(57)【要約】３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸を脱離基として含む白金錯体およびその製造方法。白金錯体の一方は、シス‐［３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸基‐ジアミン白金（ＩＩ）］（略称はＧＳＨ‐５である、その化学構造は、式（１）で示される）であり2016500126.tif 000019白金錯体の他方は、シス‐［３‐ケトン‐１，１‐シクロブタン‐ジカルボン酸基‐トランス‐１，２‐シクロヘキサンジアミン白金（ＩＩ）］（略称はＧＳＨ‐６である。その化学構造は、式（２）で示される）であり2016500126.tif 0000202016500126.tif 000021炭素原子は、Ｒ配置またはＳ配置の両方である。【選択図】なし
2016500126.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸基が、白金錯体の脱離基リガンドであり、白金錯体は、シス‐［３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸基‐ジアミン白金（ＩＩ）］（略称はＧＳＨ‐５である。その化学構造は、式（１）で示される）であってもよく
2016500126.tif 000015
白金錯体はまた、シス‐［３‐ケトン‐１，１‐シクロブタン‐ジカルボン酸基‐トランス‐１，２‐シクロヘキサンジアミン白金（ＩＩ）］（略称はＧＳＨ‐６である。その化学構造は、式（２）で示される）であってもよく、
2016500126.tif 000016
2016500126.tif 000017
炭素原子は、Ｒ配置またはＳ配置の両方である抗腫瘍二価白金錯体。
【請求項２】
式（１）および式（２）に示される二価の抗腫瘍白金錯体が、まず、テトラハロ白金酸カリウムを水溶液中、アンモニアまたはトランス‐１，２‐シクロヘキサンジアミンと反応させ、シス‐［ジハロ‐ビスアンミン白金（ＩＩ）］またはシス‐［ジハロ‐ジアミン白金（ＩＩ）］を得、次いで、方法Ａまたは方法Ｂにより、光から遠ざけて窒素パージした状態で、水溶液中で目的物を得るものであって、方法Ａでは、銀イオンを用いてシス‐［ジハロ‐ビスアンミン白金（ＩＩ）］またはシス‐［ジハロ‐ジアミン白金（ＩＩ）］からハロゲン化物イオンを除去し、得られた中間体を３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸アルカリ金属塩と反応させて目的物を得、方法Ｂでは３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸銀をシス‐［ジハロ‐ビスアンミン白金（ＩＩ）］またはシス‐［ジハロ‐ジアミン白金（ＩＩ）］と反応させ、目的物を得る方法によって調製される請求項１に記載の抗腫瘍価の白金錯体の製造方法。
【請求項３】
方法Ａに関わる３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸アルカリ金属塩が、水溶液中で３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸を２当量のＭＯＨまたはＭＨＣＯ３と反応させるか、水溶液中で当量の３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸をＭ２ＣＯ３と反応させることによって得られる（ここで、ＭはＮａ＋またはＫ＋である）請求項２に記載の抗腫瘍価の白金錯体の製造方法。
【請求項４】
方法Ｂに関わる３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸銀塩が、水溶液中で３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸１当量を硝酸銀２当量と反応させることによって得られる請求項２に記載の抗腫瘍価の白金錯体の製造方法。
【請求項５】
３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸基が、白金錯体の脱離基リガンドであり、以下の反応経路Ａによって製造される請求項２に記載の抗腫瘍価の白金錯体の製造方法：
2016500126.tif 000018
（第一に、アセトン、メタノールおよび臭素を反応させ、凝縮、臭素化を通じてＩａを得る。第二に、水素化ナトリウムの作用下に、Ｉａとマロン酸ジイソプロピルの環化反応を行いＩｂを得る。次いで、Ｉｂを水酸化ナトリウム溶液中で加水分解してＩｃを得る。Ｉｃを塩酸により酸性化し、Ｉｄ、すなわち、３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸を得る。３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸基は、水溶液中で１当量のＩｄを２当量のＭＯＨまたはＭＨＣＯ３と反応させるか、または水溶液中で等しい当量のＩｄとＭ２ＣＯ３と反応させることによって得られる。ここで、ＭはＮａ＋またはＫ＋である）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、癌を治療するための新しいタイプの白金錯体およびその製造方法、特に、脱離基として３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸基を含む抗腫瘍白金（ＩＩ）錯体に関する。
【背景技術】
【０００２】  シスプラチンの臨床応用以来、研究者は、何千もの白金錯体の薬剤スクリーニングを行ってきた。特に最近２０年間、新しいタイプの構造活性相関とその機構を有する抗腫瘍白金錯体について膨大な研究がなされているが、今に至るも、全体的なパフォーマンスにおいてシスプラチンに優る白金薬剤は見出されていない。現在、シスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチンを含むいくつかの抗腫瘍白金薬剤が、広く臨床で応用されているが、これらは、臨床使用時に高い毒性およびある種の薬剤耐性も示す。この欠点により、これらの白金薬剤の適用は、ある程度のものに限定されている。既存の白金薬剤の中でも、シスプラチンは間違いなく非常に強力な抗腫瘍活性を有するが、その毒性も最も高い。カルボプラチンの毒性は、シスプラチンよりもはるかに低いが、多くの腫瘍細胞におけるその抑制能力は満足のいくものではない。こうした状況を考えると、シスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチンの脱離基またはリガンドを変更または調整することは、依然として、高性能かつ低毒性の白金薬剤を得るための有効な方法と見なすことができるかもしれない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】  本発明の目的は、抗腫瘍白金（ＩＩ）錯体および錯体とそのリガンドの製造方法を提供することである。本発明により提供される錯体は、シスプラチンおよびオキサリプラチンよりも低毒性である。特に、ＧＳＨ‐５錯体は、カルボプラチンより低毒性であり、その抗腫瘍活性は、一般に、カルボプラチンよりも高く、シスプラチンおよびオキサリプラチンと同等である。また、望ましい水溶性を有し、ある程度の薬剤耐性を克服することができる。これは、効果的かつ低毒性の抗腫瘍白金薬剤として可能性を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】  本発明により提供される抗腫瘍価白金錯体では、３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸基が、白金錯体の脱離基リガンドである。白金錯体は、シス‐［３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジ
2016500126.tif 000003
は、式（１）で示される：【０００６】
2016500126.tif 000004
【０００７】  ＧＳＨ‐６：白金錯体はまた、シス‐［３‐ケトン‐１，１‐シクロブタン‐ジカルボン酸基‐トランス‐１，２‐シクロヘキサンジアミン白金（ＩＩ）］であってもよく、略称はＧＳＨ‐６である。その化学構造は、式（２）で示される：【０００８】
2016500126.tif 000005
【０００９】
2016500126.tif 000006
ル炭素原子は、Ｒ配置またはＳ配置の両方である。【００１０】  式（１）および式（２）に示す二価の抗腫瘍白金錯体は以下の方法によって製造される。
まず、テトラハロ白金酸カリウムを水溶液中、アンモニアまたはトランス‐１，２‐シクロヘキサンジアミンと反応させ、シス‐［ジハロ‐ジアミン（またはジアミン）白金（ＩＩ）］の錯体を得る。次いで、方法Ａまたは方法Ｂにより、光から遠ざけて窒素パージした状態で、水溶液中で目的物を得る。方法Ａでは、銀イオンを用いて［ジハロ‐ジアミン（またはジアミン）白金（ＩＩ）］からハロゲン化物イオンを除去し、得られた中間体を３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸アルカリ金属塩と反応させて目的物を得る。方法Ｂでは３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸銀は［ジハロ‐ジアミン（またはジアミン）白金（ＩＩ）］と反応させ、目的物を得る。【００１１】  方法Ａに関わる３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸アルカリ金属塩は、水溶液中で３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸を２当量のＭＯＨまたはＭＨＣＯ３と反応させるか、水溶液中で当量の３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸をＭ２ＣＯ３と反応させることによって得られる。ここで、ＭはＮａ＋またはＫ＋である。
方法Ｂに関わる３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸銀塩は水溶液中で３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸１当量を硝酸銀２当量と反応させることによって製造される。【００１２】  抗腫瘍価白金錯体のリガンドの製造方法では、３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸基は、白金錯体の脱離基リガンドであり、以下の反応経路Ａによって製造される。【００１３】
2016500126.tif 000007
【００１４】  まず、アセトン、メタノールおよび臭素を反応させ、凝縮、臭素化を通じてＩａを得る。第二に、水素化ナトリウムの作用下に、Ｉａとマロン酸ジイソプロピルの環化反応を行いＩｂを得る。次いで、Ｉｂを水酸化ナトリウム溶液中で加水分解してＩｃを得る。Ｉｃを塩酸により酸性化し、Ｉｄ、すなわち、３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸を得る。リガンド、すなわち、３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸基は、水溶液中で１当量のＩｄを２当量のＭＯＨまたはＭＨＣＯ３と反応させるか、または水溶液中で等しい当量のＩｄとＭ２ＣＯ３と反応させることによって得られる。ここで、ＭはＮａ＋またはＫ＋である。【００１５】  上記反応経路Ａにおいて、中間体ＩａおよびＩｂの製造方法は、文献中で報告されている。Ｊ．Ｆｌｕｏｒｉｎｅ  Ｃｈｅｍ．，２０１０，１３１，２２１およびＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９８８，５３，３８４１を参照。【００１６】  文献中では、３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸を製造するための２つの方法が報告されている。Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，３３，１９０５およびＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８，２４，９７を参照。反応経路Ａと比較すると前者で報告された方法は、反応ルートが長く、高圧での酸化および接触水素化工程を含み、低収量、高コストである。後者で報告された方法は、限定された化学物質である成分または中間体を使用し、収率はわずか１０％なので、これらのいずれも大規模な工業生産には適していない。【００１７】  反応経路Ａから得られた生成物は、ＨＮＭＲ（Ｈ核磁気共鳴）、ＨＲＥＳＩ‐ＭＳ（高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析法）および元素分析によって３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸であることが確認される。生成物スペクトルデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ：３．７０２  ｐｐｍ（ｓ，４Ｈ）；ＥＳＩ‐ＭＳ：［Ｍ‐Ｈ］‐１５７．０１２８（１００％）。元素分析のデータ（分子式：Ｃ６Ｈ６Ｏ５）：理論値Ｃ４５．５７％、Ｈ３．８２％。測定値Ｃ４５．５９％、Ｈ３．８５％。【００１８】効果：本発明の二価白金錯体、特にＧＳＨ‐５錯体は、望ましい水溶性を有し、従来からの凍結乾燥粉末や注射製剤とすることができる。【００１９】  本発明によって提供される錯体ＧＳＨ‐５および錯体ＧＳＨ‐６を、一連のヒト腫瘍細胞の生体外抗腫瘍活性の研究を行うために使用した。ＩＣ５０値を表１に示す。表１のデータは、様々な腫瘍細胞に対する錯体ＧＳＨ‐５の阻害効果は、程度は異なるがシスプラチンに近く、いくつかのケースでは、オキサリプラチンよりも優れ、その抗癌効果は、カルボプラチンよりもはるかに優れていることを示している。シスプラチンと同等、通常の腫瘍細胞に細胞毒性を示すことに加えて、ＧＳＨ‐５錯体は明らかにヒト乳癌薬剤耐性細胞ＭＣＦ‐７に対する阻害作用も有し、活性においてシスプラチンよりも性能が優れている。【００２０】  マウス移植腫瘍の動物モデルを用い、本発明により提供されるＧＳＨ‐５錯体とＧＳＨ‐６錯体の動物移植腫瘍Ｓ１８０肉腫とＨＥＰＳ腫瘍に対する阻害作用を個々に観察した。関連データを、それぞれ表２および表３に示す。表２の結果は、Ｓ１８０の腫瘍増殖および実験動物の体重に対し、ＧＳＨ‐５およびＧＳＨ‐６サンプルは両方ともモデル対照群と比較して、有意な阻害作用（Ｐ＜０．０５）を有することを示している。比較すると、腫瘍増殖に対しては前者が後者よりもより優れた阻害作用を有する。表３の結果は、モデル対照群と比較して、サンプルＧＳＨ‐５Ｈｅｐｓの腫瘍増殖および実験動物の体重に明らかな阻害作用（Ｐ＜０．０１）を有することを示している。比較すると、サンプルＧＳＨ‐５は、腫瘍増殖に対しＧＳＨ‐６よりも、より良い阻害作用を有する。【００２１】  本発明により提供される２つの白金錯体の毒性を、予備的に調べた。サンプルＧＳＨ‐５をマウスに静注することによって行われた急性毒性試験の結果は１５０ｍｇ／ｋｇであり、サンプルＧＳＨ‐６の結果は１００ｍｇ／ｋｇである。文献におけるシスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチンのマウスＬＤ５０値はそれぞれ１３．４０、１４．６３および１３９．００ｍｇ／ｋｇである（Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９７３，２５，２３０；Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２００１，１６（２），６７；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｚｈｅｊｉａｎｇ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９３，１５，３３参照）。【００２２】  上記の結果は、本発明により提供される錯体は、シスプラチンおよびオキサリプラチンよりも毒性であり、特に、ＧＳＨ‐５錯体は、カルボプラチンよりも毒性が低いことを示す。本発明により提供される錯体の抗腫瘍活性は、一般に、カルボプラチンよりも高い。特に、ＧＳＨ‐５錯体の抗腫瘍活性は、シスプラチンおよびオキサリプラチンのそれと同等である。また、望ましい水溶性を有し、ある程度、薬剤耐性を克服できる。これは、潜在的に効果的かつ低毒性の抗腫瘍白金薬剤である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】  本発明は、効果的な抗腫瘍生物活性と低毒性を備えた二価の白金錯体を提供する。３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸基は、２つの白金錯体の脱離基リガンドである。錯体の一つは、シス‐［３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸基‐ジアミン白金（ＩＩ）］（略称：ＧＳＨ‐５）である。その化学構造は、式（１）で示される：
【００２４】
2016500126.tif 000008
【００２５】  別の錯体は、シス‐［３‐ケトン‐１，１‐シクロブタン‐ジカルボン酸基‐トランス‐１，２‐シクロヘキサンジアミン白金（ＩＩ）］（略称：ＧＳＨ‐６）。その化学構造は、式（２）で示される：
【００２６】
2016500126.tif 000009
【００２７】
2016500126.tif 000010
ル炭素原子は、Ｒ配置またはＳ配置の両方である。
【００２８】  式（１）および式（２）に示される本発明の二価の抗腫瘍白金（ＩＩ）錯体は以下の方法により製造される。まず、テトラハロ白金酸カリウムを、水溶液中、アンモニアまたはトランス‐１，２‐シクロヘキサンジアミンと反応させ、シス‐［ジハロ‐ジアミン（またはジアミン）白金（ＩＩ）］錯体を得る。次いで、方法Ａまたは方法Ｂにより、光から遠ざけて窒素パージした状態で、水溶液中で目的物を得る。方法Ａでは、銀イオンを用いて［ジハロ‐ジアミン（またはジアミン）白金（ＩＩ）］からハロゲン化物イオンを除去し、得られた中間体を３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸アルカリ金属塩（ナトリウム塩またはカリウム塩）と反応させて目的物を得る。方法Ｂでは３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸銀を［ジハロ‐ジアミン（またはジアミン）白金（ＩＩ）］と反応させ目的物を得る。
【００２９】  方法Ａに関わる３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸アルカリ金属塩は、水溶液中で３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸を２当量のＭＯＨまたはＭＨＣＯ３（ＭはＮａ＋またはＫ＋である）と反応させるか、水溶液中で当量の３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸をＭ２ＣＯ３（ＭはＮａ＋またはＫ＋である）と反応させることによって得られる。
【００３０】  方法Ｂに関わる３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸銀塩は水溶液中で３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸１当量を硝酸銀２当量と反応させることによって得られる。
【００３１】  本発明の方法により製造される白金錯体について、化合物の分子構造を、ＨＮＭＲ、ＨＲＥＳＩ‐ＭＳ、元素分析によって決定し、水への溶解度を測定した。
ＧＳＨ‐５錯体のスペクトルデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６‐ＤＭＳＯ）：δ１．０１１‐１．０４４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２  ｏｆ  ＤＡＣＨ），１．１９５‐１．２３２（ｍ，２Ｈ，ＤＡＣＨのＣＨ２），１．４４５‐１．４７３（ｍ，２Ｈ，ＤＡＣＨのＣＨ２），１．８０１‐１．８４１（ｍ，２Ｈ，ＤＡＣＨのＣＨ２），２．０５６（ｍ，２Ｈ，ＣＨＮＨ２），３．７１８（ｓ，４Ｈ，シクロブチルのＣＨ２），５．２４８（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ２），５．９４７‐５．９７７（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ２）ｐｐｍ；ＥＳＩ‐ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４６６．．０９３５８（２９％），［Ｍ＋Ｎａ］＋＝４８８．０７５６８（１００％）。ＤＡＣＨは、トランス‐１，２シクロヘキサン骨格を、シクロブチルはシクロブチル基を表す。元素分析データ（分子式：Ｃ１２Ｈ１８Ｎ２Ｏ５Ｐｔ）：理論値Ｃ３０．９７％、Ｈ３．９０％、Ｎ６．０２％、Ｐｔ４１．９２％。測定値Ｃ３１．０２％、Ｈ３．９３％、Ｎ６．０３％、Ｐｔ４１．８７％。
錯体ＧＳＨ‐５の水への溶解度は１６ｍｇ／ｍＬであり、錯体ＧＳＨ‐６のそれは２ｍｇ／ｍＬである。
【００３２】  本発明はまた、脱離基リガンドとして３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸基を製造するための効率的な方法を提供する。これは、以下の反応経路Ａによって製造される。
【００３３】
2016500126.tif 000011
【００３４】  第一に、アセトン、メタノールおよび臭素を反応させ、凝縮および臭素化を通してＩａを得る。第二に、Ｉａおよびジイソプロピルマロン酸を水素化ナトリウムの作用下で環化反応させＩｂを得る。次いで、Ｉｂを水酸化ナトリウム溶液中で加水分解してＩｃを得る。Ｉｃを塩酸により酸性化し、Ｉｄ（３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸）を得る。リガンド（３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸基）は、水溶液中、上記１当量とＭＯＨ（ＭはＮａ＋またはＫ＋である）またはＭＨＣＯ３（ＭはＮａ＋またはＫ＋である）２当量あるいは水溶液中、同じ当量のＩｄをＭ２ＣＯ３（ＭはＮａ＋またはＫ＋である）と反応させることによって得ることができる。
【００３５】  以下、実施例を参照して本発明をさらに説明するが、これらの説明は本発明を限定するものではない。開始剤ジハロジアミン（またはトランス‐１，２‐シクロヘキサンジアミン）白金（ＩＩ）は、公知の方法により製造され、これは明細書に記載されている。
【００３６】（Ｉ）化合物の製造
実施例１：ＧＳＨ‐５錯体の製造（方法Ａ）
光から遠ざけて窒素パージした状態で、シスジョードジアミン白金（ＩＩ）（４．８３グラム、１０ミリモル）を水４００ｍｌ中に懸濁させ、ＡｇＮＯ３（３．４０グラム、２０ミリモル）水溶液３０ｍＬを添加し、暗所で１２時間、４０℃で撹拌して反応させヨウ化銀を濾別する。３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸（１．５８グラム、１０ミリモル）およびＮａＯＨ（０．８０グラム、２０ミリモル）、またはＮａ２ＣＯ３（１．０６グラム、１０ミリモル）からなる水溶液４０ｍＬを上記の濾液に添加し、撹拌しながら暗所にて２４時間、４０℃で反応させ、溶液を濾過する。濾液を濃縮して大量の固体を析出させる。濾過、水、エタノールおよびジエチルエーテルで固体洗浄を繰り返し、真空乾燥させ、６５％の収率で、白色固体２．５１グラムを得る。
【００３７】実施例２：錯体ＧＳＨ‐５の製造（方法Ｂ）
光から遠ざけて窒素パージした状態で、シスジョードジアミン白金（ＩＩ）（０．４８グラム、１ミリモル）を水１００ｍＬ中懸濁させ、３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸銀（０．３７グラム、１ミリモル）を添加し、撹拌しながら暗所にて１２時間、５５℃で反応させヨウ化銀を濾別する。濾液を濃縮し、固体を多量に析出させる。濾過し、真空乾燥させ５３％の収率で、白色固体の０．２０グラムを得る。
【００３８】実施例３：錯体ＧＳＨ‐６の製造（方法Ａ）
光から遠ざけて窒素パージの条件で、ジクロロ（トランス１Ｒ、２Ｒ‐シクロヘキサン）白金（ＩＩ）（０．３８グラム、１ミリモル）を１００ｍＬの水に懸濁させ、ＡｇＮＯ３（０．３４グラム、２ミリモル）水溶液１０ｍＬを添加し、４０℃で撹拌し、１２時間、暗所にて反応させ、塩化銀を濾別する。３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸（０．１６グラム、１ミリモル）およびＫＯＨ（０．１１グラム、２ミリモル）またはＫＨＣＯ３（０．２０グラム、２ミリモル）からなる水溶液２０ｍＬを濾液に添加し、撹拌しながら暗所にて２４時間、５５℃で反応させ、次いで、溶液を濾過する。濾液を濃縮して固体を多量に析出させる。濾過、水洗浄、真空乾燥して５１％の収率で、白色固体の０．２４グラムを得る。
【００３９】実施例４：錯体ＧＳＨ‐６の製造（方法Ｂ）
光から遠ざけて窒素パージの条件で、ジクロロ（トランス１Ｒ、２Ｒ‐シクロヘキサン）白金（ＩＩ）（０．３８グラム、１ミリモル）を１００ｍＬの水に懸濁し、３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸銀（０．３７グラム、１ミリモル）を添加し撹拌しながら暗所にて１２時間、５５℃で反応させ塩化銀を濾別する。濾液を濃縮し、固体を多量に析出させる。濾過し真空乾燥させ６６％の収率で、白色固体の０．３１グラムを得る。
【００４０】実施例５：３‐ケトン‐１，１‐シクロブタン‐ジカルボン酸（Ｉｄ）（反応経路Ａ）の製造
中間体１ａおよびＩｂは、文献中に記載される方法によって製造する。エタノール２００ｍＬに中間体Ｉｂ１５グラムを溶解し水酸化ナトリウム（１２グラム、０．３モル）水溶液３０ｍＬを加え、反応溶液を３時間還流し、真空中でそれを濾過し、白色固体を得て、エタノールで３回それを洗浄し、中間体Ｉｃを得る。
６Ｍ塩酸溶液１００ｍＬに中間体Ｉｃを溶解し、撹拌し、一晩室温で反応させる。酢酸エチル４００ｍｌで反応液を抽出し、無水硫酸ナトリウムで有機相を乾燥させ、次いでそれを約１０ｍＬに濃縮し、石油エーテルまたはジエチルエーテル３００ｍｌを添加し、冷蔵庫で一晩混合液を保ち淡黄色固体を析出させる。粗生成物を、水に溶解し加熱し、活性炭により脱色し、再結晶して８９％の収率で、白色固体生成物Ｉｄを得る。
【００４１】実施例６：リガンド（３‐ケトン‐１，１‐シクロブタン‐ジカルボン酸基）の製造（反応経路Ａ）
リガンドは、以下の３つの方法によって得ることができる。
（ｉ）Ｉｄ（１．５８グラム、１０ミリモル）およびＮａＯＨ（０．８０グラム、２０ミリモル）またはＫＯＨ（１．１２グラム、２０ミリモル）を水溶液４０ｍＬ中に溶解させることによって得る。
（ｉｉ）Ｉｄ（１．５８グラム、１０ミリモル）およびＮａＨＣＯ３（１．６８グラム、２０ミリモル）またはＫＨＣＯ３（２．００グラム、２０ミリモル）を水溶液５０ｍＬ中に溶解して得る；または
（ｉｉｉ）Ｉｄ（１．５８グラム、１０ミリモル）およびＮａ２ＣＯ３（１．０６グラム、１０ミリモル）またはＫ２ＣＯ３（１．３８グラム、１０ミリモル）を水溶液５０ｍＬに溶解して得る。
【００４２】実施例７：３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸銀の製造
暗所で水１００ｍＬ中に３‐ケトンシクロブタン‐１，１‐ジカルボン酸（１．５８グラム、１０ミリモル）を懸濁し、ＡｇＮＯ３（３．４０グラム、２０ミリモル）水溶液２０ｍＬを加え、暗所で１〜２時間、室温で撹拌、反応させ、濾過し、水で洗浄し白色固体を沈殿させ、それを真空乾燥させて、９２％の収率で、固体３．４１グラムを得る。
【００４３】（ＩＩ）錯体のインビトロ細胞毒性試験
試験例１
本試験例ではＭＴＴ法を用いて本発明錯体および一般的な臨床抗癌白金薬剤の細胞毒性試験を行う。
ＭＴＴ法：対数増殖期の細胞を選択し、それらをカウントし、約８０００から１００００細胞／ウェルで９６ウェル培養プレートに接種する。細胞を一晩培養し、細胞が壁に付着した後に薬剤を投与し、薬剤群、陽性対照群と陰性対照群を設定する。錯体は、５％グルコース水溶液を用いてストック溶液中に製造され試験される。使用前、これを一連の濃度で細胞培養培地により希釈し溶液とする。各濃度は３重複のウェルを有している。薬剤の投与後４８時間培養し、５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴを２０μＬ添加し、３７℃で４時間インキュベートし上清を除去し、ＤＭＳＯ溶解ホルマザン１５０μＬを添加する。４９０ｎｍの波長でマイクロプレートリーダーによりすべてのウェルのＯＤ値を測定し、阻害率を算出し、濃度‐阻害率曲線を描き、ＩＣ５０値を計算する。
【００４４】  本試験例では、ＭＴＴ法を用い、複数種のヒト腫瘍細胞（ヒト肺癌細胞Ａ５４９、ヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣ、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ‐７、ヒト乳癌薬剤耐性細胞ＭＣＦ‐７、ヒト乳癌細胞ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１、ヒト胃腺癌細胞ＢＧＣ８２３、ヒト肝癌細胞ＨＥＰＧ‐２、ヒトエリスロ白血病細胞Ｋ５６２、ヒト急性前骨髄球性白血病細胞ＮＢ４、ヒト大細胞肺癌細胞ＮＣＩ‐Ｈ４６０およびヒト肝癌細胞ＳＭＭＣ‐７７２１）に対する錯体ＧＳＨ‐５およびＧＳＨ‐６の細胞毒性を、陽性対照としてシスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチンを用いて試験する。製造された白金錯体は望ましい水溶性を有するため、試料の５％グルコース溶液が試験のために使用される。結果を表１に示す。
【００４５】
【表１】
2016500126.tif 000012
【００４６】（ＩＩＩ）錯体の生体内での腫瘍阻害作用
試験例２
本試験例では、マウス移植腫瘍の動物モデル方式を用い、本発明により提供される錯体の動物移植腫瘍Ｓ１８０肉腫およびＨＥＰＳ腫瘍に対する阻害作用を試験する。
ＩＣＲマウスを取得し、移植腫瘍の研究方法によって、固形腫瘍を接種する。接種後２４時間で、マウスを計量し、薬剤群あたり８匹となるように無作為に７グループに分割する。接種後２４時間（ｄ１）で初めて静脈内注射により薬剤を投与し、一日おきに合計４回、各回０．４ミリリットル／２０グラムの用量で薬剤を投与する。腫瘍を有するマウスを接種後１０日（ｄ１０）で犠牲にし、計量し、腫瘍塊を分けて重量を量り、すべての得られたデータについて統計的な処理（ｔ検定）を行う。マウス移植腫瘍Ｓ１８０とＨＥＰＳに対する錯体の阻害作用をそれぞれ表２および表３に示す。
【００４７】
【表２】
2016500126.tif 000013
【００４８】
【表３】
2016500126.tif 000014
【００４９】（ＩＶ）錯体の予備的毒性
試験例３
体重１８〜２２グラムの清浄グレードの昆明マウス５０頭（オス２５頭とメス２５頭）を選択し、各群１０頭になるように無作為に５グループに分割し、１２時間絶食させた。ＧＳＨ‐５錯体およびＧＳＨ‐６錯体を５％グルコース溶液中に溶解し、５用量で尾静脈を介してマウスに溶液を静注する。動物の受け入れ容量は０．４ｍｌ／２０グラムである。投与後１４日間連続して観察し、毒性症状とマウスの死亡を記録する。ブリス方法に従って実験結果を計算し、錯体ＧＳＨ‐５および錯体ＧＳＨ‐６のマウスに対するＬＤ５０値（静注）を得る。それぞれ１５０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇである（９５％信頼限界）。
【国際調査報告】
2016500126.tif 000022
2016500126.tif 000023
2016500126.tif 000024
2016500126.tif 000025
2016500126.tif 000026
2016500126.tif 000027
2016500126.tif 000028
2016500126.tif 000029