(57)【要約】  本明細書には、標的抗体またはその所望のフラグメントから抗体フラグメント不純物を分離する方法が記載されている。【選択図】図１Ａ−Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントから抗体フラグメント化産物不純物を分離する方法であって、
ａ）前記標的抗体または所望の抗原結合性フラグメントと、抗体フラグメント化産物不純物と、負荷緩衝液と、を含む出発材料を提供する工程と、
ｂ）前記出発材料を混合モードクロマトグラフィーカラムに負荷する工程と、
ｃ）前記材料をカラムに通して貫流させる工程であって、前記抗体フラグメント化産物不純物の少なくとも一部が混合モードクロマトグラフィー樹脂の固定相に吸着され、かつ前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントの少なくとも一部が１つ以上の溶出液画分で前記カラムから溶出される、工程と、
ｄ）１つ以上の溶出液画分を回収する工程であって、１つ以上の溶出液画分が前記出発材料と比較して前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントで富化されている、工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントを含む組成物中の抗体フラグメント化産物不純物を減少させる方法であって、
前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントと、抗体フラグメント化産物不純物と、負荷緩衝液と、を含む出発材料を提供する工程と、
ａ）前記出発材料を混合モードクロマトグラフィーカラムに負荷する工程と、
ｂ）前記材料をカラムに通して貫流させる工程であって、前記抗体フラグメント化産物不純物の少なくとも一部が混合モードクロマトグラフィー樹脂の固定相に吸着され、かつ前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントの少なくとも一部が１つ以上の溶出液画分で前記カラムから溶出される、工程と、
ｃ）１つ以上の溶出液画分を回収する工程であって、１つ以上の溶出液画分が前記出発材料と比較して前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントで富化されている、工程と、
ｄ）前記回収された標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントを含む組成物を調製する工程と、
を含む、方法。
【請求項３】
前記混合モードクロマトグラフィーカラムが、陰イオン交換（ＡＥＸ）、陽イオン交換（ＣＥＸ）、疎水性相互作用（ＨＩＣ）、親水性相互作用、水素結合、π−π結合、および金属親和性から選択される１つ以上の分離機構を利用する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記混合モードクロマトグラフィーカラムがＡＥＸ相互作用とＨＩＣ相互作用との組合せを利用する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記混合モードクロマトグラフィーカラムがＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）混合モードクロマトグラフィーカラムを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記出発材料が約８８％〜約９８％の標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記出発材料が約９８％までの標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
１つ以上の溶出液画分が約９８％〜９９．９％の標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
１つ以上の溶出液画分が少なくとも約９８％の標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
１つ以上の溶出液画分が前記出発材料よりも約１％〜約１０％多い標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
１つ以上の溶出液画分が前記出発材料よりも約１％〜約３％多い標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記出発材料が約１％〜約１０％の抗体フラグメント化産物不純物を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記出発材料が約１％〜約３％の抗体フラグメント化産物不純物を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
１つ以上の溶出液画分が約３％未満の抗体フラグメント化産物不純物を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
１つ以上の溶出液画分が約２％未満の抗体フラグメント化産物不純物を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
１つ以上の溶出液画分が約１％未満の抗体フラグメント化産物不純物を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記出発材料のｐＨが約５〜約８である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記出発材料のｐＨが約５．５〜約６．５である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記出発材料のｐＨが約５．７〜約６．０である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記出発材料が約０ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記出発材料が約１０ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記出発材料が約７ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記出発材料が約７５ｇ／Ｌ〜約２５０ｇ／Ｌの負荷容量を有する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記出発材料が約７５ｇ／Ｌ〜約１２５ｇ／Ｌの負荷容量を有する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体フラグメント化産物不純物がペプチド切断フラグメントを含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体フラグメント化産物不純物が、重鎖フラグメント化産物、ヒンジ領域フラグメント化産物、軽鎖フラグメント化産物、およびそれらの組合せから選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体フラグメント化産物不純物が抗体還元フラグメントを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体フラグメント化産物不純物が、重鎖−重鎖−軽鎖、重鎖−軽鎖、軽鎖−軽鎖、重鎖−重鎖、重鎖、および軽鎖から選択されるＩｇＧフラグメントである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントが、配列番号２を含むアミノ酸配列を有する軽鎖配列を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントが、配列番号１を含むアミノ酸配列を有する重鎖アミノ酸配列を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントが、配列番号２を含むアミノ酸配列を有する軽鎖配列と、配列番号１を含むアミノ酸配列を有する重鎖アミノ酸配列と、を含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントが、配列番号２に示される軽鎖アミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、およびそれらの組合せから選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントが、配列番号１に示される重鎖アミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、およびそれらの組合せから選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントが、配列番号２に示される軽鎖アミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、およびそれらの組合せから選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列と、配列番号１に示される重鎖アミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、およびそれらの組合せから選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列と、を含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記負荷緩衝液が約１０ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記負荷緩衝液が約４ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記負荷緩衝液が、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸ナトリウム、ヒスチジン、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、およびそれらの組合せから選択される、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記負荷緩衝液が、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、およびそれらの組合せから選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記負荷緩衝液が約１ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度を有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
標的抗体または所望の抗原結合性フラグメントを含む組成物であって、少なくとも約９９％の標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントと、約２％未満の抗体フラグメント化産物不純物と、を含む、組成物。
【請求項４１】
前記組成物が、少なくとも約９９％の標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントと、１％以下の抗体フラグメント化結合性産物と、を含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記組成物が、少なくとも約９９．５％の標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントと、約０．５％以下の抗体フラグメント化結合性産物と、を含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４３】
前記組成物が約３％以下の凝集体を含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４４】
前記組成物が約２．５％以下の凝集体を含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４５】
前記抗体フラグメント化産物不純物がペプチド切断フラグメントを含む、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記抗体フラグメント化産物不純物が、重鎖フラグメント化産物、ヒンジ領域フラグメント化産物、軽鎖フラグメント化産物、およびそれらの組合せから選択される、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記抗体フラグメント化産物不純物が抗体還元フラグメントを含む、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
前記抗体フラグメント化産物不純物が、重鎖−重鎖−軽鎖、重鎖−軽鎖、軽鎖−軽鎖、重鎖−重鎖、重鎖、および軽鎖から選択されるＩｇＧフラグメントである、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントが、配列番号２を含むアミノ酸配列を有する軽鎖配列を含む、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントが、配列番号１を含むアミノ酸配列を有する重鎖アミノ酸配列を含む、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５１】
前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントが、配列番号２を含むアミノ酸配列を有する軽鎖配列と、配列番号１を含むアミノ酸配列を有する重鎖アミノ酸配列と、を含む、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５２】
前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントが、配列番号２に示される軽鎖アミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、およびそれらの組合せから選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５３】
前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントが、配列番号１に示される重鎖アミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、およびそれらの組合せから選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５４】
前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントが、配列番号２に示される軽鎖アミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、およびそれらの組合せから選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列と、配列番号１に示される重鎖アミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、およびそれらの組合せから選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列と、を含む、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．緒言
１．１．配列リストの参照
本出願には、２０１４年１０月２１日に作成された４キロバイトのサイズを有するテキストファイルＩＦＮＡＲ−４５０ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔとして本出願と共に提出された配列リストが参照により組み込まれる。
【０００２】
１．２．発明の分野
本発明は、組換え産生タンパク質の精製に関する。より特定の実施形態では、本発明は、標的抗体またはその所望のフラグメントから抗体フラグメント不純物を分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
１．３．発明の背景
抗体などの組換え産生ポリペプチドは、広範にわたる診断用途および治療用途に使用される。抗体などの組換えポリペプチドの製造プロセスは、一般に、宿主細胞でのポリペプチドの発現（「上流処理」としても知られる）と、ポリペプチドの精製（「下流処理」としても知られる）と、を含む。
【０００４】
発現は、一般に、宿主細胞が抗体を産生するのに適した条件下で原核宿主細胞または真核宿主細胞を培養することを必要とする。抗体療法の需要の増加は、力価を絶えず増加させて効率的な上流プロセスを開発する原動力となってきた。その結果、細胞培養時に１０ｇ／Ｌの力価が得られている。
【０００５】
組換え抗体が発現された後、「細胞回収」として参照されるプロセスで細胞培養培地から無傷宿主細胞および細胞デブリが分離される。たとえば、遠心分離または濾過により細胞培養培地から宿主細胞を分離して、標的抗体と他の不純物とを含む清澄流体（これは「細胞培養上清」として参照されうる）を提供することが可能である。清澄細胞培養上清に見いだされうる不純物の例としては、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、核酸、内毒素、ウイルス、タンパク質変異体、タンパク質凝集体、および抗体フラグメント不純物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０００６】
精製とは、清澄細胞培養上清から不純物を除去することを意味し、典型的には、１つ以上のクロマトグラフィー工程を含む。典型的なプロセスは、キャプチャー工程と、中間精製工程または中間ポリッシング工程と、最終ポリッシング工程と、を含む。キャプチャー工程として、多くの場合、たとえば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーが使用される。キャプチャーに続いて、多くの場合、純度およびウイルス汚染物質除去を向上させるために、少なくとも２つの中間精製工程または中間ポリッシング工程が行われる。中間精製工程または中間ポリッシング工程は、多くの場合、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により達成される。多くのプロセスでは、最終ポリッシング工程は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、またはゲル濾過を用いて達成される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
細胞培養プロセスで達成された上流力価の増加は、生産性には望ましいが、下流プロセスに対してさらなる課題を呈しうる。たとえば、力価の増加は、凝集体、ＨＣＰ、ＤＮＡ、および抗体フラグメント不純物などの不純物のレベルの増加をもたらしうる。凝集体、ＨＣＰ、およびＤＮＡ不純物を除去するためにプラットフォーム下流プロセスを最適化する方法が知られているが、下流プラットフォームプロセスは、歴史的には抗体フラグメント不純物を除去するために設計されてきたものではない。
【０００８】
モノクローナル抗体フラグメント分離の方法および機序を調べた研究はわずかである。したがって、大ヒンジ、小ヒンジ、重鎖−重鎖−軽鎖、重鎖−軽鎖、軽鎖−軽鎖、重鎖−重鎖、重鎖、軽鎖などのＩｇＧフラグメント不純物の分離については、ほとんど知られていない。このため、抗体フラグメント不純物などの不純物を効率的に除去する精製プロセスの必要性が残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
２．発明の概要
一実施形態では、標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントから抗体フラグメント化産物不純物を分離する方法が提供される。この方法は、標的抗体または所望の抗原結合性フラグメントと、抗体フラグメント化産物不純物と、負荷緩衝液と、を含む出発材料を提供する工程と、出発材料を混合モードクロマトグラフィーカラムに負荷する工程と、材料をカラムに通して貫流させる工程であって、抗体フラグメント化産物不純物の少なくとも一部が混合モードクロマトグラフィー樹脂の固定相に吸着され、かつ標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントの少なくとも一部が１つ以上の溶出液画分でカラムから溶出される、工程と、１つ以上の溶出液画分を回収する工程であって、１つ以上の溶出液画分が出発材料と比較して標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントで富化されている、工程と、を含む。他の実施形態では、標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントを含む組成物中の抗体フラグメント化産物不純物を減少させる方法が提供される。
【００１０】
一実施形態では、混合モードクロマトグラフィーカラムは、陰イオン交換（ＡＥＸ）、陽イオン交換（ＣＥＸ）、疎水性相互作用（ＨＩＣ）、親水性相互作用、水素結合、π−π結合、および金属親和性から選択される分離機構を利用する。他の実施形態では、混合モードクロマトグラフィーカラムは、ＡＥＸとＨＩＣ相互作用との組合せを利用する。より特定の実施形態では、混合モードクロマトグラフィーカラムは、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）混合モードクロマトグラフィーカラムを含む。
【００１１】
一実施形態では、出発材料は、約８８％〜約９８％の標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントを含む。一実施形態では、出発材料は、約９８％までの標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントを含む。一実施形態では、１つ以上の溶出液画分は、約９８％〜９９．９％の標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントを含む。一実施形態では、１つ以上の溶出液画分は、少なくとも約９８％の標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントを含む。一実施形態では、１つ以上の溶出液画分は、出発材料よりも約１％〜約１０％多い標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントを含む。一実施形態では、１つ以上の溶出液画分は、出発材料よりも約１％〜約３％多い標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントを含む。
【００１２】
一実施形態では、出発材料は、約１％〜約１０％の抗体フラグメント化産物不純物を含む。一実施形態では、出発材料は、約１％〜約３％の抗体フラグメント化産物不純物を含む。一実施形態では、１つ以上の溶出液画分は、約３％未満の抗体フラグメント化産物不純物を含む。一実施形態では、１つ以上の溶出液画分は、約２％未満の抗体フラグメント化産物不純物を含む。一実施形態では、１つ以上の溶出液画分は、約１％未満の抗体フラグメント化産物不純物を含む。
【００１３】
一実施形態では、出発材料のｐＨは、約５〜約８である。一実施形態では、出発材料のｐＨは、約５．５〜約６．５である。一実施形態では、出発材料のｐＨは、約５．７〜約６．０である。
【００１４】
一実施形態では、出発材料は、約０ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する。一実施形態では、出発材料は、約１０ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。一実施形態では、出発材料は、約７ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。
【００１５】
一実施形態では、出発材料は、約７５ｇ／Ｌ〜約２５０ｇ／Ｌの負荷容量を有する。一実施形態では、出発材料は、約７５ｇ／Ｌ〜約１２５ｇ／Ｌの負荷容量を有する。
【００１６】
一実施形態では、標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖配列を含む。一実施形態では、標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖配列を含む。一実施形態では、標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖配列と、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖配列と、を含む。一実施形態では、標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントは、配列番号２に示される軽鎖アミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、およびそれらの組合せから選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む。一実施形態では、標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントは、配列番号１に示される重鎖アミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、およびそれらの組合せから選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む。一実施形態では、標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントは、配列番号２に示される軽鎖アミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、およびそれらの組合せから選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列と、配列番号１に示される重鎖アミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、およびそれらの組合せから選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列と、を含む。
【００１７】
一実施形態では、負荷緩衝液は、約１０ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。一実施形態では、負荷緩衝液は、約４ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。
【００１８】
一実施形態では、負荷緩衝液は、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸ナトリウム、ヒスチジン、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、およびそれらの組合せから選択される。一実施形態では、負荷緩衝液は、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、およびそれらの組合せから選択される。一実施形態では、負荷緩衝液は、約１ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度を有する。
【００１９】
一実施形態では、標的抗体または所望の抗原結合性フラグメントを含む組成物が提供され、組成物は、少なくとも約９９％の標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントと、約２％未満の抗体フラグメント化産物不純物と、を含む。一実施形態では、組成物は、少なくとも約９９％の標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントと、１％以下の抗体フラグメント化結合性産物と、を含む。一実施形態では、組成物は、少なくとも約９９．５％の標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントと、約０．５％以下の抗体フラグメント化結合性産物と、を含む。一実施形態では、組成物は、約３％以下の凝集体を含む。一実施形態では、組成物は、約２．５％以下の凝集体を含む。
【００２０】
一実施形態では、抗体フラグメント化産物不純物は、ペプチド切断フラグメントを含む。一実施形態では、抗体フラグメント化産物不純物は、重鎖フラグメント化産物、ヒンジ領域フラグメント化産物、軽鎖フラグメント化産物、およびそれらの組合せから選択される。一実施形態では、抗体フラグメント化産物不純物は、抗体還元フラグメントを含む。一実施形態では、抗体フラグメント化産物不純物は、重鎖−重鎖−軽鎖、重鎖−軽鎖、軽鎖−軽鎖、重鎖−重鎖、重鎖、および軽鎖から選択されるＩｇＧフラグメントである。
【００２１】
一実施形態では、標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖配列を含む。一実施形態では、標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖アミノ酸配列を含む。一実施形態では、標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖配列と、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖アミノ酸配列と、を含む。一実施形態では、標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントは、配列番号２に示される軽鎖アミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、およびそれらの組合せから選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む。一実施形態では、標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントは、配列番号１に示される重鎖アミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、およびそれらの組合せから選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む。一実施形態では、標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントは、配列番号２に示される軽鎖アミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、およびそれらの組合せから選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列と、配列番号１に示される重鎖アミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、およびそれらの組合せから選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列と、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ−Ｂ】例示的モノクローナル抗体フラグメント化産物の概略図である。
【図２】フラグメント除去および収率に及ぼすｐＨの影響を示すグラフである。
【図３Ａ−Ｂ】ｐＨ６での精製の逆相クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）プロファイルを示している。
【図４Ａ−Ｂ】ｐＨ６での精製の高圧サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）プロファイルを示している。
【図５】ｐＨ６近傍のｐＨ領域での純度に及ぼす伝導率および負荷容量の影響を示している。
【図６】ＨＰＳＥＣにより決定されるスケールアップ操作の産物品質を示している。
【図７】ＲＰＬＣにより決定されるスケールアップ操作の産物品質を示している。
【図８】精製前の追加抗体フラグメント化産物不純物による負荷スパイクの影響を示している。
【図９Ａ−Ｃ】（Ａ）Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）リガンド、（Ｂ）Ｃａｐｔｏ  Ｑ（商標）リガンド、および（Ｃ）Ｃａｐｔｏ  Ｐｈｅｎｙｌ（商標）リガンドの概略図である。
【図１０】Ｃａｐｔｏ  Ｑ（商標）樹脂を用いた低ｐＨウイルス不活性化物質の精製結果を示している。
【図１１】Ｃａｐｔｏ  Ｐｈｅｎｙｌ（商標）樹脂を用いた低ｐＨウイルス不活性化物質の精製結果を示している。
【図１２】組換え産生抗体の代表的精製プロセスのフロー図である。
【図１３Ａ】ｐＨ５、５．５、６、６．５、７、７．５、および８でのＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）樹脂を用いた精製時のＨＨＬ、ＨＨまたはＬＨＦ、ＨＬ、ＨまたはＳＨＦ、およびＬフラグメントのレベルを示すバイオアナライザークロマトグラムである。
【図１３Ｂ】図１３Ａの続きである。
【図１４Ａ】５〜６の範囲内のｐＨ、０〜３０ｍＳ／ｃｍの範囲内の伝導率、および７５〜３００ｇ／Ｌの範囲内の負荷容量でのＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）樹脂を用いた精製時のＨＨＬ、ＨＨまたはＬＨＦ、ＨＬ、ＨまたはＳＨＦ、およびＬフラグメントさらには二量体のレベルを示すバイオアナライザークロマトグラムである。
【図１４Ｂ】図１４Ａの続きである。
【図１４Ｃ】図１４Ａの続きである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
４．詳細な説明
４．１．緒言
抗体精製時にとくに上流力価の増加に伴って遭遇する共通した問題は、望ましくない抗体フラグメント汚染物質の存在である。フラグメント化は、安定性の喪失、凝集、バッチ間の非一貫性をもたらしうるとともに、投与時に有害反応をもたらしうるので、抗体フラグメント不純物の存在は、とくに治療用モノクローナル抗体産物では問題となりうる。多くのプラットフォーム下流プロセスは、凝集体、ＨＣＰ、ＤＮＡ、および潜在的ウイルス汚染物質の除去に重点を置いているので、抗体フラグメント化産物不純物を効率的に除去するプロセスが必要とされている。本明細書には、組換え産生抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントから抗体フラグメント化産物不純物を分離するための精製プロセスが記載されている。
【００２４】
４．２．用語
とくに定義されていないかぎり、本明細書で用いられる科学技術用語は、当業者が通常理解する意味を有するものとする。さらに、とくに文脈上必要とされないかぎり、単数形の用語は複数形を含むものとし、かつ複数形の用語は単数形を含むものとする。一般的には、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴまたはポリヌクレオチド化学、ならびにハイブリダイゼーションとの関連で用いられる命名法ならびにそれらの技術は、当技術分野で通常用いられる周知のものである。アミノ酸は、本明細書では、その一般に知られる三文字記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）により推奨される一文字記号のいずれかにより参照されうる。ヌクレオチドも同様に、その一般に受け入れられている一文字コードにより参照されうる。
【００２５】
本開示にしたがって用いられる場合、以下の用語は、とくに指定がないかぎり、以下の意味を有すると理解されるものとする。
【００２６】
本明細書で用いられる場合、「約」という用語は、たとえば、本発明の説明に利用される組成物中の成分の量、濃度、体積、プロセス温度、プロセス時間、収率、流量、圧力、およびそれらの範囲を修飾するために使用される。「約」という用語は、たとえば、化合物、組成物、濃縮物、または製剤の製造に用いられる典型的な測定および取扱いの手順により、これらの手順での偶発的エラーにより、方法を実施するために使用される出発材料または成分の製造、供給源、または純度、および他の類似の要件の差により、生じる可能性のある数値量の変動を意味する。「約」という用語はまた、特定の初期濃度または初期混合物を有する製剤のエージングに起因して異なる量、および特定の初期濃度または初期混合物を有する製剤の混合または処理に起因して異なる量も包含する。「約」という用語により修飾された場合、本明細書に添付された特許請求の範囲は、そのような均等物を包含する。
【００２７】
本明細書で用いられる場合、「抗体」という用語は、抗原の抗原決定基の特徴部に相補的な内表面の形状および電荷分布の三次元結合空間を有するポリペプチド鎖のフォールディングから形成される少なくとも１つの抗原結合性ドメインを含む１つのポリペプチドまたは一群のポリペプチドを意味する。抗体は、典型的には、２対のポリペプチド鎖の四量体形を有し、各対は、１本の「軽」鎖と１本の「重」鎖とを有する。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗原結合部位を形成する。各軽鎖は、１つのジスルフィド共有結合により重鎖に結合されるが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖および軽鎖はまた、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）および続いていくつかの定常ドメイン（ＣＨ）を有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）およびその他方の末端に定常ドメイン（ＣＬ）を有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインにアライメントされ、かつ軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインにアライメントされる。軽鎖は、軽鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいてλ鎖またはκ鎖のいずれかとして分類される。κ軽鎖の可変ドメインはまた、本明細書ではＶＫとも記されうる。
【００２８】
本明細書で用いられる「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性フラグメント、すなわち、少なくとも１つの抗原結合部位を含有する分子を意味する。免疫グロブリン分子は、任意のアイソタイプ（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、サブアイソタイプ（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはアロタイプ（たとえば、Ｇｍ、たとえば、Ｇ１ｍ（ｆ、ｚ、ａ、もしくはｘ）、Ｇ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（ｇ、ｂ、もしくはｃ）、Ａｍ、Ｅｍ、およびＫｍ（１、２、もしくは３））でありうる。抗体は、限定されるものではないが、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウスなどを含む任意の哺乳動物種、またはトリ（たとえば、ニワトリ）などの他の動物に由来しうる。一実施形態では、抗体は、異種ポリペプチド配列、たとえば、精製を容易にするタグに融合されうる。「抗体」としては、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの異なるエピトープ結合性フラグメントから形成される多重特異的抗体（たとえば、二重特異的抗体）、ＣＤＲ移植ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、イントラボディー、および組換え産生抗体フラグメントを含むそれらの望ましい抗原結合性フラグメントが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本明細書で用いられる場合、「望ましい抗体フラグメント」、「望ましい抗原結合性フラグメント」、または「標的抗体フラグメント」という用語は、抗体の選択的切断（たとえば、タンパク質分解消化）により形成される抗体フラグメントを意味しうるとともに、抗体フラグメントは、所望の生物学的活性を呈し、かつ宿主細胞により発現される抗体フラグメントである。一実施形態では、抗体フラグメントは、抗体の抗原結合性部分を含む治療用抗体フラグメントである。組換え産生可能な抗体フラグメントの例としては、さまざまな重鎖ドメインと軽鎖ドメインとを含む抗体フラグメント、たとえば、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、抗体フラグメントとしては、以上に列挙された抗体のいずれかのエピトープ結合性フラグメントまたは誘導体が挙げられうる。「標的抗体フラグメント」または「標的」および「組換え抗体フラグメント」または「組換え産生抗体フラグメント」という用語は、本明細書で用いられる場合、以下で考察される抗体フラグメント化産物不純物を包含しない。
【００２９】
本明細書で用いられる場合、「抗体フラグメント化産物不純物」という用語は、標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントを含む組成物に見いだされうる望ましくない不純物を意味する。抗体フラグメント化産物不純物は、非酵素反応および／または酵素反応により生成可能な所望の抗体産物のペプチド骨格に沿った１つ以上のペプチド共有結合の望ましくないおよび／または無差別な破壊から生じる。とくに本明細書に記載のないかぎり、「抗体フラグメント化産物不純物」という用語は、タンパク質骨格を破壊しない側鎖またはジスルフィド結合の化学修飾を意味しない。抗体フラグメント化産物不純物は、抗体の種々の領域、たとえば、限定されるものではないが、ヒンジ領域、１つ以上の免疫グロブリン定常ドメイン、および１つ以上の可変ドメイン、たとえば、１つ以上のＣＤＲ、の１つ以上のペプチド共有結合の破壊により形成されうる。Ｆｃ媒介エフェクター機能の欠如した抗体フラグメントの生成をもたらすヒンジ領域のフラグメント化は、循環半減期の低減をもたらしうる。Ｆｃ−Ｆａｂフラグメントをもたらすヒンジフラグメント化は、とくに標的レセプターが両方のＦａｂアームを必要とする場合、効力が低減された抗体産物をもたらしうる。切断部位に依存して、定常領域のフラグメント化は、Ｆｃ媒介エフェクター機能または循環半減期のいずれかに影響を及ぼしうる。可変領域のフラグメント化は、標的への抗体の結合に影響を及ぼす可能性があるので、効力に悪影響を及ぼしうる。図１Ａおよび１Ｂは、例示的抗体フラグメント化産物の概略図を提供する。
【００３０】
分子とカラム材料との相互作用を考察するときの「結合」という用語は、分子がカラム材料内またはカラム材料上に可逆的に固定化されるような条件下で分子をカラム材料に暴露することを意味する。
【００３１】
「細胞培養上清」という用語は、対象の組換え抗体を産生する宿主細胞を培養することにより得られる溶液を意味する。組換え抗体のほかに、細胞培養上清は、細胞培養培地の成分、宿主細胞により分泌された代謝副産物、さらには培養細胞の他の成分をも含みうる。本明細書で用いられる場合、「清澄細胞培養上清」という用語は、細胞培養上清に細胞デブリおよび／または無傷細胞が一般的には含まれないように宿主細胞が除去または回収された組成物を意味する。
【００３２】
本明細書で用いられる「賦形剤」という用語は、タンパク質の安定性向上、タンパク質の溶解性向上、および／または粘度の減少などの有益な物理的性質を製剤に付与する、希釈剤、媒体、保存剤、結合剤、または薬剤安定化剤として通常使用される不活性物質を意味する。賦形剤の例としては、タンパク質（たとえば、限定されるものではないが、血清アルブミン）、アミノ酸（たとえば、限定されるものではないが、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、グリシン）、界面活性剤（たとえば、限定されるものではないが、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、ポリソルベート、および非イオン性界面活性剤）、糖（たとえば、限定されるものではないが、グルコース、スクロース、マルトース、およびトレハロース）、ポリオール（たとえば、限定されるものではないが、マンニトールおよびソルビトール）、脂肪酸およびリン脂質（たとえば、限定されるものではないが、アルキルスルホネートおよびカプリレート）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
「宿主細胞」という語句は、組換えポリペプチド、たとえば、組換え抗体または組換え抗体フラグメントを発現する細胞を意味する。特定的には、「宿主細胞」という用語は、ベクターなどの核酸の取込みが可能であるかまたは取込みが行われた、かつ核酸の複製および１種以上のコード産物の産生を支援する、細胞を意味する。「宿主細胞」という用語は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の種などの原核細胞、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母細胞、バキュロウイルスなどの昆虫細胞、および真核細胞を含むさまざまな細胞型を意味しうる。真核宿主細胞の例としては、哺乳動物細胞、たとえば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞、ベロ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ヒーラ細胞、ＣＶ１サル腎臓細胞、マディン・ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞、３Ｔ３細胞、骨髄腫細胞系、ＣＯＳ細胞（たとえば、ＣＯＳ１およびＣＯＳ７）、ＰＣ１２細胞、ＷＩ３８細胞が挙げられる。宿主細胞という用語はまた、細胞の組合せまたは混合物、たとえば、異なる細胞型または細胞系の混合培養物をも包含する。
【００３４】
「不純物」という用語は、サンプル中に存在する標的抗体または抗体フラグメント以外の任意の異物、特定的には、生体高分子、たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を意味する。汚染物質としては、抗体フラグメント化産物不純物が挙げられうる。
【００３５】
標的抗体またはその所望のフラグメントと１種以上の汚染物質とを含む組成物または溶液から標的抗体またはその所望のフラグメントを「精製」という用語は、組成物または溶液から少なくとも１種の汚染物質を（完全にまたは部分的に）除去することにより、組成物中または溶液中の標的抗体またはその所望の抗体フラグメントの純度を向上させることを意味する。
【００３６】
「ｍＡｂ」という用語は、モノクローナル抗体を意味する。
【００３７】
本明細書で用いられる「薬学的に許容可能」という語句は、連邦政府もしくは州政府の監督官庁により認可されているか、または米国薬局方、欧州薬局方、もしくは動物、より特定的にはヒトに使用するための他の一般に公認された薬局方に列挙されていることを意味する。
【００３８】
「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、ペプチド結合により互いに連結された２つ以上のアミノ酸残基を有する分子を意味すべく同義的に用いられうる。「ポリペプチド」という用語は、抗体および他の非抗体タンパク質を意味しうる。非抗体タンパク質としては、酵素、レセプター、細胞表面タンパク質のリガンド、分泌タンパク質、融合タンパク質、それらのフラグメントなどのタンパク質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ポリペプチドは、他のポリペプチドに融合されたものまたは融合されていないものでありうる。ポリペプチドはまた、修飾、たとえば、限定されるものではないが、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、およびＡＤＰリボシル化も含みうる。ポリペプチドは、タンパク質ベースの治療剤を含めて、科学的または商業的な関心の対象となりうる。
【００３９】
「組換え体」という用語は、ヒトが介入することにより人工的または合成的に（すなわち、非天然に）改変または産生された生物学的物質、たとえば、核酸またはタンパク質を意味する。
【００４０】
抗体フラグメント化産物不純物の除去との関連で用いられるときの「除去」という用語は、精製産物中の抗体フラグメント化産物不純物の量の減少を意味する。除去の結果、精製産物に抗体フラグメント化産物不純物が不在になることもならないこともある。一般的には、除去とは、精製産物中の抗体フラグメント化産物不純物が、元の組成物中の抗体フラグメント化産物不純物のレベルと比較して、少なくとも１／２、１／３、１／４、１／５、１／１０、１／１５、１／２０、１／２５、かつ最大で１／３０、１／３５、１／４０、１／４５、または１／５０に減少することを意味する。
【００４１】
組換え産生ポリペプチドの製剤、たとえば、組換え産生抗体または抗体フラグメントを含む医薬製剤との関連で本明細書で用いられる「安定性」および「安定」という用語は、製造、調製、輸送、および貯蔵の条件下での粒子形成、凝集、分解、またはフラグメント化に対する製剤中のポリペプチドの耐性を意味する。「安定」製剤は、製造、調製、輸送、および貯蔵の条件下で生物学的活性を維持する。安定性は、参照製剤と比較して、ＨＰＳＥＣ、静的光散乱（ＳＬＳ）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）、円二色性（ＣＤ）、尿素アンフォールディング技術、内因性トリプトファン蛍光、示差走査熱量測定、および／またはＡＮＳ結合技術により測定される、粒子形成、凝集、分解、またはフラグメント化の程度により、評価可能である。
【００４２】
本明細書で用いられる場合、「実質的に純粋」とは、存在する主要種である（たとえば、モル基準で組成物中のいずれの他の個別種よりも多い）標的物質を意味する。一実施形態では、実質的に精製された画分は、標的物質が、存在するすべての高分子種の少なくとも約５０％（モル基準）を占める、組成物である。一般的には、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種を基準にして約８０％超、または約８５％超、約９０％超、約９５％超、もしくは約９９％超の標的物質を含むであろう。一実施形態では、標的物質は、本質的に均一になるまで精製され（従来の検出方法により組成物中に汚染物質種を検出できない）、組成物は、本質的に単一の高分子種、たとえば、標的高分子を含む。
【００４３】
４．３．組換え抗体産生
一実施形態では、組換え抗体は、１種以上の対象のポリペプチドを発現可能なベクターを用いて安定的または一過的のいずれかでトランスフェクトされた宿主細胞を用いて産生される。一実施形態では、組換え産生抗体はモノクローナル抗体である。本明細書で用いられる場合、「ベクター」という用語は、対象の核酸を細胞内に送達するために使用可能な物質組成物を意味する。線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性の化合物に関連付けられたポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含めて、多くのベクターが知られているが、これらに限定されるものではない。「ベクター」という用語は、自律複製するプラスミドまたは自律複製しないウイルスもしくはベクターもしくはプラスミドを含みうる。「トランスフェクション」という用語は、遺伝子改変細胞を産生するように外因性遺伝物質を細胞内に導入することを意味する。ベクターは、当技術分野で公知の方法を用いて宿主細胞内に導入可能である。たとえば、ベクターは、物理的、化学的、または生物学的な手段により宿主細胞内に移入可能である。ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（正荷電リポソーム媒介トランスフェクションを含む）、粒子照射、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、およびエレクトロポレーションが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ベクターを宿主細胞内に導入するための生物学的方法としては、たとえば、ウイルスベクターを含めて、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用が挙げられる。ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための化学的手段としては、コロイド分散系、たとえば、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに脂質ベースの系、たとえば、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームが挙げられる。一実施形態では、宿主細胞は、組換え抗体、たとえば、商業的または科学的な関心の対象となる抗体を発現するように遺伝子工学操作が可能である。
【００４４】
「細胞培養」という用語は、多細胞の生物や組織以外の細胞の成長および増殖を意味する。ｐＨ、温度、湿度、雰囲気、撹拌などの細胞培養条件は、細胞培養物の成長および／または生産性の特性を改善すべく変更可能である。宿主細胞は、懸濁状態または固体基材に結合された状態で培養されうる。宿主細胞は、小規模培養で、たとえば、実験室環境で、２５ｍｌ程度の少量から、約５０ｍｌまで、約１００ｍｌまで、約１５０ｍｌまで、または約２００ｍｌまでの量で、培養可能である。他の選択肢として、培養は、大規模、たとえば、約３００ｍｌ、５００ｍｌ、または１０００ｍｌから、約５０００ｍｌまで、約１０，０００ｍｌまで、および約１５，０００ｍｌまでの量でありうる。商業規模のバイオリアクターもまた、たとえば、約１，０００Ｌまで、約５，０００Ｌまで、または約１０，０００Ｌまで、またはそれ以上の培地量で使用可能である。哺乳動物細胞による組換え抗体の大規模産生は、連続、バッチ、およびフェドバッチの培養系を含みうる。宿主細胞は、たとえば、マイクロ担体を用いてまたは用いずに、流動床バイオリアクター、中空繊維バイオリアクター、ローラーボトル、振盪フラスコ、または撹拌タンクバイオリアクターで培養されうるとともに、バッチ、フェドバッチ、連続、半連続、または灌流のモードで操作されうる。大規模細胞培養は、典型的には、何日間さらには何週間にもわたり維持され、その間、細胞は、所望のタンパク質産物を産生する。一実施形態では、細胞培養条件は、少なくとも約１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、または５ｇ／Ｌ、かつ最大で約６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、または２０ｇ／Ｌの抗体価をもたらす。
【００４５】
組換え抗体の産生に好適な宿主細胞としては、原核細胞および真核細胞の両方が挙げられる。真核細胞の例としては、哺乳動物細胞が挙げられる。組換え抗体の産生に好適な哺乳動物細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウス骨髄腫（ＮＳ０）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ベロ細胞、ヒーラ細胞、マディン・ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞、ＣＶ１サル腎臓細胞、３Ｔ３細胞、骨髄腫細胞系、たとえば、ＮＳ０およびＮＳ１、ＰＣ１２細胞、ＷＩ３８細胞、ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７を含む）、およびＣ１２７細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一般的には、哺乳動物細胞培養は、約６．５〜約７．５のｐＨ、約３６℃〜約３８℃、典型的には、約３７℃の温度、かつ約８０％〜約９５％の相対湿度に維持される。哺乳動物細胞培養培地は、典型的には、約１％〜約１０％または約５％〜約６％の二酸化炭素（ＣＯ2）雰囲気を必要とする緩衝系を含有する。
【００４６】
宿主細胞は、さまざまな細胞培養培地中に維持可能である。「細胞培養培地」という用語は、宿主細胞を成長させる栄養溶液を意味する。細胞培養培地配合物は、当技術分野で周知である。典型的には、細胞培養培地は、緩衝剤、塩、炭水化物、アミノ酸、ビタミン、および微量必須元素を含む。細胞培養培地は、血清、ペプトン、および／またはタンパク質を含有することも含有しないこともある。細胞培養培地は、細胞培養要件および／または所望の細胞培養パラメーターに依存して、追加濃度または増加濃度の成分、たとえば、アミノ酸、塩、糖、ビタミン、ホルモン、成長因子、緩衝剤、抗生物質、脂質、微量元素などが追加されうる。無血清培養培地および規定培養培地を含めて、種々の培養培地が市販されており、限定されるものではないが、最少必須培地（ＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、ハムＦ１０培地（Ｓｉｇｍａ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）、イーグル基本培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）、ＨｙＣｌｏｎｅ細胞培養培地（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）、および特定の細胞型に合わせて配合された化学的規定（ＣＤ）培地、たとえば、ＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。所望により、市販の培地にサプリメント成分を添加することが可能である。
【００４７】
本明細書で用いられる「組換え抗体」という用語は、培養宿主細胞により産生される遺伝子工学操作された抗体を意味する。本明細書で用いられる場合、「異種」という用語は、宿主細胞により産生される通常は発現されない組換え抗体を意味する。しかしながら、異種抗体は、生物に固有であるがなんらかの方法で意図的に改変された抗体を含みうることに留意すべきである。たとえば、異種抗体は、この抗体を発現するベクターでトランスフェクトされた宿主細胞により発現される抗体を含みうる。
【００４８】
組換え産生抗体は、単独または他のアミノ酸配列との組合せのいずれかで、オリゴクローナル抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ラクダ化抗体、ＣＤＲ移植抗体、多重特異的抗体、二重特異的抗体、触媒抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、抗イディオタイプ抗体でありうるとともに、可溶形または結合形の標識可能な抗体、さらにはエピトープ結合性フラグメントなどの所望の生物学的活性を呈するそれらの所望のフラグメント、変異体、または誘導体を含む。抗体という用語はまた、限定されるものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、一本鎖抗体（ｓｖＦＣ）、二量体可変領域（ダイアボディー）、およびジスルフィド結合可変領域（ｄｓＦｖ）をはじめとする所望の抗原結合性フラグメントをも含む。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスでありうる。抗体は、任意の種に由来しうる。一実施形態では、標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントは、精製を容易にするために、親和性タグなどの異種ポリペプチド配列に融合されうる。親和性タグの例としては、ポリヒスチジンタグ、ＧＦＰタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグ、Ｖ５タグ、およびＭｙｃタグが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
一実施形態では、組換え産生抗体は、ＩｇＧ抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントである。より特定の実施形態では、組換え産生抗体は、抗Ｉ型ＩＦＮ−αレセプター（ＩＦＮ−αＲ）モノクローナル抗体である。一実施形態では、組換え産生抗体は、ＩＦＮ−αＲ１のサブユニット１を対象とする完全ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）−１κｍＡｂである。より特定の実施形態では、抗体は、ＭＥＤＩ−５４６またはその所望の抗原結合性フラグメントである。「ＭＥＤＩ−５４６」という用語は、米国特許第７，６６２，３８１号明細書に記載の抗ＩＦＮＡＲ９Ｄ４抗体のＦｃ改変体を意味する。ＭＥＤＩ−５４６の配列は、米国特許出願公開第２０１１−００５９０７８号明細書に記載されている。ＭＥＤＩ−５４６は、ヒトＩｇＧ１の下側ヒンジおよびＣＨ２ドメイン内に導入された３つの突然変異、すなわち、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、およびＰ３３１Ｓ（ここで、番号付けは、カバット方式で示されるＥＵインデックスに準拠する）の組合せを含み、ヒトＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、およびＣ１ｑへの結合の減少を引き起こす。たとえば、米国特許出願公開第２０１１／００５９０７８号明細書およびＯｇａｎｅｓｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｄ  ６４：７００−７０４（２００８）（これをもってそれら全体が参照により組み込まれる）を参照されたい。ＭＥＤＩ−５４６のＶＨおよびＶｋの配列は表１に示される。
【００５０】
【表１】
2016538267.tif 000003
【００５１】
他の実施形態では、標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントは、ＭＥＤＩ−５４６の軽鎖可変アミノ酸配列（配列番号２）を有する。他の実施形態では、標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントは、ＭＥＤＩ−５４６の重鎖可変アミノ酸配列（配列番号１）を有する。他の実施形態では、標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントは、ＭＥＤＩ−５４６の軽鎖可変アミノ酸配列（配列番号２）とＭＥＤＩ−５４６の重鎖可変アミノ酸配列（配列番号１）とを有する。
【００５２】
一実施形態では、抗体は、ＭＥＤＩ−５４６の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖アミノ酸配列を含む。ＣＤＲ領域またはＣＤＲという用語は、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ｏｒ  ｌａｔｅｒ  ｅｄｉｔｉｏｎｓ）またはＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７））により定義された免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を意味する。抗体は、典型的には、３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲとを含有する。ＣＤＲという用語は、場合にもよるが、ここでは、抗原または認識されるエピトープに対する抗体の親和性による結合に関与するアミノ酸残基の大部分を含有するこれらの領域の１つまたはこれらの領域のいくつかさらには全部を表すために使用される。６つの短いＣＤＲ配列のうち、重鎖の第３のＣＤＲ（ＨＣＤＲ３）は、より大きいサイズ可変性（それを生成する遺伝子の構成の機構に本質的に起因するより大きい多様性）を有する。それは、２アミノ酸程度に短いものから２６アミノ酸長まででありうる。ＣＤＲの長さはまた、特定の基礎的フレームワークにより収容可能な長さによっても異なりうる。機能的には、ＨＣＤＲ３は、抗体の特異性の決定に部分的な役割を果たす。当業者であれば、抗体のＣＤＲ領域を決定することが可能である。一般的には、ＨＣＤＲ１は、約５アミノ酸長であり、カバット残基３１〜３５に対応し、ＨＣＤＲ２は、約１７アミノ酸長であり、カバット残基５０〜６５に対応し、ＨＣＤＲ３は、約１１または１２アミノ酸長のであり、カバット残基９５〜１０２に対応し、ＬＣＤＲ１は、約１１アミノ酸長であり、カバット残基２４〜３４に対応し、ＬＣＤＲ２は、約７アミノ酸長であり、カバット残基５０〜５６に対応し、かつＬＣＤＲ３は、約８または９アミノ酸長であり、カバット残基８９〜９７に対応する。
【００５３】
以上で引用された参照文献のそれぞれで定義されるＣＤＲを構成する適切なアミノ酸残基は、比較として以下の表２に示される。特定のＣＤＲを構成する厳密な残基番号は、ＣＤＲの配列およびサイズに依存して異なるであろう。抗体の可変領域のアミノ酸配列が与えられれば、どの残基が特定のＣＤＲを構成するかは、当業者であればルーチン的に決定可能である。
【００５４】
【表２】
2016538267.tif 000004
【００５５】
一実施形態では、標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントは、配列番号２に示される軽鎖アミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、およびそれらの組合せから選択されるＭＥＤＩ−５４６の１つ以上の軽鎖ＣＤＲ配列を含む軽鎖アミノ酸配列を含む。一実施形態では、標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントは、配列番号１に示される重鎖アミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、およびそれらの組合せから選択されるＭＥＤＩ−５４６の１つ以上の重鎖ＣＤＲ配列を含む重鎖アミノ酸配列を含む。一実施形態では、標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントは、配列番号２に示されるＭＥＤＩ−５４６の軽鎖アミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖アミノ酸配列と、配列番号１に示されるＭＥＤＩ−５４６の重鎖アミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖アミノ酸配列と、を含む。
【００５６】
４．４  抗体フラグメント化産物不純物
望ましくない抗体フラグメント化産物不純物は、無差別な酵素プロセスおよび非酵素プロセスの結果として生成しうる。一般的には、モノクローナル抗体で観測される全フラグメント化パターンは、構造条件および溶媒条件の両方の影響を受ける。たとえば、非酵素フラグメント化は、アミノ酸配列、局所構造の可撓性、溶媒条件（たとえば、ｐＨおよび温度）、および金属またはラジカルの存在などの因子の影響を受けうる。非酵素フラグメント化の例としては、直接加水分解およびβ脱離が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、これらは、多くの場合、ヒンジ領域フラグメント化をもたらす。一次構造のほかに、二次、三次、および四次構造は、局所可撓性、溶媒への接近性、または配列中の離れた側鎖の近接度に起因して、フラグメント化パターンに影響を及ぼしうる。多くの場合、望ましくないフラグメント化率は、約５〜約６のｐＨでは低減される。抗体フラグメント化機構の詳細な考察は、Ｖｌａｓａｋ  ａｎｄ  ｌｏｎｅｓｃｕ，（２０１１）ＭＡｂｓ，３（３）：２５３−２６３に見いだされうる。
【００５７】
さまざまな抗体フラグメント化産物不純物が知られており、免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖のフラグメントを含みうる。抗体フラグメント産物不純物の例としては、大ヒンジ（ＬＨ）、小ヒンジ（ＳＨ）、重鎖−重鎖−軽鎖（ＨＨＬ）、重鎖−軽鎖（ＨＬ）、軽鎖−軽鎖（ＬＬ）、重鎖−重鎖（ＨＨ）、重鎖（Ｈ）、および軽鎖（Ｌ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態では、抗体フラグメント化産物不純物としては、限定されるものではないが、重鎖フラグメント化産物、ヒンジ領域フラグメント化産物、軽鎖フラグメント化産物、およびそれらの組合せを含めて、ペプチド切断フラグメント、たとえば、図１Ａに示されるフラグメント化産物が挙げられる。
【００５８】
「重鎖フラグメント化産物不純物」という用語は、抗体の１つ以上の重鎖の長さに沿って１つ以上のペプチド結合がランダムにまたは非意図的に破壊された抗体フラグメント化産物を意味する。１つ以上のペプチド結合の破壊は、酵素反応または非酵素反応に起因しうる。一実施形態では、重鎖フラグメント化産物のペプチド結合の破壊は、１つ以上の重鎖のＮ末端から１つ以上のＨＣＤＲ、たとえば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３の１つ以上の切断をもたらすＮ末端フラグメント化である。図１Ａに示される一実施形態では、重鎖Ｎ末端フラグメント（ＨＣ  Ｎ−ｆｒａｇ）は、任意選択で他の重鎖（ＨＣ）および１つ以上の軽鎖（ＬＣ）に結合された重鎖フラグメントのＣ末端の残りの部分（ＨＣ  Ｃ−フラグメント）を含むＣ末端フラグメント（すなわち、ＨＣ−ＬＣ−ＬＣ−ＨＣ  Ｃ−ｆｒａｇ）から切断される。一実施形態では、重鎖フラグメント化産物のペプチド結合の破壊は、抗体重鎖からＦｃ部分の一部または全部の切断をもたらすＣ末端フラグメント化である。一実施形態では、重鎖Ｃ末端フラグメント（ＨＣ  Ｃ−ｆｒａｇ）は、任意選択で他の重鎖（ＨＣ）および１つ以上の軽鎖（ＬＣ）に結合された重鎖のＮ末端の残りの部分（ＨＣ  Ｎフラグメント）を含むＮ末端フラグメント（すなわち、ＨＣ−ＬＣ−ＬＣ−ＨＣ  Ｎ−ｆｒａｇ）から切断される。
【００５９】
「軽鎖フラグメント化産物不純物」という用語は、抗体の１つ以上の軽鎖の長さに沿って１つ以上のペプチド結合がランダムにまたは非意図的に破壊されたた抗体フラグメント化産物を意味する。１つ以上のペプチド結合の破壊は、酵素反応または非酵素反応に起因しうる。一実施形態では、軽鎖フラグメント化産物のペプチド結合の破壊は、１つ以上の軽鎖のＮ末端から１つ以上のＬＣＤＲ、たとえば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３の１つ以上の切断をもたらすＮ末端フラグメント化である。一実施形態では、重鎖フラグメント化産物のペプチド結合の破壊は、抗体重鎖からＦｃ部分の一部または全部の切断をもたらすＣ末端フラグメント化である。図１Ａに示される一実施形態では、１つ以上の軽鎖フラグメント（ＬＣ）は、任意選択で１つ以上の重鎖（ＨＣ）および１つ以上の軽鎖（ＬＣ）に結合された軽鎖の残りの部分を含みうる抗体の残りの部分（すなわち、ＨＣ−ＨＣ−ＬＣ−Ｃｙｓ）から切断される。
【００６０】
「ヒンジ領域フラグメント化産物不純物」という用語は、抗体の１つ以上の軽鎖の長さに沿って１つ以上のペプチド結合が抗体のヒンジ領域近傍でランダムにまたは非意図的に破壊されたた抗体フラグメント化産物を意味する。１つ以上のペプチド結合の破壊は、酵素反応または非酵素反応に起因しうる。一実施形態では、「ヒンジ領域フラグメント化産物」は、任意選択で他の重鎖および軽鎖に結合された重鎖のＣ末端フラグメントを含む抗体の残りの部分（ＬＨＲ  Ｆｒａｇ）からの、軽鎖可変領域に結合された重鎖可変領域を含むＮ末端フラグメント（ＳＨＲフラグメント）の切断をもたらす。
【００６１】
他の実施形態では、抗体フラグメント化産物不純物としては、抗体還元により、たとえば、ジスルフィド結合切断により形成される抗体フラグメントが挙げられ、限定されるものではないが、重鎖−重鎖−軽鎖（ＨＨＬ）で表される２つの重鎖と１つの軽鎖とを含むフラグメント（約１２５ｋＤａのＭＷを有する）、重鎖−重鎖（ＨＨ）で表される２つの重鎖を含むフラグメント（約１００ｋＤａのＭＷを有する）、重鎖−軽鎖（ＨＬ）で表される１つの重鎖と１つの軽鎖とを含むフラグメント（約７５ｋＤａのＭＷを有する）、重鎖（Ｈ）で表される単一の重鎖を含むフラグメント（約５０ｋＤａのＭＷを有する）、軽鎖（Ｌ）で表される単一の軽鎖を含むフラグメント（約２５ｋＤａのＭＷを有する）、およびそれらの組合せを含めて、たとえば、図１Ｂに示されるフラグメントが挙げられる。
【００６２】
抗体フラグメント化産物不純物の存在は、上流力価の増加に伴って増加する傾向がある。しかしながら、抗体フラグメント化産物不純物の除去は、収率を減少させる傾向がある。本明細書には、精製プロセスの少なくとも１つの工程で少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の収率を維持しながら、少なくとも約１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、および１０ｇ／Ｌ、かつ最大で約５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、または２０ｇ／Ｌの力価を有する細胞培養産物に使用するのに好適な精製プロセスが記載されている。本明細書で用いられる場合、「精製プロセスの工程」という用語は、キャプチャー工程１０２、第１のポリッシング工程１０４または第２のポリッシング工程１０５を含むポリッシング工程、ウイルス不活性化工程１０３、ウイルス濾過工程１０６、およびＵＦ／ＤＦ工程１０７などの工程を意味する。一実施形態では、精製プロセスの各工程で、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の収率が維持される。一実施形態では、精製組成物、たとえば、混合モードクロマトグラフィーカラムから得られる１つ以上の溶出液画分は、約９５％〜約９９．９％、または約９７％〜約９９．９％、または約９８％〜９９．９％の標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメント、たとえば、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９７．１％、９７．２％、９７．３％、９７．４％、９７．５％、９７．６％、９７．７％、９７．８％、９７．９％、９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントと、約３％、２．９％、２．８％、２．７％、２．６％、２．５％、２．４％、２．３％、２．２％、２．１％、２％、１．９％、１．８％、１．７％、１．６％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、または０．１％未満の抗体フラグメント化産物不純物と、約３％、２．９％、２．８％、２．７％、２．６％、２．５％、２．４％、２．３％、２．２％、２．１％、２％、１．９％、１．８％、１．７％、１．６％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、または０．１％未満の凝集体と、を含む。一実施形態では、精製組成物中の標的の純度は、出発材料中の標的の純度と比較して、少なくとも約１％〜約１０％、もしくは約１％〜約３％、または少なくとも約０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、または５％、かつ最大で約５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、または１０％増加する。
【００６３】
抗体フラグメント化産物不純物の存在を検出するための方法および純度を決定するための方法は公知であり、たとえば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、たとえば、高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ＳＤＳを用いたキャピラリー電気泳動（ＣＥ−ＳＤＳ）、および逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ））が挙げられる。一実施形態では、切断部位は、質量分析（ＭＳ）またはＮ末端配列決定を用いて同定可能である。
【００６４】
４．５  精製
細胞培養物から抗体などの組換え産生ポリペプチド（本明細書では「標的ポリペプチド」、「標的抗体」、または「標的」としても参照される）を回収する際の第１の工程は、他の残留不純物と共に標的ポリペプチドまたはその所望の抗原結合性フラグメントを含有する清澄細胞培養上清を得るために、培養培地から無傷宿主細胞および宿主細胞デブリを除去することである（「回収」として参照される）。回収は、一般的には、遠心分離、凝集／沈殿、深層濾過、および無菌濾過により達成されるが、他の方法を使用することも可能である。
【００６５】
組換え産生抗体は、細胞内、ペリプラズム空間内に産生可能であるか、または培地中に直接分泌可能である。抗体が細胞内に産生される場合、第１の工程として、たとえば、遠心分離または限外濾過により、宿主細胞または溶解フラグメントのいずれかである微粒子状デブリが除去される。抗体が培地中に分泌される場合、たとえば、ＡｍｉｃｏｎやＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットなどの市販のタンパク質濃縮フィルターを用いて、発現系からの上清が濃縮されうる。タンパク質分解を阻害するために、ベスタチン、アプロチニン、ペプスタチン、ロイペプチン、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）、またはフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）などのプロテアーゼ阻害剤または１種以上のプロテアーゼ阻害剤を含むプロテアーゼ阻害剤カクテルが含まれうる。他の実施形態では、外来汚染物質の成長を防止するために、１種以上の抗生物質が含まれうる。抗生物質の例としては、アクチノマイシンＤ、アンピシリン、カルベニシリン、セフォタキシム、ホスミドマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ペニシリン、ポリミキシンＢ、およびストレプトマイシンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
清澄細胞培養上清を取得した後、限定されるものではないが、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、外来性および内在性ウイルス、内毒素、凝集体、ならびに抗体フラグメント化産物不純物を含みうる、細胞培養上清の他の不純物を除去することにより、標的ポリペプチドをさらに精製することが可能である。
【００６７】
ほとんどの精製方法は、静止材料（固相）との化学的または物理的な相互作用の差に基づいて溶液（移動相）中の標的分子を分離するなんらかの形態のクロマトグラフィーを含む。一般的なクロマトグラフィー法およびその使用は、当業者に公知である。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９を参照されたい。組換え抗体精製のための多種多様な方法が公知であり、限定されるものではないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびそれらの組合せが挙げられる。抗体精製のための他の技術、たとえば、イオン交換カラム分画、エタノール沈殿、等電点電気泳動、逆相ＨＰＬＣ、シリカクロマトグラフィー、ヘパリンクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー（たとえば、ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫安沈殿もまた、精製プロセスに含まれうる。多くの場合、親和性、電荷、疎水性度、および／またはサイズなどの異なる原理に基づいて異なるプロセスにより組換え産生抗体を分離するように、異なる精製プロセスの組合せが使用される。多くのプラットフォームプロセスは、陰イオン交換、陽イオン交換、疎水性相互作用、混合モード樹脂などの組合せクロマトグラフィー工程を含む。特定の組換えポリペプチドに合わせて精製スキームを調整できるように、各技術に対して多種多様なクロマトグラフィー樹脂が入手可能である。自動フローシステムおよび重力フローシステムは両方とも、自動画分捕集システムに結合可能である。
【００６８】
一実施形態では、精製スキームとして、精製プロセスの組合せが利用される。精製スキームの一例１００は、図１２にフロー図として示されている。サンプル精製スキーム１００は、標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントが、たとえば、宿主細胞内発現により、産生され、そして回収される第１の工程１０１を含む。組換え抗体の産生および回収の方法は、以上に考察されている。次いで、たとえば、アフィニティークロマトグラフィーを用いて、標的抗体をキャプチャーする１０２。一実施形態では、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーは、キャプチャー工程１０２として使用され、プロセスストリームからＨＣＰ、ＤＮＡ、およびウイルス汚染物質を効果的に除去することが可能である。精製プロセスはまた、典型的には、ＤＮＡ、ＨＣＰ、ウイルス汚染物質をさらに減少させるために、および凝集体を除去するために、１つ以上のポリッシングクロマトグラフィー工程１０４、１０５を含みうる。ウイルスクリアランスを改善するために、精製スキーム１００にウイルス不活性化工程１０３および／またはウイルス濾過工程１０６もまた、含まれうる。最後に、精製産物を濃縮し、最終製剤緩衝液１０７中に透析濾過することが可能である。図１２に提供されたスキームは、単なる例にすぎず、たとえば、工程の順序、工程の数、および各工程に使用される精製方法の変更は、十分に当業者の能力の範囲内にあることに留意されたい。
【００６９】
一実施形態では、キャプチャー１０２は、アフィニティークロマトグラフィーにより達成される。アフィニティークロマトグラフィーとは、ポリペプチドと固相に共有結合された結合パートナーとの特異的可逆的相互作用に基づいて組換え産生抗体などの生体分子を分離するクロマトグラフィー法を意味する。親和性相互作用の例としては、抗原と抗体、酵素と基質、またはレセプターとリガンドの可逆的相互作用が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーは、プロテインＡやプロテインＧなどの微生物タンパク質の使用を含む。プロテインＡは、主にＦｃ領域を介して哺乳動物ＩｇＧに結合する細菌細胞壁タンパク質である。プロテインＡ樹脂は、さまざまな抗体アイソタイプ、とくに、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、およびＩｇＧ4のアフィニティー精製および単離に有用である。本明細書に記載の精製プロセスに使用するのに好適である入手可能な多くのプロテインＡ樹脂が存在する。樹脂は、一般的には、その骨格組成に基づいて分類され、たとえば、ガラス系またはシリカ系の樹脂、アガロース系樹脂、および有機ポリマー系樹脂が挙げられる。
【００７０】
一実施形態では、標的抗体またはその所望のフラグメントをキャプチャーするために、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーが使用される。アフィニティークロマトグラフィー担体を通る流量は、分離を最適化するための重要なパラメーターである。分離時間の低減が望ましいこともあるが、急速すぎる流量では、内部ビーズ体積に達するのに必要な拡散時間よりも速く移動相が固相を通って移動するおそれがある。一般的には、少なくとも約５０ｃｍ／時、１００ｃｍ／時、１５０ｃｍ／時、２００ｃｍ／時、または２５０ｃｍ／時から、約３００ｃｍ／時、３５０ｃｍ／時、４００ｃｍ／時、４５０ｃｍ／時、または５００ｃｍ／時までの流量が使用される。カラム寸法もまた、変更可能である。実験台規模のカラムは、一般的には、１ｃｍ未満または５ｃｍ未満のカラム直径を有し、一方、大規模または商業生産規模では、１メートルまで、さらには２メートルまでの直径を有するカラムを使用可能である。大規模生産または商業生産では、カラム床の高さは、一般的には、少なくとも約１０ｃｍ、１５ｃｍ、または２０ｃｍ、かつ最大で約２５ｃｍまたは３０ｃｍである。
【００７１】
プロテインＡ精製との関連で用いられる緩衝溶液の組成および緩衝溶液の体積は、変更可能である。「緩衝液」または「緩衝溶液」という用語は、ｐＨ変化に対して耐性でありうる溶液を意味する。多くの場合、緩衝液は、弱共役酸塩基対、たとえば、弱酸とその共役塩基、または弱塩基とその共役酸）で作製される。いくつかの緩衝液では、緩衝剤は、結晶の酸または塩基として供給され、たとえば、トリスは、結晶の塩基として供給され、緩衝溶液を形成するために水中に溶解される。緩衝溶液のｐＨは、適切な酸または塩基を用いて調整可能である。たとえば、塩酸（ＨＣｌ）を用いてトリス緩衝溶液のｐＨを調整可能である。他の緩衝液は、２つの成分、たとえば、遊離酸または遊離塩基と対応する塩とを所望のｐＨが達成される比で混合することにより、調製される。たとえば、クエン酸ナトリウム緩衝溶液は、所望のｐＨの溶液が形成されるようにクエン酸とクエン酸三ナトリウムとを組み合わせることにより、所望のｐＨに調整可能である。他の緩衝液は、緩衝液成分とその共役酸または共役塩基とを混合することにより作製される。たとえば、リン酸緩衝液は、第一リン酸ナトリウム溶液と第二リン酸ナトリウム溶液とを所望のｐＨが達成される比で混合することにより作製される。他の実施形態では、重炭酸ナトリウム緩衝液系は、所望のｐＨを有する緩衝溶液が形成されるように炭酸ナトリウムの溶液と重炭酸ナトリウムの溶液とを組み合わせることにより調製可能である。
【００７２】
一実施形態では、カラムは、負荷前に「平衡化緩衝液」で平衡化される。「平衡化緩衝液」という用語は、たとえば、カラムのｐＨを調整することにより、カラムマトリックスから望ましくない残留物を除去したり、標的タンパク質を負荷するためのカラムマトリックスの固相を調製したりするために使用可能な緩衝液を意味する。抗体精製に使用する場合、平衡化緩衝液のｐＨは、少なくとも約６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、または７．９、かつ最大で約７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、または９．０である。一実施形態では、平衡化緩衝液は、緩衝剤、たとえば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（「Ｔｒｉｓ」として参照されることが多い）（ｐＨ範囲５．８〜８．０）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ範囲６．８〜８．２）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）（ｐＨ範囲６．５〜７．９）、または他のリン酸塩緩衝剤（ｐＨ５．８〜８．０）を、少なくとも約１０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、または７５ｍＭ、かつ最大で約１００ｍＭ、１２５ｍＭ、または１５０ｍＭの濃度で含む。一実施形態では、緩衝溶液のｐＨは、塩酸（ＨＣｌ）や水酸化ナトリウム／水酸化カリウム（ＮａＯＨ／ＫＯＨ）などの適切な酸または塩基を用いて調整可能である。一実施形態では、平衡化緩衝液は、少なくとも約６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、または７．９、かつ最大で約７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、または９．０のｐＨで、少なくとも約１０ｍＭ、１５ｍＭ、または２０ｍＭ、かつ最大で約２５ｍＭ、３０ｍＭ、５０ｍＭ、または１００ｍＭのリン酸ナトリウムを含む。そのほかに、緩衝液は、限定されるものではないが、酸化的損傷から保護するために、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、ジチオトレイトール（ＤＤＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤、内因性プロテアーゼによる標的ポリペプチドの分解を阻害するために、限定されるものではないが、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、およびフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）をはじめとするプロテアーゼ阻害剤、メタロプロテアーゼを不活性化するために、限定されるものではないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）をはじめとする金属キレート化剤、タンパク質構造を安定化するために、限定されるものではないが、グリセロール、界面活性剤、および糖をはじめとするオスモライト、または溶解性を向上させるために、限定されるものではないが、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4などの塩をはじめとするイオン性安定化剤を含めて、タンパク質の純度、安定性、および機能を向上させるために、１種以上の添加剤を含みうる。一実施形態では、カラムは、組換え産生ポリペプチドをカラムに負荷する前に、少なくとも約５かつ最大で約１０または２０カラム体積の平衡化緩衝液を用いて、平衡化される。
【００７３】
一実施形態では、清澄細胞培養上清は、カラム上に負荷される。一実施形態では、清澄細胞培養上清は、平衡化緩衝液でカラムを平衡化した後、カラム上に負荷される。さらなる実施形態では、清澄細胞培養上清は、負荷緩衝液と組み合わせてカラム上に負荷される。「負荷緩衝液」とは、標的をカラムに負荷する前に標的ポリペプチドを含む組成物と組み合わされる緩衝液を意味する。一般的には、標的ポリペプチドは、少なくとも約１ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、または２５ｍｇ／ｍｌ、かつ最大で約３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、７５ｍｇ／ｍｌ、または１００ｍｇ／ｍｌの濃度で負荷される。一実施形態では、清澄細胞培養上清は、標的ポリペプチドの所望の濃度を達成するためにおよび／または溶液のｐＨを調整するために、負荷緩衝液で約１：１、１：２、または１：３の比に希釈される。他の実施形態では、清澄細胞培養上清は、カラム上に直接負荷される（すなわち、上清は、負荷緩衝液で希釈されない）。一実施形態では、カラムは、清澄細胞培養上清を負荷した後、平衡化緩衝液で再平衡化される。より特定的な実施形態では、カラムは、標的ポリペプチドがカラム上に負荷された後、少なくとも約５かつ最大で約１０または２０カラム体積の平衡化緩衝液または負荷緩衝液で再平衡化される。一般的には、標的ポリペプチドは、少なくとも約６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、または７．９、かつ最大で約７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、または９．０のｐＨで、プロテインＡカラム上に負荷される。いくつかの実施形態では、負荷緩衝液は、平衡化緩衝液と同一である。他の実施形態では、負荷緩衝液および平衡化緩衝液は、同一ではない。他の実施形態では、負荷緩衝液はまた、負荷後にカラムを洗浄するための洗浄緩衝液としても使用される。
【００７４】
一実施形態では、負荷緩衝液は、緩衝剤、たとえば、ヒスチジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（「Ｔｒｉｓ」として参照されることが多い）（ｐＨ範囲５．８〜８．０）、４−（２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ範囲６．８〜８．２）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）（ｐＨ範囲６．５〜７．９）、または他のリン酸緩衝剤、たとえば、リン酸ナトリウムもしくはリン酸−クエン酸緩衝剤（ｐＨ５．８〜８．０）を、少なくとも約１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、または５０ｍＭ、かつ最大で約５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、または１００ｍＭの濃度で含む。一実施形態では、緩衝溶液のｐＨは、塩酸（ＨＣｌ）や水酸化ナトリウム／水酸化カリウム（ＮａＯＨ／ＫＯＨ）などの適切な酸または塩基を用いて調整可能である。抗体精製に使用する場合、負荷緩衝液のｐＨは、一般的には、少なくとも約６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、または７．９、かつ最大で約７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、または９．０に調整される。より特定の実施形態では、負荷緩衝液は、少なくとも約６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、または７．９、かつ最大で約７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、または９．０のｐＨで、少なくとも約１０ｍＭ、１５ｍＭ、または２０ｍＭ、かつ最大で約２５ｍＭ、３０ｍＭ、５０ｍＭ、または１００ｍＭのリン酸ナトリウムを含む。一実施形態では、カラムは、少なくとも約５かつ最大で約１０または２０カラム体積の平衡化緩衝液または負荷緩衝液を用いて負荷した後、再平衡化される。そのほかに、平衡化緩衝液は、限定されるものではないが、酸化的損傷から保護するために、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、ジチオトレイトール（ＤＤＴ）、またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤、内因性プロテアーゼによる標的ポリペプチドの分解を阻害するために、限定されるものではないが、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、およびフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）をはじめとするプロテアーゼ阻害剤、メタロプロテアーゼを不活性化するために、限定されるものではないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）をはじめとする金属キレート化剤、タンパク質構造を安定化するために、限定されるものではないが、グリセロール、界面活性剤、および糖をはじめとするオスモライト、または溶解性を向上させるために、限定されるものではないが、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、および（ＮＨ4）2ＳＯ4などの塩をはじめとするイオン性安定化剤を含めて、タンパク質の純度、安定性、および機能を向上させるために、１種以上の添加剤を含みうる。
【００７５】
「洗浄緩衝液」という用語は、標的組成物をカラムに負荷した後、かつ組換え産生標的ポリペプチドの溶出前、カラム材料を通り抜ける緩衝液を意味する。洗浄緩衝液は、標的の実質的溶出を伴うことなく、１種以上の汚染物質、たとえば、抗体フラグメント化産物不純物をカラム材料から除去するように機能しうる。一般的には、洗浄緩衝液は、少なくとも約６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、または７．９、かつ最大で約７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、または９．０のｐＨを有する。一実施形態では、プロセスは、１種の洗浄緩衝液を含み、カラムは、少なくとも約５または最大で約１０もしくは２０カラム体積の単一洗浄緩衝液を用いて洗浄される。他の実施形態では、プロセスは、２種以上の洗浄緩衝液を含みうる。たとえば、プロセスは、２つの異なる洗浄緩衝液を含みうる。たとえば、プロセスは、少なくとも約５または最大で約１０もしくは２０カラム体積の第１の洗浄緩衝液を用いてカラムを洗浄する第１の洗浄工程と、少なくとも約５または最大で約１０もしくは２０カラム体積の第２の洗浄緩衝液カラムを洗浄する第２の洗浄工程と、を含みうる。一実施形態では、少なくとも１種の洗浄緩衝液は、平衡化緩衝液と同一である。他の実施形態では、少なくとも１種の洗浄緩衝液は、平衡化緩衝液とは異なる。
【００７６】
そのほかに、洗浄緩衝液は、限定されるものではないが、酸化的損傷から保護するために、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、ジチオトレイトール（ＤＤＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤、内因性プロテアーゼによる標的ポリペプチドの分解を阻害するために、限定されるものではないが、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、およびフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）をはじめとするプロテアーゼ阻害剤、メタロプロテアーゼを不活性化するために、限定されるものではないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）をはじめとする金属キレート化剤、タンパク質構造を安定化するために、限定されるものではないが、グリセロール、界面活性剤、および糖をはじめとするオスモライト、または溶解性を向上させるために、限定されるものではないが、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4などの塩をはじめとするイオン性安定化剤を含めて、タンパク質の純度、安定性、および機能を向上させるために、１種以上の添加剤を含みうる。
【００７７】
「溶出緩衝液」という用語は、標的ポリペプチドをカラムから溶出させるために（すなわち、除去するために）使用される緩衝液を意味する。溶出ｐＨは、カラムに対するポリペプチドの結合親和性に依存して変化しうる。いくつかの抗体は、より高い結合親和性を呈し、かつより低い溶出ｐＨを必要としうる。一般的には、溶出緩衝液のｐＨは、負荷緩衝液のｐＨ未満である。典型的には、溶出緩衝液は、少なくとも約２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、または３．５、かつ最大で約３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．５、４．７、４．８、４．９、または５．０のｐＨを有する。溶出緩衝液の例としては、少なくとも約２５ｍＭまたは５０ｍＭかつ最大で約１００ｍＭ、１５０ｍＭ、または２００ｍＭの濃度でクエン酸ナトリウム、クエン酸、または酢酸を含む緩衝液が挙げられる。一実施形態では、溶出緩衝液は、少なくとも約２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、または３．５、かつ最大で約３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．５、４．７、４．８、４．９、または５．０のｐＨで、少なくとも約２５ｍＭ、５０ｍＭ、かつ最大で約１００ｍＭ、１５０ｍＭ、または２００ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む。そのほかに、溶出緩衝液は、限定されるものではないが、酸化的損傷から保護するために、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、ジチオトレイトール（ＤＤＴ）、またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤、内因性プロテアーゼによる標的ポリペプチドの分解を阻害するために、限定されるものではないが、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、およびフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）をはじめとするプロテアーゼ阻害剤、メタロプロテアーゼを不活性化するために、限定されるものではないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）をはじめとする金属キレート化剤、タンパク質構造を安定化するために、限定されるものではないが、グリセロール、界面活性剤、および糖をはじめとするオスモライト、または溶解性を向上させるために、限定されるものではないが、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、および（ＮＨ4）2ＳＯ4などの塩をはじめとするイオン性安定化剤を含めて、タンパク質の純度、安定性、および機能を向上させるために、１種以上の添加剤を含みうる。一実施形態では、標的分子は、少なくとも５かつ最大で１０または２０カラム体積の溶出緩衝液を用いて溶出される。溶出液は、当業者に周知の技術を用いて、たとえば、ＯＤ280ｎｍに設定された分光光度計を用いて吸光度をモニターすることにより、モニター可能である。一実施形態では、プロテインＡ精製工程は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、または８５％、かつ最大で約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、または９５％の回収率を有する。回収率は、たとえば、カラム上に負荷された量を基準にして溶出液中のタンパク質のパーセントを計算することにより、決定可能である。
【００７８】
ポリッシングクロマトグラフィー工程１０４、１０５は、ウイルス、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、内毒素、およびＤＮＡのさらなるクリアランスを提供するとともに、凝集体、望ましくない産物変異体、および他の副次的汚染物質の除去を支援する。ポリッシング工程１０４、１０５は、一般的には、１つ以上のクロマトグラフィー工程、たとえば、イオン交換クロマトグラフィー（陰イオン交換および／または陽イオン交換）、混合モードクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびそれらの組合せを含む。
【００７９】
一実施形態では、精製プロセスは、少なくとも１つのイオン交換クロマトグラフィー工程を含む。「イオン交換クロマトグラフィー」という用語は、共有結合荷電置換基を保有する固定マトリックスを用いたクロマトグラフィープロセスを意味する。「イオン交換材料」は、共有結合されていないその対イオンを周囲溶液中の類似荷電の結合パートナーまたはイオンと交換する能力を有する。ポリペプチドは、正電荷または負電荷のいずれかを有しうる多数の官能基を有する。イオン交換クロマトグラフィーは、移動相のｐＨおよび／またはイオン濃度に依存する正味電荷に基づいてポリペプチドを分離する。したがって、ポリペプチドは、移動相のｐＨおよび／またはイオン濃度を調整することにより分離可能である。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、カラムによりキャプチャーされ、次いで、溶出される（「結合および溶出」モードとしても参照される）。他の実施形態では、標的ポリペプチドは、カラムを貫流し、汚染物質は、結合される（「フロースルーモード」としても参照される）。イオン交換材料からの溶出は、一般的には、イオン交換マトリックスの荷電部位に対して標的と競合するように緩衝液のイオン強度を増加させることにより、達成される。溶出プロセスは、漸進的（グラジエント溶出）または段階的（ステップ溶出）であり、溶出液は、たとえば、ＯＤ280ｎｍに設定されたＵＶ分光光度計を用いてモニター可能である。
【００８０】
対イオンの電荷に依存して、「イオン交換クロマトグラフィー」は、「陽イオン交換」、「陰イオン交換」、または「混合モードイオン交換」として参照可能である。「陽イオン交換」という用語は、カラムを通過または貫流する水性溶液中の陽イオンとの交換に利用可能な遊離陽イオンを有して負に荷電した固相を有するクロマトグラフィー法を意味する。陽イオン交換クロマトグラフィーは、標的ポリペプチドを正に荷電する条件下に標的が維持される場合、組換え抗体を精製するために使用可能である。たとえば、溶液ｐＨが標的の等電点未満になるように、溶液を調整することが可能である。標的のほかに、他の正荷電不純物もまた、陽イオンカラム樹脂に結合されうる。このように、標的は、樹脂への不純物の結合を維持した状態で標的を溶出させる条件下（たとえば、ｐＨおよび塩濃度）でカラムから溶出させることにより、回収可能である。陽イオン交換樹脂は、スルホプロピル基、スルホエチル基、スルホイソブチル基などの強酸性リガンドまたはカルボキシル基などの弱酸性リガンドを含みうる。一般に使用される陽イオン交換樹脂の例としては、カルボキシメチル（ＣＭ）樹脂、スルホエチル（ＳＥ）樹脂、スルホプロピル（ＳＰ）樹脂、リン酸塩（Ｐ）樹脂、およびスルホン酸塩（Ｓ）樹脂が挙げられる。
【００８１】
「陰イオン交換」という用語は、固相を通過または貫流する水性溶液中の陰イオンとの交換に利用可能な遊離陰イオンを有して正に荷電した固相を有するクロマトグラフィー法を意味する。陰イオン交換カラムは、典型的には、負荷電不純物が樹脂に結合されると同時に正荷電標的がフロースルーストリーム中に回収されるように、フロースルーモードで操作される。しかしながら、陰イオン交換カラムはまた、標的のｐＩおよび除去される不純物に依存して、結合・溶出モードで使用されうる。陰イオン交換に使用される正荷電基の例としては、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）やジメチルアミノエチル（ＤＭＡＥ）などの弱塩基性基、および第４級アミン（Ｑ）基、トリメチルアンモニウムエチル（ＴＭＡＥ）基、第４級アミノエチル（ＱＡＥ）基などの強塩基性基が挙げられる。
【００８２】
一実施形態では、プロテインＡキャプチャー工程１０２から得られる溶出液は、１つ、２つ以上、または３つ以上のイオン交換分離に付され、第２のイオン交換分離工程は、第１のイオン交換分離と反対の電荷に基づく分離を含む。たとえば、キャプチャー１０２の後、陰イオン交換工程１０４が利用される場合、第２のイオン交換クロマトグラフィー工程１０５は、陽イオン交換工程でありうる。反対に、陽イオン交換工程１０４がキャプチャー１０２に続く場合、その工程に陰イオン交換工程１０５が続くであろう。他の選択肢として、他の実施形態では、精製スキーム１００は、陽イオン交換工程のみまたは陰イオン交換工程のみを含みうる。
【００８３】
他の実施形態では、精製スキームは、キャプチャー工程としておよび／またはポリッシング工程として混合モードクロマトグラフィーを含みうる。混合モードクロマトグラフィーは、タンパク質または他の溶質を吸収するために、限定されるものではないが、イオン性相互作用（すなわち、陽イオンと陰イオン）、水素結合、および／または疎水性相互作用をはじめとする化学的機構の組合せを利用する固相クロマトグラフィー担体の使用を含む。例としては、次の機構、すなわち、陰イオン交換（ＡＥＸ）、陽イオン交換（ＣＥＸ）、疎水性相互作用（ＨＩＣ）、親水性相互作用、水素結合、π−π結合、および金属親和性の２つ以上の組合せを活用するクロマトグラフィー担体が挙げられる。一実施形態では、精製スキームは、陰イオン交換（ＡＥＸ）および疎水性相互作用（ＨＩＣ）の混合モードクロマトグラフィー工程を含む。他の実施形態では、精製スキームは、陽イオン交換（ＣＥＸ）および疎水性相互作用（ＨＩＣ）の混合モードクロマトグラフィー工程を含む。より特定の実施形態では、精製スキームは、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）混合モード（ＡＥＸおよびＨＩＣ）クロマトグラフィー工程を含む。複数の機構（イオン結合、Ｈ結合、および疎水結合）が組み合わされて、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）上でのタンパク質のクロマトグラフィー挙動に関与する。他の実施形態では、精製スキームは、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ（商標）混合モード（ＣＥＸおよびＨＩＣ）クロマトグラフィー工程を含む。Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）などの混合モードクロマトグラフィーは、抗体のキャプチャーおよびキャプチャー時の宿主細胞タンパク質の低減（Ｐｅｚｚｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１），Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ，１２１８：８１９７）、モノクローナル抗体精製時の凝集体の除去（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ，１２９４：７０）、およびウイルスクリアランス（Ｃｏｎｎｅｌｌ−Ｃｒｏｗｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，１１０：１９８４）に効果的であることが知られているが、今まで、混合モードクロマトグラフィーは、標的モノクローナル抗体からモノクローナル抗体フラグメント化産物不純物を分離するために使用されてこなかった。しかしながら、本発明者らは、混合モードクロマトグラフィーがプラットフォーム製造プロセスに容易に統合可能な抗体フラグメント化産物不純物のロバストかつ有効な除去方法であることを見いだした。
【００８４】
一実施形態では、精製スキームは、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）精製工程を含む。サンプル負荷、伝導率、ｐＨなどの負荷条件は、収率に有利になるようにおよび／または不純物のクリアランスに有利になるように変化させることが可能である。一実施形態では、混合モード精製工程は、標的がカラムマトリックスに吸着されかつ汚染物質がカラムを通り抜ける結合・溶出モードで行うことが可能である。他の実施形態では、混合モード精製工程は、標的がカラムを通り抜けると同時に汚染物質がカラムマトリックスに吸着されるフロースルーモードで行うことが可能である。
【００８５】
一般的には、標的抗体または所望のその抗体フラグメントと負荷緩衝液とを含む出発材料は、カラム上に負荷される。一実施形態では、サンプル負荷は、約１０ｇ／Ｌ〜約５００ｇ／Ｌ、より典型的には約２５ｇ／Ｌ〜３００ｇ／Ｌである。結合・溶出モードで使用する場合、サンプル負荷は、一般的には、少なくとも約１ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、または３０ｇ／Ｌ、かつ最大で約３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、または５０ｇ／Ｌである。フロースルーモードで使用する場合、サンプル負荷は、一般的には、約２５ｇ／Ｌ〜５００ｇ／Ｌ、または７５ｇ／Ｌ〜２５０ｇ／Ｌ、たとえば、少なくとも約２５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１７５ｇ／Ｌ、または２００ｇ／Ｌ、かつ最大で約１００ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ）、１７５ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２２５ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌ、２７５ｇ／Ｌ、３００ｇ／Ｌ、３５０ｇ／Ｌ、４００ｇ／Ｌ、または５００ｇ／Ｌである。一般的には、より低い負荷容量（たとえば、約２５０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、または２５ｇ／Ｌ未満）の出発材料の精製は、標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントの純度が増加した産物をもたらす。一実施形態では、出発材料の伝導率は、約０ｍＳ／ｃｍ〜３０ｍＳ／ｃｍ、たとえば、少なくとも約１ｍＳ／ｃｍ、２ｍＳ／ｃｍ、３ｍＳ／ｃｍ、４ｍＳ／ｃｍ、５ｍＳ／ｃｍ、６ｍＳ／ｃｍ、７ｍＳ／ｃｍ、８ｍＳ／ｃｍ、９ｍＳ／ｃｍ、または１０ｍＳ／ｃｍ、かつ最大で約５ｍＳ／ｃｍ、６ｍＳ／ｃｍ、７ｍＳ／ｃｍ、８ｍＳ／ｃｍ、９ｍＳ／ｃｍ、１０ｍＳ／ｃｍ、１５ｍＳ／ｃｍ、２０ｍＳ／ｃｍ、２５ｍＳ／ｃｍ、または３０ｍＳ／ｃｍである。一般的には、出発材料がより低い伝導率、たとえば、約１０ｍＳ／ｃｍ、９ｍＳ／ｃｍ、８ｍＳ／ｃｍ、７ｍＳ／ｃｍ、６ｍＳ／ｃｍ、５ｍＳ／ｃｍ、４ｍＳ／ｃｍ、３ｍＳ／ｃｍ、２ｍＳ／ｃｍ、または１ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する場合、標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントの純度の増加が観測される。一実施形態では、混合モードカラム上に負荷される出発材料は、約８５％〜約９９％、または約９０％〜約９８％、または約９７％〜９８％の標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメント、たとえば、少なくとも約８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９７．１％、９７．２％、９７．３％、９７．４％、９７．５％、９７．６％、９７．７％、９７．８％、９７．９％、９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、かつ最大で約９７％、９７．１％、９７．２％、９７．３％、９７．４％、９７．５％、９７．６％、９７．７％、９７．８％、９７．９％、９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントと、約１％〜約１０％の抗体フラグメント化産物不純物または約１％〜約３％の抗体フラグメント化産物不純物、たとえば、少なくとも約１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、または１０％、かつ最大で約１０％または１５％の抗体フラグメント化産物不純物と、約１％〜約５％の凝集体または約１％〜約３％の凝集体、たとえば、約３％、２．９％、２．８％、２．７％、２．６％、２．５％、２．４％、２．３％、２．２％、２．１％、２％、１．９％、１．８％、１．７％、１．６％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、または０．１％未満の凝集体と、を含む。抗体フラグメントの残留レベルを決定する方法は公知であり、たとえば、ＲＰＬＣ、ＨＰＳＥＣが挙げられる。
【００８６】
混合モード樹脂と共に使用するのに好適な緩衝液系は、限定されるものではないが、所望のｐＨ範囲およびカラムが結合・溶出モードまたはフロースルーモードで使用されるかをはじめとする多くの因子に依存して変化しうる。カラムクロマトグラフィーで使用される通常の緩衝液としては、リン酸緩衝液、たとえば、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム、限定されるものではないが、クエン酸ナトリウムを含むクエン酸緩衝液、酢酸ナトリウム、および限定されるものではないが、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）を含む生物学的緩衝液、ならびにそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８７】
一般的には、負荷緩衝液は、約１ｍＭ〜約４０ｍＭ、たとえば、少なくとも約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、または２０ｍＭ、かつ最大で約１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、または４０ｍＭの濃度で使用される。一実施形態では、負荷緩衝液のｐＨは、約４〜約９、約５〜約８、もしくは約５．５〜約６．５、もしくは約５．７〜約６．１、または少なくとも約４、４．５、５、５．５、６、６．５、もしくは７、かつ最大で約６、６．５、７、７．５、８、８．５、もしくは９である。一般的には、より高いｐＨ（たとえば、少なくとも約５または少なくとも約５．５かつ最大で約６または最大で約６．５のｐＨ）での精製は、より低いｐＨ（たとえば、約５未満のｐＨ）と比較して、抗体フラグメント化産物不純物の除去および標的の純度を向上させる傾向がある。一実施形態では、負荷緩衝液の伝導率は、約１０ｍＳ／ｃｍ、９ｍＳ／ｃｍ、８ｍＳ／ｃｍ、７ｍＳ／ｃｍ、６ｍＳ／ｃｍ、５ｍＳ／ｃｍ、４ｍＳ／ｃｍ、３ｍＳ／ｃｍ、２ｍＳ／ｃｍ、または１ｍＳ／ｃｍ未満である。
【００８８】
一実施形態では、精製スキーム１００は、ポリッシング工程１０４または１０５として少なくとも１つの疎水相互作用分離を含む。「疎水性相互作用クロマトグラフィー」（ＨＩＣ）としは、ポリペプチドとクロマトグラフィー樹脂の固相に結合された疎水リガンドとの可逆的相互作用に基づくクロマトグラフィー分離を意味する。疎水性相互作用クロマトグラフィーは、多くの場合、抗体凝集体などのタンパク質凝集体およびプロセス関連不純物を除去するために使用される。ＨＩＣ時、標的ポリペプチドは、高い塩濃度でカラムに結合し、塩濃度の減少により溶出される。標的ポリペプチドと疎水リガンドとの相互作用は、高いイオン強度の緩衝液を用いることにより増強されるので、ＨＩＣは、イオン交換クロマトグラフィーの後で使用するのに好適な精製工程でありうる。種々のイオンは、それらが疎水相互作用（塩析効果）を促進するか、または水の構造の撹乱（カオトロピック効果）により疎水相互作用を弱めるかに依存して、いわゆる親溶媒性系列で並べることが可能である。
【００８９】
他の実施形態では、精製スキームは、ポリッシング工程１０４または１０５として「疎水電荷誘導クロマトグラフィー」（ＨＣＩＣ）を含む。ＨＣＩＣは、低ｐＨでイオン化するリガンドのｐＨ依存性挙動に基づく。ＨＣＩＣは、高い塩濃度を必要とすることなく標的ポリペプチドとカラム材料との疎水性相互作用が可能になるように、高密度でヘテロ環式リガンドを利用する。ＨＣＩＣでの溶出は、イオン化性リガンドと結合タンパク質との電荷反発を生じるようにｐＨを低下させることにより達成可能である。
【００９０】
一実施形態では、精製スキーム１００は、たとえば、内在性レトロウイルスおよび外来性ウイルスを除去するために、１つ以上のウイルス不活性化工程１０３および／またはウイルスクリアランス工程１０６を含む。一実施形態では、ウイルス不活性化工程１０３は、標的分子のキャプチャー１０２の後、組み込まれうる。ウイルス不活性化技術は、公知であり、たとえば、熱不活性化（パスツール殺菌）、ｐＨ不活性化、溶媒／界面活性剤を用いた脂質エンベロープの撹乱、ＵＶおよびγ線照射、ならびに化学的不活性化剤の使用が挙げられる。一実施形態では、ウイルス不活性化は、混合物を低ｐＨで一定時間インキュベートすることと、ｐＨを中和することと、濾過により微粒子を除去することと、を含む、低ｐＨウイルス不活性化工程を含む。一実施形態では、低ｐＨウイルス不活性化は、組換え抗体を約２〜約５または約３〜約４または約３．３〜約３．８のｐＨに調整することを含む。サンプル混合物のｐＨは、クエン酸、酢酸、カプリル酸、または他の好適な酸を含めて、任意の好適な酸により低下させうるが、これらに限定されるものではない。ｐＨレベルの選択は、標的および他の緩衝液成分の安定性プロファイルに依存する。典型的には、調整済み溶液は、少なくとも約３０または４５分間かつ最大で約１、１．５、または２時間にわたり、典型的には室温でインキュベートされる。ウイルス不活性化後、組換え抗体溶液のｐＨは、精製プロセスを継続する前に、より中性のｐＨ、たとえば、約４．５〜約８．５または約４．５〜約５．５に調整可能である。
【００９１】
他の実施形態では、ウイルス濾過などのウイルスクリアランス工程１０５が精製スキームに含まれうる。ウイルス保持フィルターは、市販されており、親水ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルター、親水ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）フィルター、および再生セルロースフィルターなどの限外濾過器または精密濾過器が挙げられる。除去されるウイルスのサイズに基づいて、ウイルスフィルターをレトロウイルスフィルターおよびパルボウイルスフィルターに分類することが可能である。
【００９２】
Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）などの混合モードクロマトグラフィーは、プラットフォームモノクローナル抗体精製プロセスに容易に統合可能である。多くのプラットフォームプロセスは、プロテインＡキャプチャー工程に続いて、低ｐＨ不活性化、ポリッシング工程、たとえば、陰イオン交換、陽イオン交換、およびそれらの組合せ、ならびに最後にナノ濾過および製剤の限外濾過／透析濾過を含む。多くのプラットフォームプロセスでは、低ｐＨウイルス不活性化工程後に得られる低ｐＨ産物は、伝導率が低く、約ｐＨ７．５に中和しなければならい。その後、ポリッシング樹脂上に負荷可能である。混合モード樹脂の使用は、低い伝導率を維持しながらより低いｐＨ（たとえば、ｐＨ５．５〜６．０）でプロセスを行うことが可能であるので必要とされる塩基の添加量がより少なくなるという点で有利であり得る。
【００９３】
一実施形態では、精製スキームは、標的のさらなる精製および濃縮を行うために、限外濾過（ＵＦ）および／または透析濾過（ＤＦ）工程１０７を含む。ＵＦ／ＤＦにより、標的高分子の濃度を増加させたり、さらには緩衝塩を特定の製剤緩衝剤に置き換えたりすることが可能である。限外濾過（ＵＦ）とは、静水圧により液体が半透膜に押圧されるタイプの膜濾過を意味する。懸濁固体および高分子量溶質たとえば標的は、保持物中に保持され、一方、水および低分子量溶質は、膜を通過して濾液中に保持される。このようにして、液体および塩が除去されるので、標的が濃縮される。一般的には、濃縮物中の低分子量組成物は、一定に維持されるので、濃縮溶液のイオン強度は、比較的一定した状態を維持する。「透析濾過」とは、抗体などのタンパク質、ペプチド、核酸、および他の生体分子を含有する溶液から、塩または緩衝成分の濃度を除去、置換、または低減するために、限外濾過膜を使用する方法を意味する。連続透析濾過（定体積透析濾過としても参照される）は、組換え産生ポリペプチドを含有する製剤を形成するために、水または新しい緩衝液たとえば製剤緩衝液を保持物に添加することにより、保持物中に最初からあった緩衝塩（または他の低分子量種）を洗浄除去することを含む。典型的には、新しい緩衝液は、保持物の体積および産物の濃度が透析濾過時にあまり変化しないように、濾液を生成するのと同一の速度で添加される。
【００９４】
４．５．製剤
一実施形態では、標的ポリペプチドは、液状製剤で調製される。より特定の実施形態では、液状製剤中の標的ポリペプチドは、抗体または抗体フラグメント、たとえば、組換え産生抗体またはその所望の抗体フラグメントである。一実施形態では、液状製剤は水などの水性担体を含む。一実施形態では、液状製剤は無菌である。他の実施形態では、液状製剤は、均一である。他の実施形態では、製剤は等張性である。一実施形態では、液状製剤は、少なくとも約１ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、７５ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１２５ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、１７５ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、２５０ｍｇ／ｍｌ、または３００ｍｇ／ｍｌの標的を含む。一実施形態では、製剤は、少なくとも約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、または６．５、かつ最大で約６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．５、８．０、８．５、または９．０のｐＨを有する。製剤はまた、緩衝剤、糖、塩、界面活性剤、可溶化剤、希釈剤、結合剤、安定化剤、親油性溶媒、アミノ酸、キレート化剤、保存剤、またはそれらの組合せをはじめとする通常の賦形剤および／または添加剤を含みうるが、これらに限定されるものではない。
【００９５】
他の実施形態では、標的は、凍結乾燥製剤として調製される。より特定の実施形態では、凍結乾燥製剤中の標的は、抗体または抗体フラグメント、たとえば、組換え産生抗体またはその所望のフラグメントである。本明細書で用いられる場合、「凍結乾燥」という用語は、少なくとも５０％の湿分が出発材料から除去される凍結乾燥などの乾燥手順に付された製剤を意味する。一実施形態では、凍結乾燥製剤は、凍結乾燥保護剤を含む。「凍結乾燥保護剤」という用語は、凍結乾燥時および後続の貯蔵時、標的の化学的および／または物理的不安定性を有意に防止または低減する、標的と組み合わされる分子を意味する。凍結乾燥保護剤としては、糖およびその対応する糖アルコール、アミノ酸、たとえば、グルタミン酸一ナトリウム、アルギニン、またはヒスチジン、メチルアミン、たとえば、ベタイン、リオトロピック塩、たとえば、硫酸マグネシウム、ポリオール、たとえば、三価以上の高分子量糖アルコール、たとえば、グリセリン、デキストラン、エリトリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、およびマンニトール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）、ならびにそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。凍結乾燥保護剤の追加の例としては、グリセリンおよびゼラチン、ならびに糖類のメリビオース、メレジトース、ラフィノース、マンノトリオース、およびスタキオースが挙げられるが、これらに限定されるものではない。還元糖の例としては、グルコース、マルトース、ラクトース、マルツロース、ｉｓｏ−マルツロース、およびラクツロースが挙げられるが、これらに限定されるものではない。非還元糖の例としては、糖アルコールおよび他の直鎖状ポリアルコールから選択されるポリヒドロキシ化合物の非還元グリコシドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。糖アルコールの例としては、モノグリコシド、二糖、たとえば、ラクトース、マルトース、ラクツロース、およびマルツロースの還元により得られる化合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。グリコシド側基は、グルコシドまたはガラクトシドでありうる。糖アルコールの追加の例としては、グルシトール、マルチトール、ラクチトール、およびｉｓｏ−マルツロースが挙げられるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態では、トレハロースまたはスクロースが凍結乾燥保護剤として使用される。一実施形態では、凍結乾燥保護剤は、「凍結乾燥保護量」で製剤に添加される。つまり、凍結乾燥保護量の凍結乾燥保護剤の存在下でのタンパク質の凍結乾燥の結果、標的は、凍結乾燥時および貯蔵時、その物理的および化学的な安定性および完全性を本質的に維持する。「再構成」製剤とは、標的が再構成製剤中に分散されるように凍結乾燥製剤を希釈液中に溶解させることにより調製された製剤のことである。再構成製剤は、患者に投与するのに好適である。「希釈液」としては、無菌水、注入用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）、無菌生理食塩水溶液、リンゲル液、またはデキストロース溶液をはじめとする薬学的に許容可能な希釈液が挙げられるが、これらに限定されるものではない。代替実施形態では、希釈液は、塩および／または緩衝剤の水性溶液を含みうる。一実施形態では、組換え産生抗体またはそのフラグメントは、少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、または５０ｍｇ／ｍｌ、かつ最大で約５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、または１００ｍｇ／ｍｌの濃度で凍結乾燥製剤に含まれる。より特定的な実施形態では、凍結乾燥製剤は、少なくとも約１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、または２５ｍＭ、かつ最大で約３０ｍＭ、４０ｍＭ、または５０ｍＭの濃度で、緩衝剤としてヒスチジン、アルギニン、グルタミン酸などのアミノ酸を含む。一実施形態では、凍結乾燥製剤は、少なくとも約５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、１７５ｍＭ、２００ｍＭ、または２２５ｍＭ、かつ最大で約２５０ｍＭまたは３００ｍＭの濃度でトレハロースやスクロースなどの糖を含む。一実施形態では、凍結乾燥製剤は、少なくとも約０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、または０．０５％（ｗ／ｖ）、かつ最大で約０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、または０．１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０などの界面活性剤を含む。一実施形態では、凍結乾燥製剤は、少なくとも約６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、または７．９、かつ最大で約７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、または９．０のｐＨを有する。
【００９６】
一実施形態では、標的は、非経口投与に供すべく製剤化される組換え産生抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントである。一実施形態では、製剤は、注射可能である。一実施形態では、標的は、静脈内投与、皮下投与、または筋肉内投与に供すべく製剤化される。
【実施例】
【００９７】
５．実施例
以下の実施例を提供して、本明細書に記載の本発明の例示に役立てる。それらは、本発明の範囲を限定したり規定したりすることを意図したものではない。
【００９８】
実施例で利用される試薬は、市販されているか、または当技術分野で公知の商業的に利用可能な機器、方法、もしくは試薬を用いて調製可能である。実施例は、本発明の種々の態様および本発明に係る方法の実施を例示したものである。実施例は、本発明の多種多様な実施形態の網羅的説明を提供することを意図したものではない。したがって、明確に理解することを目的に、例示および実例により、本発明をやや詳細に説明してきたが、当業者であれば、添付の特許請求の趣旨または範囲から逸脱することなく多くの変更および修正を加えうることは、容易に分かるであろう。
【００９９】
本明細書に挙げた出版物、特許、および特許出願はすべて、あたかも個々の出版物、特許、または特許出願が具体的かつ個別的に明示されて参照により組み込まれたのと同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１００】
実施例１：
モノクローナル抗体（ＭＥＤＩ−５４６）の精製に使用されるサイクル１のプロセスは、２ｇ／Ｌの細胞培養産物を用いて行われた。表３に示されるように、精製サイクル１の材料は、高純度であった（すなわち、単量体含有率が高く、かつフラグメントレベルが低かった）。しかしながら、４ｇ／Ｌのサイクル２の細胞培養産物は、より高いフラグメントレベルおよびより高い単量体レベルを含有する出発材料を生成した。本明細書には、サイクル１の産物品質に一致しかつ精製プロセスの各操作で＞９０％の収率を維持した状態で高濃度の細胞培養産物（すなわち、４ｇ／Ｌ）からフラグメント化種を除去可能なプロセスが記載されている。フラグメント化プロファイルの解析から、サイクル１およびサイクル２の細胞培養材料は、同一のフラグメント化種を生成することが実証された。しかしながら、サイクル２の材料は、レベルの増加した大および小ヒンジフラグメント（ＬＨＦ／ＳＨＦ）を含有していた。図１は、２つの細胞培養材料のペプチド切断部位の概略図さらにはＲＰＬＣアッセイプロファイルを示している。
【０１０１】
【表３】
2016538267.tif 000005
【０１０２】
材料および装置
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）樹脂、Ｃａｐｔｏ  Ｑ（商標）樹脂、Ｃａｐｔｏ  Ｐｈｅｎｙｌ（商標）樹脂、およびＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）樹脂は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。Ｃ０ＨＣデプスフィルターは、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から購入した。酢酸、アルギニン、酢酸ナトリウム、酢酸ナトリウム三水和物、塩化ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、トリス塩基、トリス塩酸塩、および尿素は、Ａｖａｎｔｏｒ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）から購入した。エチレングリコールは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から購入した。クロマトグラフィー実験のために、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｃｉａ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から購入したＶａｎｔａｇｅ（商標）カラムに樹脂を充填した。ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入したＡｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ上のｕｎｉｃｏｒｎ５．２ソフトウェアにより精製を制御した。統計解析のために、ＳＡＳ（Ｃａｒｙ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ）からＪｍｐバージョン８．０ソフトウェアを購入した。
【０１０３】
細胞培養物の調製
細胞懸濁液を含有するクライオバイアルを解凍し、細胞懸濁液を用いて成長培地を含有する振盪フラスコに接種した。一定レベルの二酸化炭素および空気が存在する温度制御インキュベーター内に振盪フラスコを配置し、撹拌して細胞の曝気および十分な混合を維持した。より大容量の成長培地に移して細胞を継代することにより、シードトレイン（すなわち、全細胞数を増加させるプロセス）を継続した。初期細胞拡大工程を振盪フラスコで終了させたが、産生バイオリアクターに接種するのに十分なバイオマスが蓄積されるまで、シードトレインをバイオリアクターに拡張した。シードバイオリアクターを一定温度に維持し、かつ撹拌および曝気を行って、細胞を目標の成長速度に維持した。十分な細胞量が蓄積される時点まで、制御された温度、ｐＨ、溶存酸素、曝気、および撹拌下で、産生バイオリアクターで成長させた。設定レベルの細胞量を取得した後、産生バイオリアクターに栄養素をボーラス添加で供給し、細胞成長および抗体産生を促進した。１２日目まで１日おきに産生バイオリアクターに供給し、その時点でバイオリアクターを冷却して回収および精製に備えた。
【０１０４】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ
試験サンプルをＴｏｓｏＨａａｓ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（７．８ｍｍ×３０ｃｍ）に注入した。０．１Ｍ硫酸ナトリウムと０．０５％アジ化ナトリウムとを含有する０．１Ｍリン酸ニナトリウムｐＨ６．８を１．０ｍｌ／分の流量で用いて、サンプルをアイソクラチックに溶出させた。溶出されたタンパク質を２８０ｎｍのＵＶ吸収により検出した。約１２分で観測される緩衝液関連ピークを除くすべての他のピークと比較して、産物単量体ピークの面積パーセントとして結果を報告した。単量体ピークよりも早く溶出するピークは、凝集体パーセントとして記録した。単量体ピークの後に溶出するピークは、その他のパーセントとして記録した。
【０１０５】
ＲＰ−ＨＰＬＣ
サンプル（１０μｇ）をＰＬＲＰ−Ｓ  ８ミクロン４０００Ａカラム２．０×１５０ｍｍに注入した。移動相Ａは、水中０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）であり、移動相Ｂは、アセトニトリル中０．０５％ＴＦＡであった。流量は０．７５ｍＬ／分であり、カラム温度は７５℃に設定した。アセトニトリル中３４〜４０％ＴＦＡのグラジエント（移動相Ｂ）を用いてタンパク質を５〜１２分間溶出させ、２８０ｎｍのＵＶ吸収によりモニターした。報告されたフラグメントパーセントは、すべてのフラグメントの全面積をすべてのフラグメントおよび無傷抗体の全ピーク面積で割り算したものである。
【０１０６】
モノクローナル抗体の精製／Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）への負荷
細胞培養回収産物をＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ（商標）樹脂上にキャプチャーした。負荷後、カラムを高塩および低塩のＴｒｉｓ緩衝液で逐次洗浄した。次いで、抗体を低ｐＨ酢酸緩衝液により溶出させた。酢酸を用いた低ｐＨ処理により溶出液のウイルス不活性化を行った。ウイルス不活性化産物をＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）試験への投入材料として使用した。
【０１０７】
Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）範囲設定ＤＯＥ
Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）産物品質および収率に及ぼすｐＨ、伝導率、および負荷容量の影響を調べるための試験を行った。最初にｐＨの影響を調べた。ウイルス不活性化産物（ＨＰＳＥＣ  ９９．５％単量体、０．４％凝集体、０．０フラグメント、ＲＰＬＣ  ２．８％フラグメント）を段階的に５〜８にｐＨ調整した。ｐＨ調整済み材料を各ｐＨの平衡化緩衝液中１００ｇ／Ｌの容量でカラム上に負荷し、フロースルーを捕集した。次いで、酸を適用してカラムをストリッピングした。フロースルーおよびストリップの収率および産物品質を解析した。
【０１０８】
所望の収率および純度をもたらすｐＨを選択した後、伝導率および負荷容量の影響を調べた。ｐＨ６の目標値近傍の厳しいｐＨ値（５．５〜６．５）、広範にわたる負荷容量（７５〜３００ｇ／Ｌ）、および広範にわたる伝導率（０〜３０ｍＳ／ｃｍ）で同一の出発材料を用いてｊｍｐ完全要因２3計画を行った。フロースルーおよびストリップの画分を捕集し、収率および純度を解析した。
【０１０９】
Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）ロバスト性／センターポイント／スケールアップ
ｊｍｐ一部実施要因複合計画を用いてロバスト性を調べた。主要パラメーターの最悪プラント適合製造値を含むように範囲を設計した。出発材料は、ＨＰＳＥＣによる９７．７％単量体、０．６％凝集体、１．７％フラグメント、およびＲＰＬＣによる２．８％フラグメントの最悪純度を有していた。負荷容量は、５０〜１１０ｇ／Ｌの範囲内であった。負荷ｐＨは、５．５〜６．０の範囲内であった。負荷伝導率は、３〜７ｍＳ／ｃｍの範囲内であった。負荷緩衝液伝導率は、３．５６〜４．３９ｍＳ／ｃｍの範囲内であった。精製産物の純度および収率を解析した。
【０１１０】
ロバスト性実験から決定される操作パラメーターをモノクローナル抗体精製プロセスに統合し、ベンチスケールおよびパイロットスケールの両方で行った。１Ｍ酢酸を用いてＣ０ＨＣ深層濾過ウイルス不活性化産物をｐＨ５．９±０．２に調節し、伝導率をモニターして＜７ｍＳ／ｃｍを保証した。調整済み材料を５０ｍＭ酢酸塩ｐＨ５．９±０．２で平衡化されたＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）カラムに１００ｇ／Ｌで負荷した。負荷を平衡化緩衝液で追い出し、フロースルーを捕集した。注入用の水（ＷＦＩ）および次いで１００ｍＭ酢酸を添加することによりカラムをストリッピングした。１Ｎ水酸化ナトリウムで衛生化を行った後、２％ベンジルアルコール、１００ｍＭ酢酸塩ｐＨ５．０中に貯蔵した。
【０１１１】
Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）フラグメントスパイク
Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）負荷をＲＰＬＣによる８９．７％単量体、２．７％凝集体、ＨＰＳＥＣによる７．９％フラグメントおよび９．２％フラグメントの純度にスパイクした。負荷材料を精製し、ｐＨ（ｐＨ範囲５〜８）、伝導率（０〜３０ｍＳ／ｃｍ）、および負荷容量（７５〜２５０ｇ／Ｌ）の影響を解析した。フロースルー産物の純度および収率を解析した。
【０１１２】
Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）機構
ＲＰＬＣによる２．８％フラグメントをそれぞれ含有するスパイクされていない調整済み負荷を、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）と比較してＣａｐｔｏ  Ｑ（商標）およびＣａｐｔｏ  Ｐｈｅｎｙｌ（商標）樹脂で精製した。Ｃａｐｔｏ  Ｑ（商標）でｊｍｐ完全要因ＤＯＥを行って、ｐＨ（ｐＨ７〜８）、伝導率（０〜２０ｍＳ／ｃｍ）、および負荷容量（０〜３００ｇ／Ｌ）の影響を調べた。フロースルーモードでＣａｐｔｏ  Ｐｈｅｎｙｌ（商標）樹脂でも試験を行って、伝導率（５〜９０ｍＳ／ｃｍ）の影響を調べた。
【０１１３】
Ｈｏｕ  ａｎｄ  Ｃｒａｍｅｒ（２０１１  ）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ，１２１８：７８１３にしたがってフラグメント除去相修飾機構実験を行った。２０％（ｖ／ｖ）エチレングリコール、２Ｍ尿素、および０．１Ｍアルギニンを用いてＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）調整済み負荷を個別にスパイクした。室温で２時間インキュベートした後、ＭＥＤＩ−５４６プロセスにしたがってスパイク負荷を精製した。各実験で、フロースルーおよびストリップのピークを捕集し、収率および純度を解析した。
【０１１４】
範囲設定ＤＯＥ：
Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）を抗体フラグメント化産物不純物の除去に関して評価した。最初に、産物品質および収率に及ぼすｐＨの影響を調べた。図２は、試験した各ｐＨに対してフラグメント物質収支および収率を示している。各精製負荷は、ＲＰＬＣによる３０ｍｇの抗体フラグメント化産物不純物を含有していた。ｐＨを５から８に増加させるにつれて、漸増量の抗体フラグメント化産物不純物がカラムに結合し、フロースルー材料から分離された。ｐＨの増加に伴ってフロースルー産物中のフラグメントレベルが減少したが、収率は減少した。
【０１１５】
各精製からのフロースルー産物および低ｐＨストリップ画分のフラグメント化プロファイルを示すＲＰＬＣプロファイルを解析した。ＬＨＦ／ＳＨＦは、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）樹脂に結合されるので、フロースルー産物から分離されることが、プロファイルの比較から示された。フロースルー産物は、高レベルの単量体を含有していたが、ストリップ産物は、抗体フラグメント化産物不純物で富化されていたことが、対応するＨＰＳＥＣプロファイルの検査から示される。図３Ａおよび３Ｂは、それぞれ、ストリップおよび溶出に対してｐＨ６精製のＲＰＬＣプロファイルを示している。図４Ａおよび４Ｂ、それぞれ、ストリップおよび溶出に対してｐＨ６精製のＲＰＬＣプロファイルを示している。ｐＨ６では、２．４４８２％のフラグメント純度、９９．７の単量体純度、および９０％超の収率は、サイクル２の精製目標基準を満たした。表４は、ＲＰＬＣにより決定されるｐＨ６での溶出画分中およびストリップ画分中の種々のフラグメントのパーセントを提供する。表５は、ＨＰＳＥＣにより決定されるｐＨ６での溶出画分中およびストリップ画分中の単量体、凝集体、およびフラグメントのパーセントを提供する。
【０１１６】
【表４】
2016538267.tif 000006
【０１１７】
【表５】
2016538267.tif 000007
【０１１８】
次に、ｐＨ６の目標値周辺のｐＨ範囲で伝導率および負荷容量の影響を調べた。フロースルー材料のｊｍｐスクリーニング計画の結果を図５に示す。予想どおり、より高いｐＨでの精製は、より低いｐＨと比較したとき、抗体フラグメント化産物不純物の除去および単量体の純度の増加をもたらした。また、負荷容量および伝導率は、抗体フラグメント化産物不純物を除去するための主要な因子であった。一般的には、より低い負荷容量および低い伝導率で単量体純度の増加が観測された。
【０１１９】
スケールアップロバスト性／センターポイント／スケールアップ
産業用モノクローナル抗体精製プロセスに統合されたときに抗体フラグメント化産物不純物のＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）除去がどのように機能するかを解析するために、ロバスト性試験を行った。空間内の任意のポイントから生成されるときに産物品質および収率が分かりかつ許容可能であるように、製造設備は、センターポイントパラメーターから離れた操作空間を必要とする。負荷容量、負荷ｐＨ、負荷伝導率、および緩衝液伝導率を含むプロセスパラメーターの組合せを調べた。これらの実験の負荷材料は、ＨＰＳＥＣによる９７．７％単量体、０．６％凝集体、１．７％フラグメント、およびＲＰＬＣによる２．８％フラグメントであった。図６および７は、それぞれ、ＨＰＳＥＣおよびＲＰＬＣによる産物品質の結果を示している。１１０ｇ／Ｌの容量、５．５のｐＨ、７ｍＳ／ｃｍの負荷伝導率、および４．３９ｍＳ／ｃｍの緩衝液伝導率の最悪製造条件で、ＨＰＳＥＣ単量体は９９．４％であり、ＲＰＬＣフラグメントは２．５％であり、サイクル２の目標値を満たしていた。負荷ｐＨが５．７〜６．０である場合、他のパラメーターにかかわらず、産物中にＲＰＬＣによる２．０％未満のフラグメントが予想されることが、応答曲面プロファイラーから示された。
【０１２０】
ロバストなセンターポイントＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（登録商標）フラグメント除去操作をプラットフォーム精製プロセスに統合したところ、パイロットスケールでうまく実施された。図６および７は、サイクル１参照標準と比較して、プロセスの各中間物からＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）のＨＰＳＥＣおよびＲＰＬＣクロマトグラムを示している。細胞培養サイクル２産物をＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）によりキャプチャーした。中間物は、ＨＰＳＥＣによる９８．４％単量体およびＲＰＬＣによる３．０％フラグメントであり、サイクル１材料と比較してＬＨＦ／ＳＨＦが増加した。低ｐＨウイルス不活性化後、産物は、フラグメントのわずかな増加を示した。低ｐＨウイルス不活性化産物をＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）クロマトグラフィーに適用した結果、９９．６％ＨＰＳＥＣ単量体および２．５％ＲＰＬＣフラグメントの許容レベルに純度が増加した。フラグメントは、陽イオン交換、ナノ濾過、および製剤製品でより低いレベルに維持された。最終精製材料は、サイクル２の目標値を満たし、サイクル１材料に一致した。
【０１２１】
Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）によるフラグメント還元
図１３および１４は、バイオアナライザーアッセイを用いて決定されるＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）（以上に記載のもの）を用いた精製時のＨＨＬ、ＨＨ、ＨＬ、Ｈ、およびＬのレベルの減少を実証する。図１３は、ｐＨ５、５．５、６、６．５、７、７．５、および８でのＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）樹脂を用いた精製時のＨＨＬ、ＨＨまたはＬＨＦ、ＨＬ、ＨまたはＳＨＦ、およびＬフラグメントを含む抗体還元フラグメントのレベルを示すバイオアナライザークロマトグラムを含む。溶出プロファイルは、参照標準に匹敵するが、ストリッププロファイルは、還元フラグメントが富化されている。還元フラグメントは広範なｐＨにわたりＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）に結合することがデータから示されるので、この樹脂は、モノクローナル抗体を還元形から精製するために利用可能であることが示唆される。図１４は、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）樹脂を用いた精製から生じるＨＨＬ、ＨＨまたはＬＨＦ、ＨＬ、ＨまたはＳＨＦ、およびＬフラグメントさらには二量体のレベルを示すバイオアナライザークロマトグラムである。ｐＨ５〜６および伝導率０〜３０ｍＳ／ｃｍに調整された材料を７５〜３００ｇ／Ｌでカラムに負荷した。還元抗体はＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）に結合可能であり、かつある範囲内の負荷容量、ｐＨ、および伝導率にわたり無傷モノクローナル抗体の精製が可能であることが、結果から示される。
【０１２２】
スパイク−パワー
製造プロセスへの統合に成功した後、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）の全フラグメント分離能を決定する取組みを行った。図８は、スパイク実験の結果を示している。収率が影響を受けるおそれがあるが、７．９％ＨＰＳＥＣフラグメントおよび９．２％ＲＰＬＣフラグメントまでスパイクされた負荷材料は、低い負荷容量および伝導率を用いてｐＨ８で精製した場合、サイクル２の目標値に精製可能である。また、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）カラムは、２．０％ＲＰＬＣフラグメントまで除去可能であることが結果から示される。
【０１２３】
機構
センターポイントプロセスの開発およびＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）のフラグメント除去能力の決定を行った後、抗体フラグメント化産物不純物除去の機構を調べた。Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）は、陰イオン交換、疎水性相互作用、および水素結合の能力を有する混合モードクロマトグラフィー樹脂である。関与する機構を調べるために、最初に、センターポイントＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）プロセスの精製結果を、疎水性相互作用樹脂および陰イオン交換樹脂であるＣａｐｔｏ  Ｐｈｅｎｙｌ（商標）およびＣａｐｔｏ  Ｑ（商標）のそれぞれの精製結果と比較した。リガンドの構造を図９に示す。Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）は、荷電アミン基（陰イオン交換用）、芳香族疎水環（疎水性相互作用用）、およびヒドロキシル（水素結合用）を含有する。Ｃａｐｔｏ  Ｐｈｅｎｙｌ（商標）およびＣａｐｔｏ  Ｑ（商標）は、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）と同一の骨格を有するが、Ｃａｐｔｏ  Ｐｈｅｎｙｌ（商標）は、芳香族疎水環のみを含有し、Ｃａｐｔｏ  Ｑ（商標）は、荷電アミン基のみを有する。
【０１２４】
ウイルスクリアランスおよびプラットフォーム製造に役立つであろう条件下でフロースルーモードで低ｐＨウイルス不活性化負荷をＣａｐｔｏ  Ｑ（商標）クロマトグラフィーにより精製した。図１０は、Ｃａｐｔｏ  Ｑ（商標）実験のｊｍｐＤＯＥ結果を示している。極限のｐＨ、伝導率、および負荷容量では、フロースルー産物中のフラグメントが２，８から２．４％ＲＰＬＣフラグメントまでわずかに減少する。しかしながら、フラグメントの減少は、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）産物のレベルに一致するには至らなかった。ｐＨ、伝導率、または負荷容量の典型的な製造範囲にわたり、Ｃａｐｔｏ  Ｑ（商標）により精製された産物は、互いにおよび負荷材料に類似したレベルのフラグメントを含有していた。これらの結果に基づいて、アニオン機構は、副次的役割を果たしているように思われるが、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）を用いた分離に単独では関与しない。
【０１２５】
また、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）操作の伝導率に一致する５ｍＳ／ｃｍでフロースルー条件下で低ｐＨウイルス不活性化負荷をＣａｐｔｏ  Ｐｈｅｎｙｌ（商標）樹脂に適用した。図１１は、ＨＩＣ実験の結果を示している。ＨＰＳＥＣおよびＲＰＬＣの両方の解析から、溶出分別全体を通じてフラグメントレベルに一貫性があるので、フラグメントはＣａｐｔｏ  Ｐｈｅｎｙｌ（商標）カラムと相互作用しないことが示唆される。ＨＰＳＥＣおよびＲＰＬＣのフラグメント値は、出発材料のものに一致した。フラグメントとＣａｐｔｏ  Ｐｈｅｎｙｌ（商標）リガンドとの相互作用が欠如していることから、疎水性相互作用は抗体フラグメント化産物不純物の分離を媒介する唯一の機構ではないことが示唆される。
【０１２６】
抗体フラグメント化産物不純物除去の作用機構をさらに調べるために、樹脂相修飾剤のエチレングリコール、アルギニン、および尿素を、それぞれ個別に、負荷材料にスパイクした（Ｃｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ，１２１８：７８１３）。相修飾剤実験の結果を表６に示す。エチレングリコールは、疎水性相互作用を減少させることが示された。疎水性相互作用が一定の役割を果たすのであれば、この修飾剤を負荷材料に添加することによりＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅによるフラグメント除去が破壊されるであろう。エチレングリコールの存在下で、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）によるフラグメント除去は、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）センターポイント対照と等価であった。したがって、疎水性相互作用は、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）抗体フラグメント化産物不純物除去に有意に寄与するとは思われない。
【０１２７】
【表６】
2016538267.tif 000008
【０１２８】
尿素は、疎水性相互作用および水素結合相互作用の両方に影響を及ぼすことが示されている。エチレングリコール実験およびセンターポイントＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）対照と比較して、尿素の存在下で２．３％までのＲＰＬＣフラグメントの増加が見られた。尿素は、フラグメントの極性側鎖と相互作用したかまたはタンパク質の溶媒和を変化させた可能性がある。エチレングリコールの添加による疎水性相互作用の破壊は、抗体フラグメント化産物不純物の除去に影響を及ぼさなかったので、水素結合は、フラグメント除去に重要な役割を果たすことが尿素実験から示唆される。
【０１２９】
水素結合のほかに、イオン性相互作用もまた、抗体フラグメント化産物不純物の除去に一定の役割を果たしうることが、アルギニン相修飾剤実験の結果から示唆される。アルギニンは、疎水性相互作用、水素結合性相互作用、およびイオン性相互作用を減少させる。尿素の結果と比較して、０．９％までのＨＰＳＥＣフラグメントの増加が見られたが、ＲＰＬＣフラグメントレベルは２．３％に維持された。エチレングリコールおよび尿素の結果と比較して、アルギニン実験のフラグメントの増加は最小限であったことから、いくつかのイオン性相互作用が抗体フラグメント化産物不純物の除去に寄与するが、水素結合は、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）による抗体フラグメント化産物不純物除去機構で支配的であることが実証される。
【図１Ａ−Ｂ】
2016538267.tif 000009
【図２】
2016538267.tif 000010
【図３Ａ−Ｂ】
2016538267.tif 000011
【図４Ａ−Ｂ】
2016538267.tif 000012
【図５】
2016538267.tif 000013
【図６】
2016538267.tif 000014
【図７】
2016538267.tif 000015
【図８】
2016538267.tif 000016
【図９Ａ−Ｃ】
2016538267.tif 000017
【図１０】
2016538267.tif 000018
【図１１】
2016538267.tif 000019
【図１２】
2016538267.tif 000020
【図１３Ａ】
2016538267.tif 000021
【図１３Ｂ】
2016538267.tif 000022
【図１４Ａ】
2016538267.tif 000023
【図１４Ｂ】
2016538267.tif 000024
【図１４Ｃ】
2016538267.tif 000025
【配列表】
2016538267000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年4月26日(2016.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントから抗体フラグメント化産物不純物を分離する方法であって、
ａ）前記標的抗体または所望の抗原結合性フラグメントと、抗体フラグメント化産物不純物と、負荷緩衝液と、を含む出発材料を提供する工程であって、前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントが、配列番号２に示される軽鎖アミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３から選択される軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列と、配列番号１に示される重鎖アミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３から選択される重鎖ＣＤＲアミノ酸配列と、を含む、工程と、
ｂ）前記出発材料を混合モードクロマトグラフィーカラムに負荷する工程と、
ｃ）前記材料をカラムに通して貫流させる工程であって、前記抗体フラグメント化産物不純物の少なくとも一部が混合モードクロマトグラフィー樹脂の固定相に吸着され、かつ前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントの少なくとも一部が１つ以上の溶出液画分で前記カラムから溶出される、工程と、
ｄ）１つ以上の溶出液画分を回収する工程であって、１つ以上の溶出液画分が前記出発材料と比較して前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントで富化されている、工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
前記混合モードクロマトグラフィーカラムがＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）混合モードクロマトグラフィーカラムを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１つ以上の溶出液画分が前記出発材料よりも約１％〜約１０％多い標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
１つ以上の溶出液画分が前記出発材料よりも約１％〜約３％多い標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記出発材料が約１％〜約１０％の抗体フラグメント化産物不純物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記出発材料が約１％〜約３％の抗体フラグメント化産物不純物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記出発材料のｐＨが約５〜約８である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記出発材料が約０ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体フラグメント化産物不純物がペプチド切断フラグメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体フラグメント化産物不純物が、重鎖フラグメント化産物、ヒンジ領域フラグメント化産物、軽鎖フラグメント化産物、およびそれらの組合せから選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体フラグメント化産物不純物が抗体還元フラグメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体フラグメント化産物不純物が、重鎖−重鎖−軽鎖、重鎖−軽鎖、軽鎖−軽鎖、重鎖−重鎖、重鎖、および軽鎖から選択されるＩｇＧフラグメントである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントが、配列番号２を含むアミノ酸配列を有する軽鎖配列と、配列番号１を含むアミノ酸配列を有する重鎖アミノ酸配列と、を含む、請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
一実施形態では、標的は、非経口投与に供すべく製剤化される組換え産生抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントである。一実施形態では、製剤は、注射可能である。一実施形態では、標的は、静脈内投与、皮下投与、または筋肉内投与に供すべく製剤化される。
本発明の様々な態様を以下に示す。
１．標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントから抗体フラグメント化産物不純物を分離する方法であって、
ａ）前記標的抗体または所望の抗原結合性フラグメントと、抗体フラグメント化産物不純物と、負荷緩衝液と、を含む出発材料を提供する工程と、
ｂ）前記出発材料を混合モードクロマトグラフィーカラムに負荷する工程と、
ｃ）前記材料をカラムに通して貫流させる工程であって、前記抗体フラグメント化産物不純物の少なくとも一部が混合モードクロマトグラフィー樹脂の固定相に吸着され、かつ前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントの少なくとも一部が１つ以上の溶出液画分で前記カラムから溶出される、工程と、
ｄ）１つ以上の溶出液画分を回収する工程であって、１つ以上の溶出液画分が前記出発材料と比較して前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントで富化されている、工程と、
を含む、方法。
２．標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントを含む組成物中の抗体フラグメント化産物不純物を減少させる方法であって、
前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントと、抗体フラグメント化産物不純物と、負荷緩衝液と、を含む出発材料を提供する工程と、
ａ）前記出発材料を混合モードクロマトグラフィーカラムに負荷する工程と、
ｂ）前記材料をカラムに通して貫流させる工程であって、前記抗体フラグメント化産物不純物の少なくとも一部が混合モードクロマトグラフィー樹脂の固定相に吸着され、かつ前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントの少なくとも一部が１つ以上の溶出液画分で前記カラムから溶出される、工程と、
ｃ）１つ以上の溶出液画分を回収する工程であって、１つ以上の溶出液画分が前記出発材料と比較して前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントで富化されている、工程と、
ｄ）前記回収された標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントを含む組成物を調製する工程と、
を含む、方法。
３．前記混合モードクロマトグラフィーカラムが、陰イオン交換（ＡＥＸ）、陽イオン交換（ＣＥＸ）、疎水性相互作用（ＨＩＣ）、親水性相互作用、水素結合、π−π結合、および金属親和性から選択される１つ以上の分離機構を利用する、上記１または２に記載の方法。
４．前記混合モードクロマトグラフィーカラムがＡＥＸ相互作用とＨＩＣ相互作用との組合せを利用する、上記１〜３のいずれかに記載の方法。
５．前記混合モードクロマトグラフィーカラムがＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）混合モードクロマトグラフィーカラムを含む、上記１〜４のいずれかに記載の方法。
６．前記出発材料が約８８％〜約９８％の標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントを含む、上記１〜５のいずれかに記載の方法。
７．前記出発材料が約９８％までの標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントを含む、上記１〜６のいずれかに記載の方法。
８．１つ以上の溶出液画分が約９８％〜９９．９％の標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントを含む、上記１〜７のいずれかに記載の方法。
９．１つ以上の溶出液画分が少なくとも約９８％の標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントを含む、上記１〜８のいずれかに記載の方法。
１０．１つ以上の溶出液画分が前記出発材料よりも約１％〜約１０％多い標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントを含む、上記１〜９のいずれかに記載の方法。
１１．１つ以上の溶出液画分が前記出発材料よりも約１％〜約３％多い標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントを含む、上記１〜１０のいずれかに記載の方法。
１２．前記出発材料が約１％〜約１０％の抗体フラグメント化産物不純物を含む、上記１〜１１のいずれかに記載の方法。
１３．前記出発材料が約１％〜約３％の抗体フラグメント化産物不純物を含む、上記１〜１２のいずれかに記載の方法。
１４．１つ以上の溶出液画分が約３％未満の抗体フラグメント化産物不純物を含む、上記１〜１３のいずれかに記載の方法。
１５．１つ以上の溶出液画分が約２％未満の抗体フラグメント化産物不純物を含む、上記１〜１４のいずれかに記載の方法。
１６．１つ以上の溶出液画分が約１％未満の抗体フラグメント化産物不純物を含む、上記１〜１５のいずれかに記載の方法。
１７．前記出発材料のｐＨが約５〜約８である、上記１〜１６のいずれかに記載の方法。
１８．前記出発材料のｐＨが約５．５〜約６．５である、上記１〜１７のいずれかに記載の方法。
１９．前記出発材料のｐＨが約５．７〜約６．０である、上記１〜１８のいずれかに記載の方法。
２０．前記出発材料が約０ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する、上記１〜１９のいずれかに記載の方法。
２１．前記出発材料が約１０ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する、上記１〜２０のいずれかに記載の方法。
２２．前記出発材料が約７ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する、上記１〜２１のいずれかに記載の方法。
２３．前記出発材料が約７５ｇ／Ｌ〜約２５０ｇ／Ｌの負荷容量を有する、上記１〜２２のいずれかに記載の方法。
２４．前記出発材料が約７５ｇ／Ｌ〜約１２５ｇ／Ｌの負荷容量を有する、上記１〜２３のいずれかに記載の方法。
２５．前記抗体フラグメント化産物不純物がペプチド切断フラグメントを含む、上記１〜２４のいずれかに記載の方法。
２６．前記抗体フラグメント化産物不純物が、重鎖フラグメント化産物、ヒンジ領域フラグメント化産物、軽鎖フラグメント化産物、およびそれらの組合せから選択される、上記２５に記載の方法。
２７．前記抗体フラグメント化産物不純物が抗体還元フラグメントを含む、上記１〜２６のいずれかに記載の方法。
２８．前記抗体フラグメント化産物不純物が、重鎖−重鎖−軽鎖、重鎖−軽鎖、軽鎖−軽鎖、重鎖−重鎖、重鎖、および軽鎖から選択されるＩｇＧフラグメントである、上記２７に記載の方法。
２９．前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントが、配列番号２を含むアミノ酸配列を有する軽鎖配列を含む、上記１〜２８のいずれかに記載の方法。
３０．前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントが、配列番号１を含むアミノ酸配列を有する重鎖アミノ酸配列を含む、上記１〜２９のいずれかに記載の方法。
３１．前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントが、配列番号２を含むアミノ酸配列を有する軽鎖配列と、配列番号１を含むアミノ酸配列を有する重鎖アミノ酸配列と、を含む、上記１〜３０のいずれかに記載の方法。
３２．前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントが、配列番号２に示される軽鎖アミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、およびそれらの組合せから選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む、上記１〜３１のいずれかに記載の方法。
３３．前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントが、配列番号１に示される重鎖アミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、およびそれらの組合せから選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む、上記１〜３２のいずれかに記載の方法。
３４．前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントが、配列番号２に示される軽鎖アミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、およびそれらの組合せから選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列と、配列番号１に示される重鎖アミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、およびそれらの組合せから選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列と、を含む、上記１〜３３のいずれかに記載の方法。
３５．前記負荷緩衝液が約１０ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する、上記１〜３４のいずれかに記載の方法。
３６．前記負荷緩衝液が約４ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する、上記１〜３５のいずれかに記載の方法。
３７．前記負荷緩衝液が、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸ナトリウム、ヒスチジン、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、およびそれらの組合せから選択される、上記３２または３３に記載の方法。
３８．前記負荷緩衝液が、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、およびそれらの組合せから選択される、上記３４に記載の方法。
３９．前記負荷緩衝液が約１ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度を有する、上記３４に記載の方法。
４０．標的抗体または所望の抗原結合性フラグメントを含む組成物であって、少なくとも約９９％の標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントと、約２％未満の抗体フラグメント化産物不純物と、を含む、組成物。
４１．前記組成物が、少なくとも約９９％の標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントと、１％以下の抗体フラグメント化結合性産物と、を含む、上記４０に記載の組成物。
４２．前記組成物が、少なくとも約９９．５％の標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントと、約０．５％以下の抗体フラグメント化結合性産物と、を含む、上記４０に記載の組成物。
４３．前記組成物が約３％以下の凝集体を含む、上記４０に記載の組成物。
４４．前記組成物が約２．５％以下の凝集体を含む、上記４０に記載の組成物。
４５．前記抗体フラグメント化産物不純物がペプチド切断フラグメントを含む、上記４０〜４４のいずれかに記載の組成物。
４６．前記抗体フラグメント化産物不純物が、重鎖フラグメント化産物、ヒンジ領域フラグメント化産物、軽鎖フラグメント化産物、およびそれらの組合せから選択される、上記４５に記載の組成物。
４７．前記抗体フラグメント化産物不純物が抗体還元フラグメントを含む、上記４０〜４４のいずれかに記載の組成物。
４８．前記抗体フラグメント化産物不純物が、重鎖−重鎖−軽鎖、重鎖−軽鎖、軽鎖−軽鎖、重鎖−重鎖、重鎖、および軽鎖から選択されるＩｇＧフラグメントである、上記４７に記載の組成物。
４９．前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントが、配列番号２を含むアミノ酸配列を有する軽鎖配列を含む、上記４０〜４４のいずれかに記載の組成物。
５０．前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントが、配列番号１を含むアミノ酸配列を有する重鎖アミノ酸配列を含む、上記４０〜４４のいずれかに記載の組成物。
５１．前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントが、配列番号２を含むアミノ酸配列を有する軽鎖配列と、配列番号１を含むアミノ酸配列を有する重鎖アミノ酸配列と、を含む、上記４０〜４４のいずれかに記載の組成物。
５２．前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントが、配列番号２に示される軽鎖アミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、およびそれらの組合せから選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む、上記４０〜４４のいずれかに記載の組成物。
５３．前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントが、配列番号１に示される重鎖アミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、およびそれらの組合せから選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む、上記４０〜４４のいずれかに記載の組成物。
５４．前記標的抗体またはその所望の抗原結合性フラグメントが、配列番号２に示される軽鎖アミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、およびそれらの組合せから選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列と、配列番号１に示される重鎖アミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、およびそれらの組合せから選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列と、を含む、上記４０〜４４のいずれかに記載の組成物。
【国際調査報告】
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