(57)【要約】  本発明は、改善された分析速度および容易性ならびに改善された質量分析感度を伴う、誘導体化を通して、生物学的試料からのビタミンＤおよび他のセコステロイドを含む関心のある分析物の存在、量または濃度を測定するための方法を含む。好ましい実施形態において、本発明は、誘導体化を通して、そして誘導体化および分析のための試料の収集、分離および調製を容易にする血漿収集デバイスを用いて、ヒト全血からのビタミンＤおよび他のセコステロイドを含む関心のある分析物の存在、量または濃度を測定するための方法を含む。
2016516198.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の関心のある分析物の存在、濃度または量を測定するための方法であって、
ａ．生物学的流体を収集する工程と、
ｂ．前記生物学的流体から液体試料を分離する工程と、
ｃ．前記試料を分取する工程と、
ｄ．前記試料内の関心のある分析物を誘導体化する工程と、
ｅ．前記試料を調製容器に移す工程と、
ｆ．前記試料を精製する工程と、
ｇ．前記試料の関心のある分析物を分析する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
前記生物学的流体が、全血である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記液体試料が、ＰＳＤの使用により分離および分取される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＳＤの血液保持部材、半透性部材または収集レザバのうちの１つ以上に、１つの誘導体化剤および１つ以上の内部標準のうちの１つ以上が予め添加されている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＳＤの血液保持部材、半透性部材または収集レザバのうちの１つ以上に、誘導体化剤が予め添加されている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
誘導体化剤のうちの前記１つ以上および前記１つ以上の内部標準のうちの１つ以上が、同位体標識されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記誘導体化剤が、４−（１−メチル−４−ピリンジニルメチル）−１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオン、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオン、および４−フェロセニルメチル−１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオン、ならびにそれらの異性体、同位体、および類似体のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記液体試料が、液体クロマトグラフィー、質量分析、キャピラリー電気泳動、ガスクロマトグラフィー、溶媒抽出、濾過、沈殿、遠心分離、および希釈のうちの１つ以上により精製される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記液体試料が、質量分析により分析される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
分析の前に、前記試料を内部標準で処理する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記内部標準が、同位体標識された関心のある分析物または同位体標識された誘導体化剤のうちの１つ以上を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記液体試料が、ＰＳＤの使用により分離および分取され、前記内部標準が、前記試料の導入の前に、前記ＰＳＤの試料保持部材、半透性部材または収集レザバのうちの１つ以上に添加される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
血液試料中の関心のあるセコステロイドの存在、濃度または量を測定するための方法であって、
ａ．全血を収集する工程と、
ｂ．前記全血試料から血漿試料を分離する工程と、
ｃ．前記血漿試料を分取する工程と、
ｄ．誘導体化剤を用いて前記血漿試料内のセコステロイドを誘導体化する工程と、
ｅ．前記試料を調製容器に移す工程と、
ｆ．前記試料を精製する工程と、
ｇ．前記試料の所望の成分を分析する工程と
を含む、方法。
【請求項１４】
前記血漿試料が、ＰＳＤの使用により分離および分取される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＳＤの血液保持部材、半透性部材または収集レザバのうちの１つ以上に、１つの誘導体化剤または１つ以上の内部標準のうちの１つ以上が予め添加されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
誘導体化剤のうちの前記１つ以上および前記１つ以上の内部標準のうちの１つ以上が、同位体標識されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記誘導体化剤が、４−（１−メチル−４−ピリンジニルメチル）−１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオン、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオン、および４−フェロセニルメチル−１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオン、ならびにそれらの異性体、同位体、および類似体のうちの１つ以上を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記試料が、液体クロマトグラフィー、質量分析、キャピラリー電気泳動、ガスクロマトグラフィー、溶媒抽出、濾過、沈殿、遠心分離、および希釈のうちの１つ以上により精製される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料が、質量分析により分析される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
分析の前に、前記試料を内部標準で処理する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記内部標準が、同位体標識された関心のある分析物または同位体標識された誘導体化剤のうちの１つ以上を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料が、ＰＳＤの使用により分離および分取され、前記内部標準が、前記試料の導入の前に、前記ＰＳＤの試料保持部材、半透性部材または収集レザバのうちの１つ以上に添加される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）複数の血漿試料が、複数の内部標準で別個に処理され、前記内部標準の各々は、前記内部標準の各他のものと分析的に異なるものであり、そして
（ｂ）各前記試料が前記内部標準のうちの１つで処理された後に、前記複数の試料が１バッチとして分析される、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記試料の各々が、別個のＰＳＤの使用により分離および分取され、前記試料の導入の前に、各ＰＳＤに、前記ＰＳＤの試料保持部材、半透性部材または収集レザバのうちの１つ以上において、分析的に異なる内部標準が添加される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
血液試料中のビタミンＤの存在、濃度または量を測定するための方法であって、
ａ．全血を収集する工程と、
ｂ．前記全血試料から血漿試料を分離する工程と、
ｃ．前記血漿試料を分取する工程と、
ｄ．誘導体化剤を用いて前記血漿試料内のビタミンＤを誘導体化する工程と、
ｅ．前記試料を調製容器に移す工程と、
ｆ．前記試料を精製する工程と、
ｇ．前記試料の所望の成分を分析する工程と
を含む、方法。
【請求項２６】
前記血漿試料が、ＰＳＤの使用により、前記全血試料から分離され、分取される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＰＳＤの血液保持部材、半透性部材または収集レザバのうちの１つ以上に、１つの誘導体化剤または１つ以上の内部標準のうちの１つ以上が予め添加されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
誘導体化剤のうちの前記１つ以上および前記１つ以上の内部標準のうちの１つ以上が、同位体標識されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記誘導体化剤が、４−（１−メチル−４−ピリンジニルメチル）−１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオン、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオン、および４−フェロセニルメチル−１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオン、ならびにそれらの異性体、同位体、および類似体のうちの１つ以上を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料が、液体クロマトグラフィー、質量分析、キャピラリー電気泳動、ガスクロマトグラフィー、溶媒抽出、濾過、沈殿、遠心分離、および希釈のうちの１つ以上により精製される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料が、質量分析により分析される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
分析の前に、前記試料を内部標準で処理する工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記内部標準が、同位体標識された関心のある分析物または同位体標識された誘導体化剤のうちの１つ以上を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記試料が、ＰＳＤの使用により分離および分取され、前記内部標準が、前記試料の導入の前に、前記ＰＳＤの試料保持部材、半透性部材または収集レザバのうちの１つ以上に添加される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
（ａ）複数の血漿試料が、複数の内部標準で別個に処理され、前記内部標準の各々は、前記内部標準の各他のものと分析的に異なるものであり、そして
（ｂ）各前記試料が前記内部標準のうちの１つで処理された後に、前記複数の試料が１バッチとして分析される、
請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記試料の各々が、別個のＰＳＤの使用により分離および分取され、前記試料の導入の前に、各ＰＳＤに、前記ＰＳＤの試料保持部材、半透性部材または収集レザバのうちの１つ以上において、分析的に異なる内部標準が添加される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
血漿試料中の関心のある分析物の存在、濃度または量を測定するための方法であって、
ａ．ＰＳＤの使用により血漿試料を収集、分離および分取する工程であって、前記ＰＳＤの前記収集レザバは、吸収材要素を含み、前記分取された血漿試料は、前記吸収材要素により実質的に吸収された状態になる工程と、
ｂ．前記血漿試料を分析のために調製する工程と、
ｃ．前記血漿試料を精製する工程と、
ｄ．前記血漿試料を分析する工程と
を含む、方法。
【請求項３８】
前記調製工程が、
ａ．前記吸収材要素を大気に曝露する工程、
ｂ．前記吸収材要素を調製容器に入れる工程、
ｃ．抽出剤を前記調製容器に添加する工程、および
ｄ．誘導体化剤を前記調製容器に添加する工程
という下位工程をさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記精製工程が、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、イオン移動度分離、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、直接エレクトロスプレーイオン化（ＤＥＳＩ）、および溶媒抽出のうちの１つ以上を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記分析工程が、質量分析の実施を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記誘導体化剤が、４−（１−メチル−４−ピリンジニルメチル）−１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオン、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオン、および４−フェロセニルメチル−１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオン、ならびにそれらの異性体、同位体、および類似体のうちの１つ以上を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記誘導体化剤および抽出剤が、単一の工程で一緒に添加される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記誘導体化剤が、前記関心のある分析物上の官能基と反応する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記試料の導入前または前記試料の導入後のうちの１つ以上において、内部標準が、前記吸収材要素に添加される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記試料が前記ＰＳＤに導入される前に、同位体標識された内部標準が、前記全血試料に添加される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
血漿試料中のビタミンＤおよびその類似体の存在、濃度または量を測定するための方法であって、
ａ．ＰＳＤの使用により血漿試料を収集、分離および分取する工程であって、前記ＰＳＤの前記収集レザバは、吸収材要素を含み、前記分取された血漿試料は、前記吸収材要素により実質的に吸収された状態になる工程と、
ｂ．前記血漿試料を分析のために調製する工程と、
ｃ．前記血漿試料を精製する工程と、
ｄ．前記血漿試料を分析する工程と
を含む、方法。
【請求項４７】
前記調製工程が、
ａ．前記吸収材要素を大気に曝露する工程、
ｂ．前記吸収材要素を調製容器に入れる工程、
ｃ．抽出剤を前記調製容器に添加する工程、および
ｄ．誘導体化剤を前記調製容器に添加する工程
という下位工程をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記精製工程が、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、イオン移動度分離、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、直接エレクトロスプレーイオン化（ＤＥＳＩ）、および溶媒抽出のうちの１つ以上を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記分析工程が、質量分析の実施を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記誘導体化剤が、４−（１−メチル−４−ピリンジニルメチル）−１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオン、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオン、および４−フェロセニルメチル−１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオン、ならびにそれらの異性体、同位体、および類似体のうちの１つ以上を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
同位体標識された内部標準が、前記試料に添加される、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、Ｆｒｅｄ  Ｅ．Ｒｅｇｎｉｅｒ、Ｊｉｒｉ  Ａｄａｍｅｃ、Ｊｉｎｈｅｅ  Ｋｉｍ、Ｒ．Ｐ．Ｚｏｌｔｅｋ、Ｔ．Ｅ．Ｗｏｅｎｋｅｒ、およびＷｅｎｃｈｕ  Ｙａｎｇによる、２０１３年３月１５日に出願された「Ａ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ  Ａｎａｌｙｔｅｓ  ｉｎ  ａ  Ｓｅｐａｒａｔｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｆｌｕｉｄ」という米国非仮特許出願第１３／８３３，４０２号に対する優先権を主張しており、この非仮特許出願に関連するものである。
【０００２】
連邦政府援助の研究または開発に関する声明
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）により授与された助成金番号ＩＲ４３ＧＭ９７７９８−１の下で政府援助により行われたものである。政府は本発明において特定の権利を有している。
【０００３】
我々は、分離された生物学的流体中の誘導体化された分析物、具体的にはセコステロイド、最も具体的にはビタミンＤを測定するための方法であって、それにより、そのような測定における著しい時間、不都合および費用を減じ、かつさらに、それにより、一般的な定量分析方法（例えば、質量分析）によるそのような誘導体化分析物の検出可能性を改善する方法を、本発明により開発した。
【背景技術】
【０００４】
ビタミンＤ（ＶＤ）は、カルシウムおよびリンの吸収および骨の動員（ｂｏｎｅ  ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）において重要な役割を果たす、ヒトの生存に不可欠な物質である。ビタミンＤは、ビタミンＤ3（コレカルシフェロール、ＶＤ3）として知られる形態でヒトの皮膚において産生されるか、またはビタミンＤ2（エルゴカルシフェロール、ＶＤ2）として知られる形態で食事から吸収されるかのいずれかである。ＶＤ3もＶＤ2も、肝臓においてそれらのヒドロキシル化（ｈｙｄｒｏｘａｌａｔｉｏｎ）（２５ＯＨＶＤ3および２５ＯＨＶＤ2）により活性化を受け、腎臓においてさらなるヒドロキシル化により１，２５（ＯＨ）2ＶＤ3、２４，２５（ＯＨ）2ＶＤ3、１，２５（ＯＨ）2ＶＤ2、および２４，２５（ＯＨ）2ＶＤ2へとさらに代謝される。
【０００５】
典型的に、ヒトにおけるビタミンＤの測定は、不活性なＶＤ前駆体ではなくＶＤ代謝産物の測定によって行われる。代謝産物である２５ＯＨＶＤ3、１，２５（ＯＨ）2ＶＤ3、２４，２５（ＯＨ）2ＶＤ3、２５ＯＨＶＤ、１，２５（ＯＨ）2ＶＤ2および２４，２５（ＯＨ）2ＶＤ2、ならびに他のＶＤ代謝産物は、本明細書において、一般的に、「ビタミンＤまたはＶＤ」と称される。
【０００６】
ヒトにおけるビタミンＤレベルは、腎臓および肝臓の機能に直接影響されるので、そしてビタミンＤレベルは、カルシウムおよびリンの調節に直接影響するので、血液中のビタミンＤを測定する能力は、広範囲の疾患（骨、腎臓および肝臓の疾患を含む）の診断および研究にとって重要である。セコステロイドという広いカテゴリーにおける多くの他の分析物が、診断目的のために同様に重要である。
【０００７】
これまで、セコステロイド（例えばビタミンＤを含む）の血中レベルは、高性能液体クロマトグラフィー、質量分析、競合的タンパク質結合アッセイ、または他の定量法（例えば、酵素アッセイ、免疫アッセイ、化学的比色アッセイ、または蛍光標識化）を含む方法によって、生物学的試料から測定されてきた。当該技術分野に知られている方法はさらに、Ｃｏｏｋｓｏｎ型試薬（例えば、ＰＴＡＤ）を用いて分析物を誘導体化して誘導体化されたセコステロイドまたはビタミンＤ代謝産物を生成し、液体クロマトグラフィーを用いてこれらの分析物を精製または抽出し、質量分析を用いてその精製された試料を分析物の量または濃度について分析する方法を含む。現行のビタミンＤ分析方法は、多くの場合、当該技術分野にとっての差し迫った分析上の課題、特にこうした多くのビタミンＤ形態の組織分布を識別するという試みに取り組むために必要とされる感度および特異性を欠いている。当該技術分野に知られている市販のキットアッセイは、２５（ＯＨ）Ｄについては高スループット分析を可能にするが、ビタミンＤについては可能にせず、これらのキットの研究室間性能は、不十分である。当該技術分野に知られているキットは、一般的に、アセトニトリルに基づく血清からの抽出方法に続いて、他の代謝産物から２５（ＯＨ）Ｄを分離するためのカラム分離を利用する。この方法を用いるキットは、正確にかつ別個に２５（ＯＨ）Ｄ3および２５（ＯＨ）Ｄ2を測定することができない。
【０００８】
液体クロマトグラフィー、特に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を質量分析と合わせたもの（ＬＣ−ＭＳ）の使用もまた、当該技術分野に知られている。この方法は、特に、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）が多重反応モニタリング（ＭＲＭ）法と組み合わせて採用される場合に、キットと比べて高まった感度および選択性を提供する。しかしながら、ＡＰＣＩに依拠する当該技術分野に知られているＬＣ−ＭＳ法にもいくつかの欠陥がある。特に、ＡＰＣＩは、しばしば、イオン化の間のビタミンＤ分子の時期尚早のフラグメント化に繋がり、分析の質および感度を低下させ、高いＬＯＱを伴うより高い変動性の一因となる。
【０００９】
当該技術分野に知られている方法はさらに、生物学的マトリックスにおいて予想される一部のセコステロイド分析物の低い（ｆｍｏｌ）レベルについては満足のいくイオン化効率を確立することができない。この問題に対処するためにＬＣ−ＭＳにおいてエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を用いるという試みがなされてきたが、ＥＳＩの有効性は分析物依存的であり、ビタミンＤ関連分子の構造は、それらがＥＳＩ中に容易にプロトン化するものではなく、例えあったとしても不十分な検出を結果としてもたらすであろうことを示唆している。
【００１０】
現在当該技術分野に知られている生物学的試料中のセコステロイドレベルを測定する方法には、多くのさらなる不利点（アッセイを完了するために必要とされる時間の長さ、確度のレベル、感度、および費用を含む）がある。例えば、当該技術分野に一般的なビタミンＤおよびそのアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）の抽出のための１つのアプローチは、ビタミンＤを含有することが疑われる試料溶液からタンパク質を除去することであり、そのようなタンパク質除去は、試料溶液内のタンパク質に結合されているビタミンＤ代謝産物を放出するように適合される。そうした放出されたビタミンＤは、次いで、有機溶媒を用いて抽出され得るか、またはＣｏｏｋｓｏｎ型試薬を用いて誘導体化され得る。この種の液：液抽出および／または誘導体化プロセスを実施することは、典型的に時間がかかり、また、これは、クロマトグラフィーおよび／またはＭＳの分離および分析法を用いて分析するのに十分な体積の抽出ビタミンＤを生成するために、比較的大きな体積の利用可能な試料溶液を必要とする。そのような従来からのアッセイ実施方法はさらに、労働集約的であり、試料が分離または精製されて最終的に所望の分析物のレベルについて分析され得るようになる前に一連の事前作業（例えば、抽出、遠心分離、エバポレーション、および誘導体化）を手作業で完了するための人員を必要とする。さらに、Ｃｏｏｋｓｏｎ型試薬を用いた誘導体化は、それ自体がかなり時間のかかるプロセスであり、通常、完了するのに数時間を要する。
【００１１】
血漿分離器デバイスを用いて血漿の分離を合理化することが、当該技術分野に知られている。代表的な血漿分離器デバイスは、例えば、米国特許第４，８３９，２９６号明細書に記述されている。米国特許出願公開第２０１２／２０３１８９７１号明細書により記述されるように、ＰＳＤの使用により分離された血漿に対し、ＬＣ、ＭＳ、ＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣ−ＭＳなどの定量的分離、精製または分析の技術を用いることもまた、当該技術分野において知られている。当該技術分野に知られているこれらの技術は、誘導体化されたセコステロイドおよびビタミンＤ分析物の分析方法の効率を潜在的に改善しはするが、本明細書に記述される方法のように、時間、費用および効率の節約を達成することはできず、改善された検出感度をＭＳにおいて達成することもできない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、改善された確度および感度を有し、かつ分析の前の時間がかかりかつ労働集約的な準備工程の必要のない、生物学的試料を分析物（具体的にはセコステロイド、最も具体的にはビタミンＤを含む）のレベル、量または濃度についてアッセイする方法を提供することが、本発明の目的である。さらに、これらの分析の実施において時間、費用および効率の節約を結果としてもたらす工程数の減少を伴う、生物学的試料をビタミンＤについてアッセイする方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１３】
本発明の方法は、生物学的流体試料中の関心のある分析物の存在、濃度または量を測定するものであり、前記方法は、生物学的流体を収集する工程と、前記生物学的流体から液体成分を分離する工程と、前記液体成分を分取（ａｌｉｑｕｏｔ）する工程と、誘導体化剤を用いて前記試料内の分析物を誘導体化する工程と、前記試料を調製容器に移す工程と、前記誘導体化された試料を分画する工程と、前記試料の分析物を分析する工程とを含む。
【００１４】
本発明の方法はさらに、全血試料を収集する工程と、前記全血試料から血漿試料を分離する工程と、前記血漿試料を収集表面上に収集する工程と、前記収集表面上で前記血漿試料を乾燥させる工程と、前記収集表面を調製容器に移す工程と、血漿試料中に存在することが疑われる分析物を誘導体化するために誘導体化剤を添加する工程と、前記誘導体化された試料を分画する工程と、前記分画された誘導体化試料を分析物の存在、量または濃度について分析する工程とにより、血液試料中の分析物の存在、量または濃度を測定することを含む。
【００１５】
本発明の方法は、好ましくは、血漿分離デバイス、すなわちＰＳＤを採用するものであり、ＰＳＤは、ＰＳＤの表面に適用される十分な規模の全血試料から所定の体積の血漿試料を分離および分取するデバイスを含む。ＰＳＤは、一般的に、取り外し可能な保持部材と、保持部材中の血液導入部材と、血液導入部材と連絡している拡散層部材（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ  ｌａｙｅｒ  ｍｅｍｂｅｒ）と、拡散層部材と連絡している半透性分離部材と、半透性分離部材と連絡している規定体積の収集レザバとを含み、全血試料が血液導入部材上に置かれると、試料からの血漿が拡散層部材を通って分離部材に至り、分離部材により分離され、収集レザバにより所定の体積で収集される。収集レザバはさらに、任意選択で、吸収材要素を含有または包含し得、吸収材要素は、収集された血漿試料の実質的に全てを吸収する。収集レザバは、収集された血漿試料の好都合な分離のために取り出され得る。収集された血漿試料は、次いで、さらなる処理のために調製容器に移され得る、または、任意選択で、収集された血漿試料を実質的に吸収した吸収材要素または「収集ディスク」が、そのように移され得る。ＰＳＤは、任意選択で、例えば血液成分、唾液、精液、脳脊髄液、尿、涙および均質化または抽出されたバイオ試料を含む（すなわち、生物全体、臓器、組織、毛髪、または骨からの）他の液体のまたは液化された生物学的試料の収集のために使用され得る。
【００１６】
これらおよび他の利点が、以下に記述される方法において提供されるのであるが、本明細書において特許請求される方法のなおさらなる利点は、当業者には明らかであろう。
【００１７】
血液または他の生物学的試料中の選択された誘導体化分析物を検出するための方法の１つの不利点は、試料調製に必要とされる比較的長い時間である。本発明は、時間および労働集約的な準備工程（例えば、抽出、遠心分離、およびエバポレーション）の必要性が実質的に低減した、血液または他の生物学的試料中の選択された誘導体化分析物を質量分析により検出するための方法を提供する。本発明の方法はさらに、調査されることが望まれる分析物の改善された誘導体化時間を提供する。好ましくは、そのような分析物は、セコステロイドである。さらにより好ましくは、そのような分析物は、ビタミンＤの代謝産物である。最も好ましくは、本発明の方法の工程は、少なくとも部分的に、血漿分離器デバイス、すなわちＰＳＤの使用によって行われる。
【００１８】
当該技術分野に知られている方法の別の不利点は、ＶＤおよび他のセコステロイドに関する比較的乏しいＭＳおよびＬＣ−ＭＳの感度である。本発明の方法は、ＶＤおよび他のセコステロイドに対するＭＳおよびＬＣ−ＭＳにおける改善された検出感度を可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の方法は、ＰＳＤを採用することにより当該技術分野に知られている欠陥を克服するものであり、ＰＳＤは、ＰＳＤの表面に適用される十分な規模の全血試料から所定の体積の血漿試料を分離および分取するデバイスを含む。ＰＳＤは、一般的に、取り外し可能な保持部材と、保持部材中の血液導入部材と、血液導入部材と連絡している拡散層部材と、拡散層部材と連絡している半透性分離部材と、半透性分離部材と連絡している規定体積の収集レザバとを含み、全血試料が血液導入部材上に置かれると、試料からの血漿が拡散層部材を通って分離部材に至り、分離部材により分離され、収集レザバにより所定の体積で収集される。収集レザバはさらに、任意選択で、吸収材要素または収集ディスクを含有または包含し得、吸収材要素または収集ディスクは、収集された血漿試料の実質的に全てを吸収する。収集レザバまたは収集ディスクは、収集された血漿試料の好都合な分離のために取り出され得る。収集された血漿試料は、次いで、さらなる処理のために調製容器に移され得る、または、任意選択で、収集された血漿試料を実質的に吸収した吸収材要素が、そのように移され得る。ＰＳＤは、任意選択で、例えば血液成分、唾液、精液、脳脊髄液、尿、涙および均質化または抽出されたバイオ試料を含む（すなわち、生物全体、臓器、組織、毛髪、または骨からの）他の液体のまたは液化された生物学的試料の収集のために使用され得る。
【００２０】
本発明の方法はさらに、正荷電基（例えば、好ましくは、第一級アミン）を含有しかつ１つ以上のトリアゾリジン環をさらに含有する化合物を誘導体化剤として採用することにより、当該技術分野に知られている検出感度についての欠陥を克服する。当該技術分野に知られているＣｏｏｋｓｏｎ型誘導体化剤がトリアゾリン環を含有するのに対して、本発明に従う誘導体化剤は、１つ以上のトリアゾリジン環を含有する。本発明に従う誘導体化剤は、誘導体化分析物に永久正電荷を与え、質量分析による誘導体化分析物のより確度および感度の高い検出を可能にする。誘導体化剤は、４位置換１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオンまたは他の機能的に等価な薬剤である。好ましい誘導体化剤としては、４−（１−メチル−４−ピリンジニルメチル）−１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオン、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオン、および４−フェロセニルメチル−１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオン、ならびにそれらの異性体、同位体、および類似体が挙げられる。
【００２１】
一部の実施形態において、本発明の方法は、全血試料を収集する工程と、前記全血試料から血漿試料を分離する工程と、前記血漿試料を分取する工程と、誘導体化剤を用いて前記血漿試料内のビタミンＤを誘導体化する工程と、前記試料を調製容器に移す工程と、前記試料を分画する工程と、前記試料内のビタミンＤを分析する工程とを含む、全血試料中のビタミンＤの存在、濃度または量の測定を含む。最も好ましくは、本発明の方法は、ＰＳＤの使用を含むものであり、ＰＳＤは、全血が血液導入部に導入されると、収集レザバ中に所定の体積の血漿試料を分離および分取する。ＰＳＤの収集レザバは、任意選択で、血漿試料のための収集表面として機能し得る。ＰＳＤの各部分（例えば、血液保持部材、半透性部材、収集レザバ、または吸収材要素）は、誘導体化剤で処理され得、収集された血漿試料が、先に収集レザバから前記血漿試料を取り出す必要を全く伴わずに、収集レザバ中で誘導体化を受けるという結果をもたらす。収集レザバは、抽出または誘導体化のために試験管またはガラスバイアルなどの収集レザバに入れられ得る。分離、分取、および誘導体化の開始は、異なる操作であるが、実質的に同時に行われ得る。
【００２２】
本発明の範囲内の方法はさらに、１つ以上の血漿試料への内部標準の添加によりＭＳおよびＬＣ−ＭＳの検出感度を高めて関心のある分析物の存在、量または濃度を質量分析を用いて検出することにおいてより高い精度を可能にすることにより、当該技術分野に知られている欠陥を克服し得る。内部標準は、ビタミンＤおよびそのアイソフォームの同位体標識されたコードされた異形（ｖｅｒｓｉｏｎ）、または誘導体化分析物の同位体コードされた内部標準を形成するために使用される同位体標識された誘導体化剤を含む。本明細書において、「標識された（ｌａｂｅｌｅｄ）」および「コードされた（ｃｏｄｅｄ）は、相互交換可能に使用されるものとする。血漿試料、流体、または液化試料は、分析前の任意の時点で、内部標準で処理され得る。内部標準が血漿試料中に見出されることが予想される分析物の同位体である場合は、血漿試料は、好ましくは、誘導体化の前に内部標準で処理される。最も好ましくは、ＰＳＤが使用され、ＰＳＤの血液保持部、半透性膜、収集レザバまたは吸収材要素のうちの１つ以上に内部標準が予め添加されており、その結果、血漿試料が、それがＰＳＤにより収集、分離または分取される時にそのような内部標準で処理されることとなる。ＰＳＤに同位体標識された誘導体化剤である内部標準が予め添加されている場合は、血漿試料は、先に収集レザバから前記血漿試料を取り出す必要を全く伴わずに、収集レザバ中で誘導体化を受け得る。また、内部標準は、血漿の収集の前または後に、収集レザバ上に直接置かれ得る。分離、分取、内部標準の適用、および誘導体化の開始は、異なる操作であるが、実質的に同時に行われ得る。
【００２３】
ＰＳＤに同位体標識された関心のある分析物を含む内部標準は予め添加されるが、誘導体化剤または誘導体化剤を含む内部標準は予め添加されない本発明の実施形態において、分離、分取、および内部標準の適用は、順序的に異なる操作であるが、実質的に同時に行われ得る。ＰＳＤの各部分は、１つ以上の内部標準で、１つの誘導体化剤で、または１つ以上の内部標準および１つの誘導体化剤で処理され得ることに留意されるべきであり、そのような誘導体化剤は、それ自体が内部標準を構成してもよいししなくてもよい。
【００２４】
一部の実施形態において、本発明の方法は、血液試料から血漿試料を収集、分離および分取する工程と、血漿試料を内部標準で処理する工程と、処理された血漿試料を精製する工程と、処理された血漿試料を誘導体化する工程と、試料中の分析物の濃度または量を内部標準の濃度または量と比較して試料内の分析物の濃度または量を決定するために、誘導体化された試料および内部標準の混合物を分析する工程とを含む。内部標準処理工程は、ここでは分取後に行われるものとして記述されているが、この工程は、内部標準が標識された分析物である場合は、誘導体化の前の任意の時点で行われ得、そして内部標準が標識された誘導体化剤である場合は、誘導体化の間に行われることになることが、当業者により理解されよう。同じように、本発明の全ての実施形態におけると同様に、誘導体化工程は精製後に行われるものとして記載されているが、この工程は、血漿試料の分離後の任意の時点で行われ得ることが、当業者により理解されよう。
【００２５】
好ましくは、本発明のこれらの実施形態の１つ以上の工程は、ＰＳＤの使用により達成される。好ましい実施形態において、内部標準は、血漿試料の収集の前にＰＳＤの血液保持部材、半透性部材、収集レザバまたは吸収材要素に予め添加されており、その結果、血漿試料は、ＰＳＤの使用によって内部標準で処理されることとなる。これらの実施形態において、試料、試料を含有する収集レザバ、または試料を含有する吸収材要素のうちの１つ以上がＰＳＤから取り出され、調製容器に入れられ、内部標準が添加される。
【００２６】
一部の実施形態において、本発明の方法は、複数の試料を収集、分離および分取する工程と、これらの複数の試料の各々を分析的に異なる別個の内部標準で処理する工程と、処理された試料を精製する工程と、処理された試料を誘導体化する工程と、試料中の分析物の濃度または量を内部標準の濃度または量と比較して試料内の分析物の濃度または量を決定するために、その複数の誘導体化された試料を１バッチとして分析する工程とを含む。好ましくは、これらの実施形態において、各試料は異なる内部標準で処理され、そのような違いは、好ましくは、内部標準の異なる同位体標識化を含む。最も好ましくは、これらの実施形態において、内部標準は、同位体標識された誘導体化剤を含む。内部標準処理工程は、ここでは分取後に行われるものとして記述されているが、この工程は、内部標準が標識された分析物である場合は、誘導体化の前の任意の時点で行われ得、そして内部標準が標識された誘導体化剤である場合は、誘導体化の間に行われることになることが、当業者により理解されよう。同じように、本発明の全ての実施形態におけると同様に、誘導体化工程は精製後に行われるものとして記載されているが、この工程は、血漿試料の分離後の任意の時点で行われ得ることが、当業者により理解されよう。
【００２７】
誘導体化剤内部標準は、血漿試料の収集の前に、ＰＳＤの血液保持部材、半透性部材、収集レザバまたは吸収材要素に予め添加され得、その結果、ＰＳＤの使用によって、血漿試料が内部標準で処理され、誘導体化が開始されることとなる。標識された化合物は、次いで、質量分析を用いて分析される。これらの実施形態において、当該方法はさらに、任意選択で、既知の濃度の既知のビタミンＤ誘導体を含む内部標準を供給し、その既知の内部標準を誘導体化剤で処理して誘導体化標準付加物を形成することを含み得る。誘導体化された分析物および内部標準の混合物は分離されて、分離された標識された分析物および内部標準を形成し得、分離された分析物および内部標準は、誘導体化された付加物のＬＣ−ＭＳ、またはＬＣ−ＭＳＭＳ分析を用いることで、質量分析を用いて分析され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１Ａは、ＰＳＤを用いた本発明の方法の一実施形態のブロック図である。図１Ｂは、ＰＳＤを用いた本発明の方法の一実施形態のブロック図である。
【図２】複数の試料中の分析物を評価するための内部標準を使用した本発明の実施形態の範囲内の分析のための様々な戦略を示すフローチャートである。
【図３】図２の例Ａに記述されるようにＰＳＤの使用によって内部標準としてのＤ６−２５−ヒドロキシルビタミンＤ３で処理された、血漿中の関心のある分析物２５−ヒドロキシビタミンＤ３の多重反応モニタリングを用いた質量分析の読み出しを示している。
【図４】ＰＳＤおよび液−液抽出を用いた本発明の異形によって分析された２５−ヒドロキシビタミンＤ３（分析物）の濃度の例示的な比較を示している。Ｄ６−２５−ヒドロキシビタミンＤ３が、内部標準として使用された。
【図５】本発明の実施形態に従って誘導体化を用いかつＰＳＤを用いた、標準的な２５−ヒドロキシビタミンＤ２と２５−ヒドロキシビタミンＤ３との質量分析測定の比較のための線形回帰分析を示している。
【図６】それぞれ対応する内部標準ｄ６−２５−ヒドロキシビタミンＤ２（１、２、５、１０および２０ｐｇ）およびｄ６−２５ヒドロキシビタミンＤ３（２、４、１０、２０および４０ｐｇ）のピーク面積と比較した図５の線形回帰分析において示された分析物２５−ヒドロキシビタミンＤ２（１、２、５、１０および２０ｐｇ）および２５−ヒドロキシビタミンＤ３（２、４、１０、２０および４０ｐｇ）のピーク面積の再現性を示す表を示している。
【図７】４−（１−メチル−４−ピリンジニルメチル）−１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオンによる２５−ヒドロキシビタミンＤ３および２５−ヒドロキシビタミンＤ２の誘導体化機序を示している。
【図８】それぞれ、本発明の実施形態における４−（１−メチル−４−ピリンジニルメチル）−１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオンによる１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２の誘導体化および４−（１−（メチル−Ｄ３）−４−ピリンジニルメチル）−１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオンによるエルゴステロールの誘導体化を示している。
【図９】実施例２に詳述される液−液抽出による、内部標準としてのＤ６−２５−ヒドロキシルビタミンＤ２およびＤ６−２５−ヒドロキシルビタミンＤ３で処理された血漿中の関心のある分析物２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の、多重反応モニタリングを用いた質量分析の読み出しを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明の方法の様々な異形の構成および使用が以下に詳細に述べられるが、広範な具体的な状況において採用され得る様々な特定の実施形態を本発明が含むことが理解されるべきである。本明細書で述べられる具体的な異形および実施形態は、単に本発明の方法が構成され使用され得る様式を説明するものであるにすぎず、本発明の範囲を限定する役目をするものではない。
【００３０】
具体的には、当業者により理解されるように、以下に記述される方法の様々な反復（ｉｔｅｒａｔｉｏｎ）および実施形態が提示されてはいるが、しかしながら、本発明は、これらの反復もしくは実施形態、または本明細書に提示される工程の具体的な順序に限定されるものではない。工程の数および順序の変更、他の工程の追加、および本明細書における様々な実施形態の態様の組み合わせは、全て、特許請求される発明の範囲内に入る。例えば、そして説明として、本明細書において開示される実施形態は、誘導体化工程を具体的に分離工程または精製工程の前または後に行われるものとして述べているが、これらの工程は、当業者により理解されるように、分析のための試料および関心のある分析物の質および性質に依存して、様々な順序でかつ様々な時に実施され得る。本明細書において様々な時点で記載されるＰＳＤの使用はさらに、１つ以上の工程の同時のまたは実質的に同時の実施を結果としてもたらし得る。
【００３１】
本明細書において使用される用語は、本明細書において別段の具体的な定義がない限り、当業者により一般的に理解される意味を有する。本明細書における用語は本発明の記述された特定の実施形態および異形に対して使用されるが、それらは、特許請求の範囲において具体的に記載されている場合を除き、本発明の範囲を限定することが意図されるものではない。
【００３２】
本発明の異形に従う「分析物」とは、試料中の測定されることが望まれる化合物または成分をいう。本発明の異形に従う「分析物」は、任意の化合物、任意の成分、またはジエン反応性基を含有する生物学的流体（具体的にはおよび好ましくはヒト全血または動物全血を含む）において見出されるもしくは見出され得る化合物の任意のクラスであり得る。好ましくは、分析物は、セコステロイドを含む。最も好ましくは、分析物は、ビタミンＤおよびその代謝産物（ビタミンＤ2、ビタミンＤ3、２５ＯＨＤ、２４，２５（ＯＨ）2Ｄおよび１，２５（ＯＨ）2Ｄを含む）を含む。「分析物」はさらに、上記のものの全てのものの同位体、異性体および類似体をいう。「関心のある分析物」とは、それらの分析物が試料中に実際に存在するか否かに関わらず、それらについて試料が分析されるべきである分析物をいう。
【００３３】
本発明の異形に従う「試料」とは、質量分光分析により検出可能な量の１つ以上の関心のある分析物を含有することが疑われる、液体であるかまたは液化されたものである、任意の量の物質をいう。試料は、説明として、細胞もしくは細胞培養物、臓器、臓器片もしくは臓器培養物、全血、血漿、血清、精液、毛髪、筋肉、骨、唾液、涙、尿、糞便、脳脊髄液、または検出可能な量の１つ以上の分析物を含有することが疑われる未知の物質を含み得る。試料とは、好ましくは、ある量の全血をいい、最も好ましくは、ある量のヒト血液またはその成分（例えば、血漿）をいう。
【００３４】
「ＰＳＤ」とは、本発明の様々な異形における使用のための血漿分離デバイスをいう。ＰＳＤは、試料収集および調製の他の方法と比べて時間、労力および努力を節約しながら、全血試料から所定の体積の血漿試料を分離、分取および収集し得るものであることが理解されよう。任意選択で、ＰＳＤには、本明細書に記述されるように誘導体化剤が予め添加され得、さらなる動作の必要なしに試料の収集時に誘導体化工程を開始させ得る。任意選択で、ＰＳＤには、本明細書に記述されるように内部標準が予め添加され得、さらなる動作の必要なしに試料の収集時に内部標準での処理の工程を開始させ得る。
【００３５】
ＰＳＤには、任意選択で、ＰＳＤにおける試料の収集の前に、ＰＳＤの収集レザバ内または任意選択で吸収材要素内に所望量の誘導体化剤を添加することにより、誘導体化剤が予め添加され得る。いつＰＳＤが試料を収集するために使用されることが意図されているかを考慮することなく、ＰＳＤの使用の前に、ＰＳＤに誘導体化剤が予め添加され得ることが当業者により理解されよう。当業者により理解されるように、そのような予め添加されたＰＳＤの有効貯蔵寿命は、選択された誘導体化剤が何であるか、選択された誘導体化剤の安定性、およびその劣化の速度によって決まるであろう。
【００３６】
ＰＳＤには、任意選択で、ＰＳＤにおける試料の収集の前に、ＰＳＤの収集レザバ内、半透性部材内または任意選択で吸収材要素内に所望量の内部標準を添加することにより、内部標準が予め添加され得る。いつＰＳＤが試料を収集するために使用されることが意図されているかを考慮することなく、使用の前の任意の時に、ＰＳＤに内部標準が予め添加され得ることが当業者により理解されよう。当業者により理解されるように、そのような予め添加されたＰＳＤの有効貯蔵寿命は、選択された内部標準が何であるか、選択された内部標準の安定性、およびその劣化の速度によって決まるであろう。任意選択で、血液保持部材または半透性部材に、ＰＳＤのそのような部材を液体または固体形態の所望量の内部標準で処理するまたは含浸させることにより、内部標準が予め添加され得る。好ましくは、内部標準は、同位体標識された関心のある分析物または同位体標識された誘導体化剤のうちの１つ以上である。
【００３７】
「誘導体化」とは、イオン化および質量分析による分析に好適な、誘導体化分析物と称される新たな化合物を生成する、関心のある分析物と誘導体化剤との反応をいう。本発明の異形の目的のための「誘導体化剤」とは、分析物（セコステロイドおよびビタミンＤを含む）を誘導体化するために選択される、正荷電基（例えば、本発明の好ましい実施形態においては、第一級アミン）を含有する好適な化合物をいう。本発明に従う誘導体化剤は、１つ以上のトリアゾリジン環を含有する。本発明に従う誘導体化剤は、誘導体化分析物に永久正電荷を与え、質量分析による誘導体化分析物のより確度および感度の高い検出を可能にする。誘導体化剤は、最も好ましくは、４位置換１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオンまたは他の機能的に等価な薬剤である。好適な誘導体化剤としては、例として、４−（１−メチル−４−ピリンジニルメチル）−１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオン、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオン、および４−フェロセニルメチル−１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオン、ならびにそれらの異性体、同位体、および類似体が挙げられる。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態における吸収材要素を組み入れたＰＳＤの使用は、以下の機序によって誘導体化および精製を助けると考えられる。ヒト血液は、平均しておよそ１００μｇ／μＬのタンパク質を含有する。したがって、血漿の２．５μＬアリコートは、平均しておよそ２５０μｇの血漿タンパク質を含有するであろう。吸収材要素は、収集レザバ体積のおよそ１５０％、すなわち、およそ３．７５μＬの容積能力を有している。吸収材要素の具体的な負荷能力は、要素の容積能力１μＬ当たりおよそ５０μｇのタンパク質である。したがって、ＰＳＤの使用により吸収材要素中に分離されるヒト全血試料は、平均しておよそ１８７．５μｇのタンパク質を生じるであろう。試料中のビタミンＤ分析物は、このタンパク質中に分散されるであろう。血漿試料の液体部分がエバポレーションにより吸収材要素から除去されると、残存するタンパク質は、実質的に単分子層として堆積すると考えられ、これは次いで、例えば有機溶媒を手段として、抽出され得る。タンパク質のこの考えられる単分子層堆積は、抽出の速度を高めると考えられる。
【００３９】
好ましい誘導体化剤は、４−（１−メチル−４−ピリンジニルメチル）−１，２，４−トリアゾリジン−３，５−ジオン、すなわち「ＤＲ１」である。ＤＲ１は、次のとおりに合成され得る。５０ｍｍｏｌのメチルヒドラジノカルボキシレート（Ｓｉｇｍａ、ＦＷ９０．０８）を、Ｎ2下で５０ｍｌの無水ＴＨＦに溶解させる。５０ｍｍｏｌの１，１’−カルボニルジイミダゾール（Ｓｉｇｍａ、ＦＷ１６２．１５）を、２〜３分間かけて少しずつ添加する。この混合物を、室温で１５分間にわたり撹拌する。５０ｍｍｏｌの４−アミノメチルピリジン（Ｓｉｇｍａ、ＦＷ１０８．１４）を添加し、この混合物を室温で一晩撹拌する。固体生成物（「化合物Ｉ」）を濾過により回収し、ＴＨＦで洗浄する。２０ｍｍｏｌの化合物Ｉを１０ｍｌの４Ｍ  ＫＯＨ中で２時間にわたり還流させ、次いで、室温まで冷却させる。次いで、この混合物を氷水浴中で撹拌し、そして、そのように冷却しながら、塊状（ｂｕｌｋ）沈殿物の出現まで濃ＨＣｌで滴定する。塊状沈殿物の出現は、およそ４ｍｌのＨＣｌの消費後およびおよそ６のｐＨにおいて起こる。固体生成物（化合物ＩＩ）を濾過により回収し、水で洗浄し、乾燥させる。５ｍｍｏｌの化合物ＩＩを、１５体積のアセトンに添加する。合計５倍の過剰量のヨードメタン（Ｓｉｇｍａ、ＦＷ１４１．９４）を、この固体に添加する。固体を容器に入れ、密封し、次いで、５０℃のオーブンにて６日間にわたりオーブンに入れる。乾燥した固体生成物は、実質的にＤＲ１を含む。本発明の異形の例の多くは、当業者により理解されるように、酸化剤および安定剤も利用する。好ましくは、酸化剤は、本明細書において「ＤＲ２」と称されるヨードベンゼンジアセテートであり、安定剤（または「安定化剤」は、本明細書において「ＤＲ３」と称されるアスコルビン酸である。
【００４０】
「内部標準」とは、試料の分析の前に既知量で添加される物質をいい、既知の内部標準の質量分析シグナルが、試料内の関心のある分析物の質量分析シグナル（もしあれば）と比較され得、そしてこの比較によって、関心のある分析物の存在および量が決定され得る。理想的な内部標準は、関心のある分析物と非常に類似した化学構造を有し、可能ならば、内部標準中の特定の部位における「重」原子の存在によってのみ異なる同一の化学構造を有する物質である。例えば、重水素原子が水素原子と置き換わったＶＤの重水素同位体は、ＶＤのための適切な内部標準である。分析物および内部標準は質量が異なり質量分析により別個に認識されるが、それらのフラグメント化パターンおよびフラグメントイオンの相対収率は実質的に同一である。内部標準は、好ましくは、１つ以上の同位体標識された関心のある分析物、または１つ以上の同位体標識された誘導体化剤を含む。
【００４１】
同位体標識された関心のある分析物を含む内部標準は、好ましくは同位体標識されたセコステロイド化合物を含み、最も好ましくは同位体標識されたビタミンＤ代謝産物を含む。同位体標識された誘導体化剤を含む内部標準は、好ましくはＤＲ１の同位体を含む。
【００４２】
「同位体標識化」、「同位体標識された」、「コード化」または「コードされた」とは、同じ数の陽子および電子を含有するが異なる数の中性子を含有する原子への、内部標準分子内の１つ以上の原子の置き換えをいう。同位体標識は、質量分析法により分析される場合、標識されていない分子を基準とする同位体標識された分子の質量シフトを生じ、質量分析法では、標識されていない分子の量が、それの質量分析サインと標識された内部標準分子の質量分析サインとの比較により決定され得る。質量分析の間に生じるガス相フラグメント化パターンは同位体標識化の影響を受けないので、同位体標識された内部標準の使用は、本発明の方法に適している。好適な同位体標識としては、例として、重水素（2Ｈ）、13Ｃおよび15Ｎが挙げられる。例えば、重水素で同位体標識された２５−ヒドロキシビタミンＤ３分子は、標識されていない２５−ヒドロキシビタミンＤ３分子よりも３原子質量単位（ａｍｕ）大きくなり、その両方をＭＳによって分析した場合、２５−ヒドロキシＶＤ３分子とそれの同位体標識された内部標準とを区別する検出可能な質量シフトを結果としてもたらすであろう。同位体標識は、分子中の１つ以上の位置で組み込まれ得、１つ以上の同位体標識が、同じ同位体標識される分子上に使用され得る。
【００４３】
本発明の異形に従う試料を「精製する」とは、関心のある分析物の特性を実質的に変えることなしに、試料の残存する成分から、関心のある分析物（もしあれば）を最も少なく部分的に分離することをいう。精製または精製するとは、関心のある分析物以外の全ての物質を試料から除去することをいうのではなく、むしろこれは、関心のある分析物の質量分光分析を妨げ得るであろう試料中の他の成分に対して関心のある分析物（もしあれば）の量を富化する手順をいう。精製は、質量分析による関心のある分析物の検出を妨げ得る１つ以上の物質の試料内における相対的減少を可能にするものである。この相対的減少は、試料中に存在する任意の物質が、実質的にまたは完全に除去されることを必要としない。
【００４４】
精製は、当業者に認識されるように、任意の好適な手段により達成され得る。当業者には明らかなように、精製は、例えば、沈澱、滴定、濾過、キャピラリー電気泳動、ガスクロマトグラフィー、分画、イオン移動度分離、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、直接エレクトロスプレーイオン化（ＤＥＳＩ）、溶媒抽出、遠心分離、または希釈を含む手段によって達成され得る。好ましくは、本発明の異形における精製は、高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を含む液体クロマトグラフィー（「ＬＣ」）をいう。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「クロマトグラフィー」とは、一般的に、液体またはガスにより運ばれる化学混合物が、液体または固体の固定相の周りまたは上を流れる時の化学エンティティの差別的分配の結果として、各成分へと分離されるプロセスをいう。ＬＣとは、流体が微細物質のカラムまたはキャピラリー通路に均一に浸透する時に、流体溶液の１つ以上の成分を選択的に遅延させるプロセスをいう。遅延は、１つ以上の固定相とバルク流体（すなわち移動相）との間における、このバルク流体がそれらの固定相に対して相対移動する時の、混合物成分の分配の結果としてもたらされる。ＬＣの例としては、逆相液体クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、乱流液体クロマトグラフィー、および高スループット液体クロマトグラフィーが挙げられる。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「ガスクロマトグラフィー」、すなわちＧＣは、試料混合物が気化されてキャリアケース（例えば、窒素またはヘリウム）の流れの中に注入されるクロマトグラフィーをいい、この流れが、液体または粒状固体からなる固定相を含有するカラムを通って移動する。試料混合物は、固定相に対する試料混合物内の化合物の親和性に従って分離される。
【００４７】
「分析する」とは、１つ以上の関心のある分析物の存在または不在、そして任意選択で、量または濃度を測定するのに適した技術を採用することをいう。具体的には、分析するとは、少なくとも部分的には、誘導体化剤により誘導体化分析物に与えられた正電荷を利用することにより、１つ以上の誘導体化された関心のある分析物の存在、量または濃度を測定する、定量分析法を採用することをいう。分析とは、好ましくは、質量分析（１次元質量分析およびタンデム質量分析を含む）の技術をいう。当該方法は、既知濃度のビタミンＤ、ビタミンＤ誘導体または重水素を有するビタミンＤを含む内部標準を供給し、その既知の内部標準を誘導体化試薬で処理して誘導体化標準付加物を形成することをさらに含み得る。誘導体化された分析物および内部標準の混合物は、クロマトグラフィーにおいて分離されて、差別的な質量または／および保持時間を有する分離されたピークを形成し得、分離された分析物および内部標準が、誘導体化付加物のＬＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳＭＳ分析を用いることで、質量分析を用いて分析され得る。
【００４８】
「質量分析」、すなわち「ＭＳ」とは、化合物のそれらの質量による分析の方法をいう。ＭＳは、イオンをそれらの質量電荷比（ｍａｓｓ−ｔｏ−ｃｈａｒｇｅ  ｒａｔｉｏｎ）（「ｍ／ｚ」）に基づいてフィルタリングし、検出し、測定する方法を含む。当業者により理解されるように、ＭＳは、一般的に、（１）分析されるべき化合物をイオン化して荷電化合物を形成すること、（２）その荷電化合物の分子量を検出すること、および（３）検出された荷電化合物についての質量電荷比を計算することを含む。イオン化は、当業者には明らかなように、任意の好適な手段によって行われ得る。イオン化の好適な手段としては、説明として、大気圧化学イオン化、大気圧光イオン化、誘導結合プラズマ、電解脱離、レーザーダイオード熱脱離、エレクトロスプレーイオン化、高速原子衝撃、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（「ＭＡＬＤＩ」）、または表面増強レーザー脱離（「ＳＥＬＤＩ」）が挙げられる。イオン検出もまた、当業者には明らかなように、任意の好適な手段によって行われ得る。例として、検出は、正イオンモード、または、代替的に、負イオンモードで行われ得る。検出は、所望される場合は、選択的イオンモニタリングまたは多重反応モード（「ＭＲＭ」）を用いて行われ得る。一部の実施形態において、誘導体化分析物の親娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）、選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）、またはＭＲＭが、三連四重極ＭＳプラットホームを用いて行われる。
【００４９】
「定量下限」とは、ＭＳ測定が定量的に意味のあるものとなる点をいう。これは、分析物応答が、識別可能であり、個別的であり、かつ２０％未満の相対標準偏差および８０％より高い確度で再現性がある、最も低い点である。「検出限界」とは、質量分析を用いて測定される値が、その値に伴う不確かさと同等またはそれ未満である点をいい、ゼロ濃度における平均値の相対標準偏差の３倍として定義される。
【００５０】
本発明の実施形態は、血漿試料中の関心のある分析物の存在または量を測定するための方法であって、血液試料を収集する工程と、前記血液試料から血漿試料を分離する工程と、前記血漿試料を分取する工程と、誘導体化剤を用いて前記血漿試料内の関心のある分析物を誘導体化する工程と、前記試料を調製容器に移す工程と、前記試料を精製する工程と、関心のある分析物の存在、不在、量または濃度を分析する工程とを含む、方法を含む。この方法の複数の工程は、例えばＰＳＤが採用される場合、実質的に同時に行われ得ることが理解されるべきである。さらに、一部の工程は、使用される研究室技術によっては省かれ得るまたは異なる順序で行われ得ることが理解されよう。説明として、本明細書に記述されるように、誘導体化は精製後に行われ得、試料を調製容器に移す工程は一部の状況においては省かれ得る。
【００５１】
好ましくは、血漿試料の収集は、ＰＳＤの使用により達成される。ＰＳＤは、全血試料を収集する工程と、全血試料から血漿試料を分離する工程と、血漿試料を分取して既知の体積にする工程とを、実質的に同時に行い得る。また、ＰＳＤには、血液保持部材、半透性部材、収集部材、または吸収材要素において、１つ以上の内部標準または１つ以上の誘導体化剤が予め添加され得る。
【００５２】
分析の前に、血漿試料は、１つ以上の別個に検出可能な内部標準で処理され得る。任意選択で、内部標準は、誘導体化の前または間に添加され得る。誘導体化剤が内部標準を構成することもあり得る。
【００５３】
任意選択で、２つ以上の血漿試料が分析の前に混合されて、１つのバッチで分析され得る。２つ以上の血漿試料を１つのバッチで分析する場合、前記血漿試料のうちの少なくとも１つが、好ましくは、血漿試料を混合する前に内部標準で処理される。好ましくは、これらの実施形態において、混合されるべき各血漿試料は、混合の前に、バッチの一部として混合されるべきその他の血漿試料を処理するために使用される内部標準と異なる内部標準で処理される。そのような内部標準は、１つ以上の関心のある分析物の異なる同位体、誘導体化剤（１つまたは複数）の異なる同位体、または関心のある分析物の１つ以上の同位体と誘導体化剤の１つ以上の同位体との組み合わせを含み得る。図２、例えば図２Ａおよび図２Ｂは、異なる内部標準で処理された２つの血漿試料を組み入れたアッセイの絶対的および相対的定量化を説明している。図２Ａに示されるように、２つの血漿試料中の関心のある分析物ビタミンＤは、各試料に対する別個のＰＳＤの使用によって、収集され、分取され、抽出され得る。各試料は、異なる内部標準（例えば、ビタミンＤの１−重水素同位体）で処理され、これらの試料が混合される。混合された試料は、次いで、ＤＲ１で誘導体化される。続いて、この混合物は、例えば逆相カラム上での、分離に供され得る。標識された分析物および内部標準は、カラム上のそれらの異なる特異な保持時間のせいで、別々の時間にカラムから溶出し得る。逆相カラムから溶出されるピークは、未知の試料からの誘導体化分析物を含むピークと、既知の濃度または量を有する誘導体化された内部標準または分析物を含むピークとを含む。
【００５４】
ＰＳＤを採用する実施形態において、血漿試料は、試料が収集された後に、先に収集ディスクから試料を取り出すことなしに、誘導体化剤を一部として含む溶液中にＰＳＤの収集レザバを入れることにより誘導体化され得る。任意選択で、収集レザバはＰＳＤから取り出されて調製容器に入れられ得、次いで、その調製容器に誘導体化剤が添加され得る。好ましくは、収集レザバは、吸収材要素である。これらの好ましい実施形態において、吸収材要素は、溶媒を含んだ調製容器に直接入れられ得、そこに誘導体化剤も添加され得る。
【００５５】
本発明の別の実施形態において、当該方法は、全血試料を収集する工程と、前記全血試料から血漿試料を分離する工程と、前記血漿試料を分取する工程と、誘導体化剤を用いて前記血漿試料内の分析物を誘導体化する工程と、前記試料を調製容器に移す工程と、前記試料を精製する工程と、前記試料内の関心のある分析物（もしあれば）を分析する工程とを含む。
【００５６】
本明細書において試料を調製容器に移す工程または吸収要素または収集ディスクを調製容器に移すことに言及する場合、そのような工程は、精製および／または分析のための手段への試料の分析されるべき部分の移動の任意の方法を含み得る。そのような工程は、例として、試料を容器中に注入またはデカントすること、またはＰＳＤを利用する実施形態においては、ＰＳＤ収集ディスクもしくは収集レザバを容器中に入れることを含み得る。ＰＳＤを利用するさらに他の実施形態において、この工程は、収集ディスクを取り出すことのない、ＰＳＤの収集レザバ内の血漿の現場溶出または脱離を含み得る。そのような現場溶出または脱離は、例えば、試料収集の前または後に収集ディスクの下のところで収集レザバに穴を開け、次いで、溶離溶媒が収集ディスクを通過して精製および／または分析のためにあらゆる溶離分析物を収集レザバ中の穴を通って運ぶこととなるように、収集レザバを通る溶離溶媒をポンプ輸送、滴下、または別の方法で輸送するように構成された支持構造を備えたインライン構成内にＰＳＤを配置することにより、達成され得る。
【００５７】
別の実施形態において、当該方法は、全血試料を収集する工程と、前記全血試料から血漿試料を分離する工程と、前記血漿試料を収集表面上に収集する工程と、前記収集表面上で前記血漿試料を乾燥させる工程と、誘導体化剤を収集表面に添加することにより前記血漿試料内の分析物を誘導体化する工程と、前記収集表面を調製容器に移す工程と、前記収集表面および他の成分から前記試料を精製する工程と、前記試料内の関心のある分析物（もしあれば）を分析する工程とを含む。
【００５８】
別の実施形態において、当該方法は、全血試料を収集する工程と、前記全血試料から血漿試料を分離する工程と、前記血漿試料を吸収材要素中に収集する工程と、前記血漿試料を前記吸収材要素中で乾燥させる工程と、誘導体化剤を前記吸収材要素に添加することにより前記血漿試料内の分析物を誘導体化する工程と、前記吸収材要素を調製容器に移す工程と、前記吸収材要素および他の成分から前記試料を精製する工程と、前記試料内の関心のある分析物（もしあれば）を分析する工程とを含む。
【００５９】
他の実施形態において、本発明の方法は、血漿試料を収集、分離および分取することと、血漿試料を内部標準で処理することと、血漿試料を精製することと、血漿試料を誘導体化することと、試料中の関心のある分析物（もしあれば）の濃度または量を内部標準の濃度または量と比較して関心のある分析物の存在、量または濃度を決定するために試料および内部標準の混合物を分析することとを含む。ここでは内部標準処理工程は分取の後に行われるものとして記述されているが、この工程は、内部標準が標識された分析物である場合は、誘導体化の前の任意の時点で行われ得、そして内部標準が標識された誘導体化剤である場合は、誘導体化の間に行われることになることが、当業者により理解されよう。本発明のこの実施形態の方法の１つ以上の工程は、ＰＳＤの使用により達成され得る。任意選択で、内部標準は、血漿試料の収集の前に、ＰＳＤの血液保持部材、半透性部材、収集レザバまたは吸収材要素に、予め添加され得る。
【００６０】
本発明の方法の他の実施形態は、複数の血漿試料を収集、分離および分取する工程と、これらの複数の血漿試料の各々を別個の内部標準で処理する工程と、試料を精製する工程と、試料を誘導体化する工程と、試料を混合する工程と、各試料内の関心のある分析物の存在、濃度または量を決定するために、誘導体化された混合試料を１バッチとして分析する工程とを含む。好ましくは、各血漿試料は、混合の前に異なる内部標準で処理され、そのような違いは、好ましくは、内部標準の異なる同位体標識化を含む。内部標準処理工程は、ここでは分取後に行われるものとして記述されているが、この工程は、内部標準が標識された分析物である場合は、誘導体化の前の任意の時点で行われ得、そして内部標準が標識された誘導体化剤である場合は、誘導体化の間に行われることになり、分析されるべき試料を１バッチとして混合する前の任意の時点で行われ得ることが、当業者により理解されよう。本発明のこの実施形態の方法の１つ以上の工程は、各試料に対する別個のＰＳＤの使用により達成され得る。任意選択で、各別個のＰＳＤに、その血液保持部材、半透性部材、収集レザバまたは吸収材要素において、分析的に異なる内部標準が予め添加され得る。
【実施例】
【００６１】
方法の好ましい実施形態の実施例
実施例１：
関心のある分析物ビタミンＤ２およびＤ３を、ヒト全血の試料おいて調べる。およそ２５μＬの体積のヒト全血試料をＰＳＤに導入する。３分後、２．４μＬの分取された血漿試料を含有する収集レザバをＰＳＤから取り出し、さらなる１５分間にわたり風乾させる。血漿は、前記ＰＳＤの半透性膜によって前記全血試料から分離される。レザバを、２ｍＬのポリプロピレン試験管である調製容器中に入れ、２μＬのＭｅＯＨ中の内部標準ｄ６−２５ＯＨＶＤ２（１０ｐｇ／μＬ）およびｄ６−２５ＯＨＶＤ３（２０ｐｇ／μＬ）で処理する。レザバを、さらなる３分間にわたり乾燥させる。レザバを、１５分間にわたり室温でインキュベートする。２０μＬのＤＲ１（ＭｅＯＨ中４ｍｇ／ｍＬ）をレザバに添加する。レザバを１０秒間にわたりボルテックスする。次いで、４０μＬのＤＲ２を添加し（ＭｅＯＨ中２ｍｇ／ｍＬ）、レザバをさらなる６０秒間にわたりボルテックスする。
【００６２】
誘導体化反応を、４０μＬのＤＲ３（Ｈ２Ｏ中８ｍｇ／ｍＬ）を添加することによりクエンチする。次いで、溶液を１０秒間にわたりボルテックスする。レザバの固体残留部分を何ら伴わずに、試料を新しいバイアルに移す。次いで、試料をＬＣ／ＭＳにより分析する。１５μＬの試料を、逆相カラム中に注入し、ＬＣにより分離し、ＭＳにより分析する。図３に示されるように、ＶＤ２およびＶＤ３の絶対濃度を、関心のある分析物のピーク面積を内部標準の既知のピーク面積と比較することにより決定する。
【００６３】
提案されるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ条件には以下が含まれる。
自動サンプラーにおける温度は４℃に設定した。オーブンにおける温度は４０℃に設定した。
溶媒Ａ：１００％Ｈ2Ｏ／０．０５％ギ酸、および
溶媒Ｂ：１００％ＡＣＮ／０．０５％ギ酸を使用し得る。
Ｃ１８カラム（２５０×２．１ｍｍ）ＨＡＬＯ：３５％水（０．０５％ギ酸）から５０％アセトニトリル（０．０５％ギ酸）までの勾配；０．２ｍＬ／分の流量
【００６４】
【表１】
2016516198.tif 000003
【００６５】
ＱＴＲＡＰ４０００三連四重極線形イオントラップ質量分析器（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）を、ＥＳＩ正イオンモードで使用した。ユニット分解能を使用した。
【００６６】
【表２】
2016516198.tif 000004
【００６７】
提案される基準ソースパラメータ
カーテンガス：２０
衝突ガス：高
イオンスプレー電圧：５０００
温度：４５０
イオン源ガス１：３０
イオン源ガス２：５０
【００６８】
【表３】
2016516198.tif 000005
【００６９】
実施例２：
静脈から取り出された血液を、遠心分離を用いることにより血漿に分離する。５０または１００μＬの血漿を試験管中に入れ、５０μＬの内部標準を添加する。５０μＬのリン酸緩衝液を添加した後に、この混合物をボルテックスし、次いで室温にて１〜２時間にわたり暗闇下で平衡させる。１ｍＬのＭＴＢＥ（メチルｔ−ブチルエーテル）を添加し、液−液抽出（ＬＬＥ）を行う。２分間にわたるボルテックスに続いて、試料を１０分間にわたり遠心分離する。試料を少なくとも３０分間にわたり摂氏−８０度の温度で貯蔵する。液体上層を容器中に注入し、３０℃にて窒素ガスを用いて乾燥させる。５０μＬのＤＲ１（ＭｅＯＨ中２ｍｇ／ｍＬ）を添加しながら、１０秒間にわたり容器をボルテックスする。５０μＬのＤＲ２を添加し（ＭｅＯＨ中２ｍｇ／ｍＬ）、容器をさらなる６０秒間にわたりボルテックスする。誘導体化反応を、５０μＬのＤＲ３（Ｈ２Ｏ中８ｍｇ／ｍＬ）を添加することによりクエンチする。次いで、この溶液を１０秒間にわたりボルテックスする。固体残留部分を何ら伴わずに、試料を新しい容器に移す。次いで、試料をＬＣ／ＭＳにより分析する。１５μＬの試料を、逆相カラム中に注入し、ＬＣにより分離し、ＭＳにより分析する。図９に示されるように、ＶＤ２およびＶＤ３の絶対濃度を、関心のある分析物のピーク面積を内部標準の既知のピーク面積と比較することにより決定する。
【００７０】
このように、試料から関心のある分析物を測定する具体的な構成および方法が開示されてきた。しかしながら、既に記述されたものに加えて、多くのさらなる改変が、本明細書における本発明の概念から逸脱することなく可能であることが、当業者には明らかであるはずである。したがって、本発明の主題は、本開示の趣旨以外で限定されるべきではない。さらに、本開示を解釈する際に、全ての用語は、文脈と一致する可能な限り広い様式で解釈されるべきである。特に、用語「含む」および「含んでいる」は、非排他的な様式で構成要素、成分または工程に言及するものであり、言及される構成要素、成分または工程が、明示的に言及されていない他の構成要素、成分もしくは工程と共に存在し得る、または利用され得る、または組み合わされ得ることを示すものとして解釈されるべきである。
【図１Ａ】
2016516198.tif 000006
【図１Ｂ】
2016516198.tif 000007
【図２】
2016516198.tif 000008
【図３】
2016516198.tif 000009
【図４】
2016516198.tif 000010
【図５】
2016516198.tif 000011
【図６】
2016516198.tif 000012
【図７】
2016516198.tif 000013
【図８】
2016516198.tif 000014
【図９】
2016516198.tif 000015
【国際調査報告】
2016516198.tif 000016