(57)【要約】  本発明は、増強された抗炎症特性を有する組成物および、皮膚などが挙げられるがこれに限定されない、生体組織における炎症を抑制するための方法に関する。皮膚の炎症には、刺激、発赤、腫脹、局所的な温度上昇、裂、落屑、痒み、痛み、過敏、擦過傷、変色、および出血等、ならびにこれらの組合せなどが挙げられるがこれらに限定されない、皮膚の表面の中または上に生じるあらゆる望ましくない影響が含まれる。本発明は、チャノキ（Camellia sinensis）のセラム画分（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳ）、レモン（Citrus limon）のセラム画分（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＬ）、およびアカツメクサ（Trifolium pratense）のセラム画分（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＴＰ）などの、特定の植物画分が、皮膚などが挙げられるがこれに限定されない、生体組織の炎症を抑制するために、多様な製品中で有効に利用され得ることを実証している。一実施形態において、前記植物画分は、いかなる有意な発酵もされていない。
2016516679.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体の皮膚に対する炎症特性が低減された組成物であって、前記組成物が、少なくとも１種の表面活性剤と、有効量の少なくとも１種の生物学的に活性な植物画分とを含み、前記生物学的に活性な植物画分が植物由来の膜画分、細胞質画分、細胞破砕液セラム、またはこれらの混合物もしくは組合せであり、前記植物画分がポリフェノールを実質的に含有していない、組成物。
【請求項２】
前記生物学的に活性な植物画分が、コンブ科（Laminariaceae）、シオグサ科（Cladophoraceae）、マメ科（Fabaceae）、ツバキ科（Theaceae）、キク科（Asteraceae）、シソ科（Lamiaceae）、ユリ科（Liliaceae）、イネ科（Poaceae）、クワ科（Moraceae）、マクロシスティス・ピリフェラ（Macrocystis pyrifera）、チャボジュズモ（Chaetomorpha basiretorsa）、ムラサキウマゴヤシ（Medicago sativa）、アカツメクサ（Trifolium pratense）、ダイズ（Glycine max）、チャノキ（Camellia sinensis）、レモン（Citrus limon）、キンセンカ（Calendula officinalis）、ナツシロギク（Tanacetum parthenium）、カモミール（Chamomilla recutita）、ラベンダー（Lavandula angustifolia）、セージ（Salvia officinalis）、ハス（Nelumbo nucifera）、リリウム・ブルビフェルム（Lilium bulbiferum）、エンバク（Avena sativa）、オオムギ（Hordeum vulgare）、およびこれらの組合せまたは混合物由来である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記生物学的に活性な植物画分が、チャノキ（Camellia sinensis）、レモン（Citrus limon）、およびアカツメクサ（Trifolium pratense）由来である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項４】
前記生物学的に活性な植物画分が細胞破砕液セラム画分である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物がパーソナルケア製品であり、前記製品が、クリーム、包帯、ゲル、ローション、軟膏、液、スプレー塗布器、およびこれらの組合せからなる群から選択される付けたままにしておく製品（leave-on product）、または手洗い用食器洗い洗剤、液体ハンドソープ、棒石鹸、ボディウォッシュ、シャンプー、汎用洗浄剤、およびこれらの組合せからなる群から選択される洗い落す製品（wash-off product）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、少なくとも１種の表面活性剤と、有効量の生物学的に活性な植物画分とを含む石鹸であり、前記生物学的に活性な植物画分が、植物由来の膜画分、細胞質画分、細胞破砕液セラム、またはこれらの混合物もしくは組合せである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記生物学的に活性な植物画分が、チャノキ（Camellia sinensis）、レモン（Citrus limon）、およびアカツメクサ（Trifolium pratense）由来の細胞破砕液セラム画分である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が、少なくとも１種の表面活性剤と、有効量の生物学的に活性な植物画分とを含む皮膚クリームであり、前記生物学的に活性な植物画分が、植物由来の膜画分、細胞質画分、細胞破砕液セラム、またはこれらの混合物もしくは組合せである、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
前記生物学的に活性な植物画分が、チャノキ（Camellia sinensis）、レモン（Citrus limon）、およびアカツメクサ（Trifolium pratense）由来の細胞破砕液セラム画分である、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記植物画分が約５重量％未満のポリフェノールを含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記植物画分が約１重量％未満のポリフェノールを含有する、請求項３に記載の組成物。
【請求項１２】
生体組織（biological tissue）の炎症を軽減するための方法であって、前記方法が、前記生体組織を少なくとも１種の生理活性植物画分と接触させるステップを含み、前記生理活性植物画分が植物由来の膜画分、細胞質画分、細胞破砕液セラム、およびこれらの組合せであり、前記植物画分がポリフェノールを実質的に含有していない、方法。
【請求項１３】
前記炎症が表面活性化合物によって誘発される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記表面活性剤が、陰イオン性、陽イオン性、非イオン性、双性イオン性、およびこれらの組合せから選択される表面活性剤である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記植物画分が、チャノキ（Camellia sinensis、Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳ）、レモン（Citrus limon、Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＬ）、アカツメクサ（Trifolium pratense、Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＴＰ）、またはこれらの組合せおよび／もしくは混合物由来である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記植物画分が、前記画分の乾燥重量に対して約１％未満のポリフェノールを含有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記画分がセラム画分である、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面活性化合物によって誘発される炎症および刺激を軽減するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
表面活性化合物は、それを液体中に溶解させたときに、その液体の表面張力または界面張力を低下させることができる物質である。最も一般的には、これは、水ならびに空気、固体表面、および他の物質との水の境界面を指す。いかなる溶質も溶液の特性を変えることができるが、この点で特に有効な特定の化合物は表面活性剤と呼ばれる。この有効性は、一般的には１個または２個の炭化水素「尾部」からなる、疎水性部分と、負に帯電していてもよく（陰イオン性表面活性剤）、正に帯電していてもよく（陽イオン性表面活性剤）、帯電していなくてもよく（非イオン性表面活性剤）、または頭部構造の中に正および負の双方に帯電した基を有していてもよい（両性または双性イオン性の表面活性剤）、親水性「頭部」部分とを含む両親媒性構造の結果である。
【０００３】
これらの群に属している表面活性剤のいくつかの例は、以下の通りであろう：
・陰イオン性
○ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
○オレフィンスルホン酸ナトリウム
・陽イオン性
○臭化セトリモニウム（または臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム）
○モノアルキルクワット
○Ｃ１２〜Ｃ１８エトキシル化アミン
・非イオン性
○オクチルフェノールエトキシレート
○エトキシル化アルコール
・双性イオン性／両性
○コカミドプロピルベタイン
○ココアンホポリカルボキシグリシネート
【０００４】
両親媒性構造は、表面活性剤分子が、境界面においてそれら自身を凝集および方向付けすること、複雑な配置を形成すること、溶液の湿潤能力を増大させること、疎水性物質の懸濁を可能にすること、ならびに他の両親媒性物質によって形成された配置と相互作用することを可能にする。
【０００５】
こうした配置の生物学的に重要な例は、生きている細胞および細胞小器官の形質膜であり、これは、方向付けされた２層のリン脂質によって形成される二重層構造であり、内側の膜は、互いに面している疎水性の「尾部」であり、細胞内および細胞外の媒質に面している外側は、親水性の「頭部」となっている。細胞の機能に重要な他の成分は、形質膜の中に埋め込まれているか、または付着している。
【０００６】
生きている組織の健康状態および生存能は、周囲の媒質の特性および組織の細胞の形質膜の完全性に強く依存する。表面活性剤の導入により、表面張力などの媒質の特性を変更することおよび形質膜の透過性を高めて形質膜安定性に影響を与えることができ、または、それ以外の場合には、形質膜に損傷を与え得る。導入された表面活性剤は、他の形質膜成分とも相互作用し得る。生きている組織に対する表面活性剤の望ましくない影響により、炎症および刺激などの複雑な生体反応が引き起こされ得る。
【０００７】
過去において、より刺激の少ない表面活性剤を選択すること、閉塞性フィルムによって皮膚の接触を遮断すること、遊離した表面活性剤モノマーに対する皮膚の曝露を制限するために洗剤の臨界ミセル濃度を低下させること、または皮膚剥離および皮膚細胞再生を促進するために酵素および従来の植物抽出物を添加することにより、表面活性剤誘発性の皮膚の刺激および炎症を軽減するために多くの試みがなされてきた。しかし、表面活性剤誘発性の皮膚の刺激および炎症は、依然として消費者の主な不安のうちの１つとなっている。表面活性剤は、湿潤、乳化および可溶化、洗浄、発泡、ならびに分散のプロセスを可能にするまたは向上させるための多種多様な工業用、科学用および家庭用の用途を有するからである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、表面活性剤とのヒトの接触は発生頻度が高く、こうした接触の有害な影響を軽減することが望ましい。
【０００９】
炎症は、これらに限定されないが、ヒスタミンなどの血管作用性アミン、プロスタグランジンなどのアラキドン酸代謝の産物、ならびに特にケモカインおよびインターロイキンなどのシグナル伝達タンパク質を含む、シグナル伝達物質によって媒介される生体反応の複雑なカスケードである。特定のシグナル伝達分子は、炎症性シグナル伝達カスケードにおけるその位置、炎症促進性効果についてのその範囲の広さ、および炎症反応を引き起こす比較効能などが挙げられるがこれらに限定されない因子による、炎症の制御および炎症活性の定量化に特に重要である。こうしたカスケードの例を図１に示している。
【００１０】
こうした炎症を研究および定量化する方法のうちの１つは、表皮からの生存可能なケラチノサイトのように、表面活性剤と最も接触しそうな組織の細胞を培養することによる。これらの培養細胞は、ストレスおよび処理にさらすことができ、炎症性シグナル伝達または細胞損傷に関連する放出物質のレベルは、多様なバイオアッセイによって決定することができる。皮膚ケラチノサイトは、その表皮の位置、角質層障壁の完全性の維持におけるその重要性、およびさまざまな炎症性メディエーターを産生するその能力により、刺激物質誘発性の皮膚炎症における注目の焦点になっている。ケラチノサイトは、大量の生物学的に活性なインターロイキン（ＩＬ）−１αを含有し、これは、表面活性剤などの、さまざまな刺激物質に応答して放出され得る。ＩＬ−１αは、主要なサイトカインのうちの１種であり、これは、刺激物質によって誘導することができ、炎症カスケードの初期段階でケラチノサイトから放出されることが多い。次いで、ＩＬ−１αは、多数の下流の炎症性メディエーター、例えば、シグナル伝達分子、サイトカイン、および、好中球走化性因子として知られる、ケモカインＩＬ−８の誘導をもたらす。ＩＬ−８は、損傷を受けた皮膚への白血球の動員および皮膚炎症の徴候の発現に重要である。したがって、初期の炎症反応メディエーターおよび鍵となる走化性因子である、ＩＬ−１αおよびＩＬ−８が、ケラチノサイトから分泌されるのを低減することによって、皮膚炎症の徴候は、低減、予防、および／または排除され得る。
【００１１】
例えば、米国特許第７，４４２，３９１号；第７，４７３，４３５号；第７，５３７，７９１号；第８，０４３，６３５号；第８，１０１，２１２号；第８，２７７，８５２号および第８，３１８，２２０号に記載されているプロセスによって製造される、特定の生理活性組成物（すなわち画分）は、従来の溶媒抽出された植物性抽出物と著しく異なる組成物を有する。特定の画分は、皮膚老化の原因となる複数の生体経路に影響し得る強力な抗炎症活性、抗酸化活性および光安定化活性を有すると共に、製剤の安定性、色および匂いの悪変も最小限にし、これにより局所適用に特に好適となるはずである。好適な生理活性画分としては、限定されるものではないが、細胞壁画分、細胞壁画分抽出物、膜画分、膜画分抽出物、細胞質画分、細胞質画分抽出物、細胞破砕液セラム（cell juice serum）、および／または組合せなどが挙げられる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、皮膚などが挙げられるがこれに限定されない、生体組織における炎症を抑制するための方法に関する。皮膚の炎症には、刺激、発赤、腫脹、局所的な温度上昇、裂、落屑、痒み、痛み、過敏、擦過傷、変色、および出血等、ならびにこれらの組合せなどが挙げられるがこれらに限定されない、皮膚の表面の中または上に生じるあらゆる望ましくない影響が含まれる。本発明者らは、チャノキ（Camellia sinensis）のセラム画分（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳ）、レモン（Citrus limon）のセラム画分（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＬ）、およびアカツメクサ（Trifolium pratense）のセラム画分（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＴＰ）などの、特定の植物画分の抗炎症活性が、皮膚などが挙げられるがこれに限定されない、生体組織の炎症を抑制するために、多様な製品中で有効に利用され得ることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】表面活性剤は、皮膚の刺激および炎症を誘発する。
【００１４】
【図２】ＨＥＫ培養物におけるＩＬ−１α（Ａ）およびＩＬ−８（Ｂ）の放出に対する、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の効果。
【００１５】
【図３】ＨＥＫ培養物に対する、主要なクラスの表面活性剤の代表の効果の比較。
【００１６】
【図４】図４．ＨＥＫ培養物におけるＩＬ−１αの放出に対する、エトキシル化アルコールの効果。
【００１７】
【図５】ＳＤＳ（それぞれ２５μｇ／ｍｌおよび６μｇ／ｍｌ）で処理したＨＥＫ培養物におけるＩＬ−１α（Ａ）およびＩＬ−８（Ｂ）の放出に対する、チャノキ（Camellia sinensis）セラム画分および陽性対照（アスピリンおよびＳＢ２０３５８０）の効果。
【００１８】
【図６】エトキシル化アルコール（１０００μｇ／ｍｌ）で処理したＨＥＫ培養物におけるＩＬ−１αの放出に対する、チャノキ（Camellia sinensis）セラム画分およびアスピリンの効果。
【００１９】
【図７】ＳＤＳ（それぞれ２５μｇ／ｍｌおよび６μｇ／ｍｌ）で処理したＨＥＫ培養物におけるＩＬ−１α（Ａ）およびＩＬ−８（Ｂ）の放出に対する、チャノキ（Camellia sinensis）セラム画分ならびに従来の緑茶および紅茶の調製物の効果。
【００２０】
【図８】エトキシル化アルコール（５００μｇ／ｍｌ）で処理したＨＥＫ培養物におけるＩＬ−１αの放出に対する、チャノキ（Camellia sinensis）セラム画分ならびに従来の緑茶および紅茶の調製物の効果。
【００２１】
【図９】ＳＤＳ（２５μｇ／ｍｌ）で処理したＨＥＫ培養物におけるＩＬ−１αの放出に対する、レモン（Citrus limon）のセラム画分（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＬ）およびアカツメクサ（Trifolium pratense）のセラム画分（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＴＰ）の効果。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、皮膚などが挙げられるがこれに限定されない、生体組織を、チャノキ（Camellia sinensis）のセラム画分（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳ）、レモン（Citrus limon）のセラム画分（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＬ）、およびアカツメクサ（Trifolium pratense）のセラム画分（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＴＰ）などの、特定の植物画分の有効量と接触させることによって、該生体組織における炎症を抑制するための方法に関する。
【００２３】
本発明は、炎症のバイオマーカーにも関する。一実施形態において、哺乳動物の炎症のバイオマーカーとしては、限定されるものではないが、インターロイキン−１アルファ（ＩＬ−１α）炎症カスケードと関連したバイオマーカーなどが挙げられる。ＩＬ−１αは、炎症性サイトカインであり、これは、刺激物質によって誘導され、炎症カスケードの初期段階で表皮皮膚細胞から放出されることが多い。続いて、それは、ケモカインＩＬ−８を含む下流の二次炎症性メディエーターの誘導、その後の形態学的変化、および最終的に皮膚炎症の徴候の発現をもたらす。したがって、初期の炎症反応メディエーターおよび鍵となる走化性因子である、ＩＬ−１αおよびＩＬ−８の分泌を低減することによって、皮膚の炎症および刺激を軽減、予防、および／または排除することができる。
【００２４】
特定の表面活性化合物は、皮膚の炎症および刺激を誘発することが見出されている。表面活性化合物は、時に表面活性剤と呼ばれ、典型的には、液体の表面張力、２種の液体間の界面張力、または液体と固体との間の界面張力を低下させるために製品中に使用される。表面活性剤は、洗剤、湿潤剤、乳化剤、発泡剤、および／または分散剤としても働き得る。表面活性剤は、陰イオン性、陽イオン性、非イオン性、および双性イオン性の表面活性剤ならびに／またはこれらの組合せであってもよい。
【００２５】
本発明は、生理活性組成物にも関する。一実施形態において、該生理活性組成物は、例えば、米国特許第７，４４２，３９１号；第７，４７３，４３５号；第７，５３７，７９１号；第８，０４３，６３５号；第８，１０１，２１２号；第８，２７７，８５２号および第８，３１８，２２０号に記載されているプロセスによって製造される、植物由来の単離された生物学的に活性な複合体を含む。これらの組成物、すなわち画分は、従来の溶媒抽出法によって製造されず、それらの組成物は、従来の植物性抽出物と著しく異なる。好適な生理活性画分としては、限定されるものではないが、細胞壁画分、細胞壁画分抽出物、膜画分、膜画分抽出物、細胞質画分、細胞質画分抽出物、細胞破砕液セラム画分、および／またはこれらの組合せなどが挙げられる。
【００２６】
本発明は、哺乳動物への局所適用に好適な生理活性局所製剤にも関する。一実施形態において、該生理活性局所製剤は、局所的に有効な量の本発明の生理活性組成物を含む。該生理活性局所製剤は、局所的に許容される担体をさらに含み得る。
【００２７】
本発明は、哺乳動物の皮膚組織において、皮膚を１種または複数の表面活性剤と接触させることによって引き起こされる皮膚組織における炎症活性などの、炎症活性を抑制するための方法にも関する。この方法は、本発明による生理活性組成物を提供することを含む。この方法は、該生理活性組成物を、皮膚組織において炎症活性を抑制するのに有効な量で皮膚組織に適用することをさらに含む。
【００２８】
本発明は、哺乳動物の皮膚組織を表面活性化合物誘発性損傷から保護する方法にも関する。これらの方法は、本発明の生理活性組成物を提供することを含む。これらの方法は、該生理活性組成物を、皮膚組織の表面活性化合物誘発性損傷を軽減し、皮膚組織の炎症性損傷を防ぐのに有効な量で皮膚組織に適用することをさらに含む。
【００２９】
本発明は、従来の植物抽出物、すなわち、従来法によって製造された植物抽出物の欠陥にも対処している。従来の植物加工は、広範囲の強力な生理活性組成物を十分に保存することができないという点で欠陥がある。例えば、参照により本明細書にすべて組み込まれている、米国特許第７，４４２，３９１号；第７，４７３，４３５号；第７，５３７，７９１号；第８，０４３，６３５号；第８，１０１，２１２号；第８，２７７，８５２号および第８３１８２２０号に記載されているプロセスによる、新鮮なチャノキ（Camellia sinensis）、レモン（Citrus limon）、およびアカツメクサ（Trifolium pretense）等の加工では、発酵および過剰な熱処理なしで、従来の植物加工の製品よりも表皮皮膚細胞からの表面活性化合物誘導性の炎症性のサイトカインおよびケモカインの分泌が強力に低減されることが予想外にも実証されている。
【００３０】
例えば、参照により本明細書にすべて組み込まれている、米国特許第７，４４２，３９１号；第７，４７３，４３５号；第７，５３７，７９１号；第８０４３６３５号；第８，１０１，２１２号；第８，２７７，８５２号および第８，３１８，２２０号に記載されているプロセスは、独特なことに、天然原料中の生物学的活性を保存する。これらのプロセスから得られる植物画分は、表皮皮膚細胞におけるＩＬ−１αおよび／またはＩＬ−８の表面活性剤誘導性分泌の低減にも極めて有効である。これは、培養したヒト表皮ケラチノサイトにおいて、陰イオン性、非イオン性、陽イオン性および双性イオン性などの、異なるクラスの表面活性剤によって炎症性サイトカインＩＬ−１αおよび／またはＩＬ−８を最初に誘導することによって実証された。次いで、異なるクラスからの６種の代表的な表面活性剤の低刺激性（mildness）を、ＩＬ−１αを誘導するそれらの能力および細胞毒性に基づいてランク付けした。試験した表面活性剤の中で最も刺激性が低い、非イオン性エトキシル化アルコールは、ＩＬ−１αを誘導することができたがＩＬ−８はできなかった。次に、チャノキ（Camellia sinensis）のセラム画分（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳ）、レモン（Citrus limon）のセラム画分（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＬ）、およびアカツメクサ（Trifolium pratense）のセラム画分（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＴＰ）を、ＳＤＳまたはエトキシル化アルコールのいずれかで処理したケラチノサイトにおけるＩＬ−１αおよび／またはＩＬ−８の抑制について評価し、よく知られている２種の抗炎症ベンチマーク剤アスピリンおよびＳＢ２０３５８０と比較した。チャノキ（Camellia sinensis）のセラム画分（すなわちＲｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳ）などの、このプロセスの製品の抗炎症活性を、アスピリンのそれと比較して、ＳＤＳおよびエトキシル化アルコールによって誘導されるＩＬ−１αの抑制について等しいまたはより良い効力が示された。さらに、レモン（Citrus limon）（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＬ）およびアカツメクサ（Trifolium pratense）（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＴＰ）の双方も、ＳＤＳ誘導性ＩＬ−１αをより少ない程度に抑制した。ケモカインＩＬ−８の低減について試験したときに、Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳは、ケラチノサイトにおいてＳＤＳ誘導性ＩＬ−８および基礎レベルＩＬ−８の双方を抑制したのに対して、ＳＢ２０３５８０は、ＳＤＳ誘導性ＩＬ−８のみを低減した。最終的に、Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳと同じ栽培品種から得られた従来の緑茶および紅茶の調製物は、ＳＤＳおよびエトキシル化アルコールによって誘導されるＩＬ−１αおよび／またはＩＬ−８を抑制することができなかった。したがって、本発明は、例えば、米国特許第７，４４２，３９１号；第７，４７３，４３５号；第７，５３７，７９１号；第８，０４３，６３５号；第８，１０１，２１２号；第８，２７７，８５２号および第８３１８２２０号に記載されているプロセスによって製造される、生理活性組成物を使用することによって表面活性剤誘発性の皮膚の炎症および刺激を軽減するための新規なアプローチを記載している。
【００３１】
一般的なプロセスの説明
新鮮な植物バイオマスからの植物性画分を前記画分から作製される組成物に調製するためのプロセスは、以下のように例示される。このプロセスは、膜画分を含有する（核、または葉緑体、または有色体、またはミトコンドリア、またはこれらの組合せを含有する）細胞内植物材料（または植物細胞破砕液）を得るために新鮮な植物バイオマスを破砕（または解離）および圧搾すること、ならびに膜画分を実質的に含有していない細胞の細胞質／細胞質ゾル画分（細胞破砕液の残りすべての成分）を得るために前記細胞破砕液からの前記膜画分の分離を引き起こすのに有効な周波数および時間で前記細胞破砕液を電磁波で処理することを含む。上述した処理は、有利には、前記処理中に前記細胞破砕液の温度が４０℃を超えないように行われる。
【００３２】
新鮮な植物の膜画分または細胞質／細胞質ゾル画分のいずれかに由来する植物性画分は、組成的にもかつそれらの活性においても独特である。より詳細には、本明細書中に記載のプロセスは、独特なことに、天然原料中の抗炎症活性、抗酸化活性、および他の生物学的活性を保存する。これらのプロセスから得られる植物画分は、表皮皮膚細胞におけるＩＬ−１αの表面活性剤誘導性分泌の低減にも極めて有効である。
【００３３】
膜画分は、次いで、抗タンパク質分解活性、細胞増殖抑制活性、ならびに／または抗タンパク質分解活性および細胞増殖抑制活性の双方を示す、安定な植物性化粧用組成物を得るために利用することができ、ここで、抗タンパク質分解活性は、少なくとも１種のタンパク質分解酵素の抑制によるものであり、細胞増殖抑制活性は、少なくとも１種類の細胞の細胞増殖の抑制によるものである。
【００３４】
細胞質／細胞質ゾル画分は、医薬品、化粧品、食品、治療薬および／またはパーソナルケア製剤等における成分としての使用に好適な植物性組成物を提供するために利用することができる。
【００３５】
本発明の植物性画分を調製するための全体的なプロセス
本発明の生理活性のある植物性化粧用組成物を調製するための全体的なプロセスを以下に記載している。新鮮な植物を収穫、収集、および洗浄して、新鮮な植物バイオマスを得る。この新鮮な植物バイオマスを、破砕、解離、および圧搾して、細胞内植物材料（細胞破砕液）および繊維濃縮材料（プレスケーキ）を得る。細胞破砕液は、次いで、ナイロンメッシュを通して濾過され、濾過された植物細胞破砕液が得られる。濾過された細胞破砕液は、その不安定化を引き起こす周波数で電磁波処理に曝露される。典型的には、細胞破砕液は、２．４５ＧＨｚの周波数、または従来のマイクロ波の周波数で電磁場にかけられる。他の一実施形態において、電磁場の周波数は、２．４５ＧＨｚより大きく約７．０ＧＨｚまで、またはあらゆる単一周波数、または２．４５ＧＨｚから７．０ＧＨｚの範囲の間、他の一実施形態において２．５ＧＨｚから７．０ＧＨｚまで、および他の一実施形態において３．０から６．０ＧＨｚまでにある周波数の範囲である。
【００３６】
不安定化された細胞破砕液は、次いで、沈澱する膜画分と細胞質／細胞質ゾル画分である上清とを得るために遠心分離にかけられる。膜画分は、多様な化粧製品中に添加することができる生理活性のある植物性化粧用組成物である。植物の細胞質／細胞質ゾル画分は、以下に記載のように、さらなるプロセスに使用される。
【００３７】
細胞質／細胞質ゾル画分に、場合によっては、以下にまとめているように、ｉ、ｉｉ、ｉｉｉまたはｉｖのさらなる処理が行われることもある。非限定的な例として、処理（ｉ）は、沈澱した細胞質画分を、細胞質ゾル画分を含有する上清から分離することを可能にする、等電沈殿およびその後の遠心分離を含み得る。代替的に、細胞質ゾル／細胞質画分は、（ｉｉ）さらなる電磁処理と共にその後の遠心分離もしくは濾過、または（ｉｉｉ）膜濾過、または（ｉｖ）限外濾過、またはこれらの組合せ（ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ）の結果としてさらに分離することができる。細胞質／細胞質ゾル画分成分は、「そのままで」利用することができるか、またはさらに分離して利用することができる。これらは、例えば、米国特許第７，４４２，３９１号；第７，４７３，４３５号；第７，５３７，７９１号；第８，０４３，６３５号；第８，１０１，２１２号；および第８，２７７，８５２号に記載されているような保存剤および抗酸化剤で安定化することもできる。
【００３８】
膜由来の化粧用組成物を調製するためのプロセス
一実施形態において、膜由来の化粧用組成物を調製するためのプロセスは、以下の通りである。この方法は、新鮮な植物バイオマスから分離した植物細胞破砕液を提供することを含む。本出願の全体にわたって使用される場合、「新鮮な植物バイオマス」とは、収穫されたばかりの植物バイオマスの大部分が生きている状態にあることおよび／または意味のある量の望ましくない分解を受けていないことを意味することが意図される。この植物細胞破砕液は、次いで、それを膜画分と細胞破砕液上清とに分離を引き起こすのに有効な条件下で処理される。結果として得られた膜画分は、抗タンパク質分解活性、細胞増殖抑制活性、または抗タンパク質分解活性および細胞増殖抑制活性の双方を有する。膜画分は、次いで、タンパク質分解活性、細胞増殖抑制活性、またはタンパク質分解活性および細胞増殖抑制活性の双方の調節を示す安定な生理活性のある植物性化粧用組成物を得るのに有効な条件下で変換され、ここで、タンパク質分解活性は、少なくとも１種のタンパク質分解酵素の調節によるものであり、細胞増殖調節活性は、少なくとも１種の型の細胞の細胞増殖の調節によるものである。
【００３９】
植物細胞破砕液は、すべての種類の植物から分離され得る。現在新鮮な植物バイオマスの供給源として使用され得る好適な植物の例としては、限定されるものではないが、以下の科からの植物などが挙げられる：コンブ科（Laminariaceae）、シオグサ科（Cladophoraceae）、マメ科（Fabaceae）、ツバキ科（Theaceae）、キク科（Asteraceae）、シソ科（Lamiaceae）、ユリ科（Liliaceae）、イネ科（Poaceae）およびクワ科（Moraceae）。特に、試験が行われて新鮮な植物バイオマス供給源として適切であることが見出された特定の植物の例としては、マクロシスティス・ピリフェラ（Macrocystis pyrifera）、チャボジュズモ（Chaetomorpha basiretorsa）、ムラサキウマゴヤシ（Medicago sativa）、アカツメクサ（Trifolium pretense）、レモン（Citrus limon）、ダイズ（Glycine max）、チャノキ（Camellia sinensis）、キンセンカ（Calendula officinalis）、ナツシロギク（Tanacetum parthenium）、カモミール（Chamomilla recutita）、ラベンダー（Lavandula angustifolia）、セージ（Salvia officinalis）、ハス（Nelumbo nucifera）、リリウム・ブルビフェルム（Lilium bulbiferum）、エンバク（Avena sativa）およびオオムギ（Hordeum vulgare）などが挙げられる。植物の多様な部分が使用され得る。例えば、多くの種類の植物について茎および葉の組織が使用され得る。他の植物について、本発明で使用される植物細胞破砕液の供給源として花が使用されてもよい。例えば、本発明の一実施形態では、植物細胞破砕液の分離のためにキンセンカ（Calendula officinalis）の花組織が使用される。他の一実施形態において、セージ（Salvia officinalis）の葉および茎の組織が使用される。
【００４０】
本発明の分離技術は、植物の生理活性成分を保存する方法で植物細胞破砕液を単離することを可能にする。
【００４１】
植物細胞破砕液の抽出において使用される植物バイオマスを調製する例示的な方法は、新鮮な植物の収穫、収集、および洗浄を含む。新鮮な植物バイオマスを調製するための好適なステップとしては、例えば、以下のものなどが挙げられる：（１）植物細胞の本来の含水量の保存；（２）地上の植物組織の収穫中に使用される切断の高さの最適化；（３）収穫中（例えば、地上の植物組織の切断中）の植物完全性の確保；（４）環境的影響および植物バイオマスの生体分解の時間因子の最小化；ならびに（５）加工前（例えば、破砕および解離の前）の植物バイオマスの洗浄。これらのステップのそれぞれについては、以下に述べる。
【００４２】
本来の含水量の保存：
この切断は、水分損失によってしおれるのを避けるために行われるべきである。最適な条件は、天然含水量が維持および保存されるものである。
【００４３】
切断の最適な高さおよび好ましい高さ：
収集されたバイオマスにおける土壌および他の破片の量を制限するために、植物を、少なくとも地上数センチメートルで切断するべきである。例えば、あらゆる所与の植物供給源のすべての使用可能な葉および茎のバイオマスは、地上５センチメートル以上の高さで切断され得る。花組織が植物バイオマス供給源として使用される場合には、植物細胞破砕液の抽出前に全体の植物から花を分離する。
【００４４】
収穫中の植物完全性の保存：
植物バイオマスの収穫は、植物の地上の茎および葉の組織の切断によってもよい。切断は、植物のたたき切り、すり潰し、圧壊、または、他の種類の損傷を回避するまたは最小限にする方法で行われる。必要とされる装置の種類によってたたき切りを回避するのが不可能なこともある、大規模な工業用の収穫の場合には、収集した植物における微生物の増殖、水分損失、酸化、重合、異性化、および加水分解のプロセスの強化（すなわち、望ましくない異化作用のプロセス）をもたらし得る損傷を最小限にするように注意する。例えば、本発明の一実施形態において、植物は、全体の植物として手動で切断および収集される。他の一実施形態において、植物組織は、収穫装置を使用して切断される。この場合には、各植物についてたたき切りの地上の最小の高さは、５センチメートル以上である。さらに、切断中および切断後の損傷を最小限にするために特別な注意が払われる。他の一実施形態において、開花している全体の植物が手動で収集され、次いで、さらなる加工用に花が分離される。
【００４５】
環境的影響および分解の時間因子の最小化：
切断された植物材料を加工施設に送達する時間ならびにバイオマスを日光、高温、および他の負の環境因子に曝露することは、上記のような望ましくない分解プロセスの影響を防ぐために最小限にするべきである。例えば、本発明の一実施形態において、さらなる加工のためのマメ科（Fabaceae）植物の送達時間は、切断の時間から３０分を超えない。他の一実施形態において、長距離輸送する植物は、加工施設まで一晩送達する間の鮮度および天然含水量の維持を助けるために、凍結ゲルパックの袋を含む発泡スチロール冷却器の中にその植物バイオマスを直ちに入れることを含む切断後の手順のために処理する。これらの手順は、シソ科（Lamiaceae）およびクワ科（Moraceae）からの植物バイオマスについて行われた。上記の結果を達成する他の切断後の手順も同様に用いられ得る。非限定的な例として、多くの植物種について、加工前および／または加工中の望ましくない分解を防止および／または最小限にするために、加工のための送達時間を最小限にするだけでなく、必要であれば冷凍によって、切断された植物材料を低温に保つことも有益である。
【００４６】
破砕および解離の前の洗浄ステップ：
植物組織が収穫されると、さらなる加工の前に植物から土壌粒子および他の破片を除去する洗浄ステップが行われる。洗浄は、損傷を引き起こす、または有用な成分を除去する、バイオマスからの細胞破砕液の放出の開始を防止する条件下で短時間の低圧すすぎを用いて達成される。例えば、本発明の一実施形態において、植物バイオマスの洗浄は、１ｋｇ／ｃｍ２以下の水圧で５分以内で達成された。残りの洗浄水には、いかなる緑色または黄色の色素も含有されていなかった。これは、その後の損傷のないことを示している。乾燥物含量を天然レベル近くに保つために、洗浄したバイオマスから過剰な水を除去する。
【００４７】
上記のように、植物組織バイオマスを収穫した後に、植物組織バイオマスのさらなる加工を行い、植物細胞破砕液を得る。一実施形態において、収穫した植物組織バイオマスを、破砕、解離、および圧搾して、細胞内の内容物、すなわち細胞破砕液を分離し、それを主に細胞壁を含有する繊維濃縮プレスケーキから分離する。
【００４８】
好適な加工プロトコルの例には、以下に記載のステップが含まれる。短時間かつバイオマス温度の有意な上昇なしで小さい大きさの植物組織粒子を得るために、植物の破砕にハンマーミルが使用されてもよい。一実施形態において、改変されたハンマーミルを使用して、１０秒以下の処理の間に最大の大きさが０．５センチメートル以下の解離した植物粒子を生産し、ここで、バイオマス温度の上昇は５℃以下である。
【００４９】
上記のように、望ましくない異化作用のプロセスの影響を防ぐために、破砕および解離した植物バイオマスの曝露を最小限にする。繊維濃縮材料（またはプレスケーキ）からの植物細胞破砕液の分離は、植物バイオマスの破砕および解離の後に可能な限り早く開始される。植物バイオマスは、短時間かつ温度の有意な上昇なしで加工される。一実施形態において、破砕および解離の直後に、植物バイオマスは、横型の連続スクリュープレス（Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｐｒｅｓｓ  「ＣＰ−６」、Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＦＬ）を使用して圧搾される。コーン上の圧力はレベル２４ｋｇ／ｃｍ２で維持され、スクリュー速度は１２ｒｐｍであり、かつバイオマス温度上昇は５℃以下である。
【００５０】
最初の細胞破砕液は、通常、小さい繊維粒子を含んでおり、これは、有用な細胞破砕液成分を吸収する可能性があり、ホースおよびポンプを閉塞させる恐れもある。上記の粒子は、濾過または低速遠心分離によって除去するべきである。例えば、圧搾ステップの後に生成される最初の細胞破砕液を、本発明の方法において植物細胞破砕液を使用する前に、４層のナイロン布を通して濾過する。
【００５１】
植物細胞破砕液が分離されると、その植物細胞破砕液は、細胞小器官が分散相を代表し、細胞質が連続相を代表する、相対的に安定なコロイド分散液となる。次いで、（１）不安定化した細胞破砕液を得るために、「膜画分凝集ステップの開始」を行って上記のコロイド分散液の不安定化を引き起こすこと、ならびに（２）膜画分（核、または葉緑体、または有色体、またはミトコンドリア、またはこれらの組合せを含有する）および細胞破砕液上清を得るために、不安定化した細胞破砕液混合物において「膜画分分離ステップ」を行うことを含むプロセスのために細胞破砕液を処理する。一実施形態において、膜画分不安定化の開始は、前記細胞破砕液を２．４５ＧＨｚの周波数で電磁波にかけることによって達成される。他の一実施形態において、採用される周波数は、２．４５ＧＨＺを超え最高７．０ＧＨｚまでである。不安定化が達成された後に、膜画分分離ステップが行われる。このステップとしては、例えば、濾過、または遠心分離、またはこれらの組合せなどの分離技術を使用して、不安定化した細胞破砕液を膜画分と細胞破砕液上清とに分離することなどが挙げられる。
【００５２】
細胞破砕液を不安定化するのに必要な電磁波を発生させるために、多様な機器を本発明のプロセスにおいて採用することができる：マグネトロン、パワーグリッドチューブ、クライストロン、クライストロード、交差電磁界増幅器、進行波管、およびジャイロトロン。こうした機器の１つとしては、ハイパワーマグネトロンなどが挙げられるが、これらに限定されない。従来および工業用のマグネトロンは、９１５ＭＨｚおよび２．４５ＧＨｚの周波数で作動し、これを採用することができる。しかし、それらの周波数において、細胞破砕液組成物を変性し得る望ましくない熱が生じ得る。したがって、従来または工業用のマグネトロンの周波数よりも実質的に高い周波数で作動する電磁波を使用することは有利であり、これは、熱発生による望ましくない変性なしで細胞破砕液の不安定化を可能にする。この周波数は、典型的には従来のマイクロ波マグネトロンの周波数を超え、すなわち、２．４５ＧＨｚを超え、他の一実施形態において２．４５ＧＨｚより大きく約７ＧＨｚより小さく、他の一実施形態において約３から６ＧＨｚまでである。本発明の不安定化ステップ中、細胞破砕液の温度は、有益には４０℃未満で維持され、他の一実施形態では約３５℃未満、他の一実施形態では約３０℃未満、他の一実施形態では約２５℃未満、他の一実施形態では約２０℃未満で維持される。
【００５３】
当技術分野において一般的に「タンパク質−ビタミン濃縮物」と呼ばれる、新たに得られる膜画分は、植物の生の材料供給源に特有の強い色および特有の匂いを有するペーストである。この膜画分は、主に植物の緑の部分の中に存在する葉緑体によって、または大部分は花に存在する有色体によって表される。膜画分の組成物には、主にリン脂質、膜タンパク質、クロロフィル、核、ミトコンドリアおよびカロテノイドが含まれる。
【００５４】
膜画分を実質的に含有していない細胞質／細胞質ゾル画分由来の化粧用組成物を調製するためのプロセス
本発明は、抗酸化活性、細胞増殖刺激活性、または抗酸化活性および細胞増殖刺激活性の双方を示す、膜画分を実質的に含有していない細胞質／細胞質ゾル画分由来の化粧用組成物を調製するための方法にも関する。この方法は、膜由来の化粧用組成物に関してすでに上に記載したように、新鮮な植物バイオマスから分離した細胞破砕液を提供することを含む。植物細胞破砕液は、次いで、植物細胞破砕液を膜画分と細胞質／細胞質ゾル画分とに分離するのに有効な条件下で処理される。
【００５５】
細胞質／細胞質ゾル画分は、次いで、場合によっては、細胞質／細胞質ゾル画分をその構成部分、すなわち細胞質画分と細胞質ゾル画分とに分離するのに有効な条件下でさらに加工されることもある。細胞質画分は、主に白色の可溶性タンパク質を含む；Ｃ３植物において、これらのタンパク質は、大部分はリブロース−１，５ビスリン酸カルボキシラーゼオキシゲナーゼ酵素からなる。細胞質ゾル画分は、低分子量の可溶性成分を含有する。細胞質ゾル画分は、抗酸化活性、細胞増殖刺激活性、または抗酸化活性および細胞増殖刺激活性の双方を有する細胞セラム画分を得るのに有効な条件下で精製される。細胞セラム画分は、例えば、米国特許第７，４４２，３９１号；第７，４７３，４３５号；第７，５３７，７９１号；第８，０４３，６３５号；第８，１０１，２１２号；および第８，２７７，８５２号に記載されているような、抗酸化活性、細胞増殖刺激活性、または抗酸化活性および細胞増殖刺激活性の双方を示す安定で生理活性のある植物性化粧用組成物を得るのに有効な条件下で安定化される。
【００５６】
植物細胞破砕液は、すべての種類の植物から得られ得る。現在新鮮な植物バイオマスの供給源として使用され得る好適な植物の例としては、限定されるものではないが、以下の科からの植物などが挙げられる：コンブ科（Laminariaceae）、シオグサ科（Cladophoraceae）、マメ科（Fabaceae）、ツバキ科（Theaceae）、キク科（Asteraceae）、シソ科（Lamiaceae）、ユリ科（Liliaceae）、イネ科（Poaceae）およびクワ科（Moraceae）。特に、試験が行われて新鮮な植物バイオマス供給源として適切であることが見出された特定の植物の例としては、マクロシスティス・ピリフェラ（Macrocystis pyrifera）、チャボジュズモ（Chaetomorpha basiretorsa）、ムラサキウマゴヤシ（Medicago sativa）、アカツメクサ（Trifolium pratense）、レモン（Citrus limon）、ダイズ（Glycine max）、チャノキ（Camellia sinensis）、キンセンカ（Calendula officinalis）、ナツシロギク（Tanacetum parthenium）、カモミール（Chamomilla recutita）、ラベンダー（Lavandula angustifolia）、セージ（Salvia officinalis）、ハス（Nelumbo nucifera）、リリウム・ブルビフェルム（Lilium bulbiferum）、エンバク（Avena sativa）およびオオムギ（Hordeum vulgare）などが挙げられる。植物の多様な部分が使用され得る。例えば、多くの種類の植物について茎および葉の組織が使用され得る。他の植物について、本発明で使用される植物細胞破砕液の供給源として花が使用されてもよい。例えば、本発明の一実施形態では、植物細胞破砕液の分離のためにキンセンカ（Calendula officinalis）の花組織が使用される。他の一実施形態において、葉および茎の組織が使用される。
【００５７】
細胞質画分の完全な分離を評価するための定量的判定基準は、細胞質ゾル画分中に、検出可能なレベルの高分子量タンパク質のないことおよび／またはリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼオキシゲナーゼのないことである。
【００５８】
細胞質ゾル画分は、わずかに黄色く少し特徴的な匂いを有する透明な液体である。数時間で、不安定な細胞質ゾル画分は、不可逆的に変質して重い沈澱物および特徴のない強い匂いを含む暗褐色の懸濁液になる。結果として、細胞質ゾル画分を化粧品の原料として使用することができない。以下に続く記載の手順は、細胞質ゾル画分を精製して安定な化粧品の原料である安定で活性のあるセラム画分を得ることを可能にする。これは、望ましくない沈澱物の生成ならびに色および匂いの悪変をもたらす不可逆的な変質の原因となる主な成分を細胞質ゾル画分から除去することによって達成される。この手順は以下を含む：参照により本明細書にすべて組み込まれている、米国特許第７，４４２，３９１号、第８，１０１，２１２号、および第８，２７７，８５２号に記載されているようなｐＨ調整、熱処理、冷却、吸引濾過、および安定化。
【００５９】
細胞セラム画分は、製造後に、次いで、セラム由来の化粧用組成物を得るための安定化ステップにかけられる。一実施形態において、安定化ステップは、安定化された細胞セラム画分を得るために少なくとも１種の保存剤および少なくとも１種の抗酸化剤の混合物中で細胞セラム画分をインキュベートすることを含む。本発明での使用に好適な保存剤としては、例えば、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、メチルパラベンナトリウム、およびクエン酸などが挙げられる。本発明での使用に好適な抗酸化剤の例は、二亜硫酸ナトリウムである。
【００６０】
一実施形態において、本発明は、ツバキ科（Theacea）植物に由来する単離された生理活性画分を利用する。本明細書中で使用される場合、「単離された生理活性画分」という用語は、いかなる従来の茶の加工（例えば、熱処理、酸化、発酵、乾燥）もされていないツバキ科（Theacea）植物から単離された画分（例えば、ツバキ科（Theacea）植物の新鮮なバイオマス）を含むことが意図されている。より詳細には、本発明に従って調製されるツバキ科（Theacea）植物画分は、いかなる実質的な発酵もされていないという点で独特であり、したがって、ポリフェノールなどの発酵副産物を実質的に含有していない。より詳細には、本発明のツバキ科（Theacea）植物画分は、ポリフェノールを実質的に含有していない。「ポリフェノールを実質的に含有していない」という句は、本発明の植物画分が、植物画分材料の乾燥重量に対して約１０重量％未満のポリフェノール、他の一実施形態において約８重量％未満のポリフェノール、他の一実施形態において約６重量％未満のポリフェノール、他の一実施形態において約５重量％未満のポリフェノール、他の一実施形態において約４重量％未満のポリフェノール、他の一実施形態において約３重量％未満のポリフェノール、他の一実施形態において約２重量％未満のポリフェノール、他の一実施形態において約１重量％未満のポリフェノール、他の一実施形態において約０．５重量％未満のポリフェノール、他の一実施形態において約０．２重量％未満のポリフェノール、およびさらに他の一実施形態において約０．１重量％未満のポリフェノールを含有することを意味することが意図されている。他の一実施形態において、本発明の画分は、全く発酵されておらず、かつ測定可能なポリフェノールを全く有していない。好適な単離された生理活性画分としては、限定されるものではないが、細胞壁画分、細胞壁画分抽出物、膜画分、膜画分抽出物、細胞質画分、細胞質画分抽出物、細胞破砕液セラム、および／またはこれらの組合せなどが挙げられる。
【００６１】
これらの生理活性組成物および生理活性画分は、以下に定義されるような、かつ当技術分野においてよく知られている従来のカテキン診断法を用いて決定されるような、多様なカテキンプロファイルおよび総カテキン含量を有し得る。本明細書中で使用される場合、「カテキン」という用語は一般に、これらに限定されないが、以下の特定の種類のカテキンを含む、すべてのカテキンを指す：（ｉ）（−）−エピガロカテキン（ＣＡＳ  Ｎｏ．９７０−７４−１を参照、これは参照により本明細書にその全体が組み込まれている）；（ｉｉ）（＋）−カテキン（ＣＡＳ  Ｎｏ．７２９５−８５−４を参照、これは参照により本明細書にその全体が組み込まれている）；（ｉｉｉ）（−）−エピカテキン（ＣＡＳ  Ｎｏ．４９０−４６−０を参照、これは参照により本明細書にその全体が組み込まれている）；（ｉｖ）（−）−没食子酸エピガロカテキン（ＣＡＳ  Ｎｏ．９８９−５１−５を参照、これは参照により本明細書にその全体が組み込まれている）；（ｖ）（−）−没食子酸ガロカテキン（ＣＡＳ  Ｎｏ．４２３３−９６−９を参照、これは参照により本明細書にその全体が組み込まれている）；および（ｖｉ）（−）−没食子酸エピカテキン（ＣＡＳ  Ｎｏ．１２５７−０８−５を参照、これは参照により本明細書にその全体が組み込まれている）。「総カテキン含量」とは、（本明細書中で使用される場合）特定の生理活性組成物または生理活性画分中に含有される全カテキンの合計の含量レベルを指すものであり、本明細書中で上に挙げた特定の種類のカテキンのみの含量レベルに限定されることは意図されていない。本明細書中で使用される場合、「カテキン含量プロファイル」という用語は、本発明の特定の生理活性組成物または生理活性画分中に含有される選択されたカテキンの量を表すために用いられる。
【００６２】
本発明の生理活性組成物の一実施形態において、生理活性画分は細胞壁画分であってもよい。
【００６３】
本発明の生理活性組成物の一実施形態において、生理活性画分は細胞壁画分抽出物であってもよい。本発明の特定の一実施形態において、細胞壁画分抽出物は、乾燥物１グラム当たり約２．１から約４．５ミリグラムの間、詳細には乾燥物１グラム当たり約２．６から約４．０ミリグラムの間、より詳細には乾燥物１グラム当たり約３．０から約３．６ミリグラムの間の総カテキン含量を有し得る。他の特定の一実施形態において、細胞壁画分抽出物は以下のようなカテキン含量プロファイルを有し得る：（ｉ）細胞壁画分抽出物の乾燥物１グラム当たり約２．０から約３．０ミリグラムの間の（＋）−カテキン；（ｉｉ）細胞壁画分抽出物の乾燥物１グラム当たり約０．００５から約０．０２ミリグラムの間の（−）−エピカテキン；（ｉｉｉ）細胞壁画分抽出物の乾燥物１グラム当たり約０．００５から約０．０２ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピガロカテキン；および（ｉｖ）細胞壁画分抽出物の乾燥物１グラム当たり約０．００３から約０．０１ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピカテキン。より詳細には、細胞壁画分抽出物は以下のようなカテキン含量プロファイルを有し得る：（ｉ）細胞壁画分抽出物の乾燥物１グラム当たり約２．２から約２．７ミリグラムの間の（＋）−カテキン；（ｉｉ）細胞壁画分抽出物の乾燥物１グラム当たり約０．０１から約０．０１５ミリグラムの間の（−）−エピカテキン；（ｉｉｉ）細胞壁画分抽出物の乾燥物１グラム当たり約０．０１から約０．０１５ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピガロカテキン；および（ｉｖ）細胞壁画分抽出物の乾燥物１グラム当たり約０．００５から約０．００７ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピカテキン。
【００６４】
本発明の生理活性組成物の一実施形態において、生理活性画分は膜画分であってもよい。
【００６５】
本発明の生理活性組成物の一実施形態において、生理活性画分は膜画分抽出物であってもよい。本発明の特定の一実施形態において、膜画分抽出物は、乾燥物１グラム当たり約１５．０から約３０．５ミリグラムの間、詳細には乾燥物１グラム当たり約１８．０から約２７．５ミリグラムの間、より詳細には乾燥物１グラム当たり約２１．０から約２４．５ミリグラムの間の総カテキン含量を有し得る。他の特定の一実施形態において、膜画分抽出物は以下のようなカテキン含量プロファイルを有し得る：（ｉ）膜画分抽出物の乾燥物１グラム当たり約１．７から約３．３ミリグラムの間の（−）−エピガロカテキン；（ｉｉ）膜画分抽出物の乾燥物１グラム当たり約６．１から約１０．２ミリグラムの間の（＋）−カテキン；（ｉｉｉ）膜画分抽出物の乾燥物１グラム当たり約０．３から約１．１ミリグラムの間の（−）−エピカテキン；（ｉｖ）膜画分抽出物の乾燥物１グラム当たり約６．２から約１２．５ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピガロカテキン；（ｖ）膜画分抽出物の乾燥物１グラム当たり約０．００７から約０．０３ミリグラムの間の（−）−没食子酸ガロカテキン；および（ｖｉ）膜画分抽出物の乾燥物１グラム当たり約１．３から約３．３ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピカテキン。より詳細には、膜画分抽出物は以下のようなカテキン含量プロファイルを有し得る：（ｉ）膜画分抽出物の乾燥物１グラム当たり約２．０から約３．０ミリグラムの間の（−）−エピガロカテキン；（ｉｉ）膜画分抽出物の乾燥物１グラム当たり約７．０から約９．０ミリグラムの間の（＋）−カテキン；（ｉｉｉ）膜画分抽出物の乾燥物１グラム当たり約０．５から約０．９ミリグラムの間の（−）−エピカテキン；（ｉｖ）膜画分抽出物の乾燥物１グラム当たり約８．０から約１０．０ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピガロカテキン；（ｖ）膜画分抽出物の乾燥物１グラム当たり約０．０１から約０．０２ミリグラムの間の（−）−没食子酸ガロカテキン；および（ｖｉ）膜画分抽出物の乾燥物１グラム当たり約１．８から約２．８ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピカテキン。
【００６６】
本発明の生理活性組成物の一実施形態において、生理活性画分は細胞質画分であってもよい。
【００６７】
本発明の生理活性組成物の一実施形態において、生理活性画分は細胞質画分抽出物であってもよい。
【００６８】
本発明の生理活性組成物の一実施形態において、生理活性画分は細胞破砕液セラムであってもよい。特定の一実施形態において、細胞破砕液セラムは、乾燥物１グラム当たり約８．０から約２０．０ミリグラムの間、詳細には乾燥物１グラム当たり約１０．０から約１８．０ミリグラムの間、より詳細には乾燥物１グラム当たり約１２．０から約１６．０ミリグラムの間の総カテキン含量を有し得る。他の特定の一実施形態において、細胞破砕液セラムは以下のようなカテキン含量プロファイルを有し得る：（ｉ）細胞破砕液セラムの乾燥物１グラム当たり約２．１から約４．４ミリグラムの間の（−）−エピガロカテキン；（ｉｉ）細胞破砕液セラムの乾燥物１グラム当たり約４．２から約８．６ミリグラムの間の（＋）−カテキン；（ｉｉｉ）細胞破砕液セラムの乾燥物１グラム当たり約０．２から約２．０ミリグラムの間の（−）−エピカテキン；（ｉｖ）細胞破砕液セラムの乾燥物１グラム当たり約１．２から約３．２ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピガロカテキン；（ｖ）細胞破砕液セラムの乾燥物１グラム当たり約０．０１から約０．１ミリグラムの間の（−）−没食子酸ガロカテキン；および（ｖｉ）細胞破砕液セラムの乾燥物１グラム当たり約０．２から約１．３ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピカテキン。より詳細には、細胞破砕液セラムは以下のようなカテキン含量プロファイルを有し得る：（ｉ）細胞破砕液セラムの乾燥物１グラム当たり約３．０から約３．５ミリグラムの間の（−）−エピガロカテキン；（ｉｉ）細胞破砕液セラムの乾燥物１グラム当たり約５．０から約７．０ミリグラムの間の（＋）−カテキン；（ｉｉｉ）細胞破砕液セラムの乾燥物１グラム当たり約０．７から約１．５ミリグラムの間の（−）−エピカテキン；（ｉｖ）細胞破砕液セラムの乾燥物１グラム当たり約１．７から約２．７ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピガロカテキン；（ｖ）細胞破砕液セラムの乾燥物１グラム当たり約０．０３から約０．０７ミリグラムの間の（−）−没食子酸ガロカテキン；および（ｖｉ）細胞破砕液セラムの乾燥物１グラム当たり約０．５から約１．０ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピカテキン。
【００６９】
一実施形態において、本発明の生理活性組成物を単離するために、ツバキ科（Theacea）植物の新鮮なバイオマスを使用することができる。この新鮮なバイオマスは、ツバキ（Camellia）属および／またはヒサカキ（Eurya）属のツバキ科（Theacea）植物から得ることができる。本発明での使用に好適なツバキ（Camellia）属の種としては、限定されるものではないが、チャノキ（Camellia sinensis）、ヤブツバキ（Camellia japonica）、トウツバキ（Camellia reticulate）、およびサザンカ（Camellia sasanqua）などが挙げられる。本発明での使用に好適なヒサカキ（Eurya）属の種としては、限定されるものではないが、エウリア・サンドウィチェンシス（Eurya sandwicensis）などが挙げられる。
【００７０】
本発明の生理活性組成物は、安定化剤をさらに含んでいてもよい。好適な安定化剤は、当技術分野において一般に使用されている安定化剤である。特に好適な安定化剤としては、限定されるものではないが、乳化剤、保存剤、抗酸化剤、ポリマー基質、および／またはこれらの混合物などが挙げられる。
【００７１】
本発明の一態様において、生理活性画分は、少なくとも１つの哺乳動物細胞機能に対する調節活性を有し得る。こうした調節活性としては、例えば、細胞増殖抑制活性、細胞増殖刺激活性、酵素分泌活性、酵素阻害活性、抗酸化活性、ＵＶ保護活性、抗炎症活性、創傷治癒活性、および／またはこれらの活性の組合せなどが挙げられる。細胞増殖抑制活性に関して、こうした活性は癌細胞の増殖抑制を含み得る。本発明の生理活性画分によって増殖が抑制され得る好適な癌細胞としては、限定されるものではないが、乳癌細胞および／または結腸癌細胞などが挙げられる。記載の細胞増殖抑制活性は、白血病細胞の増殖抑制も含み得る。本発明の生理活性画分によって増殖が抑制され得る好適な白血病細胞としては、限定されるものではないが、単球性白血病細胞などが挙げられる。
【００７２】
他の一実施形態において、生理活性組成物は、皮膚細胞の望ましくない過増殖もしくは低増殖の抑制および／または皮膚細胞における望ましくない非協調的酵素活性もしくは酵素分泌プロセスの抑制に有効であり得る。
【００７３】
他の一実施形態において、本発明の生理活性組成物は、当技術分野において一般に使用されている全身投与または局所投与のための送達システムをさらに含んでいてもよい。
【００７４】
本発明は、哺乳動物への局所適用に好適な生理活性局所製剤にも関する。一実施形態において、生理活性局所製剤は、局所的に有効な量の本発明の生理活性組成物を含む。生理活性局所製剤は、局所的に許容される担体をさらに含み得る。好適な局所的に許容される担体としては、限定されるものではないが、親水性クリーム基剤、親水性ローション基剤、親水性表面活性剤基剤、親水性ゲル基剤、親水性溶液基材、疎水性クリーム基剤、疎水性ローション基剤、疎水性表面活性剤基剤、疎水性ゲル基剤、および／または疎水性溶液基剤などが挙げられる。一実施形態において、生理活性組成物は、生理活性局所製剤の総重量の約０．００１パーセントから約９０パーセントの間の範囲に及ぶ量で存在し得る。
【００７５】
本発明は、哺乳動物の皮膚組織における炎症活性を抑制するための方法にも関する。この方法は、本発明による生理活性組成物を提供することを含む。この方法は、該生理活性組成物を、皮膚組織における炎症活性を抑制するのに有効な量で皮膚組織に適用することをさらに含む。この方法の一実施形態において、生理活性組成物は安定化剤をさらに含み得る（その好適な例は、本明細書中に記載の通りである）。この方法の他の一実施形態において、生理活性組成物は、局所的に許容される担体をさらに含み得る（その好適な例は、本明細書中に記載の通りである）。
【００７６】
実施例の概要
例えば、参照により本明細書にすべて組み込まれている、米国特許第７，４４２，３９１号；第７，４７３，４３５号；第７，５３７，７９１号；第８０４３６３５号；第８，１０１，２１２号；第８，２７７，８５２号および第８，３１８，２２０号に記載されているプロセスは、独特なことに、天然原料中の生物学的活性を保存する。本発明は、生理活性組成物と表面活性剤との独特な組合せを使用して表面活性剤誘発性の皮膚の刺激および炎症を軽減するための新規なアプローチを記載している。本発明において、Ｚｅｔａ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ（商標）技術由来の天然画分、例えば、Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳ、Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＬ、およびＲｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＴＰなどを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの表面活性剤誘発性皮膚細胞炎症／刺激モデルにおいて評価し、これらの原料にパーソナルケア製品および洗浄製品の影響を和らげる可能性があるかどうかを決定した。培養したヒト表皮ケラチノサイト（ＨＥＫ）を表面活性剤で処理して、鍵となる炎症性サイトカインインターロイキン（ＩＬ−１α）および鍵となるケモカインインターロイキン（ＩＬ−８）の放出を誘導した。細胞毒性をＬＤＨアッセイで評価した。細胞毒性データおよびＩＬ−１αの放出を誘導する能力に基づき、異なる４種のクラスの表面活性剤のうちの６種の代表をランク付けした。非イオン性エトキシル化アルコールは、最も刺激性の低い表面活性剤であって、ＩＬ−１αの放出を誘導することができたがＩＬ−８はできなかった。Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳは、ＳＤＳまたはエトキシル化アルコールで処理したＨＥＫにおいてＩＬ−１αおよびＩＬ−８の強力な抑制剤であったことが見出された。Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳの活性は、ＳＤＳまたはエトキシル化アルコールによって誘導されるＩＬ−１αの抑制についてアスピリン（ＩＬ−１αの陽性対照）に匹敵した。アスピリンは、エトキシル化アルコールによって誘導されるＩＬ−１αの抑制には効果がなかった。重要なことに、Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳは、ケラチノサイトにおいてＳＤＳ誘導性ＩＬ−８および基礎レベルＩＬ−８の双方を抑制したのに対して、ＳＢ２０３５８０（ＩＬ−８の既知の陽性対照）は、ＳＤＳ誘導性ＩＬ−８のみを抑制した。Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳと同じ栽培品種から得られた伝統的な緑茶および紅茶の調製物は、ＳＤＳまたはエトキシル化アルコールのいずれかによって誘導されるＩＬ−１αおよびＩＬ−８を抑制することができなかった。さらに、レモン（Citrus limon）（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＬ）およびアカツメクサ（Trifolium pratense）（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＴＰ）の双方も、ＳＤＳ誘導性ＩＬ−１αをより少ない程度に抑制した。結論として、限定されるものではないが、チャノキ（Camellia sinensis）（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳ）、レモン（Citrus limon）（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＬ）、およびアカツメクサ（Trifolium pratense）（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＴＰ）などが挙げられる、Ｚｅｔａ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ（商標）技術由来の天然画分との表面活性剤の独特な組合せは、表面活性剤誘発性の皮膚刺激および炎症反応を軽減するための新規なアプロ���チを提供し、次世代の表面活性剤含有製品に低刺激性（mildness）をもたらす。
【実施例１】
【００７７】
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、ベンチマーク陰イオン性表面活性剤として、ヒト表皮ケラチノサイト（ＨＥＫ）培養物において炎症性サイトカインＩＬ−１αおよびケモカインＩＬ−８を用量依存的に誘導する。
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、パーソナルケア製品およびクレンジング製品において広範に使用される陰イオン性表面活性剤である。ＳＤＳは、実験上の刺激性接触皮膚炎のよく知られた誘導因子であり、表皮皮膚細胞においてＩＬ−１αおよびケモカインＩＬ−８などの複数のサイトカイン放出を刺激することが示されている（Craig et al., JID 115:292, 2000；およびChung et al., JID 117:647, 2001）。表面活性剤によって誘導される炎症反応を評価するための細胞培養モデルを検証するために、ＨＥＫにおいてＩＬ−１αおよびＩＬ−８などの炎症性メディエーターを誘導するためのベンチマーク陰イオン性表面活性剤としてＳＤＳを使用した。
【００７８】
ヒト初代表皮ケラチノサイト（ＨＥＫ）培養物の増殖および処理のためのプロトコルは、以下の通りである。ＨＥＫおよびすべての細胞培養補助材料は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から得られた。細胞は、ケラチノサイト基本培地１５４（Ｍ１５４）およびヒトケラチノサイト増殖サプリメント（ＨＫＧＳ）を含む、ケラチノサイト増殖培地（ＫＧＭ）中で維持された。これらは、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２雰囲気中で３７℃で増殖させ、２から４代目までの間の継代を使用した。処理については、ケラチノサイトを、リン酸緩衝生理食塩水中のトリプシン０．０２５％／ＥＤＴＡ０．０１％によってトリプシン処理して、９６ウェルプレート中に播種し、ＫＧＭ中で約８０％のコンフルエンスまで増殖させた。次いで、細胞をＳＤＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に多様な濃度で約１６時間曝露させた。インキュベーション後、上清を回収し、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用してＩＬ−１αおよびＩＬ−８を定量化した。結果は、平均±標準偏差として表された。ＩＣ５０は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０（Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてシグモイドカーブフィッティングを使用して算出した。すべての上清についてＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）アッセイ（Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を行い、細胞毒性を評価した。
【００７９】
図２Ａおよび２Ｂに示しているように、ＳＤＳは、ＨＥＫと共に１６時間インキュベートした後に、炎症性サイトカインＩＬ−１α（Ａ）およびケモカインＩＬ−８（Ｂ）の用量依存的放出を誘導した。ＳＤＳは２５μｇ／ｍｌでＩＬ−１αの有意な（ｐ＜０．００１）誘導を示した。ＳＤＳは６μｇ／ｍｌでＩＬ−８の有意な（ｐ＜０．００１）誘導を示した。これらの濃度を残りの実験で誘導用量として使用した。
【実施例２】
【００８０】
細胞毒性およびＩＬ−１αの放出に基づいた、ＳＤＳを含む、選択した市販の表面活性剤の低刺激性（mildness）の比較
異なるクラスの表面活性剤を皮膚細胞損傷および炎症反応を誘導するそれらの能力について評価するために、異なる４種のクラスの市販の表面活性剤のうちの６種の代表を、ＬＤＨアッセイからの細胞毒性データおよびＨＥＫにおける主要な炎症性サイトカインＩＬ−１αの放出の誘導に基づいてランク付けした。
【００８１】
ＨＥＫの増殖のためのプロトコルは、実施例１の下に記載されている。ＳＤＳの代わりに、さまざまな濃度の６種の異なる表面活性剤を使用した。
【００８２】
図３に示しているように、試験した表面活性剤を、刺激性（harshness）が高くなっていく順序で一覧にしている：エトキシル化アルコール、ココアンホポリカルボキシグリシネート、オレフィンスルホン酸ナトリウム、Ｃ１２〜Ｃ１８エトキシル化アミン、ドデシル硫酸ナトリウム、モノアルキルクワット。示されている濃度は、「供給されたままの」表面活性剤材料を１００％と仮定した、ＨＥＫ培養培地（ＫＧＭ）中のパーセントである。
【実施例３】
【００８３】
エトキシル化アルコールは、非イオン性表面活性剤の例として、ＨＥＫにおいて、ＩＬ−１αの用量依存的放出を誘導するが、ＩＬ−８はしない。
実施例２における表面活性剤の低刺激性（mildness）ランキングに基づいて、エトキシル化アルコールは、試験したもののうち最も刺激性の低い表面活性剤としてランク付けされた。これは、一般的な目的および高圧洗浄の製剤において、ならびに家庭用の硬質表面洗浄において、広範に使用される。その機能としては、洗浄剤、乳化剤、マイクロエマルション、および湿潤剤などが挙げられる。したがって、本発明者らは、ＨＥＫにおいて炎症性サイトカインＩＬ−１αおよびケモカインＩＬ−８を誘導するための代表的な低刺激性の非イオン性表面活性剤としてエトキシル化アルコールを試験した。
【００８４】
ＨＥＫの増殖のためのプロトコルは、実施例１の下に記載されている。ＳＤＳの代わりに、さまざまな濃度のエトキシル化アルコールにケラチノサイトを約１６時間曝露した。
【００８５】
図４に示しているように、エトキシル化アルコールは５００〜１０００μｇ／ｍｌでＩＬ−１αの有意な（ｐ＜０．００１）誘導を示した。この濃度範囲を残りの実験で誘導用量として使用した。
【００８６】
エトキシル化アルコールによるケモカインＩＬ−８の有意な誘導は観察されなかったのに対して、ＳＤＳはＩＬ−１αおよびＩＬ−８の双方を有意に誘導したことに留意するべきである。この結果は、実施例２における発見と相関し、そこでは、本発明者らが異なるクラスからの表面活性剤をランク付けして、エトキシル化アルコールは最も刺激性の低い表面活性剤であるのに対して、ＳＤＳが最も刺激性の高い（harshest）表面活性剤に近かったことを示している。
【実施例４】
【００８７】
チャノキ（Camellia sinensis）のセラム画分（すなわちＲｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳ）は、抗炎症ベンチマーク剤と比較して、ＳＤＳで誘導されるＩＬ−１αおよびＩＬ−８を用量依存的に抑制する。
チャノキ（Camellia sinensis）のセラム画分（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳ）は、新鮮なチャノキ（Camellia sinensis）（茶樹）から、例えば、米国特許第７４７３４３５号、第８０４３６３５号、および第８３１８２２０号に記載されているプロセスによって得られる。これは、フリーラジカル捕捉特性、抗炎症性の利点、および光安定化活性について複数の利点をもたらす。したがって、本発明者らは、ＨＥＫにおける炎症性サイトカインＩＬ−１αおよびケモカインＩＬ−８の放出の低減について、Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳを抗炎症ベンチマーク剤（陽性対照）と比較した。
【００８８】
ＨＥＫの増殖のためのプロトコルは、実施例１の下に記載されている。さまざまな濃度のＲｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳ、またはアスピリン、またはＳＢ２０３５８０の存在下でＨＥＫをＳＤＳ（実施例１で決定したようにＩＬ−１αの誘導のために２５μｇ／ｍｌまたはＩＬ−８の誘導のために６μｇ／ｍｌ）と共に１６時間インキュベートすることによって処理をした。
【００８９】
図５Ａは、よく知られている抗炎症ベンチマーク剤である（Jue DM, et al. 1999; 14 (3): 231-8により総説されている）、アスピリンが、ＨＥＫにおいてＳＤＳ（２５μｇ／ｍｌ）によって誘導されるＩＬ−１α放出の用量依存的抑制を示したことを示している。アスピリンの推定ＩＣ５０は約２３０μｇ／ｍｌであった。炎症性サイトカインＩＬ−１αのＳＤＳ誘導性放出の低減について、Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳをアスピリンと比較した。Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳはＩＬ−１αのＳＤＳ誘導性放出の有効な抑制剤であることが見出された。Ｒｅｃｅｎｔｉａ  ＣＳの推定ＩＣ５０は約３１０μｇ／ｍｌであり、アスピリンの効力に匹敵する効力が示唆された。
【００９０】
図５Ａにおいて、「ベースライン」とは、処理をしていないＨＥＫの上清におけるＩＬ−１αの濃度を指す。「誘導」とは、実施例１で決定した誘導用量である、２５μｇ／ｍｌのＳＤＳで処理したＨＥＫの上清におけるＩＬ−１αの濃度を指す。異なるドナーまたは異なるドナー体部位から採取した細胞から産生されるＨＥＫ培養物などの生物学的試験系にはもともとばらつきがあるため、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１α）およびケモカイン（例えば、ＩＬ−８）の濃度によって示されるようなＨＥＫの反応は実験間で、特に「ベースライン」および「誘導」の濃度で変化し得る。
【００９１】
重要なことに、アスピリンは、炎症性ケモカインＩＬ−８のＳＤＳ誘導性放出を抑制しなかった。したがって、本発明者らは、ｐ３８  ＭＡＰＫキナーゼ抑制剤（Lee JC et al. Immunopharmacology 2000; 47, 185-201によって総説されている）である、もう１種の抗炎症ベンチマーク剤、ＳＢ２０３５８０を評価した。図５Ｂに示しているように、ＳＢ２０３５８０は、約０．７０μｇ／ｍｌの推定ＩＣ５０で、ＳＤＳ（６μｇ／ｍｌ）によって誘導されるＩＬ−８放出の用量依存的抑制を示した。ＳＢ２０３５８０と比較したときに、Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳは、約３４μｇ／ｍｌの推定ＩＣ５０で、ＳＤＳ（６μｇ／ｍｌ）によって誘導されるＩＬ−８の用量依存的抑制を示した。Ｒｅｃｅｎｔｉａ  ＣＳは、ＳＤＳ誘導性および基礎レベルの非誘導性の双方のＩＬ−８放出を抑制したのに対して、ＳＢ２０３５８０は、ＳＤＳ誘導性ＩＬ−８のみを抑制したことの発見は特に重要であった。
【００９２】
図５Ｂにおいて、「ベースライン」とは、処理をしていないＨＥＫの上清におけるＩＬ−８の濃度を指す。「誘導」とは、実施例１で決定した誘導用量である、６μｇ／ｍｌのＳＤＳで処理したＨＥＫの上清におけるＩＬ−８の濃度を指す。異なるドナーまたは異なるドナー体部位から採取した細胞から産生されるＨＥＫ培養物などの生物学的試験系にはもともとばらつきがあるため、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１α）およびケモカイン（例えば、ＩＬ−８）の濃度によって示されるようなＨＥＫの反応は実験間で、特に「ベースライン」および「誘導」の濃度で変化し得る。
【実施例５】
【００９３】
チャノキ（Camellia sinensis）のセラム画分（すなわちＲｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳ）は、ＩＬ−１αのエトキシル化アルコール誘導性放出を用量依存的に抑制する。
本発明者らは、エトキシル化アルコールによって誘導されるＩＬ−１α放出の抑制について、アスピリンをさらに評価した。
【００９４】
ＨＥＫの増殖のためのプロトコルは、実施例１の下に記載されている。さまざまな濃度のＲｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳ、またはアスピリンの存在下でＨＥＫをエトキシル化アルコール（実施例３で決定したようにＩＬ−１αの誘導のために１０００μｇ／ｍｌ）と共に１６時間インキュベートすることによって処理をした。
【００９５】
図６に示しているように、アスピリンは、エトキシル化アルコールによって誘導されるＩＬ−１α放出を抑制できなかった。驚くべきことに、Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳは、ＨＥＫにおいて、エトキシル化アルコール誘導性のＩＬ−１α放出を約５６０μｇ／ｍｌの推定ＩＣ５０で用量依存的に有効に抑制した。このデータは、Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳが、異なるクラスの表面活性剤によって誘導されるＩＬ−１α放出を低減できることを明らかに示している。
【００９６】
図６において、「ベースライン」とは、処理をしていないＨＥＫの上清におけるＩＬ−１αの濃度を指す。「誘導」とは、実施例３で決定した誘導用量である、１０００μｇ／ｍｌのエトキシル化アルコールで処理したＨＥＫの上清におけるＩＬ−１αの濃度を指す。異なるドナーまたは異なるドナー体部位から採取した細胞から産生されるＨＥＫ培養物などの生物学的試験系にはもともとばらつきがあるため、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１α）およびケモカイン（例えば、ＩＬ−８）の濃度によって示されるようなＨＥＫの反応は実験間で、特に「ベースライン」および「誘導」の濃度で変化し得る。
【実施例６】
【００９７】
チャノキ（Camellia sinensis）のセラム画分（すなわちＲｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳ）と同一の供給源からの従来の緑茶および紅茶の調製物は、ＳＤＳによって誘導されるＩＬ−１αおよびＩＬ−８を抑制しない。
ＳＤＳによって誘導される炎症性サイトカインＩＬ−１αおよびＩＬ−８の放出を低減するためのＲｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳの優れた活性を実証するために、本発明者らは、本発明において使用されるＲｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳを得るために使用される材料と同一の供給源からの市販の緑茶および紅茶の従来の調製物を並べて公平に比較した。従来の茶調製物は、製造業者に提唱されている以下に記載の方法に従って作製された。
【００９８】
従来の緑茶調製物は、チャノキ（Camellia sinensis）のセラム画分（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳ）を得るために使用されたものと同じ条件下で同時に栽培および収穫された同じ栽培品種の茶樹から得られた。Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ  Ｔｅａ  Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、Ｗａｄｍａｌａｗ  Ｉｓｌａｎｄ、Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ、ＵＳＡ製の「Ｉｓｌａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｒｅｍｉｕｍ  Ｔｅａ」２グラムを、磁気撹拌機上の８５℃の脱イオン水２００グラムの中に２分間浸した。結果として得られた液体を濾過し、室温まで放冷して、一定分量に分けて凍結保存用バイアルに入れ、さらなる実験的使用のために−３０℃で保存した。
【００９９】
従来の紅茶調製物は、チャノキ（Camellia sinensis）のセラム画分（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳ）を得るために使用されたものと同じ条件下で同時に栽培および収穫された同じ栽培品種の茶樹から得られた。Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ  Ｔｅａ  Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、Ｗａｄｍａｌａｗ  Ｉｓｌａｎｄ、Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ、ＵＳＡ製の「Ｌｉｍｉｔｅｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｅｘｃｅｐｔｉｏｎａｌ  Ｑｕａｌｉｔｙ  １００％  Ｆｉｒｓｔ  Ｆｌｕｓｈ  Ｌｏｏｓｅ  Ｔｅａ」２グラムを、磁気撹拌機上の９９℃の脱イオン水２００グラムの中に４分間浸した。結果として得られた液体を濾過し、室温まで放冷して、一定分量に分けて凍結保存用バイアルに入れ、さらなる実験的使用のために−３０℃で保存した。
【０１００】
チャノキ（Camellia sinensis）のセラム画分（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳ）は、新鮮なチャノキ（Camellia sinensis）（茶樹）から、例えば、米国特許第７４７３４３５号、第８０４３６３５号、および第８３１８２２０号に記載されているプロセスによって得られた。
【０１０１】
ＨＥＫの増殖のためのプロトコルは、実施例１の下に記載されている。さまざまな濃度のＲｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳ、または従来の緑茶調製物、または従来の紅茶調製物の存在下でＨＥＫをＳＤＳ（実施例１で決定したようにＩＬ−１αの誘導のために２５μｇ／ｍｌまたはＩＬ−８の誘導のために６μｇ／ｍｌ）と共に１６時間インキュベートすることによって処理をした。
【０１０２】
図７Ａ〜Ｂに示しているように、Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳは、ＩＬ−１αのＳＤＳ誘導性放出（Ａ）を（約０．１％の濃度で顕著な抑制を開始して）約０．３９％の推定ＩＣ５０で、かつＩＬ−８の放出（Ｂ）を（約０．０４％の濃度で顕著な抑制を開始して）約０．０４３％の推定ＩＣ５０で、用量依存的に抑制した。試験したＲｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳの最高濃度は１％であったが、これは、抑制に有効な濃度範囲の上限として解釈されるべきではない。図７Ａ〜Ｂに示されているＲｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳ、または従来の緑茶調製物、または従来の紅茶調製物の濃度は、「そのままの」材料を１００％と仮定した、ＨＥＫ増殖培地中の容量パーセントである。しかし、緑茶も紅茶も同じ濃度で顕著な抑制を示さなかった。このデータは、特許のＺｅｔａ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ（商標）技術によって加工された、Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳが、緑茶および紅茶の調製物よりも優れた多機能の利点を示す天然構成要素の独特かつ多様な組成を有することを示している。
【０１０３】
図７Ａにおいて、「ベースライン」とは、処理をしていないＨＥＫの上清におけるＩＬ−１αの濃度を指す。「誘導」とは、実施例１で決定した誘導用量である、２５μｇ／ｍｌのＳＤＳで処理したＨＥＫの上清におけるＩＬ−１αの濃度を指す。
【０１０４】
図７Ｂにおいて、「ベースライン」とは、処理をしていないＨＥＫの上清におけるＩＬ−８の濃度を指す。「誘導」とは、実施例１で決定した誘導用量である、６μｇ／ｍｌのＳＤＳで処理したＨＥＫの上清におけるＩＬ−８の濃度を指す。異なるドナーまたは異なるドナー体部位から採取した細胞から産生されるＨＥＫ培養物などの生物学的試験系にはもともとばらつきがあるため、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１α）およびケモカイン（例えば、ＩＬ−８）の濃度によって示されるようなＨＥＫの反応は実験間で、特に「ベースライン」および「誘導」の濃度で変化し得る。
【実施例７】
【０１０５】
チャノキ（Camellia sinensis）のセラム画分（すなわちＲｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳ）と同一の供給源から調製された従来の緑茶および紅茶は、エトキシル化アルコールによって誘導されるＩＬ−１αを抑制しない。
炎症性サイトカインＩＬ−１αのエトキシル化アルコール誘導性分泌の低減について、Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳを、同じ供給源から得られた従来の緑茶および紅茶の調製物と比較した。
【０１０６】
従来の緑茶および従来の紅茶の調製物は、実施例６に記載のように得られた。特に、実施例６および実施例７で使用される調製物は、同一材料の分割量である。
【０１０７】
ＨＥＫの増殖のためのプロトコルは、実施例１の下に記載されている。さまざまな濃度のＲｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳ、または従来の緑茶調製物もしくは従来の紅茶調製物の存在下でＨＥＫをエトキシル化アルコール（実施例３で決定したように、ＩＬ−１αの誘導のために５００μｇ／ｍｌ）と共に１６時間インキュベートすることによって処理をした。
【０１０８】
図８に示しているように、Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳは、ＩＬ−１αのエトキシル化アルコール誘導性放出を（約０．３％の濃度で顕著な抑制を開始して）約０．７０％の推定ＩＣ５０で用量依存的に抑制した。しかし、緑茶も紅茶も同じ濃度で顕著な抑制を示さなかった。試験したＲｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳの最高濃度は１％であったが、これは、抑制に有効な濃度範囲の上限として解釈されるべきではない。このデータは、特許のＺｅｔａ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ（商標）技術によって加工された、Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳが、緑茶および紅茶の調製物よりも優れた多機能の利点を示す天然構成要素の独特かつ多様な組成を有することを示している。
【０１０９】
図８において、「ベースライン」とは、処理をしていないＨＥＫの上清におけるＩＬ−１αの濃度を指す。「誘導」とは、実施例３で決定した誘導用量である、５００μｇ／ｍｌのエトキシル化アルコールで処理したＨＥＫの上清におけるＩＬ−１αの濃度を指す。異なるドナーまたは異なるドナー体部位から採取した細胞から産生されるＨＥＫ培養物などの生物学的試験系にはもともとばらつきがあるため、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１α）およびケモカイン（例えば、ＩＬ−８）の濃度によって示されるようなＨＥＫの反応は実験間で、特に「ベースライン」および「誘導」の濃度で変化し得る。
【実施例８】
【０１１０】
レモン（Citrus limon）のセラム画分（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＬ）およびアカツメクサ（Trifolium pratense）のセラム画分（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＴＰ）は、ＳＤＳ誘導性ＩＬ−１αを用量依存的に抑制する。
レモン（Citrus limon）（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＬ）およびアカツメクサ（Trifolium pratense）（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＴＰ）は、例えば、米国特許第７４７３４３５号、第８０４３６３５号、および第８３１８２２０号に記載されているように加工される。これらは、フリーラジカル捕捉特性、抗炎症性の利点、および光安定化活性について複数の利点をもたらす。したがって、本発明者らは、レモン（Citrus limon）（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＬ）およびアカツメクサ（Trifolium pratense）（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＴＰ）を、炎症性サイトカインＩＬ−１αのＳＤＳ誘導性分泌の低減について評価した。
【０１１１】
ＨＥＫの増殖のためのプロトコルは、実施例１の下に記載されている。さまざまな濃度のＲｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＬ、またはＲｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＴＰの存在下でＨＥＫをＳＤＳアルコール（実施例１で決定したように、ＩＬ−１αの誘導のために２５μｇ／ｍｌ）と共に１６時間インキュベートすることによって処理をした。
【０１１２】
図９に示しているように、レモン（Citrus limon）（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＬ）は、ＨＥＫにおいて、ＳＤＳによって誘導されるＩＬ−１α放出を、（約０．２％で顕著な抑制を開始して）約０．４６％の推定ＩＣ５０で、用量依存的に抑制した。アカツメクサ（Trifolium pratense）（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＴＰ）も、（約０．７５％で顕著な抑制を開始して）１％でＩＬ−１αのＳＤＳ誘導性放出の約３５％を抑制して、炎症性サイトカインＩＬ−１αのＳＤＳ誘導性放出を用量依存的に低減した。試験したＲｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＬおよびＲｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＴＰの最高濃度は１％であったが、これは、抑制に有効な濃度範囲の上限として解釈されるべきではない。
【０１１３】
図９において、「ベースライン」とは、処理をしていないＨＥＫの上清におけるＩＬ−１αの濃度を指す。「誘導」とは、実施例１で決定した誘導用量である、２５μｇ／ｍｌのＳＤＳで処理したＨＥＫの上清におけるＩＬ−１αの濃度を指す。異なるドナーまたは異なるドナー体部位から採取した細胞から産生されるＨＥＫ培養物などの生物学的試験系にはもともとばらつきがあるため、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１α）およびケモカイン（例えば、ＩＬ−８）の濃度によって示されるようなＨＥＫの反応は実験間で、特に「ベースライン」および「誘導」の濃度で変化し得る。
【０１１４】
結論として、限定されるものではないが、チャノキ（Camellia sinensis）（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳ）、レモン（Citrus limon）（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＬ）、およびアカツメクサ（Trifolium pratense）（Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＴＰ）などが挙げられる、Ｚｅｔａ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ（商標）技術由来の天然画分との表面活性剤の独特な組合せは、表面活性剤誘発性の皮膚刺激および炎症反応を軽減するための新規なアプローチを提供し、次世代の表面活性剤含有製品に低刺激性（mildness）をもたらす。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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【誤訳訂正書】
【提出日】平成27年11月5日(2015.11.5)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図３】
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【国際調査報告】
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