(57)【要約】  本発明は、細胞培養中で発現させたポリペプチドのＣ末端の不均一性を低減させるための、少なくとも１種の有効量の必須微量元素を含む細胞培養用培地、およびタンパク質Ｃ末端の不均一性を低減するための、必須微量元素を用いる細胞培養プロセスに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養中で発現した少なくとも１つのポリペプチドのアミノ酸残基の［アルファ］−アミド化および／またはＣ末端開裂を制御するための細胞培養用培地であって、ペプチジルグリシン［アルファ］−アミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）および／またはカルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）に対して作用する少なくとも１種の必須微量元素またはこの元素を含んでいる化合物を含有する培地。
【請求項２】
発現した少なくとも１つのポリペプチドのアミノ酸残基の［アルファ］−アミド化および／またはＣ末端開裂を制御するための細胞培養プロセスであって、
ｉ）ポリペプチドを生産している宿主細胞を含んでいる培地に、少なくとも１種の必須微量元素または少なくとも１種の必須微量元素を含んでいる化合物を添加する工程、および
ｉｉ）ポリペプチドを発酵させ、回収する工程、
を少なくとも含んでいる、細胞培養プロセス。
【請求項３】
前記必須微量元素またはその付加物が、
ｉ）Ｃ末端の［アルファ］−アミド化プロリンの量を減少させるか、またはＣ末端リシンの量を増加させる、
ｉｉ）イオンもしくはその塩であるかまたはイオンもしくはその塩を含んでいる化合物である、および／または
ｉｉｉ）セレン、亜鉛および銅からなる群より選択される、
請求項１に記載の培地または請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
ｉ）少なくとも、有効量のセレンまたはその付加物、ここでセレンは［アルファ］−アミド化を制御するために用いられることが好ましく、
ｉｉ）有効量の亜鉛またはその付加物、ここで亜鉛はアミノ酸残基のＣ末端開裂を制御するためおよび／または［アルファ］−アミド化を制御するために用いられることが好ましく、および／または
ｉｉｉ）有効量の銅またはその付加物、
を含んでいる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の培地またはプロセス。
【請求項５】
前記培地が、以下に挙げる必須微量元素のうちの少なくとも１種またはそれらの組み合わせを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の培地またはプロセス：
ｉ）０．１７５μＭを超えて２．９８μＭまで、好ましくは１μＭ〜２．４μＭの範囲に入る濃度のセレン、
ｉｉ）０．２μＭ〜２０μＭまで、好ましくは３μＭを超えて１５μＭまでの範囲に入る濃度の亜鉛、および／または
ｉｉｉ）０．０２μＭ〜１μＭまで、好ましくは０．１μＭ〜０．８μＭまでの範囲に入る濃度の銅。
【請求項６】
ｉ）発現したポリペプチドのＣ末端アルファ−アミド化プロリンの量が、２．０４μＭの銅と０．１７３μＭのセレンを含有している標準的な培地を使用した場合よりも減少する、ここで、好ましくは培地中には２．３μＭ±０．６μＭのセレンが存在し、好ましくは培地には０．４μＭ±０．５μＭの銅もまた含まれており、および／または
ｉｉ）発現したポリペプチドのＣ末端リシンの量が、２２μＭの亜鉛を含有している標準的な培地を使用した場合よりも増加する、ここで、好ましくは培地中には２．３μＭ〜１１μＭ±０．５μＭの亜鉛が存在する、
請求項５に記載の培地またはプロセス。
【請求項７】
前記発現したポリペプチドが、
ｉ）異種発現したポリペプチドである、ここで、この異種発現が真核細胞を用いた発現系で起こることが好ましく、および／または
ｉｉ）ａ）抗体またはその断片もしくは誘導体
ｂ）融合タンパク質、および／または
ｃ）非抗体タンパク質、
からなる群より選択される、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の培地またはプロセス。
【請求項８】
前記真核細胞を用いた発現系が、本質的に昆虫細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、哺乳類細胞および動物細胞からなる群より選択された真核細胞を含む、請求項７に記載の培地またはプロセス。
【請求項９】
前記真核細胞を用いた発現系が哺乳類の発現系である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の培地またはプロセス。
【請求項１０】
前記哺乳類の発現系が、
・ベビーハムスター腎臓細胞株（例えば、ＢＨＫ２１）
・チャイニーズハムスター卵巣細胞株（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＸＢ、またはＣＨＯ−ｄｈｆｒ-）
・マウス骨髄腫細胞株（例えば、ＳＰ２／０）
・マウス骨髄腫細胞株（例えば、ＮＳ０）
・ヒト胎児由来腎臓細胞株（例えば、ＨＥＫ−２９３）
・ヒト網膜由来細胞株（例えば、ＰＥＲ−Ｃ６）、または
・羊膜細胞細胞株（例えば、ＣＡＰ）、
からなる群より選択される少なくとも１種の哺乳類細胞株である、請求項９に記載の培地またはプロセス。
【請求項１１】
請求項２〜１０のいずれか１項に記載のプロセスから得ることができるポリペプチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが、２０％未満のＣ末端アルファアミド化プロリンを含み、ここで好ましくは前記ポリペプチドが１０％未満、好ましくは５％未満のＣ末端アルファアミド化プロリンを含む、請求項１１のポリペプチド。
【請求項１３】
前記プロセスが、
・振とうフラスコ
・Ｔ型フラスコ
・ローラーボトル
・バッグ
・バイオリアクター、および／または
・スピナーフラスコ
を備えている少なくとも１つのバイオリアクターまたは培養用ベッセル中で行われる、請求項２〜１２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１４】
ペプチジルグリシン［アルファ］−アミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）酵素の阻害剤としてのセレンまたはその塩の使用。
【請求項１５】
カルボキシルペプチダーゼ（ＣＰ）の活性化因子としての亜鉛またはその塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は広義には、細胞培養用培地の組成および細胞培養プロセスの技術分野に関する。本発明は具体的には、ポリペプチド、例えば糖タンパク質の不均一性を低減させることを指向する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類細胞中で組換えタンパク質を生産する過程では、タンパク質は発現した後にいくつかの修飾を受け（つまり翻訳後修飾を受け）、その結果、組換えタンパク質産物に不均一性が生じる。翻訳後修飾はそのタンパク質をコードしているヌクレオチド配列によってコードされているものではなく、主に環境中にある複数の酵素の作用に依存しているため、生産過程においてこれを制御することや、修飾の範囲を狭く（望ましい範囲に）保つことは難しい。そのため、特に治療用の組換えタンパク質の製造過程における最大の問題は、タンパク質産物の特徴と質を一定に保つことである。
【０００３】
ポリペプチドの品質特性に関連している可能性があるもの全てを網羅的に列挙した一覧の中で、Ｃ末端のα−アミド化はＣ末端の不均一性の群に属するとされている。重鎖のＣ末端にあるリシン（Ｌｙｓ）のプロセシングは、組換えモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に最も共通して見られる修飾のうちの一つである。重鎖のＣ末端にあるＬｙｓは、塩基性カルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）の活性によって、完全にまたは部分的に除去される可能性がある。Ｃ末端にあるＬｙｓ残基が１つ除去されると分子量が１２８Ｄａ減少し、正電荷が１単位上昇する。Ｃ末端にあるＬｙｓ残基が部分的に除去されると（ｍＡｂの立体構造のせいで）、Ｃ末端にＬｙｓ残基がない、１つある、または２つある抗体の集団が生じる（リウら、２００８）。Ｌｙｓが存在しないと、２番目にあるアミノ酸のグリシン（Ｇｌｙ）もさらに除去される可能性があり、その後、Ｃ末端に残っているアミノ酸のプロリン（Ｐｒｏ）が酵素によってα−アミド化される。
【０００４】
Ｃ末端α−アミド化はよく知られており、また、ペプチドやタンパク質の生物活性にとって重要である。神経ペプチドの多くは、活性をもつ受容体結合型分子へと成熟するのにＣ末端のα−アミド化工程を必要とする。例えば、レウロトキシン（ｌｅｕｒｏｔｏｘｉｎ）のアミド化されていない類似体の活性は、Ｃ末端にα−アミド化されたＰｒｏを有するレウロトキシンの活性の４分の１程度に低い。ヒトの血漿に含まれているヒト免疫原性ＭＡＲＴ−１ペプチドの安定性もＣ末端のα−アミド化によって顕著に向上する。ヘビ毒はＣ末端がα−アミド化されるとそのタンパク質分解が低減して溶液中での半減期が延び、また、活性も修飾されていないペプチドと比較して高くなる。テトラペプチドであるアセチル基−セリン−アスパラギン酸−リシン−プロリンは、ヒトおよびマウスの未分化造血細胞の増殖を阻害し、かつ、アンギオテンシンＩ転換酵素（ＡＣＥ）によって容易に分解されるが、そのＣ末端α−アミド化類似体はＡＣＥによって分解されず、血漿レベルは野生型ペプチドよりも２６倍高い。したがって、ペプチドのＣ末端α−アミド化によってペプチド固有の生物学的および免疫学的活性が高まり、さらにその安定性も向上する。
【０００５】
Ｃ末端α−アミド化は、主に二機能性ペプチジルグリシンα−アミド化（ＰＡＭ）酵素によって触媒される酵素反応である。第一の工程は、ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ（ＰＨＭ、ＥＣ１．１４．１４．３）ドメインによる、Ｃ末端グリシン残基のα−ヒドロキシル化である。第二の工程はペプチジルα−ヒドロキシグリシンα−アミド化リアーゼ（ＰＡＬ、ＥＣ４．３．２．５）ドメインによる、α−ヒドロキシグリシン伸長ペプチドのα−アミド化ペプチドとグリオキシル酸への脱アルキル化である（メタＮＭ、２００９）。ＰＡＭのさらなる酵素活性については、参照することによりその開示内容が全体的に本明細書に組み入れられる、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０６９７５６またはＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０５７８６６を参照のこと。
【０００６】
これに関連して、インビトロおよびインビボでのＣ末端α−アミド化を向上させるために精製したＰＡＭ酵素に関する複数の研究が行われ、これらの研究から、多種多様な活性化因子、阻害剤および補助因子が明らかになった。
【０００７】
欧州特許出願第０４０９２９４号Ａ１には、ＰＡＭ酵素の補助因子として作用するある物質についての記載がある。この分子は２２５ｎｍを超える範囲では吸収スペクトルを示さず、ペプチドではなく、ニンヒドリン陽性ではなく、分子量は１，０００Ｄａ未満で、電気透析の際には陽極へ移動し、そして両親媒性の構造を有する。前述の阻害剤は、Ｃ末端がα−アミド化されたペプチドまたはタンパク質の調製に用いられた（ギュンターＫ、１９９０）。
【０００８】
Ｃ末端α−アミド化の別の補助因子が英国特許出願第２２３３９７８Ａ号に記載されている。このＰＡＭ酵素の補助因子は、Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）n−（ＣＨＯＲ１）n−ＣＨ2ＯＲ２の式を有する化合物で、式中、Ｒは水素原子またはアルキル基を表し、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、ＰＯ3Ｈ2またはＳＯ3Ｈ基を表す（ゴッチーニら、１９９１）。
【０００９】
ブラッドバリーと共同研究者らの論文では、ＰＡＭ阻害剤である４−フェニル−３−ブテン酸のインビボでの使用が提唱されている。インビボで阻害剤を利用することによって、特定のペプチドホルモンのＣ末端α−アミド化の度合いを制御することができ、それによって、活性型の血中レベルを低下させることができる可能性がある。さらに、インビボでＣ末端α−アミド化を制御することができれば、α−アミド化に関わる酵素の細胞内局在、輸送および貯蔵に関する研究が進むだろう（ブラッドバリーら、１９８９）。
【００１０】
Ｃ末端がα−アミド化されたペプチドに関する文献のデータからは、Ｃ末端の不均一性が組換えポリペプチドの特定の特性にも影響を与える可能性があるという知見も得られている。カルシトニン、オキシトシン（ｏｘｙｔｏｃｉｎｅ）およびバソプレシンなどのα−アミド化されたペプチドが治療に有効な可能性があると認識されていることから、Ｃ末端α−アミド化のプロセスは、科学的にも商業的にも注目されている。近年、主にα−アミド化酵素によって触媒されるホルモン前駆体のアミド化反応を使用した効果的なα−アミド化反応が複数開発された（キムＫＨおよびソンＢＬ、２００１）。この例では、インビトロでの反応に二機能性ペプチジルグリシンα−アミド化酵素を利用することで、Ｃ末端伸長ペプチドを、Ｃ末端にα−アミド化された残基を有するペプチドホルモンにうまく転換することができた（マークラーＤＪ、１９９４）。英国特許出願第２  ２２０  ９３８Ａ号には、Ｃ末端グリシン伸長ペプチドを、酵素を使って対応する脱グリシン化ペプチドアミドに転換するプロセスが記載されている（カスチグリロアら、１９９０）。
【００１１】
しかしながら、Ｃ末端α−アミド化が抗体のようなより大きなポリペプチドに及ぼす影響については未だほとんど分かっていない。組換えポリペプチド、たとえば糖タンパク質のＣ末端の不均一性が毒性および免疫原性に及ぼす影響について利用できる情報はほとんどまたは全く無いが、前述した知見から、ある程度の推測は可能である。修飾によって抗体タンパク質の表面または電化が変化すれば、その抗体固有の抗原性が変化する可能性がある。抗体標的ペプチドについてマイエールと共同研究者らは、標的ペプチドのＣ末端をα−アミド化すると、対応する抗体の特異性に劇的な影響が現れることを示した。ペプチドのＣ末端がα−アミド化している場合、マウスでは抗体反応が非常に高くなった。これらのデータから本発明の発明者は、Ｃ末端がα−アミド化している治療用ポリペプチド、特に治療用抗体もまた、変化した感作（免疫原性）能を有する可能性があるのではないかと推測した。Ｃ末端α−アミド化によってペプチドの寿命が延び、その結果、Ｔ細胞反応も向上するという証拠から（マイエールら、１９９５）、抗体半減期の延長もまた、所望の薬理学的効力ならびにモノクローナル抗体それ自体に対して生じうる免疫反応応答にも相当な影響を及ぼす可能性がある。
【００１２】
従って当業者であれば理解できるように、組換え的に発現させる治療用ポリペプチド、たとえば抗体の製造では、（ｉ）産物の質を一定させるためおよび一定して高収量とするため、および／または（ｉｉ）生産プロセスの効率を上げるため、および／または（ｉｉｉ）生産されたポリペプチドの生理活性およびそこから生成された薬物の安全性を高めるおよび／または微調整するため、および／または（ｉｖ）生産され、翻訳後修飾を受けたポリペプチドの特徴を、基準のポリペプチドの特徴と合わせるために、生産されたポリペプチドのＣ末端の翻訳後修飾を制御することが特に重要である。
【００１３】
これらのことから、ＰＡＭおよび／またはＣＰ酵素の活性を制御する手段を提供することによって、組換え（糖）ポリペプチドの生産過程でＣ末端の不均一性を制御または調節する、安定かつ制御可能なプロセスが必要とされている。さらに、高品質な非免疫原性組換えポリペプチドに対する需要もある。
【００１４】
従って本発明の根底にある課題は、（治療用）ポリペプチドのＣ末端の不均一性、具体的にはＣ末端α−アミド化の程度を制御する手段および方法を提供することである。
【００１５】
前述の技術課題に対する解決策は、本発明の独立請求項を特徴とする態様の提供によって達成される。従属請求項は好ましい態様に関連するものである。数値によって区切られている値の範囲には、前記区切りの値も含まれると理解される。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、非免疫原性ポリペプチドを生産するための手段および方法を提供し、この手段および方法は、大規模なバイオプロセスに適している。
【００１７】
本発明は、発現されたポリペプチドのアミノ酸残基のα−アミド化および／またはＣ末端開裂から本質的になる翻訳後修飾によるＣ末端の不均一性を、既定の濃度の少なくとも１種の必須微量元素またはその元素を含んでいる化合物を細胞培養用培地の添加剤として使用することで調節する（たとえば低減させる）手段および方法によって前述した課題を解決するものである。
【００１８】
本発明は、必須微量元素によって、組換え的に発現させたポリペプチドのＣ末端の不均一性を制御することができるという驚くべき発見に基づいている。
【００１９】
言い換えると本発明は、細胞培養中で発現した少なくとも１つのポリペプチドのアミノ酸残基のα−［アルファ］−アミド化および／またはＣ末端開裂を制御するための細胞培養用培地に関し、この培地は、ペプチジルグリシン［アルファ］−アミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）および／またはカルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）に対して作用するおよび／またはペプチジルグリシン［アルファ］−アミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）および／またはカルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）の活性を調節する少なくとも１種の必須微量元素またはこの元素を含んでいる化合物を含有する。
【００２０】
別の側面において本発明は、発現した少なくとも１つのポリペプチドのアミノ酸残基のα−［アルファ］−アミド化および／またはＣ末端開裂を制御するための細胞培養プロセスを提供し、このプロセスは少なくとも、（ｉ）ポリペプチドを発現している宿主細胞を含んでいる細胞培養用培地に、少なくとも１種の必須微量元素を添加する工程、および（ｉｉ）宿主細胞によって生産されたポリペプチドを発酵させ、回収する工程、を含む。本発明の好ましい態様では、必須微量元素は少なくとも、亜鉛（Ｃｕ）セレン（Ｓｅ）および／または銅（Ｃｕ）からなる群より選択される。
【００２１】
本発明によれば、０．１７５μＭ〜約２．９８μＭの濃度のセレン（Ｓｅ）が添加された培地を使用することで、Ｃ末端におけるα−アミド化Ｐｒｏの形成を減少させること、または約０．２μＭ〜約２０μＭの濃度範囲の亜鉛（Ｚｎ）を含有している培地を使用することで、１箇所、好ましくは全箇所のＣ末端でＣ末端リシン残基の割合を増加させることのいずれかによって、Ｃ末端アミノ酸のα−アミド化の発生頻度の低下を促進することができる。好ましい態様では、１μＭ〜２．４μＭのセレン（Ｓｅ）および３μＭ〜１５μＭの亜鉛（Ｚｎ）を含有している培地が使用される。
【００２２】
本発明の好ましい態様では、発現とは異種発現であり、かつ、真核細胞を用いた発現系で起こり、真核細胞を用いた系には、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞、動物細胞ならびに、真菌および酵母細胞を含む下等な真核細胞が含まれる。
【００２３】
本発明によれば、ポリペプチドの発現、すなわち本発明のプロセスは、振とうフラスコ（ＳＦ）、Ｔ型フラスコ振とう機、ボトル、バッグ、ＢＲ、および／またはスピナーフラスコを備えた少なくとも１つのバイオリアクター（ＢＲ）または培養用ベッセル中で行われる。
【００２４】
本発明の別の側面では、ペプチジルグリシン［アルファ］−アミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）酵素の阻害剤として、セレンまたはその塩が使用される。
定義
【００２５】
本明細書で使用する用語には、そうでないことが明示されていない限り、オックスフォード生化学・分子生物学辞典（Ｏｘｆｏｒｄ  ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ）、オックスフォード大学出版、２００６年、ＩＳＢＮ−１３：９７８０１９８５２９１７０、最新のオンライン版：２００８年；ｅＩＳＢＮ：９７８０１９１７２７６４１で提供されているものと同じ定義が適用される。
【００２６】
専門家は、本発明の実施に有用な基本技術をさらに確立するために、細胞生物学および組織培養に関する標準的な教本や総説を参照することができる。実施例で引用した参考文献も参照のこと。分子・細胞生化学の基本的な方法は、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験の手引き（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第三版（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版局、２００１年）；分子生物学の手短なプロトコール（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）第４版（アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、１９９９年）；タンパク質の方法（タンパク質  ｍｅｔｈｏｄｓ）（ボラーグ（Ｂｏｌｌａｇ）ら、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、１９９６年）；遺伝子治療用非ウイルス性ベクター（Ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）（ワーグナー（Ｗａｇｎｅｒ）ら編、アカデミック出版、１９９９年）；ウイルスベクター（Ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ）（カプリット（Ｋａｐｌｉｔｔ）とローウィー（Ｌｏｅｗｙ）編、アカデミック出版、１９９５年）；免疫学的方法の手引き（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ）（レフコビッツ（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ）編、アカデミック出版、１９９７年）および、細胞および組織培養（Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  培養）：生物工学の実験手法（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ドイル（Ｄｏｙｌｅ）とグリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、１９９８年）などの標準的な教本に認めることができる。本開示で参照した遺伝子操作用の試薬、クローニングベクターおよびキットは、バイオラッド、ストラタジーン、インビトロジェン、シグマ・アルドリッチ、およびクロンテックなどの業者から購入することができる。加えて、国際出願のＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０６９７５６およびＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０５７８６６で開示されている内容、特に対応する実験の項で用いられている方法は、参照することにより本明細書に組み入れられる。
【００２７】
本明細書で使用する場合、細胞培養中で、生体分子、例えば発現したポリペプチドの「α−アミド化を制御する」とは、細胞培養から得られるＣ末端がα−アミド化されていないまたはα−アミド化されているＰｒｏ−ポリペプチドの量が、前記細胞培養で生産された異種ポリペプチドの全量のうちの所望のパーセンテージを構成するように、その細胞培養の生育条件、例えば、これらには限定されないが、培地、ｐＨ、温度、および細胞を回収するまでの生育期間、を調節することを意味する。
【００２８】
本明細書で使用する場合、細胞培養中で生体分子、例えば発現したポリペプチドの「アミノ酸残基のＣ末端開裂を制御する」とは、細胞培養から得られるポリペプチドの量が、所望のパーセンテージのＣ末端にＬｙｓを有するポリペプチド（前記細胞培養で生産された異種ポリペプチド全量の一部として計算する）を構成するように、その細胞培養の生育条件、例えば、これらには限定されないが、培地、ｐＨ、温度、および細胞を回収するまでの生育期間、を調節することを意味する。
【００２９】
ペプチジルグリシン［アルファ］−アミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）酵素および／またはカルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）「に対して作用する」またはペプチジルグリシン［アルファ］−アミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）酵素および／またはカルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）「の活性を調節する」という表現は、必須微量元素またはこの元素を含んでいる化合物が前記酵素に対して測定可能な影響を及ぼし、ＰＡＭおよび／またはＣＰ酵素の活性または機能がそれぞれ、上昇するおよび／または低下することを意味している。必須微量元素またはこの元素を含んでいる化合物は、ＰＡＭ酵素複合体の触媒速度を低下させることによって、Ｃ末端α−アミド化のプロセスに影響を及ぼし得る。これによって必須微量元素は、ＰＡＭ酵素複合体そのもの、またはＣ末端グリシン残基の開裂に関与するペプチジルグリシンアルファ−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ（ＰＨＭ）、または実際のα−アミド化反応に関与するペプチジルアミド−グリコレートリアーゼ（ＰＡＬ）のいずれかに影響を及ぼすかまたはそれらを調節する。そのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばヒトＰＡＭのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は当該分野で知られており、また、公開されているデータベース、例えば米国国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＮＣＢＩ）が提供しているインターネットページ、例えばＮＩＨの遺伝子配列のデータベースであるジェンバンク（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）（ジェンバンクではパブメッド・セントラル（ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ）から入手可能な対応する参考文献も引用されている）から得ることができる。例えば参考として、ＰＡＭのヒトヌクレオチドおよびアミノ酸配列は受入番号遺伝子ＩＤ：５０６６で、または受入番号：ＡＡＡ３６４１４．１  ＧＩ：１８９５９５で利用できる。
【００３０】
加えて必須微量元素は、カルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）（ＥＣ３．４．１７．２およびＥＣ３．４．１７．３）の活性に影響を与えるかまたはその活性を調節することで、この酵素の反応速度にも影響を及ぼす可能性がある。ＣＰはペプチド末端加水分解酵素であり、遊離カルボキシル基が生じているペプチドまたはポリペプチドの末端もしくは末端から２番目の結合の加水分解による開裂を触媒する。ヒトカルボキシペプチダーゼのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は当該分野で知られており、また、公開されているデータベース、例えば米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）が提供しているインターネットページ、例えばＮＩＨの遺伝子配列のデータベースであるジェンバンク（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）（ジェンバンクではパブメッド・セントラルから入手可能な対応する参考文献も引用されている）から得ることができる。例えば参考として、カルボキシペプチダーゼＢ（ＣＰ）のヒトヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、受入番号ＮＭ００４４６０およびＡＡＢ４９６６５２．１で利用することができる。受入番号：ＮＰ００１８６２．２  ＧＩ：４６０７０８０。
【００３１】
同様に、Ｃ末端α−アミド化Ｐｒｏの「形成を減少させる」という用語は、基準試料で起こる反応またはプロセスよりも生じるα−アミド化が少なくなるように、α−アミド化のプロセスまたは反応を低減させる、阻害する、遅らせる、制御する、制限するまたは調節することを意味する。ＰＡＭ酵素複合体によって起こるα−Ｐｒｏ−アミド化は基本的に、翻訳されたタンパク質のＣ末端にあるＰｒｏとＲとの間のペプチド結合の加水分解および酸化に依存しており、ここでＲは１つまたは２つ以上のアミノ酸残基、例えば、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、もしくはフェニルアラニン、またはグリシン−リシンであってよい。この反応はたいていの場合、ＰＡＭ酵素複合体によって触媒される（前段を参照のこと）。発現宿主およびポリペプチドの発現条件によって、少なくとも１つの翻訳後Ｐｒｏ−ＮＨ2を有している翻訳されたタンパク質の割合は、０％以上１００％以下の範囲をとり得る。前記α−アミド化はタンパク質のｐＨの上昇を招くため、塩基性の変異体と言える。
【００３２】
（モノクローナル）抗体またはそれらの誘導体では、翻訳後にＣ末端（例えばタンパク質の重鎖のＣ末端）のリシンとグリシンが除去され、新たにＣ末端となったＰｒｏがアミド化されることで、通常、プロリン（Ｐｒｏ）α−アミド（ＰＡ）が生成される。
【００３３】
ＰＡの量は、α−アミド化された変異体とα−アミド化されていない変異体とを、電化、疎水性または質量などの物理化学的な差によって区別することにより、様々な分析方法によって同定および定量することができる。Ｐｒｏのα−アミド化に起因する電化の変化を利用するには、イオン交換クロマトグラフィーの１種であるＣＥＸ−ＣＰＢ法（カルボキシペプチダーゼＢで消化した後に陽イオン交換クロマトグラフィーを行う）が適している。抗体の場合には、クロマトグラフィーによって分離する前にカルボキシペプチダーゼＢで消化してリシン残基を除去することで、Ｐｒｏ−α−アミド変異体とリシン変異体とが同時に溶出されることを回避する。しかしながら、これとは別の塩基性変異体と同時に溶出されることで、数パーセンテージ（例えば４％）の定量バックグラウンドが生じる可能性がある。プロリンアミド変異体とバックグラウンドを合わせたものを溶出の「偽性１Ｋ」と呼び、これはクロマトグラフィーで、Ｃ末端にリシン残基が１つある抗体変異体と同じ位置に溶出される。「偽性２Ｋ」は、Ｐｒｏアミド変異体とバックグラウンドを合わせたものを包含し、クロマトグラフィーで、Ｃ末端にリシン残基が２つある抗体変異体と同じ位置に溶出される。ＣＥＸ方法（つまり、ＣＰＢ消化によるリシンの除去を伴わないＣＥＸ）との違いは、「実際の１Ｋ」および「実際の２Ｋ」と呼ばれるリシン残基を有する抗体変異体の量が示されることである。ＣＥＸ（−ＣＰＢ）を使った定量からは、溶液中の全抗体分子に対するＰｒｏ−α−アミド化抗体のパーセンテージが得られる。α−アミド化Ｐｒｏ変異体を正確に同定し、定量する分析的な試験方法は、エンドペプチダーゼ（例えば、ＬｙｓＣ、トリプシン）で消化したタンパク質の、ＵＶ（紫外線）またはＭＳ（質量分析計）による検出を併用したＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）、いわゆるペプチドマッピングである。ＲＰ−ＨＰＬＣペプチドマッピングによる定量からは、抗体の全重鎖に対するＰｒｏ−α−アミド化重鎖のパーセンテージが得られる。
【００３４】
「偽性１Ｋ」はＣＥＸ−ＣＰＢによって決定される変異体で、抗体（ＩｇＧ）の２本の重鎖のうち、１本がそのＣ末端にＰｒｏアミドを有する変異体である。「偽性２Ｋ」はＣＥＸ−ＣＰＢによって決定される変異体で、モノクローナル抗体の両方の重鎖がそのＣ末端にＰｒｏ−α−アミドを有する変異体である。当業者であれは分かるように、本発明の目的においてはペプチドマッピングの利用も好ましい。
【００３５】
本明細書で使用する場合「影響を及ぼす」という用語は、タンパク質、酵素または化学的もしくは生理学的な反応の活性または機能を、弱める、減少させる、遅らせる、低減する、阻害するまたは調節することを意味する。
【００３６】
「阻害剤」は、化学的または生理学的な反応もしくは応答を遅らせるまたは抑制する任意の物質である。
【００３７】
２つの状態を定量した時の差を示す「誘導する」、「阻害する」、「高める」、「低減させる」、「弱める」、「影響を及ぼす」、「調節する」、「制御する」などの用語は、２つの状態の間に少なくとも統計的に有意な差があることを指すが、発現または活性（例えば、細胞もしくはポリペプチドのα−アミド化）の全消失を示す必要はない。本明細書においてこのような用語は、例えば、発現レベル、量、および活性レベルに対して用いられる。
【００３８】
本明細書で使用する場合「異種（性）」という用語は、（ａ）細胞または生物から単離され、その後、別の細胞または生物に、例えば遺伝子操作またはポリヌクレオチド輸送によって導入されること、および／または（ｂ）天然には存在しない手段によって細胞または生物から得られ、その後、例えば細胞融合、人為的な交配、または遺伝子導入の操作によって、別の細胞または生物に導入されること、を意味する。異種の材料は、例えば、それが導入される生物もしくは細胞と同じ種もしくは型、または別の種もしくは型から得ることができる。
【００３９】
「細胞を用いた発現系」は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを生産するために、本発明に従って宿主細胞もしくは宿主細胞の溶解物に導入された（例えば、遺伝子導入、感染、もしくは形質転換した）発現系もしくはその一部またはポリヌクレオチドを指す。
【００４０】
「宿主細胞」とは、それに単離したおよび／または異種ポリヌクレオチド配列を導入してある（例えば、形質転換した、感染させたもしくは遺伝子導入した）細胞、あるいは外生の核酸を取り込むことが可能な（例えば、形質転換、感染もしくは遺伝子導入によって）細胞であり、細胞には、これらには限定されないが、真核または原核細胞、例えば、哺乳類細胞、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、細菌細胞または微生物の細胞が含まれる。組み込まれた（ゲノム中に）もしくは遊離していて複製する（例えばプラスミド）導入遺伝子を発現することが可能な任意の細胞、または内生のもしくは外生のＰＡＭおよび／またはＣＰ酵素もしくは実質的に同じ機能を有するそれらのホモログおよび／またはオルソログを含む任意の細胞が、本発明の目的に好適である。例えば、好適な真菌細胞については、米国特許出願第２００８／０３０５５２３号を；好適な植物細胞については米国特許第０８／４７７，５５９号を；好適な藻類細胞については欧州特許第２５６０４７９号を；好適な動物細胞については米国特許第２０１１／０１１７６４３号を；好適な細菌細胞については米国特許第２０１３００３４８９７号を、ならびに好適な微生物細胞については欧州特許第１０５０５８２号を参照のこと。
【００４１】
「真核」細胞という用語は、有核細胞または、昆虫、植物、藻類、心筋、哺乳類および動物を包含するがこれらには限定されない生物を指す。
【００４２】
「細胞培養」または「培養」は、人工のインビトロ環境で細胞を維持することを意味する。しかしながら「細胞培養」という用語は一般的な用語であり、個々の細胞を培養することだけでなく、組織、器官、器官系または生物全体を培養することを包含するのにも用いられる場合があり、この場合必要に応じて、「組織培養」、「器官培養」、「器官系培養」または「器官型培養」という用語が「細胞培養」と同じ意味で用いられると理解される。本発明の培地を使用して、いかなる接着細胞（つまり、培養用ベッセルに接着する細胞）を培養することも、また、懸濁液培養中で生育するいかなる細胞をも培養することができる。
【００４３】
本明細書で使用する場合「細胞培養用培地」または「培地」または「発酵培地」または「細胞培養」という表現は、生育させるために用いられる栄養液を指し、かつ、細胞を培養する状況で用いられる全ての種の培地を指す。通常、細胞培養用培地は、アミノ酸、エネルギー源としての少なくとも１種の炭水化物、微量元素、ビタミン類、塩類および添加可能なその他の成分（例えば、細胞の生育および／または生産性および／または産物の質に影響を与えるための成分）を含んでいる。血清を含まない培地中で生育させた細胞から得られた組換えポリペプチドの発現レベルが、血清を加えた培地中で生育させた細胞で見られる発現レベルよりも高くなる場合があることが知られている。従って本発明の培地は、血清を含まない培地であっても、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５または２０％の血清を添加した培地のいずれであってもよい。
【００４４】
本明細書で使用する場合「フィード」、「フィード培地」または「フィード溶液」という用語は、ある種の細胞培養用培地または特定の成分から構成される溶液を指し、これらは通常、細胞の生育および／または生産性および／または産物の質に影響を与えるために、細胞培養のプロセスの間に、細胞培養に添加剤として添加される。
【００４５】
本明細書で使用する場合「細胞培養液」という用語は、その中で細胞が培養されている実際の液体を指す。このことは、前述した定義による細胞培養用培地またはフィードとは対照的に、前記液が細胞によって生産された代謝産物、細胞残渣、細胞性タンパク質（例えば、酵素または組換えタンパク質）を含んでいる可能性があることを意味している。
【００４６】
本明細書で使用する場合「α−アミド化アミノ酸残基の量」という表現は、タンパク質が発現している間または発現した後に、そのタンパク質のＣ末端に形成されるα−アミド化されたアミノ酸残基に関する。これは具体的には、α−アミド化Ｐｒｏの量に関する。特定の条件では、ポリペプチドに含まれているＰｒｏ残基は翻訳後にα−アミド化され、例えば、Ｐｒｏ−α−アミド（Ｐｒｏ−ＮＨ2）の形成を誘導する場合がある。これは場合によっては、例えば、ポリペプチド中で形成されるＰｒｏ−α−アミドの量が基準ポリペプチドでの量よりも多い、または少ない場合には望ましくない。
【００４７】
本明細書で使用する場合、必須微量元素または必須微量元素のイオンもしくはその塩「を含んでいる化合物」という用語は任意の有機化合物または無機化合物に関し、「を含んでいる化合物」は、生理学的な環境（例えば、細胞培養液）中で、以下で定義する必須微量元素と同じ潜在的な影響力を有する。
【００４８】
（微量）元素は、その要素の食事からの摂取が不足すると決まって、宿主（植物、動物および／またはヒトなど）の生体機能が最適以下になるが、生理的な量のこの元素を摂取することで予防できるまたは反転できる場合に「必須」だと見なされる。リン（Ｐ）、カリウム（Ｋ）および硫黄（Ｓ）は、全生物系における主要栄養素であるとされている。カルシウム（Ｃａ）およびマグネシウム（Ｍｇ）は比較的多量に必要である。生物は以下に挙げる元素を微量にまたは超微量にしか必要とせず、本発明では「必須微量元素」とも呼ぶ：ヒ素（Ａｓ）、ホウ素（Ｂ）、クロム（Ｃｒ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、鉄（Ｆｅ）、フッ素（Ｆ）、リチウム（Ｌｉ）、ヨウ素（Ｉ）、マンガン（Ｍｎ）、モリブデン（Ｍｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、セレン（Ｓｅ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、ケイ素（Ｓｉ）、硫黄（Ｓ）、スズ（Ｓｎ）、バナジウム（Ｖ）、亜鉛（Ｚｎ）、および場合により希土類元素。本発明によると、一定の量のセレン（Ｓｅ）、亜鉛（Ｚｎ）および／または銅（Ｃｕ）の使用が好ましい。加えて本発明によると、Ｃ末端の不均一性に対してＳｅ、ＺｎもしくはＣｕまたはこれらの任意の組み合わせと同じ機能を示す、必須微量元素の生じうる全ての酸化状態、ならびに同位元素またはラジカルまたは模倣物も使用することができる。
【００４９】
分子中の原子の「酸化状態」とは、原子が得たまたは失った価電子の数を表す。必須微量元素は、単独でまたはいかなる種類の組み合わせにおいて加えても、培地を生産している間または培地を使用する前いずれか任意の時点で、輪形動物と同時に両方を短時間（３時間）濃縮して加えても、あるいは回分（バッチ）培養をしている間に有機的な結合（例えば、アミノ酸、タンパク質または他の生体分子に結合させて）または複合体または無機鉱物源のいずれかを利用して加えてもよい。加えて必須微量元素は培養中で、細胞内もしくは細胞外のいずれかに、遊離イオンとしてまたは複合体として存在する場合がある。
【００５０】
本明細書において「微量」とは、これまでに定義した元素が、わずかな濃度でのみ存在することを意味する。微量濃度またはレベルとは、＜１０-5、＜１０-6、＜１０-7または＜１０-8もしくは＜１０-9Ｍであり得る。微量元素または全ての他の成分または化合物は培地、組成物または液中に、知られている添加によって、または微量の「不純物」を添加するために、不純な材料を意図的に使用することのいずれかによって、意図的に含まれる。従って、培地、組成物、または液は分かっているまたは予め決められた量の微量元素を含むことになる。
【００５１】
「有効量」は、１用量または任意の用量のいずれかを任意の経路で、単独でまたは他の薬剤と併用して摂取した場合に、効果を、特に期待される効果をもたらすのに有効な量（それぞれの化合物、酵素またはイオンに使用される用量または濃度または分子の数）を指す。
【００５２】
本明細書で使用する場合「医薬処方および／または組成物」という用語は、哺乳類、特にヒトへの投与に好適な、または適合した組成物を示す。
【００５３】
「（糖）ポリペプチド」、「ペプチド」、および「（糖）タンパク質」という用語は、本明細書では同じ意味で用いられ、場合によって共有結合したオリゴ糖鎖（グリカン）を有する、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の類似体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに用いられる。この用語には、アミノ酸同士をつなぎ、その結果、ポリペプチドを構成している従来のペプチド結合の変異体も含まれる。
【００５４】
本明細書で使用する場合「抗体」という用語は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、人工抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、ラクダ化抗体、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、免疫学的に活性な抗体断片（例えば、エピトープに結合可能な抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆｖ断片、抗原に免疫特異的に結合するＶＬもしくはＶＨドメインまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）のいずれかを含んでいる断片など）、二機能性または多機能性抗体、ジスルフィド結合した二重特異性Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、細胞内抗体、およびディアボディ、ならびに前述した抗体のいずれものエピトープ結合断片を指す。「抗体」という用語は特に、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち、抗原結合部位を含んでいる分子を包含することを意図している。免疫グロブリン分子はいずれの種であっても（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、どのクラスの分子であっても（例えば、ＩｇＧb、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡｉおよびＩｇＡ2）、またはどのサブクラスの分子であってもよい。
【００５５】
「抗体誘導体または断片」という用語は、完全長抗体の一部分、一般的には標的結合領域または可変領域を指す。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片が挙げられる。「Ｆｖ」断片は、標的認識部位と結合部位とを完全に含む、最小限の抗体断片である。この領域は、非共有的に密接に結合した１本の重鎖可変ドメインと１本の軽鎖可変ドメインの二量体（ＶＨ−ＶＬ二量体）からなる。この配置をとっている場合、各可変ドメインに含まれている３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面で標的結合部位を規定している。合わせて６つのＣＤＲによって、抗体に標的結合特異性が付与される。しかしながら、１つの可変ドメイン（つまり、標的に特異的な３つのＣＤＲしか含んでいない、Ｆｖの半分）だけでも、結合部位全体をもつものよりも親和性は低いが、標的を認識し、結合する能力をもつ。「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを１本のポリペプチド鎖上に有する。通常、ＦｖポリペプチドはＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それによってｓｃＦｖは標的への結合に望ましい構造をとることができる。
【００５６】
「融合タンパク質」という用語を伴う場合、ペプチド、ポリペプチドならびにタンパク質が本来は別々のタンパク質をコードしている２つ以上の遺伝子を結合することで作成されたことを意味する。この融合遺伝子を翻訳すると、本来のタンパク質それぞれに由来する機能特性を有する単一のポリペプチドが生じる。この用語の意味するところには、キメラ抗体およびヒト化抗体、ならびに構築物、例えば受容体ドメインとＩｇＧ  Ｆｃセグメントからなる構築物が包含される。
【００５７】
本明細書で使用する場合「非抗体タンパク質」という表現は、抗体ではない、生理学的に活性なタンパク質に関する。この定義には特に、インスリン、ソマトロピン、エリスロポエチン、インターフェロンアルファまたはＧ−ＣＳＦ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、第ＶＩＩＩ因子、および／またはインターロイキン２、またはこれらの断片もしくは誘導体が包含される。
【００５８】
本発明の抗体または抗体ポリペプチドについて言及する場合の「変異体」、「誘導体」および「類似体」という用語には、対応する天然の結合分子、抗体、もしくはポリペプチドの抗原結合特性の一部を少なくとも保持している任意のポリペプチドであって、それでもなお、抗体の一般的な概念との構造的な関連をいくぶんか有し、かつ、抗体の一般的な概念の機能特性をいくぶんか保持している任意のポリペプチド、例えばｓｃＦｖ、ならびに二重−、三重−または多重（higher specific）特異的抗体構築物、ペグ化抗体構築物などを含む。
【００５９】
本発明の意味においては、「タンパク質の断片または誘導体」という用語にも同様の概念が適用される。
【００６０】
「キット」という用語は、特定の機能（例えば検定を実施する、タンパク質を発現させる、細胞を培養する、ポリペプチドを精製するなど）を実施するための材料を集めたもの、好ましくは材料（好ましくは関連した材料）の集合を包装したものを指す。必要に応じてキットには、そのキットに含まれる材料の使用方法を記載した説明資料が含まれる。
【００６１】
本明細書で使用する場合、所与のイオンまたはその塩、例えば「セレンまたはその塩」、「亜鉛またはその塩」および／または「銅またはその塩」の「濃度」という用語は、細胞培養用培地（例えば細胞培養用培地、またはフィード培地、もしくはフィード溶液）、または細胞培養用の液中に含まれるセレンおよび／または亜鉛および／または銅イオンの最終濃度を示す。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】力価に関する実験計画（ＤＯＥ）から作成したパレート図である。単独でまたは併用で力価に有意な効果をもつ微量元素はボンフェローニの限界値よりも上に等級付けられ、力価に対して影響を及ぼす可能性がある微量元素がｔ値の限界よりも上に等級付けられた。力価に対して影響を及ぼさない微量元素はｔ値の限界よりも下に等級付けられたため、選択しなかった。Ａ：亜セレン酸ナトリウム（Ｎａ2ＳｅＯ3）、Ｄ：塩化亜鉛（ＺｎＣｌ2）、単位はμＭ。
【図２】ＤＯＥから作成した、亜鉛およびセレンが力価に及ぼす影響を表しているコンター図である。コンター図のうち、淡い色で示されている部分は力価が高い領域を表しており、濃い色で示されている部分は力価が低い領域を表している。白で囲んである数字は測定された力価をｇ／Ｌの単位で示すものである。
【図３】Ｃ末端α−アミド化Ｐｒｏの量に関するＤＯＥから作成したパレート図である。ボンフェローニの限界値よりも上にあるもの（Ｅ＝塩化銅（ＣｕＣＬ2×２Ｈ2Ｏ）および＝亜セレン酸ナトリウム（Ｎａ2ＳｅＯ3））は明らかに有効なもので、ｔ値の限界よりも上に順位づけられた効果は、おそらく有意なものであった。ｔ値の限界よりも下のものは有意ではなかったため、選択しなかった。
【図４】高濃度の銅およびセレンのＣ末端α−アミド化Ｐｒｏ（Ｃ末端。アミド化Ｐｒｏ）に及ぼす影響を表している、ＤＯＥソフトウェアによって作成したコンター図である。培地に含まれる銅濃度を高くするとＰＡＭ活性が高まり、Ｃ末端α−アミド化Ｐｒｏの形成が増加した。高濃度のセレンではＰＡＭ活性が下がり、Ｃ末端α−アミド化Ｐｒｏの形成が減少した。
【図５】亜鉛がＣ末端Ｌｙｓ（Ｃ末端。Ｌｙｓ）の量に主要な影響を及ぼす因子であることを表している、ＤＯＥから作成したパレート図である。ｔ値がボンフェローニの限界値を上回った因子は亜鉛だけであると算出された。
【図６】高濃度の亜鉛がＣ末端Ｌｙｓの量に影響を及ぼすことを示している、ＤＯＥソフトウェアによって作成したコンター図である。培地に含まれる亜鉛の濃度が高くなるとＣＰ活性が高まり、その結果、Ｃ末端Ｌｙｓの量が減少する。
【図７】亜鉛およびセレンの力価に対する影響を表している、ＤＯＥソフトウェアで作成したコンター図である。培地に含まれる亜鉛濃度が高いと力価も高くなった。セレン濃度は３μＭを上回ると害になり、力価の低下を引き起こすことが分かった。
【図８】銅およびセレンがＣ末端α−アミド化Ｐｒｏの量に及ぼす影響を表している、ＤＯＥソフトウェアで作成したコンター図である。培地中のセレン濃度が高い場合、および銅濃度が低い場合にＣ末端α−アミド化Ｐｒｏの量が減少しており、このことはセレンのＰＡＭ酵素に対する阻害効果を示している。
【図９】Ｃ末端Ｌｙｓの量に及ぼす亜鉛の影響を表している、ＤＯＥソフトウェアで作成したコンター図である。発酵培地に含まれる亜鉛濃度が高いとＣ末端Ｌｙｓの量が減少し、このことは、ＣＰ酵素の活性を高まったことを示している。
【図１０】図１０Ａは、ＳＦ系で実施した確認実験。Ａ）低濃度の銅および高濃度のセレンがＰＡＭ活性に及ぼす影響（Ｃ末端α−アミド化Ｐｒｏの量で表した）および、２．０４μＭの銅（Ｃｕ）と０．１７３μＭのセレン（Ｓｅ）を含有している、変更を加えていない本研究室の培地との比較。  図１０Ｂは、ＳＦ系で実施した確認実験。Ｂ）低濃度の亜鉛がＣＰ活性に及ぼす影響（Ｃ末端Ｌｙｓの量で表した）および、２２μＭの亜鉛（Ｚｎ）を含有している、変更を加えていない本研究室の培地（in-house medium）との比較。
【図１１】図１１Ａは、ＢＲ系で実施した確認実験。高濃度のセレンが細胞成長に及ぼす影響を図示している。  図１１Ｂは、ＢＲ系で実施した確認実験。高濃度のセレンが増殖率に及ぼす影響を図示している。
【図１２】高濃度のセレンがインビボでのＰＡＭ酵素活性に及ぼす影響。培地に含まれるセレン濃度が高まるにつれてＰＡＭ活性が低下し、その結果、Ｃ末端α−アミド化Ｐｒｏの量が劇的に減少した。
【図１３】図１３Ａは、ＢＲ系で実施した確認実験。低濃度の亜鉛が細胞成長に及ぼす影響を図示している。  図１３Ｂは、ＢＲ系で実施した確認実験。低濃度の亜鉛が増殖率に及ぼす影響を図示している。
【図１４】低濃度の亜鉛がインビボでのＣＰ酵素活性に及ぼす影響。培地に含まれる亜鉛濃度（Ｚｎ濃度）が低下するにつれてＣＰ活性が低減し、その結果、Ｃ末端Ｌｙｓの量の劇的に増加した。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
本発明を詳細に説明する前に、本発明は、記載した装置の特定の部品や記載した方法の工程段階には限定されず、そのような装置および方法は変わり得ることを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は特定の態様を説明することを目的としているだけであり、限定を意図していないと理解される。明細書および添付の請求項で使用する場合、単数形の「１つ」「１種」および「この」は、そうでないことが明示されていない限り、単数および／または複数の指示対象を含むことに注意する。さらに、数値で区切られているパラメーター範囲が示されている場合、この範囲にはこれらの数値が含まれると理解される。
【００６４】
本明細書は、Ｃ末端α−アミド化Ｐｒｏの量が少なく、および／またはＣ末端Ｌｙｓの量が多いポリペプチドを生産するための培養用培地ならびに方法を提供する。生育と増殖率を阻害しないことで、例えば大規模なバイオプロセスを使用して、高品質な非免疫原性の治療に有用な（糖）ポリペプチドを生産するために、規定濃度のセレン（Ｓｅ）および亜鉛（Ｚｎ）を添加することができる。
【００６５】
従って本発明は、細胞培養中で発現した少なくとも１つのポリペプチドのアミノ酸残基のα−アミド化またはＣ末端開裂を制御するための細胞培養用培地に関し、ここでこの培地は、ペプチジルグリシン［アルファ］α−アミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）またはカルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）酵素に対する作用をもつ少なくとも１種の必須微量元素もしくはこの元素を含んでいる化合物を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる。
【００６６】
ＰＡＭ酵素の多数の活性化因子や阻害剤に関して利用可能なデータが多数あるにもかかわらず、本発明の発明者は驚くことに、セレンがＰＡＭ活性に対して大きな影響をもつことを発見した。生産（発酵）培地中のセレン濃度を、セレンの最大濃度としてこれまで知られており、市販されている培地のいくつかで採用されていた約０．１μＭ（ＩＭＤＭ：０．０６７μＭ、改変ＤＭＥＭ：０．０３μＭ、改変ＲＰＭＩ：０．０３μＭ、改変ＭＥＭ：０．０３μＭ）よりも上げることで、本発明の実施例に示すように発明者は、ＰＡＭ酵素の活性を阻害し、生じる組換えポリペプチド産物のＣ末端α−アミド化の量を有意に減少させることができた。
【００６７】
加えて、生産（発酵）培地に含まれる亜鉛イオン濃度を下げることでＣＰの活性が阻害されてＣ末端Ｌｙｓの量が増加し、その結果、Ｃ末端α−アミド化の量がさらに低下した。従って本発明は、生産培地に含まれる２種類の必須微量元素（添加剤）の濃度を調節することで、Ｃ末端の不均一性の信頼性が高い産物を生産することができるという驚くべき発見を提供する。
【００６８】
本発明による第一の「一変量」アプローチでは、ＰＡＭ酵素の阻害剤としてよく知られている複数の阻害剤について試験したが、それらのほとんどが増殖率の低下または細胞培養効率の低下を招いた。第二の「多変量」アプローチでは、生産培地をいくつかのビルディングブロックに分け、実験計画（ＤＯＥ）の様式で試験した。驚くことに発明者は、セレンがインビボにおけるＣ末端α−アミド化Ｐｒｏの形成に大きく負の影響を及ぼすことを発見した。生産培地のセレン濃度を有毒に近いレベルまで上げることで、細胞培養の効率および増殖率は許容可能な程度に保ち、かつ、ここが最も重要な点であるが、ＰＡＭ酵素の活性を阻害することができる。その結果、生じるポリペプチドで認められるＣ末端α−アミド化Ｐｒｏの量が有意に減少した（実施例１１ならびに図１１および１２を参照のこと）。
【００６９】
これらの発見から本発明は、ポリペプチドを生産している宿主細胞を含んでいるまたは本質的にこれからなる培地に、少なくとも１種の必須微量元素を添加する工程；および発酵させ、ポリペプチドを回収する工程を少なくとも含むかまたは本質的にこれらの工程からなる、発現した少なくとも１つのポリペプチドのアミノ酸残基のα−アミド化および／またはＣ末端開裂を制御するための細胞培養プロセスへと自然に拡大する。
【００７０】
言い換えると本発明は、前記細胞培養から得られる組換えによって発現させたポリペプチド（抗体など）の不均一性を低減する方法に関し、前記方法は、不均一性が低減した前記ポリペプチドを得るために、ペプチジルグリシン［アルファ］−アミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）またはカルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）酵素の活性を下げるおよび／または阻害することが可能な少なくとも１種の必須微量元素を細胞培養用培地に添加する工程を含む。加えて、ＣＰ酵素の活性を低下させるおよび／または阻害することが可能な別の必須微量元素も添加する。
【００７１】
好ましい態様では、必須微量元素もしくはその付加物は、Ｃ末端［アルファ］−アミド化プロリンの量を増加させるか、またはＣ末端リシンの量を減少させる。
【００７２】
当業者は本発明に従えば、必須微量元素または必須微量元素と同じ効果を示す必須微量元素の模倣物を培地に加えることができることを理解する。本発明によると、必須微量元素はイオンもしくはその塩、またはイオンもしくはその塩を含んでいる化合物である。好ましい態様において必須微量元素は、セレン（Ｓｅ）、亜鉛（Ｚｎ）および／または銅（Ｃｕ）からなる群より選択される。前段で定義したように、Ｓｅ、Ｚｎおよび／またはＣｕの任意の好適な塩、またはセレン（Ｓｅ）、亜鉛（Ｚｎ）および／または銅（Ｃｕ）イオンを含有している、含んでいる、もしくは本質的にこれらからなる任意の無機もしくは有機化合物も、これらの化合物がそれぞれ、本発明の意味範囲においてＣ末端Ｐｒｏのα−アミド化またはＣ末端リシンの開裂に対して影響を示す限り、使用することができる。
【００７３】
ＤＯＥ実験を行っている間に、驚くべき第二の発見がなされた。実施例５および９ならびに図５、６および９に示すように、亜鉛が、ＣＰ酵素のインビボにおける主要な活性化因子であることが分かった。生産培地の亜鉛濃度を下げると、ＣＰ酵素の活性が低下し、対応する組換え産物のＣ末端Ｌｙｓの量が増える場合がある（実施例１１および図１４を参照のこと）。セレン濃度を上げ、同時に亜鉛濃度を下げると、α−アミド化Ｐｒｏおよび／またはＬｙｓの点で予め決められたＣ末端不均一性を有する基準となる産物と同等のＣ末端の不均一性を有する組換えポリペプチド産物が生じる。生産培地のＳｅおよびＺｎ濃度を調節することで、生産されたタンパク質のα−アミド化Ｐｒｏおよび／またはＬｙｓの点でのＣ末端不均一性を、基準となるタンパク質のそれぞれのＣ末端不均一性と同等に調整することができる。Ｃ末端α−アミド化Ｐｒｏの量を減らし、かつ、Ｃ末端Ｌｙｓの量を増やすことができる。
【００７４】
加えて、本発明の発明者は驚くことに、細胞培養用培地の亜鉛濃度が低くても宿主細胞の生育ならびにそれぞれのポリペプチドの発現が損なわれないことを見いだした。
【００７５】
それ故本発明は、必須微量元素またはその付加物がＣ末端α−アミド化Ｐｒｏの形成を減少させるまたはＣ末端Ｌｙｓの量を増加させる培地またはプロセスに関する。好ましい態様では、α−アミド化を制御するために、本発明のプロセスで使用される細胞培養用培地または培地に有効量のセレンが添加される。本発明のさらに好ましい態様では、アミノ酸残基のＣ末端開裂を制御するためにおよび／またはα−アミド化を制御するために、プロセスで使用される細胞培養用培地または培地に有効量の亜鉛が添加される。
【００７６】
発現したポリペプチドのα−アミド化を低いレベルに維持するため、つまり、Ｃ末端α−アミド化のプロセスを低減するもしくは阻害するために、これまでに定義した少なくとも１種の必須微量元素、好ましくはセレンを培養プロセスの最初に加えてもよい、または、規定の濃度のセレンを予め培地に含めておいてもよいことが当業者には明らかであろう。そのため、本発明のプロセスにより、組換えによって発現させたポリペプチド、例えばそのＣ末端にアルファＰｒｏアミノ酸残基を有するタンパク質またはペプチドの不均一性を、調節する、制御する、減少させるまたは低下させることができる。加えて、培地の亜鉛濃度をいくつかの市販されている培地の濃度（０．１７３μＭセレン、および／または２．０４μＭ銅および／または２２μＭ亜鉛イオン）よりも下げると、これまでに概要を示した通り、Ｃ末端α−アミド化の減少も改善される。さらなる改善は、所望のポリペプチドを発現している細胞を、さらに低濃度の銅イオン、例えば２．０４μＭ未満の銅イオン存在下で培養した場合に達成することができる。ポリペプチドのα−アミド化および非α−アミド化／脱アミド化が不均一な集団の所望される場合には、培養の遅い時点で、セレン付加物を細胞培養用培地に添加することができる。
【００７７】
従っていくつかの態様において本発明は、糖タンパク質のアミノ酸残基のＣ末端α−アミド化および／またはＣ末端開裂を調節するために有効量のセレン、および／または亜鉛および／または銅を培地に添加することによって、細胞培養において糖タンパク質を生産する細胞培養用培地またはプロセスを提供する。いくつかの態様において有効量とは、ＰＡＭ活性を阻害するまたは減じるのに十分な量である。いくつかの態様において有効量とは、ＣＰ活性を阻害する、ＣＰ活性に影響を及ぼす、減じるまたは低下するのに十分な量である。
【００７８】
本発明の好ましい態様では、α−アミド化を制御するためにセレンが用いられる。
【００７９】
本発明で使用されるセレンイオンをもたらすセレン化合物は、生理学的に許容可能なセレン塩であればいずれであってもよく、そのようなセレン塩には、水溶性（難水溶性を含む）の有機および無機セレン塩またはエステルが含まれる。他の好ましい化合物には、亜セレン酸塩、セレン酸塩、セレン酸、亜セレン酸または亜セレン酸（selenous or selenious acid）がある。他のセレン化合物、例えばセレノメチオニン（ｓｅｌｅｎｉｕｍ  ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、セレノシステイン（ｓｅｌｅｎｉｕｍ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、セレンフマル酸（ｓｅｌｅｎｉｔｅ  ｆｕｍａｒａｔｅ）、２−セレノ−５−メチルアミノメチル−ウリジンおよびセレノプロテインを使用することもできる。本発明によると、セレンイオンは、好ましくは、亜セレン酸ナトリウムの形態で使用される。亜セレン酸ナトリウムは強い毒性を有するセレン化合物であるため、亜セレン酸ナトリウムを、高用量の亜セレン酸ナトリウムと同じ生理活性を有するが毒性の低い別のセレン形態に置き換えてもよい。セレン、またはα−アミド化を制御する能力の点でセレンの機能を模倣している化合物のいずれか、例えばセレンの同位体もしくはラジカル、または周期系で同じ族に属する元素の同位体もしくはラジカルを含んでいるさらなる好適な化合物はこれまでに定義されているかまたは当業者によく知られている。
【００８０】
本発明のさらに好ましい態様では、アミノ酸残基のＣ末端開裂を制御するおよび／またはα−アミド化を制御するために亜鉛が用いられる。
【００８１】
本発明で使用される亜鉛イオンをもたらす亜鉛化合物は、生理学的に許容可能な亜鉛塩であればいずれであってもよく、そのような亜鉛には、水溶性（難水溶性を含む）の有機および無機亜鉛塩またはエステルが含まれる。他の好ましい化合物には、難溶性の亜鉛塩があり、中でも、クエン酸亜鉛、塩化亜鉛、または硝酸亜鉛が最も好ましい。用いることができる好適な亜鉛塩の例としては、酢酸亜鉛、フッ化亜鉛、硫酸アンモニウム亜鉛、ギ酸亜鉛、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛、塩化亜鉛、硝酸亜鉛、クロム酸亜鉛、フェノールスルホン酸亜鉛、クエン酸亜鉛、サリチル酸亜鉛、ジチオン酸亜鉛、硫酸亜鉛、フルオロケイ酸亜鉛、グルコン酸亜鉛、酒石酸亜鉛（ｔａｒｔａｒａｔｅ  ｚｉｎｃ）、コハク酸亜鉛、グリセロリン酸亜鉛、およびこれらの混合物が挙げられる。使用することができるＺｎ含有化合物には、これらには限定されないが、ＺｎＣｌ、Ｚｎ（ＮＯ3）2、ＺｎＢｒ、およびＺｎＳＯ4．７Ｈ2Ｏが含まれる。好ましくは、用いられるＺｎ化合物は塩化亜鉛（無水または二水和物のＺｎＣｌ2）または硫酸亜鉛七水和物（ＺｎＳＯ4．７Ｈ2Ｏ）である。通常、Ｚｎの濃度は１×（倍）の本発明の培地に関するものである。本発明によると、使用される亜鉛イオンは、好ましくは、塩化亜鉛（ＺｎＣｌ2）の形態である。本発明によれば、前段で定義したように、ＣＰ活性を低減するまたは低下する濃度まで、培地に含まれる亜鉛濃度を下げるのに好適な任意の有機または無機化合物もまた好ましい。
【００８２】
実施例に示すように、非常にわずかな量の銅イオンを本発明の培地に添加するか、またはその付加物の本発明のプロセスにおいて使用することで、生産されたポリペプチドで見られる非α−アミド化Ｐｒｏ残基の量がさらに増える場合があるという相加的または相乗的な効果がもたらされる。従って本発明によれば、本発明のプロセスで使用する細胞培養用培地または培地に有効量の銅またはその付加物を含めることが好ましい。
【００８３】
本発明で使用される銅イオンをもたらす銅化合物は、生理学的に許容可能な銅塩であればいずれであってもよく、そのような銅塩には、水溶性（難水溶性を含む）の、有機および無機銅塩またはエステルが含まれる。他の好ましい銅塩またはエステル。例えば硫酸銅、サリチル酸銅（Ｃ7Ｈ4Ｏ3Ｃｕ−Ｈ2Ｏ）、水酸化銅または酸塩化銅もよく知られている。本開示によれば、銅イオンは塩化銅の形態で用いられることが好ましい。
【００８４】
培地に結合型のセレン、亜鉛または銅イオンを放出する、主鎖ブロック共重合体を含有している重合型セレン、亜鉛または銅、有機化合物も当該分野でよく知られている。
【００８５】
そのため、本発明に従って行われ、実施例で示した実験を踏まえると、本発明の目的はプロセスまたは培地を提供することであり、培地は、濃度が０．１７５μＭを超えて約２．９８μＭまで、好ましくは１μＭ〜２．４μＭの範囲のセレン（Ｓｅ）、および／または濃度が約０．２μＭ〜約２０μＭ、好ましくは３μＭを超えて１５μＭまでの亜鉛（Ｚｎ）、および／または濃度が約０．１８μＭ〜約０．８μＭの銅（Ｃｕ）の必須微量元素のうちの少なくとも１種、またはこれらの組み合わせを含む。
【００８６】
いくつかの態様では、亜鉛（Ｚｎ）、セレン（Ｓｅ）および／または銅（Ｃｕ）の濃度は、例えば、以下に挙げる値のうちの１つもしくはいくつかよりも高くてもよい：０．００５μＭ０．００６μＭ、０．００７μＭ、０．００８μＭ、０．００９μＭ、０．０１μＭ、０．０２μＭ、０．０３μＭ、０．０４μＭ、０．０５μＭ、０．０６μＭ、０．０７μＭ、０．０８μＭ、０．０９μＭ、０．１０μＭ、０．１１μＭ０．１２μＭ、０．１３μＭ０．１４μＭ、０．１５μＭ、０．１６μＭ、０．１７μＭ、０．１８μＭ、０．１９μＭ、０．２０μＭ、０．２１μＭ、０．２２μＭ、０．２３μＭ、０．２４μＭ、０．２５μＭ、０．３０μＭ、０．３５μＭ、０．４０μＭ、０．５μＭ、１．０μＭ、１．１μＭ、１．２μＭ、１．３μＭ、１．４μＭ、１．５μＭ、１．６μＭ、１．７μＭ、１．８μＭ、１．９μＭ、２．０μＭ、２．１μＭ、２．２μＭ、２．３μＭ、２．４μＭ、２．５μＭ、２．６μＭ、２．７μＭ、２．８μＭ、２．９μＭ、３．０μＭ、５．０μＭ、１０．０μＭ、１１．０μＭ、１２．０μＭ、１３．０μＭ、１４．０μＭ、１５．０μＭ、１６．０μＭ、１７．０μＭ、１８．０μＭ、１９．０μＭ、２０．０μＭ、２１．０μＭ、２２．０μＭ、２３．０μＭ、２４．０μＭ、２５．０μＭ、２６．０μＭ、２７．０μＭ、２８．０μＭ、２９．０μＭまたは３０．０μＭ。
【００８７】
フィード溶液のセレン、亜鉛および／または銅の濃度は細胞培養用培地または細胞培養液よりも有意に高い、例えば最大３μＭとなる場合もあることに注意すること。
【００８８】
これまでに定義した必須微量元素を、細胞培養プロセスの開始時に添加することができる。あるいは、必須微量元素を細胞培養プロセスの間に、例えばフィード培地の成分として添加することもできる。好ましい態様では、複数のイオンを別々に、または組み合わせてまとめて、本明細書に記載した、または哺乳類細胞の培養の専門家に知られている他の適切な栄養素とともに、または他の栄養素は入れずに、流加培養系に添加する。
【００８９】
従って本発明の培地またはプロセスの一態様では、２．０４μＭの銅と０．１７３μＭのセレンを含有している標準的な培地を使用した場合と比較して、発現したポリペプチドのＣ末端α−アミド化Ｐｒｏの量が減少する。本発明の好ましい態様では、培地には２．３μＭ±０．６μＭのセレンが含まれ、好ましくは、０．４μＭ±０．５μＭの銅も含まれる。
【００９０】
これまでの流れから、当業者は、有効量の亜鉛および／または銅を培地にさらに加えることで、Ｃ末端アミノ酸のα−アミド化の率、量または割合をさらに減少させる、阻害するまたは低下させることができることを理解するだろう。
【００９１】
本発明では、亜鉛濃度を「最低レベル」まで下げるという用語は、そのレベルでも細胞は生育でき、かつ、十分量のポリペプチド、例えば糖タンパク質を生産することができるレベルであると理解される。本明細書において、細胞の生育および増力率に関する十分量とは、それぞれ、１４日間培養した後に少なくとも１ｇ／Ｌが生産されること、および、１４日間培養した後に少なくとも２×１０6個／ｍｌの細胞が生育していることと理解される。
【００９２】
その結果、２２μＭの亜鉛イオンを示すいくつかの標準的な培地を使用した場合と比べて、Ｃ末端Ｌｙｓの量が増えた、つまり増加した糖タンパク質を生産することができる。その結果、Ｌｙｓアミノ酸が存在するためＰＡＭ酵素はＣ末端のＰｒｏ残基をα−アミド化することができず、非α−アミド化糖タンパク質の生産／量が増加する。
【００９３】
従って本発明の培地またはプロセスは、アミノ酸残基のＣ末端開裂を制御するおよび／またはα−アミド化を制御するための亜鉛の使用に関する。加えて、本発明に従う一態様では、２２μＭの亜鉛イオンを含有している標準的な培地を使用した場合と比較して、発現したポリペプチドのＣ末端Ｌｙｓの量が増加し、ここで好ましくは、培地には２．３μＭ〜１１μＭ±０．５μＭの亜鉛イオンが含まれる。好ましい態様では、含まれる亜鉛の濃度は３μＭを超え、ここで「超える」とは、亜鉛イオンの濃度が３．００μＭを上回っていること、例えば３．０５μＭ、３．１μＭ、３．２μＭ、３．３μＭ、３．４μＭ、３．５μＭであることを示す。「超える」という用語は、セレンならびに銅の濃度に関しても同様に定義される。本発明のさらなる態様では、２２μＭの亜鉛を含有している標準的な培地を使用した場合と比較して、Ｃ末端Ｌｙｓの量は１０％、１５％、好ましくは１６％±０．７９％増加する。
【００９４】
本発明のプロセスによって得られたポリペプチドは、医薬処方および／または組成物の調製に、診断用または治療用組成物のいずれかとしての組成物の調製に、使用することができる。従って得られたポリペプチドは、生物学的に活性な薬剤の他の成分、例えば薬学上許容可能な界面活性剤、レシピエント、担体、希釈剤および媒体および／またはそのほかの診断用もしくは治療用の化合物、例えばポリペプチドに付着させたもしくは結合させたマーカーまたは薬物とともに投与することができる。以下に概要を示すように、組成物に含まれる一定の量のＳｅ、Ｚｎおよび／またはＣｕまたは化合物の組み合わせは必要に応じて変化し得る。
【００９５】
本発明の培地またはプロセスはいかなる培養プロセスに使用してもよいが、特に好ましいプロセスは真核細胞の培養、特に細胞を産生している生体分子の培養である。生物学的生産には、ワクチンの生産、タンパク質の生産、糖タンパク質の生産、抗体または抗原の生産、核酸の生産、小器官の生産、脂質の生産、炭水化物の生産などが含まれ得る。本発明によれば、ポリペプチドの生産が好ましい。
【００９６】
ポリペプチドは、細胞を用いた発現系とも呼ばれる発現系によって生産され、ここで、本発明の培地中で培養された宿主細胞がポリペプチドを発現する。好ましい態様では、それぞれのポリペプチドをコードしている遺伝子の異種発現を誘導することによって、ポリペプチドが宿主細胞中で生産される。本発明の別の好ましい態様では、前記異種発現は細胞を用いた発現系で起こる。このような細胞を用いた発現系とは、本発明の培地が存在するところでポリペプチドの発現を可能にするために本発明によるプロセスで使用される宿主細胞を意味する。
【００９７】
前段で定義した宿主細胞は、それぞれのポリペプチドをコードしている活性遺伝子などの核酸を含んでおり、この核酸は、細胞を培地中で培養している間に転写・翻訳される。遺伝子を外生遺伝子として、好ましくは制御因子とともに、導入してもよく（例えば、ＥＰ−Ｂ  ０  １４８  ６０５を参照のこと）、あるいは、遺伝子が活性な内生遺伝子として既に宿主細胞中に存在する場合も、または内生の非活性遺伝子を活性化させることもできる。このような内生遺伝子の活性化は、制御因子を相同的組換えによってゲノム中に特異的に導入することで達成することができる。詳細については国際公開第９１／０９９５５号および同第９３／０９２２２号を参照のこと。本発明の好ましい態様では、前記発現は異種タンパク質発現である。
【００９８】
理論によって拘束されることは意図しないが、本発明の培地を利用している培地またはプロセスは、少なくとも１つの翻訳後修飾されたＰｒｏ−ＮＨ2を保持するポリペプチドを発現することが可能な、これまでに定義したいかなる宿主細胞の培養にも好適である。当業者は、好適な宿主細胞に特異的な培地の組成および培養法を十分承知している。
【００９９】
さらなる好ましい態様では、本発明の前記真核細胞を用いた発現系は真核宿主細胞を含み、この真核細胞は、昆虫細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、哺乳類細胞、動物細胞および／または、糸状菌または酵母細胞などの下等な真核細胞からなる群より選択されるか、または本質的にこれらからなる。好ましい態様では、前記真核細胞を用いた発現系は哺乳類の系である。
【０１００】
本発明による細胞を用いた発現系として使用することができる昆虫、植物、藻類、真菌、哺乳類、動物および／または下等な真核生物種は、目的の導入遺伝子を保有するように遺伝子操作することが可能であれば前記種のうちのいずれであってもよく、また、当該分野でよく知られている。
【０１０１】
別の好ましい態様では、前記真核細胞を用いた発現系は、
・ベビーハムスター腎臓細胞株（例えば、ＢＨＫ２１）
・チャイニーズハムスター卵巣細胞株（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＸＢ、または  ＣＨＯ−ｄｈｆｒ-）
・マウス骨髄腫細胞株（例えば、ＳＰ２／０）
・マウス骨髄腫細胞株（例えば、ＮＳ０）
・ヒト胎児由来腎臓細胞株（例えば、ＨＥＫ−２９３）
・ヒト網膜由来細胞株（例えば、ＰＥＲ−Ｃ６）、および／または
・羊膜細胞細胞株（例えば、ＣＡＰ）
から本質的になるか、またはこれらを含むか、またはこれらからなる群より選択される。
【０１０２】
ハムスター細胞を用いた発現系の使用が好ましい。ＢＨＫ２１（「ベビーハムスター腎臓」）細胞は、シリアンハムスター細胞の見かけ上は二倍体の確立された細胞株に属し、ハムスター胎仔腎臓組織の非常に急速に生育する初代培養から得られたクローンに由来する。市販されており、本発明で使用できるＢＨＫ−２１細胞株の非限定的な例としては、ＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）；ＢＨＫ２１−ｐｃＤＮＡ３．１−ＨＣ；ＢＨＫ５７０；Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＢＨＫ細胞株；および／またはＢＨＫ２１（クローン１３）ハムスター細胞株が挙げられる。
【０１０３】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、チャイニーズハムスターの卵巣由来の細胞株である。生物学的なおよび医学的な研究に使われることが多く、また、治療用タンパク質の生産において商業利用もされている。ＣＨＯ細胞は１９６０年代に導入され、当初は単層培養として生育されていた。今日ＣＨＯ細胞は、組換えタンパク質製剤の工業生産に最も多用されている哺乳類宿主であり、かつ、通常は懸濁液培養として生育されている。
【０１０４】
市販されており、本発明で使用できるＣＨＯ細胞株の非限定的な例としては、フリースタイル（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ）ＣＨＯ−Ｓ細胞；ＥＲ−ＣＨＯ細胞株；ＣＨＯ１−１５  ５００  チャイニーズハムスター（ＣＨＩＮＥＳＥ  ＨＡＭ）；ＣＨＯ−ＤＸＢ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−、ＣＨＯ  ＤＰ−１２クローン番号１９３４；ＣＨＯ−ＣＤ３６；ＣＨＯ−ＩＣＡＭ−１；ＣＨＯ−Ｋ１；オバリー（Ｏｖａｒｙ）；ＨｕＺＰ３−ＣＨＯＬｅｃ３．２．８．１；ｘｒｓ５；ＣＨＯ−Ｋ１／ＢＢ２細胞；ＣＨＯ−Ｋ１／ＢＢ３細胞；ＣＨＯ−Ｋ１／ＥＤＧ８／Ｇアルファ１５細胞；ＣＨＯ−Ｋ１／Ｍ５細胞；ＣＨＯ−Ｋ１／ＮＫ１細胞；ＣＨＯ−Ｋ１／ＮＫ３細胞；ＣＨＯ−Ｋ１／ＮＭＵＲ１細胞；ＣＨＯ−Ｋ１／ＮＴＳＲ１細胞；ＣＨＯ−Ｋ１／ＯＸ１細胞；ＣＨＯ−Ｋ１／ＰＡＣ１／Ｇα１５細胞；ＣＨＯ−Ｋ１／ＰＴＡＦＲ細胞；ＣＨＯ−Ｋ１／ＴＲＨ１細胞；ＣＨＯ−Ｋ１／Ｖ１Ｂ細胞；５ＨＴ１Ａ  Ｇアルファ−１５−ＮＦＡＴ−ＢＬＡ  ＣＨＯ−Ｋ１細胞株；ＡＶＰＲ２  ＣＲＥ−ＢＬＡ  ＣＨＯ−Ｋ１細胞株；ＣＨＯ−Ｓ細胞ＳＦＭ適合型；ＤＧ４４細胞；Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞株；ジーンスイッチ（ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ）−ＣＨＯ細胞株；ＮＦＡＴ−ｂｌａ  ＣＨＯ−Ｋ１細胞株；Ｔ−ＲＥｘ−ＣＨＯ細胞株；ジノスタット（ＧｅｎｏＳｔａｔ）ＣＨＯ  Ｋ−１安定細胞株；ジノスタットＣＨＯ  Ｋ−１安定細胞株キット；ＣＨＯ−Ｋ１細胞株ハムスター、ＣＨＯ−ＰＥＰＴ１細胞株が挙げられる。特に好ましい態様においてハムスター細胞を用いた発現系は、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ-細胞株である。
【０１０５】
本発明の別の好ましい態様では、前記異種発現は真核細胞を用いた発現系で起こる。発現したタンパク質は、好ましくは、
・抗体、またはその断片もしくは誘導体、
・融合タンパク質、および／または
・非抗体タンパク質、
からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質である。
【０１０６】
好ましくは、本発明によるプロセスおよび培地は、以下に挙げるタンパク質のうちの１つの全体または一部と同一の、または実質的に相同のアミノ酸配列を含んでいるタンパク質の（組換え的な）生産に好適である：Ｆｌｔ３リガンド、ＣＤ４０リガンド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）などの赤血球生成刺激タンパク質、ダルベポエチンアルファなどのダルベポエチン、およびトロンボポエチン、カルシトニン、レプチン、Ｆａｓリガンド、ＮＦ−カッパＢの受容体活性化因子のリガンド（ＲＡＮＫＬ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘発リガンド（ＴＲＡＩＬ）、胸腺間質性リンパ球新生因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マスト細胞増殖因子などの成長因子、幹細胞成長因子、上皮成長因子、角化細胞成長因子、巨核球増殖分化因子、ＲＡＮＴＥＳ、成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン、インスリン様成長因子、副甲状腺ホルモン、インターフェロン（α−インターフェロン、β−インターフェロン、およびγ−インターフェロンなど）、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、シナプトタグミン様タンパク質（ＳＬＰ１−５）、ニュートロフィン−３”グルカゴン、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、およびＩＬ−１８など）、コロニー刺激因子、リンホトキシン−ｐ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血病阻止因子、オンコスタチン−Ｍ、および細胞表面分子のＥＬＫおよびＨｅｋに関する様々なリガンド（例えばｅｐｈ関連キナーゼまたはＬＥＲＫＳのリガンド）。
【０１０７】
本発明のプロセスおよび培地によって生産することができるこのほかのタンパク質としては、前述したタンパク質の受容体、そのような前述したタンパク質の受容体に対する拮抗剤、およびそのような受容体もしくは拮抗剤と実質的に相同なタンパク質いずれかのアミノ酸配列の全体もしくはその一部を含んでいるタンパク質が挙げられる。
【０１０８】
また、本発明の方法および培地によって生産できるタンパク質としては、分化抗原（ＣＤタンパク質とも呼ばれる）もしくはそれらのリガンド、またはこれらのうちのいずれかと実質的に相同なタンパク質のアミノ酸配列の全体もしくはその一部を含んでいるタンパク質が挙げられる。そのような抗原の例には、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ４０、およびそれらに対するリガンドなどがある。
【０１０９】
また、本発明のプロセスおよび培地によって、酵素活性をもつタンパク質またはそれらのリガンドも生産することができる。例えば、以下に挙げるタンパク質もしくはそれらのリガンドのうちの１つの全体もしくは一部分を含んでいるタンパク質、またはこれらのうちの１つと実質的に相同なタンパク質を含んでいるタンパク質が挙げられる：メタプロテイナーゼ−ディスインテグリンファミリーのメンバー、キナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−１、グロビン、ＩＬ−２拮抗薬、アルファ−１アンチトリプシン、ＴＮＦ−アルファ変換酵素、前述したいずれかの酵素のリガンド、ならびに多種多様な他の酵素およびそれらのリガンド。
【０１１０】
本発明の方法および培地を用いることで、インビトロで選択され、特定の標的タンパク質に結合してその活性を調節するキメラタンパク質、ならびに抗体またはその一部およびキメラ抗体、つまり、１つまたは複数のマウス抗体免疫グロブリンの可変ドメインまたはその断片と結合しているヒト抗体免疫グロブリンの定常ドメインを有している抗体、または実質的に相同のタンパク質を生産することもできる。本発明のプロセスを用いて、抗体と細胞毒性をもつ物質または発光基質とを含んでいる複合体を生産することもできる。本発明の方法および培地によって生産することができる抗体、インビトロで選択されるキメラタンパク質、または抗体／細胞傷害性物質複合体もしくは抗体／発光団複合体の例としては、前述したタンパク質および／または以下に挙げる抗原を含むがこれらには限定されないタンパク質および／または抗原のうちのいずれか１つ、またはこれらの組み合わせを認識するものが挙げられる：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＩＬ−ｌａ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１８受容体サブユニット、ＰＤＧＦ−β、およびその類似体、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−ｐ１、ＥＧＦ受容体ＶＥＧＦ受容体、肝細胞成長因子、オステオプロテジェリンリガンド、インターフェロンガンマ、Ｂリンパ球刺激因子、補体Ｃ５、ＩｇＥ、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣ１、ＰＥＭ抗原、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ−２、患者の血清中に高レベルで含まれている腫瘍関連エピトープ、乳房、結腸、扁平上皮細胞、前立腺、膵臓、肺、および／または腎臓癌細胞および／またはメラノーマ、グリオーマ、または神経芽細胞腫細胞で発現している癌関連エピトープまたはタンパク質、腫瘍の壊死性コア、インテグリンアルファ４ベータ７、インテグリンＶＬＡ−４、Ｂ２インテグリン、ＴＲＡＩＬ需要体１、２、３、および４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦ−α、接着分子ＶＡＰ−１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞間接着分子−３（ＩＣＡＭ−３）、白血球インテグリン接着（ｌｅｕｋｏｉｎｔｅｇｒｉｎａｄｈｅｓｉｎ）、血小板糖タンパク質ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、心筋ミオシン重鎖、副甲状腺ホルモン、ＭＨＣＩ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、アルファ−胎児タンパク質（ＡＦＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、Ｆｃ−ｙ−１受容体、ＨＬＡ−ＤＲ１０ベータ、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、Ｌ−セレクチン、およびＩＦＮ−γ。
【０１１１】
本発明のさらなる側面において本発明は、本発明のプロセスによって得ることができるポリペプチドを必然的に包含する。好ましい態様においてこのポリペプチドは、好ましくはこれまでに概要を示してきたようにまたは実施例で示すように、参照培地中で発現させた同じポリペプチドと比較して、３０％、２５％、２０％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２．５％および／または２％未満のＣ末端アルファアミド化プロリンを含む。特に好ましい態様においてポリペプチドは、５％未満のＣ末端アルファアミド化プロリンを含む。
【０１１２】
本発明のプロセスおよび培地を使用して、前述した生体分子のうちのいずれか、例えばタンパク質または実質的に相同なタンパク質を含んでいる組換え融合タンパク質を生産することもできる。例えば、本発明の方法および培地を使用して、前述したタンパク質のうちの１つと多量体化ドメイン、例えばロイシンジッパー、コイルドコイル、抗体のＦｃ部分、または実質的に相同なタンパク質とを含んでいる組換え融合タンパク質を生産することができる。そのような組換え融合タンパク質の中でも、ＴＮＦＲまたはＲＡＮＫの少なくとも一部分を抗体のＦｃ部分に融合させたタンパク質が特に含まれる。
【０１１３】
別の好ましい態様において前記プロセスは、
・振とうフラスコ
・Ｔ型フラスコ
・バッグ
・ローラーボトル
・バイオリアクター、および／または
・スピナーフラスコ
を備えている少なくとも１つのバイオリアクターまたは培養用ベッセル中で行われる。
【０１１４】
前記バイオリアクターまたは培養用ベッセルは、５０ｍｌ〜４０，０００Ｌの範囲の容量を保持可能であることが好ましい。標準的なバイオリアクターまたは培養用ベッセル用の大きさとしては、５０ｍｌ（例えば振とうフラスコもしくはＴ型フラスコ）、５００ｍｌ、２Ｌ、５Ｌ、１５Ｌ、１００Ｌおよび３００Ｌ（例えばバイオリアクターもしくはバッグ）、および１，０００Ｌ、２，０００Ｌ、５，０００Ｌ、１０，０００Ｌ、２５，０００ｌおよび４０，０００Ｌ（大型バイオリアクター）がある。
【０１１５】
別の好ましい態様では、細胞の培養は、単層培養の代わりに、接着培養にて行われる。一層さらに別の好ましい態様によると、細胞の培養は、懸濁液培養でも行われ得る。
【０１１６】
本発明に従って、連続したおよび非連続的な細胞培養プロセスを使用することができる。知られている他のリアクター技術、例えば、潅流技術なども利用できる。回分プロセスおよび流加プロセスが特に好ましい態様である。
【０１１７】
従って本発明は、セレンイオンがＰＡＭ酵素の作用または活性を制御するまたは遅らせることが可能であるという知識を初めて提供するものである。そのため本発明は別の態様において、ＰＡＭ酵素の阻害剤としてのセレンまたはその塩の使用を必然的に包含する。さらに本発明の別の目的は、カルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）の活性化因子としての亜鉛またはその塩の使用を提供することである。
【０１１８】
本発明はまた、培養細胞の培養に使用するキットも提供する。本発明によるキットは１つまたは複数の容器を含み、ここで少なくとも第一の容器には、本発明の培地または少なくともセレン、亜鉛および／または銅が入っている。本発明の別のキットは１つまたは複数の容器を含み、ここで第一の容器には基礎培地が入っており、第二の容器にはこれまでに定義した必須微量元素が１種以上、好ましくは高濃度で、つまり濃縮された形態で入っている。成分を含んでいる溶液は、１倍（×）の培地調製物中に含まれている同じ成分の濃度よりも濃縮されていることが好ましい。成分は、１０倍濃縮（１０×調製物）であっても、２５倍濃縮（２５×調製物）、５０倍に濃縮（５０×調製物）、または１００倍濃縮（１００×調製物）であってもよい。これまでに例示した成分のうちのいくつかまたは全ては、溶液中で混合した場合に、「基礎培地」となり得る。これらのキットは、サイトカイン、アミノ酸、ビタミン類、無機塩類、糖類、緩衝剤、脂質、インスリン（もしくはインスリン代替品）および／またはトランスフェリン（もしくはトランスフェリン代替品、および／または動物ペプチド、および／または酵母ペプチドおよび植物ペプチド）またはそれらの任意の組み合わせなどの１つ以上の添加剤が入っている１つ以上のさらなる容器をさらに含んでいてもよい。キットには、液体または固形粉末形態の培地、またはその両方が入っていてもよい。さらにキットには、培養細胞の回分（バッチ）が入っていてもよい。
【０１１９】
本発明によれば、培地または前述したいずれかの組成物および／または溶液は液体であってももしくは固形粉末であってもよく、またはその組み合わせであっても、高濃度の成分を含んだ溶液であっても、またはすぐに使える培地もしくは組成物であってもよい。粉末は、１倍（×）、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、４０倍、５０倍もしくは１００倍に濃縮した、またはｘ倍に濃縮した細胞培養用培養液または組成物に含まれている水分を蒸発させることで生成することができる。あるいは、好適な濃度の、つまり前段で定義したｘ倍に濃縮した、乾燥形態の培地成分を容器に入れる。
【０１２０】
本発明はさらに、細胞の生育に使用するための組成物を提供し、前記組成物は少なくとも、これまでに定義した有効量のセレンを含んでいる。好ましい態様では、この組成物はさらに、これまでに定義した有効量の亜鉛も含んでいる。必要に応じて、組成物は、これまでに定義したような、１つ以上の細胞をさらに含んでいる場合がある。本発明のさらに好ましい態様において組成物は、これまでに定義したように、培地を含んでいるかまたは本質的に培地からなる。
免責事項
【０１２１】
明細書を過度に長くすることなく包括的な開示を提供するために、出願人はここで、これまでに参照したそれぞれの特許および特許出願を参照することにより本明細書に組み入れる。
【０１２２】
これまでに詳細を示してきた態様における構成要素および特徴の特定の組み合わせは例示するためだけのものであり、これらの教示を、本明細書に含まれている他の教示や参照により組み込まれる特許／出願の教示と交換および置換することもまた、明らかに想定される。当業者は、特許請求した本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載したものの変異形態、修正形態、および他の実行例を理解できるだろう。従って、これまでに示してきた説明は例示のためだけのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。本発明の範囲は、添付の請求項およびその均等物で定義される。
【実施例】
【０１２３】
本発明の目的のこの他の詳細、特性、特徴および利点を下位クレームで開示しており、また、それぞれの図および実施例についての以下の説明では、説明のためだけにかつ例示的な様式で、本発明の好ましい態様を示している。しかしながらこれらの図および実施例は、本発明の範囲を限定するものとは決して見なされない。
【０１２４】
本明細書で活用しているものなど、標準的な方法の詳細は、引用文献中に見ることができる。「メルクマニュアル−診断と治療（Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ」第１７版、ビアーズ（Ｂｅｅｒｓ）およびバーコウ（Ｂｅｒｋｏｗ）編。（メルク・アンド・カンパニー、２００３年）もまた参照のこと。
【０１２５】
本発明の実践には、そうでないことが明示されていない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子組換え生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の分野の技能に含まれている、標準的な技術が利用される。専門家は、本発明の実践に有用な一般的な技術をさらに確立するために、標準的な教本や細胞生物学および組織培養の総説を参照することができる。実施例で引用されている参考文献もまた参照のこと。分子生物学および細胞生物学の基本的な方法は、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験の手引き（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第三版（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版局、２００１年）；分子生物学の手短なプロトコール（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）第４版（アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、１９９９年）；ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第ＩおよびＩＩ巻（グローバー（Ｇｌｏｖｅｒ）編、１９８５年）；オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｙｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（ゲイト（Ｇａｉｔ）編、１９８４年）；核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（ヘームズ（Ｈａｍｅｓ）およびヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）編、１９８４年）；転写と翻訳（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）（ヘームズおよびヒギンズ編１９８４年）；動物細胞の培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ）（フレッシュニー（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）およびアラン（Ａｌａｎ）、リス社、１９８７年）；哺乳類細胞用の遺伝子導入ベクター（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ）（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）およびキャロス（Ｃａｌｏｓ）編）；分子生物学の最新手法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）および分子生物学の手短なプロトコール（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第３版（アウスベルら編）；および組換えＤＮＡの方法論（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）（ウー編、アカデミック・プレス）、哺乳類細胞用の遺伝子導入ベクター（ミラーおよびキャロス編、１９８７年、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版局）；酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）第１５４および１５５巻（ウーら編）；固定化した細胞および酵素（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ）（ＩＲＬ出版、１９８６年）；パーバル（Ｐｅｒｂａｌ）、分子クローニングの実践ガイド（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８４）年；専門書、酵素学の方法（アカデミック・プレス社、ニューヨーク）；細胞および分子生物学の免疫化学的手法（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ）（メイヤー（Ｍａｙｅｒ）およびウォーカー編、アカデミック・プレス、ロンドン、１９８７年）；実験免疫学ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第Ｉ〜ＩＶ巻（ウェアー（Ｗｅｉｒ）およびブラックウェル（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）編、１９８６年）、タンパク質の方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ）（ボラーグ（Ｂｏｌｌａｇ）ら、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、１９９６年）；遺伝子治療用非ウイルス性ベクター（Ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）（ワーグナー（Ｗａｇｎｅｒ）ら編、アカデミック出版、１９９９年）；ウイルスベクター（Ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ）（カプリット（Ｋａｐｌｉｔｔ）とローウィー（Ｌｏｅｗｙ）編、アカデミック出版、１９９５年）；免疫学的方法の手引き（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ）（レフコビッツ（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ）編、アカデミック出版、１９９７年）および、細胞および組織培養（Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  培養）：生物工学の実験手法（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ドイル（Ｄｏｙｌｅ）とグリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、１９９８年）などの標準的な教本中に見ることができる。本開示で参照した遺伝子操作用の試薬、クローニングベクターおよびキットは、バイオラッド、ストラタジーン、インビトロジェン、シグマ・アルドリッチ、およびクロンテックなどの業者から購入することができる。加えて、国際出願のＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０６９７５６またはＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０５７８６６で開示されている内容、特に対応する実験の項で用いられている方法は、参照することにより本明細書に組み入れられる。
【０１２６】
実施例１：アミノ酸のアミド化／プロリンアミドの形成に及ぼすＰＡＭ阻害剤の効果
実験（種々の例示的な糖タンパク質を使った実験）を、５００Ｌの振とうフラスコ（ＳＦ）を使用し、最終容量を１２５ｍｌとして、ＳＦの系で行った。実験は全て、リサーチ・ワーキング・セル・バンク（ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｗｏｒｋｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｂａｎｋ、ｒＷＣＢ）、例えば組換えヒト抗ＩＬ−８を産生しているＣＨＯ細胞株ＤＰ−１２（ＣＨＯＤＰ−１２クローン番号１９３４［ＣＨＯ  ＤＰ−１２、クローン番号１９３４  ａＩＬ８．９２  ＮＢ２８６０５／１４］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１２４４５（商標））または腫瘍壊死因子、ＴＮＦを標的とするモノクローナル抗体を発現しているＣＨＯ−ＳＳＦ細胞（詳細についてはＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０７４１８１を参照のこと）の融解から開始し、その後、播種に十分な量の細胞が得られるまで、製造業者の説明に従って標準的な条件で複数回継代培養した。いずれの実験にも、１４日間培養した一般的な流加（フィードバッチ）発酵を用い、グルコース、グルタミンおよびアミノ酸の流加（フィーディング）を含む、一般的な流加計画を実施した。全てのＳＦを振とうインキュベーター（クーナー（Ｋｕｈｎｅｒ）、スイス）内、以下の条件でインキュベートした：温度３６．５℃、ＣＯ2＝１０％および振とう速度２００ｒｐｍ。全ての実験で、同一の本研究室の生育培地および生産培地を使用した。これらの培地は、例えば国際公開第２０１１／１３４９２０号に記載されている発酵培地と同等の成分を含み、かつ、同等の成分含量を示すものである。
【０１２７】
微量元素の影響を評価するために、選択した微量元素の濃度を、示唆された値に従って系統的に変化させた。全結果を最終的に、５Ｌのガラス製バイオリアクターを使用したバイオリアクター（ＢＲ）の系で確認した。
【０１２８】
ＳＦ系とＢＲ系の両方で、細胞成長と細胞の生存率を測定した。細胞の生存率は、Ｖｉ−セル（Ｃｅｌｌ）ＸＲ分析機（ベックマン・コールター）を用い、トリパンブルー色素排除試験法によって決定し、細胞の濃度は自動的に細胞を計数することで決定した。モノクローナル抗体含量は、親和性液体クロマトグラフィー（ＡＬＣ）によって決定した。一般的な標準物質を希釈して検量線を作成した。得られた結果を、両モノクローナル抗体のモル吸光係数の違いにより、適切な反応因子で修正した。結果は、培養細胞１リットル（Ｌ）あたりのタンパク質量（グラム、ｇ）として表した。
【０１２９】
１４日間のＢＲおよびＳＦバイオプロセスの最後に（つまり１４日目に）、培養細胞を５０ｍｌの遠心管に採取し、この培養を遠心分離し（３，２２０ｇ、１５分）、無菌的に濾過し（ミリポア、ステリフリップ（Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ）、ＳＣＧＰ００５２５）、その後、マブセレクトシュア（ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ）親和性カラムを使った１段階の精製工程により、試料を培養細胞から精製した。精製は、１ｍｌのハイトラップ（ＨｉＴｒａｐ）カラム（ＧＥヘルスケア、カタログ番号１１−００３４−９３）を使ったＡＫＴＡクロマトグラフィーの系または２００μｌのロボカラム（ＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎｓ）を使ったＴＥＣＡＮフリーダム（Ｆｒｅｅｄｏｍ）ＥＶＯピペッティング・ステーション（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ  ｓｔａｔｉｏｎ）（アトール（Ａｔｏｌｌ）、カタログ番号０１０５０４０８Ｒ）のいずれかによって行った。
【０１３０】
Ｃ末端α−アミド化Ｐｒｏの量およびＣ末端Ｌｙｓの量の測定には、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を、研究室で標準としている手法（laboratory procedure）に従って実施した。主要な電荷変異体を、０Ｋ、偽性１Ｋ（１＋）および偽性２Ｋ（２＋）と呼ぶことにした。正電荷は、重鎖のＣ末端にあるＬｙｓまたはα−アミド化Ｐｒｏを表す。電荷変異体（Ｌｙｓ、α−アミド化Ｐｒｏ）を同じＣＥＸ分析により、Ｃ末端のＣＰ開裂を指標として区別した。３つの主要な変異体よりも前に溶出された構造体をＡＰ（酸性ピーク）、主要な変異体よりも後に溶出された構造体をＢＰ（塩基性ピーク）とした。
【０１３１】
実施例２：個々の微量元素の濃度評価
様々な濃度にした個々の微量元素がＣ末端α−アミド化に及ぼす影響を調べるための実験を行った。ＰＡＭ活性に大きな影響を有する微量元素を検出するために、最初に、最小試行分離能（ＭｉｎＲｅｓ）ＩＶスクリーニング計画（デザイン・エキスパート・ソフトウェア（Ｄｅｓｉｇｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ））によって、高度に濃縮されているプラットフォーム培地に含まれている６種類の微量元素について試験した。その後、Ｃ末端α−アミド化に有意な影響を示した微量元素だけをさらに議論し、その概略を以下に詳細に示した。試験した元素、つまりセレン、亜鉛および銅の濃度を下記表１に示す。
【０１３２】
【表１】
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【０１３３】
実験は、５００ｍｌのＳＦを使用し、最終容量を１２５ｍｌとして行った。１４日間の流加バイオプロセスの後、細胞を回収し、遠心分離し、ＰＥＳ膜で無菌的に濾過し、その後直ちに一段階工程のアフィニティクロマトグラフィー（ＡＣ）精製にかけ、次いで、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）でＣ末端のα−アミド化を解析した。デザイン・エキスパート第７．１．３版（ステート・イース（Ｓｔａｔ−Ｅａｓｅ）、ミネアポリス、米国）を使って応答面を構築し、実験結果の統計分析を行った。最小試行分離能ＩＶ計画を使い、試験した微量元素の細胞の増殖率、試験したモノクローナル抗体のＣ末端α−アミド化およびＣ末端のカルボキシペプチダーゼによる切断（carboxypeptidation）に及ぼす影響を決定した。分析したデザイン・エキスパート（ステート・イース、ミネアポリス、米国）の応答には、流加の力価最終値、Ｃ末端α−アミド化Ｐｒｏの量およびＣ末端Ｌｙｓの量を含めた。
【０１３４】
実施例３：高濃度のセレンおよび亜鉛によって培養細胞１リットル（Ｌ）あたりのタンパク質量（グラム、ｇ）が増加する
最初に、試験した微量元素の力価に対する効果（１リットルあたりの量、グラム）を標準化したものをパレート図で図示し、他の元素よりも明らかに影響が大きかった効果をクリックすることで、主要効果（試験した元素）を選択した。ボンフェローニの限界値を上回る効果は明らかに有意であり、ｔ値の限界を上回る効果は有意である可能性があった。ｔ値の限界未満の効果は有意ではないため、選択しなかった。有意な効果を選択した後、ＡＮＯＶＡ統計プログラムを利用し、統計学的に有意な効果だけがこのモデルに含まれていることを確認した。特定の反応に対する主要効果を示した培地添加剤は、０．１未満のｐ値を示した。
【０１３５】
力価に対して主要な正の効果をもつこれら因子（すなわち試験した微量元素）のうち、亜鉛およびセレンが有意な効果をもつと算出され、これら両微量元素はパレート図でもボンフェローニの限界値を超えていた。前述したこれら両方の微量元素は、これら２種の相互作用がパレート図でｔ値の限界を上回っていたことから、組み合わせても力価に影響を示した（図１）。生産培地に含まれる亜鉛の濃度を２．２０１μＭから２２．０１２μＭに、セレンの濃度を０．０１７μＭから０．１７３μＭに上げると、力価はそれぞれ、０．４ｇ／Ｌから０．６ｇ／Ｌまたは０．５ｍｇ／Ｌまで上昇した。亜鉛とセレンの濃度を上げることで、力価は０．４ｇ／Ｌから０．６５ｇ／Ｌ超まで上昇した（図２）。
【０１３６】
実施例４：セレン（Ｓｅ）および銅（Ｃｕ）がＣ末端α−アミド化Ｐｒｏに及ぼす効果
試験した微量元素がＣ末端α−アミド化に及ぼす影響を分析したときに、亜鉛および銅が主要な効果を有し、これら２種がパレート図上のボンフェローニの限界値を大きく上回るだろうと予測した。予想通り、低濃度の銅では低いＣ末端α−アミド化が示された。驚くことに、高濃度のセレンはＣ末端α−アミド化を大きく低下させる効果を示した（図３）。生産培地のセレン濃度を１０倍高めると、Ｃ末端α−アミド化Ｐｒｏの量は６．５％から４．５％に低下し、銅濃度を１０倍に高めるとＣ末端α−アミド化Ｐｒｏの量は２．５％増加した（図４）。
【０１３７】
得られた結果から、生産培地中の銅およびセレンの濃度を変化させることでＰＡＭ活性を効果的に制御できると想定される。Ｃ末端のα−アミド化を低下させるためには、セレン濃度は最高値（０．１７３μＭ）であり、かつ、銅濃度は最低の範囲（０．２μＭ）でなくてはならない。
【０１３８】
実施例５：亜鉛（Ｚｎ）はＣ末端Ｌｙｓの有無に大きな影響を及ぼす
ＰＡＭの制御に有意な微量元素から亜鉛を除外したため、亜鉛がＣ末端Ｌｙｓのパーセンテージ（量）に及ぼす影響について調べた。ＬｙｓはＣ末端アミノ酸であることが多く、かつ、ＣＰ酵素の作用基質である。組換え産物がプロリン−グリシン−リシンというＣ末端配列を有する場合、Ｌｙｓ残基はＣＰの作用によって最初に切断されるはずである。その結果、末端になったＧｌｙが次いでＰＡＭ酵素の作用に曝されて、二段階反応で（前記参照のこと）、Ｃ末端アミド化Ｐｒｏを生じる。そのため、Ｃ末端α−アミド化の量は間接的に、ＣＰの作用にも依存している。
【０１３９】
試験した微量元素がＣ末端Ｌｙｓの量に及ぼす影響を解析したとき、ＣＰ酵素に主要な効果を有する微量元素としては亜鉛のみを選択した（図５）。亜鉛濃度を１０倍に高めると、Ｃ末端Ｌｙｓの量は２２％から８．５％に低下した（図６）。このことは、亜鉛がＣＰの活性化因子であることを示唆している。
【０１４０】
実施例６：微量元素Ｓｅ、ＺｎおよびＣｕの有効濃度の評価
６種の微量元素を用いたスクリーニング実験（つまり実験１）の後で、亜鉛、セレンおよび銅が、培養効率（力価）、Ｃ末端α−アミド化およびＣ末端のカルボキシペプチダーゼによる切断に主要な効果をもつと判定された。追跡実験（つまり実験２）では、本研究室の培地に含まれるこれら３種の微量元素の濃度範囲の影響を、応答面中心複合計画で調べた。
【０１４１】
選択したそれぞれの微量元素を、プラスアルファおよびマイナスアルファ（軸点）、プラス１およびマイナス１（要因点）および中心点の５レベルに変化させた。それによって応答面中心複合計画を作成し、ここで、亜鉛、銅およびセレンの濃度をそれぞれ、０．１５μＭ〜１５μＭ、０．０１μＭ〜０．２μＭおよび０．１μＭ〜６μＭに変化させた。選択した試験濃度を表２に示す。
【０１４２】
実験は、５００ｍｌのＳＦを使用し、最終容量を１２５ｍｌとして行った。１４日間の流加バイオプロセスの後、細胞を回収し、遠心分離し、ＰＥＳ膜で無菌的に濾過し、その後直ちに一段階工程のＡＣ精製にかけ、そして、ＳＥＣでＣ末端のα−アミド化を解析した。
【０１４３】
【表２】
2016527911.tif 000003
【０１４４】
前述した分析工程を実施した後、測定値をＤＯＥプログラムに挿入し、分析した。統計的に有意なα値を０．１００に設定した。このことは、Ｐ値が０．１００を超える因子は有意でないため、統計モードから除外したことを意味している。
【０１４５】
実施例７：高濃度のＳｅおよびＺｎによって培養細胞１リットル（Ｌ）あたりのタンパク質量（ｇ）が増加する
力価に関しては、ｐ値を０．０００１未満として有意な二次モデルを計算した。亜鉛のＰ値が０．００２９でセレンのＰ値が０．０００１未満と、試験した微量元素のうち２種だけが力価に対して有意な効果をもつと算出された。有意でない不適合検定も計算し（Ｐ値：０．１５０６）、また、「予想されるＲ二乗」（０．８２５１）は「調整済みＲ二乗」（０．９２８３）と適合する妥当な範囲にあった。「正確度（ＡｄｅｑＰｒｅｃｉｓｉｏｒ）」は１８．８５６と高い値が算出され、このことは、シグナル対ノイズ非が高いことを意味している。そのためこのモデルは、設計領域を決定するのに適していた。このモデルからは、亜鉛濃度を７μＭから１２μＭに上げると、力価が０．４ｇ／Ｌから０．６ｇ／Ｌを超えるまでに上昇する可能性があることが示唆された（図７）。セレンに関しては実施例１〜５の実験１で、セレン濃度を１０倍高くすることで力価を上げることが可能であることを示すことができた（図２）。発酵培地のセレン濃度は通常、約０．０１〜０．０６μＭの範囲であることが知られている。実施例６の実験２では、さらに高濃度のセレンについて試験した。３μＭの濃度では、セレンは細胞培養にとって有毒になり、生存率は８０％未満に低下した（データは示さない）。結果的に、３μＭを超える濃度のセレンによる負の影響によって、力価は低下した（図７）。従って、セレン濃度は毒性をもつ濃度よりも低い濃度に維持しなければならない。
【０１４６】
実施例８：低濃度のＣｕと高濃度のＳｅの併用によって、Ｃ末端α−アミド化Ｐｒｏは劇的に減少する
Ｃ末端のα−アミド化に関しては、Ｐ値を０．０００１として有意な二次モデルを計算した。試験した３種全ての因子（Ｚｎ、ＣｕおよびＳｅ）がＣ末端α−アミド化Ｐｒｏの量に有意な影響をもつと算出され、そのＰ値は、亜鉛が０．０１７７、銅が０．０００１未満、およびセレンのＰ値が０．０００２であった。有意でない不適合検定も計算し（Ｐ値０．３２３９）、その結果から、このモデルを予測ツールとして使用可能であることが示唆された。「正確度（ＡｄｅｑＰｒｅｃｉｓｉｏｒ）」は２０．３６３と高い値が算出され、このことは、シグナル対ノイズ非が高いことを意味している。そのためこのモデルは、設計領域を決定するのに適していた。このモデルからは、銅の濃度を下げると、Ｃ末端α−アミド化が有意に減少する可能性があることが示唆された。銅濃度を０．１８μＭ〜０．０６μＭに下げることで、Ｃ末端α−アミド化Ｐｒｏの量は２．２％から２．１％へとわずかに減少した。
【０１４７】
驚くことに、同時に、セレンがＰＡＭ酵素活性に負の影響をもつことも示された。セレン濃度を０．１７μＭから３．００μＭに上げるとＣ末端α−アミド化Ｐｒｏの量は２．２％から１．２６％に減少した（図８）。
【０１４８】
まとめると、Ｃ末端α−アミド化Ｐｒｏの量を１％未満に減少させるためには、銅の濃度を下げ、セレンの濃度を上げる必要があることを示すことができた。
【０１４９】
実施例９：高濃度のＺｎはＣ末端Ｌｙｓの量を減少させる
実施例６〜８の実験２で試験した微量元素のＣ末端Ｌｙｓ量への影響を解析するうちに、ＣＰ活性を制御する補助因子としての亜鉛の有意な重要性も検出された。ＣＰ活性に関しては、ｐ値を０．０００１未満として有意な二次モデルを計算した。亜鉛（Ｐ値０．０００１未満）がＣ末端Ｌｙｓの量に影響を及ぼす主要な要因であると算出された。ＣＰの活性について同様の効果が銅（Ｐ値０．００８０）およびセレン（Ｐ値０．００１４）にもあることも算出された。有意でない不適合検定も計算し（Ｐ値０．２８３０）、また、「予想されるＲ二乗」（０．９６６３）は「調整済みＲ二乗」（０．９９７７）と適合する妥当な範囲にあった。このことから、このモデルを予測ツールとして使用可能であることが示唆された。「正確度（ＡｄｅｑＰｒｅｃｉｓｉｏｒ）」は１００．９４２と高い値が算出され、このことは、シグナル対ノイズ非が高いことを意味している。そのため、このモデルは設計領域を決定するのに適していた。このモデルからは、亜鉛の濃度を０．１５μＭ〜５．００μＭに上げると、Ｃ末端Ｌｙｓの量が１５％から５％に減少することが示唆され（図９）、このことは亜鉛がＣＰの主要な活性化因子として作用する可能性があることを意味している。
【０１５０】
実施例１０：Ｃ末端アミド化Ｐｒｏ量を最大にし、かつ、Ｃ末端Ｌｙｓの量を最小にする
実施例２〜９で実験２を分析した後、ＤＯＥソフトウェアを使って数値およびグラフの最適化を行った。
【０１５１】
最初に、Ｃ末端アミド化Ｐｒｏの量を最小限にするためのモデルを検討した。銅を０．４μＭ、セレンを２．３μＭとし、高い望ましさ（０．８８２）を使って計算したプログラムでは、Ｃ末端アミド化Ｐｒｏの量は、９５％の確率で予測した０．７８％〜１．５２％の範囲に入る。
【０１５２】
第二の最適化手法として、Ｃ末端Ｌｙｓの量を最大にするためのモデルを検討した。亜鉛を３．６７μＭ、セレンを２．３μＭ、および銅を０．１８μＭとし、高い望ましさ（０．９２０）を使って計算したプログラムでは、Ｃ末端Ｌｙｓの量は９５％の確率で予測した１２．２７％〜１３．０２％の範囲に入る。
【０１５３】
ここから、２種類の新しい培地組成を作成した。算出した銅（０．４μＭ）およびセレン（２．３μＭ）の濃度の延長で、銅濃度が低く、セレン濃度が高い（カスタマイズされた本研究室の培地と比較して）発酵培地を作成し、ＳＦ系で、３つ組にして（in three parallels）試験した。全てのＳＦ法で、これまでの実験と同じ操作指標を用いた。銅濃度が低く、セレン濃度が高い培地で測定されたＣ末端α−アミド化Ｐｒｏの量は２．３３％±０．０９％で、予測した範囲よりもわずかに多かった。これらの結果を、本研究室の培地（２．０４μＭ銅および０．１７３μＭセレン）で生産された各タンパク質について想定した結果と比較すると、Ｃ末端α−アミド化Ｐｒｏの量は有意に減少していた（図１０Ａ）。
【０１５４】
ＣＰ活性を最適化する（つまり低下させる）ために、亜鉛濃度の低い培地を設計して３つ組にして試験し、変更を施していない本研究室の培地と比較した。２．３μＭの亜鉛を含有している培地を使用すると、ＣＰの活性は低下し、それによってＣ末端Ｌｙｓの量は１．９９％±０．０８％から１５．９７％±０．７９％に増加した（図１０Ｂ）。
【０１５５】
実施例１１：インビボのデータから、セレンが新規ＰＡＭ阻害剤であることが明らかになった
前述したＤＯＥ実験から、Ｃ末端α−アミド化のプロセスが、発酵プロセスの間に培地中に含まれる特定の微量元素によって厳密に制御されていると結論づけられた。末端のアミノ酸配列がプロリン−グリシン−リシンとなっているペプチドの場合、２つの酵素、すなわちＰＡＭおよびＣＰの作用が必要である。これまでの実験で、ＰＡＭ酵素の活性が、よく知られている補助因子である亜鉛および銅によってのみ制御されているのではないことを示すことができた。驚くことに、培地に含まれているセレンもＰＡＭ酵素の活性を有意に下げることが分かった。また、ＣＰ酵素の活性における亜鉛の重要性も示すことができた。
【０１５６】
最後に、得られたＳＦの結果をバイオリアクター（ＢＲ）環境でも試験した。全実験を５ＬのＢＲを使って行った。
【０１５７】
セレンがＰＡＭ活性に及ぼす影響について調べるために、２種類の培地組成について、すなわち、０．１７μＭのセレンを含む培地と２．３１μＭのセレンを含む培地について試験した。細胞培養の成長は２種類の培地で同等であり、生存率の有意な低下は検出されなかった。このことは、高濃度のセレンが細胞にとって有毒でないことを示している（図１１Ａ）。セレン濃度が高いと力価は１ｇ／Ｌに低下し（図１１Ｂ）、このことは、試験したセレン濃度は力価の低下を招くが、それでも増殖率には許容可能な濃度であることを意味している。高濃度のセレンは、Ｃ末端α−アミド化Ｐｒｏの量に主要な効果を示した。０．１７μＭのセレンを含有している培地中で組換えタンパク質を生産した場合、得られたペプチドは、Ｃ末端α−アミド化Ｐｒｏを９．３％含むが、２．３１μＭのセレンを含む培地を使った場合には、この量はわずか２．２５％であった（図１２）。
【０１５８】
得られた結果から、セレンがＰＡＭ酵素活性の新規阻害因子であることが分かった。従って、ＰＡＭ酵素の作用とそれに続くＣ末端α−アミド化Ｐｒｏの量を、発酵培地中に含まれる利用可能なセレンの濃度によって、インビボで（大規模なタンパク質生産の際にも）有意に制御することができる。
【０１５９】
亜鉛がＣＰ活性に及ぼす影響を調べるために、３種類の濃度、すなわち３．７μＭ、１１μＭおよび２２μＭの塩化亜鉛を試験した。細胞培養の成長は、２２μＭおよび１１μＭの濃度の亜鉛を含有している培地では同等であったが、３．７μＭの亜鉛を含有している培地で測定された成長は有意に低かった（図１３Ａ）。このことは、細胞への亜鉛の供給が不十分であったことに起因する成長の限界を示している。増殖率に関しては、亜鉛濃度が下がるにつれて、測定された増殖率も一貫して低下した。亜鉛濃度が最も高かった培地では、力価は３．８６ｇ／Ｌに達し、亜鉛濃度が１１μＭの培地の最終的な力価は２．９０ｇ／Ｌ、亜鉛濃度が最も低かった培地の最終力価はわずか１．８６ｇ／Ｌであった（図１３Ｂ）。
【０１６０】
亜鉛濃度を上げていくとＣ末端Ｌｙｓの量に有意な効果が現れることが測定された。組換えタンパク質を２２μＭの亜鉛を含有している培地中で生産した場合、得られたペプチドに含まれるＣ末端Ｌｙｓはわずか３．１５％であったが、３．７μＭの亜鉛を含有している培地ではＣ末端Ｌｙｓ含量は６％であった（図１４）。
【０１６１】
得られた結果から、亜鉛がＣＰ酵素の活性化因子であることが示された。亜鉛の濃度が上がるにつれてＣＰ酵素の活性がより高まり、その結果、Ｃ末端Ｌｙｓの量が減少する。逆に言うと、培地中の利用可能な亜鉛イオンの濃度を下げることによって、Ｃ末端Ｌｙｓの量を増やすことができる。その結果、Ｃ末端Ｌｙｓの量が増えたことで（間接的に）、Ｃ末端α−アミド化Ｐｒｏの量が減少する。
【０１６２】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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