(57)【要約】  血液脳関門（ＢＢＢ）を透過することができる操作された多価および多特異性結合タンパク質が提供され、それと共に作製方法、ならびに疾患の予防、診断、および／または治療において使用する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の脳血管の上皮組織に発現される抗原に特異的に結合し、かつ前記対象の脳への組成物の取り込みを促進する、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）結合タンパク質。
【請求項２】
前記結合タンパク質が、３〜３０ｎＭのＥＣ５０で前記抗原に結合する、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項３】
前記ＤＶＤ結合タンパク質が、ＤＶＤ−Ｉｇである、請求項１または２のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項４】
前記ＤＶＤ結合タンパク質が、ハーフＤＶＤ−Ｉｇ、ｓｃＤＶＤ−Ｉｇ、ｆＤＶＤ−Ｉｇ、ｒＤＶＤ−Ｉｇ、ｐＤＶＤ−Ｉｇ、ｍＤＶＤ−Ｉｇ、およびｃｏＤＶＤ−Ｉｇからなる群から選択される、請求項１または２のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項５】
前記標的が、トランスフェリン受容体である、請求項１〜４のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項６】
前記結合タンパク質が、哺乳動物対象に全身投与された場合、脳血管の上皮組織に発現した抗原に特異的に結合しない、結合タンパク質と同類の第２の結合タンパク質と比較したときに、前記哺乳動物対象において脳内濃度の１〜１０倍の増加を示す、請求項１〜５のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項７】
前記結合タンパク質が哺乳動物対象に投与された場合に、前記結合タンパク質が哺乳動物対象の脳実質または神経細胞体に局在する、請求項１〜６のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項８】
哺乳動物対象への全身投与から９６時間後の前記哺乳動物対象の脳内の前記結合タンパク質の前記結合タンパク質濃度が、前記哺乳動物対象への全身投与から２４時間後の前記哺乳動物対象の脳内の前記結合タンパク質の濃度の１％超である、請求項１〜７のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項９】
全身投与が、静脈内投与、皮下投与、および腹腔内投与からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項１０】
前記対象が、哺乳動物である、請求項１〜９のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項１１】
前記哺乳動物が、マウス、ラット、アレチネズミ、ハムスター、ウサギ、類人猿、サル、ヒト、イヌ、ネコ、ラクダ、ラマ、ウシ、およびウマからなる群から選択される、請求項１０に記載の結合タンパク質。
【請求項１２】
前記抗原が、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、ＬＲＰ、メラノコルチン受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、ＶＡＣＭ−１受容体、血管、ＩＧＦＲ、ＥＰＣＲ、ＥＧＦＲ、ＴＮＦＲ、レプチン受容体、Ｍ６ＰＲ、リポタンパク質受容体、ＮＣＡＭ、ＬＩＦＲ、ＬｆＲ、ＭＲＰ１、ＡｃｈＲ、ＤＴｒ、グルタチオン輸送体、ＳＲ−Ｂ１、ＭＹＯＦ、ＴＦＲＣ、ＥＣＥ１、ＬＤＬＲ、ＰＶＲ、ＣＤＣ５０Ａ、ＳＣＡＲＦ１、ＭＲＣ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＲＡＭＰ２、ＶＬＤＬＲ、ＳＴＡＢ１、ＴＬＲ９、ＣＸＣＬ１６、ＮＴＲＫ１、ＣＤ７４、ＤＰＰ４、内皮成長因子受容体１、２、および３、グルココルチコイド受容体、イオンチャネル型グルタミン酸受容体、Ｍ３受容体、アリール炭化水素受容体、ＧＬＵＴ−１、イノシトール−１，４，５−トリスリン酸（ＩＰ３）受容体、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体、Ｓ１Ｐ１、Ｐ２Ｙ受容体、ＴＭＥＭ３０Ａ、およびＲＡＧＥからなる群から選択される、対象の脳血管の上皮組織に発現される受容体を含む、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項１３】
組成物をさらに含み、前記組成物が、前記結合タンパク質と併用投与される、請求項１〜１２のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項１４】
前記組成物が、前記結合タンパク質に共有結合する、請求項１３に記載の結合タンパク質。
【請求項１５】
前記組成物が、リンカーにより前記結合タンパク質に共有結合する、請求項１３に記載の結合タンパク質。
【請求項１６】
前記組成物が、ブデノシド、上皮成長因子、コルチコステロイド、シクロスポリン、スルファサラジン、アミノサリチル酸、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、メトロニダゾール、リポキシゲナーゼ阻害剤、メサラミン、オルサラジン、バルサラジド、抗酸化剤、トロンボキサン阻害剤、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ、抗ＩＬ−６もしくはＩＬ−６受容体ｍＡｂ、成長因子、エラスターゼ阻害剤、ピリジニル−イミダゾール化合物、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、もしくはＰＤＧＦの抗体もしくはアゴニスト、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ−１９、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ９０に対する抗体もしくはそのリガンド、メトトレキサート、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、イブプロフェン、プレドニゾロン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作動物質、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤、ＴＮＦα変換酵素阻害剤、Ｔ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体、可溶性ｐ５５  ＴＮＦ受容体、可溶性ｐ７５  ＴＮＦ受容体、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ、抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＴＧＦβ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項１７】
ポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖がＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
ＶＤ１が、第１の重鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２が、第２の重鎖可変ドメインであり、
Ｃが、重鎖定常ドメインであり、
Ｘ１はリンカーであるが、但し、それはＣＨ１ではないものとし、
Ｘ２が、Ｆｃ領域であり、
（Ｘ１）ｎが、（Ｘ１）０または（Ｘ１）１であり、
（Ｘ２）ｎが、（Ｘ２）０または（Ｘ２）１であり、
前記結合タンパク質が、ＴｆＲまたはＨＩＲに特異的に結合し、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２が、３つのＣＤＲを含み、少なくとも１つのＣＤＲが、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５〜１１７、および１５６〜１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２が独立して、３つのＣＤＲを含み、少なくとも１つのＣＤＲが、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５〜１１７、および１５６〜１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または
（ｃ）ＶＤ１が、３つのＣＤＲを含み、少なくとも１つのＣＤＲが、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５〜１１７、および１５６〜１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２が、３つのＣＤＲを含み、少なくとも１つのＣＤＲが、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５〜１１７、および１５６〜１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項１８】
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２が、配列番号３０、３２、３４、３６、５６、および１０４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２が独立して、配列番号３０、３２、３４、３６、５６、および１０４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項１９】
ポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖が、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
ＶＤ１が、第１の軽鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２が、第２の軽鎖可変ドメインであり、
Ｃが、軽鎖定常ドメインであり、
Ｘ１はリンカーであるが、但し、それはＣＬではないものとし、
Ｘ２が、Ｆｃ領域を含まず、
（Ｘ１）ｎが、（Ｘ１）０または（Ｘ１）１であり、
（Ｘ２）ｎが、（Ｘ２）０または（Ｘ２）１であり、
前記結合タンパク質が、ＴｆＲまたはＨＩＲに特異的に結合し、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２が、それぞれ３つのＣＤＲを含み、少なくとも１つのＣＤＲが、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、および１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２が独立して、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、および１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または
（ｃ）ＶＤ１が、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、および１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２が、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、および１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１６に記載の結合タンパク質。
【請求項２０】
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２が、配列番号３１、３３、３５、３７、５７、１０５、１０６、１０７、および１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２が独立して、配列番号３１、３３、３５、３７、５７、１０５、１０６、１０７、および１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の結合タンパク質。
【請求項２１】
（Ｘ１）ｎが（Ｘ１）０である、請求項１９または２０に記載の結合タンパク質。
【請求項２２】
第１および第２のポリペプチド鎖を含み、前記第１のポリペプチド鎖が、第１のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
ＶＤ１が、第１の重鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２が、第２の重鎖可変ドメインであり、
Ｃが、重鎖定常ドメインであり、
Ｘ１が、第１のリンカーであり、
Ｘ２が、Ｆｃ領域であり、
前記第２のポリペプチド鎖が、第２のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
ＶＤ１が、第１の軽鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２が、第２の軽鎖可変ドメインであり、
Ｃが、軽鎖定常ドメインであり、
Ｘ１が、第２のリンカーであり、
Ｘ２が、Ｆｃ領域を含まず、
（Ｘ１）ｎが独立して、（Ｘ１）０または（Ｘ１）１であり、（Ｘ２）ｎが独立して、（Ｘ２）０または（Ｘ２）１であり、
前記第１および第２のＸ１のリンカーが、同じであるか、または異なっており、
前記第１のＸ１のリンカーがＣＨ１ではなく、かつ／または前記第２のＸ１のリンカーが、ＣＬではなく、
前記結合タンパク質が、ＴｆＲまたはＨＩＲに特異的に結合し、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２の重鎖可変ドメインが、それぞれ３つのＣＤＲを含み、前記ＣＤＲのうちの少なくとも１つが、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５、１１６、１１７、１５６、１５７、および１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２の重鎖可変ドメインが独立して、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５、１１６、１１７、１５６、１５７、および１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｃ）ＶＤ１の重鎖可変ドメインが、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５、１１６、１１７、１５６、１５７、および１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２の重鎖可変ドメインが、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５、１１６、１１７、１５６、１５７、および１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
式中、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２の軽鎖可変ドメインが、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、および１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２の軽鎖可変ドメインが独立して、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、および１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または
（ｃ）ＶＤ１の軽鎖可変ドメインが、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、および１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２の軽鎖可変ドメインが、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、および１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項２３】
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２の重鎖可変ドメインが、配列番号３０、３２、３４、３６、５６、および１０４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２の重鎖可変ドメインが独立して、配列番号３０、３２、３４、３６、５６、および１０４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
かつ、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２の軽鎖可変ドメインが、配列番号３１、３３、３５、３７、５７、１０５、１０６、１０７、および１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２の軽鎖可変ドメインが独立して、配列番号３１、３３、３５、３７、５７、１０５、１０６、１０７、および１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の結合タンパク質。
【請求項２４】
Ｘ１が、配列番号１〜２９、１７８、および１７９からなる群の一員から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーである、請求項１〜２３のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項２５】
前記結合タンパク質が、２つの第１のポリペプチド鎖および２つの第２のポリペプチド鎖を含む、２４に記載の結合タンパク質。
【請求項２６】
前記Ｆｃ領域が、変異体配列Ｆｃ領域を含む、請求項１〜２５のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項２７】
前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＤからなる群から選択されるＦｃ領域を含む、請求項１〜２６のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項２８】
前記第１のポリペプチド鎖の前記ＶＤ１および前記第２のポリペプチド鎖の前記ＶＤ１がそれぞれ、異なる第１および第２の親抗体、またはそれらの抗原結合部分に由来する、請求項２４に記載の結合タンパク質。
【請求項２９】
前記第１のポリペプチド鎖の前記ＶＤ２および前記第２のポリペプチド鎖の前記ＶＤ２がそれぞれ、異なる第１および第２の親抗体、またはそれらの抗原結合部分に由来する、請求項２４に記載の結合タンパク質。
【請求項３０】
前記第１および前記第２の親抗体が、前記抗原上の異なるエピトープと結合する、請求項２８または２９に記載の結合タンパク質。
【請求項３１】
ポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖がＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
ＶＤ１が、第１の重鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２が、第２の重鎖可変ドメインであり、
Ｃが、重鎖定常ドメインであり、
Ｘ１はリンカーであるが、但し、それはＣＨ１ではないものとし、
Ｘ２が、Ｆｃ領域であり、
（Ｘ１）ｎが、（Ｘ１）０または（Ｘ１）１であり、
（Ｘ２）ｎが、（Ｘ２）０または（Ｘ２）１であり、
前記結合タンパク質が、Ａｂｅｔａ、ＢＡＣＥ、Ｈｅｒ−２、ＲＧＭＡ、ＴＮＦα、およびＡＰＰからなる群から選択される疾患標的に特異的に結合し、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２が、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１２１、１２２、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、１４９、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２が独立して、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１２１、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、１４９、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｃ）ＶＤ１が、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１２１、１２２、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、１４９、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２が、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１２１、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、１４９、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項３２】
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２が、配列番号３８、５８、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、１６７、および１６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２が独立して、配列番号３８、５８、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、１６２、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３１のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項３３】
ポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖がＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
ＶＤ１が、第１の軽鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２が、第２の軽鎖可変ドメインであり、
Ｃが、軽鎖定常ドメインであり、
Ｘ１はリンカーであるが、但し、それはＣＬではないものとし、
Ｘ２が、Ｆｃ領域を含まず、
（Ｘ１）ｎが、（Ｘ１）０または（Ｘ１）１であり、
（Ｘ２）ｎが、（Ｘ２）０または（Ｘ２）１であり、
前記結合タンパク質が、Ａｂｅｔａ、ＢＡＣＥ、Ｈｅｒ−２、ＲＧＭＡ、ＴＮＦα、およびＡＰＰからなる群から選択される疾患標的に特異的に結合し、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２が、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、１５２、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２が独立して、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、１５２、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｃ）ＶＤ１が、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、１５２、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２が、３つの、それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、１５２、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む、請求項１〜３２のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項３４】
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２が、配列番号３９、５９、８７、８８、８９、９０、９１、９２、１００、１０２、１６３、および１７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２が独立して、配列番号３９、５９、８７、８８、８９、９０、９１、９２、１００、１０２、１６３、および１７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の結合タンパク質。
【請求項３５】
（Ｘ１）ｎが、（Ｘ１）０である、請求項３３または３４に記載の結合タンパク質。
【請求項３６】
第１および第２のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、前記第１のポリペプチド鎖が、第１のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
ＶＤ１が、第１の重鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２が、第２の重鎖可変ドメインであり、
Ｃが、重鎖定常ドメインであり、
Ｘ１が、第１のリンカーであり、
Ｘ２が、Ｆｃ領域であり、
前記第２のポリペプチド鎖が、第２のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
ＶＤ１が、第１の軽鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２が、第２の軽鎖可変ドメインであり、
Ｃが、軽鎖定常ドメインであり、
Ｘ１が、第２のリンカーであり、
Ｘ２が、Ｆｃ領域を含まず、
（Ｘ１）ｎが独立して、（Ｘ１）０または（Ｘ１）１であり、（Ｘ２）ｎが独立して、（Ｘ２）０または（Ｘ２）１であり、
前記第１および第２のＸ１のリンカーが、同じであるか、または異なっており、
前記第１のＸ１のリンカーがＣＨ１ではなく、かつ／または前記第２のＸ１のリンカーがＣＬではなく、
前記結合タンパク質が、Ａｂｅｔａ、ＢＡＣＥ、Ｈｅｒ−２、ＲＧＭＡ、ＴＮＦα、およびＡＰＰからなる群から選択される疾患標的に特異的に結合し、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２の重鎖可変ドメインが、それぞれ３つのＣＤＲを含み、少なくとも１つのＣＤＲが、配列番号１０９、１１０、１１１、１２１、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、１４９、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２の重鎖可変ドメインが独立して、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１２１、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、１４９、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｃ）ＶＤ１の重鎖可変ドメインが、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１２１、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、１４９、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２の重鎖可変ドメインが、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１２１、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、１４９、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２の軽鎖可変ドメインが、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、および１５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２の軽鎖可変ドメインが独立して、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、１５２、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｃ）ＶＤ１の軽鎖可変ドメインが、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、１５２、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２の軽鎖可変ドメインが、３つの、それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、１５２、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む、結合タンパク質。
【請求項３７】
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２の重鎖可変ドメインが、配列番号３８、５８、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、１６２、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２の重鎖可変ドメインが独立して、配列番号３８、５８、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、１６２、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
かつ、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２の軽鎖可変ドメインが、配列番号３９、５９、８７、８８、８９、９０、９１、９２、１００、１０２、１６３、および１７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２の軽鎖可変ドメインが独立して、配列番号３９、５９、８７、８８、８９、９０、９１、９２、１００、１０２、１６３、および１７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の結合タンパク質。
【請求項３８】
Ｘ１が、配列番号１〜２９、１７８、および１７９のうちの１つである、請求項１〜３７のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項３９】
前記結合タンパク質が、２つの第１のポリペプチド鎖および２つの第２のポリペプチド鎖を含む、請求項１〜３８のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項４０】
第１および第２のポリペプチド鎖の第１の組が、請求項２２に定義される通りであり、第１および第２のポリペプチド鎖の第２の組が、請求項３６に定義される通りである、請求項３９に記載の結合タンパク質。
【請求項４１】
前記Ｆｃ領域が、変異体配列Ｆｃ領域である、請求項１〜４０のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項４２】
前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤからのＦｃ領域である、請求項１〜４１のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項４３】
前記第１のポリペプチド鎖のＶＤ１および前記第２のポリペプチド鎖のＶＤ１が、それぞれ、異なる第１および第２の親抗体、またはそれらの抗原結合部分に由来する、請求項１〜４２のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項４４】
前記第１のポリペプチド鎖のＶＤ２および前記第２のポリペプチド鎖のＶＤ２が、それぞれ、異なる第１および第２の親抗体、またはそれらの抗原結合部分に由来する、請求項１〜４３のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項４５】
前記第１および前記第２の親抗体が、前記抗原上の異なるエピトープと結合する、請求項４３または４４に記載の結合タンパク質。
【請求項４６】
ポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖がＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
ＶＤ１が、第１の重鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２が、第２の重鎖可変ドメインであり、
Ｃが、重鎖定常ドメインであり、
Ｘ１はリンカーであるが、但し、それはＣＨ１ではないものとし、
Ｘ２が、Ｆｃ領域であり、
（Ｘ１）ｎが、（Ｘ１）０または（Ｘ１）１であり、
（Ｘ２）ｎが、（Ｘ２）０または（Ｘ２）１であり、
前記結合タンパク質が、ＴｆＲまたはＨＩＲ、およびＡｂｅｔａ、ＢＡＣＥ、Ｈｅｒ−２、ＲＧＭＡ、ＴＮＦα、またはＡＰＰに特異的に結合し、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２が、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５〜１１７、１５６〜１５８、１０９、１１０、１１１、１２１、１２２、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、１４９、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２が独立して、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５〜１１７、１５６〜１５８、１０９、１１０、１１１、１２１、１２２、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、１４９、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｃ）ＶＤ１が、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５〜１１７、および１５６〜１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２が、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１２１、１２２、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、１４９、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｄ）ＶＤ２が、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５〜１１７、および１５６〜１５８から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ１が、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１２１、１２２、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、１４９、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４５のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項４７】
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２が、配列番号３０、３２、３４、３６、５６、１０４、３８、５８、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、１６２、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｂ）ＶＤ１が、配列番号３０、３２、３４、３６、５６、または１０４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２が、配列番号３８、５８、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、１６２、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４６のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項４８】
ポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖がＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
ＶＤ１が、第１の軽鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２が、第２の軽鎖可変ドメインであり、
Ｃが、軽鎖定常ドメインであり、
Ｘ１はリンカーであるが、但し、それはＣＬではないものとし、
Ｘ２が、Ｆｃ領域を含まず、
（Ｘ１）ｎが、（Ｘ１）０または（Ｘ１）１であり、
（Ｘ２）ｎが、（Ｘ２）０または（Ｘ２）１であり、
前記結合タンパク質が、ＴｆＲまたはＨＩＲ、およびＡｂｅｔａ、ＢＡＣＥ、Ｈｅｒ−２、またはＡＰＰに特異的に結合し、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２が、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、１６１、１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、１５２、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２が独立して、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、１６１、１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、１５２、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｃ）ＶＤ１が、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、および１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２が、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、および１５２、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｄ）ＶＤ２が、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、および１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ１が、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、１５２、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４７のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項４９】
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２が、配列番号３１、３３、３５、３７、５７、１０５、１０６、１０７、１０８、３９、５９、８７、８８、８９、９０、９１、９２、１００、１０２、１６３、および１７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｂ）ＶＤ１が、配列番号３１、３３、３５、３７、５７、１０５、１０６、１０７、および１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２が、配列番号３９、５９、８７、８８、８９、９０、９１、９２、１００、１０２、１６３、および１７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４８に記載の結合タンパク質。
【請求項５０】
（Ｘ１）ｎが、（Ｘ１）０である、請求項４８または４９に記載の結合タンパク質。
【請求項５１】
第１および第２のポリペプチド鎖を含み、前記第１のポリペプチド鎖が、第１のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
ＶＤ１が、第１の重鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２が、第２の重鎖可変ドメインであり、
Ｃが、重鎖定常ドメインであり、
Ｘ１が、第１のリンカーであり、
Ｘ２が、Ｆｃ領域であり、
前記第２のポリペプチド鎖が、第２のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
ＶＤ１が、第１の軽鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２が、第２の軽鎖可変ドメインであり、
Ｃが、軽鎖定常ドメインであり、
Ｘ１が、第２のリンカーであり、
Ｘ２が、Ｆｃ領域を含まず、
（Ｘ１）ｎが独立して、（Ｘ１）０または（Ｘ１）１であり、（Ｘ２）ｎが独立して、（Ｘ２）０または（Ｘ２）１であり、
前記第１および第２のＸ１のリンカーが、同じであるか、または異なっており、
前記第１のＸ１のリンカーがＣＨ１ではなく、かつ／または前記第２のＸ１のリンカーが、ＣＬではなく、
前記結合タンパク質が、ＴｆＲまたはＨＩＲ、およびＡｂｅｔａ、ＢＡＣＥ、Ｈｅｒ−２、ＲＧＭＡ、ＴＮＦα、またはＡＰＰに特異的に結合し、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２の重鎖可変ドメインが、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５〜１１７、１５６〜１５８、１０９、１１０、１１１、１２１、１２２、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、１４９、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２の重鎖可変ドメインが独立して、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５〜１１７、１５６〜１５８、１０９、１１０、１１１、１２１、１２２、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、１４９、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｃ）ＶＤ１の重鎖可変ドメインが、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５、１１６、１１７、１５６、１５７、１５８、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２の重鎖可変ドメインが、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１２１、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、および１４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｄ）ＶＤ２の重鎖可変ドメインが、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５、１１６、１１７、１５６、１５７、１５８、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ１の重鎖可変ドメインが、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１２１、１２２、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、および１４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
かつ、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２の軽鎖可変ドメインが、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、１６１、１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、１５２、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２の軽鎖可変ドメインが独立して、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、１６１、１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、１５２、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｃ）ＶＤ１の軽鎖可変ドメインが、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、１６１、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２の軽鎖可変ドメインが、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、および１５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｄ）ＶＤ２の軽鎖可変ドメインが、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、１６１、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ１軽鎖可変ドメインが、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、および１５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５０のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項５２】
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２の重鎖可変ドメインが、配列番号３０、３２、３４、３６、５６、１０４、３８、５８、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、−１６２、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｂ）ＶＤ１の重鎖可変ドメインが、配列番号３０、３２、３４、３６、５６、または１０４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２の重鎖可変ドメインが、配列番号３８、５８、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、１６２、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
かつ、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２の軽鎖可変ドメインが、配列番号３１、３３、３５、３７、５７、１０５、１０６、１０７、１０８、３９、５９、８７、８８、８９、９０、９１、９２、１００、１０２、１６３、および１７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｂ）ＶＤ１の軽鎖可変ドメインが、配列番号３１、３３、３５、３７、５７、１０５、１０６、１０７、または１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２の軽鎖可変ドメインが、配列番号３９、５９、８７、８８、８９、９０、９１、９２、１００、または１０２、１６３、および１７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載の結合タンパク質。
【請求項５３】
Ｘ１が、配列番号１〜２９、１７８、および１７９のうちの１つを含む、請求項１〜５２のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項５４】
前記結合タンパク質が、２つの第１のポリペプチド鎖および２つの第２のポリペプチド鎖を含む、５３に記載の結合タンパク質。
【請求項５５】
前記Ｆｃ領域が、変異体配列Ｆｃ領域である、請求項１〜５４のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項５６】
前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤからのＦｃ領域である、請求項１〜５５のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項５７】
前記第１のポリペプチド鎖のＶＤ１および前記第２のポリペプチド鎖のＶＤ１が、それぞれ、異なる第１および第２の親抗体、またはそれらの抗原結合部分に由来する、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項５８】
前記第１のポリペプチド鎖のＶＤ２および前記第２のポリペプチド鎖のＶＤ２が、それぞれ、異なる第１および第２の親抗体、またはそれらの抗原結合部分に由来する、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項５９】
前記第１および前記第２の親抗体が、異なる抗原と結合する、請求項５７または５８に記載の結合タンパク質。
【請求項６０】
請求項１７に記載の重ポリペプチド鎖および請求項１９に記載の軽ポリペプチド鎖、または請求項３１に記載の重ポリペプチド請求項および請求項３３に記載の軽ポリペプチド鎖を含む、単一特異性結合タンパク質。
【請求項６１】
請求項１７に記載の重ポリペプチド鎖および請求項３３に記載の軽ポリペプチド鎖、請求項３１に記載の重ポリペプチド請求項および請求項１９に記載の軽ポリペプチド鎖、請求項４６に記載の重ポリペプチド請求項および請求項１９、３３、もしくは４８に記載の軽ポリペプチド鎖、または請求項１７、３１、もしくは４６に記載の重ポリペプチド請求項および請求項４８に記載の軽ポリペプチド鎖を含む、二特異性結合タンパク質。
【請求項６２】
前記結合タンパク質が、Ｏｕｔ１−（Ｘ１）ｍ−Ｉｎ１−（Ｘ２）ｎを含み、式中、Ｉｎ１が、前記対象の前記脳血管の上皮組織に発現される前記抗原に特異的に結合し、Ｏｕｔ１が、別の分子に特異的に結合し、Ｘ１がリンカーであり、Ｘ２がＦｃ領域であり、ｍが０または１であり、ｎが０または１である、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項６３】
Ｉｎ１が、約５ｎＭ〜０．０１ｎＭのＥＣ５０で、前記対象の前記脳血管の上皮組織に発現される前記抗原に特異的に結合する、請求項６２に記載の結合タンパク質。
【請求項６４】
Ｉｎ１が、トランスフェリン受容体に特異的に結合する、請求項６２に記載の結合タンパク質。
【請求項６５】
Ｉｎ１が、３ｎＭ未満のＥＣ５０でトランスフェリン受容体に特異的に結合する、請求項６４に記載の結合タンパク質。
【請求項６６】
Ｉｎ１が、配列番号５６のアミノ配列を含む、請求項６４に記載の結合タンパク質。
【請求項６７】
Ｘ１が、配列番号１７９のアミノ酸配列を含む、請求項６３に記載の結合タンパク質。
【請求項６８】
Ｏｕｔ１が、ＣＧＲＰ、ＴＮＦα、ＲＧＭＡ、サブスタンスＰ、ブラジキニン、Ｎａｖ１．７、ＬＰＡ、Ｐ２Ｘ３、ＮＧＦ、Ａｂｅｔａ；ＢＡＣＥ１；ＩＬ−１β；ＩＧＦ１もしくは２；ＩＬ−１８；ＩＬ−６；ＲＡＧＥ；ＮＧＦ；ＥＧＦＲ；ｃＭｅｔ、Ｈｅｒ−２およびＣＤ−２０からなる群から選択される別の分子に結合する、請求項６３に記載の結合タンパク質。
【請求項６９】
Ｏｕｔ１が、約１ｎＭ〜１００ｎＭのＥＣ５０で、前記対象の前記脳血管の上皮組織に発現される前記抗原に特異的に結合する、請求項６２に記載の結合タンパク質。
【請求項７０】
Ｏｕｔ１が、トランスフェリン受容体に特異的に結合する、請求項６９に記載の結合タンパク質。
【請求項７１】
Ｏｕｔ１が、３ｎＭ超のＥＣ５０でトランスフェリン受容体に特異的に結合する、請求項７０に記載の結合タンパク質。
【請求項７２】
Ｏｕｔ１が、配列番号３６のアミノ配列を含む、請求項６４に記載の結合タンパク質。
【請求項７３】
Ｘ１が、配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項６９に記載の結合タンパク質。
【請求項７４】
Ｉｎ１が、ＣＧＲＰ、ＴＮＦα、ＲＧＭＡ、サブスタンスＰ、ブラジキニン、Ｎａｖ１．７、ＬＰＡ、Ｐ２Ｘ３、ＮＧＦ、Ａｂｅｔａ；ＢＡＣＥ１；ＩＬ−１β；ＩＧＦ１もしくは２；ＩＬ−１８；ＩＬ−６；ＲＡＧＥ；ＮＧＦ；ＥＧＦＲ；ｃＭｅｔ、Ｈｅｒ−２およびＣＤ−２０からなる群から選択される別の分子に結合する、請求項６９に記載の結合タンパク質。
【請求項７５】
前記第１の親抗体またはその抗原結合部分が、前記第２の親抗体またはその抗原結合部分が前記第２の抗原に結合する効力とは異なる効力で、前記第１の抗原に結合する、請求項１〜７４のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項７６】
前記第１の親抗体またはその抗原結合部分が、前記第２の親抗体またはその抗原結合部分が前記第２の抗原に結合する親和性とは異なる親和性で、前記第１の抗原に結合する、請求項１〜７５のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項７７】
前記結合タンパク質が、表面プラズモン共鳴により測定するとき、１つ以上の標的に対して少なくとも約１０２Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０３Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０５Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも約１０６Ｍ−１ｓ−１のオン速度定数（Ｋｏｎ）を有する、請求項１〜７６のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項７８】
前記結合タンパク質が、表面プラズモン共鳴により測定するとき、１つ以上の標的に対して多くとも約１０−３ｓ−１、多くとも約１０−４ｓ−１、多くとも約１０−５ｓ−１、または多くとも約１０−６ｓ−１のオフ速度定数（Ｋｏｆｆ）を有する、請求項１〜７７のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項７９】
前記結合タンパク質が、１つ以上の標的に対して多くとも約１０−７Ｍ、多くとも約１０−８Ｍ、多くとも約１０−９Ｍ、多くとも約１０−１０Ｍ、多くとも約１０−１１Ｍ、多くとも約１０−１２Ｍ、または多くとも約１０−１３Ｍの解離定数（Ｋｄ）を有する、請求項１〜７８のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項８０】
前記結合タンパク質複合体が、薬剤をさらに含み、前記薬剤が、免疫接着分子、診断剤、造影剤、治療剤、または、細胞傷害性剤である、請求項１〜７９のいずれかに記載の結合タンパク質を含む結合タンパク質複合体。
【請求項８１】
前記造影剤が、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識、またはビオチンである、請求項８０に記載の結合タンパク質複合体。
【請求項８２】
前記結合タンパク質が、結晶化結合タンパク質である、請求項１〜８１のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項８３】
請求項１〜８２のいずれかに記載の結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする、単離された核酸。
【請求項８４】
請求項８２に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項８５】
前記ベクターが、ｐｃＤＮＡ、ｐＴＴ、ｐＴＴ３、ｐＥＦＢＯＳ、ｐＢＶ、ｐＪＶ、ｐｃＤＮＡ３．１  ＴＯＰＯ、ｐＥＦ６  ＴＯＰＯ、ｐＨｙｂＥ、ｐＢＯＳ、またはｐＢＪである、請求項８４に記載のベクター。
【請求項８６】
請求項８５に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項８７】
前記宿主細胞が、原核細胞である、請求項８６に記載の宿主細胞。
【請求項８８】
前記宿主細胞が、真核細胞である、請求項８６に記載の宿主細胞。
【請求項８９】
前記真核細胞が、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、または真菌細胞である、請求項８８に記載の宿主細胞。
【請求項９０】
結合タンパク質を産生する方法であって、前記結合タンパク質を産生するのに十分な条件下で、培養培地中で請求項８６〜８９のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項９１】
請求項９０に記載の方法から産生されたタンパク質。
【請求項９２】
請求項１〜９１のいずれかに記載の結合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項９３】
少なくとも１つの追加の治療剤をさらに含む、請求項９２に記載の薬学的組成物。
【請求項９４】
前記追加の治療剤が、造影剤、細胞傷害性剤、血管形成阻害剤、キナーゼ阻害剤、共刺激分子遮断剤、接着分子遮断剤、抗サイトカイン抗体もしくはその機能的断片、メトトレキサート、シクロスポリン、ラパマイシン、ＦＫ５０６、検出可能な標識もしくはレポーター、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ剤、筋肉弛緩剤、麻酔剤、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔、鎮静剤、局所麻酔、神経筋肉遮断剤、抗微生物剤、抗乾癬剤、コルチコステロイド（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｉｏｄ）、アナボリックステロイド、エリスロポエチン、免疫化、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性医薬、抗鬱剤、抗精神病薬、刺激剤、喘息薬、ベータアゴニスト、吸引用ステロイド、エピネフリンもしくは類似体、サイトカイン、またはサイトカインアンタゴニストである、請求項９３に記載の薬学的組成物。
【請求項９５】
前記追加の治療剤が、ブデノシド、上皮成長因子、コルチコステロイド、シクロスポリン、スルファサラジン、アミノサリチル酸、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、メトロニダゾール、リポキシゲナーゼ阻害剤、メサラミン、オルサラジン、バルサラジド、抗酸化剤、トロンボキサン阻害剤、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ、抗ＩＬ−６もしくはＩＬ−６受容体ｍＡｂ、成長因子、エラスターゼ阻害剤、ピリジニル−イミダゾール化合物、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、もしくはＰＤＧＦの抗体もしくはアゴニスト、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ−１９、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ９０に対する抗体もしくはそのリガンド、メトトレキサート、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、イブプロフェン、プレドニゾロン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作動物質、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤、ＴＮＦα変換酵素阻害剤、Ｔ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体、可溶性ｐ５５  ＴＮＦ受容体、可溶性ｐ７５  ＴＮＦ受容体、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ、抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＴＧＦβ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９３に記載の薬学的組成物。
【請求項９６】
治療が達成されるように、対象に前記結合タンパク質を投与することにより、疾患または障害に対して前記対象を治療するのに用いるための、請求項１〜９５のいずれかに記載の結合タンパク質。
【請求項９７】
前記障害が、脳障害である、請求項９６に記載の結合タンパク質。
【請求項９８】
前記脳障害が、前記脳の自己免疫もしくは炎症性疾患、前記脳の感染性疾患、神経学的障害、神経変性障害、脳癌、または脳転移である、請求項９７に記載の結合タンパク質。
【請求項９９】
前記障害が、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、精神障害、鬱病、統合失調症、急性および慢性疼痛からなる群から選択される、請求項９８に記載の結合タンパク質。
【請求項１００】
前記対象への投与が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内（ｉｎｔｒａｒｔｉｃｕｌａｒ）、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔａｒｙ）、腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心臓周囲内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、髄腔内、滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、または経皮である、請求項９９に記載の結合タンパク質。
【請求項１０１】
２つの抗原に結合することができる結合タンパク質を生成するための方法であって、
ａ）第１の抗原に結合することができる第１の親抗体またはその抗原結合部分を得るステップと、
ｂ）第２の抗原に結合することができる第２の親抗体またはその抗原結合部分を得るステップと、
ｃ）請求項１〜１００のいずれかに記載のポリペプチド鎖（複数可）をコードする構築物（複数可）を調製するステップと、
ｄ）前記ポリペプチド鎖（複数可）を発現させるステップと、
を含み、それにより、前記第１および前記第２の抗原に結合することができる前記結合タンパク質が生成される、方法。
【請求項１０２】
前記Ｆｃ領域が、変異体配列Ｆｃ領域である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤからのＦｃ領域である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記第１の親抗体またはその抗原結合部分が存在する場合、前記第２の親抗体またはその抗原結合部分が存在する場合に前記第２の抗原に結合する親和性および／または効力とは異なる親和性および／または効力で、前記第１の抗原に結合する、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０５】
イムノアッセイにより試験試料中の少なくとも１つの抗原またはその断片の存在を決定する方法であって、
前記イムノアッセイが、前記試験試料を少なくとも１つの結合タンパク質および少なくとも１つの検出可能な標識と接触させることを含み、前記少なくとも１つの結合タンパク質が、請求項１〜１０４のいずれかに記載の結合タンパク質を含む、方法。
【請求項１０６】
（ｉ）前記試験試料を前記少なくとも１つの結合タンパク質と接触させることであって、前記結合タンパク質が前記抗原またはその断片上のエピトープに結合し、第１の複合体を形成する、接触させることと、
（ｉｉ）前記第１の複合体を前記少なくとも１つの検出可能な標識と接触させることであって、前記検出可能な標識が、前記結合タンパク質、または前記結合タンパク質により結合されない前記抗原もしくはその断片上のエピトープに結合し、第２の複合体を形成する、接触させることと、
（ｉｉｉ）前記第２の複合体において前記検出可能な標識により生成されたシグナルに基づいて、前記試験試料中の前記抗原またはその断片の存在を検出することであって、前記抗原またはその断片の存在が、前記検出可能な標識により生成された前記シグナルを分析することにより特定または示される、検出することと、をさらに含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
（ｉ）前記試験試料を前記少なくとも１つの結合タンパク質と接触させることであって、前記結合タンパク質が前記抗原またはその断片上のエピトープに結合し、第１の複合体を形成する、接触させることと、
（ｉｉ）前記第１の複合体を前記少なくとも１つの検出可能な標識と接触させることであって、前記検出可能な標識が、前記結合タンパク質に結合して第２の複合体を形成することに対して、前記抗原またはその断片と競合する、接触させることと、
（ｉｉｉ）前記第２の複合体において前記検出可能な標識により生成されたシグナルに基づいて、前記試験試料中の前記抗原またはその断片の存在を検出することであって、前記抗原またはその断片の前記存在が、前記検出可能な標識により生成された前記シグナルを分析することにより測定される、検出することと、をさらに含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０８】
前記試験試料が、患者からの試料であり、前記方法が、前記患者を診断する、予後予測する、または前記患者の治療的／予防的治療の効率を評価することをさらに含み、
任意に、前記方法が、前記患者の治療的／予防的治療の有効性を評価することをさらに含む場合、前記方法が、任意に、有効性を改善させる必要に応じて前記患者の前記治療的／予防的治療を改変することをさらに含む、請求項１０５〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記方法が、自動システムまたは半自動システムで用いるのに適している、請求項１０５〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記方法が、前記試料中の１つを超える抗原の存在を決定する、請求項１０５〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
イムノアッセイにより試験試料中の抗原またはその断片の量または濃度を決定する方法であって、
前記イムノアッセイが、（ａ）少なくとも１つの薬剤および少なくとも１つの検出可能な標識を利用し、かつ（ｂ）前記検出可能な標識により生成されたシグナルを、前記抗原またはその断片を含む対照または較正物質と比較することを含み、
前記較正物質が、任意に、一連の較正物質の一部であり、各較正物質が、前記抗原またはその断片の濃度により前記一連の他の較正物質とは異なり、
前記少なくとも１つの薬剤が、請求項１〜１１０のいずれかに記載の結合タンパク質を含む、方法。
【請求項１１２】
（ｉ）前記試験試料を前記少なくとも１つの結合タンパク質と接触させることであって、前記結合タンパク質が前記抗原またはその断片上のエピトープに結合し、第１の複合体を形成する、接触させることと、
（ｉｉ）前記第１の複合体を前記少なくとも１つの検出可能な標識と接触させることであって、前記検出可能な標識が、前記結合タンパク質により結合されない前記抗原またはその断片上のエピトープに結合して、第２の複合体を形成する、接触させることと、
（ｉｉｉ）前記第２の複合体において前記検出可能な標識により生成されたシグナルに基づいて、前記試験試料中の前記抗原またはその断片の量または濃度を決定することであって、前記抗原またはその断片の量または濃度が、前記検出可能な標識により生成された前記シグナルを分析することにより特定される、決定することと、をさらに含む、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
（ｉ）前記試験試料を前記少なくとも１つの結合タンパク質と接触させることであって、前記結合タンパク質が前記抗原またはその断片上のエピトープに結合し、第１の複合体を形成する、接触させることと、
（ｉｉ）前記複合体を前記少なくとも１つの検出可能な標識と接触させることであって、前記検出可能な標識が、前記結合タンパク質に結合して第２の複合体を形成することに対して、前記抗原またはその断片と競合する、接触させることと、
（ｉｉｉ）前記第２の複合体において前記検出可能な標識により生成されたシグナルに基づいて、前記試験試料中の前記抗原またはその断片の量または濃度を決定することであって、前記抗原またはその断片の存在が、前記検出可能な標識により生成された前記シグナルを分析することにより示される、決定することと、をさらに含む、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１４】
前記試験試料が、患者からの試料であり、前記方法が、前記患者を診断すること、予後予測すること、または前記患者の治療的／予防的治療の効率を評価することをさらに含み、
前記方法が、前記患者の治療的／予防的治療の有効性を評価することをさらに含む場合、前記方法が、任意に、有効性を改善させる必要に応じて前記患者の前記治療的／予防的治療を改変することをさらに含む、請求項１１１〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記方法が、自動システムまたは半自動システムで用いるのに適している、請求項１１１〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記方法が、前記試料中の１つを超える抗原の量または濃度を決定する、請求項１１１〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
抗原またはその断片の存在、量、または濃度について試験試料をアッセイするためのキットであって、
（ａ）前記抗原またはその断片について前記試験試料をアッセイするための説明書と、
（ｂ）請求項１〜１１６のいずれかに記載の結合タンパク質を含む少なくとも１つの結合タンパク質と、を含む、キット。
【請求項１１８】
配列番号３０〜３７、５６、および５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＴｆＲに特異的に結合する、ヒト化抗体。
【請求項１１９】
配列番号１０４〜１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＩＲに特異的に結合する、ヒト化抗体。
【請求項１２０】
配列番号１０３に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをさらに含み、前記ポリペプチドが、前記結合タンパク質に結合し得るか、または前記結合タンパク質に結合し得ない、請求項１〜１１９のいずれかに記載の結合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本国際出願は、２０１２年１２月４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３３，２５２号および２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７９２，１６３号からの優先権を主張し、それらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
血液脳関門（ＢＢＢ）上の受容体に結合し、かつ脳に別の脳標的ドメインを運ぶことができる多価および多特異性結合タンパク質、作製方法、脳におけるインビボ分布、ならびに急性および慢性神経系疾患、脳癌、疼痛の治療におけるそれらの使用が提供される。
【背景技術】
【０００３】
脳は、血液脳関門（ＢＢＢ）と称される高度な血管関門系により、脳実質への血流からの抗体および他の生物学的薬物の通過を妨げる。したがって、成功したＣＮＳ薬剤開発における最も重要な要因の１つは、そのような薬物を脳に効率的に送達する能力である。脳への抗体の不十分な分布は、脳への非効率的な対流的な取り込みにより（例えば、脳の血管内皮における「密着結合」のため）、また脳の間質液の速い代謝回転により、ある程度説明され得、これは脳からのＩｇＧの効率的な対流の排除と相関し得る。サイズ、形状、親油性、および荷電等は、脳透過性を統制する重要なパラメーターであるため、公表値は０．０１％程度に低いものから０．４％程度に高いものの範囲に及ぶものの、血液中のわずか約０．１％のタンパク質が、受動拡散を通して中枢神経系にアクセスする（Ｂｅｒｇｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｌｅｖｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｇａｒｇ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｈａｓａｒ，２００９、Ｂｒａｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。野生型動物およびＦｃＲｎ欠損マウスにおけるネズミモノクローナルＩｇＧ１抗体の静脈内（ＩＶ）投与後に、実質的に同一のＩｇＧの脳／血漿の曝露比が観察された（すなわち、０．００２２±０．０００１５対０．００２１±０．０００１１、Ｐ＝０．３３４７、Ａ．Ｇａｒｇ  ａｎｄ  Ｊ．Ｐ．Ｂａｌｔｈａｓａｒ，）。中枢神経系におけるＩｇＧ輸送体の機序および速度は、大部分が未知である。
【０００４】
様々な薬物送達アプローチが、血液脳関門（ＢＢＢ）の問題に対処するために採用されている。多くのこれらのアプローチは、脳血管の上皮組織に発現された特異的受容体の輸送能力を発揮して、脳へのＢＢＢを横断する生物学的製剤を輸送する。これらの受容体はまた、ＢＢＢを横断するナノ粒子の輸送を媒介するように利用され得る。例えば、受容体を標的とするＭＡｂに結合されたナノ粒子は、ＢＢＢを横断するロペラミドを輸送するために使用されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、一般に、既存のＢＢＢ送達技術と関連するいくつかの欠点がある。例えば、輸送体の輸送動態および構造上の結合必要条件は、結合を促進するために、生物学的製剤への改変を必要とし得る。抗受容体ＭＡｂを用いた研究は、受容体の媒介による取り込み後、受容体へのＭＡｂの親和性が、ＭＡｂの解離を確実にするために大いに重要であることを示している。さらに、これらの受容体は、末梢器官における広範な発現も示し、これにより、脳に特異的な送達のためのそれらの適用を限定する。最後に、同時輸送された生物学的製剤の分子量は、取り込みを確実にするために比較的低い分子量のものでなければならない。したがって、特に、血液脳関門を妨げることなく、脳に透過し得る高分子量の操作された結合タンパク質に関しては、向上したＢＢＢ送達技術が、依然として緊急に必要とされる。そのような高分子量の結合タンパク質には、二特異性抗体ならびに２つ以上の抗原に結合することができる他の多価および多特異性結合タンパク質が含まれる（ＰＣＴ公開第ＷＯ０１７７３４２号および米国特許第７，６１２，１８１号を参照のこと）。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、対象の脳血管の上皮組織に発現し、かつ対象のＢＢＢを横断するＢＢＢ抗原に結合することができる高分子量（ＨＭＷ）の結合タンパク質（例えば、細胞外受容体、表面タンパク質、細胞内受容体、細胞内タンパク質、糖質、標的、およびリガンド受容体）を提供することにより当該技術分野において改善する。ある態様において、本開示は、少なくとも１つの結合ドメインまたは治療的に関連する標的に対して１つ以上の第２の結合ドメイン（例えば、可変ドメイン）と組み合わせた抗原（例えば、輸送受容体）を標的とする結合部位を含むＨＭＷの多価結合タンパク質（例えば、ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））を提供する。さらに、他の結合タンパク質とは異なり、本開示の結合タンパク質は、ＢＢＢの取り込みの際に非占有である１つ以上の結合部位またはドメイン（例えば、１つ、２つ、または３つの結合部位）を有し、そのため、脳内に存在する治療関連標的分子との結合に依然として利用可能である。加えてまたは代替として、１つ以上の結合部位は、脳への薬剤の送達を促進するために、治療剤（例えば、内因性または外因性治療的タンパク質）で事前充填され得る。したがって、本発明の結合タンパク質は、アルツハイマー病、パーキンソン病、疼痛、てんかん  統合失調症、および脳癌が含まれるが、これらに限定されない、脳およびＣＮＳ疾患の治療に適切である。特に、脳組織へのＤＶＤ−Ｉｇ（商標）の全身送達の実行可能性は、脳の免疫組織化学を含む様々なアッセイにより確立されている。
【０００７】
ある実施形態において、本開示は、対象の脳血管の上皮組織に発現される抗原に特異的に結合し、かつ組成物の対象の脳への取り込みを促進する、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）の結合タンパク質を提供する。ある実施形態において、本開示は、対象の脳血管の上皮組織に発現される受容体に特異的に結合する結合タンパク質を提供する。
【０００８】
ある実施形態において、対象の脳血管の上皮組織に発現される受容体は、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、ＬＲＰファミリー受容体、メラノコルチン受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、ＶＡＣＭ−１受容体、血管内皮成長因子受容体１、２、および３、グルココルチコイド受容体、イオンチャネル型グルタミン酸受容体、Ｍ３受容体、アリール炭化水素受容体、ＧＬＵＴ−１、イノシトール−１，４，５−トリスリン酸（ＩＰ３）受容体、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体、Ｓ１Ｐ１、Ｐ２Ｙ受容体、Ｍ６ＰＲ、神経性ニコチン性アセチルコリン受容体、リポタンパク質受容体、ＡｃｈＲ、ＤＴｒ、グルタチオン輸送体、ＳＲ−Ｂ１、ＭＹＯＦ、ＴＦＲＣ、ＥＣＥ１，ＬＤＬＲ、ＰＶＲ、ＣＤＣ５０Ａ、ＳＣＡＲＦ１、ＭＲＣ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＲＡＭＰ２、ＶＬＤＬＲ、ＳＴＡＢ１、ＴＬＲ９、ＣＸＣＬ１６、ＮＴＲＫ１、ＣＤ７４、ＤＰＰ４、ＴＭＥＭ３０Ａ、およびＲＡＧＥからなる群から選択され、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）ファミリー受容体には、例えば、ＬＲＰ１、ＬＲＰ１ｂ、ＬＲＰ２、ＶＬＤＬ受容体、ＬＲＰ４、およびＬＲＰ８が含まれる。任意に、ＬＲＰファミリー受容体は、ＬＲＰ２またはＬＲＰ８から選択され得る。ある実施形態において、受容体は、トランスフェリン受容体である。結合タンパク質は、様々な実施形態において、標的を含む抗原に結合する。例えば、標的は、トランスフェリン受容体を含む。
【０００９】
一実施形態において、結合タンパク質は、３〜３０ｎＭのＥＣ５０で抗原に結合する。例えば、ＥＣ５０は、少なくとも約３ｎＭ〜約１０ｎＭ、約１０ｎＭ〜約１５ｎＭ、約１５ｎＭ〜約２０ｎＭ、約２０ｎＭ〜約２５ｎＭ、または約２５ｎＭ〜約３０ｎＭである。
【００１０】
ある実施形態において、ＤＶＤ結合タンパク質は、ＤＶＤ−Ｉｇを含む。様々な実施形態において、ＤＶＤ結合タンパク質は、ハーフＤＶＤ−Ｉｇ、ｓｃＤＶＤ−Ｉｇ、ｆＤＶＤ−Ｉｇ、ｒＤＶＤ−Ｉｇ、ｐＤＶＤ−Ｉｇ、ｍＤＶＤ−Ｉｇ、およびｃｏＤＶＤ−Ｉｇからなる群から選択される。例えば、ＤＶＤ−Ｉｇは、ヒト化される。
【００１１】
様々な実施形態において、結合タンパク質は、哺乳動物対象に全身投与された場合、脳血管の上皮組織に発現した抗原に特異的に結合しない、結合タンパク質と同類の第２の結合タンパク質と比較したときに、哺乳動物対象において脳内濃度の１〜１０倍の増加を示す。様々な実施形態において、対象は、静脈内または局所的に投与される。
【００１２】
ある実施形態において、結合タンパク質は、複数の結合タンパク質を含み、例えば、結合タンパク質は、混合物、溶液、または組成物中にある。ある実施形態において、結合タンパク質は、結合タンパク質が哺乳動物対象に投与された場合、哺乳動物対象の脳実質または神経細胞体に局在する。
【００１３】
ある実施形態において、哺乳動物対象への全身投与から９６時間後の哺乳動物対象の脳内の結合タンパク質の濃度が、哺乳動物対象への全身投与から２４時間後の哺乳動物対象の脳内の結合タンパク質の濃度の１％超である。ある実施形態において、全身投与は、静脈内投与、皮下投与、および腹腔内投与からなる群から選択される。様々な実施形態において、結合タンパク質は、アプリケーターと共に使用するために製剤化される。例えば、このアプリケーターは、注射器、点滴器、パッチ、膜、またはメッシュである。
【００１４】
ある実施形態において、結合タンパク質は、哺乳動物対象の脳血管の上皮組織に発現した抗原に特異的に結合する。様々な実施形態において、哺乳動物は、マウス、ラット、アレチネズミ、ハムスター、ウサギ、類人猿、サル、ヒト、イヌ、ネコ、ラクダ、ラマ、ウシ、およびウマからなる群から選択される。
【００１５】
ある実施形態において、対象の脳血管の上皮組織に発現される受容体を含む結合タンパク質により結合した抗原は、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、ＬＲＰ、メラノコルチン受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、ＶＡＣＭ−１受容体、血管、ＩＧＦＲ、ＥＰＣＲ、ＥＧＦＲ、ＴＮＦＲ、レプチン受容体、Ｍ６ＰＲ、リポタンパク質受容体、ＮＣＡＭ、ＬＩＦＲ、ＬｆＲ、ＭＲＰ１、ＡｃｈＲ、ＤＴｒ、グルタチオン輸送体、ＳＲ−Ｂ１、ＭＹＯＦ、ＴＦＲＣ、ＥＣＥ１，ＬＤＬＲ、ＰＶＲ、ＣＤＣ５０Ａ、ＳＣＡＲＦ１、ＭＲＣ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＲＡＭＰ２、ＶＬＤＬＲ、ＳＴＡＢ１、ＴＬＲ９、ＣＸＣＬ１６、ＮＴＲＫ１、ＣＤ７４、ＤＰＰ４、内皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、例えばＥＧＦＲ１、ＥＧＦＲ２、およびＥＧＦＲ３、グルココルチコイド受容体、イオンチャネル型グルタミン酸受容体、Ｍ３受容体、アリール炭化水素受容体、ＧＬＵＴ−１、イノシトール−１，４，５−トリスリン酸（ＩＰ３）受容体、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体、Ｓ１Ｐ１、Ｐ２Ｙ受容体、ＴＭＥＭ３０Ａ、およびＲＡＧＥからなる群から選択される。
【００１６】
ある実施形態において、結合タンパク質は、組成物をさらに含み、そのため、この組成物は、結合タンパク質と併用投与される。例えば、本組成物は、薬学的に許容される担体または緩衝液を含む。様々な実施形態において、本結合タンパク質および組成物は、共有結合せず、混合されるか、または互いに接触される。
【００１７】
ある実施形態において、本組成物は、本結合タンパク質に共有結合する。ある実施形態において、本組成物は、リンカーにより本結合タンパク質に共有結合する。
【００１８】
ある実施形態において、本組成物は、ブデノシド、上皮成長因子、コルチコステロイド、シクロスポリン、スルファサラジン、アミノサリチル酸、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、メトロニダゾール、リポキシゲナーゼ阻害剤、メサラミン、オルサラジン、バルサラジド、抗酸化剤、トロンボキサン阻害剤、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、抗ＩＬ−１β  ｍＡｂｓ、抗ＩＬ−６もしくはＩＬ−６受容体ｍＡｂ、成長因子、エラスターゼ阻害剤、ピリジニル−イミダゾール化合物、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、もしくはＰＤＧＦの抗体もしくはアゴニスト、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ−１９、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ９０に対する抗体もしくはそのリガンド、メトトレキサート、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、イブプロフェン、プレドニゾロン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作動物質、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤、ＴＮＦα変換酵素阻害剤、Ｔ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体、可溶性ｐ５５  ＴＮＦ受容体、可溶性ｐ７５  ＴＮＦ受容体、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ、抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＴＧＦβ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１９】
ある実施形態において、結合タンパク質は、ポリペプチド鎖を含み、そのため、このポリペプチド鎖はＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
ＶＤ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、
Ｃは、重鎖定常ドメインであり、
Ｘ１はリンカーであるが、但し、それはＣＨ１ではないものとし、
Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、
（Ｘ１）ｎは、（Ｘ１）０または（Ｘ１）１であり、
（Ｘ２）ｎは、（Ｘ２）０または（Ｘ２）１であり、
そのため、本結合タンパク質は、ＴｆＲまたはＨＩＲに特異的に結合し、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２は、３つのＣＤＲを含み、少なくとも１つのＣＤＲは、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５〜１１７、および１５６〜１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２は独立して、３つのＣＤＲを含み、少なくとも１つのＣＤＲは、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５〜１１７、および１５６〜１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または
（ｃ）ＶＤ１は、３つのＣＤＲを含み、少なくとも１つのＣＤＲは、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５〜１１７、および１５６〜１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＤ２は、３つのＣＤＲを含み、少なくとも１つのＣＤＲは、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５〜１１７、および１５６〜１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２０】
結合タンパク質のある実施形態において、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２は、配列番号３０、３２、３４、３６、５６、および１０４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２は独立して、配列番号３０、３２、３４、３６、５６、および１０４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２１】
ある実施形態において、本結合タンパク質は、ポリペプチド鎖を含み、そのため、このポリペプチド鎖はＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
ＶＤ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、
Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、
Ｘ１はリンカーであるが、但し、それはＣＬではないものとし、
Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まず、
（Ｘ１）ｎは、（Ｘ１）０または（Ｘ１）１であり、
（Ｘ２）ｎは、（Ｘ２）０または（Ｘ２）１であり、
本結合タンパク質は、ＴｆＲまたはＨＩＲに特異的に結合し、かつ、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２はそれぞれ、３つのＣＤＲを含み、少なくとも１つのＣＤＲは、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、および１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２は独立して、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、および１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または
（ｃ）ＶＤ１は、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、および１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２は、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、および１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２２】
ある実施形態において、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２は、配列番号３１、３３、３５、３７、５７、１０５、１０６、１０７、および１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２は独立して、配列番号３１、３３、３５、３７、５７、１０５、１０６、１０７、および１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２３】
結合タンパク質のある実施形態において、（Ｘ１）ｎは、（Ｘ１）０である。
ある実施形態において、本結合タンパク質は、第１および第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、第１のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
ＶＤ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、
Ｃは、重鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、第１のリンカーであり、
Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、
第２のポリペプチド鎖は、第２のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
ＶＤ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、
Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、第２のリンカーであり、
Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まず、
（Ｘ１）ｎは独立して、（Ｘ１）０または（Ｘ１）１であり、（Ｘ２）ｎは独立して、（Ｘ２）０または（Ｘ２）１であり、
第１および第２のＸ１のリンカーが、同じであるか、または異なっており、
第１のＸ１のリンカーはＣＨ１ではなく、かつ／または第２のＸ１のリンカーはＣＬではなく、
本結合タンパク質は、ＴｆＲまたはＨＩＲに特異的に結合し、かつ、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２の重鎖可変ドメインはそれぞれ、３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲのうちの少なくとも１つは、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５、１１６、１１７、１５６、１５７、および１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２の重鎖可変ドメインは独立して、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５、１１６、１１７、１５６、１５７、および１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｃ）ＶＤ１の重鎖可変ドメインは、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５、１１６、１１７、１５６、１５７、および１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２の重鎖可変ドメインは、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５、１１６、１１７、１５６、１５７、および１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
かつ、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２の軽鎖可変ドメインは、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、および１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２の軽鎖可変ドメインは独立して、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、および１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｃ）ＶＤ１の軽鎖可変ドメインは、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、および１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２の軽鎖可変ドメインは、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、および１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２４】
ある実施形態において、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２の重鎖可変ドメインは、配列番号３０、３２、３４、３６、５６、および１０４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２の重鎖可変ドメインは独立して、配列番号３０、３２、３４、３６、５６、および１０４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
かつ、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２の軽鎖可変ドメインは、配列番号３１、３３、３５、３７、５７、１０５、１０６、１０７、および１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２の軽鎖可変ドメインは独立して、配列番号３１、３３、３５、３７、５７、１０５、１０６、１０７、および１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２５】
ある実施形態において、Ｘ１は、本明細書に記載される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーである。例えば、１つのアミノ酸配列が、配列番号１〜２９、１７８、および１７９からなる群の一員から選択される。
【００２６】
ある実施形態において、Ｆｃ領域は、変異体配列Ｆｃ領域を含む。ある実施形態において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＤからなる群から選択されるＦｃ領域を含む。様々な実施形態において、Ｆｃ領域は、ヒト化配列またはヒト配列を含む。
【００２７】
ある実施形態において、本結合タンパク質は、２つの第１のポリペプチド鎖および２つの第２のポリペプチド鎖を含む。
【００２８】
ある実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＶＤ１および第２のポリペプチド鎖のＶＤ１はそれぞれ、異なる第１および第２の親抗体、またはそれらの抗原結合部分に由来する。
【００２９】
ある実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＶＤ２および第２のポリペプチド鎖のＶＤ２はそれぞれ、異なる第１および第２の親抗体、またはそれらの抗原結合部分に由来する。ある実施形態において、第１および第２の親抗体は、抗原上の異なるエピトープに結合する。
【００３０】
ある実施形態において、本結合タンパク質は、ポリペプチド鎖を含み、このポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
ＶＤ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、
Ｃは、重鎖定常ドメインであり、
Ｘ１はリンカーであるが、但し、それはＣＨ１ではないものとし、
Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、
（Ｘ１）ｎは、（Ｘ１）０または（Ｘ１）１であり、
（Ｘ２）ｎは、（Ｘ２）０または（Ｘ２）１であり、
本結合タンパク質は、Ａｂｅｔａ、ＢＡＣＥ、Ｈｅｒ−２、ＲＧＭＡ、ＴＮＦα、およびＡＰＰからなる群から選択される疾患標的に特異的に結合し、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２は、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１２１、１２２、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、１４９、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２は独立して、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１２１、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、１４９、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｃ）ＶＤ１は、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１２１、１２２、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、１４９、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２は、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１２１、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、１４９、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３１】
ある実施形態において、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２は、配列番号３８、５８、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、１６７、および１６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２は独立して、配列番号３８、５８、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、１６２、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３２】
ある実施形態において、本結合タンパク質は、ポリペプチド鎖を含み、このポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
ＶＤ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、
Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、
Ｘ１はリンカーであるが、但し、それはＣＬではないものとし、
Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まず、
（Ｘ１）ｎは、（Ｘ１）０または（Ｘ１）１であり、
（Ｘ２）ｎは、（Ｘ２）０または（Ｘ２）１であり、
本結合タンパク質は、Ａｂｅｔａ、ＢＡＣＥ、Ｈｅｒ−２、ＲＧＭＡ、ＴＮＦα、およびＡＰＰからなる群から選択される疾患標的に特異的に結合し、かつ
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２は、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、１５２、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２は独立して、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、１５２、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｃ）ＶＤ１は、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、１５２、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２は、３つの、それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、１５２、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む。
【００３３】
ある実施形態において、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２は、配列番号３９、５９、８７、８８、８９、９０、９１、９２、１００、１０２、１６３、および１７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２は独立して、配列番号３９、５９、８７、８８、８９、９０、９１、９２、１００、１０２、１６３、および１７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３４】
結合タンパク質のある実施形態において、（Ｘ１）ｎは、（Ｘ１）０である。
本開示は、第１および第２のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質を提供し、第１のポリペプチド鎖は、第１のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
ＶＤ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、
Ｃは、重鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、第１のリンカーであり、
Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、
第２のポリペプチド鎖は、第２のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
ＶＤ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、
Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、第２のリンカーであり、
Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まず、
（Ｘ１）ｎは独立して、（Ｘ１）０または（Ｘ１）１であり、（Ｘ２）ｎは独立して、（Ｘ２）０または（Ｘ２）１であり、
第１および第２のＸ１のリンカーは、同じであるか、または異なっており、
第１のＸ１のリンカーはＣＨ１ではなく、かつ／または第２のＸ１のリンカーはＣＬではなく、
本結合タンパク質は、Ａｂｅｔａ、ＢＡＣＥ、Ｈｅｒ−２、ＲＧＭＡ、ＴＮＦα、およびＡＰＰからなる群から選択される疾患標的に特異的に結合し、かつ
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２の重鎖可変ドメインは、それぞれ３つのＣＤＲを含み、少なくとも１つのＣＤＲが、配列番号１０９、１１０、１１１、１２１、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、１４９、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２の重鎖可変ドメインは独立して、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１２１、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、１４９、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｃ）ＶＤ１の重鎖可変ドメインは、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１２１、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、１４９、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２の重鎖可変ドメインが、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１２１、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、１４９、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
かつ、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２の軽鎖可変ドメインは、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、および１５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２の軽鎖可変ドメインは独立して、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、１５２、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｃ）ＶＤ１の軽鎖可変ドメインは、それぞれ３つのＣＤＲを含み、配列番号１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、１５２、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２の軽鎖可変ドメインは、３つの、それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、１５２、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む。
【００３５】
ある実施形態において、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２の重鎖可変ドメインは、配列番号３８、５８、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、１６２、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２の重鎖可変ドメインは独立して、配列番号３８、５８、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、１６２、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
かつ、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２の軽鎖可変ドメインは、配列番号３９、５９、８７、８８、８９、９０、９１、９２、１００、１０２、１６３、および１７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２の軽鎖可変ドメインは独立して、配列番号３９、５９、８７、８８、８９、９０、９１、９２、１００、１０２、１６３、および１７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３６】
結合タンパク質のある実施形態において、Ｘ１は、本明細書に記載される配列のうちのいずれか１つである。例えば、Ｘ１は、配列番号１〜２９、１７８、および１７９のうちのいずれか１つを含む。
【００３７】
ある実施形態において、本結合タンパク質は、２つの第１のポリペプチド鎖および２つの第２のポリペプチド鎖を含む。
【００３８】
ある実施形態において、第１および第２のポリペプチド鎖の第１の組は、請求項２２に定義される通りであり、第１および第２のポリペプチド鎖の第２の組は、請求項３６に定義される通りである。
【００３９】
ある実施形態において、Ｆｃ領域は、変異体配列Ｆｃ領域である。ある実施形態において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤからのＦｃ領域である。例えば、Ｆｃ領域は、哺乳動物、例えば、ヒトに由来する。
【００４０】
ある実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＶＤ１および第２のポリペプチド鎖のＶＤ１は、それぞれ、異なる第１および第２の親抗体、またはそれらの抗原結合部分に由来する。
【００４１】
ある実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＶＤ２および第２のポリペプチド鎖のＶＤ２は、それぞれ、異なる第１および第２の親抗体、またはそれらの抗原結合部分に由来する。
【００４２】
ある実施形態において、第１および第２の親抗体は、抗原上の異なるエピトープに結合する。
【００４３】
ある実施形態において、本結合タンパク質は、ポリペプチド鎖を含み、このポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
ＶＤ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、
Ｃは、重鎖定常ドメインであり、
Ｘ１はリンカーであるが、但し、それはＣＨ１ではないものとし、
Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、
（Ｘ１）ｎは、（Ｘ１）０または（Ｘ１）１であり、
（Ｘ２）ｎは、（Ｘ２）０または（Ｘ２）１であり、
本結合タンパク質は、ＴｆＲまたはＨＩＲ、およびＡｂｅｔａ、ＢＡＣＥ、Ｈｅｒ−２、ＲＧＭＡ、ＴＮＦα、またはＡＰＰに特異的に結合し、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２は、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５〜１１７、１５６〜１５８、１０９、１１０、１１１、１２１、１２２、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、１４９、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２は独立して、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５〜１１７、１５６〜１５８、１０９、１１０、１１１、１２１、１２２、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、１４９、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｃ）ＶＤ１は、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５〜１１７、および１５６〜１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２は、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１２１、１２２、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、１４９、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｄ）ＶＤ２は、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５〜１１７、および１５６〜１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ１は、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１２１、１２２、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、１４９、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４４】
ある実施形態において、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２は、配列番号３０、３２、３４、３６、５６、１０４、３８、５８、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、１６２、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｂ）ＶＤ１は、配列番号３０、３２、３４、３６、５６、または１０４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２は、配列番号３８、５８、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、１６２、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４５】
本結合タンパク質のある実施形態において、ポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
ＶＤ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、
Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、
Ｘ１はリンカーであるが、但し、それはＣＬではないものとし、
Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まず、
（Ｘ１）ｎは、（Ｘ１）０または（Ｘ１）１であり、
（Ｘ２）ｎは、（Ｘ２）０または（Ｘ２）１であり、
本結合タンパク質は、ＴｆＲまたはＨＩＲ、およびＡｂｅｔａ、ＢＡＣＥ、Ｈｅｒ−２、またはＡＰＰに特異的に結合し、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２は、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、１６１、１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、１５２、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２は独立して、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、１６１、１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、１５２、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｃ）ＶＤ１は、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、および１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２は、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、および１５２、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｄ）ＶＤ２は、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、および１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ１は、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、１５２、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４６】
ある実施形態において、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２は、配列番号３１、３３、３５、３７、５７、１０５、１０６、１０７、１０８、３９、５９、８７、８８、８９、９０、９１、９２、１００、１０２、１６３、および１７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｂ）ＶＤ１は、配列番号３１、３３、３５、３７、５７、１０５、１０６、１０７、および１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２は、配列番号３９、５９、８７、８８、８９、９０、９１、９２、１００、１０２、１６３、および１７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４７】
一実施形態において、（Ｘ１）ｎは、（Ｘ１）０である。
ある実施形態において、本結合タンパク質は、第１および第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、第１のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
ＶＤ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、
Ｃは、重鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、第１のリンカーであり、
Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、
第２のポリペプチド鎖は、第２のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
ＶＤ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、
ＶＤ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、
Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、第２のリンカーであり、
Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まず、
（Ｘ１）ｎは独立して、（Ｘ１）０または（Ｘ１）１であり、（Ｘ２）ｎは独立して、（Ｘ２）０または（Ｘ２）１であり、
第１および第２のＸ１のリンカーは、同じであるか、または異なっており、
第１のＸ１のリンカーはＣＨ１ではなく、かつ／または第２のＸ１のリンカーはＣＬではなく、
本結合タンパク質は、ＴｆＲまたはＨＩＲ、およびＡｂｅｔａ、ＢＡＣＥ、Ｈｅｒ−２、ＲＧＭＡ、ＴＮＦα、またはＡＰＰに特異的に結合し、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２の重鎖可変ドメインは、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５〜１１７、１５６〜１５８、１０９、１１０、１１１、１２１、１２２、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、１４９、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２の重鎖可変ドメインは独立して、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５〜１１７、１５６〜１５８、１０９、１１０、１１１、１２１、１２２、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、１４９、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｃ）ＶＤ１の重鎖可変ドメインは、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５、１１６、１１７、１５６、１５７、１５８、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２の重鎖可変ドメインは、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１２１、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、および１４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｄ）ＶＤ２の重鎖可変ドメインは、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７６、７７、７８、８２、８３、１１５、１１６、１１７、１５６、１５７、１５８、１６４、１６５、１６６、１７２、１７３、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ１の重鎖可変ドメインは、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１２１、１２２、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４７、１４８、および１４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２の軽鎖可変ドメインは、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、１６１、１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、１５２、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｂ）ＶＤ１およびＶＤ２の軽鎖可変ドメインは独立して、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、１６１、１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、１５２、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｃ）ＶＤ１の軽鎖可変ドメインは、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、１６１、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２の軽鎖可変ドメインは、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、および１５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｄ）ＶＤ２の軽鎖可変ドメインは、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、８４、８５、８６、１１８、１１９、１２０、１５９、１６０、１６１、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ１軽鎖可変ドメインは、３つのＣＤＲを含み、それぞれ、配列番号１１２、１１３、１１４、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５０、１５１、および１５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４８】
ある実施形態において、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２の重鎖可変ドメインは、配列番号３０、３２、３４、３６、５６、１０４、３８、５８、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、−１６２、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｂ）ＶＤ１の重鎖可変ドメインは、配列番号３０、３２、３４、３６、５６、または１０４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２の重鎖可変ドメインは、配列番号３８、５８、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、１６２、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
かつ、
（ａ）ＶＤ１またはＶＤ２の軽鎖可変ドメインは、配列番号３１、３３、３５、３７、５７、１０５、１０６、１０７、１０８、３９、５９、８７、８８、８９、９０、９１、９２、１００、１０２、１６３、および１７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｂ）ＶＤ１の軽鎖可変ドメインは、配列番号３１、３３、３５、３７、５７、１０５、１０６、１０７、または１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつＶＤ２の軽鎖可変ドメインは、配列番号３９、５９、８７、８８、８９、９０、９１、９２、１００、または１０２、１６３、および１７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４９】
ある実施形態において、Ｘ１は、配列番号１〜２９、１７８、および１７９のうちのいずれか１つを含む。
【００５０】
ある実施形態において、本結合タンパク質は、２つの第１のポリペプチド鎖および２つの第２のポリペプチド鎖を含む。
【００５１】
ある実施形態において、Ｆｃ領域は、変異体配列Ｆｃ領域である。ある実施形態において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤからのＦｃ領域である。
【００５２】
ある実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＶＤ１および第２のポリペプチド鎖のＶＤ１はそれぞれ、異なる第１および第２の親抗体、またはそれらの抗原結合部分に由来する。
【００５３】
ある実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＶＤ２および第２のポリペプチド鎖のＶＤ２はそれぞれ、異なる第１および第２の親抗体、またはそれらの抗原結合部分に由来する。
【００５４】
ある実施形態において、第１および第２の親抗体は、異なる抗原に結合する。
本開示は、請求項１７に記載の重ポリペプチド鎖および請求項１９に記載の軽ポリペプチド鎖、または請求項３１に記載の重ポリペプチド請求項および請求項３３に記載の軽ポリペプチド鎖を含む、単一特異性結合タンパク質を提供する。
【００５５】
本開示は、請求項１７に記載の重ポリペプチド鎖および請求項３３に記載の軽ポリペプチド鎖、請求項３１に記載の重ポリペプチド請求項および請求項１９に記載の軽ポリペプチド鎖、請求項４６に記載の重ポリペプチド請求項および請求項１９、３３、もしくは４８に記載の軽ポリペプチド鎖、または請求項１７、３１、もしくは４６に記載の重ポリペプチド請求項および請求項４８に記載の軽ポリペプチド鎖を含む、二特異性結合タンパク質を提供する。
【００５６】
本明細書中の実施形態のうちのいずれか、例えば、請求項１において、本結合タンパク質は、Ｏｕｔ１−（Ｘ１）ｍ−Ｉｎ１−（Ｘ２）ｎを含み、式中、Ｉｎ１は、対象の脳血管の上皮組織に発現された抗原と特異的に結合し、Ｏｕｔ１は、別の分子と特異的に結合し、Ｘ１はリンカーであり、Ｘ２はＦｃ領域であり、ｍは０または１であり、ｎは０または１である。
【００５７】
ある実施形態において、Ｉｎ１は、約５ｎＭ〜０．０１ｎＭのＥＣ５０で、対象の脳血管の上皮組織に発現された抗原と特異的に結合する。ある実施形態において、Ｉｎ１は、トランスフェリン受容体に特異的に結合する。ある実施形態において、Ｉｎ１は、３ｎＭ未満のＥＣ５０でトランスフェリン受容体に特異的に結合する。ある実施形態において、Ｉｎ１は、配列番号５６のアミノ配列を含む。ある実施形態において、Ｘ１は、配列番号１７９のアミノ酸配列を含む。
【００５８】
ある実施形態において、Ｏｕｔ１は、ＣＧＲＰ、ＴＮＦα、ＲＧＭＡ、サブスタンスＰ、ブラジキニン、Ｎａｖ１．７、ＬＰＡ、Ｐ２Ｘ３、ＮＧＦ、Ａｂｅｔａ；ＢＡＣＥ１；ＩＬ−１β；ＩＧＦ１もしくは２；ＩＬ−１８；ＩＬ−６；ＲＡＧＥ；ＮＧＦ；ＥＧＦＲ；ｃＭｅｔ、Ｈｅｒ−２、およびＣＤ−２０からなる群から選択される別の分子に結合する。
【００５９】
ある実施形態において、Ｏｕｔ１は、約１ｎＭ〜１００ｎＭのＥＣ５０で、対象の脳血管の上皮組織に発現された抗原と特異的に結合する。ある実施形態において、Ｏｕｔ１は、トランスフェリン受容体に特異的に結合する。ある実施形態において、Ｏｕｔ１は、３ｎＭ超のＥＣ５０で、トランスフェリン受容体に特異的に結合する。ある実施形態において、Ｏｕｔ１は、配列番号３６のアミノ配列を含む。ある実施形態において、Ｘ１は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
【００６０】
ある実施形態において、Ｉｎ１は、ＣＧＲＰ、ＴＮＦα、ＲＧＭＡ、サブスタンスＰ、ブラジキニン、Ｎａｖ１．７、ＬＰＡ、Ｐ２Ｘ３、ＮＧＦ、Ａｂｅｔａ；ＢＡＣＥ１；ＩＬ−１β；ＩＧＦ１もしくは２；ＩＬ−１８；ＩＬ−６；ＲＡＧＥ；ＮＧＦ；ＥＧＦＲ；ｃＭｅｔ、Ｈｅｒ−２、およびＣＤ−２０からなる群から選択される別の分子に結合する。
【００６１】
本明細書中の実施形態のいずれにおいて、第１の親抗体またはその抗原結合部分は、ある実施形態において、第２の親抗体またはその抗原結合部分が第２の抗原に結合する効力とは異なる効力で、第１の抗原に結合する。
【００６２】
本明細書中の実施形態のいずれにおいて、第１の親抗体またはその抗原結合部分は、ある実施形態において、第２の親抗体またはその抗原結合部分が第２の抗原に結合する親和性とは異なる親和性で、第１の抗原に結合する。
【００６３】
本明細書中の実施形態のいずれにおいて、本結合タンパク質は、ある実施形態において、表面プラズモン共鳴により測定するとき、１つ以上の標的に対して少なくとも約１０２Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０３Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０５Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも約１０６Ｍ−１ｓ−１のオン速度定数（Ｋｏｎ）を有する。
【００６４】
本明細書中の実施形態のいずれにおいて、本結合タンパク質は、ある実施形態において、表面プラズモン共鳴により測定するとき、１つ以上の標的に対して多くとも約１０−３ｓ−１、多くとも約１０−４ｓ−１、多くとも約１０−５ｓ−１、または多くとも約１０−６ｓ−１のオフ速度定数（Ｋｏｆｆ）を有する。
【００６５】
本明細書中の実施形態のいずれにおいて、本結合タンパク質は、ある実施形態において、１つ以上の標的に対して多くとも約１０−７Ｍ、多くとも約１０−８Ｍ、多くとも約１０−９Ｍ、多くとも約１０−１０Ｍ、多くとも約１０−１１Ｍ、多くとも約１０−１２Ｍ、または多くとも約１０−１３Ｍの解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００６６】
重鎖、軽鎖、２つの鎖、または４つの鎖の実施形態のいずれかのさらなる実施形態には、ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲ（配列番号１）、ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号２）、ＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号３）、ＳＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号４）、ＳＡＫＴＴＰ（配列番号５）、ＲＡＤＡＡＰ（配列番号６）、ＲＡＤＡＡＰＴＶＳ（配列番号７）、ＲＡＤＡＡＡＡＧＧＰＧＳ（配列番号８）、ＲＡＤＡＡＡＡ（Ｇ４Ｓ）４（配列番号９）、ＳＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号１０）、ＡＤＡＡＰ（配列番号１１）、ＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰ（配列番号１２）、ＴＶＡＡＰ（配列番号１３）、ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号１４）、ＱＰＫＡＡＰ（配列番号１５）、ＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰ（配列番号１６）、ＡＫＴＴＰＰ（配列番号１７）、ＡＫＴＴＰＰＳＶＴＰＬＡＰ（配列番号１８）、ＡＫＴＴＡＰ（配列番号１９）、ＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰ（配列番号２０）、ＡＳＴＫＧＰ（配列番号２１）、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号２２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２３）、ＧＥＮＫＶＥＹＡＰＡＬＭＡＬＳ（配列番号２４）、ＧＰＡＫＥＬＴＰＬＫＥＡＫＶＳ（配列番号２５）、またはＧＨＥＡＡＡＶＭＱＶＱＹＰＡＳ（配列番号２６）、ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号２７）、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号２８）、またはＧ／Ｓベースの配列（例えば、Ｇ４ＳおよびＧ４Ｓの反復、配列番号２９）を含む少なくとも１つのＸ１のリンカーが含まれる。一実施形態において、Ｘ２は、Ｆｃ領域である。別の実施形態において、Ｘ２は、変異体Ｆｃ領域である。様々な実施形態において、リンカーは、本明細書に記載される配列、例えば、配列番号１〜２９、１７８、または１７９のいずれかを含む。
【００６７】
本開示は、本明細書中の実施形態のいずれかまたは特許請求の範囲のいずれかにおいて、結合タンパク質を含む結合タンパク質複合体を提供する。ある実施形態において、結合タンパク質複合体は、薬剤をさらに含み、この薬剤は、免疫接着分子、診断剤、造影剤、治療剤、または、細胞傷害性剤である。
【００６８】
ある実施形態において、造影剤は、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識、またはビオチンである。
【００６９】
本明細書中の実施形態のいずれにおいて、本結合タンパク質は、結晶化結合タンパク質である。
【００７０】
また、本明細書に開示される結合タンパク質のうちのいずれか１つをコードする単離された核酸も提供される。さらなる実施形態は、本明細書に開示される単離された核酸を含むベクターを提供し、このベクターは、ｐｃＤＮＡ、ｐＴＴ（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０（２）、ｐＴＴ３（さらなる多重クローニング部位を有するｐＴＴ、ｐＥＦＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（１７）、ｐＢＶ、ｐＪＶ、ｐｃＤＮＡ３．１  ＴＯＰＯ、ｐＥＦ６  ＴＯＰＯ、ｐＢＯＳ、ｐＨｙｂＥ、またはｐＢＪである。一実施形態において、このベクターは、米国特許公開第２００９０２３９２５９号（参照によりその全体が組み込まれる）において開示されるベクターである。
【００７１】
本開示は、本明細書に記載される実施形態のいずれかまたは特許請求の範囲のいずれかにおいて、結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする単離された核酸を提供する。
【００７２】
ある実施形態において、本開示は、本明細書に記載される単離された核酸を含むベクターを提供する。例えば、このベクターは、請求項８２に記載される単離された核酸を含む。ある実施形態において、このベクターは、ｐｃＤＮＡ、ｐＴＴ、ｐＴＴ３、ｐＥＦＢＯＳ、ｐＢＶ、ｐＪＶ、ｐｃＤＮＡ３．１  ＴＯＰＯ、ｐＥＦ６  ＴＯＰＯ、ｐＨｙｂＥ、ｐＢＯＳ、またはｐＢＪである。
【００７３】
別の態様において、宿主細胞は、本明細書に開示されるベクターで形質転換される。一実施形態において、宿主細胞は、原核細胞、例えば、大腸菌である。別の実施形態において、宿主細胞は、真核細胞、例えば、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞、または真菌細胞である。一実施形態において、宿主細胞は、哺乳動物細胞であり、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳ０、ＳＰ２、ＰＥＲ．Ｃ６、またはサッカロマイセスセレヴィシエ等の真菌細胞、またはＳｆ９等の昆虫細胞が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、例えば、異なる特異性で、２つ以上の結合タンパク質は、単一の組換え宿主細胞において産生される。例えば、抗体の混合物の発現は、米国特許第７，２６２，０２８号および同第７，４２９，４８６号でＯｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（商標）（Ｍｅｒｕｓ  Ｂ．Ｖ．，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）と称される。
【００７４】
本開示はまた、本明細書に開示される結合タンパク質を産生する方法も提供し、本方法は、結合タンパク質を産生するのに十分な条件下で、培養培地中で本明細書に開示される宿主細胞のうちのいずれか１つを培養することを含む。一実施形態において、この方法により産生される結合タンパク質のうちの５０％〜７５％は、二重特異性四価結合タンパク質である。別の実施形態において、この方法により産生される結合タンパク質のうちの７５％〜９０％は、二重特異性四価結合タンパク質である。別の実施形態において、産生される結合タンパク質のうちの９０％〜９５％は、二重特異性四価結合タンパク質である。本開示は、哺乳動物を治療するための方法を提供し、本方法は、哺乳動物に有効量の結合タンパク質を投与することを含む。
【００７５】
本開示は、本明細書に記載される結合タンパク質、例えば、特許請求の範囲のいずれかに記載の結合タンパク質、および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。
【００７６】
ある実施形態において、本組成物は、少なくとも１つの追加の治療剤をさらに含む。ある実施形態において、追加の治療剤は、造影剤、細胞傷害性剤、血管形成阻害剤、キナーゼ阻害剤、共刺激分子遮断剤、接着分子遮断剤、抗サイトカイン抗体もしくはその機能的断片、メトトレキサート、シクロスポリン、ラパマイシン、ＦＫ５０６、検出可能な標識もしくはレポーター、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ剤、筋肉弛緩剤、麻酔剤、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔、鎮静剤、局所麻酔、神経筋肉遮断剤、抗微生物剤、抗乾癬剤、コルチコステロイド（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｉｏｄ）、アナボリックステロイド、エリスロポエチン、免疫化、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性医薬、抗鬱剤、抗精神病薬、刺激剤、喘息薬、ベータアゴニスト、吸引用ステロイド、エピネフリンもしくは類似体、サイトカイン、またはサイトカインアンタゴニストである。
【００７７】
ある実施形態において、追加の治療剤は、ブデノシド、上皮成長因子、コルチコステロイド、シクロスポリン、スルファサラジン、アミノサリチル酸、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、メトロニダゾール、リポキシゲナーゼ阻害剤、メサラミン、オルサラジン、バルサラジド、抗酸化剤、トロンボキサン阻害剤、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ、抗ＩＬ−６もしくはＩＬ−６受容体ｍＡｂ、成長因子、エラスターゼ阻害剤、ピリジニル−イミダゾール化合物、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、もしくはＰＤＧＦの抗体もしくはアゴニスト、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ−１９、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ９０に対する抗体もしくはそのリガンド、メトトレキサート、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、イブプロフェン、プレドニゾロン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作動物質、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤、ＴＮＦα変換酵素阻害剤、Ｔ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体、可溶性ｐ５５  ＴＮＦ受容体、可溶性ｐ７５  ＴＮＦ受容体、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ、抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＴＧＦβ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００７８】
本開示は、本明細書中の実施形態のうちのいずれかにおいて、治療が達成されるように、対象に結合タンパク質を投与することにより、疾患または障害の対象を治療するのに用いる、結合タンパク質を提供する。
【００７９】
ある実施形態において、障害は、脳障害である。様々な実施形態において、脳障害は、脳の自己免疫もしくは炎症性疾患、脳の感染性疾患、神経学的障害、神経変性障害、脳癌、または脳転移である。
【００８０】
ある実施形態において、障害は、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、精神障害、鬱病、統合失調症、急性疼痛、および慢性疼痛からなる群から選択される。
【００８１】
本方法のある実施形態において、対象への投与は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内（ｉｎｔｒａｒｔｉｃｕｌａｒ）、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔａｒｙ）、腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心臓周囲内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、髄腔内、滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、または経皮である。ある実施形態において、本方法は、障害の兆候の減少を観察することをさらに含む。
【００８２】
本開示は、２つの抗原に結合することができる結合タンパク質を生成するための方法を提供し、本方法は、
ａ）第１の抗原に結合することができる第１の親抗体またはその抗原結合部分を得るステップと、
ｂ）第２の抗原に結合することができる第２の親抗体またはその抗原結合部分を得るステップと、
ｃ）前述の特許請求の範囲のいずれかに記載のポリペプチド鎖（複数可）をコードする構築物（複数可）を調製するステップと、
ｄ）第１および第２の抗原に結合することができる結合タンパク質が生成されるように、ポリペプチド鎖（複数可）を発現させるステップと、を含む。
【００８３】
ある実施形態において、Ｆｃ領域は、変異体配列Ｆｃ領域である。ある実施形態において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤからのＦｃ領域である。
【００８４】
ある実施形態において、第１の親抗体またはその抗原結合部分が存在する場合、第２の親抗体またはその抗原結合部分が存在する場合、第２の抗原に結合する親和性および／または効力とは異なる親和性および／または効力で、第１の抗原に結合する。
【００８５】
本開示はまた、イムノアッセイにより試験試料中の少なくとも１つの抗原またはその断片の存在を決定する方法も提供する。
【００８６】
ある実施形態において、イムノアッセイは、試験試料を少なくとも１つの結合タンパク質および少なくとも１つの検出可能な標識と接触させることを含み、少なくとも１つの結合タンパク質は、前述の特許請求の範囲のいずれかに記載の結合タンパク質を含む。
【００８７】
ある実施形態において、本方法は、
（ｉ）試験試料を少なくとも１つの結合タンパク質と接触させることであって、結合タンパク質は抗原またはその断片上のエピトープに結合し、第１の複合体を形成する、接触させることと、
（ｉｉ）第１の複合体を少なくとも１つの検出可能な標識と接触させることであって、検出可能な標識は、結合タンパク質、または結合タンパク質により結合されない抗原もしくはその断片上のエピトープに結合し、第２の複合体を形成する、接触させることと、
（ｉｉｉ）第２の複合体において検出可能な標識により生成されたシグナルに基づいて、試験試料中の抗原またはその断片の存在を検出することであって、抗原またはその断片の存在が、検出可能な標識により生成されたシグナルを分析することにより特定または示される、検出することと、をさらに含む。
【００８８】
ある実施形態において、本方法は、
（ｉ）試験試料を少なくとも１つの結合タンパク質と接触させることであって、結合タンパク質は抗原またはその断片上のエピトープに結合し、第１の複合体を形成する、接触させることと、
（ｉｉ）第１の複合体を少なくとも１つの検出可能な標識と接触させることであって、検出可能な標識が結合タンパク質に結合して第２の複合体を形成することに対して、抗原またはその断片と競合する、接触させることと、
（ｉｉｉ）第２の複合体において検出可能な標識により生成されたシグナルに基づいて、試験試料中の抗原またはその断片の存在を検出することであって、抗原またはその断片の存在が、検出可能な標識により生成されたシグナルを分析することにより測定される、検出することと、をさらに含む。
【００８９】
ある実施形態において、試験試料は、患者からの試料であり、本方法は、患者を診断すること、予後予測すること、または患者の治療的／予防的治療の効率を評価することをさらに含み、任意に、本方法が、患者の治療的／予防的治療の効率を評価することをさらに含む場合、本方法は、任意に、有効性を改善させる必要に応じて患者の治療的／予防的治療を改変することをさらに含む。
【００９０】
ある実施形態において、本方法は、自動システムまたは半自動システムで用いるのに適している。ある実施形態において、本方法は、試料中の１つを超える抗原の存在を決定する。
【００９１】
本開示は、イムノアッセイにより試験試料中の抗原またはその断片の量または濃度を決定する方法を提供する。
【００９２】
ある実施形態において、イムノアッセイは、（ａ）少なくとも１つの薬剤および少なくとも１つの検出可能な標識を利用し、かつ（ｂ）検出可能な標識により生成されたシグナルを、抗原またはその断片を含む対照または較正物質と比較することを含み、較正物質は、任意に、一連の較正物質の一部であり、各較正物質は、抗原またはその断片の濃度により一連の他の較正物質とは異なり、少なくとも１つの薬剤は、前述の特許請求の範囲のいずれかに記載の結合タンパク質を含む。
【００９３】
ある実施形態において、本方法は、
（ｉ）試験試料を少なくとも１つの結合タンパク質と接触させることであって、結合タンパク質は抗原またはその断片上のエピトープに結合し、第１の複合体を形成する、接触させることと、
（ｉｉ）第１の複合体を少なくとも１つの検出可能な標識と接触させることであって、検出可能な標識は、結合タンパク質により結合されない抗原またはその断片上のエピトープに結合して、第２の複合体を形成する、接触させることと、
（ｉｉｉ）第２の複合体において検出可能な標識により生成されたシグナルに基づいて、試験試料中の抗原またはその断片の量または濃度を決定することであって、抗原またはその断片の量または濃度は、検出可能な標識により生成されたシグナルを分析することにより特定される、決定することと、をさらに含む。
【００９４】
ある実施形態において、本方法は、
（ｉ）試験試料を少なくとも１つの結合タンパク質と接触させることであって、結合タンパク質は抗原またはその断片上のエピトープに結合し、第１の複合体を形成する、接触させることと、
（ｉｉ）複合体を少なくとも１つの検出可能な標識と接触させることであって、検出可能な標識が結合タンパク質に結合して第２の複合体を形成することに対して、抗原またはその断片と競合する、接触させることと、
（ｉｉｉ）第２の複合体において検出可能な標識により生成されたシグナルに基づいて、試験試料中の抗原またはその断片の量または濃度を決定することであって、抗原またはその断片の存在は、検出可能な標識により生成されたシグナルを分析することにより示される、決定することと、をさらに含む。
【００９５】
ある実施形態において、試験試料は、患者からの試料であり、本方法は、患者を診断すること、予後予測すること、または患者の治療的／予防的治療の効率を評価することをさらに含み、本方法が、患者の治療的／予防的治療の有効性を評価することをさらに含む場合、本方法は、任意に、有効性を改善させる必要に応じて患者の治療的／予防的治療を改変することをさらに含む。
【００９６】
ある実施形態において、本方法は、自動システムまたは半自動システムで用いるのに適している。ある実施形態において、本方法は、試料中の１つを超える抗原の量または濃度を決定する。
【００９７】
本開示はまた、抗原またはその断片の存在、量、または濃度について試験試料をアッセイするためのキットを提供し、本キットは、
（ａ）抗原またはその断片について試験試料をアッセイするための説明書、および
（ｂ）前述の特許請求の範囲のいずれかに記載の結合タンパク質を含む少なくとも１つの結合タンパク質を含む。
【００９８】
本開示は、配列番号３０〜３７、５６、および５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＴｆＲに特異的に結合するヒト化抗体を提供する。
【００９９】
本開示は、配列番号１０４〜１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＩＲに特異的に結合するヒト化抗体を提供する。
【０１００】
配列番号１０３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをさらに含むある実施形態において、ポリペプチドは、結合タンパク質に結合し得るか、または結合タンパク質に結合し得ない。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】二重可変ドメイン（ＤＶＤ）結合タンパク質構築体の略図である。
【図２】治療投与後に、実質および神経細胞体（ＩＨＣ）に局在する脳抽出物（ＭＳＤ−ＥＣＬ）中のＴｆＲ  ｍＡｂの上昇を示す脳組織の顕微鏡写真である。
【図３】ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）レベルの上昇がＩＨＣにより小脳中のプルキンエ細胞および脳神経細胞体に局在したことを示す脳組織の顕微鏡写真である。
【図４】受容体媒介性トランスサイトーシスドメインＤＶＤ−Ｉｇの生成およびインビトロ／インビボでのスクリーニングのために使用される方法およびシステムのフローチャートの説明である。
【図５】例示的なＤＶＤ  Ｉｇの図／説明である。ＤＶＤ免疫グロブリンには、ＢＢＢ抗原（抗ＢＢＢ抗原）に特異的に結合する少なくとも１つの可変ドメイン、および標的Ｘに特異的に結合する異なる少なくとも１つの可変ドメインが含まれる。例えば、様々な実施形態において、ＤＶＤ−Ｉｇは、ＴＮＦ／ＴｆＲ、ＲＧＭＡ／ＴｆＲ、Ａｂｅｔａ／ＴｆＲ、およびＨｅｒ２／ＴｆＲである。
【図６】抗体またはＤＶＤ−Ｉｇ（商標）の特徴を分析するために使用されるインビボでの組織分布プロトコルの図／説明である。
【図７】２４時間にて４０ｍｐｋの対照ヒトＩｇＧ、４８時間にて２０ｍｐＫの８Ｃ１１−ｈＦｃのＤＶＤ、４８時間にて３０ｍｐＫの非特異的なＤＶＤ対照、２４時間にて２０ｍｐｋのＴＮＦ−ＧＳ−ＡＢ２２１のＤＶＤ、または２４時間にて２０ｍｐｋのＴｆＲ（ＡＢ４０５）−ＳＬ−ＴＮＦのＤＶＤのいずれかを投与した対象からの染色した脳組織の顕微鏡写真である。
【図８】Ｂｅｎｎｅｔｔ手術から１５日後、ＢＡＬＢ−Ｃネズミ対象に対して１日目および５日目の最大可能効果の割合（％ＭＰＥ、縦座標）、および対照ＩｇＧ（１注入につき４８μｇ／１０μｌの投与）、８Ｃ１１−ＧＳ−ＡＢ２２１のＤＶＤ−Ｉｇ（抗ＴＮＦａ／抗ＴｆＲ、１注入につき５５μｇ／１０μｌの投与）、またはモルヒネ（１注入につき１０μｇ／１０μｌの投与）を用いた、髄腔内注入後（横座標）を示す棒グラフである。注入は、Ｂｅｎｎｅｔｔ手術後、５日間毎日行われた。機械的異痛は、Ｂｅｎｎｅｔｔモデルにおいて、１日目および５日目に、１２０分間の注入投与後に評価された。
【図９】対照ＩｇＧ（１注入につき４８μｇ／１０μｌ／投与）、８Ｃ１１−ＧＳ−ＡＢ２２１のＤＶＤ（抗ＴＮＦａ／抗ＴｆＲ、１注入につき５５μｇ／１０μｌ／投与）、またはガバペンチンの緊急手術後投与（１注入につき１０μｇ／１０μｌ／投与）を用いた、ネズミ対象における、有効性の割合（縦座標）および静脈内注入後１５日間の１日目および５日目（横座標）を示す棒グラフである。注入は、Ｂｅｎｎｅｔｔ手術後の５日間毎日行われた。機械的異痛は、上のＢｅｎｎｅｔｔモデルにおいて、１日目および５日目にて１２０分間の注入投与後に評価された。
【図１０】２４時間にて４０ｍｐｋのＲＧＭＡ（ＡＥ１２−１）−ｈＦｃ、３０ｍｐｋのヒトＩｇＧ対照、２０ｍｐｋのＲＧＭＡ（ＡＥ１２−１）−ＧＳ−ＡＢ４０３のＤＶＤ−Ｉｇ、または３０ｍｐｋのＲＧＭＡ（ＡＥ１２−１）−ＧＳ−ＡＢ４０３のＤＶＤ−Ｉｇのいずれかを投与した対象からの染色した脳組織の顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【０１０２】
ある態様において、本発明は、脳血管の上皮組織に発現された受容体に結合することができる多価および／または多特異性結合タンパク質を提供する。このような輸送を可能にする血液脳関門（「ＢＢＢ」）での構造体には、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、ＬＲＰ、メラノコルチン受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、ＶＡＣＭ−１受容体、血管内皮成長因子受容体１、２、および３、グルココルチコイド受容体、イオンチャネル型グルタミン酸受容体、Ｍ３受容体、アリール炭化水素受容体、ＧＬＵＴ−１、イノシトール−１，４，５−トリスリン酸（ＩＰ３）受容体、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体、Ｓ１Ｐ１、Ｐ２Ｙ受容体、およびＲＡＧＥが含まれるが、これらに限定されない。さらに、戦略は、低分子量薬物、ナノ粒子、および核酸を含むＣＮＳへの潜在的な薬物を輸送するためのシャトルとしての結合タンパク質の使用を可能にする（Ｃｏｌｏｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．１７（３）：２６６−７４、Ｂｏａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１８（２）：４４７−５５）。二重可変ドメイン結合タンパク質（ＤＶＤ結合タンパク質）または二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）（商標））、およびその薬学的組成物、ならびにそのようなＤＶＤ結合タンパク質を作製するために核酸、組換え発現ベクターおよび宿主細胞もまた、提供される。インビトロまたはインビボのいずれかで、特異的抗原を検出するために、ＤＶＤ結合タンパク質を使用する方法もまた、提供される。
【０１０３】
ある実施形態において、多価および／または多特異性結合タンパク質は、脳血管の上皮組織および治療的標的に発現された結合受容体に結合する。これらの治療的標的には、例えば、ＣＧＲＰ、ＴＮＦα、ＲＧＭＡ、サブスタンスＰ、ブラジキニン、Ｎａｖ１．７、ＬＰＡ、Ｐ２Ｘ３、ＮＧＦ、Ａｂｅｔａ；ＢＡＣＥ１；ＩＬ−１β；ＩＧＦ１もしくは２；ＩＬ−１８；ＩＬ−６；ＲＡＧＥ；ＮＧＦ；ＥＧＦＲ；ｃＭｅｔ；Ｈｅｒ−２；およびＣＤ−２０が含まれる。様々な実施形態において、結合タンパク質またはペプチドは、エピトープ、抗原、受容体、または標的に特異的に結合するアミノ酸配列を含み、そのため、結合タンパク質またはペプチドは、ＢＢＢにまたはそれを横断する輸送に対して有効である。例えば、アミノ酸配列は、結合タンパク質またはペプチドが、エピトープ、抗原、受容体、または標的に結合する少なくとも約３つのアミノ酸、少なくとも約５つのアミノ酸、少なくとも約７つのアミノ酸、少なくとも約１０のアミノ酸、少なくとも約１５のアミノ酸、または少なくとも２０のアミノ酸を含み、そのため、ＢＢＢにまたはそれを横断する輸送に対して有効である。これらの実施形態において、エピトープ、抗原、受容体、または標的には、例えば、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）、例えば、ＬＲＰ−１およびＬＲＰ−８、メラノコルチン受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、ＶＡＣＭ−１受容体、血管内皮成長因子受容体１、２、および３、グルココルチコイド受容体、イオンチャネル型グルタミン酸受容体、Ｍ３受容体、アリール炭化水素受容体、ＧＬＵＴ−１、イノシトール−１，４，５−トリスリン酸（ＩＰ３）受容体、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体、Ｓ１Ｐ１、Ｐ２Ｙ受容体、およびＲＡＧＥが含まれる。
【０１０４】
他の実施形態において、結合タンパク質またはペプチドはまた、１つ以上の標的の生物学的機能を調節することもできる。この実施形態のある態様において、結合タンパク質またはペプチドは、生物学的機能を調節するように、エピトープ、抗原、受容体、または標的に特異的に結合するアミノ酸配列を含む。これらの実施形態において、エピトープ、抗原、受容体、または標的は、ＣＧＲＰ、ＴＮＦα、ＲＧＭＡ、サブスタンスＰ、ブラジキニン、Ｎａｖ１．７、ＬＰＡ、Ｐ２Ｘ３、ＮＧＦ、Ａｂｅｔａ；ＢＡＣＥ１；ＩＬ−１β；ＩＧＦ１もしくは２；ＩＬ−１８；ＩＬ−６；ＲＡＧＥ；ＮＧＦ；ＥＧＦＲ；ｃＭｅｔ；Ｈｅｒ−２；およびＣＤ−２０から選択され得る。
【０１０５】
様々な実施形態において、結合タンパク質またはペプチドは、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、またはヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片を含む。他の実施形態において、結合タンパク質は、少なくとも１つの重可変領域（ＶＨ）および少なくとも１つの軽可変領域（ＶＬ）を含む。ある実施形態において、結合タンパク質またはペプチドは、ＶＨおよびＣＨ１ドメイン、ＶＬおよびＶＨドメイン、または単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。様々な実施形態において、結合タンパク質またはペプチドは、少なくとも１つのＶＨ、少なくとも１つのＶＬ、または少なくとも１つの超可変（ｈｖ）部位を含む。様々な実施形態において、結合またはペプチドは、定常領域を含む。例えば、定常領域は、哺乳動物、例えば、ヒトおよびマウスに由来する。
【０１０６】
ある実施形態において、結合タンパク質は、エピトープまたは抗原に対して単一特異的である。これらの実施形態において、結合タンパク質またはペプチドは、ＢＢＢにまたはそれを横断する輸送に対して有効である。他の実施形態において、２つ以上の異なる結合領域を合わせて、キメラ結合タンパク質またはペプチドを構築する。例えば、キメラタンパク質は、少なくとも２つの非同一結合領域を含む。例えば、結合タンパク質は、本明細書に記載されるＤＶＤ−Ｉｇ（商標）を含む。
【０１０７】
結合タンパク質またはペプチドは、エピトープ、抗原、受容体、または標的に特異的に結合する少なくとも１つの結合領域を含む。様々な実施形態において、結合タンパク質は、一本鎖を含む。様々な実施形態において、結合タンパク質は、複数の鎖、すなわち、少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。様々な実施形態において、結合タンパク質またはペプチドは、それぞれが、エピトープ、抗原、受容体、または標的の同じまたは異なる部分に結合するような、順序付けられるか、または指向される複数の結合領域を含む。例えば、少なくとも１つの結合領域は、それぞれが、同じまたは異なる可変領域／ドメイン上に存在するように、別の結合領域に近位および／または遠位に位置する。様々な実施形態において、結合領域は、例えば、ＶＨおよびＶＬ上で互いに平行に位置する。様々な実施形態において、結合領域は、反対側にまたは対向するように位置し、例えば、第１の結合領域が第１のＶＨまたは第１のＶＬ内にあり、第２の結合領域が第２のＶＨまたは第２のＶＬ内にある。様々な実施形態において、複数の結合領域は、それぞれの結合領域が互いに相互作用し得るか、またはあるいは、互いに相互作用しないように、同じ別々の／第３の部分（例えば、定常ドメインまたはリンカー）に、それぞれ結合する。
【０１０８】
様々な実施形態において、結合タンパク質は、受容体、抗原、または標的に単一特異的に結合する能力を有し、かつＢＢＢを横断する分子である。様々な実施形態において、結合タンパク質は、一形態（例えば、ナノ粒子、リポソーム、混合物、または溶液）で製剤化、調合、または投与され、薬剤とともに脳に送達される。例えば、結合タンパク質は、薬剤（例えば、ペプチドまたはタンパク質）を含む組成物中に投与される。様々な実施形態において、薬剤に結合するか、または付着する結合タンパク質。例えば、結合タンパク質および薬剤は、組成物内に投与される。あるいは、薬剤または結合タンパク質は、互いに、数秒間、数分間、数時間、または数日にわたって、互いに前後で投与される。
【０１０９】
様々な実施形態において、結合タンパク質は、二重特異性であり、２つの異なる抗原（またはエピトープ）に結合する。例えば、結合タンパク質は、ＢＢＢを横断するために、受容体、抗原、または標的に特異的に結合し、脳内において別の標的にも特異的に結合する。様々な実施形態において、結合タンパク質は、少なくとも１つのＶＨおよび少なくとも１つのＶＬを含む。例えば、結合タンパク質は、本明細書に記載されるＤＶＤ−Ｉｇ（商標）を含む。
【０１１０】
ある実施形態において、結合タンパク質は、少なくとも２つのＶＨドメインを含む。いくつかの実施形態において、一方のＶＨドメインは、ＢＢＢを横断するために、受容体、抗原、または標的に特異的に結合し、もう一方のＶＨドメインは、脳内において別の標的に特異的に結合する。他の実施形態において、結合タンパク質は、少なくとも２つのＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態において、一方のＶＬドメインは、ＢＢＢを横断するために、受容体、抗原、または標的に特異的に結合し、もう一方のＶＬドメインは、脳内において別の標的に特異的に結合する。他の実施形態において、結合タンパク質は、少なくとも２つのＶＨおよび少なくとも２つのＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態において、一方のＶＬドメインは、ＢＢＢを横断するために、受容体、抗原、または標的に特異的に結合し、もう一方のＶＨドメインは、脳内において別の標的に特異的に結合するが、一方のＶＨドメインは、ＢＢＢを横断するために、受容体、抗原、または標的に特異的に結合し、もう一方のＶＨドメインは、脳内において別の標的に特異的に結合する。
【０１１１】
他の実施形態によれば、結合タンパク質は、２つのポリペプチドまたはアームから作製される。それぞれのアームは、１つ以上のＶＨおよびＶＬドメインを有し得る。ある実施形態において、それぞれのアームは、２つのＶＨおよび２つのＶＬドメインを有する。他の実施形態において、アームは、２つのＶＨまたは２つのＶＬドメインのみ有する。ある実施形態において、結合タンパク質は、２つのアーム／領域を含み、それぞれのアームは、同じ標的に結合するか、または少なくとも２つの異なる標的に結合する。例えば、一方のアームは、ＢＢＢを横断するために、受容体、抗原、または標的に結合し、ＢＢＢを横断する際にもう一方のアームは、脳上または脳内の異なる標的（脳標的）に結合する。例えば、あるアーム上のＶＨまたはＶＬは、ＢＢＢを横断するために受容体に結合し、もう一方のアーム上のＶＨまたはＶＬは、標的に結合する。あるいは、様々な実施形態において、本結合タンパク質は、２つの同一の抗原を結合するアームを有し、それぞれのアームは、ＢＢＢを横断するために受容体に結合するＶＨ／ＶＬ、およびＢＢＢを横断する際に、脳の内部に見出される標的に結合するＶＨ／ＶＬを含有する。例えば、それぞれのアームは、同一の特異性および同一のＣＤＲ配列を有する。様々な実施形態において、本結合タンパク質は、ＢＢＢ受容体に結合するか、あるいは脳上または脳内において標的に結合するＶＨ１またはＶＨ２を含有するＤＶＤ−Ｉｇである。例えば、ＶＨ１またはＶＬ１は、ＢＢＢ受容体に結合し、かつ、ＶＨ２またはＶＬ２は、脳上または脳内において標的に結合する。あるいは、ＶＨ２またはＶＬ２が、ＢＢＢ受容体に結合し、かつ、ＶＨ１またはＶＬ２が、脳上または脳内において標的に結合する。
【０１１２】
様々な実施形態において、結合タンパク質は、少なくとも２つの異なる標的に結合する本明細書に記載されるＤＶＤ−Ｉｇ（商標）を含む。様々な実施形態において、結合タンパク質は、ＢＢＢ受容体に結合するＶＨ１、および脳上または脳内において標的に結合するＶＨ２を含むＤＶＤ−Ｉｇである。あるいは、結合タンパク質は、ＢＢＢ受容体に結合するＶＨ２、および脳上または脳内において標的に結合するＶＨ１を含むＤＶＤ−Ｉｇである。様々な実施形態において、ＶＬ１は、ＢＢＢ受容体に結合し、ＶＬ２は、脳上または脳内において標的に結合する。様々な実施形態において、ＶＬ２は、ＢＢＢ受容体に結合し、ＶＬ１は、脳上または脳内において標的に結合する。
【０１１３】
様々な実施形態において、結合タンパク質またはペプチドは、可変結合領域を含む。例えば、可変結合領域は、ＶＨまたはＶＬを含む。様々な実施形態において、ＶＬは、ＶＬに対して近位または遠位に位置する。例えば、ＶＨは、ＶＬに隣接、結合、または接続される。様々な実施形態において、ＶＨは、ＶＬに直接接触するか、またはＶＨは、リンカーによりＶＬに接続される。様々な実施形態において、ＶＨは、ＶＬに平行であるか、または隣接される。例えば、ＶＨは、確認または配向においてＶＨおよびＶＬを維持する共有結合によりＶＬから分離される。
【０１１４】
様々な実施形態において、結合タンパク質またはペプチドは、ＶＤ１が第１の可変ドメインであり、ＶＤ２が第２の可変ドメイン、Ｃが定常ドメインであり、Ｘ１がアミノ酸またはポリペプチドを表し、Ｘ２がＦｃ領域を表し、ｎが０または１であるような、構造ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを有するポリペプチド鎖を含む。一実施形態において、この結合タンパク質におけるＶＤ１およびＶＤ２は、重鎖可変ドメインである。別の実施形態において、ＶＤ１およびＶＤ２は、同じ抗原に結合することができる。別の実施形態において、ＶＤ１およびＶＤ２は、異なる抗原に結合することができる。さらに別の実施形態において、Ｃは、重鎖定常ドメインである。例えば、Ｘ１はリンカーであるが、但し、Ｘ１はＣＨ１ではないものとする。
【０１１５】
一実施形態において、本明細書に開示される結合タンパク質またはペプチドは、ポリペプチド鎖がＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、ＶＤ１が第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ２が第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃが重鎖定常ドメインであり、Ｘ１がリンカーであり、Ｘ２がＦｃ領域であるような、エピトープ、受容体、または抗原に結合するポリペプチド鎖を含む。一実施形態において、Ｘ１はリンカーであるが、但し、それはＣＨ１ではないものとする。
【０１１６】
様々な実施形態において、本結合タンパク質またはペプチドは、薬剤（例えば、治療剤または診断剤）に結合するか、または連結する。例えば、本結合タンパク質またはペプチドは、結合領域を分離し、かつ／または結合タンパク質またはペプチドを薬剤から分離する、リンカーを含む。関連実施形態におけるリンカーは、本結合タンパク質またはペプチドの結合領域および／またはサブセットを分離する。ある実施形態において、本結合タンパク質またはペプチドは、少なくとも１つの他のアミノ酸残基またはドメインに少なくとも１つの結合領域（例えば、ＶＨまたはＶＬ）を共有結合で結合するリンカーを含む。様々な実施形態において、リンカーは、ペプチド、タンパク質、糖、または核酸からなる群から選択される少なくとも１つを含む。関連実施形態において、リンカーは、本明細書に記載されるアミノ酸配列またはその一部分またはその複数部分を含む。様々な実施形態において、リンカーは、結合タンパク質またはペプチドを安定化し、エピトープ、抗原、受容体、または標的に対する結合領域またはペプチドのそれぞれの結合を妨害せず、そのため、このタンパク質またはペプチドは、ＢＢＢにまたはそれを横断する輸送に対して有効である。様々な実施形態において、結合タンパク質は、立体障害を減少させるリンカーを含む。
【０１１７】
様々な実施形態において、結合タンパク質ペプチドは、組換え技術により生成される。ある実施形態において、組換え結合タンパク質は、ヌクレオチド配列によりコードされるか、または結合タンパク質は、本明細書に記載される配列、例えば、本明細書の実施例および表のいずれかに示される配列と実質的に同一であるか、または相同であるアミノ酸配列を含む。例えば、組換え結合タンパク質またはペプチドは、本明細書に記載される配列のいずれかを用いて、操作し、構築される。関連実施形態において、結合タンパク質またはペプチドは、結合タンパク質またはペプチドをコードするヌクレオチド配列を担持するベクターを用いて、対象に投与される。様々な実施形態において、結合タンパク質またはペプチド（薬剤を用いるまたは用いずに）は、例えば、リポソーム、脂質／ポリカチオン（ＬＰＤ）、ペプチド、ナノ粒子、金粒子、およびポリマーを用いて送達される。
【０１１８】
様々な実施形態において、結合タンパク質またはペプチドは、本明細書に示される配列からの保存的配列修飾を有するアミノ酸配列、例えば、配列番号１〜１８５または表１〜１８中の配列を含む。「保存的配列修飾」という語句は、結合タンパク質、例えば、非修飾結合タンパク質と同様の様式で機能を可能にする同じ相対位置で側鎖を示す結合タンパク質のアミノ酸配列の特徴（例えば、結合、安定性、および配向）に、特に影響を与えないか、または変えないアミノ酸修飾を指す。保存的修飾は、例えば、結合タンパク質またはペプチドのアミノ酸配列の置換、付加、または欠失を含む。組換え多量体結合タンパク質のアミノ酸配列の修飾は、当該技術分野で任意の知られている技術、例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲベースの突然変異生成を用いて達成される。そのような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．，１９８９およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８９に記載されている。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基と置換する、例えば、小アミノ酸を異なる小アミノ酸と、親水性アミノ酸を異なる親水性アミノ酸と置換するような修飾である。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、多価結合タンパク質は、１５０超のキロダルトン（ｋＤ）を有する。他の実施形態において、本結合タンパク質は、１５０ｋＤ〜１０００ｋＤの分子量を有する。他の実施形態において、本結合タンパク質は、１５０ｋＤ〜５００ｋＤ、１５０ｋＤ〜３５０ｋＤ、１５０ｋＤ〜２５０ｋＤ、および１５０ｋＤ〜７５０ｋＤの分子量を有する。他の実施形態において、本結合タンパク質は、１５０、２００、２５０、３００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、および１５００ｋＤ超の分子量を有する。
【０１２０】
ある実施形態において、ＤＶＤ結合タンパク質は、脳血管の上皮組織に発現される抗原（例えば、標的および受容体）に結合し、かつ別の非占有結合部位を有し得る。この非占有結合部位は、ＢＢＢを横断して同時輸送される組成物（例えば、内因性または外因性治療的タンパク質）に特異的であり得る。したがって、この方法において「事前に負荷された」結合タンパク質は、その所望の治療活性を発揮するために、脳内の所望の標的部位に送達され得る。あるいは、結合部位は、脳血管の上皮組織に発現される受容体への結合により、非占有の続く輸送体およびＢＢＢの取り込みを維持することができ、そのため、それは、ＢＢＢの脳側において所望の標的分子を結合することができる。
【０１２１】
本開示のある態様において、脳血管の上皮組織またはその中に発現される抗原（例えば、受容体）に対して、結合タンパク質の結合親和性間の逆相関関係がある。本結合タンパク質は、脳血管の上皮組織に発現される受容体に特異的に結合するが、それらは、特異的結合に対して結合親和性範囲の低い方の末端で結合させることができる。したがって、いくつかの実施形態において、本結合タンパク質は、１×１０−６Ｍ〜１×１０−７の解離定数で、脳血管の上皮組織に発現される受容体に結合する。他の実施形態において、解離定数は、１×１０−６Ｍ〜１×１０−８である。いくつかの実施形態において、より低い親和性は、非ヒト哺乳動物由来の抗体のヒト化を通して達成される。
【０１２２】
他の実施形態において、様々な分量の結合タンパク質が、異なる親和性で脳血管の上皮組織に発現される受容体に結合する。ある実施形態において、本結合タンパク質は、ＤＶＤ結合タンパク質である。ある実施形態において、ＤＶＤ結合タンパク質は、２つのアームを備える。それぞれのアームは、重鎖および軽鎖を含む。それぞれの重鎖および軽鎖は、可変ドメインを含む。したがって、ＤＶＤ結合タンパク質は、４つのＶＨ／ＶＬ対を含む８つの可変ドメインまたは４つの結合部位を含み得る。これらのドメインのそれぞれは、異なる解離定数で既定の抗原に特異的に結合し得る。いくつかの実施形態において、ドメインは、１×１０−６Ｍ〜１×１０−７の解離定数で抗原に結合する。他の実施形態において、解離定数は、１×１０−６Ｍ〜１×１０−８である。ある特定の実施形態において、抗原は、脳血管の上皮組織に発現される受容体、ＢＢＢを横断して同時輸送される組成物、またはＢＢＢの脳側における標的である。
【０１２３】
本開示のある実施形態において、脳血管の上皮組織に発現される受容体に特異的に結合する結合タンパク質は、対照非特異性結合タンパク質と比較して、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断する組成物の取り込みの２倍以上の増加を有し得る。他の実施形態において、脳血管の上皮組織に発現される受容体に特異的に結合する結合タンパク質は、対照非特異性結合タンパク質と比較して、ＢＢＢを横断する組成物の取り込みの３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００倍またはそれ以上の増加を有し得る。
【０１２４】
ある実施形態において、組成物は、脳血管の上皮組織に発現される受容体に特異的に結合する結合タンパク質と併用投与される。この組成物は、結合タンパク質に直接結合され得るか、またはそれは、非共役形態で併用投与され得る。実施形態において、組成物は、結合タンパク質に結合され、ある実施形態において、組成物は、リンカーを通して結合される。リンカーは、ポリペプチドリンカーであり得る。リンカーはまた、非ポリペプチドリンカーであり得る。多くのそのようなリンカーは、当該技術分野で知られている。
【０１２５】
ある実施形態において、結合タンパク質と併用投与される組成物は、以下のブデノシド、上皮成長因子、コルチコステロイド、シクロスポリン、スルファサラジン、アミノサリチル酸、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、メトロニダゾール、リポキシゲナーゼ阻害剤、メサラミン、オルサラジン、バルサラジド、抗酸化剤、トロンボキサン阻害剤、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ、抗ＩＬ−６もしくはＩＬ−６受容体ｍＡｂ、成長因子、エラスターゼ阻害剤、ピリジニル−イミダゾール化合物、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、もしくはＰＤＧＦの抗体もしくはアゴニスト、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ−１９、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ９０に対する抗体もしくはそのリガンド、メトトレキサート、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、イブプロフェン、プレドニゾロン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作動物質、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤、ＴＮＦα変換酵素阻害剤、Ｔ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体、可溶性ｐ５５  ＴＮＦ受容体、可溶性ｐ７５  ＴＮＦ受容体、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ、抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、およびＴＧＦβのうちの１つ以上から選択され得る。
【０１２６】
本明細書で特に定義されない限り、本明細書で使用される科学および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。何らかの潜在的な曖昧性がある場合には、本明細書に提供される定義が、あらゆる辞書または付帯的な定義よりも優先される。文脈によって特に必要とされない限り、単数形の用語には複数形が含まれ、複数形の用語には単数形が含まれるものとする。「または」の使用は、特に指示のない限り、「および／または」を意味する。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」等の他の形態の使用は、限定されない。
【０１２７】
一般に、本明細書に記載される細胞および組織培養物、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝子学、タンパク質および核酸の化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用する学名は、当該技術分野でよく知られており、かつ一般的に使用されるものである。本明細書に提供される方法および技術は、一般に、当該技術分野でよく知られている従来の方法に従って、本出願を通じて引用され考察される様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されるように、行われる。酵素反応および精製技法は、当該技術分野で一般的に行われるように、または本明細書に記載されるように、製造業者の仕様書に従って行われる。本明細書に記載される、分析化学、合成有機化学、ならびに医学および薬学的化学と関連して使用される命名法、ならびにそれらの検査法および技術は、当該技術分野でよく知られており、一般に使用される。化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤化、および送達、ならびに患者の治療に対して標準的技術が使用される。
【０１２８】
本開示がより容易に理解され得るように、選択した用語が下記に定義される。
「抗体」という用語は、一般に、Ｉｇ分子のエピトープ結合特性を保持する、４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖、またはその機能的な断片、突然変異体、変異体、もしくは誘導体からなる、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子を指す。そのような断片、突然変異体、変異体、もしくは誘導体抗体形式が本技術分野で知られている。完全長抗体の一実施形態において、各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。ＣＨは、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。ＣＬは、単一のＣＬドメインからなる。ＶＨおよびＶＬは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域に散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化することができる。一般に、ＶＨおよびＶＬのそれぞれは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４の順で配列される。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスからなり得る。
【０１２９】
「二特異性抗体」という用語は、その２つの結合アームのうちの１つ（ＨＣ／ＬＣの１対）上の１つの抗原（またはエピトープ）に結合し、かつその第２の結合アーム（ＨＣ／ＬＣの異なる対）上の異なる抗原（またはエピトープ）に結合する抗体を指す。二特異性抗体は、２つの別々の抗原結合アーム（特異性およびＣＤＲ配列の両方において）を有し、それが結合するそれぞれの抗原に対して一価である。二特異性抗体には、クアドローマ技術（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０５（５９３４）：５３７−４０）、２つの異なるモノクローナル抗体の化学的コンジュゲーション（Ｓｔａｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４（６０１２）：６２８−３１）により、またはノブイントゥホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）もしくはＦｃ領域中に突然変異を導入する同様のアプローチ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（１４）：６４４４−６４４８）により生成されるものが含まれる。
【０１３０】
「親和性成熟された」抗体は、変化（複数可）を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす、その１つ以上のＣＤＲ中に１つ以上の変化を有する抗体である。例示的な親和性成熟された抗体は、標的抗原に対してナノモルまたはピコモルの親和性を有する。親和性成熟された抗体は、当該技術分野で知られている手順により産生される。Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３は、ＶＨおよびＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟を記載している。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダムな突然変異導入は、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３、Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５、Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６により記載されており、活性増強アミノ酸残基による選択的突然変異導入位置、接触または超変異位置での突然変異は、米国特許第６，９１４，１２８号に記載される通りである。
【０１３１】
「ＣＤＲ移植された抗体」という用語は、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ領域のうちの１つ以上の配列が別の抗体のＣＤＲ配列で置換されている重および軽鎖可変領域配列を含む抗体を指す。例えば、２つの抗体は、異なる種、例えば、ネズミＣＤＲのうちの１つ以上がヒトＣＤＲ配列で置換されているマウス重および軽鎖可変領域を有する抗体由来であり得る。
【０１３２】
「ヒト化抗体」という用語は、る非ヒト種由来の、より「ヒト様」になる、すなわち、ヒト生殖細胞系配列により類似するように改変された抗体を指す。ヒト化抗体の１つのタイプは、非ヒトＣＤＲ配列がヒトＶＨおよびＶＬ配列に導入されて、対応するヒトＣＤＲ配列が置換されているＣＤＲ移植された抗体である。「ヒト化抗体」はまた、ヒト抗体のアミノ酸配列と実質的に（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性）を有するフレームワーク領域（ＦＲ）配列と、非ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有する少なくとも１つのＣＤＲとを含む抗体またはその変異体、誘導体、類似体、または断片である。ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にはすべての配列が非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）の配列に対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にはすべての配列がヒト免疫グロブリンの配列である少なくとも１つの、および典型的には２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）の実質的にはすべてを含んでもよい。ヒト化抗体はまた、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４領域も含み得る。一実施形態において、ヒト化抗体はまた、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域の少なくとも一部分も含む。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖のみを含有する。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖のみを含有する。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖のヒト化可変ドメインおよび／または重鎖のヒト化可変ドメインのみを含有する。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖、ならびに重鎖の少なくとも可変ドメインを含有する。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、重鎖、ならびに軽鎖の少なくとも可変ドメインを含有する。
【０１３３】
「二重可変ドメイン結合タンパク質」および「二重可変ドメイン免疫グロブリン」という用語は、その結合アーム（複数可）（例えば、ＨＣ／ＬＣの一対）のそれぞれのポリペプチド鎖において２つの可変ドメインを有する結合タンパク質を指し（ＰＣＴ公開第ＷＯ０２／０２７７３号を参照）、これらのそれぞれが、抗原に結合することができる。一実施形態において、各可変ドメインは、異なる抗原またはエピトープに結合する。別の実施形態において、各可変ドメインは、同じ抗原またはエピトープに結合する。別の実施形態において、二重可変ドメイン結合タンパク質は、同一の特異性および同一のＣＤＲ配列を有する２つの同一の抗原結合アームを有し、それが結合する各抗原に対して二価である。一実施形態において、ＤＶＤ結合タンパク質は、単一特異的であってよく、すなわち、１つの抗原に結合することができるか、または多特異性であってよく、すなわち、２つ以上の抗原に結合することができる。２つの重鎖ＤＶＤポリペプチドおよび２つの軽鎖ＤＶＤポリペプチドを含むＤＶＤ結合タンパク質は、ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）と称される。ある実施形態において、ＤＶＤ結合タンパク質は、ＢＢＢ抗原に結合する少なくとも１つの領域を含む。他の実施形態において、ＤＶＤ−Ｉｇは、受容体、抗原、標的、脳の細胞もしくは組織に結合する少なくとも１つの他の領域、または受容体、抗原、標的、脳の細胞もしくは組織をさらに含む。一実施形態において、４本鎖ＤＶＤ結合タンパク質のそれぞれ半分は、重鎖ＤＶＤポリペプチド、軽鎖ＤＶＤポリペプチド、および２つの抗原結合部位を含む。一実施形態において、それぞれの結合部位は、抗原結合部位あたり抗原結合に関与する全６つのＣＤＲを有する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。
【０１３４】
「一本鎖二重可変ドメイン免疫グロブリン」または「ｓｃＤＶＤ−Ｉｇ（商標）」または「ｓｃＦｖＤＶＤＩｇ（商標）」という用語は、抗体一本鎖Ｆｖ断片と類似するＤＶＤ分子の抗原結合断片を指す。ｓｃＤＶＤ−Ｉｇ（商標）は、米国特許出願第６１／７４６，６５９号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ｓｃＤＶＤ−Ｉｇ（商標）は、通常、式ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｘ２−ＶＬ１−（Ｘ３）ｎ−ＶＬ２からなり、式中、ＶＨ１は第１の抗体重鎖可変ドメインであり、Ｘ１はリンカーであるが、但し、それは定常ドメインではないものとし、ＶＨ２は第２の抗体重鎖可変ドメインであり、Ｘ２はリンカーであり、ＶＬ１は第１の抗体軽鎖可変ドメインであり、Ｘ３はリンカーであるが、但し、それは定常ドメインではないものとし、ＶＬ２は第２の抗体軽鎖可変ドメインであり、ｎは０または１であり、ＶＨ１およびＶＬ１、ならびにＶＨ２およびＶＬ２は、それぞれ、合わせて、２つの機能的抗原結合部位を形成する。
【０１３５】
「ＤＶＤ−Ｆａｂ」または「ｆＤＶＤ−Ｉｇ（商標）」という用語は、抗体Ｆａｂ断片に類似するＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子の抗原結合断片を指す。ｆＤＶＤ−Ｉｇ（商標）は、米国特許出願第６１／７４６，６６３号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ある実施形態において、ｆＤＶＤ−Ｉｇ（商標）は、一般式ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを有し、式中、ＶＨ１は第１の重鎖可変ドメインであり、Ｘ１はリンカーであるが、但し、それは定常ドメインではないものとし、ＶＨ２は第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは重鎖定常ドメインであり、Ｘ２は細胞表面タンパク質であり、ｎは０または１であり、ＶＨ１、ＶＨ２、および／またはＸ１のアミノ酸配列は独立して、ライブラリー内で変化する、第１のポリペプチド鎖を含む。ある実施形態において、ｆＤＶＤ−Ｉｇ（商標）はまた、一般式ＶＬ１−（Ｙ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃを有し、式中、ＶＬ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、Ｙ１はリンカーであるが、但し、それは定常ドメインではないものとし、ＶＬ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは軽鎖定常ドメイン、ｎは０または１である、第２のポリペプチド鎖も含み、本結合タンパク質の第１のポリペプチド鎖のＶＨ１およびＶＨ２ならびに第２のポリペプチド鎖のＶＬ１およびＶＬ２を合わせて、２つの機能的抗原結合部位を形成する。ある実施形態において、第１および第２のポリペプチド鎖を合わせて、ｆＤＶＤ−Ｉｇ（商標）を形成する。
【０１３６】
「受容体ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）」構築物、または「ｒＤＶＤ−Ｉｇ（商標）」という用語は、少なくとも１つの受容体様結合ドメインを含むＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物を指す。ｒＤＶＤ−Ｉｇ（商標）は、米国特許出願第６１／７４６，６１６号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ｒＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子の可変ドメインは、１つの免疫グロブリン可変ドメインおよび１つの非免疫グロブリン可変ドメイン、例えば、受容体のリガンド結合ドメイン、または酵素の活性ドメインを含み得る。ｒＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子はまた、２つ以上の非Ｉｇドメイン（ＰＣＴ公開第ＷＯ０２／０２７７３号を参照）も含み得る。ｒＤＶＤ−Ｉｇ（商標）では、可変ドメインのうちの少なくとも１つは、受容体（ＲＤ）のリガンド結合ドメインを含む。
【０１３７】
「受容体ドメイン」（ＲＤ）、または受容体結合ドメインは、当業者により一般に理解されるように、１つ以上の受容体リガンドまたはシグナリング分子（例えば、毒素、ホルモン、神経伝達物質、サイトカイン、成長因子、または細胞認識分子）に結合するように機能する、細胞表面受容体、細胞質受容体、核内受容体、または可溶性受容体の一部を指す。
【０１３８】
多特異性および多価ＩｇＧ様分子または「ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）」という用語は、２つ以上のタンパク質（例えば、抗原）に結合することができる。ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）は、米国特許出願第６１／７４６，６１７号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ある実施形態において、特異的に改変し、いくつかの概念に適用することにより生成されるｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）が、開示される。これらの概念としては、（１）ＣＨ３の「ノブイントゥーホール」設計を用いてＦｃヘテロ二量体を形成すること、（２）ＣＨ１／ＣＬの交差を用いることにより軽鎖を欠く対合を減らすことと、（３）タンパク質産生段階で、「還元酸化」アプローチを用いて２つの別々のハーフＩｇＧ分子を対合することと、が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３９】
ある実施形態において、本発明の結合タンパク質は、ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）由来の「ハーフＤＶＤ−Ｉｇ」（商標）である。ハーフＤＶＤ−Ｉｇ（商標）は、好ましくは、抗原クラスタリングおよび望ましくない活性をもたらし得る天然に存在する抗体で観察された架橋結合を促進しない。２０１２年８月９日に公開された米国特許公開第２０１２０２０１７４６号および２０１２年６月２８日に公開された国際公開第ＷＯ／２０１２／０８８３０２号を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４０】
一実施形態において、ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）の構築物は、２等分の異なるＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子、またはハーフＤＶＤ−Ｉｇ（商標）、およびハーフＩｇＧ分子を合わせることにより作製され得る。ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）の構築物は、４つの独特の構築物から発現して、重鎖ＣＨ３の「ノブイントゥーホール」設計の使用により、一価の多特異性分子を作製し得る。別の実施形態において、ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）の構築物は、２つの別個の軽鎖を含有し得、それらのそれぞれの重鎖との軽鎖の適切な対合を確実にするために、１つのアームのＦｃ上で構造的改変を利用し得る。一態様において、重鎖定常領域ＣＨ１は、１つのＦａｂ上で軽鎖定常領域ｈＣｋと交換され得る。別の態様において、全軽鎖可変領域とｈＣｋは、重鎖可変領域とＣＨ１により交換され得る。これらの独特の構築条件に適合するｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）の構築ベクターもまた、開示される。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）は、４つのポリペプチド鎖、すなわち、第１、第２、第３、および第４のポリペプチド鎖を含む。一態様において、第１のポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−ＣＨ−（Ｘ２）ｎを含み得、式中、ＶＤ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の重鎖可変ドメインであり、ＣＨは重鎖定常ドメインであり、Ｘ１はリンカーであるが、但し、それは定常ドメインではないものとし、Ｘ２はＦｃ領域である。別の態様において、第２のポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−ＣＬ−（Ｘ２）ｎを含み得、式中、ＶＤ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１はリンカーであるが、但し、それは定常ドメインではないものとし、Ｘ２はＦｃ領域を含まない。別の態様において、第３のポリペプチド鎖は、ＶＤ３−（Ｘ３）ｎ−ＶＤ４−ＣＬ−（Ｘ４）ｎを含み得、式中、ＶＤ３は第３の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ４は第４の重鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ３はリンカーであるが、但し、それは定常ドメインではないものとし、Ｘ４はＦｃ領域である。別の態様において、第４のポリペプチド鎖は、ＶＤ３−（Ｘ３）ｎ−ＶＤ４−ＣＨ−（Ｘ４）ｎを含み得、式中、ＶＤ３は第３の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ４は第４の軽鎖可変ドメインであり、ＣＨは重鎖定常ドメインであり、Ｘ３３はリンカーであるが、但し、それは定常ドメインではないものとし、Ｘ４はＦｃ領域を含まない。別の態様において、ｎは０または１であり、第１および第２のポリペプチド鎖上のＶＤ１ドメインは、抗原Ａに対する１つの機能的結合部位を形成し、第１および第２のポリペプチド鎖上のＶＤ２ドメインは、抗原Ｂに対する１つの機能的結合部位を形成し、第３および第４のポリペプチド鎖上のＶＤ３ドメインは、抗原Ｃに対する１つの機能的結合部位を形成し、第３および第４のポリペプチド鎖上のＶＤ４ドメインは、抗原Ｄに対する１つの機能的結合部位を形成する。一実施形態において、抗原Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、同じ抗原であり得るか、またはそれらはそれぞれ、異なる抗原であり得る。別の実施形態において、抗原ＡおよびＢは、同じ抗原であり、抗原ＣおよびＤは、同じ抗原である。
【０１４２】
本明細書に使用される「モノボディＤＶＤ−Ｉｇ（商標）」または「ｍＤＶＤ−Ｉｇ（商標）」は、一方の結合アームが非機能にされている結合分子の種を指す。ｍＤＶＤ−Ｉｇ（商標）は、米国特許出願第６１／７４６，６１５号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一態様において、ｍＤＶＤ−Ｉｇ（商標）は、リガンドに結合することができる一方の機能的アームのみを有する。別の態様において、もう一方の機能的アームは、異なるリガンドに結合するために１つ以上の結合ドメインを有し得る。リガンドは、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、アプタマー、多糖、糖分子、糖質、脂質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、合成分子、無機分子、有機分子、およびこれらの組み合わせであり得る。
【０１４３】
一実施形態において、ｍＤＶＤ−Ｉｇ（商標）は、４つのポリペプチド鎖を含み、４つのうちの２つのポリペプチド鎖は、ＶＤＨ−（Ｘ１）ｎ−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含む。一態様において、ＶＤＨは重鎖可変ドメインであり、Ｘ１はリンカーであるが、但し、それはＣＨ１ではないものとし、Ｃは重鎖定常ドメインであり、Ｘ２はＦｃ領域であり、ｎは０または１である。４つのうちのその他の２つのポリペプチド鎖は、ＶＤＬ−（Ｘ３）ｎ−Ｃ−（Ｘ４）ｎを含み、式中、ＶＤＬは軽鎖可変ドメインであり、Ｘ３はリンカーであるが、但し、それはＣＨ１ではないものとし、Ｃは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ４はＦｃ領域を含まず、ｎは０または１である。別の態様において、４つのうちの少なくとも１つのポリペプチド鎖は、可変ドメイン中に位置する突然変異体を含み、この突然変異体は、特異的抗原と突然変異体結合ドメインとの間の標的結合を阻害する。
【０１４４】
式ＶＤＨ−（Ｘ１）ｎ−Ｃ−（Ｘ２）ｎを有する２つのポリペプチド鎖のＦｃ領域は、それぞれ、突然変異体を含み、２つのＦｃ領域上の突然変異体は、２つのポリペプチド鎖のヘテロ二量化を増強する。一態様において、ノブイントゥーホールの突然変異体は、これらのＦｃ領域に導入されて、Ｆｃ領域のヘテロ二量化を達成し得る。Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７，２７０：２６−３５を参照のこと。
【０１４５】
本明細書に使用される「交差ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）」または「ｃｏＤＶＤ−Ｉｇ（商標）」は、可変ドメインの交差を用いて、いくつかのＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子の内部抗原結合ドメインにおける親和性喪失の問題を解決するＤＶＤ−Ｉｇ（商標）を指す。ｃｏＤＶＤ−Ｉｇ（商標）は、米国特許出願第６１／７４６，６１９号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態において、交差二重可変ドメイン（ＤＶＤ）のＩｇは、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）のＩｇまたはＩｇ様タンパク質の軽鎖および重鎖可変ドメインを交差することにより生成される。別の態様において、可変ドメインに連結するリンカーの長さおよび配列は、それぞれの形式および抗体配列／構造（フレームワーク）に対して最適化されて、所望の特性を達成し得る。開示された概念および方法論はまた、２つを超える抗原結合ドメインを有するＩｇまたはＩｇ様タンパク質まで拡張され得る。
【０１４６】
「抗イディオタイプ抗体」という用語は、別の抗体の抗原結合部位のアミノ酸配列に対して惹起された抗体を指す。抗イディオタイプ抗体は、抗原に対する免疫応答を増強するために投与され得る。
【０１４７】
「生物学的活性」という用語は、（インビボで見出されるような天然に存在する、組換え手段により提供される、または可能にされる）分子の任意の１つ以上の生物学的特性を指す。生物学的特性には、受容体に結合すること、細胞増殖を誘導すること、細胞増殖を阻害すること、他のサイトカインを誘導すること、アポトーシスを誘導すること、および酵素活性が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４８】
「中和」という用語は、結合タンパク質が抗原に特異的に結合する場合、抗原の生物学的活性を相殺することを指す。一実施形態において、中和結合タンパク質は、抗原（例えば、サイトカイン）に結合し、抗原の生物学的活性を少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％またはそれ以上低下させる。
【０１４９】
「特異性」とは、抗原に選択的に結合する結合タンパク質の能力を指す。
「特異的に結合する」という用語は、結合タンパク質またはその断片が、生理学的条件下で、比較的安定している抗原を有する複合体を形成することを意味する。特異性結合は、少なくとも約１×１０−６Ｍまたはそれ以下の解離定数により特徴付けられ得る。他の実施形態において、解離定数は、少なくとも約１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、または１×１０−９Ｍである。２つの分子が特異的に結合するかどうかを判定するための方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴等が含まれる。
【０１５０】
「哺乳動物」という用語は、齧歯類、霊長類、イヌ、ネコ、ラクダ科動物、および有蹄類を含む、哺乳類の一員であるあらゆる種を指す。「齧歯類」という用語は、マウス、ラット、ハムスター、アレチネズミ、およびウサギを含むネズミ目の一員であるあらゆる種を指す。「霊長類」という用語は、サル、類人猿、およびヒトを含むサル目の一員であるあらゆる種を指す。「ラクダ科動物」とは、ラクダおよびラマを含むラクダ科の一員であるあらゆる種を指す。「有蹄類」という用語は、ウシ、ウマ、およびラクダ科動物を含む有蹄上目の一員であるあらゆる種を指す。
【０１５１】
「親和性」は、結合タンパク質と抗原との間の相互作用の強度であり、結合タンパク質のＣＤＲの配列、ならびに抗原の性質、例えば、そのサイズ、形状、および／または電荷により決定される。結合タンパク質は、負の副作用を最小限に抑えながら、所望の治療の評価項目を提供する親和性について選択することができる。親和性は、当業者に知られている方法を用いて測定することができる（米国特許出願第２００９０３１１２５３号）。
【０１５２】
「効力」という用語は、所望の効果を達成するための結合タンパク質の能力を指し、治療有効性の測定である。効力は、当業者に知られている方法を用いて測定することができる（米国特許出願第２００９０３１１２５３号）。
【０１５３】
「交差反応性」という用語は、それが惹起された標的以外の標的に結合する結合タンパク質の能力を指す。一般に、結合タンパク質は、適切に高い親和性でその標的組織（複数可）／抗原（複数可）に結合するが、非標的の正常組織に対して適切に低い親和性を示す。個々の結合タンパク質は、一般に、２つの基準を満たすように選択される。（１）抗体標識の知られている発現に適切な組織染色。（２）同じ臓器からのヒトとｔｏｘ種（マウスおよびカニクイザル）の組織との間の類似した染色パターン。交差反応性を評価するためのこれらおよび他の方法は、当業者に知られている（米国特許出願第２００９０３１１２５３号）。
【０１５４】
「生物学的機能」という用語は、結合タンパク質の特異的なインビトロまたはインビボにおける作用を指す。結合タンパク質は、抗原のいくつかのクラスを標的とし、複数の作用機序を介して所望の治療結果を達成し得る。結合タンパク質は、可溶性タンパク質、細胞表面抗原、ならびに細胞外タンパク質沈着物を標的とし得る。結合タンパク質は、それらの標的の活性を作働させ、拮抗し、または中和させ得る。結合タンパク質は、それらが結合する標的のクリアランスを促進し得るか、または細胞に結合した時に細胞毒性をもたらす場合がある。２つ以上の抗体の部分は、単一の結合タンパク質分子において異なる機能を達成するために、多価形式に組み込むことができる。生物学的機能を評価するために使用されるインビトロアッセイおよびインビボモデルは、当業者に知られている（米国特許出願第２００９０３１１２５３号）。
【０１５５】
「安定な」結合タンパク質は、結合タンパク質が、保存時にその物理的安定性、化学的安定性、および／または生物学的活性を本質的に保持しているものである。長期間にわたって、種々の温度にてインビトロで安定である多価結合タンパク質が望ましい。結合タンパク質を安定化し、種々の温度でそれらの安定性を評価する方法は、当業者に知られている（米国特許出願第２００９０３１１２５３号）。
【０１５６】
「溶解性」という用語は、水性溶液中に分散させたままにするタンパク質の能力を指す。水性製剤中のタンパク質の溶解性は、疎水性および親水性アミノ酸残基の適切な分布に応じて異なり、したがって、溶解性は、正確に折り畳まれたタンパク質の産生と相関し得る。当業者は、日常的なＨＰＬＣ技術および当業者に知られている方法を用いて、結合タンパク質の溶解性の増加または減少を検出することができる（米国特許出願第２００９０３１１２５３号）。
【０１５７】
結合タンパク質は、様々な宿主細胞を用いて生成され得るか、またはインビトロで産生され得、労力あたりの相対収率は「生成効率」を決定する。生成効率に影響を及ぼす因子としては、宿主細胞型（原核生物または真核生物）、発現ベクターの選択、ヌクレオチド配列の選択、および使用される方法が挙げられるが、これらに限定されない。結合タンパク質生成に使用される材料および方法、ならびに生成効率の測定は、当業者に知られている（米国特許出願第２００９０３１１２５３号）。
【０１５８】
「免疫原性」という用語は、免疫応答を誘導する物質の能力を意味する。治療的結合タンパク質の投与は、免疫応答の特定の発生をもたらし得る。多価形式の免疫原性を誘導し得る潜在的な要素は、親抗体の選択中に分析することができ、そのようなリスクを低下させるための工程は、多価結合タンパク質形式にそれらの配列を組み込む前に、親抗体を最適化するために採用することができる。抗体および結合タンパク質の免疫原性を減少させる方法は、当業者に知られている（米国特許出願第２００９０３１１２５３号）。
【０１５９】
「標的」および「検出可能な標識」という用語は、特異的結合対のメンバー間の反応（例えば、結合）を検出可能なものにするために、抗体またはその分析物等の特異的結合対のメンバーに結合させた部分を意味する。特異的結合対の標識されたメンバーは、「検出可能に標識されている」と称される。したがって、「標識された結合タンパク質」という用語は、結合タンパク質の特定を与える標識が組み込まれたタンパク質を指す。一実施形態において、標識は、可視または計測手段により検出可能なシグナルを生成することができる検出可能なマーカーであり、例えば、放射性標識アミノ酸の取り込み、または印を付けたアビジン（例えば、光学的方法または比色法により検出され得る、蛍光マーカーまたは酵素活性を含有するストレプトアビジン）により検出することができるビオチニル部分のポリペプチドへの付着である。ポリペプチドの標的の例には、以下の放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、または１５３Ｓｍ）；色原体、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；化学発光マーカー；ビオチニル基；二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）；およびガドリニウムキレート等の磁気作用物質が含まれるが、これらに限定されない。イムノアッセイに一般に使用される標的の代表的な例には、光を生じる部分、例えば、アクリジニウム化合物、および蛍光を生じる部分、例えば、フルオレセインが含まれる。この関連で、部分自体が検出可能に標識され得るが、さらに別の部分との反応後に検出可能にされ得る。
【０１６０】
「連結体」という用語は、第２の化学部分、例えば、治療剤または細胞傷害性剤等に化学的に連結された抗体等の結合タンパク質を指す。「薬剤」という用語は、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的高分子、または生物学的材料から作製された抽出物を含む。一実施形態において、治療剤または細胞傷害性剤には、百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにその類似体または相同体が含まれるが、これらに限定されない。イムノアッセイとの関連において使用される場合、連結抗体は、検出抗体として使用される検出可能に標識された抗体であってよい。
【０１６１】
「結晶」および「結晶化された」という用語は、結晶の形態で存在する結合タンパク質（例えば、抗体）、またはその抗原結合部分を指す。結晶は、物質の固体状態の一形態であり、これは、非晶質の固体状態または液体の結晶状態等の他の形態とは異なる。結晶は、原子、イオン、分子（例えば、抗体等のタンパク質）、または分子集合体（例えば、抗原／抗体複合体）の規則的な反復する三次元配列から構成される。これらの三次元配列は、本分野においてよく理解されている特異的な数学的関係に従って整列されている。結晶中で反復されている基礎的単位または構築ブロックは、非対称単位と呼ばれる。所定の十分に整えられた結晶的対称性に合致する配置での非対称単位の反復は、結晶の「単位格子」を与える。すべての三次元中での規則的な転換による単位格子の反復は、結晶を与える。Ｇｉｅｇｅ，Ｒ．ａｎｄ  Ｄｕｃｒｕｉｘ，Ａ．Ｂａｒｒｅｔｔ，ＣＲＹＳＴＡＬＬＩＺＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＡＮＤ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，２ｎｄ  ｅａ．，ｐｐ．２０  １−１６，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９９）を参照のこと。
【０１６２】
「ベクター」という用語は、核酸分子に連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの１つの種類は、「プラスミド」であり、これは、その中にさらなるＤＮＡセグメントを連結し得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別の種類は、ウイルスベクターであり、さらなるＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノム中に連結され得る。他のベクターには、ＲＮＡベクターが含まれる。あるベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自己複製を行うことができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中に導入されて、宿主細胞のゲノムに組み込まれることが可能であり、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。あるベクターは、それらが作用可能に連結されている遺伝子の発現を誘導することが可能である。そのようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター（または単に、「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態である。プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるので、本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、互換的に使用され得る。しかしながら、発現ベクターの他の形態もまた含まれ、例えば、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）等も含まれる。一群のｐＨｙｂＥベクター（米国特許出願第６１／０２１，２８２号）は、親抗体およびＤＶＤ結合タンパク質のクローニングに使用された。ｐＪＰ１８３由来のＶ１；ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，非Ｖ２は、抗体および野生型定常領域を有するＤＶＤ重鎖をクローニングするために使用された。ｐＪＰ１９１由来のＶ２；ｐＨｙｂＥ−ｈＣｋ  Ｖ３は、抗体およびカッパ定常領域を有するＤＶＤ軽鎖をクローニングするために使用された。ｐＪＰ１９２由来のＶ３；ｐＨｙｂＥ−ｈＣｌ  Ｖ２は、抗体およびラムダ定常領域を有するＤＶＤ軽鎖をクローニングするために使用された。Ｖ４は、ラムダシグナルペプチドおよびカッパ定常領域を用いて構築され、ラムダ−カッパハイブリッドＶドメインを有するＤＶＤ軽鎖をクローニングするために使用された。Ｖ５は、カッパシグナルペプチドおよびラムダ定常領域を用いて構築され、カッパ−ラムダハイブリッドＶドメインを有するＤＶＤ軽鎖をクローニングするために使用された。ｐＪＰ１８３由来のＶ７；ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，非Ｖ２は、抗体および（２３４，２３５  ＡＡ）突然変異定常領域を有するＤＶＤ重鎖をクローニングするために使用された。
【０１６３】
「組換え宿主細胞」または「宿主細胞」という用語は、外来のＤＮＡが導入されている細胞を指す。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も指す。突然変異または環境的な影響のために、後続の世代中にある修飾が生じ得るため、そのような子孫は、実際には親細胞と同一でないことがあり得るが、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内になお含まれる。一実施形態において、宿主細胞には、原核細胞および真核細胞が含まれる。一実施形態において、真核細胞には、原生生物、真菌、植物、および動物細胞が含まれる。別の実施形態において、宿主細胞には、原核細胞株大腸菌；哺乳動物細胞株ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＮＳ０、ＳＰ２、およびＰＥＲ．Ｃ６；昆虫細胞株Ｓｆ９；ならびに真菌細胞サッカロミセスセレビシアエが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６４】
「トランスフェクション」という用語は、例えば、エレクトリポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション等の宿主細胞への外因性核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入するために一般的に用いられる様々な技術を包含する。
【０１６５】
「サイトカイン」という用語は、細胞間媒介物質として別の細胞集団に作用する１つの細胞集団から放出されるタンパク質を指す。「サイトカイン」という用語には、天然源由来または組換え細胞培養物由来のタンパク質ならびに天然配列のサイトカインの生物学的に活性な同等物が含まれる。
【０１６６】
「生物学的試料」という用語は、生物または生物であったものから得られた物質の量を意味する。そのような物質には、血液、（例えば、全血）、血漿、血清、尿、羊水、滑液、内皮細胞、白血球、単球、他の細胞、臓器、組織、骨髄、リンパ節、および脾臓が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６７】
「成分」という用語は、組成物の要素を指す。診断キットに関連して、例えば、成分は、試験試料のアッセイ用のキットに含めることができる、捕捉抗体、検出もしくはコンジュゲート抗体、対照、較正物質、一連の較正物質、感受性パネル、容器、緩衝液、希釈剤、塩、酵素、酵素の補因子、検出試薬、前処理試薬／溶液、基質（例えば、溶液として）、停止液等であり得る。したがって、「成分」は、例えば、抗分析物（例えば、抗ポリペプチド）抗体に結合することにより、固体支持体上に固定されている、上記のポリペプチドまたは他の分析物を含めることができる。いくつかの成分は、溶液中にあり得るか、またはアッセイにおける使用として再構成するために凍結乾燥され得る。
【０１６８】
「対照」は、分析物を含まない（「陰性対照」）または分析物を含む（「陽性対照」）ことが知られている組成物を指す。陽性対照は、既知の濃度の分析物を含み得る。「対照」、「陽性対照」、および「較正物質」は、既知の濃度の分析物を含む組成物を指すために本明細書において互換的に使用され得る。「陽性対照」は、アッセイの性能特性を確立するために使用することが可能であり、試薬（例えば、分析物）の完全性の有用な指標である。
【０１６９】
「所定のカットオフ」および「所定のレべル」は、所定のカットオフ／レベルに対してアッセイの結果を比較することにより診断／予後診断／治療的効力の結果を評価するために使用されるアッセイのカットオフ値を一般に指し、所定のカットオフは、様々な臨床的パラメーター（例えば、疾患の重症度、進行／非進行／改善等）にすでに連結されているか、または関連している。本開示は、例示的な所定のレベルを提供し得るが、カットオフ値はイムノアッセイの性質（例えば、使用される抗体等）に応じて異なり得ることがよく知られている。さらに、本明細書における開示を他のイムノアッセイに適合させて、本開示を基礎とする他のイムノアッセイについてのイムノアッセイ特異的なカットオフ値を得ることは、当業者の通常の技術の範囲内に十分にある。所定のカットオフ／レベルの正確な値は、アッセイ間で異なり得るが、（もしあれば）本明細書に記載される相関は一般に適用可能であるはずである。
【０１７０】
本明細書に記載される診断アッセイにおいて使用される「前処理試薬」、例えば、溶解、沈殿、および／または可溶化試薬は、あらゆる細胞を溶解するものおよび／または試験試料中に存在するあらゆる分析物を可溶化するものである。前処理は、本明細書でさらに記載されるよに、すべての試料に必要というわけではない。とりわけ、分析物（例えば、目的とするポリペプチド）の可溶化は、試料中に存在するあらゆる内在性結合タンパク質からの分析物の放出を伴い得る。前処理試薬は、均一（分離工程を必要としない）または不均一（分離工程を必要とする）であり得る。不均一前処理試薬を使用すると、アッセイの次の工程に進行する前に任意の沈殿した分析物結合タンパク質は試験試料から除去される。
【０１７１】
本明細書に記載されるイムノアッセイおよびキットとの関連で「品質管理試薬」には、較正物質、対照、および感受性パネルが含まれるが、これらに限定されない。「較正物質」または「標準物質」は、抗体または分析物等の分析物の濃度を内挿するための較正（標準）曲線を確立するために典型的に（例えば、複数等、１つ以上）使用される。あるいは、所定の陽性／陰性カットオフ近くにある単一の較正物質を使用することができる。「感受性パネル」を含むように、複数の較正物質（すなわち、１つを超える較正物質または様々な量の較正物質（複数可））を組み合わせて使用することができる。
【０１７２】
「特異的結合パートナー」という用語は、特異的結合対のメンバーである。特異的結合対は、化学的または物理的な手段を介して互いに特異的に結合する２つの異なる分子を含む。したがって、抗原および抗体特異的結合に加えて、他の特異的結合対は、ビオチンおよびアビジン（またはストレプトアビジン）、炭水化物およびレクチン、相補的なヌクレオチド配列、エフェクターおよび受容体分子、補因子および酵素、酵素阻害剤および酵素等を含み得る。さらに、特異的結合対は、元の特異的結合メンバーの類似体、例えば、分析物類似体であるメンバーを含み得る。免疫反応性特異的結合メンバーには、単離されたまたは組換えで産生された、抗原、抗原断片、およびモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む抗体、ならびにその複合体、断片、および変異体（変異体の断片を含む）が含まれる。
【０１７３】
「Ｆｃ領域」という用語は、無傷の抗体のパパイン消化により生成され得る、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義する。Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または変異体Ｆｃ領域であり得る。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に、２つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含み、および任意にＣＨ４ドメインを含む。抗体エフェクター機能を変化させるために、Ｆｃ部分中のアミノ酸残基を置換することが、当該技術分野で知られている（例えば、米国特許第５，６４８，２６０号および同第５，６２４，８２１号）。Ｆｃ領域は、いくつかの重要なエフェクター機能、例えば、サイトカイン誘導、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、および抗体と抗原−抗体複合体の半減期／クリアランス速度を媒介する。いくつかの場合において、これらのエフェクター機能は、治療用の免疫グロブリンに対して望ましいが、他の場合において、治療目的に応じて、不要であるまたは有害でさえあり得る。
【０１７４】
結合タンパク質の「抗原結合部分」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する結合タンパク質（例えば、抗体）の１つ以上の断片を意味する。結合タンパク質の抗原結合部分は、完全長の抗体の断片、ならびに、２つ以上の異なる抗原に特異的に結合する、二特異的、二重特異的、または多特異的形式により行うことができる。結合タンパク質の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）単一の可変ドメインを含むｄＡｂ断片、ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によりコードされているが、これらは、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して、一価分子を形成する単一のタンパク質鎖として、これらを作製することを可能にする合成リンカーにより、組換え法を用いて連結することが可能である（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている。そのような一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されるものとする。ダイアボディ等の一本鎖抗体の他の形態もまた、包含される。さらに、一本鎖抗体はまた、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒に、一対の抗原結合領域を形成する一対の直列Ｆｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む「直鎖抗体」も含む。
【０１７５】
「多価結合タンパク質」という用語は、２つ以上の抗原結合部位を含む結合タンパク質を意味する。一実施形態において、多価結合タンパク質は、３つ以上の抗原結合部位を有するように操作され、天然に存在する抗体ではない。「多特異性結合タンパク質」という用語は、２つ以上の関連または非関連標的に結合することができる結合タンパク質を指す。一実施形態において、本明細書に提供される二重可変ドメイン（ＤＶＤ）結合タンパク質は、２つ以上の抗原結合部位を含み、四価または多価結合タンパク質である。
【０１７６】
「リンカー」という用語は、アミノ酸残基、または２つのポリペプチド（例えば、２つのＶＨまたは２つのＶＬドメイン）を連結するために使用されるペプチド結合により接続される２つ以上のアミノ酸残基を含むポリペプチドを意味する。そのようなリンカーポリペプチドは、当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８、Ｐｏｌｊａｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３）。
【０１７７】
「Ｋａｂａｔ付番」、「Ｋａｂａｔ定義」、および「Ｋａｂａｔ標識」という用語は、本明細書において、互換的に使用される。当該技術分野で認められているこれらの用語は、抗体またはその抗原結合部分の重および軽鎖可変領域中の他のアミノ酸残基よりもさらに可変（すなわち、超可変）であるアミノ酸残基に付番するシステムを指す（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９７１）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２−３９１、およびＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）。重鎖可変領域の場合、超可変領域は、ＣＤＲ１に対するアミノ酸位置３１から３５、ＣＤＲ２に対するアミノ酸位置５０から６５、およびＣＤＲ３に対するアミノ酸位置９５から１０２にわたる。軽鎖可変領域の場合、超可変領域は、ＣＤＲ１に対するアミノ酸位置２４から３４、ＣＤＲ２に対するアミノ酸位置５０から５６、およびＣＤＲ３に対するアミノ酸位置８９から９７にわたる。
【０１７８】
「ＣＤＲ」という用語は、免疫グロブリン可変領域配列内の相補性決定領域を意味する。重鎖および軽鎖の各可変領域中には３つのＣＤＲが存在し、これらは、各重および軽鎖可変領域に対して、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と表記される。「ＣＤＲセット」という用語は、抗原に結合することができる単一の可変領域中に生じる３つのＣＤＲの群を指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なる系に従って、異なって定義されてきた。Ｋａｂａｔにより記載された系（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ａｎｄ（１９９１））は、抗体のいずれの可変領域に対しても適用可能な明瞭な残基付番系を提供するのみならず、３つのＣＤＲを定義する正確な残基境界を提供する。これらのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと称され得る。Ｃｈｏｔｈｉａおよび共同研究者（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３）は、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ内のある亜部分が、アミノ酸配列のレベルで大きな多様性を有するにも関わらず、ほぼ同一のペプチド骨格立体構造を採ることを見出した。これらの亜部分は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３またはＨ１、Ｈ２、およびＨ３（「Ｌ」および「Ｈ」は、それぞれ、軽鎖および重鎖領域を表記する）と表記された。これらの領域は、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲと称される場合があり、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複する境界を有する。Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複するＣＤＲを定義する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ（１９９５）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１３３−１３９およびＭａｃＣａｌｌｕｍ（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２（５）：７３２−４５）により記載されている。さらに他のＣＤＲ境界定義が、上記系の１つに厳格に従わない場合があり得るが、それにも関わらず、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複するが、これらは、特定の残基または残基の群またはさらにはＣＤＲ全体が、抗原結合に著しい影響を与えないという予測または実験的発見に照らして、短縮または延長され得る。本明細書に使用されている方法は、これらの系のいずれかに従って定義されたＣＤＲを使用し得るが、ある実施形態は、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａにより定義されたＣＤＲを使用する。
【０１７９】
「エピトープ」という用語は、結合タンパク質、例えば、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる、ポリペプチドおよび／または他の決定基により結合される抗原の領域を意味する。ある実施形態において、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニル等の分子の化学的に活性な表面基を含み、ある実施形態において、特異的な三次元構造的特徴および／または特異的な電荷特徴を有し得る。一実施形態において、エピトープは、特異的結合パートナー上の相補的部位に結合することが知られている抗原（またはその断片）の領域のアミノ酸残基を含む。抗原断片は、１つを超えるエピトープを含むことができる。ある実施形態において、結合タンパク質が、タンパク質および／または高分子の複雑な混合物中で、その標的抗原を認識する場合に、抗原に特異的に結合する。抗体が交差競合する（一方が他方の結合または調節作用を妨げる）場合、結合タンパク質は、「同じエピトープに結合する」。さらに、エピトープの構造上の定義（重複、類似、同一）は有益であり、機能上の定義は、構造上（結合）および機能上（調節、競合）のパラメーターを包含する。タンパク質の異なる領域は、異なる機能を果たすことができる。例えば、サイトカインの特定の領域は、受容体活性をもたらすそのサイトカイン受容体と相互作用し、一方、タンパク質の他の領域は、サイトカインを安定化するために必要とされ得る。サイトカインシグナル伝達の負の影響を排除するために、サイトカインは、受容体相互作用領域（複数可）に特異的に結合する結合タンパク質を用いて標的化され得、それによりその受容体の結合を阻止する。あるいは、結合タンパク質は、サイトカイン安定化に関与する領域を標的化され得、それにより分解のためにタンパク質を指定する。エピトープ認識を可視化し、モデル化する方法は、当業者に知られている（米国特許出願第２００９０３１１２５３号）。
【０１８０】
「薬物動態」とは、薬物が、生物により、吸収され、分散され、代謝され、および排泄されるプロセスを指す。所望の薬物動態プロファイルを有する多価結合タンパク質分子を生成するために、同様の所望の薬物動態プロファイルを有する親モノクローナル抗体が選択される。選択された親モノクローナル抗体のＰＫプロファイルは、当業者に知られている方法を用いて、齧歯類において容易に決定することができる（米国特許出願第２００９０３１１２５３号）。
【０１８１】
「生物学的利用能」とは、投与後にその標的に到達する活性薬物の量を指す。生物学的利用能は、安定性、溶解性、免疫原性、および薬物動態を含む前述の特性のいくつかの関数であり、当業者に知られている方法を用いて評価することができる（米国特許出願第２００９０３１１２５３号）。
【０１８２】
「表面プラズモン共鳴」という用語は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システム（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｃｏｍｐａｎｙ、Ｕｐｐｓａｌａ、ＳｗｅｄｅｎおよびＰｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によりリアルタイムな生体特異的相互作用の分析を可能とする光学現象を意味する。さらなる記載については、Ｊoｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６を参照のこと。「Ｋｏｎ」という用語は、例えば、ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）／抗原複合体を形成する、結合タンパク質（例えば、抗体またはＤＶＤ−Ｉｇ（商標））と抗原の結合についてのオン速度定数を意味する。「Ｋｏｎ」という用語はまた、本明細書において、互換的に使用されるように、「会合速度定数」または「ｋａ」を意味する。その標的抗原への結合タンパク質の結合速度または結合タンパク質、例えば抗体と抗原との間の複合体形成の速度を示すこの値はまた、以下の式により示される。
【０１８３】
抗体（「Ａｂ」）＋抗原（「Ａｇ」）→Ａｂ−Ａｇ
「Ｋｏｆｆ」という用語は、結合タンパク質（例えば、抗体またはＤＶＤ−Ｉｇ（商標））の、例えば、当該技術分野で知られているＤＶＤ−Ｉｇ（商標）／抗原複合体からの解離についてのオフ速度定数、または「解離速度定数」を意味する。この値は、以下の式により示されるように、結合タンパク質、例えば抗体の、その標的抗原からの解離速度または遊離抗体と抗原への経時的なＡｂ−Ａｇ複合体の分離を示す。
【０１８４】
Ａｂ＋Ａｇ←Ａｂ−Ａｇ
「Ｋｄ」および「平衡解離定数」という用語は、平衡状態で滴定測定においてまたは解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を会合速度定数（Ｋｏｎ）で割ることにより得られた値を意味する。会合速度定数、解離速度定数、および平衡解離定数は、抗原への結合タンパク質（例えば、抗体またはＤＶＤ−Ｉｇ（商標））の結合親和性を表すために使用される。会合および解離速度定数を決定するための方法は、当該技術分野でよく知られている。蛍光を基礎とする技術の使用は、高い感度、および平衡状態で生理学的緩衝液中の試料を調べる能力を提供する。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）（生体分子相互作用分析）アッセイ等の他の実験的アプローチおよび機器を使用することができる（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｃｏｍｐａｎｙ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎから入手可能な機器）。さらに、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ、Ｉｄａｈｏ）から入手可能なＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（動態排除アッセイ）アッセイも使用することができる。
【０１８５】
「変異体」という用語は、アミノ酸の付加（例えば、挿入）、欠失、または保存的置換によりアミノ酸配列中の所与のポリペプチドとは異なるが、所与のポリペプチドの生物学的活性を保持するポリペプチドを意味する（例えば、変異体ＴｆＲ抗体は、ＴｆＲとの結合について抗ＴｆＲ抗体と競合することができる）。アミノ酸の保存的置換、すなわち、同様の特性（例えば、親水性ならびに荷電領域の程度および分布）の異なるアミノ酸とのアミノ酸の置き換えは、微小変化が典型的に関与すると当該技術分野で認識されている。これらの微小変化は、当該技術分野で理解されているように、アミノ酸のヒドロパシー指標を考慮することにより部分的に特定することができる（例えば、Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２を参照のこと）。アミノ酸のヒドロパシー指標は、その疎水性および荷電の考慮を基礎とする。タンパク質中の同様のヒドロパシー指標のアミノ酸を置換することができ、タンパク質はタンパク質機能を依然として保持することが当該技術分野で知られている。一態様において、±２のヒドロパシー指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性はまた、生物学的機能を保持するタンパク質となる置換を明らかにするために使用することもできる。ペプチドとの関連でアミノ酸の親水性の考慮により、抗原性および免疫原性とよく相関することが報告されている有用な尺度である、そのペプチドの最大の局所平均親水性の計算が可能となる（例えば、米国特許第４，５５４，１０１号を参照）。当該技術分野で理解されるように、同様の親水性値を有するアミノ酸の置換は、生物学的活性、例えば、免疫原性を保持するペプチドをもたらし得る。一態様において、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸を用いて、置換が行われる。アミノ酸の疎水性指標および親水性値の両方は、そのアミノ酸の特定の側鎖により影響を受ける。この観察に一致して、生物学的機能と適合するアミノ酸置換は、アミノ酸、特に、疎水性、親水性、荷電、サイズ、および他の特性により明らかにされるこれらのアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存することが理解される。「変異体」という用語は、タンパク質分解、リン酸化、または他の翻訳後修飾等により異なってプロセシングされているが、その生物学的活性または抗原反応性、例えば、ＴｆＲに結合する能力を保持するポリペプチドまたはその断片を含む。「変異体」という用語は、他に定義がなければ、変異体の断片を包含する。変異体は、野生型配列に対して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％，８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、または７５％同一であってもよい。
【０１８６】
Ｉ．結合タンパク質の生成
ＴｆＲに結合することができる結合タンパク質およびそれを作製する方法が提供される。結合タンパク質は、様々な技術を用いて生成することができる。発現ベクター、宿主細胞、および結合タンパク質を生成する方法が提供され、当該技術分野でよく知られている。
【０１８７】
Ａ．親モノクローナル抗体の生成
ＤＶＤ結合タンパク質の可変ドメインは、目的とする抗原に結合することができるポリクローナルＡｂおよびｍＡｂを含む、親抗体から得ることができる。これらの抗体は、天然に存在し得るか、または組換え技術により生成され得る。当業者は、ハイブリドーマ技術、選択されたリンパ球抗体法（ＳＬＡＭ）、ファージ、酵母、もしくはＲＮＡ−タンパク質融合ディスプレイまたは他のライブラリーの使用、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部を含む非ヒト動物の免疫化、ならびにキメラ、ＣＤＲ移植された、およびヒト化抗体の調製を含むが、これらに限定されない、抗体を産生するための多くの方法に精通している。例えば、米国特許公開第２００９０３１１２５３  Ａ１号を参照のこと。可変ドメインはまた、親和性成熟技術を用いても調製され得る。
【０１８８】
Ｂ．親モノクローナル抗体を選択するための基準
ＤＶＤ結合タンパク質分子において望まれる少なくとも１つ以上の特性を有する親抗体を選択することを含む、一実施形態が提供される。一実施形態において、所望の特性は、１つ以上の抗体パラメーター、例えば、抗原特異性、抗原に対する親和性、効力、生物学的機能、エピトープ認識、安定性、溶解性、生産効率、免疫原性、薬物動態、生物学的利用能、組織交差反応性、またはオルソロガス抗原結合等である。例えば、米国特許公開第２００９０３１１２５３号を参照のこと。
【０１８９】
Ｃ．結合タンパク質分子の構築
結合タンパク質は、２つの異なる親モノクローナル抗体由来の２つの異なる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、組換えＤＮＡ技術により、直接的にまたはリンカーを介して直列に連結され、その後に、軽鎖定常ドメインＣＬが続くように設計され得る。同様に、重鎖は、直接的にまたはリンカーを介して直列に連結された２つの異なる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、その後に、定常ドメインＣＨ１およびＦｃ領域が続く（図１）。
【０１９０】
可変ドメインは、本明細書に記載される方法のいずれか１つにより生成された親抗体から組換えＤＮＡ技術を用いて得られ得る。一実施形態において、可変ドメインは、ネズミ重または軽鎖可変ドメインである。別の実施形態において、可変ドメインは、ＣＤＲ移植されたまたはヒト化可変重もしくは軽鎖ドメインである。一実施形態において、可変ドメインは、ヒト重または軽鎖可変ドメインである。
【０１９１】
リンカー配列は、単一のアミノ酸またはポリペプチド配列であり得る。一実施形態において、リンカー配列の選択は、いくつかのＦａｂ分子の結晶構造分析に基づいている。Ｆａｂまたは抗体分子構造中の可変ドメインとＣＨ１／ＣＬ定常ドメインとの間には、天然の柔軟な連結が存在する。この天然の連結は、ＶドメインのＣ末端由来の４〜６残基およびＣＬ／ＣＨ１ドメインのＮ末端由来の４〜６残基により構成される約１０〜１２個のアミノ酸残基を含む。ＤＶＤ結合タンパク質は、それぞれ、軽鎖および重鎖中のリンカーとしてＣＬまたはＣＨ１のＮ末端の５から６個のアミノ酸残基、または１１から１２のアミノ酸残基を用いて生成された。ＣＬまたはＣＨ１ドメインのＮ末端残基、特に、最初の５から６個のアミノ酸残基は、強い二次構造なしにループ立体構造を採ることが可能であり、したがって、２つの可変ドメイン間の柔軟なリンカーとして作用することが可能である。ＣＬまたはＣＨ１ドメインのＮ末端残基は、それらがＩｇ配列の一部であるため、可変ドメインの天然の伸長であり、したがって、それらの使用は、リンカーおよび接合部から潜在的に生じる任意の免疫原性を大幅に最小化する。
【０１９２】
さらなる実施形態において、重鎖、軽鎖、二本鎖、または四本鎖の実施形態のいずれかは、ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲ（配列番号１）、ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号２）、ＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号３）、ＳＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号４）、ＳＡＫＴＴＰ（配列番号５）、ＲＡＤＡＡＰ（配列番号６）、ＲＡＤＡＡＰＴＶＳ（配列番号７）、ＲＡＤＡＡＡＡＧＧＰＧＳ（配列番号８）、ＲＡＤＡＡＡＡ（Ｇ４Ｓ）４（配列番号９）、ＳＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号１０）、ＡＤＡＡＰ（配列番号１１）、ＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰ（配列番号１２）、ＴＶＡＡＰ（配列番号１３）、ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号１４）、ＱＰＫＡＡＰ（配列番号１５）、ＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰ（配列番号１６）、ＡＫＴＴＰＰ（配列番号１７）、ＡＫＴＴＰＰＳＶＴＰＬＡＰ（配列番号１８）、ＡＫＴＴＡＰ（配列番号１９）、ＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰ（配列番号２０）、ＡＳＴＫＧＰ（配列番号２１）、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号２２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２３）、ＧＥＮＫＶＥＹＡＰＡＬＭＡＬＳ（配列番号２４）、ＧＰＡＫＥＬＴＰＬＫＥＡＫＶＳ（配列番号２５）、またはＧＨＥＡＡＡＶＭＱＶＱＹＰＡＳ（配列番号２６）、ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号２７）、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号２８）、またはＧ／Ｓに基づく配列（例えば、Ｇ４Ｓ反復、配列番号２９）を含む、少なくとも１つのリンカーを含む。一実施形態において、Ｘ２は、Ｆｃ領域である。別の実施形態において、Ｘ２は、変異体Ｆｃ領域である。
【０１９３】
様々な実施形態において、リンカーは、ＧＳ−Ｈ１０（鎖Ｈ）のＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１７８）を含む。様々な実施形態において、リンカーは、ＧＳ−Ｌ１０（鎖Ｌ）のＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１７９）を含む。様々な実施形態において、リンカーは、ＨＧ−短（鎖Ｈ）のＡＳＴＫＧＰ（配列番号２１）を含む。様々な実施形態において、リンカーは、ＬＫ−長（鎖Ｌ）のＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号１４）を含む。例えば、配列番号２１および１７８は、ＤＶＤ−Ｉｇの可変重鎖またはドメイン上に位置する。例えば、配列番号１４および１７９は、ＤＶＤ−Ｉｇの可変軽鎖またはドメイン上に位置する。
【０１９４】
他のリンカー配列は、ＣＬ／ＣＨ１ドメインのあらゆる長さのあらゆる配列を含み得るが、ＣＬ／ＣＨ１ドメインのすべての残基は含まず、例えば、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの最初の５〜１２個のアミノ酸残基；軽鎖リンカーは、ＣκまたはＣλに由来し得、重鎖リンカーは、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、Ｃε、およびＣμを含む、いずれかのアイソタイプのＣＨ１に由来し得る。リンカー配列はまた、Ｉｇ様タンパク質（例えば、ＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）、Ｇ／Ｓに基づく配列（例えば、Ｇ４Ｓ反復、配列番号２９）、ヒンジ領域由来の配列、および他のタンパク質からの他の天然配列等の他のタンパク質に由来し得る。
【０１９５】
一実施形態において、定常ドメインは、組換えＤＮＡ技術を用いて、２つの連結された可変ドメインに連結される。一実施形態において、連結された重鎖可変ドメインを含む配列は、重鎖定常ドメインに連結され、連結された軽鎖可変ドメインを含む配列は、軽鎖定常ドメインに連結される。一実施形態において、定常ドメインは、それぞれ、ヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメインである。一実施形態において、ＤＶＤ重鎖は、Ｆｃ領域にさらに連結されている。Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または変異体Ｆｃ領域であり得る。別の実施形態において、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域である。別の実施形態において、Ｆｃ領域には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤからのＦｃ領域が含まれる。
【０１９６】
別の実施形態において、２つの重鎖ＤＶＤポリペプチドおよび２つの軽鎖ＤＶＤポリペプチドを合わせて、ＤＶＤ結合タンパク質を形成する。表１Ａ〜１Ｃは、疾患の治療に有用な例示的な抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列を列挙する。一実施形態において、いずれかの配向における、表１に列挙されるＶＨおよび／またはＶＬ領域の少なくとも２つを含むＤＶＤが提供される。いくつかの実施形態において、ＶＤ１およびＶＤ２は、独立して選択される。したがって、いくつかの実施形態において、ＶＤ１およびＶＤ２は、同じ配列番号を含み、他の実施形態において、ＶＤ１およびＶＤ２は、異なる配列番号を含む。以下に提供されるＶＨおよびＶＬドメイン配列は、当該技術分野で知られているか、または当該技術分野で知られている方法を用いて容易に識別できる相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク配列を含む。いくつかの実施形態において、これらのＣＤＲおよび／またはフレームワーク配列のうちの１つ以上は、同じ抗原に結合する、当該技術分野で知られている結合タンパク質由来の他のＣＤＲおよび／またはフレームワーク配列により、機能を損なうことなく、置き換えられる。特異的な標的に結合することができる特異的ＤＶＤ結合タンパク質およびそれを作製する方法の詳細な説明は、以下の実施例の項において提供される。
【０１９７】
Ｄ．結合タンパク質の産生
本明細書に提供される結合タンパク質は、当該技術分野で知られている多くの技術のいずれかにより産生され得る。例えば、宿主細胞からの発現、ＤＶＤ重鎖およびＤＶＤ軽鎖をコードする発現ベクター（複数可）は、標準的な技術により、宿主細胞にトランスフェクトされる。原核生物または真核生物の宿主細胞中で、本明細書に提供されるＤＶＤ結合タンパク質を発現することは可能であるが、真核細胞（特に、哺乳動物細胞）は、原核細胞よりも、適切に折り畳まれ、免疫学的に活性なＤＶＤ結合タンパク質を集合および分泌する傾向がより大きいので、ＤＶＤ結合タンパク質は、真核細胞、例えば、哺乳動物の宿主細胞中で発現される。
【０１９８】
ＤＶＤタンパク質の組換え発現のための例示的なシステムにおいて、リン酸カルシウムにより媒介されたトランスフェクションにより、ＤＶＤ重鎖およびＤＶＤ軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターが、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞中に導入される。組換え発現ベクター内で、ＤＶＤ重および軽鎖遺伝子は、遺伝子の転写の高いレベルを誘導するために、それぞれ、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター制御要素に作動可能に連結されている。組換え発現ベクターは、メトトレキサート選択／増幅を用いて、ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の選択を可能にするＤＨＦＲ遺伝子も担持する。選択された形質転換体宿主細胞は、ＤＶＤ重および軽鎖の発現を可能にするために培養され、無傷のＤＶＤタンパク質が培養培地から収集される。組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培養培地からＤＶＤタンパク質を収集するために、標準的な分子生物学的技術が使用される。ＤＶＤタンパク質が合成されるまで適切な培養培地中で、本明細書に提供される宿主細胞を培養することにより、本明細書に提供されるＤＶＤタンパク質を合成する方法も提供される。本方法は、培養培地からＤＶＤタンパク質を単離することをさらに含み得る。
【０１９９】
ＤＶＤ結合タンパク質の重要な特徴は、それが、慣用の抗体として、類似の様式で産生および精製され得ることである。ＤＶＤ結合タンパク質の産生は、定常領域の配列修飾または化学的修飾を必要とせずに、所望の二重徳的活性を有する均一な単一の主産物をもたらす。「二特異性」、「多特異性」、および「多特異性多価」完全長結合タンパク質を作製するための他の前述の方法は、集合した不活性な単一特異的、多特異性、多価の完全長結合タンパク質と、異なる結合部位の組み合わせを有する多価の完全長結合タンパク質との混合物の細胞内産生または分泌された産生をもたらし得る。
【０２００】
驚くべきことに、本明細書に提供される「二重特異的多価完全長結合タンパク質」の設計は、主として、所望の「二重特異的多価完全長結合タンパク質」に集合する二重可変ドメイン軽鎖および二重可変ドメイン重鎖をもたらす。
【０２０１】
組み立てられ、発現された二重可変ドメイン免疫グロブリン分子のうちの少なくとも５０％、少なくとも７５％、および少なくとも９０％が所望の二重特異的四価タンパク質であり、それ故に、増強された商業的有用性を有する。したがって、「二重特異的四価完全長結合タンパク質」の単一の主産物をもたらす単一細胞中の二重可変ドメイン軽鎖および二重可変ドメイン重鎖を発現させるための方法が提供される。
【０２０２】
「二重特異的四価完全長結合タンパク質」の「主産物」をもたらす単一細胞中の二重可変ドメイン軽鎖および二重可変ドメイン重鎖を発現させる方法であって、「主産物」は、二重可変ドメイン軽鎖および二重可変ドメイン重鎖を含むすべての集合されたタンパク質の５０％超であり、例えば、７５％超および９０％超である、方法が提供される。
【０２０３】
Ｅ．ＤＶＤカセット
ある実施形態において、カセットは、対象の脳血管の上皮組織に発現される抗原に特異的に結合し、対象の脳への結合タンパク質の取り込みを促進する結合タンパク質を構築するために使用することができる。いくつかの実施形態において、これらの結合タンパク質の式は、
Ｏｕｔ１−（Ｘ１）ｍ−Ｉｎ１−（Ｘ２）ｎ（Ｉ）である。
【０２０４】
式Ｉに従って、Ｏｕｔ１は、第１の外部結合ドメインであり、Ｉｎ１は、第１の内部結合ドメインである。ある実施形態において、内部結合ドメインは、外部結合ドメインよりもＤＶＤ−Ｉｇ（商標）のＦｃ領域により近接に位置する結合ドメインを表す。他の実施形態において、外部結合ドメインは、結合タンパク質のＮ末端部でまたはその近くに位置するが、内部結合ドメインは、結合タンパク質のＣ末端部でまたはその近くに位置する。
【０２０５】
式Ｉに従って、Ｘ１は、リンカーである。いくつかの実施形態に従って、Ｘ１は、本明細書に定義されるリンカーのうちのいずれかである。他の特定の実施形態に従って、Ｘ１は、Ｏｕｔ１が対象の脳への結合タンパク質の取り込みを促進する対象の脳血管の上皮組織に発現される抗原に特異的に結合し、Ｉｎ１が前記抗原に特異的に結合しない場合、配列番号１４または２１のアミノ酸配列を含む配列を有するが、Ｘ１は、Ｉｎ１が対象の脳への結合タンパク質の取り込みを促進する対象の脳血管の上皮組織に発現される抗原に特異的に結合し、Ｏｕｔ１が前記抗原に特異的に結合しない場合、配列番号１７８または１７９のアミノ酸配列を含む配列を有する。式Ｉに従って、Ｘ２は、Ｆｃ領域である。式Ｉにおいて、ｍおよびｎの値は、０または１である。ある実施形態において、ｎが０である場合、Ｘ１は、Ｘ１は、Ｏｕｔ１またはＩｎ１が、対象の脳への結合タンパク質の取り込みを促進する対象の脳血管の上皮組織に発現される抗原に特異的に結合するかどうかに応じて、配列番号１４または１７９のアミノ酸配列であるを含む。ｎが１である場合、Ｘ１は、Ｏｕｔ１またはＩｎ１が、前記抗原に特異的に結合するかどうかに応じて、配列番号２１または１７８のアミノ酸配列を含む。
【０２０６】
Ｏｕｔ１が脳への結合タンパク質の取り込みを促進する対象の脳血管の上皮組織に発現される抗原に特異的に結合するために使用される場合、それは、Ｉｎ１が使用されるときほど高い親和性を有する必要がない。したがって、ある実施形態において、Ｏｕｔ１が対象の脳への結合タンパク質の取り込みを促進する対象の脳血管の上皮組織に発現される抗原特異的に結合する場合、Ｏｕｔ１が前記抗原に対して有する結合親和性は、Ｉｎ１が前記抗原に結合される場合のものよりも低い。例えば、Ｏｕｔ１が前記抗原に特異的に結合する場合、この結合のＥＣ５０は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎＭを超える。他の実施形態において、Ｏｕｔ１が前記抗原に特異的に結合する場合、この結合のＥＣ５０は、約１〜１０ｎＭ、２〜８ｎＭ、３〜１０ｎＭ、３〜９ｎＭ、３〜８ｎＭ、３〜７ｎＭ、３〜６ｎＭ、３〜５ｎＭ、３〜４ｎＭ、４〜１０ｎＭ、または５〜１０ｎＭである。
【０２０７】
他の実施形態において、Ｏｕｔ１がトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に特異的に結合する場合、Ｏｕｔ１は、Ｉｎ１がＴｆＲに特異的に結合する場合よりもＴｆＲに対して低い親和性を有する。例えば、Ｏｕｔ１が前記抗原に特異的に結合する場合、この結合のＥＣ５０は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎＭを超える。他の実施形態において、ＥＣ５０は、約３ｎＭを超える。他の実施形態において、Ｏｕｔ１がＴｆＲに特異的に結合する場合、この結合のＥＣ５０は、約１〜１０ｎＭ、２〜８ｎＭ、３〜１０ｎＭ、３〜９ｎＭ、３〜８ｎＭ、３〜７ｎＭ、３〜６ｎＭ、３〜５ｎＭ、３〜４ｎＭ、４〜１０ｎＭ、または５〜１０ｎＭである。他の実施形態において、ＥＣ５０は、約３〜１０ｎＭ、３〜９ｎＭ、３〜８ｎＭ、３〜７ｎＭ、３〜６ｎＭ、３〜５ｎＭ、または３〜４ｎＭである。ある実施形態において、Ｏｕｔ１は、配列番号５６のアミノ酸配列を含む。
【０２０８】
他の実施形態において、Ｏｕｔ１が脳への結合タンパク質の取り込みを促進する対象の脳血管の上皮組織に発現される抗原に特異的に結合する場合、Ｉｎ１は、別の抗原に結合する。この抗原は、ＣＧＲＰ、ＴＮＦα、ＲＧＭＡ、サブスタンスＰ、ブラジキニン、Ｎａｖ１．７、ＬＰＡ、Ｐ２Ｘ３、ＮＧＦ、Ａｂｅｔａ；ＢＡＣＥ１；ＩＬ−１β；ＩＧＦ１もしくは２；ＩＬ−１８；ＩＬ−６；ＲＡＧＥ；ＮＧＦ；ＥＧＦＲ；ｃＭｅｔ、Ｈｅｒ−２、およびＣＤ−２０から選択され得る。
【０２０９】
Ｉｎ１が脳への結合タンパク質の取り込みを促進する対象の脳血管の上皮組織に発現される抗原に特異的に結合するために使用される場合、それは、Ｏｕｔ１が使用される場合のものよりも高い親和性を有する必要がある。したがって、ある実施形態において、Ｉｎ１が対象の脳への結合タンパク質の取り込みを促進する対象の脳血管の上皮組織に発現される抗原に特異的に結合する場合、Ｉｎ１が前記抗原に対して有する結合親和性は、Ｏｕｔ１が前記抗原に結合する場合のものよりも高い。例えば、Ｉｎ１が前記抗原に特異的に結合する場合、この結合のＥＣ５０は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎＭを超える。他の実施形態において、Ｏｕｔ１が前記抗原に特異的に結合する場合、この結合のＥＣ５０は、約１〜０．００１ｎＭ、２〜０．００１ｎＭ、３〜０．０００１ｎＭ、３〜０．００１ｎＭ、３〜０．０１ｎＭ、３〜０．１ｎＭ、３〜１ｎＭ、３〜５ｎＭ、３〜１０ｎＭ、４〜１０ｎＭ、または５〜１０ｎＭである。
【０２１０】
他の実施形態において、Ｏｕｔ１がトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に特異的に結合する場合、Ｉｎ１は、Ｏｕｔ１がＴｆＲに特異的に結合する場合のものよりもＴｆＲに対して高い親和性を有する。例えば、Ｉｎ１が前記抗原に特異的に結合する場合、この結合のＥＣ５０は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎＭを超える。他の実施形態において、ＥＣ５０は、約３ｎＭ未満である。他の実施形態において、Ｉｎ１がＴｆＲに特異的に結合する場合、この結合のＥＣ５０は、約１〜０．００１ｎＭ、２〜０．００１ｎＭ、３〜０．０００１ｎＭ、３〜０．００１ｎＭ、３〜０．０１ｎＭ、３〜０．１ｎＭ、３〜１ｎＭ、３〜５ｎＭ、３〜１０ｎＭ、４〜１０ｎＭ、または５〜１０ｎＭである。他の実施形態において、ＥＣ５０は、約３〜０．０００１ｎＭ、３〜０．００１ｎＭ、３〜０．０１ｎＭ、３〜０．１ｎＭ、３〜１ｎＭ、３〜５ｎＭ、または３〜１０ｎＭである。ある実施形態において、Ｉｎ１は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。
【０２１１】
他の実施形態において、Ｏｕｔ１が脳への結合タンパク質の取り込みを促進する対象の脳血管の上皮組織に発現される抗原に特異的に結合する場合、Ｏｕｔ１は、別の抗原に結合する。この抗原は、ＣＧＲＰ、ＴＮＦα、ＲＧＭＡ、サブスタンスＰ、ブラジキニン、Ｎａｖ１．７、ＬＰＡ、Ｐ２Ｘ３、ＮＧＦ、Ａｂｅｔａ；ＢＡＣＥ１；ＩＬ−１β；ＩＧＦ１もしくは２；ＩＬ−１８；ＩＬ−６；ＲＡＧＥ；ＮＧＦ；ＥＧＦＲ；ｃＭｅｔ、Ｈｅｒ−２、およびＣＤ−２０から選択され得る。
【０２１２】
他の実施形態において、結合タンパク質は、第２の結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、この第２の結合タンパク質における式は、
Ｏｕｔ２−（Ｘ１）ｍ−Ｉｎ２−（Ｘ２）ｎ（ＩＩ）である。
【０２１３】
式ＩＩに従って、Ｏｕｔ２は、第２の外部結合ドメインであり、Ｉｎ２は、第２の内部結合ドメインである。上で説明されるように、ある実施形態において、内部結合ドメインは、外部結合ドメインよりもＤＶＤ−Ｉｇ（商標）のＦｃ領域により近接に位置する結合ドメインを表す。他の実施形態において、外部結合ドメインは、結合タンパク質のＮ末端部でまたはその近くに位置するが、内部結合ドメインは、結合タンパク質のＣ末端部でまたはその近くに位置する。Ｘ１およびＸ２は、上の式Ｉについて定義される通りである。
【０２１４】
Ｏｕｔ２およびＩｎ２は、上述のＯｕｔ１およびＩｎ１と同じ様式で操作される。この第２の結合タンパク質は、第１の結合タンパク質と結合して、ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）等の結合ポリペプチドを形成することができる。これらの実施形態において、第１の結合タンパク質では、ｎは１であり、第２の結合タンパク質では、ｎは０である。ある実施形態において、Ｏｕｔ１およびＯｕｔ２の両方は、対象の脳への結合タンパク質の取り込みを促進する対象の脳血管の上皮組織に発現される抗原に結合する。他の実施形態において、Ｉｎ１およびＩｎ２の両方は、前記抗原に結合する。他の実施形態に従って、Ｏｕｔ１およびＩｎ２またはＯｕｔ２およびＩｎ１は、前記抗原に結合する。ある実施形態において、Ｏｕｔ２は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、Ｉｎ２は、配列番号５７のアミノ酸配列を含む。
【０２１５】
ＩＩ．結合タンパク質の使用
２つ以上の抗原に結合するそれらの能力を考えると、本明細書に提供される結合タンパク質は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または組織免疫組織化学等の慣用のイムノアッセイを用いて、（例えば、血清または血漿等の生物学的試料中の）抗原を検出するために使用することができる。結合タンパク質は、結合したまたは結合していない抗体の検出を促進するために、検出可能な物質で直接または間接的に標識される。好適な検出可能な物質には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、および放射性物質が含まれる。好適な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれ、好適な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれ、好適な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオロセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンが含まれる。発光物質の例は、ルミソールであり、好適な放射性物質の例には、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、および１５３Ｓｍが含まれる。
【０２１６】
一実施形態において、本明細書に提供される結合タンパク質は、インビトロおよびインビボの両方でそれらの抗原標的の活性を中和することができる。したがって、そのような結合タンパク質は、例えば、抗原を含有する細胞培養中、ヒト対象中、または本明細書に提供される結合タンパク質が交差反応する抗原を有する他の哺乳動物対象中の抗原活性を阻害するために使用することができる。別の実施形態において、抗原活性が有害である疾患または障害に罹患している対象中の抗原活性を低下させる方法が提供される。本明細書に提供される結合タンパク質は、治療目的のために、ヒト対象に投与することができる。
【０２１７】
「抗原活性が有害である障害」という用語は、障害に罹患している対象における抗原の存在が、病態生理に関与しているまたは障害の悪化に寄与する因子のいずれかであるまたはそれが疑われていることが示されている疾患および他の障害を含むことを意図する。したがって、抗原活性が有害である障害は、抗原活性の低下が障害の症候および／または進行を緩和することが予測される障害である。そのような障害は、例えば、障害に罹患している対象の生物学的液体中の抗原濃度の増加（例えば、対象の血清、血漿、滑液等の抗原濃度の増加）により明らかとされ得る。本明細書に提供される結合タンパク質で治療することができる障害の非限定的な例には、以下に、および結合タンパク質を含む薬学的組成物に関連する項に論じられている障害が含まれる。
【０２１８】
ＤＶＤ結合タンパク質は、効力／安全性を増強し、かつ／または患者の対象範囲を増加させるために、２つの異なる標的を同時に遮断するための治療剤として有用である。
【０２１９】
さらに、本明細書に提供されるＤＶＤ結合タンパク質は、細胞内送達（内部移行性受容体および細胞内分子を標的化すること）、脳内への送達（血液脳関門を横断するためにトランスフェリン受容体およびＣＮＳ疾患媒介物質を標的化すること）を含む、組織特異的な送達（増強された局所ＰＫにより、より高い効力および／またはより低い毒性に対する組織マーカーおよび疾患媒介物質を標的化すること）のために使用することができる。ＤＶＤ結合タンパク質はまた、その抗原の非中和エピトープへの結合を介して特異的な位置に抗原を送達するための担体タンパク質としての役目を果たすこともでき、さらに、抗原の半減期を増加させることもできる。さらに、ＤＶＤ結合タンパク質は、患者に植え込まれた医療デバイスに物理的に連結されか、またはこれらの医療デバイスを標的とするように設計され得る（Ｂｕｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５８（３）：４３７−４４６、Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏａｔｉｎｇｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．２００（２２−２３）：６３１８−６３２４、Ｄｒｕｇ／ｄｅｖｉｃｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｌｏｃａｌ  ｄｒｕｇ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ，Ｗｕ（２００６）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２７（１１）：２４５０−２４６７、Ｍｅｄｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｍａｒｑｕｅｓ（２００５）Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．Ｒｅｇｅｎ．Ｍｅｄ．３７７−３９７を参照のこと）。簡潔に言えば、医療用インプラントの部位へ適切な細胞型を誘導することは、正常な組織機能の治癒および回復を促進し得る。あるいは、デバイスに連結された、またはそれを標的とするＤＶＤにより、デバイスの植え込み時に放出される媒介物質（サイトカインが含まれるが、これに限定されない）の阻害も提供される。
【０２２０】
Ａ．様々な疾患における結合タンパク質の使用
本明細書に提供される結合タンパク質分子は、様々な疾患を治療するための治療分子として有用であり、例えば、結合タンパク質により認識される標的は有害である。そのような結合タンパク質は、特異的疾患に関与する１つ以上の対象に結合し得る。ＢＢＢ受容体（例えば、ＴｆＲ）への結合はまた、血液脳関門の透過を増強することも示され、それ故に、脳に治療剤を送達するために有用である。本開示を制限することなく、ある疾患状態に関するさらなる情報が提供される。
【０２２１】
ａ．神経変性疾患
神経変性疾患は、通常、それらが年齢依存性である場合には慢性であり、または急性（例えば、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷等）である。それらは、神経機能の進行性の喪失（例えば、神経細胞死、軸索損失、神経炎性ジストロフィー、脱髄）、運動能力の喪失および記憶喪失により特徴付けられる。これらの慢性神経変性疾患は、複数の細胞型と媒介物質との間で複雑な相互作用を示す。そのような疾患に対する治療戦略は限定されており、非特異的な抗炎症剤（例えば、コルチコステロイド、ＣＯＸ阻害剤）または神経細胞の喪失および／もしくはシナプス機能を抑制するための薬剤で炎症プロセスを遮断することが大部分を占める。これらの治療は、疾患の進行を停止させることができない。１つを超える疾患媒介物質を標的とする特定の治療は、単一の疾患機構を標的にして観察されるものよりも慢性神経変性疾患に対してより良好な治療効力を提供することができる（Ｄｅａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．９：９０７−１３、およびＭａｓｌｉａｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎｅｕｒｏｎ．４６：８５７を参照のこと）。
【０２２２】
本明細書に提供される結合タンパク質分子は、血液脳関門を横断する治療剤の輸送を可能にし得る。ある実施形態において、これらの治療剤は、アルツハイマー病等の慢性神経変性疾患に関与する１つ以上の標的に結合する。結合タンパク質分子および他の治療剤とのその組み合わせの効力は、アミロイド前駆体タンパク質またはＲＡＧＥを過剰発現し、アルツハイマー病様の症候を発症するトランスジェニックマウス等の前臨床動物モデルで妥当性を確認することができる。さらに、結合タンパク質分子を構築し、動物モデルで効力について検査することが可能であり、ヒト患者での検査のために、最良の治療的結合タンパク質を選択することができる。結合タンパク質分子はまた、パーキンソン病等の他の神経変性疾患の治療のためにも使用することができる。他の疼痛関連の標的には、ＣＧＲＰ、ＴＮＦα、ＲＧＭＡ、サブスタンスＰ、ブラジキニン、Ｎａｖ１．７、ＬＰＡ、Ｐ２Ｘ３、およびＮＧＦが含まれる。
【０２２３】
ｂ．神経再生および脊髄損傷
病理学機構の知識の増加にかかわらず、脊髄損傷（ＳＣＩ）は、依然として、破壊的状態であり、高度の医療要求により特徴付けられる医学的適応を表す。多くの脊髄損傷は、挫傷または圧迫損傷であり、通常、原発性損傷の後に、初期損傷を悪化させ、病変部位を有意に、時には、１０倍以上に広げる二次損傷機構（例えば、サイトカインおよびケモカイン等の炎症性メディエータ）が生ずる。
【０２２４】
結合タンパク質分子の有効性は、脊髄損傷の前臨床動物モデルで妥当性を確認することができる。さらに、これらの結合タンパク質分子を構築し、動物モデルにおける有効性について検査することができ、ヒト患者における検査のために、最良の治療的結合タンパク質を選択することができる。一般に、抗体は、効率的かつ関連のある様式で血液脳関門（ＢＢＢ）を通過しない。しかしながら、例えば、脳卒中、外傷性脳損傷、多発性硬化症等のある神経疾患において、ＢＢＢは、損なわれる場合があり、脳への結合タンパク質および抗体の透過の増加を可能にする。ＢＢＢ漏出が生じない、他の神経学的状態において、グルコースおよびアミノ酸担体のような担体媒介性輸送体、ならびにＢＢＢの血管内皮での受容体媒介トランスサイトーシス媒介細胞構造体／受容体を含む内因性輸送系の標的に使用することができ、それ故に、結合タンパク質のトランスＢＢＢ輸送を可能にする。そのような輸送を可能にするＢＢＢでの構造体には、インスリン受容体、例えば、ヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）、トランスフェリン受容体、ＬＲＰファミリー、ＩＧＦＲ、ＥＰＣＲ、ＥＧＦＲ、ＴＮＦＲ、レプチン受容体、Ｍ６ＰＲ、神経性ニコチン性アセチルコリン受容体、リポタンパク質受容体、ＡｃｈＲ、ＤＴｒ、グルタチオン輸送体、ＳＲ−Ｂ１、ＭＹＯＦ、ＴＦＲＣ、ＥＣＥ１，ＬＤＬＲ、ＰＶＲ、ＣＤＣ５０Ａ、ＳＣＡＲＦ１、ＭＲＣ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＲＡＭＰ２、ＶＬＤＬＲ、ＳＴＡＢ１、ＴＬＲ９、ＣＸＣＬ１６、ＮＴＲＫ１、ＣＤ７４、ＤＰＰ４、ＴＭＥＭ３０Ａ、およびＲＡＧＥが含まれるが、これらに限定されない。さらに、戦略は、低分子量薬物、ナノ粒子、および核酸を含むＣＮＳへの潜在的な薬物を輸送するためのシャトルとしての結合タンパク質の使用を可能にする（Ｃｏｌｏｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．１７（３）：２６６−７４、Ｂｏａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１８（２）：４４７−５５）。
【０２２５】
ｃ．他の疾患標的
本発明の結合分子で治療され得る他の疾患標的または疾患状態は、米国特許出願第２００９−０３０４６９３Ａ１号および同第２０１０−００７６１７８Ａ１号に開示されており、これらのそれぞれは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。例えば、神経学的使用に適している本発明の結合タンパク質は、Ａｂｅｔａ、ＴＮＦ−アルファ、ＢＡＣＥ１、ＩＬ−１．ベータ、ＩＧＦ１，２、ＩＬ−１８、ＩＬ−６、ＲＡＧＥ、ＮＧＦ、ＥＧＦＲ、ＣＤ−２０、およびＲＧＭＡからなる群から選択される少なくとも１つの標的抗原に結合し得る。他の例示的な実施形態において、本開示の結合タンパク質は、抗癌使用に適しており、ＣＤ−２０、ＣＤ−１９、ＣＤ−８０、ＣＤ−２２、ＣＤ−４０、ＣＤ−３、ＨＥＲ−２、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１，２、ＩＧＦ１Ｒ、ＲＯＮ、ＨＧＦ、ｃ−ＭＥＴ、ＶＥＧＦ、ＤＬＬ４、ＮＲＰ１、ＰＬＧＦ、およびＥｒｂＢ３からなる群から選択される少なくとも１つの標的抗原に結合し得る。
【０２２６】
ｄ．疼痛の調節
疼痛の認知および身体から送られるおよび受けるシグナルを統制する脳の経路は、依然として、完全には理解されていない。脊髄の接合は、中脳水道周囲灰白質領域を含む脳の様々な領域への疼痛の感覚の中継および調節に関与している（Ｕｇｅｅｒ，Ｐ．Ｌ．，Ｅｃｃｌｅｓ，Ｊ．Ｃ．およびＵｇｅｅｒ，Ｅ．Ｇ．（１９８７）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｂｒａｉｎ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【０２２７】
疼痛は、急性または慢性に分類され得る。急性疼痛は、組織への損傷により生じ得、一般に、突然発症および限られた継続期間を有する。慢性疼痛は、急性疼痛よりも長く続く傾向があり、通常、長期間にわたる病気と関連する。それは、通常、治療に対してさらに耐性があり、疾患をよく表している特徴（線維筋痛等）であり得る。それは、損傷組織の結果であり得るが、大抵、神経損傷に起因すると考えられる。疼痛はまた、それを生じる損傷の種類によっても分類され得る。侵害受容性疼痛は、組織損傷により生じる疼痛であるが、神経障害性疼痛は、神経損傷により生じる疼痛である。侵害受容性疼痛は、３つの異なるサブカテゴリ：内臓痛、深部体性痛、および表在体性痛にさらに分割され得る。
【０２２８】
疼痛の例としては、急性疼痛、慢性疼痛、筋肉痛、関節痛、胸痛、頸部疼痛、肩疼痛、臀部疼痛、腹痛、手根管症候群、膝痛、背痛、筋筋膜疼痛症候群、線維筋痛、関節痛、頭痛（例えば、片頭痛）、梨状筋症候群、むち打ち、慢性筋肉痛、侵害受容性疼痛、内臓痛、深部体性痛（ｄｅｅｐ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｐａｉｎ）、表在体性痛、神経障害性疼痛、中枢性疼痛症候群、複合性局所疼痛症候群、糖尿病性末梢神経障害、帯状疱疹に伴う疼痛、ヘルペス後神経痛、神経痛、三叉神経痛、坐骨神経痛、くも膜炎（脊髄痛）、中枢性疼痛症候群、幻肢痛、幻体痛、神経障害、筋区画症候群、急性ヘルペス性疼痛、ヘルペス後痛、灼熱痛、特発性疼痛、炎症性痛覚、癌疼痛、術後疼痛、間質性膀胱炎の痛み、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、腱炎、突出痛、および偶発的な痛みが含まれるが、これらに限定されない。
【０２２９】
神経障害性疼痛は、複雑で、可変性の病因を有する慢性疼痛の特殊な型である。それは、しばしば、神経の完全もしくは部分的離断、神経、神経叢、または軟組織に対する外傷もしくは傷害、あるいは癌、ＡＩＤＳ、および突発性原因を含む他の状態に起因する慢性状態である。神経障害性疼痛は、痛覚過敏（低下した痛覚閾値および増進した疼痛知覚）および異痛（無害な機械的または熱刺激からの疼痛）により特徴付けられる。その状態は、しばしば、自然と進行する。神経障害性疼痛の知覚過敏の要素は、疼痛のより一般化され、急性の型と同じような薬学的介入に応答しないので、有効な長期間処理様式の開発が問題視されてきた。
【０２３０】
心因性疼痛は、心理学的、感情的、または行動刺激と関連しているか、または相関している状態である。したがって、身体的疼痛は、心理学的起源からなる。頭痛、筋肉痛、背痛、および腹痛は、対象に観察された心理学的疼痛の最も一般的なタイプのうちのいずれかである。
【０２３１】
鎮痛、または疼痛知覚の軽減は、例えば、鎮痛剤を使用すること、神経伝達物質の放出を阻害することによりそのような侵害経路に沿った伝達を直接減少させることを含む多くの方法により得られ得る（米国特許第８，２６８，７７４号を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２３２】
いかなる特定の理論または作用機序に拘束されることを望むものではないが、本明細書に記載される結合タンパク質またはペプチドは、疼痛の治療のための薬剤（例えば、治療的および診断的）に対して有効な送達ビヒクルであることがここで想定される。対象の治療のために使用される薬学的組成物は、本明細書では、結合タンパク質またはペプチド、および少なくとも１つの治療剤を含む。本組成物は、ＢＢＢを効率的に透過し、かつ疼痛の治療および／または調節に対して有効である。
【０２３３】
ある実施形態において、結合タンパク質は、二特異性分子、例えば、本明細書に記載される二特異性ＤＶＤ−Ｉｇである。様々な実施形態において、ＤＶＤ−Ｉｇは、ＢＢＢ受容体、抗原、または標的に特異的に結合する少なくとも１つの結合領域を有する。例えば、ＢＢＢ受容体、抗原、または標的は、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、ＬＲＰ、メラノコルチン受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、ＶＡＣＭ−１受容体、血管内皮成長因子、グルココルチコイド受容体、イオンチャネル型グルタミン酸受容体、Ｍ３受容体、アリール炭化水素受容体、ＧＬＵＴ−１、イノシトール−１，４，５−トリスリン酸（ＩＰ３）受容体、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体、Ｓ１Ｐ１、Ｐ２Ｙ受容体、および終末糖化産物の受容体（ＲＡＧＥ）受容体を含む。
【０２３４】
様々な実施形態において、薬学的組成物には、結合タンパク質またはペプチド、および検出可能な薬剤が含まれる。様々な実施形態において、検出可能な薬剤は、脳の分析用の検出可能な薬剤または造影剤を含む。例えば、検出可能な薬剤は、蛍光剤、比色剤、酵素剤、または放射性薬剤を含む。
【０２３５】
ＩＩＩ．薬学的組成物
単独で、あるいは予防剤、治療剤、および／または薬学的に許容される担体と組み合わせた、１つ以上の結合タンパク質を含む薬学的組成物が提供される。本明細書に提供される結合タンパク質を含む薬学的組成物は、障害の診断、検出、またはモニタリングする際、障害または１つ以上のその症状の予防、治療、管理、または改善する際、および／または研究において使用されるが、これらに限定されない。単独で、あるいは予防剤、治療剤、および／または薬学的に許容される担体と組み合わせた薬学的組成物の製剤化は、当業者には知られている（米国特許公開第２００９０３１１２５３  Ａ１号）。
【０２３６】
本明細書に提供される予防剤または治療剤の投与方法には、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、および皮下）、硬膜外投与、腫瘍内投与、粘膜投与（例えば、鼻腔内および経口経路）、ならびに肺内投与（例えば、吸入器または噴霧器で投与されたエアロゾル化された化合物）が含まれるが、これらに限定されない。投与の特定経路のための薬学的組成物の製剤化、ならびに様々な投与方法に必要な材料および技術が利用可能であり、当業者に知られている（米国特許公開第２００９０３１１２５３  Ａ１号）。
【０２３７】
投与量レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療的または予防的応答）が得られるように調節され得る。例えば、単回ボーラスが投与されてよく、複数回分割用量が経時的に投与されてよく、あるいは、治療状況の緊急性により指示される通りに用量を比例的に減少または増加してもよい。投与の簡便さおよび投与量の均一性のために、単位投与形態で非経口組成物を製剤化することが特に有利である。「単位投与形態」という用語は、治療される哺乳動物対象に単位投与量として好適な物理的に個別の単位を指し、各単位は、必要な薬学的担体に関連して所望の治療効果を生み出すように計算された所定の量の活性化合物を含有する。本明細書に提供される単位投与形態のための仕様は、（ａ）活性化合物の固有の特徴および達成される具体的な治療または予防効果、ならびに（ｂ）個人における感受性の処置のためにそのような活性化合物を配合する際の当該技術分野に潜在的な限界により決定され、直接依存する。
【０２３８】
本明細書に提供される結合タンパク質の治療上または予防上有効量の例示的非限定範囲は、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、例えば、１〜１０ｍｇ／ｋｇである。用量の値は緩和しようとする状態のタイプおよび重症度により異なり得ることに留意されたい。任意の特定の対象に関して、具体的な投与量レジメンは、個体の必要性、ならびに組成物の投与を施すかまたは指図する専門家の判断に従って経時的に調節されるべきであり、本明細書中に記述される投与量範囲は単なる例であって、特許請求されている組成物の範囲または実施を限定する意図はないことをさらに理解されたい。
【０２３９】
ＩＶ．併用療法
本明細書に提供される結合タンパク質はまた、様々な疾患の治療に有用な１つ以上のさらなる医薬剤または治療剤、その意図された目的のために専門医により選択されるさらなる薬剤と共に投与することもできる。例えば、さらなる薬剤は、本明細書に提供される抗体により治療されるべき疾患または状態を治療するのに有用である、当該技術分野において承認されている治療剤であり得る。この組み合わせはまた、１つを超えるさらなる薬剤、例えば、２つまたは３つのさらなる薬剤を含み得る。
【０２４０】
様々な実施形態において、結合剤は、タンパク質、ペプチド、糖質、薬物、小分子、および遺伝物質（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）である薬剤と共に投与される。様々な実施形態において、この薬剤は、造影剤、細胞毒性剤、血管形成阻害剤、キナーゼ阻害剤、共刺激分子遮断剤、接着分子遮断剤、抗サイトカイン抗体もしくはその機能的断片、メトトレキサート、シクロスポリン、ラパマイシン、ＦＫ５０６、検出可能な標識もしくはレポーター、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ剤、筋肉弛緩剤、麻酔剤、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔、鎮静剤、局所麻酔、神経筋肉遮断剤、抗微生物剤、抗乾癬剤、コルチコステロイド（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｉｏｄ）、アナボリックステロイド、エリスロポエチン、免疫化、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性医薬、抗鬱剤、抗精神病薬、刺激剤、喘息薬、ベータアゴニスト、吸引用ステロイド、エピネフリンもしくは類似体、サイトカイン、またはサイトカインアンタゴニストである。
【０２４１】
様々な実施形態において、さらなる薬剤は、治療剤である。様々な実施形態において、治療剤は、ブデノシド、上皮成長因子、コルチコステロイド、シクロスポリン、スルファサラジン、アミノサリチル酸、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、メトロニダゾール、リポキシゲナーゼ阻害剤、メサラミン、オルサラジン、バルサラジド、抗酸化剤、トロンボキサン阻害剤、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、抗ＩＬ−１β  ｍＡｂｓ、抗ＩＬ−６もしくはＩＬ−６受容体ｍＡｂ、成長因子、エラスターゼ阻害剤、ピリジニル−イミダゾール化合物、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、もしくはＰＤＧＦに対して特異的な抗体もしくはアゴニスト、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ−１９、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ９０に対する抗体もしくはそのリガンド、メトトレキサート、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、イブプロフェン、プレドニゾロン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作動物質、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤、ＴＮＦα変換酵素阻害剤、Ｔ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体、可溶性ｐ５５  ＴＮＦ受容体、可溶性ｐ７５  ＴＮＦ受容体、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ、抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、またはＴＧＦβを含む。
【０２４２】
併用療法の薬剤には、抗腫瘍剤、放射線治療、化学療法、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、シスプラチン、カルボプラチン、抗チューブリン剤、パクリタキセル、ドセタキセル、タクソール、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ジェムザール、アントラサイクリン、アドリアマイシン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、イリノテカン、受容体チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、エルロチニブ、ゲフィチニブ）、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ）、キナーゼ阻害剤、およびｓｉＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。
【０２４３】
Ｖ．診断
本明細書中の開示はまた、診断アッセイ方法、１つ以上の結合タンパク質を含む診断用キット、ならびに自動および／または半自動システムで用いる方法およびキットの適応が含まれるが、これらに限定されない、診断用適用も提供する。提供される方法、キット、および適応は、個人における疾患または障害の検出、モニタリング、および／または治療において使用され得る。これは、以下にさらに解明される。
【０２４４】
Ａ．アッセイの方法
本開示はまた、本明細書に記載される少なくとも１つの結合タンパク質を用いて、試験試料中の分析物またはその断片の存在、量、または濃度を決定するための方法も提供する。当該技術分野で知られている任意の好適なアッセイが、本方法において使用され得る。例には、イムノアッセイおよび／または質量分析を使用する方法が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４５】
本開示により提供されるイムノアッセイは、サンドイッチイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、競合阻害イムノアッセイ、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、酵素免疫測定法の乗算（ＥＭＩＴ）、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）、および均質化学発光アッセイ等を含み得る。
【０２４６】
化学発光微小粒子イムノアッセイ、特にＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）自動分析器（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）を使用するものは、イムノアッセイの例である。
【０２４７】
質量分析を使用する方法は、本開示で提供され、これには、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化）またはＳＥＬＤＩ（表面増強レーザー脱離／イオン化）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４８】
イムノアッセイおよび質量分析を用いた、生物学的試験試料の収集、取扱い、処理、および分析のための方法は、当業者にはよく知られており、本開示の実施に際して提供される（米国特許出願第２００９−０３１１２５３  Ａ１号）。
【０２４９】
Ｂ．キット
試験試料中の分析物またはその断片の存在、量、または濃度について試験試料をアッセイするためのキットも提供される。このキットは、分析物またはその断片について試験試料をアッセイするための少なくとも１つの構成成分、および分析物またはその断片試験試料について試験試料をアッセイするための説明書を含む。分析物またはその断片について試験試料をアッセイするための少なくとも１つの成分は、本明細書に開示される結合タンパク質および／または抗分析物の結合タンパク質（またはその断片、変異体、または変異体の断片）を含むことができ、これは、任意に、固相上で固定化される。
【０２５０】
任意に、キットは、較正物質または対照を含み得、単離されたまたは精製された分析物を含み得る。キットは、イムノアッセイおよび／または質量分析による分析物のための試験試料をアッセイするための少なくとも１つの成分を含むことができる。分析物、結合タンパク質、および／または抗分析物の結合タンパク質、またはその断片を含むキット成分は、当該技術分野で知られている検出可能な標識を用いて任意に標識され得る。本開示の実施の際に提供される作製のための材料および方法は、当業者に知られ得る（米国特許公開第２００９−０３１１２５３  Ａ１号）。
【０２５１】
Ｃ．キットおよび方法の適合
キット（またはその成分）、および本明細書に記載されるイムノアッセイ等のアッセイによる試験試料中の分析物の存在、量、または濃度を決定する方法は、例えば、米国特許第５，０８９，４２４号および同第５，００６，３０９号において記載される、ならびに例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）等のＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）により商業的に販売される、様々な自動および半自動システム（固相が微小粒子を含むものを含む）で用いるために適合され得る。
【０２５２】
Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能な他のプラットホームには、ＡｘＳＹＭ（登録商標）、ＩＭｘ（登録商標）（例えば、米国特許第５，２９４，４０４号を参照、ＰＲＩＳＭ（登録商標）、ＥＩＡ（ビーズ）、およびＱｕａｎｔｕｍ（商標）ＩＩ、ならびに他のプラットホームが含まれるが、これらに限定されない。さらに、アッセイ、キット、およびキットの成分は、他の形式において、例えば、電気化学的または他の携帯もしくはポイントオブケアアッセイシステムで使用することが可能である。本開示は、例えば、サンドイッチイムノアッセイを行う商業的Ａｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）電気化学的イムノアッセイシステムに適用可能である。免疫センサーならびに単回使用試験装置におけるこれらの製造および操作方法は、例えば、米国特許第５，０６３，０８１号、同第７，４１９，８２１号、および同第７，６８２，８３３号、ならびに米国特許出願公開第２００４００１８５７７号、同第２００６０１６０１６４号、同第２００９０３１１２５３号に記載されている。
【０２５３】
本明細書に記載される方法の他の好適な改変および適合が明白であり、本明細書に開示される実施形態の範囲から逸脱することなく、好適な均等物を用いて行われ得ることは当業者には容易に明らかであろう。これまで詳細にある実施形態を説明してきたが、例示のみを目的とし、限定することを意図したものではない以下の実施例を参照することにより、本発明がより明確に理解されるであろう。
【実施例】
【０２５４】
実施例１：二重可変ドメイン（ＤＶＤ）結合タンパク質の生成および特徴付け
既知のアミノ酸配列を有する親抗体を用いた、四本鎖の二重可変ドメイン（ＤＶＤ）−Ｉｇ結合タンパク質は、当該技術分野で知られている方法に従って、ＤＶＤ結合タンパク質可変重およびＤＶＤ結合タンパク質可変軽鎖配列をコードするポリヌクレオチド断片を合成し、かつｐＨｙｂＥ−Ｄ２ベクターに断片をクローニングすることにより生成された。ＤＶＤ結合タンパク質構築体は、当該技術分野で知られている方法に従って、クローニングされ、２９３細胞中に発現し、精製された。ＤＶＤ結合タンパク質におけるＤＶＤ  ＶＨおよびＶＬ鎖、ならびに選択されたＣＤＲ配列が以下に提供される。
【０２５５】
【表１−１】
2016501881.tif 000002
【０２５６】
【表１−２】
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【０２５７】
【表１−３】
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【０２５８】
【表２−１】
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【０２５９】
【表２−２】
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【０２６０】
【表２−３】
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【０２６１】
【表２−４】
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【０２６２】
【表２−５】
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【０２６３】
【表２−６】
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【０２６４】
【表２−７】
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【０２６５】
【表３−１】
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【０２６６】
【表３−２】
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【０２６７】
【表３−３】
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【０２６８】
【表３−４】
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【０２６９】
【表３−５】
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【０２７０】
【表３−６】
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【０２７１】
【表３−７】
2016501881.tif 000018
【０２７２】
実施例２：ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）の設計、構築、および分析
１．１：ヒト化抗マウスまたはヒト親抗体の構築および発現
１．１．Ａ：ヒト抗体フレームワークの選択
各ネズミ可変重および可変軽鎖遺伝子配列は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩソフトウェアを用いて、（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／ｒｅｔｒｉｅｖｅｉｇ．ｈｔｍｌ．のＮＣＢＩ  Ｉｇ  Ｂｌａｓｔウェブサイトから得られた）４４個のヒト免疫グロブリン生殖系列可変重鎖または４６個の生殖系列可変軽鎖配列に対して別々に整列させた。ヒト化は、アミノ酸配列相同性、ＣＤＲクラスター分析、発現されるヒト抗体間の使用頻度、およびヒト抗体の結晶構造に関する利用可能な情報に基づいた。抗体結合、ＶＨ−ＶＬ対形成、および他の要因に対する可能な効果を配慮して、ネズミおよびヒトフレームワークは、少数の例外を除いて異なる、ネズミ残基をヒト残基に突然変異させた。さらなるヒト化戦略を、ネズミ抗体可変領域の実際のアミノ酸配列に高度の相同性、すなわち、配列類似性を有するヒト生殖系列抗体配列またはそのサブグループの分析に基づいて設計した。
【０２７３】
相同性モデリングを用いて、抗体結合部位であるＣＤＲの構造に重要であると予測された、ネズミ抗体配列に特有の残基を特定した。相同性モデリングは、近似の三次元座標がタンパク質に対して生成される計算方法である。最初の座標、およびそれらのさらなる改良のためのガイダンスの出所は、三次元の座標が知られており、その配列が第１のタンパク質の配列に関連した、基準タンパク質の第２のタンパク質であった。２つのタンパク質の配列間の関係を使用して、基準タンパク質と、座標が望ましいタンパク質である標的タンパク質との間で対応させる。基準および標的タンパク質の一次配列を、基準タンパク質から標的タンパク質に直接移行される、２つのタンパク質の同一部分の座標と整列させる。例えば、残基の突然変異、挿入、または欠失に起因する、２つのタンパク質のミスマッチ部分の座標を、既に移行されたモデル座標との一貫性を確保するために改良された一般構造テンプレートおよびエネルギーから構築する。この計算によるタンパク質構造は、さらに改良され得るか、またはモデリング研究に直接使用され得る。モデル構造の品質は、基準および標的タンパク質が関連する競合の確度、ならびに配列アラインメントが構築される精度により決定される。
【０２７４】
ネズミｍＡｂの場合、ＢＬＡＳＴ検索および目視検査の組み合わせを用いて、好適な基準構造を特定する。基準と標的アミノ酸配列間の２５％の配列同一性は、相同性モデリング演習を試みるのに最低限必要であると考えられる。配列アラインメントを手作業で構築し、モデル座標をプログラムＪａｃｋａｌを用いて生成する（Ｐｅｔｒｅｙ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ５３（Ｓｕｐｐｌ．６）：４３０-４３５を参照）。
【０２７５】
選択された抗体のネズミおよびヒトフレームワーク領域の一次配列は、かなりの同一性を共有する。異なる残基位置は、ネズミ抗体の観察された結合効力を保持するために、ヒト化配列にネズミ残基を含めるための候補である。ヒトとネズミ配列間で異なるフレームワーク残基の一覧表を手作業で作成する。表５は、この研究のために選択されたフレームワーク配列を示す。
【０２７６】
【表４】
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【０２７７】
所与のフレームワーク残基が抗体の結合性に影響を及ぼす可能性は、ＣＤＲ残基に対するその近接により決まる。したがって、モデル構造を用いて、ネズミとヒト配列間で異なる残基を、ＣＤＲ中の任意の原子からの距離に応じて順位付けした。任意のＣＤＲ原子の４．５A以内にある残基は、最も重要と見なされ、ヒト化抗体においてネズミ残基の保持のための候補であることが推奨される（すなわち、復帰突然変異）。
【０２７８】
実施例３：親抗体およびＤＶＤ−Ｉｇ（商標）を特定および特徴付けするために使用されるアッセイ
特に指定のない限り、以下のアッセイを実施例全体を通して使用し、親抗体およびＤＶＤ−Ｉｇ（商標）を特定および特徴付けた。
【０２７９】
３．１  サイズ排除クロマトグラフィー
抗体を水で２．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、２０ｍＬをＴＳＫゲルＧ３０００  ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号ｋ５５３９−０５ｋ）を用いてＳｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣシステムで分析する。２１１ｍＭの硫酸ナトリウム、９２ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を用いて、０．３ｍＬ／分の流速にて、試料をカラムから溶出する。ＨＰＬＣシステムの操作条件は、以下の通りである：
移動相：２１１ｍＭのＮａ２ＳＯ４、９２ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４＊７Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．０
勾配：アイソクラチック
流速：０．３ｍＬ／分
検出波長：２８０ｎｍ
オートサンプラー冷却装置温度：４℃
カラムオーブン温度：周囲
実行時間：５０分
表６は、上のプロトコルにより決定されるパーセントモノマー（予想される分子量の非凝集タンパク質）として表されるＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物を含む。
【０２８０】
【表５】
2016501881.tif 000020
【０２８１】
ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）は、すべてのＤＶＤ−Ｉｇ（商標）が９０％超のモノマーを示す優れたＳＥＣプロファイルを示した。このＤＶＤ−Ｉｇ（商標）プロファイルは、親抗体について観察されるものと類似している。
【０２８２】
実施例４：親抗体およびＤＶＤ−Ｉｇ（商標）のそれらの標的抗原（複数可）に対する結合および親和性を決定するために使用されたアッセイ
Ａ：細胞に基づいた電気化学発光−メソスケールディスカバリーアッセイ（ＥＣＬ−ＭＳＤ）結合アッセイ
細胞表面上に発現された所望の標的抗原に結合する抗体またはＤＶＤについてスクリーニングするためのメソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイは、以下の通りに行われた：マウストランスフェリン受容体を過剰発現するＨｅｋ ２９３細胞を、ＭＳＤ  ９６ウェルプレート（ＭＳＤ  カタログ番号Ｌ１１ＸＢ−３、ロット番号２２９０−ＥＡ）上に添加し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中３０％  ＦＢＳ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ））を用いて３７℃で１時間ブロックした。穏やかに振とうしながら、室温で３０分間インキュベートした後、プレートをＤＰＢＳで３回洗浄し、Ａｂ／ＤＶＤ（１０，０００ｎｇ／ｍｌ）を添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートをＤＰＢＳで３回洗浄し、２５ｕｌのヤギ抗ヒトＳｕｌｆｏ  ＴＡＧ（ＭＳＤ  カタログ番号Ｒ３２ＡＣ−、Ｌｏｔ＃  Ｗ００１１６２）を１μｇ／ｍｌにて添加する。１時間のインキュベーション後、室温で１時間、プレートを洗浄し、ＭＳＤ  ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００上で読み込む前に、ＭＳＤ読み込み緩衝液を添加する。Ｘｌｆｉｔ４ソフトウェアパッケージを用いて、ＥＣ５０値を得る。
【０２８３】
実施例５：ＢＩＡＣＯＲＥ技術を用いた親和性決定
ＢＩＡＣＯＲＥ法：
ＢＩＡＣＯＲＥアッセイ（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して、オン速度およびオフ速度定の反応速度測定を用いて、抗体またはＤＶＤ−Ｉｇ（商標）の親和性を決定した。標的抗原（例えば、精製された組換え標的抗原）に対する抗体またはＤＶＤ−Ｉｇ（商標）の結合は、泳動ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、および０．００５％  界面活性剤Ｐ２０）を用いて２５℃で、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）１０００または３０００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）により表面プラズモン共鳴に基づいた測定により決定された。すべての化学物質は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から入手するか、またはそうでなければ本文に記載される異なる供給元から入手した。例えば、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中に希釈された、約５０００ＲＵのヤギ抗ヒトＩｇＧ、（Ｆｃγ）、断片特異的なポリクローナル抗体（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）は、製造業者の説明書に従って標準的なアミンカップリングキットおよび２５μｇ／ｍｌでの操作を用いてＣＭ５研究等級のバイオセンサーチップ全体に直接固定化された。バイオセンサー表面上の未反応部分をエタノールアミンでブロックする。フローセル２および４における修飾カルボキシメチルデキストラン表面を反応表面として使用する。フローセル１および３におけるヤギ抗ヒトＩｇＧなしの非修飾カルボキシメチルデキストランを基準表面として使用する。反応速度分析のために、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．０．１ソフトウェアを用いて、８個すべての注入物の会合および解離相に対して、１：１ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルから誘導された速度方程式を同時にフィッティングさせた（グローバルフィット分析を使用）。ヤギ抗ヒトＩｇＧ特異的反応表面の全体で捕捉するために、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中に、精製された抗体またはＤＶＤ−Ｉｇ（商標）を希釈した。リガンドとして捕捉されるべき抗体またはＤＶＤ−Ｉｇ（商標）（２５μｇ／ｍｌ）を５μｌ／分の流速で反応マトリックス全体に注入した。会合速度定数および解離速度定数のＫｏｎ（Ｍ−１ｓ−１）およびＫｏｆｆ（ｓ−１）は、２５μｌ／分の連続的流速下で決定される。１０〜２００ｎＭの範囲の異なる抗原濃度で速度論結合測定を行うことにより速度定数を導く。次いで、式：ＫＤ＝Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎにより、速度論的速度定数から抗体またはＤＶＤ−Ｉｇ（商標）と標的抗原との間の反応の平衡解離定数（Ｍ）を計算する。結合を時間の関数として記録し、速度論速度定数を計算する。このアッセイでは、１０６Ｍ−１ｓ−１程度に速いオン速度および１０−６ｓ−１程度に遅いオフ速度を測定することができる。
【０２８４】
【表６】
2016501881.tif 000021
【０２８５】
細胞に基づいたＭＳＤ結合アッセイにより決定される、ＡＢ４０４および４０５であるＡＢ２２１の低親和性変異体は、Ｂｉａｃｏｒｅにより有意な結合を示さなかった。Ａｂ２２１の低親和性変異体を含むＤＶＤ−Ｉｇ（商標）は、細胞に基づいたＭＳＤ結合アッセイまたはＢｉａｃｏｒｅにより測定される、結合の低下を示すか、または有意な結合を示さなかった。
【０２８６】
実施例５：Ａｂ／ＤＶＤのインビボでの生体内分布
Ａ：マウス脳および血清における抗体およびＤＶＤ  Ｉｇ（商標）の測定
６〜８週齢の野生型雌Ｃ５７Ｂ／６マウスに、抗ＴｆＲ変異体、対照ＩｇＧ、ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）（２０ｍｇ／ｋｇ）を含む抗ＴｆＲを静脈内に注入した。指示された時間後、マウスを、２ｍｌ／分の速度で１０分間、Ｄ−ＰＢＳで潅流した。脳を抽出し、ＣｏｍｐｌｅｔｅＭｉｎｉ  ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含有するＰＢＳ中１％  ＮＰ−４０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）においてＢｕｌｌｅｔ  Ｂｌｅｎｄｅｒ  Ｂｌｕｅ（ＮｅｘｔＡｄｖａｎｃｅ  ＢＢＸ２４Ｂ）を用いて均質化した。均質化した脳試料を、１４，０００ｒｐｍで２０分間回転させる前に、４℃で１時間回転させた。微量血清分離管（ＢＤＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）中で潅流する前に全血を収集し、少なくとも３０分間凝固させ、５０００ｇで９０秒間沈降させた。血清中の抗体測定のために上清を単離した。マウス血清および脳試料中の抗体またはＤＶＤ−Ｉｇ（商標）濃度を、ＥＣＬ−ＭＳＤアッセイで測定した。ＭＳＤの高結合９６ウェルプレート（ＭＳＤ  カタログ番号Ｌ１１ＸＢ−３）を、ロバ抗ヒトＩｇＧのＦ（ａｂ′）２断片、Ｆｃ断片特異的なポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で４℃で一晩コーティングした。プレートを、２５℃で１時間、３％  ＭＳＤ  Ｂｌｏｃｋ緩衝液でブロックした。各抗体またはＤＶＤ−Ｉｇ（商標）を内部標準として使用して、それぞれの抗体またはＤＶＤ−Ｉｇ（商標）濃度を定量化した。プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、１％  ＭＳＤアッセイ緩衝液を含有する０．１％  血清で希釈した標準物質および試料を添加し、２５℃で２時間インキュベートした。結合した抗体をヤギ抗ヒトＳｕｌｆｏ−ＴＡＧ、ＭＳＤで検出し、ＭＳＤ  ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００上で読み込んだ。Ｅｘｃｅｌ  Ｆｉｔソフトウェアを用いて、５パラメーター非線形回帰プログラムにより標準曲線から濃度を決定した。
【０２８７】
Ｂ．免疫組織化学
脳内の抗体分布を決定するために、野生型マウスに、指示された抗体またはＤＶＤ（２０ｍｇ／ｋｇまたは指示されるように）を静脈内に注入した。指示された時間後、上述のように、マウスを潅流し、４％  パラホルムアルデヒド中で８時間脳を固定した。固定した後、組織を、段階的に一連のアルコールからキシレンを通して処理し、次いで、パラフィン包埋した。組織学的評価のために、５μｍの脳切片を、抗ヒトＩｇＧの検出のために染色した。
【０２８８】
第一に、これらの切片を脱パラフィン処理して、再水和し、トリス洗浄緩衝液に入れた。４８のシステムに連結するＤａｋｏの自動染色器においてＩＨＣ染色を完了した。［０２２５］これらの切片を、３％  過酸化水素で３０分間ブロックし、洗浄緩衝液で洗浄し、次いで、プロテアーゼで８分間インキュベートした。切片を、ストレプトアビジンおよびビオチンブロッキングキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で各８分間ブロックし、続いて、Ｄａｋｏタンパク質を３０分間ブロックした。次に、切片を、ビオチン化したロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｆ（ａｂ’）断片化抗体を用いて、１５μｇ／ｍｌで、室温で１時間インキュベートし、続いて、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ試薬を用いて３０分間インキュベートした。ストレプトアビジンステップ後、切片をＤＡＢ色原体で３分間反応させて、茶色の沈殿物を形成した。次いで、切片を水で洗浄し、対比染色し、脱水し、微視的観察のために実装した。
【０２８９】
画像分析：１切片につき平均実質強度の半定量化分析を行った。小脳および皮質の切片を、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓソフトウェアを用いて、形態計測により分析した。２０倍率で実質染色の３つの画像において、分析を行った。４つの代表的なヒトＩｇＧ陽性領域の平均強度を１動物につき選択した。各画像におけるすべての設定（フィルターおよび光源レベル）を、実験を通して一定に保った。測定は、平均強度測定として分析され、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌにエクスポートされた。
【０２９０】
【表７】
2016501881.tif 000022
【０２９１】
脳への取り込みと親和性との間の反比例関係が、表８中に列挙される抗ＴｆＲ  Ａｂで観察された。２つの低親和性ＴｆＲ  Ａｂ（ＡＢ４０４およびＡＢ４０５）は、改善された取り込みを示し、場合によっては、対照ＩｇＧを上回る注入された用量の％の８倍超の増加が測定された。注入から２４時間後、強力な実質および神経染色が観察された。
【０２９２】
【表８】
2016501881.tif 000023
【０２９３】
２つの直交法による脳内で検出された上昇したＤＶＤ−Ｉｇ（商標）レベル：
静脈内投与による治療投与後にＢＢＢを横断して輸送することを示すＩＨＣによる神経細胞および実質への局在（図３および表８）、ならびにＭＳＤ−ＥＣＬにより測定されるように、対照ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）脳内濃度より高い（表８）。ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）のいくつかに関しては、注入された用量／脳のグラムの割合（％）により測定されるように、対照ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）と比較して、最大１０倍高い脳への取り込みが観察された。
【０２９４】
実施例６：全身投与の異なる経路によるＤＶＤ−Ｉｇ（商標）の脳への取り込み
同様の脳への取り込みは、ＤＶＤ２６７１を用いた静脈内投与および腹腔内投与（２０ｍｇ／ｋｇ）で観察された。皮下投与は、相対的に低い脳内温度および血清濃度を得た。
【０２９５】
【表９】
2016501881.tif 000024
【０２９６】
実施例７：ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）を用いた薬物動態学的研究
マウスに、２０ｍｐｋまたは５０ｍｐｋの指示されたＤＶＤ−Ｉｇ（商標）を皮下注入し、上述のように、９６時間後処理した。上述のように、９６時間後に処理する前に、別の群に、２回（０および４８時間）注入した。単回の２０ｍｐｋの皮下投与から９６時間後に、１．５８＋／−０．２０ｎＭの脳内血清濃度を保持した。異なる研究からの２０ｍｐｋのＴｆＲのＡｂまたはＤＶＤ２６７１の静脈内投与から２４時間後に測定された脳内および血清濃度を、表１０中に比較のために示す。
【０２９７】
【表１０】
2016501881.tif 000025
【０２９８】
実施例８：ＤＶＤ−Ｉｇの作製およびインビトロ／インビボスクリーニング
組換え方法を用いて、ＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質を作製し、本明細書に記載されるインビトロおよびインビボシステムを用いてスクリーニングした（図４）。特に指定されない限り、以下の実施例において、前述の実施例に記載される方法およびシステム（例えば、親抗体およびＤＶＤ−Ｉｇ（商標）を特定および特徴付けるために使用されたアッセイ）が使用された。
【０２９９】
本明細書に記載される方法および材料を用いて、標的およびＴｆＲ（標的／ＴｆＲ  ＤＶＤ）に特異的に結合するドメインを有するＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質（約１０〜４０個のＤＶＤ）が設計され、約５ミリグラム（ｍｇ）の濃度で発現された。インビトロ分析は、細胞に基づいたＴｆＲ結合アッセイ（低親和性が必要とされる）および細胞に基づいたバイオアッセイ標的（高効力が必要とされる）を用いて、標的／ＴｆＲ  ＤＶＤ−Ｉｇにおいて行われた。次いで、ネズミ対象を用いて、標的／ＴｆＲ  ＤＶＤ−Ｉｇを分析し、インビボ生体内分布／脳透過性システムにおいて比較した。対象からの標本／試料（例えば、細胞および組織）を分析して、対象における標的／ＴｆＲ  ＤＶＤ−Ｉｇの存在を判定した。一分量の標本／試料を分析して、脳内の標的／ＴｆＲ  ＤＶＤの濃度を判定し、１グラムあたりの組織に注入された用量の割合（％ＩＤ／ｇ）を計算した。別の分量の標本／試料を免疫組織化学的に分析して、脳内の標的／ＴｆＲ  ＤＶＤ−Ｉｇの局在化が判定された。ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）設計が、標的／ＴｆＲ  ＤＶＤを再設計かつ発現し、上述（例えば、インビトロ活性およびインビボ生体内分布／脳透過性）のアッセイおよび方法を用いて分析することにより最適化され得るように、副作用の兆候、準最適な取り込み、または標的効力におけるデータが分析された。
【０３００】
次いで、試験および／または最適化された標的／ＴｆＲ  ＤＶＤ  Ｉｇが、大規模に発現された。インビトロ品質管理（ＱＣ）方法および条件は、有効性研究に使用された材料において行われた。次いで、得られたＤＶＤは、２４〜９６時間の期間にわたって、複数回投与の薬物動態（ＰＫ）研究において使用された。
【０３０１】
図５は、例示的なＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質を示す。ＤＶＤ免疫グロブリンは、ＢＢＢ抗原（抗ＢＢＢ抗原）に特異的に結合する少なくとも１つの重鎖可変ドメインと、標的Ｘに特異的に結合する少なくとも１つの重鎖可変ドメインとを含む。いかなる特定の理論または作用機序に拘束されることを望むものではないが、これらの方法により操作および分析されたＤＶＤ−ＩｇがＢＢＢを効率的に透過し、脳上または脳内の標的に結合することがここで想定される。
【０３０２】
実施例９：ＤＶＤ−Ｉｇのインビボ組織分布分析
図６に示されるように、抗体またはＤＶＤ−Ｉｇにおけるインビボ組織分布の分析が行われた。０日目に、ネズミ対象に、５〜５０ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）のＤＶＤ−Ｉｇ（商標）、または対照ヒトＩｇＧ１ｋ抗体を静脈内注入または腹腔内注入した。ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）は、ＢＢＢ抗原に特異的な結合領域および標的に特異的な結合領域を含んだ。対象に、０時間、１時間、２４時間、または９６時間で注入した。対象は、ケタミンおよびキシラジンの混合物を用いて指示された時間に殺処分した。
【０３０３】
各対象からの血清を採取し、ＭＳＤ−ＥＳＬアッセイを用いて、対照抗体またはＤＶＤ−Ｉｇ（商標）の濃度について分析した。アッセイは、ヒトＩｇＧ１ｋ抗体およびＤＶＤ  Ｉｇの両方に特異的に結合したロバ抗ヒトＩｇＧのＦ（ａｂ’）２断片でコーティングしたプレートを使用した。次いで、プレートをｓｕｌｆｏ検出タグを有する完全長抗ヒトＩｇと接触させ、抗体の存在を検出した。
【０３０４】
血清収集後、対象を、２ｍｌ／分の速度で１０分間Ｄ−ＰＢＳで潅流した。脳を採取し、垂直に分割し／均等に２分割した（等分量の大脳、視神経、下垂体、小脳、および脊髄を含む）。脳の１／２を均質化し、ＭＳＤ−ＥＣＬアッセイを用いて分析した。脳のもう一方の１／２を免疫組織化学的方法により分析した。
【０３０５】
免疫組織化学的分析については、組織をパラホルムアルデヒドで処理し、次いで、パラフィン包理した。包理した材料は、ビオチン化したロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を用いて、抗ヒトＩｇＧの検出のために染色した。次いで、この材料をビオチン、ストレプトアビジン、およびジアミノベンジジン（ＤＡＢ）と接触させた。
【０３０６】
ＭＳＤ−ＥＣＬアッセイからのデータを使用して、血清中ならびに脳の異なる組織／細胞、例えば、血管、実質、および神経中のＤＶＤ−Ｉｇの存在を特定した。ＤＶＤ−Ｉｇにおけるデータを、対照ヒトＩｇＧ１ｋ抗体を投与した対象から得られたデータと比較した。
【０３０７】
実施例１０：抗マウスＴｆＲ（ＡＢ２２１）抗体およびヒト化変異体の分析
本明細書の実施例は、抗体ＡＢ２２１（ネズミＴｆＲを特異的に認識するＩｇＧ２ａ抗体）およびヒト化変異体の結合およびＢＢＢ透過性の特徴を分析した（表１２）。ＴｆＲ抗体ＡＢ２２１およびそのヒト化変異体の存在は、図６に記載されるアッセイおよび方法を用いて分析された。データは、ヒトアイソタイプＩｇＧ１対照と比較して、血清および脳内のＴｆＲ抗体ＡＢ２２１およびそのヒト化変異体のより高い存在を示す。免疫組織化学的染色は、対照アイソタイプヒトＩｇＧ１対照と比較して、小脳における血管およびプルキンエ細胞中のＡＢ２２１抗マウスＴｆＲ抗体に対してより多くの染色を示した（図２）。
【０３０８】
【表１１】
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【０３０９】
いかなる特定の理論または作用機序に拘束されることを望むものではないが、低親和性ＴｆＲ抗体が、同じＤＶＤ−Ｉｇの外側の配置で高親和性ＴｆＲ抗体よりもＢＢＢをより効率的に透過することがここで想定される。あるいは、ＤＶＤ−ＩＧの内側の配置で高親和性ＴｆＲ抗体（結合アッセイまたは同様の方法により決定される）が、同じＤＶＤ−Ｉｇの内側の配置で低親和性ＴｆＲ抗体よりもＢＢＢをより効率的に透過することもここで想定される。
【０３１０】
実施例１１：治療投与後、２つの直交法（ＩＨＣおよびＭＳＤ−ＥＣＬ）ならびにＢＢＢを横断して輸送する能力により検出されたＤＶＤ−Ｉｇの上昇レベル
直交法（ＭＳＤ−ＥＣＬアッセイおよびＩＨＣ染色）は、本明細書の実施例において使用され、ＴｆＲに結合する一部分を有するＤＶＤ−Ｉｇが、ＢＢＢを効率的に横断し、脳、例えば、神経細胞および実質に局在化されたかどうか判定した（表１３）。
【０３１１】
【表１２】
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【０３１２】
半最大阻害濃度（ＩＣ５０）は、生物学的または生化学的機能の阻害における化合物の有効性の尺度である。ＴｆＲに特異的に結合した一部分を含むＤＶＤ−Ｉｇが、対照ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）よりも脳内においてＴｆＲをより有効的に阻害し、より高濃度で存在したことが観察された（表１３）。ＭＳＤ−ＥＣＬおよび免疫組織化学的データは、ＤＶＤ−Ｉｇが、治療投与後、ＢＢＢを横断して有効に輸送されたことを示す。図３は、ＤＶＤ−Ｉｇが対照（非ＴｆＲ）ＤＶＤ−Ｉｇを投与された対象よりも脳の実質組織および神経細胞においてより局在化されたことを示す例示的な顕微鏡写真である。
【０３１３】
実施例１２：ＴＮＦ／ＴｆＲ  ＤＶＤ−Ｉｇの選択
表１４は、ＴＮＦ／ＴｆＲ  ＤＶＤ−Ｉｇの一覧表を含む。その後の疼痛の有効性の分析におけるＤＶＤの選択基準は、実施例１０中のデータに基づいて、ＤＶＤ−Ｉｇの外側の配置において低親和性ＴｆＲ抗体がＢＢＢをより効率的に透過する場合の、低ＴｆＲ結合親和性を示すデータを含んだ。ＤＶＤは、血清および脳内の最大濃度、ＢＢＢを通過する透過、最大抗ＴＮＦ効力に基づいてさらに選択された。
【０３１４】
データは、ＴＮＦ抗体８Ｃ１１が強力に結合し、ＴＮＦを阻害したことを示す。抗ＴＮＦ抗体８Ｃ１１は、以下の結合ＶＨおよびＶＬ領域を有する：
＞ＶＨ（配列番号１６２）
ＥＦＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＲＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＤＹＮＭＮＷＶＫＱＳＮＧＫＳＬＥＷＶＧＶＩＮＰＮＹＧＳＳＴＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＱＳＳＳＴＡＹＭＱＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＫＷＧＱＬＧＲＧＦＦＤＶＷＧＴＧＴＴＶＴＶＳＳ
＞ＶＬ（配列番号１６３）
ＱＩＶＬＳＱＳＰＡＩＬＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＨＷＦＱＱＫＰＧＳＳＰＫＰＷＩＹＡＴＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＳＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲ
【０３１５】
【表１３】
2016501881.tif 000028
【０３１６】
モノクローナル抗体ＡＢ２２１を、本明細書中の実施例において使用し、この抗体を用いたデータは、抗体８Ｃ１１を用いたデータと比較した。抗体８Ｃ１１の６つのＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２、および−Ｌ３ならびに重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、−Ｈ２、および−Ｈ３は、上の配列番号１６２〜１６３の強調表示／太字部分である。重鎖のＣＤＲは、ＤＹＮＭＮ（配列番号１６４）、ＶＩＮＰＮＹＧＳＳＴＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１６５）、およびＫＷＧＱＬＧＲＧＦＦＤ（配列番号１６６）である。軽鎖のＣＤＲは、ＲＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号１６７）、ＡＴＳＮＬＡＳ（配列番号１６８）、およびＱＱＷＳＳＳＰＬＴ（配列番号１６９）である。
【０３１７】
実施例１３：選択されたＤＶＤ−Ｉｇの脳内濃度および配置分析
抗体ＡＢ２２１またはヒト化変異体ＡＢ４０５を有する一部分を有するＤＶＤ−Ｉｇが構築され、本明細書中の実施例において分析された。また、対照ＤＶＤ−Ｉｇも分析された。
【０３１８】
８Ｃ１１−ｈＦｃのＤＶＤ−Ｉｇは、ＴＮＦに特異的に結合する８Ｃ１１抗体およびヒト免疫グロブリンＧのＦｃ部分に結合する抗体（ｈＦｃ）を含んだ。ＴＮＦ−ＧＳ−ＡＢ２２１のＤＶＤ−Ｉｇは、ＴＮＦに結合する抗体、ＧＳリンカー、およびネズミＴｆＲを特異的に認識するモノクローナル抗体ＡＢ２２１（ＩｇＧ２ａ）を含んだ。ＴｆＲ（ＡＢ４０５）−ＳＬ−ＴＮＦのＤＶＤ−Ｉｇは、ＡＢ４０５（ＡＢ２２１抗体のヒト化変異体）、ＳＬリンカー、およびＴＮＦに結合する抗体を含んだ。例示的な組織染色データを図７に示す。表１５は、ＴｆＲ（ＡＢ４０５）−ＳＬ−ＴＮＦのＤＶＤ−Ｉｇ、ＴＮＦ−ＧＳ−ＡＢ２２１のＤＶＤ、８Ｃ１１−ｈＦｃのＤＶＤ−Ｉｇ、ヒトＩｇＧ、またはＤＶＤ対照を投与した対象における脳内の濃度および局在データを示す。
【０３１９】
【表１４】
2016501881.tif 000029
【０３２０】
実施例１４：ＢＢＢを横断し、疼痛を有効に軽減したＴＮＦ／ＴｆＲのＤＶＤ−Ｉｇの髄腔内投与
本明細書中の実施例は、疼痛有効性モデルにおけるＴＮＦ／ＴｆＲのＤＶＤ−Ｉｇの髄腔内投与の有効性を分析した。部分的神経損傷、例えば、坐骨神経の片側の緩い結紮または慢性収縮性損傷（ＣＣＩ）は、同側下肢を持続的に固定する動物をもたらす。結紮の堅さに応じて、異痛および痛覚過敏は、数時間または数日間持続し得る。知られているように、Ｂｅｎｎｅｔｔモデルは、神経損傷を誘発するための手術を伴い、よく知られている薬物動態（ＰＫ）および疼痛有効性モデルである。
【０３２１】
ＢＡＬＢ／ｃネズミ対象は、Ｂｅｎｎｅｔｔ手術を受け、マウスＦｃに特異的な対照ＩｇＧ（１注入につき４８μｇ／１０μｌの投与）、８Ｃ１１−ＧＳ−ＡＢ２２１のＤＶＤ−Ｉｇ（抗ＴＮＦａ／抗ＴｆＲ、１注入につき５５μｇ／１０μｌの投与）、またはモルヒネ（１注入につき１０μｇ／１０μｌの投与）のいずれかを用いて、毎日髄腔内に注入した。対象に毎日注入した。機械的異痛は、上のＢｅｎｎｅｔｔモデルにおいて、１日目および５日目にて１２０分間の注入投与後に評価された（図８）。
【０３２２】
Ｂｅｎｎｅｔｔモデルにおける８Ｃ１１−ＧＳ−ＡＢ２２１のＤＶＤ−Ｉｇ（抗ＴＮＦａ／抗ＴｆＲ）の髄腔内注入は、対象において、対照ＩｇＧの髄腔内注入よりもさらに疼痛を軽減したことが観察された。８Ｃ１１−ＧＳ−ＡＢ２２１のＤＶＤ−Ｉｇを髄腔内注入した対象におけるデータは、モルヒネを髄腔内注入した対象において観察されたデータと比較された。データは、１７ｎＭの８Ｃ１１−ＧＳ−ＡＢ２２１のＤＶＤ−Ｉｇが脳内に検出され、５２ｎＭの８Ｃ１１−ＧＳ−ＡＢ２２１のＤＶＤ−Ｉｇが脊髄中に検出されたことを示す。静脈内注入後、脳内に存在する８Ｃ１１−ＧＳ−ＡＢ２２１のＤＶＤ−Ｉｇの量は、同様であることが観察され（１６ｎＭ、表１５）、これは、効率的な量が２０ｍｐＫの静脈内注入により脳内に得られたことを示す。
【０３２３】
実施例１５：ＴＮＦ／ＴｆＲのＤＶＤ−Ｉｇの静脈内投与は、ＢＢＢを横断し、疼痛を軽減するのに有効であった
本明細書中の実施例は、上述のＢｅｎｎｅｔｔ  ＰＫ／疼痛有効性モデルにおけるＴＮＦ／ＴｆＲのＤＶＤ−Ｉｇの静脈内投与の有効性を分析した。
【０３２４】
ＢＡＬＢ／ｃネズミ対象は、Ｂｅｎｎｅｔｔ手術を受け、マウスＦｃに特異的な対照ＩｇＧ（１注入につき４８μｇ／１０μｌの投与）、８Ｃ１１−ＧＳ−ＡＢ２２１のＤＶＤ（抗ＴＮＦａ／抗ＴｆＲ、１注入につき５５μｇ／１０μｌの投与）、またはガバペンチンの緊急手術後投与（１注入につき１０μｇ／１０μｌの投与）を静脈内注入した。対象に毎日注入した（２０ｍｇ／ｋｇ）。機械的異痛は、上のＢｅｎｎｅｔｔモデルにおいて、１日目および５日目にて１２０分間の注入投与後に評価された。
【０３２５】
データは、８Ｃ１１−ＧＳ−ＡＢ２２１のＤＶＤ−Ｉｇ（抗ＴＮＦａ／抗ＴｆＲ）の静脈内注入が、Ｂｅｎｎｅｔｔモデルの対象において、対照ＩｇＧの静脈内注入よりも疼痛を軽減したことを示す（図９）。最も重要なことには、８Ｃ１１−ＧＳ−ＡＢ２２１のＤＶＤ−Ｉｇの静脈内注入に対するデータは、ガバペンチンの緊急投与の静脈内注入で疼痛の軽減を得る際にわずかに有効であった。本明細書中のデータは、髄腔内投与または静脈内投与のいずれかによる８Ｃ１１−ＧＳ−ＡＢ２２１のＤＶＤ−Ｉｇの投与は、疼痛を軽減するのに有効であったことを示す。
【０３２６】
実施例１６：多発性硬化症モデルにおけるＲＧＭＡ−ＴｆＲのＤＶＤ−Ｉｇ
多くの神経変性疾患の初期段階は、神経突起の損傷により特徴付けられ、シナプス機能に障害がおきる。神経突起の変性は、しばしば、神経細胞死をもたらし、罹患した神経においてシグナル伝導を損ない、感覚、動作、認識、または神経が関連する他の機能において機能障害を引き起こす。神経突起の変性はまた、自己免疫疾患の多発性硬化症（ＭＳ）の病理学的指標でもある。
【０３２７】
反発性誘導分子Ａ（ＲＧＭＡ）は、網膜軸索における誘導分子である。誘発した脊髄損傷後、ＲＧＭＡは、病変周辺の瘢痕組織中で蓄積し、ＲＧＭＡの存在は、軸索成長の阻害剤であり得る。
【０３２８】
表１４は、ＭＳのモデルにおける適合性について分析されたＲＧＭＡ−ＴｆｒのＤＶＤ−Ｉｇを列記する。ＤＶＤ−ＩＧは、外側の配置（Ｎ末端）または内側の配置（Ｃ末端）で抗ＢＢＢ抗原部分または抗標的部分を有するように操作された。本明細書中の実施例は、抗ＢＢＢの上皮抗原部分の配置に応じて、低親和性抗体（外側の配置）または高親和性抗体（内側の配置）のいずれかを選択し得ることを示す。この実施例が外側の配置で抗ＢＢＢ抗原抗体を使用したため、ＭＳの有効性モデルで用いるＤＶＤ−Ｉｇの選択基準は、低ＴｆＲ結合親和性、最高の抗ＲＧＭＡ効力、最高の血清および脳内濃度、ならびに最大のＢＢＢ透過性であった。したがって、ＴｆＲ（ＡＢ４０５）−ＳＬ−ＲＧＭＡ（ＡＥ１２−１）のＤＶＤ−ＩｇおよびＴｆＲ（ＡＢ４０５）−ＬＳ−ＲＧＭＡ（ＡＥ１２−１）のＤＶＤ−Ｉｇが選択され、本明細書に記載されるＭＳモデルにおいて、より大規模に発現し、有効性について分析された。あるいは、内側の配置で抗ＢＢＢ抗原抗体を用いて、高ＴｆＲ結合親和性、最高の抗ＲＧＭＡ効力、最高の血清および脳内濃度、および最大のＢＢＢ透過性を有するＤＶＤ−Ｉｇを選択し得る。
【０３２９】
ＲＧＭＡ−ＪＬ３−ＶＨ（ＡＥ１２−１）（配列番号１７０）は、
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＨＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＤＷＭＧＷＩＳＰＹＳＧＮＴＮＹＡＱＫＬＱＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＧＳＧＰＹＹＹＭＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳである。
【０３３０】
ＲＧＭＡ−ＪＬ３−ＶＬ（ＡＥ１２−１））（配列番号１７１）は、
ＱＳＡＬＴＱＰＲＳＶＳＧＳＰＧＱＳＶＴＩＳＣＴＧＴＳＳＳＶＧＤＳＩＹＶＳＷＹＱＱＨＰＧＫＡＰＫＬＭＬＹＤＶＴＫＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＣＳＹＡＧＴＤＴＬＦＧＧＧＴＫＶＴＶＬＧである。
【０３３１】
６つのＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２、および−Ｌ３ならびに重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、−Ｈ２、および−Ｈ３は、上の配列番号１７０〜１７１の強調表示／太字部分である。重鎖のＣＤＲは、ＳＨＧＩＳ（配列番号１７２）、ＷＩＳＰＹＳＧＮＴＮＹＡＱＫＬＱ（配列番号１７３）、およびＶＧＳＧＰＹＹＹＭＤＶ（配列番号１７４）である。軽鎖のＣＤＲは、ＴＧＴＳＳＳＶＧＤＳＩＹＶＳ（配列番号１７５）、ＤＶＴＫＲＰＳ（配列番号１７６）、およびＣＳＹＡＧＴＤＴＬ（配列番号１７７）である。２０１０年３月２５日に公開された米国特許公開第２０１０／００７４９００号および２０１３年８月１日に公開された国際公開第ＷＯ／２０１３／１１２９２２号を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０３３２】
図１０は、２４時間にて４０ｍｐｋのＲＧＭＡ（ＡＥ１２−１）−ｈＦｃ、３０ｍｐｋのヒトＩｇＧ対照、２０ｍｐｋのＲＧＭＡ（ＡＥ１２−１）−ＧＳ−ＡＢ４０３のＤＶＤ−Ｉｇ、または３０ｍｐｋのＲＧＭＡ（ＡＥ１２−１）−ＧＳ−ＡＢ４０３のＤＶＤ−Ｉｇのいずれかを投与した対象からの染色下脳細胞の例示的な顕微鏡写真である。データは、ＲＧＭＡ（ＡＥ１２−１）−ＧＳ−ＡＢ４０３のＤＶＤ−Ｉｇと接触した対象からの脳組織の有効な染色を示し、これは、ＤＶＤ−ＩｇがＢＢＢを効率的に横断し、脳内の神経細胞／組織においてＲＧＭＡに結合したことを示す。
【０３３３】
実施例１７：アミロイド−ベータ／ＴｆＲのＤＶＤ−Ｉｇの透過性および分析
バピネオズマブは、神経毒性アミロイド−ベータペプチドを標的とするヒト化モノクローナル抗体（Ｍａｂ）である。アミロイド−ベータ（Ａβ）は、アルツハイマー病および他の神経変性の病変の早期バイオマーカーである。ネズミ抗体３Ｄ６は、ヒト化モノクローナル抗体であるバピネオズマブの親である。
【０３３４】
Ａβに特異的に結合する一部分、およびＴｆＲに結合する別の部分を含んだＤＶＤ−Ｉｇが、設計かつ構築された。Ａβに結合するＤＶＤ  Ｉｇおよび構成要素の例を表２〜４に示す。表１６は、ＴｆＲおよびＡβへの結合、血清および脳内の濃度、ならびに実質および神経におけるＩＨＣ染色についてのアッセイおよびモデル系において操作され、分析されたＡβ／ＴｆＲのＤＶＤ−Ｉｇの一覧表を示す。
【０３３５】
８週齢のＣ５７ＢＩ／６Ｎ雌ネズミ対象に、２０ｍｐｋのＤＶＤ−Ｉｇを静脈内投与した。ＡＢ４０５−ＳＬ−Ａβ（３Ｄ６）のＤＶＤ−Ｉｇ、Ａβ（３Ｄ６）−ＧＳ−ＡＢ４０３のＤＶＤ−Ｉｇ、およびＡβ（３Ｄ６）−ＳＳ−ＡＢ４０２のＤＶＤ−Ｉｇ  ２３５９はそれぞれ、ＴｆＲに再度高効力を有し、対照ＩｇＧを投与した対象よりも脳組織中でより多くの量で存在／局在したことが観察された。
【０３３６】
【表１５】
2016501881.tif 000030
【０３３７】
実施例１８：血清および脳内のＴＮＦ／ＴｆＲのＤＶＤ−Ｉｇ濃度および局在
本明細書中の実施例は、上述のＰＫ研究において、対象に投与したＴｆＲ（ＡＢ４０５）−ＳＬ−ＴＮＦのＤＶＤ−Ｉｇの濃度および局在を分析した。対象に、皮下（ＳＣ）、静脈内（ＩＶ）、または腹腔内（ＩＰ）のいずれかに異なる投与（２０〜４０ｍｐｋの単回または複数回投与）でＴｆＲ（ＡＢ４０５）−ＳＬ−ＴＮＦのＤＶＤ−Ｉｇを投与した。
【０３３８】
表１７中のデータは、静脈内および腹腔内の投与経路を用いて、ＴｆＲ（ＡＢ４０５）−ＳＬ−ＴＮＦのＤＶＤ−Ｉｇに匹敵する血清および脳内濃度を示す。
【０３３９】
【表１６】
2016501881.tif 000031
【０３４０】
実施例１９：血清および脳内のＴｆＲ／ＲＧＭＡのＤＶＤ−Ｉｇ濃度および局在
本明細書中の実施例は、上述のＰＫ研究において、雄ＢＡＬＢ／ｃネズミ対象に投与したＡＢ４０５−ＳＬ−ＲＧＭＡ  ＤＶＤ−Ｉｇの濃度および局在を分析した。対象に、皮下（ＳＣ）、静脈内（ＩＶ）、または腹腔内（ＩＰ）のいずれかに異なる投与（２０〜４０ｍｐｋの単回または複数回投与）でＡＢ４０５−ＳＬ−ＲＧＭＡのＤＶＤ−Ｉｇを投与した。表１８は、ＡＢ４０５−ＳＬ−ＲＧＭＡのＤＶＤ−Ｉｇを投与した対象における血清および脳内の濃度および局在データを示す。
【０３４１】
【表１７】
2016501881.tif 000032
【０３４２】
いかなる特定の理論または作用機序に拘束されることを望むものではないが、実施例において本明細書に記載されるＤＶＤ−Ｉｇが単回全身注入（２０ｍｐｋ、静脈内）から２時間後、実質および神経細胞中のＩＨＣ染色により検出されたことがここで想定される。脳への取り込みの増加が、注入から２４時間後に観察された。さらに、ＤＶＤ−Ｉｇは、５０ｍｐｋの単回静脈内注入後、少なくとも約９６時間脳内に保持された。ＤＶＤ−Ｉｇは、複数回の注入、例えば、２回の２０ｍｐｋの静脈内注入を用いることにより脳内に蓄積された。実際に、同様の脳への取り込みデータがいずれかの静脈内で観察された。
【０３４３】
参照による組み込み
本出願全体にわたって引用され得るすべての引用された参照（文献参照、特許、特許出願、およびウェブサイトを含む）の内容は、その中に引用された参照と同じように、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に明白に組み込まれる。本開示は、特に指定されない限り、当該技術においてよく知られている免疫学、分子生物学、および細胞生物学の従来の技術を採用する。
【０３４４】
本開示はまた、分子生物学および薬物送達の分野でよく知られている技法を参照によりそれらの全体を組み込んでいる。これらの技法は、以下の出版物：
Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）、
Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，ＳＨＯＲＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（４ｔｈ  Ｅｄ．１９９９）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ．（ＩＳＢＮ  ０−４７１−３２９３８−Ｘ）、
Ｂｅｒｇｍａｎ  Ｉ，Ｂｕｒｃｋａｒｔ  ＧＪ，Ｐｏｈｌ  ＣＲ，Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎａｎ  Ｒ，Ｂａｒｍａｄａ  ＭＡ，Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＪＡ，Ｃｈｅｕｎｇ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ＩｇＧ  ａｎｄ  ＩｇＭ  ａｎｔｉ−ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｋｅｙｓ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．１９９８  Ｊａｎ；２８４（１）：１１１−５、
Ｂｒａｅｎ  ＡＰ，Ｐｅｒｒｏｎ  Ｊ，Ｔｅｌｌｉｅｒ  Ｐ，Ｃａｔａｌａ  ＡＲ，Ｋｏｌａｉｔｉｓ  Ｇ，Ｇｅｎｇ  Ｗ．Ａ  ４−ｗｅｅｋ  ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｗｉｔｈ  ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｉｎ  ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．２０１０  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；２９（３）：２５９−６７、
ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ  ＤＲＵＧ  ＢＩＯＡＶＡＩＬＡＢＩＬＩＴＹ，  ＤＲＵＧ  ＰＲＯＤＵＣＴ  ＤＥＳＩＧＮ  ＡＮＤ  ＰＥＲＦＯＲＭＡＮＣＥ，Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）、
Ｇａｒｇ  Ａ，Ｂａｌｔｈａｓａｒ  ＪＰ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ＦｃＲｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩｇＧ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ．ＡＡＰＳ  Ｊ．２００９  Ｓｅｐ；１１（３）：５５３−７、
Ｇｉｅｇｅ，Ｒ．ａｎｄ  Ｄｕｃｒｕｉｘ，Ａ．Ｂａｒｒｅｔｔ，ＣＲＹＳＴＡＬＬＩＺＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＡＮＤ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，  ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，２ｎｄ  ｅａ．，ｐｐ．２０  １−１６，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９９）、
Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ  ＭＥＤＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ  ＲＥＬＥＡＳＥ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）、
Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  Ｔ−ＣＥＬＬ  ＨＹＢＲＩＤＯＭＡＳ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１、
Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）、
Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７）ａｎｄ（１９９１）、
Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２、
Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ  ｅｄｓ．，ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  （２００１）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．７９０  ｐｐ．（ＩＳＢＮ  ３−５４０−４１３５４−５）。
Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）、
Ｌｅｖｉｔｅｓ  Ｙ，Ｓｍｉｔｈｓｏｎ  ＬＡ，Ｐｒｉｃｅ  ＲＷ，Ｄａｋｉｎ  ＲＳ，Ｙｕａｎ  Ｂ，Ｓｉｅｒｋｓ  ＭＲ，Ｋｉｍ  Ｊ，ＭｃＧｏｗａｎ  Ｅ，Ｒｅｅｄ  ＤＫ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｒｙ  ＴＬ，Ｄａｓ  Ｐ，Ｇｏｌｄｅ  ＴＥ．Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−Ａｂｅｔａ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２００６  Ｄｅｃ；２０（１４）：２５７６−８．Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｏｃｔ  ２６、
Ｌｕ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｄｓ．，ＣＬＯＮＩＮＧ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＶＥＣＴＯＲＳ  ＦＯＲ  ＧＥＮＥ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ（２００１）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｐｒｅｓｓ．Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ．２９８  ｐｐ．（ＩＳＢＮ  １−８８１２９９−２１−Ｘ）。
ＭＥＤＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ  ＲＥＬＥＡＳＥ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）、
Ｏｌｄ，Ｒ．Ｗ．＆  Ｓ．Ｂ．Ｐｒｉｍｒｏｓｅ，ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＯＦ  ＧＥＮＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ：ＡＮ  ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＴＯ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（３ｄ  Ｅｄ．１９８５）Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｏｓｔｏｎ．Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；Ｖ．２：４０９  ｐｐ．（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０１３１８−４）。
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（２ｄ  Ｅｄ．１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ．Ｖｏｌｓ．１−３．（ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６）。
Ｓｈｅｎ  ＤＤ，Ａｒｔｒｕ  ＡＡ，Ａｄｋｉｓｏｎ  ＫＫ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ＣＳＦ  ｓａｍｐｌｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ＣＮＳ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２００４  Ｏｃｔ  １４；５６（１２）：１８２５−５７。
ＳＵＳＴＡＩＮＥＤ  ＡＮＤ  ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ  ＲＥＬＥＡＳＥ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８
Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．Ｌ．ＦＲＯＭ  ＧＥＮＥＳ  ＴＯ  ＣＬＯＮＥＳ：ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＴＯ  ＧＥＮＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（１９８７）ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ（ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｂｙ  Ｈｏｒｓｔ  Ｉｂｅｌｇａｕｆｔｓ）．６３４  ｐｐ．（ＩＳＢＮ  ０−８９５７３−６１４−４）、に記載される技法を含むが、これらに限定されない。
【０３４５】
均等物
本開示は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の具体的な形態において具現化され得る。したがって、前述の実施形態は、本開示を限定するというよりはむしろ、すべての点おいて例示していると考えるべきである。本開示の範囲は、前述の記載によるというよりはむしろ、添付される特許請求の範囲により示され、したがって、特許請求の範囲の意味および均等の範囲内にあるすべての変更は本明細書に包含されることが意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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