(57)【要約】  本発明は、ＨＤＡＣ阻害剤治療のためのバイオマーカーとしてＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される１つ以上の遺伝子の利用に関する。上記の遺伝子の発現および／または変化は、好ましくは、上記の遺伝子によって発現される各対応するｍＲＮＡまたは１つ以上のタンパク質によって決定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＤＡＣ阻害剤治療の作用を決定する方法であって、以下の：
ａ）前記ＨＤＡＣ阻害剤治療を受けている患者のサンプルを提供する工程、
ｂ）前記サンプル中のＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現および／または前記遺伝子発現の変化を決定する工程、
ｃ）前記少なくとも１つの遺伝子の前記決定された遺伝子発現および／または前記遺伝子発現の変化を前記患者における前記ＨＤＡＣ阻害剤治療の作用と相関させる工程を含む方法。
【請求項２】
ＨＤＡＣ阻害剤治療を監視する方法であって、以下の：
ａ）前記ＨＤＡＣ阻害剤治療を受けている患者のサンプルを提供する工程、
ｂ）前記サンプル中のＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現および／または前記遺伝子発現の変化を決定する工程、
ｃ）上記の工程ａおよびｂを少なくとも１回、好ましくは２回以上繰り返す工程、および
ｄ）前記ＨＤＡＣ阻害剤治療への前記患者の応答の時間プロファイルを生成するために工程ａ）〜ｃ）において決定された前記遺伝子発現を使用する工程を含む方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの遺伝子の前記遺伝子発現および／または前記遺伝子発現の変化は、さらにＨＤＡＣ阻害剤治療の前向きもしくは後ろ向きの転帰の確率と相関させられる、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
ＨＤＡＣ阻害剤治療を必要とする可能性がある患者を層別化する方法であって、以下の：
ａ）前記患者のサンプルを提供する工程、
ｂ）前記サンプル中のＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現を決定する工程、
ｃ）前記少なくとも１つの遺伝子の前記決定された遺伝子発現をＨＤＡＣ阻害剤治療が前記患者への有益な作用を有する確率と相関させる工程、および
ｄ）工程ｃにおいて決定された確率に基づいて、前記患者を前記ＨＤＡＣ阻害剤治療への応答者または非応答者であると分類する工程を含む方法。
【請求項５】
工程ａ）において提供された前記サンプルはＨＤＡＣ阻害剤が前記患者に投与される前に提供され、
工程ａ）の後に、前記サンプル中のＨＤＡＣを阻害するためにＨＤＡＣ阻害剤がエックスビボで前記サンプルに加えられ、および
工程ｂ）において、少なくとも１つの遺伝子の前記遺伝子発現が前記ＨＤＡＣ阻害剤を含む前記サンプル中で決定される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＨＤＡＣ阻害剤治療を受けている患者にとっての前記ＨＤＡＣ阻害剤治療の前向きの転帰の確率を予測する方法であって、以下の：
ａ）前記患者のサンプルを提供する工程、
ｂ）前記サンプル中のＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現を決定する工程、
ｃ）前記遺伝子発現を、工程ａ）の前に前記患者から提供されたサンプル中の前記少なくとも１つの遺伝子の前記遺伝子発現と比較する工程、および
ｄ）工程ａ）において提供された前記サンプル中と工程ａ）の前に提供された前記サンプル中との前記少なくとも１つの遺伝子の前記遺伝子発現の差を前記患者にとっての前記ＨＤＡＣ阻害剤治療の前向きの転帰の確率と相関させる工程を含む方法。
【請求項７】
工程ａ）の前に提供される前記サンプルは前記患者にＨＤＡＣ阻害剤が投与される前に前記患者から提供される、および
工程ａ）で提供される前記サンプルはＨＤＡＣ阻害剤が前記患者に投与された後に、好ましくはＨＤＡＣ阻害剤が前記患者に初めて投与された後に提供される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＨＤＡＣ阻害剤治療を必要とする患者における薬力学マーカーとしての少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現を決定する方法であって、以下の：
ａ）前記患者のサンプルを提供する工程、
ｂ）前記サンプル中の前記遺伝子発現および／またはＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を決定する工程、
ｃ）前記少なくとも１つの遺伝子の前記決定された遺伝子発現および／または前記遺伝子発現の変化をＨＤＡＣ阻害剤によるＨＤＡＣの相対的阻害と相関させる工程を含む方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の方法であって、前記少なくとも１つの遺伝子の前記遺伝子発現は、前記サンプル中の前記少なくとも１つの遺伝子または少なくとも１５０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１８０ヌクレオチド長のその断片によってコードされる少なくとも１つのｍＲＮＡのレベルを測定することによって決定される方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの遺伝子の前記遺伝子発現は前記サンプル中の前記少なくとも１つの遺伝子によってコードされる少なくとも１つのタンパク質または前記タンパク質のドメインのレベルを測定することによって決定される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのタンパク質もしくはそのドメインのレベルおよび／またはレベルの変化は、抗体または抗体を含むプローブの結合によって決定され、前記抗体は前記少なくとも１つのタンパク質もしくはそのドメインに特異的に結合する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプルは、前記ＨＤＡＣ阻害剤治療を開始する前または前記ＨＤＡＣ阻害剤治療中のいずれかに採取される、請求項４〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルは、体液のサンプル、好ましくは全血、血清もしくは血漿を含む群から選択される血液サンプル、より好ましくは全血、血清もしくは血漿を含む群から選択される末梢血サンプルである、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルは、組織サンプル、好ましくは罹患組織のサンプル、より好ましくは癌組織からの生検標本である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
工程ａ〜ｃまたは工程ａ〜ｂは少なくとも１回、好ましくは２回以上繰り返される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記ＨＤＡＣ阻害剤は、ボリノスタット、ロミデプシン、バルプロ酸、パノビノスタット、エンチノスタット、ベリノスタット、モセチノスタット、ギビノスタットおよびレスミノスタットまたはそれらの医薬上許容される塩、好ましくは遊離形にある（Ｅ）−３−（１−（４−（（ジメチルアミノ）メチル）フェニルスルホニル）−１Ｈ−ピロール−３−イル）−Ｎ−ヒドロキシアクリルアミドまたはそれらの塩酸塩もしくはメシル酸塩を含む群から選択される、先行する請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの遺伝子は、前記ＨＤＡＣ阻害剤治療を必要とする患者のためのＨＤＡＣ阻害剤治療における薬力学マーカーとしてのＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される、少なくとも１つの遺伝子の使用または前記少なくとも１つの遺伝子によってコードされたタンパク質の使用。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの遺伝子は、前記ＨＤＡＣ阻害剤治療を必要とする患者にとってのＨＤＡＣ阻害剤治療の転帰を予測するためのＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される、少なくとも１つの遺伝子の使用または前記少なくとも１つの遺伝子によってコードされたタンパク質の使用。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの遺伝子は、ＨＤＡＣ活性を決定するための代理マーカーとしてのＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される、少なくとも１つの遺伝子の使用または前記少なくとも１つの遺伝子によってコードされたタンパク質の使用。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの遺伝子は、応答者または非応答者としてＨＤＡＣ阻害剤治療を必要とする可能性がある患者を層別化するためのＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される、少なくとも１つの遺伝子の使用または前記少なくとも１つの遺伝子によってコードされたタンパク質の使用。
【請求項２１】
サンプル中のＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現を決定するためのキットであって、
前記キットは、前記少なくとも１つの遺伝子または少なくとも１５０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１８０ヌクレオチド長のその断片によってコードされる少なくとも１つのｍＲＮＡに特異的に結合するプローブを含み、および
前記キットは、任意選択的に、培地、培地成分、バッファー、バッファー成分、ＲＮＡ精製カラム、ＤＮＡ精製カラム、染料、ｄＮＴＰミックスを含む核酸、ポリメラーゼを含む酵素および塩を含む群から選択される１つ以上のさらなる成分を含むキット。
【請求項２２】
サンプル中のＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される１つの遺伝子によってコードされた少なくとも１つのタンパク質のレベルを決定するためのキットであって：
前記少なくとも１つの遺伝子もしくは前記タンパク質の１つのドメインによってコードされた少なくとも１つのタンパク質に特異的に結合するプローブを含み、および
任意選択的に、培地、培地成分、バッファー、バッファー成分、膜、ＥＬＩＳＡプレート酵素基質、染料、ポリメラーゼを含む酵素および塩を含む群から選択される１つ以上のさらなる成分を含むキット。
【請求項２３】
サンプル中のＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される少なくとも１つの遺伝子の前記遺伝子発現を決定するための請求項２１または２２に記載のキットの使用。
【請求項２４】
前記決定された遺伝子発現は前記サンプル中のＨＤＡＣ活性と相関させられる、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記サンプルは、ＨＤＡＣ阻害剤治療を必要とする可能性がある患者から提供される、請求項２３または２４に記載の使用。
【請求項２６】
請求項１〜１６のいずれかに記載の方法における請求項２１または２２に記載のキットの使用。
【請求項２７】
ＨＤＡＣ阻害剤治療を必要とする可能性がある患者の治療において使用するためのＨＤＡＣ阻害剤であって、前記治療の前および／または前記治療中のＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される少なくとも１つの遺伝子、前記少なくとも１つの遺伝子に対応する少なくとも１つのｍＲＮＡ、または前記少なくとも１つの遺伝子によってコードされた少なくとも１つのタンパク質が前記患者への前記ＨＤＡＣ阻害剤治療の作用の確率を決定するため、または前記患者が前記ＨＤＡＣ阻害剤治療への応答者であるかどうかを決定するために使用されるＨＤＡＣ阻害剤。
【請求項２８】
ＨＤＡＣ阻害剤治療を必要とする可能性がある患者を治療する方法であって、前記患者にＨＤＡＣ阻害剤を投与する工程を含み、前記方法の前および／または前記方法中のＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される少なくとも１つの遺伝子、前記少なくとも１つの遺伝子に対応する少なくとも１つのｍＲＮＡ、または前記少なくとも１つの遺伝子によってコードされた少なくとも１つのタンパク質が前記患者への前記ＨＤＡＣ阻害剤治療の作用の確率を決定するため、または前記患者が前記ＨＤＡＣ阻害剤治療への応答者であるかどうかを決定するために使用される方法。
【請求項２９】
前記ＨＤＡＣ阻害剤は、ボリノスタット、ロミデプシン、バルプロ酸、パノビノスタット、エンチノスタット、ベリノスタット、モセチノスタット、ギビノスタットおよびレスミノスタットまたはそれらの医薬上許容される塩、好ましくは遊離形にある（Ｅ）−３−（１−（４−（（ジメチルアミノ）メチル）フェニルスルホニル）−１Ｈ−ピロール−３−イル）−Ｎ−ヒドロキシアクリルアミドまたはそれらの塩酸塩もしくはメシル酸塩を含む群から選択される、請求項２７に記載のＨＤＡＣ阻害剤治療を必要とする可能性がある患者の治療において使用するためのＨＤＡＣ阻害剤または請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＤＡＣ阻害剤治療と結び付けて使用されてよい特定の特異バイオマーカー、上記バイオマーカーが適用される方法および上記方法において使用するためのキットに向けられる。
【背景技術】
【０００２】
基礎にあるＤＮＡ配列における変化以外の機構によって誘発される表現型（外観）もしくは遺伝子発現における遺伝的変化の研究は、エピジェネティクスと呼ばれている。そのような変化は残りの細胞寿命にわたって細胞分割を通して残存することが見込まれ、数世代にわたり存在する場合がある。上記の非遺伝的因子は、生体の遺伝子が異なった挙動をする、または異なった自己発現をすることを誘発する（Ｓｐｅｃｉａｌ  ｒｅｐｏｒｔ：“Ｗｈａｔ  ｇｅｎｅｓ  ｒｅｍｅｍｂｅｒ”ｂｙ  Ｐｈｉｌｉｐ  Ｈｕｎｔｅｒ，Ｐｒｏｓｐｅｃｔ  Ｍａｇａｚｉｎｅ  Ｍａｙ  ２００８  ｉｓｓｕｅ  １４６）。
【０００３】
近年のエピジェネティクスの研究は、環境因子が生体の特性に影響を及ぼし、時には子孫に継代される場合があることを証明している。現在までに、どの分子構造が関係するのかが科学的に実証されている：重要な因子は、規則正しい省スペース法でＤＮＡを保存するための、染色体の構造成分であり、ＤＮＡのための１種類のパッケージング材料であるヒストンである。ヒストンが有する化学基および対応する修飾に依存して、例えばヒストンがアセチル化、リン酸化もしくはメチル化されていると、ヒストンは永久的に遺伝子を活性化または不活性化する。
【０００４】
まとめると、原核細胞、植物および動物を含む広範囲の生体において１００例を超える継代エピジェネティック遺伝現象の例が報告されている（Ｊａｂｌｏｎｋａ，Ｅｖａ；Ｇａｌ  Ｒａｚ，２００９，Ｔｈｅ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８４（２）：１３１−１７６）。
【０００５】
エピジェネティック機構の分子的基礎は、複雑で不均一であり、特定の遺伝子の活性化状態の修飾を含むが、ＤＮＡの基本構造および配列を包含していない。さらに、ＤＮＡと関連するクロマチンタンパク質は、様々なタンパク質修飾によって誘導された活性化もしくは不活性化状態にある可能性がある。上述のように、例えばクロマチンへのそのようなエピジェネティック変化もまた、細胞の分割時に保存される。これらの修飾に基づいて、ＤＮＡがヒストンの周囲で包み込まれる方法が変化し、この構造修飾を原因として遺伝子発現も同様に変化する。そのようなクロマチンのリモデリング機構は、幾つかの機構を通して達成される可能性がある。
【０００６】
１つの重要な過程は、ヒストンタンパク質を作り上げる、例えばアセチル化、メチル化および／またはリン酸化として発生する可能性があるアミノ酸の翻訳後修飾を含む。アミノ酸が修飾されると、ヒストンタンパク質の全体形状が変化させられる場合がある。同様に、ＤＮＡは複製中に完全には巻き戻しされないので、このためそのような修飾ヒストンがＤＮＡの各新規コピー内に運ばれることが起こり得ると思われる。これらの修飾ヒストンは、次に修飾方法において同様に成形された周囲の新規ヒストンを有する鋳型構造として機能する可能性がある。
【０００７】
ヒストンの非構造化Ｎ末端（「ヒストン尾部」とも呼ばれる）は特に高度に修飾されるが、ヒストン修飾は配列全体にわたって発生する可能性がある。これらの修飾には、アセチル化、メチル化、ユビキチン化、リン酸化およびＳＵＭＯ化が含まれる。例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素（ＨＡＴｓ）によるヒストンＨ３の尾部のＫ１４およびＫ９リシンのアセチル化は、一般に転写能力と相関している。したがって脱アセチル化は転写サイレンシングと相関しており、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）活性を有する酵素によって果たされる。
【０００８】
「能動的」転写と関連しているアセチル化の傾向は、本来は生物物理学的であると思われる。リシン残基は通常その末端に正荷電窒素を有するので、このためＤＮＡ骨格の負荷電リン酸塩と結び付く可能性がある。これとは対照的に、アセチル化事象がリシン側鎖上のこの正荷電アミノ基を変化させると、正荷電アミノ基は中性アミド結合に変換され、結果としてヒストンからのＤＮＡの解放を生じさせる。これが発生すると、転写因子および転写複合体はより容易にＤＮＡに結合して転写過程の発生を可能にする。これは、ヒストン尾部への変化がＤＮＡ自体に直接作用を及ぼすエピジェネティック機構の「ｃｉｓ」モデルであると呼ぶことができる。エピジェネティック機構のまた別のモデルである「ｔｒａｎｓ」モデルでは、ヒストン尾部への変化はＤＮＡへ間接的に作用する。例えば、リシンのアセチル化はクロマチン修飾酵素（および同様に基底転写機構）のための結合部位を作成することができ、これは次にクロマチン状態への変化を誘発する。実際に、アセチル−リシンに特異的に結合するタンパク質断片（ドメイン）である保存されたブロモドメインは、（タンパク質ポリブロモ上の）ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体を含む転写を活性化するのに役立つ多数の酵素内で見いだされる。これらをまとめると、アセチル化は、転写活性化を修飾するために「ｃｉｓ」および「ｔｒａｎｓ」モデルのどちらにおいても作用すると思われる。
【０００９】
様々なシストン修飾は様々な方法で機能すると考えられる：１つの位置でのアセチル化は別の位置ではアセチル化とは異なる機能を果たす可能性が高い。同様に、複数の修飾が発生することがあり、これらの修飾はヌクレオソーム構造（ＤＮＡ＋ヒストン）の挙動を変化させるために一緒に働く可能性がある。これらのヒストンの基礎にある複数の動的修飾は体系的で再現可能な方法で遺伝子転写を調節し、ヒストンコードと呼ばれている。
【００１０】
エピジェネティック機構の調節は、様々な潜在的な医学的用途を期待できる。先天的遺伝子病は明確に理解されているが、エピジェネティクスが重要であることは、例えばアンジェルマン症候群およびプレイダー・ウィリー症候群の症例におけるように明白である。これらは遺伝子欠失もしくは遺伝子の不活性化によって誘発される通常の遺伝子病であるが、罹患者がゲノミック・インプリンティングのために本質的にヘミ接合性であるために極めて一般的であり、このため大多数の症例は両方のコピーがノックアウトされることを必要とするであろうが、この疾患を誘発するには単一遺伝子ノックアウトだけで十分である（インターネット上の‘Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ’，ＯＭＩＭ，ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｉｍを参照されたい）。
【００１１】
多細胞生体におけるエピジェネティック機構は一般に分化に伴って生じると考えられてきたが、様々な種において継代エピジェネティック遺伝についての幾つかの観察さえなされてきた。これらの数世代にわたるエピジェネティック形質の大多数は数世代をかけて経ると次第に失われる可能性があるが、数世代にわたるエピジェネティクスが進化および順応にもう一つの側面を加えられるという可能性も依然としてある。ＤＮＡの１領域に関連するエピジェネティック特徴の修飾は、生体が数世代にわたる時間尺度で特定遺伝子を発現する表現型と抑制する表現型との間で切り替わることを可能にする（Ｏ．Ｊ．Ｒａｎｄｏ  ａｎｄ  Ｋ．Ｊ．Ｖｅｒｓｔｒｅｐｅｎ，２００７，Ｃｅｌｌ  １２８（４）：６５５−６６８）。その領域のＤＮＡ配列が突然変異していない場合、その変化は可逆性であり、順応過程に柔軟性を提供する。
【００１２】
最近の研究は、エピジェネティック医薬品が、例えば放射線療法や化学療法などの現在容認されている治療にとって推定上の代償療法もしくは補助療法であること、またはこれらの最新治療の作用を強化できたことを証明している（Ｗａｎｇ，ＬＧ；Ｃｈｉａｏ，ＪＷ，２０１０，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏ．３（３７）：５３３−９）。例えばヒストン内の構造変化による原型癌遺伝子領域および腫瘍サプレッサー配列のエピジェネティック制御は、癌の形成および進行に直接的な影響を及ぼすことが証明された（Ｉｇｌｅｓｉａｓ−Ｌｉｎａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ５（４６）：３２３−９）。
【００１３】
エピジェネティック的に作用する薬物を用いたそのような新規な治療選択肢は、他の抗癌治療が提供しない特徴である可逆性の機会をさらに提供できるであろう（Ｌｉ，ＬＣ；Ｃａｒｒｏｌｌ，ＰＲ；Ｄａｈｉｙａ，Ｒ，２００５．ＪＮＣＩ  ２（９７）：１０３−１５）。現在までに、エピジェネティック新薬開発は、新規なＨＤＡＣ阻害製薬品であるボリノスタットおよびロミデプシンの市場への導入を含む、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）およびヒストンデアセチラーゼ（ｄｅａｃｔｙｌａｓ）（ＨＤＡＣ）に主として集中してきた（Ｓｐａｎｎｈｏｆｆ，Ａ；Ｓｉｐｐｌ，Ｗ；Ｊｕｎｇ，Ｍ（２００９），Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １（４１）：４−１１）。ＨＤＡＣ酵素は特に、口腔扁平上皮癌の進行において肝要な役割を果たすことが証明されている（Ｉｇｌｅｓｉａｓ−Ｌｉｎａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０），Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ５（４６）：３２３−９）。選択されたＨＤＡＣイソ酵素の過剰発現は近年、様々な癌のタイプ、例えば肝細胞癌などにおけるＨＤＡＣ−１およびＨＤＡＣ−２（Ｌｅｅ  ＴＫ，Ｐｏｈ  ＹＰ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１：Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１１，ｗｗｗ．ｊｃｉ．ｏｒｇ）または結腸直腸腫瘍におけるＨＤＡＣ−２（Ｚｈｕ  Ｐ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｅ，Ｍｅｎｇｗａｓｓｅｒ  Ｊ，Ｓｃｈｌａｇ  Ｐ，Ｊａｎｓｓｅｎ  ＫＰ，Ｇｏｅｔｔｌｉｃｈｅｒ  Ｍ．，２００４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２００４  Ｍａｙ；５（５）：４５５−６３）における予後の悪化と結び付けられてきた。上述のように、異所性ＨＤＡＣ酵素の発現もしくは活性は、周知の腫瘍サプレッサー遺伝子の抑制を誘発して悪性腫瘍進行にとって重要な他の因子の活性を修飾する数多くのヒト悪性腫瘍と関連があることが見いだされた。そこでヒストンデアセチラーゼの阻害は、抗癌薬開発における前途有望な治療概念を表す。
【００１４】
現在、遺伝子構造、すなわちＤＮＡの直接塩基配列および／または個人の遺伝子の突然変異が様々な疾患、特に癌の病因に寄与するだけではなく、さらに、例えばクロム化へのエピジェネティック二次パッケージングに影響を及ぼす環境シグナルの影響もまた発癌性の一因となる病原事象に影響を及ぼす、または誘発する可能性があることが実際に明確に認められている。
【００１５】
上述のエピジェネティック変化は、一細胞世代から他の細胞世代へ前方に継代されさえする、または一般に子孫に継代されさえする可能性があるので、そこで個人に遺伝子構造およびさらにエピジェネティック構造の両方を提供する。
【００１６】
このため、遺伝子構造または遺伝子における突然変異だけではなく、さらに個人の全体的エピジェネティック構造もまた疾患の発生に寄与する可能性があり、そのようなエピジェネティック機構に影響を及ぼす薬物への身体の応答に寄与する可能性がある。このように、エピジェネティック機構に大きな影響を及ぼす薬物によって誘発される身体のいずれかの細胞内での個人のエピジェネティック構造における変化の観察は、個人の治療への応答を予測するための妥当な方法を表す可能性がある。そのような個人の罹患組織は、そのような薬物作用を測定できる非罹患組織と同一もしくは少なくとも類似の方法でエピジェネティックレベルへの影響を有する薬物に応答する可能性が高い。
【００１７】
そのような薬物は、例えばヒストンデアクチラーゼ活性を有する酵素の阻害剤によって代表される、またはむしろ現在では一般にタンパク質デアセチラーゼと呼ばれるが、これはそれらの脱アセチル化活性がクライアントタンパク質としてのヒストンに限定されないことが多く、原型癌遺伝子および腫瘍サプレッサータンパク質機能により広域で直接的もしくは間接的に強度の影響を及ぼす可能性があるからである。
【００１８】
様々なＨＤＡＣ阻害剤は現在、血液学的悪性腫瘍および充実性腫瘍の両方を含む広範囲の腫瘍実体において臨床試験中であり、１クラスのエピジェネティック的に活性で、強力な抗増殖性の分化誘導性およびプロアポトーシス性作用物質を表す。ヒストンデアクチラーゼ阻害剤ファミリーの２つのメンバー（ボリノスタットおよびロミデプシン）は、難治性皮膚Ｔ細胞リンパ腫の治療のために既に承認されており、これらの患者における単剤療法薬として相当に大きな臨床的有用性を有することが証明されている。
【００１９】
現在は、パノビノスタット、エンチノスタット、ベリノスタット、ギビノスタットおよびレスミノスタットを含む、多数のさらなるＨＤＡＣ阻害剤が様々な段階で臨床開発中である（Ｍａｒｋｓ，ＰＡ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｗ−ｓ，２００９，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．；１０７（４）：６００−６０８）（Ｅｌｌｉｓ，Ｌ  ａｎｄ  Ｐｉｌｉ，Ｒ，２０１０，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂａｓｅｌ）；３（８）；２４１１−２４６９）。
【００２０】
しかし、当技術分野では、治療意図で、または治療過程においてできる限り早期にＨＤＡＣ阻害剤の作用を決定することが必要とされる。
【００２１】
Ｃ２Ｈ２型のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ファミリーの転写因子であるＺＦＰ６４は、発生、分化、腫瘍発生および免疫応答を含む多数の細胞機能において重要な役割を果たす。ＺＦＰ６４は、ＮＦ−κＢ活性化およびその後の侵襲性病原体への炎症性反応を伴うＴＬＲシグナル伝達における正の調節因子である（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２０１３，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｊｕｌｙ  １５，２０１３）。しかし、その生物学的機能は大部分が不明のままである。
【００２２】
ＩＨＣ染色実験（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／ＥＮＳＧ００００００２０２５６／ｔｉｓｓｕｅ／ｓｔａｉｎｉｎｇ＋ｏｖｅｒｖｉｅｗを参照）に基づくと、ＺＦＰ６４タンパク質は好ましくは特定の組織／器官内で発現し、主として核内で見いだされる。正常な組織／器官内のＺＦＰ６４タンパク質は、好ましくは：肝臓、膵臓および消化管ならびに精巣および皮膚内で発現する。癌組織内のＺＦＰ６４タンパク質は、好ましくは以下のタイプ：肝臓、リンパ腫、膵臓、甲状腺および腎臓の癌内で発現する。ＺＦＰ６４は、ＣＲＣ患者における原発腫瘍に比較して肝転移においてはアップレギュレートされる（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ  Ｐａｎｃｒｅａｔ  Ｄｉｓ  Ｉｎｔ．２０１０；９：１４９−５３）。
【００２３】
ＺＦＰ６４は、Ｎｏｔｃｈ１の共活性化によって間葉細胞の分化を調節すると同定されている。ＺＦＰ６４はＮｏｔｃｈ１の細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）と関連すると報告されており、Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子であるＨｅｓ１およびＨｅｙ１のプロモーターに動員され、それらをトランス活性化し、Ｎｏｔｃｈ１の共活性化による間葉細胞の分化に関係している（Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．２００８  Ｍａｙ  １５；１２１（Ｐｔ  １０）：１６１３−２３．ｄｏｉ：１０．１２４２／ｊｃｓ．０２３１１９）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
前臨床試験および臨床試験では、ＨＤＡＣ阻害剤の使用が特異的遺伝子発現パターンの再現性調節を生じさせることが確認された。ＨＤＡＣ阻害剤が、（ｉ）インビトロでＨＤＡＣ阻害剤により治療された様々な異なる癌細胞型ならびに（ｉｉ）臨床試験の状況においてＨＤＡＣ阻害剤により治療された癌患者の末梢血細胞の両方、および（ｉｉｉ）エックスビボでＨＤＡＣ阻害剤により治療された健常ドナーのＰＢＭＣｓ中において同一方法でこれらの遺伝子発現を調節することを証明できた。
【００２５】
このため、所定の患者の癌細胞および末梢血細胞の全体的エピジェネティック構造が特定の薬理学的物質、例えばＨＤＡＣ阻害剤の影響への感受性に関して匹敵する、およびこのためどちらの細胞型も同一もしくは類似の遺伝子発現調節を経験することになると推論することができる。このため、患者の末梢血細胞中のエピジェネティック的に誘導された特定の特異的遺伝子における遺伝子発現変化を使用すると、潜在的に同一患者の腫瘍細胞への薬物活性を決定することができる。
【００２６】
さらに、ＨＤＡＣ阻害剤を用いた患者の治療中の遺伝子発現プロファイルにおけるこれらのエピジェネティック的に誘導された変化の減少もしくは増加は、患者にとっての治療的有用性の減少もしくは増加を指示するので、このため疾患予後と相関する可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
１つの態様では、本発明は、癌患者の癌細胞系およびＰＢＭＣｓならびに末梢血細胞中のＨＤＡＣ阻害剤への曝露後に再現性で変化させられる特定の選択遺伝子の遺伝子発現の調節に関する。
【００２８】
本明細書ではバイオマーカーとも呼ぶこれらの遺伝子発現調節は、様々な有用性を有すると予測されている。
【００２９】
遺伝子発現調節は、適用されたＨＤＡＣ阻害剤の薬力学的活性のマーカーとして機能する可能性がある。
【００３０】
遺伝子発現調節は、患者をＨＤＡＣ阻害剤により治療すべきかどうか、およびＨＤＡＣ阻害剤により治療すべき患者において臨床的有用性を期待できるか否かについての予測を可能にする、ＨＤＡＣ阻害剤による治療に取り組む前の予測バイオマーカーとして（もしくは層別化のために）役立つ可能性がある。
【００３１】
遺伝子発現調節は、所定の患者について疾患が治療とは無関係にどのように進行するのかについての予測を可能にする、ＨＤＡＣ阻害剤による治療に取り組む前の予後バイオマーカーとして役立つ可能性がある。
【００３２】
遺伝子発現調節は、患者がＨＤＡＣ阻害剤による治療からどの位の期間にわたり利益を得られるかを予測するために、および一般にＨＤＡＣ阻害剤治療の進行を監視するために、ＨＤＡＣ阻害剤による治療中のバイオマーカーとして役立つ可能性がある。
【００３３】
さらに、これらのバイオマーカーは疾患進行に因果的に関係する可能性もあるので、このためそれら自体が治療標的構造を表す場合がある。このためそれらの活性は、例えばｓｉＲＮＡ干渉によりそれらのｍＲＮＡ発現パターンに影響を及ぼす、それらの存在を増加させるための遺伝子療法を介して、それらのタンパク質機能を調節するための抗体テクノロジー、またはそのようなバイオマーカー実体の機能的効力を変化させる低分子バインダーによってなど様々な手段を利用する治療的介入にとっての主題である可能性がある。さらにワクチン接種工程も可能であろう。
【００３４】
このため、本発明の主題は、ＨＤＡＣ阻害剤治療に関連する診断方法および予後診断方法における、および患者を層別化するための、少なくとも１つの遺伝子、上記少なくとも１つの遺伝子のＤＮＡ配列、上記少なくとも１つの遺伝子または少なくとも１５０ヌクレオチド長、好ましくは１８０ヌクレオチド長のそれらの断片によってコードされたＲＮＡ配列、または上記少なくとも１つの遺伝子によってコードされた少なくとも１つのタンパク質もしくは上記タンパク質の１つのドメインの使用であって、このとき上記少なくとも１つの遺伝子はＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群の１つ以上のメンバーから選択される使用である。本発明のさらなる実施形態は、治療的介入のための標的としての、上記の少なくとも１つの遺伝子、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列もしくはタンパク質各々の使用である。
【００３５】
本発明は、ＨＤＡＣ阻害剤治療を監視するため、および上記治療を必要とする可能性がある患者を応答者もしくは非応答者に層別化するための、本発明によるバイオマーカーの適用、ヌクレオチド配列、タンパク質、キット、方法および使用を含んでいる。
【００３６】
本発明のために選択した遺伝子の同定を表１に示した。
【００３７】
【表１】
2016521543.tif 000002
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明の１つの主題は、本発明による１つ以上の遺伝子の遺伝子発現を、ＨＤＡＣ阻害剤による治療を開始する前または治療の経過中のいずれかに罹患組織もしくは末梢血細胞のいずれかのサンプル中で直接的に測定することである。さらに、本発明のまた別の主題は、治療の開始前の遺伝子発現を治療中に観察される遺伝子発現と比較して、本発明において選択された１つ以上の遺伝子のこれらの発現プロファイルにおける変化を測定することである。さらに、本発明のまた別の主題は、治療を受けている患者の様々な部分母集団間の遺伝子発現を比較して、本発明において選択された１つ以上の遺伝子のこれらの発現プロファイルにおける差を測定することである。
【００３９】
本発明の特定の実施形態を以下に列挙する。
１．ＨＤＡＣ阻害剤治療の作用を決定する方法であって、以下の：
ａ）上記ＨＤＡＣ阻害剤治療を受けている患者のサンプルを提供する工程、
ｂ）上記サンプル中のＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現および／または遺伝子発現の変化を決定する工程、
ｃ）上記少なくとも１つの遺伝子の決定された遺伝子発現および／または遺伝子発現の変化を上記患者における上記ＨＤＡＣ阻害剤治療の作用と相関させる工程を含む方法。
【００４０】
本発明の特定の実施形態では、上記少なくとも１つの遺伝子の決定された遺伝子発現および／または遺伝子発現の変化と患者におけるＨＤＡＣ阻害剤治療との相関は、上記決定された遺伝子発現および／または遺伝子発現の変化を他の患者から獲得された以前のデータと比較することによって決定できるが、このとき上記少なくとも１つの遺伝子の特定の遺伝子発現および／または遺伝子発現の変化は既に上記ＨＤＡＣ阻害剤治療の作用に向けられている。そのようなデータは、例えば、表または機械読取り可能データバンクの形態で提供されてよい。
【００４１】
２．ＨＤＡＣ阻害剤治療を監視する方法であって、以下の：
ａ）上記ＨＤＡＣ阻害剤治療を受けている患者のサンプルを提供する工程、
ｂ）上記サンプル中のＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現および／または遺伝子発現の変化を決定する工程、
ｃ）上記の工程ａおよびｂを少なくとも１回、好ましくは２回以上繰り返す工程、および
ｄ）工程ａ）〜ｃ）において決定された上記遺伝子発現を使用して上記ＨＤＡＣ阻害剤治療への上記患者の応答の時間プロファイルを生成する工程を含む方法。
【００４２】
本発明によるＨＤＡＣ阻害剤治療を監視する方法は、上記少なくとも１つの遺伝子の決定された遺伝子発現および／または遺伝子発現の変化を上記患者における上記ＨＤＡＣ阻害剤治療の作用と相関させる工程を含んでいてよい。
【００４３】
３．上記少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現および／または遺伝子発現の変化は、さらにＨＤＡＣ阻害剤治療の前向きもしくは後ろ向きの転帰の確率と相関させられる、上記の項目１または２のいずれかに記載の方法。
【００４４】
４．ＨＤＡＣ阻害剤治療を必要とする可能性がある患者を層別化する方法であって、以下の：
ａ）上記患者のサンプルを提供する工程、
ｂ）上記サンプル中のＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現を決定する工程、
ｃ）上記少なくとも１つの遺伝子の決定された遺伝子発現をＨＤＡＣ阻害剤治療が上記患者への有益な作用を有する確率と相関させる工程、および
ｄ）工程ｃにおいて決定された確率に基づいて、上記患者を上記ＨＤＡＣ阻害剤治療への応答者または非応答者であると分類する工程を含む方法。
【００４５】
５．工程ａ）において提供された上記サンプルはＨＤＡＣ阻害剤が上記患者に投与される前に提供され、
工程ａ）の後に、上記サンプル中のＨＤＡＣを阻害するためにＨＤＡＣ阻害剤がエックスビボで上記サンプルに加えられ、および
工程ｂ）において、少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現が上記ＨＤＡＣ阻害剤を含む上記サンプル中で決定される、上記の項目４に記載の方法。
【００４６】
特に、上記の項目５では、「工程ａ）において提供されるサンプルはＨＤＡＣ阻害剤が上記患者に投与される前に提供される」との表現は、工程ａ）において提供される上記サンプルが、上記患者にＨＤＡＣ阻害剤が最初に投与される前に提供されることを意味する。または、上記の項目５では、「工程ａ）において提供されるサンプルはＨＤＡＣ阻害剤が上記患者に投与される前に提供される」との表現は、工程ａ）において提供される上記サンプルがＨＤＡＣ阻害剤治療のために上記患者に投与されることが意図される特定のＨＤＡＣ阻害剤（例えば、レスミノスタット）が上記患者に最初に投与される前に提供されることを意味する。
【００４７】
１つの実施形態では、患者は上記患者のサンプル中のＣＣＤＣ４３の遺伝子発現が健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較して２５％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７５％以上、いっそうより好ましくは１００％以上異なる場合に応答者であると分類できる。１つの特定実施形態では、上記の差は、健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較した、遺伝子発現における増加である。１つの特定実施形態では、上記の差は、健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較した、遺伝子発現における減少である。
【００４８】
１つの実施形態では、患者は上記患者のサンプル中のＤＰＰ３の遺伝子発現が健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較して２５％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７５％以上、いっそうより好ましくは１００％以上異なる場合に応答者であると分類できる。１つの特定実施形態では、上記の差は、健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較した、遺伝子発現における増加である。１つの特定実施形態では、上記の差は、健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較した、遺伝子発現における減少である。
【００４９】
１つの実施形態では、患者は上記患者のサンプル中のＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂの遺伝子発現が健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較して２５％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７５％以上、いっそうより好ましくは１００％以上異なる場合に応答者であると分類できる。１つの特定実施形態では、上記の差は、健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較した、遺伝子発現における増加である。１つの特定実施形態では、上記の差は、健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較した、遺伝子発現における減少である。
【００５０】
１つの実施形態では、患者は上記患者のサンプル中のＫＤＥＬＣ２の遺伝子発現が健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較して２５％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７５％以上、いっそうより好ましくは１００％以上異なる場合に応答者であると分類できる。１つの特定実施形態では、上記の差は、健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較した、遺伝子発現における増加である。１つの特定実施形態では、上記の差は、健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較した、遺伝子発現における減少である。
【００５１】
１つの実施形態では、患者は上記患者のサンプル中のＭＩＣＡＬＬ１の遺伝子発現が健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較して２５％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７５％以上、いっそうより好ましくは１００％以上異なる場合に応答者であると分類できる。１つの特定実施形態では、上記の差は、健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較した、遺伝子発現における増加である。１つの特定実施形態では、上記の差は、健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較した、遺伝子発現における減少である。
【００５２】
１つの実施形態では、患者は上記患者のサンプル中のＺＦＰ６４の遺伝子発現が健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較して２５％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７５％以上、いっそうより好ましくは１００％以上異なる場合に応答者であると分類できる。１つの特定実施形態では、上記の差は、健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較した、遺伝子発現における増加である。１つの特定実施形態では、上記の差は、健常被験者における上記遺伝子のメジアン遺伝子発現と比較した、遺伝子発現における減少である。
【００５３】
６．上記ＨＤＡＣ阻害剤治療を受けている患者にとってのＨＤＡＣ阻害剤治療の前向きの転帰の確率を予測する方法であって、以下の：
ａ）上記患者のサンプルを提供する工程、
ｂ）上記サンプル中のＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現を決定する工程、
ｃ）上記遺伝子発現を、工程ａ）の前に上記患者から提供されたサンプル中の上記少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現と比較する工程、および
ｄ）工程ａ）において提供された上記サンプル中と工程ａ）の前に提供された上記サンプル中との上記少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現の差を上記患者にとってのＨＤＡＣ阻害剤治療の前向きの転帰の確率と相関させる工程とを含む方法。
【００５４】
７．工程ａ）の前に提供される上記サンプルは上記患者にＨＤＡＣ阻害剤が投与される前に上記患者から提供される、および
工程ａ）において提供される上記サンプルは上記患者にＨＤＡＣ阻害剤が投与された後に、好ましくはＨＤＡＣ阻害剤が上記患者に初めて投与された後に提供されるが、このとき好ましくは「ＨＤＡＣ阻害剤が投与される前」は、上記ＨＤＡＣ阻害剤が投与される１秒間〜１日前、より好ましくは投与される１秒間〜１時間前を意味する、上記の項目６に記載の方法。
【００５５】
１つの実施形態では、所定の患者にとってのＨＤＡＣ阻害剤治療の前向きの転帰の確率は、ＨＤＡＣ阻害剤の投与２時間後に決定されたＣＣＤＣ４３の遺伝子発現が、ＨＤＡＣ阻害剤が上記患者に投与される前に上記患者由来のサンプル中で決定された上記遺伝子の遺伝子発現と比較して２５％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７５％以上、いっそうより好ましくは１００％以上、さらにいっそうより好ましくは１５０％以上変化した場合は、７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、いっそうより好ましくは９５％以上である。１つの特定実施形態では、上記の変化は遺伝子発現における増加である。１つの特定実施形態では、上記の変化は遺伝子発現における減少である。
【００５６】
１つの実施形態では、所定の患者にとってのＨＤＡＣ阻害剤治療の前向きの転帰の確率は、ＨＤＡＣ阻害剤の投与２時間後に決定されたＤＰＰ３の遺伝子発現が、ＨＤＡＣ阻害剤が上記患者に投与される前に上記患者由来のサンプル中で決定された上記遺伝子の遺伝子発現と比較して２５％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７５％以上、いっそうより好ましくは１００％以上、さらにいっそうより好ましくは１５０％以上変化した場合は、７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、いっそうより好ましくは９５％以上である。１つの特定実施形態では、上記の変化は遺伝子発現における増加である。１つの特定実施形態では、上記の変化は遺伝子発現における減少である。
【００５７】
１つの実施形態では、所定の患者にとってのＨＤＡＣ阻害剤治療の前向きの転帰の確率は、ＨＤＡＣ阻害剤の投与２時間後に決定されたＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂの遺伝子発現が、ＨＤＡＣ阻害剤が上記患者に投与される前に上記患者由来のサンプル中で決定された上記遺伝子の遺伝子発現と比較して２５％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７５％以上、いっそうより好ましくは１００％以上、さらにいっそうより好ましくは１５０％以上変化した場合は、７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、いっそうより好ましくは９５％以上である。１つの特定実施形態では、上記の変化は遺伝子発現における増加である。１つの特定実施形態では、上記の変化は遺伝子発現における減少である。
【００５８】
１つの実施形態では、所定の患者にとってのＨＤＡＣ阻害剤治療の前向きの転帰の確率は、ＨＤＡＣ阻害剤の投与２時間後に決定されたＫＤＥＬＣ２の遺伝子発現が、ＨＤＡＣ阻害剤が上記患者に投与される前に上記患者由来のサンプル中で決定された上記遺伝子の遺伝子発現と比較して２５％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７５％以上、いっそうより好ましくは１００％以上、さらにいっそうより好ましくは１５０％以上変化した場合は、７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、いっそうより好ましくは９５％以上である。１つの特定実施形態では、上記の変化は遺伝子発現における増加である。１つの特定実施形態では、上記の変化は遺伝子発現における減少である。
【００５９】
１つの実施形態では、所定の患者にとってのＨＤＡＣ阻害剤治療の前向きの転帰の確率は、ＨＤＡＣ阻害剤の投与２時間後に決定されたＭＩＣＡＬＬ１の遺伝子発現が、ＨＤＡＣ阻害剤が上記患者に投与される前に上記患者由来のサンプル中で決定された上記遺伝子の遺伝子発現と比較して２５％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７５％以上、いっそうより好ましくは１００％以上、さらにいっそうより好ましくは１５０％以上変化した場合は、７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、いっそうより好ましくは９５％以上である。１つの特定実施形態では、上記の変化は遺伝子発現における増加である。１つの特定実施形態では、上記の変化は遺伝子発現における減少である。
【００６０】
１つの実施形態では、所定の患者にとってのＨＤＡＣ阻害剤治療の前向きの転帰の確率は、ＨＤＡＣ阻害剤の投与２時間後に決定されたＺＦＰ６４の遺伝子発現が、ＨＤＡＣ阻害剤が上記患者に投与される前に上記患者由来のサンプル中で決定された上記遺伝子の遺伝子発現と比較して２５％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７５％以上、いっそうより好ましくは１００％以上、さらにいっそうより好ましくは１５０％以上変化した場合は、７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、いっそうより好ましくは９５％以上である。１つの特定実施形態では、上記の変化は遺伝子発現における増加である。１つの特定実施形態では、上記の変化は遺伝子発現における減少である。
【００６１】
８．ＨＤＡＣ阻害剤治療を必要とする患者における薬力学マーカーとしての少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現を決定する方法であって、以下の：
ａ）上記患者のサンプルを提供する工程、
ｂ）上記サンプル中の遺伝子発現および／またはＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を決定する工程、
ｃ）上記少なくとも１つの遺伝子の決定された遺伝子発現および／または遺伝子発現の変化をＨＤＡＣ阻害剤によるＨＤＡＣの相対的阻害と相関させる工程を含む方法。
【００６２】
９．上記少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現は、上記サンプル中の上記少なくとも１つの遺伝子または少なくとも１５０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１８０ヌクレオチド長のその断片によってコードされる少なくとも１つのｍＲＮＡのレベルを測定することによって決定される、上記の項目１〜８のいずれかに記載の方法。
【００６３】
１０．上記少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現は上記サンプル中の上記少なくとも１つの遺伝子によってコードされる少なくとも１つのタンパク質または上記タンパク質のドメインのレベルを測定することによって決定される、上記の項目１〜８のいずれかに記載の方法。
【００６４】
１１．上記少なくとも１つのタンパク質もしくはそのドメインのレベルおよび／またはレベルの変化は、抗体または抗体を含むプローブの結合によって決定され、上記抗体は上記少なくとも１つのタンパク質もしくはそのドメインに特異的に結合する、上記の項目１０に記載の方法。
【００６５】
１２．サンプルはＨＤＡＣ阻害剤治療を開始する前またはＨＤＡＣ阻害剤治療中のいずれかに採取される、上記の項目４〜１１のいずれかに記載の方法。
【００６６】
１３．上記サンプルは体液のサンプル、好ましくは全血、血清もしくは血漿を含む群から選択される血液サンプル、より好ましくは全血、血清もしくは血漿を含む群から選択される末梢血サンプルである、上記の項目１〜１２のいずれかに記載の方法。
【００６７】
１４．サンプルは組織サンプル、好ましくは罹患組織のサンプル、より好ましくは癌組織からの生検標本である、上記の項目１〜１２のいずれかに記載の方法。
【００６８】
１５．工程ａ〜ｃまたは工程ａ〜ｂは少なくとも１回、好ましくは２回以上繰り返される、上記の項目１〜１４のいずれかに記載の方法。
【００６９】
工程ａ〜ｃまたは工程ａ〜ｂが繰り返される本発明の方法では、典型的には、上記工程はＨＣＡＤ阻害剤の各投与後に、または各治療サイクル後に繰り返される。または、工程ａ〜ｃまたは工程ａ〜ｂは、例えばＨＣＡＤ阻害剤の各第２回、第３回、第４回投与などの後、または各第２、第３、第４治療サイクルなどの後に低頻度の間隔で繰り返されてもよい。この方法を使用すると、治療の経過および患者の健康状態を監視できる。
【００７０】
１６．ＨＤＡＣ阻害剤は、ボリノスタット、ロミデプシン、バルプロ酸、パノビノスタット、エンチノスタット、ベリノスタット、モセチノスタット、ギビノスタットおよびレスミノスタットまたはそれらの医薬上許容される塩、好ましくは遊離形にある（Ｅ）−３−（１−（４−（（ジメチルアミノ）メチル）フェニルスルホニル）−１Ｈ−ピロール−３−イル）−Ｎ−ヒドロキシアクリルアミドまたはそれらの塩酸塩もしくはメシル酸塩を含む群から選択される、上記の項目１〜１５のいずれかに記載の方法。
【００７１】
１７．上記少なくとも１つの遺伝子は、上記ＨＤＡＣ阻害剤治療を必要とする患者のためのＨＤＡＣ阻害剤治療における薬力学マーカーとしてのＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される、少なくとも１つの遺伝子の使用または上記少なくとも１つの遺伝子によってコードされたタンパク質の使用。
【００７２】
１８．上記少なくとも１つの遺伝子は、上記ＨＤＡＣ阻害剤治療を必要とする患者にとってのＨＤＡＣ阻害剤治療の転帰を予測するためのＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される、少なくとも１つの遺伝子の使用または上記少なくとも１つの遺伝子によってコードされたタンパク質の使用。
【００７３】
１９．上記少なくとも１つの遺伝子は、ＨＤＡＣ活性を決定するための代理マーカーとしてのＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される、少なくとも１つの遺伝子の使用または上記少なくとも１つの遺伝子によってコードされたタンパク質の使用。
【００７４】
２０．上記少なくとも１つの遺伝子は、応答者または非応答者としてＨＤＡＣ阻害剤治療を必要とする可能性がある患者を層別化するためのＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される、少なくとも１つの遺伝子の使用または上記少なくとも１つの遺伝子によってコードされたタンパク質の使用。
【００７５】
２１．上記サンプル中のＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現を決定するためのキットであって、
上記少なくとも１つの遺伝子または少なくとも１５０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１８０ヌクレオチド長のその断片によってコードされる少なくとも１つのｍＲＮＡに特異的に結合するプローブを含み、および
任意選択的に、培地、培地成分、バッファー、バッファー成分、ＲＮＡ精製カラム、ＤＮＡ精製カラム、染料、ｄＮＴＰミックスを含む核酸、ポリメラーゼを含む酵素および塩を含む群から選択される１つ以上のさらなる成分を含むキット。
【００７６】
２２．サンプル中のＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される１つの遺伝子によってコードされた少なくとも１つのタンパク質のレベルを決定するためのキットであって：
上記少なくとも１つの遺伝子もしくは上記タンパク質の１つのドメインによってコードされた少なくとも１つのタンパク質に特異的に結合するプローブを含み、および
任意選択的に、培地、培地成分、バッファー、バッファー成分、膜、ＥＬＩＳＡプレート酵素基質、染料、ポリメラーゼを含む酵素および塩を含む群から選択される１つ以上のさらなる成分を含むキット。
【００７７】
２３．サンプル中のＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現を決定するための上記の項目２１または２２に記載のキットの使用。
【００７８】
２４．上記決定された遺伝子発現は上記サンプル中のＨＤＡＣ活性と相関させられる、上記の項目２３に記載の使用。
【００７９】
２５．上記サンプルはＨＤＡＣ阻害剤治療を必要とする可能性がある患者から提供される、上記の項目２３または２４に記載の使用。
【００８０】
２６．上記の項目１〜１６のいずれかに記載の方法における上記の項目２１または２２に記載のキットの使用。
【００８１】
２７．ＨＤＡＣ阻害剤治療を必要とする可能性がある患者の治療において使用するためのＨＤＡＣ阻害剤であって、上記治療の前および／または上記治療中のＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される少なくとも１つの遺伝子、上記少なくとも１つの遺伝子に対応する少なくとも１つのｍＲＮＡ、または上記少なくとも１つの遺伝子によってコードされた少なくとも１つのタンパク質が上記患者へのＨＤＡＣ阻害剤治療の作用の確率を決定するため、または上記患者がＨＤＡＣ阻害剤治療への応答者であるかどうかを決定するために使用されるＨＤＡＣ阻害剤。
【００８２】
２８．ＨＤＡＣ阻害剤治療を必要とする可能性がある患者を治療する方法であって、患者にＨＤＡＣ阻害剤を投与する工程を含み、上記方法の前および／または上記方法中のＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される少なくとも１つの遺伝子、上記少なくとも１つの遺伝子に対応する少なくとも１つのｍＲＮＡ、または上記少なくとも１つの遺伝子によってコードされた少なくとも１つのタンパク質が上記患者へのＨＤＡＣ阻害剤治療の作用の確率を決定するため、または上記患者がＨＤＡＣ阻害剤治療への応答者であるかどうかを決定するために使用される方法。
【００８３】
２９．ＨＤＡＣ阻害剤は、ボリノスタット、ロミデプシン、バルプロ酸、パノビノスタット、エンチノスタット、ベリノスタット、モセチノスタット、ギビノスタットおよびレスミノスタットまたはそれらの医薬上許容される塩、好ましくは遊離形にある（Ｅ）−３−（１−（４−（（ジメチルアミノ）メチル）フェニルスルホニル）−１Ｈ−ピロール−３−イル）−Ｎ−ヒドロキシアクリルアミドまたはそれらの塩酸塩もしくはメシル酸塩を含む群から選択される、上記の項目２７に記載のＨＤＡＣ阻害剤治療を必要とする可能性がある患者の治療において使用するためのＨＤＡＣ阻害剤または上記の項目２８に記載の方法。
【００８４】
本発明の特に好ましい実施形態は、上述のＨＤＡＣ阻害剤治療を必要とする可能性がある患者の治療における方法、使用、キットおよびＨＤＡＣ阻害剤各々に関しており、このときＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される遺伝子はＺＦＰ６４である。
【００８５】
より好ましいのは、ＨＤＡＣ阻害剤治療を受けている患者にとってのＨＤＡＣ阻害剤治療の前向きの転帰の確率を予測する、ＨＤＡＣ阻害剤治療の特定の作用の確率を決定する、ＨＤＡＣ阻害剤治療を監視する、および／または上述したＨＤＡＣ阻害剤治療を必要とする可能性がある患者の層別化のための方法であって、このとき  ＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される遺伝子はＺＦＰ６４およびＤＰＰ３を含む群から選択される方法。
【００８６】
いっそうより好ましいのは、上記ＨＤＡＣ阻害剤治療を受けている患者にとってのＨＤＡＣ阻害剤治療の前向きの転帰の確率を予測する方法であって、以下の：
ａ）上記患者のサンプルを提供する工程、
ｂ）上記サンプル中のＺＦＰ６４の遺伝子発現を決定する工程、
ｃ）上記遺伝子発現を、工程ａ）の前に上記患者から提供されるサンプル中のＺＦＰ６４の遺伝子発現と比較する工程を含み、および
工程ａ）において提供される上記サンプル中と工程ａ）の前に提供される上記サンプル中とのＺＦＰ６４の遺伝子発現の差を上記患者のためのＨＤＡＣ阻害剤治療の前向きの転帰の確率と相関させる工程とを含む方法である。本発明のいっそうより特に好ましい実施形態は、上記ＨＤＡＣ阻害剤治療を受けている患者のためのＨＤＡＣ阻害剤治療の前向きの転帰の確率を予測する好ましい方法であって、上記遺伝子はＺＦＰ６４である方法に関する。
【００８７】
さらにいっそうより好ましいのは、上記ＨＤＡＣ阻害剤治療を受けている患者にとってのＨＤＡＣ阻害剤治療の前向きの転帰の確率を予測する方法であって、以下の：
ｄ）上記患者のサンプルを提供する工程、
ｅ）上記サンプル中のＤＰＰ３の遺伝子発現を決定する工程、
ｆ）上記遺伝子発現を、工程ａ）の前に上記患者から提供されるサンプル中のＤＰＰ３の遺伝子発現と比較する工程を含み、および
工程ａ）において提供された上記サンプル中と工程ａ）の前に提供された上記サンプル中とのＤＰＰ３の遺伝子発現の差を上記患者のためのＨＤＡＣ阻害剤治療の前向きの転帰の確率と相関させる工程とを含む方法である。本発明のいっそうより特に好ましい実施形態は、上記ＨＤＡＣ阻害剤治療を受けている患者のためのＨＤＡＣ阻害剤治療の前向きの転帰の確率を予測する好ましい方法であって、上記遺伝子はＤＰＰ３である方法に関する。
【００８８】
本発明の実施形態、例えば本発明による使用、方法、キットおよびＨＤＡＣ阻害剤では、適切な場合は、患者は好ましくは癌、特に血液癌、より特別にはホジキンリンパ腫に罹患しており、および適切な場合は、サンプルは好ましくは癌、特に血液癌、より特別にはホジキンリンパ腫に罹患している患者から入手される。
【００８９】
本発明の他の実施形態、例えば本発明による使用、方法、キットおよびＨＤＡＣ阻害剤では、適切な場合は、患者は好ましくはＣＲＣもしくはＨＣＣ、より好ましくはＨＣＣに罹患しており、および適切な場合は、サンプルは好ましくはＣＲＣもしくはＨＣＣ、より好ましくはＨＣＣに罹患している患者から入手される。
【００９０】
本発明の１つの特定実施形態では、本発明による１つ以上のバイオマーカーの遺伝子発現は、患者にＨＤＡＣ阻害剤の投与後の複数の時点に測定される。この方法でバイオマーカーの遺伝子発現の変化の時間プロファイルを決定することができ、これはバイオマーカーの妥当性を増加させる可能性がある。一般に、本発明による１つ以上のバイオマーカーは、患者にＨＤＡＣ阻害剤の投与後の複数の時点に測定される。好ましくは、本発明による１つ以上のバイオマーカーは、患者にＨＤＡＣ阻害剤の投与後に少なくとも３回、または少なくとも４回、または少なくとも５回または少なくとも６回の時点に測定される。
【００９１】
本発明による方法では、上記１つ以上の遺伝子の遺伝子発現は、好ましくはＨＤＡＣ阻害剤によるＨＤＡＣの阻害についての指標である。
【００９２】
本発明による方法では、上記１つ以上の遺伝子の遺伝子発現は、好ましくはＨＤＡＣ阻害剤治療の転帰と相関させられる。
【００９３】
本発明による方法の特定の実施形態では、サンプルは、各方法において適切に、ＨＤＡＣ阻害剤治療の出発前、またはＨＤＡＣ阻害剤治療中のいずれかに採取される。
【００９４】
好ましくは本発明によるキットは、ＨＤＡＣ阻害剤治療を必要とする患者のサンプル中の本発明による少なくとも１つの遺伝子または本発明による少なくとも１つの遺伝子によってコードされた少なくとも１つのタンパク質のレベルを決定するために使用される。
【００９５】
本明細書で使用する用語「ＨＤＡＣ」もしくはヒストンデアセチラーゼは、ヒストンの脱アセチル化を促進する、および例えば転写因子、受容体などの他のタンパク質の脱アセチル化をさらに促進する可能性がある酵素を規定する。ＨＤＡＣタンパク質のファミリーには、それらのＮＣＩ遺伝子ＩＤｓによって規定される以下のヒト遺伝子、ならびに他の哺乳動物種内のそれらの対応物：ＨＤＡＣ１、ＩＤ：３０６５；ＨＤＡＣ２、ＩＤ：３０６６；ＨＤＡＣ３、ＩＤ：８８４１；ＨＤＡＣ４、ＩＤ：９７５９；ＨＤＡＣ５、ＩＤ：１００１４；ＨＤＡＣ６、ＩＤ：１００１３；ＨＤＡＣ７、ＩＤ：５１５６４；ＨＤＡＣ８、ＩＤ：５５８６９；ＨＤＡＣ９、ＩＤ：５１５６４；ＨＤＡＣ１０、ＩＤ：８３９３３；ＨＤＡＣ１１、ＩＤ：７９８８５；ＳＩＲＴ１、ＩＤ：２３４１１；ＳＩＲＴ２、ＩＤ：２２９３３；ＳＩＲＴ３、ＩＤ：２３４１０；ＳＩＲＴ４、ＩＤ：２３４０９；ＳＩＲＴ５、ＩＤ：２３４０８；ＳＩＲＴ６、ＩＤ：５１５４８；ＳＩＲＴ７、ＩＤ：５１５４７が含まれる。
【００９６】
Ｅｎｔｒｅｚ  ＩＤおよび公式遺伝子記号（ＮＣＢＩ）により規定された遺伝子配列はヒト遺伝子に関する。しかし本発明はさらに、患者が非ヒト動物である用途のための他の哺乳動物種における対応する遺伝子も含む。
【００９７】
本明細書で使用する用語「ヒドロキサメート型のＨＤＡＣ阻害剤」は、ＨＤＡＣの活性部位に位置する亜鉛イオンをキレート化できるヒドロキサメート基を含むＨＤＡＣ阻害剤を規定する。
【００９８】
方法、使用、使用のための化合物、キットなど全部を含む本発明の全ての実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、特にレスミノスタットである（例えば、その場合のＨＤＡＣ阻害剤治療は、特に「レスミノスタット治療」である）。
【００９９】
方法、使用、使用のための化合物、キットなど全部を含む本発明の全ての実施形態では、ＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される遺伝子は、特にＺＦＰ６４である。
【０１００】
本明細書で使用する用語「阻害」は、阻害されるべき実体の活性が減少させられる、例えば酵素、例えばＨＤＡＣの場合には、例えば酵素による基質変換の代謝回転率が減少させられる。
【０１０１】
本明細書で使用する、ＨＤＡＣ阻害剤によるＨＤＡＣ阻害の状況における用語「相対的阻害」は、投与前ＨＤＡＣ活性レベル、すなわちＨＤＡＣ阻害剤の投与前に比較したＨＤＡＣ活性の阻害を意味する。
【０１０２】
本明細書で使用する用語「ＨＤＡＣの阻害のレベル」または「ＨＤＡＣ阻害のレベル」は、ＨＤＡＣ活性が阻害剤の投与後に減少させられる比率に関する。ＨＤＡＣの阻害の高レベルは、各場合において阻害剤の投与前のＨＤＡＣ活性と比較して、ＨＤＡＣ活性が強度に減少していることを意味するであろうが、他方ＨＤＡＣ活性の阻害の低レベルはＨＤＡＣ活性がほんのわずかにしか減少していないことを意味するであろう。
【０１０３】
本明細書で使用する用語「遺伝子発現」は、細胞内での遺伝子の発現産物の量に関する。発現産物には、遺伝子の転写産物、例えばｍＲＮＡおよび対応する翻訳産物、すなわちタンパク質が含まれる。遺伝子発現は相対的発現レベル、すなわち１つ以上のハウスキーピング遺伝子の発現に比較した、および／または通常は薬物を投与する前、例えば薬物を最初に投与する前、または所定の治療サイクルにおいて初めて薬物を投与する前の時点である既定の様々な時点での上記標的遺伝子の発現に比較した所定の時点での標的遺伝子の発現であると指示されることが多い。遺伝子発現は、特定のサンプル内の標的遺伝子の相対存在度を規定する。このため「遺伝子発現」にはさらに、所定の遺伝子の発現の非存在が含まれることがある。遺伝子発現についての絶対値は、通常は「Ｃｔ」値（本明細書の下記を参照）と表現され、各遺伝子について、発現が決定される特定方法、特に使用されたポリメラーゼに依存して変動してよい。
【０１０４】
本明細書で使用する「（例えば、項目ｘ、項目ｙおよび項目ｚ）を含む群から選択される」などの表現は、好ましくは「（例えば、項目ｘ、項目ｙおよび項目ｚ）から選択される」と同等である（このとき、用語「および」は上記の項目−例えば、項目ｘ、項目ｙおよび項目ｚ−の全部が選択されると理解すべきではなく、むしろ上記の群の１つ（または特定の状況に依存してそれ以上）の項目が選択されると理解すべきである）。特定の実施形態では、これはさらに「（例えば、項目ｘ、項目ｙおよび項目ｚ）からなる群から選択される」を含んでいる。
【０１０５】
表２では、上述のように、本発明による遺伝子の発現についての離散性発現範囲を規定するデータが提示されている。本明細書では、ＨＤＡＣ阻害剤治療の転帰との相関は確かな信頼性を伴って範囲２および３において確定することができ、好ましくは、ＨＤＡＣ阻害剤治療の転帰との相関は範囲１および４においてより高度の信頼性で確定することができる。
【０１０６】
【表２】
2016521543.tif 000003
【０１０７】
表２ａでは、上述のように、本発明によるＺＦＰ６４遺伝子の発現についての離散性発現範囲を特に規定するデータが提示されている。本明細書では、ＨＤＡＣ阻害剤治療の転帰との相関は確かな信頼性を伴って範囲２において確定することができ、好ましくは、ＨＤＡＣ阻害剤治療の転帰との相関は範囲１および３においてより高度の信頼性で確定することができる。
【０１０８】
【表３】
2016521543.tif 000004
【０１０９】
本明細書で使用する用語「ベースライン遺伝子発現」は、個人の集団内で決定された平均もしくは基準レベルに相当する遺伝子、ＲＮＡもしくはタンパク質の発現レベルを規定するが、このとき上記個人はＨＤＡＣ阻害剤の影響下にはない。上記集団は、母集団全体または特定部分母集団の人口統計学的構成を反映する可能性があるが、このとき部分母集団は個人が特定疾患、例えば癌もしくは特定の癌タイプに罹患しているかどうか、疾患の特定の重症度を有する、もしくは健常であるかなどを含む医学的状態；性別；民族；肥満度指数；以前の医学状態歴；年齢；個人のライフスタイルにおける特定の因子、例えば飲酒もしくは薬物使用、喫煙、投薬、食物を含む群から選択される１つ以上の因子に関して選択される個人を含む。
【０１１０】
本明細書で使用する用語「遺伝子発現の変化」は、異なる時点での上記遺伝子の遺伝子発現に比較した、好ましくはより早期の時点での上記遺伝子の遺伝子発現に比較した所定の時点での遺伝子の遺伝子発現の変化に関する。これは例えば、ベースライン遺伝子発現（上記に比較する）、投与前遺伝子発現（すなわち、ＨＤＡＣ阻害剤の投与前の同一個人についての遺伝子発現）または治療前、治療後もしくは治療中のある時点に測定された遺伝子発現に関する遺伝子発現における変化を意味する場合がある。特定の場合には、遺伝子の遺伝子発現の変化はゼロ（すなわち、遺伝子発現は変化しない）または検出不能の場合がある；しかしそのような場合は遺伝子発現の変化に関連する実施形態であって、遺伝子発現の変化を決定する結果は遺伝子発現が変化しないままであるという結果もまた含まれている。
【０１１１】
例えば、遺伝子発現の変化は、（ｉ）ＨＤＡＣ阻害剤による治療の開始前に所定の遺伝子の遺伝子発現をＨＤＡＣ阻害剤治療中の上記遺伝子の遺伝子発現と比較する工程；（ｉｉ）ＨＤＡＣ阻害剤治療中の１つの時点での所定の遺伝子の遺伝子発現をＨＤＡＣ阻害剤治療中のまた別の時点での上記遺伝子の遺伝子発現と比較する工程；および／または（ｉｉｉ）所定の遺伝子の遺伝子発現を健常者、罹患患者、未治療患者および／または治療患者の集団から決定された上記遺伝子のベースライン遺伝子発現と比較する工程によって決定されてよい。
【０１１２】
遺伝子発現の上記変化は、遺伝子発現の増加もしくは減少、すなわち遺伝子のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションに関連する場合がある。さらに、本発明による遺伝子は、相互から独立してアップレギュレートもしくはダウンレギュレートされてよい、例えば上記遺伝子の１つ以上はアップレギュレートされてよいが、他方他の遺伝子はダウンレギュレートされてよく、他方他の遺伝子の遺伝子発現は未変化のままであってよい。
【０１１３】
本明細書で使用する用語「バイオマーカー」は、１つの分子種、例えばポリペプチド、例えばタンパク質もしくはポリ核酸、例えば正常生物学的過程、病理的過程、または治療的介入への薬理反応の指標として検出および評価できるｍＲＮＡを規定する。したがって、バイオマーカーは、生理的、薬理学的または疾患過程もしくは疾患状態を反映する測定可能な特徴である。
【０１１４】
他に特に規定されない限り、例えば「バイオマーカー」もしくは「１つのバイオマーカー」などの用語には、２つ以上のバイオマーカーの組み合わせが含まれる。これは、特定の場合には２つ以上のバイオマーカーについて収集された結合データがＨＤＡＣ阻害剤治療の特定の作用についての指標である可能性があることを意味する。さらに、本発明による１つ以上のバイオマーカーについて収集されたデータの予測値もしくは予後値は、さらなるバイオマーカー、例えばベースラインＨＤＡＣ活性もしくはヒストンもしくはタンパク質アセチル化のベースラインレベルまたは医学において一般に使用される例えば肥満度指数、疾患歴、年齢などの他のバイオマーカーを入手することによって強化されてよい。
【０１１５】
本明細書で使用する診断バイオマーカーは、特定疾患状態の存在、重症度もしくは非存在を同定するために使用される上述したバイオマーカーである。
【０１１６】
本明細書で使用する予後バイオマーカーは、患者の生存確率を決定するために使用される上述したバイオマーカーである。
【０１１７】
本明細書で使用する用語「薬力学バイオマーカー」もしくは「薬力学マーカー」は、薬物、例えばＨＤＡＣ阻害剤の投与後のレベルの変化によって患者におけるその薬物の存在および／または作用を指示する上述したバイオマーカーを規定する。薬物は、患者の全身系中または患者の特定薬理学的領域内、例えば患者の血液、体液、肝臓、脂肪組織もしくは他の組織中などに存在する場合がある。薬力学バイオマーカーは、新規薬物を試験する際に上記薬物がインビボの標的に的中するかどうか、つまりインビボで何らかのＨＤＡＣ阻害が存在するかどうかを決定するために使用されてよい。
【０１１８】
さらに、薬力学バイオマーカーは、薬物動態／薬力学的モデリング（ＰＫ／ＰＤモデリング）のため、すなわち薬物動態挙動を、例えば前臨床第Ｉ相臨床試験においてＨＤＡＣ阻害剤の投与された用量とインビボでの阻害のレベルとの相関に関連する薬力学的挙動と相関させるために使用されてよい。さらに、薬力学バイオマーカーは、インビボでの、例えば第Ｉ相臨床試験のための前臨床モデル試験における用量設定のために、または第ＩＩ相臨床試験における用量設定のために第Ｉ相臨床試験で収集されたデータを使用することによって使用されてもよい。
【０１１９】
本明細書で使用する予測バイオマーカーは、特定の治療からどの患者が利益を得られる可能性が高いか、または利益を得られる可能性がないかを同定する、例えば応答者を非応答者から識別するために使用される上述したバイオマーカーである。予測バイオマーカーは、薬物投与前に患者を層別化するため、または治療監視中に使用できるが、このとき監視データは治療の後の転帰を予測するために使用される。予測バイオマーカーは、代理エンドポイントとして、すなわち治療を継続すべきかどうかを決定するためにも役立つ場合がある。
【０１２０】
本明細書で使用する「層別化」もしくは「層別化する工程」は、患者の投与前バイオマーカーレベル、すなわちＨＤＡＣ阻害剤の投与前の本発明による１つ以上のバイオマーカーのレベルに依存した本発明によるバイオマーカーの使用であって、それにより特定の患者がＨＤＡＣ阻害剤治療から利益を得られる確率を決定する使用に関する。
【０１２１】
本明細書で使用する用語「ハウスキーピング遺伝子」は、典型的には使用した技術によって良好に検出可能な発現、例えば本発明では少なくとも１００ｎｇの全ＲＮＡの量を備えるｑＰＣＲ法において＜２５のＣｔ値を示す１つ以上の構成遺伝子を規定する。類似の考察は、当然ながら発現がタンパク質レベル上で決定される場合にも当てはまる。さらに、ハウスキーピング遺伝子は、同等の治療レジメンを受けている特定患者群の全サンプル中において、薬物の投与後の遺伝子発現においてゼロから最小の変化を示す。１つ以上のハウスキーピング遺伝子の発現は、各サンプルにおける個別の差、例えば異なる細胞数によって、および／または技術的態様、例えばピペット操作の誤差によって誘発される、決定された結果における偏差を標準化するために使用される。
【０１２２】
本明細書で使用する用語「標的遺伝子」は、特定の治療による発現および調節についてこの試験系において調査される当該の遺伝子を規定する。
【０１２３】
本明細書で使用する用語「ＨＤＡＣ阻害剤治療」は、本発明を実施するための形態において詳細に説明するように、それを必要とする患者が上記患者における医学的状態（例えば、疾患）を治療するためにＨＤＡＣ阻害剤の１回以上の投与を含む治療レジメンを受けることを意味する。本明細書に規定したＨＤＡＣ阻害剤治療は、医学的状態の診断から始まり、治療のレジメンを含み、最終フォローアップ検査、すなわち、患者がそれ以上の医療を受けないが、患者の健康状態および治療の状態が制御されるまでの期間を含んでいてよい。特定の場合には、フォローアップは、所定の患者へのＨＤＡＣ阻害剤の最終投与の数カ月後もしくは数年後にさえ存在する可能性があるＨＤＡＣ阻害剤の投与の長期作用の決定を含んでいてよい。
【０１２４】
これに関連して「治療サイクル」は、その間にＨＤＡＣ阻害剤が患者に確実な特定時間間隔で投与される、およびＨＤＡＣ阻害剤が患者に全く投与されず、結果としてＨＤＡＣ阻害剤が上記患者から完全に排出される特定の期間を含んでいてよい期間を意味する。例えば、治療サイクルは１４日間を含んでいてよいが、このときＨＤＡＣ阻害剤は第１〜５日に１日２回投与され、第６〜１４日にはＨＤＡＣ阻害剤は投与されない。治療サイクルは、通常はＨＤＡＣ阻害剤治療中に少なくとも１回、好ましくは２回以上繰り返されるが、しかしこれは多数の因子、例えばＨＤＡＣ阻害剤の投与への患者の応答、ＨＤＡＣ阻害剤の望ましくない副作用の発生、患者の全身健康状態などに依存する可能性がある。
【０１２５】
本明細書で使用する「のＨＤＡＣ阻害剤治療の作用」もしくは「そのＨＤＡＣ阻害剤治療の作用」に関連する用語「作用」には、本明細書で下記に規定するＨＤＡＣ阻害剤治療の薬力学的作用および／または前向きもしくは後ろ向きの転帰が含まれる。そのような作用の例は、ａ）ＨＤＡＣ活性の減少、ヒストンのアセチル化または例えば転写因子もしくは受容体などの他のタンパク質のアセチル化の誘導、遺伝子転写の調節、タンパク質発現の調節およびシグナル伝達経路の調節された活性を含む群から選択される作用を含む、薬力学的作用、すなわち分子レベルへの作用；ｂ）腫瘍サイズ、代謝活性、細胞生存性、腫瘍の血液供給、すなわち血管新生、腫瘍の組成、例えば腫瘍を含む細胞、例えば腫瘍細胞、免疫細胞、線維芽細胞および内皮細胞の関係における変化を含む罹患組織もしくは細胞への作用；およびｃ）臨床状態における変化、健康状態、疾患の進行もしくは安定化、無増悪生存（ＰＦＳ）の減少もしくは増加した期間、疾患の治癒、強化もしくは短縮された全生存期間、疾患進行の遅延および症状の軽減もしくは悪化を含む患者の医学的状態への作用である。本発明の好ましい実施形態では、作用は薬力学的作用である。
【０１２６】
本明細書で使用する用語「ＨＤＡＣ阻害剤治療の前向きの転帰」は、ＨＤＡＣ阻害剤治療が患者にとって有益な作用を生じさせることを意味する。これには、臨床的有益性、健康の改善、疾患の安定化、無増悪生存期間の増加、疾患の治癒、強化された全生存ならびに疾患進行の遅延および症状の軽減が含まれる。
【０１２７】
本明細書で使用する用語「ＨＤＡＣ阻害剤治療の後ろ向きの転帰」は、ＨＤＡＣ阻害剤治療が患者にとっての有益な作用を生じさせないこと、またはその転帰が上述の前向きの転帰の反対、例えば健康の減退であることを意味する。
【０１２８】
本明細書で使用する「応答者」は、上記に規定したＨＤＡＣ阻害剤治療が原因で前向きの転帰を示す患者である。
【０１２９】
本明細書で使用する「非応答者」は、上記に規定したＨＤＡＣ阻害剤治療が原因で後ろ向きの転帰を示す患者である。
【０１３０】
本明細書で使用する用語「身体の液体もしくは体液」は、末梢血を含む血液、血清、血漿、尿、間質液、髄液、房水および硝子体液、胆汁、乳汁、脳脊髄液、内リンパ液、外リンパ液、射精液、胃液、粘液、腹水、胸膜液、唾液、汗、涙および膣分泌液を含むがそれらに限定されない患者の身体から排出もしくは分泌される液体を含む、患者の身体を起源とする液体もしくは液体の一部を規定する。本発明の状況において好ましい体液は、末梢血、血清、血漿および尿である。上記の体液自体が疾患および／または非罹患細胞を含む場合がある、または含まない場合がある。
【０１３１】
本明細書で使用する用語「組織サンプル」は、患者の身体を起源とする非液体材料もしくは固体を規定する。組織サンプルには、骨材料、骨髄、皮膚、毛包、粘膜、脳、軟骨、筋肉、肺、腎臓、胃、腸、膀胱および肝臓が含まれるがそれらに限定されない。上記組織サンプル自体は罹患細胞を含む、もしくは含まない場合がある、および例えば患者の身体の疾患領域から採取されたサンプル、例えば腫瘍の生検標本であってよい。好ましくは、組織サンプルは、皮膚、毛包もしくは口腔粘膜から選択される。
【０１３２】
本発明の実施形態では、医学分野の当業者には一般に公知である任意の方法および／または手段によって患者から入手される、例えば好ましくは静脈穿刺によって採取される血液サンプルである。
【０１３３】
本明細書で使用する用語「末梢血」は、心臓から遠隔の循環から得られる血液、すなわち、例えば末端部からの血液のような全身循環中の血液を規定する。
【０１３４】
本明細書で使用する用語「全血」は、例えば患者などの上記血液のドナーから得られる、細胞および液体を含む未修飾血液を規定する。
【０１３５】
本明細書で使用する用語「患者」は、ＨＤＡＣ阻害剤治療を受けることが予定される被験者を規定する。患者は罹患している可能性があり、罹患被験者および健常被験者、例えばＨＤＡＣ阻害剤の安全性、毒性および血液力学的挙動を決定するための第Ｉ相臨床試験における健常志願者を含んでいてよい。好ましくは、患者は、哺乳動物、より好ましくはヒトである。さらに好ましい実施形態では、患者は癌に罹患している。
【０１３６】
本明細書で使用する用語「ＨＤＡＣ阻害剤治療を必要とする可能性がある患者」は、疾患もしくは障害を有する、好ましくはそれに対してＨＤＡＣ阻害剤治療が有益であると期待される、および／またはＨＤＡＣ阻害剤治療に応答性である疾患もしくは障害を有すると疑われる被験者を規定する。これに関連して、「を必要とする可能性がある患者」はさらに「を必要とする患者」も含み、特定の実施形態では「を必要とする患者」を意味する。
【０１３７】
本発明による遺伝子の発現は、これらの遺伝子の転写過程に由来するｍＲＮＡを定量するための最新技術による検出方法、例えば定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アプローチを使用して測定できる。さらに、これらの遺伝子発現は、問題の遺伝子によってコードされたタンパク質の発現を分析することによって測定できる。それらの測定全ては、エックスビボまたはインビトロで実施されてよい。
【０１３８】
ＲＮＡを検出もしくは測定するための方法は特に限定されず、ＲＮＡの検出もしくは測定は、当業者には公知の任意の適切な方法によって実施されてよい。そのような方法の例は、定量的ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲとしても公知である）、ｍＲＮＡの定量的シーケンシング（ディープシーケンシングとしても公知である）、ノーザンブロット法もしくはドットブロット法である。上記の方法は、プライマー対を含む、および／またはＤＮＡ分子を含む確実な特定プローブの使用を必要とする場合がある。そのようなプライマー対は、典型的には例えば約２０塩基長の、当該の同一ポリ核酸分子（典型的には特定のｍＲＮＡ分子のｃＤＮＡコピー）の異なる領域に特異的に結合する、および上記ポリ核酸の増幅に使用できる場合がある短鎖非相補的一本鎖ＤＮＡ分子である。ＤＮＡ分子を含む上記の分子プローブは、当該のポリ核酸分子に特異的に結合する一本鎖ＤＮＡ分子および検出を促進するための１つ以上の標識（「タグ」としても公知である）を含む分子構築物である。任意選択的に、上記プローブは、１つ以上のリンカー部分をさらに含んでいてよい。上述の標識は、例えば、一本鎖ＤＮＡ分子の結合後に色強度の変化を示す色標識、蛍光標識、例えば蛍光タンパク質もしくは蛍光染料、酵素標識、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、放射標識または分子生物学において一般に適用される一本鎖ＤＮＡ分子の結合を検出することを可能にする他の標識から選択されてよい。
【０１３９】
本発明の状況では、「抗体を含むプローブ」は、エピトープに結合するための特異的抗体および検出を促進するための１つ以上の標識（「タグ」としても公知である）を含む分子構築物である。任意選択的に、上記プローブは、１つ以上のリンカー部分をさらに含んでいてよい。上述の標識は、例えば、色強度および／または変化に基づいて抗体の結合を指示する色標識、蛍光標識、例えば蛍光タンパク質もしくは蛍光染料、酵素標識、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、放射標識または分子生物学において一般に適用される抗体結合を検出することを可能にする他の標識から選択されてよい。特異的抗体のその標的エピトープへの結合を検出する他の可能性には間接的技術が含まれるが、このとき特異的抗体を検出するためには二次抗体が使用され、二次抗体は上記に規定されている標識を有し、および二次抗体は上記の特異的抗体に特異的に結合する。そのような間接的技術には、分子生物学の分野において一般に公知である方法、例えばＥＬＩＳＡ、タンパク質を検出するためのＨＰＬＣ法、ウェスタンブロット法、逆相タンパク質検出法もしくはドットブロット法が含まれる。上記の「間接的技術」は、さらにまた直接的設定において実施されてもよく、このとき上記のプローブは標的エピトープに結合し、直接的に検出される。特定の実施形態では、特異的抗体は、例えばシート材料、ビーズ、ストリップなどの上に固定化されてよい。１つの実施形態では、検出は溶液中で、または溶液中に懸濁させたビーズを用いて促進されるが、上記ビーズは本明細書で言及した固定化プローブを含む。
【０１４０】
本明細書で使用する用語「プローブ」は、さらにまた「１つのプローブ」すなわち単一プローブもまた意味する。
【０１４１】
さらなる実施形態では、タンパク質の検出および／または定量は、質量分析法もしくはＬＣ結合質量分析法によって促進される場合がある。
【０１４２】
本発明において使用するための典型的な方法は、“Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｓｅｔ；Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｒｏｇｅｒ  Ｂｒｅｎｔ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｒｏｂｅｒｔ  Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｄａｖｉｄ  Ｄ．Ｍｏｏｒｅ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｊｏｈｎ  Ａ．Ｓｍｉｔｈ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｋｅｖｉｎ  Ｓｔｒｕｈｌ（Ｅｄｉｔｏｒ）；Ｗｉｌｅｙ；ＩＳＢＮ：９７８−０−４７１−２５０９２−０に詳細に記載されている。
【０１４３】
本明細書に規定したように、特異的に結合する抗体、プライマー対もしくはＤＮＡ分子は、好ましくは他の構造に比較して少なくとも１，０００倍の標的構造への結合親和性を有する。本明細書の「構造」は、タンパク質エピトープおよびポリ核酸配列を含む分子実体に関する。本明細書では、「エピトープ」は、抗体によって認識されるタンパク質の部分である。
【０１４４】
本発明において使用するための抗体は、当業者には公知の任意の方法によって得られてよい。上記抗体のタイプは特に限定されず、原則的には、遺伝子の発現産物検出するために適する、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む任意の抗体タイプを適用することができる。
【０１４５】
本発明による方法、使用およびキットは、ＨＤＡＣの阻害に応答性である疾患もしくは障害の、準備およびフォローアップを含むＨＤＡＣ阻害剤治療において適用できる。そのような疾患および障害には、異所性細胞増殖および／または生存および／または分化におけるブロックを提示する細胞によって規定される細胞腫瘍形成が含まれる。用語の腫瘍形成には、侵攻性転移性腫瘍をインビボで形成できない細胞の過増殖に関する「良性腫瘍形成」および例えば遠隔器官における腫瘍転移を形成する全身性疾患を形成できる多発性細胞および生化学的異常を備える細胞に関する「悪性腫瘍形成」が含まれる。悪性腫瘍形成の例には、充実性および血液学的腫瘍が含まれる。充実性腫瘍の例は、乳腺、膀胱、骨、脳、中枢神経系および末梢神経系、結腸、内分泌腺（例えば、甲状腺および副腎皮質）、食道、子宮内膜、生殖細胞、頭頸部、腎臓、肝臓、肺、喉頭および下咽頭、中皮腫、卵巣、膵臓、前立腺、直腸、腎、小腸、軟部組織、精巣、胃、皮膚、尿管、膣および外陰部の腫瘍である。悪性腫瘍形成には、例えば網膜芽細胞腫およびウィルムス腫瘍を例とする遺伝性癌が含まれる。さらに、悪性腫瘍形成には、上記器官における原発腫瘍および遠隔器官における対応する二次性腫瘍（「腫瘍転移」）が含まれる。血液学的腫瘍の例は、侵攻性および不活性形の白血病およびリンパ腫、つまり非ホジキン病、慢性および急性骨髄性白血病（ＣＭＬ／ＡＭＬ）、慢性および急性リンパ球性白血病（ＣＬＬ／ＡＬＬ）、ホジキン病、多発性骨髄腫およびＴ細胞リンパ腫である。さらに含まれるのは、骨髄異形成症候群、形質細胞腫、腫瘍随伴症候群、原発部位不明の癌ならびにＡＩＤＳ関連性悪性腫瘍である。
【０１４６】
本発明の特に好ましい実施形態は、ＨＣＣおよび肝臓癌転移を含む肝臓、膵臓、結腸および結腸直腸（ＣＲＣ）を含む消化管、甲状腺、腎臓（すなわち、腎臓癌）、皮膚、精巣およびホジキンリンパ腫を含むリンパ腫からなる群から選択される癌に関する。そのような特に好ましい実施形態では、本発明による患者は、好ましくは癌患者、より好ましくはＨＣＣおよび肝臓癌転移を含む肝臓、膵臓、結腸および結腸直腸（ＣＲＣ）を含む消化管、甲状腺、腎臓（すなわち、腎臓癌）、皮膚、精巣およびホジキンリンパ腫を含むリンパ腫からなる群から選択される癌に罹患している患者である。
【０１４７】
さらに、ＨＤＡＣの阻害に応答性である疾患もしくは障害には：
（ｉ）例えば関節リウマチ、変形性関節症、痛風、多発性関節炎および乾癬性関節炎などの関節症および骨病理学的状態；
（ｉｉ）全身性エリテマトーデス；
（ｉｉｉ）血管増殖性障害、動脈硬化症および再狭窄を含む平滑筋細胞増殖；
（ｉｖ）炎症状態および皮膚状態、例えば潰瘍性大腸炎、クローン病、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、嚢胞性線維症、慢性気管支炎および喘息；
（ｖ）子宮内膜症、子宮筋腫、子宮内膜増殖症および良性前立腺肥大；
（ｖｉ）心機能異常；
（ｖｉｉ）ＨＩＶ感染症のような阻害性免疫抑制性状態；
（ｖｉｉｉ）パーキンソン病、アルツハイマー病もしくはポリグルタミン関連性障害のような神経病理学的障害；および
（ｉｘ）内因性遺伝子発現を強化する、ならびに遺伝子療法におけるトランス遺伝子発現を増強することにより治療の影響を受けやすい病理学的状態を含む群から選択される非悪性疾患が含まれる。
【０１４８】
本発明の特定の実施形態では、遺伝子発現が決定される場合は、これは上記遺伝子から転写されたｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーのｑＰＣＲによって実施されるが、このとき上記ｃＤＮＡは上記遺伝子から転写されたｍＲＮＡの完全もしくは部分コピーであってよく、上記ｍＲＮＡは典型的にはＺＦＰ６４の転写変異体について本明細書で説明したＺＦＰ６４の場合における上記遺伝子の２つ以上のエキソンを含んでいる。上記ｑＰＣＲでは、上記ｃＤＮＡの完全もしくは部分コピーは（ｑＰＣＲプライマーの各結合部位に依存して）生成されてよいが、このとき典型的には、そのようなコピーは、５０〜９０、特別には６０〜８０、より特別には６５〜７５、いっそうより特別には７３塩基対を含む。特定の場合には、上記遺伝子のエキソンの異なる組み合わせに基づく上記遺伝子の２つ以上の転写変異体（すなわち、異なるｍＲＮＡｓ）がサンプル中に存在してよい；この場合には、１つ以上の上記転写変異体のｃＤＮＡコピーが生成される可能性があるが、それらの１つ以上は次にｑＰＣＲ（１つ以上の増幅産物を生成する）によって処理されてよい；遺伝子発現を決定するための読み出しは、次にさらに上記増副産物の１つ以上に基づいていてもよい。
【０１４９】
本発明の他の特定の実施形態では、ＺＦＰ６４の遺伝子発現が決定される場合、これはＴａｑｍａｎ（登録商標）アッセイＩＤ：Ｈｓ００２１７０２２＿ｍ１または配列（配列番号１）５’ＣＡＣＣＴＣＧＧＡＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＡＧＴＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＡＡＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧＡＡＣＡＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＡＣＴＴＡＣＣＴＧ３’を有するＺＦＰ６４（ＺＦＰ６４  ｍＲＮＡイントロンが除外されている）から転写されたｍＲＮＡのｃＤＮＡコピー内の標的配列に特異的に結合するオリゴヌクレオチド対によって実施される。使用できるオリゴヌクレオチド対は、下記、またはペア１のフォワードプライマーとペア２のリバースプライマーまたはペア２のフォワードプライマーとペア１のリバースプライマーの組み合わせを含む、またはそのようなプライマーはこれらより短くても長くてもよいが、特別には１７〜２６塩基長までであってよい：
ペア１：フォワードプライマー（配列番号２）５’ＣＡＣＣＴＣＧＧＡＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＡ３’（２０塩基）、リバースプライマー（配列番号３）５’ＣＡＧＧＴＡＡＧＴＴＴＧＡＴＡＧＣＣＡＴＧＴＴＣＡ３’（２５塩基）
ペア２：フォワードプライマー（配列番号４）５’ＣＡＣＣＴＣＧＧＡＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡ３’（１９塩基）、リバースプライマー（配列番号５）５’ＣＡＧＧＴＡＡＧＴＴＴＧＡＴＡＧＣＣＡＴＧＴＴＣ３’（２４塩基）
【０１５０】
ｑＰＣＲ法によってＺＦＰ６４の遺伝子発現を決定するための上述したプライマーに加えて、ＺＦＰ６４のｃＤＮＡ配列を特異的に増幅させるためのプライマーを使用できる。一般に、それらのプローブ／プライマーは、ＺＦＰ６４の１つ以上の転写変異体に特異的に結合する短鎖ＤＮＡである。それらのプライマー対の長さは、１７〜２５、特別には１９〜２３、より特別には２０〜２２ヌクレオチド塩基を含むことができ、ＲＮＡサンプル中に存在する可能性があるゲノムＤＮＡの増幅を回避するためにイントロンを挟むように（すなわち、２つの別個のエキソンに結合しているプライマー対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーが少なくとも１つのイントロンによって分離されるように）設計されなければならない。この方法で得られるＰＣＲ産物は、５０〜４００塩基対長、特別には７０〜３００塩基対長、より特別には８０〜２００塩基対長、より特別には１２３もしくは１９８塩基対長であってよい。ＲＮＡサンプル中に残留するゲノムＤＮＡから生じるＰＣＲ産物は、理論的には増幅ｃＤＮＡと一緒に生成させることができる。しかしゲノムＤＮＡのそのようなコピーは増幅ｃＤＮＡよりはるかに長く、さらにポリメラーゼ媒介性ＰＣＲ法の伸張工程のための制限された時間枠は、長い産物の伸張を防止する（高速ポリメラーゼさえ１，０００塩基に対して１５秒間を必要とすることに留意されたい）。そこで、当業者であれば、遺伝子ＤＮＡの過剰コピーの形成を回避するための増幅工程の適切な持続時間を容易に決定することができる。
【０１５１】
本発明においてＺＦＰ６４から転写されたｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーを増幅させるために使用するための特定のプライマー対の例は下記である。
【０１５２】
【表４】
2016521543.tif 000005
【０１５３】
上記のプライマーは全部が、５８℃のアニーリング温度を有する。
【０１５４】
ＮＣＢＩデータベース内の参照番号によるＺＦＰ６４の転写変異体（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／５５７３４）
ＮＭ＿１９９４２７．２；転写変異体４、ｍＲＮＡ
ＮＭ＿０１８１９７．２；転写変異体１、ｍＲＮＡ
ＮＭ＿１９９４２６．１；転写変異体３、ｍＲＮＡ
ＮＭ＿０２２０８８．４；転写変異体２、ｍＲＮＡ
【０１５５】
さらに、ＺＦＰ６４  ｍＲＮＡレベルは、ＲＮＡシーケンシングによって同様に決定できる。これは、少なくとも２種の異なる方法、ｍＲＮＡの直接シーケンシングおよび、逆転写ｍＲＮＡであるｃＤＮＡコピーのシーケンシングによって実施できる。これらのシーケンシング法の用法は、当技術分野において周知である。
【０１５６】
本発明の特定の実施形態では、遺伝子発現が決定される場合、これはＲＮＡシーケンシングによって実施される。「全トランスクリプトーム・ショットガン・シークエンス（「ＷＴＳＳ」）」とも呼ばれるＲＮＡシーケンシング（ＲＤ．Ｍｏｒｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００８），ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４５（１）：８１−９４）は、時間内の所定の瞬間にゲノムからの特異的ＲＮＡの存在および量を解明することを可能にする（Ｃｈｕ  Ｙ，Ｃｏｒｅｙ  ＤＲ（２０１２）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒ  ２２（４）：２７１−４）。シーケンシングに基づくＲＮＡ分析は、サンプル中の所定の配列の数値頻度を記録する。本発明による遺伝子、特にＺＦＰ６４のｍＲＮＡ／ｃＤＮＡのレベルは、（他の遺伝子の他に）、細胞の全トランスクリプトームを挟んでいるプライマーのプールを用いて細胞の全ｃＤＮＡをシーケンシングすることによって検出される。
【０１５７】
本発明の特定の実施形態では、遺伝子発現が決定される場合、これはウェスタンブロットによって（タンパク質レベル上で）実施される。ウェスタンブロット（時々はタンパク質免疫ブロットと呼ばれる）は、サンプル中の特異的タンパク質を検出するために使用される、広範に使用される分析方法である。ウェスタンブロットは、ゲル電気泳動法を使用して天然タンパク質を３−Ｄ構造によって、または変性タンパク質をポリペプチドの長さによって分離する。タンパク質は、次に膜（典型的にはニトロセルロースもしくはＰＶＤＦ）へ移され、そこでタンパク質は標的タンパク質に特異的な抗体を用いて染色される。ゲル電気泳動法工程は、抗体の交差反応性の問題を解決するためにウェスタンブロット分析に含まれている。改良された免疫ブロット法であるＺｅｓｔｅｒｎ分析法（Ｚｈａｎｇ，ｉａｎｄｉ；Ｗａｎｇ，Ｄａｎ．、米国特許第８２９３４８７号明細書）は、電気泳動法工程を使用せずにこの問題に対応することができるので、このためタンパク質分析の効率を有意に改善する。ウェスタンブロット分析と比較して、Ｚｅｓｔｅｒｎ分析法は、検出工程の前に追加される溶出工程を加える。膜上で形成される免疫複合体は、過剰量の競合分子を含有する溶液に接近させられる。競合分子は、合成抗原もしくは部分抗原、または１つの分子内の抗原もしくは部分抗原の複数リピートであってよい。競合は、抗原−抗体相互作用の可逆性に起因して発生する。抗体は、膜から溶出液中への競合分子によって遊離させられる。レポーターアッセイを通しての溶出液中の抗体の量の定量は、タンパク質サンプル中の抗原量の信頼性のある指示を生じさせる。このため、エピトープへの標識抗体の特異的結合は、競合抗原を添加することによって定量できる。その他の関連技術には、ドットブロット分析、抗体が免疫染色および酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）による組織および細胞中のタンパク質を検出するために使用される免疫組織化学法が含まれる。ＺＦＰ６４についての特定の特異的抗体は、例えば：Ａｂｃａｍ  ａｂ６６６５８；ＺＦＰ６４へのウサギポリクローナル；イムノゲン：ヒトＺＦＰ６４のＣ末端アミノ酸６３３〜６８２に対応する合成ペプチドＤＧＧＱＮＩＡＶＡＴＴＡＰＰＶＦＳＳＳＳＱＱＥＬＰＫＱＴＹＳＩＩＱＧＡＡＨＰＡＬＬＣＰＡＤＳＩＰＤ（配列番号１０）内の１領域；Ｓｉｇｍａ  ＨＰＡ０３５１１２；ウサギポリクローナル；イムノゲン配列ＳＦＤＴＫＱＰＳＮＬＳＫＨＭＫＫＦＨＧＤＭＶＫＴＥＡＬＥＲＫＤＴＧＲＱＳＳＲＱＶＡＫＬＤＡＫＫＳＦＨＣＤＩＣＤＡＳＦＭＲＥＤＳＬＲＳＨＫＲＱＨＳＥＹＳＥＳＫＮＳＤＶＴＶＬＱＦＱＩＥＰＳ（配列番号１１）；ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＰＡ５−２８５４６、ウサギポリクローナル；イムノゲン：ヒトＺＦＰ６４のアミノ酸３９４〜６８１内の１領域に対応する組換えフラグメントである。
【０１５８】
本発明の特定の実施形態では、遺伝子発現が決定される場合、これはｌｕｍｉｎｅｘ法によって（タンパク質レベル上で）実施される。Ｌｕｍｉｎｅｘ法は、抗体依存法で様々な基質中での所定のタンパク質の発現を決定するためのビーズベースの技術である。このため、どちらも当該のタンパク質に特異的に結合するが、必ずしも異なる非重複エピトープには結合しない１組の捕捉抗体および検出抗体。捕捉抗体はビーズにコーティングされ、検出抗体は直接的（フィコエリトリン（ＰＥ）結合）もしくは間接的（ビオチン化−その後のストレプトアビジン−ＰＥ結合によるこの抗体の検出）のいずれかで（例えば本明細書に記載した標識を用いて）標識される、または標識した種特異的抗体（例えば、Ｚｆｐ６４エピトープ特異的ウサギ抗体に対する標識抗ウサギ抗体）によって検出できる。
【０１５９】
本発明の特定の実施形態では、遺伝子発現が決定される場合、これはＥＬＩＳＡによって（タンパク質レベル上で）実施される。酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）および酵素イムノアッセイは、抗体依存法で様々なサンプルタイプ（例えば、血漿、血清、細胞溶解物など）中の所定のタンパク質の発現を決定するための技術である。このため、どちらも当該のタンパク質には特異的に、しかし様々な非重複エピトープには必然的に結合する捕捉抗体および検出抗体を含む１セットが必要とされる。捕捉抗体は、固相、例えばプラスチック表面上に固定化され、検出抗体は、（例えば本明細書に記載した標識を用いて）、（例えばＴＭＢ、ＤＡＢ、ＡＢＴＳのような発色性基質を変換させるホースラディッシュペルオキシダーゼのような基質を検出可能なシグナルに変換させる酵素を用いて）直接的に、または間接的にのいずれかで標識される。（ビオチン化−その後のストレプトアビジン酵素もしくはストレプトアビジン蛍光標識結合によるこの抗体の検出）または標識種特異的抗体（例えばＺｆｐ６４エピトープ特異的ウサギ抗体に対する標識抗ウサギ抗体）によって検出できる。
【０１６０】
本発明の特定の実施形態では、遺伝子発現が決定される場合は、これは１回以上の特定時点に、例えば患者へのＨＤＡＣ阻害剤の投与直前にある１回以上の時点（０時間後とも呼ぶ）、および患者へのＨＤＡＣ阻害剤の投与の１〜１０時間後、特別には１〜６時間後、より特別には２〜５時間後の時点に実施される。本発明の特定の実施形態では、ＺＦＰ６４遺伝子発現が決定される場合は、これは臨床試験（ＳＡＰＨＩＲＥ、ＳＨＥＬＴＥＲ、ＳＨＯＲＥ）の説明と関連して本明細書で記載した１回以上の特定時点に、すなわち患者へのＨＤＡＣ阻害剤の投与直前、患者へのＨＤＡＣ阻害剤の投与の約２および／または５時間後に実施されてよい。
【０１６１】
典型的には、遺伝子発現がＨＤＡＣ阻害剤治療の作用を決定するため、ＨＤＡＣ阻害剤治療を監視するため、患者を層別化するため、または前向きの転帰の確率を予測するために測定される場合、これは患者へのＨＤＡＣ阻害剤の投与の前に、特定の実施形態では直前に実施される。患者を層別化するため、または前向きの転帰の確率を予測するためには、これは典型的にはＨＤＡＣ阻害剤治療の開始前に（すなわち、上記患者に初回ＨＤＡＣ阻害剤用量が投与される前に）実施され、この後には後の時点、例えば臨床試験の説明との関連で上述したように、特に治療サイクルの開始直前の１回以上の時点にさらなる測定が付随してよい。ＨＤＡＣ阻害剤治療の作用を決定するため、またはＨＤＡＣ阻害剤治療を監視するためには、これはＨＤＡＣ阻害剤治療の開始前に実施されてよく、典型的には例えば臨床試験の説明との関連で上述したように、治療サイクルの開始直前の１回以上に実施される。
【０１６２】
本発明の特定の実施形態では、ＺＦＰ６４遺伝子発現が決定される場合、これはサンプルを抗体と、特にＡｂｃａｍ  ａｂ６６６５８；Ｓｉｇｍａ  ＨＰＡ０３５１１２およびＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＰＡ５−２８５４６（本明細書でさらに説明する）と接触させる工程およびＺＦＰ６４によって発現したタンパク質と上記抗体との間の結合を測定する工程によって実施される。特に、上記結合は、本明細書で記載した方法、例えばＥＬＩＳＡ、Ｌｕｍｉｎｅｘなどを使用して測定される。
【０１６３】
本発明の特定の実施形態は、ＨＤＡＣ阻害剤を用いてそれを必要とする患者を治療する方法であって、以下の：
ａ）上記患者のサンプルを提供する工程であって、上記患者は既にＨＤＡＣ阻害剤治療を受けていた工程、
ｂ）上記サンプル中のＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される少なくとも１つの遺伝子、特にＺＦＰ６４の遺伝子発現および／または遺伝子発現の変化を決定する工程、
ｃ）上記少なくとも１つの遺伝子の決定された遺伝子発現および／または遺伝子発現の変化を上記患者における工程ａ）の上記ＨＤＡＣ阻害剤治療の作用と相関させる工程、および
ｄ）上記患者に工程ｃ）の相関に基づいて決定されるＨＤＡＣ阻害剤の用量および／または投与スケジュールを使用してＨＤＡＣ阻害剤を投与する工程を含む方法に関する。
【０１６４】
本発明のさらなる特定の実施形態は、ＨＤＡＣ阻害剤を用いてそれを必要とする患者を治療する方法であって、以下の：
ａ）上記患者のサンプルを提供する工程、
ｂ）上記サンプル中のＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される少なくとも１つの遺伝子、特にＺＦＰ６４の遺伝子発現を決定する工程、
ｃ）上記少なくとも１つの遺伝子の決定された遺伝子発現をＨＤＡＣ阻害剤治療が上記患者への有益な作用を有する確率と相関させる工程、および
ｄ）工程ｃ）において決定された確率に基づいて、上記患者を上記ＨＤＡＣ阻害剤治療への応答者であると分類する工程、および
ｅ）上記患者の応答者であるとの分類に基づいて、上記患者にＨＤＡＣ阻害剤を投与する工程を含む方法に関する。
【０１６５】
本発明のさらなる特定の実施形態は、ＨＤＡＣ阻害剤治療を必要とする可能性がある患者を層別化する方法であって、以下の：
ａ）上記患者のサンプルを提供する工程であって、上記患者は癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、もしくは結腸直腸癌（ＣＲＣ）、より特別には肝細胞癌（ＨＣＣ）であると診断された工程、
ｂ）ＺＦＰ６４について決定されたＣｔ値から１つ以上のハウスキーピング遺伝子のＣｔ値の平均値を減じることによってＺＦＰ６４の遺伝子発現のレベルについてのｄＣｔ値を入手する工程、および
ｃ）工程ｂ）においてＺＦＰ６４について入手したｄＣｔ値が１１．１５より低い、特に１０．０２より低い場合に、上記患者を応答者であると分類する工程を含む方法に関する。
【０１６６】
本発明のさらなる特定の実施形態は、ＨＤＡＣ阻害剤治療を必要とする可能性がある患者を層別化する方法であって、以下の：
ａ）上記患者のサンプルを提供する工程であって、上記患者は癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、もしくは結腸直腸癌（ＣＲＣ）、より特別には肝細胞癌（ＨＣＣ）であると診断された工程、
ｂ）ＺＦＰ６４について決定されたＣｔ値から１つ以上のハウスキーピング遺伝子のＣｔ値の平均値を減じることによってＺＦＰ６４の遺伝子発現のレベルについてのｄＣｔ値を入手する工程、および
ｃ）工程ｂ）においてＺＦＰ６４について入手したｄＣｔ値が１１．１５より低い、特に１０．０２より低い場合に、上記患者がＨＤＡＣ阻害剤治療のために適格であると分類する工程を含む方法に関する。
【０１６７】
本発明の方法の特定実施形態では、ＺＦＰ６４の遺伝子発現についての上記ｄＣＴ値は、ＺＦＰ６４について決定されたＣｔ値からハウスキーピング遺伝子１８ｓＲＮＡ、ＴＢＰおよびＧＡＰＤＨのＣｔ値の平均値を減じることによって得られる。
【０１６８】
本発明の方法の特定の実施形態では、Ｃｔ値は、上記遺伝子によって発現した、特にＺＦＰ６４によって発現したｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーのｑＰＣＲ増幅によって決定できる。
【０１６９】
本発明の特定の実施形態は、サンプル中にＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される少なくとも１つの遺伝子、特にＺＦＰ６４の遺伝子発現を決定するためのキットであって、上記遺伝子によって発現するｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーに結合する、および２つのエキソンの部分に相補的であるヌクレオチドプローブ（例えば、ＰＣＲプライマー対）、特に上記遺伝子、より特別にはＺＦＰ６４から転写されたｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーのｑＰＣＲにおいて使用するために本明細書で記載したプライマー対から選択されるプライマー対を含む、および
任意選択的に、培地、培地成分、バッファー、バッファー成分、ＲＮＡ精製カラム、ＤＮＡ精製カラム、染料、ｄＮＴＰミックスを含む核酸、ポリメラーゼを含む酵素および塩を含む群から選択される１つ以上のさらなる成分を含むキットである。
【０１７０】
本発明のまた別の特定実施形態は、サンプル中のＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１を含む群から選択される１つの遺伝子、特にＺＦＰ６４によってコードされた少なくとも１つのタンパク質のレベルを決定するためのキットであって、
上記キットは上記遺伝子によってコードされた少なくとも１つのタンパク質もしくは上記タンパク質の１つのドメインに特異的に結合するプローブを含み、上記プローブは特に本明細書に記載した標識を含む、および／または上記プローブはＺＦＰ６４に対する特定の特異的抗体として本明細書に記載した抗体である、および／または上記プローブは、例えばＥＬＩＳＡもしくはＬｕｍｉｎｅｘの関連において本明細書に記載したように固定化され、上記キットは任意選択的に、培地、培地成分、バッファー、バッファー成分、膜、ＥＬＩＳＡプレート酵素基質、染料、ポリメラーゼを含む酵素および塩を含む群から選択される１つ以上のさらなる成分を含むキットである。
【０１７１】
本発明の実施形態では、ＺＦＰ６４によって発現されたタンパク質に特異的に結合する抗体もしくはプローブが適用される場合、上記プローブもしくは抗体は、特別には本明細書で上述したようにＺＦＰ６４のための特定の特異的抗体から選択される。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】ＳＡＰＨＩＲＥ臨床試験において８００ｍｇ投与群に比較して６００ｍｇ投与群で見いだされたレスミノスタット依存性メジアンＨＤＡＣ酵素阻害率を示す図である。Ｙ軸はＨＤＡＣ阻害剤治療の第１日、０時間後の時点での数値に関連する酵素活性率に関し、Ｘ軸は各治療サイクルの開始後の日数および経過時間に分割した治療サイクルに関する。
【図２】ＨＤＡＣ阻害剤の投与０、２および５時間後の時点（ｘ軸上に示した時点）での末梢血（エックスビボ）および選択したヒト癌細胞系（インビトロ）のサンプル中で決定された、発現レベル（Ｙ軸）として測定された、ＨＤＡＣ阻害剤治療後の本発明の遺伝子についての遺伝子発現の変化間の比較を示した図である。斜線の棒は血液、黒色棒はＨｅｐＧ２細胞、白色箱はＨＴ２９細胞に関する。数値は０時間後の数値に標準化された。
【図３】ＨＤＡＣ阻害剤の投与後、０、２および５時間後の時点（ｘ軸上に示した時点）での末梢血（エックスビボ）および選択したヒト癌細胞系（インビトロ）のサンプル中で決定された、発現レベル（Ｙ軸）として測定された、ＨＤＡＣ阻害剤治療後のハウスキーピング遺伝子についての遺伝子発現の変化間の比較を示した図である。斜線の棒は血液、黒色棒はＨｅｐＧ２細胞、白色ボックスはＨＴ２９細胞に関する。数値は０時間後の数値に標準化された。
【図４ａ】図１に提示したＨＤＡＣ酵素阻害による、第１、５、８および３３日についてのＣＣＤＣ４３遺伝子発現パターンの薬力学的挙動を示す図である。これらの数値は、発現レベル（Ｙ軸）として測定され、Ｘ軸は各治療サイクルの開始後の日数および時間に細分割された治療サイクルに関する。
【図４ｂ】ＨＣＣおよびＨＬ患者の血球中におけるレスミノスタットによるＺＦＰ６４ダウンレギュレーションを示す図である。太線はレスミノスタット６００ｍｇ（ｎ＝１４ＨＣＣ＋１６ＨＬ）の１日量に関し、断続線はレスミノスタット６００ｍｇ＋ソラフェニブ４００ｍｇ（ｎ＝１９ＨＣＣ）の１日量に関し、点線はレスミノスタット８００ｍｇ（ｎ＝１５ＨＬ）の１日量に関する。データは、第１日（左のパネル）および第５日（右のパネル）の投与での相対ＺＦＰ６４発現について示した。
【図４ｃ】レスミノスタット（１０μＭ）を用いての治療後の０、２、５および２４時間後の様々な癌細胞系中でのＺＦＰ６４遺伝子発現データを示している。
【図４ｄ】レスミノスタット（５μＭ）（「Ｒ」）またはレスミノスタット（５μＭ）およびソラフェニブ（５μＭ）（「Ｒ／Ｓ」）の組み合わせを用いた、上記薬物または薬物併用の投与４時間後および２時間後のＺＦＰ６４の発現における倍率変化に関する同一健常ドナーからの肝癌細胞系ＨｅｐＧ２ならびに全血およびＰＢＭＣｓの治療を示す図である。比較のために、ＨｅｐＧ２細胞に関するｓｉＲＮＡ実験（ＺＦＰ６４ノックダウン）を図示した。サンプルをＤＭＳＯコントロールと比較し、倍率変化はレスミノスタットサンプルと比較されるｓｉＲＮＡサンプルを除いて決定する。
【図５】ＺＦＰ６４についてのサイクル１、ＳＡＰＨＩＲＥ臨床試験からのホジキンリンパ腫における血球中の第１日、０時間後のｄＣｔ値についてのボックスプロットを示す図であり、メジアン値（Ｙ軸）は１１．０８（進行性疾患患者：ＰＤ）および１０．６７（安定性疾患患者：ＳＤ）であり、ならびに各ｐ値は０．０３（マン・ホイットニー検定に基づく）である。
【図６】ＺＦＰ６４についてのＳＨＥＬＴＥＲ臨床試験からのＨＣＣにおける血球中のサイクル１、第１日、０時間後のＺＦＰ６４ベースライン発現を示す図である。患者は臨床転帰によって分離される（ＰＤ対ＳＤ）。
【図７】ＰＤ対ＳＤを経験している、ＳＨＯＲＥ臨床試験からのＣＲＣ患者におけるバイオマーカーＺＦＰ６４発現を示す図である。サイクル１、第１日、０時間後（前投与）に採取されたサンプル。
【図８】４ＳＣ臨床試験（ＳＡＰＨＩＲＥ、ＳＨＯＲＥ、ＳＨＥＬＴＥＲ）および健常志願者を比較するベースライン時の臨床的有益性対ＺＦＰ６４  ｄＣｔ値のボックスプロットを示す図である；各臨床試験についてのデータは別個に示されており、患者はＳＤおよびＰＤ群に分割される。
【図９】４ＳＣ臨床試験データおよび健常被験者を比較するベースライン時の臨床的有益性対ＺＦＰ６４  ｄＣｔ値のボックスプロットを示す図である；全臨床試験（ＳＡＰＨＩＲＥ、ＳＨＯＲＥ、ＳＨＥＬＴＥＲ）についてのデータが合併され、患者はＳＤ群およびＰＤ群に分割される。
【図１０】ＺＦＰ６４についての予後領域についてのパーセンタイル順位付けおよび分割を示す図である。上位３分の１は予測率＝０．７８を備える「非臨床的有益性（ＰＤ）」群を示し、下位３分の１は「臨床的有益性群（ＳＤ）」についての予測率＝０．６９を示す。Ｙ軸はパーセンタイルに関し、Ｘ軸はｄＣｔに関する。各場合に、ＸはＰＤ患者を表示し、ドットはＳＤ患者を表示する。
【図１１ａ】ＳＨＥＬＴＥＲ臨床試験からのＨＣＣにおける血球中のＺＦＰ６４ベースライン発現を示す図である。患者は、全生存期間の長さに比較して４０および６０パーセンタイル群に分離される。
【図１１ｂ】ＳＨＥＬＴＥＲ臨床試験からのＨＣＣにおける血球中のＺＦＰ６４ベースライン発現を示している。患者は、無増悪生存の長さに比較して４０および６０パーセンタイル群に分離される。
【図１２ａ】（ＸＸＸは１３ｂであった）ＨＣＣ患者からのＳＨＥＬＴＥＲ臨床試験データ、ベースライン時のＺＦＰ６４発現対全生存率（ＯＳ）；ＺＦＰ６４相対的発現の分割に対する全生存率（ＯＳ）のカプラン・マイヤー推定値−６０パーセンタイルでのベースライン時のＺＦＰ６４発現分割（６０％高／４０％低）を示す図である。太線は、ベースライン時の低い相対ＺＦＰ６４発現に関し、断続線はベースライン時の高い相対ＺＦＰ６４発現に関する。白丸は、データ収集時点に生存している患者に関する。
【図１２ｂ】レスミノスタット（６００ｍｇ）またはレスミノスタット（６００ｍｇ）およびソラフェニブ（４００ｍｇ）の組み合わせを摂取しているＨＣＣ患者からのＳＨＥＬＴＥＲ臨床試験データ；ベースライン時のＺＦＰ６４発現対全生存率（ＯＳ）；７５パーセンタイルでのＺＦＰ６４相対的発現の分割（７５％高／２５％低）に対する全生存率（ＯＳ）のカプラン・マイヤー推定値を示す図である。太線は、ベースライン時の高い相対ＺＦＰ６４発現に関し、点線はベースライン時の低い相対ＺＦＰ６４発現に関する。白丸は、データ収集時点に生存している患者に関しており、黒丸はフォローアップに姿を見せなくなった患者に関する。
【図１３】レスミノスタット（６００ｍｇ）を摂取しているＨＣＣ患者からのＳＨＥＬＴＥＲ臨床試験データ；ベースライン時のＺＦＰ６４発現対全生存率（ＯＳ）を示す図である。分割は、本明細書に記載した方法によって計算され、レスミノスタット（６００ｍｇ）を摂取している患者の特定部分集団にのみ基づいている。太線は、ベースライン時の高い相対ＺＦＰ６４発現に関し、点線はベースライン時の低い相対ＺＦＰ６４発現に関し、断続線は全カプラン・マイヤープロットに関する。白丸は、データ収集時点に生存している患者に関しており、黒丸はフォローアップに姿を見せなくなった患者に関する。
【図１４】ＳＨＥＬＴＥＲ臨床試験データ−レスミノスタット（６００ｍｇ）およびソラフェニブ（４００ｍｇ）を摂取しているＨＣＣ患者−ＺＦＰ６４発現、ベースライン時対全生存率（ＯＳ）を示す図である。分割は、本明細書に記載した方法によって計算され、レスミノスタット（６００ｍｇ）を摂取している患者の特定部分集団にのみ基づいている。太線は、ベースライン時の高い相対ＺＦＰ６４発現に関し、点線はベースライン時の低い相対ＺＦＰ６４発現に関し、断続線は全カプラン・マイヤープロットに関する。白丸は、データ収集時点に生存している患者に関する。
【図１５】ＨＣＣ患者からのＳＨＥＬＴＥＲデータ；ベースライン時のＺＦＰ６４発現対全生存率（ＯＳ）を示す図である。破線は、ベースライン時の高い相対ＺＦＰ６４発現に関し、太い黒線はベースライン時の低い相対ＺＦＰ６４発現に関し、一点鎖線は全カプラン・マイヤープロットに関する。白丸は、データ収集時点に生存している患者に関する。左のパネルは、レスミノスタット単剤療法群を示し、右のパネルはレスミノスタット／ソラフェニブ併用療法群を示す。この分割値は、完全試験群から取られる（評価可能な患者：レスミノスタット群に対しては高６例／低８例、併用群に対しては高１２例／低６例）。
【図１６】ＳＡＰＨＩＲＥ臨床試験からのホジキンリンパ腫における血球中のベースライン時ＺＦＰ６４発現を示す図である。患者は、全生存期間の長さに比較して３５および６５パーセンタイル群に分離される。
【図１７】ホジキンリンパ腫患者からのＳＡＰＨＩＲＥデータ；ベースライン時ＺＦＰ６４発現対全生存率（ＯＳ）−６５パーセンタイルでのベースライン時ＺＦＰ６４発現分割（高６５％／低３５％）を示す図である。太線は、ベースライン時の低い相対ＺＦＰ６４発現に関し、断続線はベースライン時の高い相対ＺＦＰ６４発現に関する。白丸は、データ収集時点に生存している患者に関する。
【図１８】ＯＳに相関させたＣＲＣ患者におけるベースライン時のＺＦＰ６４発現（ＳＨＯＲＥ臨床試験）を示す図である。太線は、高い相対ＺＦＰ６４発現に関し、断続線は低い相対ＺＦＰ６４発現に関する。
【図１９】ＤＰＰ３についてのサイクル１、第１日、０時間後のｄＣｔ値についてのボックスプロットを示す図であり、メジアン値（Ｙ軸）は９．１５（ＰＤ）および８．６７（ＳＤ）であり、ならびに各ｐ値は（マン・ホイットニー検定に基づいて）０．０３である。
【図２０】ＤＰＰ３についての予後領域についてのパーセンタイル順位付けおよび分割を提示する図である。上位３分の１は予測率＝０．６９を備える「非臨床的有益性（ＰＤ）」群を示し、下位３分の１は「臨床的有益性群（ＳＤ）」についての予測率＝０．６４を示す。Ｙ軸はパーセンタイルに関し、Ｘ軸はｄＣｔに関する。各場合に、ＸはＰＤ患者を表示し、ドットはＳＤ患者を表示する。
【図２１】０．１％のＤＭＳＯ（ビヒクルコントロール）または５μＭのレスミノスタットいずれかを用いて２４時間処置されたＨｅｐＧ２細胞中のＺＦＰ６４核タンパク質レベルを提示する図である。核画分を単離した後、ＺＦＰ６４タンパク質レベルをウェスタンブロット分析によって検出した。ヒストンＨ３は、核ローディングコントロールとして機能する。ＺＦＰ６４タンパク質レベルはレスミノスタットの添加後に減少するが、他方ヒストンＨ３レベルは本質的に未変化のままである。
【実施例】
【０１７３】
（Ｅ）−３−（１−（４−（（ジメチルアミノ）メチル）フェニルスルホニル）−１Ｈ−ピロール−３−イル）−Ｎ−ヒドロキシアクリルアミド（ＩＮＮ：レスミノスタット）は、近年開発されたヒドロキサメートクラスのＨＤＡＣ阻害剤である。ヒト被験者へのレスミノスタットの経口投与を調査し、本発明による一連のバイオマーカーを用いてその薬理学的挙動および有効性を決定した。
【０１７４】
実施例１：ＨＤＡＣの阻害
サンプルを入手し、本明細書で以下に記載する方法を用いて遺伝子発現を決定した。全血は、蛍光ＨＤＡＣ基質Ｂｏｃ−Ｋ（Ａｃ）−ＡＭＣとともに３７℃で２時間にわたりインキュベートした。赤血球を溶解させた後、残留している細胞は−８０℃で保存した。ＨＤＡＣ活性はＦＬＵＯｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡプレートリーダーを使用して蛍光分析により決定したが、このとき細胞は、細胞溶解および脱アセチル化基質からの蛍光体の生成をもたらす既定の顕色剤試薬（トリプシンおよび溶解バッファを含有する）とともにインキュベートした。最後に、投与前レベルと比較してＨＤＡＣ活性の阻害率を計算した。結果は図１に示した。
【０１７５】
ＨＤＡＣ酵素活性の阻害は一過性および時間依存性であり、レスミノスタットの１．０時間〜１．５時間後のメジアンピーク血漿レベルに対応して投与２時間後に最大阻害を示した。ＨＤＡＣ酵素活性は、両方の投与群において投与２時間後に９３％のメジアン値まで阻害できた。
【０１７６】
実施例２：末梢血細胞および癌細胞における遺伝子発現間の相関
サンプルを入手し、本明細書で以下に記載する方法を用いて遺伝子発現を決定した。結果は、下記の表３ならびに図２および３に示した。
【０１７７】
図２および３に要約した結果は、バイオマーカーが健常ドナーの血液細胞中およびレスミノスタットで処置された癌細胞系において同一方法で調節されることを証明している。上記の数値は、それらの各々に対して３つの技術的複製物が調製された２つの生物学的複製物に基づいて決定された平均値を表す。結果は再現性であることが証明された。これは、末梢血中の上記遺伝子の遺伝子発現が罹患組織中の遺伝子発現に対応することを指示している。末梢血サンプル中で決定された遺伝子発現のレベルは、罹患細胞中のＨＤＡＣの活性の特定のレベルと、例えば各特定疾患および／または患者群について決定されてよい、適切な変換因子もしくは変換表を適用することによって相関させることができる。
【０１７８】
図４ｂは、ＨＤＡＣ阻害剤であるレスミノスタットは癌患者におけるＺＦＰ６４発現をダウンレギュレートするが、ソラフェニブの追加の投与はＺＦＰ６４発現に影響を及ぼさないことを証明している。
【０１７９】
ＺＦＰ６４への同一のダウンレギュレーティング作用は、レスミノスタットの投与０、２、５および２４時間後のＺＦＰ６４の発現レベルが示されている図４ｃにおいて数種の癌細胞系について見ることができるが。さらに図４ｄでは、ＺＦＰ６４の調節が倍率変化に関して提示されており、癌細胞系および同一健常ドナーからの全血およびＰＢＭＣが相互に比較され、さらにＨｅｐＧ２細胞系内でのＺＦＰ６４のｓｉＲＮＡノックダウンと比較されている。全サンプルについてダウンレギュレーションの同一傾向を観察できる。ｓｉＲＮＡサンプルの一過性アップレギュレーションは、ｓｉＲＮＡの発現がレスミノスタット投与を用いたサンプルに匹敵するという事実に起因する。典型的には、ｓｉＲＮＡによる標的遺伝子のダウンレギュレーションは、低分子阻害剤に比して遅延させられる。
【０１８０】
実施例３：癌患者から入手したサンプル中での遺伝子発現の分析
ＨＤＡＣ酵素活性、Ｈ４ヒストンのアセチル化および１群の遺伝子の遺伝子発現を１００ｍｇ、２００ｍｇ、４００ｍｇ、６００ｍｇおよび８００ｍｇの用量群において測定した。各群は、様々なタイプの腫瘍を有する患者３例から構成した。最高用量群は、この群における最初の患者３例中１例において用量制限毒性［ＤＬＴ］（疲労および悪心グレード３）が見られたために患者６例から構成した。治療サイクルは、本明細書で以下に記載するＳＡＰＨＩＲＥ、ＳＨＥＬＴＥＲおよびＳＨＯＲＥ臨床試験について説明した通りであった。
【０１８１】
薬物血漿中濃度（ＰＫデータ）は、薬剤用量漸増中のＨＤＡＣ酵素阻害と相関させた。分析は、２００ｍｇ用量群から始まる長期薬物作用を証明した。これらの結果の結論として、８００ｍｇ用量群については追加の時点をＳＡＰＨＩＲＥ臨床試験における第８日に修正した。ＨＤＡＣ酵素活性は、この用量群において４１％まで阻害されることを証明できたが、個別阻害値は広範囲であった。
【０１８２】
ＺＦＰ６４、ＤＰＰ３、ＣＣＤＣ４３、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ／Ｂ、ＫＤＥＬＣ２およびＭＩＣＡＬＬ１に対応するｍＲＮＡｓは、Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｉｐ  Ｕ１３３  ｖ２．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、米国サンタクララ州）を用いる遺伝子チップマイクロアレイ分析によって５４．６７５プローブセットおよびその後のｑＰＣＲから抽出した。これらの実験の目的は、臨床的応答に結び付いた可能性のあるヒトＰＢＭＣｓの転写へＨＤＡＣ阻害剤が及ぼす作用を監視するためのｍＲＮＡバイオマーカーを同定することであった。追加の選択基準は、ＨＤＡＣ阻害剤に対する高振幅および安定性発現シグナルを伴う当該の遺伝子のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションであった。
【０１８３】
標準化のためのハウスキーピング遺伝子として３つの遺伝子、つまり１８ｓＲＮＡ、ＴＢＰおよびＧＡＰＤＨ（Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子ＩＤについては下記で説明する）を選択した。
【０１８４】
臨床試験についての説明
本明細書の臨床データは、（Ｅ）−３−（１−（４−（（ジメチルアミノ）メチル）フェニルスルホニル）−１Ｈ−ピロール−３−イル）−Ｎ−ヒドロキシアクリルアミド（ＩＮＮ：レスミノスタット）メシレート塩を用いた臨床試験中に、つまり４ＳＣ  ＡＧ（独国）によるＳＡＰＨＩＲＥ臨床試験（詳細な参考文献については：ｈｔｔｐ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０１０３７４７８を参照されたい）、４ＳＣ  ＡＧ（独国）によるＳＨＥＬＴＥＲ臨床試験（詳細な参考文献については：ｈｔｔｐ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ００９４３４４９を参照されたい）、および４ＳＣ  ＡＧ（独国）によるＳＨＯＲＥ臨床試験（詳細な参考文献については：ｈｔｔｐ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０１２７７４０６を参照されたい）中に獲得した。以下では各試験手順についての短い説明を記載する。
【０１８５】
オープンラベル単一治療群ＳＡＰＨＩＲＥ臨床試験は、以前に治療を受けた後に進行していた、または治療に難治性であったホジキンリンパ腫の患者を含んでいた。レスミノスタットは、１日１回６００ｍｇもしくは８００ｍｇで投与された。患者は、１４日間で１サイクルを構成する、連続５日間の治療、その後に９日間の無治療期間が続くサイクル（５＋９のスケジュール）で治療された。患者は、ＰＥＴ／ＣＴによって疾患状態の評価を受けた。試験の一次エンドポイントは全客観的奏効率（ＯＲＲ）であり、二次エンドポイントは、第１および第３治療サイクル中の投与６時間後までの両方の用量の有効性、安全性および忍容性ならびに薬物動態の分析を含んでいた。同一時点に、例えばＨＤＡＣ酵素阻害および選択された標的遺伝子の遺伝子発現における変化などの薬物動態マーカーに様々な用量のレスミノスタットが及ぼす作用を末梢血細胞中で決定した。
【０１８６】
ＳＨＥＬＴＥＲ試験は、ソラフェニブに難治性であった肝細胞癌（ＨＣＣ）を有する患者におけるレスミノスタットの治療への安全性、ＰＫおよび有効性を評価するために設計された。レスミノスタットは、単剤療法として、およびソラフェニブと併用して調査された。進行性ＨＣＣ（ＢＣＬＣの病期Ｂ／Ｃ）を有する患者が多施設共同２治療群試験に含まれた。試験参加前の中央判定（ＲＥＣＩＳＴ）によって、ソラフェニブ一次療法下での放射線学的進行が確証されなければならなかった。ソラフェニブ（４００もしくは８００ｍｇ）と組み合わされたレスミノスタット（範囲：２００〜６００ｍｇ）の用量漸増が実施された。Ａ治療群は薬物併用（レスミノスタット＋ソラフェニブ）を調査し、Ｂ治療群はレスミノスタット（６００ｍｇ）の単剤療法を調査した。第１の目的は、１２週間（ｗ）後の無増悪生存率（ＰＦＳＲ）であった。第２の目的は、安全性、忍容性、腫瘍応答、ＰＦＳ、ＴＴＰ、ＯＳならびにＰＫおよびＨＤＡＣ酵素阻害、ヒストンのアセチル化および末梢血中での遺伝子発現を含むバイオマーカー（ＢＭ）の分析を含んでいた。
【０１８７】
ＳＨＯＲＥ臨床試験（４ＳＣ−２０１−３−２０１０）は、ｋ−ｒａｓ突然変異進行性結腸直腸癌（ＣＲＣ）を有する患者のための確立された第二次化学療法レジメン（ＦＯＬＦＩＲＩ）と組み合わされたレスミノスタットの安全性、忍容性、薬物動態および有効性を評価するための第Ｉ／ＩＩ相試験として設計された。
【０１８８】
主要包含基準は、≧１８歳の年齢、組織学的もしくは細胞学的に確証された進行性もしくは転移性ｋ−ｒａｓ突然変異結腸直腸癌を含んでいた。患者は、以前に５−ＦＵを用いた治療を受けていなければならず、ＦＯＬＦＩＲＩを用いた第二次治療にとって適格でなければならない。第Ｉ相部分のためには、ｋ−ｒａｓの野生型状態およびその後の治療ラインもまた包含することが許容された。
【０１８９】
第Ｉ相部分の第１の目的は、上記併用の安全性、忍容性および薬物動態を調査することによってＦＯＬＦＩＲＩと併用したレスミノスタットのＭＴＤ（最大耐用量）を決定することであった。第２の目的は、８週間後（４サイクル）にＰＦＳＲおよびその後の８週間毎にＰＦＳ、ＴＴＰ、客観的奏効症例数、ＯＳ（全生存期間）およびＤＯＲ（奏効持続期間）を評価することであった。さらに、ＨＤＡＣ酵素阻害、ヒストンのアセチル化、遺伝子発現分析、タンパク質バイオマーカーおよび腫瘍マーカー、例えばＣＡ１９〜９およびＣＥＡを含むバイオマーカーが調査された。本出願の出願日現在、第Ｉ相試験後には患者は募集されておらず、本試験は「実施中、ｈｔｔｐ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ．上で募集していない」と表示された。
【０１９０】
第Ｉ相部分中、患者３〜６例の群は、併用のＭＴＤが決定されるまでＦＯＬＦＩＲＩ治療の標準レジメンと併用して１日当たり２００〜８００ｍｇのレスミノスタットを用量を漸増しながら摂取した。各１４日間の治療サイクルにおいて、患者には連続５日間（第１日〜第５日）にわたりレスミノスタットが投与され、その後には９日間の休薬期間（第６日〜第１４日）が続いた。第３日および第４日には、ＦＯＬＦＩＲＩレジメンの化合物が投与された。
【０１９１】
本出願の出願日現在、患者１７例が第Ｉ相部分に登録されていた：３例は２００ｍｇ、４００ｍｇおよび６００ｍｇ各用量レベルのレスミノスタット＋ＦＯＬＦＩＲＩを摂取し、患者８例は４００ｍｇの用量レベルのレスミノスタットＢＩＤ（１日２回）＋ＦＯＬＦＩＲＩを摂取した。
【０１９２】
材料および方法
サンプル
患者からの全血２．５ｍＬを、赤血球を溶解させてＲＮａｓｅｓによる分解からＲＮＡを安定化させ、遺伝子発現におけるエックスビボ変化を最小限に抑えるための化学薬品を含有するＰＡＸｇｅｎｅ（商標）チューブ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に収集した。サンプルを２０℃〜２５℃で２時間インキュベートし、次に全ＲＮＡの精製時まで−２０℃で冷凍した。
【０１９３】
サンプル収集についての好ましい手順について下記で説明する：
全手技は氷上で実施した。下記の工程を実施した：
静脈血サンプル（２ｍＬ）をラベル付きＫ−ＥＤＴＡ真空容器（例えば、ｍｏｎｏｖｅｔｔｅｓ（登録商標））中に採取する。時点「０時間後」は、投与直前の時点を意味する（投与前サンプル）。
サイクル１、第１日：０時間後（投与前）；２時間後；５時間後
サイクル１、第５日：０時間後（投与前）；２時間後；５時間後
サイクル１、第８日：０時間後（投与前）
サイクル３、第５日：０時間後（投与前）；２時間後；５時間後
許容時間偏差は、他に特に規定されない限り：＋／−１０分間である。
【０１９４】
ＰＢＭＣの単離：
必要な材料
・  ラベル付きＬｅｕｃｏｓｅｐ（商標）チューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）（使用時までは＋４〜＋８℃および暗所で保管し、使用前にＲＴへ加温する）
・  ラベル付き１５ｍＬチューブ（例えば、ＰＰチューブ、例えばＦａｌｃｏｎ（登録商標）チューブ）
・  ラベル付き２ｍＬチューブ（例えば、ＰＰチューブ）
・  赤血球溶解バッファー（Ｑｉａｇｅｎ  ７９２１７）（使用時まではＲＴで保管する）
・  ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩液）（使用時まではＲＴで保管する）
・  ＲＩＰＡ（放射性免疫沈降検定）バッファー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ８９９００）（使用時までは４℃で保管する）
・  プロテアーゼ阻害剤カクテルストック、１０μＬアリコートとして提供される（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ８７７８５）（使用時までは−８０℃で保管する）
【０１９５】
サンプルの処理
１）治療用の７ｍＬのクエン酸加血（凝固を防止するために一般に公知の手技によってクエン酸塩で処理された血液サンプル）を使用準備済みのＬｅｕｃｏｓｅｐ（商標）チューブへ移す。
２）ＲＴで停止させることなく８００ｇで１５分間遠心する。
３）ＰＢＭＣ層間の上方に５ｍｍまで残して、およそ２ｍＬの血漿上清（血小板を含有する）を取り除く。
４）遠心分離のために適切なラベル付き１５ｍＬＰＰ（例えば、Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）チューブへ上清の残り全部をピペット操作によって多孔質障壁の上方に移す。
５）１０ｍＬのＰＢＳ（ＲＴ）を加えて混合する。
６）ＲＴで停止させることなく４００ｇで７分間遠心する。
７）およそ０．５ｍＬのＰＢＳの残留容量を除く上清を取り出し、細胞を懸濁させる。
８）１．５ｍＬのＥｒｙｌｙｓｉｓ（赤血球溶解）バッファー（Ｑｉａｇｅｎ  ７９２１７）を加え、溶解のためにＲＴで４分間インキュベートする。
９）Ｅｒｙｌｙｓｉｓ（赤血球溶解）を停止させるために１０ｍＬのＰＢＳを加える。
１０）ＲＴ、４００ｇで７分間遠心する。
１１）上清を取り出し、細胞を１４ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁させる。
１２）ＲＴ、４００ｇで７分間遠心する。
１３）上清を取り出し、細胞を４．５ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁させる。
１４）細胞懸濁液から３つの等量のアリコート（３×１．５ｍＬ）をラベル付き２ｍＬチューブ中に移す。
１５）ＲＴ、４００ｇで７分間遠心する。
１６）以下の手法にしたがって上清を完全に取り除く：細胞ペレットを上向きにしてチューブを４５度傾斜させ、ゲルローダーチップを使用して細胞ペレットの反対側の液体を除去する。氷上に置く。
１７）１，０００μＬの低温ＲＩＰＡバッファーを１本のチューブのプロテアーゼ阻害剤カクテルストックに移して混合する。
１８）５０μＬのこのプロテアーゼ阻害剤カクテル溶液を３つの等分した細胞ペレット各々に移し、短時間混合する。
１９）ペレットは直ちに−８０℃で保存する。
【０１９６】
細胞ＨＤＡＣ酵素活性アッセイの手順
必要な材料
・  ラベル付き１５ｍＬチューブ（例えば、ＰＰチューブ、例えばＦａｌｃｏｎ（登録商標）チューブ）
・  ラベル付き２ｍＬチューブ（例えば、ＰＰチューブ）
・  赤血球溶解バッファー（Ｑｉａｇｅｎ  ７９２１７）（使用時まではＲＴで保管した）
・  ＤＭＳＯ中の４０ｍＭのＢｏｃ−Ｋ（Ａｃ）ＡＭＣストック（Ｂａｃｈｅｍ：Ｉ−１８７５）（使用時まで−８０℃で保存した）
【０１９７】
サンプルの処理
１）１ｍＬのクエン酸加血液を１５ｍＬのラベル付きチューブに加える。
２）５μＬの４０ｍＭのＢｏｃ−Ｋ（Ａｃ）ＡＭＣを１ｍＬのクエン酸加血液に加える（最終濃度：２００μＭのＢｏｃ−Ｋ（Ａｃ）ＡＭＣ）。
３）インキュベーター（３７℃）内で２時間インキュベートする。
４）５倍容積（５ｍＬ）の４℃の低温赤血球溶解バッファー（ＥＬバッファー、Ｑｉａｇｅｎ  ７９２１７）を加える。
５）攪拌器上で短時間混合する。
６）少なくとも１５分間、氷上でインキュベートする；その間に２回、プレート攪拌器上で混合する。
７）７ｍＬの４℃のＥＬバッファーを加える。
８）１０分間にわたり４℃、４００ｇで遠心分離し、上清を除去する。
９）２倍容積（２ｍＬ）の４℃のＥＬバッファーを加え、短時間混合する。
１０）１０分間にわたり４℃、４００ｇで遠心分離し、上清を除去する。
１１）２倍容積（２ｍＬ）の４℃のＥＬバッファーを加え、短時間混合する。
１２）サンプリングの正確な時点がラベル表示された２ｍＬチューブを取り出す。
１３）チューブラベル上に患者番号を記入する。
１４）２つの１ｍＬアリコートを調製する（アリコート操作の前にピペットを用いて再度混合する）。
１５）１０分間にわたり４００ｇ、＋４℃で遠心分離し、以下の手法にしたがって上清を完全に取り除く：細胞ペレットを備えるチューブを上向きに４５度傾斜させ、ゲルローダーチップを使用して細胞ペレットの反対側の液体を除去する。
１６）−８０℃でサンプルを冷凍する。
【０１９８】
細胞系およびＰＢＭＣからのＲＮＡの単離
サンプル、例えば細胞は、ＲＮＡを入手するために、機械的に（例えば、超音波処理）または化学的に（例えば洗剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム、イソチオシアン酸グアニジン）崩壊させる。ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質およびその他の実体を含有する細胞溶解液からＲＮＡを抽出するためには、例えば有機物（例えば、フェノール／クロロホルム）を使用する抽出法、フィルターベースのスピンバスケットフォーマット（例えば、ガラス繊維、誘導体化シリカまたはそれに核酸が結合するイオン交換膜）、磁気粒子法（常磁性コアおよびシリカのような核酸に結合するように修飾された周囲のシェルを備える粒子）および直接溶解法（例えば、サンプルを崩壊させて核酸を安定化する溶解バッファー調製物を用いる）などの様々な方法を使用できる。
【０１９９】
様々な癌細胞系およびＰＢＭＣ中のＺＦＰ６４のＲＮＡ発現レベルを決定するために、細胞膜は、細胞を溶解させてシリカ膜へのＲＮＡの結合を支持するイソチオシアン酸グアニジンを含有するバッファーを用いて化学的に崩壊させ、フィルターベースのスピンカラムによってＲＮＡを抽出した。
【０２００】
ＰａｘＧｅｎｅの手順
１）２本のラベル付きＰａｘＧｅｎｅ（登録商標）チューブ（Ｑｉａｇｅｎ  ７９２１７）（使用時までＲＴで保管する）を時点および患者毎に取り出す。
２）２ｍＬの血液を添加した後に、チューブを１０回反転させることによって混合する。
３）血液を充填したチューブをＲＴで２時間にわたりインキュベートする
４）チューブを−２０℃のフリーザーへ移す
５）血液を含有するチューブは輸送前に少なくとも２４時間にわたり−２０℃で保管する。
【０２０１】
本明細書で使用するように、ＲＴは、典型的には２１〜２５℃の範囲内にある室温を意味する。
【０２０２】
バイオマーカー測定の好ましい方法は、欧州特許出願第１２１７９１８７．５号明細書に記載されている。
【０２０３】
全血サンプルからのＲＮＡの単離
全ＲＮＡは、全血サンプルのために適切なスピンカラムベースの技術（例えば、Ｑｉａｇｅｎ製のＰＡＸｇｅｎｅ（商標）Ｂｌｏｏｄ  ｍｉＲＮＡキットまたはＰＡＸｇｅｎｅ（商標）Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡキット）を製造業者の説明書にしたがって使用してＰＡＸｇｅｎｅ（商標）バッファー中で安定化させた全血液サンプルから単離した。精製は、（ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ）チューブ内で核酸をペレット化するための遠心分離工程で開始した。再懸濁させたペレットは、バッファー中でインキュベートし、タンパク質消化を引き起こすためにプロテイナーゼＫと一緒にＲＮＡ安定性を維持するために最適化した。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）Ｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムを通しての追加の遠心分離は、細胞溶解液を均質化して残留細胞破片を除去するために実施し、フロースルー画分の上清を新鮮微小遠心チューブに移した。結合条件を調整するためにエタノールを加え、溶解物をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）ＲＮＡスピンカラムに適用した。短時間の遠心分離中、ＲＮＡは汚染物質が通過するにしたがってＰＡＸｇｅｎｅ（商標）シリカ膜に選択的に結合した。残留している汚染物質は、数回の効率的洗浄工程において取り除いた。第１および第２洗浄工程の間に、膜は、微量の結合ＤＮＡを除去するために、下記の１．３で記載するようにＤＮａｓｅＩを用いて処理した。洗浄工程後、ＲＮＡをヌクレアーゼフリー水中に溶出させ、熱変性させた。
【０２０４】
追加のＤＮａｓｅ消化およびクリーンアップ
ＲＮＡの純度を強化するため、ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて追加の溶液中ＤＮａｓｅ消化を実施した。手短には、溶出したＲＮＡは１０分間、室温で６．８１Ｋｕｎｉｔｚ単位のＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅＩとともにインキュベートした。Ｋｕｎｉｔｚ単位は、基質としての高度に重合化したＤＮＡを用いて、２５℃、ｐＨ５．０で１分間当たり１ｍｌ当たり０．００１のＡ２６０中での増加を引き起こすＤＮａｓｅＩの量として規定されたＤＮａｓｅＩを測定するために一般に使用される単位である（Ｋｕｎｉｔｚ，Ｍ．［１９５０］Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３３，３４９  ａｎｄ  ３６３）。サンプルは、次にスピンカラムベースの技術（ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ製）を使用して精製した。
【０２０５】
ＲＮＡの濃度および純度の決定
各全ＲＮＡサンプルのアリコートを使用して、分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００分光光度計（ｐｅｑｌａｂ））上でＲＮＡの濃度および純度を決定した。
【０２０６】
ＲＮＡの完全性の制御
ＲＮＡ完全性を試験したが、所定のサンプルについてはＲＮＡの品質はサンプル中で測定した全部のＲＮＡｓにわたって匹敵しているので、あらゆる潜在的異常が平均化されるために必須ではない。全サンプルは、全ＲＮＡ濃度に依存して、２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上でＲＮＡ  ６０００  ＮａｎｏもしくはＲＮＡ  ６０００  Ｐｉｃｏ  ＬａｂＣｈｉｐキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して分析した。
【０２０７】
２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒは、キャピラリー電気泳動法による全ＲＮＡサンプルの分析を許容する。ＲＮＡは断片サイズにしたがって分離され、結果は電気泳動図およびバーチャルゲル画像として報告された。
【０２０８】
ＲＮＡの品質についての指標、いわゆるＲＩＮ（ＲＮＡ完全性番号）は、電気泳動プロファイルから導き出される。ＲＩＮスケールは、１〜１０に及ぶ。１０のＲＩＮは素晴らしいＲＮＡ品質を意味するが、他方１のＲＩＮは大規模な分解を指示する。ＲＩＮ計算のために、アルゴリズムは、２８Ｓ／１８Ｓ−ｒＲＮＡ比単独には頼らず、全電気泳動プロファイル（例えば、短鎖変性ＲＮＡ種の画分、例えば約２０核酸塩基長）を考慮に入れる（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，ＢＭＣ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：３）。
【０２０９】
逆転写
高能力ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、製造業者の説明書にしたがってランダムヘキサマープライマーを用いて全ＲＮＡを一本鎖ｃＤＮＡへ逆転写した。手短には、反応ミックスのためには全ＲＮＡを過剰のランダムプライマー、４ｍＭのｄＮＴＰミックス、２．５Ｕ／反応、逆トランスクリプターゼおよびヌクレアーゼフリー水と混合した。逆転写はサーマルサイクラー内において以下の条件下で発生した：２５℃で１０分間、３７℃で１２０分間、８５℃で５分間、その後に反応液を冷却するために４℃。逆転写は、原則的には他の逆トランスクリプターゼ、プライマーおよび温度手順を用いて同様に実施できる。可能な場合は常に、２５０ｎｇの全ＲＮＡを逆転写させ、入手できない場合はより少ない量を使用した。
【０２１０】
Ｃｕｓｔｏｍ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）アレイ上での定量的リアルタイムＰＣＲ
Ｆｏｒｍａｔ  １６でのＣｕｓｔｏｍ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）アレイは、表４に略述したように本発明のバイオマーカーおよびハウスキーピング遺伝子の遺伝子発現分析のために設計された。これらのアレイは、カード１枚当たり８サンプルのｑＰＣＲ分析を可能にする。当然ながら、全反応は特異的プライマーを用いる従来型ｑＰＣＲ分析によって同様に実施できる。
【０２１１】
【表５】
2016521543.tif 000006
【０２１２】
マイクロ流体カードにＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現マスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および１ポートに付き２００ｎｇ、またはそれ以上入手できない場合はそれより少ないｃＤＮＡを装填した。
【０２１３】
反応ミックスは、各々３３０ｇおよび４℃で１分間にわたり２回遠心することによって反応チャンバー内へ移した。密封後、マイクロ流体カードはＡＢ７９００ＨＴ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上でランさせた。機器の制御、データ収集および生データ分析のためにはソフトウエアＳＤＳ  ２．４（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。プレートは相対定量（ΔΔＣｔ）モードでランし、下記の温度プロファイルを使用した：
４０サイクルにわたり、５０℃／２：００分−９４．５℃／１０：００分−［９７℃／０：３０分−５９．７℃／１：００分］。
【０２１４】
各タンパク質抽出およびウェスタンブロット分析
ＨｅｐＧ２    肝細胞癌細胞
７５ｃｍ2の細胞培養フラスコ    Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ、製品番号６５８１７０
核抽出キット    Ａｂｎｏｖａ、製品番号ＫＡ１３４６、ロット番号０４４８７３５
ＮＰ−４０代替物（１０％）    タンパク質等級洗剤、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、製品番号４９２０１８
Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）Ｐｒｅｃａｓｔゲル    １２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、１８  Ｗｅｌｌ  Ｃｏｍｂ、３０μＬ、Ｂｉｏ−ＲＡＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、製品番号３４５−０１１８
トリシンサンプルバッファー    Ｂｉｏ−ＲＡＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、製品番号１６１−０７３９（使用前に５μＬのβ−メルカプトエタノールを２５０μＬのサンプルバッファーに加える）Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｄｕａｌ  Ｃｏｌｏｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｂｉｏ−ＲＡＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、製品番号１６１−０３７４
ビオチン化Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ    Ｃｅｌｌ    Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、製品番号７７２７
ＸＴ  ＭＯＰＳ（２０×）バッファー    Ｂｉｏ−ＲＡＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、製品番号１１６１−０７８８
Ｔｒｉｓ／ＣＡＰＳバッファー（１０×）    Ｂｉｏ−ＲＡＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、製品番号１６１−０７７８
Ｉｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ  ＰＶＤＦ膜（０．２μｍ）    Ｂｉｏ−ＲＡＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、製品番号１６２−０１７７
濾紙基準サイズ    Ｂｉｏ−ＲＡＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、製品番号１７０３９６７
ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  Ｔ２０（ＰＢＳ）ブロッキングバッファー    Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、製品番号３７５１６
検出試薬１過酸化物溶液    Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、製品番号１８５９７０１
検出試薬２ルミノール強化剤溶液    Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、製品番号１８５９６９８
ブロッティングバッファー    ５０ｍＬの１０×のＴｒｉｓ／Ｃａｐｓバッファー＋２．５ｍＬの２０％のＳＤＳに５００ｍＬのＨ2Ｏを加える
洗浄バッファー（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）    ２５ｍＬ  ＰＢＳ＋ＰＢＳ中の２５ｍＬの０．１％のＴｗｅｅｎ２０
Ｇｅｌ  Ｄｏｃ  ２０００    Ｂｉｏ−ＲＡＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
【０２１５】
【表６】
2016521543.tif 000007
【０２１６】
【表７】
2016521543.tif 000008
【０２１７】
播種の４時間後、ＨｅｐＧ２細胞を０．１％のＤＭＳＯまたは５μＭのレスミノスタットのどちらかで処理した。
【０２１８】
レスミノスタット処理２４時間後、細胞をスクレーピングおよび低温ＰＢＳ中での採取前にＰＢＳで１回洗浄し、予備冷却した１５ｍＬのファルコンチューブ中に移した。
【０２１９】
細胞質抽出物および核抽出物を調製するために、低張性バッファー中に再懸濁させることによって初回細胞膨潤を誘発する。その後に、細胞膜を破断して、それにより細胞質画分への接近を許容する洗剤（例えばＮｏｎｉｄｅｎｔ  Ｐ−４０）を加える。細胞分別は、遠心分離および細胞質抽出物の除去によって実施する。引き続いて、核抽出バッファーを使用して核を溶解させる。
【０２２０】
細胞質抽出バッファー：１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、６０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＰＭＳＦ、ｐＨ７．６へ調整；洗剤：０．０７５％（ｖ／ｖ）のＮＰ−４０；核抽出バッファー：２０ｍＭのＴｒｉｓ  Ｃｌ、４２０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＳＭＦ、２５％（ｖ／ｖ）のグリセロール、ｐＨ８．０へ調整。
【０２２１】
Ａｂｎｏｖａ各抽出キットを使用したバッファーの調製：
【０２２２】
【表８】
2016521543.tif 000009
【０２２３】
【表９】
2016521543.tif 000010
【０２２４】
【表１０】
2016521543.tif 000011
【０２２５】
核抽出は、製造業者によって記載されたように（Ａｂｎｏｖａ、製品番号ＫＡ１３４６）以下のように実施した：
−  ３００×ｇ、５分間、４℃での懸濁細胞の遠心分離
−  上清を廃棄し、３ｍＬの氷冷ＰＢＳ／ホスファターゼ阻害剤溶液中でのペレットの再懸濁
−  ３００×ｇ、５分間、４℃での遠心分離
−  上清を廃棄し、３ｍＬの氷冷ＰＢＳ／ホスファターゼ阻害剤溶液中でのペレットの再懸濁
−  ３００×ｇ、５分間、４℃での遠心分離
−  上清を廃棄し、２５０μＬの氷冷低張性バッファーを加え、混合し、再懸濁させたペレットを予備冷却した１．５ｍＬチューブ内へ移す
−  氷上での１５分間にわたるインキュベーション
−  ５０μＬの１０％のＮｏｎｉｄｅｎｔ  Ｐ−４０を加え、ピペット操作により穏やかに混合する
−  ３０秒間、４℃での遠心分離
−  上清（サイトゾル画分を含有する）を新規なチューブへ移す
−  ５０μＬの氷冷核抽出バッファー中にペレットを再懸濁させ、１５秒間ボルテックスミキサーにかけ、１５分間にわたり氷上で揺動させ、３０秒間ボルテックスミキサーにかけ、１５分間にわたり氷上で揺動させる
−  １４，０００×ｇ、１０分間、４℃での遠心分離
−  上清（核画分を含有する）を新規なチューブへ移す
−  細胞質および核サンプルを−８０℃で保管した。
【０２２６】
各核サンプルから４．４μｇのタンパク質（ＢＣＡタンパク質アッセイによって測定）を同一量のトリシンバッファー（β−メルカプトエタノールを補給した）に加え、９５℃で５分間加熱し、次に氷上に配置した。サンプル−トリシンバッファーミックスをプレキャスト１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲルのウエル中に適用した。ゲルを８０〜１１０Ｖでランした。
【０２２７】
吸い取り紙およびＰＶＤＦ膜（メタノール中で短時間活性化された）をブロッティングバッファー中に浸漬させ、ブロッティング装置内に積み重ねた。ゲルは、４５分間にわたり一定の１８０ｍＡを用いて膜上にブロットした。その後、膜をＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  Ｔ２０（ＰＢＳ）ブロッティングバッファーを含有するプラスチック製箱内に配置し、２時間にわたり室温で振とうしながらインキュベートした。膜を適切なサイズに切断した後、これらの膜片は、抗体表に記載したように希釈した各一次抗体を含有する１０ｍＬの１／１０に希釈したＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  Ｔ２０ブロッキングバッファー中において４℃で一晩インキュベートした。
【０２２８】
翌日、洗浄バッファーを用いて４回洗浄した後、膜は１時間にわたり対応する１／５０．０００の希釈率のホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ二次抗体および１／１．０００の希釈率（１０ｍＬの１／１０に希釈したＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  Ｔ２０ブロッキングバッファー中で希釈した）の抗ビオチンとインキュベートした。洗浄バッファーを用いて４回洗浄した後、強化化学発光を用いてＨＲＰシグナルを検出してＸ線フィルムに露光させた。引き続いて、フィルムはＧｅｌ  Ｄｏｃ  ２０００を使用してスキャンし、対応するシグナルは「Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ」ソフトウエア（ＢｉｏＲａｄ）を用いて定量した。
【０２２９】
データの分析
分析設定
下流分析のために、３８４ウエルマイクロ流体カードのリアルタイムＰＣＲランをソフトウエアＲＱ  Ｍａｎａｇｅｒ  １．２．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）内に装填した。試験した患者各々については別個の試験（＊．ｓｄｍ  ｆｉｌｅｓ）を生成した。
【０２３０】
各ウエルについて、Ｃｔ値（サイクル閾値）、すなわち増幅曲線が明白にバックグラウンドを超え、指数曲線が線形位相にあるサイクル数をソフトウエアＲＱ  Ｍａｎａｇｅｒ  １．２．１において計算した。可能な場合は常に、機器の設定「Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｃｔ」を使用し、全ての手動設定は増幅プロットの検査に基づいて規定した。結果として生じるＣｔ値は、次にＣｔ  Ａｖｇ値を生成するために各サンプル／アッセイの組み合わせの３回の測定値内で平均化した。関連する変化（Ｃｔ  Ａｖｇの平均値の標準誤差に等価のＣｔ  ＳＤ）は、ソフトウエアＲＱ  Ｍａｎａｇｅｒ  １．２．１のアルゴリズムを使用して計算された。
【０２３１】
品質フィルタリング（技術的一様性）
各ウエルの生シグナル、つまり６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）シグナルおよびＲＯＸ（６−カルボキシル−Ｘ−ローダミン）シグナル（マスターミックス中に含有された受動的参照染料）を厳密に検査した。不規則性（例えば、曲線内の予想外の折れもしくはシフト）が観察された場合は常に、プロセスシグナルへの作用および結果として生じた増幅プロットをチェックした。必要な場合は、下流分析から不規則な生シグナルを備えるウエルを除外した。
【０２３２】
さらに、各サンプル／アッセイの組み合わせの３回の測定値の一様性は、Ｃｔ  ＳＤ値に基づいて評価した。Ｃｔ  ＳＤ値が＞０．２５であることが見いだされた場合は必ず、３つのウエルの増幅プロットが厳密に検査されたことを意味する品質フィルターＣｔ  ＳＤ≦０．２５を適用した。外れ値ウエル、つまり他の複製物に比較してｄＣｔ＞１が見いだされた場合は必ず、その後の分析から除外した。そのような外れ値は反応チャンバーの不十分な充填、ＰＣＲ中の不規則な工程、例えば小さな気泡の破裂または製造業者によって誘発される工場過失によって誘発される可能性がある。
【０２３３】
標的遺伝子発現が低く（例えば、Ｃｔ＞３２）、分子の出発数が極めて限定されている（分子およびｑＰＣＲアッセイに依存して、１，０００〜１０，０００コピー）場合は、確率論的作用はＰＣＲ増幅工程に優勢な影響を及ぼし、結果として可変性Ｃｔ値を生じさせる。特に＞３２のＣｔ値については、技術的反復測定の低い再現性が観察される。この理由から、高Ｃｔ値および＞０．２５のＣｔ  ＳＤを備える３つのウエルを分析から除外しなかった。しかし、それらの結果は注意を払って解釈しなければならない。
【０２３４】
Ｃｔ値が＜３２であるが、Ｃｔ  ＳＤ値は＞０．２５であって明白な外れ値を同定できなかった場合には、下流計算のために全３つのデータポイントを使用した。
【０２３５】
相対的発現レベルの計算
標的（バイオマーカー）転写産物の相対的発現レベルを計算するために、ΔΔＣｔ法を適用した。この方法は、１つ以上のハウスキーピング遺伝子の発現への標的遺伝子の遺伝子発現を標準化し、次にそれをキャリブレーター（参照）サンプルもしくは群における標的およびハウスキーピング遺伝子の遺伝子発現に関連付ける。
【０２３６】
ΔΔＣｔ法の基本概念：
第１工程では、Ａｖｇ  Ｃｔ値を作り出すためにサンプルＡ中の遺伝子の測定３回のＣｔ値を平均化した。標的遺伝子のＡｖｇ  Ｃｔ値とハウスキーピング遺伝子のＡｖｇ  Ｃｔ値との差を計算する（ΔＣｔ値）。引き続いてサンプルＡのΔＣｔ値とキャリブレーターサンプルのΔＣｔ値との差（ΔΔＣｔ値）を計算する。
【０２３７】
方程式２-ΔΔCtに基づいて、キャリブレーターサンプルに比較してサンプルＡ中の標的遺伝子の相対的発現を指示するＲＱ（相対量）値を決定する。キャリブレーターサンプルは、全標的遺伝子に対して１．０００のＲＱ値を入手する。ＲＱ値は、Ｘ倍の変化値と同等である。
【０２３８】
基礎のΔΔＣｔ計算は、ＲＱ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウエアを使用して実施した。様々な相対定量試験の結果は、ハウスキーピング遺伝子としての１８Ｓおよびキャリブレーターサンプルとしての各患者の第１サンプル（サイクル１、第１日、０時間後）を使用して計算した。
【０２３９】
数種のハウスキーピング遺伝子を実行するためのΔΔＣｔ法の修飾：
Ｒ／ＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージｄｄＣｔ（ｖ１．５．０，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｂｉｏｃ／ｈｔｍＬ／ｄｄＣｔ．ｈｔｍＬ；Ａｕｔｈｏｒｓ：Ｊｉｔａｏ  Ｄａｖｉｄ  Ｚｈａｎｇ，Ｒｕｄｏｌｆ  Ｂｉｃｚｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｒｋｕｓ  Ｒｕｓｃｈｈａｕｐｔ）は、相対的発現レベルの先進的計算のために実行した。このツールは、数種のハウスキーピング遺伝子を結合するため（およびさらに必要であれば、キャリブレーター（参照）群に数種のサンプルを統合するため）のアプローチを提供する。
【０２４０】
下記の計算工程は、ｄｄＣｔスクリプトによって実施する：
各遺伝子−サンプルの組み合わせについての技術的複製物の平均値を計算し、ＭｅａｎＣｔと呼ぶ。（ｄｄＣｔからのオリジナルの出力表では、このカラムは単純に「Ｃｔ」と呼ぶ。個々の技術的複製物のＣｔ値からより明確に識別するために、ｄｄＣｔ分析後には「ＭｅａｎＣｔ」と改名した）。
各サンプルについて全ハウスキーピング遺伝子のＭｅａｎＣｔ値の平均値を計算する。
全ハウスキーピング遺伝子のＭｅａｎＣ値の平均値は遺伝子Ｇｅｎｅ１の対応するＭｅａｎＣｔ値から減じる。生じた値をｄＣｔと呼ぶ。
遺伝子Ｇｅｎｅ１に対して、全参照サンプルのｄＣｔ値の平均値を（妥当な場合は）計算する。
結果として生じる全参照サンプルの平均ｄＣｔ値をサンプルＡ中のＧｅｎｅ１の対応するｄＣｔ値から減じる。生じた値をｄｄＣｔと呼ぶ。
各ｄｄＣｔ値に変換係数ｘ→２-xを適用する。生じた値をｅｘｐｒｓと呼ぶ。この数値は、相対的発現レベルもしくはＸ倍変化と等価である。
各数値に対して、平均値の標準誤差に基づく誤差を計算する。
この分析は、各患者に対して個別に実施した。第１サンプル（サイクル１、第１日、０時間後）を参照サンプルとして使用した。「ｅｘｐｒｓ」値は、個別サンプルについての相対的発現レベル（倍率変化値）を指示する。
【０２４１】
メジアン／平均遺伝子発現値
データ分布に依存して、メジアン値もしくは平均値のいずれかを使用するのが好ましい場合がある。患者全体にわたる発現レベルの分布が正常ではない場合には、本発明の実施例におけるように、メジアン値の方が平均値より好ましいので、可能性のある傾斜データ分布の原因となる。遺伝子発現の反復挙動を証明するために、治療期間にわたる発現レベルを示すための実施例を提示する。［図４］
【０２４２】
表５は、下記のように６００ｍｇまたは８００ｍｇの１日量でレスミノスタットメシレート塩が投与された治療第５日（サイクル１、第５日、０、２および５時間後）についてのメジアン発現レベル値を含有している。
【０２４３】
【表１１】
2016521543.tif 000012
【０２４４】
実施例３ａ：ＳＤ／ＰＤと相関させたＺＦＰ６４遺伝子発現
予後マーカーとしてのＺＦＰ６４
統計学的解析は、統計学的ソフトウエアＲ（Ｒ＿Ｃｏｒｅ＿Ｔｅａｍ，２０１２．Ｒ：Ａｌａｎｇｕａｇｅ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．［オンライン］入手先：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を使用して実施した。
【０２４５】
遺伝子ＺＦＰ６４のベースライン発現の統計学的分析（サイクル１、第１日、０時間後）は、ＺＦＰ６４のベースライン時遺伝子発現に基づくと、患者を２つの群に、つまりａ）本明細書に記載したようにＨＤＡＣ阻害剤治療の前向きの転帰を示すことが予想される患者、およびｂ）本明細書に記載したようにＨＤＡＣ阻害剤治療の前向きの転帰を示さないと予想される患者に分離できることを明らかにした。ＺＦＰ６４遺伝子発現についてのベースライン時の差は、発現レベルではなくｄＣｔ値を使用することによって検出可能である（２つの間の数学的関係については、上記の「ΔΔＣｔ法の基本概念」を参照されたい）。図５は、ＳＡＰＨＩＲＥ臨床試験からの２つの患者群のボックスプロット値を彼らの各メジアン値、四分位数値範囲（２５〜７５パーセンタイル）およびデータ範囲とともに示している。Ｗｅｌｃｈの２標本ｔ検定によると、２群間の差についてのｐ値は０．０３である。
【０２４６】
したがって、図６および７では、各プロットはＳＨＥＬＴＥＲ（ｐ値＝０．０４）およびＳＨＯＲＥ（ｐ値＝０．０６）臨床試験について示されており、ＺＦＰ６４のレスミノスタット治療下のマーカーとしての適用可能性を指示している。さらに、健常ドナーからの血液サンプルを採取し、臨床試験について上述したようにｍＲＮＡ発現を測定した。健常ドナーからのｄＣｔ値は臨床サンプルの発現範囲内にあり、安定性疾患（ＳＤ）を有する患者の各メジアン値は健常ドナーのメジアン値により近接近していた。これは、全個別試験についての図８および全試験の組み合わせとしての図９におけるボックスプロット図として示した。
【０２４７】
バイオマーカーとしてのＺＦＰ６４の予後値を考察すると、ｄＣｔ値のパーセンタイルランキングに基づいた予後診断力の３群への分離が可能である（図１０を参照）。７１パーセンタイル以上を含む範囲内のｄＣｔ値は、０．７８（９例中７例）の精度でＨＤＡＣ阻害剤治療が前向きの転帰を生じさせないことを指示する。５１パーセンタイル以下を含む範囲内のｄＣｔ値は、０．６９（１６例中１１例）の精度でＨＤＡＣ阻害剤治療の前向きの転帰を指示する。５１〜７１パーセンタイルの間の範囲内にあるが５１および７１パーセンタイルを含まないｄＣｔ値は、決定的な予後的指示を生じさせない。上述したようなｄＣｔ値のパーセンタイル範囲はＨＤＡＣ阻害剤治療を受けている全患者にわたる遺伝子発現の全分布に関する。
【０２４８】
実施例３ｂ：ＯＳ／ＰＦＳと相関させたＺＦＰ６４遺伝子発現
分割方法
実施例３ａにおける分析で見られた結果および指示に基づいて、遺伝子発現群間の分割を決定するためにベースライン時のＺＦＰ６４のｄＣｔ値を本明細書に記載した方法で処理した。データは下記のように処理した：当該の遺伝子の遺伝子発現データは、特定時点、例えば治療開始前のベースライン時についてのハウスキーピング遺伝子の発現に比較してリアルタイムＰＣＲｄＣｔ値として収集した。患者群は、相互に比較して低値および高値の２つの群に当該の遺伝子についてｄＣｔ値の既定パーセンタイル（総計すると２５パーセンタイル〜８５パーセンタイルまで、５パーセンタイルずつ）で段階的に分割した。上記の２つの群は次に、ＯＳ、ＰＦＳについての患者の確率を分離する統計的有意差を同定するために、ＯＳ、ＰＦＳに対するカプラン・マイヤー分析において比較した。
【０２４９】
図１０におけるデータおよびパーセンタイルランキングならびに上述の分割方法に基づいて、図１１および１１ｂにおいて図示して説明したように低値群および高値群を規定する。
【０２５０】
上記分割をＳＨＥＬＴＥＲ試験からのデータを例示している図１１における全生存（ＯＳ）および図１１ｂにおける無増悪生存（ＰＦＳ）を提示しているボックスプロット図に適用する。この分析は、高値群と低値群との間の統計的差を示しており、ＯＳとの相関についてのｐ値は０．０６であり、ＰＦＳとの相関についてのｐ値は０．０３であった。
【０２５１】
図１２および１２ｂに見られる上記データのカプラン・マイヤー分析は、図１１および１１ｂからの結果を反映している。図１２では、ＳＨＥＬＴＥＲ試験からの利用可能な全患者がＯＳに関する分析に含まれている。分割は図１１における分割に匹敵しており、高発現群の患者の６０％および低発現群の４０％が含まれ、対数順位検定を使用してｐ値が０．０４であると統計学的に決定された。メジアンＯＳ（高ＺＦＰ６４発現）は８カ月後（９５％ＣＩ（信頼区間）：５．６〜ＮＡ）であるが、メジアンＯＳ（低ＺＦＰ６４発現）は３．９カ月後（９５％ＣＩ：２．６〜９．９）である。
【０２５２】
図１２ｂでは、ＳＨＥＬＴＥＲ試験からの患者だけが分析に含まれているが、彼らはレスミノスタット（６００ｍｇ）またはレスミノスタット（６００ｍｇ）およびソラフェニブ（４００ｍｇ）の組み合わせのどちらかで治療された。分割に対するパーセンタイルは、各群についてのメジアン値と同様に、図１２とは相違している。メジアンＯＳ（高ＺＦＰ６４発現）は９．４カ月後（９５％ＣＩ：７．０〜２０．６）およびメジアンＯＳ（低ＺＦＰ６４発現）は５．１カ月後（９５％ＣＩ：３．３〜ＮＡ）であり、ｐ値は対数順位検定によって０．０２であると決定された。
【０２５３】
図１０と同様に、図１２および１２ｂは、同一傾向を示している。５１％〜７１％の図１０における中心部分は、図１２および１２ｂにおける分割のために使用された２つのパーセンタイル（各々６０パーセンタイルおよび７５パーセンタイル）と同一範囲内にある。より高いｄＣｔ  ＺＦＰ６４ベースライン値はより低いＺＦＰ６４  ｍＲＮＡ発現を意味し、レスミノスタットを用いた治療後のＨＣＣ患者における発達中の進行性疾患（ＰＤ）の指標であり、他方より低いｄＣｔ  ＺＦＰ６４ベースライン値（すなわち、より高いＺＦＰ６４  ｍＲＮＡ発現）は発達中の安定性疾患（ＳＤ）の指標であることを留意されたい。
【０２５４】
図１３では、レスミノスタット（６００ｍｇ）を摂取しているＳＨＥＬＴＥＲ試験からの評価可能な患者（臨床試験に参加している一部の患者は、データが欠如している、または低品質サンプルであるためにこの分析に包含することができなかった）のベースライン発現が分析されている。図示された分割は７５パーセンタイルであり、結果として低ＺＦＰ６４発現については０．９カ月のメジアンＯＳ（９５％ＣＩ：１．９〜ＮＡ）を生じさせ、高ＺＦＰ６４発現については７．０カ月のメジアンＯＳ（９５％ＣＩ：３．３〜ＮＡ）を生じさせ、対数順位検定によりｐ値は０．０５であると決定された。２群についての全メジアンＯＳは、断続線によって表示された３．７カ月である。
【０２５５】
図１４では、レスミノスタット（６００ｍｇ）＋ソラフェニブ（４００ｍｇ）の併用を摂取していたＳＨＥＬＴＥＲ試験からの評価可能な患者（上記参照）のベースライン発現が分析されている。図示された分割は７５パーセンタイルであり、結果として低ＺＦＰ６４発現については６．１カ月のメジアンＯＳ（９５％ＣＩ：０．６〜ＮＡ）を生じさせ、高ＺＦＰ６４発現については１１．１カ月のメジアンＯＳ（９５％ＣＩ：８．０〜ＮＡ）を生じさせ、対数順位検定によりｐ値は０．０７であると決定された。２群についての全メジアンＯＳは、断続線によって表示された８．３カ月である。
【０２５６】
図１５は、各々レスミノスタットまたはレスミノスタットおよびソラフェニブの組み合わせを一緒に摂取しているＳＨＥＬＴＥＲ試験からの評価可能な患者（上記参照）を示している。分割は、本明細書に記載した方法によって計算され、（図１１から明らかなように）全試験集団に基づいている。これら２つのグラフは、図１３および図１４各々に見られる傾向を本質的に反映しており、２つの群に分割するために使用された数値が異なるという事実を原因とする差しか提示していない。パーセンタイル（図１３および１４については７５ならびに図１５については６０）は、明確な転帰予測可能性の領域および根拠のある予測可能性が提示されていない領域が規定されている図１０において見られるパーセンタイルと匹敵しているので、マーカーとしてのＺＦＰ６４の適用可能性が確証された。
【０２５７】
図１６および１７は、ＳＨＥＬＴＥＲデータ分析についてこのセクションにおいて記載した方法と同一方法に基づいて、ＳＡＰＨＩＲＥデータについての分析を表している。図１６におけるボックスプロット図は、高および低ＺＦＰ６４発現への６５パーセンタイルでの分割に関して全生存率（ＯＳ）データを提示しており、これは２群間の統計的差を示し、対数順位検定によるｐ値は０．０４である。図１７は、６５パーセンタイルでのＺＦＰ６４発現の分割を示すＯＳのカプラン・マイヤー分析を示している。対数順位検定によるｐ値は０．０４である。
【０２５８】
図１８は、ＳＨＯＲＥ試験データについての各カプラン・マイヤー分析である。データは最終試験報告の前に収集されたが一部の打ち切られた患者（〇）は生存ラインの０．５比より上であるので、このため各群におけるＯＳについてのメジアン値は全患者データの最終評価後にある程度相違する可能性があった。それでも、ＣＲＣにおいてもＨＣＣおよびＨＬと同様の類似の傾向がみられ、相対的に低いＺＦＰ６４発現群はより短いＯＳを示し、相対的に高いＺＦＰ６４発現群はより長いＯＳを示した。
【０２５９】
予後マーカーとしてのＤＰＰ３
遺伝子ＤＰＰ３のベースライン発現の統計学的分析（サイクル１、第１日、０時間後）は、ＤＰＰ３のベースライン時遺伝子発現に基づくと、患者を２つの群に、つまりａ）本明細書に記載したようにＨＤＡＣ阻害剤治療の前向きの転帰を示すことが予想される患者、およびｂ）本明細書に記載したようにＨＤＡＣ阻害剤治療の前向きの転帰を示さないと予想される患者に分離できることを明らかにした。ＤＰＰ３ベースライン遺伝子発現での差はｄＣｔ値を使用すると検出できるが、発現レベルは検出できない。図１９が図示している各メジアン値、四分位間範囲（２５〜７５パーセンタイル）およびデータ範囲を含む２つの患者群のボックスプロット値を示している。差についての両側ｐ値は、Ｗｅｌｃｈの２標本ｔ検定によると０．０３である。バイオマーカーとしてのＤＰＰ３の予後値を考察すると、ｄＣｔ値のパーセンタイルランキングに基づいて予後診断力の３群への分離を実施する（図２０を参照）。
【０２６０】
５９パーセンタイル以上を含む範囲内のｄＣｔ値は、０．６９（１３例中９例）の精度でＨＤＡＣ阻害剤治療が前向きの転帰を生じさせないことを指示する。５２パーセンタイル以下を含む範囲内のｄＣｔ値は、０．６４（１７例中１１例）の精度でＨＤＡＣ阻害剤治療の前向きの転帰を指示する。５２〜５９パーセンタイルの間の範囲内にあるが５２および５９パーセンタイルを含まないｄＣｔ値は、決定的な予後的指示を生じさせない。上述したようなｄＣｔ値のパーセンタイル範囲はＨＤＡＣ阻害剤治療を受けている全患者にわたる遺伝子発現の全分布に関する。
【０２６１】
レスミノスタットの投与が癌細胞系、健常ドナーＰＢＭＣｓおよび全血細胞ならびにＳＨＥＬＴＥＲ、ＳＡＰＨＩＲＥおよびＳＨＯＲＥ臨床試験における患者から採取された全血細胞におけるＺＦＰ６４遺伝子発現のダウンレギュレーションを導くことが証明されている。臨床試験におけるベースライン時の相対遺伝子発現（サイクル１、第１日、０時間後）は、レスミノスタット治療下にある患者にとっての臨床転帰、つまり進行性疾患（ＰＤ）もしくは少なくとも安定性疾患または均一応答性疾患（ＳＤ）の評価の指標である。癌患者においてベースライン時（治療開始前）に測定されたより高いＺＦＰ６４発現レベルは、レスミノスタットを用いた治療後のより大きな臨床的有益性（ＰＤ対ＳＤ、ＰＦＳおよびＯＳ時間の増加）の指標である。さらに、およびより適切には、ベースライン時の上記相対遺伝子発現はさらにまた、既定の相対的に高いおよび相対的に低い発現群間の統計的に重要な差を示しているレスミノスタット治療下の患者の無増悪生存率（ＰＦＳ）および／または全生存（ＯＳ）についての指標である。
【０２６２】
細胞および全血実験は、レスミノスタットの遺伝子調節作用がソラフェニブによる影響を受けないことを証明している。レスミノスタットおよびソラフェニブの組み合わせは、レスミノスタット単独についてのダウンレギュレーションに比較してＺＦＰ６４遺伝子発現のダウンレギュレーションの匹敵する数値を示している。
【０２６３】
ＺＦＰ６４は、レスミノスタット活性についての薬力学マーカーである。
【０２６４】
ＺＦＰ６４は、レスミノスタット応答についての予後ならびに予測バイオマーカーを表した。さらに、ＺＦＰ６４は患者層別化のための比較診断を開発する機会を提供する。
【０２６５】
図についての生データ（表の番号は各図の番号と同等である）。
【０２６６】
【表１２】
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【０２６７】
【表１３】
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【０２６８】
【表１４】
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【０２６９】
【表１５】
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【０２７０】
【表１６】
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【０２７１】
【表１７】
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【０２７２】
【表１８】
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【０２７３】
【表１９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2016521543.tif 000048
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