(57)【要約】本発明は、Ｌ−スレオニン産生微生物およびこれを用いたＬ−スレオニンの産生方法に係り、さらに詳しくは、Ｌ−スレオニン産生能が強化された微生物およびこれを用いて高い歩留まりにてＬ−スレオニンを産生する方法に関する【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するＲＮＡポリメラーゼシグマ３２ファクター変異体。
【請求項２】
配列番号１５に記載の請求項１の変異体をコードする塩基配列。
【請求項３】
請求項２の塩基配列を含むベクター。
【請求項４】
請求項１の変異体を発現させるＬ−スレオニン産生能を有する組み換えエシェリキア属微生物。
【請求項５】
前記発現は、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するＲＮＡポリメラーゼシグマ３２ファクター変異体を暗号化させる塩基配列を含む組み換えベクターが形質導入されて行われるか、あるいは、前記塩基配列が染色体内にさらに挿入されて行われることを特徴とする、請求項４に記載のＬ−スレオニン産生能を有する組み換えエシェリキア属微生物。
【請求項６】
前記塩基配列は、配列番号１５の塩基配列を有することを特徴とする、請求項５に記載のＬ−スレオニン産生能を有する組み換えエシェリキア属微生物。
【請求項７】
前記エシェリキア属微生物は、大腸菌であることを特徴とする、請求項５に記載のＬ−スレオニン産生能を有する組み換えエシェリキア属微生物。
【請求項８】
請求項４から請求項７のうちのいずれか一項に記載のＬ−スレオニン産生能を有する組み換えエシェリキア属微生物を培養するステップおよび前記培養液からＬ−スレオニンを分離するステップを含むＬ−スレオニンの産生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡポリメラーゼシグマ３２ファクター変異体およびこれを用いてＬ−スレオニンを産生する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−スレオニンは、必須アミノ酸の一種であり、飼料と、食品添加剤および動物成長促進剤として広く用いられ、医薬品の合成原料および医薬用輸液剤としても有用に用いられる。
【０００３】
Ｌ−スレオニンは、主として人工変異法または遺伝子組み換え方法により開発された大腸菌またはコリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いた発酵法により産生される。大腸菌、コリネ型細菌、セラチア属細菌及びプロデンシア属細菌の野生型菌株から誘導された人工変異株がＬ−スレオニンの産生のために広く用いられている。
【０００４】
遺伝子組み換え技術が発展することに伴い、無作為的突然変異法により開発されたＬ−スレオニン産生株を対象として部位特異的な遺伝子置換、遺伝子増幅および欠失などを導入してより向上したＬ−スレオニン産生株の開発に関する技術が報告されている。スレオニンの生合成に関連する遺伝子およびこれらの発現を増大させる様々な方法が開発されたが、より高い歩留まり率のＬ−スレオニンを産生する方法へのニーズが依然として存在する。
【０００５】
広域転写機構は、全ての細胞システム（原核および真核生物）において転写体を制御する役割を果たす。広域転写機構操作は、広域転写調節子をコードする核酸、またはこの発現を調節するプロモーターを突然変異させて形質改良された広域転写調節子を含む組み換え細胞を提供し、この方法により向上した表現型を有する細胞を産生することができる。
【０００６】
シグマファクターは、ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素のプロモーター好みに焦点を合わせることにより、広域転写を調整するのに重要な役割を果たす広域転写調節子の一種である。シグマファクターは、原核生物の転写開始因子であり、遺伝子のプロモーターへのＲＮＡポリメラーゼの特異的な結合を可能にする。異なるシグマファクターは、異なる環境条件に反応して活性化され、全てのＲＮＡポリメラーゼ分子は一つのシグマファクターを含むことになる。大腸菌は、少なくとも八個のシグマファクターを有しており、シグマファクターの数は、バクテリアの種に応じて異なってくることが知られている。
【０００７】
本発明者らは、Ｌ−スレオニン産生能を有する大腸菌の高温におけるストレスに対する耐性をさらに強化させることを目指して、熱衝撃反応を統制すると知られているシグマ３２をコードするｒｐｏＨ遺伝子に関する改良研究を行い、その結果、高温でもスレオニン生合成能が大幅に低減されないように転写機作を調節するＲＮＡポリメラーゼシグマ３２ファクター変異体を開発し、これをスレオニン産生株に導入してスレオニン産生株を製作することにより本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＲＮＡポリメラーゼシグマ３２ファクター変異体を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記ＲＮＡポリメラーゼシグマ３２ファクター変異体をコードする塩基配列を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記塩基配列を含むベクターを提供することを目的とする。
さらにまた、本発明は、前記変異体を発現するＬ−スレオニン産生能を有する組み換えエシェリキア属微生物を提供することを目的とする。
これらに加えて、本発明は、前記組み換えエシェリキア属微生物を用いてＬ−スレオニンを産生する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明は、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＲＮＡポリメラーゼシグマ３２ファクター変異体を提供する。
また、本発明は、前記ＲＮＡポリメラーゼシグマ３２ファクター変異体をコードする塩基配列を提供する。
さらに、本発明は、前記変異体を発現するＬ−スレオニン産生能を有する組み換えエシェリキア属微生物を提供する。
さらにまた、本発明は、前記組み換えエシェリキア属微生物を用いてＬ−スレオニンを産生する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明による高温によるストレスに耐性を有するＲＮＡポリメラーゼシグマ３２ファクター変異体をコードする塩基配列を含むベクターに形質転換された菌株は、温度への耐性が与えられているだけではなく、Ｌ−スレオニンの歩留まり率も向上して高温における培養時にも従来の菌株に比べて格段に高いスレオニンを産生することができるので、高い歩留まりにてスレオニンを産生する上で、好適に使用することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するＲＮＡポリメラーゼシグマ３２ファクター変異体を提供する。
【００１２】
本願発明において用いられる用語「シグマ３２（ｓｉｇｍａ−３２、σ３２）ファクター」とは、広域転写調節子であるシグマファクターであり、対数期において熱衝撃反応を統制する主なシグマファクターとして知られており、ｒｐｏＨ遺伝子によりコードされる。
【００１３】
本発明の変異体は、前記変異体のアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは、９０％以上、より好ましくは、９５％以上、特に好ましくは、９９％以上の相同性を有する変異体を含む。前記アミノ酸配列に対する相同性は、例えば、文献によるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［参照：ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｐｒｏ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０，  ５８７３（１９９３）］やＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ［参照：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １８３，  ６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このようなアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている［参照：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ］。本発明の変異体は、前記変異体のアミノ酸配列に対して欠失、挿入、アミノ酸置換などを有する突然変異体を含み、且つ、コドン置換を有する突然変異体も含む。
【００１４】
本発明の好適な実施形態においては、大腸菌野生株であるＷ３１１０の無作為的突然変異が取り込まれたｒｐｏＨよりなるＤＮＡプールから変異体を抽出してｒｐｏＨ２−Ｇ６と命名した。この塩基配列の分析を行ったところ、野生型ＲＮＡポリメラーゼシグマ３２ファクターのアミノ酸配列（配列番号１６）と比較してアミノ酸配列上の突然変異が生じたことを確認することができた（実施例３）。
【００１５】
また、本発明は、前記変異体をコードする塩基配列を提供する。
本発明の好適な実施形態において、前記ＲＮＡポリメラーゼシグマ３２ファクター変異体は、好ましくは、配列番号１５の塩基配列を有していてもよい。
【００１６】
本発明の好適な実施形態において、前記変異体をコードする塩基配列は、遺伝暗号が退歩されていてもよい。遺伝コードの 縮重  とは、遺伝暗号中の文字のうち最後の字の意味がない現象のことをいい、前の二つの塩基さえ同じであれば、 最後 の位置の暗号は異なっていても同じ暗号の役割を果たす。
このため、本発明の塩基配列は、配列番号１５に記載の塩基配列と８０％以上の相同性、好ましくは、９０％以上の相同性、さらに好ましくは、９５％以上の相同性、最も好ましくは、９９％以上の相同性を有していてもよい。
【００１７】
さらに、本発明は、前記塩基配列を含むベクターを提供する。
本発明において用いられるベクターは、宿主中において複製可能なものであれば特に限定されるものではなく、当業界における公知の任意のベクターを用いることができる。通常のベクターの例としては、天然状態や組み換え状態のプラスミド、コスミド、ウィルスおよびバクテリオファージが挙げられる。例えば、把持ベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＭＢＬ３、λＭＢＬ４、λＩＸＩＩ、λＡＳＨＩＩ、λＡＰＩＩ、λｔ１０、λｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４ＡおよびＣｈａｒｏｎ２１Ａなどが使用可能であり、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系およびｐＥＴ系などが使用可能である。本発明において使用可能なベクターは、特に制限されるものではなく、公知の発現ベクターが使用可能である。好ましくは、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどが使用可能である。最も好ましくは、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターが使用可能である。
【００１８】
また、本発明は、前記変異体を発現するＬ−スレオニン産生能を有する組み換えエシェリキア属微生物を提供する。
本発明において、前記変異体の発現は、前記変異体をコードする遺伝子を作動可能に含む組み換えベクターに形質転換されて達成されるか、あるいは、前記変異体を暗号化させるポリヌクレオチドが染色体内に挿入されて達成されるが、本発明はこれに特に限定されない。
本発明における用語「形質転換」とは、目的タンパク質を暗号化させるポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に取り込んで宿主細胞内において前記ポリヌクレオチドが暗号化させるタンパク質を発現させることを意味する。取り込まれたポリヌクレオチドは、宿主細胞内において発現可能である限り、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、あるいは、染色体外に位置する。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質を暗号化させるＤＮＡおよびＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に取り込まれて発現可能である限り、いかなる形で取り込まれても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自体的に発現されるのに必要なあらゆる要素を含むポリヌクレオチド構造体である発現カセットの形で宿主細胞に取り込まれてもよい。前記発現カセットは、通常、前記遺伝子のオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ、以下、「ＯＲＦ」と略称する。）に作動可能に連結されているプロモーター、転写終結信号、リボソーム結合部位および翻訳終結信号を含む。前記発現カセットは、自体的に複製可能な発現ベクターの形であってもよい。なお、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形で宿主細胞に取り込まれて、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよい。
【００１９】
本発明において、好ましくは、前記形質転換は、ＲＮＡポリメラーゼシグマ３２ファクター変異体をコードする塩基配列を含むベクターが形質導入されて行われるか、あるいは、前記塩基配列が染色体内に挿入されて行われることを特徴とするが、本発明はこれに特に制限されない。
【００２０】
本発明の微生物は、Ｌ−スレオニンが産生可能である限り、いかなる原核微生物も含む。例えば、エシェリキア属、エルウイニア属、セラチア属、プロビデンシア属、コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属の微生物菌株を含む。好ましくは、エシェリキア属の微生物であり、さらに好ましくは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。
【００２１】
本発明の好適な実施形態において、本発明は、母菌株としてスレオニン産生菌株を活用することができる。前記スレオニン産生菌株は、メチオニン要求性、スレオニン類似体に対する耐性、リシン類似体に対する耐性、イソロイシン類似体に対する耐性およびメチオニン類似体に対する耐性を有する大腸菌であってもよい。また、スレオニン産生菌株は、スレオニン生合成遺伝子などを操作した組み換え大腸菌であってもよく、例えば、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ；ｐｐｃ）遺伝子およびアスパルトキナーゼＬ−ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ａｓｐａｒｔｏｋｉｎａｓｅ Ｌ−ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ｔｈｒＡ）、ホモセリンキナーゼ（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ；ｔｈｒＢ）、スレオニンシンターゼ（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ；ｔｈｒＣ）を含むオペロンがそれぞれ１コピー取り込まれた組み換え大腸菌またはＬ−スレオニン分解過程に与るオペロン遺伝子（ｔｄｃＢＣ）およびホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰ ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ；ｐｃｋＡ）がいずれも不活性化された組み換え大腸菌であってもよい。
【００２２】
好ましくは、大腸菌ＦＴＲ２５３３ ＫＣＣＭ １０５４１Ｐ（大韓民国登録特許番号第１０−０５７６３４２号）、大腸菌ＡＢＡ５Ｇ／ｐＡｃｓｃＢＡＲ'−Ｍ、ｐＣ−Ｐｔｒｃ−ｓｃｒＡＢ（大韓民国登録特許番号第１０−１１４５９４３号）および大腸菌ＫＣＣＭ１１１６７Ｐ（大韓民国公開特許番号第１０−２０１２−００８３７９５号）よりなるから選ばれた菌株が使用可能である。
【００２３】
本発明の好適な実施形態において、本発明により形質転換された微生物は、好ましくは、大腸菌ＦＴＲ２７００であってもよい。
【００２４】
本発明の好適な実施形態において、本発明の微生物は、Ｌ−スレオニン産生性の向上のための一つ以上の好適な表現型を有する大腸菌であってもよい。好ましくは、一つ以上の好適な表現型は、温度耐性型である。
【００２５】
また、本発明は、前記形質転換された菌株を用いてＬ−スレオニンを産生する方法を提供する。
本発明の前記培養過程は、当業界における公知の適当な培地および培養条件により行われる。このような培養過程は、当業者であれば、選択される菌株に応じて手軽に調整して用いることができる。前記培養方法としては、回分式培養、連続式培養および流加式培養が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の微生物培養に用いられる培地およびその他の培養条件は、通常のエシェリキア属微生物の培養に用いられる培地であれば、いかなるものも使用可能であるが、本発明の微生物の要求条件を適切に満たさなければならない。
【００２６】
本発明の具体的な実施形態によれば、本発明の微生物を適当な炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミンなどを含有する通常の培地内において好気性条件下において温度、ｐＨなどを調節しながら培養する。
このとき、炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、マンニトール、ソルビトールなどの炭水化物、糖アルコール、グリセロール、ピルビン酸、乳酸およびクエン酸などのアルコールおよび有機酸、グルタミン酸、メチオニンおよびリシンなどのアミノ酸などが挙げられ、澱粉加水分解物、糖みつ、廃糖みつ、米糠、カッサバ、バガスおよびトウモロコシ浸漬液などの天然の有機栄養源が使用可能であり、好ましくは、グルコースおよび殺菌済みの前処理糖みつ（すなわち、還元糖に転換された糖みつ）などの炭水化物であり、その他の適正量の様々な炭素源が制限なしに使用可能である。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムなどの無機窒素源；グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸およびペプトン、ＮＺ−アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類またはその分解生成物、脱脂大豆ケーキまたはその分解生成物など有機窒素源が使用可能である。これらの窒素源は、単独でまたは組み合わせられて使用可能である。前記培地には、リン源として、第一リン酸カリウム、第二リン酸カリウムおよび対応するナトリウム含有塩が挙げられる。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどが使用可能であり、これらに加えて、アミノ酸、ビタミンおよび適切な前駆体などが使用可能である。これらの培地または前駆体は、培養物に回分式または連続式により添加可能である。
【００２７】
培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸および硫酸などの化合物を培養物に適切な方式を用いて添加して、培養物のｐＨを調整してもよい。また、培養中には脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡の生成を抑えてもよい。さらに、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素含有ガスを注入してもよく、嫌気および未好気状態を維持するために、ガスの注入なしに、あるいは、窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入してもよい。培養物の温度は、普通、２７℃〜３７℃、好ましくは、３０℃〜３７℃である。培養期間は、所望の有用物質の生成量が得られるまで続いてもよく、好ましくは、１０〜１００時間である。
【００２８】
本発明の前記培養ステップにおいて産生されたＬ−スレオニンに対しては、さらに精製または回収が行われてもよく、このとき、本発明の微生物の培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式の培養方法などに応じて当該分野における公知の好適な方法を用いて培養液から目的とするＬ−スレオニンを精製または回収してもよい。
【００２９】
以下、本発明を実施例を挙げてより詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されることはない。
【実施例】
【００３０】
実施例１：組み換えベクターｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨの製作
（１）ｒｐｏＨ遺伝子断片の準備
ｒｐｏＨ遺伝子（配列番号１４、アミノ酸配列番号１６）を含むＤＮＡ断片約１．０ｋｂを得るために、キアゲン社製のＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐシステムを用いて大腸菌野生株であるＷ３１１０の染色体ＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出し、前記ｇＤＮＡを鋳型としてＰＣＲＨＬプレミックスキット（ＢＩＯＮＥＥＲ社製、以下、同じ。）を用いて重合酵素連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下、「ＰＣＲ」と略称する。）を行った。
ｒｐｏＨ遺伝子を増幅させるための重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）は、配列番号１および２のプライマーを用いて、９４℃における３０秒間の変性、５５℃における３０秒間のアニーリングおよび７２℃における１分間の伸張よりなるサイクルを２７回繰り返し行った。
前記重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）結果物をＥｃｏＲＩで切断して１．０Ｋｂの大きさのＤＮＡ断片（以下、「ｒｐｏＨ断片」と命名する。）を０．８％のアガロースゲルにおいて電気泳動した後、溶離して得た。
【００３１】
（２）組み換えベクターｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨの製作
複製数調節ｐＣＣ１ＢＡＣ ＥｃｏＲＩクローニングレディベクター（Ｃｏｐｙｃｏｎｔｒｏｌ ｐＣＣ１ＢＡＣ ＥｃｏＲＩ ｃｌｏｎｉｎｇ−ｒｅａｄｙ ｖｅｃｔｏｒ；ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（ＵＳＡ））および実施例１−（１）において得られたｒｐｏＨ断片をそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩで処理し、結さつしてｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨプラスミドを製作した。
【００３２】
実施例２：組み換えベクターｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨの変異体ライブラリーの製作
（１） エラープローン 重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を用いたｒｐｏＨ変異体の準備
無作為的突然変異が取り込まれたｒｐｏＨ変異体断片よりなるＤＮＡプールを得るために、実施例１−（１）において抽出したＷ３１１０のｇＤＮＡを鋳型としてクローンテック社製のｄｉｖｅｒｓｉｆｙＰＣＲｒａｎｄｏｍｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｋｉｔ（カタログ番号Ｋ１８３０−１）のユーザーマニュアルに提示されている表3の突然変異反応４の条件で重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）は、配列番号１および２のプライマーを用いて、９４℃における３０秒間の変性、６８℃における１分間の伸張よりなるサイクルを２５回繰り返し行った。
前記重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）結果物をＥｃｏＲＩで切断して１．０Ｋｂの大きさのＤＮＡ断片（以下、「ｒｐｏＨｍ断片」と命名する。）を０．８％のアガロースゲルにおいて電気泳動した後、溶離して得た。
【００３３】
（２）組み換えベクターｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨの変異体ライブラリーの製作
複製数調節ｐＣＣ１ＢＡＣ ＥｃｏＲＩクローニングレディベクターを実施例２−（１）において得られたｒｐｏＨｍ断片と結さつしてｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨｍベクターを製作した。
これをトランスフォーマックスＥＰＩ３００エレクトロコンピテント大腸菌（ＴｒａｎｓｆｏｒＭａｘ ＥＰＩ３００ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ；ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（ＵＳＡ））に形質転換し、ＬＢプレート＋１５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール＋４０μｇ／ｍｌ Ｘ−Ｇａｌ＋０．４ｍＭ ＩＰＴＧにおいて選別して青いコロニーが出ないことを確認し、取得されたコロニーを集めてプラスミドプレップを行ってｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨの変異体ライブラリーを製作した。
【００３４】
（３） ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨの変異体ライブラリーのスレオニン産生菌株の取り込み
前記実施例１−（２）において得られたｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨおよび実施例２−（２）において得られたｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨの変異体ライブラリーをコンピテントな状態で製造したスレオニン産生菌株である大腸菌ＫＣＣＭ １０５４１にそれぞれ形質転換して取り込み、得られた菌株をそれぞれＫＣＣＭ１０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨおよびＫＣＣＭ １０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨ変異体ライブラリーと命名した。
この実施例において用いられた母菌株である大腸菌ＫＣＣＭ １０５４１は、メチオニン栄養要求性、イソロイシン漏出型要求性、Ｌ−スレオニン類似体（例えば、α−アミノ−β−ヒドロキシヒドロキシ酪酸；ＡＨＶ）に対する耐性、Ｌ−リシン類似体（例えば、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン；ＡＥＣ）に対する耐性、イソロイシン類似体（例えば、α−アミノ酪酸）に対する耐性、メチオニンの類似体（例えば、エチオニン）に対する耐性などの特性を有する母菌株である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＫＣＣＭ １０２３６の染色体の内部に存在するｔｙｒＲ遺伝子およびｇａｌＲ遺伝子を不活性化させることにより向上したＬ−スレオニン産生能を有する菌株である（大韓民国特許登録番号第１０−０５７６３４２号）。
【００３５】
実施例３：温度に耐性を有するＲＮＡポリメラーゼシグマ３２ファクター変異体の選別
この実施例においては、温度に耐性を有するＲＮＡポリメラーゼシグマ３２ファクター変異体を選別するための実験を行った。
前記実施例２−（３）において製造した大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨおよび大腸菌ＫＣＣＭ １０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨ変異体ライブラリーを３７℃、３３℃の培養器においてＬＢ固体培地中に一晩培養し、これをそれぞれ下記表１の２５ｍＬの力価培地に一白金耳ずつ接種した後、これを３７℃、３３℃の震とう培養器において２００ｒｐｍにて４８時間それぞれ培養した。
【表１】
2016521763.tif 000002
【００３６】
ｒｐｏＨ変異体ライブラリーが取り込まれたそれぞれのコロニーを３７℃で培養してＫＣＣＭ １０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨに比べてスレオニンの濃度が上昇する変異体を選別し、これを３３℃で培養して評価する過程を繰り返し行ってｒｐｏＨ変異体ライブラリーに対する評価を行った。このような過程を通して、温度への耐性及び歩留まり率の向上が両立されたクローンを選別した。前記クローンからベクターを抽出してｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨ２−Ｇ６と命名した。
前記ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨ２−Ｇ６の変異を確認するために、複製数調節ｐＣＣ１ＢＡＣ ＥｃｏＲＩクローニングレディベクターキットに確認用プライマーとして提供されるｐＩＢＦＰ（配列番号３）およびｐＩＢＲＰ（配列番号４）を用いてｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨ２−Ｇ６の重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、得られた重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）結果物の配列を分析した。配列を分析したところ、ｒｐｏＨの変異体であるｒｐｏＨ２−Ｇ６（配列番号１５）は、配列番号１７のアミノ酸配列を有することを確認した。
【００３７】
実施例４：組み換え菌株のＬ−スレオニン産生能の比較
前記実施例３において得られたベクターｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨ２−Ｇ６を大腸菌ＫＣＣＭ １０５４１に形質転換して大腸菌ＫＣＣＭ １０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨ２−Ｇ６を製造した。
母菌株である大腸菌ＫＣＣＭ １０５４１、大腸菌ＫＣＣＭ １０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨおよび大腸菌をＫＣＣＭ １０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨ２−Ｇ６をそれぞれ上記表１のスレオニン力価培地を用いて三角フラスコにおいて培養してＬ−スレオニン産生性を確認した。その結果を下記表２に示す。
【表２】
2016521763.tif 000003
【００３８】
上記表２に記載されているように、母菌株である大腸菌ＫＣＣＭ １０５４１と対照 群菌株であるＫＣＣＭ １０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨ菌株は、４８時間培養した場合、３０．６ｇ／Ｌ、３０．５ｇ／ＬのＬ−スレオニンを産生したが、上記のようにして得た大腸菌ＫＣＣＭ １０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨ２−Ｇ６菌株は３１．１ｇ／ＬのＬ−スレオニンを産生して母菌株に比べて約１％向上したＬ−スレオニン産生能を示した。
３７℃では母菌株（ＫＣＣＭ １０５４１）および対照群菌株（ＫＣＣＭ１０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨ）の歩留まり率が下がる様相を示すのに対し、ＫＣＣＭ １０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨ２−Ｇ６菌株は温度による濃度低下現象を示さず、３１．８ｇ／ＬのＬ−スレオニンを産生して高温における培養時に対照群に比べて約８％向上したスレオニン産生能が与えられたことを確認することができた。
【００３９】
実施例５：選別されたｒｐｏＨ変異体（ｒｐｏＨ２−Ｇ６）のスレオニン産生菌株別の効果の比較
（１） ＡＢＡ５Ｇ／ｐＡｃｓｃＢＡＲ'−Ｍ、ｐＣ−Ｐｔｒｃ−ｓｃｒＡＢ菌株におけるｒｐｏＨ変異体（ｒｐｏＨ２−Ｇ６）効果の確認
前記実施例４において効果が確認されたベクターｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨ２−Ｇ６をスレオニン産生菌株であるＡＢＡ５Ｇ／ｐＡｃｓｃＢＡＲ'−Ｍ、ｐＣ−Ｐｔｒｃ−ｓｃｒＡＢ（大韓民国特許登録番号第１０−１１４５９４３号）に取り込んでＡＢＡ５Ｇ／ｐＡｃｓｃＢＡＲ'−Ｍ、ｐＣ−Ｐｔｒｃ−ｓｃｒＡＢ、ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨ２−Ｇ６を製作し、下記表３に示す力価培地を製造して力価評価を行った。その結果を下記表４に示す。
この実施例において用いられた母菌株であるＡＢＡ５Ｇ／ｐＡｃｓｃＢＡＲ'−Ｍ、ｐＣ−Ｐｔｒｃ−ｓｃｒＡＢは、スレオニン産生菌株であるＡＢＡ５Ｇ菌株（母菌株である大腸菌Ｗ３１１０のＮ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）突然変異の誘起により製作された菌株であり、メチオニン要求性、イソロイシン漏出、α−アミノ−β−ヒドロキシヒドロキシ酪酸に対する耐性、２−アミノエチル−１−システインに対する耐性、１−アゼチジン−２−カルボン酸に対する耐性を有する）にｐＡｃｓｃＢＡＲ'−Ｍ遺伝子群およびｐＣ−Ｐｔｒｃ−ｓｃｒＡＢ遺伝子群を含むベクターに形質転換して得られたＬ−スレオニン産生能を有する大腸菌である。
【表３】
2016521763.tif 000004
【表４】
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【００４０】
上記表４に記載されているように、大腸菌ＫＣＣＭ １０５４１を除く他のスレオニン産生菌株に取り込んだ場合にも、上記表２から確認されたところと同様に、ベクターｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨ２−Ｇ６を取り込むと、３３℃ではスレオニンの歩留まり率が維持され、３７℃でもスレオニンの歩留まり率が３３℃の歩留まり率と略同じレベルに維持されることを確認することができた。
【００４１】
（２） 大腸菌ＫＣＣＭ１１１６７Ｐ菌株におけるｒｐｏＨ変異体（ｒｐｏＨ２−Ｇ６）効果の確認
さらに他のスレオニン産生菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１１１６７Ｐ（大韓民国特許出願番号第２０１１−０００５１３６号）にベクターｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨ２−Ｇ６を取り込んで大腸菌ＫＣＣＭ１１１６７Ｐ／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨ２−Ｇ６を製作し、上記表１の力価培地を製造してスレオニン産生能を評価した。その結果を下記表５に示す。
この実施例において用いられた母菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１１１６７Ｐは、ＫＣＣＭ １０５４１菌株（大韓民国特許登録番号第１０−０５７６３４２）にｔｄｃＢを不活性化させ、ｎａｄＫを２ｃｏｐｙに強化させてＮＡＤキナーゼ活性を強化させた菌株である。
【表５】
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【００４２】
上記表５の力価評価の結果から、前記実施例５−（１）に示す他のスレオニン産生菌株に取り込まれたときと同様に、スレオニン産生能を有する菌株にｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨ２−Ｇ６が取り込まれると、３３℃ではスレオニンの歩留まり率が維持され、３７℃ではスレオニンの歩留まり率が３３℃における歩留まり率と略同様に維持されることを確認することができた。
【００４３】
実施例６：選別されたｒｐｏＨ変異体（ｒｐｏＨ２−Ｇ６）の染色体への追加挿入
（１） ｒｐｏＨ２−Ｇ６挿入用カセット断片の準備
前記実施例３において選別されたｒｐｏＨ２−Ｇ６変異体を染色体に追加的に挿入するために線形挿入用カセットを製作した。線形挿入用カセットは、下記の方法に従い製作した。
配列番号５および６のプライマーを用いて、大腸菌Ｗ３１１０ ｇＤＮＡを鋳型として重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）は、９４℃における３０秒間の変性、５５℃における３０秒間のアニーリングおよび７２℃における３０秒間の伸張よりなるサイクルを２７回繰り返し行った。このようにして得られたＤＮＡ断片を相同性部位１と命名した。
配列番号７および８のプライマーを用いて、ｐＭｌｏｘＣｍｔを鋳型として変異体ｌｏｘＰ−Ｃｍｒ−ｌｏｘＰカセットを増幅させるための重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、９４℃における３０秒間の変性、５５℃における３０秒間のアニーリングおよび７２℃における１分間の伸張よりなるサイクルを２７回繰り返し行った。このようにして得たＤＮＡ断片を相同性部位１と命名した。ここで、鋳型として用いられたｐＭｌｏｘＣｍｔは、鈴木らがｌｏｘ７１およびｌｏｘ６６と命名した変異体ｌｏｘＰを用いた改善された遺伝子の欠失方法について報告した内容を応用して当業者が製作したベクターである（Ｓｕｚｕｋｉ  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ７１：８４７２，  ２００５）。
このようにして得た相同性部位１および変異体ｌｏｘＰ−Ｃｍｒ−ｌｏｘＰカセット部分を配列番号５および８を用いて重複伸長重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、相同性領域１−変異体ｌｏｘＰ−Ｃｍｒ−ｌｏｘＰを得た。このとき、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）は、プライマーがない状態で、９４℃における３０秒間の変性、５５℃における３０秒間のアニーリングおよび７２℃における１分３０秒間の伸張よりなるサイクルを５回繰り返し行った後、プライマーを入れて２３サイクルをさらに行った。
配列番号９および１０のプライマーを用いて、ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｒｐｏＨ２−Ｇ６を鋳型として重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。９４℃における３０秒間の変性、５５℃における３０秒間のアニーリングおよび７２℃における１分間の伸張よりなるサイクルを２７回繰り返し行った。
配列番号１１および１２のプライマーを用いて、大腸菌Ｗ３１１０ ｇＤＮＡを鋳型として重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。９４℃における３０秒間の変性、５５℃における３０秒間のアニーリングおよび７２℃における３０秒間の伸張よりなるサイクルを２７回繰り返し行った。このようにして得たＤＮＡ断片を相同性部位２と命名した。
上記のｒｐｏＨ２−Ｇ６および相同性部位２の部分に対して配列番号９および１２を用いて重複伸長重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行ってｒｐｏＨ２−Ｇ６−相同性部位２を得た。このとき、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）は、プライマーがない状態で、９４℃における３０秒間の変性、５５℃における３０秒間のアニーリングおよび７２℃における１分３０秒間の伸張よりなるサイクルを５回繰り返し行った後、プライマーを入れて２３サイクルをさらに行った。
このようにして得た相同性部位１−変異体ｌｏｘＰ−Ｃｍｒ−ｌｏｘＰ、ｒｐｏＨ２−Ｇ６−相同性部位２を鋳型として、配列番号５および１２を用いて重複伸長重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行ってｒｐｏＨ２−Ｇ６挿入用カセットを製作した。このとき、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）は、プライマーがない状態で、９４℃における３０秒間の変性、５５℃における３０秒間のアニーリングおよび７２℃における３分間の伸張よりなるサイクルを５回繰り返し行った後、プライマーを入れて２３サイクルをさらに行った。このような過程を経て配列番号１３に記載のｒｐｏＨ２−Ｇ６挿入用カセットを製作した。
【００４４】
（２） 染色体の上にｒｐｏＨ２−Ｇ６変異体がさらに挿入された組み換え菌株の製造
染色体の上に既に選別されたｒｐｏＨ２−Ｇ６変異体を挿入するために、大腸菌ＫＣＣＭ １０５４１に前記実施例６−（１）において製作したｒｐｏＨ２−Ｇ６挿入用カセットＤＮＡ断片を分離精製して公知の１段階不活性化（Ｗａｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  ６；９７（１２）：６６４０，  ２０００）の方法と同様にして既存の内在されたｒｐｏＨの後ろの染色体部分にｒｐｏＨ２−Ｇ６変異体をさらに挿入した。次いで、抗生剤耐性標識遺伝子を除去してｒｐｏＨ２−Ｇ６変異体がさらに挿入された菌株を製作し、塩基配列の分析を行って重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）エラーが導入されていないことを確認した。製作されたｒｐｏＨ２−Ｇ６の追加挿入菌株をＦＴＲ２７００と命名し、前記形質転換された大腸菌ＦＴＲ２７００を２０１３年２月５日付けで韓国微生物保存センター（ＫｏｒｅａｎＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、以下、「ＫＣＣＭ」と略称する。）に寄託した（受託番号ＫＣＣＭ １１３６８Ｐ）。
【００４５】
（３） Ｌ−スレオニン産生性の確認
前記実施例６−（２）において製造した組み換え微生物を上記表１のスレオニン力価培地を用いて三角フラスコにおいて培養してＬ−スレオニン産生性を確認した。
３３℃、３７℃の培養器においてＬＢ固体培地中に一晩培養した大腸菌ＫＣＣＭ １０５４１および大腸菌ＫＣＣＭ １１３６８Ｐをそれぞれ上記表１の２５ｍＬの力価培地に一白金耳ずつ接種した後、これを３３℃、３７℃の震とう培養器において２００ｒｐｍにて４８時間培養した。
下記表６に記載されているように、母菌株である大腸菌ＫＣＣＭ １０５４１菌株は、４８時間培養した場合に３０．３ｇ／ＬのＬ−スレオニンを産生し、本発明の前記実施例６−（２）において製作されたＫＣＣＭ１１３６８Ｐ大腸菌菌株は３０．０ｇ／ＬのＬ−スレオニンを産生して母菌株と略同じＬ−スレオニン産生性を示した。３７℃では母菌株（ＫＣＣＭ １０５４１）の歩留まり率が下がる様相を示すのに対し、ＫＣＣＭ １１３６８Ｐ菌株は温度による濃度低下現象を示さず、濃度が上がる様相を示した。
これにより、ベクターの形で取り込まれて形質転換された菌株と同様に、３７℃の培養時にも３３℃の培養時と略同じレベルのスレオニン産生能あるいはこれを上回るレベルのスレオニン産生能が与えられたことを確認することができた。
【表６】
2016521763.tif 000007
【００４６】
以上の説明から、本発明が属する技術分野における当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須的特徴を変更することなく他の具体的な形態にて実施可能であるということが理解できる筈である。これと関連して、上述した実施例はあらゆる面において例示的なものであり、限定的なものではないと理解されるべきである。本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味および範囲並びにその等価概念から導き出されるあらゆる変更例または変形例が本発明の範囲に含まれるものと解釈さるべきである。
【００４７】
［受託番号］
寄託機関名：韓国微生物保存センター（海外）
受託番号：ＫＣＣＭ １１３６８Ｐ
受託日：２０１３年０２月０５日
寄託機関の名称  
韓国微生物保存センター        
寄託機関の住所（郵便番号および国名を含む）  
〒１２０-０９１  韓国ソウル特別市西大門区弘済１洞３６１-２２１番地ユリムビル    寄託日  
２０１３年０２月０５日      
寄託番号  
ＫＣＣＭ １１３６８Ｐ        
【配列表】
2016521763000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年12月18日(2015.12.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するＲＮＡポリメラーゼシグマ３２ファクター変異体。
【請求項２】
請求項１のＲＮＡポリメラーゼシグマ３２ファクター変異体をコードする塩基配列。
【請求項３】
配列番号１５に記載の請求項２の変異体をコードする塩基配列。
【請求項４】
請求項２の塩基配列を含むベクター。
【請求項５】
請求項１の変異体を発現させるＬ−スレオニン産生能を有する組み換えエシェリキア属微生物。
【請求項６】
前記発現は、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するＲＮＡポリメラーゼシグマ３２ファクター変異体を暗号化させる塩基配列を含む組み換えベクターが形質導入されて行われるか、あるいは、前記塩基配列が染色体内にさらに挿入されて行われることを特徴とする、請求項５に記載のＬ−スレオニン産生能を有する組み換えエシェリキア属微生物。
【請求項７】
前記塩基配列は、配列番号１５の塩基配列を有することを特徴とする、請求項６に記載のＬ−スレオニン産生能を有する組み換えエシェリキア属微生物。
【請求項８】
前記エシェリキア属微生物は、大腸菌であることを特徴とする、請求項６に記載のＬ−スレオニン産生能を有する組み換えエシェリキア属微生物。
【請求項９】
請求項５から請求項８のうちのいずれか一項に記載のＬ−スレオニン産生能を有する組み換えエシェリキア属微生物を培養するステップおよび前記培養液からＬ−スレオニンを分離するステップを含むＬ−スレオニンの産生方法。
【国際調査報告】
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2016521763.tif 000009
2016521763.tif 000010
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