(57)【要約】本発明は、インフルエンザワクチンの安全性、さらに、特に、アジュバント化ワクチンにおいてナルコレプシーを引き起こすリスクに関連して改善するインフルエンザワクチンおよび方法を提供する。一局面において、インフルエンザウイルスＡ核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物が提供され、ここで配列番号２のアミノ酸１０６〜１２６に等価な上記核タンパク質のフラグメントは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターに結合するが、ただし上記組成物中の全インフルエンザＡ核タンパク質が配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む場合、上記ワクチン組成物は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）株由来のＮＹＭＣ  Ｘ−１８１株に基づかない。
2016521282.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザウイルスＡ核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物であって、ここで配列番号２のアミノ酸１０６〜１２６に等価な前記核タンパク質のフラグメントは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターに結合するが、ただし前記組成物中の全インフルエンザＡ核タンパク質が配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む場合、前記ワクチン組成物は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）株由来のＮＹＭＣ  Ｘ−１８１株に基づかない、組成物。
【請求項２】
インフルエンザＡウイルス核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物であって、ここで前記核タンパク質のいずれも、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと等価かまたはそれより高い親和性でＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターに結合する配列番号２のアミノ酸１０６〜１２６に等価なフラグメントを含まないが、ただし前記組成物中の全インフルエンザＡ核タンパク質が配列番号１２に示される配列を含む場合、前記ワクチン組成物は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）株由来のＮＹＭＣ  Ｘ−１８１株に基づかない、組成物。
【請求項３】
前記組成物中の前記核タンパク質のうちの全てが配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むわけではない、請求項１または２に記載のインフルエンザワクチン組成物。
【請求項４】
前記組成物中の前記核タンパク質のうちの全てが配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むわけではない、請求項３に記載のインフルエンザワクチン組成物。
【請求項５】
インフルエンザウイルスＡ核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物であって、ここで前記核タンパク質は、配列番号２に示される核タンパク質アミノ酸配列のアミノ酸１１６に対応する位置においてイソロイシン残基を有さないが、ただし前記組成物中の全インフルエンザＡ核タンパク質が配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む場合、前記ワクチン組成物は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）株由来のＮＹＭＣ  Ｘ−１８１株に基づかない、組成物。
【請求項６】
インフルエンザウイルスＡ核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物であって、ここで前記核タンパク質は、配列番号２に示される核タンパク質アミノ酸配列のアミノ酸１１６に対応する位置においてイソロイシンを有さないが、ただし前記核タンパク質のうちの全てが配列番号２に示される核タンパク質アミノ酸配列のアミノ酸１１６に対応する位置においてメチオニンを含む場合、前記核タンパク質は、配列番号１２として示される配列を有しない、組成物。
【請求項７】
インフルエンザウイルスＡ核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物であって、ここで前記核タンパク質は、配列番号２に示される核タンパク質アミノ酸配列のアミノ酸１１６に対応する位置においてイソロイシン残基もメチオニン残基も有しない、組成物。
【請求項８】
インフルエンザウイルスＡ核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物であって、ここで前記核タンパク質は、配列番号２、配列番号１２、もしくは配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含まない、組成物。
【請求項９】
インフルエンザウイルスＡ核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物であって、ここで前記核タンパク質は、改変されていない前記核タンパク質と比較して、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターへのその結合を低減するかもしくはその結合をなくすように改変されている、組成物。
【請求項１０】
インフルエンザウイルス核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物であって、ここで（ｉ）前記組成物は、スプリットビリオンワクチンであり、存在する核タンパク質の量は、１０μｇのヘマグルチニンあたり３μｇ未満の核タンパク質であるか、または（ｉｉ）前記組成物は、サブユニットワクチンであり、存在する核タンパク質の量は、１０μｇのヘマグルチニンあたり０．５μｇ未満の核タンパク質である、組成物。
【請求項１１】
アジュバントをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
前記アジュバントは、水中油型エマルジョンである、請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
前記アジュバントは、トコフェロールをさらに含む、請求項１２に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
ＴｒｉｔｏｎもしくはＴｗｅｅｎ、またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
１以上の汎流行性インフルエンザ株に対するワクチンである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
一価ワクチン組成物である、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
スプリットビリオンワクチンである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
アジュバント化スプリットインフルエンザワクチンであって、ここで前記ワクチンは、少なくとも４種の異なるインフルエンザウイルスに由来する抗原および配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する少なくとも１種のインフルエンザＡウイルスに由来する核タンパク質を含み、前記アジュバントは、さらなる免疫刺激剤を含まない水中油型エマルジョンアジュバントであり、それによって、前記組成物は、Ｔｒｉｔｏｎを含むという点で特徴付けられる、ワクチン。
【請求項１９】
小児集団（０〜３６ヶ月）および／もしくは青年集団（４〜１９歳）において、ならびに／またはインフルエンザワクチン接種と関連して自己免疫疾患を発生させる遺伝的素因を有する被験体において使用するための、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のワクチンもしくはワクチン組成物。
【請求項２０】
ワクチン生成の適性に関してインフルエンザＡウイルスを試験する方法であって、前記方法は、前記インフルエンザウイルスの核タンパク質もしくはそのフラグメントが、Ｈ１Ｎ１株Ｘ−１７９Ａ由来の核タンパク質と比較して、同じ条件下でより低い親和性でＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に結合し得るか否かを決定する工程を包含し；ここで前記インフルエンザウイルスは、その核タンパク質がＸ−１７９Ａ株由来の核タンパク質と比較して、同一条件下でより低い親和性でＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に結合し得る場合にワクチン生成に適している、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、米国仮出願第６１／８２２，２２８号（２０１３年５月１０日出願）、同第６１／８５９，１１３号（２０１３年７月２６日出願）および同第６１／８６２，８０７号（２０１３年８月６日出願）ならびに欧州特許出願第１３１８１４２９．５号（２０１３年８月２３日出願）および同第１４１５８９９９．４号（２０１４年３月１１日出願）（これらそれぞれの完全な内容は、全ての目的のために参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、ワクチンレシピエントにおいてナルコレプシーのリスクをさらに低減する、インフルエンザワクチンおよびインフルエンザワクチンを生成するための方法を提供する分野にある。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
２００９年のＨ１Ｎ１ブタインフルエンザワクチン接種キャンペーンの後、ナルコレプシーとＡＳ０３アジュバント化（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）Ｈ１Ｎ１ワクチン（ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭ，ＧＳＫ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）の使用との疫学的関連性が、フィンランドの国立健康福祉研究所によって、小児および４〜１９歳の青年で検出された［１−３］。ナルコレプシーの発生率は、非ワクチン接種個体における０．７／１００，０００と比較すると、ワクチン接種個体において９／１００，０００であった。その比は、ワクチン接種の約２ヶ月後の始まりとして１２．７である［４］。その後、フランス、アイルランド、ノルウェー、スウェーデンおよび英国においても、ＡＳ０３アジュバント化Ｈ１Ｎ１ワクチンで同様の報告があった。フィンランドでの詳細な追跡研究は、２０１１年からの最初の関連をさらに強めた［５］。従って、ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭとナルコレプシーとの間の統計的関連性は、明らかに実証された。興味深いことに、ナルコレプシーの発生の増大は、同じＨ１Ｎ１インフルエンザ株に対して防御するが、異なる水中油型エマルジョンアジュバントを含むＦｏｃｅｔｒｉａＴＭワクチンを受けた患者では認められなかった。
【０００４】
インフルエンザワクチンに応答してナルコレプシーを発生させるリスクは非常に小さいものの、にもかかわらず、ナルコレプシーのリスクをさらに低減することは望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｚａｒａｃｏｓｔａｓ  Ｊ．；  ＢＭＪ．  ２０１１  Ｆｅｂ  ９；３４２：ｄ９０９
【非特許文献２】Ｎｏｈｙｎｅｋら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１２；７（３）：ｅ３３５３６
【非特許文献２】Ｐａｒｔｉｎｅｎら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１２；７（３）：ｅ３３７２３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は従って、患者がインフルエンザワクチンに応じてナルコレプシーを発生させる可能性をさらに低減する方法およびワクチンを提供する。
【０００７】
ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭおよびＦｏｃｅｔｒｉａＴＭが異なる水中油型エマルジョンアジュバントを有するという事実から、上記アジュバントがナルコレプシーの発生に関わっている可能性があるという仮説が拡がった。しかし本発明者らは、代わりに、その原因因子が上記２種のワクチンの中の異なる核タンパク質（ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭの中の核タンパク質は、オレキシンレセプター（図１を参照のこと）を摸倣し得る）であるらしいことを驚くべきことに発見した。ナルコレプシーは、オレキシン（ヒポクレチンとしても公知）を生成するニューロンの喪失と関連づけられた。さらに、ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭ誘発性ナルコレプシーの症例は全て、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２ハプロタイプ（ＭＨＣクラスＩＩレセプターβ鎖タンパク質：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０１９２０．２）を有する患者において見出された。そしてこのような個体は、ナルコレプシーを特に発生させやすい（このハプロタイプは、脱力発作を伴うナルコレプシーと診断された患者のうちの８５％超において、およびそれほど重症型ではないナルコレプシーを有する患者のうちの５０％において認められている）。理論によって拘束されることは望まないが、本発明者らは従って、観察されたナルコレプシーの増大は、ヒポクレチンシグナルの伝達の妨害を生じる自己免疫反応の引き金となり得る、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターがインフルエンザウイルスのＮＰタンパク質もしくはそのフラグメントに結合することによって、ならびに／またはオレキシンレセプターを発現する細胞の喪失（従って、ナルコレプシーをもたらす）によって引き起こされ得ることを提唱する。この裏付けとして、本明細書で提供されるデータは、ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭワクチンで見出される核タンパク質改変体に由来するある種のペプチドが、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターへの安定な結合を示すのに対して、別の核タンパク質に由来する対応するペプチドは示さないということを示す。このことは、ナルコレプシーと関連しなかった別のＨＬＡサブタイプへのこれら同じペプチドのより安定性が低い結合とは対照をなす。
【０００８】
本発明は従って、ワクチンがナルコレプシーの発生に関与する可能性がある核タンパク質を含むという可能性をさらに低減する方法およびワクチンを提供する。
【０００９】
１つのアプローチは、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターへの結合が低下したかもしくはないインフルエンザＡ核タンパク質を選択することである。このようにして得られたワクチン組成物は、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターへの顕著な結合を示す核タンパク質を欠いており、それによって、感受性のある個体におけるナルコレプシーの発生の引き金となるリスクを低下させる。
【００１０】
よって、第１の局面において、本発明は、インフルエンザＡウイルス核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物を提供し、ここで配列番号２のアミノ酸１０６〜１１８に等価な上記核タンパク質のフラグメントは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターに結合する。好ましくは、上記組成物中の全インフルエンザＡ核タンパク質が配列番号１２に示される配列を含むかもしくはこれに由来する場合、上記ワクチン組成物は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）株由来のＮＹＭＣ  Ｘ−１８１株に基づかない。特定の実施形態において、上記核タンパク質のフラグメントは、配列番号２のアミノ酸１０６〜１２６に等価である。
【００１１】
上記組成物中の（インフルエンザＡ）核タンパク質の全てが、配列番号１２に示される配列を含むかまたはこれに由来する公知のワクチン組成物の例は、ＦｏｃｅｔｒｉａＴＭであり、従って、これは具体的に除かれる。
【００１２】
関連する局面において、本発明は、１種以上のインフルエンザＡウイルス核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物を提供し、ここで上記核タンパク質はいずれも、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと等価かまたはそれよりも高い親和性でＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターに結合する配列番号２のアミノ酸１０６〜１２６に等価なフラグメントを含まない。好ましくは、上記組成物中の全インフルエンザＡ核タンパク質が、配列番号１２に示される配列を含むかもしくはこれに由来する場合、上記ワクチン組成物は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）株由来のＮＹＭＣ  Ｘ−１８１株に基づかない。具体的実施形態において、上記核タンパク質はいずれも、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドが、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターに関して有する結合親和性の半分、１／３もしくは１／４より高い親和性で、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターに結合する配列番号２のアミノ酸１０６〜１２６に等価なフラグメントを含まない。
【００１３】
さらに関連する局面において、本発明はまた、インフルエンザウイルスＡ核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物を提供し、ここで配列番号２のアミノ酸１０６〜１２６に等価な上記核タンパク質のフラグメントは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターに結合する。好ましくは、上記組成物中の核タンパク質が、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むかもしくはこれに由来する場合、上記ワクチン組成物は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）株由来のＮＹＭＣ  Ｘ−１８１株に基づかない。特定の実施形態において、上記組成物中のインフルエンザＡ核タンパク質のうちの全てが、配列番号１２に示される配列を含むかもしくはこれに由来するわけではない。
【００１４】
関連する実施形態において、上記組成物中のインフルエンザＡ核タンパク質のうちの全てが、配列番号３に示される配列を含むわけではない。
【００１５】
上記の種々の局面および実施形態において言及される用語「〜に由来する、〜由来の（ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ）」とは、より短いフラグメントが、例えば、タンパク質分解の結果として存在し得ることを意味する。
【００１６】
本発明者らは、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２へのインフルエンザウイルスＡ核タンパク質の結合に関与するおそらく重要な配列が、配列番号２に示される核タンパク質配列のアミノ酸１１６に対応する位置におけるイソロイシン残基であることを同定した。従って、この位置においてイソロイシンを欠いているワクチン生成の間にインフルエンザＡ核タンパク質を使用することは望ましい。
【００１７】
よって、本発明はまた、インフルエンザＡウイルス核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物を提供し、ここで上記核タンパク質は、配列番号２に示される核タンパク質配列のアミノ酸１１６に対応する位置においてイソロイシン残基を有しないが、ただし、上記組成物中の全核タンパク質が配列番号１２に示される配列を含む場合、上記ワクチン組成物は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）株由来のＮＹＭＣ  Ｘ−１８１株に基づかない。
【００１８】
関連する実施形態において、本発明は、インフルエンザウイルスＡ核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物に関し、ここで上記核タンパク質は、配列番号２に示される核タンパク質配列のアミノ酸１１６に対応する位置においてイソロイシン残基もメチオニン残基も有しない。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、インフルエンザウイルスＡ核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物を提供し、ここで上記核タンパク質は、配列番号２もしくは配列番号１２に示される配列を含まない。好ましくは、上記核タンパク質はまた、配列番号１３に示される配列を含まない。関連する実施形態において、上記核タンパク質は、配列番号３に示される配列を含まない。別の関連する実施形態において、上記核タンパク質は、配列番号１０として示される配列を含まない。
【００２０】
上記の実施形態のうちの全てにおいて、インフルエンザウイルスＡ核タンパク質への言及が、上記核タンパク質が単一のもしくは複数の供給源に由来するかに拘わらず、上記組成物中のインフルエンザウイルスＡ核タンパク質の実質的に全てもしくは全てを意味することは、注意されるべきである。「実質的に全て」は、代表的には、上記組成物が基づくインフルエンザＡ株由来の核タンパク質が、本明細書で示される要件を満たすべきであるが、他の供給源に由来する核タンパク質が少量存在してもよいことを意味する。従って、「実質的に全て」は、代表的には、上記組成物に存在するインフルエンザウイルスＡ核タンパク質のうちの少なくとも９９％を意味する。
【００２１】
従って、例えば、本発明の第１の局面を表現する別の方法は、以下である：
（ｉ）インフルエンザウイルスＡ核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物であって、ここで上記組成物に存在する全インフルエンザウイルスＡ核タンパク質に関して、配列番号２のアミノ酸１０６〜１２６に等価な上記核タンパク質のフラグメントは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターに結合する組成物。好ましくは、上記組成物中の全インフルエンザウイルスＡ核タンパク質が、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むかもしくはこれに由来する場合、上記ワクチン組成物は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）株由来のＮＹＭＣ  Ｘ−１８１株に基づかない、
（ｉｉ）単一もしくは複数の供給源に由来するインフルエンザウイルスＡ核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物であって、ここで配列番号２のアミノ酸１０６〜１２６に等価な全ての上記核タンパク質のフラグメントは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターに結合する組成物。好ましくは、上記組成物中の全インフルエンザウイルスＡ核タンパク質が、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むかもしくはこれらに由来する場合、上記ワクチン組成物は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）株由来のＮＹＭＣ  Ｘ−１８１株に基づかない、
（ｉｉｉ）単一もしくは複数の供給源に由来するインフルエンザウイルスＡ核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物であって、ここで上記核タンパク質は、配列番号２のアミノ酸１０６〜１２６に等価な上記核タンパク質のフラグメントを含み、上記組成物に存在する全インフルエンザウイルスＡ核タンパク質の上記フラグメントは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターに結合する組成物。好ましくは、上記組成物中の全核タンパク質は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む場合、上記ワクチン組成物は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）株由来のＮＹＭＣ  Ｘ−１８１株に基づかない。
【００２２】
本明細書で示される知見に基づいて、当業者は、既存のもしくは新たに同定された核タンパク質配列のいずれかを採用し得、得られる核タンパク質が、その未改変核タンパク質と比較して、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターへの結合を低下させているかもしくは結合しないように改変を行い得る。
【００２３】
よって、本発明はまた、インフルエンザウイルスＡ核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物を提供し、ここで上記核タンパク質は、未改変核タンパク質と比較して、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターへのその結合を低減するかもしくはその結合をなくすように改変されている。
【００２４】
好ましい実施形態において、上記核タンパク質は、配列番号２のアミノ酸１１６に対応する位置においてイソロイシン残基を変化させるかもしくは欠失するように改変されている。代替の実施形態において、上記核タンパク質は、（ａ）配列番号２のアミノ酸１０８に対応する位置において脂肪族アミノ酸がない；および／もしくは（ｂ）配列番号２のアミノ酸１１０に対応する位置において脂肪族アミノ酸がない；および／もしくは（ｃ）配列番号２のアミノ酸１１１に対応する位置において疎水性アミノ酸がないように、１以上のアミノ酸を変化もしくは欠失させるように改変されている。これら２つの実施形態はまた、組み合わせられ得る。従って、代表的には、得られる核タンパク質は、野生型核タンパク質配列とは異なるアミノ酸配列を有する。
【００２５】
ナルコレプシーのリスクを回避もしくは低減する別のアプローチは、最終ワクチン組成物に存在する核タンパク質の量を減らすことである。スプリットビリオンおよび全ワクチンは、特に、残留する核タンパク質のかなりの量を含み得る。
【００２６】
よって、第２の局面において、本発明は、インフルエンザウイルスＡ核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物を提供し、ここで（ｉ）上記組成物は、スプリットビリオンワクチンであり、存在するインフルエンザウイルスＡ核タンパク質の量は、１０μｇのヘマグルチニンあたり３μｇ未満の核タンパク質であるか、または（ｉｉ）上記組成物は、サブユニットワクチンであり、存在する核タンパク質の量は、１０μｇのヘマグルチニンあたり０．５μｇ未満の核タンパク質である。核タンパク質の所望のレベルに関するさらなるガイダンスは、下記にさらに与えられる。
【００２７】
本発明の第１のおよび第２の局面は、組み合わせられ得る。従って、インフルエンザＡ核タンパク質の混合物が存在する（多価ワクチン）特定の実施形態では、単に上記核タンパク質の量を、本発明の第１の局面に関して回避されるべきであるその核タンパク質に関して本明細書で特定されるレベル未満まで低減することが必要であり得る。他の核タンパク質（例えば、Ｘ−１８１株のもの）は、例えば、ワクチンの任意の特定のタイプに関して通常のレベルで含まれ得る。従って、この実施形態では、特定の核タンパク質の配列／結合特徴に依存して、ある株の抗原の製造の間には単により厳密な精製手段が適用される必要があり、他の株ではそうではない。従って、本発明は、ある一価のバルクに適用され得、これは、次いで、いずれの特別な手段にも供される必要がない他の一価バルクと合わせられて、異なる核タンパク質を有する多価ワクチンを与え得る。
【００２８】
本発明の第１および第２の局面の特定の実施形態において、上記ワクチン組成物は、アジュバント（例えば、水中油型エマルジョン）をさらに含む。ナルコレプシーの発生率の増大は、ＧＳＫのアジュバント化ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭワクチンにおいて認められたので、この効果は、アジュバントの存在によって増大され得、従って、本発明の教示を、アジュバント化ワクチン（季節性もしくは汎流行性の両方）に適用することは、特に重要であり得る。上記アジュバント（例えば、水中油型エマルジョン）は、ＧＳＫのアジュバント化ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭワクチンで使用されるＡＳ０３アジュバントの場合のように、トコフェロールをさらに含み得る。特定の実施形態において、上記水中油型エマルジョンＭＦ５９は、アジュバントとして除かれる。
【００２９】
プロセス変更はまた、ある種の核タンパク質の潜在的に有害な効果に対して効果を有し得る。例えば、使用される洗剤のタイプは、影響を有し得る。よって、本発明の第１のおよび第２の局面の一実施形態において、上記ワクチン組成物は、Ｔｒｉｔｏｎ（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００もしくはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）もしくはＴｗｅｅｎ（例えば、Ｔｗｅｅｎ−８０もしくはポリソルベート８０）、またはこれらの組み合わせをさらに含む。このようなワクチン組成物は、前段落で記載されるように、アジュバント化されてもよいし、アジュバント化されなくてもよい。
【００３０】
本発明の第１のおよび第２の局面のワクチン組成物は、１以上の汎流行性インフルエンザ株に対する、および／もしくは１以上の季節性インフルエンザ株に対するワクチンであり得る。一実施形態において、上記ワクチン組成物は、一価組成物であり、例えば、１つの汎流行性インフルエンザ株のみを含む。関連する実施形態において、上記ワクチン組成物は、インフルエンザＡ株のみを含む。
【００３１】
本発明の第１のおよび第２の局面の一実施形態において、上記ワクチンは、四価ワクチンである。
【００３２】
本発明の第１のおよび第２の局面のワクチン組成物は、例えば、全ウイルスワクチン、スプリットビリオンワクチンもしくはサブユニットワクチンであり得る。一実施形態において、上記ワクチン組成物は、スプリットビリオンワクチンである。
【００３３】
本発明のワクチン組成物が汎流行性ウイルスに対する場合の別の実施形態において、上記ワクチン組成物は、リアソータントウイルであるＮＹＭＣ  Ｘ−１５７、Ｘ１６３、Ｘ−１６３Ａ、Ｘ−１６３Ｂ、Ｘ−１７３、Ｘ−１７３Ａ、Ｘ−１７３Ｂ、Ｘ−１７３Ｃ、Ｘ−１７７、Ｘ−１７７Ａ、Ｘ−１７７Ｂ、Ｘ−１７９、Ｘ−１７９Ａ、Ｘ−１８１もしくはＸ−１８１Ｂから得られない。
【００３４】
本発明のワクチン組成物が季節性ウイルスに対する場合の別の実施形態において、上記ワクチン組成物は、リアソータントウイルスであるＮＹＭＣ  Ｘ−１５７、Ｘ１６３、Ｘ−１６３Ａ、Ｘ−１６３Ｂ、Ｘ−１７３、Ｘ−１７３Ａ、Ｘ−１７３Ｂ、Ｘ−１７３Ｃ、Ｘ−１７７、Ｘ−１７７Ａ、Ｘ−１７７Ｂ、Ｘ−１７９、Ｘ−１７９Ａ、Ｘ−１８１もしくはＸ−１８１Ｂから得られない。
【００３５】
一実施形態において、上記ワクチンは、Ｈ１株、Ｈ２株、Ｈ３株、Ｈ４株、Ｈ５株、Ｈ６株、Ｈ７株、Ｈ８株もしくはＨ９株（例えば、汎流行性Ｈ１株、Ｈ３株、Ｈ５株、Ｈ６株、Ｈ７株もしくはＨ９株）に対するものである。具体例は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ３、Ｈ７Ｎ９、Ｈ９Ｎ２、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ３およびＨ７Ｎ１である。
【００３６】
さらなる具体的実施形態は、以下で開示される：
ナルコレプシーとＭＦ５９アジュバント化インフルエンザワクチンでの免疫化との間に、有意な関連性は何ら検出されなかった。従って、上記ＮＰタンパク質は、水中油型アジュバントとさらなる免疫刺激剤とが使用される場合に、特にリスクがあり得る。このようなさらなる免疫刺激剤は、例えば、トコフェロール／トコフェロール誘導体（ＡＳ０３）、もしくはＴＬＲアゴニスト（例えば、合成ＴＬＲ４アゴニストグルコピラノシルリピドＡ（ＧＬＡ；ＷＯ２００９／１４３４５７を参照のこと）のような）であり得る。従って、上記水中油型アジュバントでアジュバント化したインフルエンザワクチンは、好ましくは、インフルエンザＡ  ＮＰタンパク質を含まない必要がある。従って、本発明の一実施形態は、以下である：
（ａ）インフルエンザＡ  ＮＰタンパク質を含まないか、または上記ワクチン中の総インフルエンザウイルスタンパク質の質量で１５％、１２％、１０％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満のインフルエンザＡ  ＮＰタンパク質を含む、不活化アジュバント化インフルエンザワクチン。好ましい実施形態において、上記アジュバントは、トコフェロール、トコフェロール誘導体、ＭＰＬ、ＧＬＡもしくば別のＴＬＲアゴニストのようなさらなる免疫刺激剤を含む水中油型エマルジョンである。代替の実施形態において、上記ワクチンは、Ａｌｕｍアジュバント化されており、吸着型ＴＬＲアゴニストのような免疫刺激剤を含む。好ましい実施形態において、上記ワクチンは、サブユニットワクチンもしくはスプリットワクチンである。
【００３７】
水中油型エマルジョンの状況において「さらなる免疫刺激剤」は、上記エマルジョンを形成する基油および洗剤に加えて含まれる免疫刺激剤を意味する。上記さらなる免疫刺激剤は、上記エマルジョンのアジュバント効果を増大するために添加される。この特許の目的のために、スクアレン、ＳｐａｎおよびＴｗｅｅｎからなるＭＦ５９は、さらなる免疫刺激剤を含まないことが理解される。ＡＳ０３中に含まれる上記トコフェロールは、さらなる免疫刺激剤であると理解される。この特許の目的のために、上記エマルジョンを形成および／もしくは安定化するために代表的に使用される界面活性剤は、これら洗剤がある種の本質的なアジュバント活性を有しているとしても、「さらなる免疫刺激剤」とみなされない。よって、以下の洗剤は、さらなる免疫刺激剤であると理解されるべきではない：ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般にはＴｗｅｅｎといわれる）、特に、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０；ＤＯＷＦＡＸＴＭ商品名の下で販売されるエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／もしくはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー（例えば、直鎖状のＥＯ／ＰＯブロックコポリマー）；オクトキシノール（これは、反復するエトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変動し得る）（オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、もしくはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン（レシチン））；ノニルフェノールエトキシレート（例えば、ＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭ  ＮＰシリーズ）；ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコールおよびオレイルアルコールから得られるポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）（例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０））；ならびにソルビタンエステル（ＳＰＡＮとして一般に公知）（例えば、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ  ８５）およびソルビタンモノラウレート））。非イオン性界面活性剤が好ましい。他方で、ＴＬＲアゴニストは、それらが油もしくは界面活性剤の化学的形態において添加されるとしても、この特許の目的のためいさらなる免疫刺激剤として数え上げる。特に、以下でアジュバントの節で記載されるＴＬＲアゴニストは、さらなる免疫刺激剤として理解される。
【００３８】
あるいは、インフルエンザＡ  ＮＰタンパク質の存在が、水中油型エマルジョンもしくはＡｌｕｍおよびさらなる免疫刺激因子でアジュバント化したワクチンにおいて完全に回避され得ない場合、ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭ中に含まれるＮＰタンパク質とは異なるＮＰタンパク質が、使用されるべきである。従って、本発明の一実施形態は、以下である：
（ｂ）インフルエンザＡウイルス由来のＮＰタンパク質を含むアジュバント化されたインフルエンザワクチンであって、以下の点で特徴付けられる：
（ｉ）上記ＮＰタンパク質は、配列番号２に示される核タンパク質配列のアミノ酸１１６に対応する位置においてイソロイシン残基を有しない、および／または
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸１０６〜１１８（代表的には、アミノ酸１０６〜１２６）に等価な上記核タンパク質のフラグメントは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターに結合する、
それによって、上記アジュバントは、水中油型エマルジョンもしくはＡｌｕｍおよびさらなる免疫刺激剤である。
【００３９】
好ましい実施形態において、上記アジュバントは、水中油型エマルジョンであり、上記さらなる免疫刺激剤は、トコフェロール、トコフェロール誘導体、ＧＬＡ、ＭＰＬもしくは別のＴＬＲアゴニストである。代替の実施形態において、上記アジュバントは、Ａｌｕｍ（例えば、水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウム）であり、ＴＬＲアゴニストを含む。
【００４０】
ＮＰタンパク質と、ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭ中で使用されるとおりの配列（配列番号２）との存在が回避できない場合（例えば、代替のバックボーンが利用可能でないことが理由で）、上記ワクチンは、単にさらなる免疫刺激剤を含まないアジュバントでアジュバント化されるべきである。これは、特に、以下に当てはまる：（ｉ）スプリットワクチン（これは比較的多量のＮＰを含む）、（ｉｉ）四価もしくはより高い価数のワクチン（ＮＰの量が加算されていくので）、（ｉｉｉ）小児集団および／もしくは青年集団に与えられる予定のワクチン（ナルコレプシー症例の大部分は、これら集団において検出されてきたので）、（ｉｖ）インフルエンザワクチン接種と関連して自己免疫疾患を発生させる遺伝的素因を有する被験体に与えられる予定のワクチン（ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を有する被験体に類似；ナルコレプシーは、これら被験体においてのみ起こったので）、ならびに（ｖ）Ｔｒｉｔｏｎを含む抗原（ナルコレプシーは、Ｔｒｉｔｏｎ含有抗原に応じて主に出現してきたので）。従って、本発明の一実施形態は、以下のとおりである：
（ｃ）アジュバント化したスプリットインフルエンザワクチンであって、ここで上記ワクチンは、少なくとも４種の異なるインフルエンザウイルスに由来する抗原および配列番号２を有する少なくとも１種のインフルエンザＡウイルスに由来するＮＰタンパク質を含み、上記アジュバントは、さらなる免疫刺激剤を含まない水中油型エマルジョンアジュバントであり、それによって、上記組成物は、Ｔｒｉｔｏｎを含む点で特徴付けられる、組成物。
【００４１】
好ましい実施形態において、このワクチンは、小児集団（０〜３６ヶ月）および／もしくは青年集団（４〜１９歳）において、ならびに／またはインフルエンザワクチン接種と関連して自己免疫疾患を発生させる遺伝的素因を有する被験体、好ましくは、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を有する被験体において使用するためのものである。
【００４２】
代替の実施形態は、以下である：
（ｄ）０〜７２ヶ月の小児および／もしくは青年（４〜１９歳）、ならびに／またはインフルエンザワクチン接種に関連して自己免疫疾患を発生させる遺伝的素因を有する被験体、好ましくは、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を有する被験体の処置のための方法であって、それによって上記の小児および／もしくは青年ならびに／または被験体は、アジュバント化されたスプリットインフルエンザワクチンでワクチン接種され、ここで上記ワクチンは、少なくとも４種の異なるインフルエンザウイルスに由来する抗原および配列番号２を有する少なくとも１種のインフルエンザＡウイルスに由来するＮＰタンパク質を含み、上記アジュバントは、さらなる免疫刺激剤を含まない水中油型エマルジョンアジュバントであり、それによって上記組成物は、Ｔｒｉｔｏｎを含む点で特徴付けられる方法。さらなる実施形態は、以下である：
（ｅ）不活化インフルエンザワクチンであって、（ｉ）ＡＳ０３アジュバント、ならびに（ｉｉ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＴｗｅｅｎ  ８０を含むが、（ａ）核タンパク質を含まないか、もしくは（ｂ）核タンパク質を含むが、核タンパク質の量は、上記ワクチン中のインフルエンザウイルスタンパク質の総質量のうちの１％未満であるかのいずれかである抗原成分を含む、ワクチン、
（ｆ）不活化スプリットインフルエンザワクチンであって、（ｉ）ＡＳ０３アジュバント、ならびに（ｉｉ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＴｗｅｅｎ  ８０を含み、核タンパク質を含むが、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターに結合し得る核タンパク質もしくは核タンパク質フラグメントを含まない抗原成分を含む、ワクチン。好ましくは、上記ワクチンは、汎流行性と関連するインフルエンザ株に対するものであり、上記インフルエンザ株は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ７Ｎ９、Ｈ９Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ３、Ｈ２Ｎ２、Ｈ１０Ｎ７、およびＨ７Ｎ１から選択される、
（ｇ）汎流行性と関連するインフルエンザ株に対する不活化スプリットインフルエンザワクチンであって、（ｉ）ＡＳ０３アジュバント、ならびに（ｉｉ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＴｗｅｅｎ  ８０を含み、核タンパク質を含むが、配列番号２のアミノ酸１１６に対応する位置においてイソロイシンを含む核タンパク質もしくは核タンパク質フラグメントを含まない抗原成分を含むワクチン。好ましくは、上記ワクチンは、汎流行性と関連するインフルエンザ株に対するものであり、上記インフルエンザ株は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ３、Ｈ７Ｎ９、Ｈ９Ｎ２、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ３、Ｈ２Ｎ２、Ｈ１０Ｎ７、およびＨ７Ｎ１から選択される、
（ｈ）汎流行性と関連するインフルエンザ株に対する不活化スプリットインフルエンザワクチンであって、（ｉ）ＡＳ０３アジュバント、ならびに（ｉｉ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＴｗｅｅｎ  ８０を含み、核タンパク質を含むが、配列ＬＸＬＹＸＸＸＩＸＸＸＸＸＸ（配列番号９）を含む核タンパク質もしくは核タンパク質フラグメントを含まない（ここでＸは、任意のアミノ酸である）抗原成分を含む、ワクチン。好ましくは、上記ワクチンは、汎流行性と関連するインフルエンザ株に対するものであり、上記インフルエンザ株は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ３、Ｈ７Ｎ９、Ｈ９Ｎ２、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ３、Ｈ２Ｎ２、Ｈ１０Ｎ７、およびＨ７Ｎ１から選択される。
【００４３】
一実施形態において、上記の非アジュバント化ワクチンのうちの抗原成分は、水中油型アジュバントで、特に、ＡＳ０３での処方のために使用され得る、
（ｉ）インフルエンザＡウイルスに由来するＮＰタンパク質を含む一価インフルエンザワクチンであって、
（ｉ）上記ＮＰタンパク質は、配列番号２に示される核タンパク質配列のアミノ酸１１６に対応する位置においてイソロイシン残基を有しない、および／または
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸１０６〜１１８（もしくは１０６〜１２６）に等価な上記核タンパク質のフラグメントは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターに結合する、
という点で特徴付けられ、それによって上記ワクチンは、１用量あたり７．５マイクログラム未満のＨＡ、および必要に応じて、アジュバントを含む、一価インフルエンザワクチン、
（ｊ）少なくとも４種の異なるインフルエンザウイルスに由来する抗原および少なくとも１種のインフルエンザＡウイルスに由来するＮＰタンパク質を含むインフルエンザワクチンであって：
ａ．上記ＮＰタンパク質のいずれも、配列番号２に示される核タンパク質配列のアミノ酸１１６に対応する位置においてイソロイシン残基を有しない、および／または
ｂ．配列番号２のアミノ酸１０６〜１１８に等価な上記少なくとも１種の核タンパク質のフラグメントは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターに結合する、
という点で特徴付けられ、それによって、上記ワクチンは、必要に応じて、アジュバントを含む、ワクチン、
（ｋ）インフルエンザＡウイルス核タンパク質を含むアジュバント化された不活化スプリットインフルエンザワクチンであって、ここで上記ワクチンは、（ｉ）配列番号２に示される核タンパク質配列のアミノ酸１１６に対応する位置においてイソロイシン残基を有するインフルエンザＡウイルス核タンパク質、および（ｉｉ）Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）由来のＮＹＭＣ  Ｘ−１８１株に由来するインフルエンザＡウイルス核タンパク質を含まない、ワクチン。本明細書中の他の箇所で説明されるように、このワクチンは、ＮＹＭＣ  Ｘ−１５７株、Ｘ１６３株、Ｘ−１６３Ａ株、Ｘ−１６３Ｂ株、Ｘ−１７３株、Ｘ−１７３Ａ株、Ｘ−１７３Ｂ株、Ｘ−１７３Ｃ株、Ｘ−１７７株、Ｘ−１７７Ａ株、Ｘ−１７７Ｂ株、Ｘ−１７９株、Ｘ−１７９Ａ株、Ｘ−１８１株もしくはＸ−１８１Ｂ株のうちのいずれかに由来する核タンパク質を含まない可能性がある。上記ワクチンは、水中油型エマルジョンアジュバント（例えば、ＭＦ５９もしくはＡＳ０３）を含み得る。上記ワクチンは、一価もしくは多価（例えば、三価もしくは四価）であり得る、
（ｌ）インフルエンザＡウイルス核タンパク質を含むアジュバント化された不活化スプリットインフルエンザワクチンであって、ここで上記ワクチンは、（ｉ）配列番号２に示される核タンパク質配列のアミノ酸１１６に対応する位置においてイソロイシン残基を有するインフルエンザＡウイルス核タンパク質、および（ｉｉ）２０１３年１０月１日より前に、世界保健機関によって、もしくはワクチンおよび関連生物製剤に関する諮問委員会によってインフルエンザワクチン中に含めることを推奨された任意のインフルエンザＡウイルス株に由来するヘマグルチニンを含まない、ワクチン。上記ワクチンはまた、（ｉｉｉ）２０１３年１０月１日より前に、世界保健機関によって、もしくはワクチンおよび関連生物製剤に関する諮問委員会によってインフルエンザワクチン中に含めることを推奨された任意のインフルエンザＢウイルス株由来のヘマグルチニンを含まない可能性がある。上記ＷＨＯの株の推奨は、インターネット上で入手可能であり［６］、２０１４年の南半球でのインフルエンザ流行期において使用するためのの株は、２０１３年９月２６日にアナウンスされた。ＦＤＡのＶＲＢＰＡＣからの推奨は、同様にオンラインで入手可能であり［７］、２０１３／１４年のインフルエンザ流行期において使用するための株は、２０１３年２月２７日にアナウンスされた。従って、特徴（ｉｉ）によって定義される株は、容易に決定され得る。上記ワクチンは、水中油型エマルジョンアジュバント（例えば、ＭＦ５９もしくはＡＳ０３）を含み得る。上記ワクチンは一価であり得るが、好ましくは、多価（例えば、三価もしくは四価）である。上記ワクチンが四価である場合、それは、理想的には、２種のＡ株および２種のＢ株に由来するヘマグルチニンを含み、ここで上記２種のＡ株は、異なるヘマグルチニンサブタイプ（例えば、Ｈ１Ｎ１株およびＨ３Ｎ２株のように、Ｈ１およびＨ３に由来する）を有し、上記２種のＢ株は、異なる系統（すなわち、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株およびＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株）を有する。以下を参照のこと。
【００４４】
上記で考察されるように、βサブユニットがＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２であるＭＨＣクラスＩＩレセプターヘテロダイマーへの潜在的結合に関して、既存の核タンパク質および特にインフルエンザワクチン製造で使用される新たな潜在的核タンパク質を試験することは、望ましい。
【００４５】
よって、本発明は、ワクチン生成の適性に関してインフルエンザＡウイルスを試験するための方法を提供し、上記方法は、上記インフルエンザウイルスの核タンパク質もしくはそのフラグメント、または上記インフルエンザウイルスのゲノムセグメントによってコードされる核タンパク質もしくはそのフラグメントが、Ｈ１Ｎ１株Ｘ−１７９Ａ由来の核タンパク質と比較して、同じ条件下でより低い親和性でＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に結合し得るか否かを決定する工程を包含し；ここで上記インフルエンザウイルスは、その核タンパク質が、Ｘ−１７９Ａ由来の核タンパク質と比較して、同じ条件下でより低い親和性でＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に結合し得る場合、ワクチン生成に適している。本明細書全体を通じて、「ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２への結合」への言及が、βサブユニットがＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２であるＭＨＣクラスＩＩレセプターヘテロダイマーへの結合を意味することは、当業者によって理解される。
【００４６】
ワクチン生成の適性に関してインフルエンザＡウイルスを試験する方法もまた提供され、上記方法は、（ａ）上記インフルエンザウイルスの核タンパク質の配列、もしくは上記核タンパク質をコードするインフルエンザウイルスのゲノムセグメントを決定する工程；および（ｂ）上記核タンパク質が、Ｘ−１７９Ａ株由来の核タンパク質と比較して同じ条件下でより低い親和性でＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２への結合を可能にする配列を有するか否かを決定する工程を包含し；ここで上記インフルエンザウイルスは、その核タンパク質が、Ｘ−１７９Ａ株由来の核タンパク質と比較して同じ条件下でより低い親和性でＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に結合し得る場合、ワクチン生成に適している。
【００４７】
上記で言及されるように、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターへの上記ウイルスのＮＰタンパク質の結合は、疾患発生に関与し得るので、ＮＰタンパク質が、Ｘ−１７９Ａ株（これは、ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭに使用された）と比較してＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に対してより低い結合親和性を有するインフルエンザＡウイルスを選択することは、ワクチンにおいて望ましい。このＮＰタンパク質は、発生期アミノ酸配列である配列番号２を有し、以下の分析から、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を結合するためのこの配列の重要な部分は、ＲＥＬＩＬＹＤＫＥＥＩＲＲＩＷＲＱＡＮＮＧ（配列番号１）であることが示されている。
【００４８】
ＦｏｃｅｔｒｉａＴＭで使用され、ナルコレプシーの引き金とならなかったインフルエンザウイルスのＮＰタンパク質は、これが配列番号２のアミノ酸１１６に対応する位置においてイソロイシンを含まない（図１を参照のこと）という点でＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭのＮＰタンパク質とは異なり、従って、この位置においてイソロイシンを有するＮＰタンパク質を回避することは望ましい。興味深いことに、数千もの公知のＮＰタンパク質のデータベース配列を本発明者らが分析したところ、この領域が高度の保存を示し、公知のＮＰタンパク質のうちの大部分、特に、ワクチン製造のために使用されるリアソータントウイルスにおいて見出されるものが、この位置もしくはその等価な位置においてイソロイシンを有するということが示された。
【００４９】
本発明はまた、ワクチン生成の適性に関してインフルエンザＡウイルスを試験する方法を提供し、上記方法は、（ａ）上記インフルエンザＡウイルスの核タンパク質の配列もしくは上記核タンパク質をコードするインフルエンザウイルスのゲノムセグメントを決定する工程；および（ｂ）配列番号２のアミノ酸１１６に対応する位置にある上記核タンパク質のアミノ酸を決定する工程を包含し；ここで上記インフルエンザウイルスは、そのＮＰタンパク質が、配列番号２のアミノ酸１１６に対応する位置においてイソロイシンを含まない場合に、ワクチン生成に適している。
【００５０】
従って、本発明はまた、本発明のワクチン組成物の調製に適したシードウイルスを提供する。一実施形態において、本発明のシードウイルスは、インフルエンザＡウイルス核タンパク質であって、ここで配列番号２のアミノ酸１０６〜１１８に等価な上記核タンパク質のフラグメントが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターに結合する核タンパク質を含む。好ましくは、上記シードウイルスのインフルエンザＡ核タンパク質が、配列番号１２に示される配列を含む場合、上記ウイルスシードは、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）株由来のＮＹＭＣ  Ｘ−１８１株ではない。特定の実施形態において、上記核タンパク質のフラグメントは、配列番号２のアミノ酸１０６〜１２６に等価である。
【００５１】
ワクチン生成に関するインフルエンザＡウイルスの適性を評価する場合、上記ウイルスの核タンパク質が、（ａ）配列番号２のアミノ酸１０８に対応する位置において脂肪族アミノ酸；および／もしくは（ｂ）配列番号２のアミノ酸１１０に対応する位置において脂肪族アミノ酸；および／もしくは（ｃ）配列番号２のアミノ酸１１１に対応する位置において疎水性アミノ酸、のうちの１以上を含むか否かをチェックすることは、さらに望ましい。ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２への結合に関する上記核タンパク質のコア結合モチーフは、配列番号２のアミノ酸１０８、１１０、１１１、１１３および１１６にあり、ここで結合は、アミノ酸１０８および１１０が脂肪族アミノ酸でありかつ１１１位のアミノ酸が疎水性アミノ酸である場合に特によく機能する。従って、これら位置においてこのようなアミノ酸を回避すると、上記ＮＰタンパク質がＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に結合し得る可能性は減少し得、このことはさらに、上記ＮＰタンパク質がナルコレプシーを引き起こす可能性を減少させる。インフルエンザウイルスは、これが、これら特定のアミノ酸のうちの１つ、２つもしくは全てを含まない場合に、ワクチン生成に特に適していると考えられる。１１１位における結合ポケットは、結合に特に重要であることが示されており、従って、上記ＮＰタンパク質がこの位置において疎水性アミノ酸を含まないことは、好ましい。上記タンパク質がこの位置においてチロシンを含まないことは、特に好ましい。なぜなら強い結合因子の公知の例は、このアミノ酸を有するからである［８］。１０８位および／もしくは１１０位におけるアミノ酸は、好ましくは、ロイシンではない。上記インフルエンザウイルスはまた、これが配列ＬＸＬＹＸＸＸＩＸＸＸＸＸＸ（配列番号９）を含まない（ここでＸは、任意のアミノ酸である）場合に、ワクチン生成に適していると考えられ得る。
【００５２】
本発明はまた、インフルエンザＡウイルスを調製する方法を提供し、上記方法は、（ａ）本発明の方法によるワクチン生成に関するインフルエンザＡウイルスの適性を試験する工程；（ｂ）培養宿主を上記工程（ａ）のインフルエンザウイルスに感染させる工程；および（ｃ）上記工程（ｂ）の宿主を培養して、さらなるウイルスを生成する工程；ならびに必要に応じて、（ｄ）工程（ｃ）で得られたウイルスを精製する工程を包含する。これら方法において、上記ウイルスは、本発明の方法によって評価されるように、ワクチン生成に適していると考えられる場合、ワクチン生成のために使用され得る。
【００５３】
本発明はさらに、インフルエンザＡ核タンパク質もしくはそのフラグメントを含むワクチンが、ヒトへの投与に適していることを確認する方法を提供し、上記方法は、上記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸１１６に対応する位置においてイソロイシンを有するか否かを決定する工程を包含し；ここで上記ワクチンは、上記核タンパク質が、配列番号２のアミノ酸１１６に対応する位置においてイソロイシンを含まない場合に、ヒトへの投与に適していると考えられる。
【００５４】
上記方法は、上記で考察されるように、上記ウイルスの核タンパク質が、（ａ）配列番号２のアミノ酸１０８に対応する位置において脂肪族アミノ酸；および／もしくは（ｂ）配列番号２のアミノ酸１１０に対応する位置において脂肪族アミノ酸；および／もしくは（ｃ）配列番号２のアミノ酸１１１に対応する位置において疎水性アミノ酸、のうちの１以上を含むか否かを試験する工程をさらに包含し得る。上記方法は、上記ウイルスの核タンパク質がこれらアミノ酸のうちの全てを有するか否かを試験する工程を包含し得る。
【００５５】
上記で考察されるように、ＮＰタンパク質（もしくはそのフラグメント）がＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に結合し得るか、もしくはＮＰタンパク質が配列番号２のアミノ酸１１６に対応する位置においてイソロイシンを有するインフルエンザＡウイルスは、ナルコレプシーと関連づけられた。従って、このようなＮＰタンパク質もしくはフラグメントの存在を回避することは、このことがインフルエンザＡワクチンの信頼性をさらに増大させ、上記ワクチンの安全性をもさらに増大させるので、望ましい。従って、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を結合し得るおよび／または配列番号２のアミノ酸１１６に対応する位置においてイソロイシンを有するインフルエンザＡウイルスが、ワクチン生成に使用される場合、上記ＮＰタンパク質（もしくはそのフラグメント）が最終ワクチン中に存在しないことを確実にするために得られるワクチンが試験されることは、好ましい。
【００５６】
従って、本発明はまた、インフルエンザワクチンがヒトへの投与に安全であることを確認するための方法を提供する。上記方法は、（ａ）インフルエンザワクチンを、核タンパク質がＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に結合し得るインフルエンザウイルス（例えば、そのＮＰが配列番号２である株）から調製する工程；および（ｂ）上記核タンパク質の存在に関して上記ワクチンを試験する工程を包含し得；ここで上記ワクチンは、これがＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に結合し得る上記核タンパク質を含まない場合に、ヒトへの投与に安全である。あるいは、上記方法は、（ａ）インフルエンザワクチンを、核タンパク質が配列番号２のアミノ酸１１６に対応する位置においてイソロイシンを有するインフルエンザウイルスから調製する工程；および（ｂ）上記核タンパク質の存在に関して上記ワクチンを試験する工程を包含し得；ここで上記ワクチンは、これがＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に結合し得る上記核タンパク質を含まない場合に、ヒトへの投与に安全であると考えられる。
【００５７】
上記で考察されるように、ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭワクチンに応じたナルコレプシーの全症例は、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２ハプロタイプを有する患者において起こったので、この患者群に特定の注意を喚起することは、望ましい。従って、ワクチンを投与する前に、患者のＨＬＡハプロタイプを考慮に入れることは、望ましい。
【００５８】
従って、本発明はまた、被験体にワクチンを投与する方法を提供し；上記方法は、（ａ）上記被験体が、上記ワクチンと関連して自己免疫疾患を発生させる遺伝的素因を有するか否かを決定する工程、および（ｂ）上記被験体にリスクがないと見出される場合に、上記ワクチンを投与する工程を包含する。好ましい実施形態において、本発明は、ワクチンを被験体に投与するための方法を提供し、上記方法は、（ａ）上記被験体がある種のＨＬＡハプロタイプを有するか否かを決定する工程；および（ｂ）上記被験体が上記ハプロタイプに関して陰性であると見出される場合に、上記被験体にワクチンを投与する工程を包含する。特に、本発明は、インフルエンザワクチンを被験体に投与するための方法を提供し、上記方法は、（ａ）上記被験体が、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２ハプロタイプを有するか否かを決定する工程、および（ｂ）上記被験体がＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に関して陰性である場合、インフルエンザワクチンを上記被験体に投与する工程を包含する。
【００５９】
本発明はまた、被験体を免疫化する方法を提供し、上記方法は、ワクチンを上記被験体に投与する工程を包含し、ここで上記被験体は、上記ワクチンと関連して自己免疫疾患を発生させるリスクを負うＨＬＡに関して陰性である。好ましい実施形態において、そのワクチンは、インフルエンザＡワクチンであり、そして／または上記被験体は、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に関して陰性である。
【００６０】
あるいは、本発明は、上記ワクチンと関連して自己免疫疾患のリスクを負うＨＬＡハプロタイプを有する被験体における使用のためのワクチンを提供し、それによって、ワクチンは、そのＨＬＡハプロタイプに結合するワクチン成分を実質的に含まない。好ましい実施形態において、上記ワクチンは、インフルエンザＡウイルスおよびＨＬＡタイプＤＱＢ１＊０６０２に対するものであり、上記ワクチンは、上記ＮＰタンパク質を含まないか、または配列番号２に示される核タンパク質配列のアミノ酸１１６に対応する位置においてイソロイシン残基を有しないＮＰタンパク質を含むか、そして／または上記ＮＰタンパク質もしくは配列番号２のアミノ酸１０６〜１１８に等価な上記核タンパク質のフラグメントが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターに結合する。好ましい実施形態において、上記ＮＰタンパク質もしくはそのフラグメントは、除去されている。より好ましい実施形態において、上記インフルエンザワクチンは、組換えワクチンではない。
【００６１】
本発明はまた、被験体をインフルエンザに対して免疫化する方法を提供し、上記方法は、インフルエンザワクチンを、上記被験体がＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に関して陽性である被験体に投与する工程を包含し、それによって上記ワクチンは、インフルエンザＡ  ＮＰタンパク質を含まないか、または配列番号２に示される核タンパク質配列のアミノ酸１１６に対応する位置においてイソロイシン残基を有しないインフルエンザＡ  ＮＰタンパク質を含むか、そして／または上記ＮＰタンパク質もしくは配列番号２のアミノ酸１０６〜１１８に等価な上記核タンパク質のフラグメントは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターに結合する。好ましい実施形態において、上記ワクチンは、組換えワクチンである。
【００６２】
本発明はまた、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を有する被験体における使用のためのＮＰを含むインフルエンザワクチンを提供し、それによって上記ＮＰタンパク質は、配列番号２の配列を含む。
【００６３】
本発明はまた、核タンパク質もしくはそのフラグメントがＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に結合し得るインフルエンザウイルスから調製されるインフルエンザワクチンを提供し、ここで上記ワクチンは、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に結合し得る核タンパク質もしくはそのフラグメントを含まない。好ましい実施形態において、上記インフルエンザワクチンは、組換えワクチンではない。
【００６４】
核タンパク質が、配列番号１の配列を含む核タンパク質と比較して、等しいかまたはそれより高い親和性でＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に結合する能力に関して試験されたインフルエンザウイルスから調製されるインフルエンザワクチンがさらに提供され、ここで上記ワクチンは、上記核タンパク質を含まない。好ましい実施形態において、本発明のインフルエンザワクチンは、組換えワクチンではない。
【００６５】
核タンパク質が、Ｘ−１７９Ａ株由来の核タンパク質と比較して、等しいかまたはそれより高い親和性でＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に結合する能力について試験されたインフルエンザウイルスから調製されるインフルエンザワクチンもまた提供され、ここで上記ワクチンは、上記核タンパク質を含まない。好ましい実施形態において、本発明のインフルエンザワクチンは、組換えワクチンではない。
【００６６】
核タンパク質もしくはそのフラグメントが、配列番号２のアミノ酸１１６に対応する位置においてイソロイシンの存在に関して試験されたインフルエンザウイルスから調製されるインフルエンザワクチンもまた提供され、ここで上記ワクチンは、上記核タンパク質もしくはそのフラグメントを含まない。好ましい実施形態において、本発明のインフルエンザワクチンは、組換えワクチンではない。
【００６７】
本発明はまた、スプリットビリオンインフルエンザワクチンを提供し、上記ワクチンは、ＨＡに対して、上記ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭワクチンより少ない量のインフルエンザＡウイルス由来の核タンパク質を含む。これは、特に、上記核タンパク質が本明細書で記載されるように試験されなかった場合、重要な安全性尺度であり得る。なぜなら核タンパク質のより低い量が、上記核タンパク質がナルコレプシーの引き金となる可能性を低くするからである。特定の実施形態において、本発明は、存在する核タンパク質の量が、１０μｇのヘマグルチニンあたり３μｇ未満の核タンパク質（例えば、１０μｇのＨＡあたり３μｇ未満のＮＰ、１０μｇのＨＡあたり２．５μｇ未満のＮＰ、１０μｇのＨＡあたり２μｇ未満のＮＰ、１０μｇのＨＡあたり１．５μｇ未満のＮＰ、１０μｇのＨＡあたり１μｇ未満のＮＰ、１０μｇのＨＡあたり０．５μｇ未満のＮＰもしくは１０μｇのＨＡあたり０．１μｇ未満のＮＰ）であるスプリットビリオンワクチン組成物を提供する。
【００６８】
組成物中のタンパク質の量を決定するための方法は、当業者に公知である。しかし、ＮＰおよびＮＡは実質的に同じ分子量（約６０ｋＤａ）を有するので、それらは通常、非還元ゲル中で共に移動する（ｃｏ−ｍｉｇｒａｔｅ）。従って、古典的なＳＤＳゲル電気泳動は、ＮＰの量を決定するために適した方法でないと思われる［９］。ワクチンバルク中のＮＰの量を決定するための一方法は、２次元電気泳動とその後のデンシトメトリーであり得る。しかし、好ましいのは、参考文献１０に記載されるように同位体標識した合成ペプチドを使用する同位体希釈質量分析である。この方法は、複数反応モニタリング（ＭＲＭ）とともに同位体希釈を使用する液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を使用する。この方法は、検体タンパク質に代表的な化学量論としてサンプルのタンパク質分解による消化による、標的となるペプチドの放出を定量する。安定な同位体標識参照ペプチドは、内部標準物質（ＩＳ）として上記サンプルの中に加えられる。ＮＰの定量は、上記同位体標識した参照ペプチドのピーク面積と、内因性の標的ペプチドのものとを比較することによって達成される。この方法は、標識されたペプチドが、各特異的な標的のために含まれることを条件として、複数のタンパク質の同時定量を可能にする。
【００６９】
あるいは、標識なし質量分析（ＬＣ／ＭＳＥ）は、定量のために、好ましくは、四重極飛行時間型（Ｑ−Ｔｏｆ）質量分析において使用される［１１］。この方法に関して、ＬＣ／ＭＳ分析の間の低衝突エネルギーおよび高衝突エネルギーの交互のスキャンは、１回の実験で両方のタンパク質の正体および量を得るために使用される。定量は、任意の所定のタンパク質に関して３種の最も強いトリプシンペプチド（ｔｒｙｐｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）のＬＣ／ＭＳＥによって測定された平均シグナル強度が、タンパク質のタイプおよびサイズに拘わらず、所定の濃度で一定であることを示す実験データに基づく。シグナル強度は濃度に比例するので、混合物中の任意のタンパク質の量は、概算され得る。
【００７０】
本発明はまた、ヘマグルチニンに対する核タンパク質の比が、以下のアッセイによって評価される場合に、１．５未満（例えば、＜１．４、＜１．３、＜１．２、＜１．１、もしくはさらに＜１．０）であるスプリットビリオンインフルエンザワクチンを提供する：上記ワクチン中のタンパク質は、沈殿させられ；上記沈殿したタンパク質は、集められ、還元され、プロピオンアミドを使用してアルキル化され；上記アルキル化タンパク質は、３７℃において一晩、トリプシンおよびＬｙｓＣ（Ｌｙｓ残基のカルボキシル側において特異的に加水分解するＬｙｓｏｂａｃｔｅｒ  ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ由来のセリンエンドプロテイナーゼ）の混合物で消化され；ギ酸で酸性化され；Ｃ１８逆相樹脂を使用してタンパク質分解フラグメントが精製され；フラグメント化のために１５種の最も強力な多重に荷電された前駆イオン（ｍｕｌｔｉｐｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｉｏｎ）を選択するとともに、精製フラグメントのＨＰＬＣ−ＭＳＭＳ（高速液体クロマトグラフィータンデム質量分析）が行われ；ＭＳスペクトルピークがインフルエンザウイルスタンパク質にマッチさせられ；１０種の最も量の多いタンパク質がＭＳスペクトルの中で選択され；そしてこれら１０種の最も量の多いタンパク質内で、ヘマグルチニンＭＳシグナルに対する核タンパク質ＭＳシグナルの比が計算される。以下で示されるように、現在のスプリットワクチンにおいて、このアッセイによって評価されるＭＳに対するＮＰの比は、１．５より高い。
【００７１】
本発明はまた、ヘマグルチニンに対する核タンパク質の比が、以下のアッセイによって評価される場合に０．３未満（例えば、＜０．２８、＜０．２６、＜０．２５、＜０．２０、もしくはさらに＜０．１０）であるスプリットビリオンインフルエンザワクチンを提供する：上記ワクチン中のタンパク質は沈殿させられ；上記沈殿したタンパク質は、集められ、還元され、プロピオンアミドを使用してアルキル化され；上記アルキル化タンパク質は、３７℃において一晩、トリプシンおよびＬｙｓＣ（Ｌｙｓ残基のカルボキシル側において特異的に加水分解するＬｙｓｏｂａｃｔｅｒ  ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ由来のセリンエンドプロテイナーゼ）の混合物で消化され；ギ酸で酸性化され；Ｃ１８逆相樹脂を使用してタンパク質分解フラグメントが精製され；フラグメント化のために１５種の最も強力な多重に荷電された前駆イオンを選択するとともに、精製フラグメントのＨＰＬＣ−ＭＳＭＳ（高速液体クロマトグラフィータンデム質量分析）が行われ；上記ワクチンに存在することが公知の株に対する正確な配列マッチによって、ＭＳスペクトルピークがインフルエンザウイルス核タンパク質およびヘマグルチニン配列にマッチさせられ；１０種の最も量の多いタンパク質がＭＳスペクトルの中で選択され；そしてこれら１０種の最も量の多いタンパク質内で、ヘマグルチニンＭＳシグナルに対する核タンパク質ＭＳシグナルの比が計算される。
【００７２】
本発明はまた、核タンパク質レベルが、行われるさらなる精製工程に起因して、スプリットビリオンワクチンよりサブユニットワクチンにおいてより低いはずであることに注意して、インフルエンザＡ核タンパク質の低下したレベルを含むサブユニットインフルエンザワクチンを提供する。特に、本発明は、存在する核タンパク質の量が１０μｇのＨＡあたり０．５μｇ未満のＮＰ（例えば、１０μｇのＨＡあたり０．１μｇ未満のＮＰ）であるサブユニットワクチンを提供する。前段落のワクチンは有利である。なぜなら、インフルエンザウイルス（そのＮＰタンパク質は、ナルコレプシーを引き起こしたインフルエンザワクチンの生成のために使用されたインフルエンザウイルスのＮＰタンパク質と特徴を共有する）からワクチンが調製されている場合、上記ワクチンが、上記ＮＰタンパク質をナルコレプシーと関連づけられた濃度で含まないことを確実にすることは望ましいからである。
【００７３】
代表的には、前段落で記載されるワクチンは、水中油型エマルジョンアジュバントでアジュバント化される。このようなワクチン（ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭのように）において、上記ワクチンを試験することは特に有利である。なぜなら、以下に説明されるように、上記アジュバントは、上記ＮＰペプチドがナルコレプシーの引き金となり得るというより高いリスクをもたらし得るからである。最も好ましい実施形態において、上記水中油型エマルジョンアジュバントは、トコフェロール、トコフェロール誘導体、ＧＬＡもしくはＴＬＲアゴニストのようなさらなる免疫刺激剤、特に、α−トコフェロールを含む。
【００７４】
上記インフルエンザワクチンは、前段落で考察される特徴について試験されたインフルエンザウイルスから生成される。この試験工程は、生成プロセスの間の任意のステージで行われ得る。それは、例えば、ワクチンが生成されるウイルス培養を始めるために使用されるシードウイルスに対して行われ得る。それはまた、ウイルス培養物から採取されたサンプルに対して行われ得る。上記試験工程はまた、生成プロセスにおいて使用されないインフルエンザウイルスに対して、例えば、上記試験工程があるウイルス株の１つのバッチを使用して行われ、その同じウイルス株の別のバッチが上記ワクチンの生成のために使用される場合に、行われ得る。上記試験工程は、あらゆる生成サイクルにおいて行われる必要はない。それは、インフルエンザワクチンを生成する同じ実体によって行われる必要もない。例えば、１つの実体が上記ウイルスを試験し、上記試験結果を他の実体に対して、例えば、データベースの中で利用可能にすることは、可能である。この選択肢は、上記試験工程がインフルエンザウイルスの配列情報を得ることによって行われる場合に特に魅力的である。なぜならこのような情報は、公のデータベースにおいて容易に利用可能にされ得るからである。
【００７５】
インフルエンザＡワクチンを調製するための方法もまた提供され、上記方法は、（ａ）第１のプレワクチン組成物を調製する工程；（ｂ）オレキシンレセプター１および／もしくはオレキシンレセプター２を摸倣する組成物構造物の量を、上記第１のワクチンから除去もしくは低減して、第２のプレワクチンを提供する工程；ならびに（ｃ）上記ワクチンを、上記第２のプレワクチンから調製する工程を包含する。好ましくは、オレキシンレセプター１および／もしくはオレキシンレセプター２を摸倣する構造物の量は、９０％超、より好ましくは、９５％、および最も好ましくは９９％超だけ低減される。例として、工程（ｂ）における除去は、クロマトグラフィーによる。本発明はまた、ウイルスからウイルスサブユニットを調製するための方法を提供し、ここで上記サブユニットは、オレキシンレセプター１および／もしくはオレキシンレセプター２を摸倣する構造物を含まずに調製される。上記方法は、上記ワクチンを処方する工程、必要に応じて上記ワクチンとアジュバントとを混合する工程、上記ワクチンを充填し、パッケージングし、ラベルを貼付する工程のようなさらなる工程を包含し得る。
【００７６】
本発明は、核タンパク質配列がアミノ酸配列ＲＥＬＩＬＹＤＫＥＥＭＲＲＩＷＲＱＡＮＮＧ（配列番号３）を含むインフルエンザウイルスからワクチンを調製するための方法をさらに提供し、上記方法は、上記アミノ酸配列を含むいずれの核タンパク質もしくはそのフラグメントをも除去して、上記ワクチンを提供する工程を包含する。別の実施形態において、本発明のワクチンは、核タンパク質配列がアミノ酸配列ＲＥＬＩＬＹＤＫＥＥＩＲＲＩＷＲＱＡＮＮＧ（配列番号３）を含むインフルエンザウイルスから、上記アミノ酸配列を含むいかなる核タンパク質もしくはそのフラグメントをも除去して、上記ワクチンを提供する工程を包含して調製される。上記方法は、上記ワクチンを処方する工程、必要に応じて上記ワクチンとアジュバントとを混合する工程、上記ワクチンを充填し、パッケージングし、ラベルを貼付する工程のようなさらなる工程を包含し得る。
【００７７】
本発明はまた、不活化もしくは生の弱毒化インフルエンザＡワクチンを提供し、ここで上記ワクチンは、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に結合し得る核タンパク質もしくはそのフラグメントを含まない。本発明はまた、オレキシンレセプター１および／もしくはオレキシンレセプター２を摸倣する核タンパク質もしくはそのフラグメントを含まない、不活化もしくは生の弱毒化インフルエンザＡワクチンを提供する。核タンパク質を含むが、上記核タンパク質の量が、１０μｇのＨＡあたり３μｇ未満のＮＰ、１０μｇのＨＡあたり２．５μｇ未満のＮＰ、１０μｇのＨＡあたり２μｇ未満のＮＰ、１０μｇのＨＡあたり１．５μｇ未満のＮＰ、１０μｇのＨＡあたり１μｇ未満のＮＰ、１０μｇのＨＡあたり０．５μｇ未満のＮＰ、もしくは１０μｇのＨＡあたり０．１μｇ未満のＮＰであるインフルエンザＡワクチンもまた、提供される。本発明はまた、核タンパク質もしくはそのフラグメントを含まない不活化インフルエンザＡワクチンを提供する。好ましくは、この段に記載されるワクチンは、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に結合し得る核タンパク質もしくはフラグメントを含んだインフルエンザＡウイルスから出発して生成されている。さらにもしくは代わりに、上記ワクチンは、水中油型エマルジョン、特に、さらなる免疫刺激因子を含むものでアジュバント化される。
【００７８】
本発明はさらに、インフルエンザＡワクチンを調製するための方法を提供し、上記方法は、オレキシンレセプター１および／またはオレキシンレセプター２、もしくはそのフラグメントを摸倣する組成物構造物の量を除去もしくは低減する工程を包含する。好ましくは、オレキシンレセプター１および／もしくはオレキシンレセプター２を摸倣する構造物の量は、９０％超、より好ましくは、９５％および最も好ましくは、９９％超だけ低減される。本発明はさらに、インフルエンザＡワクチンを調製するための方法を提供し、上記方法は、上記核タンパク質もしくはそのフラグメントの量を除去もしくは低減する工程を包含する。好ましくは、核タンパク質もしくはフラグメントの量は、９０％超程度、より好ましくは、９５％程度および最も好ましくは、９９％超程度低減される。調製物からタンパク質を除去するための方法は、当該分野で周知である。例として、上記核タンパク質もしくはそのフラグメントの量を除去もしくは低減する工程は、クロマトグラフィーもしくは免疫沈降によって行われ得る。
【００７９】
ナルコレプシーは、小児（０〜３６ヶ月）および青年（４〜１９歳）の集団において大部分は検出されてきたので、一実施形態において、本明細書で記載されるとおりの本発明の全てのワクチンは、小児（０〜３６ヶ月）および青年（４〜１９歳）の集団における使用のためのものである。
【００８０】
水中油型エマルジョンが、本明細書で記載される抗原と組み合わせて使用される場合、上記ワクチンの抗原およびアジュバント成分は、予め混合されていてもよいし、投与前に、そのエンドユーザー／ヘルスケア提供者が混合するために別個の容器の中にあってもよい。上記抗原および上記アジュバント成分は、同じ生成場所で生成されてもよいし、異なる生成場所で生成されてもよい。本発明の一局面は、アジュバント成分とともに、キットの中に処方および／もしくはパッケージのための抗原成分の使用である。本発明の別の局面は、抗原成分とともにキットの中に処方および／もしくはパッケージのための上記アジュバントの使用である。
【００８１】
（発明の詳細な説明）
（核タンパク質）
本発明は、当業者が、ワクチン生成に関するインフルエンザＡウイルスの適性を、上記ウイルスの核タンパク質のある種の特徴（例えば、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２への結合）またはある種のアミノ酸の存在について配列をチェックすることに基づいて評価することを可能にする方法を提供する。
【００８２】
本発明が、核タンパク質を試験（もしくは配列決定、分析など）することによって定義される場合、これは、全長核タンパク質を試験することを包含し得るが、通常は、上記核タンパク質のフラグメントを試験することを包含し得る。なぜなら上記核タンパク質は、抗原提示細胞による細胞内プロセシングの後に、フラグメントとしてＭＨＣクラスＩＩレセプターに結合して提示されると予測されるからである。これらフラグメントは、２００個未満のアミノ酸（例えば、１００個未満のアミノ酸、９０個未満のアミノ酸、８０個未満のアミノ酸、７０個未満のアミノ酸、６０個未満のアミノ酸、５０個未満のアミノ酸、４０個未満のアミノ酸、３０個未満のアミノ酸、もしくは２０個未満のアミノ酸）の長さを有し得る。当業者によって認識されるように、フラグメントは、代表的には、ＭＨＣクラスＩＩレセプターに結合するために少なくとも約１２個もしくは１３個のアミノ酸の長さであるはずである（例えば、少なくとも１８個、１９個、２０個もしくは２１個のアミノ酸の長さ）。本発明の方法が３０個未満のアミノ酸の長さを有するフラグメントを使用して実施されることは、このようなフラグメントがより扱いやすいことから好ましい。さらに、上記フラグメントが配列決定される場合、上記方法はまた、より短い配列が分析される場合にはより安価である。
【００８３】
フラグメントが本発明の方法において使用される場合、上記フラグメントは、配列番号２のアミノ酸１０８〜１１６、好ましくは、配列番号２のアミノ酸１０６〜１１８もしくはアミノ酸１０６〜１２６に対応するアミノ酸を含むべきである。なぜならこの配列は、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターに結合するためのコアモチーフであるからである。従って、本発明で使用され得るフラグメントは、９個のアミノ酸という最小の長さを有するが、上記で言及されるように、代表的には、ＭＨＣクラスＩＩレセプターに結合するために少なくとも約１２個もしくは１３個のアミノ酸の長さである（例えば、少なくとも１８個、１９個、２０個もしくは２１個のアミノ酸の長さ）。この状況において配列番号２のアミノ酸１０８〜１１６および１０６〜１１８および１０６〜１２６への言及は、本発明が、配列番号２のアミノ酸１０８〜１１６もしくは１０６〜１１８もしくは１０６〜１２６に示される正確に同じアミノ酸配列を含むフラグメントでのみ実施され得ることを意味しない。代わりに、これは、当業者が他の核タンパク質配列（例えば、Ｘ−１８１株における配列番号３）においてその対応するアミノ酸を見出し、それによって、任意のインフルエンザＡウイルスＮＰにおいても等価なフラグメントを同定するための参照を提供する。
【００８４】
フラグメントが１つの株から使用される場合、別の株との何らかの比較が、その株由来の対応するフラグメントに対しておこなれて、例えば、Ｘ−１８１株由来のより長いもしくはより短い配列と比較するのではなく、配列番号１を有するペプチドと配列番号３を有するペプチドとを比較するべきである。
【００８５】
本発明はまた、前段落に記載されるように、インフルエンザＮＰタンパク質もしくはフラグメントをコードするゲノムセグメントで実施され得る。従って、タンパク質配列決定なしの方法が行われ得るが、代わりに、核酸配列決定を使用（もしくはさらには別個に得られた配列情報を使用）することによって行われ得る。
【００８６】
上記ＮＰタンパク質もしくはフラグメントは、ＭＨＣクラスＩＩレセプターのβ鎖サブユニットであるＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に結合するその能力を試験することによって分析され得る。よって、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２への上記ＮＰタンパク質もしくはフラグメントの結合を試験する工程が、上記βサビユニットがＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２である機能的ＭＨＣクラスＩＩレセプターヘテロダイマーに結合することに基づくことは、当業者によって理解される。そのαサブユニットは、代表的には、ＤＱＡ１サブユニット（例えば、ＨＬＡ  ＤＱＡ１＊０１０２（これは、白色人種のアメリカ人においてＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２と最も共通して関連づけられたＤＱＡ１サブユニットである）である。このようなヘテロダイマーは、例えば、組換え発現技術を使用して、試験目的で得られ得る。可溶性ＭＨＣクラスＩＩレセプターヘテロダイマーを発現するために適した方法は、参考文献１２に記載される。ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０１９２０）から入手可能である。別の適切な方法は、参考文献１３に記載される。
【００８７】
これら実験における参照点は、配列番号２のＮＰタンパク質、もしくはより代表的には、前段落で考察されるようにその配列のフラグメント（例えば、配列番号１に示されるフラグメント）である。この配列を有するＮＰタンパク質は、ナルコレプシーと関連づけられた。このタンパク質と比較してより低い親和性で（同じ実験条件下で）ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を結合するＮＰタンパク質は、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に結合する可能性がより低くなり、従って、ナルコレプシーを引き起こす可能性がより低くなる。上記で考察されるように、代表的には、上記比較は、等価なフラグメントで行われる。例えば、上記ＮＰフラグメントが配列番号１に示されるフラグメントである場合、その試験ＮＰフラグメントは、異なるＮＰタンパク質が正確に同じ長さでない可能性があることおよび欠失もしくは挿入を有し得ることを考慮して、アミノ酸１０６〜１２６もしくはその等価な領域から得られる。
【００８８】
結合親和性を試験するために適したアッセイは、当該分野で公知である（例えば、ＮＭＲ、フィルター結合アッセイ、ゲル遅延度アッセイ（ｇｅｌ−ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）、置換／競合アッセイ（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ／ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）、リバース・ツーハイブリッド法（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）、表面プラズモン共鳴および分光法を使用する）。適切なペプチド結合アッセイの例は、参考文献１２に記載される。アッセイの特定の例において、試験ペプチド（例えば、Ｘ−１７９Ａ株由来のＮＰタンパク質フラグメント（例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるかもしくはこれを含むフラグメント）は、検出可能な標識（例えば、ビオチン）で標識され、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプター（代表的には、ヘテロダイマーの他の成分としてＨＬＡ  ＤＱＡ１＊０１０２とともに）に結合される。次いで、非標識の試験ペプチドは、レセプター標識ペプチド複合体とともにインキュベートされる。上記試験ペプチドは、上記参照標識ペプチドと結合に関して成功裡に競合するか否かは、なお結合されている標識ペプチドの量を測定することによって決定され得る。上記試験ペプチドが、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターに、より低い強さで結合する場合、それは、上記標識された参照ペプチドと結合に関して成功裡に競合しないので、これは、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターに、Ｘ−１７９Ａ株由来のＮＰタンパク質より低い強さで結合するＮＰタンパク質を同定するための便利な手段を提供する。
【００８９】
他のアッセイは、参考文献１３および８８に記載される（例えば、合成試験ペプチドがＭＨＣ−ペプチド複合体を安定化する能力を測定する、実施例中で使用されるＲＥＶＥＡＬＴＭ  ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ技術（ここでＭＨＣ−ペプチド複合体の天然のコンフォメーションの存在もしくは非存在は、特異的モノクローナル抗体によって検出される））。
【００９０】
一実施形態において、試験されている上記ＮＰタンパク質（例えば、配列番号２のアミノ酸１０６〜１１８に対応するか、または配列番号２のアミノ酸１０６〜１２６に対応するフラグメント）は、Ｘ−１７９Ａ由来のＮＰタンパク質（例えば、配列番号２のアミノ酸１０６〜１１８からなるか、もしくは配列番号２のアミノ酸１０６〜１２６からなるフラグメント）より、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターに関して少なくとも１／２の結合親和性を、例えば、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターに関して１／３、１／４、１／５もしくは１／１０の結合親和性を有する。好ましくは、上記試験されているＭＨＣクラスＩＩレセプターは、ＨＬＡ  ＤＱＡ１＊０１０２およびＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２のヘテロダイマーである。
【００９１】
上記ＮＰタンパク質はまた、前段落で考察されるように、その配列もしくはフラグメントの配列を決定することによって分析され得る。上記方法はまた、上記ＮＰタンパク質もしくはそのフラグメントをコードするウイルスセグメントの配列を分析することによって行われ得る。ペプチドおよび核酸を配列決定するために適したアッセイは、当該分野で周知であり、例えば、エドマン分解アッセイおよびサンガー配列決定法が挙げられる。核酸が分析される場合、上記核酸は、配列決定する前に、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅され得る。
【００９２】
一実施形態において、上記分析は、上記ウイルスの核タンパク質が、（ａ）配列番号２のアミノ酸１０８に対応する位置において脂肪族アミノ酸；および／もしくは（ｂ）配列番号２のアミノ酸１１０に対応する位置において脂肪族アミノ酸；および／もしくは（ｃ）配列番号２のアミノ酸１１１に対応する位置において疎水性アミノ酸のうちの１つ以上を含むか否かに関して行われる。ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２への結合のための上記核タンパク質のコア結合モチーフは、配列番号２のアミノ酸１０８、１１０、１１１、１１３および１１６にあり、ここで結合は、アミノ酸１０８および１１０が脂肪族アミノ酸であり、かつ１１１位のアミノ酸が疎水性アミノ酸である場合に特に良く機能する。従って、これらの位置においてこのようなアミノ酸を回避すると、上記ＮＰタンパク質がＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に結合し得る可能性が低減し、このことはさらに、上記ＮＰタンパク質がナルコレプシーを引き起こす可能性を低減する。インフルエンザウイルスは、これが、これら特定のアミノ酸のうちの１つ、２つもしくは全てを含まない場合に、ワクチン生成に特に適していると考えられる。１１１位の上記結合ポケットは、結合に特に重要であることが示されており、従って、上記ＮＰタンパク質がこの位置において疎水性アミノ酸を含まないことは好ましい。上記タンパク質がこの位置においてチロシンを有しないことは特に好ましい。なぜなら強い結合因子の公知の例は、このアミノ酸を有するからである［８］。１０８位および／もしくは１１０位のアミノ酸は、好ましくは、ロイシンではない。上記インフルエンザウイルスはまた、これが配列ＬＸＬＹＸＸＸＩＸＸＸＸＸＸ（配列番号９）を含まない（ここでＸは、任意のアミノ酸である）場合に、ワクチン生成に適していると考えられ得る。上記タンパク質配列はまた、代替の手段によって分析され得る。例えば、ゲノムセグメントが分析される場合、上記セグメントは、上記結合モチーフに特に関連するアミノ酸を特異的に検出するプローブを使用して分析され得る。同様に、上記ＮＰタンパク質は、免疫化学的方法（例えば、ウェスタンブロット分析もしくは免疫蛍光法）を使用して分析され得る。このような分析法が本発明で使用される場合、これらは、配列ＬＩＬＹＤＫＥＥＩ（配列番号８、配列番号２のアミノ酸１０８〜１１６に相当）の特異的検出を可能にする抗体を使用して行われるべきである。上記で考察されるように、上記ＮＰタンパク質が１１１位においてチロシンを有さず、従って、上記抗体が、１１１位においてチロシンを特異的に検出する抗体であり得ることは特に好ましい。代わりに、もしくはさらに、上記抗体は、１０８位および／もしくは１１０位のロイシンを特異的に検出し得る。関連する配列の間を区別し得る抗体を得るための方法は、当業者に公知である。
【００９３】
（核タンパク質の検出）
いくつかの局面において、本発明は、インフルエンザＡ核タンパク質を含まない不活化インフルエンザワクチンを提供する。当業者は、最終ワクチンから全ＮＰを除去することはしばしば可能でないこと、およびワクチン（特に、スプリットワクチン）がＮＰの残留量をなお含むことを認識している。例えば、ＦｏｃｅｔｒｉａＴＭワクチンは、ある量のＮＰタンパク質をなお含んでいたが、これらタンパク質は、問題とはなり得ない。なぜならそれらは、ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭ中にある量より遙かに低い量で存在したからである。
【００９４】
従って、本発明のワクチンが核タンパク質を含む場合、それは、好ましくは、上記ワクチン中の総インフルエンザウイルスタンパク質の質量の１５％未満（例えば、＜１２％、＜１０％、＜８％、＜７％、＜６％、＜５％、＜４％、＜３％、＜２％、もしくは＜１％）を構成する。上記ワクチンは、１０μｇのＨＡあたり３μｇ未満のＮＰ、１０μｇのＨＡあたり２．５μｇ未満のＮＰ、１０μｇのＨＡあたり２μｇ未満のＮＰ、１０μｇのＨＡあたり１．５μｇ未満のＮＰ、１０μｇのＨＡあたり１μｇ未満のＮＰ、１０μｇのＨＡあたり０．５μｇ未満のＮＰ、もしくは１０μｇのＨＡあたり０．１μｇ未満のＮＰを含み得る。上記ＮＰの量は、上記のように決定され得る。
【００９５】
上記で考察されるように、インフルエンザＡ核タンパク質の混合物が存在する一実施形態では、上記核タンパク質の量を、本発明の第１の局面において与えられる定義に従って回避され得るべきであるその核タンパク質に関して、本明細書で特定されるレベル未満に単に減らすことが必要であり得る。従って、この実施形態において、上記に与えられるＮＰの量の評価は、このような核タンパク質、例えば、Ｘ−１７９Ａ株の核タンパク質に関して行われる必要があるだけである。他の核タンパク質（例えば、Ｘ−１８１株のもの）は、例えば、ワクチンの任意の特定のタイプに関して通常のレベルで含まれ得る。従って、この実施形態では、単により厳密な精製手段が、特定の核タンパク質の配列／結合特徴に依存して、いくつかの株の製造の間に適用される必要があり、他の株ではそうでない。いったん最終ワクチン組成物へと合わせられると、ＮＰの総量は、上記に与えられた限界を超えることもあるが、ただし減らすことが望ましいＮＰのタイプの量は、限界を超えない。
【００９６】
組成物中のタンパク質の量を決定するための方法は、当業者に公知である。しかし、ＮＰおよびＮＡは実質的に同じ分子量を有する（約６０ｋＤａ）ので、それらは通常、非還元ゲル中で共に移動する。従って、古典的なＳＤＳゲル電気泳動は、ＮＰの量を決定するために適した方法でないと思われる（Ｃｈａｌｏｕｐｋａら、１９９６，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．  １９９６  Ｆｅｂ；１５（２）：１２１−７を参照のこと）。ワクチンバルク中のＮＰの量を決定するための一方法は、２次元電気泳動とその後のデンシトメトリーであり得る。しかし、好ましいのは、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０  （２０１２）  ２４７５-２４８２に記載されるように同位体標識した合成ペプチドを使用する同位体希釈質量分析である。この方法は、複数反応モニタリング（ＭＲＭ）とともに同位体希釈を使用する液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を使用する。この方法は、検体タンパク質に代表的な化学量論としてサンプルのタンパク質分解による消化によって放出される、標的となるペプチドを定量する。安定な同位体標識参照ペプチドは、内部標準物質（ＩＳ）として上記サンプルの中に加えられる。ＮＰの定量は、上記同位体標識した参照ペプチドのピーク面積と、内因性の標的ペプチドのものとを比較することによって達成される。この方法は、標識されたペプチドが、各特異的な標的のために含まれることを条件として、複数のタンパク質の同時定量を可能にする。
【００９７】
あるいは、標識なし質量分析（ＬＣ／ＭＳＥ）は、定量のために、好ましくは、四重極飛行時間型（Ｑ−Ｔｏｆ）質量分析において使用される［１１］。この方法に関して、ＬＣ／ＭＳ分析の間の低衝突エネルギーおよび高衝突エネルギーの交互のスキャンは、１回の実験で両方のタンパク質の正体および量を得るために使用される。定量は、任意の所定のタンパク質に関して３種の最も強いトリプシンペプチドのＬＣ／ＭＳＥによって測定された平均シグナル強度が、タンパク質のタイプおよびサイズに拘わらず、所定の濃度で一定であることを示す実験データに基づく。シグナル強度は濃度に比例するので、混合物中の任意のタンパク質の量は、概算され得る。
【００９８】
（培養宿主）
上記インフルエンザウイルスは、代表的には、細胞株を使用して生成されるが、初代細胞が代替として使用され得る。上記細胞は、代表的には、哺乳動物のものであるが、トリもしくは昆虫細胞もまた、使用され得る。適切な哺乳動物細胞としては、ヒト、ハムスター、ウシ、霊長類およびイヌの細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ヒト非腎臓細胞もしくは非ヒト細胞である。種々の細胞が使用され得る（例えば、腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞など）。適切なハムスター細胞の例は、名称ＢＨＫ２１もしくはＨＫＣＣを有する細胞株である。適切なサルの細胞は、例えば、アフリカミドリザル細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞株のような腎臓細胞［１４〜１６］である。適切なイヌの細胞は、例えば、ＣＬＤＫおよびＭＤＣＫ細胞株のような腎臓細胞である。適切なトリ細胞としては、ニワトリ胚性幹細胞に由来するＥＢｘ細胞株、ＥＢ４５、ＥＢ１４、およびＥＢ１４−０７４［１７］が挙げられる。
【００９９】
さらに適切な細胞としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＨＯ；ＭＲＣ  ５；ＰＥＲ．Ｃ６［１８］；ＦＲｈＬ２；ＷＩ−３８など。適切な細胞は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ［１９］から、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［２０］から、もしくはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から、広く入手可能である。例えば、上記ＡＴＣＣは、種々の異なるＶｅｒｏ細胞をカタログ番号ＣＣＬ  ８１、ＣＣＬ  ８１．２、ＣＲＬ  １５８６およびＣＲＬ−１５８７の下で供給しており、ＭＤＣＫ細胞をカタログ番号ＣＣＬ  ３４の下で供給している。ＰＥＲ．Ｃ６は、ＥＣＡＣＣから寄託番号９６０２２９４０の下で入手可能である。
【０１００】
本発明における使用に好ましい細胞は、Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞［２１〜２３］である。元のＭＤＣＫ細胞は、ＡＴＣＣからＣＣＬ  ３４として入手可能である。これらの派生物または他のＭＤＣＫ細胞が使用されることは好ましい。このような派生物は、例えば、参考文献２１において記載されており、この参考文献は、懸濁培養における増殖に適合したＭＤＣＫ細胞（「ＭＤＣＫ  ３３０１６」もしくはＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９として寄託された「３３０１６−ＰＦ」）を開示している。さらに、参考文献２４は、無血清培養において懸濁物中で増殖するＭＤＣＫ由来の細胞（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４４９として寄託された「Ｂ−７０２」）を開示している。いくつかの実施形態において、使用されるＭＤＣＫ細胞株は、腫瘍形成性であり得るが、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞を使用することもまた、想定される。例えば、参考文献２５は、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞（「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０２）および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０３）が挙げられる）を開示する。参考文献２６は、「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １２０４２）を含む、非常に感染しやすいＭＤＣＫ細胞を開示している。
【０１０１】
本発明の方法において１種より多くの細胞タイプの混合物を使用することも考えられるが、１つの細胞タイプを使用すること、例えば、モノクローナル細胞を使用することが、好ましい。
【０１０２】
本発明の方法において使用される細胞は、好ましくは、ヒトへの投与に使用され得るインフルエンザワクチンを生成するために適した細胞である。このような細胞は、ワクチン製造について承認され、国の管理当局によって登録された細胞バンクシステムから得られなければならず、ワクチン生成について許可された最大継代数内でなければならない（概要については参考文献２７を参照のこと）。ワクチン製造について承認された適切な細胞の例としては、ＭＤＣＫ細胞（ＭＤＣＫ  ３３０１６のような；参考文献２１を参照のこと）、ＣＨＯ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、およびＰＥＲ．Ｃ６細胞が挙げられる。本発明の方法は、好ましくは、２９３Ｔ細胞を使用しない。なぜなら、これら細胞は、ワクチン製造について承認されていないからである。
【０１０３】
好ましくは、上記ウイルスを生成するため、および上記ワクチンを調製するために使用される細胞は、同じ細胞タイプである。例えば、上記細胞は、両方ともＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞もしくはＰｅｒＣ６細胞であり得る。これは、承認を１つの細胞株について得る必要しかないので、規制当局の承認を容易にすることから好ましい。それは、競合する培養選択圧もしくは異なる細胞培養条件が回避され得るというさらなる利点を有する。本発明の方法はまた、同じ細胞株をずっと、例えば、ＭＤＣＫ  ３３０１６を使用し得る。
【０１０４】
上記インフルエンザウイルスはまた、卵の中で増殖され得る。ワクチン用のインフルエンザウイルス増殖のための現在の標準的方法は、ＳＰＦ孵化鶏卵を使用し、ウイルスは、その卵の内容物（尿膜腔液）から精製される。ウイルスを卵によって継代し、その後、上記ウイルスを、細胞培養物中で増殖させることもまた可能であり、その逆もまた同様である。
【０１０５】
（ウイルス調製）
本発明は、インフルエンザウイルスを調製するための方法を提供し、上記方法は、（ａ）ワクチン生成に関する上記インフルエンザウイルスの適性を、上記で考察される方法によって試験する工程；（ｂ）培養宿主を、上記工程（ａ）のインフルエンザウイルスに感染させる工程；および（ｃ）上記工程（ｂ）の宿主を培養して、さらなるウイルスを生成する工程；および必要に応じて（ｄ）工程（ｃ）で得られたウイルスを精製する工程を包含する。
【０１０６】
上記培養宿主は、前段落で考察されるように、細胞または孵化鶏卵であり得る。細胞が、本発明のこの局面において培養宿主として使用される場合、細胞培養条件（例えば、温度、細胞密度、ｐＨ値など）が、使用される上記細胞株および上記ウイルスに依存する広い範囲にわたって変動性であり、本願の要件に適合され得ることは公知である。従って、以下の情報は、ガイドラインを表すに過ぎない。
【０１０７】
好ましくは、上記細胞は、一般的な汚染物質源を回避するために、血清の非存在下で培養される。真核生物細胞培養のための種々の無血清培地が、当業者に公知である（例えば、イスコフ培地、ウルトラＣＨＯ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、ＥＸ−ＣＥＬＬ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））。さらに、無タンパク質培地が使用され得る（例えば、ＰＦ−ＣＨＯ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））。さもなければ、複製のための細胞はまた、特注の血清含有培地（例えば、０．５％〜１０％のウシ胎仔血清を有する、ＭＥＭもしくはＤＭＥＭ培地）中で培養され得る。
【０１０８】
上記細胞の増殖は、当業者に公知の方法に従って行われ得る。例えば、上記細胞は、遠心分離もしくは濾過のような通常の補助的方法を使用する灌流システムにおいて培養され得る。さらに、上記細胞は、感染前に、流加システム（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｓｙｓｔｅｍ）で、本発明に従って増殖させられ得る。本発明の状況において、培養システムは、上記細胞が最初にバッチシステムで培養され、培地中の栄養分（もしくは栄養分の一部）の枯渇が、濃縮された栄養分の制御された供給によって補償される流加システムに関して言及される。感染前の細胞の増殖の間に上記培地のｐＨ値を、ｐＨ６．６〜ｐＨ７．８の値に、および特に、ｐＨ７．２〜ｐＨ７．３の間の値に調節することは、有利であり得る。細胞の培養は、好ましくは、３０℃〜４０℃の間の温度で行われる。感染細胞を培養する場合（工程ｃ）、上記細胞は、好ましくは、３０℃〜３６℃の間の温度もしくは３２℃〜３４℃の間の温度、または３３℃で培養される。これは、特に好ましい。なぜなら、この温度範囲での感染細胞のインキュベーションが、ワクチンへと処方される場合に改善された効率を生じるウイルスの生成を生じることが示されたからである［２８］。
【０１０９】
酸素分圧は、感染前の培養の間に、好ましくは、２５％〜９５％の間の値において、および特には、３５％〜６０％の間の値において調節され得る。本発明の状況において示される酸素分圧の値は、空気の飽和に基づく。細胞の感染は、バッチシステムにおいては、好ましくは、約８〜２５×１０５細胞／ｍＬの細胞密度で、もしくは灌流システムにおいては、好ましくは、約５〜２０×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で行われる。上記細胞は、１０−８〜１０の間、好ましくは、０．０００１〜０．５の間のウイルス用量（ＭＯＩ値（「感染多重度」；感染時の細胞あたりのウイルス単位の数に対応する）で感染させられ得る。
【０１１０】
ウイルスは、接着培養もしくは懸濁物中で、細胞において増殖させられ得る。マイクロキャリア培養が使用され得る。したがって、一部の実施形態において、上記細胞は、懸濁物中での増殖に適合され得る。
【０１１１】
本発明に従う方法は、ウイルスの採取および単離、またはウイルスによって生成されるタンパク質の採取および単離も含む。ウイルスもしくはタンパク質の単離の間に、上記細胞は、分離、濾過もしくは限外濾過のような標準的な方法によって培養培地から分離される。次いで、上記ウイルスもしくは上記タンパク質は、勾配遠心分離、濾過、沈殿、クロマトグラフィーなどの当業者に十分公知の方法に従って濃縮され、次いで、精製される。上記ウイルスが精製の間もしくは精製後に不活化されることも本発明にしたがって好ましい。ウイルス不活化は、上記精製プロセス内のいずれかの時点で、例えば、β−プロピオラクトンもしくはホルムアルデヒドによって行われ得る。
【０１１２】
（ワクチン）
インフルエンザワクチンは、一般に、生のウイルスもしくは不活化ウイルスのいずれかに基づく。不活化ワクチンは、本発明で好ましく、これらは、全ビリオン、「スプリット」ビリオン、もしくは精製表面抗原に基づき得る。抗原はまた、ビロソームの形態で提示され得る。本発明は、これらタイプのワクチンのうちのいずれかを製造するために使用され得る。しかし、それは、一般に核タンパク質を含むインフルエンザワクチンを製造するために特に適している。このようなインフルエンザワクチンは、生のウイルス、全ビリオンもしくはスプリットビリオンインフルエンザワクチンを含む。本発明によって包含されるワクチンは、核タンパク質が１以上のプロセス／製造工程の間に存在し、従って、核タンパク質を最終ワクチン組成物中におそらく含み得るワクチンであり、これは、特定のＭＨＣクラスＩＩレセプターサブタイプへのＮＰの結合を低減もしくは回避するための工程が採用されなければ、感受性の個体において自己免疫応答のリスクが増大し得る。
【０１１３】
本発明の第１の局面において、本発明のワクチンは、ＮＰタンパク質（もしくはそのフラグメント）がＸ−１７９Ａ株のＮＰタンパク質（もしくはそのフラグメント、例えば、配列番号２に示される配列のアミノ酸１０６もしくは１０８〜１１８もしくは１２０もしくは１２６からなるかまたはこれを含むフラグメント）より低いＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に対する結合親和性を有するインフルエンザＡ  ＮＰタンパク質を有する。他の方法で表すと、このようなワクチンのＮＰタンパク質は、Ｘ−１７９Ａ株のＮＰタンパク質（もしくはそのフラグメント、例えば、配列番号２に示される配列のアミノ酸１０６もしくは１０８〜１１８もしくは１２０もしくは１２６からなるかもしくはこれを含むフラグメント）と同じかそれより高い親和性でＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に結合する領域を欠いている。
【０１１４】
本発明の第２の局面において、本発明のワクチンは、配列番号２のアミノ酸残基１１６に対応する位置においてイソロイシンを欠いているインフルエンザＡ  ＮＰタンパク質を有する。例えば、上記ワクチン組成物中に存在するインフルエンザＡ  ＮＰタンパク質。
【０１１５】
先に考察されるように、本発明は、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターへの有意な結合を示し得るＮＰの存在を回避することが目的であるので、本発明の組成物におけるインフルエンザＡ核タンパク質への言及が組成物中の全インフルエンザＡ核タンパク質を考慮せねばならないということは明らかである。不活化ウイルスが使用される場合、上記ワクチンは、全ビリオン、スプリットビリオン、もしくは精製表面抗原（インフルエンザについては、ヘマグルチニンを含み、通常はまた、ノイラミニダーゼを含む）を含み得る。ウイルスを不活化するための化学的手段としては、以下の薬剤のうちの１つ以上の有効量での処理が挙げられる：洗剤、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、バイナリーエチルアミン、アセチルエチレンイミン、もしくはこれらの組み合わせ。ウイルス不活化の非化学的方法は、当該分野で公知である（例えば、ＵＶ光もしくはγ線照射）。種々の方法の組み合わせを使用してインフルエンザウイルスを不活化することもまた可能である。例えば、ＢＰＬおよびＵＶ光の組み合わせは有用である。
【０１１６】
これまでは、ナルコレプシー症例は、上記ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭのＤｒｅｓｄｅｎ抗原（以下を参照のこと）でワクチン接種した被験体においてのみバックグラウンド発生率より高い率で検出された。上記Ｄｒｅｓｄｅｎ抗原は、ＴｒｉｔｏｎおよびＴｗｅｅｎを含む。水中油型エマルジョンアジュバントならびにＴｗｅｅｎおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００洗剤を含む抗原を含むインフルエンザワクチンに由来するナルコレプシーのリスクを低減するために、２つの方法が考えられる：（ｉ）サブユニットワクチンにおけるように、ＮＰなし、もしくはＮＰの量が実質的に低減した抗原成分の使用、または（ｉｉ）ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に結合し得るＮＰもしくはそのフラグメントを含まないワクチン生成用のシードウイルスの使用。
【０１１７】
従って、本発明の一局面は、インフルエンザＡ  ＮＰタンパク質を含まないか、または上記ワクチン中の総インフルエンザウイルスタンパク質の質量で１５％未満、例えば、＜１２％、＜１０％、＜８％、＜７％、＜６％、＜５％、＜４％、＜３％、＜２％、もしくは＜１％のインフルエンザＡ  ＮＰタンパク質を含む、水中油型アジュバント化された不活化インフルエンザワクチンである。一実施形態において、上記アジュバントは、さらなる免疫増強因子であるトコフェロール、ＧＬＡもしくはＴＬＲアゴニストを含む。好ましい実施形態において、上記アジュバントは、ＡＳ０３である。一実施形態において、上記ウイルスは、ホルムアルデヒドで不活化されている。一実施形態において、上記ワクチンは、チメロサールを含む。好ましい実施形態において、上記ワクチンの抗原成分は、洗剤、特に、Ｔｗｅｅｎ  ８０および／もしくはＴｒｉｔｏｎ  ｘ−１００（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）を含む。好ましくは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とＨＡとの間の重量／容積比は、１．５〜１５の間である。好ましくは、Ｔｒｉｔｏｎ−１００ＴＭ濃度は、１０〜５００μｇ／ｍｌの間である。特に好ましい実施形態において、上記ワクチンは、ＡＳ０３でアジュバント化された精製サブユニットワクチンである。上記ワクチンの上記抗原および上記アジュバント成分は、予め混合されていてもよいし、投与前にエンドユーザー／ヘルスケア提供者が混合するために別個の容器中にあってもよい。本発明の一局面は、水中油型アジュバントとともに、特に、ＡＳ０３とともに処方するために上記で特定された抗原成分の使用である。
【０１１８】
本発明の別の局面は、ＮＰタンパク質を含むが、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に結合し得るＮＰタンパク質もしくはＮＰフラグメントを含まない、ＡＳ０３アジュバント化不活化スプリットインフルエンザＡワクチンである。これは、Ｆｏｅｃｅｔｒｉａ（Ｘ−１８１）で使用されるものに類似であるが、ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭで使用されるものとは異なるバックボーンが使用される場合に、達成され得る。好ましい実施形態において、上記ワクチンは、Ｈ１株、Ｈ３株、Ｈ５株、Ｈ７株もしくはＨ９株に対するものであり、特に好ましい実施形態では、汎流行性Ｈ１株、Ｈ３株、Ｈ５株、Ｈ７株もしくはＨ９株に対するものである。一実施形態において、上記ウイルスは、ホルムアルデヒドで不活化されている。一実施形態において、上記ワクチンは、チメロサールを含む；代替の実施形態において、それは、保存剤を含まない。上記ワクチンの抗原成分は、洗剤、特に、Ｔｗｅｅｎ  ８０および／もしくはＴｒｉｔｏｎ  ｘ−１００（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）を含む。好ましくは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とＨＡとの間の重量／容積比は、１．５〜１５の間である。好ましくは、Ｔｒｉｔｏｎ−１００ＴＭ濃度は、１０〜５００μｇ／ｍｌの間である。上記ワクチンは、類似のもしくは同一の濃度でＷＯ２０１１／０５１２３５の表に示されるとおりの賦形剤を含み得る（以下を参照のこと）。上記ワクチンの上記抗原および上記アジュバント成分は、予め混合されていてもよいし、投与前にエンドユーザー／ヘルスケア提供者が混合するために別個の容器中にあってもよい。本発明の一局面は、水中油型アジュバントとともに、特に、ＡＳ０３とともに処方するために上記で特定された抗原成分の使用である。
【０１１９】
本発明の別の局面は、同一条件下でＸ−１７９Ａ株由来の核タンパク質と比較してより低い親和性で、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に結合するＮＰタンパク質を含む、ＡＳ０３アジュバント化不活化スプリットインフルエンザＡワクチンである。好ましい実施形態において、上記ワクチンは、Ｈ１株、Ｈ３株、Ｈ５株、Ｈ７株もしくはＨ９株に対するものであり、特に好ましい実施形態では、汎流行性Ｈ１株、Ｈ３株、Ｈ５株、Ｈ７株、もしくはＨ９株に対するものである。上記ワクチンの抗原成分は、洗剤、特に、Ｔｗｅｅｎ  ８０および／もしくはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む。上記ワクチンは、類似のもしくは同一の濃度でＷＯ２０１１／０５１２３５の表に示されるとおりの賦形剤を含み得る（以下を参照のこと）。上記ワクチンの上記抗原および上記アジュバント成分は、予め混合されていてもよいし、投与前にエンドユーザー／ヘルスケア提供者が混合するために別個の容器中にあってもよい。本発明の一局面は、水中油型アジュバントとともに、特に、ＡＳ０３とともに処方するために上記で特定された抗原成分の使用である。
【０１２０】
本発明の別の局面は、配列番号２のアミノ酸１１６に対応する位置においてイソロイシンを含まないＮＰタンパク質（図１を参照のこと）を含む、ＡＳ０３アジュバント化不活化スプリットインフルエンザＡワクチンである。好ましい実施形態において、上記ワクチンは、Ｈ１株、Ｈ３株、Ｈ５株、Ｈ７株もしくはＨ９株に対するものであり、特に好ましい実施形態では、汎流行性Ｈ１株、Ｈ３株、Ｈ５株、Ｈ７株、もしくはＨ９株に対するものである。上記ワクチンの抗原成分は、洗剤、特に、Ｔｗｅｅｎ  ８０および／もしくはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む。上記ワクチンは、類似のもしくは同一の濃度でＷＯ２０１１／０５１２３５の表に示されるとおりの賦形剤を含み得る（以下を参照のこと）。上記ワクチンの上記抗原および上記アジュバント成分は、予め混合されていてもよいし、投与前にエンドユーザー／ヘルスケア提供者が混合するために別個の容器中にあってもよい。本発明の一局面は、水中油型アジュバントとともに、特に、ＡＳ０３とともに処方するために上記で特定された抗原成分の使用である。
【０１２１】
本発明の別の局面は、配列ＬＸＬＹＸＸＸＩＸＸＸＸＸＸ（配列番号９）を含まないＮＰタンパク質（ここでＸは、任意のアミノ酸である）を含む、ＡＳ０３アジュバント化不活化スプリットインフルエンザＡワクチンである。好ましい実施形態において、上記ワクチンは、Ｈ１株、Ｈ３株、Ｈ５株、Ｈ７株もしくはＨ９株に対するものであり、特に好ましい実施形態では、汎流行性Ｈ１株、Ｈ３株、Ｈ５株、Ｈ７株、もしくはＨ９株に対するものである。上記ワクチンは、類似のもしくは同一の濃度でＷＯ２０１１／０５１２３５の表に示されるとおりの賦形剤を含み得る（以下を参照のこと）。上記ワクチンの上記抗原および上記アジュバント成分は、予め混合されていてもよいし、投与前にエンドユーザー／ヘルスケア提供者が混合するために別個の容器中にあってもよい。本発明の一局面は、水中油型アジュバントとともに、特に、ＡＳ０３とともに処方するために上記で特定された抗原成分の使用である。
【０１２２】
ビリオンは、ウイルス含有流体（例えば、尿膜腔液もしくは細胞培養上清）から、種々の方法によって採取され得る。例えば、精製プロセスは、上記ビリオンを破壊するために洗剤を含む線形スクロース勾配溶液を使用するゾーン遠心分離を含み得る。次いで、抗原は、ダイアフィルトレーションによって、必要に応じた希釈の後に精製され得る。
【０１２３】
スプリットビリオンは、精製されたビリオンを洗剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート  ８０、デオキシコレート、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ９など）で処理して、サブビリオン調製物を生成する（「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」スプリットプロセスを含む）ことによって得られる。インフルエンザウイルスをスプリットするための方法は、例えば、当該分野で周知である（例えば、参考文献２９〜３４などを参照のこと）。上記ウイルスのスプリットは、代表的には、感染性であろうと非感染性であろうと、破壊濃度のスプリット薬剤で全ウイルスを破壊するかもしくはフラグメント化することによって行われる。上記破壊は、上記ウイルスタンパク質の完全なもしくは部分的な可溶化を生じ、上記ウイルスの完全性を変化させる。好ましいスプリット薬剤は、非イオン性界面活性剤およびイオン性（例えば、カチオン性）界面活性剤（例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、ＮＰ９、４級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｃｅｔａｖｌｏｎ、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびＤＯＴ−ＭＡ）、オクチル−もしくはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００もしくはＴｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１））、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルなどである。１つの有用なスプリット手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの連続的効果を使用し、スプリットは、最初のビリオン精製の間に起こり得る（例えば、スクロース密度勾配溶液において）。よって、スプリットプロセスは、上記ビリオン含有材料の清澄化（非ビリオン材料を除去するために）、上記採取したビリオンの濃縮（例えば、吸着法（例えば、ＣａＨＰＯ４吸着）を使用して）、非ビリオン材料からの全ビリオンの分離、密度勾配遠心分離工程においてスプリット薬剤を使用する（例えば、デオキシコール酸ナトリウムのようなスプリット薬剤を含むスクロース勾配を使用する）ビリオンのスプリット、次いで、望ましくない物質を除去するための濾過（例えば、限外濾過）を含み得る。スプリットビリオンは、有用には、リン酸ナトリウム緩衝化等張性塩化ナトリウム溶液中で再懸濁され得る。スプリットインフルエンザワクチンの例は、ＢＥＧＲＩＶＡＣＴＭ、ＦＬＵＡＲＩＸＴＭ、ＦＬＵＺＯＮＥＴＭおよびＦＬＵＳＨＩＥＬＤＴＭ製品である。
【０１２４】
精製されたインフルエンザウイルス表面抗原ワクチン（糖タンパク質）は、表面抗原であるヘマグルチニン、および代表的には、同様にノイラミニダーゼを含む。精製形態でこれらタンパク質を調製するためのプロセスは、当該分野で周知である。上記ＦＬＵＶＩＲＩＮＴＭ、ＡＧＲＩＰＰＡＬＴＭおよびＩＮＦＬＵＶＡＣＴＭ製品は、インフルエンザサブユニットワクチンである。精製表面糖タンパク質ワクチンは、スプリットワクチンに対して特に有利であり得る。なぜならそれらは、遙かにより低レベルのＮＰタンパク質を含むからである。
【０１２５】
別の形態の不活化抗原は、ビロソーム［３５］（核酸を含まないウイルス様リポソーム粒子）である。ビロソームは、洗剤でのウイルスの可溶化、続いて、ヌクレオキャプシドの除去およびウイルス糖タンパク質を含む膜の再構成によって、調製され得る。ビロソームを調製するための代替法は、ウイルス膜糖タンパク質を過剰量のリン脂質に添加して、それらの膜中においてリポソームにウイルスタンパク質を与えることを含む。
【０１２６】
本発明の方法はまた、生ワクチンを精製するために使用され得る。このようなワクチンは、通常、ビリオン含有流体からビリオンを精製することによって調製される。例えば、上記流体は、遠心分離によって清澄化され得、緩衝液（例えば、スクロース、リン酸カリウム、およびグルタミン酸一ナトリウムを含む）で安定化され得る。生の弱毒化インフルエンザウイルスワクチンの種々の形態が、現在利用可能である（例えば、参考文献３６の第１７章および第１８章を参照のこと）。生ワクチンとしては、ＦＬＵＭＩＳＴＴＭ製品が挙げられる。
【０１２７】
本発明が、生のワクチンに関する場合、組成物中での特定のインフルエンザウイルスＡ核タンパク質の存在もしくは非存在への言及はまた、上記ワクチン内の株によってコードされる核タンパク質、ならびに上記ワクチン自体の中の核タンパク質に当てはまり得る。例えば、上記インフルエンザＡ株は、配列番号２のアミノ酸１０６〜１１８に等価なフラグメントが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２を含むＭＨＣクラスＩＩレセプターに結合する核タンパク質をコードし得る。Ｘ−１７９Ａのように、Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０バックボーンは、１１６位にイソロイシンを有する（ＡＹ２１００７４を参照のこと）ので、本発明の有用な生ワクチンは、１１６位においてイソロイシン以外の残基（例えば、メチオニン）を有するＮＰをコードするインフルエンザＡウイルス株を含む。
【０１２８】
上記ウイルスは、弱毒化され得る。上記ウイルスは、温度感受性であり得る。上記ウイルスは、低温適合（ｃｏｌｄ−ａｄａｐｔｅｄ）され得る。これら３つの特徴は、生のウイルスを抗原として使用する場合に特に有用である。
【０１２９】
ＨＡは、現在の不活化インフルエンザワクチンにおける主要な免疫原であり、ワクチン用量は、ＨＡレベルを参照することによって標準化されている（代表的には、ＳＲＩＤによって測定される）。既存のワクチンは、代表的には、１株あたり約１５μｇのＨＡを含むが、より低い用量が、使用され得る（例えば、小児に関して、もしくは汎流行的状況において、またはアジュバントを使用する場合）。分割量（例えば、１／２（すなわち、７．５μｇ  ＨＡ／株）、１／４および１／８）が使用されてきたことと同様に、より高い用量も使用されてきた（例えば、３×もしくは９×用量［３７、３８］）。従って、ワクチンは、０．１〜１５０μｇの間のＨＡ／インフルエンザ株、好ましくは、０．１〜５０μｇの間（例えば、０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇなど）を含み得る。特定の用量としては、１株あたり、例えば、約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約３．７５、約１．９、約１．５などが挙げられる。好ましい実施形態において、上記ワクチンは、＜３０μｇ／ｍｌの濃度でＨＡを含む。それはまた、＜１０μｇ／単位用量、７．５μｇ／単位用量；＜５μｇ／単位用量；もしくは３．７５μｇ／単位用量の濃度でＨＡを含み得る。
【０１３０】
生ワクチンに関して、投与は、ＨＡ含有量よりむしろ、５０％組織培養感染量（ｍｅｄｉａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｏｓｅ）（ＴＣＩＤ５０）によって測定され、１株あたり１０６〜１０８の間の（好ましくは、１０６．５〜１０７．５の間の）ＴＣＩＤ５０が、代表的である。
【０１３１】
本発明で使用されるインフルエンザ株は、野生型ウイルスにおいて見いだされる天然のＨＡ、もしくは改変ＨＡを有し得る。例えば、ＨＡを改変して、ウイルスをトリ種において非常に病原性にさせる決定基（例えば、ＨＡ１／ＨＡ２切断部位の周りの非常に塩基性の領域）を除去することは、公知である。逆遺伝学の使用は、このような改変を促進する。
【０１３２】
汎流行性間期の株に対して免疫化するために適しているのに加えて、本発明の組成物は、汎流行性もしくは潜在的に汎流行性の株に対して免疫化するために特に有用である。本発明は、ヒトおよび非ヒト動物にワクチン接種するのに適している。
【０１３３】
抗原が上記組成物中に有用に含まれ得る他の株は、抗ウイルス治療に抵抗性である（例えば、オセルタミビル［３９］および／もしくはザナミビルに抵抗性である）株である（耐性汎流行性株を含む［４０］）。
【０１３４】
本発明の組成物は、１つ以上の（例えば、１つ、２つ、３つ、４つもしくはそれより多い）インフルエンザウイルス株（インフルエンザＡ型ウイルスおよび／もしくはインフルエンザＢ型ウイルスを含む）に由来する抗原を含み得る。ワクチンが１より多くのインフルエンザ株を含む場合、異なる株は、代表的には、別個に増殖させられ、上記ウイルスが採取された後に混合され、抗原が調製されてきた。従って、本発明のプロセスは、１より多くのインフルエンザ株に由来する抗原を混合する工程を包含し得る。三価ワクチンは、代表的である（２つのインフルエンザＡ型ウイルス株および１つのインフルエンザＢ型ウイルス株に由来する抗原を含む）。四価ワクチンもまた有用である［４１］（２つのインフルエンザＡ型ウイルス株および２つのインフルエンザＢ型ウイルス株に由来する抗原を含むか、または３つのインフルエンザＡ型ウイルス株および１つのインフルエンザＢ型ウイルス株に由来する抗原を含む）。
【０１３５】
インフルエンザワクチンは、季節性インフルエンザ株由来の抗原のみを有してもよいし、汎流行性株由来の抗原のみ（一価）を有していてもよい。従って、上記ワクチン組成物は、１つのＡ株のみを有する一価の汎流行性のものであり得る。それはまた、季節性および汎流行性両方のインフルエンザ株由来の抗原を有し得る。例えば、上記ワクチンは、３つの季節性インフルエンザ株（例えば、２つのＡ株および１つのＢ株）および１つの汎流行性インフルエンザ株由来の抗原を含む四価ワクチンであり得る。三価の季節性インフルエンザワクチンもまた、一価の汎流行性インフルエンザワクチンとともに投与され得る。
【０１３６】
１つの好ましい実施形態において、上記ワクチンは、４種以上のインフルエンザウイルス株に由来する抗原を含む。特に好ましい実施形態において、上記ワクチンは、２つのＡ株および２つのＢ株を含む。例えば、（ｉ）Ａ／Ｈ１Ｎ１株；（ｉｉ）Ａ／Ｈ３Ｎ２株；（ｉｉｉ）Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株；および（ｉｖ）Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株。別の特に好ましい実施形態において、上記の株のうちの１種は、例えば、（ｉ）Ａ／Ｈ１Ｎ１株；（ｉｉ）Ａ／Ｈ３Ｎ２株；および（ｉｉｉ）Ｂ株と組み合わせた、Ｈ５Ｎ１株もしくはＨ７Ｎ９株のような汎流行性株である。上記四価以上のワクチンは、アジュバント化され得る。
【０１３７】
インフルエンザＡウイルスは、現在１８種のＨＡサブタイプを示す：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、およびＨ１８。それは現在、９種のＮＡサブタイプを有する：Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８およびＮ９。２種のインフルエンザＡウイルス株を含むワクチンにおいて、これらは通常、異なるＨＡサブタイプ（例えば、Ｈ１およびＨ３）および異なるＮＡサブタイプ（例えば、Ｎ１およびＮ２）に由来するので、ワクチンは、例えば、Ｈ１Ｎ１株およびＨ３Ｎ２株由来の抗原を含み得る。
【０１３８】
インフルエンザＢウイルスは、現在異なるＨＡサブタイプを示さないが、インフルエンザＢウイルス株は、２つの異なる系統に入る。これら系統は、１９８０年代後半に出現し、互いに抗原的におよび／もしくは遺伝的に区別され得るＨＡを有する［４２］。本発明のワクチンが２つのインフルエンザＢ株由来の抗原を含む場合、これらは通常、一方はＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株であり、一方はＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株である。これら株は通常、抗原的に区別されるが、アミノ酸配列の差異はまた、上記２系統を区別するために記載されてきた。例えば、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株は、アミノ酸残基１６４（「Ｌｅｅ４０」ＨＡ配列と比較して番号付けされる）において欠失を有するＨＡタンパク質をしばしば（しかし常にではない）有する［４３］。
【０１３９】
（薬学的組成物）
本発明に従って製造されるワクチン組成物は、薬学的に受容可能である。それらは、通常、上記抗原に加えて、成分を含む。例えば、それらは、代表的には、１種以上の薬学的キャリアおよび／もしくは賦形剤を含む。以下に記載されるように、アジュバントもまた含まれ得る。このような成分の詳細な議論は、参考文献４４で入手される。
【０１４０】
ワクチン組成物は、一般に、水性形態にある。しかし、いくつかのワクチンは、乾燥形態、例えば、注射可能な固体、またはパッチ上の、乾燥したかもしくは重合した調製物の形態にあり得る。
【０１４１】
ワクチン組成物は、チオメルサールもしくは２−フェノキシエタノールのような保存剤を含み得る。しかし、上記ワクチンは、実質的に水銀物質を実質的に含まないべきである（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満）ことが好ましい（例えば、チオメルサールを含まない［３３、４５］）。水銀を含まないワクチンは、より好ましい。α−トコフェロールスクシネートは、水銀化合物の代替として含まれ得る［３３］。保存剤非含有ワクチンは、特に好ましい。
【０１４２】
張度を制御するために、組成物は、生理学的塩（例えば、ナトリウム塩）を含み得ることは好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、塩化ナトリウムは、１〜２０ｍｇ／ｍｌの間で存在し得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、無水リン酸二ナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。
【０１４３】
ワクチン組成物は、一般に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間（好ましくは、２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間）の質量オスモル濃度を有し、より好ましくは、２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内に入る。ワクチン接種によって引き起こされる疼痛に対して影響を有さない質量オスモル濃度が以前に報告されている［４６］が、この範囲において質量オスモル濃度を維持することは好ましい。
【０１４４】
ワクチン組成物は、１種以上の緩衝剤を含み得る。代表的な緩衝剤としては、以下が挙げられる：リン酸塩緩衝剤；Ｔｒｉｓ緩衝剤；ホウ酸塩緩衝剤；コハク酸塩緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤（特に、水酸化アルミニウムアジュバントで）；またはクエン酸塩緩衝剤。緩衝剤は、代表的には、５〜２０ｍＭ範囲で含まれる。
【０１４５】
ワクチン組成物のｐＨは、一般に、５．０〜８．１の間、より代表的には、６．０〜８．０の間（例えば、６．５〜７．５の間、または７．０〜７．８の間）である。本発明のプロセスは、従って、バルクワクチンのｐＨを、パッケージ前に調節する工程を包含し得る。
【０１４６】
上記ワクチン組成物は、好ましくは、無菌である。上記ワクチン組成物は、好ましくは、非発熱性である（例えば、１用量あたり＜１  ＥＵ（エンドトキシン単位、標準的な尺度）、好ましくは、＜０．１  ＥＵ／用量を含む）。上記ワクチン組成物は、好ましくは、グルテン非含有である。
【０１４７】
本発明のワクチン組成物は、洗剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎ」として公知）、オクトキシノール（例えば、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）もしくはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（「ＣＴＡＢ」）、またはデオキシコール酸ナトリウム（特に、スプリットワクチンもしくは表面抗原ワクチンのために））を含み得る。上記洗剤は、微量においてのみ存在し得る。従って、上記ワクチンは、オクトキシノール−１０およびポリソルベート８０の各々について１ｍｇ／ｍｌ未満で含み得る。他の残りの微量の成分は、抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。
【０１４８】
ワクチン組成物は、１回の免疫化のための物質を含んでいてもよいし、複数回の免疫化のための物質を含んでいてもよい（すなわち、「複数用量」キット）。保存剤を含めることは、複数用量の構成（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）において好ましい。複数用量組成物中に保存剤を含める代替として（もしくはそれに加えて）、上記組成物は、物質の取り出しのための無菌アダプタを有する容器中に含まれ得る。
【０１４９】
インフルエンザワクチンは、代表的には、約０．５ｍｌの投与体積（単位用量）で投与されるが、半用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）が、小児に投与され得る。
【０１５０】
組成物およびキットは、好ましくは、２℃〜８℃の間で貯蔵される。それらは、凍結されるべきではない。それらは、理想的には、遮光して保持されるべきである。
【０１５１】
（宿主細胞ＤＮＡ）
ウイルスが単離され、そして／または細胞株上で増殖させられた場合、最終ワクチン中に残っている細胞株ＤＮＡのいかなる潜在的な腫瘍形成活性をも最小限にするために、上記ＤＮＡの量を最小限にすることは、標準的な実施である。
【０１５２】
従って、本発明に従って調製されるワクチン組成物は、好ましくは、１用量あたり１０ｎｇ（好ましくは、１ｎｇ未満、より好ましくは、１００ｐｇ未満）の残留宿主細胞ＤＮＡを含むが、微量の宿主細胞ＤＮＡが存在し得る。
【０１５３】
あらゆる残留宿主細胞ＤＮＡの平均長が５００ｂｐ未満（例えば、４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満など）であることは、好ましい。
【０１５４】
夾雑するＤＮＡは、標準的精製手順（例えば、クロマトグラフィーなど）を使用するワクチン調製の間に除去され得る。残留宿主細胞ＤＮＡの除去は、ヌクレアーゼ処理によって（例えば、ＤＮａｓｅを使用することによって）増強され得る。宿主細胞ＤＮＡ夾雑物を減らすための便利な方法は、２工程処理（第１は、ＤＮａｓｅ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（これは、ウイルス増殖の間に使用され得る）を、次いで、カチオン性洗剤（例えば、ＣＴＡＢ）（これは、ビリオン破壊の間に使用され得る）使用する）を含む参考文献４７および４８において開示される。アルキル化剤（例えば、β−プロピオラクトン）での処理はまた、宿主細胞ＤＮＡを除去するために使用され得、有利なことには、ビリオンを不活化するためにも使用され得る［４９］。ＤＮａｓｅもしくはアルキル化剤が、ＤＮＡ除去のために使用される場合、上記ＤＮａｓｅもしくはアルキル化剤（好ましくは、ＢＰＬ）はまた、生成プロセスの間に１回より多く（例えば、２回）添加され得る。ＤＮＡ除去はまた、ＤＮａｓｅとアルキル化剤との組み合わせを使用して達成され得る。
【０１５５】
（アジュバント）
本発明の組成物は、有利には、アジュバントを含み得る。これは、上記組成物を受ける被験体において誘発される免疫応答（液性および／もしくは細胞性）を高めるように機能し得る。好ましいアジュバントは、水中油型エマルジョンを含む。種々のこのようなアジュバントは公知であり、それらは、代表的には、少なくとも１種の油および少なくとも１種の界面活性剤を含み、上記油および界面活性剤は、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。上記エマルジョン中の油滴は、一般に、直径５μｍ未満であり、理想的には、サブミクロンの直径を有し、これら小さなサイズは、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ）で達成されて、安定なエマルジョンを提供する。２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴は、濾過滅菌に供され得るので、好ましい。
【０１５６】
前記エマルジョンは、動物（例えば魚類）供給源または植物供給源からのものなどの油を含むことができる。植物油の供給源としては、堅果、種子および穀粒が挙げられる。ラッカセイ油、ダイズ油、ヤシ油およびオリーブ油が、最も一般的に利用できる堅果油の例である。例えばホホバ豆から得られる、ホホバ油を使用することができる。種子油としては、紅花油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油およびこれらに類するものが挙げられる。穀粒の群の中で、トウモロコシ油が最も容易に入手できるが、他の穀類の穀粒、例えばコムギ、オートムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギおよびこれらに類するものの油も使用することができる。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油中に天然に存在しないが、堅果油および種子油から出発して適切な材料の加水分解、分離およびエステル化によって調製することができる。哺乳動物の乳からの脂肪および油は代謝性であり、従って、本発明の実施の際に使用することができる。動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、鹸化および他の手段についての手順は、当該技術分野において周知である。殆どの魚類は、容易に回収できる代謝性の油を含有する。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨油、例えば鯨ろうが、ここで使用することができる魚油のいくつかの例である。多数の分岐鎖油が５炭素イソプレン単位で生化学的に合成されており、一般にテルペノイドと呼ばれる。サメ肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサン、として公知の、分岐した不飽和テルペノイドを含有し、これは、ここで特に好ましい。スクワラン、スクアレンの飽和類似体、も好ましい油である。スクアレンおよびスクワランを含む、魚油は、商業的供給源から容易に入手することができ、または当該技術分野において公知の方法によって得ることができる。
【０１５７】
いくつかの実施形態に関して別の好ましい油は、α−トコフェロールである。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールは両方とも使用され得、好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールである。上記トコフェロールは、いくつかの形態、例えば、種々の塩および／もしくは異性体をとり得る。塩としては、有機塩（例えば、コハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩など）が挙げられる。このトコフェロールの塩が使用されるべき場合、好ましい塩は、コハク酸塩である。ＡＳ０３アジュバントで認められるように、スクアレンおよびａ  トコフェロール（例えば、ＤＬ−α−トコフェロール）を含む油の組み合わせが使用され得る。しかし、上記で説明されるように、いくつかの実施形態において、エマルジョンはいかなるさらなる免疫刺激剤をも含まない。その場合、上記エマルジョンは、α−トコフェロールを含まない。
【０１５８】
スクアレンを含む水中油型エマルジョンは、本発明での使用に最も好ましいアジュバントである（例えば、ＭＦ５９もしくはＡＳ０３（またはトコフェロールを欠く改変型ＡＳ０３））。従って、好ましいエマルジョンは、（ｉ）水もしくは緩衝液、（ｉｉ）スクアレン、ならびに（ｉｉｉ）ポリソルベート８０および／もしくはソルビタントリオレエートから本質的になり得る。
【０１５９】
油の混合物を使用することができる。
【０１６０】
界面活性剤をそれらの「ＨＬＢ」（親水親油バランス）によって分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、およびさらに好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；商品名ＤＯＷＦＡＸＴＭで販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば、線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；反復エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が様々であり得るオクトキシノール、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、すなわちｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質、例えばホスファチジルコリン（レシチン）；ノニルフェノールエトキシレート、例えばＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭＮＰシリーズ；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールから誘導されたポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）、例えばトリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０）；ならびにソルビタンエステル（一般にＳＰＡＮとして公知）、例えばソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ  ８５）およびソルビタンモノラウレートを含む（しかしこれらに限定されない）界面活性剤と共に用いることができる。非イオン性界面活性剤が好ましい。前記エマルジョンに含めるために好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ  ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【０１６１】
界面活性剤の混合物、例えばＴｗｅｅｎ  ８０／Ｓｐａｎ  ８５混合物、を使用することができる。ポリオキシエチレンソルビタンエステル、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ  ８０）、およびオクトキシノール、例えばｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、の組み合わせも適する。別の有用な組み合わせは、ラウレス９とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。
【０１６２】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０）０．０１％から１％、特に約０．１％；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の洗剤）０．００１％から０．１％、特に０．００５％から０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス９）０．１％から２０％、好ましくは０．１％から１０％および特に０．１％から１％または約０．５％である。
【０１６３】
上記ワクチンがスプリットウイルスを含む場合、上記ワクチンは、水相中に遊離界面活性剤を含むことが好ましい。これは、上記遊離界面活性剤が、上記抗原に対して「スプリット効果」を発揮し得、それによって、他の状態で存在し得る任意の非スプリットビリオンおよび／もしくはビリオン凝集物を破壊するので、有利である。遊離界面活性剤は、存在し得るいかなる非スプリットビリオンの凝集をもさらに妨げ得る。これは、スプリットウイルスワクチンの安全性を改善し得る［５０］。
【０１６４】
好ましいエマルジョンは、＜１μｍの平均液滴サイズ（例えば、≦７５０ｎｍ、≦５００ｎｍ、≦４００ｎｍ、≦３００ｎｍ、≦２５０ｎｍ、≦２２０ｎｍ、≦２００ｎｍ、もしくはこれより小さい）を有し得る。これら液滴サイズは、便利なことには、微小流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓａｔｉｏｎ）のような技術によって達成され得る。
【０１６５】
本発明で有用な特定の水中油型エマルジョンアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６６】
・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ  ８０、およびＳｐａｎ８５のサブミクロンエマルジョン。上記エマルジョンの体積での組成は、約５％  スクアレン、約０．５％  ポリソルベート８０および約０．５％  Ｓｐａｎ  ８５であり得る。重量では、これらの比は、４．３％  スクアレン、０．５％  ポリソルベート８０および０．４８％  Ｓｐａｎ  ８５になる。このアジュバントは、引用文献５４の第１０章および引用文献５５の第１２章により詳細に記載されるように、「ＭＦ５９」として公知である［５１〜５３］。上記ＭＦ５９エマルジョンは、有利なことには、クエン酸イオン（例えば、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム緩衝液）を含む。
【０１６７】
・スクアレン、α−トコフェロール、およびポリソルベート８０を含むエマルジョン。このエマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水を含み得る。これらエマルジョンは、体積で２〜１０％  スクアレン、２〜１０％  トコフェロールおよび０．３〜３％  ポリソルベート８０を有し得、スクアレン：トコフェロールの重量比は、好ましくは、＜１（例えば、０．９０）である。なぜなら、これは、より安定なエマルジョンを提供し得るからである。スクアレンおよびポリソルベート８０は、約５：２の体積比もしくは約１１：５の重量比で存在し得る。それゆえ、これら３種の成分（スクアレン、トコフェロール、ポリソルベート８０）は、１０６８：１１８６：４８５またはおおよそ５５：６１：２５の重量比で存在し得る。１つのこのようなエマルジョン（「ＡＳ０３」［５６］）は、１用量あたり（もしくはその一部であるが、質量比を維持する）、例えば、０．５ｍｌ容積において、４．８６ｍｇ  ポリソルベート８０、１０．６９ｍｇ  スクアレンおよび１１．８６ｍｇ  α−トコフェロールを有する。ＡＳ０３は、Ｔｗｅｅｎ  ８０をＰＢＳ中に溶解して、２％溶液を与え、次いで、この溶液９０ｍｌと、（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌ  スクアレン）の混合物とを混合し、次いで、上記混合物を微小流動化する（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅ）ことによって、作製され得る。得られたエマルジョンは、例えば、１００〜２５０ｎｍの間、好ましくは、約１８０ｎｍの平均直径を有するサブミクロン油滴を有し得る。上記エマルジョンはまた、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３−ｄｅ−Ｏ−ａｃｙｌａｔｅｄ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）（３ｄ−ＭＰＬ）を含み得る。このタイプの別の有用なエマルジョンは、ヒトの用量あたり、例えば、上記で検討した比で０．５〜１０ｍｇ  スクアレン、０．５〜１１ｍｇ  トコフェロール、および０．１〜４ｍｇ  ポリソルベート８０を含み得る［５７］。
【０１６８】
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）のエマルジョン。上記エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬ（下記を参照のこと）を含み得る。上記エマルジョンは、リン酸緩衝液を含み得る。
【０１６９】
・ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）およびトコフェロール（例えば、α−トコフェロールスクシネート）を含むエマルジョン。上記エマルジョンは、約７５：１１：１０（例えば、７５０μｇ／ｍｌ  ポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１００μｇ／ｍｌ  α−トコフェロールスクシネート）の質量比でこれら３種の成分を含み得、これら濃度は、抗原由来のこれら成分の何らかの寄与を含むはずである。上記エマルジョンはまた、スクアレンを含み得る。上記エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬ（下記を参照のこと）を含み得る。その水相は、リン酸緩衝液を含み得る。
【０１７０】
・スクアラン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭ  Ｌ１２１」）のエマルジョン。上記エマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中に処方され得る。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドの有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバント中でトレオニル−ＭＤＰとともに使用されてきた［５８］（０．０５〜１％  Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％  スクアラン、２．５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％  ポリソルベート８０）。このエマルジョンはまた、「ＡＦ」アジュバントでのように［５９］（５％  スクアラン、１．２５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％  ポリソルベート８０）、上記Ｔｈｒ−ＭＤＰなしでも使用され得る。微小流動化が好ましい。
【０１７１】
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルもしくはマンニドエステル（ｍａｎｎｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）（例えば、ソルビタンモノオレエート（ｍｏｎｏｌｅａｔｅ）もしくは「Ｓｐａｎ  ８０」））を含むエマルジョン。上記エマルジョンは、好ましくは、熱可逆性であり、そして／または上記油滴のうちの少なくとも９０％（体積で）が、２００ｎｍ未満のサイズを有する［６０］。上記エマルジョンはまた、アルジトール；凍結保護剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）（例えば、糖（例えば、ドデシルマルトシドおよび／もしくはスクロース））；および／またはアルキルポリグリコシドのうちの１種以上を含み得る。上記エマルジョンは、ＴＬＲ４アゴニストを含み得る［６１］。このようなエマルジョンは、凍結乾燥され得る。
【０１７２】
・スクアレン、ポロキサマー１０５およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅのエマルジョン［６２］。アジュバント化ワクチン中のこれら成分の最終濃度（重量）は、５％  スクアレン、４％  ポロキサマー１０５（プルロニックポリオール）および２％  Ａｂｉｌ−Ｃａｒｅ  ８５（ビス−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６  ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ジメチコン；カプリル／カプリントリグリセリド）である。
【０１７３】
・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献６３に記載されるように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロン液滴サイズが有利である。
【０１７４】
・非代謝性の油（例えば、軽油（ｌｉｇｈｔ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｏｉｌ））および少なくとも１種の界面活性剤（例えば、レシチン、Ｔｗｅｅｎ  ８０もしくはＳｐａｎ  ８０）のサブミクロン水中油型エマルジョン。添加剤が含まれ得る（例えば、ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−親油性結合体（例えば、参考文献６４に記載され、グルクロン酸のカルボキシル基を介して、脂肪族アミンを、デスアシルサポニン（ｄｅｓａｃｙｌｓａｐｏｎｉｎ）に添加することにより生成されるＧＰＩ−０１００）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｍｅｔｈｙｉｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）および／もしくはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミン）。
【０１７５】
・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡもしくはＱＳ２１）およびステロール（例えば、コレステロール）が螺旋状ミセルとして会合されるエマルジョン［６５］。
【０１７６】
・鉱油、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／もしくはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［６６］。
【０１７７】
・鉱油、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／もしくはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［６６］。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、エマルジョンは、送達時に抗原と即座に混合され得、従って、上記アジュバントおよび抗原は、パッケージされたもしくは配布されたワクチン（使用時に最終処方物の準備ができている）では別個に保持され得る。他の実施形態において、エマルジョンは、製造の間に抗原と混合され、従って、上記組成物は、液体アジュバント化形態（ｌｉｑｕｉｄ  ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ｆｏｒｍ）においてパッケージされる。上記抗原は、一般に、水性形態にあり、その結果、上記ワクチンは、２種の液体を混合することによって最終的に調製される。混合するための上記２種の液体の体積比は、変動し得る（例えば、５：１〜１：５の間）が、一般に、約１：１である。成分濃度が、上記の特定のエマルジョンの説明において与えられる場合、これら濃度は、代表的には、非希釈組成物に関するものであり、したがって抗原溶液と混合した後の濃度は低下する。
【０１７９】
本発明の組成物は、さらなる免疫刺激剤を含み得る。好ましい実施形態において、上記さらなる免疫刺激剤は、ＴＬＲアゴニスト（すなわち、Ｔｏｌｌ様レセプターを刺激し得る化合物）である。最も好ましくは、ＴＬＲアゴニストは、ヒトＴＬＲのアゴニストである。上記ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９もしくはＴＬＲ１１のうちのいずれかを活性化し得る；好ましくは、それは、ヒトＴＬＲ４もしくはヒトＴＬＲ７を活性化し得る。
【０１８０】
本発明の組成物は、１種より多くのＴＬＲアゴニストを含み得る。これらの２種のアゴニストは互いに異なり、それらは、同じＴＬＲもしくは異なるＴＬＲを標的とし得る。
【０１８１】
任意の特定のＴｏｌｌ様レセプターに対する化合物のアゴニスト活性は、標準的アッセイによって決定され得る。ＩｍｇｅｎｅｘおよびＩｎｖｉｖｏｇｅｎのような企業は、ヒトＴＬＲ遺伝子およびＮＦκＢと、適切なレポーター遺伝子とで安定に共トランスフェクトされる細胞株を、ＴＬＲ活性化経路を測定するために供給する。それらは、感度、広い作業範囲ダイナミクスのために設計され、ハイスループットスクリーニングのために使用され得る。１種以上の特定のＴＬＲの構成的発現は、このような細胞株において代表的である。多くのＴＬＲアゴニストは、当該分野で公知であり、例えば、米国特許第４，６６６，８８６号は、ＴＬＲ２アゴニストであるある種のリポペプチド分子を記載し、ＷＯ２００９／１１８２９６、ＷＯ２００８／００５５５５、ＷＯ２００９／１１１３３７およびＷＯ２００９／０６７０８１は各々、ＴＬＲ７の低分子アゴニストのクラスを記載し、ＷＯ２００７／０４０８４０およびＷＯ２０１０／０１４９１３は、疾患の処置のためのＴＬＲ７およびＴＬＲ８アゴニストを記載する。
【０１８２】
本発明で使用され得るＴＬＲ７アゴニストは、ベンゾナフチリジン、例えば、式Ｔ１：
【０１８３】
【化１】
2016521282.tif 000003
を有するものであり得、
ここでＲ１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ（Ｒ５）２ＯＨ、−Ｌ１Ｒ５、−Ｌ１Ｒ６、−Ｌ２Ｒ５、−Ｌ２Ｒ６、−ＯＬ２Ｒ５、もしくは−ＯＬ２Ｒ６であり；
Ｌ１は、-Ｃ（Ｏ）−もしくは-Ｏ−であり；
Ｌ２は、Ｃ１−Ｃ６アルキレン、Ｃ２−Ｃ６アルケニレン、アリーレン、ヘテロアリーレンもしくは−（（ＣＲ４Ｒ４）ｐＯ）ｑ（ＣＨ２）ｐ−であり、ここでＬ２のＣ１−Ｃ６アルキレンおよびＣ２−Ｃ６アルケニレンは、１〜４個のフルオロ基で必要に応じて置換されており；
各Ｌ３は、Ｃ１−Ｃ６アルキレンおよび−（（ＣＲ４Ｒ４）ｐＯ）ｑ（ＣＨ２）ｐ−から独立して選択され、ここでＬ３のＣ１−Ｃ６アルキレンは、１〜４個のフルオロ基で必要に応じて置換されており；
Ｌ４は、アリーレンもしくはヘテロアリーレンであり；
Ｒ２は、ＨもしくはＣ１−Ｃ６アルキルであり；
Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、-Ｌ３Ｒ５、−Ｌ１Ｒ５、−Ｌ３Ｒ７、−Ｌ３Ｌ４Ｌ３Ｒ７、−Ｌ３Ｌ４Ｒ５、−Ｌ３Ｌ４Ｌ３Ｒ５、−ＯＬ３Ｒ５、−ＯＬ３Ｒ７、−ＯＬ３Ｌ４Ｒ７、−ＯＬ３Ｌ４Ｌ３Ｒ７、−ＯＲ８、−ＯＬ３Ｌ４Ｒ５、−ＯＬ３Ｌ４Ｌ３Ｒ５および−Ｃ（Ｒ５）２ＯＨから選択され；
各Ｒ４は、Ｈおよびフルオロから独立して選択され；
Ｒ５は、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ９）２であり；
Ｒ６は、-ＣＦ２Ｐ（Ｏ）（ＯＲ９）２もしくは−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０であり；
Ｒ７は、-ＣＦ２Ｐ（Ｏ）（ＯＲ９）２もしくは−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０であり；
Ｒ８は、ＨもしくはＣ１−Ｃ４アルキルであり；
各Ｒ９は、ＨおよびＣ１−Ｃ６アルキルから独立して選択され；
Ｒ１０は、ＨもしくはＣ１−Ｃ４アルキルであり；
各ｐは、１、２、３、４、５および６から独立して選択され、そして
ｑは、１、２、３もしくは４である。
【０１８４】
これら化合物のさらなる詳細は、ＷＯ２０１１／０４９６７７において考察されており、本発明は、その中の化合物１〜２８のうちのいずれかを使用し得る。式Ｔ１の化合物の好ましい例としては、以下が挙げられる：
【０１８５】
【化２】
2016521282.tif 000004
他の有用なＴＬＲ７アゴニストとしては、ＷＯ２００９／１１１３３７に開示される化合物１〜２４７のうちのいずれか、またはＷＯ２０１２／０３１１４０の化合物１〜１０２のうちのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８６】
本発明で使用され得るＴＬＲ２アゴニストは、式Ｔ２：
【０１８７】
【化３】
2016521282.tif 000005
を有するリポペプチドであり得、ここで、
Ｒ１は、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ７−Ｃ１８アルキルもしくは-Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ６アルキルであり；
Ｒ２は、Ｃ７−Ｃ１８アルキルであり；
Ｒ３は、Ｃ７−Ｃ１８アルキルであり；
Ｌ１は、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＮＲ７Ｃ（Ｏ）−もしくは−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＮＲ７−であり；
Ｌ２は、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｏ−、−ＮＲ７Ｃ（Ｏ）−もしくは−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ７−であり；
Ｒ４は、−Ｌ３Ｒ５もしくは−Ｌ４Ｒ５であり；
Ｒ５は、-Ｎ（Ｒ７）２、−ＯＲ７、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ７、−ＮＲ７Ｃ（Ｏ）Ｌ３Ｒ８、−ＮＲ７Ｃ（Ｏ）Ｌ４Ｒ８、−ＯＬ３Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ７Ｌ３Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ７Ｌ４Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ７、−ＯＳ（Ｏ）２ＯＲ７、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ６アリール、Ｃ１０アリール、Ｃ１４アリール、Ｏ、ＳおよびＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５〜１４個の環員のヘテロアリール、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルまたはＯ、ＳおよびＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５〜６個の環員のヘテロシクロアルキルであり、ここでＲ５のアリール、ヘテロアリール、シクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルは各々置換されていないか、またはＲ５のアリール、ヘテロアリール、シクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルは、−ＯＲ９、−ＯＬ３Ｒ６、−ＯＬ４Ｒ６、−ＯＲ７、および−Ｃ（Ｏ）ＯＲ７から独立して選択される１〜３個の置換基で各々置換されており；
Ｌ３は、Ｃ１−Ｃ１０アルキレンであり、ここでＬ３のＣ１−Ｃ１０アルキレンは置換されていないか、またはＬ３のＣ１−Ｃ１０アルキレンは、１〜４個のＲ６基で置換されているか、またはＬ３のＣ１−Ｃ１０アルキレンは２個のＣ１−Ｃ６アルキル基で置換され、これらが結合されるその炭素原子上で一緒になって、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルを形成し；
Ｌ４は、−（（ＣＲ７Ｒ７）ｐＯ）ｑ（ＣＲ１０Ｒ１０）ｐ−もしくは−（ＣＲ１１Ｒ１１）（（ＣＲ７Ｒ７）ｐＯ）ｑ（ＣＲ１０Ｒ１０）ｐ−であり、ここで各Ｒ１１は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基であり、これは結合される炭素原子と一緒になって、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルを形成し；
各Ｒ６は、ハロ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、１〜２個のヒドロキシル基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、−ＯＲ７、−Ｎ（Ｒ７）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ７）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７）２、Ｃ６アリール、Ｃ１０アリールおよびＣ１４アリールから独立して選択され；
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１−Ｃ６アルキルから独立して選択され；
Ｒ８は、-ＳＲ７、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７）２、ならびにＯおよびＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５〜６個の環員のヘテロシクロアルキルから選択され；
Ｒ９はフェニルであり；
各Ｒ１０は、Ｈおよびハロから独立して選択され；
各ｐは、１、２、３、４、５および６から独立して選択され、そして
ｑは、１、２、３もしくは４である。
【０１８８】
これら化合物のさらなる詳細は、ＷＯ２０１１／１１９７５９において考察されており、本発明は、そこで開示される化合物のうちのいずれか（例えば、その実施例１〜９２）、およびその請求項１７に列挙される化合物を使用し得る。別の有用なＴＬＲ２アゴニストは、パルミトイル−Ｃｙｓ（２［Ｒ］，３−ジラウロイルオキシ−プロピル）−Ａｂｕ−Ｄ−Ｇｌｕ−ＮＨ２（ここで：Ｃｙｓは、システイン残基であり、Ａｂｕは、アミノ酪酸残基であり、Ｇｌｕは、グルタミン酸残基である）である。この化合物は、米国特許第４，６６６，８８６号の実施例１６で開示され，式Ｔ３ａ：
【０１８９】
【化４】
2016521282.tif 000006
を有する。
【０１９０】
式Ｔ１もしくはＴ２もしくはＴ３ａのアゴニストは、薬学的に受容可能な塩、薬学的に受容可能な溶媒和物（例えば、水和物）として、Ｎ−オキシド誘導体として、異性体（互変異性体もしくはエナンチオマーを含む）または異性体の混合物などとして存在し得る。１つの特に有用な塩は、化合物Ｔ１ｃのアルギニン塩であり、これは、アルギニン塩一水和物として使用され得る。
【０１９１】
他の有用なＴＬＲアゴニストは、以下の化合物である：
【０１９２】
【化５】
2016521282.tif 000007
種々の有用なＴＬＲ４アゴニストが当該分野で公知であり、そのうちの多くは、エンドトキシンもしくはリポポリサッカリド（ＬＰＳ）のアナログ、またはモノホスホリルリピドＡ（「ＭＰＬＡ」）のアナログである。例えば、本発明で使用されるＴＬＲ４アゴニストは、以下であり得る：
（ｉ）３ｄ−ＭＰＬ（すなわち、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ；３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡもしくは３−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリルリピドＡとしても公知）。エンドトキシンの上記モノホスホリルリピドＡ部分のこの誘導体は、グルコサミンの還元末端の３位が脱アシル化されている。それは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａのヘプトースなし変異体から調製されており、リピドＡに化学的に類似であるが、酸不安定性ホスホリル基および塩基不安定性アシル基を欠いている。３ｄ−ＭＰＬの調製は、最初にＧＢ−Ａ−２２２０２１１に記載され、上記生成物は、Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって製造および販売されている。それは、ＧＳＫの「ＡＳ０４」アジュバント中に存在する。さらなる詳細は、Ｍｙｅｒｓら、（１９９０）  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓの第１４５〜１５６頁、Ｊｏｈｎｓｏｎら、（１９９９）  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４２：４６４０−９；Ｂａｌｄｒｉｃｋら、（２００２）Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３５：３９８−４１３）に見出され得る
（ｉｉ）グルコピラノシルリピドＡ（ＧＬＡ）（Ｃｏｌｅｒら、（２０１１）  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６（１）：ｅ１６３３３）もしくはそのアンモニウム塩、例えば、
【０１９３】
【化６】
2016521282.tif 000008
（ｉｉｉ）アミノアルキルグルコサミニドホスフェート（例えば、ＲＣ−５２９もしくはＣＲＸ−５２４）（Ｊｏｈｎｓｏｎら、（１９９９）  Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  ９：２２７３−２２７８；Ｅｖａｎｓら、（２００３）  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２：２１９−２２９；  Ｊｏｈｎｓｏｎら、（１９９９）  Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  ９：２２７３−２２７８；Ｅｖａｎｓら、（２００３）  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２：２１９−２２９；Ｂａｚｉｎら、（２００６）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ４７：２０８７−９２）。ＲＣ−５２９およびＣＲＸ−５２４は、それらのＲ２基が異なる以下の構造を有する：
【０１９４】
【化７】
2016521282.tif 000009
（ｉｖ）ホスフェート含有非環式骨格に連結された脂質を含む化合物（例えば、Ｅ５５６４  （Ｗｏｎｇら、（２００３）  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４３（７）：７３５−４２ ；  ＵＳ２００５／０２１５５１７）
【０１９５】
【化８】
2016521282.tif 000010
（ｖ）ＷＯ０３／１０５７６９に定義されるとおりの式Ｉ、ＩＩもしくはＩＩＩの化合物、またはそれらの塩（例えば、化合物「ＥＲ  ８０３０５８」、「ＥＲ  ８０３７３２」、「ＥＲ  ８０４０５３」、「ＥＲ  ８０４０５８」、「ＥＲ  ８０４０５９」、「ＥＲ ８０４４４２」、「ＥＲ  ８０４６８０」、「ＥＲ  ８０３０２２」、「ＥＲ  ８０４７６４」、もしくは「ＥＲ  ８０４０５７」）。ＥＲ ８０４０５７は、Ｅ６０２０としても公知であり、以下の構造を有する：
【０１９６】
【化９】
2016521282.tif 000011
それに対してＥＲ ８０３０２２は、以下の構造を有する：
【０１９７】
【化１０】
2016521282.tif 000012
（ｖｉ）Ｐｅｐｐｏｌｏｎｉら、（２００３）  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２：２８５−９３で開示されるポリペプチドリガンドのうちの１つ。
【０１９８】
好ましいＴＬＲ４アゴニストは、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）のアナログである。
【０１９９】
さらなる免疫増強因子はまた、ＴＬＲを通じて作用しない免疫増強因子（ＳＭＩＰ）を含み得る。特に、本発明で使用され得るＳＭＩＰは、ＴＬＲよりむしろ（もしくはこれに加えて）Ｃ型レクチンレセプター（ＣＬＲ）もしくはＣＤ１ｄを刺激し得る。従って、本開示は、ＴＬＲアゴニズムを参照して上記で記載されるとおりの本発明を含むが、ＴＬＲアゴニスト（もしくは類似のもの）への言及は、ＣＬＲアゴニストもしくはＣＤ１ｄアゴニストいずれかへの言及によって置き換えられる。
【０２００】
ＣＬＲアゴニストとしては、トレハロース−６，６’−ジミコレート（ＴＤＭ）、その合成アナログＤ−（＋）−トレハロース−６，６’−ジベヘネート（ＴＤＢ）、およびトレハロースおよび脂肪酸の他の６，６’−ジエステルが挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明は、ＣＬＲアゴニストである、トレハロースエステルおよびジアシルトレハロースに適用され得る。これらアゴニストは、式（Ｃ）：
【０２０１】
【化１１】
2016521282.tif 000013
を有し得、
ここでＲ１Ｃ（Ｏ）−およびＲ２Ｃ（Ｏ）−は、同じかもしくは異なっており、アシル基である。適切なアシル基は、飽和であっても不飽和であってもよい。それらは、ミコール酸、コリノミコール酸、２−テトラデシル−３−ヒドロキシオクタデカン酸、２−エイコシル−３−ヒドロキシテトラコサン酸、ブルゲアン酸（ｂｏｕｒｇｅａｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ベヘン酸、パルミチン酸などのアシル残基から選択され得る。有用なミコール酸としては、シス形態もしくはトランス形態のα−、メトキシ−、およびケト−ミコール酸が挙げられる。
【０２０２】
ＣＤ１ｄアゴニストとしては、α−グリコシルセラミド（Ｄｅ  Ｌｉｂｅｒｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ２００５，  ５：  ４８５−４９６；米国特許第５，９３６，０７６号；Ｏｋｉら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．，  １１３：  １６３１−１６４０  ＵＳ２００５／０１９２２４８；Ｙａｎｇら、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．，  ２００４，  ４３：  ３８１８−３８２２；ＷＯ２００８／０４７２４９；ＷＯ２００８／０４７１７４）（例えば、α−ガラクトシルセラミド）が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明は、ＣＤ１ｄアゴニストであるグリコシルセラミドに適用され得る（α−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）、フィトスフィンゴシン含有α−グリコシルセラミド、［（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−（Ｎ−ヘキサコサノイルアミノ）−１，３，４−オクタデカントリオール（ｏｃｔａｄｅｃａｎｅｔｒｉｏｌ）］、ＯＣＨ、ＫＲＮ７０００  ＣＲＯＮＹ−１０１、３”−Ｏ−スルホ−ガラクトシルセラミドなどが挙げられる）。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、本発明は、「Ａｌｕｍ」アジュバント（例えば、上記のように、ＴＬＲアゴニストと組み合わせて）を使用する。用語「Ａｌｕｍ」とは、本明細書ではアルミニウム塩をいい、有用なアルミニウム塩としては、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。このような塩は、例えば、参考文献５４の第８＆９章に記載される。ヒドロキシドイオンを含むアルミニウム塩は、本発明での使用に好ましいアルミニウム塩である（例えば、水酸化アルミニウムおよび／もしくはリン酸アルミニウム（これは、アルミニウムヒドロキシホスフェートを含む））。水酸化アルミニウムアジュバントは、最も好ましい。組成物は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物を含み得る。患者に投与するための組成物中のＡｌ＋＋＋の濃度は、好ましくは、１ｍｇ／ｍｌ未満であり、最大０．８５ｍｇ／単位用量が好ましい。
【０２０４】
（ワクチン組成物のパッケージング）
本発明の組成物（もしくはキット成分）に適した容器としては、バイアル、シリンジ（例えば、使い捨てシリンジ）、鼻スプレーなどが挙げられる。これら容器は、滅菌であるべきである。
【０２０５】
組成物／成分がバイアル中に配置される場合、上記バイアルは、好ましくは、ガラス材料もしくはプラスチック材料から作製され得る。上記バイアルは、好ましくは、上記組成物が上記バイアルに添加される前に、滅菌される。ラテックス感受性患者に伴う問題を回避するために、バイアルは、好ましくは、ラテックス非含有ストッパーでシールされ、全てのパッケージング材料中にラテックスが存在しないことが好ましい。上記バイアルは、ワクチンの単一用量を含んでいてもよいし、１用量より多い用量（「複数用量」バイアル）、例えば、１０用量を含んでいてもよい。好ましいバイアルは、無色ガラスから作製される。
【０２０６】
バイアルは、あらかじめ充填されたシリンジがキャップに挿入され得るように適合されたキャップ（例えば、ルアーロック）を有し得、上記シリンジの内容物は、上記バイアルへと排出され得（例えば、その中の凍結乾燥物質を再構成するために）、上記バイアルの内容物は、取り出されて上記シリンジへと戻され得る。上記バイアルから上記シリンジを取り出した後、次いで、ニードルが取り付けられ得、上記組成物が、患者へと投与され得る。上記キャップは、好ましくは、シールもしくはカバーの内部に配置され得る。その結果、上記シールもしくはカバーは、上記キャップに到達し得る前に除去されなければならない。バイアルは、特に、複数用量バイアルについては、その内容物の無菌的取り出しを可能にするキャップを有し得る。
【０２０７】
成分がシリンジにパッケージされる場合、上記シリンジは、これに取り付けられるニードルを有し得る。ニードルが取り付けられていない場合、別個のニードルが、組み立ておよび使用のために、上記シリンジと共に供給され得る。このようなニードルは、鞘に入れられ得る。安全ニードル（ｓａｆｅｔｙ  ｎｅｅｄｌｅ）が好ましい。１インチ  ２３ゲージ、１インチ  ２５ゲージおよび５／８インチ  ２５ゲージのニードルが代表的である。シリンジは、記録保持を容易にするために、ロット番号、インフルエンザ流行期、および内容物の使用期限がプリントされ得るピールオフラベルとともに提供され得る。上記シリンジにおけるプランジャーは、好ましくは、上記プランジャーが吸引の間に偶発的に除去されてしまわないように、ストッパーを有し得る。上記シリンジは、ラテックスゴムキャップおよび／もしくはプランジャーを有し得る。使い捨てシリンジは、単一用量のワクチンを含む。上記シリンジは、一般に、ニードルの取り付け前に、先端をシールするために先端キャップを有し、上記先端キャップは、好ましくは、ブチルゴムから作製され得る。上記シリンジおよびニードルが別個にパッケージされる場合、上記ニードルは、好ましくは、ブチルゴムシールドと適合させられる。好ましいシリンジは、商品名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」ＴＭの下で市販されるものである。
【０２０８】
容器は、例えば、小児への送達を容易にするために、半用量の体積を示すために印が付けられ得る。例えば、０．５ｍｌ用量を含むシリンジは、０．２５ｍｌ体積を示す印を有し得る。
【０２０９】
ガラス容器（例えば、シリンジもしくはバイアル）が使用される場合、ソーダ石灰ガラスよりむしろホウケイ酸ガラスから作製された容器を使用することが好ましい。
【０２１０】
キットもしくは組成物は、（例えば、同じボックスの中に）上記ワクチンの詳細（例えば、投与の説明書、上記ワクチン内の抗原の詳細など）を含むリーフレットとともにパッケージされ得る。上記説明書はまた、警告（例えば、ワクチン接種後のアナフィラキシー反応の場合に容易に利用可能なアドレナリン溶液を保持することなど）を含み得る。
【０２１１】
（処置方法、および上記ワクチンの投与）
一局面において、本発明は、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２ハプロタイプに関して陰性であることが見出された患者にインフルエンザワクチンを、好ましくは、少なくとも１種のインフルエンザＡウイルスを含むワクチンを投与するための方法を提供する。２００９年に、ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭワクチンの投与後にナルコレプシーの症状を発生させた全ての患者は、この表現型を有することが見出され、従って、この患者群に特定の注意を喚起することは望ましい。
【０２１２】
上記患者の試験および上記インフルエンザワクチンの投与は、実質的に同時に（例えば、ヘルスケア専門家への同じ訪問の間に）行われ得る。しかし、ときおり、上記インフルエンザワクチンを受ける前に上記患者が試験されることは、より一般的である。例えば、上記試験工程および上記投与工程は、互いから数日、数ヶ月もしくはさらに数年離れて行われ得る。
【０２１３】
上記ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２ハプロタイプに関して患者を試験する方法は、当該分野で公知である。このような方法は、例えば、上記ハプロタイプの配列決定もしくは上記ＨＬＡのうちの少なくとも一部のＰＣＲ増幅を要し得る。それはまた、種々のＨＬＡハプロタイプを区別し得るハプロタイプ特異的プローブを使用して（例えば、サザンブロットアッセイで）行われ得る。上記患者は、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２に関してホモ接合性であり得るか；または上記患者は、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２ハプロタイプに関してヘテロ接合性であり得る。この場合、このような患者がインフルエンザワクチンを受けることから排除することはなお有利であり得る。
【０２１４】
本発明は、本発明に従って製造されるワクチンを提供する。これらワクチン組成物は、ヒト被験体もしくはヒト以外の動物被験体（例えば、ブタまたはトリ）への投与に適しており、本発明は、上記被験体に本発明の組成物を投与する工程を包含する、被験体における免疫応答を惹起するための方法を提供する。本発明はまた、医薬として使用するための本発明の組成物を提供し、被験体における免疫応答を惹起するための医薬の製造のための、本発明の組成物の使用を提供する。
【０２１５】
これら方法および使用によって惹起される免疫応答は、一般に、抗体応答（好ましくは、防御的抗体応答）を含む。インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能力および防御を評価するための方法は、当該分野で周知である。ヒトでの研究から、ヒトインフルエンザウイルスのヘマグルチニンに対する抗体力価が、防御と相関する（約３０〜４０の血清サンプル赤血球凝集阻害力価が、同種のウイルスによる感染から約５０％防御を与える）ことが示された［６７］。抗体応答は、代表的には、赤血球凝集阻害によって、マイクロ中和によって、単一放射免疫拡散（ｓｉｎｇｌｅ  ｒａｄｉａｌ  ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）（ＳＲＩＤ）によって、および／もしくは単一放射溶血（ＳＲＨ）によって、測定される。これらアッセイ技術は、当該分野で周知である。
【０２１６】
本発明の組成物は、種々の方法において投与され得る。最も好ましい免疫化経路は、筋肉内注射（例えば、腕もしくは脚への）によるが、他の利用可能な経路としては、皮下注射、鼻内［６８〜７０］、経口［７１］、皮内［７２、７３］、経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）［７４］などが挙げられる。
【０２１７】
本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。インフルエンザワクチンは、６ヶ月齢からの小児および成人での免疫化における使用に関して現在推奨されている。従って、ヒト被験体は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、もしくは少なくとも５５歳であってもよい。上記ワクチンを受けるのに好ましい被験体は、高齢（例えば、≧５０歳、≧６０歳、および好ましくは、≧６５歳）、若年齢（例えば、≦５歳）、入院している被験体、ヘルスケアワーカー、軍隊および軍職員、妊婦、慢性疾患の、免疫不全の被験体、上記ワクチンを受ける７日前までに抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルおよびザナミビル化合物；以下を参照のこと）を摂取している被験体、卵アレルギーがある人々、および外国に旅行する人々である。上記ワクチンは、これらの群に適しているのみではないが、一般に、集団においてより多く使用され得る。汎流行性株については、すべての年齢群への投与が好ましい。
【０２１８】
好ましい本発明の組成物は、効力についてＣＰＭＰ基準のうちの１つ、２つもしくは３つを満たす。成人（１８〜６０歳）において、これら基準は、以下である：（１）≧７０％血清保有率（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）；（２）≧４０％セロコンバージョン；および／もしくは（３）ＧＭＴ増加≧２．５倍。高齢者（＞６０歳）において、これら基準は、以下である：（１）≧６０％血清保有率；（２）≧３０％セロコンバージョン；および／もしくは（３）ＧＭＴ増加≧２倍。これら基準は、少なくとも５０名の患者でのオープンラベル研究に基づく。
【０２１９】
処置は、単一用量スケジュールもしくは複数用量スケジュールによってであり得る。複数用量は、初回免疫化スケジュールおよび／もしくは追加免疫化スケジュールにおいて使用され得る。複数用量スケジュールにおいて上記種々の用量は、同じ経路もしくは異なる経路によって与えられ得る（例えば、非経口の初回免疫（ｐｒｉｍｅ）および粘膜の追加免疫（ｂｏｏｓｔ）、粘膜の初回免疫および非経口の追加免疫など）。１より多くの用量の投与（代表的には、２用量）は、免疫学的に経験したことがない患者（例えば、これまでインフルエンザワクチンを受けたことのない人に関して）において、または新たなＨＡサブタイプ（汎流行性アウトブレイクにおけるような）に対するワクチン接種のために、特に有用である。複数用量は、代表的には、少なくとも１週間空けて（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）投与される。
【０２２０】
本発明によって生成されるワクチンは、他のワクチン（例えば、麻疹ワクチン、ムンプス・ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合体化Ｂ型インフルエンザワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合型ワクチン（例えば、四価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチン）、ＲＳウイルスワクチン、肺炎球菌結合型ワクチンなど）と実質的に同時（例えば、同じ医療相談の間に、またはヘルスケア専門家およびワクチン接種施設への訪問の間に）に患者に投与され得る。肺炎球菌ワクチンおよび／もしくは髄膜炎菌ワクチンと実施的に同時の投与は、高齢の患者において特に有用である。
【０２２１】
同様に、本発明のワクチンは、抗ウイルス化合物、および特に、インフルエンザウイルスに対して活性な抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルおよび／もしくはザナミビル）と実質的に同時（例えば、同じ医療相談の間に、またはヘルスケア専門家への訪問の間に）に、患者に投与され得る。これら抗ウイルス剤としては、ノイラミニダーゼインヒビター（例えば、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸もしくは５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン−２−エノン酸（ｅｎｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（そのエステル（例えば、そのエチルエステル）およびその塩（例えば、そのリン酸塩）を含む）が挙げられる。好ましい抗ウイルス剤は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸、エチルエステル、ホスフェート（１：１）（オセルタミビルホスフェート（ＴＡＭＩＦＬＵＴＭ）としても公知）である。
【０２２２】
（一般）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を含み、例えば、Ｘを「含む」組成物は、もっぱらＸからなってもよいし、さらなる何かを含んでいてもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【０２２３】
語句「実質的に」は、「完全に」を排除しない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、完全にＹを含まなくてもよい。必要であれば、語句「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
【０２２４】
数値ｘに関する用語「約」とは、任意であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０２２５】
２つのアミノ酸もしくはアミノ酸配列に関連して用語「対応する」とは、配列がペアワイズアラインメントアルゴリズムによってアラインメントされる場合に、互いにアラインメントされるアミノ酸に言及する。「対応する」アミノ酸を同定するにあたって使用するための好ましいペアワイズアラインメントアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを使用する（例えば、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリクスを使用して、ギャップオープンペナルティー＝１０．０、およびギャップ伸長ペナルティー＝０．５で）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズム［７５］である。このアルゴリズムは、便利なことには、ＥＭＢＯＳＳパッケージにおけるニードルツールで実施される［７６］。同じ原理が、配列比較に関連して、すなわち、所定の配列が、配列番号１もしくは２のアミノ酸１０６〜１２６に等価な配列を有するか否かを決定（これは、上記に記載されるとおりのアラインメントを代表的には要する）するために本明細書で使用される場合に、用語「等価な」に当てはまる。
【０２２６】
別段示されなければ、２種以上の成分を混合する工程を包含するプロセスは、いかなる特定の混合する順序も必要としない。従って、成分は、任意の順序で混合され得る。３つの成分が存在する場合、２つの成分が、互いに合わされ得、次いで、その組み合わせが、第３の成分と合わせられ得るなど。
【０２２７】
上記方法の種々の工程は、同時もしくは種々の時点で、同じもしくは異なる地理上の位置（例えば、国）で、そして同じもしくは異なる人々もしくは実体によって行われ得る。
【０２２８】
動物（および特にウシ）の物質が、細胞培養において使用される場合、それら物質は、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まない、特に、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から得られるべきである。全体として、動物由来物質が完全に存在しない状態で細胞を培養することが好ましい。
【０２２９】
化合物が、組成物の一部として身体に投与される場合、その化合物は、代わりに、適切なプロドラッグによって置換され得る。
【０２３０】
２つのアミノ酸配列の間のパーセンテージ配列同一性への言及は、アラインメントされた場合、アミノ酸のパーセンテージが、上記２つの配列を比較することにおいて同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性もしくは配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム（例えば、参考文献７７の第７．７．１８節において記載されるもの）を使用して決定され得る。好ましいアラインメントは、アフィンギャップ検索と、キャップオープンペナルティー１２およびギャップ伸長ペナルティー２、ＢＬＯＳＵＭマトリクス６２を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。上記Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献７８に教示される。
【０２３１】
２つの核酸配列の間のパーセンテージ配列同一性への言及は、アラインメントされた場合、塩基のパーセンテージが、上記２つの配列を比較することにおいて同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性もしくは配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム（例えば、参考文献７７の第７．７．１８節において記載されるもの）を使用して決定され得る。好ましいアラインメントプログラムは、好ましくは、デフォルトパラメーター（これは、以下のとおりである：オープンギャップ＝３；伸長ギャップ＝１）を使用する、ＧＣＧ  Ｇａｐ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｓｕｉｔｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．１）である。
【図面の簡単な説明】
【０２３２】
【図１】図１は、表３からのヌクレオキャプシドＸ−１７９Ａ／Ｘ−１８１配列フラグメントと、オレキシンレセプター２（Ｏｘ１Ｒ）およびオレキシンレセプター１（Ｏｘ２Ｒ）との間のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアラインメントである。インフルエンザフラグメントとオレキシンファミリー配列との間の他のアラインメントは、０．４未満でなかった。上記アラインメントを、デフォルトパラメーターを用いるＦＡＳＴＡパッケージからのプログラム検索で生成した。中に示されるアラインメントにおけるＯｘ２ＲおよびＯｘ１Ｒの領域は、Ｕｎｉｐｒｏｔにおいて細胞外として註釈が付けられている。
【発明を実施するための形態】
【０２３３】
（実施例）
（ナルコレプシーおよびＨ１Ｎ１汎流行性）
分子摸倣（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｉｍｉｃｒｙ）は、ウイルスおよび細菌が、身体を騙して、それらの宿主組織への自由なアクセスを認めさせようとすることによる進化的適応である。このような摸倣は、自己に似ているアミノ酸の免疫系の拡がり（ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｓｔｒｅｔｃｈ）を示すことによって機能する。微生物に応答して、免疫系は、その対応する自己成分を攻撃するように刺激される（例えば、アデノウイルスタイプ２および多発性硬化症におけるミエリン塩基性タンパク質）。
【０２３４】
（自己免疫疾患および天然の感染）
自己免疫疾患を有する患者を管理する臨床医が一般に観察するのは、天然の感染が引き金となって自己免疫疾患活性の重症度を高め得ることである。同様に、天然の感染は、遺伝的に感受性の宿主において疾患を誘発することにおいて主要な役割を果たすと考えられる。Ｈ１Ｎ１汎流行性の状況において、１５３名の被験体が、中国の北京で２００９年５月までにＨ１Ｎ１に感染した。このことが、２００９年１１月までに概算で１１８万人の感染被験体へと増大した。１１月までに、非アジュバント化Ｈ１Ｎ１ワクチンの１３６万用量が、１７００万人の集団に投与された（すなわち、人口の０．８％がワクチン接種された）。Ｈ１Ｎ１感染ピークの６ヶ月後には、北京コホートにおいて新たなナルコレプシー症例が３〜４倍増大したという報告があった（ｎ＝１４２）。ここでは５．６％の患者がワクチン接種を受けていると報告したに過ぎない。このことは、本発明者らに、ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭ処置患者において認められたナルコレプシーが、Ｈ１Ｎ１株自体に、おそらく分子摸倣に起因して関連している可能性があることを示唆した。
【０２３５】
（ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭワクチン抗原に関連した病理摸倣）
上記で言及されるように、上記ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭワクチンは、ナルコレプシーと関連づけられた一方で、ナルコレプシーの増大はＦｏｃｅｔｒｉａＴＭでのワクチン接種後に認めらることはできなかった。ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭに使用されるワクチン抗原の供給源は、高収量Ａ  Ｈ１Ｎ１リアソータントＸ−１７９Ａである一方で、ＦｏｃｅｔｒｉａＴＭに使用されるのは、高収量Ａ  Ｈ１Ｎ１リアソータントＸ−１８１である。
【０２３６】
汎流行性Ｈ１Ｎ１ワクチン調製のために、Ｘ−１７９Ａ（ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭに使用される）を、高収量株Ｘ−１５７を、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４（ＰＲ８）に対して追跡可能な内部タンパク質と、表面抗原ＨＡおよびＮＡを与えるＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９  （Ｈ１Ｎ１サブタイプ）と、および内部タンパク質ＰＢ１とを交差させることによって生成した。不適切な収量の懸念に起因して、３２倍収量のＸ−１７９Ａを、２００９年７月１４日にＸ−１５７へと再び交差させることによってリアソートしたところ、６４倍収量のＸ−１８１の生成がもたらされた（ＦｏｃｅｔｒｉａＴＭおよび他の季節性ワクチンで使用した）。この機能差は、リアソータント由来の遺伝子セグメント組み合わせのみならず、卵宿主（ｉｎ  ｏｖｏ接種）への適応の間に選択される既存の改変体およびウイルス変異にも関連する。類似の結果が、１９７６年のブタインフルエンザワクチン（これは、抗原的に区別可能でなかったが、１６倍程度収量を増大させたＸ−５３ａのＨＡ遺伝子において単一のアミノ酸変化を有した）のために調製したＸ−５３およびＸ−５３ａリアソータントでも起こった。従って、ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭに使用したＸ−１７９Ａは、以下で説明されるように、ＦｏｃｅｔｒｉａＴＭに使用したＸ−１８１と比較して、他の質的差異を有する可能性がある。
【０２３７】
ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭおよびＦｏｃｅｔｒｉａＴＭの精製プロセスは、明確な差異を有する。スプリットビリオンワクチン（ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭのように）およびサブユニットワクチン（ＦｏｃｅｔｒｉａＴＭのように）は、以下のように、インフルエンザワクチンの生成技術に関する世界保健機関の文書に定義されている：
インフルエンザワクチンの大部分は、「スプリット」ワクチンであり、これは、洗剤処理精製インフルエンザウイルスによって生成される。そのスプリットプロセスは、ウイルスを壊し、関連抗原が部分的に精製されるようにする（ｐ．８）…全ウイルス調製物と比較すると、スプリットワクチンは、よりよく特徴付けされ、オボアルブミンの含有量が少なく、反応原性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）が低いと主張されている（ｐ．１３）。サブユニットもしくは表面抗原ワクチンは、スプリットウイルスに関して生成されるが、そのワクチンが最小限のＮ、マトリクスタンパク質、核タンパク質および脂質が夾雑する非常に精製されたＨＡおよびＮＡからほとんどもっぱらなるように、より徹底的な精製が行われる。
【０２３８】
無傷のインフルエンザウイルス中の核タンパク質およびマトリクスタンパク質内容物の量は、ＨＡのものに対して、それぞれ２倍および６倍高く、このことから、これら２つの内部タンパク質がＨＡおよびＮＡを富化するために使用される精製プロセスのタイプに依存して持ち越される可能性は最も高い。実際に、以前の調査は、スプリットビリオンワクチンＦｌｕｚｏｎｅおよびＭＦＶ−Ｊｅｃｔ、ならびに精製抗原／サブユニットインフルエンザワクチンＦｌｕｖｉｒｉｎおよびＩｎｆｌｕｖａｃ（これらは、１９９２年に英国で入手可能であった）を特徴付けた［７９］。電子顕微鏡に基づいて、ウイルス核タンパク質は、スプリットビリオンワクチンにおいて容易に明らかであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによれば、全てのワクチンの中で種々のレベルまで検出可能である（スプリットビリオン＞精製抗原／サブユニット）。
【０２３９】
オレキシンレセプターの変異およびオレキシン細胞の喪失がナルコレプシーに関係していたので、本発明者らは、ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭ中のワクチン抗原が、特有の特徴を有し得、オレキシン（ヒポクレチン）もしくはそのレセプターのいずれかでの分子摸倣をもたらすと仮説を立てた。従って、Ｘ−１７９Ａ、Ｘ−１８１由来のインフルエンザタンパク質およびオレキシン関連配列（オレキシン、オレキシンＡ、オレキシンＢ、オレキシンレセプター１、オレキシンレセプター２およびＨＬＡ−ＤＱＢ１）に対して配列分析を行った。ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭ株Ｘ−１７９Ａは、ナルコレプシー症例と関係していたが、ＦｏｃｅｔｒｉａＴＭはそうではなかったので、上記インフルエンザタンパク質を、ワクチンウイルス株Ｘ−１７９Ａ（Ｐａｎｄｒｅｍｉｘ関連）とＸ−１８１（ＦｏｃｅｔｒｉａＴＭ関連）との間の、ナルコレプシーとの関連性を説明し得る差異を最初に比較した。ワクチン調製物中に存在すると予測されたタンパク質のみが、先に記載した電子顕微鏡およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ研究によって示唆されるように含まれた（ＨＡ、ＮＡ、ＮＰおよびＭ１）。
【０２４０】
潜在的なアミノ酸変化を決定するために、インフルエンザ配列を、適切な株名（Ｘ−１７９Ａ、Ｘ−１８１、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１））によって問い合わせてＮＣＢＩのＩｎｆｌｕｅｎｚａ  ＶＩｒｕｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ［８０］から検索し、重複する配列を除外した。ワクチン調製物中に存在すると予測される各インフルエンザタンパク質（ＨＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＡ）を、株にわたって比較して、Ｘ−１７９Ａが少なくとも１残基程度Ｘ−１８１とは異なる配列を同定した。３つのアミノ酸差異が見出され、ＨＡ中には１つ、およびＮＰ中には２つあった（表１）：
【０２４１】
【表１】
2016521282.tif 000014
次いで、上記差異の前後の１０残基を含む部分配列を、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアラインメントを使用してオレキシン関連配列と比較した。４つのアラインメントのみが０．４未満のｅ値を有した（次の最良のｅ値は、＞０．４であり、最良のｅ値アラインメントの、示されたアラインメントの他からの良好な分離である１０：１という次善に対する比率を与える）。このアラインメントは、Ｘ−１７９ＡおよびＸ−１８１のヌクレオキャプシドタンパク質フラグメント（１個の残基差異を含む）とオレキシンレセプター１および２との間である（図１）。上記ヌクレオキャプシドフラグメントのＸ−１７９Ａバージョンは、Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ）で報告された多くのエピトープと重複するので、オレキシンレセプター１および２（これらは、ナルコレプシーに関係している）とのこの重複は、摸倣の可能性を示唆し、ある欧州の国においてＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭワクチンの投与後にナルコレプシーが観察されたことの考えられる説明である。興味深いことに、上記ヌクレオキャプシドフラグメントのＸ−１７９Ａバージョンはまた、Ｈ１Ｎ１感染に由来するものと同一である（感染とナルコレプシーとの報告された関連性と一致［８１］）一方で、同じヌクレオキャプシドフラグメントのＸ−１８１バージョン（ＦｏｃｅｔｒｉａＴＭ関連）は、ＦｏｃｅｔｒｉａＴＭとのナルコレプシー関連性の欠如を説明し得る１つのアミノ酸置換を含む。
【０２４２】
ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭと関連したナルコレプシーを有する患者は、もっぱらＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２である。従って、スウェーデンにおいて、全２８名のナルコレプシーのワクチン接種後の症例は、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２であった。フィンランドでは、２０１０年にＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭをワクチン接種した全３４名のＨＬＡタイプ分けしたナルコレプシー患者は、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２であった。ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２についての結合モチーフは公知である。ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２のコア結合モチーフは、１位、３位、４位、６位、および９位にある。このモチーフを、１位および３位に脂肪族アミノ酸、ならびに４位に疎水性アミノ酸を有するペプチドＬＩＬＹＤＫＥＥＩＲＲＩＷＲＱＡＮＮＧ（配列番号１０）に十分適合させる、オレキシンレセプター１および２のペプチドに関する記載事項がある。６位は上記モチーフに合わないが、９位は脂肪族であり、良好な適合を提供する［８２］。ナルコレプシーにおいて、最大の容積を有するＰ４結合ポケットは、感受性にとって重要であり、０６０２への強い結合因子のいくつかの公知の例は、Ｐ４においてチロシンを有する［８］。
【０２４３】
上記ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭワクチンは、ナルコレプシーをもたらす自己抗原（ヒポクレチンもしくはそのレセプターのうちの１つ）の分子摸倣物に対する免疫応答を担うＨ１Ｎ１感染因子のある種の成分をさらに含んでいた可能性がある。しかし、ＡＳ０３アジュバント化ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭワクチンおよびＡＳ０３アジュバント化Ｈ１Ｎ１汎流行性ワクチンＡｒｅｐａｎｒｉｘ（カナダで投与されたが、ワクチン接種と関連したナルコレプシーの増大という報告はなかった）と関連したナルコレプシー徴候における不一致が原因で、決定的な結論を引き出す前になお適切に用心しなければならない。これは、単に病原性の抗原が存在しても、単独では上記関連性を説明するには十分ではないと思われることを示唆し得るか、または代わりに、製造現場（ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭに関してはドレスデン、およびカナダについてはケベック）のスプリット／精製プロセスの差異に起因して、ＡＳ０３アジュバント化ワクチン中のスプリットワクチン抗原の存在もしくは提示に差異があり得る。ドレスデンで製造されたＧＳＫ  ＡＳ０３アジュバント化Ｈ１Ｎ１ワクチンの概算で３０８０万用量が、２００９年１０月に始まって４７を超える国で使用され、フィンランド、スウェーデン、ノルウェー、およびアイルランドを含む数カ国では適用範囲は高かった。ケベックで製造されたＧＳＫ  ＡＳ０３アジュバント化Ｈ１Ｎ１ワクチンは、カナダでは高い適用範囲で使用された（Ａｒｅｐａｎｒｉｘ）。ここでは概算で１２００万用量が投与され、他の数カ国でも投与された。カナダで進行中である疫学研究では、ナルコレプシーとＡＳ０３アジュバント化Ｈ１Ｎ１ワクチン（Ａｒｅｐａｎｒｉｘ）との間には何らかの関連性があるとの報告がそのうちされる予定である。
【０２４４】
上記Ｄｒｅｓｄｅｎ抗原は、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０）およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む一方で、上記ケベック抗原は、これら賦形剤を含まない。これら洗剤は、ナルコレプシーの発生に対して影響を有し得ると推測された（Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｒｅｐｏｒｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐａｎｄｅｍｉｃ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ＥＭＡ／６８７５７８／２０１２を参照のこと）。従って、Ｄｒｅｓｄｅｎ抗原におけるように、Ｔｗｅｅｎ  ８０および／もしくはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む抗原から生成されたワクチン中のＮＰタンパク質の存在を回避することは、特に重要であり得る。これは、特に、ＭＦ５９もしくはＡＳ０３のような水中油型エマルジョンでアジュバント化されたワクチンに当てはまる。なぜならナルコレプシーは、Ｄｒｅｓｄｅｎ抗原に由来する非アジュバント化季節性ワクチンにおいては出現しなかったからである（以下を参照のこと）。
【０２４５】
以下の表２は、ドレスデンで調製された２種の異なる不活化スプリットビリオンＨ１Ｎ１抗原成分の組成を示す（ＷＯ２０１１／０５１２３５  ｐ  ４１）。
【０２４６】
【表２】
2016521282.tif 000015
（ＧＳＫの非アジュバント化Ｈ１Ｎ１季節性インフルエンザワクチンにおいてナルコレプシーはない）
ＧＳＫによって製造された汎流行性および季節性両方のインフルエンザワクチンは、同じＨ１Ｎ１抗原を含む一方で、上記アジュバントによる過剰な免疫刺激がナルコレプシーの原因になると推測するように即座に導き得る、季節性ワクチン中の非アジュバント化Ｈ１Ｎ１抗原で報告されたナルコレプシー徴候は存在しない。しかし、上記スプリットウイルスワクチンにおいて明らかにされている潜在的な抗原に関する以前の考察に鑑みれば、改善された抗原提示が任意のアジュバントでの望ましくかつ期待される効果であるということを念頭に置いて、上記ＡＳ０３アジュバントによって免疫系に優先的にもしくはより効率的に提示される病的抗原のレザバに対する一貫しないナルコレプシー関連性もまた十分に説明され得る。アジュバントは、以下を含むいくつかの方法で作用し得る：１）抗原を免疫系に送達する、２）抗原提示細胞（ＡＰＣ）による抗原の取り込みを増強する、または３）ワクチン内の抗原の構造的コンフォメーションを変化させて、それによって、進行性放出、遅延型のクリアランスおよび免疫系へのより良好な曝露を可能にする。水中油型エマルジョンの作用様式は、よりよく理解されており、現在は、先天的な炎症応答の調節、ＡＰＣ動員および活性化、注射部位での抗原残存の増強、免疫能のある細胞への抗原提示の調節、ならびに種々のサイトカインパターンの誘発を伴うと考えられる。
【０２４７】
（免疫学的説明）
Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＩＥＤＢ）を使用してインフルエンザＡウイルスの抗体およびＴ細胞エピトープに関する２００７年に公開された保存分析からの適切な知見によれば、Ｔ細胞エピトープと比較して、抗体エピトープは不足しており、最多数のＴ細胞エピトープは、ヘマグルチニンタンパク質および核タンパク質に由来する［８３］。さらに、Ｔ細胞エピトープは、抗体エピトープよりも保存されており、５０％は、ヒトＨ１Ｎ１株において８０％の同一性レベルで保存されている。このことは、インフルエンザのＴ細胞エピトープの株間交叉反応性の重大なレベルを示唆する。インフルエンザＡの核タンパク質は、クラスＩおよびクラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体によって効率的に提示され、γ−インターフェロンおよび腫瘍壊死因子を分泌するＣＤ８＋およびＣＤ４＋特異的エフェクターＴリンパ球の両方を増殖させ得る［８４］。それは、交叉反応性抗インフルエンザＡ細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）に対する主要標的抗原であり、ＰＲ８核タンパク質遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスは、強い二次的交叉反応性ＣＴＬ応答を刺激および感作（ｐｒｉｍｅ）し得る［８５］。まさにこれが理由で、非表面タンパク質のかなりの量を含むスプリットビリオンインフルエンザワクチンが、より純粋なサブユニットワクチンと比較して、細胞媒介性免疫応答を増大させると予測される。しかし、これは、諸刃の剣である。なぜならウイルス（もしくはワクチン改変）核タンパク質の規定されたエピトープに対して強い交叉反応性ＣＴＬ応答を生じる同じ免疫学的機構が、宿主組織（例えば、オレキシンレセプター）を摸倣する場合には問題となり得、遺伝的に感受性の宿主（例えば、ＤＢＱ１＊０６０２）において変性するＴ細胞媒介性自己免疫性を自己免疫疾患（例えば、ナルコレプシー）へと導くからである。上記ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭ核タンパク質フラグメントと、上記オレキシンレセプターとのアラインメントは、明瞭なナルコレプシー症候群がまた、オレキシン２レセプターノックアウトマウスおよびオレキシンノックアウトマウスにおいて生じた（おそらく、欠損オレキシンを通じてオレキシン１レセプターへのシグナル伝達）ので興味をそそる［８６］。興味深いことに、微量の免疫原性核タンパク質がＦｏｃｅｔｒｉａＴＭに存在した場合、これを、ＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭ核タンパク質およびＨ１Ｎ１感染（そのうちの両方ともイソロイシンを有する）のものと区別する、オレキシンレセプターとアラインメントしている核タンパク質フラグメント中に１個のアミノ酸置換（メチオニン）の存在がある。ＦｏｃｅｔｒｉａＴＭに含まれる核タンパク質（Ｘ−１８１ワクチン株から受け継がれる）の中のこのアミノ酸置換は、核タンパク質中の多くのアミノ酸置換が、非常に保存されているマトリクスタンパク質とは対照的に、ＣＴＬ媒介性免疫監視機構から逃れることを可能にするインフルエンザウイルスのアミノ酸置換に機能的に類似であり得る［８７］。
【０２４８】
（ＨＬＡハプロタイプ結合アッセイ）
種々のＨＬＡ−ＤＲＢ１＊ハプロタイプへのペプチドの結合を、無細胞ＲＥＶＥＡＬＴＭクラスＩＩ結合技術を使用することによって分析した（参考文献８８を参照のこと）。この技術は、合成試験ペプチドがＭＨＣ−ペプチド複合体を安定化する能力を測定する。検出は、特異的モノクローナル抗体によって検出される上記ＭＨＣ−ペプチド複合体の天然のコンフォメーションの存在もしくは非存在に基づく。各ペプチドは、公知のＴ細胞エピトープである陽性コントロールペプチドに対してスコアを与えられる。上記スコアは、上記陽性コントロールペプチドと比較して、上記試験ペプチドによって生成されるシグナルのパーセンテージとして定量的に報告される。スコアは、時間ゼロでおよび２４時間後に再び評価される。その分析はまた、各ペプチドと、試験されているＭＨＣ  ＩＩ複合体との結合の安定性を表す安定性指数を与える。
【０２４９】
合計１８個のペプチドと陽性コントロールとを試験した：
【０２５０】
【表３】
2016521282.tif 000016
２種のＨＬＡハプロタイプを試験した：ＤＱＡ１＊０１０２：ＤＱＢ１＊０６０２；およびＤＱＡ１＊０１０１：ＤＱＢ１＊０５０１。上記で考察されるように、上記ＤＱＢ１＊０６０２ハプロタイプは、ナルコレプシーに公知の関連性を有するが、上記ＤＱＢ１＊０５０１ハプロタイプは、患者のＨＬＡタイプ分け研究に基づけば、ナルコレプシーの発生から保護するようである。
【０２５１】
結合結果は、以下のとおりであった：
【０２５２】
【表４】
2016521282.tif 000017
ＤＱＢ１＊０６０２  ＨＬＡハプロタイプに関しては、４種の強い結合因子があった（すなわち、ペプチド＃１、＃５、＃９および＃１１（陽性コントロールシグナルの＞１５％））。時間０でおよびさらに２４時間後に強く結合したＸ１７９−Ａペプチド（＃１）とは対照的に、Ｘ１８１由来のその対応するフラグメント（＃２）は、両方の時点で不十分な結合因子であった。
【０２５３】
一般に、全ペプチドの結合安定性は、上記ＤＱＢ１＊０５０１ハプロタイプでより弱い。ペプチド＃１は、それでもよく結合するが、２４時間後には明らかに安定性が低下する。ペプチド＃３（ペプチド＃１のより短いバージョン）は、ＤＱＢ１＊０６０２よりもこのハプロタイプに良好に結合するのに対して、＃４（＃２のより短いバージョン）は、上記０５０１ハプロタイプで不十分な結合因子のままである。従って、ナルコレプシー患者と明らかに関連するＤＱＢ１＊０６０２と比較して、上記ＮＰペプチドは、ナルコレプシーの発生から保護するようであるハプロタイプ（ＤＱＢ１＊０５０１）にはより不十分に結合した。
【０２５４】
１５ｍｅｒのオレキシンフラグメント（＃１０）は、いずれのＨＬＡハプロタイプにも結合しなかったが、Ｔｈｒ→Ｉｌｅ変位を有するこのペプチドの改変バージョン（＃１１）は、強い結合因子であった。ペプチド＃１０の結果は、上記フラグメントがＤＱＢ１＊０６：０２  ＨＬＡとの「複合体形成を促進」するために１５アミノ酸のリンカーを必要としたという参考文献８の報告に鑑みれば、驚くべきことではない。上記Ｔｈｒ→Ｉｌｅ変異が上記ペプチドを強い結合因子へと変換する能力は、ＤＱＢ１＊０６：０２  ＨＬＡハプロタイプに対して親和性を付与するにあたって、Ｘ１７９−Ａ株のＮＰ中のイソロイシンの重要性を裏付ける。
【０２５５】
ペプチド＃１２での結果は、ペプチド＃１０中のスレオニンをメチオニンに変化させることが、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２（ナルコレプシーと関連する対立遺伝子）への結合を可能にしもしないし改善もしないことを示し、従ってＤＱＢ１＊０６０２に関してペプチド＃１および＃２で認められた結果を確認する。
【０２５６】
全体的に、これら結果は、ペプチド＃１および＃２が、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０１：０２  ＤＱＢ１＊０６：０２への顕著に異なる結合を示すことを示す。ペプチド＃１は、この対立遺伝子に対して良好な結合を示し、その高い安定性スコアは上記結合が強いことを示唆する。対照的に、ペプチド＃２は、低い初期の結合を示し、非常に少量の複合体が２４時間後に残っているに過ぎない。このことは、短い結合半減期、および不安定な複合体を示唆する。従って、ペプチド＃１（Ｘ−１７９Ａ核タンパク質のアミノ酸１０６〜１２６であり、アミノ酸位置１１６においてイソロイシン残基を含む）は、ペプチド＃２（Ｘ−１８１核タンパク質のアミノ酸１０６〜１２６であり、アミノ酸位置１１６においてメチオニン残基を含む）よりも強くかつ良好な安定性で結合した。よって、これらデータは、Ｘ−１７９Ａ核タンパク質が、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６：０２ハプロタイプを有する個体に特異的な自己免疫応答に関与し得るが、Ｘ−１８１核タンパク質は関与しないという本発明者らの仮説を裏付ける。
【０２５７】
（オレキシンとのペプチド相互作用のモデリング）
上記オレキシン（ヒポクレチン）フラグメント１〜１３（配列番号１６）は、ＨＬＡ  ＤＱＢ１＊０６０２と強く相互作用することが公知である［８］。分析から、Ｌｅｕ−３、Ｔｈｒ−６およびＶａｌ−８が、相互作用にとって重要な残基であることが示される。これら３つの残基は、インフルエンザＮＰペプチドと逆方向でＸ−１７９Ａ核タンパク質フラグメントの１２ｍｅｒフラグメント（配列番号１７）と良好な３Ｄ構造アラインメントを与え、ここでは、Ｉｌｅ−６はオレキシンＴｈｒ−６とアラインメントし、Ｉｌｅ−９は、Ｌｅｕ−３とアラインメントする。上記ＮＰ  Ｉｌｅ−６は、配列番号１（Ｘ−１７９Ａ）と配列番号３（Ｘ−１８１）との間で異なる残基である。コンピューターモデリングから、配列番号１７は、ＤＱ０６０２結晶構造の結合溝において非常に良好な適合を示すことが示される。Ｘ−１７９ＡにおけるＩｌｅ−６残基は、オレキシンのＴｈｒ−６に対してＨＬＡタンパク質の結合空間（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｖｉｔｙ）中によく適合するが、配列番号３のその対応する１２ｍｅｒフラグメント中のＸ−１８１Ａメチオニン残基は、ＨＬＡタンパク質との激しい空間的な衝突を与える。
【０２５８】
このモデリングのために、ＰＤＢファイル１ｕｖｑを、ＰｙＭｏｌ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ  Ｉｎｃ）とともに使用した。ヒポクレチンペプチド（配列番号１６）と上記ＨＬＡタンパク質との間の分子間相互作用の分析を、視覚的にかつＳｉｔｅＭａｐソフトウェア（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ  Ｉｎｃ）の使用を通じて詳細に行った。上記ペプチドのＸ線構造から３つの残基を、上記ＨＬＡタンパク質への、最も可能性の高いのは、疎水性相互作用（Ｌｅｕ−３、Ｔｈｒ−６およびＶａｌ−８）を通じて、結合を駆動するために重要であると同定した。
【０２５９】
上記核タンパク質のフラグメント（配列番号１７）のアラインメントを行ったところ、逆方向で合体するまで、多くの衝突を示し、結合を示しそうになかった。推定上の結合様式は、極性およびファン・デル・ワールス衝突（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ  ｃｌａｓｈ）の点から、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０２の結合部位に対して評価したところ、Ｉｌｅ−６がオレキシンＴｈｒ−６とアラインメントし、ＮＰ  Ｉｌｅ−９がＬｅｕ−３とアラインメントした場合に、良好な適合が認められた。アラインメント評価にノイズもしくはバイアスを入り込むのを回避するために、以下を行った：（ｉ）上記オレキシンペプチドを、ＰｙＭｏｌの変異モジュールを使用して、上記ＮＰペプチドの中に残基毎に変異させた；（ｉｉ）各位置において、上記ＮＰペプチドの各残基の最良の配座異性体（ｃｏｎｆｏｒｍｅｒ）を、上記ＨＬＡタンパク質のファン・デル・ワールス表面へのその近接によって、結合ポケットに適合するかもしくはその中に入り込まないことを評価した。上記表面を、ＰｙＭｏｌで、デフォルトの通常の外表面を使用して生成した；（ｉｉｉ）上記ＮＰペプチドに対して生成したモデルは、上記オレキシンテンプレートの位置に可能な限り近く適合するはずである。満足のいくモデルを、この方法によって生成した。アラインメント（ＮＰ  Ｇｌｕ−４  対  オレキシンＶａｌ−８）に端を発する１つの極性ミスマッチをさらに評価したが、Ｇｌｕ残基は、上記ＨＬＡタンパク質の結合溝の中で空間的に許容される（上記タンパク質の表面との衝突は認められない）。
【０２６０】
この結合仮説をさらに分析するために、上記Ｉｌｅ／Ｍｅｔ変異（配列番号１および配列番号３）を、上記で詳述した同じ原理に従って結合ポケットにおいて評価した。上記Ｉｌｅ残基がＭｅｔに変異されると、上記ＨＬＡタンパク質の表面と激しく衝突しないＭｅｔの配座異性体を見出すことはできなかった。この分析から、Ｍｅｔ変異は提唱される構造アラインメント内ではこのポケットの中で許容され得ないと結論づけられる。
【０２６１】
並行して、両方の配列（すなわち、Ｉｌｅ改変体およびＭｅｔ改変体）を、ＤＱＢ１＊０３０２（ＰＤＢ  １ｊｋ８）においてモデリングしたところ、この残基を収容する（そして公開された配列の中のインスリン由来のＴｙｒ残基と適合する）ポケットは可撓性であるので、ＩｌｅとＭｅｔとの間を区別しないはずである。
【０２６２】
同様に、ＮＰ配列およびオレキシンフラグメントの両方を、ＨＬＡ−ＤＱ２構造（ＰＤＢ  １ｓ９ｖ）においてモデリングした。上記オレキシンペプチドは、ＤＱ２溝に緩い適合および激しい衝突なしで適合する。対照的に、両方のＮＰペプチドは、上記ＤＱ２表面を突出して非常に激しい衝突を有し、この衝突は、いずれの回転異性体でも矯正できなかった。
【０２６３】
従って、これらモデリング研究は、上記ＭＨＣペプチド結合研究と一致する：モデリングした３種のＨＬＡ分子のうち、ＤＱＢ１＊０６０２のみが、Ｉｌｅ／Ｍｅｔバリエーションによって異なるＮＰペプチド間を区別し得る。
【０２６４】
よって、ＭＨＣペプチド結合研究およびモデリング研究はともに、ＤＱＢ１＊０６０２への（しかし他のＨＬＡサブタイプではない）、Ｘ−１８１核タンパク質由来ペプチドに対してある種のＸ−１７９Ａの差次的結合の証拠となる。
【０２６５】
さらに、この種のインシリコモデリングは、ＤＱＢ１＊０６０２ハプロタイプへの強い結合を回避するはずであるＮＰ内のアミノ酸置換を同定するために使用され得る。
【０２６６】
（インフルエンザワクチンの質量分析）
質量分析法を使用して、Ｘ−１７９Ａ株由来のＨＡを含む５種の不活化スプリットインフルエンザワクチン内のＮＰを同定および定量した。
【０２６７】
ワクチンの１００μｌサンプルを、１０μＬ  ５０％  ギ酸水を添加することによって酸性化した。ワクチンをボルテックスにかけ、超音波処理ウォーターバス中で１０分間超音波処理した。５００μＬの−８０℃アセトンを添加してタンパク質沈殿を行い、−８０℃で２時間貯蔵した。サンプルを、４℃、１０，０００ｒｐｍにおいて１５分間遠心分離にかけた。その上清を廃棄し、タンパク質ペレットを１０分間、ｓｐｅｅｄ  ｖａｃ中で乾燥させた。ワクチンを、２０μＬ  ８Ｍ  尿素、５０ｍＭ  炭酸水素アンモニウムおよび２０μＬ  ０．５％  プロテアーゼ、５０ｍＭ  炭酸水素アンモニウム中で再構成した。ＤＴＴを使用して、終濃度５ｍＭへと還元を行い、５５℃で３０分間還元した。上記サンプルを室温にし、終濃度１０ｍＭ、室温において３０分間でプロピオンアミドを使用してアルキル化した。６０μＬの５０ｍＭ  炭酸水素アンモニウムを各サンプルに添加し、続いて、３００ｎｇのトリプシン／ＬｙｓＣミックスを添加した。上記サンプルを、３７℃において一晩消化し、続いて、水中で１０％  ギ酸を１０μＬ添加することによって酸性化した。上記ペプチドを、Ｃ１８マイクロスピンカラムで精製し、ｓｐｅｅｄ  ｖａｃ中で３μＬ未満に乾燥させた。
【０２６８】
次いで、各サンプルを、１５μＬ  ０．２％  ギ酸、２％  アセトニトリル  ９７．８％  水の中でＨＰＬＣ−ＭＳＭＳ用に再構成し、自己充填の石英ガラス２５ｃｍ  Ｃ１８逆相カラムに注入した。流速は、８％  移動相Ｂから５０％  移動相Ｂへの９０分間にわたる直線勾配を用いる３００ｎＬ／分であった。質量分析器は、１５種の最も強力な多重に荷電された前駆イオン（ここでこれらイオンは、６０秒間排除リストに置かれた）をフラグメント化するためのデータ依存取得（ｄａｔａ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）（ＤＤＡ）モードに設定したＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓであった。結果を、上記前駆イオンに対して１０ｐｐｍおよび上記フラグメントイオンに対して０．２５Ｄａの公差設定でＢｙｏｎｉｃＴＭを使用して、配列データベース上で検索した。リバースデコイデータベースアプローチを使用する１％  ＦＤＲを採用した。上記データベースは、ＮＣＢＩからの全てのワクチン関連タンパク質配列（３１０，４９０）を含んでいた。各ワクチンに関して、上記タンパク質を、スペクトルカウントによってソートし、相対的存在量の計算を、各ワクチンにおけるスペクトルカウントによって同定した上位１０種のタンパク質の強度を合計することによって行った。上位１０種のタンパク質の各々に関して報告された強度は、これら１０種に関して合計した強度で除算し、１００を乗算し、上位１０種の存在量のパーセンテージとして表した。
【０２６９】
Ｘ−１７９株由来のＮＰおよびＨＡに関するスペクトルカウントおよびパーセンテージ存在量の値は、以下であった：
【０２７０】
【表５】
2016521282.tif 000018
さらなる分析において、ＭＳによって同定されたペプチドは、上記ワクチンに存在することが公知の株に対して、相同性によるよりむしろ配列によって正確にマッチしていた。この方法を使用すると、結果は以下のとおりであった：
【０２７１】
【表６】
2016521282.tif 000019
本発明が例示によって記載されているに過ぎず、本発明の範囲および趣旨内に留まりつつ改変が行われ得ることは、理解される。
【０２７２】
【化１２】
2016521282.tif 000020
【０２７３】
【化１３】
2016521282.tif 000021
【０２７４】
【化１４】
2016521282.tif 000022
【０２７５】
【化１５】
2016521282.tif 000023
【図１】
2016521282.tif 000024
【配列表】
2016521282000001.app
【国際調査報告】
2016521282.tif 000025
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2016521282.tif 000027
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