(57)【要約】  被験体における炎症性疾患または線維性疾患の処置方法を開示する。本方法は、治療有効量のＢｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗおよび／またはｐ２１の活性および／または量を下方制御する薬剤を被験体に投与する工程を含み、但し、前記炎症性疾患が癌ではないことを条件とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性疾患または線維性疾患の処置を必要とする被験体における炎症性疾患または線維性疾患を処置する方法であって、治療有効量の（Ｂｃｌ−ｘＬ）および／またはＢｃｌ−ｗの活性および／または量を下方制御する薬剤を前記被験体に投与し、それにより、前記炎症性疾患または線維性疾患を処置する工程を含み、ここで、前記炎症性疾患が癌ではない、方法。
【請求項２】
前記薬剤が化学物質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記薬剤がＢｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗをターゲティングするポリヌクレオチド薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記疾患が軟骨変性に関連する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記疾患が、肝臓線維症、創傷治癒、皮膚線維症、肺疾患、腎臓線維症、前立腺炎、アテローム性動脈硬化症、関節炎、および膵炎からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
（ｉ）Ｂｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗの活性および／または量を下方制御する薬剤；および
（ｉｉ）ｐ２１の活性および／または量を下方制御する薬剤
を含む、製品
【請求項７】
前記Ｂｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗの活性および／または量を下方制御する薬剤が前記ｐ２１の活性および／または量を下方制御する薬剤と異なるパッケージングに含まれる、請求項６に記載の製品。
【請求項８】
前記Ｂｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗの活性および／または量を下方制御する薬剤が前記ｐ２１の活性および／または量を下方制御する薬剤と同一のパッケージングに含まれる、請求項６に記載の製品。
【請求項９】
皮脂調節剤、抗菌薬および／または抗真菌薬、角質溶解薬および／または角質調節剤、収斂薬、抗炎症剤および／または抗刺激剤、抗酸化剤および／またはフリーラジカル消去剤、瘢痕形成剤、老化防止剤、および保湿剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤をさらに含む、請求項６に記載の製品。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの薬剤が老化防止剤である、請求項９に記載の製品。
【請求項１１】
薬学的に許容され得るキャリアおよび活性薬剤としての以下：
（ｉ）Ｂｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗの活性および／または量を下方制御する薬剤；および
（ｉｉ）ｐ２１の活性および／または量を下方制御する薬剤
を含む薬学的組成物。
【請求項１２】
局所送達のために処方された、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
炎症性疾患または線維性疾患の処置のために使用され、前記疾患が癌ではない、サイクリン依存性キナーゼインヒビター１（ｐ２１）の活性および／または量を下方制御する薬剤。
【請求項１４】
炎症性疾患または線維性疾患の処置で用いるＢｃｌ−ｘＬを発現する内因性核酸配列を下方制御するポリヌクレオチド薬およびＢｃｌ−ｗを発現する内因性核酸配列を下方制御するポリヌクレオチド薬。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチド薬がｓｉＲＮＡ薬である、請求項１４に記載の薬剤。
【請求項１６】
キャリア、ｐ２１の活性および／または量を下方制御する少なくとも１つの活性薬剤、ならびにＢｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗの活性および／または量を下方制御する少なくとも１つの活性薬剤を含む組成物であって、局所投与のために処方される、組成物。
【請求項１７】
前記Ｂｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗの活性および／または量を下方制御する少なくとも１つの活性薬剤がＡＢＴ−７３７またはＡＢＴ−２６３である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
皮脂調節剤、抗菌薬および／または抗真菌薬、角質溶解薬および／または角質調節剤、収斂薬、抗炎症剤および／または抗刺激剤、抗酸化剤および／またはフリーラジカル消去剤、瘢痕形成剤、老化防止剤、および保湿剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤をさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの薬剤が老化防止剤である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
炎症性疾患または線維性疾患の処置を必要とする被験体における炎症性疾患または線維性疾患を処置する方法であって、治療有効量のサイクリン依存性キナーゼインヒビター１（ｐ２１）の活性および／または量を下方制御する薬剤を前記被験体に投与し、それにより、前記炎症性疾患または線維性疾患を処置する工程を含み、ここで、前記疾患が癌ではない、方法。
【請求項２１】
前記薬剤が前記ｐ２１を発現する内因性核酸配列に指向するポリヌクレオチドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリヌクレオチド薬がｓｉＲＮＡである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
Ｂｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗの活性および／または量を下方制御する少なくとも１つの薬剤を前記被験体に投与する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの薬剤が、前記Ｂｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗを発現する内因性核酸配列に指向するポリヌクレオチドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記薬剤がＢｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗに対して指向するｓｉＲＮＡである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの薬剤が化学物質である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記化学物質が、ＡＢＴ−７３７、ＡＢＴ−２６３、ゴッシポール、ＡＴ−１０１、ＴＷ−３７、およびオバトクラックスからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記疾患が軟骨変性に関連する、請求項２０〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記疾患が、肝臓線維症、創傷治癒、皮膚線維症、肺疾患、骨粗鬆症、腎臓線維症、前立腺炎、アテローム性動脈硬化症、関節炎、および膵炎からなる群から選択される、請求項２０〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記肺疾患が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記薬剤を局所組成物として処方する、請求項２０〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
炎症性疾患または線維性疾患の処置を必要とする被験体における炎症性疾患または線維性疾患を処置する方法であって、治療有効量のＢｃｌ−ｘＬを発現する内因性核酸配列を下方制御する少なくとも１つのポリヌクレオチド薬およびＢｃｌ−ｗを発現する内因性核酸配列を下方制御する少なくとも１つのポリヌクレオチド薬を前記被験体に投与し、それにより、前記炎症性疾患または線維性疾患を処置する工程を含む、方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１つのポリヌクレオチド薬がｓｉＲＮＡを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記疾患が癌である、請求項３２〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記疾患が、肝臓線維症、創傷治癒、皮膚線維症、肺疾患、骨粗鬆症、腎臓線維症、前立腺炎、アテローム性動脈硬化症、関節炎、および膵炎からなる群から選択される、請求項３２〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記肺疾患が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの薬剤を局所組成物として処方する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前悪性病変の処置を必要とする被験体における前悪性病変を処置する方法であって、治療有効量のＢｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗの活性および／または量を下方制御する薬剤を前記被験体に投与し、それにより、前記前悪性病変を処置する工程を含む、方法。
【請求項３９】
ｐ２１の活性および／または量を下方制御する薬剤を前記被験体に投与する工程をさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前悪性病変の処置を必要とする被験体における前悪性病変を処置する方法であって、治療有効量のサイクリン依存性キナーゼインヒビター１（ｐ２１）の活性および／または量を下方制御する薬剤を前記被験体に投与し、それにより、前記前悪性病変を処置する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野および背景
【０００２】
本発明は、そのいくつかの実施形態では、加齢性障害の処置のためにＢｃｌ−２−ファミリータンパク質および／またはｐ２１をコードする遺伝子の下方制御によって老化細胞を死滅させる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞老化（安定な細胞周期停止形態）は、細胞の増殖能を制限する機構である。老化は、多数の細胞型において多様な細胞ストレス形態に対して応答して誘発され得る。老化は、腫瘍発生に対する強力な障壁であり、一定の抗癌剤の細胞傷害性に寄与する。老化が細胞自律的様式で腫瘍発生および組織損傷を制限する一方で、老化細胞は、その存在部位において、細胞非自律的様式で炎症、組織老化、組織破壊を誘導し、腫瘍発生および転移を促進する。したがって、その排除によって腫瘍を防止し、組織老化を抑制することができる。実際、老化細胞の排除により、動物モデルにおいて組織老化が遅延されることが示された（非特許文献１）。 生物は、微小環境に及ぼす悪影響を回避するために老化細胞を排除するための精巧な機構を発達させたかもしれない。しかし、組織におけるその機構の運命は十分に特徴づけられていない。一方では、良性色素細胞母斑（母斑）は、老化細胞に非常に豊富であり、さらに生涯を通じて皮膚内に存在することができ、このことは老化細胞が組織内に安定に組み込まれ得ることを意味する。他方では、先天性免疫系成分がｉｎ  ｖｉｔｒｏで老化細胞を特異的に認識して排除し、ｉｎ  ｖｉｖｏで老化細胞を標的にして腫瘍の退縮および肝臓線維症の逆転を生じることが以前に示されている（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。したがって、老化細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで代謝回転し得、免疫系はこの代謝回転に寄与する。免疫系が老化細胞を認識して排除しようとすることにより、直接ではないが、老化細胞が生物にとって有害であり、排除することが有益であることが示唆される。 
【０００４】
ここ１０年間で、複数の研究によって老化の誘導または老化表現型の迂回に必要な遺伝子および経路が同定されている。ｐ５３（ＴＰ５３）およびｐ１６ＩＮＫ４ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）によって調節される２つの腫瘍抑制因子経路は、老化応答を制御する。ｐ５３は増殖を阻害する遺伝子のトランス活性化によって老化を促進する一方で、ｐ１６ＩＮＫ４ａはｐ５３に伴ってｐ２１（ＣＤＫＮ１Ａ）をターゲティングし、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）２および４を阻害し、それにより、ｐＲＢリン酸化の防止および抑制性のヘテロクロマチン形成の促進が生じて増殖関連遺伝子をサイレンシングする。 
【０００５】
Ｂｃｌ−２−ファミリータンパク質は、細胞死の制御において中心的役割を果たし、アポトーシス、壊死、および自食作用を含む多様な細胞死機構を制御することができる（非特許文献５；非特許文献６）。老化における最初のファミリーメンバー（Ｂｃｌ−２）の機能については、依然として議論の余地がある。Ｂｃｌ−２は、老化細胞を上方制御または下方制御すると提案され、これらの細胞のアポトーシスの負または正の制御のいずれかに関連していた（非特許文献７；非特許文献８）。Ｂｃｌ−２に加えて、このファミリーは、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ−１、およびＡ１を含み、癌における薬理学的介入のための標的として集中的に研究されている（非特許文献９；非特許文献１０）。 
【０００６】
特許文献１は、癌処置のためのＢｃｌ−ｘＬを下方制御する化学物質を教示している。 
【０００７】
特許文献２は、癌処置のためのＢｃｌ−２ファミリーメンバーに対してターゲティングされるｄｓＲＮＡを含む薬学的組成物を教示している。 
【０００８】
特許文献３は、Ｂｃｌ−ｘＬおよびｐ−２１が含まれる多数の遺伝子に対してターゲティングされるｓｉＲＮＡの投与を教示している。 
【０００９】
特許文献４は、癌処置のためのｐ−２１を下方制御する化学物質の投与を教示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１２０１８９５３９号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４０００１８１１号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００７０２５８９５２号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１１０３０１１９２号明細書
【非特許文献】
【００１１】
（非特許文献１）Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１
（非特許文献２）Ｋｒｉｚｈａｎｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００８ｂ
（非特許文献３）Ｓａｇｉｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２
（非特許文献４）Ｘｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７
（非特許文献５）Ｃｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３
（非特許文献６）Ｒｅｅｄ，２００８
（非特許文献７）Ｕｒａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１
（非特許文献８）Ｗａｎｇ，１９９５
（非特許文献９）Ａｚｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１
（非特許文献１０）Ｚｅｉｔｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、炎症性疾患または線維性疾患の処置を必要とする被験体における炎症性疾患または線維性疾患を処置する方法であって、治療有効量のＢｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗの活性および／または量を下方制御する薬剤を前記被験体に投与し、それにより、前記炎症性疾患または線維性疾患を処置する工程を含み、但し、前記炎症性疾患が癌ではないことを条件とする、方法を提供する。本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、
（ｉ）Ｂｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗの活性および／または量を下方制御する薬剤；および （ｉｉ）ｐ２１の活性および／または量を下方制御する薬剤
を含む製品を提供する。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、薬学的に許容され得るキャリアおよび活性薬剤としての以下：
（ｉ）Ｂｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗの活性および／または量を下方制御する薬剤；および （ｉｉ）ｐ２１の活性および／または量を下方制御する薬剤
を含む薬学的組成物を提供する。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、疾患が癌でない炎症性疾患または線維性疾患の処置で用いるサイクリン依存性キナーゼインヒビター１（ｐ２１）の活性および／または量を下方制御する薬剤を提供する。 
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、炎症性疾患または線維性疾患の処置で用いるＢｃｌ−ｘＬを発現する内因性核酸配列を下方制御するポリヌクレオチド薬およびＢｃｌ−ｗを発現する内因性核酸配列を下方制御するポリヌクレオチド薬を提供する。 
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、キャリア、ｐ２１の活性および／または量を下方制御する少なくとも１つの活性薬剤、ならびにＢｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗの活性および／または量を下方制御する少なくとも１つの活性薬剤を含む組成物であって、前記組成物が局所投与のために処方されている、組成物を提供する。 
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、炎症性疾患または線維性疾患の処置を必要とする被験体における炎症性疾患または線維性疾患を処置する方法であって、治療有効量のサイクリン依存性キナーゼインヒビター１（ｐ２１）の活性および／または量を下方制御する薬剤を前記被験体に投与し、それにより、前記炎症性疾患または線維性疾患を処置する工程を含み、但し、前記疾患が癌ではないことを条件とする、方法を提供する。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、炎症性疾患または線維性疾患の処置を必要とする被験体における炎症性疾患または線維性疾患を処置する方法であって、治療有効量のＢｃｌ−ｘＬを発現する内因性核酸配列を下方制御する少なくとも１つのポリヌクレオチド薬およびＢｃｌ−ｗを発現する内因性核酸配列を下方制御する少なくとも１つのポリヌクレオチド薬を前記被験体に投与し、それにより、前記炎症性疾患または線維性疾患を処置する工程を含む、方法を提供する。 
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、前悪性病変の処置を必要とする被験体における前悪性病変を処置する方法であって、治療有効量のＢｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗの活性および／または量を下方制御する薬剤を前記被験体に投与し、それにより、前記前悪性病変を処置する工程を含む、方法を提供する。 
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、前悪性病変の処置を必要とする被験体における前悪性病変を処置する方法であって、治療有効量のサイクリン依存性キナーゼインヒビター１（ｐ２１）の活性および／または量を下方制御する薬剤を前記被験体に投与し、それにより、前記前悪性病変を処置する工程を含む、方法を提供する。 
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、薬剤は化学物質である。 
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、薬剤は、Ｂｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗに対してターゲティングされるポリヌクレオチド薬である。 
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、疾患は軟骨変性に関連する。 
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、疾患は、肝臓線維症、創傷治癒、皮膚線維症、肺疾患、骨粗鬆症、腎臓線維症、前立腺炎、アテローム性動脈硬化症、関節炎、および膵炎からなる群から選択される。 
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、肺疾患は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む。 
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｂｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗの活性および／または量を下方制御する薬剤は、ｐ２１の活性および／または量を下方制御する薬剤と異なるパッケージングに含まれる。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｂｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗの活性および／または量を下方制御する薬剤は、ｐ２１の活性および／または量を下方制御する薬剤と同一のパッケージングに含まれる。 
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、製品は、皮脂調節剤、抗菌薬および／または抗真菌薬、角質溶解薬および／または角質調節剤、収斂薬、抗炎症剤および／または抗刺激剤、抗酸化剤および／またはフリーラジカル消去剤、瘢痕形成剤、老化防止剤、および保湿剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤をさらに含む。 
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの薬剤は老化防止剤である。 
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、薬学的組成物を局所送達のために処方する。 
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ポリヌクレオチド薬はｓｉＲＮＡ薬である。 
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｂｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗの活性および／または量を下方制御する少なくとも１つの活性薬剤はＡＢＴ−７３７またはＡＢＴ−２６３である。 
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、組成物は、皮脂調節剤、抗菌薬および／または抗真菌薬、角質溶解薬および／または角質調節剤、収斂薬、抗炎症剤および／または抗刺激剤、抗酸化剤および／またはフリーラジカル消去剤、瘢痕形成剤、老化防止剤、および保湿剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤をさらに含む。 
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの薬剤は老化防止剤である。 
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、薬剤は、ｐ２１を発現する内因性核酸配列に指向するポリヌクレオチドである。 
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ポリヌクレオチド薬はｓｉＲＮＡである。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は、Ｂｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗの活性および／または量を下方制御する少なくとも１つの薬剤を被験体に投与する工程をさらに含む。 
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの薬剤は、Ｂｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗを発現する内因性核酸配列に指向するポリヌクレオチドである。 
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、薬剤は、Ｂｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗに対して指向するｓｉＲＮＡである。 
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの薬剤は化学物質である。 
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、化学物質は、ＡＢＴ−７３７、ＡＢＴ−２６３、ゴッシポール、ＡＴ−１０１、ＴＷ−３７、およびオバトクラックスからなる群から選択される。 
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、疾患は軟骨変性に関連する。 
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、疾患は、肝臓線維症、創傷治癒、皮膚線維症、肺疾患、腎臓線維症、前立腺炎、アテローム性動脈硬化症、関節炎、および膵炎からなる群から選択される。 
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、薬剤を局所組成物として処方する。 
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのポリヌクレオチド薬はｓｉＲＮＡを含む。 
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、疾患は癌である。 
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、疾患は、肝臓線維症、創傷治癒、皮膚線維症、肺疾患、腎臓線維症、前立腺炎、アテローム性動脈硬化症、関節炎、および膵炎からなる群から選択される。 
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの薬剤を局所組成物として処方する。 
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は、ｐ２１の活性および／または量を下方制御する薬剤を被験体に投与する工程をさらに含む。
【００５０】
他で定義しない限り、本明細書中で使用した全ての技術用語および／または科学用語は、本発明に属する当業者によって一般的に理解されている意味を有する。本明細書中に記載の方法と材料に類似するか等価な方法と材料を本発明の実施形態の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料を以下に記載する。矛盾する場合、本明細書（定義が含まれる）に従うであろう。さらに、材料、方法、および例は、例示のみを目的とし、本発明を必然的に制限することを意図しない。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態を、ほんの一例として、添付の図面および画像を参照して本明細書中に記載する。ここで詳細な図面を具体的に参照することにより、示した特徴が本発明の実施形態の例示および考察の説明を目的とすることが強調される。これに関して、図面と共に記載した説明により、本発明の実施形態をどのようにして実施することができるかが当業者に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１Ａ】図１Ａは、老化細胞中のＢｃｌ−ｗタンパク質およびＢｃｌ−ｘＬタンパク質の発現の上昇を示す。ビヒクル処置した成長中の細胞に対応する細胞ライセート（ＩＭＲ−９０およびＭＥＦ）（Ｇ）、老化を誘導するためにエトポシドで処置した細胞（Ｅｔｏ）；空のベクターで形質導入した細胞（Ｖ）、またはＨ−ｒａｓｖ１２発現（Ｈ−ｒａｓｖ１２）レトロウイルスで形質導入した細胞の免疫ブロット。β−チューブリンをローディングコントロールとして使用した。
【図１Ｂ】図１Ｂは、老化細胞中のＢｃｌ−ｗタンパク質およびＢｃｌ−ｘＬタンパク質の発現の上昇を示す。Ａに記載のように処置したＩＭＲ−９０細胞に対して実施したＳＡ−β−ｇａｌ活性染色。
【図１Ｃ】図１Ｃは、老化細胞中のＢｃｌ−ｗタンパク質およびＢｃｌ−ｘＬタンパク質の発現の上昇を示す。Ａに記載のように処置したＩＭＲ−９０細胞中のＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｗ、およびＢｃｌ−ｘＬのｍＲＮＡレベルの定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析。値は平均＋ＳＥＭである。
【図２Ａ】図２Ａは、Ｂｃｌ−ｗおよびＢｃｌ−ｘＬの組み合わせノックダウンによって老化細胞の死滅が誘導されることを示す。エトポシド処置した老化ＩＭＲ−９０細胞を、表示のｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞生存度を、トランスフェクションの４日後に決定した。
【図２Ｂ】図２Ｂは、Ｂｃｌ−ｗおよびＢｃｌ−ｘＬの組み合わせノックダウンによって老化細胞の死滅が誘導されることを示す。エトポシド処置した老化細胞の表示のｓｉＲＮＡでのトランスフェクションの４日後のＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｗ、およびＢｃｌ−ｘＬの発現についてのウェスタンブロット分析。β−チューブリンをローディングコントロールとして使用した。
【図３Ａ】図３Ａは、Ｂｃｌ−ｗおよびＢｃｌ−ｘＬの組み合わせノックダウンが老化細胞死を誘導することを示す。エトポシド処置した老化ＩＭＲ−９０細胞を、表示のｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞生存度を、トランスフェクションの４日後に決定した。
【図３Ｂ】図３Ｂは、Ｂｃｌ−ｗおよびＢｃｌ−ｘＬの組み合わせノックダウンが老化細胞死を誘導することを示す。エトポシド処置した老化ＩＭＲ−９０細胞を、表示のｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、細胞を、１０μΜ  ＡＢＴ−１９９またはコントロールとしてのＤＭＳＯで２４時間処置した。細胞生存度を、インキュベーション期間の終了時に決定した。
【図３Ｃ】図３Ｃは、Ｂｃｌ−ｗおよびＢｃｌ−ｘＬの組み合わせノックダウンが老化細胞死を誘導することを示す。成長中のビヒクル処置（Ｇ）、老化エトポシド処置（Ｅ）、空のベクターでの形質導入（Ｖ）、またはＨ−ｒａｓＶ１２発現（Ｈ−ｒａｓＶ１２）レトロウイルスでの形質導入を行ったＩＭＲ−９０細胞を、ＡＢＴ−１９９で２４時間処置した。細胞生存度を、インキュベーション期間の終了時に決定した。Ｂｃｌ−２阻害に感受性を示すＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を処置のポジティブコントロールとして使用した。
【図３Ｄ】図３Ｄは、Ｂｃｌ−ｗおよびＢｃｌ−ｘＬの組み合わせノックダウンが老化細胞死を誘導することを示す。成長中のビヒクル処置（Ｇ）、老化エトポシド処置（Ｅ）、空のベクターでの形質導入（Ｖ）、またはＨ−ｒａｓＶ１２発現（Ｈ−ｒａｓＶ１２）レトロウイルスでの形質導入を行ったＭＥＦ細胞を、ＡＢＴ−１９９で２４時間処置した。細胞生存度を、インキュベーション期間の終了時に決定した。
【図４Ａ】図４Ａは、ＢＨ３模倣ＡＢＴ−７３７が老化細胞の細胞死を誘導することを示す。成長中（Ｇ）、エトポシド処置（Ｅｔｏ）、空のベクターでの形質導入（Ｖ）、またはＨ−ｒａｓＶ１２発現（Ｈ−ｒａｓＶ１２）レトロウイルスでの形質導入を行ったＩＭＲ−９０細胞を、表示の用量のＡＢＴ−７３７またはコントロールとしてのＤＭＳＯで２４時間処置した。細胞生存度を、インキュベーション期間の終了時に決定した。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＢＨ３模倣ＡＢＴ−７３７が老化細胞の細胞死を誘導することを示す。成長中（Ｇ）、エトポシド処置（Ｅｔｏ）、空のベクターでの形質導入（Ｖ）、またはＨ−ｒａｓＶ１２発現（Ｈ−ｒａｓＶ１２）レトロウイルスでの形質導入を行ったＭＥＦ細胞を、表示の用量のＡＢＴ−７３７またはコントロールとしてのＤＭＳＯで２４時間処置した。細胞生存度を、インキュベーション期間の終了時に決定した。
【図５Ａ】図５Ａは、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋの存在下または非存在下でＡＢＴ−７３７またはコントロールとしてのＤＭＳＯで２４時間処置した成長中（Ｇ）、エトポシド処置（Ｅｔｏ）、またはＨ−ｒａｓｖ１２（Ｒａｓ）発現レトロウイルスでの形質導入を行ったＩＭＲ−９０細胞を示す。細胞生存度を、インキュベーション期間の終了時に決定した。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋの存在下または非存在下でＡＢＴ−７３７またはコントロールとしてのＤＭＳＯで２４時間処置した成長中（Ｇ）、エトポシド処置（Ｅｔｏ）、またはＨ−ｒａｓｖ１２（Ｒａｓ）発現レトロウイルスでの形質導入を行ったＩＭＲ−９０細胞を示す。（Ｂ）表示のようにＤＭＳＯ、ＡＢＴ−７３７、またはＡＢＴ−７３７＋ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋの存在下での成長中の細胞（Ｇ）、エトポシド処置細胞（Ｅｔｏ）、またはＨ−ｒａｓｖ１２（Ｒａｓ）発現レトロウイルスで形質導入した細胞に対応する細胞ライセートの免疫ブロットを示す。β−チューブリンをローディングコントロールとして使用した。
【図６Ａ】６Ａは、ｐ２１が老化細胞の生存度に影響を及ぼすことを示す。成長中（Ｇ）およびエトポシド（Ｅｔｏ）処置した初代のヒト（ＩＭＲ−９０、ＢＪ）およびマウス（ＭＥＦ）の線維芽細胞ならびに肺癌細胞（Ｈ１２９９）を、ｐ２１に対するｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞生存度を、トランスフェクションの４日後に決定した。
【図６Ｂ】６Ｂは、ｐ２１が老化細胞の生存度に影響を及ぼすことを示す。成長中（Ｇ）およびエトポシド（Ｅｔｏ）処置した初代のヒト（ＩＭＲ−９０、ＢＪ）およびマウス（ＭＥＦ）の線維芽細胞ならびに肺癌細胞（Ｈ１２９９）を、ｐ２１に対するｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞生存度を、トランスフェクションの４日後に決定した。
【図６Ｃ】６Ｃは、ｐ２１が老化細胞の生存度に影響を及ぼすことを示す。成長中（Ｇ）およびエトポシド（Ｅｔｏ）処置した初代のヒト（ＩＭＲ−９０、ＢＪ）およびマウス（ＭＥＦ）の線維芽細胞ならびに肺癌細胞（Ｈ１２９９）を、ｐ２１に対するｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞生存度を、トランスフェクションの４日後に決定した。
【図６Ｄ】６Ｄは、ｐ２１が老化細胞の生存度に影響を及ぼすことを示す。成長中（Ｇ）およびエトポシド（Ｅｔｏ）処置した初代のヒト（ＩＭＲ−９０、ＢＪ）およびマウス（ＭＥＦ）の線維芽細胞ならびに肺癌細胞（Ｈ１２９９）を、ｐ２１に対するｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞生存度を、トランスフェクションの４日後に決定した。
【図６Ｅ】６Ｅは、ｐ２１が老化細胞の生存度に影響を及ぼすことを示す。成長中（Ｇ）およびエトポシド（Ｅｔｏ）処置した初代のヒト（ＩＭＲ−９０、ＢＪ）およびマウス（ＭＥＦ）の線維芽細胞ならびに肺癌細胞（Ｈ１２９９）を、ｐ２１に対するｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞生存度を、トランスフェクションの表示の時点で決定した。
【図７Ａ】図７Ａは、ｐ２１がｐ５３およびｐＲＢに依存しない様式で老化細胞の生存度を維持することを示す。ｐ２１のｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡでの成長中の細胞（Ｇ）およびエトポシド処置したＢＪ細胞（Ｅｔｏ）のトランスフェクションの４日後の表示のタンパク質についてのウェスタンブロット分析を示す。β−チューブリンをローディングコントロールとして使用した。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ｐ２１がｐ５３およびｐＲＢに依存しない様式で老化細胞の生存度を維持することを示す。エトポシド処置したＢＪ細胞を、表示のｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞生存度を、トランスフェクションの４日後に決定した。同時に、細胞ライセートを回収し、ウェスタンブロットによって分析して表示のタンパク質の効率的なノックダウンを検証した。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ｐ２１がｐ５３およびｐＲＢに依存しない様式で老化細胞の生存度を維持することを示す。エトポシド処置したＢＪ細胞を、表示のｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞生存度を、トランスフェクションの４日後に決定した。同時に、細胞ライセートを回収し、ウェスタンブロットによって分析して表示のタンパク質の効率的なノックダウンを検証した。
【図８】図８は、カスパーゼ活性の阻害が老化細胞をアポトーシスから部分的に救済することを示すグラフである。エトポシド処置したＢＪ細胞を、ｓｉｐ２１またはコントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞を、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（毎日補充する）の存在下または非存在下で４日間インキュベートした。細胞生存度を、インキュベーション期間の終了時に決定した。
【図９Ａ】図９Ａは、Ｅ２Ｆ標的および炎症遺伝子がｐ２１ノックダウンに応答して上方制御されることを示す。表示の遺伝子についての成長中のＢＪ細胞（Ｇ）およびエトポシド（Ｅｔｏ）処置したＢＪ細胞のｍＲＮＡレベルの定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析。ＧＡＰＤＨｍＲＮＡを基準として使用した。データを、３回の独立したＲＴ−ＰＣＲ分析の平均＋ＳＥＭとして示した。
【図９Ｂ】図９Ｂは、Ｅ２Ｆ標的および炎症遺伝子がｐ２１ノックダウンに応答して上方制御されることを示す。表示の遺伝子についての成長中のＢＪ細胞（Ｇ）およびエトポシド（Ｅｔｏ）処置したＢＪ細胞のｍＲＮＡレベルの定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析。ＧＡＰＤＨｍＲＮＡを基準として使用した。データを、３回の独立したＲＴ−ＰＣＲ分析の平均＋ＳＥＭとして示した。
【図９Ｃ】図９Ｃは、Ｅ２Ｆ標的および炎症遺伝子がｐ２１ノックダウンに応答して上方制御されることを示す。表示の遺伝子についての成長中のＢＪ細胞（Ｇ）およびエトポシド（Ｅｔｏ）処置したＢＪ細胞のｍＲＮＡレベルの定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析。ＧＡＰＤＨｍＲＮＡを基準として使用した。データを、３回の独立したＲＴ−ＰＣＲ分析の平均＋ＳＥＭとして示した。
【図９Ｄ】図９Ｄは、Ｅ２Ｆ標的および炎症遺伝子がｐ２１ノックダウンに応答して上方制御されることを示す。表示の遺伝子についての成長中のＢＪ細胞（Ｇ）およびエトポシド（Ｅｔｏ）処置したＢＪ細胞のｍＲＮＡレベルの定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析。ＧＡＰＤＨｍＲＮＡを基準として使用した。データを、３回の独立したＲＴ−ＰＣＲ分析の平均＋ＳＥＭとして示した。
【図９Ｅ】図９Ｅは、Ｅ２Ｆ標的および炎症遺伝子がｐ２１ノックダウンに応答して上方制御されることを示す。表示の遺伝子についての成長中のＢＪ細胞（Ｇ）およびエトポシド（Ｅｔｏ）処置したＢＪ細胞のｍＲＮＡレベルの定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析。ＧＡＰＤＨｍＲＮＡを基準として使用した。データを、３回の独立したＲＴ−ＰＣＲ分析の平均＋ＳＥＭとして示した。
【図１０】図１０は、ｐ２１ノックアウトマウスにおいて老化細胞および線維性瘢痕の両方の存在が減少したことを示す写真である。野生型マウスおよびｐ２１−／−（ノックアウト）マウスを、線維症を誘導するためのＣＣ１４での６週間の処置に供した。処置後、肝臓を、老化細胞の存在についてはＳＡ−β−ｇａｌによって評価し、線維性瘢痕形成についてはシリウスレッド染色によって評価した。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
発明の特定の実施形態の説明 
【００５４】
本発明は、そのいくつかの実施形態では、加齢性障害の処置のためのＢｃｌ−２−ファミリータンパク質および／またはｐ２１をコードする遺伝子の下方制御によって老化細胞を死滅させる方法に関する。 本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明が以下の説明に記載されるか実施例によって例示される詳細な説明に必ずしも制限されないことを理解すべきである。本発明は、他の実施形態を種々の方法で実施または実行することが可能である。 
【００５５】
老化細胞を、皮膚、肝臓，肺、膵臓、前立腺の線維性疾患または炎症性疾患、ならびに関節軟骨、アテローム斑、および他の年齢関連疾患で見出すことができる。さらに、老化細胞は、老化に伴って正常組織、特に皮膚に蓄積することが示されており、組織の老化に寄与することが示唆された。したがって、老化細胞の排除により、多数の組織の老化を有意に遅延させ、老化細胞が存在する病的状態を処置することができる。
【００５６】
本発明者らは、ｓｉＲＮＡ（図２Ａ〜Ｂおよび３Ａ〜Ｂ）またはＢｃｌ−２ファミリーの特異的インヒビター（ＡＢＴ−７３７；図４Ａ〜Ｂおよび５Ａ〜Ｂ）のいずれかによるＢｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−ｗの組み合わせ阻害によって老化細胞が特異的に排除されることを示した。Ｂｃｌ−２自体の阻害ではこの課題を実行することはできない（図３Ｃ〜Ｄ）。したがって、本発明者らは、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−ｗの組み合わせ阻害により老化細胞の特異的排除が可能であり、この組み合わせ阻害を使用して老化細胞が存在する疾患を処置することができると提案する。 
【００５７】
驚いたことに、本発明者らは、典型的には（ＣＤＫ４およびＣＤＫ２のインヒビターとして）老化開始および腫瘍抑制に関連するタンパク質であるｐ２１の発現の低下（図６Ａ〜Ｅおよび図７Ａ〜Ｃ）によって老化細胞に同一の影響を及ぼすことができることを発見した。成長中の細胞におけるｐ２１ノックダウンが細胞生存度に悪影響を及ぼさなかったのに対して、老化細胞におけるそのノックダウンによりＩＭＲ−９０細胞、ＢＪ細胞、Ｈ１２９９細胞、およびＭＥＦ細胞の各々について細胞生存度が３０％、５０％、７５％、および３０％減少した（図６Ａ）。したがって、本発明者らは、ｐ２１が老化細胞の生存度を維持するために必要であることを提案する。 
【００５８】
ＲＢタンパク質リン酸化のインヒビターとしてのｐ２１の機能から予想されるように、ｐ２１ノックダウンに応答して細胞周期のＥ２Ｆ媒介制御に関連する遺伝子（例えば、サイクリン−Ａ２およびＣＤＫ−１）のｍＲＮＡレベルが有意に増加した（図９）。さらに、予想外に、ｐ２１ノックダウンによりＩＬ−８およびＩＬ−１βのｍＲＮＡレベルが増加することが見出され、これは老化細胞死に関与する炎症応答を示す。したがって、本発明者らは、ｐ２１ノックダウンが老化細胞における炎症誘発性応答および細胞死を誘導すると結論づけた。このことにより、炎症性サイトカインが免疫系に動員されてノックダウン自体によって排除されなかった細胞を死滅させるので、その治療能が増大し得る。 
【００５９】
したがって、本発明者らは、ｐ２１ノックダウンによって誘導される炎症誘発性応答を伴うＢｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−ｗを下方制御する（それにより、細胞死を誘導する）薬剤による老化細胞におけるアポトーシスの直接的な誘導の組み合わせが、前悪性病変、損傷組織、および老化組織から老化細胞を有効に排除することを提案する。これにより、老化細胞が存在する種々の容態に重要な治療的影響を及ぼすであろう。
【００６０】
したがって、本発明の１つの態様によれば、炎症性疾患または線維性疾患の処置を必要とする被験体における炎症性疾患または線維性疾患を処置する方法であって、治療有効量のＢｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗおよび／またはｐ２１の活性および／または量を下方制御する薬剤を被験体に投与する工程を含む方法を提供する。 
【００６１】
用語「Ｂｃｌ−ｘＬ」は、配列番号２１に記載の配列ならびにそのホモログおよびオルソログを有するＢ細胞リンパ腫−エクストララージとしても公知のヒトタンパク質をいう。ヒトＢｃｌ−ｘＬのｃＤＮＡ配列を配列番号２２に記載する。 
【００６２】
用語「Ｂｃｌ−ｗ」は、配列番号２３に記載の配列ならびにそのホモログおよびオルソログを有するＢｃｌ−２様タンパク質２としても公知のヒトタンパク質をいう。ヒトＢｃｌ−ｗのｃＤＮＡ配列を配列番号２４に記載する。 
【００６３】
「サイクリン依存性キナーゼインヒビター１」としても公知の用語「ｐ２１」は、配列番号２５に記載の配列ならびにそのホモログおよびオルソログを有するヒトタンパク質をいう。ヒトｐ２１のｃＤＮＡ配列を配列番号２６に記載する。 
【００６４】
特定の実施形態によれば、本方法は、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−ｗの下方制御を含む。 
【００６５】
別の実施形態によれば、本方法は、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗ、およびｐ２１のそれぞれの下方制御を含む。 
【００６６】
さらに別の実施形態によれば、本方法は、ｐ−２１の下方制御およびＢｃｌ−ｘＬの下方制御を含む。 
【００６７】
さらに別の実施形態によれば、本方法は、ｐ−２１の下方制御およびＢｃｌ−ｗの下方制御を含む。 
【００６８】
本明細書中で使用する場合、標的タンパク質の「活性および／または量の下方制御」という句は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、またはさらに少なくとも９０％の下方制御をいう。さらに、用語「下方制御」はまた、完全な阻害をいうことができる。 
【００６９】
Ｂｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗおよび／またはｐ２１の下方制御を、化学物質を使用して行うことができる。Ｂｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗの活性を減少させることが公知の化学物質には、ＡＢＴ−７３７、ＡＢＴ−２６３、ゴッシポール、ＡＴ−１０１、ＴＷ−３７、およびオバトクラックスが含まれる。 
【００７０】
特定の実施形態によれば、薬剤はＡＢＴ−７３７またはＡＢＴ−２６３である。
【００７１】
ＡＢＴ−７３７およびＡＢＴ−２６３（ＡＢＴ−２６３は、「ノバトクラックス」（Ａｂｂｏｔ）と呼ばれる生物学的に利用可能な形態である）は、現在、多発性骨髄腫、リンパ腫、急性白血病、ＣＬＬ、小細胞肺癌について第ＩＩ相（フェーズ）試験中である。 
【００７２】
ゴッシポール（天然）は、頭頸部腫瘍、膵臓癌について第ＩＩ／第ＩＩＩ相試験中である。 
【００７３】
ＡＴ−１０１（ゴッシポール誘導体；Ａｓｃｅｎｔａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）は、膵臓癌、頭頸部癌、神経膠腫について第ＩＩ／ＩＩＩ相試験中である。 
【００７４】
ＴＷ−３７（Ｕｎｉ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ）は、膵臓癌、リンパ腫について第ＩＩ相試験中である。 
【００７５】
オバトクラックス（ＧＸ１５−０７０ＭＳ；Ｇｅｍｉｎ  Ｘ、その後セファロン、現在Ｔｅｖａ）は、骨髄腫、骨髄線維症、およびマントル細胞リンパ腫について第ＩＩ相試験中である。 
【００７６】
ｐ２１の活性を下方制御する化学物質の例は、米国特許出願公開第２０１１０３０１１９２号明細書（本明細書中で参照として援用される）に開示されている。 
【００７７】
Ｂｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗおよび／またはｐ２１を、転写および／または翻訳を干渉する種々の分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング剤、リボザイム、ＤＮＡザイム、およびアンチセンス）を使用してゲノムおよび／または転写レベルで下方制御するか、例えば、アンタゴニストおよびポリペプチドを切断する酵素などを使用してタンパク質レベルで下方制御することもできる。 
【００７８】
以下は、Ｂｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗおよび／またはｐ２１の発現レベルおよび／または活性を下方制御することができる薬剤のリストである。 
【００７９】
Ｂｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗおよび／またはｐ２１を下方制御することができる薬剤の一例は、これらに特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントである。好ましくは、抗体は細胞によって内在化され得る。 
【００８０】
用語「抗体」には、本発明で使用する場合、マクロファージに結合することができるインタクトな分子ならびにその機能的フラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖなど）が含まれる。これらの機能的抗体フラグメントを以下のように定義する：（１）Ｆａｂ（抗体分子の一価の抗原結合フラグメントを含み、全抗体を酵素パパインで消化してインタクトな軽鎖および１つの重鎖の一部を生成することによって産生することができるフラグメント）；（２）Ｆａｂ’（全抗体をペプシンで処理しその後に還元してインタクトな軽鎖および重鎖の一部を生成することによって得ることができる抗体分子のフラグメント；１抗体分子あたり２つのＦａｂ’フラグメントが得られる）；（３）（Ｆａｂ’）２（全抗体を酵素ペプシンで処理しその後の還元を行わないことによって得ることができる抗体のフラグメント；Ｆ（ａｂ’）２は２つのジスルフィド結合によって相互に保持された２つのＦａｂ’フラグメントの二量体である）；（４）Ｆｖ（２つの鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作されたフラグメントとして定義される）；および（５）単鎖抗体（「ＳＣＡ」）（遺伝子融合された単鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された分子）。 
【００８１】
Ｂｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗおよび／またはｐ２１を、ＲＮＡサイレンシングによって下方制御することもできる。本明細書中で使用する場合、句「ＲＮＡサイレンシング」は、結果的に対応するタンパク質コード遺伝子の発現が抑制または「サイレンシング」されるＲＮＡ分子によって媒介される調節機構群（例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、転写遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、クエリング、相互抑制、および翻訳抑制）をいう。ＲＮＡサイレンシングは、多数の生物タイプ（植物、動物、および真菌が含まれる）で認められている。 
【００８２】
本明細書中で使用する場合、用語「ＲＮＡサイレンシング薬」は、標的遺伝子の発現を阻害または「サイレンシング」することができるＲＮＡをいう。一定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング薬は、転写後サイレンシング機構によってｍＲＮＡ分子の完全なプロセシング（例えば、完全な翻訳および／または発現）を防止することができる。ＲＮＡサイレンシング薬には、非コードＲＮＡ分子（例えば、対の鎖を含むＲＮＡ二重鎖）およびかかる小非コードＲＮＡを生成することができる前駆体ＲＮＡが含まれる。例示的なＲＮＡサイレンシング薬には、ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡなど）が含まれる。１つの実施形態では、ＲＮＡサイレンシング薬はＲＮＡ干渉を誘導することができる。別の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング薬は、翻訳抑制を媒介することができる。 
【００８３】
ＲＮＡ干渉は、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって媒介された動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシング過程をいう。植物における対応する過程を、一般に、転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡサイレンシングといい、真菌においてはクエリングともいう。転写後遺伝子サイレンシング過程は、外来遺伝子の発現を防止するために使用される進化的に保存された細胞防御機構と考えられ、一般に、多様な植物相および門で共有されている。かかる外来遺伝子発現からの防御は、相同な一本鎖ＲＮＡまたはウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答を介した宿主ゲノム内へのウイルス感染またはトランスポゾンエレメントの無作為な取り込みに由来する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の産生に応答して進化したかもしれない。 
【００８４】
細胞内に長いｄｓＲＮＡが存在することにより、ダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性が刺激される。ダイサーは、ｄｓＲＮＡの短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として公知のｄｓＲＮＡの短片へのプロセシングに関与する。ダイサー活性由来の短干渉ＲＮＡは、典型的には、約２１〜約２３ヌクレオチド長であり、約１９塩基対の二重鎖を含む。ＲＮＡｉ応答はまた、一般に、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とし、この複合体は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で切断される。 
【００８５】
したがって、本発明は、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を下方制御するためのｄｓＲＮＡの使用を意図する。 
【００８６】
１つの実施形態によれば、ｄｓＲＮＡは３０ｂｐを超える。長ｄｓＲＮＡ（すなわち、３０ｂｐを超えるｄｓＲＮＡ）は、これらのより長い二本鎖ＲＮＡ領域によってインターフェロンおよびＰＫＲ応答が誘導されると考えられており、その使用は非常に制限されてきた。しかし、長ｄｓＲＮＡの使用により、細胞が多数のｓｉＲＮＡを試験する必要性を軽減する最適なサイレンシング配列を選択することができるという点、長ｄｓＲＮＡによりサイレンシングライブラリーがｓｉＲＮＡにおいて必要とされるよりも複雑でないという点、および、おそらく、もっとも重要なことは、長ｄｓＲＮＡは治療薬として使用した場合にウイルス回避変異を防止することができるという点で多数の利点を得ることができる。 
【００８７】
種々の研究において、長ｄｓＲＮＡを使用してストレス応答の誘導や有意なオフターゲット効果を生じることなく遺伝子発現をサイレンシングすることができることが示されている（例えば、Ｓｔｒａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．１３  ３８０３−３８１０；Ｂｈａｒｇａｖａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００４；１３：１１５−１２５；Ｄｉａｌｌｏ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．２００３；１３：３８１−３９２；Ｐａｄｄｉｓｏｎ  Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００２；９９：１４４３−１４４８；Ｔｒａｎ  Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２００４；５７３：１２７−１３４を参照のこと）。 
【００８８】
特に、本発明はまた、インターフェロン経路が活性化されない細胞（例えば、胚細胞および卵母細胞）における遺伝子サイレンシングのための長ｄｓＲＮＡ（３０塩基超の転写物）の誘導を意図する（例えば、Ｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２００１，Ｖｏｌ  ９８，ｐａｇｅｓ  １４４２８−１４４３３およびＤｉａｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｏｃｔｏｂｅｒ  １，２００３，１３（５）：３８１−３９２．ｄｏｉ：１０．１０８９／１５４５４５７０３３２２６１７０６９を参照のこと）。 
【００８９】
本発明はまた、遺伝子発現を下方制御するためのインターフェロンおよびＰＫＲ経路を誘導しないように特異的にデザインされた長ｄｓＲＮＡの導入を意図する。例えば、Ｓｈｉｎａｇｗａ  ａｎｄ  Ｉｓｈｉｉ（Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１７（１１）：１３４０−１３４５，２００３）は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）プロモーター由来の長二本鎖ＲＮＡを発現するためのｐＤＥＣＡＰと呼ばれるベクターを開発した。ｐＤＥＣＡＰ由来の転写物が細胞質へのｄｓＲＮＡ排出を容易にする５’−ｃａｐ構造および３’−ポリ（Ａ）テールの両方を欠くので、ｐＤＥＣＡＰ由来の長ｄｓ−ＲＮＡはインターフェロン応答を誘導しない。 
【００９０】
哺乳動物系におけるインターフェロンおよびＰＫＲ経路の別の回避方法は、トランスフェクションまたは内因性発現のいずれかを介した小阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の導入による方法である。 
【００９１】
用語「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する小阻害ＲＮＡ二重鎖（一般に、１８〜３０塩基対）をいう。典型的には、ｓｉＲＮＡは、中央の１９ｂｐ二重鎖領域および末端の対称性の２塩基の３’−オーバーハングを有する２１量体として化学合成されるが、２５〜３０塩基長の化学合成されたＲＮＡ二重鎖は同一の位置の２１量体と比較して効力が１００倍も増加し得ることが最近記載されている。ＲＮＡｉ誘発においてより長いＲＮＡを使用して得られる効力の増加は、産物（２１量体）の代わりに基質（２７量体）をダイサーに提供することに起因し、これによりＲＩＳＣ内へのｓｉＲＮＡ二重鎖の侵入の速度または効率が改善されると理論立てられる。 
【００９２】
３’−オーバーハングの位置がｓｉＲＮＡの効力に影響を及ぼし、アンチセンス鎖上に３’−オーバーハングを有する対称性の二重鎖が一般にセンス鎖上に３’−オーバーハングを有するものより効力が高いことが見出されている（Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。反対の有効性パターンがアンチセンス転写物のターゲティング時に認められるので、これはＲＩＳＣ中への非対称性鎖負荷に寄与し得る。 
【００９３】
１つを超えるｓｉＲＮＡ薬を使用してＢｃｌ−ｘＬまたはＢｃｌ−ｗおよび／またはｐ２１をターゲティングすることができると認識されるであろう。したがって、本発明は、各ｓｉＲＮＡがＢｃｌ−ｘＬ遺伝子中の異なる配列をターゲティングする、少なくとも２つのＢｃｌ−ｘＬをターゲティングするｓｉＲＮＡ、少なくとも３つのＢｃｌ−ｘＬをターゲティングするｓｉＲＮＡ、または、さらに少なくとも４つのＢｃｌ−ｘＬをターゲティングするｓｉＲＮＡの使用を意図する。さらに、本発明は、各ｓｉＲＮＡがＢｃｌ−ｗ遺伝子中の異なる配列をターゲティングする、少なくとも２つのＢｃｌ−ｗをターゲティングするｓｉＲＮＡ、少なくとも３つのＢｃｌ−ｗをターゲティングするｓｉＲＮＡ、または、さらに少なくとも４つのＢｃｌ−ｗをターゲティングするｓｉＲＮＡの使用を意図する。さらに、本発明は、各ｓｉＲＮＡがｐ２１遺伝子中の異なる配列をターゲティングする、少なくとも２つのｐ２１をターゲティングするｓｉＲＮＡ、少なくとも３つのｐ２１をターゲティングするｓｉＲＮＡ、または、
さらに少なくとも４つのｐ２１をターゲティングするｓｉＲＮＡの使用を意図する。 
【００９４】
二本鎖干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の鎖を連結してヘアピン構造またはステム−ループ構造（例えば、ｓｈＲＮＡ）を形成することができる。したがって、記載のように、本発明のＲＮＡサイレンシング薬はまた、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり得る。 
【００９５】
用語「ｓｈＲＮＡ」は、本明細書中で使用する場合、第１および第２の相補配列領域を含むステム−ループ構造を有するＲＮＡ薬であって、前記領域の相補度および配向が前記領域間で塩基対合が起こるのに十分であり、前記第１および第２の領域がループ領域によって連結され、前記ループが前記ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）の間の塩基対合の欠如に起因する、ＲＮＡ薬をいう。ループ内のヌクレオチド数は、３〜２３、５〜１５、７〜１３、４〜９、または９〜１１の間の数およびこれらの範囲の両端の数である。ループ中のいくつかのヌクレオチドは、ループ中の他のヌクレオチドとの塩基対相互作用に関与し得る。ループを形成するために使用することができるオリゴヌクレオチド配列の例には、５’−ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ−３’（配列番号２７；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０）および５’−ＵＵＵＧＵＧＵＡＧ−３’（配列番号２８；Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＲＮＡ  ８：１４５４）が含まれる。得られた一本鎖オリゴヌクレオチドがＲＮＡｉ機構と相互作用することができる二本鎖領域を含むステム−ループ構造またはヘアピン構造を形成することが当業者に認識されるであろう。 
【００９６】
別の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング薬はｍｉＲＮＡであり得る。ｍｉＲＮＡは、種々のサイズの初期転写物をコードする遺伝子から作製された小ＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、動物および植物の両方で同定されている。初期転写物（「ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ」と呼ばれる）は、種々の核酸分解工程によってより短い前駆体ｍｉＲＮＡ、すなわち「ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ」にプロセシングされる。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは折りたたまれた形態で存在し、その結果最終的な（成熟）ｍｉＲＮＡが二重鎖で存在し、この二重鎖の２つの鎖はｍｉＲＮＡ（最終的に標的と塩基対を形成する鎖）と呼ばれる。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、前駆体からｍｉＲＮＡ二重鎖を除去するダイサー形態の基質であり、その後、ｓｉＲＮＡと同様に、二重鎖をＲＩＳＣ複合体内に取り入れることができる。ｍｉＲＮＡは遺伝子導入法によって発現することができ、完全な初期形態よりもむしろ前駆体形態の発現によって有効であり得ることが証明されている（Ｐａｒｉｚｏｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １８：２２３７−２２４２およびＧｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １７：１３７６−１３８６）。 
【００９７】
ｓｉＲＮＡと異なり、ｍｉＲＮＡは部分的にのみ相補性を示す転写配列に結合し（Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  ９：１３２７−１３３３）、定常状態のＲＮＡレベルに影響を及ぼすことなく翻訳を抑制する（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ  ７５：８４３−８５４；Ｗｉｇｈｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ  ７５：８５５−８６２）。ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの両方はダイサーによってプロセシングされ、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体の成分と会合する（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：８３４−８３８；Ｇｒｉｓｈｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃｅｌｌ  １０６：２３−３４；Ｋｅｔｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：２６５４−２６５９；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：６８８９−６８９４；Ｈａｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：１１４６−１１５０；Ｍｏｕｒｌａｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：７２０−７２８）。最近の報告（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ  ２９７：２０５６−２０６０）は、ｓｉＲＮＡ経路と比較してｍｉＲＮＡ経路による遺伝子制御が標的転写物に対する相補度のみによって決定されることが仮説として取り上げられている。ｍＲＮＡ標的と部分的にのみ同一なｓｉＲＮＡが、ｍｉＲＮＡと同様に、ＲＮＡ分解の誘発よりもむしろ翻訳抑制で機能すると推測されている。 
【００９８】
本発明との使用に適切なＲＮＡサイレンシング薬を、以下のように合成することができる。第１に、Ｂｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗのｍＲＮＡおよび／またはｐ２１配列を、ＡＡジヌクレオチド配列のＡＵＧ開始コドンを下流方向へスキャンする。各ＡＡおよび３’隣接１９ヌクレオチドの出現を、潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として記録する。非翻訳領域（ＵＴＲ）が調節タンパク質結合部位でより豊富であるので、好ましくは、ｓｉＲＮＡ標的部位を読み取り枠から選択する。ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体は、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合を干渉することができる（Ｔｕｓｃｈｌ  ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ．２：２３９−２４５）。ＧＡＰＤＨについて、５’ＵＴＲに指向するｓｉＲＮＡが細胞ＧＡＰＤＨｍＲＮＡの約９０％減少を媒介し、タンパク質レベルを完全に消滅させることが証明されているので、非翻訳領域に指向するｓｉＲＮＡも有効であり得ることが認識されるであろう。 
【００９９】
第２に、潜在的な標的部位を、任意の配列アラインメントソフトウェア（ＮＣＢＩサーバから利用可能なＢＬＡＳＴソフトウェア（ｗｗｗｄｏｔｎｃｂｉｄｏｔｎｌｍｄｏｔｎｉｈｄｏｔｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）など）を使用して適切なゲノムデータベース（例えば、ヒト、マウス、ラットなど）と比較する。他のコード配列と有意な相同性を示す推定標的部位を除去する。 
【０１００】
適格標的配列をｓｉＲＮＡ合成のテンプレートとして選択する。Ｇ／Ｃ含量が５５％より高い配列と比較して遺伝子サイレンシングの媒介に有効であることが証明されているので、好ましい配列はＧ／Ｃ含量が低い配列である。いくつかの標的部位を、評価のために標的遺伝子の長さに沿って選択することが好ましい。選択されたｓｉＲＮＡのより良好な評価のために、ネガティブコントロールを併せて使用することが好ましい。ネガティブコントロールｓｉＲＮＡは、好ましくは、ｓｉＲＮＡと同一のヌクレオチド組成を含むが、ゲノムとの有意な相同性を欠く。したがって、任意の他の遺伝子といかなる有意な相同性も示さないことを条件として、ｓｉＲＮＡのスクランブルヌクレオチド配列を使用することが好ましい。 
【０１０１】
例えば、Ｂｃｌ−ｘＬを下方制御することができる適切なｓｉＲＮＡは、配列番号２９、３０、または３１のｓｉＲＮＡであり得る。Ｂｃｌ−ｗを下方制御することができる適切なｓｉＲＮＡは、配列番号３２、３３、または３４のｓｉＲＮＡであり得る。ｐ２１を下方制御することができる適切なｓｉＲＮＡは、配列番号３５、３６、または３７のｓｉＲＮＡであり得る。 
【０１０２】
本発明のＲＮＡサイレンシング薬がＲＮＡのみを含む分子に限定される必要はないが、化学修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに含むと認識されるであろう。 
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本明細書中に提供したＲＮＡサイレンシング薬を、細胞透過性ペプチドと機能的に会合することができる。本明細書中で使用する場合、「細胞透過性ペプチド」は、細胞の細胞質および／または核膜を通過した膜透過性複合体の輸送に関連するエネルギー非依存性（すなわち、非エンドサイトーシス）転位置性を付与する短い（約１２〜３０残基）アミノ酸配列または機能的モチーフを含むペプチドである。本発明の膜透過性複合体で使用した細胞透過性ペプチドは、好ましくは、遊離しているか、ジスルフィド結合するように改変されている二本鎖リボ核酸とジスルフィド結合を形成するように誘導体化された少なくとも１つの非機能的システイン残基を含む。かかる性質を付与する代表的なアミノ酸モチーフは、米国特許第６，３４８，１８５号明細書（その内容が本明細書中で参考として明確に援用される）に列挙されている。本発明の細胞透過性ペプチドには、好ましくは、ペネトラチン、トランスポーチン（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）、ｐＩｓｌ、ＴＡＴ（４８−６０）、ｐＶＥＣ、ＭＴＳ、およびＭＡＰが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０４】
Ｂｃｌ−ｘＬまたはＢｃｌ−ｗまたはｐ２１を下方制御することができる別の薬剤は、ｍＲＮＡ転写物またはそのＤＮＡ配列を特異的に切断することができるＤＮＡザイム分子である。ＤＮＡザイムは、一本鎖および二本鎖の標的配列の両方を切断することができる一本鎖ポリヌクレオチドである（Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｒ．Ｒ．ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９５；２：６５５；Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．＆  Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９７；９４３：４２６２）。ＤＮＡザイムの一般的なモデル（「１０−２３」モデル）が提案されている。「１０−２３」ＤＮＡザイムは、７〜９個の各デオキシリボヌクレオチドの２つの基質認識ドメインに隣接した１５個のデオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを有する。このＤＮＡザイム型は、その基質ＲＮＡをプリン：ピリミジン連結部で効果的に切断することができる（Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．＆  Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９；ＤＮＡザイムのｒｅｖについては、Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ，ＬＭ（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ４：１１９−２１（２００２））を参照のこと）。 
【０１０５】
一本鎖および二本鎖の標的切断部位を認識する操作された合成ＤＮＡザイムの構築および増幅の例は、Ｊｏｙｃｅ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第６，３２６，１７４号明細書に開示されている。ヒトウロキナーゼ受容体に指向する類似のデザインのＤＮＡザイムは、ウロキナーゼ受容体発現を阻害し、結腸癌細胞転移を首尾よく阻害することが最近認められた（Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ，２０００２，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ４０９，Ａｎｎ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｇｅｎ  Ｔｈｅｒ  ｗｗｗｄｏｔａｓｇｔｄｏｔｏｒｇ）。別の出願では、ｂｃｒ−ａｂｌ癌遺伝子に相補的なＤＮＡザイムは、首尾よく白血病細胞における癌遺伝子発現を阻害し、ＣＭＬおよびＡＬＬの場合の自家骨髄移植における再発率を低下させた。 
【０１０６】
Ｂｃｌ−ｘＬまたはＢｃｌ−ｗまたはｐ２１を、Ｂｃｌ−ｘＬまたはＢｃｌ−ｗをコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリッド形成することができるアンチセンスポリヌクレオチドの使用によって下方制御することもできる。 
【０１０７】
アンチセンスアプローチに重要な２つの態様を考慮しながらＢｃｌ−ｘＬまたはＢｃｌ−ｗまたはｐ２１を効率的に下方制御するために使用することができるアンチセンス分子をデザインしなければならない。第１の態様は適切な細胞の細胞質内へのオリゴヌクレオチドの送達であり、第２の態様は細胞内の指定したｍＲＮＡにその翻訳を阻害する方法で特異的に結合するオリゴヌクレオチドのデザインである。 
【０１０８】
先行技術は、広範な種々の細胞型にオリゴヌクレオチドを効率的に送達させるために使用することができる多数の送達ストラテジーを教示している（例えば、Ｌｕｆｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ７６：７５−６（１９９８）；Ｋｒｏｎｅｎｗｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ９１：８５２−６２（１９９８）；Ｒａｊｕｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ８：９３５−４０（１９９７）；Ｌａｖｉｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２３７：５６６−７１（１９９７）およびＡｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２３１：５４０−５（１９９７）を参照のこと）。 
【０１０９】
さらに、標的ｍＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドの両方の構造変化のエネルギー論を説明する熱力学サイクルに基づいた標的ｍＲＮＡに対して最も高い推定結合親和性を有する配列を同定するためのアルゴリズムも利用可能である（例えば、Ｗａｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ６５：１−９（１９９９）を参照のこと）。 
【０１１０】
かかるアルゴリズムは、細胞におけるアンチセンスアプローチを実行するために首尾よく使用されている。例えば、Ｗａｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．によって開発されたアルゴリズムにより、科学者はウサギβ−グロビン（ＲＢＧ）転写物およびマウス腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）転写物のアンチセンスオリゴヌクレオチドを首尾よくデザインすることができた。この研究グループは、より最近に、動態学的ＰＣＲ技術によって評価した場合の細胞培養物中の３つのモデル標的ｍＲＮＡ（ヒト乳酸デヒドロゲナーゼＡおよびＢならびにラットｇｐｌ３０）に対する合理的に選択したオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性がほとんど全ての場合（ホスホジエステルオリゴヌクレオチドおよびホスホロチオアートオリゴヌクレオチドの化学的性質を有する２つの細胞型における３つの異なる標的に対する試験が含まれる）において有効であることが証明されたことを報告している。 
【０１１１】
さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を使用した特異的オリゴヌクレオチドのデザインおよび効率の予測のためのいくつかのアプローチも発表されている（Ｍａｔｖｅｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：１３７４−１３７５（１９９８））。 
【０１１２】
Ｂｃｌ−ｘＬまたはＢｃｌ−ｗまたはｐ２１を下方制御することができる別の薬剤は、Ｂｃｌ−ｘＬまたはＢｃｌ−ｗまたはｐ２１をコードするｍＲＮＡ転写物を特異的に切断することができるリボザイム分子である。リボザイムは、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡの切断による遺伝子発現の配列特異的阻害のために使用されつつある（Ｗｅｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：４８６−９６（１９９８））。任意の特異的標的ＲＮＡを切断するようにリボザイムをデザインできたことにより、リボザイムが基礎研究および治療への応用の両方における有益なツールとなっている。治療領域では、感染症におけるウイルスＲＮＡ、癌における優性癌遺伝子、および遺伝的障害における特異的体細胞変異をターゲティングするためにリボザイムが利用されている（Ｗｅｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｖｉｒｏｌ．１０：１６３−７１（１９９８））。最も注目すべきは、ＨＩＶ患者のためのいくつかのリボザイム遺伝子療法プロトコールは既に第Ｉ相試験中である。より最近では、トランスジェニック動物研究、遺伝子標識の検証、および経路の解明のためにリボザイムが使用されている。いくつかのリボザイムは、臨床試験の種々の段階にある。アンギオザイムは、ヒト臨床試験で研究するために最初に化学合成されたリボザイムであった。アンギオザイムは、ＶＥＧＦ−ｒ（血管内皮成長因子受容体）（血管形成経路における重要成分）の形成を特異的に阻害する。Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．および他の企業は、動物モデルにおける抗血管形成治療薬の重要性を証明してきた。ヘプタザイム（Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを選択的に破壊するようにデザインされたリボザイム）は、細胞培養アッセイにおいてＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの減少に有効であることが見出された（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ−ＷＥＢホームページ）。 
【０１１３】
細胞内のＢｃｌ−ｘＬまたはＢｃｌ−ｗまたはｐ２１の遺伝子発現のさらなる制御方法は、三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）を介した方法である。最近の研究では、配列特異的様式で二本鎖らせんＤＮＡ中のポリプリン／ポリピリミジン（ｐｏｌｙｐｉｒｉｍｉｄｉｎｅ）領域を認識して結合することができるＴＦＯをデザインすることができることが示されている。これらの認識規則は、Ｍａｈｅｒ  ＩＩＩ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９；２４５：７２５−７３０；Ｍｏｓｅｒ，Ｈ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７；２３８：６４５−６３０；Ｂｅａｌ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２；２５１：１３６０−１３６３；Ｃｏｏｎｅｙ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８；２４１：４５６−４５９；およびＨｏｇａｎ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，ＥＰ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ３７５４０８によって概説されている。介入物の導入および骨格置換などのオリゴヌクレオチドの改変ならびに結合条件（ｐＨおよびカチオン濃度）の至適化がＴＦＯ活性の固有の障害（電荷斥力および不安定性など）の克服に役立っており、合成オリゴヌクレオチドが特定の配列をターゲティングすることができることが最近示された（最近の概説については、Ｓｅｉｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｌａｚｅｒ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００３；１１２：４８７−９４を参照のこと）。 
【０１１４】
一般に、三重鎖形成オリゴヌクレオチドは、以下の配列が対応する。
オリゴ    ３’−−Ａ    Ｇ    Ｇ    Ｔ
二重鎖    ５’−−Ａ    Ｇ    Ｃ    Ｔ
二重鎖    ３’−−Ｔ    Ｃ    Ｇ    Ａ 
【０１１５】
しかし、Ａ−ＡＴトリプレットおよびＧ−ＧＣトリプレットの三重らせん安定性が最も高いことが示されている（Ｒｅｉｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｊｅｌｔｓｃｈ，ＢＭＣ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００２，Ｓｅｐｔｌ２，Ｅｐｕｂ）。この著者は、Ａ−ＡＴおよびＧ−ＧＣ規則にしたがってデザインしたＴＦＯが非特異的三重鎖を形成しないことを証明し、これは三重鎖形成が実際に配列特異的であることを示す。 
【０１１６】
したがって、Ｂｃｌ−ｘＬまたはＢｃｌ−ｗまたはｐ２１の調節領域の任意の所与の配列について、三重鎖形成配列を考案することができる。三重鎖形成オリゴヌクレオチドは、好ましくは、少なくとも１５、より好ましくは２５、さらにより好ましくは３０、またはそれを超えるヌクレオチド長、５０ｂｐまたは１００ｂｐまでである。 
【０１１７】
（例えば、カチオン性リポソームを介した）細胞のＴＦＯでのトランスフェクションおよび標的ＤＮＡとの三重らせん構造の形成によって立体および機能の変化、転写の開始および伸長の遮断が誘導され、それにより内因性ＤＮＡ内の配列が望ましく変化して遺伝子発現が特異的に下方制御される。ＴＦＯで処置した細胞におけるかかる遺伝子発現の抑制の例には、哺乳動物細胞におけるエピソームｓｕｐＦＧ１および内因性ＨＰＲＴ遺伝のノックアウト（Ｖａｓｑｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９９；２７：１１７６−８１およびＰｕｒｉ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００１；２７６：２８９９１−９８）ならびに前立腺癌の病因で重要なＥｔｓ２転写因子（Ｃａｒｂｏｎｅ，ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２００３；３１：８３３−４３）および炎症促進性ＩＣＡＭ−１遺伝子（Ｂｅｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００２；２７７：３２４７３−７９）の発現の配列および標的特異的な下方制御が含まれる。さらに、Ｖｕｙｉｓｉｃｈ  ａｎｄ  Ｂｅａｌは、最近、配列特異的ＴＦＯがｄｓＲＮＡに結合し、ｄｓＲＮＡ依存性酵素（ＲＮＡ依存性キナーゼなど）の活性を阻害することができることを示している（Ｖｕｙｉｓｉｃｈ  ａｎｄ  Ｂｅａｌ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２０００；２８：２３６９−７４）。 
【０１１８】
さらに、上記原理にしたがってデザインされたＴＦＯは、ＤＮＡ修復が可能な定方向変異誘発を誘導することができ、したがって、内因性遺伝子の発現の下方制御および上方制御の両方を行うことができる（Ｓｅｉｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｌａｚｅｒ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００３；１１２：４８７−９４）。有効なＴＦＯのデザイン、合成、および投与の詳細な説明を、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許出願公開第２００３／０１７０６８号明細書および同第２００３／００９６９８０号明細書、Ｅｍａｎｕｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．の同第２００２／０１２８２１８号明細書および同第２００２／０１２３４７６号明細書、ならびにＬａｗｎの米国特許第５，７２１，１３８号明細書に見出すことができる。 
【０１１９】
Ｂｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗおよび／またはｐ２１の量または活性の下方制御のためのポリヌクレオチド薬を、典型的には、発現構築物の一部として投与する。この場合、構成性様式または誘導性様式でＢｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗおよび／またはｐ２１を下方制御することができる薬剤の発現を指示することができるシス作用性調節エレメント（例えば、プロモーター）の調節下でポリヌクレオチド薬を核酸構築物中にライゲーションする。 
【０１２０】
核酸薬を、適切な遺伝子送達ビヒクル／方法（トランスフェクション、形質導入など）を使用して送達させることができる。任意選択的に、適切な発現系を使用する。適切な構築物の例には、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ＰｚｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ（それぞれ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ．（ｗｗｗｄｏｔｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｄｏｔｃｏｍ）から市販されている）が含まれるが、これらに限定されない。 
【０１２１】
発現構築物はまた、ウイルスであり得る。ウイルス構築物の例には、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびヘルペスウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。 
【０１２２】
レトロウイルス構築物などのウイルス構築物は、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサーもしくは遺伝子座規定エレメント、または他の手段（選択的スプライシング、核外ＲＮＡ輸送、またはメッセンジャーの翻訳後修飾など）によって遺伝子発現を調節する他のエレメントを含む。かかるベクター構築物は、ウイルス構築物中に既に存在しないかぎり、パッケージングシグナル、長末端反復（ＬＴＲ）またはその一部、および使用したウイルスに適切なプラス鎖およびマイナス鎖のプライマー結合部位も含む。さらに、かかる構築物は、典型的には、構築物が存在する宿主細胞からのペプチドの分泌のためのシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は、哺乳動物シグナル配列または本発明のペプチドバリアントのシグナル配列である。任意選択的に、構築物はまた、ポリアデニル化を指示するシグナルならびに１つ以上の制限部位および翻訳終結配列を含むことができる。例として、かかる構築物は、典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２の鎖ＤＮＡ合成起源、および３’ＬＴＲまたはその一部を含むであろう。 
【０１２３】
好ましくは、ウイルス感染量は、少なくとも１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、またはそれを超えるｐｆｕまたはウイルス粒子である。 
【０１２４】
二本鎖ＲＮＡを、遺伝子セグメントの末端への２つの対立するプロモーターの付加によって合成することができ、ここで、一方のプロモーターは遺伝子の５’側に隣接して配置され、逆方向プロモーターを遺伝子セグメントの３’側に隣接して配置する。次いで、適切なポリメラーゼを使用してｄｓＲＮＡを転写することができる。 
【０１２５】
潜在的な治療薬としての小ポリヌクレオチド薬（例えば、ｓｉＲＮＡ）の適用には、その薬理学的性質を強化する送達アプローチが必要である。これらの送達アプローチは、以下を目的とする：（１）腎クリアランス速度の低下によって循環系中の小ポリヌクレオチド薬の保持時間を増加させること；（２）血清ヌクレアーゼから小ポリヌクレオチド薬を保護すること；（３）有効な生体内分布を確実にすること；（４）標的細胞へのターゲティングおよび標的細胞内への小ポリヌクレオチド薬の取り込みを容易にすること；および（５）細胞質への輸送およびＲＩＳＣ内への取り込みを促進すること。ｉｎ  ｖｉｖｏでの小ポリヌクレオチド薬送達を促進する種々のアプローチ（カチオン性ナノ粒子、脂質、およびリポソーム、抗体（Ａｂ）−融合分子（Ａｂ−プロタミンおよびＡｂ−ポリ−アルギニン）、ならびにコレステロール抱合薬およびアプタマー抱合薬が含まれる）が開発されている。それ自体で、ｓｉＲＮＡなどの小ポリヌクレオチド薬は腎臓濾過のサイズ閾値を下回り、循環系から迅速にクリアランスされる。小ポリヌクレオチド薬および種々の送達試薬の複合体は循環中により長期間留まる。これは、複合体が腎クリアランスのサイズカットオフを超えるか、送達薬が血清タンパク質（例えば、血清アルブミン）との会合を促進するからである。さらに、ナノ粒子内への小ポリヌクレオチド薬のキャプシド形成（脂質またはカチオン性ポリマーをベースとした系のいずれかを使用）は、小ポリヌクレオチド薬を血清ヌクレアーゼから保護するのに役立つ。Ａｂ−融合分子は、静脈内注射後に裸の未修飾小ポリヌクレオチド薬を特定の細胞型に有効に送達させるために使用されている。ｓｉＲＮＡがこれらの組換えＡｂ−融合分子表面上に露呈すると考えられるにもかかわらず、ｓｉＲＮＡは標的細胞に有効に送達され、これらの分子との複合体形成により核酸分解からいくらか保護されることが示唆された。小ポリヌクレオチド薬のリン酸骨格、糖部分、およびヌクレオシド塩基に対する化学修飾の組込みにより、血清ヌクレアーゼによる分解に対する耐性が増大する。しかし、これらの修飾のうちのいくつかがサイレンシング効率に悪影響を及ぼす場合、小ポリヌクレオチド薬への化学修飾の組込みと小ポリヌクレオチド薬の阻害活性との間でバランスを取らなければならない。バイスタンダー細胞中の有効なサイレンシングおよびオフターゲットサイレンシングの最小化に必要な小ポリヌクレオチド薬の投薬量を減少するための魅力的なストラテジーは、小ポリヌクレオチド薬を特異的な細胞型および組織にターゲティングする送達薬の使用である。小ポリヌクレオチド薬が静電相互作用またはアプタマーもしくはリガンドの小ポリヌクレオチド薬への直接抱合によって会合することができる高正電荷のペプチドまたはタンパク質に融合されるＡｂまたはリガンドを使用してこのストラテジーが行われている。これらの試薬（Ａｂ、リガンド、およびアプタマー）は、細胞表面分子に高親和性で結合し、これらのマーカーを発現する細胞に小ポリヌクレオチド薬を特異的に送達させることができる。これらのターゲティグ試薬のナノ粒子との組み合わせ（例えば、特異的Ａｂでコーティングした脂質ナノ粒子を���む免疫リポソーム）により、小ポリヌクレオチド薬の送達量、結果として、サイレンシング効率を増加させることができる。 
【０１２６】
したがって、本発明は、これらの薬剤の送達のための脂質ベースの系の使用を意図する。遺伝子の脂質媒介導入に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、およびＤＣ−Ｃｈｏｌである（Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１４（１）：５４−６５（１９９６））。最近、キトサンを使用して核酸を腸細胞に送達させることができることが示されている（Ｃｈｅｎ  Ｊ．（２００４）Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  １０（１）：１１２−１１６）。本発明のこの態様にしたがって使用することができる他の非脂質ベースのベクターには、ポリリジンおよびデンドリマー、カーボンナノチューブ、ナノゲル、ポリマーベースの粒子が含まれるが、これらに限定されない。 
【０１２７】
本明細書中に記載の薬剤が老化細胞を死滅させることが示されているので、本発明者らは、これらの薬剤を使用して細胞老化に関連する疾患を有する被験体を処置することができることを提案する。 
【０１２８】
本明細書中で使用する場合、用語「被験体」は、哺乳動物被験体、好ましくはヒトをいう。 
【０１２９】
炎症応答に関与する多数の疾患および容態を、上記の方法を使用して処置することができる。かかる疾患および容態の例を以下にまとめる。 
【０１３０】
炎症性疾患−慢性炎症性疾患および急性炎症性疾患が含まれるが、これらに限定されない。 過敏症に関連する炎症性疾患 
【０１３１】
過敏症の例には、Ｉ型過敏症、ＩＩ型過敏症、ＩＩＩ型過敏症、ＩＶ型過敏症、即時型過敏症、抗体媒介性過敏症、免疫複合体媒介性過敏症、Ｔリンパ球媒介性過敏症、およびＤＴＨが含まれるが、これらに限定されない。 
【０１３２】
Ｉ型過敏症または即時型過敏症（喘息など）。 
【０１３３】
ＩＩ型過敏症には、リウマチ様疾患、リウマチ様自己免疫疾患、関節リウマチ（Ｋｒｅｎｎ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ  ２０００  Ｊｕｌ；１５（３）：７９１）、脊椎炎、強直性脊椎炎（Ｊａｎ  Ｖｏｓｗｉｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  ２００１；３（３）：１８９）、全身性疾患、
全身性自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス（Ｅｒｉｋｓｏｎ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  １９９８；１７（１−２）：４９）、硬化症、全身性硬化症（Ｒｅｎａｕｄｉｎｅａｕ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９  Ｍａｒ；６（２）：１５６）；Ｃｈａｎ  ＯＴ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  １９９９  Ｊｕｎ；１６９：１０７）、腺疾患、腺自己免疫疾患、膵自己免疫疾患、糖尿病、Ｉ型糖尿病（Ｚｉｍｍｅｔ  Ｐ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  １９９６  Ｏｃｔ；３４  Ｓｕｐｐｌ：Ｓ１２５）、甲状腺疾患、自己免疫性甲状腺疾患、グレーブス病（Ｏｒｇｉａｚｚｉ  Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  ２０００  Ｊｕｎ；２９（２）：３３９）、甲状腺炎、自発性自己免疫性甲状腺炎（Ｂｒａｌｅｙ−Ｍｕｌｌｅｎ  Ｈ．ａｎｄ  Ｙｕ  Ｓ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００  Ｄｅｃ  １５；１６５（１２）：７２６２）、橋本甲状腺炎（Ｔｏｙｏｄａ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ  １９９９  Ａｕｇ；５７（８）：１８１０）、粘液水腫、特発性粘液水腫（Ｍｉｔｓｕｍａ  Ｔ．Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ．１９９９  Ａｕｇ；５７（８）：１７５９）；自己免疫性生殖疾患、卵巣疾患、卵巣自己免疫（Ｇａｒｚａ  ＫＭ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８  Ｆｅｂ；３７（２）：８７）、自己免疫性抗精子不妊症（Ｄｉｅｋｍａｎ  ＡＢ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  Ｍａｒ；４３（３）：１３４）、反復胎児消失（Ｔｉｎｃａｎｉ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌｕｐｕｓ  １９９８；７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１０７−９）、神経変性疾患、神経学的疾患、神経学的自己免疫疾患、多発性硬化症（Ｃｒｏｓｓ  ＡＨ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１  Ｊａｎ  １；１１２（１−２）：１）、アルツハイマー病（Ｏｒｏｎ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ  Ｓｕｐｐｌ．１９９７；４９：７７）、重症筋無力症（Ｉｎｆａｎｔｅ  ＡＪ．Ａｎｄ  Ｋｒａｉｇ  Ｅ，Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９；１８（ｌ−２）：８３）、運動神経障害（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ＡＪ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０００  Ｍａｙ；７（３）：１９１）、ギラン・バレー症候群、ニューロパシー、および自己免疫性ニューロパシー（Ｋｕｓｕｎｏｋｉ  Ｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．２０００  Ａｐｒ；３１９（４）：２３４）、筋無力性疾患、ランバート・イートン筋無力症候群（Ｔａｋａｍｏｒｉ  Ｍ．Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．２０００  Ａｐｒ；３１９（４）：２０４）、傍腫瘍性神経学的疾患、小脳萎縮、傍腫瘍性小脳萎縮、非傍腫瘍性スティッフマン症候群、小脳萎縮、進行性小脳萎縮、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症、シデナム（Ｓｙｄｅｈａｍ）舞踏病、ジルドラトゥレット症候群、多腺性内分泌症、自己免疫性多腺性内分泌症（Ａｎｔｏｉｎｅ  ＪＣ．ａｎｄ  Ｈｏｎｎｏｒａｔ  Ｊ．Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｌ（Ｐａｒｉｓ）２０００  Ｊａｎ；１５６（１）：２３）；ニューロパシー、異常免疫ニューロパシー（Ｎｏｂｉｌｅ−Ｏｒａｚｉｏ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｕｐｐｌ  １９９９；５０：４１９）；神経性筋強直症、後天性神経性筋強直症、先天性多発性関節拘縮（Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１９９８  Ｍａｙ  １３；８４１：４８２）、心血管疾患、心血管性自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症（Ｍａｔｓｕｕｒａ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌｕｐｕｓ．１９９８；７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１３５）、心筋梗塞（Ｖａａｒａｌａ  Ｏ．Ｌｕｐｕｓ．１９９８；７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１３２）、血栓症（Ｔｉｎｃａｎｉ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌｕｐｕｓ  １９９８；７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１０７−９）、肉芽腫症、ウェゲナー肉芽腫症、動脈炎、高安動脈炎、および川崎病（Ｐｒａｐｒｏｔｎｉｋ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｗｉｅｎ  Ｋｌｉｎ  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ  ２０００  Ａｕｇ  ２５；１１２（１５−１６）：６６０）；抗ＶＩＩＩ因子自己免疫疾患（Ｌａｃｒｏｉｘ−Ｄｅｓｍａｚｅｓ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ．２０００；２６（２）：１５７）；脈管炎、壊死性小血管脈管炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、糸球体腎炎、ｐａｕｃｉ−ｉｍｍｕｎｅ型巣状壊死性糸球体腎炎、半月体形成性糸球体腎炎（Ｎｏｅｌ  ＬＨ．Ａｎｎ  Ｍｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎｅ（Ｐａｒｉｓ）．２０００  Ｍａｙ；１５１（３）：１７８）；抗リン脂質症候群（Ｆｌａｍｈｏｌｚ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  １９９９；１４（４）：１７１）；心不全、心不全におけるアゴニスト様β−アドレノセプター抗体（Ｗａｌｌｕｋａｔ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ．１９９９  Ｊｕｎ  １７；８３（１２Ａ）：７５Ｈ）、血小板減少性紫斑（Ｍｏｃｃｉａ  Ｆ．Ａｎｎ  Ｉｔａｌ  Ｍｅｄ  Ｉｎｔ．１９９９  Ａｐｒ−Ｊｕｎ；１４（２）：１１４）；溶血性貧血、自己免疫性溶血性貧血（Ｅｆｒｅｍｏｖ  ＤＧ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  １９９８  Ｊａｎ；２８（３−４）：２８５）、胃腸疾患、胃腸管の自己免疫疾患、腸疾患、慢性炎症性腸疾患（Ｇａｒｃｉａ  Ｈｅｒｏｌａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．２０００  Ｊａｎ；２３（１）：１６）、セリアック病（Ｌａｎｄａｕ  ＹＥ．ａｎｄ  Ｓｈｏｅｎｆｅｌｄ  Ｙ．Ｈａｒｅｆｕａｈ  ２０００  Ｊａｎ  １６；１３８（２）：１２２）、筋系の自己免疫疾患、筋炎、自己免疫性筋炎、シェーグレン症候群（Ｆｅｉｓｔ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００  Ｓｅｐ；１２３（１）：９２）；平滑筋自己免疫疾患（Ｚａｕｌｉ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ  １９９９  Ｊｕｎ；５３（５−６）：２３４）、肝疾患、自己免疫性肝疾患、自己免疫性肝炎（Ｍａｎｎｓ  ＭＰ．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２０００  Ａｕｇ；３３（２）：３２６）、ならびに原発性胆汁性肝硬変（Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ  ＣＰ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．１９９９  Ｊｕｎ；１１（６）：５９５）が含まれるが、これらに限定されない。 
【０１３４】
ＩＶ型過敏症またはＴ細胞媒介性過敏症には、リウマチ様疾患、関節リウマチ（Ｔｉｓｃｈ  Ｒ，ＭｃＤｅｖｉｔｔ  ＨＯ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９４  Ｊａｎ  １８；９１（２）：４３７）、全身性疾患、全身性自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス（Ｄａｔｔａ  ＳＫ．，Ｌｕｐｕｓ  １９９８；７（９）：５９１）、腺疾患、腺自己免疫疾患、膵疾患、膵自己免疫疾患、１型糖尿病（Ｃａｓｔａｎｏ  Ｌ．ａｎｄ  Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ  ＧＳ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６４７）；甲状腺疾患、自己免疫性甲状腺疾患、グレーブス病（Ｓａｋａｔａ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １９９３  Ｍａｒ；９２（１）：７７）；卵巣疾患（Ｇａｒｚａ  ＫＭ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８  Ｆｅｂ；３７（２）：８７）、前立腺炎、自己免疫性前立腺炎（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＲＢ．ｅｔ  ａｌ．，Ｕｒｏｌｏｇｙ  １９９７  Ｄｅｃ；５０（６）：８９３）、多腺性症候群、多腺性自己免疫症候群、多腺性自己免疫症候群Ｉ型（Ｈａｒａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９１  Ｍａｒ  １；７７（５）：１１２７）、神経学的疾患、自己免疫性神経学的疾患、多発性硬化症、神経炎、視神経炎（Ｓｏｄｅｒｓｔｒｏｍ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １９９４  Ｍａｙ；５７（５）：５４４）、重症筋無力症（Ｏｓｈｉｍａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９０  Ｄｅｃ；２０（１２）：２５６３）、全身強直症候群（Ｈｉｅｍｓｔｒａ  ＨＳ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００１  Ｍａｒ  ２７；９８（７）：３９８８）、心血管疾患、シャーガス病における心自己免疫（Ｃｕｎｈａ−Ｎｅｔｏ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９６  Ｏｃｔ  １５；９８（８）：１７０９）、自己免疫性血小板減少性紫斑（Ｓｅｍｐｌｅ  ＪＷ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １９９６  Ｍａｙ  １５；８７（１０）：４２４５）、抗ヘルパーＴリンパ球自己免疫（Ｃａｐｏｒｏｓｓｉ  ＡＰ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８；１１（１）：９）、溶血性貧血（Ｓａｌｌａｈ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  １９９７  Ｍａｒ；７４（３）：１３９）、肝疾患、自己免疫性肝疾患、肝炎、慢性活動性肝炎（Ｆｒａｎｃｏ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  １９９０  Ｍａｒ；５４（３）：３８２）、胆汁性肝硬変、原発性胆汁性肝硬変（Ｊｏｎｅｓ  ＤＥ．Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ（Ｃｏｌｃｈ）１９９６  Ｎｏｖ；９１（５）：５５１）、腎疾患、自己免疫性腎疾患、腎炎、間質性腎炎（Ｋｅｌｌｙ  ＣＪ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １９９０  Ａｕｇ；１（２）：１４０）、結合組織病、耳疾患、自己免疫性結合組織病、自己免疫性耳疾患（Ｙｏｏ  ＴＪ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９４  Ａｕｇ；１５７（１）：２４９）、内耳疾患（Ｇｌｏｄｄｅｋ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １９９７  Ｄｅｃ  ２９；８３０：２６６）、皮膚疾患、皮膚病、真皮疾患、水疱性皮膚疾患、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡���および落葉状天疱瘡が含まれるが、これらに限定されない。 
【０１３５】
遅延型過敏症の例には、接触皮膚炎および薬疹が含まれるが、これらに限定されない。 
【０１３６】
過敏症を媒介するＴリンパ球型の例には、ヘルパーＴリンパ球および細胞傷害性Ｔリンパ球が含まれるが、これらに限定されない。 
【０１３７】
ヘルパーＴリンパ球媒介性過敏症の例には、Ｔｈ１リンパ球媒介性過敏症およびＴｈ２リンパ球媒介性過敏症が含まれるが、これらに限定されない。 自己免疫疾患 
【０１３８】
心血管疾患、リウマチ様疾患、腺疾患、胃腸疾患、皮膚病、肝疾患、神経学的疾患、筋疾患、腎疾患、生殖関連疾患、結合組織病、および全身性疾患が含まれるが、これらに限定されない。 
【０１３９】
自己免疫性心血管疾患の例には、アテローム性動脈硬化症（Ｍａｔｓｕｕｒａ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌｕｐｕｓ．１９９８；７  Ｓｕｐｐｌ２：Ｓ１３５）、心筋梗塞（Ｖａａｒａｌａ  Ｏ．Ｌｕｐｕｓ．１９９８；７  Ｓｕｐｐｌ２：Ｓ１３２）、血栓症（Ｔｉｎｃａｎｉ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌｕｐｕｓ  １９９８；７  Ｓｕｐｐｌ２：Ｓ１０７−９）、ウェゲナー肉芽腫症、高安動脈炎、川崎病（Ｐｒａｐｒｏｔｎｉｋ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｗｉｅｎ  Ｋｌｉｎ  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ  ２０００  Ａｕｇ  ２５；１１２（１５−１６）：６６０）、抗ＶＩＩＩ因子自己免疫疾患（Ｌａｃｒｏｉｘ−Ｄｅｓｍａｚｅｓ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ．２０００；２６（２）：１５７）、壊死性小血管脈管炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、ｐａｕｃｉ−ｉｍｍｕｎｅ型巣状壊死性糸球体腎炎および半月体形成性糸球体腎炎（Ｎｏｅｌ  ＬＨ．Ａｎｎ  Ｍｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎｅ（Ｐａｒｉｓ）．２０００  Ｍａｙ；１５１（３）：１７８）、抗リン脂質症候群（Ｆｌａｍｈｏｌｚ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  １９９９；１４（４）：１７１）、抗体誘導性心不全（Ｗａｌｌｕｋａｔ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ．１９９９  Ｊｕｎ  １７；８３（１２Ａ）：７５Ｈ）、血小板減少性紫斑（Ｍｏｃｃｉａ  Ｆ．Ａｎｎ  Ｉｔａｌ  Ｍｅｄ  Ｉｎｔ．１９９９  Ａｐｒ−Ｊｕｎ；１４（
２）：１１４；Ｓｅｍｐｌｅ  ＪＷ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １９９６  Ｍａｙ  １５；８７（１０）：４２４５）、自己免疫性溶血性貧血（Ｅｆｒｅｍｏｖ  ＤＧ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  １９９８  Ｊａｎ；２８（３−４）：２８５；Ｓａｌｌａｈ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  １９９７  Ｍａｒ；７４（３）：１３９）、シャーガス病における心自己免疫（Ｃｕｎｈａ−Ｎｅｔｏ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９６  Ｏｃｔ  １５；９８（８）：１７０９）、および抗ヘルパーＴリンパ球自己免疫（Ｃａｐｏｒｏｓｓｉ  ＡＰ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８；１１（１）：９）が含まれるが、これらに限定されない。 
【０１４０】
自己免疫性リウマチ様疾患の例には、関節リウマチ（Ｋｒｅｎｎ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ  ２０００  Ｊｕｌ；１５（３）：７９１；Ｔｉｓｃｈ  Ｒ，ＭｃＤｅｖｉｔｔ  ＨＯ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ｕｎｉｔｓ  ＳＡ  １９９４  Ｊａｎ  １８；９１（２）：４３７）および強直性脊椎炎（Ｊａｎ  Ｖｏｓｗｉｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  ２００１；３（３）：１８９）が含まれるが、これらに限定されない。 
【０１４１】
自己免疫性腺疾患の例には、膵疾患、Ｉ型糖尿病、甲状腺疾患、グレーブス病、甲状腺炎、自発性自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺炎、特発性粘液水腫、卵巣自己免疫、自己免疫性抗精子不妊症、自己免疫性前立腺炎、および多腺性自己免疫症候群Ｉ型が含まれるが、これらに限定されない。疾患には、膵臓の自己免疫疾患、１型糖尿病（Ｃａｓｔａｎｏ  Ｌ．ａｎｄ  Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ  ＧＳ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６４７；Ｚｉｍｍｅｔ  Ｐ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  １９９６  Ｏｃｔ；３４  Ｓｕｐｐｌ：Ｓ１２５）、自己免疫性甲状腺疾患、グレーブス病（Ｏｒｇｉａｚｚｉ  Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  ２０００  Ｊｕｎ；２９（２）：３３９；Ｓａｋａｔａ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １９９３  Ｍａｒ；９２（１）：７７）、自発性自己免疫性甲状腺炎（Ｂｒａｌｅｙ−Ｍｕｌｌｅｎ  Ｈ．ａｎｄ  Ｙｕ  Ｓ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００  Ｄｅｃ  １５；１６５（１２）：７２６２）、橋本甲状腺炎（Ｔｏｙｏｄａ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ  １９９９  Ａｕｇ；５７（８）：１８１０），特発性粘液水腫（Ｍｉｔｓｕｍａ  Ｔ．Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ．１９９９  Ａｕｇ；５７（８）：１７５９）、卵巣自己免疫（Ｇａｒｚａ  ＫＭ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８  Ｆｅｂ；３７（２）：８７）、自己免疫性抗精子不妊症（Ｄｉｅｋｍａｎ  ＡＢ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  Ｍａｒ；４３（３）：１３４）、自己免疫性前立腺炎（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＲＢ．ｅｔ  ａｌ．，Ｕｒｏｌｏｇｙ  １９９７  Ｄｅｃ；５０（６）：８９３）、および多腺性自己免疫症候群Ｉ型（Ｈａｒａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９１  Ｍａｒ  １；７７（５）：１１２７）が含まれるが、これらに限定されない。 
【０１４２】
自己免疫性胃腸疾患の例には、慢性炎症性腸疾患（Ｇａｒｃｉａ  Ｈｅｒｏｌａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．２０００  Ｊａｎ；２３（１）：１６）、セリアック病（Ｌａｎｄａｕ  ＹＥ．ａｎｄ  Ｓｈｏｅｎｆｅｌｄ  Ｙ．Ｈａｒｅｆｕａｈ  ２０００  Ｊａｎ  １６；１３８（２）：１２２）、結腸炎、回腸炎、およびクローン病が含まれるが、これらに限定されない。 
【０１４３】
自己免疫性皮膚病の例には、自己免疫性水疱性皮膚疾患（尋常性天疱瘡，水疱性類天疱瘡、および落葉状天疱瘡などであるが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。 
【０１４４】
自己免疫性肝疾患の例には、肝炎、自己免疫性慢性活動性肝炎（Ｆｒａｎｃｏ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  １９９０  Ｍａｒ；５４（３）：３８２）、原発性胆汁性肝硬変（Ｊｏｎｅｓ  ＤＥ．Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ（Ｃｏｌｃｈ）１９９６  Ｎｏｖ；９１（５）：５５１；Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ  ＣＰ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．１９９９  Ｊｕｎ；１１（６）：５９５）、および自己免疫性肝炎（Ｍａｎｎｓ  ＭＰ．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２０００  Ａｕｇ；３３（２）：３２６）が含まれるが、これらに限定されない。 
【０１４５】
自己免疫性神経学的疾患の例には、多発性硬化症（Ｃｒｏｓｓ  ＡＨ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１  Ｊａｎ  １；１１２（１−２）：１）、アルツハイマー病（Ｏｒｏｎ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ  Ｓｕｐｐｌ．１９９７；４９：７７）、重症筋無力症（Ｉｎｆａｎｔｅ  ＡＪ．Ａｎｄ  Ｋｒａｉｇ  Ｅ，Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９；１８（ｌ−２）：８３；Ｏｓｈｉｍａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９０  Ｄｅｃ；２０（１２）：２５６３）、ニューロパシー、運動神経障害（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ＡＪ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０００  Ｍａｙ；７（３）：１９１）；ギラン・バレー症候群および自己免疫性ニューロパシー（Ｋｕｓｕｎｏｋｉ  Ｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．２０００  Ａｐｒ；３１９（４）：２３４）、筋無力症、ランバート・イートン筋無力症候群（Ｔａｋａｍｏｒｉ  Ｍ．Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．２０００  Ａｐｒ；３１９（４）：２０４）；傍腫瘍性神経学的疾患、小脳萎縮、傍腫瘍性小脳萎縮、および全身強直症候群（Ｈｉｅｍｓｔｒａ  ＨＳ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ｕｎｉｔｓ  ＳＡ  ２００１  Ｍａｒ  ２７；９８（７）：３９８８）；非傍腫瘍性スティッフマン症候群、進行性小脳萎縮、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症、シデナム（Ｓｙｄｅｈａｍ）舞踏病、ジルドラトゥレット症候群、および自己免疫性多腺性内分泌症（Ａｎｔｏｉｎｅ  ＪＣ．ａｎｄ  Ｈｏｎｎｏｒａｔ  Ｊ．Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｌ（Ｐａｒｉｓ）２０００  Ｊａｎ；１５６（１）：２３）；異常免疫ニューロパシー（Ｎｏｂｉｌｅ−Ｏｒａｚｉｏ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｕｐｐｌ  １９９９；５０：４１９）；後天性神経性筋強直症、先天性多発性関節拘縮（Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１９９８  Ｍａｙ  １３；８４１：４８２）、神経炎、視神経炎（Ｓｏｄｅｒｓｔｒｏｍ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １９９４  Ｍａｙ；５７（５）：５４４）、ならびに神経変性疾患が含まれるが、これらに限定されない。 
【０１４６】
自己免疫性筋疾患の例には、筋炎、自己免疫性筋炎および原発性シェーグレン症候群（Ｆｅｉｓｔ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００  Ｓｅｐ；１２３（１）：９２）ならびに平滑筋自己免疫疾患（Ｚａｕｌｉ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ  １９９９  Ｊｕｎ；５３（５−６）：２３４）が含まれるが、これらに限定されない。 
【０１４７】
自己免疫性腎疾患の例には、腎炎および自己免疫性間質性腎炎（Ｋｅｌｌｙ  ＣＪ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １９９０  Ａｕｇ；１（２）：１４０）が含まれるが、これらに限定されない。 
【０１４８】
生殖に関連する自己免疫疾患の例には、反復胎児消失（Ｔｉｎｃａｎｉ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌｕｐｕｓ  １９９８；７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１０７−９）が含まれるが、これに限定されない。 
【０１４９】
自己免疫性結合組織病の例には、耳疾患、自己免疫性耳疾患（Ｙｏｏ  ＴＪ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９４  Ａｕｇ；１５７（１）：２４９）および内耳の自己免疫疾患（Ｇｌｏｄｄｅｋ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １９９７  Ｄｅｃ  ２９；８３０：２６６）が含まれるが、これらに限定されない。 
【０１５０】
全身性自己免疫疾患の例には、全身性エリテマトーデス（Ｅｒｉｋｓｏｎ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  １９９８；１７（１−２）：４９）および全身性硬化症（Ｒｅｎａｕｄｉｎｅａｕ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９  Ｍａｒ；６（２）：１５６）；Ｃｈａｎ  ＯＴ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  １９９９  Ｊｕｎ；１６９：１０７）が含まれるが、これらに限定されない。
感染症 
【０１５１】
感染症の例には、慢性感染症、亜急性感染症、急性感染症、ウイルス性疾患、細菌性疾患、原生動物疾患、寄生虫病、真菌性疾患、マイコプラズマ性疾患、およびプリオン病が含まれるが、これらに限定されない。  
【０１５２】
移植片拒絶疾患
移植片の移植に関連する疾患の例には、移植片拒絶、慢性移植片拒絶、亜急性移植片拒絶、超急性移植片拒絶、急性移植片拒絶、および移植片対宿主病が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５３】
アレルギー疾患
アレルギー疾患の例には、喘息、じんま疹、蕁麻疹、花粉アレルギー、チリダニアレルギー、毒液アレルギー、化粧品アレルギー、ラテックスアレルギー、化学物質アレルギー、薬物アレルギー、虫刺アレルギー、動物鱗屑アレルギー、有刺植物アレルギー、ツタウルシアレルギー、および食物アレルギーが含まれるが、これらに限定されない。 
【０１５４】
特定の実施形態によれば、薬剤（およびその組み合わせ）を、前悪性病変の処置のために使用する。 
【０１５５】
本明細書中で使用する場合、句「前悪性病変」は、悪性腫瘍に変化する可能性が高い細胞塊および／または組織をいう。前悪性病変の例には、腺腫様ポリープ、バレット食道、ＩＰＭＮ（膵管内乳頭粘液性（Ｍｕｃｉｎｕｓ）新形成）、乳房内のＤＣＩＳ（腺管上皮内癌）、白斑症、および紅板症が含まれるが、これらに限定されない。したがって、本発明のこの態様の薬剤を使用して処置される前悪性病変は、悪性の固形または非固形（例えば、血液学的悪性疾患）の癌（または腫瘍）に変化し得る。特定の実施形態によれば、本発明の薬剤を使用して処置される前悪性病変は、結腸の腺腫様ポリープ、直腸の腺腫様ポリープ、小腸の腺腫様ポリープ、およびバレット食道である。 
【０１５６】
線維性疾患の例には、上皮性関門組織の疾患、皮膚、肺、または腸の疾患が含まれる。 
【０１５７】
本明細書中に記載の薬剤を使用して処置することができる意図される線維性疾患には、好酸球性食道炎、好酸球増加症候群（ＨＥＳ）、レフラー心内膜炎、心内膜心筋線維症、特発性肺線維症、および強皮症が含まれるが、これらに限定されない。 
【０１５８】
特定の実施形態によれば、薬剤を、肝臓線維症、創傷治癒、皮膚線維症、肺疾患、腎臓線維症、前立腺炎、アテローム性動脈硬化症、関節炎、骨粗鬆症、または膵炎の処置のために使用する。 
【０１５９】
本発明によって意図される例示的な肺疾患は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である。 
【０１６０】
さらに（ｓｉｌｌ）別の実施形態によれば、疾患は軟骨変性に関連する（例えば、関節炎）。
【０１６１】
さらに別の実施形態によれば、疾患は骨変性に関連する（例えば、骨粗鬆症）。 
【０１６２】
さらに別の実施形態によれば、疾患は癌ではない。 
【０１６３】
本発明の薬剤（およびその組み合わせ）自体を提供するか、特定の使用を意図した組成物に処方することができる。本明細書中に記載の薬剤の組み合わせを単一の処方物で提供するか、個別の組成物で提供することができると認識されるであろう。 
【０１６４】
意図する組成物には、Ｂｃｌ−ｘＬを下方制御する薬剤およびＢｃｌ−ｗを下方制御する薬剤（例えば、ｓｉＲＮＡ薬）を含む組成物が含まれる。 
【０１６５】
別の意図する組成物は、Ｂｃｌ−ｘＬを下方制御する薬剤およびＢｃｌ−ｗを下方制御する薬剤（例えば、ｓｉＲＮＡ薬）およびｐ２１を下方制御する薬剤（例えば、ｓｉＲＮＡ薬）を含む組成物である。 
【０１６６】
別の意図する組成物は、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−ｗを下方制御する薬剤（例えば、化学物質）およびｐ２１を下方制御する薬剤（例えば、ｓｉＲＮＡ薬）を含む組成物である。 
【０１６７】
別の意図する組成物は、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−ｗを下方制御する薬剤（例えば、化学物質）およびｐ２１を下方制御する薬剤（例えば、化学物質）を含む組成物である。 
【０１６８】
さらに、本発明者らは、１つの製品中に個別にパッケージングした薬剤の組み合わせを提供することを意図する。 
【０１６９】
したがって、１つの意図する製品は、Ｂｃｌ−ｘＬを下方制御する薬剤およびＢｃｌ−ｗを下方制御する薬剤（例えば、ｓｉＲＮＡ薬）を含む。 
【０１７０】
別の意図する製品は、Ｂｃｌ−ｘＬを下方制御する薬剤およびＢｃｌ−ｗを下方制御する薬剤（例えば、ｓｉＲＮＡ薬）およびｐ２１を下方制御する薬剤（例えば、ｓｉＲＮＡ薬）を含む製品である。 
【０１７１】
別の意図する製品は、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−ｗを下方制御する薬剤（例えば、化学物質）およびｐ２１を下方制御する薬剤（例えば、ｓｉＲＮＡ薬）を含む製品である。 
【０１７２】
別の意図する製品は、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−ｗを下方制御する薬剤（例えば、化学物質）およびｐ２１を下方制御する薬剤（例えば、化学物質）を含む製品である。
【０１７３】
本発明の薬剤が老化細胞を選択的に死滅させるので、本発明者らは、薬剤の別の用途が皮膚を若返らせるための老化防止剤としての化粧品組成物中での使用であることを意図する。したがって、本発明の薬剤を、化粧品のために処方することができる。 
【０１７４】
かかる組成物は、典型的には、薬学的に許容され得る賦形剤、特に、外部局所適用に適切な皮膚科学的に許容され得る賦形剤を含む。 
【０１７５】
本発明の化粧品組成物は、増粘薬、防腐剤、香料、着色剤、薬液用フィルターまたはミネラルフィルター、保湿剤、温泉水などから選択される当業者に公知の少なくとも１つの薬学的アジュバントをさらに含むことができる。 
【０１７６】
組成物は、皮脂調節剤、抗菌薬、抗真菌薬、角質溶解薬、角質調節剤、収斂薬、抗炎症薬／抗刺激薬、抗酸化剤／フリーラジカル消去剤、瘢痕形成剤、老化防止剤、および／または保湿剤から選択される少なくとも１つの薬剤を含むことができる。 
【０１７７】
用語「皮脂調節剤」は、例えば、５−α−レダクターゼインヒビター、特に、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｅｘｐａｎｓｃｉｅｎｃｅから販売されている活性薬剤５−α−アボクタ（登録商標）をいう。その亜鉛塩およびグルコン酸塩、サリチル酸塩、およびピログルタミン酸も皮脂抑制活性を有する。適用１２週間後に皮脂分泌速度を有意に減少させるスピロノラクトン（抗アンドロゲン且つアルドステロンアンタゴニスト）も挙げることができる。例えば、カボチャＣｕｃｕｒｂｉｔａ  ｐｅｐｏの種子、カボチャ種子油、およびキャベツヤシ由来の他の抽出分子は、５−α−レダクターゼの転写および活性の阻害によって皮脂産生を制限する。皮脂量に作用する脂質起源の他の皮脂調節剤（リノール酸など）が興味深い。 
【０１７８】
用語「抗菌薬」および「抗真菌薬」は、Ｐ．ａｃｎｅｓのような一定の細菌または一定の真菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｆｕｒｆｕｒ）などの病原性微生物の成長を制限するか破壊する分子をいう。化粧品または栄養補助食品で一般的に使用される防腐剤、抗菌活性を有する分子（偽防腐剤）（カプリル酸誘導体（カプリロイルグリシン、グリセリルカプリラートなど）、ヘキサンジオールおよびレブリン酸ナトリウム、亜鉛および銅の誘導体（グルコナートおよびＰＣＡ）、フィトスフィンゴシンおよびその誘導体、過酸化ベンゾイル、ピロクトンオラミン、ジンクピリチオン、硫化セレン、エコナゾール、ケトコナゾール、または局所抗生物質（エリスロマイシンおよびクリンダマイシンなど）など）が最も伝統的である。 
【０１７９】
用語「角質調節剤」および「角質溶解薬」は、表皮の角質層の死細胞の排除を制御または補助する薬剤をいう。最も一般的に使用されている角質調節剤／角質溶解薬には以下が含まれる：果実のα−ヒドロキシ酸（ＡＨＡ）（クエン酸、グリコール酸、リンゴ酸、乳酸など）、ＡＨＡエステル、ＡＨＡの他の分子との組み合わせ（リンゴ酸およびアーモンドタンパク質の組み合わせ（ケラトライト（登録商標））、グリコール酸または乳酸のアルギニンとの組み合わせ、またはヒドロキシ酸の脂質分子との組み合わせ（ＬＨＡ（登録商標）（リポ−ヒドロキシ酸）など）、両性ヒドロキシ酸複合体（ＡＨＣａｒｅ）、柳樹皮（Ｓａｌｉｘ  ａｌｂａ樹皮抽出物）、アゼライン酸およびその塩およびエステル、サリチル酸およびその誘導体（カプリロイルサリチル酸など）、または他の分子との組み合わせ（サリチル酸およびポリサッカリド（β−ヒドロキシ酸、すなわちＢＨＡ）、タザロテン、アダパレン、ならびにレチノイドファミリー分子（トレチノイン、レチンアルデヒド、イソトレチノイン、およびレチノールなど）との組み合わせなど）。 
【０１８０】
用語「収斂薬」は、毛穴の収斂を補助する薬剤をいい、ポリフェノール、亜鉛誘導体、およびウイッチヘーゼルが最も一般的に使用されている。 
【０１８１】
用語「抗炎症剤／抗刺激剤」は、サイトカインまたはアラキドン酸代謝媒介物質によって誘導される炎症反応を制限し、平滑化特性および抗刺激特性を有する薬剤をいう。グリシルレチン酸（甘草誘導体）およびその塩およびエステル、α−ビザボロール、イチョウ、キンセンカ、リポ酸、β−カロテン、ビタミンＢ３（ナイアシンアミド、ニコチンアミド）、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＢ１２、フラボノイド（緑茶、ケルセチンなど）、リコペンまたはルテイン、アボカド糖、アボカド油留出物、アラビノガラクタン、ルピナスペプチド、ルピナス全抽出物、キノアペプチド抽出物、シクロセラミド（登録商標）（オキサゾリン誘導体）、抗糖化剤（カルノシン、Ｎ−アセチル−システイン、イソフラボン（例えば、ゲニステイン／ゲニスチン、ダイゼイン／ダイジンなど）、湧水または温泉水（オード・アベンヌ、オード・ラ・ロッシュ・ポゼ、オード・サン・ジェルベ、オード・ユリアージュ、オード・ガマルド）、クコ抽出物（ナガバクコ）、植物アミノ酸ペプチドまたは複合体、局所ダプソン、または抗炎症薬など）が最も伝統的である。 
【０１８２】
用語「抗酸化剤」は、他の化学物質の酸化を減少または防止する分子をいう。組み合わせて使用することができる抗酸化剤／フリーラジカル消去剤は、チオールおよびフェノール、甘草誘導体（グリシルレチン酸およびその塩およびエステルなど）、α−ビザボロール、イチョウ抽出物、キンセンカ抽出物、シクロセラミド（登録商標）（オキサゾリン誘導体）、アボカドペプチド、微量元素（銅、亜鉛、およびセレンなど）、リポ酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ３（ナイアシンアミド、ニコチンアミド）、ビタミンＣ、ビタミンＥ、補酵素Ｑ１０、オキアミ、グルタチオン、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、リコペンまたはルテイン、β−カロテン、ポリフェノールファミリー（タンニン、フェノール酸、アントシアニン、フラボノイド（例えば、緑茶、レッドベリー、ココア、ブドウ、チャボトケイソウ、または柑橘類の抽出物）、またはイソフラボン（例えば、ゲニステイン／ゲニスチンおよびダイゼイン／ダイジンなど）など）から構成される群から選択されることが有益である。抗酸化剤群には、抗糖化剤（カルノシンまたは一定のペプチド、Ｎ−アセチル−システインなど）および抗酸化剤またはフリーラジカル捕捉酵素（スーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、チオレドキシンレダクターゼ、およびそのアゴニストなど）がさらに含まれる。 
【０１８３】
組み合わせて使用することができる傷を修復する／バリア機能を修復する薬剤は、ビタミンＡ、パンテノール（ビタミンＢ５）、アボカドフラン（登録商標）、アボカド糖、ルペオール、マカペプチド抽出物、キノアペプチド抽出物、アラビノガラクタン、酸化亜鉛、マグネシウム、ケイ素、マデカス酸またはアシアト酸、硫酸デキストラン、補酵素Ｑ１０、グルコサミンおよびその誘導体、コンドロイチン硫酸および他のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、硫酸デキストラン、セラミド、コレステロール、スクアラン、リン脂質、発酵または未発酵のダイズペプチド、植物ペプチド、海洋、植物、または生物工学的なポリサッカリド（藻類抽出物またはシダ抽出物など）、微量元素、タンニンが豊富な植物の抽出物（オーク没食子で最初に見出された没食子酸タンニンまたは加水分解性タンニンと呼ばれる没食子酸由来のタンニンなど）、およびフラバン単位（そのモデルはカテキュー（アカシアカテキュー）によって提供される）の重合に起因するカテキンタンニンであることが有利である。使用することができる微量元素は、銅、マグネシウム、マンガン、クロム、セレン、ケイ素、亜鉛、およびその混合物から構成される群から選択されることが有利である。 
【０１８４】
組み合わせて成熟被験体の座瘡を処置するように作用することができる老化防止剤は、抗酸化剤、特に、ビタミンＣ、ビタミンＡ、レチノール、レチナール、任意の分子量のヒアルロン酸、アボカドフラン（登録商標）、ルピナスペプチド、およびマカペプチド抽出物である。
【０１８５】
最も一般的に使用されている保湿薬／軟化剤は、グリセリンまたはその誘導体、尿素、ピロリドンカルボン酸およびその誘導体、任意の分子量のヒアルロン酸、グリコサミノグリカンおよび海洋、植物、または生物工学的な起源の任意の他のポリサッカリド（例えば、キサンタンガム、フコゲル（登録商標）など）、一定の脂肪酸（ラウリン酸、ミリスチン酸、一価不飽和および多価不飽和のω−３、ω−６、ω−７、およびω−９脂肪酸（リノール酸、パルミトレイン酸など）など）、ヒマワリ油留出物、アボカドペプチド、およびクプアスバターである。 
【０１８６】
疾患の処置のために、本発明の薬剤を薬学的組成物に処方することができる。 
【０１８７】
本明細書中で使用する場合、「薬学的組成物」は、１つ以上の本明細書中に記載の有効成分の他の化学成分（生理学的に適切なキャリアおよび賦形剤など）との調製物をいう。薬学的組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。 
【０１８８】
本明細書中の用語「有効成分」は、生物学的効果について説明することができるＢｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗおよび／またはｐ２１を下方制御することができる薬剤をいう。薬学的組成物が特定の疾患の処置で有用であることが公知のさらなる活性薬剤を含むことができると認識されるであろう。したがって、例えば、皮膚線維性疾患の処置のために、本発明者らは、少なくとも１つの上記の皮脂調節剤、抗菌薬、抗真菌薬、角質溶解薬、角質調節剤、収斂薬、抗炎症剤／抗刺激剤、抗酸化剤／フリーラジカル消去剤、瘢痕形成剤、老化防止剤、および／または保湿剤と共に上記の薬剤を含む薬学的組成物を意図する。 
【０１８９】
以後、互換的に使用することができる句「生理学的に許容され得るキャリア」および「薬学的に許容され得るキャリア」は、生物に有意に刺激を与えず、且つ投与した化合物の生物学的活性および性質を抑制しないキャリアまたは希釈剤をいう。アジュバントは、これらの句に含まれる。 
【０１９０】
本明細書中の用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために薬学的組成物に添加される不活性物質をいう。賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖およびデンプン型、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、およびポリエチレングリコールが含まれるが、これらに限定されない。 
【０１９１】
本発明の薬学的組成物を、当該分野で周知の過程によって（例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠作製、湿式粉砕、乳化、カプセル化、捕捉、または凍結乾燥の各過程によって）製造することができる。 
【０１９２】
したがって、本発明で用いる薬学的組成物を、薬学的に使用することができる調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および助剤を含む１つ以上の生理学的に許容され得るキャリアを使用した従来の様式で処方することができる。適切な処方は、選択される投与経路に依存する。 
【０１９３】
注射のために、薬学的組成物の有効成分を、水溶液、好ましくは生理学的に適合可能な緩衝液（ハンクス液、リンゲル液、または生理学的塩緩衝液など）に処方することができる。 
【０１９４】
適切な投与経路には、例えば、経口経路、直腸経路、経粘膜経路、特に経鼻経路、腸経路、または非経口経路（筋肉内、皮下、および髄内への注射が含まれる）、および髄腔内、直接脳室内、心臓内（右心室腔内または左心室腔内）への注射、一般的な冠状動脈内、静脈内、腹腔内（ｉｎｒｔａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）、鼻腔内、または眼内への注射が含まれ得る。 
【０１９５】
特定の実施形態によれば、投与経路は局所送達を介した投与経路である。 
【０１９６】
あるいは、全身様式よりもむしろ局所様式で（例えば、患者の組織領域への薬学的組成物の直接注射によって）薬学的組成物を投与することができる。 
【０１９７】
本発明の薬学的組成物を、当該分野で周知の過程によって（例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠作製、湿式粉砕、乳化、カプセル化、捕捉、または凍結乾燥の各過程によって）製造することができる。 
【０１９８】
したがって、本発明で用いる薬学的組成物を、薬学的に使用することができる調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および助剤を含む１つ以上の生理学的に許容され得るキャリアを使用した従来の様式で処方することができる。適切な処方は、選択される投与経路に依存する。 
【０１９９】
注射のために、薬学的組成物の有効成分を、水溶液、好ましくは生理学的に適合可能な緩衝液（ハンクス液、リンゲル液、または生理学的塩緩衝液など）に処方することができる。経粘膜投与のために、透過すべきバリアに適切な浸透剤を処方物中で使用する。かかる浸透剤は、一般に、当該分野で公知である。 
【０２００】
経口投与のために、薬学的組成物を、活性化合物を当該分野で周知の薬学的に許容され得るキャリアと組み合わせることによって容易に処方することができる。かかるキャリアは、薬学的組成物を患者による経口摂取のための錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、および懸濁液などとして処方することができる。経口用の薬学的調製物を、固体賦形剤を使用して、任意選択的に得られた混合物を粉砕し、顆粒混合物を加工し、必要に応じて適切な助剤を添加後、錠剤または糖衣錠コアを得ることによって作製することができる。適切な賦形剤は、特に、充填剤（糖（ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールが含まれる）；セルロース調製物（例えば、メイズデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど）；および／または生理学的に許容され得るポリマー（ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）など）など）である。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を添加することができる。 
【０２０１】
適切なコーティングを有する糖衣錠コアを提供する。この目的のために、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を任意選択的に含むことができる糖濃縮液を使用することができる。染料または色素を、識別または活性化合物の用量の異なる組み合わせを特徴づけるために錠剤または糖衣錠コーティングに添加することができる。 
【０２０２】
経口で使用することができる薬学的組成物には、ゼラチンから作製した押し込み型のカプセルならびにゼラチンおよび可塑剤（グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された密封軟カプセルが含まれる。押し込み型カプセルは、充填剤（ラクトースなど）、結合剤（デンプンなど）、潤滑剤（タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）、および、任意選択的に、安定剤と混合して有効成分を含むことができる。軟カプセルでは、有効成分を、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解または懸濁することができる。さらに、安定剤を添加することができる。経口投与のための全ての処方物は、選択された投与経路に適切な投薬量であるべきである。 
【０２０３】
口内投与のために、組成物は、従来の様式で処方した錠剤またはロゼンジの形態を取ることができる。 
【０２０４】
鼻孔吸入による投与のために、本発明にしたがって使用するための有効成分を、適切な噴射剤（ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ−テトラフルオロエタン、または二酸化炭素）を使用して加圧パックまたはネブライザーからエアロゾルスプレーを噴射する形態で送達させることが都合が良い。加圧エアロゾルの場合、投薬単位を、弁に一定量を送達させることによって決定することができる。化合物と適切な粉末基剤（ラクトースまたはデンプンなど）との粉末混合物を含む、例えば、ディスペンサーで用いるゼラチンのカプセルおよびカートリッジを処方することができる。 
【０２０５】
本明細書中に記載の薬学的組成物を、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために処方することができる。注射用処方物を、単位投薬形態（例えば、任意選択的に防腐剤を添加したアンプルまたは多用量容器）中に含めることができる。組成物は、油性または水性のビヒクルの懸濁液、溶液、または乳濁液であってよく、処方剤（懸濁剤、安定剤、および／または分散剤など）を含むことができる。 
【０２０６】
非経口投与のための薬学的組成物は、水溶性活性調製物の水溶液を含む。さらに、有効成分の懸濁液を、適切な油性または水ベースの注射用懸濁液として調製することができる。適切な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油（ゴマ油など）または合成脂肪酸（オレイン酸エチルなどのエステル、トリグリセリド、またはリポソームなど）が含まれる。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質（カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなど）を含むことができる。任意選択的に、懸濁液はまた、適切な安定剤または高濃度溶液を調製するために有効成分の溶解性を増加させる薬剤を含むことができる。 
【０２０７】
あるいは、有効成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば、滅菌された発熱物質を含まない水ベースの溶液）で再構成するための粉末形態であり得る。
【０２０８】
本発明の薬学的組成物を、例えば、従来の坐剤基剤（カカオバターまたは他のグリセリドなど）を使用した坐剤または停留浣腸などの直腸組成物に処方することもできる。 
【０２０９】
本発明の文脈での使用に適切な薬学的組成物には、有効成分が意図する目的を達成するのに有効な量で含まれる組成物が含まれる。より具体的には、治療有効量は、障害（例えば、線維性疾患または炎症性疾患）の症状の防止、緩和、もしくは改善、または処置される被験体の延命に有効な有効成分（例えば、ｓｉＲＮＡ薬）の量を意味する。 
【０２１０】
治療有効量の決定は、特に、本明細書中に提供した詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。 
【０２１１】
本発明の方法で使用した任意の調製物のために、所望の濃度または力価を達成するための治療有効量または用量を、動物モデル（例えば、ＣＣ１４によって誘導された肝臓線維症のマウスモデル、セルレインによって誘導された膵炎のマウスモデル、ＣＯＰＤのマウスモデル）から評価することができる。かかる情報を使用して、ヒトに有用な用量をより正確に決定することができる。 
【０２１２】
本明細書中に記載の有効成分の毒性および治療有効性を、実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。これらの動物研究から得たデータを、ヒトで用いる投薬量の範囲の策定で使用することができる。投薬量は、使用した投薬形態および利用した投与経路に応じて変動し得る。正確な処方、投与経路、および投薬量を、患者の容態を考慮して各医師が選択することができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９７５，ｉｎ「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１  ｐ．ｌを参照のこと）。 
【０２１３】
投薬量および間隔を、正常血糖（最小有効濃度、ＭＥＣ）を誘導するのに十分な細胞数が得られるように個別に調整することができる。ＭＥＣは、各調製物について変動するが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は、各々の特徴および投与経路に依存するであろう。検出アッセイを使用して血漿濃度を決定することができる。 
【０２１４】
勿論、組成物の投与量は、処置される被験体、苦痛の重症度、投与様式、担当医の判断などに依存するであろう。
【０２１５】
本発明の組成物は、必要に応じて、有効成分を含む１つ以上の単位投薬形態を含むことができるパックまたはディスペンサーデバイス（ＦＤＡ認定キットなど）中に存在することができる。パックは、例えば、金属製またはプラスチック製の箔（ブリスターパックなど）を含むことができる。パックまたはディスペンサーデバイスに、投与説明書を同梱することができる。パックまたはディスペンサーに、製造、医薬品の使用または販売を規制する政府機関によって指示された形態で容器に添付された通知も同梱することができ、この通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与についての政府機関による承認を反映している。かかる通知書は、例えば、処方薬について米国食品医薬品局によって承認されたラベルまたは承認された製品の添付文書であり得る。適合可能な薬学的キャリア中に処方された本発明の調製物を含む組成物を、上記でさらに詳述するかのように調製し、適切な容器に入れ、表示の容態の処置について表示することもできる。 
【０２１６】
本出願由来の特許の存続期間中、Ｂｃｌ−ｘＬおよび／またはＢｃｌ−ｗおよび／またはｐ２１を下方制御することができる多数の関連薬剤が開発され、句「下方制御することができる薬剤」の範囲が全てのかかる新規のテクノロジーを推測的に含むことを意図すると期待される。 
【０２１７】
用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、「ｈａｖｉｎｇ」、およびその変化形は、「〜が含まれるが、これらに限定されない」を意味する。 
【０２１８】
用語「〜からなる」は、「〜を含み、且つそれに制限される」を意味する。 
【０２１９】
用語「〜から本質的になる」は、さらなる成分、工程、および／または部分が特許請求の範囲に記載の組成物、方法、または構造の基本的および新規の特徴を実質的に変化させない場合に限り、組成物、方法、または構造がさらなる成分、工程、および／または部分を含むことができることを意味する。 
【０２２０】
本明細書中で使用される場合、用語「方法」は、所与の課題を実施するための様式、手段、技術、および手順（化学分野、薬理学分野、生物学分野、生化学分野、および医学分野の当業者に公知であるか、この当業者によって公知の様式、手段、技術、および手順から容易に開発される様式、手段、技術、および手順が含まれるが、これらに限定されない）をいう。 
【０２２１】
本明細書中で使用する場合、用語「処置」には、容態の抑止、実質的な阻害、容態の進行の遅延もしくは逆転、容態の臨床的もしくは審美的な症状の実質的な改善、または容態の臨床的もしくは審美的な症状の出現の実質的な防止が含まれる。 
【０２２２】
明確にするために個別の実施形態に記載の本発明の一定の特徴を単一の実施形態で組み合わせて提供することもできると認識される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態に記載の本発明の種々の特徴を、個別に提供するか、任意の適切なサブコンビネーションで提供するか、本発明の任意の他の記載の実施形態中に適切に提供することもできる。これらの要素を含まない実施形態が無効とならない限り、種々の実施形態に記載の一定の特徴は、前記実施形態の必須の特徴と見なすべきではない。 
【０２２３】
前述および以下の特許請求の範囲に記載の本発明の種々の実施形態および態様は、以下の実施例において実験的に裏付けられる。
【０２２４】
ここで以下の実施例に関して言及し、実施例は、上記の説明と共に、制限されない様式で本発明のいくつかの実施形態を例証する。 
【０２２５】
一般に、本明細書中で使用した命名法および本発明で利用した実験手順には、分子的技術、生化学的技術、微生物学的技術、および組換えＤＮＡ技術が含まれる。かかる技術は、文献に十分に説明されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号明細書；同第４，６８３，２０２号明細書；同第４，８０１，５３１号明細書；同第５，１９２，６５９号明細書；および同第５，２７２，０５７号明細書に記載の方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」ｂｙ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；利用可能な免疫アッセイが特許および科学文献に広く記載されており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号明細書；同第３，８３９，１５３号明細書；同第３，８５０，７５２号明細書；同第３，８５０，５７８号明細書；同第３，８５３，９８７号明細書；同第３，８６７，５１７号明細書；同第３，８７９，２６２号明細書；同第３，９０１，６５４号明細書；同第３，９３５，０７４号明細書；同第３，９８４，５３３号明細書；同第３，９９６，３４５号明細書；同第４，０３４，０７４号明細書；同第４，０９８，８７６号明細書；同��４，８７９，２１９号明細書；同第５，０１１，７７１号明細書；および同第５，２８１，５２１号明細書を参照のこと；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）ａｎｄ「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌ．１−３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）（これら全てが本明細書中に完全に記載されているものとして参照して援用される）を参照のこと。他の一般的な文献が本明細書の至る所に提供されている。本明細書中の手順は、当該分野で周知であると考えられ、読み手の便宜のために提供する。本明細書中の全ての情報は、本明細書中で参考として援用される。 一般的な材料と方法 
【０２２６】
組織培養：ヒト初代線維芽細胞（ＩＭＲ−９０、ＢＪ）を、ＡＴＣＣ  ＭＥＦから入手したか、１３．５日目の胚から調製した。全培養物を、ｌ０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補足したＤＭＥＭ中で維持した。エトポシド（５０ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）での処置またはＩＭＲ−９０細胞への感染を使用した発癌性Ｈ−ｒａｓＶ１２の導入（Ｎａｒｉｔａ、２００３に記載）によって老化を誘導した。 
【０２２７】
免疫ブロッティング：細胞をＲＩＰＡ緩衝液で溶解した。等量のタンパク質を、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。以下の抗体を使用して検出した：抗Ｒｂ（９３１３）、抗切断ｐａｒｐ（９５４１）、抗切断カスパーゼ−３（９６６１）、抗ホスホ−ｐ５３（９２８４）、抗マウス−ｐ５３（２５２４）、抗ホスホ−ＮＦ−κΒ（３０３３）、抗Ｂｃｌ−２（２８７０）、抗Ｂｃｌ−ｗ（２７２４）、および抗Ｂｃｌ−ｘＬ（２７６４）を、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。抗ヒトｐ５３（ＤＯ１およびＰＡ６１８０１）、抗ｐｌ６（ｓｃ−７５９）、抗マウス−ｐ２１（ｓｃ−３９７）、抗ＮＦκＢｐ６５（ｓｃ−３７２）、および抗α−チューブリン（ｓｃ−９１０４）を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。抗ヒト−ｐ２１（５５６４３１）をＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手し、抗Ｍｃｌ−１（１２３９−１）をＥｐｉｔｏｍｉｃｓから入手した。 
【０２２８】
ＲＮＡ単離および定量的ＲＴ−ＰＣＲ：定量的ＲＴ−ＰＣＲのために、総ＲＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ，Ｄｕｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して単離した。１μｇアリコートの総ＲＮＡを、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびランダムヘキサマープライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して逆転写した。ＡＢＩ  ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）においてＰｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してリアルタイムＰＣＲを行った。 
【０２２９】
特異的遺伝子についての値をＧＡＰＤＨに対して正規化した。プライマー配列は以下であった：（１）ＧＡＰＤＨ順方向、５’−ＧＡＣＡＧＴＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＴＴＣ−３’（配列番号１）；逆方向、５’−ＣＧＴＴＧＡＣＴＣＣＧＡＣＣＴＴＣＡＣ−３’（配列番号２）；（２）Ｂｃｌ−２順方向、５’−ＡＣＴＧＧＡＧＡＧＴＧＣＴＧＡＡＧＡＴＴＧＡＴＧ−３’（配列番号３）；逆方向、５’−ＣＴＡＣＴＴＣＣＴＣＴＧＴＧＡＴＧＴＴＧＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＧ−３’（配列番号４）；（３）Ｂｃｌ−ｗ順方向、５’−ＴＧＡＣＡＣＣＴＧＧＧＴＧＧＡＡＡＧＡＧ−３’（配列番号５）；逆方向、５’−ＣＣＡＣＴＧＴＧＧＴＣＣＣＡＴＣＴＡＡＧ−３’（配列番号６）；（４）Ｂｃｌ−ｘＬ順方向、５’−ＣＣＡＴＡＣＴＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＣＴＧ−３’（配列番号７）；逆方向、５’−ＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＧＴＡＧＧＡＡＧＴＧ−３’（配列番号８）；（５）ｐ２１順方向、５’−ＴＧＴＣＴＴＴＣＣＴＧＧＣＡＣＴＡＡＣＧ−３’（配列番号９）；逆方向、５’−ＡＡＡＣＡＧＴＣＣＡＧＧＣＣＡＧＴＡＴＧ−３’（配列番号１０）；（６）ＩＬ−８順方向、５’−ＧＴＣＴＧＣＴＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＡＣ−３’（配列番号１１）；逆方向、５’−ＧＣＴＴＣＣＡＣＡＴＧＴＣＣＴＣＡＣＡＡ−３’（配列番号１２）；（７）ＭＭＰ−３、順方向、５’−ＴＣＴＧＡＧＧＧＧＡＧＡＡＡＴＣＣＴＧＡ−３’（配列番号１３）；逆方向、５’−ＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＧＣＣＡＡＡＡＴＧＡ−３’（配列番号１４）；（８）サイクリンＡ２、順方向、５’−ＡＴＧＧＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＡＣＣＴＡ−３’（配列番号１５）；逆方向、５’−ＴＧＧＧＴＴＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＡＣＡＣ−３’（配列番号１６）；（９）ＣＤＫ１順方向、５’−ＡＧＣＣＧＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＡＣ−３’（配列番号１７）；逆方向、５’−ＴＣＡＴＧＧＣＴＡＣＣＡＣＴＴＧＡＣ−３’（配列番号１８）；（１０）ＩＬ−１β順方向、５’−ＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＡＴＴＣＴＣＴＴＣ−３’（配列番号１９）；逆方向、５’−ＴＧＧＣＧＡＧＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＴＣ−３’（配列番号２０）。 
【０２３０】
生存度アッセイ：成長中の細胞および老化細胞を、１２ウェルプレート中に７．５×１０４細胞／ウェルでプレートした。翌日、細胞をＤＭＳＯコントロール、ＡＢＴ−７３７（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ，ＵＳＡ）、またはＡＢＴ−１９９（ＣｈｅｍｉｅＴｅｋ，ＵＳＡ）で処置し、細胞生存度を２４時間後に分析した。３００μｌのＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で２０分間インキュベートした。１００μｌのサンプルを９６ウェルプレートに２連で取り、Ｔｅｃａｎプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｍ２００）を使用して５４０ｎｍのＯＤを読み取った。１００μＭのｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＵＳＡ）との３時間のプレインキュベーション後に表示のＡＢＴ−７３７を添加した。 
【０２３１】
ｓｉＲＮＡ：ｐ２１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｃｌ−ｘＬをターゲティングするＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓＳＭＡＲＴｐｏｏｌ低分子干渉ＲＮＡおよび非ターゲティングプールｓｉＲＮＡ（コントロール）を、Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ１試薬を使用して細胞にトランスフェクトした（全てＤｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ，ＵＳＡから入手）。ｓｉＲＮＡを、トランスフェクション２４時間後に洗い流し、生存度を上記のように４日後に分析した。 （実施例１） Ｂｃｌ−ｗタンパク質およびＢｃｌ−ｘＬタンパク質の発現は、老化細胞中で上昇する 
【０２３２】
成長中および老化した正常なヒト（ＩＭＲ−９０）およびマウス（ＭＥＦ）の二倍体線維芽細胞中のＢｃｌ−２ファミリーメンバーのタンパク質レベルを分析した。老化は、発癌性Ｈ−ｒａｓＶ１２の発現またはＤＮＡ損傷剤エトポシドでの処置のいずれかによってこれらの細胞中で誘導された。Ｂｃｌ−ｗレベルおよびＢｃｌ−ｘＬレベルは、ヒトおよびマウスの両起源の老化細胞で上昇した。この効果は、老化を誘導するために使用した刺激と無関係であった（図１Ａ）。対照的に、Ｍｃｌ−１レベルおよびＢｃｌ−２レベルの変化は、あまり顕著でないか、細胞起源および老化を誘導するために使用したストレス刺激に依存した。老化の古典的マーカーｐｌ６、ｐ２１、またはｐ５３のレベルを、陽性ＳＡ−β−ｇａｌ染色と共に細胞の老化表現型のポジティブコントロールとして使用する（図１Ａ〜Ｂ）。これらの遺伝子の
ｍＲＮＡレベルは、成長中の細胞と老化細胞との間であまり変化せず、タンパク質レベルの増加を転写後レベルで制御することができることを示したことに注目すべきである（図１Ｃ）。 
（実施例２）
Ｂｃｌ−ｗおよびＢｃｌ−ｘＬの組み合わせノックダウンにより、老化細胞死が誘導される
【０２３３】
３つのタンパク質であるＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｗ、およびＢｃｌ−ｘＬのいずれがエトポシド処置した老化ＩＭＲ−９０細胞にアポトーシス耐性を付与するのかを区別するために、本発明者らは、これらの各タンパク質の個別の機能を特異的に阻害することを試みた。ｓｉＲＮＡを使用してＢｃｌ−ｗおよびＢｃｌ−ｘＬをノックダウンし、ｓｉＲＮＡがタンパク質レベルでのＢｃｌ−２遺伝子のノックダウンで無効であるので、特異的インヒビターＡＢＴ−１９９を使用してＢｃｌ−２を遮断した（図２Ｂ）。老化細胞におけるＢｃｌ−ｗおよびＢｃｌ−ｘＬの個別のノックダウンにより、その生存度がわずかに低下した（図３Ａ）。興味深いことに、組み合わせノックダウンは相乗効果があり、５０％の細胞を死滅させた。Ｂｃｌ−ｗおよびＢｃｌ−ｘＬノックダウンに加えてＢｃｌ−２阻害のさらなる寄与を評価するために、Ｂｃｌ−２インヒビターであるＡＢＴ−１９９を使用した（図３Ｂ）。Ｂｃｌ−２の阻害は統計的に有意であるが、老化細胞生存度に及ぼすＢｃｌ−ｗおよびＢｃｌ−ｘＬの阻害のさらなる影響は小さかった。さらに、ＡＢＴ−１９９でのＢｃｌ−２のみの阻害は老化細胞の生存度にほとんど影響を及ぼさず、加えて、発癌性Ｈ−ｒａｓＶ１２で誘導した老化ＩＭＲ−９０細胞については細胞生存度の減少が小さかった（図３Ｃ〜Ｄ）。 
（実施例３） ＢＨ３模倣ＡＢＴ−７３７は老化細胞の細胞死を誘導する 
【０２３４】
抗アポトーシスタンパク質であるＢｃｌ−ｗおよびＢｃｌ−ｘＬのレベルの増加が独立したアプローチによって老化細胞のアポトーシス耐性を説明することができるという仮説をさらに試験するために、タンパク質のＢｃｌ−２ファミリーの薬理学的インヒビターＡＢＴ−７３７で細胞を処置した（Ｃｈａｕｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。正常なヒト（ＩＭＲ−９０）およびマウス（ＭＥＦ）の線維芽細胞を、ＤＮＡ損傷の誘導または発癌性Ｈ−ＲａｓＶ１２での形質導入によって老化するように誘導した。老化表現型を確立した後、細胞をＡＢＴ−７３７で２４時間処置した。成長中の細胞、ビヒクル処置細胞、またはベクターで形質導入した細胞を、それぞれＤＮＡ損傷または発癌性Ｈ−ＲａｓＶ１２のコントロールとして使用した。この処置により老化細胞の生存度が５０％減少した一方で、コントロール細胞に及ぼす影響は僅かであった（図４Ａ〜Ｂ）。したがって、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質の薬理学的阻害によって老化細胞が特異的に排除されることが示された。 
（実施例４） ＡＢＴ−７３７はカスパーゼ依存性アポトーシスによって老化細胞を死滅させる 
【０２３５】
Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーは、アポトーシス経路を負に制御する（Ａｚｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｃｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｒｅｅｄ，２００８）。ＡＢＴ−７３７がアポトーシス経路を介して老化細胞を死滅させるかどうかを決定するために、ＤＮＡ損傷誘導性老化ＩＭＲ−９０細胞、発癌性Ｈ−ＲａｓＶ１２誘導性老化細胞、および成長中のコントロール細胞を、ＡＢＴ−７３７のみまたは汎カスパーゼインヒビターｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋと組み合わせて処置した。予想通り、ＡＢＴ−７３７処置後にＡＢＴ−７３７は老化細胞死を誘導する一方で、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋは老化細胞死を防止した（図５Ａ）。カスパーゼ−３がアポトーシス機構によって切断されるので、本発明者らは、ＡＢＴ−７３７のみまたは汎カスパーゼインヒビターｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋとの組み合わせでの処置後のカスパーゼ−３の活性化切断形態の存在を試験した。ＡＢＴ−７３７で処置した老化細胞のみがカスパーゼ−３切断を示す（図５Ｂ）。ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋの添加により、この切断が無効にされた。ＡＢＴ−７３７が老化細胞のアポトーシスを誘導すると結論付けることができる。 
（実施例５） ｐ２１（ＣＤＫＮ１Ａ）は老化細胞の生存度を維持する 
【０２３６】
ＣＤＫ４およびＣＤＫ２のインヒビターとして、ｐ２１は細胞老化の主な調節因子である（Ｃａｍｐｉｓｉ  ａｎｄ  ｄ’Ａｄｄａ  ｄｉ  Ｆａｇａｇｎａ，２００７）。ｐ２１はいくつかの環境下でアポトーシスを阻害することも示唆された（Ａｂｂａｓ  ａｎｄ  Ｄｕｔｔａ，２００９）。老化細胞の生存度へのｐ２１の寄与を調査するために、成長中の細胞および老化細胞（正常なヒト細胞（ＩＭＲ−９０、ＢＪ）およびマウス（ＭＥＦ）線維芽細胞ならびに肺癌細胞（Ｈ１２９９））においてｓｉＲＮＡを使用してｐ２１をノックダウンした。成長中の細胞におけるｐ２１ノックダウンが細胞生存度に悪影響を及ぼさなかったのに対して、老化細胞におけるそのノックダウンによりＩＭＲ−９０細胞、ＢＪ細胞、Ｈ１２９９細胞、およびＭＥＦ細胞の各々について細胞生存度が３０％、５０％、７５％、および３０％減少した（図６Ａ〜Ｄ）。興味深いことに、ｐ２１のｓｉＲＮＡでトランスフェクトした老化ＢＪ細胞の生存度の連続した減少が長期間認められ、ｐ２１ノックダウンの蓄積効果が示された（図６Ｅ）。したがって、ｐ２１は、老化細胞の生存度を維持するために必要である。 
（実施例６） 老化細胞の死滅は、ｐ５３およびｐＲＢに非依存性であり、カスパーゼ−３活性化に関与する 
【０２３７】
ＤＮＡ損傷応答が得られる刺激（例えば、電離放射線およびテロメア機能不全）は、主にｐ５３経路によって老化を誘導する（Ｃａｍｐｉｓｉ  ａｎｄ  ｄ’Ａｄｄａ  ｄｉ  Ｆａｇａｇｎａ，２００７）。活性ｐ５３は、ｐ２１（特に、リン酸化を抑制し、それ故、ｐＲＢを不活化させるサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）インヒビター）の発現の誘導により老化による成長停止を部分的に生じさせる。ｐＲＢは、Ｅ２Ｆ（細胞周期の進行に必要な遺伝子の発現を刺激する転写因子）の活性の抑制によって細胞増殖を停止させる。 
【０２３８】
老化ＢＪ細胞におけるｐ２１のノックダウンにより、アポトーシスエフェクターであるカスパーゼ−３およびＰＡＲＰの切断から示されるアポトーシス機構の活性化を生じるが、成長中のＢＪ細胞においては生じなかった。これは、ｐ５３レベルおよびｐ５３活性（ｐ−ｐ５３）の顕著な増加およびｐＲＢレベルの低下を伴っていた（図７Ａ）。ｐ５３およびＥ２ＦはＤＮＡ損傷に応答してアポトーシスを誘導することが公知であるので、本発明者らは、ｐ２１ノックダウンがｐ５３またはｐＲＢに依存する様式で老化細胞の生存度に影響を及ぼすかどうかをチェックした。 
【０２３９】
ｐ２１、ｐ５３、またはｐＲＢを、エトポシド処置したＢＪ細胞において個別にノックダウンするか、ｐ２１と組み合わせてノックダウンした。驚いたことに、ｐ５３ノックダウンは、老化細胞の生存度を減少させたが、ｐ２１のみと比較してその程度は低かった（図７Ｂ）。両遺伝子を同時にノックダウンした場合、ｐ２１ノックダウンのみと比較してｐ５３についてさらなる影響は検出されなかった。ウェスタンブロットから認められるように、ｐ５３ノックダウンによってｐ２１レベルが減少した。したがって、ｐ２１レベルはｐ５３自体よりもむしろｐ５３の下流で老化細胞の生存度の維持を担うと結論付けることができる。 
【０２４０】
ｐＲＢのｐ２１とのノックダウンは、ｐ２１のみのノックダウンと比較して老化細胞の生存度にさらなる影響を及ぼさなかった（図７Ｃ）。驚いたことに、ｐＲＢを単独でノックダウンした場合、細胞の生存度に影響を及ぼさなかったが、むしろｐ２１レベルを増加させた。したがって、ｐ２１はｐ５３およびｐＲＢに非依存性の様式で老化細胞の生存度を維持する。 
（実施例７） ｐ２１ノックダウン後の老化細胞死は、部分的にのみカスパーゼ依存性である 
【０２４１】
ｐ２１ノックダウンに原因する細胞死のタイプを解明するために、カスパーゼ媒介細胞死を、汎カスパーゼインヒビターであるｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋの添加によって評価した。ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋは、細胞死を２０％しか救済することができなかった（図８）。切断カスパーゼ−３バンドおよび切断ＰＡＲＰバンドが明白であるように、カスパーゼ−３はｐ２１ノックダウンを行ったエトポシド処置細胞で活性化された（図８）。ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋがｐ２１ノックダウンによって媒介された細胞生存度の減少を完全に救済できなかったことを考慮すると、カスパーゼ依存性アポトーシスが認められた細胞死の一部しか担っていないと判断することができる。したがって、壊死などの他の細胞死機構を老化細胞におけるｐ２１のノックダウンによって誘導することができると仮定することができる。 
（実施例８） Ｅ２Ｆ標的および炎症遺伝子は、ｐ２１ノックダウンに対する応答として下方制御される
【０２４２】
ｐ２１は、転写因子（Ｅ２Ｆ１、ＳＴＡＴ３、およびＭＹＣなど）の転写活性を、直接結合および転写因子のトランス活性化活性の阻害によって阻害することができる（Ａｂｂａｓ  ａｎｄ  Ｄｕｔｔａ，２００９）。したがって、ｐ２１ノックダウンに応答したＥ２Ｆ標的のｍＲＮＡレベルおよびＳＡＳＰ成分の変化を測定した。Ｅ２Ｆ標的であるサイクリン−Ａ２およびＣＤＫ−１のｍＲＮＡレベルの有意な増加がｐ２１ノックダウン後に検出された（図９Ａ〜Ｅ）。さらに、ｐ２１ノックダウンによりＩＬ−８およびＩＬ−１βのｍＲＮＡレベルが増加し、これは老化細胞死に関与する炎症応答を示し得る。したがって、ｐ２１ノックダウンは、老化細胞において炎症誘発性応答および細胞死を誘導する。炎症性サイトカインが免疫系に動員されてノックダウン自体によって排除されなかった細胞を死滅させるので、このアプローチによって、このアプローチの治療可能性が増大し得る。 
（実施例９） ｐ２１ノックダウンが肝臓線維症を減少させる 
【０２４３】
線維性肝において、老化細胞は、主に活性化された肝星細胞に由来する。この肝星細胞は、肝臓損傷に応答して最初に増殖し、線維性瘢痕中に沈着する細胞外基質を生成する（Ｋｒｉｚｈａｎｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，２００８）。肝臓線維症に及ぼすｐ２１ノックダウンによる老化細胞の排除の影響を評価するために、本発明者らは、野生型マウスおよびｐ２１−／−マウスに線維症を誘導させた。マウスを、以前に記載のように６週間のＣＣｌ４での処置に供して肝臓線維症を誘導させた（Ｋｒｉｚｈａｎｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  ２００８）。処置後、両遺伝子型マウス由来の肝臓を、ＳＡ−β−ｇａｌ染色によって老化細胞の存在について試験し、シリウスレッド染色によって線維症の程度について試験した。組織培養実験と一致して、ｐ２１ノックアウトマウス由来の肝臓は、野生型と比較して含有する老化細胞が有意に少なかった（図１０）。重要なことに、この低下は、線維性瘢痕量の有意な減少を伴っていた（図１０）。 
【０２４４】
これらの所見は、ｉｎ  ｖｉｖｏでｐ２１の非存在下において老化細胞の頻度が低下し、それにより線維症が減少することが示唆される。したがって、本発明者らは、ｐ２１阻害による老化細胞の排除が線維症に治療効果を有し得ることを提案する。 
【０２４５】
本発明を特定の実施形態と併せて記載しているが、多数の変更形態、修正形態、および変形形態が当業者に明らかであることが自明である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および範囲内にかかる変更形態、修正形態、および変形形態の全てが包含されることが意図される。 
【０２４６】
本明細書中で言及された全ての刊行物、特許、および特許出願は、個別の刊行物、特許、または特許出願が具体的且つ個別に本明細書中で参照として援用されることを示すのと同一の範囲にその全体が本明細書中で参照として援用される。さらに、本出願中で任意の文献が引用または特定されているが、かかる文献が本発明の先行技術として利用可能であることを承認すると解釈されないものとする。使用された節の見出しの範囲に、本発明が必然的に限定されると解釈すべきではない。 
【０２４７】
文献目録
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2016516808.tif 000004
【図１Ｃ】
2016516808.tif 000005
【図２Ａ】
2016516808.tif 000006
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図６Ｄ】
2016516808.tif 000009
【図６Ｅ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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