(57)【要約】  ポリメラーゼ鎖置換増幅のための二本鎖核酸標的の、変性することのない、等温増幅（“ｉＳＤＡ”）および検出のための、方法、プライマーおよびプローブを提供する。本明細書に記載の方法および組成物は、臨床的に関連する標的レベルの検出を可能にする、高度に感受性、特異性かつ迅速であり、核酸標的に高度に特異的である。該方法および組成物は、生物学的サンプルにおいて核酸標的を増幅または検出するために容易に用いられ得る。
2016510991.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）標的核酸配列を有するゲノム核酸を、
フォワードプライマーおよびリバースプライマー、
（ここで、フォワードプライマーは、式：Ａ−Ｂを有し、式中、Ｂは、標的核酸配列に相補的なフォワードプライマーの一部を含み、Ａは、標的核酸配列に非相補的なフォワードプライマーの一部およびフォワードニッキング酵素認識配列を含み、
ここで、リバースプライマーは、式：Ａ’−Ｂ’を有し、式中、Ｂ’は、標的核酸配列に相補的なフォワードプライマーの一部を含み、Ａ’は、標的核酸配列に非相補的なリバースプライマーの一部およびリバースニッキング酵素認識配列を含み、
そして、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、特異的ハイブリダイゼーションおよび効率的な伸長のためのソフトウェアによって最適化された配列を含む）、
鎖置換活性を有するポリメラーゼ酵素、ならびに
ニッキング酵素認識配列に特異的なニッキング酵素
を含む増幅反応混合物と接触させ、
（ｂ）標的核酸の増幅に好適な増幅条件下で増幅反応混合物およびゲノム核酸をインキュベートして、増幅された標的核酸を生産し（ここで、該接触工程およびインキュベート工程は、約４０℃から約６５℃の温度で行われ、熱変性することなく標的核酸の増幅が生じる）、そして
（ｃ）増幅された標的核酸を検出する工程
を含む、鎖置換型等温増幅法。
【請求項２】
増幅反応混合物が、１個またはそれ以上のバンパーオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ゲノム核酸がＲＮＡであり、増幅反応混合物が逆転写酵素をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ゲノム核酸が二本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
標的核酸配列が一本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
増幅された標的核酸を検出する工程が、蛍光共鳴エネルギー（ＦＲＥＴ）、放射性標識、側方流動、または酵素標識の使用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
増幅された標的核酸を検出する工程が、増幅された標的核酸の少なくとも一部分にオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドプローブが蛍光発生プローブである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドプローブが、マイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）、フルオロフォア、およびクエンチャーを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドプローブがＦＲＥＴプローブである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
増幅された標的核酸へのハイブリダイゼーションが起こるときに、オリゴヌクレオチドプローブが蛍光を発する、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドプローブが切断されて、蛍光シグナルを生じる、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
増幅された標的核酸を検出する工程が側方流動を用いることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
フォワードプライマーおよびリバースプライマーの少なくとも一方が蛍光標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
増幅された標的核酸を検出する工程が、固体支持体に増幅された標的核酸を結合させ、蛍光標識を有するオリゴヌクレオチドプローブを含む増幅された標的核酸を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
増幅反応混合物が、インターナルコントロールをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ソフトウェアが、Vienna Folding Packageを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ソフトウェアが、各隣接塩基対についての二本鎖形成時の熱力学のための最近傍モデルを適用したアルゴリズムを用いて二本鎖安定性を計算することにより、フォワードプライマーおよびリバースプライマーのＴｍを調製するためのソフトウェアを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
フォワードプライマーおよびリバースプライマーが、増幅反応混合物中に異なる濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
フォワードプライマーおよびリバースプライマーの少なくとも一方が、少なくとも１個の修飾塩基で置換されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
フォワードニッキング酵素認識配列およびリバースニッキング酵素認識配列の少なくとも一方が、エンドヌクレアーゼＶのための切断部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
接触工程およびインキュベート工程が、約４５℃から約５５℃の温度で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
Ａ’が、切断部位のための配列を含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
本願は、２０１３年３月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／７７６，２５６号、発明の名称“正確な鎖置換型等温増幅のための方法”に基づく優先権の利益を主張し、その内容全体は、引用により本明細書に包含される。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、標的特異的プライマーを用いて効率的なプライマー伸長増幅を達成し、予め変性する工程を必要としない、鎖置換型等温増幅のための方法に関する。
【０００３】
等温増幅法は、効率的なプライマー伸長のために一本鎖にされた標的を必要とする。核酸のヘリカーゼ依存性増幅はまた、ＤＮＡポリメラーゼを用いる増幅を可能にするために、二本鎖を巻き戻しするためのヘリカーゼ酵素を必要とする（米国特許第７２８２３２８号）。米国特許第５，４５５，１６６号に記載される鎖置換型の指数関数的増幅（“ＳＤＡ”）は、最初に一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）への標的の変性、制限酵素によって一本鎖へのニック挿入を可能とするヘミホスホロチオエート部位の作成、および５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼによる伸長を必要とする。二本鎖を一本鎖にするために反応温度を約９５℃に上げることが、標的鎖へのプライマーの結合を可能にするために必要とされる。最先端のＳＤＡ増幅法は、鎖置換型等温増幅のためのｓｓＤＮＡを得るために高温での標的の変性を必要とする。
【０００４】
ＳＤＡ増幅におけるヘミホスホロチオエート部位の作成の代わりに標的の鎖の一方を切断するためのニッキング酵素の使用は、文献（Ehses et al, J. Biochem. Biophys. Methods. 63:170−86 (2005)）に記載されている。予測不可能な副生成物を低減するためのプライマーの設計もまた、記載されている。標的の添加後および何らかの酵素の添加前での９５℃での変性が、Ehsesらの方法で必要とされている。９５℃での標的の変性を要しないニッキング酵素ＳＤＡ増幅法は、米国特許出願公開第２００９／００９２９６７号に記載されている。しかしながら、後者の方法の制限は、利用可能なニッキング酵素が限られた種類であり、天然のニック挿入部位が目的の標的部位に存在することが顕著に少ないことである。脱塩基部位のエンドヌクレアーゼ増幅アッセイは、米国特許出願公開第２００４／０１０１８９３号に記載されている。他の増幅システムと組み合わせた増幅後検出システムとしてのこのアッセイの使用もまた、記載されている。これらのアッセイは、ｄｓＤＮＡの変性工程を必要とする。
【０００５】
二本鎖（ｄｓ）核酸を別の方法で変性させることができることが、当技術分野で公知である。熱変性は、ｄｓＤＮＡを一本鎖に分離するための最先端の技術である。天然ＤＮＡは、約８５℃で変性する（White, Handler and Smith, Principles of Biochemistry 5th Edition, McGraw−Hill Kogakush, Ltd, pages 192−197, 1993）。初期の段階で、増幅におけるプライマー伸長が、一本鎖ＤＮＡ鎖へのプライマーの結合を必要とすることが、確立された。これは、好ましくは、約９５℃でサンプルを加熱することによって達成された（M Panaccio and A Lew. PCR based diagnosis in the presence of 8% (v/v) blood. Nucleic acids Res., 19: 1151 (1991)。近年、ネイキッド（naked）ＤＮＡにおけるワトソン−クリック型塩基対が、通常の条件下でフーグスティーン型塩基対に自発的に反転することが報告され、ＤＮＡブリージングが示唆された（Fran−Kamentskii. Artificial DNA; PNA ＆ XNA, 2:1, 1−3 (2011)）。
【０００６】
数種のヌクレアーゼが、ＤＮＡの一方の鎖だけを切断して、ＤＮＡへニックを挿入する（Besnier and Kong, EMBO Reports, 21: 782−786 (2001)）。このようなタンパク質のほとんどは、ＤＮＡ修復および他のＤＮＡ関連代謝に関与しており、ＤＮＡを操作するために安易に使用することができない。それらは、通常、長い配列を認識し、他のタンパク質と結合して、製造が困難な活性複合体を形成している（Higashitani et al., J. Mol. Biol., 237: 388−4000 (1994)）。二本鎖ＤＮＡの一方の鎖のみにニックを挿入する一本鎖ニッキングエンドヌクレアーゼおよび伝統的な制限エンドヌクレアーゼが、ＲＥＢＡＳＥデータベースに列記され、更新されている（rebase.neb.com; Roberts et al., Nucl. Acids Res., 31: 418−420 (2003)）。ニッキングエンドヌクレアーゼの作製は、既に記載されている（Xu et al, PNAS 98: 12990−12995 (2001)）。
【０００７】
等温増幅を用いる他の方法が、最近発表された（Niemz et al., Trends in Biotechnol., 29:240−250 (2011)）。しかしながら、これらの増幅法は、熱または他の変性もまた利用するものである。
【０００８】
以下の文献および刊行物は、引用により本明細書中に包含される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５，８２４，７９６号
【特許文献２】米国特許第５，９１２，３４０号
【特許文献３】米国特許第５，４５５，１６６号
【特許文献４】米国特許第７，２８２，３２８号
【特許文献５】米国特許第４，９４３，５２２号
【特許文献６】米国特許第７４８８５７８号
【特許文献７】米国特許出願公開第２０１２−００１５３５８号
【特許文献８】米国特許第５，６２４，８２５号
【特許文献９】米国再発行特許第３９８８５号
【特許文献１０】米国特許第５，４５５，１６６号
【特許文献１１】米国特許第５，４２２，２５２号
【特許文献１２】米国特許第５，６２４，８２５号
【特許文献１３】米国特許第５，７１２，１２４号
【特許文献１４】米国特許第５，２７０，１８４号
【特許文献１５】米国特許第５，４７０，７２３号
【特許文献１６】米国特許第５，５６１，９４４号
【特許文献１７】米国特許第５，７３６．３６５号
【特許文献１８】米国特許第６，１２７，１２１号
【特許文献１９】米国特許第６，６６０，８４５号
【特許文献２０】米国特許第６６８３１７３号
【特許文献２１】米国特許第７０４５６１０号
【特許文献２２】米国特許第７７５１９８２号
【特許文献２３】米国特許第７，７９９，５５４号
【特許文献２４】米国特許第８，２０２，９７２号
【特許文献２５】米国特許出願公開第２０１０／０５７８６２号
【特許文献２６】米国特許出願公開第２０１１／０１７１６４９号
【特許文献２７】米国特許出願公開第２０１２／０２４４５３５号
【特許文献２８】ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／３８５８４
【特許文献２９】ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／６４９５８
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Afonina et al., Single Nucleotide Polymorphism Detection with fluorescent MGB Eclipse Systems in A−Z of Quantitative PCR, Ed. S. A. Bustin, International University Line, La Jolla, CA, pages 718−731 and XII−XIII, 2004)
【非特許文献２】Besnier and Kong, EMBO Reports, 21: 782−786 (2001)
【非特許文献３】Ehses et al., J. Biochem. Biophys. Methods. 63:170−86 (2005).
【非特許文献４】Eschenmoser et al, Helvetica Chimica Acta, 76: 2161−2183 (1993)
【非特許文献５】Fran−Kamentskii. Artificial DNA; PNA ＆ XNA, 2:1, 1−3 (2011)
【非特許文献６】Molecular Cloning: a laboratory manual
【非特許文献７】Niemz et al., Trends in Biotechnol., 29:240−250 (2011))
【非特許文献８】Nuovo, Diagn Mol Pathol. 9(4):195−202 (2000)
【非特許文献９】M Panaccio and A Lew. PCR based diagnosis in the presence of 8% (v/v) blood. 核酸s Res., 19: 1151 (1991)
【非特許文献１０】Polley et al, J. Clin. Microbiol, 48:2866−2871 (2010)
【非特許文献１１】Ramirez et al, Nucl. Acids Res., 40:5560−8 (2012)
【非特許文献１２】Roberts et al., Nucl. Acids Res., 31: 418−420 (2003)
【非特許文献１３】Walker et al., NAR 20: 1691− 1695 (1992)
【非特許文献１４】Walker, PCR Methods and Applications, 3: 1−6 (1993)
【非特許文献１５】Walker et al., NAR 22: 2670 (1994)
【非特許文献１６】Walker et al., Clin. Chem., 42: 9−13 (1996)
【非特許文献１７】Walker et al., Clin. Chem., 42: 1604−8 (1996)
【非特許文献１８】Walker et al., NAR 24:349 (1996)
【非特許文献１９】Wang et al., Clin. Chem., 49: 1599 (2003)
【非特許文献２０】White, Handler and Smith, Principles of Biochemistry 5th Edition, McGraw−Hill Kogakush, Ltd, pages 192−197, 1993
【非特許文献２１】Xu et al, PNAS 98: 12990−12995 (2001)
【非特許文献２２】Zheleznaya et al., Biochemistry (Mosc). 74:1457−66 (2009)
【発明の概要】
【００１１】
概要
本発明は、一般的に、ｄｓＤＮＡ変性を要することなく、標的核酸増幅の利点を利用する、等温アッセイに関する。本発明の方法は、優れた特異的増幅と共に標的核酸の効率的な検出を可能にする。本発明は、特定の方法に従って設計されたプライマーが、予め変性することなく、標的特異的なプライマーの効率的なプライマー伸長増幅を可能にすることを予想外に明らかにした。一般的に、本発明は、生物学的サンプル（例えば、血液、鼻咽頭または喉のスワブ、創傷スワブ、または他の組織）を含むサンプル中のポリメラーゼプライマー伸長のための核酸標的の変性を要することのない、等温増幅のための方法（鎖置換型等温増幅（“ｉＳＤＡ”））、プライマーおよびプローブを提供する。核酸標的は、二本鎖でもよく、またはＲＳＶウイルスのような一本鎖であってもよい。ＲＮＡ標的は、一本鎖または二本鎖であってよい。
【００１２】
本明細書に記載の方法は、核酸標的を変性することなく、プライマー伸長を可能にするプライマーオリゴヌクレオチドを使用している。いくつかの例において、該プライマーは、安定性を改善するために、またはプライマーの自己会合を排除するために塩基を修飾されている。一態様において、修飾塩基は、プライマーの自己会合を制限するために使用されている。
【００１３】
特定の例では、プライマーは、５’−非相補的末端配列を含み、該末端配列はさらにニッキング酵素に特異的な配列を含む。
【００１４】
本明細書に記載の方法において、臨床標的（例えば、微生物または組織）を含むと疑われる生物学的サンプルまたは組織中に存在する核酸は、当技術分野で公知の方法で抽出される。標的核酸は変性されることなく増幅され、検出される。さらに具体的には、標的特異的プライマーは、標的に特異的な配列および標的ではない相補的な５’−末端配列を含み、その相補的配列にハイブリダイズした時に、末端配列がニッキング酵素に特異的な配列を含む。少なくとも１回の増幅サイクルが、第二の増幅サイクル中に鎖置換を可能にするニック挿入部位を含む二本鎖アンプリコンを提供する。増幅された核酸は、蛍光共鳴エネルギー（“ＦＲＥＴ”）、放射性標識、側方流動、酵素標識などを含む、当技術分野の種々の方法により検出され得る。
【００１５】
本明細書に記載の方法はまた、二本鎖ＤＮＡ標的を変性することなく、少なくとも１回の増幅サイクルでの増幅を可能にするプライマーを設計するための方法を含む。
【００１６】
特定の方法においては、本明細書の方法は、側方流動によるｉＳＤＡまたはＲＴ−ｉＳＤＡ増幅標的の検出を含む。
【００１７】
当業者は、本明細書に記載の増幅方法が、他の方法と組み合わせて実行可能であることを理解し得る。一態様において、米国特許出願公開第２００９／００９２９６７号に記載の増幅方法は、本明細書に記載の方法と組み合わせることができる。
【００１８】
本明細書の記載は、個体由来の生物学的サンプルにおいて核酸配列を特異的に検出するための等温増幅方法を提供する。本明細書はまた、特定のゲノム核酸配列の特徴的ヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを記載する。本方法は、増幅前の変性工程なしに等温増幅を行うことを含む。増幅工程は、特定のゲノム核酸標的が存在する場合に、増幅産物（複数可）を生成するためにサンプル核酸をプライマー対と接触させる工程を含む。好ましいプライマーは、特定の標的遺伝子の特定の領域を標的とする。好ましいプライマーの各々は、標的に非相補的な５’−オリゴヌクレオチド末端配列を有し、ここで、該非相補的末端配列は、相補的配列にハイブリダイズするとき、ニッキング酵素切断部位を含む配列を含む。オリゴヌクレオチドプローブは、直接的または間接的に増幅された標的を検出する。好ましいオリゴヌクレオチドプローブは、その相補的に増幅された標的へのハイブリダイゼーションにより蛍光を発する、５’−マイナーグルーブバインダー−フルオロフォア−オリゴヌクレオチド−クエンチャー−３’複合体である。いくつかの態様において、１個またはそれ以上のプライマーが標識されている。いくつかの態様において、二本鎖結合蛍光色素が用いられる。いくつかの態様において、１個またはそれ以上のバンパーオリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの態様において、プローブ（複数可）が含まれない。いくつかの態様において、増幅された標的は、固体支持体または膜上に捕捉され、標識されたプローブにより検出される。いくつかの態様において、プライマー濃度は、異なる濃度で存在する。いくつかの態様において、インターナルコントロール（ＩＣ）が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、固体支持体上に固定化されたｐＤＮＡによるｉＳＤＡ増幅されたアンプリコンのデュアルキャプチャおよび検出の例を図示する。
【図２】図２は、プレアデス（Pleiades）プローブを利用した蛍光検出を用いる、異なる濃度のｌｄｈ１遺伝子のリアルタイム ｉＳＤＡ 増幅の例を示す。
【図３】図３は、図１で示した方法を用いる、ｌｄｈ１ ｉＳＤＡ増幅されたアンプリコンの側方流動比色検出の例を示す。
【図４】図４は、プレアデス（Pleiades）プローブを利用した蛍光検出を用いる、２つの異なるｍｅｃＡ上に設計されたアッセイのリアルタイムｉＳＤＡの例を示す。
【図５】図５は、異なるポリメラーゼを用いるリアルタイム ｉＳＤＡ 増幅の例を示す。
【図６】図６は、Ｎｔ．ＡｌｗＩ切断（ニッキング）部位を含むＰＣＲ増幅された標的上のＮｔ．ＡｌｗＩの評価のゲル分析の例を示す。
【図７】図７は、ｉＳＤＡ  ｂｉｐｌｅｘにより増幅されたｌｄｈ１およびＩＣ アンプリコンの側方流動検出の例を示す。
【図８】図８は、相補的および非相補的配列を含むプライマーの概略図を示す。
【図９】図９は、黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌のｌｄｈ１遺伝子のプローブ特異的ｉＳＤＡ検出と判別を示す。
【図１０】図１０は、５つの異なる抽出方法を用いて抽出された黄色ブドウ球菌の核酸の特異的リアルタイム ｉＳＤＡ 増幅を示す。
【図１１】図１１は、本発明の鎖置換型等温増幅法での使用に最適化されたプライマーおよびプローブを用いる増幅と、常套のプライマーおよびプローブを用いる増幅とを比較した増幅反応の結果を示す。
【図１２】図１２は、リアルタイム蛍光検出および増幅後 側方流動検出の両方を用いる、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の抽出されたＲＮＡ核酸の特異的逆転写酵素−ｉＳＤＡ（ＲＴ−ｉＳＤＡ）増幅を示す。
【図１３】図１３は、天然および変性された熱帯熱マラリア原虫ＤＮＡのリアルタイム ｉＳＤＡ 増幅を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
参照態様の詳細な説明
Ｉ．概要
一般に、本明細書の開示は、ポリメラーゼ鎖置換型増幅（“ｉＳＤＡ”）のための二本鎖核酸標的の、変性することのない、等温増幅および検出のための方法、プライマーおよびプローブを提供する。該開示された方法および組成物は、臨床的に関連する標的レベルの検出を可能とする、高い感受性、特異性およびスピードを備えて、核酸標的に高度に特異的である。該方法および組成物は、生物学的サンプル中での核酸標的の増幅または検出に容易に用いることができる。
【００２１】
Ehsesら(J. Biochem. Biophys. Methods. 63:170−86 (2005)、引用により本明細書中に包含される）によると、プライマーは、とりわけ、より長いインキュベーション時間および低濃度の初期のテンプレートＤＮＡについて、予測不可能な副生成物の蓄積を最小限にするのを可能にする配列を同定し、分析する、Ｖｉｅｎｎａ  Ｆｏｌｄｉｎｇパッケージ （tbi.univie.ac.at./ivo/RNA/）を用いて設計され得る。より具体的には、Ｖｉｅｎｎａ  Ｆｏｌｄｉｎｇパッケージは、ハイブリダイゼーション反応の最小自由エネルギーの計算に基づいてプライマーの二次構造を予測し、別のＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖構造の確率を計算する、ソフトウェア製品である。Ｖｉｅｎｎａ  Ｆｏｌｄｉｎｇパッケージのようなソフトウェアを用いて設計されたプライマーは、改善されたハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを有し、それ故に、標的配列の効率的な伸長を可能にすると考えられる。そして、選択されたプライマーのＴｍは、Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｄｅｓｉｇｎソフトウェア２．３のような好ましいソフトウェアパッケージを用いて計算することにより調整され得る（Afonina et al., Single Nucleotide Polymorphism Detection with fluorescent MGB Eclipse Systems in A−Z of Quantitative PCR, Ed. S. A. Bustin, International University Line, La Jolla, CA, pages 718−731 および XII−XIII, 2004;また、米国特許第6683173号および同第7751982号を参照のこと）。該ソフトウェアは、隣接する塩基対毎に二重鎖形成時の熱力学のための最近傍モデルを適用したアルゴリズムを用いて二重鎖安定性を計算することにより、最適な伸長のためのプライマーのＴｍを調整する。各最近傍熱力学的パラメーターは、２個の対応する隣接する塩基対の熱力学的寄与を定義する。その後、好適な二重鎖安定性を有する好ましいオリゴヌクレオチドプライマー配列が選択される。該プライマーはまた、必要であるか、または所望であれば、修飾塩基を含むように設計されてよい（米国特許第７，０４５，６１０号；同第６，１２７，１２１号；同第６，６６０，８４５；同第５，９１２，３４０号および米国特許出願公開第２０１０／０５７８６２号、それらは全て引用により本明細書中に包含される）。プローブまたはＭＧＢプローブの場合において、同様のソフトウェアパッケージ（例えば、Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｄｅｓｉｇｎソフトウェア２．３）を使用することができる。
【００２２】
ＩＩ．定義
本明細書で用いる用語“サンプル”は、標的配列を包含すると考えられる任意の供給源サンプルを意味する。これらのサンプルは、本明細書に記載の方法により試験され得る。サンプルは、実験室起源であるか、または実験室外起源であってよい。サンプルは、緩衝液、抽出液、溶媒などのような液体中に懸濁または溶解されていてよい。サンプルにはまた、植物、動物およびヒト組織または全血、血液画分、血清、血漿、脳脊髄液、リンパ液、母乳、尿、呼吸器、腸管および尿生殖路の種々の外分泌物、涙、ならびに唾液のような体液のような生物学的サンプル；および、細胞抽出物、細胞培養上清、固定組織標本、および固定細胞試料のような生物学的液体が含まれる。サンプルは、鼻咽頭または喉スワブ、便、創傷または直腸スワブを含む。生物学的サンプルはまた、生検および剖検サンプルのような組織切片または組織学的目的のために採取された凍結切片も含んでよい。生物学的サンプルは、例えば、ヒトを含む任意の動物から得られる。生物学的サンプルは、ヒトにおいて疾患を引き起こすウイルス、細菌、または真菌のような微生物を含む、ヒトおよび動物の病原体を含み得る。生物学的サンプルはさらに、遺伝子突然変異した代謝性障害の産物も含み得る。
【００２３】
用語“フラッププライマー”または“オーバーハングプライマー”は、標的核酸配列に相補的ではない５’−配列セグメントを含むプライマーを意味し、ここで、該末端配列は、ニッキング酵素特異的配列および標的核酸配列に相補的な３−’配列セグメントをさらに含む。フラッププライマーは、標的核酸配列のプライマー伸長または増幅に好適である。該プライマーは、１つまたはそれ以上の非相補的なまたは修飾されたヌクレオチド（例えば、引用により本明細書に包含される、米国特許第７，０４５，６１０号に記載のピラゾロピリミジン）を、例えば、５’−末端を含む任意の位置に含んでいてよい。
【００２４】
用語“等温鎖置換型増幅”（“ｉＳＤＡ”）は、標的核酸配列に非相補的な５’−配列セグメントを含むプライマーを用いるプライマー伸長を意味し、ここで、該末端配列は、ニッキング酵素特異的配列および標的核酸配列に相補的な３’−配列セグメントをさらに含んでいてよい。
【００２５】
用語“蛍光発生プローブ”は、ａ）結合したマイナーグルーブバインダー、フルオロフォア、およびクエンチャーを有するオリゴヌクレオチド、ｂ）結合したフルオロフォア、およびクエンチャーを有するオリゴヌクレオチド、ｃ）結合したマイナーグルーブバインダー、およびフルオロフォアを有するオリゴヌクレオチド、ｄ）結合したフルオロフォアおよびクエンチャーを有するオリゴヌクレオチド、ｅ）結合したフルオロフォアを有するオリゴヌクレオチド、またはｆ）ＤＮＡ結合試薬のいずれかを意味する。プローブは、例えば、５’末端を含む任意の位置に、１つまたはそれ以上の非相補的または修飾ヌクレオチド（例えば、米国特許第７，０４５，６１０号に記載のピラゾロピリミジン）を含んでいてよい。いくつかの態様において、フルオロフォアは、修飾ヌクレオチドに結合されている。いくつかの態様において、プローブは、切断されて蛍光シグナルを生じる。
【００２６】
好ましくは、修飾塩基は、天然塩基のみからなるプローブと比較して、プローブ−標的配列の二本鎖の熱安定性を増大させる（すなわち、標的配列と二本鎖を形成したプローブのハイブリダイゼーション融解温度を上昇させる）。修飾塩基は、天然塩基のみと比較して、プローブおよびプライマーの自己会合を低減させる。修飾塩基には、天然に生じる修飾塩基および合成修飾塩基ならびに主要塩基の類縁体、例えば、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、イノシン、５−Ｎ４−エテノシトシン、４−アミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンおよび６−アミノ−４−ヒドロキシ−［３，４−ｄ］ピリミジンが含まれる。標的配列に結合する核酸を含むプローブのハイブリダイゼーションに適合する任意の修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体が、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体自体が塩基対形成に関与しないか、または天然に存在するヌクレオチドと比較して塩基対形成特性を変更する場合であっても、有用である。修飾塩基の例は、米国特許番号第７，０４５，６１０号；同第５，８２４，７９６号；同第６，１２７，１２１号；同第５，９１２，３４０号；およびＰＣＴ国際公開公報  ＷＯ０１／３８５８４；ＷＯ０１／６４９５８（これらは各々、引用によりその全体を本明細書中に包含される）に記載されている。好ましい修飾塩基には、ウリジンに対して、５−ヒドロキシブチニルウリジン；アデニンに対して、４−（４，６−ジアミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−ブト−３−イン−１−オール、４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、および４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン；チミンに対して、５−（４−ヒドロキシ−ブト−１−イニル）−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオン；ならびに、グアニンに対して、６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンが含まれる。特に好ましい修飾塩基には、“Ｓｕｐｅｒ  Ａ（登録商標）：４−（４，６−ジアミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−ブト−３−イン−１−オール”、“Ｓｕｐｅｒ  Ｇ（登録商標）：４−ヒドロキシ−６−アミノピラゾロピリミジン”（www.elitechgroup.com）および“Ｓｕｐｅｒ  Ｔ（登録商標）：５−（４−ヒドロキシ−ブト−１−イニル）−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオン”が含まれる。ユニバーサル塩基として“Ｓｕｐｅｒ−Ｄ(商標)：３−アルキニルピラゾロピリミジン”類縁体が、引用により本明細書に包含される米国特許出願番号第２０１２／０２４４５３５号に記載されている。
【００２７】
用語“蛍光ラベル”または“フルオロフォア”は、約４００ｎｍから約９００ｎｍの間に蛍光発光極大を有する化合物を意味する。これらの化合物には、括弧内のナノメートル（ｎｍ）での発光極大を有するもの、Ｃｙ２(商標)（５０６）、ＧＦＰ（Red Shifted）（５０７）、ＹＯ−ＰＲＯ(商標)−１（５０９）、ＹＯＹＯ(商標)−１（５０９）、カルセイン（５１７）、ＦＩＴＣ（５１８）、ＦｌｕｏｒＸ(商標)（５１９）、Ａｌｅｘａ(商標)（５２０）、ローダミン１１０（５２０）、５−ＦＡＭ（５２２）、オレゴングリーン(商標)５００（５２２）、オレゴングリーン(商標)４８８（５２４）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ(商標)（５２５）、ローダミングリーン(商標)（５２７）、ローダミン１２３（５２９）、マグネシウムグリーン(商標)（５３１）、カルシウムグリーン(商標)（５３３）、ＴＯ−ＰＲＯ(商標)−１（５３３）、ＴＯＴＯ（登録商標）−１（５３３）、ＪＯＥ（５４８）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０（５５０）、Ｄｉｌ（５６５）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６８（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５６４／５７０（５７０）、Ｃｙ３(商標)（５７０）、Ａｌｅｘａ(商標)５４６（５７０）、ＴＲＩＴＣ（５７２）、マグネシウムオレンジ(商標)（５７５）、フィコエリスリンＲ＆Ｂ（５７５）、ローダミンファロイジン（５７５）、カルシウムオレンジ(商標)（５７６）、ピロニンＹ（５８０）、ローダミンＢ（５８０）、ＴＡＭＲＡ（５８２）、ローダミンレッド(商標)（５９０）、Ｃｙ３．５(商標)（５９６）、ＲＯＸ（６０８）、カルシウムクリムソン(商標)（６１５）、Ａｌｅｘａ(商標)５９４（６１５）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）（６１５）、ナイルレッド（６２８）、ＹＯ−ＰＲＯ(商標)−３（６３１）、ＹＯＹＯ(商標)−３（６３１）、Ｒ−フィコシアニン（６４２）、Ｃ−フィコシアニン（６４８）、ＴＯ−ＰＲＯ(商標)−３（６６０）、ＴＯＴＯ（登録商標）−３（６６０）、ＤｉＤ ＤｉｌＣ（５）（６６５）、Ｃｙ５(商標)（６７０）、チアジカルボシアニン（６７１）、およびＣｙ５．５（６９４）が含まれる。さらなるフルオロフォアが、ＰＣＴ国際特許公開番号  ＷＯ０３／０２３３５７および米国特許第７，６７１，２１８号に記載されている。これらのおよび他の好適な色素クラスの例は、Haugland et al., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Sixth Ed., Molecular Probes, Eugene, Ore. (1996)；米国特許第３，１９４，８０５号；同第３，１２８，１７９号；同第５，１８７，２８８号；同第５，１８８，９３４号；同第５，２２７，４８７号；同第５，２４８，７８２号；同第５，３０４，６４５号；同第５，４３３，８９６号；同第５，４４２，０４５号；同第５，５５６，９５９号；同第５，５８３，２３６号；同第５，８０８，０４４号；同第５，８５２，１９１号；同第５，９８６，０８６号；同第６，０２０，４８１号；同第６，１６２，９３１号；同第６，１８０，２９５号；および、同第６，２２１，６０４号；欧州特許第１４０８３６６号；Smith et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2:1195−1204 (1993); Whitaker, et al., Anal. Biochem. 207:267−279 (1992); Krasoviskii and Bolotin, Organic Luminescent Materials, VCH Publishers, NY. (1988); Zolliger, Color Chemistry, 2nd Edition, VCH Publishers, NY. (1991); Hirschberg et al., Biochemistry 37:10381−10385 (1998); Fieser and Fieser, REAGENTS FOR ORGANIG SYNTHESIS, Volumes 1 to 17, Wiley, US (1995); ならびに Geiger et al., Nature 359:859−861 (1992)に見出され得る。さらに他の色素が、www.zeiss.comなどのオンラインサイトから提供される。ホスホン酸色素は、共有の米国特許第７，６７１，２１８号および同第７，７６７，８３４号に記載されている。
【００２８】
クエンチャーおよびフルオロフォア対の選択ならびにオリゴヌクレオチドへのそれらの結合について、当該技術分野におけるガイドラインが多数ある（Ｈａｕｇｌａｎｄ、１９９６；米国特許第３，９９６，３４５号および同第４，３５１，７６０号など）。好ましいクエンチャーが、引用により本明細書中に包含される米国特許第６，７２７，３５６号に記載されている。他のクエンチャーには、ビスアゾクエンチャー（米国特許第６，７９０，９４５号）およびBiosearch Technologies, Inc.社からの色素（Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ（商標）クエンチャー：ＢＨ−１、ＢＨ−２およびＢＨ−３クエンチャーとして提供される）、Ｄａｂｃｙｌ、ＴＡＭＲＡおよびカルボキシテトラメチル ローダミンが含まれる。
【００２９】
用語“リンカー”は、分子の種々の部分を組み立てるため、または固体支持体、表面もしくは膜に分子（または、その一部）を共有結合させるために用いられる部分を意味する。典型的に、リンカーまたは連結基は、本明細書に記載のおよび本発明で用いる複合体のリガンドまたは構成成分中の官能基（例えば、フルオロフォア、オリゴヌクレオチド、マイナーグルーブ（副溝）バインダー、またはクエンチャー）と相互作用するために、および共有結合を形成するために使用される官能基を有する。連結基上の官能基（他の構成成分と相互作用する前）の例には、−ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ２、−ＯＨ、および−ＳＨが含まれる。連結基はまた、複合体に他の基（例えば、ホスホラミダイト部分など）を結合する分子の一部でもある。さらに、リンカーは、直鎖もしくは非環式部分、環式部分、芳香環、およびそれらの組み合わせを含み得る。
【００３０】
用語“固体支持体”は、例えば、ガラス、孔径制御多孔質ガラス(controlled pore glass)、高分子材料、ポリスチレン、ビーズ、被覆ガラスなどを含む、オリゴヌクレオチドの結合に適合する何らかの支持体を意味する。
【００３１】
側方流動アッセイ技術は、当該技術分野で周知であり、多孔質ペーパーまたは焼結ポリマーのストリップ上で行われる。例えば、米国特許第６，４８５，９８２号、同第７，７９９，５５４号、および同第７，９０１，６２３号を参照のこと。
【００３２】
本明細書中、略語  ＭＧＢ、ＦＬ、Ｑ、ＣＰＧ、およびＯＤＮは、それぞれ“マイナーグルーブバインダー”、“蛍光ラベル”または“フルオロフォア”、“クエンチャー”、“多孔質ガラスビーズ”（固体支持体の一例として）、および“オリゴヌクレオチド”部分または分子を意味し、これらは文脈上明らかである。用語“プローブ”および“複合体”は互換的に用いられ、結合するマイナーグルーブバインダー、フルオロフォア、およびクエンチャーを有するオリゴヌクレオチドを意味する。
【００３３】
用語“オリゴヌクレオチド”、“核酸”および“ポリヌクレオチド”は、本明細書中、互換的に用いられる。これらの用語は、核酸、ヌクレオチド、または一本鎖もしくは二本鎖形態でのそれらのポリマー、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、天然ヌクレオチドの類縁体、およびそれらのハイブリッドを含む化合物を意味する。該用語には、修飾されたかまたは天然に存在しないヌクレオチドを含むポリマー、またはNielsen et al., Science, 254:1497−1500 (1991)に記載のペプチド核酸、Bolli et al., Nucleic Acids Res., 24:4660−4667 (1996)に記載のビシクロＤＮＡオリゴマー、および関連する構造体を含むが、これらに限定されない、ＤＮＡもしくはＲＮＡへの安定な塩基対形成が可能なポリマーの他のタイプが含まれる。他に特記されない限り、該用語は、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で核酸にハイブリダイズする天然ヌクレオチドの既知の類縁体を包含する。そのような類縁体の例には、ホスホロチオエート、ホスホラミデート（phosphoramidate）、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、およびペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。“サブ配列”または“セグメント”は、ヌクレオチドのより長い配列の一部を含むヌクレオチドの配列を意味する。いくつかの態様において、ヌクレオチドは、天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡ以外のヌクレオチドに対して優先的な結合を示す天然ヌクレオチドの類縁体を含んでいてよく、かかるヌクレオチドの例は、ｐＤＮＡである（Eschenmoser et al, Helvetica Chimica Acta, “Why Pentose− and Hexose−Nucleic Acids?”, pp. 76: 2161−2183 (1993)）。
【００３４】
用語“ニッキング酵素（または、ニッキングエンドヌクレアーゼ）”は、ニック形成部位として知られている特異的に認識されるヌクレオチド配列において、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖を切断する酵素を意味する。かかる酵素は、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖のみを、切断するというよりむしろ“ニックを形成”して、ＤＮＡ分子を生成する。これらのニッキング酵素には、Ｎ．ＡｌｗＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣｌ、Ｎｔ．ＢｂｖＣｌ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｂ．ＢｓｔｓＣＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、Ｎｂ．Ｂｐｕ１０Ｉ、Ｎｔ．Ｂｐｕ１０ＩおよびＮｔ．Ｂｓｔ９Ｉが含まれ、これらはそれぞれ、www.neb.com、www.fermentas.comおよびwww.sibenzyme.comより市販されている。Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社のＲＥＢＡＳＥのウェブサイト（rebase.neb.com/cgi-bin/azlist-nick）は、９１７のニッキング酵素を列記している。制限エンドヌクレアーゼに基づく人工的なニッキングエンドヌクレアーゼの設計が、Zheleznayaらの、Biochemistry (Mosc). 74:1457−66 (2009)で検討され、それは引用により本明細書中に包含される。“ニッキング酵素”はまた、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖を切断する人工的に作製された酵素、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼを含む。
【００３５】
用語“側方流動”は、アッセイ基質として使用される非吸収性側方流動が可能な多孔質膜を記載する。結合対のメンバーは、基板内に定義されたインジケータ領域に固定される。サンプルは、標識ゾーンから離れた位置に適用され、該ゾーンを通って横方向に流れることが許されている。サンプル中の任意の分析物が、固定化された特異的結合メンバーによって錯体形成し、検出される。免疫結合対を利用する側方流動が、当技術分野でよく知られている（ＵＳ４，９４３，５２２）。ＤＮＡ結合対を用いる側方流動が、ＵＳ７４８８５７８に記載されている。ｐＤＮＡ結合対は、共有の米国特許出願第２０１２−００１５３５８Ａ１号に記載されている。ビオチン−ストレプトアビジン親和性対は、当技術分野で周知であり、市販されている。ストレプトアビジン被覆された標識は、共有結合または吸着結合したストレプトアビジンまたは他のビオチン結合種であってもよく、該標識は、蛍光または可視色素を添加したポリスチレンナノ粒子、カーボンブラックナノ粒子、金属コロイド、または蛍光、放射線、磁気により、もしくは視覚的に検出可能な他の種であってもよい。側方流動用緩衝液は、界面活性剤、タンパク質、界面活性剤、および塩を含む水性懸濁液であり得る。側方流動ストリップは、ニトロセルロース、修飾ニトロセルロース、ポリエーテルスルホン、セルロース、ガラス繊維、ポリフッ化ビニリデン、またはナイロンからなる多孔質マトリックスであってもよい。側方流動ストリップは、ｉＳＤＡ反応生成物に特異的な親和性の対からなる少なくとも１つの検出領域を有する。
【００３６】
本明細書に記載の方法の実施は、他に特記しない限り、当技術分野の技術内であるような、有機化学、生化学、オリゴヌクレオチド合成および修飾、バイオコンジュゲート化学、核酸ハイブリダイゼーション、分子生物学、微生物学、遺伝学、組み換えＤＮＡ、および関連分野における常套技術を用い得る。これらの技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch ＆ Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Ausubel, et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley ＆ Sons (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995, 1996); Gait (ed.), OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1984);および、Eckstein (ed.), OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1991)を参照のこと。
【００３７】
ＩＩＩ．説明
一面において、本明細書は、個体からの生物学的サンプル中の核酸配列を特異的に検出するための等温方法を提供する。等温方法は、室温で、または約４０℃から約６５℃で、またはより好ましくは、約４５℃から約５５℃で、完全に行われ得る。本明細書はまた、特定のゲノム核酸配列の特徴的ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを提供する。この方法は、増幅の前に変性工程なしに等温増幅を行うことを含む。増幅工程は、特定のゲノム核酸標的が存在する場合に、サンプル核酸をプライマー対と接触させて増幅産物を生成することを含む。プライマー“ａ−ｂ”は、相補的配列にハイブリダイズしたとき、相補的配列“ｂ”、および非相補的ニッキング酵素認識配列部位“ａ”を含む（図８）。プライマーａ−ｂはさらに、特異的ハイブリダイゼーションおよび効率的な伸長のための自由エネルギー最小化により選択された配列を含む。プライマーは、熱変性することなく増幅を可能にする特定の標的遺伝子の特定の領域を標的とする。バンパープライマーは、鎖置換によって標的特異的な一本鎖ＤＮＡの新規に合成されたアンプリコンを生成するために、フラッププライマーの５’−末端の上流にハイブリダイズする（Nuovo GJ, .Diagn Mol Pathol. 2000 Dec;9(4):195−202.）。オリゴヌクレオチドプローブは、直接的または間接的に増幅された標的を検出する。好ましいオリゴヌクレオチドプローブは、５’−マイナーグルーブバインダー−フルオロフォア−オリゴヌクレオチド−クエンチャー−３’複合体であり、その相補的な増幅された標的へのハイブリダイゼーションにより蛍光を発する。
【００３８】
いくつかの態様において、プローブ（複数可）は除かれている。いくつかの態様において、増幅された標的は、固体支持体、表面または膜上に捕捉され、標識されたプローブにより検出される。いくつかの態様において、プライマー濃度は、異なる濃度で存在する。いくつかの態様において、インターナルコントロールが提供される。
【００３９】
特定の態様において、ヒト、動物、および／または植物病源体の核酸が増幅され、検出される。
【００４０】
別の態様において、増幅された標的核酸はＲＮＡであり、この方法は逆転写酵素の工程をさらに含む。
【００４１】
別の面において、５’−非相補的配列は、ニック挿入部位の配列を含む。好適なニック挿入部位を有する任意の酵素を使用することができるが、好ましいニッキング酵素認識配列は、N.Alw I, Nb.BbvCl, Nt.BbvCl, Nb.BsmI, Nt.BsmAI, Nt.BspQI, Nb.BsrDI, Nt.BstNBI, Nb.BstsCI, Nt.CviPII, Nb.Bpu10I, Nt.Bpu10I および Nt.Bst9I, Nb.Mva1269I ならびにエンドヌクレアーゼＶから選択される。
【００４２】
別の態様において、相補的プライマー配列は、熱変性または化学的変性を必要としないエンドヌクレアーゼＶ（“Ｅｎｄｏ Ｖ”）切断部位を有する配列を含み、より完全には、Ｅｎｄｏ Ｖ−ベースの増幅プライマーを記載し、引用により本明細書中に包含される、米国特許第８，２０２，９７２号または米国特許出願公開番号２０１１／０１７１６４９に記載されている。より具体的には、エンドヌクレアーゼＶは、イノシンなどの脱アミノ化修飾塩基を含むＤＮＡオリゴヌクレオチドを認識する修復酵素である。Ｅｎｄｏ Ｖは、イノシンなどの修飾塩基への３’側の第二または第三リン酸ジエステル結合を切断する。米国特許第８，２０２，９７２号は、３’末端の末端塩基に隣接するイノシンを含むフォワードおよびリバースプライマーを拡張するエンドヌクレアーゼＶに基づく増幅方法を記載している。増幅の第二の工程にて、Ｅｎｄｏ Ｖは、同じ鎖におけるイノシンへの３’側の第二または第三リン酸ジエステル結合を切断する。ニックの３’−ヒドロキシルは、鋳型指示様式(template−directed manner)でＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。プライマー対を含むイノシンの５’末端の上流に相補的なネステッドプライマー対のシリーズを用いて、伸長産物シリーズが生成される。米国特許第８，２０２，９７２号は、“標的ｄｓＤＮＡは、熱変性、化学的変性、または熱変性および化学的変性の両方の変性をされてもよい”ことを、必要とする。
【実施例】
【００４３】
実施例
以下の実施例は、本明細書に記載の目的を説明するために提供され、それに限定されるものではない。
【００４４】
これらの実施例において、ｉＳＤＡは、全量２０μＬ（モノ試薬）中、終濃度  ３．７５ｍＭ ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４ ｐＨ７．６、２５０ｎＭ フォワードプライマー、１μＭ リバースプライマー、５０ｎＭ バンパーオリゴヌクレオチド、２００ｎＭ プローブ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、４０μｇ／ｍＬ ＢＳＡ、１０ｎｇ ゲノムＤＮＡ、４Ｕ Ｎ．ＢｂｖＣ１Ｂおよび３．６Ｕ Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われた。２０μＬのモノ試薬を、１０μＬのサンプル核酸を含む９６ウェルＰＣＲプレートに添加した。サンプル核酸は、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳＥ ｅａｓｙＭＡＧ抽出試薬（Biomerieux, l’Etoile, France）を用いて、ｅａｓｙＭａｇで抽出することにより得られた。プレートを、ＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）光学接着フィルム（Applied Biosystems, Foster City, CA）で密封後、ウェルプレートの底部のアッセイ溶液を集めるために遠心した。その後、アッセイを、４８℃にて３０分間、ＡＢＩ ７５００ ＤＸ Ｆａｓｔ Ｂｌｏｃｋ リアルタイムＰＣＲ装置で行った。
【００４５】
実施例１
本実施例は、培養した黄色ブドウ球菌亜種ＣＯＬ（ｇｉ｜５７６５００３６：２６２２５０−２６３２０３）由来のｅａｓｙＭａｇ抽出された核酸からのｌｄｈ１遺伝子の変性のない効率的なｉＳＤＡ増幅を示す。プライマー、バンパーおよびプローブ配列を表１に示す。
【００４６】
以下の表１は、ｉＳＤＡ増幅のためのｌｄｈ１オリゴヌクレオチド配列を示している。下線を付した配列は、Ｎ．ＢｂｖＣ１Ｂためのニック挿入部位を示す。大文字の配列は、ｌｄｈ１特異的であり、５’−末端の小文字の配列は、ｌｄｈ１標的に非相補的であり、そしてｐＤＮＡ配列は、括弧内に示されている。Ｑ１４は、ヘキサエチレングリコールリンカーであり、ＭＧＢは、ＤＰＩ３マイナーグルーブバインダーであり、ＦＡＭは、フルオレセインであり、そしてＥＤＱは、Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）ダーククエンチャーである（クエンチング範囲３９０−６２５ｎｍ、最大吸収５２２ｎｍ、Epoch Biosciences, Inc., Bothell, WA）。
【００４７】
【表１】
2016510991.tif 000003
【００４８】
オリゴヌクレオチド１から５を用いるリアルタイム ｉＳＤＡ増幅を、１反応当たり１０から５００コピーの範囲の標的濃度で上記の通りに行った。結果を図２に示す。
【００４９】
側方流動：
図１に概略的に示され、図３に結果が示される通り、プローブ３が側方流動形式で捕捉および検出を可能にするプローブ６および７に置き換えられること以外、同様のｉＳＤＡ増幅を行った。一旦、ｉＳＤＡ反応が完了すると、２μＬの産物を、ストレプトアビジンでコーティングしたラベルおよびＨＦ１３５ニトロセルロース（Millipore）上で側方流動アッセイを行うための緩衝液の容量を含むウェルに等分し、その後、側方流動ストリップをウェルに加えた。一例において、２μＬのｉＳＤＡ ｌｄｈ１反応混合物を、調製物(formulation)  １５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）、１％ トライトンＸ−１００、０．５％ ＢＳＡ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ＮａＮ３、および１００ｎｇ／μＬ ストレプトアビジンでコーティングした直径３００ｎｍの青色染色したポリスチレン系ナノ粒子（Seradyn）を含む１００μＬの側方流動緩衝液中に希釈した。次いで、希釈された産物に、ｐＤＮＡ捕捉プローブ６に相補的な固定化されたｐＤＮＡオリゴを含む、ニトロセルロースストリップ、４ｘ２５ｍｍ、を添加した。ｐＤＮＡが、１２０ｐｍｏｌ／ｃｍの濃度および約１ｍｍの線幅で架橋されたポリチミジンテールを介して固定化された。ポジティブな結果が、肉眼で容易に観察された（図３に示される通り）。
【００５０】
実施例２
本実施例は、変性することなく、ｉＳＤＡ増幅を可能にする、ｍｅｃＡ遺伝子配列からのプライマーの設計の汎用性を示している。核酸は、培養された黄色ブドウ球菌亜種ＣＯＬからｅａｓｙＭａｇ抽出された。設計１および２のプライマー、バンパーおよびプローブ配列を以下の表２に示す。ｐＤＮＡ配列は、括弧内に示される。
【００５１】
以下の表２は、ｍｅｃＡ増幅のための設計１および２のオリゴヌクレオチド配列を示す。下線を付した配列は、Ｎｔ．ＢｂｖＣ１Ｂのためのニック挿入部位を示し、大文字の配列は、ｍｅｃＡ特異的であり、５’−末端の小文字の配列は、ｍｅｃＡ標的に非相補的であり、ｐＤＮＡ配列は、括弧内に示され、Ａ＊は、Ｓｕｐｅｒ  Ａ（ＵＳ７，０４５，６１０）であり、そしてＱ１４は、ヘキサエチレングリコールリンカーである。
【００５２】
【表２】
2016510991.tif 000004
【００５３】
実施例２に記載の方法と同様の方法で、プライマー、プローブおよびバンパーオリゴヌクレオチド（設計１、配列番号８−１２、および設計２、配列番号１５−１８）を用いて、効率的リアルタイムｉＳＤＡを図４に示す通りに達成した。
【００５４】
実施例３
本実施例は、リアルタイムｉＳＤＡ増幅における異なるポリメラーゼの使用を示している。ｉＳＤＡ増幅を、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（バチルス・ステアロサーモフィルスＤＮＡポリメラーゼの一部、New England BioLabs Inc., Ipswich, MA）またはＢｓｔ２．０  ＷａｒｍＳｔａｒｔ（バチルス・ステアロサーモフィルスＤＮＡポリメラーゼＩの試験管内で設計されたホモログ、New England BioLabs Inc.）のいずれかを用いて、上記の通りに行った。後者の酵素は、ｍｅｃＡ標的を増幅し、４５℃以上で活性である。結果を図５に示し、Ｂｓｔ２．０  ＷａｒｍＳｔａｒｔ  酵素での良好な結果が示される。
【００５５】
実施例４
本実施例は、Ｎｔ．Ａｌｗ１ニッキング酵素が、ＮｔＡｌｗ１ニック挿入部位が設計されたＰＣＲアンプリコンを正常に切断するが、それは、ｌｄｈ１遺伝子がＮｔＡｌｗ１のための天然のニック挿入部位を含んでいるにもかかわらず、抽出されたゲノムＤＮＡを切断しなかったことを示す。
【００５６】
以下の表３の配列は、ＰＣＲアンプリコンにニック挿入部位を組み込むために用いられた。ｌｄｈ１特異的配列は、従来のＰＣＲ設計ソフトウェアで設計された。
【００５７】
以下の表３において、ｌｄｈ１増幅のための設計３および４のオリゴヌクレオチド配列は、Ｅｃｌｉｐｓｅ  設計ソフトウェア  ２．３を用いて作製された。下線を付した配列は、ＮｔＡｌｗ１のためのニック挿入部位を示し、大文字の配列は、ｌｄｈ１特異的であり、５’−末端の小文字の配列は、ｌｄｈ１標的に非相補的である。
【００５８】
【表３】
2016510991.tif 000005
【００５９】
設計３および設計４のプライマーは、ＮｔＡｌｗ１のためのニック挿入部位を含むＰＣＲアンプリコンを生成するために用いられ、ＮｔＡｌｗ１のためのニック挿入部位を含む便利な標的が得られる。ＰＣＲで生成されたアンプリコンを含むｉＳＤＡは、アガロースゲル上で分析され、結果が図６に示される。
【００６０】
実施例５
本実施例は、ｌｄｈ１およびインターナルコントロール（“ＩＣ”）のｉＳＤＡバイプレキシング(bi-plexing)を示す。ＩＣテンプレートは、プラスミドベクター内にナンセンスな非特異的標的ＤＮＡ断片を含む。好ましくは、対照核酸は、以下の表４に示される配列を含む。
【００６１】
以下の表４において、ＩＣの増幅のためのオリゴヌクレオチド配列は、ｉＳＤＡ増幅について上記の通りに、作製された。下線を付した配列は、Ｎｔ．ＢｂｖＣ１Ｂのためのニック挿入部位を表し、大文字の配列はＩＣ特異的であり、そして５’−末端の小文字の配列は、ＩＣ標的に対して非相補的である。同じｌｄｈ１プライマー、バンパー、捕捉および検出オリゴヌクレオチド（配列番号１、２、４−７、表１）を、ＩＣを含むｌｄｈ１のバイプレキシングのために用いた。ＩＣプライマー、バンパー、捕捉および検出プローブの配列を表４に示す。
【００６２】
【表４】
2016510991.tif 000006
【００６３】
ｉＳＤＡ増幅を、ｌｄｈ１およびＩＣプライマーの両方の濃度が、制限プライマーについて２５０ｎＭであり、過剰プライマーについて５００ｎＭであり、フォワードおよびリバースバンパープライマーが５０ｎＭであり、キメラｐＤＮＡ−ＤＮＡプローブおよびビオチニル化プローブがそれぞれ２００ｎＭであること以外、上記の通りに行った。各標的希釈は、５０００のＩＣ２コピーを含んでいた。増幅反応を、４８℃にて３０分間インキュベーションして行い、その後、それを上記の通り側方流動分析により分析した。側方流動分析を図７に示し、この特定のアッセイについて、６０コピーの検出下限を示している。
【００６４】
実施例６
この実施例は、黄色ブドウ球菌（ＢＡＡ−１５５６、ＡＴＣＣ）および表皮ブドウ球菌（S.epidermidis）（１２２２８、ＡＴＣＣ）のプローブ特異的ｉＳＤＡ検出ならびに判別を示す。
【００６５】
黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌（５ｘ１０８ｃｆｕ／ｍＬ）の培養物を、水浴ソニケーター（Ｂｒａｎｓｏｎ  ５５１０、Ｂｒａｎｓｏｎｉｃ）中で１０分間超音波処理した。粗溶解物を、実施例１に記載の方法に従って、５ｘ１０４ｃｆｕ／反応の濃度で、ｌｄｈ１遺伝子についてアッセイした。黄色ブドウ球菌のみでのｌｄｈ１遺伝子の効率的な特異的検出が、図９に示される。
【００６６】
実施例７
この実施例は、異なる方法で抽出される同じサンプルからの核酸のｉＳＤＡ増幅を示す。
【００６７】
黄色ブドウ球菌サンプルを、以下の抽出方法を用いて抽出した。
ａ）シリカスピンカラムの有無下での、カオトロピック塩（８Ｍ  塩酸グアニジニウムまたは４Ｍ  グアニジンチオシアネート）を用いる抽出。
細菌細胞（５ｘ１０８ｃｆｕ）を、Molecular Cloning: a laboratory manual（７−１９頁、７−２４頁）に記載の方法に従って抽出した。各抽出物からのＤＮＡを２００μＬのＴＥ緩衝液中に再懸濁し、２つの１００μＬアリコートに分けた。一方のアリコートをＰＣＲおよびｉＳＤＡ分析のために取り置き、別のアリコートを、製品の取り扱い説明書に従って、ＱＩＡｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ キット（Ｑｉａｇｅｎ）スピンカラム上で精製した。ＤＮＡを、１００μＬの溶出緩衝液中に溶出した。
ｂ）エタノール沈殿後、フェノール／クロロホルム抽出（Molecular Cloning: a laboratory manual, App.E3-E4）。
ｃ）水浴ソニケーター（Ｂｒａｎｓｏｎ  ５５１０、Ｂｒａｎｓｏｎｉｃ）中で１０分間の超音波処理。
ｄ）室温にて、１０％の終濃度のトライトンＸ１００でインキュベーション後、エタノール沈殿。
【００６８】
異なる非変性ＤＮＡ核酸画分の濃度は、リアルタイムｌｄｈ１ ＰＣＲアッセイ（米国特許出願第１３／４７９，５５７号に記載）により５００コピー／反応で正規化された。図１０に示すように、５つすべての抽出物は、サイクル９（９分）の辺りで実質的に同じシグナル結果を生じた。ＮＴＣは増幅を示さず、図示されていない。
【００６９】
実施例８
この実施例は、表５に示した従来の設計プライマーおよびプローブと比較して、本発明で設計されたプライマーおよびプローブでのｌｄｈ１遺伝子のｉＳＤＡ増幅を示している。
【００７０】
実施例１に記載の方法を用いて、表１および５に記載のｌｄｈ１遺伝子に対するプライマーおよびバンパープライマーを試験し、ここでプライマーの両セットが、５ｘ１０３から５ｘ１０５の標的コピー／反応の範囲の標的濃度を有した。増幅反応を、図１１ＡおよびＢに示す通り、アガロースゲル電気泳動により分析した。図１１ＡおよびＢ中の矢印は、アンプリコンの増幅産物を示す。図１１Ａに示される通り、本明細書に記載のプライマーでの増幅は、３つの濃度の全てで顕著な増幅を示し、一方、従来の設計プライマーは、少ない増幅を示した。
【００７１】
【表５】
2016510991.tif 000007
【００７２】
実施例９
本実施例は、ＲＳＶ核酸の１ステップＲＴ−ｉＳＤＡ増幅を示す。ＲＴ−ｉＳＤＡは、８Ｕ  ＷａｒｍＳｔａｒｔ  Ｂｓｔ  ポリメラーゼをＢｓｔ  ポリメラーゼの代わりに用い、８Ｕ  Ｎｔ．ＢｂｖＣ１  ニッキング酵素を１０μＬ反応物当たりに用いたこと以外、段落番号００４４に記載のｉＳＤＡの終濃度と同じ濃度を用いる。また、反応混合物は、１０μＬ／反応当たり、１０Ｕ  ＲＮＡ阻害剤（Life Technologies）、０．５μＬ  オムニスクリプト逆転写酵素（Qiagne）、テンプレートＲＮＡおよび１μｇ  ＢＳＡを含む。反応混合物を、図１２ａに示す通り、４９℃で２５分間、リアルタイム検出後、図１２ｂに示す通り、側方流動検出した。プライマー、バンパープライマーおよびプローブを、以下の表６に示す。Ｔ＊＝Ｓｕｐｅｒ  Ｔであり、他の略語は、上記の通りである。側方流動膜は、ｐＤＮＡのテストライン（架橋ポリチミジンテールにより固定）およびフロー制御としてのＢＳＡ−ビオチンラインを有する。
【００７３】
【表６】
2016510991.tif 000008
【００７４】
実施例１０
本実施例は、天然および変性の熱帯熱マラリア原虫ゲノムＤＮＡのｉＳＤＡ増幅を示す。プライマーおよびプローブは、ミトコンドリアＤＮＡを標的として用いて設計され（Polley et.al,. J. Clin. Microbiol, 48:2866−2871 (2010)）、以下の表７に示される。熱帯熱マラリア原虫、ＮＦ５４株からの抽出およびｉＳＤＡ増幅は、上記の通りに行われた。図１３Ａは、天然および変性ＤＮＡについて、９５℃にて５分間での、同一のリアルタイムｉＳＤＡ増幅を示す。図１３Ｂは、１００および１０００コピーでの天然ＤＮＡの増幅を示す。
【００７５】
【表７】
2016510991.tif 000009
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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