(57)【要約】  本発明は、血液型A及び/又は血液型Bのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖が、スペーサーを介してグラフトされたポリマー粒子を含む、ゲルの形態のアフィニティークロマトグラフィーマトリックスであって、オリゴ糖の密度が、マトリックス1ml当たり0.2から0.7mgの間であることを特徴とするマトリックスに関する。本発明はまた、治療的使用のための免疫グロブリンの濃縮物を調製するためのこのマトリックスの使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液型A及び/又は血液型Bのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖がグラフトされたポリマー粒子を含み、前記オリゴ糖が、スペーサーを介して、前記粒子へとグラフトされている、ゲルとしてのアフィニティークロマトグラフィーマトリックスであって、オリゴ糖の密度が、マトリックス1ml当たり0.2から0.7mgの間に含まれ、前記スペーサーが、式(I)-NH-R1-CO-NH-R2-[式中、R1は、C4〜C6アルキル基であり、R2は、C3〜C8アルキル基である]を有し、前記スペーサーが、そのアミン官能基を介して粒子に結合していることを特徴とするマトリックス。
【請求項２】
(i)血液型Aのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖がグラフトされたポリマー粒子、及び/又は(ii)血液型Bのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖がグラフトされたポリマー粒子を含む、請求項1に記載のマトリックス。
【請求項３】
(i)血液型Aのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖がグラフトされたポリマー粒子、及び(ii)血液型Bのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖がグラフトされたポリマー粒子を含む、請求項2に記載のマトリックス。
【請求項４】
血液型Aのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖、及び血液型Bのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖の両方がグラフトされたポリマー粒子を含む、請求項1に記載のマトリックス。
【請求項５】
(i)血液型Aのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖がグラフトされたポリマー粒子と、(ii)血液型Bのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖がグラフトされたポリマー粒子と、(iii)血液型Aのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖、及び血液型Bのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖の両方がグラフトされたポリマー粒子との混合物を含む、請求項1に記載のマトリックス。
【請求項６】
オリゴ糖の密度が、マトリックス1ml当たり0.3から0.4mgの間に含まれ、好ましくは、マトリックス1ml当たり約0.3mgである、請求項1から5のいずれか一項に記載のマトリックス。
【請求項７】
血液型Aのエピトープに対応するオリゴ糖及び/又は血液型Bのエピトープに対応するオリゴ糖が、三糖である、請求項1から6のいずれか一項に記載のマトリックス。
【請求項８】
血液型Aのエピトープに対応するオリゴ糖が、三糖のN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)-ガラクトース(Gal)-フコースである、請求項7に記載のマトリックス。
【請求項９】
血液型Bのエピトープに対応するオリゴ糖が、オリゴ糖のガラクトース-ガラクトース-フコースである、請求項7に記載のマトリックス。
【請求項１０】
R1が、C5アルキル基である、請求項1から9のいずれか一項に記載のマトリックス。
【請求項１１】
R2が、C3アルキル基である、請求項1から10のいずれか一項に記載のマトリックス。
【請求項１２】
血液型Aのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖がグラフトされたポリマー粒子と、血液型Bのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖がグラフトされたポリマー粒子とが、25/75から75/25(v/v)、好ましくは、約50/50(v/v)の比率で混合されている、請求項3に記載のマトリックス。
【請求項１３】
ポリマーが、架橋ポリマーである、請求項1から12のいずれか一項に記載のマトリックス。
【請求項１４】
ポリマーが、セルロースであり、粒子が、好ましくは、多孔性のセルロースビーズである、請求項13に記載のマトリックス。
【請求項１５】
抗-A抗体及び/又は抗-B抗体に結合するアフィニティークロマトグラフィーにおける、請求項1から14のいずれか一項に記載のマトリックスの使用。
【請求項１６】
治療的使用のための免疫グロブリンG(IgG)を産業スケールで生産するための、請求項15に記載のマトリックスの使用。
【請求項１７】
治療的使用のための免疫グロブリンG(IgG)の濃縮物を調製するための方法であって、エタノール分画及び/又はカプリル酸分画及び/又はクロマトグラフィー分離によって、Ig組成物を血漿から得る工程と、請求項1から14のいずれか一項に記載のマトリックスを適用するアフィニティークロマトグラフィーを介して、組成物中におそらく存在する抗-A抗体及び/又は抗-B抗体を除去する工程とを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液製剤の、血液型A及び/又は血液型Bの抗原に対する抗体を保持及び除去することを意図された、アフィニティークロマトグラフィーを適用するためのマトリックスに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、多くの病態が、免疫グロブリン(Ig)の組成物で処置されている。例えば、抗体の産生が欠如する原始的免疫不全症、川崎病、小児及び成人の自己免疫性血小板減少性紫斑病、抗体の産生が欠如する続発性免疫不全症、とりわけ、再発性感染症と関連する慢性リンパ性白血病又は骨髄腫、細菌感染症と関連する小児のHIV感染、多巣性運動神経障害、ギラン-バレー症候群、B19型パルボウイルスによる重度、慢性、又は急性感染症、後天性免疫欠損症又は構成的免疫欠損症、コルチコイド抵抗性皮膚筋炎、急性筋無力症、特発性慢性多発性神経根炎、例えば、HIV感染と関連する、自己免疫性血小板減少性紫斑病、スティッフパーソン症候群、自己免疫性好中球減少症、抵抗性自己免疫性赤芽球減少症、自己抗体により獲得される抗凝固症候群、多発性関節リウマチ、ブドウ膜炎等を挙げることができる。
【０００３】
Igを濃縮したヒト血漿画分の、治療における使用の増大により、例えば、ヒト血漿からの、静脈内経路を介して注射可能な、高度に精製されたIg濃縮物(IgIV)、又は皮下経路を介して注射可能な、高度に精製されたIg濃縮物(Igsc)の大スケールの生産が要求される。
【０００４】
今日、この生産は、とりわけ、得られたIg濃縮物の無毒性に関して、多くの制約に直面している。
【０００５】
欧州薬局方によれば、溶血の危険性を低減するために、これらの濃縮物の、血液型A及び/又は血液型Bの抗原(本記載では、縮約して「抗-血液型A抗体」及び「抗-血液型B」、更に又は「抗-A抗体」及び「抗-B抗体」、更に又は「抗-A同種凝集素」及び「抗-B同種凝集素」と称する)に対する抗体の含量を低減すべきである。
【０００６】
Igに対する必要が恒常的に増大しつつあることを踏まえると、統計学的に血液型Oに富むドナーのプールをいっそう増大させることが必要である。したがって、Ig濃縮物を、血漿のプールから、産業的生産の間に、血液製剤の抗-A抗体及び抗-B抗体を除去する可能性をもたらす方法を有することが不可欠となっている。
【０００７】
出願WO2007/077365は、Ig濃縮物を調製するための方法であって、抗-A抗体及び抗-B抗体を枯渇させることを目的とする、イムノアフィニティークロマトグラフィー工程を含む方法について記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】出願WO2007/077365
【特許文献２】EP 0 703 922
【特許文献３】WO 99/64462
【特許文献４】特許出願WO 94/29334
【特許文献５】特許出願WO 02/092632
【特許文献６】米国特許第4 764 369号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Thorpeら、2009、Vox Sang. 97、160〜168
【非特許文献２】Cohnら、1946、J. Am. Chem. Soc. 68、459
【非特許文献３】Oncleyら、1949、J. Am. Chem. Soc. 71、541
【非特許文献４】Steinbuchら、1969、Arch. Biochem. Biophys. 134(2):279〜84
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
出願人は、今回、アフィニティークロマトグラフィーにより、産業スケールで、血液製剤の抗-A抗体及び/又は抗-B抗体を保持及び除去するのに、特に有用な支持体を開発した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、本発明は、血液型A及び/又は血液型Bのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖がグラフトされたポリマー粒子を含み、前記オリゴ糖が、スペーサーを介して、前記粒子へとグラフトされている、ゲルとしてのアフィニティークロマトグラフィーマトリックスであって、オリゴ糖の密度が、マトリックス1ml当たり0.2から0.7mgの間に含まれることを特徴とするマトリックスを提供する。前記スペーサーは、式(I)-NH-R1-CO-NH-R2[式中、R1は、C4〜C6アルキル基であり、R2は、C3〜C8アルキル基である]を有し、前記スペーサーは、そのアミン官能基を介して粒子に結合していることを特徴とする。
【００１２】
これらのグラフトされた粒子についての概略図を、図1に示す。
【００１３】
特定の実施形態では、マトリックスは、(i)血液型Aのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖がグラフトされたポリマー粒子、及び/又は(ii)血液型Bのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖がグラフトされたポリマー粒子を含む。
【００１４】
好ましい実施形態では、マトリックスは、(i)血液型Aのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖がグラフトされたポリマー粒子、及び(ii)血液型Bのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖がグラフトされたポリマー粒子を含む。この実施形態を、図4Aに例示する。
【００１５】
別の実施形態では、マトリックスは、血液型Aのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖、及び血液型Bのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖の両方がグラフトされたポリマー粒子を含む。この実施形態を、図4Bに例示する。
【００１６】
特定の実施形態では、マトリックスは、(i)血液型Aのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖がグラフトされたポリマー粒子と、(ii)血液型Bのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖がグラフトされたポリマー粒子と、(iii)血液型Aのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖、及び血液型Bのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖の両方がグラフトされたポリマー粒子との混合物を含む。この実施形態を、図4Cに例示する。
【００１７】
全ての実施形態では、血液型Aのエピトープに対応するリガンドを粒子へと結合させるスペーサーと、血液型Bのエピトープに対応するリガンドを粒子へと結合させるスペーサーとは、同一な場合もあり、異なる場合もあり、好ましくは、同一であるが、常に、式(I)を伴う。
【００１８】
本発明は、このマトリックス又は支持体の、抗-A抗体及び/又は抗-B抗体に結合するアフィニティークロマトグラフィーにおける使用も更に目的とする。
【００１９】
本発明はまた、治療的使用のための免疫グロブリンG(IgG)を産業スケールで生産するための、このマトリックス又は支持体の使用も目的とする。
【００２０】
本発明はまた、治療的使用のための免疫グロブリン(Ig)の濃縮物を調製するための方法であって、エタノール分画及び/又はカプリル酸分画及び/又はクロマトグラフィー分離によって、Ig組成物を血漿から得る工程と、本明細書で規定されるマトリックスを使用するアフィニティークロマトグラフィーを介して、組成物中におそらく存在する抗-A抗体及び/又は抗-B抗体を除去する工程とを含む方法も提供する。
【００２１】
このマトリックスの利点は、抗-A抗体及び抗-B抗体に対するその高度な選択性及び特異性、並びに抗-A抗体及び抗-B抗体に対するその高度な結合能である。したがって、カラム容量当たり大量の製剤を通すことにより、産業スケールにおける製剤の処理時間を短縮することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明に従う特定の実施形態における、血液型A又は血液型Bのエピトープに対応する1つのオリゴ糖がグラフトされたポリマー粒子についての、単純化された概略図を例示する図である。
【図２】血液型Aのエピトープに対応する三糖がグラフトされたポリマー粒子を例示する、本発明の好ましい実施形態についての、単純化された概略図を例示する図である。
【図３】血液型Bのエピトープに対応する三糖がグラフトされたポリマー粒子を例示する、本発明の好ましい実施形態についての、単純化された概略図を例示する図である。
【図４Ａ】血液型Aのエピトープに対応するオリゴ糖を保有する粒子と、血液型Bのエピトープに対応するオリゴ糖を保有する粒子との混合物を含むマトリックスの、本発明の特定の実施形態についての、単純化された概略図を表す図である。
【図４Ｂ】血液型Aのエピトープに対応するオリゴ糖、及び血液型Bのエピトープに対応するオリゴ糖の両方を保有する粒子を含むマトリックスの、本発明の特定の実施形態についての、単純化された概略図を例示する図である。
【図４Ｃ】血液型Aのエピトープに対応するオリゴ糖を保有する粒子と、血液型Bのエピトープに対応するオリゴ糖を保有する粒子と、血液型Aのエピトープに対応するオリゴ糖、及び血液型Bのエピトープに対応するオリゴ糖の両方を保有する粒子との混合物を含むマトリックスの、本発明の特定の実施形態についての、単純化された概略図を例示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
支持体:
本発明のマトリックスは、ポリマー粒子の支持体を含み、好ましくは、ゲル又は樹脂の形態にある。
【００２４】
これらのポリマー粒子は、球形又は楕円形であることが好ましく、これらはとりわけ、ビーズでありうる。これらの粒子は一般に、平均サイズが、約0.1μmから約1,000μm、好ましくは、約20から約500μm、更に好ましくは、約50から約200μm、更に好ましくは、約70μmから約120μmの直径である。
【００２５】
これらの粒子は、多孔性であることが好ましい。
【００２６】
ポリマーは、天然の場合もあり、非天然の場合もあり、有機の場合もあり、無機の場合もあり、架橋されている場合もあり、架橋されていない場合もある。
【００２７】
ポリマーは、好ましくは、架橋された有機ポリマーであることが好ましい。
【００２８】
好ましい実施形態では、ポリマーはセルロースであり、粒子は、多孔性のセルロースビーズであることが好ましい。
【００２９】
これは、架橋セルロースであることが更に好ましい。
【００３０】
可能なポリマーの他の種類は、アガロース、デキストラン、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、スチレンとジビニルベンゼンとのコポリマー、又はこれらのポリマーの混合物を含む。
【００３１】
粒子は、例えば、カラムを充填するために使用されうるクロマトグラフィー媒体をもたらしうる。
【００３２】
リガンド:
本発明に従う支持体により保有されるリガンドは、天然では糖類である、血液型A又は血液型Bの抗原を表すオリゴ糖である。
【００３３】
より具体的には、本発明に従うマトリックスにより保有される、血液型Aのエピトープに対応するオリゴ糖及び/又は血液型Bのエピトープに対応するオリゴ糖は、三糖であることが典型的である。「血液型のエピトープに対応するオリゴ糖」という用語は、抗原的観点から、抗原性決定基が、それぞれ、抗-A抗体及び抗-B抗体により認識される同一の単位又は類似の単位を指す。したがって、本発明に従う支持体により保有されるリガンドは、抗-A抗体又は抗-B抗体に特異的である。
【００３４】
好ましくは、本発明においてリガンドとして使用される、血液型Aのエピトープに対応するオリゴ糖は、三糖のN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)-ガラクトース(Gal)-フコース、より具体的にはN-アセチルGalα1-3(Fucα1-2)Galであり、スペーサーは、酸素原子を介して結合し、ガラクトース:
【００３５】
【化１】
2016532100.tif 000002
【００３６】
の1位の炭素に結合している。
【００３７】
本発明においてリガンドとして使用される、血液型Bのエピトープに対応するオリゴ糖は、好ましくはオリゴ糖のガラクトース-ガラクトース-フコース、より具体的にはGalα1-3(Fucα1-2)Galであり、スペーサーは、酸素原子に結合し、ガラクトース:
【００３８】
【化２】
2016532100.tif 000003
【００３９】
の1位の炭素に結合している。
【００４０】
スペーサー:
リガンドは、リガンドを粒子へと結合させるスペーサーに、共有結合的に結合している。スペーサーは、立体障害を低減し、抗-A抗体及び抗-B抗体に対するリガンドの接近可能性を増大させて、これらに結合させる可能性をもたらす。
【００４１】
スペーサーは、粒子上に、好ましくは上記で記載した三糖のN-アセチルGalα1-3(Fucα1-2)Galである、血液型Aのエピトープに対応するオリゴ糖、又は好ましくは上記で記載した三糖のGalα1-3(Fucα1-2)Galである、血液型Bのエピトープに対応するオリゴ糖のいずれかを固定化するために使用する。
【００４２】
粒子は、複数のスペーサーを保有しうる。
【００４３】
リガンドとスペーサーとの間の結合は、例えば、アミド結合でありうる。
【００４４】
スペーサーは、少なくとも1つのC原子、O原子、N原子、又はS原子を含むことが典型的である。
【００４５】
スペーサーは、例えば、-(CH2)mX(CH2)n-又は-(CH2)mX1(CH2)nX2(CH2)p-[式中、X、X1、及びX2は各々、互いから独立に、O、S、NH、及び共有結合から選択され、m、n、及びpは各々、独立に、0、1、2、3、4、5、又は6である]でありうる。別の実施形態では、上記の水素原子のうちの1つ、2つ、又は3つは、等しい数のOH基及び/又はメチル基で置きかえることができる。
【００４６】
ある実施形態では、スペーサーは、
【００４７】
【化３】
2016532100.tif 000004
【００４８】
[式中、X1及びX2の各々は、O、S、及びNHから独立に選択され、Ra、Rb、Rc、及びRdの各々は、H、OH、及びメチルから独立に選択される]から選択される構造を含む。
【００４９】
別の実施形態では、スペーサーは、
【００５０】
【化４】
2016532100.tif 000005
【００５１】
の中から選択される構造を含む。
【００５２】
好ましい実施形態では、スペーサーは、式(I)-NH-R1-CO-NH-R2-[式中、R1は、C4〜C6アルキル基であり、R2は、C3〜C8アルキル基である]を有し、前記スペーサーは、そのアミン官能基(上記のボールド体)を介して、粒子に結合している。このマトリックスの概略図を、図1に示す。
【００５３】
R1は、直鎖状又は分枝状の、好ましくは、直鎖状の、C4〜C6アルキル基である。R1は、C5アルキル基であることが好ましい。
【００５４】
R2は、直鎖状又は分枝状の、好ましくは、直鎖状の、C3〜C8アルキル基である。R2は、C3アルキル基であることが好ましい。
【００５５】
好ましい実施形態では、リガンド(上記で記載した三糖であることが好ましい)を、式:(粒子)-NH-C5H10-CO-NH-C3H6-(リガンド)のスペーサーを用いて、粒子へとグラフトする。
【００５６】
好ましい実施形態では、図2に例示される、血液型Aのエピトープに対応する三糖(N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)-ガラクトース(Gal)-フコース)であるリガンドがグラフトされた架橋セルロースのビーズと、図3に例示される、血液型Bのエピトープに対応する三糖(ガラクトース-ガラクトース-フコース)であるリガンドがグラフトされた架橋セルロースビーズとを混合する。三糖を、式:(ビーズ)-NH-C5H10-CO-NH-C3H6-(リガンド)のスペーサーを用いて、ビーズへとグラフトする。
【００５７】
マトリックスの調製:
リガンドは、粒子とスペーサーとの間の共有結合、及びスペーサーとリガンドとの間の共有結合により、化学的に固定化する。
【００５８】
この固定化は、当業者が従来の方式で達成することができる。
【００５９】
好ましい実施形態では、粒子は、アームである-NH-R1-COOHを保有する。これは、ε-アミノカプロン酸(式中、R1は、ペンチル基である)であることが好ましい。
【００６０】
従来、粒子は、エピクロルヒドリン、エピブロムヒドリン、ジブロモプロパノール及びジクロロプロパノール、ジブロモブタン、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ジビニルスルホン、アリルグリシジルエーテル、及びアリルブロミド等の二官能性試薬を使用することにより活性化することができる。二官能性試薬は、粒子とアームである-NH-R1-COOHの両方と反応することが可能である。アリルブロミド等のアリルヘテロ官能性化合物は、好ましい二官能性試薬であり、活性化マトリックスを得る可能性をもたらす。
【００６１】
セルロース、ハイドロゲル又はヒドロキシル基を有する他の材料を含有する複合体等のある特定の固体支持体では、例えば、二官能性試薬との反応の前に、水酸化物供給源により、ヒドロキシル基からプロトンを除去すると有利である。
【００６２】
次いで、血液型A及び/又は血液型Bの抗原を表すリガンドを、結合基である-NH-R2[式中、R2は、直鎖状又は分枝状の、好ましくは、直鎖状の、C3〜C8アルキル基である]を介して、アームである-NH-R1-COOHを保有する活性化粒子上に固定化する。このために、N-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキノリン(EEDQ)型の縮合剤を適用することにより、粒子により保有されるアームである-NH-R1-COOHのCOOH官能基を、リガンドであるNH2-R2-オリゴ糖のNH2官能基と反応させる。
【００６３】
当業者は、A型抗原を表すリガンド又はB型抗原を表すリガンドのいずれか、或いは更にこれらの両方を、同じ粒子上にグラフトすることができる。使用されるスペーサーは、同一であることが好ましい。これは、A型抗原を表すリガンドの、B型抗原を表すリガンドに照らして同等なグラフティングを確保するのに特に有利である。当業者は更に、A型抗原を表すリガンドの、B型抗原を表すリガンドに照らした所定の比率を保有する粒子を得るために、粒子に対するリガンドの反応性に応じて、いかにして適切な条件を採用するのかについても精通している。
【００６４】
ゲルとしてのマトリックスは、アフィニティークロマトグラフィーに適合させたマトリックスをゲルとして得る目的で、当業者に公知であるので、これは、リガンドを保有するポリマー粒子への緩衝液の標準的な添加により調製する。
【００６５】
リガンドの密度、すなわち、マトリックスの容量当たりの、グラフトされるリガンドの(すなわち、血液型A又は血液型Bのエピトープに対応するオリゴ糖の)量は、マトリックス1ml当たり約0.2から約0.7mgの間、更に好ましくは、マトリックス1ml当たり約0.3から約0.4mgの間に含まれると有利である。オリゴ糖の密度は、マトリックス1ml当たり約0.3mgであることが好ましい。
【００６６】
本発明によれば、この密度は、1mg/mlの密度(例えば、出願WO2007/077365において言及されている、Glycorex Transplantation AB社(Sweden)製のGLYCOSORB ABO(登録商標)ゲル上の)と比較して、アフィニティークロマトグラフィーによる精製時間を大幅に短縮する可能性をもたらす。マトリックス容量を増大させることができ、クロマトグラフィーカラムを通す流量も増大させることができる。したがって、0.3mg/mlのマトリックスによるリガンドの密度(1mg/mlの密度と比較した)により、プロセスの持続時間は、半減し、これは、産業スケールでは、注目すべき利益を表す。リガンドの密度の減少はまた、マトリックスの費用の削減も可能とし、したがって、本発明に従うマトリックス上のアフィニティー工程をより廉価なものとし、免疫グロブリンの最終組成物の原価の削減に寄与するので有利である。リガンドの密度の減少は、抗-A抗体及び/又は抗-B抗体を除去する能力の保存を伴うと有利である。
【００６７】
好ましい実施形態では、次いで、血液型Aのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖がグラフトされたポリマー粒子と、血液型Bのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖がグラフトされたポリマー粒子とを、例えば、25/75から75/25(v/v)、好ましくは、約50/50(v/v)の比率で混合することができる。
【００６８】
血液型Aのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖がグラフトされたポリマー粒子、及び血液型Bのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖がグラフトされたポリマー粒子はまた、必要な場合、血液型Aのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖と血液型Bのエピトープに対応する少なくとも1つのオリゴ糖の両方を保有するポリマー粒子と混合することもできる。
【００６９】
アフィニティークロマトグラフィー:
本明細書で規定されるマトリックスは、抗-A抗体及び/又は抗-B抗体に結合するアフィニティークロマトグラフィーにおいて有用である。
【００７０】
このために、マトリックスを、クロマトグラフィーカラムへと導入することができる。産業スケールでは、要求される場合、カラムは、1から150リットル、又は250から500Lでさえ含有する場合もある。パイロットスケールにおける適用の場合、高さが1から50cmのカラムを使用することが可能であり、次いで、直径を、使用されるカラムの高さへと適合させる。カラム内で使用されるマトリックスの容量は、溶液の初期の抗-A抗体レベル及び/又は抗-B抗体レベルに比例して、抗-A抗体及び/又は抗-B抗体の所望の残留レベルに従い調整する。マトリックス容量はまた、産業的プロセスの制約を満たすように、とりわけ、処理される製剤の容量へと適合させるように調整することもできる。
【００７１】
免疫グロブリンの液体調製物(又は血液製剤の派生物)中に存在する、抗-A抗体及び/又は抗-B抗体は、マトリックスに結合し、吸着しなかった製剤は、回収し、抗-A抗体及び/又は抗-B抗体を枯渇させる。免疫グロブリンの液体調製物又は血液製剤の派生物は、マトリックスにより保有されたリガンドとの抗体の結合を可能とする速度で、かつ、そのような条件下で、マトリックスを通して流し込む。
【００７２】
マトリックスは、繰り返し、例えば、劣化を伴わずに約100回まで、再使用することができる。マトリックスの再生は、当業者に公知の手順により、例えば、1Mの、例えば、ソーダ(NaOH)で処理することにより、達成することができる。再生の後における再使用は、薬物を作製するための産業的プロセスの安全性要件、とりわけ、生物学的除染の必要性及びバッチ間の夾雑を誘導しうる製剤中の微量物質の除去を満たす。アフィニティーマトリックスを再使用することにより、免疫グロブリンの製造時における製造原価を削減することも可能であるので有利である。
【００７３】
こうして、最終免疫グロブリン製剤の製造原価を劇的に増大させずに、溶液中に当初存在する、抗-A抗体及び/又は抗-B抗体の、頑健で十分な除去を可能とすることにより、本発明に従うアフィニティーマトリックスを、免疫グロブリン等の薬物を製造するための産業的使用へと完全に適合させる。
【００７４】
免疫グロブリン製剤の精製:
本発明のマトリックスを使用するアフィニティークロマトグラフィーは、調製物又は組成物中におそらく存在する、所望されない抗-A抗体及び/又は抗-B抗体を除去し、したがって治療的使用のための免疫グロブリンの濃縮物を調製することにより、免疫グロブリンのこれらの調製物又は組成物を精製するのに特に有利である。
【００７５】
「除去すること」とは、存在する抗-A抗体及び/又は抗-B抗体の量の、好ましくは、少なくとも25%、更に好ましくは、少なくとも50%、更により優先的に、少なくとも80又は90%の実質的な低減を意味する。アフィニティークロマトグラフィーの後で得られる、本発明のIg濃縮物の、抗-A抗体及び抗-B抗体のそれぞれの含量(1/64の希釈率における)は、IgGの初期濃度を30g/Lとして適用される、直接クームス試験における陰性試験に適合する。アフィニティークロマトグラフィーの後で得られる、本発明のIg濃縮物は、23ng/mgのIgGを超えない抗-A抗体の含量、及び20ng/mgのIgGを超えない抗-B抗体の含量を含むことが好ましい。残留抗-A抗体及び残留抗-B抗体の分量決定の方法は、とりわけ、出願WO2007/077365において記載されている。抗-A抗体及び抗-B抗体を定量する方法は、フローサイトメトリーにより実行することが好ましい。その原理は、抗A抗体及び抗B抗体の含量に比例する蛍光シグナルの検出を適用する、これらの抗体の力価の、意図される特異的な決定に従った、A型又はB型のヒト赤血球の使用に基づく。フローサイトメトリーによる分量決定法では、一般に、基準試料、例えば、免疫グロブリンの陽性対照(力価1:32のEDQM、型番07/306等; Thorpeら、2009、Vox Sang. 97、160〜168)、又は抗-Dモノクローナル抗体濃縮物若しくは他の任意の適切な基準製剤を使用する。
【００７６】
免疫グロブリン製剤は、本質的に、IgGを含有する。これらのIgGは、血漿又は既にIgが濃縮された血漿画分から得られたポリクローナルIgGであることが典型的である。
【００７７】
治療的使用のためのIg濃縮物は、50から100g/Lの間に含まれる濃度である。これらの濃縮物は、臨床的使用が意図されており、特に、静脈内経路を介して注射することができる。この目的で、Ig濃縮物は、安全でなければならず、必要な場合は、この臨床的使用に適合性の、安定化剤等の賦形剤を含有するべきである。
【００７８】
治療的使用のためのIg濃縮物はまた、皮下経路を介して投与することもできる。この場合、製剤の濃度は、100g/L以上であり、150g/L以上であると有利である。
【００７９】
治療的使用のためのIg濃縮物はまた、筋内経路を介して投与することもできる。
【００８０】
これらのIg濃縮物は、以下の方式:
a)例えば、エタノール分画及び/又はカプリル酸分画及び/又はクロマトグラフィー分離による、Ig組成物の調製、
b)Ig組成物の、本発明のマトリックス上のパーコレーションによる、イムノアフィニティークロマトグラフィー、並びに
c)生物学的安全性工程、好ましくは、夾雑するウイルス及び/又は粒子を除去するためのナノ濾過
で得ることができる。
【００８１】
Ig組成物は、元はCohnら(Cohnら、1946、J. Am. Chem. Soc. 68、459; Oncleyら、1949、J. Am. Chem. Soc. 71、541)が開発したエタノール分画により得ることができ、でなければ、例えば、EP 0 703 922及びWO 99/64462において記載されている、クロマトグラフィー分離により、更にSteinbuchら、1969、Arch. Biochem. Biophys. 134(2):279〜84)により記載されているカプリル酸分画により得ることもできる。特許出願WO 94/29334及び同WO 02/092632において出願人により開発された方法、殊更、WO 02/092632において記載されている方法が特に好ましい。この場合、血漿又はIgGが濃縮された血漿画分を、カプリル酸分画(免疫グロブリン以外の夾雑物の沈殿による前精製)、アルカリ性のpHで実行されるアニオン交換樹脂支持体上の単回のクロマトグラフィー、4から7の間に含まれるpHの適切な緩衝液による工程における、IgGの選択的溶出にかける。ウイルス不活化処理を実行することができ、例えば、米国特許第4 764 369号において、Horowitzにより記載されている通り、溶媒洗浄剤により実施することができる。
【００８２】
このようにして採取されたIgG画分は、既に濃縮されているが、次いで、限外濾過及び滅菌濾過によるさらなる濃縮工程を経る場合もある。
【００８３】
次いで、この濃縮物を、本発明のマトリックス上のイムノアフィニティークロマトグラフィー工程にかける。免疫グロブリンの調製物のpHを、クロマトグラフィーの前に、約6から約7、好ましくは、約6のpHへと調整することが好ましい。
【００８４】
カラムのロードは、抗-A抗体及び/又は抗-B抗体の求められる残留レベルへと適合させる。このようなマトリックスの特異性により、IgG画分のあらかじめのコンディショニングは要求されない、すなわち、血漿分画法により得られた、任意のIgG画分又はIgG濃縮物が適切でありうる。
【００８５】
濃縮物のパーコレーションは、溶出機構を伴わない。したがって、IgG濃縮物がどのようにして得られたのかに関わらず、IgG濃縮物は、任意選択でポンプを介するカラムを通してパーコレートされる。このパーコレーションにより、抗-A抗体及び抗-B抗体の保持が可能となる。リガンドとIg調製物との間の接触時間は、1分以上であり、2分程度であると有利である。
【００８６】
次いで、カラムのデッドスペース内になおも存在するIgGを回収するために、カラムを、水で洗浄することができる。
【００８７】
IgG濃縮物のパーコレーションの後、抗-A抗体及び抗-B抗体を枯渇させたIgG画分を得る。
【００８８】
方法はその後、限外濾過及び滅菌濾過による濃縮工程を含みうる。
【００８９】
次いで、保持された抗-A抗体及び抗-B抗体を脱着させるために、クロマトグラフィーカラム及びマトリックスを洗浄し及び溶出させることができる。
【００９０】
後続の実施例では、本発明について例示するが、その範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００９１】
アフィニティークロマトグラフィー(産業スケール)
クロマトグラフィー条件:
10±2g/LのIgGを含む、出願WO2002/092632において記載されている方法に従う分画により得られた免疫グロブリンの調製物を、産業スケールで、図2に例示される、血液型Aのエピトープに対応する三糖(N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)-ガラクトース(Gal)-フコース)がグラフトされた架橋セルロースビーズ(「Iso A HyperCel」と称するゲル)と、図3に例示される、血液型Bのエピトープに対応する三糖(ガラクトース-ガラクトース-フコース)がグラフトされた架橋セルロースビーズ(「Iso B HyperCel」と称するゲル)との50/50混合物(v/v)を含むカラム上で実行される、抗-A/抗-Bアフィニティークロマトグラフィー工程にかける。
【００９２】
三糖は、式:
(ビーズ)-NH-C5H10-CO-NH-C3H6-(リガンド)
のスペーサーを介してビーズへとグラフトされる。グラフトされた三糖の密度は、マトリックスゲル1ml当たり0.3mgである。
【００９３】
抗-A残留活性及び抗-B残留活性を点検するために、pHを6(±0.05)に調整した、「溶出物」と称する免疫グロブリンの調製物(アニオン交換クロマトグラフィーの後で得られた画分)を、以下の1mlカラム(0.5mlのゲルであるIso A HyperCel+0.5mlのゲルであるIso B HyperCelを含む)に通した:
カラムのフォーマット: D=0.5cm×5.1cm(カラムの容量(VC: volume of the column)=1ml)
接触時間: 2分
ロード: Aリガンド+Bリガンド1mg当たりの溶出調製物6g、すなわち、カラム1本当たりの製剤180ml。
【００９４】
試験の後、ゲルを水(最小で10VC)で洗浄する。
【００９５】
方法の異なる工程条件を、下記の表にまとめる。
【００９６】
【表１】
2016532100.tif 000006
【００９７】
単一の非吸着画分(NAF)を回収した。
【００９８】
分量決定試験:
収率は、洗浄及びパーコレーションの後、非吸着画分中のIgGを定量することにより決定した。アフィニティークロマトグラフィー工程の前の濃度に対する、最終調製物中に存在する抗-A同種凝集素及び抗-B同種凝集素の割合に対応する抗-A残留活性及び抗-B残留活性を、下記に記載される技法に従い、フローサイトメトリー(欧州薬局方により要求される希釈率の測定より高感度で正確な技法)により測定した。
【００９９】
A型及びB型の赤血球を、EDTA上で回収し、0.9%のNaCl溶液中で2回洗浄した(2回の洗浄の間に、1,730gで5分間の遠心分離)。2×106個の赤血球を、マイクロ滴定プレート上に分配し、作業濃度へと希釈(PBS pH7.4、1%のBSA)された、50μLの基準陽性対照(1:32のEDQM、型番07/306; Thorpeら、2009)又は試料を添加した。プレートを、攪拌しながら、37℃で2時間インキュベートした。洗浄の後、フィコエリトリン(PE)でマーキングされた、ヒト抗-IgGヤギF(ab')2抗体(Fc特異的抗体)(Beckman Coulter)を、PBS-BSA中で1/20へと希釈して使用した。プレートを、室温で30分間、遮光して、インキュベートした。
【０１００】
洗浄の後、各ペレットを、200μLのPBS-BSA中に再懸濁させ、フローサイトメーター(Beckman Coulter Cytomics FC 500)で読み取った。
【０１０１】
陽性対照の平均蛍光強度(MFI)は、0.23g/Lから30g/Lの範囲の濃度についてのIgG濃度(検量線)と対比して報告した。結果は、試料の傾きと、陽性基準物質の傾きとの比として表す。検量線の式は、y=ax+b[式中、「a」は、検量線の傾きの値であり、「b」は、試験のバックグラウンドノイズに対応するゼロ点である]である。試料の式は、y'=a'x+bであり、試料のMFIについての既知の値(y')及びIgGの濃度(x')を使用することにより、傾きの比を、{(MFI-b)/[IgGの濃度]}/aとして計算した。
【０１０２】
結果:
得られたIgG収率並びに抗-A残留活性及び抗-B残留活性を、下記の表に示す。
【０１０３】
【表２】
2016532100.tif 000007
【０１０４】
この表の結果は、非吸着画分中のIgG収率が98%であることを示し、これにより、アフィニティー支持体は、抗-A同種凝集素及び抗-B同種凝集素に対する良好な特異性を有することが実証される。
【０１０５】
この表の結果はまた、抗-A残留活性及び抗-B残留活性の実質的な低減も示し、それぞれ12%及び8%である。したがって、このようにして得られた製剤は、IgGの30g/Lの初期濃度で適用された直接クームス試験における陰性結果に適合する(1/64の希釈率で)。
【図１】
2016532100.tif 000008
【図２】
2016532100.tif 000009
【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【国際調査報告】
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