(57)【要約】被検体の非造血細胞におけるＥＰＯ媒介ヘモグロビン発現を誘導するための組成物を提供する。該組成物は、式（Ｉ）で表される化合物と、薬学的に許容できる担体を含み、式中Ｒがグリコシル基である。2016516745.tif 000013
2016516745.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式（Ｉ）で表される化合物と、薬学的に許容できる担体を含み、
【化１】
2016516745.tif 000006
式中、Ｒがグリコシル基であることを特徴とする、被検体の非造血細胞においてエリスロポエチン（ＥＰＯ）媒介ヘモグロビン（Ｈｂ）発現を誘導するための組成物。
【請求項２】
前記グリコシル基が、ジヒドロキシアセトン、ブドウ糖、ガラクトース、グリセルアルデヒド、トレオース、キシロース、マンノース、リボース、リブロース、タガトース、プシコース、果糖、ソルボース、ラムノース、エリトロース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、蔗糖、乳糖、麦芽糖、ラクツロース、トレハロース、セロビオース（cellobose）、イソマルトトリオース、ニゲロトリオース、マルトトリオース、メレジトース、マルトトリウロース、ラフィノース、ケストース、及びそれらの組み合わせで構成される群より１つ選択されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記化合物が、被検体の非造血細胞においてＨｂ−α、Ｈｂ−β、または二量体Ｈｂの発現を誘導することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記化合物が、エリスロポエチン―エリスロポエチン受容体結合親和性を高めることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記化合物が、前記エリスロポエチンが結合したエリスロポエチン受容体複合体に結合することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記化合物が内因性ＥＰＯ発現を高め、非造血細胞におけるＨｂ発現を刺激することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記非造血細胞が、腎細胞、肝細胞、心筋細胞、筋原細胞、グリア細胞、神経細胞、および網膜色素上皮細胞から構成される群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
被検体の非造血細胞におけるエリスロポエチン（ＥＰＯ）媒介ヘモグロビン（Ｈｂ）発現を誘導する方法であって、次の式（Ｉ）で表される化合物の治療有効量を前記被検体に投与する工程を含み、
【化２】
2016516745.tif 000007
式中、Ｒがグリコシル基であることを特徴とする、方法。
【請求項９】
前記グリコシル基が、ジヒドロキシアセトン、ブドウ糖、ガラクトース、グリセルアルデヒド、トレオース、キシロース、マンノース、リボース、リブロース、タガトース、プシコース、果糖、ソルボース、ラムノース、エリトロース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、蔗糖、乳糖、麦芽糖、ラクツロース、トレハロース、セロビオース、イソマルトトリオース、ニゲロトリオース、マルトトリオース、メレジトース、マルトトリウロース、ラフィノース、ケストース、及びそれらの組み合わせで構成される群より１つ選択されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物が、被検体の非造血細胞においてＨｂ−α、Ｈｂ−β、または二量体Ｈｂ発現を誘導することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物が、内因性ＥＰＯ発現を高め、被検体の非造血細胞においてＨｂ発現を刺激することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記被検体が、低酸素症、貧血、腎臓虚血、心筋虚血、肺虚血、神経変性疾患、神経精神病的疾患、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）関連の疾患、及びそれらの組み合わせから構成される群より選択される疾患または症候群を患っていることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
次の式（Ｉ）で表される化合物と、薬学的に許容できる担体を含み、
【化３】
2016516745.tif 000008
式中、Ｒがグリコシル基であることを特徴とする、被検体の非造血細胞においてエリスロポエチン（ＥＰＯ）媒介ミトコンドリア新生を誘導するための組成物。
【請求項１４】
前記グリコシル基が、ジヒドロキシアセトン、ブドウ糖、ガラクトース、グリセルアルデヒド、トレオース、キシロース、マンノース、リボース、リブロース、タガトース、プシコース、果糖、ソルボース、ラムノース、エリトロース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、蔗糖、乳糖、麦芽糖、ラクツロース、トレハロース、セロビオース、イソマルトトリオース、ニゲロトリオース、マルトトリオース、メレジトース、マルトトリウロース、ラフィノース、ケストース、及びそれらの組み合わせで構成される群より１つ選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記化合物が、ミトコンドリア数またはＥＰＯ媒介ミトコンドリア新生を誘導するためのＰＧＣ−１α発現の増加を誘導することを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記化合物が、エリスロポエチン−エリスロポエチン受容体結合親和性を高めることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
前記化合物が、前記エリスロポエチンが結合したエリスロポエチン受容体複合体に結合することを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１８】
前記化合物が、内因性ＥＰＯ発現を高め、被検体の非造血細胞においてＨｂ発現を刺激することを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＥＰＯ媒介ミトコンドリア新生がＰＧＣ−１α依存的であることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２０】
前記非造血細胞が、腎細胞、肝細胞、心筋細胞、筋原細胞、グリア細胞、神経細胞、および網膜色素上皮細胞から構成される群より選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２１】
被検体の非造血細胞においてエリスロポエチン（ＥＰＯ）媒介ミトコンドリア新生を誘導する方法であって、次の式（Ｉ）で表される化合物の治療有効量を前記被検体に投与する工程を含み、
【化４】
2016516745.tif 000009
式中、Ｒがグリコシル基であることを特徴とする、方法。
【請求項２２】
前記グリコシル基が、ジヒドロキシアセトン、ブドウ糖、ガラクトース、グリセルアルデヒド、トレオース、キシロース、マンノース、リボース、リブロース、タガトース、プシコース、果糖、ソルボース、ラムノース、エリトロース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、蔗糖、乳糖、麦芽糖、ラクツロース、トレハロース、セロビオース、イソマルトトリオース、ニゲロトリオース、マルトトリオース、メレジトース、マルトトリウロース、ラフィノース、ケストース、及びそれらの組み合わせで構成される群より１つ選択されることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記化合物が、ミトコンドリア数またはＥＰＯ媒介ミトコンドリア新生を誘導するためのＰＧＣ−１α発現の増加を誘導することを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記被検体が、低酸素症、貧血、虚血関連疾患、神経変性疾患、神経精神病的疾患、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）関連の疾患、心筋障害、脳老化、慢性の肝疾患、多発性硬化症、ポンペ病、高血圧、心不全、肥満、糖尿病、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、老化、メタボリック症候群、及びそれらの組み合わせから構成される群より選択される疾患または症候群を患っていることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記虚血関連疾患が、心臓虚血、虚血性神経変性、脳虚血（brain ischemia）、心筋虚血、手足虚血、脳虚血（cerebral ischemia）、肝臓虚血、網膜虚血、脳卒中、ネフローゼ虚血（nephritic ischemia）、肺虚血、腸虚血、心臓血管虚血、腎虚血（renal ischemia）及び虚血腎（kidney ischemia）から構成される群より１つ選択されることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、及びハンティントン病で構成される群より選択されることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
オートファジー異常を有する被検体においてオートファジーを誘導する方法であって、次の式（Ｉ）で表される化合物の治療有効量を前記被検体に投与する工程を含み、
【化５】
2016516745.tif 000010
式中、Ｒはグリコシル基であり、前記オートファジーが前記被検体におけるタンパク質凝集体の分解を強化することを特徴とする、方法。
【請求項２８】
前記グリコシル基が、ジヒドロキシアセトン、ブドウ糖、ガラクトース、グリセルアルデヒド、トレオース、キシロース、マンノース、リボース、リブロース、タガトース、プシコース、果糖、ソルボース、ラムノース、エリトロース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、蔗糖、乳糖、麦芽糖、ラクツロース、トレハロース、セロビオース、イソマルトトリオース、ニゲロトリオース、マルトトリオース、メレジトース、マルトトリウロース、ラフィノース、ケストース、及びそれらの組み合わせで構成される群より１つ選択されることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記オートファジー異常が、前記被検体において前記タンパク質凝集体を発現する細胞にあることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記被検体の細胞が、神経細胞またはグリア細胞であることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記タンパク質凝集体が、ハンチンチン、アミロイドβ（Ａβ）、α−シヌクレイン、タウ、スーパーオキシドジスムターゼ１(ＳＯＤ１)、それらのバリアント及び変異型、及びそれらの組み合わせから構成される群より選択される凝集体であることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記オートファジー異常が、神経変性疾患、網膜疾患、クローン病、老化、心臓肥大、慢性心不全、結核、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性繊維症、肝臓脂肪変性、腎多嚢胞病、腎不全、筋肉退化、骨パジェット病、封入体筋障害、前頭側頭型認知症、糸球体疾患、代謝病、II型糖原病、炎症性腸疾患、及びポンペ病から構成される群より選択される１つの疾患であることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記神経変性疾患が、ハンティントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及び不眠から構成される群より選択されることを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
オートファジー異常を有する被検体においてオートファジーを誘導するための組成物であって、次の式（Ｉ）で表される化合物と、薬学的に許容できる担体を含み、
【化６】
2016516745.tif 000011
式中、Ｒがグリコシル基である、ことを特徴とする組成物。
【請求項３５】
前記グリコシル基が、ジヒドロキシアセトン、ブドウ糖、ガラクトース、グリセルアルデヒド、トレオース、キシロース、マンノース、リボース、リブロース、タガトース、プシコース、果糖、ソルボース、ラムノース、エリトロース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、蔗糖、乳糖、麦芽糖、ラクツロース、トレハロース、セロビオース、イソマルトトリオース、ニゲロトリオース、マルトトリオース、メレジトース、マルトトリウロース、ラフィノース、ケストース、及びそれらの組み合わせで構成される群より１つ選択されることを特徴とする、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
被検体における記憶喪失を予防する方法であって、次の式（Ｉ）で表される化合物の治療有効量を前記被検体に投与する工程を含み、
【化７】
2016516745.tif 000012
式中、Ｒはグリコシル基であり、前記化合物が被検体におけるオートファジーを活性化させることを特徴とする、方法。
【請求項３７】
前記グリコシル基が、ジヒドロキシアセトン、ブドウ糖、ガラクトース、グリセルアルデヒド、トレオース、キシロース、マンノース、リボース、リブロース、タガトース、プシコース、果糖、ソルボース、ラムノース、エリトロース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、蔗糖、乳糖、麦芽糖、ラクツロース、トレハロース、セロビオース、イソマルトトリオース、ニゲロトリオース、マルトトリオース、メレジトース、マルトトリウロース、ラフィノース、ケストース、及びそれらの組み合わせで構成される群より１つ選択されることを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記化合物が、前記被検体におけるオートファジーを活性化させるためのエリスロポエチン（ＥＰＯ）を誘導することを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記オートファジーが、前記被検体におけるタンパク質分解を強化することを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記オートファジー異常が、ハンティントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、及び不眠から構成される群より選択される神経変性疾患であることを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検体においてヘモグロビン発現、ミトコンドリア新生、およびオートファジーを誘導する組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
虚血は酸素欠乏、細胞障害、及び心不全、脳卒中、慢性閉塞性肺疾患、虚血性網膜障害、肝損傷、および急性腎不全などの関連臓器機能不全を引き起こす。ミトコンドリア機能障害は臓器虚血障害の主要な要因であるため、酸素の欠乏で、ミトコンドリアの酸化的リン酸化が急速に停止し、その結果エネルギー代謝に必要なＡＴＰ産生の主要なソースが失われる。
【０００３】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は低酸素症と貧血の間の組織酸素化における変化に対応した赤血球量の調整に不可欠である。ＥＰＯの保護効果は、虚血により誘導された障害の様々な組織と実験モデルで示されており、非造血性代謝的適応、アポト−シスの阻害または血管新生の刺激に対する効果の結果と考えられている。最近、ＥＰＯは心臓のエネルギー代謝の主要制御因子であるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体コアクチベータ−１−α（ＰＧＣ−１α）によって媒介される、ミトコンドリア新生の活性化を通じて心臓のミトコンドリア増殖を刺激することが報告されている。臨床的に、ＥＰＯは貧血の修正を超えた保護効果を誘導することで患者の心臓リモデリングを逆行させ、心機能を改善し、運動耐容能を高めて生活の質を向上する。これらの発見は、ＥＰＯにより媒介される保護がその細胞内エネルギーに対する調整効果に依存する可能性を示唆している。
【０００４】
ヘモグロビン（Ｈｂ）は赤血球中の主要な酸素輸送体である。その主要形態であるヘモグロビンＡは、それぞれが１個のヘム基を持つαリペプチド鎖及びβポリペプチド鎖２本ずつで構成される四量体である。最近、Ｈｂが多くの非造血細胞で発現され、組織酸素輸送を促進または細胞の酸素化を向上し、低酸素性/虚血性障害に対する内在的な保護メカニズムを提供する可能性があることが予期せず発見された。
【０００５】
睡眠は学習や記憶の基礎となる大脳の可塑的な変化に関与しているとされている。レム睡眠（急速眼球運動、ＲＥＭ）とノンレム睡眠（ＮＲＥＭ）の両方が記憶において重要な役割を果たす。ラットの行動観察で、学習期間はその後に続くレム睡眠の増加に関係しているが、レム睡眠を剥奪すると、以前に学習した情報の認知手続記憶や潜在記憶が損なわれることが示唆されている。ＮＲＥＭは、宣言的記憶である単語ペア関連リスト（ｗｏｒｄ  ｐａｉｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｌｉｓｔ）を保持する能力と正の相関性があることが分かった。さらに、ＮＲＥＭ中の海馬での鋭波−リップル波の再活性化による短期記憶から長期記憶への変換が、記憶の定着に重要であった。また、健常者において、夜間初期のＮＲＥＭの間に振動電位（０．７５Ｈｚ）を経頭蓋に印加することによって徐波振動様電位場を誘導することで、海馬依存性の宣言的記憶の保持が強化されることも示されている。
【０００６】
アルツハイマー病などの認知症（ＡＤ）を罹患した患者には、往々にして夜間の睡眠中断がある。早期ＡＤ患者のレム睡眠が疾患の経過による影響を比較的受けない一方で、後期のＡＤではレム睡眠の重大な損失が顕著である。これら夜間の睡眠の中断は認知症の重篤度の進行に従って増加する。記憶喪失は脂質、タンパク質、核酸への酸化的損傷の蓄積とミトコンドリア崩壊を伴い、それらすべてが加齢と疾患において神経機能を妨害する。また睡眠遮断（ＳＤ）は酸化的ストレスも誘導し、それが記憶喪失とミトコンドリア活性の低下を招く。研究によると、若い成人における３６時間のＳＤは、約６０歳の健常者と類似した神経心理学的結果となる。したがって、ミトコンドリア機能とＲＯＳホメオスタシスの調整は、酸化的ストレス関連の記憶喪失における治療介入として有用である可能性がある。
【０００７】
さらに、ＥＰＯとＥＰＯ受容体の両方がニューロンとアストロサイトで発現され、ＥＰＯは主に脳内のアストロサイトで産生される。ＥＰＯは貧血患者において赤血球産生を強化するために広く用いられており、最近心保護と神経保護を含む多くの非造血性の有益な効果を有することが分かった。早期の臨床試験では、慢性腎不全患者のＥＰＯ治療中における認知改善が示された。最近の研究では、神経精神病患者において高用量ＥＰＯ治療が海馬の可塑性と認知能力を改善することが示されている。高用量ＥＰＯは可塑性、シナプス結合、記憶関連のニューラルネットワ−クの活性を調整することで海馬の長期増強を改善し、健康なマウスにおける認知能力のオペラント条件付けの安定性も向上する。
【０００８】
ＥＰＯがＳＤにより誘導される海馬の学習及び記憶障害の治療において下流のミトコンドリアレギュレーター発現の調整により薬理的応用に極めて重要な役割を果たすと仮定される。ＥＰＯは血液脳関門（ＢＢＢ）を自由に通れないために臨床的利用が限られることから、高用量遺伝子組み換えＥｐｏ（ｒＥｐｏ）の全身投与しか神経保護的活性を生じることはできない。
【０００９】
オートファジー、または「自食作用」は、タンパク質、タンパク質凝集体、オルガネラなどの細胞質成分を標的としてリソソームで分解するための重要な生理的過程である。オートファジーの過程はニューロンのホメオスタシス維持にも不可欠であり、その機能不全は疾患数の増加に直接関連している。さらに、オートファジーは飢餓中の細胞代謝を持続し、ストレス中に蓄積される損傷したオルガネラとタンパク質を排除するために細胞内栄養をリサイクルするようになっている。
【００１０】
オートファジー不全は神経変性、肝疾患、癌など（但しこれらに限らない）疾患の主要な要因である。ヒトの神経変性病の多くが異常な変異及び（または）ポリユビキチン化タンパク質の蓄積、及び過剰な神経細胞死に関連している。
【００１１】
カシュウ（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ  Ｔｈｕｎｂ）は貧血、肝疾患及びその他通常老化に関連付けられる疾患の治療に用いられる漢方薬である。本発明はカシュウ（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ  Ｔｈｕｎｂ）から分離・同定された小分子化合物を提供する。これらの化合物は心疾患、脳虚血、アルツハイマー病、炎症性疾患の実験モデルにおいて効果があり、かつ抗酸化物質とフリーラジカル捕捉性を持つ。さらに、本発明はこの化合物の動物モデルにおける治療的効果と生理学的機序も提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、非造血細胞におけるＥＰＯ媒介ヘモグロビン発現とミトコンドリア新生を誘導する組成物および方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、被検体の非造血細胞においてエリスロポエチン（ＥＰＯ）媒介ヘモグロビン（Ｈｂ）発現を誘導する組成物を提供する。前記組成物が式（Ｉ）で示される化合物と、薬学的に許容できる担体を含み、
【化１】
2016516745.tif 000003
式中、Ｒはグリコシル基である。
【００１４】
前記グリコシル基は、ジヒドロキシアセトン、ブドウ糖、ガラクトース、グリセルアルデヒド、トレオース、キシロース、マンノース、リボース、リブロース、タガトース、プシコース、果糖、ソルボース、ラムノース、エリトロース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、蔗糖、乳糖、麦芽糖、ラクツロース、トレハロース、セロビオース、イソマルトトリオース、ニゲロトリオース、マルトトリオース、メレジトース、マルトトリウロース、ラフィノース、ケストース、及びそれらの組み合わせで構成される群より１つ選択される。
【００１５】
本発明によれば、前記化合物は被検体の非造血細胞におけるＨｂ−α、Ｈｂ−β、または二量体Ｈｂの発現を誘導し、エリスロポエチン―エリスロポエチン受容体の結合親和性を高めるとともに、エリスロポエチン結合エリスロポエチン受容体複合体にも結合する。加えて、前記化合物は内因性ＥＰＯ発現を高め、非造血細胞におけるＨｂ発現を刺激する。
【００１６】
前記非造血細胞は腎細胞、肝細胞、心筋細胞、筋原細胞、グリア細胞、神経細胞、および網膜色素上皮細胞から構成される群より選択される。
【００１７】
本発明はさらに、被検体の非造血細胞においてエリスロポエチン（ＥＰＯ）媒介ヘモグロビン（Ｈｂ）発現を誘導する方法を提供し、前記方法が、式（Ｉ）で示される前記化合物の治療有効量を被検体に投与する工程を含む。本発明によれば、前記被検体は、低酸素症、貧血、腎臓虚血、心筋虚血、肺虚血、神経変性疾患、神経精神病的疾患、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）関連の疾患、及びそれらの組み合わせから構成される群より選択される疾患または症候群を患っている。
【００１８】
本発明はさらに、被検体の非造血細胞においてエリスロポエチン（ＥＰＯ）媒介ミトコンドリア新生を誘導する組成物を提供し、前記組成物が式（Ｉ）で示される前記化合物と、薬学的に許容できる担体を含む。
【００１９】
本発明によれば、前記化合物はＥＰＯ媒介ミトコンドリア新生を誘導するためのミトコンドリア数またはＰＧＣ−１αの発現増加を誘導し、エリスロポエチン―エリスロポエチン受容体の結合親和性を高め、エリスロポエチン結合エリスロポエチン受容体複合体にも結合する。加えて、前記化合物は前記被検体の非造血細胞における内因性ＥＰＯ発現を強化し、Ｈｂ発現を刺激する。前記ＥＰＯ媒介ミトコンドリア新生はＰＧＣ−１α依存的である。
【００２０】
前記非造血細胞は、腎細胞、肝細胞、心筋細胞、筋原細胞、グリア細胞、神経細胞、および網膜色素上皮細胞から構成される群より選択される。
【００２１】
本発明はさらに、被検体の非造血細胞においてエリスロポエチン（ＥＰＯ）媒介ミトコンドリア新生を誘導する方法を提供し、前記方法が、前記被検体に式（Ｉ）で示される前記化合物の治療有効量を投与する工程を含む。前記化合物はＥＰＯ媒介ミトコンドリア新生を誘導するためのミトコンドリア数またはＰＧＣ−１αの発現増加を誘導する。
【００２２】
前記被検体は、低酸素症、貧血、虚血関連疾患、神経変性疾患、神経精神病的疾患、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）関連の疾患、心筋障害、脳老化、慢性の肝疾患、多発性硬化症、ポンペ病、高血圧、心不全、肥満、糖尿病、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、老化、メタボリック症候群、及びそれらの組み合わせから構成される群より選択される疾患または症候群を患っている。
【００２３】
前記虚血関連疾患は、心臓虚血、虚血性神経変性、脳虚血（ｂｒａｉｎ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）、心筋虚血、手足虚血、脳虚血（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）、肝臓虚血、網膜虚血、脳卒中、ネフローゼ虚血（ｎｅｐｈｒｉｔｉｃ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）、肺虚血、腸虚血、心臓血管虚血、腎虚血（ｒｅｎａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）及び虚血腎（ｋｉｄｎｅｙ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）から構成される群より１つ選択される。前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、及びハンティントン病から構成される群より１つ選択される。
【００２４】
本発明はさらに、オートファジー異常を有する被検体においてオートファジーを誘導する方法を提供し、前記方法が式（Ｉ）で示される前記化合物の治療有効量を前記被検体に投与する工程を含み、そのうち、前記オートファジーが前記被検体におけるタンパク質凝集体の分解を強化する。
【００２５】
前記オートファジー異常は、被検体においてタンパク質凝集体を発現している細胞内にあり、そのうち、タンパク質凝集体は、ハンチンチン、アミロイドβ（Ａβ）、α−シヌクレイン、タウ、スーパーオキシドジスムターゼ１(ＳＯＤ１)、それらのバリアント及び変異型、及びそれらの組み合わせから構成される群より選択される凝集体である。前記被検体の細胞は神経細胞またはグリア細胞である。
【００２６】
前記オートファジー異常は、神経変性疾患、網膜疾患、クローン病、老化、心臓肥大、慢性心不全、結核、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性繊維症、肝臓脂肪変性、腎多嚢胞病、腎不全、筋肉退化、骨パジェット病、封入体筋障害、前頭側頭型認知症、糸球体疾患、代謝病、II型糖原病、炎症性腸疾患、及びポンペ病から構成される群より選択される１つの疾患である。前記神経変性疾患は、ハンティントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及び不眠から構成される群より選択される。
【００２７】
本発明はさらに、オートファジー異常を有する被検体においてオートファジーを誘導するための組成物を提供する。前記組成物が、式（Ｉ）で示される前記化合物と、薬学的に許容できる担体を含む。
【００２８】
さらに、本発明は被検体における記憶喪失を予防する方法を提供し、前記方法が、前記被検体に式（Ｉ）で示される前記化合物の治療有効量を投与する工程を含む。前記化合物はエリスロポエチン（ＥＰＯ）を誘導し、前記被検体においてオートファジーを活性化する。
【００２９】
前記オートファジーは前記被検体におけるタンパク質分解を強化する。
前記オートファジー異常は、ハンティントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、及び不眠から構成される群より選択される神経変性疾患である。
【００３０】
この特許又は出願ファイルは、少なくとも１つの色彩を付して作成された図面を含んでいる。彩色図面が付された、この特許又は特許出願公開の写しは、請求及び所要の手数料の納付により、特許商標庁によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＥＨ−２０１の特性解析を示す図である。（Ａ）ＥＨ−２０１のＨＰＬＣプロファイルである。Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  ＲＰ−１８カラム（４．６×２５０ｍｍ  ｉ．ｄ．、５μｍ）がＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（２０／８０、ｖ／ｖ）で流速０．８ｍｌ／分、６０分間でグラジエント１００％ＭｅＯＨまで、検出波長２８０ｎｍ及び３００ｎｍで使用された。（Ｂ）ＥＨ−２０１の正イオンモードＬＣ−ＡＰＣＩ／ＭＳ／ＭＳである。
【図２】ＥＨ−２０１がＥＰＯ発現の強力な誘導物質であることを示す図である。（Ａ）ＥＨ−２０１の化学構造である。（Ｂ）、（Ｃ）ＥＨ−２０１処理済み腎臓切片及び肝細胞のＥＰＯ発現がＱ−ＰＣＲ及びウェスタンブロット分析により分析された。（Ｄ）、（Ｅ）初代マウス心筋細胞と（Ｆ）、（Ｇ）Ｃ２Ｃ１２筋管細胞がＥＨ−２０１で処理され、ＥＰＯ及びＥＰＯＲ発現への効果がＱＰＣＲとウェスタンブロット分析で分析された。（Ｈ）骨髄細胞がＥＨ−２０１と４８時間培養され、ＥＰＯ発現がＱ−ＰＣＲにより検出された。（Ｉ）骨髄細胞がＥＨ−２０１と培養され、９日目に赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）についてコロニー数がカウントされた。（Ｊ）ヘモグロビン比色測定を使用して分化された赤芽球前駆細胞の定量化が行われた。対照群はビークル処理を表す。値は平均±ＳＥＭ（それぞれｎ＝６）で示される。*Ｐ＜０．０１、*Ｐ＜０．０５ｖｓ．対照群、スチューデントＴ検定。
【図３】ＥＨ−２０１によるミトコンドリア新生の誘導がＥＰＯにより媒介されることを示す図である。（Ａ）、（Ｂ）ＥＨ−２０１処理済み腎臓切片と初代心筋細胞、及び（Ｃ）、（Ｄ）ＥＰＯ中和抗体（ｎＥＰＯ−ａｂ、１μｇ／ｍｌ）ありとなしのＥＨ−２０１処理済み肝細胞とＣ２Ｃ１２筋管細胞がＰＧＣ−１α発現についてＱＰＣＲ（ｎ＝６）とウェスタンブロット分析（ｎ＝４）、クエン酸シンターゼ活性（ｎ＝３）、及びｍｔＤＮＡコピー数（ｎ＝６）とＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒアッセイ（ｎ＝６）により分析された。対照群はビークル処理を示す。（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）ｒｈＥＰＯが腎臓切片、肝細胞、Ｃ２Ｃ１２筋管細胞に与えられた。ミトコンドリア活性がＰＧＣ−１α  Ｑ−ＰＣＲ（ｎ＝６）、クエン酸シンターゼ活性（ｎ＝３）、ｍｔＤＮＡコピー数（ｎ＝６）、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒアッセイ（ｎ＝６）により判定された。対照群はビークル処理を示す。ＰＧＣ−１α  ｓｉＲＮＡ導入Ｃ２Ｃ１２筋管細胞がｒｈＥＰＯで処理された（ｎ＝６）。対照群はスクランブルｓｉＲＮＡ処理を示す。値は平均±ＳＥＭとして示される。**Ｐ＜０．０１、*Ｐ＜０．０５ｖｓ．未処理の対照群、ｎ．ｓ．有意差なし、スチューデントＴ検定。
【図４】非造血細胞におけるＥＨ−２０１によるヘモグロビン発現の誘導がＥＰＯにより媒介されることを示す図である。（Ａ）酸素正常または低酸素（５％Ｏ２）下で２４時間培養されたＣ２Ｃ１２筋管細胞がヘモグロビン−α（Ｈｂ−α）とヘモグロビン−β（Ｈｂ−β）の発現についてＲＴ−ＰＣＲとそれに続く１.５％アガロースゲル電気泳動より分析された。（Ｂ）ＰＧＣ−１α  ｓｉＲＮＡトランスフェクションありまたはなしのｒｈＥＰＯ処理済みＣ２Ｃ１２筋管細胞がヘモグロビン発現についてＱ−ＰＣＲ（ｎ＝６）により分析された。対照群はスクランブルｓｉＲＮＡ処理を示す。（Ｃ）、（Ｄ）ｒｈＥＰＯ処理済み腎臓切片と肝細胞がヘモグロビン発現についてＱ−ＰＣＲ（ｎ＝６）により分析された。対照群はビークル処理を示す。（Ｅ）、（Ｆ）ＥＨ−２０１処理済み腎臓切片と初代マウス心筋細胞及び（Ｇ）、（Ｈ）ＥＰＯ中和抗体（ｎＥＰＯ−ａｂ、１μｇ／ｍｌ）ありとなしのＥＨ−２０１処理済み肝細胞とＣ２Ｃ１２筋管細胞がヘモグロビン発現についてＱ−ＰＣＲ（ｎ＝６）により分析された。値は平均±ＳＥＭとして示される。**Ｐ＜０.０１、*Ｐ＜０.０５ｖｓ．未処理の対照群、＃Ｐ＜０.０５ｖｓ．  ｒｈＥＰＯ処理対照群（５０ｎｇ／ｍｌ）。（Ｉ）ｒｈＥＰＯとＥＨ−２０１のＴＦ−１細胞増殖に対する効果がトリパンブルー色素排除試験法（図４Ｉ上部、ｎ＝６）により判定された。ｒｈＥＰＯ（２ｎｇ／ｍｌ）とＥＨ−２０１同時処理ＴＦ−１細胞が中和抗体（ｎＥＰＯＲ−ａｂ、０.５μｇ／ｍｌ；ｎＥＰＯ−ａｂ、１μｇ／ｍｌ）ありまたはなしで４８時間増殖試験により培養された（図４Ｉ下部、ｎ＝６）。値は平均±ＳＥＭとして示される。**Ｐ＜０.０１、*Ｐ＜０.０５ｖｓ．対照群（図４Ｉ上部）またはｒｈＥＰＯ単独（図４Ｉ下部）、＃＃Ｐ＜０.０１ｖｓ．ｒｈＥＰＯ+ＥＨ−２０１ ２５Ｍ、スチューデントＴ検定。
【図５】ＥＨ−２０１がマウスにおける持久力とミトコンドリア活性とヘモグロビン発現の活性化を向上することを示す図である。（Ａ）正常なマウスの持久力がロータロッド運動により酸素正常または低酸素（８％Ｏ２）条件下で測定された（ＮＤ：正常食）。（Ｂ）ＥＨ−２０１の血漿赤血球数とヘモグロビンレベルに対する効果である。（Ｃ）、（Ｄ）ＥＨ−２０１処理の３日後にマウスの腎臓と肝臓におけるＥＰＯ  ｍＲＮＡ発現がＱ−ＰＣＲにより測定された。ＥＰＯの血清レベルがＥＬＩＳＡにより判定された。（Ｅ）、（Ｆ）ＥＨ−２０１処理の３日後に分離された心筋組織のヘモグロビン発現についてＱ−ＰＣＲで分析され、ミトコンドリア新生がｍｔＤＮＡコピー数によって判定された。（Ｇ）ＥＨ−２０１治療の心室ヘモグロビン（Ｈｂ）発現に対する効果がＳＤＳ−ＰＡＧＥでのＴＭＢＺ染色により定量化された（図５Ｇ左側）。Ｈｂ発現の定量化（四量体と二量体、図５Ｇ右側）。値は平均±ＳＥＭ（各群ｎ＝５匹）で示される。**Ｐ＜０.０１、*Ｐ＜０.０５ｖｓ．ＮＤ群；＃＃Ｐ＜０.０１、＃Ｐ＜０.０５ｖｓ．７日目のＮＤ群、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）とテューキーポストホックテストによる。
【図６】ＥＨ−２０１がマウスにおけるドキソルビシン（Ｄｏｘ）誘導心筋症の心機能障害に対して治療効果を有することを示す図である。（Ａ）カプラン・マイヤー法（詳細な処理プロトコルは材料と方法に記載）を使用して生存率が分析された。正常（Ｎ）群は生理食塩水注射を示す。（Ｂ）Ｄｏｘ注射の２週間後に低酸素性ロータロッド持久力試験を行っているマウスに対するＥＨ−２０１治療の効果を示す。（Ｃ）、（Ｄ）心臓異常と機能に対するＥＨ−２０１の効果がＥＣＧと心エコー検査で特徴付けられた。ＥＦは駆出率、ＦＳは短縮率、ＬＶＩＤｓ／ｄは収縮期／拡張期の左心室内部直径である。（Ｅ）ヘマトキシリン・エオシンとマッソントリクロームで染色したマウス心臓の左心室薄片の代表写真である（図６Ｅの左部分、棒＝１０μｍ）。青い染色は線維症を示し、間質性線維症の定量化が行われた（図６Ｅの右部分）。（Ｆ）Ｄｏｘ２週間後の分離された心筋組織のヘモグロビン発現がＱ−ＰＣＲにより分析された。（Ｇ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける治療群の各心筋ライセートのＴＭＢＺ染色が行われた。（Ｈ）図６Ｇの定量値である。値は平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝各群５〜６匹）。**Ｐ＜０.０１、*Ｐ＜０.０５ ｖｓ． Ｄｏｘ群、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）とテューキーポストホックテストによる。
【図７】ＥＨ−２０１がマウスにおけるシスプラチン誘導腎症で貧血と腎機能の回復を加速することを示す図である。（Ａ）プロトコル概略説明図である。（Ｂ）末梢血中のＲＢＣ数の時間経過動態である。（Ｃ）シスプラチン注射後の血中尿素窒素（ＢＵＮ）値の時間経過動態である。（Ｄ）２８日目のＥＨ−２０１治療マウスの腎臓機能回復を示す。（Ｅ）２８日目のＥＨ−２０１処理後腎臓切片のヘマトキシリン・エオシン染色である（棒＝１００μｍ）、（Ｆ）（Ｇ）２８日目の腎臓と肝臓におけるＥＰＯ発現がＱ−ＰＣＲにより判定された。（Ｈ）２８日目に治療マウスから分離された骨髄細胞におけるＢＦＵ−Ｅコロニー数である。値は平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝各群５〜６匹）。＃＃Ｐ＜０.０１ｖｓ．正常群；**Ｐ＜０.０１、*Ｐ＜０.０５ ｖｓ．対照群、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）とテューキーポストホックテストによる。
【図８】ＥＨ−２０１がＳｉｒｔ１発現を誘導することを示す図である。ＥＨ−２０１処理済み腎臓切片と肝細胞のライセートにおけるＳｉｒｔ１タンパク質発現がウェスタンブロット分析（ｎ＝４）により分析された。対照群はビークル処理を表す。値は平均±ＳＥＭとして表される。**Ｐ＜０.０１、*Ｐ＜０.０５、対照群と比較。
【図９】ＥＨ−２０１のＥＰＯ／ＥＰＯＲ複合体に対するコンピュータによるドッキング結果のリボン図である。ドッキング計算はＥＰＯＲタンパク質モデル（ＰＤＢエントリコード１ｃｎ４）の細胞外ドメインと複合されたＥＰＯに対しＤｏｃｋｉｎｇＳｅｒｖｅｒを使用して行われた。球体と棒の炭素主鎖（緑色）はリガンド分子ＥＨ−２０１を示し、へリックス（赤色、図９の左部分）はＥＰＯのへリックスＡを示し、ループ（灰色、図９の右部分）はＥＰＯＲのループ５を示す。ＰＲＯ１４４、ＧＬＵ１４７、ＰＲＯ１４９、Ｍｅｔ１５０、ＴＨＲ１５１を含む予測相互作用残基は、ＥＰＯ結合に重要なＥＰＯＲのループ５に位置する。
【図１０】ＥＨ−２０１誘導ＥＰＯ産生はＨｉｆ−α活性化に関与しないことを示す図である。（Ａ）低酸素応答配列（ＨＲＥ）誘起ルシフェラーゼレポーター（Ｌｕｃｉ）導入ＨＥＫ２９３細胞がＥＨ−２０１とともに酸素正常または低酸素（５％Ｏ２、陽性対照として）下で２４時間培養された。β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）用のプラスミドがトランスフェクションコントロールとして使用され、ｐＧＬ３−ｖがベクターコントロールとして用いられた。３つの独立した実験で類似の結果が観察された。（Ｂ）ＥＨ−２０１処理済み肝細胞のＶＥＧＦ発現がＱ−ＰＣＲ（ｎ＝３）で分析された。低酸素条件が陽性対照として用いられた。（Ｃ）ＥＨ−２０１処理済み腎臓切片の細胞核ライセートにおけるＨｉｆ−２αタンパク質発現レベルがウェスタンブロット分析により分析された（Ｈ：陽性対照としての５％Ｏ２低酸素）。対照群はビークル処理を表す。値は平均±ＳＥＭとして表される。**Ｐ＜０.０１、*Ｐ＜０.０５酸素正常と比較、スチューデントＴ検定。
【図１１】ＥＨ−２０１が肝臓と骨格筋においてミトコンドリア機能および発生を増加することを示す図である。（Ａ）、（Ｂ）ＥＨ−２０１処理１４日後の分離された肝臓および骨格筋組織がミトコンドリア活性についてＰＧＣ−１α  Ｑ−ＰＣＲ、クエン酸シンターゼ活性、ｍｔＤＮＡコピー数により分析された。値は平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝各群５匹）。**Ｐ＜０.０１、*Ｐ＜０.０５ｖｓ．ＮＤ群；＃＃Ｐ＜０.０１、＃Ｐ＜０.０５ｖｓ．７日目ＮＤ群、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）とテューキーポストホックテストによる。
【図１２】ＥＨ−２０１がマウスにおけるドキソルビシン（Ｄｏｘ）誘導心筋症の心機能障害に対して治療効果を有することを示す図である。（Ａ）Ｄｏｘ注射２週間後のマウスの体重に対するＥＨ−２０１の効果である。（Ｂ）心機能に対するＥＨ−２０１の効果がＥＣＧにより特徴付けられ、心拍数は１秒当たりの拍数（ｂｐｓ）で示される。値は平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝各群５〜６匹）。**Ｐ＜０.０１、*Ｐ＜０.０５ｖｓ．Ｄｏｘ群、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）とテューキーポストホックテストによる。
【図１３】ＥＨ−２０１が初代アストロサイトおよびＰＣ１２神経細胞においてＥＰＯ発現を刺激することを示す図である。（Ａ）ＥＨ−２０１の構造である。（Ｂ）、（Ｃ）リアルタイムＰＣＲは２４時間のＥＨ−２０１治療が初代アストロサイトおよびＰＣ１２神経細胞においてＥＰＯ  ｍＲＮＡを増加することを示している。ＧＡＰＤＨの発現が内部対照として使用された。（Ｄ）ウェスタンブロット分析は２４時間のＥＨ−２０１治療がアストロサイトおよびＰＣ１２神経細胞においてＥＰＯタンパク質発現を増加することを示している。結果は少なくとも３回の独立した測定の未処理の対照群の相対指数±ＳＤとして表される。*Ｐ＜０.０５、**Ｐ＜０.０１、未処理の対照群と比較、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）とそれに続くチューキーの多重比較検定による。（Ｅ）リアルタイムＰＣＲは２４時間のＥＰＯ治療がアストロサイトおよびＰＣ１２神経細胞においてＨｂ−α  ｍＲＮＡを増加しないことを示している。（Ｆ）リアルタイムＰＣＲは２４時間のＥＨ−２０１治療がアストロサイトおよびＰＣ１２神経細胞においてＨｂ−α  ｍＲＮＡを増加しないことを示しているＧＡＰＤＨの発現が内部対照として使用された。結果は少なくとも３回の独立した測定の未処理の対照群の相対指数±ＳＤとして表される。*Ｐ＜０.０５、**Ｐ＜０.０１、未処理の対照群と比較、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）とそれに続くチューキーの多重比較検定による。
【図１４】神経ＥＰＯ誘導因子であるＥＨ−２０１が、初代アストロサイトとＰＣ１２神経細胞において、ミトコンドリア機能調節因子（ＰＧＣ−１α、Ｈｂ−β）および抗酸化物質遺伝子（ＨＯ−１）の発現を刺激することを示す図である。（Ａ）リアルタイムＰＣＲは２４時間のＥＰＯまたはＥＨ−２０１治療が初代アストロサイトにおけるＰＧＣ−１αを増加することを示している。（Ｂ）リアルタイムＰＣＲは２４時間のＥＰＯまたはＥＨ−２０１治療が初代アストロサイトにおけるＨｂ−β発現を増加することを示している。（Ｃ）リアルタイムＰＣＲは２４時間のＥＰＯまたはＥＨ−２０１治療が初代アストロサイトにおけるＨＯ−１  ｍＲＮＡ発現を増加することを示している。（Ｄ）リアルタイムＰＣＲは２４時間のＥＰＯまたはＥＨ−２０１治療がＰＣ１２神経細胞におけるＰＧＣ−１αを増加することを示している。（Ｅ）リアルタイムＰＣＲは２４時間のＥＰＯまたはＥＨ−２０１治療がＰＣ１２神経細胞におけるＨｂ−β発現を増加することを示している。（Ｆ）リアルタイムＰＣＲは２４時間のＥＰＯまたはＥＨ−２０１治療がＰＣ１２神経細胞におけるＨＯ−１  ｍＲＮＡ発現を増加することを示している。ＧＡＰＤＨの発現が内部対照として使用された。結果は少なくとも３回の独立した測定の未処理の対照群の相対指数±ＳＤとして表される*Ｐ＜０.０５、**Ｐ＜０.０１、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）とそれに続くチューキーの多重比較検定による。
【図１５】ＥＨ−２０１が初代アストロサイトおよびＰＣ１２神経細胞においてミトコンドリア活性を高め、細胞中のＲＯＳを減少し、Ｈ２Ｏ２誘導細胞毒性を弱毒化することを示す図である。（Ａ）（Ｅ）Ｈｂ−β  Ａｂにより特定されたＥＨ−２０１で処理された初代アストロサイトおよびＰＣ１２神経細胞におけるＨｂの異なる形態（単量体:１６ｋＤ、二量体:３２ｋＤ、四量体:６４ｋＤ）の発現を示す。結果は少なくとも３回の独立した測定からの未処理の対照群の相対発現±ＳＤとして表される。*Ｐ＜０.０５、**Ｐ＜０.０１、スチューデントＴ検定による。（Ｂ）、（Ｆ）ＥＰＯまたはＨ−２０１で２４時間処理されたアストロサイトおよびＰＣ１２細胞のコハク酸デヒドロゲナーゼ活性がＭＴＴ還元試験を使用して判定され（ｎ＝８）、それぞれの対照条件（治療なし２４時間後）と比較して示された。値は平均±ＳＤ（ｎ＝８）である。*Ｐ＜０.０５、**Ｐ＜０.０１、未処理の対照群と比較。（Ｃ）、（Ｇ）ＥＰＯまたはＥＨ−２０１で２４時間処理されたアストロサイトとＰＣ１２細胞が１００μＭのＨ２Ｏ２に６時間暴露された。細胞中のＲＯＳ形成がＤＣＦＨ−ＤＡアッセイを使用して測定された。グラフは相対蛍光単位（ＲＦＵ）での結果を示す。値は平均±ＳＤ（ｎ＝８）である。＃＃Ｐ＜０.０１、未処理の対照群と比較；*Ｐ＜０.０５、**Ｐ＜０.０１、Ｈ２Ｏ２対照群と比較。スケールバー：５０μｍ。（Ｄ、Ｈ）ＥＰＯまたはＥＨ−２０１で２４時間処理されたアストロサイトおよびＰＣ１２細胞が５００μＭのＨ２Ｏ２に６時間暴露された。細胞毒性がトリパンブルーで分析された。値は平均±ＳＤである（ｎ＝３）。＃＃Ｐ＜０.０１、未処理の対照群と比較；*Ｐ＜０.０５、**Ｐ＜０.０１、Ｈ２Ｏ２対照群と比較、スチューデントＴ検定を使用。
【図１６】アストロサイトおよびＰＣ１２神経細胞におけるＥＨ−２０１の神経保護作用にはＥＰＯが必須であることを示す図である。（Ａ）ｍ（Ｄ）ＥＨ−２０１と抗ＥＰＯ抗体の共インキュベーションでは、ＭＴＴ還元試験（ｎ＝８）による評価で、アストロサイトおよびＰＣ１２細胞におけるコハク酸デヒドロゲナーゼ活性のＥＨ−２０１に誘導される増加が失われる結果となった。*Ｐ＜０.０５、**Ｐ＜０.０１、対照群と比較。（Ｂ）、（Ｅ）ＥＨ−２０１と抗ＥＰＯ抗体の２４時間共インキュベーションでは、ＤＣＦＨ−ＤＡアッセイによる評価で（ｎ＝８）、Ｈ２Ｏ２により誘導されるＲＯＳ産生のＥＨ−２０１媒介による減少が失わる結果となった。（Ｃ）、（Ｆ）トリパンブルー染色により評価で（ｎ＝３）、Ｈ２Ｏ２媒介細胞毒性のＥＨ−２０１媒介による減少が失わる結果となった。*Ｐ＜０.０５、**Ｐ＜０.０１、Ｈ２Ｏ２と比較；＃＃Ｐ＜０.０１、対照群と比較、スチューデントＴ検定を使用。
【図１７】睡眠遮断誘導記憶喪失のマウスモデルにおけるＥＨ−２０１の効果を示す図である。（Ａ）睡眠遮断（ＳＤ）マウスにおけるＥＨ−２０１治療の手順である。（Ｂ）各群からのマウス海馬におけるＥＰＯ発現のリアルタイムＰＣＲ分析である。（Ｃ）各群からのマウス海馬におけるＥＰＯ発現のウェスタンブロット分析である。**Ｐ＜０.０１、ＳＤ群と比較して統計的に有意；＃＃Ｐ＜０.０１、対照群と比較して統計的に有意。（Ｄ）マウス海馬（ｎ＝６）におけるＨｂβ、ＰＧＣ−１α、ＨＯ−１発現レベルのリアルタイムＰＣＲ分析である。*Ｐ＜０.０５、**Ｐ＜０.０１、ＳＤ群と比較して統計的に有意、かつ＃Ｐ＜０.０５、＃＃Ｐ＜０.０１、対照群と比較して統計的に有意、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）とそれに続くチューキーの多重比較検定による。（Ｅ）ミトコンドリア活性のマーカーとしてＭＴＴアッセイを使用した。値は未処理マウスとＥＨ−２０１投与マウスの睡眠遮断後のミトコンドリア機能を表す。*Ｐ＜０.０５、**Ｐ＜０.０１、ＳＤ群と比較して統計的に有意；＃＃Ｐ＜０.０１、対照群と比較して統計的に有意、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）とそれに続くチューキーの多重比較検定による。（Ｆ）ＥＨ−２０１で処理済または未処理のマウスにおける５連続訓練試行中のステップスルー型受動回避習得を示す。ＥＨ−２０１処理はマウスの学習能力に影響を与えない。（Ｇ）ＥＨ−２０１で処理済または未処理のマウスにおける３連続訓練試行中のステップスルー型受動回避習得を示す。*Ｐ＜０.０５、**Ｐ＜０.０１、ＳＤ群と比較して統計的に有意；＃＃Ｐ＜０.０１、対照群と比較して統計的に有意、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）とそれに続くチューキーの多重比較検定による。
【図１８】マウスＲＰＥ細胞における細胞ＥＰＯ発現レベルのＥＨ−２０１誘導を示す図である。Ｃ５７マウスＲＰＥ細胞が、１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭで、０.４、２、１０μｇ／ｍｌのＥＨ−２０１とともに培養された。培地は３７℃で２４時間培養された。培養期間後、全細胞ライセート（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）が溶解緩衝液で作製された。トータル細胞ライセート（ｔｏｔａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）が作製され、内因性ＥＰＯのレベルを検出するためにウェスタンブロット分析が行われた。ＧＡＰＤＨがローディングコントロールとして用いられた。棒は平均±ＳＤを示す（ｎ＝３異なる実験；**Ｐ＜０.０１、***Ｐ＜０.００１）。
【図１９】ＥＨ−２０１によるオートファジーの誘導を示す図である。初代マウス肝細胞が異なる用量（０.６、２.５、１０、４０μｇ／ｍｌ）のＥＨ−２０１、ラパマイシン（オートファジー活性化因子、Ｒｍ、５０ｎＭ）または３−メチルアデニン（３ＭＡ、１０ｍＭ）で２４時間（ＡとＢ）処理された。飢餓状態（ｓｔｖ）下の初代マウス肝細胞培養がオートファジー活性化対照として用いられた（Ａ、Ｂ）。これらの処理された細胞はモノダンシルカダベリン（ＭＤＣ）で染色された後、蛍光顕微鏡検査が行われ（スケールバー：５０ｍｍ）、蛍光強度が分光蛍光計で測定された（Ｂ）。肝細胞ライセートでウェスタン免疫ブロットが行われ、ＬＣ３抗体を使用してオートファジーマーカータンパク質ＬＣ３の発現が検査された（Ｃ）、（Ｄ）。ＥＨ−２０１で１８時間処理された腎臓切片を使用してＥＨ−２０１のオートファジー誘導に対する効果が検査された。オートファジー誘導の分析はＬＣ３に対するウェスタンブロット分析により行われた。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔイメージングソフトウェア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で免疫反応バンドを使用してＬＣ３−ＩＩ／ＬＣ３−Ｉの定量化が行われた。データは平均±ＳＥＭとして示されている。**Ｐ＜０.０１、*Ｐ＜０.０５、対照群と比較。
【図２０】ＥＨ−２０１誘導オートファジー活性化が肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の誘導を介していることを示す図である。肝細胞は異なる用量（０.６、２.５、１０、４０ｍｇ／ｍｌ）のＥＨ−２０１で２４時間処理された。ｒｈＥＰＯは遺伝子組換えヒトＥＰＯを表し、ｒｍＨＧＦは遺伝子組換えマウス肝細胞増殖因子を表し、ｎＥＰＯ−ａｂはＥＰＯ中和抗体を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下の具体的な例は本発明の例示のために用いられる。当業者であれば本発明のその他の利点および効果を容易に理解できるであろう。また本発明はその他異なる実施方法で実施または応用することもでき、本明細書中の詳細は異なる観点および応用に基づいて、本発明の要旨を逸脱することなく、多様な修飾や変更も可能であろう。
【００３３】
本明細書および図面においてエリスロポエチンはＥＰＯと短縮されている。
【実施例】
【００３４】
実施例１  ＥＨ−２０１の抽出、分離、特徴づけ
【００３５】
ＥＨ−２０１、２,３,５,４’−テトラヒドロキシスチルベン−２−Ｏ−β−ｄ−グルコシド（以下、ＥＨ−２０１という）（図２Ａ）が抽出され、９９.２％の純度に精製された。カシュウ（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ  Ｔｈｕｎｂ）．の根の乾燥破砕物が４０％エタノールで抽出された後濃縮され、シロップが形成された。標的成分を豊富にするために、抽出物が１５％エタノールで２回希釈され、ダイヤイオンＨＰ−２０樹脂カラムに充填された後、シーケンシャルの２０％、４０％、７０％エタノールでそれぞれ溶出された。４０％エタノールの溶出物が収集され、濃縮された。その後４０％エタノール溶出物がソニケーションにより１０％エタノールに再溶解され、等量の酢酸エチルで５回連続分配された。その後酢酸エチルの残渣がＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラムを通過され、メタノールで溶出された。淡黄色の化合物、ＥＨ−２０１が取得された。カシュウ（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ  Ｔｈｕｎｂ）．の根の未加工乾燥破砕物から純粋に最終化合物ＥＨ−２０１だけ（９９.２％）の全収率は約０.５‰である。将来的な臨床試験の目的のため、この化合物の結晶化がさらに行われた。ＥＨ−２０１の３０％エタノール水溶液が−２０℃の冷凍庫にオーバーナイトで置かれた後、４℃の冷蔵庫内に置かれた。数日後針状結晶が取得された。
【００３６】
ＥＨ−２０１の化学的同一性がＬＣ／ＭＳ／ＭＳ、ＵＶ、１Ｈ−ＮＭＲ、プロトンデカップリング１３Ｃ−ＮＭＲデータ（図１と表１）により、および１Ｈ−ＮＭＲとプロトンデカップリング１３Ｃ−ＮＭＲデータセットがＢｒｕｋｅｒ  ＡＶＩＩＩ−５００  ＮＭＲ分光計を使用して、確認された。ＥＨ−２０１のプロトンおよびカーボンの化学シフトを表１に示す。精製ＥＨ−２０１のＬＣＭＳデータがＢｒｕｋｅｒ  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分光計Ｅｓｑｕｉｒｅ２０００を用いて正イオン極性のＡＰＣＩ（Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ；大気圧化学イオン化）モードでＨＰＬＣグレードの水とメタノールのグラジエントを使用して６０分以上逆相Ｃ１８カラムで行われた（図１Ａ）。ＬＣＭＳデータは図１Ｂに示すとおりであり、ｍ／ｚ４０７.０でＥＨ−２０１の正しい質量が示されている。ｍ／ｚ４０７.０でのＥＨ−２０１のイオンに対してさらにＭＳ／ＭＳ分析が行われ、４０７.０のイオンだけが分離、断片化された。得られたｍ／ｚ２４５.１の娘イオンは糖部位のないＥＨ−２０１と一致する。したがって、この化合物は２,３,５,４’−テトラヒドロキシスチルベン−２−O−β−ｄ−グルコシド（ＴＳＧまたはＴＨＳＧ）と同定された（図２Ａ）。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
実施例２  本発明の化合物による非造血細胞におけるミトコンドリア機能とヘモグロビン発現の活性化
【００３９】
この例は、非造血細胞におけるミトコンドリア機能とヘモグロビン発現の本発明の化合物による活性化を評価する際に役立つさまざまな試験について説明する。本発明の化合物は前述の例１の方法に従って調製される。この化合物の有効性は一連の活性試験を使用して評価され、これらの試験については以下で詳細に説明する。
【００４０】
１. 動物
国家実験動物中心（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ、台湾）から取得した８〜１０週齢のＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ；特定の病原体が存在しない）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス（２０〜２５ｇ）が２２±２℃の恒温に保たれたケージ１つに５〜６匹ずつ入れられ、１２時間の明暗サイクル下で標準実験用飼料（ＰＭＩ、Ｂｒｅｎｔｗｏｏｄ、米国ミズーリ州）と水が自由摂餌・自由摂水で与えられた。実験プロトコルは国立陽明大学（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｙａｎｇ−Ｍｉｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｙａｎｇ−Ｍｉｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）により承認された。動物の苦しみを最小限にするとともに、使用する動物の数を減少し、利用可能な場合はインビボ法の代替方法を利用するためのあらゆる取り組みが行われた。動物を使用するすべての研究について、動物を使用する実験の報告に関するＡＲＲＩＶＥ指針に沿って報告された。
【００４１】
２. 細胞培養と処理
Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞、ＨＥＫ２９３、ＴＦ−１細胞がＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ（ＢＣＲＣ、台湾新竹市）より購入された。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞は筋管細胞に分化され、２４時間薬剤で処理された。Ｅｘ  ｖｉｖｏ  ２５０μｍ厚の腎臓切片が前述の８〜１０週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから作製された。切片はガス培養（１５ｍＭのＨＥＰＥＳと２０ｍＭの重炭酸ナトリウムでバッファされたＤＭＥＭ／Ｆ１２）で大気（ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ）チャンバー内において３７℃、５０％Ｏ２：５％ＣＯ２：４５％Ｎ２で１８時間薬剤により処理された。前述の８〜１０週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスからマウス初代肝細胞が分離・精製され、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、ドイツ）添加ＤＭＥＭ中の１％ゼラチンコートマイクロプレートに蒔かれた。肝細胞の接着後、薬剤を含む新鮮な培地が２４時間添加された。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ新生仔マウスの心筋細胞培養が前述の国立陽明大学の動物中心（Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ）から取得した生後１日のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから作製され、分離された心室細胞が１０％ＦＣＳ含有Ｍ１９９倍地（Ｇｉｂｃｏ、ドイツ）で再懸濁された。心筋細胞は３７℃、５％ＣＯ２の湿気がある環境において１％のゼラチンが予めコーティングされたプレート上で培養された。自発的拍動細胞のサブコンフレント状態が培養４８時間後に達成され、その後さまざまな薬剤での処理が２４時間行われた。コロニー形成アッセイとヘモグロビン比色測定用の骨髄系前駆細胞培養が前述のとおり用意された。ノックダウン実験で、Ｃ２Ｃ１２筋管細胞がスクランブルまたはＰＧＣ−１α特異的ｓｉＲＮＡ（表２）でリポフェクタミン２０００試薬を使用してメーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示に従い導入された。これらの培養細胞はｈＥＰＯ（組換えヒトエリスロポエチン、ロシュ、ドイツ）またはＥＨ−２０１で処理されるか、ＥＰＯ中和抗体（Ｒ＆Ｄ、ミネソタ州）と示された期間共インキュベーションされた。その後、薬剤処理細胞と組織ライセートが収集され、特異的なｍＲＮＡとタンパク質の発現、およびミトコンドリア活性の検査のために均質化された。
【００４２】
【表２】
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【００４３】
３. リアルタイムＰＣＲ
トータルＲＮＡがＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して抽出され、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって逆転写された。ＥＰＯ、ＥＰＯＲ、ＰＧＣ−１α、Ｈｂ−α、Ｈｂ−β、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現が定量リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によりＡＢＩ７５００シーケンス検出器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘＲ（ＡＢＩ−７５００）を使用して定量化された。
【００４４】
相対的ｍＲＮＡ発現レベルがＧＡＰＤＨを内在性コントロールとしてＴＴＣｔ法を使用して判定された。使用されたプライマーを表２に示す。
【００４５】
４.ウェスタンブロット
トータルタンパク質（５０μｇ）が１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、ＰＶＤＦメンブレン上に転写された後、ＥＰＯ、ＰＧＣ−１α、ＧＡＰＤＨ、ＰＣＮＡ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カリフォルニア州より）、Ｓｉｒｔ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビレリカ）、またはＨｉｆ−２α（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、リトルトン）に対する抗体でプロービングされた。適切なホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体での培養後、メーカー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）のプロトコルに従ってＥＣＬ検出によりシグナルが可視化された。
【００４６】
５. ｍｔＤＮＡコピー数の定量化
トータル細胞性ＤＮＡが従来のフェノール・クロロホルム法を使用して精製され、前述のとおりｍｔＤＮＡコピー数が測定された。
【００４７】
６. ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒアッセイ
ミトコンドリア含量がＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒマイクロプレートアッセイにより評価された。処理済みの細胞に０.１μＭ緑色蛍光ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ−Ｇｒｅｅｎ（ＭＴＧ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が６０分間３７℃でロードされた。細胞内ＭＴＧ含量が蛍光測光法（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）により測定された。その後、固定細胞がＨ３３３４２で標識され、細胞密度が評価された。ＭＴＧ／Ｈ３３２５８蛍光比が計算された。
【００４８】
７. クエン酸シンターゼ活性の測定
クエン酸シンターゼ活性が組織ライセートで測定された。４１２ｎｍでの吸収の変化が測定され、活性がμｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質として表された。
【００４９】
８. ＴＦ−１細胞増殖アッセイ
ｔＥＰＯ感受性細胞株の細胞ＴＦ−１が９６ウェルのマイクロプレートに細胞密度１ｘ１０５細胞／ｍｌで、２％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ  １６４０培地に播種され、細胞がｒｈＥＰＯとＥＨ−２０１により、ＥＰＯＲ中和抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）ありとなしで、４８時間処理された。細胞数はトリパンブルー色素排除試験法により判定された。
【００５０】
９.ロータロッド持久力評価
治療群に分けられる前に、８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスがロータロッド装置上で（１４ｒｐｍ）３日間にわたり１日３回、各最長１０分間の連続訓練セッションで訓練された。このタスクを習得できなかったマウスは実験から除外された。訓練後、適格のマウスが７日間ＥＨ−２０１治療群（１日１０、３０または９０ｍｇ／ｋｇ、各群ｎ＝５）に無作為に分けられた。試験日に各マウスは酸素正常または酸素性（８％Ｏ２）の大気下で２２ｒｐｍのロータロッドで３回のトライアルを実施した。マウスが疲れてロータロッド上から落下するまで時間経過とともに持久力のパフォーマンスが計測された。最長トライアル時間は６０分で、各トライアル間に３０分間の休憩時間があった。
【００５１】
１０. ＥＰＯ  ＥＬＩＳＡ
マウスＥＰＯ専用のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ、ミネソタ州）を使い、メーカーの指示にしたがって、血清ＥＰＯ濃度が分析された。
【００５２】
１１. ドキソルビシン誘導心筋症
８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスに、１５ｍｇ／ｋｇのドキソルビシン−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射１回により心筋症が誘導された、正常群には生理食塩水（ｎ＝６）が注射された。注射の７日後、ドキソルビシン誘導心筋症の発生が心電図で延長されたＳ−Ｔ間隔を観察することにより確認された。注射されたマウスの平均８０％（２７／３４）で誘導が成功し、不十分なマウスはＥＨ−２０１治療実験から除外された。心筋症マウスは追加の1週間、対照群（Ｄｏｘ、ｎ＝９）と３つのＥＨ−２０１治療群（各群ｎ＝６）で構成される４つのコホートに無作為に分けられた。ＥＨ−２０１が餌に混ぜて経口投与された。Ｄｏｘ群には通常の食事が与えられ、ＥＨ−２０１治療群には異なる用量のＥＨ−２０１（１日当たり１０、３０、または９０ｍｇ／ｋｇ）のを含む通常の食事が与えられた。１週間後、マウスにロータロッド持久力試験、心エコー検査、心電図が実施された。心電図の後マウスは犠牲にされ、分離された心臓に対して組織学的検査とヘモグロビン分析が行われた。
【００５３】
１２. ヘモグロビン染色
分離された心筋組織ライセートに、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と、その後の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、ヘモグロビン染色が行われた。Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ（登録商標）イメージャー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してゲルの写真撮影とスキャンが行われた。ＴＭＢＺ染色は７０ｍＭの亜硫酸ナトリウム溶液を添加することによりゲルから除去された。その後、３０％のイソプロパノールを使用して亜硫酸ナトリウムが置換され、続いてタンパク質ローディングコントロールの分析のためゲルはクマシーブルーで染色された。
【００５４】
１３. 心エコー検査と心電図
すべての治療群からのマウスがイソフルラン（０.７５〜１.５％吸入）で麻酔され、心エコー測定がＡＴＬ  ＨＤＩ５０００超音波システム（Ｐｈｉｌｉｐｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＭモードで各マウス３回行われた。心電図（ＥＣＧ）のパラメータを評価するため、３つの電極が使用された。リードＩからのＥＣＧトレースがイソフルラン麻酔マウス中の皮下針電極に接続された心電計により記録された。すべてのプローブが増幅器とデジタル変換器に接続され、ローパス１ｋＨｚとハイパス１ｋＨｚのフィルターで１００ｍＶ範囲の信号が記録された。ＬａｂＶＩＥＷソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｉｎｃ．）搭載の取得データシステムを使用してＥＣＧ信号が記録・分析された。
【００５５】
１４. シスプラチン誘導腎症
８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス４０匹に腹腔内注射で３つの用量のシスプラチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が７、６、６ｍｇ／ｋｇ体重のスキームに従って、４日間隔で投与され、正常群（ｎ＝６）には生理食塩水が注射された（図６Ａ）。１３日目に収集された血清試料の尿素窒素含量（ＢＵＮ）が測定された。ＢＵＮ値が１００ｍｇ／ｄＬより大きいマウスが実験に選択された。注射されたマウスの平均７０％（２６／４０）で腎機能障害が誘導され、有効でないマウスはＥＨ−２０１治療実験から除外された。その後追加の2週間、マウスは対照群（対照、ｎ＝８）と３つのＥＨ−２０１投与群（各群ｎ＝６）で構成される４つのコホートに無作為に分けられた。５日ごとにすべてのマウスから血液試料が収集された。Ｓｙｓｍｅｘ  Ｋｘ−２１血液分析装置（Ｓｙｓｍｅｘ  Ａｍｅｒｉｃａ）を使用して全血球算定からＲＢＣ数が判定され、市販のキット（Ｕｒｅａ  ＦＳ、ＤｉａＳｙｓ、ドイツ）を使用してウレアーゼＧＬＤＨ法を通じて血清ＢＵＮレベルが判定された。
【００５６】
１５. 骨髄系前駆細胞コロニー形成アッセイ
赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）アッセイのため、６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ、台湾）の大腿骨から骨髄細胞懸濁が分離・培養された。すべての細胞が、１５％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、ドイツ）、１％ウシ血清アルブミン、０.８％メチルセルロース、０.１ｍＭの２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２Ｕ／ｍｌのＥＰＯ（Ｒｏｃｈｅ、ドイツ）、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＭＥＭα培地で培養された。ＢＦＵ−Ｅについて、倒立顕微鏡を使用し、９日目にコロニー（≧５０細胞）がカウントされた。
【００５７】
１６. ヘモグロビン比色測定
分化された赤芽球前駆細胞の検出のため、分離された骨髄系前駆細胞が、１％ウシ血清アルブミン、７.５μＭの２−メルカプトエタノール、１.４ｍＭのＬ−グルタミン酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、５μＭのＦｅＣｌ３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２５［ｍＵ／ｍｌ］のＥＰＯを含むＭＥＭα培地で、薬剤処理ありで９６時間培養された。その後、抽出されたヘモグロビンが２,７−ジアミノフルオレン（ＤＡＦ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）反応溶液と混合された。６１０ｎｍでの吸収における変化が２５℃で１分間連続的に監視された。反応の初速度が測定され、試料中のＨｂ量がＨｂ標準曲線から判定された。
【００５８】
１７. ルシフェラーゼレポーターアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞がＥＰＯ遺伝子からの最小低酸素応答配列（ＨＲＥ）の４つの反復配列を含むルシフェラーゼレポータープラスミド（ｐＧＬ３、Ｐｒｏｍｅｇａ）で導入された。導入細胞はＥＨ−２０１と酸素正常下で２４時間培養された。細胞はＨｉｆ−１α活性の陽性対照として低酸素様（７５ｍＭ  ＣｏＣｌ２）または低酸素条件（５％Ｏ２）下に保たれた。処理後、細胞ライセートが採取され、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりルシフェラーゼ発現が測定された。
【００５９】
１８. 組織学的分析
心臓および腎臓の組織がパラフィン包埋のため１０％ホルマリンで固定された。５μｍ厚のパラフィン薄片（心臓の断面）がＨ＆Ｅおよびマッソントリクローム染色プロトコル用に作製された。ミトコンドリア線維症の分析のため、生存能力のある心筋で各動物６枚の無作為の顕微鏡写真が４００倍の拡大で撮影された。ＮＩＨのＩｍａｇｅＪプログラムを使用し、予備知識のない観察者によって、顕微鏡写真における線維症の程度が定量化された。
【００６０】
１９. マウスおよび細胞培養からの網膜色素上皮細胞シート分離
完全な眼が６〜８週齢のＣ５７／ＢＬ６マウス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、台湾）から素早く取り除かれ、８.０ｇ／ＬのＮａＣｌ、０.２ｇ／  ＬのＫＣｌ、０.８ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１.１５ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４を含む氷冷ＰＢＳで保存された。眼は高グルコース、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２.５ｍ  ＭＬ−グルタミン、１％の可欠アミノ酸を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で構成される増殖培地（ＧＭ）で２回洗浄された。洗浄後、眼は解剖のため新鮮なＰＢＳに移された。顕微解剖用はさみと直立解剖顕微鏡を使用して各眼の鋸状縁周囲が円形に切開された。神経網膜と水晶体を含む後眼杯が新鮮なＧＭ培地に配置され、２０分間３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養され、神経網膜からの網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞シート分離が促進された。神経網膜からＲＰＥシートを分離した後、ＲＰＥ細胞の完全なシートが剥離され、エッペンドルフチューブに収集された。ＲＰＥ細胞は１５００ｒｐｍで５分間遠心分離され、ＧＭ培地で再懸濁された。細胞懸濁液（０.５ｍｌ）が１２ウェルプレートに加えられた。細胞は３７℃、５％ＣＯ２で１０日間培養され、１日おきに培地（ＧＭ）が交換された。１０日後、細胞はＥＤＴＡで洗浄され、４分間トリプシン処理されて細胞が剥離された。細胞はチューブに収集され、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離された後、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ｌ−グルタミン、重炭酸ナトリウムで再懸濁された。細胞は６ｃｍ皿にコンフルエンスに到達するまで置かれ、その時点でトリプシン処理されてより大きい皿で増殖された。
【００６１】
Ｃ５７マウスのＲＰＥ細胞は０.４、２、１０μｇ／ｍｌのＥＨ−２０１と１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭで培養された。培養物は３７℃で２４時間培養された。培養期間の後、全細胞ライセート（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）が溶解緩衝液で作製された。トータル細胞ライセート（ｔｏｔａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）が作製され、ウェスタンブロット分析で内因性ＥＰＯのレベルが検出された。ＧＡＰＤＨがローディングコントロールとして使用された。
【００６２】
２０. 統計
すべての結果は平均±ＳＥＭで表される。統計分析はスチューデントＴ検定を使用して行われた。動物実験群間の違いを調べるために一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）が使用された。実験群の平均間のポストホック差がチューキーテストで判定された。Ｐ＜０.０５で有意とみなされた。
【００６３】
２１. 結果
（１）ＥＨ−２０１は有力なＥＰＯ誘導因子である
ＥＨ−２０１にＥＰＯ発現を誘導する能力があるか否かを判定するために、腎臓切片と肝細胞が生体外でＥＨ−２０１処理された。ＥＨ−２０１は腎臓切片と肝細胞においてＥＰＯ  ｍＲＮＡとタンパク質の発現を濃度依存的に著しく誘導することが観察された（図２Ｂと図２Ｃ）。Ｓｕ，  Ａ．Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．により作成された公共利用可能なデータベース中のヒト組織におけるＥＰＯの遺伝子発現パターンによると、ＥＰＯ転写はヒト心筋細胞で驚くほど高レベルで発現される。このため、ＥＨ−２０１が新生仔マウスの心筋細胞とＣ２Ｃ１２筋細胞でＥＰＯ発現を誘導できるか否かもテストされた。ＥＨ−２０１が初代心筋細胞およびＣ２Ｃ１２筋細胞においてＥＰＯおよびＥＰＯ受容体（ＥＰＯＲ）の発現を濃度依存的に誘導することが観察された（図２Ｄと図２Ｇ）。骨髄系前駆細胞はＥＰＯを発現して造血を媒介するため、骨髄細胞がＥＨ−２０１とともに培養され、その赤血球産生に対する効果が調べられた。ＥＨ−２０１に暴露された骨髄細胞でＥＰＯ  ｍＲＮＡの発現が増加した（図２Ｈ）。ＥＨ−２０１はＢＦＵ−Ｅコロニー数（図２Ｉ）とＨｂ発現を濃度依存的に若干増加させた（図２Ｊ）。したがって、ＥＨ−２０１はＥＰＯ誘導因子である。
【００６４】
（２）ＥＨ−２０１によるミトコンドリア新生の誘導がＥＰＯに媒介される
ＥＨ−２０１がミトコンドリア新生に影響を与えるか否かを判定するために、非造血細胞におけるＥＰＯ誘導因子の効果をテストする一連の実験が行われた。ＥＨ−２０１処理済みの腎臓切片で、ミトコンドリアマーカー酵素クエン酸シンターゼが濃度依存的に増加し、ミトコンドリアコピー数とＰＧＣ−１α発現における著しい増加も観察された（図３Ａ）。ミトコンドリア新生に対するＥＨ−２０１の促進効果も肝細胞、心筋細胞、Ｃ２Ｃ１２筋細胞で観察された（図３Ｂから図３Ｄ）。しかし、ＥＰＯ中和抗体処理でＥＨ−２０１誘導ミトコンドリア新生の効果が消失し（図３Ｃと図３Ｄ）、一方ＥＰＯ処理でＰＧＣ−１α発現とミトコンドリア新生が増加した（図３Ｅから図３Ｇ）。次にＰＧＣ−１α特異的ｓｉＲＮＡ導入Ｃ２Ｃ１２筋細胞を使用してこれらの効果がＰＧＣ−１α依存経路によって媒介されるかが調べられた。ＰＧＣ−１α  ｓｉＲＮＡはＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現を４４％減少させ、同時にＥＰＯのミトコンドリア新生誘導を失敗させる結果となり（図３Ｇ）、これはＥＰＯによるミトコンドリア新生の活性化はＰＧＣ−１α依存的であることを示唆している。したがって、哺乳類サーチュイン（Ｓｉｒｔ１）はＰＧＣ−１αとともに骨格筋および肝臓におけるミトコンドリアの機能と発生を制御するため、Ｓｉｒｔ１の発現が調べられ、ＥＨ−２０１処理によってＳｉｒｔ１発現が増加することが分かり（図８）、これはＥＨ−２０１のＥＰＯ媒介ミトコンドリア活性誘導がＳｉｒｔ１/ＰＧＣ−１α経路を通じて生じる可能性を示唆している。このためＥＨ−２０１によるＰＧＣ−１αの増加は、高まったＥＰＯレベルによる非造血細胞におけるミトコンドリア新生の誘導に依存する。
【００６５】
（３）ＥＨ−２０１による非造血細胞におけるヘモグロビン発現の誘導はＥＰＯにより媒介される
非造血細胞においてヘモグロビン（Ｈｂ）の発現が低酸素誘導性ＥＰＯシグナリングによって制御されるか否かが判定された。低酸素条件ありとなしでＣ２Ｃ１２細胞を培養することで体外実験が行われた。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞の低酸素への暴露によってＨｂ−αとＨｂ−βの発現が顕著に増加した（図４Ａ）。ＥＰＯ処理済みＣ２Ｃ１２筋細胞で、Ｈｂ−α発現の誘導はＨｂ−βのそれよりも処理により影響を受けやすかった（図４Ｂ）。さらに、Ｈｂ−αとＨｂ−β両方の発現がＥＰＯ処理済み腎臓切片で濃度依存的に増加し、一方ＥＰＯ処理済み肝細胞ではＨｂ−βの発現のみが誘導の影響を受けた（図４Ｃと図４Ｄ）。Ｈｂサブユニットの発現はＥＨ−２０１処理済み非造血細胞で有意に増加し（図４Ｅから図４Ｈ）、この増加は中和ＥＰＯ抗体の併用処理によって消失した（図４Ｇと図４Ｈ）。ＰＧＣ−１α  ｓｉＲＮＡによるＨｂ発現の誘導におけるＥＰＯシグナリングの役割を判定するための研究も行われた。Ｃ２Ｃ１２筋細胞におけるＰＧＣ−１α発現の減少がＨｂ−αとＨｂ−β  ｍＲＮＡ両方の発現の減少につながり、またＨｂ−αに対するＥＰＯの誘導効果も減少させた（図４Ｂ）ことが分かった。したがって、非造血細胞におけるＨｂ発現の制御はＥＰＯ媒介ＰＧＣ−１α依存的およびＰＧＣ−１α非依存的経路の両方を通じて発生する。これらの結果は、ＥＰＯ媒介シグナリングが非造血細胞におけるＥＨ−２０１のヘモグロビン発現誘導に必要であることを示している。
【００６６】
（４）Ｈｉｆ−α活性化に関与するのではなく、ＥＰＯのＥＰＯＲへの結合エンハンサーとして作用するＥＨ−２０１
ＥＨ−２０１の作用の裏側にあるメカニズムを調べるため、コンピュータによるドッキング法を行い、ＥＨ−２０１のＥＰＯＲへの結合を予測した。ＥＨ−２０１はＥＰＯ結合ＥＰＯＲ複合体（ＥＰＯ／ＥＰＯＲ）に、ＥＰＯフリーのネイティブＥＰＯＲよりも優先的に、結合することが分かった（予測総分子間エネルギーはそれぞれ−７.４８ｋｃａｌ／ｍｏｌおよび−６.３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。ＡｕｔｏｄｏｃｋでＥＰＯ／ＥＰＯＲ複合体において負の好ましい結合自由エネルギーを持つＥＨ−２０１向けの３つ以上の予め形成された結合部位が特定され、ＥＰＯＲ上の予測される相互作用残基（Ｍｅｔ１５０、Ｔｈｒ１５１、図９）にはループ５に位置するホットスポット残基が関与していた。ＥＰＯオートクリン活性もＥＰＯＲ活性化とＥＰＯ産生の制御で重要な役割を果たすため、ＥＨ−２０１がＥＰＯのＥＰＯＲへの結合エンハンサーとして作用し、そのためＥＰＯＲ活性化が高められる可能性があるという仮説がテストされた。ＥＰＯ生物活性についてＴＦ−１細胞（ＥＰＯＲ陽性）増殖アッセイが行われた。ｒｈＥＰＯがＴＦ−１細胞の増殖を濃度依存的に誘導し、一方でｒｈＥＰＯがない場合、ＥＨ−２０１単独では細胞増殖を誘導することはできないことが分かった（図４Ｉ）。ｒｈＥＰＯが非常に低濃度でも（２ｎｇ／ｍｌ）存在すれば、ＥＨ−２０１は濃度依存的にＴＦ−１細胞の増殖を有意に誘導した。中和ＥＰＯまたはＥＰＯＲ中和抗体の添加はいずれもＴＦ−１細胞の増殖を有意に減少した（図４Ｉ）。これらのデータは、ＥＰＯがＥＨ−２０１の活性に必要であり、ＥＰＯ/ＥＰＯＲ複合体がＥＰＯとＥＰＯＲ結合のエンハンサーとして作用するＥＨ−２０１の標的である可能性があることを示している。また、ＥＰＯ発現は低酸素誘導因子（Ｈｉｆ）により制御されるため、ＥＨ−２０１誘導ＥＰＯ発現がＨｉｆの活性化を生じるか否かも調査された。図１０Ａに示すように、低酸素応答配列誘起ルシフェラーゼレポーターを使用したＨｉｆ−１αの活性化の評価で、ＥＨ−２０１処理はプロモーター活性を活性化しなかった。さらに、Ｈｉｆ−１αを標的とした血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現が低酸素の間上方制御された一方で、ＥＨ−２０１はＶＥＧＦ発現に変化を生じなかった（図１０Ｂ）。ＥＨ−２０１処理はＨｉｆ−２αタンパク質レベルを安定化することもなかった（図１０Ｃ）。これらの発見は、ＥＨ−２０１によるＥＰＯの誘導がＨｉｆ−１αまたはＨｉｆ−２αの活性化によるものではないことを示唆している。
【００６７】
（５）ＥＨ−２０１の投与がマウスの持久力を高める
ＥＨ−２０１のＥＰＯ誘導効果を踏まえ、ＥＨ−２０１が低酸素性ストレスを受けたマウスにおいて持久力を高めるか否が判断された。特に、３日間のＥＨ−２０１投与は酸素正常と低酸素の両方で用量依存的に疲労までのラン時間を増加し（図５Ａ）、７日目にさらに向上された。しかし、末梢血中のＲＢＣ数とＨｂ含量には若干の増加があったのみであり（図５Ｂ）、これはＥＨ−２０１が内因性ＥＰＯレベルの増加を誘導することでＲＢＣ数を増加した（図５Ｄ）ことを示唆しており、腎臓および肝臓ＥＰＯの産生の誘導により確認された（図５Ｃ）とおりであった。ＥＨ−２０１治療マウスの心筋におけるＨｂ−αとＨｂ−βの発現は有意に増加し（図５Ｆ）、ＴＭＢＺ染色で観察されたＨｂタンパク質発現の増加によって確認された（図５Ｇ）とおりであった。高用量のＥＨ−２０１は心臓のミトコンドリア新生（図５Ｅ）も誘導した。さらに、ＥＨ−２０１治療は肝臓と骨格筋におけるＰＧＣ−１α発現とミトコンドリア含量および活性を有意に増加した（図１１Ａと１１Ｂ）。これらの結果は、ＥＨ−２０１の治療が非造血組織における内因性ＥＰＯ発現の増加とミトコンドリア新生およびＨｂ発現の刺激の誘導を通じてマウスの持久力と低酸素耐性を大幅に向上したことを示している。
【００６８】
（６）樹立されたドキソルビシン誘導心筋症に対するＥＨ−２０１の治療的効果
心筋虚血におけるＥＨ−２０１の治療可能性を評価するため、ドキソルビシン（Ｄｏｘ）誘導心筋症モデルが使用された。Ｄｏｘ注射の１週間後、ＥＨ−２０１の治療効果を調べるため、ＥＣＧ測定で特定された心筋症マウスに対して７日間のＥＨ−２０１治療が開始された。ＥＨ−２０１投与群の生存率は改善されたようであり、高用量群は研究期間終了まで生存した（図６Ａ）。低酸素性ロータロッド持久力試験の後、いずれの群も体重の当初の変化から回復はしなかったものの（図１２Ａ）、ＥＨ−２０１投与群の持久力活動は確実に増加し（特に３０および９０ｍｇ／ｋｇの用量で）、一方Ｄｏｘ群では若干減少した（図６Ｂ）。Ｄｏｘ注射の後２週間後まで心筋損傷がＥＣＧにより測定され、これらのＥＣＧパラメータは有意に異常であり、Ｄｏｘにより引き起こされた広範な心臓障害を反映していた（図６Ｃ）。ＥＨ−２０１投与の７日後、これらのＥＣＧの兆候はＥＨ−２０１（３０、９０ｍｇ／ｋｇ）で治療されたマウスにおいて大幅に回復され、心臓活動の改善が示された（図６Ｃと図１２Ｂ）。Ｄｏｘ投与２週間後に行われた心エコー検査では、Ｄｏｘのみ投与されたマウスに、駆出率と短縮率の低下で特徴付けられる顕著な心臓機能低下が示された。ＥＨ−２０１（３０、９０ｍｇ／ｋｇ）の治療を受けたマウスは比較すると駆出率と短縮率が有意に高かった（図６Ｄ）。しかし、収縮期と拡張期で左心室の直径に群の間で有意差はなかった。これらの結果はＥＨ−２０１での治療がＤｏｘにより誘導される心臓機能障害を大幅に緩和したことを示している。さらに、Ｄｏｘにより損傷された心臓には細胞質空胞変性、筋細線維喪失、進行した心筋線維症が現れ、それらはＥＨ−２０１治療によって改善された（図６Ｅ）。画像定量化結果によると、Ｄｏｘは正常なマウスと比較して心室筋内膜内の線維症の領域を増加し（正常、１.７１±０.１８％ｖｓ．Ｄｏｘ、８.３１％±０.９４％、図６Ｅ）、一方で線維症は中〜高用量のＥＨ−２０１で治療されたマウスにおいてほぼなくなったことが示された。また、ＥＨ−２０１投与マウスの分離された心筋におけるＨｂ発現が上方制御され（図６Ｆ、３０、９０ｍｇ／ｋｇ）、Ｈｂ二量体型が増加した（図６Ｇと図６Ｈ）。総合すると、これらのデータは、ＥＨ−２０１が治療効果を有し、Ｄｏｘ誘導心筋症マウスの心臓機能と虚血性耐性を高めたことを示している。
【００６９】
（７）ＥＨ−２０１がシスプラチン誘導腎症における貧血と腎機能を改善する
急性腎障害は腎毒性薬物の使用によって引き起こされる腎臓虚血に起因することがあるため、腎不全での貧血に対するＥＨ−２０１誘導ＥＰＯ産生の効果を調べるために、樹立されたシスプラチン誘導腎症マウスモデルが採用された（図７Ａ）。シスプラチンの１回目注射後１０日目から重度の貧血と１３日目から腎機能不全が観察された（図７Ｂと図７Ｃ）。特に、３０および９０ｍｇ／ｋｇのＥＨ−２０１の２週間の投与（２８日目、図７Ｂ）は、貧血をほぼ完全に回復させた。さらに、ＥＨ−２０１  ３０および９０ｍｇ／ｋｇの治療群のＢＵＮレベルも大きく回復した（図７Ｄ）。組織化学的検査では１３日目から尿細管上皮壊死、空胞形成、落屑が見られた。しかし、ＥＨ−２０１での治療によってこの腎障害が大幅に弱毒化された（図７Ｅ）。加えて、貧血マウスの腎臓におけるＥＰＯの大幅な増加と、ＥＨ−２０１治療がさらなる増加にはつながらないことが観察され（図７Ｆ）、この発見は残りの機能している腎臓細胞と、ＥＨ−２０１が腎臓の低酸素性ストレスを解消することで回復された腎臓機能の補償効果のためである可能性がある。ＥＨ−２０１  ３０および９０ｍｇ／ｋｇの治療は肝臓ＥＰＯ発現の大幅な回復を誘導した（図７Ｇ）。さらに、ＥＨ−２０１投与は骨髄において赤血球系前駆細胞も活性化させた（図７Ｈ）。まとめると、これらの発見はＥＨ−２０１がＥＰＯの産生を誘導することによりシスプラチン誘導貧血および腎機能障害からの回復を向上したことを示している。
【００７０】
（８）ＥＨ−２０１がマウスのＲＰＥ細胞における細胞ＥＰＯ発現レベルを向上する
図１８にマウスのＲＰＥ細胞における細胞ＥＰＯ発現レベルのＥＨ−２０１誘導を示す。Ｃ５７マウスのＲＰＥ細胞が０.４、２、１０μｇ／ｍｌのＥＨ−２０１と１０％ＦＣＳが添加されたＤＭＥＭで培養された。培養物は３７℃で２４時間培養された。培養期間後、全細胞ライセート（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）が溶解緩衝液で作製された。トータル細胞ライセート（ｔｏｔａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）が作製され、内因性ＥＰＯのレベルを検出するためウェスタンブロット分析が行われた。ＧＡＰＤＨがローディングコントロールとして使用された。バーは平均±ＳＤを表す（ｎ＝３異なる実験；**Ｐ＜０.０１、***Ｐ＜０.００１）。
【００７１】
実施例３  本発明の化合物による神経細胞におけるミトコンドリア機能とヘモグロビン発現の活性化
【００７２】
この実験では、本発明の化合物による神経細胞におけるミトコンドリア機能とヘモグロビン発現の活性化を評価するために有用なさまざまなアッセイについて説明する。本発明の化合物は例１で説明された方法に従って作製される。この化合物の有効性が一連の活性アッセイを使用して評価され、これらのアッセイについて以下で詳細に説明する。
【００７３】
１. 細胞培養
アストロサイトが豊富な培養物が前述の国立陽明大学（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｙａｎｇ  Ｍｉｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）動物中心（Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）から取得した生後１日のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから作製された。簡単に説明すると、皮質組織がトリプシンにより消化され、その結果の解離細胞が１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに懸濁され、１００ｍｍ培養皿で培養された。３日の培養後、培地が新鮮な１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに交換され、細胞は３７℃でさらに３日間維持された。細胞はトリプシンで解離され、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに懸濁されて、１０ｃｍ皿で７〜８日間培養されてから使用された。この方法で作製された細胞は約９０〜９５％のアストロサイトを含み、これはアストロサイトの特異的マーカー、グリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に対する抗体での免疫化学染色により判定された。ラットＰＣ１２神経細胞はＲＰＭＩ  １６４０で維持された。
【００７４】
２. ＲＮＡ単離とリアルタイムＰＣＲ
ＲＮＡがＲＮＡ−ＢｅｅＴＭ ＲＮＡ単離試薬（Ｔｅｌ−ｔｅｓｔ、テキサス州フレンズウッド）を使用して作製された。５μgトータルＲＮＡのアリコットがＡＭＶ−ＲＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と培養され、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍとＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を使用したβ−アクチン、ＮＧＦ、ＰＧＣ−１αの発現レベルのＲＴ−ＰＣＲ分析用にｃＤＮＡが産生された。マウスβ−アクチンの発現レベルが内部参照として使用された。相対遺伝子発現レベルが２−ΔΔＣＴ法で計算された。断片（１００〜２５０ｂｐ）が各遺伝子の特異的プライマーを使用して増幅された。次のプライマーが使用された：ＥＰＯ（５'−ＡＡＴ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＡＣＡ  ＧＧ−３'および５'−ＡＣＣ  ＣＧＡ  ＡＧＣ  ＡＧＴ  ＧＡＡ  ＧＴＧ  Ａ−３'）、Ｈｂ−β（５'−ＴＧＡ  ＴＧＣ  ＴＧＡ  ＧＡＡ  ＧＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＣＴＣ  ＴＧ−３'）および（５'−ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＴＴＧ  ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＴＧＡ−３'）、ＰＧＣ−１α（５'−ＡＧＣ  ＣＧＴ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＴＧＡ  ＣＡＡ  ＣＧＡ  Ｇ−３'）および（５'−ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＴＧＧ  ＴＴＣ  ＴＧＡ  ＧＴＧ  ＣＴＡ  ＡＧ−３'）、ＨＯ−１(５'−ＣＧＣ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＣＡＡ  ＣＡＴ  Ｔ−３'）および（５'−ＴＧＴ  ＧＴＴ  ＣＣＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＴＣＡ  Ｃ−３'）およびＧＡＰＤＨ（５'−ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＧＡ  ＡＧ−３’および５’−ＡＣＣ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＧＡＣ−３'）。
【００７５】
３.ウェスタンブロット
細胞と脳組織ライセートが放射性免疫沈降法溶解緩衝液を使用して作製された。約２０μｇのタンパク質がロードされ、ＥＰＯに対するモノクローナルマウス抗体（１：５００；ｓｃ−７９５６、米国カリフォルニア州サンタクルーズ）とＨｂ−β（１：５００；ｓｃ−３１１１６、米国カリフォルニア州サンタクルーズ）、ローディングコントロールとしての抗ＧＡＰＤＨ抗体（１：１０,０００；ａｂ９３８５、Ａｂｃａｍ、英国ケンブリッジ）を使用してウェスタンブロット分析が行われた。化学発光検出増強のためホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ＩｇＧ二次抗体が使用された（Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国バッキンガムシャー）。
【００７６】
４. コハク酸デヒドロゲナーゼアッセイ
アストロサイトまたはＰＣ１２神経細胞が１ウェル当たり１０４細胞で９６ウェルプレートに蒔かれた。２４時間後、細胞はＥＰＯまたはＥＨ−２０１含有培地（１ウェル当たり１００μｌ）ありまたはなしで４８時間培養された。コハク酸デヒドロゲナーゼ活性はＭＴＴ還元試験により判定された。活性は細胞タンパク質レベルに対してノーマライズされ（ＢｉｏＲａｄタンパク質キットで測定）、吸収の変化がマイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２）を使用して測定された。活性は対照群の条件に相対して表された。
【００７７】
５. 細胞内活性酸素種産生
アストロサイトとＰＣ１２神経細胞がＥＰＯまたはＥＨ−２０１で２４時間処理された。培地が１００μＭのＨ２Ｏ２で置き換えられ、細胞が６時間（アストロサイト）または３０分間（ＰＣ１２細胞）培養された。その後、細胞における活性酸素種（ＲＯＳ）産生が２’,７’−ジクロロフルオレセインジアセタート（ＤＣＦＨ−ＤＡ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、米国オレゴン州ユージーン）を使用して測定された。ＤＣＦＨ−ＤＡは細胞内に蓄積し、細胞質エステラーゼによって加水分解され、２’,７’−ジクロロフルオレセインとなる。２’,７’−ジクロロフルオレセインはＨ２Ｏ２により酸化されて蛍光産物、２’,７’−ジクロロフルオレセインを産生する。簡単に説明すると、９６ウェルプレートの培養物が１％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで洗浄され、５０μＭのＤＣＦＨ−ＤＡがロードされ、３０分間３７℃で維持された。その後ウェルはクレブス緩衝液で２回洗浄され、細胞は５０％メタノール中で０.１Ｎ  ＮａＯＨで可溶化された。ウェルは１０分間撹拌され、２’−７’−ジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）蛍光色素が蛍光顕微鏡で観察されるか、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２）で測定された。
【００７８】
６. Ｈ２Ｏ２がアストロサイトとＰＣ１２神経細胞において細胞毒性を誘導した
アストロサイトとＰＣ１２神経細胞がＥＰＯまたはＥＨ−２０１で２４時間処理された。アストロサイトの培地が５００μＭのＨ２Ｏ２で置き換えられ、細胞は６時間培養された。ＰＣ１２細胞の培地が２５０μＭのＨ２Ｏ２で置き換えられ、細胞は４時間培養された。細胞生存性がトリパンブルー色素排除法により判定され、光学顕微鏡で評価された。
【００７９】
７. 睡眠遮断手順
４０匹の１２週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ成熟雄マウスがＮａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（台湾台北市）より取得された。マウスは恒温で維持され、実験用飼料（ＰＭＩ、Ｂｒｅｎｔｗｏｏｄ、米国ミズーリ州）と水が自由摂餌・自由摂水で与えられた。実験手順は国立陽明大学（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｙａｎｇ−Ｍｉｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。動物は同室内で睡眠が遮断された（ＳＤ）、または飼育ケージの中で保たれた。簡単に説明すると、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス（７週齢）が午前６時に照明が点灯される１２時間／１２時間の明暗スケジュールで７日間飼育された。マウスは飼育ケージ内で午前６時から穏やかに触れて睡眠を妨害する方法で５時間睡眠遮断されるか、妨害なく放置された（非睡眠遮断マウス）。マウスには睡眠遮断前の３日間、標準飼料または異なる濃度のＥＨ−２０１（１日５０、１００または２００ｍｇ／ｋｇ）を含む標準飼料が与えられた。
【００８０】
８. 受動回避試験
以前に説明された方法に若干変更を加えて受動回避実験が実施された。モジュール化試験室間がギロチンドアで仕切られた２ウェイシャトルボックスが使用された。１室は４０Ｗの電球で照らされ、他方の１室は暗いまま保たれた。訓練セッションで、動物は個別にギロチンドアに背を向けた明室に入れられた。動物が暗室に入ると、ドアが少し下がり、グリッドフロアを通じて０.５ｍＡのフットショックが２秒間かけられた。試験セッションで、動物は再び明室に入れられたが、フットショックはかけられなかった。ステップスルーの遅延が各セッションで記録された。
【００８１】
９. 統計分析
結果はすべて平均と標準偏差（ＳＤ）として表された。３群以上間の平均間の有意差は一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）とその後のチューキーのポストホックテストで判定された。スチューデントＴ検定でペアを成す試料の統計比較が行われた。＜０.０５のＰ値が有意であるとみなされた。
【００８２】
１０. 結果
（１）ＥＨ−２０１が初代アストロサイトとＰＣ１２神経細胞において神経ＥＰＯを誘導し、ＥＰＯ発現を増加させた
神経ＥＰＯ誘導因子、ＥＨ−２０１は初代アストロサイトとＰＣ１２神経細胞においてＥＰＯ発現を増加させた。外因性ＥＰＯは血液脳関門を通過できないため、その臨床的使用は制限されている。したがって、内因性神経ＥＰＯ誘導因子、ＥＨ−２０１の効果が試験された。ＥＨ−２０１の構造を図１３Ａに示す。ＥＨ−２０１処理の後、アストロサイトはリアルタイムＰＣＲ分析による測定で、ＥＰＯ  ｍＲＮＡ発現における用量依存的増加を示した（図１３Ｂ）。ＥＨ−２０１処理は、ＰＣ１２神経細胞においてＥＰＯ  ｍＲＮＡの発現も上方制御した（図１３Ｃ）。アストロサイトとＰＣ１２細胞における細胞内ＥＰＯタンパク質発現はＥＨ−２０１処理中上方制御された（図１３Ｄ）。
【００８３】
（２）ＥＨ−２０１が初代アストロサイトおよびＰＣ１２神経細胞においてミトコンドリア機能調節因子ＰＧＣ−１αとＨｂの発現を上昇させた
２４時間のＥＰＯまたはＥＨ−２０１治療後、細胞ｍＲＮＡが抽出され、ＥＰＯ媒介遺伝子の発現が測定された。リアルタイムＰＣＲはＰＧＣ−１α発現およびＨｂ−β  ｍＲＮＡ発現の上昇を示した。アストロサイト（図１４Ａから図１４Ｃまで）およびＰＣ１２神経細胞（図１４Ｄから図１４Ｆまで）の両方で、ＥＰＯによって上方制御される既知の抗酸化物質遺伝子であるＨＯ−１も、ＥＨ−２０１治療中誘導された。しかし、Ｈｂ−α発現は有意な変化がなかった（図１３Ｅから図１３Ｆ）。
【００８４】
（３）ＥＨ−２０１が初代アストロサイトおよびＰＣ１２神経細胞においてミトコンドリア活性を増加し、酸化的ストレスを減弱化した
ＰＧＣ−１αとＨｂはミトコンドリア機能調節因子として知られているため、Ｈｂのどの形態がＥＨ−２０１によって制御されるのかが分析された。図１５Ａと図１５Ｅでは、ＥＨ−２０１がアストロサイトとＰＣ１２細胞において３つすべての形態のＨｂの発現を増加したことが示されている。次に、ＥＰＯまたはＥＨ−２０１ありまたはなしで処理された細胞におけるミトコンドリア活性がＭＴＴアッセイにより測定された。図１５Ｂと図１５ＦはＥＰＯまたはＥＨ−２０１がアストロサイトとＰＣ１２細胞の両方でミトコンドリア活性を誘導したことを示している。これら遺伝子のＥＰＯまたはＥＨ−２０１媒介上方制御がアストロサイトとＰＣ１２細胞でＨ２Ｏ２によって誘導される酸化的ストレスを減弱化するか否かが調べられた。酸化プローブ、ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡを使用したＨ２Ｏ２への暴露後の培養細胞におけるＲＯＳ産生が予測された。ＥＰＯとＥＨ−２０１処理がアストロサイト（図１５Ｃ）とＰＣ１２細胞（図１５Ｇ）における細胞中のＲＯＳを減少した。ＥＰＯとＥＨ−２０１はＨ２Ｏ２に暴露された細胞における細胞毒性も減少し、ＥＰＯのミトコンドリア制御とＲＯＳホメオスタシス効果が生物学的に重要であることを示唆している（図１５Ｄと図１５Ｈ）。
【００８５】
（４）ＥＰＯは初代アストロサイトおよびＰＣ１２神経細胞におけるＥＨ−２０１媒介ミトコンドリア活性増加と酸化的ストレスの減弱化に必須である
アストロサイトとＰＣ１２細胞においてＥＨ−２０１での処理後増加したミトコンドリア活性とＨ２Ｏ２誘導ＲＯＳ産生および細胞毒性がＥＰＯ依存的であるか否かが評価された。ＥＨ−２０１処理で観察されたミトコンドリア活性の増加は、ＭＴＴアッセイによる測定で、ＥＨ−２０１単独で処理された細胞と比較して、抗ＥＰＯ抗体が存在すると妨げられた（図１６Ａ）。ＥＨ−２０１で処理されたアストロサイトとＰＣ１２細胞におけるＨ２Ｏ２により誘導されるＲＯＳ産生の減少は、細胞が抗ＥＰＯ抗体と共インキュベーションされたとき消失した（図１６Ｂ）。抗ＥＰＯ抗体もＨ２Ｏ２により誘導された細胞毒性においてＥＨ−２０１が媒介する減少を阻害した（図１６Ｃ）。
【００８６】
（５）睡眠遮断により誘導される記憶喪失のマウスモデルにおけるＥＨ−２０１の効果
ＳＤモデルを使用して記憶に対するＥＨ−２０１の神経保護的効果が評価された。実験手順の概要を図１７Ａに示す。治療を受けた各動物の海馬からのＥＰＯ発現が分析された。リアルタイムＰＣＲとウェスタンブロット分析はＥＨ−２０１が与えられた動物でＥＰＯ発現の増加を示した（図１７Ｂと図１７Ｃ）。海馬におけるＨｂβ、ＨＯ−１、ＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現がリアルタイムＰＣＲにより分析された（図１７Ｄ）。さらにＭＴＴアッセイを使用してミトコンドリアコハク酸デヒドロゲナーゼ活性が評価された（図１７Ｅ）。受動回避試験でＥＨ−２０１が３日間与えられた動物は学習能力において差を示さなかった（図１７Ｆ）。しかし、ＳＤ後ＥＨ−２０１投与マウスにおいて受動回避試験で記憶パフォーマンスの有意な改善があった（図１７Ｇ）。ＥＨ−２０１が、特に用量１００ｍｇ／ｋｇと２００ｍｇ／ｋｇで、与えられた動物からの遺伝子発現の変化と海馬におけるミトコンドリア活性の増加は、受動回避試験と創刊関係があった。
【００８７】
実施例４  本発明の化合物によるオートファジーの誘導
この例は、本発明の化合物によるオートファジー誘導の評価に役立つさまざまなアッセイを説明している。本発明の化合物は実施例１の方法に従って作製される。この化合物の有効性が一連の活性アッセイを私用して評価され、これらアッセイについて以下で詳細に説明する。
【００８８】
１. ＰＯＳ貪食アッセイ
上述の処理後、細胞はＦＩＴＣ−ＯＳ（１ｘ１０７ＯＳ／ウェル）で処理され、３７℃で４時間培養された。未処理の細胞を使用してベースライン蛍光色素が取得された。細胞は（ＥＢＳＳ）で４回洗浄され、余分なＰＯＳが除去された。最後に、ＥＢＳＳが各ウェルに１００μｌ／ウェル添加され、蛍光計でＦＩＴＣ−ＯＳ蛍光色素を励起４８５ｎｍと放射５３５ｎｍで定量化することにより平均ＦＩＴＣ−ＯＳ蛍光色素が分析された。その後、フルオロ消光染料が各ウェルに２５μｌ／ウェルずつ添加され、染料は３７℃で３０分間培養された。染料が蛍光色素の蛍光計分析（励起、４８５ｎｍ：放射、５３５ｎｍ）により定量化された。
【００８９】
２.ウェスタンブロット分析
示された処理の後、細胞は氷冷ＰＢＳで２回洗浄され、抽出バッファ（１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ６.８、１０％ＳＤＳ、１Ｍ  ＤＴＴ）で溶解された。１０〜１５μｇのトータルタンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、化学発光を使用して、免疫ブロッティングにより分析された。使用された初代抗体はＬＣ３Ｂ抗体（Ｇｅｎｅ  Ｔｅｘ、米国、１：１０００）、ＥＰＯ（ＧＡＰＤＨ（米国カリフォルニア州サンタクルーズ、１：１０００）またはＧＡＰＤＨ（米国カリフォルニア州サンタクルーズ、１：１０００）、ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧまたはペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ（米国カリフォルニア州サンタクルーズ、１：１０００）であった。タンパク質バンドの強度がＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化され、対照に対する特異的バンドの割合が分析された。
【００９０】
３. モノダンシルカダベリンでの自己貪食空胞の標識
モノダンシルカダベリン（ＭＤＣ）はオートフアゴソームとオートリソソームに選択的に取り込むことができる自然蛍光色素である。細胞は０.０５ｍＭのＭＤＣとＰＢＳにおいて３７℃で１時間培養された。培養後、細胞はＰＢＳで２回洗浄され、すぐに蛍光顕微鏡により分析された（励起：３８０〜４２０ｎｍ、バリアフィルター４５０ｎｍ）。
【００９１】
４. 細胞培養と処理
マウスの腎臓切片と初代マウス肝細胞の培養は前述のとおりである。これらの培養物が異なる用量（０.６、２.５、１０、４０ｍｇ／ｍｌ）のＥＨ−２０１、オートファジー活性化因子ラパマイシン（Ｒｍ、５０ｎＭ）またはオートファジー阻害剤３−メチルアデニン（３ＭＡ、１０ｍＭ）で２４時間処理された。飢餓状態（ｓｔｖ）下の細胞の培養がオートファジー活性化対照として用いられた。
【００９２】
５. 結果
（１）図１９Ａから図１９ＤにＥＨ−２０１によるオートファジーの誘導を示す。
(２）図２０Ａと図２０Ｂに示すように、ＥＨ−２０１により誘導されるオートファジー活性化は肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の誘導を介していた。
【００９３】
前述の説明は本発明の特徴と機能を例示したのみであり、本発明の範囲を限定することを意図していない。当業者であれば本発明の開示における要旨と原則に従って行われた前述の説明に対する同等の変化と変更はすべて、本発明の特許請求の範囲内に含まれることが明らかであろう。
【図１Ａ】
2016516745.tif 000014
【図１Ｂ】
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【図２ＡＢ】
2016516745.tif 000016
【図２ＣＤ】
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【図２ＥＦＧ】
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【図２ＨＩＪ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３ＥＦ】
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【図３Ｇ】
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【図４ＡＢ】
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【図４ＣＤ】
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【図４ＥＦ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図５ＡＢ】
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【図５ＣＤＥ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６ＡＢＣ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６ＦＨ】
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【図６Ｇ】
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【図７ＡＢＣ】
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【図７ＤＥ】
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【図７ＦＧＨ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ＡＢＣ】
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【図１１ＡＢ】
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【図１２ＡＢ】
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【図１３ＡＢＣＤ】
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【図１３ＥＦ】
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【図１４ＡＢＣ】
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【図１４ＤＥＦ】
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【図１５ＡＢ】
2016516745.tif 000053
【図１５ＣＤ】
2016516745.tif 000054
【図１５ＥＦ】
2016516745.tif 000055
【図１５ＧＨ】
2016516745.tif 000056
【図１６ＡＢＣ】
2016516745.tif 000057
【図１６ＤＥＦ】
2016516745.tif 000058
【図１７ＡＢＣ】
2016516745.tif 000059
【図１７Ｄ】
2016516745.tif 000060
【図１７ＥＦＧ】
2016516745.tif 000061
【図１８】
2016516745.tif 000062
【図１９ＡＢ】
2016516745.tif 000063
【図１９ＣＤ】
2016516745.tif 000064
【図２０ＡＢ】
2016516745.tif 000065
【手続補正書】
【提出日】平成28年3月25日(2016.3.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式（Ｉ）で表される化合物と、薬学的に許容できる担体を含み、
【化１】
2016516745.tif 000066
式中、Ｒがグリコシル基であることを特徴とする、被検体の非造血細胞においてエリスロポエチン（ＥＰＯ）媒介ヘモグロビン（Ｈｂ）発現を誘導するための組成物。
【請求項２】
前記グリコシル基が、ジヒドロキシアセトン、ブドウ糖、ガラクトース、グリセルアルデヒド、トレオース、キシロース、マンノース、リボース、リブロース、タガトース、プシコース、果糖、ソルボース、ラムノース、エリトロース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、蔗糖、乳糖、麦芽糖、ラクツロース、トレハロース、セロビオース（cellobose）、イソマルトトリオース、ニゲロトリオース、マルトトリオース、メレジトース、マルトトリウロース、ラフィノース、ケストース、及びそれらの組み合わせで構成される群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記化合物が、被検体の非造血細胞においてＨｂ−α、Ｈｂ−β、または二量体Ｈｂの発現を誘導することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記化合物が、エリスロポエチン―エリスロポエチン受容体結合親和性を高めることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記化合物が、前記エリスロポエチンが結合したエリスロポエチン受容体複合体に結合することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記化合物が内因性ＥＰＯ発現を高め、非造血細胞におけるＨｂ発現を刺激することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記非造血細胞が、腎細胞、肝細胞、心筋細胞、筋原細胞、グリア細胞、神経細胞、および網膜色素上皮細胞から構成される群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
低酸素症、貧血、腎臓虚血、心筋虚血、肺虚血、神経変性疾患、神経精神病的疾患、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）関連の疾患、及びそれらの組み合わせから構成される群より選択される疾患または症候群を治療するための請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
次の式（Ｉ）で表される化合物と、薬学的に許容できる担体を含み、
【化２】
2016516745.tif 000067
式中、Ｒがグリコシル基であることを特徴とする、被検体の非造血細胞においてエリスロポエチン（ＥＰＯ）媒介ミトコンドリア新生を誘導するための組成物。
【請求項１０】
前記グリコシル基が、ジヒドロキシアセトン、ブドウ糖、ガラクトース、グリセルアルデヒド、トレオース、キシロース、マンノース、リボース、リブロース、タガトース、プシコース、果糖、ソルボース、ラムノース、エリトロース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、蔗糖、乳糖、麦芽糖、ラクツロース、トレハロース、セロビオース、イソマルトトリオース、ニゲロトリオース、マルトトリオース、メレジトース、マルトトリウロース、ラフィノース、ケストース、及びそれらの組み合わせで構成される群より選択されることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記化合物が、ミトコンドリア数またはＥＰＯ媒介ミトコンドリア新生を誘導するためのＰＧＣ−１α発現の増加を誘導することを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記化合物が、エリスロポエチン−エリスロポエチン受容体結合親和性を高めることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記化合物が、前記エリスロポエチンが結合したエリスロポエチン受容体複合体に結合することを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
前記化合物が、内因性ＥＰＯ発現を高め、被検体の非造血細胞においてＨｂ発現を刺激することを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＥＰＯ媒介ミトコンドリア新生がＰＧＣ−１α依存的であることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１６】
前記非造血細胞が、腎細胞、肝細胞、心筋細胞、筋原細胞、グリア細胞、神経細胞、および網膜色素上皮細胞から構成される群より選択されることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１７】
低酸素症、貧血、虚血関連疾患、神経変性疾患、神経精神病的疾患、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）関連の疾患、心筋障害、脳老化、慢性の肝疾患、多発性硬化症、ポンペ病、高血圧、心不全、肥満、糖尿病、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、老化、メタボリック症候群、及びそれらの組み合わせから構成される群より選択される疾患または症候群を治療するための請求項９に記載の組成物。
【請求項１８】
前記虚血関連疾患が、心臓虚血、虚血性神経変性、脳虚血（brain ischemia）、心筋虚血、手足虚血、脳虚血（cerebral ischemia）、肝臓虚血、網膜虚血、脳卒中、ネフローゼ虚血（nephritic ischemia）、肺虚血、腸虚血、心臓血管虚血、腎虚血（renal ischemia）及び虚血腎（kidney ischemia）から構成される群より選択されることを特徴とする、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、及びハンティントン病で構成される群より選択されることを特徴とする、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
オートファジー異常を有する被検体においてオートファジーを誘導するための組成物であって、次の式（Ｉ）で表される化合物を含み、
【化３】
2016516745.tif 000068
式中、Ｒはグリコシル基であり、前記オートファジーが前記被検体におけるタンパク質凝集体の分解を強化することを特徴とする、組成物。
【請求項２１】
前記グリコシル基が、ジヒドロキシアセトン、ブドウ糖、ガラクトース、グリセルアルデヒド、トレオース、キシロース、マンノース、リボース、リブロース、タガトース、プシコース、果糖、ソルボース、ラムノース、エリトロース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、蔗糖、乳糖、麦芽糖、ラクツロース、トレハロース、セロビオース、イソマルトトリオース、ニゲロトリオース、マルトトリオース、メレジトース、マルトトリウロース、ラフィノース、ケストース、及びそれらの組み合わせで構成される群より選択されることを特徴とする、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記オートファジー異常が、前記被検体において前記タンパク質凝集体を発現する細胞にあることを特徴とする、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記被検体の細胞が、神経細胞またはグリア細胞であることを特徴とする、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
前記タンパク質凝集体が、ハンチンチン、アミロイドβ（Ａβ）、α−シヌクレイン、タウ、スーパーオキシドジスムターゼ１(ＳＯＤ１)、それらのバリアント及び変異型、及びそれらの組み合わせから構成される群より選択される凝集体であることを特徴とする、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２５】
前記オートファジー異常が、神経変性疾患、網膜疾患、クローン病、老化、心臓肥大、慢性心不全、結核、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、肝臓脂肪変性、腎多嚢胞病、腎不全、筋肉退化、骨パジェット病、封入体筋障害、前頭側頭型認知症、糸球体疾患、代謝病、II型糖原病、炎症性腸疾患、及びポンペ病から構成される群より選択される１つの疾患であることを特徴とする、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２６】
前記神経変性疾患が、ハンティントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及び不眠から構成される群より選択されることを特徴とする、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
被検体における記憶喪失を予防するための組成物であって、次の式（Ｉ）で表される化合物を含み、
【化４】
2016516745.tif 000069
式中、Ｒはグリコシル基であり、前記化合物が被検体におけるオートファジーを活性化させることを特徴とする、組成物。
【請求項２８】
前記グリコシル基が、ジヒドロキシアセトン、ブドウ糖、ガラクトース、グリセルアルデヒド、トレオース、キシロース、マンノース、リボース、リブロース、タガトース、プシコース、果糖、ソルボース、ラムノース、エリトロース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、蔗糖、乳糖、麦芽糖、ラクツロース、トレハロース、セロビオース、イソマルトトリオース、ニゲロトリオース、マルトトリオース、メレジトース、マルトトリウロース、ラフィノース、ケストース、及びそれらの組み合わせで構成される群より選択されることを特徴とする、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記化合物が、前記被検体におけるオートファジーを活性化させるためのエリスロポエチン（ＥＰＯ）を誘導することを特徴とする、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
前記オートファジーが、前記被検体におけるタンパク質分解を強化することを特徴とする、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３１】
前記被検体が、ハンティントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、及び不眠から構成される群より選択される神経変性疾患に罹患していることを特徴とする、請求項２７に記載の組成物。
【国際調査報告】
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