(57)【要約】  本発明は、肝臓腫瘍型を診断し、患者予後を評価するための材料及び方法に関する。具体的には、本発明は、原発性肝臓腫瘍を最新のWHO分類に従って特定及び分類することができるマーカータンパク質の決定に関するものであるが、これに限定されるものではない。特に、本発明は、非腫瘍性肝細胞と腫瘍性肝細胞と胆管上皮細胞を区別することが可能となるマーカータンパク質候補を提供する。これにより、精緻化されるべき腫瘍分化の等級付け並びに原発性肝臓腫瘍及び胆管癌の亜型の発症機序の示差診断が可能になる。【選択図】  図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓組織試料の細胞表現型を決定する方法であって:
(1)該肝臓組織試料からマーカータンパク質を抽出すること;
(2)該肝臓組織試料における複数のマーカータンパク質の発現レベルを決定すること(ここで、該複数のマーカータンパク質は、表1A、表2〜11のうちのいずれか1つによって表されるバイオマーカーパネルから選択される);任意に、表1A、表2〜11のうちのいずれか1つによって表されるバイオマーカーパネルから選択される異なる複数のマーカータンパク質を用いて、工程(2)を反復すること;
(3)該決定された発現レベルを既知の細胞表現型における該複数のマーカータンパク質の発現レベルの参照セットと比較し、それにより、該肝臓組織試料の細胞表現型を決定すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
肝臓細胞の細胞表現型を特定する方法であって:
(1)該肝臓細胞における複数のマーカータンパク質の発現レベルを決定すること;
(2)該決定された発現レベルを、該複数のマーカータンパク質の発現レベルの参照セットであって、該参照レベルが細胞表現型を表す、前記参照セットと比較すること;
(3)該肝臓細胞におけるマーカータンパク質の発現レベルと参照発現レベルの比較に基づいて、該肝臓細胞の細胞表現型を特定すること;
を含み、
ここで、該複数のマーカータンパク質が、表1A、表2〜11のうちのいずれか1つによって表されるバイオマーカーパネルから選択される、前記方法。
【請求項３】
前記細胞表現型が、正常肝臓上皮細胞(肝細胞)、正常胆管上皮細胞(胆管細胞)、肝細胞癌細胞、末梢胆管細胞癌細胞、又は肝門部胆管細胞癌細胞から選択される、請求項1又は請求項2記載の方法。
【請求項４】
前記発現レベルを第2の細胞表現型を表す発現レベルの第2の参照セットと比較することをさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記肝臓細胞が肝臓腫瘍細胞である、請求項2〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記バイオマーカーパネルが、表5及び/又は表7によって表され、前記細胞表現型が、肝細胞癌細胞及び胆管細胞癌細胞から選択される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記複数のマーカータンパク質が表5のパートAから選択される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
前記肝臓腫瘍細胞が肝臓腫瘍生検試料から得られる、請求項5〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記肝臓腫瘍生検が、肝動脈化学塞栓療法による治療を以前に受けたことがある患者から得られた、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
前記複数のマーカータンパク質が表7から選択される、請求項6記載の方法。
【請求項１１】
前記複数のマーカータンパク質が表7のパートAから選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
複数のマーカータンパク質の発現レベルを決定する工程が:
(a)前記肝臓細胞又は前記肝臓組織試料を複数の結合メンバーと接触させること(ここで、各々の結合メンバーは、該複数のマーカータンパク質のうちの1つ又は該マーカータンパク質をコードする核酸配列に選択的に結合する);並びに
(b)該特異的結合メンバー及びマーカータンパク質又は該マーカータンパク質をコードする核酸配列によって形成される複合体を検出及び/又は定量すること
を含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
前記特異的結合メンバーが、前記複数のマーカータンパク質のうちの1つに選択的に結合する抗体又は抗体断片である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
前記特異的結合メンバーが、前記複数のマーカータンパク質のうちの1つをコードする核酸に選択的に結合する核酸配列である、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
前記特異的結合メンバーがアプタマーである、請求項12記載の方法。
【請求項１６】
前記結合メンバーが固体支持体に固相化されている、請求項12〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
複数のマーカータンパク質の発現レベルを決定する前記工程が質量分析によって行われる、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
複数のタンパク質の発現レベルを決定する前記工程が、タンパク質由来ペプチドの1以上の遷移を用いる選択反応モニタリング;及び試験下の前記肝臓細胞又は前記肝臓組織試料中のペプチドレベルを、細胞表現型を表すことが以前に決定されたペプチドレベルと比較することによって行われる、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
前記ペプチドレベルを比較することが、前記肝臓細胞又は前記肝臓組織試料由来のタンパク質由来ペプチドの量を、既知の量の対応する合成ペプチドを用いて決定することを含み、ここで、該合成ペプチドは、標識を除いて、該肝臓細胞又は該肝臓組織試料から得られるペプチドと配列が同一である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記標識が、異なる質量又は重同位体のタグである、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
個体における肝臓腫瘍の診断又は予後モニタリングの方法であって:
(a)該個体から得られる肝臓腫瘍細胞における、表1A、表2〜11のうちのいずれか1つによって表されるバイオマーカーパネルから選択される複数のマーカータンパク質の存在又は発現レベルを決定すること;
(b)該肝臓腫瘍細胞の細胞表現型を特定すること;及び
(c)該肝臓腫瘍細胞の細胞表現型に基づいて診断又は予後判定を選択すること
を含む、前記方法。
【請求項２２】
肝臓腫瘍を有する個体の治療レジメンを決定する方法であって:
(a)該個体から得られる肝臓腫瘍細胞における、表1A、表2〜11のうちのいずれか1つによって表されるバイオマーカーパネルから選択される複数のマーカータンパク質の存在又は発現レベルを決定すること;
(b)該肝臓腫瘍細胞の細胞表現型を特定すること;及び
(c)該肝臓腫瘍細胞の細胞表現型に基づいて治療レジメンを選択すること
を含む、前記方法。
【請求項２３】
前記肝臓腫瘍細胞が肝臓腫瘍生検由来のものである、請求項21又は請求項22記載の方法。
【請求項２４】
前記バイオマーカーパネルが表5によって表される、請求項21〜23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
前記バイオマーカーパネルが表5のパートAによって表される、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
前記個体が、肝動脈化学塞栓療法による治療を以前に受けたことがある、請求項21〜23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
前記バイオマーカーパネルが表7によって表される、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
前記バイオマーカーパネルが表7のパートAによって表される、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
個体の肝臓癌を診断する方法であって、表1A、表2〜11から選択される1以上のマーカータンパク質又はその断片を、該個体から得られる血液、組織、唾液、又は尿試料中で検出することを含む、前記方法。
【請求項３０】
前記1以上のタンパク質マーカー又はその断片が特異的結合メンバーを用いて検出される、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
前記結合メンバーが、前記1以上のマーカータンパク質に特異的な抗体である、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
前記複数のマーカータンパク質が、コラーゲンアルファ1(XVIII)鎖、プラスチン-3、AKR1B10、フィブロネクチン、ベータ3チューブリン、アスポリン、14-3-3タンパク質イータ、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質3のうちのいずれか1つ、又はこれらの組合せから選択される、請求項1〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
前記複数のマーカータンパク質が、AKR1B10及び/又はベータ3チューブリンを含む、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
表1A、表2〜11から選択される1以上のマーカータンパク質の肝臓癌の診断マーカーとしての使用。
【請求項３５】
対象の再発性又は原発性肝臓腫瘍を診断する方法であって、試料中のコラーゲンアルファ1(XVIII)鎖、プラスチン-3、AKR1B10、フィブロネクチン、ベータ3チューブリン、アスポリン、14-3-3タンパク質イータ、及びジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質3からなる群から選択される1以上のマーカータンパク質の有無を決定することを含む、前記方法。
【請求項３６】
前記マーカータンパク質が、ベータ3チューブリン及び/又はAKR1B10である、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
前記マーカータンパク質がベータ3チューブリンである、請求項35記載の方法。
【請求項３８】
前記試料が、血液、血漿、血清、肝臓組織、肝臓細胞のうちのいずれか1つ、又はこれらの組合せから選択される、請求項35〜37のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
前記試料が、肝臓組織、任意に、ホルマリン固定パラフィン包埋肝臓組織切片である、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
前記試料中の1以上のマーカータンパク質の有無を決定することが、免疫組織化学検査(IHC)又は質量分析のいずれかによって行われる、請求項35〜39のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
前記肝臓腫瘍が、肝細胞癌、末梢胆管細胞癌、又は肝門部胆管細胞癌細胞からなる群から選択される、請求項35〜40のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
対象の再発性又は原発性肝臓腫瘍を診断するキットであって、試料中のコラーゲンアルファ1(XVIII)鎖、プラスチン-3、AKR1B10、フィブロネクチン、ベータ3チューブリン、アスポリン、14-3-3タンパク質イータ、及びジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質3からなる群から選択される1以上のマーカータンパク質の有無を決定するための試薬を含む、前記キット。
【請求項４３】
前記マーカータンパク質が、ベータ3チューブリン及び/又はAKR1B10である、請求項41記載のキット。
【請求項４４】
前記マーカータンパク質がベータ3チューブリンである、請求項43記載のキット。
【請求項４５】
前記キットが、前記試料を調製するのに好適な試薬を含み、ここで、該試料が、血液、血漿、血清、肝臓組織、肝臓細胞のうちのいずれか1つ、又はこれらの組合せから選択される、請求項42〜44のいずれか一項記載のキット。
【請求項４６】
前記試料が肝臓組織であり、前記キットが、肝臓組織を調製するのに、任意に、ホルマリン固定パラフィン包埋肝臓組織切片を調製するのに好適な試薬を含む、請求項45記載のキット。
【請求項４７】
前記試料中の1以上のマーカータンパク質の有無を決定することが、免疫組織化学検査によって行われる、請求項42〜46のいずれか一項記載のキット。
【請求項４８】
前記肝臓腫瘍が、肝細胞癌、末梢胆管細胞癌、又は肝門部胆管細胞癌細胞からなる群から選択される、請求項42〜47のいずれか一項記載のキット。
【請求項４９】
肝臓細胞の細胞表現型をインビトロで決定するのに使用するためのキットであって、使用者が、試験下の細胞における、表2〜11によって表されるバイオマーカーパネルに提供される複数のマーカータンパク質又はその断片の存在又は発現レベルを決定するのを可能にし;
(a)アッセイ互換フォーマットの参照ペプチドのセット(ここで、該セット中の各々のペプチドは、表1A、表2〜11のうちのいずれか1つに提供される該複数のマーカータンパク質のうちの1つを固有に表すものである);並びに任意に
(b)洗浄溶液、希釈液、及び緩衝液からなる群から選択される1以上の構成要素
を含む、前記キット。
【請求項５０】
個体における肝臓腫瘍の診断又は予後モニタリングのためのキットであって:
(a)複数の結合メンバーがその上に固相化されている固体支持体(ここで、各々の結合メンバーは、表1A、表2〜11のうちのいずれか1つによって表されるバイオマーカーパネルから選択されるタンパク質;又は該タンパク質もしくはその断片をコードする核酸に選択的に結合する);
(b)標識を含む発色剤;並びに
(c)洗浄溶液、希釈液、及び緩衝液から選択される1以上の構成要素
を含む、前記キット。
【請求項５１】
肝臓腫瘍を有する個体の治療レジメンを決定するためのキットであって、
(a)複数の結合メンバーがその上に固相化されている固体支持体(ここで、各々の結合メンバーは、表1A、表2〜11のうちのいずれか1つによって表されるバイオマーカーパネルから選択されるタンパク質;又は該タンパク質もしくはその断片をコードする核酸に選択的に結合する);
(b)標識を含む発色剤;並びに
(c)洗浄溶液、希釈液、及び緩衝液から選択される1以上の構成要素
を含む、前記キット。
【請求項５２】
前記バイオマーカーパネルが、表5、又は表4のパートAによって表される、請求項51記載のキット。
【請求項５３】
前記バイオマーカーパネルが、表7又は表7のパートAによって表される、請求項51記載のキット。
【請求項５４】
表1A、表2〜11のうちのいずれか1つから選択されるバイオマーカーパネルから選択される複数のタンパク質のうちの1つの断片と同一の配列を各々有する複数の合成ペプチドであって、該断片が、トリプシン、ArgC、AspN、又はLys-C消化による該タンパク質の消化によって生じ、ここで、1以上の該複数の合成ペプチドが標識を含む、前記複数の合成ペプチド。
【請求項５５】
前記標識が重同位体である、請求項54記載の複数の合成ペプチド。
【請求項５６】
選択反応モニタリングで使用するための、請求項54又は請求項55記載の複数の合成ペプチド。
【請求項５７】
肝臓細胞分類装置及び情報通信端末装置を含む肝臓細胞分類システムであって、該肝臓細胞分類装置が制御コンポーネント及び記憶コンポーネントを含み、該装置がネットワークを通じて互いに通信可能に接続されており;
(1)該情報通信端末装置が、
(1a)対象の肝臓組織試料から得られるタンパク質データを該肝臓細胞分類装置に伝達するタンパク質データ送信ユニット;
(1b)該肝臓細胞分類装置から伝達される該対象の肝臓細胞分類の結果を受け取る結果受信ユニット;
を含み、
(2)該肝臓細胞分類装置が、
(2a)該情報通信端末装置から伝達される該対象の肝臓組織試料から得られるタンパク質データを受け取るタンパク質データ受信ユニット;
(2b)該データ受信ユニットからのデータを該記憶ユニットに保存されているデータと比較するデータ比較ユニット;
(2c)該データ比較ユニットの結果に基づいて、該対象の肝臓組織のクラス(例えば、細胞表現型)を決定する分類器ユニット;及び
(2d)該分類器ユニットによって得られる該対象の分類結果を該情報通信端末装置に伝達する分類結果送信ユニット;
を含み、かつ
該記憶ユニットが、表1A、表2〜10、又は表11のうちのいずれか1つ又は複数から選択される少なくとも1つのタンパク質のタンパク質発現レベルデータを含む、前記肝臓細胞分類システム。
【請求項５８】
前記記憶ユニットが、表5又は表11から選択される複数のタンパク質のデータを含み、前記分類が、肝細胞癌と末梢胆管癌の間のものである、請求項57記載の肝臓細胞分類システム。
【請求項５９】
前記記憶ユニットが、表7又は表11から選択される複数のタンパク質のデータを含み、前記分類が、TACE後の肝臓腫瘍における肝細胞癌と胆管癌の間のものである、請求項57記載の肝臓細胞分類システム。
【請求項６０】
肝臓組織試料中のタンパク質発現レベルを決定するための装置に接続された、請求項57〜59のいずれか一項記載の肝臓細胞分類システム。
【請求項６１】
前記装置が、液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS/MS)を用いて、多数の試料を処理することができる、請求項58記載の肝臓細胞分類システム。
【請求項６２】
制御コンポーネント及び記憶コンポーネントを含む情報処理装置に、対象の肝臓組織を決定及び/又は分類する方法であって:
(i)対象から得られた表1A、表2〜11のうちのいずれか1つから選択される少なくとも1つ(好ましくは、複数)のタンパク質のタンパク質発現レベルに基づくデータを該記憶コンポーネントに保存されているタンパク質発現レベルデータと比較する比較工程;並びに
(ii)該対象の肝臓組織細胞を該比較工程で計算された比較に基づいて分類するための;及び該組織が、正常(肝細胞、胆管細胞)、肝細胞癌、肝胆管細胞癌(TACE療法前もしくはTACE療法後)、末梢胆管癌、肝門部胆管癌(原発性硬化性胆管炎を伴うもしくは伴わない)、又は転移性結腸直腸癌を含む表現型に分類される、分類工程
を含む、前記方法を実行させる肝臓組織細胞分類プログラム。
【請求項６３】
その上に記録された請求項60記載の肝臓組織細胞分類プログラムを含む、コンピュータ可読記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(発明の分野)
本発明は、腫瘍型を診断し、患者予後を評価するための材料及び方法に関する。特に、本発明は、原発性肝臓腫瘍を特定及び分類することができるマーカータンパク質の決定に関する。
【背景技術】
【０００２】
(発明の背景)
肝臓は、損傷後に再生することができる複雑な臓器である。肝臓は、様々な特徴の中でもとりわけ、胆管と肝実質を形成するのに必要とされるいくつかの特殊化した細胞で高度に構造化されている。最も一般的な細胞型は、肝実質の大部分を形成する肝細胞である。胆管細胞は、肝内胆管系の胆管を形成するそれほど一般的ではない細胞型である。
【０００３】
原発性肝臓腫瘍は、最新のWHO分類に従って、上皮性、間葉系、生殖細胞、リンパ系、及び混合起源のもの又は起源不明のものに分類される[1]。上皮性腫瘍は最も一般的であり、通常、それぞれ、肝細胞及び胆管上皮に対するその表現型の類似性、及び推定される起源によって、肝細胞性のものと胆管細胞性のものに分けられる。肝細胞癌(HCC)と胆管癌(CC)は、最も一般的な悪性型である。HCCは、世界で5番目に多く見られる癌であり、通常、慢性肝疾患を背景として発症する[2]。CCは、肝内胆管系のどの部分からも生じることができ、好発部位、考えられる生物学的特徴の違い、及び発症機序に基づいて、末梢性のものと肝門部/肝門部周囲のものに分類される。この分類は、末梢CCにおけるウイルス性肝炎又はアルコール性肝疾患などのリスク因子との関連によって裏付けられる。対照的に、多くの場合、慢性胆管症(例えば、原発性硬化性胆管炎(PSC))を背景とする上皮内腫瘍形成を通じた多段階発癌は、肝門部/肝門部周囲CCの発症の原因であるように思われる[3]。
【０００４】
いくつかの原発癌は、肝細胞分化の部分と胆管細胞分化の部分が交互になった、混合表現型を示す。全ての原発性肝臓腫瘍、特に、上皮性腫瘍は、「純粋な」HCC及びCCが両端にあり、混合型の癌が中間辺りにある表現型範囲の一部であり得るという癌幹細胞理論により広く基づいて、肝前駆細胞からの発生がこれらの腫瘍について提唱されている[4,5]。これに関して、本発明者らは、肝動脈化学塞栓療法(TACE)を伴う局所焼灼治療がHCCにおける胆管細胞分化と関連することを最近報告した[6]。この観察に対する可能な説明は、TACEが、TACEに抵抗性があり、かつ胆管系譜を含む多能性分化が可能であるわずかな前駆細胞集団に有利な選択圧を提供するというものである。肝細胞及び胆管細胞/前駆細胞成分は、比較的数が限られた既知の従来型マーカーを用いて、単一もしくは二重免疫染色又は遺伝子発現解析(RT-PCR)により、マイクロダイセクション処理された組織から特定された[6]。TACE後の腫瘍の異なるHCC/CC成分の表現型及び発症機序の詳細、その正常対応物及び典型的悪性対応物とのその類似性をより明確にするのを助け、診断、予後判定を助け、新たな選択的治療標的及び予測マーカーを潜在的に同定するために、より多くのマーカーが必要とされる。
【０００５】
液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS/MS)に基づくプロテオミクスは、培養細胞及び臨床組織を含む複雑な試料から抽出される多数のマーカータンパク質を同定及び定量する点で従来の生化学的方法よりも優れていることが証明されている[7-8]。最近、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織への質量分析に基づくプロテオミクス解析の適用は、ヒトとモデル生物の両方に由来する高度に特徴付けられたFFPE組織が大量に収集されていること[9-10]、及び質量分析に基づくプロテオミクス解析が不均質な組織切片から腫瘍細胞集団を濃縮するレーザーキャプチャーマイクロダイセクションと適合性があることが理由で、特に注目を集めている。
【０００６】
レーザーマイクロダイセクション処理されたFFPE組織の大規模な包括的プロテオミクス解析を用いて、疾患の新規のタンパク質バイオマーカーとしての役割を果たし得る組織学的組織型間の示差発現マーカータンパク質を発見するのに成功している[10-13]。これらの研究の多くは、スペクトルカウンティング及びペプチドプリカーサーイオンのシグナル強度などの、標識を使用しない定量的プロテオミクス戦略を利用している。両アプローチとも、軽減されたスペクトルの複雑さ、拡大された分析深度、及び優れた線形ダイナミックレンジ(スペクトルカウンティングについては、2桁を超える)から恩恵を受け、結果として、高レベルの定量的プロテオームカバレッジを提供している[11-15]。
【０００７】
腫瘍マーカーマーカータンパク質の標準的な肝臓組織学検査及び免疫組織化学検査は、HCCとCCを識別するいくつかの手段を提供しているが、操作者間でのばらつき及び感度の欠如が生じやすい。したがって、肝臓腫瘍を主要な細胞型−肝細胞又は胆管細胞−に関して特徴付け、かつ薬物応答性の分子マーカーを組み入れる可能性があるより情報量の多いマーカーが依然として必要とされている。腫瘍細胞系譜のそのようなバイオマーカーは、疾患の早期診断、予後モニタリング、最適化された治療選択を助けることができ、将来の創薬のための新たな選択的治療標的を潜在的に同定することができる。
【発明の概要】
【０００８】
(発明の概要)
したがって、本発明は、原発性肝臓腫瘍の分類、特に、肝細胞癌と胆管細胞癌の区別において使用するための新規のバイオマーカーを提供する。そのような分類は、治療レジメン及び予後判定が具体的に患者1人1人に合わせて施されることを可能にする。
【０００９】
第1の態様において、本発明は、肝臓組織試料の細胞表現型を決定する方法であって、
(1)該肝臓組織試料からマーカータンパク質を抽出すること;
(2)該肝臓組織試料における複数のマーカータンパク質の発現レベルを決定すること(ここで、該複数のマーカータンパク質は、表1A、表2〜11のうちのいずれか1つによって表されるバイオマーカーパネルから選択される);任意に、表1A、表2〜11のうちのいずれか1つによって表されるバイオマーカーパネルから選択される異なる複数のマーカータンパク質を用いて、工程(2)を反復すること;
(3)該決定された発現レベルを既知の細胞表現型における該複数のマーカータンパク質の参照発現レベルと比較し、それにより、該肝臓組織試料の細胞表現型を決定すること
を含む、方法を提供する。
【００１０】
第2の態様において、肝臓細胞の細胞表現型を特定する方法であって、
(1)該肝臓細胞における複数のマーカータンパク質の発現レベルを決定すること;
(2)該発現レベルを、該複数のマーカータンパク質の発現レベルの参照セットであって、該参照レベルが細胞表現型を表す、参照セットと比較すること;
(3)該肝臓細胞におけるマーカータンパク質の発現レベルと参照発現レベルの比較に基づいて、該肝臓細胞の細胞表現型を特定すること;
を含み、
ここで、該複数のマーカータンパク質が、表1A、表2〜10、又は表11のうちのいずれか1つによって表されるバイオマーカーパネルから選択される、方法が提供される。
【００１１】
これらの態様の実施態様において、細胞表現型は、正常肝臓上皮細胞(肝細胞)、正常胆管上皮細胞(胆管細胞)、肝細胞癌細胞、末梢胆管細胞癌細胞、又は肝門部胆管細胞癌細胞から選択される。
【００１２】
いくつかの他の実施態様において、本方法は、該発現レベルを第2の細胞表現型を表す発現レベルの第2の参照セットと比較することをさらに含む。
【００１３】
いくつかの実施態様において、肝臓細胞は、肝臓腫瘍細胞である。
【００１４】
いくつかの実施態様において、バイオマーカーパネルは、表5及び/又は表7によって表され、細胞表現型は、肝細胞癌細胞及び胆管細胞癌細胞から選択され、好ましくは、複数のマーカータンパク質は、表5のパートAから選択される。
【００１５】
いくつかの他の実施態様において、肝臓腫瘍細胞は、肝臓腫瘍生検試料から得られ、好ましくは、肝動脈化学塞栓療法による治療を以前に受けたことがある患者から得られる。
【００１６】
またいくつかの他の実施態様において、複数のマーカータンパク質は、表7から選択され、好ましくは、複数のマーカータンパク質は、表7のパートAから選択される。
【００１７】
これらの態様のまたいくつかの他の実施態様において、複数のマーカータンパク質の発現レベルを決定する工程は、
(a)肝臓細胞又は肝臓組織試料を複数の結合メンバーと接触させること(ここで、各々の結合メンバーは、該複数のマーカータンパク質のうちの1つ又は該マーカータンパク質をコードする核酸配列に選択的に結合する);並びに
(b)該特異的結合メンバー及びマーカータンパク質又は該マーカータンパク質をコードする核酸配列によって形成される複合体を検出及び/又は定量すること
を含む。
【００１８】
特異的結合メンバーは、該複数のマーカータンパク質のうちの1つに選択的に結合する抗体もしくは抗体断片、又は該複数のマーカータンパク質のうちの1つをコードする核酸に選択的に結合する核酸配列である。
【００１９】
任意に、特異的結合メンバーはアプタマーであるか、又は該結合メンバーは固体支持体に固相化されている。
【００２０】
これらの態様のいくつかの他の実施態様において、複数のマーカータンパク質の発現レベルを決定する工程は、質量分析によるか、又はタンパク質由来ペプチドの1以上の遷移を用いる選択反応モニタリング;及び試験下の肝臓細胞もしくは肝臓組織試料中のペプチドレベルを、細胞表現型を表すことが以前に決定されたペプチドレベルと比較することによって行われる。
【００２１】
好ましくは、ペプチドレベルを比較することは、肝臓細胞又は肝臓組織試料由来のタンパク質由来ペプチドの量を、既知の量の対応する合成ペプチドを用いて決定することを含み、ここで、該合成ペプチドは、標識を除いて、該肝臓細胞又は該肝臓組織試料から得られるペプチドと配列が同一である。より好ましくは、標識は、異なる質量又は重同位体のタグである。
【００２２】
第3の態様において、本発明は、個体における肝臓腫瘍の診断又は予後モニタリングの方法であって、
(a)該個体から得られる肝臓腫瘍細胞における、表2〜11のうちのいずれか1つによって表されるバイオマーカーパネルから選択される複数のマーカータンパク質の存在又は発現レベルを決定すること;
(b)該肝臓腫瘍細胞の細胞表現型を特定すること;及び
(c)該肝臓腫瘍細胞の細胞表現型に基づいて診断又は予後判定を選択すること
を含む、方法を提供する。
【００２３】
第4の態様において、本発明は、肝臓腫瘍を有する個体の治療レジメンを決定する方法であって、
(a)該個体から得られる肝臓腫瘍細胞における、表2〜11のうちのいずれか1つによって表されるバイオマーカーパネルから選択される複数のマーカータンパク質の存在又は発現レベルを決定すること;
(b)該肝臓腫瘍細胞の細胞表現型を特定すること;及び
(c)該肝臓腫瘍細胞の細胞表現型に基づいて治療レジメンを選択すること
を含む、方法を提供する。
【００２４】
これらの第3及び第4の態様のいくつかの実施態様において、肝臓腫瘍細胞は、肝臓腫瘍生検由来のものである。
【００２５】
これらの態様のいくつかの他の実施態様において、バイオマーカーパネルは、表5によって、好ましくは、表5のパートAによって表される。
【００２６】
これらの態様のいくつかのさらなる実施態様において、個体は、肝動脈化学塞栓療法による治療を以前に受けたことがある。好ましくは、バイオマーカーパネルは、表7によって、より好ましくは、表7のパートAによって表される。
【００２７】
第5の態様において、本発明は、個体の肝臓癌を診断する方法であって、表1A、表2〜11から選択される1以上のマーカータンパク質又はその断片を、該個体から得られる血液、組織、唾液、又は尿試料中で検出することを含む、方法を提供する。好ましくは、該1以上のタンパク質マーカー又はその断片は、特異的結合メンバーを用いて検出され、より好ましくは、該結合メンバーは、該1以上のマーカータンパク質に特異的な抗体である。
【００２８】
全てのこれらの態様のいくつかの実施態様において、複数のマーカータンパク質は、コラーゲンアルファ1(XVIII)鎖、プラスチン-3、AKR1B10、フィブロネクチン、ベータ3チューブリン、アスポリン、14-3-3タンパク質イータ、もしくはジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質3のうちのいずれか1つ、又はこれらの組合せから選択され、好ましくは、複数のマーカータンパク質は、AKR1B10及び/又はベータ3チューブリンを含む。
【００２９】
別の態様において、本発明は、表1A、表2〜11から選択される1以上のマーカータンパク質の肝臓癌の診断マーカーとしての使用を提供する。
【００３０】
また別の態様において、本発明は、対象の再発性又は原発性肝臓腫瘍を診断する方法であって、試料中のコラーゲンアルファ1(XVIII)鎖、プラスチン-3、AKR1B10、フィブロネクチン、ベータ3チューブリン、アスポリン、14-3-3タンパク質イータ、及びジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質3からなる群から選択される1以上のマーカータンパク質の有無を決定することを含む、方法を提供する。好ましくは、肝臓腫瘍は、肝細胞癌、末梢胆管細胞癌、又は肝門部胆管細胞癌細胞からなる群から選択される。
【００３１】
この態様の一実施態様において、マーカータンパク質は、ベータ3チューブリン及び/又はAKR1B10、好ましくは、ベータ3チューブリンである。
【００３２】
別の実施態様において、試料は、血液、血漿、血清、肝臓組織、肝臓細胞のうちのいずれか1つ、又はこれらの組合せから選択され、好ましくは、試料は、肝臓組織、任意に、ホルマリン固定パラフィン包埋肝臓組織切片である。
【００３３】
別の実施態様において、試料中の1以上のマーカータンパク質の有無を決定することは、免疫組織化学検査(IHC)又は質量分析のいずれかによって行われる。
【００３４】
別の態様において、本発明は、対象の再発性又は原発性肝臓腫瘍を診断するキットであって、試料中のコラーゲンアルファ1(XVIII)鎖、プラスチン-3、AKR1B10、フィブロネクチン、ベータ3チューブリン、アスポリン、14-3-3タンパク質イータ、及びジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質3からなる群から選択される1以上のマーカータンパク質の有無を決定するための試薬を含む、キットを提供する。好ましくは、肝臓腫瘍は、肝細胞癌、末梢胆管細胞癌、又は肝門部胆管細胞癌細胞からなる群から選択される。
【００３５】
一実施態様において、マーカータンパク質は、ベータ3チューブリン及び/又はAKR1B10、好ましくは、ベータ3チューブリンである。
【００３６】
別の実施態様において、キットは、試料を調製するのに好適な試薬を含み、ここで、該試料は、血液、血漿、血清、肝臓組織、肝臓細胞のうちのいずれか1つ、又はこれらの組合せから選択される。
【００３７】
また別の実施態様において、試料は肝臓組織であり、キットは、肝臓組織を調製するのに、任意に、ホルマリン固定パラフィン包埋肝臓組織切片を調製するのに好適な試薬を含む。
【００３８】
別の実施態様において、試料中の1以上のマーカータンパク質の有無を決定することは、免疫組織化学検査によって行われる。
【００３９】
また別の態様において、本発明は、肝臓細胞の細胞表現型を決定する際に使用するためのキットであって、使用者が、試験下の細胞における、表1A、表2〜11のうちのいずれか1つによって表されるバイオマーカーパネルに提供されるタンパク質又はその断片、該マーカータンパク質に対する複数の抗体、及び該マーカータンパク質又はその断片をコードする複数の核酸分子から選択される複数の分析物の存在又は発現レベルを決定するのを可能にし;
(a)該分析物のうちの1つに各々結合することができる複数の結合メンバーがその上に固相化されている固体支持体;
(b)標識を含む発色剤;並びに任意に、
(c)洗浄溶液、希釈液、及び緩衝液からなる群から選択される1以上の構成要素
を含む、キットを提供する。
【００４０】
本発明は、肝臓細胞の細胞表現型をインビトロで決定する際に使用するためのキットであって、使用者が、試験下の細胞における、表1A、表2〜11によって表されるバイオマーカーパネルに提供される複数のタンパク質又はその断片の存在又は発現レベルを決定するのを可能にし;
(a)アッセイ互換フォーマットの参照ペプチドのセット(ここで、該セット中の各々のペプチドは、表1A、表2〜11のうちのいずれか1つに提供される複数のマーカータンパク質のうちの1つを固有に表すものである);並びに任意に
(b)洗浄溶液、希釈液、及び緩衝液からなる群から選択される1以上の構成要素
を含む、キットも提供する。
【００４１】
またさらなる態様において、本発明は、個体における肝臓腫瘍の診断、予後モニタリングのための又は肝臓腫瘍を有する個体の治療レジメンを決定するためのキットであって、
(a)複数の結合メンバーがその上に固相化されている固体支持体(ここで、各々の結合メンバーは、表1A、表2〜11のうちのいずれか1つによって表されるバイオマーカーパネルから選択されるタンパク質;又は該タンパク質もしくはその断片をコードする核酸に選択的に結合する);
(b)標識を含む発色剤;並びに
(c)洗浄溶液、希釈液、及び緩衝液から選択される1以上の構成要素
を含む、キットを提供する。
【００４２】
好ましくは、バイオマーカーパネルは、表5によるか、又は表4のパートAによるか、又は表7もしくは表7のパートAによって表される。
【００４３】
またさらなる態様において、本発明は、表1A、表2〜11のうちのいずれか1つから選択されるバイオマーカーパネルから選択される複数のタンパク質のうちの1つの断片と同一の配列を各々有する複数の合成ペプチドであって、該断片が、トリプシン、ArgC、AspN、又はLys-C消化による該タンパク質の消化によって生じ、ここで、1以上の該複数の合成ペプチドが標識を含む、任意に、選択反応モニタリングで使用するための、複数の合成ペプチドを提供する。好ましくは、該標識は重同位体である。
【００４４】
本発明は、肝臓細胞分類装置及び情報通信端末装置を含む肝臓細胞分類システムであって、該肝臓細胞分類装置が制御コンポーネント及び記憶コンポーネントを含み、該装置がネットワークを通じて互いに通信可能に接続されており;
(1)該情報通信端末装置が、
(1a)対象の肝臓組織試料から得られるタンパク質データを該肝臓細胞分類装置に伝達するタンパク質データ送信ユニット;
(1b)該肝臓細胞分類装置から伝達される該対象の肝臓細胞分類の結果を受け取る結果受信ユニット;
を含み、
(2)該肝臓細胞分類装置が、
(2a)該情報通信端末装置から伝達される該対象の肝臓組織試料から得られるタンパク質データを受け取るタンパク質データ受信ユニット;
(2b)該データ受信ユニットからのデータを該記憶ユニットに保存されているデータと比較するデータ比較ユニット;
(2c)該データ比較ユニットの結果に基づいて、該対象の肝臓組織のクラス(例えば、細胞表現型)を決定する分類器ユニット;及び
(2d)該分類器ユニットによって得られる該対象の分類結果を該情報通信端末装置に伝達する分類結果送信ユニット;
を含み、かつ
該記憶ユニットが、表1A、表2〜10、又は表11のうちのいずれか1つ又は複数から選択される少なくとも1つのタンパク質のタンパク質発現レベルデータを含む、肝臓細胞分類システムも提供する。
【００４５】
好ましくは、記憶ユニットは、表5又は表11から選択される複数のタンパク質のデータを含み、分類は、肝細胞癌と末梢胆管癌の間のものであり;或いは、記憶ユニットは、表7又は表11から選択される複数のタンパク質のデータを含み、分類は、TACE後の肝臓腫瘍における肝細胞癌と胆管癌の間のものである。
【００４６】
いくつかの実施態様において、本発明による肝臓細胞分類システムは、肝臓組織試料中のタンパク質発現レベルを決定するための装置に接続されており、好ましくは、該装置は、液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS/MS)を用いて、多数の試料を処理することができる。
【００４７】
本発明のまたさらなる態様において、制御コンポーネント及び記憶コンポーネントを含む情報処理装置に、対象の肝臓組織を決定及び/又は分類する方法であって:
(i)対象から得られた表1A、表2〜11のうちのいずれか1つから選択される少なくとも1つ(好ましくは、複数)のタンパク質のタンパク質発現レベルに基づくデータを該記憶コンポーネントに保存されているタンパク質発現レベルデータと比較する比較工程;並びに
(ii)該対象の肝臓組織細胞を該比較工程で計算された比較に基づいて分類するための;及び該組織が、正常(肝細胞、胆管細胞)、肝細胞癌、肝胆管細胞癌(TACE療法前もしくはTACE療法後)、末梢胆管癌、肝門部胆管癌(原発性硬化性胆管炎を伴うもしくは伴わない)、又は転移性結腸直腸癌を含む表現型に分類される、分類工程
を含む、方法を実行させる肝臓組織細胞分類プログラムが提供される。好ましくは、その上に記録された、請求項48記載の肝臓組織細胞分類プログラム。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
(図面の簡単な説明)
【図１】全ワークフロー。全データ解析ワークフロー;スペクトルファイル(0)、スペクトルセレクター(1)、シークエスト(Sequest)(2)、パーコレーター(Percolator)(3)、マスコット(Mascot)(4)、イベント検出器(5)、プリカーサーイオン面積検出器(6)、定量されたペプチド面積(7)、1％FDRでのペプチド同定＋スペクトルカウンティング(8)、曲線下面積(AUC)を含むペプチドマトリックス(9)、スペクトルカウント情報を含むペプチドデータマトリックス(10)、統計的検証(11;12)、及び最終リスト(13)。
【図２】ベン図。この図は、固有のペプチドと共通のペプチドを含むマーカータンパク質の2つの定量方法(左:スペクトルカウント;右:曲線下面積)の比較を示している。数は、この研究で行われた全ての比較にわたる、各々の定量方法で有意に調節されることが分かったマーカータンパク質及び両方に共通したマーカータンパク質を示している。
【図３】外れ値並びに曲線下面積(AUC)のデータセット(A)及びスペクトルカウントのデータセット(B)内でネスト化される群/クラスターを特定するための主成分分析(PCA)。各々の小さい三角形は、試料の各々についての最初の2つのPC成分に沿ったPCスコアを表す。試料の命名規則は、バッチ番号_組織型番号である。
【図４】火山型プロット(Volcano plot)によるタンパク質上方調節の検証。(a)AKR1B10(左上のパネル、正常肝実質(1)対HCC(2);右上のパネル、正常肝実質(1)対正常胆管(9))及びチューブリン-ベータ3鎖(左下のパネル、正常肝実質(1)対末梢CC(5);右下のパネル、末梢CC(5)対正常胆管(9))の火山型プロット。
【図５】免疫組織化学染色(IHC)によるタンパク質上方調節の検証。(1):組織型1(正常肝臓);(2)組織型2(HCC);(3)組織型9(正常胆管)、及び(4)組織型5(末梢CC)。AKR1B10はHCCでは散在性に発現されるが、正常肝実質及び末梢CCでは、その発現がごくまばらであるか又は弱い。AKR1B10は、正常胆管でも散在性に陽性である。正常肝臓、HCC、正常胆管、及び末梢CCに対するチューブリン-ベータ3鎖の免疫染色。チューブリン-ベータ3鎖の発現は、末梢CCに特異的であるように見える。
【図６】コラーゲンアルファ1(XVIII)鎖(1)、プラスチン-3(2)、AKR1B10(3)、フィブロネクチン(4)、ベータ3チューブリン(5)、アスポリン(6)、及びジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質3(7)の正規化されたスペクトルカウント。
【図７】表11は、固有のペプチド配列と共通のペプチド配列の両方を含むマーカータンパク質(467個)のリストを示している。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
(定義)
「複数のマーカータンパク質」という用語は、本明細書に開示される少なくとも2つのマーカータンパク質を意味する。
【００５０】
「マーカータンパク質」という用語は、翻訳後修飾を含む、同定されたタンパク質の全ての生物学的に関連する形態を含む。例えば、マーカータンパク質は、グリコシル化形態、リン酸化形態、多量体形態、断片化形態、又は前駆体形態で存在することができる。マーカータンパク質断片は、天然に存在するもの、又は例えば、酵素的に生成されたもの及び完全なマーカータンパク質の生物学的に活性のある機能体であってもよい。断片は、典型的には、少なくとも約10アミノ酸、通常、少なくとも約50アミノ酸の長さであり、300アミノ酸もの長さ又はそれより長いものであることができる。
【００５１】
「細胞表現型」という用語は、細胞又は細胞の群の特徴又は形質を指す。細胞表現型は、細胞の解剖学的部位、形態、発生、生化学的又は生理学的特性、挙動、及び生化学/挙動の産物を指す。細胞表現型は、細胞遺伝子の発現及び環境因子の影響並びにこれら2つの間の相互作用から生じる。
【００５２】
「肝臓組織試料」という用語は、切除又はコア針生検により取り出された肝臓組織の標本を含むが、これらに限定されない。
【００５３】
「発現レベル」という用語は、例えば、曲線下面積及びスペクトルカウンティングなどのLC-MS/MS標識を使用しない定量アプローチによって決定される、肝臓組織試料中のタンパク質の相対量を指す。
【００５４】
「比較する」という用語は、他の試料(例えば、本発明者らのデータベースに保存されているタンパク質の量)と比べた試料中のタンパク質(単数又は複数)の相対量を測定することを意味する。
【００５５】
「参照セット」という用語は、分類器(例えば、典型例又はHCC又はCC)として使用される試料(例えば、本発明者らのデータベース中のもの)を指す。これらの分類器を用いて、新規症例由来の非典型的標本の診断を助けることができる。
【００５６】
「参照レベル」、「発現レベルの参照セット」;「参照発現レベル」及び「参照量」という用語は、本明細書では同義語として使用されており、例えば、公的データベースからアクセス可能なデータ記録の形態で提供され得る、予め決定されたレベルを指す。
【００５７】
「抗体」という用語は、ポリクローナル抗血清、モノクローナル抗体、単鎖及びFab断片などの抗体の断片、並びに遺伝子改変抗体を含む。抗体は、キメラであっても、単一種のものであってもよい。
【００５８】
本明細書で互換的に使用される「マーカータンパク質」及び「バイオマーカー」という用語は、翻訳後修飾を含む、同定されたタンパク質の全ての生物学的に関連する形態を含む。例えば、マーカータンパク質は、グリコシル化形態、リン酸化形態、多量体形態、又は前駆体形態で存在することができる。
【００５９】
「対照」という用語は、培養細胞株、ヒトもしくは動物対象から採取された細胞の初代培養物、又はHCCもCCも含まないヒトもしくは動物対象から採取された生検材料を指す。
【００６０】
「抗体アレイ」又は「抗体マイクロアレイ」という用語は、各々の固有のアドレス指定可能な要素において、抗原に対する規定の特異性を有する抗体が、続いて起こるその標的抗原の捕捉及び続いて起こるそのような結合の度合いの検出を可能にする形で固相化されている連続的な固体表面上の固有のアドレス指定可能な要素のアレイを意味する。特異的抗原の結合及び検出が、隣接するそのような固有のアドレス指定可能な要素に干渉しないように、各々の固有のアドレス指定可能な要素は、固体表面上の全ての他の固有のアドレス指定可能な要素から離れている。
【００６１】
「ビーズ懸濁液アレイ」という用語は、各々の粒子が、そのサイズ及び色又は蛍光シグナチャーに関する暗号化特徴を含み、かつそのような暗号化特徴の特定の組合せのビーズの全てが、続いて起こるその標的抗原の捕捉及び続いて起こるそのような結合の程度の検出を可能にする形で、抗原に対する規定の特異性を有する抗体でコーティングされている、1以上の同定可能な程度に異なる粒子の水性懸濁液を意味する。そのようなアレイの例は、www.luminexcorp.comに見出すことができ、そこには、Luminex(登録商標) 100(商標)システムへのxMAP(登録商標)ビーズ懸濁液アレイの適用が記載されている。
【００６２】
「選択反応モニタリング」、「SRM」、及び「MRM」という用語は、既知のバイオマーカーを表す既知の質量電荷比のプリカーサーイオンがイオントラップ型又は三連四重極型質量分析計でのタンデム質量分析による分析のために優先的に標的とされる質量分析アッセイを意味する。分析中、親イオンは断片化され、第2の予め規定された質量電荷比の娘イオンの数がカウントされる。通常、予め規定された数の安定同位体置換を有するが、他の部分は標的イオンと化学的に同一である等価なプリカーサーイオンが本方法に含まれ、定量的内部標準としての役割を果たす。
【００６３】
本明細書で使用される「示差発現」は、タンパク質発現における少なくとも1つの認識可能な差を指す。これは、組織タンパク質発現における定量的に測定可能な、半定量的に推定可能な、又は定性的に検出可能な差であってもよい。したがって、示差発現タンパク質は、ある細胞表現型(例えば、HCC)の組織では強く発現され、別の細胞表現型(例えば、CC)ではあまり強く発現されないか又は全く発現されない場合がある。さらに、発現は、タンパク質が、比較されている2つの細胞表現型間で切断又は翻訳後修飾などの任意の認識可能な変化を受ける場合、示差的であるとみなすことができる。
【００６４】
「単離された」という用語は、本明細書の全体を通じて、マーカータンパク質、抗体、又はポリヌクレオチドが、場合により、それが天然で生じ得る物理的環境とは異なる物理的環境に存在することを意味する。
【００６５】
本明細書で使用されるように、「対象」という用語は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物及び非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。
【００６６】
「治療する(treat)」、「治療する(treating)」、「治療」、「予防する(prevent)」、「予防する(preventing)」、又は「予防」という用語は、治療的処置、予防的処置、及び対象が障害又は他のリスク因子を発症するリスクを軽減する適用を含む。治療は、障害の完全な治癒を要求するものではなく、症状又は基礎的なリスク因子の軽減を包含する。
【００６７】
(略語)
LMD:レーザーマイクロダイセクション; TACE:肝動脈化学塞栓療法; HCC:肝細胞癌; CC:胆管細胞癌、PSC:原発性硬化性胆管炎; FFPE:ホルマリン固定パラフィン包埋; AUC:曲線下面積; PSM:ペプチドスペクトルマッチ。
【００６８】
(詳細な説明)
本発明者らは、肝臓腫瘍細胞を含む、肝臓細胞の異なる細胞表現型間でタンパク質発現レベルの統計的に有意な差を示すマーカータンパク質を同定した。特に、本発明者らは、TACE後のHCCの成分(HCC及びCC)間で異なる発現レベルを有するマーカータンパク質を決定した。HCCと診断された症例は、肝動脈化学塞栓療法(TACE)による治療を受けることが多いが、腫瘍は通常再発し、しかし、もはや典型的なHCC表現型を示すことはなく、典型的なHCCに見えるいくつかの領域、典型的なCCに見えるいくつかの領域、及び定義不可能ないくつかの領域を有する。本発明は、既にTACEを受けた患者において、CCよりもHCCに特異的なマーカータンパク質、又はHCCよりもCCに特異的なマーカータンパク質の同定を可能にする。本発明者らは、その正常対応物及び典型的悪性対応物と比較したその類似性又は相違点をさらに調べた。本発明者らは、他の組織型比較における有意差も発見した。これらの示差発現マーカータンパク質は、腫瘍型の診断、患者予後の評価、及び適切な治療レジメンの決定を助ける有用なバイオマーカーを提供する。
【００６９】
TACE後の混合型腫瘍の肝細胞表現型及び胆管細胞表現型に特異的なマーカータンパク質セット(又はバイオマーカーパネル)、並びにその正常対応物及び典型的腫瘍性対応物とのその類似性の同定により、共通の前駆細胞に由来する可能性があるにもかかわらず、分化プロセスが全く異なるということが確認される。同じぐらい重要なのは、本発明者らによる、正常肝細胞と腫瘍性肝細胞と胆管上皮細胞の間で示差発現されるマーカータンパク質の同定であるが、それは、これらが、悪性形質転換又は腫瘍分化の新たなマーカー;並びに臨床症状と画像撮影及び組織学検査での様子の両方において重複することが多いHCCと末梢CCの間の新たなマーカーを提供するからである(22,23)。
【００７０】
(1.マーカータンパク質及びその使用方法)
本発明は、本明細書において、検討された2つの細胞型間で示差発現されており、かつ特定の細胞表現型の決定を可能にするマーカータンパク質を提供する。
【００７１】
表1Aは、本発明による好ましいマーカータンパク質(その同義語を含む)、すなわち、ベータ3チューブリン、AKR1B10、コラーゲンアルファ1(XVIII)鎖、プラスチン-3、フィブロネクチン、アスポリン、14-3-3タンパク質イータ、及びジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質3を示している。
表1A:好ましいマーカータンパク質
【表１】
2016538545.tif 000003
Pre-TACE:肝動脈化学塞栓療法前; HCC:肝細胞癌; CC:胆管細胞癌; PSC:原発性硬化性胆管炎;
【００７２】
表1Bは、共通のペプチド及び固有のペプチドを用いて2つのタイプの肝臓組織間で統計的に有意な示差発現レベルを示したタンパク質の数を示している(p-値＜0.05及びLog2[倍率変化]≧2又は≦-2)。これらの数は、組織型比較当たりの曲線下面積データセットとスペクトルカウンティングデータセットの両方に共通した示差調節タンパク質の数(両方に共通の467個のタンパク質)を示している。
表1B:肝臓組織のタイプ間で統計的に有意な示差発現を示すタンパク質の数。
【表２】
2016538545.tif 000004
1:正常肝臓; 2:HCC; 3:TACE後のHCC、肝細胞性部分; 4:TACE後のHCC、胆管細胞性部分; 5:末梢CC; 6:PSCを含まない肝門部CC; 7:PSCを含む肝門部CC; 8:転移性結腸直腸癌。
【００７３】
表2〜10に示されるマーカータンパク質は、以下の細胞型の区別を可能にする:
表2:正常肝細胞とHCC。
表3:末梢胆管癌と正常胆管。
表4:肝門部胆管癌と正常胆管。
表5:肝細胞癌と末梢胆管癌。
表6:肝細胞と胆管細胞。
表7:TACE後の肝臓腫瘍内の肝細胞癌と胆管癌。
表8:末梢胆管癌と転移性結腸直腸癌。
表9:肝門部胆管癌と原発性硬化性胆管炎を伴う肝門部胆管癌。
表10:肝門部胆管癌と転移性結腸直腸癌。
【００７４】
この決定は、臨床医に、肝臓腫瘍の細胞表現型に関する知識、及び結果として、治療の種類及び評価に関する正確な決定を初めて提供するものであり、予後判定を提供することができる。各々の表について、効果量(g)の負の値は全て、第2の組織型と比べて第1の組織型でより低濃度で存在したマーカータンパク質に関する。効果量(g)の正の値は全て、第2の組織型と比べて第1の組織型でより高濃度で存在したマーカータンパク質に関する。
【００７５】
各々のタンパク質調節についての統計的有意性は、名前の付いた2つの組織型間の各々のタンパク質のスペクトルカウントの数を比較する関連のないt-検定を実施した後に計算されたp-値として示されている。標準化効果量の不偏推定量であるヘッジのgを、これらの推定量の95％信頼区間とともに計算した。g＜0.2という値は、極めて小さい差とみなされ、g＝0.5は、平均差とみなされ、g＞0.8は、大きい差とみなされる。非標準化効果量の推定量(すなわち、比較された2つの組織型における平均スペクトルカウントの差)も、これらの推定量の95％信頼区間とともに計算した。表には、これらの標準化効果量の不偏推定量と非標準化効果量の推定量を示した。Q-値(調整済みp値)は、p-値よりもストリンジェントな統計的有意性の尺度を提供するものであり、これを、直接的な偽発見率アプローチを用いて計算した。ここには個々のQ-値を示していないが、≦0.05のq-値を有する全てのマーカータンパク質を各表2〜10のセクションAに記載し、一方、≦0.05のp-値を有する全てのマーカータンパク質を各表2〜10のセクションBに示している。
【００７６】
表2〜10に示されるマーカータンパク質のタンパク質発現レベルは、当技術分野で周知であるスペクトルカウンティング(共通のペプチド及び固有のペプチド)に基づく標識を使用しないLC-MS/MS定量を用いて決定された。2つの組織型間の平均スペクトルカウントにおいて統計的に有意な差を示す全てのマーカータンパク質が表2〜10に示されている。本発明者らは、各々のタンパク質についての最も強度の高い3つのペプチドのMS1ピークの曲線下面積(AUC)に基づく別のデータ解析法も使用した。表11(図7)のマーカータンパク質(467個のマーカータンパク質)中のマーカータンパク質は全て、両方の定量方法(共通のペプチドと固有のペプチドの両方のスペクトルカウンティング及びAUC)に共通する組織比較のうちの少なくとも1つにおいて有意に調節されることが分かった。表には、組織型比較(組織型番号対組織型番号)、uniprot ID、及びタンパク質名が、両方の定量方法についてのP-値、t-スコア、及びlog2倍率変化値とともに含まれている。
【００７７】
表2〜10において、有意に調節されるマーカータンパク質は、ストリンジェントなq-値(セクションA)によってフィルタリングされ、その後、あまりストリンジェントでないp-値(セクションB)によってフィルタリングされた。表11(図7)において、マーカータンパク質は、p-値及び倍率変化(組み合わせたもの)に基づいてフィルタリングされた。まとめると、表2〜10は、スペクトルカウントのみを定量に考慮したのに対し、表11は、スペクトルカウントと曲線下面積を考慮した。
【００７８】
表2は、正常肝細胞と肝細胞癌細胞(HCC)とを区別する際に使用するタンパク質マーカーを提供する。
表2−正常肝細胞と肝細胞癌とを識別するタンパク質*
【表３】
2016538545.tif 000005
2016538545.tif 000006
2016538545.tif 000007
2016538545.tif 000008
2016538545.tif 000009
2016538545.tif 000010
2016538545.tif 000011
*太字は、正常肝細胞と比較した肝細胞癌における相対発現の増加を示す。
【００７９】
表2は、マーカータンパク質が、正常肝細胞と比べて、HCCで相対的に過剰発現されているのか(太字で識別されているもの)、それとも過小発現されているのかに関する情報を提供する。したがって、複数のこれらのマーカータンパク質の存在、不在、又は発現レベルの変化を決定し、これらの変化を既知の発現レベルの参照と比較することにより、試験下の細胞がHCCであるのか、それとも正常肝細胞であるのかを決定することができる。複数のマーカータンパク質は、全体として表2から、又は好ましくは、2つの細胞型間でより大きい統計的有意差を示すマーカータンパク質を記載しているパートAから選択することができる。
【００８０】
表3は、マーカータンパク質が、正常胆管細胞と比べて、末梢胆管癌で相対的に過剰発現されているのか(太字で識別されているもの)、それとも過小発現されているのかに関する情報を提供する。したがって、複数のこれらのマーカータンパク質の存在、不在、又は発現レベルの変化を決定し、これらの変化を既知の発現レベルの参照と比較することにより、試験下の細胞が末梢胆管癌であるのか、それとも正常胆管細胞であるのかを決定することができる。
表3−末梢胆管癌と正常胆管細胞とを識別するタンパク質*
【表４】
2016538545.tif 000012
2016538545.tif 000013
2016538545.tif 000014
*太字は、正常胆管細胞と比較した末梢胆管癌における相対発現の増加を示す。
【００８１】
表4は、マーカータンパク質が、正常胆管細胞と比べて、肝門部胆管癌で相対的に過剰発現されているのか(太字で識別されているもの)、それとも過小発現されているのかに関する情報を提供する。したがって、複数のこれらのマーカータンパク質の存在、不在、又は発現レベルの変化を決定し、これらの変化を既知の発現レベルの参照と比較することにより、試験下の細胞が肝門部胆管癌であるのか、それとも正常胆管細胞であるのかを決定することができる。
表4−肝門部胆管癌と正常胆管細胞とを識別するタンパク質*
【表５】
2016538545.tif 000015
2016538545.tif 000016
2016538545.tif 000017
*太字は、正常胆管細胞と比較した肝門部胆管癌における相対発現の増加を示す。
【００８２】
表5は、マーカータンパク質が、肝細胞癌と比べて、末梢癌で相対的に過剰発現されているのか(太字で識別されているもの)、それとも過小発現されているのかに関する情報を提供する。したがって、複数のこれらのマーカータンパク質の存在、不在、又は発現レベルの変化を決定し、これらの変化を既知の発現レベルの参照と比較することにより、試験下の細胞が肝細胞癌であるのか、それとも末梢癌であるのかを決定することができる。
表5−肝細胞癌と末梢胆管癌とを識別するタンパク質*
【表６】
2016538545.tif 000018
2016538545.tif 000019
2016538545.tif 000020
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2016538545.tif 000028
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2016538545.tif 000030
*太字は、肝細胞癌と比較した末梢胆管癌における相対発現の増加を示す。
【００８３】
表6は、マーカータンパク質が、正常肝細胞と比べて、正常胆管細胞で相対的に過剰発現されているのか(太字で識別されているもの)、それとも過小発現されているのかに関する情報を提供する。したがって、複数のこれらのマーカータンパク質の存在、不在、又は発現レベルの変化を決定し、これらの変化を既知の発現レベルの参照と比較することにより、試験下の細胞が正常胆管細胞であるのか、それとも正常肝細胞であるのかを決定することができる。
表6−正常肝細胞と正常胆管細胞とを識別するタンパク質*
【表７】
2016538545.tif 000031
2016538545.tif 000032
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2016538545.tif 000040
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2016538545.tif 000058
2016538545.tif 000059
*太字は、正常肝細胞と比較した正常胆管細胞における相対発現の増加を示す。
【００８４】
表7は、マーカータンパク質が、TACE後の肝臓腫瘍内の胆管癌と比べて、肝細胞癌で相対的に過剰発現されているのか(太字で識別されているもの)、それとも過小発現されているのかに関する情報を提供する。したがって、複数のこれらのマーカータンパク質の存在、不在、又は発現レベルの変化を決定し、これらの変化を既知の発現レベルの参照と比較することにより、試験下の細胞がTACE後の肝臓腫瘍内の胆管癌であるのか、それとも肝細胞癌であるのかを決定することができる。
【００８５】
表7のセクションAのマーカータンパク質は全て、0.05以下のq-値を有するタンパク質である。太字の(及び負の効果量(g)を有する)マーカータンパク質は、TACE後のCC領域と比べて、TACE後のHCC領域で存在量がより少ない。表7Bのマーカータンパク質は全て、0.05以下のp-値を有するマーカータンパク質である。
表7−TACE後の肝臓腫瘍内の肝細胞癌と胆管癌を識別するタンパク質*
【表８】
2016538545.tif 000060
2016538545.tif 000061
2016538545.tif 000062
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2016538545.tif 000067
2016538545.tif 000068
*太字は、TACE後の肝細胞癌と比較した胆管癌における相対発現の増加を示す。
【００８６】
表8は、マーカータンパク質が、TACE後の肝臓腫瘍内の転移性結腸直腸癌と比べて、末梢胆管癌で相対的に過剰発現されているのか(太字で識別されているもの)、それとも過小発現されているのかに関する情報を提供する。したがって、複数のこれらのマーカータンパク質の存在、不在、又は発現レベルの変化を決定し、これらの変化を既知の発現レベルの参照と比較することにより、試験下の細胞が末梢胆管癌であるのか、それとも転移性結腸直腸癌であるのかを決定することができる。
表8−末梢胆管癌と転移性結腸直腸癌とを識別するタンパク質*
【表９】
2016538545.tif 000069
2016538545.tif 000070
2016538545.tif 000071
2016538545.tif 000072
*太字は、末梢胆管癌と比較した転移性結腸直腸癌における相対発現の増加を示す。
【００８７】
表9は、マーカータンパク質が、TACE後の肝臓腫瘍内のHCC＋原発性硬化性胆管炎と比べて、肝門部胆管癌で相対的に過剰発現されているのか、それとも過小発現されているのかに関する情報を提供する。したがって、複数のこれらのマーカータンパク質の存在、不在、又は発現レベルの変化を決定し、これらの変化を既知の発現レベルの参照と比較することにより、試験下の細胞が末梢肝門部胆管癌であるのか、それとも原発性硬化性胆管炎であるのかを決定することができる。
表9−肝門部胆管癌と原発性硬化性胆管炎を伴う肝門部胆管癌とを識別するタンパク質*
【表１０】
2016538545.tif 000073
【００８８】
表10は、肝門部胆管癌と結腸直腸転移の間で有意差を示したマーカータンパク質としての情報を提供する。
表10
【表１１】
2016538545.tif 000074
2016538545.tif 000075
【００８９】
表11(図7)は、両方の定量方法(スペクトルカウンティング及び曲線下面積)に共通した組織比較のうちの少なくとも1つにおいて有意に調節されることが分かった固有のペプチド配列と共通のペプチド配列の両方を有するマーカータンパク質(467個)のリストを示している。表11には、組織型比較(組織型番号対組織型番号)、Uniprot ID、及びタンパク質名が、両方の定量方法についてのP-値、t-スコア、及びlog2倍率変化値とともに含まれている。正のLog2倍率変化は、第1の組織型と比較して第2の組織型で上方調節されたタンパク質を指し、一方、負のLog2倍率変化は、第2の組織型で下方調節されたタンパク質を指す(例えば、組織比較1_2において、P51857(AK1D1)は、曲線下面積について-3.0581及びスペクトルカウントについて-2.6145のLog2倍率変化を生じた。これは、P51857が、組織1(正常肝臓)と比較して組織2(HCC)で減少したことを意味する)。
【００９０】
したがって、本発明は、任意の適切な手段によってその相対発現を決定することにより、異なる肝臓細胞表現型を区別することができるマーカータンパク質を初めて提供するものである。本明細書における開示は、どのようにしてそのような発現レベルを利用することができるかではなく、どのようにしてそのような発現レベルを決定及び/又は定量することができるかの詳細を提供しており、定量方法それ自体は、本発明の限定要素ではない。
【００９１】
本発明は、肝臓組織試料の細胞表現型を決定する方法であって、
(1)該肝臓組織試料からマーカータンパク質を抽出すること;
(2)該試料における複数のマーカータンパク質の発現レベルを決定すること(ここで、該複数のマーカータンパク質は、表2〜10のうちのいずれか1つ又は表11の関連セクションによって表されるバイオマーカーパネルから選択される);任意に、表2〜11のうちのいずれか1つから選択される異なる複数のマーカータンパク質を用いて、工程(2)を反復すること;
(3)該決定された発現レベルを既知の細胞表現型における該複数のマーカータンパク質の参照発現レベルと比較し、それにより、該肝臓組織試料の細胞表現型を決定すること
を含む、方法を提供する。
【００９２】
本発明は、肝臓細胞の細胞表現型を特定する方法であって、
(1)該肝臓細胞における複数のマーカータンパク質の発現レベルを決定すること;
(2)該決定された発現レベルを、該複数のマーカータンパク質の発現レベルの参照セットであって、該参照レベルが特定の細胞表現型を表す、参照セットと比較すること;
(3)該肝臓細胞におけるマーカータンパク質の発現レベルと参照発現レベルの比較に基づいて、該肝臓細胞の細胞表現型を特定すること;
を含み、
ここで、該複数のマーカータンパク質が、表2〜11のうちのいずれか1つによって表されるバイオマーカーパネルから選択される、方法も提供する。
【００９３】
好ましくは、既知の細胞表現型は、正常肝臓上皮細胞(肝細胞)、正常胆管上皮細胞(胆管細胞)、肝細胞癌細胞、末梢胆管細胞癌細胞、及び肝門部胆管細胞癌細胞を含む。
【００９４】
全ての場合において、複数のマーカータンパク質は、全体として関連する表によって表されるバイオマーカーパネルから、又は最も大きい統計的有意差を示すマーカータンパク質を含む表のパートAから選択することができる。或いは、複数のマーカータンパク質は、表全体又はパートAのいずれかからの2つの細胞型と比較したとき、過剰発現されるか(太字で識別されているもの)又は過小発現されることが示されたものから選択することができる。
【００９５】
或いは、複数のマーカータンパク質は、関連する組織比較についての表11から選択することができる。
【００９６】
全ての場合において、複数のタンパク質は、それぞれの表に提供された2個、3個、5個、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、120個、又はそれより多くのタンパク質マーカーを含み得る。表5に関して、複数のマーカータンパク質は、2個、3個、5個、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、又はそれより多くのタンパク質マーカーを含み得る。
【００９７】
或いは、本方法は、表2〜10のいずれか1つに提供されたタンパク質マーカーの存在又は少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％の発現レベルの変化を決定することを含み得る。
【００９８】
一実施態様において、本方法は、表2〜10のうちのいずれか1つ又は表11又は表11の関連セクションに提供されたタンパク質マーカーの存在又は100％の発現レベルの変化を決定し得る。
【００９９】
好ましくは、複数のマーカータンパク質は、コラーゲンアルファ1(XVIII)鎖、プラスチン-3、AKR1B10、フィブロネクチン、ベータ3チューブリン、アスポリン、14-3-3タンパク質イータ、もしくはジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質3のうちのいずれか1つ、又はこれらの組合せから選択され、好ましくは、複数のマーカータンパク質は、AKR1B10及び/又はベータ3チューブリンを含む。
【０１００】
肝臓組織試料は、肝臓腫瘍を有することが疑われる個体から採取された生検試料であってもよい。或いは、生検は、肝臓腫瘍の治療、例えば、肝動脈化学塞栓療法を伴う又は伴わない手術、移植を以前に受けたことがある個体から採取されてもよい。
【０１０１】
該複数のマーカータンパク質の発現レベルを決定する工程は、該試料中のマーカータンパク質の存在又は不在、及び発現レベルの変化の度合いを決定することを含む。細胞表現型についての既知の発現レベルの参照又は標準と比較する場合、該存在、不在、又は発現の度合いの変化は、細胞表現型を示すものとなる。
【０１０２】
本発明のこの態様及び全ての他の態様について、参照又は標準タンパク質発現レベルを、同じ対象由来の非腫瘍肝臓組織から決定することができる。このように、タンパク質発現レベルの差を用いて、肝臓腫瘍の細胞表現型を決定することができる。或いは、参照レベルは、表2〜10のうちのいずれか1つもしくは複数又は表11の関連セクションから選択されるような、対象となるマーカータンパク質の発現レベルを表すデータを含むデータベースであってもよい。参照レベルが、肝臓腫瘍分類システム、例えば、本発明によるものによって提供されることが理想的である。発現レベルを表すデータは、多数の肝臓試料から得られ、かつ平均又は範囲として提示されたデータ集であってもよい。データは、対象となるタンパク質に各々固有である特定のペプチドのレベルに関するものであってもよい。
【０１０３】
表5に提供されるバイオマーカーにより、正確でかつ信頼性のある区別がHCC細胞とCC細胞の間でなされることが初めて可能になる。
【０１０４】
特に、表5から選択されるマーカータンパク質もしくはその断片、又は該タンパク質に対する抗体、又は該タンパク質もしくはその断片をコードする核酸を、肝臓細胞の細胞表現型を決定するためのマーカーとして使用することができ、ここで、該細胞表現型は、HCC又はCCから選択される。
【０１０５】
好ましくは、肝臓腫瘍細胞の細胞表現型を決定する方法であって、
(1)該肝臓腫瘍細胞における表5から選択される複数のマーカータンパク質のタンパク質発現レベルを決定すること;
(2)該タンパク質発現レベルを該複数のマーカータンパク質の発現レベルの参照と比較すること;及び
(3)該複数のマーカータンパク質の発現レベルの比較に基づいて、該細胞の該細胞表現型を決定すること;
を含み、
ここで、該肝臓腫瘍細胞の該細胞表現型がHCC又はCCから選択される、方法が提供される。
【０１０６】
肝臓腫瘍細胞が、肝臓腫瘍の治療、例えば、肝動脈化学塞栓療法を伴う手術、移植を以前に受けたことがある個体から採取された生検由来のものである場合、表5から選択されるものに加えて、又はその代わりに、表7から選択される複数のマーカータンパク質のタンパク質発現レベルを決定することが好ましい場合がある。
【０１０７】
したがって、一実施態様において、肝臓腫瘍細胞の細胞表現型を決定する方法は:
(1)該肝臓腫瘍細胞における
a)表5、又は
b)表7、又は
c)表5及び表7、又は
d)表5A、又は
e)表7A、又は
f)表5A及び表7A
から選択される複数のマーカータンパク質のタンパク質発現レベルを決定すること;
(2)該タンパク質発現レベルを該複数のマーカータンパク質の発現レベルの参照と比較すること;並びに
(3)該複数のマーカータンパク質の発現レベルの比較に基づいて、該細胞の該細胞表現型を決定すること;
を含み、
ここで、該肝臓腫瘍細胞の該細胞表現型は、HCC又はCCから選択される。
【０１０８】
また、本明細書において決定されるマーカータンパク質を、診断法及び/もしくは予後判定法のための並びに/又は肝臓腫瘍細胞の細胞表現型の決定に基づく個体の治療レジメンの選択もしくは決定のための腫瘍抗原としても使用し得ることが理解されるであろう。例えば、マーカータンパク質又はその断片は、細胞死の結果として、血流中に分泌されるか又は血流中に失われる可能性があり、したがって、標準的な技術、例えば、抗体を用いて、血液、尿、又は唾液試料から検出することができる。そのようなタンパク質マーカー(例えば、腫瘍抗原)の検出により、臨床医は、個体が肝臓癌を有するかどうかを決定し、かつ腫瘍の細胞分類を決定することが可能になる。したがって、同じ方法を用いて、限定されないが、血液、唾液、又は尿由来のものを含む試料を用いて、初期の肝臓腫瘍を診断し得ると想定される。
【０１０９】
したがって、個体における肝臓腫瘍の診断又は予後モニタリングの方法であって、
(a)該個体から得られる肝臓腫瘍細胞における、表2〜10のうちのいずれか1つ又は表11の関連セクションによって表されるバイオマーカーパネルから選択される複数のマーカータンパク質の存在又は発現レベルを決定すること;
(b)該肝臓腫瘍細胞の細胞表現型を特定すること;及び
(c)該肝臓腫瘍細胞の細胞表現型に基づいて診断又は予後判定を選択すること
を含む、方法が提供される。
【０１１０】
さらに、肝臓腫瘍を有する個体の治療レジメンを決定する方法であって、
(a)該個体から得られる肝臓腫瘍細胞における、表2〜10のうちのいずれか1つ又は表11の関連セクションによって表されるバイオマーカーパネルから選択される複数のマーカータンパク質の存在又は発現レベルを決定すること;
(b)該肝臓腫瘍細胞の細胞表現型を特定すること;及び
(c)該肝臓腫瘍細胞の細胞表現型に基づいて治療レジメンを選択すること
を含む、方法が提供される。
【０１１１】
特に、本発明による方法は、表5及び/又は表7に提供される複数のタンパク質マーカーに関して確認されたタンパク質発現レベルに基づく肝臓腫瘍細胞の細胞表現型の決定に基づくことができる。
【０１１２】
本方法は、決定された発現レベルを、該複数のマーカータンパク質の以前に決定された参照レベルと比較することを含み得る。参照レベルは、好ましくは、予め決定されたレベルであり、これは、例えば、アクセス可能なデータ記録の形態で提供されてもよい。参照レベルは、表5及び/又は表7で同定されているいくつかのバイオマーカーの発現レベルの好ましい代表例であり、1つずつは、既知の細胞表現型から得られる値の導き出された平均及び範囲である。他の実施態様においては、参照レベルが、検討されている細胞表現型に応じて、本明細書に提供される表によって表される他のバイオマーカーパネルから選択されるマーカータンパク質の発現レベルを表すものであり得ることが理解されるであろう。
【０１１３】
肝臓腫瘍細胞は、好ましくは、個体由来の肝臓腫瘍生検に由来するものであり、より好ましくは、バイオマーカーパネルは、表5によって、より好ましくは、表5のパートAによって表される。
【０１１４】
またさらに、複数のマーカータンパク質は、表11のセクション2_5のバイオマーカーパネルから選択されることが好ましい。
【０１１５】
生検が、肝動脈化学塞栓療法(TACE)による治療を以前に受けたことがある患者由来のものである場合、複数のマーカータンパク質は、表7又は表7のパートAのバイオマーカーパネルから選択されることが好ましい。より好ましくは、複数のマーカータンパク質は、表11のセクション3_4から選択される。
【０１１６】
本明細書に提供される全ての方法について、マーカータンパク質の第2のセットの発現レベルを決定するさらなる工程が実施され得ることが想定される。マーカータンパク質の第2のセットは、第1のセットと同じバイオマーカーパネルから選択されてもよく、又は本明細書中の表によって表される異なるバイオマーカーパネルから選択されてもよい。例えば、本方法は、表5、又は表11の関連セクションから選択される複数のマーカータンパク質の発現レベルを最初に決定し、その後、表7(又は表11の関連セクション)から選択される複数のマーカータンパク質の発現レベルを決定することを含み得る。マーカータンパク質の第1のセット及び第2のセットの発現レベルは、順次又は同時に測定することができる。
【０１１７】
複数のマーカータンパク質の存在又は発現レベルの変化を決定することは、多くの方法で達成されてもよく、該方法は全て、十分に当業者の能力の範囲内にある。
【０１１８】
決定は、マーカータンパク質レベル、これらのマーカータンパク質をコードする核酸の直接的な定量を伴ってもよく、又は決定は、例えば、存在するマーカータンパク質の量と関連付けられる尺度を提供するアッセイを用いる、間接的な定量を伴ってもよい。
【０１１９】
したがって、複数のマーカータンパク質の存在又は発現レベルを決定することは、
(a)肝臓細胞を複数の結合メンバーと接触させること(ここで、各々の結合メンバーは、該複数のマーカータンパク質のうちの1つ又は該マーカータンパク質をコードする核酸配列に選択的に結合する);並びに
(b)該特異的結合メンバー及びマーカータンパク質又は該マーカータンパク質をコードする核酸配列によって形成される複合体を検出及び/又は定量すること
を含むことができる。
【０１２０】
結合メンバーは、マーカータンパク質もしくはその部分に特異的な抗体であってもよく、又は結合メンバーは、マーカータンパク質の存在、発現の増加又は減少を表す核酸分子に結合する核酸分子、例えば、mRNA配列であってもよい。
【０１２１】
特定のマーカータンパク質に対して作製される抗体は、該マーカータンパク質の任意の生物学的に関連のある状態に対するものであってもよい。したがって、例えば、これらを、体内にグリコシル化形態で存在するタンパク質の非グリコシル化形態に対して、タンパク質の前駆体形態、もしくは例えば、そのシグナル配列がない、前駆体タンパク質のより成熟した形態に対して、又はマーカータンパク質の関連エピトープを担持するペプチドに対して作製することができる。
【０１２２】
検出及び/又は定量は、1以上のマーカータンパク質の既知の発現レベルの標準を用いて標準曲線を作成すること、及び上の工程(b)で得られる複合体のレベルと比較することを含み得る。
【０１２３】
様々な方法が、複数のマーカータンパク質の存在又はレベルの変化を決定するのに好適である可能性があり:非限定的な例として、これらには、ウェスタンブロット、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、RIA(放射免疫アッセイ)、競合EIA(競合酵素免疫アッセイ)、DAS-ELISA(二重抗体サンドイッチ-ELISA)、液体免疫アレイ技術、免疫細胞化学的又は免疫組織化学的技術、特異的抗体を含むタンパク質マイクロアレイの使用に基づく技術、「ディップスティック」アッセイ、親和性クロマトグラフィー技術、及び液体結合アッセイが含まれる。
【０１２４】
抗体は、当技術分野で標準的である技術を用いて取得することができる。抗体を産生する方法は、哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、又はサル)をタンパク質又はその断片で免疫することを含む。抗体を、当技術分野で公知の様々な技術のいずれかを用いて、免疫された動物から取得し、好ましくは、対象となる抗原への抗体の結合を用いてスクリーニングすることができる。例えば、ウェスタンブロッティング技術又は免疫沈降を使用することができる(Armitageらの文献、Nature, 357:80-82, 1992)。動物からの抗体及び/又は抗体産生細胞の単離は、動物を屠殺する工程を伴ってもよい。哺乳動物をペプチドで免疫することの代替又は補足として、タンパク質に特異的な抗体を、例えば、その表面に機能的な免疫グロブリン結合ドメインを提示するラムダバクテリオファージ又は繊維状バクテリオファージを用いて、発現された免疫グロブリン可変ドメインの組換え産生ライブラリーから取得することができる;例えば、WO92/01047号を参照されたい。ライブラリーは、未感作のもの、すなわち、どのタンパク質(もしくは断片)でも免疫されていない生物から得られる配列から構築されたものであってもよく、又は対象となる抗原に暴露された生物から得られる配列を用いて構築されたものであってもよい。
【０１２５】
本発明による抗体は、当技術分野で周知であるいくつかの方法で修飾することができる。実際、「抗体」という用語は、所要の特異性を有する結合ドメインを有する任意の結合物質を含むものとみなされるべきである。したがって、本発明は、抗体断片、抗体の誘導体、機能的等価物、及びホモログを含み、これには、合成分子、及びその形状が抗体の形状を模倣し、抗体が抗原又はエピトープに結合することが可能になる分子を含む。もとの非ヒト抗体よりも免疫原性が低い抗体を提供するように、非ヒト源由来のCDRが、通常、フレームワークアミノ酸残基の一部の改変を伴って、ヒトフレームワーク領域上に移植されているヒト化抗体も、本発明に含まれる。
【０１２６】
本発明によるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、遺伝子突然変異又は他の変化を受けてもよい。もとの抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ分子を産生するために、モノクローナル抗体を組換えDNA技術の技術に供することができることが当業者によってさらに理解されるであろう。そのような技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域又は相補性決定領域(CDR)をコードするDNAを異なる免疫グロブリンの定常領域又は定常領域＋フレームワーク領域に導入することを含み得る。例えば、EP 0 184 187 A号、GB 2 188 638 A号、又はEP 0 239 400 A号を参照されたい。キメラ抗体のクローニング及び発現は、EP 0 120 694 A号及びEP 0 125 023 A号に記載されている。
【０１２７】
本明細書に開示される方法に従って使用するための好ましい抗体は、他のポリペプチドに結合することができる抗体などの夾雑物を含まない及び/又は血清成分を含まないという意味において、単離されている。ポリクローナル抗体は、本発明の範囲内であるが、いくつかの目的のために、モノクローナル抗体が好ましい。例えば、本明細書で使用された一次モノクローナル抗体は、抗AKR1B10(クローン1A6; 1:500; Abcam, Cambridge, UK)及び抗チューブリンベータ3(クローンTU20; 1:500; Abcam)であった。
【０１２８】
試料に対する抗体の結合は、任意の適当な手段によって決定することができる。個々のレポーター分子によるタグ化は1つの可能性である。レポーター分子は、直接的に又は間接的に、検出可能な、好ましくは、測定可能なシグナルを発生させることができる。レポーター分子の結合は、直接的に又は間接的に、共通結合によるもの、例えば、ペプチド結合を介するもの、又は非共通結合によるものであってもよい。ペプチド結合を介する結合は、抗体とレポーター分子をコードする遺伝子融合体の組換え発現の結果としてのものであってもよい。1つの好ましい様式は、各々の抗体と、個々の蛍光色素、リン光体、又はスペクトル的に離れた吸収もしくは放出特徴を有するレーザー励起色素との共通結合によるものである。好適な蛍光色素としては、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリスリン、及びテキサスレッドが挙げられる。好適な発色性色素としては、ジアミノベンジジンが挙げられる。
【０１２９】
他のレポーターとしては、巨大分子性コロイド粒子、又は着色されているか、磁気を帯びているか、もしくは常磁性であるラテックスビーズなどの微粒子材料、及び視覚的に観察されるか、電子的に検出されるか、又は他の方法で記録される検出可能なシグナルを直接的に又は間接的に生じさせることができる生物学的又は化学的活性物質が挙げられる。例えば、これらの分子は、発色もしくは変色させるか又は電気的性質の変化をもたらす反応を触媒する酵素であってもよい。これらは、エネルギー状態間の電子遷移が特徴的なスペクトル吸収又は放出をもたらすように、分子として励起可能なものであってもよい。これらには、バイオセンサーとともに使用される化学実体が含まれ得る。ビオチン/アビジン又はビオチン/ストレプトアビジン及びアルカリホスファターゼ検出系を利用してもよい。
【０１３０】
本発明による1以上(又は複数)のマーカータンパク質の過剰発現の決定は、当業者に周知の多くの異なる方法で行うことができ、該方法には、例として、個体から得られる試料(組織又は血液)中の該マーカータンパク質もしくはその断片の存在もしくは発現量を決定すること、又は例えば、マーカータンパク質遺伝子から発現されるマーカータンパク質mRNAレベルを調べることにより、マーカータンパク質遺伝子の発現を決定することが含まれる。
【０１３１】
好ましくは、本方法は、マーカータンパク質の発現レベルを検出することを含む。そのような検出は、該ポリペプチド又はその断片を認識することができる抗体又は抗体断片を該試料(組織又は血液)と接触させる工程を含み得る。
【０１３２】
解析は、例えば、1以上のマーカータンパク質の存在を、例えば、免疫組織化学染色を用いる顕微鏡観察によってモニタリングすることによる、定性的解析を含み得る。免疫組織化学的解析は、ホルマリン固定パラフィン固定試料又は凍結組織試料のいずれかに対して行うことができる。
【０１３３】
1以上のマーカータンパク質を検出及び定量するために使用し得る考えられるIHC法の例は、本発明に記載されている通りである。
【０１３４】
一態様において、本発明は、対象の再発性又は原発性肝臓腫瘍を診断する方法であって、試料中のコラーゲンアルファ1(XVIII)鎖、プラスチン-3、AKR1B10、フィブロネクチン、ベータ3チューブリン、アスポリン、14-3-3タンパク質イータ、及びジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質3からなる群から選択される1以上のマーカータンパク質の有無を決定することを含む、方法を提供する。好ましくは、肝臓腫瘍は、肝細胞癌、末梢胆管細胞癌、又は肝門部胆管細胞癌細胞からなる群から選択される。
【０１３５】
この態様の一実施態様において、マーカータンパク質は、ベータ3チューブリン及び/又はAKR1B10、好ましくは、ベータ3チューブリンである。
【０１３６】
別の実施態様において、試料は、血液、血漿、血清、肝臓組織、肝臓細胞のうちのいずれか1つ、又はこれらの組合せから選択され、好ましくは、試料は、肝臓組織、任意に、ホルマリン固定パラフィン包埋肝臓組織切片である。
【０１３７】
別の実施態様において、試料中の1以上のマーカータンパク質の有無を決定することは、免疫組織化学検査(IHC)又は質量分析のいずれかによって行われる。
【０１３８】
1つの好ましい実施態様において、対象の再発性又は原発性肝臓腫瘍を診断する方法は、試料中のベータ3チューブリン、及び任意に、AKR1B10の有無を決定することを含み、ここで、該肝臓腫瘍は、肝細胞癌、末梢胆管細胞癌、又は肝門部胆管細胞癌細胞からなる群から選択され、該試料は、肝臓組織、任意に、ホルマリン固定パラフィン包埋肝臓組織切片であり、試料中の1以上のマーカータンパク質の有無を決定することは、免疫組織化学検査(IHC)によって行われる。
【０１３９】
より好ましくは、本方法は、一次抗体を用いてベータ3チューブリンを決定することを含む。
【０１４０】
さらなる例として、結合アッセイでマーカータンパク質、例えば、ベータ3チューブリン及び/又はAKR1B10に特異的に結合することができる一次抗体は、検出可能な分子、例えば、限定されないが、放射性標識もしくは蛍光標識で又は発色基質を利用する酵素に標識することができる。この技術において有用な放射性標識の例は、32P、3H、又は14Cである。この技術において有用な蛍光分子の例は、緑色蛍光タンパク質、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミンイソチオシアネート(TRICT)、Cy3色素、及びCy5色素である。この技術において有用な可能性がある発色基質を伴う酵素の例は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はグルコースオキシダーゼである。
【０１４１】
(上記のように)一次抗体自体からのシグナルを検出する代わりに、一次抗体に結合する二次抗体を利用することができる。二次抗体を、その例が上に記載されている検出のための好適な分子で標識することができる。
【０１４２】
代わりの検出方法において、一次又は二次抗体をビオチン分子で標識することができ、これをその後、検出用の好適な発色基質を伴うストレプトアビジン又はアビジン結合酵素によって結合させることができる。
【０１４３】
当業者に明白となる上記の技術のさらなるバリエーションが存在する。
【０１４４】
本発明の文脈において、そのような技術において使用することができる抗体は、動物の免疫を伴う標準的な技術により作製することができ、又は組換え技術によりインビトロで作製することができる。抗体は、この文脈において、抗イディオタイプに対応する全免疫グロブリン又は抗体の断片(Fab断片)であることができる。そのような抗体は、上で論じられているように、当業者によって容易に産生されることができる。
【０１４５】
本発明は、マーカータンパク質を検出するための及びこれから細胞表現型を決定し得る組織学的解析の使用、並びに個体に対する適切な診断及び予後判定を示している。
【０１４６】
一実施態様において、本方法は、肝臓腫瘍組織切片中の、好ましくは、チューブリンベータ3及び/又はAKR1B10タンパク質を含む、複数のマーカータンパク質の測定を含む。切片は、組織学の分野ではルーチンであるような、新鮮な凍結切片又はホルマリン固定パラフィン包埋切片であってもよい。切片の染色は、標的タンパク質に特異的な一次抗体による検出の前に、抗原賦活化の工程を必要とする場合がある。
【０１４７】
したがって、本発明は、結合メンバー、例えば、抗体を用いて、1以上のマーカータンパク質(好ましくは、複数)の発現レベルを決定する方法を提供する。そのようなアッセイに関する材料及び方法は、以下でより詳細に記載されている。
【０１４８】
或いは、複数のマーカータンパク質に対する抗体は、マーカータンパク質又はその断片を検出剤として用いて、肝臓癌を有することが疑われる患者の血液又は唾液中で検出することができる。
【０１４９】
さらなる実施態様において、個体由来の試料中の1以上(又は複数)のマーカータンパク質の決定は、自己抗体の検出及び定量を含み得る。マーカータンパク質又はその断片は、そのような自己抗体に特異的に結合することができなければならない。ELISAなどの技術を使用することができる。複数のマーカータンパク質の濃度の変化は、参照又は対照試料中のレベルと比較した、それに対する自己抗体の存在又はレベルの変化を検出することによって確認することができる。
【０１５０】
自己抗体のレベルは、生検から得られた肝臓細胞もしくは肝臓腫瘍細胞又はインビトロで成長させた細胞株に対する(1D又は2D電気泳動からの)ウェスタンブロットによるか;或いは精製されたマーカータンパク質を用いるELISA、タンパク質マイクロアレイ、又はビーズ懸濁液アレイによって検出することができる。
【０１５１】
例として、異なる肝臓細胞表現型におけるマーカータンパク質に対する自己抗体の検出を、次の通りに実施することができる。組換えマーカータンパク質をバキュロウイルス感染昆虫細胞で発現させ、これを用いて、マイクロタイタープレートの表面をコーティングする。血液又は唾液試料、好ましくは、血液の血漿試料、及びより好ましくは、血液の血清試料を各々のマイクロタイタープレートの2連のウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートする。プレートを吸引し、洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識抗ヒトIgG抗血清を添加し、37℃で1時間インキュベートする。最後に、プレートを吸引し、洗浄し、その後、テトラ-メチルベンジジン(TMB)を添加することによって、抗ヒト抗血清の結合を明らかにする。テトラ-メチルベンジジン(TMB)は、HRPの存在下で、着色された生成物を生じ、その強度は、450nmでプレートを読み取ることによって測定される。二次抗体がHRP標識抗ヒトIgM抗血清であることを除いて、同一のセットのプレートを試験する。参照標準又は対照試料で見られるレベルと比較すると、肝臓細胞又は肝臓腫瘍細胞マーカーマーカータンパク質の各々に対するIgG、IgE、IgA、IgD、及び/又はIgM自己抗体のレベルは変化している。
【０１５２】
他の実施態様において、複数のタンパク質マーカーに対する自己抗体は、肝臓腫瘍試料由来の細胞を用いるウェスタンブロッティング法を使用し、その後、腫瘍内に存在するタンパク質マーカーに特異的な抗体の存在を検出することによって検出することができる。
【０１５３】
(i)抗体チップもしくはチップのアレイ、又はその抗体と相互作用する複数のマーカータンパク質を検出することができるビーズ懸濁液アレイ;或いは(ii)タンパク質チップもしくはチップのアレイ、又はマーカータンパク質と相互作用する1以上の自己抗体を検出することができるビーズ懸濁液アレイ;或いは(iii)抗体アレイとタンパク質アレイの両方の組合せを使用することが、本発明の範囲内で企図される。
【０１５４】
本発明の任意の態様による本明細書で企図される特異的結合メンバーのさらなるクラスは、アプタマー(核酸アプタマー及びペプチドアプタマーを含む)を含む。好都合なことに、タンパク質マーカーに対するアプタマーは、米国特許第5,475,096号及び第5,270,163号に記載されている、SELEX(対数的濃縮によるリガンドの系統的進化)として知られる技術によって提供することができる。
【０１５５】
或いは、マーカータンパク質をコードする核酸の示差発現を検出法として使用することができる。核酸の発現は、RT-PCR、ノーザンブロッティング、又はインサイチュハイブリダイゼーション、例えば、FISHなどの当技術分野で公知の方法によって検出することができる。
【０１５６】
逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)などの遺伝子発現技術は、mRNA発現レベルの正確な測定を与えることができ、試料中の1以上のマーカータンパク質mRNAの不在ではなく、その存在を用いて、細胞表現型分類を提供することもできる。RT-PCRは、定量的なバージョンを含む様々なフォーマットで及び単一の細胞におけるmRNAレベルの決定を可能にする感度で実施することができる。
【０１５７】
一実施態様において、マーカータンパク質遺伝子の発現は、試料中のマーカータンパク質mRNAの存在又は量を決定することによって評価することができ、これを行う方法は、当業者に周知である。例として、これらは、(i)マーカータンパク質核酸にハイブリダイズすることができる標識プローブを用いて;及び/又は(ii)マーカータンパク質転写物が試料中に存在するかどうかを決定するためのマーカータンパク質核酸配列に基づく1以上のプライマーを必要とするPCRを用いて、試料中のマーカータンパク質mRNAの存在を決定することを含む。また、プローブは、マイクロアレイに含まれる配列として固相化されていてもよい。
【０１５８】
本発明のこれらの及びその他の態様に従って、複数のマーカータンパク質は、コラーゲンアルファ1(XVIII)鎖、プラスチン-3、AKR1B10、フィブロネクチン、ベータ3チューブリン、アスポリン、14-3-3タンパク質イータ、もしくはジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質3のうちのいずれか1つ、又はこれらの組合せから選択され、好ましくは、複数のマーカータンパク質は、AKR1B10及び/又はベータ3チューブリンを含む。
【０１５９】
いくつかの実施態様において、複数のタンパク質マーカーの存在又は量の決定は、試験下の細胞に由来するmRNAの存在又は量を測定することを含む。検討下の肝臓細胞におけるタンパク質マーカーをコードするmRNAの存在又はレベルは、該細胞をその表現型によって分類することを可能にする。
【０１６０】
タンパク質マーカーをコードするmRNAのレベルを測定するのに好適な技術は、当業者に容易に利用可能であり、「リアルタイム」逆転写酵素PCR又はノーザンブロットを含む。タンパク質マーカーをコードするmRNAのレベルを測定する方法は、各々独立に、複数のタンパク質マーカーをコードする遺伝子のうちの1つの配列又はその相補体に対する複数のプライマー又はプローブを使用することを含み得る。該プライマー又はプローブの各々は、表5(又は表2〜10のいずれか又はまとめられた表11の関連セクション)に提供されるタンパク質マーカーをコードするヌクレオチド配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、98％、99％、又は100％の同一性を有する少なくとも10、15、20、25、30、又は50個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み得る。
【０１６１】
好ましくは、本発明によるプローブ又はプライマーは、ストリンジェントな条件下で、タンパク質マーカーをコードするその特異的な核酸配列にハイブリダイズする。
【０１６２】
本発明の方法は、肝臓細胞を上記のような結合メンバーと接触させることを含み得るが、該結合メンバーを細胞ライセートと接触させて、1以上の該マーカータンパク質との直接的又は間接的な接触を増大させることも含む。
【０１６３】
結合メンバーは、固体支持体上に固相化されていてもよい。これは、抗体アレイ又は核酸マイクロアレイの形態のものであってもよい。これらのようなアレイは、当技術分野で周知である。固体支持体を細胞ライセートと接触させ、それにより、結合メンバーが、1以上のマーカータンパク質の存在又は量を表す細胞産物に結合するのを可能にする。
【０１６４】
いくつかの実施態様において、結合メンバーは、マーカータンパク質又はその部分に結合することができる抗体又はその断片である。他の実施態様において、結合メンバーは、検出されるべき核酸の配列に結合することができる(すなわち、該配列に相補的な)核酸分子であってもよい。
【０１６５】
本方法は、固体支持体を、1以上のマーカータンパク質、抗体、又は核酸に結合することができる発色剤と接触させることをさらに含み得る。
【０１６６】
発色剤は、標識を含み得、本方法は、細胞、細胞培養培地、又は細胞ライセートにおける1以上のマーカータンパク質、抗体、又は核酸の存在又は量を表す値を得るために、標識を検出することを含み得る。
【０１６７】
標識は、例えば、放射性標識、蛍光体、リン光体、レーザー色素、発色性色素、巨大分子性コロイド粒子、着色されているか、磁気を帯びているか、もしくは常磁性であるラテックスビーズ、検出可能な結果をもたらす反応を触媒する酵素であってもよく、又は標識は、タグである。
【０１６８】
本方法は、好ましくは、単一の試料における複数のマーカータンパク質又は該マーカータンパク質をコードする核酸の存在又は発現レベルを決定することを含む。例えば、表5(又は表2〜10のうちのいずれか1つ又はまとめられた表11の関連セクション)から選択される複数のタンパク質マーカーのうちの1つに各々特異的な複数の結合メンバーは、固体支持体上の所定の場所に固相化されていてもよい。固体支持体上の結合メンバーの数は、該支持体上の結合メンバーの総数の10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、又は100％を占めてもよい。
【０１６９】
1以上のマーカータンパク質遺伝子の発現を検出するためのさらなる方法は、当業者に明白であろう。
【０１７０】
いくつかの実施態様において、1以上の該マーカータンパク質の存在又は発現レベルの決定は、質量分析により行うことができる。表5(又は表2〜10のうちのどれか他のもの又はまとめられた表11の関連セクション)から選択されるタンパク質マーカーのレベルを測定するのに好適な技術としては、SILAC、AQUA(WO 03/016861号に開示されており、その内容の全体は引用により本明細書中に具体的に組み込まれている)、及びTMTcalibrator(WO 2008/110581号に開示されており;その内容の全体は引用により本明細書中に具体的に組み込まれている)を含む、選択反応モニタリング(SRM)及び多重反応モニタリング(MRM)同位体希釈質量分析に関連する技術が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７１】
WO 2008/110581号には、アイソバリック質量タグを用いて参照試料中の全マーカータンパク質の別々のアリコートを標識する方法が開示されており、該アリコートは、標識後、標準較正曲線を作成するために、定量的比率で混合することができる。その後、試験試料を、同じセットのアイソバリック質量タグのさらなる独立したメンバーで標識し、較正曲線と混合する。この混合物をタンデム質量分析にかけ、特定のマーカータンパク質に由来するペプチドを、MS/MSスペクトルにおけるアイソバリック質量タグから遊離した固有の質量報告イオンの出現に基づいて同定及び定量することができる。
【０１７２】
参照レベルとして、既知の又は予測されるタンパク質マーカー由来ペプチドを、該タンパク質マーカーのトリプシン、ArgC、AspN、又はLys-C消化によって生成させることができる。いくつかの例において、質量分析に基づくタンパク質マーカーの決定を利用する場合、本発明の方法は、タンパク質マーカー及び/又は少なくとも1つのタンパク質マーカー由来ペプチドを含み、各々のアリコートが既知の分量のものである少なくとも2つの異なるアリコートを含む較正試料を提供することを含み、ここで、該生体試料及び各々の該アリコートは、1以上のアイソバリック質量標識で示差標識されている。好ましくは、アイソバリック質量標識は各々、質量分析で明瞭に識別することができる異なる質量マーカー群を含む。
【０１７３】
したがって、肝臓細胞の細胞表現型を決定する方法であって、既知のタンパク質マーカー由来ペプチドについての1以上の決定された遷移を用いる選択反応モニタリングにより、肝臓細胞における表5から(又は表2〜10のうちのいずれか1つ又はまとめられた表11の関連セクションから)選択される1以上の該マーカータンパク質の存在又は発現レベルを決定すること;決定された発現レベルを、特定の細胞表現型、例えば、HCC又はCCを表すことが以前に決定された発現レベルの参照セットと比較すること;並びに該1以上の、好ましくは、複数のマーカータンパク質の発現の変化に基づいて、細胞表現型を決定又は特定することを含む、方法。比較工程は、既知の量の対応する合成ペプチドを用いて、肝臓細胞由来のマーカータンパク質由来ペプチドの量を決定することを含み得る。合成ペプチドは、細胞から得られるペプチドと配列が同一であるが、異なる質量又は重同位体のタグなどの標識によって区別することができる。
【０１７４】
より好ましくは、該決定及び/又は定量は、質量分析により行われる。
【０１７５】
標識を含む又は含まない、1以上のこれらの合成タンパク質マーカー由来ペプチドは、本発明のさらなる態様を形成する。これらの合成ペプチドは、肝臓細胞の細胞表現型、特に、HCC又はCC表現型を決定するためのキットの形態で提供されてもよい。
【０１７６】
タンパク質発現のレベルを決定するための他の好適な方法としては、表面増強レーザー脱離イオン化-飛行時間型(SELDI-TOF)質量分析; LS/MS/MSを含む、マトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間型(MALDI-TOF)質量分析;エレクトロスプレーイオン化(ESI)質量分析;並びに好ましいSRM及びTMT-SRMが挙げられる。これらの方法の各々の前に、カラム又はバッチモードで行われる免疫沈降又は親和性クロマトグラフィーによるマーカータンパク質濃縮の工程があってもよい。限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びアプタマーを含む、マーカータンパク質に対する所要の特異性を有する任意の結合物質を、そのような濃縮で利用してもよい。
【０１７７】
液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS/MS)に基づくプロテオミクスは、培養細胞(原核生物/真核生物)及び組織(新鮮凍結/ホルマリン固定パラフィン包埋)を含む複雑な試料から多数のマーカータンパク質を同定し、正確に定量する点で従来の生化学的方法よりも優れていることが証明されており、偏りのない形での新規バイオマーカーの同定をもたらす[7,8,9]。本発明者らは、特定のホルマリン固定組織型のレーザーマイクロダイセクション(LMD)を使用し、それにより、正常肝細胞、正常胆管細胞、及びそのそれぞれの形質転換同等物について濃縮された保存用腫瘍材料の領域を、LC-MSプロテオミクスによって独立に解析することを可能にした。その優れた線形ダイナミックレンジ(2〜3桁の大きさ)及び高い定量的プロテオームカバレッジのために、スペクトルカウンティングを相対定量に使用した[10,11]。
【０１７８】
したがって、上で詳述されているように、本明細書に記載され、かつ表1A及び表2〜11に示されている複数のタンパク質マーカーのメンバーである示差発現タンパク質は、定性的に、その発現が、第2の細胞表現型と比べて第1の細胞表現型で活性化されているか、又は完全に不活化されていてもよい。そのような定性的に調節されるタンパク質は、1つの表現型、例えば、HCC又はCCでは検出されるが、両方で検出されることはない、所与の細胞型における発現パターンを示す。本明細書で使用される「検出される」は、本明細書に記載される技術を用いて検出されるタンパク質発現パターンを指す。
【０１７９】
或いは、本明細書に記載される複数のマーカータンパク質のメンバーである示差発現タンパク質は、その発現が、第2の細胞表現型と比べて第1の細胞表現型で調節されていてもよく、すなわち、定量的に増大又は減少していてもよい。発現が、比較されている細胞表現型、例えば、HCCとCCの間で異なる度合いは、標準的な特徴付け技術、例えば、2D-電気泳動ゲルの銀染色によって可視化されるのに十分な大きさでありさえすればよい。発現の差を可視化し得る他のそのような標準的な特徴付け技術は、当業者に周知である。これらには、クロマトグラフィーによるフラクションの連続的な分離及びピークの比較、キャピラリー電気泳動、マイクロチップ上でのものを含むマイクロチャネルネットワークを用いた分離、SELDI解析、並びにqPST解析が含まれる。
【０１８０】
クロマトグラフィーによる分離は、Pharmaciaの文献に記載されている通りに高速液体クロマトグラフィーによって実施することができ、クロマトグラムは、分離の時間に対する280nmでの光の吸光度のプロットの形態で得られる。次に、不完全に分解されたピークを生じる材料を、再度クロマトグラフィーにかけるなどする。
【０１８１】
キャピラリー電気泳動は、多くの刊行物に、例えば、Beckmanによって、そのP/ACE 5000システムに同梱される「Total CE Solutions」という文献に記載されている技術である。この技術は、小さいキャピラリーチューブ中に含まれる試料にわたって電位を印加することに依存する。チューブは、電荷を帯びた表面、例えば、負の電荷を帯びたケイ酸塩ガラスを有する。反対の電荷を帯びたイオン(この場合、正のイオン)は表面に引き付けられ、その後、表面と同じ極性の適当な電極(この場合、陽極)に移動する。試料のこの電気浸透流(EOF)において、正のイオンは、最も速く移動し、電荷を帯びていない材料及び負の電荷を帯びたイオンが続く。したがって、マーカータンパク質は、本質的には、その表面の電荷に従って分離される。
【０１８２】
マイクロチャネルネットワークは、キャピラリーに少し似た様子で機能し、ポリマー材料のフォトアブレーションによって形成されることができる。この技術では、UVレーザーを用いて、好適なUV吸収特性を有するポリマー、例えば、ポリエチレンテレフタレート又はポリカーボネートに一気に放出される高エネルギー光パルスを生成させる。入射光子は、限定された空間を有する化学結合を破壊し、内圧の上昇、小爆発、及びアブレーションされた材料の排出をもたらし、マイクロチャネルを形成する空隙を残す。マイクロチャネル材料は、キャピラリー電気泳動の場合と同様に、EOFに基づく分離を達成する。マイクロチャネル材料は、各々のチップが、それ自体の試料インジェクター、分離カラム、及び電気化学的検出器を有する、マイクロチップの形態に適合性がある: J.S.Rossierらの文献、1999, Electrophoresis 20: 727-731ページを参照されたい。
【０１８３】
ProteinChip技術と組み合わせた表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析(SELDI-TOF-MS)も、迅速でかつ感度の高いマーカータンパク質プロファイリング手段を提供することができ、2Dゲル電気泳動に代わるものとして補足的な様式で使用される。ProteinChipシステムは、タンパク質試料をチップの表面化学(例えば、アニオン性、カチオン性、疎水性、親水性など)に基づいて選択的に結合させることができるアルミニウムチップからなる。次いで、結合したマーカータンパク質は、モル濃度過剰のエネルギー吸収性小分子とともに共結晶化される。次いで、チップは、N2 320nm UVレーザーの高強度短パルスによって分析され、タンパク質が飛行時間型質量分析によって分離及び検出される。実験内の各々の群のスペクトルプロファイルを比較し、対象となる任意のピークを下記のような技術を用いてさらに分析して、タンパク質の正体を確認することができる。
【０１８４】
アイソトピック又はアイソバリックTandem Mass Tags(登録商標)(TMT(登録商標))(Thermo Scientific, Rockford, USA)技術を用いて、本明細書に記載されるバイオマーカーパネルのメンバーである示差発現マーカータンパク質を検出することもできる。簡潔に説明すると、比較用の試料中のマーカータンパク質を任意に消化し、安定同位体タグで標識し、質量分析によって定量する。このように、異なる試料中の等価なマーカータンパク質の発現を、そのそれぞれの同位体ピークの強度又はタンデム質量分析実験における断片化の間にTMT試薬から遊離したレポーターイオンの強度を比較することによって直接比較することができる。
【０１８５】
本明細書に記載される複数のタンパク質マーカーのメンバーである示差発現マーカータンパク質はさらに、標的マーカータンパク質及び/又はフィンガープリントマーカータンパク質と呼ぶことができる。本明細書で使用される「フィンガープリントマーカータンパク質」は、その発現パターンを予後判定又は診断に関する細胞表現型評価の一部として利用し得る示差発現タンパク質を指す。フィンガープリントタンパク質は、標的タンパク質又は経路タンパク質の特徴も有し得る。例えば、本明細書に記載される1以上のマーカータンパク質を、肝臓腫瘍マーカーとして及び肝臓細胞の細胞表現型を決定するものとして使用することができる。例えば、表2〜11に提供されるマーカーのいずれか、しかし、少なくともチューブリンベータ3及び/又はAKR1B10タンパク質を、肝臓腫瘍のマーカーとして使用し得ることが企図される。血液中でのこれらのタンパク質の検出は、おそらく肝臓癌の診断ツールを提供することになるであろう。マーカータンパク質は、細胞死の後、血流中に分泌されるか又は血液中に失われる可能性があり、循環腫瘍抗原としての役割を果たし得る。
【０１８６】
上記のように、本発明は、1以上のマーカータンパク質を個体由来の肝臓組織試料、血液又は唾液試料中で決定し得るいくつかの方法を提供する。本方法は、表2〜10のうちのいずれか1つ又は表11の関連セクションから選択される1以上(好ましくは、複数)のマーカータンパク質の発現レベルを検出することを含む。
【０１８７】
文脈により別途指示されない限り、上で述べられた特徴の記載及び定義は、本発明の任意の特定の態様又は実施態様に限定されるものではなく、記載されている全ての態様及び実施態様に等しく適用される。したがって、上で述べられた特徴は、全ての組合せ及び順列で開示されている。
【０１８８】
(2.キット)
上記の方法及びこれらの方法を実施し、特に、肝臓細胞の細胞表現型、好ましくは、肝臓腫瘍細胞をインビトロで決定する際に使用するためのキットにおいて、肝臓癌の診断マーカーとして使用することができる、表2〜11から選択される1以上のマーカータンパク質が本明細書に包含される。
【０１８９】
好ましくは、キットは、正常肝臓上皮細胞(肝細胞)、正常胆管上皮細胞(胆管細胞)、肝細胞癌細胞、末梢胆管細胞癌細胞、及び肝門部胆管細胞癌細胞から選択される細胞表現型の決定/特定を可能にする。
【０１９０】
より好ましくは、キットは、肝臓腫瘍細胞がHCC細胞又はCC細胞として特定されることを可能にする。
【０１９１】
キットは、使用者が
a)表5(又は表2〜10のうちの1つ又はまとめられた表11の関連セクション)に提供される複数のマーカータンパク質又はその断片;
b)試験下の肝臓細胞における、該マーカータンパク質に対する抗体及び該マーカータンパク質又はその断片をコードする核酸分子;
から選択される複数の分析物の存在又は発現レベルを決定することを可能にし、
該キットは:
(a)該複数の分析物のうちの1つに各々独立に特異的である複数の結合メンバーがその上に固相化されている固体支持体;
(b)標識を含む発色剤;並びに任意に、
(c)洗浄溶液、希釈液、及び緩衝液からなる群から選択される1以上の構成要素
を含む。
【０１９２】
好適な結合メンバーは本明細書に記載されている。特に、マーカータンパク質又はその断片の検出のために、結合メンバーは、表5(もしくは表2〜10のうちのいずれか1つ又はまとめられた表11の関連セクション)から選択されるマーカータンパク質のうちの1つもしくは複数、又はその組合せに結合することができる抗体であってもよい。
【０１９３】
本発明によるキットは、試料中のコラーゲンアルファ1(XVIII)鎖、プラスチン-3、AKR1B10、フィブロネクチン、ベータ3チューブリン、アスポリン、14-3-3タンパク質イータ、及びジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質3からなる群から選択される1以上のマーカータンパク質の有無を決定するための試薬を含むことにより、対象の再発性又は原発性肝臓腫瘍の診断に使用することができる。好ましくは、肝臓腫瘍は、肝細胞癌、末梢胆管細胞癌、又は肝門部胆管細胞癌細胞からなる群から選択される。
【０１９４】
一実施態様において、マーカータンパク質は、ベータ3チューブリン及び/又はAKR1B10、好ましくは、ベータ3チューブリンである。
【０１９５】
別の実施態様において、キットは、試料を調製するのに好適な試薬を含み、ここで、該試料は、血液、血漿、血清、肝臓組織、肝臓細胞のうちのいずれか1つ、又はこれらの組合せから選択される。
【０１９６】
また別の実施態様において、試料は肝臓組織であり、キットは、肝臓組織を調製するのに、任意に、ホルマリン固定パラフィン包埋肝臓組織切片を調製するのに好適な試薬を含む。
【０１９７】
別の実施態様において、試料中の1以上のマーカータンパク質の有無を決定することは、免疫組織化学検査によって行われる。
【０１９８】
1つの好ましい実施態様において、対象の再発性又は原発性肝臓腫瘍を診断するためのキットは、試料中のベータ3チューブリン、及び任意に、AKR1B10の有無を決定するための試薬を含み、ここで、該肝臓腫瘍は、肝細胞癌、末梢胆管細胞癌、又は肝門部胆管細胞癌細胞からなる群から選択され、該キットは、肝臓組織を調製するのに、任意に、ホルマリン固定パラフィン包埋肝臓組織切片を調製するのに好適な試薬を含み、かつ該キットは、免疫組織化学検査(IHC)によって試料中の1以上のマーカータンパク質の有無を決定するのに好適である。
【０１９９】
より好ましくは、キットは、ベータ3チューブリンに対する一次抗体を含む。
【０２００】
上記のように、試料中のマーカータンパク質、抗体、又は核酸分子の存在又は量を決定するための様々な方法が当技術分野で公知である。様々な好適なアッセイが以下でより詳細に記載されており、各々が本発明の実施態様を形成する。
【０２０１】
キットは、1以上のマーカータンパク質の発現レベルの決定を比較することができる定量的尺度を提供する標準又は参照をさらに提供することができる。標準は、肝臓細胞の細胞表現型、例えば、HCC又はCCを示すマーカータンパク質発現のレベルを示すことができる。
【０２０２】
キットは、本方法を実施するための印刷された説明書も含み得る。
【０２０３】
一実施態様において、キットは、質量分析アッセイを実施するためのものであってもよく、また、アッセイ互換フォーマットの参照ペプチド(例えば、SRMペプチド)のセットを含んでいてもよく、ここで、該セット中の各々のペプチドは、表5(又は表2〜10のうちのいずれか1つ又はまとめられた表11の関連セクション)に提供される複数のマーカータンパク質の各々を固有に表すものである。好ましくは、2以上の、好ましくは、3つのそのような固有のペプチドは、そのためにキットが設計されている各々のタンパク質に対して使用され、固有のペプチドの各々のセットは、既知の表現型の該細胞、例えば、HCC又はCC細胞の標準調製物におけるそのようなタンパク質のレベルを反映する既知の量で提供される。任意に、キットは、試料からのタンパク質の単離及び抽出のためのプロトコル及び試薬、トリプシンなどのタンパク質分解酵素の精製調製物、並びにモニタリングされるプリカーサーの質量及び特定の遷移の詳細を含む方法の詳細なプロトコルも提供することができる。ペプチドは、合成ペプチドであってもよく、また、炭素、窒素、酸素、及び/又は水素の1以上の重同位体を含んでいてもよい。
【０２０４】
任意に、本発明のキットはまた、適当な細胞、容器、成長培地、及び緩衝液を含んでいてもよい。
【０２０５】
本発明は、肝臓腫瘍を有するもしくは肝臓腫瘍を有することが疑われるか又は肝臓腫瘍を治療した後の個体のインビトロ診断もしくは予後モニタリングへの、表5に提供される複数のマーカータンパク質又はその断片のうちの1つ又は複数、該マーカータンパク質に対する1以上の抗体、及び該マーカータンパク質又はその断片をコードする1以上の核酸分子に各々独立に結合することができる複数の結合メンバーの使用を含み得る。
【０２０６】
キットは、肝臓腫瘍試料中の複数のタンパク質マーカーの検出用の試薬を含んでいてもよく、ここで、該複数のタンパク質マーカーは、表5もしくは表5のパートA、又は表11のセクション2_5から選択される。
【０２０７】
キットは、各々の抗体が表5又は表11のセクション2_5から選択される複数のタンパク質マーカーの異なる個々のタンパク質マーカーに特異的に結合する、複数の一次抗体を含んでいてもよい。
【０２０８】
抗体は、アッセイプレート、ビーズ、ミクロスフェア、又は粒子上に固相化されていてもよい。任意に、ビーズ、ミクロスフェア、又は粒子は、染色されていても、タグ化されていても、又は標識されていてもよい。
【０２０９】
キットは、一次抗体に特異的に結合する1以上の二次抗体をさらに含んでいてもよい。二次抗体は、標識、例えば、蛍光標識されていてもよく、又はタグ化されていてもい。
【０２１０】
キットは、タグ化された二次抗体の存在を検出するための1以上の検出試薬をさらに含んでいてもよい。
【０２１１】
さらに、本発明は、本明細書に記載される方法と合致した、肝臓腫瘍細胞の細胞表現型を分類するための又は個体の肝臓腫瘍を決定するためのキットを提供する。好ましくは、キットは、試料(組織又は血液)に対して表2〜11のうちの1つ又は複数から選択される1以上(好ましくは、複数)のマーカータンパク質の存在又は発現レベルの決定を実施するのに必要な試薬、及び試験を実施し、結果を解釈するための説明書を含む。好ましいタイプのキットは、以下の試薬のうちの1つ又は複数を含んでいてもよい:
(a)例えば、ELISAなどの結合アッセイにおいてもしくは免疫組織化学検査において使用するための、該1以上のマーカータンパク質もしくはその断片を認識することができる抗体。該抗体は、直接標識されることによるか、もしくは1以上の他の種、例えば、標識された二次抗体との相互作用を通じて検出することができる;並びに/又は
(b)例えば、マーカータンパク質mRNAの存在及び/もしくは量を検出するための、1以上のマーカータンパク質の核酸配列に基づく1以上のプライマー;並びに/又は
(c)例えば、マーカータンパク質遺伝子発現を検出するための、1以上のマーカータンパク質遺伝子の核酸配列に基づくプローブ。抗体試薬に関しては、プローブは、それらを検出することができるように、直接的に又は間接的に好都合に標識することができる。
【０２１２】
(3.肝臓細胞分類システム)
本発明は、肝臓細胞分類装置及び情報通信端末装置を含む肝臓細胞分類システムであって、該肝臓細胞分類装置が制御コンポーネント及び記憶コンポーネントを含み、該装置がネットワークを通じて互いに通信可能に接続されており;
(1)該情報通信端末装置が、
(1a)対象の肝臓組織試料から得られるタンパク質データを該肝臓細胞分類装置に伝達するタンパク質データ送信ユニット;
(1b)該肝臓細胞分類装置から伝達される該対象の肝臓細胞分類の結果を受け取る結果受信ユニット;
を含み、
(2)該肝臓細胞分類装置が、
(2a)該情報通信端末装置から伝達される該対象の肝臓組織試料から得られるタンパク質データを受け取るタンパク質データ受信ユニット;
(2b)該データ受信ユニットからのデータを該記憶ユニットに保存されているデータと比較するデータ比較ユニット;
(2c)該データ比較ユニットの結果に基づいて、該対象の肝臓組織のクラス(例えば、細胞表現型)を決定する分類器ユニット;及び
(2d)該分類器ユニットによって得られる該対象の分類結果を該情報通信端末装置に伝達する分類結果送信ユニット;
を含み、かつ
該記憶ユニットが、表2〜10のうちのいずれか1つもしくは複数又は表11から選択される少なくとも1つ(好ましくは、複数)のタンパク質のタンパク質発現レベルデータを含む、肝臓細胞分類システムも提供する。
【０２１３】
対象の肝臓組織試料から得られるデータは、好ましくは、発現レベルデータ、例えば、本明細書に記載される方法、例えば、LC-MS/MS及び他のプロテオミクス的アプローチから得られる発現レベルデータである。データは、単に、正常組織又は腫瘍(もしくは腫瘍の疑いがある)組織のいずれかである組織の試料から得られたものであってもよい。
【０２１４】
データ受信ユニットによって受け取られるタンパク質データは、正確なタンパク質レベルであってもよく、又は該タンパク質データは、それからタンパク質レベルを計算することができるペプチドレベルであってもよい。ペプチドは、該少なくとも1つ(好ましくは、複数)のタンパク質に固有のものである。いくつかの実施態様において、全て該タンパク質に固有である多数の、すなわち、2つ、3つ、4つ、又は5つのペプチドを使用することが好ましい。多数のペプチドを使用する場合、データを照合し、任意に、データ比較工程でメジアン値を使用することができる。
【０２１５】
記憶ユニットは、好ましくは、肝臓組織又は腫瘍試料を表すタンパク質発現レベルに関するデータセットを含む。好ましい実施態様において、タンパク質発現レベルは、試料中の正確なペプチドレベルから得られる。これは、データが、本明細書に記載されるLC-MS/MS法などのプロテオミクス法を用いて得られたものである場合、特にそうである。データセットは、例えば、本明細書中、表11によって提供されるようなデータセット集から、肝臓組織(正常又は腫瘍)で見られるタンパク質発現レベルの代表的な(例えば、平均の)レベルを提供することができる。或いは、データセットが、同じ源から得られた異なる細胞表現型(例えば、HCC対末梢CC)組織のタンパク質発現レベルと比較したときのタンパク質発現レベルの比を表す値を含むことが好ましい場合がある。
【０２１６】
このように、本システムは、肝臓組織試料(非腫瘍又は腫瘍)から得られるタンパク質発現レベルを、同じタンパク質についての特定の肝臓細胞表現型を表すタンパク質発現レベルと比較し、それにより、該組織をその細胞型によって分類することができる。
【０２１７】
本システムは、入力されたデータを、データ送信ユニットを通じて、記憶ユニットに既に保持されている保存データに追加する手段をさらに含むことができ、その結果、この新しいデータを決定ユニットによって実施される解析に含めることができる。このように、肝臓細胞表現型(腫瘍又は非腫瘍)を表すデータは、絶えず更新される。
【０２１８】
肝臓組織分類システムは、肝臓組織(腫瘍又は非腫瘍)試料中のタンパク質発現レベルを決定し、このデータをタンパク質データ送信ユニットに供給するための装置に接続することができる。
【０２１９】
該装置が、本明細書に記載されるLC-MS/MSを用いて多数の試料を処理することができることが理想的である。
【０２２０】
本発明のこの態様に従って、制御コンポーネント及び記憶コンポーネントを含む情報処理装置に、対象の肝臓組織を決定及び/又は分類する方法であって:
(i)対象から得られた表2〜11から選択される少なくとも1つ(好ましくは、複数)のタンパク質のタンパク質発現レベルに基づくデータを該記憶コンポーネントに保存されているタンパク質発現レベルデータと比較する比較工程;並びに
(ii)該比較工程で計算された比較に基づいて該対象の肝臓組織細胞を分類するための;及び該組織が、正常(肝細胞、胆管細胞)、肝細胞癌、肝胆管細胞癌(TACE療法前もしくはTACE療法後)、末梢胆管癌、肝門部胆管癌(原発性硬化性胆管炎を伴うもしくは伴わない)、又は転移性結腸直腸癌を含む表現型に分類される、分類工程
を含む、方法を実行させる肝臓組織(腫瘍又は非腫瘍)細胞分類プログラムも提供される。
【０２２１】
本発明のこの態様に従って、その上に記録された上記の肝臓組織細胞分類プログラムを含む、コンピュータ可読記録媒体も提供される。
【０２２２】
タンパク質発現レベルを表すデータは、試料中のペプチドレベルから得られたものであってもよく、この場合、該ペプチドは、各々、表2〜11のうちのいずれか1つから選択される特定のタンパク質に固有のものである。例えば、ペプチドが、タンパク質分解酵素消化、例えば、トリプシン、aspN、gluC、及び当技術分野で周知の他のそのような酵素によって得られるタンパク質に固有のものとなるペプチドを設計し得ることが理解されるであろう。
【０２２３】
本発明の全ての態様及び実施態様に従って、複数のマーカータンパク質は、コラーゲンアルファ1(XVIII)鎖、プラスチン-3、AKR1B10、フィブロネクチン、ベータ3チューブリン、アスポリン、14-3-3タンパク質イータ、もしくはジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質3のうちのいずれか1つ、又はこれらの組合せから選択され、好ましくは、複数のマーカータンパク質は、AKR1B10及び/又はベータ3チューブリンを含む。
【実施例】
【０２２４】
(4.実施例)
これから、本発明の特定の態様及び実施態様を、例として、図面及び上記の表を参照しながら、例示することにする。本明細書に記載される文書は全て、あらゆる目的のためにその全体が引用により本明細書中に組み込まれる。
【０２２５】
(4.1  材料及び方法)
(肝臓組織)
本研究は、合計55の保存標本から採取された9種類の肝臓組織: TACE後の混合HCC/CC(HCCの部分とCCの部分は個別に調べられた)、未処置のHCC、正常肝実質、正常胆管、未処置の末梢CC、未処置の肝門部/肝門部周囲CC、PSCを伴う肝門部CC、及び転移性結腸直腸癌からなる。標本は全て、27〜80歳の範囲の成人患者由来の外科切除された又は外植された肝臓であった。各々の群の組織の詳細は、次の通りである:
・TACE後の混合癌(n＝7): TACEによる治療の前に、全ての結節を、門脈相での洗い出しがある結節性動脈化病変のコンコーダントイメージングに関する欧州肝臓学会(European Association for the Study of the Liver)(EASL)基準に準拠して、放射線学的にHCCと診断した[16]。HCCとCCの併存を示唆する特徴、特に、低動脈化の存在をTACE除外の基準とした。外植された肝臓では、HCC成分の他に、胆管細胞性分化が組織学的に示唆された。HCC成分とCC成分を個別に調べた。
・HCC(n＝7):移植前にいかなる治療も受けず、小柱状又は偽腺状パターンで配列し、かつ硬変肝で発症した、高分化から中分化のHCCを調べた。肝硬変の病因は、ウイルス性肝炎(n＝3)及び過剰なアルコール摂取(n＝4)であった。多数の腫瘍が存在する場合、1つの腫瘍を各々の症例から選択した。
・正常肝臓組織(n＝7):脂肪変性も、炎症も、線維化も伴わない、組織学的に特筆すべき点のない肝臓組織を、転移性癌のために外科切除された標本から選択した。
・正常胆管(n＝6):組織学的に特筆すべき点のない肝門部胆管を、パラセタモールの過剰摂取による急性肝不全のために外植された肝臓標本から選択する。
・末梢CC(n＝7):症例は全て、線維性間質の背景に対して高分化から中分化の管状腺癌を示した。肝門部又は肝門部周囲組織は、どの症例でも冒されていなかった。背景肝は、どの症例でも硬変性ではなかったが、2例が、中等度の脂肪変性を伴う初期の架橋線維化を有していた。
・肝門部CC(n＝7):全て、主に肝門部/肝門部周囲胆管を冒す管腺癌であった。慢性肝胆管系疾患の病歴がある患者はいなかった。
・PSCを伴うCC(n＝7):4つの症例は、PSCの治療中にCCを有すると診断され、外科切除を受けたが、3つの症例は、外植された肝臓でCCを有することが偶然に分かった。腫瘍は全て、組織学的に腺癌であり、4例は、PSCを伴うCCで見られることもある粘液巣を伴っていた。
・転移性結腸直腸癌(n＝7):全て、典型的な腸型腺癌であった。
【０２２６】
(組織サンプリング)
外科切除された新鮮な肝臓標本を本発明者らの病理学検査室ですぐに受け取った。肉眼的に調べた後、試料を徹底的に調べ、10％ホルマリンで少なくとも4時間固定した後、パラフィンに包埋した。
【０２２７】
(FFPE組織のマイクロダイセクション)
10μm厚の切片をFFPE組織ブロックから調製した。キシレン及びアルコールで脱パラフィン処理した後、1.5×107μm2(0.15mm3)の標的部位をレーザーキャプチャーマイクロダイセクションシステム(LMD6500, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)を用いて選択的に切削した。解剖された組織を50μLのQproteome(登録商標) FFPE組織抽出バッファー(QIAGEN, Valencia, CA)に直接浸漬させ、タンパク質抽出まで-80℃で保存した。試料を何回かに分けて調製し、例えば、第1週(第1バッチ)で、各々の組織/腫瘍型の第1の生物学的複製物を調製し、解析した。第2週(第2バッチ)で、各々の組織/腫瘍型の第2の生物学的複製物を調製し、解析した。このプロセスを、各々の組織/腫瘍型の第7の生物学的複製物を調製し、解析する第7週(第7バッチ)まで続けた。異なる組織型間でのタンパク質発現レベルの差が、何らかの試料調製のばらつきではなく、試料の生物学/病理学によるものであることを保証するために、試料をこのように調製し、解析した。
【０２２８】
(FFPE肝臓組織からのタンパク質抽出)
-80℃で保存した後、試料を氷上で解凍し、その後、ホモジナイズし、ボルテックス処理し、遠心分離した。試料を1.5mlのコレクションチューブに移し、Qproteome(登録商標)キットに提供されているようなコレクションチューブシーリングクリップで密閉した。試料を、750rpmで撹拌しながら、100℃で20分間、その後、80℃でさらに2時間、ヒーティングブロック上でインキュベートした。加熱後、試料チューブを氷上に1分間置き、コレクションチューブシーリングクリップを取り外した。各々のチューブを、14,000gで、4℃で15分間遠心分離した。その後、上清を、シリコン処理した新しいコレクションチューブに移した。その後、Bradfordタンパク質アッセイ及びマイクロプレートルミノメーターを用いて、各々の試料のタンパク質濃度を決定した。
【０２２９】
(1D電気泳動ゲル)
20％w/vのポリアクリルアミドマトリックスの上に1cmの高さの4％w/vのポリアクリルアミドマトリックスを含むように、スタッキングゲルを構築した。タンパク質試料及びプレステイン分子量マーカーをSigma製の2×Laemmli試料バッファー(1:1)中で各々調製し、ゲルを、150Vで20分間、又はタンパク質試料及び分子量マーカーが4〜20％w/vゲルの界面に集中することが観察されるまでトリス-グリシン泳動バッファー(Invitrogen, Loughborough, UK)中に泳動させた。各々の試料を100μg/ウェルでゲルに充填した。電気泳動後、ゲルをImperialタンパク質染料(Pierce, IL, USA)で短時間染色し、その後、タンパク質を可視化するために及び均質な集団としてのその移動を確認するために、水中で脱染した。4〜20％w/vゲルの界面で見られるタンパク質バンドを各々のレーンから切り出した。
【０２３０】
分離ゲルについては、本発明者らは、Invitrogen, Carlsbad, CA, USA製の1mm厚の10ウェルNu-PAGE 4〜12％ビス-トリスゲルを使用した。
【０２３１】
(還元/アルキル化/トリプシン消化)
ゲルバンドを細かく刻んで、1mm3の小片にし、その後、脱染し、ACNで脱水した。その後、タンパク質を、25mM炭酸水素アンモニウム中の10mMジチオスレイトールで、56℃で1時間還元し、25mM炭酸水素アンモニウム中の55mMヨードアセトアミドで、室温で45分間アルキル化した。その後、ゲル片を洗浄し、乾燥させ、2μgのシークエンス等級のトリプシン中で、氷上で10分間再水和させ、100μLの25mM炭酸水素アンモニウムで再構成し、その後、追加の20μLの炭酸水素アンモニウム溶液で覆い、37℃で一晩インキュベートした。得られたタンパク質分解ペプチドを水性抽出(30μLの炭酸水素アンモニウム、20分間のボルテックス処理)及び2回の疎水性抽出(100μLの50％ACN、5％ギ酸、20分間のボルテックス処理、10分間の超音波処理)に供した。試料を素早くボルテックス処理し、遠心分離し、その後、-80℃に凍結させた。その後、凍結試料を真空下で濃縮して〜20μLとし、その後、0.1％ギ酸を継ぎ足して70μLとし、30000MWフィルター(Millipore)を用いてゲル微粒子を完全に濾過し、最終的に、LC-MS/MSに使用するまで-80℃で保存した。
【０２３２】
(液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS/MS))
凍結/解凍後、10μLの各々の試料を、Proxeon EASY-nLC IIシステム(Thermo Fisher Scientific)を用いて、Thermo製のプレ-カラム(EASY-Column、2cm、内径100μm、5μm C18-A1)に注入した。その後、アセトニトリル中の0.1％ギ酸の増加勾配(80分間かけて5〜50％)を用いてThermo製の分析カラム(EASY-Column、10cm、内径75μm、3μm C18-A2)に300nL/分の流量で通して、ペプチドを分解した。質量スペクトルを、クロマトグラフィー実行(115分)の全体を通して、各々のFTMSスキャン(400m/zで30000分解能の2回のμScans)の後に20回のCIDスキャンを用いて、LTQ-Orbitrap Velos(Thermo Fisher Scientific)で獲得した。各々のFTMSスキャンからの最も強度の高いイオンのうちの20個に対してCIDを実施し、その後、30秒間(20ppmのm/z域)、動的除外リストに載せた。各々のFTMSスキャンのAGCイオン注入目標は、1000000個(500msの最大注入時間)であった。各々のMSA CIDスキャンのAGCイオン注入目標は、10000個(50msの最大イオン注入時間)であった。
【０２３３】
(データ前処理)
(ペプチド同定)
ピークリストを、Proteome Discoverer 1.4を用いてXcalibur生データファイルフォーマットから抽出し、Mascot 2.2及びSequest HT検索エンジンを用いて検索した。図1は、統計解析前のペプチド同定及び定量に使用された全データ解析ワークフローを示している。スペクトルファイルノード(0)を用いて、対象となる生データファイルを選択した。スペクトルセレクター(1)ノードをそのデフォルト値(データをスムージング処理しない、シグナル対ノイズ閾値なし)に設定し、荷電状態フィルタリングも脱同位体化も行わなかった。マスコット(Mascot)ノード(4)とシークエスト(Sequest)ノード(2)はどちらも、UniProtKB/Swiss-Protデータベース(http://www.uniprot.org/downloads 20th February 2013からダウンロードされるuniprot_sprot.fasta)、分類法ホモ・サピエンス(Homo-sapiens)(ヒト)に対してデータを検索するように設定した。これらのノード(2;4)を、最大2つの切断ミス(C-末端のK/RはPを制限する)を有するトリプシン消化ペプチドを検索するようにプログラムし、静的修飾をカルバミドメチル(C)として設定した。動的修飾を脱アミド化(N/Q)、酸化(M)に設定した。両方のデータベース検索エンジンについて、プリカーサー質量許容差を10ppmに、フラグメント質量許容差を0.5Daに設定した。ペプチド同定後、そのq-値を、ターゲット-デコイ法に基づいて1％の偽発見率(FDR)で計算し、パーコレーター(Percolator)ノード(3)でフィルタリングした。タンパク質フィルターである「タンパク質当たりのペプチド」オプションを2に設定した。「第1位のペプチドのみをカウントする」と「最高スコアのタンパク質中のペプチドのみをカウントする」の両方をアクティブとして設定した。これにより、タンパク質レベルでの最大のストリンジェンシーが保証された。ノード5は、同じ保持時間の間に溶出するMS1スペクトル中のプリカーサーイオンの同位体をクラスタリングすると同時に、ノイズ及びスパイクシグナルをさらなる処理に使用されるスペクトルから除去する「イベント検出器」を表す。これは、プリカーサーイオン定量及びピーク面積定量において使用される。ノード6は、各々のプリカーサーイオンの面積を計算するプリカーサーイオン面積検出器ノードを表す。正確にするために、これは、実際のペプチドではなく、3つの最も多く存在するペプチドの平均を用いて、タンパク質面積を計算する。実行された2つのデータ定量方法;曲線下面積(AUC)(9)及びスペクトルカウンティング(10)によって、さらなる統計解析に使用されるデータマトリックス(11;12)が作成された。両方の定量方法に共通し、かつ示差調節を示すマーカータンパク質について、最終リスト(13)を取得した。
【０２３４】
(タンパク質定量)
62の組織標本データファイル(8つの組織型についてn＝7、正常胆管についてn＝6)の各々について、Proteome Discover 1.4を用いて、同定されたタンパク質のリストをエクセルにエクスポートした。定量のために、本発明者らは、積分を用いて各々のプリカーサーイオンの曲線下面積(AUC)を計算する、Proteome Discoverer 1.4の「プリカーサーイオン面積検出器(The Precursor Ions Area Detector)」(図1(6))というノードを利用した。より正確にするために、これは、タンパク質当たりの全てのペプチドではなく、タンパク質当たりの3つの最も多く存在するペプチドの平均を用いて、タンパク質面積を計算する。各々の試料中の各々のタンパク質についてのPSMの数も定量(スペクトルカウンティング)に使用した。Proteome Discovererの結果を、各々の試料ファイルからの各々のタンパク質についてのuniprot受託番号、タンパク質名、ペプチドスペクトルマッチの数、及びタンパク質面積を含むエクセルシートにエクスポートした。各々の試料中の各々のタンパク質についてのスペクトルカウントの数とタンパク質面積推定値の両方をさらなる統計的検証に使用した。
【０２３５】
(正規化:)
各々の試料由来の各々のタンパク質についてのスペクトルカウントとAUCの両方を正規化して、ゲルへのタンパク質の充填の不均一さ、ゲル内消化及びペプチド抽出のばらつき、並びにLC-MS/MSシステムへの注入容量のばらつきなどのアーティファクトによる試料間の差について補正した。タンパク質面積推定値をlog10変換した後、正規化した。以下の方程式を用いて、正規化を行った。
【数１】
2016538545.tif 000076
(式中、
- Nは、各々の試料中の各々のタンパク質についての正規化値であり、
- pは、各々の試料中の各々のタンパク質についての非正規化値であり、
- Σnは、LC-MS/MS分析当たりのPSMの総数又はlog10変換されたタンパク質の総面積であり、
-
【化１】
2016538545.tif 000077
は、全てのLC-MS/MS分析のΣnのメジアン値である。)
【０２３６】
(統計解析)
主成分分析(PCA)を行って、多変量データセットを検討し、外れ値及びデータセット内でネスト化される群/クラスターを特定した。正規化されたタンパク質値をPCAに使用し、PCAは、Simca v. 11, MKS Umetrics AB, Sweden[17]を用いて実施した。
【０２３７】
正規化されたタンパク質値に関して組織型のクラス階層を構築する階層的クラスタリングと組織型間のタンパク質の示差調節を観察する統計解析の両方を、MATLAB: The MathWorks社(R2012a)[18]で実施した。2種類の階層的クラスタリングを行って、凝集型クラスタリング(agglomerative based clustering)を用いて、正規化されたタンパク質存在量をグループ化した。第1のアプローチでは、全試料(62個)中の全ての正規化されたタンパク質レベルを全ての他の試料(62個)にわたって比較することにより、ピアソンの相関係数が得られ、これにより、62×62のr2ピアソン相関係数からなる平方データマトリックスが得られた。第2のクラスタリングを、非加重平均距離(UPGMA)結合とともに「都市ブロック」距離メトリック(別名、マンハッタン距離)を用いて実施し、階層ツリーを作成した。このプロセスは、まず、全ての列に沿って全てのデータ点をクラスタリングし(行でクラスタリングされたデータを生じさせ)、その後、データマトリックス中の全ての行に沿って全てのデータ点をクラスタリングした。この場合、行はマーカータンパク質に対応し、列は試料に対応した。
【０２３８】
表2〜10について; R並びに以下のRパッケージ: q値及びMBESSを用いて、統計解析を実施した。各々の群比較及び各々のタンパク質について、関連のないt-検定をコンピュータで計算して、p値を得た。その後、Storeyによって提唱された直接的偽発見率アプローチ(偽発見率への直接的アプローチ(A direct approach to false discovery rates.)、Journal of the Royal Statistical Society, 2002, Series B, 64: 479-498)を用いて、q値(調整済みp値)を計算した。標準化効果量の不偏推定量であるヘッジのgを、これらの推定量の95％信頼区間とともに計算した(Hedges, L. V.及びOlkin, I.の文献(1985)。メタアナリシスのための統計法(Statistical methods for meta-analysis.)、New York: Academic press)。g＜0.2は、極めて小さい差とみなされ、g＝0.5は、平均差とみなされ、g＞0.8は、大きい差とみなされる。非標準化効果量の推定量(すなわち、平均差)を、これらの推定量の95％信頼区間とともに計算した。
【０２３９】
表11(図7)について、群(組織型)間比較の対応のないt-検定の各々を、各々のタンパク質について実施して、正規化されたタンパク質面積又は正規化されたスペクトルカウント(PSMの数)からなるタンパク質発現データマトリックスから有意水準推定値(p-値)を得た。タンパク質が、＜0.05のp-値、＞2のlog2倍率比又は＜-2のlog2倍率比(それぞれ、4倍の上方調節及び4倍の下方調節を表す)を有する場合、該タンパク質を2つの組織型間で示差調節されるとみなした。これらのp-値及びlog2倍率変化を、Cui, Xら及びBest, C.J.Mら[19-20]によって記載されている通りに用いて、火山型プロットを作成した。
【０２４０】
(免疫組織化学検査(IHC))
4つの組織型(正常肝臓(n＝7)、正常胆管(n＝6)、HCC(n＝7)、及び末梢CC(n＝7))は、識別することが臨床的に最も重要であるので、これらを検証IHCに用いた。各々の症例から選択された1つの代表的な切片を免疫染色に用いた。IHC用の切片は、LC-MSによって分析される同じ症例から採取した。FFPE標本に対する免疫染色は、自動染色装置Bond Max(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)を用いて実施した。脱パラフィン処理された切片をpH 6.0のバッファー中で10分間熱処理した。使用された一次モノクローナル抗体は、抗AKR1B10(クローン1A6; 1:500; Abcam, Cambridge, UK)及び抗チューブリンベータ3(クローンTU20; 1:500; Abcam)であった。
【０２４１】
組織型番号キー;(表11の第1列で使用されているもの)
1)＝正常肝臓上皮(肝細胞)。
2)＝肝細胞癌。すなわち、TACE療法後の混合型肝胆管細胞癌。
3)＝肝細胞性分化の部分、及び
4)＝胆管細胞性分化の部分。
5)＝末梢(肝内)胆管癌。
6)＝原発性硬化性胆管炎を有さない患者に由来する肝門部胆管癌。
7)＝原発性硬化性胆管炎を有する患者に由来する肝門部胆管癌。
8)＝転移性結腸直腸癌。
9)＝正常胆管上皮(胆管細胞)。
【０２４２】
(4.2  結果)
(タンパク質マーカー同定)
ペプチドレベルで1％FDRの第1位のペプチド(タンパク質ID当たり2個以上の第1位のペプチド)を用いて、合計で2864個のタンパク質を同定した。この2864個タンパク質のうち、2628個(92％)が少なくとも1つの固有のペプチド配列を有し、2009個(70％)のタンパク質が固有のペプチド配列をのみを有していた。2864個タンパク質のうちの236個(8％)のタンパク質が共通のペプチド配列のみを有することがさらに観察された。固有のペプチドと共通のペプチドを有する619個のタンパク質のうち、本発明者らは、固有のペプチドのみを用いて定量を実施し、この定量を固有のペプチドと共通のペプチドの使用と比較し、2つのデータセットからの倍率変化値を比較したとき、0.99の相関を見出した(スペクトルカウンティングについては0.992及び曲線下面積については0.999)。したがって、固有のペプチドのみと比較して、共通のペプチドと固有のペプチドを用いても、精度に対する有害効果がないように思われるので、及び共通のペプチドと固有のペプチドを用いると、さらなるカバレッジが得られるので、本発明者らは、メインテキスト(表1、表11)中のスペクトルカウンティングとAUCの両方の形態の定量から共通のペプチド配列と固有のペプチド配列を用いて得られた結果をここに提示している。
【０２４３】
(タンパク質定量及び階層的クラスタリング)
本発明者らは、曲線下面積データセットを用いると、1072個のタンパク質が組織型比較のうちの少なくとも1つにおいて有意に調節されるが、スペクトルカウンティングデータセットを用いると、611個のタンパク質が(組織型比較のうちの少なくとも1つにおいて)有意に調節されることを見出した。合計467個のマーカータンパク質は、両方の定量方法で観察したとき、組織型比較のうちの少なくとも1つにおいて有意に調節されることが分かった(例えば、図2のベン図のスペクトルカウンティング(右)とAUC(左)の両方に共通するもの)。これら467個の共通のマーカータンパク質についての曲線下面積(AUC)データセット(図3A)及びスペクトルカウンティングデータセット(図3B)を用いたPCAバイ-プロットは、共通の起源を有する細胞からなる組織型/群間での明確な分離を示す。組織型1、2、及び3(図3A及び3Bの左側のプロットの外側の楕円)は全て肝細胞起源であり、組織型4〜9(図3A及び3Bの右側のプロットの楕円)は、このバイ-プロットの2つの平面を挟んで明確に分かれる腺上皮に属していた。各々のバイ-プロットにおいて、正常肝実質(組織型-1)の全症例が互いに近接していることも理解することができる(図3A及び3Bの左側のプロットの内側の楕円)。
【０２４４】
また、同じ467個の共通のマーカータンパク質の階層的クラスタリングは、肝細胞組織型と腺上皮とをクラスタリングするPCAを用いて得られた結果を裏付けた。ピアソンの相関係数と正規化されたタンパク質面積値を用いるタンパク質データマトリックスとに基づくこれら467個のマーカータンパク質のクラスタリングは、組織型1、8、及び9に由来する試料を単一のネスト化された亜群にクラスタリングした(データは示さない)。スペクトルカウンティングをデータマトリックスとして用いると同様の結果が得られたが、階層的クラスタリングを実施したとき、曲線下面積データマトリックスによって、群間のより良好な分離が得られることが分かった。表1は、組織型比較当たりの曲線下面積データセットとスペクトルカウンティングデータセットの両方に共通した示差調節されるマーカータンパク質の数を示している。
【０２４５】
(9種の組織型間でのタンパク質発現プロファイリングの差)
(TACE後の混合癌:)
TACE後の癌のHCC成分とCC成分は、理論的には同じ起源であるが、これら2つの部分は、PCA(図3)及び階層的クラスタリング(データは示さない)によって明確に示されるような有意に異なるタンパク質マーカーのプロファイルを示した。合計で95個のマーカータンパク質が、CC領域と比較して、TACE後のHCC領域で有意に調節されることが示された。この95個のマーカータンパク質のうち、60個(63％)は、正常肝実質と胆管の間の比較で同定された分子と重複しており(下記参照)、TACE後の癌が2系統分化を示すことができるという仮説と一致した。78個のマーカータンパク質がHCC成分でより多く存在することが分かったのに対し、17個のマーカータンパク質は、CC部分で有意に上方調節されていた。2個のマーカータンパク質と5個のマーカータンパク質は、それぞれ、TACE後の癌のHCC成分と従来型のHCCの間及びTACE後の癌のCC成分と末梢CCの間で有意な差を示した(表1)。これらのマーカータンパク質の名前は、表11で入手可能である。
【０２４６】
(正常肝実質対正常胆管:)
(表6を参照) 200個を越えるマーカータンパク質が正常肝臓と胆管の間で有意に異なるレベルで発現していた(表1及び表6)。これらのマーカータンパク質の約半分は、肝臓酵素であり、これらは、正常肝実質により多く存在していた。対照的に、正常胆管でより強く発現していたマーカータンパク質は多岐にわたり、これには、ケラチン7及び19、アネキシン、並びにガレクチンが含まれた(表11)。
【０２４７】
(正常肝実質対HCC:)
(表2を参照)正常肝実質とHCCの間で統計的に有意な差を示す11個のマーカータンパク質のうち、5個のマーカータンパク質(14-3-3タンパク質イータ、アルド-ケトレダクターゼファミリー1メンバーB10[AKR1B10]、不均一核リボヌクレオタンパク質R、ヒストンH1.5、ケラチンタイプII細胞骨格6B)は、癌組織で過剰発現されているようであった。HCCで存在量がより少なかった残りの6個はほとんど、成熟した肝細胞機能を表すと考えられている肝臓酵素であった。本発明に従って、1以上の、又は複数のマーカーマーカータンパク質を、14-3-3タンパク質イータ、アルド-ケトレダクターゼファミリー1メンバーB10[AKR1B10]、不均一核リボヌクレオタンパク質R、ヒストンH1.5、ケラチンタイプII細胞骨格6Bからなる群から選択することができる。
【０２４８】
(正常胆管対末梢又は肝門部CC:)
(表3及び4を参照)正常胆管と腫瘍性胆管の間で統計的に有意な差を示したマーカータンパク質の数は、末梢CCについては37個、肝門部CCについては32個である(表1、表11)。6個のマーカータンパク質と8個のマーカータンパク質は、それぞれ、末梢CCと肝門部CCで有意に過剰発現されていた。これらのうち、3個のマーカータンパク質(チューブリン-ベータ3鎖、ペリオスチン、コラーゲンアルファ-1(XII)鎖)は、両方のタイプのCCで上方調節されていた。14個のマーカータンパク質は、両方のタイプのCCで存在量が有意により少なかった。本発明に従って、1以上の、又は複数のマーカータンパク質を、チューブリン-ベータ3鎖、ペリオスチン、及びコラーゲンアルファ-1(XII)鎖からなる群から選択することができる。
【０２４９】
該1以上の、又は複数のマーカータンパク質を、アルギニノコハク酸リアーゼ、N9G)、N9G)-ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ1A及び1B、フィラミン-A、並びにプラスチン-3から選択することもできる。
【０２５０】
(HCC対末梢CC:)
(表5を参照) 165個のマーカータンパク質は、肝実質で発症するこれら2つのタイプの癌の間で統計的に有意な差を示した(表1、表4、及び表11)。HCCで過剰発現されるほとんどのマーカータンパク質が、肝臓酵素又はミトコンドリアマーカータンパク質であったのに対し、末梢CCで上方調節されるマーカータンパク質は、細胞間接着、細胞移動、及びシグナル伝達を含む、多様な機能を有していた。アネキシン及びS100-A11などの多機能マーカータンパク質も末梢CCでより多く存在していた。96個のマーカータンパク質(58％)は、正常肝実質と正常胆管の間の比較で同定されたマーカータンパク質と重複していた。
【０２５１】
(末梢CC対肝門部CC:)
これら2つのタイプのCCはどちらも、胆管上皮起源の腺癌である。興味深いことに、14個は、末梢CCと肝門部CCの間で有意な差を示した。例えば、胃型ムチンのMUC5ACは、肝門部CCで有意により多く存在していたが、テネイシンは、末梢CCで上方調節されていた。本発明に従って、タンパク質マーカーには、MUC5AC及びテネイシンが含まれ得る。
【０２５２】
(PSCを伴うCC対肝門部CC:)
(表9)これら2つのタイプのCCは、組織学的に区別不可能である。しかし、5個のマーカータンパク質(アルファ-1B-糖タンパク質、アスポリン、デコリン、メチル-CpG-結合タンパク質2、及びミメカン)は、PSCを伴うCCと従来型の肝門部CCの間で存在量が有意に異なっていた。これらは全て、PSCと無関係な肝門部CCでより多く存在していた。本発明に従って、1以上の、又は複数のマーカータンパク質を、アルファ-1B-糖タンパク質、アスポリン、デコリン、メチル-CpG-結合タンパク質2、及びミメカンからなる群から選択することができる。
【０２５３】
(末梢又は肝門部CC対結腸直腸転移:)
(表10を参照)結腸直腸転移と比べて末梢CCで有意に異なるレベルで発現されるマーカータンパク質はわずか29個であり、結腸直腸転移と比べて肝門部CCで有意に異なるレベルで発現されるマーカータンパク質は63個であった(表1、表10、表11)。ルーチンの病理検査で最も一般的に使用される腸マーカーであるケラチン20は、この組織比較で統計的有意に達しなかった。CCで有意により多く存在するマーカータンパク質には、アネキシンA4及びA5、タンパク質-グルタミンガンマ-グルタミルトランスフェラーゼ2、並びに血漿プロテアーゼC1阻害因子が含まれた。
【０２５４】
AKR1B10及びチューブリン-ベータ3を検証試験としての火山型プロット及び免疫組織化学検査によってさらに検討した。AKR1B10を選択したが、それは、AKR1B10が、正常肝臓又は末梢CCよりもHCCで有意に上方調節されており、これが、HCCに特異的な診断マーカーになり得ることが示唆されるからである。チューブリン-ベータ3は、正常肝臓、HCC、又は正常胆管のいずれかの組織型よりも末梢CCで有意に上方調節されており、チューブリン-ベータ3が末梢CCに特異的な診断的価値を有することが示唆された。4つの組織型:正常肝実質、HCC、正常胆管、及び末梢CCは、識別することが臨床的に最も重要であるので、本発明者らは、これらに注目した。
【０２５５】
AKR1B10(O60218)は、AUCデータマトリックスを定量に用いて正常肝実質(組織型1)と比較したとき、統計的に有意なもの(p-値2.83E-02及びlog 2倍率変化2.95)として、HCC(組織型2)で上方調節されている(図4、上のパネル)。スペクトルカウンティングデータもまた、正常組織と比べたHCCでのAKR1B10の統計的に有意な増大(p-値7.93 E-04及びlog 2倍率変化3.87)を示している。驚くことに、AKR1B10は、正常肝実質と比較したとき、正常胆管(組織型9)で上方調節されていることが分かった。
【０２５６】
免疫染色したとき、AKR1B10は、正常肝臓では局所的にしか発現されていなかったが、これは、HCCではより散在性に陽性であった(図5)。AKR1B10は、硬変肝(HCCの背景)でも中程度に発現されており、これが多段階肝発癌の初期に上方調節されることを示唆した。AKR1B10は、正常胆管では散在性に陽性であり、末梢CCではまばらに陽性であり、プロテオミクスの結果と一致した(表1)。
【０２５７】
チューブリン-ベータ3鎖(Q13509)は、正常肝実質又は正常胆管と比較したとき、末梢CC(組織型5)で上方調節されていることが分かった。驚くことに、チューブリン-ベータ3鎖は、正常肝臓、HCC、及び正常胆管では完全に陰性であったが、これは、7例中5例の末梢CCでは散在性に発現されていた(図5)。
【０２５８】
最後に、図6は、検討下の組織型におけるその中に示されたマーカータンパク質の発現に関して得られたスペクトルカウントを示している。
【０２５９】
(4.3  考察)
本発明者らは、レーザーマイクロダイセクションとLC-MS/MSプロテオミクスの組合せが、選択された腫瘍亜集団におけるタンパク質発現の広範なプロファイリングを可能にする強力な手法であることを示した。この技術を、プロスペクティブな組織ベースの研究とレトロスペクティブな組織ベースの研究の両方の設計における大きな利点であるFFPE組織学的保存用材料に適用することができる。特定の系譜に特異的であることが既に知られているマーカータンパク質(例えば、胆管上皮におけるケラチン7及び19[21])の同定により、この技術の頑健性が裏付けられる。本発明者らは、十分に特徴付けられた肝胆管系譜及びその腫瘍性対応物に特異的であり、かつ診断及び予後判定能力を有するバイオマーカーとして、治療標的として、又は根本的な発癌プロセスを理解するために使用し得るマーカータンパク質のセットを同定した。
【０２６０】
TACE後の混合腫瘍の肝細胞表現型及び胆管細胞表現型に特異的なタンパク質セット並びにその正常対応物及び典型的腫瘍性対応物とのその類似性の同定により、共通の前駆細胞に由来する可能性があるにもかかわらず、分化プロセスが全く異なるということが確認される。同じぐらい重要なのは、正常肝細胞と腫瘍性肝細胞と胆管上皮細胞の間で示差発現されるマーカータンパク質の同定であるが、それは、これらが、悪性形質転換又は腫瘍分化のマーカー;並びに臨床症状と画像撮影及び組織学検査での様子の両方において重複することが多いHCCと末梢CCの間のマーカーを提供するからである[22-23]。留意すべきことに、HCC患者の血清で一般に増加するマーカーであるアルファ-フェトタンパク質(AFP)[2]は、この研究ではどの組織型でも同定されなかった。これは、おそらく、組織試料中の発現レベルがLC-MS/MS検出閾値未満であることによるものである。血清AFPレベルは、HCC患者の約75％で上昇していることが知られているが、組織におけるその発現は、IHCによってさえ、40％の患者で検出される[24-25]。
【０２６１】
興味深いことに、正常肝実質と比較してHCCで有意に過剰発現されることが示された5つのマーカータンパク質(14-3-3タンパク質イータ; AK1BA; H15、及びK2C6B)のうちの1つ(14-3-3タンパク質イータ)は、癌表現型に寄与することが知られている機構において役割を果たすことが知られているが、それは、14-3-3タンパク質イータの異常発現がいくつかのヒト腫瘍で報告されているからである[26-27]。別の2つ(不均一核リボヌクレオタンパク質R及びヒストンH1.5)は、クロマチンリモデリング、DNAメチル化、及び核内での前駆体mRNAのプロセシングを通じて、遺伝子転写に関与している。また、本発明者らは、HCCで有意に上方調節されるタンパク質としてAKR1B10を同定し、これは、さらなるIHCによって確認された。この調査結果は、ランダムベースの遺伝子フィッシング法によって、AKR1B10が非腫瘍性肝臓組織と比較してHCCで有意に上方調節される遺伝子として同定された以前の研究[28]と一致している。
【０２６２】
本発明者らは、CCで特異的に上方調節される分子にも関心があった。3つのマーカータンパク質(チューブリン-ベータ3鎖、ペリオスチン、コラーゲンアルファ-1(XII)鎖)は、正常胆管と比較してCCで上方調節されていた。チューブリン-ベータ3は、微小管の主要な構成成分であり、適切な軸索誘導及び維持において極めて重要な役割を果たしている。ペリオスチンは、細胞の付着及び拡散を誘導し、細胞接着において役割を果たしている。コラーゲンアルファ-1(XII)は、浸潤性乳癌で過剰発現されることが知られている[11]、I型コラーゲン含有フィブリルと相互作用する。コラーゲンの沈着の増大及び架橋の異常は、浸潤性乳癌の発症と関連しており、その結果は、細胞外マトリックスの硬化の一因となり、その場での疾患の進行を促進することが示されている要因となる[11]。CCにおけるこれら3つのマーカータンパク質の過剰発現、並びに生物学及び病理学におけるその既知の機能的役割は、これらが、CCの有用なマーカーとなるであろうということを意味する。
【０２６３】
3つのタイプのCCは、組織学的に非常によく似ている。末梢CCと肝門部CCの間で存在量の有意な差を示すごく少数のマーカーが同定されている[29]。本発明は、異なる根本的な発癌プロセスを表し得る少なくとも5つのそのようなマーカータンパク質を提供する。PSCを伴うCCは、根本的な分子事象が従来型のCCとは異なると考えられている。しかしながら、これら2つのタイプのCCは、組織学的にほとんど同一であり、信頼性のある分子識別器が存在しない。本発明者らの知る限り、PSCを伴う発癌に特異的に関与する癌遺伝子も腫瘍抑制遺伝子も同定されていない。本発明者らは、これら2つの組織型間で、5つの有意に調節されるマーカータンパク質を同定した。これらは全て、PSCを伴うCCで存在量がより少なかった。
【０２６４】
結論として、本発明者らは、レーザーマイクロダイセクションとLC-MS/MSの組合せが、腫瘍細胞亜集団の包括的なプロテオミクス的プロファイリングを可能にし、かつFFPE保存用組織に適用可能であることを示した。本発明者らは、非腫瘍性肝細胞と腫瘍性肝細胞と胆管上皮細胞の区別において使用するための、原発性肝臓腫瘍の示差診断において腫瘍分化の等級付けを精緻化するための、及び胆管癌の亜型の発症機序を調べるための、バイオマーカー、特に、コラーゲンアルファ1(XVIII)鎖、プラスチン-3、AKR1B10、フィブロネクチン、ベータ3チューブリン、アスポリン、14-3-3タンパク質イータ、及びジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質3を同定した。
【０２６５】
(5.参考文献)
【化２】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図７−８】
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【図７−９】
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【図７−１０】
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【図７−１１】
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【図７−１２】
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【図７−１３】
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【図７−１４】
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【図７−１５】
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【図７−１６】
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【図７−１７】
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【図７−１８】
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【図７−１９】
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【図７−２０】
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【図７−２１】
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【図７−２２】
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【図７−２３】
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【図７−２４】
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【図７−２５】
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【図７−２６】
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【図７−２７】
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【図７−２８】
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【図７−２９】
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【図７−３０】
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【図７−３１】
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【図７−３２】
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【図７−３３】
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【図７−３４】
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【図７−３５】
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【図７−３６】
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【図７−３７】
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【図７−３８】
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【図７−３９】
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【図７−４０】
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【図７−４１】
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【図７−４２】
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【図７−４３】
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【図７−４４】
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【図７−４５】
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【図７−４６】
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【図７−４７】
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【図７−４８】
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【図７−４９】
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【図７−５０】
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【図７−５１】
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【図７−５２】
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【図７−５３】
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【図７−５４】
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【図７−５５】
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【図７−５６】
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【図７−５７】
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【図７−５８】
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【図７−５９】
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【図７−６０】
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【図７−６１】
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【図７−６２】
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【図７−６３】
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【図７−６４】
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【図７−６５】
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【図７−６６】
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【図７−６７】
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【図７−６８】
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【図７−６９】
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【図７−７０】
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【図７−７１】
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【図７−７２】
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【図７−７３】
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【図７−７４】
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【図７−７５】
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【図７−７６】
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【図７−７７】
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【図７−７８】
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【図７−７９】
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【図７−８０】
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【図７−８１】
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【図７−８２】
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【図７−８３】
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【図７−８４】
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【図７−８５】
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【図７−８６】
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【図７−８７】
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【図７−８８】
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【図７−８９】
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【図７−９０】
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【図７−９１】
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【図７−９２】
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【図７−９３】
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【図７−９４】
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【図７−９５】
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【図７−９６】
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【図７−９７】
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【図７−９８】
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【図７−９９】
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【図７−１００】
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【図７−１０１】
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【図７−１０２】
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【図７−１０３】
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【図７−１０４】
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【図７−１０５】
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【図７−１０６】
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【図７−１０７】
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【図７−１０８】
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【図７−１０９】
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【図７−１１０】
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【図７−１１１】
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【図７−１１２】
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【図７−１１３】
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【図７−１１４】
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【図７−１１５】
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【図７−１１６】
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【図７−１１７】
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【図７−１１８】
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【国際調査報告】
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