(57)【要約】  対象の心臓に、経皮逆行性冠静脈洞潅流を介して、ＳＤＦ−１をコードするＤＮＡプラスミドおよび製薬的に許容できるキャリア又は希釈剤を含有する医薬組成物を投与することを含む、心筋症を有する対象を処置する方法が、本明細書中で記載される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋症、虚血性心筋症、又は非虚血性心筋症のいずれか１つを有する対象を処置する方法であって、前記対象の心臓に経皮逆行性冠静脈洞潅流を介して、ＳＤＦ−１をコードするＤＮＡプラスミドと製薬的に許容できるキャリア又は希釈剤とを含有する医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡプラスミドは、配列番号１の配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象は、急性心筋梗塞に罹患している、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記対象は、慢性収縮不全の病歴を有するか、および／又は以前に心筋梗塞に罹患したことがある、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物中の前記ＤＮＡプラスミドの濃度は、約０．１２５ｍｇ／ｍｌ〜約２．０ｍｇ／ｍｌである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物中の前記ＤＮＡプラスミドの濃度は、約０．３７５ｍｇ／ｍｌ〜約１．１２５ｍｇ／ｍｌである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記対象に投与される前記ＤＮＡプラスミドの総量は、約１０ｍｇ〜約７５ｍｇである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記対象に投与される前記ＤＮＡプラスミドの総量は、約１５ｍｇ〜約４５ｍｇである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記対象に投与される前記ＤＮＡプラスミドの総量は、約３０ｍｇである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象の心臓に送達される前記医薬組成物の総体積は、約３０ｍｌ〜約１００ｍｌである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象の心臓に送達される前記医薬組成物の総体積は、約４０ｍｌである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記製薬的に許容できるキャリア又は希釈剤は、５％デキストロースである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記製薬的に許容できるキャリア又は希釈剤は、不活性緩衝液をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記経皮逆行性冠静脈洞潅流投与は、バルーンを備えたカテーテルを前記対象の大腿静脈、内頸静脈、前肘静脈、腕頭静脈又は鎖骨下静脈の中に挿入することと、前記カテーテルを冠静脈洞内に進めることと、前記バルーンを冠静脈洞、前室間静脈、後外側静脈又は大心静脈の中で拡張させることと、を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記バルーンを、２ＡＴＭ以下の圧力まで拡張させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記医薬組成物は、前記カテーテルを通して前記冠静脈洞、前記前室間静脈、前記後外側静脈又は前記大心静脈に、約２分間にわたって注入され、前記バルーンの拡張は、前記注入の後約１０分間維持される、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
心筋症、虚血性心筋症又は非虚血性心筋症のいずれか１つを有する対象を処置するための、ＳＤＦ−１をコードするＤＮＡプラスミドの使用であって、前記ＳＤＦ−１をコードするＤＮＡプラスミドが、製薬的に許容できるキャリア又は希釈剤をさらに含有する医薬組成物中で提供され、前記医薬組成物が、前記対象に経皮逆行性冠静脈洞潅流を介して投与される、使用。
【請求項１８】
前記ＤＮＡプラスミドは、配列番号１の配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１３年３月１５日に提出された米国特許仮出願第６１／７９２，９５４号の利益を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本明細書中で開示される本発明は、虚血性心疾患についての処置の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
心不全（ＨＦ）は、西洋諸国において罹患および死亡の主要な原因の１つである。現行のガイドラインベースの治療の存在下であっても、ＨＦは、６千６百万人の米国人の米国有病率と、１年に６７０，０００件の新たな発症例を有する。ＨＦは、医療制度にとって非常にコストがかかる。米国における２００８年についての慢性ＨＦの直接的および間接的な費用の見積もりは、３４８億ドルであり、これは、この疾患に伴う再発性の、長期の入院に大きく起因する。新規な有効であるＨＦ処置は、生活の質を改善し、ＨＦ入院の数を減らす。このことは、臨床的利益および医療制度のコスト削減の両方をもたらす。
【０００４】
ＨＦの主因の１つは、心筋梗塞（ＭＩ）を含む、虚血性心臓血管疾患に起因する、かつての損傷である。虚血性ＨＦ患者の大部分は、心臓収縮不全又は心臓ポンプ機能の不全を有する。近年の臨床試験データに基づき、心臓収縮ＨＦを有する患者の６２〜６７％が、かつての虚血性心疾患によって起こるＨＦを有すると見積もられる。ＨＦ集団のこの区分は、治療介入からの利益を受ける可能性が高い。
【０００５】
近年、虚血性の病因のＨＦおよびその前兆である急性ＭＩの両方が、有望な最初の結果と共に、幹細胞ベースの再生医療による処置の標的となっている。再生医療は、虚血性心疾患の処置について高い治療的有効性を有する。何故なら、症候の緩和又は心仕事量負荷の低減のいずれかに焦点をあてる現行の処置とは異なり、再生医療は、変性した器官を修復し、その器官における機能を維持する機会を提供するからである。予備的有効性（すなわち、心機能における改善）が、多くの臨床試験において示されている。他方で、臨床的に有望である幹細胞治療は、臨床使用のための細胞を得ることおよび調製することの、複雑且つ時間のかかる手順に関する挑戦に直面する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
対象の心臓に、経皮逆行性冠静脈洞潅流を介して、ＳＤＦ−１をコードするＤＮＡプラスミドおよび製薬的に許容できるキャリア又は希釈剤を含有する医薬組成物を投与することを含む、虚血を有する対象を処置する方法が、本明細書中で記載される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ルシフェラーゼをコードするプラスミドの逆行性注入後のルシフェラーゼ発現を示す。発現は、５ｍｇ（ＡおよびＢ）又は１５ｍｇ（ＣおよびＤ）のプラスミドを投薬した切除ブタ心臓からの生物発光画像によって測定される。
【図２】ルシフェラーゼをコードするプラスミドの逆行性輸液後のルシフェラーゼ発現を示す。着色領域は、タンパク質発現の区域を表す。前心筋透視図（ＡおよびＤ）、後心筋透視図（ＢおよびＥ）、並びに心筋内透視図（ＣおよびＦ）を、２つの状態の心臓について示す。
【図３】心不全のブタモデルにおけるＪＶＳ−１００の逆行性冠静脈洞送達の６０日後での、ＬＶＥＦ（Ａ）、ＬＶＥＳＶ（Ｂ）および壁運動スコア指数（ＷＭＳＩ）（Ｃ）。
【図４】逆行性注入のための冠静脈洞におけるバルーンカテーテルの蛍光画像を図示する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本出願が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。本明細書の全開示を通して挙げられた全ての特許、特許出願、出願公開および刊行物、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、ウェブサイトおよび他の出版物は、別途記載のない限り、それ自体が参考によって組み込まれる。本明細書中の用語についての複数の定義がある場合、この節における定義を優先する。別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語は、本出願が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。分子生物学用語の一般的な定義は、例えば、以下において見出され得る：Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；ａｎｄ  Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４。
【０００９】
従来的分子生物学技術を含む方法が、本明細書中で記載される。このような技術は、当該分野で一般に公知であり、以下のような方法論論文において詳細に記載される：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｖｏｌ．１〜３，ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２（定期的に更新される）。核酸の化学合成のための方法は、例えば、以下で説明される：Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９〜１８６２，１９８１，ａｎｄ  Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５，１９８１．核酸の化学合成は、例えば、市販の自動化オリゴヌクレオチド合成機によって実施されてもよい。免疫学的方法（例えば、抗原特異的抗体の調製、免疫沈降、およびイムノブロッティング）は、例えば、以下で記載される：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｅｄ．Ｍａｓｓｅｙｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２．遺伝子移入および遺伝子治療の従来的方法もまた、本出願における使用のために採用され得る。例えば、以下を参照されたい：Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｅｄ．Ｔ．Ｂｌａｃｋｅｎｓｔｅｉｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，１９９９；Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），ｅｄ．Ｐ．Ｄ．Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７；およびＲｅｔｒｏ−ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｅｄ．Ｃ．Ｐ．Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，１９９６。
【００１０】
ＵＲＬ又は他のこのような識別子又はアドレスについて言及された場合、このような識別子は変更され得ること、およびインターネット上で特定の情報が書き込まれたり消されたりするが、同等の情報が、インターネットを検索することによって探し出され得ることが、理解される。これらへの言及が、このような情報の入手可能性および公開配布を証明する。
【００１１】
本明細書中で使用される場合、「核酸」は、少なくとも２つの共有結合したヌクレオチドサブユニット又はヌクレオチドアナログサブユニットを含むポリヌクレオチドをいう。核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、又はＤＮＡ又はＲＮＡのアナログであってもよい。ヌクレオチドアナログは、市販されており、このようなヌクレオチドアナログを含むポリヌクレオチドを調製する方法は、公知である。核酸は、１本鎖、２本鎖、又はこれらの混合であってもよい。本明細書の目的のために、別途特定されない限り、核酸は、２本鎖であるか、又は文脈から明らかである。
【００１２】
本明細書中で使用される場合、「ＤＮＡ」は、全ての型およびサイズのＤＮＡ分子を含むことを意味し、これらのＤＮＡ分子としては、ｃＤＮＡ、プラスミド、並びに改変ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含むＤＮＡが挙げられる。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、「ヌクレオチド」は、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸、およびヌクレオシド三リン酸を含む。ヌクレオチドはまた、ホスホロチオエートヌクレオチドおよびデアザプリンヌクレオチド並びに他のヌクレオチドアナログなどであるがこれらに限定されない改変ヌクレオチドをも含む。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、用語「対象」は、哺乳動物および鳥類などの動物をいい、ヒト、霊長類、げっ歯類、ウシ、ブタ、ネコ、イヌ、ウマ、ニワトリなどが挙げられる。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、対象への「投与」は、１以上の送達薬剤および／又は大型核酸分子を、一緒に又は別個に、対象内に導入するか又は対象の上に塗布し、この対象内に存在する標的細胞が、最終的にこの薬剤および／又は大型核酸分子と接触するようにさせることによる手順である。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、「発現」は、核酸がペプチドに翻訳されるか、又は、ＲＮＡに転写され、このＲＮＡは、例えば、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に翻訳される、プロセスをいう。核酸がゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、適切な真核宿主細胞又は真核宿主生物が選択される場合に、ｍＲＮＡのスプライシングを含んでもよい。宿主細胞において発現される異種核酸について、これは、まず細胞に送達され、次いで、一旦細胞内に入ってから、最終的に核に移動しなければならない。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、「心筋症」は、何らかの理由による、心筋（すなわち、実際の心臓の筋肉）の機能の悪化をいう。心筋症を有する対象は、多くの場合、不整脈、突然心臓死又は心不全による入院又は死の危険を有する。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、用語「虚血性心筋症」は、心筋への不適切な酸素送達に起因する心臓の筋肉の衰弱をいい、最も一般的な病因として冠動脈疾患を伴う。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「虚血性心疾患」は、その血液供給の非存在又は相対的不足ゆえに、心臓の筋肉が損傷されるか又は非能率的にしか働かない任意の状態をいい、最も多くの場合、アテローム性動脈硬化症によって発症し、狭心症、急性心筋梗塞、慢性虚血性心疾患、および突然死が挙げられる。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「心筋梗塞」は、心臓の筋肉（心筋）の区域の、この区域への血液供給の遮断に起因する、損傷又は死をいう。
【００２１】
用語「６分間歩行試験」又は「６ＭＷＴ」は、平らで固い表面上を、６分間の間素早く歩行できる患者の距離（６ＭＷＤ）を測定する試験をいう。これは、全ての系の包括的且つ統合された応答が、運動の間に含まれたことを証明し、これらの系としては、肺系および心臓血管系、全身的循環、末梢循環、血液、神経筋単位および筋肉代謝が挙げられる。これは、運動に関与する種々の器官および系のそれぞれの機能、又は運動制限のメカニズムに対する特定の情報は提供せず、最大心肺運動試験によって可能になる。自己ペースの６ＭＷＴは、最大下レベルの機能能力を評価する。（例えば、ＡＭ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，Ｖｏｌ．１６６．Ｐｐ  １１１〜１１７（２００２）を参照されたい）。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）機能分類」は、心不全の程度についての分類をいう。これは、患者を、物理的活動の間にどれだけ制限されるかに基づいて、４つのカテゴリーのうちの１つに置く；制限／症候は、正常な呼吸並びに種々の程度の呼吸および又は狭心症の痛みに関する。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
本出願は、心筋機能の低下および／又は不全をもたらす心筋症を対象において処置するための組成物および方法に関する。本明細書中の組成物および方法によって処置される心筋症は、肺塞栓、静脈血栓、心筋梗塞、一過性脳虚血発作、末梢血管障害、アテローム性動脈硬化症、虚血性心疾患および／又は他の心筋損傷又は血管疾患に関連する心筋症を含み得る。
【００２５】
本発明の特定の実施形態において、患者は、虚血性の病因のＨＦを示し、収縮不全の病歴および／又はかつてのＭＩを有し得る者である。患者は、心エコー検査において３回の連続的な異常壁運動として規定される、領域不全の十分に規定された区域を有し得る。症候的収縮心不全患者は、低下した６分間歩行距離を示し、拡張した心臓を有し、運動を行う能力が低下し、そして健康な患者と比較して生活の質が低い。彼らはまた、ＮＴｐｒｏＢＮＰ濃度の上昇を示す。
【００２６】
前臨床モデルおよび臨床試験において、生物製剤の送達のために安全且つ実行可能であることを示されている、経皮逆行性冠静脈洞潅流は、十分に確立された代替の投与経路である。この技術に伴う方法論は、一般に、無菌技術および局所麻酔を用い、ガイドシースを内頸静脈内、鎖骨下静脈、前肘静脈、腕頭静脈、大腿静脈、径脈、又は他の好適な侵入点に挿入し、その後、標準的プロトコールを用いてワイヤーによって導かれるバルーンカテーテルを静脈内に進めることを含む。一旦、下大静脈において、カテーテルを右心房内に進め、次いで、後動脈壁に沿って回して、中隔尖又は三尖弁のすぐ上に置く。カテーテルの冠静脈洞内へのゆっくりとした侵入の後、バルーンを、妨げとならない中央位置に置く。このバルーンは、冠静脈洞において、執り行う医師の臨床判断によって決定される梗塞区域の近くの、以下のうちの１つの位置に配置されなければならない：１）冠静脈洞；２）中心静脈；３）小心静脈；又は４）大心静脈。しかし、それぞれの症例の特定の特徴は、これらの４つの位置以外の位置にバルーンを置くことを必要とする場合がある。一旦配置された後、バルーンは（好ましくは、約２ＡＴＭ以下の圧力まで）拡張されて、潅流される医薬がカテーテル腔を通して、特定の時間（好ましくは、２分間）にわたって冠静脈洞内に注入される。幾つかの実施形態において、このバルーンは、注入後約１０分間拡張したままであり、医薬の心臓組織内への逆行性分散を可能にする。
【００２７】
本明細書中で、心筋症を有する対象の心臓に、経皮逆行性冠静脈洞潅流を介して間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）をコードするポリヌクレオチドを投与することにより、この対象を処置する方法が、記載される。記載の方法の幾つかの実施形態において、ＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡプラスミドである。記載の方法の幾つかの実施形態において、ＳＤＦ−１をコードするＤＮＡプラスミドは、配列番号１の配列を含む。
【００２８】
本明細書中で、非虚血性心筋症を有する対象の心臓に、経皮逆行性冠静脈洞潅流を介して間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）をコードするポリヌクレオチドを投与することにより、この対象を処置する方法が、記載される。記載の方法の幾つかの実施形態において、ＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡプラスミドである。記載の方法の幾つかの実施形態において、ＳＤＦ−１をコードするＤＮＡプラスミドは、配列番号１の配列を含む。
【００２９】
本明細書中で、虚血性心筋症を有する対象の心臓に、経皮逆行性冠静脈洞潅流を介して間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）をコードするポリヌクレオチドを投与することにより、この対象を処置する方法が、記載される。記載の方法の幾つかの実施形態において、ＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡプラスミドである。記載の方法の幾つかの実施形態において、ＳＤＦ−１をコードするＤＮＡプラスミドは、配列番号１の配列を含む。
【００３０】
本明細書中で記載される方法は、急性心筋梗塞に罹患している対象を処置するために使用され得る。記載の方法はまた、慢性収縮不全の病歴を有する対象を処置するために使用され得る。さらに、これらの方法は、以前に心筋梗塞に罹患したことがある対象を処置するために使用され得る。幾つかの実施形態において、記載の方法は、心筋梗塞を有するか又は心筋梗塞を有したことのある対象、又は慢性収縮の病歴を有する対象を同定すること、並びにこの対象の心臓に、逆行性冠静脈洞潅流を介してＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを投与することを、含み得る。
【００３１】
本明細書中で、少なくとも１つの記載のＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチド、および製薬的に許容できるキャリアを含む組成物が、記載される。記載の組成物は、例えば、心筋症を処置するための対象への投与のために、有用である。このような組成物は、例えば、本明細書中で記載され例示されるような虚血性心筋症を処置するための対象への投与のために、有用である。記載の組成物は、例えば、非虚血性心筋症を処置するための対象への投与のために、有用である。この組成物は、本明細書中で記載され例示されるものを含む、当該分野で公知であり且つ好適である種々の調製のいずれかで処方され得る。幾つかの実施形態において、この組成物は、水性処方物である。水溶液は、抗体又は抗原結合断片を水中又は好適な生理学的緩衝液中に混合し、所望される場合必要に応じて好適な着色剤、香味添加剤、保存料、安定化剤および増粘剤などを添加することにより、調製され得る。水性懸濁液はまた、ポリヌクレオチドを、粘性材料、例えば天然ゴム又は合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどの周知の懸濁化剤と共に、水中又は生理学的緩衝液中に分散させることによって作製され得る。幾つかの実施形態において、記載の方法は、ＳＤＦ−１をコードするＤＮＡプラスミドおよび製薬的に許容できるキャリアを含む組成物の使用を含む。記載の方法の幾つかの実施形態において、配列番号１の配列を有するＳＤＦ−１をコードするＤＮＡプラスミド、および製薬的に許容できるキャリアを含む組成物の使用を含む。
【００３２】
本明細書中で記載される場合、製薬的に許容できるキャリアは、特定の百分率のデキストロースを有する溶液であり得る。幾つかの実施形態において、生理学的に許容できるキャリアは、約１％のデキストロースを含む。幾つかの実施形態において、生理学的に許容できるキャリアは、約２％のデキストロースを含む。幾つかの実施形態において、生理学的に許容できるキャリアは、約３％のデキストロースを含む。幾つかの実施形態において、生理学的に許容できるキャリアは、約４％のデキストロースを含む。幾つかの実施形態において、生理学的に許容できるキャリアは、約５％のデキストロースを含む。幾つかの実施形態において、生理学的に許容できるキャリアは、約６％のデキストロースを含む。幾つかの実施形態において、生理学的に許容できるキャリアは、約７％のデキストロースを含む。幾つかの実施形態において、生理学的に許容できるキャリアは、約８％のデキストロースを含む。幾つかの実施形態において、生理学的に許容できるキャリアは、約９％のデキストロースを含む。幾つかの実施形態において、生理学的に許容できるキャリアは、約１０％のデキストロースを含む。幾つかの実施形態において、記載の方法は、ＳＤＦ−１をコードするＤＮＡプラスミドおよび約２％のデキストロースを含む製薬的に許容できるキャリアを含む、組成物の使用を含む。記載の方法の幾つかの実施形態において、配列番号１の配列を有するＳＤＦ−１をコードするＤＮＡプラスミドおよび約２％のデキストロースを含む製薬的に許容できるキャリアを含む、組成物の使用を含む。幾つかの実施形態において、記載の方法は、ＳＤＦ−１をコードするＤＮＡプラスミドおよび約３％のデキストロースを含む製薬的に許容できるキャリアを含む、組成物の使用を含む。記載の方法の幾つかの実施形態において、配列番号１の配列を有するＳＤＦ−１をコードするＤＮＡプラスミド、および約３％のデキストロースを含む製薬的に許容できるキャリアを含む組成物の使用を含む。幾つかの実施形態において、記載の方法は、ＳＤＦ−１をコードするＤＮＡプラスミドおよび約４％のデキストロースを含む製薬的に許容できるキャリアを含む、組成物の使用を含む。記載の方法の幾つかの実施形態において、配列番号１の配列を有するＳＤＦ−１をコードするＤＮＡプラスミド、および約４％のデキストロースを含む製薬的に許容できるキャリアを含む組成物の使用を含む。幾つかの実施形態において、記載の方法は、ＳＤＦ−１をコードするＤＮＡプラスミドおよび約５％のデキストロースを含む製薬的に許容できるキャリアを含む、組成物の使用を含む。記載の方法の幾つかの実施形態において、配列番号１の配列を有するＳＤＦ−１をコードするＤＮＡプラスミド、および約５％のデキストロースを含む製薬的に許容できるキャリアを含む組成物の使用を含む。幾つかの実施形態において、記載の方法は、ＳＤＦ−１をコードするＤＮＡプラスミドおよび約６％のデキストロースを含む製薬的に許容できるキャリアを含む、組成物の使用を含む。記載の方法の幾つかの実施形態において、配列番号１の配列を有するＳＤＦ−１をコードするＤＮＡプラスミド、および約６％のデキストロースを含む製薬的に許容できるキャリアを含む組成物の使用を含む。幾つかの実施形態において、記載の方法は、ＳＤＦ−１をコードするＤＮＡプラスミドおよび約７％のデキストロースを含む製薬的に許容できるキャリアを含む、組成物の使用を含む。記載の方法の幾つかの実施形態において、配列番号１の配列を有するＳＤＦ−１をコードするＤＮＡプラスミド、および約７％のデキストロースを含む製薬的に許容できるキャリアを含む組成物の使用を含む。幾つかの実施形態において、記載の方法は、ＳＤＦ−１をコードするＤＮＡプラスミドおよび約８％のデキストロースを含む製薬的に許容できるキャリアを含む、組成物の使用を含む。記載の方法の幾つかの実施形態において、配列番号１の配列を有するＳＤＦ−１をコードするＤＮＡプラスミド、および約８％のデキストロースを含む製薬的に許容できるキャリアを含む組成物の使用を含む。
【００３３】
製薬的に許容できるキャリアに加え、心筋症、虚血性心筋症又は非虚血性心筋症を処置する記載の方法における使用のための、本明細書中で記載されるＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを含む組成物は、さらに緩衝液を含み得る。幾つかの実施形態において、記載の組成物は、二塩基酸、炭酸および他塩基酸、リン酸又はそれらの好適な塩を含む緩衝液を含み得る。幾つかの実施形態において、記載の組成物は、生理学的ｐＨを維持する緩衝液を組み込み得る。幾つかの実施形態において、記載の組成物は、わずかに酸性のｐＨを維持する緩衝液を組み込み得る。幾つかの実施形態において、記載の組成物は、わずかに塩基性のｐＨを維持する緩衝液を組み込み得る。幾つかの実施形態において、記載の組成物は、約５．４のｐＨを約７．４に上げる緩衝液を組み込み得る。
【００３４】
心筋症、虚血性心筋症又は非虚血性心筋症を処置する記載の方法における使用のための、本明細書中で記載されるＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを含む組成物は、ＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを、約０．１２５ｍｇ／ｍｌ〜約２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で含み得る。幾つかの実施形態において、記載の組成物は、約０．１２５ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを有する。幾つかの実施形態において、記載の組成物は、約０．２５ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを有する。幾つかの実施形態において、記載の組成物は、約０．３７５ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを有する。幾つかの実施形態において、記載の組成物は、約０．５ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを有する。幾つかの実施形態において、記載の組成物は、約０．６２５ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを有する。
【００３５】
幾つかの実施形態において、記載の組成物は、約０．７５ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを有する。幾つかの実施形態において、記載の組成物は、約０．８７５ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを有する。幾つかの実施形態において、記載の組成物は、約１ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを有する。幾つかの実施形態において、記載の組成物は、約１．１２５ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを有する。幾つかの実施形態において、記載の組成物は、約１．２５ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを有する。幾つかの実施形態において、記載の組成物は、約１．３７５ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを有する。幾つかの実施形態において、記載の組成物は、約１．５ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを有する。幾つかの実施形態において、記載の組成物は、約１．６２５ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを有する。幾つかの実施形態において、記載の組成物は、約１．７５ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを有する。幾つかの実施形態において、記載の組成物は、約１．８７５ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを有する。幾つかの実施形態において、記載の組成物は、約２ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを有する。記載の実施形態のそれぞれにおいて、ＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を有するＤＮＡプラスミドであり得る。
【００３６】
心筋症、虚血性心筋症又は非虚血性心筋症を処置する記載の方法における使用のための、本明細書中で記載されるＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを含む組成物は、対象に総量約１０ｍｇ〜約７５ｍｇのポリヌクレオチドを投与するために使用され得る。幾つかの実施形態において、対象に送達されるＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドの総量は、約１０ｍｇである。幾つかの実施形態において、対象に送達されるＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドの総量は、約１５ｍｇである。幾つかの実施形態において、対象に送達されるＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドの総量は、約２０ｍｇである。幾つかの実施形態において、対象に送達されるＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドの総量は、約２５ｍｇである。幾つかの実施形態において、対象に送達されるＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドの総量は、約３０ｍｇである。幾つかの実施形態において、対象に送達されるＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドの総量は、約３５ｍｇである。幾つかの実施形態において、対象に送達されるＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドの総量は、約４０ｍｇである。幾つかの実施形態において、対象に送達されるＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドの総量は、約４５ｍｇである。幾つかの実施形態において、対象に送達されるＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドの総量は、約５０ｍｇである。幾つかの実施形態において、対象に送達されるＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドの総量は、約５５ｍｇである。幾つかの実施形態において、対象に送達されるＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドの総量は、約６０ｍｇである。幾つかの実施形態において、対象に送達されるＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドの総量は、約６５ｍｇである。幾つかの実施形態において、対象に送達されるＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドの総量は、約７０ｍｇである。幾つかの実施形態において、対象に送達されるＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドの総量は、約７５ｍｇである。記載の実施形態のそれぞれにおいて、ＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を有するＤＮＡプラスミドであり得る。
【００３７】
心筋症、虚血性心筋症又は非虚血性心筋症を処置する記載の方法における使用のための、本明細書中で記載されるＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを含む組成物は、対象の心臓に総体積約３０ｍｌ〜約１００ｍｌで送達され得る。１つの実施形態において、対象の心臓に送達される、ＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを含む組成物の総体積は、約３０ｍｌである。１つの実施形態において、対象の心臓に送達される、ＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを含む組成物の総体積は、約３５ｍｌである。１つの実施形態において、対象の心臓に送達される、ＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを含む組成物の総体積は、約４０ｍｌである。１つの実施形態において、対象の心臓に送達される、ＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを含む組成物の総体積は、約４５ｍｌである。１つの実施形態において、対象の心臓に送達される、ＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを含む組成物の総体積は、約５０ｍｌである。１つの実施形態において、対象の心臓に送達される、ＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを含む組成物の総体積は、約５５ｍｌである。１つの実施形態において、対象の心臓に送達される、ＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを含む組成物の総体積は、約６０ｍｌである。１つの実施形態において、対象の心臓に送達される、ＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを含む組成物の総体積は、約６５ｍｌである。１つの実施形態において、対象の心臓に送達される、ＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを含む組成物の総体積は、約７０ｍｌである。１つの実施形態において、対象の心臓に送達される、ＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを含む組成物の総体積は、約７５ｍｌである。１つの実施形態において、対象の心臓に送達される、ＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを含む組成物の総体積は、約８０ｍｌである。１つの実施形態において、対象の心臓に送達される、ＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを含む組成物の総体積は、約８５ｍｌである。１つの実施形態において、対象の心臓に送達される、ＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを含む組成物の総体積は、約９０ｍｌである。１つの実施形態において、対象の心臓に送達される、ＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを含む組成物の総体積は、約９５ｍｌである。１つの実施形態において、対象の心臓に送達される、ＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを含む組成物の総体積は、約１００ｍｌである。記載の実施形態のそれぞれにおいて、ＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を有するＤＮＡプラスミドであり得る。
【００３８】
ＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドを経皮逆行性冠静脈洞潅流を介して対象の心臓に投与することにより、心筋症、虚血性心筋症又は非虚血性心筋症を有する対象を処置する記載の方法は、種々の方法において実施され得、これらの幾つかは、バルーンカテーテルが対象内において拡張される位置によって変動する。１つの実施形態において、この方法は、バルーンを有するカテーテルを、対象の大腿静脈、内頸静脈、鎖骨下静脈、前肘静脈、腕頭静脈、又は径脈の中に挿入し、このカテーテルを冠静脈洞内に侵入させ、バルーンを対象の冠静脈洞内で拡張した後に、ＳＤＦ−１をコードするプラスミドを含む組成物を投与することによって、実施され得る。１つの実施形態において、この方法は、バルーンを有するカテーテルを、対象の大腿静脈、内頸静脈、鎖骨下静脈、前肘静脈、腕頭静脈、又は径脈の中に挿入し、このカテーテルを冠静脈洞内に侵入させ、バルーンを対象の中心静脈内で拡張した後に、ＳＤＦ−１をコードするプラスミドを含む組成物を投与することによって、実施され得る。１つの実施形態において、この方法は、バルーンを有するカテーテルを、対象の大腿静脈、内頸静脈、鎖骨下静脈、前肘静脈、腕頭静脈、又は径脈の中に挿入し、このカテーテルを冠静脈洞内に侵入させ、バルーンを対象の小心静脈内で拡張した後に、ＳＤＦ−１をコードするプラスミドを含む組成物を投与することによって、実施され得る。１つの実施形態において、この方法は、バルーンを有するカテーテルを、対象の大腿静脈、内頸静脈、鎖骨下静脈、前肘静脈、腕頭静脈、又は径脈の中に挿入し、このカテーテルを冠静脈洞内に侵入させ、バルーンを対象の大心静脈内で拡張した後に、ＳＤＦ−１をコードするプラスミドを含む組成物を投与することによって、実施され得る。記載の方法の幾つかの実施形態において、蛍光顕微鏡可視化を可能にするため、造影剤が、ＳＤＦ−１プラスミドを含む組成物の送達の前に投与されてもよい。記載の実施形態のそれぞれにおいて、ＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を有するＤＮＡプラスミドであり得る。記載の方法は、当業者に公知の種々の異なるカテーテル型を用いて実施され得ることを理解されたい。例えば、好適なカテーテルは、コンプライアントバルーン又はノンコンプライアントバルーンを有してもよく、このバルーンを拡張するために気体又は液体で満たされてもよく、又は、本明細書中で記載される特定のカテーテルとは異なる他の特性を有してもよい。
【００３９】
１つの実施形態において、この方法は、バルーンを有するカテーテルを、対象の大腿静脈、内頸静脈、鎖骨下静脈、前肘静脈、腕頭静脈、又は径脈の中に挿入し、このカテーテルを冠静脈洞内に侵入させ、バルーンを対象の冠静脈洞内で２ＡＴＭ以下の圧力まで拡張した後に、ＳＤＦ−１をコードするプラスミドを含む組成物を投与することによって、実施され得る。１つの実施形態において、この方法は、バルーンを有するカテーテルを、対象の大腿静脈、内頸静脈、鎖骨下静脈、前肘静脈、腕頭静脈、又は径脈の中に挿入し、このカテーテルを冠静脈洞内に侵入させ、バルーンを対象の中心静脈内で２ＡＴＭ以下の圧力まで拡張した後に、ＳＤＦ−１をコードするプラスミドを含む組成物を投与することによって、実施され得る。１つの実施形態において、この方法は、バルーンを有するカテーテルを、対象の大腿静脈、内頸静脈、鎖骨下静脈、前肘静脈、腕頭静脈、又は径脈の中に挿入し、このカテーテルを冠静脈洞内に侵入させ、バルーンを対象の小心静脈内で２ＡＴＭ以下の圧力まで拡張した後に、ＳＤＦ−１をコードするプラスミドを含む組成物を投与することによって、実施され得る。１つの実施形態において、この方法は、バルーンを有するカテーテルを、対象の大腿静脈、内頸静脈、鎖骨下静脈、前肘静脈、腕頭静脈、又は径脈の中に挿入し、このカテーテルを冠静脈洞内に侵入させ、バルーンを対象の大心静脈内で２ＡＴＭ以下の圧力まで拡張した後に、ＳＤＦ−１をコードするプラスミドを含む組成物を投与することによって、実施され得る。１つの実施形態において、この方法は、バルーンを有するカテーテルを、対象の大腿静脈、内頸静脈、鎖骨下静脈、前肘静脈、腕頭静脈、又は径脈の中に挿入し、このカテーテルを冠静脈洞内に侵入させ、バルーンを対象の冠静脈洞内で１ＡＴＭ以下の圧力まで拡張した後に、ＳＤＦ−１をコードするプラスミドを含む組成物を投与することによって、実施され得る。１つの実施形態において、この方法は、バルーンを有するカテーテルを、対象の大腿静脈、内頸静脈、鎖骨下静脈、前肘静脈、腕頭静脈、又は径脈の中に挿入し、このカテーテルを冠静脈洞内に侵入させ、バルーンを対象の中心静脈内で１ＡＴＭ以下の圧力まで拡張した後に、ＳＤＦ−１をコードするプラスミドを含む組成物を投与することによって、実施され得る。１つの実施形態において、この方法は、バルーンを有するカテーテルを、対象の大腿静脈、内頸静脈、鎖骨下静脈、前肘静脈、腕頭静脈、又は径脈の中に挿入し、このカテーテルを冠静脈洞内に侵入させ、バルーンを対象の小心静脈内で１ＡＴＭ以下の圧力まで拡張した後に、ＳＤＦ−１をコードするプラスミドを含む組成物を投与することによって、実施され得る。１つの実施形態において、この方法は、バルーンを有するカテーテルを、対象の大腿静脈、内頸静脈、鎖骨下静脈、前肘静脈、腕頭静脈、又は径脈の中に挿入し、このカテーテルを冠静脈洞内に侵入させ、バルーンを対象の大心静脈内で１ＡＴＭ以下の圧力まで拡張した後に、ＳＤＦ−１をコードするプラスミドを含む組成物を投与することによって、実施され得る。記載の方法の幾つかの実施形態において、蛍光顕微鏡可視化を可能にするため、造影剤が、ＳＤＦ−１プラスミドを含む組成物の送達の前に投与されてもよい。記載の実施形態のそれぞれにおいて、ＳＤＦ−１をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を有するＤＮＡプラスミドであり得る。
【００４０】
一旦バルーンが拡張されると、医薬組成物が、カテーテルを通して対象へ約２分間にわたって注入され得る。この方法の幾つかの実施形態において、医薬組成物の注入後、このバルーンは、約５〜１５分間拡張したままであってもよい。この方法の幾つかの実施形態において、医薬組成物の注入後、このバルーンは、約７〜１２分間拡張したままであってもよい。この方法の幾つかの実施形態において、医薬組成物の注入後、このバルーンは、約１０分間拡張したままであってもよい。
【００４１】
ＳＤＦ−１をコードするプラスミドを有する記載の医薬組成物の投与後、ＳＤＦ−１タンパク質が、心臓の細胞内で発現され得る。幾つかの実施形態において、心臓の幾つかの細胞におけるプラスミドの持続期間は、約１０日間であり得る。幾つかの実施形態において、心臓の幾つかの細胞におけるプラスミドの持続期間は、約２０日間であり得る。幾つかの実施形態において、心臓の幾つかの細胞におけるプラスミドの持続期間は、約３０日間であり得る。幾つかの実施形態において、心臓の幾つかの細胞におけるプラスミドの持続期間は、約４０日間であり得る。幾つかの実施形態において、心臓の幾つかの細胞におけるプラスミドの持続期間は、約５０日間であり得る。幾つかの実施形態において、心臓の幾つかの細胞におけるプラスミドの持続期間は、約６０日間であり得る。
【００４２】
以下の実施例は、本明細書中で記載される主題の特定の実施形態を記載するために、より詳細に提供される。これらの実施例は、限定されないが、実施形態を説明することが意図される。
【実施例】
【００４３】
実施例Ｉ−ブタにおけるルシフェラーゼの逆行性注入
この研究の到達点は、かつて梗塞した心筋へのプラスミドの逆行性注入の後のタンパク質発現の存在および分布を決定することであった。この目的を達成するために、我々は、急性心筋梗塞の４か月後のブタに逆行性注入した３日後、ブタ心臓におけるルシフェラーゼプラスミドＤＮＡ発現を評価した。この研究に使用されたプラスミド（ＡＣＬ−０１１１０Ｌ）は、ＪＶＳ−１００に含まれるプラスミドと、発現をモニタリングするためにＳＤＦ−１の代わりにルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現することを除き同一の骨格を有する。急性心筋梗塞を４か月前に発症した３匹の成体ヨークシャーブタに、逆行性送達を介して各５ｍｇ（ブタ１匹）又は１５ｍｇ（ブタ２匹）のプラスミドを含有する４０ｍｌのＡＣＬ−０１１１０Ｌを注入した。逆行性送達は、バルーンカテーテル（ARROW Double Lumen Wedge Balloon Catheter）の冠静脈洞を通した大冠静脈への挿入、バルーンの拡張、およびＡＣＬ−０１１１０Ｌの冠静脈系への注入から構成される。注入の３日後、動物を屠殺し、心筋を切除した。レポーター（ルシフェラーゼ）遺伝子発現を、Ｘｅｎｏｇｅｎ画像化システムを用いて未処置の切除心臓において測定した。５ｍｇ用量を与えた動物において発現は検出されなかった（図１（ＡおよびＢ））が、他方で、１５ｍｇを与えた両動物については、有意なタンパク質発現を検出した（図１（ＣおよびＤ））。これらの結果は、ＪＶＳ−１００タンパク質発現を惹起するために必要な最小用量が、５〜１５ｍｇの間で存在することを示唆する。
【００４４】
実施例ＩＩ−逆行性冠静脈洞送達後のプラスミド発現
注入部位の影響を決定するために、プラスミド生体分布を、Ｃｏｏｋ  Ａｄｖａｎｃｅ  ３５ＬＰカテーテル（ｎ＝２）又はＣｏｏｋ  Ａｄｖａｎｃｅ（登録商標）３５ＬＰカテーテルとＣｏｏｋ  Ｃａｎｔａｔａ（登録商標）マイクロカテーテルとの組み合わせのどちらかを用いた４匹のブタにおいて試験した。４匹（４／４）の家畜ブタを麻酔し、血管アクセスを、右頸静脈を介して得た。大心静脈の測定を取った後、適切な大きさにしたＣｏｏｋ  Ａｄｖａｎｃｅ（登録商標）３５ＬＰバルーンカテーテルを、心静脈の中に配置した。４匹の動物のうち２匹において、ルシフェラーゼタグ化ＪＶＳ−１００，ＡＣＬ−０１１１０Ｌ（１ｍｇ／ｍｌ）を、２分間の経過にわたって注入した。十（１０）ｍｌのプラスミドを、４つのそれぞれの位置にてマイクロカテーテルを通して注入した。注入後、閉塞を、１０分間維持した。注入手順の四十八（４８）時間後、動物を屠殺し、心臓を切除した。各心臓を、Ｄ−ルシフェラーゼ基質中に置き、次いで、ルシフェラーゼ発現について画像化した（図２（Ａ〜Ｆ））。
【００４５】
この研究からの結果は、Ｃｏｏｋ  Ａｄｖａｎｃｅ  ３５  ＬＰのみを通した逆行性注入後の両動物の心組織において強い発現を示した。これらの結果に基づき、我々は、Ｃｏｏｋ  Ａｄｖａｎｃｅ  ３５ＬＰバルーンカテーテルを通したプラスミドの逆行性冠静脈洞投与は、心臓に分布をもたらし、これは４８時間後も検出可能なままであると結論した。
【００４６】
実施例ＩＩＩ−ブタモデルにおけるＪＶＳ−１００の逆行性冠静脈洞送達
ＪＶＳ−１００の送達を、逆行性冠静脈洞投与を用いて、確立されたＭＩのブタ閉塞／再灌流モデルにおいて試験した。この研究において、２４匹のブタに、左冠動脈前下行枝１（ＬＡＤ）の閉塞の３０日後、２つの用量レベル、すなわち、１５ｍｇ又は４５ｍｇのうち１つにて、ＪＶＳ−１００の単回用量を注射した。ブタは全て、収縮不全（ＬＶＥＦ＜４０％）、および心臓リモデリングの証拠（ＬＶＥＳＶ＞５５ｍｌ）を、注射の時点（ＭＩの３０日後）で有した。各群４匹の動物を、３日後又は６０日後のどちらかで屠殺した。動物を、３日目および６０日目における、心臓および他の組織へのプラスミドの生体分布、臨床病理学（血液学、血清化学、凝集）並びに組織の病理組織学試験を含め、安全性エンドポイントについて評価した。効力の測定を、６０日目における動物において実施した。
【００４７】
４０ｍｌの５％デキストロース溶液中１５ｍｇおよび４５ｍｇの用量での、逆行性潅流を介した試験物質の投与は、何ら副作用を伴わなかった。１匹のブタのみが、計画された剖検の前に死んだ。この死は、動物モデルにおける心臓損傷の合併症によるものであり、投与した試験物質に関連しなかった。試験物質の投与は、死亡率、臨床治験、体重の変化、臨床的病理学エンドポイント又は有害な顕微鏡的知見を何ら伴わなかった。ビヒクル対照と比較して、いかなる処置群にも血液学パラメータの中に試験関連の作用は存在しなかった。試験物質の投与は、対照と比較して、一時的な、注入６時間後時点での、一時的なクレアチニンキナーゼＭＢおよびトロポニン−Ｉのわずかな増加を伴った。この増加の大きさは、ＭＩの後で見られた臨床的に妥当性のある増加と比較して、小さかった。
【００４８】
投薬の前および６０日目に、連続的な心エコー写真撮影によって、心臓サイズおよび機能をモニタリングすることにより、効力を測定した。対照動物は、６０日目に、ＬＶＥＳＶの増大（すなわち、悪化）の傾向、並びに機能における改善のなさ（すなわち、ＬＶＥＦおよび壁運動スコア指標（ＷＭＳＩ））を示し、心不全モデルと一致した。対照的に、低用量群および抗用量群の両方が、心機能の改善の傾向（ＬＶＥＦおよびＷＭＳＩ）並びにＬＶリモデリング（ＬＶＥＳＶ）の減弱を実証した（図４）。ＬＶＥＦ又はＬＶＥＳＶに対して統計学的有意な処置効果はなかったが、偽薬対照と比較した低用量処置群において、統計学的に有意な改善が、ＷＭＳＩにおいて存在する（ｐ＝０．０２９）（図３（Ｃ））。基線値における有意な相違は、これらの分析に用いたいずれのパラメータについても、対照群と処置群との間で観察されなかった。基線は、０日目における処置の直前、梗塞の３０日後と規定される。基線から６０日目までの有意な相違は、試験したいずれのパラメータについても、対照群又は処置群のいずれにおいても存在しなかった。
【００４９】
互いに比較した場合、用量群の間で、統計学的な相違は測定されなかった。さらに、どの用量が最も有効であるかの非統計学的な傾向はなく、機能測定（ＬＶＥＦおよびＷＭＳＩ）が低用量においてわずかに利益が多いことを示す一方で、ＬＶリモデリング測定（ＬＶＥＳＶおよびＬＶＥＤＶ）は、高用量群においてわずかに低い悪化を示した。
【００５０】
心臓組織および非心臓組織におけるＪＶＳ−１００分布を、注射の３日後および６０日後に測定した。心臓組織において、各時点にて、ＪＶＳ−１００プラスミドは、分析した心臓の全ての切片に存在し、冠静脈洞内への滴下後の広範な分布を実証した。低レベルのＪＶＳ−１００が、３日目に、非標的化組織において検出され、腎臓において最も高いレベルを有した。処置の約６０日後までに、ＪＶＳ−１００は、試験した全ての非標的組織から完全に除去された。限定的な量のＪＶＳ−１００が、ブタ心臓の幾つかの右心室および左心室において検出された。４０ｍＬ中１５ｍｇでの処置の場合において、１つの末梢冠静脈洞組織にもまた、ブタ組織ＤＮＡの１μｇあたり９８コピーのＪＶＳ−１００を検出した。
【００５１】
このブタＭＩ効力および安全性研究の結果は、逆行性冠静脈洞送達を介した１５ｍｇ又は３０ｍｇの用量でのＪＶＳ−１００投与が、治療利益の証拠を示したことを実証する。いずれの用量においても、何ら毒物学的効果の証拠は観察されなかった。
【００５２】
実施例ＩＶ−ヒト対象におけるＪＶＳ−１００の逆行性注入
我々は、虚血性心疾患を有する対象への、バルーン閉塞カテーテルシステムを用いた逆行性注入を介したＪＶＳ−１００送達を計画する。無菌技術および局所麻酔を用い、アクセスシースを、大腿静脈の最も遠位の位置内に挿入する。冠静脈洞へのアクセスを、標準的カテーテル技術を用いて達成する。一旦冠静脈洞へのアクセスを達成した後、バルーン閉塞カテーテルを、標準的カテーテル技術を用いて冠静脈洞内に配置する。カテーテルの冠静脈洞内へのゆっくりとした侵入の後、バルーンを、妨げとならない中央位置に置く。このバルーンは、冠静脈洞において、執り行う医師の臨床判断によって決定される梗塞区域の近くの、以下のうちの１つの位置に配置されなければならない：
１）冠静脈洞、
２）大心静脈、
３）前室間静脈、および
４）後外側静脈。
【００５３】
しかし、それぞれの症例の特定の特徴は、これらの４つの位置以外の位置にバルーンを置くことを必要とする場合がある（図４）。実際の配置を、この発生頻度を決定するために記録する。一旦配置した後、バルーンを、２ＡＴＭ以下で拡張させ、総体積４０ｍｌのＪＶＳ−１００を、４つの１０ｍＬシリンジに分け、そしてカテーテル腔を通して冠静脈洞内に計２分間にわたって注入した。このバルーンは、注入後約１０分間拡張したままであり、プラスミドの心臓組織内への逆行性分散を可能にする。
【００５４】
逆行性注入によって送達するＪＶＳ−１００の提唱した用量、１５ｍｇ、３０ｍｇおよび４５ｍｇは、表１にまとめた蓄積データに基づく。１５ｍｇ（０．３７５ｍｇ／ｍｌ）用量は、ＪＶＳ−１００タンパク質発現を示し、有効であると示された最低用量と同等である。３０ｍｇ（０．７５ｍｇ／ｍｌ）用量は、心筋内注射によって送達されたＧＬＰ研究、心不全のブタモデル（１５６４−００３）へのＪＶＳ−１００送達における、我々のＪＶＳ−１００逆行性注入発現研究効力におけるＪＶＳ−１００のタンパク質発現を示した最低用量より大きい。４５ｍｇ（１．１２５ｍｇ／ｍｌ）用量は、ＧＬＰ逆行性研究において効力が実証され、探索研究において毒性が観察されなかった１００ｍｇ用量の半分より少ない。
【００５５】
【表２】
2016516070.tif 000004
【００５６】
配列番号１
ＡＧＡＴＣＴＣＣＴＡＧＧＧＡＧＴＣＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧＣＧＧＴＴＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＧＣＧＧＴＴＴＧＡＣＴＣＡＣＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＡＧＴＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＡＧＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＣＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＣＧＣＣＴＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧＡＣＣＴＣＣＡＴＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＴＣＣＡＧＣＣＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＴＧＣＡＴＴＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＴＴＣＣＣＣＧＴＧＣＣＡＡＧＡＧＴＧＡＣＧＴＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＡＴＡＧＡＧＴＣＴＡＴＡＧＧＣＣＣＡＣＣＣＣＣＴＴＧＧＣＴＴＣＴＴＡＴＧＣＡＴＧＣＴＡＴＡＣＴＧＴＴＴＴＴＧＧＣＴＴＧＧＧＧＴＣＴＡＴＡＣＡＣＣＣＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＧＴＴＡＴＡＧＧＴＧＡＴＧＧＴＡＴＡＧＣＴＴＡＧＣＣＴＡＴＡＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＡＴＴＧＡＣＣＡＴＴＡＴＴＧＡＣＣＡＣＴＣＣＣＣＴＡＴＴＧＧＴＧＡＣＧＡＴＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＡＣＴＡＡＴＣＣＡＴＡＡＣＡＴＧＧＣＴＣＴＴＴＧＣＣＡＣＡＡＣＴＣＴＣＴＴＴＡＴＴＧＧＣＴＡＴＡＴＧＣＣＡＡＴＡＣＡＣＴＧＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＡＣＴＧＡＣＡＣＧＧＡＣＴＣＴＧＴＡＴＴＴＴＴＡＣＡＧＧＡＴＧＧＧＧＴＣＴＣＡＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＡＣＡＡＡＴＴＣＡＣＡＴＡＴＡＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＧＴＣＣＣＣＡＧＴＧＣＣＣＧＣＡＧＴＴＴＴＴＡＴＴＡＡＡＣＡＴＡＡＣＧＴＧＧＧＡＴＣＴＣＣＡＣＧＣＧＡＡＴＣＴＣＧＧＧＴＡＣＧＴＧＴＴＣＣＧＧＡＣＡＴＧＧＧＣＴＣＴＴＣＴＣＣＧＧＴＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＣＴＴＣＴＡＣＡＴＣＣＧＡＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＣＡＴＧＣＣＴＣＣＡＧＣＧＡＣＴＣＡＴＧＧＴＣＧＣＴＣＧＧＣＡＧＣＴＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＡＡＣＡＧＴＧＧＡＧＧＣＣＡＧＡＣＴＴＡＧＧＣＡＣＡＧＣＡＣＧＡＴＧＣＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＣＡＡＧＧＣＣＧＴＧＧＣＧＧＴＡＧＧＧＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＧＣＴＣＧＧＧＧＡＧＣＧＧＧＣＴＴＧＣＡＣＣＧＣＴＧＡＣＧＣＡＴＴＴＧＧＡＡＧＡＣＴＴＡＡＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＴＧＡＧＴＴＧＴＴＧＴＧＴＴＣＴＧＡＴＡＡＧＡＧＴＣＡＧＡＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＧＴＴＧＣＧＧＴＧＣＴＧＴＴＡＡＣＧＧＴＧＧＡＧＧＧＣＡＧＴＧＴＡＧＴＣＴＧＡＧＣＡＧＴＡＣＴＣＧＴＴＧＣＴＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＧＡＣＡＴＡＡＴＡＧＣＴＧＡＣＡＧＡＣＴＡＡＣＡＧＡＣＴＧＴＴＣＣＴＴＴＣＣＡＴＧＧＧＴＣＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＴＧＣＣＡＴＣＧＧＴＧＡＣＣＡＣＴＡＧＴＧＧＣＴＣＧＣＡＴＣＴＣＴＣＣＴＴＣＡＣＧＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＴＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＧＣＣＧＧＴＴＧＡＧＴＣＧＣＧＴＴＣＴＧＣＣＧＣＣＴＣＣＣＧＣＣＴＧＴＧＧＴＧＣＣＴＣＣＴＧＡＡＣＴＧＣＧＴＣＣＧＣＣＧＴＣＴＡＧＧＴＡＡＧＴＴＴＡＡＡＧＣＴＣＡＧＧＴＣＧＡＧＡＣＣＧＧＧＣＣＴＴＴＧＴＣＣＧＧＣＧＣＴＣＣＣＴＴＧＧＡＧＣＣＴＡＣＣＴＡＧＡＣＴＣＡＧＣＣＧＧＣＴＣＴＣＣＡＣＧＣＴＴＴＧＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＣＡＡＣＴＣＴＡＣＧＴＣＴＴＴＧＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＧＴＴＣＴＧＣＧＣＣＧＴＴＡＣＡＧＡＴＣＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＧＣＣＡＡＧＧＴＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＣＴＧＧＴＣＣＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＣＧＣＴＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＧＡＣＧＧＧＡＡＧＣＣＣＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＴＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣＡＴＧＣＣＧＡＴＴＣＴＴＣＧＡＡＡＧＣＣＡＴＧＴＴＧＣＣＡＧＡＧＣＣＡＡＣＧＴＣＡＡＧＣＡＴＣＴＣＡＡＡＡＴＴＣＴＣＡＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＣＴＧＴＧＣＣＣＴＴＣＡＧＡＴＴＧＴＡＧＣＣＣＧＧＣＴＧＡＡＧＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＧＡＣＡＡＧＴＧＴＧＣＡＴＴＧＡＣＣＣＧＡＡＧＣＴＡＡＡＧＴＧＧＡＴＴＣＡＧＧＡＧＴＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＡＧＣＣＴＴＡＡＡＣＡＡＧＴＡＡＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣＣＴＡＴＴＣＴＡＴＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＡＴＧＣＴＡＧＡＧＣＴＣＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＣＴＣＧＡＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＣＣＡＣＴＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＴＴＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣＡＴＣＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＡＧＴＡＧＧＴＧＴＣＡＴＴＣＴＡＴＴＣＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧＧＡＧＧＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＡＴＡＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＴＧＧＧＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧＧＣＴＣＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＧＡＧＧＣＧＧＡＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＧＣＣＧＣＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡＴＧＡＣＣＡＡＡＡＴＣＣＣＴＴＡＡＣＧＴＧＡＧＴＴＴＴＣＧＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＧＴＣＡＧＡＣＣＣＣＧＴＡＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＴＴＧＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＣＧＣＧＴＡＡＴＣＴＧＣＴＧＣＴＴＧＣＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＡＣＣＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＧＣＣＧＧＡＴＣＡＡＧＡＧＣＴＡＣＣＡＡＣＴＣＴＴＴＴＴＣＣＧＡＡＧＧＴＡＡＣＴＧＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＣＡＧＡＴＡＣＣＡＡＡＴＡＣＴＧＴＴＣＴＴＣＴＡＧＴＧＴＡＧＣＣＧＴＡＧＴＴＡＧＧＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＡＡＧＡＡＣＴＣＴＧＴＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＡＣＣＴＣＧＣＴＣＴＧＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴＡＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧＴＧＧＣＧＡＴＡＡＧＴＣＧＴＧＴＣＴＴＡＣＣＧＧＧＴＴＧＧＡＣＴＣＡＡＧＡＣＧＡＴＡＧＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＡＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＧＧＧＧＴＴＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＧＣＣＣＡＧＣＴＴＧＧＡＧＣＧＡＡＣＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＧＡＡＣＴＧＡＧＡＴＡＣＣＴＡＣＡＧＣＧＴＧＡＧＣＴＡＴＧＡＧＡＡＡＧＣＧＣＣＡＣＧＣＴＴＣＣＣＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＡＧＧＣＧＧＡＣＡＧＧＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＧＣＧＧＣＡＧＧＧＴＣＧＧＡＡＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＣＡＣＧＡＧＧＧＡＧＣＴＴＣＣＡＧＧＧＧＧＡＡＡＣＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＴＴＴＡＴＡＧＴＣＣＴＧＴＣＧＧＧＴＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＧＡＣＴＴＧＡＧＣＧＴＣＧＡＴＴＴＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＣＧＴＣＡＧＧＧＧＧＧＣＧＧＡＧＣＣＴＡＴＧＧＡＡＡＡＡＣＧＣＣＡＧＣＡＡＣＧＣＧＧＣＣＴＴＴＴＴＡＣＧＧＴＴＣＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＣＴＣＡＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡＴＡＧＡＡＧＧＣＧＡＴＧＣＧＣＴＧＣＧＡＡＴＣＧＧＧＡＧＣＧＧＣＧＡＴＡＣＣＧＴＡＡＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＡＧＣＧＧＴＣＡＧＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＧＣＣＡＡＧＣＴＣＴＴＣＡＧＣＡＡＴＡＴＣＡＣＧＧＧＴＡＧＣＣＡＡＣＧＣＴＡＴＧＴＣＣＴＧＡＴＡＧＣＧＧＴＣＣＧＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＣＡＧＴＣＧＡＴＧＡＡＴＣＣＡＧＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＡＴＴＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＴＡＴＴＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＡＴＣＧＣＣＡＴＧＧＧＴＣＡＣＧＡＣＧＡＧＡＴＣＣＴＣＧＣＣＧＴＣＧＧＧＣＡＴＧＣＴＣＧＣＣＴＴＧＡＧＣＣＴＧＧＣＧＡＡＣＡＧＴＴＣＧＧＣＴＧＧＣＧＣＧＡＧＣＣＣＣＴＧＡＴＧＣＴＣＴＴＣＧＴＣＣＡＧＡＴＣＡＴＣＣＴＧＡＴＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＧＣＴＴＣＣＡＴＣＣＧＡＧＴＡＣＧＴＧＣＴＣＧＣＴＣＧＡＴＧＣＧＡＴＧＴＴＴＣＧＣＴＴＧＧＴＧＧＴＣＧＡＡＴＧＧＧＣＡＧＧＴＡＧＣＣＧＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＴＧＣＡＧＣＣＧＣＣＧＣＡＴＴＧＣＡＴＣＡＧＣＣＡＴＧＡＴＧＧＡＴＡＣＴＴＴＣＴＣＧＧＣＡＧＧＡＧＣＡＡＧＧＴＧＡＧＡＴＧＡＣＡＧＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＣＡＣＴＴＣＧＣＣＣＡＡＴＡＧＣＡＧＣＣＡＧＴＣＣＣＴＴＣＣＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＣＡＡＣＧＴＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴＧＣＧＣＡＡＧＧＡＡＣＧＣＣＣＧＴＣＧＴＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＧＡＴＡＧＣＣＧＣＧＣＴＧＣＣＴＣＧＴＣＴＴＧＣＡＧＴＴＣＡＴＴＣＡＧＧＧＣＡＣＣＧＧＡＣＡＧＧＴＣＧＧＴＣＴＴＧＡＣＡＡＡＡＡＧＡＡＣＣＧＧＧＣＧＣＣＣＣＴＧＣＧＣＴＧＡＣＡＧＣＣＧＧＡＡＣＡＣＧＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＧＡＴＴＧＴＣＴＧＴＴＧＴＧＣＣＣＡＧＴＣＡＴＡＧＣＣＧＡＡＴＡＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＣＧＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＣＧＴＧＣＡＡＴＣＣＡＴＣＴＴＧＴＴＣＡＡＴＣＡＴＧＣＧＡＡＡＣＧＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣＴＣＴＴＧＡＴＣ
【図１】
2016516070.tif 000005
【図２】
2016516070.tif 000006
【図３】
2016516070.tif 000007
【図４】
2016516070.tif 000008
【配列表】
2016516070000001.xml
【国際調査報告】
2016516070.tif 000012
2016516070.tif 000013