(57)【要約】本発明は、少なくとも１つの変異（例えばＬＤＬＲシグナル促進変異）を含んでなる、低密度リポタンパク質受容体をコードするポリヌクレオチド分子を調製し、製造し、および治療的に使用するための組成物および方法に関する。
2016538829.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）をコードするポリヌクレオチドであって、前記ＬＤＬＲが、ＥＧＦ−Ａドメイン、細胞内ドメイン、およびＥＧＦ−ドメインと細胞内ドメインとの両方からなる群から選択されるドメイン中に、少なくとも１つの変異を含み、
前記ポリヌクレオチドが、
（ａ）配列番号３７〜５５および７２４〜７２９からなる群から選択される目的のポリペプチドをコードする、連結ヌクレオシドの第１の領域；
（ｂ）少なくとも１つの５’末端キャップを含む、前記第１の領域に対して５’に位置する第１の隣接領域；
（ｃ）連結ヌクレオシドの３’テーリング配列を含む、前記第１の領域に対して３’に位置する第２の隣接領域
を含み、前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの化学修飾ヌクレオシドを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記連結ヌクレオシドの第１の領域が、少なくとも核酸配列のオープンリーディングフレームを含み、前記核酸配列が、配列番号５６〜７１８および７３２〜７３７からなる群から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記目的のポリペプチドが、少なくとも２つの変異を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記少なくとも２つの変異が、前記細胞内ドメインに位置する、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記２つの変異が、Ｋ８１６Ｒ、Ｋ８３０Ｒ、およびＣ８３９Ａからなる群から選択される、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記２つの変異が、Ｋ８３０ＲおよびＣ８３９Ａである、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記目的のポリペプチドが、前記細胞内ドメインに３つの変異を含み、かつ前記３つの変異が、Ｋ８１６Ｒ、Ｋ８３０Ｒ、およびＣ８３９Ａである、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記目的のポリペプチドが、前記ＥＧＦ−Ａドメインに１つの変異、および前記細胞内ドメインに少なくとも２つの変異を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ＥＧＦ−Ａドメイン中の前記１つの変異が、Ｎ３１６ＡおよびＬ３３９Ｄからなる群から選択され、かつ前記細胞内ドメイン中の前記少なくとも２つの変異が、Ｋ８１６Ｒ、Ｋ８３０Ｒ、およびＣ８３９Ａからなる群から選択される、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記ＥＧＦ−Ａドメイン中の前記１つの変異がＮ３１６Ａであり、かつ前記細胞内ドメインが前記Ｋ８３０ＲおよびＣ８３９Ａ変異を含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記ＥＧＦ−Ａドメイン中の前記１つの変異がＮ３１６Ａであり、かつ前記細胞内ドメインが前記Ｋ８１６Ｒ、Ｋ８３０Ｒ、およびＣ８３９Ａ変異を含む、請求項９に記載のポ
リヌクレオチド。
【請求項１２】
前記ＥＧＦ−Ａドメイン中の前記１つの変異がＬ３３９Ｄであり、かつ前記細胞内ドメインが前記Ｋ８３０ＲおよびＣ８３９Ａ変異を含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記ＥＧＦ−Ａドメイン中の前記１つの変異がＬ３３９Ｄであり、かつ前記細胞内ドメインが前記Ｋ８１６Ｒ、Ｋ８３０Ｒ、およびＣ８３９Ａ変異を含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記ドメインが前記細胞内ドメインであり、および前記少なくとも１つの変異が、ＩＤＯＬがＬＤＬＲを分解するのを妨げる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの化学修飾ヌクレオシドが、表５の修飾から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記表５の修飾がウリジン修飾である、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記表５の修飾がシチジン修飾である、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドが、２つの化学修飾ヌクレオシドを含む、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
第１の前記化学修飾ヌクレオシドがウリジンであり、第２の前記化学修飾ヌクレオシドがシトシンである、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
対象の血漿中のコレステロールレベルを調節する方法であって、前記対象を請求項１〜１９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含む組成物に接触させるステップを含む、方法。
【請求項２１】
細胞表面のＬＤＬＲのレベルまたは量を増大させる方法であって、前記対象を請求項１〜１９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含む組成物に接触させるステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異などの少なくとも１つの変異を含んでなる、低密度リポタンパク質受容体をコードするポリヌクレオチドを設計、調製、製造および／または製剤化するための、組成物、方法、工程、キット、および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
高コレステロールは、心臓麻痺および脳卒中のいくつかのリスク因子の１つである。質の悪い食生活と運動不足が高コレステロールの一般的な原因であるが、ＬＤＬＲ欠乏によって引き起こされる家族性高コレステロール血症（ＦＨ：ｆａｍｉｌｉａｌ  ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）などの遺伝的変化は、高コレステロールの原因であり得る。いくつかのコレステロール低下薬が、目下市場に出ているが、それらはリスク、あるいは特定の病状またはその他の薬剤との禁忌なしではない。このような薬剤としては、脂肪吸収を妨げ、コレステロール吸収を低下させ、またはコレステロール輸送経路中の遺伝子を標的とする、スタチン、フィブラート、ナイアシン、胆汁酸捕捉剤（樹脂）、フィトステロール、あるいはその他の化合物が挙げられる。
【０００３】
核酸ベースのコレステロール低下薬としては、例えば、ホモ接合型家族性高コレステロール血症（ＦＨ）の治療のために２０１３年１月に認可された、ＡｐｏＢ−１００を標的とする、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤ミポメルセンが挙げられる。２０１２年の１２月に、ＦＤＡは、同じ病状のためにロミタピドもまた認可した。
【０００４】
より問題となるのは、コレステロール標的化薬剤と関連付けられている、肝臓に関わる問題、特に血清トランスアミナーゼの上昇と、肝臓脂肪蓄積（または肝臓脂肪症）である。例えば、ミポメルセンを取り巻く潜在的に重大な安全上の懸念の理由から、薬剤は、枠で囲まれた肝臓毒性に関する警告文を有し、処方者および薬局の認定、ならびに各新規処方箋と共に薬剤が適切に使用されていることの文書化を要する。ミポメルセンは、ＬＤＬコレステロールの低下に概して有効であった（臨床試験において、過半数の患者はＬＤＬレベルに２０％を超える低下を有し、ホモ接合型ＦＨ試験ではＬＤＬが２４．７％低下した）一方で、典型的なＦＨ患者は４００〜１０００ｍｇ／ｄＬの平均ＬＤＬを有した。結果的に、これらの患者では、低下はおそらく十分でなかった。加えて、当然のことながら薬剤の究極的な意図される効果は、心臓血管系の利点であったが、試験は、心臓血管系予後を評価するには規模が十分でなかった。さらに、第３相試験で、ミポメルセン群において、心臓障害の重篤有害事象が出現した。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】その内容が参照により本明細書に援用される、２０１３年３月９日に出願された同一譲受人の同時係属米国特許出願第１３／７９１，９２２号明細書に教示される、ＩＶＴポリヌクレオチドコンストラクトの概略図。
【図２】ＩＶＴポリヌクレオチドコンストラクトの概略図。
【図３】本発明の一連のキメラポリヌクレオチドの概略図。
【図４】位置的修飾の様々なパターンを例示して、ｍＲＮＡポリヌクレオチドのこれらの領域と類似する領域を示す、一連のキメラポリヌクレオチドの概略図。
【図５】式Ｉをベースとする位置的修飾の様々なパターンを例示する、一連のキメラポリヌクレオチドの概略図。
【図６】式Ｉをベースとする位置的修飾の様々なパターンを例示して、ブロックされまたは構造化された３’末端をさらに例示する、一連のキメラポリヌクレオチドの概略図。
【図７】本発明の環状ポリヌクレオチドコンストラクトの概略図。
【図８】本発明の環状ポリヌクレオチドコンストラクトの概略図。
【図９】少なくとも１つのスペーサー領域を含んでなる、本発明の環状ポリヌクレオチドコンストラクトの概略図。
【図１０】少なくとも１つのセンサー領域を含んでなる、本発明の環状ポリヌクレオチドコンストラクトの概略図。
【図１１】少なくとも１つのセンサー領域と、スペーサー領域とを含んでなる、本発明の環状ポリヌクレオチドコンストラクトの概略図。
【図１２】本発明の非コード環状ポリヌクレオチドコンストラクトの概略図。
【図１３】本発明の非コード環状ポリヌクレオチドコンストラクトの概略図。
【図１４】ＬＤＬＲの構造を示す、ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）ら著、ネイチャー・レビューズ・ドラッグ・ディスカバリー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）、２００８年１月、第７巻、ｐ８４〜９９からの図。
【図１５】ＬＤＬＲの機能を示す、ダニエルズ（Ｄａｎｉｅｌｓ）ら著、インターナショナル・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・サイエンシズ（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ）、２００９年、第５巻、第５号、ｐ４７４〜４８８からの図。
【図１６】ＬＤＬＲ（野性型ＬＤＬＲまたは様々なＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異を有するＬＤＬＲ）をコードする、本発明の様々なポリヌクレオチドで形質移入された、ＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリープロット。
【図１７】ＰＣＳＫ９存在下または不在下における、ＬＤＬＲ（野性型ＬＤＬＲまたは様々なＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異を有するＬＤＬＲ）をコードする、本発明の様々なポリヌクレオチドで形質移入された、ＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリープロット。
【図１８Ａ】様々なＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異を有するＬＤＬＲをコードする修飾ｍＲＮＡなどの、ＬＤＬＲをコードする本発明の様々なポリヌクレオチドで形質移入された細胞のフローサイトメトリープロットであり、図１８Ａは、ボディパイ（ＢＯＤＩＰＹ）−ＬＤＬのＬＤＬＲ  ｍＲＮＡ形質移入細胞への結合の等高線図を示す図。
【図１８Ｂ】様々なＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異を有するＬＤＬＲをコードする修飾ｍＲＮＡなどの、ＬＤＬＲをコードする本発明の様々なポリヌクレオチドで形質移入された細胞のフローサイトメトリープロットであり、図１８Ｂは、ボディパイ−ＬＤＬの最大半量細胞結合を示す図。
【図１９Ａ】ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡによる形質移入後の半減期に対する効果を示しており、図１９Ａは、野生型ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡを示す図。
【図１９Ｂ】ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡによる形質移入後の半減期に対する効果を示しており、図１９Ｂは、４つの変異（Ｎ３１６Ａ、Ｅ３１７Ａ、Ｄ３３１Ａ、およびＹ３３６Ａ）があるＬＤＬＲをコードするＬＤＬＲ  ｍＲＮＡを示す図。
【図１９Ｃ】ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡによる形質移入後の半減期に対する効果を示しており、図１９Ｃは、１つのＹ３３６Ａ変異があるＬＤＬＲをコードするＬＤＬＲ  ｍＲＮＡを示す図。
【図１９Ｄ】ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡによる形質移入後の半減期に対する効果を示しており、図１９Ｄは、１つのＥ３１７Ａ変異があるＬＤＬＲをコードするＬＤＬＲ  ｍＲＮＡを示す図。
【図１９Ｅ】ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡによる形質移入後の半減期に対する効果を示しており、図１９Ｅは、１つのＮ３１６Ａ変異があるＬＤＬＲをコードするＬＤＬＲ  ｍＲＮＡを示す図。
【図１９Ｆ】ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡによる形質移入後の半減期に対する効果を示しており、図１９Ｆは、１つのＬ３３９Ｄ変異があるＬＤＬＲをコードするＬＤＬＲ  ｍＲＮＡを示す図。
【図１９Ｇ】ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡによる形質移入後の半減期に対する効果を示しており、図１９Ｇは、１つのＤ３３１Ｅ変異があるＬＤＬＲをコードするＬＤＬＲ  ｍＲＮＡを示す図。
【図２０】ＰＣＳＫ９の量を変化させた場合における、細胞表面ＬＤＬＲ発現に対する効果を示す図。
【図２１】ＬＤＬＲ発現のゲルプロファイルを示す図。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異などの少なくとも１つの変異を含んでなる、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することで、ＬＤＬＲ分解の問題に対処する。本発明は、例えば、構造的および機能的統合性を保ちながら、核酸ベースの治療薬を最適化し、発現閾値を克服し、発現速度、半減期および／またはタンパク質濃度を改善し、タンパク質局在を最適化し、免疫応答および／または分解経路などの有害生物応答を回避するのに有用な特性などの、当該技術分野の問題の１つまたは複数を回避する構造的および／または化学的特性を有する、核酸ベースの化合物またはポリヌクレオチド（コードおよび非コードの両方、ならびにそれらの組み合わせ）を提供することで、この必要性に対処する。これらの障壁は、本発明を使用することで低下または排除されてもよい。
【０００７】
例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異などの少なくとも１つの変異を含んでなる、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ：ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）をコードするポリヌクレオチドを設計、調製、製造および／または製剤化するための、組成物、方法、工程、キット、および装置が、本明細書に記載される。非限定的な実施形態では、このようなポリヌクレオチドは、目的の１つまたは複数のペプチドまたはポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡ分子の形態を取るか、またはそれとして機能する。一実施形態では、このようなポリヌクレオチドは、実質的に非コードである。
【０００８】
本明細書で提供されるのは、ＬＤＬＲをコードするポリヌクレオチドである。一態様では、ポリヌクレオチドは、天然および非天然起源ヌクレオシドなどの、本明細書で開示される少なくとも１つの化学修飾ヌクレオシドを含んでなる。
【０００９】
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、例えば、連結ヌクレオシドの第１の領域、第１の領域に対して５’に位置する第１の隣接領域、および第１の領域に対して３’に位置する第２の隣接領域を含んでなるＬＤＬＲの発現のための、ＩＶＴポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドである。第１の領域は、例えば配列番号３７〜５５などであるがこれに限定されるものではないＬＤＬＲをコードする目的のポリペプチドをコードしてもよい。連結ヌクレオシドの第１の領域は、少なくとも１つの核酸配列のオープンリーディングフレームを含んでなってよく、例えば配列番号５６〜７１８であるが、これに限定されるものではない。
【００１０】
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、例えば、連結ヌクレオシドの第１の領域、第１の領域に対して５’に位置する第１の隣接領域、および第１の領域に対して３’に位置する第２の隣接領域を含んでなるＬＤＬＲの発現のための、ＩＶＴポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドである。第１の領域は、例えば配列番号３７〜５５などであるがこれに限定されるものではないＬＤＬＲをコードする目的のポリペプチドをコードしてもよい。連結ヌクレオシドの第１の領域は、少なくとも１つの核酸配列のオープンリーディ
ングフレームを含んでなってよく、例えば配列番号５６〜７１８などであるが、これに限定されるものではない。
【００１１】
一実施形態では、例えば、本明細書に記載されるＩＶＴポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドは、例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異などの少なくとも２つの変異を含んでなる、目的のポリペプチドをコードしてもよい。変異は、細胞内ドメイン、ＥＧＦ−Ａドメイン、または細胞内ドメインとＥＧＦ−Ａドメインとの両方に位置してもよい。非限定的例として、目的のポリペプチドは、Ｋ８３０ＲおよびＣ８３９Ａなどの、細胞内ドメイン上の２つの変異を含んでなる。別の非限定的例として、目的のポリペプチドは、Ｋ８１６Ｒ、Ｋ８３０Ｒ、およびＣ８３９Ａなどの細胞内ドメイン上の３つの変異を含んでなる。
【００１２】
別の実施形態では、例えば、本明細書に記載されるＩＶＴポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドは、例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異などのＥＧＦ−Ａドメイン上の１つの変異、および細胞内ドメイン上の少なくとも２つの変異を含んでなる、目的のポリペプチドをコードしてもよい。ＥＧＦ−Ａドメイン上の変異は、Ｎ３１６ＡおよびＬ３３９Ｄであってもよいが、これに限定されるものではなく、細胞内ドメイン上の変異は、Ｋ８１６Ｒ、Ｋ８３０Ｒ、およびＣ８３９Ａであってもよいが、これに限定されるものではない。非限定的例として、目的のポリペプチドは、ＥＧＦ−Ａドメイン上のＮ３１６Ａ変異と、細胞内ドメイン上のＫ８３０ＲおよびＣ８３９Ａ変異とを含んでなってもよい。別の非限定的例として、目的のポリペプチドは、ＥＧＦ−Ａドメイン上のＮ３１６Ａ変異と、細胞内ドメイン上のＫ８１６Ｒ、Ｋ８３０Ｒ、およびＣ８３９Ａ変異とを含んでなってもよい。非限定的例として、目的のポリペプチドは、ＥＧＦ−Ａドメイン上のＬ３３９Ｄ変異と、細胞内ドメイン上のＫ８３０ＲおよびＣ８３９Ａ変異とを含んでなってもよい。別の非限定的例として、目的のポリペプチドは、ＥＧＦ−Ａドメイン上のＬ３３９Ｄ変異と、細胞内ドメイン上のＫ８１６Ｒ、Ｋ８３０Ｒ、およびＣ８３９Ａ変異とを含んでなってもよい。
【００１３】
一実施形態では、第１の隣接領域は、５’非翻訳領域（ＵＴＲ：ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）の特性を有する連結ヌクレオシド配列を含んでなってよく、例えば、配列番号３７〜５５のいずれかをコードする核酸のいずれかの天然５’ＵＴＲ、配列番号３〜１９、およびそれらの機能的変異型などであるが、これに限定されるものではない。一態様では、第１の隣接領域は、構造ＵＴＲであってもよい。第１の隣接領域はまた、、少なくとも１つの５’末端キャップを含んでなってもよく、例えば、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、２−アジド−グアノシン、Ｃａｐ２、およびＣａｐ４などであるが、これに限定されるものではない。
【００１４】
一実施形態では、第２の隣接領域は、３’ＵＴＲの特性を有する連結ヌクレオシド配列を含んでなってもよく、例えば、配列番号３７〜５５のいずれかをコードする核酸のいずれかの天然３’ＵＴＲ、配列番号２０〜３６、およびそれらの機能的変異型などであるが、これに限定されるものではない、。第２の隣接領域はまた、連結ヌクレオシドの３’テーリング配列を含んでなってもよく、例えば、少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡテール、ポリＡ〜Ｇカルテット、およびステムループ配列などであるが、これに限定されるものではない。
【００１５】
一実施形態では、例えば、ＩＶＴポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドは、表５に
列挙される修飾などであるがこれに限定されるものではない少なくとも１つの化学修飾ヌクレオシドを含んでなってもよく、例えば、ウリジン修飾、シチジン修飾、グアノシン修飾、アデノシン修飾および／またはチミジン修飾などであるが、これに限定されるものではない。別の実施形態では、例えば、ＩＶＴポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドは、２つの化学修飾ヌクレオシドを含んでなる。２つの化学修飾ヌクレオシドは、ウリジン修飾、シチジン修飾、グアノシン修飾、アデノシン修飾および／またはチミジン修飾などであるが、これに限定されるものではない、表５に列挙される修飾であってもよい。さらに別の実施形態では、例えば、ＩＶＴポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドは、３つの化学修飾ヌクレオシドを含んでなってもよい。
【００１６】
例えば、本発明のＩＶＴポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドは、精製されていてもよい。
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、例えば、ＬＤＬＲをコードするキメラポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドであり、例えば、キメラポリヌクレオチドであるポリヌクレオチドは、式Ｉ、
５’［Ａｎ］ｘ−Ｌ１−［Ｂｏ］ｙ−Ｌ２−［Ｃｐ］ｚ−Ｌ３  ３’
Ｉ
を含んでなる配列を有し、
式中、
ＡおよびＢは、それぞれ独立して連結ヌクレオシド領域を含んでなり；
Ｃは、連結ヌクレオシドの任意選択の領域であり；
領域Ａ、Ｂ、またはＣの少なくとも１つは、位置的に修飾され；
ｎ、ｏ、およびｐは、独立して１５〜１０００の整数であり；
ｘおよびｙは、独立して１〜２０であり；
ｚは０〜５であり；
Ｌ１およびＬ２は、独立して任意選択のリンカー部分であり、前記リンカー部分は、核酸ベースまたは非核酸ベースのいずれかであり；および
Ｌ３は、任意選択のコンジュゲートまたは任意選択のリンカー部分であり、前記リンカー部分は、核酸ベースまたは非核酸ベースのいずれかである。
【００１７】
一実施形態では、位置Ａ、ＢまたはＣは位置的に修飾されており、位置的に修飾された領域は、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、またはウリジンの同一ヌクレオシドタイプの１つまたは複数の少なくとも２つの化学修飾ヌクレオシドを含んでなり、同一タイプのヌクレオシドの少なくとも２つの化学修飾は、異なる化学修飾である。一態様では、同一ヌクレオチドタイプは、２、３または４つまたはそれを超える同一ヌクレオシドタイプなどの、表５に記載されるウリジン、アデノシン、チミジン、シチジンまたはグアノシン修飾のいずれかであってもよい。非限定的例として、同一ヌクレオシドタイプの２つは、ウリジンおよびシチジンから選択される。別の非限定的例として、化学修飾は、全て天然起源または全て非天然起源であってもよい。
【００１８】
一実施形態では、例えば、本明細書に記載されるキメラポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドは、少なくとも２つの変異を含んでなる、目的のポリペプチドをコードしてもよい。変異は、細胞内ドメイン、ＥＧＦ−Ａドメイン、または細胞内ドメインとＥＧＦ−Ａドメインとの両方に位置してもよい。非限定的例として、目的のポリペプチドは、Ｋ８３０ＲおよびＣ８３９Ａなどの、細胞内ドメイン上の２つの変異を含んでなる。別の非限定的例として、目的のポリペプチドは、Ｋ８１６Ｒ、Ｋ８３０Ｒ、およびＣ８３９Ａなどの細胞内ドメイン上の３つの変異を含んでなる。
【００１９】
別の実施形態では、例えば、本明細書に記載されるキメラポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドは、ＥＧＦ−Ａドメイン上の１つの変異と、細胞内ドメイン上の少なくとも
２つの変異とを含んでなる、目的のポリペプチドをコードしてもよい。ＥＧＦ−Ａドメイン上の変異は、Ｎ３１６ＡおよびＬ３３９Ｄであってもよいが、これに限定されるものではなく、細胞内ドメイン上の変異は、Ｋ８１６Ｒ、Ｋ８３０Ｒ、およびＣ８３９Ａであってもよいが、これに限定されるものではない。非限定的例として、目的のポリペプチドは、ＥＧＦ−Ａドメイン上のＮ３１６Ａ変異と、細胞内ドメイン上のＫ８３０ＲおよびＣ８３９Ａ変異とを含んでなってもよい。別の非限定的例として、目的のポリペプチドは、ＥＧＦ−Ａドメイン上のＮ３１６Ａ変異と、細胞内ドメイン上のＫ８１６Ｒ、Ｋ８３０Ｒ、およびＣ８３９Ａ変異とを含んでなってもよい。非限定的例として、目的のポリペプチドは、ＥＧＦ−Ａドメイン上のＬ３３９Ｄ変異と、細胞内ドメイン上のＫ８３０ＲおよびＣ８３９Ａ変異とを含んでなってもよい。別の非限定的例として、目的のポリペプチドは、ＥＧＦ−Ａドメイン上のＬ３３９Ｄ変異と、細胞内ドメイン上のＫ８１６Ｒ、Ｋ８３０Ｒ、およびＣ８３９Ａ変異とを含んでなってもよい。
【００２０】
一実施形態では、Ａの連結ヌクレオシド領域の少なくとも１つは、配列番号３７〜５５のいずれかをコードする核酸のいずれかの天然５’ＵＴＲ、配列番号３〜１９、およびそれらの機能的変異型などであるが、これに限定されるものではない、連結ヌクレオシド配列を含んでなってもよい。
【００２１】
別の実施形態では、Ａの連結ヌクレオシド領域の少なくとも１つは、キャップ領域である。キャップ領域は、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、２−アジド−グアノシン、Ｃａｐ２、およびＣａｐ４などであるが、これに限定されるものではない、少なくとも１つのキャップを含んでなってもよい。
【００２２】
一実施形態では、Ｃの連結ヌクレオシド領域の少なくとも１つは、配列番号３７〜５５のいずれかをコードする核酸のいずれかの天然３’ＵＴＲ、配列番号２０〜３６、およびそれらの機能的変異型などであるが、これに限定されるものではない、連結ヌクレオシド配列を含んでなってもよい。
【００２３】
一実施形態では、Ｃの連結ヌクレオシド領域の少なくとも１つは、ポリＡテール領域である。
一実施形態では、Ｂの連結ヌクレオシド領域の少なくとも１つは、配列番号５６〜７１８などであるが、これに限定されるものではない、核酸配列の少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含んでなる。
【００２４】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、２つの領域にわたってコードされる。
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドの領域Ｂまたは領域Ｃは、位置的に修飾され、ポリペプチドは、完全に領域Ａ内でコードされる。
【００２５】
別の実施形態では、領域Ａまたは領域Ｃは位置的に修飾され、ポリペプチドは、完全に領域Ｂ内でコードされる。
一実施形態では、領域Ａ、ＢまたはＣの少なくとも１つは、ヒト細胞内の発現のためにコドン最適化されてもよい。
【００２６】
別の実施形態では、コドン最適化領域の全体的なＧ：Ｃ含有量は、コドン最適化前のＧ：Ｃ含有量以下であってもよい。
本明細書に記載されるキメラポリヌクレオチドはまた、環状であってもよい。
【００２７】
本明細書で提供されるのは、ＬＤＬＲをコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つ
と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる組成物である。薬学的に許容可能な賦形剤は、溶剤、水性溶剤、非水性溶剤、分散媒、希釈剤、分散体、懸濁補助剤、表面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存料、脂質、リピドイド  リポソーム、脂質ナノ粒子、コア−シェルナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、およびそれらの混合物であってもよいが、これに限定されるものではない。非限定的例として、薬学的に許容可能な賦形剤は脂質であり、脂質は、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ｒｅＬＮＰ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＤＭＡ、およびＰＥＧ化脂質、ならびにそれらの混合物から選択されてもよい。
【００２８】
本発明の様々な実施形態の詳細は、以下の説明に記載される。本発明のその他の特徴、目的、および利点は、説明と図面から、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００２９】
前述の事項およびその他の目的、特徴、および利点は、異なる図全体にわたり、同様の参照文字が同一部分を指す添付図面で例示されるように、以下の本発明の特定の実施形態の説明から明らかになるであろう。図面は必ずしも一定の縮尺でなく、むしろ重点は、本発明の様々な実施形態の原理を例示することに置かれる。
【００３０】
（詳細な説明）
細胞、組織または臓器、および究極的には生物にとって有益な生理学的な成果をもたらすために、試験管内（インビトロ）、生体内（インビボ）、原位置(ｉｎ  ｓｉｔｕ）ま
たは生体外(ｅｘ  ｖｉｖｏ）を問わず、例えば、リボ核酸（ＲＮＡ：ｒｉｂｏｎｕｃｌ
ｅｉｃ  ａｃｉｄ）などの核酸を設計し、合成して細胞内部に送達できることは、治療薬、診断薬、試薬分野で、および生物学的アッセイにとって、大きな関心事である。１つの有益な成果は、核酸の細胞内翻訳、および少なくとも１つのコードされる目的のペプチドまたはポリペプチドの生成を引き起こすことである。同様に、非コードＲＮＡは、多くの研究の焦点となっており；非コードポリヌクレオチドの使用は、単独で、およびコードポリヌクレオチドとの併用で、治療シナリオに有益な成果を提供し得る。
【００３１】
本明細書には、ポリヌクレオチド、特に、ＩＶＴポリヌクレオチド、キメラポリヌクレオチドおよび／または環状ポリヌクレオチドの設計、調製、製造および／または製剤化のための組成物（医薬組成物を含む）および方法が記載される。
【００３２】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドを選択、設計および／または使用するためのシステム、工程、装置、およびキットもまた提供される。
本発明によって、ポリヌクレオチドは、好ましくは、当該技術分野におけるその他の分子の欠損を回避する方法で修飾される。
【００３３】
ヒト疾患、抗体、ウイルス、獣医学用途の分野および多様なインビボの状況における、ポリヌクレオチドをコードする修飾ポリヌクレオチド（すなわち修飾ｍＲＮＡ）などのポリヌクレオチドの使用は、以前、調査されており、これらの研究は、例えば、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国仮特許出願第６１／６１８，８６２号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６４５号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１３０号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８６６号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６４７号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１３４号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８６８号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６４８号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１３５号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８７３号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６５０号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１４７号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８７８号明細書
、米国仮特許出願第６１／６８１，６５４号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１５２号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８８５号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６５８号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１５５号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８９６号明細書、米国仮特許出願第６１／６６８，１５７号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６６１号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１６０号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，９１１号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６６７号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１６８号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，９２２号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６７５号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１７４号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，９３５号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６８７号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１８４号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，９４５号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６９６号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１９１号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，９５３号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，７０４号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，２０３号明細書の表６、米国仮特許出願第６１／６８１，７２０号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，２１３号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，７４２号明細書の表６および７；国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６８号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６３号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６９号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６７０号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６４号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６５号パンフレット、国際公開第２０１３１５１７３６号パンフレットの表６；国際公開第２０１３１５１６７２号パンフレットの表６および７；国際公開第２０１３１５１６７１号パンフレットの表６、１７８、および１７９；米国仮特許出願第６１／６１８，８７０号明細書の表６、２８、および２９；米国仮特許出願第６１／６８１，６４９号明細書の表６、５６、および５７；米国仮特許出願第６１／７３７，１３９号明細書の表６、１８６、および１８７；国際公開第２０１３１５１６６７号パンフレットの表６、１８５、および１８６に列挙されるもので開示される。前述のいずれもＩＶＴポリヌクレオチド、キメラポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドとして合成されることができ、このような実施形態は本発明によって検討される。
【００３４】
したがって、本明細書で提供されるのは、組織内安定性および／またはクリアランス、受容体取り込みおよび／または動態、細胞アクセス、翻訳機構との関わり、ｍＲＮＡ半減期、翻訳効率、免疫回避、タンパク質生成能力、分泌効率（当てはまる場合）、循環へのアクセスしやすさ、タンパク質半減期、および／または細胞の状態、機能、および／または活性の調節など、当該技術分野における１つまたは複数の問題を改善するように設計された、ポリヌクレオチドである。
【００３５】
一態様では、本発明は、ＬＤＬＲをコードするポリヌクレオチドを提供する。例示的な実施形態では、ＬＤＬＲをコードする本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの変異を含んでなる。例示的な実施形態では、ＬＤＬＲをコードする本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異（例えば、細胞表面のＬＤＬＲ滞留時間増大または細胞表面のＬＤＬＲレベル増大）を含んでなる。当業者には理解されるように、例えば、所望の生物学的または治療的成果を得るための、細胞表面受容体の活性および／または発現の調節などの細胞表面受容体の調節は、かなり困難であり得る。具体的には、複雑な細胞表面受容体の発現調節（例えば増大）は、特にインビボでそれを行おうとする場合に、困難であり得る。本発明は、ポリヌクレオチド、例えば修飾ｍＲＮＡであって、特にインビボ送達に適したものの使用を特徴とする。本発明の修飾ｍＲＮＡは、例えば、多様な生物学的および／または治療的状況における、生物活性ＬＤＬＲの発現促進を容易にするように設計されている。
【００３６】
Ｉ．発明の組成物
ポリヌクレオチド
本発明は、いくつかの実施形態では１つまたは複数の目的のペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸分子、特に、ポリヌクレオチドを提供する。「核酸」という用語は、その最も広い意味では、ヌクレオチドのポリマーを含んでなる、任意の化合物および／または物質を含む。これらのポリマーは、ポリヌクレオチドと称されることが多い。
【００３７】
代表的核酸または本発明のポリヌクレオチドとしては、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ：ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、トレオース核酸（ＴＮＡ：ｔｈｒｅｏｓｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、グリコール核酸（ＧＮＡ：ｇｌｙｃｏｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ：ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ロックド核酸（β−Ｄ−リボ立体配置を有するＬＮＡ、α−Ｌ−リボ立体配置を有するα−ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’−アミノ官能基化を有する２’−アミノ−ＬＮＡ、および２’−アミノ官能基化を有する２’−アミノ−α−ＬＮＡを含む、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ））、エチレン核酸（ＥＮＡ：ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ：ｃｙｃｌｏｈｅｘｅｎｙｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、もしくはそれらのハイブリッドまたは組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３８】
一実施形態では、試験管内（インビトロ）転写（ＩＶＴ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）酵素合成法のみを使用して製造される本発明のポリヌクレオチドは、「ＩＶＴポリヌクレオチド」と称される。ＩＶＴポリヌクレオチドを製造する方法は、当該技術分野で公知であり、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国仮特許出願第６１／６１８，８６２号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６４５号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１３０号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８６６号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６４７号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１３４号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８６８号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６４８号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１３５号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８７３号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６５０号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１４７号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８７８号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６５４号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１５２号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８８５号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６５８号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１５５号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８９６号明細書、米国仮特許出願第６１／６６８，１５７号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６６１号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１６０号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，９１１号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６６７号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１６８号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，９２２号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６７５号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１７４号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，９３５号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６８７号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１８４号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，９４５号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６９６号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１９１号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，９５３号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，７０４号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，２０３号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８７０号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６４９号明細書、および米国仮特許出願第６１／７３７，１３９号明細書；および国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６７号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６８号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６３号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６９号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６７０号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６４号
パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６５号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６７１号パンフレット、および国際公開第２０１３１５１７３６号パンフレットに記載される。
【００３９】
別の実施形態では、サイズおよび／または化学修飾パターン、化学修飾位置、化学修飾パーセントまたは化学修飾数、および前述の組み合わせが異なる部分または領域を有する本発明のポリヌクレオチドは、「キメラポリヌクレオチド」として知られている。本発明による「キメラ」は、２つ以上の不調和なまたは異種起源の部分または領域を有する実体である。本明細書の用法では、ポリヌクレオチドの「部分」または「領域」は、ポリヌクレオチドの全長に満たないポリヌクレオチドの任意の部分と定義される。
【００４０】
さらに別の実施形態では、環状である本発明のポリヌクレオチドは、「環状ポリヌクレオチド」または「ｃｉｒｃＰ」として知られている。本明細書の用法では、「環状ポリヌクレオチド」または「ｃｉｒｃＰ」は、ＲＮＡと実質的に同様に機能して、その特性を有する、一本鎖環状ポリヌクレオチドを意味する。「環状」という用語はまた、ｃｉｒｃＰの任意の二次または三次立体配置を包含することが意図される。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、約３０〜約１００，０００（例えば、３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜３，０００、３０〜５，０００、３０〜７，０００、３０〜１０，０００、３０〜２５，０００、３０〜５０，０００、３０〜７０，０００、１００〜２５０、１００〜５００、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜３，０００、１００〜５，０００、１００〜７，０００、１００〜１０，０００、１００〜２５，０００、１００〜５０，０００、１００〜７０，０００、１００〜１００，０００、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜３，０００、５００〜５，０００、５００〜７，０００、５００〜１０，０００、５００〜２５，０００、５００〜５０，０００、５００〜７０，０００、５００〜１００，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜３，０００、１，０００〜５，０００、１，０００〜７，０００、１，０００〜１０，０００、１，０００〜２５，０００、１，０００〜５０，０００、１，０００〜７０，０００、１，０００〜１００，０００、１，５００〜３，０００、１，５００〜５，０００、１，５００〜７，０００、１，５００〜１０，０００、１，５００〜２５，０００、１，５００〜５０，０００、１，５００〜７０，０００、１，５００〜１００，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜５，０００、２，０００〜７，０００、２，０００〜１０，０００、２，０００〜２５，０００、２，０００〜５０，０００、２，０００〜７０，０００、および２，０００〜１００，０００）ヌクレオチドを含む。
【００４２】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの目的のペプチドまたはポリペプチドをコードしてもよい。目的のペプチドまたはポリペプチドは、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、その変異型または変異体であってもよい。
【００４３】
例示的な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、野生型ＬＤＬＲタンパク質または野生型タンパク質の変異型などのＬＤＬＲタンパク質をコードする。例示的な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、変異型ＬＤＬＲタンパク質、すなわち、１つまたは複数のアミノ酸の差異、挿入または欠失によって、野生型ＬＤＬＲと異なるＬＤＬＲをコードする。非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質は、例えば、天然に存在する多形性などの多形性を含んでなり得る。非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質は、例えば、天然に存在する変異または非天然起源変異またはその両方などの変異を含んでなる。
【００４４】
例示的な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＬＤＬＲまたはＬＤＬＲタンパ
ク質の生物学的特性を変化させる、少なくとも１つの変異を含んでなる。例示的な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＬＤＬＲの発現、特に細胞表面発現を変化させる、少なくとも１つの変異を含んでなる。このような変異は、本明細書で、「細胞表面発現促進」変異」と称される。代表的な「細胞表面発現促進変異」は、例えば、ＬＤＬＲ分解を阻害または低下するなどして変化させ、したがって例えば、ＬＤＬＲまたはＬＤＬＲタンパク質の細胞表面発現などの発現増大、または細胞表面のＬＤＬＲレベル増大をもたらす。例示的な実施形態では、細胞表面発現促進変異は、ＬＤＬＲ分解と関係があるＬＤＬＲドメインで起こる。
【００４５】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＥＧＦ−Ａドメインの変異を含んでなる、ＬＤＬＲタンパク質をコードしてもよい。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＩＤＯＬ相互作用ドメインの変異を含んでなる、ＬＤＬＲタンパク質の変異型をコードしてもよい。ＩＤＯＬ（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｄｅｇｒａｄｅｒ  ｏｆ  ＬＤＬＲ：ＬＤＬＲの誘導性分解因子）はＥ３ユビキチンリガーゼであり、肝臓Ｘ受容体の活性化に続いて誘導され、引き続いて、受容体のユビキチン化と分解を仲介するＬＤＬＲ（ＩＤＯＬ相互作用ドメイン）内の細胞質内ドメインと、相互作用することが知られている。非限定的例として、例えば、その中に変異を導入することによるＩＤＯＬ相互作用ドメインの改変は、ＩＤＯＬ媒介ＬＤＬＲ分解の阻害をもたらし、ＬＤＬＲタンパク質発現の増大を引き起こす。さらなる非限定的例として、例えば、その中に変異を導入することによるＩＤＯＬ相互作用ドメインの変化は、ＩＤＯＬ媒介ＬＤＬＲ分解をもたらし、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ：ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ
ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）取り込みを促進する。
【００４６】
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＬＤＬＲタンパク質が、例えば、ＰＣＳＫ９相互作用ドメインの変異などの改変を含んでなる、ＬＤＬＲタンパク質をコードしてもよい。ＰＣＳＫ９（プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシンタイプ９）は、プロティナーゼＫ酵素であり、ＬＤＬＲ（ＰＣＳＫ９相互作用ドメイン）の表皮成長因子様反復Ａ（ＥＧＦ−Ａ）ドメインと結合して、ＬＤＬＲ分解を誘導する。非限定的例として、例えば、その中に変異を導入することによるＰＣＳＫ９相互作用ドメインの改変は、ＰＣＳＫ９媒介ＬＤＬＲ分解の阻害をもたらし、ＬＤＬＲタンパク質発現の増大を引き起こす。さらなる非限定的例として、例えば、その中に変異を導入することによるＰＣＳＫ９相互作用ドメインの改変は、ＰＣＳＫ９媒介ＬＤＬＲ分解の阻害をもたらし、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）取り込みを促進する。
【００４７】
さらに別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＩＤＯＬ相互作用ドメインおよびＰＣＳＫ９相互作用ドメインの改変を含んでなる、ＬＤＬＲタンパク質をコードしてもよい。非限定的例として、例えば、ＰＣＳＫ９相互作用ドメインおよびＩＤＯＬ相互作用ドメインの変異などの改変は、ＬＤＬＲタンパク質発現の増大をもたらす。さらなる非限定的例として、例えば、ＰＣＳＫ９相互作用ドメインおよびＩＤＯＬ相互作用ドメインの変異などの改変は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）取り込みを促進する。
【００４８】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、８３９アミノ酸長のＬＤＬＲタンパク質またはそれらの変異型をコードしてもよい。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、８６０アミノ酸長のＬＤＬＲタンパク質またはそれらの変異型をコードしてもよい。
【００４９】
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、非コードである少なくとも１つの核酸配列を含んでなってもよい。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも１つの目的のペプチドポリペプチドをコードする領域の長さは、約３０ヌクレオチド長を超える（例えば、少なくとも
約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、４，１００、４，２００、４，３００、４，４００、４，５００、４，６００、４，７００、４，８００、４，９００、５，０００、５，１００、５，２００、５，３００、５，４００、５，５００、５，６００、５，７００、５，８００、５，９００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００を超え、または１００，０００個以下のヌクレオチド）。本明細書の用法では、このような領域は、「コード領域」または「コードする領域」と称されてもよい。
【００５０】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ：ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ）であり、もしくはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として機能する。本明細書の用法では、「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）という用語は、少なくとも１つの目的のペプチドまたはポリペプチドをコードして、インビトロ、インビボ、原位置または生体外で、翻訳されて、コードされる目的のペプチドポリペプチドを生じることができる、任意のポリヌクレオチドを指す。
【００５１】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、構造修飾されるかまたは化学修飾されてもよい。本明細書の用法では、「構造」修飾とは、ポリヌクレオチド中で、ヌクレオチド自体に対する著しい化学修飾なしに、２つ以上の連結ヌクレオシドが、挿入されるか、欠失するか、重複するか、反転するかまたは無作為化されているものである。構造修飾をもたらすために、化学結合は必然的に破壊され再編成されているため、構造修飾は化学的性質のものであり、したがって化学修飾である。しかし、構造修飾は、異なるヌクレオチド配列をもたらす。例えば、ポリヌクレオチド「ＡＴＣＧ」は、「ＡＴ−５ｍｅＣ−Ｇ」に化学修飾されてもよい。同一ポリヌクレオチドは、「ＡＴＣＧ」から「ＡＴＣＣＣＧ」に構造修飾されてもよい。この場合、ジヌクレオチド「ＣＣ」が挿入されており、ポリヌクレオチドに構造修飾がもたらされる。
【００５２】
一実施形態では、ＩＶＴポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドなどの本発明のポリヌクレオチドは、同一ヌクレオシドタイプの全てまたはいずれかの均一な化学修飾、または同一ヌクレオシドタイプの全てまたはいずれかにおける同一開始修飾の単なる下方用量設定によって生じる修飾集団、または全てのウリジンが例えば、プソイドウリジンなどのウリジンアナログによって置換されるなどの無作為の組み込みがある、同一ヌクレオシドタイプの全ていずれかの測定された化学修飾パーセントを有してもよい。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド全体にわたり、同一ヌクレオシドタイプの２つ、３つ、または４つに、（例えば、全てのウリジンおよび全てのシトシンが、同様に修飾されるなどの）均一な化学修飾を有してもよい。
【００５３】
本発明のポリヌクレオチドが、化学修飾および／または構造修飾される場合、ポリヌクレオチドは、「修飾ポリヌクレオチド」と称されてもよい。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、自己切断ペプチドをコードする配列を含んでもよい。自己切断ペプチドは、２Ａペプチドであってもよいが、これに限定されるものではない。非限定的例として、２Ａペプチドは、ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１）のタンパク質配列、その断片または変異型を有してもよい。一実施形態では、２Ａペプチドは、最後のグリシンおよび最後のプロリン間を切断する。別の非限定的例として、本発明のポリヌクレオチドは、ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１）のタンパク質配列、その断片または変異型を有する２Ａペ
プチドをコードする、ポリヌクレオチド配列を含んでもよい。
【００５４】
２Ａペプチドをコードするこのような１つのポリヌクレオチド配列は、ＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＣＴＡＣＴＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴ（配列番号２）である。２Ａペプチドのポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載される方法および／または当該技術分野で公知の方法によって、修飾されまたはコドン最適化されてもよい。
【００５５】
一実施形態では、この配列が使用されて、コード領域が、２つ以上の目的のポリペプチドに分離されてもよい。非限定的例として、２Ａペプチドをコードする配列は、第１のコード領域Ａと第２のコード領域Ｂの間（Ａ−２Ａｐｅｐ−Ｂ）にあってもよい。２Ａペプチドの存在は、１本の長いタンパク質のプロテインＡ、タンパク質Ｂ、および２Ａペプチドへの切断をもたらす。プロテインＡおよびタンパク質Ｂは、同一のまたは異なる、目的のペプチドまたはポリペプチドであってもよい。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド中で２Ａペプチドが使用されて、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超えるタンパク質が生成されてもよい。
【００５６】
ＩＶＴポリヌクレオチド構造
従来、ｍＲＮＡ分子の基本的成分は、少なくとも１つのコード領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップ、およびポリＡテールを含む。本発明のＩＶＴポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡとして機能することができるが、核酸ベースの治療薬を使用した効果的なポリペプチド生成における既存の問題を克服するのに役立つそれらの機能的および／または構造的設計特性において、野生型ｍＲＮＡとは区別される。
【００５７】
図１は、本発明のＩＶＴポリヌクレオチドの一次コンストラクト１００を示す。本明細書の用法では、「一次コンストラクト」は、１つまたは複数の目的のポリペプチドをコードするとともにその中でコードされる目的のポリペプチドが翻訳されるのに十分な構造的および／または化学的特性を保持する、本発明のポリヌクレオチドを指す。
【００５８】
図１によれば、ここでＩＶＴポリヌクレオチドの一次コンストラクト１００は、第１の隣接領域１０４および第２の隣接領域１０６で挟まれる連結ヌクレオチド１０２の第１の領域を含有する。第１の隣接領域１０４は、ポリペプチドの天然５’ＵＴＲをコードする核酸のいずれかの５’ＵＴＲ、または、異種５’ＵＴＲまたは合成５’ＵＴＲなどであるがこれに限定されるものではない非天然５’ＵＴＲなどの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）として機能する連結ヌクレオシド配列を含んでもよい。目的のポリペプチドは、シグナル配列領域１０３によってコードされる、１つまたは複数のシグナル配列をその５’末端に含んでなってもよい。隣接領域１０４は、１つまたは複数の完全または不完全な５’ＵＴＲ配列を含んでなる連結ヌクレオチド領域を含んでなってもよい。隣接領域１０４はまた、５’末端キャップ１０８を含んでなってもよい。第２の隣接領域１０６は、ポリペプチドの天然３’ＵＴＲをコードし得る１つまたは複数の完全なまたは不完全な３’ＵＴＲ、または、異種３’ＵＴＲまたは合成３’ＵＴＲなどであるがこれに限定されるものではない非天然３’ＵＴＲを含んでなってもよい。隣接領域１０６はまた、３’テーリング配列１１０を含んでなってもよい。３’テーリング配列は、ポリＡテール、ポリＡ〜Ｇカルテットおよび／またはステムループ配列であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００５９】
第１の領域１０２の５’末端と第１の隣接領域１０４との架橋は、第１の作動可能領域１０５である。従来、この作動可能領域は、開始コドンを含んでなる。作動可能領域は、あるいは、開始コドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含んでなってもよい。
【００６０】
第１の領域１０２の５’末端と第１の隣接領域１０４との架橋は、第１の作動可能領域
１０５である。従来、この作動可能領域は、開始コドンを含んでなる。作動可能領域は、あるいは、開始コドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含んでなってもよい。
【００６１】
第１の領域１０２の３’末端と第２の隣接領域１０６との架橋は、第２の作動可能領域１０７である。従来、この作動可能領域は、終止コドンを含んでなる。作動可能領域は、あるいは、終止コドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含んでなってもよい。ＩＶＴポリヌクレオチド中ではまた、複数の連続する終止コドンが使用されてもよい。一実施形態では、本発明の操作領域は、２つの終止コドンを含んでなってもよい。第１の終止コドンは、「ＴＧＡ」または「ＵＧＡ」であってもよく、第２の終止コドンは、「ＴＡＡ」、「ＴＧＡ」、「ＴＡＧ」、「ＵＡＡ」、「ＵＧＡ」、または「ＵＡＧ」からなる群から選択されてもよい。
【００６２】
図２は、本発明の典型的なＩＶＴポリヌクレオチド一次コンストラクト１３０を示す。ポリヌクレオチド一次コンストラクトは、１つまたは複数の目的のポリペプチドをコードするとともにその中でコードされる目的のポリペプチドが翻訳されるのに十分な構造的および／または化学的特性を保持する、ポリヌクレオチド転写物を指す。目的のポリペプチドの非限定的例としては、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）およびその変異型（例えば、ＬＤＬＲ細胞表面促進変異などの少なくとも１つの変異を含んでなるＬＤＬＲタンパク質）（本明細書の表３、１０、および１１）、および本明細書の表３、およびそれぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国仮特許出願第６１／６１８，８６２号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６４５号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１３０号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８６６号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６４７号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１３４号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８６８号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６４８号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１３５号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８７３号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６５０号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１４７号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８７８号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６５４号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１５２号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８８５号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６５８号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１５５号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８９６号明細書、米国仮特許出願第６１／６６８，１５７号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６６１号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１６０号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，９１１号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６６７号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１６８号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，９２２号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６７５号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１７４号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，９３５号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６８７号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１８４号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，９４５号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６９６号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１９１号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，９５３号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，７０４号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，２０３号明細書の表６；米国仮特許出願第６１／６８１，７２０号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，２１３号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，７４２号明細書の表６および７；国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６８号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６３号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６９号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６７０号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６４号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６５号パンフレット、国際公開第２０１３１５１７３６号パンフレットの表６；国際公開第２０１３１５１６７２号パンフレットの表６および７；国際公開第２０１３１５１６７１号パンフレットの表６、１７８、および１７９；米国仮特許出願第６１／６１８，８７０号明細書の表６、２８、およ
び２９；米国仮特許出願第６１／６８１，６４９号明細書の表６、５６、および５７；米国仮特許出願第６１／７３７，１３９号明細書の表６、１８６、および１８７；国際公開第２０１３１５１６６７号パンフレットの表６、１８５、および１８６に記載される、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。野生型ヒト低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）の代表的参照アミノ酸および核酸配列は、それぞれ、＞ｇｉ｜４５０４９７５｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿０００５１８．１｜低密度リポタンパク質受容体イソ型１前駆体［ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）］（配列番号７４４）および＞ｇｉ｜３０７７７５４１０｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿０００５２７．４｜ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）転写変異型１  ｍＲＮＡ（配列番号７４５）に記載される。野生型マウス低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）の代表的参照アミノ酸および核酸配列は、それぞれ、＞ｇｉ｜１１３１９５７００｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿０３４８３０．２｜低密度リポタンパク質受容体イソ型１前駆体［ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）］（配列番号７４６）および＞ｇｉ｜３５８０３０３０２｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿０１０７００．３｜ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）低密度リポタンパク質受容体（Ｌｄｌｒ）転写変異体１  ｍＲＮＡ（配列番号７４７）に記載される。受入番号は、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のウェブサイトにある。
【００６３】
図２に戻ると、ここでＩＶＴポリヌクレオチドの一次コンストラクト１３０は、第１の隣接領域１３４および第２の隣接領域１３６で挟まれる連結ヌクレオチド１３２の第１の領域を含有する。本明細書の用法では、「第１の領域」は、「コード領域」または「コードする領域」または単に「第１の領域」と称されてもよい。この第１の領域は、コードされる目的のポリペプチドを含んでもよいが、これに限定されるものではない。一態様では、第１の領域１３２は、少なくとも１つの目的のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含んでもよいが、これに限定されるものではない。オープンリーディングフレームは、全体または一部がコドン最適化されてもよい。隣接領域１３４は、完全にまたは部分的にコドン最適化され得る１つまたは複数の完全なまたは不完全な５’ＵＴＲ配列を含む連結ヌクレオチド領域を含んでなってもよい。隣接領域１３４は、ｍｉＲ配列、テルザック（ＴＥＲＺＡＫ）（商標）配列、および翻訳制御配列を含むがこれに限定されるものではない、少なくとも１つの核酸配列を含んでもよい。隣接領域１３４はまた、５’末端キャップ１３８を含んでなってもよい。５’末端キャッピング領域１３８は、天然起源キャップ、合成キャップまたは最適化キャップを含んでもよい。最適化キャップの非限定的例としては、ローズ（Ｒｈｏａｄｓ）によって、米国特許第７０７４５９６号明細書、および国際公開第２００８１５７６６８号パンフレット、国際公開第２００９１４９２５３号パンフレット、および国際公開第２０１３１０３６５９号パンフレットで教示されるキャップが挙げられる。第２の隣接領域１０６は、１つまたは複数の完全または不完全な３’ＵＴＲを含む連結ヌクレオチド領域を含んでなってもよい。第２の隣接領域１３６は、完全にコドン最適化されまたは部分的にコドン最適化されてもよい。隣接領域１３４は、ｍｉＲ配列および翻訳制御配列を含むがこれに限定されるものではない、少なくとも１つの核酸配列を含んでもよい。第２の隣接領域１３６の後にポリヌクレオチド一次コンストラクトは、３’テーリング配列１４０を含んでなってもよい。３’テーリング配列１４０は、合成テーリング領域１４２および／または鎖終止ヌクレオシド１４４を含んでもよい。合成テーリング領域の非石灰漬例としては、ポリＡ配列、ポリＣ配列、ポリＡ〜Ｇカルテットが挙げられる。鎖終止ヌクレオシドの非限定的例としては、２’−Ｏメチル、Ｆ、およびロックド核酸（ＬＮＡ：ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）が挙げられる。
【００６４】
第１の領域１３２の５’末端と第１の隣接領域１３４との架橋は、第１の作動可能領域１４４である。従来、この作動可能領域は、開始コドンを含んでなる。作動可能領域は、
あるいは、開始コドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含んでなってもよい。
【００６５】
第１の領域１３２の３’末端と第２の隣接領域１３６との架橋は、第２の作動可能領域１４６である。従来、この作動可能領域は、終止コドンを含んでなる。作動可能領域は、あるいは、終止コドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含んでなってもよい。本発明によれば、複数の連続する終止コドンもまた使用されてもよい。
【００６６】
本発明のＩＶＴポリヌクレオチドの一次コンストラクトの第１の領域の最短長は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、またはデカペプチドをコードするのに十分な核酸配列の長さであり得る。別の実施形態では、長さは、例えば５〜３０、１０〜３０、２〜２５、５〜２５、１０〜２５、または１０〜２０アミノ酸などの２〜３０アミノ酸のペプチドをコードするのに十分であってもよい。長さは、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１７、２０、２５または３０アミノ酸のペプチド、または例えば３５、３０、２５、２０、１７、１５、１４、１３、１２、１１または１０アミノ酸以下などの４０アミノ酸以下のペプチドをコードするのに十分であってもよい。ポリヌクレオチド配列がコードし得るジペプチドの例としては、カルノシンおよびアンセリンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６７】
本発明の目的のポリペプチドをコードするＩＶＴポリヌクレオチドの一次コンストラクトの第１の領域の長さは、約３０ヌクレオチド長を超える（例えば、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、および３，０００、４，０００、４，１００、４，２００、４，３００、４，４００、４，５００、４，６００、４，７００、４，８００、４，９００、５，０００、５，１００、５，２００、５，３００、５，４００、５，５００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００を超え、または１００，０００以下のヌクレオチド）。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ＩＶＴポリヌクレオチドは、約３０〜約１００，０００（例えば、３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜３，０００、３０〜５，０００、３０〜７，０００、３０〜１０，０００、３０〜２５，０００、３０〜５０，０００、３０〜７０，０００、１００〜２５０、１００〜５００、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜３，０００、１００〜５，０００、１００〜７，０００、１００〜１０，０００、１００〜２５，０００、１００〜５０，０００、１００〜７０，０００、１００〜１００，０００、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜３，０００、５００〜５，０００、５００〜７，０００、５００〜１０，０００、５００〜２５，０００、５００〜５０，０００、５００〜７０，０００、５００〜１００，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜３，０００、１，０００〜５，０００、１，０００〜７，０００、１，０００〜１０，０００、１，０００〜２５，０００、１，０００〜５０，０００、１，０００〜７０，０００、１，０００〜１００，０００、１，５００〜３，０００、１，５００〜５，０００、１，５００〜７，０００、１，５００〜１０，０００、１，５００〜２５，０００、１，５００〜５０，０００、１，５００〜７０，０００、１，５００〜１００，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜５，０００、２，０００〜７，０００、２，０００〜１０，０００、２，０００〜２５，０００、２，０００〜５０，０００、２，０００〜７０，０００、２，０００〜１００，０
００、および４，５００〜５，５００）ヌクレオチドを含む。
【００６９】
本発明によれば、ＩＶＴポリヌクレオチドの第１および第２の隣接領域は、独立して、１５〜１，０００ヌクレオチド長（例えば、３０、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、４，５００、５，０００、５，５００を超えるヌクレオチド、または少なくとも３０、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、４，５００、５，０００、５，５００ヌクレオチド）の範囲であってもよい。
【００７０】
本発明によれば、ＩＶＴポリヌクレオドのテーリング配列は、０〜５００ヌクレオチド長（例えば、少なくとも６０、７０、８０、９０、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド）の範囲であってもよい。テーリング領域がポリＡテールである場合、長さはポリＡ結合タンパク質結合の単位でまたは関数として決定され得る。この実施形態では、ポリＡテールは、ポリＡ結合タンパク質の少なくとも４個の単量体に結合するのに十分な長さである。ポリＡ結合タンパク質単量体は、一続きのおよそ３８ヌクレオチドと結合する。このように、約８０ヌクレオチドおよび１６０ヌクレオチドのポリＡテールが、機能的であることが観察されている。
【００７１】
本発明によれば、ＩＶＴポリヌクレオチドのキャッピング領域は、単一キャップを含んでなってもよく、またはキャップを形成する一連のヌクレオチドを含んでなってもよい。この実施形態では、キャッピング領域は、例えば、２〜９、３〜８、４〜７、１〜５、５〜１０、または少なくとも２、または１０以下など、１〜１０ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの実施形態では、キャップは存在しない。
【００７２】
本発明によれば、ＩＶＴポリヌクレオチドの第１および第２の作動可能領域は、５〜３０、１０〜２０、１５、または少なくとも４、または３０またはそれ未満など、３〜４０ヌクレオチド長の範囲であってもよく、開始および／または終止コドンに加えて、１つまたは複数のシグナルおよび／または制限配列を含んでなってもよい。
【００７３】
一実施形態では、本発明のＩＶＴポリヌクレオチドは、構造修飾されまたは化学修飾されてもよい。本発明のＩＶＴポリヌクレオチドが、化学修飾および／または構造修飾される場合、ポリヌクレオチドは、「修飾ＩＶＴポリヌクレオチド」と称されてもよい。
【００７４】
一実施形態では、本発明のＩＶＴポリヌクレオチドが化学修飾される場合、それらは、同一ヌクレオシドタイプの全てまたはいずれかの均一な化学修飾、または同一ヌクレオシドタイプの全てまたはいずれかにおける同一開始修飾の単なる下方用量設定によって生じる修飾集団、または全てのウリジンが例えば、プソイドウリジンなどのウリジンアナログによって置換されるなどの無作為の組み込みがある、同一ヌクレオシドタイプの全ていずれかの測定された化学修飾パーセントを有してもよい。別の実施形態では、ＩＶＴポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド全体にわたり、同一ヌクレオシドタイプの２つ、３つ、または４つに、（例えば、全てのウリジンおよび全てのシトシンが、同様に修飾されるなどの）均一な化学修飾を有してもよい。
【００７５】
一実施形態では、本発明のＩＶＴポリヌクレオチドは、２Ａペプチドなどであるがこれに限定されるものではない、本明細書に記載される自己切断ペプチドをコードする配列を
含んでもよい。ＩＶＴポリヌクレオチド中の２Ａペプチドのポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載される方法および／または当該技術分野で公知の方法によって、修飾されまたはコドン最適化されてもよい。
【００７６】
一実施形態では、この配列が使用されて、ＩＶＴポリヌクレオチド中の２つ以上の目的のポリペプチドのコード領域が分離されてもよい。
一実施形態では、本発明のＩＶＴポリヌクレオチドは、構造修飾または化学修飾されてもよい。化学修飾および／または構造修飾される場合、ＩＶＴポリヌクレオチドは、「修飾ＩＶＴポリヌクレオチド」と称されてもよい。
【００７７】
一実施形態では、ＩＶＴポリヌクレオチドは、目的の少なくとも１つのペプチドまたはポリペプチドをコードしてもよい。別の実施形態では、ＩＶＴポリヌクレオチドは、目的の２つ以上のペプチドまたはポリペプチドをコードしてもよい。目的のペプチドまたはポリペプチドの非限定的例としては、抗体の重鎖と軽鎖、酵素とその基質、標識とその結合分子、第２のメッセンジャーとその酵素あるいは多量体タンパク質または複合体の成分が挙げられる。
【００７８】
ＩＶＴポリヌクレオチド（一次コンストラクトなどであるが、これに限定されるものではない）、ＩＶＴポリヌクレオチドを含んでなる製剤および組成物、およびＩＶＴポリヌクレオチドを製造、使用、および投与する方法が、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、同時係属米国仮特許出願第６１／６１８，８６２号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／６８１，６４５号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／７３７，１３０号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／６１８，８６６号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／６８１，６４７号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／７３７，１３４号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／６１８，８６８号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／６８１，６４８号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／７３７，１３５号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／６１８，８７３号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／６８１，６５０号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／７３７，１４７号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／６１８，８７８号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／６８１，６５４号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／７３７，１５２号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／６１８，８８５号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／６８１，６５８号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／７３７，１５５号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／６１８，８９６号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／６６８，１５７号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／６８１，６６１号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／７３７，１６０号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／６１８，９１１号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／６８１，６６７号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／７３７，１６８号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／６１８，９２２号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／６８１，６７５号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／７３７，１７４号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／６１８，９３５号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／６８１，６８７号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／７３７，１８４号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／６１８，９４５号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／６８１，６９６号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／７３７，１９１号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／６１８，９５３号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／６８１，７０４号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／７３７，２０３号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／６１８，８７０号明細書、同時係属米国仮特許出願第６１／６８１，６４９号明細書、および同時係属米国仮特許出願第６１／７３７，１３９号明細書；国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６７号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６８号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６３号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６９
号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６７０号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６４号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６５号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６７１号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６７２号パンフレット、および国際公開第２０１３１５１７３６号パンフレットに記載される。
【００７９】
一実施形態では、ＩＶＴポリヌクレオチドは、例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異などの少なくとも１つの変異を含んでなるＬＤＬＲタンパク質配列などであるが、これに限定されるものではない、ＬＤＬＲタンパク質をコードする。
【００８０】
キメラポリヌクレオチド構造
本発明のキメラポリヌクレオチドまたはＲＮＡコンストラクトは、ＩＶＴポリヌクレオチドと同様のモジュール構造を保つが、キメラポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに有用な特性を与える１つまたは複数の構造的および／または化学的な修飾または改変を含んでなる。したがって、本発明の修飾ｍＲＮＡ分子であるキメラポリヌクレオチドは、「キメラ修飾ｍＲＮＡ」または「キメラｍＲＮＡ」と称される。
【００８１】
キメラポリヌクレオチドは、サイズおよび／または化学修飾パターン、化学修飾位置、化学修飾パーセントまたは化学修飾数、および前述の組み合わせが異なる、部分または領域を有する。
【００８２】
キメラポリヌクレオチドがｍＲＮＡとして機能して目的のポリペプチドをコードする、部分または領域の例としては、非翻訳領域（５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲなどのＵＴＲ）、コード領域、キャップ領域、ポリＡテール領域、開始領域、終止領域、シグナル配列領域、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。図３は、ｍＲＮＡとして使用されてもよい、本発明のキメラポリヌクレオチドの特定の実施形態を例示する。図４は、位置的修飾の様々なパターンを同定し、ｍＲＮＡポリヌクレオチドのこれらの領域と類似する領域を示す、一連のキメラポリヌクレオチドの概略図を例示する。その他の領域を連結し、またはそれらの間に位置する領域または部分は、小領域を有するようにも設計されてもよい。これらは、図で示される。
【００８３】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、式Ｉ、
５’［Ａｎ］ｘ−Ｌ１−［Ｂｏ］ｙ−Ｌ２−［Ｃｐ］ｚ−Ｌ３  ３’
式Ｉ
を含んでなる構造を有し、
式中、
ＡおよびＢのそれぞれは、独立して連結ヌクレオシド領域を含んでなり；
Ｃは、連結ヌクレオシドの任意選択の領域であり；
領域Ａ、ＢまたはＣの少なくとも１つは位置的に修飾されて、位置的に修飾された領域は、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、またはウリジンの同一ヌクレオシドタイプの１つまたは複数の少なくとも２つの化学修飾ヌクレオシドを含んでなり、同一タイプのヌクレオシドの少なくとも２つの化学修飾は、異なる化学修飾であり；
ｎ、ｏ、およびｐは、独立して１５〜１０００の整数であり；
ｘおよびｙは、独立して１〜２０であり；
ｚは０〜５であり；
Ｌ１およびＬ２は、独立して任意選択のリンカー部分であり、前記リンカー部分は、核酸ベースまたは非核酸ベースのいずれかであり；および
Ｌ３は、任意選択のコンジュゲートまたは任意選択のリンカー部分であり、前記リンカー部分は、核酸ベースまたは非核酸ベースのいずれかである。
【００８４】
いくつかの実施形態では、式Ｉのキメラポリヌクレオチドは、目的の１つまたは複数のペプチドまたはポリペプチドをコードする。このようなコードされる分子は、２つ以上の領域にかけてコードされてもよい。
【００８５】
一実施形態では、Ａの連結ヌクレオシド領域の少なくとも１つは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）として機能し得る、連結ヌクレオシド配列を含んでなってもよい。連結ヌクレオシド配列は、天然または合成５’ＵＴＲであってもよい。非限定的例として、キメラポリヌクレオチドは、目的のポリペプチドをコードしてもよく、Ａの連結ヌクレオシド配列は、キメラポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの天然５’ＵＴＲをコードしてもよく、または連結ヌクレオシド配列は、合成ＵＴＲなどであるが、これに限定されるものではない、非異種５’ＵＴＲであってもよい。
【００８６】
別の実施形態では、Ａの連結ヌクレオシド領域の少なくとも１つは、キャップ領域であってもよい。キャップ領域は、５’ＵＴＲとして機能するＡの連結ヌクレオシド領域に対して、５’に位置してもよい。キャップ領域は、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、２−アジド−グアノシン、Ｃａｐ２、およびＣａｐ４などであるが、これに限定されるものではない、少なくとも１つのキャップを含んでなってもよい。
【００８７】
一実施形態では、Ｂの連結ヌクレオシド領域の少なくとも１つは、少なくとも１つの核酸配列オープンリーディングフレームを含んでなってもよい。核酸配列は、コドン最適化されてもよく、および／または少なくとも１つの修飾を含んでなってもよい。
【００８８】
一実施形態では、Ｃの連結ヌクレオシド領域の少なくとも１つは、３’ＵＴＲとして機能し得る、連結ヌクレオシド配列を含んでなってもよい。連結ヌクレオシド配列は、天然または合成３’ＵＴＲであってもよい。非限定的例として、キメラポリヌクレオチドは、目的のポリペプチドをコードしてもよく、Ｃの連結ヌクレオシド配列は、キメラポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの天然３’ＵＴＲをコードしてもよく、または連結ヌクレオシド配列は、合成ＵＴＲなどであるが、これに限定されるものではない非異種３’ＵＴＲであってもよい。
【００８９】
一実施形態では、Ａの連結ヌクレオシド領域の少なくとも１つは、５’ＵＴＲとして機能する連結ヌクレオシド配列を含んでなり、Ｃの連結ヌクレオシド領域の少なくとも１つは、３’ＵＴＲとして機能する連結ヌクレオシド配列を含んでなる。一実施形態では、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは、同一または異なる生物種起源であってもよい。別の実施形態では、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは、同一または異なる生物種起源の異なるタンパク質からの天然非翻訳領域をコードしてもよい。
【００９０】
図５および６は、式Ｉをベースとする、位置的修飾の様々なパターンを例示する一連のキメラポリヌクレオチド、ならびにブロックされたまたは構造化された３’末端を有するものの概略図を提供する。
【００９１】
本発明のキメラポリヌクレオチドは、それらの部分または領域を含めて、ヘミマー、ギャップマー、ウィングマー、またはブロックマーに分類されてもよい。
本明細書の用法では、「ヘミマー」は、１つの化学修飾のパターン、パーセント、位置、または集団の半分と、第２の化学修飾のパターン、パーセント、位置、または集団の半分とを含んでなる、領域または部分を含んでなる、キメラポリヌクレオチドである。本発明のキメラポリヌクレオチドはまた、ヘミマー小領域を含んでなってもよい。一実施形態
では、部分または領域は、１つの５０％および別の５０％である。
【００９２】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチド全体が、１つの５０％および別の５０％である。本発明の任意のキメラポリヌクレオチドの任意の領域または部分が、ヘミマーであってもよい。ヘミマーのタイプとしては、パターンヘミマー、集団ヘミマーまたは位置ヘミマーが挙げられる。定義上、ヘミマーは５０：５０パーセントヘミマーである。
【００９３】
本明細書の用法では、「ギャップマー」は、部分または領域間にギャップがある少なくとも３つの部分または領域を有する、キメラポリヌクレオチドである。「ギャップ」は、それに隣接する２つの部分または領域のキメラの性質と異なる連結ヌクレオシドまたは単一ヌクレオシド領域を含んでなり得る。ギャップマーの２つの部分または領域は、互いに同一であってもまたは異なっていてもよい。
【００９４】
本明細書の用法では、「ウィングマー」は、部分または領域間にギャップがある少なくとも３つの部分または領域を有する、キメラポリヌクレオチドである。ギャップマーとは異なり、ウィングマー中のギャップ周囲の２つの隣接部分または領域は、程度または種類が同じである。このような類似は、異なる修飾の単位数の長さ、または修飾数にあってもよい。ウィングマーのウィングは、ギャップより長くてもまたは短くてもよい。ウィング部分または領域は、ギャップを含んでなる領域よりも、２０、３０、４０、５０、６０  ７０、８０、９０または９５％大きく、またはより短い長さであってもよい。
【００９５】
本明細書の用法では、「ブロックマー」は、部分または領域が、均等なサイズまたは数、および修飾タイプである、パターン化されたポリヌクレオチドである。ブロックマー中の領域または小領域は、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１  ６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０または５００ヌクレオシド長であってもよい。
【００９６】
化学修飾パターンを有する本発明のキメラポリヌクレオチドは、それらの部分または領域を含めて、「パターンキメラ」と称される。パターンキメラはまた、ブロックマーと称されることもある。パターンキメラは、領域または部分内、全体、またはそれらの間に修飾パターンを有する、ポリヌクレオチドである。
【００９７】
部分または領域内の修飾パターンは、画定領域内で開始および終止するものである。部分または領域にわたる修飾パターンは、部分または領域で開始して、別の隣接する部分または領域で終了するパターンである。部分または領域間の修飾パターンは、１つの部分または領域で開始して終了し、必ずしも第１の領域または部分に隣接しない異なる部分または領域で反復されるものである。
【００９８】
パターンキメラまたはブロックマーの領域または小領域は、ＡＢＡＢ［ＡＢ］ｎなどの単純な交互パターンを有してもよく、式中、各「Ａ」および各「Ｂ」は、異なる化学修飾（塩基、糖または主鎖リンカーの少なくとも１つ）、異なるタイプの化学修飾（例えば、天然起源および非天然起源）、異なる修飾百分率または異なる修飾集団を表す。パターンは、ｎ回繰り返されてもよく、式中、ｎ＝３〜３００である。さらに、各ＡまたはＢは、パターン内の１〜２５００単位（例えば、ヌクレオシド）を表し得る。パターンはまた、ＡＡＢＢＡＡＢＢ［ＡＡＢＢ］ｎ（交互の二重繰り返し）またはＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ［ＡＡＡＢＢＢ］ｎ（交互の三重繰り返し）パターンなどの交互の繰り返しであってもよい。パターンは、ｎ回繰り返されてもよく、式中、ｎ＝３〜３００である。
【００９９】
異なるパターンはまた、混ぜ合わされて二次パターンを形成してもよい。例えば、単一交互パターンが三重交互パターンと組み合わされて、二次交互パターンＡ’Ｂ’を形成してもよい。一実施例は、［ＡＢＡＢＡＢ］［ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ］［ＡＢＡＢＡＢ］［ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ］［ＡＢＡＢＡＢ］［ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ］であり、式中、［ＡＢＡＢＡＢ］はＡ’であり［ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ］はＢ’である。同様に、これらのパターンは、ｎ回繰り返されてもよく、式中ｎ＝３〜３００である。
【０１００】
パターンは、３つ以上の異なる修飾を含んで、ＡＢＣＡＢＣ［ＡＢＣ］ｎパターンを形成してもよい。これらの三成分パターンはまた、ＡＡＢＢＣＣＡＡＢＢＣＣ［ＡＡＢＢＣＣ］ｎなどのように繰り返されてもよく、ＡＢＣＡＢＣＡＡＢＢＣＣＡＢＣＡＢＣＡＡＢＢＣＣなどのその他のパターンとの組み合わせとして設計されてもよく、より高次のパターンであってもよい。
【０１０１】
位置、パーセント、および集団の修飾の領域または小領域は、各修飾タイプからの均等な貢献度を反映する必要はない。それらは、「１−２−３−４」、「１−２−４−８」などのシリーズを形成してもよく、各整数は、特定の修飾タイプの単位数を表す。あるいは、それらは、「１−３−３−１−３−１−５」などの奇数のみ、または「２−４−２−４−６−４−８」などの偶数のみ、または「１−３−４−２−５−７−３−３−４」などの奇数および偶数の単位の両方の混合物であってもよい。
【０１０２】
パターンキメラは、それらの化学修飾が、程度（上述のものなど）によって、または種類（例えば、異なる修飾）によって変動してもよい。
同一ヌクレオシドタイプ（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、またはＵ）の２つ以上のヌクレオシドメンバーの２つ以上の異なる化学修飾がある少なくとも１つの領域を有する本発明のキメラポリヌクレオチド（それらの部分または領域を含む）は、「位置的修飾」キメラと称される。位置的修飾キメラは、本明細書では、「選択的配置」キメラまたは「選択的配置ポリヌクレオチド」とも称される。名称が暗示するように、選択的配置は、任意のＡ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵの修飾が合成法のために同一である当該技術分野のポリヌクレオチドとは異な
るポリヌクレオチドの設計を指し、それらのポリヌクレオチドまたは領域内で、個々のＡ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵに異なる修飾を有し得る。例えば、位置修飾キメラポリヌクレオチド中では、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、またはＵのヌクレオシドタイプのいずれかに、２つ以上の異なる化学修飾があってもよい。また２つ以上の同一ヌクレオシドタイプに、任意の２つ以上の組み合わせがあってもよい。例えば、位置修飾キメラポリヌクレオチドまたは選択的位置キメラポリヌクレオチドは、分子中のアデニン集団に３つの異なる修飾を含んでなって、かつまたコンストラクト中のシトシン集団にも３つの異なる修飾を有してもよく、それらは全て独自の非無作為位置を有してもよい。
【０１０３】
化学修飾パーセントを有する、それらの部分または領域を含めた、本発明のキメラポリヌクレオチドは、「パーセントキメラ」と称される。パーセントキメラは、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも８％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の位置、パターンまたは集団の修飾を含んでなる、領域または部分を有してもよい。あるいは、パーセントキメラは、修飾の位置、パターン、または集団に関して、完全に修飾されてもよい。パーセントキメラの修飾パーセントは、天然起源および非天然起源修飾間で分割されてもよい。
【０１０４】
化学修飾集団を有する本発明のキメラポリヌクレオチド（それらの部分または領域を含む）は、「集団キメラ」と称される。集団キメラは、ヌクレオシド（それらの塩基、糖または主鎖結合、またはそれらの組み合わせ）が、選択修飾集団を有する、領域または部分を含んでなってもよい。このような修飾は、表現型結果を誘導、改変または調節する修飾などの機能的集団から選択されてもよい。例えば、機能的集団は、サイトカインのレベルを増大させる、化学修飾の集団または選択であってもよい。その他の機能的集団は、個別にまたは集団で機能して、１つまたは複数のサイトカインレベルを低下させてもよい。したがってキメラポリヌクレオチド中におけるこれらの同様の機能修飾の選択の使用は、「機能的集団キメラ」を構成する。本明細書の用法では、「機能的集団キメラ」は、特有の機能的特徴が、上述されるように修飾集団によって定義されるものであってもよく、または用語は、キメラポリヌクレオチド自体の総合的機能に適用されてもよい。例えば、概してキメラポリヌクレオチドは、未修飾または非キメラポリヌクレオチドと比較して、異なるまたはより優れた方法で機能してもよい。
【０１０５】
全てのウリジンが例えばプソイドウリジンなどのウリジンアナログによって交換されるなどの無作為の組み込みがある、同一ヌクレオシドタイプの全てのいずれかの均一な化学修飾を有するポリヌクレオチド、または同一ヌクレオシドタイプの全てのいずれかの同一出発修飾の単なる下方用量設定によって生じる修飾集団、または同一ヌクレオシドタイプの全ていずれかの測定された化学修飾パーセントは、キメラと見なされないことに留意すべきである。同様に、ポリヌクレオチド全体にわたり同一ヌクレオシドタイプの２つ、３つ、または４つの均一な化学修飾を有する（全てのウリジンおよび全てのシトシンなどが同様に修飾されているなど）ポリヌクレオチドは、キメラポリヌクレオチドと見なされない。キメラでないポリヌクレオチドの一例は、先行技術のカノニカルプソイドウリジン／５−メチルシトシン修飾ポリヌクレオチドである。これらの均一なポリヌクレオチドは、完全にインビトロ転写（ＩＶＴ）酵素合成を通じて得られ；合成酵素の制限のために、それらは、ポリヌクレオチドに見られる、同一ヌクレオシドタイプ、すなわち、アデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）またはウリジン（Ｕ）のそれぞれの出現時に、１種類の修飾のみを含有する。このようなポリヌクレオチドは、ＩＶＴポリヌクレオチドとして特性決定されてもよい。
【０１０６】
本発明のキメラポリヌクレオチドは、構造修飾または化学修飾されてもよい。本発明の
キメラポリヌクレオチドが、化学修飾および／または構造修飾される場合、ポリヌクレオチドは、「修飾ポリヌクレオチド」と称されてもよい。
【０１０７】
本発明のいくつかの実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、目的の２つ以上のペプチドまたはポリペプチドをコードしてもよい。このような目的のペプチドまたはポリペプチドとしては、抗体の重鎖と軽鎖、酵素とその基質、標識とその結合分子、第２のメッセンジャーとその酵素、あるいは多量体タンパク質または複合体の成分が挙げられる。
【０１０８】
本発明のキメラポリヌクレオチドの領域または部分は、リンカーまたはスペーサー部分によって隔てられてもよい。このようなリンカーまたは空隙は、核酸ベースまたは非ヌクレオシドであってもよい。
【０１０９】
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、２Ａペプチドなどであるがこれに限定されるものではない、本明細書に記載される自己切断ペプチドをコードする配列を含んでもよい。キメラポリヌクレオチド中の２Ａペプチドのポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載される方法および／または当該技術分野で公知の方法によって、修飾されまたはコドン最適化されてもよい。
【０１１０】
前述の事項にもかかわらず、本発明のキメラポリヌクレオチドは、位置的に修飾されていない、または本明細書で定義されるキメラでない、領域または部分を含んでなってもよい。
【０１１１】
例えば、キメラポリヌクレオチドの領域または一部は、１つまたは複数のＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、またはＵにおいて均一に修飾されてもよいが、本発明によれば、ポリヌクレオチドは、領域または部分全体にわたり均一に修飾されない。
【０１１２】
キメラポリヌクレオチドの領域または部分は、１５〜１０００ヌクレオシド長であってもよく、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるような２〜１００の異なる領域またはパターンを有してもよい。
【０１１３】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、１つまたは複数の目的のポリペプチドをコードする。別の実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、実質的に非コードである。別の実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、コードおよび非コード両方の領域および部分を有する。
【０１１４】
図３は、図１のポリヌクレオチドのスキャフォールドをベースとする、本発明の特定のキメラポリヌクレオチドの設計を例示する。図に示されるのは、キメラポリヌクレオチドの領域または部分であり、パターンのある領域は、位置的に修飾された領域を表し、白抜き領域は、修飾されてもされなくてもよいが、修飾される場合は均一に修飾される領域を図示する。本発明のキメラポリヌクレオチドは、完全に位置的に修飾されてもよく、または部分的に位置的に修飾されてもよい。それらはまた、任意のパターンまたは設計であってもよい小領域を有してもよい。図３に示されるのは、キメラ小領域およびヘミマー小領域である。
【０１１５】
一実施形態では、ペプチドをコードする、本発明のキメラポリヌクレオチドの領域の最短長は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、またはデカペプチドをコードするのに十分な長さであり得る。別の実施形態では、長さは、例えば５〜３０、１０〜３０、２〜２５、５〜２５、１０〜２５、または１０〜２０アミノ酸などの２〜３０アミノ酸のペプチドをコードするのに十分であってもよい。長さは、少なくとも１１、１２、１３、１
４、１５、１７、２０、２５または３０アミノ酸のペプチド、または例えば３５、３０、２５、２０、１７、１５、１４、１３、１２、１１または１０アミノ酸以下などの４０アミノ酸以下のペプチドをコードするのに十分であってもよい。ポリヌクレオチド配列がコードし得るジペプチドの例としては、カルノシンおよびアンセリンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１１６】
一実施形態では、目的のペプチドまたはポリペプチドをコードする、本発明のポリヌクレオチドの領域の長さは、約３０ヌクレオチド長（例えば、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、８５０、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、および３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００ヌクレオチド長、または１００，０００ヌクレオチド長以下）を超える。本明細書の用法では、このような領域は、「コード領域」または「コードする領域」と称されてもよい。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、キメラポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドは、約３０〜約１００，０００（例えば３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜３，０００、３０〜５，０００、３０〜７，０００、３０〜１０，０００、３０〜２５，０００、３０〜５０，０００、３０〜７０，０００、１００〜２５０、１００〜５００、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜３，０００、１００〜５，０００、１００〜７，０００、１００〜１０，０００、１００〜２５，０００、１００〜５０，０００、１００〜７０，０００、１００〜１００，０００、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜３，０００、５００〜５，０００、５００〜７，０００、５００〜１０，０００、５００〜２５，０００、５００〜５０，０００、５００〜７０，０００、５００〜１００，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜３，０００、１，０００〜５，０００、１，０００〜７，０００、１，０００〜１０，０００、１，０００〜２５，０００、１，０００〜５０，０００、１，０００〜７０，０００、１，０００〜１００，０００、１，５００〜３，０００、１，５００〜５，０００、１，５００〜７，０００、１，５００〜１０，０００、１，５００〜２５，０００、１，５００〜５０，０００、１，５００〜７０，０００、１，５００〜１００，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜５，０００、２，０００〜７，０００、２，０００〜１０，０００、２，０００〜２５，０００、２，０００〜５０，０００、２，０００〜７０，０００、２，０００〜１００，０００および４，５００〜５，５００）ヌクレオチドを含む。
【０１１８】
本発明によれば、ポリヌクレオチドの領域または小領域はまた、独立して、１５〜１，０００ヌクレオチド長の範囲（例えば、３０、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００および９５０ヌクレオチドまたは少なくとも３０、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０，１，０００、２，０００、３，０００、４，０００および５，０００ヌクレオチドを超える）であってもよい。
【０１１９】
本発明によれば、ポリヌクレオチド領域または小領域は、０〜５００ヌクレオチド長（例えば、少なくとも６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド）の範囲であってもよい。領域がポリＡテールである場合、長さは、単位で、またはポリＡ結合タンパク質結合の関数として、判定されてもよい。この実施形態では、ポリＡテールは、ポリＡ結合タンパク質の少なくとも４単量体に結合するのに、十分長い。ポリＡ結合タンパク質単量体は、一続きのおよそ３８ヌクレオチドと結合する。したがって、約８０ヌクレオチド〜約１６０ヌクレオチドのポリＡテールは、機能的であることが観察されている。ｍＲＮＡとして機能する本発明のキメラポリヌクレオチドは、ポリＡテールを含んでなる必要はない。
【０１２０】
本発明によれば、ｍＲＮＡとして機能するキメラポリヌクレオチドは、キャッピング領域を有してもよい。キャッピング領域は、単一キャップ、またはキャップを形成する一連のヌクレオチドを含んでなってもよい。この実施形態では、キャッピング領域は、例えば、２〜９、３〜８、４〜７、１〜５、５〜１０、または少なくとも２、または１０以下など、１〜１０ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの実施形態では、キャップは存在しない。
【０１２１】
本発明は、環状または環式のキメラポリヌクレオチドを検討する。名称が暗示するように、環状ポリヌクレオチドは本質的に環状であり、ライゲーション、共有結合、同一タンパク質またはその他の分子または複合体との共通の会合によるか、それともハイブリダイゼーションによるかを問わず、末端が何らかの方法で連結することを意味する。例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／５３９０４号明細書（代理人整理番号Ｍ５１．２０）で教示される環状ポリヌクレオチドのいずれかが、本発明によってキメラにされてもよい。
【０１２２】
キメラポリヌクレオチド、キメラポリヌクレオチドを含んでなる製剤および組成物、およびキメラポリヌクレオチドを製造、使用、および投与する方法は、その内容全体が参照により援用される、同時係属国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／５３９０７号明細書（代理人整理番号Ｍ５７．２０）にもまた記載される。
【０１２３】
環状ポリヌクレオチド構造
本発明は、環状または環式のポリヌクレオチドを検討する。名称が暗示するように、環状ポリヌクレオチドは本質的に環状であり、ライゲーション、共有結合、同一タンパク質またはその他の分子または複合体との共通の会合によるか、それともハイブリダイゼーションによるかを問わず、末端が何らかの方法で連結することを意味する。環状ポリヌクレオチドのいずれかは、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、２０１４年９月３日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０５３９０４号明細書（代理人整理番号Ｍ５１）で教示される。
【０１２４】
本発明の環状ポリヌクレオチドは、図面７〜１３に示される環状ＲＮＡコンストラクトスキャフォールドに従って、設計されてもよい。このようなポリヌクレオチドは、環状ポリヌクレオチドまたは環状コンストラクトである。
【０１２５】
少なくとも１つの目的のペプチドまたはポリペプチドをコードする本発明の環状ポリヌクレオチドまたはｃｉｒｃＰは、環状ＲＮＡまたはｃｉｒｃＲＮＡとして知られている。本明細書の用法では、「環状ＲＮＡ」または「ｃｉｒｃＲＮＡ」は、少なくとも１つの目的のペプチドまたはポリペプチドをコードし得る、環状ポリヌクレオチドを意味する。少なくとも１つのセンサー配列を含んでなり、目的のペプチドまたはポリペプチドをコードしない本発明のｃｉｒｃＰは、環状スポンジまたはｃｉｒｃＳＰとして知られている。本
明細書の用法では、「環状スポンジ」、「環状ポリヌクレオチドスポンジ」または「ｃｉｒｃＳＰ」は、少なくとも１つのセンサー配列を含んでなり、目的のポリペプチドをコードしない環状ポリヌクレオチドを意味する。本明細書の用法では、「センサー配列」は、内在性核酸結合分子の受容体または疑似受容体を意味する。センサー配列の非限定的例としては、マイクロＲＮＡ結合部位、マイクロＲＮＡシード配列、シード配列なしのマイクロＲＮＡ結合部位、転写因子結合部位、および疑似受容体として機能するように操作された人工結合部位、およびそれらの部分と断片が挙げられる。
【０１２６】
少なくとも１つのセンサー配列を含んでなり、少なくとも１つの目的のペプチドまたはポリペプチドをコードする本発明のｃｉｒｃＰは、環状ＲＮＡスポンジまたはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰとして知られている。本明細書の用法では、「環状ＲＮＡスポンジ」または「ｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ」は、少なくとも１つのセンサー配列と、少なくとも１つの目的のペプチドまたはポリペプチドをコードする少なくとも１つの領域とを含んでなる、環状ポリヌクレオチドを意味する。
【０１２７】
図７は、本発明の環状ポリヌクレオチドの典型的な環状コンストラクト２００を示す。本明細書の用法では、「環状コンストラクト」という用語は、実質的にＲＮＡ分子と同様に機能し、その特性を有してもよい、環状ポリヌクレオチド転写物を指す。一実施形態では、環状コンストラクトは、ｍＲＮＡの機能を果たす。環状コンストラクトが、目的の１つまたは複数のペプチドまたはポリペプチド（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡまたはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ）をコードする場合、ポリヌクレオチド転写物は、その中でコードされる目的のポリペプチドが翻訳されるのに十分な、構造的および／または化学的特性を保持する。環状コンストラクトは、本発明のポリヌクレオチドであってもよい。構造修飾または化学修飾される場合、コンストラクトは、修飾ｃｉｒｃＰ、修飾ｃｉｒｃＳＰ、修飾ｃｉｒｃＲＮＡまたは修飾ｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰと称されてもよい。
【０１２８】
図７に戻ると、ここで、環状コンストラクトは、第１の隣接領域２０４および第２の隣接領域２０６で挟まれる、連結ヌクレオチド２０２の第１の領域を含有する。本明細書の用法では、「第１の領域」は、「コード領域」、「非コード領域」、または「コードする領域」または単に「第１の領域」と称されてもよい。一実施形態では、この第１の領域は、少なくとも１つの目的のペプチドまたはポリペプチドをコードするおよび／またはセンサー領域をコードするヌクレオチドなどであるが、これに限定されるものではない、ヌクレオチドを含んでなってもよい。目的のペプチドまたはポリペプチドは、その５’末端に、シグナルペプチド配列領域２０３によってコードされる、１つまたは複数のシグナルペプチド配列を含んでなってもよい。第１の隣接領域２０４は、ｍＲＮＡおよび／またはＤＮＡ配列中で、非翻訳領域（ＵＴＲ）と同様に機能してもよい、連結ヌクレオシド領域またはその一部を含んでなってもよい。第１の隣接領域はまた、極性領域２０８を含んでなってもよい。極性領域２０８は、ＩＲＥＳ配列またはその一部を含んでもよい非限定的例として、直線化される場合、この領域は、第１の部分が第１の領域２０２の５’末端上、第１の領域２０２および第２の部分が３’末端にあるように、分割されてもよい。第２の隣接領域２０６は、テーリング配列領域２１０を含んでなってもよく、ｍＲＮＡおよび／またはＤＮＡ中で、ＵＴＲと同様に機能してもよい、連結ヌクレオチド領域またはその一部２１２を含んでなってもよい。
【０１２９】
第１の領域２０２の５’末端と第１の隣接領域２０４との架橋は、第１の作動可能領域２０５である。一実施形態では、この作動可能領域は、開始コドンを含んでなってもよい。作動可能領域は、あるいは、開始コドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含んでなってもよい。
【０１３０】
第１の領域２０２の３’末端と第２の隣接領域２０６との架橋は、第２の作動可能領域
２０７である。従来、この作動可能領域は、終止コドンを含んでなる。作動可能領域は、あるいは、終止コドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含んでなってもよい。本発明によれば、複数の連続した終止コドンもまた使用されてもよい。一実施形態では、本発明の操作領域は、２つの終止コドンを含んでなってもよい。第１の終止コドンは、「ＴＧＡ」または「ＵＧＡ」であってもよく、第２の終止コドンは、「ＴＡＡ」、「ＴＧＡ」、「ＴＡＧ」、「ＵＡＡ」、「ＵＧＡ」、または「ＵＡＧ」からなる群から選択されてもよい。
【０１３１】
図８を参照すると、少なくとも１つの非核酸部分２０１が使用されて、環状コンストラクト２００が調製されることができ、ここで、非核酸部分２０１は、第１の隣接領域２０４が第２の隣接領域２０６の近くに導かれるように使用される。本発明で使用されてもよい非核酸部分の非限定的例は、本明細書に記載される。環状コンストラクト２００は、２つ以上の非核酸部分を含んでなってもよく、追加的な非核酸部分は、第１の非核酸部分と異種であってもまたは同種であってもよい。
【０１３２】
図９を参照すると、連結ヌクレオシド２０２の第１の領域は、スペーサー領域２１４を含んでなってもよい。このスペーサー領域２１４が使用されることにより、環状コンストラクトが２つ以上のオープンリーディングフレーム、非コード領域またはオープンリーディングフレーム、および非コード領域を含み得るように、連結ヌクレオシド２０２の第１の領域が分離され得る。
【０１３３】
図１０を参照すると、第２の隣接領域２０６は、３’ＵＴＲ  ２１２中に１つまたは複数のセンサー領域２１６を含んでなってもよい。本明細書で考察されるように、これらのセンサー配列は、環状コンストラクトの局所微小環境のリガンドのための疑似受容体（または結合部位）として機能する。例えば、マイクロＲＮＡ結合部位またはｍｉＲＮＡシードは、それらが環状ポリヌクレオチドの環境内に存在する任意のマイクロＲＮＡの疑似受容体として機能するように、センサーとして使用されてもよい。図９に示されるように、１つまたは複数のセンサー領域２１６は、スペーサー領域２１４によって隔てられてもよい。
【０１３４】
図１１に示されるように、１つまたは複数のセンサー領域２１６を含む環状コンストラクト２００は、連結ヌクレオシド２０２中の第１の領域内にスペーサー領域２１４もまたも含んでもよい。上で図７について考察されるように、このスペーサー領域２１４が使用されることにより、環状コンストラクトが２つ以上のオープンリーディングフレームおよび／または２つ以上の非コード領域を含み得るように、連結ヌクレオシド２０２の第１の領域が分離され得る。
【０１３５】
図１２を参照すると、環状コンストラクト２００は、センサー領域２１６などであるが、これに限定されるものではない、少なくとも１つの非コード領域を含んでなるｃｉｒｃＳＰとして知られている、非コードコンストラクトであってもよい。センサー領域２１６のそれぞれは、ｍｉＲ配列、ｍｉＲシード、ｍｉＲ結合部位および／またはシードなしのｍｉＲ配列を含んでもよいが、これに限定されるものではない。
【０１３６】
図１３を参照すると、少なくとも１つの非核酸部分２０１が使用されて、非コードコンストラクトである環状コンストラクト２００が調製されてもよい。非コードコンストラクトである環状コンストラクト２００は、２つ以上の非核酸部分を含んでなってもよく、その中で追加的な非核酸部分は、第１の非核酸部分と異種であってもまたは同種であってもよい。
【０１３７】
環状ポリヌクレオチド、環状ポリヌクレオチドを含んでなる製剤および組成物、および
環状ポリヌクレオチドを製造、使用、および投与する方法は、その内容全体が参照により援用される、同時係属国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／５３９０４号明細書（代理人整理番号Ｍ５１．２０）にもまた記載される。
【０１３８】
ポリヌクレオチド多量体
本発明によれば、複数の異なるキメラポリヌクレオチドおよび／またはＩＶＴポリヌクレオチドは、３’末端で修飾されたヌクレオチドを使用して、３’末端を介して共に連結されてもよい。化学的コンジュゲーションが使用されて、細胞内送達の化学量論比が調節されてもよい。例えば、グリオキシル酸回路酵素、イソクエン酸リアーゼ、およびリンゴ酸シンターゼが細胞内に１：１の比率で提供されて、細胞脂肪酸代謝が改変されてもよい。この比率は、１つのポリヌクレオチド種上の３’−アジド末端ヌクレオチドと、対向するポリヌクレオチド生物種上のＣ５−エチニルまたはアルキニル含有ヌクレオチドとを使用して、キメラポリヌクレオチドおよび／またはＩＶＴポリヌクレオチドを化学的に連結することで調節されてもよい。修飾ヌクレオチドは、マサチューセッツ州イプスウィッチ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）のニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）の末端トランスフェラーゼを使用して、製造業者のプロトコルに従って、転写後に付加される。３’−修飾ヌクレオチドの付加後、文献に記載されるようにして、２つのポリヌクレオチド種が銅の存在または不在下において、水溶液中で組み合わされて、クリックケミストリー機序を通じて、新規共有結合が形成されてもよい。
【０１３９】
別の実施例では、官能化リンカー分子が使用されて、３つ以上のキメラポリヌクレオチドおよび／またはＩＶＴポリヌクレオチドが共に連結されてもよい。例えば、官能化糖類分子は、化学修飾されて、複数の化学反応基（ＳＨ−、ＮＨ２−、Ｎ３など）を含有し、３’−官能化ｍＲＮＡ分子上の同族の部分（すなわち、３’−マレイミドエステル、３’−ＮＨＳ−エステル、アルキニル）と反応してもよい。修飾糖類上の反応基数は、化学量論的方法で調節されて、コンジュゲートされたキメラポリヌクレオチドおよび／またはＩＶＴポリヌクレオチドの化学量論比が直接調節され得る。
【０１４０】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドおよび／またはＩＶＴポリヌクレオチドは、一定パターンで共に連結されてもよい。パターンは、ＣＤ［ＣＤ］ｘなどの単純な交互パターンであってもよく、式中、各「Ｃ」および各「Ｄ」は、キメラポリヌクレオチド、ＩＶＴポリヌクレオチド、異なるキメラポリヌクレオチドまたは異なるＩＶＴポリヌクレオチドを表す。パターンは、ｘ回繰り返されてもよく、式中、ｘ＝１〜３００である。パターンはまた、ＣＣＤＤ［ＣＣＤＤ］ｘ（交互の二重繰り返し）などの交互の繰り返し、またはＣＣＣＤＤＤ［ＣＣＣＤＤＤ］ｘ（交互の三重繰り返し）パターンであってもよい。交互の二重繰り返しまたは交互の三重繰り返しは、ｘ回繰り返されてもよく、式中、ｘ＝１〜３００である。
【０１４１】
ポリヌクレオチドのコンジュゲートおよび組み合わせ
タンパク質生成をさらに向上させるために、本発明のポリヌクレオチドは、その他のポリヌクレオチド、染料、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラーレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進薬（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ、例えば糖タンパク質などのタンパク質、または例えば共リガンドのための特異的親和性を有する分子などのペプチド、または例えばがん細胞または内皮細胞または骨細胞などの指定された細胞型と結合する抗体などの抗体、ホルモンおよびホルモン受容体、脂質やレクチンや炭水化物やビ
タミンや補助因子などの非ペプチド化学種、または薬剤にコンジュゲートされるように設計され得る。
【０１４２】
コンジュゲーションは、安定性および／または半減期の増大をもたらしてもよく、特に、細胞、組織または生物内の特定部位へのポリヌクレオチドの標的化において有用であってもよい。
【０１４３】
本発明によれば、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒性ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重らせん形成を誘発するＲＮＡ、アプタマー、またはベクターなどの１つまたは複数と共に、またはそれらにコンジュゲートされて投与されてもよく、またはそれらをさらにコードしてもよい。
【０１４４】
ナノ粒子製剤は、ホスフェートコンジュゲートを含んでなってもよい。ホスフェートコンジュゲートは、インビボ循環時間を増大させてもよくおよび／またはナノ粒子の標的化送達を増大させてもよい。本発明によって使用するためのホスフェートコンジュゲートは、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０３３４３８号パンフレット、または米国特許出願公開第２０１３０１９６９４８号明細書に記載される方法によって製造されてもよい。非限定的例として、ホスフェートコンジュゲートは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０３３４３８号パンフレットに記載される式のいずれか１つの化合物を含んでもよい。
【０１４５】
ナノ粒子製剤は、ポリマーコンジュゲートを含んでなってもよい。ポリマーコンジュゲートは、可溶性コンジュゲートであってもよい。ポリマーコンジュゲートは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３００５９３６０号明細書に記載されるような構造を有してもよい。一態様では、本発明のポリヌクレオチドとコンジュゲートされるポリマーは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３００７２７０９号明細書に記載される方法および／またはゼグメント化高分子試薬を使用して製造されてもよい。別の態様では、ポリマーコンジュゲートは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１９６９４８号明細書に記載されるポリマーコンジュゲートなどであるが、これに限定されるものではない、環状部分を含んでなるペンダント側鎖基を有してもよい。
【０１４６】
ナノ粒子製剤は、コンジュゲートを含んでなり、対象における本発明のナノ粒子の送達を促進してもよい。さらに、コンジュゲートは、対象におけるナノ粒子の食作用クリアランスを阻害してもよい。一態様では、コンジュゲートは、ヒト膜タンパク質ＣＤ４７から設計された「自己」ペプチドであってもよい。（例えば「自己」粒子は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、ロドリーグ（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ）ら著、（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２０１３年、第３３９巻、ｐ９７１〜９７５））によって記載される。ロドリーグ（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ）らによって示されるように、自己ペプチドは、ナノ粒子のマクロファージ媒介性クリアランスを遅延させ、それはナノ粒子送達を促進した。別の態様では、コンジュゲートは、膜タンパク質ＣＤ４７であってもよい（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、ロドリーグ（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ）ら著、（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２０１３年、第３３９巻、ｐ９７１〜９７５）を参照されたい）。ロドリーグ（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ）らは、「自己」ペプチドと同様に、ＣＤ４７が、スクランブルされたペプチドおよびＰＥＧ被覆ナノ粒子と比較して、対象中の循環粒子の比率を増大させ得ることを示した。
【０１４７】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドはナノ粒子に製剤化され、それはコンジュゲートを含んでなり、対象における本発明のナノ粒子の送達を促進する。コンジュゲート
は、ＣＤ４７膜であってもよく、またはコンジュゲートは、既述の「自己」ペプチドなどのＣＤ４７膜タンパク質から誘導されてもよい。別の態様では、ナノ粒子は、ＰＥＧ、およびＣＤ４７のコンジュゲートまたはその誘導体を含んでなってもよい。さらに別の態様では、ナノ粒子は、上述の「自己」ペプチドおよび膜タンパク質ＣＤ４７の両方を含んでなってもよい。
【０１４８】
別の態様では、「自己」ペプチドおよび／またはＣＤ４７タンパク質は、本発明のポリヌクレオチドの送達について本明細書に記載されるように、ウイルス様粒子または偽ウイルス粒子にコンジュゲートされてもよい。
【０１４９】
別の実施形態では、医薬組成物は、本発明のポリヌクレオチドと、分解できる結合を有してもよいコンジュゲートとを含んでなる。コンジュゲートの非限定的例としては、イオン化可能水素原子を含んでなる芳香族部分、スペーサー部分、および水溶性ポリマーが挙げられる。非限定的例として、分解できる結合があるコンジュゲートを含んでなる医薬組成物、およびこのような医薬組成物を送達する方法は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１８４４４３号明細書に記載される。
【０１５０】
二機能性ポリヌクレオチド
本発明の一実施形態では、二機能性ポリヌクレオチド（例えば、二機能性ＩＶＴポリヌクレオチド、二機能性キメラポリヌクレオチドまたは二機能環状ポリヌクレオチド）がある。名称が暗示するように、二機能性ポリヌクレオチドは、少なくとも２つの機能を有するか、またはその能力があるものである。これらの分子はまた、慣例によって、多機能と称されてもよい。
【０１５１】
二機能性ポリヌクレオチドの多機能性は、ＲＮＡによってコードされてもよく（機能は、コードされる生成物が翻訳されるまで、顕在化しなくてもよい）、またはポリヌクレオチド自体の特性であってもよい。それは、構造的または化学的であってもよい。二機能性修飾ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと共有結合的に、または静電気的に結合する機能を含んでなってもよい。さらに、２つの機能は、キメラポリヌクレオチドと別の分子との合体に関連して提供されてもよい。
【０１５２】
二機能性ポリヌクレオチドは、抗増殖性であるペプチドをコードしてもよい。これらのペプチドは、直鎖、環状、拘束またはランダムコイルであってもよい。それらは、アプタマー、シグナル伝達分子、リガンド、またはそれらの模倣体またはミメティックとして機能してもよい。抗増殖性ペプチドは、翻訳されると、３〜５０アミノ酸長であってもよい。それらは、５〜４０、１０〜３０、またはおよそ１５アミノ酸長であってもよい。それらは、一本鎖、多連鎖または分枝であってもよく、ひとたび翻訳されると、複合体、凝集体または任意の多ユニット構造を形成してもよい。
【０１５３】
非コードポリヌクレオチド
本明細書に記載されるように、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、例えば非コード領域を有するなど、部分的にまたは実質的に翻訳可能でない配列を含んでなってもよい。非限定的一例として、非コード領域は、ＩＶＴポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドの第１の領域であってもよい。あるいは、非コード領域は、第１の領域以外の領域であってもよい。別の非限定的例として、非コード領域は、キメラポリヌクレオチドのＡ、Ｂおよび／またはＣ領域であってもよい。
【０１５４】
このような分子は、通常、翻訳されないが、リボソームタンパク質または移転ＲＮＡ（ｔＲＮＡ：ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＲＮＡ）などの、１つまたは複数の翻訳機構構成要素への結合および隔離の１つまたは複数によって、タンパク質生成に対する効果を発揮し得、そ
れによって細胞内のタンパク質発現を効果的に低下させるか、または細胞内の１つまたは複数の経路またはカスケードを調節して、それは次にタンパク質レベルを変化させる。ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ：ｌｏｎｇ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ、またはｌｉｎｃＲＮＡ）またはその一部、小型核小体ＲＮＡ（ｓｎｏ−ＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ：ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはＰｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を含有するか、またはそれをコードしてもよい。そのいずれでもポリヌクレオチド中でコードされてもよいｌｎｃＲＮＡを標的化するように設計されたこのようなｌｎｃＲＮＡ分子およびＲＮＡｉコンストラクトの例は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１２／０１８８８１  Ａ２号パンフレットで教示される。
【０１５５】
目的のポリペプチド
本発明のポリヌクレオチドは、目的の１つまたは複数のペプチドまたはポリペプチドをコードしてもよい。目的のペプチドまたはポリペプチドは、例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異などの少なくとも１つの変異を含んでなってもよい。非限定的例として、目的のペプチドまたはポリペプチドは、例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異などの、少なくとも２つの変異を含んでなるＬＤＬＲタンパク質であってもよい。本発明のポリヌクレオチドはまた、１つまたは複数のペプチドまたはポリペプチドのレベル、シグナル伝達または機能に影響を及ぼしてもよい。目的のポリペプチドとしては、ＬＤＬＲ、野性型ＬＤＬＲおよびＬＤＬＲ変異体および本明細書の表３、１０および１１で教示されるもの、または、例えば、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国仮特許出願第６１／６１８，８６２号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６４５号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１３０号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８６６号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６４７号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１３４号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８６８号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６４８号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１３５号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８７３号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６５０号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１４７号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８７８号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６５４号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１５２号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８８５号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６５８号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１５５号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８９６号明細書、米国仮特許出願第６１／６６８，１５７号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６６１号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１６０号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，９１１号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６６７号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１６８号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，９２２号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６７５号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１７４号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，９３５号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６８７号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１８４号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，９４５号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６９６号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１９１号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，９５３号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，７０４号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，２０３号明細書の表６、米国仮特許出願第６１／６８１，７２０号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，２１３号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，７４２号明細書の表６および７；国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６８号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６３号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６９号パンフレッ
ト、国際公開第２０１３１５１６７０号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６４号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６５号パンフレット、国際公開第２０１３１５１７３６号パンフレットの表６；国際公開第２０１３１５１６７２号パンフレットの表６および７；国際公開第２０１３１５１６７１号パンフレットの表６、１７８、および１７９；米国仮特許出願第６１／６１８，８７０号明細書の表６、２８、および２９；米国仮特許出願第６１／６８１，６４９号明細書の表６、５６、および５７；米国仮特許出願第６１／７３７，１３９号明細書の表６、１８６、および１８７；国際公開第２０１３１５１６６７号パンフレットの表６、１８５、および１８６に列挙されるもののいずれかが挙げられる。
【０１５６】
本発明によれば、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の目的のポリペプチドまたはその断片をコードするように設計されてもよい。このような目的のポリペプチドとしては、独立して、ポリヌクレオチドの１つまたは複数の領域または部分またはその全体によってコードされてもよい、ポリペプチド全体、複数のポリペプチドまたはポリペプチド断片が挙げられるが、これに限定されるものではない。本明細書の用法では、「目的のポリペプチド」という用語は、本発明のポリヌクレオチド内でコードされるように選択され、またはその機能が本発明のポリヌクレオチドによって影響を受ける、任意のポリペプチドを指す。
【０１５７】
本明細書の用法では、「ポリペプチド」は、ほとんどの場合、ペプチド結合によって共に連結する、アミノ酸残基（天然または非天然）のポリマーを意味する。用語は、本明細書の用法では、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを指す。場合によっては、コードされるポリペプチドが約５０アミノ酸よりも小型であれば、ポリペプチドはペプチドと称される。ポリペプチドがペプチドである場合、それは少なくとも約２、３、４、または少なくとも５アミノ酸残基長である。したがって、ポリペプチドとしては、遺伝子産物、天然起源ポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、パラログ、前述の断片およびその他の均等物、変異型、およびアナログが挙げられる。ポリペプチドは、単一分子であってもよく、または二量体、三量体または四量体などの多重分子複合体であってもよい。それらはまた、抗体またはインスリンなどの一本鎖または多連鎖ポリペプチドを含んでなってもよく、結合または連鎖してもよい。通常、多連鎖ポリペプチドには、ジスルフィド結合が見られる。ポリペプチドという用語はまた、その中で１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工化学的類似体である、アミノ酸ポリマーにも適用されてもよい。
【０１５８】
「ポリペプチド変異型」という用語は、それらのアミノ酸配列が、天然または参照配列とは異なる分子を指す。アミノ酸配列変異型は、天然または参照配列と比較して、アミノ酸配列中の特定の位置に置換、欠失、および／または挿入を有してもよい。通常、変異型は、天然または参照配列と、少なくとも約５０％の同一性（相同性）、少なくとも約６０％の同一性、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９９％の同一性を有する。好ましくは、それらは、天然または参照配列と、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％同一（相同的）である。
【０１５９】
いくつかの実施形態では「変異型模倣体」が提供される。本明細書の用法では、「変異型模倣物」という用語は、活性化配列を模倣する１つまたは複数のアミノ酸を含有するものである。例えば、グルタミン酸は、ホスホロスレオニンおよび／またはホスホロセリンの模倣体の役割を果たしてもよい。あるいは、変異型模倣体は、不活性化をもたらすか、または模倣物を含有する不活性化生成物をもたらしてもよく、例えば、フェニルアラニンは、チロシンの活性化置換の機能を果たしてもよく；またはアラニンは、セリンの不活性化置換の機能を果たしてもよい。
【０１６０】
アミノ酸配列に適用される「相同性」は、配列を整列させて、必要ならば、最大パーセント相同性を達成するために、ギャップを導入した後に、第２の配列のアミノ酸配列中の残基と同一である候補アミノ酸配列中の残基の百分率と定義される。アライメントのための方法およびコンピュータプログラムは、当該技術分野で周知である。相同性は、パーセント同一性の計算に依存するが、計算に導入されたギャップおよびペナルティのために、値が異なってもよいものと理解される。
【０１６１】
ポリペプチド配列に適用される「ホモログ」は、第２の生物種の第２の配列と実質的な同一性を有する、その他の生物種の対応する配列を意味する。
「アナログ」は、例えば、アミノ酸残基の置換、付加または欠失などの、１つまたは複数のアミノ酸改変によって異なるが、依然として、親または出発ポリペプチドの特性の１つまたは複数を保つ、ポリペプチド変異型を含むことが意図される。
【０１６２】
本発明は、変異型および誘導体を含む、ポリペプチドベースの数種類の組成物を検討する。これらとしては、置換的、挿入的、欠失的、および共有結合的な変異型および誘導体が挙げられる。「誘導体」という用語は、「変異型」という用語の同意語として使用されるが、通常、参照分子または出発分子との比較で、何らかの方法で修飾されかつ／または変化した分子を指す。
【０１６３】
したがって、参照配列、特に本明細書で開示されるポリペプチド配列との比較で、置換、挿入および／または付加、欠失、および共有結合修飾を含有する、ペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明の範囲内に含まれる。例えば、１つまたは複数のリジンなどの配列タグまたはアミノ酸が、本発明のペプチド配列に付加され得る（例えば、Ｎ末端またはＣ末端に）。ペプチド精製または局在化のために、配列タグが使用され得る。ペプチド溶解度を増大させ、またはビオチン化を可能にするために、リジンが使用され得る。あるいは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシおよびアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基が任意選択的に欠失して、トランケート型配列を提供してもよい。あるいは、特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端またはＮ末端残基）は、例えば、可溶性のより大型の配列の一部としての配列発現などの配列の用途次第で、欠失するか、または固体担体に結合されてもよい。
【０１６４】
「置換変異型」は、ポリペプチドに言及する場合、天然配列または出発配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、それに変えて同一位置に異なるアミノ酸挿入されているものである。置換は、分子中の１つのアミノ酸のみが置換されている単一置換であってもよく、または同一分子中の２つ以上のアミノ酸が置換されている多置換であってもよい。
【０１６５】
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ＬＤＬＲタンパク質の置換変異型をコードする。置換変異型は、１つ、２つ、３つまたは４つ以上の置換を含んでなってもよい。非限定的例として、１つ、２つ、３つまたは４つ以上の置換は、ＬＤＬＲタンパク質のＥＧＦ−Ａドメインに位置してもよい。別の非限定的例として、１つまたは複数の置換は、ＬＤＬＲタンパク質のＩＤＯＬ相互作用ドメインに位置してもよい。別の非限定的例として、１つまたは複数の置換は、ＬＤＬＲタンパク質のＰＣＳＫ９相互作用ドメインに位置してもよい。さらに別の非限定的例として、置換は、ＬＤＬＲタンパク質のＩＤＯＬ相互作用ドメインおよびＰＣＳＫ９相互作用ドメインに位置してもよい。さらに別の非限定的例として、置換は、ＥＧＦ−ＡドメインおよびＩＤＯＬ相互作用ドメインに位置してもよい。さらに別の非限定的例として、置換は、ＥＧＦ−ＡドメインおよびＰＣＳＫ９相互作用ドメインに位置してもよい。さらに別の非限定的例として、置換は、ＰＣＳＫ９相互作用ドメインおよびＩＤＯＬ相互作用ドメインに位置してもよい。
【０１６６】
一実施形態では、置換変異型は、変異と称される。本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ以上の変異を含んでなってもよい。非限定的例として、ポリヌクレオチドは、ＬＤＬＲタンパク質のＥＧＦ−Ａドメインに少なくとも１つの変異を含んでなる、ＬＤＬＲタンパク質をコードする。非限定的例として、ポリヌクレオチドは、ＬＤＬＲタンパク質のＩＤＯＬ相互作用ドメインに少なくとも１つの変異を含んでなる、ＬＤＬＲタンパク質をコードする。非限定的例として、ポリヌクレオチドは、ＬＤＬＲタンパク質のＰＣＳＫ９結合ドメインに少なくとも１つの変異を含んでなる、ＬＤＬＲタンパク質をコードする。非限定的例として、ポリヌクレオチドは、ＬＤＬＲタンパク質のＩＤＯＬ相互作用ドメインおよびＰＣＳＫ９相互作用ドメインに少なくとも１つの変異を含んでなる、ＬＤＬＲタンパク質をコードする。非限定的例として、ポリヌクレオチドは、ＥＧＦ−ＡドメインおよびＩＤＯＬ相互作用ドメインに少なくとも１つの変異を含んでなる、ＬＤＬＲタンパク質をコードする。非限定的例として、ポリヌクレオチドは、ＰＣＳＫ９相互作用ドメインおよびＩＤＯＬ相互作用ドメインに少なくとも１つの変異を含んでなる、ＬＤＬＲタンパク質をコードする。
【０１６７】
本明細書の用法では「保存的アミノ酸置換」という用語は、通常配列中に存在するアミノ酸を、類似したサイズ、電荷、または極性の異なるアミノ酸に換える置換を指す。保存的置換の例としては、別の非極性残基による、イソロイシン、バリン、およびロイシンなどの非極性（疎水性）残基の置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例としては、アルギニンおよびリジン間、グルタミンおよびアスパラギン間、およびグリシンおよびセリン間などの、別の残基極性（親水性）による極性（親水性）残基の置換が挙げられる。さらに、別の塩基性残基によるリジン、アルギニンまたはヒスチジンなどの塩基性残基の置換、または別の酸性残基によるアスパラギン酸またはグルタミン酸などの酸性残基の置換は、保存的置換の追加的な例である。非保存的置換の例としては、システイン、グルタミン、グルタミン酸またはリジンなどの極性（親水性）残基による、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基の置換および／または非極性残基による極性残基の置換が挙げられる。
【０１６８】
「挿入変異型」は、ポリペプチドに言及する場合、天然配列または出発配列中の特定位置のアミノ酸に直接隣接して、１つまたは複数のアミノ酸が挿入されたものである。アミノ酸に「直接隣接する」とは、アミノ酸のα−カルボキシまたはα−アミノ官能基のいずれかに結合することを意味する。
【０１６９】
「欠失変異型」は、ポリペプチドに言及する場合、天然アミノ酸配列または出発アミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸が除去されたものである。通常、欠失変異型は、１つまたは複数のアミノ酸が、分子の特定領域で欠失している。
【０１７０】
「共有結合誘導体」は、ポリペプチドに言及する場合、有機タンパク性または非タンパク性誘導体化剤による、および／または翻訳後修飾による、天然タンパク質または出発タンパク質の修飾を含む。共有結合修飾は、従来、タンパク質の標的アミノ酸残基剤と、選択された側鎖または末端残基と反応する能力がある有機誘導体化剤とを反応させることで、または選択された組換え宿主細胞内で機能する翻訳後修飾の機構を活用することで、導入されている。結果として生じる共有結合誘導体は、生物学的活性にとって、免疫測定法にとって、または組換え体糖タンパク質のイムノアフィニティー精製のための抗タンパク質抗体の調製にとって、重要な残基の同定を目的とするプログラムにおいて、有用である。このような修飾は、当技術分野の技術の範囲内であり、過度の実験なく実施される。
【０１７１】
特定の翻訳後修飾は、発現したポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、しばしば翻訳後に脱アミドされて、対応
するグルタミルおよびアスパルチル残基になる。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミドされる。これらの残基のいずれの形態も、本発明に従って生成されたポリペプチドに存在してもよい。
【０１７２】
その他の翻訳後修飾としては、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化が挙げられる（Ｔ．Ｅ．クレイグトン（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）著、「タンパク質：構造および分子特性（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）」、サンフランシスコ、米国、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．）１９８３年、ｐ７９〜８６）。
【０１７３】
「特徴」は、ポリペプチドに言及する場合、分子の特徴的なアミノ酸配列ベースの構成要素と定義される。本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特徴としては、表面顕在化、局所性立体構造的形状、折り畳み、ループ、半ループ、ドメイン、半ドメイン、部位、末端、または任意のそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１７４】
本明細書の用法では、ポリペプチドに言及する場合、「表面発現」という用語は、最外側の表面に出現する、タンパク質のポリペプチドベースの構成要素を指す。
本明細書の用法では、ポリペプチドに言及する場合、「局所性立体構造的形状」という用語は、タンパク質の限定できる空間内に位置する、タンパク質のポリペプチドベースの構造的発現を意味する。
【０１７５】
本明細書の用法では、ポリペプチドに言及する場合、「折り畳み」という用語は、エネルギー最小化時に、結果として生じるアミノ酸配列の立体構造を指す。折り畳みは、折りたたみ過程の二次的または三次的レベルで起こってもよい。二次的レベル折り畳みの例としては、βシートおよびαらせんが挙げられる。三次的折り畳みの例としては、エネルギー力の凝集または分離のために形成される、ドメインおよび領域が挙げられる。このようにして形成される領域としては、疎水性および親水性ポケットなどが挙げられる。
【０１７６】
本明細書の用法では、タンパク質立体構造に関わる「曲がり」という用語は、ペプチドまたはポリペプチド主鎖の方向を変化させて、１つ、２つ、３つまたはそれを超えるアミノ酸残基が関与してもよい、曲がりを意味する。
【０１７７】
本明細書の用法では、ポリペプチドに言及する場合、「ループ」という用語は、ペプチドまたはポリペプチド主鎖の方向を逆転させるのに役立ってもよい、ポリペプチドの構造的特徴を指す。ループがポリペプチドに見られて、主鎖の方向を変化させるのみである場合、それは４つ以上のアミノ酸残基を含んでなってもよい。オリバ（Ｏｌｉｖａ）らは、少なくとも５クラスのタンパク質ループを同定した（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ）、１９９７年、第２６６巻、第４号、ｐ８１４〜８３０）。ループは、開放型または閉鎖型であってもよい。閉鎖型ループまたは「環式」ループは、架橋部分間に、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超えるアミノ酸を含んでなってもよい。このような架橋部分は、ジスルフィド架橋を有するポリペプチドに典型的なシステイン−システイン架橋（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ）を含んでなってもよく、または代案として架橋部分は、本明細書で使用されるジブロモジルイル剤などの非タンパク質ベースであってもよい。
【０１７８】
本明細書の用法では、ポリペプチドに言及する場合、「半ループ」という用語は、それが由来するループとして同定されたループに属するアミノ酸数の少なくとも半分を有する部分を指す。ループは、常に偶数のアミノ酸残基を含有しなくてもよいものと理解される
。したがって、ループが奇数のアミノ酸を含有しまたはそれを含んでなると同定された場合、奇数ループの半ループは、ループの整数部分または次の整数部分を含んでなる（ループ／２＋／−０．５アミノ酸のアミノ酸数）。例えば、７アミノ酸ループとして同定されたループは、３アミノ酸または４アミノ酸の半ループを生じ得る（７／２＝３．５＋／−０．５は３または４である）。
【０１７９】
本明細書の用法では、ポリペプチドに言及する場合、「ドメイン」という用語は、１つまたは複数の識別可能な構造特性または機能特性または性質（例えば、結合能力、タンパク質−タンパク質相互作用部位の役割を果たす）を有するポリペプチドのモチーフを指す。
【０１８０】
本明細書の用法では、ポリペプチドに言及する場合、「半ドメイン」という用語は、それが由来するドメインとして同定されたドメインに属するアミノ酸数の少なくとも半分を有する部分を指す。ドメインは、常に偶数のアミノ酸残基を含有しなくてもよいものと理解される。したがって、ドメインが奇数のアミノ酸を含有しまたはそれを含んでなると同定された場合、奇数ドメインの半ドメインは、ドメインの整数部分または次の整数部分を含んでなる（ドメイン／２＋／−０．５アミノ酸のアミノ酸数）。例えば、７アミノ酸ドメインとして同定されたドメインは、３アミノ酸または４アミノ酸の半ドメインを生じ得る（７／２＝３．５＋／−０．５は３または４である）。ドメインまたは半ドメイン内にサブドメインが同定されてもよく、これらのサブドメインが、それらが由来するドメインまたは半ドメイン中で同定された構造特性または機能的性質の全てに満たない、構造特性または機能的性質を保持することもまた理解される。本明細書のドメインタイプのいずれかを含んでなるアミノ酸が、ポリペプチド主鎖に沿って連続していなくてもよいこともまた理解される（すなわち、非隣接アミノ酸は構造的に折り畳まれて、ドメイン、半ドメインまたはサブドメインを生じてもよい）。
【０１８１】
本明細書の用法では、ポリペプチドに言及する場合、アミノ酸ベースの実施形態に関する「部位」という用語は、「アミノ酸残基」および「アミノ酸側鎖」の同意語として使用される。部位は、本発明のポリペプチドベースの分子中で、修飾され、操作され、改変され、誘導体化され、または変動してもよい、ペプチドまたはポリペプチド内の位置を表す。
【０１８２】
本明細書の用法では「複数の末端」または「１つの末端」という用語は、ポリペプチドに言及する場合、ペプチドまたはポリペプチドの端を指す。このような端は、ペプチドまたはポリペプチドの最初のまたは最後の部位のみに限定されず、末端領域に追加的なアミノ酸を含んでもよい。本発明のポリペプチドベースの分子は、Ｎ末端（遊離アミノ基（ＮＨ２）があるアミノ酸によって終結する）およびＣ末端（遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）があるアミノ酸によって終結する）の両方を有することで、特徴付けられてもよい。本発明のタンパク質は、場合によっては、ジスルフィド結合によって、または非共有結合力によってまとめられた、複数のポリペプチド鎖（多量体、オリゴマー）で構成される。これらの種類のタンパク質は、複数のＮ末端およびＣ末端を有する。あるいは、ポリペプチド末端は、場合によっては、有機コンジュゲートなどの非ポリペプチドベース部分によって開始しまたは終結するように、修飾されてもよい。
【０１８３】
これらの特徴のいずれかが、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの所望の構成要素として同定されまたは定義された後、移動、交換、反転、欠失、ランダム化、または複製によって、これらの特徴のいくつかの操作および／または修飾のいずれかを実施してもよい。さらに、特徴の操作は、本発明の分子に対する修飾と同一の結果をもたらしてもよいものと理解される。例えば、ドメインの欠失を伴う操作は、全長分子未満をコードする核酸の修飾と全く同じように、分子長の改変をもたらす。
【０１８４】
修飾および操作は、部位特異的変異誘発または化学合成中における推測的組み込みなどであるが、これに限定されるものではない、当該技術分野で公知の方法によって達成され得る。次に結果として生じる修飾分子は、本明細書に記載されるもの、または当該技術分野で公知の任意のその他の適切なスクリーニングアッセイなどのインビトロまたはインビボアッセイを使用して、活性について試験されてもよい。
【０１８５】
本発明によれば、ポリペプチドは、一連の実験を通じて発見されるコンセンサス配列を含んでなってもよい。本明細書の用法では、「コンセンサス」配列は、１つまたは複数の部位における変動性を許容する集合的配列集団を表す単一の配列である。
【０１８６】
当業者によって認識されるように、タンパク質断片、機能的タンパク質ドメイン、および相同タンパク質もまた、本発明の目的のポリペプチドの範囲内と見なされる。例えば、本明細書で提供されるのは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００を超えるアミノ酸長の参照タンパク質の任意のタンパク質断片（少なくとも１つのアミノ酸残基が参照ポリペプチド配列よりも短いが、その他の点では同一のポリペプチド配列を意味する）である。別の実施例では、本明細書に記載される配列のいずれかと、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％同一である、一続きの約２０、約３０、約４０、約５０、または約１００アミノ酸を含む任意のタンパク質が、本発明に従って使用され得る。特定の実施形態では、本発明に従って使用されるポリペプチドは、本明細書で提供されまたは参照される配列のいずれかで示されるように、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれを超える変異を含む。
【０１８７】
目的のポリペプチドのタイプ
本発明のポリヌクレオチドは、生物製剤、抗体、ワクチン、治療用タンパク質もしくはペプチド、細胞透過性ペプチド、分泌タンパク質、原形質膜タンパク質、細胞質もしくは細胞骨格タンパク質、細胞内膜結合タンパク質、核タンパク質、ヒト疾患に関連したタンパク質、標的部分、またはそれに対していかなる治療指標も同定されていないが、それでもなお研究および発見の分野において有用性を有するヒトゲノムによってコードされたタンパク質を含むが、これに限定されるものではない、いくつかの標的カテゴリーのいずれかから選択される、目的のポリペプチドをコードするように設計されてもよい。非限定的例として、本発明のポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレットに記載されるような、生物製剤、抗体、ワクチン、治療用タンパク質もしくはペプチド、細胞透過性ペプチド、分泌タンパク質、原形質膜タンパク質、細胞質内もしくは細胞骨格タンパク質、細胞内膜結合タンパク質、核タンパク質、ヒト疾患に関連したタンパク質をコードするように設計されてもよい。
【０１８８】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、参照ポリペプチド配列といくらかの同一性がある変異型ポリペプチドをコードしてもよい。本明細書の用法では、「参照ポリペプチド配列」は、出発ポリペプチド配列を指す。参照配列は、野性型配列であっても、または別の配列の設計でそれに言及される任意の配列であってもよい。「参照ポリペプチド配列」は、例えば、野生型ＬＤＬＲ、または少なくとも１つの変異（例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異）を含んでなるＬＤＬＲ、本明細書の表３、表１０、および表１１に記載されるポリペプチドのいずれか、またはそれぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国仮特許出願第６１／６１８，８６２号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６４５号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１３０号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８６６号明細書、米国仮特許出願第６１／６
８１，６４７号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１３４号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８６８号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６４８号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１３５号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８７３号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６５０号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１４７号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８７８号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６５４号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１５２号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８８５号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６５８号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１５５号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，８９６号明細書、米国仮特許出願第６１／６６８，１５７号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６６１号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１６０号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，９１１号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６６７号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１６８号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，９２２号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６７５号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１７４号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，９３５号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６８７号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１８４号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，９４５号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，６９６号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，１９１号明細書、米国仮特許出願第６１／６１８，９５３号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，７０４号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，２０３号明細書の表６；米国仮特許出願第６１／６８１，７２０号明細書、米国仮特許出願第６１／７３７，２１３号明細書、米国仮特許出願第６１／６８１，７４２号明細書の表６および７；国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６８号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６３号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６９号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６７０号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６４号パンフレット、国際公開第２０１３１５１６６５号パンフレット、国際公開第２０１３１５１７３６号パンフレットの表６；国際公開第２０１３１５１６７２号パンフレットの表６および７；国際公開第２０１３１５１６７１号パンフレットの表６、１７８、および１７９；米国仮特許出願第６１／６１８，８７０号明細書の表６、２８、および２９；米国仮特許出願第６１／６８１，６４９号明細書の表６、５６、および５７；米国仮特許出願第６１／７３７，１３９号明細書の表６、１８６、および１８７；国際公開第２０１３１５１６６７号パンフレットの表６、１８５、および１８６で開示されるポリペプチドのいずれか１つなどのＬＤＬＲタンパク質であってもよい。非限定的例として、参照ポリペプチド配列は、任意のコードする低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）またはその変異型であってもよい。
【０１８９】
参照分子（ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）は、設計された分子（ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）と、いくらかの同一性を共有してもよい。当該技術分野で公知の「同一性」という用語は、配列を比較することで判定される、２つ以上のペプチド、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列間の関係性を指す。当該技術分野では、同一性はまた、一連の２つ以上のアミノ酸残基またはヌクレオシド間の一致数によって決まる、それらの配列間の関連性の程度も意味する。同一性は、特定の数理モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって対処される、（存在する場合）ギャップアライメントがある、２つ以上の配列のより小さい方の間の完全な一致のパーセントを測定する。関連ペプチドの同一性は、公知の方法によって、容易に計算され得る。このような方法としては、レスク，Ａ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編集、「コンピュータによる分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、オックスフォード大学出版、ニューヨーク、１９８８年；スミス，Ｄ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編集、「バイオコンピューティング：インフォマティクスおよびゲノムプロジェクツ（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ
）、ニューヨーク、１９９３年；グリフィン，Ａ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）およびグリフィン，Ｈ．Ｇ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）編集、「配列データのコンピュータ解析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ）」、第１部、ヒュマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー、１９９４年；フォン・ヘインジュ，Ｇ．（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．）著、「分子生物学における配列解析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年；グリブスコブ，Ｍ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．）およびデブルー，Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）編集、「配列解析入門書（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ）」、Ｍ．ストックトン・プレス（Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９１年；およびカリロ（Ｃａｒｉｌｌｏ）ら著、ＳＩＡＭジャーナル・オン・アプライド・マシマティクス（ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．）、１９８８年、第４８巻、ｐ１０７３に記載されるものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、コードされるポリペプチド変異型は、参照ポリペプチドと同一の活性または類似した活性を有してもよい。あるいは、変異型は、参照ポリペプチドと比較して、活性変化（例えば、増大または減少）を有してもよい。概して、特定のポリヌクレオチドまたは本発明のポリペプチドの変異型は、本明細書に記載されて当業者に知られている、配列アラインメントプログラムおよびパラメータによる判定で、その特定の参照ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドと、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるが１００％未満の配列同一性を有する。このようなアライメント用ツールとしては、ＢＬＡＳＴスイート（スティーブン・Ｆ・アルチュール（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ）、トーマス・Ｌ・マッデン（Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ）、アレハンドロＡ．シャファー（Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ）、ジングイ・ザング（Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ）、ゼング・ザング（Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ）、ウェブ・ミラー（Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ）、およびディビッドＪ．リップマン（Ｄａｖｉｄ  Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ）著、「ギャップドＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：タンパク質データベース検索プログラムの新世代（Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ）」、ニュークレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．）、１９９７年、第２５巻、ｐ３３８９〜３４０２のものが挙げられる。その他のツールは、具体的に「同一性」の定義中で、本明細書に記載される。
【０１９１】
ＢＬＡＳＴアルゴリズム中のデフォルトパラメータとしては、例えば、予測閾値１０、ワードサイズ２８、一致／不一致スコア１、−２、ギャップコスト線形が挙げられる。任意のフィルターが適用され得、例えばホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）などの生物種特有の反復の選択についても同様である。
【０１９２】
標的部分
本発明のいくつかの実施形態では、標的部分を発現するようにポリヌクレオチドが提供される。これらとしては、インビボまたはインビトロのいずれでも、細胞を特定の組織空間に標的化するように、または特定の部分と相互作用するように機能する細胞表面のタンパク質結合パートナーまたは受容体が挙げられる。適切なタンパク質結合パートナーとしては、抗体とそれらの機能的断片、スキャフォールドタンパク質、またはペプチドが挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、ポリヌクレオチドを用いて、脂質、炭水化物、またはその他の生物の部分または生体分子の合成および細胞外局在化を誘導し得る。
【０１９３】
ポリペプチドライブラリー
一実施形態では、ポリヌクレオチドが使用されて、ポリペプチドライブラリーが作成されてもよい。これらのライブラリーは、それぞれ様々な構造修飾もしくは化学修飾の設計を含有するポリヌクレオチド集団の作成から生じてもよい。この実施形態では、ポリヌクレオチド集団は、本明細書で教示されまたは当該技術分野で公知の抗体または抗体断片、タンパク質結合パートナー、スキャフォールドタンパク質、およびその他のポリペプチドを含むが、これに限定されるものではない、複数のコードされるポリペプチドを含んでなってもよい。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的細胞または培養物への直接導入に適してもよく、それは次に、コードされるポリペプチドを合成してもよい。
【０１９４】
特定の実施形態では、それぞれ異なるアミノ酸修飾があるタンパク質の複数の変異型が生成されて試験され、薬物動態学；安定性；生体適合性；および／または生物学的活性；または発現レベルなどの生物物理学的特性の観点から、最良の変異型が判定されてもよい。このようなライブラリーは、１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、または１０９を超える想定される変異型（１つまたは複数の残基の置換、欠失、および１つまたは複数の残基の挿入を含むが、これに限定されるものではない）を含有してもよい。
【０１９５】
抗微生物および抗ウイルス性ポリペプチド
本発明のポリヌクレオチドは、１つまたは複数の抗菌性ペプチド（ＡＭＰ：ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）または抗ウイルスペプチド（ＡＶＰ：ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）をコードするように設計されてもよい。ＡＭＰおよびＡＶＰは、微生物、無脊椎動物、植物、両生類、鳥類、魚類、および哺乳類などであるが、これに限定されるものではない、幅広い動物から単離され記載されている（ワング（Ｗａｎｇ）ら著、ニュークレイック・アシッドリ・サーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）２００９年、第３７巻（データベース版）：Ｄ９３３〜７）。
【０１９６】
抗微生物および抗ウイルス性ポリペプチドは、その内容が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレットに記載される。抗微生物ポリペプチドの非限定的例は、その内容が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレットの段落［０００１８９］〜［０００１９９］に記載される。別の非限定的例として、抗ウイルス性ポリペプチドは、その内容が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレットの段落［０００１８９］〜［０００１９５］および［０００２００］に記載される。
【０１９７】
ポリヌクレオチド領域
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、その他の核酸ベースの分子の既知の領域または部分と同様に機能する、領域、小領域または部分を含んでなるように設計されてもよい。このような領域としては、本明細書で考察されるｍＲＮＡ領域と、非コード領域とが挙げられる。非コード領域は、領域が１つまたは複数の細胞傷害性ヌクレオシドであるかまたはそれを組み込む場合のように単一ヌクレオシドのレベルであってもよい。
【０１９８】
細胞傷害性ヌクレオシド
一実施形態では、１つまたは複数の細胞傷害性ヌクレオシドが、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれてもよい。例えば、細胞傷害性ヌクレオシドが、二機能性修飾ＲＮＡまたはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドに組み込まれてもよい。細胞傷害性ヌクレオシド抗がん剤としては、アデノシンアラビノシド、シタラビン、シトシンアラビノシド、５−フルオロウラシル、フルダラビン、フロクスウリジン、フトラフール（ＦＴＯＲＡＦＵＲ）（登録商標）（テガフールとウラシルの組み合わせ）、テガフール（（ＲＳ）−５−フル
オロ−１−（テトラヒドロフラン−２−イル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン）、および６−メルカプトプリンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１９９】
いくつかの細胞傷害性ヌクレオシド類似体は、抗がん剤として臨床利用され、または臨床試験対象である。このような類似体の例としては、シタラビン、ゲムシタビン、トロキサシタビン、デシタビン、テザシタビン、２’−デオキシ−２’−メチリデンシチジン（ＤＭＤＣ）、クラドリビン、クロファラビン、５−アザシチジン、４’−チオ−アラシチジン、シクロペンテニルシトシン、および１−（２−Ｃ−シアノ−２−デオキシ−β−Ｄ−アラビノ−ペントフラノシル）−シトシンが挙げられるが、これに限定されるものではない。このような化合物の別の例は、リン酸フルダラビンである。これらの化合物は、全身投与されてもよく、限定はされないが、増殖する正常細胞との比較で腫瘍細胞に対して特異性がわずかまたは全くないなど、細胞傷害薬に典型的な副作用を有し得る。
【０２００】
細胞傷害性ヌクレオシド類似体のいくつかのプロドラッグもまた、当該技術分野で報告される。例としては、Ｎ４−ベヘノイル−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４−オクタデシル−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４−パルミトイル−１−（２−Ｃ−シアノ−２−デオキシ−β−Ｄ−アラビノ−ペントフラノシル）シトシン、およびＰ−４０５５（シタラビン５’−エライジン酸エステル）が挙げられるが、これに限定されるものではない。一般に、これらのプロドラッグは、主に肝臓および体循環中で、活性薬剤に変換されてもよく、腫瘍組織内で、活性薬剤の選択的放出をほとんど示さない。例えば、５’−デオキシ−５−フルオロシチジンの（および最終的に５−フルオロウラシルの）プロドラッグであるカペシタビンは、肝臓および腫瘍組織内の両方で代謝される。「生理学的条件下で容易に加水分解性の基」を含有する一連のカペシタビン類似体は、参照により本明細書に援用される，フジウ（Ｆｕｊｉｕ）らに付与された米国特許第４，９６６，８９１号明細書によって特許請求されている。フジウ（Ｆｕｊｉｕ）によって記載される系列は、５’−デオキシ−５−フルオロシチジンのＮ４アルキルおよびアラルキルカルバメートを含み、言外の含みは、これらの化合物が正常な生理学的条件下で加水分解によって活性化され、５’−デオキシ−５−フルオロシチジンを提供するであろうということである。
【０２０１】
一連のシタラビンＮ４−カルバメートが、その内容全体が参照により本明細書に援用される、ファドル（Ｆａｄｌ）ら著、ファルマジ（Ｐｈａｒｍａｚｉｅ）、１９９５年、第５０巻、ｐ３８２〜７によって報告されており、その中では化合物が、肝臓および血漿中でシタラビンに変換するように設計されている。その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２００４／０４１２０３号パンフレットは、プロドラッグの一部がＮ４−カルバメートである、ゲムシタビンのプロドラッグを開示する。これらの化合物は、ゲムシタビンの胃腸毒性を克服するように設計され、胃腸管からの未変化のプロドラッグの吸収後、肝臓および血漿中の加水分解放出によって、ゲムシタビンを提供することが意図された。その内容全体が参照により本明細書に援用される、ノムラ（Ｎｏｍｕｒａ）ら著、バイオオルガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー（Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．）、２００３年、第１１巻、ｐ２４５３〜６１は、細胞傷害性ヌクレオシド化合物を生成するために、酸性条件下のさらなる加水分解を要する中間体を生体内還元時に生じる、１−（３−Ｃ−エチニル−β−Ｄ−リボ−ペントファラノシル（ｐｅｎｔｏｆａｒａｎｏｓｙｌ））シトシンのアセタール誘導体を記載した。
【０２０２】
化学療法薬であってもよい細胞傷害性ヌクレオチドとしてはまた、ピラゾロ［３，４−Ｄ］−ピリミジン、アロプリノール、アザチオプリン、カペシタビン、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メルカプトプリン、６−チオグアニン、アシクロビル、アラ−アデノシン、リバビリン、７−デアザ−アデノシン、７−デアザ−グアノシン、６−アザ−ウラシル、６−アザ−シチジン、チミジンリボヌクレオチド、５−ブロモデオキシウリ
ジン、２−クロロ−プリン、およびイノシン、またはそれらの組み合わせも挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２０３】
非翻訳領域（ＵＴＲ）を有するポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、非翻訳領域として作用しまたは機能する、１つまたは複数の領域または部分を含んでなってもよい。ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの目的のポリペプチドをコードするように設計される場合、ポリヌクレオチドは、これらの非翻訳領域の１つまたは複数を含んでなってもよい。
【０２０４】
定義上、遺伝子の野性型非翻訳領域（ＵＴＲ）は転写されるが翻訳されない。ｍＲＮＡ中では、５’ＵＴＲは、転写開始部位に始まって開始コドンまで継続するが、開始コドンを含まず；一方で、３’ＵＴＲは、終止コドンに続いてすぐに始まって、転写終結シグナルまで継続する。核酸分子の安定性および翻訳に関してＵＴＲの果たす調節的役割を示す証拠が、相次いでいる。ＵＴＲの調節的特性は、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれて、とりわけ安定性を増強し得る。特定の特性はまた、転写物が望まれない臓器部位に導かれる場合における、転写物の制御される下方制御を確実にするために、組み込まれ得る。
【０２０５】
表１および２は、本発明のポリヌクレオチドで使用されてもよい、代表的ＵＴＲの一覧を提供する。表１に示されるのは、本発明の５’非翻訳領域の一覧である。１つまたは複数のヌクレオチドが、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧを含む末端に付加され、またはそれから除去される、５’ＵＴＲの変異型が使用されてもよい。
【０２０６】
【表１】
2016538829.tif 000003
【０２０７】
表２に示されるのは、本発明の３’非翻訳領域の一覧である。１つまたは複数のヌクレオチドが、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧを含む末端に付加され、またはそれから除去される、３’ＵＴＲの変異型が使用されもよい。
【０２０８】
【表２−１】
2016538829.tif 000004
【０２０９】
【表２−２】
2016538829.tif 000005
【０２１０】
【表２−３】
2016538829.tif 000006
【０２１１】
【表２−４】
2016538829.tif 000007
【０２１２】
【表２−５】
2016538829.tif 000008
【０２１３】
【表２−６】
2016538829.tif 000009
【０２１４】
【表２−７】
2016538829.tif 000010
【０２１５】
【表２−８】
2016538829.tif 000011
【０２１６】
５’ＵＴＲおよび翻訳開始
天然５’ＵＴＲは、翻訳開始において役割を果たす特徴を有する。これらは、それによってリボソームが多数の遺伝子の翻訳を開始する過程に関与することが一般に知られているコザック配列のようなシグネチャを保有する。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、Ｒは、別の「Ｇ」がそれに続く、開始コドン（ＡＵＧ）上流のプリン（アデニンまたはグアニン）三塩基である。５’ＵＴＲはまた、延長因子結合に関与する二次構造を形成することが知られている。
【０２１７】
特定の標的臓器の多量に発現する遺伝子に典型的に見られる機能を操作することによって、本発明のポリヌクレオチドの安定性と、タンパク質生成とを向上させ得る。例えば、肝臓細胞系または肝臓内で、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、αフェトプロテイン、エリスロポエチン、または第ＶＩＩＩ因子などの、肝臓で発現されるｍＲＮＡの５’ＵＴＲの導入が利用されて、ポリヌクレオチドなどの核酸分子の発現が促進され得る。同様に、その組織内の発現を改善するためのその他の組織特異的ｍＲＮＡからの５’ＵＴＲの使用は、筋肉（ＭｙｏＤ、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、Ｈｅｒｃｕｌｉｎ）で、内皮細胞（Ｔｉｅ−１、ＣＤ３６）で、骨髄性細胞（Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ−１、ｉ−ＮＯＳ）で、白血球（ＣＤ４５、ＣＤ１８）で、脂肪組織（ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アジポネクチン）で、肺上皮細胞（ＳＰ−Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）で可能である。ポリヌクレオチドの設計および製造において有用な非翻訳領域としては、その内容全体が参照により本明細書に援用される、同時係属国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０２１５２２号明細書（代理人整理番号Ｍ４２）で開示されるものが挙げられるが、これに限定されない。
【０２１８】
その他の非ＵＴＲ配列もまた、ポリヌクレオチド内の領域または小領域として使用され
てもよい。例えば、イントロンが、またはイントロン配列の一部が、本発明のポリヌクレオチド領域に組み込まれてもよい。イントロン配列の組み込みは、タンパク質生成ならびにポリヌクレオチドレベルを増大させてもよい。
【０２１９】
特徴の組み合わせが隣接領域に包含されてもよく、その他の特徴内に含有されてもよい。例えば、ＯＲＦは、強力なコザック翻訳開始シグナルを含有してもよい５’ＵＴＲ、および／またはポリＡテールの鋳型付加のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含んでもよい３’ＵＴＲで挟まれてもよい。５’ＵＴＲは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１００２９３６２５号明細書に記載される５’ＵＴＲなどの同一および／または異なる遺伝子からの、第１のポリヌクレオチド断片および第２のポリヌクレオチド断片を含んでなってもよい。
【０２２０】
同時係属の所有者共通の国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０２１５２２号明細書（代理人整理番号Ｍ４２）は、本発明のポリヌクレオチドで隣接領域として使用されてもよい、代表的ＵＴＲの一覧を提供する。１つまたは複数のヌクレオチドが、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧを含む末端に付加され、またはそれから除去される、５’または３’ＵＴＲの変異型が使用されてもよい。
【０２２１】
任意の遺伝子からの任意のＵＴＲが、ポリヌクレオチド領域に組み込まれてもよいものと理解すべきである。さらに、任意の既知遺伝子の複数の野生型ＵＴＲが使用されてもよい。野性型領域の変異型でない人工ＵＴＲを提供することもまた、本発明の範囲内である。これらのＵＴＲまたはその部分は、それらがそれから選択された転写物と同一の配向にされてもよく、あるいは配向または位置は、改変されてもよい。したがって５’もしくは３’ＵＴＲは、反転され、短縮され、延長されて、１つまたは複数のその他の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲからできていてもよい。本明細書の用法では、ＵＴＲ配列に関する「改変された」という用語は、ＵＴＲが、参照配列との関連で、何らかの方法で変更されていることを意味する。例えば、３’または５’ＵＴＲは、上で教示されるように、配向または位置の変化によって、野性型または天然ＵＴＲと比較して改変されてもよく、または追加的なヌクレオチド、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換または遺伝子転位の組み入れによって、改変されてもよい。これらの変更のいずれもが、変異型ＵＴＲを含んでなる「改変」ＵＴＲ（３’または５’を問わない）を生成する。
【０２２２】
一実施形態では、５’または３’ＵＴＲなどの二重、三重または四重ＵＴＲが、使用されてもよい。本明細書の用法では、「二重」ＵＴＲは、その中で、同一ＵＴＲの２つのコピーが、逐次または実質的逐次のいずれかで、コードされるものである。例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１００１２９８７７号明細書に記載されるような二重β−グロビン３’ＵＴＲを使用してもよい。
【０２２３】
パターン化されたＵＴＲを有することもまた、本発明の範囲内である。本明細書の用法では「パターン化されたＵＴＲ」は、１回、２回、または３回を超えて反復される、ＡＢＡＢＡＢまたはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢまたはＡＢＣＡＢＣＡＢＣまたはそれらの変異型などの、反復するまたは交互のパターンを反映するＵＴＲである。これらのパターン中では、各文字、Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルでの異なるＵＴＲを表す。
【０２２４】
一実施形態では、隣接領域は、そのタンパク質が共通の機能、構造、性状の特徴を共有する、転写物ファミリーから選択される。例えば、目的のポリペプチドは、特定の細胞、組織で、または発生中のある時点で、発現されるタンパク質ファミリーに属してもよい。これらの遺伝子のいずれかからのＵＴＲは、同一であるかまたは異なるタンパク質ファミリーの任意のその他のＵＴＲと交換されて、新規ポリヌクレオチドが生成されてもよい。本明細書の用法では、「タンパク質ファミリー」は、最も広い意味で使用されて、少なく
とも１つの機能、構造、特徴、局在化、起源、または発現パターンを共有する、２つ以上の目的のポリペプチドの群を指す。
【０２２５】
一実施形態では、隣接領域は、異種であってもよい。
一実施形態では、５’非翻訳領域は、３’非翻訳領域とは異なる生物種に由来してもよい。
【０２２６】
非翻訳領域は、翻訳エンハンサー要素（ＴＥＥ：ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ）もまた含んでもよい。非限定的例として、ＴＥＥは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００９０２２６４７０号明細書に記載されるもの、および当該技術分野で公知のものを含んでもよい。
【０２２７】
３’ＵＴＲおよびＡＵに富む要素
天然または野性型３’ＵＴＲは、それらの中に包埋された一続きのアデノシンおよびウリジンを有することが知られている。これらのＡＵ富化シグネチャは、代謝回転率の高い遺伝子に特に多く見られる。それらの配列特性および機能的性質に基づいて、ＡＵ富化要素（ＡＲＥ：ＡＵ  ｒｉｃｈ  ｅｌｅｍｅｎｔ）は、３つのクラスに分離され得る（チェン（Ｃｈｅｎ）ら、１９９５年）：クラスＩＡＲＥはＵ富化領域内にＡＵＵＵＡモチーフのいくつかの分散コピーを含有する。Ｃ−ＭｙｃおよびＭｙｏＤは、クラスＩＡＲＥを含有する。クラスＩＩＡＲＥは、２つ以上の重複するＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）九量体を有する。この種のＡＲＥを含有する分子としては、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−ａが挙げられる。クラスＩＩＩＡＲＥＳは、あまり明確に定義されていない。これらのＵ富化領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含有しない。ｃ−Ｊｕｎおよびミオゲニンは、このクラスの十分に研究された２つの例である。ＡＲＥに結合する大部分のタンパク質は、メッセンジャーを不安定化することが知られている一方で、ＥＬＡＶファミリーのメンバーは、中でも注目すべきことにＨｕＲは、ｍＲＮＡの安定性を増大させることが実証されている。ＨｕＲは、全ての３つのクラスのＡＲＥと結合する。３’ＵＴＲ中への核酸分子のＨｕＲ特異的結合部位を設計することで、ＨｕＲ結合を引き起こし、ひいてはインビボでのメッセージの安定化を引き起こす。
【０２２８】
３’ＵＴＲ  ＡＵ富化要素（ＡＲＥ）の導入、除去または修飾が利用されて、本発明のポリヌクレオチドの安定性が調節され得る。特定のポリヌクレオチドが操作される場合、ＡＲＥの１つまたは複数のコピーが導入されて、本発明のポリヌクレオチドの安定性を低下させ、それによって翻訳を抑え、結果として生じるタンパク質生成を低下させ得る。同様に、ＡＲＥは、同定されおよび除去されまたは変異されて、細胞内安定性が増大されて、ひいては翻訳および結果として生じるタンパク質生成が増大され得る。形質移入実験は、本発明のポリヌクレオチドを使用して、妥当な細胞系内で実施され得、タンパク質生成は、形質移入後の様々な時点でアッセイされ得る。例えば、細胞は、妥当なタンパク質に対するＥＬＩＳＡキットを使用して、形質移入の６時間、１２時間、２４時間、４８時間、および７日後に、生成されたタンパク質をアッセイすることで、異なるＡＲＥ操作分子によって形質移入され得る。
【０２２９】
マイクロＲＮＡ結合部位
マイクロＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡ）は、核酸分子の３’ＵＴＲに結合して、核酸分子の安定性を低下させるか、または翻訳を阻害するかのいずれかによって、遺伝子発現を下方制御する１９〜２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡである。本発明のポリヌクレオチドは、１つまたは複数のマイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列、またはマイクロＲＮＡシードを含んでなってもよい。このような配列は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００５／０２６１２１８号明細書および米国特許出願公開第２００５／００５９００５号明細書で教示されるものなどの任意の既知のマ
イクロＲＮＡに相当してもよい。
【０２３０】
マイクロＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち、成熟マイクロＲＮＡの２〜８位の領域内の配列を含んでなり、その配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列と完璧なワトソン・クリック相補性を有する。マイクロＲＮＡシードは、成熟マイクロＲＮＡの２〜８位または２〜７位を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡシードは、７ヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２〜８）を含んでなってもよく、その中で、対応するｍｉＲＮＡ標的内のシード相補的部位は、マイクロＲＮＡ位置１に対向するアデニン（Ａ）で挟まれる。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡシードは、６ヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２〜７）を含んでなってもよく、その中で、対応するｍｉＲＮＡ標的内のシード相補的部位は、マイクロＲＮＡ位置１に対向するアデニン（Ａ）で挟まれる。例えば、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、グリムソン  Ａ（Ｇｒｉｍｓｏｎ  Ａ）、ファー  ＫＫ（Ｆａｒｈ
ＫＫ）、ジョンストン  ＷＫ（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＷＫ）、ガレット−エンゲル  Ｐ（Ｇａｒｒｅｔｔ−Ｅｎｇｅｌｅ  Ｐ）、リム  ＬＰ（Ｌｉｍ  ＬＰ）、バーテル  ＤＰ（Ｂａｒｔｅｌ  ＤＰ）著、モレキュラー・セル（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．）、２００７年７月６日、第２７巻、第１号、ｐ９１〜１０５を参照されたい。マイクロＲＮＡシードの塩基は、標的配列と完全な相補性を有する。対象のマイクロＲＮＡが利用できるという条件で、マイクロＲＮＡ標的配列を操作して、本発明のポリヌクレオチド（例えば、３’ＵＴＲ様領域またはその他の領域）に入れることで、分子を分解のためまたは翻訳低下のために標的化し得る。このプロセスは、核酸分子送達時のオフターゲット効果の危険性を低下させる。マイクロＲＮＡの同定、マイクロＲＮＡ標的領域、およびそれらの発現パターン、および生物学における役割が、報告されている（それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、ボナウアー（Ｂｏｎａｕｅｒ）ら著、カレント・ドラッグ・ターゲッツ（Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ）、２０１０年、第１１巻、ｐ９４３〜９４９；アナンド（Ａｎａｎｄ）およびチェレシュ（Ｃｈｅｒｅｓｈ）著、カレント・オピニオン・イン・ヘマトロジー（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ）、２０１１年、第１８巻、ｐ１７１〜１７６；コントレラス（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ）およびラオ（Ｒａｏ）著、ロイケミア（Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、２０１２年、第２６巻、ｐ４０４〜４１３（２０１１年１２月２０日．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）；バーテル（Ｂａｒｔｅｌ）著、セル（Ｃｅｌｌ）、２００９年、第１３６巻、ｐ２１５〜２３３；ランドグラフ（Ｌａｎｄｇｒａｆ）ら著、セル（Ｃｅｌｌ）、２００７年、第１２９巻、ｐ１４０１〜１４１４）。
【０２３１】
例えば、核酸分子がｍＲＮＡであり、肝臓に送達されることが意図されないが、肝臓に入ってしまった場合、ｍｉＲ−１２２の１つまたは複数の標的部位が、ポリヌクレオチドの３’ＵＴＲ領域に組み入れられれば、肝臓に豊富なマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１２２が、対象遺伝子の発現を阻害し得る。異なるマイクロＲＮＡための１つまたは複数の結合部位の導入は、ポリヌクレオチドの寿命、安定性、およびタンパク質翻訳をさらに低下させるように、操作され得る。
【０２３２】
本明細書の用法では、「マイクロＲＮＡ部位」という用語は、マイクロＲＮＡ標的部位またはマイクロＲＮＡ認識部位、またはそれに対してマイクロＲＮＡが結合または会合する任意のヌクレオチド配列を指す。「結合」は、従来のワトソン・クリックハイブリダイゼーション規則に従ってもよく、またはマイクロＲＮＡと、マイクロＲＮＡ部位にあるまたはそれに隣接する標的配列との、任意の安定結合を反映してもよいものと理解すべきである。
【０２３３】
逆に、本発明のポリヌクレオチドの目的で、マイクロＲＮＡ結合部位は、例えば、特定の組織内のタンパク質発現を増大させるために、それらがその中で生じる配列から除去操
作され得る（すなわちそれから除去され得る）。例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位が除去されて、肝臓内のタンパク質発現が改善されてもよい。複数組織内の発現調節は、導入または除去あるいは１つまたは数種のマイクロＲＮＡ結合部位を通じて達成され得る。
【０２３４】
マイクロＲＮＡが、ｍＲＮＡを調節し、それによってタンパク質発現を調節することが知られている組織の例としては、肝臓（ｍｉＲ−１２２）、筋肉（ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−１２６）、骨髄性細胞（ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７）、脂肪組織（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ−１ｄ、ｍｉＲ−１４９）、腎臓（ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４）、および肺上皮細胞（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１２６）が挙げられるが、これに限定されるものではない。マイクロＲＮＡはまた、血管新生（ｍｉＲ−１３２）（その内容全体が参照により本明細書に援用される、アナンド（Ａｎａｎｄ）およびチェレシュ（Ｃｈｅｒｅｓｈ）著、カレント・オピニオン・イン・ヘマトロジー（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ）、２０１１年、第１８巻、ｐ１７１〜１７６などの複雑な生物学的過程を調節し得る）。
【０２３５】
本発明で有用な発現プロファイル、マイクロＲＮＡ、および細胞系としては、例えば、それぞれその内容全体が参照により援用される、国際公開第２０１４１１３０８９号パンフレット（代理人整理番号Ｍ３７）および国際公開第２０１４０８１５０７号パンフレット（代理人整理番号Ｍ３９）で教示されるものが挙げられる。
【０２３６】
本発明のポリヌクレオチド中では、このような過程に関与するマイクロＲＮＡの結合部位は、ポリヌクレオチド発現の発現を生物学的に妥当な細胞型に対して、または妥当な生物学的過程に関連して調節するために、除去または導入されてもよい。マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ配列、およびｍｉＲ結合部位の一覧は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、２０１３年１月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／７５３，６６１号明細書の表９、２０１３年１月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／７５４，１５９号明細書の表９、および２０１３年１月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／７５８，９２１号明細書の表７に列挙される。
【０２３７】
組織または疾患特異的遺伝子発現を駆動するマイクロＲＮＡの使用の例は、列挙される（その内容全体が参照により本明細書に援用される、ゲットナー（Ｇｅｔｎｅｒ）およびナルディーニ（Ｎａｌｄｉｎｉ）、ティシュ・アンティジェン（ＴｉｓｓｕｅＡｎｔｉｇｅｎｓ）著、２０１２年、第８０巻、ｐ３９３〜４０３）。さらに、マイクロＲＮＡシード部位がｍＲＮＡに組み込まれて、特定細胞内の発現が低下され得、生物学改善がもたらされる。この一例は、ＵＧＴ１Ａ１発現レンチウイルスベクターへのｍｉＲ−１４２部位の組み込みである。ｍｉＲ−１４２シード部位の存在は、造血細胞内の発現を低下させ、結果として抗原提示細胞内の発現を低下させ、ウイルス性に発現されるＵＧＴ１Ａ１に対する免疫応答の不在をもたらした（いずれもその内容全体が参照により本明細書に援用される、シュミット（Ｓｃｈｍｉｔｔ）ら著、ガストロエンテロロジー（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）２０１０年、第１３９巻、９９９〜１００７；ゴンザレズ−アセキノラザ（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ａｓｅｑｕｉｎｏｌａｚａ）ら著、ガストロエンテロロジー（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）２０１０年、第１３９巻、ｐ７２６〜７２９）。修飾ｍＲＮＡへのｍｉＲ−１４２部位の組み込みは、造血細胞内のコード化タンパク質の発現を低下させ得るだけでなく、ｍＲＮＡがコードするタンパク質に対する免疫応答もまた、低下または消滅させ得る。ｍＲＮＡへのｍｉＲ−１４２シード部位（１つまたは複数）の組み込みは、完全なタンパク質欠乏症がある患者（ＵＧＴ１Ａ１  Ｉ型、ＬＤＬＲ欠損患者、ＣＲＩＭ陰性Ｐｏｍｐｅ患者など）を治療する場合に、重要である。
【０２３８】
最後に、異なる細胞型内のマイクロＲＮＡの発現パターンの理解を通じて、ポリヌクレオチドは、特定の細胞型内の、または特定の生物学的条件下のみでの、より標的化された発現のために、操作され得る。組織特異的マイクロＲＮＡ結合部位の導入を通じて、組織内の、または生物学的条件に関連して、タンパク質発現に最適なポリヌクレオチドが設計され得る。
【０２３９】
形質移入実験は、操作されたポリヌクレオチドを使用して、妥当な細胞系内で実施され得、タンパク質生成は、形質移入後の様々な時点でアッセイされ得る。例えば、細胞は、妥当なタンパク質に対するＥＬＩＳＡキットを使用して、形質移入の６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、および７日後に、生成されたタンパク質をアッセイすることで、異なるマイクロＲＮＡ結合部位操作ポリヌクレオチドによって形質移入され得る。インビボ実験はまた、マイクロＲＮＡ結合部位操作分子を使用して、製剤化ポリヌクレオチドの組織特異的発現における変化を調べることで、実施され得る。
【０２４０】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのｍｉＲ配列またはその変異型を含んでなってもよい。ポリヌクレオチドで使用するためのｍｉＲ配列の非総記的一覧は、その内容が参照により本明細書に援用される、同時係属国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願第１３／６２５３１（Ｍ０３７．２０）号明細書の表９に記載される。
【０２４１】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素またはＰＣＳＫ９の非翻訳領域に結合して阻害する、少なくとも１つのｍｉＲ配列を含んでなってもよい。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素またはＰＣＳＫ９の非翻訳領域に結合して阻害するｍｉＲ配列の非限定的例は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３１５４７６６号パンフレットに記載される。非限定的例として、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−５２０ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−２２４またはその変異型を含んでなる、ｍｉＲ配列を含んでなってもよい（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３１５４７６６号パンフレットを参照されたい）。別の非限定的例として、ポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３１５４７６６号パンフレットの配列番号１、配列番号２、配列番号１０および／または配列番号１１を含んでなり、またはそれをコードする、ｍｉＲ配列を含んでなってもよい。さらに別の非限定的例として、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−２２４またはその変異型を含んでなるｍｉＲ配列を含んでなってもよい（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３１５４７６６号パンフレットを参照されたい）。別の非限定的例として、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−５２０ｄ−５ｐおよびｍｉＲ−２２４またはその変異型を含んでなる、ｍｉＲ配列を含んでなってもよい（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３１５４７６６号パンフレットを参照されたい）。
【０２４２】
５’キャップを有する領域
天然ｍＲＮＡの５’キャップ構造は、核外搬出に関与し、ｍＲＮＡ安定性を増大させ、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ：Ｃａｐ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）に結合する。ＣＢＰは、成熟環式ｍＲＮＡ化学種を形成するＣＢＰとポリ（Ａ）結合タンパク質との結合を通じて、細胞内ｍＲＮＡ安定性および翻訳能力の原因となる。キャップは、ｍＲＮＡスプライシング中における、５’隣接イントロン除去の除去をさらに促進する。
【０２４３】
内在性ｍＲＮＡ分子は、５’末端でキャップされてもよく、ｍＲＮＡ分子の末端グアノシンキャップ残基と５’末端転写センスヌクレオチドの間に、５’−ｐｐｐ−５’−三リン酸結合が生じる。次に、この５’−グアニル酸キャップがメチル化されて、Ｎ７−メチル−グアニル酸残基を生じてもよい。ｍＲＮＡリボース糖の５’末端の末端および／また
は前方末端転写ヌクレオチドはまた、任意選択的に２’−Ｏ−メチル化されてもよい。グアニル酸キャップ構造の加水分解および切断を通じた５’キャップ除去は、分解のために、ｍＲＮＡ分子などの核酸分子を標的としてもよい。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、キャップ部分が組み込まれるように設計されてもよい。本発明のポリヌクレオチドの修飾は、非加水分解性キャップ構造を生じてキャップ除去を防止し、ひいてはｍＲＮＡ半減期を増大させてもよい。キャップ構造の加水分解は、５’−ｐｐｐ−５’ホスホロジエステル結合の切断を必要とするため、キャッピング反応中に修飾ヌクレオチドが使用されてもよい。例えば、マサチューセッツ州イプスウィッチ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）のニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）からのワクシニアキャッピング酵素が、製造会社の使用説明書に従ってα−チオ−グアノシンヌクレオチドと共に使用されて、５’−ｐｐｐ−５’キャップ中にホスホロチオエート結合が生成してもよい。α−メチル−ホスホネートおよびセレン含有ホスフェートヌクレオチドなどの追加的な修飾グアノシンヌクレオチドが、使用されてもよい。
【０２４５】
追加的な修飾としては、（上述されるような）糖環の２’−ヒドロキシル基上の、ポリヌクレオチドの５’−末端および／または５’−前方末端ヌクレオチドのリボース糖の２’−Ｏ−メチル化が挙げられるが、これに限定されるものではない。複数の特徴的な５’キャップ構造が使用されて、ｍＲＮＡ分子として機能するポリヌクレオチドなどの核酸分子の５’キャップが生成され得る。
【０２４６】
本明細書で、合成キャップアナログ、化学キャップ、化学キャップアナログ、または構造もしくは機能キャップアナログとも称されるキャップアナログは、キャップ機能を保ちながら、それらの化学構造が、天然の（すなわち内在性、野生型または生理学的な）５’キャップと異なる。キャップアナログは、化学的に（すなわち非酵素的に）または酵素的に合成されてもよく、および／または本発明のポリヌクレオチドに連結にしてもよい。
【０２４７】
例えば、抗逆転キャップアナログ（ＡＲＣＡ：Ａｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇ）キャップは、５’−５’−三リン酸基によって連結する２つのグアニンを含有し、その中で１つのグアニンは、Ｎ７メチル基ならびに３’−Ｏ−メチル基を含有する（すなわち、Ｎ７，３’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−三リン酸−５’−グアノシン（ｍ７Ｇ−３’ｍｐｐｐ−Ｇ；同様な意味合いで３’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇと称されてもよい）。別の未修飾グアニンの３’−Ｏ原子は、キャップドポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドと連結するようになる。Ｎ７−および３’−Ｏ−メチル化グアニンは、キャップドポリヌクレオチドの末端部分を提供する。
【０２４８】
別の代表的キャップはｍＣＡＰであり、それはＡＲＣＡと類似するが、グアノシン上に２’−Ｏ−メチル基を有する（すなわち、Ｎ７，２’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−三リン酸−５’−グアノシン、ｍ７Ｇｍ−ｐｐｐ−Ｇ）。
【０２４９】
一実施形態では、キャップは、ジヌクレオチドキャップアナログである。非限定的例として、ジヌクレオチドキャップアナログは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，５１９，１１０号明細書に記載されるようなジヌクレオチドキャップアナログなどのボラノリン酸基またはホホロセレノ酸（ｐｈｏｐｈｏｒｏｓｅｌｅｎｏａｔｅ）基によって、異なるホスフェート位置で修飾されてもよい。
【０２５０】
別の実施形態では、キャップは、キャップアナログは、当該技術分野で公知のおよび／または本明細書に記載される、キャップアナログのＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）置換ジククレオチド（ｄｉｃｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）形態である。キャップアナログのＮ
７−（４−クロロフェノキシエチル）置換ジククレオチド（ｄｉｃｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）形態の非限定的例としては、Ｎ７−（４−クロロフェノキシエチル）−Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧおよびＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）−Ｍ３’−ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログが挙げられる（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、コレ（Ｋｏｒｅ）ら著、バイオオルガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２０１３年、第２１巻、ｐ４５７０〜４５７４に記載される様々なキャップアナログおよびキャップアナログ合成法を参照されたい）。別の実施形態では、本発明のキャップアナログは、４−クロロ／ブロモフェノキシエチルアナログである。
【０２５１】
キャップアナログが、ポリヌクレオチドまたはその領域の同時キャッピングを可能にする一方で、インビトロ転写反応では、２０％までの転写物は、キャップされないまであり得る。これと、ならびに内在性細胞転写機構によって生成された核酸の内在性５’キャップ構造からのキャップアナログの構造的相違が、翻訳能力の低下および細胞安定性の低下をもたらすこともある。
【０２５２】
本発明のポリヌクレオチドはまた、より真性の５’キャップ構造を生成するために、酵素を使用して、（ＩＶＴであるかまたは化学合成であるかを問わない）製造後に、キャップされてもよい。本明細書の用法では、「より真性の」という語句は、内在性または野性型特徴を構造的または機能的のいずれかで、密接に反映しまたは模倣する特徴を指す。すなわち、「より真性の」特徴は、先行技術の合成的特性またはアナログなどと比較して、内在性、野生型、天然または生理学的な細胞機能および／または構造をより良く代表するものであり、または１つまたは複数の点で、対応する内在性、野生型、天然または生理学的な特徴がより優れているものである。本発明のより真性の５’キャップ構造の非限定的例は、当該技術分野で公知の合成５’キャップ構造（または野生型、天然または生理学的な５’キャップ構造）と比較して、とりわけ、キャップ結合タンパク質の強化結合、半減期増大、５’エンドヌクレアーゼに対する感受性低下、および／または５’キャップ除去低下を有するものである。例えば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素および組換え２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素は、ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドとグアニンキャップヌクレオチドとの間に、カノニカル５’−５’−三リン酸結合を生成し得、キャップグアニンはＮ７メチル化を含有し、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルを含有する。このような構造は、Ｃａｐ１構造と称される。このキャップは、例えば、当該技術分野で公知のその他の５’キャップアナログ構造と比較して、より高い翻訳能力および細胞安定性と、細胞炎症促進性サイトカインの活性化低下とをもたらす。キャップ構造としては、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ，ｐＮ２ｐ（キャップ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ（キャップ１）、および７ｍＧ（５’）−ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２５３】
非限定的例として、製造後のキャッピングキメラポリヌクレオチドは、より効率的であってもよく、ほぼ１００％のキメラポリヌクレオチドがキャッピングされてもよい。これは、インビトロ転写反応の過程で、キャップアナログがキメラポリヌクレオチドに結合する場合の約８０％とは対照的である。
【０２５４】
本発明によれば、５’末端キャップは、内在性キャップまたはキャップアナログを含んでもよい。本発明によれば、５’末端キャップは、グアニンアナログを含んでなってもよい。有用なグアニンアナログとしては、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、および２−アジド−グアノシンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２５５】
ウイルス配列
オオムギ黄萎ウイルス（ＢＹＤＶ−ＰＡＶ）、ヤーグジークテヒツジレトロウイルス（ＪＳＲＶ）および／または地方病性経鼻腫瘍ウイルスの翻訳エンハンサー配列（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１２１２９６４８号パンフレットを参照されたい）などであるが、これに限定されるものではない、追加的なウイルス配列が操作されて、本発明のポリヌクレオチドに挿入され得、インビトロおよびインビボでコンストラクトの翻訳を刺激し得る。形質移入の１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、および７日後に、形質移入実験が妥当な細胞系内で実施され得、タンパク質生成がＥＬＩＳＡによってアッセイされ得る。
【０２５６】
ＩＲＥＳ配列
さらに、提供されるのは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ：ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）を含有してもよいポリヌクレオチドである。最初に特徴ピコルナウイルスＲＮＡとして同定されたＩＲＥＳは、５’キャップ構造不在下における、タンパク質合成の開始に重要な役割を果たす。ＩＲＥＳは、唯一のリボソーム結合部位の機能を果たしてもよく、またはｍＲＮＡの複数リボソーム結合部位の１つの役割を果たしてもよい。２つ以上の機能的リボソーム結合部位を含有するポリヌクレオチドは、リボソームによって独立して翻訳される、いくつかのペプチドまたはポリペプチド（「マルチシストロン性核酸分子」）をコードしてもよい。ポリヌクレオチドがＩＲＥＳと共に提供される場合、第２の翻訳可能な領域が、任意選択的にさらに提供される。本発明に従って利用され得るＩＲＥＳ配列の例としては、限定されることなく、ピコルナウイルス（例えばＦＭＤＶ）、ペストウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）またはコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）由来のものが挙げられる。
【０２５７】
ポリＡテール
ＲＮＡプロセシング中に、アデニンヌクレオチドの長鎖（ポリＡテール）がｍＲＮＡ分子などのポリヌクレオチドに付加されて、安定性が増大されてもよい。転写直後に、転写物の３’末端が切断されて、３’ヒドロキシルが遊離されてもよい。次にポリＡポリメラーゼが、アデニンヌクレオチド鎖をＲＮＡに付加する。ポリアデニル化と称されるこの過程は、例えば、およそ８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０残基長を含む、およそ８０からおよそ２５０残基長であり得る、ポリＡテールを付加する。
【０２５８】
ポリＡテールはまた、コンストラクトが核から搬出された後に、付加されてもよい。
本発明によれば、安定化のために、ポリＡテール上の末端基が組み込まれてもよい。本発明のポリヌクレオチドは、デス−３’ヒドロキシルテールを含んでもよい。それらは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、ジュンジ・リー（Ｊｕｎｊｉｅ  Ｌｉ）ら著、（カレント・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２００５年８月２３日、第１５巻、ｐ１５０１〜１５０７）によって教示されるような、構造部分または２’−Ｏメチル修飾もまた含んでもよい。
【０２５９】
本発明のポリヌクレオチドは、ヒストンｍＲＮＡを含む代替ポリＡテール構造がある転写物をコードするように設計されてもよい。ノーベリー（Ｎｏｒｂｕｒｙ）によると、「末端ウリジン化が、ヒト複製依存性ヒストンｍＲＮＡ上で検出されている。これらのｍＲＮＡの代謝回転は、染色体ＤＮＡ複製の完了または阻害に続く、潜在的に毒性のヒストン蓄積の防止に重要と考えられる。これらのｍＲＮＡは、それらの３’ポリ（Ａ）テールの
欠如によって識別され、その機能は、それに代えて、安定なステムループ構造とその同族のステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ：ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）とが担う；後者は、ポリアデニル化ｍＲＮＡ上のＰＡＢＰと同様の機能を果たす」（その内容全体が参照により本明細書に援用される、ノーベリー（Ｎｏｒｂｕｒｙ）著、「細胞質内ＲＮＡ：本末転倒の例（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ＲＮＡ：ａ  ｃａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔａｉｌ  ｗａｇｇｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｏｇ）」、ネイチャー・レビューズ・モレキュラー・セル・バイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；ＡＯＰ）、２０１３年８月２９日オンライン公開；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ３６４５）。
【０２６０】
ユニークなポリＡテール長は、本発明のポリヌクレオチドに特定の利点を提供する。
通常、ポリＡテール長は、存在する場合、３０ヌクレオチド長を超える。別の実施形態では、ポリＡテールは、３５ヌクレオチド長を超える（例えば、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、および３，０００またはそれを超えるヌクレオチド）。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはその領域は、約３０〜約３，０００（例えば３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜７５０、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜２，０００、３０〜２，５００、５０〜１００、５０〜２５０、５０〜５００、５０〜７５０、５０〜１，０００、５０〜１，５００、５０〜２，０００、５０〜２，５００、５０〜３，０００、１００〜５００、１００〜７５０、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜２，０００、１００〜２，５００、１００〜３，０００、５００〜７５０、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜２，５００、５００〜３，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜２，５００、１，０００〜３，０００、１，５００〜２，０００、１，５００〜２，５００、１，５００〜３，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜２，５００、および２，５００〜３，０００）ヌクレオチドを含む。
【０２６１】
一実施形態では、ポリＡテールは、ポリヌクレオチドの全体的な長さ、またはポリヌクレオチドの特定領域の長さに対して、設計される。この設計は、コード領域の長さ、特定の特徴または領域の長さに基づいてもよく、またはポリヌクレオチドから発現される、最終生成物の長さに基づいてもよい。
【０２６２】
これに関連して、ポリＡテールは、ポリヌクレオチドまたはその特徴よりも、さらに１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％長くてもよい。ポリＡテールはまた、それが属するポリヌクレオチドの一部として設計されてもよい。これに関連して、ポリＡテールは、コンストラクト全長、コンストラクト領域、またはポリＡテールを差し引いたコンストラクト全長の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％またはそれを超えてもよい。さらに、操作された結合部位と、ポリヌクレオチドのポリＡ結合タンパク質へのコンジュゲーションとが、発現を促進してもよい。
【０２６３】
さらに、複数の異なるポリヌクレオチドが、ポリＡテールの３’末端の修飾ヌクレオチドを使用して、３’末端を通じて、ＰＡＢＰ（ポリＡ結合タンパク質）を介して、共に連結してもよい。形質移入の１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、および７日後に、形質移入実験が妥当な細胞系内で実施され得、タンパク質生成がＥＬＩＳＡによってアッセイされ得る。
【０２６４】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ポリＡ〜Ｇカルテット領域を含むように設計される。Ｇカルテットは、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方において、Ｇ富化配列によって形成され得る、環状の水素結合する一続きの４つのグアニンヌクレオチドである。この実施形態では、Ｇカルテットは、ポリＡテールの末端に組み込まれる。結果として生じるポリヌクレオチドは、安定性、タンパク質生成、および様々な時点における半減期を含むその他のパラメータについてアッセイされる。ポリＡ〜Ｇカルテットは、ｍＲＮＡからのタンパク質生成をもたらすことが発見され、それは１２０ヌクレオチドのポリＡテールのみを使用して見られるものの少なくとも７５％に相当する。
【０２６５】
開始コドン領域
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、開始コドン領域と類似性でありまたはそのように機能する領域を有してもよい。
【０２６６】
一実施形態では、ポリヌクレオチドの翻訳は、開始コドンＡＵＧでないコドン上で開始してもよい。ポリヌクレオチドの翻訳は、ＡＣＧ、ＡＧＧ、ＡＡＧ、ＣＴＧ／ＣＵＧ、ＧＴＧ／ＧＵＧ、ＡＴＡ／ＡＵＡ、ＡＴＴ／ＡＵＵ、ＴＴＧ／ＵＵＧなどであるが、これに限定されるものではない、代替開始コドン上で開始してもよい（それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、トウリオール（Ｔｏｕｒｉｏｌ）ら著、バイオロジー・オブ・ザ・セル（Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ）、２００３年、第９５巻、ｐ１６９〜１７８；およびマツダ（Ｍａｔｓｕｄａ）およびマウロ（Ｍａｕｒｏ）著、プロス・ワン（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ）、２０１０年、第５巻、ｐ１１を参照されたい）。非限定的例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替開始コドンＡＣＧ上で開始する。別の非限定的例として、ポリヌクレオチド翻訳は、代替開始コドンＣＴＧまたはＣＵＧ上で開始する。さらに別の非限定的例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替開始コドンＧＴＧまたはＧＵＧ上で開始する。
【０２６７】
翻訳を開始するコドン、例えば、限定はされないが、開始コドンまたは代替開始コドンなどに隣接するヌクレオチドが、翻訳効率、ポリヌクレオチドの長さおよび／または構造に影響を及ぼすことが知られている。（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、マツダ（Ｍａｔｓｕｄａ）およびマウロ（Ｍａｕｒｏ）著、プロス・ワン（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ）、２０１０年、第５巻、ｐ１１を参照されたい）。翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドのいずれかの遮蔽が利用されて、ポリヌクレオチドの翻訳開始位置、翻訳効率、長さおよび／または構造が改変されてもよい。
【０２６８】
一実施形態では、コドンを遮蔽しまたは隠して遮蔽された開始コドンまたは代替開始コドンにおける翻訳開始確率を低下させるために、遮蔽剤が、開始コドンまたは代替開始コドンの近傍で使用されてもよい。遮蔽剤の非限定的例としては、アンチセンスロックド核酸（ＬＮＡ）ポリヌクレオチドおよびエクソン接合部複合体（ＥＪＣ）が挙げられる（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、遮蔽剤ＬＮＡポリヌクレオチドおよびＥＪＣについて記載する、マツダ（Ｍａｔｓｕｄａ）およびマウロ（Ｍａｕｒｏ）著、プロス・ワン（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ）、２０１０年、第５巻、ｐ１１を参照されたい）。
【０２６９】
別の実施形態では、ポリヌクレオチドの開始コドンを遮蔽して代替開始コドン上で翻訳が開始する可能性を高めるために、遮蔽剤が使用されてもよい。
一実施形態では、第１の開始コドンまたは代替開始コドンを遮蔽して遮蔽された開始コドンまたは代替開始コドンの下流にある開始コドンまたは代替開始コドン上で翻訳が開始する可能性を高めるために、遮蔽剤が使用されもよい。
【０２７０】
一実施形態では、開始コドンまたは代替開始コドンは、ｍｉＲ結合部位に対する完全な
補体内に位置してもよい。ｍｉＲ結合部位の完全な補体は、遮蔽剤と同様に、翻訳、ポリヌクレオチドの長さおよび／または構造の調節を促進し得る。非限定的例として、開始コドンまたは代替開始コドンは、ｍｉＲ−１２２結合部位に対する完全な補体の中央に位置してもよい。開始コドンまたは代替開始コドンは、１番目のヌクレオチド、２番目のヌクレオチド、３番目のヌクレオチド、４番目のヌクレオチド、５番目のヌクレオチド、６番目のヌクレオチド、７番目のヌクレオチド、８番目のヌクレオチド、９番目のヌクレオチド、１０番目のヌクレオチド、１１番目のヌクレオチド、１２番目のヌクレオチド、１３番目のヌクレオチド、１４番目のヌクレオチド、１５番目のヌクレオチド、１６番目のヌクレオチド、１７番目のヌクレオチド、１８番目のヌクレオチド、１９番目のヌクレオチド、２０番目のヌクレオチドまたは２１番目のヌクレオチドの後に位置してもよい。
【０２７１】
別の実施形態では、ポリヌクレオチドの翻訳を開始コドンでないコドン上で開始させるために、ポリヌクレオチドの開始コドンが、ポリヌクレオチド配列から除去されてもよい。ポリヌクレオチドの翻訳は、除去された開始コドンに続くコドン上、または下流開始コドン上、または代替開始コドンで開始されてもよい。非限定的例では、下流開始コドンまたは代替開始コドン上で翻訳を開始させるために、ポリヌクレオチド配列の最初の３ヌクレオチドとして、開始コドンＡＴＧまたはＡＵＧが除去される。開始コドンが除去されたポリヌクレオチド配列は、翻訳開始、ポリヌクレオチドの長さ、および／またはポリヌクレオチドの構造を調節し、または調節を試みるために、下流開始コドンおよび／または代替開始コドンに対する、少なくとも１つの遮蔽剤をさらに含んでなってもよい。
【０２７２】
終止コドン領域
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）前に、少なくとも２つの終止コドンを含んでもよい。終止コドンは、ＴＧＡ、ＴＡＡ、およびＴＡＧから選択されてもよい。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、終止コドンＴＧＡおよび１つの追加的な終止コドンを含む。さらなる実施形態では、追加終止コドンは、ＴＡＡであってもよい。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、３つの終止コドンを含む。
【０２７３】
シグナル配列
ポリヌクレオチドはまた、治療的に妥当な部位へのポリペプチドの輸送を容易にする追加的な特徴をコードしてもよい。タンパク質輸送を促進するこのような１つの特徴は、シグナル配列である。本明細書の用法では、「シグナル配列」または「シグナルペプチド」は、それぞれ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであり、約９〜２００ヌクレオチド（３〜６０アミノ酸）長で、それぞれ、コード領域またはコードされるポリペプチドの５’（またはＮ末端）に組み込まれる。これらの配列の付加は、１つまたは複数の分泌系経路を通じた、コードされるポリペプチドの小胞体への輸送をもたらす。数種のシグナルペプチドは、タンパク質が輸送された後に、シグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。
【０２７４】
本発明で利用されてもよい追加的なシグナル配列としては、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ／またはｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｌｉｎｅ．ｂｉｃ．ｎｕｓ．ｅｄｕ．ｓｇ／ｓｐｄｂ／に見られるデータベースで教示されるものが挙げられる。米国特許第８，１２４，３７９号明細書；米国特許第７，４１３，８７５号明細書、および米国特許第７，３８５，０３４号明細書に記載されるものもまた、本発明の範囲内であり、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される。
【０２７５】
標的選択
本発明によれば、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの目的のポリペプチドをコードする連結ヌクレオシドの少なくとも第１の領域を含んでなってもよい。本発明の目的のポ
リペプチドまたは「標的」は、下の表３に列挙される。目的のポリペプチドをコードする遺伝子の名称および説明に加えて、表３に示されるのは、ＥＮＳＥＭＢＬ転写物ＩＤ（ＥＮＳＴ）、ＥＮＳＥＭＢＬタンパク質ＩＤ（ＥＮＳＰ）、および利用できる場合は、最適化配列ＩＤ（ＯＰＴ配列番号）である。任意の特定の遺伝子では、１つまたは複数の変異型またはイソ型が存在してもよい。存在する場合、それらもまた表に示される。表で開示されるのは、可能な隣接領域であることが、当業者によって理解されるであろう。これらは、ＯＲＦまたはコード領域の５’（上流）または３’（下流）のいずれかで、各ＥＮＳＴ転写物中でコードされる。コード領域は、ＥＮＳＰ配列を教示することで、確定的かつ具体的に開示される。その結果、タンパク質をコードするものに隣接する教示される配列は、隣接領域と見なされる。１つまたは複数の利用可能データベースまたはアルゴリズムを利用することで、５’および３’隣接領域をさらに特性決定することもまた可能である。データベースは、ＥＮＳＴ転写物の隣接領域に含まれる特徴をアノテートし、これらは当該技術分野で利用できる。
【０２７６】
【表３−１】
2016538829.tif 000012
【０２７７】
【表３−２】
2016538829.tif 000013
【０２７８】
表３は、少なくとも１つの変異（例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異）を含んでなるＬＤＬＲタンパク質配列を含むヒトＬＤＬＲタンパク質配列と、対応するＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡコンストラクトとを示す。
【０２７９】
タンパク質切断シグナルおよび部位
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つのタンパク質切断部位を含有する、少なくとも１つのタンパク質切断シグナルを含んでもよい。タンパク質切断部位は、Ｎ末端；Ｃ末端；ＮとＣ末端の中間点、Ｎ末端と中間点の間、中間点とＣ末端の間などであるが、これに限定されるものではない、ＮおよびＣ末端間の任意の場所；およびそれらの組み合わせに位置してもよい。
【０２８０】
本発明のポリペプチドとしては、プロタンパク質コンバターゼ（またはプロホルモンコンバターゼ）、トロンビンまたはＸａ因子タンパク質切断シグナルが挙げられるが、これに限定されるものではない。プロタンパク質コンバターゼは、プロホルモンコンバターゼ
１／３（ＰＣ１／３）、ＰＣ２、フューリン、ＰＣ４、ＰＣ５／６、対形成塩基性アミノ酸開裂酵素４（ＰＡＣＥ４）およびＰＣ７として知られている、酵母ケキシンに関連する７つの塩基性アミノ酸特異的サブチリシン様セリンプロテイナーゼと、サブチリシンケキシンイソ酵素１（ＳＫＩ−１）およびプロタンパク質コンバターゼサブチリシンケキシン９（ＰＣＳＫ９）と称される、非塩基性残基で切断する２つのその他のサブチラーゼとを含んでなる、９つのプロティナーゼのファミリーである。
【０２８１】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが、少なくとも１つのコード化タンパク質切断シグナルを含有するように操作されてもよい。コード化タンパク質切断シグナルは、開始コドン前；開始コドン後；コード領域前；コード領域の中間点、開始コドンと中間点の間、中間点と終止コドンの間などであるが、これに限定されるものではない、コード領域内；コード領域後、終止コドン前；２つの終止コドンの間；終止コドン後；およびそれらの組み合わせを含むが、これに限定されるものではない、任意の領域に位置してもよい。
【０２８２】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのコード化タンパク質切断部位を含有する、少なくとも１つのタンパク質切断シグナルを含んでもよい。コード化タンパク質切断シグナルとしては、プロタンパク質コンバターゼ（またはプロホルモンコンバターゼ）、トロンビンおよび／またはＸａ因子タンパク質切断シグナルが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２８３】
非限定的例として、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第７，３７４，９３０号明細書および米国特許出願公開第２００９０２２７６６０号明細書は、フューリン切断部位を使用して、細胞のゴルジ装置からの発現産物中のＧＬＰ−１のＮ末端メチオニンを切断する。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つのタンパク質切断シグナルおよび／または部位を含むが、ただしポリペプチドはＧＬＰ−１でない。
【０２８４】
挿入および置換
一実施形態では、ポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、同一塩基の少なくとも１つの領域および／または一連のヌクレオシドの挿入によって置換されてもよい。ヌクレオチド領域および／または一連のヌクレオチドは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、または少なくとも８ヌクレオチドを含んでもよいが、これに限定されるものではなく、ヌクレオチドは、天然および／または非天然であってもよい。非限定的例として、ヌクレオチド群は、５〜８個のアデニン、シトシン、チミン、本明細書で開示される一連の別のヌクレオチドのいずれかおよび／またはそれらの組み合わせを含んでもよい。
【０２８５】
一実施形態では、ポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、アデニン、シトシン、チミン、本明細書で開示される別のヌクレオチドのいずれかなどであるが、これに限定されるものではない、２つの異なる塩基の少なくとも２つのヌクレオチド領域および／または一連のヌクレオチドおよび／またはそれらの組み合わせの挿入によって置換されてもよい。例えば、５’ＵＴＲは、５〜８個のアデニン塩基の挿入と、それに続く５〜８個のシトシン塩基の挿入によって、置換されてもよい、別の実施例では、５’ＵＴＲは、５〜８個のシトシン塩基の挿入と、それに続く５〜８個のアデニン塩基の挿入によって、置換されてもよい。
【０２８６】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、転写開始部位下流に、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されてもよい、少なくとも１つの置換および／または挿入を含んでもよい。非限定的例として、少なくとも１つの置換および／または挿入は、転写開始部位のすぐ下流の
領域（＋１〜＋６などであるが、これに限定されるものではない）で、少なくとも１つの核酸が置換されることで、転写開始部位の下流で起こってもよい。転写開始部位のすぐ下流のヌクレオチド領域の変化は、開始速度に影響を及ぼし、見かけのヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）反応定数値を増大させ、初期転写をキュアリングする転写複合体からの短い転写物の分離を増大させてもよい（その内容全体が参照により本明細書に援用される、ブリーバ（Ｂｒｉｅｂａ）ら著、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００２年、第４１巻、ｐ５１４４〜５１４９）。少なくとも１つのヌクレオシドの修飾、置換および／または挿入は、配列のサイレント変異を引き起こしてもよく、またはアミノ酸配列中に変異を引き起こしてもよい。
【０２８７】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、転写開始部位下流に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２または少なくとも１３個のグアニン塩基の置換を含んでもよい。
【０２８８】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、転写開始部位のすぐ下流の領域に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５または少なくとも６個のグアニン塩基の置換を含んでもよい。非限定的例として、領域内のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡであれば、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３または少なくとも４個のアデニンヌクレオチドで置換されてもよい。別の非限定的一例では、領域内のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡであれば、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３または少なくとも４個のシトシン塩基で置換されてもよい。別の非限定的一例では、領域内のヌクレオチドが、ＧＧＧＡＧＡであれば、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３または少なくとも４個のチミン、および／または本明細書に記載されるヌクレオチドのいずれかで置換されてもよい。
【０２８９】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、開始コドン上流に、少なくとも１つの置換および／または挿入を含んでもよい。明確にするために記すと、当業者は、開始コドンが、タンパク質コード領域の第１のコドンである一方で、転写開始部位は、転写が開始する部位であることを認識する。ポリヌクレオチドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７または少なくとも８個のヌクレオチド塩基の置換および／または挿入を含んでもよいが、これに限定されるものではない。ヌクレオチド塩基は、開始コドン上流の１つ、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つの位置で、挿入または置換されてもよい。挿入および／または置換されるヌクレオチドは、同一塩基（例えば、全てＡまたは全てＣまたは全てＴまたは全てＧ）、２つの異なる塩基（例えば、ＡおよびＣ、ＡおよびＴ、またはＣおよびＴ）、３つの異なる塩基（例えば、Ａ、ＣおよびＴまたはＡ、ＣおよびＴ）、または少なくとも４つの異なる塩基であってもよい。非限定的例として、ポリヌクレオチド中のコード領域上流のグアニン塩基は、アデニン、シトシン、チミン、または本明細書に記載されるヌクレオチドのいずれかで置換されてもよい。別の非限定的一例では、ポリヌクレオチド中のグアニン塩基の置換は、転写開始部位の下流領域内および開始コドン前に、１つのグアニン塩基が残るように設計されてもよい（その内容全体が参照により本明細書に援用される、エスベルト（Ｅｓｖｅｌｔ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１１年、第４７２巻、第７３４４号、ｐ４９９〜５０３を参照されたい）。非限定的例として、転写開始部位下流であるが開始コドン上流である１つの位置に、少なくとも５つのヌクレオチドが挿入されてもよく、少なくとも５つのヌクレオチドは、同一塩基タイプであってもよい。
【０２９０】
転写後制御調節因子の組み込み
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの転写後制御調節因子
を含んでもよい。これらの転写後制御調節因子は、小型分子、化合物、および制御配列であってもよいが、これに限定されるものではない。非限定的例として、転写後制御は、ニュージャージー州サウスプレーンフィールド（Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）のＰＣＴセラピューティクス株式会社（ＰＴＣ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）によって、同社のジェムス（ＧＥＭＳ）（商標）（小型分子による遺伝子発現調節（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｌｕｅｓ））スクリーニング技術を使用して同定される、小型分子を使用して達成されてもよい。
【０２９１】
転写後制御調節因子は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２００６０２２７１２号パンフレットに詳述される方法、またはそれに記載される遺伝子発現調節因子によってスクリーニングされる、遺伝子発現調節因子であってもよい。翻訳制御に関与するＲＮＡ制御配列を同定する方法は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２００４０６７７２８号パンフレットに記載される。非翻訳領域依存性の遺伝子発現を調節する化合物を同定する方法は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２００４０６５５６１号パンフレットに記載される。
【０２９２】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの５’および／または３’非翻訳領域に位置する、少なくとも１つの転写後制御調節因子を含んでもよい。
【０２９３】
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの転写後抑制調節因子を含んで、翻訳早期終止を調節してもよい。転写後制御調節因子は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２００４０１０１０６号パンフレット、国際公開第２００６０４４４５６号パンフレット、国際公開第２００６０４４６８２号パンフレット、国際公開第２００６０４４５０３号パンフレット、および国際公開第２００６０４４５０５号パンフレットに記載される化合物であってもよく、またはそれに概説される方法によって発見されてもよい。非限定的例として、化合物は、翻訳早期終止を調節するために、２８ＳリボソームＲＮＡ領域に結合してもよい（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２００４０１０１０６号パンフレットを参照されたい）。
【０２９４】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの転写後制御調節因子を含んで、タンパク質発現を変化させてもよい。非限定的例として、ＶＥＧＦの発現は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２００５１１８８５７号パンフレット、国際公開第２００６０６５４８０号パンフレット、国際公開第２００６０６５４７９号パンフレット、および国際公開第２００６０５８０８８号パンフレットに記載される化合物、またはそれに記載される方法によって発見される化合物を使用して、調節されてもよい。
【０２９５】
本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの転写後制御調節因子を含んで、翻訳を制御してもよい。一実施形態では、転写後制御調節因子は、ＲＮＡ制御配列であってもよい。非限定的例として、ＲＮＡ制御配列は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２００６０７１９０３号パンフレットに記載される方法によって同定されてもよい。
【０２９６】
ＩＩ．ポリヌクレオチドの設計、合成、および定量化
設計−コドン最適化
ポリヌクレオチド、それらの領域または部分または小領域は、コドン最適化されてもよい。コドン最適化法は、当該技術分野で公知であり、いくつかの目的の１つまたは複数を
達成する試みにおいて、有用であってもよい。これらの目的としては、適切な折りたたみを確実にするための標的および宿主生物におけるコドン頻度の一致；ｍＲＮＡ安定性を増大させ、または二次構造を低下させるためのＧＣ含有量の偏り、遺伝子の構築または発現を損なうこともあるタンデム反復コドンまたは塩基ランの最小化；転写および翻訳制御領域の個別調整；タンパク質輸送配列の挿入または除去；コード化タンパク質中の翻訳後修飾部位（例えばグリコシル化部位）の除去／付加；タンパク質ドメインの付加、除去またはシャッフル；制限酵素認識部位の挿入または欠失；翻訳比率を調節してタンパク質の様々なドメインの適切な折り畳みを可能にするためのリボソーム結合部位およびｍＲＮＡ分解部位の修飾；またはポリヌクレオチド中の二次構造問題の低減または排除が挙げられる。コドン最適化ツール、アルゴリズム、およびサービスは、当該技術分野で公知であり、非限定的例としては、ライフテクノロジーズのジーンアートＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カリフォルニア州メンロパーク（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ  ＣＡ）のＤＮＡ２．０が提供するサービスおよび／または独自仕様の方法が挙げられる。一実施形態では、ＯＲＦ配列は、最適化アルゴリズムを使用して最適化される。各アミノ酸のためのコドン選択肢は、表４に記載される。
【０２９７】
【表４】
2016538829.tif 000014
【０２９８】
本発明のいくつかの実施形態で有益と見なされてもよい特徴は、ポリヌクレオチド領域によってコードされてもよく、このような領域は、ポリペプチドをコードする領域の上流（５’）または下流（３’）であってもよい。これらの領域は、タンパク質コード領域またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のコドン最適化の前および／または後に、ポリヌクレオチドに組み込まれてもよい。ポリヌクレオチドが、５’および３’隣接領域
の両方を含有する必要はない。このような特徴の例としては、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック配列、オリゴ（ｄＴ）配列、および検出可能タグが挙げられるが、これに限定されるものではなく、ＸｂａＩ認識を有してもよい複数クローニング部位を含んでもよい。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲ領域が、隣接領域として提供されてもよい。複数の５’または３’ＵＴＲは、隣接領域に包含されてもよく、同一または異なる配列であってもよい。皆無を含む隣接領域の任意の部分は、コドン最適化されてもよく、いずれも独立して、コドン最適化の前および／または後に、１つまたは複数の異なる構造的または化学修飾を含有してもよい。
【０３００】
最適化後に（所望ならば）、ポリヌクレオチド成分は再構成されて、プラスミド、ウイルス、コスミド、および人工染色体などであるが、これに限定されるものではないベクターに形質転換される。例えば、最適化ポリヌクレオチドは再構成されて、化学的コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、トウモロコシ、ショウジョウバエなどに形質転換されてもよく、本明細書に記載される方法によって、高コピー数プラスミド様または染色体構造体が生じる。
【０３０１】
合成ポリヌクレオチドおよびそれらの核酸アナログは、生化学的過程の調査および研究において重要な役割を果たす。ポリヌクレオチドおよび核酸を合成するために、様々な酵素補助による方法および化学ベースの方法が、開発されている。
【０３０２】
酵素的方法としては、ＲＮＡポリメラーゼが使用されて、本発明のポリヌクレオチドが合成される、インビトロ転写が挙げられる。転写のための酵素的方法およびＲＮＡポリメラーゼは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／５３９０７号明細書の段落［０００２７６］〜［０００２９７］などに記載される。
【０３０３】
固相化学合成が利用されて、本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたはその部分が製造されてもよい。本明細書に記載されるポリヌクレオチドの固相化学合成製造は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／５３９０７号明細書の段落［０００２９８］〜［０００３０７］などに記載される。
【０３０４】
液相化学合成が利用されて、本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたはその部分が製造されてもよい。本明細書に記載されるポリヌクレオチドの液相化学合成製造は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／５３９０７号明細書の段落［０００３０８］などに記載される。
【０３０５】
異なる合成法の組み合わせが利用されて、本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたはその部分が製造されてもよい。これらの組み合わせは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／５３９０７号明細書の段落［０００３０９］〜［０００３１２］などに記載される。
【０３０６】
本発明のポリヌクレオチドの領域または小領域のために使用されてもよい小型領域合成。これらの合成法は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／５３９０７号明細書の段落［０００３１３］〜［０００３１４］などに記載される。
【０３０７】
ポリヌクレオチド領域または小領域のライゲーションが利用されて、本明細書に記載されるポリヌクレオチドが調製されてもよい。これらのライゲーション法は、その内容全体
が参照により本明細書に援用される、国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／５３９０７号明細書の段落［０００３１５］〜［０００３２２］などに記載される。
【０３０８】
修飾およびコンジュゲートされたポリヌクレオチド
鎖の合成中にまたは合成後に、非天然修飾ヌクレオチドがポリヌクレオチドまたは核酸に導入されて、所望の機能または特性が得られてもよい。修飾は、ヌクレオチド間系統、プリンまたはピリミジン塩基、または糖の上にあってもよい。修飾は、化学合成によって、またはポリメラーゼ酵素によって、鎖の末端に、または鎖中の他のいずれかの箇所に導入されてもよい。例えば、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）はヌクレアーゼ耐性であり、ＲＮＡに強力なハイブリダイゼーションを提供する。２つのコドン中にヘキシトール残基がある短いメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が、構築されている（その内容全体が参照により本明細書に援用される、ラブリク（Ｌａｖｒｉｋ）ら著、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００１年、第４０巻、ｐ１１７７７〜１１７８４）。５’および３’ＨＮＡ配列で挟まれるホスホロチオエート中心配列を含んでなる、キメラＨＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドのアンチセンス効果もまた試験されている（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、カング（Ｋａｎｇ）ら著、ニュークレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００４年、第３２巻、第４号、ｐ４４１１〜４４１９を参照されたい）。六員環を含んでなる修飾ヌクレオチドの調製と、ＲＮＡ干渉、アンチセンス療法またはその他の用途におけるその使用は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、ヘルデウィジン（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ）らに付与された、米国特許出願公開第２００８／０２６１９０５号明細書および米国特許出願公開第２０１０／０００９８６５号明細書および国際公開第９７／３００６４号パンフレットで開示される。修飾核酸およびそれらの合成は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、同時係属国際公開第２０１３０５２５２３号パンフレット（代理人整理番号Ｍ０９）で開示される。修飾ポリヌクレオチドの合成およびストラテジーは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、フェルマ（Ｖｅｒｍａ）およびエクスタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）著、アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９８年、第７６巻、ｐ９９〜１３４によって概説される。
【０３０９】
酵素的または化学的ライゲーション法のいずれかが利用されて、ポリヌクレオチドまたはそれらの領域が、蛍光性標識、液体、ナノ粒子、送達因子などの異なる機能ブロックとコンジュゲートされ得る。ポリヌクレオチドおよび修飾ポリヌクレオチドのコンジュゲートは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、グッドチャイルド（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ）著、バイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９０年、第１巻、第３号、ｐ１６５〜１８７によって概説される。（それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される）ビナヤク（Ｖｉｎａｙａｋ）らに付与された、米国特許第６，８３５，８２７号明細書および米国特許第６，５２５，１８３号明細書は、標識固体担体を使用した標識オリゴヌクレオチドの合成を教示する。
【０３１０】
定量化
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、エキソソーム中で、または１つまたは複数の体液から誘導された際に、定量化されてもよい。本明細書の用法では「体液」としては、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ：ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ
ｆｌｕｉｄ）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー氏腺液または尿道球腺液、汗、糞便物質、毛髪、涙、嚢胞液、胸膜および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経、膿、皮脂、吐瀉物、膣分泌物、粘膜分泌物、糞便水、膵液、副鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、および臍帯血が挙げられる。あるいは、エキソソームは、肺、心臓、膵臓、
胃、腸管、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、および胎盤からなる群から選択される臓器から取得されてもよい。
【０３１１】
エキソソーム定量化法では、２ｍＬ以下のサンプルが対象から入手され、エキソソームは、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心法、ナノメンブレン限外濾過、免疫吸着捕捉、親和性精製、マイクロ流体分離、またはそれらの組み合わせによって単離される。分析では、ポリヌクレオチドのレベルまたは濃度は、投与されるコンストラクトの発現、存在、不在、トランケーションまたは改変レベルであってもよい。１つまたは複数の臨床表現型に、またはヒト疾患生物マーカーのアッセイに、レベルを相関させることが有利である。アッセイは、コンストラクト特異的プローブ、血球計算法、ｑＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、電気泳動法、質量分析法、またはそれらの組み合わせを使用して実施されてもよい一方で、エキソソームは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）などの免疫組織化学的方法を使用して、単離されてもよい。エキソソームはまた、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心法、ナノメンブレン限外濾過、免疫吸着捕捉、親和性精製、マイクロ流体分離、またはそれらの組み合わせによって単離されてもよい。
【０３１２】
これらの方法は、研究者に、残留または送達ポリヌクレオチドのレベルをリアルタイムでモニターする能力をもたらす。これは、本発明のポリヌクレオチドが、構造的または化学修飾のために、内在性形態と異なることから可能である。
【０３１３】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、紫外線可視分光法（ＵＶ／Ｖｉｓ：ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  ｖｉｓｉｂｌｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）などであるが、これに限定されるものではない方法を使用して、定量化されてもよい。ＵＶ／Ｖｉｓ分光計の非限定的例は、マサチューセッツ州ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）のサーモフィッシャー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）のナノドロップ（ＮＡＮＯＤＲＯＰ）（登録商標）分光計である。定量化されるポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが適切なサイズであり、ポリヌクレオチド分解が起きなかったことを判定するために、分析されてもよい。ポリヌクレオチド分解は、アガロースゲル電気泳動；強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）などであるが、これに限定されるものではないＨＰＬＣベースの精製法；液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣＭＳ：ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）；キャピラリー電気泳動法（ＣＥ：ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）；および毛細血管ゲル電気泳動（ＣＧＥ：ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）などであるが、これに限定されるものではない方法によってチェックされてもよい。
【０３１４】
精製
本明細書に記載されるポリヌクレオチドの精製は、ポリヌクレオチド浄化、品質保証、および品質管理を含んでもよいが、これに限定されるものではない。浄化は、マサチューセッツ州ダンバーズ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）のベックマン・コールター・ゲノミクス（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）からのジェンコート（ＧＥＮＣＯＵＲＴ）（登録商標）ビーズ；ポリＴビーズ；デンマーク国ベズベック（Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）のエキシコン社（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ）からのエルエヌエー（ＬＮＡ）（商標）オリゴＴ捕捉プローブ；または強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ：ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅ  ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ：ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ＨＰＬＣ）などであるが、これに限定されるものではないＨＰＬＣベースの精製法などであるが、これに限定されるものではない、当該技術分野で公知
の方法によって実施されてもよい。「精製」という用語は、「精製ポリヌクレオチド」などのように、ポリヌクレオチドに関して使用される場合、少なくとも１つの汚染物質から分離されたものを指す。本明細書の用法では、「汚染物質」は、別の物質を不適当にし、不純にして、または劣化させる、任意の物質である。したがって、精製ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）は、それが自然界で見られるのと異なる形態または設定で、またはそれが処理または精製法の対象とされる前に存在したのと異なる、形態または設定で存在する。
【０３１５】
品質保証および／または品質管理チェックは、ゲル電気泳動、ＵＶ吸光度、または分析ＨＰＬＣなどであるが、これに限定されるものではない方法を使用して実施されてもよい。
【０３１６】
別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、逆転写酵素ＰＣＲを含むが、これに限定されるものではない方法によって配列決定されてもよい。
ＩＩＩ．修飾
本明細書の用法では、ポリヌクレオチド（キメラポリヌクレオチド、ＩＶＴポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドなど）における、「化学修飾」または必要に応じて「化学修飾された」という用語は、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）、チミジン（Ｔ）またはシチジン（Ｃ）リボ−またはデオキシリブヌクレオシド（ｄｅｏｘｙｒｉｂｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ）に関する、それらの位置、パターン、パーセントまたは集団の１つまたは複数における修飾を指す。通常、本明細書では、これらの用語は、天然の５’末端ｍＲＮＡキャップ部分のリボヌクレオチド修飾を指すことは意図されない。
【０３１７】
ポリペプチドでは、「修飾」という用語は、２０個のアミノ酸の基準セットと比較した修飾を指す。
修飾は、様々な別個の修飾であってもよい。いくつかの実施形態では、領域は、１つ、２つ、またはそれを超える（任意選択的に異なる）ヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を含有してもよい。いくつかの実施形態では、細胞に導入された修飾ポリヌクレオチドは、細胞内で、未修飾ポリヌクレオチドと比較して分解の低下を示してもよい。
【０３１８】
本発明で有用な修飾としては、表５のものが挙げられるが、これに限定されるものではない。表中に記述されるのは、修飾の記号、核酸塩基タイプ、および修飾が天然起源であるかないかである。
【０３１９】
【表５−１】
2016538829.tif 000015
【０３２０】
【表５−２】
2016538829.tif 000016
【０３２１】
【表５−３】
2016538829.tif 000017
【０３２２】
【表５−４】
2016538829.tif 000018
【０３２３】
【表５−５】
2016538829.tif 000019
【０３２４】
【表５−６】
2016538829.tif 000020
【０３２５】
【表５−７】
2016538829.tif 000021
【０３２６】
【表５−８】
2016538829.tif 000022
【０３２７】
【表５−９】
2016538829.tif 000023
【０３２８】
【表５−１０】
2016538829.tif 000024
【０３２９】
【表５−１１】
2016538829.tif 000025
【０３３０】
【表５−１２】
2016538829.tif 000026
【０３３１】
【表５−１３】
2016538829.tif 000027
【０３３２】
【表５−１４】
2016538829.tif 000028
【０３３３】
【表５−１５】
2016538829.tif 000029
【０３３４】
【表５−１６】
2016538829.tif 000030
【０３３５】
【表５−１７】
2016538829.tif 000031
【０３３６】
本発明のポリヌクレオチドにおいて有用であってもよいその他の修飾は、表６に列挙される。
【０３３７】
【表６−１】
2016538829.tif 000032
【０３３８】
【表６−２】
2016538829.tif 000033
【０３３９】
【表６−３】
2016538829.tif 000034
【０３４０】
ポリヌクレオチドは、ヌクレオシド間に任意の有用なリンカーを含み得る。主鎖修飾を含むこのようなリンカーは、表７に記載される。
【０３４１】
【表７】
2016538829.tif 000035
【０３４２】
ポリヌクレオチドは、糖、核酸塩基、またはヌクレオシド間結合などに対する（例えば結合ホスフェートに対する／リン酸ジエステル結合に対する／リン酸ジエステル主鎖に対する）、任意の有用な修飾を含み得る。ピリミジン核酸塩基の１つまたは複数の原子は、任意選択的に置換されたアミノ、任意選択的に置換されたチオール、任意選択的に置換されたアルキル（例えば、メチルまたはエチル）、またはハロ（例えば、クロロまたはフルオロ）で交換されまたは置換されてもよい。特定の実施形態では、修飾（例えば、１つまたは複数の修飾）は、糖およびヌクレオシド間結合のそれぞれの中に存在する。本発明による修飾は、リボ核酸（ＲＮＡ）からデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）への、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはそれらのハイブリッド）の修飾であってもよい。追加的な修飾は、本明細書に記載される。
【０３４３】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡがその中に導入された細胞の先天性免疫応答を実質的に誘導しない。誘導性先天性免疫応答の特徴としては、１）炎症促進性サイトカインの発現増大、２）細胞内ＰＲＲ（ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５などの活性化、および／または３）タンパク質翻訳の終結または低下が挙げられる。
【０３４４】
特定の実施形態では、細胞内に導入されたポリヌクレオチドが、細胞内で分解することが望ましくあってもよい。例えば、ポリヌクレオチドの分解は、タンパク質生成の精密なタイミングが所望される場合に、好ましくあってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、細胞内において指向性に作用される能力がある、分解ドメインを含有するポリヌクレオチドを提供する。
【０３４５】
ポリヌクレオチド領域のいずれでも、本明細書で教示されるように、またはそれぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、２０１２年１０月３日に出願された国際出願ＰＣＴ／２０１２／０５８５１９号明細書（代理人整理番号Ｍ９）、および２０１３年６月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／８３７２９７号明細書（代理人整理番号Ｍ３６）で教示されるように、化学修飾されてもよい。
【０３４６】
修飾ポリヌクレオチド分子
本発明は、例えば、ポリヌクレオチド分子の修飾リボヌクレオシド、および修飾リボヌクレオチドの基本単位もまた含む。例えば、これらの基本単位は、本発明のポリヌクレオチドを調製する上で有用たり得る。このような基本単位は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０５２５２３号パンフレット（代理人整理番号Ｍ９）および国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／７５１７７号明細書（代理人整理番号Ｍ３６）で教示される。
【０３４７】
糖上の修飾
ポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載されるようなＲＮＡまたはｍＲＮＡ）に組み込まれてもよい修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチド（例えば、基本単位分子）は、リボ核酸の糖上で修飾され得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、いくつかの異なる置換基で修飾または置換され得る。２’位における代表的置換としては、Ｈ；ハロ；任意選択的に置換されたＣ１〜６アルキル；任意選択的に置換されたＣ１〜６アルコキシ；任意選択的に置換されたＣ６〜１０アリールオキシ；任意選択的に置換されたＣ３〜８シクロアルキル；任意選択的に置換されたＣ３〜８シクロアルコキシ；任意選択的に置換されたＣ６〜１０アリールオキシ；任意選択的に置換されたＣ６〜１０アリール−Ｃ１〜６アルコキシ；任意選択的に置換されたＣ１〜１２（ヘテロシクリル）オキシ；糖（例えば、リボース、ペントース、または本明細書に記載される任意のもの）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ（式中、Ｒは、Ｈまたは任意選択的に置換されたアルキルであり、ｎは、０〜２０の整数（例えば、０〜４、０〜８、０〜１０、０〜１６、１〜４、１〜８、１〜１０、１〜１６、１〜２０、２〜４、２〜８、２〜１０、２〜１６、２〜２０、４〜８、４〜１０、４〜１６、および４〜２０）である）；その中で２’ヒドロキシルが、Ｃ１〜６アルキレンまたはＣ１〜６ヘテロアルキレン架橋によって、同一リボース糖の４’炭素に結合されて、代表的架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋が挙げられる、「ロックされた」核酸（ＬＮＡ）；本明細書で定義されるようなアミノアルキル；本明細書で定義されるようなアミノアルコキシ；本明細書で定義されるようなアミノ；および本明細書で定義されるようなアミノ酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０３４８】
一般に、ＲＮＡは、酸素を有する５員環である糖類リボースを含む。代表的な非限定的修飾ヌクレオチドとしては、リボース中の酸素の置換（例えば、Ｓによる、Ｓｅによる、またはメチレンまたはエチレンなどのアルキレンによる）；二重結合の付加（例えば、リ
ボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置換する）；リボース環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成する）；リボースの環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、およびホスホロアミダート主鎖もまた有するモルホリノなどの追加的な炭素またはヘテロ原子を有する６または７員環を形成する）；多環形態（例えば、トリシクロ；およびグリコール核酸（例えば、リボースがリン酸ジエステル結合に付着するグリコール単位によって交換されたＲ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡ）、（ＧＮＡ）などの「アンロックされた」形態、トレオース核酸（リボースがα−Ｌ−トレオフラノシル−（３’→２’）で置換されたＴＮＡ）；およびペプチド核酸（２−アミノ−エチル−グリシン結合がリボースおよびリン酸ジエステル主鎖を置換するＰＮＡ）が挙げられる。糖類は、リボース中の対応する炭素と逆の立体化学的配置を有する、１つまたは複数の炭素もまた含有し得る。したがって、ポリヌクレオチド分子は、例えば、糖としてアラビノースを含有するヌクレオチドを含み得る。このような糖修飾は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０５２５２３号パンフレット（代理人整理番号Ｍ９）および国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／７５１７７号明細書（代理人整理番号Ｍ３６）で教示される。
【０３４９】
核酸塩基上の修飾
本開示は、修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドを提供する。本明細書に記載されるように「ヌクレオシド」は、有機塩基（例えば、プリンまたはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも称される）との組み合わせで、糖分子（例えば、ペントースまたはリボース）またはその誘導体を含有する化合物と定義される。本明細書に記載されるように、「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドと定義される。修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、任意の有用な方法によって、（例えば、１つまたは複数の修飾または非天然ヌクレオシドを含むように、化学的に、酵素的に、または組換え的に）合成されてもよい。ポリヌクレオチドは、連結ヌクレオシドの１つおよび複数の領域を含んでなってもよい。このような領域は、変動する主鎖結合を有してもよい。結合は、標準リン酸エステル結合であってもよく、その場合、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド領域を含んでなる。
【０３５０】
修飾ヌクレオチド塩基対形成は、標準アデノシン−チミン、アデノシン−ウラシル、またはグアノシン−シトシン塩基対だけでなく，非標準または修飾塩基を含んでなるヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチド間に形成される塩基対もまた包含し、水素結合供与体および水素結合受容体の配置は、非標準塩基と標準塩基構造間の、または２つの相補的非標準塩基構造間の水素結合を可能にする。このような非標準塩基対形成の一例は、修飾ヌクレオチドイノシンと、アデニン、シトシンまたはウラシル間の塩基対形成である。
【０３５１】
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含み得る。ＲＮＡに見られる核酸塩基の例としては、アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシルが挙げられるが、これに限定されるものではない。ＤＮＡに見られる核酸塩基の例としては、アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンが挙げられるが、これに限定されるものではない。このような修飾核酸塩基（天然起源および非天然起源間の区別を含む）は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０５２５２３号パンフレット（代理人整理番号Ｍ９）および国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／７５１７７号明細書（代理人整理番号Ｍ３６）で教示される。
【０３５２】
修飾糖類、核酸塩基、およびヌクレオシド間結合の組み合わせ
本発明のポリヌクレオチドは、糖、核酸塩基、および／またはヌクレオシド間結合に対する修飾の組み合わせを含み得る。これらの組み合わせは、本明細書に記載される任意の１つまたは複数の修飾を含み得る。
【０３５３】
修飾ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチド組み合わせの例は、下の表８に提供される。これらの修飾ヌクレオチドの組み合わせが使用されて、本発明のポリヌクレオチドが形成され得る。特に断りのない限り、修飾ヌクレオチドが、本発明のポリヌクレオチドの天然ヌクレオチドを完全に置換してもよい。非限定的例として、天然ヌクレオチドは、本明細書に記載される修飾ヌクレオシドで置換されてもよい。別の非限定的一例では、天然ヌクレオチドウリジンが、本明細書で開示される修飾ヌクレオシドの少なくとも１つで、部分的に（例えば、約０．１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９．９％）置換されてもよい。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせが、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれてもよく、このような修飾は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０５２５２３号パンフレット（代理人整理番号Ｍ９）および国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／７５１７７号明細書（代理人整理番号Ｍ３６）で教示される。
【０３５４】
【表８−１】
2016538829.tif 000036
【０３５５】
【表８−２】
2016538829.tif 000037
【０３５６】
ＩＶ．医薬組成物
製剤化、投与、送達、および投薬
本発明は、１つまたは複数の薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わされた、ポリヌクレオチド組成物および複合体を提供する。医薬組成物は、任意選択的に、例えば、治療的および／または予防的活性物質などの、１つまたは複数の追加的な活性物質を含んでなってもよい。本発明の医薬組成物は、絶対無菌および／または発熱性物質非含有であってもよい。医薬品の製剤化および／または製造の概論は、例えば、レミントン：調剤の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）、第２１版、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）、２００５年（その内容全体が参照により本明細書に援用される）にある。
【０３５７】
いくつかの実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者または対象に投与される。本開示の目的で、「活性成分」という語句は、通常、本明細書に記載されるように送達されるポリヌクレオチドを指す。
【０３５８】
本明細書で提供される医薬組成物の記述は、主にヒトへの投与に適する医薬組成物を対象とするが、このような組成物は、通常、例えば非ヒト哺乳類などの非ヒト動物などの任意のその他の動物への投与に適することが、当業者によって理解される。組成物が様々な動物への投与に適するようにするための、ヒトへの投与に適する医薬組成物の修飾は、よく知られており、通常、熟練した獣医学の薬理学者は、たとえあったとしても単なる通常の実験法によって、このような修飾を設計しおよび／または実施し得る。医薬組成物の投与が検討される対象としては、ヒトおよび／またはその他の霊長類；畜牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および／またはラットなどの商業的価値を持つ哺乳類を含む哺乳類；および／または家禽、ニワトリ、カモ、ガチョウ、および／またはシチメンチョウなどの商業的価値を持つ鳥類を含む鳥類が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０３５９】
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学技術分野で公知の、または将来開発される、任意の方法によって製剤化されてもよい。一般に、このような準備の方法は、活性成分を賦形剤および／または１つまたは複数のその他の副成分と会合させるステップと、次に、必要ならばおよび／または望ましければ、製品を所望の単回または複数用量単位に分割、成形および／または包装するステップとを含む。
【０３６０】
本発明による医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容可能な賦形剤、および／または任意の追加的な成分の相対量は、治療される対象のアイデンティティー、サイズ、および／または病状次第で、さらには組成物が投与される手段次第で、様々である。一例として、組成物は、例えば、０．５〜５０％、１〜３０％、５〜８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）などの０．１％〜１００％の活性成分を含んでなってもよい。
【０３６１】
製剤
本発明のポリヌクレオチドは、（１）安定性を増大させ；（２）細胞形質移入を増大させ；（３）持続性または遅延性放出を可能にし（例えば、ポリヌクレオチドのデポー製剤からの）；（４）生体内分布を変化させ（例えば、特定の組織または細胞型にポリヌクレオチドを標的化する）；（５）インビボで、コード化タンパク質の翻訳を増大させ；および／または（６）インビボで、コード化タンパク質の放出プロファイルを変化させるための１つまたは複数の賦形剤を使用して製剤化され得る。任意のおよび全ての溶媒、分散媒、希釈剤、またはその他の液体ビヒクル、分散体または懸濁液助剤、表面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存料などの従来の賦形剤に加えて、本発明の賦形剤は、限定されることなく、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コア−シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、（例えば、対象に移植するための）ポリヌクレオチドで形質移入された細胞、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体、およびそれらの組み合わせを含み得る。したがって、本発明の製剤は１つまたは複数の賦形剤を含み得、賦形剤は、それぞれ、一緒になってポリヌクレオチドの安定性を増大させ、ポリヌクレオチドによる細胞形質移入を増大させ、ポリヌクレオチドがコードするタンパク質の発現を増大させ、および／またはポリヌクレオチドがコードするタンパク質の放出プロファイルを変化させる量である。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、自己組織化核酸ナノ粒子を使用して、製剤化されてもよい。
【０３６２】
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学技術分野で公知の、または将来開発される、任意の方法によって製剤化されてもよい。一般に、このような準備方法は、活性成分を賦形剤および／または１つまたは複数のその他の副成分と会合させるステップを含む。
【０３６３】
本開示に記載の医薬組成物は、バルクで、単回単位用量で、および／または複数の単回単位用量で、製剤化、包装、および／または販売されてもよい。本明細書の用法では、「単位用量」は、所定量の活性成分を含んでなる医薬組成物の不連続量を指す。活性成分の量は、通常、対象に投与される活性成分の用量および／またはこのような用量の半分または３分の１などのこのような用量の便利な画分に等しい。
【０３６４】
本開示による医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容可能な賦形剤、および／または任意の追加的な成分の相対量は、治療される対象のアイデンティティー、サイズ、および／または病状次第で、さらに組成物が投与される手段次第で様々であってもよい。例えば、組成物は、０．１％〜９９％（ｗ／ｗ）の活性成分を含んでなってもよい。一例として、組成物は、例えば、０．５〜５０％、１〜３０％、５〜８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）などの０．１％〜１００％の活性成分を含んでなってもよい。
【０３６５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される製剤は、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含有してもよい。非限定的例として、製剤は、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのポリヌクレオチドを含有してもよい。
【０３６６】
一実施形態では、本明細書に記載される製剤は、２つ以上のタイプのポリヌクレオチドを含んでなってもよい。一実施形態では、製剤は、直鎖および環状形態のポリヌクレオチドを含んでなってもよい。別の実施形態では、製剤は、環状ポリヌクレオチドおよびＩＶ
Ｔポリヌクレオチドを含んでなってもよい。さらに別の実施形態では、製剤は、ＩＶＴポリヌクレオチド、キメラポリヌクレオチド、および環状ポリヌクレオチドを含んでなってもよい。
【０３６７】
一実施形態では、製剤は、ＬＤＬＲタンパク質、または少なくとも１つの変異（例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異）を含んでなるＬＤＬＲタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドを含有してもよい。
【０３６８】
医薬製剤は、本明細書の用法では、所望の特定の投与形態に適するような、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、希釈剤、またはその他の液体ビヒクル、分散体または懸濁液助剤、表面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存料などを含むが、これに限定されるものではない、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含んでなってもよい。医薬組成物を製剤化するための様々な賦形剤および組成物を調製する技術は、当該技術分野で公知である（その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ａ．Ｒ．ジェナーロ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）著、レミントン：調剤の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）、第２１版、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）、メリーラン州ボルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）、２００６年を参照されたい）。従来の賦形剤媒体の使用は、任意の従来の賦形剤媒体が、任意の望ましくない生物学的効果の発生、またはさもなければ医薬組成物の任意のその他の成分との有害な方法での相互作用などによって、物質またはその誘導体と不適合であってもよい場合を除き、本開示の範囲内で検討されてもよい。
【０３６９】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の粒度は、増大および／または低下してもよい。粒度の変化はまた、炎症などであるが、これに限定されるものではない、生物学的反応を無効にするのを促進することができてもよく、または哺乳類に送達される、修飾ｍＲＮＡの生物学的効果を増大させてもよい。
【０３７０】
医薬組成物の製造で使用される薬学的に許容可能な賦形剤としては、不活性希釈剤、表面活性剤および／または乳化剤、保存料、緩衝剤、平滑剤、および／または油が挙げられるが、これに限定されるものではない。このような賦形剤は、任意選択的に、本発明の医薬製剤に包含されてもよい。
【０３７１】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、コレステロールなどの分子を隔離し得るナノ構造中で投与され、またはそれと共に投与され、それに製剤化され、またはそれと共に送達されてもよい。これらのナノ構造およびこれらのナノ構造を製造する方法の非限定的例は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１９５７５９号明細書に記載される。これらのナノ構造の代表的構造は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１９５７５９号明細書の図１に示され、コアとコア周囲のシェルとを含んでもよい。
【０３７２】
リピドイド
リピドイドの合成は、広範囲にわたって説明され、これらの化合物を含有する製剤は、特にポリヌクレオチドの送達に適している（全てその内容全体が本明細書に援用される、マホン（Ｍａｈｏｎ）ら著、バイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ
Ｃｈｅｍ．）、２０１０年、第２１巻、ｐ１４４８〜１４５４；シュローダー（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ）ら著、ジャーナル・オブ・インターナル・メディシン（Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ
Ｍｅｄ．）、２０１０年、第２６７巻、ｐ９〜２１；アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００８年、第２
６巻、ｐ５６１〜５６９；ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．）、２０１０年、第１０７巻、ｐ１８６４〜１８６９；ジークバルト（Ｓｉｅｇｗａｒｔ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．）、２０１１年、第１０８巻、ｐ１２９９６〜３００１を参照されたい）。
【０３７３】
これらのリピドイドは、齧歯類および非ヒト霊長類において、二本鎖低分子干渉ＲＮＡ分子を効果的に送達するのに使用される一方で、（全てその内容全体が本明細書に援用される、アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００８年、第２６巻、ｐ５６１〜５６９；フランク・カメネットスキー（Ｆｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｙ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．）、２００８年、第１０５巻、ｐ１１９１５〜１１９２０；アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２００９年、第１７巻、ｐ８７２〜８７９；ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．）、２０１０年、第１０７巻、ｐ１８６４〜１８６９；ロイシュナー（Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２０１１年、第２９巻、ｐ１００５〜１０１０を参照されたい）本開示は、それらの製剤化と、ポリヌクレオチド送達におけるその使用を記載する。
【０３７４】
これらのリピドイドを含有する、複合体、ミセル、リポソームまたは粒子が調製され得、したがって、局在性および／または全身性投与経路を通じたリピドイド製剤の注射に続く、コード化タンパク質生成による判定で、効果的なポリヌクレオチドの送達がもたらされ得る。ポリヌクレオチドのリピドイド複合体は、静脈内、筋肉内、または皮下手段を含むが、これに限定されるものではない、様々な手段によって投与され得る。
【０３７５】
核酸のインビボ送達は、製剤組成、粒子ＰＥＧ化の性質、負荷の程度、ポリヌクレオチドと脂質の比率、および粒度を含むが、これに限定されるものではない、生物物理学的パラメータなどであるが、これに限定されるものではない、多数のパラメータによって影響を受けてもよい。（その内容全体が参照により本明細書に援用される、アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２００９年、第１７巻、ｐ８７２〜８７９）。一例として、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質のアンカー鎖長の小さな変化が、インビボ効能に顕著な効果をもたらしてもよい。ペンタ［３−（１−ラウリルアミノプロピオニル）］−トリエチレンテトラミン塩酸塩（ＴＥＴＡ−５ＬＡＰ；別名９８Ｎ１２−５、その内容全体が参照により本明細書に援用される、ムルガイアー（Ｍｕｒｕｇａｉａｈ）ら著、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２０１０年、第４０１巻、ｐ６１を参照されたい）、Ｃ１２−２００（誘導体および変異型を含む）、およびＭＤ１を含むが、これに限定されるものではない、異なるリピドイドを用いた製剤が、インビボ活性について試験され得る。
【０３７６】
本明細書で「９８Ｎ１２−５」と称されるリピドイドは、その内容全体が参照により援用される、アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２００９年、第１７巻、ｐ８７２〜８７９によって開示される。
【０３７７】
本明細書で「Ｃ１２−２００」と称されるリピドイドは、いずれもその内容全体が参照により本明細書に援用される、ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．）、２０１０年、第１０７巻、ｐ１８６４〜１８６９；およびリュー（Ｌｉｕ）およびファング（Ｈｕａｎｇ）著、モレキュラー・セラピー、２０１０年、ｐ６６９〜６７０によって開示される。リピドイド製剤は、ポリヌ
クレオチドに加えて、３つまたは４つまたはそれを超える成分のいずれかを含んでなる粒子を含み得る。
【０３７８】
リピドイドを含んでなるリピドイドおよびポリヌクレオチド製剤は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０９７０７７号明細書（代理人整理番号Ｍ０３０．２０）の段落［０００４１５］〜［０００４２２］などに記載される。
【０３７９】
リポソーム、リポプレックス、および脂質ナノ粒子
本発明のポリヌクレオチドは、１つまたは複数のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して、製剤化され得る。一実施形態では、ポリヌクレオチドの医薬組成物は、リポソームを含む。リポソームは、主に脂質二重層から構成されてもよく、栄養素および医薬製剤を投与するための送達ビヒクルとして使用されてもよい、人工的に調製される小胞である。リポソームは異なるサイズであり得、直径が数百ナノメートルであってもよく、狭い水性区画によって隔てられる一連の同心円状二重層を含有してもよい、多重膜小胞（ＭＬＶ：ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）；直径が５０ｎｍより小さくてもよい小型単細胞小胞（ＳＵＶ：ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）；および直径が５０〜５００ｎｍであってもよい大型単層小胞（ＬＵＶ：ｌａｒｇｅ  ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）などであるが、これに限定されるものではない。リポソーム設計としては、不健康組織へのリポソーム付着を改善するための、またはエンドサイトーシスなどであるが、これに限定されるものではない事象を活性化するための、オプソニンまたはリガンドが挙げられるが、これに限定されるものではない。リポソームは、医薬製剤の送達を改善するために、低または高ｐＨを含有してもよい。
【０３８０】
リポソームの形成は、封入される医薬製剤およびリポソーム成分、その中に脂質小胞が分散する媒体の性質、封入物質の有効濃度およびその可能な毒性、小胞の適用および／または送達に関与する任意の追加的な処理、サイズの最適化、意図される用途のための小胞の多分散性および貯蔵寿命、および安全かつ効率的なリポソーム製品のバッチ毎の再現性と、大規模製造可能性などであるが、これに限定されるものではない、物理化学的特性に左右されてもよい。
【０３８１】
非限定的例として、合成膜小胞などのリポソームは、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１７７６３８号明細書、米国特許出願公開第２０１３０１７７６３７号明細書、米国特許出願公開第２０１３０１７７６３６号明細書、米国特許出願公開第２０１３０１７７６３５号明細書、米国特許出願公開第２０１３０１７７６３４号明細書、米国特許出願公開第２０１３０１７７６３３号明細書、米国特許出願公開第２０１３０１８３３７５号明細書、米国特許出願公開第２０１３０１８３３７３号明細書、および米国特許出願公開第２０１３０１８３３７２号明細書に記載される方法、器具、および装置によって製剤化されてもよい。
【０３８２】
一実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物としては、限定されることなく、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）リポソーム、ワシントン州ボスウェル（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）のマリーナ・バイオテック（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）からのディラツ−（ＤｉＬａ２）リポソーム、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、およびＭＣ３から形成されるものなどのリポソーム（その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１００３２４１２０号明細書）；およびジャンセン・バイオテック株式会社（Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）か
らのドキシル（ＤＯＸＩＬ）（登録商標）などであるが、これに限定されるものではない、小分子薬剤を送達してもよいリポソームが挙げられる。
【０３８３】
一実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物としては、限定されることなく、以前記載され、インビトロおよびインビボにおけるオリゴヌクレオチド送達に適することが示されている、安定化プラスミド脂質粒子（ＳＰＬＰ：ｓｔａｂｌｉｚｉｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄ−ｌｉｐｉｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）または安定化核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ：ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｐｉｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）の合成から形成されるものなどのリポソームが挙げられる（全てその内容全体が本明細書に援用される、ウィラー（Ｗｈｅｅｌｅｒ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．）、１９９９年、第６巻、ｐ２７１〜２８１；ザング（Ｚｈａｎｇ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．）、１９９９年、第６巻、ｐ１４３８〜１４４７；ジェフズ（Ｊｅｆｆｓ）ら著、ファーマスーティカル・リサーチ（Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．）、２００５年、第２２巻、ｐ３６２〜３７２；モリシー（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．）、２００５年、第２巻、ｐ１００２〜１００７；ジマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２００６年、第４４１巻、ｐ１１１〜１１４；ヘイズ（Ｈｅｙｅｓ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．）、２００５年、第１０７巻、ｐ２７６〜２８７；センプル（Ｓｅｍｐｌｅ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２０１０年、第２８巻、ｐ１７２〜１７６；ジャッジ（Ｊｕｄｇｅ）ら著、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．）、２００９年、第１１９巻、ｐ６６１〜６７３；ド・フジュロル（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ）著、ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．）、２００８年、第１９巻、ｐ１２５〜１３２；米国特許出願公開第２０１３０１２２１０４号明細書を参照されたい）。ウィラー（Ｗｈｅｅｌｅｒ）らによる最初の製造方法は洗剤透析法であり、それは、後からジェフズ（Ｊｅｆｆｓ）らによって改良されて、自発的小胞形成法と称される。リポソーム製剤は、ポリヌクレオチドに加えて、３〜４つの脂質成分から構成される。一例として、リポソームは、ジェフズ（Ｊｅｆｆｓ）らによって記載されるように、５５％のコレステロール、２０％のジステロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１０％のＰＥＧ−Ｓ−ＤＳＧ、および１５％の１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）を含有し得るが、これに限定されるものではない。別の実施例として、特定のリポソーム製剤は、ヘイズ（Ｈｅｙｅｓ）らによって記載されるように、４８％のコレステロール、２０％のＤＳＰＣ、２％のＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ、および３０％のカチオン性脂質を含有してもよいが、これに限定されるものではなく、カチオン性脂質は、１，２−ジステアルロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、または１，２−ジリノレニルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）であり得る。
【０３８４】
いくつかの実施形態では、リポソーム製剤は、約約２５．０％のコレステロール〜約４０．０％のコレステロール、約３０．０％のコレステロール〜約４５．０％のコレステロール、約３５．０％のコレステロール〜約５０．０％のコレステロールおよび／または約４８．５％のコレステロール〜約６０％のコレステロールを含んでなってもよい。好ましい実施形態では、製剤は、２８．５％、３１．５％、３３．５％、３６．５％、３７．０％、３８．５％、３９．０％、および４３．５％からなる群から選択される、コレステロールの百分率を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、製剤は、約５．０％〜約１０．０％のＤＳＰＣおよび／または約７．０％〜約１５．０％のＤＳＰＣを含んでなってもよい。
【０３８５】
一実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つの免疫原または任意のその他の目的の
ポリペプチドをコードしてもよい、ポリヌクレオチドを送達するために形成されてもよい、リポソームを含んでもよい。ポリヌクレオチドは、リポソームによってカプセル化されてもよく、および／またはそれは、次にリポソームによってカプセル化されてもよい水性コアに含まれてもよい（それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される。国際公開第２０１２０３１０４６号パンフレット、国際公開第２０１２０３１０４３号パンフレット、国際公開第２０１２０３０９０１号パンフレット、および国際公開第２０１２００６３７８号パンフレット、および米国特許出願公開第２０１３０１８９３５１号明細書、米国特許出願公開第２０１３０１９５９６９号明細書、および米国特許出願公開第２０１３０２０２６８４号明細書を参照されたい）。
【０３８６】
別の実施形態では、リポソームは、標的化送達のために製剤化されてもよい。非限定的例として、リポソームは、肝臓への標的化送達のために製剤化されてもよい。標的化送達のために使用されるリポソームとしては、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１９５９６７号明細書に記載されるリポソームが挙げられるが、これに限定されるものではなく、リポソームを製造する方法は、同明細書に記載される。
【０３８７】
別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、カチオン性水中油型エマルションに製剤化されてもよく、エマルション粒子は、油中子およびカチオン性脂質を含んでなり、それは分子をエマルション粒子に固着させるポリヌクレオチドと相互作用し得る（その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１２００６３８０号パンフレットを参照されたい）。
【０３８８】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、その中に親水性相が分散する、連続疎水性相を含んでなる、油中水型エマルションに製剤化されてもよい。非限定的例として、エマルションは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１０８７７９１号パンフレットに記載される方法によって製造されてもよい。
【０３８９】
別の実施形態では、脂質製剤は、少なくともカチオン性脂質、形質移入を促進してもよい脂質、および脂質部分に結合する親水性頭部基を含有する、少なくとも１つの脂質を含んでもよい（それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１１０７６８０７号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１１０２００５８２号明細書）。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、官能化脂質二重層間に架橋を有してもよい脂質小胞に製剤化されてもよい（その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１２０１７７７２４号明細書を参照されたい）。
【０３９０】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０８６５２６号パンフレットに記載されるようなリポソームに製剤化されてもよい。ポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０８６５２６号パンフレットに記載される、逆転ｐＨ勾配および／または最適化内部緩衝液組成物を使用して、リポソームにカプセル化されてもよい。
【０３９１】
一実施形態では、医薬組成物は、ワシントン州ボスウェル（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）のマリーナ・バイオテック（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）からのディラツ−（ＤｉＬａ２）リポソーム、ワシントン州ボスウェル（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）のマリーナ・バイオテック（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）からのスマーティクルズ（ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ）（登録商標）、中性ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）ベースのリポソーム（例えば、卵巣がんのためのｓｉＲＮＡ送達（その内容全体が参照により本明細書に援用される、ランデン（Ｌａｎｄｅｎ）ら著、キャンサ−・バイオロジー・アンド・セラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｙ）、２０
０６年、第５巻、第１２号、ｐ１７０８〜１７１３）、およびイスラエル国（Ｉｓｒａｅｌ）のクワイエット・セラピューティクス（Ｑｕｉｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）からのヒアルロナン被覆リポソームなどであるが、これに限定されるものではないリポソームに製剤化されてもよい。
【０３９２】
一実施形態では、カチオン性脂質は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３００９０３７２号明細書に記載されるものなどの低分子量カチオン性脂質であってもよい。
【０３９３】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、官能化脂質二重層間に架橋を有してもよい脂質小胞に製剤化されてもよい。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、カチオン性脂質を含んでなるリポソームに製剤化されてもよい。リポソームは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３００６８２５号パンフレットに記載されるように１：１〜２０：１である、ＲＮＡ中のリン酸塩に対するカチオン性脂質中の窒素原子のモル比（Ｎ：Ｐ比）を有してもよい。別の実施形態では、リポソームは、２０：１を超えまたは１：１未満のＮ：Ｐ比を有してもよい。
【０３９４】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質−ポリカチオン複合体に製剤化されてもよい。脂質−ポリカチオン複合体の形成は、当該技術分野で公知の方法、および／またはその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１２０１７８７０２号明細書に記載されるような方法によって達成されてもよい。非限定的例として、ポリカチオンとしては、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１２０１３３２６号パンフレットまたは米国特許出願公開第２０１３０１４２８１８号明細書に記載される、ポリリジン、ポリオルニチンおよび／またはポリアルギニンおよびカチオン性ペプチドなどであるが、これに限定されるものではない、カチオン性ペプチドまたはポリペプチドが挙げられる。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コレステロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などであるが、これに限定されるものではない中性脂質をさらに含んでもよい、脂質−ポリカチオン複合体に製剤化されてもよい。
【０３９５】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、アミノアルコールリピドイドに製剤化されてもよい。本発明で使用されてもよいアミノアルコールリピドイドは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，４５０，２９８号明細書に記載される方法によって製剤化されてもよい。
【０３９６】
リポソーム製剤は、カチオン性脂質成分、カチオン性脂質の飽和度、ＰＥＧ化の性質、全ての成分の比率、およびサイズなどの生物物理学的パラメータの選択などによって影響を受けてもよいが、これに限定されるものではない。センプル（Ｓｅｍｐｌｅ）らによる一例（その内容全体が参照により本明細書に援用される、センプル（Ｓｅｍｐｌｅ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．）、２０１０年、第２８巻、ｐ１７２〜１７６）では、リポソーム製剤は、５７．１％のカチオン性脂質、７．１％のジパルミトイルホスファチジルコリン、３４．３％のコレステロール、および１．４％のＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡから構成された。別の例として、カチオン性脂質の組成を変更することで、様々な抗原提示細胞に、ｓｉＲＮＡをより効果的に送達し得た（その内容全体が参照により本明細書に援用される、バシャ（Ｂａｓｈａ）ら著、モレキュラー・セラピー（ＭｏｌＴｈｅｒ．）、２０１１年、第１９巻、ｐ２１８６〜２２００）。いくつかの実施形態では、リポソーム製剤は、約３５〜約４５％のカチオン性脂質、約４０％〜約５０％のカチオン性脂質、約５０％〜約６０％のカチオン性脂質および／または約５５％〜約６５％のカチオン性脂質を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、リポ
ソーム中の脂質とｍＲＮＡの比率は、約約５：１〜約２０：１、約１０：１〜約２５：１、約１５：１〜約３０：１および／または少なくとも３０：１であってもよい。
【０３９７】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ：ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）製剤中のＰＥＧの比率が増大または低下されてもよく、および／またはＰＥＧ脂質の炭素鎖長がＣ１４〜Ｃ１８に改変されて、ＬＮＰ製剤の薬物動態学および／または生体内分布が変化されてもよい。非限定的例として、ＬＮＰ製剤は、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、およびコレステロールと比較して、約０．５％〜約３．０％、約１．０％〜約３．５％、約１．５％〜約４．０％、約２．０％〜約４．５％、約２．５％〜約５．０％および／または約３．０％〜約６．０％の脂質モル比のＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有してもよい。別の実施形態では、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧは、ＰＥＧ−ＤＳＧ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）、ＰＥＧ−ＤＭＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール）および／またはＰＥＧ−ＤＰＧ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）などであるが、これに限定されるものではないＰＥＧ脂質で置換されてもよい。カチオン性脂質は、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、Ｃ１２−２００、およびＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡなどであるが、これに限定されるものではない、当該技術分野で公知の任意の脂質から選択されてもよい。
【０３９８】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１２１７０９３０号パンフレットに記載されるものなどの脂質ナノ粒子に製剤化されてもよい。
【０３９９】
一実施形態では、ポリヌクレオチドを含んでなる製剤は、少なくとも１つの脂質を含んでなってもよいナノ粒子である。脂質は、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ化脂質、およびアミノアルコール脂質から選択されてもよいが、これに限定されるものではない。別の態様では、脂質は、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｄ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、およびアミノアルコール脂質などであるが、これに限定されるものではない、カチオン性脂質であってもよい。アミノアルコールカチオン性脂質は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号明細書に記載される脂質であってもよく、および／またはそれに記載される方法によって製造されてもよい。非限定的例として、カチオン性脂質は、２−アミノ−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ，２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号明細書の化合物１）；２−アミノ−３−［（９Ｚ）−オクタデク−９−エン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ）−オクタデク−９−エン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号明細書の化合物２）；２−アミノ−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−［（オクチルオキシ）メチル］プロパン−１−オール（米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号明細書の化合物３）；および２−（ジメチルアミノ）−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号明細書の化合物４）；またはそれらの任意の薬学的に許容可能な塩または立体異性体であってもよい。
【０４００】
一実施形態では、カチオン性脂質は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１２０４０１８４号パンフレット、国際公開第２０１１１５３
１２０号パンフレット、国際公開第２０１１１４９７３３号パンフレット、国際公開第２０１１０９０９６５号パンフレット、国際公開第２０１１０４３９１３号パンフレット、国際公開第２０１１０２２４６０号パンフレット、国際公開第２０１２０６１２５９号パンフレット、国際公開第２０１２０５４３６５号パンフレット、国際公開第２０１２０４４６３８号パンフレット、国際公開第２０１００８０７２４号パンフレット、国際公開第２０１０２１８６５号パンフレット、国際公開第２００８１０３２７６号パンフレット、国際公開第２０１３０８６３７３号パンフレット、および国際公開第２０１３０８６３５４号パンフレット、米国特許第７，８９３，３０２号明細書、米国特許第７，４０４，９６９号明細書、米国特許第８，２８３，３３３明細書、および米国特許第８，４６６，１２２号明細書、および米国特許出願公開第２０１０００３６１１５号明細書、米国特許出願公開第２０１２０２０２８７１号明細書、米国特許出願公開第２０１３００６４８９４号明細書、米国特許出願公開第２０１３０１２９７８５号明細書、米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号明細書、米国特許出願公開第２０１３０１７８５４１号明細書、および米国特許出願公開第２０１３０２２５８３６号明細書に記載されるカチオン性脂質から選択されてもよいが、これに限定されるものではない。別の実施形態では、カチオン性脂質は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１２０４０１８４号パンフレット、国際公開第２０１１１５３１２０号パンフレット、国際公開第２０１１１４９７３３号パンフレット、国際公開第２０１１０９０９６５号パンフレット、国際公開第２０１１０４３９１３号パンフレット、国際公開第２０１１０２２４６０号パンフレット、国際公開第２０１２０６１２５９号パンフレット、国際公開第２０１２０５４３６５号パンフレット、国際公開第２０１２０４４６３８号パンフレット、および国際公開第２０１３１１６１２６号パンフレット、または米国特許出願公開第２０１３０１７８５４１号明細書および米国特許出願公開第２０１３０２２５８３６号明細書に記載される、式Ａから選択されてもよいが、これに限定されるものではない。さらに別の実施形態では、カチオン性脂質は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２００８１０３２７６号パンフレットの式ＣＬＩ〜ＣＬＸＸＩＸ、米国特許第７，８９３，３０２号明細書の式ＣＬＩ〜ＣＬＸＸＩＸ、米国特許第７，４０４，９６９号明細書の式ＣＬＩ〜ＣＬＸＸＸＸＩＩ、および米国特許出願公開第２０１０００３６１１５号明細書の式Ｉ〜ＶＩ、米国特許出願公開第２０１３０１２３３３８号明細書の式Ｉから選択されてもよいが、これに限定されるものではない。非限定的例として、カチオン性脂質は、（２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−２０，２３−ジエン−１０−アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメミルヘキサコサ（ｄｉｍｅｍｙｌｈｅｘａｃｏｓａ）−１７，２０−ジエン−９−アミン、（１Ｚ，１９Ｚ）−Ｎ５Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６、１９−ジエン−８−アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルドコサ−１３，１６−ジエン−５−アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘニコサ−１２，１５−ジエン−４−アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリコサ−１４，１７−ジエン−６−アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルテトラコサ−１５，１８−ジエン−７−アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８，２１−ジエン−１０−アミン、（１５Ζ，１８Ζ）−Ν，Ν−ジメチルテトラコサ−１５，１８−ジエン−５−アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリコサ−１４，１７−ジエン−４−アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメイヒルオクタコサ（ｄｉｍｅｉｈｙｌｏｃｔａｃｏｓａ）−１９，２２−ジエン−９−アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８，２１−ジエン−８−アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ−１７，２０−ジエン−７−アミン、（１６Ｚ，１９Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６，１９−ジエン−６−アミン、（２２Ｚ，２５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘントリアコンタ−２２，２５−ジエン−１０−アミン、（２１Ｚ，２４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリアコンタ−２１，２４−ジエン−９−アミン、（１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコス（ｄｉｍｅｔｙｌｈｅｐｔａｃｏｓ）−１８−エン−１０−アミン、（１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコス１７−エン−９−アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタコサ−１９，２２−ジエン−７
−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサン−１０−アミン、（２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ−エチル−Ｎ−メチルノナコサ−２０，２３−ジエン−１０−アミン、１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−１−ノニリコサ−１１，１４−ジエン−１−イル］ピロリジン、（２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコス−２０−エン−１０−アミン、（１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエプタコス（ｅｐｔａｃｏｓ）−１５−エン−１０−アミン、（１４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコス−１４−エン−１０−アミン、（１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコス−１７−エン−１０−アミン、（２４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリトリアコント−２４−エン−１０−アミン、（２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコス−２０−エン−１０−アミン、（２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘントリアコント−２２−エン−１０−アミン、（１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタコス−１６−エン−８−アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘニコサ−１２，１５−ジエン−１−アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−１３，１６−ジエン−１−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］エプタデカン（ｅｐｔａｄｅｃａｎ）−８−アミン、１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヘキシルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナデカン−１０−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ノナデカン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘニコサン−１０−アミン，Ν，Ν−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］ノナデカン−１０−アミン，Ν，Ν−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘキサデカン−８−アミン、Ν，Ν−ジメチル−［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ウンデシルシクロプロピル］テトラデカン−５−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−｛７−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプチル｝ドデカン−１−アミン、１−［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヘプチルシクロプロピル］−Ν，Ν−ジメチルオクタデカン−９−アミン、１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−デシルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタデカン−６−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ペンタデカン−８−アミン、Ｒ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、Ｓ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−｛２−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−１−［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝ピロリジン、（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−［（５Ｚ）−ｏｃｔ−５−ｅｎ−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、１−｛２−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−１−［（オクチ���オキシ）メチル］エチル｝アゼチジン、（２Ｓ）−１−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−（ヘプチルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−（ノニルオキシ）−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−［（９Ｚ）−オクタデク−９−エン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン；（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−６，９，１２−トリエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（ペンチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−（ヘキシルオキシ）−３−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ν，Ν−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−［（１３Ｚ，１６Ｚ）−ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ
）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１３Ｚ，１６Ｚ）−ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イルオキシ］−３−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１３Ｚ）−ドコス−１３−エン−１−イルオキシ］−３−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、１−［（１３Ｚ）−ドコス−１３−エン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−［（９Ｚ）−ヘキサデク−９−エン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｒ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｈ（１−メトイルオクチル（ｍｅｔｏｙｌｏ  ｃｔｙｌ））オキシ］−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、（２Ｒ）−１−［（３，７−ジメチルオクチル）オキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−（オクチルオキシ）−３−（｛８−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］オクチル｝オキシ）プロパン−２−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−｛［８−（２−オクリルシクロプロピル（ｏｃｌｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ））オクチル］オキシ｝−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミンおよび（１１Ｅ，２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１１，２０，２−トリエン−１０−アミン、またはそれらの薬学的に許容可能な塩または立体異性体から選択されてもよい。
【０４０１】
一実施形態では、脂質は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１２１７０８８９号パンフレットに記載されるものなどの切断可能な脂質であってもよい。
【０４０２】
別の実施形態では、脂質は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３００６４８９４号明細書の式（Ｉ）などであるが、これに限定されるものではないカチオン性脂質であってもよい。
【０４０３】
一実施形態では、カチオン性脂質は、当該技術分野で公知の方法、および／またはそれぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１２０４０１８４号パンフレット、国際公開第２０１１１５３１２０号パンフレット、国際公開第２０１１１４９７３３号パンフレット、国際公開第２０１１０９０９６５号パンフレット、国際公開第２０１１０４３９１３号パンフレット、国際公開第２０１１０２２４６０号パンフレット、国際公開第２０１２０６１２５９号パンフレット、国際公開第２０１２０５４３６５号パンフレット、国際公開第２０１２０４４６３８号パンフレット、国際公開第２０１００８０７２４号パンフレット、国際公開第２０１０２１８６５号パンフレット、国際公開第２０１３０８６３７３号パンフレット、および国際公開第２０１３０８６３５４号パンフレットに記載されるような方法によって、合成されてもよい。
【０４０４】
別の実施形態では、カチオン性脂質は、トリアルキルカチオン性脂質であってもよい。トリアルキルカチオン性脂質と、トリアルキルカチオン性脂質を製造して使用する方法との非限定的例は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３１２６８０３号パンフレットに記載される。
【０４０５】
一実施形態では、ポリヌクレオチドのＬＮＰ製剤は、３％の脂質モル比でＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有してもよい。別の実施形態では、ＬＮＰ製剤ポリヌクレオチドは、１．５％の脂質モル比でＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有してもよい。
【０４０６】
一実施形態では、ポリヌクレオチドの医薬組成物は、参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１２０９９７５５号パンフレットに記載されるＰＥＧ化脂質の少なくとも１つを含んでもよい。
【０４０７】
一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホホエタノールアミン（ｐｈｏｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００）を含有してもよい。一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００、当該技術分野で公知のカチオン性脂質、および少なくとも１つの他の成分を含有してもよい。別の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００、当該技術分野で公知のカチオン性脂質、ＤＳＰＣ、およびコレステロールを含有してもよい。非限定的例として、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、およびコレステロールを含有してもよい。別の非限定的例として、ＬＮＰ製剤は、２：４０：１０：４８のモル比でＰＥＧ−ＤＭＧ２０００、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＳＰＣおよびコレステロールを含有してもよい（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、ゲール（Ｇｅａｌｌ）ら著、「自己増幅するＲＮＡワクチンの非ウイルス性送達（Ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ＲＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）」、２０１２年、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、ＰＭＩＤ：２２９０８２９４を参照されたい）。
【０４０８】
一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１１１２７２５５号パンフレットまたは国際公開第２００８１０３２７６号パンフレットに記載される方法によって製剤化されてもよい。非限定的例として、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１１１２７２５５号パンフレットおよび／または国際公開第２００８１０３２７６号パンフレットに記載されるようにしてＬＮＰ製剤中でカプセル化されてもよい。
【０４０９】
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１２０２０７８４５号明細書に記載されるような非経口手段によって送達されるナノ粒子に製剤化されてもよい。
【０４１０】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１５６８４５号明細書または国際公開第２０１３０９３６４８号パンフレットまたは国際公開第２０１２０２４５２６号パンフレットに記載される方法によって製造される脂質ナノ粒子に製剤化されてもよい。
【０４１１】
本明細書に記載される脂質ナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１６４４００号明細書に記載されるシステムおよび／または方法によって、絶対無菌環境内で製造されてもよい。
【０４１２】
一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，４９２，３５９号明細書に記載される、核酸−脂質粒子などのナノ粒子に製剤化されてもよい。非限定的例として、脂質粒子は、１つまたは複数の活性剤または治療薬；粒子中に存在する約５０モル％〜約８５モル％の総脂質を含んでなる１つまたは複数のカチオン性脂質；粒子中に存在する約１３モル％〜約４９．５モル％の総脂質を含んでなる１つまたは複数の非カチオン性脂質；および粒子中に存在する約０．５モル％〜約２モル％の総脂質を含んでなる、粒子の凝集を阻害する１つまたは複数の複合脂質を含んでなってもよい。ナノ粒子中の核酸は、本明細書に記載されおよび／または当該技術分野で公知のポリヌクレオチドであってもよい。
【０４１３】
一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１１１２７２５５号パンフレットまたは国際公開第２００８１０３２７６号パンフレットに記載される方法によって製剤化されてもよい。非限定的例として
、本明細書に記載される修飾ＲＮＡは、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１１１２７２５５号パンフレットおよび／または国際公開第２００８１０３２７６号パンフレットに記載されるようにしてＬＮＰ製剤中でカプセル化されてもよい。
【０４１４】
一実施形態では、本明細書に記載されるＬＮＰ製剤は、ポリカチオン性組成物を含んでなってもよい。非限定的例として、ポリカチオン性組成物は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００５０２２２０６４号明細書の式１〜６０から選択されてもよい。別の実施形態では、インビボおよび／またはインビトロで、本明細書に記載される修飾ＲＮＡを送達するために、ポリカチオン性組成物を含んでなるＬＮＰ製剤が使用されてもよい。
【０４１５】
一実施形態では、本明細書に記載されるＬＮＰ製剤は、透過性増強剤分子をさらに含んでなってもよい。非限定的透過性増強分子は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００５０２２２０６４号明細書に記載される。
【０４１６】
一実施形態では、医薬組成物は、ワシントン州ボスウェル（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）のマリーナ・バイオテック（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）からのディラツ−（ＤｉＬａ２）リポソーム、ワシントン州ボスウェル（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）のマリーナ・バイオテック（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）からのスマーティクルズ（ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ）（登録商標）、中性ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）ベースのリポソーム（例えば、卵巣がんのためのｓｉＲＮＡ送達（その内容全体が参照により本明細書に援用される、ランデン（Ｌａｎｄｅｎ）ら著、キャンサ−・バイオロジー・アンド・セラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｙ）、２００６年、第５巻、第１２号、ｐ１７０８〜１７１３））、およびイスラエル国（Ｉｓｒａｅｌ）のクワイエット・セラピューティクス（Ｑｕｉｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）からのヒアルロナン被覆リポソームなどであるが、これに限定されるものではないリポソームに製剤化されてもよい。
【０４１７】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１２０６０２９３号明細書に記載されるような、凍結乾燥ゲル相リポソーム組成物に製剤化されてもよい。
【０４１８】
ナノ粒子製剤は、炭水化物担体およびポリヌクレオチドを含んでなる炭水化物ナノ粒子であってもよい。非限定的例として、炭水化物担体としては、無水物修飾フィトグリコーゲンまたはグリコーゲンタイプの物質、フトグリコーゲン（ｐｈｔｏｇｌｙｃｏｇｅｎ）オクテニルコハク酸、フィトグリコーゲンβ−デキストリン、無水物修飾フィトグリコーゲンβ−デキストリンが挙げられるが、これに限定されるものではない（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１２１０９１２１号パンフレットを参照されたい）。
【０４１９】
本発明のナノ粒子製剤は、粒子の送達を改善するために、界面活性剤またはポリマーで被覆されてもよい。一実施形態では、ナノ粒子は、ＰＥＧコーティングなどであるが、これに限定されるものではない、親水性コーティングで、および／または中性表面電荷を有するコーティングで、被覆されてもよい。親水性コーティングは、中枢神経系内で、ポリヌクレオチドなどであるが、これに限定されるものではない、より大きなペイロードがあるナノ粒子を送達するのを促進してもよい。非限定的例として、親水性コーティングを含んでなるナノ粒子、およびこのようなナノ粒子を製造する方法は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１８３２４４号明細書に記載される。
【０４２０】
一実施形態では、本発明の脂質ナノ粒子は、親水性ポリマー粒子であってもよい。親水性ポリマー粒子および親水性ポリマー粒子を製造する方法の非限定的例は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０２１０９９１号明細書に記載される。
【０４２１】
別の実施形態では、本発明の脂質ナノ粒子は、疎水性ポリマー粒子であってもよい。
脂質ナノ粒子製剤は、迅速排除脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ：ｒａｐｉｄｌｙ  ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）として知られている生分解性カチオン性脂質によって、カチオン性脂質を置換することで、改良されてもよい。ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、およびＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡなどであるが、これに限定されるものではない、イオン化可能カチオン性脂質は、血漿および組織内に経時的に蓄積内にして、毒性の潜在的な供給源になってもよいことが示されている。迅速排除脂質の迅速な代謝は、ラットにおいて、脂質ナノ粒子の耐容性および治療指数を１ｍｇ／ｋｇ用量から１０ｍｇ／ｋｇ用量に一桁分改善し得る。酵素分解されるエステル結合の包含は、カチオン性成分の分解および代謝プロファイルを改善し得る一方で、なおもｒｅＬＮＰ製剤の活性を保つ。エステル結合は、脂質鎖の内部に位置し得、またはそれは、脂質鎖の端末側終端に位置してもよい。内部エステル結合は、脂質鎖中の任意の炭素を置換してもよい。
【０４２２】
一実施形態では、内部エステル結合は、飽和炭素のいずれの側に位置してもよい。
一実施形態では、免疫応答は、ナノ化学種、ポリマー、および免疫原を含んでもよい脂質ナノ粒子を送達することで引き起こされてもよい（それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１２０１８９７００号明細書および国際公開第２０１２０９９８０５号パンフレット）。ポリマーは、ナノ化学種をカプセル化し、またはナノ化学種を部分的にカプセル化してもよい。免疫原は、本明細書に記載される、組換えタンパク質、修飾ＲＮＡおよび／またはポリヌクレオチドであってもよい。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、病原体に対するワクチンなどであるが、これに限定されるものではない、ワクチンで使用するために製剤化されてもよい。
【０４２３】
脂質ナノ粒子は操作されて、脂質ナノ粒子が粘膜関門を透過してもよいように、粒子の表面性質が変化されてもよい。粘膜関門を透過する脂質ナノ粒子、および粘液が位置する領域は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０２７０７７号明細書（代理人整理番号Ｍ０３０．２０）の例えば段落［０００４９１］〜［０００５０１］に記載される。
【０４２４】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、限定されることなく、英国ロンドン（Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）のサイレンス・セラピューティクス（Ｓｉｌｅｎｃｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）からのアツプレックス（ＡＴＵＰＬＥＸ）（商標）システム、ＤＡＣＣシステム、ＤＢＴＣシステム、およびその他のｓｉＲＮＡ−リポプレックス技術；マサチューセッツ州ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）のステムジェント（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）（登録商標）からのステムフェクト（ＳＴＥＭＦＥＣＴ）（商標）；およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはプロタミンベースの核酸酸の標的化送達および非標的化送達（全てその内容全体が参照により本明細書に援用される、アレク（Ａｌｅｋｕ）ら著、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）、２００８年、第６８巻、ｐ９７８８〜９７９８；ストルンベルグ（Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇ）ら著、インターナショナル・ジャーナル・オブ・クリニカル・ファーマコロジー・アンド・セラピューティクス（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ）、２０１２年、第５０巻、ｐ７６〜７８；サンテル（Ｓａｎｔｅｌ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、２００６年、第１３巻、ｐ１２２２〜１２３４；サンテル（Ｓａｎｔｅｌ）ら著
、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、２００６年、第１３巻、ｐ１３６０〜１３７０；グートビア（Ｇｕｔｂｉｅｒ）ら著、パルモナリー・ファーマコロジー・アンド・セラピューティクス（Ｐｕｌｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第２３巻、ｐ３３４〜３４４；カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎｎ）ら著、マイクロバスキュラー・リサーチ（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ）、２０１０年、第８０巻、ｐ２８６〜２９３；ヴァイデ（Ｗｅｉｄｅ）ら著、ジャーナル・オブ・イムノセラピー（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．）、２００９年、第３２巻、ｐ４９８〜５０７；ヴァイデ（Ｗｅｉｄｅ）ら著、ジャーナル・オブ・イムノセラピー（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．）、２００８年、第３１巻、ｐ１８０〜１８８；パスコロ（Ｐａｓｃｏｌｏ）著、エキスパート・オピニオン・オン・バイオロジカル・セラピー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、第４巻、ｐ１２８５〜１２９４；フォティン−・ムレチェク（Ｆｏｔｉｎ−Ｍｌｅｃｚｅｋ）ら著、２０１１年、ジャーナル・オブ・イムノセラピー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．）、第３４巻、ｐ１〜１５；ソン（Ｓｏｎｇ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００５年、第２３巻、ｐ７０９〜７１７ピア（Ｐｅｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．）、２００７年、第６号、第１０４巻、ｐ４０９５〜４１００；ド・フジュロル（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ）著、ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．）、２００８年、第１９巻、ｐ１２５〜１３２）などのリポプレックスとして製剤化される。
【０４２５】
一実施形態では、このような製剤はまた、組成物がインビボで、肝実質細胞、免疫細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、抗原提示細胞、および白血球を含むが、これに限定されるものではない異なる細胞型を受動的にまたは能動的に対象とするように、構築されまたは改変されてもよい。（全てその内容全体が参照により本明細書に援用される、アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第１８巻、ｐ１３５７〜１３６４ソン（Ｓｏｎｇ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００５年、第２３巻、ｐ７０９〜７１７ジャッジ（Ｊｕｄｇｅ）ら著、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ  Ｃｌｉｎ
Ｉｎｖｅｓｔ．）、２００９年、第１１９巻、ｐ６６１〜６７３；カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎｎ）ら著、マイクロバスキュラー・リサーチ（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ）、２０１０年、第８０巻、ｐ２８６〜２９３；サンテル（Ｓａｎｔｅｌ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、２００６年、第１３巻、ｐ１２２２〜１２３４；サンテル（Ｓａｎｔｅｌ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、２００６年、第１３巻、ｐ１３６０〜１３７０；グートビア（Ｇｕｔｂｉｅｒ）ら著、パルモナリー・ファーマコロジー・アンド・セラピューティクス（Ｐｕｌｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第２３巻、ｐ３３４〜３４４；バシャ（Ｂａｓｈａ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２０１１年、第１９巻、ｐ２１８６〜２２００；フェンスケ（Ｆｅｎｓｋｅ）およびキュリス（Ｃｕｌｌｉｓ）、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．）、２００８年、第５号、ｐ２５〜４４；ピア（Ｐｅｅｒ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ．）、２００８年、第３１９巻、ｐ６２７〜６３０；ピア（Ｐｅｅｒ）およびリーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．）２０１１年、第１８巻、ｐ１１２７〜１１３３）。製剤の肝細胞への受動的標的化の一例としては、アポリポタンパク質Ｅと結合して、インビボでこれらの製剤の肝実質細胞への結合および取り込みを促進することが示されている、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡおよびＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡベースの脂質ナノ粒子製剤が挙げられる（その内容全体が参照により本明細書に援用される、アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第１８巻、ｐ１３５７〜１３６４）。製剤はまた、それらの表面上の異なるリガンドの発現を通じて選択的に標的化され得、それは葉酸、トランスフェリン、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、および抗体標
的化アプローチによって例示されるが、それによって限定されない（全てその内容全体が参照により本明細書に援用される、コルハトカル（Ｋｏｌｈａｔｋａｒ）ら著、カレント・ドラッグ・ディスカバリー・テクノロジー（Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．）、２０１１年、第８巻、ｐ１９７〜２０６；ムサッキオ（Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ）およびトーチリン（Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ）、フロンティアズ・イン・バイオサイエンス（Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．）、２０１１年、第１６巻、ｐ１３８８〜１４１２；ユー（Ｙｕ）ら著、モレキュラー・メンブレン・バイオロジー（Ｍｏｌ  Ｍｅｍｂｒ  Ｂｉｏｌ．）、２０１０年、第２７巻、ｐ２８６〜２９８；パティル（Ｐａｔｉｌ）ら著、クリティカル・レビューズ・イン・セラピューティック・ドラッグ・キャリアー・システムズ（Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．）、２００８年、第２５巻、ｐ１〜６１；ブノワ（Ｂｅｎｏｉｔ）ら著、バイオモレキュールズ（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．）、２０１１年、第１２巻、ｐ２７０８〜２７１４；チャオ（Ｚｈａｏ）ら著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．）、２００８年、第５巻、ｐ３０９〜３１９；アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第１８巻、ｐ１３５７〜１３６４；スリニバサン（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ）ら著、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．）、２０１２年、第８２０巻、ｐ１０５〜１１６；ベン・アリ（Ｂｅｎ−Ａｒｉｅ）ら著、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．）、２０１２年、第７５７巻、ｐ４９７〜５０７；ピア（Ｐｅｅｒ）著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．）、２０１０年、第２０巻、ｐ６３〜６８；ピア（Ｐｅｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．）、２００７年、第１０４巻、ｐ４０９５〜４１００；キム（Ｋｉｍ）ら著、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．）、２０１１年、第７２１巻、ｐ３３９〜３５３；スブラマニャ（Ｓｕｂｒａｍａｎｙａ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第１８巻、ｐ２０２８〜２０３７；ソン（Ｓｏｎｇ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００５年、第２３巻、ｐ７０９〜７１７ピア（Ｐｅｅｒ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ．）、２００８年、第３１９巻、ｐ６２７〜６３０；ピア（Ｐｅｅｒ）およびリーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．）２０１１年、第１８巻、ｐ１１２７〜１１３３）。
【０４２６】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、固体脂質ナノ粒子として製剤化される。固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ：ｓｏｌｉｄ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）は、１０〜１０００ｎｍの平均直径を有する球状であってもよい。ＳＬＮは固体脂質コアマトリックスを有し、それは親油性分子を可溶化し得、界面活性剤および／または乳化剤によって安定化されてもよい。さらなる実施形態では、脂質ナノ粒子は、自己組織化脂質−ポリマーナノ粒子であってもよい。（その内容全体が参照により本明細書に援用される、ザング（Ｚｈａｎｇ）ら著、エーシ−エス・ナノ（ＡＣＳ  Ｎａｎｏ）、２００８年、第２巻、第８号、ｐ１６９６〜１７０２を参照されたい）。非限定的例として、ＳＬＮは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３１０５１０１号パンフレットに記載されるＳＬＮであってもよい。別の非限定的例として、ＳＬＮは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３１０５１０１号パンフレットに記載される方法または工程によって生成されてもよい。
【０４２７】
リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチドが誘導するタンパク質生成の効率を改善するために使用されてもよいが、それはこれらの製剤が、ポリヌクレオチドによる細胞形質移入を増大できてもよく、および／またはコード化タンパク質の翻訳を増大できてもよいためである。このような一実施例は、脂質カプセル化の使用
を伴って、ポリプレックスプラスミドＤＮＡの効果的な全身送達を可能にする。（その内容全体が参照により本明細書に援用される、ヘイズ（Ｈｅｙｅｓ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２００７年、第１５巻、ｐ７１３〜７２０）。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子はまた、ポリヌクレオチドの安定性を増大させるために使用されてもよい。
【０４２８】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、放出制御および／または標的化送達のために製剤化され得る。本明細書の用法では、「放出制御」は、特定の放出パターンと一致して、治療成績をもたらす、医薬組成物または化合物放出プロファイルを指す。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される、および／または放出制御および／または標的化送達技術分野で公知の、送達剤内にカプセル化されてもよい。本明細書の用法では、「カプセル化する」という用語は、封入し、取り囲みまたは包むことを意味する。本発明の製剤化合物に関して、カプセル化は、実質的、完全または部分的であってもよい。「実質的にカプセル化された」という用語は、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９％を超える、または９９．９９９％を超える本発明の医薬組成物または化合物が、送達剤内に、封入され、取り囲まれまたは包まれてもよいことを意味する。「部分的カプセル化」は、本発明の医薬組成物または化合物の１０、１０、２０、３０、４０未満、５０以下が、送達剤内に、封入され、取り囲まれまたは包まれてもよいことを意味する。有利なことに、カプセル化は、蛍光および／または電子顕微鏡写真を使用して、本発明の医薬組成物または化合物の漏出または活性を測定することで、判定されてもよい。例えば、少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９または９９．９９％を超える本発明の医薬組成物または化合物が、送達剤内にカプセル化される。
【０４２９】
一実施形態では、放出制御製剤としては、三元ブロック共重合体が挙げられるが、これに限定されるものではない。非限定的例として、製剤は、２つの異なるタイプの三元ブロック共重合体を含んでもよい（それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１２１３１１０４号パンフレットおよび国際公開第２０１２１３１１０６号パンフレット）。
【０４３０】
別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子または迅速排除脂質ナノ粒子内にカプセル化されてもよく、次に、脂質ナノ粒子または迅速排除脂質ナノ粒子は、本明細書に記載されおよび／または当該技術分野で公知のポリマー、ハイドロゲルおよび／または外科用シーラント内にカプセル化されてもよい。非限定的例として、ポリマー、ハイドロゲルまたは外科用シーラントは、ＰＬＧＡ；酢酸ビニルエチレン（ＥＶＡｃ）；ポロキサマー；フロリダ州アラチュア（Ａｌａｃｈｕａ，ＦＬ）のナノセラピューティクス株式会社（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）からのゲルサイト（ＧＥＬＳＩＴＥ）（登録商標）；カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）のハロザイム・セラピューティクス（Ｈａｌｏｚｙｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）からのハイレネックス（ＨＹＬＥＮＥＸ）（登録商標）；ジョージア州コーネリア（Ｃｏｒｎｅｌｉａ，ＧＡ）のエチコン株式会社（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．）からのフィブリノーゲンポリマーなどの外科用シーラント；イリノイ州ディアフィールド（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）のバクスター・インターナショナル株式会社（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）からのティセル（ＴＩＳＳＥＬＬ）（登録商標）；ＰＥＧベースのシーラント；およびイリノイ州ディアフィールド（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）のバクスター・インターナショナル株式会社（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）からのコシール（ＣＯＳＥＡＬ）（登録商標）であってもよい。
【０４３１】
別の実施形態では、脂質ナノ粒子は、対象への注射時にゲルを形成してもよい、当該技
術分野で公知の任意のポリマー内にカプセル化されてもよい。別の非限定的例として、脂質ナノ粒子は、生分解性であってもよい、ポリマーマトリックス内にカプセル化されてもよい。
【０４３２】
一実施形態では、放出制御および／または標的化送達のためのポリヌクレオチド製剤は、少なくとも１つの放出制御コーティングもまた含んでもよい。放出制御コーティングとしては、オパドライ（ＯＰＡＤＲＹ）（登録商標）、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニル共重合体、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ユードラジット・アールエル（ＥＵＤＲＡＧＩＴ  ＲＬ）（登録商標）、ユードラジット・アールエス（ＥＵＤＲＡＧＩＴ  ＲＳ）（登録商標）、およびエチルセルロース水性分散体（アクアコート（ＡＱＵＡＣＯＡＴ）（登録商標）およびシュアリース（ＳＵＲＥＬＥＡＳＥ）（登録商標））などのセルロース誘導体が挙げられるが、これに限定されるものではない。放出制御および／または標的化送達製剤は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０２７０７７号明細書に記載され、製剤の非限定的例は、段落［０００５１５］〜［０００５１９］にある。
【０４３３】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、アキューリンズ（ＡＣＣＵＲＩＮＳ）（商標）を含む治療用ナノ粒子内に、カプセル化されてもよい。治療用ナノ粒子は、本明細書に記載される方法によって、およびその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０２７０７７号明細書（代理人整理番号Ｍ０３０．２０）の段落［０００５１９］〜［０００５５１］などであるが、これに限定されるものではない、当該技術分野で公知の方法によって、製剤化されてもよい。一実施例として、治療用ナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０２７０７７号明細書（代理人整理番号Ｍ０３０．２０）の段落［０００５３１］〜［０００５３３］中などに記載されるものなどの徐放ナノ粒子であってもよい。
【０４３４】
一実施形態では、本発明のナノ粒子は、ポリマーマトリックスを含んでなってもよい。非限定的例として、ナノ粒子は、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ酸無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメラート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅｓ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリル酸、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）またはそれらの組み合わせなどであるが、これに限定されるものではない、２つ以上のポリマーを含んでなってもよい。
【０４３５】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、ジブロック共重合体を含んでなる。一実施形態では、ジブロック共重合体は、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ酸無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメラート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅｓ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリル酸、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）またはそれらの組み合わせなどであるが、これに限定されるものではない、ポリマーと組み合わされたＰＥＧを含んでもよい。別の実施形態では、ジブロック共重合体は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、欧州特許出願第  号明細書に記載
されるジブロック共重合体を含んでなってもよい。さらに別の実施形態では、ジブロック共重合体は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３１２００５２号パンフレットに記載されるものなどの高度Ｘジブロック共重合体であってもよい。
【０４３６】
さらに別の非限定的例では、脂質ナノ粒子は、ブロック共重合体ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧを含んでなる（例えば、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、熱感受性のハイドロゲル（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）が、ＴＧＦ−β１遺伝子送達ビヒクルとして使用される、リー（Ｌｅｅ）ら著、「Ｔｇｆ−β１遺伝子送達ビヒクルとしての熱感受性ハイドロゲルは糖尿病性創傷治癒を促進する（Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ａｓ  ａ  Ｔｇｆ−β１  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｖｅｈｉｃｌｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ．）」、ファーマスーティカル・リサーチ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００３年、第２０巻、第１２号、ｐ１９９５〜２０００；制御される遺伝子送達系として使用される、リー（Ｌｉ）ら著、「熱感受性生分解性ハイドロゲルベースの制御される遺伝子送達系（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ．）」、ファーマスーティカル・リサーチ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００３年、第２０巻、第６号、ｐ８８４〜８８８；およびチャン（Ｃｈａｎｇ）ら著、「非イオン両親媒性生分解性ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ共重合体はラット骨格筋内の遺伝子送達効率を高める（Ｎｏｎ−ｉｏｎｉｃ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ
ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｒａｔ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ．）」ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ．）、２００７年、第１１８巻、ｐ２４５〜２５３を参照されたい）。本発明のポリヌクレオチドは、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロック共重合体を含んでなる、脂質ナノ粒子に製剤化されてもよい。
【０４３７】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、合成ナノキャリア内にカプセル化されてもよい。合成ナノキャリアは、本明細書に記載される方法によって、およびその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０２７０７７号明細書（代理人整理番号Ｍ０３０．２０）の段落［０００５５２］〜［０００５６３］などであるが、これに限定されるものではない、当該技術分野で公知の方法によって、製剤化されてもよい。
【０４３８】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、両性イオン性脂質内にカプセル化され、それと結合され、および／またはそれと会合されてもよい。両性イオン性脂質および両性イオン性脂質を使用する方法の非限定的例は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０２１６６０７号明細書に記載される。一態様では、両性イオン性脂質は、本明細書に記載されるリポソームおよび脂質ナノ粒子中で使用されてもよい。
【０４３９】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１９７１００号明細書に記載されるようなコロイドナノキャリアに製剤化されてもよい。
【０４４０】
一実施形態では、ナノ粒子は、経口投与のために、最適化されてもよい。ナノ粒子は、キトサンまたはその誘導体などであるが、これに限定されるものではない、少なくとも１つのカチオン性生体高分子を含んでなってもよい。非限定的例として、ナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１２０２８２３４
３号明細書に記載される方法によって、製剤化されてもよい。
【０４４１】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、脂質ＫＬ５２（その内容全体が参照により本明細書に明示的に援用される、米国特許出願公開第２０１２／０２９５８３２号明細書で開示されるアミノ脂質）を含んでなる。ＬＮＰ投与の活性および／または安全性（ＡＬＴ／ＡＳＴ、白血球数およびサイトカイン誘導の１つまたは複数を調べることで測定される）が、このような脂質の組み込みによって改善されてもよい。ＫＬ５２を含んでなるＬＮＰは、静脈内で、および／または１回または複数回で、投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ＫＬ５２を含んでなるＬＮＰの投与は、ＭＣ３を含んでなるＬＮＰと比較して、均等なまたは改善されたｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現をもたらす。
【０４４２】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、より小型のＬＮＰを使用して送達されてもよい。このような粒子は、０．１μｍ未満、１．０μｍ未満、５μｍ未満、１０μｍ未満、１５μｍ未満、２０μｍ未満、２５μｍ未満、３０μｍ未満、３５μｍ未満、４０μｍ未満、５０μｍ未満、５５μｍ未満、６０μｍ未満、６５μｍ未満、７０μｍ未満、７５μｍ未満、８０μｍ未満、８５μｍ未満、９０μｍ未満、９５μｍ未満、１００μｍ未満、１２５μｍ未満、１５０μｍ未満、１７５μｍ未満、２００μｍ未満、２２５μｍ未満、２５０μｍ未満、２７５μｍ未満、３００μｍ未満、３２５μｍ未満、３５０μｍ未満、３７５μｍ未満、４００μｍ未満、４２５μｍ未満、４５０μｍ未満、４７５μｍ未満、５００μｍ未満、５２５μｍ未満、５５０μｍ未満、５７５μｍ未満、６００μｍ未満、６２５μｍ未満、６５０μｍ未満、６７５μｍ未満、７００μｍ未満、７２５μｍ未満、７５０μｍ未満、７７５μｍ未満、８００μｍ未満、８２５μｍ未満、８５０μｍ未満、８７５μｍ未満、９００μｍ未満、９２５μｍ未満、９５０μｍ未満、９７５μｍ未満などであるが、これに限定されるものではない、０．１μｍ未満から１００ｎｍまでの直径を含んでなってもよい。
【０４４３】
別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１ｎｍ〜約１０ｎｍ、約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１ｎｍ〜約９０ｎｍ、約５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５ｎｍ〜約１０ｎｍ、約５ｎｍ〜約２０ｎｍ、約５ｎｍ〜約３０ｎｍ、約５ｎｍ〜約４０ｎｍ、約５ｎｍ〜約５０ｎｍ、約５ｎｍ〜約６０ｎｍ、約５ｎｍ〜約７０ｎｍ、約５ｎｍ〜約８０ｎｍ、約５ｎｍ〜約９０ｎｍ、約１０〜約５０ｎＭ、約２０〜約５０ｎｍ、約３０〜約５０ｎｍ、約４０〜約５０ｎｍ、約２０〜約６０ｎｍ、約３０〜約６０ｎｍ、約４０〜約６０ｎｍ、約２０〜約７０ｎｍ、約３０〜約７０ｎｍ、約４０〜約７０ｎｍ、約５０〜約７０ｎｍ、約６０〜約７０ｎｍ、約２０〜約８０ｎｍ、約３０〜約８０ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍ、約５０〜約８０ｎｍ、約６０〜約８０ｎｍ、約２０〜約９０ｎｍ、約３０〜約９０ｎｍ、約４０〜約９０ｎｍ、約５０〜約９０ｎｍ、約６０〜約９０ｎｍおよび／または約７０〜約９０ｎｍの直径を含んでなってもよい、より小型のＬＮＰを使用して送達されてもよい。
【０４４４】
いくつかの実施形態では、このようなＬＮＰは、マイクロ流体ミキサーを含んでなる方法を使用して合成される。代表的マイクロ流体ミキサーとしては、オーストリア国アラーハイリゲン・バイ・ヴィルドン（Ａｌｌｅｒｈｅｉｌｉｇｅｎ  ｂｅｉ  Ｗｉｌｄｏｎ，Ａｕｓｔｒｉａ）のマイクロイノバ（Ｍｉｃｒｏｉｎｎｏｖａ）によって製造されるものを含むが、これに限定されるものではないスリット・インターデジタル・マイクロミキサー；および／またはねじれ形ヘリンボーンマイクロミキサー（ＳＨＭ：ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｈｅｒｒｉｎｇｂｏｎｅ  ｍｉｃｒｏｍｉｘｅｒ）、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、（ジガルトセブ，Ｉ．Ｖ．（Ｚｈｉｇａｌｔｓｅｖ，Ｉ．Ｖ．）ら著、「ミリ秒マイクロ流体混合を使用した水性およびトリグリセリドコアがある限界寸法脂質ナノ粒子システムのボトムアップ設計および合成（Ｂｏｔｔｏｍ−ｕｐ  ｄｅ
ｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌｉｍｉｔ  ｓｉｚｅ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｗｉｔｈ  ａｑｕｅｏｕｓ  ａｎｄ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｃｏｒｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｍｉｘｉｎｇ）」、（ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ．）、２０１２年、第２８巻、ｐ３６３３〜４０；ベリボー，Ｎ．Ｍ．（Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ，Ｎ．Ｍ．）ら著、「ｓｉＲＮＡのインビボ送達のための非常に強力な限界寸法脂質ナノ粒子のマイクロ流体合成（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐｏｔｅｎｔ  ｌｉｍｉｔ−ｓｉｚｅ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ
ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ）」、モレキュラー・セラピー・ニュークレイック・アシッズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ．）、２０１２年、１：ｅ３７；チェン，Ｄ．（Ｃｈｅｎ，Ｄ．）ら著，「制御されるマイクロ流体製剤によって可能になる強力なｓｉＲＮＡ含有脂質ナノ粒子の迅速な発見（Ｒａｐｉｄ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ｓｉＲＮＡ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｅｎａｂｌｅｄ  ｂｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」米国化学会誌（Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．）、２０１２年、第１３４巻、第１６号、ｐ６９４８〜５１）が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、ＳＨＭを含んでなるＬＮＰを生成する方法は、少なくとも２つの投入ストリームを混合するステップをさらに含んでなり、混合は、微細構造誘導性カオス的移流（ＭＩＣＡ：ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｈａｏｔｉｃ  ａｄｖｅｃｔｉｏｎ）によって起こる。この方法によって、流体ストリームはヘリンボーンパターンで存在するチャネルを通過して、回転流が引き起こされて流体は互いの周辺に折りたたまれる。この方法はまた、表面が、流体循環中の方向を変化させることを特徴とする、流体混合のための表面を含んでなってもよい。ＳＨＭを使用してＬＮＰを生成する方法としては、それぞれその内容全体が参照により本明細書に明示的に援用される、米国特許出願公開第２００４／０２６２２２３号明細書および米国特許出願公開第２０１２／０２７６２０９号明細書で開示されるものが挙げられる。
【０４４５】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ドイツ国マインツ（Ｍａｉｎｚ  Ｇｅｒｍａｎｙ）のマイクロ技術研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｆｕｅｒ  Ｍｉｋｒｏｔｅｃｈｎｉｋ  Ｍａｉｎｚ  ＧｍｂＨ）からのスリット櫛形微細構造ミキサー（ＳＩＭＭ−Ｖ２：Ｓｌｉｔ  Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  Ｍｉｘｅｒ）または標準スリット櫛形微細構造ミキサー（ＳＳＩＭＭ：Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｌｉｔ
Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｍｉｘｅｒ）またはキャタピラ（ＣＰＭＭ）または衝突ジェット（ＩＪＭＭ：Ｉｍｐｉｎｇｉｎｇ−ｊｅｔ））などであるが、これに限定されるものではない、マイクロミキサーを使用して生成される、脂質ナノ粒子に製剤化されてもよい。
【０４４６】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、マイクロ流体技術を使用して生成されてもよい、脂質ナノ粒子に製剤化されてもよい。（それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、ジョージＭ．ホワイトサイド（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｍ．Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ）著、「マイクロ流体工学の起源と未来（Ｔｈｅ  Ｏｒｉｇｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ．）」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２００６年、第４４２巻、ｐ３６８〜３７３；およびアブラハム（Ａｂｒａｈａｍ）ら著、「マイクロチャネルのためのカオスミキサー（Ｃｈａｏｔｉｃ  Ｍｉｘｅｒ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ．）」、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００２年、第２９５号、ｐ６４７〜６５１を参照されたい。非限定的例として、制御されるマイクロ流体の製剤化は、低レイノルズ数でマイクロチャネル中の定常圧力駆動流のストリームを混合する受動的方法を含む（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、アブラハム（Ａｂｒａｈａｍ）ら著、「マイクロチャネルのためのカオスミキサー（Ｃ
ｈａｏｔｉｃ  Ｍｉｘｅｒ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ．）」、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００２年、第２９５号、ｐ６４７〜６５１を参照されたい）。
【０４４７】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、マサチューセッツ州ホリストン（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）のハーバードアパレタス（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）または英国ロイストン（Ｒｏｙｓｔｏｎ，ＵＫ）のドロマイト・マイクロフルイディクス（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）からのものなどであるが、これに限定されるものではない、マイクロミキサーチップを使用して生成される脂質ナノ粒子に製剤化されてもよい。マイクロミキサーチップは、分割および再結合機序による、２つ以上の流体ストリームの迅速な混合のために、使用され得る。
【０４４８】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０６３４６８号パンフレットまたは米国特許第８，４４０，６１４号明細書に記載される薬剤封入微小球を使用する送達のために製剤化されてもよい。微小球は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０６３４６８号パンフレットに記載される、式、（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物を含んでなってもよい。別の態様では、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、脂質（ＡＰＰＬ）は、本発明のポリヌクレオチドを細胞に送達するのに有用である（その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０６３４６８号パンフレットを参照されたい）。
【０４４９】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、約１０〜約２０ｎｍ、約１０〜約３０ｎｍ、約１０〜約４０ｎｍ、約１０〜約５０ｎｍ、約１０〜約６０ｎｍ、約１０〜約７０ｎｍ、約１０〜約８０ｎｍ、約１０〜約９０ｎｍ、約２０〜約３０ｎｍ、約２０〜約４０ｎｍ、約２０〜約５０ｎｍ、約２０〜約６０ｎｍ、約２０〜約７０ｎｍ、約２０〜約８０ｎｍ、約２０〜約９０ｎｍ、約２０〜約１００ｎｍ、約３０〜約４０ｎｍ、約３０〜約５０ｎｍ、約３０〜約６０ｎｍ、約３０〜約７０ｎｍ、約３０〜約８０ｎｍ、約３０〜約９０ｎｍ、約３０〜約１００ｎｍ、約４０〜約５０ｎｍ、約４０〜約６０ｎｍ、約４０〜約７０ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍ、約４０〜約９０ｎｍ、約４０〜約１００ｎｍ、約５０〜約６０ｎｍ、約５０〜約７０ｎｍ約５０〜約８０ｎｍ、約５０〜約９０ｎｍ、約５０〜約１００ｎｍ、約６０〜約７０ｎｍ、約６０〜約８０ｎｍ、約６０〜約９０ｎｍ、約６０〜約１００ｎｍ、約７０〜約８０ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約７０〜約１００ｎｍ、約８０〜約９０ｎｍ、約８０〜約１００ｎｍおよび／または約９０〜約１００ｎｍなどであるが、これに限定されるものではない、約１０〜約１００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子に製剤化されてもよい。
【０４５０】
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０〜５００ｎｍの直径を有してもよい。
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、１００ｎｍを超え、１５０ｎｍを超え、２００ｎｍを超え、２５０ｎｍを超え、３００ｎｍを超え、３５０ｎｍを超え、４００ｎｍを超え、４５０ｎｍを超え、５００ｎｍを超え、５５０ｎｍを超え、６００ｎｍを超え、６５０ｎｍを超え、７００ｎｍを超え、７５０ｎｍを超え、８００ｎｍを超え、８５０ｎｍを超え、９００ｎｍを超え、９５０ｎｍを超え、または１０００ｎｍを超える直径を有してもよい。
【０４５１】
一態様では、脂質ナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０５９９２２号パンフレットに記載される、限界寸法脂質ナノ粒子であってもよい。限界寸法脂質ナノ粒子は、水性コアまたは疎水性コアを取り巻く脂質二重層を含んでなってもよく；脂質二重層は、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン、セレブロシド、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸ジアシルホファチジルコリン（ｄｉａ
ｃｙｌｐｈｏｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、および１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）などであるが、これに限定されるものではない、リン脂質を含んでなってもよい。別の態様では、限界寸法脂質ナノ粒子は、ＤＬＰＥ−ＰＥＧ、ＤＭＰＥ−ＰＥＧ、ＤＰＰＣ−ＰＥＧ、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧなどであるが、これに限定されるものではない、ポリエチレングリコール脂質を含んでなってもよい。
【０４５２】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０６３５３０号パンフレットに記載される送達方法を使用して、特定位置に、送達されても、局在化されてもおよび／または濃縮されてもよい。非限定的例として、対象にポリヌクレオチドが送達される前に、それと同時に、またはその後に、空のポリマー粒子が対象に投与されてもよい。空のポリマー粒子は、ひとたび対象に接触すると容量変化を起こし、対象中の特定位置に、留まり、包埋され、固定化されまたは捕捉される。
【０４５３】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、活性物質放出系に製剤化されてもよい（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１０２５４５号明細書を参照されたい）。活性物質放出系は、１）触媒的活性核酸とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドインヒビター鎖に結合する少なくとも１つのナノ粒子、および２）治療効果のある物質（例えば、本明細書に記載されるポリヌクレオチド）に結合する、少なくとも１つの基質分子に結合する化合物を含んでなってもよく、治療効果のある物質は、触媒的活性核酸による基質分子の切断によって、放出される。
【０４５４】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、非細胞物質を含んでなる内部コアと、細胞膜を含んでなる外面とを含んでなる、ナノ粒子に製剤化されてもよい。細胞膜は、細胞に由来してもよく、または膜は、ウイルスに由来してもよい。非限定的例として、ナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０５２１６７号パンフレットに記載される方法によって、製造されてもよい。別の非限定的例として、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０５２１６７号パンフレットに記載されるナノ粒子が使用されて、本明細書に記載されるポリヌクレオチドが送達されてもよい。
【０４５５】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、多孔性ナノ粒子担持脂質二重層（前細胞）に製剤化されてもよい。前細胞は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０５６１３２号パンフレットに記載される。
【０４５６】
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，４２０，１２３号明細書および米国特許第８，５１８，９６３号明細書および欧州特許第２０７３８４８Ｂ１号明細書に記載される、またはそれに記載される方法によって製造される、重合性ナノ粒子に製剤化されてもよい。非限定的例として、ポリマーナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，５１８，９６３号明細書に記載される、またはそれに記載される方法によって製造される、ナノ粒子などのように、高いガラス転移温度を有してもよい。別の非限定的例として、経口、非経口、および局所製剤のためのポリマーナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、欧州特許第２０７３８４８Ｂ１号明細書に記載される方法によって製造されてもよい。
【０４５７】
別の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、イメージングで使用されるナノ粒子に製剤化されてもよい。ナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１２９６３６号明細書に記載されるものなどのリポソームナノ粒子であってもよい。非限定的例として、リポソームは、ガドリニウム
（ＩＩＩ）２−｛４，７−ビス−カルボキシメチル−１０−［（Ｎ，Ｎ−ジステアリルアミドメチル−Ｎ’−アミド−メチル］−１，４，７，１０−テトラ−アザシクロドデク−１−イル｝−酢酸と、中性完全飽和リン脂質成分を含んでなってもよい（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１２９６３６号明細書を参照されたい）。
【０４５８】
一実施形態では、本発明で使用されてもよいナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１３０３４８号明細書に記載される方法によって形成される。
【０４５９】
本発明のナノ粒子は、その欠乏が貧血から神経管欠陥に至る健康被害をもたらし得るものなどであるが、これに限定されるものではない、栄養素をさらに含んでもよい（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０７２９２９号パンフレットに記載されるナノ粒子を参照されたい）。非限定的例として、栄養素は、第一鉄塩、第二鉄塩または元素鉄の形態の鉄、ヨウ素、葉酸、ビタミン、または微量栄養素であってもよい。
【０４６０】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、膨潤性ナノ粒子に製剤化されてもよい。膨潤性ナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，４４０，２３１号明細書に記載されるものであってもよいが、これに限定されるものではない。非限定的実施形態として、本発明のポリヌクレオチドを肺系統に送達するために、膨潤性ナノ粒子が使用されてもよい（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，４４０，２３１号明細書を参照されたい）。
【０４６１】
本発明のポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，４４９，９１６号明細書に記載されるものなどであるが、これに限定されるものではない、ポリ酸無水物ナノ粒子に製剤化されてもよい。
【０４６２】
本発明のナノ粒子および微粒子は幾何学的に操作されて、マクロファージおよび／または免疫応答が調節されてもよい。一態様では、幾何学的に操作される粒子は、肺送達などであるが、これに限定されるものではない標的化送達のために、本発明のポリヌクレオチドを組み込むために、様々な形状、サイズおよび／または表面電荷を有してもよい（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０８２１１１号パンフレットを参照されたい）。幾何学的に操作された粒子が有してもよいその他物理的特徴としては、細胞および組織との相互作用を変化させ得る、開窓、アングルアーム、非対称性、および表面粗度、電荷が挙げられるが、これに限定されるものではない。非限定的例として、本発明のナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０８２１１１号パンフレットに記載される方法によって製造されてもよい。
【０４６３】
一実施形態では、本発明のナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０９０６０１号パンフレットに記載されるものなどであるが、これに限定されるものではない、水溶性ナノ粒子であってもよい。ナノ粒子は、優れた水溶性を示すために、コンパクトで両性イオン性のリガンドを有する、無機ナノ粒子であってもよい。ナノ粒子はまた、小さな水力学的直径（ＨＤ：ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）、時間、ｐＨ、および塩分に対する安定性、および低レベルの非特異的タンパク質結合を有してもよい。
【０４６４】
一実施形態では、本発明のナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１７２４０６号明細書に記載される方法によって開発
されてもよい。
【０４６５】
一実施形態では、本発明のナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１７２４０６号明細書に記載されるものなどであるが、これに限定されるものではない、ステルスナノ粒子または標的特異性ステルスナノ粒子である。本発明のナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１７２４０６号明細書に記載される方法によって製造されてもよい。
【０４６６】
別の実施形態では、ステルスまたは標的特異性ステルスナノ粒子は、ポリマーマトリックスを含んでなってもよい。ポリマーマトリックスは、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ酸無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメラート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅｓ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリル酸、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリエステル、ポリ酸無水物、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリシアノアクリル酸またはそれらの組み合わせなどであるが、これに限定されるものではない、２つ以上のポリマーを含んでなってもよい。
【０４６７】
一実施形態では、ナノ粒子は、高密度核酸層を有する、ナノ粒子−核酸ハイブリッド構造であってもよい。非限定的例として、ナノ粒子−核酸ハイブリッド構造は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１７１６４６号明細書に記載される方法によって製造されてもよい。ナノ粒子は、本明細書に記載されるおよび／または当該技術分野で公知のポリヌクレオチドなどであるが、これに限定されるものではない、核酸を含んでなってもよい。
【０４６８】
本発明のナノ粒子の少なくとも１つは、コアナノ構造内に包埋されてもよく、またはナノ構造の中またはその表面に、少なくとも１つのペイロードを保有しまたは結合させる能力がある、低密度多孔性３−Ｄ構造またはコーティングで被覆されてもよい。少なくとも１つのナノ粒子を含んでなるナノ構造の非限定的例は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３１２３５２３号パンフレットに記載される。
【０４６９】
ポリマー、生分解性ナノ粒子、およびコア−シェルナノ粒子
本発明のポリヌクレオチドは、天然および／または合成ポリマーを使用して製剤化され得る。送達のために使用されてもよいポリマーの非限定的例としては、限定されることなく、カリフォルニア州パサデナ（Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）のアローヘッド・リサーチ・コーポレーション（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．）からのダイナミック・ポリコンジュゲート（ＤＹＮＡＭＩＣ  ＰＯＬＹＣＯＮＪＵＧＡＴＥ）（登録商標）；ウィスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のミルス（ＭＩＲＵＳ）（登録商標）ビオ（Ｂｉｏ）およびウィスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のロシュ・マジソン（Ｒｏｃｈｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ）からの製剤；ワシントン州シアトル（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）のフェーズアールエクス（ＰＨＡＳＥＲＸ）（登録商標）からのスマート・ポリマー・テクノロジー（ＳＭＡＲＴＴ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）（商標）などのフェーズアールエクス（ＰＨＡＳＥＲＸ）（商標）ポリマー製剤；ＤＭＲＩ／ＤＯＰ；ポロキサマー；カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のビカル（Ｖｉｃａｌ）からのバックスフェクチン（ＶＡＸＦＥＣＴＩＮ）（登録商標）アジュバント；キトサン；カリフォルニア州パサデナ（Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）のカランド・フファーマスーティカルズ（Ｃａｌａｎｄｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）からのシクロデキストリン；デンドリマー；およびポリ（乳酸‐コ‐グリコール酸
）（ＰＬＧＡ）ポリマーが挙げられるが、これに限定されるものではない。カリフォルニア州パサデナ（Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）のアローヘッド・リサーチ・コーポレーション（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．）からのロンデル（ＲＯＮＤＥＬ）（商標）アールエヌエーアイ／オリゴヌクレオチド・ナノパーティクル・デリバリー（ＲＮＡｉ／Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）ポリマー；およびワシントン州シアトル（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）のフェーズアールエクス（ＰＨＡＳＥＲＸ）（登録商標）などであるが、これに限定されるものではない、ｐＨ応答性共ブロックポリマーである。
【０４７０】
キトサン製剤の非限定的例としては、正に帯電したキトサンコアおよび負に帯電した基質外側部分が挙げられる（その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１２０２５８１７６号明細書）。キトサンとしては、Ｎ−トリメチルキトサン、モノ−Ｎ−カルボキシメチルキトサン（ＭＣＣ）、Ｎ−パルミトイルキトサン（ＮＰＣＳ）、ＥＤＴＡ−キトサン、低分子量キトサン、キトサン誘導体、またはそれらの組み合せが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０４７１】
一実施形態では、本発明で使用されるポリマーは、細菌などであるがこれに限定されるものではない望まれない物質のポリマー表面への付着を低下させおよび／または阻害する処理を受ける。ポリマーは、当該技術分野で公知のおよび／または記載される方法、および／またはその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１２１５０４６７号パンフレットに記載される方法によって処理されてもよい。
【０４７２】
ＰＬＧＡ製剤の非限定的例としては、ＰＬＧＡ注射用デポーが挙げられるが、これに限定されるものではない（例えば、６６％Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）中に溶解しているＰＬＧＡ並びに水性溶剤およびロイプロリドである残部により形成されたエリガード（登録商標）。注射されると、ＰＬＧＡおよびロイプロリドペプチドが皮下空間内に沈殿する）。
【０４７３】
これらのポリマーアプローチの多くは、細胞質内へのオリゴヌクレオチドのインビボ送達における有効性を実証した（その内容全体が参照により本明細書に援用される、ド・フジュロル（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ）著、ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．）、２００８年、第１９巻、ｐ１２５〜１３２で概説される）。この場合は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、核酸の堅調なインビボ送達をもたらした２ポリマーアプローチは、動的ポリコンジュゲートおよびシクロデキストリンベースのナノ粒子である。（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１５６７２１号明細書を参照されたい）。これらの送達アプローチの１番目は、動的ポリコンジュゲートを使用して、マウスのインビボでｓｉＲＮＡを効果的に送達し、肝実質細胞内で内在性標的ｍＲＮＡをサイレンシングすることが示されている（その内容全体が参照により本明細書に援用される、ロゼマ（Ｒｏｚｅｍａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．）、２００７年、第１０４巻、ｐ１２９８２〜１２８８７）。この特定のアプローチは多要素ポリマー系であり、その重要な特徴としては、膜活性ポリマーが挙げられ、この場合はｓｉＲＮＡである核酸がジスルフィド結合を通じて、それに共有結合的に連結して、そこでは、（電荷遮蔽のための）ＰＥＧおよび（肝実質細胞標的化のための）Ｎ−アセチルガラクトサミン基の両方が、ｐＨ感受性結合を通じて結合する（その内容全体が参照により本明細書に援用される、ロゼマ（Ｒｏｚｅｍａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．）、２００７年、第１０４巻、ｐ１２９８２〜１２８８７）。肝実質細胞への結合およびエンドソーム内への侵入に際して、ポリマー複合体は低ｐＨ環境内で分解し、ポリマーの正電荷が曝露されて、ポリマーからのｓｉＲＮＡのエンドソーム漏出および細胞質内放出がもたらされる。マンノース基によるＮ−アセチルガラ
クトサミン基の置換を通じて、標的をアシアロ糖タンパク質受容体発現肝実質細胞から、類洞内皮およびクッパー細胞に変化させ得ることが示された。別のポリマーアプローチは、トランスフェリン標的化シクロデキストリン含有ポリカチオンナノ粒子の使用を伴う。これらのナノ粒子は、トランスフェリン受容体発現ユーイング肉腫腫瘍細胞における、ＥＷＳ−ＦＬＩ１遺伝子産物の標的化サイレンシングを実証し、（その内容全体が参照により本明細書に援用される、フー・リスコバン（Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ）ら著、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）、２００５年、第６５巻、ｐ８９８４〜８９８２）これらのナノ粒子に製剤化されたｓｉＲＮＡは、非ヒト霊長類において良好に耐えられた（その内容全体が参照により本明細書に援用される、ハイデル（Ｈｅｉｄｅｌ）ら著、米国科学アカデミー紀（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）、２００７年、第１０４巻、ｐ５７１５〜２１）。これらの両方の送達ストラテジーは、標的化送達およびエンドソーム漏出機構の両方を使用する、合理的なアプローチを取り入れる。
【０４７４】
ポリマー製剤は、（例えば、筋肉内または皮下注射に続いて）ポリヌクレオチドの持続性または遅延性の放出を可能にし得る。ポリヌクレオチドの放出プロファイルの改変は、例えば、長期にわたるコード化タンパク質の翻訳をもたらし得る。ポリマー製剤はまた、ポリヌクレオチドの安定性を増大させるために使用されてもよい。生分解性ポリマーは、ポリヌクレオチド以外の核酸を分解から保護するために以前使用されており、インビボでペイロードの持続性放出をもたらすことが示されている（それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、ロゼマ（Ｒｏｚｅｍａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．）、２００７年、第１０４巻、ｐ１２９８２〜１２８８７サリバン（Ｓｕｌｌｉｖａｎ）ら著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．）、２０１０年、第７巻、ｐ１４３３〜１４４６；コンバーティン（Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｅ）ら著、バイオマクロモレキュールズ（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．）、２０１０年、１０月１日；チュー（Ｃｈｕ）ら著、アカウンツ・オブ・ケミカル・リサーチ（Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ．）、２０１２年、１月１３日；マンガニエロ（Ｍａｎｇａｎｉｅｌｌｏ）ら著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．）、２０１２年、第３３巻、ｐ２３０１〜２３０９；ブノワ（Ｂｅｎｏｉｔ）ら著、バイオモレキュールズ（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．）、２０１１年、第１２巻、ｐ２７０８〜２７１４；シンハー（Ｓｉｎｇｈａ）ら著、ニュークレイック・アシッド・セラピューティクス（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒ．）、２０１１年、第２巻、ｐ１３３〜１４７；ド・フジュロル（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ）著、ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．）、２００８年、第１９巻、ｐ１２５〜１３２；シャファート（Ｓｃｈａｆｆｅｒｔ）およびワグナー（Ｗａｇｎｅｒ）著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．）、２００８年、第１６巻、ｐ１１３１〜１１３８；チャトゥールベディ（Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ）ら著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．）、２０１１年第８巻、ｐ１４５５〜１４６８；デービス（Ｄａｖｉｓ）著、モレキュラー・ファーマコロジー（Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．）、２００９年、第６巻、ｐ６５９〜６６８；デービス（Ｄａｖｉｓ）著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１０年、第４６４巻、ｐ１０６７〜１０７０）。
【０４７５】
一実施形態では、医薬組成物は、徐放性製剤であってもよい。さらなる実施形態では、徐放性製剤は、皮下送達されてもよい。徐放性製剤としては、ＰＬＧＡ微小球；酢酸ビニルエチレン（ＥＶＡｃ）；ポロキサマー；フロリダ州アラチュア（Ａｌａｃｈｕａ，ＦＬ）のナノセラピューティクス株式会社（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）からのゲルサイト（ＧＥＬＳＩＴＥ）（登録商標）；カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）のハロザイム・セラピューティクス（Ｈａｌｏｚｙｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）からのハイレネックス（ＨＹＬＥＮＥＸ）（登録商標）；ジョージア州コーネリア（Ｃｏｒｎｅｌｉａ，ＧＡ）のエチコン株式会社（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｉ
ｎｃ．）からのフィブリノーゲンポリマーなどの外科用シーラント；イリノイ州ディアフィールド（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）のバクスター・インターナショナル株式会社（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）からのティセル（ＴＩＳＳＥＬＬ）（登録商標）；ＰＥＧベースのシーラント、およびイリノイ州ディアフィールド（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）のバクスター・インターナショナル株式会社（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）からのコシール（ＣＯＳＥＡＬ）（登録商標）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０４７６】
非限定的例として、修飾ｍＲＮＡは、調節可能な放出速度（例えば、数日間および数週間）があるＰＬＧＡ微小球を調製し、ＰＬＧＡ微小球内に修飾ｍＲＮＡを封入することで、カプセル化工程において修飾ｍＲＮＡの完全性を保ちながら、ＰＬＧＡ微小球に製剤化されてもよい。ＥＶＡｃは、前臨床徐放インプラント用途（例えば、緑内障のためのピロカルピン眼科用挿入物である持続放出製品オキュサート（Ｏｃｕｓｅｒｔ）、または徐放プロゲステロン子宮内デバイスであるプロゲスタサート（ｐｒｏｇｅｓｔａｓｅｒｔ）；経皮送達系であるテストダーム（Ｔｅｓｔｏｄｅｒｍ）、デュラゲシク（Ｄｕｒａｇｅｓｉｃ）およびセレギリン（Ｓｅｌｅｇｉｌｉｎｅ）；カテーテル）で広く使用される、非生分解性生体適合性ポリマーである。ポロキサマーＦ−４０７ＮＦは、５℃未満の温度で低粘度を有し、１５℃を超える温度で固体ゲルを形成する、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンの親水非イオン性界面活性剤トリブロック共重合体である。ＰＥＧベースの外科用シーラントは、送達デバイス内で混合された２つの合成ＰＥＧ成分を含んでなり、それは１分以内に調製され得、３分以内にシールされて、３０日以内に再吸収される。ゲルサイト（ＧＥＬＳＩＴＥ）（登録商標）および天然ポリマーは、投与部位で原位置ゲル化できる。それらは、イオン性相互作用を通じて、タンパク質およびペプチド治療薬候補と相互作用し、安定効果を提供することが示されている。
【０４７７】
ポリマー製剤はまた、異なるリガンドの発現を通じて選択的に標的化され得、それは葉酸、トランスフェリン、およびＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）によって例示されるが、それによって限定されない（それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、ブノワ（Ｂｅｎｏｉｔ）ら著、バイオモレキュールズ（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．）、２０１１年、第１２巻、ｐ２７０８〜２７１４；ロゼマ（Ｒｏｚｅｍａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．）、２００７年、第１０４巻、ｐ１２９８２〜１２８８７；デービス（Ｄａｖｉｓ）著、モレキュラー・ファーマコロジー（ＭｏｌＰｈａｒｍ．）、２００９年、第６巻、ｐ６５９〜６６８；デービス（Ｄａｖｉｓ）著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１０年、第４６４巻、ｐ１０６７〜１０７０）。
【０４７８】
本発明のポリヌクレオチドは、高分子化合物と共に、またはそれに、製剤化されてもよい。ポリマーとしては、ポリエテン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ｌ−リジン）（ＰＬＬ）、ＰＥＧグラフト化ＰＬＬ、カチオン性リポポリマー、生分解性カチオン性リポポリマー、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、架橋分枝ポリ（アルキレンイミン）、ポリアミン誘導体、修飾ポロキサマー、生分解性ポリマー、弾性生分解性ポリマー、生分解性ブロック共重合体、生分解性ランダム共重合体、生分解性ポリエステル共重合体、生分解性ポリエステルブロック共重合体、生分解性ポリエステルブロックランダム共重合体、マルチブロック共重合体、直鎖生分解性共重合体、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸）（ＰＡＧＡ）、生分解性架橋カチオン性多重ブロック共重合体、ポリカーボネート、ポリ酸無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメラート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅｓ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリル酸、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポ
リ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、アクリルポリマー、アミン含有ポリマー、デキストランポリマー、デキストランポリマー誘導体またはまたはそれらの組み合わせなどであるが、これに限定されるものではない、少なくとも１つのポリマーが挙げられる。
【０４７９】
非限定的例として、本発明のポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第６，１７７，２７４号明細書に記載されるようなＰＬＬにグラフト化されたＰＥＧの高分子化合物と共に製剤化されてもよい。製剤は、インビトロで細胞に形質移入し、またはポリヌクレオチドをインビボ送達するために、使用されてもよい。別の実施例では、ポリヌクレオチドは、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００９００４２８２９号明細書および米国特許出願公開第２００９００４２８２５号明細書に記載されるように、乾燥医薬組成物中で、または乾燥できる溶液中で、カチオン性ポリマーと共に、溶液または媒体に懸濁されてもよい。
【０４８０】
別の非限定的例として、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロック共重合体（その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第ＵＳ２０１２０００４２９３号明細書および米国特許第８，２３６，３３０号明細書を参照されたい）またはＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡブロック共重合体（その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第６，００４，５７３号明細書を参照されたい）と共に、製剤化されてもよい。非限定的例として、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＥＧおよびＰＬＡまたはＰＥＧおよびＰＬＧＡのジブロック共重合体と共に製剤化されてもよい（その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，２４６，９６８号明細書を参照されたい）。
【０４８１】
ポリアミン誘導体は、核酸を送達し、または疾患を治療および／または予防するために使用されてもよく、または植込み型または注入型装置に包含されてもよい（それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１００２６０８１７号明細書（現在は、米国特許第８，４６０，６９６号明細書））。非限定的例として、医薬組成物は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１００２６０８１７号明細書（現在は、米国特許第８，４６０，６９６号明細書に記載される、ポリヌクレオチドおよびポリアミン誘導体を含んでもよい。非限定的例として、本発明のポリヌクレオチドは、炭水化物ジアジド単量体と、オリゴアミンを含んでなるジルキンユナイト（ｄｉｌｋｙｎｅ  ｕｎｉｔｅ）とを合わせることで調製される１，３−双極性付加ポリマーを含んでなるポリマーなどであるが、これに限定されるものではない、ポリアミンデ（ｐｏｌｙａｍｉｎｄｅ）ポリマーを使用して送達されてもよい（その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，２３６，２８０号明細書）。
【０４８２】
本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのアクリルポリマーと共に製剤化されてもよい。アクリルポリマーとしては、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸およびメタクリル酸共重合体、メタクリル酸メチル共重合体、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレート共重合体、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリシアノアクリル酸、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０４８３】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１１１１５８６２号パンフレット、国際公開第２０１２０８２５７４号パンフレット、および国際公開第２０１２０６８１８７号パンフレット、および米国特許出願公開第２０１２０２８３４２７号明細書に記載される、少なくとも１つのポリマーおよび／またはその誘導体と共に製剤化されてもよい。別の実施形態で
は、本発明のポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１１１１５８６２号パンフレットに記載される、式Ｚのポリマーと共に製剤化されてもよい。さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１２０８２５７４号パンフレットまたは国際公開第２０１２０６８１８７号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１２０２８３４２号明細書に記載される、式Ｚ、Ｚ’またはＺ’’のポリマーと共に製剤化されてもよい。本発明の修飾ＲＮＡと共に製剤化されたポリマーは、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１２０８２５７４号パンフレットまたは国際公開第２０１２０６８１８７号パンフレットに記載される方法によって合成されてもよい。
【０４８４】
本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのアクリルポリマーと共に製剤化されてもよい。アクリルポリマーとしては、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸およびメタクリル酸共重合体、メタクリル酸メチル共重合体、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレート共重合体、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリシアノアクリル酸、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０４８５】
本発明のポリヌクレオチドの製剤は、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリ（アミン−コ−エステル）またはそれらの組み合わせなどであるが、これに限定されるものではない少なくとも１つのアミンを含有するポリマーを含んでもよい。非限定的例として、ポリ（アミン−コ−エステル）は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０８２５２９号パンフレットに記載され、および／またはそれに記載される方法によって製造されるポリマーであってもよい。
【０４８６】
例えば、本発明のポリヌクレオチドは、ポリ（アルキレンイミン）、生分解性カチオン性リポポリマー、生分解性ブロック共重合体、生分解性ポリマー、または生分解性ランダム共重合体、生分解性ポリエステルブロック共重合体、生分解性ポリエステルポリマー、生分解性ポリエステルランダム共重合体、直鎖生分解性共重合体、ＰＡＧＡ、生分解性架橋カチオン性多重ブロック共重合体、またはそれらの組み合わせを含む、医薬化合物に製剤化されてもよい。生分解性カチオン性リポポリマーは、当該技術分野で公知の方法、および／またはそれぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第６，６９６，０３８号明細書、米国特許出願公開第２００３００７３６１９号明細書および米国特許出願公開第２００４０１４２４７４号明細書に記載される方法によって製造されてもよい。ポリ（アルキレンイミン）は、当該技術分野で公知の方法、および／またはその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１００００４３１５号明細書に記載される方法を使用して、製造されてもよい。生分解性ポリマー、生分解性ブロック共重合体、生分解性ランダム共重合体、生分解性ポリエステルブロック共重合体、生分解性ポリエステルポリマー、または生分解性ポリエステルランダム共重合体は、当該技術分野で公知の方法および／またはその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第６，５１７，８６９号明細書および米国特許第６，２６７，９８７号明細書に記載されるような方法を使用して、製造されてもよい。直鎖生分解性共重合体は、当該技術分野で公知の方法および／または米国特許第６，６５２，８８６号明細書に記載されるような方法を使用して、製造されてもよい。ＰＡＧＡポリマーは、当該技術分野で公知の方法および／またはその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第６，２１７，９１２号明細書に記載されるような方法を使用して、製造されてもよい。ＰＡＧＡポリマーは、ポリ−Ｌ−リジン、ポリアルギン（ｐｏｌｙａｒｇｉｎｅ）、ポリオルニチン、ヒストン、アビジン、プロタミン、ポリラクチドおよびポリ（ラクチド−コ−グリコリド）などであるが、これに限定されるものではない、ポリマーと共重合されて、共重合体またはブロック共重合体を形成してもよい。生分解性架橋カチオン性多重ブロック
共重合体は、当該技術分野で公知の方法および／またはそれぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，０５７，８２１号明細書、米国特許第８，４４４，９９２号明細書、または米国特許出願公開第２０１２００９１４５号明細書に記載されるような方法によって製造されてもよい。例えば、多重ブロック共重合体は、分枝ポリエチレンイミンと比較して、別個のパターンを有する、直鎖ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）ブロックを使用して合成されてもよい。さらに、組成物または医薬組成物は、本明細書に記載される、またはそれぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１００００４３１５号明細書、または米国特許第６，２６７，９８７号明細書および米国特許第６，２１７，９１２号明細書に記載されるような、当該技術分野で公知の方法によって製造されてもよい。
【０４８７】
本発明のポリヌクレオチドは、ポリカチオン性側鎖を含有してもよい少なくとも１つの分解性ポリエステルと共に、製剤化されてもよい。分解性ポリエステルとしては、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。別の実施形態では、分解性ポリエステルは、ＰＥＧコンジュゲーションを含んでＰＥＧ化ポリマーを形成してもよい。
【０４８８】
本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの架橋性ポリエステルと共に製剤化されてもよい。架橋性ポリエステルとしては、当該技術分野で公知のもの、およびその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１２０２６９７６１号明細書に記載されるものが挙げられる。
【０４８９】
本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのシクロデキストリンポリマーに製剤化されてもよく、またはそれと共に製剤化されてもよい。シクロデキストリンポリマーおよびシクロデキストリンポリマーを製造する方法としては、当該技術分野で公知のもの、およびその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１８４４５３号明細書に記載されるものが挙げられる。
【０４９０】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの架橋カチオン結合ポリマーに製剤化されてもよく、またはそれと共に製剤化されてもよい。架橋カチオン結合ポリマーおよび架橋カチオン結合ポリマーを製造する方法としては、当該技術分野で公知のもの、およびそれぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３１０６０７２号パンフレット、国際公開第２０１３１０６０７３号パンフレット、および国際公開第２０１３１０６０８６号パンフレットに記載されるものが挙げられる。
【０４９１】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの分枝ポリマーに製剤化されてもよく、またはそれと共に製剤化されてもよい。分枝ポリマーおよび分枝ポリマーを製造する方法としては、当該技術分野で公知のもの、およびそれぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３１１３０７１号パンフレットに記載されるものが挙げられる。
【０４９２】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、少なくともＰＥＧ化アルブミンポリマーに製剤化されてもよく、またはそれと共に製剤化されてもよい。ＰＥＧ化アルブミンポリマーおよびＰＥＧ化アルブミンポリマーを製造する方法としては、当該技術分野で公知のもの、およびそれぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０２３１２８７号明細書に記載されるものが挙げられる。
【０４９３】
一実施形態では、本明細書に記載されるポリマーは、ＰＥＧ末端の脂質にコンジュゲートされもよい。非限定的例として、ＰＬＧＡがＰＥＧ末端の脂質にコンジュゲートされて
、ＰＬＧＡ−ＤＳＰＥ−ＰＥＧが形成されてもよい。別の非限定的例として、本発明によって使用されるＰＥＧコンジュゲートは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２００８１０３２７６号パンフレットに記載される。ポリマーは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，２７３，３６３号明細書に記載されるコンジュゲートなどであるが、これに限定されるものではない、リガンドコンジュゲートを使用して、コンジュゲートされてもよい。
【０４９４】
一実施形態では、本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、投与前にＰＥＧまたはリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム溶液と混合されてもよい。別の実施形態では、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＰＥＧと混合されてもよく、またリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム溶液と混合されてもよい。さらに別の実施形態では、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＰＥＧと混合されてもよく、第２の対象タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、リン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム溶液と混合されてもよい。
【０４９５】
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、別の化合物にコンジュゲートされてもよい。コンジュゲートの非限定的例は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第７，９６４，５７８号明細書および米国特許第７，８３３，９９２号明細書に記載される。別の実施形態では、本発明の修飾ＲＮＡは、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第７，９６４，５７８号明細書および米国特許第７，８３３，９９２号明細書に記載されるような、式１〜１２２のコンジュゲートにコンジュゲートされてもよい。本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、金などであるが、これに限定されるものではない、金属にコンジュゲートされてもよい（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、ギルヨハン（Ｇｉｌｊｏｈａｎｎ）ら著、米国化学会誌（Ｊｏｕｒｎ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、２００９年、第１３１巻、第６号、ｐ２０７２〜２０７３を参照されたい）。別の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、金−ナノ粒子にコンジュゲートされてもよく、および／またはその中にカプセル化されてもよい（それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１２１６２６９号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１２０３０２９４０号明細書および米国特許出願公開第２０１３０１７７５２３号明細書）。
【０４９６】
その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１００００４３１３号明細書に記載されるように、遺伝子送達組成物は、ヌクレオチド配列およびポロキサマーを含んでもよい。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、米国特許出願公開第２０１００００４３１３号明細書に記載される、ポロキサマーを含む遺伝子送達組成物中で使用されてもよい。
【０４９７】
一実施形態では、本発明のポリマー製剤は、コレステロールおよびポリエチレングリコール基に共有結合的に連結してもよいカチオン性リポポリマーに、カチオン性担体を含んでもよいポリマー製剤を接触させることで、安定化されてもよい。ポリマー製剤は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００９００４２８２９号明細書に記載される方法を使用して、カチオン性リポポリマーに接触されてもよい。カチオン性担体としては、ポリエチレンイミン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド−ポリアミン、ジデオキシ−ジアミノ−ｂ−シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、ポリ（２−ジメチルアミノ）メタクリル酸エチル、ポリ（リジン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（アルギニン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）、１−［
２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウム塩化物（ＤＯＴＩＭ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸塩（ＤＯＳＰＡ）、３Ｂ−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ−コレステロールＨＣｌ）ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム塩化物ＤＯＤＡＣ）、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。非限定的例として、ポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３００６５９４２号明細書に記載されるものなどのカチオン性リポポリマーと共に製剤化されてもよい。
【０４９８】
本発明のポリヌクレオチドは、１つまたは複数のポリマーのポリプレックスに製剤化されてもよい（例えば、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，５０１，４７８号明細書、米国特許出願公開第２０１２０２３７５６５号明細書および米国特許出願公開第２０１２０２７０９２７号明細書および米国特許出願公開第２０１３０１４９７８３号明細書および国際公開第２０１３０９０８６１号パンフレットを参照されたい）。非限定的例として、ポリプレックスは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０９０８６１号パンフレットに記載される、新規のα−アミノアミジンポリマーを使用して形成されてもよい。別の非限定的例として、ポリプレックスは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，５０１，４７８号明細書に記載されるクリックポリマーを使用して形成されてもよい。
【０４９９】
一実施形態では、ポリプレックスは、２つ以上のカチオン性ポリマーを含んでなる。カチオン性ポリマーは、直鎖ＰＥＩなどのポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）を含んでなってもよい。別の実施形態では、ポリプレックスは、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）、そのＰＥＧ化類似物ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋ、およびそれらの混合物を含んでなる（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１４９７８３号明細書を参照されたい。
【０５００】
本発明のポリヌクレオチドはまた、ポリマーや脂質、および／またはリン酸カルシウムなどであるが、これに限定されるものではない、その他の生分解性因子の組み合わせを使用して、ナノ粒子として製剤化され得る。１つまたは複数のポリヌクレオチドの送達が促進されてもよいように、成分は、コア−シェル中、ハイブリッド中、および／または層毎の構造中で混合されて、ナノ粒子の微調整を可能にしてもよい（その内容全体が参照により本明細書に援用される、ワング（Ｗａｎｇ）ら著、ネイチャー・マテリアルズ（Ｎａｔ
Ｍａｔｅｒ．）２００６年、第５巻、ｐ７９１〜７９６；フラー（Ｆｕｌｌｅｒ）ら著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．）、２００８年、第２９巻、ｐ１５２６〜１５３２；デコッカー（ＤｅＫｏｋｅｒ）ら著、アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビューズ（Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．）、２０１１年、第６３巻、ｐ７４８〜７６１；エンドレス（Ｅｎｄｒｅｓ）ら著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．）、２０１１年、第３２巻、ｐ７７２１〜７７３１；スー（Ｓｕ）ら著、モレキュラー・ファーマコロジー（Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．）、２０１１年６月６日、第８巻、第３号、ｐ７７４〜８７）。非限定的例として、ナノ粒子は、親水性−疎水性ポリマー（例えばＰＥＧ−ＰＬＧＡ）、疎水性ポリマー（例えばＰＥＧ）および／または親水性ポリマーなどであるが、これに限定されるものではない、複数のポリマーを含んでなってもよい（その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１２０２２５１２９号パンフレット）。
【０５０１】
別の非限定的例として、ポリヌクレオチドのための親水性ポリマーを含んでなるナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３１１９９３６号パンフレットに記載されるもの、またはそれに記載される方法によって製造されるものであってもよい。
【０５０２】
一実施形態では、本発明で使用されてもよい生分解性ポリマーは、ポリ（エーテル無水物）ブロック共重合体である。非限定的例として、本明細書で使用される生分解性ポリマーは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２００６０６３２４９号パンフレットに記載されるようなブロック共重合体であってもよく、またはその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２００６０６３２４９号パンフレットに記載される方法によって製造されてもよい。
【０５０３】
別の実施形態では、本発明で使用されてもよい生分解性ポリマーは、アルキルおよびシクロアルキル末端生分解性脂質である。非限定的例として、アルキルおよびシクロアルキル末端生分解性脂質は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０８６３２２号パンフレットに記載されるものであってもよく、および／または国際公開第２０１３０８６３２２号パンフレットに記載される方法によって製造されてもよい。
【０５０４】
さらに別の実施形態では、本発明で使用されてもよい生分解性ポリマーは、脂質部分に位置する、１つまたは複数の生分解性基を有するカチオン性脂質である。非限定的例として、生分解性脂質は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１９５９２０号明細書に記載されるものであってもよい。
【０５０５】
脂質および／またはポリマーと組み合わされた生分解性リン酸カルシウムナノ粒子は、インビボでポリヌクレオチドを送達することが示されている。一実施形態では、アニスアミドなどの標的化リガンドもまた含有してもよい、脂質被覆リン酸カルシウムナノ粒子が使用されて、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドが送達されてもよい。例えば、マウス転移性肺モデルにおいて、ｓｉＲＮＡを効果的に送達するために、脂質被覆リン酸カルシウムナノ粒子が使用された（その内容全体が参照により本明細書に援用される、リー（Ｌｉ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．）、２０１０年、第１４２号、ｐ４１６〜４２１；リー（Ｌｉ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．）、２０１２年、第１５８号、ｐ１０８〜１１４；ヤング（Ｙａｎｇ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２０１２年、第２０巻、ｐ６０９〜６１５）。この送達系は、標的化ナノ粒子とエンドソーム漏出を促進する成分であるリン酸カルシウムとの両方を組み合わせて、ｓｉＲＮＡの送達を改善する。
【０５０６】
一実施形態では、リン酸カルシウムが、ＰＥＧ−ポリアニオンブロック共重合体と共に使用されて、ポリヌクレオチドを送達してもよい（それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、カジカワ（Ｋａｚｉｋａｗａ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．）、２００４年、第９７巻、ｐ３４５〜３５６；（カジカワ（Ｋａｚｉｋａｗａ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．）、２００６年、第１１１巻、ｐ３６８〜３７０）。
【０５０７】
一実施形態では、ＰＥＧ電荷反転型ポリマー（その内容全体が参照により本明細書に援用される、ピテラ（Ｐｉｔｅｌｌａ）ら著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．）、２０１１年、第３２巻、ｐ３１０６〜３１１４）が使用されて、ナノ粒子が形成され、本発明のポリヌクレオチドが送達されてもよい。ＰＥＧ電荷反転型ポリマーは、酸性ｐＨでポリカチオンに切断され、ひいてはエンドソーム漏出を促進することで、ＰＥ
Ｇポリアニオンブロック共重合体上で改善されてもよい。
【０５０８】
一実施形態では、本発明で使用されるポリマーは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０５５３３１号パンフレットに記載されるペンタブロックポリマーなどであるが、これに限定されるものではない、ペンタブロックポリマーであってもよい。非限定的例として、ペンタブロックポリマーは、ＰＧＡ−ＰＣＬ−ＰＥＧ−ＰＣＬ−ＰＧＡを含んでなり、ＰＥＧはポリエチレングリコールであり、ＰＣＬはポリ（Ｅ−カプロラクトン）であり、ＰＧＡはポリ（グリコール酸）であり、ＰＬＡはポリ（乳酸）である。別の非限定的例として、ペンタブロックポリマーは、ＰＥＧ−ＰＣＬ−ＰＬＡ−ＰＣＬ−ＰＥＧを含んでなり、ＰＥＧはポリエチレングリコールであり、ＰＣＬはポリ（Ｅ−カプロラクトン）であり、ＰＧＡはポリ（グリコール酸）であり、ＰＬＡはポリ（乳酸）である。
【０５０９】
一実施形態では、本発明で使用されてもよいポリマーは、少なくとも１つのジエポキシドおよび少なくとも１つのアミノグリコシドを含んでなる（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０５５９７１号パンフレットを参照されたい）。ジエポキシドは、１，４ブタンジオールジグリシジルエーテル（１，４Ｂ）、１，４−シクロヘキサンジメタノールジグリシジルエーテル（１，４Ｃ）、４−ビニルシクロヘキセンジエポキシド（４ＶＣＤ）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（エッジ）、グリセロールジグリシジルエーテル（ＧＤＥ）、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル（ＮＰＤＧＥ）、ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル（ＰＥＧＤＥ）、ポリ（プロピレングリコール）ジグリシジルエーテル（ＰＰＧＤＥ）、およびレソルシノールジグリシジルエーテル（ＲＤＥ）から選択されてもよいが、これに限定されるものではない。アミノグリコシドは、ストレプトマイシン、ネオマイシン、フラマイセチン、パロモマイシン、リボスタマイシン、カナマイシン、アミカシン、アルベカシン、ベカナマイシン、ジベカシン、トブラマイシン、スペクチノマイシン、ハイグロマイシン、ゲンタマイシン、ネチルマイシン、シソマイシン、イセパマイシン、ベルダマイシン、アストロマイシン、およびアプラマイシンから選択されてもよいが、これに限定されるものではない。非限定的例として、ポリマーは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０５５９７１号パンフレットに記載される方法によって、製造されてもよい。別の非限定的例として、少なくとも１つの少なくとも１つのジエポキシドと少なくとも１つのアミノグリコシドとを含んでなる、ポリマーのいずれかを含んでなる、組成物は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０５５９７１号パンフレットに記載される方法によって製造されてもよい。
【０５１０】
一実施形態では、本発明で使用されてもよいポリマーは、架橋ポリマーであってもよい。非限定的例として、架橋ポリマーが使用されて、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，４１４，９２７号明細書に記載されるような粒子が形成されてもよい。別の非限定的例として、架橋ポリマーは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１７２６００号明細書に記載される方法によって得られてもよい。
【０５１１】
別の実施形態では、本発明で使用されてもよいポリマーは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，４６１，１３２号明細書に記載されるものなどの架橋ポリマーであってもよい。非限定的例として、架橋ポリマーは、体組織を治療するための治療用組成物で使用されてもよい。治療用組成物は、注射またはカテーテル挿入など、様々な当該技術分野で公知の方法、および／または本明細書に記載される方法を使用して、損傷を受けた組織に投与されてもよい。
【０５１２】
一実施形態では、本発明で使用されてもよいポリマーは、その内容全体が参照により本
明細書に援用される、国際公開第２０１３０４９３２８号パンフレットに記載されるものなどであるが、これに限定されるものではない、ジアルファテック（ｄｉ−ａｌｐｈａｔｉｃ）置換ＰＥＧ化脂質であってもよい。
【０５１３】
一実施形態では、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧであるブロック共重合体が、本発明で使用されてもよい（例えば、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、熱感受性のハイドロゲル（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）が、ＴＧＦ−β１遺伝子送達ビヒクルとして使用される、リー（Ｌｅｅ）ら著、「Ｔｇｆ−β１遺伝子送達ビヒクルとしての熱感受性ハイドロゲルは糖尿病性創傷治癒を促進する（Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ａｓ  ａ  Ｔｇｆ−β１  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｖｅｈｉｃｌｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ）」、ファーマスーティカル・リサーチ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００３年、第２０巻、第１２号、ｐ１９９５〜２０００；制御される遺伝子送達系として使用される、リー（Ｌｉ）ら著、「熱感受性生分解性ハイドロゲルベースの制御される遺伝子送達系（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ）」、ファーマスーティカル・リサーチ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００３年、第２０巻、第６号、ｐ８８４〜８８８；およびチャン（Ｃｈａｎｇ）ら著、「非イオン両親媒性生分解性ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ共重合体はラット骨格筋内の遺伝子送達効率を高める（Ｎｏｎ−ｉｏｎｉｃ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｒａｔ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ）」、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ）、２００７年、第１１８巻、ｐ２４５〜２５３を参照されたい）。本発明は、筋肉内および皮下投与などであるが、これに限定されるものではない投与のために、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧと共に製剤化されてもよい。
【０５１４】
別の実施形態では、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロック共重合体が本発明で使用されて、生分解性徐放システムが開発される。一態様では、本発明のポリヌクレオチドは、投与前にブロック共重合体と混合される。別の態様では、本発明のポリヌクレオチド酸は、ブロック共重合体と同時投与される。
【０５１５】
一実施形態では、本発明で使用されるポリマーは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８４５４９４６号明細書に記載されるような多官能価Ｎ−マレイミジルポリマー誘導体などであるが、これに限定されるものではない、多官能価ポリマー誘導体であってもよい。
【０５１６】
コア−シェルナノ粒子の使用は、カチオン性架橋ナノゲルコアおよび様々なシェルを合成する、ハイスループットアプローチにさらに焦点を合わせる（その内容全体が参照により本明細書に援用されるジークバルト（Ｓｉｅｇｗａｒｔ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）、２０１１年、第１０８巻、ｐ１２９９６〜１３００１）。重合性ナノ粒子の複合体形成、送達、および内部移行は、ナノ粒子のコアおよびシェル成分の両方で化学成分を変化させることで、正確に制御され得る。例えば、コア−シェルナノ粒子は、それらがコレステロールをナノ粒子に共有結合的に付着した後に、マウス肝実質細胞にｓｉＲＮＡを効率的に送達してもよい。
【０５１７】
一実施形態では、中央ＰＬＧＡ層を含んでなる中空脂質コア、およびＰＥＧ含有外部中性脂質層が使用されて、本発明のポリヌクレオチドが送達されてもよい。非限定的例として、ルシフェレアーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒｅａｓｅ）発現腫瘍を有するマウスでは、脂質−ポリマー−脂質ハイブリッドナノ粒子が、従来のリポプレックスと比較して、ルシフェラ
ーゼ発現を有意に抑制することが確認された。（その内容全体が参照により本明細書に援用される、シャイ（Ｓｈｉ）ら著、アンゲヴァンテ・ケミー・インターナショナル・エディション（Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ．）、２０１１年、第５０巻、ｐ７０２７〜７０３１）。
【０５１８】
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書で開示されるポリヌクレオチドコアと、ポリマーシェルとを含んでなってもよい。ポリマーシェルは、本明細書に記載され、当該技術分野で公知であるポリマーのいずれであってもよい。追加的な実施形態では、ポリマーシェルが使用されて、ポリヌクレオチドがコア内で保護されてもよい。
【０５１９】
本発明のポリヌクレオチドと共に使用されるコア−シェルナノ粒子は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，３１３，７７７号明細書または国際公開第２０１３１２４８６７号パンフレットに記載され、それに記載される方法によって形成されてもよい。
【０５２０】
一実施形態では、コア−シェルナノ粒子は、本明細書で開示されるポリヌクレオチドコアと、ポリマーシェルとを含んでなってもよい。ポリマーシェルは、本明細書に記載され、当該技術分野で公知であるポリマーのいずれであってもよい。追加的な実施形態では、ポリマーシェルが使用されて、ポリヌクレオチドがコア内で保護されてもよい。
【０５２１】
一実施形態では、本明細書に記載される製剤と共に使用されるポリマーは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１１１２００５３号パンフレットに記載されるような修飾ポリマー（修飾ポリアセタールなどであるが、これに限定されるものではない）であってもよい。
【０５２２】
一実施形態では、製剤は、ポリマー担体と少なくとも１つの核酸分子とを含んでなる、ポリマー担体カーゴ複合体であってもよい。ポリマー担体カーゴ複合体の非限定的例は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３１１３３２６号パンフレット、国際公開第２０１３１１３５０１号パンフレット、国際公開第２０１３１１３３２５号パンフレット、国際公開第２０１３１１３５０２号パンフレット、および国際公開第２０１３１１３７３６号パンフレット、および欧州特許第２６２３１２１号明細書に記載される。一態様では、ポリマー担体カーゴ複合体は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１３１１３３２５号パンフレットおよび国際公開第２０１３１１３５０２号パンフレットに記載されるものなどであるが、これに限定されるものではない、負に帯電した核酸分子を含んでなってもよい。
【０５２３】
一実施形態では、医薬組成物は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリマー担体カーゴ複合体を含んでなってもよい。ポリヌクレオチドは、感染症に関連する病原体からの抗原、アレルギーまたはアレルギー性疾患に関連する抗原、自己免疫疾患に関連する抗原、またはがんまたは腫瘍疾患関連抗原などであるが、これに限定されるものではない、目的のタンパク質をコードしてもよい（例えば、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３１１３３２６号パンフレット、国際公開第２０１３１１３５０１号パンフレット、国際公開第２０１３１１３３２５号パンフレット、国際公開第２０１３１１３５０２号パンフレット、および国際公開第２０１３１１３７３６号パンフレット、および欧州特許第２６２３１２１号明細書に記載される抗原を参照されたい）。
【０５２４】
非限定的例として、コア−シェルナノ粒子が使用されて、眼疾患または障害が治療されてもよい（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１２０３２１７１９号明細書を参照されたい）。
【０５２５】
一実施形態では、本明細書に記載される製剤と共に使用されるポリマーは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１１１２００５３号パンフレットに記載されるような修飾ポリマー（修飾ポリアセタールなどであるが、これに限定されるものではない）であってもよい。
【０５２６】
ペプチドおよびタンパク質
本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドによる細胞の形質移入を増大させるために、ペプチドおよび／またはタンパク質と共に製剤化され得る。一実施形態では、細胞透過性のペプチドなどであるが、これに限定されるものではないペプチド、および細胞内送達を可能にするタンパク質およびペプチドが使用されて、医薬製剤が送達されてもよい。本発明の薬剤製剤と共に使用されてもよい細胞透過性ペプチドの非限定的例としては、例えば、ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、ペネトラチン、トランスポータン、またはｈＣＴ由来細胞透過性ペプチドなどの細胞内空間への送達を容易にするポリカチオンに付着する、細胞透過性ペプチド配列が挙げられる（例えば、全てその内容全体が参照により本明細書に援用される、カロン（Ｃａｒｏｎ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、２００１年、第３巻、第３号、ｐ３１０〜８；ランゲル（Ｌａｎｇｅｌ）著、「細胞透過性ペプチド：プロセスおよび応用（Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、シーアールシー・プレス（ＣＲＣ）、フロリダ州ボカラトン（Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ＦＬ）、２００２年；エル−アンダロウシ（Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ）ら著、カレント・ファーマスーティカル・デザイン（Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．）、２００３年、第１１巻、第２８号、ｐ３５９７〜６１１；およびデシャイエ（Ｄｅｓｈａｙｅｓ）ら著、セルラー・アンド・モレキュラー・ライフ・サイエンシズ（Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．）、２００５年、第６２巻、第１６号、ｐ１８３９〜４９を参照されたい）。組成物はまた、例えば、細胞内空間への組成物送達を促進するリポソームなどの細胞透過性因子を含むように、製剤化され得る。本発明のポリヌクレオチドは、細胞内送達を可能にするために、マサチューセッツ州ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）のエルロン・セラピューティクス（Ａｉｌｅｒｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）およびマサチューセッツ州ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）のパーメロン・バイオロジクス（Ｐｅｒｍｅｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）からのペプチドおよび／またはタンパク質などであるが、これに限定されるものではない、ペプチドおよび／またはタンパク質に複合体化されてもよい（全てそれらの内容全体が参照により本明細書に援用される、クロニカン（Ｃｒｏｎｉｃａｎ）ら著、エーシーエス・ケミカル・バイオロジー（ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．）、２０１０年、第５巻、ｐ７４７〜７５２；マクノートン（ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、２００９年、第１０６巻、ｐ６１１１〜６１１６；Ｓａｗｙｅｒ著、ケミカル・バイオロジー・アンド・ドラッグ・デザイン（Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．）、２００９年、第７３巻、ｐ３〜６；ベルジン（Ｖｅｒｄｉｎｅ）およびヒリンスキー（Ｈｉｌｉｎｓｋｉ）著、メソッズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、２０１２年、第５０３巻、ｐ３〜３３）。
【０５２７】
一実施形態では、細胞透過性ポリペプチドは、第１のドメインおよび第２のドメインを含んでなってもよい。第１のドメインは、スーパーチャージポリペプチドを含んでなってもよい。第２のドメインは、タンパク質結合パートナーを含んでなってもよい。本明細書の用法では、「タンパク質結合パートナー」としては、抗体およびそれらの機能的断片、スキャフォールドタンパク質、またはペプチドが挙げられるが、これに限定されるものではない」。細胞透過性ポリペプチドは、タンパク質結合パートナーのための細胞内結合パートナーをさらに含んでなってもよい。細胞透過性ポリペプチドは、ポリヌクレオチドが導入されてもよい細胞から分泌されてもよい。
【０５２８】
ペプチドまたはタンパク質含有製剤は、ポリヌクレオチドによる細胞形質移入を増大させ、（例えば、特定の組織または細胞型を標的化することで）ポリヌクレオチドの生体内分布を変化させ、および／またはコード化タンパク質の翻訳を増大させるために使用されてもよい。（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１２１１０６３６号パンフレットおよび国際公開第２０１３１２３２９８号パンフレットを参照されたい）。
【０５２９】
一実施形態では、細胞透過性ペプチドは、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１２９７２６号明細書、米国特許出願公開第２０１３０１３７６４４号明細書、および米国特許出願公開第２０１３０１６４２１９号明細書に記載されるものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【０５３０】
細胞
本発明のポリヌクレオチドは、生体外で（ｅｘ  ｖｉｖｏ）細胞内に形質移入され得、それは引き続いて対象に移植される。非限定的例として、医薬組成物は、修飾ＲＮＡを肝臓および骨髄性細胞に送達するための赤血球、ウイルス様粒子（ＶＬＰ：ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）内の修飾ＲＮＡを送達するためのビロソーム、およびメリーランド州ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）のマックスサイト（ＭＡＸＣＹＴＥ）（登録商標）からの、およびフランス国リヨン（Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）のエリテック（ＥＲＹＴＥＣＨ）（登録商標）からのものなどであるが、これに限定されるものではない、修飾ＲＮＡを送達するための電気穿孔細胞を含んでもよい。ポリヌクレオチド以外のペイロードを送達するための、赤血球、ウイルス性粒子、および電気穿孔細胞の使用の例は、実証されている（全てその内容全体が参照により本明細書に援用される、ゴッドフリン（Ｇｏｄｆｒｉｎ）ら著、エキスパート・オピニオン・オン・バイオロジカル・セラピー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２０１２年、第１２巻、ｐ１２７〜１３３；ファング（Ｆａｎｇ）ら著、エキスパート・オピニオン・オン・バイオロジカル・セラピー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２０１２年、第１２巻、ｐ３８５〜３８９；フー（Ｈｕ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．）、２０１１年、第１０８巻、ｐ１０９８０〜１０９８５；ルンド（Ｌｕｎｄ）ら著、ファーマスーティカル・リサーチ（Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．）、２０１０年、第２７巻、ｐ４００〜４２０；ハックリーデ（Ｈｕｃｋｒｉｅｄｅ）ら著、ジャーナル・オブ・リポソーム・リサーチ（Ｊ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．）、２００７年、第１７巻、ｐ３９〜４７；クシ（Ｃｕｓｉ）著、ヒューマン・ワクチン（Ｈｕｍ  Ｖａｃｃｉｎ．）、２００６年、第２巻、ｐ１〜７；ド・ジョンジュ（ｄｅ  Ｊｏｎｇｅ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．）、２００６年、第１３巻、４００〜４１１頁）。
【０５３１】
ポリヌクレオチドは、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１１０８５２３１号パンフレットおよび国際公開第２０１３１１６６５６号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１１０１７１２４８号明細書に記載される方法によって合成される、合成ＶＬＰ内で送達されてもよい。
【０５３２】
本発明のポリヌクレオチドの細胞ベースの製剤が使用されて、（例えば細胞担体中の）細胞形質移入を確実にし、（例えば細胞担体を特定の組織または細胞型に標的化することによって）ポリヌクレオチドの生体内分布を変化させ、および／またはコード化タンパク質の翻訳を増大させてもよい。
【０５３３】
細胞への導入
ウイルス媒介性技術および非ウイルス媒介性技術を含む多様な方法が、当該技術分野で公知であり、細胞に核酸を導入するのに適する。典型的な非ウイルス媒介性技術の例とし
ては、電気穿孔、リン酸カルシウム媒介性移入、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、リポソーム媒介性移入、マイクロインジェクション、微粒子銃媒介性移入（ナノ粒子）、カチオン性ポリマー媒介性移入（ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）または細胞融合が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０５３４】
ソノポレーション、または細胞超音波処理の技術は、細胞原形質膜の透過性を改良するための音波（例えば、超音波周波数）の使用である。ソノポレーション法は、当業者に知られており、インビボで核酸を送達するのに使用される（全てその内容全体が参照により本明細書に援用される、ヨーン（Ｙｏｏｎ）およびパーク（Ｐａｒｋ）著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．）、２０１０年、第７巻、ｐ３２１〜３３０；ポステマ（Ｐｏｓｔｅｍａ）およびギリヤ（Ｇｉｌｊａ）著、カレント・ファーマシューティカル・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２００７年、第８巻、ｐ３５５〜３６１；ニューマン（Ｎｅｗｍａｎ）およびベッティンガー（Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ）著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．）、２００７年、第１４巻、ｐ４６５〜４７５）。ソノポレーション法は、当該技術分野で公知であり、例えば、細菌に関して米国特許出願公開第２０１００１９６９８３号明細書で、例えばその他の細胞型に関して米国特許出願公開第２０１００００９４２４号明細書でもまた教示され、それらの内容全体は、それぞれ参照により本明細書に援用される。
【０５３５】
電気穿孔技術もまた当該技術分野で周知であり、インビボでおよび臨床的に核酸を送達するのに使用される（全てその内容全体が参照により本明細書に援用される、アンドレ（Ａｎｄｒｅ）ら著、カレント・ジーン・セラピー（Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、２０１０年、第１０巻、ｐ２６７〜２８０；チャレラ（Ｃｈｉａｒｅｌｌａ）ら著、カレント・ジーン・セラピー（Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第１０巻、ｐ２８１〜２８６；ホフマン（Ｈｏｊｍａｎ）著、カレント・ジーン・セラピー（Ｃｕｒｒ
Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第１０巻、ｐ１２８〜１３８）。電気穿孔装置は、マサチューセッツ州ホリストン（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）のビーティーエックス（ＢＴＸ）（登録商標）インスツルメンツ（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）（例えば、アジャイルパルス・イン・ビボ・システム（ＡｇｉｌｅＰｕｌｓｅ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｓｙｓｔｅｍ））およびペンシルベニア州ブルーベル（Ｂｌｕｅ  Ｂｅｌｌ，ＰＡ）のイノビオ（Ｉｎｏｖｉｏ）（例えば、イノビオ（Ｉｎｏｖｉｏ）ＳＰ−５Ｐ筋肉内送達デバイスまたはセレクトラ（ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ）（登録商標）３０００皮内送達デバイス）を含むが、これに限定されるものではない世界中の多数の企業によって販売される。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、電気穿孔によって送達されてもよい。
【０５３６】
微小器官
ポリヌクレオチドは、微小器官に含有されてもよく、次にそれは持続性治療製剤中で、コードされる目的のポリペプチドを発現し得る。微小器官およびそれらの製剤は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０２７０７７号明細書の段落［０００７０１］〜［０００７０５］中などに記載される。
【０５３７】
ヒアルロニダーゼ
本発明のポリヌクレオチドの筋肉内または皮下局所注射は、ヒアルロナンの加水分解を触媒するヒアルロニダーゼを含み得る。ヒアルロニダーゼは、間質関門の構成要素であるヒアルロナンの加水分解を触媒することで、ヒアルロナンの粘度を低下させ、それによって組織透過性を高める（その内容全体が参照により本明細書に援用される、フロスト（Ｆｒｏｓｔ）著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ
Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ）、２００７年、第４巻、ｐ４２７〜４４０）。それは、形質移入細胞によって生成されるコードされるタンパク質の分散と、全身分布を促進するのに有用である。あるいは、ヒアルロニダーゼが使用されて、筋肉内または皮下投与される本発明のポリヌクレオチドに曝露される、細胞数が増大され得る。
【０５３８】
ナノ粒子模倣体
本発明のポリヌクレオチドは、ナノ粒子模倣体内にカプセル化されおよび／またはそれに吸収されてもよい。ナノ粒子模倣体は、病原体、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物、プリオン、および細胞などであるが、これに限定されるものではない、送達機能生物または粒子を模倣し得る。非限定的例として、本発明のポリヌクレオチドは、ウイルスの送達機能を模倣し得る、非ヴィロン粒子内にカプセル化されてもよい。（それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１２００６３７６号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１３０１７１２４１号明細書および米国特許出願公開第２０１３０１９５９６８号明細書を参照されたい）。
【０５３９】
ナノチューブ
本発明のポリヌクレオチドは、ロゼットナノチューブ、リンカーがある対塩基を有するロゼットナノチューブ、炭素ナノチューブ、および／または単一壁炭素ナノチューブなどであるが、これに限定されるものではない、少なくとも１つのナノチューブに付着し得、または別の方法でそれに結合し得る。ポリヌクレオチドは、立体化学力、イオン力、共有結合力および／またはその他の力などであるが、これに限定されるものではない力を介して、ナノチューブに結合してもよい。ポリヌクレオチドを含んでなるナノチューブおよびナノチューブ製剤は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０２７０７７号明細書の段落［０００７０８］〜［０００７１４］中などに記載される。
【０５４０】
コンジュゲート
本発明のポリヌクレオチドは、担体または標的化群に共有結合する、または一緒になって融合タンパク質（例えば、標的化群と治療用タンパク質またはペプチドとを有する）を生じる２つのコード領域を含む、ポリヌクレオチドなどのコンジュゲートを含む。
【０５４１】
本発明のコンジュゲートとしては、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ：ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ：ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ：ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、またはグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）；または脂質などの天然に存在する物質が挙げられる。リガンドはまた、例えば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えばアプタマー）のような合成ポリマーなどの組換え体または合成分子であってもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物共重合体、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリード（ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸共重合体、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩、またはαらせんペプチドが挙げられる。
【０５４２】
ポリヌクレオチドコンジュゲート、特にＲＮＡの調製を教示する、代表的な米国特許としては、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第４，８２８，９７９号明細書；米国特許第４，９４８，８８２号明細書；米国特許第５，２１８，１０５号明細書；米国特許第５，５２５，４６５号明細書；米国特許第５，５４１，３１３号明細書；米国特許第５，５４５，７３０号明細書；米国特許第５，５５２，５３８号明細書；米国特許第５，５７８，７１７、５，５８０，７３１号明細書；米国特許第５，５９１，５８４号明細書；米国特許第５，１０９，１２４号明細書；米国特許第５，１１８，８０２号明細書；米国特許第５，１３８，０４５号明細書；米国特許第５，４１４，０７７号明細書；米国特許第５，４８６，６０３号明細書；米国特許第５，５１２，４３９号明細書；米国特許第５，５７８，７１８号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第４，５８７，０４４号明細書；米国特許第４，６０５，７３５号明細書；米国特許第４，６６７，０２５号明細書；米国特許第４，７６２，７７９号明細書；米国特許第４，７８９，７３７号明細書；米国特許第４，８２４，９４１号明細書；米国特許第４，８３５，２６３号明細書；米国特許第４，８７６，３３５号明細書；米国特許第４，９０４，５８２号明細書；米国特許第４，９５８，０１３号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，２４５，０２２号明細書；米国特許第５，２５４，４６９号明細書；米国特許第５，２５８，５０６号明細書；米国特許第５，２６２，５３６号明細書；米国特許第５，２７２，２５０号明細書；米国特許第５，２９２，８７３号明細書；米国特許第５，３１７，０９８号明細書；米国特許第５，３７１，２４１、５，３９１，７２３号明細書；米国特許第５，４１６，２０３、５，４５１，４６３号明細書；米国特許第５，５１０，４７５号明細書；米国特許第５，５１２，６６７号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５６５，５５２号明細書；米国特許第５，５６７，８１０号明細書；米国特許第５，５７４，１４２号明細書；米国特許第５，５８５，４８１号明細書；米国特許第５，５８７，３７１号明細書；米国特許第５，５９５，７２６号明細書；米国特許第５，５９７，６９６号明細書；米国特許第５，５９９，９２３号明細書；米国特許第５，５９９，９２８および５，６８８，９４１号明細書；米国特許第６，２９４，６６４号明細書；米国特許第６，３２０，０１７号明細書；米国特許第６，５７６，７５２号明細書；米国特許第６，７８３，９３１号明細書；米国特許第６，９００，２９７号明細書；米国特許第７，０３７，６４６号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０５４３】
一実施形態では、本発明のコンジュゲートは、本発明のポリヌクレオチドのための担体として機能してもよい。コンジュゲートは、ポリ（エチレングリコール）にグラフト化されてもよい、ポリアミン、ポリリジン、ポリアルキレンイミン、およびポリエチレンイミンなどであるが、これに限定されるものではない、カチオン性ポリマーを含んでなってもよい。非限定的例として、コンジュゲートは、ポリマーコンジュゲートと類似してもよく、ポリマーコンジュゲートを合成する方法は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第６，５８６，５２４号明細書に記載される。
【０５４４】
基質にコンジュゲーションさせる方法の非限定的例は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０２１１２４９号明細書に記載される。方法は、ポリヌクレオチドを含んでなるコンジュゲートされたポリマー粒子を製造するのに使用されもよい。
【０５４５】
コンジュゲートはまた、標的化群、例えば、細胞または組織標的化剤、例えば、腎臓胞などの特定の細胞型と結合するレクチン、糖タンパク質、脂質、またはタンパク質、例えば抗体も含み得る。標的化群は、甲状腺刺激ホルモン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤プロテインＡ、ムチン炭水化物、多価の乳糖、多価のガラクトース
、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣剤、またはアプタマーであり得る。
【０５４６】
標的化群は、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、共リガンドに対する特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、がん細胞、内皮細胞、または骨細胞などの特定の細胞型と結合する抗体であり得る。標的化群はまた、ホルモンおよびホルモン受容体もまた含んでもよい。それらとしてはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価乳糖、多価ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、多価マンノース、多価フルコース（ｆｒｕｃｏｓｅ）、またはアプタマーなどの非ペプチド化学種も挙げられる。リガンドは、例えば、リポ多糖、またはｐ３８ＭＡＰキナーゼ活性化剤であり得る。
【０５４７】
標的化群は、特定の受容体を標的とする能力がある、任意のリガンドであり得る。例としては、限定されることなく、葉酸、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース−６Ｐ、アパタマー（ａｐａｔａｍｅｒ）、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬ、およびＨＤＬリガンドが挙げられる。特定の実施形態では、標的化群は、アプタマーである。アプタマーは、未修飾であり得、または本明細書で開示される修飾の任意の組み合わせを有し得る。
【０５４８】
非限定的例として、標的化群は、血液−中枢神経系関門を越える標的化送達のための、グルタチオン受容体（ＧＲ：ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）結合コンジュゲートであってもよい（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０２１６６１０１２号明細書を参照されたい。
【０５４９】
一実施形態では、本発明のコンジュゲートは、相乗的な生体分子−ポリマーコンジュゲートであってもよい。相乗的な生体分子−ポリマーコンジュゲートは、より大きな治療効果を提供する、長時間作用型連続放出系であってもよい。相乗的生体分子−ポリマーコンジュゲートは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１９５７９９号明細書に記載されるものであってもよい。
【０５５０】
別の実施形態では、本発明で使用されてもよいコンジュゲートは、アプタマーコンジュゲートであってもよい。アパタマー（ａｐａｔａｍｅｒ）コンジュゲートの非限定的例は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１２０４０５２４号パンフレットに記載される。アプタマーコンジュゲートは、ポリヌクレオチドを含んでなる製剤の標的化送達を提供するために、使用されてもよい。
【０５５１】
一実施形態では、本発明で使用されてもよいコンジュゲートは、ポリマーコンジュゲートを含有するアミンであってもよい。ポリマーコンジュゲートを含有するアミンの非限定的例は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，５０７，６５３号明細書に記載される。
【０５５２】
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、ロックド核酸と類似した修飾などであるが、これに限定されるものではない、化学修飾を含んでもよい。
Ｓａｎｔａｒｉｓからのものなど、ロックド核酸（ＬＮＡ）の調製を教示する典型的な米国特許としては、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第６，２６８，４９０号明細書；米国特許第６，６７０，４６１号明細書；米国特許第６
，７９４，４９９号明細書；米国特許第６，９９８，４８４号明細書；米国特許第７，０５３，２０７号明細書；米国特許第７，０８４，１２５号明細書；および米国特許第７，３９９，８４５号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０５５３】
ＰＮＡ化合物の調製を教示する典型的な米国特許としては、そのそれぞれが参照により本明細書に援用される、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；米国特許第５，７１４，３３１号明細書；および米国特許第５，７１９，２６２号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、例えば、ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９１年、第２５４巻、ｐ１４９７〜１５００に見られる。
【０５５４】
本発明で取り上げるいくつかの実施形態は、ホスホロチオエート主鎖があるポリヌクレオチドと；特に、先述の米国特許第５，４８９，６７７号明細書の−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖として知られている］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［式中、天然リン酸ジエステル主鎖は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−ＣＨ２−として表される］；および先述の米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミド主鎖である、その他の修飾主鎖があるオリゴヌクレオシドとを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で取り上げるポリヌクレトチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｔｏｔｉｄｅ）は、先述の米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノ主鎖構造を有する。
【０５５５】
２’位における修飾はまた、送達を促進してもよい。好ましくは、２’位における修飾は、ポリペプチドコード配列中に位置せず、すなわち、翻訳可能領域にない。２’位における修飾は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよび／またはテーリング領域に位置してもよい。２’位における修飾は、以下の１つを２’位に含み得る：Ｈ（すなわち、２’−デオキシ）；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、式中、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってもよい。代表的な適切な修飾としては、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（式中、ｎおよびｍは１〜約１０である）が挙げられる。その他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、以下の１つを２’位に含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカアリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、薬物動態特性を改善する基、または薬力学的特性を改善する基、および同様の性質を有するその他の置換基。いくつかの実施形態では、修飾としては、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしてもまた知られている）（マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）ら著、ヘルベティカ・ケミカ・アクタ（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ）、１９９５年、第７８巻、ｐ４８６〜５０４）すなわち、アルコキシ−アルコキシ基が挙げられる。別の代表的修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、以下に本明細書の実施例で記載されるように、２’−ＤＭＡＯＥとしてもまた知られているＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野では２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、すなわち、下で本明細書の実施例にもまた記載される、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２である。その他修飾としては、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２
’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。同様の修飾はまた、その他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位に、または２’−５’連結ｄｓＲＮＡ中に、および５’末端ヌクレオチドの５’位に作成されてもよい。本発明のポリヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。このような修飾糖構造の調製を教示する典型的な米国特許としては、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第４，９８１，９５７号明細書；米国特許第５，１１８，８００号明細書；米国特許第５，３１９，０８０号明細書；米国特許第５，３５９，０４４号明細書；米国特許第５，３９３，８７８号明細書；米国特許第５，４４６，１３７号明細書；米国特許第５，４６６，７８６号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５１９，１３４号明細書；米国特許第５，５６７，８１１号明細書；米国特許第５，５７６，４２７号明細書；米国特許第５，５９１，７２２号明細書；米国特許第５，５９７，９０９号明細書；米国特許第５，６１０，３００号明細書；米国特許第５，６２７，０５３号明細書；米国特許第５，６３９，８７３号明細書；米国特許第５，６４６，２６５号明細書；米国特許第５，６５８，８７３号明細書；米国特許第５，６７０，６３３号明細書；および米国特許第５，７００，９２０号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０５５６】
なおも別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞透過性ポリペプチドに、共有結合的にコンジュゲートされる。細胞透過性ペプチドは、シグナル配列もまた含んでもよい。本発明のコンジュゲートは、安定性増大；細胞形質移入増大；および／または生体内分布の変化（例えば、特定の組織または細胞型に標的化される）を有するように設計され得る。
【０５５７】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、送達を促進する因子にコンジュゲートされてもよい。非限定的例として、因子は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１１０６２９６５号パンフレットに記載されるような、標的化ブロックを有する、標的化単量体またはポリマーなどの単量体またはポリマーであってもよい。別の非限定的一例では、因子は、本発明のポリヌクレオチドと共有結合的に連結する、輸送因子であってもよい（例えば、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第６，８３５．３９３号明細書および米国特許第７，３７４，７７８号明細書を参照されたい）。さらに別の非限定的例では、因子は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第７，７３７，１０８号明細書および米国特許第８，００３，１２９号明細書に記載されるものなどの膜関門輸送促進因子であってもよい。
【０５５８】
別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ワシントン州シアトル（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）のフェーズアールエクス（ＰＨＡＳＥＲＸ）（登録商標）株式会社からのスマート・ポリマー・テクノロジー（ＳＭＡＲＴＴ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）（商標）にコンジュゲートされてもよい。
【０５５９】
別の態様では、コンジュゲートは、組織または生物中で、ナノ粒子をニューロンに選択的に誘導するペプチドであってもよい。非限定的例として、使用されるペプチドは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１２９６２７号明細書に記載されるペプチドであってもよいが、これに限定されるものではない。
【０５６０】
さらに別の態様では、コンジュゲートは、血液脳関門を越えるのを補佐し得るペプチドであってもよい。
自己組織化ナノ粒子
本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、自己組織化ナノ粒子に製剤化されてもよい。核酸自己組織化ナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際特
許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０２７０７７号明細書の段落［０００７４０］〜［０００７４３］中などに記載される。ポリマーベースの自己組織化ナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０２７０７７号明細書の段落［０００７４４］〜［０００７４９］中などに記載される。
【０５６１】
自己組織化巨大分子
ポリヌクレオチドは、送達のために、両親媒性巨大分子（ＡＭ：ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）に製剤化されてもよい。ＡＭは、ポリ（エチレングリコール）に共有結合的に連結するアルキル化糖主鎖を有する、生体適合性両親媒性ポリマーを含んでなる。水溶液中において、ＡＭは、自己組織化してミセルを形成する。ＡＭを形成する方法、およびＡＭの非限定的例は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０２１７７５３号明細書に記載される。
【０５６２】
無機ナノ粒子
本発明のポリヌクレオチデス（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｓ）は、無機ナノ粒子に製剤化されてもよい。（その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，２５７，７４５号明細書）。無機ナノ粒子としては、水膨潤性の粘土物質が挙げられるが、これに限定されるものではない。非限定的例として、無機ナノ粒子としては、単純なケイ酸塩から製造される合成）スメクタイト粘土が挙げられる（例えば、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第５，５８５，１０８号明細書および米国特許第８，２５７，７４５号明細書を参照されたい）。
【０５６３】
一実施形態では、無機ナノ粒子は、本明細書で開示されるポリヌクレオチドコアと、ポリマーシェルとを含んでなってもよい。ポリマーシェルは、本明細書に記載され、当該技術分野で公知であるポリマーのいずれであってもよい。追加的な実施形態では、ポリマーシェルが使用されて、ポリヌクレオチドがコア内で保護されてもよい。
【０５６４】
半導電および金属ナノ粒子
本発明のポリヌクレオチデス（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｓ）は、半導電または金属素材を含んでなる水分散性ナノ粒子に製剤化されてもよく（その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１２０２２８５６５号明細書）、または磁性ナノ粒子に形成されてもよい（それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１２０２６５００１号明細書および米国特許出願公開第２０１２０２８３５０３号明細書）。水分散性ナノ粒子は、疎水性ナノ粒子または親水性ナノ粒子であってもよい。
【０５６５】
一実施形態では、半導電および／または金属ナノ粒子は、本明細書で開示されるポリヌクレオチドのコアと、ポリマーシェルとを含んでなってもよい。ポリマーシェルは、本明細書に記載され、当該技術分野で公知であるポリマーのいずれであってもよい。追加的な実施形態では、ポリマーシェルが使用されて、ポリヌクレオチドがコア内で保護されてもよい。
【０５６６】
外科用シーラント：ゲルおよびハイドロゲル
一実施形態では、本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、当該技術分野で公知の任意のハイドロゲル中にカプセル化されてもよく、それは対象に注射されるとゲルを形成してもよい。ゲルおよびハイドロゲルなどの外科用シーラントは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０２７０７７号明細書の段落［０００７６２］〜［０００８０９］中などに記載される。
【０５６７】
懸濁製剤
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド、水不混和性油デポー、界面活性剤および／または共界面活性剤および／または共溶媒を含んでなる、懸濁製剤が提供される。油および界面活性剤の組み合わせは、ポリヌクレオチドとの懸濁製剤を可能にしてもよい。水不混和性デポー中のポリヌクレオチド送達が使用されて、デポーから周囲の生理学的環境内へのｍＲＮＡの持続性放出を通じて生物学的利用能が改善され、ヌクレアーゼによるポリヌクレオチド分解が防止されてもよい。
【０５６８】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの懸濁製剤は、ポリヌクレオチド、油性溶液、および界面活性剤の組み合わせを使用して製剤化されてもよい。このような製剤は、ポリヌクレオチドを含んでなる水相と、油および界面活性剤を含んでなる油性相とを含んでなる、二液系として製剤化されてもよい。懸濁製剤のための代表的油としては、ゴマ油、およびミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）（飽和ココナツおよびパーム核油に由来するカプリルおよびカプリン酸脂肪酸およびグリセリンまたはプロピレングリコールのエステルを含んでなる）、コーンオイル、大豆油、落花生油、蜜蝋、および／またはパーム核油が挙げられるが、これに限定されるものではない。代表的界面活性剤としては、クレモフォール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリエチレングリコール、トランスクトール、カプムル（Ｃａｐｍｕｌ）（登録商標）、ラブラソール、ミリスチン酸イソプロピル、および／またはスパン（Ｓｐａｎ）８０が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、懸濁液は、エタノール、グリセロールおよび／またはプロピレングリコールを含むが、これに限定されるものではない、共溶媒を含んでなってもよい。
【０５６９】
懸濁液は、最初に、ポリヌクレオチド水溶液と、１つまたは複数の界面活性剤を含んでなる油性相とを含んでなる、ポリヌクレオチド製剤を調製することで、形成されてもよい。懸濁液形成は、２つの相（水性および油性）の混合の結果として起こる。いくつかの実施形態では、このような懸濁液が水相に送達されて、水中油型エマルションが形成されてもよい。いくつかの実施形態では、懸濁液の水相への送達は、水中油型エマルションの形成をもたらし、その中でポリヌクレオチドを含んでなる油性相は、ナノメートルサイズの小滴から、マイクロメートルサイズの小滴に至るサイズであってもよい小滴を形成する。いくつかの実施形態では、油、界面活性剤、共界面活性剤および／または共溶媒の特定の組み合わが利用されて、ポリヌクレオチドが油相中に懸濁されてもよく、および／または水性環境内への送達時に、水中油型エマルションが形成されてもよい。
【０５７０】
いくつかの実施形態では、懸濁液は、周囲環境内へのポリヌクレオチドの放出調節を提供してもよい。このような実施形態では、ポリヌクレオチド放出は、水不混和性デポーからの拡散と、それに続く周囲環境（例えば水性環境）内への再可溶化によって調節されてもよい。
【０５７１】
いくつかの実施形態では、水不混和性デポー内のポリヌクレオチド（例えば、油相内に懸濁される）は、ポリヌクレオチド安定性の変化（例えばヌクレアーゼによる分解の変化）をもたらしてもよい。
【０５７２】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、注射時に（例えば水相への送達時に）、エマルションが自然発生的に形成されるように、製剤化されてもよい。このような粒子形成は、油相から水相へのポリヌクレオチド放出のために、体積に対して高い表面積比を提供してもよい。
【０５７３】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，４９６，９４５号明細書に記載されるナノエマルションなどであるが
、これに限定されるものではない、ナノエマルションに製剤化されてもよい。ナノエマルションは、本明細書に記載されるナノ粒子を含んでなってもよい。非限定的例として、ナノ粒子は、脂質または界面活性剤層で取り囲まれてもよく、またはそれで被覆されてもよい、液体疎水性コアを含んでなってもよい。脂質または界面活性剤層は、少なくとも１つの膜組み込みペプチドを含んでなってもよく、また標的化リガンドを含んでなってもよい（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，４９６，９４５号明細書を参照されたい）。
【０５７４】
カチオンおよびア二オン
本明細書で開示されるポリヌクレオチド製剤は、カチオンまたはア二オンを含んでもよい。一実施形態では、製剤は、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｇ＋、およびそれらの組み合わせなどであるが、これに限定されるものではない、金属カチオンを含む。非限定的例として、製剤は、金属カチオンと複合体化されたポリマーおよびポリヌクレオチドを含んでもよい。（例えば、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第６，２６５，３８９号明細書および米国特許第６，５５５，５２５号明細書を参照されたい）。
【０５７５】
いくつかの実施形態では、二価および一価カチオンの組み合わせを含んでなるカチオン性ナノ粒子は、ポリヌクレオチドと共に製剤化されてもよい。このようなナノ粒子は、所定時間（例えば、数時間、数日間など）にわたり、溶液中で自然発生的に形成してもよい。このようなナノ粒子は、二価のカチオン単独の存在下で、または一価カチオン単独の存在下で形成しない。カチオン性ナノ粒子中の、またはカチオン性ナノ粒子を含んでなる１つまたは複数のデポー中の、ポリヌクレオチドの送達は、長時間作用型デポーとして作用することで、および／またはヌクレアーゼによる分解速度を低下させることで、ポリヌクレオチドの生物学的利用能を改善してもよい。
【０５７６】
成形ナノ粒子および微粒子
本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、ナノ粒子および／または微粒子に製剤化されてもよい。これらのナノ粒子および／または微粒子は、任意のサイズ、形状、および化学的性質に成形されてもよい。一例として、ナノ粒子および／または微粒子は、ノースカロライナ州モリスビル（Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＣ）のリキダ・テクノロジーズ（ＬＩＱＵＩＤＡ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）（登録商標）によるプリント（ＰＲＩＮＴ）（登録商標）技術を使用して製造されてもよい（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２００７０２４３２３号パンフレットを参照されたい）。
【０５７７】
一実施形態では、成形ナノ粒子は、本明細書で開示されるポリヌクレオチドコアと、ポリマーシェルとを含んでなってもよい。ポリマーシェルは、本明細書に記載され、当該技術分野で公知のポリマーのいずれであってもよい。追加的な実施形態では、ポリマーシェルが使用されて、ポリヌクレオチドがコア内で保護されてもよい。
【０５７８】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、微粒子に製剤化されてもよい。微粒子は、ポリヌクレオチドのコアと、生体適合性および／または生分解性ポリマーのコルテキスト（ｃｏｒｔｅｘｔ）とを含有してもよい。非限定的例として、本発明と共に使用されてもよい微粒子は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，４６０，７０９号明細書、米国特許公報第２０１３０１２９８３０号明細書、および国際公開第２０１３０７５０６８号パンフレットに記載されるものであってもよい。別の非限定的例として、微粒子は、所望の時間にわたり本発明のポリヌクレオチドの放出を延長するように、設計されてもよい。（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許公報第２０１３０１２９８３０号明細書における治療用タンパク質の持続放出を参照されたい）。
【０５７９】
本発明と共に使用される微粒子は、少なくとも１ミクロンから少なくとも１００ミクロン（例えば、少なくとも１ミクロン、少なくとも５ミクロン、少なくとも１０ミクロン、少なくとも１５ミクロン、少なくとも２０ミクロン、少なくとも２５ミクロン、少なくとも３０ミクロン、少なくとも３５ミクロン、少なくとも４０ミクロン、少なくとも４５ミクロン、少なくとも５０ミクロン、少なくとも５５ミクロン、少なくとも６０ミクロン、少なくとも６５ミクロン、少なくとも７０ミクロン、少なくとも７５ミクロン、少なくとも８０ミクロン、少なくとも８５ミクロン、少なくとも９０ミクロン、少なくとも９５ミクロン、少なくとも９７ミクロン、少なくとも９９ミクロン、および少なくとも１００ミクロン）の直径を有してもよい。
【０５８０】
ナノジャケットおよびナノリポソーム
本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、ペンシルベニア州ステートカレッジ（Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，ＰＡ）のキーストーン・ナノ（Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｎａｎｏ）によって、ナノジャケットおよびナノリポソームに製剤化されてもよい。ナノジャケットは、カルシウム、リン酸塩を含む体内で天然に見られる化合物からできており、小量のケイ酸塩もまた含んでもよい。ナノジャケットは、サイズが５〜５０ｎｍの範囲であってもよく、ポリヌクレオチドなどであるが、これに限定されるものではない、親水性および疎水性化合物を送達するのに使用されてもよい。
【０５８１】
ナノリポソームは、体内で天然に生じる脂質などであるが、これに限定されるものではない、脂質からできている。ナノリポソームは、サイズが６０〜８０ｎｍの範囲であってもよく、ポリヌクレオチドなどであるが、これに限定されるものではない、親水性および疎水性化合物を送達するのに使用されてもよい。一態様では、本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、セラミドナノリポソームなどであるが、これに限定されるものではない、ナノリポソームに製剤化される。
【０５８２】
偽ウイルス粒子
一実施形態では、本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、偽ウイルス粒子（例えば、偽ウイルス粒子）に製剤化されてもよい。非限定的例として、偽ウイルス粒子は、マサチューセッツ州ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）のアウラ・バイオサイエンシズ（Ａｕｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって開発されたもの、および／またはそれによって記載されるものであってもよい。一態様では、偽ウイルス粒子は、ケラチノサイトおよび基底膜に薬剤を送達するために開発されてもよい（例えば、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３００１２４５０号明細書、米国特許出願公開第２０１３００１２５６６号明細書、米国特許出願公開第２１０３００１２４２６号明細書、および米国特許出願公開第２０１２０２０７８４０号明細書、および国際公開第２０１３００９７１７号パンフレットを参照されたい）。
【０５８３】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドを送達するのに使用される偽ウイルス粒子は、ヘルペスおよび乳頭腫ウイルスなどであるが、これに限定されるものではない、ウイルスに由来してもよい（例えば、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３００１２４５０号明細書、米国特許出願公開第２０１３００１２５６６号明細書、米国特許出願公開第２１０３００１２４２６号明細書、および米国特許出願公開第２０１２０２０７８４０号明細書、および国際公開第２０１３００９７１７号パンフレット；およびそれぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、マー（Ｍａ）ら著、「ＤＮＡ送達ビヒクルとしてのＨＰＶ偽ウイルス粒子（ＨＰＶ  ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｉｏｎｓ  ａｓ  ＤＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅｓ）」、セラピューティック・デリバリー（Ｔｈｅｒ  Ｄｅｌｉｖ．）、２０１１年、第２巻、第４号、ｐ４２７〜４３０；キンズ（Ｋｉｎｅｓ）ら著、「細胞表面結合前に基底膜に起こ
るパピローマウイルス感染に至る初期段階（Ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｓｔｅｐｓ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｃｃｕｒ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｉｏｒ  ｔｏ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、２００９年、第１０６巻、第４８号、ｐ２０４５８〜２０４６３；ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）ら著、「マウスモデルにおけるＨＰＶの生殖器伝染はノノキシノール−９によって増強されカラギーナンによって阻害される（Ｇｅｎｉｔａｌ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＰＶ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｉｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｎｏｎｏｘｙｎｏｌ−９  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ）」、ネイチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）２００７年、第１３巻、第７号、Ｐ８５７〜８６１；ゴードン（Ｇｏｒｄｏｎ）ら著、「ＳＩＶ  ＤＮＡを送達するヒトパピローマウイルスプセデュドビリオン（Ｐｓｅｄｕｄｏｖｉｒｉｏｎ）ワクチンによる膣粘膜の標的化（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｖａｇｉｎａｌ  Ｍｕｃｏｓａ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｐｓｅｄｕｄｏｖｉｒｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ  ＳＩＶ  ＤＮＡ）」、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、２０１２年、第１８８巻、第２号、ｐ７１４〜７２３；クブル（Ｃｕｂｕｒｕ）ら著、「ＨＰＶベクターによる膣内免疫は組織常駐ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導する（Ｉｎｔｒａｖａｇｉｎａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＨＰＶ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｉｓｓｕｅ−ｒｅｓｉｄｅｎｔ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）」、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）、２０１２年、第１２２巻、第１２号、ｐ４６０６〜４６２０；ハング（Ｈｕｎｇ）ら著、「ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を保有するＨＰＶ−１６プセデュドビリオン（Ｐｓｅｄｕｄｏｖｉｒｉｏｎ）を使用した卵巣がん遺伝子治療（Ｏｖａｒｉａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｕｓｉｎｇ  ＨＰＶ−１６  Ｐｓｅｄｕｄｏｖｉｒｉｏｎ  Ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ＨＳＶ−ｔｋ  Ｇｅｎｅ）」、プロス・ワン（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ）、２０１２年、第７巻、第７号、ｅ４０９８３；ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）ら著、「ヒトパピローマウイルスによる雌マウス生殖管への付着と感染におけるヘパラン硫酸の役割（Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｈｅｐａｒａｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  ｉｎ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｔｏ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｆｅｍａｌ  Ｇｅｎｉｔａｌ  Ｔｒａｃｔ  ｂｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）」、ジャーナル・オブ・ヴィロロジー（Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、２００９年、第８３巻、第５号、ｐ２０６７〜２０７４を参照されたい）。
【０５８４】
偽ウイルス粒子は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１２００１５８９９号明細書および米国特許出願公開第２０１３０１７７５８７号明細書、および国際公開第２０１００４７８３９号パンフレット、国際公開第２０１３１１６６５６号パンフレット、国際公開第２０１３１０６５２５号パンフレット、および国際公開第２０１３１２２２６２号パンフレットに記載される方法によって調製されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）であってもよい。一態様では、ＶＬＰは、バクテリオファージであるＭＳ、Ｑβ、Ｒ１７、ｆｒ、ＧＡ、Ｓｐ、ＭＩ、Ｉ、ＭＸＩ、ＮＬ９５、ＡＰ２０５、ｆ２、ＰＰ７；および植物ウイルスであるカブクリンクルウイルス（ＴＣＶ：Ｔｕｒｎｉｐ  ｃｒｉｎｋｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、トマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ：Ｔｏｍａｔｏ  ｂｕｓｈｙ  ｓｔｕｎｔ  ｖｉｒｕｓ）、インゲンマメ南部モザイクウイルス（ＳＢＭＶ：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｅａｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）；およびソラマメモットルウイルス、ブロムモザイクウイルス、カシアイエローブロッチウイルス、ササゲクロロティックモットルウイルス（ＣＣＭＶ：Ｃｏｗｐｅａ  ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、メランドリウムイエローフレックウイルス、およびクレイトニア潜伏ウイルスを含む、ブロモウイルス属（Ｂｒｏｍｏｖｉｒｕｓ）のメンバーであってもよいが、これに限定されるものではない。別の態様では、ＶＬＰは、それ
ぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１７７５８７号明細書または米国特許第８，５０６，９６７号明細書に記載されるようなインフルエンザウイルスに由来してもよい。さらに別の態様では、ＶＬＰは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３１１６６５６号パンフレットに記載されるような、脂質膜に、または粒子外部にアンカーされる、Ｂ７−１および／またはＢ７−２分子を含んでなってもよい。一態様では、ＶＬＰは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１２０４９３６６号パンフレットに記載されるＶＬＰなどの、ノロウイルス、ロタウイルス組換えＶＰ６タンパク質または二層ＶＰ２／ＶＰ６に由来してもよい。
【０５８５】
偽ウイルス粒子は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１０１２０２６６号パンフレット、および米国特許出願公開第２０１２０１７１２９０号明細書；およびそれぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、マー（Ｍａ）ら著、「ＤＮＡ送達ビヒクルとしてのＨＰＶ偽ウイルス粒子（ＨＰＶ  ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｉｏｎｓ  ａｓ  ＤＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅｓ）」、セラピューティック・デリバリー（Ｔｈｅｒ  Ｄｅｌｉｖ．）、２０１１年、第２巻、第４号、ｐ４２７〜４３０；キンズ（Ｋｉｎｅｓ）ら著、「細胞表面結合前に基底膜に起こるパピローマウイルス感染に至る初期段階（Ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｓｔｅｐｓ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｃｃｕｒ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｉｏｒ  ｔｏ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、２００９年、第１０６巻、第４８号、ｐ２０４５８〜２０４６３；ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）ら著、「マウスモデルにおけるＨＰＶの生殖器伝染はノノキシノール−９によって増強されカラギーナンによって阻害される（Ｇｅｎｉｔａｌ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＰＶ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｉｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｎｏｎｏｘｙｎｏｌ−９  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ）」、ネイチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、２００７年、第１３巻、第７号、Ｐ８５７〜８６１；ゴードン（Ｇｏｒｄｏｎ）ら著、「ＳＩＶ  ＤＮＡを送達するヒトパピローマウイルスプセデュドビリオン（Ｐｓｅｄｕｄｏｖｉｒｉｏｎ）ワクチンによる膣粘膜の標的化（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｖａｇｉｎａｌ  Ｍｕｃｏｓａ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｐｓｅｄｕｄｏｖｉｒｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ  ＳＩＶ  ＤＮＡ）」、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、２０１２年、第１８８巻、第２号、ｐ７１４〜７２３；クブル（Ｃｕｂｕｒｕ）ら著、「ＨＰＶベクターによる膣内免疫は組織常駐ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導する（Ｉｎｔｒａｖａｇｉｎａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ
ＨＰＶ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｉｓｓｕｅ−ｒｅｓｉｄｅｎｔ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）」、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）、２０１２年、第１２２巻、第１２号、ｐ４６０６〜４６２０；ハング（Ｈｕｎｇ）ら著、「ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を保有するＨＰＶ−１６プセデュドビリオン（Ｐｓｅｄｕｄｏｖｉｒｉｏｎ）を使用した卵巣がん遺伝子治療（Ｏｖａｒｉａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｕｓｉｎｇ  ＨＰＶ−１６  Ｐｓｅｄｕｄｏｖｉｒｉｏｎ  Ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ＨＳＶ−ｔｋ  Ｇｅｎｅ）」、プロス・ワン（ＰＬｏＳ
ＯＮＥ）、２０１２年、第７巻、第７号、ｅ４０９８３；ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）ら著、「ヒトパピローマウイルスによる雌マウス生殖管への付着と感染におけるヘパラン硫酸の役割（Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｈｅｐａｒａｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  ｉｎ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｔｏ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｆｅｍａｌ  Ｇｅｎｉｔａｌ  Ｔｒａｃｔ  ｂｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）」、ジャーナル・オブ・ヴィロロジー（Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、２００９年、第８３巻、第５号、ｐ２０６７〜２０７４に記載されるものなどであるが、これに限定されるもの
ではない、ヒト乳頭腫ウイルス様粒子であってもよい。
【０５８６】
一態様では、偽ウイルス粒子は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１１６４０８号明細書、および米国特許出願公開第２０１３０１１５２４７号明細書に記載されるものなどであるが、これに限定されるものではない、ビリオン由来ナノ粒子であってもよい。非限定的例として、ビリオン由来ナノ粒子が使用されて、がん治療のためにおよび／または免疫系の腫瘍認識を促進するのに使用されてもよい、ポリヌクレオチドが送達されてもよい。非限定的例として、薬剤を少なくとも１つの腫瘍に選択的に送達してもよいビリオン由来ナノ粒子は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３１１９８７７号パンフレットに記載される乳頭腫由来粒子であってもよい。ビリオン由来ナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１１６４０８号明細書、および米国特許出願公開第２０１３０１１５２４７号明細書、または国際公開第２０１３１１９８７７号パンフレットに記載される方法によって製造されてもよい。
【０５８７】
一実施形態では、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、自己組織化粒子であってもよい。自己組織化ＶＬＰおよび自己組織化ＶＬＰを製造する方法の非限定的例は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３１２２２６２号パンフレットに記載される。
【０５８８】
ミニセル
一態様では、ポリヌクレオチドは、細菌ミニセルに製剤化されてもよい。非限定的例として、細菌ミニセルは、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０８８２５０号パンフレットまたは米国特許出願公開第２０１３０１７７４９９号明細書に記載されるものであってもよい。本明細書に記載されるポリヌクレオチドなどの治療薬を含んでなる細菌ミニセルは、脳腫瘍に治療薬を送達するのに使用されてもよい。
【０５８９】
半固体組成物
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、疎水性マトリックスと共に製剤化されて、半固体組成物が形成れてもよい。非限定的例として、半固体組成物またはペースト様組成物は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０７６０４号パンフレットに記載される方法によって製造されてもよい。半固体組成物は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０７６０４号パンフレットに記載されるような徐放性製剤であってもよい。
【０５９０】
別の実施形態では、半固体組成物は、組成物周囲に形成される、微孔質膜または生分解性ポリマーをさらに有してもよい（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０７６０４号パンフレットを参照されたい）。
【０５９１】
本発明のポリヌクレオチドを使用する半固体組成物は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０７６０４号パンフレットに記載されるような半固体混合物の特徴を有してもよい（例えば、少なくとも１０−４Ｎ・ｍｍ−２の弾性係数、および／または少なくとも１００ｍＰａ・ｓの粘度）。
【０５９２】
エキソソーム
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、エキソソームに製剤化されてもよい。エキソソームには、少なくとも１つのポリヌクレオチドが装入されて、細胞、組織および／または生物に送達されてもよい。非限定的例として、ポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０８４０００号パンフレットに記載さ
れるエキソソームに装入されてもよい。
【０５９３】
シルクベースの送達
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、持続性放出シルクベース送達システムに製剤化されてもよい。シルクベース送達システムは、シルクフィブロイン溶液と、本明細書に記載される、および／または当該技術分野で公知のポリヌクレオチドなどであるが、これに限定されるものではない、治療薬とを接触させることで、形成されてもよい。非限定的例として、本発明で使用されてもよい持続性放出シルクベース送達システム、およびこのようなシステムを製造する方法は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０１７７６１１号明細書に記載される。
【０５９４】
微粒子
一実施形態では、ポリヌクレオチドを含んでなる製剤は、微粒子を含んでなってもよい。微粒子は、本明細書に記載されるポリマー、および／またはポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステルおよびポリ酸無水物などであるが、これに限定されるものではない、当該技術分野で公知のポリマーを含んでなってもよい。微粒子は、吸着材表面を有して、ポリヌクレオチドなどの生物活性分子を吸着してもよい。非限定的例として本発明と共に使用される微粒子、および微粒子を製造する方法は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３１９５９２３号明細書および米国特許出願公開第２０１３０１９５８９８号明細書、および米国特許第８，３０９，１３９号明細書および米国特許第８，２０６，７４９号明細書に記載される。
【０５９５】
別の実施形態では、製剤は、微粒子およびポリヌクレオチドを含んでなる、マイクロエマルションであってもよい。非限定的例として、微粒子を含んでなるマイクロエマルションは、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３１９５９２３号明細書および米国特許出願公開第２０１３０１９５８９８号明細書、および米国特許第８，３０９，１３９号明細書および米国特許第８，２０６，７４９号明細書に記載される。
【０５９６】
アミノ酸脂質
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、アミノ酸脂質に製剤化されてもよい。アミノ酸脂質は、アミノ酸残基および１つまたは複数の親油性テールを含んでなる、親油性化合物である。アミノ酸脂質およびアミノ酸脂質を製造する方法の非限定的例は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，５０１，８２４号明細書に記載される。
【０５９７】
一実施形態では、アミノ酸脂質は、親水性部分および親油性部分を有する。親水性部分は、アミノ酸残基であってもよく、親油性部分は、少なくとも１つの親油性テールを含んでなってもよい。
【０５９８】
一実施形態では、アミノ酸脂質製剤は、対象にポリヌクレオチドを送達するのに使用されてもよい。
別の実施形態では、アミノ酸脂質製剤は、ポリヌクレオチドに結合して、それを放出する、アミノ酸脂質を含んでなる、放出可能形態でポリヌクレオチドを送達してもよい。非限定的例として、ポリヌクレオチドの放出は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第７，０９８，０３２号明細書、米国特許第６，８９７，１９６号明細書、米国特許第６，４２６，０８６号明細書、米国特許第７，１３８，３８２号明細書、米国特許第５，５６３，２５０号明細書、および米国特許第５，５０５，９３１号明細書に記載されるものなどであるが、これに限定されるものではない、酸不安定性リ
ンカーによって提供されてもよい。
【０５９９】
微小胞
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、微小胞に製剤化されてもよい。微小胞の非限定的例としては、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３０２０９５４４号明細書に記載されるものが挙げられる。
【０６００】
一実施形態では、微小胞は、ＡＲＲＤＣ１媒介微小胞（ＡＲＭＭ：ＡＲＲＤＣ１−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｖｅｒｓｉｃｌｅ）である。ＡＲＭＭおよびＡＲＭＭを製造する方法の非限定的例は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３１１９６０２号パンフレットに記載される。
【０６０１】
高分子電解質間複合体
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、高分子電解質間複合体に製剤化されてもよい。高分子電解質間複合体は、電荷動的高分子が、１つまたは複数のアニオン性分子と複合体化すると形成される。電荷動的高分子および高分子電解質間複合体および高分子電解質間複合体を製造する方法の非限定的例は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，５２４，３６８号明細書に記載される。
【０６０２】
シルスタリン（Ｃｙｒｓｔａｌｌｉｎｅ）高分子システム
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、結晶性高分子システムに製剤化されてもよい。結晶性高分子システムは、結晶性部分、および／または結晶性部分を含んでなる末端単位がある、ポリマーである。「ＣＹＣポリマー」結晶性ポリマーシステムと称される、結晶性部分、および／または結晶性部分を含んでなる末端単位があるポリマー、およびこのようなポリマーおよびシステムを製造する方法の非限定的例は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，５２４，２５９号明細書に記載される。
【０６０３】
賦形剤
医薬製剤は、本明細書の用法では、所望される特定の投与形態に適する、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、希釈剤、またはその他の液体ビヒクル、分散体または懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存料、固体バインダー、潤滑剤、着香剤、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調節剤、ｐＨ調節剤などを含むが、これに限定されるものではない、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含んでなってもよい。医薬組成物を製剤化するための様々な賦形剤および組成物を調製する技術は、当該技術分野で公知である（その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ａ．Ｒ．ジェナーロ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）著、レミントン：調剤の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）、第２１版、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）、メリーランド州ボルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）、２００６年を参照されたい）。任意の従来の賦形剤媒体が、任意の望ましくない生物学的効果の発生、またはさもなければ医薬組成物の任意のその他の成分との有害な方法での相互作用などによって、物質またはその誘導体と不適合である場合を除き、従来の賦形剤媒体の使用は、本開示の範囲内で検討されてもよく、その使用は、本発明の範囲内で検討される。
【０６０４】
いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋であってもよい。いくつかの実施形態では、賦形剤は、ヒト用途および獣医学用途のために認可される。いくつかの実施形態では、賦形剤は、米国食品医薬品局によって認可されてもよい。いくつかの実施形態では、賦形剤は、製薬等級であってもよい。いくつかの実施形態では、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ：Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｐｏｅｉａ）、欧州薬局方（ＥＰ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）、英国薬局方、および／または国際薬局方の標準規格を満たしてもよい。
【０６０５】
医薬組成物の製造で使用される薬学的に許容可能な賦形剤としては、不活性希釈剤、分散剤および／または顆粒化剤、表面活性剤および／または乳化剤、崩壊剤、結合剤、保存料、緩衝剤、平滑剤、および／または油が挙げられるが、これに限定されるものではない。このような賦形剤は、医薬組成物に任意選択的に包含されてもよい。組成物は、カカオ脂および坐薬ワックス、着色剤、コート剤、甘味剤、着香料、および／または芳香剤などの賦形剤もまた含んでもよい。
【０６０６】
代表的希釈剤としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム乳糖、スクロース、セルロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉砂糖など、および／またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０６０７】
代表的顆粒化剤および／または分散剤としては、ジャガイモデンプン、コーンスターチ、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーガム、柑橘類パルプ、寒天、ベントナイト、セルロースおよび木材製品、天然スポンジ、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニル−ピロリドン）（クロスポビドン）、ナトリウムカルボキシメチルデンプン（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、メチルセルロース、α化デンプン（デンプン１５００）、微結晶性デンプン、水不溶性デンプン、カルシウムカルボキシメチルセルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ビーガム（ＶＥＥＧＵＭ）（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウム、第四級アンモニウム化合物など、および／またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０６０８】
代表的表面活性剤および／または乳化剤としては、天然乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドルクス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、およびレシチン）、コロイド粘土（例えば、ベントナイト［ケイ酸アルミニウム］およびビーガム（ＶＥＥＧＵＭ）（登録商標）［ケイ酸アルミニウムマグネシウム］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、トリアセチンモノステアリン酸、ジステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸グリセリル、およびモノステアリン酸プロピレングリコール、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、およびカルボキシビニルポリマー）、カラゲナン、セルロース系誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル；（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート［ツイーン（ＴＷＥＥＮ）（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［ツイーン（ＴＷＥＥＮ）（登録商標）６０］、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸［ツイーン（ＴＷＥＥＮ）（登録商標）８０］、ソルビタンモノパルミテート［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）４０］、モノステアリン酸ソルビタン［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）６０］、ソルビタントリステアレート［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）６５］、グリセリルモノオレイン酸、ソルビタンモノオレイン酸［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えば、ポリオキシエチレンモノステアリン酸［ミルジ（ＭＹＲＪ）（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシ化ヒマシ油、ポリオキシメチレ
ンステアリン酸、およびソルトール（ＳＯＬＵＴＯＬ）（登録商標））、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、（例えばクレモフォア（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ）（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル、（例えばポリオキシエチレンラウリルエーテル［ブリジ（ＢＲＩＪ）（登録商標）３０］）、ポリ（ビニル−ピロリドン）、ジエチレングリコールモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、エチルラウレート、ラウリル硫酸ナトリウム、プルオリンク（ＰＬＵＯＲＩＮＣ）（登録商標）Ｆ６８、ポロキサマー（ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ）（登録商標）１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドキュセートナトリウムなど、および／またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０６０９】
代表的結合剤としては、デンプン（例えばコーンスターチおよびデンプンペースト）；ゼラチン；糖（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、乳糖、ラクチトール、マンニトール）；アミノ酸（例えばグリシン）；天然および合成ガム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュモス抽出物、パンワールガム、ガッチガム、イサポール穀皮粘液剤、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶セルロース、酢酸セルロース、ポリ（ビニル−ピロリドン）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ビーガム（ＶＥＥＧＵＭ）（登録商標））、およびカラマツアラボガラクタン）；アルギン酸塩；ポリエチレンオキシド；ポリエチレングリコール；無機カルシウム塩；ケイ酸；ポリメタクリレート；ワックス；水；アルコールなど、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０６１０】
代表的保存料としては、抗酸化剤、キレート化剤、抗菌性保存料、抗真菌性保存料、アルコール保存料、酸性保存料、および／またはその他の保存料が挙げられるが、これに限定されるものではない。酸化は、ｍＲＮＡ特に液体ｍＲＮＡ製剤の可能な分解経路である。酸化を防止するために、製剤に抗酸化剤が添加され得る。代表的抗酸化剤としては、αトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アコルビル（ａｃｏｒｂｙｌ）、ベンジルアルコール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ＥＤＴＡ、Ｍ−クレゾール、メチオニン、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオグリセロールおよび／または亜硫酸ナトリウムが挙げられるが、これに限定されるものではない。代表的キレート化剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、ナトリウムエデト酸、酒石酸、および／またはエデト酸三ナトリウムが挙げられる。代表的抗菌性保存料としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、および／またはチメロサールが挙げられるが、これに限定されるものではない。代表的抗真菌性保存料としては、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、ナトリウムプロピオネート、および／またはソルビン酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。代表的アルコール保存料としては、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシベンゾエート、および／またはフェニルエチルアルコールが挙げられるが、これに限定されるものではない。代表的酸性保存料としては、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、β−カロテン、クエン酸、酢酸、デヒドロ酢酸、アスコルビン
酸、ソルビン酸、および／またはフィチン酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。その他保存料としては、トコフェロール、酢酸トコフェロール、メシル酸デテロキシム、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエネド（ｈｙｄｒｏｘｙｔｏｌｕｅｎｅｄ）（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、グリダント・プラス（ＧＬＹＤＡＮＴＰＬＵＳ）（登録商標）、フェノニップ（ＰＨＥＮＯＮＩＰ）（（登録商標）、メチルパラベン、ジャーマール（ＧＥＲＭＡＬＬ）（登録商標）１１５、ジャーマベン（ＧＥＲＭＡＢＥＮ）（登録商標）ＩＩ、ネオロン（ＮＥＯＬＯＮＥ）（商標）、カトン（ＫＡＴＨＯＮ）（商標）、および／またはユーキシル（ＥＵＸＹＬ）（登録商標）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０６１１】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド溶液のｐＨがｐＨ５からｐＨ８に保たれて、安定性が改善される。ｐＨを調節するための代表的緩衝液としては、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、ヒスチジン（またはヒスチジンＨＣｌ）、炭酸ナトリウム、および／またはリンゴ酸ナトリウムが挙げられるが、これに限定されるものではない。別の実施形態では、上に列挙した代表的緩衝液が、（カリウムを含むが、これに限定されるものではない）追加的な一価の対イオンと共に使用されてもよい。二価のカチオンもまた、緩衝液対イオンとして使用されてもよい；しかし、これらは、錯体形成および／またはｍＲＮＡ分解のために好ましくない。
【０６１２】
代表的緩衝剤としては、クエン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、リン酸緩衝溶液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン、Ｄ−グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、第二リン酸カルシウム、リン酸、三塩基性リン酸カルシウム、水酸化リン酸カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、二塩基性リン酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、塩基性リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、発熱性物質非含有水、等張生理食塩水、リンゲル液、エチルアルコールなど、および／またはそれらの組み合わせも挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０６１３】
代表的平滑剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、滑石、麦芽、グリセリルベハナート（ｂｅｈａｎａｔｅ）、水素化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムなど、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０６１４】
代表的油としては、アーモンド、アプリコット穀粒、アボカド、ババス、ベルガモット、ブラックカレント（ｂｌａｃｋ  ｃｕｒｒｅｎｔ）種子、ルリヂサ、カデ、カモミール、キャノーラ、ヒメウイキョウ、カルナウバ、ヒマシ油、シナモン、カカオ脂、ココナツ、タラ肝、コーヒ、トウモロコシ、綿実、エミュー、ユーカリノキ、月見草、魚、亜麻仁、ゲラニオール、ヒョウタン、ブドウ種子、ヘーゼルナッツ、ヤナギハッカ、ミリスチン酸イソプロピル、ホホバ、ククイナッツ、ラバンジン、ラベンダー、レモン、リツェアクベバ、マカデミア（ｍａｃａｄｅｍｉａ）ナッツ、ゼニアオイ、マンゴー種子、メドウフォーム種子、ミンク、ナツメグ、オリーブ、オレンジ、オレンジラフィー、パーム、パーム核、モモ穀粒、落花生、ケシの実、カボチャ種子、ナタネ、米糠、ローズマリー、紅花、ビャクダン、サスクアナ（ｓａｓｑｕａｎａ）、セイボリー、シーバックソーン、ゴマ
、シアバター、シリコーン、大豆、ヒマワリ、ティーツリー、アザミ、ツバキ、ベチベル、クルミ、およびコムギ胚芽油が挙げられるが、これに限定されるものではない。代表的油としては、ステアリン酸ブチル、カプリルトリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコン３６０、ミリスチン酸イソプロピル、鉱物油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油、および／またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０６１５】
配合者の判断次第で、カカオ脂および坐薬ワックス、着色剤、コート剤、甘味剤、着香料、および／または芳香剤などの賦形剤が、組成物中に存在し得る。
代表的添加剤としては、生理学的生体適合性緩衝液（例えば、トリメチルアミン塩酸塩）、錯化剤の付加（例えば、ＤＴＰＡまたはＤＴＰＡ−ビスアミドなどの）またはカルシウムキレート錯体（例えばカルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミドとして）、または任意選択的にカルシウム塩またはナトリウム塩の付加（例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウムまたは乳酸カルシウム）が挙げられる。さらに、抗酸化剤および懸濁剤も使用され得る。
【０６１６】
ｍＲＮＡのための抗凍結剤
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド製剤は、シロプロテクタント（ｃｙｒｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を含んでなってもよい。本明細書の用法では、用語「抗凍結剤」は、所与の物質と組み合わされると、凍結時に起こる物質に対する障害を低下させまたは排除するのを促進する１つまたは複数の薬剤を指す。いくつかの実施形態では、抗凍結剤は、凍結中にポリヌクレオチドを安定化させるために、それらと組み合わされる。−２０℃〜−８０℃におけるｍＲＮＡの冷凍貯蔵は、ポリヌクレオチドの長期間（例えば３６ヶ月間）安定性にとって有利であってもよい。いくつかの実施形態では、抗凍結剤がポリヌクレオチド製剤に包含されて、凍結／解凍サイクルを通じた、および冷凍貯蔵条件下でのポリヌクレオチドが安定化される。本発明の抗凍結剤としては、スクロース、トレハロース、乳糖、グリセロール、デキストロース、ラフィノースおよび／またはマンニトールが挙げられるが、これに限定されるものではない。トレハロースは、米国食品医薬品局によって、一般的に安全とみなされている（ＧＲＡＳ）として記載され、一般に商業的医薬製剤で使用される。
【０６１７】
増量剤
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド製剤は、増量剤を含んでなってもよい。本明細書の用法では、「増量剤」という用語は、製剤に包含されて、製剤に、所望の粘稠度および／または製剤成分安定化を与える、１つまたは複数の薬剤を指す。いくつかの実施形態では、増量剤が凍結乾燥ポリヌクレオチド製剤に包含されて、「薬理的にエレガントな」ケークをもたらし、長期間（例えば３６ヶ月間）にわたる保存し中に、凍結乾燥ポリヌクレオチドを安定化する。本発明の増量剤としては、スクロース、トレハロース、マンニトール、グリシン、乳糖および／またはラフィノースが挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、抗凍結剤と増量剤組み合わせ（例えば、スクロース／グリシンまたはトレハロース／マンニトール）が包含されて、ポリヌクレオチドを凍結中に安定化し、凍結乾燥のための増量剤もまた提供してもよい。
【０６１８】
本発明のポリヌクレオチド製剤および製剤化方法の非限定的例は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、２０１２年１２月に１４日に出願された、国際公開第２０１３０９０６４８号パンフレットでもまた提供される。
【０６１９】
不活性成分
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド製剤は、不活性成分である少なくとも１つの賦形剤を含んでなってもよい。本明細書の用法では、用語「不活性成分」は、製剤に包
含される１つまたは複数の不活性剤を指す。いくつかの実施形態では、本発明の製剤で使用されてもよい不活性成分の全て、皆無または一部は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ：Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）により認可されてもよい。不活性成分および不活性成分が製剤化されてもよい投与経路の非総記的一覧は、同時係属国際出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０２７０７７号明細書（代理人整理番号Ｍ０３０）の表４に記載される。
【０６２０】
送達
本開示は、薬物送達の科学における有望な進歩を勘案した、任意の適切な手段による、治療、製薬、診断またはイメージングのいずれかのためのポリヌクレオチドの送達を包含する。送達は、ネイキッドまたは製剤化送達であってもよい。
【０６２１】
ネイキッド送達
本発明のポリヌクレオチドは、細胞にネイキッドで送達されてもよい。本明細書の用法では、「ネイキッド」は、形質移入を促進する薬剤を含まないポリヌクレオチドを送達することを指す。例えば、細胞に送達されるポリヌクレオチドは、修飾を含有しなくてもよい。ネイキッドポリヌクレオチドは、当該技術分野で公知であり、本明細書に記載される、投与経路を使用して、細胞に送達されてもよい。
【０６２２】
製剤化送達
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載される方法を使用して、製剤化されてもよい。製剤は、修飾であってもおよび／または未修飾であってもよい、ポリヌクレオチドを含有してもよい。製剤としては、細胞透過剤、薬学的に許容できる担体、送達剤、生体内分解性または生体適合性ポリマー、溶剤、および持効性送達デポーが挙げられる、これに限定されるものではない。製剤化ポリヌクレオチドは、当該技術分野で公知であり、本明細書に記載される、投与経路を使用して、細胞に送達されてもよい。
【０６２３】
組成物はまた、直接浸漬または水浴；カテーテル経由；ゲル、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、および／またはドロップによる；組成物で被覆または含浸された布帛または生分解性物質などの基材の使用を含むが、これに限定されるものではない、当該技術分野のいくつかの方法のいずれかで、臓器または組織への直接送達のために製剤化されてもよい。
【０６２４】
投与  本発明のポリヌクレオチドは、治療的に有効な成果をもたらす、任意の手段によって投与されてもよい。これらとしては、腸内（腸管内へ）、胃腸部、硬膜外（硬膜内へ）、経口（口を経由する）、経皮、硬膜周囲、大脳内（大脳内へ）、脳室内（脳室内へ）、皮膚上（皮膚上への塗布）、皮内（皮膚自体の中へ）、皮下（皮膚の下）、経鼻投与（鼻を通じて）、静脈内（静脈内へ）、静脈内ボーラス、点滴、動脈内（動脈内へ）、筋肉内（筋肉内へ）、心臓内（心臓内へ）、骨内注入（骨髄内へ）、クモ膜下腔内（脊柱管内へ）、腹腔内（腹膜内への輸液または注射）、膀胱内注入、硝子体内（眼を通じて）、空洞内注射（病的窩洞内へ）、腔内（陰茎基部内へ）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身分布のための無傷の皮膚を通じた拡散）、経粘膜（粘膜を通じた拡散）、経腟、吹送（鼻からの吸引）、舌下、唇下、浣腸、点眼（結膜上へ）、点耳、耳介（耳介内へまたはそれを経由する）、バッカル（頬に向けられた）、結膜、皮膚性、歯性（１つまたは複数の歯へ）、電気浸透、子宮頚、副鼻腔内、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質内、腹腔内、羊水内、関節内、胆管内、気管支内、滑液包内、軟骨内（軟骨内部）、仙骨内（ウマ科の尾内部）、大槽内（小脳延髄槽大槽内部）、角膜内（角膜内部）、歯冠内、冠内（冠動脈内部）、陰茎海綿体内（陰茎の陰核海綿体）の膨張性空隙内部）、椎間板内（椎間板内部）、導管内（腺導管内部）、十二指腸内（十二指腸内部）、硬膜内（硬膜内部または真下）、表皮内（表皮へ）、食道内（食道へ）、胃内（胃内部）、歯肉内（歯肉内部
）、回腸内（小腸遠位部分内部）、病巣内（局在性の病変の内部またはそれへの直接導入）、管腔内（管腔内部）、リンパ管内（リンパ内部）、髄内（骨髄腔内部）、髄膜内（髄膜内部）、眼内（眼内部）、卵巣内（卵巣内部）、心膜内（心膜内部）、胸膜内（胸膜内部）、前立腺内（前立腺腺内部）、肺内（肺またはその気管支内部）、副鼻腔内（鼻洞または眼窩周囲洞内部）、脊髄内（脊柱内部）、滑液嚢内（関節の滑液腔内部）、腱内（腱内部）、精巣内（精巣内部）、クモ膜下腔内（脳脊髄軸の任意のレベルにおける脳脊髄液内部）、胸郭内（胸郭内部）、小管内（臓器細管内部）、腫瘍内（腫瘍内部）、鼓室内（中耳内部）、血管内（１つまたは複数の血管内部）、脳（心）室内（脳（心）室内部）、イオン注入（その中で可溶性塩イオンが身体組織に移動する電流の手段による）、灌注（開放創傷または身体窩洞を浸すまたは洗い流す）、喉頭（喉頭に直接）、鼻腔胃（鼻を通じて胃内に）、密封包帯技術（次に領域を閉鎖する包帯剤によって被覆される局所投与手段）、眼部（外眼部に）、中咽頭（口および咽頭に直接）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜周囲、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器（局所性または全身性効果のための経口または経鼻吸入による気道内部）、眼球後（脳橋背後または眼球背後）、心筋内の（心筋に入る）、軟部組織、クモ膜下、結膜下、粘膜下、局所、経胎盤性（胎盤を通じてまたはそれを越える）、経気管（気管壁を通じて）、経鼓膜（鼓室を越えてまたはそれを通じて）、尿管（尿管へ）、尿道（尿道へ）、膣、仙骨ブロック、診断、神経ブロック、胆管灌流、心臓灌流、フォトフェレーシスまたは脊髄が挙げられるが、これに限定されるものではない。特定の実施形態では、組成物は、それらが、血液脳関門、血管関門、またはその他の上皮性関門を越えられるようにする方法で投与されてもよい。一実施形態では、投与経路のための製剤は、少なくとも１つの不活性成分を含んでもよい。投与経路および特定の投与経路のための製剤に包含されてもよい不活性成分の非限定的例は、表９に示される。表９では、「ＡＮ」は麻酔薬を意味し、「ＣＮＢＬＫ」は頸神経ブロックを意味し、「ＮＢＬＫ」は神経ブロックを意味し、「ＩＶ」は静脈内を意味し、「ＩＭ」は筋肉内を意味し、「ＳＣ」は皮下を意味する。
【０６２５】
【表９−１】
2016538829.tif 000038
【０６２６】
【表９−２】
2016538829.tif 000039
【０６２７】
【表９−３】
2016538829.tif 000040
【０６２８】
【表９−４】
2016538829.tif 000041
【０６２９】
【表９−５】
2016538829.tif 000042
【０６３０】
【表９−６】
2016538829.tif 000043
【０６３１】
【表９−７】
2016538829.tif 000044
【０６３２】
【表９−８】
2016538829.tif 000045
【０６３３】
【表９−９】
2016538829.tif 000046
【０６３４】
【表９−１０】
2016538829.tif 000047
【０６３５】
【表９−１１】
2016538829.tif 000048
【０６３６】
【表９−１２】
2016538829.tif 000049
【０６３７】
【表９−１３】
2016538829.tif 000050
【０６３８】
【表９−１４】
2016538829.tif 000051
【０６３９】
【表９−１５】
2016538829.tif 000052
【０６４０】
【表９−１６】
2016538829.tif 000053
【０６４１】
【表９−１７】
2016538829.tif 000054
【０６４２】
【表９−１８】
2016538829.tif 000055
【０６４３】
本発明のポリヌクレオチドのための非限定的投与経路は、下に記載される。
非経口および注射投与
非経口投与のための液体剤形としては、薬学的に許容可能なエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、および／またはエリキシル剤が挙げられるが、これに限定されるものではない。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば、水またはその他の溶媒；エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、およびそれらの混合物などの可溶化剤および乳化剤などの、当該技術分野で一般に使用される不活性希釈剤を含んでなってもよい。不活性希釈剤に加えて、経口組成物は、湿潤剤、乳化および懸濁剤、甘味剤、着香料、および／または芳香剤などの補助剤を含み得る。非経口投与のため
の特定の実施形態では、組成物は、クレモフォール（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ）（登録商標）、アルコール、油、改質油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはそれらの組み合わせなどの可溶化剤と混合される。
【０６４４】
非経口投与のための医薬組成物は、少なくとも１つの不活性成分を含んでなってもよい。任意のまたは皆無の使用される不活性成分が、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可されていてもよい。非経口投与のための医薬組成物で使用するための不活性成分の非総記的一覧としては、塩酸、マンニトール、窒素、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、および水酸化ナトリウムが挙げられる。
【０６４５】
注射用製剤、例えば、無菌注射用水性または油性懸濁液は、適当な分散剤、湿潤剤、および／または懸濁剤を使用して、公知の技術に従って製剤化されてもよい。無菌注射用製剤は、無毒の非経口的に許容可能な希釈剤および／または溶媒中の、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液としての、無菌注射液、懸濁液、および／またはエマルションであってもよい。用いられてもよい許容できるビヒクルおよび溶媒は、水、米国薬局方リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液である。無菌の不揮発性油が、溶剤または懸濁媒として慣習的に用いられている。この目的で、合成モノまたはジグリセリドを含む、あらゆる無刺激不揮発性油を用い得る。オレイン酸などの脂肪酸が、注射剤の調製で使用され得る。無菌製剤はまた、局所麻酔薬、保存料、および緩衝剤などの補助剤を含んでなってもよい。
【０６４６】
注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通過させる濾過によって、および／または使用前に滅菌水またはその他の無菌注射用培地中に溶解または分散され得る、無菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって、滅菌され得る。
【０６４７】
注射用製剤は、組織、臓器および／または対象の領域内に直接注射されてもよい。非限定的例として、虚血性領域への心筋内注射によって、組織、臓器および／または対象に、製剤が直接注射されてもよい。（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、ザンギー（Ｚａｎｇｉ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２０１３年を参照されたい）。
【０６４８】
活性成分の効果を延長するために、皮下または筋肉内注射からの活性成分の吸収を遅延させることが、往々にして望ましい。これは、水溶性が劣る結晶性または非晶質物質の液体懸濁液の使用によって、達成されてもよい。次に薬剤の吸収速度は、その溶出速度に左右され、それは次に、結晶サイズおよび結晶形態に左右されてもよい。あるいは、非経口的投与薬剤形態の吸収遅延は、薬剤を油ビヒクルに溶解または懸濁することで達成される。注射用デポー製剤は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー内に、薬剤の微小カプセル化マトリックスを形成することで製造される。薬剤とポリマーの比率および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、薬剤放出速度は調節され得る。その他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（酸無水物）が挙げられる。デポー注射用製剤は、身体組織と適合性のリポソームまたはマイクロエマルションに、薬剤を封入することで調製される。
【０６４９】
直腸内および膣内投与
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により援用される、国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０２７０７７号明細書の段落［０００９１０］〜［０００９１３］中などに記載される方法または組成物によって、直腸内および膣内投与のために製剤化されてもよい。
【０６５０】
経口投与
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により援用される、国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０２７０７７号明細書の段落［０００９１４］〜［０００９２４］中などに記載される方法または組成物によって、経口投与のために製剤化されてもよい。経口投与は、液体剤形または固体剤形であってもよい。
【０６５１】
局所または経皮投与
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により援用される、国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０２７０７７号明細書の段落［０００９２５］〜［０００９４１］中などに記載される方法または組成物によって、局所または経皮投与のために製剤化されてもよい。
【０６５２】
デポー投与
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により援用される、国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０２７０７７号明細書の段落［０００９４２］〜［０００９４８］中などに記載される方法または組成物によって、デポー投与のために製剤化されてもよい。
【０６５３】
肺投与
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により援用される、国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０２７０７７号明細書の段落［０００９４９］〜［０００９５４］中などに記載される方法または組成物によって、肺投与のために製剤化されてもよい。
【０６５４】
鼻腔内、経鼻、およびバッカル投与
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により援用される、国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０２７０７７号明細書の段落［０００９５５］〜［０００９５８］中などに記載される方法または組成物によって、鼻腔内、経鼻またはバッカル投与のために製剤化されてもよい。
【０６５５】
眼部および耳介（Ｏｔｉｃ）投与
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により援用される、国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０２７０７７号明細書の段落［０００９５９］〜［０００９６５］中などに記載される方法または組成物によって、眼部または耳介（ｏｔｉｃ）投与のために製剤化されてもよい。
【０６５６】
ペイロード投与：検出可能薬剤および治療薬
本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、その中で、生物学的標的への物質の送達（「ペイロード」）が所望される、例えば、標的検出のための検出可能物質の送達、または治療薬送達などの、いくつかの異なる筋書きで使用され得る。検出法としては、例えば、免疫組織化学的検査、生物発光イメージング（ＢＬＩ：ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ
ｉｍａｇｉｎｇ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ：Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ
Ｉｍａｇｉｎｇ）、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ：ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）、電子顕微鏡検査、Ｘ線コンピュータ断層撮影、ラマンイメージング、光干渉断層撮影、吸収イメージング、赤外線画像、蛍光反射イメージング、蛍光顕微鏡検査、蛍光分子断層撮影、核磁気共鳴イメージング、Ｘ線イメージング、超音波イメージング、光音響イメージング、実験室アッセイ、または標識付け／染色／イメージングが必要な任意の状況などの、インビトロおよびインビボの両方でのイメージング法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０６５７】
ポリヌクレオチドは、任意の有用な配向でリンカーおよびペイロードの両方を含むように設計され得る。例えば、２つの末端を有するリンカーが使用されて、デアザ−アデノシンまたはデアザ−グアノシンのＣ−７またはＣ−８位、またはシトシンまたはウラシルのＮ−３またはＣ−５位など、一端にペイロードが付着され、もう一方の末端に核酸塩基が付着される。本発明のポリヌクレオチドは、２つ以上のペイロード（例えば、標識および転写阻害剤）、ならびに切断可能なリンカーを含み得る。一実施形態では、修飾ヌクレオチドは７−デアザ−アデノシン三リン酸で修飾されて、切断可能なリンカーの一端が７−デアザ−アデニンのＣ７位に付着して、リンカーのもう一方の末端が阻害剤（例えば、シチジン上の核酸塩基のＣ５位）に付着し、標識（例えば、Ｃｙ５）がリンカーの中心に付着する（例えば、参照により本明細書に援用される、米国特許第７，９９４，３０４号明細書の図５および９および１０欄のＡ＊ｐＣｐ  Ｃ５  Ｐａｒｇ  Ｃａｐｌｅｓｓの化合物１を参照されたい）。コードする領域への修飾７−デアザ−アデノシン三リン酸の組み込み時に、生じるポリヌクレオチドは、標識および阻害剤（例えばポリメラーゼ阻害剤）に付着する切断可能なリンカーを有する。（例えば、切断可能なジスルフィド部分を有するリンカーを還元する還元条件による）リンカーの切断時に、標識および阻害剤が放出される。追加的なリンカーおよびペイロード（例えば、治療薬、検出可能標識、および細胞透過性ペイロード）は、本明細書およびその内容全体が参照により本明細書に援用される、２０１３年３月９日に出願された、国際出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／３００６２号明細書（代理人整理番号Ｍ３００）に記載される。
【０６５８】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、例えば検出可能薬剤または治療薬の特定細胞小器官への標的化など、ペイロードの細胞内標的化に使用され得る。代表的細胞内標的としては、高度なｍＲＮＡプロセシングのための核局在化、または阻害剤を含有するｍＲＮＡに連結する核局在配列（ＮＬＳ：ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０６５９】
一例では、リンカーはリボース環の２’位および／またはポリヌクレオチドの３’および／または５’位に付着する（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１２０３０６８３号パンフレットを参照されたい）。リンカーは、本明細書で開示される、当該技術分野で公知のおよび／またはその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１２０３０６８３号パンフレットで開示される任意のリンカーであってもよい。
【０６６０】
別の実施例では、ポリヌクレオチドは、切断可能なリンカーを介して、ウイルス阻害性ペプチド（ＶＩＰ：ｖｉｒａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ）のポリヌクレオチドに付着し得る。切断可能なリンカーは、細胞内でＶＩＰおよび色素を放出する。別の実施例では、ポリヌクレオチドは、リンカーを介して、コレラ毒素、ジフテリア毒素、および百日咳毒素などのいくつかの細菌毒素の作用の原因であるＡＤＰ−リボシル化に、付着し得る。これらの毒素タンパク質は、ヒト細胞内で標的タンパク質を修飾する、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼである。例えば、コレラ毒素ＡＤＰ−リボシル化Ｇタンパク質は、生命にかかわる下痢をもたらす小腸内層からの大量の体液分泌を引き起こすことで、ヒト細胞を修飾する。
【０６６１】
いくつかの実施形態では、ペイロードは、細胞毒、放射性イオン、化学療法薬、またはその他の治療薬などの治療薬であってもよい。細胞毒または細胞毒性薬としては、細胞に有害であってもよい任意の薬剤が挙げられる。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｉｎｅｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストス
テロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、例えばマイタンシノールなどのマイタンシノイド（その内容全体を本明細書に援用する、米国特許第５，２０８，０２０号明細書を参照されたい）、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５、それらの全てが参照により本明細書に援用される、米国特許第５，４７５，０９２号明細書、米国特許第５，５８５，４９９号明細書、および米国特許第５，８４６，５４５号明細書を参照されたい）、およびそれらのアナログまたはホモログが挙げられるが、これに限定されるものではない。放射性イオンとしては、ヨウ素（例えば、ヨウ素１２５またはヨウ素１３１）、ストロンチウム８９、亜リン酸、パラジウム、セシウム、イリジウム、ホスフェート、コバルト、イットリウム９０、サマリウム１５３、およびプラセオジムが挙げられるが、これに限定されるものではない。その他治療薬としては、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパクロランブシル、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、およびマイタンシノイド）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０６６２】
いくつかの実施形態では、ペイロードは、様々な有機小型分子、無機化合物、ナノ粒子、酵素または酵素基質、蛍光性物質、ルミネセンス物質（例えば、ルミノール）、生物発光物質（例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリン）、化学発光物質、放射性物質（例えば、１８Ｆ、６７Ｇａ、８１ｍＫｒ、８２Ｒｂ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１３３Ｘｅ、２０１Ｔｌ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈ、または９９ｍＴｃ（例えば、過テクネチウム酸塩（テクネチウム酸塩（ＶＩＩ）、ＴｃＯ４−）として）、および造影剤（例えば、金（例えば、金ナノ粒子）、ガドリニウム（例えば、キレート化Ｇｄ）、酸化鉄（例えば、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）、単結晶酸化鉄ナノ粒子（ＭＩＯＮ）、および超小型超常磁性酸化鉄（ＵＳＰＩＯ））、マンガンキレート（例えば、Ｍｎ−ＤＰＤＰ）、硫酸バリウム、ヨウ化造影剤（イオヘキソール）、マイクロバブル、またはパーフルオロカーボン）などの検出可能薬剤であってもよい。このような光学的検出可能標識としては、例えば、限定されることなく、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体（例えば、アクリジンおよびイソチオシアン酸アクリジン）；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５−二スルホン酸塩；Ｎ−（４−アニリノ−ｌ−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ボディパイブリリアントイエロー；クマリンおよび誘導体（例えば、クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、および７−アミノ−４−トリフルオロチルクマリン（クマリン１５１））；シアニン染料；シアノシン；４’，６−ジアミニジノ（ｄｉａｍｉｎｉｄｉｎｏ）−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５’’−ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−チルクマリン；ジエチレントリアミン五酢酸塩；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］−ナフタレン−１−塩化スルホニル（ＤＮＳ、塩化ダンシル）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアン酸（ＤＡＢＩＴＣ）；エオジンおよび誘導体（例えば、エオジンおよびエオジンイソチオシアン酸塩）；エリスロシンおよび誘導体（例えば、エリスロシンＢおよびエリスロシンイ
ソチオシアン酸塩）；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体（例えば、５−カルボキシフルオセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、Ｘ−ローダミン−５−（および−６）−イソチオシアン酸塩（ＱＦＩＴＣまたはＸＲＩＴＣ）、およびフルオレスカミン）；２−［２−［３−［［１，３−ジヒドロ−１，１−ジメチル−３−（３−スルホプロピル）−２Ｈ−ベンズ［ｅ］インドール−２−イルイデン］エチリデン］−２−［４−（エトキシカルボニル）−１−ピペラジニル］−１−シクロペンテン−１−イル］エテニル］−１，１−ジメチル−３−（３−スルホルプロピル（ｓｕｌｆｏｒｐｒｏｐｙｌ））−１Ｈ−ベンズ［ｅ］インドリウム水酸化物、分子内塩、ｎ，ｎ−ジエチルエタンアミンとの化合物（１：１）（ＩＲ１４４）；５−クロロ−２−［２−［３−［（５−クロロ−３−エチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾール−イルイデン）エチリデン］−２−（ジフェニルアミノ）−１−シクロペンテン−１−イル］エテニル］−３−エチルベンゾチアゾリウム過塩素酸塩（ＩＲ１４０）；マラカイトグリーンイソチオシアン酸塩；４−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローザニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体（例えば、ピレン、酪酸ピレン、およびスクシンイミジル１−ピレン）；酪酸塩量子ドット；リアクティブレッド４（シバクロン（ＣＩＢＡＣＲＯＮ）（商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）；ローダミンおよび誘導体（例えば、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢ塩化スルホニルロダルニン（ｒｈｏｄａｒｎｉｎｅ）（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアン酸塩、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（テキサスレッド）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）テトラメチルローダミン、およびテトラメチルローダミンイソチオシアン酸塩（ＴＲＩＴＣ））；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウムキレート誘導体；シアニン−３（Ｃｙ３）；シアニン−５（Ｃｙ５）；シアニン−５．５（Ｃｙ５．５）；シアニン−７（Ｃｙ７）；ＩＲＤ７００；ＩＲＤ８００；アレクサ６４７；ラジョルタ（Ｊｏｌｔａ）ブルー；フタロシアニン；およびナフタロシアニンが挙げられる。
【０６６３】
いくつかの実施形態では、検出可能薬剤は、活性化に際して検出可能になる検出不能前駆物質（例えば、蛍光発生テトラジン−フルオロフォアコンストラクト（例えば、テトラジン−ボディパイＦＬ、テトラジン−オレゴングリーン４８８、またはテトラジン−ボディパイＴＭＲ−Ｘ）または酵素活性化可能な蛍光発生剤（例えば、プロセンス（ＰＲＯＳＥＮＳＥ）（登録商標）（ＶｉｓＥｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ）））であってもよい。その中で酵素標識組成物が利用され得るインビトロアッセイとしては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降法アッセイ、免疫蛍光、酵素免疫測定法（ＥＩＡ：ｅｎｚｙｍｅ
ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ：ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、およびウエスタンブロット分析が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０６６４】
組み合わせ
１つまたは複数のその他の治療薬、予防薬、診断薬、または造影剤と組み合わせて、ポリヌクレオチドが使用されてもよい。「と組み合わせて」によって、薬剤が、同時に投与されなくてはならない、および／または一緒に送達するために製剤化されなくてはならないと、暗示することは意図されないが、これらの送達方法は本開示の範囲内である。組成物は、１つまたは複数のその他の所望の治療薬または医学的手技と、同時に、その前に、またはそれに引き続いて、投与され得る。一般に、各薬剤は、その薬剤について決定された、用量でおよび／または時間スケジュールで、投与される。いくつかの実施形態では、本開示は、薬剤と組み合わされた医薬、予防的、診断、またはイメージング組成物の送達
を包含し、薬剤は、医薬、予防的、診断、またはイメージング組成物の生物学的利用能を改善してもよく、それらの代謝を低減および／または修正してもよく、それらの排出を阻害してもよく、および／またはそれらの体内分布を修正してもよい。一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により援用される、国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０２７０７７号明細書の段落［０００９７８］〜［００１０２３］中などに記載されるような、１つまたは複数のその他の薬剤との組み合わせで使用されてもよい。
【０６６５】
組み合わせで利用される治療的に、予防的に、診断的に、またはイメージング活性薬剤は、単一組成物中で合わせて投与されてもよく、または異なる組成物中で別々に投与されてもよいことがさらに理解されるであろう。一般に、組み合わせで利用される薬剤は、それらが個々に利用されるレベルを超えないレベルで利用されることが予期される。いくつかの実施形態では、組み合わせで利用されるレベルは、個々に利用されるものよりも低いであろう。一実施形態では、組み合わせは、本明細書に記載される分割投与計画に従って、個別にまたは一緒に投与されてもよい。
【０６６６】
投薬
本発明は、本発明に従って、それを必要とする対象に、修飾ｍＲＮＡおよびそれらがコードするタンパク質または複合体を投与するステップを含んでなる方法を提供する。核酸、タンパク質または複合体、またはそれらの医薬、イメージング、診断、または予防的組成物は、疾患、障害、および／または病状（例えば、作業記憶欠陥に関する疾患、障害、および／または病状）を予防し、治療し、診断し、またはイメージングするのに効果的な、任意の量および任意の投与経路を使用して、対象に投与されてもよい。要する正確な量は、対象の生物種、年齢、および全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与方法、その活性方法などに応じて、対象毎に様々であろう。本発明に従った組成物は、典型的に、投与の容易さと投与量の均一性のために、投与単位形態で製剤化される。しかし、本発明の組成物の１日の総使用量は、主治医によって、健全な医学的判断の範囲内で決定されてもよいことが、理解されるであろう。任意の特定患者のための、特定の治療的に有効であり、予防的に有効であり、または適切なイメージング用量であるレベルは、治療される障害および障害の重症度；用いられる特定化合物の活性；用いられる特定組成物；患者の年齢、体重、総体的な健康、性別、および食生活；用いられる特定化合物の投与時間、投与経路、および排出速度；治療持続期間；用いられる特定化合物との組み合わせでまたはそれと同時に使用される薬剤；および医療技術分野で周知の同様の要素を含む、多様な要素に左右されるであろう。
【０６６７】
特定の実施形態では、本発明による組成物は、所望の治療、診断、予防、またはイメージング効果を得るために、１日あたり、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．００５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ対象体重で、毎日１回または複数回、送達するのに十分な用量レベルで投与されてもよい（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３０７８１９９号パンフレットに記載される単位用量範囲を参照されたい）。所望の用量は、毎日３回、毎日２回、毎日１回、隔日、３日に１回、毎週、隔週、３週間毎、または４週間毎に送達されてもよい。特定の実施形態では、所望の用量は、複数投与を使用して送達されてもよい（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４回、またはそれを超える投与）。複数投与が用いられる場合、本明細書に記載されるものなどの分割投与計画が使用されてもよい。
【０６６８】
本発明によれば、分割投与計画でのポリヌクレオチドの投与は、哺乳類対象において、より高レベルのタンパク質を生じることが発見された。本明細書の用法では、「分割投与」は、例えば単一単位用量の２回以上の投与などの、単一単位用量または総一日用量の２つ以上の用量への分配である。本明細書の用法では、「単一単位用量」は、１用量／１回／単一経路／単一接触点で、すなわち、単回投与事象で、投与される任意の治療薬の用量である。本明細書の用法では、「総一日用量」は、２４時間以内に投与されまたは処方される量である。それは、単一単位用量として投与されてもよい。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、対象に分割用量で投与される。ポリヌクレオチドは、緩衝液のみの中で製剤化されてもよく、または本明細書に記載される製剤に製剤化されてもよい。
【０６６９】
剤形
本明細書に記載される医薬組成物は、局所、鼻腔内、気管内、または注射用（例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、心臓内、腹腔内、皮下）などの本明細書に記載される投与形態に製剤化され得る。
【０６７０】
液体剤形
非経口投与のための液体剤形としては、薬学的に許容可能なエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、および／またはエリキシル剤が挙げられるが、これに限定されるものではない。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば、水またはその他の溶媒；エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、およびそれらの混合物などの可溶化剤および乳化剤を含むが、これに限定されるものではない、当該技術分野で一般に使用される不活性希釈剤を含んでなってもよい。非経口投与のための特定の実施形態では、組成物は、クレモフォール（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ）（登録商標）、アルコール、油、改質油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはそれらの組み合わせなどの可溶化剤と混合されてもよい。
【０６７１】
注射用
注射用製剤、例えば、無菌注射用水性または油性懸濁液は、適当な分散剤、湿潤剤、および／または懸濁剤を使用して、公知の技術に従って製剤化されてもよい。無菌注射用製剤は、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液などの、無毒の非経口的に許容可能な希釈剤および／または溶媒中の無菌注射液、懸濁液、および／またはエマルションであってもよい。用いられてもよい許容できるビヒクルおよび溶媒としては、水、米国薬局方リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液が挙げられるが、これに限定されるものではない。無菌の不揮発性油が、溶剤または懸濁媒として慣習的に用いられている。この目的で、合成モノまたはジグリセリドを含む、あらゆる無刺激不揮発性油を用い得る。オレイン酸などの脂肪酸が、注射剤の調製で使用され得る。
【０６７２】
注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通過させる濾過によって、および／または使用前に滅菌水またはその他の無菌注射用培地中に溶解または分散され得る、無菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって、滅菌され得る。
【０６７３】
活性成分の効果を延長するために、皮下または筋肉内注射からの活性成分の吸収を遅延させることが、望ましいこともある。これは、水溶性が劣る結晶性または非晶質物質の液体懸濁液の使用によって、達成されてもよい。次にポリヌクレオチドの吸収速度は、その溶出速度に左右され、それは次に、結晶サイズおよび結晶形態に左右されてもよい。ある
いは、非経口的に投与されたポリヌクレオチドの吸収遅延は、油ビヒクルにポリヌクレオチドを溶解させまたは懸濁させることで、達成されてもよい。注射用デポー製剤は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー内に、ポリヌクレオチドの微小カプセル化マトリックスを形成することで製造される。ポリヌクレオチドとポリマーの比率および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、ポリヌクレオチド放出速度は調節され得る。その他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（酸無水物）が挙げられるが、これに限定されるものではない。デポー注射用製剤は、身体組織と適合性のリポソームまたはマイクロエマルション内に、ポリヌクレオチドを封入することで製剤化されてもよい。
【０６７４】
肺
肺送達のために有用である、本明細書に記載される製剤はまた、医薬組成物の鼻腔内送達のためにも使用されてもよい。鼻腔内投与に適する別の製剤は、活性成分を含んでなり、約０．２μｍ〜５００μｍの平均的粒子を有する粗粉末であってもよい。このような製剤は、その中で嗅剤が服用される方法で、すなわち鼻の近くに保持される粉末容器からの鼻腔を通じた迅速な吸入によって、投与されてもよい。
【０６７５】
経鼻投与に適する製剤は、例えば、わずか約０．１％（ｗ／ｗ）から１００％（ｗ／ｗ）に至る活性成分を含んでなってもよく、本明細書に記載される追加的な成分の１つまたは複数を含んでなってもよい。医薬組成物は、バッカル投与に適する配合で、調製され、包装され、および／または販売されてもよい。このような製剤は、例えば、従来法を使用して製造される、錠菓および／またはロゼンジ形態であってもよく、例えば、約０．１％〜２０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含有してもよく、残部は、経口的に溶解性のおよび／または分解性の組成物、および任意選択的に１つまたは複数の本明細書に記載される追加的な成分を含んでなってもよい。交互に、バッカル投与に適する製剤は、活性成分を含んでなる、粉末および／またはエアロゾル化したおよび／または霧状の溶液および／または懸濁液を含んでなってもよい。このような、粉末化、エアロゾル化、および／またはエアロゾル化製剤は、分散時に約０．１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲の平均粒子および／または液滴サイズを有してもよく、本明細書に記載される任意の追加的な成分の１つまたは複数をさらに含んでなってもよい。
【０６７６】
医薬品の製剤化および／または製造の概論は、例えば、（その内容全体が参照により本明細書に援用される）レミントン：調剤の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）、第２１版、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）、２００５年にある。
【０６７７】
コーティングまたはシェル
錠剤、糖衣丸、カプセル、丸薬、および顆粒の固体剤形は、腸内コーティングおよび製剤処方技術分野で周知のその他のコーティングなどのコーティングおよびシェルを用いて調製され得る。それらは不透明剤を任意選択的に含んでなってもよく、または任意選択的に遅延方法で、腸管の特定部分で活性成分のみを放出し、または活性成分を優先的に放出する、組成物であり得る。使用され得る包埋組成物の例としては、ポリマー物質、およびワックスが挙げられる。類似タイプの固体組成物は、乳糖または乳糖類、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用する、軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いられてもよい。
【０６７８】
複数用量および反復用量投与
いくつかの実施形態では、本発明の化合物および／または組成物は、２つ以上の用量で投与されてもよい（本明細書で「複数用量投与」と称される）。このような用量は、同一
成分を含んでなってもよく、または先の用量に包含されない成分を含んでなってもよい。このような用量は、先の用量と比較して、同一質量および／または容量の成分を含んでなってもよく、または変化した質量および／または容量の成分を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、複数用量投与は、反復用量投与を含んでなってもよい。本明細書の用法では、「反復用量投与」という用語は、連続して、または実質的に同一質量および／または容量で供される、実質的に同一成分を含んでなる反復投与計画中で、投与される２つ以上の用量を指す。いくつかの実施形態では、対象は、反復用量応答を示してもよい。本明細書の用法では、「反復用量応答」という用語は、反復用量投与計画中で投与される別の投与量と異なる反復用量に対する、対象中の反応を指す。いくつかの実施形態では、このような反応は、ｍＲＮＡを含んでなる反復用量に応答した、タンパク質発現であってもよい。このような実施形態では、タンパク質発現は、反復用量投与計画中の別の投与量と比較して、上昇してもよく、またはタンパク質発現は、反復用量投与計画中の別の投与量と比較して低下してもよい。タンパク質発現の変化は、約１％〜約２０％、約５％〜約５０％約１０％〜約６０％、約２５％〜約７５％、約４０％〜約１００％および／または少なくとも１００％であってもよい。投与されるＲＮＡから翻訳されるタンパク質のレベルが、反復投与計画中の別の用量と比較して、４０％を超えて低下する、反復投与計画の一部として投与されるｍＲＮＡの発現低下は、本明細書で「反復用量耐性」と称される。
【０６７９】
医薬組成物の性質
本明細書に記載される医薬組成物は、以下の性質の１つまたは複数によって特徴付けられ得る。
【０６８０】
生物学的利用能
ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるような送達剤と共に組成物に製剤化された際に、本明細書に記載されるような送達剤を欠く組成物と比較して、生物学的利用能の増大を示し得る。本明細書の用法では、「生物学的利用能」という用語は、哺乳類に投与された所与の量のポリヌクレオチドの全身性の利用可能性を指す。生物学的利用能は、哺乳類への化合物の投与に続いて、化合物の無変化形態の曲線下面積（ＡＵＣ：ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ）、または最大血清または血漿濃度（Ｃｍａｘ）を測定することで、評価され得る。ＡＵＣは、横軸（Ｘ−軸）に沿う時間に対する、縦軸（Ｙ−軸）に沿う化合物の血清または血漿濃度をプロットする曲線下面積の測定である。概して、特定化合物のＡＵＣは、当業者に知られており、その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｇ．Ｓ．バンカー（Ｇ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ）著、「現代薬学、薬剤および薬科学（Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第７２巻、マーセル・デッカー・ニューヨーク株式会社（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｉｎｃ．）、１９９６年に記載されるような方法を使用して、計算され得る。
【０６８１】
Ｃｍａｘ値は、哺乳類への化合物投与に続いて、哺乳類の血清または血漿中で得られる化合物の最大濃度である。特定化合物のＣｍａｘ値は、当業者に知られている方法を使用して測定され得る。「生物学的利用能増大」または「薬物動態改善」いう語句は、本明細書の用法では、哺乳類におけるＡＵＣ、Ｃｍａｘ、またはＣｍｉｎとして測定される第１のポリヌクレオチドの全身性の利用可能性が、本明細書に記載されるような送達剤との同時投与時に、このような同時投与が起こらない場合よりも大きいことを意味する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの生物学的利用能は、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％増大し得る。
【０６８２】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの液体製剤は、様々なインビボ半減期を有してもよく、治療効果を得るために用量の調節を要する。これに対処するために、本発明のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド製剤は、反復投与における、生物学的利用能および／または治療効果を改善するように設計されてもよい。このような製剤は、ポリヌクレオチドの持続性放出を可能にしてもよく、および／またはヌクレアーゼによるポリヌクレオチド分解速度を低下させてもよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド、水不混和性油デポー、界面活性剤および／または共界面活性剤および／または共溶媒を含んでなる、懸濁製剤が提供される。油および界面活性剤の組み合わせは、ポリヌクレオチドとの懸濁製剤を可能にしてもよい。水不混和性デポー中のポリヌクレオチド送達が使用されて、デポーから周囲の生理学的環境内へのポリヌクレオチドの持続性放出を通じて生物学的利用能が改善され、および／またはヌクレアーゼによるポリヌクレオチド分解が防止されてもよい。
【０６８３】
いくつかの実施形態では、二価および一価カチオンの組み合わせを含んでなるカチオン性ナノ粒子は、ポリヌクレオチドと共に製剤化されてもよい。このようなナノ粒子は、所定時間（例えば、数時間、数日間など）にわたり、溶液中で自然発生的に形成してもよい。このようなナノ粒子は、二価のカチオン単独の存在下で、または一価カチオン単独の存在下で形成しない。カチオン性ナノ粒子中の、またはカチオン性ナノ粒子を含んでなる１つまたは複数のデポー中の、ポリヌクレオチドの送達は、長時間作用型デポーとして作用することで、および／またはヌクレアーゼによる分解速度を低下させることで、ポリヌクレオチドの生物学的利用能を改善してもよい。
【０６８４】
治療濃度域
ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるような送達剤と共に組成物に製剤化されると、本明細書に記載されるような送達剤を欠く投与されたポリヌクレオチド組成物治療濃度域と比較して、投与されたポリヌクレオチド組成物の治療濃度域の増大を示し得る。本明細書の用法では、「治療濃度域」は、高確率で治療効果を引き起こす、作用部位における治療効果のある物質の血漿濃度範囲またはレベル範囲を指す。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの治療濃度域は、本明細書に記載されるような送達剤と同時投与されると、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％増大し得る。
【０６８５】
分布容量
ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるような送達剤と共に、組成物に製剤化されると、本明細書に記載されるような送達剤を欠く組成物と比較して、例えば、低下または標的化などの、改善された分布容量（Ｖｄｉｓｔ）を示し得る。分布容量（Ｖｄｉｓｔ）は、血液中または血漿中の薬剤濃度に対する、体内の薬剤の量に関する。本明細書の用法では、「分布容量」という用語は、血液中または血漿中と同一濃度で、体内に薬剤総量を含有するのに必要な液量を指す：Ｖｄｉｓｔは、体内薬剤量／血液中または血漿中薬剤濃度に等しい。例えば、１０ｍｇの用量および１０ｍｇ／Ｌの血漿濃度では、分布容量は１リットルになる。分布容量は、薬剤が血管外組織内に存在する程度を反映する。大きな分布容量は、化合物が、血漿タンパク質結合と比較して、組織構成要素に結合する傾向を反映する。臨床状況において、Ｖｄｉｓｔは、定常状態濃度を達成するための負荷量を決定するのに利用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような送達剤と同時投与された場合、ポリヌクレオチドの分布容量は、少なくとも約２％、少なくとも約
５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％低下し得る。
【０６８６】
生物学的効果
一実施形態では、動物に送達される修飾ｍＲＮＡの生物学的効果は、動物中のタンパク質発現を分析することで、分類されてもよい。タンパク質発現は、本発明の修飾ｍＲＮＡを投与された哺乳類から収集された生物学的サンプルを分析することで、判定されてもよい。一実施形態では、哺乳類に投与された修飾ｍＲＮＡによってコードされる発現タンパク質が、少なくとも５０ｐｇ／ｍｌであることが好ましくあってもよい。例えば、哺乳類に送達される修飾ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質について５０〜２００ｐｇ／ｍｌのタンパク質の発現は、哺乳類におけるタンパク質の治療有効量と見なされてもよい。
【０６８７】
質量分析法によるポリヌクレオチド酸の検出
質量分析法（ＭＳ：Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）は、イオンへの変換後の分子に関する構造的および分子量／濃度情報を提供し得る分析技術である。分子は最初にイオン化されて、正または負の荷電を獲得し、次にそれらは、質量分析器を通過して移動し、それらの質量／電荷（ｍ／ｚ）比に従って、検出器の異なる領域に到達する。
【０６８８】
質量分析法は、分画サンプルをイオン化し、さらなる分析のための荷電分子を作成するためのイオン源を含む、質量分光計を使用して、実施される。例えばサンプルのイオン化は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ：ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ：ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ
ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）、光イオン化、電子イオン化、高速原子衝撃（ＦＡＢ：ｆａｓｔ  ａｔｏｍ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）／液体二次イオン化（ＬＳＩＭＳ：ｌｉｑｕｉｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ：ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ
ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）、電界イオン化、電界脱離、サーモスプレー／プラズマスプレーイオン化、および粒子ビームイオン化によって実施されてもよい。当業者は、イオン化法の選択が、測定される検体、サンプルタイプ、検出器タイプ、正対負イオンモードの選択などに基づいて決定され得ることを理解するであろう。
【０６８９】
サンプルがイオン化された後、それによって生成する正に帯電したまたは負に帯電したイオンが分析されて、質量対電荷比（すなわち、ｍ／ｚ）が判定されてもよい。質量−対−電荷比を判定するための適切な分析器としては、クアドロポール（ｑｕａｄｒｏｐｏｌｅ）分析器、イオントラップ分析器、および飛行時間分析器が挙げられる。イオンは、いくつかの検出モードを使用して、検出されてもよい。例えば、選択されたイオンが検出されてもよく（すなわち、選択的イオンモニタリングモード（ＳＩＭ：ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ
ｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｍｏｄｅ）を使用する）、またはあるいは、イオンは、例えば、多重反応モニタリング（ＭＲＭ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）または選択反応モニタリング（ＳＲＭ：ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）などのスキャニングモードを使用して、検出されてもよい。
【０６９０】
安定同位体標識ペプチド標準希釈液と一体となった液体クロマトグラフィー多重反応モニタリング（ＬＣ−ＭＳ／ＭＲＭ：Ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）は、タンパク質検証のための効果的な方法であることが示されている（例えば、それぞれその内容全体が参照により本
明細書に援用される、ケシシアン（Ｋｅｓｈｉｓｈｉａｎ）ら著、モレキュラー・アンド・セルラー・プロテオミクス（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）、２００９年、第８巻、ｐ２３３９〜２３４９；クーン（Ｋｕｈｎ）ら著、クリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ）、２００９年、第５５巻、ｐ１１０８〜１１１７；ロペス（Ｌｏｐｅｚ）ら著、クリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ）、２０１０年、第５６巻、ｐ２８１〜２９０）。生物マーカー発見研究で頻繁に使用される非標的質量分析法とは異なり、標的化ＭＳ法は、複雑な混合物中の数十から数百の選択されたペプチドに装置の全分析能力を集中させる、ＭＳのペプチド配列ベースモードである。対象タンパク質に由来するペプチドのみに、検出および断片化を限定することで、発見モードＭＳ法と比較して、感度および再現性が劇的に改善される。この質量分析法に基づくタンパク質の多重反応モニタリング（ＭＲＭ）定量化法は、臨床サンプルの迅速な標的化された多重タンパク質発現プロファイリングを通じて、生物マーカーの発見および定量化に劇的な影響を及ぼし得る。
【０６９１】
一実施形態では、本発明の少なくとも１つの修飾ｍＲＮＡによってコードされる少なくとも１つのタンパク質を含有してもよい生物学的サンプルは、ＭＲＭ−ＭＳ法によって分析されてもよい。生物学的サンプルの定量化は、内標準として、同位体標識されたペプチドまたはタンパク質をさらに含んでもよいが、これに限定されるものではない。
【０６９２】
本発明によれば、生物学的サンプルは、ひとたび対象から入手されると、酵素消化を受けてもよい。本明細書の用法では、「消化」という用語は、より短いペプチドへの切断を意味する。本明細書の用法では、「サンプルを消化タンパク質に処理する」という語句は、サンプル中のタンパク質を分解するようにサンプルを操作することを意味する。これらの酵素としては、トリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、およびキモトリプシンが挙げられるが、これに限定されるものではない。一実施形態では、本発明の少なくとも１つの修飾ｍＲＮＡによってコードされる少なくとも１つのタンパク質を含有してもよい生物学的サンプルは、酵素を使用して消化されてもよい。
【０６９３】
一実施形態では、本発明の修飾ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を含有してもよい生物学的サンプルは、エレクトロスプレーイオン化を使用してタンパク質について分析されてもよい。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析法（ＥＳＩＭＳ：Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）は、イオンが質量分析法によって分析される前に、電気エネルギーを使用して、溶液から気相へのイオン移入を促進する。サンプルは、当該技術分野で公知の方法を使用して分析されてもよい（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、ホー（Ｈｏ）ら著、Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．２００３  ２４（１）：３−１２）。溶液に含有されるイオン性化学種は、荷電小滴の微細な噴霧を分散させ、溶剤を蒸発させ、荷電小滴からイオンを駆出して、高度に荷電した小滴のミストを生成することで、気相に移入されてもよい。高度に荷電した小滴のミストは、クアドロポール（ｑｕａｄｒｏｐｏｌｅ）質量分析器などであるが、これに限定されるものではない、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４つの質量分析器を使用して分析されてもよい。さらに、質量分析法は、精製するステップを含んでもよい。非限定的例として、第１のクアドラポール（ｑｕａｄｒａｐｏｌｅ）は、それが、異なるｍ／ｚ比を有するその他の分子イオンを排除して、ＭＳ分析前の複雑で時間のかかるサンプル精製手順を排除してもよいように、単一ｍ／ｚ比を選択するように設定されてもよい。
【０６９４】
一実施形態では、本発明の修飾ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を含有してもよい生物学的サンプルは、タンデムＥＳＩＭＳシステム（例えばＭＳ／ＭＳ）内で、タンパク質について分析されてもよい。非限定的例として、小滴は、生成物スキャン（またはドータースキャン）、前駆体スキャン（ペアレントスキャン）、ニュートラルロスまたは
多重反応モニタリングを使用して、分析されてもよい。
【０６９５】
一実施形態では、本発明の修飾ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を含有してもよい生物学的サンプルは、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法（ＭＡＬＤＩＭＳ：ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）を使用して、分析されてもよい。ＭＡＬＤＩは、タンパク質などの大型および小型分子の両方の非破壊気化およびイオン化を提供する。ＭＡＬＤＩ分析では、検体は、最初に、紫外線吸収弱有機酸もまた含んでもよいがこれに限定されるものではないマトリックス化合物の大きなモル過剰量と、共結晶化される。ＭＡＬＤＩで使用されるマトリックスの非限定的例は、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸、および２，５−ジヒドロキシ安息香酸である。検体−マトリックス混合物のレーザー照射は、マトリックスおよび検体の気化をもたらしてもよい。レーザー誘発性脱離は、無処理検体の高いイオン収率を提供して、高い確度で化合物を測定できるようにする。サンプルは、当該技術分野で公知の方法を使用して分析されてもよい（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）、ウェイ（Ｗｅｉ）、およびシウズダク（Ｓｉｕｚｄａｋ）、分析化学の百科事典、２０００年：ｐ５８８０〜５８９４）。非限定的例として、ＭＡＬＤＩ分析で使用される質量分析器としては、線形飛行時間（ＴＯＦ：ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ）、ＴＯＦリフレクトロンまたはフーリエ変換質量分析器が挙げられ得る。
【０６９６】
一実施形態では、乾燥小滴法を使用して、検体マトリックス混合物が形成されてもよい。生物学的サンプルは、マトリックスと混合されて、マトリックス−対−サンプル比がほぼ５０００：１である、飽和マトリックス溶液が生成する。次にアリコート（およそ０．５〜２．０μＬ）の飽和マトリックス溶液が乾燥されて、検体−マトリックス混合物が形成される。
【０６９７】
一実施形態では、検体−マトリックス混合物は、薄層法を使用して形成されてもよい。マトリックス均質膜が最初に形成され、その後、サンプルが次に装入されてマトリックスによって吸収され、検体−マトリックス混合物が形成してもよい。
【０６９８】
一実施形態では、検体−マトリックス混合物は、厚層法を使用して形成されてもよい。マトリックス均質膜は、ニトロセルロースマトリックス添加剤と共に形成される。ひとたび均一なニトロセルロースマトリックス層が得られたら、サンプルが装入されてマトリックス内に吸収され、検体−マトリックス混合物が形成する。
【０６９９】
一実施形態では、検体−マトリックス混合物は、サンドイッチ法を使用して形成されてもよい。マトリックス結晶の薄層は、薄層法と同様に調製され、水性トリフルオロ酢酸の小滴、サンプル、およびマトリックスの添加がそれに続く。次にサンプルは、マトリックス内に吸収されて、検体−マトリックス混合物が形成する。
【０７００】
Ｖ．本発明のポリヌクレオチドの使用
好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫応答などの有害生物応答および／または分解経路の回避またはそれからの逃避を提供して、発現閾値を克服し、および／またはタンパク質生成能力を改善し、発現比率または翻訳効率を改善して、薬剤またはタンパク質半減期および／またはタンパク質濃度を改善し、タンパク質局在を最適化して、組織内の安定性および／またはクリアランス、受容体取り込みおよび／または動態、組成物による細胞アクセス、翻訳機構との関わり、分泌効率（当てはまる場合）、循環へのアクセスしやすさ、および／または細胞の状態、機能および／または活性の調節の１つまたは複数を改善するように、設計される。
【０７０１】
治療薬
ＬＤＬＲ関連疾患、障害および／または病状
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＬＤＬＲ関連疾患、障害または病状を治療および／または予防するのに、使用されてもよい。ＬＤＬＲ関連疾患、障害または病状の非限定的例としては、ＬＤＬ低下、コレステロール低下、高コレステロール血症、高脂血症、およびアテローム性動脈硬化が挙げられる。
【０７０２】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、心疾患のリスクを低下させるのに使用されてもよい。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、アテローム性動脈硬化を発症するリスクを低下させるのに使用されてもよい。理論による拘束は望まないが、アテローム性動脈硬化は、大多数の心血管疾患の原因である。
【０７０３】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、高コレステロール血症を治療および／または予防するのに使用されてもよい。非限定的例として、高コレステロール血症は、家族性高コレステロール血症である。
【０７０４】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＬＤＬを低下させるのに使用されてもよい。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、対象においてコレステロールを低下させるのに使用されてもよい。非限定的例として、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、対象の血漿中のコレステロールレベルを低下させることができてもよい。
【０７０５】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、高脂血症を治療または予防するのに使用されてもよい。
代謝疾患、障害および／または病状
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、代謝疾患、障害および／または病状を治療および／または予防するのに使用されてもよい。非限定的例として、代謝障害、障害または病状は、酸性リパーゼ疾患、バース症候群（ＢＴＨＳ：Ｂａｒｔｈ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、橋中央ミエリン溶解、ファーバー病、ガングリオシド症、ハンター症候群、ハーラー症候群、トリメチルアミン尿症、レッシュ・ナイハン症候群、脂質蓄積症、代謝性ミオパシー、ミトコンドリア性ミオパシー、ムコリピドーシス、ムコリピドーシス、ムコ多糖症、ポンペ病、グリコーゲン蓄積症、尿素サイクル疾患、高シュウ酸尿症およびシュウ酸症であってもよい。
【０７０６】
心血管疾患、障害および／または病状
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、心血管疾患、障害および／または病状を治療および／または予防するのに使用されてもよい。非限定的例として、心血管疾患、障害または病状は、心不全、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、不整脈、狭窄症、逆流症、僧帽弁プロラパーゼ（ｐｒｏｌａｐａｓｅ）であってもよい。
【０７０７】
治療薬
修飾核酸および修飾ＲＮＡなどの本発明のポリヌクレオチド、およびそれらから翻訳される本明細書に記載されるタンパク質は、治療的または予防的薬剤として使用され得る。それらは、医療で使用するために提供される。例えば、本明細書に記載されるポリヌクレオチドが対象に投与され得、ポリヌクレオチドがインビボで翻訳されて、対象において治療的または予防的ポリペプチドが生成する。提供されるのは、ヒトおよびその他の哺乳類において、疾患または病状を診断、治療または予防するための成物、方法、キット、および試薬である。本発明の活性治療薬としては、ポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドま
たはポリヌクレオチドから翻訳されるポリペプチドを含有する細胞とが挙げられる。
【０７０８】
特定の実施形態では、本明細書で提供されるのは、抗体依存性細胞毒性を誘導するタンパク質と共に、哺乳類対象の免疫を増大させる１つまたは複数のタンパク質をコードする翻訳可能な領域を含有する、１つまたは複数のポリヌクレオチドを含有する、組み合わせ治療薬である。例えば、本明細書で提供されるのは、トラスツズマブおよび顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）をコードする１つまたは複数の核酸を含有する治療薬である。具体的には、このような組み合わせ治療薬は、トラスツズマブに対する誘導性耐性を生じる、Ｈｅｒ２＋乳がん患者に有用である（例えば、アルブレヒト（Ａｌｂｒｅｃｈｔ）著、イムノセラピー（Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）、２０１０年、第２巻、第６号、ｐ７９５〜８）を参照されたい。
【０７０９】
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを使用して、細胞集団内で組換えポリペプチドの翻訳を誘導する方法である。このような翻訳は、生体内（インビボ）、生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）、培養内（ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、または試験管内（インビトロ）であり得る。細胞集団は、少なくとも１つのヌクレオシド修飾と、組換えポリペプチドをコードする翻訳可能領域とを有する核酸を含有する、組成物の有効量と接触される。集団は、核酸が、細胞集団の１つまたは複数の細胞内に局在化して、組換えポリペプチドが細胞内で核酸から翻訳されるような条件下で接触される。
【０７１０】
「有効量」の組成物は、少なくともある程度は、標的組織、標的細胞型、投与手段、核酸の物理的特性（例えば、サイズ、および修飾ヌクレオシドの範囲）、およびその他の決定要因に基づいて、提供される。一般に、組成物の有効量は、細胞内で効率的なタンパク質生成を提供し、好ましくは対応する未修飾核酸を含有する組成物よりもさらに効率的である。増大効率は、細胞形質移入（すなわち、核酸で形質移入された細胞の割合）の増大、核酸からのタンパク質翻訳の増大、核酸分解の低下（例えば、修飾核酸からのタンパク質翻訳の持続期間の増大によって実証される）、または宿主細胞の先天性免疫応答の低下によって実証されてもよい。
【０７１１】
本発明の態様は、それを必要とする対象哺乳類において、組換えポリペプチドのインビボ翻訳を誘導する方法を対象とする。その中では、少なくとも１つの構造的または化学修飾と、組換えポリペプチドをコードする翻訳可能領域とを有する核酸を含有する組成物の有効量が、本明細書に記載される送達方法を使用して、対象に投与される。核酸は、核酸が対象の細胞内に局在化して、組換えポリペプチドが細胞内で核酸から翻訳されるような量とその他の条件で、提供される。その中に核酸が局在化する細胞、またはその中に細胞が存在する組織は、１回または２回以上の核酸投与で標的化されてもよい。
【０７１２】
特定の実施形態では、投与されたポリヌクレオチドは、その中で組換えポリペプチドが翻訳される、細胞、組織または生物には実質的に存在しない機能活性を提供する、１つまたは複数の組換えポリペプチドの生成を誘導する。例えば、欠損している機能活性は、酵素的、構造的、または遺伝子制御的な性質であってもよい。関連実施形態では、投与されたポリヌクレオチドは、その中で組換えポリペプチドが翻訳される細胞内に存在するが、実質的に欠損している機能活性を（例えば、相乗的に）増大させる、１つまたは複数の組換えポリペプチドの生成を誘導する。
【０７１３】
その他の実施形態では、投与されたポリヌクレオチドは、その中で組換えポリペプチドが翻訳される細胞内に実質的に存在しないポリペプチド（または複数ポリペプチド）を置換する、１つまたは複数の組換えポリペプチドの生成を誘導する。このような不在は、コードする遺伝子またはそれらの調節経路の遺伝子変異に起因してもよい。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、細胞内の内在性タンパク質のレベルを望ましいレベル
に増大させ；このような増大は、内在性タンパク質のレベルを正常以下のレベルから正常レベルにしてもよく、または正常レベルを過正常のレベルにしてもよい。
【０７１４】
あるいは、組換えポリペプチドは、細胞内に存在し、その表面に存在し、またはそれから分泌される、内在性タンパク質の活性と拮抗するように機能する。通常は、内在性タンパク質の活性は、例えば、活性または局在化に変化をもたらす内在性タンパク質変異のために、対象にとって有害である。さらに、組換えポリペプチドは、細胞内に存在し、その表面に存在し、またはそれから分泌される、生物学的部分の活性と直接または間接的に拮抗する。拮抗される生物学的部分の例としては、脂質（例えば、コレステロール）、リポタンパク質（例えば、低密度リポタンパク質）、核酸、炭水化物、志賀および破傷風毒素などのタンパク質毒素、またはボツリヌス、コレラ、およびジフテリア毒素などの小分子毒素が挙げられる。さらに、拮抗される生体分子は、細胞傷害性または細胞分裂阻害活性などの望ましくない活性を示す内在性タンパク質であってもよい。
【０７１５】
本明細書に記載される組換えタンパク質は、潜在的に核などの特定区画内の、細胞内局在のために操作されてもよく、または細胞からの分泌、または細胞原形質膜への移行のために、操作される。
【０７１６】
いくつかの実施形態では、本発明に従ったポリヌクレオチドおよびそれらがコードするポリペプチドは、以下の１つまたは複数を含むが、これに限定されるものではない、多様な疾患、障害、および／または病状のいずれかを治療するために使用されてもよい：自己免疫障害（例えば、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ）；炎症性疾患（例えば、関節炎、骨盤内炎症性疾患）；伝染性疾患（例えば、ウイルス感染症（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＲＳＶ）、細菌感染症、真菌感染症、敗血症）；神経学的障害（例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病；自閉症；デュシェンヌ型筋ジストロフィー）；心臓血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症、血栓症、凝固障害、黄斑変性などの血管原性障害）；増殖性疾患（例えば、がん、良性新生物）；呼吸器疾患（例えば、慢性閉塞性肺疾患）；消化障害（例えば、炎症性腸疾患、潰瘍）；筋骨格障害（例えば、線維筋痛症、関節炎）；内分泌、代謝、および栄養障害（例えば、糖尿病、骨粗鬆症）；泌尿器系障害（例えば、腎疾患）；心理学的障害（例えば、うつ病、統合失調症）；皮膚障害（例えば、創傷、湿疹）；血液およびリンパ管障害（例えば、貧血、血友病）など。
【０７１７】
別の実施形態では、本発明は、最近、ゲノム研究によって特性決定されたタンパク質である、ソルチリンをコードする修飾ｍＲＮＡ分子を対象の細胞集団に導入し、それによって対象において高脂血症改善することで、対象において高脂血症を治療する方法を提供する。ＳＯＲＴ１遺伝子は、ソルチリンと称される、トランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ：ｔｒａｎｓ−Ｇｏｌｇｉ  ｎｅｔｗｏｒｋ）膜貫通タンパク質をコードする。遺伝的研究は、５人のうちの１人が、ＳＯＲＴ１遺伝子の１ｐ１３遺伝子座に一塩基多型ｒｓ１２７４０３７４を有して、それが、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ：ｖｅｒｙ−ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）の低レベルを有する素因になることを示している。約３０％の人々に存在するマイナー対立遺伝子の各コピーは、ＬＤＬコレステロールを８ｍｇ／ｄＬ変化させる一方で、人口の約５％に存在するマイナー対立遺伝子の２つのコピーはＬＤＬコレステロールを１６ｍｇ／ｄＬ低下させる。マイナー対立遺伝子の保因者はまた、心筋梗塞リスクに４０％の低下を有することも示されている。マウスにおける機能性インビボ試験は、マウス肝臓組織内のＳＯＲＴ１の過剰発現が、有意により低い、８０％程も低い、ＬＤＬコレステロールレベルをもたらしたこと、ＳＯＲＴ１のサイレンシングが、ＬＤＬコレステロールをおよそ２００％増大させたことを記載する（ムスヌル  Ｋ（Ｍｕｓｕｎｕｒｕ  Ｋ）ら著、「１ｐ１３コレステロール遺伝子座のＳＯＲＴ１を通じた非コード変異型から表現型へ（Ｆｒｏ
ｍ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ｖａｒｉａｎｔ  ｔｏ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｖｉａ  ＳＯＲＴ１  ａｔ  ｔｈｅ  １ｐ１３  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｌｏｃｕｓ．）」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１０年、第４６６巻、ｐ７１４〜７２１）。
【０７１８】
本開示のその他の態様は、ポリヌクレオチドを含有する細胞の哺乳類対象への移植に関する。哺乳類対象への細胞の投与は当業者に知られており、局所移植（例えば、局所または皮下投与）、臓器送達または全身性注射（例えば、静脈注射または吸入）、および薬学的に許容可能な担体中の細胞製剤が挙げられるが、これに限定されるものではない。ポリヌクレオチドを含有するこのような組成物は、筋肉内、経動脈的、腹腔内、静脈内、鼻腔内、皮下、内視鏡的、経皮的、またはクモ膜下腔内投与のために製剤化され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、持続放出のために製剤化されてもよい。
【０７１９】
治療薬を投与されてもよい対象は、疾患、障害、または有害病状を患っており、またはそれを発症するリスクがあってもよい。提供されるのは、臨床診断、生物マーカーレベル、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ：ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ
ｓｔｕｄｙ）、およびその他の当該技術分野で公知の方法を含む基準に基づいて、対象を同定、診断、および分類する方法である。
【０７２０】
免疫応答の調節
免疫応答の回避
本明細書に記載されるように、本発明のポリヌクレオチドの有用な特徴は、細胞の先天性免疫応答を低下させ、それから逃避しまたはそれを回避する能力である。一態様では、本明細書で提供されるのは、細胞に送達されると、例えば、本発明のポリヌクレオチドに対応する未修飾ポリヌクレオチドまたは本発明の異なるポリヌクレオチドなどの基準化合物によって引き起こされる応答と比較して、宿主からの免疫応答の低下をもたらす、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。本明細書の用法では、「基準化合物」は、哺乳類に投与されると、既知の程度、レベルまたは免疫刺激量を有する先天性免疫応答をもたらす、任意の分子または物質である。基準化合物は核酸分子でなくてもよく、それは本発明のポリヌクレオチドのいずれでなくてもよい。したがって、ポリヌクレオチドの回避、それからの逃避または免疫応答始動の失敗の尺度は、このような応答を始動することが知られている任意の化合物または物質に対する相対的な用語で表され得る。
【０７２１】
「先天性免疫応答」という用語は、一般にウイルス性または細菌起源である、外来性一本鎖核酸に対する細胞性応答を含み、それは、具体的にはインターフェロンであるサイトカインの発現と放出の誘導、および細胞死を内包する。本明細書の用法では、先天性免疫応答またはインターフェロン応答は、単細胞レベルで機能して、サイトカイン発現、サイトカイン放出、タンパク質合成の全体的な阻害、細胞ＲＮＡの全体的破壊、主要組織適合性分子の上方制御、および／またはアポトーシス死の誘導、アポトーシスに関与する遺伝子の遺伝子転写誘導、抗増殖、および先天性および適応性免疫細胞活性化を引き起こす。Ｉ型ＩＦＮによって誘導されるいくつかの遺伝子としては、ＰＫＲ、ＡＤＡＲ（ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ）、ＯＡＳ（２’，５’−オリゴアデニル酸シンセターゼ）、ＲＮａｓｅ  Ｌ、およびＭｘタンパク質が挙げられる。ＰＫＲおよびＡＤＡＲは、それぞれ、翻訳開始およびＲＮＡ編集の阻害をもたらす。ＯＡＳは、エンドリボヌクレアーゼＲＮａｓｅ  Ｌを活性化して、ｓｓＲＮＡを分解するｄｓＲＮＡ依存性シンセターゼである。
【０７２２】
いくつかの実施形態では、先天性免疫応答は、Ｉ型またはＩＩ型インターフェロンの発現を含んでなり、Ｉ型またはＩＩ型インターフェロンの発現は、本発明のポリヌクレオチドと接触されていない細胞からの対照と比較して、２倍を超えて増大しない。
【０７２３】
いくつかの実施形態では、先天性免疫応答は、１つまたは複数のＩＦＮシグネチャ遺伝子の発現を含んでなり、１つまたは複数のＩＦＮシグネチャ遺伝子の発現は、本発明のポリヌクレオチドと接触されていない細胞からの対照と比較して、３倍を超えて増大しない。
【０７２４】
いくつかの状況では、それは、細胞内の先天性免疫応答を排除するのに有利であり得る一方で、本発明は、投与に際して、このような応答を完全に排除することなく、インターフェロンシグナル伝達を含む、実質的に低下した（有意により少ない）免疫応答をもたらす、ポリヌクレオチドを提供する。
【０７２５】
いくつかの実施形態では、免疫応答は、基準化合物によって誘導される免疫応答と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、または９９．９％を超えて、より低い。免疫応答自体は、１型インターフェロンの発現または活性のレベル、またはＴｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８）などのインターフェロン調節遺伝子の発現を判定することで、測定されてもよい。先天性免疫応答の低下はまた、細胞集団への１つまたは複数の投与に続く、細胞死低下のレベルを測定することで測定され得て；例えば、細胞死は、基準化合物で観察された細胞死発生頻度と比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、または９５％を超えて、より少ない。さらに、細胞死は、ポリヌクレオチドと接触された細胞の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％未満、または０．０１％未満に影響を及ぼしてもよい。
【０７２６】
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、同一配列がある未修飾インビトロ合成ポリヌクレオチドまたは基準化合物よりも、免疫原性が有意により低い。本明細書の用法では、「免疫原性が有意により低い」は、免疫原性の検出可能な低下を指す。別の実施形態では、この用語は、免疫原性の倍の低下を意味する。別の実施形態では、この用語は、検出可能な免疫応答を始動させることなく、ポリヌクレオチドの有効量が投与され得るような低下を指す。別の実施形態では、この用語は、組換えタンパク質の発現を検出可能に低下させるのに十分な免疫応答を引き起こすことなく、ポリヌクレオチドが繰り返し投与され得るような低下を指す。別の実施形態では、この低下は、組換えタンパク質の検出可能な発現を排除するのに十分な免疫応答を引き起こすことなく、ポリヌクレオチドが繰り返し投与され得るような低下である。
【０７２７】
別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、その未修飾対応物または基準化合物よりも、免疫原性が２倍低い。別の実施形態では、免疫原性は、３倍低下される。別の実施形態では、免疫原性は、５倍低下される。別の実施形態では、免疫原性は、７倍低下される。別の実施形態では、免疫原性は、１０倍低下される。別の実施形態では、免疫原性は、１５倍低下される。別の実施形態では、免疫原性は、２倍低下される。別の実施形態では、免疫原性は、５０倍低下される。別の実施形態では、免疫原性は、１００倍低下される。別の実施形態では、免疫原性は、２００倍低下される。別の実施形態では、免疫原性は、５００倍低下される。別の実施形態では、免疫原性は、１０００倍低下される。別の実施形態では、免疫原性は、２０００倍低下される。別の実施形態では、免疫原性は、さらに２倍低下される。
【０７２８】
免疫原性を判定する方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１２、ＩＦＮα、ＴＮＦ−α、ランテス、ＭＩＰ−１αまたはβ、ＩＬ−６、ＩＦＮ−β、またはＩＬ−８）の分泌の測定、ＤＣ活性化マーカー（例えば、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、およびＣＤ８６）の発現の測定、または適応性免疫応答のためのアジュバントとして作用する能力の測定が挙げられる。
【０７２９】
本明細書で教示される修飾の組み合わせを含む、本発明のポリヌクレオチドは、それらを治療法として、より適切にする優れた性質を有してもよい。
当該技術分野の「全てまたは皆無」モデルは、ポリヌクレオチドの治療的有用性に関連した生物学的現象を説明するのには、非常に不十分であると評価されている。本発明者らは、タンパク質生成を改善するためには、修飾の性質、または修飾の組み合わせ、パーセント修飾を検討して、２つ以上のサイトカインまたは尺度を調査し、特定のポリヌクレオチドの有効性およびリスクプロファイルを判定してもよいと断定した。
【０７３０】
本発明の一態様では、未修飾ポリヌクレオチドとの比較で、ポリヌクレオチドの有効性を判定する方法は、その発現が本発明の外来性核酸の投与によって引き起こされる、１つまたは複数のサイトカインの測定および分析を伴う。これらの値は、未修飾核酸の投与、またはサイトカイン応答、ＰｏｌｙＩＣ、Ｒ−８４８またはその他の当該技術分野で公知の標準物質などの測定基準と比較される。
【０７３１】
本明細書で開発された標準的な測定基準の一例は、その発現が、修飾核酸の投与またはそれとの接触の結果として、細胞内、組織または生物内で引き起こされる、１つまたは複数（またはパネル）のサイトカインのレベルまたは量に対する、細胞、組織または生物内で生成されるコードされるポリペプチド（タンパク質）のレベルまたは量の比率の測定値である。このような比率は、本明細書で、タンパク質：サイトカイン比または「ＰＣ」比として言及される。ＰＣ比が高いほど、修飾核酸はより有効である（タンパク質をコードするポリヌクレオチドが測定された）。本発明のサイトカインによる好ましいＰＣ比は、１を超え、１０を超え、１００を超え、１０００を超え、１０，０００を超え、またはそれを超えてもよい。異なるまたは未修飾コンストラクトの修飾核酸よりも、さらに高いＰＣ比を有する修飾核酸が好ましい。
【０７３２】
ＰＣ比は、ポリヌクレオチドに存在するパーセント修飾によって、さらに資格を与えてもよい。例えば、１００％修飾核酸に対して正規化して、サイトカイン（またはリスク）またはサイトカインプロファイルの関数としてのタンパク質生成が判定され得る。
【０７３３】
一実施形態では、本発明は、修飾核酸（ポリヌクレオチド）のＰＣ比を比較することで、化学的性質、サイトカインまたはパーセント修飾の全体にわたり、任意の特定の修飾ポリヌクレオチドの相対的有効性を判定する方法を提供する。
【０７３４】
タンパク質生成の増大と免疫刺激能の低下を維持する、様々なレベルの核酸塩基置換を含有するポリヌクレオチドが生成され得る。その天然起源ヌクレオチド対応物に対する任意の修飾ヌクレオチドの相対百分率は、ＩＶＴ反応中に変動し得る（例えば、シチジンに対する、１００、５０、２５、１０、５、２．５、１、０．１、０．０１％の５メチルシチジンの使用；ウリジンに対する、１００、５０、２５、１０、５、２．５、１、０．１、０．０１％のプソイドウリジンまたはＮ１−メチル−プソイドウリジンの使用）。異なる比率を利用するポリヌクレオチドはまた、同一塩基に対する２つ以上の異なるヌクレオチドを使用しても生成され得る（例えば、異なる比率のプソイドウリジンおよびＮ１−メチル−プソイドウリジン）。ポリヌクレオチドはまた、２つ以上の「塩基」位置で、同時に、５メチルシチジン／シチジンおよびプソイドウリジン／Ｎ１−メチル−プソイドウリジン／ウリジンの比率などの混合比率で生成され得る。改変された修飾ヌクレオチド比を有する修飾ｍＲＮＡの使用は、化学修飾ヌクレオチドへの潜在的曝露を低減するのに有益であり得る。最後に、タンパク質生成または免疫刺激能のいずれかまたはその両方を調節するポリヌクレオチド内への修飾ヌクレオチドの位置的導入もまた想定される。このようなポリヌクレオチドが、これらの改善された性質を示す能力は、（本明細書に記載されるＰＢＭＣアッセイなどのアッセイを使用して）インビトロで評価され得、ポリヌクレオチドがコードするタンパク質生成およびサイトカインなどの内在的免疫認識媒介物の両方の
測定を通じて、インビボでもまた評価され得る。
【０７３５】
別の実施形態では、ポリヌクレオチドおよびその未修飾対応物の相対的免疫原性は、所与の量の未修飾ヌクレオチドまたは基準化合物同程度に、上記応答の１つを引き起こすのに必要なポリヌクレオチドの量を判定することで、判定される。例えば、同一反応を引き起こすのに２倍量のポリヌクレオチドが必要であれば、その場合、ポリヌクレオチドの免疫原性は未修飾ヌクレオチドまたは基準化合物よりも２倍低い。
【０７３６】
別の実施形態では、ポリヌクレオチドおよびその未修飾対応物の相対的免疫原性は、同一量の未修飾ヌクレオチドまたは基準化合物と比較して、ポリヌクレオチドの投与に応えて分泌されるサイトカイン（例えば、ＩＬ−１２、ＩＦＮα、ＴＮＦ−α、ランテス、ＭＩＰ−１αまたはβ、ＩＬ−６、ＩＦＮ−β、またはＩＬ−８）の量を判定することで、判定される。例えば、半量のサイトカインが分泌されれば、その場合、ポリヌクレオチドの免疫原性は、未修飾ヌクレオチドよりも２倍低い。別の実施形態では、上記方法で免疫原性が計算される前に、刺激のバックグラウンドレベルが減算される。
【０７３７】
細胞または細胞集団内の免疫応答の抗体価測定、低減または排除を実施する方法もまた、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、細胞は様々な用量の同一ポリヌクレオチドと接触されて、用量応答が評価される。いくつかの実施形態では、細胞は、同一であるかまたは異なる用量のいくつかの異なるポリヌクレオチドと接触されて、所望の効果を生じる最適組成物が判定される。免疫応答に関して、所望の効果は、細胞の免疫応答の回避、それからの逃避またはその低下であってもよい。所望の効果はまた、タンパク質生成効率の改変であってもよい。
【０７３８】
本発明のポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３００３４７５号パンフレットに記載される方法を使用して、免疫応答を低下させるのに使用されてもよい。
【０７３９】
天然に存在する変異体
別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、生物学的活性増大、患者予後改善、または保護機能などを含む、改善された疾患修飾活性を有する、天然に存在するタンパク質の変異型を発現するのに、利用され得る。多くこのような変更遺伝子が、哺乳類で記載される（全てその内容全体が参照により本明細書に援用される、ナドー（Ｎａｄｅａｕ）著、カレント・オピニオン・イン・ジェネティクス・アンド・デベロップメント（Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、２００３年、第１３号、ｐ２９０〜２９５；ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）およびユー（Ｙｕ）著、プロス・ジェネティクス（ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．）、２０１２年、第８巻、ｅ１００２６４４；コーダ（Ｃｏｒｄｅｒ）ら著、ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、１９９４年、第７巻、ｐ１８０〜１８４）。ヒトにおける例としては、アポＥ２タンパク質、アポＡ−Ｉ変異型タンパク質（アポＡ−Ｉミラノ、アポＡ−Ｉパリ）、機能亢進性第ＩＸ因子タンパク質（第ＩＸ因子パドアＡｒｇ３３８Ｌｙｓ）、トランスサイレチン変異体（ＴＴＲ  Ｔｈｒ１１９Ｍｅｔ）が挙げられる。ＡｐｏＥ２（ｃｙｓ１１２、ｃｙｓ１５８）の発現は、アルツハイマー病、および場合により心血管疾患などのその他の病状に対する感受性を低下させることで、その他のＡｐｏＥイソ型（ＡｐｏＥ３（ｃｙｓ１１２、ａｒｇ１５８）、およびＡｐｏＥ４（ａｒｇ１１２、ａｒｇ１５８））と比較して、保護を与えることが示されている（全てその内容全体が参照により本明細書に援用される、コーダ（Ｃｏｒｄｅｒ）ら著、ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、１９９４年、第７巻、ｐ１８０〜１８４セリパ（Ｓｅｒｉｐａ）ら著、リジュベネーション・リサーチ（Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．）、２０１１年、第１４巻、ｐ４９１〜５００；リュー（Ｌｉｕ）ら著、ネイチャー・レビュ
ーズ・ニューロロジー（Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｌ．）、２０１３年、第９巻、ｐ１０６〜１１８）。アポＡ−Ｉ変異型の発現は、コレステロールの低下と関連付けられている（全てその内容全体が参照により本明細書に援用される、デゴマ（ｄｅＧｏｍａ）およびラダー（Ｒａｄｅｒ）著、２０１１年、ネイチャー・レビューズ・カージオロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｃａｒｄｉｏｌ）、第８巻、ｐ２６６〜２７１；ニッセン（Ｎｉｓｓｅｎ）ら著、２００３年、米国医師会雑誌（ＪＡＭＡ）、第２９０巻、ｐ２２９２〜２３００）。特定集団におけるアポＡ−Ｉのアミノ酸配列は、アポＡ−Ｉミラノ（Ａｒｇ１７３がＣｙｓに変化）中で、およびアポＡ−Ｉパリ（Ａｒｇ１５１がＣｙｓに変化）中で、システインに変化している。Ｒ３３８Ｌ位（ＦＩＸパドア）における第ＩＸ因子変異は、約１０倍の活性増大を有する第ＩＸ因子タンパク質をもたらす（全てその内容全体が参照により本明細書に援用される、シミオニ（Ｓｉｍｉｏｎｉ）ら著、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．）、２００９年、第３６１巻、ｐ１６７１〜１６７５；フィン（Ｆｉｎｎ）ら著、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、２０１２年、第１２０巻、ｐ４５２１〜４５２３；カントレ（Ｃａｎｔｏｒｅ）ら著、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、２０１２年、第１２０巻、ｐ４５１７〜２０）。１０４または１１９位（Ａｒｇ１０４Ｈｉｓ、Ｔｈｒ１１９Ｍｅｔ）におけるトランスサイレチンの変異は、疾患を引き起こすＶａｌ３０Ｍｅｔ変異もまた保有する患者に、保護を提供することが示されている（全てその内容全体が参照により本明細書に援用される、サライバ（Ｓａｒａｉｖａ）、ヒューマン・ミューテーション（Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．）、２００１年、第１７巻、ｐ４９３〜５０３；トランスサイレチン変異データベースｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｂｍｃ．ｕｐ．ｐｔ／ｍｊｓａｒａｉｖａ／ｔｔｒｍｕｔ．ｈｔｍｌ）。Ｍｅｔ１１９およびＨｉｓ１０４変異をそれぞれ保有する、ポルトガル人および日本人のＭｅｔ３０患者における臨床症状と症状重症度の違いが、より高い安定性を分子に与える、非病原性変異体によって発揮された明らかな保護効果と共に観察された（全てその内容全体が参照により本明細書に援用される、コエリョ（Ｃｏｅｌｈｏ）ら著、１９９６年、ニューロマスキュラー・ディスオーダーズ（Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）（補遺）第６巻、Ｓ２０；テラザキ（Ｔｅｒａｚａｋｉ）ら著、１９９９年、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ）、第２６４巻、ｐ３６５〜３７０）。これらの保護的ＴＴＲ対立遺伝子をコードする修飾ｍＲＮＡは、ＴＴＲアミロイドーシス患者で発現され得、それによって病原性の変異ＴＴＲタンパク質の効果が低下される。
【０７４０】
低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、少なくとも１つの低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質またはその変異型をコードする。ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）らの図１４は、ＬＤＬＲの構造を示し（その内容全体が参照により本明細書に援用される、ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）ら著、ネイチャー・レビューズ・ドラッグ・ディスカバリー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）、２００８年１月、第７巻、ｐ８４〜９９の図４ａを参照されたい）、星印は、カルシウム結合によって安定化された領域を表す。ＬＤＬＲは、リガンド結合領域、表皮成長因子（ＥＧＦ：ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）様領域、β−プロペラ構造、グリコシル化領域、膜貫通ドメイン、および細胞質領域を含んでなる。受容体は、システインに富むリガンド結合領域の７反復、ＥＧＦ前駆体様の３反復、Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｐから構成される６枚羽根β−プロペラ構造、高度にグリコシル化された領域、膜貫通ドメイン、および情報伝達のためのＮＰＸＹモチーフを含有する小型細胞質ドメインからなる。
【０７４１】
ＬＤＬＲは、血中のコレステロール量を調節する上で重要な役割を果たす。ＬＤＬＲは、身体からの最多量の過剰なコレステロールの除去に関与する臓器である肝臓に特に豊富である。肝細胞表面のＬＤＬＲ数は、コレステロール（低密度リポタンパクの形態）が、
血流からどの程度迅速に除去されるかを決定する。ＬＤＬＲタンパク質変異体などの変異型は、遺伝型高コレステロールとしてもまた知られている、常染色体優性疾患家族性高コレステロール血症（ＦＨ）を引き起こし得る。
【０７４２】
ダニエルズ（Ｄａｎｉｅｌｓ）らの図１５に示されるように、ＬＤＬＲは、血流中の循環ＬＤＬを細胞内に輸送し、そこでＬＤＬは遊離コレステロールに分解されて、身体で使用され、貯蔵されおよび／またはそれから除去される（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、ダニエルズ（Ｄａｎｉｅｌｓ）ら著、インターナショナル・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・サイエンシズ（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ）、２００９年、第５巻、第５号、ｐ４７４〜４８８の図４を参照されたい）。次に受容体は、細胞表面に再循環される。欠陥ＬＤＬＲはＦＨをもたらして、アテローム性動脈硬化および心疾患のリスクを増大し得る。
【０７４３】
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、少なくとも１つの変異（例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現向上変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異）を含んでなる、少なくとも１つのＬＤＬＲタンパク質をコードする。ＬＤＬＲタンパク質は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個の変異を含んでもよい。変異は、ＬＤＬＲタンパク質の１つ、２つ、３つ、４つ、５つの異なるドメインまたは６つ以上の異なるドメインに位置してもよい。一態様では、１つまたは複数の変異は、ＬＤＬＲタンパク質の同一ドメインに位置してもよい。別の態様では、変異は、ＬＤＬＲの２つの異なるドメインに位置してもよい。変異が位置してもよいＬＤＬＲタンパク質のドメインの非限定的例としては、ＥＧＦ−Ａドメイン、細胞内ドメイン、およびＰＣＳＫ９相互作用ドメインが挙げられる。
【０７４４】
ＬＤＬＲタンパク質が２つ以上の変異を含んでなる一実施形態では、変異は、ＬＤＬＲタンパク質の同一ドメインに位置してもよく、またはＬＤＬＲタンパク質の異なるドメインに位置してもよい。非限定的例として、変異は、ＬＤＬＲタンパク質の細胞内ドメインに位置してもよい。別の非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質のＥＧＦ−Ａドメインがある。
【０７４５】
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、少なくとも１つの変異（例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現向上変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異）を含んでなる。
【０７４６】
ＬＤＬＲ変異体  −  ＥＧＦ−Ａドメイン
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ＬＤＬＲタンパク質のＥＧＦ−Ａドメイン中に、少なくとも１つの変異（例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現向上変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異）を含んでなる、少なくとも１つのＬＤＬＲタンパク質をコードする。非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質の細胞内ドメインは、配列ＧＴＮＥＣＬＤＮＮＧＧＣＳＨＶＣＮＤＬＫＩＧＹＥＣＬＣＰＤＧＦＱＬＶＡＱＲＲＣＥ（配列番号７１９）と、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％相同的な配列を含んでなってもよい。非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質の細胞内ドメインは、配列ＧＴＮＥＣＬＤＮＮＧＧＣＳＨＶＣＮＤＬＫＩＧＹＥＣＬＣＰＤＧＦＱＬＶＡＱＲＲＣＥ（配列番号７１９）を含んでなってもよい。一態様では、変異は、荷電側鎖、酸がある別の酸性アミノ酸による、荷電側鎖がある酸性アミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）の
置換であってもよい。非限定的例として、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）が、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）で置換されてもよい。別の態様では、変異は、荷電側鎖酸性アミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）による、疎水性側鎖脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシンまたはバリン）の置換であってもよい。非限定的例として、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）が、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）で置換されてもよい。さらに別の態様では、変異は、疎水性側鎖、脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシンまたはバリン）による、極性中性側鎖アミノ酸（例えば、アスパラギン、システイン、グルタミン、メチオニン、セリンまたはスレオニン）の置換であってもよい。非限定的例として、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）が、アラニン（Ａｌａ、Ａ）で置換されてもよい。別の態様では、変異は、疎水性側鎖脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシンまたはバリン）による、荷電側鎖酸性アミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）の置換であってもよい。非限定的例として、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）が、アラニン（Ａｌａ、Ａ）で置換されてもよい。
【０７４７】
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、少なくとも１つのヒトＬＤＬＲタンパク質をコードし、タンパク質は、配列番号４３であり、ＥＧＦ−Ａドメインは、配列番号４３のアミノ酸３１４からアミノ酸３５３と定義される。ＬＤＬＲタンパク質は、グルタミン酸による３３１位のアスパラギン酸の置換（Ｄ３３１Ｅと称される）、アスパラギン酸による３３９位のロイシンの置換（Ｌ３３９Ｄと称される）、アラニンによる３１６位のアスパラギンの置換（Ｎ３１６Ａと称される）、アラニンによる３１７位のグルタミン酸の置換（Ｅ３１７Ａと称される）またはそれらの組み合わせなどであるが、これに限定されるものではない、ＥＧＦ−Ａドメイン中の少なくとも１つの変異（例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異）を含んでもよい。非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質は、Ｄ３３１Ｅである、ＥＧＦ−Ａドメイン中の少なくとも１つの変異を含む。別の非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質は、Ｌ３３９Ｄである、ＥＧＦ−Ａドメイン中の少なくとも１つの変異を含む。なおも別の非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質は、Ｎ３１６Ａである、ＥＧＦ−Ａドメイン中の少なくとも１つの変異を含む。なおも別の非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質は、Ｅ３１７Ａである、ＥＧＦ−Ａドメイン中の少なくとも１つの変異を含む。別の非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質は、Ｄ３３１ＥおよびＬ３３１Ｄである、ＥＧＦ−Ａドメイン中の少なくとも１つの変異を含む。別の非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質は、Ｄ３３１ＥおよびＮ３１６Ａである、ＥＧＦ−Ａドメイン中の少なくとも１つの変異を含む。別の非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質は、Ｄ３３１ＥおよびＥ３１７Ａである、ＥＧＦ−Ａドメイン中の少なくとも１つの変異を含む。別の非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質は、Ｌ３３９ＤおよびＮ３１６Ａである、ＥＧＦ−Ａドメイン中の少なくとも１つの変異を含む。別の非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質は、Ｌ３３９ＤおよびＥ３１７Ａである、ＥＧＦ−Ａドメイン中の少なくとも１つの変異を含む。別の非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質は、Ｎ３１６ＡおよびＥ３１７Ａである、ＥＧＦ−Ａドメイン中の少なくとも１つの変異を含む。
【０７４８】
ＬＤＬＲ変異体  −  細胞内ドメイン
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ＬＤＬＲタンパク質の細胞内ドメイン中に、少なくとも１つの変異（例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異）を含んでなる、少なくとも１つのＬＤＬＲタンパク質をコードする。非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質の細胞内ドメインは、配列ＫＮＷＲＬＫＮＩＮＳＩＮＦＤＮＰＶＹＱＫＴＴＥＤＥＶＨＩＣＨＮＱＤＧＹＳＹＰＳＲＱＭＶＳＬＥＤＤＶＡ（配列番号７２０）と、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なく
とも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％相同的な配列を含んでなってもよい含んでなってもよい。非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質の細胞内ドメインは、配列ＫＮＷＲＬＫＮＩＮＳＩＮＦＤＮＰＶＹＱＫＴＴＥＤＥＶＨＩＣＨＮＱＤＧＹＳＹＰＳＲＱＭＶＳＬＥＤＤＶＡ（配列番号７２０）を含んでなってもよい含んでなってもよい。一態様では、変異は、別の荷電側鎖塩基性アミノ酸による、荷電側鎖塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン、リジン）の置換であってもよい。非限定的例として、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）が、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）で置換されてもよい。別の態様では、変異は、疎水性側鎖脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシンまたはバリン）による、極性中性側鎖アミノ酸（例えば、アスパラギン、システイン、グルタミン、メチオニン、セリンまたはスレオニン）の置換であってもよい。非限定的例として、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）が、アラニン（Ａｌａ、Ａ）で置換されてもよい。
【０７４９】
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、少なくとも１つのＬＤＬＲタンパク質をコードし、タンパク質は、配列番号４３であり、細胞内ドメインは、配列番号４３のアミノ酸８１１〜アミノ酸８６０と定義される。ＬＤＬＲタンパク質は、アルギニンによる８１１位のリジンの置換（Ｋ８１１Ｒと称される）、アルギニンによる８１６位のリジンの置換（Ｋ８１６Ｒと称される）、アルギニンによる８３０位のリジンの置換（Ｋ８３０Ｒと称される）、およびアラニンによる８３９位のシステインの置換（Ｃ８３９Ａと称される）などであるが、これに限定されるものではない、細胞内ドメイン中の少なくとも１つの変異（例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異）を含んでもよい。
【０７５０】
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ヒトＬＤＬＲタンパク質配列の細胞内ドメイン中に、２つの変異（例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異）を含んでなる、少なくとも１つのＬＤＬＲタンパク質をコードする。非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質は、細胞内ドメイン中に、変異Ｋ８３０ＲおよびＣ８３９Ａを含んでなる。別の非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質は、配列番号５４に示されるタンパク質配列を有し、細胞内ドメイン中に変異Ｋ８３０ＲおよびＣ８３９Ａを含んでなる。
【０７５１】
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ＬＤＬＲタンパク質の細胞内ドメイン中に、３つの変異（例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異）を含んでなる、少なくとも１つのＬＤＬＲタンパク質をコードする。非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質は、細胞内ドメイン中に、変異Ｋ８１６Ｒ、Ｋ８３０Ｒ、およびＣ８３９Ａを含んでなる。別の非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質は、配列番号５５に示されるタンパク質配列を有し、細胞内ドメイン中に変異Ｋ８１６Ｒ、Ｋ８３０Ｒ、およびＣ８３９Ａを含んでなる。
【０７５２】
ＬＤＬＲ変異体  −  ＥＧＦ−Ａドメインおよび細胞内ドメイン
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ＬＤＬＲタンパク質のＥＧＦ−Ａドメイン中の少なくとも１つの変異（例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異）と、細胞内ドメイン中の少なくとも１つの変異（例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異）とを含んでなる、少なくとも１つのＬＤＬＲタンパク質をコードする。
【０７５３】
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ＥＧＦ−Ａドメイン中の１つの変異（例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面変異におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異）と、細胞内ドメイン中の２つの変異（例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異）を含んでなる、少なくとも１つのＬＤＬＲタンパク質をコードする。非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質は、ＥＧＦ−Ａドメイン中に変異Ｎ３１６Ａを含んでなり、細胞内ドメインに変異Ｋ８３０ＲおよびＣ８３９Ａを含んでなる。別の非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質は、配列番号５０に示されるタンパク質配列を有し、ＥＧＦ−Ａドメインに変異Ｎ３１６Ａを含んでなり、細胞内ドメインに変異Ｋ８３０ＲおよびＣ８３９Ａを含んでなる。非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質は、ＥＧＦ−Ａドメイン中に変異Ｌ３３９Ｄ含んでなり、細胞内ドメインに変異Ｋ８３０ＲおよびＣ８３９Ａを含んでなる。別の非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質は、配列番号５２に示されるタンパク質配列を有し、ＥＧＦ−Ａドメインに変異Ｌ３３９Ｄを含んでなり、細胞内ドメインに変異Ｋ８３０ＲおよびＣ８３９Ａを含んでなる。
【０７５４】
別の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ＥＧＦ−Ａドメイン中の１つの変異（例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異）と、細胞内ドメイン中の３つの変異（例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異）を含んでなる、少なくとも１つのＬＤＬＲタンパク質をコードする。非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質は、ＥＧＦ−Ａドメイン中に変異Ｎ３１６Ａを含んでなり、細胞内ドメインに変異Ｋ８１６Ｒ、Ｋ８３０Ｒ、およびＣ８３９Ａを含んでなる。別の非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質は、配列番号５１に示されるタンパク質配列を有し、ＥＧＦ−Ａドメインに変異Ｎ３１６Ａを含んでなり、細胞内ドメインに変異Ｋ８１６Ｒ、Ｋ８３０Ｒ、およびＣ８３９Ａを含んでなる。非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質は、ＥＧＦ−Ａドメイン中に変異Ｌ３３９Ｄを含んでなり、細胞内ドメインに変異Ｋ８１６Ｒ、Ｋ８３０Ｒ、およびＣ８３９Ａを含んでなる。別の非限定的例として、ＬＤＬＲタンパク質は、配列番号５３に示されるタンパク質配列を有し、ＥＧＦ−Ａドメインに変異Ｌ３３９Ｄを含んでなり、細胞内ドメインに変異Ｋ８１６Ｒ、Ｋ８３０Ｒ、およびＣ８３９Ａを含んでなる。
【０７５５】
ＬＤＬＲ変異体  −  ＥＧＦ−ＡドメインおよびＰＣＳＫ９結合
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ＬＤＬＲタンパク質に、プロタンパク質コンバターゼサブチリシン／ケキシンタイプ９（ＰＣＳＫ９）結合の欠損を引き起こす、少なくとも１つの変異（例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異）をＥＧＦ−Ａドメイン中に含んでなる、少なくとも１つのＬＤＬＲタンパク質をコードする。ＰＣＳＫ−９の結合部位は、以前、ＬＤＬＲのＥＧＦ−Ａ（またはＥＧＦ様反復）ドメインに位置確認されている（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、クウォン（Ｋｗｏｎ）ら著、「ＰＣＳＫ９によるＬＤＬ受容体認識のための分子的基盤（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ＰＣＳＫ９）」、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、２００８年、第１０５巻、第６号、ｐ１８２０〜１８２５を参照されたい）。したがって、ＰＣＳＫ９結合欠損ＬＤＬＲは、コレステロールを肝実質細胞に運び込む。
【０７５６】
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ＰＣＳＫ９結合に欠損がある、少なくとも１つのＬＤＬＲタンパク質をコードする。非限定的例として、少なくと
も１つの変異（例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異）を含んでなってもよいＬＤＬＲタンパク質は、本明細書に記載されるようなＰＣＳＫ９結合欠損である。
【０７５７】
ＬＤＬＲ変異体  −  細胞内ドメインおよびＩＤＯＬ
別の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ＩＤＯＬ（モシン（ｍｏｓｉｎ）制御軽鎖結合タンパク質（ＭＹＬＩＰ：ｍｏｓｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｈｉｇｈ  ｃｈａｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）としてもまた知られている、ＬＤＬＲの誘導性分解因子）がＬＤＬＲを分解するのを妨げる、少なくとも１つの変異（例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異）を細胞内ドメイン中に含んでなる、少なくとも１つのＬＤＬＲタンパク質をコードする（例えば、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、ゼルサー（Ｚｅｌｃｅｒ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００９年、第３２５巻、第５９３６号、ｐ１００〜１０４；ソレンティノ（Ｓｏｒｒｅｎｔｉｎｏ）およびゼルサー（Ｚｅｌｃｅｒ）著、２０１２年、第２３巻、第３号、ｐ２１３〜２１９；およびザング（Ｚｈａｎｇ）ら著、ジャーナル・オブ・リピド・リサーチ（Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２０１３年、第５４巻、ｐ１４１０〜１４２０によって記載される細胞内ドメイン変異を参照されたい）。理論による拘束は望まないが、ＩＤＯＬは、膜貫通タンパク質の細胞質内ドメインとの相互作用を媒介する、バンド４．１およびエズリン／ラジジン（Ｒａｄｉｚｉｎ）／モエイシン（Ｍｏｅｉｓｉｎ）相同性（ＦＥＲＭ）ドメインを含有する。ＩＤＯＬはまた、Ｃ末端ＲＩＮＧドメインも含有して、Ｅ３−ユビキチンリガーゼの機能を果たすことが提案されている。
【０７５８】
ゼルサー（Ｚｅｌｃｅｒ）によると、ＬＤＬＲ細胞内ドメインは、ユビキチン化の潜在的部位である、３つの高度に保存されたリジンおよび１つのシステインを含有するが、これらの残基のいずれかの単一変異または３つのリジンの全ての変異は、ＩＤＯＬによるＬＤＬＲの分解を妨げなかった。ゼルサー（Ｚｅｌｃｅｒ）は、細胞内ドメインの未変化Ｋ２０または未変化Ｃ２９のいずれかが、ＩＤＯＬ媒介性分解に重要であったと記載した。ザング（Ｚｈａｎｇ）は、ユビキテーション（ｕｂｉｑｕｉｔａｔｉｏｎ）におけるリジン残基の利用法次第で、様々な結合特異的ユビキテーション（ｕｂｉｑｕｉｔａｔｉｏｎｓ）が起こり得、Ｋ４８およびＫ６８結合特異的ユビキチン化が、ポリユビキチン化の最も優勢な形態であると述べる。
【０７５９】
ＬＤＬＲ変異体  −  ＤＡＢ２結合欠損
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、結合が欠損して、ホモログ２、マイトジェン応答性リンタンパク質（ＤＡＢ２）を無力化してもよい。理論による拘束は望まないが、ＤＡＢ２結合欠損ＬＤＬＲは、ＤＡＢ２経路を通じたＬＤＬＲの内部移行を制限し、ひいてはＬＤＬＲ取り込みを低下させてもよい。
【０７６０】
ＬＤＬＲ変異体  −  ＮＰＸＹモチーフ
一実施形態では、ＬＤＬＲの被覆ピットを通じた迅速なエンドサイトーシスのためのシグナルを変更するために、ＬＤＬＲのＮＰＸＹモチーフが修飾されてもよい。ＮＰＸＹモチーフは、少なくとも１つの変異、少なくとも２つの変異、少なくとも３つの変異、少なくとも４つの変異、または５つ以上の変異を含んでなってもよい。非限定的例として、ＮＰＸＹモチーフは、ＬＤＬＲ配列のアミノ酸８２２からアミノ酸８２９を含んでなってもよい。別の非限定的例として、ＮＰＸＹモチーフは、配列ＮＦＤＮＰＶＹＱ（配列番号７２１）を含んでなってもよい。
【０７６１】
一実施形態では、ＬＤＬＲ配列は、ＮＰＸＹモチーフに変異を含まない。別の実施形態では、ＬＤＬＲ配列は、変異を含んでなってもよいが、変異は、ＬＤＬＲの８２２、８２６、８２７または８２８位になくてもよく、ＬＤＬＲのアミノ酸８２２からアミノ酸８２９は（配列番号７２１）で示される。
【０７６２】
ＬＤＬＲ変異体  −  ＮＰＸＹモチーフおよびＳＮＸ１７結合
別の実施形態では、ＬＤＬＲのＮＰＸＹモチーフが修飾されて、ＬＤＬＲのＮＰＸＹモチーフへのＳｏｒｔｉｎｇ  Ｎｅｘｉｎ１７（ＳＮＸ１７）の結合を低下させてもよい。受容体のエンドソームの再循環を調節するために、ＬＤＬＲのＮＰＸＹモチーフへのＳＮＸ１７の結合低下が使用されてもよい。
【０７６３】
一実施形態では、ＳＮＸ１７のＰＸドメイン（ＰＩ３Ｐ結合）は、少なくとも１つの変異を含んでなってもよい。少なくとも１つの変異は、ＬＤＬＲのＮＰＸＹモチーフにＳＮＸ１７が結合する能力を変化させ、ひいては受容体のエンドソーム再循環を調節してもよい。
【０７６４】
一実施形態では、ＳＮＸ１７のＦＥＲＭ様ドメインは、少なくとも１つの変異を含んでなってもよい。少なくとも１つの変異は、ＬＤＬＲのＮＰＸＹモチーフにＳＮＸ１７が結合する能力を変化させ、ひいては受容体のエンドソーム再循環を調節してもよい。
【０７６５】
一実施形態では、ＳＮＸ１７のＲａｓ結合ドメインは、少なくとも１つの変異を含んでなってもよい。少なくとも１つの変異は、ＬＤＬＲのＮＰＸＹモチーフにＳＮＸ１７が結合する能力を変化させ、ひいては受容体のエンドソーム再循環を調節してもよい。
【０７６６】
ＬＤＬＲ変異体およびリン酸化
一実施形態では、本明細書に記載されるＬＤＬＲ配列は、少なくとも１つのリン酸化されているアミノ酸を含んでなってもよい。非限定的例として、配列ＮＱＤＧＹＳＹＰＳＲ（配列番号７２２）中の少なくとも１つのアミノ酸が、リン酸化されてもよい。非限定的例として、配列番号７２２のＬＤＬＲの２つのチロシン（Ｙ）が、リン酸化されてもよい。別の非限定的例として、本明細書に記載されるＬＤＬＲ配列中の少なくとも１つのチロシン（Ｙ）が、リン酸化されてもよい。さらに別の非限定的例として、本明細書に記載されるＬＤＬＲの８４５位のチロシンおよび８４７位のチロシンがリン酸化される。
【０７６７】
一実施形態では、本明細書に記載されるＬＤＬＲ配列は、少なくとも１つのリン酸化されているアミノ酸を含んでなってもよいが、８２８位のチロシンはリン酸化されていない。
【０７６８】
別の実施形態では、本明細書に記載されるＬＤＬＲ配列は、少なくとも１つのリン酸化されているアミノ酸を含んでなってもよく、アミノ酸の少なくとも１つは８２８位のチロシンである。
【０７６９】
ＬＤＬＲ変異体  −  Ｃ末端変異型
一実施形態では、本明細書に記載されるＬＤＬＲ配列は、Ｃ末端配列ＬＥＤＤＶＡ（配列番号７）に、少なくとも１つのアミノ酸変異を含んでなってもよい。非限定的例として、配列番号７２３は、ＬＤＬＲ配列のアミノ酸８５５〜アミノ酸８６０であってもよい。
【０７７０】
ＬＤＬＲ変異体  −  Ｎ結合グリコシル化部位
一実施形態では、ＬＤＬＲ配列はＬＤＬＲ配列のＮ結合グリコシル化部位に、少なくとも１つの変異を含んでなってもよい。非限定的例として、少なくとも１つの変異は、アミノ酸９７、１５６、２７２、５１５および／または６５７に位置してもよい。
【０７７１】
別の一実施形態では、ＬＤＬＲ配列はＬＤＬＲ配列のＯ結合グリコシル化部位に、少なくとも１つの変異を含んでなってもよい。非限定的例として、少なくとも１つの変異は、アミノ酸７２１〜７６８に位置してもよい。
【０７７２】
さらに別の実施形態では、ＬＤＬＲ配列は、少なくとも１つの変異をＮ結合グリコシル化部位に、および少なくとも１つの変異をＯ結合グリコシル化部位に含んでなってもよい。
【０７７３】
ＬＤＬＲ変異体  −  ＬＤＬＲＡＰ１
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、低密度リポタンパク質受容体アダプタータンパク質１（ＬＤＬＲＡＰ１：ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｄａｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）への結合が欠損していてもよい。理論による拘束は望まないが、ＬＤＬＲＡＰ１結合欠損ＬＤＬＲは、ＬＤＬＲの結合および内部移行を制限し、ひいてはＬＤＬＲ取り込みを低下させてもよい。
【０７７４】
ＬＤＬＲ変異体  −  融合物
一実施形態では、本明細書に記載されるＬＤＬＲ配列およびコンストラクトのエクトドメインは、細胞質内ドメインと融合してもよい。非限定的例として、ＬＤＬＲエクトドメインは、葉酸受容体ＴＭ−細胞質内ドメインと融合してもよい。別の非限定的例として、ＬＤＬＲエクトドメインは、ＧＰＩ結合受容体ＴＭ−細胞質内ドメインと融合してもよい。
【０７７５】
ＬＤＬＲ変異体  −  表面−シグナル伝達促進変異
一実施形態では、ＬＤＬＲタンパク質は、少なくとも１つの変異（例えば、ＬＤＬＲ細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるＬＤＬＲ滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるＬＤＬＲレベル増大をもたらす変異）を含んでなって、ＬＤＬＲの表面発現を促進する。非限定的例として、少なくとも１つの変異は、ＥＧＦ−Ａドメイン、細胞内ドメイン、本明細書に記載されるＬＤＬＲのドメインまたは領域、またはそれらの組み合わせに位置する。非限定的例として、少なくとも１つの変異は、ＬＤＬＲの表面発現を促進するために、ＥＧＦ−Ａドメインおよび細胞内ドメインに位置する。
【０７７６】
病原性生物または病的細胞の標的化
本明細書で提供されるのは、細胞分裂阻害または細胞傷害性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用して、細菌、酵母、原虫、蠕虫などの病原性の微生物、またはがん細胞などの病的細胞を標的化する方法である。好ましくは導入されるｍＲＮＡは、標的病原性生物中で排他的にまたは優先的に翻訳されて、治療薬の可能なオフターゲット効果を低下させる、修飾ヌクレオシドまたはその他の核酸配列修飾を含有する。このような方法は、血液、精液、卵を含む任意の生物学的材料に、かつ胚組織および臓器を含む移植材料に見られる、病原性生物を除去し、または病的細胞を死滅させるのに有用である。
【０７７７】
バイオプロセシング
ポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドの生成方法は、細胞培養プロセスにおけるタンパク質生成物の収率を高めるために有用であってもよい。バイオプロセシング方法およびその使用は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレットの段落［０００９３４］〜［０００９４５］中などに記載される。
【０７７８】
細胞
一実施形態では、細胞は、哺乳類細胞、細菌細胞、植物、微生物、藻類、および真菌細
胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ウサギ、ハムスターまたはウシ細胞などであるが、これに限定されるものではない、哺乳類細胞である。さらなる実施形態では、細胞は、ＨｅＬａ、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＫＥＫ２９３Ｔ、Ｖｅｒｏ、Ｃａｃｏ、Ｃａｃｏ−２、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、Ｋ５６２、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＤＧ４４、ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＣＨＯ−Ｓ、Ｈｕｖｅｃ、ＣＶ−１、Ｈｕｈ−７、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３、Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＩＭＲ−９０、ＭＣＦ−７、Ｕ−２０Ｓ、Ｐｅｒ．Ｃ６、ＳＦ９、ＳＦ２１またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｅｒ  Ｏｖａｒｙ）細胞を含むが、これに限定されるものではない、確立された細胞系に由来してもよい。
【０７７９】
特定の実施形態では、細胞は、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）細胞、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞、タマホコリカビ属（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）細胞、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）細胞、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）細胞、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）細胞、およびペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）細胞などであるが、これに限定されるものではない、真菌細胞である。
【０７８０】
特定の実施形態では、細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、またはＢＬ２１細胞などであるが、これに限定されるものではない細菌細胞である。本発明の方法によって形質移入される初代および二次培養細胞は、多様な組織から入手され得、培養中で維持され得る全ての細胞型を含むが、これに限定されるものではない。例として、本発明の方法によって形質移入され得る初代および二次培養細胞としては、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞（例えば、乳腺上皮細胞、腸管上皮細胞）、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液の有形成分（例えばリンパ球、骨髄細胞）、筋肉細胞、およびこれらの体細胞型の前駆体が挙げられるが、これに限定されるものではない。初代細胞はまた、同一生物種ドナーから、または別の生物種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、鳥類、ヒツジ、ヤギ、ウマ）から入手されてもよい。
【０７８１】
精製および単離
当業者は、培養細胞から目的のタンパク質を精製または単離するために使用される方法を決定できるべきである。一般に、これは、親和性結合または非親和性精製を使用する捕捉方法を通じて実施される。目的のタンパク質が、培養細胞によって分泌されなければ、精製または単離の前に培養細胞の溶解が実施されるべきである。本発明では、細胞培養液成分、ならびに消泡剤化合物、およびその他の栄養素および補給剤、細胞、細胞残骸、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ウイルスなどの細胞培養添加剤と共に、目的のタンパク質を含有する非清澄化細胞培養液が使用されてもよい。工程は、バイオリアクター自体の中で実施されてもよい。流体は、ｐＨまたは温度またはその他の刺激特性などの所望の刺激に予備調整されてもよく、または流体は、ポリマーの添加時に調整され得、またはポリマーは、そのポリマーを流体中で可溶化させるのに必要な刺激条件の必須パラメータに適切に調整されたキャリヤ液に、添加され得る。ポリマーは、流体と共に完全に循環されてもよく、次に刺激（ｐＨ、温度、塩濃度、などの変化）が適用されてもよく、所望のタンパク質およびポリマーが溶液から析出され得る。ポリマーおよび所望のタンパク質は、流体の残りから分離され、任意選択的に１回または複数回洗浄され得、任意の捕捉されたまたは緩く結合する汚染物質が除去される。次に、所望のタンパク質が、例えば溶出などによって、ポリマーから回収されてもよい。好ましくは、溶出は、所望のタンパク質の選択された溶出中に、ポリマーがその沈殿形態に留まって任意の不純物をそれに保持するような、一連の条件下で実施されてもよい。ポリマーおよびタンパク質ならびに任意の不純物は、
水または緩衝溶液などの新規流体中で可溶化されてもよく、タンパク質は、ポリマーまたは不純物よりもタンパク質に対する優先度および選択性を有する、アフィニティ、イオン交換、疎水性、またはいくつかのその他のタイプのクロマトグラフィーなどの手段によって、回収されてもよい。溶出したタンパク質は、次に回収されてもよく、適切ならば、バッチ様工程または連続流動工程のいずれかで、追加的な処理工程を受けてもよい。
【０７８２】
別の実施形態では、それは、潜在的な目的の細胞系または細胞系コレクション中における特定のポリペプチド、特に、既知の活性を有する参照タンパク質のタンパク質変異型などの目的のポリペプチドの発現を最適化することが有用となり得る。一実施形態では、複数の標的細胞型を提供し、複数の標的細胞型のそれぞれをポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡと独立して接触させることにより、標的細胞内における目的のポリペプチド発現を最適化する方法が提供される。さらに、培養条件が、タンパク質生産効率を増大させるように変更されてもよい。引き続いて、複数の標的細胞型内における目的のポリペプチドの存在および／またはレベルが検出および／または定量化されて、効率的な標的細胞およびそれに関連する細胞培養条件の選択によって、目的のポリペプチドの発現が最適化できるようになる。このような方法は、目的のポリペプチドが、効率的なタンパク質生成を複雑にすることが多い、１つまたは複数の翻訳後修飾を含有して、または実質的三次構造を有する場合に、有用であってもよい。
【０７８３】
タンパク質回収
目的のタンパク質は、好ましくは、分泌ポリペプチドとして培養液から回収されてもよく、または分泌シグナルなしで発現される場合は、それは宿主細胞溶解産物から回収され得る。目的のタンパク質の実質的に均質な調製物が得られるような方法で、その他の組換えタンパク質および宿主細胞タンパク質から、目的のタンパク質を精製することが必要なこともある。細胞および／または微粒子細胞破片は、培養液または溶解産物から除去されてもよい。次に目的の生成物は、例えば、イムノアフィニティーまたはイオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、セファデックス（登録商標）クロマトグラフィー、シリカ上のまたはＤＥＡＥなどのカチオン交換樹脂上のクロマトグラフィーによって、汚染物質可溶性タンパク質、ポリペプチド、および核酸から精製されてもよい。宿主細胞によって異種発現されるタンパク質を精製する方法は、当該技術分野で周知である。
【０７８４】
本明細書に記載される方法および組成物は、哺乳類対象中において、内因性作動薬生物学的反応を軽減または遮断でき、および／または受容体またはシグナル伝達分子に拮抗できる、タンパク質を生成するのに使用されてもよい。例えば、多発性硬化症などの慢性自己免疫障害、および関節リウマチ、乾癬、紅斑性狼瘡、強直性脊椎炎およびクローン病などの炎症性疾患において、ＩＬ−１２およびＩＬ−２３受容体シグナル伝達が促進されてもよい（キクリー  Ｋ（Ｋｉｋｌｙ  Ｋ）、リュー  Ｌ（Ｌｉｕ  Ｌ）、ナー  Ｓ（Ｎａ
Ｓ）、セジウィック  ＪＤ（Ｓｅｄｇｗｉｃｈ  ＪＤ）著、カレント・オピニオン・イン・イムノロジー（Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、２００６年、第１８巻、第６号、ｐ６７０〜５）。別の実施形態では、核酸は、ケモカイン受容体の拮抗物質をコードする。ケモカイン受容体ＣＸＣＲ−４およびＣＣＲ−５は、宿主細胞へのＨＩＶ侵入に必要である（アレンザナ−セイスデドス  Ｆ（Ａｒｅｎｚａｎａ−Ｓｅｉｓｄｅｄｏｓ  Ｆ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９９６年１０月３日、第３８３号、第６５９９巻、ｐ４００）。
【０７８５】
遺伝子サイレンシング
本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、細胞集団内の１つまたは複数の標的遺伝子の発現をサイレンシング（すなわち、妨げまたは実質的に低下させる）のに有用である。ポリペプチドが翻訳されて、ヒストンＨ３メチル化および引き続くヘテロクロマチン形成
を通じて、標的遺伝子の遺伝子転写を低下させるような条件下で、配列特異的ヒストンＨ３メチル化を誘導できる目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、集団中の細胞内に導入される。いくつかの実施形態では、サイレンシング機序は、哺乳類対象中に存在する細胞集団上で実施される。非限定的例として、有用な標的遺伝子は、変異型ヤヌスキナーゼ−２ファミリーメンバーであり、変異標的遺伝子を発現する哺乳類対象は、異常なキナーゼ活性に起因する骨髄増殖性疾患に罹患している。
【０７８６】
ポリヌクレオチドおよびＲＮＡｉ剤の同時投与もまた、本明細書で提供される。
生物学的経路の調節
細胞内に装入された迅速翻訳ポリヌクレオチドは、標的生物学的経路を調節する望ましい機序を提供する。このような調節としては、所与の経路の拮抗作用または受容体活性化作用が挙げられる。一実施形態では、ポリヌクレオチドが細胞内に局在して、細胞内でポリヌクレオチドからポリペプチドが翻訳され得、ポリペプチドが生物学的経路内のポリペプチド機能の活性を阻害するような条件下で、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる組成物の有効量を細胞に接触させることで、細胞内において生物学的経路に拮抗するための方法が提供される。代表的生物学的経路は、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、紅斑性狼瘡、強直性脊椎炎大腸炎、またはクローン病などの自己免疫または炎症性疾患中で欠陥があるものであり；特に、ＩＬ−１２およびＩＬ−２３シグナル伝達経路の拮抗作用には、特定の効用がある。（キクリー  Ｋ（Ｋｉｋｌｙ  Ｋ）、リュー  Ｌ（Ｌｉｕ  Ｌ）、ナー  Ｓ（Ｎａ  Ｓ）、セジウィック  ＪＤ（Ｓｅｄｇｗｉｃｈ
ＪＤ）著、カレント・オピニオン・イン・イムノロジー（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、２００６年、第１８巻、第６号、ｐ６７０〜５を参照されたい）。
【０７８７】
さらに、提供されるのは、ケモカイン受容体の拮抗物質をコードするポリヌクレオチドであり；ケモカイン受容体ＣＸＣＲ−４およびＣＣＲ−５は、例えば、宿主細胞内へのＨＩＶ侵入に必要である（アレンザナ−セイスデドス  Ｆ（Ａｒｅｎｚａｎａ−Ｓｅｉｓｄｅｄｏｓ  Ｆ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９９６年１０月３日、第３８３号、第６５９９巻、ｐ４００）。
【０７８８】
あるいは、提供されるのは、核酸が細胞内に局在化して、細胞内で核酸から組換えポリペプチドが翻訳され得、組換えポリペプチドが生物学的経路内で機能性のポリペプチドの活性を誘導するような条件下で、組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの有効量を細胞に接触させることで、細胞内の生物学的経路を苦悶させる（ａｇｏｎｉｚｉｎｇ）方法である。代表的な苦悶する生物学的経路としては、細胞運命決定を調節する経路が挙げられる。このような苦悶は可逆的であり、またはあるいは、不可逆的である。
【０７８９】
細胞表面のリガンドまたは受容体の発現
本明細書に記載されるいくつかの態様および態様の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドが使用されて、細胞表面にリガンドまたはリガンド受容体（例えば、自動誘導部分）が発現され得る。細胞表面に付着したリガンドまたはリガンド受容体部分は、細胞が、インビボで、組織または薬剤との所望の生物学的相互作用を有することができるようにし得る。リガンドは、抗体、抗体断片、アプタマー、ペプチド、ビタミン、炭水化物、タンパク質またはポリペプチド、例えば細胞表面受容体などの受容体、接着分子、糖タンパク質、糖残基、治療薬、薬物、グリコサミノグリカン、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。例えば、リガンドは、がん細胞特異的抗原を認識する抗体であり得、細胞が腫瘍細胞と優先的に相互作用できるようにして、改変細胞が腫瘍特異的に局在化できるようにする。好ましいリガンドは、治療される組織の外面で標的分子と相互作用できてもよいため、リガンドは、治療される組織内に蓄積する能力を細胞組成物に与え得る。その他の組織との限定的交差反応性を有するリガンドが、一般的に好ましい。
【０７９０】
場合によっては、リガンドは、細胞を特定組織に標的化させまたは特定リガンドと相互作用させる、自動誘導部分として作用し得る。このような自動誘導部分としては、限定されることなく、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単一ドメイン抗体、ラクダ化抗体および抗体断片、ヒト化抗体および抗体断片、および前述の多価バージョンを含む、特定の結合対、抗体、モノクローナル抗体、またはそれらの誘導体またはアナログ；限定されることなく、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片などの単一特異性または二重特異性抗体、ｓｃＦｖタンデム（（ＳＣＦＶ）２断片）、典型的に共有結合しまたは別の方法で安定化された（すなわち、ロイシンジッパーまたはらせん安定化）ｓｃＦｖ断片である、二特異性抗体、三特異性抗体または四特異性抗体を含む、多価結合試薬；および例えば、アプタマー、受容体、および融合タンパク質を含むその他の自動誘導部分の任意のメンバーが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０７９１】
いくつかの実施形態では、自動誘導部分は、細胞標的化特異性の調整を可能にし得る表面結合抗体であってもよい。高度に特異的な抗体が、所望の標的化部位のために、目的のエピトープに対して生成され得ることから、これは特に有用である。一実施形態では、複数抗体が細胞表面に発現されて、各抗体は、所望の標的に対して異なる特異性を有し得る。このようなアプローチは、自動誘導相互作用の結合活性および特異性を増大させ得る。
【０７９２】
当業者は細胞の所望の局在性または機能に基づいて、任意の自動誘導部分を選択し得、例えば、タモキシフェンなどのエストロゲン受容体リガンドは、細胞表面にエストロゲン受容体数の増加を有するエストロゲン依存性乳がん細胞に、細胞を標的化し得る。リガンド／受容体相互作用のその他の非限定的例としては、ＣＣＲＩ（例えば、関節リウマチおよび／または多発性硬化症における炎症性の関節組織または脳の治療のための）、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８（例えば、リンパ節組織の標的化）、ＣＣＲ６、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０（例えば、腸管組織の標的化）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ１０（例えば、皮膚の標的化）、ＣＸＣＲ４（例えば、一般的な遊出増大のための）、ＨＣＥＬＬ（例えば、炎症および炎症性疾患、骨髄の治療のための）、アルファ４ベータ７（Ａｌｐｈａ４ｂｅｔａ７）（例えば、腸粘膜標的化のための）、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１（例えば、内皮の標的化）が挙げられる。一般に、標的化に関与する任意の受容体（例えば、がん転移）が、本明細書に記載される方法および組成物で使用するために利用され得る。
【０７９３】
細胞系の調節
標的哺乳類細胞中の細胞運命の改変を誘導する方法が提供される。標的哺乳類細胞は前駆細胞であってもよく、改変は、系統への分化を駆動し、またはこのような分化を阻止することを伴ってもよい。あるいは、標的哺乳類細胞は、分化した細胞であってもよく、細胞運命の改変としては、がん細胞のがん幹細胞への脱分化など、多能性前駆細胞への脱分化を駆動し、またはこのような脱分化を阻止することが挙げられる。細胞運命の変化が所望される状況では、細胞運命の改変が誘導されるような条件下で、細胞運命誘導性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの有効量が、標的細胞内に装入される。いくつかの実施形態では、修飾ｍＲＮＡは、細胞亜集団を第１の表現型から第２の表現型に再プログラムするのに有用である。このような再プログラム化は、一時的または恒久的であってもよい。任意選択的に、再プログラム化は、標的細胞が中間表現型を取るように誘導する。
【０７９４】
さらに、本発明の方法は、高い形質移入効率、細胞への再形質移入能力、および標的細胞内で生成される組換えポリペプチド量の維持の理由から、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を生成するのに特に有用である。さらに、本明細書に記載される方法を利用して生成されたｉＰＳ細胞の使用は、奇形腫形成発生率の低下を有することが予期される。
【０７９５】
標的細胞集団において、細胞分化を低下させる方法もまた提供される。例えば、ポリペプチドが翻訳されて前駆細胞の分化を低下させるような条件下で、１つまたは複数の前駆
細胞型を含有する標的細胞集団が、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの有効量を有する組成物に接触される。非限定的実施形態では、標的細胞集団は、哺乳類対象中の受傷組織、または外科手術の影響を受けた組織を含有する。例えば、前駆細胞は、間質前駆細胞、神経前駆細胞、または間葉前駆細胞である。
【０７９６】
特定の実施形態では、提供されるのは、１つまたは複数の分化因子Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ４をコードするポリヌクレオチドである。これらのｍＲＮＡが生成する因子は、線維芽細胞内に導入されて、心筋細胞への再プログラム化を駆動する。このような再プログラム化は、ｍＲＮＡ含有パッチまたはその他の素材に、損傷を受けた心臓組織を接触させて、心臓再生を促進することで、インビボで実施され得る。このようなプロセスは、線維症とは対照的に心筋細胞発生を促進する。
【０７９７】
細胞死の仲介
一実施形態では、ポリヌクレオチド組成物が使用されて、細胞死受容体、細胞死受容体リガンド、またはそれらの組み合わせの発現が増大されることで、細胞（例えば、がん細胞）内でアポトーシスが誘導され得る。組成物およびそれらの使用方法は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレットの段落［０００９６６］〜［０００９６９］中などに記載される。
【０７９８】
ＶＩ．キットおよび装置
キット
本発明は、好都合におよび／または効果的に本発明の方法を実施するための、多様なキットを提供する。典型的に、キットは、使用者が、対象の複数回治療を実施できるよう、および／または複数回実験を実施できるようにするのに、十分な量および／または数の構成要素を含んでなる。
【０７９９】
一態様では、本発明は、本発明の分子（ポリヌクレオチド）を含んでなるキットを提供する。一実施形態では、キットは、１つまたは複数の機能的抗体またはそれらの機能断片を含んでなる。
【０８００】
前記キットは、翻訳可能領域を含んでなる第１のポリヌクレオチドを含んでなるタンパク質生成のためのものであり得る。キットは、包装および取扱説明書および／または製剤組成物を形成するための送達剤をさらに含んでなってもよい。送達剤は、生理食塩水、緩衝液、リピドイドまたは本明細書で開示される任意の送達剤を含んでなってもよい。
【０８０１】
一実施形態では、緩衝溶液としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸塩および／またはＥＤＴＡが挙げられる。別の実施形態では、緩衝溶液としては、生理食塩水、２ｍＭカルシウム添加生理食塩水、５％スクロース、２ｍＭカルシウム添加５％スクロース、５％マンニトール、２ｍＭカルシウム添加５％マンニトール、乳酸リンゲル液、塩化ナトリウム、２ｍＭカルシウム添加塩化ナトリウム、およびマンノースが挙げられるが、これに限定されるものではない（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１２０２５８０４６号明細書を参照されたい）。さらなる実施形態では、緩衝溶液は沈殿されてもよく、またはそれは凍結乾燥されてもよい。各構成要素の量は、一貫性のある再現可能な高濃度生理食塩水または単純な緩衝液配合を可能にするように、変化させてもよい。構成要素はまた、一定時間にわたり、および／または多様な条件下で、緩衝溶液中の修飾ＲＮＡ安定性を増大させるために、変化させてもよい。一態様では、本発明は、標的細胞内に導入されると、翻訳可能領域によってコードされるタンパク質の所望量を生成するのに有効な量で提供される、翻訳可能領域を含んでなるポリヌクレオチド；細胞の先天性免疫応答を実質的に阻害するのに有効な量で提供される、阻害性核酸を含んでなる第２のポリヌクレオチド；および包装および取扱説明書を含んで
なる、タンパク質生成のためのキットを提供する。
【０８０２】
一態様では、本発明は、翻訳可能領域を含んでなるポリヌクレオチドと、包装および取扱説明書とを含んでなる、タンパク質生成のためのキットを提供し、ポリヌクレオチドは、細胞ヌクレアーゼによる分解の低下を示す。
【０８０３】
一態様では、本発明は、翻訳可能領域を含んでなるポリヌクレオチドと、第１の核酸の翻訳可能領域の翻訳に適する哺乳類細胞とを含んでなる、タンパク質生成のためのキットを提供し、ポリヌクレオチドは、細胞ヌクレアーゼによる分解の低下を示す。
【０８０４】
装置
本発明は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが組み込まれてもよい装置を提供する。これらの装置は、安定な製剤中に、ヒト患者などのそれを必要とする対象に即座に送達するのに利用できる製剤中に、ポリヌクレオチドを合成するための試薬を含有する。
【０８０５】
本明細書に教示される単一、複数または分割投薬計画に従って、投与のための装置が用いられて、本発明のポリヌクレオチドが送達されてもよい。このような装置は、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、２０１３年３月９日に出願された、国際出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／３００６２号明細書（代理人整理番号Ｍ３００）で教示される。
【０８０６】
細胞、臓器および組織への複数投与の当該技術分野で公知の方法および装置が、本発明の実施形態として本明細書で開示される方法および組成物と併用して使用するために、検討される。これらとしては、例えば、複数針を有する方法および装置、例えば管腔またはカテーテルを用いるハイブリッド装置、ならびに加熱、電流または放射線駆動機構を利用する装置が挙げられる。
【０８０７】
本発明によれば、これらの複数投与装置が使用されて、本明細書で検討される、単一、複数または分割用量が送達されてもよい。このような装置は、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、２０１３年３月９日に出願された、国際出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／３００６２号明細書（代理人整理番号Ｍ３００）で教示される。
【０８０８】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも３本の針によって、３つの異なる、任意選択的に隣接する部位に、同時に、または６０分以内に皮下または筋肉内投与される（例えば、４、５、６、７、８、９または１０個の部位への同時投与、または６０分以内の投与）。
【０８０９】
カテーテルおよび／または管腔を使用する方法および装置
カテーテルおよび管腔を使用する方法および装置が用いられて、本発明のポリヌクレオチドが、単一、複数または分割投与計画で投与されてもよい。このような方法および装置は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、２０１３年３月９日に出願された、国際出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／３００６２号明細書（代理人整理番号Ｍ３００）に記載される。
【０８１０】
電流を利用する方法および装置
電流を利用する方法および装置が用いられて、本明細書で教示される単一、複数または分割投与計画に従って、本発明のポリヌクレオチドが送達されてもよい。このような方法および装置は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、２０１３年３月９日に
出願された、国際出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／３００６２号明細書（代理人整理番号Ｍ３００）に記載される。
【０８１１】
ＶＩＩ．定義
本明細書の様々な箇所で、本開示の化合物の置換基が、群または範囲で開示される。本開示は、このような群および範囲のメンバーのありとあらゆる個々の下位組み合わせを含むことが、特に意図される。
【０８１２】
約：本明細書の用法では、「約」という用語は、列挙される値の＋／−１０％を意味する。
組み合わせ投与：本明細書の用法では、「組み合わせ投与」または「混合型投与」という用語は、２つ以上の薬剤が、対象に、同時に、または患者に対する各薬剤効果の重なりがあってもよいような間隔内に、投与されることを意味する。いくつかの実施形態では、それらは、互いに約６０、３０、１５、１０、５、または１分以内に投与される。いくつかの実施形態では、薬剤の投与は、コンビナトリアル（例えば、相乗的）効果が達成されるように、間隔が十分に接近している。
【０８１３】
アジュバント：本明細書の用法では、「アジュバント」という用語は、抗原に対する対象の免疫応答を促進する物質を意味する。
動物：本明細書の用法では、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、任意の発達期にあるヒトを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、任意の発達期にある非ヒト動物を指す。特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳類（例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、畜牛、霊長類、またはブタ）である。いくつかの実施形態では、動物としては、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、および蠕虫が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、動物は、遺伝子組換え動物、遺伝子改変動物、またはクローンである。
【０８１４】
抗原：本明細書の用法では、「抗原」という用語は、それぞれの抗体と特異的に結合する物質を指す。抗原は、本明細書で使用されるがん抗原などの身体由来、または例えば感染性因子などの外部環境由来のいずれであってもよい。
【０８１５】
目的の抗原または所望の抗原：本明細書の用法では、「目的の抗原」または「所望の抗原」という用語は、本明細書に記載される抗体およびそれらの断片、変異体、変異型、および改変によって、免疫特異的に結合される、本明細書で提供されるタンパク質およびその他の生体分子を含む。目的の抗原の例としては、インスリン；インスリン様成長因子；ｈＧＨ；ｔＰＡ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８などのサイトカイン；インターフェロン（ＩＦＮ：ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）α、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮωまたはＩＦＮτ；ＴＮＦαおよびＴＮＦβ、ＴＮＦγ、ＴＲＡＩＬなどの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ：ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）；Ｇ−ＣＳＦ、Ｇｍ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ；ＭＣＰ−１；およびＶＥＧＦが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０８１６】
およそ：本明細書の用法では、目的の１つまたは複数の値に適用される「およそ」または「約」という用語は、規定の基準値と類似した値を指す。特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、特に記載されまたは文脈から明らかでない限り、規定の基準値のいずれかの方向（上回るまたは下回る）で、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％
、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満の範囲内にある、一連の値を指す（このような数値が、可能な値の１００％を超える場合を除く）。
【０８１７】
結合（会合）される：本明細書の用法では、２つ以上の部分に対して使用される場合、「結合される」、「コンジュゲートされる」、「連結される」、「付着される」、および「係留される」という用語は、部分が、直接、または連結剤の役割を果たす１つまたは複数の追加的な部分を介してのいずれかで、互いに物理的に結合し（会合し）または結びついて、例えば生理的条件状などのその中で構造が使用される条件下で、部分が物理的に結合したままであるように、十分に安定した構造を形成することを意味する。「結合」は、厳密に、直接共有化学結合を介さなくてもよい。それはまた、「結合される」実体が、物理的に結合したままであるように十分安定した、イオン結合または水素結合またはハイブリダイゼーションベースの結合性を示唆してもよい。
【０８１８】
二機能性：本明細書の用法では、「二機能性」という用語は、少なくとも２つの機能を果たしまたは維持する、任意の物質、分子または部分を指す。機能は、同一結果または異なる結果をもたらしてもよい。機能を生じる構造は、同一であってもまたは異なっていてもよい。例えば、本発明の二機能性修飾ＲＮＡは、細胞傷害性ペプチドをコードしてもよい一方で（第１の機能）、コードするＲＮＡを含んでなるヌクレオシドは、それ自体で、およびそれ自体が、細胞傷害性である（第２の機能）。本実施例では、二機能性修飾ＲＮＡのがん細胞への送達は、がんを改善しまたは治療してもよいペプチドまたはタンパク質分子を生じるだけでなく、修飾ＲＮＡの翻訳の代わりに分解が起きた場合、ヌクレオシドの細胞傷害性ペイロードもまた細胞に送達する。
【０８１９】
生体適合性：本明細書の用法では、「生体適合性」という用語は、わずかまたは皆無の傷害、毒性または免疫系による拒絶反応リスクをもたらす、生きている細胞、組織、臓器またはシステムとの適合性を意味する。
【０８２０】
生分解性：本明細書の用法では、「生分解性」という用語は、生物の作用によって無害の生成物に分解され得ることを意味する。
生物活性：本明細書の用法では、「生物活性」という語句は、生体系および／または生物中で活性を有する、任意の物質の特性を指す。例えば、生物に投与されると、生物に対する生物学的効果を有する物質は、生物活性と見なされる。特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの一部だけでも生物活性であれば、または生物学的に関連したと見なされる活性を模倣すれば、生物活性と見なされてもよい。
【０８２１】
がん幹細胞：本明細書の用法では、「がん幹細胞」は、自己複製および／または異常な増殖および分化を経て、腫瘍を形成し得る細胞である。
キメラ：本明細書の用法では、「キメラ」は、２つ以上の不調和なまたは異種起源の部分または領域を有する実体である。
【０８２２】
キメラポリヌクレオチド：本明細書の用法では、「キメラポリヌクレオチド」は、サイズおよび／または化学修飾パターン、化学修飾位置、化学修飾パーセントまたは化学修飾数、および前述の組み合わせが異なる、部分または領域を有する核酸ポリマーである。
【０８２３】
化合物：本明細書の用法では、「化合物」という用語は、示される構造体の全ての立体異性体、幾何学的異性体、互変異性体、および同位体を含むことが意図される。
本明細書に記載される化合物は、非対称性であり得る（例えば、１つまたは複数の立体中心を有する）。特に断りのない限り、鏡像異性体およびジアステレオマーなどの全ての立体異性体が意図される。非対称的置換炭素原子を含有する本開示の化合物は、光学活性またはラセミ形態で単離され得る。ラセミ混合物分解、または立体選択的合成などによっ
て、光学活性出発原料から光学活性形態を調製する方法は、当該技術分野で公知である。オレフィン、Ｃ＝Ｎ二重結合などの多くの幾何学的異性体もまた、本明細書に記載される化合物中に存在し得、全てのこのような安定異性体が本開示で検討される。本開示の化合物のシスおよびトランス幾何異性体が記載され、異性体混合物としてまたは分離された異性体として、単離されてもよい。
【０８２４】
本開示の化合物はまた、互変異性形態も含む。互変異性形態は、単結合の隣接する二重結合との交換、および同時のプロトン移動から得られる。互変異性形態としては、プロトトロピー互変異性体が挙げられ、これは、同一実験式経験式および総電荷を有する、核異性プロトン付加状態である。プロトトロピー互変異性体例としては、ケトン−エノール対、アミド−イミド酸対、ラクタム−ラクチム対、アミド−イミド酸対、エナミン−イミン対、およびプロトンが、１Ｈ−および３Ｈ−イミダゾール、１Ｈ−、２Ｈ−および４Ｈ−１，２，４−トリアゾール、１Ｈ−および２Ｈ−イソインドール、および１Ｈ−および２Ｈ−ピラゾールなどの複素環系の２つ以上の位置を占有し得る環状形態が挙げられる。互変異性形態は、平衡状態にあり得、または適切な置換によって１つの形態に立体的にロックされ得る。
【０８２５】
本開示の化合物はまた、中間体または最終化合物中に現れる原子の全ての同位体も含む。「同位体」は、同一原子番号を有するが、異なる核内中性子数からもたらされる、異なる質量数を有する原子を指す。例えば、水素同位体としては、トリチウムおよび重水素が挙げられる。
【０８２６】
本開示の化合物および塩は、ルーチンの方法によって、溶媒和化合物および水和物が形成される溶剤または水分子との組み合わせで、調製され得る。
コミットした：本明細書の用法では、「コミットした」という用語は、細胞に言及する場合、細胞が分化経路に十分深く入り込んでおり、正常な状況下では、それが異なる細胞型に分化しまたは分化度の低い細胞型に復帰することなく特定の細胞型または細胞型小集団への分化を継続することを意味する。
【０８２７】
保存的：本明細書の用法では、「保存的」という用語は、それぞれ比較される２つ以上の配列の同一位置で未変化である、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を指す。比較的保存されたヌクレオチドまたはアミノ酸は、配列中の他の箇所に出現するヌクレオチドまたはアミノ酸よりもさらに関連性の高い配列間で保存されているものである。
【０８２８】
いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに１００％同一であれば、「完全に保存的」と言われる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一であれば、「高度に保存的」と言われる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％、約９８％、または約９９％同一であれば、「高度に保存的」と言われる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一であれば、「保存的」と言われる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、または約９９％同一であれば、「保存的」と言われる。配列の保存は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの全長に適用されてもよく、またはその部分、領域または特徴に適用されてもよい。
【０８２９】
放出制御：本明細書の用法では、「放出制御」という用語は、治療成績をもたらす特定の放出パターンと一致する、医薬組成物または化合物放出プロファイルを指す。
環式または環化：本明細書の用法では、「環式」という用語は、連続ループの存在を指す。環式分子は、連結してサブユニットの切れ目のない鎖を形成するのみで、環状でなくてもよい。本発明の操作されたＲＮＡまたはｍＲＮＡなどの環式分子は、単一単位または多量体であってもよく、または１つまたは複数の複合体構成要素またはより高次の構造を含んでなってもよい。
【０８３０】
細胞分裂阻害：本明細書の用法では、「細胞分裂阻害」は、細胞（例えば、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原虫、寄生生物、プリオン、またはそれらの組み合わせの増殖、分裂、または繁殖を阻害、低減、抑制することを指す。
【０８３１】
細胞傷害性：本明細書の用法では、「細胞傷害性」は、細胞（例えば、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原虫、寄生生物、プリオン、またはそれらの組み合わせを死滅させ、またはそれに傷害性、有毒、または致死性効果を引き起こすことを指す。
【０８３２】
送達：本明細書の用法では、「送達」は、化合物、物質、実体、部分、カーゴまたはペイロードを送達する作用または方法を指す。
送達剤：本明細書の用法では、「送達剤」は、ポリヌクレオチドの標的細胞へのインビボ送達を少なくともある程度容易にする、任意の物質を指す。
【０８３３】
不安定化：本明細書の用法では、「不安定（ｄｅｓｔａｂｌｅ）」、「不安定化」、または「不安定化領域」という用語は、同一領域または分子の出発、野生型または天然形態よりも不安定な領域または分子を意味する。
【０８３４】
検出可能標識：本明細書の用法では、「検出可能標識」は、Ｘ線検査、蛍光、化学発光、酵素活性、吸光度などを含む、当該技術分野で公知の方法によって容易に検出される別の実体に、付着し、組み込まれ、またはそれと結合する、１つまたは複数のマーカー、シグナル、または部分を指す。検出可能標識としては、放射性同位体、フルオロフォア、発色団、酵素、染料、金属イオン、ビオチンなどのリガンド、アビジン、ストレプトアビジンおよびハプテン、量子ドットなどが挙げられる。検出可能標識は、本明細書で開示されるペプチドまたはタンパク質中の任意の位置に位置してもよい。それらは、アミノ酸、ペプチド、またはタンパク質の内部にあってもよく、またはＮまたはＣ末端に位置してもよい。
【０８３５】
ジアステレオマー：本明細書の用法では、「ジアステレオマー」という用語は、互いに鏡像でなく、互いに重ね合わせることができない、立体異性体を意味する。
消化する：本明細書の用法では、「消化する」という用語は、より小型の小片または成分への切断を意味する。ポリペプチドまたはタンパク質に言及する場合、消化はペプチドの生成をもたらす。
【０８３６】
分化細胞：本明細書の用法では、「分化細胞」という用語は、その天然形態では多能性でない、任意の体細胞を指す。分化細胞はまた、部分的に分化した細胞も包含する。
分化：本明細書の用法では、「分化因子」という用語は、所望の細胞型への細胞の分化を引き起こし得る、タンパク質、ＲＮＡまたは小分子などの発達可能性改変因子を指す。
【０８３７】
分化する：本明細書の用法では、「分化する」は、非コミット細胞または低コミット細胞が、コミット細胞の特徴を獲得する過程を指す。
遠位：本明細書の用法では、「遠位」という用語は、中心から離れて、または目的の地
点または領域から離れて、位置していることを意味する。
【０８３８】
投与計画：本明細書の用法では、「投与計画」は、投与スケジュールであり、または医師が決定する、治療、予防、または対症療法ケアの計画である。
用量分割係数（ＤＳＦ：Ｄｏｓｅ  ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）−総一日用量または単一単位用量のＰＵＤで除した、用量分割療法のＰＵＤの比率。値は、投与計画群の比較から誘導される。
【０８３９】
鏡像異性体：本明細書の用法では、「鏡像異性体」という用語は、少なくとも８０％（すなわち、少なくとも９０％の１つの鏡像異性体および最大で１０％の別の鏡像異性体）、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９８％の光学的純度または鏡像体過剰率（当該技術分野の標準法による測定で）を有する、本発明の化合物の個々の光学活性形態を意味する。
【０８４０】
カプセル化する：本明細書の用法では、「カプセル化する」という用語は、封入し、取り囲みまたは包むことを意味する。
コード化タンパク質切断シグナル：本明細書の用法では、「コード化タンパク質切断シグナル」は、タンパク質切断シグナルをコードするヌクレオチド配列を指す。
【０８４１】
操作される：本明細書の用法では、本発明の実施形態は、それらが構造的または化学的を問わない、出発点、野性型または天然分子と異なる特徴または性状を有するように設計された場合に、「操作される」。
【０８４２】
有効量：本明細書の用法では、薬剤の「有効量」という用語は、例えば、臨床結果などの有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量であり、したがって「有効量」は、その中にそれが適用される文脈に左右される。例えば、高コレステロールを治療する薬剤を投与することに関連して、薬剤の有効量は、例えば、薬剤投与なしで得られる応答と比較して、本明細書で定義されるような高コレステロール治療を達成するのに十分な量である。
【０８４３】
エキソソーム：本明細書の用法では、「エキソソーム」は、ＲＮＡ分解に関与する、哺乳類細胞または複合体によって分泌される小胞である。
発現：本明細書の用法では、核酸配列の「発現」は、以下の事象の１つまたは複数を指す：（１）（例えば、転写による）ＤＮＡ配列からのＲＮＡテンプレートの生成；（２）（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、および／または３’末端プロセッシングによる）ＲＮＡ転写物のプロセッシング；（３）ＲＮＡのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳；および（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
【０８４４】
特徴：本明細書の用法では、「特徴」は、特性、性状、または特有の要素を指す。
製剤：本明細書の用法では、「製剤」は、少なくともポリヌクレオチドおよび送達剤を含む。
【０８４５】
断片：本明細書の用法では、「断片」は、部分を指す。例えば、タンパク質断片は、培養細胞から単離された完全長タンパク質を消化することで得られる、ポリペプチドを含んでなってもよい。
【０８４６】
機能的：本明細書の用法では、「機能的」生体分子は、それによって特徴付けられる性状および／または活性を示す形態の生体分子である。
相同性：本明細書の用法では、「相同性」という用語は、例えば、核酸分子間（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）および／またはポリペプチド分子間などの、ポ
リマー分子間の全体的な関連性を指す。いくつかの実施形態では、重合性分子は、それらの配列が、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であり、または類似していれば、互いに「相同的」と見なされる。「相同的」という用語は、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）間の比較を指す。本発明によれば、２つのポリヌクレオチド配列は、少なくとも１つの一続きの少なくとも約２０個のアミノ酸にわたり、それらがコードするポリペプチドが、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％にさえ至れば、相同的と見なされる。いくつかの実施形態では、相同的なポリヌクレオチド配列は、一続きの少なくとも４〜５個の一意に特定化されたアミノ酸をコードする能力によって、特徴付けられる。６０ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチド配列では、相同性は、一続きの少なくとも４〜５個の一意に特定化されたアミノ酸をコードする能力によって判定される。本発明によれば、タンパク質が、少なくとも１つの一続きの少なくとも約２０個のアミノ酸について、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％同一であれば、２つのタンパク質配列は相同的と見なされる。
【０８４７】
同一性：本明細書の用法では、「同一性」という用語は、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間などの、ポリマー分子間の全体的な関連性を指す。２つのポリヌクレオチド配列のパーセント同一性の計算は、例えば、２つの配列を最適比較目的で整列させることで実施され得る（例えば、最適アライメントのために第１のおよび第２の核酸配列の片方または両方にギャップを導入し得、非同一の配列は、比較目的で無視され得る）。特定の実施形態では、比較目的で整列される配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次に、対応するヌクレオチド配列部位のヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同一のヌクレオチドによって占有される場合、分子は、その位置において同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適アライメントのために導入する必要がある、ギャップ数と各ギャップ長とを考慮した、配列により共有される同一位置数の関数である。２つの配列間の配列の比較およびパーセント同一性の判定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。例えば、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、そのそれぞれが参照により本明細書に援用される、レスク，Ａ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編集、「コンピュータによる分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、オックスフォード大学出版、ニューヨーク、１９８８年；スミス，Ｄ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編集、「バイオコンピューティング：インフォマティクスおよびゲノムプロジェクツ（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９３年；フォン・ヘインジュ，Ｇ．（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．）著、「分子生物学における配列解析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年；グリフィン，Ａ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）およびグリフィン，Ｈ．Ｇ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）編集、「配列データのコンピュータ解析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ）」第１部、ヒュマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー、１９９４年；およびグリブスコブ，Ｍ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．）およびデブルー，Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）編集、「配列解析入門書（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ）」、Ｍ  ストックトン・プレス（Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９１年に記載されるものなどの方法を使用して、確認され得る。例えば、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ
４を使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている、メイヤーズ（Ｍｅｙｅｒｓ）およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）のアルゴリズム（コンピュータ・アプリケーションズ・イン・ザ・バイオサイエンシズ（ＣＡＢＩＯＳ）、１９８９年、第４巻、ｐ１１〜１７）を使用して、判定され得る。あるいは、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のギャッププログラムを使用して判定され得る。配列間のパーセント同一性を判定するために、一般に用いられる方法としては、参照により本明細書に援用される、カリロ，Ｈ．（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．）およびリップマン，Ｄ．（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．）、ＳＩＡＭジャーナル・オン・アプライド・マシマティクス（ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．）、１９８８年、第４８巻、ｐ１０７３で開示されるものが挙げられるが、これに限定されるものではない。同一性を判定する技術は、公的に利用可能なコンピュータプログラムで体系化される。２つの配列間の相同性を判定するための代表的コンピュータソフトウェアとしては、ＧＣＧプログラムパッケージ、デブルー，Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）ら著、ニュークレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９８４年、第１２巻、第１号、ｐ３８７、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ、アルチュール，Ｓ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）ら著、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．）、１９９０年、第２１５巻、ｐ４０３）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０８４８】
感染性因子：本明細書の用法では、「感染性因子」という語句は、感染症を生じることができる因子を意味する。
遺伝子の発現を阻害する：本明細書の用法では、「遺伝子の発現を阻害する」という語句は、遺伝子の発現産物量の低下を引き起こすことを意味する。発現産物は、遺伝子から転写されたＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であり得、または遺伝子から転写されたｍＲＮＡから転写されたポリペプチドであり得る。典型的に、ｍＲＮＡレベルの低下は、それから翻訳されるポリペプチドレベルの低下をもたらす。発現レベルは、ｍＲＮＡまたはタンパク質を測定する標準技術を使用して、判定されてもよい。
【０８４９】
感染性因子：本明細書の用法では、「感染性因子」は、ヒト、動物、植物または別の生きている生物において、新興伝染病、死亡またはその他の生物学的機能障害を引き起こし得る、生物工学の結果として操作されてもよい、任意の微生物、ウイルス、伝染性物質、または生物産物、またはこのような任意の微生物、ウイルス、伝染性物質、または生物産物の任意の天然起源成分またはバイオ工学処理成分を指す。
【０８５０】
インフルエンザ：本明細書の用法では、「インフルエンザ」または「流感」は、インフルエンザウイルス、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のＲＮＡウイルスによって引き起こされる、鳥類および哺乳類の感染症である。
【０８５１】
異性体：本明細書の用法では、「異性体」という用語は、本発明の任意の化合物の任意の互変異性体、立体異性体、鏡像異性体、またはジアステレオマーを意味する。本発明の化合物は、１つまたは複数のキラル中心および／または二重結合を有し得、したがって、二重結合異性体（すなわち、幾何学的Ｅ／Ｚ異性体）またはジアステレオマー（例えば、鏡像異性体（すなわち、（＋）または（−））またはシス／トランス異性体）などの立体異性体として存在することが、認識されている。本発明によれば、本明細書に示される化学構造、したがって本発明の化合物は、対応する立体異性体の全て、すなわち、ステレオマー的純粋形態（例えば、幾何学的純粋、鏡像異性的純粋、またはジアステレオマー的純粋）と、例えば、ラセミ体などの鏡像異性および立体異性混合物との両方を包含する。発明の化合物の鏡像異性および立体異性混合物は、典型的に、キラル相ガスクロマトグラフィー、キラル相高速液体クロマトグラフィー、化合物のキラル塩錯体としての結晶化、ま
たはキラル溶剤中の化合物の結晶化などの周知の方法によって、それらの構成要素鏡像異性体または立体異性体に分離され得る。鏡像異性体および立体異性体はまた、周知の非対称性合成法によって、ステレオマー的にまたは鏡像異性的に純粋な中間体、試薬、および触媒から入手され得る。
【０８５２】
インビトロ（試験管内）：本明細書の用法では、「インビトロ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、または微生物）内でなく、例えば、試験管または反応容器内、ペトリ皿などの細胞培養中などの人工環境内で起こる事象を指す。
【０８５３】
インビボ（生体内）：本明細書の用法では、「インビボ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、または微生物、あるいはその細胞もしくは組織）内で起こる事象を指す。
単離された：本明細書の用法では、「単離された」という用語は、それが結合される構成要素の少なくとも一部から分離された、物質または実体を指す（自然界または実験的状況を問わない）。単離された物質は、それらが結合していた物質に関して、様々なレベルの純度を有してもよい。単離された物質および／または実体は、それらが最初に結合されていた、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれを超える別の成分から分離されてもよい。いくつかの実施形態では、単離された薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％を超えて、または約９９％を超えて純粋である。本明細書の用法では、物質がその他の構成要素を実質的に含まなければ、それは「純粋」である。実質的に単離された：「実質的に単離された」は、その中でそれが形成されまたは検出される環境から、化合物が実質的に分離されていることを意味する。部分的分離としては、例えば、本開示の合物に富む組成物が挙げられる。実質的分離としては、重量基準で、本開示の化合物またはそれらの塩を少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％含有する組成物が挙げられる。化合物およびそれらの塩を単離する方法は、当該技術分野のルーチンである。
【０８５４】
ＩＶＴポリヌクレオチド：本明細書の用法では、「ＩＶＴポリヌクレオチド」は、インビトロ転写（ＩＶＴ）酵素的合成法のみを使用して生成されてもよい、直鎖ポリヌクレオチドである。
【０８５５】
ＬＤＬＲ関連疾患：本明細書の用法では、「ＬＤＬＲ関連疾患」または「ＬＤＬＲ関連障害」は、それぞれ、異常なＬＤＬＲ活性（例えば、活性低下または活性増大）に起因する疾患または障害を指す。非限定的例として、高コレステロール血症は、ＬＤＬＲ関連疾患である。
【０８５６】
リンカー：本明細書の用法では、「リンカー」は、例えば、１０〜１，０００個の原子などの一群の原子を指し、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、イオウ、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、およびイミンなどであるが、これに限定されるものではない、原子または化学基を含んでなり得る。リンカーは、第１の末端の核酸塩基または糖部分上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドに、例えば、第２の末端における検出可能薬または治療薬などのペイロードに、付着され得る。リンカーは、核酸配列中への組み込みを妨げないような十分な長さであってもよい。リンカーは、（例えば、２つ以上のキメラポリヌクレオチド分子またはＩＶＴポリヌクレオチエス（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｅｓ）の連結を通じた）ポリヌクレオチド多量体、またはポリヌクレオチドコンジュゲートの形成、ならびに本明細書に記載されるようなペイロード投与などの任意の有用な目的のために使用され得る。リンカーに組み込まれ得る化学基の例としては、そのそれぞれが、本明細書に記載されるように任意選択的に置換され得る、アルキル、アルケニル、アルキニル
、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、またはヘテロシクリルが挙げられるが、これに限定されるものではない。リンカーの例としては、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール（例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、またはテトラエチレングリコールなどのエチレンまたはプロピレングリコール単量体単位）、およびデキストランポリマーおよびその誘導体が挙げられるが、これに限定されるものではない。その他の例としては、例えば、還元剤または光分解を使用して切断され得る、ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）またはアゾ結合（−Ｎ＝Ｎ−）などのリンカー中の切断可能部分が挙げられるが、これに限定されるものではない。選択的に切断可能な結合の非限定的例としては、例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、またはその他の還元剤、および／または光分解の使用によって切断され得るアミド結合、ならびに例えば酸性または塩基性加水分解によって切断され得るエステル結合が挙げられる。
【０８５７】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位：本明細書の用法では、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位は、ｍｉＲＮＡの少なくとも「シード」領域がそれに結合する、核酸転写物のヌクレオチド位置または領域に相当する。
【０８５８】
修飾：本明細書の用法では「修飾」は、本発明の分子の変化した状態または構造を指す。分子は、化学的、構造的、および機能的を含む、多くの方法で修飾されてもよい。一実施形態では、本発明のｍＲＮＡ分子は、例えば、天然リボヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｇ、およびＣとの関わりで、非天然ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの導入によって修飾される。キャップ構造などの非標準のヌクレオチドは「修飾」と見なされないが、それらは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕリボヌクレオチドの化学構造とは異なる。
【０８５９】
粘液：本明細書の用法では、「粘液」は、粘稠でムチン糖タンパク質を含んでなる天然物質を指す。
天然起源：本明細書の用法では、「天然起源」は、人為的な補助なしに自然に存在することを意味する。
【０８６０】
中和抗体：本明細書の用法では、「中和抗体」は、その抗原と結合して、それが有する任意の生物学的活性を中和または無効化することで、細胞を抗原または感染性因子から守る抗体を指す。
【０８６１】
非ヒト脊椎動物：本明細書の用法では、「非ヒト脊椎動物」としては、野生および家畜化された生物種を含む、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）以外の全ての脊椎動物が挙げられる。非ヒト脊椎動物の例としては、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、畜牛、シカ、イヌ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、ラバ、ブタ、ウサギ、トナカイ、ヒツジ、水牛、およびヤクなどの哺乳類が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０８６２】
オフターゲット：本明細書の用法では、「オフターゲット」は、任意の１つまたは複数の標的、遺伝子、または細胞転写物に対する、任意の意図されない効果を指す。
オープンリーディングフレーム：本明細書の用法では、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、所定の読み枠内に終止コドンを含有しない配列を指す。
【０８６３】
作動可能に連結する：本明細書の用法では、「作動可能に連結する」という語句は、２つ以上の分子、コンストラクト、転写物、実体、部分などの間の機能的結合を指す。
任意選択的に置換される：本明細書では、「任意選択的に置換されるＸ」（例えば、任意選択的に置換されるアルキル）という形態の語句は、「Ｘ、式中、Ｘは任意選択的に置
換される」（例えば、「アルキル、式中、前記アルキルは任意選択的に置換される」）と均等であることが意図される。特徴「Ｘ」（例えば、アルキル）自体が任意選択的であると、意味することは意図されない。
【０８６４】
部分：本明細書の用法では、ポリヌクレオチドの「部分」または「領域」は、ポリヌクレオチドの全長に満たないポリヌクレオチドの任意の部分と定義される。
ペプチド：本明細書の用法では、「ペプチド」は、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長など、５０アミノ酸長以下である。
【０８６５】
パラトープ：本明細書の用法では、「パラトープ」は、抗体の抗原結合部位を指す。
患者：本明細書の用法では、「患者」は、治療を求めまたはそれを必要としていてもよく、治療を要求していてもよく、治療を受けており、治療を受けるであろう対象、または特別な疾患または病状について訓練を受けた専門家の介護下にある対象を指す。
【０８６６】
薬学的に許容可能：「薬学的に許容可能」という語句は、本明細書で、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー性応答がなく、またはその他の問題または合併症が、妥当な利点／リスク比で釣り合う、ヒトおよび動物の組織との接触で使用するのに適する、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために用いられる。
【０８６７】
薬学的に許容可能な賦形剤：「薬学的に許容可能な賦形剤」という語句は、本明細書の用法では、本明細書に記載される化合物以外で、患者において実質的に無毒および非炎症性の特性を有する、任意の成分（例えば、活性化合物を懸濁または溶解できるビヒクル）を指す。賦形剤としては、例えば、粘着防止剤、抗酸化剤、バインダー、コーティング、圧搾助剤、崩壊剤、染料（着色料）、皮膚軟化剤、乳化剤、増量剤（希釈剤）、皮膜形成剤またはコーティング、香味料、芳香剤、流動促進剤（流れ促進剤）、潤滑剤、保存料、印刷インク、吸着材、サスペンシング（ｓｕｓｐｅｎｓｉｎｇ）または分散剤、甘味料、および水和水が挙げられる。代表的賦形剤としては、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、α化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、滑石、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、およびキシリトールが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０８６８】
薬学的に許容可能な塩：本開示は、本明細書に記載される化合物の薬学的に許容可能な塩もまた含む。本明細書の用法では、「薬学的に許容可能な塩」は、開示される化合物の誘導体を指し、その中では、（例えば、遊離塩基を適切な有機酸と反応させることで）、既存の酸または塩基部分をその塩形態に変換させることで、親化合物が修飾される。薬学的に許容可能な塩の例としては、アミンなどの塩基性残基の無機または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩などが挙げられるが、これに限定されるものではない。典型的な酸付加塩としては、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプ
トン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、櫛状、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。典型的なアルカリ性またはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびにアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むが、これに限定されるものではない、無毒のアンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミンカチオンが挙げられる。本開示の薬学的に許容可能な塩としては、例えば、無毒の無機または有機酸から形成される、従来の親化合物の無毒の塩が挙げられる。本開示の薬学的に許容可能な塩は、従来の化学的方法によって、塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成され得る。一般に、このような塩は、水中または有機溶剤中または両者の混合物中で、これらの化合物の遊離酸または塩基形態と、化学量論的に適量の塩基または酸とを反応させることで調製され得て；一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。適切な塩の一覧は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、「レミントン薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１７版、マック・パブリッシング・カンパニー（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏｍｐａｎｙ）、ペンシルベニア州イーストン（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）、１９８５年、ｐ．１４１８；「薬用塩類：性質、選択、および用途（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ）」、Ｐ．Ｈ．シュタール（Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ）およびＣ．Ｇ．ワームース（Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ）編集、ワイリー−ＶＣＨ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ）、２００８年；およびベルジュ（Ｂｅｒｇｅ）ら著、ジャーナル・オブ・ファーマスーティカル・サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９７７年、第６６巻、ｐ１〜１９に見られる。
【０８６９】
薬学的に許容可能な溶媒和化合物：「薬学的に許容可能な溶媒和化合物」という用語は、本明細書の用法では、適切な溶剤の分子が結晶格子に組み込まれる、本発明の化合物を意味する。適切な溶剤は、投与される用量で生理学的に許容性である。例えば、溶媒和化合物は、有機溶媒、水、またはその混合物を含む溶液からの結晶化、再結晶化、または沈殿によって製剤化されてもよい。適切な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一、二、および三水和物）、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２−（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２−ピロリドン、安息香酸ベンジルなどである。水が溶剤である場合、溶媒和化合物は、「水和物」と称される。
【０８７０】
薬物動態：本明細書の用法では、「薬物動態」は、生きている生物に投与される物質の予定運命の判定に関する、分子または化合物の任意の１つまたは複数の性質を指す。薬物動態は、吸収、分布、代謝、および排泄の程度と速度を含む、いくつかの領域に分類される。これは、一般に、ＡＤＭＥと称され、（Ａ）吸収（Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）は、物質が血液循環に入る過程であり；（Ｄ）分布（Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）は、身体の体液および組織全体にわたる物質の分散または内転移であり；（Ｍ）代謝（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）（または生体内転換）は、親化合物の娘代謝産物への不可逆的変換であり；（Ｅ）
排泄（Ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ）（または排出）は、身体からの物質の排除を指す。稀には、いくつかの薬剤は、体組織内に不可逆的に蓄積される。
【０８７１】
物理化学的：本明細書の用法では、「物理化学的」は、物理的および／または化学的性質を意味し、またはそれに関する。
単位薬当たりポリペプチド（ＰＵＤ：Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｅｒ  ｕｎｉｔ  ｄｒｕｇ）：本明細書の用法では、ＰＵＤまたは単位薬当たり製品は、体液または組織中で測定される、通常は１ｍｇ、ｐｇ、ｋｇなどの（ポリペプチドなどの）製品である、総一日用量の細分化部分と定義され、通常は、体流中測定値で除したｐｍｏｌ／ｍＬ、ｍｍｏｌ／ｍＬなどの濃度で定義される。
【０８７２】
予防する：本明細書の用法では、「予防する」という用語は、感染症、疾患、障害および／または病状の発生を部分的にまたは完全に遅延させ；特定の感染症、疾患、障害、および／または病状の１つまたは複数の症状、特徴、または臨床徴候の発生を部分的にまたは完全に遅延させ；特定の感染症、疾患、障害、および／または病状の１つまたは複数の症状、特徴、または徴候の発生を部分的にまたは完全に遅延させ；感染症、特定の疾患、障害および／または病状からの進行を部分的にまたは完全に遅延させ；および／または感染症、疾患、障害、および／または病状に関連する病変を発生するリスクを低下させることを指す。
【０８７３】
プロドラッグ：本開示は、本明細書に記載される化合物のプロドラッグもまた含む。本明細書の用法では、「プロドラッグ」は、化学的または物理的変化に際して治療薬として作用する物質、分子または実体を賓述する形態にある、任意の物質、分子または実体を指す。プロドラッグは、何らかの方法で共有結合されまたは隔離されてもよく、哺乳類対象への投与前、投与時、または投与後に、活性薬剤成分を放出し、またはそれに変換される。プロドラッグは、ルーチン操作でまたはインビボのいずれかで、修飾が切断されて親化合物になるように、化合物中に存在する官能基を修飾することで、調製され得る。プロドラッグとしては、その中でヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、またはカルボキシル基が、任意の基に結合する化合物が挙げられ、任意の基は哺乳類対象に投与されると切断して、それぞれ、遊離ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、またはカルボキシル基が形成する。プロドラッグの調製および使用は、いずれもその内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｔ．ヒグチ（Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ）およびＶ．ステラ（Ｖ．Ｓｔｅｌｌａ）著、「（Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、米国化学会（Ａ．Ｃ．Ｓ．）シンポジウム・シリーズ第１４巻；および「医薬品設計における生体可逆的担体（Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ）」、エドワード  Ｂ．ロシェ（Ｅｄｗａｒｄ  Ｂ．Ｒｏｃｈｅ）編集、アメリカン・ファーマスーティカル・アソシエーション・アンド・ペルガモン・プレス（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年で考察される。
【０８７４】
増殖する：本明細書の用法では、「増殖する」という用語は、迅速に、成長、増殖または増大し、または成長、増殖または増大を引き起こすことを意味する。「増殖性」は、増殖する能力を有することを意味する。「抗増殖性」は、増殖特性に、対抗し、または不適当である性質を有することを意味する。
【０８７５】
前駆細胞：本明細書の用法では、「前駆細胞」という用語は、分化によってそれから生じ得る細胞と比較して、より大きな発生能を有する細胞を指す。
予防的：本明細書の用法では、「予防的」は、疾患の広がりを予防するために使用される、治療薬または行動方針を指す。
【０８７６】
予防法：本明細書の用法では、「予防法」は、健康を維持して、疾患の広がりを予防するために取られる手段を指す。「免疫フロフィラクシス（ｐｈｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」は、疾患の広がりを予防するために、能動的または受動的免疫を生じる手段を指す。
【０８７７】
タンパク質切断部位：本明細書の用法では、「タンパク質切断部位」は、アミノ酸鎖の制御される切断が、化学的、酵素的または光化学的手段によって達成され得る部位を指す。
【０８７８】
タンパク質切断シグナル：本明細書の用法では、「タンパク質切断シグナル」は、ポリペプチドを切断のためにフラグしまたは標識する、少なくとも１つのアミノ酸を指す。
目的のタンパク質：本明細書の用法では、「目的のタンパク質」または「所望のタンパク質」という用語は、本明細書で提供されるもの、およびそれらの断片、変異体、変異型、および改変を含む。
【０８７９】
隣接した：本明細書の用法では、「隣接した」という用語は、中心に、または目的の地点または領域に、より近く位置していることを意味する。
プソイドウリジン：本明細書の用法では、プソイドウリジンは、ヌクレオシドウリジンのＣ−グリコシド異性体を指す。「プソイドウリジンアナログ」は、プソイドウリジンの任意の修飾、変異型、イソ型または誘導体である。例えば、プソイドウリジンアナログとしては、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−プソイドウリジン、１−メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）、１−メチル−４−チオ−プソイドウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、３−メチル−プソイドウリジン（ｍ３Ψ）、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、２−メトキシ−４−チオ−プソイドウリジン、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３Ψ）、および２’−Ｏ−メチル−プソイドウリジン（Ψｍ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０８８０】
精製された：本明細書の用法では、「精製する」、「精製された」、「精製」は、実質的に純粋にすること、または望まれない成分、材料汚染、混和材料または不完全性を除去することを意味する。
【０８８１】
反復形質移入：本明細書の用法では、「反復形質移入」という用語は、同一細胞培養物へのポリヌクレオチドの複数回の形質移入を指す。細胞培養物は、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１４回、少なくとも１５回、少なくとも１６回、少なくとも１７回少なくとも１８回、少なくとも１９回、少なくとも２０回、少なくとも２５回、少なくとも３０回、少なくとも３５回、少なくとも４０回、少なくとも４５回、少なくとも５０回またはそれを超えて形質移入され得る。
【０８８２】
サンプル：本明細書の用法では、「サンプル」または「生物学的サンプル」という用語は、その組織、細胞または構成成分（例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜帯血、尿、膣液および精液を含むが、これに限定されるものではない体液）の部分集合を指す。サンプルは、例えば、血漿、血清、脊髄流体、リンパ液、皮膚の外的部分、呼吸器、腸管、および尿生殖路、涙、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、臓器を含むが、これに限定されるものではない、生物全体またはその組織、細胞または構成成分の部
分集合、またはその画分または一部から調製される、ホモジネート、溶解産物または抽出物をさらに含んでもよい。サンプルは、タンパク質または核酸分子などの細胞構成要素を含有してもよい、栄養ブロスまたはゲルなどの培地をさらに指す。
【０８８３】
シグナル：配列本明細書の用法では、「シグナル配列」という語句は、タンパク質の輸送または局在化を誘導し得る配列を指す。
単一単位用量：本明細書の用法では、「単一単位用量」は、１用量／１回／単一経路／単一接触点で、すなわち、単回投与事象で、投与される任意の治療薬の用量である。
【０８８４】
類似性：本明細書の用法では、「類似性」という用語は、例えば、ポリヌクレオチド分子間（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）および／またはポリペプチド分子間などの、ポリマー分子間の全体的な関連性を指す。ポリマー分子相互のパーセント類似性の計算は、当該技術分野で理解されるように、パーセント類似性計算は、保存的置換を考慮に入れること以外は、パーセント同一性の計算と同一方法で実施され得る。
【０８８５】
分割投与：本明細書の用法では、「分割投与」は、単一単位用量または総一日用量の２つ以上の用量への分配である。
安定：本明細書の用法では、「安定」は、反応混合物から有用な純度への単離を乗り切るのに十分に堅固で、好ましくは有効な治療薬に処方できる化合物を指す。
【０８８６】
安定化された：本明細書の用法では、「安定化する」、「安定化された」、「安定化領域」という用語は、安定にすること、または安定になることを意味する。
立体異性体：本明細書の用法では、「立体異性体」という用語は、化合物（例えば本明細書に記載される任意の式の化合物）が有してもよい、全ての想定される異なる異性体ならびに立体構造形態、特に基本的分子構造の全ての想定される立体化学的および立体構造的異性体、全てのジアステレオマー、鏡像異性体および／または配座異性体を指す。本発明のいくつかの化合物は、異なる互変異性形態で存在してもよく、後者は全て本発明の範囲内に含まれる。
【０８８７】
対象：本明細書の用法では、「対象」または「患者」という用語は、例えば、実験、診断、予防、および／または治療目的で、本発明による組成物が投与されてもよい、任意の生物を指す。典型的な対象としては、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、およびヒトなどの哺乳類）および／または植物が挙げられる。
【０８８８】
実質的に：本明細書の用法では、「実質的に」という用語は、目的の特性または性質の全てまたはほぼ全ての広がりまたは程度を示す、定性的状態を指す。生物学技術分野の当業者は、生物学的および化学的現象が、もしあったとしても、滅多に完了せずおよび／または完全性に進行せず、または絶対的結果を達成または回避しないことを理解するであろう。したがって本明細書では、「実質的に」という用語は、多くの生物学的および化学的現象において固有である、可能な完全性欠如を取り込むために使用される。
【０８８９】
実質的に均等：本明細書の用法では、用量間の倍数差に関して、用語は、プラス／マイナス２％を意味する。
実質的に同時：本明細書の用法では、複数の用量に関して、用語は、２秒間以内を意味する。
【０８９０】
罹患している：疾患、障害、および／または病状に「罹患している」個体は、疾患、障害、および／または病状の１つまたは複数の症状によって診断され、またはそれを示す。
罹患し易い：疾患、障害、および／または病状に「罹患し易い」個体は、疾患、障害、および／または病状の症状によって診断されず、および／またはそれを示さなくてもよい
が、疾患またはその症状を生じる性向を保有する。いくつかの実施形態では、疾患、障害、および／または病状（例えば、がん）に罹患し易い個体は、以下の１つまたは複数によって特徴付けられてもよい：（１）疾患、障害、および／または病状の発生に関連する、遺伝子変異；（２）疾患、障害、および／または病状の発生に関連する、遺伝子多形性；（３）疾患、障害、および／または病状に関連する、タンパク質および／または核酸の発現および／または活性の増大および／または低下；（４）疾患、障害、および／または病状の発生に関連する、嗜癖および／または生活習慣；（５）疾患、障害、および／または病状の家族歴；および（６）疾患、障害、および／または病状の発生に関連する微生物への曝露および／またはそれによる感染。いくつかの実施形態では、疾患、障害、および／または病状に罹患し易い個体は、疾患、障害、および／または病状を発生する。いくつかの実施形態では、疾患、障害、および／または病状に罹患し易い個体は、疾患、障害、および／または病状を発生しない。
【０８９１】
持続性放出：本明細書の用法では、「持続性放出」という用語は、特定時間にわたる放出速度に一致する、医薬組成物または化合物遊離プロファイルを指す。
合成：「合成」という用語は、人の手によって生産され、調製され、および／または製造されることを意味する。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたはその他の分子の合成は、化学的または酵素的であってもよい。
【０８９２】
標的細胞：本明細書の用法では、「標的細胞」は、目的の任意の１つまたは複数の細胞を指す。細胞は、試験管内（インビトロ）、生体内（インビボ）、原位置（ｉｎ  ｓｉｔｕ）または生物組織または臓器内に見られてもよい。生物は、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒト、および最も好ましくは患者であってもよい。
【０８９３】
治療薬：「治療薬」という用語は、対象に投与されると、治療、診断、および／または予防的効果を有し、および／または所望の生物学的および／または薬理学的効果を引き起こす、任意の薬剤を指す。
【０８９４】
治療有効量：本明細書の用法では、「治療有効量」という用語は、感染症、疾患、障害、および／または病状に罹患しているまたはそれに罹患し易い対象に投与されると、治療し、症状改善し、診断し、予防し、および／または感染症、疾患、障害、および／または病状の発生を遅延させるのに十分である、送達される因子（例えば核酸、薬剤、治療薬、診断薬、予防薬など）の量を意味する。
【０８９５】
治療的に有効な成果：本明細書の用法では、「治療的に有効な成果」という用語は、感染症、疾患、障害、および／または病状に罹患しているまたはそれに罹患し易い対象において、治療し、症状改善し、診断し、予防し、および／または感染症、疾患、障害、および／または病状の発生を遅延させるのに十分である成果を意味する。
【０８９６】
総一日用量：本明細書の用法では、「総一日用量」は、２４時間以内に投与されまたは処方される量である。それは、単一単位用量として投与されてもよい。
全能性：本明細書の用法では、「全能性」は、成体身体に見られる全ての細胞、ならびに胎盤を含む胚体外組織を生成する発生能がある細胞を指す。
【０８９７】
転写因子：本明細書の用法では、「転写因子」という用語は、例えば、転写の活性化または抑制によって、ＤＮＡのＲＮＡへの転写を制御するＤＮＡ結合タンパク質を指す。いくつかの転写因子は、単独で転写制御をもたらす一方で、他の転写因子は、その他のタンパク質と協調して作用する。いくつかの転写因子は、特定条件下で、転写を活性化し得、また抑制もし得る。一般に、転写因子は、標的遺伝子の調節領域内の特定のコンセンサス配列と高度に類似した、特異的標的配列または配列に結合する。転写因子は、単独で、ま
たはその他の分子との複合体中で、標的遺伝子の転写を制御してもよい。
【０８９８】
転写：本明細書の用法では、「転写」という用語は、細胞に外来性核酸を導入する方法を指す。形質移入の方法としては、化学的方法、物理的処理およびカチオン性脂質または混合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０８９９】
分化転換：本明細書の用法では、「分化転換」は、１タイプの分化した細胞が、識別特性を失い、それらの表現型をその他の完全に分化した細胞の表現型に変化させる能力を指す。
【０９００】
治療：本明細書の用法では、「治療」という用語は、特定の感染症、疾患、障害、および／または病状の１つまたは複数の症状または特徴を部分的にまたは完全に緩和し、改善し、好転させ、軽減し、発症を遅延させ、進行を阻害し、重症度を低下させ、および／または発生率を低下させることを指す。例えば、がんの「治療」は、腫瘍の生存、増殖、および／または広がりを阻害することを指してもよい。治療は、疾患、障害、および／または病状に関連する病変を生じるリスクを低下させる目的で、疾患、障害、および／または病状の徴候を示さない対象に、および／または疾患、障害、および／または病状の早期徴候のみを示す対象に、施されてもよい。
【０９０１】
未修飾：本明細書の用法では、「未修飾」は、任意の方法によって変化させる前の任意の物質、化合物または分子を指す。未修飾は、生体分子の野性型または天然形態を指してもよいが、常にそうでなくてもよい。分子は、一連の修飾を受けてもよく、それによって各修飾分子が、後続の修飾のための「未修飾」出発分子の役割を果たしてもよい。
【０９０２】
単能性：本明細書の用法では、「単能性」は、細胞に言及する場合、単一細胞系を生じることを意味する。
ワクチン：本明細書の用法では、「ワクチン」という語句は、特定の疾患に対する免疫を改善する生物学的製剤を指す。
【０９０３】
ウイルスタンパク質：本明細書の用法では、「ウイルスタンパク質」という語句は、ウイルス起源の任意のタンパク質を意味する。
均等物および範囲
当業者は、単に通例の実験法を使用して、本明細書に記載される本発明による特定の実施形態の多くの均等物を認識し、または見極めることができるであろう。本発明の範囲は、上の説明に限定されることは意図されず、むしろ添付の特許請求の範囲に記載される。
【０９０４】
別段の指示がありまたはさもなければ文脈から明白な場合を除いて、特許請求の範囲では、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」などの冠詞は、１つまたは２つ以上を意味してもよい。グループの１つまたは複数の構成要素間に「または」を含む特許請求の範囲または説明は、別段の指示がありまたはさもなければ文脈から明白な場合を除いて、１つ、２つ以上、または全てのグループ構成要素が存在し、用いられ、またはさもなければ所与の生成物または方法に関連する場合に、満たされると見なされる。本発明は、その中でグループの正確に１つの構成要素が、存在し、用いられ、またはさもなければ所与の生成物または方法に関連する、実施形態を含む。本発明は、その中で２つ以上の、または全てのグループ構成要素が、存在し、用いられ、またはさもなければ所与の生成物または方法に関連する実施形態を含む。
【０９０５】
「含んでなる（含む）」という用語は、限定がなく、追加的な要素またはステップの包含を容認するが、必ずしもそれを必要としないことが意図されることにもまた、留意されたい。したがって「含んでなる」という用語が本明細書で使用される場合、「からなる」
という用語もまた包含されて、開示される。
【０９０６】
範囲が示される場合、両端が包含される。さらに、特に断りのない限り、またはさもなければ文脈および当業者の理解から明白な場合を除いて、範囲として表される値は、本発明の異なる実施形態で、文脈上例外が明記されていない限り、範囲下限の単位の１０分の１まで、任意の特定値または記述される範囲内の部分的範囲を取り得るものと理解される。
【０９０７】
さらに、先行技術に含まれる本発明の任意の特定の実施形態は、任意の１つまたは複数の請求項から、明示的に排除されてもよいものと理解される。このような実施形態は、当業者に知られていると見なされるため、たとえ除外が本明細書で明示的に記載されていない場合でさえ、それらは除外されてもよい。本発明の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の核酸またはそれによってコードされるタンパク質；任意の製造方法；任意の使用方法など）は、先行技術の存在に関連があるかどうかに関わりなく、任意の理由で、任意の１つまたは複数の請求項から排除され得る。
【０９０８】
例えば、本明細書で引用される参照、文献、データベース、データベース入力項目、および技巧などの全ての引用される情報源は、引用中に明示的に記述されない場合でさえも、参照により本出願に援用される。引用される出典と本出願の記述が矛盾する場合は、本出願の記述が効力を持つものとする。
【０９０９】
セクションおよび表見出しは、限定を意図しない。
（実施例）
実施例１．ポリヌクレオチドの製造
本発明によれば、ポリヌクレオチドおよびまたはそれらの部分または領域の製造は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、２０１３年３月１５日に出願された、「ＲＮＡ転写物の生成のための製造法（Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ）」という名称の米国特許出願第６１／８００，０４９号明細書（代理人整理番号Ｍ５００）で教示される方法を使用することで、達成されてもよい。
【０９１０】
精製法として、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、２０１３年３月１５日に出願された、「ｍＲＮＡ製造中にＤＮＡ断片を除去する方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｒｅｍｏｖｉｎｇ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｍＲＮＡ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）」という名称の米国特許出願第６１／７９９，８７２号明細書（代理人整理番号Ｍ５０１）；２０１３年３月１５日に出願された、「リボ核酸精製（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」という名称の米国特許出願第６１／７９４，８４２号明細書（代理人整理番号Ｍ５０２）で教示されるものが挙げられる。
【０９１１】
ポリヌクレオチドを検出および特性決定する方法は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、２０１３年３月１５日に出願された、「ｍＲＮＡ分子の特性決定（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）という名称の米国特許出願第６１／７９８，９４５号明細書（代理人整理番号Ｍ５０５）で教示されるように実施されてもよい。
【０９１２】
本発明のポリヌクレオチドの特性決定は、ポリヌクレオチドマッピング、逆転写酵素配列決定、電荷分布分析、およびＲＮＡ不純物検出からなる群から選択される手順を使用して達成されてもよく、特性決定するステップは、ＲＮＡ転写物配列を決定するステップ、ＲＮＡ転写物の純度を判定するステップ、またはＲＮＡ転写物の電荷不均一性を判定するステップを含んでなる。このような方法は、例えば、それぞれその内容全体が参照により
本明細書に援用される、２０１３年３月１５日に出願された、「ｍＲＮＡ不均一性および安定性の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）」という名称の米国特許出願第６１／７９９，９０５号明細書（代理人整理番号Ｍ５０６）；および２０１３年３月１５日に出願された、「ｍＲＮＡのイオン交換精製（Ｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ）」という名称の米国特許出願第６１／８００，１１０号明細書（代理人整理番号Ｍ５０７）で教示される。
【０９１３】
実施例２．キメラポリヌクレオチド合成：三リン酸経路
序論
本発明によれば、三リン酸化学反応を使用して、キメラポリヌクレオチドの２つの領域または部分が、連結またはライゲートされてもよい。
【０９１４】
この方法に従って、５’一リン酸および末端３’脱ＯＨまたはブロックＯＨを用いて、１００個以下のヌクレオチドの第１の領域または部分が化学的に合成される。領域が８０ヌクレオチドより長い場合、それはライゲーションのための２本の鎖として合成されてもよい。
【０９１５】
第１の領域または部分が、インビトロ転写（ＩＶＴ）を使用して、非位置的に修飾された領域または部分として合成される場合、引き続く３’末端のキャッピングによる５’一リン酸の変換が続いてもよい。
【０９１６】
一リン酸保護基は、当該技術分野で公知のもののいずれかから、選択されてもよい。
キメラポリヌクレオチド第２の領域または部分は、化学合成法またはＩＶＴ法のいずれかを使用して、合成されてもよい。ＩＶＴ法は、修飾キャップがあるプライマーを使用し得る、ＲＮＡポリメラーゼを含んでもよい。あるいは、８０ヌクレオチドまでのキャップが化学的に合成されて、ＩＶＴ領域または部分と連結されてもよい。
【０９１７】
ライゲーション法であるＤＮＡＴ４リガーゼによるライゲーションとそれに続くＤＮＡｓｅによる処置が、連結を容易に回避するはずであることに留意されたい。
キメラポリヌクレオチド全体が、リン酸−糖主鎖と共に、製造されなくてもよい。領域または部分の１つがポリペプチドをコードする場合、このような領域または部分は、リン酸エステル−糖主鎖を含んでなることが好ましい。
【０９１８】
次に任意の既知のクリックケミストリー、オルトクリック（ｏｒｔｈｏｃｌｉｃｋ）ケミストリー、ソリュリンク（ｓｏｌｕｌｉｎｋ）、または当業者に知られているその他のバイオコンジュゲートの化学的性質を使用して、ライゲーションが実施される。
【０９１９】
合成経路
キメラポリヌクレオチドは、一連の出発断片を使用して作られる。このような断片としては、
（ａ）正常３’ＯＨを含んでなる、キャッピングされ保護された５’断片（ＳＥＧ．１）、
（ｂ）ポリペプチドのコード領域を含んでもよく、正常３’ＯＨを含んでなる、５’三リン酸断片（ＳＥＧ．２）、
（ｃ）コルジセピンを含んでなりまたは３’ＯＨを含まない、キメラポリヌクレオチドの３’末端（例えばテール）のための５’一リン酸断片（ＳＥＧ．３）
が挙げられる。
【０９２０】
合成（化学的またはＩＶＴ）後、断片３（ＳＥＧ．３）は、コルジセピン、次にピロホ
スファターゼで処置されて、５’一リン酸が生成される。
次にＲＮＡリガーゼを使用して、断片２（ＳＥＧ．２）がＳＥＧ．３にライゲートされる。次にライゲートポリヌクレオチドが精製されて、ピロホスファターゼで処置され、二リン酸が切断される。次に処置されたＳＥＧ．２−ＳＥＧ．３コンストラクトが精製されて、ＳＥＧ．１が５’末端にライゲートされる。キメラポリヌクレオチドのさらなる精製ステップが実施されてもよい。
【０９２１】
キメラポリヌクレオチドポリペプチドをコードする場合、ライゲートまたは連結断片は、５’ＵＴＲ（ＳＥＧ．１）、オープンリーディングフレームまたはＯＲＦ（ＳＥＧ．２）、および３’ＵＴＲ＋ポリＡ（ＳＥＧ．３）として表されてもよい。
【０９２２】
各ステップの収率は、９０〜９５％程度であってもよい。
実施例３．ｃＤＮＡ生成のためのＰＣＲ
ｃＤＮＡ調製のためのＰＣＲ手順は、マサチューセッツ州ウォーバーン（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）のカパ・バイオシステムズ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の２×ＫＡＰＡ
ＨＩＦＩ（商標）ホットスタート・レディミックス（ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ）を使用して実施される。このシステムは、２×ＫＡＰＡレディミックス（ＲｅａｄｙＭｉｘ）１２．５μｌ；順方向プライマー（１０μｍ）０．７５μｌ；逆方向プライマー（１０μｍ）０．７５μｌ；テンプレートｃＤＮＡ−１００ｎｇを含み、ｄＨ２０で２５．０μｌに希釈される。反応条件は、９５℃で５分間、９８℃で２０秒間を２５サイクル、次に５８℃で１５秒間、次に７２℃で４５秒間、次に７２℃で５分間、次に４℃で終結する。
【０９２３】
本発明の逆方向プライマーは、ｍＲＮＡ中に、ポリ−Ａ１２０のためのポリ−Ｔ１２０を組み込む。より長いまたはより短いポリ（Ｔ）配列があるその他の逆方向プライマーが使用されて、ポリヌクレオチドｍＲＮＡ中のポリ（Ａ）テールの長さが調節され得る。
【０９２４】
反応物は、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ＰＣＲマイクロキットを使用して、製造会社の使用説明書に従って清浄にされる（最高５μｇ）。より大規模の反応では、より大容量の製品を使用した精製が必要になる。精製に続いて、ナノドロップ（ＮＡＮＯＤＲＯＰ）（商標）を使用してｃＤＮＡが定量化され、アガロースゲル電気泳動法によって分析されて、ｃＤＮＡが予想サイズであることが確認される。次に、インビトロ転写反応に進む前に、ｃＤＮＡが配列解析される。
【０９２５】
実施例４．インビトロ転写（ＩＶＴ）
インビトロ転写反応は、均一に修飾されたポリヌクレオチドを含有するポリヌクレトディズ（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｔｏｄｉｅｓ）を生じる。このような均一に修飾されたポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの領域または部分を含んでなってもよい。供試ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）混合物は、天然および非天然ＮＴＰを使用してイン・ハウス作成される。
【０９２６】
典型的なインビトロ転写反応物は、
１  １．０μｇのテンプレートｃＤＮＡ、
２  ２．０μｌの１０×転写緩衝液（４００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１９０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのスペルミジン）、
３  ７．２μｌのカスタムＮＴＰ（各２５ｍＭ）、
４  ２０ＵのＲＮａｓｅ阻害剤、
５  ３０００ＵのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、
６  最大２０．０μｌのｄＨ２０
を含み、および
７  ３７℃で３〜５時間インキュベーションされる。
【０９２７】
粗製ＩＶＴ混合物は、翌日の精製のために４℃で一晩保存されてもよい。次に１ＵのＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅが使用されて、元のテンプレートが消化される。３７℃で１５分間のインキュベーション後、ｍＲＮＡは、テキサス州オースティン（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）のアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）のメガクリア（ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ）（商標）キットを使用して、製造会社の使用説明書に従って精製される。このキットは、５００μｇまでのＲＮＡを精製し得る。精製に続いて、ＲＮＡはナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を使用して定量化され、アガロースゲル電気泳動法によって分析されて、ＲＮＡが適切なサイズであり、ＲＮＡ分解が起きていないことが確認される。
【０９２８】
実施例５．酵素的キャッピング
ポリヌクレオチドのキャッピングは、以下のようにして実施され、混合物は、６０μｇ〜１８０μｇのＩＶＴ  ＲＮＡおよび７２μに満たす量のｄＨ２０を含む。混合物は６５℃で５分間インキュベートされ、ＲＮＡが変性されて、次に即座に氷に移動される。
【０９２９】
次にプロトコルは、１０×キャッピング緩衝液（０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭのＫＣｌ、１２．５ｍのＭＭｇＣｌ２）（１０．０μｌ）；２０ｍのＭＧＴＰ（５．０μｌ）；２０ｍＭのＳ−アデノシルメチオニン（２．５μｌ）；ＲＮａｓｅ阻害剤（１００Ｕ）；２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（４００Ｕ）；ワクシニアキャッピング酵素（グアニリルトランスフェラーゼ）（４０Ｕ）；ｄＨ２０（２８μｌまで）を混合し、６０μｇのＲＮＡでは３７℃で３０分間、または１８０μｇのＲＮＡでは最大２時間インキュベーションすることを伴う。
【０９３０】
次にポリヌクレオチドは、テキサス州オースティン（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）のアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）のメガクリア（ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ）（商標）キットを使用して、製造会社の使用説明書に従って精製される。精製に続いて、ＲＮＡはマサチューセッツ州ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）のサーモフィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）のナノドロップ（ＮＡＮＯＤＲＯＰ）（商標）を使用して定量化され、アガロースゲル電気泳動法によって分析されて、ＲＮＡが適切なサイズであり、ＲＮＡ分解が起きていないことが確認される。ＲＮＡ生成物はまた、逆転転写ＰＣＲを実施して、配列決定のためのｃＤＮＡを生成することで、配列決定されてもよい。
【０９３１】
実施例６．ポリＡテーリング反応
ｃＤＮＡ中のポリ−Ｔなしでは、最終生成物の浄化前に、ポリ−Ａテーリング反応が実施されなくてはならない。これは、キャップドＩＶＴＲＮＡ（１００μｌ）；ＲＮａｓｅ阻害剤（２０Ｕ）；１０×テーリング緩衝液（０．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＭｇＣｌ２）（１２．０μｌ）；２０ｍＭのＡＴＰ（６．０μｌ）；ポリＡポリメラーゼ（２０Ｕ）；１２３．５μｌに満たす量のｄＨ２０を混合して、３７℃で３０分間インキュベーションすることで実施される。ポリＡテールが、転写物中に既にあれば、次にテーリング反応がスキップされて、テキサス州オースティン（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）のアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）のメガクリア（ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ）（商標）キットによる精製に、直接進められてもよい（最大５００μｇ）。ポリＡポリメラーゼは、好ましくは、酵母中で発現される組換え酵素である。
【０９３２】
ポリＡテーリング反応の処理能力または完全性が、常に正確なサイズのポリＡテールをもたらすとは限らないことを理解すべきである。したがって例えば、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０
、１５０〜１６５、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４または１６５などのおよそ４０〜２００ヌクレオチドのポリＡテールは、本発明の範囲内である。
【０９３３】
実施例７．天然５’キャップおよび５’キャップ類似体
ポリヌクレオチドの５’キャッピングは、製造業者のプロトコルに従って、以下の化学的ＲＮＡキャップアナログを使用するインビトロ転写反応中に同時に完了して、５’−グアノシンキャップ構造が生成されてもよい：３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ［ｔｈｅＡＲＣＡｃａｐ］；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（マサチューセッツ州イプスウィッチ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）のニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ））。修飾ＲＮＡの５’キャッピングは、ワクシニアウイルスキャッピング酵素を使用して、転写後に完了されて、「キャップ０」構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが生成されてもよい（マサチューセッツ州イプスウィッチ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）のニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ））。キャップ１構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素および２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼの両方を使用して生成されてもよく、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ−２’−Ｏ−メチルが生成される。キャップ２構造は、キャップ１構造から生成されてもよく、２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼを使用した、５’末端から３番目のヌクレオチドの２’−Ｏ−メチル化がそれに続く。キャップ３構造は、キャップ２構造から生成されてもよく、２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼを使用した、５’末端から４番目のヌクレオチドの２’−Ｏ−メチル化がそれに続く。酵素は、好ましくは、組換え源に由来する。
【０９３４】
哺乳類細胞に形質移入される場合、修飾ｍＲＮＡは、１２〜１８時間にわたり、または例えば、２４、３６、４８、６０、７２または７２時間を超えるなど、１８時間を超えて安定性を有する。
【０９３５】
実施例８．キャッピングアッセイ
Ａ．タンパク質発現アッセイ
本明細書に教示されるキャップのいずれかを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、等しい濃度で細胞に形質移入され得る。形質移入の６、１２、２４および３６時間後に、培養液中に分泌されるタンパク質量は、ＥＬＩＳＡによってアッセイされ得る。培地中により高レベルのタンパク質を分泌する合成ポリヌクレオチドは、より高い翻訳能力があるキャップ構造がある合成ポリヌクレオチドに相当する。
【０９３６】
Ｂ．純度解析合成
本明細書に教示されるキャップのいずれかを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、変性アガロース−尿素ゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析を使用して、純度について比較され得る。電気泳動による単一統合バンドがあるポリヌクレオチドは、複数バンドまたは縞バンドがあるポリヌクレオチドと比較して、より高純度の生成物に相当する。単一ＨＰＬＣピークがある合成ポリヌクレオチドもまた、より高純度の生成物に相当する。より高効率でのキャッピング反応は、より純粋なポリヌクレオチド集団を提供する。
【０９３７】
Ｃ．サイトカイン解析
本明細書に教示されるキャップのいずれかを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、複数濃度で細胞に質移入され得る。形質移入の６、１２、２４および３６時間後、培養液中に分泌されるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−βなどの炎症促進性サイトカインの量が、ＥＬＩＳＡによってアッセイされ得る。培地中へのより高レベルの炎症促進性
サイトカイン分泌をもたらすポリヌクレオチドは、免疫活性化キャップ構造を含有するポリヌクレオチドに相当する。
【０９３８】
Ｄ．キャッピング反応効率
本明細書に教示されるキャップのいずれかを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ処理後に、ＬＣ−ＭＳによってキャッピング反応効率について分析され得る。キャップドポリヌクレオチドのヌクレアーゼ処理は、遊離ヌクレオチドと、ＬＣ−ＭＳによって検出可能であるキャップド５’−５三リン酸キャップ構造との混合物をもたらす。ＬＣ−ＭＳスペクトル上のキャップド生成物の量は、反応からの全ポリヌクレオチドのパーセントとして表され得、キャッピング反応効率に対応する。より高いキャッピング反応効率があるキャップ構造は、ＬＣ−ＭＳによってより多量のキャップド生成物を有する。
【０９３９】
実施例９．修飾ＲＮＡまたはＲＴ  ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動
個々のポリヌクレオチド（２０μｌ容量中の２００〜４００ｎｇ）または逆転写ＰＣＲ産物（２００〜４００ｎｇ）は、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の非変性１．２％アガロースＥ−ゲル上のウェルに装入されて、製造業者のプロトコルに従って１２〜１５分間泳動される。
【０９４０】
実施例１０．ナノドロップ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）修飾ＲＮＡ定量化およびＵＶスペクトルデータ
ナノドロップ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）ＵＶ吸光度読み取りのために、ＴＥ緩衝液（１μｌ）中の修飾ポリヌクレオチドが使用されて、化学合成またはインビトロ転写反応からの各ポリヌクレオチドの収率が定量化される。
【０９４１】
実施例１１．リピドイドを使用する修飾ｍＲＮＡの製剤
細胞への添加前に、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドとリピドイドとを設定比率で混合することで、インビトロ実験のために製剤化される。インビボ製剤は、身体全体にわたる循環を促進するための追加の成分の添加を要してもよい。これらのリピドイドが、インビボ研究に適した粒子を形成する能力を試験するために、ｓｉＲＮＡ−リピドイド製剤のための標準製剤過程が、出発点として使用されてもよい。粒子形成後、ポリヌクレオチドが添加されて、複合体と一体化される。カプセル化効率は、標準色素排除アッセイを使用して評価される。
【０９４２】
実施例１２．タンパク質発現をスクリーニングする方法
Ａ．エレクトロスプレーイオン化
対象に投与されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を含有してもよい生物学的サンプルが調製されて、１、２、３または４台の質量分析器を使用して、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）のための製造業者のプロトコルに従って分析される。生物学的サンプルはまた、タンデムＥＳＩ質量分析システムを使用して分析されてもよい。
【０９４３】
タンパク質断片、またはタンパク質全体のパターンは、所与のタンパク質の既知の対照と比較されて、同一性が比較によって評価される。
Ｂ．マトリックス支援レーザー脱離／イオン化
対象に投与される１つまたは複数のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を含有してもよい生物学的サンプルが調製されて、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）のための製造業者のプロトコルに従って分析される。
【０９４４】
タンパク質断片、またはタンパク質全体のパターンは、所与のタンパク質の既知の対照と比較されて、同一性が比較によって評価される。
Ｃ．液体クロマトグラフィー／質量分析／質量分析
１つまたは複数のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を含有してもよい生物学的サンプルは、トリプシン酵素で処理されて、中に含有されるタンパク質が消化されてもよい。結果として生じるペプチドは、液体クロマトグラフィー／質量分析／質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ：ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）によって分析される。ペプチドは質量分光計内で断片化されて、コンピュータアルゴリズムによってタンパク質配列データベースとマッチされ得る診断パターンが得られる。消化されたサンプルが希釈されて、所与のタンパク質について、１ｎｇ以下の出発原料が得られてもよい。単純な緩衝液バックグラウンド（例えば、水または揮発性塩）を含有する生物学的サンプルは、直接溶液内消化に適しており；より複雑なバックグラウンド（例えば、洗剤、非揮発性塩、グリセロール）は、サンプル分析を容易にするための追加的な浄化工程を要する。
【０９４５】
タンパク質断片、またはタンパク質全体のパターンは、所与のタンパク質の既知の対照と比較されて、同一性が比較によって評価される。
実施例１３．環化および／または鎖状化
本発明によれば、ポリヌクレオチドは環化または鎖状化されて、翻訳能力がある分子が生成し、ポリＡ結合タンパク質と５’末端結合タンパク質との相互作用を促進してもよい。環化または鎖状化機序は、１）化学的、２）酵素的、および３）リボザイム触媒性の少なくとも３つの異なる経路を通じて起こってもよい。新たに形成される５’−／３’−結合は、分子内または分子間にあってもよい。
【０９４６】
第１の経路では、核酸の５’末端および３’末端は、互いに近ければ、分子の５’末端と３’末端の間に新規共有結合を形成する、化学反応基を含有する。合成ｍＲＮＡ分子の３’末端の３’アミノ末端ヌクレオチドは、有機溶剤中で５’ＮＨＳエステル部分上の求核攻撃を受けて、新規５’−／３’−アミド結合を形成するように、５’末端がＮＨＳエステル反応基を含有してもよく、３’末端が３’アミノ末端ヌクレオチドを含有してもよい。
【０９４７】
第２の経路では、Ｔ４ＲＮＡリガーゼが使用されて、５’リン酸化核酸分子が核酸の３’ヒドロキシル基に酵素的に連結されて、新規ホスホロジエステル結合が形成されてもよい。例証的反応では、１μｇの核酸分子が、１〜１０単位のＴ４ＲＮＡリガーゼ（マサチューセッツ州イプスウィッチ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）のニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））と共に、製造業者のプロトコルに従って、３７℃で１時間インキュベートされる。並んでいる５’および３’領域の両方と塩基対形成できる分割ポリヌクレオチドの存在下で連結反応が起こって、酵素的連結反応を促進してもよい。
【０９４８】
第３の経路では、インビトロ転写中に、結果として生じる核酸分子が、核酸分子の５’末端と核酸分子の３’末端とを連結できる活性リボザイム配列を含有し得るように、ｃＤＮＡテンプレートの５’または３’末端のいずれかがリガーゼリボザイム配列をコードする。リガーゼリボザイムは、グループＩイントロン、グループＩイントロン、肝炎デルタウイルス、ヘアピンリボザイムに由来してもよく、またはＳＥＬＥＸ（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：試験管内進化法）によって選択されてもよい。リボザイムリガーゼ反応は、０〜３７℃の温度で１〜２４時間かかってもよい。
【０９４９】
実施例１４．ＬＤＬ受容体のインビトロ発現
ドイツ国ヴェセル（Ｗｅｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＬＧＣスタンダーズ有限責任会社（ＬＧＣ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ＧｍｂＨ）からのヒト胎児腎臓上皮（ＨＥＫ２９３）細
胞は、米国サンノゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＵＳＡ）のＢＤバイオサイエンシズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からの６ウェルプレート上に接種される。ＨＥＫ２９３は、ウェルあたり３ｍＬの細胞培養液中の約５００，０００細胞の密度で接種される。野性型ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡ（５−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾、または１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾；５’キャップ、ｃａｐ１；少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない）、ＬＤＬＲ  ＥＧＦ−Ａドメイン配列変異体ｍＲＮＡ（５−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾；５’キャップ、ｃａｐ１；少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない）、ＬＤＬＲ  ＥＧＦ−Ａおよび細胞質内ドメイン配列変異体（５−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾；５’キャップ、ｃａｐ１；少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない）、またはＬＤＬＲ細胞質内ドメイン配列変異体（５−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾；５’キャップ、ｃａｐ１；少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない）、またはＧ−ＣＳＦの対照（５−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾；５’キャップ、ｃａｐ１；少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない）を含有する製剤は、細胞播種の直後にウェルあたり８００ｎｇの量で添加されてインキュベートされる。調製され試験されるＬＤＬＲ  ｍＲＮＡ配列変異型としては、Ｎ３１６Ａ、Ｅ３１７Ａ、Ｄ３３１Ａ、およびＹ３３６Ａ（＃３９９）の４アミノ酸置換変異型、またはＹ３３６Ａ（＃４００）、Ｅ３１７Ａ（＃４０１）、Ｎ３１６Ａ（＃４０２）、Ｌ３３９Ｄ（＃４０３）、Ｄ３３１Ｅ（＃４０４）の単一アミノ酸置換変異型が挙げられる。これらの配列変異型は、Ｋ８１６Ｒ、Ｋ８３０Ｒ、またはＣ８３９Ａを含む、いくつかの細胞質内ドメイン変異型の１つまたは複数もまた含有してもよい。ｍＲＮＡ形質移入細胞は、抗ＬＤＬＲ抗体で処理されて、１セットのＬＤＬＲ形質移入細胞は、対照として正常ヤギＩｇＧで処理される。結合一次抗体は、フィコエリトリン（ＰＥ：Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）標識二次抗体による処理に続いて、ＦＡＣＳ分析によって検出される。ゲート生細胞パーセントは、ＬＤＬＲを発現することが検出される。対照非免疫ＩｇＧで染色されたＬＤＬＲ  ｍＲＮＡ処理細胞では染色が観察されず、Ｇ−ＣＳＦｍＲＮＡで形質移入された細胞ではＬＤＬＲ陽性細胞が検出されないことが期待される。
【０９５０】
実施例１５．インビトロＬＤＬＲ発現
Ａ．発現
ドイツ国ヴェセル（Ｗｅｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＬＧＣスタンダーズ有限責任会社（ＬＧＣ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ＧｍｂＨ）からのヒト胎児腎臓上皮（ＨＥＫ２９３）細胞は、米国サンノゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＵＳＡ）のＢＤバイオサイエンシズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からの６ウェルプレート上に接種される。ＨＥＫ２９３は、ウェルあたり３ｍＬの細胞培養液中の約５００，０００細胞の密度で接種される。野性型ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡ（５−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾、または１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾；５’キャップ、ｃａｐ１；少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない）、ＬＤＬＲ  ＥＧＦ−Ａドメイン配列変異体ｍＲＮＡ（５−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾；５’キャップ、ｃａｐ１；少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない）、ＬＤＬＲ  ＥＧＦ−Ａおよび細胞質内ドメイン配列変異体（５−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾；５’キャップ、ｃａｐ１；少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない）、またはＬＤＬＲ細胞質内ドメイン配列変異体（５−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾；５’キャップ、ｃａｐ１；少なくとも
１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない）、またはＧ−ＣＳＦの対照（５−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾；５’キャップ、ｃａｐ１；少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない）を含有する製剤は、細胞播種の直後にウェルあたり８００ｎｇの量で添加されて、６０μｇ／ｍＬの外来性ヒトＰＣＳＫ９の存在および不在下でインキュベートされる。調製され試験されるＬＤＬＲ  ｍＲＮＡ配列変異型としては、Ｎ３１６Ａ、Ｅ３１７Ａ、Ｄ３３１Ａ、およびＹ３３６Ａ（＃３９９）の４アミノ酸置換変異型（本明細書では４変異ＬＤＬＲ変異体とも称される）、またはＹ３３６Ａ（＃４００）、Ｅ３１７Ａ（＃４０１）、Ｎ３１６Ａ（＃４０２）、Ｌ３３９Ｄ（＃４０３）、Ｄ３３１Ｅ（＃４０４）の単一アミノ酸置換変異型が挙げられる。これらの配列変異型は、Ｋ８１６Ｒ、Ｋ８３０Ｒ、またはＣ８３９Ａを含む、いくつかの細胞質内ドメイン変異型の１つまたは複数もまた含有してもよい。ｍＲＮＡ形質移入細胞は、抗ＬＤＬＲ抗体で処理されて、１セットのＬＤＬＲ形質移入細胞は、対照として正常ヤギＩｇＧで処理される。３７℃で１５時間後、形質移入媒体が除去されて、細胞は洗浄され、上述されるようにフィコエリトリン（ＰＥ）にコンジュゲートされた抗ＬＤＬＲ抗体で処理される。ＬＤＬＲ形質移入細胞の１セットは、ＰＥにコンジュゲートされた正常ヤギＩｇＧで処理され、別の非形質移入細胞のセットは、対照として使用される。Ｇ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡで形質移入された細胞が、追加的な陰性対照として使用される。結合一次抗体は、上述されるようにフローサイトメトリーによって検出される。
【０９５１】
ＦＡＣＳ分析は、野生型ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡで形質移入された細胞における細胞表面ＬＤＬＲ発現をゲート生細胞のパーセントとして示すことが、期待される。対照的に、ＰＣＳＫ９結合領域に置換があるＬＤＬＲ  ｍＲＮＡ変異型のそれぞれは、外来性ＰＣＳＫ９による抑制的調節に対してより低い感度を示すと予測され、パーセント低下の値は、−８．１％〜２９％に及ぶ（野生型ＬＤＬＲで観察された５８％の低下と比較して）。細胞質内ドメインに、Ｋ８１６Ｒ、Ｋ８３０Ｒ、またはＣ８３９Ａ、またはこれらの変異型の任意の組み合わせを含む、変異の１つまたは複数を含有するＬＤＬＲ  ＰＣＳＫ９結合変異型もまた、外来性ＰＣＳＫ９に対して非感受性であると期待される。後者変異型はまた、ＬＤＬＲのＩＤＯＬ依存性ユビキチン化を欠くことも予期されるため、これらの変異型は、見かけのＬＤＬＲ半減期の増大のために、ＰＣＳＫ９抑制的調節に対する感受性がさらにより低くなってもよい。
【０９５２】
Ｂ．ＬＤＬＲの機能性
発現されたＬＤＬＲが機能的かどうかを評価するために、ボディパイ標識ＬＤＬが使用される。ＨＥＫ２９３細胞は、ＬＤＬＲまたはＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡのいずれかで一晩形質移入され、細胞は洗浄されて、増大される量のボディパイＬＤＬと共にインキュベートされる。３７℃で１時間のインキュベーションに続いて、細胞が洗浄されて、細胞結合型ボディパイＬＤＬが、フローサイトメトリーによって評価される。ボディパイＬＤＬ結合の等高線図が得られる。野生型、ＬＤＬＲ  ＰＣＳＫ９および／または細胞質内ドメイン結合変異型では、ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡ形質移入細胞へのボディパイＬＤＬの結合は、ボディパイＬＤＬ濃度と共に増大する、ゲート細胞数における右方移行として明らかである。ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡコンストラクトのそれぞれで形質移入された細胞において、ゲート細胞数に同様の右方移行が見られることが予測される。野性型、ＰＣＳＫ９結合欠損、および／または細胞質内ドメイン変異型ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡのいずれかで形質移入された細胞に結合するボディパイＬＤＬについて、最大半量細胞結合が同一であることもまた予測される。各コンストラクトについて、ボディパイＬＤＬ結合は、高親和性（０．６〜０．７ｎｇ／ｍＬの最大半量結合）かつ飽和性であることが予測される。Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡで形質移入された細胞では、ボディパイＬＤＬ結合が観察されない可能性が高い。
【０９５３】
Ｃ．細胞の細胞表面ＬＤＬＲの半減期に対する効果
外来性ＰＣＳＫ９が、ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡで形質移入された細胞の細胞表面ＬＤＬ受容体の見かけの半減期を調節し得るかどうかを評価するために、ＨＥＫ２９３細胞が播種され、インキュベートされ、上述されるようにＬＤＬＲ  ｍＲＮＡで形質移入される。細胞単層が洗浄されて、ＰＣＳＫ９（６０μｇ／ｍＬ）ありまたはなしで新鮮培地が添加される。３７℃で様々なインキュベーション時間後、細胞表面ＬＤＬＲ発現が、上述されるように抗ＬＤＬＲ抗体を使用するフローサイトメトリーによって、モニターされる。野生型ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡで形質移入された細胞の細胞表面ＬＤＬＲは、時間依存的方法で低下することが期待される。同様に、野生型ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡで形質移入された細胞の培地へのＰＣＳＫ９の添加は、細胞表面ＬＤＬＲの見かけの半減期を低下させることが予測される。対照的に、ＰＣＳＫ９結合欠損ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡで、またはＰＣＳＫ９結合欠損および細胞質内ドメイン変異体ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡで形質移入された細胞の培地へのＰＣＳＫ９の添加は、細胞表面ＬＤＬＲの見かけの半減期にわずかまたは皆無の変化を生じる。これらのデータは、細胞質内ドメイン変異の存在または不在下で、ＰＣＳＫ９結合部位に変異があるＬＤＬＲをコードするＬＤＬＲ  ｍＲＮＡで形質移入された細胞が、外来性ＰＣＳＫ９に応答できないことを示すと予想され、これらの結合変異型が、インビボで野生型ＬＤＬＲよりもさらに長い半減期を有して、高コレステロール血症がある患者を治療するために有用であってもよいことが示唆される。
【０９５４】
Ｄ．ＬＤＬＲのユビキチン化
共に、または単独で、または組み合わせで、ＬＤＬＲの細胞質内ドメインをコードするＬＤＬＲ  ｍＲＮＡの変異（Ｋ８１６Ｒ、Ｋ８３０Ｒ、またはＣ８３９Ａ）は、ＬＤＬＲのユビキチン化を妨げ、ひいてはＬＤＬＲの細胞半減期を延長することが期待される。これを評価するために、ＨＥＫ２９３細胞またはＨｅｐ−Ｇ２細胞が、野性型ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡ（５−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾、または１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾；５’キャップ、ｃａｐ１；少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない）、ＬＤＬＲ  ＥＧＦ−Ａドメイン配列変異体ｍＲＮＡ（５−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾；５’キャップ、ｃａｐ１；少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない）、ＬＤＬＲ  ＥＧＦ−Ａおよび細胞質内ドメイン配列変異体（５−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾；５’キャップ、ｃａｐ１；少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない）、またはＬＤＬＲ細胞質内ドメイン配列変異体（５−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾；５’キャップ、ｃａｐ１；少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない）、またはＧ−ＣＳＦの対照（５−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾；５’キャップ、ｃａｐ１；少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない）を含有する製剤で形質移入されて、細胞播種の直後にウェルあたり８００ｎｇの量で添加されてインキュベートされる。調製され試験されるＬＤＬＲ
ｍＲＮＡ配列変異型としては、Ｎ３１６Ａ、Ｅ３１７Ａ、Ｄ３３１Ａ、およびＹ３３６Ａ（＃３９９）の４アミノ酸置換変異型、またはＹ３３６Ａ（＃４００）、Ｅ３１７Ａ（＃４０１）、Ｎ３１６Ａ（＃４０２）、Ｌ３３９Ｄ（＃４０３）、Ｄ３３１Ｅ（＃４０４）の単一アミノ酸置換変異型が挙げられる。これらの配列変異型は、Ｋ８１６Ｒ、Ｋ８３０Ｒ、またはＣ８３９Ａを含む、いくつかの細胞質内ドメイン変異型の１つまたは複数もまた含有してもよい。細胞は、ＬＸＲαのためのオキシステロールリガンドと共に３７℃で最高２４時間インキュベートされて、ＩＤＯＬの発現が誘導される。ＩＤＯＬが、ＬＤＬＲをユビキチン化する能力は、ユビキチンおよびＬＤＬＲ特異的抗体による細胞抽出物のウエスタン分析によって評価される。細胞質内ドメイン変異を含有するＬＤＬＲ変異型は、ユビキチン化低下を示すことが期待される。
【０９５５】
実施例１６．インビボＬＤＬＲ発現
インビボでＬＤＬＲ  ｍＲＮＡの機能を評価するために、ＬＤＬ受容体欠損マウスが使用される。動物は、野性型ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡ（５−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾、または１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾；５’キャップ、ｃａｐ１；少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない）、ＬＤＬＲ  ＥＧＦ−Ａドメイン配列変異体ｍＲＮＡ（５−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾；５’キャップ、ｃａｐ１；少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない）、ＬＤＬＲ  ＥＧＦ−Ａおよび細胞質内ドメイン配列変異体（５−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾；５’キャップ、ｃａｐ１；少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない）、またはＬＤＬＲ細胞質内ドメイン配列変異体（５−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾；５’キャップ、ｃａｐ１；少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない）、またはＧ−ＣＳＦの対照（５−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾；５’キャップ、ｃａｐ１；少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない）を含有する、例えば、Ｃ１２−２００を使用するものなどの様々な用量のナノ粒子製剤を投与されて、細胞播種の直後にウェルあたり８００ｎｇの量で添加されてインキュベートされる。調製され試験されるＬＤＬＲ  ｍＲＮＡ配列変異型としては、Ｎ３１６Ａ、Ｅ３１７Ａ、Ｄ３３１Ａ、およびＹ３３６Ａ（＃３９９）の４アミノ酸置換変異型、またはＹ３３６Ａ（＃４００）、Ｅ３１７Ａ（＃４０１）、Ｎ３１６Ａ（＃４０２）、Ｌ３３９Ｄ（＃４０３）、Ｄ３３１Ｅ（＃４０４）の単一アミノ酸置換変異型が挙げられる。これらの配列変異型は、Ｋ８１６Ｒ、Ｋ８３０Ｒ、またはＣ８３９Ａを含む、いくつかの細胞質内ドメイン変異型の１つまたは複数もまた含有してもよい。様々な時間後に、マウスは殺処分されて、血清サンプルが得られ、ウエスタンブロット法によって肝臓のＬＤＬＲ発現レベルが評価される。ＰＣＳＫ９結合変異型によってコードされるＬＤＬＲの見かけの半減期は、増大することが期待される。細胞質内ドメインの変異もまた保有する、ＰＣＳＫ９結合変異体によってコードされるＬＤＬＲの半減期も、増大することがさらに期待される。ＬＤＬＲ変異体の延長半減期は、血清ＶＬＤＬ＋ＩＤＬ＋ＬＤＬコレステロールのレベル低下に関連すると予測される。これらのデータは、ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡがある家族性高コレステロール血症を治療するためのアプローチをさらに確認する。
【０９５６】
実施例１７．マウスＬＤＬＲ変異体コンストラクト
本発明によれば、ポリヌクレオチドは、マウスＬＤＬＲをコードする連結ヌクレオシドの少なくとも第１の領域を含んでなってもよい。本発明のマウスＬＤＬＲタンパク質配列は、下の表１０に列挙される。表１０に示されるのは、遺伝子およびタンパク質配列識別子の名称および説明である。任意の特定の遺伝子では、１つまたは複数の変異型またはイソ型が存在してもよい。表で開示されるのは、可能な隣接領域であることが、当業者によって理解されるであろう。コード領域は、タンパク質配列を教示することで、確定的かつ具体的に開示される。その結果、タンパク質をコードするものに隣接する教示される配列は、隣接領域と見なされる。１つまたは複数の利用可能データベースまたはアルゴリズムを利用することで、５’および３’隣接領域をさらに特性決定することもまた可能である。データベースは、ＥＮＳＴ転写物の隣接領域に含まれる特徴をアノテートし、これらは当該技術分野で利用できる。
【０９５７】
【表１０】
2016538829.tif 000056
【０９５８】
ＬＤＬＲマウスタンパク質配列のＥＧＦ−Ａドメインは、ＫＴＮＥＣＬＤＮＮＧＧＣＳＨＩＣＫＤＬＫＩＧＳＥＣＬＣＰＳＧＦＲＬＶＤＬＨＲＣＥ（配列番号７３０）であり、細胞内ドメインは、ＲＮＷＲＬＫＮＩＮＳＩＮＦＤＮＰＶＹＱＫＴＴＥＤＥＬＨＩＣＲＳＱＤＧＹＴＹＰＳＲＱＭＶＳＬＥＤＤＶＡ（配列番号７３１）である。
【０９５９】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドのいずれもマウスＬＤＬＲコンストラクトをコードしてもよく、インビボでの実験で使用されて、動物に対する変異の効果が評価されてもよい。
【０９６０】
実施例１７．ＬＤＬＲ変異体コンストラクト
本発明によれば、ポリヌクレオチドは、ヒトＬＤＬＲをコードする連結ヌクレオシドの少なくとも第１の領域を含んでなってもよい。本発明のヒトＬＤＬＲタンパク質配列は、下の表１１に列挙される。表１１に示されるのは、遺伝子およびタンパク質配列識別子の名称および説明である。任意の特定の遺伝子では、１つまたは複数の変異型またはイソ型が存在してもよい。表で開示されるのは、可能な隣接領域であることが、当業者によって理解されるであろう。コード領域は、タンパク質配列を教示することで、確定的かつ具体的に開示される。その結果、タンパク質をコードするものに隣接する教示される配列は、隣接領域と見なされる。１つまたは複数の利用可能データベースまたはアルゴリズムを利
用することで、５’および３’隣接領域をさらに特性決定することもまた可能である。データベースは、ＥＮＳＴ転写物の隣接領域に含まれる特徴をアノテートし、これらは当該技術分野で利用できる。
【０９６１】
【表１１】
2016538829.tif 000057
【０９６２】
実施例１８．ＬＤＬＲ−ＩＤＯＬ変異体のインビトロ実験
Ａ．ＬＤＬＲ−ＩＤＯＬ変異体のインビトロ発現
ＨＥＫ２９３細胞は、ヒトまたはマウスＬＤＬＲ変異体をコードするｍＲＮＡで形質移入されて、対照ヒトまたはマウスＬＤＬＲ（野性型）と比較される。ＨＥＫ２９３細胞は、リポフェクタミン２０００を使用して、ｍＲＮＡ（約４〜４０００ｎｇのｍＲＮＡ）用量を増大させて、ヒトまたはマウスＬＤＬＲをコードするｍＲＮＡによって１２〜１４時間形質移入される。細胞は収集されて、ヤギ抗ｈＬＤＬＲ−ＰＥまたはヤギＩｇＧ−ＰＥ抗体のいずれかで染色されて、フローサイトメーターで分析される。ＬＤＬＲ発現は、各用量および評価されるコンストラクトに対するＬＤＬＲ陽性細胞の百分率として、評価される。
【０９６３】
この試験のためのヒトＬＤＬＲ変異体をコードするｍＲＮＡとしては、変異Ｎ３１６Ａ、Ｋ８３０Ｒ、およびＣ８３９Ａ（アミノ酸配列は配列番号５０に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号７３５に示され、およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に図示
されず、５’キャップはＣａｐであり、ｍＲＮＡは５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾される）、変異Ｋ８３０Ｒ、Ｃ８３９Ａ、およびＬ３３９Ｄ（アミノ酸配列は配列番号５２に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号７３６に示され、およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に図示されず、５’キャップはＣａｐであり、ｍＲＮＡは５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾される）、または変異Ｋ８３０ＲおよびＣ８３９Ａ（アミノ酸配列は配列番号５４に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号７３７に示され、およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に図示されず、５’キャップはＣａｐであり、ｍＲＮＡは５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾される）が挙げられる。
【０９６４】
この試験のためのマウスＬＤＬＲ変異体をコードするｍＲＮＡとしては、変異Ｎ３１７Ａ、Ｋ８３２Ｒ、およびＣ８４１Ａ（アミノ酸配列は配列番号７２４に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号７３２に示され、およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に図示されず、５’キャップはＣａｐであり、ｍＲＮＡは５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾される）、変異Ｌ３４０Ｄ、Ｋ８３２Ｒ、およびＣ８４１Ａ（アミノ酸配列は配列番号７２６に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号７３３に示され、およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に図示されず、５’キャップはＣａｐであり、ｍＲＮＡは５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾される）、または変異Ｋ８３２ＲおよびＣ８４１Ａ（アミノ酸配列は配列番号７２８に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号７３４に示され、およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に図示されず、５’キャップはＣａｐであり、ｍＲＮＡは５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾される）が挙げられる。
【０９６５】
Ｂ．ＬＤＬＲ−ＩＤＯＬ変異体へのインビトロＬＤＬ結合
ＬＤＬＲ−ＩＤＯＬ変異体の発現の確立に続いて、これらのｍＲＮＡのインビトロ生物活性が評価されて、野生型受容体のインビトロ生物活性と比較される。ＬＤＬＲ−ＩＤＯＬ変異体をコードするｍＲＮＡは、ボディパイ標識ＬＤＬ結合アッセイを使用して、リガンド結合について評価される。ＨＥＫ２９３細胞は、ＬＤＬＲ−ＩＤＯＬ変異体をコードするｍＲＮＡで、約４ｎｇ〜約４０００ｎｇの範囲の用量で、１２〜１４時間形質移入される。
【０９６６】
この試験のためのヒトＬＤＬＲ変異体をコードするｍＲＮＡとしては、変異Ｎ３１６Ａ、Ｋ８３０Ｒ、およびＣ８３９Ａ（アミノ酸配列は配列番号５０に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号７３５に示され、およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に図示されず、５’キャップはＣａｐであり、ｍＲＮＡは５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾される）、変異Ｋ８３０Ｒ、Ｃ８３９Ａ、およびＬ３３９Ｄ（アミノ酸配列は配列番号５２に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号７３６に示され、およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に図示されず、５’キャップはＣａｐであり、ｍＲＮＡは５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾される）、または変異Ｋ８３０ＲおよびＣ８３９Ａ（アミノ酸配列は配列番号５４に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号７３７に示され、およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に図示されず、５’キャップはＣａｐであり、ｍＲＮＡは５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾される）が挙げられる。
【０９６７】
この試験のためのマウスＬＤＬＲ変異体をコードするｍＲＮＡとしては、変異Ｎ３１７Ａ、Ｋ８３２Ｒ、およびＣ８４１Ａ（アミノ酸配列は配列番号７２４に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号７３２に示され、およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に図示されず、５’キャップはＣａｐであり、ｍＲＮＡは５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾される）、変異Ｌ３４０Ｄ、Ｋ８３２Ｒ、およびＣ８４１Ａ（アミノ酸配列は配列番号７２６に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号７３３に示さ
れ、およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に図示されず、５’キャップはＣａｐであり、ｍＲＮＡは５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾される）、または変異Ｋ８３２ＲおよびＣ８４１Ａ（アミノ酸配列は配列番号７２８に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号７３４に示され、およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に図示されず、５’キャップはＣａｐであり、ｍＲＮＡは５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾される）が挙げられる。
【０９６８】
細胞は、増大する濃度の蛍光標識ＬＤＬＲリガンド（ＬＤＬ−ボディパイ）（約０．１μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ）と共に、３７℃で１時間インキュベートされる。次に細胞は収集されて、フローサイトメーターで分析される。
【０９６９】
Ｃ．ＬＤＬＲ発現のＰＣＳＫ９抑制的調節
ＬＤＬＲ−ＩＤＯＬ変異体をコードするｍＲＮＡは、ＰＣＳＫ９抑制的調節に対する抵抗性について評価される。
【０９７０】
ＨＥＫ２９３細胞は、リポフェクタミン２０００を使用して、ＬＤＬＲ−ＩＤＯＬ変異体をコードするｍＲＮＡで、約４ｎｇ〜約４０００ｎｇの範囲の用量で、１２〜１４時間形質移入される。
【０９７１】
この試験のためのヒトＬＤＬＲ変異体をコードするｍＲＮＡとしては、変異Ｎ３１６Ａ、Ｋ８３０Ｒ、およびＣ８３９Ａ（アミノ酸配列は配列番号５０に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号７３５に示され、およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に図示されず、５’キャップはＣａｐであり、ｍＲＮＡは５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾される）、変異Ｋ８３０Ｒ、Ｃ８３９Ａ、およびＬ３３９Ｄ（アミノ酸配列は配列番号５２に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号７３６に示され、およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に図示されず、５’キャップはＣａｐであり、ｍＲＮＡは５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾される）、または変異Ｋ８３０ＲおよびＣ８３９Ａ（アミノ酸配列は配列番号５４に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号７３７に示され、およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に図示されず、５’キャップはＣａｐであり、ｍＲＮＡは５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾される）が挙げられる。
【０９７２】
この試験のためのマウスＬＤＬＲ変異体をコードするｍＲＮＡとしては、変異Ｎ３１７Ａ、Ｋ８３２Ｒ、およびＣ８４１Ａ（アミノ酸配列は配列番号７２４に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号７３２に示され、およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に図示されず、５’キャップはＣａｐであり、ｍＲＮＡは５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾される）、変異Ｌ３４０Ｄ、Ｋ８３２Ｒ、およびＣ８４１Ａ（アミノ酸配列は配列番号７２６に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号７３３に示され、およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に図示されず、５’キャップはＣａｐであり、ｍＲＮＡは５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾される）、または変異Ｋ８３２ＲおよびＣ８４１Ａ（アミノ酸配列は配列番号７２８に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号７３４に示され、およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に図示されず、５’キャップはＣａｐであり、ｍＲＮＡは５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾される）が挙げられる。
【０９７３】
細胞は、７５μｇ／ｍＬのＰＣＳＫ９の存在下または不在下で、培地と共に、８時間にわたり培養される。細胞は収集されて、ヤギ抗ｈＬＤＬＲ−ＰＥ抗体で染色される。細胞はフローサイトメーターで分析されて、ＬＤＬＲのＰＣＳＫ９媒介抑制的調節が評価される。
【０９７４】
実施例１９．ＬＤＬＲ−ＩＤＯＬ変異体インビボ試験
ヒトまたはマウスＬＤＬＲ−ＩＤＯＬ変異体をコードするｍＲＮＡの能力が、インビボでヒトまたはマウスＬＤＬＲ（野生型）と比較される。
【０９７５】
ＬＤＬＲ−ＩＤＯＬ変異体をコードするｍＲＮＡは、尾静脈注射によってノックアウト（ＫＯ：ｋｎｏｃｋｏｕｔ）ＬＤＬＲマウスに静脈内投与される。ｍＲＮＡは脂質ナノ粒子に製剤化され、ｍＲＮＡは０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。
【０９７６】
この試験のためのヒトＬＤＬＲ変異体をコードするｍＲＮＡとしては、変異Ｎ３１６Ａ、Ｋ８３０Ｒ、およびＣ８３９Ａ（アミノ酸配列は配列番号５０に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号７３５に示され、およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に図示されず、５’キャップはＣａｐであり、ｍＲＮＡは５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾される）、変異Ｋ８３０Ｒ、Ｃ８３９Ａ、およびＬ３３９Ｄ（アミノ酸配列は配列番号５２に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号７３６に示され、およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に図示されず、５’キャップはＣａｐであり、ｍＲＮＡは５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾される）、または変異Ｋ８３０ＲおよびＣ８３９Ａ（アミノ酸配列は配列番号５４に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号７３７に示され、およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に図示されず、５’キャップはＣａｐであり、ｍＲＮＡは５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾される）が挙げられる。
【０９７７】
この試験のためのマウスＬＤＬＲ変異体をコードするｍＲＮＡとしては、変異Ｎ３１７Ａ、Ｋ８３２Ｒ、およびＣ８４１Ａ（アミノ酸配列は配列番号７２４に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号７３２に示され、およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に図示されず、５’キャップはＣａｐであり、ｍＲＮＡは５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾される）、変異Ｌ３４０Ｄ、Ｋ８３２Ｒ、およびＣ８４１Ａ（アミノ酸配列は配列番号７２６に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号７３３に示され、およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に図示されず、５’キャップはＣａｐであり、ｍＲＮＡは５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾される）、または変異Ｋ８３２ＲおよびＣ８４１Ａ（アミノ酸配列は配列番号７２８に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号７３４に示され、およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に図示されず、５’キャップはＣａｐであり、ｍＲＮＡは５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンで完全修飾される）が挙げられる。
【０９７８】
マウス肝臓は、ｍＲＮＡ投与の３０分間後からｍＲＮＡ投与の９６時間後にかけて収集される。肝臓は、ｍＲＮＡ発現（ｑＰＣＲ）および／またはおよびタンパク質発現（ウエスタンブロット）のために処理される。
【０９７９】
実施例２０．野生型ＬＤＬＲおよびＰＣＳＫ９結合欠損変異体の発現
ドイツ国ヴェセル（Ｗｅｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＬＧＣスタンダーズ有限責任会社（ＬＧＣ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ＧｍｂＨ）からのヒト胎児腎臓上皮（ＨＥＫ２９３）細胞は、米国サンノゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＵＳＡ）のＢＤバイオサイエンシズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からの４８ウェルプレート上に接種される。ＨＥＫ２９３は、ウェルあたり０．２ｍＬの細胞培養液中の約６０，０００細胞の密度で接種される。１μＬのリポフェクタミンおよび１５０ｎｇの野性型（ＷＴ：ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ配列は配列番号７３８に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）または１５０ｎｇの変異体ＬＤＬＲ配列ｍＲＮＡまたはＧ−ＣＳＦｍＲＮＡの対照（ｍＲＮＡは配列番号７３９に示される；５−メ
チルシトシンおよびプソイドウリジンによる完全修飾；５’キャップ、ｃａｐ１；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない）を含有する製剤は、細胞播種の直後にウェルあたり６０，０００の量で添加されてインキュベートされる。
【０９８０】
調製され試験される変異体ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡ配列としては、４アミノ酸置換変異型（４Ａ：Ｎ３１６Ａ、Ｅ３１７Ａ、Ｄ３３１Ａ、およびＹ３３６Ａ）（ｍＲＮＡ配列は配列番号６９に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）、またはＹ３３６Ａ（ｍＲＮＡ配列は配列番号６８に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）、Ｅ３１７Ａ（ｍＲＮＡ配列は配列番号６７に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）、Ｎ３１６Ａ（ｍＲＮＡ配列は配列番号６６に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）、Ｌ３３９Ｄ（ｍＲＮＡ配列は配列番号６５に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）、Ｄ３３１Ｅ（ｍＲＮＡ配列は配列番号６４に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）の単一アミノ酸置換変異型が挙げられる。
【０９８１】
対照Ｇ−ＣＳＦｍＲＮＡ形質移入細胞は、ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）のアール・アンド・ディー・システムズ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）からの抗ＬＤＬＲ抗体（ヒトＬＤＬ  Ｒアフィニティ精製ポリクローナルＡｂＡＦ２１４８）で処理され、ＬＤＬＲ形質移入細胞の１セットは、ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）のアール・アンド・ディー・システムズ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）からの正常ヤギＩｇＧ（精製ヤギＩｇＧアール・アンド・ディー・システムズ（Ｒ＆Ｄ
ｓｙｓｔｅｍｓ）カタログ番号ＡＣ−１０８−Ｃ）で処理された。結合一次抗体は、ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）のアール・アンド・ディー・システムズ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）からのフィコエリトリン（ＰＥ）標識抗体による処理に続き、ＦＡＣＳ分析によって検出された。ＰＥへのコンジュゲーションは、イノーバ・バイオサイエンシズ（Ｉｎｎｏｖａ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ライトニング・リンク（ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−ｌｉｎｋ）コンジュゲーション・キット（ライトニング・リンク（Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ）Ｒ−ＰＥ抗体標識キット、ノーバス・バイオロジカルズ（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、カタログ番号：７０３−００１０）によって完了した。
【０９８２】
図１６に示されるように、ＦＡＣＳ分析は、全てのゲート生細胞の３２％が、１５０ｎｇ用量の野性型ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡで、ＬＤＬＲを発現することが検出されたことを示す（図１６中のＷＴ）。同様に、ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡ変異体で形質移入された細胞では、全てのゲート生細胞の１２〜３３％が、１５０ｎｇ用量で、ＬＤＬＲを発現することが検出されたことを示す。対照非免疫ＩｇＧ染色（ＬＤＬＲ  ＷＴ形質移入アイソタイプ染色）されたＬＤＬＲ  ｍＲＮＡ処理細胞では、染色は観察されず、Ｇ−ＣＳＦｍＲＮＡで形質移入された細胞中にＬＤＬＲ陽性細胞は検出されなかった（ＧＣＳＦ形質移入ＬＤＬＲ染色）。
【０９８３】
実施例２１．外来性ＰＣＳＫ９によるＬＤＬＲの抑制的調節
ドイツ国ヴェセル（Ｗｅｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＬＧＣスタンダーズ有限責任会社
（ＬＧＣ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ＧｍｂＨ）からのヒト胎児腎臓上皮（ＨＥＫ２９３）細胞は、米国サンノゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＵＳＡ）のＢＤバイオサイエンシズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からの４８ウェルプレート上に接種される。ＨＥＫ２９３は、ウェルあたり０．２ｍＬの細胞培養液中の約６０，０００細胞の密度で接種される。１μＬのリポフェクタミン２０００および１５０ｎｇの野性型（ＷＴ）ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ配列は配列番号７３８に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）または１５０ｎｇのＬＤＬＲ配列変異体ｍＲＮＡまたは１５０ｎｇのＧ−ＣＳＦｍＲＮＡの対照（ｍＲＮＡは配列番号７３９に示される；５−メチルシトシンおよびプソイドウリジンによる完全修飾；５’キャップ、ｃａｐ１；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない）を含有する製剤は、細胞播種の直後にウェルあたり８００ｎｇの量で添加されて、６０μｇ／ｍＬの外来性ヒトＰＣＳＫ９の存在および不在下でインキュベートされる。
【０９８４】
調製され試験されるＬＤＬＲ  ｍＲＮＡ配列変異体としては、４アミノ酸置換変異型（４Ａ：Ｎ３１６Ａ、Ｅ３１７Ａ、Ｄ３３１Ａ、およびＹ３３６Ａ）（ｍＲＮＡ配列は配列番号６９に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）、またはＹ３３６Ａ（ｍＲＮＡ配列は配列番号６８に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）、Ｅ３１７Ａ（ｍＲＮＡ配列は配列番号６７に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）、Ｎ３１６Ａ（ｍＲＮＡ配列は配列番号６６に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）、Ｌ３３９Ｄ（ｍＲＮＡ配列は配列番号６５に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）、Ｄ３３１Ｅ（ｍＲＮＡ配列は配列番号６４に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）の単一アミノ酸置換変異型が挙げられる。
【０９８５】
３７℃で１５時間後、形質移入培地が除去され、細胞が洗浄されて、上述されるように、ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）のアール・アンド・ディー・システムズ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）からのフィコエリトリン（ＰＥ）にコンジュゲートされた抗ＬＤＬＲ抗体（ヒトＬＤＬＲアフィニティ精製ポリクローナルＡｂＡＦ２１４８）で処理された。ＬＤＬＲ形質移入細胞の１セットは、ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）のアール・アンド・ディー・システムズ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）からのＰＥにコンジュゲートされた正常ヤギＩｇＧ（精製ヤギＩｇＧ、アール・アンド・ディー・システムズ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）カタログ番号ＡＣ−１０８−Ｃ）で処理され、別の非形質移入細胞のセットは、対照として使用された。Ｇ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡで形質移入された細胞は、追加的な陰性対照として使用された。ＰＥへのコンジュゲーションは、イノーバ・バイオサイエンシズ（Ｉｎｎｏｖａ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ライトニング・リンク（ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−ｌｉｎｋ）コンジュゲーション・キット（ライトニング・リンク（Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ）Ｒ−ＰＥ抗体標識キット、ノーバス・バイオロジカルズ（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、カタログ番号：７０３−００１０）によって完了した。結合一次抗体は、上述されるようにフローサイトメトリーによって検出された。
【０９８６】
図１７に示されるように、ＦＡＣＳ分析は、野生型ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡで形質移入された細胞における細胞表面ＬＤＬＲ発現が、ゲート生細胞の５１．６％であったことを示した。この値は、細胞形質移中に外来性ＰＣＳＫ９が培地に添加されると、ゲート生細胞の２１．５％に低下する。対照的に、ＰＣＳＫ９結合領域中に置換があるＬＤＬＲ  ｍＲＮＡ変異体のそれぞれは、外来性ＰＣＳＫ９（表１２）による抑制的調節に対して、より低い感受性を示し、パーセント低下の値は−８．１％〜２９％の範囲である（野生型ＬＤＬＲで観察された５８％低下と比較して）。
【０９８７】
【表１２】
2016538829.tif 000058
【０９８８】
実施例２２．変異体ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡによって発現されたＬＤＬＲの機能性
発現されたＬＤＬＲが機能性であるかどうかを評価するために、ボディパイ標識ＬＤＬが使用された。ウェルあたり６０，０００個のＨＥＫ２９３細胞は、１μＬのリポフェクタミン２０００および１５０ｎｇのコードする野性型（ＷＴ）ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ配列は配列番号７３８に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）または１５０ｎｇのＬＤＬＲ変異体ｍＲＮＡまたは１５０のＧ−ＣＳＦｍＲＮＡの対照（ｍＲＮＡは配列番号７３９に示される；５−メチルシトシンおよびプソイドウリジンによる完全修飾；５’キャップ、ｃａｐ１；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない）を含有する製剤で一晩形質移入された。
【０９８９】
調製され試験されるＬＤＬＲ変異体ｍＲＮＡ配列としては、４アミノ酸置換変異型（４Ａ：Ｎ３１６Ａ、Ｅ３１７Ａ、Ｄ３３１Ａ、およびＹ３３６Ａ）（ｍＲＮＡ配列は配列番号６９に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）、またはＹ３３６Ａ（ｍＲＮＡ配列は配列番号６８に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）、Ｅ３１７Ａ（ｍＲＮＡ配列は配列番号６７に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）、Ｎ３１６Ａ（ｍＲＮＡ配列は配列番号６６に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）、Ｌ３３９Ｄ（ｍＲＮＡ配列は配列番号６５に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは
配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）、Ｄ３３１Ｅ（ｍＲＮＡ配列は配列番号６４に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）の単一アミノ酸置換変異型が挙げられる。
【０９９０】
細胞は洗浄されて、増大する量（０μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌ）のボディパイＬＤＬと共にインキュベートされた。３７℃で１時間のインキュベーションに続いて、細胞は洗浄され、フローサイトメトリーによって細胞結合型ボディパイＬＤＬが評価された。等高線図は、図１８Ａに示される。野生型（ＷＴ）およびＬＤＬＲ  ＰＣＳＫ９結合変異型では、ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡ形質移入細胞へのボディパイＬＤＬの結合は、ボディパイＬＤＬ濃度と共に増大する、ゲート細胞数における右方移行として明らかであった。ゲート細胞数における同様の右方移行は、ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡコンストラクトのそれぞれで形質移入された細胞で見られた。図１８Ｂに示されるように、最大半量細胞結合は、野性型またはＰＣＳＫ９結合欠損ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡのいずれかで形質移入された細胞のボディパイＬＤＬ結合について、同一であった。各コンストラクトでは、ボディパイＬＤＬ結合は、高親和性（最大半量結合０．６〜０．７ｎｇ／ｍＬ）および飽和性であった。Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡで形質移入された細胞では、ボディパイＬＤＬ結合は、観察されなかった。
【０９９１】
実施例２３．細胞表面ＬＤＬＲ半減期の評価
外来性ＰＣＳＫ９が、ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡで形質移入された細胞において、細胞表面ＬＤＬ受容体の見かけの半減期を調節し得るかどうかを評価するために、ウェルあたり１３０，０００個の細胞で、ＨＥＫ２９３細胞が２４ウェルプレート上に播種されて、ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡで形質移入され、上述されるように１４時間インキュベートされた。細胞単層は洗浄され、ＰＣＳＫ９（６０μｇ／ｍＬ）添加またはＰＣＳＫ９非添加の新鮮培地が添加された。３７℃で様々なインキュベーション時間後、細胞表面ＬＤＬＲ発現が、上述されるように抗ＬＤＬＲ抗体を使用するフローサイトメトリーによって、モニターされた。図１９Ａに示されるように、３００ｎｇの野生型ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ配列は配列番号７３８に示される；およそ１６０ヌクレオチドノポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）で形質移入された細胞における細胞表面ＬＤＬＲは、時間依存的方法で低下して、見かけの半減期はおよそ１３時間であった。野生型ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡで形質移入された細胞の培地へのＰＣＳＫ９添加は、細胞表面ＬＤＬＲの見かけの半減期を約４時間に低下させた。図１９Ａ中で、「＊」は、統計的検定による有意差を表す。
【０９９２】
対照的に、３００ｎｇのＰＣＳＫ９結合欠損ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡで形質移入された細胞の培地へのＰＣＳＫ９の添加は、細胞表面ＬＤＬＲの見かけの半減期に、わずかまたは皆無の変化しか生じなかった（図１９Ｂ〜１９Ｇ）。調製され試験されるＰＣＳＫ９結合欠損ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡ配列（変異体ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡ）としては、４アミノ酸置換変異型（４Ａ：Ｎ３１６Ａ、Ｅ３１７Ａ、Ｄ３３１Ａ、およびＹ３３６Ａ）（ｍＲＮＡ配列は配列番号６９に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）、またはＹ３３６Ａ（ｍＲＮＡ配列は配列番号６８に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）、Ｅ３１７Ａ（ｍＲＮＡ配列は配列番号６７に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）、Ｎ３１６Ａ（ｍＲＮＡ配列は配列番号６６に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃ
ａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）、Ｌ３３９Ｄ（ｍＲＮＡ配列は配列番号６５に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）、Ｄ３３１Ｅ（ｍＲＮＡ配列は配列番号６４に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）の単一アミノ酸置換変異型が挙げられる。
【０９９３】
これら図１９Ｂ〜１９Ｇのデータは、ＰＣＳＫ９結合部位に変異型があるＬＤＬＲをコードするＬＤＬＲ  ｍＲＮＡで形質移入された細胞が、外来性ＰＣＳＫ９に応答できないことを示し、これらの結合変異体が、インビボで野生型ＬＤＬＲよりもさらに長い半減期を有して、高コレステロール血症がある患者を治療するのに有用であってもよいことが示唆される。
【０９９４】
実施例２４．細胞表面ＬＤＬＲに対する増大するＰＣＳＫ９量の効果
１０％ウシ胎仔血清添加完全細胞培地ＭＥＭ（グルタマックス（ＧｌｕｔａＭＡＸ）、ライフサイエンス（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、カタログ番号４１０９０−０３６）に添加されたＰＣＳＫ９量を増大させることによる、細胞表面ＬＤＬＲ発現の抑制的調節を評価することを目的とした。ＨＥＫ２９３細胞は、ウェルあたり３００，０００個の細胞で播種されて、６時間培養され、３００ｎｇの野生型ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ配列は配列番号７３８に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）、またはＰＣＳＫ９結合変異体をコードするＬＤＬＲ  ｍＲＮＡのいずれかで、１５時間にわたり形質移入された。調製され試験されるＰＣＳＫ９結合変異体ｍＲＮＡ配列としては、Ｎ３１６Ａ（ｍＲＮＡ配列は配列番号６６に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）、およびＤ３３１Ｅ（ｍＲＮＡ配列は配列番号６４に示される；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）の単一アミノ酸置換変異型が挙げられる。ｍＲＮＡ  ＵＧＴ１Ａ１をコードする対照（ｍＲＮＡ配列は配列番号７４０に示される；ほぼ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシオスチン（ｍｅｔｈｙｌｃｙｏｓｔｉｎｅ）および１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）もまた使用された。
【０９９５】
１５時間の培養後、細胞単層は洗浄されて、緩衝液単独または増大する量のＰＣＳＫ９を含有する緩衝液のいずれかが添加された。細胞は、５時間培養されて、細胞表面ＬＤＬＲ発現が、上述されるようにフローサイトメトリーによって測定された。図２０に示されるように、野生型ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡで形質移入された細胞における細胞表面ＬＤＬ受容体は、ＰＣＳＫ９によって用量依存的方法で低下した。ＬＤＬＲの最大の低下は、２０μｇ／ｍＬの外来性ＰＣＳＫ９で得られた。対照的に、ＰＣＳＫ９結合欠損変異型Ｎ３１６ＡまたはＤ３３１ＥをコードするＬＤＬＲ  ｍＲＮＡで形質移入された細胞では、ＰＣＳＫ９は、細胞表面ＬＤＬＲに影響を及ぼさなかった。ＵＧＴ１Ａ１をコードするｍＲＮＡで形質移入されたＨＥＫ２９３細胞では、細胞表面ＬＤＬＲは検出されなかった。これらのデータは、ＰＣＳＫ９結合部位中の変異型をコードするＬＤＬＲ  ｍＲＮＡから発現されるＬＤＬＲが、外来性ＰＣＳＫ９に対して非感受性であることを示す。
【０９９６】
実施例２５．ＬＤＬＲの肝細胞形質導入製剤
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、当該技術分野で公知の方法、本明細書に記載される方法および／またはその内容全体が参照により本明細書に援用される、「修飾ヌクレオシド、ヌ
クレオチド、および核酸組成物（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」という名称の国際公開第２０１３０９０６４８号パンフレットに記載される方法を使用して、製剤化される。本明細書で使用されるＬＮＰは、イオン化可能脂質ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡまたはカチオン性脂質Ｃ１２−２００を含んでなり得る。
【０９９７】
ＬＤＬＲまたはＬＤＬＲ変異体をコードする修飾ｍＲＮＡ（例えば、配列番号６３〜６９；少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡテール配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；少なくとも１つの本明細書に記載される化学修飾で修飾される）は、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡまたはＣ１２−２００を含んでなるＬＮＰに製剤化される。製剤化ＬＤＬＲまたはＬＤＬＲ変異体は、野性型マウスおよびＬＤＬＲ欠損マウスに投与される。野性型およびＬＤＬＲ欠損マウスの肝細胞中のＬＤＬＲの発現は、当該技術分野で公知の方法、または本明細書に記載される方法を使用して、修飾ｍＲＮＡの投与後に所定間隔で測定される。
【０９９８】
実施例２６．ＬＮＰ製剤化修飾ｍＲＮＡの送達
ルシフェラーゼｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ配列は配列番号７４１に示される；少なくとも１４０ヌクレオチドのポリＡテール配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１）は、５−メチルシトシンおよびプソイドウリジンのいずれかによって完全修飾され、５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによって完全修飾され、プソイドウリジンによって完全修飾され、１−メチルプソイドウリジンによって完全修飾され、または２５％のウリジン残基が２−チオウリジンで修飾され、２５％のシトシン残基が５−メチルシトシンで修飾される。次にルシフェラーゼｍＲＮＡは、カチオン性脂質ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（ＫＣ２）またはＣ１２−２００を含んでなる脂質ナノ粒子に製剤化される。ＰＢＳ中の製剤化ＬＮＰ、またはＰＢＳ単独の対照が、表１３に概説されるように、ＬＤＬＲ−／−または正常マウスに静脈内に投与される。マウスは、注射の２時間、８時間、２４時間、および４８時間後にイメージングされる。イメージングの１０分前に、マウスにＤ−ルシフェリン溶液が、１５０ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射される。次に動物は麻酔されて、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）のイビス・ルミナ・ツー（ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ）イメージングシステムによって、イメージングが得られる。
【０９９９】
【表１３】
2016538829.tif 000059
【１０００】
実施例２７．ＬＤＬＲのインビボ試験のためのマウスモデル
マウスモデル（ＬＤＬＲ−／−マウス）は、ＬＤＬＲ受容体遺伝子のエクソン４中に挿
入されたネオカセットを使用して、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド系統から開発された。マウスモデルは、２００〜４００ｍｇ／ｄｌの上昇した血清コレステロールレベルを有して（８０〜１００ｍｇ／ｄｌが正常レベルと見なされる）、高脂肪食を与えられると２００ｍｇ／ｄｌを超えて上昇する。
【１００１】
実施例２８．ＬＤＬＲのインビボ試験
１．１ｍｇ／ｋｇのヒトＬＤＬＲ  ｍＲＮＡ（配列番号６３；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）またはルシフェラーゼ（配列番号７４１；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）は、Ｃ１２−２００（モル比４０％）、コレステロール（モル比２５％）、ＰＥＧ脂質（モル比５％）、およびＤＳＰＣ（モル比３０％）を含んでなる脂質ナノ粒子に製剤化された。脂質ナノ粒子の平均サイズは１０５ｎｍであり、ＰＤＩは０．１５、ｐＨ７．４におけるζは０．７ｍＶ、カプセル化効率（リボグリーン（ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ））は５５％であり、総脂質と修飾ｍＲＮＡの質量比は２０：１であった。製剤化ｍＲＮＡは、１００μＬで静脈内投与された。１．４ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＬＤＬＲが、対照として使用された。投与の６時間および２４時間後に肝臓が採取され、ミクロソーム調製物が作成されて、ＬｉｃｏｒウエスタンブロットおよびＣＥアッセイを使用して分析された。ＣＥアッセイでは、濃度が、カルネキシン負荷対照に対して正規化された。ＬＤＬＲ発現は、投与の６時間および２４時間後に見られた。
【１００２】
実施例２９．ＬＤＬＲ変異型のインビボ試験
Ａ．マウスＬＤＬＲ
マウスＬＤＬＲ二重変異体（ＰＣＳＫ９およびＩＤＯＬ変異型）をコードするｍＲＮＡ、マウスＬＤＬＲＰＣＳＫ９変異体をコードするｍＲＮＡ、マウスＬＤＬＲＩＤＯＬ変異体をコードするｍＲＮＡ、およびマウス野性型ＬＤＬＲをコードするｍＲＮＡは製剤化されて、ＬＤＬＲ−／−マウスに投与される。投与の２、４、５、６、８および／または２４時間後にサンプルが収集され、当該技術分野で公知の方法（例えば、ＣＥアッセイまたはウエスタンブロット）を使用して、発現が評価される。
【１００３】
複数回投与の効果を判定するために、最も有望なＬＤＬＲ変異体コンストラクトのｍＲＮＡが、マウスに繰り返し投与される（例えば、３回の連続投与）。投与の２、４、５、６、８および／または２４時間後にサンプルが収集されて、当該技術分野で公知の方法（例えば、ＣＥアッセイまたはウエスタンブロット）を使用して発現が評価される。
【１００４】
複数回投与および二重変異体の効果を判定するために、マウスＬＤＬＲ二重変異型（Ｎ３１７ＡおよびＫ８３２Ｒ）をコードするｍＲＮＡが、マウスに繰り返し投与される（例えば、３回の連続投与）。投与の２、４、５、６、８および／または２４時間後にサンプルが収集されて、当該技術分野で公知の方法（例えば、ＣＥアッセイまたはウエスタンブロット）を使用して発現が評価される。
【１００５】
Ｂ．ヒトＬＤＬＲ
ヒトＬＤＬＲ二重変異体（ＰＣＳＫ９およびＩＤＯＬ変異型）をコードするｍＲＮＡ、ヒトＬＤＬＲＰＣＳＫ９変異体をコードするｍＲＮＡ、ヒトＬＤＬＲＩＤＯＬ変異体をコードするｍＲＮＡ、およびマウス野性型ＬＤＬＲをコードするｍＲＮＡは製剤化されて、ＬＤＬＲ−／−マウスに投与される。投与の２、４、５、６、８および／または２４時間後にサンプルが収集され、当該技術分野で公知の方法（例えば、ＣＥアッセイまたはウエスタンブロット）を使用して、発現が評価される。
【１００６】
実施例３０．ＰＣＳＫ９／ＩＤＯＬＬＤＬＲ変異型のインビボ試験
ＬＤＬＲ−／−マウスには、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、または０．０５ｍｇ／ｋｇで、Ｃ１２−２００（モル比４０％）、コレステロール（モル比２５％）、ＰＥＧ２０００−ＤＯＭＧ脂質（モル比５％）、およびＤＳＰＣ（モル比３０％）を含んでなる脂質ナノ粒子に製剤化された、１００μｌのマウスＬＤＬＲ  ｍＲＮＡ（配列番号７４２；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）、マウスＬＤＬＲ変異体１（野性型配列（配列番号７４２）ｍＲＮＡと比較して変異Ｎ３１７Ａ、Ｋ８３２Ｒ、およびＣ８４１Ａを含んでなる（配列番号７２４；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）、マウスＬＤＬＲ変異体２（野性型配列（配列番号７４２）ｍＲＮＡと比較して変異Ｌ３４０Ｄ、Ｋ８３２Ｒ、およびＣ８４１Ａを含んでなる（配列番号７３３；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）、またはマウスＩＤＯＬ変異体（野性型配列（配列番号７４２）ｍＲＮＡと比較して変異Ｋ８３２ＲおよびＣ８４１Ａを含んでなる（配列番号７３４；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）が静脈内投与された。脂質ナノ粒子の平均サイズは１０５ｎｍであり、ＰＤＩは０．１５、ｐＨ７．４におけるζは０．７ｍＶ、カプセル化効率（リボグリーン（ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ））は５５％であり、総脂質と修飾ｍＲＮＡの質量比は２０：１であった。コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ２０００−ＤＯＭＧ（４０：２５：３０：５モル比）、を含んでなるＣ１２−２００脂質ナノ粒子に製剤化された、０．５ｍｇ／ｋｇのルシフェラーゼ（配列番号７４１；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）の対照、野性型マウスおよび組換えマウスＬＤＬＲ標準が、対照として使用された。投与の６時間後に、投与２４時間後の肝臓を採取して、Ｌｉｃｏｒウエスタンブロットを使用して、ミクロソーム調製物が作成された。図２１および表１４に示されるように、マウスＬＤＬＲ変異型は、評価された全ての濃度で野生型ＬＤＬＲよりも良好に発現された。
【１００７】
【表１４】
2016538829.tif 000060
【１００８】
実施例３１．ＬＤＬＲ  ＩＤＯＬ結合変異体インビトロ試験
１００ｎｇのＬＤＬＲをコードする野性型マウスｍＲＮＡ（配列番号：７４２；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）およびマウスＬＤＬＲ変異体１（野性型配列（配列番号７４２）ｍＲＮＡと比較して変異Ｎ３１７Ａ、Ｋ８３２Ｒ、およびＣ８４１Ａを含んでなる（配列番号７２４；およそ１４０ヌクレオチド
のポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ０；１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）が、ＨｅＬａおよびＨｅｐａ１−６に形質移入された。細胞はまた、１００μＬ中の１００ｎｇのルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号７４１；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；５−メチルシトシンおよび１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）または１００μＬ中の１．１ｍｇ／ｋｇＩＤＯＬ  ｍＲＮＡ（配列番号７４３；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中には示されない；５’キャップ、Ｃａｐ１；１−メチルプソイドウリジンによる完全修飾）でも形質移入された。ＬＤＬＲ発現は、フローサイトメトリーによって１４時間後に分析された。
【１００９】
表１５に示されるように、マウスＬＤＬＲ変異体１は、ＩＤＯＬ媒介性ＬＤＬＲ抑制的調節に対する抵抗性を示す。Ｈｅｐａ１−６中では、マウスＩＤＯＬと同時形質移入されたマウスＬＤＬＲ野性型は、ベースラインの１６．７％に低下し、マウスＬＤＬＲ変異体１は、ベースライン発現の６２．９％に低下し、野生型ＬＤＬＲ発現は、ベースラインの６２．３％に低下した。ＨｅＬａ細胞中では、マウスＩＤＯＬと同時形質移入されたマウスＬＤＬＲ野性型は、ベースラインの５０．５％に低下し、マウスＬＤＬＲ変異体１は、ベースライン発現の８４．２％に低下し、ＨｅＬａ中の野生型ＬＤＬＲ発現発現は、わずかまたは皆無であった。
【１０１０】
【表１５】
2016538829.tif 000061
【１０１１】
その他の実施形態
使用された言葉は限定でなく説明の言葉であり、そのより広い態様で本発明の真の範囲および趣旨を逸脱することなく、添付の特許請求の範囲内で変更形態をなし得ることが理解される。
【１０１２】
本発明は、相当詳しく、かついくつかの説明される実施形態に関してある程度の特殊性をもって説明される一方で、それが任意のこのような詳細または実施形態または任意の特別な実施形態に限定されるべきであることは意図されず、先行技術を考慮して、このような請求項の最も広い可能な解釈を提供し、ひいては、意図される本発明の範囲を事実上包含するように、添付の特許請求の範囲を参照して解釈されるべきものである。
【１０１３】
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その内容全体を参照によって援用する。矛盾する場合は、定義を含めて本明細書が優先される。これに加えて、セクション見出し、材料、方法、および実施例は、例証のみを意図し、限定は意図されない。
【図１】
2016538829.tif 000062
【図２】
2016538829.tif 000063
【図７】
2016538829.tif 000064
【図８】
2016538829.tif 000065
【図９】
2016538829.tif 000066
【図１０】
2016538829.tif 000067
【図１１】
2016538829.tif 000068
【図１２】
2016538829.tif 000069
【図１３】
2016538829.tif 000070
【図３】
2016538829.tif 000071
【図４】
2016538829.tif 000072
【図５】
2016538829.tif 000073
【図６】
2016538829.tif 000074
【図１４】
2016538829.tif 000075
【図１５】
2016538829.tif 000076
【図１６】
2016538829.tif 000077
【図１７】
2016538829.tif 000078
【図１８Ａ】
2016538829.tif 000079
【図１８Ｂ】
2016538829.tif 000080
【図１９Ａ】
2016538829.tif 000081
【図１９Ｂ】
2016538829.tif 000082
【図１９Ｃ】
2016538829.tif 000083
【図１９Ｄ】
2016538829.tif 000084
【図１９Ｅ】
2016538829.tif 000085
【図１９Ｆ】
2016538829.tif 000086
【図１９Ｇ】
2016538829.tif 000087
【図２０】
2016538829.tif 000088
【図２１】
2016538829.tif 000089
【配列表】
2016538829000001.app
【国際調査報告】
2016538829.tif 000090
2016538829.tif 000091
2016538829.tif 000092
2016538829.tif 000093
2016538829.tif 000094
2016538829.tif 000095