(57)【要約】【課題】同定、認証、追跡、および検証の目的で、ＤＮＡタガントを用いて、物品とくに価値のある物品の効率的、安定、かつ検出可能なマーキングを可能にするシステムの必要性が、当技術分野に存在する。【解決手段】本発明は、デオキシリボ核酸をオブジェクトおよび基材に安定に結合して固定する方法を提供する。本方法は、デオキシリボ核酸をアルカリ条件に暴露することと、デオキシリボ核酸をオブジェクまたは基材に接触させることと、を含む。アルカリ条件は、デオキシリボ核酸と、約９．０以上のｐＨを有するアルカリ溶液と、を混合することにより生成され、そしてデオキシリボ核酸を基材に接触させる。固定されたＤＮＡは、タガントとして使用可能であり、光学レポーターなどの他の検出可能タガントと組み合わせて使用可能である。ＤＮＡでマーキングされたオブジェクトの認証方法もまた、提供する。【選択図】  図１
2016521129.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デオキシリボ核酸を基材に結合する方法であって、
前記デオキシリボ核酸をアルカリｐＨに暴露することと、
前記アルカリに暴露されたデオキシリボ核酸を前記基材に接触させることと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記デオキシリボ核酸を暴露することが、前記デオキシリボ核酸と、約９．０〜約１４．０の範囲内のｐＨを有するアルカリ溶液と、を混合することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アルカリ溶液が高ｐＨ緩衝剤の溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記高ｐＨ緩衝剤が、ＣＡＢＳ（４−［シクロヘキシルアミノ］−１−ブタンスルホン酸）、ＣＡＰＳ（Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸）、ＡＭＰ（２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール）、ＣＡＰＳＯ（Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシル−３−アミノプロパンスルホン酸）、ＣＨＥＳ（２−（Ｎシクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸）、ＡＭＰＳＯ（３−［（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、およびそれらの２種以上の混合物からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アルカリ溶液がアルカリ金属の水酸化物の溶液である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記アルカリ金属が、リチウム（Ｌｉ）、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、およびルビジウム（Ｒｂ）からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記アルカリ金属水酸化物溶液が、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、および水酸化カリウムからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アルカリ金属水酸化物が水酸化ナトリウムである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記アルカリ金属水酸化物溶液が約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの濃度である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記アルカリ金属水酸化物溶液が約０．４Ｍ〜約０．８Ｍの濃度である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アルカリ金属水酸化物溶液が約０．６Ｍの濃度である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記デオキシリボ核酸がアルカリ溶液と混合され、かつ約１５Ｃ〜約２５Ｃでインキュベートされる、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記デオキシリボ核酸がアルカリ溶液と混合され、かつ約１８℃〜約２２℃の温度でインキュベートされる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記デオキシリボ核酸が約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの濃度のアルカリ金属水酸化物溶液と混合され、かつ約１５℃〜約２５℃の温度で約１分間〜約６時間インキュベートされる、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前記デオキシリボ核酸が約０．６Ｍの濃度の水酸化ナトリウム溶液と混合され、かつ約１８℃〜約２２℃の温度で約１０分間〜約２時間インキュベートされる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アルカリｐＨを中和することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
マーカーＤＮＡでマーキングされたオブジェクトであって、前記マーカーＤＮＡが、前記オブジェクトに結合されたアルカリｐＨ活性化ＤＮＡである、オブジェクト。
【請求項１８】
前記アルカリｐＨ活性化ＤＮＡが、コットン、ウール、ナイロン、プラスチック、金属、ガラス、木材、印刷インク、および医薬組成物からなる群から選択される材料に結合されている、請求項１７に記載のマーカーＤＮＡでマーキングされたオブジェクト。
【請求項１９】
前記プラスチック材料が、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリアミド、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリビニルクロリド（ＰＶＣ）、ポリスルホン、ポリビニルアセテート（ＰＶＡ）、ポリエステル（ＰＥＳ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ベンゾシクロブテン（ＢＣＢ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリビニリデンクロリド（ＰＶＤＣ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、高耐衝撃性ポリスチレン（ＨＩＰＳ）、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、フェノール化合物ホルムアルデヒド樹脂（ＰＦ）、メラミンホルムアルデヒド（ＭＦ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリエーテルケトンイミド、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリメチルペンテン（ＰＭＰ）、ポリエーテルケトン（ＰＥＫ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリフェニレンスルフィド（ＰＰＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、フルロポリマー(fluropolymer)、シリコーン、アイオノマー、成形可能エラストマー、エチレンビニルアルコール（ＥＶＯＨ）、メサロセン(methalocene)ポリマー、およびポリエチレンナフタレートからなる群から選択される、請求項１８に記載のマーカーＤＮＡでマーキングされたオブジェクト。
【請求項２０】
前記医薬組成物が、医薬錠剤、医薬カプセル剤、または医薬粉末剤である、請求項１８に記載のマーカーＤＮＡでマーキングされたオブジェクト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、オブジェクトの表面上への追跡可能ＤＮＡタガントの安定な結合および固定、またはタガントを結合した後で検出してオブジェクトを認証できるようにオブジェクトに適用可能な染料含有液やインクなどの液体中への組込み、を促進する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
より安価な材料を用いたハイエンド製品の偽造およびブレンドは、主要ブランド名に対する重大な責任問題になってきた。国際商業会議所（International Chamber of Commerce）（ＩＣＣ）は、２００８年に偽造品が６５００億ドルの収入損失および２５０万人の雇用喪失をもたらしたと報告した。ＩＣＣは、２０１５年に収入損失が世界経済の２％に相当する１．７兆ドルを超えるであろうと予測した。収入損失に加えて、特定の偽造製品は、深刻な健康上および安全上の問題に直接関連付けられた。偽造品は、テキスタイルからマイクロチップさらには医薬品に至るまで、ほとんどの産業に浸透してきた。
【０００３】
偽造は、世界中の多種多様な産業に広がり、深刻な問題になってきた。年換算で約６０００億ドル相当の偽造品が市場に入り込んでいると推定された（Cattaui, 2012）。医薬品、玩具、娯楽品、衣類、ファッションアクセサリー、貨幣、エレクトロニクス、およびいずれの他の価値ある製品も含めて、製品は、消費者市場に模倣偽造品を有する。偽造品に関連する問題は、オリジナル名および経済に打撃を与えるだけではなく、これらの製品が信頼性できる供給元から出荷されたものではないので、それらの品質および有効性が損なわれる可能性があることである。偽造コンポーネントを含む製品の不具合から生じる可能性のある致命的な影響と比較して、偽造が偽物販売者に与える影響は、最小限に抑えられることが多い。２０１１年、何千もの偽物チップが電子産業のすべての分野に販売された後、VisionTech（Clearwater, FL）は、偽造チップの販売で実際に告発された数少ない会社の１つであった。
【０００４】
医薬品の偽造はまた、米国内で巨大産業になってきた。これらの偽物薬剤は、それらを販売するのに必要とされる精度も一貫性も備えていないので、きわめて危険なこともある。真の薬剤または類似の薬剤を用いて初期試験に合格すれば、これらの偽造者は、より後の段階で、消費者に知らせることなく、多種多様な成分を含む製品を販売することが可能である。オンラインで購入される医薬品が世界的に増加傾向にあるので、偽造医薬品の販売がより容易になってきた。これらの偽造品は、中国やインドなどの国内の薬剤供給の７０％を占め、これらの国々から多くの他の国々に薬剤が供給されるので、世界中にさらに多くの死者をもたらすことになる（Chakraborty, FoxBusiness, June 2012を参照されたい）。２０１２年４月、Avastin（癌治療剤）と呼ばれる薬剤が模倣された。「…１２０個の偽物バイアルがAlzutanという名称で、トルコで購入され、２月に米国診療所を最初に襲った偽物と著しく類似した輸送パターンで、英国を拠点とする仲介者により英国を経由して輸送された。」これらの偽造薬剤は、高い利益で販売され、罰金が安いため、このプロセスは、犯罪者には魅力的になっている。これは、何十億ドルもの産業になってきており、次の十年間で１０００億ドルに達すると推定される（Chakraborty）。このため、より安い製品に引かれて偽造品であることに気付かない消費者は、これらの偽物の影響を受けやすくなり、かなり深刻な健康リスクを抱える可能性がある。
【０００５】
偽造製品に侵されてきた他の産業は、電子産業である。標準的なミュージックプレーヤーやミュージックホーンの周知の偽造以外に、マイクロチップなどの製品もまた、偽造されてきた。これらの製品の顧客は、米国国防総省（United States Department of Defense）（ＤｏＤ）であるので、これは、たいへん困った状況である。極東からの偽造マイクロチップは、海軍およびペンタゴンの武器システムに入り込んできている（Kelley, Business Insider, Military & Defense）。これらの偽造品製造者は、初期試験に合格するようにオリジナルのように機能する製品を最初に開発するが、その後、粗悪なより安価な製品を製造し、依然としてオリジナルとして販売する。それらが武器の流れに進入してしまうと、偽造品の検出が信じられないほど困難であり、それらに信頼性がないため、製品不良が多くなり、国防上大きな脆弱性を残す。これらの製品が不良である可能性があるだけでなく、無認可の情報筋から米国の武器システム内の欠陥マイクロチップへのアクセスにより、検出されることなく米国の通信機関内にアクセスできる可能性もある（Kelley）。
【０００６】
会社は、偽物に関係したり、そのシステムが損なわれるおそれがあることを認めることに伴う副次的影響のリスクを冒したりすることを控えるので、サプライヤーチェーンの関係者に影響を与えることなく、偽造マイクロチップの事例は、ほとんど報告されずに見過ごされている。米軍プログラムのＴＨＡＡＤ（終端高高度地域防衛）システムの場合、今後の偽造部品からシステムを保護したり、そのようなシステムに支障をきたす問題への認識を高めたりする手段として、システムが損なわれることが開示された。このシステムは、飛行中のミサイルを撃ち落とすために開発されたものであり、高い精度を必要とするので、そのチップの１つでも誤動作すると、危険に晒される可能性がある。主に極東の供給元から購入されるこれらの偽造マイクロチップは、軍用機器が耐えなければならない環境に耐えられない商用グレードの製品であることが多い。ということは、機器が機能を突然停止して致命的な結果をもたらす可能性があることを意味する。
【０００７】
偽造を防ぐ手段の裏付けとして、２０１２年の会計年度の国防授権法（National Defense Authorization Act）でセクション８１８の新しい指令が成立した。この指令により、米国政府に部品または製品を販売する会社は、所定の位置に偽造防止手段を有することが義務付けられる。これらは、販売前のそれらの製品の検査および認証を含む。また、指令により、欠陥製品に起因して起こるいかなる損害のコストおよび法的影響も含めて、供給業者は、供給する偽造製品の責任を負うものとみなされる。この指令が国防授権法（National Defense Authorization Act）に追加されるまで、消費者への偽造製品の提供に関して法的影響がなく、必要とされる強制的な監視システムも検出システムもなかった。
【０００８】
偽造に巻き込まれるリスクがあるため、多くの会社は、製品を保護する方法を見いだして偽造を防止する方法を確立すべく、独自に行動するようになってきた。使用される方法の１つは、製品にフルオロフォアを添加して、どの製品が合法的であるかを視覚的に検出できるようにすることである。フルオロフォアとは、光で励起すると蛍光を発したりより長い波長の光を再放出したりする化学化合物のことである。これが起こるのは、フルオロフォア中の分子が励起されて光子や蛍光を発するからである。フルオロフォアは、これらの製品に対して製造の初期の段階で適用可能な染料またはマーカーとして機能しうる。
【０００９】
この方法は、最初は有効であるが、偽造者がフルオロフォアと一緒に製品をコピーするので、もはや製品を保護しなくなる。偽造者は、製品からフルオロフォアを抽出し、それを複製し、その偽造製品に添加して、本物の製品とまったく同様にＵＶ光下で製品から蛍光を発するようにできる。このため、法科学的に製品を認証可能な、安全で偽造者自身により複製できない偽造防止方法の必要性が生じてきた。米軍が現在検討している方法の１つは、ＤＮＡを用いて認証製品にマーキングすることである。特異的配列を有するＤＮＡは、インクまたは他の材料を利用してこれらの製品中に取り込まれる。これは、材料が蛍光を発するようにして、ＵＶ光下で検出可能である。特異的ＤＮＡ配列は、複製することが実質上不可能であるので、偽造を不可能にする。このＤＮＡは、材料全体にわたり埋め込まれるので、除去するのは不可能であろう。
【００１０】
セキュリティーマーカーとしての核酸
比較的単純なヌクレオチドビルディングブロックで構成されているにもかかわらず、核酸は、多くの情報をコードしうる。たとえば、ヒトゲノムは、脳の神経回路網から、骨格、組織、および器官の複雑な構造まで、人体のすべての構成要素の合成および集合に必要なすべての情報をコードする。核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびより不安定性リボ核酸（ＲＮＡ）を含む。核酸配列は、ユニークかつ複雑でありうるので、いくつかの共通のコード化問題、たとえば、製品の認証および追跡ならびに偽造製品の検出の解決にこれらの特定の特性を利用することに、最近、大きな関心が寄せられるようになってきた。
【００１１】
多くの製品製造業者は、「トレードドレス」として同定可能な明確な品質および決定的なデザインを利用して、それらの高品質および高値な製品をユニークに同定することにより、それらの顧客の信頼を得ている。また、他の者は、偽造防止目的でラベルを追加する。伝統的な偽造防止ラベルは、とくに標的とされる物理的または化学的な特性を有する材料、たとえば、小切手帳上の磁気ストリップ、クレジットカード上のレーザーホログラフ、株券上の蛍光インク、および機密文書上の感熱インクから一般に形成される。偽造防止ラベルはまた、特異的抗原を同定の必要なオブジェクトに添加することによっても、行われてきた。抗原は、その後、抗原に特異的な抗体を用いて検出可能である。しかしながら、抗原および抗体は、温度および湿度の多くの環境条件下で特性上不十分な安定性を有するタンパク質であり、変性したりさらには分解したりして活性を喪失する傾向があり、しかも容易に破壊されうるので、同定の確度および信頼性は、低減される。
【００１２】
したがって、核酸、たとえば、本質的な遺伝情報をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）などは、一般に使用される偽造防止ラベルおよびマーカーに代わる改善された代替物として注目されてきた。ＤＮＡおよびＲＮＡは、約２０〜５０塩基長までの比較的短い鎖からなる「オリゴヌクレオチド」またはより長い鎖の「ポリヌクレオチド」として参照される、ヌクレオチドの鎖からなるポリマーである。これらのオリゴヌクレオチド鎖またはポリヌクレオチド鎖は、ストリング上のビーズのように逐次的に結合一体化されたいくつかのヌクレオチドからなる。各ヌクレオチドは、わずか４種類の含窒素塩基、すなわち、ＤＮＡの場合、アデニン（「Ａ」として省略形で表されることが多い）、グアニン（「Ｇ」として表される）、シトシン（「Ｃ」として表される）、およびチミン（「Ｔ」として表される）、ならびにＲＮＡの場合、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）、の１つに結合されたリボース糖−リン酸からなる。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、同一の糖−リン酸骨格を共有する。１個のヌクレオチドのリボース糖の３’−ヒドロキシル基は、その近接するヌクレオチドの５’−リン酸基に共有結合されて、櫛の歯によく似た鎖から突出する各平面状含窒素塩基と共に鎖状構造を形成する。
【００１３】
１本のオリゴヌクレオチド鎖またはポリヌクレオチド鎖中の塩基Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣは、異なる鎖中の他の塩基との特異的対合を行って二本鎖構造を形成したり、または同一の鎖との特異的対合を行って二本鎖ループまたはヘアピン構造を形成したりすることが可能である。すなわち、アデニンは、２つの水素結合を介してＤＮＡ中のチミンと（またはＲＮＡ中のウラシルと）特異的に結合し、シトシンは、３つの水素結合を介してグアニンと特異的に結合する。言い換えれば、ＴはＡに、ＧはＣに結合することにより、２本のヌクレオチド鎖を一体化させて二本鎖を形成したり、一本のヌクレオチド鎖の２つの部分を一体化させてループにより結合された二本鎖の各鎖を含む二本鎖領域を形成したりするであろう。
【００１４】
核酸をマーカーまたはタガントとして使用する追加の利点は、適切な正しい保護を行えば、これらの分子を長期間にわたり保存できることである。氷河、氷床、タール坑、ならびに湿原および沼沢に保存された試料に基づく証拠から、ＤＮＡは、何千年にもわたり、いくつかの場合、何百万年にもわたり、分解に対して抵抗力があることが示される。そのような証拠は、古代人さらには植物および動物の祖先および起源に関する情報を推定するために使用されてきた。保護マーカーＤＮＡはまた、長期間残存した後で同定、認証、および追跡の目的で使用できるように、対象となる高値な物品またはオブジェクトにコーティングするためのポリマー中で安定化させることが可能である。長期間にわたり持続するこの能力が、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた増幅により、少数の分子を検出する非常に感度の高い方法と相まって、核酸とくにＤＮＡは、マーカーとして使用するのに魅力的な候補になっている。さらに、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列に塩基を追加するごとに、可能なユニークな配列の数が４倍に増加するので、核酸は、ほとんど無制限のコード能力を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
同定、認証、追跡、および検証の目的で、ＤＮＡタガントを用いて、物品とくに価値のある物品の効率的、安定、かつ検出可能なマーキングを可能にするシステムの必要性が、当技術分野に存在する。ブランド名を保護したり、容易かつ迅速に偽造製品を検出したり、偽造者の告発を支援する法科学的証拠を提供したりする必要性が、存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
概要
本発明は、デオキシリボ核酸を基材に固定するまたはデオキシリボ核酸を基材に結合する方法を提供する。本方法は、デオキシリボ核酸をアルカリｐＨに暴露することと、アルカリに暴露されたデオキシリボ核酸を基材に接触させることと、を含む。
【００１７】
本発明の一実施形態は、デオキシリボ核酸を基材に結合する方法を提供する。本方法は、デオキシリボ核酸をアルカリ条件に暴露することであって、アルカリ条件がデオキシリボ核酸と高ｐＨ（たとえば、約９．０〜約１４．０のｐＨなど）を有するアルカリ溶液とを混合することにより生成される、暴露することと、アルカリに暴露されたデオキシリボ核酸を基材に接触させることと、を含む。一実施形態では、アルカリ溶液は、アルカリ金属の水酸化物の溶液である。
【００１８】
本発明の他の実施形態では、アルカリ溶液は、高ｐＨ緩衝剤の溶液である。他の実施形態では、高ｐＨ緩衝剤は、ＣＡＢＳ（４−［シクロヘキシルアミノ］−１−ブタンスルホン酸）、ＣＡＰＳ（Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−プロパンスルホン酸）、ＡＭＰ（２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール）、ＣＡＰＳＯ（Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシル−３−アミノプロパンスルホン酸）、ＣＨＥＳ（２−（Ｎシクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸）、ＡＭＰＳＯ（３−［（１，１−ジメチル２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、および上記の任意の２種以上の混合物からなる群から選択される。
【００１９】
他の実施形態では、マーカーＤＮＡでマーキングされたオブジェクトを提供する。マーカーＤＮＡは、オブジェクトに結合されたアルカリｐＨ活性化ＤＮＡである。
【００２０】
他の実施形態では、アルカリｐＨ活性化ＤＮＡは、コットン、ウール、ナイロン、プラスチック、金属、ガラス、木材、印刷インク、および医薬組成物からなる群から選択される材料に結合される。
【００２１】
一実施形態では、マーカーＤＮＡでマーキングされたオブジェクトは、医薬錠剤、医薬カプセル剤、または医薬粉末剤の１つを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】Giza86コットンのマーキングおよび認証。図１Ａ：Giza86のバックグラウンドＤＮＡ解析を示している。図１Ｂ：ＤＮＡマーキング後のGiza86コットンの認証。図１Ｃおよび１Ｄ：洗浄後のGiza86コットンの認証。
【図２】Giza88コットンのマーキングおよび認証。図２Ａ：Giza88コットンのバックグラウンドＤＮＡ解析を示している。図２Ｂ：ＤＮＡマーキング後のGiza86コットンの認証。図２Ｃおよび２Ｄ：洗浄後のGiza88コットンの認証。
【図３】Giza86コットンのマーキングおよび認証。図［［１］］３Ａ：洗浄前のGiza86コットンの認証。図３Ｂ：水洗浄後のGiza86コットンの認証。図３Ｃ：逐次的な水洗浄およびアルコール洗浄の後のGiza86コットンの認証。図３Ｄ：逐次的な水洗浄、アルコール洗浄、および溶媒洗浄の後のGiza86コットンの認証。
【図４】Giza88コットンのマーキングおよび認証。図４Ａ：洗浄前のGiza88コットンの認証。図４Ｂ：水洗浄後のGiza88コットンの認証。図４Ｃ：逐次的な水洗浄およびアルコール洗浄の後のGiza88コットンの認証。図４Ｄ：逐次的な水洗浄、アルコール洗浄、および溶媒洗浄の後のGiza88コットンの認証。
【図５】ウール糸のマーキングおよび仕上げ布の認証。糸をSigNature（登録商標）ＤＮＡでマーキングし、織成し、そしてプロ仕上げした。SigNature（登録商標）ＤＮＡを回収して認証した。図５Ａ：仕上げ布の認証。図５Ｂ：同一の認証手順をマーキングされていない布で行った。
【図６】一連の１０回のドライクリーニング後のSigNature（登録商標）ＤＮＡでマーキングされた布の認証。糸をSigNature（登録商標）ＤＮＡでマーキングし、布を織成し、プロ仕上げし、そして１０サイクルのドライクリーニングに付した。図６Ａ〜Ｅは、それぞれ、布を６、７、８、９、および１０回ドライクリーニングした後の認証である。
【図７】ナイロン（図７Ａ）およびＰＥＴ（図７Ｂ）のペレットのマスターバッチをSigNature（登録商標）ＤＮＡと混合し、押し出し、そして得られた糸およびフィルムを洗浄した。図７Ｃは、ＤＮＡを含まない対照を示している。最終製品を記載のように認証した。
【図８】洗浄前および洗浄後のSigNature（登録商標）ＤＮＡでマーキングされたカシミヤの認証。図８Ａは、マーキングされたカシミヤからのマーカーＤＮＡの検出を示している。図８Ｂは、洗浄後のマーキングされたカシミヤからのマーカーＤＮＡの検出を示している。
【図９】ドライクリーニングサイクルの前および後のSigNature（登録商標）ＤＮＡでマーキングされたカシミヤの認証。１、２、または３サイクルのドライクリーニングの前および後のマーキングされていないカシミヤおよびＤＮＡでマーキングされたカシミヤ。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
詳細な説明
定義：
本明細書で用いられる場合、「基材に結合する」および「固定する」という用語は、ＤＮＡの結合および固定に適用されるとき、交換可能である。
【００２４】
本明細書で用いられる「タガント」という用語は、ＤＮＡマーカーを意味し、任意選択で、ＤＮＡマーカーは、第２のマーカー物質との組合せでありうる。マーカーＤＮＡおよび存在する場合の追加の１種以上のマーカーは、オブジェクトの性質、たとえば、その製造元などを表すために、オブジェクトに固着される。タガントでマーキングされるオブジェクトは、貯蔵状態であるか輸送状態であるかにかかわらず、任意の追跡可能固体アイテム、たとえば、電子デバイス、衣類アイテム、紙、繊維、もしくは布、または任意の他の商業アイテム、または現金もしくは貴重品でありうる。他の選択肢として、タガントでマーキングされる商業アイテムは、液体、たとえば、インク、染液、スプレーなどでありうる。他の選択肢として、商業アイテムは、商品アイテム、たとえば、紙、金属、木材、プラスチック、または粉末でありうる。タガントは、会社もしくはアイテムタイプ（たとえば、モデル番号）に特異的でありうるか、アイテムの特定のロットもしくはバッチ（ロット番号）に特異的でありうるか、またはたとえばアイテムに特有のシリアル番号の場合のように実際のアイテムに特異的でありうる。それに加えて、タガントは、さまざまな他の有用なデータアイテムの任意の１つ以上を表すことが可能である。たとえば、タガントは、タグ付きの製品もしくはアイテムを製造した会社の名称および連絡先情報、製造日、製品もしくはアイテムの販売業者および／または意図された小売業者を表すデータをコードすることが可能である。タガントはまた、たとえば、限定されるものではないが、コンポーネントデータ、たとえば、アイテムに組み込まれたコンポーネントの供給元、または製品もしくはアイテムの製造に使用された製造プラントもしくは機械のアイデンティティー、製品もしくはアイテムが商業ストリーム中に置かれた日、販売業者による受取り日、および／または小売業者への配達日、ならびに任意の他の有用な商業データ、あるいは他のデータ、たとえば、カスタムメイドアイテムの所有者の個人情報などを表すことが可能である。データまたは表示の各要素は、タガント中に暗号化またはコード化することが可能であり、かつオブジェクトから回収されたタガントから解読したり、本明細書に記載の方法に従ってデコードまたは解読したりすることが可能である。次いで、デコードまたは解読されたデータを用いて、オブジェクトの性質を検証したり、またはオブジェクトを認証したり、または偽造アイテムを除外したりすることが可能である。
【００２５】
「ＰＣＲ」という用語は、ポリメラーゼ連鎖反応を意味する。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは、好熱性細菌（サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus））から最初に単離された熱安定性Ｔａｑポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、鋳型核酸配列を境界付ける特異的配列に相補的な短いプライマーオリゴヌクレオチド対を用いて、融解サイクル、再アニーリングサイクル、および重合サイクルによる温度サイクルを介して、鋳型核酸配列のコピー数を拡大するのに有用な増幅技術である。ＰＣＲとしては、ＤＮＡ鎖をコピーして元のＤＮＡ鎖のコピーを１００万個以上提供する標準的ＰＣＲ法（たとえば、PCR with Arbitrary Primers:Approach with Care.W.C.Black IV,Ins.Mol.Biol.2:1-6,Dec.2007を参照されたい）、ＰＣＲ産物の量を各サイクルでモニター可能なリアルタイムＰＣＲ技術（Real time quantitative PCR：C.A.Heid,J.Stevens,K.J.Livak and P.M.Williams,1996 Genome Research 6:986-994）、ＲＮＡを最初にＤＮＡにコピーした後でＤＮＡ鎖を標準的ＰＣＲ反応により増幅する逆転写ＰＣＲ（たとえば、Quantitative RT-PCR:Pitfalls and Potential:W.F.Freeman,S.J.Walker and K.E.Vrana;BioTechniques 26:112-125,January 1999を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
本明細書で用いられる「モノマー」という用語は、１つ以上の他のエンティティーに共有結合してオリゴマーまたはポリマーを形成可能な任意の化学エンティティーを意味する。「モノマー」の例としては、ヌクレオチド、アミノ酸、糖、アミノ酸などが挙げられる。
【００２７】
「核酸」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドでありうるヌクレオチドで構成されたポリマーを意味する。この化合物は、天然のまたは合成により生成されたデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドでありうる。合成により生成された核酸は、天然に存在する配列または非天然のユニークな配列でありうる。
【００２８】
「リボ核酸」および「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチドで構成されたポリマーを意味する。「デオキシリボ核酸」および「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボヌクレオチドで構成されたポリマーを意味する。
【００２９】
「ヌクレオチド」という用語は、窒素含有塩基、通常、デオキシリボヌクレオチドの場合、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、またはチミン（Ｔ）、および通常、リボヌクレオチドの場合、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、またはウラシル（Ｕ）に共有結合された糖リン酸、通常、リボース−５’−リン酸または２’−デオキシリボース−５’−リン酸を含むモノマー単位を意味する。
【００３０】
本明細書で用いられる「オリゴヌクレオチド」という用語は、共有結合によりヌクレオチドモノマーで構成された２〜約２０ヌクレオチド長の鎖を形成する一本鎖または二本鎖のポリマーを意味する。
【００３１】
本明細書で用いられる「ポリヌクレオチド」という用語は、共有結合によりヌクレオチドモノマーで構成された一般的には約２０ヌクレオチド長よりも長い鎖を形成する一本鎖または二本鎖のポリマーを意味する。
【００３２】
天然に存在する配列を有する核酸は、配列特異的に核酸にハイブリダイズすることが可能である。すなわち、それらは、ハイブリダイゼーション反応に関与することが可能であり、その際、相補的塩基対Ａ：Ｔ（アデニン：チミン）およびＧ：Ｃ（グアニン：シトシン）が、まとめてワトソン・クリック塩基対形成相互作用として知られる、各鎖の平面状近接塩基間の分子間（または分子内）水素結合およびπ電子を介する協同的スタッキング相互作用を形成する。核酸鎖の塩基はまた、ハイブリダイズしていわゆる「揺らぎ」相互作用により非ワトソン・クリック塩基対を形成することが可能であり、その際、通常のワトソン・クリック塩基対形成相互作用よりも低い結合エネルギーであるが、Ｇ（グアニン）がＵ（ウラシル）と対合するか、または他の選択肢として、Ｉ（イノシン）がＣ（シトシン）、Ｕ（ウラシル）、もしくはＡ（アデニン）と対合する。
【００３３】
「同定可能配列」または「検出可能配列」という用語は、同定される標的ヌクレオチド配列との特異的相互作用を行うように設計されたプライマーまたはプローブによるハイブリダイゼーションおよび／またはＰＣＲ技術により検出可能なヌクレオチド配列を意味する。標的ヌクレオチド配列と特異的プローブまたはプライマーとの相互作用は、標的ヌクレオチド配列の存在を決定する光学的および／または視覚的手段により検出可能である。
【００３４】
一実施形態では、本発明は、ＤＮＡおよびフルオロフォアを種々の基質に結合可能な方法を提供する。この方法を用いれば、ＤＮＡを材料に結合することが可能であり、すべての種類の仕上げプロセス、たとえば、洗浄およびクリーニングに耐えることが可能であり、しかも安全に取り出して製品を認証することが可能である。いくつかの方法により認証を行うことが可能である。一方法は、フルオロフォアを製品に添加することを含む。こうすると、ＵＶ光によりフルオロフォアの存在を検出しうるので、迅速な同定が可能になる。他の認証方法は、化学リンカーを介してＤＮＡを基材に結合することを含む。リンカーは、多くの場合、末端に反応性官能基を有する炭素原子鎖を含む。この反応性官能基を活性化させて、利用可能な基、基材、またはマーキングされる製品に共有結合することが可能である。製品に結合されたこのＤＮＡは、特定の製品に特有であるので、そのフィンガープリントとして機能し、認証を可能にする。製品の蛍光が第１のレベルの保護であり、かつＤＮＡが複製できない第２のユニークな限定層であれば、これらの方法の組合せは、フールプルーフ同定方法を形成するであろう。
【００３５】
一実施形態では、本発明は、本質的にコピーできないかつ種々の化学処理およびテキスタイル処理に耐える植物ＤＮＡマーカーのSigNature（登録商標）ＤＮＡ（Applied DNA Sciences, Stony Brook, NY）を提供する。接着を確保するために、天然繊維および合成繊維の両方ならびに他のアモルファス材料、たとえば、ウール、コットン、ポリエステル、たとえば、ナイロン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）などにしっかりと結合されるようにSigNature（登録商標）ＤＮＡを配合した。テキスタイル製品のマーキングにいかなる追加の工程も必要とすることなく、これらのテキスタイル布を製造プロセス時にSigNature（登録商標）ＤＮＡでマーキングすることが可能である。概念実証として、標準的プロトコルを用いて種々のウール糸および布を仕上げ、以下の実施例に記載されるように販売時点でのSigNature（登録商標）ＤＮＡの残存率を調べた。試験したすべてのテキスタイルで、SigNature（登録商標）ＤＮＡを回収し、製品を法科学的に認証した。こうして、テキスタイル製品をSigNature（登録商標）ＤＮＡでマーキングすることにより、ＤＮＡレベルでテキスタイル製品をマーキングし、ブランド付けし、かつ法科学的に認証する経済的で信頼性のある安全な方法を提供することが可能である。
【００３６】
本発明を示す例として本発明の実施形態を以下に列挙するが、これらに限定されるものではなく、当業者には自明であろうが、これらは、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【００３７】
例示的実施形態は、オブジェクトの外観を乱すことなくオブジェクトからのタガントの回収率を増加させる方法を提供する。本発明のいくつかの例示的実施形態を以下で詳細に説明する。
【００３８】
本発明の例示的実施形態はまた、活性化ＤＮＡタガントを結合すべくオブジェクト上または液体中に取り込まれたタガントを用いてオブジェクトを認証する方法を提供する。
【００３９】
たとえば、本発明の例示的実施形態は、オブジェクトからのタガントの回収率を増加させる方法を提供する。本方法は、オブジェクトまたは表面に活性化ＤＮＡタガントを結合すべくオブジェクトの表面上または液体中にＤＮＡタガントを取り込むことを含む。
【００４０】
アルカリ金属
アルカリ金属は、元素のリチウム（Ｌｉ）、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、ルビジウム（Ｒｂ）、セシウム（Ｃｓ）、およびフランシウム（Ｆｒ）からなる周期表の第Ｉ族のメンバーである。周期表のこれらのアルカリ金属は、類似の化学特性を呈する元素である。
【００４１】
周期表の第Ｉ族元素のアルカリ金属のメンバーは、それらの化学特性に関与するそれらの電子配置に基づいて一系列に配置される。
【００４２】
第Ｉ族のアルカリ金属の最初の５つの各メンバー、すなわち、リチウム（Ｌｉ）、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、ルビジウム（Ｒｂ）、およびセシウム（Ｃｓ）の化学は、十分に確立されている。フランシウムは、放射能があるため特別な対策をとらなければならないので、その化学は、十分に確立されておらず、したがって、その性質は、それほど十分に特徴付けられていない。
【００４３】
【表１】
2016521129.tif 000003
【００４４】
原子番号は、核１個あたりのプロトン数に対応し、電子殻中の電子の全数に等しい。
【００４５】
アルカリ金属はまた、水と反応して強アルカリの水酸化物を形成するため、十分注意して取り扱わなければならない。アルカリ金属は、その  が少なく、丁度１個の電子を失うことにより貴ガス配置を達成できるので、周期表のそれぞれの周期で最も低い第１イオン化エネルギーを有する。すべてのアルカリ金属の第２イオン化エネルギーは、同様に核のより近くが完全殻状態であるので、非常に高い。したがって、それらは、ほとんどの場合、１個の電子を失って陽イオンを形成する。
【００４６】
Ｌｉ＋陽イオンは、小さくかつその反対荷電の陰イオンを分極してその化合物をより共有結合性にするので、リチウムの化学は、その族の残りのものといくつかの差異を示す。水酸化リチウムは、潮解性でないただ１つのアルカリ金属水酸化物である。フランシウムもまた、いくつかの差異を示すと予測される。なぜなら、その原子量が大きいので、その電子が光にかなり近い速度で移動し、相対論的効果がより顕在化するからである。アルカリ金属の電気陰性度およびイオン化エネルギーは、リチウムからセシウムまで連続して減少するが、最後のアルカリ金属のフランシウムの電気陰性度およびイオン化エネルギーは、７ｓ電子の安定化ならびにセシウム原子およびフランシウム原子の相対原子半径に起因して、セシウムよりもわずかに高いと計算される。
【００４７】
水酸化物陰イオンは、化学式：ＯＨ−を有する。それは、共有結合により保持一体化された酸素原子および水素原子からなり、負電荷を有する。それは、水の重要な成分である。それは、触媒として、配位子、求核剤、および塩基として機能する。水酸化物イオンは、塩を形成し、塩の一部は、水性溶液中で解離して、溶媒和された水酸化物イオンを遊離する。
【００４８】
有機化学では、水酸化物イオンは、触媒としてまたは求核試薬として作用可能である。ヒドロキシル（ＯＨ）基は、アルコール、フェノール、カルボン酸、および関連官能基に存在する。
【００４９】
水は、その成分イオンと平衡状態にある。
［Ｈ２Ｏ］＜＝＞［Ｈ＋］＋［ＯＨ−］
【００５０】
水は、１０−７Ｍの濃度の［Ｈ＋］イオンを含有する。これは、対数スケールで７．０のｐＨを有する水として表される。
【００５１】
強アルカリは、ほとんど完全に解離される。したがって、強アルカリの水酸化ナトリウムは、水性溶液中で本質的に完全に解離される。
［ＮａＯＨ］＝＞［Ｎａ＋］＋［ＯＨ−］
【００５２】
水は、部分的にしか解離されず、式： 
【数１】
2016521129.tif 000004
に従って一定の解離定数Ｋを有する。
【００５３】
したがって、ＯＨ−イオンの濃度が増加すると、共有結合して水分子を生成することにより、Ｈ＋イオンの濃度が低下する。この式を用いて、［Ｈ＋］の濃度ひいては水酸化ナトリウム溶液のｐＨを容易に推定することが可能である。
【００５４】
１．０Ｍ  ＮａＯＨは、１０−１４Ｍの［Ｈ＋］イオンを含有する。すなわち、１４．０のｐＨを有する。
【００５５】
０．１Ｍ  ＮａＯＨは、１０−１３Ｍの［Ｈ＋］イオンを含有する。すなわち、１３．０のｐＨを有する。
【００５６】
０．０１Ｍ  ＮａＯＨは、１０−１２Ｍの［Ｈ＋］イオンを含有する。すなわち、１２．０のｐＨを有する。
【００５７】
０．００１Ｍ  ＮａＯＨは、１０−１１Ｍの［Ｈ＋］イオンを含有する。すなわち、１１．０のｐＨを有する。
【００５８】
０．０００１Ｍ  ＮａＯＨは、１０−１０Ｍの［Ｈ＋］イオンを含有する。すなわち、１０．０のｐＨを有する。
【００５９】
０．００００１Ｍ  ＮａＯＨは、１０−９Ｍの［Ｈ＋］イオンを含有する。すなわち、９．０のｐＨを有する。他の場合も同様である。
【００６０】
生物の細胞からのＤＮＡのアルカリ抽出は、ＤＮＡのアルカリ安定性の利点を生かしている。細胞膜をアルカリ処理により破壊すると、細胞内容物が放出され、二本鎖の核ＤＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡが融解して一本鎖ＤＮＡ形が放出される。これらのＤＮＡ鎖は、容易に再ハイブリダイズして、アルカリ処理細胞環境から単離可能なそれらの二本鎖螺旋構造に素早く戻る。
【００６１】
驚くべきことに、単離されたＤＮＡのアルカリ処理はまた、共有結合するようにＤＮＡを活性化することを、本発明者らは発見した。理論により拘束することを望むものではないが、アルカリ条件は、ＤＮＡ鎖の３’末端の遊離ヒドロキシルのイオン化をもたらすと考えられる。ＤＮＡの３’末端に生成された負荷電−Ｏ−基は、強求核剤であり、正荷電基と反応して安定な共有結合を形成し、安定にＤＮＡに結合する。
【００６２】
本発明は、デオキシリボ核酸を基材に結合する方法を提供する。本方法は、デオキシリボ核酸をアルカリ条件に暴露することと、デオキシリボ核酸を基材に接触させることと、を含む。基材に結合されたＤＮＡは、ハイブリダイゼーションプローブによる結合、ＰＣＲ増幅、およびＤＮＡ配列決定方法に利用可能である。
【００６３】
一実施形態では、アルカリ条件は、デオキシリボ核酸と、高ｐＨを有するアルカリ溶液と、を混合することにより生成され、たとえば、アルカリ溶液のｐＨは、約９．０以上のｐＨ、または約１０．０以上のｐＨ、または約１１．０以上のｐＨ、さらには約１２．０以上のｐＨでありうる。また、アルカリ条件に暴露されたデオキシリボ核酸は、基材に接触される。一実施形態では、アルカリ溶液は、アルカリ金属の水酸化物の溶液である。
【００６４】
本発明の他の実施形態は、デオキシリボ核酸を基材に結合する方法を提供する。本方法は、デオキシリボ核酸をアルカリ条件に暴露することであって、アルカリ条件が、デオキシリボ核酸とアルカリ溶液とを混合することにより生成される、暴露することと、アルカリ条件に暴露されたデオキシリボ核酸を基材に接触させることと、を含み、アルカリ溶液は、アルカリ金属の水酸化物の溶液であり、かつアルカリ金属は、リチウム（Ｌｉ）、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、およびルビジウム（Ｒｂ）からなる群から選択される。
【００６５】
本発明の他の実施形態は、デオキシリボ核酸を基材に結合する方法を提供する。本方法は、デオキシリボ核酸をアルカリ条件に暴露することであって、アルカリ条件が、デオキシリボ核酸とアルカリ溶液とを混合することにより生成される、暴露することと、アルカリ条件に暴露されたデオキシリボ核酸を基材に接触させることと、を含み、アルカリ溶液は、アルカリ金属水酸化物の溶液であり、かつアルカリ金属水酸化物は、水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、および水酸化セシウム（ＣｓＯＨ）からなる群から選択される。一実施形態では、アルカリ金属水酸化物は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）である。
【００６６】
本発明の他の実施形態は、デオキシリボ核酸を基材に結合する方法を提供する。本方法は、デオキシリボ核酸をアルカリ条件に暴露することと、アルカリ条件に暴露されたデオキシリボ核酸を基材に接触させることと、を含み、アルカリ条件は、デオキシリボ核酸とアルカリ金属水酸化物溶液とを混合することにより生成され、アルカリ金属水酸化物溶液は、約１ｍＭ〜約１．０Ｍの濃度を有する。
【００６７】
本発明の他の実施形態は、デオキシリボ核酸を基材に結合する方法を提供する。本方法は、デオキシリボ核酸をアルカリ条件に暴露することと、アルカリ条件に暴露されたデオキシリボ核酸を基材に接触させることと、を含み、アルカリ条件は、デオキシリボ核酸とアルカリ金属水酸化物溶液とを混合することにより生成され、アルカリ金属水酸化物溶液は、約１０ｍＭ〜約０．９Ｍの濃度を有する。
【００６８】
本発明の他の実施形態は、デオキシリボ核酸を基材に結合する方法を提供する。本方法は、デオキシリボ核酸をアルカリ条件に暴露することと、アルカリ条件に暴露されたデオキシリボ核酸を基材に接触させることと、を含み、アルカリ条件は、デオキシリボ核酸とアルカリ金属水酸化物溶液とを混合することにより生成され、アルカリ金属水酸化物溶液は、約０．１ｍＭ〜約０．８Ｍの濃度を有する。
【００６９】
本発明の他の実施形態は、デオキシリボ核酸を基材に結合する方法を提供する。本方法は、デオキシリボ核酸をアルカリ条件に暴露することと、アルカリ条件に暴露されたデオキシリボ核酸を基材に接触させることと、を含み、アルカリ条件は、デオキシリボ核酸とアルカリ金属水酸化物溶液とを混合することにより生成され、アルカリ金属水酸化物溶液は、約０．４ｍＭ〜約０．８Ｍの濃度を有する。
【００７０】
本発明の他の実施形態は、デオキシリボ核酸を基材に結合する方法を提供する。本方法は、デオキシリボ核酸をアルカリ条件に暴露することと、アルカリ条件に暴露されたデオキシリボ核酸を基材に接触させることと、を含み、アルカリ条件は、デオキシリボ核酸とアルカリ金属水酸化物溶液とを混合することにより生成され、アルカリ金属水酸化物溶液は、約０．６Ｍの濃度を有する。
【００７１】
本発明の他の実施形態は、デオキシリボ核酸を基材に結合する方法を提供する。本方法は、デオキシリボ核酸をアルカリ条件に暴露することと、アルカリに暴露されたデオキシリボ核酸を基材に接触させることと、を含み、アルカリ条件を生成するために、デオキシリボ核酸は、約９．０〜約１４．０のｐＨを有するアルカリ溶液と混合され、約０℃〜約６５℃の温度でインキュベートされる。
【００７２】
本発明の他の実施形態は、デオキシリボ核酸を基材に結合する方法を提供する。本方法は、デオキシリボ核酸をアルカリ条件に暴露することと、アルカリに暴露されたデオキシリボ核酸を基材に接触させることと、を含み、アルカリ条件を生成するために、デオキシリボ核酸は、約９．０〜約１４．０のｐＨを有するアルカリ溶液と混合され、約５℃〜約５５℃の温度でインキュベートされる。
【００７３】
本発明の他の実施形態は、基材へのデオキシリボ核酸の結合を増加させる方法を提供する。本方法は、デオキシリボ核酸をアルカリ条件に暴露することと、アルカリに暴露されたデオキシリボ核酸を基材に接触させることと、を含み、アルカリ条件を生成するために、デオキシリボ核酸は、約９〜約１４のｐＨを有するアルカリ溶液と混合され、約１０℃〜約４５℃の温度でインキュベートされる。
【００７４】
本発明の他の実施形態は、基材へのデオキシリボ核酸の結合を増加させる方法を提供する。本方法は、デオキシリボ核酸をアルカリ条件に暴露することと、アルカリに暴露されたデオキシリボ核酸を基材に接触させることと、を含み、アルカリ条件を生成するために、デオキシリボ核酸は、約９〜約１４のｐＨを有するアルカリ溶液と混合され、約１５℃〜約３５℃の温度でインキュベートされる。
【００７５】
本発明の他の実施形態は、デオキシリボ核酸を基材に結合する方法を提供する。本方法は、デオキシリボ核酸をアルカリ条件に暴露することと、アルカリ条件に暴露されたデオキシリボ核酸を基材に接触させることと、を含み、アルカリ条件は、デオキシリボ核酸とアルカリ金属水酸化物溶液とを混合して、混合物を約０℃〜約６５℃の温度でインキュベートすることにより生成される。
【００７６】
本発明の他の実施形態は、デオキシリボ核酸を基材に結合する方法を提供する。本方法は、デオキシリボ核酸をアルカリ条件に暴露することと、アルカリ条件に暴露されたデオキシリボ核酸を基材に接触させることと、を含み、アルカリ条件は、デオキシリボ核酸とアルカリ金属水酸化物溶液とを混合して、混合物を約１５℃〜約２２℃の温度でインキュベートすることにより生成される。
【００７７】
他の実施形態では、本発明は、デオキシリボ核酸を基材に結合する方法を提供する。本方法は、デオキシリボ核酸をアルカリ条件に暴露することと、アルカリ条件に暴露されたデオキシリボ核酸を基材に接触させることと、を含み、アルカリ条件は、デオキシリボ核酸と、約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの濃度を有するアルカリ金属水酸化物溶液と、を混合して、混合物を約１０℃〜約４５℃の温度で約１分間〜約６時間にわたりインキュベートすることにより生成される。
【００７８】
他の実施形態では、本発明は、デオキシリボ核酸を基材に結合する方法を提供する。本方法は、デオキシリボ核酸をアルカリ条件に暴露することと、アルカリ条件に暴露されたデオキシリボ核酸を基材に接触させることと、を含み、アルカリ条件を生成するために、デオキシリボ核酸と、約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの濃度を有するアルカリ金属水酸化物溶液と、を混合して、混合物を約１５℃〜約２５℃の温度で約１分間〜約６時間にわたりインキュベートすることにより、アルカリ条件を生成する。
【００７９】
他の実施形態は、デオキシリボ核酸を基材に結合する方法を提供する。本方法は、デオキシリボ核酸をアルカリ条件に暴露することと、アルカリ条件に暴露されたデオキシリボ核酸を基材に接触させることと、を含み、アルカリ条件は、デオキシリボ核酸と、約０．６Ｍの濃度を有するアルカリ金属水酸化物溶液と、を混合して、混合物を約１５℃〜約３５℃の温度で約１分間〜約６時間にわたりインキュベートすることにより生成される。
【００８０】
他の実施形態は、デオキシリボ核酸を基材に結合する方法を提供する。本方法は、デオキシリボ核酸をアルカリ条件に暴露することと、アルカリ条件に暴露されたデオキシリボ核酸を基材に接触させることと、を含み、アルカリ条件を生成するために、デオキシリボ核酸と、約０．６Ｍの濃度を有するアルカリ金属水酸化物溶液と、を混合して、混合物を約１８℃〜約２２℃の温度で約１０分間〜約２時間にわたりインキュベートすることにより、アルカリ条件を生成する。
【００８１】
一実施形態では、本発明は、デオキシリボ核酸を基材に結合する方法を提供する。本方法は、デオキシリボ核酸をアルカリ条件に暴露することであって、アルカリ条件が、デオキシリボ核酸と、高ｐＨを有するアルカリ溶液と、を混合し、混合物をインキュベートし、次いで、アルカリ溶液を中和することにより生成される、暴露することと、アルカリ条件に暴露されたデオキシリボ核酸を含有する中和された溶液を基材に接触させることと、を含む。一実施形態では、アルカリ溶液は、リチウム（Ｌｉ）、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、およびルビジウム（Ｒｂ）からなる群から選択されるアルカリ金属の水酸化物の溶液である。
【００８２】
他の実施形態では、本発明は、デオキシリボ核酸を基材に結合する方法を提供する。本方法は、デオキシリボ核酸をアルカリ条件に暴露することと、アルカリ条件に暴露されたデオキシリボ核酸を基材に接触させることと、を含み、アルカリ条件は、デオキシリボ核酸とアルカリ金属水酸化物溶液とを混合して、モル過剰のポリイオンポリマーを添加することにより生成される。
【００８３】
ポリイオンポリマーは、任意の好適なポリイオンポリマーでありうる。一実施形態では、ポリ陰イオンポリマーは、ポリアミノ酸である。ポリアミノ酸は、Ｌ−リシンなどの天然アミノ酸のホモポリマーまたはＤ−リシンなどの天然に存在しないアミノ酸のホモポリマーでありうる。一実施形態では、ポリアミノ酸ホモポリマーは、ポリプトレシン、ポリカダベリン、ポリスペルミジン、およびポリリシンからなる群から選択される。
【００８４】
他の選択肢として、他の実施形態では、アルカリ条件を生成するために、デオキシリボ核酸と任意の好適な高ｐＨ緩衝剤の溶液と混合することが可能である。高ｐＨ緩衝剤は、約９．０〜約１１．０の範囲内またはそれ以上のｐＫａを有する任意の好適な高ｐＨ緩衝剤でありうる。一実施形態では、高ｐＨ緩衝剤のｐＨは、たとえば、約９．０以上のｐＨ、約１０．０以上のｐＨ、または約１１．０以上のｐＨでありうる。たとえば、他の実施形態では、アルカリ条件を生成するために、デオキシリボ核酸と、約１０．０〜１１．４の有用なｐＨ範囲（２５℃）および約１０．７０のｐＫａ（２５℃）を有するＣＡＢＳ（４−［シクロヘキシルアミノ］−１−ブタンスルホン酸）  製品番号C5580  Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri、約９．７〜１１．１の有用なｐＨ範囲（２５℃）、約１０．５６のｐＫａ（２０℃）、約１０．４０のｐＫａ（２５℃）、および約１０．０２のｐＫａ（３７℃）を有するＣＡＰＳ（Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸）  Sigma Aldrich  製品番号C6070およびC2632、約９．０〜１０．５の有用なｐＨ範囲（２５℃）、約９．７０のｐＫａ（２５℃）を有するＡＭＰ（２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール）  Sigma Aldrich  製品番号A9199およびA9879、約８．９〜１０．３の有用なｐＨ範囲（２５℃）、約９．６０のｐＫａ（２５℃）、約９．４３のｐＫａ（３７℃で）を有するＣＡＰＳＯ（Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシル−３−アミノプロパンスルホン酸）  Sigma Aldrich  製品番号C2278およびC8085、約８．６０〜１０．０の有用なｐＨ範囲（２５℃で）、約９．５５のｐＫａ（２０℃）、約９．４９のｐＫａ（２５℃）、および約９．３６のｐＫａ（３７℃）を有するＣＨＥＳ（２−（Ｎシクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸）  Sigma Aldrich  製品番号C2885およびC8210、約８．３〜９．７の有用なｐＨ範囲（２５℃）、約９．００のｐＫａ（２５℃）、約９．１０のｐＫａ（３７℃）を有するＡＭＰＳＯ（３−［（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）  Sigma Aldrich  製品番号A6659およびA7585などの好適な高ｐＨ緩衝剤と、を混合することが可能である。
【００８５】
本発明の代表的な実施形態では、アルカリ条件に暴露されたデオキシリボ核酸は、液体組成物の成分として添加される。液体組成物は、任意の好適な液体組成物、たとえば、印刷インクなどでありうる。たとえば、一実施形態では、インクは、熱硬化エポキシ−アクリレートインク、たとえば、それぞれMarkem（登録商標）, Keene, NH製の製品番号4408Rまたは970シリーズTouch Dry（登録商標）ペレットでありうる。他の選択肢として、Dupont（登録商標）製のArtistri（登録商標）P5000+シリーズ−顔料インク、またはエポキシアクリレートインク、たとえば、Rahn USA Corp.製の製品番号00-988を使用することが可能である。
【００８６】
本発明に係るタガントとしては、たとえば、核酸タガントが挙げられる。核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）に対する一般用語であり、合成のもの、または動物、植物、細菌、ウイルス、菌類に由来するもの、または合成ベクター、または以上に列挙したいずれかの核酸の断片などでありうる。合成核酸は、動物、植物、細菌、菌類、ウイルス、もしくは任意の他の生物の天然に存在する核酸または合成ベクターの配列を有しうることに留意すべきである。他の選択肢として、合成核酸は、天然に見いだされないユニークな配列を有しうる。そのようなユニークな非天然配列は、天然に見いだされる一続きの配列を有しうるが、非天然配列全体は、ユニークであり、いずれの植物にも、動物にも、ウイルスにも、いずれの他の天然生物にも、見いだされないことを理解すべきである。特定的には、本発明に係るタガント中に暗号化またはコード化されるデータまたは表示の要素をコードする核酸配列は、ユニークな非天然配列であるので、対象となるオブジェクトの認証に使用するのに適している。
【００８７】
本発明に係るアルカリ処理により活性化された結合ＤＮＡとの組合せに有用なタガントは、任意の好適な検出可能タガントまたは追跡可能タガント、たとえば、化学的マーカーまたは生物学的マーカーでありうる。本発明に係る方法の実施形態では、タガントは、ＵＶフルオロフォア、セラミックＩＲマーカー、他のＤＮＡ、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、脂質、糖、多糖、フェロモン、香気剤、微量元素、希土類元素、またはそれらの任意の２つ以上の組合せから選択される。
【００８８】
本発明の実施形態では、タガントは、核酸を含む。一実施形態では、タガントは、ＤＮＡから本質的になり、同定または認証に有用な他の有意な成分を含まない。
【００８９】
他の選択肢としてまたは追加として、他のタガント、たとえば、紫外（ＵＶ）タガント、アップコンバートフォスファー（ＵＣＰ）赤外（ＩＲ）タガント、ＵＶマーカータガント、ＵＶフルオロフォアタガント、セラミックＩＲマーカータガント、タンパク質タガント、および／または微量元素タガントなどを、本発明に係る方法に従ってアルカリ処理により活性化されるデオキシリボ核酸タガントと組み合わせて使用することが可能である。例示的実施形態では、使用されるタガントは、たとえば、ＤＮＡタガントとＩＲアップコンバートフォスファー（ＵＣＰ）タガントとの組合せを含みうる。他の例示的実施形態では、使用されるタガントは、たとえば、ＤＮＡタガントとＩＲアップコンバートフォスファー（ＵＣＰ）タガントとＵＶタガントとの組合せを含みうる。たとえば、例示的実施形態では、ＩＲ（ＵＣＰ）タガントは、たとえば、グリーン、ブルー、またはレッド（ＵＣＰ）ＩＲタガント、たとえば、Boston Applied Technologies Inc. (Woburn, MA)製のグリーンＩＲマーカー、製品番号BPP-1069、ブルーＵＣＰ、製品番号BPP-1070、またはレッドＵＣＰ、製品番号BPP-1071などでありうる。
【００９０】
本発明に係る方法に従って可溶性タガントが溶解される溶液は、たとえば、水、ＴＥ緩衝剤（１０ｍＭトリス・ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）、トリス−グリシン緩衝剤、トリス−ＮａＣｌ緩衝剤、ＴＢＥ緩衝剤（トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ）、ＴＡＥ緩衝剤（トリス−酢酸−ＥＤＴＡ）、およびＴＢＳ緩衝剤（トリス−緩衝生理食塩水）、ＨＥＰＥＳ緩衝剤（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ緩衝剤（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ緩衝剤（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）、ＭＥＳ緩衝剤（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＰＢＰ緩衝剤（リン酸ナトリウム＋ＥＤＴＡ）、ＴＥＮ緩衝剤（トリス／ＥＤＴＡ／ＮａＣｌ）、ＴＢＳＴ緩衝剤（トリス−ＨＣｌ、ＮａＣｌ、およびTween 20）、ＰＢＳＴ緩衝剤（Tween 20を含むリン酸緩衝生理食塩水）、ならびに生物科学および化学科学で使用される多くの他の既知の緩衝剤のいずれかを含みうる。
【００９１】
本発明の例示的実施形態に係るデオキシリボ核酸タガントおよび任意選択の追加のタガントでマーキングされる対象となるオブジェクトは、たとえば、セラミック表面、プラスチックフィルム、ビニールシート、アンティーク、ジュエリーアイテム、識別カード、クレジットカード、磁気ストリップカード、描画、アートワーク、記念品、コレクター向けスポーツ用品、および他のコレクター向け用品を含む。次いで、これらのオブジェクトの認証は、その上に結合または共有結合されたタガントを、たとえば、以下にさらに詳細に記載される方法を用いて、同定することにより、検証可能である。
【００９２】
一実施形態では、アルカリ条件に暴露されたデオキシリボ核酸が結合される表面は、ポリマー、たとえば、いずれも市販品として容易に入手可能な、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ナイロン、またはポリプロピレン（ＰＰ）からなる群から選択されるポリマーで形成された、オブジェクトまたはアイテムの表面でありうる。
【００９３】
一実施形態では、本発明に係る方法は、本発明に係る方法に従ってアルカリ条件に暴露されたデオキシリボ核酸をオブジェクトに結合することをさらに含み、デオキシリボ核酸は、活性化デオキシリボ核酸がオブジェクトに化学結合されることにより、認証、追跡、および偽造防止の機能をオブジェクトに提供する。
【００９４】
オブジェクト上に適用されたアルカリ条件に暴露されたデオキシリボ核酸は、追跡可能デオキシリボ核酸タガントを提供する。追跡可能デオキシリボ核酸タガントは、同定、検証、認証されるオブジェクトの全部もしくは一部に適用可能であり、またはオブジェクトが商業アイテムである場合、アイテムは、商業ストリームを通る任意の時点で追跡可能である。
【００９５】
他の実施形態では、追跡可能デオキシリボ核酸は、オブジェクトに結合されたアルカリｐＨ活性化ＤＮＡでありうる。
【００９６】
他の実施形態では、アルカリｐＨ活性化ＤＮＡは、コットン、ウール、ナイロン、プラスチック、金属、ガラス、木材、印刷インク、および医薬粉末からなる群から選択される材料を含むオブジェクトに結合される。
【００９７】
他の実施形態では、アルカリｐＨ活性化ＤＮＡは、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリアミド、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリビニルクロリド（ＰＶＣ）、ポリスルホン、ポリビニルアセテート（ＰＶＡ）、ポリエステル（ＰＥＳ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ベンゾシクロブテン（ＢＣＢ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリビニリデンクロリド（ＰＶＤＣ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、高耐衝撃性ポリスチレン（ＨＩＰＳ）、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、フェノール化合物ホルムアルデヒド樹脂（ＰＦ）、メラミンホルムアルデヒド（ＭＦ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリエーテルケトンイミド、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリメチルペンテン（ＰＭＰ）、ポリエーテルケトン（ＰＥＫ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリフェニレンスルフィド（ＰＰＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、フルロポリマー(fluropolymer)、シリコーン、アイオノマー、成形可能エラストマー、エチレンビニルアルコール（ＥＶＯＨ）、メサロセン(methalocene)ポリマー、およびポリエチレンナフタレート材料からなる群から選択されるプラスチック材料に結合される。
【００９８】
一実施形態では、追跡可能デオキシリボ核酸でマーキングされたオブジェクトは、医薬錠剤、医薬カプセル剤、または医薬粉末剤を含む医薬組成物を含む。
【００９９】
本発明の他の例示的実施形態は、タガントが結合または共有結合されたオブジェクトを提供することと、ユニークな追跡可能デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）タガントを同定することにより、オブジェクトの同定、追跡、または認証の検証を行うべく、オブジェクトをサンプリングすることと、を含む、オブジェクトの認証方法を提供する。一実施形態では、ユニークなタガントは、ユニークなＤＮＡ配列を有するＤＮＡタガントであり、ユニークなＤＮＡ配列は、ユニークなＤＮＡ配列と、ユニークなタガントに結合または共有結合されたオブジェクトに対応するデータ要素と、をマッチングするデータベースに記憶される。結果的に、データベースは、タガントが検出されたタグ付きオブジェクトの位置決定、追跡、認証、およびアイデンティティーの検証を行うためにアクセス可能なコンピューター上に配置可能である。
【０１００】
以下に記載の実施例に有用なＤＮＡタガントは、任意の好適なＤＮＡタガントを含み、たとえば、一実施形態では、ＤＮＡタガントは、約４０塩基対〜約１０００塩基対の長さを有する二本鎖ＤＮＡオリゴマーなどである。他の実施形態では、ＤＮＡタガントは、約８０〜５００塩基対の長さを有する二本鎖ＤＮＡオリゴマーである。他の実施形態では、ＤＮＡタガントは、約１００〜約２５０塩基対の長さを有する二本鎖ＤＮＡオリゴマーである。他の選択肢として、ＤＮＡタガントは、任意の好適な長さ、たとえば、約４０塩基〜約１０００塩基、約８０〜５００塩基、または約１００〜約２５０塩基の一本鎖ＤＮＡでありうる。ＤＮＡタガントは、天然源から単離されているかまたは合成であるかにかかわらず、天然ＤＮＡでありうるか、またはＤＮＡタガントは、合成により生成された非天然配列でありうる。ＤＮＡの全部または一部分は、同定可能配列を含みうる。
【０１０１】
例示的な一実施形態では、ＤＮＡタガントは、任意の好適な検出および／または同定の方法、たとえば、タガント配列特異的核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション方法（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションＦＩＳＨを含む）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた増幅、たとえば、定量／リアルタイムＰＣＲ、およびさまざまな標準的な周知の方法のいずれかによる増幅配列（アンプリコン）の検出などにより、同定可能である。
【０１０２】
他の実施形態では、相補的配列にハイブリダイズ可能な特異的ヌクレオチド配列をそれぞれ有するＤＮＡプローブを用いて、ハイブリダイゼーションを行うことが可能である。ＤＮＡタガントに対する相補体を有するプローブのみが、相補的プローブのユニークな位置でハイブリダイズして検出シグナルを発生するように、アレイまたはマトリックスの各セルまたはウェルに１つずつ異なるプローブを含みうる。他の選択肢として、相補的プローブが、特定のパターンで配置された、いくつかのセルまたはウェル中に存在する場合、相補的ＤＮＡタガント配列とのハイブリダイゼーションは、アレイまたはマトリックス中の特異的プローブの精密なパターンで検出されるであろう。たとえば、ＰＣＲ同定方法では、核酸タガント、たとえば、オブジェクトから回収されたＤＮＡタガントは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅され、ゲル電気泳動により分割される。本発明に係る核酸タガントの配列は、ユニークかつタグ付きオブジェクトに特異的であるので、元の核酸は、ユニークなタガント配列の一部に相補的な特異的配列を有するプライマーを使用することによってのみ、増幅されるであろう。この手順を用いれば、調べられたオブジェクトが元の核酸を有する場合、タガントの元の核酸配列の一部と同一のあらかじめ決められたサイズおよび配列のアンプリコンを生成するように、ＰＣＲ手順により抽出核酸が増幅されるであろう。これとは対照的に、調べられたオブジェクトから回収されたサンプルが、認証オブジェクトに対応するユニークな核酸を含まない場合、増幅核酸産物は、おそらく、存在しないであろう。または、プライマーが、回収された核酸を増幅して１つ以上のランダムアンプリコンを生成する場合、これらの１つ以上のアンプリコンは、認証オブジェクトからのユニークなタガント核酸配列を有することができない。さらに、偽造物品に由来するランダムアンプリコンはまた、ランダムな長さであり、タガント特異的プライマーにより特定される厳密な長さのアンプリコンを産生する可能性は、無視できるほど小さい。したがって、ＰＣＲ産物のサイズを比較することにより、ラベル付きオブジェクトの認証を検証することが可能であり、非認証オブジェクトをスクリーニングして排除することが可能であるので、偽造防止スクリーニングの目的は達成される。
【０１０３】
任意の分子量または物理的寸法に基づく分離、たとえば、限定されるものではないが、任意の好適なマトリックス媒体、たとえば、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、または混合アガロース−ポリアクリルアミドゲルでのゲル電気泳動などを行った後、増幅アンプリコンの数およびアンプリコンの長さを決定することが可能であり、電気泳動分離は、スラブゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動により行われうる。
【０１０４】
他の選択肢として、アルカリ条件に暴露されて対象となるアイテムまたは表面に結合されたデオキシリボ核酸をＰＣＲに付すことが可能であり、ＰＣＲアンプリコンを回収して、周知の慣例的核酸配列決定技術に従って配列決定することが可能である。
【実施例】
【０１０５】
示された以下の実施例は、例示的なものにすぎないことが意図され、かつ本発明の例示的実施形態は、そこで述べられた条件または材料に限定されるものではないと、理解すべきである。
【０１０６】
以下の実施例により本発明の実施形態を例示する。ＤＮＡを活性化し、次いで、任意の溶液中または緩衝液中で混合し、そして表面上に適用して結合させることにより、特異的アルカリ活性化ＤＮＡ配列でマーキングすることが可能である。
【０１０７】
実施例１：ＤＮＡタガントのアルカリ活性化
使い捨てスナップキャップマイクロチューブ中で５０μＬの０．６Ｍ  ＮａＯＨ溶液（EMD Millipore Chemicals、ＡＣＳグレード）と混合して、室温で３０分間放置することにより、０．５ｍｇ／Ｌの濃度で二本鎖１９９塩基対ＤＮＡタガントを含有する５０マイクロリットルの担体核酸（脱イオン水中４０ｍｇ／ｍＬ）を活性化した。活性化核酸混合物は、必要に応じて希釈して、マーキングされるアイテムまたは物品に適用できる状態であった。
【０１０８】
実施例２：生綿のマーキングおよび認証
Gizaコットン品種86および88（Giza86およびGiza88）中のＤＮＡの内因性レベルを決定するために、コットンをクリーニングして外部デブリを除去し、全ＤＮＡを抽出してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅した。続いて、ADNAS所有権付きプロトコルに従って標準的キャピラリー電気泳動（ＣＥ）を用いてＤＮＡを解析した。予想どおり、ADNAS外因性マーカーＤＮＡは、これらの２つのサンプルで検出されなかった図１および２、パネル１）。
【０１０９】
後続の実験では、ADNAS外因性マーカーＤＮＡ（SigNature（登録商標）ＤＮＡとしても知られる）を配合し、テキスタイルに結合するように調整し、ジンニングプロセス時に生綿に適用した。コットンを乾燥させ（室温で約３０分間）、次いで、法科学的認証を提供するために、慣例的ＤＮＡ検出方法により試験した。ADNASマーカーＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応で増幅し、我々の所有権付き方法を用いて解析した。SigNature（登録商標）ＤＮＡは、Giza86およびGiza88の両方で強く検出された（図１および２、パネル２）。コットンへの吸着ＤＮＡと結合ＤＮＡとを識別するために、Giza86およびGiza88の両方を種々の水洗浄に付し、コットンをオーブン中で乾燥させ、次いで、第２ラウンドのＤＮＡ認証に付した。激しい水洗浄にもかかわらず、SigNature（登録商標）ＤＮＡは、配合物１および配合物２の両方から回収された（図１および２、パネル３および４）。
【０１１０】
実施例３：洗浄後のＤＮＡの取出し試験
以上に記載したようにGiza86コットンおよびGiza88コットンをSigNature（登録商標）ＤＮＡでマーキングした。ADNASマーカーＤＮＡがコットン繊維または天然コーティングワックスに結合されたかを調べるために、ワックスを溶解して除去することが知られる化学物質を用いてコットンを逐次洗浄に付した。第１の洗浄は、激しい水濯ぎからなっていた。第２の洗浄は、強力撹拌を行ってアルコールでコットンを洗浄することからなっていた。第３の逐次洗浄は、同様に強力撹拌を行って溶媒でコットンを洗浄することからなっていた。ADNASマーカーＤＮＡをＰＣＲ増幅し、我々の所有権付き方法を用いて解析した。簡潔に述べると、各洗浄後、すべてのサンプルでＤＮＡが検出されたことから、ADNASマークは、配合物１を用いて本来のコットン繊維にしっかりと結合されたことが示唆される（図３および４）。配合物２を用いて類似のデータが得られたことから（データは示されていない）、マーカーＤＮＡは、過酷な溶媒処理により除去されるコーティングワックスに結合されないことが示される。
【０１１１】
実施例４：ウール糸のマーキングおよび認証
リックローラーを用いてウール糸をSigNature（登録商標）ＤＮＡでマーキングした。次いで、マーキングされた糸を布の形態に織成して、プロ仕上げした。プロ仕上げは、洗毛、洗剤洗浄、水濯ぎ、酸処理、および最終乾燥からなっていた。１週間にわたる仕上げプロセスの終了時、布を認証し、SigNature（登録商標）ＤＮＡを回収した（図５、パネル１）。併行して、マーキングされていない糸も織成し、製造業者のプロセスに従って仕上げた。このマーキングされていない布をＤＮＡでマーキングされた布と同一の試験に付した。SigNature（登録商標）ＤＮＡは、マーキングされていない布では検出されなかった。SigNature（登録商標）ＤＮＡが布に永久的に結合されたことをさらに確証するために、仕上げ布をプロのドライクリーニング業者により１０回ドライクリーニングした。各サイクルの終了時、布のサンプルを切り取って認証した。SigNature（登録商標）ＤＮＡは、すべてのサンプルから回収されることが示された。そのほかに、回収されたSigNature（登録商標）ＤＮＡの量は、すべてのサンプルで同一ではないにしても類似していたことから、SigNature（登録商標）ＤＮＡは、これらの激しい一連の洗浄時に洗浄除去されなかったことが示唆される（図６）。
【０１１２】
実施例５：合成繊維のマーキングおよび認証
すべての他のアモルファス製品と同様に、繊維形成物質またはマスターバッチを押し出すことにより、ナイロンおよびポリエステルの合成糸を形成する。押出しプロセスは、マスターバッチを融点よりも高い温度に加熱してから材料を物理的に引っ張って糸を形成することを必要とする。引っ張られた糸をただちに冷水浴中に浸漬する。合成繊維をマーキングするために、ナイロン、ポリエステル、およびＰＥＴのマスターバッチをSigNature（登録商標）ＤＮＡと混合し、押出し、そしてポリエステルおよびナイロンからSigNature（登録商標）ＤＮＡで形成された糸またはＰＥＴマスターバッチから生成されたフィルムを認証した。SigNature（登録商標）ＤＮＡは、３つの製品のすべてから回収された。回収されたＤＮＡが押出し製品中に分散されていたかを確認するために、ナイロンおよびポリエステルの糸さらにはＰＥＴから生成されたフィルムを激しい洗浄に付し、次いで、SigNature（登録商標）ＤＮＡを回収して標準的プロトコルにより解析した。ナイロン糸（図７Ａ）、ポリエステル糸、およびＰＥＴから作製されたフィルム（図７Ｂ）を含めて、すべてのサンプルからSigNature（登録商標）ＤＮＡを回収し、以上に記載されるようにＰＣＲ認証プロセスで増幅した。SigNature（登録商標）ＤＮＡを添加しなかった陰性対照を併行して処理したが、増幅ピークを示さなかった（図７Ｃ）。
【０１１３】
実施例６：カシミヤのマーキングおよび認証
カシミヤをSigNature（登録商標）ＤＮＡでマーキングした。併行して、マーキングされていないカヒミヤ（cahmere）をＤＮＡでマーキングされたカシミヤと同一の試験に付した。SigNature（登録商標）ＤＮＡは、マーキングされたカシミヤサンプルでは検出されたが（図８Ｂ）、マーキングされていないカヒミヤ(cahmere)では検出されなかった（図８Ｂ）。SigNature（登録商標）ＤＮＡがカシミヤに永久的に結合されたことをさらに確証するために、マーキングされたカシミヤをプロのドライクリーニング業者により３回ドライクリーニングした。各サイクルの終了時、カシミヤのサンプルを切り取って認証した。SigNature（登録商標）ＤＮＡは、ＤＮＡでマーキングされたすべてサンプルから回収されることが示された（図９）。
【０１１４】
実施例７：印刷インクを用いたアルカリ活性化ＤＮＡの組込み
以上の実施例１に記載されるようにＤＮＡを活性化した。活性化ＤＮＡを標準的緩衝液、たとえば、ＴＥ（トリス．ＨＣＬ  ｐＨ７．４）、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸）、またはＴＢＥ緩衝液（トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ）で希釈し、次いで、印刷インクと混合した。次いで、混合物をパドルブレンドし、オブジェクト、アイテム、文書などに印刷し、次いで、硬化させた（たとえば、高強度水銀ランプ下で加熱することにより）。次いで、任意の好適な溶媒、たとえば、ＭＥＫ、ＥｔＯＨ、ＭＥＫ、エーテル、アセトンなど、または任意の好適な水性緩衝液、たとえば、ＴＥ（トリス．ＨＣＬ  ｐＨ７．４）、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｎ−（−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸）、ＴＢＥ緩衝剤（トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ）など、を含むコットンスワブを用いて、ＤＮＡを含む硬化されたインクをサンプリングし、そして印刷表面を横切って拭き取った。ＤＮＡのサンプルをスワブにより取得し、次いで、以上に記載されるように標準的ＰＣＲ手順によりＤＮＡを認証する。
【０１１５】
実施例８：医薬粉末剤へのアルカリ活性化ＤＮＡの組込み
以上の実施例１に記載されるようにＤＮＡを活性化した。標準的緩衝液、たとえば、ＴＥ（トリス．ＨＣＬ  ｐＨ７．４）、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸）、ＴＢＥ緩衝液（トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ）などに活性化ＤＮＡを希釈し、次いで、活性医薬組成物と１種以上の賦形剤との混合物を含む粉末剤と混合する。次いで、任意の好適な方法により、たとえば、空気ストリーム中で加熱することにより、活性化ＤＮＡを含む粉末を乾燥させる。乾燥粉末をサンプリングし、乾燥粉末のサンプルと、任意の好適な溶媒、たとえば、ＭＥＫ、ＥｔＯＨ、ＭＥＫ、エーテル、アセトンなど、または任意の好適な水性緩衝液、たとえば、ＴＥ（トリス．ＨＣＬ  ｐＨ７．４）、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸）、ＴＢＥ緩衝液（トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ）などと、を混合することにより、乾燥粉末に関連付けられたＤＮＡを認証のために取り出す。次いで、以上に記載されるように標準的ＰＣＲ手順により、取り出されたＤＮＡを認証する。
【０１１６】
実施例９：錠剤へのＤＮＡコーティング粉末の圧縮
実施例４のように調製された活性化ＤＮＡ溶液を含む乾燥粉末を錠剤の形態に圧縮する。たとえば、錠剤の一部を擦取、切断、研磨、または削取してサンプルを捕集することにより、認証のためにＤＮＡを取り出す。次いで、以上に記載されるように標準的ＰＣＲ手順により、錠剤から捕集されたＤＮＡサンプルを認証する。
【０１１７】
実施例１０：医薬錠剤上への活性化ＤＮＡのコーティング
以上の実施例１に記載されるようにＤＮＡを活性化した。標準的緩衝液、たとえば、ＴＥ（トリス．ＨＣＬ  ｐＨ７．４）、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸）、ＴＢＥ緩衝液（トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ）などに活性化ＤＮＡを希釈し、次いで、活性物質と賦形剤とを含む錠剤上にコーティングする。次いで、任意の好適な方法により、たとえば、空気ストリーム中で加熱することにより、活性化ＤＮＡを含むコーティング錠剤を乾燥させる。たとえば、錠剤の一部を擦取、切断、研磨、または削取することにより、ＤＮＡを取得する。他の選択肢として、任意の好適な溶媒、たとえば、ＭＥＫ、ＥｔＯＨ、ＭＥＫ、エーテル、アセトンなど、または任意の好適な水性緩衝液、たとえば、ＴＥ（トリス．ＨＣＬ  ｐＨ７．４）、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸）、ＴＢＥ緩衝液（トリス−ホウ酸塩−ＥＤＴＡ）など、で湿らせたスワブを用いて錠剤を拭き取ることにより、認証のためにＤＮＡを取得する。他の選択肢として、好適な溶媒または好適な緩衝液、たとえば、この実施例で以上にすでに述べたものなどで湿らせた布を用いて錠剤を払拭することにより、認証のためにＤＮＡを取得する。次いで、以上に記載されるようにＰＣＲ手順により、錠剤から捕集されたＤＮＡサンプルを認証する。
【０１１８】
実施例１１：医薬カプセル剤を用いた活性化ＤＮＡの組込み
次いで、実施例４で調製された活性化ＤＮＡ溶液を含む粉末をカプセル中にカプセル化する。カプセルを穿刺または切断して開放し、その中の粉末をサンプリングし、粉末のサンプルと、任意の好適な溶媒、たとえば、ＭＥＫ、ＥｔＯＨ、ＭＥＫ、エーテル、アセトンなど、または任意の好適な水性緩衝液、たとえば、ＴＥ（トリス．ＨＣＬ  ｐＨ７．４）、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸）、ＴＢＥ緩衝液（トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ）などと、を混合することにより、認証のためにカプセル中のＤＮＡを取り出す。次いで、以上に記載されるように標準的ＰＣＲ手順により、カプセル剤から取り出されたＤＮＡを認証する。
【０１１９】
実施例１２：同定表示を用いたアルカリ活性化ＤＮＡの組込み
以上の実施例１に記載されるようにＤＮＡを活性化した。標準的緩衝液、たとえば、ＴＥ（トリス．ＨＣＬ  ｐＨ７．４）、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸）、ＴＢＥ緩衝液（トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ）などに活性化ＤＮＡを希釈し、ＤＮＡ溶液を同定表示上にスプレーすることにより同定表示（たとえば、アイテムに固着されたラベル、ロゴ、またはバッジ）に適用する。他の選択肢として、ＤＮＡ溶液中に同定表示を浸漬することにより、ＤＮＡ溶液を同定表示に適用する。次いで、好適な方法により、たとえば、ヒートランプ下で加熱することにより、または空気ストリーム中で乾燥させることにより、ＤＮＡを含む同定表示上のコーティングを乾燥させる。任意の好適な溶媒、たとえば、ＭＥＫ、ＥｔＯＨ、ＭＥＫ、エーテル、アセトンなど、または任意の好適な水性緩衝液、たとえば、ＴＥ（トリス．ＨＣＬ  ｐＨ７．４）、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸）、ＴＢＥ緩衝液（トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ）など、で湿らせたスワブを用いて同定表示を拭き取ることにより、認証のために同定表示中のＤＮＡを取り出す。好適な溶媒または好適な緩衝液、たとえば、この実施例で以上にすでに述べたものに同定表示を浸漬することにより、ＤＮＡを同定表示から取り出して認証する。他の選択肢として、同定表示の一部を擦取、切断、研磨、または削取してサンプルを捕集することにより、ＤＮＡを表示から捕集する。次いで、以上に記載されるように標準的ＰＣＲ手順を実施することにより、取り出されたＤＮＡを認証する。
【０１２０】
本明細書に引用された米国特許および参照文献（それらの全開示が参照により本明細書に組み込まれる）を考慮すれば、本発明の全範囲が分かるであろう。
【０１２１】
本発明の例示的実施形態を説明してきたが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲の境界により規定される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、種々の変更を加えうることは容易に分かるであろうことに、さらに留意されたい。
【図１Ａ】
2016521129.tif 000005
【図１Ｂ】
2016521129.tif 000006
【図１Ｃ】
2016521129.tif 000007
【図１Ｄ】
2016521129.tif 000008
【図２Ａ】
2016521129.tif 000009
【図２Ｂ】
2016521129.tif 000010
【図２Ｃ】
2016521129.tif 000011
【図２Ｄ】
2016521129.tif 000012
【図３Ａ】
2016521129.tif 000013
【図３Ｂ】
2016521129.tif 000014
【図３Ｃ】
2016521129.tif 000015
【図３Ｄ】
2016521129.tif 000016
【図４Ａ】
2016521129.tif 000017
【図４Ｂ】
2016521129.tif 000018
【図４Ｃ】
2016521129.tif 000019
【図４Ｄ】
2016521129.tif 000020
【図５Ａ】
2016521129.tif 000021
【図５Ｂ】
2016521129.tif 000022
【図６Ａ】
2016521129.tif 000023
【図６Ｂ】
2016521129.tif 000024
【図６Ｃ】
2016521129.tif 000025
【図６Ｄ】
2016521129.tif 000026
【図６Ｅ】
2016521129.tif 000027
【図７Ａ】
2016521129.tif 000028
【図７Ｂ】
2016521129.tif 000029
【図７Ｃ】
2016521129.tif 000030
【図８Ａ】
2016521129.tif 000031
【図８Ｂ】
2016521129.tif 000032
【図９】
2016521129.tif 000033
【手続補正書】
【提出日】平成28年3月24日(2016.3.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デオキシリボ核酸を基材に結合する方法であって、
前記デオキシリボ核酸をアルカリｐＨに暴露することと、
前記アルカリに暴露されたデオキシリボ核酸を前記基材に接触させることと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記デオキシリボ核酸を暴露することが、前記デオキシリボ核酸と、約９．０〜約１４．０の範囲内のｐＨを有するアルカリ溶液と、を混合することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アルカリ溶液が高ｐＨ緩衝剤の溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記高ｐＨ緩衝剤が、ＣＡＢＳ（４−［シクロヘキシルアミノ］−１−ブタンスルホン酸）、ＣＡＰＳ（Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸）、ＡＭＰ（２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール）、ＣＡＰＳＯ（Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシル−３−アミノプロパンスルホン酸）、ＣＨＥＳ（２−（Ｎシクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸）、ＡＭＰＳＯ（３−［（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、およびそれらの２種以上の混合物からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アルカリ溶液がアルカリ金属の水酸化物の溶液である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記アルカリ金属が、リチウム（Ｌｉ）、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、およびルビジウム（Ｒｂ）からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記アルカリ金属水酸化物溶液が、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、および水酸化カリウムからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アルカリ金属水酸化物が水酸化ナトリウムである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記アルカリ金属水酸化物溶液が約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの濃度である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記アルカリ金属水酸化物溶液が約０．４Ｍ〜約０．８Ｍの濃度である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アルカリ金属水酸化物溶液が約０．６Ｍの濃度である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記デオキシリボ核酸がアルカリ溶液と混合され、かつ約１５℃〜約２５℃でインキュベートされる、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記デオキシリボ核酸がアルカリ溶液と混合され、かつ約１８℃〜約２２℃の温度でインキュベートされる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記デオキシリボ核酸が約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの濃度のアルカリ金属水酸化物溶液と混合され、かつ約１５℃〜約２５℃の温度で約１分間〜約６時間インキュベートされる、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前記デオキシリボ核酸が約０．６Ｍの濃度の水酸化ナトリウム溶液と混合され、かつ約１８℃〜約２２℃の温度で約１０分間〜約２時間インキュベートされる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アルカリｐＨを中和することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
マーカーＤＮＡでマーキングされたオブジェクトであって、前記マーカーＤＮＡが、前記オブジェクトに結合されたアルカリｐＨ活性化ＤＮＡである、オブジェクト。
【請求項１８】
前記アルカリｐＨ活性化ＤＮＡが、コットン、ウール、ナイロン、プラスチック、金属、ガラス、木材、印刷インク、および医薬組成物からなる群から選択される材料に結合されている、請求項１７に記載のマーカーＤＮＡでマーキングされたオブジェクト。
【請求項１９】
前記プラスチック材料が、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリアミド、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリビニルクロリド（ＰＶＣ）、ポリスルホン、ポリビニルアセテート（ＰＶＡ）、ポリエステル（ＰＥＳ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ベンゾシクロブテン（ＢＣＢ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリビニリデンクロリド（ＰＶＤＣ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、高耐衝撃性ポリスチレン（ＨＩＰＳ）、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、フェノール化合物ホルムアルデヒド樹脂（ＰＦ）、メラミンホルムアルデヒド（ＭＦ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリエーテルケトンイミド、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリメチルペンテン（ＰＭＰ）、ポリエーテルケトン（ＰＥＫ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリフェニレンスルフィド（ＰＰＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、フルロポリマー(fluropolymer)、シリコーン、アイオノマー、成形可能エラストマー、エチレンビニルアルコール（ＥＶＯＨ）、メサロセン(methalocene)ポリマー、およびポリエチレンナフタレートからなる群から選択される、請求項１８に記載のマーカーＤＮＡでマーキングされたオブジェクト。
【請求項２０】
前記医薬組成物が、医薬錠剤、医薬カプセル剤、または医薬粉末剤である、請求項１８に記載のマーカーＤＮＡでマーキングされたオブジェクト。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
「ＰＣＲ」という用語は、ポリメラーゼ連鎖反応を意味する。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは、好熱性細菌（サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus））から最初に単離された熱安定性Ｔａｑポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、鋳型核酸配列を境界付ける特異的配列に相補的な短いプライマーオリゴヌクレオチド対を用いて、融解サイクル、再アニーリングサイクル、および重合サイクルによる温度サイクルを介して、鋳型核酸配列のコピー数を拡大するのに有用な増幅技術である。ＰＣＲとしては、ＤＮＡ鎖をコピーして元のＤＮＡ鎖のコピーを１００万個以上提供する標準的ＰＣＲ法（たとえば、PCR with Arbitrary Primers:Approach with Care.W.C.Black IV,Ins.Mol.Biol.2:1-6,Dec.2007を参照されたい）、ＰＣＲ産物の量を各サイクルでモニター可能なリアルタイムＰＣＲ技術（Real time quantitative PCR：C.A.Heid,J.Stevens,K.J.Livak and P.M.Williams,1996 Genome Research 6:986-994）、ＲＮＡを最初にＤＮＡ鎖にコピーした後でＤＮＡ鎖を標準的ＰＣＲ反応により増幅する逆転写ＰＣＲ（たとえば、Quantitative RT-PCR:Pitfalls and Potential:W.F.Freeman,S.J.Walker and K.E.Vrana;BioTechniques26:112-125,January 1999を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
アルカリ金属はまた、水と反応して強アルカリの水酸化物を形成するため、十分注意して取り扱わなければならない。アルカリ金属は、周期表のそれぞれの周期で最も低い第１イオン化エネルギーを有する。すべてのアルカリ金属の第２イオン化エネルギーは、同様に核のより近くが完全殻状態であるので、非常に高い。したがって、それらは、ほとんどの場合、１個の電子を失って陽イオンを形成する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
他の実施形態では、アルカリｐＨ活性化ＤＮＡは、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリアミド、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリビニルクロリド（ＰＶＣ）、ポリスルホン、ポリビニルアセテート（ＰＶＡ）、ポリエステル（ＰＥＳ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ベンゾシクロブテン（ＢＣＢ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリビニリデンクロリド（ＰＶＤＣ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、高耐衝撃性ポリスチレン（ＨＩＰＳ）、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、フェノール化合物ホルムアルデヒド樹脂（ＰＦ）、メラミンホルムアルデヒド（ＭＦ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリエーテルケトンイミド、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリメチルペンテン（ＰＭＰ）、ポリエーテルケトン（ＰＥＫ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリフェニレンスルフィド（ＰＰＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、フルロポリマー(fluropolymer)、シリコーン、アイオノマー、成形可能エラストマー、エチレンビニルアルコール（ＥＶＯＨ）、メタロセン(metallocene)ポリマー、およびポリエチレンナフタレート材料からなる群から選択されるプラスチック材料に結合される。
【国際調査報告】
2016521129.tif 000034
2016521129.tif 000035