(57)【要約】  本発明において、有利な特性を有する、鎖延長されたポロキサマーから調製される熱可逆性ハイドロゲルが提供される。加えて、本発明は、生物材料を含む熱可逆性ハイドロゲルおよびその調製のためのプロセス、生細胞を含む熱可逆性ハイドロゲル、薬学的適用のための適用システムならびに表面に組成物を形成するためのｉｎ−ｖｉｔｒｏ方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のポロキサマーＰをジイソシアネートと反応させることにより調製される、鎖延長されたポロキサマーＰ*であって、各ポロキサマーが、２個のポリ（オキシエチレン）ブロックＰＥＧおよび１個のポリ（オキシプロピレン）ブロックＰＰＧを含み、Ｐのポリ（オキシプロピレン）ブロックの分子量が、２３５０ＤＡよりも大きく、但し１１，０００以上のポロキサマーＰの分子量Ｍｗおよび６０％を超えるＰにおけるポリエチレンオキシドの比率では、少なくとも２種の異なるポロキサマーを反応させる、鎖延長されたポロキサマーＰ*。
【請求項２】
２種の異なるポロキサマーが反応される、請求項１に記載の鎖延長されたポロキサマーＰ*。
【請求項３】
３種の異なるポロキサマーが反応される、請求項１に記載の鎖延長されたポロキサマーＰ*。
【請求項４】
鎖延長されたポロキサマーが、次式
【化１】
2016509610.tif 000006
（式中、ａおよびｂはそれぞれ、１〜１１０の間の整数であり、ｍ≧３であり、ａは、ポリ（エチレンオキシド）ブロックＰＥＧの繰り返し単位数を表し、ｂは、ポリ（プロピレンオキシド）ブロックＰＰＧの繰り返し単位数を表す）
によって表される構造単位を有し、ジイソシアネートが、式Ｏ＝Ｃ＝Ｎ−Ｘ−Ｎ＝Ｃ＝Ｏによって表され、Ｘが、ジイソシアネートの脂肪族または芳香族部分を表し、
２種の異なるポロキサマーＰおよびＰ’を用いる場合、鎖延長されたポロキサマーは、次式
【化２】
2016509610.tif 000007
および／または次式
【化３】
2016509610.tif 000008
（式中、ａ、ｂ、ｍおよびＸは、上に定義されている通りのものであり、それぞれ第２のポロキサマーＰ’において示されている通り、ｃは、ポリ（エチレンオキシド）ブロックＰＥＧの繰り返し単位数を表し、ｄは、ポリ（プロピレンオキシド）ブロックＰＰＧの繰り返し単位数を表し、ｃおよびｄはそれぞれ、１〜１１０の間の整数であり、ｍ’≧３である）
によって表される構造単位を追加で有する、請求項１に記載の鎖延長されたポロキサマーＰ*。
【請求項５】
ジイソシアネートが、脂肪族ジイソシアネートおよび芳香族ジイソシアネートからなる群から選択される、請求項１から３の一項に記載の鎖延長されたポロキサマーＰ*。
【請求項６】
ジイソシアネートが、ブタンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネート、メチレンビス−シクロヘキシルジイソシアネート（Ｈ12−ＭＤＩ）、リジンジイソシアネート（ＬＤＩ）およびジフェニルメタンジイソシアネート（ＭＤＩ）からなる群から選択される、請求項５に記載の鎖延長されたポロキサマーＰ*。
【請求項７】
ポロキサマーが、ポロキサマー２７２、３３３、３３４、３３５、４０２、４０３および４０７から選択される、請求項１から６に記載の鎖延長されたポロキサマーＰ*。
【請求項８】
４０℃〜６０℃の温度において、ポリウレタンの形成に適した触媒の存在下、ポロキサマーと０．８〜１．２当量のジイソシアネートとの反応により形成される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の鎖延長されたポロキサマーＰ*。
【請求項９】
（ａ）請求項１から８のいずれか一項に記載の鎖延長されたポロキサマーＰ*と、
ｂ）抗生物質、抗菌または抗真菌活性物質、タンパク質、グルコサミノグリカン、リゾチームおよび天然または合成ポリアミノ酸からなる群から選択される生物材料と
を含む、熱可逆性ハイドロゲル。
【請求項１０】
（ａ）請求項１から８のいずれか一項に記載の鎖延長されたポロキサマーＰ*を形成し、
（ｂ）鎖延長されたポロキサマーを、抗生物質、抗菌または抗真菌活性物質、タンパク質、グルコサミノグリカン、リゾチームおよび天然または合成ポリアミノ酸からなる群から選択される生物材料と混合する
ことによって調製される熱可逆性ハイドロゲル。
【請求項１１】
Ｐが、請求項７に記載のポロキサマーから選択される、請求項９または１０に記載の熱可逆性ハイドロゲル。
【請求項１２】
生細胞をさらに含む、請求項１０または１１に記載の熱可逆性ハイドロゲル。
【請求項１３】
生細胞が、単核細胞、間葉系幹細胞、その前駆細胞およびそれらから分化した細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、上皮細胞、筋芽細胞、腱細胞、単核造血幹細胞および前駆細胞ならびにそれらから分化した細胞、免疫細胞、多核細胞、巨細胞、マクロファージおよび破骨細胞からなる群から選択される、請求項１２に記載の熱可逆性ハイドロゲル。
【請求項１４】
細胞が、遺伝子改変またはゲルにおいて改変されている、請求項１２に記載の熱可逆性ハイドロゲル。
【請求項１５】
生物材料が、合成ポリアミノ酸または抗生物質、抗菌もしくは抗カビ活性物質、および／または細胞成長および細胞分化を阻害もしくは刺激するタンパク質であり、および／または
生物材料が、フィブリン、ゼラチン、コラーゲンおよび骨形成タンパク質（ＢＭＰ）からなる群から選択されるタンパク質であり、
および／または
タンパク質が、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インターロイキン−１Ｂ（ＩＬ−１Ｂ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、神経成長因子（ＮＧＦ）およびエリスロポエチン等の造血成長因子およびＧ−ＣＳＦ等のコロニー刺激因子からなる群から選択される成長因子であり、および／またはタンパク質が、ホルモンまたは酵素、好ましくは、フォリスタチンまたはミオスタチンであり、
および／または
生物材料が、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、フォリスタチンまたはミオスタチンであり、および／または
タンパク質が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＹおよびＩｇＷからなる群から選択される抗体または免疫グロブリンであり、または
グルコサミノグリカンがヒアルロナンである、
請求項９から１４のいずれか一項に記載の熱可逆性ハイドロゲル。
【請求項１６】
生物材料が、β−ラクタム抗生物質、テトラサイクリン、アミノグリコシド、マクロライド、抗ウイルス薬、アリルアミン、抗カビ抗生物質、イミダゾールおよびその誘導体、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦ−β（トランスフォーミング成長因子ベータ）スーパーファミリー、好ましくは、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）およびＧＤＦ（増殖分化因子）ファミリー、より好ましくは、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７およびＧＤＦ−５、可溶性コラーゲン、細かく粉砕したコラーゲン、ゼラチン、ヒト血液、動物血液、ヒトまたは動物血液の成分ならびにコラーゲンＩ、ＩＩまたはＩＩＩ型からなる群から選択される、請求項１４に記載の熱可逆性ハイドロゲル。
【請求項１７】
鎖延長されたポロキサマーが、直鎖状脂肪族または環状脂肪族ジイソシアネートを用いることにより調製される、請求項９から１６のいずれか一項に記載の熱可逆性ハイドロゲル。
【請求項１８】
ハイドロゲルが、トレーサーをさらに含有する、請求項９から１６のいずれか一項に記載の熱可逆性ハイドロゲル。
【請求項１９】
トレーサーが、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴにより可視化することができる放射性物質から選択される、請求項９から１７のいずれか一項に記載の熱可逆性ハイドロゲル。
【請求項２０】
医学的使用のための、請求項９から１８のいずれか一項に記載の熱可逆性ハイドロゲル。
【請求項２１】
医学的使用が、薬物送達または生物医学的適用である、請求項２０に記載の医学的使用のための熱可逆性ハイドロゲル。
【請求項２２】
請求項９から２０のいずれか一項に記載の熱可逆性ハイドロゲルを含む適用システム。
【請求項２３】
細胞／組織成長を刺激もしくは阻害するまたは細胞を死滅させる治療剤をさらに含む、請求項２２に記載の適用システム。
【請求項２４】
酸素放出物質または酵素と組み合わせた酸素放出物質をさらに含む、請求項２２または２３に記載の適用システム。
【請求項２５】
医学的状態の処置における使用のための医薬の製造における、請求項９から２０のいずれか一項に記載の熱可逆性ハイドロゲルの使用であって、医薬が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける組織への熱可逆性ハイドロゲルの水溶液の適用に役立つ使用。
【請求項２６】
水溶液が、生物学的活性材料の溶液または懸濁液を含む、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
医学的状態が、皮膚の熱傷または擦過傷である、請求項２５に記載の使用。
【請求項２８】
医学的状態が、外科手術によって撹乱された組織である、請求項２５に記載の使用。
【請求項２９】
外科手術が、椎体形成術または椎骨形成術である、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
外科手術が、トロカールのカニューレにより行われる、請求項２８または２９に記載の使用。
【請求項３１】
熱可逆性ハイドロゲルが、薬学的に許容される担体において組織に投与される、請求項２５に記載の使用。
【請求項３２】
熱可逆性ハイドロゲルが、非経口的投与のための薬学的に許容される担体において提供される、請求項２５に記載の使用。
【請求項３３】
熱可逆性ハイドロゲルが、生体組織の表面に配置される、または
熱可逆性ハイドロゲルが、医療機器の表面に配置される、または
熱可逆性ハイドロゲルが、向かい合う表面に配置され、これにより、表面が互いに接着する傾向を生じさせる、
請求項２５に記載の使用。
【請求項３４】
生体組織が臓器である、
および／または
臓器が、皮膚、内臓器官、筋骨格系の組織、好ましくは、骨、軟骨、結合組織、好ましくは、腱および脂肪組織から選択される、
請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
請求項９から２１に記載の熱可逆性ハイドロゲルの水溶液、その混合物または請求項２２、２３もしくは２４に記載の医学的適用システムを表面に適用するステップを含む、表面に組成物を形成するためのｉｎ−ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項３６】
方法が、請求項１３に記載の生細胞を含有する熱可逆性ハイドロゲルの水溶液を適用するステップを含む、および／または
熱可逆性ハイドロゲルが、ブタンジイソシアネートにより鎖延長されたポロキサマー４０３から調製される、および／または酸素放出物質ＣａＯ2である、
請求項３５に記載のｉｎ−ｖｉｔｒｏ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鎖延長されたポロキサマーに関する。特に、本発明は、斯かる鎖延長されたポロキサマーから調製された熱可逆性ハイドロゲルに関する。さらに、本発明は、生物材料を含む熱可逆性ハイドロゲルおよびその調製のための方法、薬学的適用のための適用システム、ならびに表面に組成物を形成するためのｉｎ−ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
用語「ポロキサマー」は、商品名「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）」または「Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）」（ＢＡＳＦ  ＳＥの登録商標）としても公知の、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックコポリマー（ＵＳ３，７４０，４２１において初めて言及）のクラスを指す。これらは、親水性ポリエチレングリコール外部ブロックおよび疎水性ポリプロピレングリコール内部ブロックからなるブロックコポリマー、即ち、（ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）−トリブロックコポリマーであり、次の構造により広く要約することができる：
【０００３】
【化１】
2016509610.tif 000002
これらのブロックコポリマーは、水において相分離によりゾルまたはゲルを形成する：ポリエチレングリコールブロックは水に溶解し、一方、ポリプロピレングリコールブロックは互いに会合するようになる。このプロセスは、ミセル形成と呼ばれる。ミセルは、より低い温度では相対的に無秩序な状態で存在するが（ゾル状態）、温度が上がると秩序的なミセル形成がもたらされ、液体の凝固を生じる（ゲル状態）（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｄｉｓ  Ｐ．，Ｈｏｌｚｗａｒｔｈ  Ｊ．Ｆ．，Ｈａｔｔｏｎ  Ｔ．Ａ．  Ｍｉｃｅｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ）−Ｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ）−Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ）Ｔｒｉｂｌｏｃｋ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ：Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．１９９４；２７（９）：２４１４〜２５を参照）。斯かるゲルは、したがって、熱可逆性ハイドロゲルとも称される。
【０００４】
ポロキサマーに基づくハイドロゲルは、かなり以前から公知であった（Ｊ．，Ｓｗａｆｆｏｒｄ  Ｗ．Ｂ．：Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ  ａｓ  ａ  ｓｕｐｐｏｓｉｔｏｒｙ  ｂａｓｅ．  Ａｍ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｓｕｐｐｏｒｔ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ．  １９６０；１３２：３０１〜３０３を参照）。さらに、ポロキサマー４０７（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７）およびヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＭＤＩ）の鎖延長されたポリマーについて記載されている（Ｊｉａｎｇ  Ｊ．，Ｍａｌａｌ  Ｒ．，Ｌｉ  Ｃ．，Ｌｉｎ  Ｍ．Ｙ．，Ｃｏｌｂｙ  Ｒ．Ｈ．，Ｇｅｒｓａｐｐｅ  Ｄ．，Ｒａｆａｉｌｏｖｉｃｈ  Ｍ．Ｈ．，Ｓｏｋｏｌｏｖ  Ｊ．Ｃ．，Ｃｏｈｎ  Ｄ．：Ｒｈｅｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｍｕｌｔｉｂｌｏｃｋ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００８；４１：３６４６〜３６５２を参照）。
【０００５】
ポロキサマーは、生物学的に不活性であるため、程なく医薬品の坐薬として用いられ、再生医療の出現と共に、細胞担体としても用いられるようになった（Ｋａｍｉｌ  Ｓ．Ｈ．，Ｅａｖｅｙ  Ｒ．Ｄ．，Ｖａｃａｎｔｉ  Ｍ．Ｐ．，Ｖａｃａｎｔｉ  Ｃ．Ａ．，Ｈａｒｔｎｉｃｋ  Ｃ．：Ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ａｓ  ａ  ｇｒａｆｔ  ｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  ｌａｒｙｎｇｏｔｒａｃｈｅａｌ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  −  Ａ  ｐｉｇ  ｍｏｄｅｌ．  Ａｒｃｈ．Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．２００４；１３０（９）：１０４８〜１０５１を参照）。
【０００６】
このようなハイドロゲルの特別な利点は、記載されている熱感受性挙動に存する。よって、取り込んだ細胞の侵襲性が最小となる適用を考えることができる。後者は、液体状態で容易に導入することができる。植え込み後に、温度変化によりゲル形成が行われ、これにより、細胞は所望の位置に維持される（Ｃｏｈｎ  Ｄ．，Ｌａｎｄｏ  Ｇ．，Ｓｏｓｎｉｋ  Ａ．，Ｇａｒｔｙ  Ｓ．，Ｌｅｖｉ  Ａ．：ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ−ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｅｒ  ｅｓｔｅｒ  ｕｒｅｔｈａｎｅ）ｓ  ａｓ  ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｈｅｒｍｏ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉ−ｂｌｏｃｋ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００６；２７（９）：１７１８〜１７２７；Ｎｇｕｙｅｎ  Ｍ．Ｋ．，Ｌｅｅ  Ｄ．Ｓ．  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  ２０１０；１０（６）：５６３〜５７９を参照）。
【０００７】
例えば、熱傷の処置において、熱可逆性ハイドロゲルの使用は有利である。ハイドロゲルは、活性物質の経皮的または局所的送達を可能にし、皮膚表面における高い水分含量を維持する。これは、脱水を防止する。加えて、ハイドロゲルは、相当な程度まで損傷組織に接着し、一定の弾性を有し、これにより、ハイドロゲルの分離を回避し、同時に、創傷から出現する分泌物を吸収する。一般に、ハイドロゲルは、創傷部位においてゲル状態へと迅速に移行して創傷における水分を維持するため、治癒を促進する。
【０００８】
低いポリマー濃度を有する大部分のポロキサマーは、不十分な機械的特性を有するゲルしか形成しないが、鎖延長されたポロキサマーは、より優れたゲル安定性を達成する。鎖を延長させる初期の試みは、アクリル酸エステル（アクリレート）により行われた。この試みは、ポロキサマーに、Ｃ＝Ｃ二重結合による連結部分をもたらす。その後、複数のポロキサマー部分を接続できるように、化学的付加反応が行われた。アクリル酸の誘導体は、生理的に無害という訳ではない。ジイソシアネートにより鎖延長が行われる場合、個々のポロキサマーは、ウレタン部分により連結される。ポリウレタンは、その組織適合性のために、医療用移植片として長期にわたり用いられてきた。今日までに判明したさらに別の不利益は、細胞による材料の生物学的認識の欠如であり、細胞は、これまで材料に接着することができなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
よって、本発明の目的は、従来技術の公知の不利益を持たず、医学的適用に適した、ポロキサマーに基づく鎖延長されたハイドロゲルを提供することである。本発明のさらなる目的は、生物学的活性剤または活性物質を放出することができる熱可逆性ハイドロゲルを提供することである。加えて、本発明の目的は、細胞が生物材料に接着している、生物材料および生細胞を含有する熱可逆性ハイドロゲルと、その治療適用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述の目的は、請求項１〜８に記載の鎖延長されたポロキサマー、請求項９〜２１に記載の熱可逆性ハイドロゲル、請求項２２〜２４に記載の適用システム、請求項２５〜３４に記載の熱可逆性ハイドロゲルの医学的使用ならびに請求項３５および３６に記載のｉｎ−ｖｉｔｒｏプロセスを提供することにより達成される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１ａ〜図１ｅは、ジイソシアネートを用いることにより鎖延長されたポロキサマーから調製された、熱可逆性ハイドロゲルの物理的特性を示す図であり、ヘキサメチレンジイソシアネートを用いることにより鎖延長されたポロキサマー４０３またはＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ１２３（ＰＭＴ００１）、ブタンジイソシアネートを用いることにより鎖延長されたポロキサマー４０３（ＰＭＴ００２；ＢＤＩ−ハイドロゲル）、およびメチレンビスシクロヘキシルジイソシアネートを用いることにより鎖延長されたポロキサマー４０３（ＰＭＴ００３）を試験した。これらの測定は、ルートヴィヒ・マクシミリアン大学ミュンヘン（Ｌｕｄｗｉｇ  Ｍａｘｉｍｉｌｉａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｕｎｉｃｈ）薬物研究センター（Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）のＷ．Ｆｒｉｅｓｓ教授／博士の研究室における協力プロジェクトの一環として行われた。  図１ａにおいて、相対濁度は、この文脈において、ｗｔ．％で表すポリマー濃度に対しプロットされ、図１ｂにおいて、平均保存可能期間モジュールは、温度に対しプロットされ、図１ｃにおいて、平均貫入抵抗は、温度に対しプロットされ、図１ｄにおいて、ゲルの強度は、温度に対しプロットされ、図１ｅにおいて、生物材料としてのタンパク質の放出された平均比率は、時間に対しプロットされる。
【図２】図２ａおよび図２ｂは、以後「ＢＤＩ−ハイドロゲル」とも称される、ブタンジイソシアネートを用いることにより鎖延長されたポロキサマー４０３からなる熱可逆性ハイドロゲルの異なるポリマー濃度（２．４％、５％および１０％）における、細胞生存を図解する画像を示す図である。この文脈において、「Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイ」によって、先ず１時間毎に（図２ａ、段「０ｈ」から「５ｈ」）、続いて１日毎に（図２ｂ、段「１ｄ」、「２ｄ」および「３ｄ」）、最終的に１週間後に（図２ｂ、段「７ｄ」）、異なるポリマー濃度を試験した。
【図３】図３は、１０％、２０％コラーゲンありまたはコラーゲンなしにおける、各事例１、２、３および７日後の、本発明の熱可逆性ＢＤＩ−ハイドロゲルにおける細胞形態を示す図である。スケールは、２００μｍである；全画像は、同じ拡大率レベルで撮像した。
【図４】図４は、コラーゲンＩありまたはなしの本発明の熱可逆性ＢＤＩ−ハイドロゲルにおける７日後の、ｅＧＦＰ−ＳＣＰ１の細胞生存を図解する顕微鏡像を示す図である（ＭＷ±ＳＤ、ｒ＝３、ｎ＝３）。ダン（Ｄｕｎｎ）による多重比較検定を用いたクラスカル・ワリス（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）統計は、コラーゲンＩなし（Ａ）またはあり（ＢおよびＣ）の本発明の熱可逆性ハイドロゲルの間に有意差を生じた。この文脈において、α＝０．０５、*ｐ＜０．０５および**ｐ＜０．０１である。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色後の例示的な顕微鏡像（下部、１０×拡大率）；スケールは２００μｍである。
【図５】図５は、共焦点レーザー走査顕微鏡により可視化した、２０％コラーゲンＩありまたはなしの本発明の熱可逆性ＢＤＩ−ハイドロゲル（図面において、「ＢＤＩ−ハイドロゲル」と称する）における７日後のｅＧＦＰ−ＳＣＰ１細胞を示す図である。画像は、１０×拡大率（スケール：２００μｍ；画像Ａ）または６３×（スケール：５０μｍ；画像Ｂ）のレベルで撮像した。
【図６】図６ａは、ＣａＯ2ありのＢＤＩ−ハイドロゲルにおけるシリンジ内培養２４時間後の酸素飽和度（Ａ）または細胞生存（Ｂ）を示す図であり、「対照」は、ＣａＯ2なしのＢＤＩ−ハイドロゲルを表す（ＭＷ±ＳＤ、ｒ＝３、ｎ＝１）。  図６ｂは、０．２５ｍｇ／ｍｌ  ＣａＯ2および様々なカタラーゼ濃度を有するＢＤＩ−ハイドロゲルにおけるシリンジ内培養２４時間後の酸素飽和度（Ａ）および細胞生存（Ｂ）を示す図である（ＭＷ±ＳＤ、ｒ＝３、ｎ＝１）。  図６ｃは、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＣａＯ2および１００Ｕ／ｍｌカタラーゼを有するＢＤＩ−ハイドロゲルまたは０．２５ｍｇ／ｍｌ  ＣａＯ2および１００Ｕ／ｍｌカタラーゼの濃度のＢＤＩ−ハイドロゲルにおけるシリンジ内培養７２時間後の酸素飽和度（Ａ）および細胞生存（Ｂ）を示す図である（ＭＷ±ＳＤ、ｒ＝３、ｎ＝１）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、ジイソシアネートを用いてポロキサマーから調製される、鎖延長されたポロキサマーを提供する。このような鎖延長されたポロキサマーは、医療分野において様々な仕方で用いることができる、熱可逆性ハイドロゲルに変換することができる。
【００１３】
後の段階でハイドロゲルに変換することができる、本発明における有用なポロキサマーは、一般に、ポロキサマーＰの分子量が４０００Ｄａを超えるポロキサマーである。好ましくは、ポリプロピレンブロックの分子量は、２３５０Ｄａを超える。好ましい実施形態において、上述のポロキサマーにおけるまたは上述のポロキサマー（複数）のそれぞれにおけるポリエチレンオキシド部分の比率は、２０％〜８０％、より好ましくは、２０％〜７０％、特に好ましくは、２０％〜６０％である。少なくとも１種のポロキサマーＰをジイソシアネートと反応させることにより調製され、２個のポリオキシエチレンブロックＰＥＧおよび１個のポリオキシプロピレンブロックＰＰＧからなり、Ｐのポリプロピレンオキシドブロックの分子量が２３５０Ｄａよりも大きい、鎖延長されたポロキサマーＰ*が、本発明に特に適している。２種以上のポロキサマー、例えば、２種の異なるポロキサマーＰおよびＰ’が存在する場合、各ポロキサマーは、上述の要件を満たす。
【００１４】
特に、本発明に係る鎖延長されたポロキサマーを得るために、少なくとも１１，０００ＤａのポロキサマーＰの分子量および６０％を超えるＰにおけるポリエチレンオキシドの比率を有する上に引用されている事例において、前述のポロキサマーとは異なる追加的なポロキサマーが用いられる。ポロキサマー４０７（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７）は、１１，０００Ｄａの分子量および６０％を超えるポリエチレンオキシドの含量を有するポロキサマーの例として役立つことができる。したがって、本発明において、ポロキサマー４０７を用いる場合、好ましくは、ポロキサマー４０７とは異なる少なくとも１種のポロキサマーが組み合わせて用いられる。
【００１５】
別の実施形態において、少なくとも１１，０００Ｄａの上述のポロキサマーＰの分子量および６０％を超えるＰにおけるポリエチレンオキシドの含量のために、ジイソシアネートは、式Ｏ＝Ｃ＝Ｎ−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ（式中、ｎ＝４、５またはｎ＞６）によって表されるジイソシアネート、イソホロンジイソシアネート、メチレンジ（４，４’−イソシアナト）シクロヘキサン（Ｈ12−ＭＤＩ）、リジンジイソシアネートおよび芳香族ジイソシアネート、好ましくは、ジフェニルメタンジイソシアネート（ＭＤＩ）からなる群から選択される。好ましい実施形態において、ポロキサマー４０７が用いられる場合、後者は、必要に応じて追加的なポロキサマーおよび先述から選択されるジイソシアネートと組み合わせて鎖延長される。
【００１６】
好ましくは、少なくとも１種のポロキサマーＰの少なくとも３個の繰り返し単位が反応される。
【００１７】
ポロキサマー部分は、鎖延長のためにジイソシアネートと反応される。その高い反応性のため本分野に一般に好まれる、芳香族ジイソシアネートを本発明に用いることができるが、発癌性ジアミンへと分解され得るという不利益が存在する。対照的に、脂肪族ジイソシアネートにおける相当する分解は、例えば、プトレシンまたはカダベリン等のジアミンを生じるが、これは、身体の代謝プロセスにおいて僅かな程度で起こる。加えて、脂肪族化合物は、また、他の分解反応に対し抵抗性であり、このような性質が、黄変その他が回避されるのであれば、脂肪族化合物が技術的適用において用いられることの理由である。したがって、脂肪族、特に、直鎖状ジイソシアネートが本発明において好ましい。
【００１８】
市販のポロキサマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）またはＬｕｔｒｏｌ（登録商標））は、エチレンオキシドまたはポリエチレングリコール−（ＰＥＧ）部分ａおよびポリプロピレンオキシドまたは（ＰＰＧ−）部分ｂの割合ならびにブロックの長さが異なる。これにより、水における異なる挙動が生じる。
【００１９】
上に記載されているポロキサマーが、ジイソシアネートと反応される場合、本発明の鎖延長されたポロキサマーＰ*は、特に、出発材料として単一のポロキサマーとなる場合、式Ｏ＝Ｃ＝Ｎ−Ｘ−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ（式中、Ｘは、ジイソシアネートの脂肪族または芳香族部分である）のジイソシアネートから調製され、次の構造単位：
【００２０】
【化２】
2016509610.tif 000003
（式中、ａおよびｂはそれぞれ、１〜１１０の間の整数であり、ｍ≧３であり；ａは、ポリ（エチレンオキシド）ブロックＰＥＧの繰り返し単位数を表し、ｂは、ポリ（プロピレンオキシド）ブロックＰＰＧの繰り返し単位数を表す）を含有する。２種の異なるポロキサマー（ＰおよびＰ’）が、出発材料として関わる場合、鎖延長されたポロキサマーＰ*は、同様に、次式
【００２１】
【化３】
2016509610.tif 000004
および／または次式
【００２２】
【化４】
2016509610.tif 000005
（式中、ａ、ｂ、ｍおよびＸは、上に定義されている通りのものであり、それぞれ第２のポロキサマーＰ’において示されている通り、ｃは、ポリ（エチレンオキシド）ブロックＰＥＧの繰り返し単位数を表し、ｄは、ポリ（プロピレンオキシド）ブロックＰＰＧの繰り返し単位数を表し、ｃおよびｄはそれぞれ、１〜１１０の間の整数であり、ｍ’≧３である）
によって表される構造単位を有する。
【００２３】
好ましい実施形態において、鎖延長されたポロキサマーＰは、１種または複数のポロキサマー２７２、２７８、３３１、３３３、３３４、３３５、３３８、４０１、４０２、４０３および４０７（商品名：Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）またはＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｌ９２、Ｆ９８、Ｌ１０１、Ｐ１０３、Ｐ１０４、Ｐ１０５、Ｆ１０８、Ｌ１２１、Ｌ１２２、Ｐ１２３およびＦ１２７）から選択される。ポロキサマー４０７は、好ましくは、１種または複数の他のポロキサマーと組み合わせて用いられる。さらに好ましい実施形態において、ポロキサマー４０７は、さらに別のポロキサマーと組み合わせてあるいは単独で、式Ｏ＝Ｃ＝Ｎ−（ＣＨ2）n−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ（式中、ｎ＝４、５またはｎ＞６）の直鎖状ジイソシアネート、またはイソホロンジイソシアネート、メチレンジ（４，４’−イソシアナト）シクロヘキサン（Ｈ12−ＭＤＩ）もしくはリジンジイソシアネート等の脂肪族ジイソシアネート、または芳香族ジイソシアネート、好ましくは、ジフェニルメタンジイソシアネート（ＭＤＩ）と反応される。
【００２４】
本発明のポロキサマーは、一般に、液体、ペースト様または固体の形態となり得る。例えば、通常条件下において、ポロキサマー２７２、３３１、４０１および４０２（または「Ｌ」のマークを付けたＰｌｕｒｏｎｉｃ型）は液体であり、ポロキサマー３３３、３３４、３３５および４０３（または「Ｐ」のマークを付けたＰｌｕｒｏｎｉｃ型）はペースト様であり、ポロキサマー２７８、６６８および４０７（または「Ｆ」のマークを付けたＰｌｕｒｏｎｉｃ型）は固体である。
【００２５】
ポロキサマー４０３、４０７および３３８に基づく熱可逆性ハイドロゲルが、本発明において特に好ましい。
【００２６】
今日まで、主にポロキサマー４０７または「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７」（上述の一般式（式中、ａ＝１００、ｂ＝６５）による；即ち、［ＰＥＧ］65［ＰＰＧ］100［ＰＥＧ］65）が、医学的および薬学的目的のハイドロゲルにおいて用いられてきた。
【００２７】
本発明において、複数のポロキサマーＰを組み合わせて、鎖延長されたポロキサマーＰ*を形成することも可能である。この場合、２または３種の異なるポロキサマーからなる鎖延長されたポロキサマーＰ*が好ましい。
【００２８】
本発明において、鎖延長されたポロキサマーＰ*を反応させて、熱可逆性ハイドロゲルとすることができる。本発明の熱可逆性ハイドロゲルは、好ましくは、
（ａ）上述の鎖延長されたポロキサマーＰ*と、
（ｂ）抗生物質、抗菌または抗真菌活性物質、タンパク質、グルコサミノグリカン、リゾチームおよびポリアミノ酸からなる群から選択される生物材料と
を含む、熱可逆性ハイドロゲルである。
【００２９】
本発明の熱可逆性ハイドロゲルは、
（ａ）上述の鎖延長されたポロキサマーＰ*を形成し、
（ｂ）鎖延長されたポロキサマーを、抗生物質、抗菌または抗真菌活性物質、タンパク質、グルコサミノグリカン、リゾチームおよびポリアミノ酸からなる群から選択される生物材料と混合する
ことにより得ることができる。
【００３０】
鎖延長剤として特に有利であることが証明された芳香族および脂肪族、特に、直鎖状ジイソシアネートが、ジイソシアネートとして好ましい。
【００３１】
上に言及されている通り、細胞による材料の生物学的認識性の欠如は、現況技術において不利である。その理由として、前記細胞は、今日まで、このような材料に接着できなかったからである。より詳細には、本発明は、鎖延長されたポロキサマーに基づくハイドロゲルを生物材料としてのコラーゲンと反応させるという例示的な着想と共に、それから調製された熱可逆性ハイドロゲルの驚くほど有利な特性の発見に基づく。好ましい実施形態において、例えば、細かく粉砕したまたは可溶性コラーゲンを生物材料として用いることができる。研究室における実験は、ある特定の耐性範囲内の細胞が、拡張された細胞形態を提示することを示し、コラーゲンへの接着を示唆した。
【００３２】
本発明において、例えば、特に、上に記載されている通り、直鎖状または脂肪族ジイソシアネートにより鎖延長される場合、低濃度における相対的に疎水性のポロキサマー４０３（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２３）からであっても、適切な物理的特性を有する多用途の熱可逆性ハイドロゲルを製造することができることが判明した。このようなハイドロゲルは、細胞および高分子量タンパク質のための適用システムとして特に価値があることを証明した。本発明に係るハイドロゲルは、周知の鎖延長されたポロキサマーに基づくハイドロゲルと比較して、大幅に改善された特性を提示する。よって、ポロキサマー４０７（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７）に排他的に基づくハイドロゲルと比較した、ポロキサマー４０３に基づく熱可逆性ハイドロゲルの特別な利点とは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてより安定的であることである。
【００３３】
統合された細胞のより長い細胞生存および生物学的機能性を得るために、ハイドロゲルは、本発明に係る生物材料により改変される。それにより、細胞は、インテグリン結合を介して接着することができる接着点を得る。斯かる接着は、細胞活性の必要条件である（Ｐｏｐｏｖ  Ｃ．，Ｒａｄｉｅ  Ｔ．，Ｈａａｓｔｅｒｓ  Ｆ．，Ｐｒａｌｌ  Ｗ．Ｃ．，Ａｓｚｏｄｉ  Ａ．，Ｇｕｌｌｂｅｒｇ  Ｄ．ら：ｌｎｔｅｇｒｉｎｓ  ａｌｐｈａ２ｂｅｔａ１  ａｎｄ  ａｌｐｈａ１１  ｂｅｔａ１  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｏｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ．  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ．  ２０１１；２：ｅ１８６を参照）。
【００３４】
本発明において、適した生物材料は、抗生物質、抗菌または抗真菌活性物質、タンパク質、グルコサミノグリカン、リゾチームおよびポリアミノ酸からなる群から選択される。抗生物質、抗菌または抗真菌活性物質は、好ましくは、β−ラクタム抗生物質、テトラサイクリン、アミノグリコシド、マクロライド、抗ウイルス薬、アリルアミン、抗カビ（ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）抗生物質、イミダゾールおよびその誘導体から選択される。ポリアミノ酸は、好ましくは、天然および合成ポリアミノ酸から選択される。
【００３５】
好ましい実施形態において、生物材料は、タンパク質のクラスから選択される。
【００３６】
本発明において、タンパク質は、好ましくは、細胞成長および細胞分化を阻害または刺激するタンパク質からなる群から、あるいは、フィブリン、ゼラチン、コラーゲンおよび骨形成タンパク質（ＢＭＰ）からなる群から選択される。タンパク質は、さらに、成長因子となることができ、好ましくは、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インターロイキン−１Ｂ（ＩＬ−１Ｂ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、神経成長因子（ＮＧＦ）およびエリスロポエチン等の造血成長因子およびＧ−ＣＳＦ等のコロニー刺激因子からなる群から選択される。
【００３７】
好ましい実施形態において、生物材料は、β−ラクタム抗生物質、テトラサイクリン、アミノグリコシド、マクロライド、抗ウイルス薬、アリルアミン、抗カビ抗生物質、イミダゾールおよびその誘導体、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦ−β（トランスフォーミング成長因子ベータ）スーパーファミリー、好ましくは、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）およびＧＤＦ（増殖分化因子）ファミリー、より好ましくは、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７およびＧＤＦ−５から選択される。
【００３８】
好ましい実施形態において、生物材料は、可溶性コラーゲン、細かく粉砕したコラーゲン、ゼラチン、ヒト血液、動物血液、ヒトまたは動物血液の成分からなる。
【００３９】
好ましい実施形態において、生物材料は、コラーゲンＩ、ＩＩまたはＩＩＩ型からなる。
【００４０】
好ましい実施形態において、生物材料またはタンパク質は、ホルモンまたは酵素、より好ましくは、フォリスタチンまたはミオスタチンである。
【００４１】
タンパク質は、免疫グロブリンまたは抗体となることができ、好ましくは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＹおよびＩｇＷからなる群から選択される。
【００４２】
さらに、生物材料が、グルコサミノグリカンである場合、ヒアルロナン（ヒアルロン酸）を用いることができる。
【００４３】
本発明の熱可逆性ハイドロゲルは、生細胞を含むこともできる。
【００４４】
前述の細胞は、好ましくは、単核細胞、特に、間葉系幹細胞、前駆細胞、および骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、上皮細胞、筋芽細胞、腱細胞（ｔｅｎｄｏｃｙｔｅ）等のそれらから分化した細胞、または単核造血幹細胞および前駆細胞、ならびに免疫細胞または巨細胞、マクロファージおよび破骨細胞等の多核細胞等のそれらから分化した細胞からなる群から選択される。
【００４５】
さらに好ましい実施形態において、細胞は、遺伝子改変またはゲルにおいて改変されている。
【００４６】
好ましい実施形態において、熱可逆性ハイドロゲルは、トレーサーを含有することもできる。この文脈において、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴにより可視化することができる、放射性物質から作製されたトレーサーが好ましい。斯かるトレーサーの例は、トリチウム、14Ｃ、18Ｆ、32Ｐ、35Ｓ、111Ｉｎおよび123Ｉ等、放射性同位体である。
【００４７】
驚くべきことに、現在、本発明の熱可逆性ハイドロゲルにおいて、生物材料との接続により、
−  取り込まれた細胞の拡張された細胞形態が生じ、これは、生物材料（例えば、コラーゲン）へのインテグリン結合の形成をもたらし、同時に、
−  熱可逆性ハイドロゲルの機械的に有利な特性がほとんど改変されない
ことが判明した。
【００４８】
本発明の熱可逆性ハイドロゲルは、医療分野における広範囲の適用を可能にする。したがって、本発明は、医学的使用のための熱可逆性ハイドロゲルであって、前記医学的使用が、薬物送達または生物医学的適用である熱可逆性ハイドロゲルを提供する。
【００４９】
好ましい実施形態において、本発明は、上述の熱可逆性ハイドロゲルを含む適用システムを提供する。本実施形態において、前述の適用システムは、好ましくは、細胞／組織成長を刺激もしくは阻害するまたは細胞を死滅させる治療剤をさらに含む。
【００５０】
本発明の熱可逆性ハイドロゲルを用いることにより、多数の治療剤を導入することができる。例として、生物材料のための上述の薬剤と共に、一般に、合成無機および有機化合物、タンパク質およびペプチド、多糖および他の糖、脂質、ガングリオシドならびに治療、予防または診断活性を有する核酸配列が挙げられる。核酸配列は、遺伝子、転写を阻害するための相補的ＤＮＡに結合するアンチセンス分子およびリボザイムを含む。取り込むべき治療剤は、血管作動剤、向神経活性剤、ホルモン、抗凝固薬、免疫調節物質、細胞傷害性薬剤、抗生物質、抗ウイルス剤、アンチセンス剤、抗原および抗体等、種々の生物学的活性を有し得る。抗体または抗原、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）または抗原に結合することができる同様の人工タンパク質を含むタンパク質を同様に導入することができる。タンパク質は、１００アミノ酸残基以上からなるものとして定義され；ペプチドは、１００アミノ酸残基未満である。他に断りがなければ、用語「タンパク質」は、タンパク質およびペプチドの両方を表す。例として、インスリン、パラトルモン、パラトルモン断片、イリシン（ｉｒｉｓｉｎ）、ミオスタチン、フォリスタチンおよび他のホルモンが挙げられる。
【００５１】
特異的な治療剤は、抗生物質、抗ウイルス剤、ステロイド系および非ステロイド系抗炎症剤の両方、抗悪性腫瘍薬、チャネル遮断薬を含む鎮痙薬、細胞成長阻害剤および抗接着分子を含む細胞／細胞外マトリックス相互作用のモジュレーター、酵素および酵素阻害剤、抗凝固薬および／または抗トロンビン剤、成長因子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質合成の阻害剤、細胞の増殖および／または成長をモジュレートする化合物、血管拡張剤、ならびに組織病変の処置に一般的に用いられる他の薬用物質を含む。これらの化合物の具体例として、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、プロスタサイクリン、ヘパリン、サリチル酸塩、硝酸塩、カルシウムチャネル遮断薬、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）およびアニソイル化（ａｎｉｓｏｙｌａｔｅｄ）プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）およびアニソイル化プラスミノーゲン−ストレプトキナーゼ−アクチベーター複合体（ＡＰＳＡＣ）、コルヒチンおよびアルキル化剤およびアプタマーが挙げられる。細胞相互作用のモジュレーターの具体例として、インターロイキン、血小板由来成長因子、酸性および塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＦＧβ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子ならびにこれらの抗体が挙げられる。核酸の具体例として、タンパク質をコードする遺伝子およびｃＤＮＡ、発現ベクター、アンチセンスならびに遺伝子発現の調節または防止に用いることのできるリボザイム等の他のオリゴヌクレオチドが挙げられる。他の生物学的活性剤の具体例として、細胞外マトリックスの改変された成分またはその受容体ならびに脂質およびコレステロールゼクエストレーション剤が挙げられる。
【００５２】
治療剤としてのタンパク質の例として、インターフェロンおよびインターロイキン等のサイトカイン（ｃｙｃｔｏｋｉｎｅ）、タンパク質ならびにコロニー刺激因子も挙げられる。治療剤としての炭水化物は、炎症を阻害しつつ、セレクチンの受容体に結合することが示されたシアリルルイスxを含む。成長因子、サイトカイン、インターフェロン、インターロイキン、タンパク質、コロニー刺激因子、ジベレリン、オーキシンおよびビタミンを含むように広く構築され、上述のペプチド断片または他の活性断片をさらに含み、ベクター、即ち、形質転換によるものであれ一過性発現によるものであれ、標的細胞において斯かる因子を合成する能力を有する核酸構築物をさらに含み、組織における斯かる因子の合成を刺激または抑制するエフェクターをさらに含み、この場合、天然シグナル分子、アンチセンスおよび三重らせん核酸その他を含む、細胞または組織の成長因子である「送達可能な成長因子等価物（ｄｅｌｉｖｅｒａｂｌｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）」（略称ＤＧＦＥ）を用いることができる。ＤＧＦＥの例は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、骨成長タンパク質（ＢＭＰ）および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ならびにこれらをコードするＤＮＡである。血餅溶解剤の例は、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼおよびヘパリンである。
【００５３】
抗酸化活性を有する（即ち、活性酸素を破壊またはその生成を防止する）薬物も、例えば、接着の防止において有用な、本発明の熱可逆性ハイドロゲルにおいて治療剤として提供することができる。例として、スーパーオキシドジスムターゼが挙げられる、あるいは他のタンパク質薬物として、カタラーゼ、ペルオキシダーゼおよびチトクロムＰ４５０等の一般的オキシダーゼまたは酸化酵素、グルタチオンペルオキシダーゼならびに他のネイティブまたは変性ヘムタンパク質（ｈａｅｍｏｐｒｏｔｅｉｎ）が挙げられる。
【００５４】
哺乳類ストレス応答タンパク質もしくは熱ショックタンパク質７０（ｈｓｐ７０）およびｈｓｐ９０等の熱ショックタンパク質、またはフラボノイド等のストレス応答タンパク質もしくは熱ショックタンパク質の発現を阻害もしくは低下させる刺激を、治療剤としてハイドロゲルにおいて提供することもできる。
【００５５】
さらに好ましい実施形態において、本発明の熱可逆性ハイドロゲルに基づく前述の適用システムは、酸素放出物質をさらに含む。酸素放出物質は、この文脈において、好ましくは、酵素と組み合わせて存在する。酵素の例として、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼおよびチトクロムＰ４５０等の一般的オキシダーゼまたは酸化酵素、グルタチオンペルオキシダーゼならびに他のネイティブまたは変性ヘムタンパク質が挙げられる。
【００５６】
酸素放出物質による本発明の適用システムは、後述する実施例８に記載されている。
【００５７】
ゲルへの酸素放出物質の添加の目的は、細胞に供給することができる新たな血管が形成されるまで、より大きい構築物における酸素の欠如による細胞死を防止することである。拡散作用による供給は、多くても、数ミリメートルしか及ばない。過酸化物および細胞が排他的に、本発明に係る熱可逆性ハイドロゲルに添加される場合、細胞は、生成する過酸化水素の作用により死ぬ。しかし、カタラーゼ等、過酸化物分解酵素が添加される場合、細胞死を防止することができる。
【００５８】
本発明は、医学的状態の処置のための医薬の製造における使用のための上述の熱可逆性ハイドロゲルであって、前記医薬が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける組織への熱可逆性ハイドロゲルの水溶液の適用に役立つ熱可逆性ハイドロゲルをさらに提供する。
【００５９】
好ましい実施形態において、前述の水溶液は、生物学的活性材料の溶液または懸濁液を含む。
【００６０】
好ましい実施形態において、前述の医学的状態は、皮膚の熱傷または擦過傷である。
【００６１】
別の好ましい実施形態において、前述の医学的状態は、外科手術により撹乱された組織である。好ましい実施形態において、前述の外科的介入は、椎体形成術または椎骨形成術である。
【００６２】
本発明の熱可逆性ハイドロゲルの適用は、腹腔鏡検査および内視鏡検査等、公知の技法を用いることによりもたらすこともできる。例えば、米国特許第５，３２８，４７１号または第５，２１３，５８０号に記載されているもの等、公知のカテーテルシステムを用いてもよい。
【００６３】
好ましい実施形態において、前述の医学的使用は、外科手術が、トロカールのカニューレにより行われることを特徴とする。
【００６４】
好ましい実施形態において、前述の医学的使用のために、熱可逆性ハイドロゲルは、薬学的に許容される担体において組織に適用される。生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水が、斯かる担体の例である。
【００６５】
好ましい実施形態において、前述の医学的使用のために、熱可逆性ハイドロゲルは、非経口的投与のための薬学的に許容される担体において提供される。
【００６６】
好ましい実施形態において、前述の医学的使用のために、熱可逆性ハイドロゲルは、生体組織の表面にまたは医療機器の表面に配置される。加えて、熱可逆性ハイドロゲルは、向かい合う表面の間に配置して、これにより、表面が互いに接着する傾向を生じさせることができる。
【００６７】
好ましい実施形態において、前述の医学的使用のために、生体組織は、臓器である。前述の実施形態において、前述の医学的使用のために、臓器は、好ましくは、皮膚、内臓器官、筋骨格系の組織、好ましくは、骨、軟骨、結合組織、好ましくは、腱および脂肪組織から選択される。
【００６８】
最後に、本発明は、上述の熱可逆性ハイドロゲルの水溶液、その混合物または上述の医学的適用システムを表面に適用するステップを含む、表面に組成物を形成するためのｉｎ−ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
【００６９】
好ましくは、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ方法は、生細胞を含有する上述の熱可逆性ハイドロゲルの水溶液の適用を含む。
【００７０】
より好ましくは、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ方法は、前述の適用システム、とりわけ、生細胞および酸素放出物質および酵素を含む適用システムを用いて行われる。この文脈において、過酸化カルシウムが、好ましくは、酸素放出物質として用いられる。例えば、カタラーゼが酵素として好ましい。
【００７１】
上述のｉｎ−ｖｉｔｒｏ方法の特に好ましい実施形態において、本発明の熱可逆性ハイドロゲルは、ポロキサマー４０３（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１２３）から調製される。
【００７２】
次の実施例は、本発明に係る鎖延長されたポロキサマーまたはそれから得られる熱可逆性ハイドロゲルの調製および特性を説明する。
【実施例１】
【００７３】
ヘキサメチレンジイソシアネートを用いることにより鎖延長されたポロキサマーの調製
還流冷却器を備えるガラスフラスコにおいて、１７．４ｇのポロキサマー４０３（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１２３；３ｍｍｏｌ）を、乾燥トルエンにより８０ｇとする。清澄な溶液が得られるまで、これを磁気撹拌子で約４５℃にて撹拌する。微量の水を除去するために、２０ｍｌのトルエンを留去する。その後、各事例において、シリンジによって、０．４９ｇのヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＤＩ、２．９２ｍｍｏｌ）および２ｍｌのトルエンにおける１２０μｌの１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）の溶液を添加する。温度を５５℃まで上昇させる。２時間後に、ロータリーエバポレーターを用いてトルエンを除去する。その後、重量の定常性（ｃｏｎｓｔａｎｃｙ）が得られるまで、４５℃（水浴）にて十分な（ｆｉｎｅ）真空条件下で乾燥を行う。
【実施例２】
【００７４】
ブタンジイソシアネートを用いることにより鎖延長されたポロキサマーの調製
還流冷却器を備えるガラスフラスコにおいて、１７．４ｇのポロキサマー４０３（３ｍｍｏｌ）を、乾燥トルエンにより８０ｇとする。清澄な溶液が得られるまで、これを磁気撹拌子で約４５℃にて撹拌する。微量の水を除去するために、２０ｍｌのトルエンを留去する。その後、各事例において、シリンジによって、０．３７３ｇのブタンジイソシアネート（ＢＤＩ、２．９２ｍｍｏｌ）および２ｍｌのトルエンにおける１２０μｌの１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）の溶液を添加する。温度を５５℃まで上昇させる。２時間後に、ロータリーエバポレーターを用いてトルエンを除去する。その後、恒量になるまで、４５℃（水浴）にて十分な真空条件下で乾燥を行う。
【実施例３】
【００７５】
メチレンジフェニルジイソシアネートを用いることにより鎖延長されたポロキサマーの調製
還流冷却器を備えるガラスフラスコにおいて、１７．４ｇのポロキサマー４０３（３ｍｍｏｌ）を秤量する。６３ｇの乾燥トルエンを添加する。清澄な溶液が得られるまで、４５℃にて揺動。微量の水を除去するために、３０ｍｌのトルエンを留去する。その後、各事例において、シリンジによって、０．７３８ｇのジフェニル−メタンジイソシアネート（ＭＤＩ、２．９２ｍｍｏｌ）および２ｍｌのトルエンにおける１２０μｌの１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）の溶液を添加する。温度を再度４５℃まで上昇させる。２時間後に、ロータリーエバポレーターを用いてトルエンを除去する。その後、恒量になるまで、４５℃（水浴）にて十分な真空条件下で乾燥を行う。
【実施例４】
【００７６】
３種の異なるポロキサマーから得られる、ヘキサメチレンジイソシアネートを用いることにより鎖延長されたポロキサマーの調製
還流冷却器を備えるガラスフラスコにおいて、１１．６ｇのポロキサマー４０３（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１２３；２ｍｍｏｌ）、１２．５ｇのポロキサマー４０７（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−１２７；１ｍｍｏｌ）および１４．６ｇのポロキサマー３３８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−１０８、１ｍｍ）を秤量し、乾燥トルエンにより９０ｇとする。清澄な溶液が得られるまで、これを磁気撹拌子で約４５℃にて撹拌する。微量の水を除去するために、２０ｍｌのトルエンを留去する。その後、各事例において、シリンジによって、０．６６５ｇのヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＭＤＩ、３．９５ｍｍｏｌ）および５ｍｌのトルエンにおける１２０μｌの１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）の溶液を添加する。温度を５５℃まで上昇させる。２時間後に、ロータリーエバポレーターを用いてトルエンを除去する。その後、恒量になるまで、４５℃（水浴）にて十分な真空条件下で乾燥を行う。１０℃より低い温度で水に十分に溶解する、相対的固体ポリマーが得られる。
【００７７】
得られたポリマーの１０％溶液であっても、３５℃の加熱下で凝固し、透明なゲルを生じる。
【００７８】
３種の異なるポロキサマーから得られる、実施例４において得られる鎖延長されたポロキサマーは、ポロキサマー４０３（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１２３）から排他的に調製された鎖延長されたポロキサマーに対して、透明かつ低濃度で凝固するという利点を有する。ポロキサマー４０７（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７）から排他的に調製された鎖延長されたポロキサマーと比較すると、新しい材料が、３７℃において数日経た後でも上清培養培地に溶解しないことを強調するべきである。
【実施例５】
【００７９】
鎖延長されたポロキサマーから作製された熱可逆性ハイドロゲルの特性
材料は、１５°〜３５℃の間の温度範囲において２種の特徴的変化を示す。４℃から進めて加熱を開始すると、先ず、１５°〜２０℃の間で、以前に透明であった液体（ゾル）に濁りが生じる。図１ａにおいて、ヘキサメチレンジイソシアネートを用いることにより鎖延長された１０％のポロキサマー４０３の熱可逆性ハイドロゲルの挙動を表す。
【００８０】
２２°〜３５℃の間において、次に、粘性が数桁上がる。例として、図１ｂは、それぞれ、ヘキサメチレンジイソシアネートを用いることにより鎖延長されたポロキサマー４０３（ＰＭＴ００１と称される）、ブタンジイソシアネートを用いることにより鎖延長されたポロキサマー４０３（ＰＭＴ００２）およびメチレンビス−シクロヘキシルジイソシアネートを用いることにより鎖延長されたポロキサマー４０３（ＰＭＴ００３）の１０％溶液を示す。後者は、より少ない繰り返し単位を有する。
【００８１】
図１ｃは、同じ熱可逆性ハイドロゲルＰＭＴ００１〜ＰＭＴ００３に関して、貫入抵抗が、３０°〜３５℃の間の明らかなピークにより同様のパターンを有することを示す。
【００８２】
図１ｄは、増加濃度により、予想通り、ゲル（２５％）の強度が増加することを示す。
【００８３】
図１ｅは、ゲルが、数週間にわたる均一なタンパク質放出に適していることを示す。示されている測定において、それぞれ２０％および２５％の濃度で、ヘキサメチレンジイソシアネートを用いることにより鎖延長されたポロキサマー４０３を用いた。
【実施例６】
【００８４】
ゲル濃度の効果
所望の量の鎖延長されたポロキサマー（ポリマー）を無菌条件下で秤量し、適切な量の細胞培養培地と混合する。両者をシリンジにおいて４℃で数日間貯蔵し、何度も反復して撹拌する。これにより、２５〜３０℃でゲル化する均質な溶液が生成される。約１５℃において、１ミリリットル当たり１００，０００個の不死化幹細胞が添加される。細胞数は、ノイバウエル（Ｎｅｕｂａｕｅｒ）計数チャンバーにおいて測定され、細胞は、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）チューブにおいて遠心分離されてペレットとなり、続いて混合物に添加される。先ず１時間毎に、続いて１日毎に、最終的に１週間後に、「Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイ」によって異なるポリマー濃度（２．５％、５％および１０％）を試験する。試料の底部および内部両方の顕微鏡試験を行う。１０％ポリマー濃度の細胞生存は、この文脈において、より低濃度のものよりも幾分低い。他方では、このゲルの強度は相当高い。
【００８５】
図２および図３に結果を示す。
【実施例７】
【００８６】
コラーゲンの例を用いた生物材料の効果
生物材料を有する熱可逆性ゲルの高い生物学的活性を実証するために、一連の実験を行い、本発明に係る１０％ハイドロゲルにおける様々な濃度（０％、１０％および２０％）の可溶性コラーゲンにおいて、１ミリリットル当たり１００，０００個の不死化幹細胞を培養した。３７℃にて多湿雰囲気下、５％二酸化炭素および９５％空気により培養を行う。「Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ−アッセイ」によって、７日間にわたり活力を測定した。加えて、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いることにより細胞形態を試験した。図４および図５に結果を示す。
【００８７】
１．細胞培養培地における、１，４−ブタンジイソシアネートにより鎖延長されたポロキサマー４０３のポリマーの１０％溶液（実施例２を参照）を上に記載されている通りに調製する。１００，０００個のｅＧＦＰ−ＳＣＰ１細胞を、この溶液１ｍｌに懸濁する。ノイバウエル計数チャンバーにおいて細胞数を測定し、ファルコンチューブにおいて細胞を遠心分離してペレットにし、次にゲルに移す。１、２、３および７日後に、試料を試験する。細胞生存（図４、左側を参照）は、７日後に４５％と許容できるが、細胞は丸い形態を示し、接着増加は、単に拡張した細胞形態から結論付けることができるため、これは細胞の接着増加を示さない。
【００８８】
２．手順は上述と同じであるが、溶液にラット尾部由来の１０％可溶性コラーゲン（「Ｃｏｌｌ  Ｉ型−ラット尾部」、Ｍｅｒｃｋ）を添加する（図４、中央を参照）。この場合、細胞生存は、７日後に約４０％と相当に高い。ほんの３日後に、細胞の典型的な細長い形態が明らかとなる。
【００８９】
３．手順は２．と同様であるが、今回に限りは、混合物に２０％コラーゲンが導入される（図４、右側を参照）。細胞生存は、８０％と優れている。細胞は、さらにより顕著な細長い形態を提示する。
【００９０】
図４は、それぞれの顕微鏡像を示し、コラーゲンＩありまたはなしの本発明の熱可逆性ハイドロゲルにおける７日後のｅＧＦＰ−ＳＣＰ１の細胞生存を図解する。コラーゲンＩなしまたはありの本発明の熱可逆性ハイドロゲルの間の有意差は、目に見えるようになる。ヨウ化プロピジウム染色後の例示的な顕微鏡像を下部に示す（１０×拡大率）；スケール（目盛り線）は２００μｍ。
【００９１】
図５は、共焦点レーザー走査顕微鏡により可視化された、２０％コラーゲンＩありまたはなしの熱可逆性ハイドロゲル（本図において「ＢＤＩ−ハイドロゲル」と称される）における７日後のｅＧＦＰ−ＳＣＰ１細胞を示す。１０×（左側）または６３×（右側）の拡大率で画像を撮像した。
【実施例８】
【００９２】
適用システムにおける細胞生存における酸素の効果
ａ）酵素なしで異なる濃度の酸素放出物質（ＣａＯ2）を有する適用システム。
１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌおよび０．１ｍｇ／ｍｌの過酸化カルシウム（ＣａＯ2）の濃度において、ポロキサマー４０３およびブタンジイソシアネートから得られた熱可逆性ハイドロゲル（即ち、「ＢＤＩ−ハイドロゲル」）を含有するシリンジにおいて、ｈＴＥＲＴ不死化ヒト間葉系幹細胞を培養し、１時間毎の間隔で酸素飽和度を測定した。その後、活力アッセイにより細胞生存率を測定した。図６ａに結果を示す。
【００９３】
ｂ）酸素含有物質（ＣａＯ2）および異なる濃度の酵素を含有する適用システム。
酵素として１００Ｕ／ｍｌまたは２００Ｕ／ｍｌのカタラーゼまたはカタラーゼなし（対照）を添加したことを除き、実施例８ａ）を反復した。図６ｂに結果を示し、本図から、１００Ｕ／ｍｌまたは２００Ｕ／ｍｌのカタラーゼ濃度が、細胞生存に有益な効果を有することが理解できる。
【００９４】
ｃ）一定の酵素濃度において異なる濃度の酸素放出物質を有する適用システム。
実施例８ｂ）と同様に、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＣａＯ2および１００Ｕ／ｍｌカタラーゼを有するＢＤＩ−ハイドロゲルまたは０．２５ｍｇ／ｍｌ  ＣａＯ2および１００Ｕ／ｍｌカタラーゼを有するＢＤＩ−ハイドロゲルにおけるシリンジ内培養７２時間後に酸素飽和度（Ａ）および細胞生存（Ｂ）を測定した。図６ｃに結果を示し、本図から、「ＢＤＩ−ハイドロゲル」と表される対照と比較して、０．２５ｍｇ／ｍｌ  ＣａＯ2の濃度および１００Ｕ／ｍｌのカタラーゼ濃度において、７２時間後であっても、約７０％の値により、細胞生存が改善されることが理解できる。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【国際調査報告】
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