(57)【要約】  本発明は、対象者における食物誘因体重増加及び/又は食物誘因インスリン抵抗性を低減させるため並びに食物誘因体重増加及び/又は食物誘因インスリン抵抗性に起因する疾患、例えば過体重、肥満及び肥満関連疾患を治療するための、ラクトバチルス ラムノサスCNCM I-3690株の使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象者における食物誘因体重増加及び/又は食物誘因インスリン抵抗性を低減させるために使用するラクトバチルス ラムノサスCNCM I-3690株。
【請求項２】
食物誘因体重増加及び/又は食物誘因インスリン抵抗性に起因する病状の治療、予防又は緩和に使用する、請求項１に記載のラクトバチルス ラムノサスCNCM I-3690株。
【請求項３】
前記病状が過体重、肥満及び肥満関連疾患から選択される、請求項１又は２に記載のラクトバチルス ラムノサスCNCM I-3690株。
【請求項４】
経口投与可能な組成物に含まれている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のラクトバチルス ラムノサスCNCM I-3690株。
【請求項５】
前記組成物が食品又は補助食品である、請求項４に記載のラクトバチルス ラムノサスCNCM I-3690株。
【請求項６】
前記食品が発酵乳製品である、請求項５に記載のラクトバチルス ラムノサスCNCM I-3690株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロバイオティクスの分野に関し、より具体的には体重増加及びインスリン抵抗性を調節するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
過体重及び肥満の罹患率は、過去25年間にわたって世界中の多くの地域で相当増加した。25以上のボディマスインデックス(BMI)は過体重とみなされ、30以上のBMIは肥満と定義される。
1980年から、世界中の肥満人口は倍以上に増加している。2008年には、14億人を超える成人(20歳以上)が過体重であった。このうち２億人を超える男性及びほぼ３億人の女性が肥満であった。
【０００３】
肥満は、しばしば、インスリン抵抗性(すなわち、細胞がインスリンに対して適切に応答することがもはやできない状態)を伴い、代謝症候群を包含する主要な疾患、例えば高血圧、II型糖尿病、心血管疾患並びに肝臓疾患に至る。
脂肪蓄積及び体重の個体間差は、遺伝的背景、健康状態、薬物療法又は年齢のような種々のファクターと相互に関連付けられ得るが、肥満及びインスリン抵抗性が現在頻発している主原因の１つは、日常生活における身体活動の減少と、高脂肪高スクロース食物に富む欧米スタイルの食物(diet)との組合せであることが広く受け容れられている。
【０００４】
また、近年の多くの研究により、肥満及び肥満関連代謝異常は腸微生物叢の組成変化と関連付けられること(概説として、LEY, Curr Opin Gastroenterol. 26, 5-11, 2010を参照)並びに消化管微生物叢は宿主代謝に影響を及ぼし、食物からのエネルギー獲得を増大させることができること(MARIK, Front Endocrinol (Lausanne), 3, 87, 2012)が示されている。
【０００５】
したがって、消化管微生物叢の改変は、代謝症候群を改善するための標的であることが示唆されている。このことは、肥満及び肥満関連代謝異常(インスリン抵抗性を含む)を低減させる手助けとなり得るプレバイオティクス、プロバイオティクス又はシンバイオティクスを用いることにより達成することができる(MALLAPPAら，Indian J Endocrinol Metab, 16, 20-7, 2012；DELZENNEら，Nat Rev Endocrinol, 7, 639-46, 2011)。
【０００６】
幾つかのプロバイオティクス株は、脂肪蓄積及び/又は肥満関連代謝異常を低減させることが報告されている。LEEら(Biochim Biophys Acta, 1761, 736-44, 2006)は、抱合型リノール酸を産生するラクトバチルス ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)株PL60が食物誘因(diet-induced)肥満マウスにおいて抗肥満効果を有することを示し；ラクトバチルス ガセリ(Lactobacillus gasseri)SBT2055は、ヒト成人において腹部肥満症及び体重を低減させることが示されており(KADOOKAら，Eur J Clin Nutr, 64, 636-43, 2010)、ラクトバチルス ガセリBNR17は、高炭水化物食を与えたラットにおいて体重増加を減少させることが示されている(KANGら，J Microbiol, 48, 712-4, 2010)。ANDREASENら(Br J Nutr, 104, 1831-8, 2010)は、ラクトバチルス アシドフィラス(Lactobacillus acidophilus)NCFM投与時のインスリン抵抗性改善を報告した。ラクトバチルス プランタラム(Lactobacillus plantarum)株No. 14は、高脂肪食を与えたマウスにおいて肥満細胞のサイズを減少させることが示された(TAKEMURAら，Exp Biol Med (Maywood), 235, 849-56, 2010)。ARONSSONら(PLoS One, 5, 2010)は、ラクトバチルス パラカゼイsspパラカゼイ(Lactobacillus paracasei ssp paracasei)株F19がアンギオポイエチン様４タンパク質(ANGPTL4)の発現増大により脂肪貯蔵を減少させることができることを報告した。MAら(J Hepatol, 49, 821-30, 2008)は、プロバイオティクスVSL#3が肝臓NKT細胞の増加により高脂肪食誘因肝臓脂肪症及びインスリン抵抗性を改善することを報告した。ラクトバチルス ラムノサスGG及びラクトバチルス サケイ(Lactobacillus sakei)NR28(併用の抗肥満効果を有する)によるマウス微生物群系の改変がJIら(Benef Microbes, 3, 13-22, 2012)により報告された。ANら(Lipids Health Dis, 10, 116, 2011)は、高脂肪食誘導肥満ラットにおけるビフィドバクテリウム株(ビー.シュードカテヌラタム(B. pseudocatenulatum)SPM 1204、ビー.ロンガム(B. longum)SPM 1205及びビー.ロンガムSPM 1207)の混合物の抗肥満及び脂質低下効果を記載した。PCT出願WO2007/043933は、摂食量及び脂肪沈着を低減させるため並びに肥満及びインスリン非感受性を予防又は治療するための、ラクトバチルス カゼイF19、ラクトバチルス アシドフィラスNCFB 1748又はビフィドバクテリウム ラクティス(Bifidobacterium lactis)Bb12の使用を提案する。AMARら(AMARら，EMBO Mol Med, 3, 559-72, 2011)は、糖尿病マウスへのプロバイオティクス株であるビフィドバクテリウム ラクティスB420の投与が空腹時血糖症を改善し、グルコース回転率を、通常固形飼料を与えた対照マウスのレベルまで回復させることを示した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これら異なるプロバイオティクスの効果は株特異的であり、そして異なる機序により媒介されているようである。よって、過体重及び肥満並びにそれらに関係する代謝性疾患の発症を抑制するために使用することができる他のプロバイオティクス株についての需要が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、マウスにおいて、食物誘因肥満及びインスリン抵抗性に対するプロバイオティクスの予防効果を調べることを企図した。本発明者らは、高脂肪食(HFD)を与えたマウスに108細胞/日で12週間経口投与したラクトバチルス ラムノサスCNCM I-3690株が、体重増加、インスリン抵抗性を有意に減少させることを見出した。更に、16S rRNA遺伝子の454パイロシークエンシングでの消化管微生物叢の分析により、ラクトバチルス ラムノサスCNCM I-3690株が、HF食と比較して、消化管微生物叢の構造を変化させることが示された。より詳細な分析により、CNCM I-3690株は、異なる操作的分類単位(operational taxonomic unit；OTU)の相対数を変化させるが、最も上昇したのはラクテート及びアセテート産生菌のOUTであることが明らかになった。盲腸内容物の短鎖脂肪酸分析により、CNCM I-3690株は、454パイロシークエンシングでの微生物叢分析と一致して、HFDに比して、腸アセテート量を有意に増加させることが確証された。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１ＡＢ】４群：NC、HFD、HFD＋CNCM I-3690、HFD＋ビー.ラクティスB420(Danisco)についての体重増加(Ａ)及び空腹時血中グルコース(Ｂ)。データは、平均±S.E.M.で示す。** ｐ＜0.01、* ｐ＜0.05(HFD群と比較)、## ｐ＜0.01、# ｐ＜0.05(NC群と比較)(SPSSにおける一元ANOVAに続くチューキーのポストホック(post hoc)検定による)。
【図１ＣＤ】４群：NC、HFD、HFD＋CNCM I-3690、HFD＋ビー.ラクティスB420(Danisco)についての空腹時インスリン(Ｃ)及びHOMA-IR(Ｄ)。データは、平均±S.E.M.で示す。** ｐ＜0.01、* ｐ＜0.05(HFD群と比較)、## ｐ＜0.01、# ｐ＜0.05(NC群と比較)(SPSSにおける一元ANOVAに続くチューキーのポストホック検定による)。HOMA-IRは、次式に従って算出した：空腹時血中グルコース(mmol/L)×空腹時インスリン(mU/L)/22.5。
【図１ＥＦ】４群：NC、HFD、HFD＋CNCM I-3690、HFD＋ビー.ラクティスB420(Danisco)についてのOGTT(Ｅ)及びOGTTの曲線下面積(AUC)(Ｆ)。データは、平均±S.E.M.で示す。** ｐ＜0.01、* ｐ＜0.05(HFD群と比較)、## ｐ＜0.01、# ｐ＜0.05(NC群と比較)(SPSSにおける一元ANOVAに続くチューキーのポストホック検定による)。
【図２】各週における４群の摂食量。データは、２ケージのマウスの平均として示す。統計分析は行わなかった。
【図３】動物試験中の各月における４群の累積摂食量。データは、２ケージのマウスの平均として示す。統計分析は行わなかった。
【図４】４群の12週間累積摂食量。データは、２ケージのマウスの平均として示す。統計分析は行わなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
CNCM I-3690株は、2006年11月19日にブダペスト条約に従いCNCMに寄託されており、PCT出願WO 2009/122042に開示され、その抗微生物特性及び免疫調節特性が報告されている。この株はまた抗酸化特性を有し、このことはPCT出願WO 2011/083354に開示されている。
したがって、本発明の１つの目的は、対象者における食物誘因体重増加及び/又は食物誘因インスリン抵抗性を低減させるための、ラクトバチルス ラムノサスCNCM I-3690株又は該株を含む組成物の使用である。
【００１１】
「食物誘因体重増加」及び「食物誘因インスリン抵抗性」は、本明細書では、脂肪(特に、不飽和脂肪)及び/又は単糖(特に、スクロース及びフルクトースを含む)の過剰な食物摂取に起因する体重増加及びインスリン抵抗性と定義する。所与の対象者について、脂肪及び/又は単糖の過剰な食物摂取とは、当該対象者の生理学的要求を満たしエネルギーバランスを維持するに必要な量より多い量の食物脂肪及び/又は単糖の消費をいう。対象者における食物誘因体重増加又はインスリン抵抗性の低減に対する処置の効果は、当該処置を受けた対象者で観察された体重増加又はインスリン抵抗性と、当該処置を受けていないが、同じ食物を与えられ身体的活動が同レベルである同じ対象者で観察された体重増加又はインスリン抵抗性とを比較することによって評価することができる。
【００１２】
対象者におけるインスリン抵抗性を評価する試験は、当該分野において公知である(概説としては、例えば、FERRANNINI & MARI, J Hypertens., 16, 895-906, 1998を参照)。対象者におけるインスリン抵抗性のレベルは、当該分野において公知の任意のインスリン抵抗性試験(例えば、インスリン抵抗性の恒常性モデル評価；HOM-IR)を用いて測定することができる。
【００１３】
本発明はまた、食物誘因体重増加及び/又は食物誘因インスリン抵抗性に起因する病状の治療、予防又は緩和に使用するラクトバチルス ラムノサスCNCM I-3690株又は該株を含む組成物を包含する。
食物誘因体重増加及び/又は食物誘因インスリン抵抗性に起因する病状の例は、過体重、肥満及び関連する疾患、例えば、２型糖尿病、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、高血圧などである。
【００１４】
本発明または、ラクトバチルス ラムノサスCNCM I-3690株又は該株を含む組成物を対象者に投与することを含んでなる、その必要がある対象者において食物誘因体重増加及び/又は食物誘因インスリン抵抗性を低減させる方法を提供する。
ラクトバチルス ラムノサスCNCM I-3690株は、生存していてもしていなくてもよい菌全体の形態で使用することができる。或いは、この株は、細菌溶解物の形態で又は細菌画分の形態で使用することができる。
【００１５】
本発明における使用のための組成物は、投与、特に経口投与に適切な任意の形態であることができる。この形態には、例えば、固体、半固体、液体及び粉体が含まれる。一般に、より容易な投与には液体組成物、例えば飲料形態が好ましい。
菌が生菌の形態であるとき、組成物は、乾燥重量１ｇあたり、代表的には105〜1013コロニー形成単位(cfu)、好ましくは少なくとも106cfu、より好ましくは少なくとも107cfu、更により好ましくは少なくとも108cfu、最も好ましくは少なくとも109cfuを含んでなってもよい。これは、液体組成物の場合、一般には104〜1012コロニー形成単位(cfu)、好ましくは少なくとも105cfu、より好ましくは少なくとも106cfu、更により好ましくは少なくとも107cfu、最も好ましくは少なくとも109cfu/mlに相当する。
【００１６】
本発明における使用に好適な組成物は栄養組成物であり、これには、食品、特に乳製品が含まれる。これら栄養組成物にはまた補助食品及び機能性食品も含まれる。「補助食品」とは、食料品に通常使用される化合物から作られ、錠剤、粉体、カプセル、頓服水剤その他の通常は食物と関係付けられない任意の形態であり、健康に有益な効果を有する製品をいう。「機能性食品」は、健康に有益な効果を有する食物である。特に、補助食品及び機能性食品は、疾患、例えば慢性疾患に対して、生理学的効果−保護的又は治療的効果−を有することがある。
本発明における使用に適切な組成物の他の例は、医薬組成物である。
【００１７】
本発明の組成物はまた、CNCM I-3690株の他に、１以上の他の乳酸菌株(プロバイオティクスであってもなくても)、例えばラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ストレプトコッカス属及びビフィドバクテリウム属から選択される１以上の菌株を含んでなることができる。具体的には、この(これら)他の株は、ストレプトコッカス サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)の１以上の株及び/又はラクトバチルス ブルガリカス(Lactobacillus bulgaricus)の１以上の株を含むことができる。
本発明は、脂質貯蔵に対する菌株CNCM I-3690の効果を説明する実施例に言及する以下の更なる説明からより明確に理解されよう。
【実施例】
【００１８】
実施例１：エル.ラムノサスCNCM I-3690による高脂肪食誘導肥満及びインスリン抵抗性の改善
材料及び方法
C57BL/6Jマウス(雄、12週齢)を、下記の異なる処置を施す３群(１群あたり８マウス)に分けた：
Ａ群：高脂肪食(34.9％脂肪含有、5.24kcal/ｇ、Research Diets, Inc.[New Brunswick, NJ]社製)(HFD)；
Ｂ群：高脂肪食＋プロバイオティクス株エル.ラムノサスCNCM I3690(108CFU/マウス/日)(HFD＋CNCM I-3690);
Ｃ群：高脂肪食＋比較としてのプロバイオティクス株ビフィドバクテリウム ラクティスB420(Danisco)(108CFU/マウス/日)(HFD＋ビー.ラクティスB420)(この株は、高脂肪食に関連する代謝に対する有害効果を低減させることが以前に報告された(AMARら，2011，前出)；
Ｄ群：通常固形飼料(4.3％脂肪含有、3.85kcal/ｇ、Research Diets, Inc.[New Brunswick, NJ]社製)(NC)。
【００１９】
エル.ラムノサスCNCM I-3690又はビフィドバクテリウム ラクティスB420の懸濁物は、動物試験の前に調製し、−80℃で保存し、各マウスへの経口投与の１時間前に解凍した。
動物の処置を12週間継続し、その間、各マウスの体重及びケージごとの摂食量を週に２回測定した。月に１回、代謝ケージを用いて新鮮な糞便及び尿サンプルを採集し、後の分析のために即座に−80℃で保存した。
【００２０】
プロバイオティクス投与期間の２週め、６週め及び11週めでのマウス糞便中のプロバイオティクス株の量を逆転写(RT)-qPCRにより定量した。その結果、プロバイオティクス株は腸で生存し得ることが確証された。
試験の終時に、５時間の絶食後、眼窩静脈叢から採血し、15分間４℃で3000rpmの遠心分離により血清を単離した。全ての動物を頸椎脱臼により犠牲にした。犠牲後、精巣上体の脂肪体、肝臓及び空腸を摘出し、秤量し、直ぐにRNALater(Ambion)中で維持した。
【００２１】
動物を犠牲にする前に経口グルコース負荷試験(OGTT)を行った。５時間の絶食後、2.0ｇ/kg体重のグルコースをマウスに経口投与した。尾から血液サンプルを採取し、グルコース投与の前並びに15、30、60及び120分後の血中グルコースレベルをACCU-Checkグルコースメーター(Roche Diagnostics, Canada)で測定した。グルコース投与前の血中グルコースレベルを空腹時血中グルコース(FBG)レベルとみなす。空腹時インスリン(FINS)レベルはELISAアッセイ(Mercodia, Sweden)により測定した。HOMA-IRは次式に従って算出した：空腹時血中グルコース(mmol/L)×空腹時インスリン(mU/L)/22.5。
【００２２】
結果
結果を図１に示す。Ａ：体重増加；Ｂ：空腹時血中グルコースレベル(FBG)；Ｃ：空腹時インスリンレベル(FINS)；Ｄ：インスリン抵抗性の恒常性評価(HOMA-IR)指数；Ｅ：経口グルコース負荷試験(OGTT)曲線、Ｆ：OGTTの曲線下面積(AUC)。データは平均±S.E.M.として示す。** ｐ＜0.01、* ｐ＜0.05(対HFD群)、## ｐ＜0.01、# ｐ＜0.05(対NC群)(SPSSにおける一元ANOVAに続くチューキーのポストホック検定による)。
【００２３】
HFD群は、NC給餌マウスと比較して、より多い体重増加(図1A)、上昇した空腹時血中グルコースレベル(図1B)、空腹時インスリンレベル(図1C)及びHOMA-IRレベル(図1D)、並びに減少したグルコース耐性(図1E、F)を示した。HFD給餌に２種類のプロバイオティクス株を追加することにより体重増加が有意に減少した(図1A)。HFD＋プロバイオティクス群とHFD群との間で空腹時血中グルコース(FBG)レベル及び空腹時インスリン(FINS)レベルに有意差はなかったが、エル.ラムノサスCNCM I-3690又はビフィドバクテリウム ラクティスB420は共にHOMA-IR指数を低減させ、CNCM I-3690の場合の低減は有意であった(図1D)。この２つの株はまたグルコース不耐性を有意に減少させた(図1E、F)。このことは、これら株がインスリン抵抗性を改善し得ることを示している。
【００２４】
12週間の試験の各週について、１日あたりのマウスあたりの平均エネルギー摂取(図２)を算出した。全ての試験で、NC群のエネルギー摂取が最低であり、HFD＋プロバイオティクス群のエネルギー摂取は、７週めを除き、HFD群とほぼ同じであった。更に、４群のマウスについての、３ヶ月の累積エネルギー摂取(図３)及び12週間累積エネルギー摂取(図４)を算出した。これにより、プロバイオティクス処置群で観察された体重減少はエネルギー摂取の減少に帰せられないことが示された。
【００２５】
これら結果は、この２つのプロバイオティクス株が、HFDにより誘導された肥満及びインスリン抵抗性を有意に改善すること、及びエル.ラムノサスCNCM I-3690株による改善がビフィドバクテリウム ラクティスB420による改善に少なくとも匹敵することを示す。
【図１ＡＢ】
2016501010.tif 000002
【図１ＣＤ】
2016501010.tif 000003
【図１ＥＦ】
2016501010.tif 000004
【図２】
2016501010.tif 000005
【図３】
2016501010.tif 000006
【図４】
2016501010.tif 000007
【国際調査報告】
2016501010.tif 000008
2016501010.tif 000009
2016501010.tif 000010