(57)【要約】調製物から所望のタンパク質を精製する方法は、調製物を、最初の製造媒体中に存在しているクロマチンの約５％未満を有する形態で用意し、調製物を、非イオン性有機ポリマーと、所望のタンパク質を沈殿させる又は非イオン性親水性面に吸着させるのに十分な量で接触させ、この接触ステップ前又は最中に塩濃度を調節することを含み、この調節ステップで、生理学的導電率より高い導電率を得るのに十分な塩濃度にする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
最初の製造媒体中に存在するクロマチンの約５％未満を有する形態で調製物を用意するステップと、
前記調製物を、非イオン性有機ポリマーと、所望のタンパク質を沈殿させる又は非イオン性親水性面に吸着させるのに十分な量で接触させるステップと、
前記接触ステップ前又は最中に塩濃度を調節するステップとを含み、
前記調節ステップで、生理学的導電率より高い導電率を得るのに十分な塩濃度にする、
調製物から所望のタンパク質を精製する方法。
【請求項２】
前記沈殿した所望のタンパク質を多孔質膜上で保持することで可溶性汚染物質に前記膜を通過させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記沈殿した所望のタンパク質を可溶性汚染物質から、沈殿物を遠心分離で沈降させることで分離するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記非イオン性親水性面が、膜、モノリス、粒子、任意で磁性である粒子及びこれらの組み合わせから成る群から選択される１種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
単一の一体型装置において行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記非イオン性有機ポリマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記非イオン性有機ポリマーの平均ポリマーサイズが、（ａ）約１５００〜約１５０００ダルトン、（ｂ）約２０００〜約１２０００ダルトン、（ｃ）約３０００〜約１００００ダルトン、（ｄ）約４０００〜約８０００ダルトン及び（ｆ）約５０００〜約６０００ダルトンから成る群から選択される範囲にある、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記導電率が生理学的導電率より少なくとも１ｍＳ／ｃｍ高い、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、塩酸グアニジン及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記塩が、（ａ）約０．５〜約１．５Ｍ、（ｂ）約２．０〜約３．０Ｍ及びこれらの中間範囲から成る群から選択される濃度の塩化ナトリウムである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ｐＨを、（ａ）約５〜約９、（ｂ）約６〜約８、（ｃ）約６．５〜約７．５、（ｄ）約７．５〜約８．５及びこれらの中間範囲から成る群から選択される範囲に調節するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記調製物が、細胞培養培地、培養した生物からの抽出物及び体液から成る群から選択される生物学的原料から得られる、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１３年２月２８日に出願の米国仮特許出願第６１／７７０８９０号の優先権を主張するものであり、この文献は参照により全て本願に援用される。
【０００２】
本明細書で開示の実施形態は、抗体（ＩｇＧ抗体を含む）を含めたタンパク質の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
非イオン性有機ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でのタンパク質沈殿技法が知られている。殆どの場合、この技法は、低い塩濃度で、塩を追加することなく用いられるが、例外が知られている（Ｄ．Ｇｅｒｖａｉｓら、特許文献１；非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。
【０００４】
立体排除クロマトグラフィの技法が知られている（非特許文献４；本明細書で援用され、付録Ａとして添付の特許文献２も参照のこと）。この技法では非イオン性親水性面を利用し、その面上で、所望の産物の保持がＰＥＧ等の非イオン性有機ポリマーにより引き起こされる。高いＮａＣｌ濃度はウイルス結合効率を上昇させると報告されている（上記の非特許文献４）。高濃度のＮａＣｌの存在下、流動化粒子上でこの技法を行うことでＩｇＧ調製物の回収率及び純度が上昇すると報告されている（非特許文献５）。
【０００５】
モノクローナル抗体を含有する細胞培養収穫物のクロマチン含有量を削減する方法が文献に記載されている（非特許文献６）。クロマチンが、ヌクレオソームとして知られる安定した会合体状にあるＤＮＡ及びヒストンタンパク質を含むことは知られている。Ｇａｎらは、クロマチン及びそのカタボライトが抗体とも会合体を形成し、続く分画法の有効性を制限してしまうことを報告している。Ｇａｎらは、９９％のクロマチン削減を達成する方法を発表しており、そのような削減により陽イオン交換クロマトグラフィで得られる精製の質が向上したとも報告している。Ｇａｎらが報告した技法の変化形が、Ｇａｇｎｏｎら（２０１３、上記）により、流動化親水性粒子上での立体排除クロマトグラフィにより分画されるＩｇＧの回収率及び純度を向上させると報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０／０２０４４５５（Ａ１）号明細書
【特許文献２】国際出願ＰＣＴ／ＳＧ２０１２／０００１９９号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋ．Ｉｎｇｈａｍ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１８６（１９７８）１０６−１１３
【非特許文献２】Ｋ．Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，４０（１９７０）７３４−７４４
【非特許文献３】Ｓ．Ｂｒａｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇｒ．２８（２０１２）１２９−１３６
【非特許文献４】Ｊ．Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ  １２７０（２０１２）１６２−１７０
【非特許文献５】Ｐ．Ｇａｇｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，１３２４：１７１−１８０，（２０１４）
【非特許文献６】Ｈ．Ｇａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，１２９１（２０１３）３３−４０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
調製物から所望のタンパク質を精製する方法は、最初の製造媒体中に存在するクロマチンの約５％未満を有する形態で調製物を用意し、この調製物を非イオン性有機ポリマーと、所望のタンパク質を沈殿させる又は非イオン性親水性面に吸着させるのに十分な量で接触させ、この接触ステップ前又は最中に塩濃度を調節することを含み、この調節ステップで、生理学的導電率より高い導電率を得るのに十分な塩濃度にする。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
驚くべきことに、少なくとも９５％のクロマチンが除去されるようにコンディショニングした所望のタンパク質の不純な調製物に行うＰＥＧ仲介分画法（ＰＥＧ仲介法は、所望のタンパク質を、生理学的導電率より高い導電率を得るのに十分な追加の塩と接触させる少なくとも１つの段階を含む）は、所望のタンパク質の精製を、バイオアフィニティクロマトグラフィの公知の高機能法を用いた現行の方法より高い精製度で達成できることを発見した。
【００１０】
特定の実施形態において、本明細書で開示の方法は、少なくとも９５％のクロマチンが除去されるようにコンディショニングした不純な調製物から所望の抗体を精製するためのマルチステップ法であり、（ｉ）不純な調製物を、非イオン性有機ポリマーと、所望の抗体の沈殿を引き起こすのに十分な量で、通常の生理学的導電率より高い導電率を得るのに十分な濃度の塩の同時存在下で接触させ、（ｉｉ）任意で混合物から塩を削減又は排除し、（ｉｉｉ）非イオン性有機ポリマーを、所望の抗体を沈殿状態で維持するには不十分な濃度まで削減するステップを含み、必要に応じて追加の分画法によりさらに精製し得る高純度の抗体が得られる。
【００１１】
特定の実施形態において、本明細書で開示の方法は、少なくとも９５％のクロマチンが除去されるようにコンディショニングした不純な調製物から所望の抗体を精製するためのマルチステップ法であり、（ｉ）不純な調製物を、非イオン性有機ポリマーと、所望の抗体の沈殿を引き起こすのに十分な量で接触させ、（ｉｉ）通常の生理学的導電率より高い導電率を得るのに十分な塩濃度になるまで塩を添加し、（ｉｉｉ）混合物から塩を削減又は排除し、（ｉｉｉ）非イオン性有機ポリマーを、所望の抗体を沈殿状態で維持するには不十分な濃度まで、少なくとも１つの電気的陽性面の存在下で削減し、（ｉｖ）調製物からこの少なくとも１つの電気的陽性面を分離するステップを含み、必要に応じて追加の分画法によりさらに精製し得る高純度の抗体が得られる。
【００１２】
特定の実施形態において、本明細書で開示の方法は、少なくとも９５％のクロマチンが除去されるようにコンディショニングした不純な調製物から所望の抗体を精製するためのマルチステップ法であり、（ｉ）不純な調製物を、非イオン性有機ポリマーと、所望の抗体の沈殿を引き起こすのに十分な量で、通常の生理学的導電率より高い導電率を得るのに十分な濃度の塩の同時存在下で接触させ、（ｉｉ）非イオン性有機ポリマーを、所望の抗体を沈殿状態で維持するには不十分な濃度まで削減するステップを含み、必要に応じて追加の分画法によりさらに精製し得る高純度の抗体が得られる。
【００１３】
特定の実施形態において、本明細書で開示の方法は、少なくとも９５％のクロマチンが除去されるようにコンディショニングした不純な調製物から所望の抗体を精製するためのマルチステップ法であり、（ｉ）不純な調製物を、非イオン性有機ポリマーと、所望の抗体を非イオン性親水性面を備えたモノリスの面上に蓄積させるのに十分な量で、通常の生理学的導電率より高い導電率を得るのに十分な塩の存在下で接触させ、（ｉｉ）蓄積した抗体をポリマー及び塩のクリーンな溶液で洗浄し、次に、任意で、蓄積した抗体を、塩を欠いた又は塩が欠乏したポリマーのクリーンな溶液で洗浄し、（ｉｉｉ）次に、所望の抗体を蓄積状態で維持するには不十分な濃度まで非イオン性有機ポリマーを削減することで精製した抗体を溶出させるステップを含む。
【００１４】
特定の実施形態において、本明細書で開示の方法は、少なくとも９５％のクロマチンが除去されるようにコンディショニングした不純な調製物から所望の抗体を精製するためのマルチステップ法であり、（ｉ）不純な調製物を、非イオン性有機ポリマーと、所望の抗体の沈殿を引き起こすのに十分な量で接触させ、（ｉｉ）通常の生理学的導電率より高い導電率を得るのに十分な塩濃度になるまで塩を添加し、（ｉｉｉ）混合物から塩を削減又は排除し、（ｉｉｉ）非イオン性有機ポリマーを、所望の抗体を沈殿状態で維持するには不十分な濃度まで、少なくとも１つの電気的陽性面の存在下で削減し、（ｉｖ）調製物からこの少なくとも１つの電気的陽性面を分離するステップを含み、必要に応じて追加の分画法によりさらに精製し得る高純度の抗体が得られる
【００１５】
前出の実施形態のいずれにおいても、非イオン性親水性粒子が任意で、本方法のいずれの段階においても存在し得る。幾つかのそのような実施形態において、非イオン性親水性粒子は、１０ｎｍ、１００ｎｍ、１ミクロン、１０ミクロン、１００ミクロン、中間値又はこれらの値より大きい平均サイズを有し得る。幾つかの実施形態において、粒子は磁性又は常磁性になり得て、磁界又は磁性面でのその収集が可能となる。
【００１６】
特定の実施形態においては、本方法をデッドエンド濾過媒体で実行し得て、沈殿物は保持され、沈殿しない汚染物質は媒体を通過して排除される。
【００１７】
特定の実施形態においては、本方法を遠心分離で実行し得て、沈殿物は沈降し、汚染物質を含有する上清を廃棄することができる。
【００１８】
本方法を遠心分離形式で実行する幾つかの実施形態においては、少なくとも９５％のクロマチンを除去した不純なＩｇＧ調製物を、平均分子量が６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ−６０００）及びＮａＣｌから構成される、１９％のＰＥＧ−６０００及び０．８ＭのＮａＣｌを含有する沈殿溶液を添加することで沈殿させる。沈殿物を遠心分離により沈降させ、汚染物質を含有する上清を捨てる。沈殿したＩｇＧを任意で、１９％のＰＥＧ−６０００、０．８ＭのＮａＣｌ及び所望のｐＨ値をもたらすバッファ物質の新しい溶液に再懸濁させ得て、再沈降させ、上清を捨てる。次に、沈殿物を任意で、ＰＥＧ−６０００及び所望のｐＨ値をもたらすバッファ物質を含有するものの塩を欠く又は塩が欠乏している新しい溶液に再懸濁させ、次に再沈降させ、その後、上清を捨てる。次に、沈殿した高純度ＩｇＧを、後続の分画ステップ又は精製抗体の望む用途に合わせて調合したバッファで再可溶化する。
【００１９】
本方法を濾過形式で実行する幾つかの実施形態においては、少なくとも９５％のクロマチンを除去した不純なＩｇＧ調製物を、平均分子量が６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ−６０００）及びＮａＣｌから構成される、１９％のＰＥＧ−６０００及び０．８ＭのＮａＣｌを含有する沈殿溶液を添加することで沈殿させる。沈殿物は、平均孔径０．２２ミクロンのメンブランフィルタで捕捉され、汚染物質を含有する上清は膜を通過して捨てられる。沈殿したＩｇＧを任意で、１９％のＰＥＧ−６０００、０．８ＭのＮａＣｌ及び所望のｐＨ値をもたらすバッファ物質の新しい溶液に再懸濁させ、再濾過し、上清を捨てる。次に、沈殿物を任意で、ＰＥＧ−６０００及び所望のｐＨ値をもたらすバッファ物質を含有するものの塩を欠く又は塩が欠乏している新しい溶液に再懸濁させ得て、次に再濾過し、その後、上清を捨てる。次に、沈殿した高純度ＩｇＧを、後続の分画ステップ又は精製抗体の望む用途に合わせて調合したバッファで再可溶化し、任意で、前回使用したものと同じ膜で濾過することで沈殿した抗体を上清中の可溶性汚染物質から分離する。
【００２０】
本方法を濾過形式で実行し、核形成の中心としての非イオン性親水性粒子、少なくとも９５％のクロマチンを除去した不純なＩｇＧ調製物を用いる幾つかの実施形態においては、５％ｗ／ｖに達するデンプン粒子を添加してから、ＩｇＧを粒子に、平均分子量が６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ−６０００）及びＮａＣｌから構成される、１９％のＰＥＧ−６０００及び０．８ＭのＮａＣｌを含有する沈殿溶液を添加することで押し付ける。ＩｇＧは、純粋なＩｇＧ沈殿物を形成する代わりに粒子上に蓄積する。ＩｇＧが蓄積した粒子は平均孔径０．２２ミクロンのメンブランフィルタで捕捉され、汚染物質を含有する上清は膜を通過して捨てられる。ＩｇＧが蓄積した粒子を任意で、１９％のＰＥＧ−６０００、０．８ＭのＮａＣｌ及び所望のｐＨ値をもたらすバッファ物質の新しい溶液に再懸濁させ、再濾過し、上清を捨てる。次に、ＩｇＧが蓄積した粒子を任意で、ＰＥＧ−６０００及び所望のｐＨ値をもたらすバッファ物質を含有するものの塩を欠く又は塩が欠乏している新しい溶液に再懸濁させ得て、次に再濾過し、その後、上清を捨てる。次に、高純度ＩｇＧを、後続の分画ステップ又は精製抗体の望む用途に合わせて調合したバッファで再可溶化し、膜を通して濾過し、膜はデンプン粒子を保持し、精製されたＩｇＧは膜により保持され、捨てられる。
【００２１】
本方法を磁性粒子形式で実行し、核形成の中心としての非イオン性親水性粒子、少なくとも９５％のクロマチンを除去した不純なＩｇＧ調製物を用いる幾つかの実施形態においては、１％ｗ／ｖに達する、デンプンをコーティングした磁性ナノ粒子を添加してから、ＩｇＧを粒子に、平均分子量が６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ−６０００）及びＮａＣｌから構成される、１９％のＰＥＧ−６０００及び０．８ＭのＮａＣｌを含有する沈殿溶液を添加することで押し付ける。ＩｇＧは、純粋なＩｇＧ沈殿物を形成する代わりに粒子上に蓄積する。ＩｇＧが蓄積した粒子は磁界で捕捉され、汚染物質を含有する上清は捨てられる。ＩｇＧが蓄積した粒子を任意で、１９％のＰＥＧ−６０００、０．８ＭのＮａＣｌ及び所望のｐＨ値をもたらすバッファ物質の新しい溶液に再懸濁させ、磁界で再捕捉し、上清を捨てる。次に、ＩｇＧが蓄積した粒子を任意で、ＰＥＧ−６０００及び所望のｐＨ値をもたらすバッファ物質を含有するものの塩を欠く又は塩が欠乏している新しい溶液に再懸濁させ得て、次に磁界で再捕捉し、その後、上清を捨てる。次に、高純度ＩｇＧを、後続の分画ステップ又は精製抗体の望む用途に合わせて調合したバッファで再可溶化する。ナノ粒子を、磁界で捕捉することで除去する。
【００２２】
本方法を磁性粒子形式で実行し、核形成の中心としての非イオン性親水性粒子、少なくとも９５％のクロマチンを除去した不純なＩｇＧ調製物を用いる幾つかの実施形態においては、１％ｗ／ｖに達する、デンプンをコーティングした磁性ナノ粒子を添加してから、ＩｇＧを粒子に、平均分子量が６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ−６０００）及びＮａＣｌから構成される、１９％のＰＥＧ−６０００及び０．８ＭのＮａＣｌを含有する沈殿溶液を添加することで押し付ける。ＩｇＧは、純粋なＩｇＧ沈殿物を形成する代わりに粒子上に蓄積する。ＩｇＧが蓄積した粒子は磁界で捕捉され、汚染物質を含有する上清は捨てられる。ＩｇＧが蓄積した粒子を任意で、１９％のＰＥＧ−６０００、１．０ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）の新しい溶液に再懸濁させ、磁界で再捕捉し、上清を捨てる。次に、高純度ＩｇＧを再可溶化する。ナノ粒子を磁界で捕捉することで除去し、ＩｇＧを疎水性陰イオン交換体、例えばＣａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を充填したカラムに通し、ここで抗体は結合する。次に、ＮａＣｌ濃度を３００ｍＭに低下させることで抗体を溶出させる。
【００２３】
本方法を固定層クロマトグラフィ形式で実行し、ＩｇＧを蓄積させるための核形成の中心としての非イオン性親水性面を備えたモノリスを用いる幾つかの実施形態においては、少なくとも９５％のクロマチンを除去した不純なＩｇＧ調製物を、平均分子量が６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ−６０００）及びＮａＣｌから構成される、１９％のＰＥＧ−６０００及び０．８ＭのＮａＣｌを含有する沈殿溶液の存在下、モノリス表面に押し付ける。ＩｇＧは、沈殿物を形成する代わりにモノリス表面上に蓄積する。汚染物質を含有する上清はモノリスを通過し、捨てられる。モノリスを、１９％のＰＥＧ−６０００、１．０ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）の新しい溶液で洗浄する。１．０ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）の溶液を適用することで、高純度ＩｇＧがモノリスから溶出する。追加の精製を行うことが望ましい幾つかのそのような実施形態においては、ＩｇＧを任意で、疎水性陰イオン交換体、例えばＣａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を充填したカラムに通し、ここで抗体は結合する。次に、ＮａＣｌ濃度を３００ｍＭに低下させることで抗体を溶出させる。密接に関わる実施形態において、最終洗浄バッファは１９％のＰＥＧ−６０００、５０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．０）を含有し、ＩｇＧを５０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．０）で溶出させ、陽イオン交換体に通し、続いて塩濃度を上昇させる及び／又はｐＨを上昇させることで溶出させる。密接に関わる実施形態において、最終洗浄バッファは１９％のＰＥＧ−６０００、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）を含有し、ＩｇＧを５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で溶出させ、さらに精製するために疎水性陽イオン交換体に通す。密接に関わる実施形態において、最終洗浄バッファは１９％のＰＥＧ−６０００、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を含有し、ＩｇＧを１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で溶出させ、さらに精製するためにヒドロキシアパタイトに通す。上述した追加精製ステップには全て、存在しているかもしれないさらなる汚染物質を除去することに加えて、残留しているＰＥＧをＩｇＧ調製物から除去する効果を有することがわかる。
【００２４】
幾つかの実施形態において、所望のタンパク質は抗体になり得る。幾つかの実施形態において、所望のタンパク質はＩｇＧ抗体になり得る。幾つかの実施形態において、所望のタンパク質はＩｇＭ抗体になり得る。幾つかの実施形態において、所望のタンパク質はモノクローナル抗体になり得る。幾つかの実施形態において、所望のタンパク質は非抗体タンパク質になり得る。幾つかの実施形態において、所望のタンパク質は凝固因子になり得る。幾つかの実施形態において、所望のタンパク質はフィブリノゲンになり得る。幾つかの実施形態において、所望のタンパク質は因子ＶＩＩＩになり得る。幾つかの実施形態において、所望のタンパク質は、複合体又は因子ＶＩＩＩ及びフォン・ヴィルブランド因子になり得て、この複合体は抗血友病因子（ａｎｔｉ−ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａｃ  ｆａｃｔｏｒ）としても知られる。
【００２５】
特定の実施形態において、通常の生理学的導電率より高い導電率を得るのに十分な塩濃度は通常の生理学的導電率よりずっと高くなり得る。通常の導電率は１２〜１６ｍＳ／ｃｍになり得て、「ずっと高い」とみなされる値には２０ｍＳ／ｃｍ、３０ｍＳ／ｃｍ、４０ｍＳ／ｃｍ、５０ｍＳ／ｃｍ、６０ｍＳ／ｃｍ、７０ｍＳ／ｃｍ、８０ｍＳ／ｃｍ、９０ｍＳ／ｃｍ、１００ｍＳ／ｃｍ、１５０ｍＳ／ｃｍ、２００ｍＳ／ｃｍ又はこれらの中間値又はこれらより高い値、例えば最高でＮａＣｌの飽和溶液の導電率が含まれ得る。実験データは、約５０〜１５０ｍＳ／ｃｍ（ＮａＣｌ濃度約０．５〜約１．５Ｍに対応）で汚染物質の削減及びＩｇＧの回収を最も効果的に行い得ることを示している。他のケースにおいて、「生理学的導電率より高い」という表現は、１７、１８若しくは１９ｍＳ／ｃｍ又はこれらの中間値であると理解し得る。全てのＩｇＧが異なる挙動を示し、またＩｇＧが入っている不純な調製物の成分も影響を及ぼすことから、特定のＩｇＧ調製物に合う最も好適な導電率を求めるための単純な実験を行うことが必要となると理解されたい。より高い純度の達成がＰＥＧ沈殿で可能になる利点に加えて、酸性汚染物質を含めた汚染物質の削減により少なくとも１つの電気的陽性面の必要容量も減少し、電気的陽性面がより効果的なものとなり、面の寸法も縮小し得ると認識するのが重要である。
【００２６】
特定の実施形態において、導電率を上昇させるために使用する塩は中性の塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウムになり得る。特定の実施形態において、塩はカオトロピック塩、例えばとりわけ酢酸グアニジン、塩酸グアニジン、硫酸グアニジン、ホスフェート、チオシアン酸ナトリウム又はチオシアン酸カリウムになり得る。特定の実施形態においては、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、リン酸カリウムを含めた沈殿塩の使用を回避するが、これはこれらの化合物が自発的相分離を引き起こす強い傾向を有し、濃厚なＰＥＧ溶液が濃厚な塩溶液上に浮かぶからである。殆どの目的で、また特には出発点として、概して、ＮａＣｌが選択塩となる。
【００２７】
特定の実施形態において、塩濃度は２．０Ｍより高く、２．５Ｍより高く、３Ｍより高く、４Ｍより高く、最高で飽和溶液である。幾つかのそのような実施形態において、塩はＮａＣｌである。幾つかのそのような実施形態において、塩はＫＣｌである。
【００２８】
特定の実施形態において、導電率が生理学的導電率より高い（特に、生理学的導電率よりずっと高い値を含む）工程段階中、作業ｐＨを最適化する必要は低下する又はなくなると考えられる。低導電率値では、ｐＨがタンパク質間の電荷相互作用を変化させる。タンパク質がその等電点にある時、正味の電荷はゼロであり、自己反発性は最小限である。ｐＨが等電点より高い時、正味の電荷は負となり、ｐＨが上昇するにつれて自己反発性が上昇する。ｐＨが等電点より低い時、正味の電荷は正となり、ｐＨが低下するにつれて自己反発性が上昇する。したがって、既定のＩｇＧがその等電点にある又は等電点に近い場合は概して、ＰＥＧによる沈殿が好まれる。塩イオンは溶液中の帯電体間での静電的相互作用と競合するため、等電点から離れたｐＨ値ではタンパク質間での反発度が低下し、ｐＨの効果が低下する又は無効となる。開示の方法の文脈における実際的な意義は、幾つかの実施形態において、高導電率を生み出す濃度での塩の存在によりｐＨを調節する必要性がおおむねなくなることである。本方法を特定の不純な調製物中の特定のＩｇＧに合わせてカスタマイズすることを目的として、中性ｐＨ７．０は良い出発点であり、ｐＨの調節は不要となると考えられる。
【００２９】
塩が２Ｍより高い濃度で存在する幾つかの実施形態において、溶液のｐＨは７、８、８．５、それより高い値、６、６．５、６〜８．５の間の別の値又は６未満である。
【００３０】
幾つかのそのような実施形態において、塩はＮａＣｌ又はＫＣｌ又はこれらの組み合わせ又はこれらのいずれか若しくは両方と別の塩との組み合わせである。
【００３１】
幾つかの実施形態において、非イオン性有機ポリマーは、とりわけポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、デキストラン、セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン又はこれらの組み合わせになり得る。
【００３２】
幾つかの実施形態において、非イオン性有機ポリマーは、約２０００ダルトン（Ｄ）、３０００Ｄ、４０００Ｄ、５０００Ｄ、６０００Ｄ、８０００Ｄ、１００００Ｄ若しくは１２０００Ｄのポリマーサイズ又は中間値のポリマーサイズのＰＥＧとなる。実験により、平均ポリマーサイズが小さければ小さいほど、沈殿を達成するのに必要な濃度が高くなることが立証されている。これは単なる質量調節ではない。ＰＥＧポリマーの有効性はその流体力学的半径非依存性質量に比例するため、同じ質量ではあるが分岐度が異なるＰＥＧポリマーは異なる沈殿仲介能を有するという事実によってもたらされる革新的な効果がある。幾つかの実施形態においては、ポリマーサイズの組み合わせを用い得る。
【００３３】
幾つかの実施形態において、ＰＥＧはＰＥＧ−６０００となり、生理学的導電率若しくはそれより低い値でＩｇＧの沈殿を達成する又はこれらの導電率値でＩｇＧを沈殿状態で維持するのに必要なＰＥＧの濃度は、１２〜１８％又は１４〜１６％になり得る。幾つかの実施形態においては、ＰＥＧ−６０００の濃度を、約８０ｍＳ／ｃｍの導電率を生み出すのに十分な塩濃度、例えば１ＭのＮａＣｌにおいて、ＩｇＧの沈殿を達成するために及び／又はＩｇＧを沈殿状態で維持するために、上昇させる必要がある。生理学的濃度での沈殿を達成するのに必要なＰＥＧ−６０００濃度が１５〜１６％であるそのような一実施形態において、１ＭのＮａＣｌの存在下で沈殿を達成するのに必要なＰＥＧ−６０００の濃度は１８〜２２％である。これは、塩がＰＥＧの流体力学的半径を減少させる、塩の公知でありながら概して見過ごされている作用を反映している。各ＩｇＧクローン及びＩｇＧクローンが入っている不純な調製物の独特の個々の特徴に対応するには最適化が必要になるという理解のもとで、これらの濃度をガイドライン又は出発点として用いることができる。
【００３４】
幾つかの実施形態において、不純なＩｇＧ調製物は、例えば哺乳動物の細胞、酵母菌又は細菌由来の細胞培養収穫物から成り得る。幾つかの実施形態において、不純な調製物は培養した細胞の抽出物から成り得る。幾つかの実施形態において、不純なＩｇＧ調製物は体液、例えば血漿、血清、乳又は他の体液から成り得る。
【００３５】
幾つかの実施形態において、不純な調製物は、処理して細胞を除去してある細胞培養収穫物になり得る。そのような一実施形態においては、収穫物を事前に、物理的な方法、例えば遠心分離及び濾過によりコンディショニングし得る。
【００３６】
前出の実施形態の全てにおいて、少なくとも９５％クリアランスのクロマチン及び関係するカタボライトを除去するようにコンディショニングされている不純な調製物に開示の方法を実行することで系の能力が不均衡に上昇して高い精製が達成される。幾つかのそのような実施形態においては、収穫物を、面上に固定した多価有機イオンにより正電荷がもたらされる１つ以上の正に帯電した面と接触させることでコンディショニングし得る。別のそのような実施形態において、コンディショニング法は、所望の産物の調製物を可溶性の多価有機イオンと接触させることを含む。別のそのような実施形態において、コンディショニング法は、所望の産物の調製物を可溶性及び／又は不溶性の多価有機イオンと接触させることを含む。
【００３７】
幾つかの実施形態においては、調製物中のクロマチンを、最初の生物学的原料より少なくとも９５％低いレベルまでコンディショニング法により削減することができ、このコンディショニング法は収穫物を１種以上の多価有機イオンと接触させることを含む。幾つかのそのような実施形態において、多価有機イオンは電気的陽性である。
【００３８】
幾つかの実施形態において、可溶性電気的陽性多価イオンは、メチレンブルー、エタクリジン、クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、セチルトリメチルアンモニウムブロミド及びこれらの組み合わせから成る陽イオンの群から選択される１種を含む。
【００３９】
幾つかの実施形態において、多価イオンは、面に共有結合しているせいで不溶性である。
【００４０】
幾つかの実施形態において、不溶性電気的陽性多価イオンは、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基、４級アミノ基、１つ以上のタイプのアミノ基によりもたらされる２以上の正電荷を有する錯体カチオン及びこれらの組み合わせから成る群から選択される。
【００４１】
幾つかの実施形態において、不溶性電気的陽性多価イオンはトリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）である。
【００４２】
幾つかの実施形態において、多価有機イオンは電気的陰性である。
【００４３】
幾つかの実施形態において、可溶性電気的陰性多価イオンは、ヘプタン酸、ヘプテン酸、オクタン酸、オクテン酸、ノナン酸、ノネン酸、デカン酸、メチルブルー及びこれらの組み合わせから成る群から選択される。
【００４４】
幾つかの実施形態において、不溶性電気的陰性多価イオンは、リン酸基、カルボキシル基、スルホ基、１つ以上のタイプの負に帯電した基によりもたらされる２以上の負電荷を有する錯体アニオン及びこれらの組み合わせから成る群から選択される。
【００４５】
幾つかの実施形態において、不溶性電気的陰性多価錯体はイミノ二酢酸又はニトリロ酢酸になり得る。
【００４６】
幾つかの実施形態において、不溶性多価イオンは、金属イオンに対して１：１の親和性を有する。
【００４７】
幾つかの実施形態においては、アラントインが任意で、（ａ）約０．６〜約５０％、（ｂ）約０．７〜約２０％、（ｃ）約０．８〜約１０％、（ｄ）約０．９〜約５％、（ｅ）約１〜約２％及びこれらの中間範囲から成る群から選択される範囲の過飽和濃度で存在し得る。
【００４８】
前出の実施形態の１つ以上において、有機多価イオンでの不純な調製物のコンディショニングは、試料を、可溶性電気的陽性有機添加剤と接触させることを含む。そのような幾つかの実施形態において、電気的陽性有機添加剤は、エタクリジン、メチレンブルー、セチルトリメチルアンモニウムブロミドから成る群から選択される少なくとも１つの種を含む。幾つかのそのような実施形態において、そのような種の濃度又は種の組み合わせの凝集体濃度は、０．００１〜１％、０．０１〜０．１％、０．０２〜０．０５％、０．０１〜０．１％又は中間値の範囲である。幾つかのそのような実施形態においては、調製物のｐＨを、所望のＩｇＧの回収率の著しい低下を引き起こさないアルカリ値まで調節し得る。そのような一実施形態においては、ｐＨを、抗体等電点の半ｐＨ単位以内のｐＨ値まで、あるいは実験結果から抗体回収率が許容範囲であるならそれ以上に調節し得るが、そのような調節は概して不要である。ｐＨ調節を行う限りでは、タンパク質等電点の１ｐＨ単位以内、１．５ｐＨ単位以内又は２ｐＨ単位以内又はそれより大きいｐＨ単位以内の値で十分である。
【００４９】
前出の実施形態の１つ以上において、有機多価イオンでの不純な調製物のコンディショニングは、試料を可溶性電気的陰性有機添加剤と接触させることを含む。幾つかのそのような実施形態において、電気的陰性有機添加剤は、ヘプタン酸、ヘプテン酸、オクタン酸、オクテン酸、ノナン酸、ノネン酸、デカン酸、メチルブルーから成る群から選択される少なくとも１つの種を含む。幾つかのそのような実施形態において、そのような種の濃度又は種の組み合わせの総濃度は、０．００１〜１０％、０．０１〜１％又は０．１〜０．５％の範囲である。幾つかのそのような実施形態においては、調製物のｐＨを、所望のタンパク質の回収率の著しい低下を引き起こさない酸性値まで調節して下げ得る。幾つかのそのような実施形態においては、調製物のｐＨを、３．５〜６．５、４．０〜６．０、４．５〜５．５、５．０〜５．３、５．１５〜５．２５の範囲又は５．２又は別の中間値に調節し得る。
【００５０】
前出の実施形態の１つ以上において、有機多価イオンでの不純な調製物のコンディショニングは、試料を、溶解させていないアラントインと接触させることを含む。幾つかのそのような実施形態において、不純な調製物中に存在する添加アラントインは、約０．６〜５０％、０．７〜２０％、０．８〜１０％、０．９〜５％、１〜２％又は中間値に達し得る。前出の実施形態の１つ以上においては、ドライアラントインの平均粒径を、過飽和溶液中の溶解させていないアラントインの総表面積を最も広くすることを目標として、入手可能な中で最も小さいサイズとなるように選択する。そのような一実施形態においては、アラントインを、より小さい粒径となるように造粒する。
【００５１】
幾つかの実施形態において、固体表面上に固定されるマルチモードの有機イオンが電気的陽性である場合、固定化マルチモード有機イオンは窒素含有基、例えば１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基、４級アミノ基又はそのような基の組み合わせ若しくはポリマーになり得る。幾つかのそのような実施形態において、窒素含有化合物は２（アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）になり得る。幾つかの実施形態において、正に帯電した窒素含有基は、イミン、ピリジン又は他の電気的陽性基になり得る。幾つかの実施形態において、窒素含有化合物の正電荷は、窒素原子以外の残基、例えば硫黄原子上に存し得る。
【００５２】
前出の実施形態の１つ以上において、有機多価イオンでの不純な調製物のコンディショニングは、試料を、非イオン性又は両性イオン界面活性剤と、その臨界ミセル濃度より低い濃度で接触させることを含む。
【００５３】
前出の実施形態の１つ以上において、有機多価イオンでの不純な調製物のコンディショニングは、（ｉ）電気的陰性面を有する第１固形基質である第１成分を用意し、（ｉｉ）不純な調製物を第１成分と接触させ（所望のタンパク質の第１成分への結合は作業条件により実質的に防止される）、（ｉｉｉ）低クロマチン含有量の所望のタンパク質を第１成分から分離することを含む。幾つかのそのような実施形態において、第１電気的陰性面は、第２電気的陰性面を伴い得る。
【００５４】
前出の実施形態の１つ以上において、有機多価イオンでの不純な調製物のコンディショニングは、（ｉ）電気的陽性面を有する第１固形基質である第１成分を用意し、（ｉｉ）不純な調製物を第１成分と接触させ（所望のタンパク質の第１成分への結合は作業条件により実質的に防止される）、（ｉｉｉ）低クロマチン含有量の所望のタンパク質を第１成分から分離することを含む。幾つかのそのような実施形態において、第１電気的陽性面は２（アミノエチル）アミンの残基を担持する。幾つかのそのような実施形態において、第１電気的陽性面は、第２電気的陽性面を伴い得る。
【００５５】
前出の実施形態の１つ以上において、有機多価イオンでの不純な調製物のコンディショニングは、（ｉ）電気的陽性面を有する第１固形基質である第１成分を用意し、（ｉｉ）電気的陰性面を有する第２固形基質である第２成分を用意し、（ｉｉｉ）不純な調製物を第１成分及び第２成分と接触させ（第１及び第２成分は、不順な調製物が両方の成分と同時に接触し得るように構成され、所望のタンパク質の第１又は第２成分への結合は作業条件により実質的に防止される）、（ｉｖ）低クロマチン含有量の所望のタンパク質を第１及び第２成分から分離することを含む。幾つかのそのような実施形態において、第１電気的陽性面は、２（アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）の残基を担持する。
【００５６】
前出の実施形態の１つ以上において、有機多価イオンでの不純な調製物のコンディショニングは、（ｉ）不純な調製物を、金属を結合可能な少なくとも１つの表面結合リガンドを備える少なくとも１つの固体表面と接触させ（金属を結合可能な表面結合リガンドは最初は実質的に金属を欠いており、この少なくとも１つの固体表面への所望のタンパク質の結合を実質的に防止するように作業条件は選択される）、（ｉｉ）この少なくとも１つの表面結合リガンドから不純な調製物を分離することを含む。
【００５７】
前出の実施形態の１つ以上においては、可溶性電気的陽性若しくは電気的陰性有機添加剤及び／又は電気的陰性、電気的陽性若しくは金属親和性リガンドを担持する固体表面で既に処理した不純な調製物を続いて、流体接触面が正電荷を帯びているデバイスに流し得る。
【００５８】
クロマチンを対象とした清澄化法の応用を描いた一実施形態においては、アラントインを細胞培養収穫物に１％（ｖ／ｖ）の量で添加する。細胞培養物は細胞を含有し得て、あるいは細胞が事前に除去されてしまっているものになり得る。メチレンブルーを濃度０．０２５％（ｗ／ｖ）まで添加する。あるいは、エタクリジンを濃度０．０２５％まで添加し得る。あるいは、０．０２５％のセチルトリメチルアンモニウムブロミドを濃度０．０２５％まで添加し得る。あるいは、これら又は他の電気的陽性有機添加剤の組み合わせを合計濃度０．０２５％で使用し得る。次に、混合物を２時間にわたって撹拌しながらインキュベートする。電気的陽性金属親和性リガンド２（アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）を担持している粒子を２〜５％ｖ：ｖの量で添加する。混合物を４時間にわたって撹拌しながらインキュベートし、次に固形物を適切な手段で除去する。所望のタンパク質を含有している残った溶液を任意で、その流体接触面が正電荷を帯びているデプスフィルタに通し得る。
【００５９】
クロマチンを対象とした清澄化法の応用を描いた別の実施形態においては、アラントインを細胞培養収穫物に１％（ｖ／ｖ）の量で添加する。細胞培養物は細胞を含有し得て、あるいは細胞が事前に除去されてしまっているものになり得る。０．７％のヘプタン酸を添加する。あるいは、０．４％のオクタン酸を添加する。あるいは、０．４％のオクテン酸を添加する。あるいは、０．３％のペラルゴン酸（ノナン酸）を添加する。あるいは、０．３％のノネン酸を添加する。あるいは、０．２％のカプリン酸を添加する。あるいは、０．５％のメチルブルーを添加する。あるいは、これら又は他の電気的陰性有機添加剤の組み合わせを使用し得る。次に、混合物を２時間にわたって撹拌しながらインキュベートする。電気的陽性金属親和性リガンド２（アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）を担持している粒子を２〜５％ｖ：ｖの量で添加する。混合物を４時間にわたって混合しながらインキュベートし、次に固形物を適切な方法で除去する。所望のタンパク質を含有している残った溶液を任意で、その流体接触面が正電荷を帯びているデプスフィルタに通し得る。
【００６０】
幾つかの実施形態においては、特定のコンディショニング法のクロマチン削減度を、ＤＮＡ削減度及びヒストン削減度を測定し、これら２つの値を平均することで概算する。幾つかのそのような実施形態においては、ＤＮＡをインターカレーティング染料アッセイにより測定し、ヒストンを典型的には免疫アッセイにより測定する。幾つかのそのような実施形態においては、ヒストンの量はクロマチンの量の一次関数であることから、総ヒストン含有量を、１種のヒストンの含有量を求め、量をクロマチン中の他のヒストンの相対的な比率に比例させて調節することで測定することができる。例えば、総ヒストン量は、ヒストンＨ１の測定を行い、次に９倍して完全なクロマチン中の他のヒストンに対するＨ１の質量比とすることで概算することができる。あるいは、総ヒストン量を、Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ、Ｈ３又はＨ４を測定し、これらのうちのいずれかの結果に４．５を掛けることで概算し得る。あるいは、個々のアッセイをＨ１、Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ、Ｈ３、Ｈ４について行い、結果を合計することができる。あるいは、ＤＮＡアッセイで、ポリメラーゼ連鎖反応技術を活用し得る。しかしながら、実験データは、総クロマチン量を概算するためにＤＮＡを使用すると、製造中の細胞死に続くＤＮＡの酵素仲介加水分解により総クロマチン量を実際より少なく概算してしまう可能性を示している。ヒストン及びＤＮＡアッセイは共に、精確な結果を得るための特殊な抽出手順を必要とし得る。
【００６１】
特定の実施形態においては、ＩｇＧ調製物を、本方法の１つ以上の段階で１種以上の抗ウイルス性化合物と接触させ得る。幾つかのそのような実施形態において、１種以上の抗ウイルス性化合物は、エタクリジン、メチレンブルー、塩化ベンザルコニウム、クロルヘキシジン、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、トリ（ｎ−ブチル）ホスフェートから成る群から選択される。
【００６２】
特定の実施形態において、本方法の実行中に用いる非イオン性親水性粒子はナノ粒子又はミクロ粒子である。幾つかのそのような実施形態において、非イオン性親水性粒子は多孔質である。特定の実施形態において、粒径は約５０ｎｍ〜約５００μｍ、約５０ｎｍ〜約５０μｍ、約５０ｎｍ〜約４μｍ、約５０ｎｍ〜約３μｍ、約５０ｎｍ〜約１μｍ、約１００ｎｍ〜約１μｍ、約２００ｎｍ〜約２μｍ、約２００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約５００ｎｍ〜約１μｍ又は約５μｍ〜約５０μｍである。
【００６３】
幾つかの実施形態において、調製物から所望のタンパク質を精製する方法を提供し、本方法は、調製物を、最初の製造媒体中に存在しているクロマチンの約５％未満を有する形態で用意し、調製物を、非イオン性有機ポリマーと、所望のタンパク質を沈殿させる又は非イオン性親水性面に吸着させるのに十分な量で接触させ、この接触ステップ前又は最中に塩濃度を調節することを含み、この調節ステップで、生理学的導電率より高い導電率を得るのに十分な塩濃度にする。
【００６４】
幾つかの実施形態において、本明細書で開示の方法は、沈殿した所望のタンパク質を多孔質膜上で保持することで可溶性汚染物質に膜を通過させることをさらに含む。
【００６５】
幾つかの実施形態において、本明細書で開示の方法は、沈殿した所望のタンパク質を可溶性汚染物質から、沈殿物を遠心分離で沈降させることで分離することをさらに含む。
【００６６】
幾つかの実施形態において、非イオン性親水性面は、膜、モノリス、粒子、任意で磁性である粒子及びこれらの組み合わせから成る群から選択される１種を含む。
【００６７】
幾つかの実施形態において、本方法は単一の一体型装置において行われる。
【００６８】
幾つかの実施形態において、非イオン性有機ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【００６９】
幾つかの実施形態において、非イオン性有機ポリマーの平均ポリマーサイズは、（ａ）約１５００〜約１５０００ダルトン、（ｂ）約２０００〜約１２０００ダルトン、（ｃ）約３０００〜約１００００ダルトン、（ｄ）約４０００〜約８０００ダルトン及び（ｆ）約５０００〜約６０００ダルトンから成る群から選択される範囲にある。
【００７０】
幾つかの実施形態において、導電率は生理学的導電率より少なくとも１ｍＳ／ｃｍ高い。幾つかの実施形態において、導電率は、生理学的導電率より、選択した塩溶液の飽和溶液に対応する導電率まで、約１ｍＳ／ｃｍ、５ｍＳ／ｃｍ、１０ｍＳ／ｃｍ、２０ｍＳ／ｃｍ、４０ｍＳ／ｃｍ、８０ｍＳ／ｃｍ、１６０ｍＳ／ｃｍ又は中間値分高い。幾つかの実施形態において、生理学的導電率より高い様々な導電率は、約３５ｍＳ／ｃｍ〜およそ生理学的導電率より約１３５ｍＳ／ｃｍ高い値になり得る。
【００７１】
幾つかの実施形態において、塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、塩酸グアニジン及びこれらの組み合わせから成る群から選択される。
【００７２】
幾つかの実施形態において、塩は、（ａ）約０．５〜約１．５Ｍ、（ｂ）約２．０〜約３．０Ｍ及びこれらの中間範囲から成る群から選択される濃度の塩化ナトリウムである。
【００７３】
幾つかの実施形態において、本方法は、ｐＨを、（ａ）約５〜約９、（ｂ）約６〜約８、（ｃ）約６．５〜約７．５、（ｄ）約７．５〜約８．５及びこれらの中間範囲から成る群から選択される範囲に調節することをさらに含む。
【００７４】
幾つかの実施形態において、調製物は、細胞培養培地、培養した生物からの抽出物及び体液から成る群から選択される生物学的原料から得られる。
【００７５】
本明細書で開示の方法をより理解し易いように下で用語を定義する。追加の定義は、「発明を実施するための形態」全体を通して明記されている。
【００７６】
「クロマチン」とは染色体の基本的な組成のことである。生細胞におけるその完全な形態において、クロマチンは、少量の他のタンパク質及びペプチドと会合しているＤＮＡ及びヒストンタンパク質を最も多く含む。クロマチンはヌクレオソームに編成され、ヌクレオソームは、ＤＮＡが１．６５回巻き付いた、ヒストン２ａ、２ｂ、３及び４（それぞれ２個）を含めたヒストンタンパク質の八量体を含む。ヌクレオソームは、ヒストンＨ１と会合しているリンカーＤＮＡの部位により直線に繋がっている。細胞死と同時にクロマチンは崩壊し始める。組み換えタンパク質の作成で用いるような細胞培養工程において、クロマチン及びその崩壊産物は細胞培養培地に吐き出され、所望の組み換え産物を含め、細胞培養培地の成分と会合体を形成し得る。用語「クロマチンカタボライト」は、クロマチンの崩壊産物のことを指す際に用い得る。これらの崩壊産物には、２〜３０又はそれより多いヌクレオソームを含有するアレイ、個々のヌクレオソーム、ヌクレオソームフラグメント、ＤＮＡ及びヒストンタンパク質が含まれる（上記のＧａｎら、上記のＧａｇｎｏｎら（２０１３）。「ヒストンタンパク質」とは、クロマチンカタボライトであると理解される。「ＤＮＡ」は、そのサイズに関わらず、クロマチンカタボライトの１つの種であると理解される。個々の「ヌクレオソーム」及びヌクレオソームアレイは、クロマチンカタボライトであると理解される。
【００７７】
「立体排除クロマトグラフィ」とは、抗体分子（例えば、ＩｇＧ又は他の抗体生成物）の保持を、抗体及び非イオン性粒子の親水性面からの非イオン性有機ポリマー（例えば、ＰＥＧ）の同時相互立体排除により仲介する精製方法のことである。タンパク質表面と粒子表面との間に直接的な化学的相互作用は起きないと考えられる。このことが、従来のクロマトグラフィ法、例えばイオン交換又は疎水性相互作用クロマトグラフィで可能なものより広い条件範囲で結合を維持する能力を本方法にもたらし、本方法を独特のものにしている。
【００７８】
「水和面」又は「高水和面」又は「親水性面」とは、可能性として水素結合、電気ひずみ又はこれら２つのメカニズムの組み合わせを通じて水と強く相互作用する面のことである。そのような相互作用は、ヒドロキシル、負電荷若しくは正電荷又は非荷電極性基等の化学基が仲介し得る。水和性の化学基の存在が、既定の材料（例えば、粒子又は対流クロマトグラフィ（ｃｏｎｖｅｃｔｉｖｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）材料）の本来の組成の基本的な特徴になり得る。あるいは、その特徴を、そのような基を面に固定する化学修飾により追加し得る又は強化し得て、炭水化物、ウレイドが含まれるがこれらに限定されない。いわゆる疎水性面は概して、高く水和されないとみなされるが、それでも疎水性残基と組み合わせて強水和性基を含む面は、本明細書で開示の方法を実行するのに十分に水和され得る。
【００７９】
「凝集体」とは、生理学的条件下で安定し且つ広いｐＨ範囲及び導電率条件にわたって安定し続け得る２つ以上の分子の会合体のことである。凝集体は多くの場合、少なくとも１つの生体分子（例えば、タンパク質、核酸、脂質）及び別の分子又は金属イオンを含む。会合は、いずれのタイプ又はいずれの組み合わせの化学相互作用を通じても起こり得る。抗体の凝集体は２つのカテゴリに分類することができる。「ホモ凝集体」とは、２つ以上の抗体分子の安定した会合体のことであり、「ヘテロ凝集体」とは、１つ以上の抗体分子と１つ以上の非抗体分子との安定した会合体のことである。非抗体成分は、ヌクレオチド、内毒素、金属イオン、タンパク質、脂質又は細胞培養培地成分から成る群の１種以上の実体から成り得る。
【００８０】
「抗体」とは、ヒト又は他の哺乳動物の細胞株由来のクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥの免疫グロブリンのことであり、天然又は遺伝子組み換え形態が含まれ、例えばヒト化、ヒト、単鎖、キメラ、合成、組み換え、ハイブリッド、変異、移植、インビトロ生成（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ）抗体が含まれる。「抗体」は複合体形態も含み得て、免疫グロブリン部分を含有する融合タンパク質又はＩｇＧを別の官能部分（別の抗体、酵素、蛍光体若しくは別のシグナル生成部分、ビオチン、薬剤又は他の官能部分を含む）に合成で結合することで作り出されるイムノコンジュゲートを含むがこれらに限定されない。
【００８１】
「抗体生成物」とは、少なくとも一部が抗体又は抗体の一部を含むタンパク質性の実体のことである。最も単純な例は抗体である。複合体例にはＦｃ融合タンパク質が含まれ、Ｆｃ−融合タンパク質は、組み換え手段により抗体のＦｃ部位に官能性非抗体タンパク質が共有結合したものである。別の複合体例は抗体コンジュゲート又はイムノコンジュゲートであり、抗体の官能性を上昇させることで例えば免疫アッセイで使用できるように抗体を蛍光性にしたり、あるいは抗体を同じ目的で酵素に結合させたり、がん細胞を殺すために細胞毒素に結合させたり、他の目的で他の部分に結合させる、（殆どの場合は合成手段により）別の部分に結合した抗体から成る。他の抗体生成物は、２つの異なるターゲットに対する結合特異性を備えた２つのドメインを有する二価の複合体（例えば、２つの抗体フラグメント間での融合体）である。
【００８２】
「内毒素」とは、溶解時に細胞から放出されるグラム陰性細菌の外膜中に存在する、毒性があり熱安定性のリポ多糖物質のことである。内毒素は、その高いリン酸及びカルボキシル残基含有量から概ね酸性になり得て、また脂質Ａ領域の脂肪酸含有量から高疎水性になり得る。内毒素は、水素結合の機会を広く提供し得る。
【００８３】
「非イオン性有機ポリマー」とは、帯電基を欠いた、繋がった繰り返し有機サブユニットから構成される天然又は合成の炭化水素のことである。線状、殆ど線状だが若干分岐したもの又は殆ど分岐したものになり得る。本明細書で開示の方法の実行に適した例には、以下に限定するものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が含まれる。ＰＥＧは構造式ＨＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｈを有する。例には、以下に限定するものではないが、１００未満〜１００００ダルトンを超える平均ポリマー分子量を有する組成物が含まれる。市販のＰＥＧ調製物の平均分子量は典型的にはハイフンを付けた添字で示される。例えば、ＰＥＧ−６０００とは、約６０００ダルトンの平均分子量を有する調製物のことである。そのような剤の有効濃度はポリマーの種類及び本明細書で開示の方法で処理する抗体生成物の特徴に応じて異なる。
【００８４】
「有機多価イオン」とは、少なくとも１の電荷及び少なくとも１つの追加の化学官能性を具有することで多価となる天然又は合成由来の有機分子、イオン又は塩のことである。特定の実施形態において、有機多価イオン少なくとも１つの追加の化学官能性は、有機多価イオンが２つ以上の同様の又は異なる電荷を帯びるような追加の電荷である。有機多価イオンは正味の正電荷、正味の負電荷又は正味の中性電荷を帯び得る。有機多価イオンが正味の正電荷を帯びる場合、陰イオン、例えば塩化物イオン、臭化物イオン、硫酸イオン、有機酸イオン、乳酸イオン、グルコン酸イオン及び本方法に不適合ではない他の陰イオンと共に提供され得る。特定の実施形態において、有機多価イオンの正電荷のいくらかはアミン、イミン又は他の窒素部分により供給される。有機多価イオンは付加的に複合的な化学的性質のものになり得て、また疎水性残基、他の官能性部分を含み得る及び／又は例えば水素結合、疎水性相互作用、ｐｉ−ｐｉ結合、金属配位及びインターカレーションに関与する能力を含めた、他のタイプの化学的相互作用に関与する能力を有し得る。特定の実施形態における正に帯電した有機多価イオンの例には、以下に限定するものではないが、ジアミノ酸、ジ−、トリ又はより大きなホモ若しくはヘテロペプチド、例えばポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリジメトリン、ポリメチルアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニア、ポリジアリルジメチルアンモニア、ポリビニルベンジルトリメチルアンモニア、ポリビニルグアニジン、ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジン、ＤＥＡＥ−デキストラン、ＤＥＡＥ−セルロース、エタクリジン（ＣＡＳ番号４４２−１６−０、７−エトキシアクリジン−３，９−ジアミン）、トリス（２−アミノエチル）アミン、グアニジン、クロルヘキシジン、アレキシジン、シトリシダル（ｃｉｔｒｉｃｉｄａｌ）、プロタミン、スペルミン、スペルミジン、サルミン、キトサン並びにこれらの変種及び誘導体が含まれる。例えば、エタクリジンの変種及び誘導体は、９−アミノアクリジン（アミナクリン）、３，６アクリジンジアミン（プロフラビン）、アクリソルシン（ａｃｒｉｓｏｒｃｉｎ）、アクリザン（ａｃｒｉｚａｎｅ）フェナクリダン（ｐｈｅｎａｃｒｉｄａｎｅ）、アクリジンオレンジ、キナクリン、アクリシド、アクリドン、アクリジン−９−カルボン酸、アクラニル（ｌ−［（６−クロロ−２−メトキシ−９−アクリジニル）アミノ］−３−（ジエチルアミノ）−２−プロパノールジヒドロクロリド）、フェノサフラニン、フェノキサジン、フェノチアジン、アクリフラビン（３，６−ジアミノ−１０−メチルアクリジニウム、クロリド及び３，６−アクリジンイジアミン）及びこれらの塩（例えば、塩化物、臭化物、硫酸塩、乳酸塩、グルコン酸塩）を含むと理解される。別の有効な電気的陽性多価有機イオン群には、チアジン、例えばメチレンブルー、その誘導体、類似体及びその塩が含まれる。有機多価イオンが正味で電気的陰性である場合は、陽イオン、例えばナトリウム若しくはカリウム又は本方法に不適合ではない他の陽イオンと共に提供され得る。特定の実施形態において、有機多価イオンの負の電荷のいくらかはカルボキシル、リン酸又はスルホ部分により供給される。有機多価イオンは付加的に複合的な化学的性質のものになり得て、また疎水性残基、他の官能性部分を含み得る及び／又は例えば水素結合、疎水性相互作用、ｐｉ−ｐｉ結合、金属配位及びインターカレーションに関与する能力を含めた、他のタイプの化学的相互作用に関与する能力を有し得る。特定の実施形態における負に帯電した有機多価イオンの例には、以下に限定するものではないが、脂肪酸、例えばヘプタン酸、ヘプテン酸、オクタン酸、オクテン酸、ノナン酸、ノネン酸、デカン酸、メチルブルー、アニオン性ポリマー及びこれらの塩（例えば、塩化物、臭化物、硫酸塩、乳酸塩、グルコン酸塩）が含まれる。
【００８５】
「ポリヌクレオチド」とは、鎖状に共有結合した複数のヌクレオチドモノマーから構成される生体高分子のことである。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）及びＲＮＡ（リボ核酸）は、ポリヌクレオチドの例である。ポリヌクレオチドは、高い水素結合形成傾向を有し得る。
【００８６】
「タンパク質」とは、炭素、水素、酸素、窒素及び通常は硫黄を含有する複雑な有機巨大分子群のことであり、主にペプチド結合で繋がれた１本以上のアミノ酸の鎖から構成される。タンパク質は天然又は組み換え由来になり得る。タンパク質を、例えばグリコシル化、ペグ化又は他の化学部分との共役を通して非アミノ酸部分で修飾し得る。タンパク質の例には、以下に限定するものではないが、抗体、凝固因子、酵素及びペプチドホルモンが含まれる。
【００８７】
「タンパク質調製物」とは、対象とするタンパク質を含有する水性又はほぼ水性の溶液のことであり、例えば細胞含有細胞培養収穫物、（実質的に）細胞を含有しない細胞培養物上清又は精製段階で得られる、対象のタンパク質を含有する溶液である。
【００８８】
「界面活性剤」には「表面活性剤」が含まれ、例えば概して疎水性部位と親水性部位とを具有することで両親媒性と称される有機分子群である。水溶液中、十分な濃度で、界面活性剤は、疎水性部位を中心として集まったクラスタへと自己会合することで水との接触を最小限に抑えることができ、親水性部位は外に向かって放射状に広がって水との接触を最大にする。生物学的調製物、特には疎水性を有する又は疎水性領域を有する物質を含有するものの存在下、界面活性剤の疎水性部位は疎水性物質の一部に自発的に会合し、界面活性剤の親水性部位の影響下、可溶性を上昇させる傾向がある。また、水性溶媒中に共に溶解している異なる疎水性物質間で起きる疎水性相互作用の調整にも使用し得る。本明細書で開示の方法の特定の実施形態を実行するのに適した界面活性剤の例には、以下に限定するものではないが、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、Ｔｗｅｅｎ８０、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）及びＴｒｉｔｏｎ（例えば、ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）並びに両性イオン界面活性剤、例えばＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、ＣＨＡＰＳＯ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート）及びオクチルグリコシド（例えば、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−（ヒドロキシメチル）−６−オクトキシオキサン−３，４，５−トリオール）が含まれる。
【００８９】
「合成粒子」のサイズは、１００ｎｍ未満〜１００ミクロンを超えるものになり得る。合成粒子は多孔質又は非多孔質になり得る。合成粒子は重合体になり得て、例えばポリメタクリレート、ポリアクリレート、アガロース、セルロース、デキストラン又は他のポリマーから構成され、あるいは無機になり得て、例えばシリカである。合成粒子は全体を通して均一な構造になり得て、あるいは合成粒子は複合体になり得て、ある物質（例えば、合金、疎水性ポリマー）の内部コアから成り、高水和性であり且つ化学基を結合させて高水和面にし得る適用面がコーティングされている。「合成粒子」は、クロマトグラフィ用途向けに設計した粒子又はクロマトグラフィ分野とは完全に異なる用途向けの粒子を含み得る。
【００９０】
「不純な調製物」とは、対象とするタンパク質を含有する水性又はほぼ水性の溶液のことであり、例えば細胞含有細胞培養収穫物、（実質的に）細胞を含有しない細胞培養物上清、細胞抽出物、体液又は精製段階で得られる、対象のタンパク質を含有する溶液のことである。
【００９１】
「ウレイド」とは、１つ以上のウレア部分を含む天然若しくは合成由来の環式若しくは非環式の有機分子又はその誘導体のことである。特定の実施形態において、本明細書で開示の方法はウレイド、例えばウレア、尿酸、ヒダントイン、アラントイン（ＣＡＳ番号９７−５９−６、アルクロキサ、アルジオキサ、ヘモカン（ｈｅｍｏｃａｎｅ）、ウレイドヒダントイン、５−ウレイドヒダントイン、グリオキシウレイド、グリオキシル酸ジウレイド、２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニルウレア）、プリン及びこれらの誘導体を提供する。特定の実施形態において、本明細書で開示の方法は、式Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ２又はＲ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ’又はＲ’Ｒ“ＮＨ−ＣＯ−ＮＲ”’Ｒ””（関連する「Ｒ基」はＨ又は任意の有機部分になり得る）の有機分子を提供する。
【００９２】
「ウイルス」又は「ビリオン」とは、生きている宿主（主に細菌、植物及び動物）の細胞内でのみ増殖し、ＲＮＡ又はＤＮＡコア、タンパク質外被及び、より複雑なタイプでは、周囲を囲むエンベロープから構成される極微（大体直径２０〜３００ｎｍ）で代謝的に不活性な感染病原体のことである。
【００９３】
特定の実施形態においては、立体排除クロマトグラフィ（ＳＸＣ）を流動化親水性非イオン性粒子上で行う。特定の実施形態において、ＳＸＣ粒子は、１０ミクロン未満〜２００ミクロンを超えるものになり得るミクロ粒子である。特定の実施形態において、ＳＸＣ粒子は、サイズが１０ｎｍ未満〜１０００ｎｍになり得るナノ粒子である。特定の実施形態において、ＳＸＣ粒子は非多孔質になり得る。特定の実施形態において、ＳＸＣ粒子はミクロ多孔質になり得る。特定の実施形態において、ＳＸＣ粒子はマクロ多孔質になり得る。特定の実施形態において、ＳＸＣ粒子は、磁性面上で又は磁界においてその捕捉を可能にするような形に構成され得る。
【００９４】
特定の実施形態において、ＳＸＣは、流動化親水性非イオン性粒子上で行われる。特定の実施形態において、ＳＸＣ粒子は、１０ミクロン未満〜２００ミクロンを超えるものになり得るミクロ粒子である。特定の実施形態において、ＳＸＣ粒子は、サイズが１０ｎｍ未満〜１０００ｎｍになり得るナノ粒子である。特定の実施形態において、ＳＸＣ粒子は非多孔質になり得る。特定の実施形態において、ＳＸＣ粒子はミクロ多孔質になり得る。特定の実施形態において、ＳＸＣ粒子はマクロ多孔質になり得る。特定の実施形態において、ＳＸＣ粒子は、磁性面上で又は磁界においてその捕捉を可能にするような形に構成され得る。
【００９５】
特定の実施形態においては、ＮａＣｌ以外の１種以上の塩を洗浄ステップで使用し得る。そのような塩は、構造壊乱塩と称されることもあり且つナトリウム若しくはカリウムイソチオシアネートを例とするいわゆるカオトロピック塩又は構造形成塩と称されることもあり且つ硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム若しくはリン酸カリウムを例とするいわゆるコスモトロピック塩を含み得る。
【００９６】
特定の実施形態においては、塩以外の洗浄剤を塩と組み合わせて又は塩の代わりに使用し得て、例えば非イオン性カオトロープ（例えば、ウレア）又は非イオン性若しくは両性界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、オクタグルコシド、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ）又は非イオン性有機溶媒（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール）又は糖（例えば、スクロース、ソルビトール）又はキレート剤である。そのイオン性及び陰イオン交換過程干渉潜在能力により、電気的陽性キレート剤（例えば、ＴＲＥＮ）が、電気的陰性キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）より好ましいと考えられる。他の洗浄剤も考えられ、例えばアルギニン等のアミノ酸であり、キレート剤と同様に、同じ理由から電気的陽性優位種が好ましい。
【００９７】
特定の実施形態においては、本方法を単一単位操作として行う。
【００９８】
特定の実施形態においては、立体排除クロマトグラフィ粒子上でのＩｇＧの保持の促進に使用するＰＥＧの平均サイズは８ｋＤａ、６、４、３、２又は１ｋＤａになり得る。特定の実施形態において、立体排除クロマトグラフィ粒子上でのＩｇＧの保持の促進に使用する物質はＰＥＧ以外のポリマーになり得て、例えばポリプロピレングリコール、ポリビニルピロリドン、デキストラン又は他の非イオン性有機ポリマーである。
【００９９】
特定の実施形態において、所望の抗体生成物は完全に無傷の抗体、例えば分子量が約１５０ｋＤａのＩｇＧである。
【０１００】
特定の実施形態において、試料は、コンディショニング済みの細胞培養物上清（ＣＣＳ）から成る。特定の実施形態において、ＣＣＳは遠心分離、フロキュレーション、濾過又はこれらの技法の組み合わせによりコンディショニングされる。特定の実施形態において、ＣＣＳはより包括的な手段によりコンディショニングされ、特に調製物のクロマチン含有量及び／又は凝集体含有量を削減する化学的添加剤の使用が含まれる。特定の実施形態においては、ＣＣＳを、９５％以上のクロマチンを除去し且つ同時に非ヒストン宿主タンパク質、内毒素及びウイルスの実質的な除去並びに凝集体含有量の１％以下までの削減を達成し、その一方で抗体回収率９０〜９９％をサポートする方法で清澄化する。
【０１０１】
特定の実施形態において、本明細書で開示の請求の方法は凝集体含有量を削減する。特定の実施形態において、本明細書で開示の請求の方法は抗体フラグメントの含有量を削減する。
【０１０２】
当業者ならば、上記の工程の数多くの変化形を、その必須要素から逸脱することなく用い得ることがわかる。例えば、実施形態は、工程ステップを分割して２、３又はそれより多い単位操作で実行することを含み得る。
【０１０３】
特定の実施形態において、本明細書で開示の請求の方法には他の精製方法が先行し得る又は後続し得る又は先行及び後続し得る。幾つかのそのような実施形態において、開示の方法には特には、所望のＩｇＧを面上に保持する分画法が後続し得て、残留ＰＥＧは洗い流され、続いて抗体を、抗体が保持されている今やＰＥＧが不在である面から溶出させる。幾つかのそのような実施形態において、抗体を保持する面は、陽イオン交換クロマトグラフィ媒体、アパタイト媒体、正電荷と疎水性とを組み合わせたミックスモード媒体から成る群のクロマトグラフィ媒体になり得る。そのような一実施形態において、正電荷と疎水性とを組み合わせたミックスモードクロマトグラフィ媒体は、Ｃａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）の名で市販のクロマトグラフィ製品を代表とする。
【０１０４】
幾つかの実施形態において、開示の方法の最後でＩｇＧ調製物が非ＩｇＧ沈殿濃度の非イオン性有機ポリマーを含有していると仮定すると、後続の精製法を、とりわけそのポリマーを調製物から削減又は排除するように選択し得る。そのような一実施形態において、ＩｇＧは少なくとも１つの電気的陰性面に結合され得て、その面に非イオン性有機ポリマーは結合しないため、排除される。そのような一実施形態において、その少なくとも１つの電気的陰性面はいわゆる陽イオン交換体になり得て、ＩｇＧ調製物を含めたタンパク質のクロマトグラフィによる分画を実行する目的で知られ且つ販売されているようなものである。そのような一実施形態において、陽イオン交換体は膜、モノリス、粒子を充填したカラムの形態又は別の物理的形式になり得る。別の実施形態において、少なくとも１つの電気的陰性面は、その電気陰性度を通じた静電相互作用に加えて疎水性及び／又は水素結合相互作用への関与を可能にする面組成を有するいわゆるマルチモードクロマトグラフィ材料から成り得る。別の実施形態において、疎水性相互作用及び水素結合への関与も可能にする面組成を有する電気的陽性クロマトグラフィ材料も用い得る。そのような一実施形態において、ＰＥＧ含有ＩｇＧ調製物を、Ｃａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅを充填した、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０のカラムに通した。抗体は結合し、ＰＥＧは結合せず排除された。ＮａＣｌ濃度を０．３Ｍに低下させることで抗体を溶出させ、ＩｇＧが溶出した。
【０１０５】
特定の実施形態においては、ＳＸＣ粒子を、モノクローナルＩｇＧ抗体を含有する細胞培養物上清に添加する。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、粒子によるＩｇＧの保持に必要なレベルまで添加する。粒子に結合しない汚染物質を含有する液体を、例えば膜に通す濾過により除去し、クリーンなＰＥＧバッファ（以降、洗浄バッファと称する）と置き換える。ＰＥＧの存在を除き、バッファの配合は、抗体は結合しないままであるのに対して、残留汚染物質の電気的陽性粒子への結合に適している。液体を再度、例えば膜を通す濾過により除去する。ＳＸＣ粒子を、ＰＥＧを欠く又はＰＥＧが欠乏しているがその他の点では洗浄バッファと同様のバッファに懸濁させると、ＩｇＧが粒子から可溶性形態で解離する。このＩｇＧを例えば、ＳＸＣ粒子及び電気的陽性粒子（これらは廃棄又はリサイクルされ得る）を保持する膜を通す濾過により収集する。
【０１０６】
特定の実施形態においては、ＳＸＣ粒子を、モノクローナルＩｇＧ抗体を含有する不純な調製物に添加する。ＰＥＧを、同じく溶液中に存在する０．８ＭのＮａＣｌの存在下、粒子によるＩｇＧの保持に必要なレベルまで添加する。粒子に結合しない汚染物質を含有する液体を、例えば膜を通す濾過により除去し、クリーンなＰＥＧ−ＮａＣｌバッファと置き換える。塩高含有洗浄バッファを例えば膜を通す濾過により除去し、ＮａＣｌを欠く又はＮａＣｌが欠乏しているクリーンなＰＥＧバッファと置き換える。洗浄バッファを除去する。ＳＸＣ粒子をＰＥＧを欠く又はＰＥＧが欠乏しているバッファに懸濁させると、ＩｇＧが粒子から可溶性形態で解離する。このＩｇＧを、例えばＳＸＣ粒子（廃棄又はリサイクルされ得る）を保持する膜を通す濾過により収集する。幾つかの実施形態においては、ＳＸＣ用の粒子を工程から割愛する。
【０１０７】
特定の実施形態においては、ＳＸＣ粒子を、モノクローナルＩｇＧ抗体を含有する不純な調製物に添加する。ＰＥＧを、粒子によるＩｇＧの保持に必要なレベルまで添加する。粒子に結合しない汚染物質を含有する液体を、例えば膜を通す濾過により除去し、０．８ＭのＮａＣｌも含有するクリーンなＰＥＧバッファと置き換える。粒子を再度膜上で収集し、その一方で塩高含有バッファを除去し、ＮａＣｌを欠く又はＮａＣｌが欠乏しているクリーンなＰＥＧバッファと置き換える。粒子を膜で再収集し、バッファを除去する。ＳＸＣ粒子を、ＰＥＧを欠く又はＰＥＧが欠乏しているバッファに懸濁させると、ＩｇＧが粒子から可溶性形態で解離する。ＳＸＣ粒子は膜により除去され、精製されたＩｇＧは膜を通過する。幾つかの実施形態においては、ＳＸＣ用の粒子を工程から割愛する。
【０１０８】
膜の使用を伴う実施形態のいずれにおいても、当業者には、これらの実施形態をいわゆるデッドエンド濾過形式又はタンジェンシャルフロー濾過形式のいずれでも行えることが明白であり、開示の方法を実験室規模で行うには又は最も効果的なバッファ条件を練るには前者のほうが便利であり、後者は工業規模用途により適当であると考えられ、部分的に又は完全に自動化し得る。
【０１０９】
本明細書で開示の方法の追加の目的及び利点は、一部は以下の記載で説明され、一部は記載から自明であり、あるいは本明細書で開示の方法を実行することでわかるであろう。本明細書で開示の方法の目的及び利点は、請求項に明記された要素及び組み合わせにより実現及び成し遂げられる。
【０１１０】
上記の全般的な説明及び以下の詳細な説明が共に例であり説明のためのものに過ぎず、請求されるような本明細書で開示の方法を限定しないことを理解されたい。
【実施例】
【０１１１】
実施例１
立体排除クロマトグラフィ媒体へのＩｇＧ結合に関する条件の定義。実験を行うことで、哺乳動物細胞の培養で得られた抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体からの宿主細胞タンパク質の最も効果的な削減をサポートする塩濃度を求めた。実験を、平均直径約３０ミクロンの非イオン性親水性デンプン粒子を使用して行った。粒子を、異なるアリコートの細胞培養物上清（ＣＣＳ）と混合した。ＣＣＳの宿主タンパク質濃度は約２４３０１１ｐｐｍであった。試料をアラントイン、エタクリジン、陰イオン交換粒子及び陽イオン交換粒子で処理し、これによって宿主タンパク質濃度は１６５２１３ｐｐｍまで低下した。ＰＥＧ−６０００を最終濃度１８％まで添加した。次に、ＮａＣｌを異なるアリコートに添加することで０．０、０．２、０．４、０．８及び１．０Ｍの系列を得た。処理した試料における宿主細胞タンパク質汚染物質レベルは１５５５８ｐｐｍ、１９９４ｐｐｍ、６６２ｐｐｍ、９０ｐｐｍ及び２６６ｐｐｍであった。したがって、０．８Ｍでの精製の改善率は９９．９５％であり、３ｌｏｇを超える削減となる。
【０１１２】
実施例２
陰イオン交換処理に関する塩濃度の決定。実施例１の抗体をＶＥＡＸで評価した。試料を、３〜９の異なるｐＨ値での別々の実験において平衡化した、ただし塩を欠くＶＥＡＸカラムに通した。試料を、ｐＨは８であるが０〜１Ｍの異なるレベルの塩を含むＶＥＡＸカラムにも通した。最も効果的な汚染物質削減は、塩の不在下、ｐＨ８．０で達成された。続く実験で、ターゲットｐＨを８．２に絞り込んだ。ｐＨ８．１５、８．２５は共に性能で劣った。これらの条件下、ＶＥＡＸは、宿主タンパク質（宿主タンパク質、ＤＮＡ、ウイルス、内毒素を含む）の最高９９．８％の削減を達成した。これらの条件により、この抗体に関する、ＳＸＣと組み合わせた陰イオン交換による汚染物質抽出の関する条件が規定された。
【０１１３】
実施例３
陰イオン交換処理に関する塩濃度の決定。実験１、２の抗体を、積み重ねた平膜及び中空繊維形式の陰イオン交換膜に通した。ＶＥＡＸに関して、汚染物質削減は、同じ条件下で本質的に同じであった。これらの実験結果は、ＳＸＣと陰イオン交換膜との統合により６ｌｏｇを超える精製（９９．９９９９％）を達成できることを示す。
【０１１４】
実施例４
ＳＸＣと電気的陽性粒子との組み合わせ。細胞培養物上清からのＨＥＲ２  ＩｇＧは、１９％のＰＥＧ−６０００の存在下、１ＭのＮａＣｌで、デンプン粒子に結合した。Ｄｏｗｅｘ  ＡＧ１ｘ８  ２００−４００メッシュの形態の電気的陽性粒子も、４％ｗ／ｖの量で存在した。流体を、０．２２ミクロンの細孔を有する膜を通す濾過により除去し、次に１９％のＰＥＧ−６０００、１ＭのＮａＣｌ及び５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を含有するクリーンなバッファと置き換えた。流体を除去し、１９％のＰＥＧ−６０００及び５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を含有するクリーンなバッファと置き換えた。このステップを繰り返し、次に流体を濾過により除去した。流体を、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）と置き換えた。宿主細胞タンパク質は、最初の試料の１４２０００ｐｐｍから約１２０ｐｐｍまで削減された。
【０１１５】
実施例５
ＳＸＣと電気的陽性粒子との組み合わせ。実施例４の形式を繰り返した。ただし、デンプン粒子を１９％のＰＥＧ−６０００及び５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）で洗浄するまで電気的陽性粒子を添加しなかった。流体を除去し、次に５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）と置き換えることで、ＩｇＧをＳＸＣ粒子から解離させた。宿主細胞タンパク質は、最初の試料の１４２０００ｐｐｍから約１ｐｐｍ未満まで削減された。
【０１１６】
実施例６
ＳＸＣと電気的陽性粒子との組み合わせ。実施例５の形式を繰り返した。ただし、Ｄｏｗｅｘ粒子の代わりにＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑ粒子を使用した。宿主細胞タンパク質削減結果は同等であったが、ＩｇＧ回収率はこちらのほうが高かった。
【０１１７】
実施例７
ＳＸＣと電気的陽性粒子との組み合わせ。実施例６の形式を繰り返し、最良の結果を得るのに必要な時間がどのぐらいかを求めるために、ＳＸＣ粒子からのＩｇＧ解離後の粒子曝露時間を段階的に変化させた。結果は３０分と６０分とでは本質的に同じであったが、より短い曝露時間では劣った。
【０１１８】
実施例８
２７５３５７ｐｐｍの宿主細胞タンパク質、５２８３ｐｐｍのＤＮＡ及び１３．９６％の凝集体を含有するＩｇＧ含有細胞培養収穫物を１％のアラントイン、次に０．０２５％のエタクリジンの添加によりコンディショニングし、次に１５分間にわたって混合した。事前に５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で洗浄することで平衡化した、ＭａｃｒｏＰｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑ、ＭａｃｒｏＰｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ｔＢｕｔｙｌ及びＣｈｅｌｅｘ−１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）の等しい割合の混合物。平衡化した混合粒子を不純なＩｇＧ調製物に２％（ｖ：ｖ）の量で添加し、次に一晩にわたって４〜８℃で混合した。固形物を精密濾過により除去した。１．２５ｍｇのデンプンコーティング２００ｎｍ磁性粒子を、２０ｍＬのコンディショニング済みの不純なＩｇＧ調製物に添加した。１．６ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）中の２０ｍＬの３６％のＰＥＧ−６０００をボルテックスミキサ（５００ｒｐｍ）で混合しながら少しずつ添加することで１８％のＰＥＧ−６０００及び０．８ＭのＮａＣｌの最終濃度にした。ボルテックスミキサによる混合を３０分間にわたって継続し、次にＩｇＧを担持させた粒子を磁気により収集した。ＩｇＧを担持させた粒子を新しい５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．８ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で洗浄し、洗浄溶液を除去した。洗浄バッファを除去し、粒子を再度同じやり方で洗浄した。洗浄バッファを除去し、抗体を５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７）中で再可溶化した。電気的陽性−疎水性クロマトグラフィ媒体（Ｃａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を充填し、同じ条件に平衡化した１ｍＬのカラム。可溶化したＩｇＧをカラムに通し、ＩｇＧは結合し、一部の汚染物質は結合したと理解され、残留ＰＥＧは結合した。次に、５カラム体積の平衡化バッファでの洗浄を行うことで、より徹底的に、結合していない成分を系から排除した。ＩｇＧを、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で終了する１０カラム体積のリニアグラジエントで溶出させた。精製性能を以下の表に示す。ｐｏｓｔ−ｃｏｎはコンディショニング後を、ｐｏｓｔ−ＮＰはナノ粒子後を、ｐｏｓｔ−ＣＡはＣａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅ後を意味する。左側の「回収率」の下の値はそのステップでの回収率を示し、右側の値は、それまでのステップとそのステップとの累積回収率を示す。ｂｌｄは、検出限界を下回ったことを示す。さらなる詳細については、前出のＧａｇｎｏｎら（２０１４）を参照のこと。
【表１】
2016509069.tif 000002
【０１１９】
実施例９
１７６２４４ｐｐｍの宿主タンパク質汚染物質及び１９％の凝集体を含有するＩｇＧ含有細胞培養収穫物を、１％のアラントイン、４％の電気的陽性金属親和性粒子（ＴＲＥＮ  ４０  ｈｉｇｈ、Ｂｉｏ−Ｗｏｒｋｓ社）の添加によりコンディショニングし、４時間にわたって室温で混合した。分析用に採取した試料は、宿主タンパク質が９０２５９ｐｐｍまで、凝集体が１．２％まで削減されたことを示した。ｐＨを５．２まで低下させ、０．５％のカプリル酸を添加し、混合物を２時間にわたってインキュベートした。分析用に採取した試料は、宿主タンパク質が１７５８ｐｐｍ、凝集体が約０．４％であることを示した。固形物を電気的陽性デプスフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＰＣ１）で除去した。宿主タンパク質は１３５ｐｐｍまで削減され、凝集体は０．０５％未満まで削減された。抗体を、１８％のＰＥＧ−６０００（ｐＨ７．０）中での沈殿により精製した。次に、沈殿物を１．８Ｍの硫酸アンモニウムで洗浄することでＰＥＧを除去し、次に抗体を５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）中で再可溶化した。宿主タンパク質は３２ｐｐｍまで削減された。陰イオン交換クロマトグラフィカラム（ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）（ボイド排除モード、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）で運転した）に通した後、宿主タンパク質は１ｐｐｍ未満まで削減された。８００ｍＭのＮａＣｌの存在下で行うＰＥＧ沈殿においてのみ異なる並行実験により、宿主タンパク質を１ｐｐｍ未満まで削減した。陰イオン交換ステップにより宿主タンパク質及び凝集体を検出できないレベルまで削減した。
【０１２０】
実施例１０
２８６０１０ｐｐｍの宿主タンパク質汚染物質及び２３％の凝集体を含有するＩｇＧ含有細胞培養収穫物を、１％のアラントイン及び０．０２５％のエタクリジンの添加によりコンディショニングし、撹拌しながら室温で１時間にわたってインキュベートした。粒子の１：１：１混合物（Ｃｈｅｌｅｘ−１００、ＭａｃｒｏＰｒｅｐ  ｔＢｕｔｙｌ、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を混合し、生理学的条件に平衡化し、沈殿した混合粒子を収穫物に合計量５％で添加し、次に２時間にわたって室温で混合した。宿主タンパク質は４３０５８ｐｐｍまで、凝集体は３．４％まで削減された。ｐＨ８．０で行った一続きの実験において、試料をＰＥＧ−６０００での沈殿により分画し、別の実験で濃度は６００ｍＭ、８００ｍＭ、９００ｍＭ及び１０００ｍＭ（１Ｍ）であった。次に、沈殿物をＰＥＧ、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）中で洗浄し、その後、抗体を５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）中で再可溶化した。その系列中の宿主タンパク質はそれぞれ５１、５５、４５及び４１ｐｐｍまで削減された。Ｄｏｗｅｘ  ＡＧ１Ｘ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）の形態の陰イオン交換粒子を各試料に５％ｖ／ｖの量で添加し、６０分間にわたって混合した。系列全体の宿主タンパク質は１６、１７、１５及び１３ｐｐｍまで削減された。別の一続きの実験を、全ての詳細に関して同じで行った。ただし、最初のＰＥＧ沈殿をｐＨ７．０で行った。ＰＥＧステップ後の宿主タンパク質は６００ｍＭのＮａＣｌトラックで４４ｐｐｍ、８００ｍＭのトラックで４３ｐｐｍ、９００ｍＭのトラックで２９ｐｐｍ、１０００ｍＭのトラックで３１ｐｐｍであった。Ｄｏｗｅｘでの処理後、宿主タンパク質は、２０、１７、１２及び１６ｐｐｍにそれぞれ削減された。
【０１２１】
実施例１１
２８６０１０ｐｐｍの宿主タンパク質汚染物質及び２３％の凝集体を含有するＩｇＧ含有細胞培養収穫物を、１％のアラントイン及び０．０２５％のエタクリジンの添加によりコンディショニングし、撹拌しながら室温で１時間にわたってインキュベートした。粒子の１：１：１：１混合物（Ｃｈｅｌｅｘ−１００、ＭａｃｒｏＰｒｅｐ  ｔＢｕｔｙｌ、ＭａｃｒｏＰｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）及び電気的陽性金属親和性粒子（ＴＲＥＮ  ４０  ｈｉｇｈ、Ｂｉｏ−Ｗｏｒｋｓ社）を混合し、生理学的条件に平衡化し、沈殿した混合粒子を収穫物に合計量５％で添加し、次に２時間にわたって室温で混合した。宿主タンパク質は３８０６１ｐｐｍまで、凝集体は１．４％まで削減された。ｐＨ８．０で行った一続きの実験において、試料をＰＥＧ−６０００での沈殿により分画し、別の実験でＮａＣｌ濃度は６００ｍＭ、８００ｍＭ、９００ｍＭ及び１０００ｍＭ（１Ｍ）であった。次に、沈殿物をＰＥＧ、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）中で洗浄し、その後、抗体を５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）中で再可溶化した。宿主タンパク質はそれぞれ７９、６９、５６及び５７ｐｐｍまで削減された。Ｄｏｗｅｘ  ＡＧ１Ｘ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）の形態の陰イオン交換粒子を各試料に５％ｖ／ｖの量で添加し、６０分間にわたって混合した。宿主タンパク質は系列全体で１８、１７、１６及び１３ｐｐｍまで削減された。別の一続きの実験を、全ての詳細に関して同じで行った。ただし、最初のＰＥＧ沈殿をｐＨ７．０で行った。ＰＥＧステップ後の宿主タンパク質は６００ｍＭのＮａＣｌトラックで９４ｐｐｍ、８００ｍＭのトラックで６２ｐｐｍ、９００ｍＭのトラックで６７ｐｐｍ、１０００ｍＭのトラックで４６ｐｐｍであった。Ｄｏｗｅｘでの処理後、宿主タンパク質は、２８、９、２３及び１７ｐｐｍにそれぞれ削減された。
【０１２２】
実施例１２
３２１４８３ｐｐｍの宿主タンパク質及び２６％の凝集体を含有するＩｇＭ含有細胞培養収穫物を、１％のアラントイン、０．０２５％のエタクリジン及びＮａＣｌの添加によりコンディショニングすることで２５ｍＳ／ｃｍの導電率を得た。混合物を１時間にわたってインキュベートし、固形物を遠心分離により除去し、液体を等しい割合のＭａｃｒｏＰｒｅｐ  ｔＢｕｔｙｌ、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑ、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ及びＣｈｅｌｅｘ−１００を充填したカラムに流し、カラム対収穫物の体積比は５％であった。宿主タンパク質は７３６６３ｐｐｍに、凝集体は０．８％に削減された。試料を並行ではあるが別の実験において、共に１３％のＰＥＧ−６０００（ｐＨ７）で分画した（一方は１００ｍＭのＮａＣｌ、もう一方は８００ｍＭのＮａＣｌ）。次に、沈殿物を１３％のＰＥＧ、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）で洗浄することで過剰な塩を除去し、次にＩｇＭを５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）で再可溶化した。１００ｍＭのＮａＣｌでの宿主タンパク質は７４１１ｐｐｍまで削減された。８００ｍＭのＮａＣｌでの宿主タンパク質は４１７ｐｐｍまで削減された。凝集体含有量は１．１％まで上昇した。試料を陰イオン交換モノリス（ＣＩＭ  ＱＡ、ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社）にｐＨ７．０で流し、塩化ナトリウムグラジエントで溶出させた。１００ｍＭのＮａＣｌでのＰＥＧ沈殿に対応する試料中の宿主タンパク質は１４２４ｐｐｍまで削減された。８００ｍＭのＮａＣｌでのＰＥＧ沈殿に対応する試料中の宿主タンパク質は６３ｐｐｍまで削減された。凝集体は、両方の調製物に関し０．０１％未満であった。
【０１２３】
本明細書で開示の本方法を他の精製方法を組み合わせることでより高いレベルの精製を達成し得る。そのような他の精製方法の例には、以下に限定するものではないが、ＩｇＧの精製に一般に使用される方法、例えばタンパク質Ａ及び他の形態のアフィニティクロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、固定化金属親和性クロマトグラフィ、追加のミックスモードクロマトグラフィ法、また沈殿、結晶化及び液体／液体抽出の方法が含まれる。様々な方法に関して適当な条件を練り、これらを本明細書で開示の方法と統合することで特定の抗体の必要な精製を成し遂げることは当業者の知識の範囲内である。
【０１２４】
本明細書で引用した全ての文献は、あたかも個々の刊行物又は特許又は特許出願が目的を問わず参照により全て援用されるべく具体的且つ個別に指示されたかのように、参照により全て目的を問わず同程度まで本明細書に援用される。参照により援用される刊行物及び特許又は特許出願が本明細書の開示と矛盾する場合は、本明細書が、そのような矛盾する文献に取って代わる及び／又はそのような矛盾する文献より優先されるものとする。
【０１２５】
本明細書及び請求項で用いられる原料の量、クロマトグラフィ条件等を表す全ての数値は、全ての場合において「約」という語により修飾されることを理解されたい。したがって、別段の定めがない限り、明細書及び添付の請求項に記載の数値パラメータは、本明細書で開示の本方法で得ようとする所望の性能に応じて異なり得る近似値である。
【０１２６】
当業者には明白なように、その趣旨及び範囲から逸脱することなく、本明細書で開示の本方法の数多くの改良形及び変化形をつくることができる。本明細書に記載の具体的な実施形態は単なる例として挙げられたに過ぎず、いかなる形でも本発明を限定するものではない。明細書及び実施例は単なる例とみなされ、本明細書で開示の方法の真の範囲及び趣旨は以下の請求項により示されるものとする。
【国際調査報告】
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