(57)【要約】  ＴＮＦ結合タンパク質及びそれを使用する処置方法が提供される。該結合タンパク質をコードする核酸、並びにそのような結合タンパク質を作製するための組換え発現ベクター及び宿主細胞も提供される。
2016516041.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴＮＦに特異的に結合する結合タンパク質であって、抗体可変領域及びＦｃ領域を含み、抗ヒトＴＮＦ参照抗体により示される細胞内在化の量よりも少ない、細胞表面ヒトＴＮＦへの結合の際の細胞内在化量を示す、結合タンパク質。
【請求項２】
前記参照抗体が、インフリキシマブ、アダリムマブ、又はゴリムマブである、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項３】
抗原提示細胞上で細胞表面ヒトＴＮＦに対して一価として結合する、請求項１又は２に記載の結合タンパク質。
【請求項４】
第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖を含み、
前記第一のポリペプチド鎖が、ＶＤＨ−（Ｘ１）ｎ−Ｃ−Ｙ１（ここで、
ＶＤＨは、重鎖可変ドメインであり、
Ｘ１は、ＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
Ｃは、ＣＨ１ドメインであり、
Ｙ１は、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０又は１である）を含み；
前記第二のポリペプチド鎖が、ＶＤＬ−（Ｘ３）ｍ−Ｃ（ここで、
ＶＤＬは、軽鎖可変ドメインであり、
Ｘ３は、ＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
Ｃは、ＣＬ１であり、
ｍは、０又は１である）を含み；
Ｘ２が、Ｙ１の二量体化を阻害する少なくとも１つの突然変異を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項５】
Ｙ１が、表３に示された群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の結合タンパク質。
【請求項６】
Ｘ１及び／又はＸ３が、表１に示されたアミノ酸配列を含む、請求項３〜５のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項７】
ＶＤＨが、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブの重鎖ＣＤＲ又は完全なＶＨドメインアミノ酸配列を含む、請求項３〜６のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項８】
ＶＤＬが、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブの軽鎖ＣＤＲ又は完全なＶＬドメインアミノ酸配列を含む、請求項３〜７のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項９】
第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖を含み、
前記第一のポリペプチド鎖が、ＶＤＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤＨ２−Ｘ２−（Ｘ３）ｍ−Ｙ１（ここで、
ＶＤＨ１は、第一の重鎖可変ドメインであり、
Ｘ１は、Ｘ１がＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
ＶＤＨ２は、第二の重鎖可変ドメインであり、
Ｘ２は、ＣＨ１であり、
Ｘ３は、リンカーであり、
Ｙ１は、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０又は１であり、ｍは、０又は１である）を含み；
前記第二のポリペプチド鎖が、ＶＤＬ１−（Ｘ４）ｍ−ＶＤＬ２−Ｘ５（ここで、
ＶＤＬ１は、第一の軽鎖可変ドメインであり、
Ｘ４は、Ｘ４がＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
ＶＤＬ２は、第二の軽鎖可変ドメインであり、
Ｘ５は、ＣＬ１であり、
ｍは、０又は１である）を含み；
Ｙ１が、Ｙ１のホモ二量体化を阻害する少なくとも１つの突然変異を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項１０】
Ｘ１、Ｘ２、及び／又はＸ４が、表１に示されたアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の結合タンパク質。
【請求項１１】
Ｙ１が、表３に示されたアミノ酸配列を含む、請求項９〜１０に記載の結合タンパク質。
【請求項１２】
ＶＤＨ１及び／又はＶＤＨ２が、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブの重鎖ＣＤＲ又は完全なＶＨドメインアミノ酸配列を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項１３】
ＶＤＬ１及び／又はＶＤＬ２が、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブの軽鎖ＣＤＲ又は完全なＶＬドメインアミノ酸配列を含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項１４】
４つのポリペプチド鎖を含み、
前記４つのポリペプチド鎖のうちの２つが、ＶＤＨ−（Ｘ１）ｎ−Ｃ−Ｙ１（ここで、
ＶＤＨは、重鎖可変ドメインであり、
Ｘ１は、ＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
Ｃは、ＣＨ１ドメインであり、
Ｙ１は、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０又は１である）を含み；
前記４つのポリペプチド鎖のうちの２つが、ＶＤＬ−（Ｘ２）ｍ−Ｘ３（ここで、
ＶＤＬは、軽鎖可変ドメインであり、
Ｘ２は、ＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
Ｘ３は、ＣＬドメインであり、
ｍは、０又は１である）を含み；
前記４つのポリペプチド鎖のうちの少なくとも１つが、可変ドメイン内に位置する突然変異を含み、前記突然変異が、標的となる、特異的抗原と突然変異体結合ドメインとの結合を阻害する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項１５】
Ｙ１が、ヘテロ二量体化を増大する突然変異を含む、請求項１４に記載の結合タンパク質。
【請求項１６】
Ｙ１が、表３に示されたアミノ酸配列を含む、請求項１４〜１５のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項１７】
Ｘ１及び／又はＸ２が、表１に示されたアミノ酸配列を含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項１８】
ＶＤＨが、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブの重鎖ＣＤＲ又は完全なＶＨドメインアミノ酸配列を含む、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項１９】
ＶＤＬが、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブの軽鎖ＣＤＲ又は完全なＶＬドメインアミノ酸配列を含む、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項２０】
４つのポリペプチド鎖を含み、
前記４つのポリペプチド鎖のうちの２つが、ＶＤＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤＨ２−Ｃ−Ｙ１（ここで、
ＶＤＨ１は、第一の重鎖可変ドメインであり、
ＶＤＨ２は、第二の重鎖可変ドメインであり、
Ｃは、重鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、ＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
Ｙ１は、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０又は１である）を含み；
前記４つのポリペプチド鎖のうちの２つが、ＶＤＬ１−（Ｘ２）ｍ−ＶＤＬ２−Ｘ３（ここで、
ＶＤＬ１は、第一の軽鎖可変ドメインであり、
ＶＤＬ２は、第二の軽鎖可変ドメインであり、
Ｘ２は、ＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
Ｘ３は、ＣＬドメインであり、
ｍは、０又は１である）を含み；
前記４つのポリペプチド鎖のうちの少なくとも１つが、前記第一の可変ドメイン又は前記第二の可変ドメイン内に位置する突然変異を含み、前記突然変異が、標的となる、特異的抗原と突然変異体結合ドメインとの結合を阻害する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項２１】
前記突然変異が、ＶＤＨ１及び／又はＶＤＨ２内に位置する、請求項２０に記載の結合タンパク質。
【請求項２２】
前記突然変異が、ＶＤＬ１及び／又はＶＤＬ２内に位置する、請求項２０又は２１に記載の結合タンパク質。
【請求項２３】
Ｙ１が、ヘテロ二量体化を増大する突然変異を含む、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項２４】
Ｙ１が、表３に示されたアミノ酸配列を含む、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項２５】
Ｘ１及び／又はＸ２が、表１に示されたアミノ酸配列を含む、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項２６】
ＶＤＨ１及び／又はＶＤＨ２が、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブの重鎖ＣＤＲ又は完全なＶＨドメインアミノ酸配列を含む、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項２７】
ＶＤＬ１及び／又はＶＤＬ２が、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブの軽鎖ＣＤＲ又は完全なＶＬドメインアミノ酸配列を含む、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項２８】
第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖を含み、
前記第一のポリペプチド鎖が、ＶＤＨ−（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−（Ｘ３）ｍ−Ｙ１（ここで、
ＶＤＨは、重鎖可変ドメインであり、
Ｘ１は、Ｘ１がＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
Ｘ２は、ＣＨ１であり、
Ｘ３は、リンカーであり、
Ｙ１は、Ｆ領域であり、
ｎは、０又は１であり、ｍは、０又は１である）を含み；
前記第二のポリペプチドが、ＶＤＬ−（Ｘ４）ｎ−Ｘ５−（Ｘ６）ｍ−Ｙ２（ここで、
ＶＤＬは、軽鎖可変ドメインであり、
Ｘ４は、Ｘ４がＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
Ｘ５は、ＣＬ１であり、
Ｘ６は、リンカーであり、
Ｙ２は、Ｆ領域であり、
ｎは、０又は１であり、ｍは、０又は１である）を含み；
Ｙ１及びＹ２が、それぞれ突然変異を含み、Ｙ１及びＹ２上の前記突然変異が、Ｙ１とＹ２の相互作用を増大させる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項２９】
Ｙ１及び／又はＹ２が、表３に示されたアミノ酸配列を含む、請求項２８〜２９のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項３０】
Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４、及び／又はＸ６が、表１に示されたアミノ酸配列を含む、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項３１】
ＶＤＨが、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブの重鎖ＣＤＲ又は完全なＶＨドメインアミノ酸配列を含む、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項３２】
ＶＤＬが、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブの軽鎖ＣＤＲ又は完全なＶＬドメインアミノ酸配列を含む、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項３３】
第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖を含み、
前記第一のポリペプチド鎖が、ＶＤＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤＨ２−Ｘ２−（Ｘ３）ｍ−Ｙ１（ここで、
ＶＤＨ１は、第一の重鎖可変ドメインであり、
Ｘ１は、Ｘ１がＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
ＶＤＨ２は、第二の重鎖可変ドメインであり、
Ｘ２は、ＣＨ１であり、
Ｘ３は、リンカーであり、
Ｙ１は、Ｆ領域であり、
ｎは、０又は１であり、ｍは、０又は１である）を含み；
前記第二のポリペプチドが、ＶＤＬ１−（Ｘ４）ｎ−ＶＤＬ２−Ｘ５−（Ｘ６）ｍ−Ｙ２（ここで、
ＶＤＬ１は、第一の軽鎖可変ドメインであり、
Ｘ４は、Ｘ４がＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
ＶＤＬ２は、第二の軽鎖可変ドメインであり、
Ｘ５は、ＣＬ１であり、
Ｘ６は、リンカーであり、
Ｙ２は、Ｆ領域であり、
ｎは、０又は１であり、ｍは、０又は１である）を含み；
Ｙ１及びＹ２が、それぞれ突然変異を含み、Ｙ１及びＹ２上の前記突然変異が、Ｙ１とＹ２の間のヘテロ二量体化を増大させる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項３４】
Ｙ１及び／又はＹ２が、表３に示されたアミノ酸配列を含む、請求項３３〜３４のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項３５】
Ｘ１及び／又はＸ３が、表１に示されたアミノ酸配列を含む、請求項３３〜３４のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項３６】
ＶＤＨ１及び／又はＶＤＨ２が、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブの重鎖ＣＤＲ又は完全なＶＨドメインアミノ酸配列を含む、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項３７】
ＶＤＬ１及び／又はＶＤＬ２が、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブの軽鎖ＣＤＲ又は完全なＶＬドメインアミノ酸配列を含む、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項３８】
第一、第二、第三及び第四のポリペプチド鎖を含み、
前記第一のポリペプチド鎖が、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−ＣＨ−（Ｘ２）ｎ（ここで、ＶＤ１は、第一の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第二の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、ＣＨ１ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを前提としたリンカーであり、Ｘ２は、Ｆｃ領域である）を含み；
前記第二のポリペプチド鎖が、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−ＣＬ−（Ｘ２）ｎ（ここで、ＶＤ１は、第一の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第二の軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは、軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを前提としたリンカーであり、Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まない）を含み；
前記第三のポリペプチド鎖が、ＶＤ３−（Ｘ３）ｎ−ＶＤ４−ＣＬ−（Ｘ４）ｎ（ここで、ＶＤ３は、第三の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ４は、第四の重鎖可変ドメインであり、ＣＬは、軽鎖定常ドメインであり、Ｘ３は、定常ドメインではないことを前提としたリンカーであり、Ｘ４は、Ｆｃ領域である）を含み；
前記第四のポリペプチド鎖が、ＶＤ３−（Ｘ３）ｎ−ＶＤ４−ＣＨ−（Ｘ４）ｎ（ここで、ＶＤ３は、第三の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ４は、第四の軽鎖可変ドメインであり、ＣＨは、ＣＨ１ドメインであり、Ｘ３は、定常ドメインではないことを前提としたリンカーであり、Ｘ４は、Ｆｃ領域を含まない）を含み；
ｎが、０又は１であり、前記第一及び第二のポリペプチド鎖上の前記ＶＤ１ドメインが、第一の抗原のための１つの機能的結合部位を形成し、前記第一及び第二のポリペプチド鎖上の前記ＶＤ２ドメインが、第二の抗原のための１つの機能的結合部位を形成し、前記第三及び第四のポリペプチド鎖上の前記ＶＤ３ドメインが、第三の抗原のための１つの機能的結合部位を形成し、前記第三及び第四のポリペプチド鎖上の前記ＶＤ４ドメインが、第四の抗原のための１つの機能的結合部位を形成する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項３９】
前記第一、第二、第三又は第四の抗原のうちの少なくとも１つが、ヒトＴＮＦである、請求項３８に記載の結合タンパク質。
【請求項４０】
Ｘ２及び／又はＸ４が、Ｘ２及びＸ４のヘテロ二量体化を増大する少なくとも１つの突然変異を含む、請求項３８〜３９のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項４１】
Ｘ２及び／又はＸ４が、表３に示されたアミノ酸配列を含む、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項４２】
Ｘ１及び／又はＸ３が、表１に示されたアミノ酸配列を含む、請求項３８〜４１のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項４３】
ＶＤ１、ＶＤ２、ＶＤ３及び／又はＶＤ４が、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブの重鎖ＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ、完全なＶＨドメイン又は完全なＶＬドメインアミノ酸配列を含む、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項４４】
ポリペプチド鎖を含み、
前記ポリペプチド鎖が、ＲＤ１−（Ｘ）ｎ−ＶＤＨ−Ｃ−Ｙ又はＶＤＨ−（Ｘ）ｎ−ＲＤ１−Ｃ−Ｙ（ここで、
ＲＤ１は、リセプターのリガンド結合ドメインを含み、
ＶＤＨは、重鎖可変ドメインであり、
Ｃは、重鎖定常ドメインであり、
Ｘは、ＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
Ｙは、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０又は１である）を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項４５】
ＲＤ１が、ヒトＴＮＦに結合するリセプターを含む、請求項４４に記載の結合タンパク質。
【請求項４６】
ＲＤ１が、エタネルセプトのＴＮＦリセプター結合部分を含む、請求項４４〜４５のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項４７】
ＶＤＨが、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブの重鎖ＣＤＲ、又は完全なＶＨドメインアミノ酸配列を含む、請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項４８】
前記請求項のいずれか１項に記載の結合ポリペプチドと、医薬的に許容し得る担体又は賦形剤と、を含む組成物。
【請求項４９】
必要とする対象におけるＴＮＦ関連障害を処置する方法であって、請求項４８に記載の組成物の有効量を、前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項５０】
請求項１〜４７のいずれか１項に記載の結合ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５１】
請求項５０に記載のポリペプチドを含むベクター。
【請求項５２】
請求項５０又は５１に記載のポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、全体として参照により本明細書に取り込まれる、２０１３年３月１５日出願の米国特許仮出願第６１／７８８，１１３号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本出願は、全体として参照により本明細書に取り込まれる、２０１３年１月２２日出願の米国特許仮出願第６１／７５５，２８８号、２０１２年１２月２８日出願の同第６１／７４６，６１６号、及び２０１２年１２月２８日出願の同第６１／７４６，６１７号にも関係する。
【背景技術】
【０００３】
インフリキシマブ、アダリムマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、及びセルトリズマブなどの治療性の組織壊死因子α（ＴＮＦα）結合タンパク質の使用が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、強直性脊椎炎、多発性硬化症、乾癬及び関節リウマチ（ＲＡ）をはじめとする多くの慢性炎症性疾患の処置を改革した。患者の生活の質を改善することへの成功したものの、治療性ＴＮＦ結合タンパク質での長期処置は、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の発生をもたらす強度の免疫原性反応を誘発する可能性がある。そのようなＡＤＡ反応は、治療性ＴＮＦ結合タンパク質の安全性及び薬物動態の両方に強い影響を与える可能性があり、一方でこれらの薬物の有用性及び効能にも影響を及ぼす可能性がある。したがって、治療薬として使用され、患者における免疫原性の低い、新規なＴＮＦ結合タンパク質が、当該技術分野で求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本開示は、新規なＴＮＦ結合タンパク質及びそれを使用する処置方法を提供する。同じく提供されるのが、該結合タンパク質をコードする核酸、並びにそのような結合タンパク質を作製するための組換え発現ベクター及び宿主細胞である。本開示は、少なくとも一部が、二価ＴＮＦ結合タンパク質（例えば、抗ＴＮＦモノクローナル抗体）が抗原提示細胞の細胞表面でＴＮＦに結合して、内在化するようになり得る、という発見に基づくものである。本明細書に開示された結合タンパク質は、一般に、細胞表面ＴＮＦαへの一価結合を示す（即ち、各結合タンパク質は、提示する抗原の表面で１つのＴＮＦ分子のみに結合し得る）。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって一態様において、本開示は、ヒトＴＮＦに特異的に結合する結合タンパク質であって、抗体可変領域及びＦｃ領域を含み、抗ヒトＴＮＦ参照抗体（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、又はゴリムマブ）により示される細胞内在化の量よりも少ない、細胞表面ヒトＴＮＦへの結合の際の細胞内在化量を示す、結合タンパク質を提供する。特定の実施形態において、該結合タンパク質は、抗原提示細胞上で細胞表面ヒトＴＮＦに対して一価として結合する。
【０００６】
特定の実施形態において、該結合タンパク質は、第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖を含み、
該第一のポリペプチド鎖は、ＶＤＨ−（Ｘ１）ｎ−Ｃ−Ｙ１（ここで、
ＶＤＨは、重鎖可変ドメインであり、
Ｘ１は、ＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
Ｃは、ＣＨ１ドメインであり、
Ｙ１は、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０又は１である）を含み；
該第二のポリペプチド鎖は、ＶＤＬ−（Ｘ３）ｍ−Ｃ（ここで、
ＶＤＬは、軽鎖可変ドメインであり、
Ｘ３は、ＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
Ｃは、ＣＬ１であり、
ｍは、０又は１である）を含み；
Ｘ２は、Ｙ１のホモ二量体化を阻害する少なくとも１つの突然変異を含む。１つの特別な実施形態において、Ｙ１は、表３に示された群から選択されるアミノ酸配列を含む。１つの特別な実施形態において、Ｘ１及び／又はＸ３は、表１に示されたアミノ酸配列を含む。１つの特別な実施形態において、ＶＤＨは、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブの重鎖ＣＤＲ又は完全なＶＨドメインアミノ酸配列を含む。１つの特別な実施形態において、ＶＤＬは、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブの軽鎖ＣＤＲ又は完全なＶＬドメインアミノ酸配列を含む。
【０００７】
特定の実施形態において、該結合タンパク質は、第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖を含み、
該第一のポリペプチド鎖は、ＶＤＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤＨ２−Ｘ２−（Ｘ３）ｍ−Ｙ１（ここで、
ＶＤＨ１は、第一の重鎖可変ドメインであり、
Ｘ１は、Ｘ１がＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
ＶＤＨ２は、第二の重鎖可変ドメインであり、
Ｘ２は、ＣＨ１であり、
Ｘ３は、リンカーであり、
Ｙ１は、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０又は１であり、ｍは、０又は１である）を含み；
該第二のポリペプチド鎖は、ＶＤＬ１−（Ｘ４）ｍ−ＶＤＬ２−Ｘ５（ここで、
ＶＤＬ１は、第一の軽鎖可変ドメインであり、
Ｘ４は、Ｘ４がＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
ＶＤＬ２は、第二の軽鎖可変ドメインであり、
Ｘ５は、ＣＬ１であり、
ｍは、０又は１である）を含み；
Ｙ１は、Ｙ１のホモ二量体化を阻害する少なくとも１つの突然変異を含む。１つの特別な実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、及び／又はＸ４は、表１に示されたアミノ酸配列を含む。１つの特別な実施形態において、Ｙ１は、表３に示されたアミノ酸配列を含む。１つの特別な実施形態において、ＶＤＨ１及び／又はＶＤＨ２は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブの重鎖ＣＤＲ又は完全なＶＨドメインアミノ酸配列を含む。１つの特別な実施形態において、ＶＤＬ１及び／又はＶＤＬ２は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブの軽鎖ＣＤＲ又は完全なＶＬドメインアミノ酸配列を含む。
【０００８】
特定の実施形態において、該結合タンパク質は、４つのポリペプチド鎖を含み、
前記４つのポリペプチド鎖のうちの２つは、ＶＤＨ−（Ｘ１）ｎ−Ｃ−Ｙ１（ここで、
ＶＤＨは、重鎖可変ドメインであり、
Ｘ１は、ＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
Ｃは、ＣＨ１ドメインであり、
Ｙ１は、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０又は１である）を含み；
前記４つのポリペプチド鎖のうちの２つは、ＶＤＬ−（Ｘ２）ｍ−Ｘ３（ここで、
ＶＤＬは、軽鎖可変ドメインであり、
Ｘ２は、ＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
Ｘ３は、ＣＬドメインであり、
ｍは、０又は１である）を含み；
前記４つのポリペプチド鎖のうちの少なくとも１つは、可変ドメイン内に位置する突然変異を含み、前記突然変異は、標的となる、特異的抗体と突然変異体結合ドメインとの結合を阻害する。１つの特別な実施形態において、Ｙ１は、ヘテロ二量体化を増大する突然変異を含む。１つの特別な実施形態において、Ｙ１は、表３に示されたアミノ酸配列を含む。１つの特別な実施形態において、Ｘ１及び／又はＸ２は、表１に示されたアミノ酸配列を含む。１つの特別な実施形態において、ＶＤＨは、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブの重鎖ＣＤＲ又は完全なＶＨドメインアミノ酸配列を含む。１つの特別な実施形態において、ＶＤＬは、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブの軽鎖ＣＤＲ又は完全なＶＬドメインアミノ酸配列を含む。
【０００９】
特定の実施形態において、該結合タンパク質は、４つのポリペプチド鎖を含み、
前記４つのポリペプチド鎖のうちの２つは、ＶＤＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤＨ２−Ｃ−Ｙ１（ここで、
ＶＤＨ１は、第一の重鎖可変ドメインであり、
ＶＤＨ２は、第二の重鎖可変ドメインであり、
Ｃは、重鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、ＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
Ｙ１は、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０又は１である）を含み；
前記４つのポリペプチド鎖のうちの２つは、ＶＤＬ１−（Ｘ２）ｍ−ＶＤＬ２−Ｘ３（ここで、
ＶＤＬ１は、第一の軽鎖可変ドメインであり、
ＶＤＬ２は、第二の軽鎖可変ドメインであり、
Ｘ２は、ＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
Ｘ３は、ＣＬドメインであり、
ｍは、０又は１である）を含み；
前記４つのポリペプチド鎖のうちの少なくとも１つは、第一の可変ドメイン又は第二の可変ドメイン内に位置する突然変異を含み、前記突然変異は、標的となる、特異的抗体と突然変異体結合ドメインとの結合を阻害する。１つの特別な実施形態において、該突然変異は、ＶＤＨ１及び／又はＶＤＨ２内に位置する。１つの特別な実施形態において、該突然変異は、ＶＤＬ１及び／又はＶＤＬ２内に位置する。１つの特別な実施形態において、Ｙ１は、ヘテロ二量体化を増大する突然変異を含む。１つの特別な実施形態において、Ｙ１は、表３に示されたアミノ酸配列を含む。１つの特別な実施形態において、Ｘ１及び／又はＸ２は、表１に示されたアミノ酸配列を含む。１つの特別な実施形態において、ＶＤＨ１及び／又はＶＤＨ２は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブの重鎖ＣＤＲ又は完全なＶＨドメインアミノ酸配列を含む。１つの特別な実施形態において、ＶＤＬ１及び／又はＶＤＬ２は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブの軽鎖ＣＤＲ又は完全なＶＬドメインアミノ酸配列を含む。
【００１０】
特定の実施形態において、該結合タンパク質は、第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖を含み、
前記第一のポリペプチド鎖は、ＶＤＨ−（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−（Ｘ３）ｍ−Ｙ１（ここで、
ＶＤＨは、重鎖可変ドメインであり、
Ｘ１は、Ｘ１がＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
Ｘ２は、ＣＨ１であり、
Ｘ３は、リンカーであり、
Ｙ１は、Ｆ領域であり、
ｎは、０又は１であり、ｍは、０又は１である）を含み；
前記第二のポリペプチドは、ＶＤＬ−（Ｘ４）ｎ−Ｘ５−（Ｘ６）ｍ−Ｙ２（ここで、
ＶＤＬは、軽鎖可変ドメインであり、
Ｘ４は、Ｘ４がＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
Ｘ５は、ＣＬ１であり、
Ｘ６は、リンカーであり、
Ｙ２は、Ｆ領域であり、
ｎは、０又は１であり、ｍは、０又は１である）を含み；
Ｙ１及びＹ２は、それぞれ突然変異を含み、Ｙ１及びＹ２上の突然変異は、Ｙ１とＹ２の相互作用を増大させる。１つの特別な実施形態において、Ｙ１及び／又はＹ２は、表３に示されたアミノ酸配列を含む。１つの特別な実施形態において、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４、及び／又はＸ６は、表１に示されたアミノ酸配列を含む。１つの特別な実施形態において、ＶＤＨは、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブの重鎖ＣＤＲ又は完全なＶＨドメインアミノ酸配列を含む。１つの特別な実施形態において、ＶＤＬは、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブの軽鎖ＣＤＲ又は完全なＶＬドメインアミノ酸配列を含む。
【００１１】
特定の実施形態において、該結合タンパク質は、第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖を含み、
前記第一のポリペプチド鎖は、ＶＤＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤＨ２−Ｘ２−（Ｘ３）ｍ−Ｙ１（ここで、
ＶＤＨ１は、第一の重鎖可変ドメインであり、
Ｘ１は、Ｘ１がＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
ＶＤＨ２は、第二の重鎖可変ドメインであり、
Ｘ２は、ＣＨ１であり、
Ｘ３は、リンカーであり、
Ｙ１は、Ｆ領域であり、
ｎは、０又は１であり、ｍは、０又は１である）を含み；
前記第二のポリペプチドは、ＶＤＬ１−（Ｘ４）ｎ−ＶＤＬ２−Ｘ５−（Ｘ６）ｍ−Ｙ２（ここで、
ＶＤＬ１は、第一の軽鎖可変ドメインであり、
Ｘ４は、Ｘ４がＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
ＶＤＬ２は、第二の軽鎖可変ドメインであり、
Ｘ５は、ＣＬ１であり、
Ｘ６は、リンカーであり、
Ｙ２は、Ｆ領域であり、
ｎは、０又は１であり、ｍは、０又は１である）を含み；
Ｙ１及びＹ２は、それぞれ突然変異を含み、Ｙ１及びＹ２上の突然変異は、Ｙ１とＹ２の間のヘテロ二量体化を増大させる。１つの特別な実施形態において、Ｙ１及び／又はＹ２は、表３に示されたアミノ酸配列を含む。１つの特別な実施形態において、Ｘ１及び／又はＸ３は、表１に示されたアミノ酸配列を含む。１つの特別な実施形態において、ＶＤＨ１及び／又はＶＤＨ２は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブの重鎖ＣＤＲ又は完全なＶＨドメインアミノ酸配列を含む。１つの特別な実施形態において、ＶＤＬ１及び／又はＶＤＬ２は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブの軽鎖ＣＤＲ又は完全なＶＬドメインアミノ酸配列を含む。
【００１２】
特定の実施形態において、該結合タンパク質は、第一、第二、第三及び第四のポリペプチド鎖を含み、
前記第一のポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−ＣＨ−（Ｘ２）ｎ（ここで、ＶＤ１は、第一の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第二の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、ＣＨ１ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを前提としたリンカーであり、Ｘ２は、Ｆｃ領域である）を含み；
前記第二のポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−ＣＬ−（Ｘ２）ｎ（ここで、ＶＤ１は、第一の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第二の軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは、軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを前提としたリンカーであり、Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まない）を含み；
前記第三のポリペプチド鎖は、ＶＤ３−（Ｘ３）ｎ−ＶＤ４−ＣＬ−（Ｘ４）ｎ（ここで、ＶＤ３は、第三の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ４は、第四の重鎖可変ドメインであり、ＣＬは、軽鎖定常ドメインであり、Ｘ３は、定常ドメインではないことを前提としたリンカーであり、Ｘ４は、Ｆｃ領域である）を含み；
前記第四のポリペプチド鎖は、ＶＤ３−（Ｘ３）ｎ−ＶＤ４−ＣＨ−（Ｘ４）ｎ（ここで、ＶＤ３は、第三の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ４は、第四の軽鎖可変ドメインであり、ＣＨは、ＣＨ１ドメインであり、Ｘ３は、定常ドメインではないことを前提としたリンカーであり、Ｘ４は、Ｆｃ領域を含まない）を含み；ｎは、０又は１であり、第一及び第二のポリペプチド鎖上のＶＤ１ドメインは、第一の抗原のための１つの機能的結合部位を形成し、第一及び第二のポリペプチド鎖上のＶＤ２ドメインは、第二の抗原のための１つの機能的結合部位を形成し、第三及び第四のポリペプチド鎖上のＶＤ３ドメインは、第三の抗原のための１つの機能的結合部位を形成し、第三及び第四のポリペプチド鎖上のＶＤ４ドメインは、第四の抗原のための１つの機能的結合部位を形成する。１つの特別な実施形態において、第一、第二、第三又は第四の抗原のうちの少なくとも１つは、ヒトＴＮＦである。１つの特別な実施形態において、Ｘ２及び／又はＸ４は、Ｘ２及びＸ４のヘテロ二量体化を増大する少なくとも１つの突然変異を含む。１つの特別な実施形態において、Ｘ２及び／又はＸ４は、表３に示されたアミノ酸配列を含む。１つの特別な実施形態において、Ｘ１及び／又はＸ３は、表１に示されたアミノ酸配列を含む。１つの特別な実施形態において、ＶＤ１、ＶＤ２、ＶＤ３及び／又はＶＤ４は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブの重鎖ＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ、完全なＶＨドメイン又は完全なＶＬドメインアミノ酸配列を含む。
【００１３】
特定の実施形態において、該結合タンパク質は、ポリペプチド鎖を含み、
該ポリペプチド鎖は、ＲＤ１−（Ｘ）ｎ−ＶＤＨ−Ｃ−Ｙ又はＶＤＨ−（Ｘ）ｎ−ＲＤ１−Ｃ−Ｙ（ここで、
ＲＤ１は、リセプターのリガンド結合ドメインを含み、
ＶＤＨは、重鎖可変ドメインであり、
Ｃは、重鎖定常ドメインであり、
Ｘは、ＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
Ｙは、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０又は１である）を含む。
【００１４】
１つの特別な実施形態において、ＲＤ１は、ヒトＴＮＦに結合するリセプターを含む。１つの特別な実施形態において、ＲＤ１は、エタネルセプトのＴＮＦリセプター結合部分を含む。１つの特別な実施形態において、ＶＤＨは、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブの重鎖ＣＤＲ、又は完全なＶＨドメインアミノ酸配列を含む。
【００１５】
別の態様において、本開示は、前記請求項のいずれか１項に記載の結合ポリペプチドと、医薬的に許容し得る担体又は賦形剤と、を含む組成物を提供する。
【００１６】
別の態様において、本開示は、必要とする対象におけるＴＮＦ関連障害を処置する方法であって、本明細書に開示された組成物の有効量を、該対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００１７】
別の態様において、本開示は、本明細書に開示された結合ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１８】
別の態様において、本開示は、本明細書に開示されたポリペプチドを含むベクターを提供する。
【００１９】
別の態様において、本開示は、本明細書に開示されたポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＬＰＳで刺激された末梢血単球上のＴＮＦαの表面発現を測定する実験の結果を示す。
【図２】図２は、ＬＰＳで刺激された末梢血単球及びＴ細胞上のＴＮＦαの表面発現を測定する実験の結果を示す。
【図３】図３は、ＬＰＳで刺激された末梢血単核細胞による抗ＴＮＦα抗体の内在化を測定する実験の結果を示す。
【図４】図４は、ＬＰＳで処置されたヒト単球上のＴＮＦαの表面発現を測定する実験の結果を示す。
【図５】図５は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＬＰＳで刺激された末梢血単球上のＴＮＦαの表面発現を測定する実験の結果を示す。
【図６】図６は、ＬＰＳで刺激された細胞上のＴＮＦαの表面発現を測定する実験の結果を示す。
【図７】図７は、ＬＰＳで刺激されたヒト単球由来樹状細胞上のＴＮＦαの表面発現を測定する実験の結果を示す。
【図８】図８は、ＬＰＳで刺激された単球由来樹状細胞による抗ＴＮＦα抗体の内在化を測定する実験の結果を示す。
【図９】図９は、ＬＰＳで刺激された末梢血単核細胞による抗ＴＮＦα抗体の内在化反応速度を測定する実験の結果を示す。
【図１０】図１０は、本明細書に開示された模範的なハーフボディー（ｈａｌｆ−ｂｏｄｙ）一価抗ＴＮＦ抗体及びＤＶＤ−Ｉｇ分子を示す。
【図１１】図１１は、本明細書に開示された模範的なＡｂｂｍＡｂの一価抗ＴＮＦ抗体又はＤＶＤ−Ｉｇ分子を示す。
【図１２】図１２は、本明細書に開示された模範的な一価免疫グロブリン（Ｍ−ボティー）分子を示す。
【図１３】図１３は、本明細書に開示された模範的な多重可変性（ｍｕｌｔｉ−ｖａｒｉａｂｌｅ）一価抗ＴＮＦポリ−Ｉｇ分子を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本開示は、新規なＴＮＦ結合タンパク質及びそれを使用した処置方法を提供する。同じく提供されるのが、該結合タンパク質をコードする核酸、並びにそのような結合タンパク質を作製するための組換え発現ベクター及び宿主細胞である。本開示は、少なくとも一部が、二価ＴＮＦ結合タンパク質（例えば、抗ＴＮＦモノクローナル抗体）が抗原提示細胞の細胞表面でＴＮＦに結合して、内在化するようになり得る、という発見に基づくものである。本明細書に開示された結合タンパク質は、一般に、細胞表面ＴＮＦ結合に関して一価である（即ち、各結合タンパク質が、提示する抗原の表面で１つのＴＮＦ分子のみに結合し得る）。
【００２２】
Ｉ．  定義
本明細書で他に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学的及び技術的用語は、当業者に共通して理解される意味を有する。しかし用語の意味及び範囲は、潜在的にあいまいな事象であっても明瞭でなければならず、本明細書に示された定義は、任意の辞書又は非本質的定義よりも優先される。さらに、文脈により他に必要とされない限り、単数の用語は、複数を包含し、複数の用語は、単数を包含するものとする。一般に、本明細書に記載された細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝子工学、タンパク質及び核酸化学、並びにハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名法、及びそれらの技術は、当該技術分野で周知のものであり、共通して用いられている。
【００２３】
本発明がより即座に理解されるように、特定の用語を、最初に定義する。
【００２４】
本明細書で用いられる用語「モノボディーＤＶＤ」又は「ｍＤＶＤ」は、全体として参照により本明細書に取り込まれる、米国特許仮出願第６１／７５５，２８８号に記載された一価ＤＶＤ−Ｉｇ分子を指す。
【００２５】
本明細書で用いられる用語「多価ＤＶＤ」又は「ｐＤＶＤ」は、全体として参照により本明細書に取り込まれる、米国特許仮出願第６１／７４６，６１６号に記載された多価ＤＶＤ−Ｉｇ分子を指す。
【００２６】
本明細書で用いられる用語「リセプターＤＶＤ」又は「ｒＤＶＤ」は、全体として参照により本明細書に取り込まれる、米国特許仮出願第６１／７４６，６１７号に記載されたリセプターＤＶＤ−Ｉｇ分子を指す。
【００２７】
本明細書で用いられる用語「インフリキシマブ」は、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標）として販売される、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＣＡＳ）番号１７０２７７−３１−３を有する抗ＴＮＦ抗体を指す。
【００２８】
本明細書で用いられる用語「ゴリムマブ」は、ＳＩＭＰＯＮＩ（商標）として販売される、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＣＡＳ）番号４７６１８１−７４−５を有する抗ＴＮＦ抗体を指す。
【００２９】
本明細書で用いられる用語「セルトリズマブ」は、ＣＩＭＺＩＡ（商標）として販売される、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＣＡＳ）番号４２８８６３−５０−７を有する抗ＴＮＦ抗体を指す。
【００３０】
本明細書で用いられる用語「アダリムマブ」は、ＨＵＭＩＲＡ（商標）として販売される、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＣＡＳ）番号３３１７３１−１８−１を有する抗ＴＮＦ抗体を指す。
【００３１】
本明細書で用いられる用語「インフリキシマブ」は、ＥＮＢＲＥＬ（商標）として販売される、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＣＡＳ）番号１０９４−０８−２を有する抗ＴＮＦイムノアドヘシンを指す。
【００３２】
本明細書で用いられる用語「ヒトＴＮＦα」は、１７ｋＤの分泌形態及び２６ｋＤの膜結合形態として存在するヒトサイトカインを指すものとし、その生物活性形態は、非共有結合された１７ｋＤ分子の三量体で構成されている。ヒトＴＮＦαの構造は、例えばＰｅｎｎｉｃａ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７２４−７２９；Ｄａｖｉｓ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６：１３２２−１３２６；及びＪｏｎｅｓ，Ｅ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：２２５−２２８にさらに記載されている。用語、ヒトＴＮＦαは、組換えヒトＴＮＦαを含むものとし、それは標準の組換え体発現法により調製するか、又は商品として購入することができる（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．２１０−ＴＡ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．）。
【００３３】
本明細書で用いられる用語「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖、又はそれらの任意の機能的フラグメント、突然変異体、バリアント若しくは誘導体で構成されていて、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の本質的なエピトープ結合特性を保持している、任意のＩｇ分子を指す。そのような突然変異体、バリアント、又は誘導体の抗体フォーマットは、当該技術分野で公知である。それらの非限定的実施形態を、以下に議論する。
【００３４】
全長抗体において、各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと略される）及び重鎖定常領域で構成されている。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３で構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと略される）及び軽鎖定常領域で構成されている。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬで構成されている。ＶＨ及びＶＬ領域は、さらに、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と称される領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に分別することができる。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスのものであってもよい。
【００３５】
用語「Ｆｃ領域」は、インタクト抗体のパパイン消化により作製され得る免疫グロブリン重鎖のＣ−末端領域を定義するために用いられる。Ｆｃ領域は、ネイティブ配列Ｆｃ領域又はバリアントＦｃ領域であってもよい。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に、２つの定常ドメイン：ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、場合によりＣＨ４ドメインを含む。Ｆｃ部分のアミノ酸残基を置換して抗体エフェクターの機能を改変することが、当該技術分野で公知である（Ｗｉｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，６４８，２６０号及び同第５，６２４，８２１号）。抗体のＦｃ部分は、複数の重要なエフェクター機能、例えばサイトカイン誘導、ＡＤＣＣ、ファゴサイトーシス、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）並びに抗体及び抗原−抗体複合体の半減期／クリアランス率を仲介する。幾つかの例において、これらのエフェクター機能は、治療性抗体には望ましいが、他の例では、治療目的に応じて不必要な場合も、又は有害な場合さえもある。特定のヒトＩｇＧアイソタイプ、特にＩｇＧ１及びＴｇＧ３は、それぞれＦｃγＲ及び相補性Ｃ１ｑへの結合によりＡＤＣＣ及びＣＤＣを仲介する。新生児期Ｆｃリセプター（ＦｃＲｎ）は、抗体の循環半減期を決定する重要成分である。さらに別の実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸残基は、抗体の定常領域、例えば抗体のＦｃ領域内で置換されて、抗体のエフェクター機能を改変する。免疫グロブリンの２つの同一重鎖の二量体化が、ＣＨ３ドメインの二量体化により仲介され、ヒンジ領域内のジスルフィド結合により安定化される（Ｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ；２６４：４１５−２０；Ｔｈｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ  １９９９  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ；２９３：６７−７９．）。重鎖−重鎖ジスルフィド結合を妨害するヒンジ領域内のシステイン残基の突然変異は、ＣＨ３ドメインの二量体化を不安定化させる。ＣＨ３二量体化を担う残基が、同定された（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  １９９８  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：９２６６−７３．）。それゆえ、一価半量Ｉｇを作製することが可能である。興味深いこととして、これらの一価半量Ｉｇ分子は、本質的にＩｇＧ及びＩｇＡサブクラスの両方で見いだされている（Ｓｅｌｉｇｍａｎ  １９７８  Ａｎｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２９：８５５−７０；Ｂｉｅｗｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ  １９８３  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５１：３９５−４００）。ＦｃＲｎ：ＩｇＦｃ領域の反応速度は、２：１であると決定され（Ｗｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ  ２０００  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：９６９８−７０８）、半量Ｆｃは、ＦｃＲｎ結合を仲介するのに十分である（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ  １９９４  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ；２４：５４２−５４８．）。ＣＨ３二量体化にとって重要な残基は、ＣＨ３のβシート構造の内部境界上に位置するため、ＣＨ３ドメインの二量体化を崩壊する突然変異は、ＦｃＲｎ結合に対してより大きな有害な影響を及ぼす可能性はないが、ＦｃＲｎ結合を担う領域は、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインの外部境界に位置する。しかし半量Ｉｇ分子は、正規の抗体よりも小さなサイズであるため組織透過に特に利点を有し得る。一実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸残基は、本発明の結合タンパク質の定常領域、例えばＦｃ領域内で置換されるため、重鎖の二量体化が崩壊して、半量のＤＶＤ−Ｉｇ分子が生成する。
【００３６】
本明細書で用いられる用語、抗体の「抗原結合タンパク質」（又は単に「抗体部分」）は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能が、全長抗体のフラグメントにより実施され得ることが示された。そのような抗体の実施形態が、２つ以上の異なる抗原に特異的に結合する二重特異性、デュアルスペシフィック、又は多重特異性フォーマットであってもよい。用語、抗体の「抗原結合部分」に含まれる結合フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、つまりＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインのからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、つまりヒンジ領域のジスルフィド結合により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の１つのアームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）単一可変ドメインを含むｄＡｂフラグメント（本明細書に参照により取り込まれる、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公報ＷＯ９０／０５１４４  Ａ１号）、並びに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、が挙げられる。さらにＦｖフラグメントの２つのドメイン：ＶＬ及びＶＨは、別個の遺伝子によりコードされるが、それらは組換え法を利用して、ＶＬ及びＶＨ領域が対合して一価分子を形成する単一タンパク質鎖として作製させることができる合成リンカーにより、つなぐことができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えばＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３参照）。そのような単鎖抗体もまた、用語、抗体の「抗原結合部分」に含まれるものとする。ダイアボディーなどの単鎖抗体の他の形態も、包含される。ダイアボディーは、ＶＨ及びＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖上で発現される二価二重特異性抗体であるが、過度に短いリンカーを利用して同じ鎖上の２つのドメインの間の対合ができず、それにより別の鎖の相補性ドメインと対合するようにドメインに働きかけ、２つの抗原結合部位を作製する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３参照）。そのような抗体結合部分は、当該技術分野で公知である（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ  ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００１）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．７９０  ｐｐ．（ＩＳＢＮ  ３−５４０−４１３５４−５））。加えて、単鎖抗体には、一対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）も含み、相補性軽鎖ポリペプチドと一緒に、一対の抗原結合領域を形成する、「直鎖状抗体」もある（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）；及び米国特許第５，��４１，８７０号）。
【００３７】
本明細書で用いられる用語「ＶＨドメイン」及び「ＶＬドメイン」は、ＦＲ（フレームワーク領域）１、２、３及び４、並びにＣＤＲ（相補性決定領域）１、２及び３を含む単一抗体の、それぞれ可変重鎖及び軽鎖ドメインを指す（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ）参照）。
【００３８】
本明細書で用いられる用語「ＣＤＲ」又は「相補性決定領域」は、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される非隣接の抗原結合部位を意味する。これらの特別な領域は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，６６０９−６６１６（１９７７）、及びＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（１９９１）、及びＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）、及びＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６）に記載されており、その定義は、互いに比較した場合のアミノ酸残基の重複又は部分集合を含む。先に引用された参照それぞれにより定義されたＣＤＲを含むアミノ酸残基を、比較のために示す。好ましくは用語「ＣＤＲ」は、配列比較に基づいてＫａｂａｔにより定義されたＣＤＲである。
【００３９】
本明細書で用いられる用語「フレームワーク（ＦＲ）アミノ酸残基」は、免疫グロブリン鎖のフレームワーク領域内のそれらのアミノ酸を指す。本明細書で用いられる用語「フレームワーク領域」又は「ＦＲ領域」は、可変領域の一部でありＣＤＲの一部ではないアミノ酸残基を包含する（例えば、ＣＤＲのＫａｂａｔ定義を利用する）。
【００４０】
本明細書で用いられる用語「〜に特異的に結合する」は、少なくとも約１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍ、若しくはそれを超えるＫｄを有する抗原に結合する、又は非特異的抗原への親和性よりも少なくとも２倍大きな親和性を有する抗原に結合する、結合ポリペプチドの能力を指す。しかし、結合ポリペプチドが配列内の関係する２つ以上の抗原に特異的に結合し得ることは、理解されよう。例えば本発明の結合ポリペプチドは、抗原のヒト及び非ヒト（例えば、マウス又は非ヒト霊長類）の両方のオルソログに特異的に結合することができる。
【００４１】
本明細書で用いられる用語「ポリペプチド」は、アミノ酸の任意のポリマー鎖を指す。用語「ペプチド」及び「タンパク質」は、用語ポリペプチドと互換的に用いられ、アミノ酸のポリマー鎖も指す。用語「ポリペプチド」は、タンパク質配列のネイティブ又は人工のタンパク質、タンパク質フラグメント及びポリペプチド類似体を包含する。ポリペプチドは、モノマー又はポリマーであってもよい。
【００４２】
用語「リンカー」は、ペプチド結合によりつながれた２つ以上のアミノ酸残基を含むポリペプチドを表すために用いられており、１つ以上の抗原結合部分を連結させるために用いられる。そのようなリンカーポリペプチドは、当該技術分野で周知である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３参照）。好ましいリンカーとしては、本明細書に表７に示されたアミノ酸リンカーが挙げられるが、それらに限定されない。
【００４３】
本明細書で用いられる用語「Ｋｏｎ」は、当該技術分野で公知の通り、抗体を抗原に結合させて抗体／抗原複合体を形成するためのオンレート定数を指すものとする。
【００４４】
本明細書で用いられる用語「Ｋｏｆｆ」は、当該技術分野で公知の通り、抗体を抗体／抗原複合体から解離させるためのオフレート定数を指すものとする。
【００４５】
本明細書で用いられる用語「Ｋｄ」は、当該技術分野で公知の通り、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を指すものとする。
【００４６】
本明細書で用いられる用語「ベクター」は、連結された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指すものとする。ベクターの一タイプが、「プラスミド」であり、それはさらなるＤＮＡセグメントをライゲートし得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別のタイプが、さらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノム内にライゲートし得る、ウイルスベクターである。特定のベクターは、導入される宿主細胞内で自律複製が可能である（例えば、複製の細菌起源を有する細菌ベクター及びエピソーマルの哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーマルの哺乳動物ベクター）を宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込み、それにより宿主ゲノムと共に複製することができる。その上、特定のベクターは、操作可能に連結された遺伝子の発現を指図することができる。そのようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と称する。一般に組換えＤＮＡ技術で有用性のある発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。プラスミドは、ベクターの最も共通して用いられる形態であるため、本明細書において「プラスミド」及び「ベクター」は、互換的に用いられ得る。しかし本発明は、均等な機能をもたらす発現ベクターのそのような別の形態、例えばウイルスベクター（例えば、複製欠損性レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）を包含するものとする。
【００４７】
本明細書で定義された「形質転換」は、外来性ＤＮＡが宿主細胞に入る任意の工程を指す。形質転換は、当該技術分野で周知の様々な方法を利用して天然又は人工条件下で起こり得る。形質転換は、原核又は真核宿主細胞内に外来核酸配列を挿入するための任意の公知方法に依存してもよい。該方法は、形質転換される宿主細胞を基にして選択され、ウイルス感染、電気穿孔、リポフェクション、及び粒子衝撃を挙げることができるが、それらに限定されない。そのような「形質転換された」細胞には、挿入されたＤＮＡが自律複製するプラスミドとして又は宿主染色体の一部として複製し得る、安定に形質転換された細胞がある。それらは、挿入されたＤＮＡ又はＲＮＡを限定された期間に一過性に発現する細胞も包含する。
【００４８】
本明細書で用いられる用語「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）は、外来性ＤＮＡが導入された細胞を指すものとする。そのような用語が特定の対象細胞のみならず、そのような細胞の子孫も指すものとすることが、理解されなければならない。特定の修飾は、突然変異又は環境的影響のいずれかにより連続した世代で起こり得るため、そのような子孫は、実際には親細胞と同一でない場合もあり、それも本明細書で用いられる用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。好ましくは宿主細胞は、生物界のいずれかから選択される原核及び真核細胞を包含する。好ましい真核細胞としては、原生生物、真菌、植物及び動物細胞が挙げられる。最も好ましい宿主細胞としては、原核細胞株Ｅ．Ｃｏｌｉ；哺乳動物細胞株ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３及びＣＯＳ；昆虫細胞株Ｓｆ９；並びに真菌細胞Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが挙げられるが、それらに限定されない。
【００４９】
ＩＩ．  改善されたＴＮＦ結合タンパク質
一態様において、本発明は、新規なＴＮＦ結合タンパク質を提供する。これらの結合タンパク質は、細胞（例えば、抗原提示細胞）の表面でＴＮＦαへの一価結合を示し、即ち各結合タンパク質は、提示する抗原の表面で１つのＴＮＦ分子のみに結合し得る。特定の実施形態において、本明細書に開示された結合タンパク質は、ヒトＴＮＦに結合し、その結合するタンパク質は、参照抗体（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブ）により示された細胞内在化に比較して、細胞表面ＴＮＦへの結合の際に低い細胞内在化を示す。
【００５０】
特定の実施形態において、公知のＴＮＦ結合剤のＴＮＦ結合ドメインは、本明細書に開示された新規なＴＮＦ結合タンパク質を産生するようにリフォーマットされる。任意のＴＮＦ結合物質のＴＮＦ結合ドメインが、用いられ得る。特定の実施形態において、抗ＴＮＦ抗体：インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、及び／又はゴリムマブの可変ドメイン（又はそのＣＤＲ）が、用いられる。特定の実施形態において、エタネルセプトのＴＮＦ結合ドメインが、用いられる。特定の実施形態において、表２に示された可変ドメインのアミノ酸の１つ以上が、用いられる。
【００５１】
細胞表面ＴＮＦへの一価結合を実現する任意の結合タンパク質フォーマットを、本明細書に開示されたＴＮＦ結合タンパク質内で用いることができる。特定の実施形態において、該ＴＮＦ結合タンパク質は、全体として参照により本明細書に取り込まれる米国特許仮出願第６１／７５５，２８８号に記載された「モノボディーＤＶＤ」又は「ｍＤＶＤ」分子である。特別な実施形態において、該ＴＮＦ結合タンパク質は全体として参照により本明細書に取り込まれる米国特許仮出願第６１／７４６，６１６号に記載された「多価ＤＶＤ」又は「ｐＤＶＤ」分子である。特別な実施形態において、該ＴＮＦ結合タンパク質は、全体として参照により本明細書に取り込まれる米国特許仮出願第６１／７４６，６１７号に記載された「リセプターＤＶＤ」又は「ｒＤＶＤ」分子である。
【００５２】
特定の実施形態において、該ＴＮＦ結合タンパク質は、第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖を含む半量の抗体分子であり、
該第一のポリペプチド鎖は、ＶＤＨ−（Ｘ１）ｎ−Ｃ−Ｙ１（ここで、
ＶＤＨは、重鎖可変ドメインであり、
Ｘ１は、ＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
Ｃは、ＣＨ１ドメインであり、
Ｙ１は、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０又は１である）を含み；
該第二のポリペプチド鎖は、ＶＤＬ−（Ｘ３）ｍ−Ｃ（ここで、
ＶＤＬは、軽鎖可変ドメインであり、
Ｘ３は、ＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
Ｃは、ＣＬ１であり、
ｍは、０又は１である）を含み；
Ｘ２は、Ｙ１の二量体化を阻害する少なくとも１つの突然変異を含む。
【００５３】
特定の実施形態において、該ＴＮＦ結合タンパク質は、第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖を含む半量のＤＶＤ分子であり、
該第一のポリペプチド鎖は、ＶＤＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤＨ２−Ｘ２−（Ｘ３）ｍ−Ｙ１（ここで、
ＶＤＨ１は、第一の重鎖可変ドメインであり、
Ｘ１は、Ｘ１がＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
ＶＤＨ２は、第二の重鎖可変ドメインであり、
Ｘ２は、ＣＨ１であり、
Ｘ３は、リンカーであり、
Ｙ１は、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０又は１であり、ｍは、０又は１である）を含み；
該第二のポリペプチド鎖は、ＶＤＬ１−（Ｘ４）ｍ−ＶＤＬ２−Ｘ５（ここで、
ＶＤＬ１は、第一の軽鎖可変ドメインであり、
Ｘ４は、Ｘ４がＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
ＶＤＬ２は、第二の軽鎖可変ドメインであり、
Ｘ５は、ＣＬ１であり、
ｍは、０又は１である）を含み；
Ｙ１は、Ｙ１のホモ二量体化を阻害する少なくとも１つの突然変異を含む。
【００５４】
特定の実施形態において、該ＴＮＦ結合タンパク質は、４つのポリペプチド鎖を含むモノボディー分子であり、
前記４つのポリペプチド鎖のうちの２つは、ＶＤＨ−（Ｘ１）ｎ−Ｃ−Ｙ１（ここで、
ＶＤＨは、重鎖可変ドメインであり、
Ｘ１は、ＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
Ｃは、ＣＨ１ドメインであり、
Ｙ１は、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０又は１である）を含み；
前記４つのポリペプチド鎖のうちの２つは、ＶＤＬ−（Ｘ２）ｍ−Ｘ３（ここで、
ＶＤＬは、軽鎖可変ドメインであり、
Ｘ２は、ＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
Ｘ３は、ＣＬドメインであり、
ｍは、０又は１である）を含み；
前記４つのポリペプチド鎖のうちの少なくとも１つは、可変ドメイン内に位置する突然変異を含み、前記突然変異は、標的となる、特異的抗体と突然変異体結合ドメインとの結合を阻害する。
【００５５】
特定の実施形態において、該ＴＮＦ結合タンパク質は、４つのポリペプチド鎖を含むモノボディー分子であり、
前記４つのポリペプチド鎖のうちの２つは、ＶＤＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤＨ２−Ｃ−Ｙ１（ここで、
ＶＤＨ１は、第一の重鎖可変ドメインであり、
ＶＤＨ２は、第二の重鎖可変ドメインであり、
Ｃは、重鎖定常ドメインであり、
Ｘ１は、ＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
Ｙ１は、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０又は１である）を含み；
前記４つのポリペプチド鎖のうちの２つは、ＶＤＬ１−（Ｘ２）ｍ−ＶＤＬ２−Ｘ３（ここで、
ＶＤＬ１は、第一の軽鎖可変ドメインであり、
ＶＤＬ２は、第二の軽鎖可変ドメインであり、
Ｘ２は、ＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
Ｘ３は、ＣＬドメインであり、
ｍは、０又は１である）を含み；
前記４つのポリペプチド鎖のうちの少なくとも１つは、第一の可変ドメイン又は第二の可変ドメイン内に位置する突然変異を含み、前記突然変異は、標的となる、特異的抗体と突然変異体結合ドメインとの結合を阻害する。
【００５６】
特定の実施形態において、該ＴＮＦ結合タンパク質は、第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖を含む１つのアームのモノボディー分子であり、
前記第一のポリペプチド鎖は、ＶＤＨ−（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−（Ｘ３）ｍ−Ｙ１（ここで、
ＶＤＨは、重鎖可変ドメインであり、
Ｘ１は、Ｘ１がＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
Ｘ２は、ＣＨ１であり、
Ｘ３は、リンカーであり、
Ｙ１は、Ｆ領域であり、
ｎは、０又は１であり、ｍは、０又は１である）を含み；
前記第二のポリペプチドは、ＶＤＬ−（Ｘ４）ｎ−Ｘ５−（Ｘ６）ｍ−Ｙ２（ここで、
ＶＤＬは、軽鎖可変ドメインであり、
Ｘ４は、Ｘ４がＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
Ｘ５は、ＣＬ１であり、
Ｘ６は、リンカーであり、
Ｙ２は、Ｆ領域であり、
ｎは、０又は１であり、ｍは、０又は１である）を含み；
Ｙ１及びＹ２は、それぞれ突然変異を含み、Ｙ１及びＹ２上の突然変異は、Ｙ１とＹ２の相互作用を増大させる。
【００５７】
特定の実施形態において、該ＴＮＦ結合タンパク質は、第一のポリペプチド鎖及び第二のポリペプチド鎖を含む１つのアームのモノボディーＤＶＤ−Ｉｇ分子であり、
前記第一のポリペプチド鎖は、ＶＤＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤＨ２−Ｘ２−（Ｘ３）ｍ−Ｙ１（ここで、
ＶＤＨ１は、第一の重鎖可変ドメインであり、
Ｘ１は、Ｘ１がＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
ＶＤＨ２は、第二の重鎖可変ドメインであり、
Ｘ２は、ＣＨ１であり、
Ｘ３は、リンカーであり、
Ｙ１は、Ｆ領域であり、
ｎは、０又は１であり、ｍは、０又は１である）を含み；
前記第二のポリペプチドは、ＶＤＬ１−（Ｘ４）ｎ−ＶＤＬ２−Ｘ５−（Ｘ６）ｍ−Ｙ２（ここで、
ＶＤＬ１は、第一の軽鎖可変ドメインであり、
Ｘ４は、Ｘ４がＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
ＶＤＬ２は、第二の軽鎖可変ドメインであり、
Ｘ５は、ＣＬ１であり、
Ｘ６は、リンカーであり、
Ｙ２は、Ｆ領域であり、
ｎは、０又は１であり、ｍは、０又は１である）を含み；
Ｙ１及びＹ２は、それぞれ突然変異を含み、Ｙ１及びＹ２上の突然変異は、Ｙ１とＹ２の間のヘテロ二量体化を増大させる。
【００５８】
特定の実施形態において、該ＴＮＦ結合タンパク質は、第一、第二、第三及び第四のポリペプチド鎖を含む多価ＤＶＤ−Ｉｇ分子であり、
前記第一のポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−ＣＨ−（Ｘ２）ｎ（ここで、ＶＤ１は、第一の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第二の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、ＣＨ１ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを前提としたリンカーであり、Ｘ２は、Ｆｃ領域である）を含み；
前記第二のポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−ＣＬ−（Ｘ２）ｎ（ここで、ＶＤ１は、第一の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第二の軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは、軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを前提としたリンカーであり、Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まない）を含み；
前記第三のポリペプチド鎖は、ＶＤ３−（Ｘ３）ｎ−ＶＤ４−ＣＬ−（Ｘ４）ｎ（ここで、ＶＤ３は、第三の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ４は、第四の重鎖可変ドメインであり、ＣＬは、軽鎖定常ドメインであり、Ｘ３は、定常ドメインではないことを前提としたリンカーであり、Ｘ４は、Ｆｃ領域である）を含み；
前記第四のポリペプチド鎖は、ＶＤ３−（Ｘ３）ｎ−ＶＤ４−ＣＨ−（Ｘ４）ｎ（ここで、ＶＤ３は、第三の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ４は、第四の軽鎖可変ドメインであり、ＣＨは、ＣＨ１ドメインであり、Ｘ３は、定常ドメインではないことを前提としたリンカーであり、Ｘ４は、Ｆｃ領域を含まない）を含み；ｎは、０又は１であり、第一及び第二のポリペプチド鎖上のＶＤ１ドメインは、第一の抗原のための１つの機能的結合部位を形成し、第一及び第二のポリペプチド鎖上のＶＤ２ドメインは、第二の抗原のための１つの機能的結合部位を形成し、第三及び第四のポリペプチド鎖上のＶＤ３ドメインは、第三の抗原のための１つの機能的結合部位を形成し、第三及び第四のポリペプチド鎖上のＶＤ４ドメインは、第四の抗原のための１つの機能的結合部位を形成する。
【００５９】
特定の実施形態において、該ＴＮＦ結合タンパク質は、ポリペプチド鎖を含むリセプターＤＶＤ（ｒＤＶＤ）分子であり、
該ポリペプチド鎖は、ＲＤ１−（Ｘ）ｎ−ＶＤＨ−Ｃ−Ｙ又はＶＤＨ−（Ｘ）ｎ−ＲＤ１−Ｃ−Ｙ（ここで、
ＲＤ１は、リセプターのリガンド結合ドメインを含み、
ＶＤＨは、重鎖可変ドメインであり、
Ｃは、重鎖定常ドメインであり、
Ｘは、ＣＨ１ではないことを前提としたリンカーであり、
Ｙは、Ｆｃ領域であり、
ｎは、０又は１である）を含む。
【００６０】
任意のアミノ酸リンカーを、本明細書に開示されたＴＮＦ結合タンパク質内で用いることができる。特定の実施形態において、該リンカーは、表１に示されたものから選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６１】
任意のＦｃ突然変異体を用いて、本明細書に開示された半分子（例えば、半抗体及び半ＤＶＤ−Ｉｇ）、又はヘテロマー分子（例えば、ｐＤＶＤ及びｍＤＶＤ）を実現することができる。特定の実施形態において、Ｆｃ突然変異体は、表３に示されたものから選択される。
【表１】
2016516041.tif 000003
【表２】
2016516041.tif 000004
【表３】
2016516041.tif 000005
【００６２】
ＩＩＩ．  遺伝子操作されたＴＮＦ結合タンパク質
特定の好ましい実施形態において、本明細書に開示された方法及び組成物を用いて生成された該ＴＮＦ結合タンパク質は、対応する親参照結合タンパク質に比較して改善された特性（例えば、親和性又は安定性）を示す。例えば、該遺伝子操作された結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴による測定で約０．１ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数で標的抗原から解離され得るか、又は約１×１０−６Ｍ以下のＩＣ５０で標的抗原の活性を阻害し得る。あるいは該結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴による測定で約１×１０−２ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数で標的抗原から解離され得るか、又は約１×１０−７Ｍ以下のＩＣ５０で標的抗原の活性を阻害し得る。あるいは該結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴による測定で約１×１０−３ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数で該標的から解離され得るか、又は約１×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０で該標的を阻害し得る。あるいは該結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴による測定で約１×１０−４ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数で該標的から解離され得るか、又は約１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０で該活性を阻害し得る。あるいは該結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴による測定で約１×１０−５ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数で該標的から解離され得るか、又は約１×１０−１０Ｍ以下のＩＣ５０で該活性を阻害し得る。あるいは該結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴による測定で約１×１０−５ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数で該標的から解離され得るか、又は約１×１０−１１Ｍ以下のＩＣ５０で該活性を阻害し得る。
【００６３】
特定の実施形態において、該遺伝子操作された結合タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域などの重鎖定常領域を含む。好ましくは該重鎖定常領域は、ＩｇＧ１重鎖定常領域又はＩｇＧ４重鎖定常領域である。さらに、該結合タンパク質は、κ軽鎖定常領域又はλ軽鎖定常領域のいずれかの軽鎖定常領域を含み得る。該結合タンパク質は、κ軽鎖定常領域を含む。あるいは該結合タンパク質は、例えばＦａｂフラグメント又は単鎖Ｆｖフラグメントであってもよい。
【００６４】
特定の実施形態において、該遺伝子操作された結合タンパク質は、当該技術分野で公知の遺伝子操作されたエフェクター機能を含む（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，６４８，２６０号、同第５６２４８２１号参照）。結合タンパク質のＦｃ部分は、複数の重要なエフェクター機能、例えばサイトカイン誘導、ＡＤＣＣ、ファゴサイトーシス、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）並びに結合タンパク質及び抗原−結合タンパク質複合体の半減期／クリアランス率を仲介する。幾つかの例において、これらのエフェクター機能は、治療性結合タンパク質には望ましいが、他の例では、治療目的に応じて不必要な場合も、又は有害な場合さえもある。特定のヒトＩｇＧアイソタイプ、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ３は、それぞれＦｃγＲ及び相補性Ｃ１ｑへの結合によりＡＤＣＣ及びＣＤＣを仲介する。新生児期Ｆｃリセプター（ＦｃＲｎ）は、結合タンパク質の循環半減期を決定する必須成分である。さらに別の実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸残基は、結合タンパク質の定常領域、例えば結合タンパク質のＦｃ領域内で置換されて、結合タンパク質のエフェクター機能を改変する。
【００６５】
特定の実施形態において、該遺伝子操作された結合タンパク質は、別の機能的分子（例えば、別のペプチド又はタンパク質）に誘導体化、又は連結されている。例えば本発明の標識された結合タンパク質が、本発明の結合タンパク質又は結合タンパク質部分を１つ以上の別の分子物質、例えば別の結合タンパク質（例えば、二重特異性結合タンパク質又はダイアボディー）、検出可能な薬剤、細胞傷害剤、医薬剤、及び／又は結合タンパク質と別の分子（ストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジンタッグ）との会合を仲介し得るタンパク質若しくはペプチドなど、に機能的に連結することにより（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合又はその他の方法により）誘導され得る。
【００６６】
本発明の結合タンパク質又は結合タンパク質部分を誘導体化し得る有用な検出可能な薬剤として、蛍光化合物が挙げられる。模範的な蛍光検出可能剤としては、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリンなどが挙げられる。結合タンパク質は、アルカリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの検出可能な酵素で誘導体化することもできる。結合タンパク質が、検出可能な酵素で誘導体化された場合、このタンパク質は、検出可能な反応産物を産生するために酵素が使用するさらなる試薬を添加することによって検出される。例えば、検出可能な薬剤：西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素及びジアミノベンジジンの添加により、検出可能な着色反応産物がもたらされる。結合タンパク質は、ビオチンで誘導体化させて、アビジン又はストレプトアビジン結合を間接的に測定することにより検出することもできる。
【００６７】
別の実施形態において、該遺伝子操作された結合タンパク質は、該結合タンパク質のＯ−又はＮ−結合のグリコシル化部分が突然変異されたグリコシル化部位突然変異を生成するようにさらに修飾される。当業者は、そのような突然変異体を、標準的な周知の技術を利用して作製することができる。生物活性を保持しながら、結合活性を上昇又は低下させたグリコシル化部位突然変異体が、本発明の別の目的である。
【００６８】
さらに別の実施形態において、本発明の遺伝子操作された結合タンパク質又は抗原結合部分のグリコシル化が、修飾される。例えばグリコシル化された結合タンパク質を作製することができる（即ち、結合タンパク質がグリコシル化を欠損する）。グリコシル化は、例えば抗原への結合タンパク質の親和性を上昇させるように、改変することができる。そのような炭水化物修飾は、例えば結合タンパク質配列内のグリコシル化の部位１つ以上を改変することにより、遂行され得る。例えば１つ以上のアミノ酸置換を実施して、１つ以上の可変領域グリコシル化部位を排除し、それにより該部位のグリコシル化を排除することができる。そのようなグリコシル化は、抗原への結合タンパク質の親和性を上昇させ得る。そのようなアプローチは、全体として参照により本明細書に取り込まれる、ＰＣＴ公報第ＷＯ２００３０１６４６６Ａ２号、米国特許第５，７１４，３５０号及び同第６，３５０，８６１号にさらに詳細に記載される。
【００６９】
追加又は代わりとして、本発明の遺伝子操作された結合タンパク質は、例えば少量のフコシル残基を有する低フコシル化結合タンパク質、又は多量の二分割ＧｌｃＮＡｃ構造を有する結合タンパク質など、別のタイプのグリコシル化でさらに修飾することができる。そのような改変されたグリコシル化パターンが、結合タンパク質のＡＤＣＣ能力を高めることが実証された。そのような炭水化物修飾は、例えば改変されたグリコシル化機序を有する宿主細胞内で該結合タンパク質を発現させることにより、遂行することができる。改変されたグリコシル化機序が改変された細胞は、当該技術分野で記載されており、本発明の組換え結合タンパク質を発現し、それによりグリコシル化が改変された結合タンパク質を産生する宿主細胞として、利用することができる。例えば、全体として参照により本明細書に取り込まれる、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０；Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１，並びに欧州特許第ＥＰ１，１７６，１９５、ＰＣＴ公報ＷＯ０３／０３５８３５、ＷＯ９９／５４３４２８０号を参照されたい。当該技術分野で公知の技術を利用すれば、専門家は、ヒトタンパク質グリコシル化を示す結合タンパク質を作製することができる。例えば酵母の菌株を、非天然由来グリコシル化酵素を発現するように遺伝子修飾し、それによりこれらの酵母菌株内で産生されたグリコシル化タンパク質（糖タンパク質）が、動物細胞、特にヒト細胞と同等のタンパク質グリコシル化を示した（米国特許出願公開第２００４００１８５９０号及び同第２００２０１３７１３４号、並びにＰＣＴ公報ＷＯ２００５１００５８４  Ａ２号）
【００７０】
ＩＶ．  ＴＮＦ結合タンパク質の生成
本発明のＴＮＦ結合タンパク質は、当該技術分野で公知の複数の技術のいずれかにより生成することができる。例えば、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクター（複数可）が標準技術により宿主細胞内にトランスフェクトされる場合の、宿主細胞からの発現。用語「トランスフェクション」の様々な形態は、外来性ＤＮＡを原核又は真核宿主細胞に導入するのに共通して用いられる非常に様々な技術、例えば電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクションなどを包含するものとする。原核又は真核宿主細胞のいずれかの内部で本発明の結合タンパク質を発現させることは可能であるが、真核細胞内での結合タンパク質の発現が好ましく、最も好ましいのは哺乳動物の宿主細胞内であり、それはそのような真核細胞（特に哺乳動物細胞）が適正にフォールディングされた免疫活性の結合タンパク質を組み立てて分泌する可能性が、原核細胞よりも高いためである。
【００７１】
本発明の組換え結合タンパク質を発現するための好ましい哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞など。例えばＲ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載された通りＤＨＦＲ選択マーカと共に使用）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が挙げられる。結合タンパク質の遺伝子をコードする組換え発現ベクターは、哺乳動物の宿主細胞に導入される場合、宿主細胞内で結合タンパク質を発現させるのに十分な時間、又はより好ましくは宿主細胞が産生された培地中に結合タンパク質を分泌させるのに十分な期間、宿主細胞を培養することにより、結合タンパク質が産生される。結合タンパク質は、標準のタンパク質精製法を利用して培地から回収することができる。
【００７２】
宿主細胞を用いて、Ｆａｂフラグメント又はｓｃＦｖ分子などの機能的結合タンパク質フラグメントを生成することもできる。先の手順の変更が本発明の範囲内であることは、理解されよう。例えば、本発明の結合タンパク質の軽鎖及び／又は重鎖のいずれかの機能的フラグメントをコードするＤＮＡで宿主細胞をトランスフェクトすることが、望ましい場合がある。組換えＤＮＡ技術を利用して、該当する抗原に必ずしも結合しない、軽鎖及び重鎖のいずれか又は両方をコードするＤＮＡの幾つか又は全てを除去してもよい。そのような切除されたＤＮＡ分子から発現された分子も、本発明の結合タンパク質に包含される。加えて、標準の化学的架橋法により本発明の結合タンパク質を第二の結合タンパク質に架橋させることにより、１つの重鎖及び１つの軽鎖が本発明の結合タンパク質であり、他の重鎖及び軽鎖が該当する抗原以外の抗原に特異的であるような、二官能化結合タンパク質を生成してもよい。
【００７３】
本発明の結合タンパク質又はその抗原結合タンパク質の組換え発現に好ましいシステムでは、結合タンパク質の重鎖及び結合タンパク質の軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターが、リン酸カルシウムを介したトランスフェクションによりｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入される。組換え発現ベクター内では、結合タンパク質の重鎖及び軽鎖遺伝子が、それぞれＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモータ制御因子に操作可能に連結して、高レベルの遺伝子転写に至らせる。組換え発現ベクターは、メトトレキサート選択／増幅を利用してベクターをトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の選択を可能にするＤＨＦＲ遺伝子も運搬する。選択されたトランスフォーマント宿主細胞を培養して、結合タンパク質の重鎖及び軽鎖の発現を可能にし、インタクトの結合タンパク質が、培地から回収される。標準の分子生物学技術を利用して、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトし、トランスフォーマントを選択し、宿主細胞を培養して、培地から結合タンパク質を回収する。さらに本発明は、本発明の組換え結合タンパク質が合成されるまで、本発明の宿主細胞を適切な培地中で培養することにより、本発明の組換え結合タンパク質を合成する方法を提供する。該方法は、培地から組換えタンパク質を単離することをさらに含み得る。
【００７４】
Ｖ．  医薬組成物
一態様において、１種以上の結合タンパク質を単独で、又は予防剤、治療剤、及び／若しくは医薬的に許容し得る担体と併せて含む医薬組成物が、提供される。本明細書で提供される結合タンパク質を含む医薬組成物は、非限定的に障害を診断、検出若しくはモニタリングする際、障害若しくは１つ以上の症状を予防、処置、管理、若しくは寛解する際、及び／又は研究の際に使用されるためのものである。単独での、又は予防剤、治療剤、及び／若しくは医薬的に許容し得る担体と併せた医薬組成物の配合は、当業者に公知である（米国特許出願公開第２００９０３１１２５３  Ａ１号）。
【００７５】
本明細書で提供される予防又は治療剤を投与する方法としては、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）、硬膜外投与、腫瘍内投与、粘膜投与（例えば、鼻内及び経口経路）及び肺内投与（例えば、吸入器又はネブライザーで投与されるエアロゾル化化合物）が挙げられるが、それらに限定されない。特定の投与経路に向けた医薬組成物の配合、並びに様々な投与方法に必要な材料及び技術は、当業者に公知である（米国特許出願公開第２００９０３１１２５３  Ａ１号）。
【００７６】
最適な所望の応答（例えば、治療又は予防的応答）をもたらすように、投与レジメンを調整してもよい。例えば単一のボーラスを投与してもよく、数回の分割用量を経時的に投与してもよく、又は治療状況の緊急性によって示される通り用量を比例して減少若しくは増加させてもよい。投与の容易性及び投与量の均一性のために、非経口投与組成物を単位投与剤形で配合することは、特に有利である。用語「単位投与剤形」は、処置される哺乳動物対象の単位用量として適している物理的に別個の単位を指し；それぞれの単位は必要な薬学的担体に関連して所望の治療的作用を生じるように計算された活性化合物の既定量を含む。本明細書で提供される単位投与剤形の詳細は、（ａ）活性化合物の独自の特徴及び得られる特定の治療又は予防効果、並びに（ｂ）個体における感受性の処置のためのそのような活性化合物を調合する技術分野における固有の制限に左右され、それらに直接依存する。
【００７７】
本明細書で提供される結合タンパク質の治療的又は予防的有効量の模範的で非限定的な範囲は、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、例えば１〜１０ｍｇ／ｋｇである。投与量の値が緩和される状態のタイプ及び重症度に応じて変動し得ることに、留意されたい。さらに、任意の特定の対象に向けて、専用の投与レジメンを、個体の要件、及び該組成物を投与する人又は投与を指揮する人の専門的判断に従って経時的調整し得ること、並びに本明細書で示された投与量範囲が模範に過ぎず、請求された組成物の範囲又は実務を限定するものではないことが、理解されなければならない。
【００７８】
ＶＩ．  ＴＮＦ結合分子を利用した処置方法
一態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に開示されたＴＮＦ結合分子の治療有効量を、ＴＮＦ関連障害の処置を必要とする個体に投与することにより、対象におけるそのような障害を処置する方法である。そのような方法を利用して、非限定的に以下のものをはじめとする任意のＴＮＦ関連障害を処置することができる：
【００７９】
Ａ．敗血症
腫瘍壊死因子は、低血圧、心筋抑制、血管漏出症候群、臓器の壊死、トキシック・セカンダリー・メディエータ放出の刺激及び凝固カスケードの活性化を含む生物学的作用を伴う、敗血症の病態生理学における立証された役割を有する（例えば、Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２：１６２−１６９；Ｍｏｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第５，２３１，０２４号；Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ａ．による欧州特許公報第２６０６１０  Ｂ１号；Ｔｒａｃｅｙ，Ｋ．Ｊ．ａｎｄ  Ｃｅｒａｍｉ，Ａ．（１９９４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４５：４９１−５０３；Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｃ．（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：７１４−７２１参照）。したがって、本発明のＴＮＦ結合タンパク質を用いて、敗血症性ショック、エンドトキシンショック、グラム陰性菌敗血症及び毒素性ショック症候群をはじめとする任意の臨床場面における敗血症を処置することができる。
【００８０】
さらに、敗血症を治療するために、本発明の組み合わせを、敗血症をさらに緩和し得る１種以上の追加の治療剤、例えば、インターロイキン−１阻害剤（ＰＣＴ公報ＷＯ９２／１６２２１号及びＷＯ９２／１７５８３号に記載されたものなど）、サイトカインであるインターロイキン−６（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９３／１１７９３参照）、又は血小板活性化因子のアンタゴニスト（例えば、欧州特許公開公報ＥＰ３７４５１０号参照）と同時投与することができる。敗血症を処置するための他の併用療法は、本明細書にさらに議論される。
【００８１】
追加として、特定の実施態様において、本発明のＴＮＦ結合タンパク質は、処置の時点で５００ｐｇ／ｍＬを超え（例えば、１０００ｐｇ／ｍＬを超える）ＩＬ−６の血清又は血漿中濃度を有する敗血症患者の下位群に含まれるヒト対象に投与される（Ｄａｕｍ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．によるＰＣＴ公報ＷＯ９５／２０９７８号参照）。
【００８２】
Ｂ．自己免疫疾患
腫瘍壊死因子は、種々の自己免疫疾患の病態生理学における役割を果たすことに関連づけられた。例えばＴＮＦαは、関節リウマチにおいて、組織の炎症を活性化すること及び関節の破壊を引き起こすことに関連づけられた（例えば、Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２：１６２−１６９；Ｍｏｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第５，２３１，０２４号；Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ａによる欧州特許公報第２６０６１０  Ｂ１号；上掲のＴｒａｃｅｙ  ａｎｄ  Ｃｅｒａｍｉ；Ａｒｅｎｄ，Ｗ．Ｐ．ａｎｄ  Ｄａｙｅｒ，Ｊ−Ｍ．（１９９５）Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕｍ．３８：１５１−１６０；Ｆａｖａ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９４：２６１−２６６参照）。ＴＮＦαは、糖尿病において、島細胞の死滅を促進すること及びインスリン抵抗性を仲介することにも関連づけられた（例えば、上掲のＴｒａｃｅｙ  ａｎｄ  Ｃｅｒａｍｉ；ＰＣＴ公報ＷＯ９４／０８６０９号参照）。ＴＮＦαは、多発性硬化症において、乏突起膠細胞への細胞毒性を仲介すること及び炎症性プラークを誘導することにも関連づけられた（例えば、上掲のＴｒａｃｅｙ  ａｎｄ  Ｃｅｒａｍｉ参照）。キメラ及びヒト化マウス抗ｈＴＮＦα抗体は、関節リウマチの処置についての臨床試験を受けた（例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｌａｎｃｅｔ  ３４４：１１２５−１１２７；Ｅｌｌｉｏｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｌａｎｃｅｔ  ３４４：１１０５−１１１０；Ｒａｎｋｉｎ，Ｅ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｒ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．３４：３３４−３４２参照）。
【００８３】
本発明の抗ＴＮＦ／ＪＡＫ阻害剤の組み合わせを用いて、自己免疫疾患、特に関節リウマチ、リウマチ様脊椎炎、骨関節炎及び痛風性関節炎、アレルギー、多発性硬化症、自己免疫性糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎並びにネフローゼ症候群をはじめとする炎症に関連するものを処置することができる。典型的にはそれらの組み合わせは、全身に投与されるが、特定の障害では、抗ＴＮＦ及び／又はＪＡＫ阻害剤を炎症部位に局所投与することが有益となり得る（例えば、単独での、又はＰＣＴ公報ＷＯ９３／１９７５１号に記載されたようなシクロヘキサン−イリデン誘導体と組み合わせた、関節リウマチにおける関節への局所投与又は糖尿病性潰瘍への局部適用）。本発明の抗ＴＮＦＪＡＫ阻害剤の組み合わせを、本明細書にさらに議論される通り、自己免疫疾患の処置に有用な１種以上の追加的治療剤と共に投与することもできる。
【００８４】
Ｃ．感染性疾患
腫瘍壊死因子は、種々の感染性疾患において観察される生物学的作用を仲介することに関連づけられた。例えばＴＮＦαは、マラリアにおいて、脳の炎症及び毛細血管の血栓症、並びに梗塞を仲介することに関連づけられた。ＴＮＦαは、髄膜炎において、脳の炎症を仲介すること、血液脳関門（ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｔｈｅｒ）の破壊を誘導すること、敗血症性ショック症候群を惹起すること、及び静脈梗塞を活性化させることにも関連付けられた。ＴＮＦαは、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）において、悪液質を誘導すること、ウイルス増殖を刺激すること、及び中枢神経系の損傷を仲介することにも関連づけられた。したがって、本発明の抗ＴＮＦ／ＪＡＫ阻害剤の組み合わせを、細菌性髄膜炎（例えば、欧州特許公開公報ＥＰ５８５７０５号参照）、脳マラリア、ＡＩＤＳ及びＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）（例えば、欧州特許公開公報ＥＰ２３０５７４号参照）、並びに移植後のサイトメガロウイルス感染（例えば、Ｆｉｅｔｚｅ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５８：６７５−６８０参照）をはじめとする感染性疾患の処置に用いることができる。本発明の抗ＴＮＦ／ＪＡＫ阻害剤の組み合わせを用いて、感染（インフルエンザなど）が原因の発熱及び筋肉痛、並びに感染後の（例えば、ＡＩＤＳ又はＡＲＣの後の）悪液質をはじめとする感染性疾患に関連する症状を緩和することもできる。
【００８５】
Ｄ．移植
腫瘍壊死因子は、同種移植片拒絶及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の主要なメディエータとして、そしてＴ細胞リセプターのＣＤ３複合体を対象とするラット抗体ＯＫＴ３を用いて腎移植片拒絶を抑制する場合に観察された有害反応を仲介することに関連づけられた（例えば、Ｅａｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５９：３００−３０５；Ｓｕｔｈａｎｔｈｉｒａｎ，Ｍ．ａｎｄ  Ｓｔｒｏｍ，Ｔ．Ｂ．（１９９４）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３１：３６５−３７５参照）。したがって、本発明の抗ＴＮＦ／ＪＡＫ阻害剤の組み合わせを用いて、同種移植片及び異種移植片の拒絶をはじめとする移植片拒絶、並びにＧＶＨＤを阻害することができる。該組み合わせを、単独で用いてもよいが、それを、同種移植片への免疫反応を阻害する、又はＧＶＨＤを阻害する１種以上の他の薬剤と併用することができる。例えば、１つの実施態様において、ＴＮＦ結合タンパク質をＯＫＴ３と併用して、ＯＫＴ３に誘導される反応を阻害する。別の実施態様において、ＴＮＦ結合タンパク質を、免疫応答を調節することに関与する別の標的、例えば、細胞表面分子ＣＤ２５（インターロイキン−２リセプターα）、ＣＤ１１ａ（ＬＦＡ−１）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４、ＣＤ８０（Ｂ７−１）及び／又はＣＤ８６（Ｂ７−２）を対象とする１種以上の抗体と併用する。さらに別の実施態様において、本発明のＴＮＦ結合タンパク質を、１種以上の一般的な免疫抑制剤、例えばシクロスポリンＡ又はＦＫ５０６と組み合わせて用いる。
【００８６】
Ｅ．悪性腫瘍
腫瘍壊死因子は、悪液質を誘導すること、腫瘍の成長を刺激すること、転移の可能性を増大すること、及び悪性腫瘍における細胞毒性を仲介することに関連づけられた。したがって、本発明のＴＮＦ結合タンパク質を、悪性腫瘍の処置に用いて、腫瘍の成長若しくは転移を阻害すること、及び／又は悪性腫瘍に続く悪液質を緩和することができる。該抗ＴＮＦ／ＪＡＫ阻害剤の組み合わせは、全身投与してもよく、又は腫瘍部位に局所投与してもよい。
【００８７】
Ｆ．肺障害
腫瘍壊死因子は、白血球内皮活性化を刺激すること、肺細胞へ細胞毒性を導くこと、及び血管漏出症候群を誘導することをはじめとする、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の病態生理に関連づけられた。したがって、本発明のＴＮＦ結合タンパク質を用いて、成人呼吸窮迫症候群（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９１／０４０５４号参照）、ショック肺、慢性炎症性肺疾患、肺サルコイドーシス、肺線維症及びケイ肺症をはじめとする様々な肺障害を処置することができる。該抗ＴＮＦ／ＪＡＫ阻害剤の組み合わせは、全身投与してもよく、又は肺の表面に、例えばエアゾールとして、局所投与してもよい。本発明の抗ＴＮＦ／ＪＡＫ阻害剤の組み合わせは、本明細書にさらに議論される通り、肺障害の処置に有用な１種以上の追加的治療剤と共に投与することもできる。
【００８８】
Ｇ．腸障害
瘍壊死因子は、炎症性腸疾患の病態生理に関連づけられた（例えば、Ｔｒａｃｙ，Ｋ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：４７０−４７４；Ｓｕｎ，Ｘ−Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８１：１３２８−１３３１；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｔ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８１：３０１−３０５参照）。キメラネズミ抗ｈＴＮＦα抗体は、クローン病の処置についての臨床試験を受けた（ｖａｎ  Ｄｕｌｌｅｍｅｎ，Ｈ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０９：１２９−１３５）。本発明の抗ＴＮＦ／ＪＡＫ阻害剤の組み合わせを用いて、クローン病及び潰瘍性大腸炎という２つの症候群を含む特発性炎症性腸疾患などの腸障害を処置することもできる。本発明の抗ＴＮＦ／ＪＡＫ阻害剤の組み合わせを、本明細書にさらに議論される通り、腸障害の処置に有用な１種以上の追加的薬剤と共に投与することもできる。
【００８９】
Ｈ．心臓障害
本発明の抗ＴＮＦ／ＪＡＫ阻害剤の組み合わせを用いて、心臓の虚血（例えば欧州特許公開公報ＥＰ４５３８９８号参照）及び心不全（心筋の虚弱）（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９４／２０１３９号参照）を含めた様々な心臓障害を処置することもできる。
【００９０】
Ｉ．他の障害
本発明の抗ＴＮＦ／ＪＡＫ阻害剤の組み合わせを用いて、ＴＮＦα活性が有害となる他の様々な障害を処置することもできる。ＴＮＦα活性が病態生理に関連づけられた、つまり本発明のＴＮＦ結合タンパク質を用いて処置され得る他の疾患及び障害の例としては、炎症性骨障害及び骨吸収疾患（例えば、Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：５１６−５１８；Ｋｏｎｉｇ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．３：６２１−６２７；Ｌｅｒｎｅｒ，Ｕ．Ｈ．ａｎｄ  Ｏｈｌｉｎ，Ａ．（１９９３）Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．８：１４７−１５５；及びＳｈａｎｋａｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｓｔｅｒｎ，Ｐ．Ｈ．（１９９３）Ｂｏｎｅ  １４：８７１−８７６参照）、アルコール性肝炎（例えば、ＭｃＣｌａｉｎ，Ｃ．Ｊ．ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，Ｄ．Ａ．（１９８９）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ９：３４９−３５１；Ｆｅｌｖｅｒ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ａｌｃｏｈｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｅｓ．１４：２５５−２５９；及びＨａｎｓｅｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２０：４６１−４７４参照）、ウイルス性肝炎（Ｓｈｅｒｏｎ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１２：２４１−２４５；及びＨｕｓｓａｉｎ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．４７：１１１２−１１１５）、及び劇症肝炎をはじめとする肝炎；凝固障害（例えば、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌｌ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２２：１６２２−１６２７；及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌｌ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．３６７：５５−６０参照）、火傷（例えば、Ｇｉｒｏｉｒ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６７：Ｈ１１８−１２４；及びＬｉｕ，Ｘ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｕｒｎｓ  ２０：４０−４４参照）、再灌流障害（例えば、Ｓｃａｌｅｓ，Ｗ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６７：Ｇ１１２２−１１２７；Ｓｅｒｒｉｃｋ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５８：１１５８−１１６２；及びＹａｏ，Ｙ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ  ２９：１５７−１６８参照）、ケロイド形成（例えば、ＭｃＣａｕｌｅｙ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：３００−３０８参照）、瘢痕組織の形成；発熱；歯周病；肥満並びに放射線毒性が挙げられる。
【００９１】
特定の実施形態において、本発明の抗ＴＮＦ／ＪＡＫ阻害剤の組み合わせは、
骨関節炎、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、敗血症性関節炎、ライム関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、全身性紅斑性狼瘡、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎、喘息、アレルギー性疾患、乾癬、皮膚炎、強皮症、移植片対宿主病、臓器移植片拒絶、臓器移植に関連する急性又は慢性免疫疾患、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、播種性血管内凝固、川崎病、バセドウ病、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、ウェゲナー肉芽腫症、ヘノッホ・シェーライン紫斑症、腎臓の顕微鏡的血管炎、慢性活動性肝炎、ブドウ膜炎、敗血症性ショック、毒素性ショック症候群、敗血症症候群、悪液質、感染性疾患、寄生性疾患、急性横断性脊髄炎、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、卒中、原発性胆汁性肝硬変、溶血性貧血、悪性腫瘍、心不全、心筋梗塞、アジソン病、孤発性の多内分泌腺機能低下症候群Ｉ型、多内分泌腺機能低下症候群ＩＩ型（シュミット症候群）、成人（急性）呼吸窮迫症候群、脱毛症、円形脱毛症、血清反応陰性関節症、関節症、ライター病、乾癬性関節症、潰瘍性大腸性関節症、腸疾患性滑膜炎、クラミジア菌関連関節症、エルシニア菌関連関節症、サルモネラ菌関連関節症、脊椎関節症、アテローム性疾患／動脈硬化症、アトピー性アレルギー、自己免疫性水疱性疾患、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、類天疱瘡、線状ＩｇＡ病、自己免疫性溶血性貧血、クームス陽性溶血性貧血、後天性悪性貧血、若年性悪性貧血、筋痛性脳脊髄炎／ロイヤルフリー病、慢性粘膜皮膚カンジダ症、巨細胞性動脈炎、原発性硬化性肝炎、突発性自己免疫性肝炎、後天性免疫不全症候群、後天性免疫不全関連疾患、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、分類不能型免疫不全症（分類不能型原発性低γグロブリン血症）、拡張型心筋症、女性不妊症、卵巣機能不全、早期卵巣機能不全、線維性肺疾患、突発性間質性肺炎、炎症後間質性肺疾患、間質性肺炎、結合組織疾患関連間質性肺疾患、混合性結合組織疾患関連肺疾患、全身性硬化症関連間質性肺疾患、関節リウマチ関連間質性肺疾患、全身性紅斑性狼瘡関連肺疾患、皮膚筋炎／多発性筋炎関連肺疾患、シェーグレン病関連肺疾患、強直性脊椎炎関連肺疾患、血管炎性びまん性肺疾患（ｖａｓｃｕｌｉｔｉｃ  ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌｕｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ヘモシデローシス関連肺疾患、薬物によって誘導された間質性肺疾患、線維症、放射性線維症、閉塞性細気管支炎、慢性好酸球性肺炎、リンパ球浸潤性肺疾患、感染後間質性肺疾患、通風関節炎、自己免疫性肝炎、１型自己免疫性肝炎（古典的自己免疫性又はルポイド肝炎）、２型自己免疫性肝炎（抗ＬＫＭ抗体肝炎）、自己免疫媒介性低血糖症、黒色表皮腫を伴うＢ型インスリン抵抗性、副甲状腺機能低下症、臓器移植に関連する急性免疫疾患、臓器移植に関連する慢性免疫疾患、変形性関節症、原発性硬化性胆管炎、１型乾癬、２型乾癬、特発性白血球減少症、自己免疫性好中球減少症、腎臓病ＮＯＳ、糸球体腎炎、腎臓の顕微鏡的血管炎、ライム病、円板状紅斑性狼瘡、特発性男性不妊症又は男性不妊症ＮＯＳ、精子自己免疫性、多発性硬化症（全てのサブタイプ）、交感性眼炎、結合組織疾患に続発する肺高血圧症、グッドパスチャー症候���、結節性多発動脈炎の肺症状、急性リウマチ熱、リウマチ性脊椎炎、スチル病、全身性硬化症、シェーグレン症候群、高安病／動脈炎、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫自己免疫性甲状腺機能低下症（橋本病）、萎縮性自己免疫性甲状腺機能低下症、原発性粘液水腫、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性血管炎、白斑、急性肝疾患、慢性肝疾患、アルコール性肝硬変、アルコール誘発性肝障害、胆汁うっ滞、特異体質性肝疾患、薬物誘発性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎、アレルギー、Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ）感染、精神障害（例えば、うつ病及び統合失調症）、Ｔｈ２型及びＴｈ１型を介した疾病、急性及び慢性疼痛（疼痛の様々な形態）、癌、例えば肺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌及び造血器悪性腫瘍（白血病及びリンパ腫）、無βリポタンパク質血症、先端チアノーゼ、急性及び慢性寄生性又は感染性プロセス、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性又は慢性細菌感染、急性膵炎、急性腎不全、腺癌、心房異所性拍動、ＡＩＤＳ認知症複合、アルコール誘発性肝炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性接触性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、同種移植片拒絶、α−１−アンチトリプシン欠乏症、筋萎縮性側索硬化症、貧血、狭心症、前角細胞変性、抗リン脂質症候群、抗受容器過敏反応（ａｎｔｉ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）、大動脈瘤、動脈瘤、大動脈解離、動脈性高血圧、動脈硬化症、動静脈痩、運動失調、心房細動（持続的又は発作性）、心房粗動、房室ブロック、Ｂ細胞リンパ腫、骨移植片拒絶、骨髄移植片（ＢＭＴ）拒絶、脚ブロック、バーキットリンパ腫、火傷、心不整脈、気絶心筋症候群（ｃａｒｄｉａｃ  ｓｔｕｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心臓腫瘍、心筋症、心肺バイパス炎症反応、軟骨移植片拒絶、小脳皮質変性、小脳障害、無秩序型又は多源性心房頻脈、化学療法関連疾患、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性アルコール症、慢性炎症性病変、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性サリチル酸中毒、結腸直腸癌、うっ血性心不全、結膜炎、接触性皮膚炎、肺性心、冠動脈疾患、クロイツフェルト−ヤコブ病、培養陰性敗血症、嚢胞性線維症、サイトカイン療法関連疾患、パンチドランカー、脱髄性疾患、デング出血熱、皮膚炎、皮膚科学的症状、糖尿病、糖尿病性動脈硬化疾患、びまん性レビー小体病、拡張型うっ血性心筋症、大脳基底核の障害、中年のダウン症候群、中枢神経ドーパミン受容体を遮断する薬物によって誘発された薬物誘発性運動障害、薬物感受性、湿疹、脳脊髄炎、心内膜炎、内分泌疾患、喉頭蓋炎、エプスタイン−バーウイルス感染、紅痛症、垂体外路及び小脳障害、家族性血球貪食性リンパ組織球症、致死的胸腺移植組織拒絶、フリードライヒ失調症、機能的末梢動脈疾患、真菌性敗血症、ガス壊疸、胃潰瘍、糸球体腎炎、いずれかの臓器又は組織の移植片拒絶、グラム陰性敗血症、グラム陽性敗血症、細胞内生物体に起因する肉芽腫、有毛細胞白血病、ハラーホルデン・スパッツ病、橋本甲状腺炎、枯草熱、心臓移植片拒絶、血色素症、血���透析、溶血性尿毒症症候群／血栓溶解血小板減少紫斑病、出血、Ａ型肝炎、ヒス束不整脈、ＨＩＶ感染／ＨＩＶ神経障害、ホジキン病、運動過剰障害、過敏症反応、過敏性肺炎、高血圧、運動低下障害、視床下部−下垂体−副腎皮質系評価、特発性アジソン病、特発性肺線維症、抗体媒介性細胞毒性、無力症、乳児脊髄性筋萎縮症、大動脈の炎症、Ａ型インフルエンザ、電離放射線暴露、虹彩毛様体炎／ブドウ膜炎／視神経炎、虚血再灌流傷害、虚血性発作、若年性関節リウマチ、若年性脊髄性筋萎縮症、カポジ肉腫、腎移植片拒絶、レジオネラ、リーシュマニア症、ハンセン病、皮質脊髄系の病変、脂肪性浮腫、肝臓移植片拒絶、リンパ浮腫、マラリア、悪性リンパ腫、悪性組織球増殖症、悪性黒色腫、髄膜炎、髄膜炎菌血症、代謝性偏頭痛、特発性偏頭痛、ミトコンドリア型多臓器障害（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、混合性結合組織病、モノクローナル高ガンマグロブリン血症、多発性骨髄腫、多系統変性症（メンセル・デジェリーヌ−トーマス・シャイ−ドレーガー及びマシャド−ジョセフ）、重症筋無力症、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・チュバキュロシス、骨髄形成異常、心筋梗塞、真菌虚血障害、上咽頭癌、新生児慢性肺疾患、腎炎、ネフローゼ、神経変性疾患、神経原性筋萎縮、好中球減少性発熱、非ホジキンリンパ腫、腹部大動脈及びその分枝の閉塞、閉塞性動脈疾患、精巣炎／精巣上体炎、精巣炎／精管復元術処置、臓器肥大、骨粗しょう症、膵臓移植片拒絶、膵癌、腫瘍随伴性症候群／悪性腫瘍の高カルシウム血症、副甲状腺移植片拒絶、骨盤内炎症性疾患、通年性鼻炎、心膜疾患、末梢アテローム硬化性疾患、末梢血管疾患、腹膜炎、悪性貧血、ニューモシスチス・カリニ肺炎、肺炎、ＰＯＥＭＳ症候群（多発神経炎、臓器肥大、内分泌疾患、単クローン性γグロブリン血症及び皮膚変化症候群（ｓｋｉｎ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ））、灌流後症候群（ｐｏｓｔ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ポンプ後症候群（ｐｏｓｔ  ｐｕｍｐ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心筋梗塞後開心術症候群、子癇前症、進行性核上性麻痺、原発性肺高血圧、放射線療法、レイノー現象、レイノー病、レフサム病、規則的なＱＲＳ幅の狭い頻脈、腎血管性高血圧、再灌流傷害、拘束型心筋症、肉腫、老年性舞踏病、レビー小体型老人性認知症、血清反応陰性関節炎、ショック、鎌形赤血球貧血症、皮膚同種異系移植片拒絶、皮膚変化症候群、小腸移植片拒絶、固形腫瘍、特定の不整脈（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｒｒｈｙｔｈｍｉａｓ）、脊髄性運動失調、脊髄小脳変性、連鎖球菌性筋炎、小脳の構造的病変、亜急性硬化性全脳炎、卒倒、心血管系の梅毒、全身性アナフィラキシー、全身性炎症反応症候群、全身性発症若年性関節リウマチ、毛細血管拡張症、閉塞性血栓血管炎、血小板減少症、毒性、移植片、外傷／出血、ＩＩＩ型過敏症反応、ＩＶ型過敏症、不安定狭心症、尿毒症、尿路性敗血症、じんましん、心臓弁膜症、静脈瘤、血管炎、静脈疾患、静脈血栓症、心室細動、ウイルス及び真菌感染、ウイルス性脳炎／無菌性髄膜炎、ウイルス関連血球貪食症候群、ウェルニッケ−コルサコフ症候群、ウィルソン病、��ずれかの臓器又は組織の異種移植片拒絶、急性冠動脈症候群、急性特発性多発性神経炎、急性炎症性脱髄性多発神経根神経障害、急性虚血、成人スチル病、円形脱毛症、アナフィラキシー、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、動脈硬化症、アトピー性湿疹、アトピー性皮膚炎、自己免疫性皮膚炎、連鎖球菌感染に伴う自己免疫障害、自己免疫性腸疾患、自己免疫性難聴、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性早期卵巣機能不全、眼瞼炎、気管支拡張症、水疱性類天疱瘡、循環器疾患、劇症型抗リン脂質抗体症候群、セリアック病、頸椎症、慢性虚血、瘢痕性類天疱瘡、多発性硬化症のリスクを伴う臨床的孤立性症候群（ＣＩＳ）、結膜炎、若年発症精神障害、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、涙嚢炎、皮膚筋炎、糖尿病性網膜症、椎間板ヘルニア、椎間板脱出症、薬物誘発性免疫性溶血性貧血、心内膜炎、子宮内膜症、眼内炎、上強膜炎、多形性紅斑、多形滲出性紅斑、妊娠性類天疱瘡、ギランバレー症候群（ＧＢＳ）、枯草熱、ヒューズ症候群、特発性パーキンソン病、特発性間質性肺炎、ＩｇＥ媒介アレルギー、免疫性溶血性貧血、封入体筋炎、感染性眼炎症性疾患、炎症性脱髄疾患、炎症性心疾患、炎症性腎疾患、間質性肺線維症／通常型間質性肺炎、紅彩炎、角膜炎、乾性角結膜炎（Ｋｅｒａｔｏｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ  ｓｉｃｃａ）、クスマウル病又はクスマウルマイヤー病、ランドリー麻痺、ランゲルハンス細胞組織球症、網状皮斑、黄斑変性症、顕微鏡的多発血管炎、ベヒテレフ病、運動ニューロン障害、粘膜類天疱瘡、多臓器不全、重症筋無力症、骨髄異形成症候群、心筋炎、神経根障害、神経症、非Ａ非Ｂ型肝炎、視神経炎、骨溶解症、卵巣癌、小関節型若年性関節リウマチ、末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、静脈炎、結節性多発動脈炎（又は結節性動脈周囲症）、多発性軟骨炎、リウマチ性多発筋痛症、白毛症、多関節型若年性関節リウマチ、多内分泌欠乏症候群、多発性軟骨炎、リウマチ性多発筋痛症、白毛症、多関節型若年性関節リウマチ、多内分泌欠乏症候群、多発性筋炎、リウマチ性多発筋痛症（ＰＭＲ）、ポンプ後症候群、一次性パーキンソン症候群、前立腺癌、直腸癌、造血器悪性腫瘍（白血病及びリンパ腫）、前立腺炎、赤芽球癆、原発性副腎機能不全、再発性視神経脊髄炎、再狭窄、リウマチ性心疾患、ＳＡＰＨＯ（滑膜炎
、ざ瘡、膿疱症、骨増殖症及び骨炎）、続発性アミロイドーシス、ショック肺、強膜炎、坐骨神経痛、続発性副腎機能不全、シリコーン関連結合組織病、スネッドンウィルキンソン皮膚症、強直性脊椎炎、スティーブンスジョンソン症候群（ＳＪＳ）、全身性炎症反応症候群、側頭動脈炎、トキソプラスマ性網膜炎、中毒性表皮壊死症、横断性脊椎炎、ＴＲＡＰＳ（腫瘍壊死因子受容体１型（ＴＮＦＲ）関連周期性症候群）、１型アレルギー反応、ＩＩ型糖尿病、じんましん、通常型間質性肺炎（ＵＩＰ）、血管炎、春季結膜炎、ウイルス性網膜炎、フォークト小柳原田症候群（ＶＫＨ症候群）、並びに滲出型黄斑変性からなる群から選択されるＴＮＦ関連障害の処置に用いられる。特定の実施形態において、該ＴＮＦ関連疾患又は障害は、関節リウマチである。
【００９２】
ＶＩＩ．  診断
本明細書の開示は、非限定的に、診断的アッセイ方法、１種以上のＴＮＦ結合タンパク質を含有する診断用キット、並びに自動化及び／又は半自動化システムで使用するための方法及びキットの適合をはじめとする診断適用も提供する。提供された方法、キット、及び適合は、個体の疾患又は障害の検出、モニタリング、及び／又は処置で用いられ得る。これを、以下にさらに明確にする。
【００９３】
アッセイの方法
本開示は、本明細書に記載された少なくとも１種の結合タンパク質を使用して、試験試料中の被分析物又はそのフラグメントの存在、量又は濃度を決定する方法も提供する。当該技術分野で公知の任意の適切なアッセイを、該方法で用いることができる。例としては、免疫アッセイ及び／又は質量分析法を利用した方法が挙げられるが、それらに限定されない。
【００９４】
本開示により提供された免疫アッセイとしては、なかでも、サンドイッチイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、拮抗阻害イムノアッセイ、蛍光偏光免疫測定法（ＦＰＩＡ）、酵素増幅免疫測定法（ＥＭＩＴ）、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）、及び均一化学発光アッセイ（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ａｓｓａｙｓ）を挙げることができる。
【００９５】
化学発光マイクロ粒子イムノアッセイ、特にＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）自動分析装置（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）を用いるものが、イムノアッセイの一例である。
【００９６】
質量分析法を用いる方法が、本開示により提供され、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法）又はＳＥＬＤＩ（表面増強レーザー脱離イオン化法）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００９７】
イムノアッセイ及び質量分析法を利用して生物学的試験試料を回収する、取扱う、処理する、そして分析する方法は、当業者に周知であり、本開示の実務において提供される（米国特許出願公開第２００９−０３１１２５３  Ａ１号）。
【００９８】
キット
試験試料中の被分析物又はそのフラグメントの存在、量又は濃度について試験試料をアッセイするキットも、提供される。該キットには、試験試料を被分析物又はそのフラグメントについてアッセイするための少なくとも１つの成分と、被分析物又はそのフラグメントについて試験試料をアッセイするための使用説明書と、が含まれる。試験試料を被分析物又はそのフラグメントについてアッセイするための少なくとも１つの成分は、場合により固相に固定された、本明細書に開示された結合タンパク質、及び／又は抗被分析物結合タンパク質（又はそのフラグメント、バリアント、若しくはそのバリアントのフラグメント）を含む組成物を含み得る。
【００９９】
場合により該キットは、検量用試料又は対照を含んでいてもよく、それが単離又は精製された被分析物を含んでいてもよい。該キットは、イムノアッセイ及び／又は質量分析法により試験試料を被分析物についてアッセイするための少なくとも１つの成分を含み得る。被分析物、結合タンパク質、及び／若しくは抗被分析物結合タンパク、又はそれらのフラグメントをはじめとする該キットの成分は、任意の当該技術分野で公知の検出可能な標識を用いて、場合により標識されていてもよい。本開示の実務で提供される作製のための材料及び方法は、当業者に公知である（米国特許出願公開第２００９−０３１１２５３  Ａ１号）。
【０１００】
キット及び方法の適合
本明細書に記載されたイムノアッセイなどのアッセイにより試験試料中の被分析物の存在、量又は濃度を決定するキット（又はその成分）及び方法は、例えば米国特許第５，０８９，４２４号及び同第５，００６，３０９号に記載される通り、そして例えばＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）からＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）として市販される通り、様々な自動化及び半自動化システム（固相がマイクロ粒子を含むものなど）で使用されるように適合させることができる。
【０１０１】
Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから市販される他のプラットフォームとしては、ＡｘＳＹＭ（登録商標）、ＩＭｘ（登録商標）（例えば、米国特許第５，２９４，４０４号参照）、ＰＲＩＳＭ（登録商標）、ＥＩＡ（ビーズ）、及びＱｕａｎｔｕｍ（商標）ＩＩ、並びにそれらの他のプラットフォームが挙げられるが、それらに限定されない。追加として、該アッセイ、キット及びキット成分は、他のフォーマット、例えば電気化学的又は他のハンドヘルド若しくはポイントオブケアのアッセイシステムで、使用することができる。本開示は、例えばサンドイッチイムノアッセイを実施する市販のＡｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標），Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）電気化学式イムノアッセイシステムに適用可能である。イムノセンサー、並びに単回使用型テストデバイスでのその製造及び操作方法が、例えば米国特許第５，０６３，０８１号、同第７，４１９，８２１号、及び同第７，６８２，８３３号、並びに米国特許出願公開第２００４００１８５７７号、同第２００６０１６０１６４号及び同第２００９０３１１２５３号に記載される。
【実施例】
【０１０２】
ＶＩＩＩ．  例証
以下に実施例は、例示を目的とするに過ぎず、本発明を限定するものではない。
【０１０３】
実施例１．単球細胞による二価ＴＮＦ結合分子の内在化
単球の単離、培養及び刺激：
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）での密度勾配遠心分離により、健常ドナーのロイコパックから単離した。単球を、ＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いた磁気選別により単離した。得られた単球の、フローサイトメトリー分析により評定された純度は、典型的には９８％を超えていた。単球を、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌペニシリン、及びストレプトマイシン、及び１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｃｅｌｌｇｒｏ）中、１×１０６細胞／ｍｌの密度で、３７℃及び５％ＣＯ２で培養した。表面ＴＮＦα発現をテストするために、ＰＢＭＣ又は単球を、超低濃度（０．０２５ｎｇ／ｍｌ）、低濃度（０．２５ｎｇ／ｍｌ）又は高濃度（２５０ｎｇ／ｍｌ）のＬＰＳ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で指示された期間、刺激した。
【０１０４】
樹状細胞の分化及び刺激
１００ｎｇ／ｍｌ組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ａｂｂｖｉｅ）及び５ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で単球を４日間培養することにより、樹状細胞を作製した。ＴＮＦα産生を調査するために、ＤＣを１μｇ／ｍｌ  ＬＰＳ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で指示された期間、刺激した。
【０１０５】
細胞の染色及びフローサイトメトリー分析
ＬＰＳで刺激したＰＢＣ、単球又はＤＣを、抗ＴＮＦα特異性モノクローナル抗体ＡＢ４３６（ＭＡＫ１９５−ＡＭ２１）、ＡＢ４３７（ＭＡＫ１９５−ＡＭ２４）、ＡＢ４４１（ＭＡＫ１９９−ＡＭ１）又はＡＢ４４４（ＭＡＫ１９９−ＡＭ４）により氷上で１時間、染色した。陰性対照として、アイソタイプが適合する対照抗体（ＡＢ４４６）を用いた。抗体は全て、抗体標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従ってＡ４８８とコンジュゲートさせた。単球及びＴ細胞を、それぞれＣＤ１４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の発現に基づいてゲーティングした。試料を、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターで分析し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウエア（ＴｒｅｅＳｔａｒ  Ｉｎｃ．，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）を用いて解析を実施した。
【０１０６】
内在化
表面ＴＮＦに結合した抗体の内在化を調査するために、Ａｌｅｘａ  ４８８がコンジュゲートされたＡＢ４３６抗体の存在下、単球をＬＰＳで４、７、９又は２４時間刺激した。細胞を透過処理して、核をＤＡＰＩで染色した。共焦顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を用いて、画像を得た。樹状細胞による抗ＴＮＦ抗体の内在化を試験するために、抗ＴＮＦ（ＡＢ４４１）又は適合するアイソタイプ対照抗体の存在下、単球由来ＤＣをＬＰＳで４時間刺激した。抗ＴＮＦα特異性抗体及び対照抗体を、製造業者のプロトコルに従って、ｐＨ感受性色素ｐＨＲｏｄｏ  Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とコンジュゲートさせた。細胞を、蛍光顕微鏡及びＦＡＣＳにより分析した。指示があれば、Ａ４８８でコンジュゲートされた抗ＨＬＡ−Ａ，Ｂ．Ｃ（Ｗ６／３２，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）抗体で細胞表面を染色し、核をＮｕｃｅ  ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。ＤＣ上の膜ＴＮＦによる抗ＴＮＦα抗体の内在化速度を試験するために、細胞を刺激せずに放置するか、又はＬＰＳで１若しくは２４時間刺激した。表面ＴＮＦαを、ｐＨＲｏｄｏ  ＲｅｄをコンジュゲートさせたＴＮＦα抗体（ＡＢ４４１）で染色した。染色された細胞を、ＲＰＭＩ培地中で指示された時間、培養し、ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを用いて、内在化を蛍光の増加として評定した。
【０１０７】
細胞表面ビオチン化
細胞（２〜３×１０６）を氷冷ＰＢＳ−ＣＭ（１ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１ｍＭ  ＭｇＣ１２を含有するＰＢＳ）で２回洗浄し、光を防護して穏やかに撹拌しながら氷上で３０分間、ＰＢＳ−ＣＭ中の１ｍｇ／ｍｌ細胞不透過性ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＳＳ−Ｂｉｏｔｉｎを用いることにより細胞表面タンパク質を２回誘導体化させた。過剰なビオチンは、細胞を氷上で５０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ中、１０分間インキュベートすることによりクエンチした。細胞をＰＢＳ−ＣＭで２回洗浄し、総タンパク質を氷上の１５０ｌ溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド，０．５％デオキシコール酸ナトリウム、７ｍｌ溶解緩衝液中の１錠ＥＤＴＡ不含プロテアーゼインヒビターカクテル、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）で４５分間抽出し、４℃、１２，０００×ｇで１０分間、遠心分離した。透明化された上清を、氷上の新しいマイクロ遠心管に移して、総タンパク質をＢＣＡ（ビシンコニン酸）タンパク質アッセイ試薬により推定した。細胞表面のビオチン化タンパク質を濃縮するために、総タンパク質量２５〜７５μｇ新しい管に入れて、溶解緩衝液を用いて容量を５００μｌにし、ストレプトアビジンがコンジュゲートされたアガロースビーズ５０μｌと混合した。管を４℃で一晩回転させながら混合した。２，５００×ｇで３分間遠心分離することによりアガロースビーズを回収して、逐次、新しい氷冷溶解緩衝液１ｍｌで２回、５００ｍＭ氷冷ＮａＣｌ  １ｍｌで１回、そして５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８  １ｍｌで１回、懸濁させることにより洗浄した。ストレプトアビジン・アガロース結合の細胞表面ビオチン化タンパク質を別の管の総タンパク質６〜１５μｇと共に、４Ｍ尿素及び５％ｂ−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液４０μｌに懸濁させ、４〜２０％  Ｎｏｖｅｘ  Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、０，２μＭニトロセルロース膜上に１時間、移動させた。ニトロセルロース膜を、ＴＢＳ−Ｔ（０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する，
２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５）中の５％脱脂粉乳中、室温で穏やかに撹拌しながら３０分間インキュベートし、ＴＢＳ−Ｔ中、室温で５分間の洗浄を１回施し、以下の一次抗体中、４℃で穏やかに撹拌しながら一晩インキュベートした：（１）ウサギ−パンカドヘリンＩｇＧ（ＴＢＳ−Ｔ中の５％ウシ血清アルブミンＢＳＡ中に１：１０００）；（２）
ＦＩＴＣマウス抗ヒトＣＤ１４  ＩｇＧ（ＴＢＳ−Ｔ中の５％脱脂粉乳中に１：５００）；（３）ヒト抗ヒトＴＮＦ−α，ｈＭＡＫ１９９  ＡＭ４，ＩｇＧ（ＴＢＳ−Ｔ中の５％脱脂粉乳中に１：１０００）；及び（４）ウサギ抗−ＧＡＰＤＨ  ＩｇＧ（ＴＢＳ−Ｔ中の５％脱脂粉乳中に１：５０００）。
【０１０８】
翌日、膜を室温で激しく撹拌しながらＴＢＳ−Ｔでそれぞれ１５分間ずつ２回洗浄した。膜を、室温で穏やかに撹拌しながら、ＴＢＳ−Ｔ中の５％脱脂粉乳中の適切な、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）がコンジュゲートされた二次ＩｇＧ中で４５分間インキュベートし、室温で激しく撹拌しながらＴＢＳ−Ｔでそれぞれ１５分間ずつ２回洗浄した。膜をＥＣＬ又はＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅのいずれかのウェスタンブロッティングシステム中でインキュベートして、Ｘ線フィルムに様々な時間、暴露した。
【０１０９】
細胞表面ビオチン化で用いられた試薬
ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＳＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ；Ｃａｔａｌｏｇ＃２１３３１）
ストレプトアビジン・アガロース樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ；Ｃａｔａｌｏｇ＃２０３４７）
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ；Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｔ−９２８４）
ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ；Ｃａｔａｌｏｇ＃２８３１０）
ＥＤＴＡ不含プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＵＳＡ；Ｃａｔａｌｏｇ＃１１８３６１７０００１）
デオキシコール酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ；Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｄ６７５０）
ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ；Ｃａｔａｌｏｇ＃２３２２５）
ストレプトアビジン・アガロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ；Ｃａｔａｌｏｇ＃２０３４７）
ＰＭＳＦ、フッ化フェニルメタンスルホニル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ；Ｃａｔａｌｏｇ＃７８８３０）
Ｎｏｖｅｘ  ４−２０％  Ｇｅｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ；Ｃａｔａｌｏｇ＃ＥＣ６０２８ＢＯＸ）
０．２μＭニトロセルロース膜（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ；Ｃａｔａｌｏｇ＃ＬＣ２０００）
Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ；Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｐ９４１６）
ＦＩＴＣマウス抗ヒトＣＤ１４  ＩｇＧ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＵＳＡ；Ｃａｔａｌｏｇ＃５５５３９７）
ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ；Ｃａｔａｌｏｇ＃３７５２５）
ウサギ−パンカドへリンＩｇＧ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ；Ｃａｔａｌｏｇ＃４０６８）
ウサギ抗ＧＡＰＤＨ  ＩｇＧ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ；Ｃａｔａｌｏｇ＃２１１８）
ヒト抗ヒトＴＮＦ  ｈＭＡＫ１９９  ＡＭ４  ＩｇＧ（Ａｂｂｖｉｅ）
ヒツジ由来抗ヒトＩｇＧ  ＨＲＰ結合全抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ；Ｃａｔａｌｏｇ＃ＮＡ９３３Ｖ）
ＥＣＬウェスタンブロッティング分析システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ；Ｃａｔａｌｏｇ＃ＲＰＮ２１０８）
ＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ；Ｃａｔａｌｏｇ＃ＲＰＮ２２３２）
Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ；Ｃａｔａｌｏｇ＃２８９０６８３６）
【０１１０】
一価分子の構築
２つの異なる親モノクローナル抗体からの２つの異なる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を、組換えＤＮＡ技術により直接タンデムに、又は短いリンカーを介して連結させ、その後、軽鎖定常ドメインを、そして場合によりＦｃ領域を連結させるように、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ）分子を設計する。同様に重鎖は、タンデムに連結された２つの異なる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、その後、定常ドメインＣＨ１及びＦｃ領域を含む。一例において、スワッピングされたＣＨ１にＣＬ定常領域を組み込むように、又はＶＨ＋ＣＨにＶＬ＋ＣＬを組み込むように、ポリＩｇ分子を設計する。
【０１１１】
可変ドメインは、本明細書に記載された方法の任意の１つにより作製された親抗体から、組換えＤＮＡ技術を利用して得られる。特定の実施形態において、該可変ドメインは、ＣＤＲ移植又はヒト化された可変重鎖又は軽鎖ドメインである。特定の実施形態において、該可変ドメインは、ヒト重鎖又は軽鎖可変ドメインである。
【０１１２】
特定の実施形態において、第一及び第二の可変ドメインは、組換えＤＮＡ技術を利用して互いに直接連結される。特定の実施形態において、該可変ドメインは、リンカー配列を介して連結される。特定の実施形態において、２つの可変ドメインが、互いに連結される。該可変ドメインは、同じ抗原に結合してもよく、又は異なる抗原に結合してもよい。本発明のポリ−Ｉｇ分子は、１つの免疫グロブリン可変ドメイン及び１つの非免疫グロブリン可変ドメイン、例えばリセプターのリガンド結合ドメイン、酵素の活性ドメインを含んでいてもよい。ポリ−Ｉｇ分子は、２つ以上の非Ｉｇドメインを含んでいてもよい。
【０１１３】
リンカー配列は、単一のアミノ酸又はポリペプチド配列であってもよい。特定の実施形態において、該リンカー配列は、ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）；ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）；ＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）；ＳＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）；ＳＡＫＴＴＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）；ＲＡＤＡＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）；ＲＡＤＡＡＰＴＶＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）；ＲＡＤＡＡＡＡＧＧＰＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）；ＲＡＤＡＡＡＡ（Ｇ４Ｓ）４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）；ＳＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）；ＡＤＡＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）；ＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）；ＴＶＡＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）；ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）；ＱＰＫＡＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）；ＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）；ＡＫＴＴＰＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）；ＡＫＴＴＰＰＳＶＴＰＬＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）；ＡＫＴＴＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）；ＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）；ＡＳＴＫＧＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）；ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：），ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）；ＧＥＮＫＶＥＹＡＰＡＬＭＡＬＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）；ＧＰＡＫＥＬＴＰＬＫＥＡＫＶＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）；ＧＨＥＡＡＡＶＭＱＶＱＹＰＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：），ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）；及びＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）からなる群から選択される。加えて内部ドメインをスワッピングするポリ−Ｉｇは、重鎖に関する重鎖及び軽鎖のトランジションと、軽鎖に関する軽鎖から重鎖へのトランジションとを組み合わせるハイブリダイズされた長い又は短いリンカーを利用し、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＩＦＰＰ（ＳＥＱ  ＩＮ  ＮＯ．Ｘ）；ＡＳＴＶＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．Ｘ）；ＴＶＡＡＰＳＶＦＰＬＡＰ（ＳＥＤ  ＩＤ  ＮＯ．Ｘ）；及びＴＶＡＳＴＰ  ９ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．Ｘ）からなる。
【０１１４】
リンカー配列の選択は、複数のＦａｂ分子の結晶構造解析に基づく。Ｆａｂ又は抗体分子構造内の可変ドメインとＣＨ１／ＣＬ定常ドメインの間には天然の柔軟な連結が存在する。この天然の連結は、ＶドメインのＣ−末端から４〜６の残基と、ＣＬ／ＣＨ１ドメインのＮ−末端から４〜６残基と、により寄与されたおよそ１０〜１２のアミノ酸残基を含む。本発明のＤＶＤ  Ｉｇは、それぞれＤＶＤ−Ｉｇの軽鎖及び重鎖におけるリンカーとして、ＣＬ又はＣＨ１のＮ−末端の５〜６のアミノ酸残基又は１１〜１２のアミノ酸残基を用いて作製された。ＣＬ又はＣＨ１ドメインのＮ−末端残基、特に最初の５〜６のアミノ酸残基は、強固な二次構造を含まないループコンホメーションを採用し、それゆえ２つの可変ドメインの間で柔軟なリンカーとして働くことが可能である。ＣＬ又はＣＨ１ドメインのＮ−末端残基は、Ｉｇ配列の一部であるため可変ドメインの自然な延長部分であり、それゆえリンカー及びジャンクションから潜在的に生じる任意の免疫原性を大幅に最小化する。
【０１１５】
他のリンカー配列は、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの全ての残基ではなくＣＬ／ＣＨ１ドメインの任意の長さの任意の配列、例えばＣＬ／ＣＨ１ドメインの最初の５〜１２のアミノ酸残基を含むことができ、軽鎖リンカーは、Ｃκ又はＣλであってもよく、重鎖リンカーは、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、Ｃε、及びＣμをはじめとする任意のアイソタイプのＣＨ１から得ることができる。リンカー配列は、Ｉｇ様タンパク質（例えば、ＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）；Ｇ／Ｓに基づく配列（例えば、Ｇ４ＳはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９を繰り返している）；ヒンジ領域由来の配列；及び他のタンパク質の他の天然配列など、他のタンパク質から得られてもよい。
【０１１６】
特定の実施形態において、定常ドメインは、組換えＤＮＡ技術を利用して２つの連結された可変ドメインに連結する。一実施形態において、連結された重鎖可変ドメインを含む配列が、重鎖定常ドメインに連結し、連結された軽鎖可変ドメインを含む配列が、軽鎖定常ドメインに連結する。一実施形態において、該定常ドメインは、それぞれヒト重鎖定常ドメイン及びヒト軽鎖定常ドメインである。一実施形態において、ＤＶＤ重鎖は、さらにＦｃ領域に連結する。Ｆｃ領域は、ネイティブ配列のＦｃ領域又はバリアントのＦｃ領域であってもよい。別の実施形態において、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域である。別の実施形態において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、又はＩｇＤのＦｃ領域を含む。
【０１１７】
２９３細胞内でのトランスフェクション及び発現
参照分子の発現は、ＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞を対応する軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）の核酸を含むプラスミドで一過性にコトランスフェクトすることにより遂行した。ＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞は、ＣＯ２インキュベータ（８％ＣＯ２、１２５ＲＰＭ、３７℃）中で振とうさせたフラスコ（２Ｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃａｔ＃４３１１９８）内の０．５Ｌ量のＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  Ｃａｌｉｆ．）で増殖させた。培養物が１×１０６細胞／ｍｌに達したら、細胞をトランスフェクション複合体でトランスフェクトさせた。トランスフェクション複合体は、最初、ＬＣ−プラスミド１５０μｇ及びＨＣ−プラスミド１００μｇをＦｒｅｅｓｔｙｌｅ培地２５ｍｌ中で互いに混合し、続いてＰＥＩ原液［原液：１ｍｇ／ｍｌ（ｐＨ７．０）直鎖状２５ｋＤａ  ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃａｔ＃２３９６６］５００μｌを添加することにより調製した。トランスフェクション複合体を転倒混和して、室温で２０分間インキュベートした後、細胞培養物に添加した。トランスフェクションに続いて、培養物をＣＯ２インキュベータ（８％ＣＯ２、１２５ＲＰＭ、３７℃）で引き続き発育させた。トランスフェクションの２４時間後に、培養物に１０％Ｔｒｙｐｔｏｎ  Ｎ１溶液（Ｏｒｇａｎｏ  Ｔｅｃｈｎｉｅ，Ｌａ  Ｃｏｕｒｎｅｕｖｅ  Ｆｒａｎｃｅ  Ｃａｔ＃１９５５３）２５ｍｌを補充した。トランスフェクションの９日後に、細胞を遠心分離（１６，０００ｇ、１０分間）により培養物から取り出し、残された上清を滅菌ろ過し（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＨＶ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ  Ｓｔｅｒｉｃｕｐ，０．４５  ｕｍ）、精製ステップの開始まで４℃に静置した。
【０１１８】
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含有するディスポーザブル２ｍｌ充填カラム（Ｏｒｏｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより充填）を用いて、各分子を個別に精製した。カラムをＰＢＳで予め平衡にし、その後、回収された試料０．５５Ｌを１ｍｌ／分で一晩（１５時間）かけてロードし、フロースルーは供給容器内に戻して再循環させた。ロードステップの後、カラムを２０ｍｌＰＢＳで洗浄し、溶離緩衝液［５０ｍＭクエン酸、ｐＨ３．５］を４ｍｌ／分で供給して、１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．２（およそ６．０の最終ｐＨになる）０．２ｍｌを既に含有する管に画分（１ｍｌ）を回収することにより、タンパク質を溶出した。抗体を含む画分をクロマトグラムに基づいてプールし、最終的な貯蔵緩衝液［１０ｍＭクエン酸、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ６．０］に透析した。透析後に、試料を０．２２μｍ  Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過し、タンパク質濃度を吸光度［Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ８４５３ダイオードアレイ分光光度計］により決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を分析試料（還元及び非還元の両方）で実施して、最終的な純度を評定し、適切なサイズの重鎖及び軽鎖バンドの存在を検証し、顕著な量のフリー（例えば、複合していない）軽鎖（非還元試料中）及び不対合のポリ−Ｉｇが存在しないことを確認した。
【０１１９】
サイズ排除クロマトグラフィー
分子を水で２．５μｇ／ｍＬに希釈し、２０ｍＬを、ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｃａｔ＃ｋ５５３９−０５ｋ）を用いたＳｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣシステムで分析する。試料を２１１ｍＭ硫酸ナトリウム、９２ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０で流速０．３ｍＬ／分でカラムから溶出させる。ＨＰＬＣシステムの運転条件は、以下の通りである：
移動相：２１１ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４、９２ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．０
勾配：イソクラティック
流速：０．３ｍＬ／分
検出波長：２８０ｎｍ
オートサンプラークーラーの温度：４℃
カラムオーブンの温度：周囲温度
実行時間：５０分間
【０１２０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
還元及び変性の両条件下で、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、分子を分析する。還元条件では、試料を、１００ｍＭ  ＤＴＴを含む２×トリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｃａｔ＃ＬＣ２６７６，ｌｏｔ＃１３２３２０８）と１：１で混合して、ＢＭＥ（β−メルカプトエタノール）の存在下、９０℃で１０分間加熱する。変性条件では、試料を、試料緩衝液と１：１で混合して、９０℃で１０分間加熱する。還元及び変性された試料（１０ｇ／レーン）を、１２％プレキャストトリスグリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｃａｔ＃ＥＣ６００５ｂｏｘ，ｌｏｔ＃６１１１０２１）にロードする。ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ  ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｃａｔ＃ＬＣ５９２５，ｌｏｔ＃１３５１５４２）を、分子量マーカーとして使用する。ゲルをＸＣｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ  ｍｉｎｉ  ｃｅｌｌ  ｇｅｌ  ｂｏｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｃａｔ＃ＥＩ０００１）で泳動し、最初は７５ボルトの電圧を加えてゲル中の試料を濃縮し、次にダイフロントがゲルの底部に達するまで一定電圧１２５ボルトを加えることにより、タンパク質を分離する。用いられた泳動緩衝液は、１０×トリスグリシンＳＤＳ緩衝液（ＡＢＣ，ＭＰＳ−７９−０８０１０６）から調製された１×トリスグリシンＳＤＳ緩衝液である。ゲルをコロイダルブルー染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃４６−７０１５，４６−７０１６）で一晩染色し、バックグランドが透明になるまでＭｉｌｌｉ−Ｑ水で脱色する。その後、染色されたゲルを、Ｅｐｓｏｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎスキャナー（ｍｏｄｅｌ  １６８０，Ｓ／Ｎ  ＤＡＳＸ００３６４１）を用いてスキャンする。
【０１２１】
ＢＩＡＣＯＲＥ技術を利用した親和性測定
ＢＩＡＣＯＲＥアッセイ（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）により、抗体又はポリ−Ｉｇの親和性を決定し、オンレート及びオフレート定数の反応速度の測定を行う。抗体又はポリ−Ｉｇの、標的抗原（例えば、精製された組換え標的抗原）への結合は、２５℃の泳動用ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び０．００５％界面活性剤Ｐ２０）を用い、ＢｉａｃｏｒｅＲ  １０００又は３０００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）での表面プラズモン共鳴に基づく測定により決定する。化学薬品は全て、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、さもなければ本文書に記載された異なる供給源から得られる。例えば、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で希釈されたヤギ抗マウスＩｇＧ，（Ｆｃγ），フラグメント特異性ポリクローナル抗体（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ）およそ５０００ＲＵを、標準のアミンカップリングキットを用い、製造業者の使用説明書及び手順に従って、ＣＭ５研究用バイオセンサーチップに２５μｇ／ｍｌで直接固定する。バイオセンサー表面の未反応の部分を、エタノールアミンでブロックする。フローセル２及び４内の修飾されたカルボキシメチルデキストラン表面を、反応表面として用いる。フローセル１及び３内のヤギ抗マウスＩｇＧを含まない非修飾カルボキシメチルデキストランを、参照表面として用いる。反応速度の分析では、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ４．０．１ソフトウエアの使用により、１：１ラングミュア結合モデルから得られた速度式を、８つの注入全ての結合及び解離相に同時にフィッティングする（グローバルフィット解析を利用）。精製された抗体又はポリ−Ｉｇを、ヤギ抗マウスＩｇＧ特異性反応表面での捕捉のためにＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水で希釈する。リガンド（２５μｇ／ｍｌ）として捕捉される抗体又はポリ−Ｉｇを、５μｌ／分の流速で反応マトリックスに注入する。結合及び解離速度定数ｋｏｎ（Ｍ−１Ｓ−１）及びｋｏｆｆ（Ｓ−１）を、２５μｇ／ｍｌの連続流速で決定する。速度定数は、１０〜２００ｎＭの範囲内の異なる抗原濃度で反応速度論的結合測定を行うことにより得られる。その後、抗体又はポリ−Ｉｇと標的抗原との反応の平衡解離定数（Ｍ）を、以下の式による反応速度定数から計算する：ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ。結合は、時間の関数として記録され、反応速度定数は、計算される。このアッセイにおいて、１０６Ｍ−１Ｓ−１もの速いオンレートと、１０−６Ｓ−１という遅いオフレートが、測定され得る。
【０１２２】
結果
末梢血単核細胞を、０．０２５ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳで指示された期間、刺激した。表面に存在するＴＮＦαを、抗ＴＮＦα抗体（ＡＢ４３６及びＡＢ４３７）で染色した。ＴＮＦα陽性細胞の出現率を、インキュベーション時間に対してプロットした。単球を，ＣＤ１４発現に基づいてゲーティングした。これらの結果を、図１に示す。
【０１２３】
末梢血単核細胞を、０．２５ｎｇ／ｍｌ又は２５０ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳで指示された期間、刺激した。表面に存在するＴＮＦαを、抗ＴＮＦαＡ抗体（ＡＢ４３６、ＡＢ４３７、ＡＢ４４１及びＡＢ４４４）で染色した。ＴＮＦα陽性細胞の出現率を、インキュベーション時間に対してプロットした。単球を，ＣＤ１４発現に基づいてゲーティングし、Ｔ細胞を、ＣＤ３に基づいてゲーティングした。これらの結果を、図２に示す。
【０１２４】
末梢血単核細胞を、Ａｌｅｘａ４８８がコンジュゲートされた抗ＴＮＦα（ＡＢ４３６）抗体（緑色）の存在下、０．２５ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳで指示された期間、刺激した。該細胞を透過処理して、核をＤＡＰＩ（青色）で染色した。これらの結果を、図３に示す。
【０１２５】
図４に、ＬＰＳ処置されたヒト単球内でのＴＮＦα発現を示す。Ａ．細胞表面結合ＴＮＦα：ＣＤ１４＋ヒト単球を、未処置にするか、又は１００ｎｇ／ｍＬ  ＬＰＳで指示された期間、処置した。細胞表面タンパク質を、細胞不透過性Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＳＳ−Ｂｉｏｔｉｎを用いて誘導体化し、総タンパク質を界面活性剤含有緩衝液に抽出し、細胞表面のビオチン化タンパク質を、ストレプトアビジン・アガロース上に濃縮した。表面でビオチン化されたタンパク質及び総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分解して、抗ヒトＴＮＦα  ＩｇＧを用いたイムノブロッティングに供した。ＣＤ１４及びＧＡＰＤＨ発現を、それぞれ細胞表面及び細胞質のタンパク質負荷対照として用いた。ｔｍ＝膜透過、ｓ＝可溶性。Ｂ．可溶性ＴＮＦαのレベル：（Ａ）と同様に処置されたＣＤ１４＋ヒト単球から得たコンディション培地を、可溶性ＴＮＦαについてアッセイした。（Ｃ）表面発現ＴＮＦαを、ＬＰＳでの単球刺激の２４時間後に、（Ａ）と同様に評定した。（Ｄ）（Ｃ）からの上清を、可溶性ＴＮＦαについて分析した。
【０１２６】
図５に、ＧＭ−ＣＳＦ及びＬＰＳで刺激された末梢血単球上での表面ＴＮＦα発現を示す。末梢血単球を、１μｇ／ｍｌ  ＬＰＳ及び１００ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＧＭ−ＣＳＦで２４時間刺激した。表面に存在するＴＮＦαを、抗ＴＮＦα抗体（塗りつぶされたヒストグラム：ＡＢ４３６、ＡＢ４３７、ＡＢ４４１及びＦＡＢ２１０）、又はアイソタイプの合う対照抗体（赤色の線で描かれたヒストグラム）で染色した。
【０１２７】
末梢血単球を、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）及び５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４を補充した培地で４日間培養した。細胞を、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＦＮαの存在下又は非存在下、１μｇ／ｍｌ  ＬＰＳで指示された期間、刺激した。表面に存在するＴＮＦαを、抗ＴＮＦα抗体（塗りつぶされたヒストグラム：ＡＢ４３６）、又はアイソタイプの合う対照抗体（赤色の線で描かれたヒストグラム）で染色した。これらの結果を、図６に示す。
【０１２８】
図７に、ＬＰＳ処置されたヒト単球由来樹状細胞内でのＴＮＦα発現を示す。Ａ．細胞表面結合ＴＮＦαＡ：ヒト樹状細胞を、未処置のまま放置するか、又は１μｇ／ｍＬ  ＬＰＳで指示された期間、処置した。細胞表面タンパク質を、細胞不透過性Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＳＳ−Ｂｉｏｔｉｎを用いて誘導体化し、総タンパク質を界面活性剤含有緩衝液に抽出し、細胞表面のビオチン化タンパク質を、ストレプトアビジン・アガロース上に濃縮した。表面ビオチン化されたタンパク質及び総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分解して、抗ヒトＴＮＦα  ＩｇＧを用いたイムノブロッティングに供した。カドヘリン及びＧＡＰＤＨ発現を、それぞれ細胞表面及び細胞質のタンパク質負荷対照として用いた。ｔｍ＝膜透過、ｓ＝可溶性。Ｂ．可溶性ＴＮＦαのレベル：（Ａ）と同様に処置されたヒト樹状細胞から得たコンディション培地を、可溶性ＴＮＦαについてアッセイした。
【０１２９】
末梢血単球を、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）及び５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４を補充した培地で４日間培養した。（Ａ）細胞を、ｐＨＲｏｄｏ  Ｒｅｄ  ｄｙｅをコンジュゲートされた抗ＴＮＦα（ＡＢ４４１）抗体の存在下で４時間（青色で塗りつぶされたヒストグラム。顕微鏡像では赤い点状の染色）、又は同じ色素をコンジュゲートされたアイソタイプの合う対照抗体の存在下（赤色ドットのヒストグラム）、１μｇ／ｍｌ  ＬＰＳで刺激した。（Ｂ）細胞を（Ａ）と同様に４時間処置し、最後の２０分間はｎｕｃｅ  ｂｌｕｅ染色で処置して、核を染色した（青色）。細胞を洗浄して、表面のＭＨＣクラスＩを染色して（緑色）表面を標識した。内在化された抗ＴＮＦα抗体（赤色：ＡＢ４４１）を、蛍光顕微鏡測定により視覚化した。これらの結果を、図８に示す。
【０１３０】
末梢血単球を、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）及び５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４を補充した培地で４日間培養した。細胞を、刺激せずに放置するか（青色の線で描かれた丸）、又は１μｇ／ｍｌ  ＬＰＳで１時間（左図）若しくは２４時間（右図）刺激した（赤色で塗りつぶした丸）。細胞を回収して、ｐＨＲｏｄｏ  Ｒｅｄ  ｄｙｅをコンジュゲートされた抗ＴＮＦα（ＡＢ４４１）抗体で、表面のＴＮＦαを染色した。Ｔ細胞を培地中で指示された時間、培養し、内在化を、ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを用いた蛍光強度の上昇として測定した。これらの結果を、図９に示す。
【０１３１】
これらのデータをまとめると、二価ＴＮＦ結合タンパク質が単球細胞によって内在化されることが実証される。
【０１３２】
実施例２．模範的一価抗体フォーマット
ハーフボディー
ハーフボティー分子は、Ｃ２２７Ｓ、Ｃ２３０Ｓ、Ｆ４０５Ｒ突然変異（ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎに従う）を有するＦｃ領域を含むモノクローナル抗体（Ａ）又は二重可変ドメイン免疫グロブリン（Ｂ）を表している。これらの突然変異は、重鎖間のジスルフィド結合を阻害することにより、抗体四量体の形成を妨害する。得られた分子は、可変ドメインの抗原に一価結合することが可能なｍＡｂ又はＤＶＤ−Ｉｇの１つの重鎖及び１つの軽鎖の二量体で構成される。ＤＶＤ−Ｉｇのハーフボディーの場合、分子は、２つの別個の可変ドメイン、又は同じターゲットに結合する２つの可変ドメインを含むように設計され得る。ハーフボディーｍＡｂは、抗ＴＮＦの任意のＶＨ及びＶＬ対で構成されてもよい。ハーフボディーＤＶＤ−Ｉｇは、抗ＴＮＦと抗ＩＬ−１７の間のＶＨ／ＶＬ可変ドメイン対の任意の組み合わせで構成されるか（表：「ハーフボディー抗ＴＮＦ分子の例」）、さもなければ長−長、長−短、短−短、及びＧＳ１０というリンカー組み合わせ（リンカーの表を参照）を用いて構成されてもよい。模範的ハーフボディー分子を、図１０に示す。
【０１３３】
Ａｂｂｍａｂ
ＡｂｂｖｉｅのｍＡｂ（Ａｂｂｍａｂ）分子は、ＣＨ３−ｈｏｌｅ突然変異を有するＦｃを含むモノクローナル抗体（Ａ）又は二重可変ドメイン免疫グロブリン（Ｂ）を表している（表３参照）。１つの重鎖上のＣＨ３−ｈｏｌｅに加えて、軽鎖が、ＣＨ２とｋｎｏｂ突然変異を有するＣＨ３とに結合したリンカー配列を含む。この分子は二量体化して、１つの軽鎖に対合した１つの重鎖と、１つのＣＨ２−ＣＨ３鎖を形成する。これにより、一価結合ドメインに連結されたインタクトＦｃの形成が可能になる。Ａｂｂｍａｂは、抗ＴＮＦの任意のＶＨ及びＶＬ対で構成されていてもよい。ＡｂｂｍａｖＤＶＤ−Ｉｇは、例えば抗ＴＮＦと他の可変ドメインの間の、ＶＨ／ＶＬ可変ドメイン対の任意の組み合わせで構成されていてもよい（模範的な抗ＴＮＦ可変ドメイン、リンカーを、それぞれ表２及び１に示す）。模範的なＡｂｂｍａｂ分子を、図１１に示す。
【０１３４】
Ｍ−ボディー
一価免疫グロブリン（ｍ−ボディー）分子は、ＣＨ３  ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ突然変異を有するＦｃを含むモノクローナル抗体（Ａ）又は二重可変ドメイン免疫グロブリン（Ｂ）を表している（表３参照）。しかし一価性は、重鎖のＣＤＲ内の重要な残基の突然変異により実現される。これにより、２つの類似した重鎖の間の軽鎖と、該当する抗原に対して活性でない１つの鎖との共有が可能になる。
【０１３５】
Ｍ−ボディーは、抗ＴＮＦの任意のＶＨ及びＶＬ対で構成されていてもよい。Ｍ−ボディーＤＶＤ−Ｉｇは、ＶＨ／ＶＬ可変ドメインの任意の組み合わせで構成されていてもよい（模範的な抗ＴＮＦ可変ドメイン、リンカーを、それぞれ表２及び１に示す）。加えて、ＤＶＤ−Ｉｇは、同じアーム上の抗原に対して活性であり、反対側のアームのＣＤＲ上の両者についてのノックアウト突然変異を有する、２つの可変ドメインを含んでいてもよい。加えて、Ｍ−ボディーＤＶＤは、抗ＴＮＦである一価ドメイン（ＣＤＲ突然変異と称される）と対合した二価ドメインも含み得る。模範的なｍ−ボディー分子を、図１２に示す。
【０１３６】
ポリ−Ｉｇ分子
多重可変性の一価抗ＴＮＦポリ−Ｉｇ分子は、３つの独立した可変ドメインを組み合わせても、又は２つの二価ドメインと１つの一価ドメインとを組み合わせてもよい（Ａ）。加えて、多重可変性の一価分子は、４つの独立した可変ドメインを組み合わせても、又は１つの二価ドメインと２つの一価ドメインを組み合わせてもよい（Ｂ）。各フォーマットは、ＣＨ３  ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ突然変異を有するＦｃを含む（表３参照）。加えて、二価及び一価ドメインは、重鎖Ｆａｂの間、又はそれらの内部に位置してもよく、各配置は異なる結果をもたらし得る。模範的分子を、図１３に示す。
【０１３７】
均等物
本開示は、本開示の主旨及び本質的特徴を逸脱せずに他の特定の形式で具体化されてもよい。それゆえ前述の実施形態は、全ての事柄において、本開示の限定ではなくむしろ例示と見なされなければならない。つまり本開示の範囲は、前述の記載よりもむしろ添付の特許請求の範囲により示され、特許請求の範囲の意義及び均等性の範囲に含まれる全ての変更が、本明細書に包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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