(57)【要約】  ジアンヒドロガラクチトール製剤の分析のための改良された分析方法は、ジアンヒドロガラクチトールの純度を決定し、ジアンヒドロガラクチトールの製剤において不純物を検出する方法、並びに任意のそのような不純物を同定する方法を提供する。本発明の方法は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、特に、蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）を有するＨＰＬＣを使用し；ＨＰＬＣはタンデム質量分析により追跡されることができる。本発明の方法はさらに、ジアンヒドロガラクチトールの製剤に存在する少なくとも１つの特定の物質ピークの分取ＨＰＬＣ回収を実行するステップを含むことができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジアンヒドロガラクチトールの製剤に存在する不純物の存在及び量を分析する分析方法であって、ズルシトール及び製剤の他の汚染物質からジアンヒドロガラクチトールを分離する勾配移動相での溶出を使用して高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムでジアンヒドロガラクチトールの製剤をＨＰＬＣに供することにより前記製剤を分析するステップを含み；
前記高速液体クロマトグラフィーでは蒸発光散乱検出（ＥＬＤＳ）を用いる、分析方法。
【請求項２】
前記ＨＰＬＣカラムは、Ｃ１８化合物に結合されるシリカゲルカラムであり、ルイス酸−ルイス塩基の化学を用いるエンドキャッピング手法で仕上げられる、請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
溶出が、９５％水／５％アセトニトリルから７０％水／３０％アセトニトリルの勾配で行われ、９５％水／５％アセトニトリルに戻す、請求項１に記載の分析方法。
【請求項４】
溶離液を変化させるためのタイムスケジュールが次のようである、請求項３に記載の分析方法：０分、９５％水／５％アセトニトリル；１５分、９５％水／５％アセトニトリル；１５．１分、７０％水／３０％アセトニトリル；２０分、７０％水／３０％アセトニトリル；２０．１〜３５分、９５％水／５％アセトニトリル。
【請求項５】
前記方法は、ジアンヒドロガラクチトールのモノエポキシドの分解産物、モノエポキシドの二量体、及びズルシトールを検出する、請求項１に記載の分析方法。
【請求項６】
さらに前記方法はジアンヒドロガラクチトールの二量体と濃縮生成物を検出する、請求項５に記載の分析方法。
【請求項７】
ＨＰＬＣに起因するピークがＬＣ−ＭＳによって分析される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
さらに前記方法はジアンヒドロガラクチトール自体以外の化合物を表す高速液体クロマトグラフィーによって決定される１つ以上のピークの相対濃度を決定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記カラム温度は約３０℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
流速は約０．５ｍＬ／分である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＥＬＳＤ検出器は、３５℃のドリフト管温度及びゲイン４００、２ｐｐｓ、４５ＰＳＩの冷却モードで操作される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
移動相Ａ及び移動相Ｂが、０．０５％ギ酸／水である移動相Ａ及び１００％メタノールである移動相Ｂと一緒に使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
溶出が１００％の０．０５％ギ酸／水を用いて０分〜２５分、９０％の０．０５％ギ酸／水及び１０％の１００％メタノールを用いて２５分〜２５．１分、１０％の０．０５％ギ酸／水及び９０％の１００％メタノールを用いて２５．１分〜３５分、及び１００％の０．０５％ギ酸／水を用いて３５．１分〜５０分で行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
さらに前記方法は不純物に対する外部較正標準曲線の作成を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法はさらに、不純物に対する外部較正標準曲線の作成を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記不純物がズルシトール、ジアンヒドロガラクチトールのモノエポキシドの分解産物、及びジアンヒドロガラクチトールの二量体からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記不純物がズルシトール、ジアンヒドロガラクチトールのモノエポキシドの分解産物、及びジアンヒドロガラクチトールの二量体からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
未知の不純物について、該未知の不純物の含有量がジアンヒドロガラクチトールの基準物質のクロマトグラフィーによって確立される較正標準曲線を使用して推定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
未知の不純物について、該未知の不純物の含有量がジアンヒドロガラクチトールの基準物質のクロマトグラフィーによって確立される較正標準曲線を使用して推定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
溶出シーケンスの後に、追加の溶出シーケンスが次のように行われる、請求項１３に記載の方法：１００％の０．０５％ギ酸を用いて０分〜７．５分；９７％の０．０５％ギ酸及び３％のメタノールを用いて７．５分〜７．６分；及び１００％の０．０５％ギ酸を用いて７．６分〜２０分。
【請求項２１】
ＨＰＬＣ用カラム温度は約３０℃であり、ＨＰＬＣ用試料温度は約５℃であり、ＨＰＬＣ用流速は約０．５ｍＬ／分であり、及び注入量は約１０〜１００μＬである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＥＬＳＤについて、ゲインは約４００であり、ドリフト管温度は約４５℃であり、ガス圧は窒素の約３５ＰＳＩであり、ネブライザーは冷却に設定され、データ転送速度は毎秒２ポイントであり、及びレイリー（Ｒａｙｌｅｉｇｈ）係数は約６．０である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
２．０％ズルシトール、１．６％ズルシトール、１．０％ズルシトール、０．６０％ズルシトール、０．２０％ズルシトール、及び０．１０％ズルシトールの標準がシステムの感度及び線形性を決定するために使用される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
ズルシトールの保持時間は約６．４分であり、ジアンヒドロガラクチトールの保持時間は約１２．１分である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
ズルシトール不純物の量及びパーセンテージがＨＰＬＣ及びＥＬＳＤの結果から決定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
ズルシトール以外の未知の不純物の量及びパーセンテージがＨＰＬＣ及びＥＬＳＤの結果から決定される、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
この出願は、Ｘｉａｏｙｕｎ及びＭｉｋｅ Ｌｉによる、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ ｉｎ Ｄｉａｎｈｙｄｒｏｇａｌａｃｔｉｔｏｌ（ジアンヒドロガラクチトール中の不純物を分析及び決定する改良された分析方法）」と題し、２０１３年１１月１８日に出願された米国特許出願番号第１４／０８３，１３５号の利益を主張し、それは、その利益を主張され、Ｘｉａｏｙｕｎ Ｌｕによる、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ ｉｎ Ｄｉａｎｈｙｄｒｏｇａｌａｃｔｉｔｏｌ（ジアンヒドロガラクチトール中の不純物を分析及び決定する改良された分析方法）」と題し、２０１３年７月２日に出願された、一部継続の米国特許出願番号第１３／９３３，８４４号であり、それは順番に利益を主張され、Ｘｉａｏｙｕｎ Ｌｕによって、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ ｉｎ Ｄｉａｎｈｙｄｒｏｇａｌａｃｔｉｔｏｌ（ジアンヒドロガラクチトール中の不純物を分析及び決定する改良された分析方法）」と題し、２０１３年２月２６日に米国を指定して出願された一部継続のＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＩＢ２０１３／０００７９３号であり、順番に、Ｘｉａｏｙｕｎ Ｌｕによって、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ ｉｎ Ｄｉａｎｈｙｄｒｏｇａｌａｃｔｉｔｏｌ（ジアンヒドロガラクチトール中の不純物を分析及び決定する改善された分析方法）」と題し、２０１２年２月２７日に出願された米国仮出願番号第６１／６０３，４６４号の利益を主張される。これらの出願の全ての内容は、この参照により、それらの全体が本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
この発明は、特に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む、ジアンヒドロガラクチトールの改善された分析方法を対象とする。
【背景技術】
【０００３】
ジアンヒドロガラクチトール（１，２：５，６ジアンヒドロガラクチトール又はＤＡＧ）は、化学療法活性を含む有意な薬理学的活性を有する多くのヘキシトール又はヘキシトール誘導体のうちの１つである。特に、ジアンヒドロガラクチトールは、Ｎｉｅｌｓｅｎへの米国特許第７，１５７，０５９号のような化学療法で使用するために提案されており、この参照により本明細書中に組み込まれる。
【０００４】
ジアヒロドガラクチトールは、多くの新生物に対して活性を有する。しかしながら、ジアンヒドロガラクチトールが治療剤として、首尾よく使用される場合、極めて高い純度及び不純物の除去が必須である。不純物の存在は、望ましくない副作用をもたらし得る。一つの例が数年前に発生し、不純物がアミノ酸のトリプトファンのバッチの中に存在する場合、タンパク質の正常な構成物質は、好酸球増加筋痛症候群のかなりの大流行の原因となり、不可逆的な障害と少なくとも３７人の死亡の非常に多くの事例を引き起こした。ジアンヒドロガラクチトールのような治療剤が免疫不全や肝臓又は腎臓機能障害を有する患者、又は高齢の患者に使用すべきである場合、これは特に重要である。そのような患者は、汚染物質に対する感受性に起因する望ましくない副作用の高い発生を経験するかもしれない。
【０００５】
ジアンヒドロガラクチトールの製剤に見られる不純物の一つは、ズルシトールである。他の不純物は、それらの調製方法に応じて、同様にジアンヒドロガラクチトールの製剤に存在する。
【０００６】
したがって、ジアンヒドロガラクチトールが治療目的で投与される場合、副作用を誘発する可能性のより低い高純度の製剤を提供するための、ジアンヒドロガラクチトールの製剤における不純物及び分解産物を検出するための改善された分析方法の必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
それらのニーズを満たすジアンヒドロガラクチトールの製剤においてジアンヒドロガラクチトールの純度を決定し、不純物及び分解産物を検出する方法は、本明細書中に記載される。
【０００８】
一般的に、この分析方法は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、特に、屈折率（ＲＩ）検出を有するＨＰＬＣを使用する。
【０００９】
一つの代替手段において、ジアンヒドロガラクチトールの製剤において存在する不純物の存在及び量を分析するための分析方法は、以下のステップを含む：
（１）ズルシトール及び製剤の他の汚染物質からジアンヒドロガラクチトールを分離する勾配移動相での溶出を使用してジアンヒドロガラクチトールの製剤を高速液体クロマトグラフィーに供することにより前記製剤を分析するステップ；及び
（２）ジアンヒドロガラクチトール自体以外の化合物を表す高速液体クロマトグラフィーによって決定される１つ以上のピークの相対濃度を決定するステップ。
【００１０】
ジアンヒドロガラクチトール自体以外の化合物は、（１）ズルシトール；（２）ズルシトール以外の不純物；及び（３）ジアンヒドロガラクチトールの分解産物、の少なくとも１つであり得る。
【００１１】
この方法の一つの代替手段において、溶出は、約２．５ｍＭ〜約０．１ｍＭのＮａＯＨの勾配である。好ましくは、溶出は、約１．５ｍＭ〜約０．１ｍＭのＮａＯＨの勾配である。さらに好ましくは、溶出は、約１ｍＭ〜約０．１ｍＭのＮａＯＨの勾配である。
【００１２】
この方法の別の代替手段において、溶出は、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウム及び酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩の組み合わせの勾配であり、ギ酸アンモニウムと酢酸アンモニウムの総濃度は、約２．５ｍＭ〜約０．１ｍＭである。好ましくは、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウム及び酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩の総濃度は、約１．５ｍＭ〜約０．１ｍＭである。さらに好ましくは、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウム及び酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩の総濃度は、約１ｍＭ〜約０．１ｍＭである。典型的には、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウム及び酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩の割合は、溶出開始時の約１００：１から溶出終了時の１：１００に変化する。
【００１３】
典型的にこの方法において、ジアンヒドロガラクチトール自体以外の化合物を表す高速液体クロマトグラフィーによって決定される１つ以上のピークの相対濃度を決定するステップは、蒸発光散乱検出によって行われる。典型的に、蒸発光散乱検出はエレクトロスプレーＬＣ／ＭＳに対応する。典型的に、蒸発光散乱検出は１００％水性移動相の蒸発を促進する揮発性溶媒のポストカラム添加を含む。典型的に、揮発性溶媒はメタノール、エタノール、イソプロパノール、及びアセトニトリルからなる群から選択される。
【００１４】
一つの代替手段において、エレクロロスプレータンデム質量分析計がインストールされ、ＥＬＳＤを有するＨＰＬＣシステムにオンラインで接続される。典型的にこの代替手段において、ジアンヒドロキシガラクチトールの製剤で存在しうる各不純物に対する化学情報を提供する質量スペクトルデータが収集される。また、典型的にこの代替手段において、ジアンヒドロキシガラクチトールの製剤で存在しうる各不純物に対する構造情報を提供するタンデム質量スペクトルデータが、収集される。
【００１５】
本発明の方法はさらに、ジアンヒドロガラクチトールの製剤で存在する少なくとも１つの特定の物質のピークの分取ＨＰＬＣを実施するステップを含むことができる。ジアンヒドロガラクチトールの製剤に存在する少なくとも１つの物質ピークは、不純物であることができる。
【００１６】
別の代替手段において、勾配溶出の代わりに、アイソクラチック（定組成）溶出を使用することができる。アイソクラチック溶出が使用される場合、一般的に、本発明の方法は、以下のステップを含む：
（１）ズルシトール及び製剤の他の汚染物質からジアンヒドロガラクチトールを分離するアイソクラチック移動相での溶出を使用してジアンヒドロガラクチトールの製剤を高速液体クロマトグラフィーに供することにより前記製剤を分析するステップ；及び
（２）ジアンヒドロガラクチトール自体以外の化合物を表す高速液体クロマトグラフィーによって決定される１つ以上のピークの相対濃度を決定するステップ。
【００１７】
一つの代替手段において、アイソクラチック溶出を使用する場合、アイソクラチック移動相は、ＮａＯＨであり、ＮａＯＨの濃度は、約５ｍＭ〜約０．１ｍＭである。好ましくは、ＮａＯＨの濃度は、約２．５ｍＭ〜約０．１ｍＭである。さらに好ましくは、ＮａＯＨの濃度は、約１ｍＭである。
【００１８】
別の代替手段において、アイソクラチック溶出を使用する場合、アイソクラチック移動相は、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウム及び酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩の組み合わせであり、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウム及び酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩の総濃度は、約５ｍＭ〜０．１ｍＭである。好ましくは、水酸化アンモニウムと揮発性酢酸アンモニウムの総濃度は、約２．５ｍＭ〜約０．１ｍＭである。さらに好ましくは、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウム及び酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩の総濃度は、約１ｍＭである。典型的に、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウム及び酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩の割合は、約５０：５０である。
【００１９】
典型的にこの代替手段において、ジアンヒドロガラクチトール自体以外の化合物を表す高速液体クロマトグラフィーによって決定される１つ以上のピークの相対濃度を決定するステップは、上記のように、蒸発光散乱検出（ＥＬＳＤ）によって行われる。典型的に、蒸発光散乱検出は、エレクトロスプレーＬＣ／ＭＳに適合する。典型的に、蒸発光散乱検出は、１００％水性移動相の蒸発を促進する揮発性溶媒のポストカラム添加を含む。典型的に、揮発性溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、及びアセトニトリルからなる群から選択される。
【００２０】
同様にこの代替手段において、エレクトロスプレータンデム質量分析計がインストールされ、ＥＬＳＤを有するＨＰＬＣシステムにオンラインで接続される。典型的にこの代替手段において、ジアンヒドロキシガラクチトールの製剤において存在しうる各不純物に対する化学情報を提供する質量スペクトルデータが収集される。また、典型的にこの代替手段において、ジアンヒドロキシガラクチトールの製剤において存在しうる各不純物に対する構造情報を提供するタンデム質量スペクトルデータが、収集される。
【００２１】
本発明に係る方法のこの代替手段はさらに、ジアンヒドロガラクチトールの製剤に存在する少なくとも１つの特定物質のピークのＨＰＬＣ回収を実施するステップを含む。ジアンヒドロガラクチトールの製剤において存在する少なくとも１つの物質ピークは、不純物であることができる。
【００２２】
さらに別の代替手段において、ジアンヒドロガラクチトールの製剤において存在する不純物の存在及び量を分析するための分析方法は、ズルシトール及び製剤の他の汚染物質からジアンヒドロガラクチトールを分離する勾配移動相での溶出を使用して高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）でジアンヒドロガラクチトールの製剤をＨＰＬＣに供することにより前記製剤を分析するステップを含み；
前記高速液体クロマトグラフィーでは蒸発光散乱検出（ＥＬＳＤ）を用いる。
【００２３】
典型的に、ＨＰＬＣカラムは、Ｃ１８化合物に結合されるシリカゲルカラムであり、ルイス酸−ルイス塩基の化学を用いるエンドキャッピング手法で仕上げられる。
【００２４】
典型的に、溶出は、９５％水／５％アセトニトリルから７０％水／３０％アセトニトリルの勾配で行われ、９５％水／５％アセトニトリルに戻す。典型的に、溶離液を変化させるためのタイムスケジュールは、次の通りである：０分、９５％水／５％アセトニトリル；１５分、９５％水／５％アセトニトリル；１５．１分、７０％水／３０％アセトニトリル；２０分、７０％水／３０％アセトニトリル；２０．１〜３５分、９５％水／５％アセトニトリル。典型的に、本発明の方法は、ジアンヒドロガラクチトールのモノエポキシドの分解産物、モノエポキシドの二量体、及びズルシトールを検出する。好ましくは、本発明の方法はまた、ジアンヒドロガラクチトールの二量体と濃縮生成物を検出する。
【００２５】
典型的に、ＨＰＬＣに起因するピークがＬＣ−ＭＳによって分析される。
【００２６】
典型的に、本発明の方法はさらに、ジアンヒドロガラクチトール自体以外の化合物を表す高速液体クロマトグラフィーによって決定される１つ以上のピークの相対濃度を決定するステップを含む。
【００２７】
ＥＬＳＤによる検出の代替手段において、典型的に、カラム温度は約３０℃である。
【００２８】
典型的に、流速は約０．５ｍＬ／分である。典型的に、ＥＬＳＤ検出器が３５℃のドリフト管温度及びゲイン４００、２ｐｐｓ、４５ＰＳＩの冷却モードで操作される。典型的にこの代替手段において、移動相Ａ及び移動相Ｂが、０．０５％ギ酸／水である移動相Ａ及び１００％メタノールである移動相Ｂと一緒に使用される。典型的に、これらの移動相を用いて、溶出が１００％の０．０５％ギ酸／水を用いて０分〜２５分、９０％の０．０５％ギ酸／水及び１０％の１００％メタノールを用いて２５分〜２５．１分、１０％の０．０５％ギ酸／水及び９０％の１００％メタノールを用いて２５．１分〜３５分、及び１００％の０．０５％ギ酸／水を用いて３５．１分〜５０分で行われる。
【００２９】
本発明の方法はさらに、不純物に対する外部較正標準曲線の作成を含む。不純物がズルシトール、ジアンヒドロガラクチトールのモノエポキシドの分解産物、及びジアンヒドロガラクチトールの二量体からなる群から選択される。本発明の方法は、ジアンヒドロガラクチトールの基準物質のクロマトグラフィーによって確立される較正標準曲線を使用して未知の不純物の含有量を推定することができる。
【００３０】
ＨＰＬＣ及びＥＬＳＤを使用する別の代替手段は、二重の溶出シーケンスを使用する。二重の溶出シーケンスは次の通りである：溶出シーケンスの最初の部分では、溶出は、１００％の０．０５％ギ酸／水を用いて０分〜２５分、９０％の０．０５％ギ酸／水及び１０％の１００％メタノールを用いて２５分〜２５．１分、１０％の０．０５％ギ酸／水及び９０％のメタノールを用いて２５．１分〜３５分、及び１００％の０．０５％ギ酸／水を用いて３５．１分〜５０分行われ、及び溶出シーケンスの第２の部分では、溶出は次の通りに行われる：１００％の０．０５％ギ酸を用いて０分〜７．５分；９７％の０．０５％ギ酸及び３％のメタノールを用いて７．５分〜７．６分、及び１００％の０．０５％ギ酸を用いて７．６分〜２０分。この代替手段において、典型的に、ＨＰＬＣ用カラム温度は約３０℃であり、ＨＰＬＣ用試料温度は約５℃であり、ＨＰＬＣ用流速は約０．５ｍＬ／分であり、及び注入量は約１０〜１００μＬである。この代替手段において、典型的に、ＥＬＳＤについて、ゲインは約４００であり、ドリフト管温度は約４５℃であり、ガス圧は窒素の約３５ＰＳＩであり、ネブライザーは冷却に設定され、データ転送速度は毎秒２ポイントであり、及びレイリー（Ｒａｙｌｅｉｇｈ）係数は約６．０である。典型的にこの代替手段において、０．１、０．０８、０．０５、０．０３、０．０１、０．００５ｍｇ／ｍＬのズルシトールの標準がシステムの感度及び線形性を決定するために使用される。典型的にこの代替手段において、ズルシトールの保持時間は約６．４分であり、ジアンヒドロガラクチトールの保持時間は約１２．１分である。この代替手段において、ズルシトール不純物の量及びパーセンテージがＨＰＬＣ及びＥＬＳＤの結果から決定されることができる。また、この代替手段において、ズルシトール以外の未知の不純物の量及びパーセンテージがＨＰＬＣ及びＥＬＳＤの結果から決定されることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
本発明のこれら及び他の特徴、態様、及び利点は、以下の説明、添付の特許請求の範囲、及び添付の図面を参照してよく理解されるだろう：
【００３２】
【図１】図１は、バルク薬物及び薬物製品において、ＲＲＴ約０．６でズルシトール及び未知の関連物質の分解を示すジアンヒドロガラクチトールの製剤の代表的なＨＰＬＣ／ＲＩクロマトグラムである。
【００３３】
【図２】図２は、比較、水ブランクについて、標準におけるジアンヒドロガラクチトールの分解とズルシトールを示す代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを示し；図２において、ジアンヒドロガラクチトール−ズルシトール標準は、トップパネルに示され、水ブランクは、下のパネルに示される。
【００３４】
【図３】図３は、分解産物としてモノエポキシドとズルシトールと共に可能なジアンヒドロガラクチトール二量体と可能な濃縮生成物の存在を示す検出用蒸発散乱交検出を使用するジアンヒドロガラチトールの臨床サンプルのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【００３５】
【図４】図４は、図３のＨＰＬＣクロマトグラムの２２．６分に発生する不純物ピークの質量分析のプロファイルである。
【００３６】
【図５】図５は、移動相Ａとして０．０５％ギ酸／水及び移動相Ｂとして１００％メタノールを使用して例３で行われるような、ジアンヒドロガラクチトールのサンプルのクロマトグラムである。
【００３７】
【図６】図６は、例４で行われるようなブランク溶液の例のクロマトグラムである。
【００３８】
【図７】図７は、例４で行われるような０．１０％ズルシトール溶液の例のクロマトグラムである。
【００３９】
【図８】図８は、例４で行われるような試験溶液の例のクロマトグラムである。
【発明の詳細な説明】
【００４０】
本発明は、ジアンヒドロガラクチトールの純度を決定し、ジアンヒドガラクチトールの製剤において存在する不純物の存在と濃度を決定するための改良された分析方法を対象とする。
【００４１】
ジアンヒドロガラクチトールの構造は、式（Ｉ）で以下に示される。
【化１】
2016538574.tif 000003
【００４２】
ジアンヒドロガラクチトールの製剤において存在する重要な不純物の一つは、ズルシトールである。ズルシトールの構造を以下の式（ＩＩ）に示す。他の不純物は、ジアンヒドロキシガラクチトールの製剤において存在することが知られている。
【化２】
2016538574.tif 000004
【００４３】
ジアンヒドロガラクチトールの製剤を分析する改良された方法は、蒸発光散乱検出（ＥＬＤＳ）を用いるＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）に基づく。一つの代替手段において、そのようなジアンヒドロガラクチトールの製剤に存在する全ての重要な成分を検出し、同定するために、ＨＰＬＣは、質量分析法（ＭＳ）と組み合わされる。
【００４４】
ＨＰＬＣの理論と実践は、Ｌ.Ｒ. Ｓｎｙｄｅｒら、「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍｏｄｅｒｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（現代の液体クロマトグラフィー入門）」（第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ, ２００９年）に記載される。ＭＳの理論と実践は、Ｅ. ｄｅ Ｈｏｆｆｍａｎｎ ＆ Ｖ. Ｓｔｒｏｏｂａｎｔ、「Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（質量分析：原理と応用）」（第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ, ２００７年）で記載される。
【００４５】
ＨＰＬＣ法は、ＲＲＴ０．６で観察される未知の関連物質の分解に加え、ジアンヒドロガラクチトールの製剤において、合成中間体の分解、ズルシトールを示した（図１）。図１は、ジアンヒドロガラクチトールの製剤の代表的なＨＰＬＣ／ＲＩクロマトグラムであり、バルク薬物と薬物製品におけるＲＲＴ約０．６でズルシトールと未知の関連物質の分解を示す。比較、水ブランクについて、標準でジアンヒドロガラクチトールとズルシトールの分解を示す代表的なＨＬＰＣクロマトグラムは、図２に示される。図２において、ジアンヒドロガラクチトール−ズルシトール標準は、トップパネルに示され、水ブランクは、下のパネルに示される。
【００４６】
本出願は、潜在的に共溶出物質の分解について改良されたクロマトグラフィー条件を示す。熱的ストレスのジアンヒドロガラクチトール生成物サンプルは、ズルシトールの分解及び他の関連不純物及び分解産物の適切なクロマトグラフィー条件の確認を提供するために評価される。その後、ＬＣ／ＭＳ及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳが行われてＲＲＴ約０．６で未知のＤＡＧ関連物質が特徴付けられ、この未確認成分の質量スペクトル特徴付け及び化学構造の決定を提供する。
【００４７】
以前に用いたＨＰＬＣ条件は、５０ｍＭのＮａＯＨ移動相を使用してジアンヒドロガラクチトールとその関連物質のアイソクラチック溶出を含む。これらの条件の改良において、本明細書中で開示される本発明の方法の一部として用いられるように、勾配移動相が使用される。一つの代替手段は、濃度勾配におけるＮａＯＨの使用である。ＮａＯＨが濃度勾配で使用される場合、典型的に、溶出は、約２．５ｍＭ〜約０．１ｍＭのＮａＯＨの勾配である。好ましくは、溶出は、約１．５ｍＭ〜約０．１ｍＭのＮａＯＨの勾配である。さらに好ましくは、溶出は、約１ｍＭ〜約０．１ｍＭのＮａＯＨの勾配である。
【００４８】
別の代替手段において、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウム及び酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩の組み合わせは、溶離液として使用されることができる。この代替手段において、ギ酸アンモニウム及び酢酸アンモニウムの総濃度は、約２．５ｍＭ〜約０．１ｍＭである。好ましくは、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウム及び酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩の総濃度は、約１．５ｍＭ〜約０．１ｍＭである。さらに好ましくは、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウム及び酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩の総濃度は、約１ｍＭ〜約０．１ｍＭである。典型的には、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウム及び酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩の割合は、溶出の開始時に１００：１から溶出の終了時に１：１００に変化する。
【００４９】
他の勾配溶出スキームが当該分野で公知である。
【００５０】
典型的に、本発明に係るＨＰＬＣ分析方法において、検出は、蒸発光散乱（ＥＬＳＤ）によるものである。蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）は、カラム溶出液を霧化し、得られた粒子成分に光を照射し、得られた散乱光を検出する。理論的に、ＥＬＳＤは、任意の非揮発性成分を検出することができる。非発色性化合物の蒸発光散乱検出は、光散乱検出のための噴霧溶質粒子を生成するために、ＨＰＬＣ溶離液の噴霧及び移動相溶媒の蒸発に基づく。噴霧溶質粒子を生成するためのこの蒸発と溶媒蒸発法は、エレクトロスプレーＬＣ／ＭＳ手法と同等である。典型的に、ＥＬＳＤ検出は、エレクトロスプレーＬＣ／ＭＳに適合する。
【００５１】
エレクトロスプレーＬＣ／ＭＳアプリケーションに適合するＥＬＳＤ検出を用いるＨＰＣ法の実施は、１００％水性移動相の蒸発を促進する揮発性溶媒のポストカラム添加を含む。揮発性溶媒は、典型的に、メタノール、エタノール、イソプロパノール、及びアセトニトリルからなる群から選択される。
【００５２】
したがって、本発明に係る方法において、エレクトロタンデム質量分析計がインストールされ、ＥＬＳＤを有するＨＰＬＣシステムにオンライン接続される。分子情報を提供する質量スペクトルデータ及びジアンヒドロガラクチトールの製剤において存在しうる各不純物に対す化学構造情報を提供するタンデム質量スペクトルデータが収集されることができる。ＨＰＬＣを用いるタンデムにおける質量分析法は、各観察される不純物と分解産物に対する分子イオン情報と一致する分子量を有する分子イオン情報と可能な化学構造を提供するだろう。
【００５３】
別の代替手段において、ＤＡＧの製剤において存在する不純物を含む、特定のＤＡＧ関連物質ピークの分取ＨＰＬＣ回収が行われることができる。
【００５４】
したがって、ジアンヒドロガラクチトールの製剤において存在する不純物の存在及び量を分析する分析方法は、以下のステップを含む：
（１）ズルシトール及び製剤の他の汚染物質からジアンヒドロガラクチトールを分離する勾配移動相での溶出を使用してジアンヒドロガラクチトールの製剤を高速液体クロマトグラフィーに供することにより前記製剤を分析するステップ；及び
（２）ジアンヒドロガラクチトール自体以外の化合物を表す高速液体クロマトグラフィーによって決定される１つ以上のピークの相対濃度を決定するステップ。
【００５５】
ジアンヒドロガラクチトール自体以外の化合物は、少なくとも：（１）ズルシトール；（２）ズルシトール以外の不純物；及び（３）ジアンヒドロガラクチトールの分解産物であることができる。
【００５６】
典型的に、一つの代替手段において、この方法において、移動相勾配は、水酸化ナトリウムの勾配である。
【００５７】
別の代替手段において、この方法において、移動相勾配は、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウム及び酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アンモニウム塩の組み合わせの勾配である。
【００５８】
典型的にこの方法において、検出は蒸発光散乱による。典型的に、蒸発光散乱を用いる場合、本発明の方法はさらに、移動相の成分の蒸発を促進する揮発性溶媒のポストカラム添加のステップを含む。
【００５９】
典型的に、本発明はさらに、エレクトロスプレータンデム質量分析法による高速液体クロマトグラフィーから溶出する１つ以上のピークを分析するステップを含む。
【００６０】
一つの代替手段において、本発明はさらに、少なくとも１つの特定のＤＡＧ関連物質ピークの分取ＨＰＬＣ回収のステップを含む。
【００６１】
不純物又は分解産物（ズルシトール以外）が存在する場合、未知の不純物又は分解産物は、カラムクロマトグラフィーによる分離によって同定することができ、次に、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、質量分析（ＭＳ）、フーリエ変換赤外分光（ＦＴ−ＩＲ）、元素分析、ＨＰＬＣによる純度の決定、及びカールフィッシャー滴定法による水分の含有量の決定からなる群から選択される少なくとも１つの標準分析手法によって同定のために特徴付けられることができる固体の未知サンプルを得るために少なくとも１つの精製手法に続く。これらの方法は、当該分野で周知である。
【００６２】
別の代替手段において、本発明の方法は：
（１）ズルシトール及び製剤の他の汚染物質からジアンヒドロガラクチトールを分離するアイソクラチック移動相での溶出を使用してジアンヒドロガラクチトールの製剤を高速液体クロマトグラフィーに供することにより前記製剤を分析すること；及び
（２）ジアンヒドロガラクチトール自体以外の化合物を表す高速液体クロマトグラフィーによって決定される１つ以上のピークの相対濃度を決定することを含む。
【００６３】
勾配溶出を使用する方法のように、ジアンヒドロガラクチトール自体以外の化合物は、：（１）ズルシトール；（２）ズルシトール以外の不純物；及び（３）ジアンヒドロガラクチトールの分解産物のうちの少なくとも一つであることができる。
【００６４】
この代替手段において、アイソクラチック移動相を用いる溶出は、水酸化ナトリウムを用いる溶出又は水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウム及び酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アモニウム塩の組み合わせを用いる溶出のいずれかであることができる。アイソクラチック移動相が水酸化ナトリウムの場合、典型的に、ＮａＯＨの濃度は、約５ｍＭ〜約０．１ｍＭである。好ましくは、ＮａＯＨの濃度は、約２．５ｍＭ〜約０．１ｍＭである。さらに好ましくは、ＮａＯＨの濃度は、約１ｍＭである。アイソクラチック移動相が、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウム及び酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アモニウム塩の組み合わせである場合、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウム及び酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アモニウム塩の組み合わせの総濃度は、約５ｍＭ〜約０．１ｍＭである。好ましくは、水酸化アンモニウムと揮発性酢酸アンモニウムの総濃度は、約２．５ｍＭ〜約０．１ｍＭである。さらに好ましくは、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウム及び酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アモニウム塩の総濃度は、約１ｍＭである。典型的に、水酸化アンモニウムとギ酸アンモニウム及び酢酸アンモニウムからなる群から選択される揮発性アモニウム塩の割合は、約５０：５０である。
【００６５】
分解を改良する代替方法において、改変された溶出条件を用いて蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）が用いられる。典型的に、この方法において、ＨＰＬＣカラムは、Ｃ１８化合物に結合されるシリカゲルカラムであり、ＹＭＣ  Ｃ１８カラムのようなルイス酸−ルイス塩基の化学を用いるエンドキャッピング手法で仕上げられる。典型的に、溶出は、９５％水／５％アセトニトリルから７０％水／３０％アセトニトリルの勾配で行われ、９５％水／５％アセトニトリルに戻される。好ましくは、溶離液を変化させるためのタイムスケジュールが次のようである：０分、９５％水／５％アセトニトリル；１５分、９５％水／５％アセトニトリル；１５．１分、７０％水／３０％アセトニトリル；２０分、７０％水／３０％アセトニトリル；２０．１〜３５分、９５％水／５％アセトニトリル。好ましくは、ＨＰＬＣ法は、ジアンヒドロガラクチトールのモノエポキシド分解産物、モノエポキシド二量体、及びズルシトールを検出する。さらに好ましくは、ＨＰＬＣ法はまた、ジアンヒドロガラクチトールの二量体及び濃縮生成物を検出する。
【００６６】
好ましくは、本発明の方法のこの代替手段において、ＨＰＬＣから得られたピークは、ＬＣ−ＭＳによって分析される。
【００６７】
別の代替手段において、例３で示すように、アトランティス（Ａｔｌａｎｔｉｓ）ＨＰＬＣカラムが使用される。典型的にこの方法において、カラム温度は約３０℃である。典型的にこの方法において、流速は約０．５ｍＬ／分である。典型的にこの方法において、注入量は約１０μＬ〜約１００μＬである。典型的にこの方法において、ＥＬＳＤ検出器が使用される。典型的にこの方法において、ＥＬＳＤ検出器は３５℃のドリフト管温度及びゲイン４００、２ｐｐｓ、４５ＰＳＩの冷却モードで操作される。典型的にこの方法において、移動相Ａ及び移動相Ｂは０．０５％ギ酸／水である移動相Ａ及び１００％メタノールである移動相Ｂと一緒に使用される。典型的にこの方法において溶出は、１００％の０．０５％ギ酸／水を用いて０分〜２５分、９０％の０．０５％ギ酸／水及び１０％の１００％メタノールを用いて２５分〜２５．１分、１０％の０．０５％ギ酸／水及び９０％の１００％メタノールを用いて２５．１分〜３５分、及び１００％の０．０５％ギ酸／水を用いて３５．１分〜５０分で行われる。
【００６８】
典型的に、本発明の代替手段はさらに、不純物に対する外部較正標準曲線の作成を含む。不純物がズルシトール、ジアンヒドロガラクチトールのモノエポキシドの分解産物、及びジアンヒドロガラクチトールの二量体からなる群から選択されることができるが、限定されない。この方法において、未知の不純物について、未知の不純物の含有量がジアンヒドロガラクチトールの基準物質のクロマトグラフィーによって確立される較正標準曲線を使用して推定されることができる。
【００６９】
別の代替手段において、例４で示されるように、上記の溶出シーケンスの後に、つまり溶出は、１００％の０．０５％ギ酸／水を用いて０分〜２５分、９０％の０．０５％ギ酸／水及び１０％の１００％メタノールを用いて２５分〜２５．１分、１０％の０．０５％ギ酸／水及び９０％の１００％メタノールを用いて２５．１分〜３５分、１００％の０．０５％ギ酸／水を用いて３５．１分〜５０分行われ、さらなる溶出シーケンスが次のように行われる：１００％の０．０５％ギ酸を用いて０分〜７．５分；９７％の０．０５％ギ酸及び３％のメタノールを用いて７．５分〜７．６分；及び１００％の０．０５％ギ酸を用いて７．６分〜２０分。この代替手段において、典型的に、ＨＰＬＣ用カラム温度は約３０℃であり、ＨＰＬＣ用試料温度は約５℃であり、ＨＰＬＣ用流速は約０．５ｍＬ／分であり、及び注入量は約１００μＬである。典型的にこの代替手段において、ＥＬＳＤについて、ゲインは約４００であり、ドリフト管温度は約４５℃であり、ガス圧は窒素の約３５ＰＳＩであり、ネブライザーは冷却に設定され、データ転送速度は毎秒２ポイントであり、及びレイリー（Ｒａｙｌｅｉｇｈ）係数は約６．０である。典型的にこの代替手段において、０．００５〜０．１ｍｇ／ｍＬでズルシトールの基準がシステムの感度及び線形性を決定するために使用される。典型的にこの代替手段において、ズルシトールの保持時間は約６．４分であり、ジアンヒドロガラクチトールの保持時間は約１２．１分である。この代替手段において、ズルシトール不純物の量及びパーセンテージがＨＰＬＣ及びＥＬＳＤの結果から決定されることができる。また、この代替手段において、ズルシトール以外の未知の不純物の量及びパーセンテージがＨＰＬＣ及びＥＬＳＤの結果から決定されることができる。
【００７０】
本発明を以下の実施例により説明する。これらの実施例は、単に例示目的のためであり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００７１】
例１ アイソクラティック水酸化ナトリウムの溶出を使用するジアンヒドロガラクチトール製剤のＨＰＬＣ分析
この例で記載される手法は、屈折率検出を有するイオン交換高速液体クロマトグラフィーによりジアンヒドロガラクチトール薬剤製剤においてズルシトールと関連不純物を決定するために使用される。
【００７２】
この手法において、サンプルは、５ｍｇ／ｍＬの目的濃度でジアンヒドロガラクチトールを用いて調製される。ズルシトール、ジアンヒドロガラクチトール、及び関連不純物は、屈折率検出を用いるアイソクラチック移動相として５０ｍＭのＮａＯＨを用いて、陰イオン交換カラム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＲＣＸ−１０、２５０×４．１ｍｍ、７μｍ）を使用して分離される。ズルシトール濃度は、外部参照基準を用いて決定され、関連物質の含有量は、ＤＡＧ参照基準を使用して推定される。
【００７３】
ある適切なＨＰＬＣシステム及びデータ収集システムは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２００ Ｓｅｒｉｅｓ ＨＰＬＣシステム又は以下を装備した同等のものである：Ｑｕａｔポンプ、Ｍｏｄｅｌ Ｇ１３１１Ａ又は同等；オートサンプラ、モデル１３２９Ａ又は同等；ＲＩＤ検出器、モデル１３６２Ａ又は同等；３０±３℃の可能なカラム温度制御装置；及び脱気装置、モデルＧ１３２２又は同等。カラムは、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＲＣＸ陰イオン交換カラム２５０×４．１ｍｍ、７μｍ、Ｐ／Ｎ７９４４０、又は同等である。データ収集は、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ及びＣｈｅｍＳｔｏｒｅ Ｃｌｉｅｎｔ／Ｓｅｒｖｅｒ又は同等のデータシステムにより行われる。
【００７４】
以下の化学物質が使用される。水はＭｉｌｌｉ−Ｑ水又は脱イオン水である。水酸化ナトリウムは、標準的な精製されたグレードである。ズルシトール及びＤＡＧ参照標準は、純度＞９８．０％である。
【００７５】
移動相（５０ｍＭのＮａＯＨ）について、２．０ｇのＮａＯＨを１リットルの水に溶かす。その溶液を０．４５μｍフィルターを通してろ過する。移動相は１ヶ月まで室温で保存することができる。ズルシトール参照ストック溶液（公称５００μｇ／ｍＬ）について、２５ｍｇのズルシトール参照標準を５０ｍＬのメスフラスコに正確に秤量する。ズルシトールを脱イオン水と混合ウェルで希釈する。調製された原液は２〜８℃で３日まで保存することができる。ＤＡＧ参照ストック溶液（公称５００μｇ／ｍＬ）について、２５ｍｇを５０ｍＬのメスフラスコに正確に秤量する。そのＤＡＧを脱イオン水及び混合ウェルで希釈する。調製されたストック溶液を２〜８℃で３日まで保存することができる。ズルシトール−ＤＡＧ標準溶液（ズルシトール５０μｇ／ｍＬ＋ＤＡＧ５０μｇ／ｍＬ；各１％の５ｍｇ／ｍＬ  ＤＡＧ）について、１．０ｍＬのズルシトールストック及び１．０ｍＬのＤＡＧストックをそれぞれ定量的に１０ｍＬのメスフラスコの中に移し、水と混合ウェルで容積まで希釈する。
【００７６】
ＡＰＩサンプル（公称１ｍｇ／ｍＬ）からのＤＡＧの製剤について、約２５ｍｇのＤＡＧのＡＰＩサンプルをきれいな２５ｍＬのメスフラスコで正確に秤量する。ＤＡＧのＡＰＩサンプルを約５ｍＬのイオン化水に溶解し、脱イオン化水で希釈し、混合する。試験サンプルの一部１〜２ｍＬをＨＰＬＣバイアルに移す。調製されたサンプルは、２〜８℃で２日まで保存することができる。
【００７７】
ＡＰＩサンプルに対するＤＡＧサンプル製剤（公称５ｍｇ／ｍＬ）について、約５０ｍｇのＡＰＩサンプルをきれいな１０ｍＬのメスフラスコに正確に秤量する。ＤＡＧ  ＡＰＩサンプルを約５ｍＬの水に溶解し、水で容量まで希釈し、混合する。
【００７８】
凍結乾燥された（４０ｍｇ／バイアル）サンプルからのＤＡＧサンプルの製剤について、サンプルが保存されている冷蔵庫からサンプルが取り出され、封が除去される。５．０ｍＬの水の容積を定量的に移し、その溶液をＤＡＧを溶解するために混合し、８ｍｇ／ｍＬの溶液を得る。再構築された溶液の一部１．０ｇを脱イオン化水で８．０ｇに希釈し、混合する。試験サンプルのさらなる一部１〜２ｍＬをＨＰＬＣバイアルに移す。調製したサンプルを２〜８℃で２日まで保存することができる。
【００７９】
凍結乾燥粉末（４０ｍｇ／バイアル）を使用する薬物製品のＤＡＧサンプル製剤（公称５ｍｇ／ｍＬ）について、バイアルの封を洗浄し、除去する。凍結乾燥バイアルを８．０ｍＬの水で再構築して５ｍｇ／ｍＬの溶液を得る。その一部１〜２ｍＬをＨＰＬＣバイアルに移す。サンプルを（２つのバイアルを使用して）二重に調製する。調製したサンプルを２〜８℃で２４時間まで保存することができる。
【００８０】
ＨＰＬＣ分析について、ＨＰＬＣシステムが少なくとも２０分間までウォームアップされることができる。必要な場合、適切な溶媒入口に上記のように調製されたＨＰＬＣ移動相を置く。溶媒ラインを移動相でプライミングする。システムとカラムを少なくとも３０分間、１．５ｍＬ／分の流速でＨＰＬＣ移動相で平衡化する。サンプル分析シーケンスを作成する。システム適合性が確認された後、水ブランクが標準及び次にサンプルの注射によって注入される。ズルシトール−ＤＡＧ標準は、サンプルの全１０回の注入の後に挿入され、次いで実行の終わりに最終区分（ブラケッティング）の標準を挿入する。ある適切なサンプルの分析シーケンスを表１に示す。
【表１】
2016538574.tif 000005
【００８１】
サンプルをＲＩＤを使用して分析する。上記に示したように、ある適切なカラムは、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＲＣＸイオン交換カラム（２５０×４．１ｍｍ、７μｍ）、Ｐ／Ｎ ７９４４０又は同等である。移動相は、脱イオン化水中の５０ｍＭのＮａＯＨである（アイソクラチック溶出）。流量は１．５ｍＬ／分である。カラム温度は３０℃である。注入量は、５０μＬである。検出は、３５℃でＲＩＤによる。実行時間は８分である。
【００８２】
クロマトグラムの分析及び統合について、ＨＰＬＣソフトウェアが使用される。ブランク、サンプル、及び試験標準のためのクロマトグラムが見直され、比較される。いくつかのピークのマニュアル統合と割り当てが必要かもしれない。スロープ感度、ピーク幅、拒絶反応に対するピーク高さ閾値、ショルダーピーク、ベースライン、及び分裂ピークの統合型、並びに他のパラメータは、適切な統合を得るために調整され、これらのパラメータに対する値は、記録され、全てのサンプル及び標準に適用される。
【００８３】
システムの適合性を次のように評価する。ズルシトール−ＤＡＧ標準溶液の６回の反復注入は、表２のクロマトグラフィー性能要件を使用して評価される。
【表２】
2016538574.tif 000006
【００８４】
ブラケティング標準溶液注入におけるズルシトールとＤＡＧピーク面積は、前のＳＳＴ注入での各々の平均ピーク面積の８０％〜１２０％であるべきである。１つのブラケティング標準が基準を満さない場合、最終通過ブラケティング標準の後に分析されるサンプルは、再分析されるべきである。
【００８５】
データの分析において、相対ピーク面積＝（ピーク面積／総ピーク面積）×１００、ここで、「ピーク面積」は個々のピーク面積であり、「総ピーク面積」は、ピーク面積の合計である。
【００８６】
ズルシトール濃度が示されるように計算される：ズルシトール（Ｃｕ、μｇ／ｍＬ）＝Ｃｓ×平均サンプルピーク面積／Ｄｕｌ−ＤＡＧ標準注入の平均ズルシトールピーク面積、ここでＣｓは、μｇ／ｍＬでズルシトール濃度である。
【００８７】
ＤＡＧ薬物物質又は薬物製品中のズルシトール含量（重量％）を示されるように算出する：ズルシトール重量％＝Ｃｕ（μｇ／ｍＬ）／１０００／ＳＣ（ｍｇ／ｍＬ）×１００％、ここで、Ｃｕは上記のように計算されるズルシトール濃度（μｇ／ｍＬ）であり、ＳＣは薬剤物質又は薬剤製品のために調製されるようなサンプル濃度（ｍｇ／ｍＬ）である。ズルシトールが存在する場合、０．０５％と等しいか大きい場合にはズルシトールの重量パーセントが報告され、最も近い０．０１％の位で報告される。
【００８８】
ズルシトール以外の未知の又は以前に同定された不純物がＤＡＧ製剤に存在する場合、その濃度は、次のように算出される：未知の不純物濃度（μｇ／ｍＬ）＝Ｃｓ×平均サンプルピーク面積／Ｄｕｌ−ＤＡＧ標準注入の平均ＤＡＧピーク面積。存在する場合、未知の不純物重量パーセントは、次のように計算される：Ｃｕ（μｇ／ｍＬ）／１０００／ＳＣ（ｍｇ／ｍＬ）×１００％、ここで、Ｃｕ＝上記のように算出される未知の濃度（μｇ／ｍＬ）、及びＳＣ＝薬物物質に対する［００７７］又は薬剤製品に対する［００７９］において調製されるようなサンプル濃度（ｍｇ／ｍＬ）。未知の不純物が存在する場合、０．０５％に等しい又はより大きい場合には各未知の不純物は、もっとも近い０．０１％の位で報告される。
【００８９】
重量パーセントでのアッセイ結果が各サンプルに対して及び二重のサンプルの平均に対して計算される。
【００９０】
例２  水／アセトニトリルの勾配を使用する蒸発光散乱検出器を使用するＨＰＬＣ分析
不純物の分解を促進するために、下記のような水／アセトニトリルの勾配で蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）を使用して、ＨＰＬＣ分析の別の方法が用いられた。
【００９１】
屈折率（ＲＩ）検出器の制限により、ＨＰＬＣ／ＲＩ法は、信頼性の不純物プロファイルデータを得るための十分な特異性を有せず、それは未知又は不完全に特徴付けられる不純物の許容できないレベルに患者の曝露リスクを曝す。この懸念に対処するために、Ａｇｉｌｅｎｔにより製造される蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）のようなさらに高感度の検出器がジアンヒドロガラクチトール薬物物質又は薬剤製品で見られる不純物の決定のためにＨＰＬＣシステムと組み合わせて使用される。
【００９２】
例えば、ＤＡＧサンプルを表３で示される勾配を有するＹＭＣ  Ｃ１８カラムを使用するＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ法によって分析した：
【表３】
2016538574.tif 000007
【００９３】
クロマトグラム（図３）に示すように、ズルシトールを４．５分の保持時間で溶出した。表４にまとめたＬＣ−ＭＳデータでサポートされるように、そのピークは、ズルシトールがモノエポキシド関連化合物であると同定された直後に溶出した。１１．４６分で観察されたピークは、ＤＡＧ二量体の可能性があり、２７１、３５７、４１７、５１２、及び他のピークのｍ／ｚを有する複数のピークに貢献される２２．６分で溶出されたピークである（図４）。これらのデータは、前の研究によって予想される不純物のプロファイルと一致する。予想されるように、モノエポキシドとズルシトールは、この方法によって得られる２つの主な分解産物でさる。
【表４】
2016538574.tif 000008
【００９４】
例３  モノエポキシドのピークの解像度を改善する水／メタノール勾配にけるギ酸を用いたＨＰＬＣ分析
モノエポキシドのピークの解像度を改善するために、新しい方法が開発された。この新しい方法は、次のパラメータを採用する：カラムは、Ａｔｌａｎｔｉｓ Ｃ１８、２５０ｘ４．６ｍｍ、５μｍであった。カラム温度は３０℃であった。流速は、０．５ｍＬ／分であった。注入量は１００μＬであった。ＥＬＳＤ検出器は、３５℃のドリフト管温度で、ゲイン４００、２ｐｐｓ、４５ＰＳＩを有する冷却モードで操作された。移動相Ａは０．０５％ギ酸／水であった。移動相Ｂは１００％メタノールであった。勾配を表５に示した：
【表５】
2016538574.tif 000009
【００９５】
早く溶出する不純物のより良い解像度が観察された（図５の以下のＤＡＧサンプルのクロマトグラムを参照）。ズルシトール標識ピーク２は６．２６分の保持時間又は０．５９の相対保持時間（ＲＲＴ）で溶出された。ジアンヒドロガラクチトールは、１０．８６分で溶出された。
【００９６】
ＥＬＳＤ応答が線形ではないので、外部較正標準曲線は、ズルシトールなどの既知の不純物に対して要求され、試験されたジアンヒドロガラクチトールのサンプルで不純物の含量を決定する。ジアンヒドロガラクチトールのサンプルに含まれる未知の不純物について、未知の不純物含量がジアンヒドロガラクチトール基準物質のクロマトグラフィーによって確立される較正標準曲線を使用して推定されることができる。
【００９７】
例４  二重勾配ＨＰＬＣ溶出を使用する不純物の検出又は決定のためのさらなる改良方法
ジアンヒドロガラクチトール中の不純物の検出又は決定のためのさらに改良された分析方法は、ＨＰＬＣで二重勾配溶出を用いるＨＰＬＣ及びＥＬＳＤを採用する。この方法を以下に記載する。
【００９８】
この分析方法において、以下の材料及び装置が使用される：Ａｔｌａｎｔｉｓ Ｃ１８、２５０×４．６ｍｍ、５μｍＨＰＬＣカラム；４つ１組の又は２成分のＨＰＬＣポンプ；蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）；積分器又はコンピュータベースの分析システム；較正化学天秤；及びクラスＡメスフラスコとピペット。以下の試薬及び標準が使用される：上記のようなズルシトール参照標準；ＨＰＬＣグレード水又は同等のギ酸（ＦＡ）；ＨＰＬＣグレード又は同等のアセトニトリル（ＡＣＮ）；及びＨＰＬＣグレード又は同等のメタノール（ＭｅＯＨ）。
【００９９】
本発明の方法で使用される溶液について、体積は、分析の必要性に合うように測定されうる。全ての移動相がろ過されることが重要である。ろ過装置における焼結ガラスは、ＥＬＳＤで感度を妨害しうる緩衝液の源であってもよい。全てのろ過装置をＭｉｌｌｉ−Ｑグレードの水で十分に洗浄すべきである。これを実行するには、約５００ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑグレードの水がろ過装置を通してろ過される。水を廃棄し、移動相を次にろ過する。
【０１００】
試験溶液の調製は、適切なＰＰＥ（手袋、実験室コート、及び安全眼鏡）を使用してドラフト内でされるべきである。試験溶液の調製は、処分のためにドラフト内に格納されるべきであり、適切に標識されるべきである。
【０１０１】
移動相Ａは１０００ｍＬの水に０．５ｍＬのギ酸をピペットで取ることにより調製される。移動相Ａはろ過され、脱気される。
【０１０２】
移動相ＢはＭｅＯＨである。移動相Ｂはろ過され、脱気される。
【０１０３】
希釈液Ａは水である。希釈液Ｂは１８０ｍＬの水及び混合ウェルを有する２０ｍＬのＡＣＮを混合することにより調製される。
【０１０４】
標準溶液及びサンプル溶液の調製を以下に記載する。ブランク溶液は水である。ズルシトールストック溶液を２０ｍＬのメスフラスコに１００ｍｇのズルシトール参照標準を正確に移すことにより調製する。約１５ｍＬの希釈剤Ｂを添加し、溶解のために超音波で分解する。溶液を室温まで冷却し、希釈剤Ｂ及び混合ウェル（５ｍｇ／ｍＬ）を用いて容積まで希釈する。以下の標準溶液を調製する：０．２、０．１、０．０８、０．０５、０．０３、０．０１及び０．００５ｍｇ／ｍＬ（システム感度溶液）。４．０％標準溶液を５０ｍＬのメスフラスコに２．０ｍＬのズルシトールストック溶液をピペットで取ることにより調製する。溶液を水と混合ウェル（０．２ｍｇ／ｍＬ）で希釈する。２．０％標準溶液を１０ｍＬのメスフラスコに５．０ｍＬの４．０％標準溶液をピペットで取ることにより調製する。溶液を水と混合ウェル（０．１０ｍｇ／ｍＬ）で希釈する。１．６％標準溶液を１０ｍＬのメスフラスコに４．０ｍＬの４．０％標準溶液をピペットで取ることにより調製する。溶液を水と混合ウェル（０．０８ｍｇ／ｍＬ）で希釈する。１．０％標準溶液を１０ｍＬのメスフラスコに２．５ｍＬの４．０％標準溶液をピペットで取ることにより調製する。溶液を水と混合ウェル（０．０５ｍｇ／ｍＬ）で希釈する。０．６０％標準溶液を２０ｍＬのメスフラスコに３．０ｍＬの４．０％標準溶液をピペットで取ることにより調製する。溶液を水と混合ウェル（０．３０ｍｇ／ｍＬ）で希釈する。０．２０％標準溶液を２０ｍＬのメスフラスコに１．０ｍＬの４．０％標準溶液をピペットで取ることにより調製する。溶液を水と混合ウェル（０．０１ｍｇ／ｍＬ）で希釈する。０．１０％標準溶液（システム感度溶液）を１０ｍＬのメスフラスコに５．０ｍＬの０．２０％標準溶液をピペットで取ることにより調製する。溶液を水と混合ウェル（０．００５ｍｇ／ｍＬ）で希釈する。
【０１０５】
試験サンプルワーキング溶液は二重（Ａ及びＢ）で調製されるべきである。サンプル溶液は、分析の直前に調製されるべきである。サンプル注入は、サンプル溶液調製の１５分以内に行われなければならない。いくつかの場合、サンプル希釈はオーバーロードされるなんらかの不純物を定量するために要求されるかもしれない。
【０１０６】
サンプル調製のために、約５０ｍｇの試験サンプルが１０ｍＬのメスフラスコに正確に移される。試験サンプルを水に溶解して容積及び混合ウェル（５ｍｇ／ｍＬ）に希釈される。
【０１０７】
ＨＰＬＣ操作条件は次の通りである：カラムは、Ａｔｌａｎｔｉｓ Ｃ１８ ２５０×４．６ｍｍ、５μｍである。移動相Ａは０．０５％ＦＡ／水である。移動相ＢはＭｅＯＨである。勾配ＡとＢを以下の表６に示す。カラム温度は３０℃である。サンプル温度は５℃である。流速は０．５ｍＬ／分である。注入量は１００μＬである。実行時間は勾配Ａに対して５０分、勾配Ｂに対して２０分である。
【表６】
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【０１０８】
ＳＬＳＤの操作条件は次の通りである：ゲインは４００である。ドリフト管温度は４５℃である。ガス圧（窒素）は３５ＰＳＩである。ネブライザーを冷却に設定する。データ転送速度は毎秒２秒である。レイリー（Ｒａｙｌｅｉｇｈ）係数は、直接検出器で設定され、６．０である。
【０１０９】
注入シーケンスを表７に示す。ブランク注入は、安定かつ再現可能なベースラインが得られるまで、繰り返されるべきである。
【表７】
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【０１１０】
必要に応じて追加の試験サンプル注入を追加してもよい。６回未満の試験サンプル注入が０．２０％標準溶液チェック注入を繰り返す前に行われるべきである。
【０１１１】
評価のために、全てのピークが検出される未知の不純物に関連して統合されるべきである。ベースラインのノイズが問題になる場合、廃棄物が検出器から適切に流し出されているか確認する。ＥＬＳＤからの廃棄物を流しだすチューブの内部に蓄積された液体がないことを確認する必要があるかもしれない。必要に応じて、チューブの位置を修正するべきである。廃棄物が適切に流れ出ている場合、ベースラインのノイズは問題であり、検出器を洗浄してもよい。必要な場合、次の洗浄方法を分析前に使用してもよい。洗浄のために、ＨＰＬＣ条件は次の通りである：カラムは機器から取り除かれるべきであり、ユニオンを使用すべきである。移動相は１００％Ｈ２Ｏである（アイソクラチック１００％）。流量は毎分１．０ｍＬである。カラム温度は周囲温度である。実行時間は６０分である。ＥＬＳＤ操作条件は次の通りである：ゲインは５０である。ドリフト管温度は１００℃である。ガス圧（窒素）は５０ＰＳＩである。ネブライザーは７５％で加熱に設定される。
【０１１２】
典型的な保持時間を表８に示す。表８において、「ＤＡＧ」はジアンヒドロガラクチトールである。試験サンプル中のＤＡＧは、この方法で定量化されない。ＤＡＧは必要とされるＤＡＧの濃度により、広いピークとして観察される。試験溶液中のＤＡＧの保持時間は、約１０分〜１３分の間である。
【表８】
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【０１１３】
図６は、ブランク溶液の例のクロマトグラムである。
【０１１４】
図７は、０．１０％標準溶液（システム感度溶液）の例のクロマトグラムである。
【０１１５】
図８は、試験溶液の例のクロマトグラムである。
【０１１６】
システム適合性要件は次の通りである。ブランク溶液注入のために、干渉のないピークがズルシトールのピークの保持時間又は任意の既知の不純物の保持時間で観察されるべきである。安定かつ再現性のあるベースラインが観察されるべきであり、この条件が満たされるまでブランク溶液を注入することを続ける。システム感度について、０．１０％の標準溶液の注入に続くズルシトールのピークが観察されるべきである。ズルシトールのピークに対する信号対ノイズ比が報告されるべきである。移動相で汚染が疑われる場合（すなわち、ベースラインのノイズが１．０ＬＳＵより大きい）又はズルシトールのピークが観察されない場合、移動相は再調製されるべきであり、又は上記のクリーンアップ手法が行われるべきである。０．２０％の最初及び最後の注入のためのズルシトールのピークに対するＵＳＰテーリング係数は、２．０未満である。精度について、５回の注入でピーク面積のｌｏｇに対する％ＲＳＤが計算される。％ＲＳＤは、１５％未満でなければならない。
【０１１７】
計算のために、ブランクに起因しない全てのピークが統合されるべきである。（０．２０標準の５回の正確な注入を含む）ズルシトールの２．０％の標準溶液を通じて０．１０％の濃度の対数に対する応答の対数がプロットされる。相関係数（ｒ）は、線形性曲線に対して０．９８より大きくなければならない。傾きと切片が曲線から決定される。ズルシトールに対する線形性曲線は、サンプルにおける未知及びズルシトール不純物のｍｇ／ｍＬで濃度を決定するために使用される。
【０１１８】
サンプル中の個々の未知の不純物の決定のために、上記のようなズルシトールに対する線形性曲線からの傾きと切片が使用される。未知のＬｏｇ［面積応答］を使用して、未知のＬｏｇ［濃度］が式（１）を使用して次のように決定される：
【数１】
2016538574.tif 000013
【０１１９】
未知の不純物の量（ｍｇ／ｍＬ）が式（２）を使用して次のように決定される：
【数２】
2016538574.tif 000014
【０１２０】
各未知の不純物のパーセンテージが式（３）を使用して次のように決定される：
【数３】
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【０１２１】
また、ズルシトール標準を使用する定量がＥｍｐｏｗｅｒ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ.）でｌｏｇ−ｌｏｇ線形関数を使用して形成されてもよい。
【０１２２】
同様の式、特に式（４）〜（６）がサンプル中のズルシトールの不純物の決定のために使用される。
【０１２３】
ズルシトールに対すｌｏｇ［面積応答］を使用して、ズルシトールのｌｏｇ［濃度］が式（４）を使用して決定される：
【数４】
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【０１２４】
ズルシトール不純物の濃度（ｍｇ／ｍＬ）が式（５）を使用して決定される：
【数５】
2016538574.tif 000017
【０１２５】
ズルシトール不純物のパーセンテージが式（６）を使用して決定される：
【数６】
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【０１２６】
［発明の効果］
本発明は、ズルシトール及び未知の不純物を含む、ジアンヒドロガラクチトールの製剤に存在する不純物の検出及び定量のための改良された分析方法、並びにジアンヒドロガラクチトールの製剤に存在する未知の不純物の単離及び同定のための方法を提供する。本発明の方法は、医薬用途で適した高純度のジアンヒドロガラクチトールの大規模調製を可能にし、医薬用途を意図したジアンヒドロガラクチトールの製剤における不純物の存在によって引き起こされる重大な副作用の可能性を低減する。
【０１２７】
本発明に係る方法は、ジアンヒドロガラクチトールの製剤及びジアンヒドロガラクチトールの製剤において不純物の決定と定量の分析のための産業上の利用可能性を有する。
【０１２８】
値の範囲に関して、本発明は、文脈が他を明確に示さない限り、下限の単位の少なくとも１０分の１の範囲の上限及び下限の間の各途中にある値を含む。また、本発明は、記載された範囲から特に除外されない限り、範囲の上限と下限のいずれか又は両方を含むいずれかの他の記載される途中の値及び範囲を含む。
【０１２９】
別段の定義がない限り、本明細書中で使用される全ての技術的及び科学的用語の意味は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される。当業者はまた、本明細書中に記載される発明と類似する又は等しいいずれかの方法及び材料はまた、本発明を実施又は試験するために使用されることができることを理解する。
【０１３０】
本明細書中で論じる刊行物及び特許は、本発明の出願日前の開示についてのみ提供される。本明明細書中に、本発明が先行発明のおかげで刊行物のように先行する権利がない承認として解釈されるべきである。さらに、提供された刊行物の日付は、独立して確認される必要があり得る実際の公開日と異なってもよい。
【０１３１】
引用した全ての刊行物は、全ての公開された特許、特許出願、及び参考文献、並びにそれらの公開された文書に組み込まれているそれらの刊行物を含む、その全体が参考として本明細書中に組み込まれる。しかしながら、参考により本明細書中に組み込まれたいずれかの刊行物が公開された情報に言及する限り、出願人は、何らかのそのような情報が先行技術であるこの出願の出願日後に公開することを認めることはない。
【０１３２】
この明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形は複数形を含む。例えば、用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容が別に明確に示さない限り、複数の言及を含む。また、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、一連の全ての要素を指すと理解されるべきである。明細書中で例示的に記載される本発明は、いずれの要素、限定又は制限なしに適切に実施され得る。本明細書中に具体的に開示されない。したがって、例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等は、拡張的で限定せずに読まれるものとする。また、本明細書中で使用される用語及び表現は、説明の用語として使用され、限定的でなく、示される及び記載される将来又はその任意の位置の任意の等価物を排除するそのような用語及び表現の使用において意図がなく、様々な変更が請求される本発明の範囲内で可能であることが認識される。したがって、本発明は、好ましい態様及び任意の特徴により具体的に開示されているが、本明細書中に開示される本発明の修正及び変更は、当業者によりあてにされることができ、そのような修正及び変更は、本明細書中に開示される本発明の範囲内であると考えられる。本発明は、本明細書中に広くかつ一般的に記載されている。一般的な開示の範囲内に入るより狭い種類及び下位概念のグループのそれぞれはまた、それらの発明の一部を形成する。これは、削除した材料がその中に存在するか否かに関わらず、種類からの任意の課題を除く但し書き又は否定的な制限を有する各発明の一般的な記載を含む。また、本発明の特徴又は側面がマーカッシュグループの用語に記載されるところ、当該技術分野の教育を受けた者は、本発明はまた、それによって、マーカッシュグループのメンバーの任意の個々のメンバー又はサブグループの用語で記載されるものであることを認識するだろう。また、上記の記載は、例示的であることを意図され、限定的ではないことが理解されるべきである。多くの態様は、上記の記載を見直す際に、当業者に明らかであるだろう。したがって、本発明の範囲が上記の記載を参照することなく決定されるべきであるが、代わりに添付の特許請求の範囲を参考にして決定されるべきであり、そのような特許請求の範囲に等しい完全な範囲に沿って、権利が与えられる。当業者は、記載される本発明の特定の態様に対する多くの等価物である、通常の実験より多くない使用をして確認することを認識し、又はすることができるだろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲により含まれるこが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年9月17日(2015.9.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジアンヒドロガラクチトールの製剤に存在する不純物の存在及び量を分析する分析方法であって、ズルシトール及び製剤の他の汚染物質からジアンヒドロガラクチトールを分離する勾配移動相での溶出を使用して高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムでジアンヒドロガラクチトールの製剤をＨＰＬＣに供することにより前記製剤を分析するステップを含み；
前記高速液体クロマトグラフィーでは蒸発光散乱検出（ＥＬＤＳ）を用い、及び
前記ＨＰＬＣカラムは、Ｃ１８化合物に結合されるシリカゲルカラムであり、ルイス酸−ルイス塩基の化学を用いるエンドキャッピング手法で仕上げられる、分析方法。
【請求項２】
溶出が、９５％水／５％アセトニトリルから７０％水／３０％アセトニトリルの勾配で行われ、９５％水／５％アセトニトリルに戻す、請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
溶離液を変化させるためのタイムスケジュールが次のようである、請求項２に記載の分析方法：０分、９５％水／５％アセトニトリル；１５分、９５％水／５％アセトニトリル；１５．１分、７０％水／３０％アセトニトリル；２０分、７０％水／３０％アセトニトリル；２０．１〜３５分、９５％水／５％アセトニトリル。
【請求項４】
前記方法は、ジアンヒドロガラクチトールのモノエポキシドの分解産物、モノエポキシドの二量体、及びズルシトールを検出する、請求項１に記載の分析方法。
【請求項５】
さらに前記方法はジアンヒドロガラクチトールの二量体と濃縮生成物を検出する、請求項４に記載の分析方法。
【請求項６】
ＨＰＬＣに起因するピークがＬＣ−ＭＳによって分析される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
さらに前記方法はジアンヒドロガラクチトール自体以外の化合物を表す高速液体クロマトグラフィーによって決定される１つ以上のピークの相対濃度を決定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記カラム温度は約３０℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
流速は約０．５ｍＬ／分である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＥＬＳＤ検出器は、３５℃のドリフト管温度及びゲイン４００、２ｐｐｓ、４５ＰＳＩの冷却モードで操作される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
移動相Ａ及び移動相Ｂが、０．０５％ギ酸／水である移動相Ａ及び１００％メタノールである移動相Ｂと一緒に使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
溶出が１００％の０．０５％ギ酸／水を用いて０分〜２５分、９０％の０．０５％ギ酸／水及び１０％の１００％メタノールを用いて２５分〜２５．１分、１０％の０．０５％ギ酸／水及び９０％の１００％メタノールを用いて２５．１分〜３５分、及び１００％の０．０５％ギ酸／水を用いて３５．１分〜５０分で行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
さらに前記方法は不純物に対する外部較正標準曲線の作成を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法はさらに、不純物に対する外部較正標準曲線の作成を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記不純物がズルシトール、ジアンヒドロガラクチトールのモノエポキシドの分解産物、及びジアンヒドロガラクチトールの二量体からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記不純物がズルシトール、ジアンヒドロガラクチトールのモノエポキシドの分解産物、及びジアンヒドロガラクチトールの二量体からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
未知の不純物について、該未知の不純物の含有量がジアンヒドロガラクチトールの基準物質のクロマトグラフィーによって確立される較正標準曲線を使用して推定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
未知の不純物について、該未知の不純物の含有量がジアンヒドロガラクチトールの基準物質のクロマトグラフィーによって確立される較正標準曲線を使用して推定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
溶出シーケンスの後に、追加の溶出シーケンスが次のように行われる、請求項１２に記載の方法：１００％の０．０５％ギ酸を用いて０分〜７．５分；９７％の０．０５％ギ酸及び３％のメタノールを用いて７．５分〜７．６分；及び１００％の０．０５％ギ酸を用いて７．６分〜２０分。
【請求項２０】
ＨＰＬＣ用カラム温度は約３０℃であり、ＨＰＬＣ用試料温度は約５℃であり、ＨＰＬＣ用流速は約０．５ｍＬ／分であり、及び注入量は約１０〜１００μＬである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＥＬＳＤについて、ゲインは約４００であり、ドリフト管温度は約４５℃であり、ガス圧は窒素の約３５ＰＳＩであり、ネブライザーは冷却に設定され、データ転送速度は毎秒２ポイントであり、及びレイリー（Ｒａｙｌｅｉｇｈ）係数は約６．０である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
２．０％ズルシトール、１．６％ズルシトール、１．０％ズルシトール、０．６０％ズルシトール、０．２０％ズルシトール、及び０．１０％ズルシトールの標準がシステムの感度及び線形性を決定するために使用される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
ズルシトールの保持時間は約６．４分であり、ジアンヒドロガラクチトールの保持時間は約１２．１分である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
ズルシトール不純物の量及びパーセンテージがＨＰＬＣ及びＥＬＳＤの結果から決定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
ズルシトール以外の未知の不純物の量及びパーセンテージがＨＰＬＣ及びＥＬＳＤの結果から決定される、請求項１９に記載の方法。
【国際調査報告】
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