(57)【要約】  ＧＬＰ−１Ｒに特異的に結合する抗体およびそのＧＬＰ−１との融合タンパク質が、本発明において開示される。これらの融合タンパク質は、効率よくヒトＧＬＰ−１Ｒ受容体と結合し、受容体シグナル伝達経路を活性化することができるため、糖尿病、過体重、肥満、およびその関連疾病を治療するのに有用である。【選択図】図１
2016532448.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の方式：
ａ．次の配列のいずれかから選択される軽鎖ＣＤＲ３配列：
Ｌ１〜Ｌ１３の軽鎖ＣＤＲ３配列：配列番号４６〜配列番号５３から選択されるいずれかとの差が合計で３個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された軽鎖ＣＤＲ３配列、
ｂ．次の配列のいずれかから選択される重鎖ＣＤＲ３配列：
Ｈ１〜Ｈ１３の重鎖ＣＤＲ３配列：配列番号２０〜配列番号２７から選択されるいずれかとの差が合計で４個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された重鎖ＣＤＲ３配列、
ｃ．（ａ）の軽鎖ＣＤＲ３配列および（ｂ）の重鎖ＣＤＲ３配列
のいずれかのアミノ酸配列を含むことを特徴とするＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体。
【請求項２】
次の方式：
ａ．次のいずれかから選択される軽鎖ＣＤＲ１配列：
Ｌ１〜Ｌ１３の軽鎖ＣＤＲ１配列：配列番号２８〜配列番号３７から選択されるいずれかとの差が３個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された軽鎖ＣＤＲ１、
ｂ．次のいずれかから選択される軽鎖ＣＤＲ２配列：
Ｌ１〜Ｌ１３の軽鎖ＣＤＲ２配列：配列番号３８〜配列番号４５から選択されるいずれかとの差が２個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された軽鎖ＣＤＲ２、
ｃ．次のいずれかから選択される重鎖ＣＤＲ１配列：
Ｈ１〜Ｈ１３の重鎖ＣＤＲ１配列：配列番号６〜配列番号１２から選択されるいずれかとの差が２個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された重鎖ＣＤＲ１、
ｄ．次のいずれかから選択される重鎖ＣＤＲ２：
Ｈ１〜Ｈ１３の重鎖ＣＤＲ２配列：配列番号１３〜配列番号１９から選択されるいずれかとの差が３個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された重鎖配列
の１種または２種以上を組み合わせたアミノ酸配列をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体。
【請求項３】
次の方式：
ａ．次の方式の１種または２種以上を含む軽鎖可変領域：
ｉ．配列番号２８〜配列番号３７のいずれかから選択される軽鎖ＣＤＲ１配列、
ｉｉ．配列番号３８〜配列番号４５のいずれかから選択される軽鎖ＣＤＲ２配列、
ｉｉｉ．配列番号４６〜配列番号５３のいずれかから選択される軽鎖ＣＤＲ３配列、
ｂ．次の方式の１種または２種以上を含む重鎖可変領域：
ｉ．配列番号６〜配列番号１２のいずれかから選択される重鎖ＣＤＲ１配列、
ｉｉ．配列番号１３〜配列番号１９のいずれかから選択される重鎖ＣＤＲ２配列、
ｉｉｉ．配列番号２０〜配列番号２７のいずれかから選択される重鎖ＣＤＲ３配列、
ｃ．（ａ）の軽鎖可変領域配列および（ｂ）の重鎖可変領域配列
のいずれかを含むことを特徴とするＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体。
【請求項４】
次の方式：
ａ．次の方式のいずれかから選択される軽鎖可変領域配列：
ｉ．Ｌ１〜Ｌ１３の軽鎖可変領域配列：配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５から選択されるいずれかと少なくとも８０％が同一な配列を有するアミノ酸、
ｉｉ．Ｌ１〜Ｌ１３の軽鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチド配列：配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４のうちのいずれかと少なくとも８０％が同一なポリヌクレオチド配列でコードされたアミノ酸配列、
ｂ．次のいずれかから選択される重鎖可変領域配列：
ｉ．Ｈ１〜Ｈ１３の重鎖可変領域配列：配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９のいずれかと少なくとも８０％が同一なアミノ酸配列、
ｉｉ．Ｈ１〜Ｈ１３の重鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチド配列：配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８のうちのいずれかと少なくとも８０％が同一なポリヌクレオチド配列でコードされたアミノ酸配列、
ｃ．（ａ）の軽鎖可変領域配列および（ｂ）の重鎖可変領域配列
のいずれかのアミノ酸配列を含むことを特徴とするＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体。
【請求項５】
次の方式：
ａ．Ｌ１〜Ｌ１３の軽鎖可変領域配列：配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５から選択されるいずれかの軽鎖可変領域配列、
ｂ．Ｈ１〜Ｈ１３重鎖可変領域配列：配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９から選択されるいずれかの重鎖可変領域配列、
ｃ．ａの軽鎖可変領域配列およびｂの重鎖可変領域配列
のいずれかのアミノ酸配列をさらに含むことを特徴とする請求項４に記載のＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体。
【請求項６】
方式ｃにおけるａの軽鎖可変領域配列とｂの重鎖可変領域配列の組み合わせが、Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０、Ｌ１１Ｈ１１、Ｌ１２Ｈ１２、Ｌ１３Ｈ１３のいずれかから選択されることを特徴とする請求項５に記載のＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体。
【請求項７】
次の方式：
ａ．配列番号１０６の軽鎖定常領域アミノ酸配列、
ｂ．配列番号１０７の軽鎖定常領域アミノ酸配列、
ｃ．配列番号１０８の重鎖定常領域アミノ酸配列、
ｄ．配列番号１０９の重鎖定常領域アミノ酸配列、
ｅ．配列番号１０６の軽鎖定常領域アミノ酸配列および配列番号１０８の重鎖定常領域アミノ酸配列、
ｆ．配列番号１０７の軽鎖定常領域アミノ酸配列および配列番号１０８の重鎖定常領域アミノ酸配列、
ｇ．配列番号１０６の軽鎖定常領域アミノ酸配列および配列番号１０９の重鎖定常領域アミノ酸配列、
ｈ．配列番号１０７の軽鎖定常領域アミノ酸配列および配列番号１０９の重鎖定常領域アミノ酸配列
のいずれかのアミノ酸配列をさらに含むことを特徴とする請求項６に記載のＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体。
【請求項８】
マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、抗原結合抗体フラグメント、１本鎖抗体、２本鎖抗体、３本鎖抗体、４本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ｆａ’）ｘフラグメント、ドメイン抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体から選択されることを特徴とする請求項１または３または４に記載のＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体。
【請求項９】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１２７から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むＧＬＰ−１と、請求項１または３または４に記載の抗体とを融合して形成されることを特徴とするＧＬＰ−１融合タンパク質。
【請求項１０】
ＧＬＰ−１が、Ｎ’−Ｒ１−Ｌ−Ｒ２−Ｃ’、Ｎ’−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１−Ｃ’またはＮ’−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１ｒ−Ｃ’
（式中、Ｌは、ＬＫ１〜ＬＫ３のアミノ酸配列：配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２から選択されるいずれかの、全長の、部分的なまたは反復したアミノ酸配列を含むペプチドリンカー配列であり、
Ｒ１は、ＧＬＰ−１のアミノ酸配列であり、
Ｒ１ｒは、ＧＬＰ−１の逆方向アミノ酸配列であり、
Ｒ２は、請求項１または３または４に記載の抗体の軽鎖または重鎖のアミノ酸配列であり、
Ｃ’は、ＧＬＰ−１融合タンパク質ポリペプチド鎖のカルボキシル末端を表し、
Ｎ’は、ＧＬＰ−１融合タンパク質ポリペプチド鎖のアミノ末端を表す）
の結合方式により請求項１または３または４に記載の抗体の軽鎖および／または重鎖と融合されることを特徴とする請求項９に記載のＧＬＰ−１融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項９に記載のＧＬＰ−１融合タンパク質をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項１４】
医薬的に許容されるベクターと混合された請求項９に記載のＧＬＰ−１融合タンパク質を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１５】
インスリン非依存型糖尿病の予防または治療に用いる医薬品を製造する請求項１４に記載の医薬組成物の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体の技術分野に関し、特に、ＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体およびそのＧＬＰ−１との融合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
２型糖尿病の典型的な症状は次の３つの側面を含む。１）末梢のインスリン抵抗性、主にインスリンに対する骨格および筋肉の感受性が低下し、これらの組織へのグルコースの輸送が影響を受ける（非特許文献１、非特許文献２）、２）過度の肝臓グルコース産生、インスリンの調節に対する肝細胞の感受性の低下（非特許文献１、非特許文献３）およびグルカゴンの過度の分泌（非特許文献４）、３）ランゲルハンス島β細胞失調、疾患の初期に、β細胞の増殖およびインスリン分泌量の増加により、血糖に対するインスリン抵抗性の影響が代償的に補われる（非特許文献５）が、時間の経過およびインスリン抵抗性の程度の増加に伴い、β細胞が疲弊し、それに伴いインスリン分泌が低下し、２型糖尿病の真の開始に至る（非特許文献６、非特許文献７）。
【０００３】
グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、３０個のアミノ酸を含むペプチドセグメントである。腸内のＬ細胞から分泌され、グルコースの取り込みを刺激する（非特許文献８、非特許文献９）。分泌を刺激した後、ＧＬＰ−１が膵臓のＧＬＰ−１Ｒ（グルカゴン様ペプチド−１受容体）と結合し、下流のアデニル酸シクラーゼシグナル伝達経路を活性化し、インスリンの合成および分泌を促進する。ＧＬＰ−１の分泌は、さらに胃排出を減少させ、これにより食物の消化後に循環系に入るグルコースの量を減少させる（非特許文献１０）。マウスならびに１型および２型糖尿病患者において、ＧＬＰ−１は、インスリンの分泌を増加させ、血糖値を低下させた（非特許文献１１、非特許文献１２）。ある研究では、ＧＬＰ−１は、さらに膵β細胞の死滅を抑制し、その増殖を促進することが示されている（非特許文献１３、非特許文献１４）。臨床では、ＧＬＰ−１による糖尿病患者の治療の実現可能性および効果がすでに実証されており（非特許文献１５）、ＧＬＰ−１およびその誘導体を使用して糖尿病を治療する方法を記載した特許もすでにある（特許文献１、特許文献２）。しかしながら、ＧＬＰ−１の生物学的半減期は比較的短く、治療効果は良好でない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第５，８９９，８８３号明細書
【特許文献２】米国特許第６，９８９，１４８号明細書
【特許文献３】国際公開第００／１６７９７号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９８／０８５３１号パンフレット
【特許文献５】国際公開第９８／１９６９８号パンフレット
【特許文献６】米国特許第６，００６，７５３号明細書
【特許文献７】国際公開第９９／６４０６０号パンフレット
【特許文献８】国際公開第００／０７６１７号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｋａｈｎ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｆｉｎｅ，Ｊ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ（１９９３）７：９２−１０５
【非特許文献２】Ｗｅｙｅｒら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９９）１０４：７８７−７９４
【非特許文献３】Ｌａｍら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．（２００９）１１：３７５−３７８
【非特許文献４】Ｕｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｏｒｃｉ，Ａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．（１９７７）１３７：４８２−４９１
【非特許文献５】Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．（２０００）１１：３７５−３７８
【非特許文献６】ＤｅＦｒｏｎｚｏ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ．（１９８８）３７：６６７−６８７
【非特許文献７】Ｋａｈｎら、Ｊ  Ｎｕｔｒ．（２００１）１３１：３５４Ｓ−３６０Ｓ
【非特許文献８】Ｏｒｓｋｏｖら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  （１９９４）４３：５３５−５３９
【非特許文献９】Ｄｒｕｃｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：３４３１−３４３８
【非特許文献１０】Ｗｅｔｔｅｒｇｒｅｎら、Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．（１９９３）３８：６６５−６７３
【非特許文献１１】Ｎａｕｃｋら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ．（１９９７）１０５：１８７−１９５
【非特許文献１２】Ｔｏｄｄら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９７）２７：５３３−５３６
【非特許文献１３】Ｐｅｒｆｅｔｔｉら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２０００）１４１：４６００−４６０５
【非特許文献１４】Ｈｕｉら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２００３）１４４：１４４４−１４５５
【非特許文献１５】Ｓａｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｇａｒｂｅｒ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｏｂｅｓ．（２０１３）２０：８７−９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的の１つは、ＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体を提供することである。
【０００７】
本発明のもう１つの目的は、ＧＬＰ−１の生物学的半減期を延長させ、ＧＬＰ−１の分子生物学的活性を保つことが可能な、ＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体がＧＬＰ−１と形成する融合タンパク質を提供することである。また、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体により形成される融合タンパク質は、抗体により提供される分子標的性を有し、かつ抗体の免疫原性も他の融合パートナータンパク質より低い。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明でその技術的課題を解決するための用いる技術手法は次の通りである。
次の方式：
ａ．次の配列のいずれかから選択される軽鎖ＣＤＲ３配列：
Ｌ１〜Ｌ１３の軽鎖ＣＤＲ３配列：配列番号４６〜配列番号５３から選択されるいずれかとの差が合計で３個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された軽鎖ＣＤＲ３配列、好ましくは、Ｌ１〜Ｌ１３の軽鎖ＣＤＲ３配列：配列番号４６〜配列番号５３から選択されるいずれかとの差が合計で２個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された軽鎖ＣＤＲ３配列、より好ましくは、Ｌ１〜Ｌ１３の軽鎖ＣＤＲ３配列：配列番号４６〜配列番号５３から選択されるいずれかとの差が１個のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された軽鎖ＣＤＲ３配列、
ｂ．次の配列のいずれかから選択される重鎖ＣＤＲ３配列：
Ｈ１〜Ｈ１３の重鎖ＣＤＲ３配列：配列番号２０〜配列番号２７から選択されるいずれかとの差が合計で４個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された重鎖ＣＤＲ３配列、好ましくは、Ｈ１〜Ｈ１３の重鎖ＣＤＲ３配列：配列番号２０〜配列番号２７から選択されるいずれかとの差が合計で３個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された重鎖ＣＤＲ３配列、より好ましくは、Ｈ１〜Ｈ１３の重鎖ＣＤＲ３配列：配列番号２０〜配列番号２７から選択されるいずれかとの差が合計で２個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された重鎖ＣＤＲ３配列、さらに好ましくは、Ｈ１〜Ｈ１３の重鎖ＣＤＲ３配列：配列番号２０〜配列番号２７から選択されるいずれかとの差が１個のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された重鎖ＣＤＲ３配列、
ｃ．（ａ）の軽鎖ＣＤＲ３配列および（ｂ）の重鎖ＣＤＲ３配列
のいずれかのアミノ酸配列を含む、ＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体。
【０００９】
好ましくは、前記抗体は、次の方式：
ａ．次のいずれかから選択される軽鎖ＣＤＲ１配列：
Ｌ１〜Ｌ１３の軽鎖ＣＤＲ１配列：配列番号２８〜配列番号３７から選択されるいずれかとの差が３個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された軽鎖ＣＤＲ１、好ましくは、Ｌ１〜Ｌ１３の軽鎖ＣＤＲ１配列：配列番号２８〜配列番号３７から選択されるいずれかとの差が合計で２個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された軽鎖ＣＤＲ１配列、より好ましくは、Ｌ１〜Ｌ１３の軽鎖ＣＤＲ１配列：配列番号２８〜配列番号３７から選択されるいずれかとの差が１個のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された軽鎖ＣＤＲ１配列、
ｂ．次のいずれかから選択される軽鎖ＣＤＲ２配列：
Ｌ１〜Ｌ１３の軽鎖ＣＤＲ２配列：配列番号３８〜配列番号４５から選択されるいずれかとの差が２個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された軽鎖ＣＤＲ２、好ましくは、Ｌ１〜Ｌ１３の軽鎖ＣＤＲ２配列：配列番号３８〜配列番号４５から選択されるいずれかとの差が１個のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された軽鎖ＣＤＲ２配列、
ｃ．次のいずれかから選択される重鎖ＣＤＲ１配列：
Ｈ１〜Ｈ１３の重鎖ＣＤＲ１配列：配列番号６〜配列番号１２から選択されるいずれかとの差が２個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された重鎖ＣＤＲ１、好ましくは、Ｈ１〜Ｈ１３の重鎖ＣＤＲ１配列：配列番号６〜配列番号１２から選択されるいずれかとの差が１個のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された重鎖ＣＤＲ１配列、
ｄ．次のいずれかから選択される重鎖ＣＤＲ２：
Ｈ１〜Ｈ１３の重鎖ＣＤＲ２配列：配列番号１３〜配列番号１９から選択されるいずれかとの差が３個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された重鎖配列、好ましくは、Ｈ１〜Ｈ１３の重鎖ＣＤＲ２配列：配列番号１３〜配列番号１９から選択されるいずれかとの差が合計で２個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された重鎖ＣＤＲ２配列、より好ましくは、Ｈ１〜Ｈ１３の重鎖ＣＤＲ２配列：配列番号１３〜配列番号１９から選択されるいずれかとの差が１個のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された重鎖ＣＤＲ２配列
の１種または２種以上を組み合わせたアミノ酸配列を含む。
【００１０】
次の方式：
ａ．次の方式の１種または２種以上を含む軽鎖可変領域：
ｉ．配列番号２８〜配列番号３７のいずれかから選択される軽鎖ＣＤＲ１配列、
ｉｉ．配列番号３８〜配列番号４５のいずれかから選択される軽鎖ＣＤＲ２配列、
ｉｉｉ．配列番号４６〜配列番号５３のいずれかから選択される軽鎖ＣＤＲ３配列、
ｂ．次の方式の１種または２種以上を含む重鎖可変領域：
ｉ．配列番号６〜配列番号１２のいずれかから選択される重鎖ＣＤＲ１配列、
ｉｉ．配列番号１３〜配列番号１９のいずれかから選択される重鎖ＣＤＲ２配列、
ｉｉｉ．配列番号２０〜配列番号２７のいずれかから選択される重鎖ＣＤＲ３配列、
ｃ．（ａ）の軽鎖可変領域配列および（ｂ）の重鎖可変領域配列
のいずれかを含む、ＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体。
【００１１】
次の方式：
ａ．次の方式のいずれかから選択される軽鎖可変領域配列：
ｉ．Ｌ１〜Ｌ１３の軽鎖可変領域配列：配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５から選択されるいずれかと少なくとも８０％が同一な配列を有するアミノ酸、
ｉｉ．Ｌ１〜Ｌ１３の軽鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチド配列：配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４のうちのいずれかと少なくとも８０％が同一なポリヌクレオチド配列でコードされたアミノ酸配列、
ｂ．次のいずれかから選択される重鎖可変領域配列：
ｉ．Ｈ１〜Ｈ１３の重鎖可変領域配列：配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９のいずれかと少なくとも８０％が同一なアミノ酸配列、
ｉｉ．Ｈ１〜Ｈ１３の重鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチド配列：配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８のうちのいずれかと少なくとも８０％が同一なポリヌクレオチド配列でコードされたアミノ酸配列、
ｃ．（ａ）の軽鎖可変領域配列および（ｂ）の重鎖可変領域配列
のいずれかのアミノ酸配列を含む、ＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体。
【００１２】
好ましくは、前記抗体は、次の方式：
ａ．Ｌ１〜Ｌ１３の軽鎖可変領域配列：配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５から選択されるいずれかの軽鎖可変領域配列、
ｂ．Ｈ１〜Ｈ１３重鎖可変領域配列：配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９から選択されるいずれかの重鎖可変領域配列、
ｃ．ａの軽鎖可変領域配列およびｂの重鎖可変領域配列
のいずれかのアミノ酸配列を含む。
【００１３】
好ましくは、方式ｃにおけるａの軽鎖可変領域配列とｂの重鎖可変領域配列の組み合わせは、Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０、Ｌ１１Ｈ１１、Ｌ１２Ｈ１２、Ｌ１３Ｈ１３のいずれかから選択される。
【００１４】
好ましくは、前記抗体は、次の方式：
ａ．配列番号１０６の軽鎖定常領域アミノ酸配列、
ｂ．配列番号１０７の軽鎖定常領域アミノ酸配列、
ｃ．配列番号１０８の重鎖定常領域アミノ酸配列、
ｄ．配列番号１０９の重鎖定常領域アミノ酸配列、
ｅ．配列番号１０６の軽鎖定常領域アミノ酸配列および配列番号１０８の重鎖定常領域アミノ酸配列、
ｆ．配列番号１０７の軽鎖定常領域アミノ酸配列および配列番号１０８の重鎖定常領域アミノ酸配列、
ｇ．配列番号１０６の軽鎖定常領域アミノ酸配列および配列番号１０９の重鎖定常領域アミノ酸配列、
ｈ．配列番号１０７の軽鎖定常領域アミノ酸配列および配列番号１０９の重鎖定常領域アミノ酸配列
のいずれかのアミノ酸配列を含む。
【００１５】
好ましくは、前記抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、抗原結合抗体フラグメント、１本鎖抗体、２本鎖抗体、３本鎖抗体、４本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ｆａ’）ｘフラグメント、ドメイン抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体から選択される。
【００１６】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１２７から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むＧＬＰ−１と、本発明の抗体とを融合して形成されるＧＬＰ−１融合タンパク質。
【００１７】
好ましくは、ＧＬＰ−１は、Ｎ’−Ｒ１−Ｌ−Ｒ２−Ｃ’、Ｎ’−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１−Ｃ’またはＮ’−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１ｒ−Ｃ’
（式中、Ｌは、ＬＫ１〜ＬＫ３のアミノ酸配列：配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２から選択されるいずれかの、全長の、部分的なまたは反復したアミノ酸配列を含むペプチドリンカー配列であり、
Ｒ１は、ＧＬＰ−１のアミノ酸配列であり、
Ｒ１ｒは、ＧＬＰ−１の逆方向アミノ酸配列であり、
Ｒ２は、請求項１または３または４に記載の抗体の軽鎖または重鎖のアミノ酸配列であり、
Ｃ’は、ＧＬＰ−１融合タンパク質ポリペプチド鎖のカルボキシル末端を表し、
Ｎ’は、ＧＬＰ−１融合タンパク質ポリペプチド鎖のアミノ末端を表す）
の結合方式により請求項１または３または４に記載の抗体の軽鎖および／または重鎖と融合される。
【００１８】
本発明のＧＬＰ−１融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００１９】
本発明のポリヌクレオチドを含むベクター。
【００２０】
本発明のベクターを含む宿主細胞。
【００２１】
医薬的に許容されるベクターと混合された本発明のＧＬＰ−１融合タンパク質を含む医薬組成物。
【００２２】
インスリン非依存型糖尿病の予防または治療に用いる医薬品を製造する、本発明の抗体またはＧＬＰ−１融合タンパク質を含むか、またはそれに基づく医薬組成物の用途。
【００２３】
インスリン様ペプチド−１を用いて２型糖尿患者の血糖値を制御する方法においてＧＬＰ−１Ｒが果たす重要な作用、およびＧＬＰ−１Ｒの治療の著しい特徴が、インスリン分泌を刺激するが低血糖に関連する危険を伴わないという能力であることを考慮する。本発明は、ＧＬＰ−１をＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体と融合し、ＧＬＰ−１の生物学的半減期を延長させ、ＧＬＰ−１の分子生物学的活性を保つ。また、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体により形成される融合タンパク質は、抗体により提供される分子標的性を有し、かつ抗体の免疫原性も他の融合パートナータンパク質より低い。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の有益な効果は、次の通りである。ＧＬＰ−１をＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体と融合し、ＧＬＰ−１の生物学的半減期を延長させ、ＧＬＰ−１の分子生物学的活性を保つ。また、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体により形成される融合タンパク質は、抗体により提供される分子標的性を有し、かつ抗体の免疫原性も他の融合パートナータンパク質より低い。
【００２５】
発明の詳細
本発明は、ＧＬＰ−１が体内においてジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ−ＩＶ）によって迅速に除去されるが有効性が不十分である欠点について、ＧＬＰ−１Ｒの抗体を用いてそれと融合させることにより、その半減期および生物学的活性を増強する。融合に用いられる抗体は、ＧＬＰ−１と受容体の結合を阻害しない前提の下で、ＧＬＰ−１Ｒの生物学的活性を特異的に識別し、自身の受容体との高親和力および安定性により、受容体周囲におけるＧＬＰ−１の局所的な濃度を持効的に増加させ、受容体と結合する作用時間および力価を大幅に増加させることができる。また、抗体との融合により、ＧＬＰ−１がＤＰＰ−ＩＶによって識別または捕獲される立体障害を増加させ、体内で除去される確率を減少させ、ＧＬＰ−１の作用時間を増加させる。文献の報告によれば、ＧＬＰ−１ＲのＮ末端細胞外ドメインおよびその膜貫通ドメインの部分的咬合状態の解放は、ＧＬＰ−１がＧＬＰ−１Ｒとの結合箇所に入り、その生物活性を行使する重要なステップである。本発明に記載の抗体とＧＬＰ−１Ｒの結合は、受容体のＮ末端細胞外ドメインにかなり関連し、受容体との結合は、前記咬合状態の解放に役立ち、ＧＬＰ−１の進入に有利である。そのため、ＧＬＰ−１は、ＧＬＰ−１Ｒに対する抗体と融合した後に、自身の半減期および親和力価を増加させ、さらに強い生物学的活性を有するようになり、ＧＬＰ−１療法よりもさらに優れた重要な刷新である。さらに重要なことは、本発明で用いる部分抗体自体が、ＧＬＰ−１が存在する状況の下で、ＧＬＰ−１ＲによるＧＬＰ−１の作動を増強する生物学的特性を有することである。以上のいくつかの理由により、本発明に記載のＧＬＰ−１融合タンパク質は、ＧＬＰ−１よりも有効なＧＬＰ−１Ｒ作動薬である。
【００２６】
融合タンパク質を長期間繰り返し用いたときの抗原性には、普遍的な懸念が存在する。ＧＬＰ−１融合物療法については、糖尿病患者がこの疾患であると診断されると、治療を一生受ける必要があるため、特に懸念となる。また、免疫グロブリンのＦｃ部分に、不要なエフェクター機能が残され、Ｆｃ融合タンパク質療法が懸念となる可能性がある。コンピュータ支援による免疫グロブリンの三次元構造の予測ならびに抗体の配列の最適化およびヒト化によって、さらには繰り返しおよび長期的に用いた後に免疫反応を誘導するリスクが低下し、エフェクター機能を有さなくなる特定のＧＬＰ−１融合タンパク質を同定し、本発明において考察されるＧＬＰ−１部分のアミノ酸は、好ましくは、グリシンおよびセリンを豊富に含むペプチドリンカーにより抗体の軽鎖および重鎖を融合する。グリシンおよびセリンは、比較的小さい側鎖を有し、ペプチドリンカーの配列は、相当な柔軟性を有し、ＧＬＰ−１と抗体との間の相対位置の剛性を減少させ、ＧＬＰ−１が自由にＧＬＰ−１Ｒと相互作用できるようにする。また、ペプチドリンカーの存在は、ＧＬＰ−１と抗体を隔離し、両者のドメインの相互作用を回避する。グリシンおよびセリンが交互に現れ、不要な免疫原性を融合タンパク質に過度に繰り返し導入することを回避するが、ペプチドリンカーは、融合タンパク質の体内の免疫原性、好ましくはペプチドリンカーの長さを不可避に増加させ、平衡構造柔軟度および免疫原性は重要であるため、本発明は、長さが異なる３つのペプチドリンカーを提供し、融合に用いる。また、本発明では、ＧＬＰ−１と抗体をペプチドリンカーで異なる結合の方式を用いて融合を形成することを提供し、これにより形成されるＧＬＰ−１融合タンパク質の形式は、次のものを含む。
１）ＧＬＰ−１を有し、Ｎ’−Ｒ１−Ｌ−Ｒ２−Ｃ’の方式で軽鎖と結合する融合タンパク質、
２）ＧＬＰ−１を有し、Ｎ’−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１−Ｃ’の方式で軽鎖と結合する融合タンパク質、
３）ＧＬＰ−１を有し、Ｎ’−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１ｒ−Ｃ’の方式で軽鎖と結合する融合タンパク質、
４）ＧＬＰ−１を有し、Ｎ’−Ｒ１−Ｌ−Ｒ２−Ｃ’の方式で重鎖と結合する融合タンパク質、
５）１）および４）を同時に有する融合タンパク質、
６）２）および４）を同時に有する融合タンパク質、
７）３）および４）を同時に有する融合タンパク質。
【００２７】
本発明において、ＧＬＰ−１をコードするＤＮＡと前記抗体の全長／可変領域／フラグメント軽鎖または全長／可変領域／全長重鎖ＤＮＡは、ペプチドリンカー配列をコードするＤＮＡにより、融合軽鎖または融合重鎖ＤＮＡとして結合するとともに、軽鎖ＤＮＡの５’末端は、さらにシグナルリーダーペプチドをコードするＤＮＡを導入して遺伝子を形成し、この遺伝子を基礎に変異／野生型のＧＬＰ−１および抗体配列を結合することができる。本発明は、遺伝子合成の方法によりＧＬＰ−１の配列を得て、ＰＣＲの方法によりペプチドリンカー配列および抗体軽鎖または重鎖ＤＮＡと結合させる。ＧＬＰ−１Ｒの抗体軽鎖または重鎖可変領域配列について、特定のハイブリドーマ細胞からＰＣＲの方法によって抽出し、特定の抗体亜型の定常領域ＤＮＡと結合して組成し得られる。野生型抗体亜型の定常領域ＤＮＡは、特定のライブラリーからクローニングして得られ、配列最適化の基礎とすることができる。ここでいう融合タンパク質の発現に用いる遺伝子は、クローニングの方式によって発現ベクターに入れられ、融合タンパク質の生成および発現に用いられる。発現プロセスにおいて、軽鎖および重鎖の発現ベクターを合わせた後、コトランスフェクションまたは形質転換の方式で、その遺伝子を有するＤＮＡを宿主細胞の中に導入し、最適化適応誘導プロモーターを用いて、形質転換体または所望の配列をコードする遺伝子を増幅する培地を選択し、適切なｐＨ、温度において培養する。ＤＮＡ導入方式は、一般に用いられるＣａＰＯ４、エレクトロポレーションおよびＰＥＩなどの方式を選定する。
【００２８】
ここでいうベクターにおける核酸の発現に適した適切な宿主細胞には、高等真核細胞などがあり、哺乳動物宿主細胞系発現の実例には、チャイニーズハムスター卵巣細胞系（ＣＨＯ）およびヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３または懸濁培養したＨＥＫ２９３細胞系）などがあり、軽鎖Ｎ末端に位置するシグナルリーダーペプチドが、哺乳動物宿主細胞系からの組換え融合タンパク質の分泌を指示する。発現およびクローニングに用いるベクター上に、融合タンパク質をコードする核酸を吸収する能力を有する細胞を選別するために用いる、ベクターを宿主細胞において常に複製させることが可能な選択マーカーを有し、かつ融合タンパク質コード配列と有効に結合し、ｍＲＮＡ合成を指示するプロモーターを有する。そのうちの１つの実例は、抗生物質抵抗性ならびにＢ型肝炎ウイルスおよびサルウイルスプロモーター（ＳＶ４０）を有するベクターを用いることであり、融合タンパク質を発現するＣＨＯ宿主細胞を安定化させることが好ましい。
【００２９】
本発明は、宿主細胞系が融合タンパク質を発現した後、アフィニティークロマトグラフィーの方法を用いて、細胞培養上澄に分泌した部分を精製する。本発明における実例は、プロテインＧのアフィニティーカラムを用いて、全長抗体が融合した融合タンパク質を捕獲し、次いで低ｐＨでカラムの充填剤から溶出した後、収集することを含む。穏やかな溶出条件は、プロテインの変性の防止に役立つ。
【００３０】
１種または２種以上の賦形剤を用いて、本発明の融合タンパク質を調製してもよい。本発明の融合タンパク質は、医薬用の緩衝液、調節を経て許容可能な安定性を提供するｐＨ、および投与（例えば非経口投与）可能なｐＨと組み合わせてもよい。任意選択的に、１種または２種以上の医薬用の抗菌剤を付加してもよい。ｍ−クレゾールおよびフェノールが、好ましい医薬用抗菌剤である。１種または２種以上の医薬用塩溶液を付加し、イオン強度または張力を調節してもよい。１種または２種以上の賦形剤を付加し、製剤の等張性をさらに調節してもよい。グリセリンは、等張性調節賦形剤の実例である。医薬用とは、ヒトまたはその他動物への投与に適しているため、毒性成分または望ましくない汚染物を含有せず、かつ活性化合物の活性に干渉しないことを意味する。
【００３１】
溶液製剤または適切な希釈剤を用いて再構成可能な凍結乾燥粉末で本発明の融合タンパク質を調製してもよい。凍結乾燥剤形は、融合タンパク質を安定化させる剤形であり、再構成製品の予期される使用貯蔵期間内にｐＨを保つ緩衝能力を有するか、または有さない。ここで考察される融合タンパク質を含む溶液は、凍結乾燥前に、好ましくは等張であり、これを再構成させた後に、等張溶液を形成することができる。
【００３２】
本発明の融合タンパク質の医薬用塩溶液の形式は、本発明の範囲内にある。酸付加塩の形成に常用される酸は、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸、および、例えばｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐーブロモベンゼンスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸などの有機酸である。好ましい酸付加塩は、例えば塩酸および臭化水素酸などの無機酸で形成された塩である。
【００３３】
塩基付加塩は、例えばアンモニウム、塩基またはアルカリ土類金属水酸化物などの無機塩基由来の塩、炭酸塩、炭酸水素塩などを含む。本発明の塩溶液の調製に有用なこれらの塩基は、そのため、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウムなどを含む。
【００３４】
本発明の融合タンパク質は、生物学的活性を有する。生物学的活性とは、この融合タンパク質が体内で結合し、ＧＬＰ−１Ｒを作動して細胞ストレス応答を引き起こすことをいう。応答は、インスリンの分泌の上昇、グルカゴン分泌の抑制、食欲の抑制、体重の減少、満腹の誘導、アポトーシスの抑制、膵β細胞増殖および膵β細胞分化の誘導を含むが、これらに限定されない。代表的なＧＬＰ−１融合タンパク質について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ活性を測定した。先ず、ステップ４（図１）は、この融合タンパク質とＧＬＰ−１Ｒの相互作用の蛍光検出データを提供する。次いで、ステップ５は、この融合タンパク質とヒトＧＬＰ−１Ｒの相互作用後に、活性化させたｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性の測定を提供する。実験において、ヒトＧＬＰ−１Ｒを発現するＣＨＯ細胞を用いた。これらの細胞において、ＧＬＰ−１Ｒの活性化によってアデニル酸シクラーゼの活性化が引き起こされ、この酵素の活性化は、またｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）によって駆動されるレポーター遺伝子の発現を誘導した。ステップ１２（図２）は、レポーター遺伝子がルシフェラーゼであるデータを提供する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験データは、融合タンパク質がＧＬＰ−１Ｒを結合し活性化することができ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの結果はＧＬＰ−１−Ｇｌｙ８（７−３７）ＯＨよりも有効であることを共同で表している。ステップ１３（図３）は、絶食し本発明の融合タンパク質のいずれかを腹腔内注射した１６時間後にグルコースをマウスに経口投与した後の血糖値の変化データを提供する。ステップ１３のマウスにおいて生成されたデータは、この融合タンパク質が体内で活性を有し、かつ天然のＧＬＰ−１よりも長い半減期を有することを示した。
【００３５】
通常の技能を有する内科医が有効であることをすでに知っている任意の経路でこれらの融合タンパク質を投与することができる。末梢非経口は、こうした方法に属す。医学文献において、通常、非経口投与は、消毒注射器または例えばシリンジポンプなどのその他の機械装置によって個体に剤形を注射することと理解されている。末梢非経口は、経静脈、筋肉内、皮下および腹腔内の投与経路を含んでもよい。
【００３６】
本発明の融合タンパク質は、経口、直腸、経鼻または下気道の経路で投与してもよく、これらは非経口以外の経路である。これらの非経口以外の経路のうち、下気道経路および経口経路が好ましい。
【００３７】
本発明の融合タンパク質は、複数の疾患および疾病の治療に用いることができる。本発明の融合タンパク質は、先ず、ＧＬＰ−１Ｒに作用することによりその生物学的作用を発揮する。そのため、本発明のＧＬＰ−１融合タンパク質を用いて、ＧＬＰ−１Ｒ刺激に対して、またはＧＬＰ−１化合物の投与に対して応答のある疾患および／または疾病の被験者を治療することができる。これらの被験者を、「ＧＬＰ−１化合物治療が必要」または「ＧＬＰ−１Ｒ刺激が必要」な被験者という。インスリン非依存型糖尿病、インスリン依存型糖尿病、脳梗塞（特許文献３を参照）、心筋梗塞（特許文献４を参照）、肥満（特許文献５を参照）、手術後異化変化（特許文献６を参照）、機能性胃腸症および過敏性腸症候群（特許文献７を参照）を含む。例えば、インスリン非依存型糖尿病に発展する危険のある被験者（特許文献８を参照）など、ＧＬＰ−１化合物での予防的治療が要求される被験者も含む。耐糖能異常または空腹時血糖異常の被験者、体重が被験者の身長および体液に対して正常体重を約２５％超える被験者、膵臓の一部を切除した被験者、両親のいずれかまたは両方がインスリン非依存型糖尿病である被験者、妊娠糖尿病になったことのある被験者および急性または慢性膵炎になったことのある被験者は、いずれもインスリン非依存型糖尿病に発展するリスクがある。本特許に記載される融合タンパクの有効量は、所望の治療および／または予防効果が得られ、許容できない副作用がないときの、ＧＬＰ−１受容体刺激が必要な被験者に投与する用量である。「所望の治療効果」は、次の１つまたは２つ以上を含む。疾患または疾病に関連する症状の改善、疾患または疾病に関連する症状の発作の遅延、治療していない場合に比べた寿命の延長、治療していない場合に比べたクオリティー・オブ・ライフの向上。糖尿病を治療するＧＬＰ−１融合タンパク質の「有効量」は、治療していない場合に比べ、血糖値をよりよく制御することができ、これにより糖尿病の合併症（例えば、網膜症、神経障害または腎症）の発作の遅延をもたらす量である。糖尿病を予防するＧＬＰ−１融合タンパク質の「有効量」は、治療していない場合に比べ、血糖値上昇の発作を遅延させる量であり、前記発作は、例えばスルホニルウレア系、チアゾリジンジオン、インスリンおよび／またはビグアニド系などの血糖降下薬治療を必要とする。患者の血糖値を有効に正常化する融合タンパク質の用量は、多くの要素によって決まり、被験者の性別、体重および年齢、血糖調節異常の重篤性、投与経路および生物学的利用能を含むが、これらに限定されない。融合タンパク質の薬物動態プロファイル、潜在能力および剤形。用量は、０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ体重とすることができ、好ましくは、０．０５〜０．５  ｍｇ／ｋｇ体重である。好ましくは、週１回または２回、本発明の融合タンパク質を投与する。治療する疾患によって決まり、この融合タンパク質を、例えば週３回以上など、より頻繁に投与する必要がある可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】組換えで発現したＧＬＰ−１融合タンパク質（ＧＬＰ−１（Ａ８Ｇ）−ＬＫ−Ｌ１３Ｈ１３）とヒトＧＬＰ−１Ｒ（ｈＧＬＰ−１Ｒ）の発現を安定化するチャイニーズハムスター卵巣細胞株（＊と示された実線ピーク）およびチャイニーズハムスター卵巣細胞株自体（点線ピーク）の特異的結合をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で検出した比較である。
【図２】レポーター遺伝子法で得られたＧＬＰ−１野生型（円形）およびＧＬＰ−１（Ａ８Ｇ）−ＬＫ−Ｌ１３Ｈ１３（三角形）の、ｈＧＬＰ−１Ｒの発現を安定化するチャイニーズハムスター卵巣細胞株の作動曲線である。
【図３】マウス（ＩＣＲ）耐糖能実験であり、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｇ）−ＬＫ−Ｌ１３Ｈ１３を５ｍｇ／匹（四角形）および１５ｍｇ／匹（三角形）、単回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した１６時間後の、絶食状態のマウスの耐糖能に対する影響を調べた。
【図４】マウス（Ｃ５７ＢＬ）耐糖能実験であり、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｇ）−ＬＫ−Ｌ１３Ｈ１３を１５ｍｇ／匹（三角形）、単回腹腔内（ｉ．ｐ）注射した４０時間後の、絶食状態のマウスの耐糖能に対する影響を調べた。
【図５】２型糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂマウス）血糖値時間糖曲線であり、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｇ）−ＬＫ−Ｌ１３Ｈ１３を１０ｎｍｏｌ／ｋｇの濃度で（逆三角形）、２型糖尿病マウスに単回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した後の、マウス血糖値変化の時間曲線である。
【図６】２型糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂマウス）日摂食量時間曲線であり、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｇ）−ＬＫ−Ｌ１３Ｈ１３を１０ｎｍｏｌ／ｋｇの濃度で（逆三角形）単回、２型糖尿病マウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射する３日前から注射後５日目までの期間内のマウス日摂食量の変化を記録した時間曲線である。図６および図５は、並行して行った実験の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
次に、具体的な実施例によって、図面と合わせ、本発明の技術手法についてさらに具体的に説明する。
【００４０】
本発明において、特に指定がない場合、用いられる原料および設備などは、いずれも市販されているものであるか、または当該技術分野で常用されているものである。下記の実施例における方法は、特別な説明がない場合、いずれも当該技術分野の通常の方法である。
【実施例】
【００４１】
ステップ１：免疫用抗原細胞安定株の作製
ＣＨＯ−ＤＨＦＲ細胞を６ウェルプレートに接種し、２４時間培養した後、ｈＧＬＰ−１Ｒ遺伝子（ヌクレオチド配列は配列番号１１３を参照、アミノ酸配列は配列番号１１４を参照）を含むｐＹＳプラスミドを６ウェルプレート内の細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの前に培養液を交換し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社が推奨するＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００のトランスフェクション条件に基づきトランスフェクションを行った。４８時間後に、１０ｎＭのＭＴＸを含有する完全培地にさらに換え、３日ごとに液を換え、２週間程度待ち、安定成長したクローンが現れた。コロニーを消化分散させ、５０％の癒合度に成長するまで待ち、ＭＴＸの濃度を徐々に高め、ＭＴＸの濃度が１０μＭになるまで加圧選別を行った。作製した安定細胞株について、それぞれＦＡＣＳ検出を行い、抗ｈＧＬＰ−１Ｒの抗体（Ａｂｃａｍ）を用いて加圧後の細胞集団を同定し、１０μＭのＭＴＸ選別後のＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ｈＧＬＰ−１Ｒ細胞膜上でｈＧＬＰ−１Ｒが大量に発現した。最後に、サブクローニング、同定を経て、ｈＧＬＰ−１Ｒ高発現細胞安定株６株を得た。
【００４２】
ステップ２：抗体の調製
フロイントアジュバント中で乳化したＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ｈＧＬＰ−１Ｒ全細胞を、２×１０６個の細胞／匹の用量で、ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）に皮下注射した。２週間後に、不完全フロイントアジュバント乳化免疫原を用いて、免疫マウスを増強し、この後、週１回増強した。尾を切断する方式によって採血し、血清を遠心分離し、ＦＡＣＳを行って血清力価を測定した。適切な抗体価に達したときに、断頭によりマウスを安楽死させ、無菌状態で脾臓細胞を得た。成長状態が対数増殖期にあるＳＰ２／０細胞を収集し、２０００ｒｐｍで３分間遠心し、沈殿を無血清培養で再懸濁し、再度遠心−再懸濁し、計数を行った。脾臓細胞およびＳＰ２／０細胞を混合し、ＳＰ２／０：脾臓細胞≧１：１を保証し、「洗浄−遠心」を計３回行った。最後の１回の遠心後の沈殿を振盪し、３７℃まで予熱したＰＥＧ−１３５０  １ｍＬに一滴ずつ加え（３０秒以内に滴下を完了する）、１分間上下に吹いて吸い、３７℃まで予熱した無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）３０ｍＬにゆっくりと加え、ＰＥＧの融合作用を終了し、１５００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞沈殿を振盪し、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、メトトレキサートおよびチミジン；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０％のＦＢＳ（Ｂｉｏｉｎｄ）を付加したＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を融合培地とし、各ウェルに脾細胞２００００個およびフィーダー細胞５０００個を９６ウェルプレート中に入れ、各ウェル１００μｌとした。融合したハイブリドーマ細胞およびフィーダー細胞をともに９６ウェルプレートの中で培養し、ＨＡＴ選別を行い、融合していない細胞を除去した。１０日後に、培養プレート中のハイブリドーマ細胞上澄に対してＥＬＩＳＡ検出を行った。
【００４３】
ステップ３：全細胞ＥＬＩＳＡ選別
ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ｈＧＬＰ−１ＲのｈＧＬＰ−１Ｒを発現した細胞およびｈＧＬＰ−１Ｒを発現していないＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ブランク細胞をそれぞれ９６ウェルプレートに接種し、９０％の癒合度まで成長させた。細胞培養上澄を除去し、ＰＢＳで２回洗い、１００％のメタノール１００μｌを加え、４℃で１０分間固定した。新しく調製した０．６％のＨ２Ｏ２−ＰＢＳ  １００μｌをさらに加え、室温で２０分間処理し、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳ−１％のＢＳＡで密封した後、ハイブリドーマ細胞上澄を加え、４℃で９０分間培養した。複数回洗浄した後、５０００倍に希釈したＧｘＭ−ＨＲＰ−Ｆｃ二次抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１００μｌを各ウェルに加え、３７℃で０．５時間培養した。５回洗浄した後、各ウェルにＴＭＢ発色基質１００μｌを加え、３７℃で１５分間反応させ、２ＭのＨ２ＳＯ４で終了し、ＯＤ４５０値を読み取った。陽性対照は、免疫マウスの血清とし、陰性対照は細胞培地上澄とした。抗ｈＧＬＰ−１Ｒ抗体を分泌するハイブリドーマ株を選択し、クローン化を行い、ｈＧＬＰ−１Ｒに対する分泌を安定化することができる細胞株を得た。最後に、ハイブリドーマ細胞が分泌した抗体上澄を選択し、ＦＡＣＳ検証を行った。
【００４４】
ステップ４：陽性ハイブリドーマ細胞上澄フロー分析同定（ＦＡＣＳ）
１０ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳで消化し、ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ｈＧＬＰ−１Ｒ細胞１０５個を収集し、それぞれ１．５ｍｌのＥＰチューブに加え、遠心後に上澄を捨て、陰性対照試料は、フロー式サンプルローディングバッファー（ＰＢＳ、２％のＦＢＳ）で再懸濁した。陽性処理群細胞は各チューブに抗体上澄２００μｌを加え、室温で培養し、１５００ｒｐｍで遠心し、上澄を捨て、フロー式サンプルローディングバッファーで１回洗い、さらに遠心し、再懸濁し、各ウェルに、１：５０で希釈したＦＩＴＣマーカーのヒツジ抗マウス蛍光抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）２００μｌを加え、室温で光を避けて３０分間培養し、遠心し、上澄を捨て、さらにフロー式サンプルローディングバッファーで１回洗い、遠心し、最後にフロー式サンプルローディングバッファーで再懸濁し、機械で検出した。ハイブリドーマ細胞上澄およびｈＧＬＰ−１Ｒが発現したＣＨＯ−ＤＨＦＲ細胞は、特異的結合を有し、灰色のピークと点線のピークは陰性対照であり、ハイブリドーマ細胞上澄が対応する実線ピーク（＊で記されている）は著しく右に寄っていた（図１）。
【００４５】
ステップ５：抗体遺伝子のクローニングおよびサブクローニング
抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を収集し、ＱＩＡＧＥＮのｍＲＮＡ抽出試薬キットの操作手順書に基づき、ハイブリドーマ細胞のｍＲＮＡを抽出した。次いで、抽出したｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、逆転写プライマーは、マウスの軽、重鎖定常領域の特異性プライマーであり、重鎖逆転写プライマーは（５’−ＴＴＴＧＧＲＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣ−３’）（配列番号１１５）であり、軽鎖逆転写プライマーは（５’−ＴＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡ−３’）（配列番号１１６）および（５’−ＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡ−３’）（配列番号１１７）であった。ＲＴ−ＰＣＲの反応条件は、２５℃で５分間、５０℃で６０分間、７０℃で１５分間とした。逆転写したｃＤＮＡを、０．１ｍＭのＴＥで５００μｌまで希釈し、限外ろ過遠心管（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５）の中に加え、２０００ｇで１０ｍｉｎ遠心し、ろ液を捨て、さらに０．１ｍＭのＴＥ  ５００μｌを加え、２０００ｇで１０分間遠心し、ろ液を捨て、調製チューブを新しい遠心チューブの中に逆さに置き、２０００ｇで１０分間遠心し、精製したｃＤＮＡを得て、精製したｃＤＮＡ  １０μｌをテンプレートとし、５倍のテーリングバッファー（ｔａｉｌｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）４μｌ、ｄＡＴＰ（１ｍＭ）４μｌおよび１０Ｕのターミナルトランスフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた後、均一に混ぜ、３７℃で５分間培養した後、６５℃で５分間培養し、次いで、ポリＡテールを加えたｃＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲで抗体の軽、重鎖可変領域遺伝子を増幅した。上流プライマーは、いずれもＯｌｉｇｏｄＴであり、重鎖下流プライマーは、（５’−ＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣ−３’）（配列番号１１８）および（５’−ＴＧＧＡＣＡＧＧＧＣＴＣＣＡＴＡＧＴＴＣＣ−３’）（配列番号１１９）であり、軽鎖下流プライマーは、（５’−ＡＣＴＣＧＴＣＣＴＴＧＧＴＣＡＡＣＧＴＧ−３’）（配列番号１２０）である。ＰＣＲ反応条件：９５℃で５分間、９５℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で１分間を４０サイクル、７２℃で７分間。ＰＣＲ生成物をＰＭＤ  １８−Ｔベクターに結合した後、シークエンシングを行った。シークエンシングで得られた抗体軽鎖および重鎖可変領域配列は、付録の配列表を参照。
【００４６】
すでにシークエンシングして得られた抗体のＤＮＡ配列に基づきＰＣＲプライマーを設計し、これにより完全な軽鎖、重鎖シグナルペプチドならびに可変領域およびマウスＩｇＧ１定常領域を、発現ベクターｐＴＭ５と結合した。
【００４７】
ステップ６：懸濁ＨＥＫ２９３宿主細胞系における抗ＧＬＰ−１Ｒの抗体の一過性発現
懸濁ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ発現細胞系をスピナーフラスコに接種し、３７℃で２４時間の回転培養の後、トランスフェクションに用いた。トランスフェクションのプロセスにおいて、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をトランスフェクション媒体とし、ＤＮＡと混合した後、細胞培養に加えた。ＰＥＩとＤＮＡの混合の好ましい配合比は、１：１から５：１である。細胞は、ＰＥＩとＤＮＡの混合物を受けた後、３７℃の回転培養を９６時間以上継続し、抗原結合タンパクを発現し、その間に、０．５％のカゼインペプトンを、発現に必要なアミノ酸源として細胞培養に加え、最後に細胞上澄を収集し、抗原結合タンパク質の精製分離に用いた。
【００４８】
ステップ７：抗体ヒト化および最適化
先ず、得られたマウス抗体軽、重鎖可変領域配列を選別し、ＮＣＢＩのオンライン抗体可変領域配列照合ツールＩｇ  Ｂｌａｓｔを用いて、導入した抗体可変領域配列と相同のヒトの抗体生殖細胞系遺伝子配列（Ｉｇ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  Ｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を検索し、ＣＤＲ配列を除き、相同性が最も高いヒト遺伝子配列をテンプレート配列としてＣＤＲグラフティングを行い、ヒト化抗体可変領域配列を得て、ヒト化抗体軽、重鎖の遺伝子を外注して合成した。配列に基づきＰＣＲプライマーを設計し、合成配列の５’末端および３’末端に適切な制限酵素切断部位を導入し、ＰＣＲ増幅後に、ヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４定常領域配列とグラフティングした後、完全な組換えヒト化抗体配列を得た。組換えた抗体は、ステップ６に基づき発現を行い、ステップ４におけるＦＡＣＳ技術により、ＧＬＰ−１Ｒに対する親和力を検証した。ＧＬＰ−１Ｒに対する親和力を残したヒト化抗体群から、親和力の最も優れた抗体を選び出し、部位特異的変異導入により、可変領域配列をさらに改造し、ＧＬＰ−１Ｒに対する親和力をさらに向上させた。
【００４９】
ステップ８：ＧＬＰ−１ヒト化融合タンパク質の遺伝子クローニングとサブクローニング
最適化したヒト化抗体を、軽鎖のＮ末端またはＣ末端においてＧＬＰ−１およびその誘導体配列と融合し、ＧＬＰ−１融合タンパク質をなした。両者の配列は、ペプチドリンカー配列（ＬＫ）を架橋として結合した。シグナルペプチド−ＧＬＰ−１−ペプチドリンカーのヌクレオチド配列は、金斯瑞生物科技有限公司が合成し、合成遺伝子をテンプレートとし、「シグナルペプチド−ＧＬＰ１−リンカー」部分の配列をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ上流プライマーは（５’−ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣ−３’）（配列番号１２１）であり、ＰＣＲ下流プライマーは（５’−ＡＧＡＧＣＣＧＧＴＧＧＣＡＧＡＧＣＣＡＧ−３’）（配列番号１２２）であり、ＰＣＲ反応条件は、９５℃で５分間、９５℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を３５サイクル、７２℃で７分間とした。また、ヒト化抗体のヌクレオチド配列をテンプレートとし、融合タンパク質の抗体部分の配列を増幅した。
【００５０】
ＰＣＲ上流プライマーは、（５’−ＣＴＧＧＣＴＣＴＧＣＣＡＣＣＧＧＣＴＣＴＧＣＣＡＴＣＣＡＧＡＴ
ＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣ−３’）（配列番号１２３）であり、ＰＣＲ下流プライマーは、（５’−ＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣ−３’）（配列番号１２４）であり、ＰＣＲ反応条件は、９５℃で５分間、９５℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で１分間を３５サイクル、７２℃で７分間とした。次いで、オーバーラップＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ＰＣＲ）によって、融合タンパク質核酸配列の「シグナルペプチド−ＧＬＰ−１−ペプチドリンカー」部分を抗体部分と結合し、プライマー両端にＮｈｅ１およびＮｏｔ１の酵素切断部位を付加し、これにより、完全な融合タンパク質配列を発現ベクターｐＴＭ５と結合した。オーバーラップＰＣＲの上流プライマーは、（５’−ＣＣＧＧＣＴＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣ−３’）（配列番号１２５）であり、下流プライマーは、（５’−ＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣ−３’）（配列番号１２６）であった。ＰＣＲ反応条件：９５℃で５分間、９５℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で１分間を３５サイクル、７２℃で７分間。ＰＣＲ生成物をＰＴＭ５ベクターに結合した後、シークエンシングを行った。
【００５１】
ステップ９：懸濁ＨＥＫ２９３宿主細胞系におけるＧＬＰ−１融合タンパク質の一過性発現
ＨＥＫ２９３懸濁細胞をスピナーフラスコの中に接種し、トランスフェクションの前に培地を換えた。融合タンパク質軽／重鎖遺伝子を含むベクターを、ＤＮＡ総量０．５〜１．５μｇ／ｍｌの濃度で、１．５〜７．５μｇ／ｍｌのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と混合し、１５〜２５分間静置した後、細胞培養に加えた。２４時間後に、さらに細胞培養に０．５〜１％のＴｒｙｐｔｏｎ  Ｎ１を加えた。５〜１０日間培養した後に収集した上澄の中に、分泌発現したＧＬＰ−１融合タンパク質を含有した。
【００５２】
ステップ１０：懸濁ＣＨＯ宿主細胞系におけるＧＬＰ−１融合タンパク質の安定発現
懸濁ＣＨＯ細胞を６ウェルプレートに接種し、ステップ１におけるトランスフェクション条件で、融合タンパク質の発現ベクターをトランスフェクションした。４８時間後に、３００ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシン（重鎖）および６ｍｇ／ｍｌのピューロマイシン（軽鎖）を加え、共同選別を行った。細胞に大量のアポトーシスが現れた後（死亡率＞９０％）、抗生物質濃度を徐々に下げ、余剰細胞の成長を回復し、その後、スピナーフラスコ拡大培養に換え、次いで上澄中の抗体の発現を確認した。その後の培地において、半分の抗生物質濃度を保ち、ＧＬＰ−１融合タンパク質に対する細胞の安定発現を維持した。
【００５３】
ステップ１１：ＧＬＰ−１融合タンパク質の細胞培養上澄からの精製および調製
細胞培養を遠心してその中の細胞を除去し、その上澄が共役タンパクＧリガンドのアフィニティーカラムを経た後、ｐＨ２．５〜３．５の溶出液で、発現したＧＬＰ−１融合タンパク質をカラム上から溶出した。溶出チューブの中に予め中和緩衝液を入れておき、溶出液の低ｐＨ値を速やかに中和した。溶出後に収集したタンパク質溶液をＰＢＳに対して透析した。
【００５４】
ステップ１２：レポーター遺伝子実験でのＧＬＰ−１融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＧＬＰ−１受容体の作動機能の検出（図２を参照）
各ウェルに２００００個の、共発現ｈＧＬＰ１Ｒ−ＣＲＥ−ルシフェラーゼのＣＨＯ−ＤＨＦＲ−細胞を９６ウェル細胞培養プレートに接種し、３７℃で一晩培養した。２日目に、培地上澄を除去し、無血清培地で細胞表面を２回洗浄し、残液を吸い取り、さらに１００μｌを加えて無血清培地で精製抗体またはＧＬＰ−１を希釈し、３７℃で４時間培養した。刺激の終了後、ＰｒｏｍｅｇａのＢｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏ化学発光基質１００μｌを加え、最後に、細胞分解物を白色９６ウェルプレートに移し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＤｅｖｉｃｅｓのＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｌルミノメーターで相対発光強度を読み取った。
【００５５】
ステップ１３：マウス（ＩＣＲ）絶食状態での耐糖能試験
マウスの静脈内ブドウ糖負荷を測定し、本特許のＧＬＰ−１融合タンパク質（好ましくは、抗体ＧＬＰ−１（Ａ８Ｇ）−ＬＫ−Ｌ１３Ｈ１３））の効果を評価した。４群では、各群に少なくとも３から５匹のマウスを含んだ。Ｉ群は、同体積ＰＢＳ対照腹腔内注射を受けた。ＩＩ群は、１５μｇ／匹の単回腹腔内注射を受けた。ＩＩＩ群は、５μｇ／匹の単回腹腔内注射を受けた。注射後に、マウスに６〜１６時間の絶食処置を行い、絶食の完了後、マウス血液試料を取り、その基礎血糖値を測定した。次いで、濃度１．５ｇ／ｋｇのグルコース胃ゾンデ経口投与を受けさせた。グルコース胃ゾンデ経口投与の後、１５分、３０分、６０分、および９０分後にその血液試料を採取し、血糖値を測定した（図３を参照）。
【００５６】
ステップ１４：耐糖能試験によるＧＬＰ−１融合タンパク質のマウス（Ｃ５７ＢＬ）体内持効性（４０時間）の検出
マウスの静脈内ブドウ糖負荷を測定し、本特許のＧＬＰ−１融合タンパク質（好ましくは、抗体ＧＬＰ−１（Ａ８Ｇ）−ＬＫ−Ｌ１３Ｈ１３））のマウス体内での持効性を評価した。両群では、少なくとも３から５匹のマウスを含んだ。Ｉ群は、同体積ＰＢＳ対照腹腔内注射を受けた。ＩＩ群は、１５μｇ／匹の濃度の単回腹腔内注射を受けた。注射の２４時間後に、マウスに１６時間の絶食処置を行い、絶食の完了後、マウス血液試料を取り、その基礎血糖値を測定した。次いで、濃度１．５ｇ／ｋｇのグルコース胃ゾンデ経口投与を受けさせた。グルコース胃ゾンデ経口投与の後、１５分、３０分、６０分、および９０分後にその血液試料を採取し、血糖値を測定した（図４を参照）。
【００５７】
ステップ１５：ＧＬＰ−１融合タンパク質による２型糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂマウス）の血糖値低下の持効性研究（７２時間）
異なる時点で２型糖尿病マウスの血糖値を測定し、本特許のＧＬＰ−１融合タンパク質（好ましくは、抗体ＧＬＰ−１（Ａ８Ｇ）−ＬＫ−Ｌ１３Ｈ１３））による２型糖尿病マウス体内でのその血糖値低下の持効性を評価した。両群では、各群に少なくとも６匹のマウスを含んだ。注射開始前に、マウス血液試料を取り、その基礎血糖値を測定した。その後、Ｉ群は、同体積ＰＢＳ対照腹腔内注射を受け、ＩＩ群は１０ｎｍｏｌ／ｋｇ濃度の単回腹腔内注射を受けた。注射後１、４、６、２４、４８、７２時間後に、それぞれその血液試料を採取し、両群のマウスの血糖値を測定した（図５を参照）。
【００５８】
ステップ１６：ＧＬＰ−１融合タンパク質による２型糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂマウス）の日摂食量減少の持効性研究（１２０時間）
２型糖尿病マウスの日摂食量の変化を測定し、本特許のＧＬＰ−１融合タンパク質（好ましくは、抗体ＧＬＰ−１（Ａ８Ｇ）−ＬＫ−Ｌ１３Ｈ１３））による２型糖尿病マウスの摂食レベル面低下の持効性を評価した。このステップおよびステップ１５は、同じロットのマウスで同時に行った。両群では、各群に少なくとも６匹のマウスを含んだ。ステップ１５の注射の３日前から注射の５日（１２０時間）後まで、毎朝同じ時間に各群のマウスの日摂食量を秤量した（図６を参照）。
【００５９】
以上に記載の実施例は、本発明の好ましい方式に過ぎず、本発明に対していかなる形式の限定を行うものでもなく、特許請求の範囲に記載の技術手法を超えない前提の下で、さらに他の変更および修正がある。
【図１】
2016532448.tif 000003
【図２】
2016532448.tif 000004
【図３】
2016532448.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2016532448000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成28年4月11日(2016.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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