(57)【要約】  標的ＤＮＡ配列の増幅中の特異性を改善することための方法および組成物を提供する。該方法および組成物は、増幅反応においてＲＮａｓｅ  Ｈ酵素、ポリメラーゼ、およびＲＮａｓｅ  Ｈ酵素感受性のブロック型切断性オリゴヌクレオチドプライマーを使用することに依存するものであり、反応混合物に、２．０ｍＭ以下の遊離Ｍｇ＋＋カチオンを含む最適化終濃度の二価の金属塩および／または少なくとも約０．００１％のポリエチレングリコールヘキサデシルエーテルを含む最適化終濃度の非イオン性界面活性剤のいずれかを含める。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ＤＮＡ配列の増幅中の特異性を改善する方法であって：
（ａ）（ｉ）切断ドメインを有するオリゴヌクレオチドプライマーであって、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素によって切断可能であり、ブロッキング基の５’側に位置し、前記ブロッキング基は前記オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端または前記３’末端の付近に連結され、前記ブロッキング基はプライマー伸長を妨げ、かつ／または前記オリゴヌクレオチドプライマーがＤＮＡ合成の鋳型としての機能を果たすことを阻害する、オリゴヌクレオチドプライマーと、
（ｉｉ）標的配列を含んでもよいか、または含まなくてもよい試料核酸と、
（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼと、
（ｉｖ）耐熱性であり、３０℃において７０℃と比べて少なくとも１０倍の活性の低下を有するＲＮａｓｅ  Ｈ酵素、
を含む反応混合物を準備すること、
（ｂ）前記オリゴヌクレオチドプライマーを標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズさせ、二本鎖基質を形成すること；
（ｃ）ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライマーを、前記ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素で、前記切断ドメイン内の切断部位または前記切断ドメインに隣接している切断部位において切断して、前記ブロッキング基を前記オリゴヌクレオチドプライマーから除去すること；並びに
（ｄ）前記オリゴヌクレオチドプライマーを前記ＤＮＡポリメラーゼで伸長させること
を含み、
ここで、前記反応混合物は、３’−ミスマッチ識別アッセイによって調整したとき、前記標的ＤＮＡの増幅のために少なくとも約５．０以上または約５０％以上のΔＣｐが得られるような濃度の２価のカチオンを含む、方法。
【請求項２】
２価のカチオンが、Ｍｇ＋＋、Ｍｎ＋＋およびＣｏ＋＋から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
２価のカチオンがＭｇ＋＋を含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｍｇ＋＋の終濃度が約２．０ｍＭ以下の遊離Ｍｇ＋＋を含み、ただし、標的ＤＮＡ配列の増幅が起こる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
反応混合物が、さらに、Ｍｇ＋＋と異なる２価のカチオンを含む請求項３に記載の方法。
【請求項６】
Ｍｇ＋＋と異なる２価のカチオンが、Ｍｎ＋＋、Ｃｏ＋＋またはＭｎ＋＋とＣｏ＋＋の組合せから選択される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素がＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素である請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素がピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２、ピロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｕｓ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２、メタノコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２またはスルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素が配列番号１から５のいずれか１つによってコードされている請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素がピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２である請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２が配列番号４によってコードされている請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素が化学修飾またはブロッキング抗体のいずれかによって可逆的に不活化される請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ブロッキング基がオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端ヌクレオチドに結合している請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ブロッキング基が３’末端残基の５’側に結合しており、オリゴヌクレオチドプライマーがＤＮＡ合成の鋳型としての機能を果たすことを阻害する請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ブロッキング基が１つ以上の脱塩基残基を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
１つ以上の脱塩基残基がＣ３スペーサーである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ブロッキング基が、ＲＤＤＤＤｘ、ＲＤＤＤＤＭｘ、ＲＤｘｘＤ、ＲＤｘｘＤＭ、ＲＤＤＤＤｘｘＤ、ＲＤＤＤＤｘｘＤＭおよびＤｘｘＤからなる群より選択される１つの構成員を含むものであり、ここで、ＲはＲＮＡ残基であり、ＤはＤＮＡ残基であり、Ｍはミスマッチ残基であり、ｘはＣ３スペーサーである請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ブロッキング基が、伸長増幅反応の検出を可能にする標識を含む請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
増幅反応の検出を可能にする標識がオリゴヌクレオチドプライマーの切断部位から３’側に結合している請求項１から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
標識がフルオロフォアである請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
標識が質量分析による増幅反応の検出のための質量タグである請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２２】
切断ドメインが、以下の部分：ＤＮＡ残基、脱塩基残基、修飾ヌクレオシドまたは修飾リン酸ヌクレオチド間結合のうちの１つ以上を含む請求項１から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
切断ドメインが単一のＲＮＡ残基を含む請求項１から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
切断ドメインが２つの隣接しているＲＮＡ残基を含む請求項１から２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
切断ドメインが３つ以上のＲＮＡ残基の連続配列を含む請求項１から２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
切断ドメインがＲＮＡ残基を欠く請求項１から２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
切断ドメインが１つ以上の２’修飾ヌクレオシドを含む請求項１から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
１つ以上の２’修飾ヌクレオシドが、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡヌクレオシド、２’−フルオロヌクレオシド、ロックド核酸、２’−エチレン核酸残基、２’−アルキルヌクレオシド、２’−アミノヌクレオシドおよび２’−チオヌクレオシドからなる群より選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
１つ以上の２’修飾ヌクレオシドが２’−Ｏ−メチルＲＮＡヌクレオシドである請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
１つ以上の２’修飾ヌクレオシドが２’−フルオロヌクレオシドである請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
切断部位にフランキングしている配列が、ヌクレアーゼ切断に抵抗性の１つ以上のヌクレオシド間結合を含む請求項１から３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
ヌクレアーゼ抵抗性結合がホスホロチオエートである請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
第１および第２の反応混合物が非イオン性界面活性剤を含む請求項１から３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
非イオン性界面活性剤がポリエチレングリコールヘキサデシルエーテルを含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテルが第１および第２の反応混合物中に少なくとも約０．００１％の終濃度で存在している請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
標的ＤＮＡ配列の増幅方法であって：
（ａ）（ｉ）切断ドメインを有するオリゴヌクレオチドプライマーであって、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素によって切断可能であり、ブロッキング基の５’側に位置し、前記ブロッキング基は前記オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端または前記３’末端の付近に連結され、前記ブロッキング基はプライマー伸長を妨げ、かつ／または前記オリゴヌクレオチドプライマーがＤＮＡ合成の鋳型としての機能を果たすことを阻害する、オリゴヌクレオチドプライマーと、
（ｉｉ）標的配列を含んでもよいか、または含まなくてもよい試料核酸と、
（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼと、
（ｉｖ）耐熱性であり、３０℃において７０℃と比べて少なくとも１０倍の活性の低下を有するＲＮａｓｅ  Ｈ酵素、
を含む反応混合物を準備すること、
（ｂ）前記オリゴヌクレオチドプライマーを標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズさせて、二本鎖基質を形成すること；
（ｃ）ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライマーを、前記ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素で、前記切断ドメイン内の切断部位または前記切断ドメインに隣接している切断部位において切断して、前記ブロッキング基を前記オリゴヌクレオチドプライマーから除去すること；並びに
（ｄ）前記オリゴヌクレオチドプライマーを前記ＤＮＡポリメラーゼで伸長させること
を含み、
ここで、前記反応混合物は、２価のカチオンと、ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテルを含む非イオン性界面活性剤とを含む、方法。
【請求項３７】
ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテルが反応混合物中に少なくとも約０．００１％の終濃度で存在する請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
２価のカチオンが、Ｍｇ＋＋、Ｍｎ＋＋およびＣｏ＋＋から選択される請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
２価のカチオンがＭｇ＋＋を含む請求項３６、３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
反応混合物が約２．０ｍＭ以下の遊離Ｍｇ＋＋の終濃度のＭｇ＋＋を含み、ただし、標的ＤＮＡ配列の増幅が起こる請求項３６から３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
反応混合物がさらに、Ｍｇ＋＋と異なる２価のカチオンを含む請求項３６から４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
Ｍｇ＋＋と異なる２価のカチオンが、Ｍｎ＋＋、Ｃｏ＋＋またはＭｎ＋＋とＣｏ＋＋の組合せから選択される請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素がＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素である請求項３６から４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素がピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２、ピロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｕｓ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２、メタノコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２またはスルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２である請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素が配列番号１から５のいずれか１つによってコードされている請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素がピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２である請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２が配列番号４によってコードされている請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素が化学修飾またはブロッキング抗体のいずれかによって可逆的に不活化される請求項３６から４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
ブロッキング基がオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端ヌクレオチドに結合している請求項３６から４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
ブロッキング基が３’末端残基の５’側に結合しており、オリゴヌクレオチドプライマーがＤＮＡ合成の鋳型としての機能を果たすことを阻害する請求項３６から４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
ブロッキング基が１つ以上の脱塩基残基を含む請求項３６から５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
１つ以上の脱塩基残基がＣ３スペーサーである請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ブロッキング基が、ＲＤＤＤＤｘ、ＲＤＤＤＤＭｘ、ＲＤｘｘＤ、ＲＤｘｘＤＭ、ＲＤＤＤＤｘｘＤ、ＲＤＤＤＤｘｘＤＭおよびＤｘｘＤからなる群より選択される１つの構成員を含むものであり、ここで、ＲはＲＮＡ残基であり、ＤはＤＮＡ残基であり、Ｍはミスマッチ残基であり、ｘはＣ３スペーサーである請求項３６から５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
ブロッキング基が、伸長増幅反応の検出を可能にする標識を含む請求項３６から５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
さらに、増幅反応の検出を可能にする標識を含み、前記標識がオリゴヌクレオチドプライマーの切断部位の３’側に結合している請求項３６から５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
標識がフルオロフォアである請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
標識が質量分析による増幅反応の検出のための質量タグである請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５８】
切断ドメインが、以下の部分：ＤＮＡ残基、脱塩基残基、修飾ヌクレオシドまたは修飾リン酸ヌクレオチド間結合のうちの１つ以上を含む請求項３６から５７のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
切断ドメインが単一のＲＮＡ残基を含む請求項３６から５８のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
切断ドメインが２つの隣接しているＲＮＡ残基を含む請求項３６から５９のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
切断ドメインが３つ以上のＲＮＡ残基の連続配列を含む請求項３６から６０のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
切断ドメインがＲＮＡ残基を欠く請求項３６から６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
切断ドメインが１つ以上の２’修飾ヌクレオシドを含む請求項３６から６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
１つ以上の２’修飾ヌクレオシドが、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡヌクレオシド、２’−フルオロヌクレオシド、ロックド核酸、２’−エチレン核酸残基、２’−アルキルヌクレオシド、２’−アミノヌクレオシドおよび２’−チオヌクレオシドからなる群より選択される請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
１つ以上の２’修飾ヌクレオシドが２’−Ｏ−メチルＲＮＡヌクレオシドである請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
１つ以上の２’修飾ヌクレオシドが２’−フルオロヌクレオシドである請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
切断部位にフランキングしている配列が、ヌクレアーゼ切断に抵抗性の１つ以上のヌクレオシド間結合を含む請求項３６から６６のいずれかに記載の方法。
【請求項６８】
ヌクレアーゼ抵抗性結合がホスホロチオエートである請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
標的ＤＮＡ配列の増幅を行うためのキットであって、２価のカチオンおよび会合した対イオンを含む金属塩を含有する反応バッファーを含み、前記２価のカチオンがＭｇ＋＋を含み、前記反応バッファーは、標的ＤＮＡの増幅を行うための反応混合物中で約２．０ｍＭ以下の遊離Ｍｇ＋＋の前記金属塩の終濃度をもたらす、キット。
【請求項７０】
さらに非イオン性界面活性剤を含む請求項６９に記載のキット。
【請求項７１】
非イオン性界面活性剤がポリエチレングリコールヘキサデシルエーテルを含む請求項６９または７０に記載のキット。
【請求項７２】
ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテルが、標的ＤＮＡの増幅を行うための反応混合物中に少なくとも約０．００１％の終濃度で存在する請求項７１に記載のキット。
【請求項７３】
反応混合物が、さらに、Ｍｇ＋＋と異なる２価のカチオンを含む少なくとも１種類の金属塩を含む請求項６９から７２のいずれかに記載のキット。
【請求項７４】
Ｍｇ＋＋と異なる２価のカチオンが、Ｍｎ＋＋、Ｃｏ＋＋またはＭｎ＋＋とＣｏ＋＋の組合せから選択される請求項７３に記載のキット。
【請求項７５】
さらに、
−  １種類以上のオリゴヌクレオチドプライマーであって、少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプライマーは切断ドメインを有し、ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素によって切断可能であり、ブロッキング基の５’側に位置し、前記ブロッキング基は前記オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端または前記３’末端の付近に連結され、前記ブロッキング基はプライマー伸長を妨げ、かつ／または前記オリゴヌクレオチドプライマーがＤＮＡ合成の鋳型としての機能を果たすことを阻害する、オリゴヌクレオチドプライマーと、
−ＤＮＡポリメラーゼと、
−耐熱性であり、３０℃において７０℃と比べて少なくとも１０倍の活性の低下を有するＲＮａｓｅ  Ｈ酵素、
を含む、請求項６９から７４のいずれかに記載のキット。
【請求項７６】
ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素がＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素である請求項７５に記載のキット。
【請求項７７】
ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素がピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２、ピロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｕｓ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２、メタノコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２またはスルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２である請求項７６に記載のキット。
【請求項７８】
ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素が配列番号１から５のいずれか１つによってコードされている請求項７６に記載のキット。
【請求項７９】
ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素がピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２である請求項７６に記載のキット。
【請求項８０】
ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２が配列番号４によってコードされている請求項７９に記載のキット。
【請求項８１】
ブロッキング基が、ＲＤＤＤＤｘ、ＲＤＤＤＤＭｘ、ＲＤｘｘＤ、ＲＤｘｘＤＭ、ＲＤＤＤＤｘｘＤ、ＲＤＤＤＤｘｘＤＭおよびＤｘｘＤからなる群より選択される１つの構成員を含むものであり、ここで、ＲはＲＮＡ残基であり、ＤはＤＮＡ残基であり、Ｍはミスマッチ残基であり、ｘはＣ３スペーサーである請求項７５から８０のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００８年４月３０日に出願された米国特許仮出願第６１／０４９，２０４号（参照によりこの全体が組み込まれる。）の優先権を主張する２００９年４月３０日に出願された米国特許出願第１２／４３３，８９６号の一部継続出願である２００９年７月２２日に出願された米国特許出願第１２／５０７，１４２号の一部継続出願である２０１３年３月１５日に出願された米国特許出願第１３／８３９，３３４号の一部継続出願である２０１３年８月５日に出願された米国特許出願第１３／９５９，６３７号の一部継続出願である。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式でＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で提出した配列表を含み、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる。２０１３年１１月２９日に作成した前記ＡＳＣＩＩのコピーは、名称がＩＤＴ０１−００４−ＰＣＴ＿ＳＴ２５．Ｔｘｔであり、サイズは１０１，１１９バイトである。
【０００３】
本発明は、生物学的アッセイを開始させるため、補助するため、モニタリングするため、または行うために核酸鎖を切断する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのプライマー系増幅反応の特異性は、ＤＮＡ鋳型とのプライマーハイブリダイゼーションの特異性に大きく依存する。典型的な増幅反応に使用される高温下において、プライマーは、理想的には、目的の標的配列のみにハイブリダイズしてプライマー伸長産物を形成し、標的配列の相補鎖を生成する。しかしながら、増幅反応混合物は、典型的には、プライマーハイブリダイゼーションの特異性を確実にするのに必要とされる温度よりかなり下の室温でアセンブリングされる。低温条件下では、プライマーは他の一部相補的な核酸配列または他のプライマーに非特異的に結合して所望のものでない伸長産物の合成を開始させることがあり得、これは、標的配列とともに増幅され得る。非特異的プライマー伸長産物の増幅は所望の標的配列の増幅と競合し得、所望の配列の増幅の効率が有意に低下し得る。また、非特異的増幅によって、一部の特定のアッセイでは偽陽性結果がもたらされることがあり得る。
【０００５】
ＰＣＲにおいて頻繁に観察される非特異的増幅産物の型の一例は、「プライマーダイマー」として知られる増幅反応の鋳型非依存性アーティファクトである。プライマーダイマーは、長さが典型的には２つのプライマーの長さの和に近く、１つのプライマーが別のプライマー上に伸長された場合に増幅される二本鎖断片である。得られる二本鎖は所望のものでない鋳型を形成しており、これは長さが短いため効率的に増幅される。
【０００６】
非特異的増幅は、反応の開始前にプライマー伸長産物（例えば、プライマーダイマー）の形成を低減させることにより低減させることができる。一例である「ホットスタート」プロトコルと称される方法では、１種類以上の重要試薬を、必要なハイブリダイゼーション特異性がもたらされるのに充分に温度が上昇するまで反応混合物に入れない。この様式では反応混合物において、低温ではプライマー伸長が補助され得ない。最初の高温インキュベーション工程後に反応チューブを開放し、入れてない試薬を添加する手作業でのホットスタート法は大きな労力がかかり、反応混合物の汚染のリスクが増大する。
【０００７】
あるいは、米国特許第５，４１１，８７６号明細書、およびＣｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０（７）：１７１７−１７２３に記載のように、ワックスなどの感熱性物質を用いて反応成分を分離または隔離することもできる。これらの方法では、高温での予備反応インキュベーションによって感熱性物質を溶融させ、これにより試薬の混合を可能にする。
【０００８】
ＰＣＲの開始前にプライマー伸長産物の形成を低減させるための別の方法は、ＤＮＡポリメラーゼの熱可逆性不活化に依存するものである。米国特許第５，７７３，２５８号明細書および同第５，６７７，１５２号明細書（ともに参照により本明細書に組み込まれる。）には、モディファイア基の共有結合によって可逆的に不活化されるＤＮＡポリメラーゼが記載されている。不活化させたＤＮＡポリメラーゼの高温でのインキュベーションにより、モディファイア−酵素間結合の切断がもたらされ、これにより該酵素の活性形態が放出される。ＤＮＡポリメラーゼ特異的抗体によるＤＮＡポリメラーゼの非共有結合性可逆的阻害が米国特許第５，３３８，６７１号明細書（参照により本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
【０００９】
本発明の目的の１つは、例えば、繰り越される相互汚染の問題に対処するために使用され得、この相互汚染は、増幅反応、特に、大量コピー数の増幅産物が生成されるＰＣＲにおいて大きな懸念である。先行技術では、この問題を解決するための試みが幾つかの様式でなされている。例えば、直接ＵＶ照射によって夾雑ＤＮＡが有効に除去され得る（Ｒｙｓ  ＆  Ｐｅｒｓｉｎｇ，１９９３，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１（９）：２３５６−６０およびＳａｒｋａｒ  ＆  Ｓｏｍｍｅｒ，１９９０  Ｎａｔｕｒｅ．３４３（６２５３）：２７）が、ＰＣＲ試薬の照射は、ポリメラーゼ、プライマーおよび鋳型ＤＮＡの添加前に行われなければならない。さらに、反応液中に存在する大量数のモノヌクレオチドがＵＶ光の大部分を吸収するため、このアプローチは不充分であり得る。代替法として、「ＵＮＧ法」は、ｄＵＴＰを増幅された断片に組み込み、産物の組成を天然に存在する天然ＤＮＡと異なるように改変するものである（Ｌｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９０，Ｇｅｎｅ，９３（１）：１２５−１２８）。酵素ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）は、ＰＣＲ混合物のその他の成分と一緒に添加する。ＵＮＧ酵素は、増幅前にウラシル塩基を夾雑アンプリコンのＤＮＡ鎖から切断し、かかるすべての産物を、試料ＤＮＡに影響を及ぼすことなく新たなＤＮＡ合成のための鋳型として機能を果たすことができないようにする。次いで、ＵＮＧ酵素は熱不活化され、次いでＰＣＲが行われる。ｄＵＴＰおよびＵＮＧ酵素に対する要件はＰＣＲの実施コストを有意に追加する。
【００１０】
本発明の別の目的は、ホットスタート反応が耐熱性ＲＮａｓｅ  Ｈを用いたカップリング型反応配列によって行われるＰＣＲアッセイを提供することである。
【００１１】
リボヌクレアーゼ酵素
リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）は、ＲＮＡのより小さい成分への加水分解を触媒する酵素である。この酵素は；体液中；皮膚表面上；および多くの物体、例えば、未処理の検査用ガラス製品の表面上に内在する。二本鎖ＲＮａｓｅは、ほぼすべての細胞内環境に存在し、ＲＮＡ含有二本鎖構築物を切断する。一本鎖ＲＮａｓｅは細胞外環境に遍在し、従って、広範な条件下で機能を果たすために極めて安定である。
【００１２】
ＲＮａｓｅ  Ｈは、これまでに調べられたすべての生物体に存在する保存されたリボヌクレアーゼファミリーである。これには、２つの主要なＲＮａｓｅ  Ｈクラス：ＲＮａｓｅ  Ｈ１とＲＮａｓｅ  Ｈ２が存在する。レトロウイルスＲＮａｓｅ  Ｈ酵素は原核生物のＲＮａｓｅ  Ｈ１と類似している。これらの酵素はすべて、ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖のＲＮＡ成分を切断することができるという特徴を共有している。ヒトとマウスのＲＮａｓｅ  Ｈ１遺伝子はアミノ酸レベルで７８％同一である（Ｃｅｒｒｉｔｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，５３，３００−３０７）。原核生物では、該遺伝子はｒｎｈａ（ＲＮａｓｅ  Ｈ１）およびｒｎｈｂ（ＲＮａｓｅ  Ｈ２）と命名されている。第３ファミリーの原核生物Ｒｎａｓｅであるｒｎｈｃ（ＲＮａｓｅ  Ｈ３）が提案されている（Ｏｈｔａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８，６０５−６１８）。
【００１３】
進化的に、「古代」生物体（古細菌種）は一部の場合において１種類のみのＲＮａｓｅ  Ｈ酵素を有するようであり、これは、現代のＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素（原核生物のもの）に最も密接に関連している（Ｏｈｔａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｅｎｇ，８８，１２−１９）。例外が存在し、古細菌ハロバクテリウムはＲＮａｓｅ  Ｈ１オルソログを有する（Ｏｈｔａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３８１，７９５−８０２）。また、ＲＮａｓｅ  Ｈ１遺伝子はサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）においても同定されている（Ｉｔａｙａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９，４４４３−４４４９）。ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素はあらゆる生体生物体に存在するようである。ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素クラスはすべて、ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖のＲＮＡ成分を加水分解するが、基質および補因子の要件は異なる。例えば、ＩＩ型酵素はＭｇ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｃｏ＋＋（および場合によってはＮｉ＋＋）を補因子として利用するが、Ｉ型酵素はＭｇ＋＋を必要とし、Ｍｎ＋＋イオンには阻害され得る。反応生成物は両方の酵素クラスで同じである：切断生成物は３’−ＯＨおよび５’−リン酸基を有する（図１参照）。ＲＮＡ：ＲＮＡ二本鎖を切断するＲＮａｓｅ  クラスＩＩＩ酵素（例えば、Ｄｉｃｅｒ、Ａｇｏ２、Ｄｒｏｓｈａ）も同様の産物をもたらし、ＲＮａｓｅ  Ｈと類似性を有するヌクレアーゼドメインを含む。ほとんどの他のリボヌクレアーゼ、特に一本鎖リボヌクレアーゼでは、環状２’，３’−リン酸基生成物と５’−ＯＨ生成物がもたらされる（図２参照）。
【００１４】
Ｉ型ＲＮａｓｅ  Ｈ
大腸菌ＲＮａｓｅ  Ｈ１は広範に特性評価されている。この酵素に関して非常に多くの研究が行われており、この酵素はアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計に影響を及ぼすため、基質要件の特性評価が重要視されている；これには、大腸菌ＲＮａｓｅ  Ｈ１（Ｃｒｏｏｋｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３１２（Ｐｔ  ２），５９９−６０８；Ｌｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７２，２７５１３−２７５１６；Ｌｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６，３９０−３９８；Ｌｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７２，１８１９１−１８１９９；Ｌｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７１，８３−９１；Ｌｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７１，７３−８２；Ｌｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７８，１４９０６−１４９１２；Ｌｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７８，４９８６０−４９８６７参照）と、ヒトＲＮａｓｅ  Ｈ１（Ｗｕ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ，８，５３−６１；Ｗｕ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７４，２８２７０−２８２７８；Ｗｕ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７６，２３５４７−２３５５３参照）の両方に関する研究が含まれている。組織培養では、ヒトＲＮａｓｅ  Ｈ１の過剰発現はアンチセンスオリゴ（ＡＳＯ）の効力を増大させるが、ｓｉＲＮＡまたはＡＳＯのいずれかを用いたＲＮａｓｅ  Ｈ１のノックダウンはアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力を低下させる。
【００１５】
Ｉ型ＲＮａｓｅ  Ｈは、基質における充分な活性のために多種類のＲＮＡ塩基を必要とする。１つまたは２つしかＲＮＡ塩基を有しないＤＮＡ／ＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＤＮＡオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ）は不活性である。大腸菌ＲＮａｓｅ  Ｈ１では、連続する３つのＲＮＡ塩基を有する基質は弱い活性を示す。充分な活性は、４ＲＮＡ塩基の伸長で観察された（Ｈｏｇｒｅｆｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６５，５５６１−５５６６）。ＲＮａｓｅ  Ｈ１は、１９９１年にサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からクローニングし、これは、大腸菌の該酵素と５６％しかアミノ酸同一性を有しないが、同様の触媒特性を有する（Ｉｔａｙａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９，４４４３−４４４９）。この酵素は６５℃で安定であったが、８０℃まで加熱すると急速に活性が失われた。
【００１６】
ヒトＲＮａｓｅ  Ｈ１遺伝子（Ｉ型ＲＮａｓｅ  Ｈ）は１９９８年にクローニングされた（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，５３，３００−３０７およびＡｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ，８，５３−６１）。この酵素は、切断を行うためにＤＮＡ／ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ内に５塩基ＲＮＡ伸長を必要とする。最大活性は、中性ｐＨの１ｍＭ  Ｍｇ＋＋バッファーにおいて観察され、Ｍｎ＋＋イオンは阻害性であった（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７４，２８２７０−２８２７８）。ＲＮＡを２’修飾ヌクレオシド（例えば、２’−ＯＭｅ、２’−Ｆなど）に置き換えた場合、切断は観察されなかった。
【００１７】
３つのアミノ酸（Ａｓｐ−１０、Ｇｌｕ−４８およびＡｓｐ−７０）が大腸菌ＲＮａｓｅ  Ｈ１の触媒性部位を構成しており、該部位は、該タンパク質の高度に保存されたカルボキシ末端ドメイン内に存在している（Ｋａｔａｙａｎａｇｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４７，３０６−３０９）；このドメインは部位特異的変異誘発および結晶構造の測定の両方によって評価されている。同じアミノ酸が二価イオン補因子の配位に関与している。
【００１８】
興味深いことに、基質二本鎖の２’修飾はらせんの幾何構造を改変させ、ＲＮａｓｅ  Ｈ１の活性に有害な影響を及ぼし得る。ＲＮＡセグメントにフランキングする２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル（ＭＯＥ）修飾により、おそらく糖鎖のコンホメーションおよびらせんの幾何構造の改変のため切断速度が低下する。ロックド核酸（ＬＮＡ）塩基は、より大きな度合いでらせんの幾何構造を乱すものであり、より大きな程度で酵素活性が影響を受けた（Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７１，８３−９１およびＭｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７１，７３−８２）。Ｄａｍｈａ（マギル大学）により、基質二本鎖内に存在させた場合の２’−Ｆ修飾ヌクレオシド（２’−デオキシ−２’−フルオロ−ｂ−Ｄ−リボース）の効果が研究されており、この基はＲＮａｓｅ  Ｈ１によって切断され得ないことが見出されている（Ｙａｚｂｅｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，３０，３０１５−３０２５）。式ＡおよびＢは、ＲＮａｓｅ  Ｈ１切断について提案されている２つの異なる機構を示し、どちらも２’ＯＨ基の関与を必要とする。
【００１９】
【化１】
2016510601.tif 000002
【００２０】
Ｄａｍｈａの研究は、反応機構が２’−ＯＨ基を伴う該酵素の既知の活性部位と整合している。該酵素活性部位は、おそらく二本鎖の静電結合に寄与しているリシン残基のクラスター内に存在している。結合表面と負電荷を有するリン酸基主鎖間の相互作用がＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖の副溝（ｇｒｏｖｅ）に沿って生じると考えられている（Ｎａｋａｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８８，１１５３５−１１５３９）；従って、副溝に影響を及ぼす構造の変化は基質と活性部位間の相互作用に影響を及ぼす。例えば、副溝幅はＢ型ＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖では７．５Åであり、純粋なＡ型ＲＮＡ：ＲＮＡ二本鎖では１１Åであり、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のハイブリッドＡ型二本鎖では８．５Åである（Ｆｅｄｏｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２３３，５０９−５２３）。２’修飾は副溝内に突出し、これにより、ＲＮａｓｅ  Ｈ１による切断に対する修飾基質の活性の低下または解消におけるこの基の挙動の幾つかが説明され得る。化学構造の変化に関して最も「保存的」なＲＮＡアナログである２’−Ｆヌクレオシドであっても活性に有害な影響を及ぼす。
【００２１】
ＩＩ型ＲＮａｓｅ  Ｈ
ヒトＩＩ型ＲＮａｓｅ  Ｈは、最初にＥｄｅｒおよびＷａｌｄｅｒによって１９９１年に精製され、特性評価された（Ｅｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６６，６４７２−６４７９）。この酵素は、クラスＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈとして知られるものの特徴的な二価の金属イオン依存性を有していたため、最初はヒトＲＮａｓｅ  Ｈ１と表示された。現在の命名法では、これはＩＩ型ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素である。Ｍｇ＋＋中では活性であるがＭｎ＋＋イオンには阻害されるＩ型酵素とは異なり、ＩＩ型酵素は多種多様な２価のカチオンについて活性である。ヒトＩＩ型ＲＮａｓｅ  Ｈの最適な活性は１０ｍＭ  Ｍｇ＋＋、５ｍＭ  Ｃｏ＋＋または０．５ｍＭ  Ｍｎ＋＋で観察される。
【００２２】
重要なことに、ＩＩ型ＲＮａｓｅ  Ｈ（以下、本明細書においてＲＮａｓｅ  Ｈ２と称する。）の基質特異性はＲＮａｓｅ  Ｈ１と異なる。特に、この酵素は、ＤＮＡ配列（二本鎖形態の）内に埋もれた単一のリボヌクレオチドを切断し得る（Ｅｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７５，１２３−１２６）。興味深いことに、切断はＲＮＡ残基の５’側で起こる（図３参照）。原核生物ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素の概要については、Ｋａｎａｙａによる最近の総説を参照のこと（Ｋａｎａｙａ（２００１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，３４１，３７７−３９４）。
【００２３】
大腸菌ＲＮａｓｅ  Ｈ２遺伝子はクローニングされ（Ｉｔａｙａ，Ｍ．（１９９０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８７，８５８７−８５９１）、特性評価されている（Ｏｈｔａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ），１２７，８９５−８９９）。ヒトの該酵素と同様、大腸菌の該酵素はＭｎ＋＋イオンを伴って機能を果たし、実際、マグネシウムよりもマンガンを伴う方が活性である。
【００２４】
ＲＮａｓｅ  Ｈ２遺伝子はクローニングされており、該酵素は、さまざまな真核生物供給源および原核生物供給源で特性評価されている。ピロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）（ＫＯＤ１）のＲＮａｓｅ  Ｈ２はクローニングされており、詳細に研究されている（Ｈａｒｕｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８０，６２０７−６２１４；Ｍｕｋａｉｙａｍａ，ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４３，１３８５９−１３８６６）。また、関連生物体ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｕｓ）のＲＮａｓｅ  Ｈ２もクローニングされているが、充分には特性評価されていない（Ｓａｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，３０９，２４７−２５２）。
【００２５】
メタノコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）のＲＮａｓｅ  Ｈ２は、Ｌａｉによってクローニングし、特性評価された（Ｌａｉ，ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８，８９７−９０４；Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２，７８５−７９１）。該酵素に対する金属イオン結合を定量的に測定するために等温滴定カロリメトリーが使用された。彼らはＭｎ＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｃａ＋＋およびＢａ＋＋の結合について試験し、すべての場合で１：１の結合モル比が観察され、該酵素の活性部位内に１種類しか二価の金属イオン補因子が存在しないことが示唆された。Ｍｎ＋＋の会合定数はＭｇ＋＋のものより１０倍高かった。ピーク酵素活性は０．８ｍＭ  ＭｎＣｌ２においてみられた。
【００２６】
サイクリングプローブ反応などのＲＮａｓｅ  ＨによるＲＮＡ含有プローブの切断に基づいた核酸ハイブリダイゼーションアッセイ（Ｗａｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，４０３，７１１号明細書）は、これまで、夾雑一本鎖リボヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドのバックグラウンド切断により、ならびにＭｇ２＋および他の２価のカチオンによって助長される水触媒性加水分解により制限されている。一本鎖リボヌクレアーゼの効果は、一本鎖リボヌクレアーゼをブロックするがＲＮａｓｅ  Ｈの活性に干渉しないＲｎａｓｉｎなどのインヒビターによってある程度まで緩和され得る。
【００２７】
一本鎖リボヌクレアーゼはＲＮＡ残基の３’側を切断し、リボースの２’位と３’位に環状リン酸基をもたらす（図２参照）。同じ産物が自発的水触媒性加水分解によっても生成する。どちらの場合も、この環状リン酸基はさらに加水分解され得、該酵素による触媒反応では３’−一リン酸エステルが、または自発的加水分解では３’−と２’−一リン酸エステルの混合物が形成され得る。ＲＮａｓｅ  Ｈによって形成される切断生成物（図１）とプローブの非特異的切断によって形成されるもの（図２）との違いは、この２つの経路を識別するための根拠をもたらす。この違いは、ＲＮａｓｅ  Ｈ２および一本鎖リボヌクレアーゼによる切断を単一のＲＮＡ残基しか有しない基質と比較した場合、さらにより顕著になる。この場合、ＲＮａｓｅ  Ｈ２および一本鎖リボヌクレアーゼはリン酸基主鎖上の異なる位置を攻撃する（図３参照）。
【００２８】
ＲＮａｓｅ  Ｈは、サイクリングプローブアッセイ、ＰＣＲアッセイ（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，７６３，１８１号明細書；Ｓａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第７，１３５，２９１号明細書；ならびにＢｅｈｌｋｅおよびＷａｌｄｅｒ，米国特許出願公開第２００８００６８６４３号明細書）および多項式（ｐｏｌｙｎｏｍｉａｌ）増幅反応（Ｂｅｈｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第７，１１２，４０６号明細書）において切断酵素として使用されている。このようなアッセイによってもたらされる改善にもかかわらず、依然として相当な制限が存在する。ＰＣＲアッセイではホットスタートＤＮＡポリメラーゼが使用され、これは相当なコストを追加する。さらに、代替のＤＮＡポリメラーゼが必要とされるたびに該酵素の新たなホットスタートバージョンが開発されなければならない。また、このような種々のアッセイの有用性は、反応に使用されるオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの望ましくない切断によって、例えば、水および二価の金属イオンに触媒されるＲＮＡ残基の３’側での加水分解、一本鎖リボヌクレアーゼによる加水分解ならびにＲＮＡ残基の５’−リン酸基以外の位置でのＩＩ型ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素によって触媒される典型的な切断反応によって制限されている。本発明は、このような制限を解決し、さらなる利点および生物学的アッセイにおけるＲＮａｓｅ  Ｈの使用のための新たなアッセイ形式をもたらすものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２９】
【特許文献１】米国特許第５，４１１，８７６号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７７３，２５８号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６７７，１５２号明細書
【特許文献４】米国特許第５，３３８，６７１号明細書
【特許文献５】米国特許第５，４０３，７１１号明細書
【特許文献６】米国特許第５，７６３，１８１号明細書
【特許文献７】米国特許第７，１３５，２９１号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２００８／００６８６４３号明細書
【特許文献９】米国特許第７，１１２，４０６号明細書
【非特許文献】
【００３０】
【非特許文献１】Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０（７）：１７１７−１７２３
【非特許文献２】Ｒｙｓ  ＆  Ｐｅｒｓｉｎｇ，１９９３，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１（９）：２３５６−６０
【非特許文献３】Ｓａｒｋａｒ  ＆  Ｓｏｍｍｅｒ，１９９０  Ｎａｔｕｒｅ．３４３（６２５３）：２７
【非特許文献４】Ｌｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９０，Ｇｅｎｅ，９３（１）：１２５−１２８
【非特許文献５】Ｃｅｒｒｉｔｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，５３，３００−３０７
【非特許文献６】Ｏｈｔａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８，６０５−６１８
【非特許文献７】Ｏｈｔａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｅｎｇ，８８，１２−１９
【非特許文献８】Ｏｈｔａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３８１，７９５−８０２
【非特許文献９】Ｉｔａｙａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９，４４４３−４４４９
【非特許文献１０】Ｃｒｏｏｋｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３１２（Ｐｔ  ２），５９９−６０８
【非特許文献１１】Ｌｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７２，２７５１３−２７５１６
【非特許文献１２】Ｌｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６，３９０−３９８
【非特許文献１３】Ｌｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７２，１８１９１−１８１９９
【非特許文献１４】Ｌｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７１，８３−９１
【非特許文献１５】Ｌｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７１，７３−８２
【非特許文献１６】Ｌｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７８，１４９０６−１４９１２
【非特許文献１７】Ｌｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７８，４９８６０−４９８６７
【非特許文献１８】Ｗｕ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ，８，５３−６１
【非特許文献１９】Ｗｕ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７４，２８２７０−２８２７８
【非特許文献２０】Ｗｕ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７６，２３５４７−２３５５３
【非特許文献２１】Ｈｏｇｒｅｆｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６５，５５６１−５５６６
【非特許文献２２】Ｋａｔａｙａｎａｇｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４７，３０６−３０９
【非特許文献２３】Ｙａｚｂｅｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，３０，３０１５−３０２５
【非特許文献２４】Ｎａｋａｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８８，１１５３５−１１５３９
【非特許文献２５】Ｆｅｄｏｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２３３，５０９−５２３
【非特許文献２６】Ｅｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６６，６４７２−６４７９
【非特許文献２７】Ｅｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７５，１２３−１２６
【非特許文献２８】Ｋａｎａｙａ（２００１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，３４１，３７７−３９４
【非特許文献２９】Ｉｔａｙａ，Ｍ．（１９９０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８７，８５８７−８５９１
【非特許文献３０】Ｏｈｔａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ），１２７，８９５−８９９
【非特許文献３１】Ｈａｒｕｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８０，６２０７−６２１４
【非特許文献３２】Ｍｕｋａｉｙａｍａ，ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４３，１３８５９−１３８６６
【非特許文献３３】Ｓａｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，３０９，２４７−２５２
【非特許文献３４】Ｌａｉ，ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８，８９７−９０４
【非特許文献３５】Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２，７８５−７９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
本発明により、核酸増幅、検出、ライゲーション、シークエンシングおよび合成と関連するＲＮａｓｅ  Ｈ切断を使用する新規な生物学的アッセイを提供する。さらに、本発明により、ＲＮａｓｅ  Ｈによる切断を利用するための新たなアッセイ形式およびかかるアッセイのための新規なオリゴヌクレオチド基質を提供する。本発明の化合物、キットおよび方法により、プライマーダイマーなどの非特異的増幅不純物を実質的に含有していない高度に特異的なプライマー系増幅反応を行う簡便で経済的な手段がもたらされる。本発明の方法およびキットでは、可逆的に不活化されるＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡリガーゼ酵素の必要性が回避される。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
本発明の目的の１つは、核酸増幅および検出アッセイ、例えば限定されないが、ＰＣＲ、ＯＬＡ（オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ）、ＬＣＲ（ライゲーション連鎖反応）、多項式増幅およびＤＮＡシークエンシングにおけるホットスタートプロトコルを可能にすることであり、ここで、ホットスタート成分は耐熱性ＲＮａｓｅ  Ｈまたは反応で使用される高温において活性が得られる他のニッキング酵素である。かかるアッセイで本発明の修飾オリゴヌクレオチドを使用し、該修飾オリゴヌクレオチドは、相補核酸配列にハイブリダイズするまで反応に関与することができず、切断されて、機能性の５’末端または３’末端が生成する。標準的な未修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドが使用される対応するアッセイと比較すると、特異性が大きく向上する。さらに、可逆的に不活化させるＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼに対する要件が削減される。
【００３３】
プライマー伸長を伴うアッセイの場合（例えば、ＰＣＲ、多項式増幅およびＤＮＡシークエンシング）、オリゴヌクレオチド阻害活性の修飾は、好ましくは３’末端またはこの付近に存在させる。オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用する一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害活性は該オリゴヌクレオチドの３’末端付近に、例えば、本発明のオリゴヌクレオチドの３’末端から約１０塩基までに位置し得る。他の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害活性は、本発明のオリゴヌクレオチドの３’末端付近に、例えば３’末端から約１から６塩基に位置し得る。他の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害活性は、本発明のオリゴヌクレオチドの３’末端付近に、例えば３’末端から約１から５塩基に位置し得る。他の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害活性は、本発明のオリゴヌクレオチドの３’末端付近に、例えば３’末端から約１から３塩基に位置し得る。他の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害活性が位置し得る３’末端からの厳密な位置（即ち、塩基の数）は、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーが標的配列上のこの短鎖型相補鎖（即ち、ハイブリダイゼーションが所望される配列）にハイブリダイズする能力に影響する要素に依存する。かかる要素としては、限定されないが、反応（１つまたは複数）に使用されるＴｍ、バッファー組成およびアニーリング温度が挙げられる。
【００３４】
ライゲーションアッセイ（例えば、ＯＬＡおよびＬＣＲ）では、活性阻害修飾は、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端のいずれか、またはこの付近に位置し得る。他の実施形態では、ライゲーションアッセイでは、活性阻害修飾は、使用する場合は、好ましくは、プローブ切断によって除去される領域内の切断性ＲＮＡ塩基の３’側のドメイン内に位置する。他の実施形態では、ライゲーションアッセイでは、Ｃ３スペーサーが本発明のオリゴヌクレオチドプローブ内のＲＮＡ塩基の近くに、ミスマッチ識別の改善に役立つ特異性を改善するために位置し得る。他の実施形態では、ＯＬＡアッセイ（この場合、読出しはライゲーション事象の産物を増幅させるためのＰＣＲアッセイに依存する。）において、任意のブロッキング基が、ＲＮａｓｅ  Ｈ切断によって除去される本発明のオリゴヌクレオチドのドメイン内に位置し得る。かかる実施形態では、読出しがライゲーション事象の産物を増幅させるためのＰＣＲアッセイに依存するＯＬＡアッセイにおいて、ＲＮａｓｅ  Ｈ切断性ドメイン内のブロッキング基の厳密な位置は、切断に対する特異性が改変されるように調整され得、切断性ＲＮＡ塩基に相対するブロッキング基の厳密な位置により、最適な切断速度を得るために必要とされる酵素の量が改変され得る。
【００３５】
本発明のまたさらなる目的は、プライマー伸長およびライゲーションに干渉するためのオリゴヌクレオチドの新規な修飾を提供することである。
【００３６】
本発明のまたさらなる目的は、オリゴヌクレオチドがＤＮＡ合成の鋳型としての機能を果たすことを妨げ、これによりＰＣＲに干渉するオリゴヌクレオチドの修飾を提供することである。
【００３７】
本発明のまたさらなる目的は、ＲＮａｓｅ  Ｈによって切断されるＲＮＡがない修飾オリゴヌクレオチド配列を提供することである。かかる一実施形態では、オリゴヌクレオチドが単一の２’−フルオロ残基を含むものであり、切断はＩＩ型ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素によって媒介される。より好ましい一実施形態では、オリゴヌクレオチドは隣接している２つの２’−フルオロ残基を含むものである。
【００３８】
本発明のまたさらなる目的は、上記のアッセイにおける使用のための、所望のものでない切断反応、例えば限定されないが、水および二価の金属イオンに触媒されるＲＮＡ残基３’側での加水分解、一本鎖リボヌクレアーゼによる加水分解ならびにＲＮＡ残基の５’−リン酸基以外の位置でのＩＩ型ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素によって触媒される非典型的な切断反応が阻害されるように修飾されたオリゴヌクレオチドを提供することである（図３参照）。かかる一実施形態では、ＲＮＡ残基の２’−ヒドロキシ基が代替的な官能基、例えばフッ素またはアルコキシ置換基（例えば、Ｏ−メチル）で置き換えられる。かかる別の実施形態では、ＲＮＡ残基の３’側のリン酸基がホスホロチオエートまたはジチオエート結合で置き換えられる。また別の実施形態では、オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ抵抗性結合で、ＲＮＡ残基の３’−リン酸基からさらに下流において、またはＲＮＡ残基の５’側で、ＲＮａｓｅ  Ｈ２による異常型切断が抑制されるように修飾される。かかる実施形態に有用なヌクレアーゼ抵抗性結合としては、ホスホロチオエート、ジチオエート、メチルホスホネート、および無塩基残基、例えばＣ３スペーサーが挙げられる。本発明のＰＣＲアッセイに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーへのかかるヌクレアーゼ抵抗性結合の組込みは特に有益であることがわかった（実施例２５、２７および２８参照）。
【００３９】
本発明のまたさらなる目的は、上記のアッセイにおける使用のための、バリアント対立遺伝子の識別の向上がもたらされるように切断部位にフランキングする位置が修飾されたオリゴヌクレオチドを提供することである。かかる修飾としては、限定されないが、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ残基および二次ミスマッチ置換が挙げられる（実施例２３参照）。
【００４０】
またさらなる目的は、オリゴヌクレオチドの切断が蛍光の変化によって測定され得る本発明における使用のためのオリゴヌクレオチドおよびアッセイ形式を提供することである。かかる一実施形態では、ＲＮａｓｅ  Ｈによって切断性のプライマーはフルオロフォアおよびクエンチャーで標識され、アッセイは蛍光の増大によってモニタリングされる（実施例１９から２１参照）。
【００４１】
本発明のまたさらなる目的は、ＲＮａｓｅ  Ｈ組成物およびこの使用のためのプロトコルを提供することであり、ここで、該酵素は耐熱性であり、低温で低減された活性を有する。
【００４２】
またさらなる一実施形態では、ＩＩ型ＲＮａｓｅ  Ｈをサイクリングプローブ反応において使用し、ここで、プローブ内のＲＮＡ残基は２’−フルオロ残基で置き換えられている。より好ましい一実施形態では、隣接している２つの２’−フルオロ残基を有するプローブが使用される。
【００４３】
プライマー伸長アッセイ、ライゲーションアッセイおよびサイクリングプローブ反応に関する本発明の態様の多くを、それぞれ、表１、２および３にまとめる。
【００４４】
本発明のまたさらなる一実施形態では、ＩＩ型ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素が新規な方法において、ＤＮＡシークエンシングのために使用される。
【００４５】
本発明のまたさらなる一実施形態では、ＩＩ型ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素が新規な方法において、ＤＮＡ合成のために使用される。
【００４６】
またさらなる目的は、プライマー配列と標的核酸間の塩基ミスマッチの存在を識別するための本発明のアッセイ能を、オーバーラップしているブロック型プライマーの組を提供することにより増大させることである。本発明の一実施形態において、ブロック型切断性プライマーのＲＮＡ塩基は一塩基多型（ＳＮＰ）の部位に位置する。当業者には、多型部位に被さるプライマーが二本鎖ＤＮＡ標的核酸の上または下の（センスまたはアンチセンス）鎖に特異的となり得ることが容易に認識されよう。本発明の一実施形態では、ＳＮＰ（一ヌクレオチド多型）の部位に直接位置するＲＮＡ残基を有し、プライマーとパーフェクトマッチを有する標的とのハイブリダイゼーションにより、ＲＮａｓｅ  Ｈ２による効率的な切断がもたらされるが、この部位にミスマッチを有する標的とのハイブリダイゼーションでは、ＲＮａｓｅ  Ｈ２による切断が不充分になるようにした単一のブロック型切断性プライマーが使用される。第１のプライマーから適切な距離に位置する第２の未修飾プライマーとペアにする場合、ＰＣＲを用いて対立遺伝子特異的増幅反応が行われ得、このとき、ミスマッチ標的を使用した場合、マッチ標的を使用した場合と比べて産物の検出において有意な遅延が観察される。本発明の別の実施形態では、２種類のブロック型切断性プライマーをペアにし、第１のものは上の鎖に対応し、第２のものは下の鎖に対応し、ＳＮＰ部位がＲＮＡ塩基に位置する。この２種類のプライマーはオーバーラップしており、ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断による活性化後、ＰＣＲプライマーペアとしての機能を果たし、ミスマッチ標的よりもマッチ標的を優先的に増幅させる。変異部位においてオーバーラップしている上流ブロック型プライマーと下流ブロック型プライマーを組み込むことにより、アッセイの選択性がさらに向上する。
【００４７】
本発明の別の目的において、標的ＤＮＡ配列の増幅中の特異性を改善する方法を提供する。該方法は４つの工程を含む。第１の工程は、反応混合物を準備することを含むものである。反応混合物は：（ｉ）切断ドメインを有するオリゴヌクレオチドプライマーであって、前記オリゴヌクレオチドプライマーはＲＮａｓｅ  Ｈ酵素によって切断可能であり、ブロッキング基の５’側に位置し、前記ブロッキング基は前記オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端または前記３’末端の付近に連結され、前記ブロッキング基はプライマー伸長を妨げ、かつ／または前記オリゴヌクレオチドプライマーがＤＮＡ合成の鋳型としての機能を果たすことを阻害するオリゴヌクレオチドプライマーと；（ｉｉ）標的配列を含含んでもよいか、または含まなくてもよい試料核酸と；（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼと、
（ｉｖ）耐熱性であり、３０℃において７０℃と比べて少なくとも１０倍の活性の低下を有するＲＮａｓｅ  Ｈ酵素、を含むものである。第２の工程は、前記オリゴヌクレオチドプライマーを標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズさせ、二本鎖基質を形成することを含むものである。第３の工程は、ハイブリダイズした前記オリゴヌクレオチドプライマーを、前記ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素で、前記切断ドメイン内の切断部位または前記切断ドメインに隣接している切断部位において切断し、前記ブロッキング基を前記オリゴヌクレオチドプライマーから除去することを含むものである。第４の工程は、前記オリゴヌクレオチドプライマーを前記ＤＮＡポリメラーゼで伸長させることを含むものである。前記反応混合物は、３’−ミスマッチ識別アッセイによって調整したとき、前記標的ＤＮＡの増幅のために少なくとも約５．０以上または約５０％以上のΔＣｐが得られるような濃度の２価のカチオンを含むものである。
【００４８】
本発明の別の目的において、標的ＤＮＡ配列の増幅方法を提供する。該方法は４つの工程を含む。第１の工程は、反応混合物を準備することを含むものである。反応混合物は：
（ｉ）切断ドメインを有するオリゴヌクレオチドプライマーであって、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素によって切断可能であり、ブロッキング基の５’側に位置し、前記ブロッキング基は前記オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端または前記３’末端の付近に連結され、前記ブロッキング基はプライマー伸長を妨げる、かつ／または前記オリゴヌクレオチドプライマーがＤＮＡ合成の鋳型としての機能を果たすことを阻害する、オリゴヌクレオチドプライマーと；（ｉｉ）標的配列を含んでもよいか、または含まなくてもよい試料核酸と；（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼと、（ｉｖ）耐熱性であり、３０℃において７０℃と比べて少なくとも１０倍の活性の低下を有するＲＮａｓｅ  Ｈ酵素、を含むものである。第２の工程は、前記オリゴヌクレオチドプライマーを標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズさせて、二本鎖基質を形成することを含むものである。第３の工程は、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライマーを、前記ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素で、前記切断ドメイン内の切断部位または前記切断ドメインに隣接している切断部位において切断して、該ブロッキング基を前記オリゴヌクレオチドプライマーから除去することを含むものである。第４の工程は、前記オリゴヌクレオチドプライマーを前記ＤＮＡポリメラーゼで伸長させることを含むものである。前記反応混合物は、２価のカチオンと、ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテルを含む非イオン性界面活性剤とを含むものである。
【００４９】
本発明の別の目的において、標的ＤＮＡ配列の増幅を行うためのキットを提供する。該キットは、２価のカチオンおよび会合した対イオンを含む金属塩を含有する反応バッファーを含む。前記２価のカチオンはＭｇ＋＋を含み、前記反応バッファーは、標的ＤＮＡの増幅を行うための反応混合物中で約２．０ｍＭ以下の遊離Ｍｇ＋＋の前記金属塩の終濃度をもたらすものである。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、多数のＲＮＡ塩基を含む基質に対してＲＮａｓｅ  Ｈ酵素により起こる切断パターンを示す。
【図２】図２は、一本鎖リボヌクレアーゼ酵素により、または水触媒性加水分解によって起こる切断パターンを示す。この場合、最終生成物によりリボースの２’と３’の位置に環状リン酸基がもたらされる。
【図３】図３は、ＲＮａｓｅ  Ｈ２および一本鎖リボヌクレアーゼによる単一のＲＮＡ塩基を含む基質における切断部位を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、５つの古細菌ＲＮａｓｅ  Ｈ２合成遺伝子から生成した誘導タンパク質を示すＳＤＳ１０％ポリアクリルアミドゲルの写真である。ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）およびピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）での誘導タンパク質を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、５つの古細菌ＲＮａｓｅ  Ｈ２合成遺伝子から生成した誘導タンパク質を示すＳＤＳ１０％ポリアクリルアミドゲルの写真である。メタノカルドコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、ピロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｄａｒｅｎｓｉｓ）での誘導タンパク質を示す。
【図５】図５は、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを用いた組換えＨｉｓ  ｔａｇ  ＲＮａｓｅ  Ｈ２タンパク質の精製後の純粋な単一のバンドを示すクマシーブルー染色タンパク質ゲルを示す。
【図６】図６は、図５のタンパク質ゲルを使用し、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いて行ったウエスタンブロットを示す。
【図７】図７は、ピロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）およびピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）由来の組換えＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素による、キメラ１１ＤＮＡ−８ＲＮＡ−１１ＤＮＡ鎖と相補ＤＮＡ鎖を含む二本鎖の消化を示すゲルの写真である。
【図８Ａ】図８Ａは、ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）およびメタノカルドコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）由来の組換えＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素による、キメラ１４ＤＮＡ−１ＲＮＡ−１５ＤＮＡ鎖と相補ＤＮＡ鎖を含む二本鎖の消化を示すゲルの写真である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ピロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）由来の組換えＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素による、キメラ１４ＤＮＡ−１ＲＮＡ−１５ＤＮＡ鎖と相補ＤＮＡ鎖を含む二本鎖の消化を示すゲルの写真である。
【図９】図９は、９５℃で種々の時間のインキュベーションのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素の活性に対する効果を示す。
【図１０】図１０は、種々のインキュベーション温度でのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２による単一リボヌクレオチド含有基質の切断の相対量を示すゲルの写真である。
【図１１】図１１は、図１０のゲルにおける切断された基質の実際の量を示すグラフである。
【図１２】図１２は、種々の２価のカチオンの存在下での種々の単一２’修飾基質のピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｉｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２による切断を示すゲルの写真である。
【図１３】図１３は、単一２’−フルオロまたは二重２’−フルオロ（ジ−フルオロ）修飾基質のピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２による切断を示すゲルの写真である。存在させた２価のカチオンはＭｎ＋＋であった。
【図１４】図１４は、考えられ得る１６種類すべてのジ−フルオロ修飾基質のピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２による相対切断を定量するグラフである。
【図１５】図１５は、さまざまな数の３’ＤＮＡ塩基（即ち、ＲＮＡ残基の３’側のＤＮＡ塩基の数）を有するｒＮ基質のピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２による相対切断を定量するグラフである。
【図１６】図１６は、さまざまな数の５’ＤＮＡ塩基（即ち、ＲＮＡ残基の５’側のＤＮＡ塩基の数）を有するｒＮ基質のピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２による相対切断を定量するグラフである。
【図１７】図１７は、さまざまな数の３’ＤＮＡ塩基（即ち、ｆＵｆＣ残基の３’側のＤＮＡ塩基の数）を有するジ−フルオロ基質のピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２による相対切断を定量するグラフである。
【図１８】図１８は、ブロック型ＰＣＲプライマーのＲＮａｓｅ  Ｈ２活性化の反応の概略図である。
【図１９】図１９は、単一のｒＵ含有ブロック型プライマーを用いて行ったエンドポイントＰＣＲ反応の産物を示すゲルの写真である。接尾辞２Ｄ、３Ｄなどは、ｒＵ残基とプライマーの３’末端の間のＤＮＡ塩基の数を表す。プライマーはジデオキシＣ残基でブロックされている。
【図２０】図２０Ａは、未修飾およびブロック型の両方のｒＮプライマーを使用し、ＲＮａｓｅ  Ｈ２なし）でのヒトＨＲＡＳ遺伝子内の３４０ｂｐアンプリコンのＰＣＲ増幅プロットである。サイクル数をＸ軸上に示し、相対蛍光強度をＹ軸上に示す。図２０Ｂは、未修飾およびブロック型の両方のｒＮプライマーを使用し、ＲＮａｓｅ  Ｈ２ありでのヒトＨＲＡＳ遺伝子内の３４０ｂｐアンプリコンのＰＣＲ増幅プロットである。サイクル数をＸ軸上に示し、相対蛍光強度をＹ軸上に示す。
【図２１】図２１Ａは、未修飾およびブロック型の両方のｒＮプライマーを使用し、ＲＮａｓｅ  Ｈ２なしでのヒトＥＴＳ２遺伝子内の１８４ｂｐアンプリコンのＰＣＲ増幅プロットである。サイクル数をＸ軸上に示し、相対蛍光強度をＹ軸上に示す。図２１Ｂは、未修飾およびブロック型の両方のｒＮプライマーを使用し、ＲＮａｓｅ  Ｈ２ありでのヒトＥＴＳ２遺伝子内の１８４ｂｐアンプリコンのＰＣＲ増幅プロットである。サイクル数をＸ軸上に示し、相対蛍光強度をＹ軸上に示す。
【図２２】図２２Ａは、未修飾および３’−ｆＮ  修飾型の両方のプライマーを使用し、ＲＮａｓｅ  Ｈ２なしでの合成１０３ｂｐアンプリコンのＰＣＲ増幅プロットである。図２２Ｂは、未修飾および３’−ｆＮ  修飾型の両方のプライマーを使用し、ＲＮａｓｅ  Ｈ２ありでの合成１０３ｂｐアンプリコンのＰＣＲ増幅プロットである。
【図２３】図２３は、単一のホスホロチオエートヌクレオシド間修飾を含むｒＮプライマー（配列番号１９２）のＨＰＬＣ図を示す。上パネルは、２種類の異性体の分割を示す最初の合成生成物を示す。真ん中のパネルは精製Ｒｐ異性体であり、下パネルは精製Ｓｐ異性体である。
【図２４】図２４は、単一のＲＮＡ塩基を有する基質（それぞれ、出現順に配列番号３０２および１０３を有する。）でのＲＮａｓｅ  Ｈ２およびＲＮａｓｅ  Ａ（対比）酵素的切断と、種々のホスホロチオエート立体異性体との関係を示す。
【図２５】図２５は、ＨＣＶアンプリコンに対して標準およびブロック型／切断性プライマーを用いて行ったＰＣＲ反応による産物を分離するために使用したポリアクリルアミドゲルの写真を示し、標準プライマーの使用では、所望のものでない小型のプライマーダイマー種の形成がもたらされるが、ブロック型プライマーの使用では所望の産物の特異的増幅がもたらされる。ことを示す。核酸を蛍光染色を用いてイメージングし、明瞭性のため画像を反転した。
【図２６】図２６は、種々の濃度（％ｖｏｌ：ｖｏｌとして表示）の異なる界面活性剤を含有するバッファー中における放射性標識ｒＣ含有基質のピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２による相対切断を定量するグラフである。
【図２７】図２７は、蛍光クエンチ（Ｆ／Ｑ）ブロック型ＰＣＲプライマーのＲＮａｓｅ  Ｈ２活性化の反応の概略図である。
【図２８】図２８は、非ブロック型プライマーと蛍光クエンチ二重標識プローブ（ＤＬＰ）との使用によって生じた蛍光シグナルを示す増幅プロットであり、１０３塩基合成アンプリコンに対するブロック型蛍光クエンチ切断性プライマーと比較している。サイクル数をＸ軸上に示し、相対蛍光強度をＹ軸上に示す。
【図２９】図２９は、Ｆ／Ｑ構成ブロック型蛍光クエンチ切断性プライマーの使用によって生じた蛍光シグナルを示す増幅プロットであり、１０３塩基合成アンプリコンに対するＱ／Ｆ構成ブロック型蛍光クエンチ切断性プライマーと比較している。サイクル数をＸ軸上に示し、相対蛍光強度をＹ軸上に示す。
【図３０】図３０Ａは、ＳＭＡＤ  ７遺伝子内の一塩基が異なるＤＮＡ鋳型を識別するためのＦ／Ｑ構成ブロック型蛍光クエンチ切断性プライマーの使用によって生じた蛍光シグナルを示す増幅プロットである。ＦＡＭ標識「Ｃ」対立遺伝子プローブを使用したＦＡＭチャネルでの結果を示す。図３０Ｂは、ＳＭＡＤ  ７遺伝子内の一塩基が異なるＤＮＡ鋳型を識別するためのＦ／Ｑ構成ブロック型蛍光クエンチ切断性プライマーの使用によって生じた蛍光シグナルを示す増幅プロットである。ＨＥＸ標識「Ｔ」対立遺伝子プローブを使用したＨＥＸチャネルでの結果を示す。サイクル数をＸ軸上に示し、相対蛍光強度をＹ軸上に示す。
【図３１】図３１は、プライマープローブアッセイにおいて使用した蛍光クエンチ（ＦＱＴ）プライマーのＲＮａｓｅ  Ｈ２切断の反応の概略図である。プライマードメインは、標的核酸に相補的であり、プライマーＤＮＡ合成のために使用される。レポータードメインは、標的に非相補的であり、レポーター色素とクエンチャー基間に配置されたＲＮＡ塩基を含む。レポータードメインは、このドメインが鋳型として使用されるＰＣＲ中に二本鎖形態に変換されるまで一本鎖のままである。二本鎖形態への変換により、レポータードメインがＲＮａｓｅ  Ｈ２に対する基質に変換される；ＲＮａｓｅ  Ｈ２による切断によりレポーターがクエンチャーから分離され、検出可能な事象となる。
【図３２】図３２Ａは、ＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡを使用し、ヒトＤｒｏｓｈａ遺伝子に特異的なプライマーを用いて行われたｑＰＣＲ反応の増幅プロットを示す。未修飾プライマーおよび蛍光クエンチ二重標識プローブ（ＤＬＰ）、５’−ヌクレアーゼアッセイ形式を用いて行われた反応。反応は、表示した鋳型（ＨｅＬａ  ｃＤＮＡ）ありまたはなしで行った。図３２Ｂは、ＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡを使用し、ヒトＤｒｏｓｈａ遺伝子に特異的なプライマーを用いて行われたｑＰＣＲ反応の増幅プロットを示す。蛍光クエンチＦＱＴフォワードプライマーおよび未修飾リバースプライマーをプライマー−プローブアッセイ形式で用いて行われた反応。反応を、表示したＲＮａｓｅ  Ｈ２の添加ありまたはなしで行った。サイクル数をＸ軸上に示し、相対蛍光強度をＹ軸上に示す。
【図３３】図３３は、パーフェクトマッチであるか、または単一のＲＮＡ塩基に対して＋２の位置（リボヌクレオチドの２塩基３’側）にミスマッチを含むものであるかのいずれかである切断性ブロック型プライマーの配列を示す。ＳＮＰ部位  ｒｓ４９３９８２７のＳＭＡＤ７標的配列をプライマーの下側にアラインメントし、このストラテジーによって、プライマーが第１の対立遺伝子とハイブリダイズしたときに単一のミスマッチの存在が、第２の対立遺伝子とハイブリダイズしたときダブルミスマッチの存在がどのようにしてもたらされるかを示す。ＤＮＡ塩基は大文字であり、ＲＮＡ塩基は小文字であり、ＳｐＣ３はスペーサーＣ３修飾である。図３３に、それぞれ、出現順に配列番号２３１から２３２、２３４、２３３、３０３、２３５から２３６、２３８、２３７および３０３を開示している。
【図３４】図３４は、線形プライマー伸長反応においてＤＮＡ合成をプライミングする種々のオリゴヌクレオチド組成物の相対的機能活性を示すグラフである。
【図３５】図３５は、ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性ライゲーションプローブを用いてＤＮＡライゲーションによるシークエンシングのサイクルを行うためのスキームを示す。図３５に「３’−ＡＧＴＣＣＡＧＧＴＣＡ」配列を配列番号：３０４として開示する。
【図３６】図３６は、一組の特定の例示的な合成配列（それぞれ、出現順に配列番号２５３、２５５、２５４、２５６、２５７−２５９、３０５、２５８、３０６および２５８）のＲＮＡ含有切断性ライゲーションプローブのハイブリダイゼーション、ライゲーション、およびその後のＲＮａｓｅ  Ｈ２による切断のスキームを示す。
【図３７】図３７は、合成鋳型に対して切断性ライゲーションプローブを用いて行われたライゲーション反応による産物を分離するために使用したポリアクリルアミドゲルの写真を示し、９量体プローブがアクセプター核酸（ＡＮＡ）に効率的にライゲーションされること、およびライゲーション生成物がＲＮａｓｅ  Ｈ２によって効率的に切断され、一塩基長くなったＡＮＡ種がもたらされることを示す。核酸を蛍光染色を用いてイメージングし、明瞭性のため画像を反転した。
【図３８】図３８は、３つまたは４つのいずれかの５−ニトロインドール残基を含むＲＮＡ含有切断性ライゲーションプローブのハイブリダイゼーションおよびライゲーションのスキームを示す。図３８に、それぞれ、出現順に配列番号２５７、２６０、３０７、２５８、３０８および２５８を開示する。
【図３９】図３９は、合成鋳型に対して切断性ライゲーションプローブを用いて行われたライゲーション反応による産物を分離するために使用したポリアクリルアミドゲルの写真を示し、３つの５−ニトロインドール（３ｘ５ＮＩ）塩基を含む８量体プローブはアクセプター核酸（ＡＮＡ）に効率的にライゲーションされるが、４つの５−ニトロインドール（４ｘ５ＮＩ）塩基を含む８量体プローブはされないことを示す。核酸を蛍光染色を用いてイメージングし、明瞭性のため画像を反転した。
【図４０】図４０は、合成鋳型に対して切断性ライゲーションプローブを用いて行われた反応によるライゲーション生成物を分離するために使用したポリアクリルアミドゲルの写真を示し、５’末端に単一の固定ＤＮＡ塩基、４つのランダム塩基、および３つのユニバーサル塩基５−ニトロインドールを含む８量体プローブは、単一の固定ＤＮＡ塩基によって指向されるとおりに標的に特異的にライゲーションし得ることを示す。
【図４１Ａ】図４１は、従来のオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）のスキームを示す。パネルＡは、２対立遺伝子標的系をインテロゲーションするために必要とされる３種類のオリゴヌクレオチドを示す。パネルＢは、ライゲーション生成物の作製に関与する工程を示す。
【図４１Ｂ】図４１は、従来のオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）のスキームを示す。パネルＡは、２対立遺伝子標的系をインテロゲーションするために必要とされる３種類のオリゴヌクレオチドを示す。パネルＢは、ライゲーション生成物の作製に関与する工程を示す。
【図４２Ａ】図４２は、本発明のＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）のスキームを示す。パネルＡは、２対立遺伝子標的系をインテロゲーションするために必要とされる４種類のオリゴヌクレオチドを示す。パネルＢは、ＲＮａｓｅ  Ｈ２法を用いたライゲーション生成物の作製に関与する工程を示す。パネルＣは、この方法で、どのようにして塩基多型の実体が２回試験されるかを示す。
【図４２Ｂ】図４２は、本発明のＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）のスキームを示す。パネルＡは、２対立遺伝子標的系をインテロゲーションするために必要とされる４種類のオリゴヌクレオチドを示す。パネルＢは、ＲＮａｓｅ  Ｈ２法を用いたライゲーション生成物の作製に関与する工程を示す。パネルＣは、この方法で、どのようにして塩基多型の実体が２回試験されるかを示す。
【図４２Ｃ】図４２は、本発明のＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）のスキームを示す。パネルＡは、２対立遺伝子標的系をインテロゲーションするために必要とされる４種類のオリゴヌクレオチドを示す。パネルＢは、ＲＮａｓｅ  Ｈ２法を用いたライゲーション生成物の作製に関与する工程を示す。パネルＣは、この方法で、どのようにして塩基多型の実体が２回試験されるかを示す。
【図４３−１】図４３は、ライゲーション生成物を検出するための蛍光マイクロビーズおよびＬｕｍｉｎｅｘ  Ｌ１００システムを用いたＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性プローブＯＬＡの各工程中に本発明の実施例で使用した配列（それぞれ、出現順に配列番号２６８、３０９から３１０、３０９、３００、３１０、３０９、３１１、３０９および３１１から３１２）のアラインメントを示す。
【図４３−２】図４３は、ライゲーション生成物を検出するための蛍光マイクロビーズおよびＬｕｍｉｎｅｘ  Ｌ１００システムを用いたＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性プローブＯＬＡの各工程中に本発明の実施例で使用した配列（それぞれ、出現順に配列番号２６８、３０９から３１０、３０９、３００、３１０、３０９、３１１、３０９および３１１から３１２）のアラインメントを示す。
【図４４】図４４は、図４３に示すＲＮａｓｅ  Ｈ２  対立遺伝子識別ＯＬＡで生成した反応生成物の実体を評価するためにＬｕｍｉｎｅｘ  Ｌ１００システムによって検出された生成蛍光シグナルを示す図表である。
【図４５Ａ】図４５Ａは、単一のブロック型切断性プライマーアプローチの概要を示す一組の概略図であり、「フォワード」方向について示す。
【図４５Ｂ】図４５Ｂは、単一のブロック型切断性プライマーアプローチの概要を示す一組の概略図であり、「リバース」方向について示す。
【図４５Ｃ】図４５Ｃは、デュアルブロック型切断性プライマーアプローチの概略を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明により、切断ドメインと３’または５’ブロッキング基とを有する新規な核酸化合物を提供する。このような化合物により、核酸増幅、検出、ライゲーション、シークエンシングおよび合成のための既存の方法に対する改善がもたらされる。また、このような新規な核酸化合物の使用を含む新しいアッセイ形式も提供する。
【００５２】
定義
本発明の理解を補助するため、幾つかの用語を以下に定義する。
【００５３】
用語「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で用いる場合、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含むもの）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含むもの）、およびプリンまたはピリミジン塩基のＮグリコシドである任意の他の型のポリヌクレオチドをいう。用語「核酸」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」間に意図する長さの区別はなく、これらの用語は互換的に用いている。これらの用語は分子の一次構造のみに言及している。従って、これらの用語は、二本鎖および一本鎖のＤＮＡならびに二本鎖および一本鎖のＲＮＡを包含している。また、本発明における使用では、オリゴヌクレオチドは、塩基、糖鎖またはリン酸基主鎖が修飾されているヌクレオチドアナログならびに非プリンまたは非ピリミジンヌクレオチドアナログを含むものであってもよい。
【００５４】
オリゴヌクレオチドは任意の適切な方法によって、例えば、Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１８６２のジエチルホスホルアミダイト法；および米国特許第４，４５８，０６６号明細書の固相支持体法（各々は参照により本明細書に組み込まれる。）などの方法による直接化学合成によって調製され得る。オリゴヌクレオチドと修飾ヌクレオチドのコンジュゲートの合成方法の総説はＧｏｏｄｃｈｉｌｄ，１９９０，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １（３）：１６５−１８７（参照により本明細書に組み込まれる）に示されている。
【００５５】
用語「プライマー」は、本明細書で用いる場合、適切な条件下でＤＮＡ合成の開始点としての機能を果たすことができるオリゴヌクレオチドをいう。かかる条件としては、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が４種類の異なるヌクレオシド三リン酸および伸長のための薬剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在下、適切なバッファー中で適切な温度にて誘導されるものが挙げられる。また、プライマー伸長をヌクレオチド三リン酸の１種類以上の非存在下で行ってもよく、この場合、限定的な長さの伸長産物が生成する。本明細書で用いる場合、用語「プライマー」は、第１のオリゴヌクレオチドが、隣接している位置でハイブリダイズする第２のオリゴヌクレオチドとのライゲーションによって「伸長」されるライゲーション媒介性反応に使用されるオリゴヌクレオチドを包含していることを意図する。従って、用語「プライマー伸長」は、本明細書で用いる場合、ＤＮＡ合成の開始点としてプライマーが使用される個々のヌクレオシド三リン酸の重合と、２種類のオリゴヌクレオチドのライゲーションによる伸長産物の形成の両方をいう。
【００５６】
プライマーは、好ましくは一本鎖ＤＮＡである。プライマーの適切な長さはプライマーの意図される用途に依存するが、典型的には６から５０ヌクレオチド、好ましくは１５から３５ヌクレオチドの範囲である。短鎖プライマー分子は、一般的に、鋳型との充分に安定なハイブリッド複合体を形成するために低温が必要とされる。プライマーは鋳型核酸の厳密な配列を反映している必要はないが、鋳型とハイブリダイズするように充分に相補的でなければならない。所与の標的配列の増幅のための適切なプライマーの設計は当該技術分野でよく知られており、本明細書で挙げた文献に記載されている。
【００５７】
プライマーに、プライマーの検出または固定化を可能にするが、ＤＮＡ合成の開始点としての機能を果たすというプライマーの基本的特性を改変しないさらなる特長を組み込んでもよい。例えば、プライマーの５’末端に、標的核酸にハイブリダイズしないが増幅産物のクローニングまたは検出を容易にするさらなる核酸配列を含有させ得る。ハイブリダイズする鋳型に充分に相補的なプライマー領域を、本明細書においてハイブリダイズ領域と称する。
【００５８】
用語「標的、「標的配列」、「標的領域」および「標的核酸」は、本明細書で用いる場合、同義的であり、核酸の増幅対象、シークエンシング対象または検出対象の領域または配列をいう。
【００５９】
用語「ハイブリダイゼーション」は、本明細書で用いる場合、２本の一本鎖核酸の相補的塩基対合による二本鎖構造の形成をいう。ハイブリダイゼーションは、充分に相補的な核酸鎖間または含まれるミスマッチ領域が微量である「実質的に相補的な」核酸鎖間で起こり得る。充分に相補的な核酸鎖のハイブリダイゼーションが強く好まれる条件は「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」または「配列特異的ハイブリダイゼーション条件」と称される。実質的に相補的な配列の安定な二本鎖は、低ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で得られる場合もあり得；許容されるミスマッチの度合いは、ハイブリダイゼーション条件の適切な調整によって制御され得る。核酸技術分野の当業者は二本鎖の安定性を、幾つかの可変量、例えば、オリゴヌクレオチドの長さおよび塩基対組成、イオン強度、ならびにミスマッチ塩基対の発生率などを考慮し、当該技術分野で手引き（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｗｅｔｍｕｒ，１９９１，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６（３／４）：２２７−２５９；およびＯｗｃｚａｒｚｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４７：５３３６−５３５３（これらは参照により本明細書に組み込まれる。）参照）に従って経験的に判定することができよう。
【００６０】
用語「増幅反応」は、鋳型核酸配列コピーの増大がもたらされる、または鋳型核酸の転写がもたらされる任意の化学反応、例えば酵素反応をいう。増幅反応としては、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えば、リアルタイムＰＣＲ（米国特許第４，６８３，１９５号明細書および同第４，６８３，２０２号明細書；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ，１９９０）参照）ならびにリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｂａｒａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，４９４，８１０号明細書参照）が挙げられる。例示的な「増幅反応条件」または「増幅条件」は、典型的には２工程サイクルまたは３工程サイクルのいずれかを含むものである。２工程サイクルは、高温変性工程、続いてハイブリダイゼーション／伸長（またはライゲーション）工程を有する。３工程サイクルは、変性工程、続いてハイブリダイゼーション工程、続いて別途の伸長またはライゲーション工程を含む。
【００６１】
本明細書で用いる場合、「ポリメラーゼ」は、ヌクレオチドの重合を触媒する酵素をいう。一般的に、該酵素は合成を、核酸鋳型配列にアニーリングしたプライマーの３’末端から開始させる。「ＤＮＡポリメラーゼ」はデオキシリボヌクレオチドの重合を触媒する。既知のＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ，１０８：１）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ  Ｉ（Ｌｅｃｏｍｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｕｂｌｅｄａｙ，１９８３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：７５０５）、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１１２）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ  １９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：７６６１）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｅｎｅｓｈ  ａｎｄ  ＭｃＧｏｗａｎ，１９７７，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ４７５：３２）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼとも称される、Ｃａｒｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９：４１９３）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｉａｚ  ａｎｄ  Ｓａｂｉｎｏ，１９９８  Ｂｒａｚ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ，３１：１２３９）、テルムス・アクウァーティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｏｒｉｏｌ，１２７：１５５０）、ピロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５０４）、ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ（国際公開第０１３２８８７号パンフレット）、およびピロコッカス属ＧＢ−Ｄ（ＰＧＢ−Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｊｕｎｃｏｓａ−Ｇｉｎｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１６：８２０）が挙げられる。上記の任意の酵素のポリメラーゼ活性は当該技術分野でよく知られた手段によって測定され得る。
【００６２】
本明細書で用いる場合、プライマーは、増幅反応において充分にストリンジェントな条件下で使用したとき、該プライマーが主として標的核酸にハイブリダイズする場合、標的配列に「特異的」である。典型的には、プライマーは、該プライマー−標的間の二本鎖の安定性が試料においてみられる該プライマーと任意の他の配列間で形成される二本鎖の安定性よりも大きい場合、標的配列に特異的である。当業者には、種々の要素、例えば、塩条件ならびにプライマーの塩基組成およびミスマッチの位置がプライマーの特異性に影響を及ぼすこと、および多くの場合で常套的な実験によるプライマーの特異性の確認が必要となることが認識されよう。プライマーが標的配列とのみ安定な二本鎖を形成し得るハイブリダイゼーション条件が選択され得る。従って、適切にストリンジェントな増幅条件での標的特異的プライマーの使用により、標的プライマー結合部位を含む標的配列の選択的な増幅が可能になる。
【００６３】
用語「非特異的増幅」は、本明細書で用いる場合、標的配列以外の核酸配列の増幅をいい、これは、プライマーが標的配列以外の配列にハイブリダイズし、次いでプライマー伸長の基質としての機能を果たすことにより起こる。プライマーの非標的配列とのハイブリダイゼーションは「非特異的ハイブリダイゼーション」と称され、特に、低温、低ストリンジェンシー、予備増幅条件の際、または試料中に一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の場合のような真の標的と非常に密接に関連している配列を有するバリアント対立遺伝子が存在する状況で起こりやすい。
【００６４】
用語「３’−ミスマッチ識別」は、充分に相補的な配列をミスマッチ含有（ほぼ相補的な）配列と識別するＤＮＡポリメラーゼの特性をいい、この場合、伸長される核酸（例えば、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチド）は、該核酸がハイブリダイズする鋳型と比較すると該核酸の３’末端にミスマッチを有する。一部の実施形態では、伸長される核酸は、充分に相補的な配列と比べて３’末端にミスマッチを含む。
【００６５】
用語「３’−ミスマッチ識別アッセイ」は、それぞれの３’末端またはこの付近に異なる塩基組成を有する１つまたはこれ以上の（ｏｎｅ  ｏｆ  ｍｏｒｅ）ヌクレオチド残基が存在すること以外は実質的に同一の配列を有する２種類のプライマーを用いて標的ＤＮＡ配列をインテロゲーションしたとき、標的ＤＮＡ配列の増幅の特異性の改善の存在（ｐｒｅｓｅｎｔ）を見分けるためのアッセイをいう。例えば、標的ＤＮＡ配列と完璧な相補性を有する３’末端配列を有する第１のプライマーは３’−マッチプライマーとみなし、標的ＤＮＡ配列に非相補性の少なくとも１つのヌクレオチド塩基を有する３’末端配列を有する第２のプライマーは３’−ミスマッチプライマーとみなす。３’−ミスマッチ識別アッセイの一例を本実施例の多くに、例えばとりわけ実施例３６および３７に示している。
【００６６】
用語「プライマーダイマー」は、本明細書で用いる場合、鋳型非依存性の非特異的増幅産物をいい、これは、別のプライマーが鋳型としての機能を果たすプライマー伸長により生じると考えられる。プライマーダイマーは、多くの場合、２つのプライマーのコンカテマー、即ちダイマーであると思われるが、２つより多くのプライマーのコンカテマーも存在する。用語「プライマーダイマー」は、本明細書において一般的に鋳型非依存性の非特異的増幅産物を包含するために用いている。
【００６７】
用語「反応混合物」は、本明細書で用いる場合、所与の反応を行うのに必要な試薬を含む溶液をいう。「増幅反応混合物」は、増幅反応を行うのに必要な試薬を含む溶液をいい、典型的には、オリゴヌクレオチドプライマーとＤＮＡポリメラーゼまたはリガーゼを適切なバッファー中に含むものである。「ＰＣＲ反応混合物」は、典型的には、オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ（最も典型的には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ）、ｄＮＴＰおよび二価の金属カチオンを適切なバッファー中に含むものである。反応混合物は、反応が可能であるのに必要なすべての試薬が含まれている場合は完全と称され、必要な試薬の一部しか含まれていない場合は不完全と称される。当業者には、簡便性、保存安定性の理由のため、または成分濃度の用途依存的調整を可能にするために、反応成分は、各々が全成分の一部を含むものである別個の溶液として常套的に保存されること、および反応成分を反応前に合わせて完全な反応混合物となることが理解されよう。さらに、当業者には、反応成分は商品化のために別個にパッケージングされること、および有用な市販のキットは、本発明のブロック型プライマーを含む反応成分の任意の一部を含むものであってもよいことが理解されよう。
【００６８】
本発明の解釈上、用語「非活性化型」または「不活化（される）」は、本明細書で用いる場合、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼのいずれかが意図する目的のために該オリゴヌクレオチドと相互作用することができないため、プライマー伸長反応またはライゲーション反応に関与できないことをいう。オリゴヌクレオチドがプライマーである一部の実施形態では、非活性化型状態は、プライマー伸長が抑制されるように該プライマーが３’末端またはこの付近でブロックされるため起こる。特定の基をプライマーの３’末端またはこの付近に結合させた場合、ＤＮＡポリメラーゼはプライマーに結合することができず、伸長は起こり得ない。しかしながら、非活性化型プライマーは、実質的に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズできる。
【００６９】
本発明の解釈上、用語「活性化（される）」は、本明細書で用いる場合、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼとの反応に関与することができることをいう。プライマーまたは他のオリゴヌクレオチドは、実質的に相補核酸配列にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼと相互作用することができるように切断されて機能性の３’末端または５’末端が生じた後、活性化状態になる。例えば、オリゴヌクレオチドがプライマーである場合、プライマーは鋳型にハイブリダイズし、３’−ブロッキング基は該プライマーから例えば切断酵素によって除去され得、この結果、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーの３’末端に結合してプライマー伸長を促進させることができるようになる。
【００７０】
用語「切断ドメイン」または「切断性ドメイン」は、本明細書で用いる場合、同義的であり、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチドの５’末端と３’末端間に存在し、該プライマーまたは他のオリゴヌクレオチドを切断する切断化合物、例えば切断酵素によって認識される領域をいう。本発明の解釈上、切断ドメインは、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチドが相補核酸配列にハイブリダイズした場合のみ切断されるが一本鎖である場合は切断されないように設計される。切断ドメインまたはこれにフランキングする配列は、ａ）ポリメラーゼもしくはリガーゼによるプライマーもしくは他のオリゴヌクレオチドの伸長もしくはライゲーションを妨げる、もしくは阻害する、ｂ）バリアント対立遺伝子を検出するための識別を向上させる、またはｃ）所望のものでない切断反応を抑制する部分を含むものであり得る。１つ以上のかかる部分を切断ドメインまたはこれにフランキングする配列に含めてもよい。
【００７１】
用語「ＲＮａｓｅ  Ｈ切断ドメイン」は、本明細書で用いる場合、１つ以上のリボ核酸残基またはＲＮａｓｅ  Ｈに対する基質を供給する代替的なアナログを含む型の切断ドメインである。ＲＮａｓｅ  Ｈ切断ドメインは、プライマーまたはオリゴヌクレオチド内のどこに位置してもよく、好ましくは、該分子の３’末端もしくは５’末端またはこの付近に位置する。
【００７２】
「ＲＮａｓｅ  Ｈ１切断ドメイン」は、一般的に少なくとも３つの残基を含むものである。「ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断ドメイン」は、１つのＲＮＡ残基、連続的に連結しているＲＮＡ残基の配列またはＤＮＡ残基もしくは他の化学基によって分離されたＲＮＡ残基の配列を含むものであり得る。一実施形態において、ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断ドメインは２’−フルオロヌクレオシド残基である。より好ましい一実施形態では、ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性ドメインは隣接している２つの２’−フルオロ残基である。
【００７３】
用語「切断化合物」または「切断剤」は、本明細書で用いる場合、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチド内の切断ドメインを認識し、該切断ドメインの存在に基づいて該オリゴヌクレオチドを選択的に切断することができる任意の化合物をいう。本発明に使用される切断化合物は、実質的に相補核酸配列にハイブリダイズした場合は切断ドメインを含むプライマーまたは他のオリゴヌクレオチドのみを選択的に切断するが、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチドが一本鎖である場合は切断しないものである。切断化合物は、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチドを、切断ドメイン内で、または切断ドメインに隣接して切断する。用語「隣接して」は、本明細書で用いる場合、切断化合物がプライマーまたは他のオリゴヌクレオチドを切断ドメインの５’末端または３’末端のいずれかで切断することを意味する。本発明において好ましい切断反応では、５’−リン酸基と３’−ＯＨ基がもたらされる。
【００７４】
好ましい一実施形態では、切断化合物は「切断酵素」である。切断酵素は、プライマーまたは他のヌクレオチドが実質的に相補核酸配列にハイブリダイズすると切断性ドメインを認識し得るが、相補核酸配列を切断しない（即ち、二本鎖において単一の鎖の破壊をもたらす）タンパク質またはリボザイムである。また、切断酵素は、切断ドメインを含むプライマーまたは他のオリゴヌクレオチドが一本鎖である場合も、これを切断しない。切断酵素の例はＲＮａｓｅ  Ｈ酵素および他のニッキング酵素である。
【００７５】
用語「ニッキング」は、本明細書で用いる場合、完全にまたは一部が二本鎖の核酸の二本鎖部分の一方の鎖のみの切断をいう。核酸がニックされる位置は「ニッキング部位」（ＮＳ）と称される。「ニッキング剤」（ＮＡ）は、一部または完全に二本鎖の核酸をニックする薬剤である。これは、酵素または任意の他の化学物質の化合物もしくは組成物であり得る。一部の特定の実施形態では、ニッキング剤は、完全にまたは一部が二本鎖の核酸の特定のヌクレオチド配列を認識し、該完全にまたは一部が二本鎖の核酸の一方の鎖のみを、認識配列の位置に対して特定の位置（即ち、ＮＳ）で切断するものであり得る。かかるニッキング剤（「配列特異的ニッキング剤」と称される。）としては、限定されないが、ニッキングエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ）が挙げられる。
【００７６】
「ニッキングエンドヌクレアーゼ」（ＮＥ）は、本明細書で用いる場合、従って、完全にまたは一部が二本鎖の核酸分子のヌクレオチド配列を認識し、該核酸分子の一方の鎖のみを認識配列に対して特定の位置で切断するエンドヌクレアーゼをいう。かかる場合では、認識部位から切断点までの配列全体が「切断ドメイン」を構成する。
【００７７】
用語「ブロッキング基」は、本明細書で用いる場合、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチドに増幅反応が起こらないように結合される化学部分をいう。例えば、プライマー伸長および／またはＤＮＡライゲーションが起こらない。ブロッキング基がプライマーまたは他のオリゴヌクレオチドから除去されたら、該オリゴヌクレオチドは、設計されたアッセイ（ＰＣＲ、ライゲーション、シークエンシングなど）に関与することができる。従って、「ブロッキング基」は、ポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼによる認識を阻害する任意の化学部分であり得る。ブロッキング基は切断ドメイン内に組み込んでもよいが、一般的には切断ドメインの５’側または３’側のいずれかに位置する。ブロッキング基は１つより多くの化学部分で構成されていてもよい。本発明において、「ブロッキング基」は典型的には、オリゴヌクレオチドがこの標的配列にハイブリダイゼーションした後に除去される。
【００７８】
用語「蛍光発生プローブ」は、ａ）フルオロフォアおよびクエンチャーが結合されており、場合により、副溝結合部が結合されているオリゴヌクレオチド、またはｂ）ＤＮＡ結合試薬、例えばＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ色素のいずれかをいう。
【００７９】
用語「蛍光標識」または「フルオロフォア」は、約３５０から９００ｎｍの最大蛍光放射を有する化合物をいう。多種多様なフルオロフォアが使用され得、限定されないが：５−ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセインとも称される；スピロ（イソベンゾフラン−１（３Ｈ）、９’−（９Ｈ）キサンテン）−５−カルボン酸、３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−６−カルボキシフルオレセインとも称される。）；５−ヘキサクロロ−フルオレセイン；（［４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロ−（３’，６’−ジピバロイル−フルオレセイニル）−６−カルボン酸］）；６−ヘキサクロロ−フルオレセイン；（［４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロ−（３’，６’−ジピバロイルフルオレセイニル）−５−カルボン酸］）；５−テトラクロロ−フルオレセイン；（［４，７，２’，７’−テトラ−クロロ−（３’，６’−ジピバロイルフルオレセイニル）−５−カルボン酸］）；６−テトラクロロ−フルオレセイン；（［４，７，２’，７’−テトラクロロ−（３’，６’−ジピバロイルフルオレセイニル）−６−カルボン酸］）；５−ＴＡＭＲＡ（５−カルボキシテトラメチルローダミン）；キサンチリウム、９−（２，４−ジカルボキシフェニル）−３，６−ビス（ジメチル−アミノ）；６−ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）；９−（２，５−ジカルボキシフェニル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）；ＥＤＡＮＳ（５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸）；１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ（５−（（（（２−ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸）；Ｃｙ５（インドジカルボシアニン−５）；Ｃｙ３（インド−ジカルボシアニン−３）；およびＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（２，６−ジブロモ−４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸）；Ｑｕａｓａｒ（Ｒ）−６７０色素（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ｃａｌ  Ｆｌｕｏｒ（Ｒ）Ｏｒａｎｇｅ色素（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ｒｏｘ色素；Ｍａｘ色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ならびにこの適切な誘導体が挙げられる。
【００８０】
本明細書で用いる場合、用語「クエンチャー」は、蛍光ドナーに結合または近接すると該ドナーからの放射を低減させ得る分子または化合物の一部分をいう。クエンチングは、幾つかの任意の機構によって、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動、光誘導型電子移動、項間交差の常磁性促進、デクスター交換結合、および励起子結合、例えば暗複合体（ｄａｒｋ  ｃｏｍｐｌｅｘ）の形成によって行われ得る。蛍光は、フルオロフォアによって放射された蛍光がクエンチャーの非存在下での蛍光と比べて少なくとも１０％、例えば、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．９％またはそれ以上低減されている場合、「クエンチ」されている。幾つかの市販のクエンチャーが当該技術分野で知られており、限定されないが、ＤＡＢＣＹＬ、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ（商標）クエンチャー（ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２およびＢＨＱ−３）、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（Ｒ）ＦＱおよびＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（Ｒ）ＲＱが挙げられる。これらはいわゆるダーククエンチャーである。これらは内在性の蛍光を有しておらず、事実上、内因的に蛍光性である他のクエンチャー（ＴＡＭＲＡなど）で見られるバックグラウンドの問題が解消される。
【００８１】
用語「ライゲーション」は、本明細書で用いる場合、２つのポリヌクレオチド末端の共有結合をいう。種々の実施形態において、ライゲーションは、第１のポリヌクレオチド（アクセプター）の３’末端と第２のポリヌクレオチド（ドナー）の５’末端との共有結合を伴う。ライゲーションにより、ポリヌクレオチド末端間にホスホジエステル結合の形成がもたらされる。種々の実施形態において、ライゲーションは、ポリヌクレオチド末端同士の共有結合をもたらす任意の酵素、化学物質または工程によって媒介され得る。一部の特定の実施形態では、ライゲーションはリガーゼ酵素によって媒介される。
【００８２】
本明細書で用いる場合、「リガーゼ」は、第１のポリヌクレオチドの３’ヒドロキシル基を第２のポリヌクレオチドの５’リン酸基に共有結合させ得る酵素をいう。リガーゼの例としては、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼなどが挙げられる。
【００８３】
ライゲーション反応はＤＮＡ増幅法において、例えば「リガーゼ連鎖反応」（ＬＣＲ）（「リガーゼ  増幅反応」（ＬＡＲ）とも称される、Ｂａｒａｎｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８８：１８９（１９９１）；およびＷｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０（１９８９）（参照により本明細書に組み込まれる。）参照）において使用され得る。ＬＣＲでは、隣接している２種類のオリゴヌクレオチド（これは、独自に標的ＤＮＡの一方の鎖にハイブリダイズする。）と相補的な一組の隣接しているオリゴヌクレオチド（これは、反対側の鎖にハイブリダイズする。）の４種類のオリゴヌクレオチドを混合し、ＤＮＡリガーゼをこの混合物に添加する。標的配列の存在下では、ＤＮＡリガーゼは、ハイブリダイズした分子の組の各々を共有結合させる。重要なことに、ＬＣＲでは、２種類のオリゴヌクレオチドはギャップがない配列と塩基対合した場合のみ互いにライゲーションされる。変性、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの反復サイクルによりＤＮＡの短鎖セグメントが増幅される。隣接しているオリゴヌクレオチド間の連結部におけるミスマッチはライゲーションを阻害する。他のオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイと同様、この特性により、ＬＣＲを、ＳＮＰなどのバリアント対立遺伝子間の識別に使用することが可能になる。また、ＬＣＲは、一塩基変化の検出の向上を得るためにＰＣＲと併用して使用されている。Ｓｅｇｅｖ、国際公開第９００１０６９号パンフレット（１９９０）参照。
【００８４】
本発明の新規なオリゴヌクレオチドおよび化合物．
一実施形態において、本発明の新規なオリゴヌクレオチドは、適用例を数例挙げると例えばＰＣＲ、ＤＮＡシークエンシングおよび多項式増幅の場合のようなＤＮＡ複製のためのプライマーである。この実施形態では、プライマーは、ＤＮＡ複製（即ち、プライマー伸長）をブロックする不活性型構成と、ＤＮＡ複製を進行させる活性型構成を有する。プライマーの不活性型構成は、プライマーが一本鎖であるか、またはプライマーが目的のＤＮＡ配列にハイブリダイズし、プライマーの３’末端もしくはこの付近に連結された化学部分によってプライマー伸長がブロックされたままであるかのいずれかの場合に存在する。プライマーの活性型構成は、プライマーが目的の核酸配列にハイブリダイズし、続いて、ＲＮａｓｅ  Ｈまたは他の切断剤による作用を受けてブロッキング基が除去され、酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）がプライマー伸長を触媒することが可能になった場合に存在する。
【００８５】
伸長を抑制するためにオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）の３’末端またはこの付近に位置し得る幾つかのブロッキング基が当該技術分野で知られている。プライマーまたは他のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成の開始を抑制または阻害するために３’末端ヌクレオチドが、例えば、３’デオキシリボヌクレオチド残基（例えば、コルジセピン）、２’，３’−ジデオキシリボヌクレオチド残基、非ヌクレオチド結合またはアルカン−ジオール修飾（米国特許第５，５５４，５１６号明細書）の付加によって修飾され得る。また、プライマー伸長を阻害またはブロックするために使用され得るアルカンジオール修飾は、Ｗｉｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８（８）：２０６５）およびＡｒｎｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，（米国特許第６，０３１，０９１号明細書）にも記載されている。適切なブロッキング基のさらなる例としては、３’ヒドロキシル置換（例えば、３’−リン酸、３’−三リン酸または３’−リン酸ジエステルのアルコール、例えば３−ヒドロキシプロピルでの）、末端ＲＮＡ塩基の２’３’環状リン酸、２’ヒドロキシル置換（例えば、リン酸または立体的にバルキーな基、例えばトリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）またはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ））が挙げられる。オリゴヌクレオチドの３’末端の２’−アルキルシリル基、例えばＴＩＰＳおよびＴＢＤＭＳでの置換は、Ｌａｉｋｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許出願第１１／６８６，８９４号明細書（これは参照により本明細書に組み込まれる。）に記載されている。また、バルキー置換基をオリゴヌクレオチドの３’末端残基の塩基に組み込み、プライマー伸長をブロックしてもよい。
【００８６】
また、プライマー伸長を阻害するためのブロッキング基を上流に、即ち３’末端残基の５’側に位置してもよい。ポリメラーゼによる結合を障害する立体的にバルキーな置換基は、３’末端の上流の残基の塩基、糖鎖またはリン酸基に組み込まれ得る。かかる置換基としては、バルキーアルキル基（ｔ−ブチル、トリイソプロピルなど）ならびにポリ芳香族化合物（例えば、フルオロフォアおよびクエンチャー）が挙げられ、３’末端から１から約１０残基に位置し得る。あるいは、Ｃ３スペーサーなどの無塩基残基がこのような位置に、プライマー伸長をブロックするために組み込まれ得る。かかる一実施形態では、隣接している２つのＣ３スペーサーが使用されている（実施例２７および２８参照）。
【００８７】
ＰＣＲの場合、３’末端残基の上流のブロック部分は、２つの機能を果たし得る：１）プライマー伸長を阻害し得る、および２）伸長産物がリバースプライマーからの合成によってコピーされる場合、プライマーがＤＮＡ合成の鋳型としての機能を果たすことをブロックし得る。後者は、プライマー伸長が起こり得る場合であってもＰＣＲがブロックされるのに充分なものである。３’末端残基の上流に位置するＣ３スペーサーはこの様式で機能を果たし得る（実施例２６および２７参照）。
【００８８】
また、ブロッキング基として使用される修飾を、標的核酸配列に非相補的なプライミング配列の３’側の領域内に存在させてもよい。
【００８９】
オリゴヌクレオチドは、さらに、プライマー伸長を阻害するために使用されるブロッキング基の上流に位置する切断ドメインを含む。ＲＮａｓｅ  Ｈ切断ドメインが好ましい。単一のＲＮＡ残基または１つ以上の代替的なヌクレオシドでのＲＮＡ塩基の置換えを含むＲＮａｓｅ  Ｈ２切断ドメインが最も好ましい。
【００９０】
一実施形態において、ＲＮａｓｅ  Ｈ２は、単一の２’−フルオロ残基を含む二本鎖を切断するために使用され得る。切断は、２’−フルオロ残基の５’側で起こる。好ましい一実施形態では、隣接している２つの２’−フルオロ残基を含むＲＮａｓｅ  Ｈ２切断ドメインが使用される（実施例６参照）。連続する２つの２’−フルオロ修飾が存在する場合、活性が向上する。この実施形態では、切断は、２’−フルオロ残基間で優先的に起こる。未修飾のＲＮＡ残基を含むオリゴヌクレオチドとは異なり、２’−フルオロ基を有するオリゴヌクレオチドは一本鎖リボヌクレアーゼによって切断されず、水触媒性切断に抵抗性であり、高温で完全に安定である。また、切断の向上は、２’−フルオロ修飾ＲＮＡ残基を２’ＬＮＡ  修飾ＲＮＡ残基とともに使用した場合にも観察されている。２’−フルオロ含有オリゴヌクレオチドは特定の用途において、ＲＮＡ含有オリゴヌクレオチドと比べ、オリゴヌクレオチドと標的配列間のミスマッチに関してより大きな識別をもたらすことにおいてさらに好都合であることがわかった。
【００９１】
切断がａｎ  ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素によって媒介される本発明において使用され得るＲＮＡ残基の代替物としては、限定されないが、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡヌクレオシド、好ましくは、２’−Ｏ−メチルＲＮＡヌクレオシド、２’−フルオロヌクレオシド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２’−ＥＮＡ残基（エチレン核酸）、２’−アルキルヌクレオシド、２’−アミノヌクレオシドおよび２’−チオヌクレオシドが挙げられる。ＲＮａｓｅ  Ｈ切断ドメインは、このような修飾残基の１つ以上を単独で含むものであってもＲＮＡ塩基との組合せで含むものであってもよい。また、より大きな性能を得るためにＤＮＡ塩基および無塩基残基（Ｃ３スペーサーなど）を含めてもよい。
【００９２】
切断剤がＲＮａｓｅ  Ｈ１  酵素である場合、少なくとも３つのＲＮＡ残基の連続配列が好ましい。一般的に４つのＲＮＡ残基の連続配列で最大活性がもたらされる。切断剤がＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素である場合、単一のＲＮＡ残基または２つの隣接している２’−フルオロ残基が好ましい。
【００９３】
修飾残基をＲＮａｓｅ  Ｈ切断ドメイン内に組み込むことの目的の１つは、水触媒性加水分解または一本鎖リボヌクレアーゼによる切断に起因するプライマーまたはプローブのバックグラウンド切断を抑制することである。２’−ヒドロキシル基を、ＲＮＡ残基の隣接しているリン酸基が攻撃され得ない置換基で置き換えることによってこの目的が達成される。このアプローチの例としては、上記の２’置換ヌクレオシド、例えば２’−フルオロおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオシドの使用が挙げられる。これは、切断がＲＮａｓｅ  Ｈ２によって媒介され、切断ドメイン内に単一のＲＮＡ残基が存在する場合、特に好都合である。図３に示すように、この場合、一本鎖リボヌクレアーゼによる切断または水触媒性加水分解はＲＮａｓｅ  Ｈ２による切断と異なる位置で起こる。
【００９４】
ＲＮＡ残基の一本鎖リボヌクレアーゼによる切断および水触媒性加水分解を抑制するために使用され得る修飾の他の例としては、隣接している該残基（ＲＮＡ塩基の３’側）の５’酸素原子のアミノ基、チオール基またはメチレン基（ホスホネート結合）での置換が挙げられる。あるいは、隣接している該残基の５’炭素上の水素原子の一方または両方がメチル基などのよりバルキーな置換基で、リボヌクレオチド残基のバックグラウンド切断を抑制するために置き換えられ得る。別のかかる実施形態では、ＲＮＡ残基の３’側のリン酸基がホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはボロネート結合で置き換えられ得る。ホスホロチオエートの場合、Ｓ立体異性体が好ましい。また、このような種々の修飾の組合せも使用され得る。
【００９５】
一本鎖リボヌクレアーゼまたは水触媒性加水分解によるＲＮＡ残基でのバックグラウンド切断によりブロックされた３’末端（図３参照）がもたらされ、これはＤＮＡ合成のためのプライマーとして機能を果たすことができないことに注意されたい。これにより、かかる切断が起こったとしても偽陽性結果の発生が緩和される。
【００９６】
切断ドメイン内にブロッキング基を含めてもよいが、切断がブロッキング基の５’側で起こり、遊離の３’−ＯＨが生成するものとする。しかしながら一般的には、切断ドメインとブロッキング基は１から約１５塩基離す。切断が起こった後、切断部位の３’側のブロッキング基を含むプライマー部分が鋳型から解離し、機能性の３’−ヒドロキシル基が露出し、ポリメラーゼ酵素による作用を受けることができる。切断部位とブロッキング基間の最適な距離は切断剤およびブロッキング基の性質に依存する。オリゴヌクレオチドの切断が単一のＲＮＡ残基においてＲＮａｓｅ  Ｈ２によって媒介される場合、切断部位とブロッキング基間は３から約８塩基の距離が好ましい。ブロッキング基が立体的に小さい場合、例えば、下記の構造
【００９７】
【化２】
2016510601.tif 000003
の場合のような３’末端ヌクレオチドにおけるホスホジエステルの場合、切断部位は３’末端から５塩基であることが一般的に最適である。ブロッキング基がより大きい場合、切断部位をさらに遠くに位置することが好都合である。
【００９８】
好ましい一実施形態では、好熱菌由来ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素がオリゴヌクレオチドの切断に使用される。なおより好ましい一実施形態では、室温では高温よりも活性が低い好熱菌由来ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素が使用される。これにより、ホットスタート型の反応を、ＰＣＲおよび他のプライマー伸長アッセイにおいて本発明のブロック型プライマーを用いて、実際にホットスタート、即ち可逆的に不活化されるＤＮＡポリメラーゼを必要とすることなく行うことが可能になる。標準的なあまり高価でないＴａｑポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼポリメラーゼを、ずっとより高価なホットスタートバージョンの酵素の代わりに使用することができる。さらに、種々の用途では、代替的なＤＮＡポリメラーゼが好ましい場合があり得る。ＲＮａｓｅ  Ｈをアッセイのホットスタート成分として使用すると、異なる各ＤＮＡポリメラーゼの可逆的に不活化される新たなアナログを開発する必要性がなくなる。
【００９９】
該酵素のホットスタート特性はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｉｉ  ＲＮａｓｅ  Ｈ２の場合のようにタンパク質に内因性であってもよい（実施例４参照）。あるいは、該酵素は、例えば、マレイン酸無水物の類似体（無水シトラコン（ｃｉｔｒｏｃｏｎｉｃ）酸など）を用いた化学修飾によって可逆的に不活化されるものであってもよい。このような化合物は、タンパク質のアミノ基と反応し、高温で放出され、活性が回復する。また別の実施形態では、ＲＮａｓｅ  Ｈに対する抗体が使用され得、該抗体は該酵素をブロックするものであり、高温で変性される。
【０１００】
また別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ニッキング剤、例えばニッキング酵素に特異的な配列によって認識されて切断される切断ドメインを有する。また、ニッキング剤は、オリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）を修飾核酸または修飾核酸群において切断するように設計され得る。この実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的核酸とハイブリダイゼーションするとニッキング剤によって認識されるように設計されており、オリゴヌクレオチド／標的二本鎖のニッキングは、ブロッキング基を除去し、オリゴヌクレオチドの伸長を可能にするために使用され得る。ニッキング部位（ＮＳ）は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの３’末端またはこの付近に、具体的にはオリゴヌクレオチドの３’末端から１から約１５塩基に位置する。
【０１０１】
例示的なニッキング剤としては、限定されないが、特定の配列を認識する一本鎖ニッキング制限エンドヌクレアーゼ、例えばＮ．ＢｓｔＮＢＩ；または修復酵素、例えばＭｕｔ  Ｈ、ＭｕｔＹ（ＡＰエンドヌクレアーゼとの併用で）、またはウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＡＰ  ＬｙａｓｅおよびＡＰエンドヌクレアーゼとの併用で）；ならびにバクテリオファージｆｌ遺伝子ＩＩタンパク質が挙げられる。
【０１０２】
本発明のブロック型プライマーでは、標的とのハイブリダイゼーションの後、プライマー伸長の前に切断を要することにより非特異的な反応が最小限になる。プライマーが関連配列に誤ってハイブリダイズした場合、特に、切断部位またはこの付近に存在するミスマッチがある場合、プライマーの切断が阻害される。これにより、かかる位置における偽プライミングの頻度が低下し、これにより反応の特異性が増大する。ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｉｉ）ＩＩ型ＲＮａｓｅ  Ｈおよび本発明に使用される他のＲＮａｓｅ  Ｈ酵素では、一部の切断は、切断部位にミスマッチがある場合であっても起こることに注意されたい。反応条件、特に、ＲＮａｓｅ  Ｈの濃度ならびに各サイクルにおけるハイブリダイゼーションおよび伸長に許容される時間は、プライマーが真の標的にハイブリダイズした場合とミスマッチがある場合での切断効率の差が最大限になるように最適化され得る。これにより、本発明の方法をＳＮＰを含むバリアント対立遺伝子間の識別のために非常に有効に使用することが可能になる（実施例１２から１４、２２から２５参照）。
【０１０３】
上記のように、ＲＮＡ残基をオリゴヌクレオチドに組み込んだ場合、切断されたプライマーの３’末端に形成される２’，３’環状リン酸基（または２’もしくは３’リン酸基）によってプライマー伸長がブロックされるため、プライマーのバックグラウンド切断によって偽陽性プライミングはもたらされない。ＤＮＡポリメラーゼの基質の形成のためには、自由に到達可能な３’ＯＨ基が必要とされる。また、ＰＣＲで起こる一般的な副反応であるプライマーダイマーの形成も本発明の３’ブロック型プライマーを用いて阻害することができる。これにより、ＰＣＲにおけるより大きな度合いでの多重化（例えば、ＤＮＡ検出／増幅アッセイの場合の多種類の標的配列の検出）が可能になる。
【０１０４】
なんら理論に拘束されないが、ミスマッチがある場合、おそらくＲＮａｓｅ  Ｈ２によって触媒された非定型の切断が低頻度でＲＮＡ残基の３’側で起こり、遊離３’−ＯＨが生成してプライマー伸長がもたらされ得ることが観察されている。これは、反応の特異性の低下をもたらし得る。この効果を緩和するため、ヌクレアーゼ抵抗性残基がプライマー内のＲＮＡ残基の３’側に組み込まれ得る（実施例２２、２５および２８参照）。かかる基としては、限定されないが、１つ以上のホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネートおよび無塩基残基、例えばＣ３スペーサーが挙げられる。
【０１０５】
また、ＲＮＡ残基の５’側および３’側の両方において、本発明の方法でのバリアント対立遺伝子の識別および検出を向上させるために他の置換を使用してもよい。かかる置換としては、限定されないが、２’−Ｏ−メチルＲＮＡおよび二次ミスマッチが挙げられる（実施例２３参照）。
【０１０６】
プライマー伸長を抑制するブロッキング基の性質はあまり重要でない。これは、３’末端残基またはこの上流に位置し得る。標識基をブロッキング基に組み込んでもよく、オリゴヌクレオチドプライマーの３’セグメント上の他の位置に結合してもよく、これは、切断が起こった後、鋳型から解離する。かかる標識基としては、限定されないが、フルオロフォア、クエンチャー、ビオチン、ハプテン、例えばジゴキシゲニン、タンパク質、例えば酵素および抗体、質量タグ（これは、切断断片の質量を質量分析による検出のために改変させるものである。）、ならびに放射性標識、例えば１４Ｃ、３Ｈ、３５Ｓ、３２Ｐおよび３３Ｐが挙げられる。また、このような標識基をプライマーの切断部位の５’側に結合してもよく、この場合、標識基は伸長産物内に組み込まれる。
【０１０７】
一実施形態において、オリゴヌクレオチドの３’末端またはこの付近のブロッキング基は蛍光性部分であり得る。この場合、蛍光分子の放出がプライマー伸長反応の進行のモニタリングに使用され得る。これは、オリゴヌクレオチドが切断部位の５’側にクエンチャー部分も含有している場合、助長される。反応中のオリゴヌクレオチドの切断によってフルオロフォアがクエンチャーから分離し、蛍光の増大がもたらされる。また、クエンチャー自体がフルオロフォアである場合（Ｔａｍｒａなど）、蛍光の減少が観察され得る。
【０１０８】
またさらなる一実施形態では、オリゴヌクレオチドは切断ドメインの５’側において蛍光分子で標識され、該分子の３’末端またはこの付近に位置するブロッキング基は、数例挙げるとＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（Ｒ）、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ（商標）またはＴａｍｒａなどのクエンチャーである。この場合も、オリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）からのクエンチャー切断によって蛍光の増大がもたらされ、これが、オリゴヌクレオチドの伸長反応の進行のモニタリングに使用され得る。さらに、この場合、プライマー伸長産物は蛍光標識されている。
【０１０９】
またさらなる一実施形態では、本発明のブロック型プライマーは核酸シークエンシングに使用される。ＤＮＡ増幅反応の場合と同様、本発明のオリゴヌクレオチドを使用した場合、ＤＮＡシークエンシングに対するプライマー伸長の特異性も増大する。シークエンシングの一実施形態では、蛍光標識され、連鎖停止剤として使用される２’，３’ジデオキシヌクレオチド三リン酸と反応時に生じるネステッド断片は電気泳動によって、好ましくはキャピラリー電気泳動によって分離される。
【０１１０】
また別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーが蛍光性基で標識され、３’ジデオキシヌクレオチド三リン酸連鎖停止剤は標識されない。この実施形態では、ブロッキング基がクエンチャーであり得、この場合、プライマー自体が蛍光性でないためバックグラウンド蛍光が低減される。伸長産物のみが蛍光性となる。
【０１１１】
本発明の別の態様は、代替的な２価のカチオン、例えばＭｎ２＋、Ｎｉ２＋またはＣｏ２＋をＭｇ２＋とともに、またはなしでアッセイバッファーに組み込むことを包含する。本発明の一部の特定の実施形態では、かかる代替的な２価のカチオンを存在させた場合、ＲＮａｓｅ  Ｈ２による切断の向上によって具体的なアッセイの有効性が増大する。一実施形態において、隣接している２つの２’−フルオロヌクレオシド残基がＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性ドメインを構成している場合、０．３から１ｍＭのＭｎＣｌ２と２から４ｍＭのＭｇＣｌ２により、アッセイにおいて最適な性能が得られた（実施例３参照）。
【０１１２】
本発明の方法
本明細書に記載のプライマー、プローブおよび他の新規なオリゴヌクレオチドは、幾つかの生物学的アッセイに使用され得る。以下の列挙は包括的ではないが、本発明の方法のほとんどは、６つの一般カテゴリー：（１）プライマー伸長アッセイ（例えば、ＰＣＲ、ＤＮＡシークエンシングおよび多項式増幅）、（２）オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、（３）サイクリングプローブ反応、（４）ライゲーションによるシークエンシング、（５）ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素を用いた末端標識断片の作製によるシークエンシング、ならびに（６）ライゲーションによる合成に分類される。
【０１１３】
本明細書に記載のプライマー、プローブおよび他の新規なオリゴヌクレオチドは、幾つかのプライマー伸長アッセイに使用され得る。
【０１１４】
プライマー伸長アッセイ
本発明の一実施形態において、目的の標的ＤＮＡ配列の増幅方法を提供する。該方法は：
（ａ）切断ドメインを有するプライマーであって、該プライマーの３’末端またはこの付近に連結され、プライマー伸長を抑制するブロッキング基を有するプライマー、目的の標的ＤＮＡ配列を有する試料核酸、切断酵素およびポリメラーゼを含む反応混合物を準備する工程；
（ｂ）該プライマーを該標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズさせ、二本鎖基質を形成する工程；
（ｃ）ハイブリダイズしたプライマーを該切断酵素で、該切断ドメイン内または該切断ドメインに隣接している点において切断し、該ブロッキング基を該プライマーから除去する工程；ならびに
（ｄ）該プライマーを該ポリメラーゼで伸長させる工程
を含む。
【０１１５】
ＰＣＲ全般
ＰＣＲにおいて使用する場合、切断ドメインを含む３’−ブロック型プライマーがまず、標的配列にハイブリダイズする。この実施形態では、プライマーは、相補ＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーション後に３’ブロッキング基の切断が起こるまで伸長することができない。例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈ切断ドメインがプライマーに存在する場合、ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素は、プライマーと標的によって形成される二本鎖基質を認識し、プライマーを切断ドメイン内で、または切断ドメインに隣接して切断する。次いでプライマーが伸長され得、次いで標的の増幅が起こり得る。プライマーは伸長前にＲＮａｓｅ  Ｈによって認識されて切断される必要があるため、非特異的増幅が低減される。
【０１１６】
慣用的なＰＣＲでは、「ホットスタート」ポリメラーゼは、多くの場合、プライマーダイマーを低減させるため、および非特異的増幅を減少させるために使用される。ＲＮａｓｅ  Ｈによる切断を必要とする本発明のブロック型プライマーは同じ利点をもたらし得るものである。低温で活性をほとんどまたは全くもたない好熱菌由来ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素が好ましい。プライマーの活性化は、標的配列とのハイブリダイゼーションおよび高温での切断の後でのみ起こる。ホットスタートである可逆的に不活化されるＤＮＡポリメラーゼの使用と比べたときのこのアプローチの利点は上記に記載している。もちろん、所望によりホットスタートＲＮａｓｅ  Ｈ酵素とホットスタートＤＮＡポリメラーゼを併用してもよい。
【０１１７】
３つの型のホットスタートＲＮａｓｅ  Ｈ酵素（表１、２および３参照）：１）ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｉｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２の場合のように低温で内因性活性をほとんどまたは全くもたない耐熱性ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素；２）化学修飾によって可逆的に不活化される耐熱性ＲＮａｓｅ  Ｈ；および３）ブロック抗体によって可逆的に不活化される耐熱性ＲＮａｓｅ  Ｈを本明細書において記載する。また、ランダム変異誘発などの当該技術分野でよく知られた手段により、本発明のアッセイにおいて望ましいＲＮａｓｅ  Ｈの形質がさらに改善され得るＲＮａｓｅ  Ｈの変異型バージョンが合成され得る。あるいは、本発明に望ましい特徴を共有する他の酵素の変異型株が使用され得る。
【０１１８】
一実施形態において、プライマー内の切断ドメインはＲＮａｓｅ  Ｈによって切断性である。またさらなる一実施形態では、ＲＮａｓｅ  Ｈ切断ドメインが単一のＲＮＡ残基からなるものであり、プライマーの切断はＩＩ型ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素によって、好ましくは好熱菌由来ＩＩ型ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素、さらにより好ましくは、室温では高温よりも活性が低い好熱菌由来ＩＩ型ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素によって媒介される。またさらなる一実施形態では、ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断ドメインが隣接している２つの２’−フルオロヌクレオシド残基からなるものである。切断ドメインが隣接している２つの２’−フルオロヌクレオシド残基からなる本発明のなおより好ましい一実施形態では、ＰＣＲは、Ｍｇ２＋に加えて代替的な２価のカチオン、例えば限定されないがＭｎ２＋、Ｎｉ２＋またはＣｏ２＋を含むバッファー中で行われる。さらなる一実施形態では、切断ドメインを含む本発明の新規な３’−ブロック型プライマーは、好熱菌由来ニッキング酵素が使用され、切断ドメインがニッキング部位であるホットスタートＰＣＲのバリエーションにおいて使用され得る。
【０１１９】
あるいは、ホットスタート特徴をもたない切断酵素を本発明において、従来のホットスタート法を用いて、例えば、高温での酵素添加、必要な試薬または酵素のワックス中への封入、またはホットスタートの可逆的に不活化されるＤＮＡポリメラーゼを用いて使用してもよい。
【０１２０】
本発明の特異性の増大は、増幅反応に使用した場合、リアルタイムＰＣＲ適用で、標準的なＤＮＡプライマーを用いる慣用的なリアルタイムＰＣＲと比べてより特異的な結果を得ることが可能になる。例えば、二本鎖ＤＮＡ結合色素アッセイ、例えばＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎアッセイは、ＰＣＲによって生じる二本鎖産物（例えば、プライマーダイマー）（あれば）に色素が結合するとシグナルが生成し、これにより偽陽性結果がもたらされ得るという点において不都合点を有する。しかし、本発明のプライマーを使用した場合、非特異的増幅およびプライマーダイマー形成は低減され、二本鎖ＤＮＡ結合色素のシグナルの強度は所望の標的の増幅のみを反映する（実施例１７参照）。
【０１２１】
試薬濃度およびアッセイの反応条件は、この有用性が最大限となるように変更され得る。本発明のブロック型プライマーを用いたＰＣＲの相対効率は、ブロック解除酵素の濃度とアニーリング／伸長反応温度での滞留時間（このときブロック解除が進行している。）に関係する。酵素の量が少なく、滞留時間が短い状態では、切断は不完全であり得、ブロック型プライマーを用いた反応は、非ブロック型プライマーを用いる反応よりも効率が低い。酵素濃度または滞留時間のいずれかが増大するにつれて、ブロック型プライマーでの反応効率は増大し、非ブロック型プライマーのものと同一になる。さらにより多くの酵素またはより長い滞留時間を使用するとアッセイの特異性が低下することがあり得、切断部位またはこの周辺配列内のミスマッチを識別する系の能力が低下し得る（実施例４参照）。これは、ミスマッチ配列にハイブリダイズした場合、プライマーの切断効率が増大するために生じる。真の標的部位における切断は、各サイクルで既に１００％であるためさらには増大し得ない。従って、本アッセイは、より高い特異性が必要とされるＳＮＰアッセイに対して、または必要とされる特異性が低いｍＲＮＡの発現レベルの定量に対して微調整され得る。また、特異性は、反応バッファーの組成を変えることによっても調整され得る。例えば、３ｍＭのＭｇ＋＋イオン濃度は非常にロバストで高効率のアッセイを支持し得る；Ｍｇ＋＋イオン濃度を２．５ｍＭ、２．０ｍＭまたはこれより下まで低下させると、ＳＮＰ識別の特異性が増大され得るが、また反応効率が若干低くなり得る（実施例３６および３７参照）。一部の特定のＤＮＡポリメラーゼ酵素には、高いＭｇ＋＋イオン濃度の使用が必要とされ得る。従って、Ｍｇ＋＋イオン濃度の最適化は、アッセイが特定の必要性に適合するように性能を調整するために使用され得、この工程は全当業者が熟知している。一部のＤＮＡポリメラーゼ酵素は、少量の界面活性剤をバッファー中に存在させた場合、より良好な性能を示す。ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２、およびおそらく他のＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素も同様に、少量の界面活性剤をバッファー中に存在させた場合、より高い反応速度を有する。界面活性剤の含有量は広い範囲で調整され得るが、なおＰＣＲ増幅と適合性であり得、非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、Ｂｒｉｊ−５８など）または選択されたイオン性界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）が使用される（実施例１８および３８参照）。
【０１２２】
別の実施形態では、１つのブロック型プライマーと１つの非ブロック型プライマーを有するプライマーペアが使用され得る。別の実施形態では、配列特異性が低く、種々の配列を切断し得る酵素が選択され得る。また別の実施形態では、バリアント対立遺伝子の識別能を増大させるために、切断部位にフランキングしているさらなるミスマッチが付加され得る。また、特異性を増大させるために、２’−Ｏ−メチルヌクレオシドなどの修飾塩基をプライマー内の切断部位のいずれか側に導入してもよい（実施例２３参照）。
【０１２３】
本明細書に記載の種々のアッセイの反応は、数例挙げると、蛍光の検出、質量タグによる検出、酵素的検出を用いて、ならびにプローブまたはプライマーをさまざまな他の基で、例えばビオチン、ハプテン、放射性ヌクレオチドおよび抗体で標識することによってモニタリングされ得る。一実施形態では、本発明の修飾プライマーを用いたＰＣＲの進行はリアルタイムで、例えばＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎを用いる色素インターカレートアッセイを使用してモニタリングされる。またさらなる一実施形態では、本発明の修飾プライマーを用いたＰＣＲの進行は、フルオロフォアおよびクエンチャー（分子ビーコンなど）で標識したプローブを用いて、または、プローブの切断が行われる５’ヌクレアーゼアッセイの場合のようにしてモニタリングされる。あるいは、ＲＮａｓｅ  Ｈ２によって切断性である二重標識プローブを使用してもよい。後者の場合、ハイブリダイズしたプライマーおよびプローブの切断はどちらも同じ酵素によって媒介され得る。プローブ内のＲＮａｓｅ  Ｈ切断ドメインはＲＮＡ残基のみを含むものであり得る。一般に、本発明のブロック型プライマーの切断ドメインにおいて有用な残基のあらゆる組合せが該プローブ内の切断ドメインとして使用され得る。特に、ＲＮａｓｅ  Ｈ２を切断酵素として使用する場合、単一のＲＮＡ残基または隣接している２つの２’−Ｆ残基がプローブ内の切断ドメインとして好ましい。かかる修飾オリゴヌクレオチドプローブはリアルタイムＰＣＲにおいて特に有用であり、標準的なＤＮＡプライマーまたは本発明のブロック型プライマーとともに使用され得る。かかるリアルタイムＰＣＲアッセイでは、好熱菌由来バージョンのＲＮａｓｅ  Ｈ２、特に、低温での活性が低い好熱菌由来ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素が好ましい。本明細書に示す実施例では、幾つかの好熱菌由来ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素を単離し、サーモサイクリング条件下で安定であり、ＰＣＲにおいて有用であることを示している。本発明のブロック型プライマーとともに使用した場合、特定のホットスタートＤＮＡポリメラーゼの必要性がなくなり得る。これによりアッセイコストの有意な削減がもたらされる。
【０１２４】
別の実施形態では、本発明のブロック型プライマーは、米国特許出願公開第２００９／００６８６４３号明細書に記載のＰＣＲのためのプライマー−プローブアッセイ形式において使用され得る。この場合、プライマーはまた、オリゴヌクレオチドの５’末端に、標的核酸に相補的であってもそうでなくてもよい標識ドメインも含有している。プライマーの伸長によって生成する産物は、次のＰＣＲサイクルにおけるリバースプライマーによる合成のための鋳型としての機能を果たす。これにより標識ドメインが二本鎖構造に変換される。かかる一実施形態では、フルオロフォアおよびクエンチャーが標識ドメインに結合され、二本鎖形態内でのフルオロフォアとクエンチャー間の距離が一本鎖状態と比べて増大することによって生じる蛍光の増大によって反応がモニタリングされる。また別のかかる実施形態では、標識ドメインは、フルオロフォアとクエンチャー間に位置する切断ドメインを含有している。切断は、切断ドメインが二本鎖である場合にのみ起こる。この場合も反応は蛍光の増大によってモニタリングされる。この場合、切断剤は、プライマーとこの相補鎖の両方の鎖を切断するもの、例えば制限酵素であり得る。あるいは、切断剤は、プライマーのみを切断するニッキング剤、好ましくはＲＮａｓｅ  Ｈ酵素、さらにより好ましくは耐熱性ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素であり得る。このアッセイ形式ではプライマー内に２つの切断ドメイン：切断が起こってプライマーが活性化されて伸長が可能になるブロッキング基の５’側の第１のものと、標識ドメイン内の第２のものが存在する。どちらの部位の切断も同じ切断剤によって媒介され得る。また、標識ドメインに他の標識基を、例えば限定されないが数例挙げるとビオチン、ハプテンおよび酵素を含有させてもよい。あるいは、標識ドメイン内の切断によって放出される５’断片を、質量分析による検出のための質量タグとして使用してもよい。
【０１２５】
また別の実施形態では、本発明のブロック型プライマーは、米国特許出願公開第２００９／００６８６４３号明細書に記載のＰＣＲのための鋳型−プローブアッセイ形式において使用され得る。
【０１２６】
本発明の別の実施形態では、ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性ブロック型オリゴヌクレオチドは、亜硫酸水素ナトリウムで処理した核酸、例えば限定されないが、ＤＮＡおよびＲＮＡの５−メチルシトシン残基をＰＣＲ解析によって検出するために使用される。先の研究では、核酸鋳型をバイサルファイトで処理すると、塩基の５’炭素上のメチル化されていないシトシンが速やかに脱アミノ化されることが確立されている。この脱アミノ化反応によって非メチル化シトシンがウラシルに変換され、核酸配列内に機能性のＣ→Ｔトランジション変異がもたらされる。また、５−メチルシトシンはこの脱アミノ化に対して高度に抵抗性であり、チミンへの変換ではなく５−メチルシトシンヌクレオチドのシトシンとしての保存がもたらされることも知られている。バイサルファイト変換手法後の５’シトシンメチル化修飾の検出のためには数多くの方法が使用されている。例としては、限定されないが、標準的なミスマッチ特異的定量的および非定量的ＰＣＲ法、ならびに生成した亜硫酸水素ナトリウム反応生成物のサブクローニングおよびシークエンシングが挙げられる。
【０１２７】
本発明において、鋳型は、当業者によく知られた方法によってバイサルファイト処理される。出発鋳型がＲＮＡであった場合、相補的なｃＤＮＡ鎖がよく知られた任意の逆転写法によって作成される。標的鋳型シトシン（ここではウラシルに変換される）または５−メチルシトシンとマッチしているかまたは識別されるかのいずれかであるブロック型切断性オリゴヌクレオチドが、ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素とバイサルファイト処理鋳型を含むＰＣＲ反応に添加される。鋳型を含むミスマッチ（変換シトシン＞ウラシルまたは未変換５−メチルシトシン＞５−メチルシトシン）塩基の増幅は、ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断反応のミスマッチ識別のため、マッチ塩基鋳型と比べて大きく低減される。亜硫酸水素ナトリウム変換手法で常に懸念されるシトシンのウラシルへの不完全なバイサルファイト変換は、バイサルファイト変換鋳型内の既知の非５’−メチル化シトシンを標的化するブロック型切断性オリゴヌクレオチドを設計することにより検出され得る。未変換シトシンのこのようなプライマーでのＰＣＲ増幅では、標準的な非ブロック型プライマーと比べて大きな識別が示されるはずである。本発明では、メチル化シトシンと非メチル化シトシンの識別が有意に増大することが期待される。
【０１２８】
対立遺伝子特異的ＰＣＲ
また、本発明のブロック型プライマーは対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）において使用され得る。一般に、ＡＳ−ＰＣＲは、遺伝子のバリアント対立遺伝子、特にＳＮＰなどの一塩基変異を検出するために使用される（例えば、米国特許第５，４９６，６９９号明細書参照）。ゲノム内のＳＮＰの位置ならびに変異型癌遺伝子の配列は当該技術分野で知られており、ＰＣＲプライマーは、これらの領域とオーバーラップしているように設計され得る。
【０１２９】
一塩基ミスマッチの検出は、診断の際および特定の疾患を具体的な遺伝子配列または変異と相関させる際に極めて重要なツールである。ＡＳ−ＰＣＲは生物学の技術分野で１０年以上もの間、知られているが（Ｂｏｔｔｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１８，ｐｐ．３８８−４０２）、依然として、特定のミスマッチと充分に相補的な配列をより正確に識別するツールが必要とされている。本発明は、この必要性の対処するものである。
【０１３０】
ＡＳ−ＰＣＲでは、バリアント遺伝子座とオーバーラップしているプライマーが使用される。一般的に、プライマーは、３’末端ヌクレオチドが変異部位上に位置するように設計される。あるいは、変異部位は、場合によっては３’末端から１塩基または２塩基超えて存在する。ミスマッチが３’末端またはこの付近に存在する場合、プライマー伸長、従ってＰＣＲが阻害される。プライマーと厳密にマッチしている場合と１つ以上のミスマッチが存在する対立遺伝子バリアントの場合での増幅の効率の違いは、一部の場合ではエンドポイントＰＣＲによって測定され得、この場合、最終増幅産物は、例えばゲル電気泳動によって解析される。より一般的には、リアルタイムＰＣＲは増幅効率を調べるために使用される。リアルタイムでのアンプリコンの蛍光系検出方法、例えば、ＤＮＡ色素結合アッセイまたは二重標識プローブアッセイが最も多くの場合で使用される。バックグラウンドレベルより上の蛍光が最初に検出可能な（Ｃｐまたはクロス点）ＰＣＲサイクルにより増幅効率の尺度がもたらされる。プライマーと標的ＤＮＡ間にミスマッチがある場合、増幅効率は低下し、Ｃｐは遅延される。一般的に、ＳＮＰの識別には４から５サイクルのＣｐの増大で充分である。
【０１３１】
本発明のＡＳ−ＰＣＲの一実施形態では、プライマーが単一のＲＮＡ残基を含むものであり、ミスマッチがプライマーのＲＮＡ残基上に直接的にアラインメントされ得る。切断の違いと相関するパーフェクトマッチとミスマッチ間のクロス点（Ｃｐ）値の差はすぐにわかる（実施例１３参照）。一部の場合では、ミスマッチ一塩基をＲＮＡ残基の５’側または３’側のいずれかにアラインメントするとＣｐ値の差が大きくなる。ミスマッチをＲＮＡ残基の５’側に位置すると、その後のＲＮａｓｅ  Ｈ２切断によって、ミスマッチは切断されたプライマーの３’末端の最後の塩基となり得る。驚くべきことに、ミスマッチをＲＮＡ残基上に直接有するようにすることは、ほとんどの場合で、ミスマッチをＲＮＡ残基の５’側に位置するよりも有効である。
【０１３２】
別の実施形態では、プライマーは多数のＲＮＡ残基または隣接している２つの２’−フルオロ残基を含むものであり、ミスマッチの検出は、１つのＲＮＡ残基を含むプライマーの場合と同じ原理に従う；ミスマッチは、好ましくは予測される切断点付近または該切断点上に位置する。
【０１３３】
別の実施形態では、アッセイの感度を上げるために第２のミスマッチが使用される。またさらなる一実施形態では、第２のミスマッチは、ＳＮＰ部位上に直接的なミスマッチの３’側に位置する。またさらなる一実施形態では、第２のミスマッチは、ＳＮＰ部位上に直接的なミスマッチから１塩基または２塩基に位置する（実施例２３参照）。
【０１３４】
また別の実施形態では、修飾残基は、プライマー内の変異部位上に位置する塩基の５’側または３’側に組み込まれる。本発明のかかる一実施形態では、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドがプライマー内のＲＮＡ塩基のすぐ５’側に位置する（実施例２２参照）。
【０１３５】
また、アッセイの感度はヌクレアーゼ抵抗性アナログをプライマー内に、変異部位上の塩基の３’側に組み込むことによっても上げることができる。かかるヌクレアーゼ抵抗性アナログとしては、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネートおよび無塩基残基、例えばＣ３スペーサーが挙げられる。本発明のかかる一実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合が、変異部位上のＲＮＡ塩基からプライマーの３’末端までの各位置に組み込まれる。また別のかかる実施形態では、ホスホロチオエート結合またはホスホロジチオエート（ｄｉｔｉｏａｔｅ）が、ＲＮＡ残基の３’側の塩基からプライマーの３’末端までのすべての位置に組み込まれる。また別のかかる実施形態では、単一のホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートがプライマー内のＲＮＡ塩基のすぐ下流の残基の３’側に導入される。一実施形態では、ホスホロチオエート結合がＳＮＰ部位上に直接的なＲＮＡモノマーの３’側の各モノマー間、ならびにＲＮＡモノマーとＲＮＡ塩基の３’側の塩基間に位置する（実施例２５参照）。
【０１３６】
また、アッセイの感度は、３’ブロッキング基（１つまたは複数）の位置を最適化することによっても改善され得る。一実施形態において、ブロッキング基は、オリゴヌクレオチドの３’末端に対して内部に位置する。さらなる一実施形態では、１つより多くの（ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｏｎ）ブロッキング基が３’末端に対して内部に位置する。またさらなる一実施形態では、ＲＮＡモノマーはＳＮＰ部位上に直接的に置かれ、該ＲＮＡモノマーの３’側にＤＮＡモノマー、続いて２つのＣ３スペーサー、続いて最後に３’末端の塩基を伴う（実施例２８参照）。また、アッセイの感度および特異性は、反応バッファー中のマグネシウムイオン濃度の最適化によっても改善され得（ｂｅ）、ここで、低マグネシウムレベル（例えば、１．５ｍＭまたは２．０もしくは２．５ｍＭなど）では高い特異性が得られ得、高マグネシウムレベル（例えば、３．０ｍＭ、３．５ｍＭなど）では低い特異性が得られ得るが増幅効率は高くなり得る（実施例３６および３７参照）。
【０１３７】
標的ＤＮＡ配列の増幅中の特異性の改善の簡便な定量的測定の一例は、マッチプライマーおよびミスマッチプライマー（対比）を用いた標的ＤＮＡ配列の増幅でのＣｐ値（ΔＣｐ）の変化の実測値である。少なくとも約５またはこれより大きい好ましいΔＣｐまたは少なくとも約５０％以上のΔＣｐの相対的増大は、マグネシウムイオン濃度の最適化による特異性の改善を示す。しかしながら、より典型的には、本実施例によって明らかになったように、好ましいΔＣｐはよりずっと大きいもの、例えば、少なくとも約１０から２０もしくはこれより大きいΔＣｐ値または少なくとも約１００％以上のΔＣｐの相対的増大であり得る。マグネシウムイオン濃度の最適化による特異性の改善を示すΔＣｐの実測値は、プライマーの設計およびインテロゲーションされる具体的な標的ＤＮＡ配列に依存し得る。
【０１３８】
対立遺伝子特異的ＰＣＲの一実施形態では、プライマーは、１つより多くのミスマッチが検出されるように設計され得る。例えば、フォワードプライマーは第１のミスマッチを検出し得るものであり、リバースプライマーは第２のミスマッチを検出し得るものである。この実施形態では、アッセイは、２つのミスマッチが解析対象の同じ遺伝子または染色体上に存在するかどうかを示すために使用され得る。このアッセイは、対象の細菌が病原性および抗生物質抵抗性の両方であるかどうかを調べるなどの用途に有用であり得る。
【０１３９】
別の実施形態では、フォワードおよびリバースプライマーがどちらもブロック型であり、ミスマッチにおいてオーバーラップしている。さらなる一実施形態では、ブロッキング基はオリゴヌクレオチドの３’末端に対して内部である。またさらなる一実施形態では、フォワードおよびリバースプライマーの一方または両方で、ＲＮＡモノマーはＳＮＰ部位上に直接的に置かれ、該ＲＮＡモノマーの３’側にＤＮＡモノマー、続いて２つのＣ３スペーサー、続いて最後に３’末端の塩基を伴う。
【０１４０】
逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
また別の実施形態では、本発明の方法は、カップリング型逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）において使用され得る。かかる一実施形態では、逆転写とＰＣＲが相違する２つの工程で行われる。まず、試料ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーを、オリゴｄＴプライマーまたは配列特異的プライマーのいずれかを用いて合成する。また、ランダム６量体などもｃＤＮＡ合成のプライミングに使用され得る。得られたｃＤＮＡは次いで、本発明のブロック型プライマーおよび方法が使用されるＰＣＲのための基質として使用される。
【０１４１】
あるいは、逆転写とＰＣＲを単一の密閉チューブでの反応で行ってもよい。かかる一実施形態では、逆転写用の１種類とＰＣＲ用の２種類の３種類のプライマーが使用される。逆転写用のプライマーはＰＣＲアンプリコンの位置に対して３’側のｍＲＮＡに結合する。必須ではないが、逆転写プライマーは、ＲＮＡ残基または修飾アナログ（２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基など）（これは、ｍＲＮＡにハイブリダイズしたとき、ＲＮａｓｅ  Ｈの基質を形成しない。）を含むものであってもよい。好ましくは、低温で低い活性を有するＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素が切断剤として使用される。
【０１４２】
３種類のプライマーのＲＴ−ＰＣＲアッセイでは、ＲＴ−プライマーがＰＣＲ反応に関与しないように阻害することが望ましい。これは、ＰＣＲプライマーよりも低いＴｍを有し、このためＰＣＲ条件ではハイブリダイズしないＲＴ−プライマーを用いることにより行われ得る。あるいは、例えば隣接している２つのＣ３スペーサーを組み込んだ非複製可能プライマーがＲＴ−プライマーとして使用され得る（多項式増幅の場合と同様、米国特許第７，１１２，４０６号明細書参照）。この場合、ｃＤＮＡがフォワードＰＣＲプライマーの伸長によってコピーされるときはＲＴ−プライマーに対する結合部位が含まれていない。
【０１４３】
一実施形態では、リバースＰＣＲプライマーのみが本発明の組成物および方法を用いてブロック型となっている。また別の実施形態では、フォワードＰＣＲプライマーとリバースＰＣＲプライマーの両方がブロック型である。リバースＰＣＲプライマーは、３プライマーＲＴ−ＰＣＲアッセイでは、逆転写に使用されることを妨げるためにブロック型である。所望の場合、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ残基などの修飾塩基をリバースＰＣＲプライマーに組み込んでもよいが、かかる修飾（あれば）はプライマー配列がＤＮＡ合成の鋳型としての機能を果たし、コピーされるものでなければならない。
【０１４４】
本発明の２プライマーＲＴ−ＰＣＲアッセイでは、フォワードＰＣＲのみがブロック型である。リバースＰＣＲプライマーはＲＴ−プライマーとしての機能も果たし、従ってブロック型にはされ得ない。
【０１４５】
包括的ではないが、表１に、ブロッキング基、標識基、切断部位の実施形態、オリゴヌクレオチドの切断部位または他の領域に対する修飾、バッファー条件および酵素のどのようなバリエーションによって、アッセイ形式をこの具体的な適用に応じてさらに最適化することができるかを示す。アッセイ形式および適用の例としては、ＰＣＲ；二本鎖ＤＮＡ結合色素（ＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎなど）、５’ヌクレアーゼアッセイ（Ｔａｑｍａｎ（商標）アッセイ）または分子ビーコンを用いるリアルタイムＰＣＲ；プライマー−プローブおよび鋳型−プローブアッセイ（米国特許出願公開第２００９／００６８６４３号明細書参照）；多項式または連結線形（ｌｉｎｋｅｄ  ｌｉｎｅａｒ）増幅アッセイ；ＰＣＲによる遺伝子の構築または断片合成；対立遺伝子特異的ＰＣＲならびに一ヌクレオチド多型および他のバリアント対立遺伝子を検出するために使用される他の方法；核酸シークエンシングアッセイ；ならびに鎖置換増幅が挙げられる。このような種々のアッセイにおいて、本発明のプライマー切断が、具体的な反応の特異性を向上させるために使用され得る。
【０１４６】
【表１】
2016510601.tif 000004
【０１４７】
サイクリングプローブ反応
サイクリングプローブ反応は、特定の核酸配列を検出するための別の手法である（米国特許第５，４０３，７１１号明細書参照）。この反応は定温条件下で、または温度サイクリングを用いて操作される。ＰＣＲとは異なり、産物は線形様式で蓄積される。
【０１４８】
表２は、サイクリングプローブ反応に基づいたアッセイを改善するための本発明の考えられ得る要素の非包括的な組を示す。本発明の新しい特長としては、１）ホットスタートＲＮａｓｅ  Ｈ酵素の使用；２）ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素による新規な配列の切断（例えば、ＩＩ型ＲＮａｓｅ  Ｈによる２’−フルオロヌクレオシドを含む基質の切断）；および３）特異性を向上させるため、および／または非特異的切断反応を抑制するためのＲＮａｓｅ  Ｈ切断ドメインにフランキングしている修飾および二次ミスマッチの導入が挙げられる。かかる修飾および二次ミスマッチは、切断がＩＩ型ＲＮａｓｅ  Ｈによって媒介され、切断ドメインが単一のＲＮＡ残基または隣接している２つの２’−フルオロ残基である場合に特に有用である。
【０１４９】
【表２】
2016510601.tif 000005
【０１５０】
ＤＮＡライゲーションアッセイ
本発明はまた、ＤＮＡライゲーションアッセイの特異性を増大させるためにも有用であり得る。本発明のドナーおよび／またはアクセプターオリゴヌクレオチドが設計され得、これらは標的ＤＮＡ配列上で互いに隣接して結合し、ライゲーションが抑制されるように修飾される。ライゲーションを阻害するために有用なアクセプターオリゴヌクレオチド上のブロッキング基は、プライマー伸長を抑制するために使用されるものと同じである。ドナーオリゴヌクレオチドのブロッキングは、５’−ＯＨ基を例えばホスホジエステルとして、例えば：
【０１５１】
【化３】
2016510601.tif 000006
としてキャッピングすることにより容易に行われ得る。他の５’ブロッキング基としては、５’−Ｏ−アルキル置換基、例えば５’−Ｏ−メチルまたは５’−Ｏ−トリチル基、５’−Ｏ−ヘテロアルキル基、例えば５’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、５’−Ｏ−アリール基、および５’−Ｏ−シリル基、例えばＴＩＰＳまたはＴＢＤＭＳが挙げられる。また、５’デオキシ残基もライゲーションをブロックするために使用され得る。
【０１５２】
また、立体的にバルキーな基がオリゴヌクレオチドの５’末端またはこの付近に位置してライゲーション反応をブロックしてもよい。５’−リン酸基は、これがＤＮＡリガーゼの天然基質であるため５’−ＯＨをブロックするために使用することができない。標的ＤＮＡ配列にハイブリダイゼーションして初めて、ブロッキング基が例えばＲＮａｓｅ  Ｈ切断性ドメインでの切断によって除去され、ライゲーションが起こることが可能になる。好ましくは、切断は、ＲＮａｓｅ  Ｈ  ＩＩ型酵素、さらにより好ましくは好熱菌由来ＩＩ型ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素によって媒介される。より好ましくは、室温では高温よりも活性が低い好熱菌由来ＩＩ型ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素が、切断の媒介およびこれによるアクセプターおよび／またはドナーオリゴヌクレオチドの活性化に使用される。あるいは、配列特異的ニッキング酵素、例えば制限酵素が、ドナーおよび／またはアクセプターオリゴヌクレオチドの切断を媒介するために使用され得る。
【０１５３】
さらなる一実施形態では、切断反応がまず高温で行われ、このとき、２種類のオリゴヌクレオチドのうちの一方のみが標的配列にハイブリダイズする。次いで温度を下げると、第２のオリゴヌクレオチドが標的にハイブリダイズし、次いでライゲーション反応が起こる。
【０１５４】
ドナーオリゴヌクレオチド内に位置する切断ドメインが存在するまたさらなる一実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、５’末端またはこの付近でブロックされておらず、単に遊離の５’−ＯＨを有する。このオリゴヌクレオチドは、ライゲーション反応におけるドナーとしての機能を果たすことができない；この機能を果たすためには５’−リン酸基が必要である。従って、５’末端が機能的にブロックされている。ＲＮａｓｅ  Ｈによる切断によって５’−リン酸基が生成し、ドナーオリゴヌクレオチドがライゲーション反応に関与することが可能になる。
【０１５５】
本発明の重要な利点の１つは、変異部位の二重のインテロゲーションが可能であり、従って標準的なライゲーションアッセイよりも特異性が大きいことである。切断工程とライゲーション工程の両方にバリアント対立遺伝子を識別する機会が存在する。
【０１５６】
表３は、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイを改善するための本発明の考えられ得る要素の非包括的な組を示す。
【０１５７】
【表３】
2016510601.tif 000007
【０１５８】
ＤＮＡシークエンシング反応
一実施形態において、目的の標的ＤＮＡのシークエンシング方法を提供する。該方法は、
（ａ）切断ドメインを有するプライマーであって、該プライマーの３’末端またはこの付近に連結され、プライマー伸長を抑制するブロッキング基を有するプライマー、目的の標的ＤＮＡ配列を含む試料核酸、切断酵素、ヌクレオチド三リン酸連鎖停止剤（例えば、３’ジデオキシヌクレオチド三リン酸）およびポリメラーゼを含む反応混合物を準備すること、
（ｂ）該プライマーを該標的核酸とハイブリダイズさせ、二本鎖基質を形成すること；
（ｃ）ハイブリダイズしたプライマーを該切断酵素で、該切断ドメイン内または該切断ドメインに隣接している点において切断し、該ブロッキング基を該プライマーから除去すること；ならびに
（ｄ）該プライマーを該ポリメラーゼで伸長させること
を伴うものである。
【０１５９】
一実施形態において、本発明は「次世代」シークエンシングプラットフォームにおいて使用される。一例の型の次世代シークエンシングは「合成によるシークエンシング」であり、この場合、ゲノムＤＮＡを剪断し、アダプターオリゴヌクレオチドを用いてライゲーションするか、または遺伝子特異的プライマーによって増幅し、次いで、これを、ＰＣＲのためにガラススライド上にコートしてあるか、またはエマルジョン中に入れてあるかのいずれかである相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。続くシークエンシング反応では、色素標識ヌクレオチド三リン酸の組み込み、または伸長反応で放出されるピロリン酸部とＡＴＰスルフリラーゼとの反応によってＡＴＰが生成し、次いで、ルシフェラーゼとこの基質ルシフェリンのＡＴＰ触媒性反応によってオキシルシフェリンと光が発生することによる化学発光による検出のいずれかを行う。
【０１６０】
第２の型の次世代シークエンシングは「ライゲーションによるシークエンシング」であり、この場合、４種類の塩基の各々を表す４種類のオリゴヌクレオチドの組を使用する。各組において、約７から１１塩基フルオロフォア標識オリゴヌクレオチドが使用され、ここで、一塩基は指定されており、残りはユニバーサル塩基または縮重塩基のいずれかである。例えば、３つのユニバーサル塩基（イノシンなど）と４つの縮重位置を含む８塩基オリゴヌクレオチドを使用する場合、各々が１つの位置に指定の塩基（Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ）と、分子の５’末端もしくは３’末端またはライゲーションに干渉しない内部位置のいずれかに結合させた蛍光標識とを有する各組に、４４即ち２５６種類の異なるオリゴヌクレオチドが存在し得る。各々が４種類の塩基のうちの１種類に特異的な４種類の異なる標識が使用される。この４種類のオリゴヌクレオチドの組の混合物を、増幅させた試料ＤＮＡにハイブリダイズさせる。ＤＮＡリガーゼの存在下では、標的にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドが、アクセプターＤＮＡ分子にライゲーションされた状態になる。結合された標識の検出により、オリゴヌクレオチド内の指定の塩基に相補的な位置における試料ＤＮＡ中の対応する塩基を決定することが可能になる。
【０１６１】
本発明の一実施形態において、約７から１１塩基のドナーオリゴヌクレオチドは、指定の塩基をオリゴヌクレオチドの５’末端に含む。残りの塩基は縮重塩基またはユニバーサル塩基であり、指定の塩基に特異的な標識が指定の塩基の３’側に組み込まれる。プローブの３’末端は、ドナーオリゴヌクレオチドがアクセプターとしても機能を果たさないように不可逆的にブロックされている。一部の場合では、これは標識基によって行われ得る。オリゴヌクレオチドの５’末端から２番目の塩基、即ち、指定の塩基の隣の残基は、４種類のＲＮＡ塩基の縮重混合物である。あるいは、ＲＮａｓｅ  Ｈ２によって認識される任意のアナログ、例えば２’−フルオロヌクレオシドがこの位置で置換され得る。また、ユニバーサル塩基、例えばリボイノシンまたはリボ−５−ニトロインドールをこの位置に組み込んでもよい。プローブは、標準的なライゲーションによるシークエンシング反応の場合と同様に、まず標的配列にハイブリダイズし、アクセプターＤＮＡ断片にライゲーションされた状態になる。指定の塩基の検出後、プローブをＲＮＡ残基の５’側で切断するＲＮａｓｅ  Ｈ２を添加すると、指定の塩基がアクセプター断片の３’末端に結合された状態になる。最終結果は、アクセプター断片が一塩基伸長され、次に配列内の次の塩基を決定することが可能な状態になっている。サイクルは何度も何度も反復され、各場合において、ドナーオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの位置が標的配列の３’方向に一塩基ずつ移動する。指定の塩基が常にライゲーション反応の接合部に位置しているため、特異性が従来のライゲーションによるシークエンシングと比べて増大する。
【０１６２】
ドナーオリゴヌクレオチドプローブに、場合によりユニバーサル塩基、例えば限定されないが、５−ニトロインドール、リボ−５’−ニトロインドール、２’−Ｏ−メチル−５−ニトロインドール、イノシン、リボイノシン、２’−Ｏ−メチルリボイノシンおよび３−ニトロピロールを含めてもよい。これにより、アッセイに必要とされる各組における異なるオリゴヌクレオチドの数が、ユニバーサル塩基で置換されたプローブ上の縮重位置ごとに４つ減る。また、該方法に、ライゲーション反応とＲＮａｓｅ  Ｈ２切断工程の間にキャッピング工程を含めてもよい。キャッピング反応は、ＤＮＡポリメラーゼと連鎖停止剤を導入し、これにより、先の工程でドナーオリゴヌクレオチドプローブとライゲーションされなかったアクセプター断片分子（あれば）をキャッピングすることにより行われ得る。
【０１６３】
上記の例では、ライゲーション反応、従ってシークエンシング読出しは５’から３’の方向に１回に一塩基ずつ進行する。あるいは、ドナーオリゴヌクレオチドを、各サイクルで２つの塩基が決定されるように設計してもよい。この場合、ドナーオリゴヌクレオチドの５’末端の最初の２つの塩基を指定する（例えば、ｐＡ−Ｃ−Ｒ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｉ−Ｉ−Ｘ、ここで、Ｒ＝全４種類のＲＮＡ塩基の縮重混合物、Ｎ＝縮重ＤＮＡ塩基、Ｉ＝イノシン、およびＸはフルオロフォアである。）。すべての場合で、ドナーオリゴヌクレオチドとアクセプターとのライゲーションを可能にする５’−リン酸基（ｐ）が存在する。１６のかかるオリゴヌクレオチドの組が必要とされ、各々は、考えられ得る１６種類のジヌクレオチドのものである。１６種類の各々は異なるフルオロフォアで標識され得る。あるいは、ライゲーション反応を、各々が４種類のかかるオリゴヌクレオチドの組を有する４つの別個のプールを用いて行ってもよい。この場合、必要とされる異なるフルオロフォアは４種類だけである。
【０１６４】
５’から３’の方向のシークエンシングのための別の実施形態では、下記の型：ｐＡ−Ｎ−Ｒ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｉ−Ｉ−Ｘ（ここで、ｐ、Ｎ、Ｒ、ＩおよびＸは先の例で規定した通りである。）のドナーオリゴヌクレオチドが使用され得る。各サイクルで一塩基が決定されるが、１、３、５などの交互の位置である。これは、参照データベースと比較すると配列の同定には充分となり得る。所望の場合、残りの塩基（２、４、６位など）は、シークエンシング反応を同じ鋳型で、最初のアクセプターオリゴヌクレオチドを用いて、上流または下流に一塩基ずつシフトさせて反復することにより決定され得る。関連する一例では、下記の型：ｐ−Ａ−Ｆ−ＦＮ−Ｎ−Ｎ−Ｉ−Ｉ−Ｘ（ここで、ｐ、Ｎ、ＩおよびＸは上記に規定した通りであり、Ｆは、全４種類の２’−フルオロヌクレオシドの縮重混合物である。）のドナーオリゴヌクレオチドが使用され得る。ライゲーション後、ＲＮａｓｅ  Ｈ２による切断により、アクセプターの３’末端に２つの塩基（即ち、ＡＦ）の付加がもたらされる。次のライゲーション反応後、アクセプターの３’末端の配列は、…Ａ−Ｆ−Ｓ−Ｆ−Ｆ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｉ−Ｉ−Ｘとなり得、ここで、Ｓは３位の指定の塩基であり、Ｘは、指定の塩基がＡでなかった場合、先のサイクルと異なるフルオロフォアであり得る。次に、ＲＮａｓｅ  Ｈ２での切断が２つの２’−フルオロ残基間で行われる。単独の２’−フルオロ残基でのＲＮａｓｅ  Ｈ２による切断の方がずっとゆっくり起こり、ＲＮａｓｅ  Ｈ２濃度と反応時間を調整することにより回避することができる。
【０１６５】
シークエンシングを３’から５’の方向に進行させる上記の方法の変形法を行ってもよい。この場合、以下のような構造：Ｘ−Ｉ−Ｉ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｆ−Ｆ−Ｓ−ＯＨ（ここで、指定の塩基（Ｓ）はオリゴヌクレオチドの３’末端に存在させる。）のアクセプターオリゴヌクレオチドを各サイクルで添加する。５’末端は、オリゴヌクレオチドがドナーとしての機能を果たさないようにブロックされる。ＲＮａｓｅ  Ｈ２による切断によって、ドナー断片の５’末端が配列ｐＦ−Ｓとなり、これを次のシークエンシングサイクルのために調製する。アクセプターとのライゲーションが起こらなかった場合にドナーオリゴヌクレオチドの５’−リン酸基を除去するためのホスファターゼを使用するキャッピング工程を、サイクルの切断反応の前に含めてもよい。
【０１６６】
さらなる一実施形態では、本発明により、リボ三リン酸（またはＲＮａｓｅ  Ｈ２に対する基質を供給する代替的なアナログ、例えば２’−フルオロヌクレオシド三リン酸）を蛍光標識プライマーとともに使用してＤＮＡシークエンシングの改善をもたらす。当該技術分野で知られた従来のシークエンシング法と同様、三リン酸残基はＤＮＡポリメラーゼによって組み込まれ得る。リボ三リン酸またはＲＮａｓｅ  Ｈ２に対する基質を供給する代替的なアナログの濃度は、ポリメラーゼによって生成される各伸長産物中に平均１つのかかる塩基がランダムに組み込まれるような濃度に調整される。プライマーに由来する断片のネステッドファミリーがＲＮａｓｅ  Ｈ２での切断によって生成し、次いで、標準的なＤＮＡシークエンシング法の場合のように電気泳動によって分離される。あるいは、多数のＲＮＡ残基または修飾ヌクレオシド、例えば２’−フルオロヌクレオシドを伸長産物に組み込んでもよく、その後のＲＮａｓｅ  Ｈ２での消化は、平均、各鎖が１回だけ切断されるように制限する。４つの別個の反応を実施し、各々で、塩基の１つが異なるリボ三リン酸（Ａ、Ｃ、ＴもしくはＧ）または他のＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性アナログで置換される。このアッセイでは、高価な蛍光標識ジデオキシ三リン酸連鎖停止剤の使用が不要になる。
【０１６７】
次世代ＤＮＡシークエンシング（ＮＧＳ）
現代の次世代シークエンシング（ＮＧＳ）法は、典型的には、標的核酸試料の部分断片のＰＣＲ増幅の後、実際のシークエンシング反応および塩基同一性インテロゲーションを行うことを伴うものである。ＳＮＰ部位に隣接している領域の選択的増幅は、本発明のＲＮａｓｅ  Ｈ２法でのブロック型切断性プライマーを用いて行われ得、ＮＧＳ解析へのインプットのための配列が富化される。さらに、ＮＧＳ法は、多くの特定の目的配列を富化させるためにマルチプレックスＰＣＲ反応の必要性を伴う場合があり得、プライマーダイマーおよび他の不要な反応が生じ得、これらは、不要な断片をシークエンシングワークフローに寄与させ、有用な情報量を減少させ、コストを増大させ、スループットを低下させる。このような不要な副反応は、本発明のＲＮａｓｅ  Ｈ２法でのブロック型切断性プライマーを用いて抑制され得る。典型的には、ＮＧＳのワークフローの一部として行われるＰＣＲ増幅では高忠実度ＤＮＡポリメラーゼが使用され、これは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼよりも１０から１００倍低い塩基組込みエラー率を有するものであり得る。多くの高忠実度ＤＮＡポリメラーゼは３’−エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有し、これにより、一部の場合では、非ヌクレオチドブロッキング基が修飾プライマーの３’末端から除去され得る。一部の特定の設計のブロック型切断性プライマー、特に、内部鋳型ブロッキング基（例えば、内部Ｃ３スペーサー）を有し、未修飾ＤＮＡの３’末端を有するものは、高忠実度ポリメラーゼの３’−エキソヌクレアーゼ活性によって認識されず、ブロック型切断性プライマーおよびＲＮａｓｅ  Ｈ２を高忠実度ＤＮＡポリメラーゼが使用される増幅反応と関連させて使用することが可能である（実施例３９および４０参照）。
【０１６８】
オリゴヌクレオチドの合成
本発明の別の実施形態では、オリゴヌクレオチド合成のための改善された方法を提供する。上記のものと同様の手法を使用し、アクセプター断片の３’末端にさらなる塩基を付加するためにドナーオリゴヌクレオチドとしての機能を果たす組成物をアクセプター断片にライゲーションさせ得る。合成を受ける成長ポリヌクレオチドはアクセプター断片である。この場合、ドナー断片組成物は、好ましくは、ヘアピンを形成して３’末端に約１から８塩基の突出端を有する二本鎖領域をもたらす一本鎖オリゴヌクレオチドである。５’末端の塩基は、成長アクセプター断片に付加させる所望の塩基であり得る。全４種類の塩基（Ａ、Ｃ、ＴおよびＧ）を含むポリヌクレオチドの合成のためには、５’塩基が異なる以外は同一の配列を有するものであり得る４種類の異なるドナー断片が使用される。好ましくは、ドナーは３’末端がブロックされており、このためアクセプターとして反応できない。ドナーの３’末端またはこの付近に位置するブロッキング基は、反応のモニタリングを可能にする標識であってもよい。ドナーの５’末端の４種類の異なる塩基に対応する４種類の異なる標識が使用され得る。５’末端の所望の塩基に隣接している塩基はＲＮＡ塩基またはＲＮａｓｅ  Ｈ２に対する基質を供給する代替的なアナログ、例えば２’−フルオロヌクレオシドである。３’末端の突出端はランダム（縮重）塩基またはユニバーサル塩基または両方の組合せであり得る。ドナー断片はアクセプター断片に、アクセプターの３’末端とドナーオリゴヌクレオチドの３’−突出端とのハイブリダイゼーションによって結合する。次いで、ＤＮＡリガーゼ酵素を用いてこの２つの断片を連接する。次に、ＩＩ型ＲＮａｓｅ  Ｈを用いて生成物をＲＮａｓｅ  Ｈ２切断部位の５’側で切断し、ドナーの５’塩基をアクセプターの３’末端に転移させる。場合により、ライゲーションされなかったかもしれない成長ポリヌクレオチド鎖の分子を、ＤＮＡポリメラーゼによって触媒されるジデオキシヌクレオチド三リン酸（または他の連鎖停止剤）を用いた反応によってキャッピングする第３の工程を、サイクルのリガーゼ反応とＲＮａｓｅ  Ｈ２切断反応間に含めてもよい。一実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、デオキシヌクレオチドターミナルトランスフェラーゼである。サイクルを反復し、アクセプター断片を５’から３’の方向に伸長させ続けることができる。各工程で成長ポリヌクレオチドの単離を容易にするため、アクセプターを固相支持体に、例えば孔径制御多孔質ガラスまたはポリスチレンに結合させてもよい。
【０１６９】
上記の配列決定法と同様、ドナーオリゴヌクレオチドを用いて、各サイクルでアクセプターの３’末端オリゴヌクレオチドに２つの塩基を付加してもよい。この場合、ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性残基はドナーの５’末端の３’側に位置し得る。この酵素的合成法は長鎖ＤＮＡ分子の合成に特に好都合である。各塩基に対応するヘアピン試薬は、さらなるサイクルまたはさらなる合成での再利用のために収集され得る。系に有機溶媒が使用されないため、廃棄物処理が簡素化される。
【０１７０】
本発明のキット
本発明ではまた、前述の方法における本発明のプライマーおよび他の新規なオリゴヌクレオチドの使用を可能にする、核酸増幅、検出、シークエンシング、ライゲーションまたは合成のためのキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、切断化合物、例えばニッキング酵素またはＲＮａｓｅ  Ｈ酵素が収容された容器；ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはＤＮＡリガーゼが収容された別の容器を含むものであり、好ましくはキットを使用するための使用説明小冊子を存在させる。一部の特定の実施形態では、キットは、ニッキング酵素またはＲＮａｓｅ  Ｈ酵素と併用されるＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼの両方が収容された容器を含むものである。場合により、アッセイに使用される修飾オリゴヌクレオチドを該酵素とともに含めてもよい。アッセイに使用される切断酵素薬剤、ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはＤＮＡリガーゼおよびオリゴヌクレオチドは好ましくは、長期安定性を示す状態で、例えば適切な保存バッファー中または凍結乾燥状態もしくはフリーズドライ状態で保存される。また、キットにさらに、ニッキング剤もしくはＲＮａｓｅ  Ｈ用のバッファー、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼ用のバッファー、または両バッファーを含めてもよい。あるいは、キットにさらに、ニッキング剤またはＲＮａｓｅ  ＨとＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼの両方に適切なバッファーを含めてもよい。バッファーはＲｎａｓｉｎおよび一本鎖リボヌクレアーゼの他のインヒビターを含むものであってもよい。本発明のキットの種々の成分の説明は、本発明の種々の方法に関する先のセクションを見るとよい。
【０１７１】
場合により、キットには、本発明のキットを、本発明の新規なプライマーおよび／または他の新規なオリゴヌクレオチドの存在下で核酸を増幅またはライゲーションするためにどのようにして使用するかに関する情報を提供する使用説明小冊子が内包され得る。一部の特定の実施形態では、情報は、アッセイに使用されるＲＮａｓｅ  Ｈ、ニッキング剤、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼおよびオリゴヌクレオチドをどのようにして使用および／または保存するかに関する１つ以上の説明ならびにニッキング剤またはＲＮａｓｅ  ＨおよびＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼ用のバッファー（１種類または複数種）、適切な反応温度（１つまたは複数）および反応時間（１つまたは複数）などの説明を含む。
【０１７２】
従って、一実施形態では、試料からの核酸の選択的増幅のためのキットを提供する。該キットは
（ａ）第１および第２のオリゴヌクレオチドプライマー、各々は３’末端と５’末端を有し、ここで、各オリゴヌクレオチドは、増幅対象の核酸またはこの相補鎖の一部分に相補的であり、少なくとも一方のオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅ  Ｈ切断性ドメインと、オリゴヌクレオチドの３’末端またはこの付近に連結されたブロッキング基であって、プライマー伸長を抑制するため、および／またはプライマーが反対方向のプライマーから指向されるＤＮＡ合成によってコピーされるのを妨げるためのブロッキング基を含むものである；
（ｂ）ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素；ならびに
（ｃ）核酸を増幅させるための使用説明マニュアル
を備えている。
【０１７３】
場合によりキットにＤＮＡポリメラーゼを含めてもよい。
【０１７４】
さらなる一実施形態では、核酸の選択的増幅のためのキットに、３’末端と５’末端を有し、ＲＮａｓｅ  Ｈ切断性ドメイン、フルオロフォアおよびクエンチャーを含み、該切断性ドメインが該フルオロフォアと該クエンチャー間に位置するオリゴヌクレオチドプローブであって、増幅対象の核酸またはこの相補鎖の一部分に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブを含める。
【０１７５】
また別の実施形態では、本発明は、標的核酸配列の存在下でのアクセプターオリゴヌクレオチドとドナーオリゴヌクレオチドのライゲーションのためのキットに関する。該キットは
（ａ）ドナーオリゴヌクレオチドとアクセプターオリゴヌクレオチド、ここで、該オリゴヌクレオチドの一方または両方は、ＲＮａｓｅ  Ｈ切断性ドメインおよびライゲーションを抑制するブロッキング基を含むものである；
（ｂ）ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素；ならびに
（ｃ）該アクセプターおよび該ドナーオリゴヌクレオチドを標的核酸配列の存在下でライゲーションするための使用説明マニュアル
を備えている。
【０１７６】
さらなる一実施形態では、場合によりキットにＤＮＡリガーゼ酵素を含めてもよい。
【０１７７】
ライゲーション用キットのさらなる一実施形態では、ドナーオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅ  Ｈ切断ドメインを含んでいるが５’末端またはこの付近にブロッキング基がなく、代わりに遊離の５’−ＯＨを有するものである。
【０１７８】
ブロッキング基の設計
幾つかの実施形態において、切断ドメインを含むオリゴヌクレオチドプライマーを提供し、該切断ドメインはＲＮａｓｅ  Ｈ酵素によって切断可能であり、ブロッキング基の５’側に位置する。ブロッキング基は、オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端またはこの付近に連結され得る。ブロッキング基はプライマー伸長を妨げるもの、および／または該オリゴヌクレオチドプライマーがＤＮＡ合成の鋳型としての機能を果たすことを阻害するものである。ブロッキング基は、ＲＤＤＤＤｘ、ＲＤＤＤＤＭｘ、ＲＤｘｘＤ、ＲＤｘｘＤＭ、ＲＤＤＤＤｘｘＤ、ＲＤＤＤＤｘｘＤＭおよびＤｘｘＤからなる群より選択される幾つかの設計のうちの１つを含むものであり得、ここで、ＲはＲＮＡ残基であり、ＤはＤＮＡ残基であり、Ｍはミスマッチ残基であり、ｘはＣ３スペーサーである。Ｍを有するブロッキング基（例えば、ＲＤＤＤＤＭｘ、ＲＤｘｘＤＭ、ＲＤＤＤＤｘｘＤＭ）を含むオリゴヌクレオチドを標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ（ｈｙｂｒｉｚｅ）させて二本鎖基質を形成すると、ミスマッチは、オリゴヌクレオチドのブロッキング基のＭと標的ＤＮＡ配列内のこの対合パートナーの位置に存在する。
【実施例】
【０１７９】
本発明を、以下の実施例を参照することによってさらに説明する。しかしながら、本実施例は、上記の実施形態と同様、例示的であり、可能な本発明の範囲をなんら限定するものと解釈されるべきでないことに注意されたい。
【０１８０】
［実施例１］好熱菌由来の生物体由来のコドン最適化ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素のクローニング
この実施例では、好熱菌由来の生物体由来のコドン最適化ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素のクローニングを記載する。
【０１８１】
潜在的に新しい有用な活性を有する機能性の新規なＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素を探索するため、候補遺伝子を、公衆ヌクレオチド配列リポジトリのゲノム配列がこれまでに決定されている古細菌の超好熱菌から同定した。ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素はいくらかのアミノ酸相同性を共有しており、幾つかの高度に保存され残基の存在を有するが、同定された候補遺伝子間の実際の相同性は低く、これらが機能性のＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素を表すのか、未知の機能の遺伝子であるのか、非機能性のＲＮａｓｅ  Ｈ２遺伝子であるのかは不確かであった。表４に示すように、ＲＮａｓｅ  Ｈ２遺伝子が特性評価されていない２種類の生物体と、ＲＮａｓｅ  Ｈ２遺伝子（ｒｎｈｂ）と機能性タンパク質が同定されており、機能性酵素であることがわかっている陽性対照として使用するための３種類の生物体を含む５つの遺伝子を試験に選択した。特性不明の２つの予測ｒｎｈｂ遺伝子をこの最初の試験に選択したが、多くのさらなる古細菌種はこのゲノム配列が決定されているがこのｒｎｈｂ遺伝子が特性不明であるものも同様に試験され得る。
【０１８２】
【表４】
2016510601.tif 000008
参考文献１から６：１）Ｈａｒｕｋｉ，Ｍ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｋ．，Ｋｏｃｈｉ，Ｔ．，Ｍｕｒｏｙａ，Ａ．，Ｋｏｇａ，Ｙ．，Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｍ．，Ｉｍａｎａｋａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｋａｎａｙａ，Ｓ．（１９９８）超好熱菌の古細菌由来の組換えＲＮａｓｅ  ＨＩＩの遺伝子クローニングおよび特性評価。Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８０，６２０７−６２１４；２）Ｈａｒｕｋｉ，Ｍ．，Ｔｓｕｎａｋａ，Ｙ．，Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｍ．ａｎｄ  Ｋａｎａｙａ，Ｓ．（２００２）単一のリボヌクレオチドを含むＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡキメラ基質のＤＮＡ−ＲＮＡ接合部における原核生物ＲＮａｓｅｓ  ＨＩＩでの切断。ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，５３１，２０４−２０８；３）Ｍｕｋａｉｙａｍａ，Ａ．，Ｔａｋａｎｏ，Ｋ．，Ｈａｒｕｋｉ，Ｍ．，Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｍ．ａｎｄ  Ｋａｎａｙａ，Ｓ．（２００４）超耐熱性細菌由来の速度論的にロバストな単量体タンパク質。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４３，１３８５９−１３８６６  ４）Ｓａｔｏ，Ａ．，Ｋａｎａｉ，Ａ．，Ｉｔａｙａ，Ｍ．ａｎｄ  Ｔｏｍｉｔａ，Ｍ．（２００３）超好熱菌の古細菌ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）から精製したＲＮａｓｅ  ＨＩＩおよびＦＥＮ−１による岡崎断片プロセッシングのための協同的調節。Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，３０９，２４７−２５２；５）Ｌａｉ，Ｂ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｃａｏ，Ａ．ａｎｄ  Ｌａｉ，Ｌ．（２００３）メタノコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ＲＮａｓｅ  ＨＩＩの金属イオン結合および酵素的機構。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２，７８５−７９１；および６）Ｌａｉ，Ｌ．，Ｙｏｋｏｔａ，Ｈ．，Ｈｕｎｇ，Ｌ．Ｗ．，Ｋｉｍ，Ｒ．ａｎｄ  Ｋｉｍ，Ｓ．Ｈ．（２０００）古細菌ＲＮａｓｅ  ＨＩＩ：ヒト主要ＲＮａｓｅ  Ｈのホモログの結晶構造。Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８，８９７−９０４．
【０１８３】
上記に示したｒｎｈｂ遺伝子にコードされたタンパク質の予測される物性を表５に示す（Ｐａｃｅ，Ｃ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，４，ｐ．２４１１）。
【０１８４】
【表５】
2016510601.tif 000009
【０１８５】
この５つの配列の組内での異なる古細菌種に由来するＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素（または候補酵素）間のアミノ酸類似性は３４％から６５％の範囲である。アミノ酸同一性のマトリックスを以下の表６に示す。
【０１８６】
【表６】
2016510601.tif 000010
【０１８７】
天然遺伝子配列のコドンを、標準的なコドン使用頻度表を用いて大腸菌での発現に対して最適化した。以下の配列を、標準的な方法を用いて合成オリゴヌクレオチドから作製した人工遺伝子としてアセンブリングし、プラスミド内にクローニングした。ＤＮＡ配列同一性を両鎖において検証した。人工ＤＮＡ構築物の配列を以下に示す。小文字は、５’末端にＢａｍ  ＨＩ部位および３’末端にＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位を含むリンカー配列を表す。大文字はコード配列を表し、ＡＴＧ開始コドンに下線を付している。
【０１８８】
配列番号１  −ピロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）由来のコドン最適化ｒｎｈｂ遺伝子
【化４】
2016510601.tif 000011
【０１８９】
配列番号２  −ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来のコドン最適化ｒｎｈｂ遺伝子
【化５】
2016510601.tif 000012
【０１９０】
配列番号３  −メタノカルドコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）由来のコドン最適化ｒｎｈｂ遺伝子
【化６】
2016510601.tif 000013
【０１９１】
配列番号４  −ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｉｉ）由来のコドン最適化ｒｎｈｂ遺伝子
【化７】
2016510601.tif 000014
【０１９２】
配列番号５  −スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）由来のコドン最適化ｒｎｈｂ遺伝子
【化８】
2016510601.tif 000015
【０１９３】
［実施例２］組換えＲＮａｓｅ  Ｈ２ペプチドの発現
以下の実施例は、組換えＲＮａｓｅ  Ｈ２ペプチドの発現を示す。
【０１９４】
実施例１の５つの合成遺伝子配列を、特有のＢａｍ  ＨＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限部位を用いて細菌発現ベクターｐＥＴ−２７ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）内にサブクローニングした。このベクターには、発現されたペプチドのカルボキシ末端に（終止コドンに続いて）６つのヒスチジン残基（これが一緒になって「Ｈｉｓ−タグ」を構成する。）（配列番号３１３）が位置している。「Ｈｉｓ−タグ」により、当業者によく知られた方法であるＮｉアフィニティクロマトグラフィーを使用する組換えタンパク質の迅速で簡単な精製の使用が可能になる。あるいは、合成遺伝子を、Ｈｉｓ−タグなしの天然形態内で発現させ、サイズ排除クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィーまたは同様に当業者によく知られた他のかかる方法を用いて精製させ得る。
【０１９５】
ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を各プラスミドで形質転換し、０．５ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を用いて２５℃で４．５時間誘導した。すべてのクローンについて、５ｍＬのＩＰＴＧ誘導培養物を、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ（Ｒ）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ＲｅａｇｅｎｔおよびＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｒ）Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で製造業者の使用説明書に従って処理して可溶性タンパク質を放出させ、核酸を分解させた。回収したタンパク質を、製造業者によって示されたプロトコルに従ってＮｉアフィニティカラム（Ｎｏｖａｇｅｎ）に通し、１Ｍイミダゾール含有バッファーで溶出した。
【０１９６】
溶菌液の「全」画分と「可溶性」画分の両方を、ＳＤＳ１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて調べた。タンパク質をクマシーブルー染色で可視化した。ＩＰＴＧ誘導後、大量の組換えタンパク質が５つのすべての古細菌の  ＲＮａｓｅ  Ｈ２合成遺伝子から生成した。この精製方法を使用し、可溶性画分のタンパク質が４種類の酵素ピロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）およびピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）から回収された。スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２では、この溶解手順を用いて可溶性タンパク質が回収されなかった。誘導されたＲＮａｓｅ  Ｈ２タンパク質の例を図４Ａおよび４Ｂに示す。
【０１９７】
組換えタンパク質を作製および精製し、特性評価のために小規模量の該タンパク質を得るための改善された方法を以下のようにして開発した。各クローンで得られる可溶性タンパク質の量を最大限にするため、３７℃の誘導温度を６時間使用する。ピロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）およびスルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）では、ＣｅｌＬｙｔｉｃ（商標）Ｂ  １０×溶解試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を溶解に使用する。５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．９中の１０倍希釈液を作製し、誘導培養物由来のペレット化細菌ペースト０．５ｇあたり１０ｍＬを使用する。ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）およびピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）では、誘導培養物１００ｍＬあたり５ｍＬのＢｕｇｂｕｓｔｅｒ（Ｒ）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を細胞溶解に使用する。また、全クローンで誘導培養物１００ｍＬあたり、５ＫＵのｒＬｙｓｏｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ）および２５０ＵのＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を、菌体溶解を向上させるため、および溶液の粘度を下げるために使用する。遠心分離で細胞残屑を除去した後、ライセートを７５℃で１５分間加熱し、存在するＤＮａｓｅ  Ｉおよび他の細胞内ヌクレアーゼ（あれば）を失活させる。次いでライセートを１６，０００×ｇで２０分間スピンし、加熱処理後に変性したタンパク質を沈降させる。遠心分離工程単独で、組換え耐熱性酵素の高度な機能精製がもたらされる。
【０１９８】
得られた可溶性上清みを、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ（Ｒ）Ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を含有するＮｉアフィニティカラムに通し、２００ｍＭのイミダゾールを含有する溶出バッファーで溶出する。精製されたタンパク質を次いで、７０％硫酸アンモニウムの存在下で沈殿させ、保存バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０％グリセロール）中に再縣濁させ、タンパク質を長期保存のために濃縮して安定化させる。濃縮したタンパク質は同じ保存バッファーに対して２×２時間（各々×２５０容量）透析して残留塩を除去する。最終の精製タンパク質を−２０℃で保存する。このようなプロトコルを使用し、ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｉｉ）では、２００ｍＬのＩＰＴＧ誘導培養物から約２ｍｇの可溶性タンパク質が得られる。Ｎｉカラムに通した後、約０．７ｍｇの純粋なタンパク質が回収される。機能使用のため、濃縮酵素ストックを保存バッファー中で希釈し、試験したすべての酵素反応において１：１０で添加した。従って、すべての反応バッファーは０．０１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および５％のグリセロールを含有している。
【０１９９】
上記に概要を示したクローニングＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素の各々について組換えタンパク質を作製し、精製した。ピロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）およびスルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）由来の試料を、ＳＤＳ１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて調べた。タンパク質はクマシーブルー染色で可視化した。結果を図５に示す。発現および精製の方法が予測どおりに機能した場合、これらのタンパク質にはすべて、６×ヒスチジンタグ（配列番号３１３）が含まれているはずであり、これは、抗Ｈｉｓ抗体を用いてウエスタンブロットによって検出され得る。図５に示すゲルはナイロン膜に転写されたエレクトロブロットであり、ウエスタンブロットは抗Ｈｉｓ抗体を用いて行った。結果を図６に示す。組換えタンパク質はすべて抗Ｈｉｓ抗体によって認識され、所望の組換えタンパク質種が作製および精製されたことが示された。
【０２００】
組換えタンパク質の大規模調製物は、当業者によく知られた微生物発酵手順を用いてより良好に発現させることができる。熱処理の後、遠心分離して変性タンパク質を沈降させると相当な精製がもたらされ、最終の精製は、Ｈｉｓ−タグの必要またはＮｉ−アフィニティクロマトグラフィーの使用なしで、サイズ排除またはアニオン交換クロマトグラフィーを用いて行われ得る。
【０２０１】
［実施例３］組換えペプチドのＲＮａｓｅ  Ｈ２活性
以下の実施例は、組換えペプチドのＲＮａｓｅ  Ｈ２活性を示す。
【０２０２】
ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素はＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖内のＲＮＡ残基を切断する。少なくとも４つの連続するＲＮＡ残基が存在する場合、ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素はすべて、この種の基質を切断し得る。ＲＮａｓｅ  Ｈ１酵素は、キメラＲＮＡ／ＤＮＡ種のＲＮＡ「域」を４残基未満に短くすると急速に活性を失う。他方、ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素は、単一のＲＮＡ残基のみを含むＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖を切断することができる。すべての場合において、切断生成物は３’−ヒドロキシルと５’−リン酸基を含むものである（図１参照）。多数のＲＮＡ残基が存在する場合、切断はＲＮＡ塩基間で起こり、ＲＮＡ−リン酸間結合が切断される。単一のＲＮＡ残基しか存在しない場合、切断はＩＩ型ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素でしか起こらない。この場合、切断はＲＮＡ塩基の５’側のＤＮＡ−リン酸結合において起こる（図３参照）。ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素は二価の金属イオン補因子の存在を必要とする。典型的には、ＲＮａｓｅ  Ｈ１酵素はＭｇ＋＋イオンの存在を必要とするが、ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素は任意の幾つかの２価のカチオン、例えば限定されないがＭｇ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｃｏ＋＋およびＮｉ＋＋を伴って機能を果たすことができる。
【０２０３】
実施例２に記載の組換えＲＮａｓｅ  Ｈ２タンパク質を両方の型のＲＮａｓｅ  Ｈ活性について試験し、上記に示した特徴について調べた。
【０２０４】
多数のＲＮＡ塩基を有する基質の切断。以下の合成３０ｂｐ基質を使用し、これらの酵素の長いＲＮＡドメインの切断に対する活性を試験した。基質は、一方の鎖に１１個のＤＮＡ塩基、８個のＲＮＡ塩基および１１個のＤＮＡ塩基と他方の鎖としてパーフェクトマッチＤＮＡ相補鎖を有する「１１−８−１１」設計である。使用したオリゴヌクレオチドを以下に示し、ここで、大文字はＤＮＡ塩基を表し、小文字はＲＮＡ塩基を表す。
【０２０５】
配列番号６
【化９】
2016510601.tif 000016
【０２０６】
配列番号７
【化１０】
2016510601.tif 000017
【０２０７】
アニーリングさせると、これらの一本鎖（ｓｓ）オリゴヌクレオチドは以下の「１１−８−１１」二本鎖（ｄｓ）基質を形成する：
【０２０８】
配列番号６および７はそれぞれ、出現順に
【化１１】
2016510601.tif 000018
【０２０９】
各組換えタンパク質生成物のアリコートを一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド基質とともに、８０μｌ反応容量で、バッファー５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０中にて４５℃または７０℃で２０分間インキュベートした。反応を、ゲル負荷バッファー（ホルムアミド／ＥＤＴＡ）の添加によって停止させ、変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ゲルを、ＧｅｌＳｔａｒ（商標）（Ｌｏｎｚａ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）を用いて染色し、ＵＶ励起によって可視化した。５種類の組換えペプチドすべてで、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖（１１−８−１１）基質内の８塩基ＲＮＡ配列の切断能が示された。重要なことに、組換えタンパク質は一本鎖ＲＮＡ含有オリゴヌクレオチド（配列番号６）を分解せず、二本鎖基質が必要とされることが示された。さらに、ｄｓＤＮＡ基質は切断されなかった。
【０２１０】
２価のカチオンの非存在下では切断は観察されなかった（例えば、Ｍｇ＋＋が反応バッファー中に存在しない場合、活性は観察されなかった。）。Ｍｇ＋＋滴定を行い、高い酵素活性が２から８ｍＭのＭｇＣｌ２で観察された。最適な活性が３から６ｍＭのＭｇＣｌ２で観察された。また、切断活性を他の２価のカチオン、例えばＭｎ＋＋およびＣｏ＋＋を用いて検出した。ＭｎＣｌ２では、良好な活性が０．３ｍＭから１０ｍＭの２価カチオン濃度で見られた。酵素活性は３００ｎＭから１ｍＭの範囲で最適であった。ＣｏＣｌ２では、活性は０．３ｍＭから２ｍＭの範囲で見られ、最適な活性は０．５から１ｍＭの範囲であった。従って、単離したこれらの酵素は、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性およびＲＮａｓｅ  Ｈ２クラスに特徴的な２価のカチオン要件を示すものである。
【０２１１】
ピロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）およびピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）由来の組換えＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素による１１−８−１１基質の消化を図７に示す。
【０２１２】
ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素による基質切断により、３’−ＯＨと５’−リン酸基を有する生成物がもたらされることが予測される。これらの新しい組換えＲＮａｓｅ  Ｈ２タンパク質による反応生成物の実体を質量分析によって調べた。エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）は、このサイズの核酸断片のほぼ単一のドルトンの分解度を有する（＋／−０．０２％の精度）。オリゴヌクレオチド１１−８−１１基質（配列番号６および７）をＥＳＩ−ＭＳによって、消化の前と後の両方で、３種類のピロコッカス属の種のＲＮａｓｅ  Ｈ酵素を用いて調べた。主な質量の実測値を表７に、質量の実測値と整合する核酸種の同定とともに報告する。
【０２１３】
【表７】
2016510601.tif 000019
【０２１４】
同定された主な種を示す。ＤＮＡ塩基を大文字で示し、ＲＮＡ塩基小文字で示し、リン酸部＝「Ｐ」である。分子量は丸めを行って最近似値のドルトンにしている。他に表示がない場合、核酸鎖は５’−ヒドロキシルまたは３’−ヒドロキシルで終結している。
【０２１５】
すべての場合において、ＤＮＡ相補鎖がインタクトな状態（分解なし）で観察された。ＲＮＡ含有鎖は効率的に切断され、反応生成物の質量の実測値は、生成した主要断片である以下の種：１）未消化ＤＮＡ残基と単一の３’−ＲＮＡ残基を含み、３’−ヒドロキシル基を有するものであった種（配列番号８）、および２）５’−リン酸基、単一の５’−ＲＮＡ残基および未消化ＤＮＡ残基を有する種（配列番号９）と整合する。観察された反応生成物は、ＲＮａｓｅ  Ｈ１およびＲＮａｓｅ  Ｈ２の両酵素の既知の切断特性と整合する。
【０２１６】
【化１２】
2016510601.tif 000020
【０２１７】
【化１３】
2016510601.tif 000021
【０２１８】
単一のＲＮＡ塩基を有する基質の切断．ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素は単一のＲＮＡ残基を含む基質を特徴的に切断するが、ＲＮａｓｅ  Ｈ１酵素は切断することができない。以下の合成３０ｂｐ基質を使用し、これらの酵素の単一のＲＮＡ残基での切断に対する活性を試験した。基質は、一方の鎖に１４個のＤＮＡ塩基、１個のＲＮＡ塩基および１５個のＤＮＡ塩基と他方の鎖としてパーフェクトマッチＤＮＡ相補鎖を有する「１４−１−１５」設計である。４種類の異なる基質を４つのＲＮＡ塩基：Ｃ、Ｇ、ＡおよびＵの各々を含む８成分一本鎖オリゴヌクレオチドから作製した。使用したオリゴヌクレオチドを以下に示し、ここで、大文字はＤＮＡ塩基を表し、小文字はＲＮＡ塩基を表す。
【０２１９】
ｒＣについて：
【０２２０】
配列番号１０
【化１４】
2016510601.tif 000022
【０２２１】
配列番号１１
【化１５】
2016510601.tif 000023
【０２２２】
アニーリングさせると、これらの一本鎖（ｓｓ）オリゴヌクレオチドは、以下の「１４−１−１５  ｒＣ」二本鎖（ｄｓ）基質を形成する：
【０２２３】
配列番号１０および１１はそれぞれ、出現順に
【化１６】
2016510601.tif 000024
【０２２４】
ｒＧについて：
【０２２５】
【化１７】
2016510601.tif 000025
【０２２６】
【化１８】
2016510601.tif 000026
【０２２７】
アニーリングさせると、これらの一本鎖（ｓｓ）オリゴヌクレオチドは、以下の「１４−１−１５  ｒＧ」二本鎖（ｄｓ）基質を形成する：
【０２２８】
配列番号１２および１３はそれぞれ、出現順に
【化１９】
2016510601.tif 000027
【０２２９】
ｒＡについて：
【化２０】
2016510601.tif 000028
【化２１】
2016510601.tif 000029
【０２３０】
アニーリングさせると、これらの一本鎖（ｓｓ）オリゴヌクレオチドは、以下の「１４−１−１５  ｒＡ」二本鎖（ｄｓ）基質を形成する：
【０２３１】
配列番号１４および１５はそれぞれ、出現順に
【化２２】
2016510601.tif 000030
【０２３２】
ｒＵについて：
【０２３３】
配列番号１６
【化２３】
2016510601.tif 000031
【０２３４】
配列番号１７
【化２４】
2016510601.tif 000032
【０２３５】
アニーリングさせると、これらの一本鎖（ｓｓ）オリゴヌクレオチドは、以下の「１４−１−１５  ｒＵ」二本鎖（ｄｓ）基質を形成する：
【０２３６】
配列番号１６および１７はそれぞれ、出現順に
【化２５】
2016510601.tif 000033
【０２３７】
各組換えタンパク質生成物のアリコートを上記に示した一本鎖および二本鎖オリゴヌクレオチド基質とともに、８０μｌ反応容量で、バッファー５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０中にて７０℃で２０分間インキュベートした。反応を、ゲル負荷バッファー（ホルムアミド／ＥＤＴＡ）の添加によって停止させ、変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ゲルを、ＧｅｌＳｔａｒ（商標）（Ｌｏｎｚａ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）を用いて染色し、ＵＶ励起によって可視化した。５種類の組換えペプチドすべてで、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖（１４−１−１５）内の単一のＲＮＡ塩基の切断能が示された。４つのＲＮＡ塩基の各々は、これらの酵素による切断性基質としての機能を果たした。重要なことに、これらの組換えタンパク質は一本鎖ＲＮＡ含有オリゴヌクレオチド（配列番号１０、１２、１４、１６）を分解せず、二本鎖基質が必要とされることが示された。従って、単離したこれらの酵素はＲＮａｓｅ  Ｈ２活性を示すものである。２価のカチオンの滴定を試験し、結果は、８−１１−８基質を用いて先で得られたものと同一であった。
【０２３８】
ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）およびメタノカルドコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）由来の組換えＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素による４種類の１４−１−１５基質（配列番号１０〜１１、１２〜１３、１４〜１５および１６〜１７）ならびに１１−８−１１基質（配列番号６および７）の消化を図８Ａに、ピロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）については図８Ｂに示す。
【０２３９】
ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素による基質切断により、３’−ＯＨと５’−リン酸基を有する生成物がもたらされることが予測される。さらに、単一のリボヌクレオチドを含む基質のＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素による切断は、ＲＮＡ残基の５’側のＤＮＡ結合において特徴的に起こる。単一のリボヌクレオチド基質を用いたこれらの新しい組換えＲＮａｓｅ  Ｈ２タンパク質による反応生成物の実体を質量分析によって調べた。オリゴヌクレオチド１４−１−１５  ｒＣ基質（配列番号１０および１１）をＥＳＩ−ＭＳによって、消化の前と後の両方で、３種類のピロコッカス属の種のＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素およびメタノカルドコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）酵素を用いて調べた。主な質量の実測値を表８に、質量の実測値と整合する核酸種の同定とともに報告する。
【０２４０】
【表８】
2016510601.tif 000034
【０２４１】
同定された主な種を示す。ＤＮＡ塩基を大文字で示し、ＲＮＡ塩基小文字で示し、リン酸部＝「Ｐ」である。分子量は丸めを行って最近似値のドルトンにしている。他に表示がない場合、核酸鎖は５’−ヒドロキシルまたは３’−ヒドロキシルで終結している。
【０２４２】
すべての場合において、ＤＮＡ相補鎖がインタクトな状態（分解なし）で観察された。ＲＮＡ含有鎖は効率的に切断され、反応生成物の質量の実測値は、生成した主要断片である以下の種：１）未消化ＤＮＡ残基を含み、３’−ヒドロキシルを有するものであった種（配列番号１８）、および２）５’−リン酸基、単一の５’−ＲＮＡ残基および未消化ＤＮＡ残基を有する種（配列番号１９）と整合する。観察された反応生成物は、ＲＮａｓｅ  Ｈ２クラス酵素の既知の切断特性と整合する。
【０２４３】
配列番号１８
【化２６】
2016510601.tif 000035
【０２４４】
配列番号１９
【化２７】
2016510601.tif 000036
【０２４５】
要約すると、５種類の古細菌種に由来するＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素をコードしていると予測されたクローニングしたコドン最適化ｒｎｈｂ遺伝子ですべて、ＲＮａｓｅ  Ｈ２ファミリーの構成員で予測されるものと整合する酵素活性を示す組換えタンパク質生成物が生成した。１）酵素は機能を果たすのに２価のカチオンを必要とした（ここに示した実験はＭｇ＋＋を用いて行った。）。また、Ｍｎ＋＋またはＣｏ＋＋イオンの使用でも活性が存在する；２）一本鎖核酸は分解されない；３）二本鎖ヘテロ二本鎖核酸は、一方の鎖が１つ以上のＲＮＡ塩基を含む基質である；４）２つ以上の連続するＲＮＡ塩基を含む基質では、切断はＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ内のＲＮＡ間結合において起こる；単一のＲＮＡ塩基を含む基質では、切断はＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ内のＲＮＡ塩基のすぐ５’側のＤＮＡ結合において起こる；および６）反応生成物は３−ヒドロキシルと５’−リン酸基を有する。
【０２４６】
［実施例４］ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２の反応温度の最適化および熱安定性
この実施例およびその後のすべての作業では、酵素の使用量は、以下の単位の定義に基づいて標準化した。ここで：
１単位は、４ｍＭのＭｇ２＋を含むｐＨ８．０のバッファー中、７０℃で１分間に、単一のｒＣ残基を含むヘテロ二本鎖基質が１ナノモル切断される酵素の量と定義する。
【０２４７】
基質配列番号１０および１１を、単位濃度を正規化する目的のためのＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素調製物の特性評価に使用した。特に記載のない限り、以下の標準化バッファーを使用した。「Ｍｇ切断バッファー」：４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、および３００ｎＭオリゴ−ｄＴ（２０ｍｅｒ  ｐｏｌｙ−ｄＴ  オリゴヌクレオチド）。ＢＳＡおよびオリゴ−ｄＴは、プラスチックチューブで非特異的結合部位を飽和させ、実施されるアッセイの定量性を改善するために使用する。
【０２４８】
精製組換えピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素を熱安定性について試験した。酵素のアリコートを９５℃で種々の期間インキュベートし、次いで、単一のｒＣを含有する基質（配列番号１０および１１）を切断するために使用した。基質のＲＮＡ鎖を、６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌのγ−３２Ｐ−ＡＴＰおよび酵素Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（Ｏｐｔｉｋｉｎａｓｅ，ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて３２Ｐで放射性標識した。追跡標識を反応混合物に添加した（１：５０）。反応を、１００ｎＭの基質を１００マイクロ単位（μＵ）の酵素とともにＭｇ切断バッファー中で用いて行った。反応液を７０℃で２０分間インキュベートした。反応生成物を、変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて分離し、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｙｃｌｏｎｅ（商標）Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ホスフォイメージャー）を用いて可視化した。各バンドの相対強度を、製造業者の画像解析ソフトウェアを用いて定量し、結果を、切断された全基質に対する割合としてプロットした。結果を図９に示す。酵素は９５℃において３０分間を超えて充分な活性を保持していた。活性は、４５分間のインキュベーション後５０％まで、８５分間のインキュベーション後１０％まで低下した。
【０２４９】
このような結果は、ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素が、９５℃での長時間インキュベーションに耐えるのに充分に耐熱性であり、従って、ＰＣＲ反応で典型的に使用される条件に耐え得ることを示す。
【０２５０】
次に、ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素の活性の温度依存性を特性評価した。活性は３０℃から７０℃までの４０℃の温度範囲にわたって試験した。ｒＣ基質（配列番号１０および１１）のＲＮＡ鎖を上記のようにして放射性標識した。反応を、１００ｎＭの基質を２００マイクロ単位（μＵ）の酵素とともにＭｇ切断バッファー中で用いて行った。反応液を、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃または７０℃で１０分間インキュベートした。反応を、冷ＥＤＴＡ含有ホルムアミドゲル負荷バッファーの添加によって停止させた。次いで反応生成物を、変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて分離し、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｙｃｌｏｎｅ（商標）Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ホスフォイメージャー）を用いて可視化した。得られたゲル画像を図１０に示す。各バンドの相対強度を、製造業者の画像解析ソフトウェアを用いて定量し、結果を、切断された全基質に対する割合としてプロットした（図１１参照）。酵素は、３０℃において約０．１％しか活性を示さず、約５０から６０℃まで認識可能な活性は得られない。
【０２５１】
従って、実際上、該酵素は室温で機能的に不活性である。従って、この酵素を用いた反応は氷上で、またはさらには室温であってもセットアップされ得、温度が上昇するまで反応は進行しない。ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断をＰＣＲ反応と関連させた場合、本明細書において示された温度依存性活性は有効に機能し、修飾ＤＮＡポリメラーゼの非存在下における「ホットスタート」反応形式がもたらされ得よう。
【０２５２】
［実施例５］ＲＮａｓｅ  Ｈ２による非標準塩基の切断
ＲＮａｓｅ  Ｈ１およびＲＮａｓｅ  Ｈ２の天然の生物学的基質は、１つ以上のＲＮＡ残基を含む二本鎖ＤＮＡ配列である。２’位にヒドロキシル（ＲＮＡ）以外の置換を含む修飾塩基は、これらの酵素の基質であることが観察されなかった。以下の実施例は、ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素がＲＮＡ含有修飾基質に対して活性を有することを示す。
【０２５３】
修飾塩基を含む以下の１４−１−１５基質を試験し、ＲＮａｓｅ  Ｈ２が単一の非ＲＮＡ  ２’修飾塩基を切断のための部位として認識し得るかどうかを調べた。修飾は塩基の２’位置に位置し、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２’−Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）および２’−フルオロ（２’Ｆ）を含める；単一のリボ−Ｃ含有基質を陽性対照として使用した。以下、本明細書において、ＬＮＡ塩基は「＋」接頭辞を伴って表示し（＋Ｎ）、２’ＯＭｅ塩基は「ｍ」接頭辞を伴って表示し（ｍＮ）、２’Ｆ塩基は「ｆ」接頭辞を伴って（ｆＮ）、２’−アミノ塩基は「ａ」接頭辞を伴って（ａＮ）表示する。
【０２５４】
リボ−Ｃ基質
【０２５５】
配列番号１０および１１はそれぞれ、出現順に
【化２８】
2016510601.tif 000037
ＬＮＡ−Ｃ基質
【０２５６】
配列番号２０および２７４はそれぞれ、出現順に
【化２９】
2016510601.tif 000038
【０２５７】
２’ＯＭｅ−Ｃ基質
配列番号２１および２７４はそれぞれ、出現順に
【化３０】
2016510601.tif 000039
【０２５８】
２’Ｆ−Ｃ基質
配列番号２２および２７４はそれぞれ、出現順に
【化３１】
2016510601.tif 000040
【０２５９】
上記の４種類の基質を、８０μｌ反応容量で、種々のバッファー中にて７０℃で２０分間、組換えピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素とともにインキュベートした。試験したバッファーは、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０を含み、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＣｏＣｌ２または１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２のいずれかを有するものであった。反応を、ゲル負荷バッファー（ホルムアミド／ＥＤＴＡ）の添加によって停止させ、変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ゲルを、ＧｅｌＳｔａｒ（商標）（Ｌｏｎｚａ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）を用いて染色し、ＵＶ励起によって可視化した。結果を図１２に示す。単一のリボ−Ｃ残基を有する対照基質は１００％切断された。単一のＬＮＡ−Ｃまたは単一の２’ＯＭｅ−Ｃ残基を含む基質は切断されなかった。しかしながら、単一の２’−Ｆ−Ｃ残基を含む基質はわずかな程度、切断された。この切断はマンガン含有バッファー中でのみ起こり、コバルトバッファー中またはマグネシウムバッファー中のいずれかでは見られなかった。
【０２６０】
２’−Ｆ−Ｃ塩基における切断は予想外であった。２’−フルオロ塩基の切断を、以下の基質を用いてさらに調べた。
【０２６１】
リボ−Ｃ基質
【０２６２】
配列番号１０および１１はそれぞれ、出現順に
【化３２】
2016510601.tif 000041
【０２６３】
２’Ｆ−Ｃ基質
配列番号２２および２７４はそれぞれ、出現順に
【化３３】
2016510601.tif 000042
【０２６４】
２’Ｆ−Ｕ基質
配列番号２３および２７５はそれぞれ、出現順に
【化３４】
2016510601.tif 000043
【０２６５】
２’Ｆ−Ｃ＋２’ＦＵ（ｆＣｆＵ）基質
配列番号２４および２７６はそれぞれ、出現順に
【化３５】
2016510601.tif 000044
【０２６６】
上記の４種類の基質を、８０μｌ反応容量で、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０および１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２を含むバッファー中にて７０℃で２０分間、組換えピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素または組換えピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素のいずれかとともにインキュベートした。反応を、ゲル負荷バッファー（ホルムアミド／ＥＤＴＡ）の添加によって停止させ、変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ゲルを、ＧｅｌＳｔａｒ（商標）（Ｌｏｎｚａ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）を用いて染色し、ＵＶ励起によって可視化した。結果を図１３に示す。単一のリボ−Ｃ残基を有する対照基質は１００％切断された。単一の２’−Ｆ−Ｃまたは単一の２’−Ｆ−Ｕ残基を含む基質はわずかな程度、切断された。隣接している２’−Ｆ−Ｃおよび２’−Ｆ−Ｕ残基（ｆＣｆＵ）を含むジ−フルオロ基質はほぼ１００％切断された。さらに、ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）およびピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素はどちらも、修飾基質を同一の様式で切断した。この実施例は、ｆＣ基の予想外の切断がｆＣに限定されず、ｆＵでも起こったことを示す。より重要なことには、２つの連続する２’−フルオロ修飾塩基の組合せはＲＮａｓｅ  Ｈ２のさらに良好な基質であった。この新規な切断特性は、Ｐ．アビシ（ａｂｙｓｓｉ）酵素およびＰ．フリオサス（ｆｕｒｉｏｓｕｓ）酵素の両方で見られた。かかる非定型の基質の切断は、すべての古細菌ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素に共通する特性であり得る。
【０２６７】
ジ−フルオロｆＣｆＵ基質の切断生成物の実体を質量分析を用いて、実施例３に記載の方法を使用して試験した。従来のリボヌクレオチド基質を使用すると、ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素による切断により、３’−ＯＨと５’−リン酸基を有する生成物がもたらされる。ｆＣｆＵ基質（配列番号２４および２７６）を消化の前と後の両方でＥＳＩ−ＭＳにより、組換えピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素によって調べた。主な質量の実測値を表９に、質量の実測値と整合する核酸種の同定とともに報告する。
【０２６８】
【表９】
2016510601.tif 000045
同定された主な種を示す。ＤＮＡ塩基を大文字で示し、２’−Ｆ塩基をｆＣまたはｆＵとして示し、リン酸部＝「Ｐ」である。分子量は丸めを行って最近似値のドルトンにしている。他に表示がない場合、核酸鎖は５’−ヒドロキシルまたは３’−ヒドロキシルで終結している。
【０２６９】
質量分析データは、ジ−フルオロ基質、例えば上記で試験したｆＣｆＵ二本鎖のＲＮａｓｅ  Ｈ２による消化により、２つのフルオロ塩基間の切断がもたらされることを示す。さらに、反応生成物は、ＲＮＡ含有基質の消化で得られる生成物と同様、３’−ヒドロキシルと５’−リン酸基を含むものである。
【０２７０】
修飾塩基の切断は２価のカチオンの非存在下では観察されなかった。滴定を行い、酵素活性が０．２５から１０ｍＭのＭｎＣｌ２および０．２５から１．５ｍＭのＣｏＣｌ２で観察された。酵素活性はＭｎＣｌ２およびＣｏＣｌ２の両方で、０．５ｍＭから１ｍＭの範囲で最適であった。以下、本明細書において、０．６ｍＭのＭｎＣｌ２または０．５ｍＭのＣｏＣｌ２を反応において使用した。Ｍｇバッファーの使用では、修飾基質の切断に対する活性の低下が観察された。全体的に、Ｍｎバッファーの使用はジ−フルオロ（ｆＮｆＮ）基質の切断に対して最適な活性が観察されたが、リボヌクレオチド（ｒＮ）基質の切断に対してはＭｇバッファーの方が卓越していた。
【０２７１】
ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素が単一または２つの２’−Ｆ塩基において切断できる能力は予想外であった。次に、ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素を、さらにさまざまな修飾基質を切断する能力について、上記と同じ方法を用いてこの実施例で試験した。基質の修飾鎖を上記のようにして放射性標識した。反応を、１００ｎＭの基質と４８０から１０００ｍＵの組換え酵素をＭｎ切断バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．６ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中で用いて行った。反応液を７０℃で２０分間インキュベートした。反応生成物を、変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて分離し、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｙｃｌｏｎｅ（商標）Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ホスフォイメージャー）を用いて可視化した。各バンドの相対強度を、製造業者の画像解析ソフトウェアを用いて定量し、切断された全基質に対する割合としてプロットした結果を表１０に示す。
【０２７２】
【表１０】
2016510601.tif 000046
【０２７３】
上記の結果から、これまで認識されていなかった多くの異なる２’修飾がＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素によって切断され得ることが明らかである。２’修飾基質のうち、ジ−フルオロ化合物（２つの連続する２’−フルオロ塩基を有するもの）が最も活性であった。３つまたは４つの連続する２’−フルオロ塩基を有する幾つかのものなどのさらなる基質を試験した。２’−フルオロ含有量を２残基より多くに増大させると、活性の増大は見られなかった。
【０２７４】
同様の一連の実験を、より少ない量の酵素を用いて行った。以下の実験を、先で使用した４８０ｍＵの代わりに１４８μＵの組換えピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２を使用し（３０００倍少ない酵素）、バッファーは２価のカチオンの混合物（３ｍＭ  ＭｇＣｌ２＋０．６ｍＭ  ＭｎＣｌ２）を含むものにしたこと以外は同一のプロトコルを用いて実施した。この条件下では、単一のリボヌクレオチド残基を含む基質は完全に切断されるが、修飾基質は切断されない。結果を表１１に示す。ＲＮａｓｅ  Ｈ２は、ＲＮＡ塩基を含む基質の切断において２’修飾塩基の切断よりも活性である。
【０２７５】
【表１１】
2016510601.tif 000047
【０２７６】
従って、ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２は、ＲＮＡ塩基は全く含まないが代わりに２’修飾塩基を含む基質を切断するために使用され得る。試験した化合物のうち、ジ−フルオロ（ｆＮｆＮ）含有基質の性能が最良であった。修飾基質の使用は一般的に、酵素の増量を必要とするが、該酵素は触媒的に非常に強力であり、ジ−フルオロ基質の１００％切断を得るのに充分な酵素を使用することに困難性は示されない。
【０２７７】
この実施例に記載した２’修飾基質は、典型的なＲＮａｓｅ酵素による切断を受けにくい。このため、この基質は、切断事象がＲＮａｓｅ  Ｈ２によって媒介され、他のＲＮａｓｅ酵素、特に一本鎖リボヌクレアーゼによる切断に完全に抵抗性の基質が使用される新規なアッセイ形式において使用され得る。
【０２７８】
［実施例６］ジ−フルオロｆＮｆＮ基質の切断に対する塩基の優先性
以下の実施例は、考えられ得る１６種類すべての２’−フルオロジヌクレオチドがＲＮａｓｅ  Ｈ２によって切断され得ることを示す。相違する塩基の優先性を観察する。
【０２７９】
各基質の修飾鎖を上記のようにして放射性標識した。反応を、１００ｎＭの基質を２５ｍＵの組換え酵素とともにＭｎ切断バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．６ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中で用いて行った。反応液を７０℃で２０分間インキュベートした。反応生成物を、変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて分離し、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｙｃｌｏｎｅ（商標）Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ホスフォイメージャー）を用いて可視化した。各バンドの相対強度を定量し、切断された全基質に対する割合としてプロットした結果を図１４に示す。酵素量を、低活性の基質に対する相対切断効率の正確な評価が行われ得るように最も活性な基質が、過剰な酵素を存在させることなく９０から９５％で切断されるように滴定した。
【０２８０】
１６種類のすべてのジヌクレオチドｆＮｆＮペアがＲＮａｓｅ  Ｈ２によって切断されたが、明白な基質優先性が観察された。一般に、配列ｆＮｆＵを有する基質の性能は低く、ジヌクレオチドペアの３’位におけるｆＵ塩基の位置は不利であることが示された。最も低活性の基質はｆＵｆＵであり、ｆＡｆＣまたはｆＡｆＧ基質の＞９０％切断がもたらされた条件下で示された切断は１０％であった。
【０２８１】
より多くの量の酵素を使用すると、基質間の切断効率の相対差は軽微であり、ここで試験したすべての基質で１００％の切断が容易に得られ得る。
【０２８２】
［実施例７］ｒＮおよびｆＮｆＮ基質の切断のための３’塩基および５’塩基の長さの最適化
以下の実施例は、プライマーまたはプローブ配列の３’末端および５’末端に対する切断性ドメインの位置の最適化を示す。先の実施例では、基質はすべて、切断性ドメインにフランキングしている５’側および３’側の両方に１４または１５個のＤＮＡ塩基を有するものであった。切断性プローブおよびプライマーの設計における使用のためには、場合によっては、このようなフランキング配列をできる限り短く作製することが、Ｔｍ（ハイブリダイゼーション温度）を制御するため、またはプライミング反応の特異性を改善するために有益であり得る。従って、効率的な酵素的切断が得られるのに必要な二本鎖の最低限の長さを規定することが重要である。
【０２８３】
この実験では、単一のｒＣ切断性塩基、リボヌクレオチドに５’−フランキングしている２５個のＤＮＡ塩基の固定ドメインおよび３’側にさまざまな数の塩基を有する、表１３に示す合成基質二本鎖を作製した。
【０２８４】
【表１２】
2016510601.tif 000048
【０２８５】
各基質の修飾鎖を上記のようにして放射性標識した。反応を、１００ｎＭの基質を１００μＵの組換え酵素とともに、Ｍｇ切断バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中で用いて行った。反応液を７０℃で２０分間インキュベートした。反応生成物を、変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて分離し、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｙｃｌｏｎｅ（商標）Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ホスフォイメージャー）を用いて可視化した。各バンドの相対強度を定量し、切断された全基質に対する割合としてプロットした結果を図１５に示す。最大の切断は、３’側のリボヌクレオチドにフランキングしている４から５個のＤＮＡ塩基の場合に起こった。
【０２８６】
次の実験では、単一のｒＵ切断性塩基を有し、３’側のリボヌクレオチドにフランキングしている２５塩基対の固定ドメインおよび５’側に２から１４塩基対を有する、表１４に示す合成基質二本鎖を作製した。最低５つの非対合塩基（ダングリングエンド）を未修飾相補鎖上に残し、長鎖核酸試料に対するハイブリダイゼーションをシミュレーションした。
【０２８７】
【表１３】
2016510601.tif 000049
【０２８８】
各基質の修飾鎖を前述のようにして放射性標識した。反応を、１００ｎＭの基質を１２３μＵの組換え酵素とともに、ＭｇカチオンとＭｎカチオンの両方を含む混合バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．６ｍＭ  ＭｎＣｌ２、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中で用いて行った。反応液を７０℃で２０分間インキュベートした。反応生成物を、変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて分離し、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｙｃｌｏｎｅ（商標）Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ホスフォイメージャー）を用いて可視化した。各バンドの相対強度を定量し、結果を、切断された全基質に対する割合として図１６にプロットした。短鎖の基質では、切断はほとんど見られなかった。活性は、５’−ＤＮＡドメインの長さに伴って、５’側のｒＵ塩基にフランキングしている約１０から１２塩基の二本鎖で最大の切断が得られるまで増大した。
【０２８９】
同様の実験の実験を行い、ジ−フルオロ（ｆＮｆＮ）基質の切断に必要とされる３’−ＤＮＡドメインの最適な長さを調べた。表１５に示す二本鎖を合成し、試験し、ｆＵｆＣジ−フルオロ基質の３’末端に必要とされるＤＮＡ塩基の長さを機能的に規定した。２２塩基対の固定ドメインを５’末端に位置させ、３’−ドメインを２から１４塩基でさまざまにした。
【０２９０】
【表１４】
2016510601.tif 000050
【０２９１】
各基質の修飾鎖を上記のようにして放射性標識した。反応を、１００ｎＭの基質を３７ｍＵの組換え酵素とともに、ＭｇカチオンとＭｎカチオンの両方を含む混合バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．６ｍＭ  ＭｎＣｌ２、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中で用いて行った。反応液を７０℃で２０分間インキュベートした。反応生成物を、変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて分離し、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｙｃｌｏｎｅ（商標）Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ホスフォイメージャー）を用いて可視化した。各バンドの相対強度を定量し、結果を、切断された全基質に対する割合として図１７にプロットした。切断性ドメインの３’側に２つのＤＮＡ塩基を有する基質では、切断は見られなかった。４つのＤＮＡ塩基では切断が見られ、８から１０個のＤＮＡ塩基がｆＵｆＣ切断ドメインの３’側に存在する場合で最大の切断が得られるまで着実に増大した。興味深いことに、切断ドメインの３’側のＤＮＡ塩基の最適な長さは、ジ−フルオロ基質の場合（８から１０塩基）の方が単一のリボヌクレオチド基質の場合（４から５塩基）と比べて長い。
【０２９２】
要約すると、リボヌクレオチド含有基質では、最大の切断活性は、少なくとも４から５個のＤＮＡ残基が３’側に位置し、１０から１２個のＤＮＡ残基が切断性ドメインの５’側に位置した場合に見られる。ジ−フルオロ基質では、最大の切断活性は、少なくとも８から１０個のＤＮＡ残基が切断性ドメインの３’側に位置した場合に見られる；先の実施例から、１４から１５個のＤＮＡ残基が切断性ドメインの５’側に位置した場合に活性が高いことが明白である。
【０２９３】
［実施例８］ＤＮＡプライマーに対する適用：プライマー伸長アッセイ形式およびＤＮＡシークエンシングにおける潜在的有用性
上記の実施例では、耐熱性ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素が二本鎖核酸を、単一の内部リボヌクレオチドまたは２’−フルオロジヌクレオチドにおいて切断する能力を特性評価した。実施例７では、この切断反応に有効な基質となる短鎖オリゴヌクレオチドを設計するためのパラメータが確立されている。このような特長を組み合わせると、プライマー伸長アッセイ、例えばＤＮＡシークエンシングまたはＰＣＲにおいて機能する切断性プライマーが作製され得る。一本鎖オリゴヌクレオチドは切断反応の基質ではなく、このため修飾オリゴヌクレオチドプライマーは、標的配列にハイブリダイズするまで機能的に「不活性」である。切断性ドメインを、本来は未修飾であるオリゴヌクレオチドに組み込んだ場合、このオリゴヌクレオチドはＰＣＲをプライミングする機能を果たし得、プライマードメインのかなりの部分が最終ＰＣＲ産物から切断されて反応が不能となった最終生成物がもたらされ得る（プライミング部位がなく、生成物は、もはや最初のプライマーセットを用いたＰＣＲのための鋳型でなくなる。）。切断性ドメインを、３’末端がブロックされているオリゴヌクレオチドに組み込んだ場合、このプライマーは、ＰＣＲにおいて切断が起こるまで活性にならない。切断によって、ブロック型プライマーは「活性化」される。このため、この形式では、切断事象の前ではＤＮＡ合成が起こり得ないため、ＰＣＲ反応に対して「ホットスタート」がもたらされ得る。実施例４では、この切断事象は、ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｉｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２で、高温に達するまで非常に不充分であることが示された。さらに、切断反応とプライマー伸長間の関連によりアッセイに対して特異性が高まる。これは、プライマーが鋳型にハイブリダイズしたとき、どちらの工程も、形成された二本鎖の酵素による認識が必要とされるためである。この反応の概略を図１８に示す。この図解は、単純なプライマー伸長反応ならびにＰＣＲの両方にあてはまることに注意のこと。また、他の種類の酵素的アッセイ、例えばライゲーション反応においても利用することができる。
【０２９４】
以下の実施例は、ＤＮＡシークエンシングのためのＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性プライマーの使用を示す。現在使用されているＤＮＡシークエンシングの最も一般的な方法は、ジデオキシターミネーターヌクレオチドの存在下で行われる連続ＤＮＡ合成反応（プライマー伸長反応）を伴うものである。反応は、多数回サイクルのプライマー伸長が行われ、産物が線形様式で蓄積される熱サイクリング形式で行われる。
【０２９５】
ＤＮＡシークエンシングは、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて行った。以下のプライマーを使用した：
Ｍ１３（−２７）
【０２９６】
配列番号６６
【化３６】
2016510601.tif 000051
【０２９７】
Ｍ１３（−２７）−ｒＣ
配列番号６７
【化３７】
2016510601.tif 000052
【０２９８】
先のように、ＤＮＡ塩基を大文字で示し、ＲＮＡ塩基を小文字で示し、ＳｐＣ３は、オリゴヌクレオチドの３’末端に位置したスペーサーＣ３ブロッキング基である。ブロック型切断性プライマーは、リボヌクレオチドの５’側に１７個のＤＮＡ塩基およびリボヌクレオチドの３’側に４個のＤＮＡ塩基を含むものであり（１７−１−４設計）、このため、実施例７で確立した最適化設計規則に適合する。
【０２９９】
シークエンシング反応を、０．７５Ｘ  ＡＢＩ  Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファー、１６０ｎＭのプライマー、０．５Ｘ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒおよび２３０ｎｇ  プラスミドＤＮＡ鋳型を含む２０μｌ容量で、セットアップした。場合により、４ｍＭのさらなるＭｇＣｌ２を反応液に、１４、１．４または０．１４ｍＵの組換えピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２とともに、またはなしで補給した。以下のサイクルシークエンスプログラムを使用した：９６℃で３０秒間、続いて、２５サイクルの［９６℃で５秒間、５０℃で１０秒間、５５℃で４分間］。ＤＮＡシークエンシング反応は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ型番３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒで実施した。得られたシークエンシングトレースを、品質およびリード長について調べた。結果を以下の表１６にまとめる。
【０３００】
【表１５】
2016510601.tif 000053
【０３０１】
未修飾プライマーを用いた対照反応では高品質のＤＮＡ配列トレースが得られ、使用可能なリード長はわずかに８００塩基を超えていた。これらの反応液へのＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素の添加は反応液の品質を障害しなかった。シークエンシングキットに備えられたバッファーのカチオン含有量は製造業者（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって開示されておらず、このため、実際の反応条件は確かでない。反応液に対するさらなる４ｍＭ  ＭｇＣｌ２の補給の効果はなかった。ｒＣブロック型切断性プライマーは、ＲＮａｓｅ  Ｈ２の添加なしではＤＮＡシークエンシングを補助しなかった。ＲＮａｓｅ  Ｈ２を添加すると、２０μｌの反応液中１４ｍＵの酵素の使用で高品質シークエンシング反応が得られた。より少ない量の酵素の使用では、反応の質が低下するか、または機能性の反応が全くなかった。反応バッファーのマグネシウム含有量の補給は、ブロック型プライマーを用いる切断およびプライマー伸長反応を得るために必要であった。ここで使用した酵素の量は、最適な条件下（７０℃、２０分間のインキュベーション）でｒＮ基質の１００％切断を得るために必要とされる量より１００倍多い。本明細書において実施したサイクルシークエンス反応では、プライマーのアニーリングを５０℃で実施し、伸長反応を５５℃でそれぞれ１０秒間および４分間実施した。このような低温は、ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２では最適下限である（上記の実施例４参照）。高温でのサイクルシークエンス反応の実施は、必要とされる酵素が少ないが、この必要はない。
【０３０２】
この実施例は、ＲＮａｓｅ  Ｈ２に対する内部切断部位を含むブロック型プライマーがプライマー伸長系シークエンシング法、例えばジデオキシ（Ｓａｎｇｅｒ）シークエンシングで使用され得、既存のハイスループット蛍光シークエンシングプロトコルの使用と適合性であることを示す。ブロック型プライマーおよび本発明の方法の使用によりシークエンシング反応の特異性が高まり得、従って、シークエンシングをより多くのサイクルで、および未修飾プライマーは充分に奏功しない非常に複雑な核酸試料に対して行うことが可能になる。
【０３０３】
［実施例９］ＤＮＡプライマーへの適用：ＰＣＲおよび定量的リアルタイムＰＣＲにおけるｒＮプライマー
実施例８では、ＲＮａｓｅ  Ｈ２がブロック型プライマーを切断するために使用され得ること、ならびにこの系をＤＮＡ合成およびプライマー伸長反応、例えばＤＮＡシークエンシングと関連させ得ることが示された。以下の実施例は、この方法のＰＣＲにおける有用性を示す。第１の系は、エンドポイントＰＣＲ形式における使用を示し、第２の系は、定量的リアルタイムＰＣＲ形式における使用を示す。
【０３０４】
合成エンドポイントＰＣＲアッセイにおける使用のための表１７に示すプライマーを作製した。Ｓｙｎ−ＦｏｒおよびＳｙｎ−Ｒｅｖプライマーは、人工アンプリコン（合成オリゴヌクレオチド鋳型）に特異的な未修飾の対照プライマーである。Ｓｙｎ−Ｆｏｒプライマーは、未修飾の対照Ｓｙｎ−Ｒｅｖプライマーまたは異なる修飾Ｓｙｎ−Ｒｅｖプライマーと対合する。単一のｒＵ（切断性）塩基に続いて２から６個のＤＮＡ塩基を含み、すべてジデオキシ−Ｃ残基（ｄｄＣ）で終結している一組の修飾Ｓｙｎ−Ｒｅｖプライマーを作製した。ｄｄＣ残基は、プライマー機能を抑制するブロッキング基としての機能を果たす。ｄｄＣブロッキング基は、ＲＮａｓｅ  Ｈ２の作用によるｒＵ塩基でのプライマーの切断によって除去される（ブロック解除工程、図１８に示す。）。合成鋳型は、以下（配列番号７５）に示すような１０３塩基長オリゴヌクレオチドである。プライマー結合部位に下線を付している。
【０３０５】
【表１６】
2016510601.tif 000054
【０３０６】
合成鋳型
【０３０７】
配列番号７５
【化３８】
2016510601.tif 000055
【０３０８】
ＰＣＲ反応を２０μｌ容量で、２００ｎＭのプライマー、２ｎｇの鋳型、２００μＭの各ｄＮＴＰ（合計８００μＭ）、１単位のＩｍｍｏｌａｓｅ（耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｉｏｌｉｎｅ）、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．３、５０ｍＭのＫＣｌおよび３ｍＭのＭｇＣｌ２を用いて行った。反応を、１００μＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２ありまたはなしのいずれかで行った。反応を９５℃で５分間の浸漬から開始し、続いて、３５サイクルの［９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で１秒間］を行った。反応生成物を１０％非変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ＧｅｌＳｔａｒ染色を用いて可視化した。結果を図１９に示す。未修飾対照プライマーでは正しいサイズの強いバンドが得られた。３’末端ブロック型ｒＵプライマーでは、ＲＮａｓｅ  Ｈ２の非存在下において産物は全く得られなかった。ＲＮａｓｅ  Ｈ２の存在下では、ブロック型プライマーによりＤ４、Ｄ５およびＤ６プライマーの使用で、正しいサイズの強いバンドが得られた。Ｄ２またはＤ３プライマーの使用では、シグナルは見られなかった。この実施例は、ブロック型プライマーが、本発明の方法を用いたＰＣＲ反応に使用され得ることを示す。さらに、この実施例は、４から５つの３’−ＤＮＡ塩基の存在がｒＮ含有プライマーの切断に最適であることがわかった実施例７で予備形成二本鎖基質の切断を用いて得られた結果と整合する。
【０３０９】
次に、上記のものと同じ合成ＰＣＲアンプリコンアッセイ系を、ＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ検出を使用する定量的リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて試験した。反応を３８４ウェル形式にて、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームを用いて行った。反応液は、１×ＢＩＯ−ＲＡＤ  ｉＱ（商標）ＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、２００ｎＭの各プライマー（フォワード＋リバース）、２×１０６コピーの合成鋳型オリゴヌクレオチド（配列番号７５）および５ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２を１０μｌ容量中に含むものにした。熱サイクリングパラメータには９５℃での最初の５分間の浸漬を含め、次いで、４５サイクルの［９５℃で１０秒間＋６０℃で２０秒間＋７２℃で３０秒間］を行った。反応はすべて三連で実施し、反応には同じ未修飾フォワードプライマー（配列番号６８）を使用した。リバースプライマーは、未修飾プライマーと２から６Ｄ修飾プライマー（配列番号６９から７４）とで変えた。これらの実験のＣｐ値（陽性反応が最初に検出されるＰＣＲサイクル数）を以下の表１８に示す。Ｃｐは、未修飾のＦｏｒ＋Ｒｅｖプライマーを用いて行った対照反応と、ＲＮａｓｅ  Ｈ２の存在下でＤ４、Ｄ５またはＤ６ブロック型プライマーを用いて行ったカップリング型切断ＰＣＲ反応とで本質的に同一であった。ＲＮａｓｅ  Ｈ２の非存在下では、ブロック型プライマーの使用で陽性シグナルは検出されなかった。エンドポイントアッセイにおいて見られたように、短い３’−ＤＮＡドメイン（Ｄ２またはＤ３）を有するプライマーでは性能が低かった。
【０３１０】
【表１７】
2016510601.tif 000056
【０３１１】
以下の実施例は、内在性ヒト遺伝子標的およびＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡを鋳型として使用した定量的リアルタイムＰＣＲアッセイ形式におけるｒＮブロック型プライマー（ＦｏｒとＲｅｖどちらも）を用いたＲＮａｓｅ  Ｈ２切断の使用を示す。ヒトＨＲＡＳ遺伝子（ＮＭ＿１７６７９５）に特異的な表１９に示すプライマーを設計し、合成した。この場合、Ｃ３スペーサーをブロッキング基として使用した。
【０３１２】
【表１８】
2016510601.tif 000057
【０３１３】
これらのプライマーは、以下に示すＨＲＡＳ遺伝子内の３４０ｂｐアンプリコンを定義する。プライマー結合部位に下線を付している。
【０３１４】
ＨＲＡＳアッセイアンプリコン
【０３１５】
配列番号８０
【化３９】
2016510601.tif 000058
【０３１６】
反応を１０ｌ容量で、３８４ウェル形式にて、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームを用いて行った。反応液に１×ＢＩＯ−ＲＡＤ  ｉＱ（商標）ＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を含め、ｉＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（２５Ｕ／ｍｌ）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｎＭの各プライマー（フォワード＋リバース）、２ｎｇのｃＤＮＡ（ＨｅＬａ細胞の全ＲＮＡから作製）を、５ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２とともに、またはなしで使用した。熱サイクリングパラメータには９５℃での最初の５分間の浸漬を含め、次いで、５０サイクルの［９５℃で１０秒間＋６０℃で２０秒間＋７２℃で３０秒間］を行った。反応はすべて三連で実施した。未修飾プライマーを使用すると、クロス点（Ｃｐ）は２７サイクル目であった。ＲＮａｓｅ  Ｈ２の非存在下では、ブロック型プライマーを用いて行った反応によってＰＣＲは補助されず、５０サイクルの反応の間、蛍光シグナルは検出されなかった。ＲＮａｓｅ  Ｈ２の存在下では、ブロック型プライマーを用いて行った反応で、２７．４サイクル目に、対照の非ブロック型プライマーと本質的に同一の検出可能なシグナルが得られた。リアルタイムＰＣＲ蛍光プロットを図２０に示す。
【０３１７】
以下の実施例は、別の内在性ヒト遺伝子標的およびＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡを鋳型として用いた定量的リアルタイムＰＣＲアッセイ形式におけるｒＮブロック型プライマーを用いたＲＮａｓｅ  Ｈ２切断の使用を示す。ヒトＥＴＳ２遺伝子（ＮＭ＿００５２３９）に特異的な表２０に示すプライマーを設計し、合成した。
【０３１８】
【表１９】
2016510601.tif 000059
【０３１９】
これらのプライマーは、以下に示すＥＴＳ２遺伝子内の１８４ｂｐアンプリコンを定義する。プライマー結合部位に下線を付している。
【０３２０】
ＥＴＳ２アッセイアンプリコン
【０３２１】
配列番号８５
【化４０】
2016510601.tif 000060
【０３２２】
反応を１０μｌ容量で、３８４ウェル形式にて、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームを用いて行った。反応液に１×ＢＩＯ−ＲＡＤ  ｉＱ（商標）ＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を含め、ｉＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（２５Ｕ／ｍｌ）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｎＭの各プライマー（フォワード＋リバース）、２ｎｇのｃＤＮＡ（ＨｅＬａ細胞の全ＲＮＡから作製）を、５ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２とともに、またはなしで使用した。熱サイクリングパラメータには９５℃での最初の５分間の浸漬を含め、次いで、５０サイクルの［９５℃で１０秒間＋６０℃で２０秒間＋７２℃で３０秒間］を行った。反応はすべて三連で実施した。非ブロック型プライマーを使用すると、Ｃｐは２５．７サイクル目であった。ＲＮａｓｅ  Ｈ２の非存在下では、ブロック型プライマーを用いて行った反応によってＰＣＲは補助されず、５０サイクルを超えても蛍光シグナルは検出されなかった。ＲＮａｓｅ  Ｈ２の存在下では、ブロック型プライマーを用いて行った反応で、未修飾の対照プライマーより６サイクル遅い３１．７サイクル目に検出可能なシグナルが得られた。１種類のブロック型プライマー（未修飾Ｆｏｒ＋ブロック型Ｒｅｖまたはブロック型Ｆｏｒ＋未修飾Ｒｅｖ）を用いて行った反応では中間のＣｐ値が示された。リアルタイムＰＣＲ蛍光プロットを図２１に示す。
【０３２３】
本発明の反応条件を使用すると、ＨＲＡＳアッセイは、未修飾プライマーの使用とブロック型プライマーの使用の対比で同一の性能であった。しかしながら、ＥＴＳ２アッセイでは、未修飾プライマーとブロック型プライマーとの対比で遅れが示された。急速な熱サイクリングが行われるＰＣＲ反応の状況では、プライマーのハイブリダイゼーションと切断速度論が、ブロック型プライマーを使用する反応の反応全体の効率に大きな役割を果たしている。ＤＮＡ合成はブロック解除事象と関連しており、ブロック解除は、プライマーが活性化状態になってＤＮＡ合成をプライミングし得る前にハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ  Ｈ２の結合および基質の切断を必要とする。存在させるＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素の量を増やすこと、または反応のアニーリング時間を増やすことのいずれかによって各サイクルで生じる切断プライマーの量を増大させることが可能なはずである。ＤＮＡ合成は、上記の実施例で使用したアニーリング温度（６０℃）とほぼ同時に伸長温度（７２℃）で起こる。しかしながら、ブロック解除は、アニーリング工程期間中（６０℃）でしか起こり得ず、伸長工程中（７２℃）では起こり得ない。これは、ＲＮａｓｅ  Ｈ２の二本鎖基質の形成をアニーリング工程中でのみ可能にするが７２℃（このとき、プライマーは一本鎖形態でしか存在しない。）では可能にしない使用プライマーのＴｍのためである。
【０３２４】
ＰＣＲサイクルパラメータを、６０℃で行う単一事象としてのアニーリング／伸長を伴う２工程反応に変更し、アニーリング／伸長工程期間をさまざまにし、これらの反応パラメータの変更により、ブロック型ＥＴＳ２プライマーが未修飾の対照プライマーと同様の効率を伴う性能を示すことが可能になり得るかどうかを調べた。反応を１０μｌ容量で、３８４ウェル形式にて、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームを用いて行った。反応液に１×ＢＩＯ−ＲＡＤ  ｉＱ（商標）ＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を含め、ｉＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（２５Ｕ／ｍｌ）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｎＭの各プライマー（フォワード＋リバース）、２ｎｇのｃＤＮＡ（ＨｅＬａ細胞の全ＲＮＡから作製）を、５ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２とともに、またはなしで使用した。熱サイクリングパラメータには９５℃での最初の５分間の浸漬を含め、次いで、４５サイクルの［９５℃で１０秒間＋６０℃で２０から１２０秒間］を行った。反応はすべて三連で実施した。ブロック型プライマーと未修飾の対照プライマーで得られたＣｐ値の差（ΔＣｐ）を以下の表２１にまとめる。
【０３２５】
【表２０】
2016510601.tif 000061
【０３２６】
サイクリングパラメータを微調整し、６０℃でのアニーリング工程期間を２０秒間から１から２分間に増大すると、ブロック型切断性プライマーと対照未修飾プライマー間で一様な性能がもたらされた。サイクリングパラメータを固定し、酵素を増大させて同様の実験を行った。予測どおり、より多くの量の酵素の使用でブロック型プライマーの性能を改善することが可能であった。酵素の使用量を１０ｍＵ  ＲＮａｓｅ  Ｈに２倍にすると、６０℃で３０秒間のアニーリング工程を使用した場合、対照のブロックなしプライマーとブロック型切断性プライマーの差が最小限になった。
【０３２７】
上記の実施例は、実施例７に教示された最適化設計の単一のリボヌクレオチド残基を含むブロック型プライマーが定量的リアルタイムＰＣＲアッセイにおいてＲＮａｓｅ  Ｈ２とともに使用され得ることを示す。
【０３２８】
［実施例１０］ＤＮＡプライマーへの適用：ＰＣＲおよび定量的リアルタイムＰＣＲにおけるｆＮｆＮプライマー
上記の実施例９では、エンドポイントＰＣＲおよび定量的リアルタイムＰＣＲアッセイにおけるｒＮブロック型プライマーの使用のためのＲＮａｓｅ  Ｈ２媒介性切断の有用性が示された。この実施例では、定量的リアルタイムＰＣＲアッセイにおけるｆＮｆＮブロック型プライマーの使用の有用性を示す。
【０３２９】
ＲＮａｓｅ  Ｈ２によるジ−フルオロ基質の切断によって３’−ＯＨ末端を有する種がもたらされるため、単一の２’−Ｆ塩基（ｆＮ）を有するプライマーはＤＮＡ合成をプライミングし得ると仮定すると、この生成物もまた、実施例９に記載のものと同じ反応形式が使用されるＰＣＲ反応を補助し得るはずである。ジ−フルオロ基質の切断はマンガンカチオンの存在下で最良に進行するが、ＰＣＲ反応は一般的にマグネシウムカチオンの存在下で行われる。未修飾プライマーを用いたＰＣＲ反応を、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む標準的なｑＰＣＲバッファーおよび３ｍＭ  ＭｇＣｌ２＋０．６ｍＭ  ＭｎＣｌ２を含む改良バッファーを用いて試験した。反応の遂行は同一であり、この少量のマンガンの存在は反応の定量性に有害な影響を及ぼさなかった。
【０３３０】
末端３’−ｆＮプライマーがＰＣＲにおいて機能を果たす能力を、実施例９に記載の合成ＰＣＲアンプリコン系を用いて調べた。表２２に示す以下のプライマーを試験した：
【０３３１】
【表２１】
2016510601.tif 000062
【０３３２】
合成鋳型
【０３３３】
配列番号７５
【化４１】
2016510601.tif 000063
【０３３４】
反応を１０μｌ容量で、３８４ウェル形式にて、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームを用いて行った。反応液に１×ＢＩＯ−ＲＡＤ  ｉＱ（商標）ＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を含め、ｉＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（２５Ｕ／ｍｌ）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、０．６ｍＭのＭｎＣｌ２、２００ｎＭの各プライマー（フォワード＋リバース）、２×１０６コピーの合成オリゴヌクレオチド標的を、１．７５Ｕのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２とともに、またはなしで使用した。熱サイクリングパラメータには９５℃での最初の５分間の浸漬を含め、次いで、３０サイクルの［９５℃で１０秒間＋６０℃で１２０秒間＋７２℃で１２０秒間］を行った。反応はすべて三連で実施した。結果を図２２に示す。ＲＮａｓｅ  Ｈ２の非存在下では、３’末端に２’−Ｆ塩基を有するプライマーはＰＣＲを、未修飾プライマーと比べて同一の効率で補助した。しかしながら、ＲＮａｓｅ  Ｈ２の存在下では、２’−Ｆ修飾プライマーでは未修飾プライマーと比べて３．５Ｃｐの遅れが示された。これは、ＲＮａｓｅ  Ｈ２によるＤＮＡ合成の阻害に起因するものではなく、ＲＮａｓｅ  Ｈ２による増幅産物からのプライマーの切断レベルが低いことに起因するものである。ＤＮＡ合成後、新たに形成されたＤＮＡ産物にｆＮ含有プライマーが組み込まれるとＲＮａｓｅ  Ｈ２の潜在的基質が生じる（上記の実施例５参照）。２’−Ｆ塩基における切断によって、このアンプリコン鎖からプライミング部位が除去され、この産物が有効に安定化され、この結果、作製された産物はいずれもさらなるプライミング事象を行えなくなる。多項式増幅で起こるのがこの反応シーケンスである。単一の２’−Ｆ残基を含む基質の切断は比較的不充分であるが、このため、観察されるＰＣＲ反応効率の低下は軽度にすぎない。ＰＣＲ後の７２℃でのインキュベーションを長くすると増幅産物からのプライマーの全切断がもたらされ、さらに増幅を起こす能力が完全にブロックされ、これにより産物は不能になるはずである。これはＰＣＲ反応の相互汚染防除に有用なはずである。
【０３３５】
単一の２’−Ｆ残基の切断が不充分であることを考慮すると、より少ない量での酵素の使用または７２℃での伸長工程の排除によって、単一の２’フルオロ残基を含むプライマー伸長反応生成物を有意に切断することなく、ＲＮａｓｅ  Ｈ２によるジフルオロブロック型プライマーの切断が可能になる。あるいは、末端２’−Ｆ残基と隣接しているＤＮＡ塩基との間へのホスホロチオエート修飾の選択的配置によって、この切断事象をブロックすることが可能なはずである。
【０３３６】
ジ−フルオロブロック型プライマーがｑＰＣＲを補助できる能力が、表２３に示すプライマーを用いて、上記の実施例９に記載の合成オリゴヌクレオチドアンプリコン系において示された。
【０３３７】
【表２２】
2016510601.tif 000064
【０３３８】
合成鋳型
【０３３９】
配列番号７５
【化４２】
2016510601.tif 000065
【０３４０】
反応を１０μｌ容量で、３８４ウェル形式にて、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームを用いて行った。反応液に１×ＢＩＯ−ＲＡＤ  ｉＱ（商標）ＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を含め、ｉＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（２５Ｕ／ｍｌ）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、０．６ｍＭのＭｎＣｌ２、２００ｎＭの各プライマー（フォワード＋リバース）、２×１０６コピーの合成オリゴヌクレオチド標的を、１．７５Ｕのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２とともに、またはなしで使用した。熱サイクリングパラメータには９５℃での最初の５分間の浸漬を含め、次いで、４５サイクルの［９５℃で１０秒間＋６０℃で１２０秒間＋７２℃で１２０秒間］を行った。反応はすべて三連で実施した。３’末端に単一の２’−フルオロ塩基を有する対照プライマー（これは、ｆＮｆＮブロック型プライマーの切断生成物を模倣する。）を用いて実施した反応は２０のＣｐを有した。また、ブロック型ｆＵｆＣプライマーを用いて実施した反応も２０のＣｐを有した。
【０３４１】
次に、ジ−フルオロプライマー切断アッセイにおいて必要とされるＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素の量をより詳細に試験した。反応を１０μｌ容量で、３８４ウェル形式にて、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームを用いて行った。反応液に１×ＢＩＯ−ＲＡＤ  ｉＱ（商標）ＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を含め、ｉＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（２５Ｕ／ｍｌ）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、０．６ｍＭのＭｎＣｌ２、２００ｎＭの各プライマー（フォワード＋リバース）、２×１０６コピーの合成オリゴヌクレオチド標的を使用した。すべての反応で同じ未修飾のＳｙｎ−Ｆｏｒプライマーを使用した。反応あたり０から６００ｍＵまでの組換えピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２を添加した。熱サイクリングパラメータには９５℃での最初の５分間の浸漬を含め、次いで、４５サイクルの［９５℃で１０秒間＋６０℃で１２０秒間＋７２℃で１２０秒間］を行った。反応はすべて三連で実施した。各プライマーでのＲＮａｓｅ  Ｈ２の種々の量に対応するＣｐ値を表２４に示す。
【０３４２】
【表２３】
2016510601.tif 000066
【０３４３】
ＲＮａｓｅ  Ｈ２の最適な量は２００ｍＵである（太字と下線で示すＣｐ＝２１．３）。より高濃度のＲＮａｓｅ  Ｈ２ではＰＣＲ反応の効率が下がり、３’フルオロＵプライマーおよびブロック型ジフルオロプライマーの両方の場合と同程度になる。おそらく、これは、上記に論考したようにＰＣＲ産物内におけるｆＵセットでの切断レベルが低いことによるものである。
【０３４４】
一般的に、約２００ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｉｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２  ｐｅｒ  １０μｌが、ブロック型プライマーが使用され、ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断ドメインが連続する２つの２’−フルオロヌクレオシドであるカップリング型ＲＮａｓｅ  Ｈ２−ＰＣＲのための最適な酵素濃度である。標準的な未修飾ＤＮＡプライマーと比べて２から６サイクルのＣｐの増大が典型的に観察される。この小さな差はアッセイ性能に影響しない。これは、結果が常に、未知試料の試験に使用するものと同じプライマーを用いて生成した標的コピー数に対するＣｐの標準曲線と比較されるからである。
【０３４５】
結論として、この実施例では、ブロック型ｆＮｆＮプライマーが、本発明の方法によるＲＮａｓｅ  Ｈ２切断を用いたｑＰＣＲ反応を補助し得ることが示され、使用すべきＲＮａｓｅ  Ｈ２の最適な量およびサイクリング条件が規定される。
【０３４６】
［実施例１１］ＰＣＲ反応におけるｒＮブロック型プライマーの使用での特異性の改善。
【０３４７】
理論的には、ＰＣＲではほぼ無限に増幅する可能性を有し、ＰＣＲ反応は、反応ミックス中の試薬の消費によってのみ制限されるはずである。実際の実務では、ＰＣＲ反応は、特異性の保持を補助するため典型的には４０から４５サイクルに制限される。ＰＣＲの増幅力は莫大であり、サイクル数が４０から４５を超えると、ミスプライミング事象が次第によく見られるようになり、所望のものでない産物の増幅および偽陽性シグナルが生じる。この実施例では、本発明の方法による切断性ブロック型プライマーをどのようにして使用して反応の特異性を改善し、より多くのＰＣＲサイクル数の使用を可能にし、これによりＰＣＲの潜在的感度を増大させるかを示す。
【０３４８】
この実施例において、本発明者らは３つのヒト遺伝子に特異的なＰＣＲ反応を試験し、各組のプライマーペアの増幅における特異性を、ヒトおよびラットｃＤＮＡを鋳型として用いて比較した。従来の未修飾オリゴヌクレオチドを本発明の新たな切断性ブロック型プライマーと比較した。表２５に示す以下のプライマーを使用した。ＤＮＡ塩基を大文字で、ＲＮＡ塩基を小文字で示す。使用した３’−ブロッキング基はＣ３スペーサー（ＳｐＣ３）であった。試験した遺伝子標的は、ヒトＥＴＳ２、ＮＭ＿００５２３９（ラットホモログＮＭ＿００１１０７１０７）、ヒトＨＲＡＳ、ＮＭ＿１７６７９５（ラットホモログＮＭ＿００１０６１６７１）、およびヒトＡＣＡＣＡ、ＮＭ＿１９８８３４（ラットホモログＮＭ＿０２２１９３）であった。
【０３４９】
【表２４】
2016510601.tif 000067
【０３５０】
ＰＣＲ反応を３８４ウェル形式にて、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームを用いて行った。反応液は、１×ＢＩＯ−ＲＡＤ  ｉＱ（商標）ＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、２００ｎＭの各プライマー（フォワード＋リバース）および１．３ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２を１０μｌ容量中に含むものにした。鋳型ＤＮＡは、２ｎｇのヒトＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡまたは２ｎｇのラット脊髄ｃＤＮＡのいずれかにした。熱サイクリングパラメータには９５℃での最初の５分間の浸漬を含め、次いで、６０サイクルの［９５℃で１０秒間＋６０℃で９０秒間］を行った。この条件下において、ヒトｃＤＮＡで観察されたＣｐ値は真の陽性事象を表す。もし、ラットｃＤＮＡの使用でシグナルが検出された場合、これを偽陽性事象として記録した。これらの３つ遺伝子では、ヒトおよびラット配列はプライマー結合部位が相違している。従って、ヒト遺伝子特異的プライマーを用いたラットｃＤＮＡでのＰＣＲ産物の検出は、ミスプライミングに由来する所望のものでない偽陽性結果である。結果を以下の表２６に示す。
【０３５１】
【表２５】
2016510601.tif 000068
【０３５２】
未修飾プライマーを使用すると、ヒトｃＤＮＡでのヒト標的の検出は成功裡であり、２３から２６のＣｐが観察された。３つのＰＣＲアッセイすべてで、サイクリングを継続した場合にヒト遺伝子特異的プライマーでラットｃＤＮＡにおける産物も検出され、３５から５６のＣｐが観察された。これらは、低レベルの真の陽性シグナルを検出するＰＣＲアッセイの検出能を制限する所望のものでない偽陽性シグナルを表す。
【０３５３】
修飾プライマーを使用すると、ヒトｃＤＮＡでの所望の産物の検出は成功裡であり、Ｃｐはすべて、未修飾プライマーで得られた値の１以内であった。しかしながら、修飾プライマーとのラットｃＤＮＡの使用では、６０サイクル目であっても偽陽性シグナルは見られなかった。ＲＮａｓｅ  Ｈ２ブロック型切断性プライマーの使用により特異性の改善がもたらされ、偽プライミング事象の検出なく、より長時間でより感度のよいＰＣＲ反応（この場合、６０サイクルまで）の使用が可能になる。これにより、大過剰の野生型配列の存在下におけるバリアント対立遺伝子検出能をずっと大きくすることが可能になる。
【０３５４】
［実施例１２］定常状態条件下におけるｒＣ基質のミスマッチ識別
実施例１１では、本発明の方法によって、バックグラウンドミスプライミング事象をものともせずにｑＰＣＲ反応の特異性を改善できることが示された。この実施例では、一塩基の違い（ＳＮＰ）に関するＲＮａｓｅ  Ｈ２切断反応の特異性を示す。ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素が単一のｒＣ塩基を含む二本鎖基質内の塩基ミスマッチを識別する能力を定常状態条件下で試験した。以下の基質を３２Ｐ−末端標識し、上記の実施例４に記載の「Ｍｇ切断バッファー」中でインキュベートした。反応液は、１００ｎＭの基質を１００μＵの酵素とともに２０μＬ容量中に含むものにし、７０℃で２０分間インキュベートした。反応生成物を、変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて分離し、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｙｃｌｏｎｅ（商標）Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ホスフォイメージャー）を用いて可視化した。各バンドの相対強度を定量し、結果を、切断された全基質に対する割合としてプロットした。
【０３５５】
パーフェクトマッチ（ｒＣ：Ｇ、配列番号１０および１１）ならびにｒＣ塩基（３種類の二本鎖、配列番号１０と１００から１０２）、ｒＣに対して＋１位（３種類の二本鎖、配列番号１０と１０３から１０５）およびｒＣに対して−１位（３種類の二本鎖、配列番号１０と１０６から１０８）に可能な各塩基ミスマッチを含む１０種類の二本鎖を試験した。結果をパーフェクトマッチ＝１００％に対して正規化し、以下の表２７に示す。
【０３５６】
【表２６】
2016510601.tif 000069
【０３５７】
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ＲＮａｓｅ  Ｈ２は、この条件下で一塩基ミスマッチ同士を識別することができた。厳密な識別度合いは、ミスマッチにおいてどの塩基が対合しているかによって異なった。興味深いことに、−１位のミスマッチ（ｒＣ塩基の一塩基５’側）では比較的良好なミスマッチ識別が示されたが、＋１位のミスマッチ（ｒＣ塩基の一塩基３’側）では一般的に有効性が低かった。選択性は比較的控えめのようであるが、ＰＣＲサイクルの反復に伴って大きく増幅される。
【０３５８】
［実施例１３］熱サイクリング中のｒＮ基質のミスマッチ識別
ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素が定常状態条件下でｒＣ基質の塩基ミスマッチを識別する能力を実施例１２に記載した。この実施例では、この酵素が、熱サイクリング条件下において全ｒＮ含有基質の塩基ミスマッチを識別する能力を調べた。この条件では、切断性基質は、温度上昇によって二本鎖が破壊される前の短時間の該酵素によるプロセッシングにのみ利用可能である。ミスマッチ識別は、蛍光定量的リアルタイムＰＣＲアッセイの状況において評価した。本発明者らは、このような速度論的に制限された条件下では、塩基ミスマッチ識別が定常状態条件下で観察されるものよりも大きく改善されることを見出した。
【０３５９】
以下の核酸をこの実施例で使用した。オリゴヌクレオチドは、すべての最近傍のペアとミスマッチが包含されるように合成した。
【０３６０】
未修飾フォワードプライマー：
【０３６１】
配列番号６８
【化４３】
2016510601.tif 000070
【０３６２】
ブロック型ｒＮ基質リバースプライマー（３’末端にＣ３スペーサーブロッキング基）を以下に示す。ＤＮＡ塩基は大文字であり、ＲＮＡ塩基は小文字である。差異領域を太字と下線で示す。単一のＲＮＡ残基を含む合計２８種類のブロック型プライマーを合成した。
【０３６３】
ｒＡシリーズ：
【０３６４】
配列番号１０９
【化４４】
2016510601.tif 000071
【０３６５】
配列番号１１０
【化４５】
2016510601.tif 000072
【０３６６】
配列番号１１１
【化４６】
2016510601.tif 000073
【０３６７】
配列番号１１２
【化４７】
2016510601.tif 000074
【０３６８】
配列番号１１３
【化４８】
2016510601.tif 000075
【０３６９】
配列番号１１４
【化４９】
2016510601.tif 000076
【０３７０】
配列番号１１５
【化５０】
2016510601.tif 000077
【０３７１】
ｒＵシリーズ：
【０３７２】
配列番号１１６
【化５１】
2016510601.tif 000078
【０３７３】
配列番号１１７
【化５２】
2016510601.tif 000079
【０３７４】
配列番号１１８
【化５３】
2016510601.tif 000080
【０３７５】
配列番号１１９
【化５４】
2016510601.tif 000081
【０３７６】
配列番号１２０
【化５５】
2016510601.tif 000082
【０３７７】
配列番号１２１
【化５６】
2016510601.tif 000083
【０３７８】
配列番号１２２
【化５７】
2016510601.tif 000084
【０３７９】
ｒＣシリーズ：
配列番号１２３
【化５８】
2016510601.tif 000085
【０３８０】
配列番号１２４
【化５９】
2016510601.tif 000086
【０３８１】
配列番号１２５
【化６０】
2016510601.tif 000087
【０３８２】
配列番号１２６
【化６１】
2016510601.tif 000088
【０３８３】
配列番号１２７
【化６２】
2016510601.tif 000089
【０３８４】
配列番号１２８
【化６３】
2016510601.tif 000090
【０３８５】
配列番号１２９
【化６４】
2016510601.tif 000091
【０３８６】
ｒＧシリーズ：
【０３８７】
配列番号１３０
【化６５】
2016510601.tif 000092
【０３８８】
配列番号１３１
【化６６】
2016510601.tif 000093
【０３８９】
配列番号１３２
【化６７】
2016510601.tif 000094
【０３９０】
配列番号１３３
【化６８】
2016510601.tif 000095
【０３９１】
配列番号１３４
【化６９】
2016510601.tif 000096
【０３９２】
配列番号１３５
【化７０】
2016510601.tif 000097
【０３９３】
配列番号１３６
【化７１】
2016510601.tif 000098
【０３９４】
使用したブロックなしの対照リバースプライマー（ＲＮａｓｅ  Ｈ２による切断後のブロック型プライマーの反応生成物を模倣）は：
【０３９５】
配列番号２９０
【化７２】
2016510601.tif 000099
であった。
【０３９６】
以下のパーフェクトマッチ合成鋳型およびミスマッチ合成鋳型を使用した。塩基を変えた位置を下線を伴うボールドフォントで示す。リボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの一塩基５’側もしくは一塩基３’側において可能な各塩基変異に対する独自の鋳型を作製した。合計で、２８種類の鋳型を合成し、試験した。
【０３９７】
ｒＡ鋳型：
【０３９８】
配列番号１３７
【化７３】
2016510601.tif 000100
【０３９９】
配列番号１３８
【化７４】
2016510601.tif 000101
【０４００】
配列番号１３９
【化７５】
2016510601.tif 000102
【０４０１】
配列番号１４０
【化７６】
2016510601.tif 000103
【０４０２】
配列番号１４１
【化７７】
2016510601.tif 000104
【０４０３】
配列番号１４２
【化７８】
2016510601.tif 000105
【０４０４】
配列番号１４３
【化７９】
2016510601.tif 000106
【０４０５】
ｒＵ鋳型：
【０４０６】
配列番号１４４
【化８０】
2016510601.tif 000107
【０４０７】
配列番号１４５
【化８１】
2016510601.tif 000108
【０４０８】
配列番号１４６
【化８２】
2016510601.tif 000109
【０４０９】
配列番号１４７
【化８３】
2016510601.tif 000110
【０４１０】
配列番号１４８
【化８４】
2016510601.tif 000111
【０４１１】
配列番号１４９
【化８５】
2016510601.tif 000112
【０４１２】
配列番号１５０
【化８６】
2016510601.tif 000113
【０４１３】
ｒＧ鋳型：
【０４１４】
配列番号１５１
【化８７】
2016510601.tif 000114
【０４１５】
配列番号１５２
【化８８】
2016510601.tif 000115
【０４１６】
配列番号１５３
【化８９】
2016510601.tif 000116
【０４１７】
配列番号１５４
【化９０】
2016510601.tif 000117
【０４１８】
配列番号１５５
【化９１】
2016510601.tif 000118
【０４１９】
配列番号１５６
【化９２】
2016510601.tif 000119
【０４２０】
配列番号１５７
【化９３】
2016510601.tif 000120
ｒＣ鋳型
【０４２１】
配列番号１５８
【化９４】
2016510601.tif 000121
【０４２２】
配列番号１５９
【化９５】
2016510601.tif 000122
【０４２３】
配列番号１６０
【化９６】
2016510601.tif 000123
【０４２４】
配列番号１６１
【化９７】
2016510601.tif 000124
【０４２５】
配列番号１６２
【化９８】
2016510601.tif 000125
【０４２６】
配列番号１６３
【化９９】
2016510601.tif 000126
【０４２７】
配列番号１６４
【化１００】
2016510601.tif 000127
【０４２８】
ともに、これらの核酸（配列番号６８、２９１、１１６および６９はそれぞれ、出現順に）は、表示の通りにＰＣＲアッセイセットアップを構成する：
【化１０１】
2016510601.tif 000128
【０４２９】
末端Ｃ３スペーサー基（「ｘ」で表示）は、ｒＵ含有オリゴヌクレオチドがプライマーとして有用になることをブロックする。鋳型にハイブリダイズすると、この二本鎖がＲＮａｓｅ  Ｈ２に対する基質となり、切断がｒＵ残基のすぐ５’側で起こり、図示した（←）機能性プライマーがもたらされる。
【０４３０】
定量的リアルタイムＰＣＲ反応を、未修飾プライマー配列番号６８、およびｒＮ含有プライマー配列番号１０９から１３６と鋳型配列番号１３７から１６４のペアの組合せを用いて行った。反応を、３８４ウェル形式にて、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームを用いて行った。反応液は、１×ＢＩＯ−ＲＡＤ  ｉＱ（商標）ＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、２００ｎＭの各プライマー（フォワード＋リバース）および１．３ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２を１０μｌ容量中に含むものにした。熱サイクリングパラメータには９５℃での最初の５分間の浸漬を含め、次いで、４５サイクルの［９５℃で１０秒間＋６０℃で２０秒間＋７２℃で３０秒間］を行った。この条件下では、Ｆｏｒ＋Ｒｅｖ（未修飾）プライマーを用いて行った対照反応と、パーフェクトマッチＦｏｒ（未修飾）＋ｒＮ  Ｒｅｖ（ブロック型）プライマーを用いて行った対照カップリング型ＲＮａｓｅ  Ｈ２  切断−ＰＣＲ反応とでＣｐ値は同一であった。従って、使用した反応条件は、リアルタイム熱サイクリングの速度論的拘束内でパーフェクトマッチ種が切断されるのに充分なインキュベーション時間とＲＮａｓｅ  Ｈ２濃度を有するものであり、この点からの逸脱（あれば）は、ブロック型プライマーと種々の鋳型間に存在する塩基ミスマッチによって付与された反応効率の変化を表す。
【０４３１】
プライマーと鋳型のペアの組合せを上記のようにして実験し、結果を以下に、ΔＣｐ（これは、対照とミスマッチ反応間で観察されるサイクル閾値の差である。）を示してまとめる。各ＣｐはＰＣＲ（これは、この条件下では指数関数的反応である。）のサイクルを表すため、ΔＣｐが１０とは、実際には２１０の差、即ち１０２４倍の感度の変化を表す。対立遺伝子特異的ＰＣＲアッセイでは、４から５サイクルのΔＣｐで一般的にＳＮＰ間の識別が充分になされる。
【０４３２】
ｒＮ塩基に対して中央の位置の塩基を変えて行った試験の結果を以下に表２８に示す（配列番号２９２および２９３はそれぞれ、出現順に）：
【０４３３】
【表２７】
2016510601.tif 000129
【０４３４】
反応性効率の非常に大きな差が熱サイクリング条件下でのｒＮ基質のＲＮａｓｅ  Ｈ２切断において見られ、およそ４０倍の差（ΔＣｐ  ５．３）から３０，０００倍を超える差（ΔＣｐ  １４．９）に及ぶ。５サイクル未満のΔＣｐが示されたアッセイはなかった。従って、ＲＮａｓｅ  Ｈ２のｒＮ切断反応は、速度論的アッセイ（ｑＰＣＲ）の状況において定常状態条件下でよりもはるかに大きな特異性と、標準的なＤＮＡプライマーを用いる対立遺伝子特異的ＰＣＲよりもずっと大きな選択性を示す。高い特異性は、発明の詳細な説明に記載し、以下の実施例に示すプライマーの設計によって付与され得る。
【０４３５】
ｒＮ塩基に対して−１位の塩基を変えて行った試験の結果を以下に表２９に示す（配列番号２９４および２９５はそれぞれ、出現順に）：
【０４３６】
【表２８】
2016510601.tif 000130
【０４３７】
ｒＮ塩基に対して＋１位の塩基を変えて行った試験の結果を以下に表３０に示す（配列番号２９６および２９７はそれぞれ、出現順に）：
【０４３８】
【表２９】
2016510601.tif 000131
【０４３９】
ｒＮ塩基に対して−１位および＋１位について上記に示したすべての配列バリアントのｒＡ、ｒＣおよびｒＧプローブを含むペアの組合せについて同様に試験した。結果を以下の表３１から３６に示す。
【０４４０】
表３１：ｒＡ塩基に対して−１の位置の考えられ得るすべての塩基ミスマッチのΔＣｐ
【０４４１】
【表３０】
2016510601.tif 000132
【０４４２】
表３２：ｒＡ塩基に対して＋１の位置の考えられ得るすべての塩基ミスマッチのΔＣｐ
【０４４３】
【表３１】
2016510601.tif 000133
【０４４４】
表３３：ｒＣ塩基に対して−１の位置の考えられ得るすべての塩基ミスマッチのΔＣｐ
【０４４５】
【表３２】
2016510601.tif 000134
【０４４６】
表３４：ｒＣ塩基に対して＋１の位置の考えられ得るすべての塩基ミスマッチのΔＣｐ
【０４４７】
【表３３】
2016510601.tif 000135
【０４４８】
表３５：ｒＧ塩基に対して−１の位置の考えられ得るすべての塩基ミスマッチのΔＣｐ
【０４４９】
【表３４】
2016510601.tif 000136
【０４５０】
表３６：ｒＧ塩基に対して＋１の位置の考えられ得るすべての塩基ミスマッチのΔＣｐ
【０４５１】
【表３５】
2016510601.tif 000137
【０４５２】
一塩基ミスマッチの状況におけるピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２によるｒＮ基質の切断の反応効率の相対変化は、対合塩基の実体、切断部位に対するミスマッチの相対位置および隣接塩基により異なる。この実施例で規定したミスマッチの表は、ミスマッチ遺伝子座とマッチ遺伝子座間の予測される差（ΔＣｐ）を最大限にする最適なミスマッチ検出アッセイを設計するために使用され得、新たなアッセイ設計の最適化を自動化するためのアルゴリズムに構築され得る。
【０４５３】
［実施例１４］定常状態条件下でのｆＵｆＵ基質のミスマッチ識別
ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素が、ｆＵｆＵジヌクレオチドペアを含む二本鎖基質内の塩基ミスマッチを識別する能力を定常状態条件下で試験した。以下の基質を３２Ｐ−末端標識し、上記の実施例５および６に記載の「Ｍｎ切断バッファー」中でインキュベートした。反応液は、１００ｎＭの基質を１Ｕの酵素とともに２０μＬ容量中に含むものにし、７０℃で２０分間インキュベートした。反応生成物を、変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて分離し、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｙｃｌｏｎｅ（商標）Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ホスフォイメージャー）を用いて可視化した。各バンドの相対強度を定量し、結果を、切断された全基質に対する割合としてプロットした。
【０４５４】
パーフェクトマッチ（配列番号４２と１８３）、２’−フルオロジヌクレオチドペア内のミスマッチ（配列番号４２と１６５から１７１）ならびに２’−フルオロジヌクレオチドペアに隣接しているミスマッチ（配列番号４２と１７２から１７７）を含む表３７に示す１４種類の二本鎖を試験した。結果をパーフェクトマッチ＝１００％に対して正規化した。
【０４５５】
【表３６】
2016510601.tif 000138
2016510601.tif 000139
【０４５６】
ピロコッカス属のＲＮａｓｅ  Ｈ２は、この条件下で一塩基ミスマッチ同士を非常に効率的に識別することができた。厳密な識別度合いは、ミスマッチにおいてどの塩基が対合しているかによって異なった。興味深いことに、−１位および＋１位（ｆＵｆＵドメインに対して）のどちらのミスマッチも有効であった。ｆＵｆＵ基質の使用での切断に対する特異性は、定常状態アッセイ条件下においてｒＣ基質（上記の実施例１２）よりも有意に高かった。
【０４５７】
上記の試験ではｆＵｆＵジヌクレオチドペアを使用し、これは、先に実施例６において、可能な１６種類のジヌクレオチドペアの切断に対して最も効率性の低いジ−フルオロ基質であることが示された。これは、ミスマッチ結果に影響を及ぼし得る。同様の実験を、同じ相補鎖使用し、ｆＵｆＣジ−フルオロ基質鎖に置き換えて実施した。ｆＵｆＣではｆＵｆＵ基質と比べて高い切断活性が見られたため、ＲＮａｓｅ  Ｈ２は２０ｍＵに減らした。結果を以下の表３８に示す。
【０４５８】
【表３７】
2016510601.tif 000140
2016510601.tif 000141
【０４５９】
この場合も、ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２は一塩基ミスマッチ同士を非常に効率的に識別することができた。厳密な識別度合いは、ミスマッチにおいてどの塩基が対合しているかによって異なった。先のように、−１位および＋１位（ｆＵｆＣドメインに対して）のどちらのミスマッチも有効であった。ｆＵｆＣ基質の使用での切断に対する特異性は、定常状態アッセイ条件下においてｒＣ基質（上記の実施例１２）よりも有意に高く、また、ｆＵｆＵ基質よりもわずかに大きな特異性が示された。熱サイクリング中の速度論的アッセイ条件下では、ジ−フルオロ基質の使用でのミスマッチアッセイで、さらに大きな選択性が示され得る。
【０４６０】
［実施例１５］基質内へのホスホロチオエートヌクレオチド間修飾の選択的配置
ホスホロチオエートヌクレオシド間結合の組込みの効果を、幾つかの異なる基質で試験した。ホスホロチオエート（ＰＳ）結合は、典型的には比較的ヌクレアーゼ抵抗性とみなされており、ヌクレアーゼ含有溶液、例えば血清中におけるオリゴヌクレオチドの安定性を増大させるために一般的に使用されている。ＰＳ結合は２つの立体異性体ＲｐとＳｐを形成し、これらは通常、異なるヌクレアーゼに対して異なる安定化レベルを示す。
【０４６１】
２つの修飾塩基間にＰＳ結合を有するジ−フルオロ基質を調べた。両ジアステレオマーの混合物を本試験に使用した。
【０４６２】
未修飾ｆＵｆＣ基質：
【０４６３】
配列番号４１および２９８はそれぞれ、出現順に
【化１０２】
2016510601.tif 000142
【０４６４】
ＰＳ修飾ｆＵ＊ｆＣ基質（「＊」＝ＰＳ結合）：
【０４６５】
配列番号１９１および２９９はそれぞれ、出現順に
【化１０３】
2016510601.tif 000143
（注−配列内のギャップはアラインメント目的のためのものである。）
【０４６６】
上記の基質を７０℃で１時間、「Ｍｎ切断バッファー」中で、１２０μｌ容量中１６０ピコモルの基質（１．３μＭ）および４単位の組換えピロコッカス属ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素を用いてインキュベートした。反応を、ゲル負荷バッファー（ホルムアミド／ＥＤＴＡ）の添加によって停止させ、変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ゲルを、ＧｅｌＳｔａｒ（商標）（Ｌｏｎｚａ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）を用いて染色し、ＵＶ励起によって可視化した。未修飾基質はこの条件下で１００％切断された；しかしながら、ＰＳ修飾基質は本質的に未切断であった。ホスホロチオエート修飾によってジ−フルオロ基質の切断が有効にブロックされ得る。
【０４６７】
次に、単一のｒＣ残基を含む基質を試験し、ＲＮＡ塩基のいずれか側（表示した通りの５’側または３’側）におけるＰＳ修飾の配置を試験した。両ジアステレオマーの混合物を本試験に使用した。
【０４６８】
上記の基質を７０℃で１時間、「Ｍｇ切断バッファー」中で、１２０μｌ容量中１６０ピコモルの基質（１．３μＭ）および４単位の組換えピロコッカス属ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素を用いてインキュベートした。反応を、ゲル負荷バッファー（ホルムアミド／ＥＤＴＡ）の添加によって停止させ、変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ゲルを、ＧｅｌＳｔａｒ（商標）（Ｌｏｎｚａ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）を用いて染色し、ＵＶ励起によって可視化した。未修飾基質はこの条件下で１００％切断された。５’−＊ｒＣおよび３’−ｒＣ＊のどちらのＰＳ修飾基質もこの条件下でおよそ５０％切断された。このような結果は、他方の異性体よりも切断に対して抵抗性である一方の立体異性体ＲｐまたはＳｐと最も整合する。
【０４６９】
３’−ｒＣ＊基質をより詳細に試験した。ＲＮａｓｅ  Ｈ２はこの基質をリボヌクレオチドの５’側で切断するが、他のＲＮａｓｅ（例えば、ＲＮａｓｅ  Ａ、ＲＮａｓｅ  １など）はこの基質をリボヌクレオチドの３’側で切断するため、ＰＳ修飾を、基質を他のヌクレアーゼによる不要な分解から保護するがＲＮａｓｅ  Ｈ２基質として利用可能なままにする手段として使用することが可能であり得る。ＲＮａｓｅ  Ａおよび他の一本鎖リボヌクレアーゼによるＲＮＡ基質の切断は、Ｓｐホスホロチオエート異性体の方がＲｐ異性体よりも大きな程度で阻害することはよく知られている。Ｓｐ異性体とＲｐ異性体のＲＮａｓｅ  Ｈ２切断に対する相対効果は知られていない。従って、この２つの立体異性体を精製し、ＳｐおよびＲｐ異性体の３’−ｒＣ＊基質の安定性に対する相対寄与を試験した。
【０４７０】
ホスホロチオエート異性体がＨＰＬＣ手法によって分離され得ること、およびこの分離は、オリゴヌクレオチド内にＰＳ結合が１つしか存在しない場合、容易に行われることはよく知られている。従ってＨＰＬＣを用いて、３’−ｒＣ＊基質、配列番号１９２（５’−ＣＴＣＧＴＧＡＧＧＴＧＡＴＴＣ（＊）ＡＧＧＡＧＡＴＧＧＧＡＧＧＣＧ−３’；図２３）の２つのＰＳ異性体を精製した。質量７ナノモルの一本鎖の３’−ｒＣ＊含有オリゴヌクレオチドを使用した。特性評価により、試験物質が９４６４ドルトン（計算値９４６５）（ＥＳＩ−ＭＳによる。）の分子量を有し、モル純度９５％（キャピラリー電気泳動による。）を有することが示された。この物質を４．６ｍｍ×５０ｍｍ  Ｘｂｒｉｄｇｅ（商標）Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）（２．５ミクロン粒径）にインジェクトした。開始時の移動相（バッファーＡ）は、５％アセトニトリルを含む１００ｍＭ  ＴＥＡＡ  ｐＨ７．０にし、これに３５℃で純粋なアセトニトリル（バッファーＢ）を混合した。使用したＨＰＬＣ法で試料は明白に２つのピークに分割され、これらのピークを収集し、再度泳動させて純度を調べた。混合異性体試料および精製した被検物のＨＰＬＣ図を図２３に示す。「Ａ」および「Ｂ」のピークはともに、９４６４ドルトン（ＥＳＩ−ＭＳによる。）の同一の質量を有した。最初の試料から、１．３ナノモルのピーク「Ａ」と３．６ナノモルのピーク「Ｂ」が回収された。
【０４７１】
質量またはＨＰＬＣデータに基づくと、どのピークがＲｐであり、どのピークがＳｐ異性体であるのかを同定することは可能でなかった。ＲＮａｓｅ  Ａによる分解に対する相対抵抗性を使用し、異性体の実体を精製画分に帰属させた。Ｓｐ異性体は、ＲＮａｓｅ  Ａ分解に対してＲｐ異性体よりも相対的に大きな抵抗性がもたらされることが知られている。精製生成物を一本鎖形態において試験した。基質を、６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌのγ−３２Ｐ−ＡＴＰおよび酵素Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（Ｏｐｔｉｋｉｎａｓｅ，ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて３２Ｐで放射性標識した。追跡標識を反応混合物に添加した（１：５０）。反応を、１００ｎＭの基質を２０μｌ容量で、１ｐｇ（７２アトモル）のＲＮａｓｅ  ＡとともにＭｇ切断バッファー中で用いて行った。反応液を７０℃で２０分間インキュベートした。反応生成物を、変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて分離し、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｙｃｌｏｎｅ（商標）Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ホスフォイメージャー）を用いて可視化した。各バンドの相対強度を定量し、結果を、切断された全基質に対する割合としてプロットした。ピーク「Ａ」の方がピーク「Ｂ」よりもＲＮａｓｅ  Ａによって完全に分解された；従って、ピーク「Ａ」をＲｐ異性体の実体に帰属させ、ピーク「Ｂ」をＳｐ異性体に帰属させた。
【０４７２】
各立体異性体のＲＮａｓｅ  Ｈ２切断に対する相対感受性を試験した。基質のＲＮＡ含有鎖を、６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌのγ−３２Ｐ−ＡＴＰおよび酵素Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（Ｏｐｔｉｋｉｎａｓｅ，ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて３２Ｐで放射性標識した。追跡標識を反応混合物に添加した（１：５０）。反応を、１００ｎＭの基質を２０μｌ容量で、１００μＵの組換えピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２とともにＭｇ切断バッファー中で用いて行った。基質は一本鎖および二本鎖の両方の形態で使用した。反応液を７０℃で２０分間インキュベートした。反応生成物を、変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて分離し、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｙｃｌｏｎｅ（商標）Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ホスフォイメージャー）を用いて可視化した。各バンドの相対強度を定量し、結果を、切断された全基質に対する割合としてプロットした。予測どおり、一本鎖基質はＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素によって切断されなかった。対照の未修飾ｒＣ二本鎖（配列番号１０および１１）は、使用した条件下で１００％切断された。Ｓｐ異性体３’−ｒＣ＊二本鎖基質（ピーク「Ｂ」）は約３０％切断されたが、Ｒｐ異性体（ピーク「Ａ」）はこの条件下で＜１０％切断された。従って、ラセミ体的に純粋なホスホロチオエート修飾基質のこの位置（リボヌクレオチドの３’側）での切断に対する相対感受性は、ＲＮａｓｅ  Ｈ２とＲＮａｓｅ  Ａで正反対である。Ｓｐ異性体の方がより容易にＲＮａｓｅ  Ｈ２によって切断されるが、ＲＮａｓｅ  ＡにはＲｐ異性体の方がより容易に切断される。従って、ラセミ体的に純粋なＳｐ異性体ホスホロチオエート修飾をリボヌクレオチドの３’側に有する単一リボヌクレオチド含有基質が、この結合を、一本鎖ヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ  Ａなど）による不要な分解からは保護するがなおＲＮａｓｅ  Ｈ２による切断に対する機能性基質であるようにするために使用され得る。酵素切断とホスホロチオエート立体異性体との関係を図２４にまとめる。
【０４７３】
［実施例１６］ｑＰＣＲアッセイにおけるｒＮ含有二重標識プローブの有用性
以下の実施例は、ｒＵ含有二重標識プローブを用いたリアルタイムＰＣＲアッセイを示す。先に、本発明者らは、実施例９において、ＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ検出形式を使用するｑＰＣＲにおけるｒＮブロック型プライマーの使用の実現可能性を示した。本発明の方法を用いたブロック型オリゴヌクレオチドの切断はまた、二重標識プローブアッセイ形式にも適用され得る。定温サイクリングプローブアッセイ形式において４ＲＮＡ塩基切断ドメインを含む二重標識プローブを切断するためのＲＮａｓｅ  Ｈ１の使用は、Ｈａｒｖｅｙ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．によって報告されている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３３：２４６−２５５，２００４）。ＲＮａｓｅ  Ｈを使用する別の二重標識プローブアッセイが報告されており、この場合、単一のリボヌクレオチド残基を含む分子ビーコンが、ＲＮａｓｅ  Ｈ２を使用するエンドポイントＰＣＲ形式において多型を検出するために使用された（Ｈｏｕ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１７：４３３−４４３，２００７）。この実施例において、本発明者らは、プローブのＲＮａｓｅ  Ｈ２切断に依存するｑＰＣＲアッセイ形式における単一リボヌクレオチド含有二重標識プローブの使用を示す。
【０４７４】
表３９に示す以下のオリゴヌクレオチドをｑＰＣＲアッセイにおけるプローブおよびプライマーとして、二重標識蛍光クエンチプローブとともに使用した。標的は合成オリゴヌクレオチド鋳型であった。
【０４７５】
【表３８】
2016510601.tif 000144
【０４７６】
合成鋳型（プライマーおよびプローブ結合部位に下線を付している。）。
【０４７７】
配列番号７５
【化１０４】
2016510601.tif 000145
【０４７８】
定量的リアルタイムＰＣＲ反応を、未修飾プライマー配列番号６８および６９とプローブ配列番号１９３および１９４を用いて行った。反応を、３８４ウェル形式にて、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームを用いて行った。反応液は、２００ｎＭの各プライマー（フォワード＋リバース）および２００ｎＭプローブ、２×１０６コピーの合成鋳型ならびに５ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２を１０μｌ容量中に含むものにした。熱サイクリングパラメータには９５℃での最初の１０分間のインキュベーションを含め、次いで、４５サイクルの［９５℃で１０秒間＋６０℃で３０秒間＋７２℃で１秒間］を行った。使用するバッファーは使用するポリメラーゼに応じて変えた。
【０４７９】
ＰＣＲを、５’−エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて行った場合、ポリメラーゼによってプローブが分解される。この条件下では、ＤＮＡプローブはｒＮ修飾プローブと同じ性能を示すはずである。この反応は陽性対照を構成する。５’−エキソヌクレアーゼ活性がないＤＮＡポリメラーゼを使用した場合、いずれのプローブも分解されないはずである。この反応は陰性対照を構成する。しかしながら、エキソ陰性ポリメラーゼをＲＮａｓｅ  Ｈ２とともにを用いたＰＣＲ反応では、ｒＮ含有プローブは分解されるがＤＮＡプローブは分解されず、本発明の機能が実証されるはずである。この試験では、以下の２種類の耐熱性ポリメラーゼ：Ｉｍｍｏｌａｓｅ（インタクトな５’ヌクレアーゼ活性、Ｂｉｏｌｉｎｅ）およびＶｅｎｔ  Ｅｘｏ−（５’−エキソヌクレアーゼ陰性変異型、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用した。使用したバッファーは、該ＤＮＡポリメラーゼに対して製造業者が推奨するバッファーにし、ＲＮａｓｅ  Ｈ２活性に対して最適化しなかった。Ｉｍｍｏｌａｓｅでは、バッファーは１６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６７ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．３および３ｍＭのＭｇＣｌ２を含むものにした。Ｖｅｎｔ  Ｅｘｏ−では、バッファーは１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．８、１０ｍＭ  ＫＣｌおよび３ｍＭのＭｇＳＯ４を含むものにした。
【０４８０】
ｑＰＣＲ反応は記載の通りに実施し、結果を以下に表４０に示す。
【０４８１】
【表３９】
2016510601.tif 000146
【０４８２】
エキソヌクレアーゼ陽性ポリメラーゼを使用すると、どちらのプローブも同様の機能性能を示し、ＲＮａｓｅ  Ｈ２ありまたはなしの両方で同様のＣｐ値が得られた。しかしながら、エキソヌクレアーゼ欠損変異型ポリメラーゼを使用すると、ＤＮＡプローブは検出可能な蛍光シグナルを全く生成しなかった；ｒＵプローブは、ＲＮａｓｅ  Ｈ２の非存在下で蛍光シグナルを生成しなかったが、ＲＮａｓｅ  Ｈ２の存在下では切断され、予測されるＣｐ値でシグナルを生成した。ジ−フルオロ含有プローブの使用でも同様の結果が得られ得る。ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断ドメインが変異部位上に位置した場合、かかるプローブは、バリアント対立遺伝子を識別するために使用され得る。
【０４８３】
また、ＲＮａｓｅ  Ｈ切断性プローブは、増幅系アッセイ系の特異性をさらに増大させるために、本発明のブロック型プライマーの使用と関連させることもできる。
【０４８４】
［実施例１７］プライマーダイマー形成を抑制するためのｒＮ含有ブロック型プライマーの有用性
プライマーダイマーまたは他の小型の標的非依存性アンプリコンの形成は、エンドポイントＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲの両方において大きな問題であり得る。このような生成物は、プライマーが良好に設計されているようである場合であっても生じ得る。さらに、場合によっては、特定の領域にハイブリダイズするプライマーの選択のための配列の制約のため、最適下限の設計を有するプライマーを使用することが必要である。例えば、特定のウイルスのＰＣＲアッセイは、株間で可変的である領域のプライマーが選択される場合、亜型特異的または血清型特異的であり得る。逆に、ＰＣＲ反応は、プライマーがウイルスゲノムの高度に保存された領域に位置する場合、すべてのウイルス株が広く増幅されるように設計され得る。従って、プライマーを選択するために利用可能な配列空間は非常に限定され得、プライマーダイマーが形成される可能性を有する「不良」プライマーを使用しなければならない場合があり得る。「ホットスタート」ＰＣＲ法の使用は、このような問題が、すべてではないが一部解消され得る。
【０４８５】
以下の実施例は、広範なウイルス血清型の検出を可能にする保存されたドメイン内の部位を使用するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＰＣＲ系核酸検出アッセイの開発においてプライマーダイマーが大きな問題であることがわかったという米国特許０６００１６１１に示された、かかる場合の一例に由来するものである。本発明者らは、ここに、切断性ブロック型プライマーにより、特に「ホットスタート」ＤＮＡポリメラーゼの非存在下で不要なプライマーダイマー形成が抑制され得ることを示す。
【０４８６】
表４１に示す以下のオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲアッセイにおけるプライマーとして使用した。標的は、プラスミドから単離したクローン化合成アンプリコンであった。
【０４８７】
【表４０】
2016510601.tif 000147
【０４８８】
クローン化合成標的（プライマー結合部位に下線を付している。）。
【０４８９】
配列番号１９９
Ｃ型肝炎ウイルス亜型１ｂアンプリコン（２４２ｂｐ）：
【化１０５】
2016510601.tif 000148
【０４９０】
ＰＣＲ反応を３８４ウェル形式にて、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームを用いて行った。反応液は、１×Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）ＤｙＮＡｍｏ反応ミックスを、ＤｙＮＡｍｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、２００ｎＭの各プライマー（フォワード＋リバース）とともに、１．３ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２ありまたはなしで１０μｌ容量中に含むものにした。鋳型ＤＮＡは、２０００コピーの線状化ＨＣＶプラスミドアンプリコンまたは非標的対照のいずれかであった。熱サイクリングパラメータには、９５℃での最初の２分間の浸漬を含め、次いで、５０サイクルの［９５℃で１５秒間＋６０℃で３０秒間］を行った。試料を８％ポリアクリルアミド非変性ゲル上で分離し、ＧｅｌＳｔａｒ染色を用いて可視化した。結果を図２５に示す。ブロックなしの標準プライマーでは、５５ｂｐから９０ｂｐサイズの範囲のサイズを有する多数の産物が生成され、所望の完全長産物は見られなかった。ＲＮａｓｅ  Ｈ２の非存在下では、ブロック型プライマーの使用で増幅産物は全くもたらされなかった。ＲＮａｓｅ  Ｈ２がある場合、ブロック型プライマーによって予測サイズの単一の強いアンプリコンが生成し、所望のものでない小型種は見られなかった。
【０４９１】
ＤｙＮＡｍｏは非ホットスタートＤＮＡポリメラーゼである。本発明のＲＮａｓｅ  Ｈ２ブロック型プライマーを、低温では低い活性を有するホットスタートＲＮａｓｅ  Ｈ２とともに使用すると、所望のものでないプライマーダイマーが反応から排除され、所望のアンプリコンの形成がもたらされたが標準的な非ブロック型プライマーではもたらされず、小型の所望のものでない種のみが生じた。
【０４９２】
［実施例１８］ＲＮａｓｅ  Ｈ２アッセイバッファーにおける界面活性剤の使用
界面活性剤の存在は、ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素による切断に有益であることがわかった。反応条件を最適化するため、種々の界面活性剤を種々の濃度で試験した。
【０４９３】
各組換えＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素のアリコートを、上記に示した一本鎖および二本鎖オリゴヌクレオチド基質とともに８０μｌ反応容量で、バッファー５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０中で７０℃にて２０分間インキュベートした。反応を、ゲル負荷バッファー（ホルムアミド／ＥＤＴＡ）の添加によって停止させ、変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。配列番号１０および１１の基質のＲＮＡ鎖を３２Ｐで放射性標識した。反応を、１００ｎＭの基質を１００マイクロ単位（μＵ）の酵素とともにＭｇ切断バッファー中で、種々の濃度の種々の界面活性剤とともに用いて行った。試験対象の界面活性剤には、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０、ＣＴＡＢ、およびＮ−ラウロイル（ｌａｕｒｙｏｌ）サルコシルを含めた。ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｓｉｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２での結果を図２６に示す。さらなる実験を行い、ＣＴＡＢ界面活性剤濃度をより精密に滴定した。最大酵素活性を得るための界面活性剤の最適レベルは（ｖｏｌ：ｖｏｌ）：Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００では０．０１％、Ｔｗｅｅｎ−２０では０．０１％およびＣＴＡＢでは０．００１３％であった。界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−８０およびＮ−ラウロイルサルコシルならびに試験したその他の界面活性剤は性能を示さなかった。従って、非イオン系（Ｔｒｉｔｏｎ、Ｔｗｅｅｎ）およびイオン系（ＣＴＡＢ）界面活性剤はどちらも、本発明の好熱菌由来ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素を安定化させるために使用され得る。
【０４９４】
［実施例１９］ｑＰＣＲにおける蛍光クエンチ（Ｆ／Ｑ）切断性プライマーの使用
上記の実施例９では、切断性ブロック型プライマーがＰＣＲにおいて機能し、さらに、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  検出が使用されるリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に使用され得ることが示された。この実施例では、本発明者らは、ＰＣＲ反応過程においてプライマー自体が検出可能なシグナルを生成する蛍光クエンチ切断プライマーの使用を示す。
【０４９５】
図１８は、ブロック型切断性プライマーを用いてＰＣＲを行うためのスキームを示す。図２７は、蛍光クエンチ切断性プライマーを用いてＰＣＲを行うためのスキームを示す。この場合、ペアの一方のプライマーは蛍光色素で検出可能に標識される。蛍光クエンチャーは、プライマーの３’末端またはこの付近に位置し、プローブがインタクトなときはプライミングおよびＤＮＡ合成を有効に抑制する。色素とクエンチャーの間に単一のリボヌクレオチド塩基が位置する。このリボヌクレオチドでのＲＮａｓｅ  Ｈ２による切断によってレポーターとクエンチャーが分離し、クエンチングが解消され、検出可能なシグナルがもたらされる。同時に、切断によってプライマーが活性化され、ＰＣＲが進行する。
【０４９６】
表４２に示す以下の合成オリゴヌクレオチドを使用し、合成鋳型を用いたこの反応を実証した。対照として、未修飾プライマーと標準的な蛍光クエンチプローブを用いて５’−ヌクレアーゼＴａｑｍａｎ（Ｒ）アッセイを行った。ＲＮＡ塩基の３’側に４、５または６つのＤＮＡ塩基を有する３種類の合成蛍光クエンチ切断性プライマーバリアントを比較した。先に、Ｃ３スペーサーまたはｄｄＣ末端基を有するオリゴヌクレオチド基質の使用では、ＲＮＡ塩基に対して３’側に４つのＤＮＡ塩基が最適であることが確立されていた。３’末端またはこの付近におけるバルキーな疎水性クエンチャー基の存在によりこのドメイン内に必要とされるＤＮＡ残基の最適な数が変わり得ることが考えられ得た。
【０４９７】
【表４１】
2016510601.tif 000149
【０４９８】
合成鋳型
配列番号７５
【化１０６】
2016510601.tif 000150
【０４９９】
ＰＣＲ反応を１０μｌ容量で、２００ｎＭのプライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰ（合計８００μＭ）、１単位のｉＴａｑ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．３、５０ｍＭのＫＣｌおよび３ｍＭのＭｇＣｌ２を用いて行った。反応を、種々の量のピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２ありまたはなしのいずれかで、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームで、２×１０６コピーの合成鋳型／標的オリゴヌクレオチド（配列番号７５）を用いて行った。反応を９５℃で５分間の浸漬から開始し、続いて、４５サイクルの［９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で１秒間］を行った。ＦｏｒおよびＲｅｖプライマー（配列番号６８および６９）を内部配置型ＤＬＰ（配列番号２００）とともに使用した。あるいは、Ｆｏｒプライマー（配列番号６８）をＦＱプライマー（個々に）（配列番号２０１から２０３）とともに使用した。
【０５００】
Ｆ／Ｑ切断性プライマーの使用により、リアルタイムでＰＣＲ中に、５’−ヌクレアーゼアッセイ形式における従来の二重標識プローブ（ＤＬＰ）（配列番号２００）を用いて得られるものと同様の検出可能な蛍光シグナルがもたらされた。ＲＮＡ塩基の３’側に４つのＤＮＡ残基を有するプライマー配列番号２０１では、未修飾プライマーと比べて遅い増幅が示された。ＲＮＡ塩基の３’側に５つおよび６つのＤＮＡ塩基を有するプライマー配列番号２０２および２０３はより効率的であり、等しく良好な性能を示した。従って、このアッセイ形式では、３’−ブロッキング基が小型である場合は３から４つのＤＮＡ塩基設計が最適であるのとは反対に、ＲＮＡ塩基の３’側に５つのＤＮＡ塩基を有するオリゴヌクレオチド設計を使用することが好ましい。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎアッセイ形式を使用した先の実施例では、１．３ｍＵのＲＮａｓｅ  Ｈ２により未修飾プライマーと同一のプライミング効率がもたらされた。このＦ／Ｑアッセイ形式では、１．３ｍＵのＲＮａｓｅ  Ｈ２の使用により増幅の遅れがもたらされたが、２．６ｍＵのＲＮａｓｅ  Ｈ２の使用で、未修飾プライマーと比べて同一の結果がもたらされた。従って、Ｆ／Ｑアッセイ形式ではＲＮａｓｅ  Ｈ２の量を増大させることが好ましい。増幅もシグナルの検出もどちらもＲＮａｓｅ  Ｈ２依存性であった。
【０５０１】
ｑＰＣＲ反応のための増幅プロットの実施例を、５’−ヌクレアーゼアッセイのＤＬＰ（配列番号２００）を用いて実施し、Ｆ／Ｑ切断性５Ｄプライマー（配列番号２０２）を図２８に示す。両方法は、蛍光が最初に検出されるＣｐ値が同一（２０．０）であるため増幅効率が同様であることが明白である。興味深いことに、ΔＲｆ（検出された蛍光シグナルの大きさ）のピークは、ＦＱプライマーよりもＤＬＰの使用でわずかに高レベル側に存在した。最大蛍光シグナル放出の差について考えられ得る説明の１つは、ＦＱプライマー上の蛍光色素が反応終了時に一部クエンチされたままであったということである。５’−ヌクレアーゼアッセイでは、プローブが分解されてレポーター色素が反応混合物中に放出され、一本鎖の短鎖核酸断片に結合される。ＦＱプライマーアッセイ形式では、蛍光レポーター色素はＰＣＲアンプリコンに結合されたままであり、二本鎖形式である。ＤＮＡによってフルオレセイン発光がクエンチされ得、このため、この構成が最終シグナルを低下させているのかもしれない。
【０５０２】
従って、本発明者らは、プライマーにおける色素／クエンチャー構成を変えると蛍光シグナルが改変され得るかどうかを、同じプライマーのＦ／Ｑ型とＱ／Ｆ型を比較して試験した。上記で使用した合成アンプリコンアッセイでは、好ましい５−ＤＮＡプローブは３’末端に存在する「Ｇ」残基を有するものである。Ｇ残基はＦＡＭをクエンチする傾向があるが、他の塩基はＦＡＭ蛍光に対してほとんど効果がない。従って、アンプリコンをこの塩基を交換して修飾した。表４３の配列を合成し、蛍光リアルタイムＰＣＲアッセイ形式で試験した。
【０５０３】
【表４２】
2016510601.tif 000151
【０５０４】
合成鋳型
配列番号２０６
【化１０７】
2016510601.tif 000152
【０５０５】
ＰＣＲ反応を１０μｌ容量で、２００ｎＭのプライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰ（合計８００μＭ）、１単位のｉＴａｑ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．３、５０ｍＭのＫＣｌおよび３ｍＭのＭｇＣｌ２を用いて行った。反応は、２．６ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２を用いて、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームで、２×１０６コピーの合成鋳型／標的オリゴヌクレオチド（配列番号２０６）を用いて実施した。反応を９５℃で５分間の浸漬から開始し、続いて、４５サイクルの［９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で１秒間］を行った。Ｆｏｒプライマー（配列番号６８）を、ＦＱプライマー（配列番号２０４）またはＱＦプライマー（配列番号２０５）のいずれかとともに使用した。
【０５０６】
Ｆ／ＱおよびＱ／Ｆ切断性プライマーの使用では同一のＣｐがもたらされ、両プライマーは反応において等しい効率で性能を示すことが示された。予測どおり、Ｑ／Ｆプライマーでは、Ｆ／Ｑプライマーと比べて大きいΔＲｆが示された。どちらの型のプライマーもアッセイにおいて等しく良好に奏功する。
【０５０７】
［実施例２０］マルチプレックスｑＰＣＲにおける蛍光クエンチ（Ｆ／Ｑ）切断性プライマーの使用
マルチプレックスアッセイは、現在、実験を合理化してスループットを増大させるために一般的に使用されている。目的の実験的遺伝子に特異的なｑＰＣＲアッセイを、正規化目的のための内部参照対照遺伝子に特異的な第２のｑＰＣＲアッセイと併用することは特に一般的である。ｑＰＣＲのためのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ検出の弱点の１つはマルチプレックス反応が可能でないことである。色素標識蛍光クエンチプローブまたはプライマーの使用では、かかるマルチプレックス反応を行うことが可能でない。現在、同じ反応チューブ内で２、３または４種類の異なるフルオロフォアの組合せが可能であるリアルタイムＰＣＲサイクリング／検出装置が入手可能である。この実施例では、マルチプレックスｑＰＣＲにおける蛍光クエンチ（Ｆ／Ｑ）切断性プライマーの有用性を示す。
【０５０８】
表４４に示す以下のオリゴヌクレオチド試薬を合成し、マルチプレックスｑＰＣＲを、５’−ヌクレアーゼアッセイでの二重標識プローブまたはＦ／Ｑ切断性プライマーのいずれかを用いて行った。一方のアッセイはヒトＭＹＣ遺伝子（ＮＭ＿００２４７６）に特異的なものにし、第２のアッセイは、一般的に使用されている内部正規化対照遺伝子であるスプライシング因子のヒトＳＦＲＳ９遺伝子（ＮＭ＿００３７６９）に特異的なものにした。
【０５０９】
【表４３】
2016510601.tif 000153
【０５１０】
ＰＣＲ反応を１０μｌ容量で、２００ｎＭのプライマー（および、適宜プローブ）、２００μＭの各ｄＮＴＰ（合計８００μＭ）、１単位のｉＴａｑ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．３、５０ｍＭのＫＣｌおよび３ｍＭのＭｇＣｌ２を用いて行った。反応は、１０ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２を用いて、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームで、全ＨｅＬａ細胞ＲＮＡから作製した２ｎｇのｃＤＮＡを用いて行った。反応を９５℃で５分間の浸漬から開始し、続いて、４５サイクルの［９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で１秒間］を行った。
【０５１１】
５’−ヌクレアーゼアッセイのためのマルチプレックス反応には、ＭＹＣ  ＦｏｒとＲｅｖプライマー＋ＭＹＣプローブ（配列番号２０７から２０９）およびＳＦＲＳ９  ＦｏｒとＲｅｖプライマー＋ＳＦＲＳ９プローブ（配列番号２１２から２１４）を含めた。ＦＱ切断性プライマーアッセイのためのマルチプレックス反応には、ＭＹＣ−Ｆｏｒ−ＦＱとＭＹＣ−Ｒｅｖ−Ｂブロック型プライマー（配列番号２１０および２１１）ならびにＳＦＲＳ９−Ｆｏｒ−ＦＱとＳＦＲＳ９−Ｒｅｖ−Ｂブロック型プライマー（配列番号２１５および２１６）を含めた。また、アッセイはすべて、比較のためシングルプレックス形式で実施した。ＦＡＭプライマーおよびプローブはフルオレセイン色素チャネル内で検出されたが、ＭＡＸプライマーおよびプローブはＨＥＸ色素チャネル内で検出された。マルチプレックス型ＤＬＰ  ５’−ヌクレアーゼアッセイおよびマルチプレックス型ＦＱ切断性プライマーアッセイはどちらも良好に奏功し、非常に同様のデータが得られ、これを以下の表４５にまとめる。
【０５１２】
【表４４】
2016510601.tif 000154
【０５１３】
ＲＮａｓｅ  Ｈ濃度を滴定し、マルチプレックス形式では反応効率を維持するために高レベルの酵素が必要とされた。例えば、シングルプレックスＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ検出形式でのブロック型プライマーには１．３ｍＵの酵素が必要とされた。シングルプレックス形式でのブロック型ＦＱプライマーには２．６ｍＵの酵素が必要とされた。マルチプレックス形式でのブロック型ＦＱプライマーには１０ｍＵの酵素が必要とされた。従って、切断性プライマーを異なるアッセイ形式で使用する場合、使用するＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素の量を滴定することが重要である。
【０５１４】
マルチプレックスプローブの使用が一般的な実務である別の適用は対立遺伝子識別ＳＮＰである。以下のアッセイを設計し、ＳＭＡＤ７遺伝子の結腸直腸癌の発症と関連していることがわかっている部位ｒｓ４９３９８２７におけるＳＮＰペアを識別した。この部位におけるＦＱブロック型プライマーを、上記の実施例に教示された標準的な設計特長を用いて、この遺伝子の「Ｃ」および「Ｔ」対立遺伝子を識別するためのさらなる最適化をなんら行うことなく設計し、合成した。配列を以下に表４６に示す。
【０５１５】
【表４５】
2016510601.tif 000155
【０５１６】
上記のプライマーは、ＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４）以下の８５ｂｐ領域を標的化する。プライマー結合部位に下線を付し、ＳＮＰの位置を太字のイタリック体で強調している。
【０５１７】
ｒｓ４９３９８２７（ＳＭＡＤ７）Ｃ対立遺伝子（配列番号２２０）
【化１０８】
2016510601.tif 000156
【０５１８】
ｒｓ４９３９８２７（ＳＭＡＤ７）Ｔ対立遺伝子（配列番号２２１）
【化１０９】
2016510601.tif 000157
【０５１９】
ＰＣＲ反応を１０μｌ容量で、２００ｎＭのＦＱ−Ｆｏｒおよび未修飾のリバースプライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰ（合計８００μＭ）、１単位のｉＴａｑ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．３、５０ｍＭのＫＣｌおよび３ｍＭのＭｇＣｌ２を用いて行った。反応は、２．６ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２を用いて、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームで、２ｎｇの標的ＤＮＡを用いて行った。標的ＤＮＡは、２つのＳＭＡＤ７対立遺伝子（Ｃｏｒｅｉｌｌ  １８５６２および１８５３７）にホモ接合型の細胞から作製したゲノムＤＮＡであった。「Ｃ」および「Ｔ」対立遺伝子（配列番号２２０および２２１）を個々に（ホモ接合体）および一体で（ヘテロ接合体）試験した。反応を９５℃で５分間の浸漬から開始し、続いて、４５サイクルの［９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で１秒間］を行った。データ収集は、ＦＡＭチャネルおよびＨＥＸチャネルを検出するマルチプレックスモードに設定した。
【０５２０】
結果を図３０に示す。ＦＡＭ標識「Ｃ」プローブは「Ｃ」標的ＤＮＡの存在を検出したが「Ｔ」標的ＤＮＡは検出しなかったこと、およびＨＥＸ「Ｔ」プローブは「Ｔ」標的ＤＮＡの存在を検出したが「Ｃ」標的ＤＮＡは検出しなかったことが明白である。従って、ＦＱ切断性プライマーはマルチプレックス形式においてＳＮＰを識別するために使用され得る。
【０５２１】
［実施例２１］プライマー−プローブアッセイにおける蛍光クエンチ切断性プライマーの使用
本発明者らは以前に、相違するが関連している２つのエレメント、核酸分子の５’末端の方に位置するレポータードメインと、３’末端に位置するプライマードメインとを含む蛍光クエンチプライマーを用いて核酸試料を検出する方法を報告した（米国特許出願公開第２００９／００６８６４３号明細書）。プライマードメインは、標的核酸に相補的であり、ＰＣＲで使用する条件下で該標的核酸に結合する。これは、例えばＰＣＲにおいて、相補的な標的を鋳型として用いてＤＮＡ合成をプライミングし得る。レポータードメインは、標的に相補的なものであり得る配列、または標的核酸に無関連で標的にハイブリダイズしないものであり得る配列を含むものである。さらに、レポータードメインには検出可能なエレメント、例えば蛍光レポーター色素およびクエンチャーが含まれる。レポーター色素とクエンチャーは、レポータードメインが一本鎖のランダムコイルコンホメーションである場合はレポーター色素からの蛍光シグナルがクエンチャーによって有効に抑制されるような適切な数のヌクレオチドによって隔離されている。ＰＣＲ中、プライマードメインがＤＮＡ合成をプライミングし、これによりＦＱＴ合成オリゴヌクレオチドが産物核酸内に組み込まれ、これ自体が次のＰＣＲサイクルの鋳型として使用され得る。次のＰＣＲサイクル中のプライマー伸長時、ＦＱＴプローブ全体が、レポータードメインを含む二本鎖形態に変換される。剛直な二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ）の形成によりフルオロフォアとクエンチャー間の物理的距離が増大し、蛍光放射の抑制が低減される（従って、蛍光強度が増大する。）。従って、ＰＣＲ中のＦＱＴプライマーの二本鎖形態への変換は検出可能な事象を構成する。レポーター色素とクエンチャー間の部位でのレポータードメインの切断によって、レポーター色素とクエンチャーが物理的に分離した状態になり、もはや同じ核酸分子上で共有結合状態でなくなると、蛍光シグナルのさらなる増大が得られ得る。この切断事象は二本鎖核酸配列の形成に依存性であり、このため、ＦＱＴプライマーが最初の一本鎖状態である場合は切断は起こり得ない。レポーターとクエンチャーを分離するための適切な方法としては、例えば、ｄｓＤＮＡ内の特定の配列を切断する制限エンドヌクレアーゼの使用が挙げられる。あるいは、ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断ドメインがフルオロフォアとクエンチャー間に位置し得る。フルオロフォアとクエンチャー間への単一のリボヌクレオチド残基の位置により、ＦＱＴプライマーがＰＣＲ中、ＲＮａｓｅ  Ｈ２の適切な基質となり得る。この反応のスキームを図３１に示す。この実施例では、プライマー−プローブリアルタイムＰＣＲアッセイにおいて蛍光クエンチプライマーの切断を媒介するための耐熱性ＲＮａｓｅ  Ｈ２の使用を示す。
【０５２２】
未修飾ＦｏｒおよびＲｅｖプライマーを５’−ヌクレアーゼアッセイにおける使用に適切な内部位置二重標識プローブとともに含めたヒトＤｒｏｓｈａ遺伝子のためのｑＰＣＲアッセイを設計した。また、Ｆｏｒプライマーは、未修飾Ｆｏｒプライマーと同じプライマードメイン配列を使用し、レポータードメインを５’末端に付加したＦＱＴフォワードプライマーとして合成し、該レポータードメインには、１１塩基分隔離されたレポーター色素（フルオレセイン−ｄＴ）とダーククエンチャー（ＩＢＦＱ）を含め、中央位置ｒＵ塩基（切断部位）を含めた。配列を以下に表４７に示す。
【０５２３】
【表４６】
2016510601.tif 000158
【０５２４】
上記のプライマーは、ヒトＤｒｏｓｈａ遺伝子（ＲＮＡＳＥＮ，ＮＭ＿０１３２３５）の以下の１４１ｂｐ領域を標的化する。プライマー結合部位に下線を付し、５’−ヌクレアーゼアッセイのための内部プローブ結合部位はボールドフォントである。
【０５２５】
Ｄｒｏｓｈａアンプリコン（配列番号２２６）
【化１１０】
2016510601.tif 000159
【０５２６】
５’−ヌクレアーゼｑＰＣＲ反応を１０μｌ容量で、２００ｎＭの未修飾ＦｏｒおよびＲｅｖプライマーを２００ｎＭのプローブ、２００μＭの各ｄＮＴＰ（合計８００μＭ）、１単位のｉＴａｑ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．３、５０ｍＭのＫＣｌおよび３ｍＭのＭｇＣｌ２とともに用いて行った。ＦＱＴ  ｑＰＣＲ反応は１０μｌ容量で、２００ｎＭのＦＱＴ−フォワードプライマーおよび２００ｎＭの未修飾のリバースプライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰ（合計８００μＭ）、１単位のｉＴａｑ（ホットスタート耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ，ＢＩＯ−ＲＡＤ）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．３、５０ｍＭのＫＣｌおよび３ｍＭのＭｇＣｌ２を用いて行った。反応は、２．６ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２を用いて、またはなしで、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームにおいて行った。反応は、全ＨｅＬａ細胞ＲＮＡから作製した１０ｎｇのｃＤＮＡを用いて、またはなしで行った。反応を９５℃で５分間の浸漬から開始し、続いて、４５サイクルの［９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で１秒間］を行った。
【０５２７】
５’−ヌクレアーゼｑＰＣＲ反応の結果を図３２Ａに示す。陽性シグナルが２６サイクル目に見られた。ＦＱＴプライマーｑＰＣＲ反応の結果を図３２Ｂに示す。陽性シグナルが、５’−ヌクレアーゼアッセイ結果とほぼ同一の２７サイクル目に見られた。この場合、シグナルはＲＮａｓｅ  Ｈ２切断に依存性であった。従って、ＲＮａｓｅ  Ｈ２による内部ＲＮＡ残基での切断は、相違する蛍光クエンチレポータードメインを有するＦＱＴプライマーからシグナルを生成させるために使用され得る。
【０５２８】
［実施例２２］ミスマッチ識別を改善するための切断性ブロック型プライマーにおける修飾塩基の使用
本発明者らは、実施例１３でＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎアッセイ形式でのｑＰＣＲにおいて一塩基ミスマッチを識別するために、および実施例２０で蛍光クエンチ（ＦＱ）アッセイ形式においてブロック型切断性プライマーが使用され得ることを示した。厳密な塩基ミスマッチおよび配列状況にもよるが、ミスマッチ標的の検出可能なシグナルはパーフェクトマッチ標的の検出の５から１５サイクル後に生じた。より大きなミスマッチ識別レベルが所望される状況があり得る（例えば、主に野生型細胞バックグラウンドにおけるレア変異型対立遺伝子の検出）。本発明者らは、この実施例において、切断性プライマー内への２’ＯＭｅ  ＲＮＡ修飾残基の選択的配置によってミスマッチ識別が改善され得ることを示す。
【０５２９】
上記の実施例５では、修飾塩基は、使用される修飾の型および切断部位との相対的な位置にもよるがＲＮａｓｅ  Ｈ２によるヘテロ二本鎖基質の切断と適合性であり得ることが示された。従って、本発明者らは、単一の未修飾のリボヌクレオチド塩基を有するブロック型プライマーにおける２’ＯＭｅ修飾の使用をより詳細に示す。表４８に以下に示す以下のプライマーを合成し、合成オリゴヌクレオチド鋳型を用いたＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ形式でのｑＰＣＲ反応に使用した。単一のｒＵ残基を有するブロック型切断性プライマーを、さらなる修飾なしのもの（配列番号１１６）、またはｒＵの５’側に２’ＯＭｅ塩基を有するもの（配列番号２２８）、またはｒＵの３’側に２’ＯＭｅ塩基を有するもの（配列番号２２９）のいずれかで合成した。２’ＯＭｅ残基をリボヌクレオチドの５’側に位置すると最終プライマー内に残留し、これはＲＮａｓｅ  Ｈ２による切断に起因する。従って、この反応生成物を模倣させるために３’末端に３’−２’ＯＭｅ  Ｕ残基を有する合成鋳型に特異的なＳｙｎ−Ｒｅｖ−ｍＵプライマーを作製した（配列番号２２７）。
【０５３０】
【表４７】
2016510601.tif 000160
【０５３１】
以下の合成オリゴヌクレオチドを鋳型として使用した。プライマー結合部位に下線を付している。
【０５３２】
合成鋳型，配列番号１４４：
【化１１１】
2016510601.tif 000161
【０５３３】
ＰＣＲ反応を１０μｌ容量で、２００ｎＭの未修飾フォワードプライマーを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎマスターミックスで上記に示した種々のリバースプライマーの各々２００ｎＭとのペアを用いて行った。反応は、１．３から２００ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２を用いて、またはなしで、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームにおいて、標的なし、または２×１０６コピーの合成オリゴヌクレオチド鋳型を用いて行った。反応を９５℃で５分間の浸漬から開始し、続いて、４５サイクルの［９５℃で１０秒間、６０℃で２０秒間、および７２℃で３０秒間］を行った。結果を表４９にまとめる。
【０５３４】
【表４８】
2016510601.tif 000162
【０５３５】
３’末端に２’ＯＭｅ塩基を有する非ブロック型プライマー（配列番号２２７）では未修飾プライマー（配列番号６９）と比べて２サイクルの遅れが示され、末端２’ＯＭｅ塩基をプライミング効率をわずかに低下させるが、それでもなおＰＣＲプライマーとして機能性であることが示された。単一のｒＵ塩基を含むブロック型プライマー（配列番号１１６）は予測どおりの性能を示し（実施例１３参照）、低濃度のＲＮａｓｅ  Ｈ２で良好に奏功した（データは示さず）。２’ＯＭｅ  ＲＮＡ含有プライマーでは、より高濃度のＲＮａｓｅ  Ｈ２が必要とされた。リボヌクレオチドの５’側に２’ＯＭｅ残基を有するプライマー（配列番号２２８）では、５０ｍＵのＲＮａｓｅ  Ｈ２で良好な活性が示され、１００ｍＵ以上のＲＮａｓｅ  Ｈ２を使用した場合、ブロックなしの２’ＯＭｅ対照プライマー（配列番号２２７）と同一の性能を示した。リボヌクレオチドの３’側に２’ＯＭｅ残基を有するプライマー（配列番号２２９）は、試験したいずれのＲＮａｓｅ  Ｈ２レベルでも機能しなかった。次に、リボヌクレオチドの５’側に２’ＯＭｅ残基を有するプライマー（配列番号２２８）をミスマッチ識別ｑＰＣＲアッセイにおいて試験した。
【０５３６】
標準的な構成のブロック型ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性プライマー（配列番号１１６）を、この配列の５’−２’ＯＭｅ型（配列番号２２８）と比較した。この２種類の「Ｒｅｖ」プライマーを未修飾「Ｆｏｒ」プライマー（配列番号６８）とともに、３種類の異なる合成オリゴヌクレオチド鋳型（最初に実施例１３においてミスマッチ識別の可能性の規定において使用）と一緒に使用した。これらの鋳型は、パーフェクトマッチ対照（鋳型配列番号１４４）、Ｔ／Ｕミスマッチ（鋳型配列番号１３７）またはＧ／Ｕミスマッチ（鋳型配列番号１５８）をもたらす。３種類の鋳型オリゴヌクレオチドを以下に、マッチとミスマッチ（対比）の領域を示すために真下にアラインメントした切断性ブロック型プライマー（配列番号１１６）とともに示す。
【０５３７】
合成鋳型，配列番号１４４（Ａ：Ｕマッチ）：
【化１１２】
2016510601.tif 000163
【０５３８】
合成鋳型，配列番号１３７（Ｔ：Ｕミスマッチ）：
【化１１３】
2016510601.tif 000164
【０５３９】
合成鋳型，配列番号１５８（Ｇ：Ｕミスマッチ）：
【化１１４】
2016510601.tif 000165
【０５４０】
ＰＣＲ反応を１０μｌ容量で、２００ｎＭの未修飾フォワードプライマーを２００ｎＭの切断性ブロック型Ｒｅｖプライマー（配列番号１１６）または５’ｍＵ含有切断性ブロック型Ｒｅｖプライマー（配列番号２２８）とともにＢｉｏ−Ｒａｄ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎマスターミックス中で用いて行った。反応は、１．３ｍＵ（プライマー配列番号１１６）または１００ｍＵ（プライマー配列番号２２８）のピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２を用いて行った。反応を、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームで、２×１０６コピーの異なる合成オリゴヌクレオチド鋳型（配列番号１３７、１４４または１５８）を用いて実施した。反応を９５℃で５分間の浸漬から開始し、続いて、４５サイクルの［９５℃で１０秒間、６０℃で２０秒間、および７２℃で３０秒間］を行った。結果を表５０にまとめ、ΔＣｐ（ΔＣｐ＝Ｃｐミスマッチ−Ｃｐマッチ）として示す。
【０５４１】
【表４９】
2016510601.tif 000166
【０５４２】
試験した両方の場合で、２’ＯＭｅ残基を切断性リボヌクレオチドのすぐ５’側に付加するとミスマッチ識別が有意に改善された。Ｔ／ＵミスマッチはΔＣｐで５．３から１２．７に改善され、Ｇ／ＵミスマッチはΔＣｐで１０．９から１４．４に改善された。この新たなプライマー設計では、１．３ｍＵ（１０ｕｌアッセイにおいて）と比べて１００ｍＵのＲＮａｓｅ  Ｈ２の使用が必要とされたが、該酵素は安価であり、反応特異性におけるブーストは相当であった。本発明者らは、切断性プライマー内の選択した位置における化学修飾残基の使用によりアッセイのミスマッチ識別能が有意に改善され得ると結論づける。
【０５４３】
［実施例２３］ミスマッチ識別を改善するための切断性ブロック型プライマーにおけるダブルミスマッチ設計の使用
野生型（ＷＴ）配列に相補的な一部の核酸プローブは、パーフェクトマッチＷＴ標的と一塩基ミスマッチを有する変異型標的の両方に充分な同様の親和性で結合し、これらの２つの配列（ＷＴと変異型）は容易に識別されない。プローブと標的配列の間に導入された単一のミスマッチでは、野生型標的（これはプローブと１つのミスマッチを有する。）に対する結合は有意に破壊され得ないが、変異型標的（ここではこれはプローブと２つのミスマッチを有する。）に対する結合は破壊され得る。このストラテジーは、ハイブリダイゼーション系アッセイならびに核酸結合タンパク質との相互作用に依存性のアッセイの選択性を改善するために使用されている。この実施例では、本発明の切断性ブロック型プライマーの使用による塩基識別を改善するためのダブルミスマッチストラテジーの使用を示す。
【０５４４】
この試験では、ＦＱ形式の代わりにＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ検出形式を使用したこと以外は実施例２０に示したＳＭＡＤ７  ｑＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイをモデル系として使用した。塩基ミスマッチを切断性リボヌクレオチドに位置するブロック型切断性プライマーを合成した。このプローブ設計を使用すると、切断部位の５’側に位置するいずれのミスマッチ（ＲＮＡ塩基）もプライマー伸長産物中に保持され、従ってＰＣＲ中に複製される。ＰＣＲ中においてダブルミスマッチの存在を維持するためには、該ドメイン内に、切断除去されて娘産物中に保持されない新たなミスマッチが切断性ＲＮＡ残基の３’側に位置しなければならない。内部付加される第２のミスマッチはパーフェクトマッチ標的とのプライマーの機能を破壊しないものであることが望ましい。実施例１３において、「＋１位」（即ち、ＲＮＡ塩基のすぐ３’側）に存在するミスマッチは、切断および機能性プライマー効率に対して有意な影響を有し得ることが示された。従って、ダブルミスマッチをＲＮＡ塩基の３’側の「＋２位」に位置させたが、この構成は単一のミスマッチとして破壊性であり得るものでなくダブルミスマッチとして破壊性であり得るものにした。
【０５４５】
この部位におけるブロック型切断性プライマーを、ＳＭＡＤ７遺伝子（ＳＮＰ遺伝子座ｒｓ４９３９８２７）内の「Ｃ」および「Ｔ」対立遺伝子間を識別するための標準的な設計特長を用いて設計し、合成した。すべてのアッセイで同じ未修飾のリバースプライマーを使用した（配列番号２１７）。パーフェクトマッチ「Ｃ」対立遺伝子プライマーは配列番号２３１であり、パーフェクトマッチ「Ｔ」対立遺伝子プライマーは配列番号２３５である。次に、リボヌクレオチドに対して＋２の位置（ＲＮＡ残基の２塩基３’側）に変異を有する一連のプライマーを作製した。塩基ミスマッチの実体により、この位置にミスマッチを有することによってアッセイに導入され得る相対摂動が改変され得ることが予測された。従って、パーフェクトマッチ（野生型）および考えられ得る３種類すべての塩基ミスマッチを合成し、試験した（配列番号２３２から２３４および２３６から２３８）。配列を以下に表５１に示す。
【０５４６】
【表５０】
2016510601.tif 000167
【０５４７】
上記のプライマーは、ＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４）の以下の８５ｂｐ領域を標的化する。プライマー結合部位に下線を付し、ＳＮＰの位置を太字のイタリック体で強調している。ＳＮＰ識別を改善するための「二重変異型」アプローチのスキームの説明を補助するため、図３３にプライマーを標的とアラインメントしている。
【０５４８】
ｒｓ４９３９８２７（ＳＭＡＤ７）Ｃ対立遺伝子（配列番号２２０）
【化１１５】
2016510601.tif 000168
【０５４９】
ｒｓ４９３９８２７（ＳＭＡＤ７）Ｔ対立遺伝子（配列番号２２１）
【化１１６】
2016510601.tif 000169
【０５５０】
ＰＣＲ反応を１０μｌ容量で、２００ｎＭの未修飾Ｒｅｖプライマー（配列番号２１７）および該一連の切断性ブロック型Ｆｏｒプライマー（配列番号２３１−２３８）をＢｉｏ−Ｒａｄ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎマスターミックス中で用いて行った。反応は、２．６ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２を用いて、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームで、２ｎｇの標的ＤＮＡを用いて行った。標的ＤＮＡは、２つのＳＭＡＤ７対立遺伝子（Ｃｏｒｅｉｌｌ  １８５６２および１８５３７）にホモ接合型の細胞から作製したゲノムＤＮＡであった。「Ｃ」および「Ｔ」対立遺伝子（配列番号２２０および２２１）を個々に試験した。反応を９５℃で５分間の浸漬から開始し、続いて、８０サイクルの［９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で１秒間］を行った。結果を以下の表５２に示す。
【０５５１】
【表５１】
2016510601.tif 000170
【０５５２】
「Ｃ」対立遺伝子では、標準的な設計のパーフェクトマッチプローブ（配列番号２３１）で未修飾対照プライマーと同様の増幅効率が示され、「Ｔ」標的に対するミスマッチ識別は１０．７サイクル（ΔＣｐ＝１０．７）であった。ミスマッチプライマーでは、「Ｃ」対立遺伝子標的で検出効率の軽微な低下が示された（２．４サイクルまでのシフトが観察された。）が、ＳＮＰ部位におけるミスマッチ識別は有意に増大し、ｒＣＡＡプライマー（配列番号２３２）で１８．８サイクルのΔＣｐが見られた。
【０５５３】
「Ｔ」対立遺伝子でも、標準的な設計のパーフェクトマッチプローブ（配列番号２３５）で、未修飾対照プライマーと同様の増幅効率が示され、「Ｃ」標的に対するミスマッチ識別は１３．４サイクル（ΔＣｐ＝１３．４）であった。しかしながら「Ｃ」対立遺伝子とは異なり、「Ｔ」対立遺伝子に対するミスマッチプライマーでは、「Ｔ」対立遺伝子標的で検出効率の大きな低下が示された。２０サイクルもの大きなシフトが観察された。それでもなお、相対的ＳＮＰ識別は改善され、ｒＵＡＣプライマー（配列番号２３７）では２４．２サイクルのΔＣｐが見られた。ＳＭＡＤ７遺伝子のこの領域では、「Ｔ」対立遺伝子によって切断性ＲＮＡ塩基部位に「ＡＴリッチ」鎖が作出され、この配列の熱安定性は低い。＋２位におけるミスマッチの存在は、この領域内の該構造を、「Ｔ」対立遺伝子で、より安定性の高い「Ｃ」対立遺伝子よりもずっと大きく不安定化されるはずであり、これは、「Ｔ」標的に対する「Ｔ」対立遺伝子プローブでＣｐの増大が観察された説明となり得る。しかしながら、このＣｐ値のシフトはアッセイの有用性を制限しない。ブロック型切断性プライマーの固有の特異性の増大を考慮すると（実施例１１参照）、６０から８０またはこれ以上のサイクルまでの常套的に伸長反応に問題はないはずである。一部の特定の状況では、ダブルミスマッチ形式の識別力の増大は、低い全体反応効率を認識するのに充分な価値がある。「ＡＴリッチ」領域でも、ＳＭＡＤ７「Ｔ」対立遺伝子と同様、ダブルミスマッチを＋３位に位置させ、この破壊効果をさらに切断性リボヌクレオチドから除去することが有用であり得る。
【０５５４】
［実施例２４］切断性ブロック型プライマーを用いたＳＮＰ部位でのＰＣＲ増幅によって作製される反応生成物の実体
ＰＣＲまたは任意のプライマー伸長適用における使用のため、塩基ミスマッチ（ＳＮＰ部位）をブロック型切断性プライマー内のリボヌクレオチド残基に直接位置させると、ＲＮＡ塩基の５’側で起こる切断事象により、鋳型核酸内に塩基バリアントの存在をもたらすプライマー伸長産物がもたらされる。ＲＮＡ塩基の３’側で起こる切断事象では、産物をプライマー内に存在するＲＮＡ塩基に変更し、後続のＰＣＲサイクルで複製されるエラーを生じさせるプライマー伸長産物がもたらされる。従って、リボヌクレオチドの３’側での切断は所望のものでない事象である。ＰＣＲの莫大な増幅力を考慮すると、少量の３’−切断であっても配列エラーを含む産物がかなりの量で蓄積され得る。例えば、０．１％の割合での切断は、１０００分子のうち１分子がＲＮＡ残基の部位「誤」塩基を有するものになり得、次いでこれは、後続のＰＣＲサイクルで「パーフェクトマッチ」として検出可能となり得る。これは、ｑＰＣＲ反応において１０サイクルシフト（ΔＣｐ＝１０）と同等であり得る。実施例１３において教示された設計パラメータを使用すると、ＳＮＰ識別のサイクルシフトは５から１５までで異なった。従って、少量の所望のものでない思いも寄らない３’−切断により、実施例１３で見られたＳＮＰインテロゲーション中の偽陽性シグナルの遅れが容易に説明され得る。
【０５５５】
対立遺伝子特異的ＳＮＰ識別反応における偽陽性シグナルは２つの原因で生じ得る。第１に、ミスマッチではなく、ＲＮＡ塩基の５’側の「正常」ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断部位における不充分な切断の継続（図３参照）。この反応により出発標的と同一のプライマー伸長産物がもたらされる。第２に、対立遺伝子特異的ＳＮＰ識別反応における偽陽性シグナルもＲＮＡ塩基の３’側のどこかの「異常」位置での不充分な切断によって生じ得る。この反応では、プライマーと同一のプライマー伸長産物が生成され得、次いでこれが、この同じプライマーを用いて高効率で増幅され得る。第１のシナリオが正しいならば、対立遺伝子「Ａ」プライマーを対立遺伝子「Ｂ」標的とともに用いて行った反応による産物は、ほとんどが対立遺伝子「Ｂ」産物で得られるばずであり、これは、対立遺伝子「Ａ」プライマーで非効率的に継続して増幅され得る。第２のシナリオが正しいとすれば、対立遺伝子「Ａ」プライマーを対立遺伝子「Ｂ」標的とともに用いて行った反応による産物は、ほとんどが対立遺伝子「Ａ」産物で得られるはずであり、これは、対立遺伝子「Ａ」プライマーで効率的に増幅され得る。
【０５５６】
これらの可能性を識別するため、１回目のＰＣＲ増幅を、ＳＭＡＤ７「Ｔ」対立遺伝子プライマーをＳＭＡＤ７「Ｔ」対立遺伝子標的ＤＮＡまたはＳＭＡＤ７「Ｃ」対立遺伝子標的ＤＮＡとともに用いて行う再増幅実験を行った。反応生成物を１０８倍に希釈し、「Ｔ」と「Ｃ」対立遺伝子プライマーを用いて再増幅を行い、反応生成物中に存在するＳＮＰ塩基の実体が１回目の増幅中に変化するかどうかを調べた。ＳＭＡＤ７  ｒｓ４９３９８２７対立遺伝子系を使用し、以下に表５３に示す以下のプライマーおよび標的ＤＮＡを使用した。
【０５５７】
【表５２】
2016510601.tif 000171
【０５５８】
上記のプライマーは、ＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４）の以下の８５ｂｐ領域を標的化する。ＳＭＡＤ７系における純粋な標的としての使用のための合成オリゴヌクレオチドを合成し、以下に示す。プライマー結合部位に下線を付し、ＳＮＰの位置を太字のイタリック体で強調している。
【０５５９】
ｒｓ４９３９８２７（ＳＭＡＤ７）Ｃ対立遺伝子（配列番号２２０）
【化１１７】
2016510601.tif 000172
【０５６０】
ｒｓ４９３９８２７（ＳＭＡＤ７）Ｔ対立遺伝子（配列番号２２１）
【化１１８】
2016510601.tif 000173
【０５６１】
ＰＣＲ反応を１０μｌ容量で、２００ｎＭの未修飾Ｒｅｖプライマー（配列番号２１７）および「Ｔ」対立遺伝子切断性ブロック型Ｆｏｒプライマー（配列番号２３５）をＢｉｏ−Ｒａｄ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎマスターミックス中で用いて行った。反応は、２．６ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２を用いて、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームで、６．６×１０５コピーの合成オリゴヌクレオチド標的ＳＭＡＤ７「Ｃ」対立遺伝子（配列番号２２０）またはＳＭＡＤ７「Ｔ」対立遺伝子（配列番号２３０）を用いて行った。反応を９５℃で５分間の浸漬から開始し、続いて、８０サイクルの［９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で１秒間］を行った。このＳＮＰ部位において行ったｑＰＣＲ増幅の結果を以下の表５４に示す。
【０５６２】
【表５３】
2016510601.tif 000174
【０５６３】
「Ｔ」対立遺伝子プライマーは、マッチ「Ｔ」対立遺伝子標的ＤＮＡおよびミスマッチ「Ｃ」対立遺伝子標的ＤＮＡを用いて実施した反応間で１３．６のΔＣｐが示された先の結果と同様の性能を示した。
【０５６４】
この実験を、上記のＰＣＲ増幅の反応生成物の１０８希釈物を標的ＤＮＡとして用いて繰り返した。ミスマッチ部位での切断がリボヌクレオチドの５’側の予測される位置で起こったならば、反応生成物は「真」のままであるはずであり、「Ｔ」対立遺伝子産物はインプット「Ｔ」対立遺伝子鋳型から作製され得、「Ｃ」対立遺伝子産物はインプット「Ｃ」対立遺伝子鋳型に作製され得る。しかしながら、認識可能な切断（あれば）がリボヌクレオチドの３’側で起こったならば、反応生成物はＳＮＰ部位がプライマーの配列に変換されるはずである。この場合、「Ｔ」対立遺伝子産物は「Ｃ」対立遺伝子標的から作製され得る。
【０５６５】
ＰＣＲ反応を１０μｌ容量で、２００ｎＭの未修飾Ｒｅｖプライマー（配列番号２１７）および「Ｔ」対立遺伝子切断性ブロック型Ｆｏｒプライマー（配列番号２３５）または「Ｃ」対立遺伝子切断性ブロック型Ｆｏｒプライマー（配列番号２３１）をＢｉｏ−Ｒａｄ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎマスターミックス中で用いて行った。反応は、２．６ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２を用いて、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームにおいて行った。インプット標的ＤＮＡは、上記の表５４に示した反応生成物の１０８希釈物であった。反応を９５℃で５分間の浸漬から開始し、続いて、４５サイクルの［９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で１秒間］を行った。このＳＮＰ部位において行ったｑＰＣＲ増幅の結果を以下の表５５に示す。
【０５６６】
【表５４】
2016510601.tif 000175
【０５６７】
「Ｔ」対立遺伝子プライマーを「Ｔ」対立遺伝子標的および「Ｃ」対立遺伝子標的の両方とともに用いて先で作製した反応生成物（表５４）は、ここでは「Ｔ」対立遺伝子プライマーの使用でほぼ同一の増幅効率を示すが、先では、この２種類の異なる出発標的ＤＮＡ間で１３．６のΔＣｐで観察された。これは、同様の配列を有する産物核酸と最も整合する、即ち、どちらもここでは主に「Ｔ」対立遺伝子である。この仮説と整合して、これらの試料はどちらもここでは、「Ｃ」対立遺伝子プライマーの使用で同様のＣｐの遅れを示す。従って、「Ｃ」対立遺伝子標的を用いた「Ｔ」対立遺伝子プライマー増幅による産物は大部分が「Ｔ」対立遺伝子に変換されたようであり、リボヌクレオチド塩基の３’側で起こったプライマー切断事象によって生じた該生成物と整合した。「Ｔ」対立遺伝子プライマー（表５４）を用いた最初の増幅による反応生成物をサブクローニングし、ＤＮＡ配列を決定した。同定されたクローンはすべて、出発鋳型が「Ｔ」対立遺伝子であろうと「Ｃ」対立遺伝子であろうと「Ｔ」対立遺伝子の存在を有するものであり、この結論に対してさらなる支持が追加される。
【０５６８】
［実施例２５］ミスマッチ識別を改善するための切断性ブロック型プライマーにおけるホスホロチオエート修飾ヌクレオチド間結合の使用
実施例２４の結果は、ミスマッチプライマー／標的の組合せを用いて行ったＰＣＲにより、標的ではなくプライマーとマッチした配列を有する産物が生成され得ることを示す。この種の産物がもたらされ得る最も起こり得るシナリオは、リボヌクレオチド残基の３’側の位置でのミスマッチプライマーの切断から始まる。プライマーのこのドメイン内の不要な切断を抑制する化学修飾の使用により、切断性ブロック型プライマーの性能が特にＳＮＰ識別において改善され得る。表示の通りにリボヌクレオチドの３’側の位置にヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエート（ＰＳ）修飾ヌクレオチド間結合が位置する以下の表５６に示す以下のプライマーを合成した。実施例１５において、ＲＮＡ塩基において直接３’結合にＰＳ結合を位置すると切断効率が低下し得ることが確立された。従って、この修飾調査では、この部位のさらに３’側のＤＮＡ結合に着目した。実施例１３において先で使用した合成アンプリコン系を使用した。
【０５６９】
【表５５】
2016510601.tif 000176
【０５７０】
標準的な構成のブロック型ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性プライマー（配列番号１１６）を、この配列のＰＳ修飾型（配列番号３０１および２３９から２４１）と比較した。この「Ｒｅｖ」プライマーの組を未修飾「Ｆｏｒ」プライマー（配列番号６８）とともに、２種類の異なる合成オリゴヌクレオチド鋳型（最初に実施例１３においてミスマッチ識別の可能性の規定において使用）と一緒に使用した。これらの鋳型は、パーフェクトマッチ対照（鋳型配列番号１４４）とＴ／Ｕミスマッチ（鋳型配列番号１３７）をもたらす。この２種類の鋳型とオリゴヌクレオチドを以下に、マッチとミスマッチ（対比）の領域を示すために真下にアラインメントした切断性ブロック型プライマー（配列番号１１６）とともに示す。
【０５７１】
合成鋳型，配列番号１４４（Ａ：Ｕマッチ）：
【化１１９】
2016510601.tif 000177
【０５７２】
合成鋳型，配列番号１３７（Ｔ：Ｕミスマッチ）：
【化１２０】
2016510601.tif 000178
【０５７３】
ＰＣＲ反応を１０μｌ容量で、２００ｎＭの未修飾Ｆｏｒプライマー（配列番号６８）および上記に示した異なる切断性ブロック型Ｒｅｖプライマー（配列番号１１６、３０１および２３９から２４１）をＢｉｏ−Ｒａｄ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎマスターミックス中で用いて行った。反応は、１．３ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２を用いて、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームにおいて行った。インプット標的ＤＮＡは、上記に示した２×１０６コピーの合成標的配列（配列番号１３７および１４４）であった。反応を９５℃で５分間のインキュベーションから開始した後、４５サイクルの［９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で１秒間］を行った。このＳＮＰ部位において行ったｑＰＣＲ増幅の結果を以下の表５７に示す。
【０５７４】
【表５６】
2016510601.tif 000179
【０５７５】
３’「＋１」位へのＰＳ修飾結合の配置（ｒＵＣ＊ＣＣＣ）により、このアッセイでＳＮＰ識別においてほぼ５サイクルの改善がもたらされ（配列番号２４１対１１６）、リボヌクレオチドの３’側のドメイン内におけるヌクレアーゼの安定性の増大によってアッセイ性能が有意に改善され得ることが示された。リボヌクレオチドからさらに３’側の結合の修飾では影響は最小限であった。また、この領域内の結合のすべての修飾（ｒＵＣ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ，配列番号２４１のヌクレオチド２３から２７）も有益であり、相対的ＳＮＰ識別が３サイクル改善されることが示されたが、予想外なことに、３’＋１結合における１つだけの修飾の使用よりも有益性が低いことが示された。これは、同様にＰＳ修飾に起因する低結合親和性Ｔｍと関連し得る。
【０５７６】
従って、切断性リボヌクレオチドの３’側の結合におけるヌクレアーゼ抵抗性修飾の付加により、ＲＮａｓｅ  Ｈ２媒介性切断性ブロック型プライマーＰＣＲアッセイでのＳＮＰ識別が高まり得る。典型的には、ＰＳ結合の２つの立体異性体のうちの一方（ＲｐまたはＳｐ異性体）のみが有益性をもたらす。従って、活性の改善は、実施例１５で示されたように、ここではキラル的に純粋なＰＳ化合物の単離によって実現され得る。他のヌクレアーゼ抵抗性修飾、例えば数例挙げると、非キラルホスホロジチオエート結合、メチルホスホネート結合、ホスホルアミデート結合、ボラノホスフェート結合、および無塩基残基、例えばＣ３スペーサーがこの領域に適切であり得る。
【０５７７】
［実施例２６］ｑＰＣＲアッセイにおけるブロックなしの３’−ヒドロキシルを有する切断性プライマーの使用
上記の実施例では、プライマー伸長がＲＮａｓｅ  Ｈ２切断の前に起こることを抑制するために、ブロッキング基をプライマーの３’末端位置させた。一部の特定のプライマー設計および適用では、３’−ブロッキング基を使用することは必要でない、またはさらには望ましい場合があり得る。本発明者らは、先に、鋳型機能はブロックされるがプライマー機能は保持される様式で化学修飾されたプライマーを使用する多項式増幅と称される核酸増幅方法を報告した。さまざまな基、例えば内部Ｃ３スペーサーおよび内部２’ＯＭｅ  ＲＮＡ塩基がこの目的に使用され得る。ネステッドプライマーを使用すると、高い特異性が得られ、増幅力は、使用されるネステッドプライマーの数に依存性であり、増幅は、ＰＣＲで見られるような指数関数的増幅ではなく多項式拡大に従って起こる（米国特許第７，１１２，４０６号明細書ならびに係属中の米国特許出願公開第２００５／０２５５４８６号明細書および同第２００８／００３８７２４号明細書参照）。多項式増幅プライマーエレメントを本発明のＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性ドメインと併用することにより、ブロックなしの３’−ヒドロキシルを有し、プライマー伸長は補助し得るがＰＣＲは補助することができない新規なプライマー設計がもたらされる。切断されると、鋳型ブロッキング基は除去され、ＰＣＲにおける使用のためのプライマー機能が回復する。この実施例では、３’−ヒドロキシルを有する切断性鋳型ブロック型プライマーのｑＰＣＲにおける使用を示す。
【０５７８】
先の実施例で使用した人工合成アンプリコンとの使用のための以下に表５８に示す以下のプライマーを合成した。
【０５７９】
【表５７】
2016510601.tif 000180
【０５８０】
合成アンプリコンオリゴヌクレオチド鋳型（配列番号１４３）を以下に、上部にアラインメントして示した未修飾および種々の修飾切断性Ｆｏｒプライマーならびに下側にアラインメントした未修飾Ｒｅｖプライマーとともに示す。ＤＮＡ塩基は大文字であり、ＲＮＡ塩基は小文字であり、「ｘ」はスペーサー−Ｃ３基を示す。
【０５８１】
【化１２１】
2016510601.tif 000181
【０５８２】
ＰＣＲ反応を１０μｌ容量で、２００ｎＭの個々のＦｏｒプライマー（配列番号６８、２４２から２４６）および未修飾Ｒｅｖプライマー（配列番号６９）をＢｉｏ−Ｒａｄ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎマスターミックス中で用いて行った。反応は１．３ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２を用いて、またはなしで、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームにおいて行った。インプット標的ＤＮＡは、上記に示した２×１０６コピーの合成標的であった（配列番号１４４）。反応を９５℃で５分間のインキュベーションから開始した後、６０サイクルの［９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で１秒間］を行った。ｑＰＣＲ増幅の結果を以下に表５９に示す。
【０５８３】
【表５８】
2016510601.tif 000182
【０５８４】
非ブロック型プライマーは、このアッセイ系においておよそ１７サイクル目に検出可能なシグナルをもたらした。ブロックなしのＲｅｖプライマーを３’ブロック型Ｆｏｒプライマーとともに使用すると、シグナルは、ＲＮａｓｅ  Ｈ２なしで実施した６０サイクル以内のＰＣＲで検出されなかったが、ＲＮａｓｅ  Ｈ２ありでは、およそ１７の同様のサイクル検出時間が見られた。遊離３’−ヒドロキシル基を有する内部ブロック型フォワードプライマーは３’修飾プライマーと同一の挙動を示した。ブロックなしの３’−ヒドロキシルにもかかわらず、ＰＣＲにおける機能にＲＮａｓｅ  Ｈ２でのプライマー切断が必要とされ、おそらく内部Ｃ３スペーサーによってもたらされる鋳型機能の喪失のためである。また、３’末端付近に位置するＣ３スペーサーにより、プライマー伸長もある程度阻害され得る。ＲＮａｓｅ  Ｈ２の非存在下ではシグナルは検出されなかった；ＲＮａｓｅ  Ｈ２ありでは、切断および増幅は正常に進行した。
【０５８５】
この実施例は、切断性プライマーが、切断性プライマーＰＣＲアッセイにおいて機能するために３’末端残基を修飾する必要がないこと、および鋳型機能を破壊する内部修飾を有するプライマーが等しく良好な性能を示し得ることを示す。プライマー設計に対するこの所見の重要性を考慮し、この結果が一般化され得ることが確実になるように、内在性ヒト遺伝子標的を使用し、ヒトゲノムＤＮＡを用いて同様の実験を行った。
【０５８６】
以下に表６０に示す以下のプライマーを、先の実施例で使用したｑヒトＳＭＡＤ７遺伝子を基にして「Ｃ」対立遺伝子のみを用いて合成した。
【０５８７】
【表５９】
2016510601.tif 000183
【０５８８】
ＳＭＡＤ７アンプリコン配列（配列番号２２０）を以下に、上部にアラインメントして示した未修飾および種々の修飾切断性Ｆｏｒプライマーとともに示す。ＤＮＡ塩基は大文字であり、ＲＮＡ塩基は小文字であり、「ｘ」はスペーサー−Ｃ３基を示す。
【０５８９】
【化１２２】
2016510601.tif 000184
【０５９０】
ＰＣＲ反応を１０μｌ容量で、２００ｎＭの個々のＦｏｒプライマー（配列番号２３０から２３１、２４７から２５０）および未修飾Ｒｅｖプライマー（配列番号２１７）をＢｉｏ−Ｒａｄ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎマスターミックス中で用いて行った。反応は、２．６ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２を用いて、またはなしで、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームにおいて行った。インプット標的ＤＮＡは、ヒト細胞株由来の２ｎｇのゲノムＤＮＡであった（Ｃｏｒｅｉｌｌ  １８５６２，ＳＭＡＤ７「Ｃ」対立遺伝子）。反応を９５℃で５分間のインキュベーションから開始した後、６０サイクルの［９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で１秒間］を行った。ｑＰＣＲ増幅の結果を以下の表６１に示す。
【０５９１】
【表６０】
2016510601.tif 000185
【０５９２】
非ブロック型プライマーは、ヒトゲノムＤＮＡを用いたこのアッセイ系において、およそ２６サイクル目に検出可能なシグナルをもたらした。ブロックなしのＲｅｖプライマーを３’ブロック型Ｆｏｒプライマーとともに使用すると、シグナルは、ＲＮａｓｅ  Ｈ２なしで実施した６０サイクル以内のＰＣＲで検出されなかったが、ＲＮａｓｅ  Ｈ２ありでは、およそ２６の同様のサイクル検出時間が見られた。遊離３’−ヒドロキシル基を有する内部ブロック型Ｆｏｒプライマーはすべて、３’修飾プライマーと同一の挙動を示した。ＲＮａｓｅ  Ｈ２の非存在下ではシグナルは検出されなかった；ＲＮａｓｅ  Ｈ２ありでは、切断および増幅は正常に進行し、検出はおよそ２６サイクルでなされた。
【０５９３】
この実施例は、さらに、切断性プライマーが、切断性プライマーｑＰＣＲアッセイにおいて機能するために３’末端を修飾する必要がないことを示す。鋳型機能を破壊する内部修飾を有するプライマーは依然として該アッセイにおいてプライマーとして機能するためにプライマー切断事象を必要とする。切断がＲＮａｓｅ  Ｈ２を用いて内部切断性残基において行われた場合、単一のＲＮＡ塩基と同様、増幅効率は、未修飾プライマーの使用で見られるものと同一である。この新規な型の鋳型ブロック型切断性プライマーは、ヒトゲノムＤＮＡなどの複雑な核酸試料においてＰＣＲを行うために使用され得る。
【０５９４】
［実施例２７］内部鋳型ブロッキング基および３’−ヒドロキシルを有する切断性プライマーはＤＮＡ合成をプライミングし得る
実施例２６に開示した切断性鋳型ブロック型プライマーはブロックなしの３’−ヒドロキシル基を有し、この基は、オリゴヌクレオチドが線形プライマー伸長反応においてプライマーとして機能することを可能にするはずであるが、内部鋳型ブロッキング基は、プライマーのほとんどが複製され得ないためＰＣＲにおける機能を抑制する。このため、娘産物中にプライマー結合部位は存在しない。ＲＮａｓｅ  Ｈ２によるプライマーの切断によって鋳型ブロッキング基を含むドメインが除去され、正常なプライマー機能が回復する。この実施例では、このような組成物が、ＤＮＡ合成をプライミングする機能を果たし得ることを示す。
【０５９５】
以下に表６２に示す以下のプライマーを使用し、先の実施例で使用した人工合成アンプリコン系を用いて線形プライマー伸長反応を行った。
【０５９６】
【表６１】
2016510601.tif 000186
【０５９７】
上記のＳｙｎ−Ｆｏｒプライマーに相補的な新たに合成した１０３量体オリゴヌクレオチド鋳型を作製し（配列番号２５１）、これを以下に、上部にアラインメントした未修飾および種々の修飾切断性フォワードプライマーとともに示す。ＤＮＡ塩基は大文字であり、ＲＮＡ塩基は小文字であり、「ｘ」はスペーサー−Ｃ３基を示す。
【０５９８】
【化１２３】
2016510601.tif 000187
【０５９９】
上記に示した６種類のＦｏｒプライマーを３２Ｐで上記のようにして放射性標識した。プライマー伸長反応を２０μＬ容量で、０．８ＵのｉＴａｑポリメラーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、８００μＭのｄＮＴＰ、３ｍＭのＭｇＣｌ２を１×ｉＴａｑバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．４、５０ｍＭ  ＫＣｌ）中で、ならびに２ｎＭのプライマーおよび鋳型（４０ｆｍｏｌの各オリゴヌクレオチド，２０μＬの反応液中）を用いて行った。反応を９５℃で５分間のインキュベーションから開始した後、３５サイクルの［９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で１秒間］をＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＴＣ−１００サーマルサイクラーで行った。反応を、冷ＥＤＴＡ含有ホルムアミドゲル負荷バッファーの添加によって停止させた。反応生成物を、変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて分離し、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｙｃｌｏｎｅ（商標）Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ホスフォイメージャー）を用いて可視化した。各バンドの相対強度を上記のようにして定量し、結果を、プライマー伸長産物を表すバンド中に存在する全放射性物質に対する割合としてプロットした。結果を図３４に示す。
【０６００】
この反応条件下では、対照の非ブロック型プライマー（配列番号６８）の６１％が高分子量プライマー伸長産物に変換された。予測どおり、３’末端ブロック型切断性プライマー（配列番号２４２）ではプライマー伸長産物は全く示されなかった。同様に、内部Ｃ３基と３’−ヒドロキシルを有するＤ１およびＤ２切断性プライマー（配列番号２４３から２４４）もプライマー伸長を補助しなかった。わずかにより長い末端ＤＮＡドメインを有する切断性プライマー（Ｄ４およびＤ５配列，配列番号２４５から２４６）はプライマー伸長を補助し、Ｄ４ではプライマーの伸長産物への４７％変換が示され、Ｄ５では６０％変換が示され、反応効率は未修飾対照プライマーと同一であった。従って、内部Ｃ３スペーサーが３’末端の非常に近くに位置している場合、プライミング機能と鋳型機能の両方が破壊される。３’末端から４残基より遠くに位置した場合、鋳型機能のみがブロックされる。
【０６０１】
［実施例２８］ミスマッチ識別を改善するための内部鋳型ブロッキング基と３’−ヒドロキシルを有する切断性プライマーの使用
実施例２４では、ＲＮＡ塩基の３’側でのＲＮａｓｅ  Ｈ２によるＲＮＡ含有プライマーの切断が、ｑＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイにおける偽陽性シグナルの後期発生の一因となり得る所望のものでない事象であることが示された。実施例２５では、このドメインに対してヌクレアーゼ抵抗性を付与する修飾によってＳＮＰ識別が改善され得ることが示された。実施例２６および２７に記載の新規な組成物には、ＲＮａｓｅ  Ｈ２による切断によって除去されるドメイン内のプライマーの鋳型機能を破壊する切断性リボヌクレオチドの３’側に内部Ｃ３基が位置している。この実施例は、Ｃ３スペーサー基がＲＮＡ塩基の近くに位置することにより、プローブが「非ブロック型」のままで未修飾３’−ヒドロキシルを有する形式を用いたＳＮＰ識別における切断性プライマーの性能が改善されることを示す。
【０６０２】
先の実施例と同様のヒトＳＭＡＤ７遺伝子に対する以下に表６３に示す以下のプライマーを合成した。「Ｃ」対立遺伝子に特異的なプライマーを作製し、「Ｃ」対立遺伝子および「Ｔ」対立遺伝子両方のゲノムＤＮＡ標的において試験した。
【０６０３】
【表６２】
2016510601.tif 000188
【０６０４】
ＳＭＡＤ７アンプリコン配列（配列番号２２０、「Ｃ」標的）を以下に、上部にアラインメントした未修飾および２種類の修飾切断性Ｆｏｒプライマーとともに示す。ＤＮＡ塩基は大文字であり、ＲＮＡ塩基は小文字であり、「ｘ」はスペーサー−Ｃ３基を示す。ｒｓ４９３９８２７  Ｃ／Ｔ  ＳＮＰの部位を太字と下線で示している。
【０６０５】
【化１２４】
2016510601.tif 000189
【０６０６】
同じプライマーをミスマッチＳＭＡＤ７アンプリコン配列（配列番号２２１，「Ｔ」標的）とアラインメントする。
【０６０７】
【化１２５】
2016510601.tif 000190
【０６０８】
ＰＣＲ反応を１０μｌ容量で、２００ｎＭの個々のＦｏｒプライマー（配列番号２３０から２３１、２４７から２５０）および未修飾Ｒｅｖプライマー（配列番号２１７）をＢｉｏ−Ｒａｄ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎマスターミックス中で用いて行った。反応は、２．６ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２を用いて、またはなしで、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームにおいて行った。インプット標的ＤＮＡは、ＳＭＡＤ７「Ｃ」および「Ｔ」対立遺伝子（Ｃｏｒｅｉｌｌ  １８５６２および１８５３７）にホモ接合型のヒト細胞株由来の２ｎｇのゲノムＤＮＡであった。反応を９５℃で５分間のインキュベーションから開始した後、７５サイクルの［９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で１秒間］を行った。ｑＰＣＲ増幅の結果を以下の表６４に示す。
【０６０９】
【表６３】
2016510601.tif 000191
【０６１０】
未修飾プライマーは非識別的であるように設計され、両方の対立遺伝子を同様の効率で増幅し、およそ２６から２７サイクル目に検出可能なシグナルをもたらす。どちらの切断性プライマーも機能のためにはＲＮａｓｅ  Ｈ２に依存性であり、切断酵素の非存在下ではいずれの対立遺伝子でも検出可能なシグナルは全くもたらされなかった。少ない量のＲＮａｓｅ  Ｈ２（２．６から１０ｍＵ）を使用すると、３’ブロック型切断性プライマー（配列番号２３１）は、マッチ「Ｃ」対立遺伝子ではおよそ２７サイクルで検出可能なシグナルをもたらし、ミスマッチ「Ｔ」対立遺伝子では３８から４０サイクルのＣｐの遅れが示された（ΔＣｐは１０から１３）。より多くの量のＲＮａｓｅ  Ｈ２を使用すると、特異性は失われ、両方の対立遺伝子は同様の効率で増幅された。２つのＣ３スペーサーをリボヌクレオチドの３’側に有する切断性プライマー（配列番号２５２）では、より高レベルのＲＮａｓｅ  Ｈ２が効率的な切断／プライミングに必要とされ、パーフェクトマッチ「Ｃ」対立遺伝子であっても２．６および１０ｍＵの酵素の使用でＣｐ値の遅れが示された。ＲＮＡ切断性部位付近におけるこの種の修飾がより多くの量の酵素を必要とすることは驚くべきことではない。実施例２２では、２’ＯＭｅ修飾をリボヌクレオチドに隣接して位置すると、充分な活性を得るために１００ｍＵのＲＮａｓｅ  Ｈ２が必要とされることが示された。より多くの量の酵素を使用すると効率的な切断がもたらされ、５０または２００ｍＵのＲＮａｓｅ  Ｈ２の使用で陽性シグナルが約２７サイクル目に検出された。重要なことに、ＳＮＰ識別は、このプライマー設計の使用で顕著に改善され、２．６から５０ｍＵの濃度範囲のＲＮａｓｅ  Ｈ２の使用で、「Ｔ」対立遺伝子でのΔＣｐはおよそ２５サイクルであった。２００ｍＵの酵素を使用した場合、ミスマッチ識別は低下した；しかしながら、ＳＮＰ識別は依然としてほぼ１４サイクル目のΔＣｐであった。最適な酵素濃度は５０ｍＵであり、この時点のプライミング効率は未修飾プライマーと同様であり、ＳＮＰ識別は２５．７サイクル目のΔＣｐで示された。
【０６１１】
従って、リボヌクレオチド付近に２つの内部Ｃ３スペーサー基とブロックなしの３’−ヒドロキシルを有するこの切断性プライマー設計「ＲＤｘｘＤ」では、最初のプライマー設計「ＲＤＤＤＤ−ｘ」と比べて有意に改善されたミスマッチ識別が示された（ここで、Ｒ＝ＲＮＡ塩基、Ｄ＝ＤＮＡ塩基、およびｘ＝Ｃ３スペーサー）。関連の設計、例えば「ＲＤＤｘｘＤ」または「ＲＤｘｘＤＤ」でも同様に改善された機能が示され得、目的のＳＮＰの厳密な配列状況に応じた設計における少しの最適化は有益であり得る。鋳型機能を破壊するが３’−ヒドロキシルは未修飾のままにするＣ３スペーサーなどの化学修飾基の使用により、リボヌクレオチドにおけるＲＮａｓｅ  Ｈ２による切断の特異性が向上し得、ＳＮＰ識別が改善され得る。
【０６１２】
［実施例２９］ＤＮＡシークエンシング法におけるＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性ライゲーションプローブの使用
先の実施例では、切断性オリゴヌクレオチドがＤＮＡ合成反応をプライミングする場合のプライマーとしての適用のためのＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性オリゴヌクレオチド組成物の使用を報告した。上記の実施例に開示した適用は、幾つかの異なる検出形式でのエンドポイントＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲの両方を含む。実施例８では、ＤＮＡポリメラーゼとジデオキシヌクレオチドターミネーターを用いるサンガーシークエンシング法を使用するＤＮＡシークエンシング適用における切断性プライマーの使用を示した；この場合、ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性オリゴヌクレオチドはプライマーとしても機能した。また、ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性オリゴヌクレオチドは、ライゲーション形式アッセイにおいても同様に使用され得る。かかる適用の一例は、切断性ライゲーションプローブを用いたＤＮＡシークエンシングである。この実施例では、ＤＮＡシークエンシングにおける使用に適切な形式でのＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性ライゲーションプローブの使用を示す。
【０６１３】
未知核酸配列内の塩基の実体を連続的にインテロゲーション（即ち、ＤＮＡシークエンシング）するためのライゲーションプローブの使用は報告されている（米国特許第５，７５０，３４１号明細書および同第６，３０６，５９７号明細書ならびに米国特許出願公開第２００８／０００３５７１号明細書参照）。５’から３’の方向のライゲーションによるシークエンシングのための基本スキームは、核酸アクセプター分子が未知核酸配列にハイブリダイズすることで始まる。この配列に、５’末端に固定の既知ＤＮＡ塩基を有し、続いて未知配列の標的核酸に対するプローブの安定な核酸ハイブリダイゼーションを可能にするランダム塩基またはユニバーサル塩基を有する一連の塩基インテロゲーションプローブをハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションおよび続くライゲーション反応は、ライゲーションプローブと標的間のパーフェクトまたはほぼパーフェクトマッチに依存性である；パーフェクトマッチはライゲーション部位に必要とされる。ライゲーションにより、ライゲーション部位に存在する具体的な塩基の同定を可能にする検出可能な事象がもたらされる。ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性部位はライゲーションプローブ内に含める。ライゲーション後、プローブはＲＮａｓｅ  Ｈ２によって切断され、プローブの大部分を放出するが、新たに同定された塩基はアクセプター核酸配列にライゲーションされたままにし、このとき、これは、ライゲーションと切断のサイクルの結果、１残基伸長されている。この一連の酵素的および化学的事象が、ライゲーション、塩基同定および切断の多数回サイクルで反復され、これにより未知核酸配列が決定される。
【０６１４】
上記に挙げた特許参考文献には、ライゲーションによるシークエンシングのための方法が教示されているが、切断を行ってライゲーションプローブを放出させ、多数回サイクルのライゲーション／検出を可能にするための該文献に提案されている方法は不充分であり、実施することが困難である。本発明の方法を用いたＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性オリゴヌクレオチドでは既存の方法と比べて改善がもたらされ、コストが低く、ＤＮＡシークエンシングに切断性ライゲーションプローブを使用することがより容易な構築が可能である。ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性ライゲーションプローブを用いたＤＮＡシークエンシングのスキームの一例を図３５に示す。
【０６１５】
この方法におけるＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性ライゲーションプローブは、５’末端に固定の既知ＤＮＡ塩基（１つまたは複数）を含む。この固定の既知塩基（１つまたは複数）は、単一の最も５’側の塩基であってもよく、５’末端の方に２つまたは３つまたはこれ以上の塩基を含むものであってもよい。この実施例では、プローブの５’末端の単一のＤＮＡ塩基のみが固定された系を使用する。合成オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡリガーゼを用いた酵素的ライゲーションを可能にする５’−リン酸基を有する。また、該プローブの活性型アデニル化形態を使用してもよい。記載のように、５’末端の最初の塩基を固定する（既知）。従って、ＤＮＡシークエンシングを行うためには、「Ａ」プローブ、「Ｃ」プローブ、「Ｔ」プローブおよび「Ｇ」プローブの４種類の非依存性プローブが必要とされる。明らかに、固定塩基の数が１つより多い場合は、より多くのプローブが必要とされる（例えば、最初の２つの塩基を、考えられ得る各ジヌクレオチドペアの一方の固定の既知配列として使用する場合、１６種類のライゲーションプローブが必要とされる。）。固定の既知ＤＮＡ残基の後の最初の塩基（この場合、５’末端から２番目の塩基）は、ＲＮａｓｅ  Ｈ２による切断性の残基である。この実施例ではＲＮＡ塩基を使用しているが、２’−Ｆ残基または他の切断性修飾塩基（例えば、先の実施例に記載のもの）も使用され得る。プローブ内の残りの塩基はランダム塩基（該４種類のＤＮＡ塩基の不均一系ミックス）および／またはユニバーサル塩基（例えば、イノシン、５−ニトロインドール、もしくは当業者によく知られた他のかかる基）である。プローブの全長は通常、およそ８から９塩基であるが、使用される具体的なリガーゼ酵素に応じて、より長いまたはより短いプローブ長も可能である。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用する場合、効率的なハイブリダイゼーションおよび酵素的ライゲーションを得るには８つの長さで充分である。また、より長鎖のプローブも使用され得る。
【０６１６】
プローブ集団の複雑性は４Ｎに従って増大し、ここで、Ｎ＝使用されているランダム塩基の数である。例えば、プローブ「ｐＴｎＮＮＮＮＮＮ」は、５’末端に固定「Ｔ」塩基、単一の「ｎ」ＲＮＡ塩基および６つの「Ｎ」ＤＮＡ塩基の合計７つのランダム残基を有するものである（ｐ＝リン酸基、ｎ＝ＲＮＡ、Ｎ＝ＤＮＡ）。この場合、該集団において４７分子（１６，３８４）の複雑性が提示される。プローブの複雑性は、ランダムＮ塩基をユニバーサル塩基の基に置き換えることにより低減され得る。これは３’末端の方で特に有効である。例えば、３つのイノシン残基を使用すると、上記のプローブは「ｐＴｎＮＮＮＩＩＩ」に変換され得る（前述のように、Ｉ＝イノシン）。このプローブの複雑性は４４分子（２５６）である。複雑性２５６を有するプローブでは複雑性１６，３８４を有するものよりも、１００％ライゲーションを得るために必要とされるライゲーションプローブのインプット量が有意に少なくなる。１つ以上のユニバーサル塩基の使用が一般的に好ましい。最後に、ライゲーションプローブは３’末端またはこの付近に検出可能なシグナルをもたらすための色素分子を有し、該シグナルはライゲーション後に解像され得る。また、３’修飾基は、ライゲーションを３’末端においてブロックしてライゲーションプローブ自体がアクセプター核酸としての機能を果たし得ないようにする機能も果たす。
【０６１７】
ＤＮＡシークエンシングにおけるこの設計のＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性ライゲーションプローブの使用を図３５に概略的に示す。ユニバーサルプライマーまたはアクセプター核酸が未知核酸にハイブリダイズする。アクセプター分子のハイブリダイゼーションを可能にするにはユニバーサルアダプター配列が未知配列の末端に結合することが必要とされ得、このストラテジーにより全反応で同じアクセプター核酸を使用することが可能になる。アクセプター核酸は、ライゲーションに利用可能な３’−ヒドロキシル基を有するものでなければならない。ライゲーションプローブミックスが反応液にモル過剰（上記の８量体イノシン含有プローブ設計では＞２５６倍過剰）で導入され、酵素的ライゲーションを行うためにＴ４  ＤＮＡリガーゼが使用される。遊離プローブは洗浄によって除去され、保持された蛍光シグナルが測定される。保持された色素の色によって、ライゲーション反応中にどのプローブ（ＡとＧとＣとＴ）が結合したかが同定される。次いでプローブを切断するためにＲＮａｓｅ  Ｈ２が使用され、「Ｎ」塩基とユニバーサル塩基は除去されるが既知塩基はアクセプター核酸に結合されたままである。この様式で、鋳型内の対応する塩基の実体が決定され、アクセプター核酸は一塩基伸長されており、アクセス可能な３’−ヒドロキシルはもう一度ライゲーションに利用可能となり、該工程のサイクリングが可能になる。
【０６１８】
以下に表６５に示す以下のオリゴヌクレオチドを、本発明の方法を用いたＲＮＡ含有蛍光ライゲーションプローブのライゲーションおよび続く切断を示すための代表的な合成系として作製した。ここでは、ライゲーションプローブは９つの固定塩基配列（「Ｎ」塩基またはユニバーサル塩基修飾は全くなし）を有するものである。表示「ＣＬＰ」は「切断性ライゲーションプローブ」を示す。表示「ＡＮＡ」は「アクセプター核酸」を示し、これは、ライゲーション反応のための３’−ヒドロキシルアクセプター部位を提供する。「Ｔａｒｇ−Ａ」は、相補的な「Ｔ」ライゲーションプローブ（「ＣＬＰ−Ｔ−Ｃｙ３」）が関与するライゲーション反応に指向される標的核酸である。「Ｔａｒｇ−Ｔ」は、相補的な「Ａ」ライゲーションプローブ（「ＣＬＰ−Ａ−ＦＡＭ」）が関与するライゲーション反応に指向される標的核酸である。
【０６１９】
【表６４】
2016510601.tif 000192
【０６２０】
図３６は、上記に示す合成オリゴヌクレオチド配列を用いたライゲーション−切断反応サイクルで予測される結果を示す。「Ｔａｒｇ−Ａ」（配列番号２５８）は「ＣＬＰ−Ｔ−Ｃｙ３」（配列番号２５６）のハイブリダイゼーションおよびライゲーションに指向されるが、「Ｔａｒｇ−Ｔ」（配列番号２５９）は「ＣＬＰ−Ａ−ＦＡＭ」（配列番号２５５）のハイブリダイゼーションおよびライゲーションに指向される。反応が高い特異性を有すると仮定すると、残りの２種類のライゲーションプローブはこの実験ではマッチ標的を有しておらず、このためライゲーション反応に関与しないはずである。ライゲーション後、新たに形成された「ＡＮＡ」＋「ＣＬＰ」の融合産物がＲＮａｓｅ  Ｈ２に対する基質となる。ＲＮａｓｅ  Ｈ２による切断によってライゲーションプローブ（ＲＮＡ塩基および蛍光レポーター色素を含む。）の３’末端の放出がもたらされ、「ＡＮＡ」分子が一塩基長くなる。
【０６２１】
「Ｔ」標的核酸（配列番号２５９）または「Ａ」標的核酸（配列番号２５８）と「ＡＮＡ」アクセプター核酸（配列番号２５７）を１．７５μＭで混合し、４種類すべてのライゲーションプローブ（配列番号２５３から２５６）を、８０μＬの容量のＴ４  ＤＮＡリガーゼバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭジチオトレイトール，１ｍＭ  ＡＴＰ）中３．５μＭ（各々）の濃度まで添加し、７０℃まで３分間加熱し、２５℃までゆっくり冷却した。ライゲーション反応液を３７℃で５分間、１４０単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼとともに、またはなしでインキュベートした。６５℃で１０分間加熱することによって反応を停止させた。次いで、反応容量をＲＮａｓｅ  Ｈ２バッファー［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０（終濃度１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（終濃度５０ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（終濃度４ｍＭ）］の添加によって２００μＬに調整し、２０単位のＲＮａｓｅ  Ｈ２を各チューブに添加した。反応混合物を６０℃で３０分間インキュベートした後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムで脱塩し、試料を凍結乾燥した。試料を７０μＬの水中で再水和し、１０μＬアリコートを、２０％アクリルアミド，７Ｍ尿素，変性ゲル上で解析した後、ＧｅｌＳｔａｒ染色（＃５０５３５  ＧｅｌＳｔａｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ，Ｌｏｎｚａ）を用いて可視化した。反応液の残りはさらなる試験、例えば質量分析または必要に応じて他の方法のために−２０℃で保存した。
【０６２２】
ゲル画像を図３７に示す。レーン１および５は、サイズマーカー（レーンＭ）に相対する移動を可視化するための酵素の非存在下での成分オリゴヌクレオチドを示す。レーン２および３は、Ｔａｒｇ−Ａ（配列番号２５８）を４種類の切断ライゲーションプローブ（配列番号２５３から２５６）とともにＴ４  ＤＮＡリガーゼの存在下でインキュベートした二連の反応である。アクセプター核酸（ＡＮＡ，配列番号２５７）のサイズの上方シフトが明白に見られ、これはＣＬＰ−Ｔ−Ｃｙ３（配列番号２５６）とのライゲーションを表し、ライゲーション生成物であることが確認される。この他の３種類のプローブ（ミスマッチ塩基）ではなく正しいＣＬＰ−Ｔ−Ｃｙ３  プローブとの特異的ライゲーションが起こり、これを色素の色の目視検査によって検証し（これは、図３７に示す白黒画像では認識することができない。）、質量分析によってさらに検証した。同様に、レーン７および８は、Ｔａｒｇ−Ｔ（配列番号２５９）を４種類の切断ライゲーションプローブ（配列番号２５３から２５６）とともにＴ４  ＤＮＡリガーゼの存在下でインキュベートした二連の反応である。アクセプター核酸（ＡＮＡ，配列番号２５７）のサイズの上方シフトが明白に見られ、これはＣＬＰ−Ａ−ＦＡＭ（配列番号２５５）とのライゲーションを表し、ライゲーション生成物であることが確認される。その他の３種類のプローブ（ミスマッチ塩基）ではなく正しいＣＬＰ−Ａ−ＦＡＭプローブとの特異的ライゲーションが起こり、これを、この場合も色素の色の目視検査によって検証し、質量分析解析によって確認した。最後に、レーン４および８は、このようなライゲーション生成物はＲＮａｓｅ  Ｈ２で処理するとサイズが小さくなり、切断が起こったことを示すことを示す。得られたバンドは最初のＡＮＡバンドと比べてわずかに低下した移動度を示しており、この新たな種が出発材料よりも長いことを示していることに注意のこと。質量分析により、レーン４および８の反応生成物の実際の質量が出発ＡＮＡ核酸の予測された１塩基伸長と整合していること、正しい塩基が挿入されていること、ならびに新たな「ＡＮＡ＋１」種が３’−ヒドロキシルを有することが確認された。この新たなＡＮＡ＋１種が次に、ライゲーション／切断の第２サイクルのために調製される。
【０６２３】
従って、この実施例では、短鎖ＲＮＡ含有短鎖プローブは相補的な標的核酸の存在下でアクセプター核酸に特異的にライゲーションされ得ることが示された。ライゲーションは、ライゲーションプローブの５’末端塩基にマッチしている鋳型塩基の同定に対して高感度であり、正しい相補プローブの特異的ライゲーションは、異なるプローブ配列の不均一系ミックス内から検出され得る。最後に、ＲＮａｓｅ  Ｈ２はライゲーションプローブをＲＮＡ塩基の５’側で切断し、プローブの大部分を放出し、一塩基長伸長されたアクセプター核酸分子をもたらし得る。伸長されたアクセプター核酸は３’−ヒドロキシルを含み、ライゲーション／切断の反復サイクルに使用され得る。
【０６２４】
［実施例３０］ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性ライゲーションプローブにおけるユニバーサル塩基の使用
上記の実施例２９では、ユニバーサル塩基、例えば５’−ニトロインドールまたはイノシンが切断性ライゲーションプローブにおいて使用され得ることを提案した。この実施例では、プローブ配列が固定された（ランダムＮ塩基が含まれていない）モデル系におけるユニバーサル塩基５−ニトロインドールの使用を示す。以下に表６６に示すオリゴヌクレオチドを、実施例２９の合成プローブ／鋳型系を基にして合成した。切断ライゲーションプローブを、５’−リン酸基、５’末端に「Ａ」塩基（「Ｔ」標的に対するライゲーションに指向）、単一のリボヌクレオチド、および２つまたは３つのさらなる固定ＤＮＡ塩基を有する８量体として設計した。３つまたは４つの５−ニトロインドール塩基を３’末端の方に位置させた。ＦＡＭ蛍光色素を３’末端に結合した。実施例２９の場合と同じアクセプター核酸（ＡＮＡ）およびＴ標的核酸を使用した。この実施例のオリゴヌクレオチド成分のアラインメントを示す反応スキームを図３８に示す。
【０６２５】
【表６５】
2016510601.tif 000193
【０６２６】
「Ｔ」標的核酸（配列番号２５９）と「ＡＮＡ」アクセプター核酸（配列番号２５７）を２μＭで、３Ｘまたは４Ｘの５’−ニトロインドール含有ＣＬＰ（切断性ライゲーションプローブ，配列番号２６０から２６１）とＴ４  ＤＮＡリガーゼバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭジチオトレイトール，１ｍＭ  ＡＴＰ）中で混合した。反応液を７０℃で５分間加熱し、２５℃までゆっくり冷却した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を７．５から１２０単位の範囲で添加し、ライゲーション反応液を２５℃または３７℃で５分間インキュベートした。５０ｍＭの終濃度までのＥＤＴＡの添加によって反応を終了させ、最終反応容量は５０μＬであった。等容量の９０％ホルムアミド、１×ＴＢＥ負荷バッファーを各試料に添加し、次いで、これを７０℃で３分間熱変性させ、氷上で冷却した。試料を変性７Ｍ尿素，２０％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ゲルを、ＧｅｌＳｔａｒ（商標）染料を用いて染色し、ＵＶ励起によって可視化した。ゲル画像を図３９に示す。
【０６２７】
３つの５−ニトロインドールユニバーサル塩基を有する８量体切断性ライゲーションプローブ（配列番号２６０）は、高酵素量（６０から１２０単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ）の使用で良好に奏功し、ほぼ１００％のライゲーション効率が示された。対照的に、４つの５−ニトロインドールユニバーサル塩基を有する８量体切断性ライゲーションプローブ（配列番号２６１）では、いずれの酵素量の使用でもアクセプター核酸とライゲーションしなかった。２５℃と３７℃で同じ結果が見られ、反応性のこの差が２つのプローブのＴｍの差と関連するものでないことが示唆された。むしろ、この反応性の差はＴ４  ＤＮＡリガーゼ酵素の基質優先性と関連している可能性が高い。この実施例では、３つの５−ニトロインドール塩基が８量体ライゲーションプローブの３’末端に位置し得、良好な機能が保持される得ることを示す。この同じ実験を９量体ライゲーションプローブを用いて繰り返した。この場合、「６つのＤＮＡ＋３つの５−ニトロインドール塩基」を有するプローブと「５つのＤＮＡ＋４つの５−ニトロインドール塩基」を有するプローブはどちらもＴ４  ＤＮＡリガーゼの基質になったが、「４つのＤＮＡ塩基＋５つの５−ニトロインドール塩基」を有するプローブはならず（データは示さず）、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは良好に機能するためにライゲーションプローブの５’末端の方に５つの固定ＤＮＡ塩基を必要とするという見解、および５’−ニトロインドール塩基はこの要件がみたされてから導入され得るという見解と整合した。厳密な最適プローブ設計は種々のリガーゼ酵素により異なり得る。
【０６２８】
この所見は、ライゲーションプローブの低複雑性プールの合成を可能にするため重要である。
【０６２９】
［実施例３１］ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性ライゲーションプローブにおけるランダム塩基およびユニバーサル塩基の使用
実施例２９および３０では、プローブ配列の一部または全部が標的とパーフェクトマッチであるＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性ライゲーションプローブの使用を示した。未知配列の核酸のシークエンシングでは、見られる任意の配列に対してプローブハイブリダイゼーションが起こり得るように主にランダム塩基を含むプローブを使用することが必要である。この実施例では、ランダム塩基（Ｎ量体）ドメイン、ユニバーサル塩基（５−ニトロインドール）ドメインおよび５’末端に固定ＤＮＡ塩基を１つだけ有する８量体切断性ライゲーションプローブの使用を示す。表６７に示す以下のオリゴヌクレオチドを使用した：
【０６３０】
【表６６】
2016510601.tif 000194
【０６３１】
「Ｔ」標的核酸（配列番号２５９）と「ＡＮＡ」アクセプター核酸（配列番号２５７）を一緒に各々０．４μＭの終濃度で混合し、３種類の切断性ライゲーションプローブ（配列番号２６２から２６４）を個々に５０μＭ（標的およびアクセプターに対して１２５倍過剰）の終濃度で、最終反応容量５０μＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼバッファー中で添加した。反応液を７０℃まで５分間加熱し、２５℃までゆっくり冷却した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを添加し（４００Ｕ）、ライゲーション反応液を３７℃で３０分間インキュベートした。６５℃で１０分間の加熱によって反応を停止させた後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムで脱塩し、その後、試料を凍結乾燥し、１０μＬの９０％ホルムアミド，１×ＴＢＥ負荷バッファーと混合した１０μＬの水中で再水和させた。試料を７０℃で３分間熱変性させ、氷上で冷却した。反応生成物を２０％アクリルアミド７Ｍ尿素変性ゲル上で分離した後、ＵＶ徹照を伴うＧｅｌＳｔａｒ染色（５０５３５  ＧｅｌＳｔａｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ，Ｌｏｎｚａ）を用いて可視化した。結果を図４０に示す。
【０６３２】
標的核酸は、ライゲーション点に相補的な部位に「Ｔ」塩基を含むものであった。この鋳型は「Ａ−ＦＡＭ」ライゲーションプローブ（配列番号２６２）のライゲーションに正しく指向されたが、ミスマッチ「Ｔ−Ｃｙ３」（配列番号２６３）または「Ｇ−Ｃｙ５」（配列番号２６４）ライゲーションプローブには指向されなかった。ライゲーション特異性は、ライゲーションプローブ（他の場合は、ランダム「Ｎ」塩基またはユニバーサル５−ニトロインドール塩基を含む。）の５’末端の単一の固定ＤＮＡ塩基によって指向された。ライゲーションプローブはライゲーション反応に、標的およびアクセプター核酸に対して１２５倍モル過剰で添加した。ライゲーションプローブは４塩基「Ｎ」ドメインを含むものであり、このため核酸混合物の複雑性は４４（２５６）であった。従って、理論的には反応液中に、インプットアクセプター核酸の約５０％だけとライゲーションするのに充分なパーフェクトマッチプローブが含まれていた。図４０の相対蛍光画像から、概算で半分のアクセプターは長鎖ライゲーション生成物種内に存在し、半分は未反応であったことが明白であり、反応が予測どおり進行したことを示す。ミスマッチ配列がアクセプターに任意の認識可能な効率でライゲーションした場合、１２５倍過剰のライゲーションプローブは＞５０％のアクセプター核酸分子と反応している可能性が高いが、これは観察されなかった。従って、この設計の切断性ライゲーションプローブを用いたライゲーション反応は効率的また特異的であった。
【０６３３】
［実施例３２］オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）におけるＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性プローブの使用
ＤＮＡシークエンシングにおける切断性ライゲーションプローブの使用は、この一般的な類型のアッセイのための可能な形式／適用の一例を表すにすぎない。シークエンシング適用は、標的核酸が未知配列であるという点で特殊である。より典型的には、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイは、対象の試料核酸中における既知核酸配列の有無を調べるために使用される。例えば、ＯＬＡは、ヒトＤＮＡのバックグラウンドにおいて病原性生物体に特異的な核酸配列の存在を検出するために使用され得る。別の例は、特定の標的核酸遺伝子座における既知の規定された多型の有無を調べること（例えば、対立遺伝子識別アッセイまたはＳＮＰアッセイ）であり得る。このようなすべての適用において、１つのライゲーションプローブは、最も３’側または最も５’側の塩基がＳＮＰ部位とアラインメントされ、第２のパーフェクトマッチ核酸が隣接して位置するるように配置され、この結果、プローブ配列がＳＮＰ塩基に対してマッチしている場合、ライゲーション事象が起こり得るようにする。プローブ配列がＳＮＰ塩基に対してミスマッチである場合、ライゲーションは阻害される。ライゲーション事象により、検出可能な種の形成がもたらされる。
【０６３４】
対立遺伝子識別（ＳＮＰ）アッセイをこの実施例において、本発明の新規なＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性ライゲーションオリゴヌクレオチドプローブの有用性を示すためにに示す。ここに示す配列設計では、ＳＮＰ部位がアクセプターライゲーションプローブの３’末端の方に位置している。
【０６３５】
従来のＯＬＡでは、３種類の合成オリゴヌクレオチドを用いて２つの対立遺伝子が識別される（図４１Ａ）。ＳＮＰ部位に「Ｃ」対立遺伝子と「Ａ」対立遺伝子が含まれている場合、「Ｇ」塩基（「Ｃ」対立遺伝子に対してマッチ）を有するものと「Ｔ」塩基（「Ａ」対立遺伝子に対してマッチ）を有するものの２種類のアクセプターオリゴヌクレオチドが必要とされる。アクセプターオリゴヌクレオチドは遊離３’−ヒドロキシル基を有する。標的に対してこの５’末端がライゲーションプローブの３’末端に隣接して位置するようにハイブリダイズする第３のオリゴヌクレオチド（ドナー核酸）が使用される。アクセプター核酸は５’−リン酸基を有する；一般的に、ドナーオリゴヌクレオチドの３’末端は、ライゲーション反応に関与できないようにブロックされている。このように、標的上におけるアクセプタープローブとドナープローブの両方のパーフェクトマッチハイブリダイゼーションにより、この２種類のオリゴヌクレオチドが頭−尾様式で位置し、これによって、アクセプターの３’−ヒドロキシルとドナーの５’−リン酸基間のライゲーションが可能になる（図４１Ｂ）。対照的に、ＳＮＰ部位におけるミスマッチはこの構造を破壊し、ライゲーションを阻害する。従来のＯＬＡでは、ＳＮＰ塩基の実体はハイブリダイゼーション／ライゲーション時に１回インテロゲーションされ、特異性は、ＤＮＡリガーゼがミスマッチ種でなくパーフェクトマッチ種に対してライゲーションを行う能力に完全に依存性である。典型的には、３種類のオリゴヌクレオチド（２種類のライゲーションプローブとアクセプター）は同様のＴｍを有し、このため、これらは、同一の条件下で標的核酸と一緒に機能し得る。
【０６３６】
本発明の新しいＲＮａｓｅ  Ｈ２  ＯＬＡでは、４種類の合成核酸を用いて２つの対立遺伝子を識別する（図４２Ａ）。ＳＮＰ部位に「Ｃ」対立遺伝子と「Ａ」対立遺伝子が含まれている場合、この実施形態には、「Ｇ」塩基（「Ｃ」対立遺伝子に対してマッチ）を有するものと「Ｔ」塩基（「Ａ」対立遺伝子に対してマッチ）を有するものの２種類の切断性アクセプターライゲーションプローブが必要とされる。切断性アクセプターライゲーションプローブは、分子の３’末端の方に位置した単一のＲＮＡ塩基を有し、この塩基が、標的ＳＮＰ部位の塩基と相補的である、またはそうでない（マッチとミスマッチ（対比））ようにアラインメントされる。さらなるＤＮＡ塩基がＲＮＡ塩基の３’側に位置し（好ましくは、すべて標的に相補的である４つのＤＮＡ塩基）、ライゲーションを抑制するためのブロッキング基が３’末端に位置する。切断性ライゲーションプローブの一般的な設計および機能は、ｑＰＣＲ形式のＳＮＰ識別アッセイにおける実施例１３で示した切断性プライマーと同様である。また、切断性ライゲーションプローブは、上記の実施例に概要を示したＲＮａｓｅ  Ｈ２切断部位におけるＳＮＰ識別を改善するための種々の化学修飾塩基および無塩基残基を用いて設計され得る（実施例２２、２３、２５および２８参照）。好ましくは、切断性ライゲーションプローブは、切断性プローブと標的とのハイブリダイゼーションが酵素に最適な温度範囲で可能であるように６０から７０℃の範囲のＴｍを有する（ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断バッファー中で）ように設計される。
【０６３７】
従来のＯＬＡ形式とは異なり、ＲＮａｓｅ  Ｈ２  ＯＬＡ形式のドナーオリゴヌクレオチドはＳＮＰインテロゲーションプローブでもある。従って、「Ｇ」塩基（「Ｃ」対立遺伝子に対してマッチ）を有するものと「Ｔ」塩基（「Ａ」対立遺伝子に対してマッチ）を有するものの２種類のドナープローブが必要とされる。どちらのドナープローブも、５’末端にライゲーションを可能にするリン酸基を有し、場合により３’末端はブロックされている（図４２Ａ）。この２種類のドナーライゲーションプローブは、ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性ライゲーションプローブよりも低いＴｍを有するものであり得、このため、切断性ライゲーションプローブおよびドナーライゲーションプローブの標的核酸とのハイブリダイゼーションは、反応温度の制御によって示差的に調節され得る。このアッセイ形式でのこれらのドナープローブはＲＮａｓｅ  Ｈ２と相互作用しない。
【０６３８】
ＲＮａｓｅ  Ｈ２  ＯＬＡを行うためには、４種類すめてのＯＬＡプローブを、標的核酸の存在下、ＲＮａｓｅ  Ｈ２活性と適合性のバッファー中で混合する（上記の実施例参照）。好ましくは、これはおよそ６０から７０℃で行われる。ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性アクセプターオリゴヌクレオチド（ｎｕｌｃｅｏｔｉｄｅ）は標的核酸に相補的であり、この条件下でハイブリダイズする。アクセプタープローブのＲＮＡ塩基と標的ＳＮＰ部位の塩基がマッチしている場合、ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断が起こり得る（図４２Ｂ）。ドナーライゲーションプローブ（非切断性プローブ）は切断性プローブよりも低いＴｍを有することが好ましい。次いで、第１段階の反応（アクセプターオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよびＲＮａｓｅ  Ｈ２による切断）が、非切断性ドナープローブのＴｍよりも充分に上であり、標的にハイブリダイズしない温度で行われ得る。ＲＮａｓｅ  Ｈ２によるアクセプタープローブの切断によってＲＮＡ塩基が除去されてＳＮＰ部位が現れ、非切断性ライゲーションプローブ（ドナーオリゴヌクレオチド）とのハイブリダイズに利用可能になる。
【０６３９】
ＯＬＡのＲＮａｓｅ  Ｈ２切断相が終了したら、非切断性ライゲーションプローブと標的とのハイブリダイゼーションを可能にするために反応温度を下げる。ＤＮＡリガーゼの存在下では、ドナープローブの５’末端の塩基がＳＮＰ部位の塩基と対合した場合、非切断性プローブの５’末端が隣接している切断されたプローブの３’末端とライゲーションする（図４２Ｂ）。従って、ＲＮａｓｅ  Ｈ２  ＯＬＡアッセイでは、ＳＮＰ部位の塩基の実体が、アクセプターオリゴヌクレオチドプローブのＲＮａｓｅ  Ｈ２媒介性切断中に１回、ライゲーション反応時に再度の２回インテロゲーションされる（図４２Ｃ）。２つの異なる酵素的事象によるＳＮＰ塩基の実体の二重のインテロゲーションにより、従来のＯＬＡを用いて得られ得るものよりも大きな特異性がもたらされる。
【０６４０】
［実施例３３］ＯＬＡにおけるＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性プローブを用いたＳＮＰ識別
ＯＬＡ生成物の検出を可能にするさまざまな方法が存在している。この実施例では、蛍光検出をビーズ捕捉アッセイ形式で行い、実施例３２に概要を示したＲＮａｓｅ  Ｈ２  ＯＬＡ対立遺伝子識別アッセイを行う。Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｌ１００検出システムでの検出を伴うＬｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰ蛍光マイクロビーズシステム（Ｌｕｍｉｎｅｘ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）での使用に適合性である配列を設計した。
【０６４１】
「ＯＬＡ−Ｃ−アンチタグ」および「ＯＬＡ−Ｔ−アンチタグ」配列（配列番号２６５から２６６）を、カルボジイミドカップリング化学反応を用いたカルボキシレートｘＭＡＰ蛍光ビーズとのコンジュゲーションを可能にするための５’−アミノモディファイアを用いて作製した。「ＯＬＡ−Ｔ−Ｔａｇ」および「ＯＬＡ−Ｃ−Ｔａｇ」配列（配列番号２６９から２７０）は、ライゲーション反応においてドナーオリゴヌクレオチドとしての機能を果たし、５’末端の方に、標的配列に相補的でありＳＮＰ部位（Ｃ／Ｔ塩基）が５’末端に位置する１２塩基配列を有する。これらの１２塩基ドメインのＴｍは５０から５３℃であると推定される（１０ｍＭ  Ｍｇ＋＋含有バッファー中）。どちらの配列も、ライゲーションを可能にする５’−リン酸基を有する。これらの配列の３’末端は「タグ」配列であり、これは、「アンチタグ」配列に相補的であり、アンチタグを有するビーズにハイブリダイゼーションによって捕捉されることが可能である。「ＯＬＡ−Ｃ」および「ＯＬＡ−Ｔ」プローブ（配列番号２６７から２６８）は、アクセプター断片としての機能を果たし、標的に相補的であり、単一のリボヌクレオチド塩基（ｒＣまたはｒＵ）がＳＮＰ部位に位置している。切断性ライゲーションプローブのＴｍは約７５℃であると推定される（１０ｍＭ  Ｍｇ＋＋含有バッファー中）。どちらのオリゴヌクレオチドプローブも５’末端にビオチンを有し、これは、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｌ１００システムでの検出のためのレポーター色素ストレプトアビジン−フィコエリトリンの結合を可能にする。「Ｃ」対立遺伝子（標的内のＧ塩基，配列番号２７１）および「Ｔ」対立遺伝子（標的内のＡ塩基，配列番号２７２）に対応する合成の９８量体オリゴヌクレオチド標的をこの実施例で使用した。配列番号２６５から２７２に対応する配列を以下に表６８に示す。このアッセイの種々の工程における種々のプローブ、標的、タグおよびアンチタグの配列のアラインメントおよび相互作用を図４３に示す。
【０６４２】
【表６７】
2016510601.tif 000195
【０６４３】
アンチタグオリゴとｘＭＡＰミクロスフェアとのカップリング。５’アミノ基を含むアンチタグオリゴヌクレオチドを１．２５×１０７個のｘＭＡＰ  Ｍｕｌｔｉ−Ａｎａｌｙｔｅ  ＣＯＯＨ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（Ｌ１００−Ｃ１２７−０１およびＬ１００−Ｃ１３８−０１，Ｌｕｍｉｎｅｘ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）と、３ｍｇ／ｍＬのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（０３４４９−１Ｇ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｔｃｈ）を用いて、０．１Ｍ  ＭＥＳ，ｐＨ４．５バッファー（Ｍ−８２５０  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｔｃｈ）中で室温にて９０分間、暗所で（製造業者のプロトコルを修正）カップリングさせた。カップリング後、ミクロスフェアを０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で１回、次いで０．１％ＳＤＳで１回洗浄した。ミクロスフェアを２００μＬのＴＥ  ｐＨ７．５中に再縣濁させた。ミクロスフェアの濃度を、光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＴＭＳ，Ｆｒｅｙｅｒ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＩＬ）下にて血球計算盤で計測することにより測定した。５’ビオチン修飾を含む２５から２５０ｆｍｏｌの相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、ハイブリッドを２μｇ／ｍＬのストレプトアビジンＲ−フィコエリトリンコンジュゲート（Ｓ８６６  １ｍｇ／ｍＬ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて検出することにより、成功裡のカップリングが測定された。平均蛍光強度は濃度依存性様式で増大しなければならなかった。２種類のアンチタグ配列間で交差ハイブリダイゼーションは観察されなかった。
【０６４４】
ＯＬＡアッセイ。２５０ｎＭの終濃度のｒｓ４９３９８２７  ＯＬＡ  Ｃおよびｒｓ４９３９８２７  ＯＬＡ  Ｔオリゴ（配列番号２６７から２６８）と、１２５ｎＭのＣ、ＴまたはＣ／Ｔミックスいずれかの鋳型オリゴヌクレオチド（配列番号２７１から２７２）を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ７．６）、２５ｍＭ  ＫＡｃ、１０ｍＭ  ＭｇＡｃ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＮＡＤおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００バッファー（Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼバッファー，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｔｃｈ，ＭＡ）中に含むＲＮａｓｅ  Ｈ２消化混合物（１０μＬ）を調製した。試料を、６５℃で３０分間、５ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２とともに、またはなしでインキュベートした。各ＲＮａｓｅ  Ｈ２消化反応では、容量を、２．５ピコモルのｒｓ４９３９８２７  ＯＬＡ  １２Ｃタグおよび２．５ピコモルのｒｓ４９３９８２７  ＯＬＡ  １２Ｔタグオリゴヌクレオチド（配列番号２６９から２７０）（各オリゴについて１００ｎＭ終濃度）を、４０ＵのＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｔｃｈ，ＭＡ）とともに、またはなしで添加することによって２５μＬに増大させ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ７．６）、２５ｍＭ  ＫＡｃ、１０ｍＭ  ＭｇＡｃ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＮＡＤおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の最終バッファー組成を維持した。ライゲーション反応液を４５℃で３０分間インキュベートした。
【０６４５】
蛍光ビーズ上でのライゲーション生成物の捕捉およびシグナルの検出。１０μＬの各ライゲーション混合物を１５μＬのＨ２Ｏならびに各型で１００ビーズ／μＬの密度の２５μＬのｘＭＡＰビーズ混合物（Ｂｅａｄセット１２７および１３８）と合わせた。試料を７０℃まで９０秒間加熱した後、５０℃で３０分間加熱した。試料をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ濾過プレート（ＭＡＢＶＮ１２５０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に移し、１００μＬの５０℃の０．２  Ｍ  ＮａＣｌ，０．１  Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０，０．０８％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００バッファーで２回洗浄した。ミクロスフェアを５０℃で１５分間、ストレプトアビジン−Ｒフィコエリトリン（Ｓ８６６  １ｍｇ／ｍＬ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の７５μＬの２μｇ／ｍＬ溶液とともにインキュベートした。平均蛍光をＬｕｍｉｎｅｘ  Ｌ１００検出システム（Ｌｕｍｉｎｅｘ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）で測定した。
【０６４６】
結果を図４４に示す。「Ｃ」対立遺伝子アンチタグ配列を有する蛍光ビーズでは、「Ｃ」対立遺伝子標的または「Ｃ／Ｔ」ミックスの存在下で反応を行った場合のみ、陽性蛍光シグナルが示された。「Ｔ」対立遺伝子アンチタグ配列を有する蛍光ビーズでは、「Ｔ」対立遺伝子標的または「Ｃ／Ｔ」ミックスの存在下で反応を行った陽性蛍光シグナルが示された。シグナルはＲＮａｓｅ  Ｈ２の使用に依存性であり、標的ＤＮＡの非存在下では観察されなかった。従って、本発明のＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイは、標的ＤＮＡ内に存在するＣ／Ｔ  ＳＮＰの存在の高度に特異的な様式での識別において有効であることが示された。
【０６４７】
［実施例３４］内部鋳型ブロッキング基を有するフォワードおよびリバースオーバーラップ切断性プライマーの使用によるミスマッチのデュアルインテロゲーション
実施例２８では、内部鋳型ブロッキング基の有用性を示した。この実施例では、ミスマッチ識別を改善するために、内部鋳型ブロッキング基を有するオーバーラップしているフォワードおよびリバース切断性プライマーを併用することの有用性を示す。
【０６４８】
先の実施例では、単一のブロック型切断性プライマーを使用し、ＰＣＲを用いてＳＮＰインテロゲーションを行い、一方のブロック型切断性プライマーに、未修飾プライマーと対合するＳＮＰ部位に切断性ＲＮＡ残基が位置する。ブロック型切断性プライマーは、二本鎖ＤＮＡ標的の上または下の（センスまたはアンチセンス）鎖のいずれかに相補的に設計され得る。従って、この型の２つの異なるＳＮＰ識別アッセイがＳＮＰごとに行われ得る。「Ｆｏｒ」方向の単一のブロック型切断性プライマーアプローチの概略を示す模式図を図４５ａに示し、「Ｒｅｖ」方向の場合を図４５ｂに示す。代替的ななアプローチは２種類のブロック型切断性プライマーを使用することであり、これらはどちらもインテロゲーション下のＳＮＰに特異的であり、一方は「フォワード」プライマーとしての機能を果たし、「リバース」プライマーとしての機能を果たす。この場合、２種類のプライマーの３’末端は、不活性なブロック状態のときは互いにオーバーラップしているが、ＲＮａｓｅ  Ｈ２による切断後に活性化されると互いにオーバーラップしなくなる。二重ブロック型切断性プライマーアプローチの概略を示す模式図を図４５ｃに示す。二重対立遺伝子特異的ブロック型切断性プライマーの使用により、ＳＮＰ部位の塩基の実体に対するインテロゲーションが各ＰＣＲサイクルで２回もたらされることによって反応の特異性が増大する。
【０６４９】
ヒトＳＭＡＤ７遺伝子のための以下に表６９に示す以下のプライマーを先の実施例と同様に合成した。プライマーは、非特異的であり、いずれの対立遺伝子も同様の効率で増幅し得るか、または「Ｃ」対立遺伝子もしくは「Ｔ」対立遺伝子のいずれかに特異的であるかのいずれかであった。プライマーセットを、「Ｃ−対立遺伝子」ゲノムＤＮＡ標的および「Ｔ−対立遺伝子」ゲノムＤＮＡ標的の両方で試験した。
【０６５０】
【表６８】
2016510601.tif 000196
【０６５１】
８５塩基対のＳＭＡＤ７アンプリコン配列（配列番号２８０）を以下に示す。ｒｓ４９３９８２７  Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ部位を括弧で示す。
【０６５２】
配列番号２８０
【化１２６】
2016510601.tif 000197
【０６５３】
ブロック型切断性プライマーを用いたＰＣＲを使用する対立遺伝子識別アッセイの相対特異性を、上記に示したＳＭＡＤ７アンプリコンの状況において試験した。アッセイは、「Ｆｏｒ」方向の単一のブロック型切断性プライマー、「Ｒｅｖ」方向の単一のブロック型切断性プライマー、または両方向の二重ブロック型切断性プライマーを用いて試験した。プライマー設計には、上記の実施例２８において定義した「ＲＤＤＤＤ−ｘ」および「ＲＤｘｘＤ」バリアントを含めた。また、対照として、対立遺伝子特異的でない未修飾プライマーも使用した。
【０６５４】
使用した「Ｆｏｒ」方向プライマーを、以下にＳＭＡＤ７標的とアラインメントする。
【０６５５】
【化１２７】
2016510601.tif 000198
【０６５６】
ＰＣＲ反応をＲｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームで、１０μｌ容量で、２００ｎＭの修飾または未修飾のＦｏｒプライマー（配列番号２３０、２３１、２３５、２５２および２７３）を未修飾Ｒｅｖプライマー（配列番号２１７）とのペアで使用し、２０ｎｇのゲノムＤＮＡ（Ｃｏｒｉｅｌｌ  ＧＭ０７０４８ホモ接合型Ｃ／Ｃ対立遺伝子またはＧＭ１８９７６ホモ接合型Ｔ／Ｔ対立遺伝子）を用いて行った。反応をＢｉｏ−Ｒａｄ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎマスターミックス中で、「ＲＤＤＤＤ−ｘ」プライマー（配列番号２３１および２３５）では２．６ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２、または「ＲＤｘｘＤ」プライマー（配列番号２５２および２７３）では２００ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２を用いて実施した。反応を９５℃で５分間の浸漬から開始し、続いて、４５サイクルの［９５℃で１０秒間および６０℃で３０秒間］を行った。このＳＮＰ部位において行ったｑＰＣＲ増幅の結果を以下の表７０に示す。
【０６５７】
【表６９】
2016510601.tif 000199
【０６５８】
ＤＮＡ試料ホモ接合型Ｃ／ＣまたはＴ／Ｔは、「ＲＤＤＤＤ−ｘ」または「ＲＤｘｘＤ」いずれかの設計のプライマーを用いて容易に識別され、「ＲＤｘｘＤ」型の方がマッチとミスマッチ間の良好なシグナル分離を示した（ΔＣｐ値がより大きい。）。
【０６５９】
次に、対立遺伝子識別実験を「Ｒｅｖ」向きの反応を用いて行った。使用した「Ｒｅｖ」方向プライマーを以下にＳＭＡＤ７標的とアラインメントする。
【０６６０】
【化１２８】
2016510601.tif 000200
【０６６１】
ＰＣＲ反応をＲｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームで、１０μｌ容量で、２００ｎＭの修飾または未修飾のＲｅｖプライマー（配列番号２７５、２７６、２７７、２７８および２７９）を未修飾Ｒｅｖプライマー（配列番号２７４）とのペアで使用し、２０ｎｇのゲノムＤＮＡ（Ｃｏｒｉｅｌｌ  ＧＭ０７０４８ホモ接合型Ｃ／Ｃ対立遺伝子またはＧＭ１８９７６ホモ接合型Ｔ／Ｔ対立遺伝子）を用いて行った。反応をＢｉｏ−Ｒａｄ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎマスターミックス中で、「ＲＤＤＤＤ−ｘ」プライマー（配列番号２７６および２７７）では２．６ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２、または「ＲＤｘｘＤ」プライマー（配列番号２７８および２７９）では５０ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２を用いて実施した。反応を９５℃で５分間の浸漬から開始し、続いて、４５サイクルの［９５℃で１０秒間および６０℃で３０秒間］を行った。このＳＮＰ部位において行ったｑＰＣＲ増幅の結果を以下の表７１に示す。
【０６６２】
【表７０】
2016510601.tif 000201
【０６６３】
ＤＮＡ試料ホモ接合型Ｃ／ＣまたはＴ／Ｔは、「ＲＤＤＤＤ−ｘ」または「ＲＤｘｘＤ」いずれかのの設計のプライマーを用いて容易に識別され、「ＲＤｘｘＤ」型の方がマッチとミスマッチ間の良好なシグナル分離を示した（ΔＣｐ値がより大きい。）。
【０６６４】
次に、実験を、新しいデュアルインテロゲーション「Ｆｏｒ＋Ｒｅｖ」向きの反応法を用いて行った。使用したプライマーを以下にＳＭＡＤ７標的とアラインメントする。
【０６６５】
【化１２９】
2016510601.tif 000202
【０６６６】
ＰＣＲ反応をＲｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームで、１０μｌ容量で、２００ｎＭの修飾または未修飾Ｆｏｒプライマー（配列番号２３０、２３１、２３５、２５２および２７３）を修飾または未修飾のＲｅｖプライマー（配列番号２９４、２９５、２９６、２９７および２９８）とのペアで使用し、２０ｎｇのゲノムＤＮＡ（Ｃｏｒｉｅｌｌ  ＧＭ０７０４８ホモ接合型Ｃ／Ｃ対立遺伝子またはＧＭ１８９７６ホモ接合型Ｔ／Ｔ対立遺伝子）を用いて行った。反応をＢｉｏ−Ｒａｄ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎマスターミックス中で、「ＲＤＤＤＤ−ｘ」プライマー（配列番号２３１、２３５、２７６および２７７）では２．６ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２、「ＲＤｘｘＤ」「Ｃ−対立遺伝子」プライマー（配列番号２５２および２７６）では５０ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２、または「ＲＤｘｘＤ」「Ｔ−対立遺伝子」プライマー（配列番号２７３および２７９）では２００ｍＵのピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２を用いて実施した。反応を９５℃で５分間の浸漬から開始し、続いて、４５サイクル以上の［９５℃で１０秒間および６０℃で３０秒間］を行った。「ＲＤＤＤＤ−ｘ」プライマーを使用した反応は４５サイクル実施した。「ＲＤｘｘＤ」プライマーを使用した反応は７５サイクル実施した。このＳＮＰ部位において行ったｑＰＣＲ増幅の結果を以下の表７２に示す。
【０６６７】
【表７１】
2016510601.tif 000203
【０６６８】
「ＲＤＤＤＤ−ｘ」設計のブロック型切断性プライマーを使用した「デュアルインテロゲーション」アッセイ（表７２）では、シングルインテロゲーションアッセイ形式（表７０および７１）と比べてミスマッチ識別の低下が示された。特異性がバックグラウンドによって制限され、これらのプライマーペアでは鋳型の非存在下で増幅が示された。「デュアルインテロゲーション」形式は、これまで、「加ピロリン酸分解活性化重合」（ＰＡＰ）法を使用するＰＣＲ形式でのＳＮＰインテロゲーションの特異性を増大させるために使用されており（Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｓｏｍｍｅｒ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３６：１５６−１６６，２００４参照）、これはバックグラウンドの問題を有しなかった。ＰＡＰ形式では、ブロック型ＦｏｒおよびＲｅｖプライマーは３’末端の単一の塩基のみがオーバーラップした。「ＲＤＤＤＤ−ｘ」プライマーは、以下のアラインメントに示すように９塩基がオーバーラップしている。
【０６６９】
【化１３０】
2016510601.tif 000204
【０６７０】
このオーバーラップの量は、明らかに、ブロック型切断性プライマーの一方または両方のＲＮａｓｅ  Ｈ２による切断が「プライマーダイマー事象」となることが可能であるのに充分である。ブロック型プライマーの１つの切断および活性化後、機能性のプライマーダイマー鋳型が形成され、これが、以下に示すようにＰＣＲを補助し得る。
【０６７１】
【化１３１】
2016510601.tif 000205
【０６７２】
対照的に、「ＲＤｘｘＤ」設計のブロック型切断性プライマーを使用した「デュアルインテロゲーション」アッセイ（表７２）では、シングルインテロゲーションアッセイ形式（表７０および７１）と比べて有意に改善されたミスマッチ識別が示された。この形式では、「Ｆｏｒ」および「Ｒｅｖ」の両プライマーによるＳＮＰ識別による相加的効果が可能になる。このブロック型切断性プライマー設計形式を使用すると、「Ｆｏｒ」プライマーと「Ｒｅｖ」プライマー間に５つの不連続な塩基のオーバーラップしか存在せず、これは「プライマーダイマー事象」が起こることを可能にするには不充分である。
【０６７３】
【化１３２】
2016510601.tif 000206
【０６７４】
従って、リボヌクレオチド付近に２つの内部Ｃ３スペーサー基とブロックなしの３’−ヒドロキシルを有するこの二重切断性プライマー設計「ＲＤｘｘＤ」では、単一フォワードブロック型プライマー設計と比べてなお一層さらなる改善が示された。この新しい形式は、要求の多い適用、例えばレアアレル検出アッセイにおいて特に有用性を有するはずである。
【０６７５】
［実施例３５］ブロック型切断性プライマーを用いた莫大に過剰な野生型ＤＮＡにおける変異型対立遺伝子の検出の改善
先の実施例では、切断性ＲＮＡ残基におけるマッチ塩基対合とミスマッチ塩基対合を識別するためのブロック型切断性プライマーの有用性を示した。この実施例では、この方法を、莫大に過剰な野生型ＤＮＡの存在下でレア変異型対立遺伝子の存在を検出するため（レアアレル検出）に使用することの有用性を示す。
【０６７６】
高バックグラウンドの野生型配列の存在下でのレアアレル（１つまたは複数）の検出能は、医学的診断および基礎研究の両方において重要性が高まっている。このような種は１０−２から１０−５またはこれより低いレベルで存在し得る。この型の標的核酸を使用すると、バイアス検出プローブ系と関連して存在するすべての対立遺伝子の無バイアス増幅により充分な感度がもたらされず、かかる方法では、典型的には、変異型対立遺伝子を野生型対立遺伝子と比べて１０−１から１０−２のレベルでしか検出することができない。目的の配列がわずか一塩基の違いであり得る関連配列と比べて選択的に増幅されるバイアス増幅方法では、このような結果が大きく改善され得る。本明細書に記載のようなＲＮａｓｅ  Ｈ２切断を伴うブロック型切断性プライマーではバイアス型の増幅がもたらされ、これは、この適用において有用であり、医学的診断適用における有用性に必要とされる充分な範囲内である１０−４以下のレベルのレアアレル検出を可能にする。
【０６７７】
反応をＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０を用いて、１０μＬで、０．４ＵのｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、１×ｉＴａｑ反応バッファー、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、３ｍＭのＭｇＣｌ２、８００μＭのｄＮＴＰならびに２００ｎＭのフォワードおよびリバースプライマーを含めた３８４ウェル形式で行った。Ｐ．ａ．ＲＮａｓｅ  Ｈ２を表示の通りに、プライマーの設計に応じて種々の濃度で添加した。検出は、５’−ヌクレアーゼアッセイを使用し、二重標識プローブ（配列番号２８３）を２００ｎＭの濃度で用いて行った。使用した種々のプライマーおよびプローブの配列を以下の表７３に示す。デュアルインテロゲーション反応は、ＢＩＯ−ＲＡＤ  ｉＱ  ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用し、５’−ヌクレアーゼプローブオリゴヌクレオチドを使用しなかったこと以外は同一の条件下で実施した。標的核酸は、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから取得したヒトゲノムＤＮＡ（ＧＭ１８５６２またはＧＭ１８５３７）であった。１つの遺伝子型のゲノムＤＮＡをバックグラウンドとして０または２００ｎｇ（約６６，０００コピー）のいずれかで使用し、これを、反応液あたり２ｎｇ（約６００コピー）、０．２ｎｇ（約６０コピー）、０．０２ｎｇ（約６コピー）または０ｎｇの第２の遺伝子型のゲノムＤＮＡと混合した。熱サイクリングは、９５℃での最初の５分間の浸漬、続いて９５℃で１０秒間および６０℃で３０秒間を５０サイクル用いて行った。ＣｐおよびΔＣｐ値を先の実施例に記載のようにして計算した。
【０６７８】
【表７２】
2016510601.tif 000207
【０６７９】
結果を表７４に示す。標準的な未修飾対立遺伝子特異的プライマー（Ｆｏｒ配列番号２８１または２８２とＲｅｖ配列番号２１７とのペア）の使用では、非特異的対照プライマー（Ｆｏｒ配列番号２３０とＲｅｖ配列番号２１７）と本質的に同一のＣｐ検出値が得られた。「ＲＤＤＤＤｘ」設計プライマー（Ｆｏｒ配列番号２３１または２３５とＲｅｖ配列番号２１７とのペア）では、「Ｔ」対立遺伝子バックグラウンドにおける「Ｃ」対立遺伝子および「Ｃ」対立遺伝子バックグラウンドにおける「Ｔ」対立遺伝子の両方を１％レベルで、バックグラウンドより３サイクル上の検出閾値で検出することができた。「ＲＤｘｘＤ」設計プライマー（Ｆｏｒ配列番号２５２または２７３とＲｅｖ配列番号２１７とのペア）ではより優れた結果が得られ、「Ｔ」対立遺伝子バックグラウンドにおける「Ｃ」対立遺伝子および「Ｃ」対立遺伝子バックグラウンドにおける「Ｔ」対立遺伝子の両方の存在が０．１％レベルで、バックグラウンドより６サイクル上の検出閾値で検出された；レアアレルの０．０１％レベルでの検出はバックグラウンドより３サイクル上の検出閾値で達成された。「ＲＤｘｘＤ」設計プライマー（Ｆｏｒ配列番号２５２とＲｅｖ配列番号２７８とのペアおよびＦｏｒ配列番号２７３とＲｅｖ配列番号２７９とのペア）を用いた両方向アッセイは、「Ｔ」対立遺伝子では同様のストリンジェンシーの性能であり、「Ｃ」対立遺伝子では有意に良好であった。特に、「Ｃ」対立遺伝子両方向アッセイ（Ｆｏｒ配列番号２５２とＲｅｖ配列番号２７８とのペア）では、バックグラウンドより１４サイクルより大きく上の検出閾値が示され、このため、おそらく、このアッセイは、さらに低いレアアレルレベル（０．００１％以下）でも有効であり得る。
【０６８０】
【表７３】
2016510601.tif 000208
表７４．レアアレル検出のためのブロック型切断性プライマーの使用。
ＳＭＡＤ７  ｒｓ４９３９８２７遺伝子座の増幅反応を、表示した（３’末端配列を示す。）種々のプライマーでの検出のための内部非識別的二重標識加水分解プローブを用いて５０サイクル実施した。Ｐ．ａ．ＲＮａｓｅ  Ｈ２は、１０μＬあたりの表示量で添加した。プライマーと比べてＳＮＰ部位がミスマッチであるヒトＤＮＡは、反応液あたり０または２００ｎｇ（６６，０００コピー）のいずれかで存在させた；プライマーと比べてＳＮＰ部位がマッチしているＤＮＡは、反応液あたり２ｎｇ（６６６コピー）、０．２ｎｇ（６６コピー）、０．０２ｎｇ（６コピー）または０．０ｎｇで存在させた。反応は三連で実施し、平均Ｃｐ値を示す。標的核酸と比較したプライマー内のミスマッチの位置に下線を付している。
【０６８１】
当業者には、３’末端プライマー構築物の二重のインテロゲーションがさまざまであり得るが、依然としてフォワードおよびリバースプライマーの自己プライミングは抑制されるがなお充分なＲＮａｓｅ  Ｈ２切断部位が提供されるという重要な機能要件は維持されていることが認識され得よう。例えば、代替的なな構築物の一例は「ＲｘＤＤＤＤ」であり得、この場合、スペーサーはリボヌクレオチドの隣に位置しており、リボヌクレオチドが直接ミスマッチ部位上に存在する。別の実施形態では、フォワードおよびリバースプライマーが異なる構築物を有するものであり得る。例えば、フォワードプライマーは「ＲＤｘｘＤ」構築物であり得るが、リバースプライマーは「ＲｘＤＤＤＤ」である。別の実施形態では、ミスマッチが、ＲＮＡ塩基に隣接しているＤＮＡ塩基に存在し得る。例えば、プライマーは「ＲＤｘｘＤ」構築物を含むものであり得る。この場合、ミスマッチは下線のＤＮＡ塩基に存在する。
【０６８２】
［実施例３６］マグネシウムカチオンレベルの最適化によりミスマッチ識別が改善され得る
この実施例では、ＲＮａｓｅ  Ｈ２を伴うブロック型切断性プライマーを使用する対立遺伝子特異的ＰＣＲのミスマッチ識別が、バッファー中のＭｇ＋＋イオンの濃度を変えることにより改善され得ることを示す。
【０６８３】
ＰＣＲバッファー中のマグネシウムレベルの変更は、ポリメラーゼおよびプライマー結合のＴｍに対する効果によって増幅反応の効率と特異性に影響を及ぼし得ることが認識されていた。しかしながら、ｒｈＰＣＲでは、ＳＮＰ識別はＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素によって媒介され、ＲＮＡ塩基でのこの酵素によるマッチ切断とミスマッチ切断（対比）の特異性にマグネシウム濃度がどのように影響を及ぼすのかに関する情報は知られていない。ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２は、２から１０ｍＭのＭｇ＋＋イオン濃度で酵素活性において広いピークを示し、遊離Ｍｇ＋＋濃度が２ｍＭ未満に低下すると活性が劇的に低下する；該酵素は１ｍＭ  Ｍｇ＋＋で最大活性の５０％である。ｒｈＰＣＲでは、ｄＮＴＰを典型的には０．８ｍＭ濃度で存在させ、各ｄＮＴＰは１分子のＭｇ＋＋に結合してこれを反応バッファー中での利用可能性から除去する。従って、３ｍＭ  Ｍｇ＋＋を０．８ｍＭ  ｄＮＴＰとともに含むバッファーは、実際には２．２ｍＭの遊離Ｍｇ＋＋を有する。この実施例では、ｒｈＰＣＲにおける種々のＭｇ＋＋イオン濃度の反応効率およびＳＮＰ識別の質に対する効果を調べる。
【０６８４】
先の実施例では、ブロック型切断性プライマーを用いたＰＣＲ反応を、ロバストな反応を確実にするためにｑＰＣＲにおいて一般的に使用されている濃度である３ｍＭのＭｇＣｌ２を使用して行った。この実施例では、本発明者らは、マグネシウムレベルを下げると、ＳＮＰジェノタイピングアッセイにおけるマッチ反応とミスマッチ反応間のΔＣｐによって測定される増幅反応の特異性が増大し得ることを示す。ＰＣＲを行う場合、研究者らは典型的には、自家製バッファー  を使用するか、または既製の市販のマスターミックスを購入するかのいずれかである。マグネシウム濃度を自家製バッファー中で高くまたは低くなるように調整するのは簡単である。既製のバッファー中におけるマグネシウム濃度を上げることは簡単であるが、バッファーにマグネシウムが既に混合物中に設定された濃度で添加されて装備されている場合、マグネシウムを下げることは困難であり得る。しかしながら、ヌクレオチド三リン酸（例えば、ｒＮＴＰ）を添加することにより、既製の混合物中のマグネシウムを下げることが可能である。ｒＮＴＰは、各ヌクレオチド三リン酸に対して単一のマグネシウム分子とキレート形成し、バッファー中の遊離マグネシウムの濃度が有効に低減させる。この実施例では、本発明者らは、バッファーのマグネシウム含有量を直接調整することによる、またはｒＮＴＰを反応ミックスに添加することによってバッファーの遊離マグネシウム含有量を間接的に調整することによる、ブロック型切断性プライマーおよびＲＮａｓｅ  Ｈ２を用いたＰＣＲの特異性の改善を示す。
【０６８５】
方法：遊離マグネシウムとキレート形成するｒＮＴＰを用いた固定ＭｇＣｌ２濃度を有する既製のマスターミックス中のマグネシウムの低減。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を、２０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（ＧＭ１８５６２またはＧＭ１８５３７，Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて、ヒトＳＭＡＤ７遺伝子（ｒｓ４９３９８２７，ＮＭ＿００５９０４）内のＳＮＰ部位に特異的なプライマーを使用して行った。ＤＮＡ試料ＧＭ１８５６２は、この遺伝子座のＣ対立遺伝子に対してホモ接合型であり、ＤＮＡ試料ＧＭ１８５３７は、Ｔ対立遺伝子に対してホモ接合型である。反応には、１×ｉＱ  ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用し、これは、３ｍＭのＭｇＣｌ２を含む既製の市販のマスターミックスである。０、５、９６または３８４ｆｍｏｌのいずれかのＰ．ａ．ＲＮａｓｅ  Ｈ２（１０μＬの反応液中０、０．５、９．６または３８．４ｎＭの終濃度、これは、０、２．６、５０または２００ｍＵの酵素と同等である。）。２００ｎＭの各プライマーを使用した。対照反応では、ブロックなしのフォワードおよびリバースプライマー、ｒｓ４９３９８２７  Ｆｏｒ（配列番号２１７）とｒｓ４９３９８２７  Ｒｅｖ（配列番号２３０）を使用した。各対立遺伝子に特異的な２種類の異なる型のブロック型プライマー、ＲＤＤＤＤｘ設計（実施例１３参照）またはＲＤｘｘＤ設計（実施例２８参照）のいずれかを使用した。ブロック型切断性フォワードプライマーは、以下の通りの未修飾リバースプライマーとの組合せ：ｒｓ４９３９８２７  Ｃ−Ｆｏｒ  ＲＤＤＤＤｘ（配列番号２３１）とｒｓ４９３９８２７  Ｒｅｖ（配列番号２３０）、ｒｓ４９３９８２７  Ｔ−Ｆｏｒ  ＲＤＤＤＤｘ（配列番号２３５）とｒｓ４９３９８２７  Ｒｅｖ（配列番号２３０）、ｒｓ４９３９８２７  Ｃ−Ｆｏｒ  ＲＤｘｘＤ（配列番号２５２）とｒｓ４９３９８２７  Ｒｅｖ（配列番号２３０）、ｒｓ４９３９８２７  Ｔ−Ｆｏｒ  ＲＤｘｘＤ（配列番号２７３）とｒｓ４９３９８２７  Ｒｅｖ（配列番号２３０）で使用した。また、０．５ｍＭまたは１ｍＭいずれかのｒＡＴＰ（水で希釈）を一部の反応液に添加した。この実施例で使用したすべてのオリゴヌクレオチドを表７５に示す。サイクリングはＲｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）で、以下の通りに行った：９５℃で３分間、続いて７５サイクルの９５℃で１０秒間および６０℃で３０秒間。反応はすべて三連で行った。サーモサイクリングの前に９５℃での最初の３分間のインキュベーションから始めることにより、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼの再活性化が可能である。
【０６８６】
【表７４】
2016510601.tif 000209
【０６８７】
結果を表７６に示す。未修飾プライマーの使用では効率的な増幅反応がもたらされ、ｒＡＴＰを含む反応もしくは含まない反応間またはＰ．ａ．ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素を伴う反応もしくは伴わない反応間に差は見られなかった。増幅をｒＡＴＰの存在下で行った場合、ミスマッチ識別の増大が観察され（ΔＣｐの増大）、これは、ＲＤｘｘＤ設計のプライマーでは反応液中に存在するｒＡＴＰの濃度により異なったが、ＲＤＤＤＤｘ設計のプライマーでは異ならなかった。ＲＮａｓｅ  Ｈ２を反応液に添加しなかった場合、ブロック型切断性プライマーの使用時に増幅は起こらなかった（示さず）。
【０６８８】
【表７５】
2016510601.tif 000210
【０６８９】
方法：反応ミックス中のマグネシウム濃度を直接変える．定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を、２０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（ＧＭ１８５６２またはＧＭ１８５３７，Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて、ヒトＳＭＡＤ７遺伝子（ｒｓ４９３９８２７，ＮＭ＿００５９０４）内のＳＮＰ部位に特異的なプライマーを使用して行った。ＤＮＡ試料ＧＭ１８５６２は、この遺伝子座のＣ対立遺伝子に対してホモ接合型であり、ＤＮＡ試料ＧＭ１８５３７は、Ｔ対立遺伝子に対してホモ接合型である。反応には、０．４ＵのホットスタートＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ｉＴａｑ（商標），Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した。反応液は、ｉＴａｑ（商標）バッファーを３ｍＭ、２．５ｍＭ、２ｍＭまたは１．５ｍＭのＭｇＣｌ２とともに含むものにした。また、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２＋１ｍＭ  ｒＡＴＰを含む反応液も試験した。これは、ｒＮＴＰなしでの２ｍＭのＭｇＣｌ２の使用がシミュレーションされるはずである。また、反応には、２００ｎＭの各プライマー、２００ｎＭの５’−ヌクレアーゼアッセイ検出プローブ（配列番号２８３）および０または７６８ｆｍｏｌのＰ．ａ．ＲＮａｓｅ  Ｈ２（１０μＬ反応液中０もしくは７６．８ｎＭの終濃度、または０もしくは４００ｍＵの酵素）を含めた。対照反応では、ブロックなしのフォワードおよびリバースプライマー、ｒｓ４９３９８２７  Ｆｏｒ（配列番号２１７）とｒｓ４９３９８２７  Ｒｅｖ（配列番号２３０）を使用した。ＲＤｘｘＤ設計のブロック型切断性Ｆｏｒプライマーを未修飾Ｒｅｖプライマーとともに、以下の組合せ：ｒｓ４９３９８２７  Ｃ−Ｆｏｒ  ＲＤｘｘＤ（配列番号２５２）とｒｓ４９３９８２７  Ｒｅｖ（配列番号２３０）、ｒｓ４９３９８２７  Ｔ−Ｆｏｒ  ＲＤｘｘＤ（配列番号２７３）とｒｓ４９３９８２７  Ｒｅｖ（配列番号２３０）で使用した。この実験で使用したすべてのオリゴヌクレオチドを表７７に示す。サイクリングはＲｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）で、以下の通りに行った：９５℃で３分間、続いて８５サイクルの９５℃で１０秒間および６０℃で３０秒間。反応はすべて三連で行った。サーモサイクリングの前に９５℃での最初の３分間のインキュベーションから始めることにより、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼの再活性化が可能である。
【０６９０】
【表７６】
2016510601.tif 000211
【０６９１】
結果を表７８に示す。マグネシウムレベルを反応バッファーにおいて低下させた場合、ミスマッチ識別の増大が観察された。予測どおり、２ｍＭのＭｇ２＋の使用でのミスマッチ識別の増大は、１ｍＭのｒＡＴＰを３ｍＭのＭｇ２＋を含む反応液に添加した場合に観察された増大と同様であった。未修飾プライマーの使用では効率的な増幅反応がもたらされ、種々の量のＭｇ２＋またはｒＡＴＰを含む反応間に差は見られなかった。ＲＮａｓｅ  Ｈ２を反応に存在させなかった場合、ブロック型切断性プライマーの使用時に増幅は起こらなかった（示さず）。
【０６９２】
【表７７】
2016510601.tif 000212
【０６９３】
従って、マグネシウム濃度は、ブロック型切断性プライマーをＰＣＲ系ジェノタイピングにおいて使用した場合、ＳＮＰ識別に関して得られるΔＣｐ値に実質的に影響を及ぼし得る。試験対象の種々の遺伝子座間で個々のプライマーペアの性能を最適化するためにマグネシウムレベルの滴定が必要とされる場合があり得、かかる実験は当業者によって容易に行われ得る。
【０６９４】
［実施例３７］マグネシウム最適化によりレアアレル検出が改善され得る．
この実施例では、ブロック型切断性プライマーを用いたＰＣＲでの混合対立遺伝子ＤＮＡ試料中における「レアアレル」の検出能が、反応バッファー中に存在するマグネシウム濃度を最適化することによって改善され得ることを示す。
【０６９５】
実施例３６では、対立遺伝子特異的ＰＣＲアッセイにおいてマッチブロック型切断性プライマーとミスマッチブロック型切断性プライマーとで得られる識別が、直接、または遊離マグネシウムレベルを低下させるｒＮＴＰの添加によって間接的にマグネシウムレベルを直接低下させることによって改善され得ることが示された。この実施例では、この方法を、ＲＤｘｘＤ設計のプライマーを用いたレアアレル検出に拡張する（実施例２８および３５参照）。この場合、市販のＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎマスターミックスを使用し、これは、マグネシウム濃度が３ｍＭであった（製造業者によって提供）；ｒＮＴＰを反応ミックスに添加し、遊離マグネシウムレベルを低下させた。
【０６９６】
ヒトＳＭＡＤ７遺伝子（ｒｓ４９３９８２７，ＮＭ＿００５９０４）内の一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）に特異的なブロック型切断性プライマーを各対立遺伝子に対して、ＲＤｘｘＤ設計を用いて設計した。対照反応では、ブロックなしのフォワードおよびリバースプライマー、ｒｓ４９３９８２７  Ｆｏｒ（配列番号２１７）とｒｓ４９３９８２７  Ｒｅｖ（配列番号２３０）を使用した。ＲＤｘｘＤ設計のブロック型切断性Ｆｏｒプライマーを未修飾Ｒｅｖプライマーとともに、以下の組合せ：ｒｓ４９３９８２７  Ｃ−Ｆｏｒ  ＲＤｘｘＤ（配列番号２５２）とｒｓ４９３９８２７  Ｒｅｖ（配列番号２３０）、ｒｓ４９３９８２７  Ｔ−Ｆｏｒ  ＲＤｘｘＤ（配列番号２７３）とｒｓ４９３９８２７  Ｒｅｖ（配列番号２３０）で使用した。レアアレル検出実験をセットアップするため、第１の対立遺伝子に対するＤＮＡは高量で添加し（野生型ＤＮＡをシミュレーションするため）、第２の対立遺伝子は少量で添加する（レア変異型ＤＮＡをシミュレーションするため）。このシナリオにおいて、「野生型」ＤＮＡはブロック型切断性Ｆｏｒプライマーに対してミスマッチであるが、「変異型」（レアアレル）ＤＮＡはブロック型切断性Ｆｏｒプライマーに対してマッチしている。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を、反応にバックグラウンドとして含めた２００ｎｇ（約６６，０００ゲノム当量コピー）または０ｎｇの「野生型」ヒトゲノムＤＮＡ（ＧＭ１８５６２またはＧＭ１８５３７のいずれか，Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）の存在下で行った。ＧＭ１８５６２およびＧＭ１８５３７はｒｓ４９３９８２７  ＳＮＰ（ＣまたはＴ）の２つの対立遺伝子に対してホモ接合型である。ＧＭ１８５６２は、ｒｓ４９３９８２７遺伝子座のＣ対立遺伝子に対してホモ接合型であり、ＧＭ１８５３７はＴ対立遺伝子に対してホモ接合型である。バックグラウンドゲノム「野生型」ＤＮＡに加えて、バックグラウンドＤＮＡの一方と反対のｒｓ４９３７８２７  ＳＮＰ（ＣまたはＴ）の対立遺伝子に由来する２、０．２、０．０２または０ｎｇ（６６０、６６、６または０ゲノム当量コピー）の「変異型」ヒトゲノムＤＮＡを反応に加えた。また、反応には、１×ｉＱ  ＳＹＢＲＴＭ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）、および１９２（ｒＣ含有プライマーでは）ｆｍｏｌまたは７６８（ｒＵ含有（ｃｏｎｔａｉｎｇ）プライマーでは）ｆｍｏｌいずれかのＰ．ａ．ＲＮａｓｅ  Ｈ２（１０μＬの反応液中１９．２または７６．８ｎＭの終濃度，これは、それぞれ１００または４００ｍＵのＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素に等価である。）も含めた。２００ｎＭの各プライマーを各反応に使用した。また、０または１ｍＭいずれかのｒＡＴＰ（水で希釈）を各反応液に添加した。実施例３７で使用したすべてのオリゴヌクレオチドを表７９に示す。サイクリングはＲｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）で、以下の通りに行った：９５℃で３分間、続いて６５サイクルの９５℃で１０秒間および６０℃で３０秒間。反応はすべて三連で行った。サーモサイクリングの前に９５℃での最初の３分間のインキュベーションから始めることにより、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼの再活性化が可能である。
【０６９７】
【表７８】
2016510601.tif 000213
【０６９８】
ＤＮＡ塩基は大文字であり、ＲＮＡ塩基は小文字である；ｘ＝Ｃ３スペーサー（プロパンジオール）
結果を以下の表８０、８１、８２および８３に示す。１：１０，０００のレアアレル識別レベル（２００ｎｇの「野生型またはミスマッチ」鋳型と０．０２ｎｇの「変異型またはマッチ」鋳型）では、１ｍＭのｒＡＴＰの添加により、ΔＣｐ（この場合、「変異型」Ｔ−対立遺伝子が存在しない反応バックグラウンドで１：１０，０００の試料中で測定されたＣｐと定義する。）は７．０サイクル（３９．５−３２．５＝７．０，表８０）から１２．６サイクル（４６．０−３３．４，表８１）に増大した。ＤＮＡを交換してＣ対立遺伝子をレア変異型として使用した場合、１ｍＭのｒＡＴＰ添加により、ΔＣｐは１．８サイクル（３６．７−３４．９＝１．８，表８２）から１８．４サイクル（５３．６−３５．２＝１８．４，表８３）に増大した。重要なことに、反応効率は障害されず、陽性蛍光シグナルが最初に見られたときのＣｐは３ｍＭ  Ｍｇ＋＋の反応と３ｍＭ  Ｍｇ＋＋＋１ｍＭ  ｒＡＴＰの反応間で同様であった。
【０６９９】
未修飾プライマーの使用により効率的な増幅反応がもたらされ、ｒＡＴＰを含めた反応間に有意差は見られなかった。ＲＮａｓｅ  Ｈ２を反応に加えなかった場合、ブロック型切断性プライマーの使用時に増幅は起こらなかった（示さず）。
【０７００】
【表７９】
2016510601.tif 000214
【０７０１】
【表８０】
2016510601.tif 000215
【０７０２】
【表８１】
2016510601.tif 000216
【０７０３】
【表８２】
2016510601.tif 000217
【０７０４】
この実施例は、バッファー中のマグネシウム濃度を調整することにより、ブロック型切断性プライマーおよびＲＮａｓｅ  Ｈ２を使用するＰＣＲレアアレル検出アッセイにおける識別および検出限界が改善され得ること、ならびに検出限界が信頼性を伴って１：１０，０００のレベルに達し得ることを示す。
【０７０５】
［実施例３８］ブロック型切断性プライマーおよびＲＮａｓｅ  Ｈ２を用いたＰＣＲにおける非イオン性界面活性剤Ｂｒｉｊ（Ｒ）−５８の使用
実施例１８では、ブロック型切断性プライマーおよびピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）（Ｐ．ａ．）ＲＮａｓｅ  Ｈ２を使用してＰＣＲを行う場合、反応ミックスに非イオン性界面活性剤を含めることの有益性が示された。この実施例では、界面活性剤Ｂｒｉｊ（Ｒ）−５８（ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル、またはポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルのいずれかとしても知られている。）が他の非イオン性界面活性剤、例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の代わりに、ブロック型切断性プライマーおよびピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）（Ｐ．ａ．）ＲＮａｓｅ  Ｈ２を使用するＰＣＲにおいて代用され得ることを示す。
【０７０６】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を１０μＬ反応液中で、２０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（ＧＭ１８５６２またはＧＭ１８５３７，Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて、ヒトＳＭＡＤ７遺伝子（ｒｓ４９３９８２７，ＮＭ＿００５９０４）内の部位に特異的なプライマーを使用して行った。ＤＮＡ試料ＧＭ１８５６２はＣ対立遺伝子に対してホモ接合型であり、ＧＭ１８５３７はＴ対立遺伝子に対してホモ接合型である。反応には、０．５Ｕ（１０．８ｎｇ／１１．１ｎＭ／１１１ｆｍｏｌ）いずれかの天然Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した。使用した最終反応バッファー条件は１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（２５℃でｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣＬおよび３ｍＭ  ＭｇＣｌ２であった。また、反応には、界面活性剤なしのＲＮａｓｅ  Ｈ２希釈バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ８．４，１００ｍＭ  ＫＣＬ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０％グリセロール）中で希釈した１μＬのＰ．ａ．ＲＮａｓｅ  Ｈ２（５ｆｍｏｌ；１０μＬ反応液中０．５ｎＭの終濃度または２．６ｍＵの酵素）も使用した。１μＬの水（界面活性剤なし）または１μＬの０．００１％、０．０１％、０．１％のＢｒｉｊ（Ｒ）−５８  または０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を各１０μＬの最終反応容量に添加した。また、２００ｎＭの各プライマーおよび５’ヌクレアーゼ検出プローブも各反応に使用した。対照反応では、ブロックなしのフォワードおよびリバースプライマー、ｒｓ４９３９８２７  Ｆｏｒ（配列番号２１７）とｒｓ４９３９８２７  Ｒｅｖ（配列番号２３０）を使用した。ＲＤＤＤＤｘ設計のブロック型切断性フォワードプライマー（実施例１３参照）を未修飾リバースプライマーとの以下の通り：ｒｓ４９３９８２７  Ｃ−Ｆｏｒ  ＲＤＤＤＤｘ（配列番号２３１）とｒｓ４９３９８２７  Ｒｅｖ（配列番号２３０）の組合せで使用した。ＳＭＡＤ７  ５’−ヌクレアーゼ蛍光クエンチプローブを検出のために２００ｎＭで含めた（配列番号２８３）。この実施例で使用したオリゴヌクレオチドを表８４に示す。サイクリングはＲｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）で、以下の通りに行った：９５℃で３分間、続いて４５サイクルの９５℃で１０秒間および６０℃で３０秒間。反応はすべて三連で行った。
【０７０７】
【表８３】
2016510601.tif 000218
【０７０８】
結果を以下の表８５に示す。ＣｐおよびΔＣｐ値は、界面活性剤なし、０．０００１％、０．００１％、０．０１％終濃度のＢｒｉｊ（Ｒ）−５８、または０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００界面活性剤のいずれかを用いたＰＣＲで得られたものである。界面活性剤なしまたは０．０００１％Ｂｒｉｊ（Ｒ）−５８の使用では、未修飾またはブロック型いずれのプライマー設計でも増幅はもたらされなかった。Ｂｒｉｊ（Ｒ）−５８の濃度を０．００１％以上の終濃度に増大させると、未修飾およびブロック型の両方のプライマー設計で効率的な増幅反応がもたらされた。０．００１％より高いＢｒｉｊ（Ｒ）−５８濃度では、０．０１％の非イオン性界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて行った反応と比べて、種々のＢｒｉｊ（Ｒ）−５８濃度間で増幅効率に有意差は示されなかった。この結果は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＰ．ａ．ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素はどちらもこの条件下で活性であることを示す。ＲＮａｓｅ  Ｈ２を反応に加えなかった場合、ブロック型切断性プライマーの使用時に増幅は起こらなかった（示さず）。
【０７０９】
【表８４】
2016510601.tif 000219
【０７１０】
このような結果は、Ｂｒｉｊ（Ｒ）−５８が、ブロック型切断性プライマーおよびＲＮａｓｅ  Ｈ２を使用するＰＣＲにおいて非イオン性界面活性剤として使用され得ることを示す。
【０７１１】
［実施例３９］：高忠実度３’−エキソヌクレアーゼＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲにおけるＲＮａｓｅ  Ｈ２とのブロック型切断性プライマーの使用
この実施例では、高忠実度プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼとともに良好に機能するブロック型切断性プライマーの組成を示す。
【０７１２】
テルムス・アクウァーティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から得られたもの（Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）などの多くのＤＮＡポリメラーゼは５’−エキソヌクレアーゼ活性を有するが、３’−エキソヌクレアーゼ活性がない。このような酵素は多くの場合、ロバストであるが「プルーフリーディング」機能を持たず、一般的に「低忠実度」とみなされている。この類型のポリメラーゼは、常套的なＰＣＲ系配列検出アッセイに典型的に使用されており、上記の先のほどんどの実施例で使用した。ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）から得られたもの（Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ）、サーモコッカス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）から得られたもの（ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ）などの他のポリメラーゼは５’−エキソヌクレアーゼ活性はないが、３’−エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有する。これらの酵素は「高忠実度」ポリメラーゼとみなされている。高忠実度ポリメラーゼは、多くの場合、ＤＮＡクローニングまたはポリメラーゼによって導入されたレア変異であっても有害となる次世代シークエンシング（ＮＧＳ）適用において使用される。しかしながら、３’−エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、プライマーの３’末端の末端塩基または末端ブロッキング基、例えばＲＤＤＤＤｘプライマー設計において末端ブロック部分として使用されるＣ３スペーサー基を除去し得る；ブロッキング基が除去されることにより、プライマーがＲＮａｓｅ  Ｈ２の切断の非存在下で機能することが可能になり、これにより、本明細書において教示したようなブロック型切断性プライマーの使用によって得られる多くの有益性が消去される。高忠実度増幅が所望される適用、例えばクローニング、遺伝子合成、ＮＧＳなどのためのブロック型切断性プライマーの使用を可能にする方法を有することが望ましい。
【０７１３】
方法。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を、２ｅ３コピーの合成オリゴヌクレオチドＤＮＡ鋳型（配列番号１４４）を用いて、この鋳型に特異的なプライマーを使用して行った。反応には、１×Ｐｈｕｓｉｏｎ（Ｒ）−ＨＦバッファー（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、および０、２．５、５、９．６，１９．２，１９２、２８８、３８４または７６８ｆｍｏｌのＰ．ａ．ＲＮａｓｅ  Ｈ２（それぞれ、１０μＬの反応液中、０、０．２５、０．５、０．９６、１．９２，１９．２、２８．８、３８．４もしくは７６．８ｎＭの終濃度、または０、１．３、２．６、５、１０、１００、１５０、２００もしくは４００ｍＵの酵素）を使用した。８００μＭのデオキシヌクレオチドおよび２００ｎＭの各プライマーを各反応に含め、１．５ｍＭのさらなるＭｇＣｌ２を各反応液に加え、３ｍＭのＭｇＣｌ２の終濃度にした。０．２ＵのＰｈｕｓｉｏｎ（Ｒ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）を各増幅反応に使用した。Ｐｈｕｓｉｏｎは、３’−エキソヌクレアーゼ活性を有する高忠実度ＤＮＡポリメラーゼである。検出のため、ＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）をストック試薬に対して３０，０００倍に希釈の終濃度まで添加した（希釈物はｄＨ２Ｏで新鮮に作製した。）。対照反応では、未修飾プライマー（Ｓｙｎ−Ｆｏｒ，配列番号６８およびＳｙｎ−Ｒｅｖ，配列番号６９）を使用した。２種類の異なる型のブロック型切断性プライマーＲＤＤＤＤｘ設計およびＲＤｘｘＤ設計を使用し、どちらも標的合成鋳型に対してパーフェクトマッチであった。この２種類のブロック型切断性リバースプライマーを未修飾フォワードプライマーとの組合せ（Ｓｙｎ  Ｒｅｖ  ｒＵ  ＤＤＤＤｘ，配列番号１１６とＳｙｎ−Ｆｏｒ，配列番号６８；Ｓｙｎ  Ｒｅｖ  ｒＵ  ＤｘｘＤ，配列番号２８４とＳｙｎ−Ｆｏｒ，配列番号６８）で使用した。この実験で使用したオリゴヌクレオチドを表８６に示す。ＰＣＲは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｒ）ＣＦＸ３８４（商標）Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で、以下の通りに行った：９５℃で３分間、続いて４０サイクルの９５℃で１０秒間および６０℃で３０秒間。反応はすべて三連で行った。
【０７１４】
【表８５】
2016510601.tif 000220
【０７１５】
結果を以下の表８７および８８に示す。予測どおり、未修飾対照プライマーでは、高忠実度３’−エキソヌクレアーゼＰｈｕｓｉｏｎ（Ｒ）ＤＮＡポリメラーゼとともに良好な性能を示し、ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素の添加ありまたはなしで一様な増幅効率が示された。ＲＤＤＤＤｘ設計のブロック型切断性プライマー（配列番号１１６）では、ＲＮａｓｅ  Ｈ２の非存在下で充分な効率の増幅が示され、ＲＮａｓｅ  Ｈ２が存在する場合は増幅効率が低下した。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用すると、逆が見られる：ＲＮａｓｅ  Ｈ２の非存在下では増幅は起こらず、少量のＲＮａｓｅ  Ｈ２の存在であっても効率的な増幅が起こる（通常、２．６ｍＵの酵素で１００％効率），実施例１３）。この予想外の観察結果は、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼの３’−エキソヌクレアーゼ活性によってこのプライマーのＣ３末端ブロッキング基が除去され得、このためプライマー伸長およびＰＣＲがＲＮａｓｅ  Ｈ２切断なしで進行することを示唆する。さらに、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼとＲＮａｓｅ  Ｈ２との間に有害な相互作用が存在するようであり、このため、両酵素がＲＤＤＤＤｘ類型のブロック型切断性プライマーとともに存在する場合に増幅効率の低下が起こった（注：ＲＮａｓｅ  Ｈ２を添加した場合では未修飾プライマーの使用で効率の低下は見られない。）。
【０７１６】
【表８６】
2016510601.tif 000221
【０７１７】
このような結果とは対照的に、ＲＤｘｘＤブロック型切断性プライマーは、ＲＮａｓｅ  Ｈ２の非存在下でＰＣＲを補助しなかった。従って、この設計のプライマーは、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼの３’−エキソヌクレアーゼ活性によってブロック解除されない。ＲＮａｓｅ  Ｈ２の存在下ではプライマー切断およびＰＣＲが起こった。低用量のＲＮａｓｅ  Ｈ２（反応あたり１００ｍＵ）の使用では低効率ＰＣＲが見られ、反応あたり４００ｍＵのＲＮａｓｅ  Ｈ２の使用ではブロックなしの対照プライマーとほぼ同等であった。
【０７１８】
【表８７】
2016510601.tif 000222
【０７１９】
高忠実度３’−エキソヌクレアーゼＤＮＡポリメラーゼ、例えばＰｈｕｓｉｏｎを使用する場合、ＲＤｘｘＤ設計のブロック型切断性プライマーはＲＤＤＤＤｘ設計よりも好ましいと本発明者らは結論づける。未修飾プライマーを用いて行われる反応と等しい反応効率またはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて典型的に見られる反応効率を得るためには、高濃度のＲＮａｓｅ  Ｈ２が必要であり得る。
【０７２０】
［実施例４０］：ＲＮａｓｅ  Ｈ２とともに高忠実度３’−エキソヌクレアーゼＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲにおける使用のためのブロック型切断性プライマーの設計の改善
この実施例では、「ＲＤＤＤＤｘｘＤ」と称するブロック型切断性プライマーの新しい設計の、３’エキソヌクレアーゼ活性を有する高忠実度ＤＮＡポリメラーゼとの組合せでのＲＮａｓｅ  Ｈ２依存性ＰＣＲ（ｒｈＰＣＲ）における有用性を示す。
【０７２１】
先の実施例３９では、ＲＤｘｘＤ設計のブロック型切断性プライマーは、高忠実度３’−エキソヌクレアーゼＤＮＡポリメラーゼの使用で良好に奏功するが、ＲＤＤＤＤｘ設計は同様の性能を示さないことが示された。一般に、ＲＤｘｘＤブロック型切断性プライマーは、ＰＣＲにおいてピーク増幅効率に達するため（即ち、未修飾プライマーを用いて行われるものと同等の反応を得るため）には高濃度のＲＮａｓｅ  Ｈ２を必要とするが、ＲＤＤＤＤｘ設計で必要とされるのは低濃度のＲＮａｓｅ  Ｈ２の使用である。場合によっては、ＲＤＤＤＤｘ型プライマーを低濃度のＲＮａｓｅ  Ｈ２とともに使用することが好都合であり得る。この実施例では、ＲＤＤＤＤｘプライマーのバリアントである新しいＲＤＤＤＤｘｘＤプライマーの性能を示す。この新しいＲＤＤＤＤｘｘＤプライマーは、比較的低濃度のＲＮａｓｅ  Ｈ２が使用されるＰＣＲにおいて高忠実度３’−エキソヌクレアーゼＤＮＡポリメラーゼとともに良好に機能し得る。この設計のブロック型切断性プライマーの他の特性の説明については実施例２６を参照のこと。
【０７２２】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を、２０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（ＧＭ１８５３７，Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて、ヒトＳＭＡＤ７遺伝子（ｒｓ４９３９８２７，ＮＭ＿００５９０４）内の部位に特異的なプライマーを使用して行った。ＧＭ１８５３７  ＤＮＡはこの遺伝子座におけるホモ接合型Ｔ／Ｔである。Ｐｈｉｒｅ（Ｒ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）は高忠実度３’−エキソヌクレアーゼＤＮＡポリメラーゼであり、この実施例で行った実験で使用した。反応には、１×Ｐｈｉｒｅ（Ｒ）バッファー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）、および０、２．５、９．６，１９．２、９６，１９２、３８４、７６８または１１５２ｆｍｏｌのＰ．ａ．ＲＮａｓｅ  Ｈ２（それぞれ、１０μＬの反応液中、０、０．２５、０．９６、１．９２、９．６，１９．２、３８．４  ７６．８もしくは１１５．２ｎＭの終濃度または０、１．３、５、１０、５０、１００、２００、４００もしくは６００ｍＵの酵素）を使用した。８００μＭのデオキシヌクレオチドおよび２００ｎＭの各プライマーを各反応に含めた。１．５ｍＭの補給的ＭｇＣｌ２を各反応液に添加し、３ｍＭのＭｇＣｌ２の終濃度にした。０．１ＵのＰｈｉｒｅ（Ｒ）ＤＮＡポリメラーゼを各増幅反応に使用し、検出を可能にするためにＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）を（ストック色素から）３０，０００倍希釈の終濃度まで添加した。ＲＤＤＤＤｘ、ＲＤｘｘＤおよび新しいＲＤＤＤＤｘｘＤの設計を含む３種類の型のブロック型切断性プライマーを試験した。配列を以下の表８９に示す。未修飾ｒｓ４９３９８２７  Ｆｏｒとｒｓ４９３９８２７  Ｒｅｖプライマー（配列番号２１７および２３０）は対照反応として使用した。３種類の設計のブロック型切断性Ｆｏｒプライマーを個々に未修飾リバースプライマーとの組合せ、例えば、ペア：ｒｓ４９３９８２７  Ｔ−Ｆｏｒ  ＲＤＤＤＤｘ（配列番号２３５）とｒｓ４９３９８２７  Ｒｅｖ（配列番号２１７）；ｒｓ４９３９８２７  Ｔ−Ｆｏｒ  ＲＤｘｘＤ（配列番号２７３）とｒｓ４９３９８２７  Ｒｅｖ（配列番号２１７）；およびｒｓ４９３９８２７  Ｔ−Ｆｏｒ  ＲＤＤＤＤｘｘＤ（配列番号２８５）とｒｓ４９３９８２７  Ｒｅｖ（配列番号２１７）で試験した。ＰＣＲをＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｒ）ＣＦＸ３８４（商標）Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で以下の通りに行った：９８℃で３分間、続いて４０サイクルの９８℃で１０秒間および６０℃で３０秒間。反応はすべて三連で行った。
【０７２３】
【表８８】
2016510601.tif 000223
【０７２４】
結果を表９０および９１に示す。ＲＤＤＤＤｘブロック型切断性プライマーは、ＲＮａｓｅ  Ｈ２の非存在下で高忠実度３’−エキソヌクレアーゼＰｈｉｒｅ（Ｒ）ＤＮＡポリメラーゼとともにＰＣＲを補助し、これは、３’−ブロックが高忠実度ポリメラーゼの３’−エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性によって除去され、このためＰＣＲがＲＮａｓｅ  Ｈ２切断／活性化の必要性なく進行することを示唆する。同一の結果が、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎ（Ｒ）を用いた実施例３９でも報告され、この類型のすべてのＤＮＡポリメラーゼで同様の挙動が期待され得ることが示唆される。また、先の実施例での結果と同様、ＲＮａｓｅ  Ｈ２増幅反応に加えた場合に増幅効率の低下が見られ、ＲＤＤＤＤｘ設計のプライマーでは、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼとＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素との間にいくらかの拮抗作用が生じていることが示唆された。ＲＤｘｘＤブロック型切断性プライマーはＲＮａｓｅ  Ｈ２の非存在下でＰＣＲを補助しなかった。従って、この設計のプライマーは、Ｐｈｉｒｅ（Ｒ）ＤＮＡポリメラーゼの３’−エキソヌクレアーゼ活性によって容易にはブロック解除され得ない。ＲＮａｓｅ  Ｈ２の存在下ではプライマー切断およびＰＣＲが起こった。低用量のＲＮａｓｅ  Ｈ２（反応あたり１００ｍＵ）の使用では低効率ＰＣＲが見られ、反応あたり４００から６００ｍＵのＲＮａｓｅ  Ｈ２の使用で、ブロックなしの対照プライマーとほぼ同等であった。従って、ＲＤＤＤＤｘおよびＲＤｘｘＤのどちらのブロック型切断性プライマーの結果も、２つの異なる高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（Ｒ）およびＰｈｉｒｅ（Ｒ）を使用した場合で同様であった。
【０７２５】
新しい設計のＲＤＤＤＤｘｘＤプライマーではＲＮａｓｅ  Ｈ２の非存在下で増幅は示されず、高忠実度３’−エキソヌクレアーゼＤＮＡポリメラーゼは、このプライマー設計に存在する３’−ブロック効果を除去できないことが示された。さらに、比較的低濃度のＲＮａｓｅ  Ｈ２の使用で良好な増幅効率が得られ、このプライマー設計では、ポリメラーゼとＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素間の拮抗作用がないか、または最小限であることが示唆された。
【０７２６】
【表８９】
2016510601.tif 000224
【０７２７】
【表９０】
2016510601.tif 000225
【０７２８】
高忠実度３’−エキソヌクレアーゼＤＮＡポリメラーゼ酵素を使用した場合、ＲＤＤＤＤｘｘＤおよびＲＤｘｘＤのどちらのブロック型切断性プライマー設計もＰＣＲを補助すると本発明者らは結論づける。ＲＤＤＤＤｘｘＤ設計では必要とされるインプットＲＮａｓｅ  Ｈ２濃度は低いが、ＲＤｘｘＤでは高いインプットＲＮａｓｅ  Ｈ２濃度が必要とされる。このアプローチにより、高忠実度ＤＮＡ複製が必要とされる適用、例えばＤＮＡクローニング、遺伝子合成またはＮＧＳにおいてブロック型切断性プライマーストラテジーを使用することが可能である。
【０７２９】
追加確認
本明細書において挙げた参考文献、例えば刊行物、特許出願および特許はすべて、参照により、あたかも各参考文献が具体的に個々に示されて参照により組み込まれ、この全体が本明細書に示されているのと同様に本明細書に組み込まれる。
【０７３０】
本発明を説明する文脈において（特に、以下の特許請求の範囲の文脈において）、用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および同様の指示対象物の使用は、本明細書において特に記載のない限り、または文脈と明らかに矛盾していない限り、単数形と複数形の両方を包含していると解釈されたい。用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（〜を含む）」、「ｈａｖｉｎｇ（〜を有する）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（〜を含む）」および「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（〜を含む）」は、特に記載のない限り、非限定の用語（即ち、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ（〜を含むが、限定されない）」を意味する。）と解釈されたい。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書において特に記載のない限り、該範囲内に含まれる個別の各値に個々に言及する簡略表記法として供することを意図したものにすぎず、個別の各値は、あたかも本明細書に個々に記載されているかのごとく本明細書に組み込まれている。本明細書に記載の方法はすべて、本明細書において特に記載のない限り、または文脈と明らかに矛盾していない限り、任意の適切な順序で行われ得る。本明細書において示す例または例示の文言（例えば、「ｓｕｃｈ  ａｓ（例えば／など）」）の使用はいずれもすべて、本発明をよりよく説明することを意図したものにすぎず、特許請求の範囲を除いて本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書における文言は、本発明の実施に不可欠な特許請求の範囲に示されていない要素（あれば）を示していると解釈されるべきでない。
【０７３１】
本発明らが認識している本発明を実施するための最良の形態を含む本発明の好ましい実施形態を本明細書において説明している。該好ましい実施形態の変形例は、当業者には前述の説明を読むと自明となり得よう。本発明者らは、当業者が適宜、かかる変形例を使用することを予測しており、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載したものと別の様式で実施されること意図している。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲に記載の主題の準拠法によって許容されるあらゆる修正および均等物を包含している。さらに、本明細書において特に記載のない限り、または文脈と明らかに矛盾していない限り、考えられ得るすべての変形例における上記の要素の任意の組合せが本発明に包含される。
【図１】
2016510601.tif 000226
【図２】
2016510601.tif 000227
【図３】
2016510601.tif 000228
【図４Ａ】
2016510601.tif 000229
【図４Ｂ】
2016510601.tif 000230
【図５】
2016510601.tif 000231
【図６】
2016510601.tif 000232
【図７】
2016510601.tif 000233
【図８Ａ】
2016510601.tif 000234
【図８Ｂ】
2016510601.tif 000235
【図９】
2016510601.tif 000236
【図１０】
2016510601.tif 000237
【図１１】
2016510601.tif 000238
【図１２】
2016510601.tif 000239
【図１３】
2016510601.tif 000240
【図１４】
2016510601.tif 000241
【図１５】
2016510601.tif 000242
【図１６】
2016510601.tif 000243
【図１７】
2016510601.tif 000244
【図１８】
2016510601.tif 000245
【図１９】
2016510601.tif 000246
【図２０】
2016510601.tif 000247
【図２１】
2016510601.tif 000248
【図２２】
2016510601.tif 000249
【図２３】
2016510601.tif 000250
【図２４】
2016510601.tif 000251
【図２５】
2016510601.tif 000252
【図２６】
2016510601.tif 000253
【図２７】
2016510601.tif 000254
【図２８】
2016510601.tif 000255
【図２９】
2016510601.tif 000256
【図３０】
2016510601.tif 000257
【図３１】
2016510601.tif 000258
【図３２】
2016510601.tif 000259
【図３３】
2016510601.tif 000260
【図３４】
2016510601.tif 000261
【図３５】
2016510601.tif 000262
【図３６】
2016510601.tif 000263
【図３７】
2016510601.tif 000264
【図３８】
2016510601.tif 000265
【図３９】
2016510601.tif 000266
【図４０】
2016510601.tif 000267
【図４１Ａ】
2016510601.tif 000268
【図４１Ｂ】
2016510601.tif 000269
【図４２Ａ】
2016510601.tif 000270
【図４２Ｂ】
2016510601.tif 000271
【図４２Ｃ】
2016510601.tif 000272
【図４３−１】
2016510601.tif 000273
【図４３−２】
2016510601.tif 000274
【図４４】
2016510601.tif 000275
【図４５Ａ】
2016510601.tif 000276
【図４５Ｂ】
2016510601.tif 000277
【図４５Ｃ】
2016510601.tif 000278
【配列表】
2016510601000001.app
【国際調査報告】
2016510601.tif 000279
2016510601.tif 000280
2016510601.tif 000281
2016510601.tif 000282