(57)【要約】【化１】2016527274.tif 000014本出願は、ＡＸＬまたはｃ−Ｍｅｔが過剰発現する任意の固形がんまたは血液がんを含む特定のがんの治療のため、化合物（Ｉ）またはその塩を単独または他の治療活性剤と組み合わせて使用することについて記載する。【選択図】なし
2016527274.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＸＬおよび／またはｃ−Ｍｅｔが過剰発現される任意の固形または血液がんの治療方法であって、そのような治療が必要と認識される被検体に、
【化１】
2016527274.tif 000007
である化合物またはその塩を投与する工程を含む、治療方法。
【請求項２】
非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の治療方法であって、そのような治療が必要と認識される被検体に、
【化２】
2016527274.tif 000008
である化合物またはその塩を投与する工程を含む、治療方法。
【請求項３】
乳がんの治療方法であって、そのような治療が必要と認識される被検体に、
【化３】
2016527274.tif 000009
である化合物またはその塩を投与する工程を含む、治療方法。
【請求項４】
胃がんの治療方法であって、そのような治療が必要と認識される被検体に、
【化４】
2016527274.tif 000010
である化合物またはその塩を投与する工程を含む、治療方法。
【請求項５】
膵臓がんの治療方法であって、そのような治療が必要と認識される被検体に、
【化５】
2016527274.tif 000011
である化合物またはその塩を投与する工程を含む、治療方法。
【請求項６】
前記化合物またはその塩が、一日１回〜４回投与される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項７】
前記化合物またはその塩が、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５５ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項８】
前記化合物またはその塩が、別の治療剤と組み合わせて投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項９】
第二剤がエルロチニブまたはゲフィチニブである、請求項８に記載の治療方法。
【請求項１０】
前記ＮＳＣＬＣがＥＧＦＲ阻害剤を用いる治療に抵抗性または非感受性である、請求項２に記載の治療方法。
【請求項１１】
前記ＮＳＣＬＣがエルロチニブまたはゲフィチニブを用いる治療に抵抗性または非感受性である、請求項１０に記載の治療方法。
【請求項１２】
前記化合物またはその塩が、別の治療剤と組み合わせて投与される、請求項９または１０に記載の治療方法。
【請求項１３】
前記化合物またはその塩が、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５５ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項９または１０に記載の治療方法。
【請求項１４】
前記化合物またはその塩が、一日１回〜４回投与される、請求項９または１０に記載の治療方法。
【請求項１５】
ＡＸＬまたはｃ−Ｍｅｔが過剰発現される任意の固形または血液がんの治療に使用するための化合物
【化６】
2016527274.tif 000012
またはその塩。
【請求項１６】
前記がんが、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん、胃がん、および膵臓がんから選択される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記化合物またはその塩が、一日１回〜４回投与される、請求項１５または１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記化合物またはその塩が、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５５ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
前記化合物またはその塩が、別の治療剤と組み合わせて投与される、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
第二剤がエルロチニブまたはゲフィチニブである、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記がんがＮＳＣＬＣである、請求項１６に記載の使用。
【請求項２２】
前記ＮＳＣＬＣがＥＧＦＲ阻害剤を用いる治療に抵抗性または非感受性である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記ＮＳＣＬＣがエルロチニブまたはゲフィチニブを用いる治療に抵抗性または非感受性である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記化合物またはその塩が、別の治療剤と組み合わせて投与される、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
前記化合物またはその塩が、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５５ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２６】
前記化合物またはその塩が、一日１回〜４回投与される、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２７】
がんの治療に使用される医薬の製造に使用するための化合物
【化７】
2016527274.tif 000013
またはその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、受容体型チロシンキナーゼＡＸＬおよびｃ−ＭＥＴの阻害剤となる新規化合物に関する。この化合物は、ＡＸＬまたはｃ−ＭＥＴにより媒介される疾患（例、がん）の治療およびがん治療に対する耐性の発生の治療に適している。
【背景技術】
【０００２】
受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、膜貫通型タンパク質であって、細胞外環境から細胞質と核へとシグナルを伝達して正常細胞プロセス（生存、増殖、分化、接着、運動を含むもの）を制御するものである。ＲＴＫの異常な発現または活性化は、細胞形質転換、腫瘍形成、および転移と関連する各種ヒトがんの発病に関係があるとされている。これらの所見は、がん治療剤としてチロシンキナーゼ阻害剤を開発することに関する重大な関心へと繋がっている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。
【０００３】
ＡＸＬは、ＴＡＭ（ＴＹＲＯ３、ＡＸＬ、ＭＥＲ）受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーのメンバーであって、慢性骨髄性白血病（非特許文献４）または慢性骨髄増殖性疾患（非特許文献５）の患者由来の細胞で発現するトランスフォーミング遺伝子として最初に同定されたものである。ＡＸＬ活性化は、その同族のタンパク質リガンドであるＧａｓ６（ｇｒｏｗｔｈ  ａｒｒｅｓｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ６）との結合、その細胞外ドメインを介するホモタイピック二量体化、またはインターロイキン（ＩＬ）−１５受容体もしくはＨＥＲ２を介するクロストークにより起こる。ＡＸＬ情報伝達は、細胞応答（ホスホイノシチド３キナーゼ−Ａｋｔの活性化、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）およびｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼカスケードの活性化、ＮＦ−κΒ経路の活性化、シグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）情報伝達の活性化を含むもの）を刺激する（非特許文献６）。ＡＸＬ情報伝達の多数の生体事象（浸潤、移動、生存維持シグナリング、血管新生、化学療法剤および標的化治療剤への耐性、細胞形質転換、および増殖を含むもの）は、がんと関連する望ましくない特質に相当する（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。
【０００４】
受容体ＡＸＬは、血管平滑筋の生体恒常性を制御し（非特許文献１０）、オリゴデンドロサイトの細胞生存の制御に関係があるとされている（非特許文献１１）。ノックアウトマウスを使った研究が明らかにしたのは、ＴＡＭ受容体が、マクロファージおよび樹状細胞の関与する炎症を阻害すること（非特許文献１２；非特許文献１３）、アポトーシスを起こした細胞の貪食を促進すること（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）、およびナチュラルキラー細胞の分化を刺激すること（非特許文献１７）により自然免疫に重要な役割を果たすことである。
【０００５】
ＡＸＬは、遺伝子増幅および／またはタンパク質発現が変化することにより、恒常的に活性化されることが分かった（非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０）。ＡＸＬ発現の変化は、各種ヒトがんにおいて報告され（非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６）、肺がん（非特許文献２７）、前立腺がん（非特許文献２８）、乳がん（非特許文献２９）、食道がん（非特許文献３０）、卵巣がん（非特許文献３１）、すい臓がん（非特許文献３２；非特許文献３３）、肝臓がん（非特許文献３４）、胃がん（非特許文献３５；非特許文献３６）、甲状腺がん（非特許文献３７）、腎細胞がん（非特許文献３８；非特許文献３９）、および神経膠芽腫（非特許文献４０）の浸潤性と転移とに相関する。
【０００６】
実際、ＡＸＬの過剰発現は、これらの多くのヒトがんの後期および全生存率不良と関連する（非特許文献４１；非特許文献４２）。がん細胞の移動と浸潤を促進すること、腫瘍における血管新生に関与すること、およびがん細胞の生存と腫瘍増殖を助長すること（非特許文献４３；非特許文献４４；非特許文献４５；非特許文献４６）により、ＡＸＬはヒトの悪性疾患の６種類の基本メカニズムの内、少なくとも３つに寄与する。ＡＸＬは、不死化乳腺上皮細胞の上皮間葉転換（ＥＭＴ）により強力に誘導される。そして、ＡＸＬをノックダウンすることにより、高転移性の乳がん細胞が乳腺からリンパ節およびいくつかの主要な器官へと拡散するのを完全に阻止し、全生存率が向上した（非特許文献４７；非特許文献４８）。このことは、ＡＸＬが、がん転移に必要な腫瘍細胞ＥＭＴの重要な下流エフェクターに相当することを示す。
【０００７】
ＡＸＬは、複数の治療法（消化管間葉性腫瘍（非特許文献４９）におけるイマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）ならびに乳がん（非特許文献５０）におけるハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）およびＥＧＦＲ阻害剤療法（例、ラパチニブ（ｌａｐａｔｉｎｉｂ）））への「チロシンキナーゼスイッチ」を介した耐性獲得の進行中にも誘導されるし、急性骨髄性白血病における化学療法後（非特許文献５１）にも誘導される。ＡＸＬのノックダウンは、化学療法剤による治療に応答して星状細胞腫細胞の化学療法への感受性が有意に増加することに繋がることも報告された（非特許文献５２）。これらのデータは、ＡＸＬを、従来の化学療法および分子に基づくがん治療剤に対する腫瘍耐性に関する重要な媒介物として示す。
【０００８】
受容体ｃ−ＭＥＴは、化学的発がん物質で処理した骨肉腫細胞株におけるＴＰＲ−ＭＥＴがん遺伝子として、最初に同定された。ＴＰＲ−Ｍｅｔタンパク質は、非腫瘍性細胞を形質転換し、その細胞に浸潤性および転移性を付与することができる（非特許文献５３）。そのがん化能力は、ＴＰＲ−ＭＥＴの自発的二量体化、そして、恒常的活性化の結果である。ＨＧＦおよびｃ−ＭＥＴの発現異常は、幅広い範囲の固形がん（乳がん、前立腺がん、甲状腺がん、肺がん、胃がん、直腸がん、すい臓がん、腎臓がん、卵巣がん、および子宮がん、悪性グリオーマ、ブドウ膜黒色腫、ならびに骨肉腫および軟部肉腫を含むもの）の発症と予後不良に関連する（非特許文献５４）。野生型ｃ−ＭＥＴ遺伝子の増幅がある胃腫瘍は、ＭＥＴ阻害により感受性があり、従って、ｃ−ＭＥＴが魅力的な標的となっている（非特許文献５５）。
【０００９】
インビトロおよびインビボでの研究は、ｃ−ＭＥＴ活性化の増加および制御不能が、悪性表現型と関連する幅広い範囲の生体応答に繋がることを示した。これらの応答には、運動性／浸潤性の増加、腫瘍形成の増加、血管新生の亢進、ＤＮＡ損傷剤（例、アドリアマイシン）、紫外線、および電離性放射線により誘導されるアポトーシスからのがん細胞の保護、ならびにＤＮＡ鎖切断の修復率の向上が含まれる（非特許文献５６，非特許文献５７；非特許文献５８）。これらのデータに基づくと、ＨＧＦは、ＤＮＡ損傷後の突然変異原性を高め、遺伝子損傷がある腫瘍細胞を生存させ、従って、化学療法および放射線療法の投与計画に対する抵抗性を導く可能性がある（非特許文献５９；非特許文献６０）。
【００１０】
ＭＥＴの増幅は、ＥＧＦＲ阻害剤（例、Ｔａｒｃｅｖａ（商標）、Ｉｒｅｓｓａ（商標）、Ｔｙｋｅｒｂ（商標））への非小細胞肺がんの耐性、トラスタズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）へのＨＥＲ２陽性乳がんの耐性を媒介するのにユニークで重要な役割を果たす（非特許文献６１；非特許文献６２，非特許文献６３，非特許文献６４；非特許文献６５）。ｓｈＲＮＡもしくは小分子を単独使用またはＥＧＦＲ阻害剤の併用による、Ｔａｒｃｅｖａ（商標）またはＩｒｅｓｓａ（商標）抵抗性細胞におけるｃ−ＭＥＴの阻害により、ＥＧＦＲ阻害剤へのＭＥＴ媒介抵抗性を克服した（非特許文献６６；非特許文献６７，非特許文献６８；非特許文献６９）。ＨＧＦ−ｃ−ＭＥＴ軸の多面的腫瘍形成促進活性に起因して、この経路を阻害することは、複数の相補的メカニズムを介して多くの一般的がんにおいて強力な抗腫瘍作用を有すると予測されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｒｏｓｔｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１１．［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］
【非特許文献２】Ｇｏｒｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｒａｃｔ．２０１１．［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］
【非特許文献３】Ｇｒａｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２０１１，１０，５６９
【非特許文献４】Ｏ’Ｂｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９１，１１，５０１６
【非特許文献５】Ｊａｎｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９１，６，２１１３
【非特許文献６】Ｈａｆｉｚｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．，２００６，１７，２９５
【非特許文献７】Ｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００８，１００，３５
【非特許文献８】Ｈａｆｉｚｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．，２００６，１７，２９５
【非特許文献９】Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５，６５，９２９４
【非特許文献１０】Ｋｏｒｓｈｕｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．２００６，９８，１４４６
【非特許文献１１】Ｓｈａｎｋａｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００３，２３，４２０８
【非特許文献１２】Ｓｈａｒｉｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００６，２０３，１８９１
【非特許文献１３】Ｒｏｔｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ．２００７，１３１，１１２４
【非特許文献１４】Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ．１９９９，３９８，７２３
【非特許文献１５】Ｌｕ＆Ｌｅｍｋｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００１，２９３，３０６
【非特許文献１６】Ｐｒａｓａｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００６，３，９６
【非特許文献１７】Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  ２００９，１１３，２４７０
【非特許文献１８】Ｏ’Ｂｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，２７０，５５１
【非特許文献１９】Ｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ．２０１０，１４，１０７３
【非特許文献２０】Ｍｕｄｄｕｌｕｒｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０１１，３０，２８８８
【非特許文献２１】Ｃｒｏｓｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ．１９９５，１８，４４３
【非特許文献２２】Ｃｈａｌｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１９９６，１０，７８１
【非特許文献２３】Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｙｒｏｉｄ．１９９９，９，５６３
【非特許文献２４】Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２００４，６６，４５０
【非特許文献２５】Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．２００６，９４，１４４６
【非特許文献２６】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ．２０１０，１１６，２９７
【非特許文献２７】Ｓｈｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．２００５，７，１０５８
【非特許文献２８】Ｓｈｉｏｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．２０１０，１２，１１６
【非特許文献２９】Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８，６８，１９０５
【非特許文献３０】Ｈｅｃｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０，１０，１００９
【非特許文献３１】Ｒａｎｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１０，７０，７５７０
【非特許文献３２】Ｋｏｏｒｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００９，８，６１８
【非特許文献３３】Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ，２０１１，１１７，７３４
【非特許文献３４】Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．２０１０，４９，８８２
【非特許文献３５】Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００２，２２，１０７１
【非特許文献３６】Ｓａｗａｂｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｇ．２００７，４６，１５５
【非特許文献３７】Ａｖｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１１，７１，１７９２
【非特許文献３８】Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００３，２２，５３３
【非特許文献３９】Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００９，１５，４７４２
【非特許文献４０】Ｈｕｔｔｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８，１４，１３０
【非特許文献４１】Ｒｏｃｈｌｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１９９９，１３，１３５２
【非特許文献４２】Ｖａｊｋｏｃｚｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．．２００６，１０３，５７９９
【非特許文献４３】Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５，６５，９２９４
【非特許文献４４】Ｔａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００８，２７，４０４４
【非特許文献４５】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００９，２８，３４４２
【非特許文献４６】Ｍｕｄｄｕｌｕｒｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１０，８，１５９
【非特許文献４７】Ｇｊｅｒｄｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１０，１０７，１１２４
【非特許文献４８】Ｖｕｏｒｉｌｕｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２０１１，３０，１４３６
【非特許文献４９】Ｍａｈａｄｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００７，２６，３９０９
【非特許文献５０】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００９，６９，６８７１
【非特許文献５１】Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２００８，２６８，３１４
【非特許文献５２】Ｋｅａｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２０１０，９，１２９８
【非特許文献５３】Ｓａｔｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐ．，２００７，９，１０２
【非特許文献５４】Ｊａｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．  Ｏｎｃｏｌ／Ｈｅｍａｔｏｌ．，２００５，５３，３５
【非特許文献５５】Ｓｍｏｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００６，１０３，２３１６
【非特許文献５６】Ｃｏｍｏｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２００２，１０９，８５７
【非特許文献５７】Ｓａｔｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐ．，２００７，９，１０２
【非特許文献５８】Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２００１，２１，４９６８
【非特許文献５９】Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２００１，２１，４９６８
【非特許文献６０】Ｈｉｓｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ，２００４，１３，１０８５
【非特許文献６１】Ｓａｔｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｕｐｄａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，２００９，３，１０９
【非特許文献６２】Ｅｎｇｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，３１６，１０３９
【非特許文献６３】Ｓｈａｔｔｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００８，６８，１４７１
【非特許文献６４】Ａｇａｒｗａｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２００９，１００，９４１
【非特許文献６５】Ｋｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２００９，１２４，１７７８
【非特許文献６６】Ａｇａｒｗａｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２００９，１００，９４１
【非特許文献６７】Ｂａｃｈｌｅｉｔｎｅｒ−Ｈｏｆｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，２００８，７，３４９９
【非特許文献６８】Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，  ２００８，９９，９１１
【非特許文献６９】Ｂｅａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００７，１０４，２０９３２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本出願は、ＡＸＬまたはｃ−Ｍｅｔが過剰発現する任意の固形がんまたは血液がんを含む特定のがんの治療のため、特定のＡＸＬ／ｃ−Ｍｅｔ阻害剤であるＣＥＰ−４０７８３またはその塩を単独または他の治療活性剤と組み合わせて使用することについて記載する。ＣＥＰ−４０７８３の構造を以下に示す。
【化１】
2016527274.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＡＸＬおよびｃ−ＭｅｔのＣＥＰ−４０７８３による阻害に関する結合アッセイデータを図示する。
【図２】図２は、ＡＸＬおよびｃ−ＭｅｔからのＣＥＰ−４０７８３の解離速度のデータを図示する。
【図３】図３Ａは、ＮＣＩ−Ｈ１２９９ＮＳＣＬＣの異種移植片を有する雌ＳＣＩＤマウスにおける、ＣＥＰ−４０８７３経口投与後のＡＸＬリン酸化への効果を図示する。図３Ｂは、ＧＬＴ−１６胃がんの皮下腫瘍移植片を有するｎｕ／ｎｕマウスにおける、ＣＥＰ−４０８７３経口投与後のｃ−Ｍｅｔリン酸化への効果を図示する。
【図４】図４は、雌ＳＣＩＤマウスにおける、ＮＩＨ３Ｔ３／ＡＸＬ腫瘍異種移植片中の経口投与ＣＥＰ−４０７８３の抗腫瘍効力を図示する。
【図５】図５は、雌胸腺欠損ヌードマウスにおける、ＧＴＬ−１６胃がん異種移植片中の経口投与ＣＥＰ−４０７８３の抗腫瘍効力を図示する。
【図６】図６は、雌胸腺欠損ヌードマウスにおける、ＥＢＣ−１ヒトＮＳＣＬＣ異種移植片中の経口投与ＣＥＰ−４０７８３の抗腫瘍効力を図示する。
【図７】図７は、ＥＢＣ−１ヒトＮＳＣＬＣ異種移植片の増殖へのＣＥＰ−４０８７３の各種投薬スケジュールの効果を図示する。
【図８】図８は、４Ｔ１−Ｌｕｃ２マウス乳がん細胞を移植（ｉ．ｖ．）した雌Ｂａｌｃ／ｃマウスにおける経口投与ＣＥＰ−４０７８３の抗腫瘍効果を図示する。
【図９】図９Ａおよび図９Ｂは、雌ヌードマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｌｅｕ正所性乳腺腫異種移植片の転移へのＣＥＰ−４０７８３経口投与の効果を図示する。
【図１０】図１０は、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）非感受性の原発性ＮＳＣＬＣであるヒトＴｕｍｏｒＧｒａｐｈｓ（商標）におけるＣＥＰ−４０７８３経口投与の効果を図示する。
【図１１】図１１は、活性化ＡＸＬおよびｃ−Ｍｅｔを有する「エルロチニブ感受性」ＮＳＣＬＣのＴｕｍｏｒＧｒａｆｔ（商標）におけるＣＥＰ−４０７８３およびエルロチニブの活性を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書中で使用される場合、他に規定されない限りにおいて、次の用語は以下のものに帰される意味を有する。
【００１５】
用語「約」は、所定値の±１０％のことを指す。
【００１６】
「医薬組成物」は、ヒトを含む被検体への投与に適した安全性および／または作用効果プロフィールを有する組成物を指す。
【００１７】
「医薬的に許容可能な」をそれ自体または他の用語（複数可）と合わせて使用する場合は、材料（例、有効成分、塩、賦形剤、担体、ビヒクル、または希釈剤）であって、処方剤を含む他の成分と化学的および／または物理的に全体として適合可能なもの、ならびに／あるいはその受容者に全体として生理学的に適合可能なもののことを指す。
【００１８】
「被検体」は、哺乳動物綱のメンバーを指す。哺乳動物の例には、限定はされないが、ヒト、霊長目、チンパンジー、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、家畜、イヌ、ネコ、ヒツジ、およびウシが含まれる。
【００１９】
「治療的有効量」は、特定の被検体または被検体集団において治療中の特定の疾患または状態と関連する一又は複数の症状の重症度を改善またはその悪化を阻害するのに十分な化合物量を指す。投与形態（複数可）、投与量（複数可）、及び投与経路（複数可）の決定と選択は、医薬および医学技術分野の通常の技術レベルの範囲内にあることが理解されるべきである。
【００２０】
「治療」は、治療中の疾患と関連するもしくはその原因となる少なくとも一つの症状または特徴を、急性的もしくは予防的に減弱または緩和することを指す。例えば、治療には、疾患の症状の減弱あるいは症状および／または疾患それ自体のいずれかの根治が含まれる場合がある。用語「予防する」、「予防性」、および「予防的」は、絶対的なものではなく、むしろ、化合物または組成物の投与により、状態、症状、または病状の起こりやすさもしくは重症度を減弱および／あるいは状態、症状、または病状の発症をある期間遅延可能とする使用および結果を指すと理解されるべきである。いくつかの実施形態では、用語「治療すること」、「治療された」、および「治療」は、治癒的使用および結果とともに、本明細書中に記載される特定の状態、症状、疾患、または病気の重症度を縮減または減少するような使用および結果を指す。
【００２１】
本明細書中で使用される用語「治療活性剤」および「治療剤」は、単独で使用されるか又は他の用語（複数可）と合わせて使用する場合、特定の状態、症状、病気、または疾患の治療に有用である可能性があるか、または有用であることが既に分かっている任意の化合物（すなわち治療薬またはその塩）であって、ＣＥＰ−４０７８３ではないものを指す。
【００２２】
本明細書中に記載される化合物（ＣＥＰ−４０７８３および／または任意の他の治療活性剤を含むもの）は、それ自体、遊離塩基として単離および使用可能であるか、又は、塩形態で単離される場合がある。用語「塩（複数可）」および「塩形態（複数可）」は、それら自体で使用されるか、他の用語（複数可）と合わせて使用される場合、特に断りがない限り、本明細書中で定義されるあらゆる無機および有機塩（工業的に許容可能な塩を含むもの）ならびに本明細書中で定義される医薬的に許容される塩を含む。本明細書中で使用される工業的に許容可能な塩は、製造および／または加工（精製を含む）と共に輸送および保存に一般的に適する塩であるが、臨床的または治療的な使用のために典型的に投与される塩でなくてもよい。工業的に許容可能な塩は、ラボスケール（すなわち、複数グラムもしくはそれ以下）またはラージスケール（すなわち、キログラムまでか、それ以上を含むもの）で調製可能である。本明細書中で使用される医薬的に許容される塩は、処方剤を含む他の成分と化学的および／または物理的に全体として適合可能な塩ならびに／あるいはその受容者に全体として生理学的に適合可能な塩である。医薬的に許容可能な塩は、ラボスケール（すなわち、複数グラムもしくはそれ以下）またはラージスケール（すなわち、キログラムまでか、それ以上を含むもの）で調製可能である。医薬的に許容される塩は、標準的に投与される塩またはヒトへの臨床もしくは治療的な使用に関して（ＦＤＡ等の監督官庁により）承認された塩に限定されないと理解されるべきである。当業者は、いくつかの塩が工業的に許容可能な塩と共に医薬的に許容される塩の両者であることを容易に理解する。そのような全ての塩（塩形態の混合物を含むもの）は、本出願の範囲内であることが理解されるべきである。
【００２３】
一態様では、本出願は、
【化２】
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である化合物またはその塩を提供する。この化合物は、ＣＥＰ−４０７８３としても知られる、化学名３−（４−フルオロフェニル）−ｌ−イソプロピル−２，４−ジオキソ−ｌ，２，３，４−テトラヒドロピリミジン−５−カルボン酸［４−（６，７−ジメトキシキノリン−４−イルオキシ）−３−フルオロフェニル］−アミドと呼ばれる場合がある。
【００２４】
別の態様では、本出願は、ＡＸＬまたはｃ−Ｍｅｔが過剰発現される任意の固形がん又は血液がんを含む各種がんの治療方法を提供し、本方法は、治療が必要であると認識される被検体へ、ＣＥＰ−４０７８３または医薬的に許容可能なその塩を投与する工程を含む。別の態様では、本出願は、ＡＸＬまたはｃ−Ｍｅｔが過剰発現される固形がんまたは血液がんを治療するための医薬の調製におけるＣＥＰ−４０７８３または医薬的に許容可能なその塩の使用であって、前記医薬が治療を必要とすると認識される被検体にその後投与されるものを提供する。好ましくは、ＣＥＰ−４０７８３または医薬的に許容可能なその塩を、医薬的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物で、前記被検体に投与する。
【００２５】
別の態様では、本出願は、特定のがん（限定はされないが、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん、胃がん、および膵臓がんを含むもの）を、ＣＥＰ−４０７８３または医薬的に許容可能なその塩を使用して治療する方法を記載する。いくつかの実施形態では、がんは、ＥＧＦＲ阻害剤を用いる治療に抵抗性または非感受性のＮＳＣＬＣである。いくつかの実施形態では、ＣＥＰ−４０７８３または医薬的に許容可能なその塩は、単剤として投与される。他の実施形態では、ＣＥＰ−４０７８３または医薬的に許容可能なその塩は、別の治療剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、他の治療剤はエルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）である。さらにいくつかの実施形態では、他の治療剤はゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）である。
【００２６】
前記治療方法（または医薬的使用）のいずれかにおいては、ＡＸＬまたはｃ−Ｍｅｔが過剰発現される固形がんまたは血液がんは、ＣＥＰ−４０７８３またはその塩を使用して、予防的、急性的、または慢性的に治療される場合がある。いくつかの実施形態では、ＣＥＰ−４０７８３またはその塩は、別の治療剤と組み合わせて使用される場合がある。いくつかの実施形態では、ＣＥＰ−４０７８３または医薬的に許容可能なその塩は、他の治療剤と同時に投与される。他の実施形態では、ＣＥＰ−４０７８３または医薬的に許容可能なその塩は、引き続いて投与、つまり、他の治療剤の前または後に投与される。そのような実施形態では、ＣＥＰ−４０７８３または医薬的に許容可能なその塩は、被検体が別の薬剤を用いる治療に何らかの程度の抵抗性または非感受性を示した後に投与される。いくつかの実施形態では、他の治療剤はエルロチニブである。さらにいくつかの実施形態では、他の治療剤はゲフィチニブである。
【００２７】
本明細書中に記載される治療応用例では、ＣＥＰ−４０７８３または医薬的に許容可能なその塩は、多種多様な経口および／または非経口投与形態で投与可能である。一実施形態では、本発明の化合物は、経口で送達される。非経口投与は、注射による投与、つまり、静脈内、筋肉内、皮中、皮下、十二指腸内、または腹腔内への投与として理解されるべきである。ある実施形態では、本発明の化合物は、静脈内または皮下に投与される。また、本明細書中に記載される化合物は、吸引、例えば、鼻腔内に投与可能である。さらに、本発明の化合物は、経皮投与可能である。本化合物はまた、直腸送達、バッカル錠で送達、または吹送法により送達可能でもある。
【００２８】
特定の状況に対する適切な投与量の決定は、当業者の技術範囲内である。一般的には、治療を、化合物の最適用量未満のより少ない投与量で開始する。その後、投与量を、その状況下で最適な効果に到達するまで、少しずつ量を増やして、増加させる。適宜、一日当たりの総投与量を分割し、所望ならば、一日の間に複数回に分けて投与してもよい。いくつかの実施形態では、例えば、ＣＥＰ−４０７８３またはその塩を、一日当たり１回〜４回投与する。標準的な用量は、約１ｍｇ〜約１，０００ｍｇ（例、約５ｍｇ〜約５００ｍｇ）である。ある実施形態では、標準的な用量は、約１ｍｇ〜約３００ｍｇ（例、約５ｍｇ〜約２５０ｍｇ）である。さらに別の実施形態では、標準的な用量は、約１０ｍｇ〜１００ｍｇである。いくつかの実施形態では、ＣＥＰ−４０７８３またはその塩は、体重に応じて投薬される。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＥＰ−４０７８３またはその塩を、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ（例、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、または、約５ｍｇ／ｋｇ〜約７５ｍｇ／ｋｇ）の量で投与する。いくつかの実施形態では、ＣＥＰ−４０７８３またはその塩を、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５５ｍｇ／ｋｇの量で投与する。
【００２９】
ＣＥＰ−４０７８３は、任意の数の各種方法を使用して、例えば、ＷＯ２０１３／００７４６３３に記載される方法を使用して、調製可能である。
【実施例】
【００３０】
バイオロジー
ＣＥＰ−４０７８３は、経口投与で活性がある、強力で選択的なＡＸＬおよびｃ−Ｍｅｔキナーゼ阻害剤であって、それら酵素に対するＩＣ５０値は、それぞれ７ｎＭおよび１２ｎＭである。ＡＸＬをトランスフェクトした２９３ＧＴ細胞では、ＣＥＰ−４０７８３は、組換え酵素の場合と比較して２７倍活性が高く、ＩＣ５０値は、０．２６ｎＭであった。相対的に高い細胞での能力が、ＮＣＩ−Ｈ１２９９ヒトＮＳＣＬ細胞で観察された（ＩＣ５０＝０．１ｎＭ）。ＣＥＰ−４０７８３はまた、ＧＴＬ−１６細胞でｃ−Ｍｅｔに対して優れた活性を示した（ＩＣ５０＝６ｎＭ）。細胞中でＣＥＰ−４０７８３の阻害活性が増加したことは、ＡＸＬおよびｃ−Ｍｅｔの両者上の滞在時間が伸びたことに起因する可能性があり、ＩＩ型メカニズムと矛盾しない。標的上でＣＥＰ−４０７８３の滞在時間が延長したことにより、インビボでの効力、選択性、および治療指標が改善する可能性がある。さらに、ＣＥＰ−４０７８３は、２９８種類のキナーゼに対する高いカイノーム（ｋｉｎｏｍｅ）選択性を示し、Ｓ９０（１μＭで＞９０％阻害を示すキナーゼの割合）は０．０４であった。
【００３１】
様々な種間のＰＫデータのまとめを以下の表１に提示する。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
ＣＥＰ−４０７８３は、ＡＸＬおよびｃ−Ｍｅｔの阻害に関して、時間依存性の結合動力学を示す
時間依存性結合アッセイを、Ｇｒｅｉｎｅｒ低容量白色３８４ウェルプレートで実施した。アッセイバッファーは、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＧＴＡ、および０．０１％Ｂｒｉｊ−３５からなる一方、化合物希釈バッファーは、アッセイバッファー中に１％ＤＭＳＯを含んでいた。化合物希釈バッファー（５μｌ）を、アッセイプレートに添加した。ＣＥＰ−４０７８３のハーフログ希釈系列を、３８４ウェルポリプロピレンプレートにおいて、１５０×アッセイ終濃度でＤＭＳＯ中に調製し、１００μｌをアッセイプレートにロボットを使って移した。キナーゼトレーサー（５μＬ；インビトロジェンＰＶ５５９２）を、全てのウェルに加えた。トレーサー終濃度は、ＡＸＬに対しては１０ｎＭで、ｃ−Ｍｅｔに対しては１００ｎＭとした。ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ  Ｅｕ−抗ＧＳＴ抗体（５μＬの６ｎＭ、２ｎＭの終濃度；インビトロジェンＰＶ５５９４）を、ＤＭＳＯ（阻害剤なし）コントロールウェルに加える一方で、残りのウェルには、５μＬの同抗体プラス１５ｎＭのＧＳＴタグ付き酵素（５ｎＭの終濃度）を入れた。動力学測定を、レーザー光源（３３７ｎｍ）、Ｌａｎｃｅ／ＤＥＬＦＩＡデュアルミラー、ならびにＡＰＣ（６６５ｎｍ）およびユーロピウム（６１５ｎｍ）フィルターを装着したＥｎ  Ｖｉｓｉｏｎ（商標）２１０４プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上で直ちに開始した。３０回の測定を４分間隔で実施し、６６５ｎｍ／６１５ｎｍのエミッション比率を計算した。酵素なしコントロールに対応する平均比率を、全てのデータから差し引いた。化合物の阻害曲線を、化合物濃度のｌｏｇ１０に対してパーセントコントロール活性をプロットして作成した。ＩＣ５０値を、ＸＬｆｉｔのＳ字形用量−反応（可変勾配）方程式を使用して、非線形回帰により計算した。そのＩＣ５０変化倍数を、初期値を得られた最も低い値で割り算して計算し、最大変化が観察された時間もまた、記録した（ｔｍａｘ）。
【００３４】
ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｅｕ−キナーゼ結合アッセイを使用して試験した場合、ＣＥＰ−４０７８３は、ＡＸＬおよびｃ−Ｍｅｔに対して時間依存性結合動力学を呈した。それはＩＩ型メカニズムと矛盾しない（図１を参照されたい）。結合データによると、時間ｔ０から２ｈｒのｔｍａｘまでの、ＡＸＬのＣＥＰ−４０７８３による阻害のＩＣ５０値が３５倍にシフトする。ＣＥＰ−４０７８３はまた、時間依存性のｃＭｅｔ阻害を呈し、ＩＣ５０が３８倍シフトしたことが認められた。
【００３５】
ＡＸＬおよびｃ−ＭｅｔからのＣＥＰ−４０７８３の解離
また、ＡＸＬおよびｃ−ＭｅｔからのＣＥＰ−４０７８３の解離速度を、ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｅｕ−キナーゼ結合アッセイを使用して測定した。アッセイバッファーを、結合用に調製し、全ての希釈のために使用した。８０ｎＭのＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ  Ｅｕ−抗ＧＳＴ抗体：２０ｎＭのＧＳＴタグ付き酵素混合物の５μＬのアリコートを、Ｇｒｅｉｎｅｒ低容量白色３８４ウェルプレートに加えた。コントロールウェルには抗体だけ加えた。ＤＭＳＯ中の化合物（１００ｎＬ）を、アッセイ終濃度の２０００倍で保持しているピンツールにより加えた。ＤＭＳＯを、阻害剤なしコントロールウェルに加えた。外気温で一時間インキュベートして酵素−阻害剤複合体を形成させた後、２μＬの反応混合物を３８４ウェルＯｐｔｉｐｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）へ移し、７８μＬのキナーゼトレーサー２３６を加えた。トレーサー終濃度は、ＡＸＬに対しては１００ｎＭで、ｃ−Ｍｅｔに対しては２００ｎＭとした。記録を直ちに開始し、合わせて６０時点を、２５℃または３７℃で２分間隔にて取った。バックグラウンド差し引き率を、阻害剤なしのコントロールに対して標準化し、トレーサー結合％を計算した。それは、時間に対してプロットした。そのデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中の１相結合モデルに適合させた。
【００３６】
図２に見られるように、ＣＥＰ−４０７８３は、２５℃で、ＡＸＬおよびｃＭｅｔに対し非常にゆっくりとした「オフレート」を示し、それは、擬似的な不可逆結合動力学で説明される。解離速度は、温度がより高くなると（３７℃）、わずかではあるが上昇した。ＣＥＰ−４０７８３の強力なＡＸＬおよびｃ−Ｍｅｔへの細胞における活性は、治療薬−受容体滞在時間を延長させる結果となる遅い解離速度により説明可能である。Ｉ型キナーゼ阻害剤は、この技術を使用すると速い解離速度を示すことが示されている。
【００３７】
ＣＥＰ−４０７８３は、腫瘍異種移植片中でＡＸＬおよびｃ−Ｍｅｔリン酸化を阻害する
雌Ｎｕ／Ｎｕマウス（６〜８週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を、標準的ラボ飼料（Ｔｅｋｌａｄ  Ｌａｂｃｈｏｗ、Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で、マイクロアイソレーター装置にて５匹／ケージで維持した。動物は湿度と温度の制御条件下で飼育し、明／暗サイクルを、１２時間間隔で設定した。マウスを実験操作の少なくとも１週間前に隔離した。実験は、Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認された（プロトコル０３−０２３）。
【００３８】
手短には、ＮＣＩ−Ｈ１２９９  ＮＳＣＬ細胞（ＡＸＬ試験用）またはＧＴＬ−１６胃がん細胞（ｃ−Ｍｅｔ試験用）を回収して、ＤＭＥＭ培地に５×１０７／ｍＬの密度で再懸濁した。そして、細胞懸濁物（５×１０６細胞）のアリコート（１００μＬ）を、各マウスの左わき腹の皮下に、２３ゲージの針を使って接種した。腫瘍異種移植体積が約３００〜５００ｍｍ３に達したら、ＰＥＧ−４００ビヒクルまたはＣＥＰ−４０７８３の指定された用量の単一経口投与を、１００μＬ／投薬で、マウスに与えた。投薬後の指定された時点で、マウス（各時点当たり３匹のマウス）を断頭して屠殺し、血液を２０μＬのヘパリンナトリウム（Ｈ２０中の１０，０００ユニット／ｍＬ、カタログ＃０２１０１９３１９１、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ）を含む１．５ｍＬの微小遠心チューブに回収し、短時間氷上に放置した。そのチューブを４℃で８分間、２０，８１７×ｇ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機５４１７Ｒ、ＦＡ４５−３０−１１ローター付き）で遠心分離した。血漿を回収し、１．５ｍＬの微小遠心チューブに移して、その後−８０℃で保管した。腫瘍を切り出して計量し、メスで小片に切り刻み、氷上の１４ｍＬの丸底チューブ（カタログ＃３５２０５９、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、ＮＪ）中に置いた。２ボリュームの界面活性剤抜きＦＲＡＫ溶解バッファー［１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、５０ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのフッ化ナトリウム、２ｍＭのピロリン酸ナトリウム、０．１％ＢＳＡとプラスして新しく調製した１ｍＭの活性化バナジウム酸ナトリウム、４ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＰＭＳＦ、およびプロテアーゼ阻害剤カクテルＩＩＩ（１：１００希釈、カタログ＃５３９１３４、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）］を、１ボリュームの腫瘍に加えた（例えば、５００μＬのＦＲＡＫ溶解バッファーを２５０ｍｇの組織へ加えた）。その後、組織を、携帯式の組織ブレンダーで、各サイクルが１０〜１５秒で、１〜２分の間隔をもって、２〜３サイクルで破砕した。その後溶解物を、各回４〜５ストロークで２回超音波破砕した。組織溶解物を１．５ｍＬの微小遠心チューブに移して、４℃で１０分間、２０，８１７×ｇ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機５４１７Ｒ、ＦＡ４５−３０−１１ローター付き）で遠心分離した。上清（１２μＬ）を、１０８μＬのＦＲＡＫ溶解バッファーと新たに加えた１００ｎＭのジチオトレイトール（カタログ＃Ｆ８２０−０２、ＪＴ  Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）を有する４０μＬの４×ＬＤＳサンプルバッファー（カタログ＃ＮＰ０００７、インビトロジェン）を含む１．５ｍＬ微小遠心チューブへ移した。残りの上清を−８０℃で保存した。血漿と腫瘍溶解物の両方の化合物レベルを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定した。腫瘍ＰＤ解析に関しては、リン酸化ｃ−Ｍｅｔおよびトータルｃ−Ｍｅｔと、リン酸化ＡＸＬおよびトータルＡＸＬとの免疫ブロット解析を、抗体供給元（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により提供されたプロトコルに従って実施した。ウサギリン酸化ｃ−Ｍｅｔ（Ｙ１２３４／１２３５）抗体（カタログ＃３１２９）およびｃ−Ｍｅｔ抗体（カタ���グ＃３１２７）と、ウサギリン酸化ＡＸＬ（Ｙ７０２）抗体（カタログ＃５７２４）およびＡＸＬ抗体（カタログ＃４９３９）を、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から購入した。サンプルは、９０℃で５分間加熱して不活化した。２０μＬの各サンプルを、色素の前端がゲルから出るまで、１５０ＶでＮｕＰＡＧＥ  ７％トリスアセテートゲル（カタログ＃ＥＡ０３５５２Ｂｏｘ、インビトロジェン）により分析した。そのゲルを、湿式ＸＣｅｌｌ  ＩＩブロットモジュール（カタログ＃ＥＬ９０５１、インビトロジェン）を使用して、３０Ｖの一定電圧で２時間、ニトロセルロース膜（カタログ＃ＬＣ２０００、インビトロジェン）へ転写した。その膜を、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）および３％Ｎｅｓｔｌｅ  Ｃａｒｎａｔｉｏｎ脱脂乳（Ｎｅｓｔｌｅ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ）を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中で、室温（ＲＴ）で１時間ブロッキングした。その膜を、抗リン酸化ｃ−Ｍｅｔ（Ｔｙｒ１２３４／１２３５）抗体または抗リン酸化ＡＸＬ抗体（Ｔｙｒ７０２；３％ウシ血清アルブミン含有ＴＢＳＴ中で１：１０００に希釈したもの）で、穏やかに振とうしながら室温で１．５時間または４０℃で一晩インキュベートした。各回１０分間、ＴＢＳＴで３回洗浄後、膜を、３％脱脂乳含有ＴＢＳＴ中で希釈したホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）（カタログ＃Ｗ４０１Ｂ、プロメガ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）結合ヤギ抗ウサギ抗体と共に、穏やかに振とうしながら室温で１時間インキュベートした。各回１０分間で３回、ＴＢＳＴで洗浄し、そして一度、５分間ＴＢＳで洗浄後、膜を、５ｍＬのＥＣＬ（商標）ウエスタンブロティング検出試薬（カタログ＃ＲＰＮ２１０６、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）と、５分間インキュベートした。そして、Ｋｏｄａｋ化学発光ＢｉｏＭａｘフィルム（カタログ＃１７８，８２０７；Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ  Ｈｅａｌｔｈ社、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）に暴露して、可視化した。その後、膜を、ストリッピングバッファー（６２．５ｍＭのＴｒｉｓＨＣ１、ｐＨ６．８、２％ＳＤＳおよび１００ｍＭの２−メルカプトエタノール）と、３０分間５６℃でインキュベートすることによりストリッピングした。そして、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体および抗ＡＸＬ抗体で再度ブロッティングし、その後、１：１０，０００に希釈したヤギ抗ウサギＨＲＰ二次抗体でブロッティングした。リン酸化およびトータルＡＸＬと、リン酸化およびトータルｃ−Ｍｅｔの個々のバンドイメージのあるフィルムをスキャンし（ＨＰ  Ｓｃａｎｊｅｔ７４００ｃ、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ社、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、Ｇｅｌ−Ｐｒｏ解析ソフトウエア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使って定量した。その後、ビヒクルコントロールの腫瘍サンプルに対する各腫瘍サンプルの標準化ＡＸＬリン酸化および標準化ｃ−Ｍｅｔリン酸化の程度を計算した。
【００３９】
ＰＫ／ＰＤ試験において、ＣＥＰ−４０７８３は、ＮＣＩ−Ｈ１２９９  ＮＳＣＬ異種移植片を使用すると、用量および時間依存性のＡＸＬリン酸化阻害を示した。０．３ｍｇ／ｋｇで投薬６時間後に、約８０％標的阻害があり、１ｍｇ／ｋｇで６〜２４時間の間では、完全な標的阻害から＞９０％阻害までを示した。一方、１０ｍｇ／ｋｇでのｐｏ投与では、投薬４８時間後まで、完全なＡＸＬ阻害が生じた。ＮＣＩ−Ｈ１２９９  ＮＳＣＬＣを保持する雌Ｓｃｉｄマウスに、指示されるようにＣＥＰ−４０７８３を投与し、投与後６時間で、血漿と腫瘍サンプルを回収した（図３Ａ）。腫瘍サンプル中のリン酸化ＡＸＬ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＃５７２４）とトータルＡＸＬ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＃４９７７）への効果を、免疫ブロッティングにより検出し、標準化されたＡＸＬリン酸化阻害の大きさを計算した。
【００４０】
ＧＴＬ−１６胃がんｓｃ腫瘍異種移植片を有するｎｕ／ｎｕマウスに、指示されるように投薬して、血漿と腫瘍サンプルを、投薬６および２４時間後に回収した（図３Ｂ）。ｃ−Ｍｅｔリン酸化への効果を、ＥＬＩＳＡ（インビトロジェンＫＨＯ０２８１およびＫＨＯ２０３１）を使用して測定し、標準化されたｃ−Ｍｅｔリン酸化阻害の大きさを計算した。
【００４１】
ＣＥＰ−４０７８３は、ＮＩＨ３Ｔ３／ＡＸＬ異種移植片の成長を阻害する
改変ＮＩＨ３Ｔ３／ＡＸＬ細胞株を以下のようにして作製した。ヒトＡＸＬｃＤＮＡを、ｐＱＣＸＩＰベクターにサブクローンし、その配列を、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａで、シークエンシングして確認した。４ｍＬのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中のＰＴ６７細胞（５×１０５）を、６ウェルプレート（カタログ＃３５３０４６、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）の各ウェルに播種し、５％ＣＯ２の加湿したインキュベーター中で、３７℃で一晩培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（カタログ＃５２８８７、インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）トランスフェクション試薬を製造元のプロトコルに従って使用して、２μｇのｐＱＣＸＩＰ−ＡＸＬを、細胞にトランスフェクションした。手短には、５００μＬの培養培地中のＤＮＡと、２０μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００トランスフェクション試薬を含む５００μＬの培地とを混合し、その混合物を室温で２０分間インキュベートした。培養培地を吸引し、ディッシュを２ｍＬの１×ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、カタログ＃２１−０３１−ＣＭ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）で洗浄した後、１ｍＬの適切なトランスフェクション混合物を各ウェルに加えた。それらのウェルを５％ＣＯ２、３７℃の加湿したインキュベーターに戻し、３０分ごとに慎重に揺り動かし、３時間のインキュベーション後に混合物を除去して４ｍＬの新しい完全培地を各ディッシュに加えた。トランスフェクション後約４８時間および６０時間経ったら上清を再び回収し、０．４５μｍフィルターでろ過した。培地を分注して、使用するまで−８０℃で保存した。ＡＸＬレトロウイルスでＮＩＨ３Ｔ３細胞を感染することによる、ＮＩＨ３Ｔ３／ＡＸＬ安定細胞株の作製：１０ｃｍ培養ディッシュに播種したＮＩＨ３Ｔ３細胞の場合、ＡＸＬレトロウイルスにプラスして新たに加えるポリブレン（終濃度８μｇ／ｍＬ）を含む４．５ｍＬの回収培地に変える。６〜８時間後、６ｍＬの完全ＤＭＥＭ培地を、各培養ディッシュ中に加え、細胞を４８時間その培地と共にインキュベートした。細胞を１：４で継代し、その後、全ての非感染ＮＩＨ３Ｔ３細胞が死滅するまで０．５μｇ／ｍＬのピュロマイシンで選抜する。その後細胞を拡張し、インビボ異種移植試験の前に、細胞中のＡＸＬ発現とチロシンリン酸化を免疫ブロットで確認した。
【００４２】
雌Ｓｃｉｄ／Ｂｅｉｇｅマウス（６〜８週齢、Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＹ）を、標準的ラボ飼料（Ｔｅｋｌａｄ  Ｌａｂｃｈｏｗ、Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で、マイクロアイソレーター装置にて５匹／ケージで維持した。動物は湿度と温度の制御条件下で飼育し、明／暗サイクルを、１２時間間隔で設定した。マウスを実験操作の少なくとも１週間前に隔離した。全ての動物実験を、Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）により承認されたプロトコル＃０３−０２３に従って実施した。
【００４３】
ＮＩＨ３Ｔ３／ＡＸＬ細胞を回収し、ＤＭＥＭ培地中に５×１０７／ｍＬの密度で再懸濁した。細胞懸濁物（５×１０６細胞）のアリコート（１００μＬ）を、各マウスの左わき腹の皮下に、２３ゲージの針を使って接種した。そのマウスをモニターし、腫瘍サイズを測定した。ＮＩＨ３Ｔ３／ＡＸＬ腫瘍体積が３００ｍｍ３に達したら、腫瘍保持マウスを、ランダムに互いに異なる処置群（８〜１０匹のマウス／群）に分けた。そして、ビヒクル（ＰＥＧ−４００）またはＰＥＧ−４００中に指定された用量で処方されたＣＥＰ−４０７８３のいずれかを、一日一回、投薬体積当たり１００μＬ投与した。各腫瘍の長さ（Ｌ）および幅（Ｗ）を、ノギスで測定し、そして、マウスの体重を２〜３日ごとに測定した。腫瘍体積は、式：０．５２３６＊Ｌ＊Ｗ＊（Ｌ＋Ｗ）／２を使って計算した。腫瘍体積およびマウス体重の統計解析を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ検定を用いて行った。血漿および腫瘍サンプルは、各用量レベルでの最終投薬後２時間で得た。そして、血漿および腫瘍溶解物中の化合物レベルを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。
【００４４】
図４に示すように、ＮＩＨ３Ｔ３−ＡＸＬ腫瘍異種移植片を皮下に保持する雌ＳＣＩＤマウスに、ビヒクルまたはＣＥＰ−４０７８３のいずれかを、以下の用量：０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇで、経口（ＰＯ／ｐｅｒ  ｏｓ）、一日一回（ｑｄ）投与した。腫瘍サイズおよびマウス体重を、２〜３日ごとに測定および記録し、そして、腫瘍体積絶対値を計算した。ＣＥＰ−４０７８３を投与すると、試験した全ての用量で完全に腫瘍が退縮した。これは、これらのＡＸＬ依存性腫瘍中でのＡＸＬ活性の継続的かつ有意な薬力学的阻害と矛盾しない。
【００４５】
ＣＥＰ−４０７８３は、ＧＴＬ−１６胃がん異種移植片の増殖を阻害する
ヒト胃がん細胞株ＧＴＬ−１６を、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（アメリカ培養細胞系統保存機関）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、カタログ＃  ＳＨ３００７００３、Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）入りのＤＭＥＭ培地中で培養した。雌Ｎｕ／Ｎｕマウス（６〜８週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を、標準的ラボ飼料（Ｔｅｋｌａｄ  Ｌａｂｃｈｏｗ、Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で、マイクロアイソレーター装置にて５匹／ケージで維持した。動物は湿度と温度の制御条件下で飼育し、明／暗サイクルを、１２時間間隔で設定した。マウスを実験操作の少なくとも１週間前に隔離した。実験は、Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社の動物実験委員会により承認された（プロトコル０３−０２３）。ＧＴＬ−１６細胞を回収し、ＤＭＥＭ培地中に５×１０７／ｍＬの密度で再懸濁した。そして、細胞懸濁物（５×１０６細胞）のアリコート（１００μＬ）を、各マウスの左わき腹の皮下に、２３ゲージの針を使って接種した。その後、マウスを毎日モニターした。腫瘍体積が約２００ｍｍ３となったら、マウスを、ランダムに互いに異なる処置群（８〜１０匹のマウス／群）に分けた。そして、ビヒクル（ＰＥＧ−４００）またはＰＥＧ−４００中に指定された用量で処方されたＣＥＰ−４０７８３のいずれかを、一日一回（ｑｄ）、投薬体積当たり１００μＬで経口投与した。各腫瘍の長さ（Ｌ）および幅（Ｗ）をノギスで測定し、マウスの体重を２〜３日ごとに測定した。その後、腫瘍体積を式：０．５２３６＊Ｌ＊Ｗ＊（Ｌ＋Ｗ）／２を使って計算した。腫瘍体積およびマウス体重の統計解析を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ検定を使用して行った。＊＊ｐ＜０．０１：ＣＥＰ−４０７８３処置群に対してビヒクルを比較した場合。血漿および腫瘍サンプルは、各用量レベルでの最終投薬後２時間で得た。そして、血漿および腫瘍溶解物中の化合物レベルを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。ＴＧＩ値の計算は、試験の最後に行い、各ＣＥＰ−４０７８３処置群の腫瘍体積（ＴＶ）とビヒクル処置群のものとを、以下の式：１−（化合物処置群の最終日のＴＶ／ビヒクル処置群の最終日ＴＶ）を使って比較することにより実施した。
【００４６】
これらのデータ（図５）は、ＣＥＰ−４０７８３の経口投与により、このｃ−Ｍｅｔ依存性腫瘍モデルにおいて、１０および３０ｍｇ／ｋｇで有意な抗腫瘍効力（腫瘍停滞および退縮）が生じることを実証する。
【００４７】
ＣＥＰ−４０７８３は、ＥＢＣ−１  ＮＳＣＬＣ異種移植片の増殖を阻害する
ヒトＮＳＣＬがん細胞株ＥＢＣ−１を、ＡＴＣＣ（アメリカ培養細胞系統保存機関、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、カタログ＃ＳＨ３００７００３、Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）入りのＤＭＥＭ培地中で培養した。雌Ｎｕ／Ｎｕマウス（６〜８週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を、標準的ラボ飼料（Ｔｅｋｌａｄ  Ｌａｂｃｈｏｗ、Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で、マイクロアイソレーター装置にて５匹／ケージで維持した。動物は湿度と温度の制御条件下で飼育し、明／暗サイクルを、１２時間間隔で設定した。マウスを実験操作の少なくとも１週間前に隔離した。実験は、Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社の動物実験委員会により承認された（プロトコル０３−０２３）。ＧＴＬ−１６細胞を回収し、ＤＭＥＭ培地中に５×１０７／ｍＬの密度で再懸濁した。そして、細胞懸濁物（５×１０６細胞）のアリコート（１００μＬ）を、各マウスの左わき腹の皮下に、２３ゲージの針を使って接種した。その後、マウスを毎日モニターした。腫瘍体積が約２５０ｍｍ３となったら、マウスをランダム化して互いに異なる処置群（８〜１０匹のマウス／群）に分けた。そして、ビヒクル（ＰＥＧ−４００）またはＰＥＧ−４００中に指定された用量で処方されたＣＥＰ−４０７８３のいずれかを、一日一回、投薬体積当たり１００μＬで経口投与した。各腫瘍の長さ（Ｌ）および幅（Ｗ）をノギスで測定し、マウスの体重を２〜３日ごとに測定した。その後、腫瘍体積を式：０．５２３６＊Ｌ＊Ｗ＊（Ｌ＋Ｗ）／２を使って計算した。腫瘍体積およびマウス体重の統計解析を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ検定を使用して行った。＊＊ｐ＜０．０１：ＣＥＰ−４０７８３処置群に対してビヒクルを比較した場合。血漿および腫瘍サンプルは、各用量レベルでの最終投薬後２時間で得た。そして、血漿および腫瘍溶解物中の化合物レベルを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。ＴＧＩ値の計算は、試験の最後に行い、各ＣＥＰ−４０７８３処置群の腫瘍体積（ＴＶ）とビヒクル処置群のものとを、以下の式：１−（化合物処置群の最終日のＴＶ／ビヒクル処置群の最終日ＴＶ）を使って、比較することにより実施した。
【００４８】
図６に示すように、１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇの用量のＣＥＰ−４０７８３の経口投与により、腫瘍が退縮した。このｃ−Ｍｅｔ依存性腫瘍モデルでは、３ｍｇ／ｋｇでは、腫瘍は停滞し、部分的に退縮するのが観察された。
【００４９】
非連続的および交互にＣＥＰ−４０７８３の経口投薬を行うスケジュールは、有意な抗腫瘍効力を維持する
図６に関して上記した方法と類似する方法を採用して、非連続的および交互にＣＥＰ−４０７８３の経口投薬を行うスケジュールの抗腫瘍効果を評価した。ＥＢＣ−１腫瘍異種移植片が約２００ｍｍ３に到達した際に、マウスを、ランダム化して互いに異なる処置群（８〜１０匹のマウス／群）に分けた。そして、ビヒクル（ＰＥＧ−４００）またはＰＥＧ−４００中に１０ｍｇ／ｋｇで処方されたＣＥＰ−４０７８３のいずれかを、一日一回、経口投与した。７日間連続投薬した後、動物を、一日一回１０ｍｇ／ｋｇを７日間続け、７日間止める投薬計画、あるいは、合計２１日間、一日一回１０ｍｇ／ｋｇの投薬を断続的に週２回（ｑ２ｄ）または週３回（ｑ３ｄ）経口投薬するものにその後スイッチした。
【００５０】
図７に見られるように、ＣＥＰ−４０７８３を７日間経口投薬し、その後投薬休止期を有するもの（ｑｄｘ７、７日ごとに投薬）および／または交互に投薬するスケジュール、つまりｑ３ｄ（３日ごとに投薬）もしくはｑ２ｄ（２日ごとに投薬）の場合、有意な抗腫瘍効力が維持される。具体的には、部分的応答が、ＣＥＰ−４０７８３の経口投薬を７日ごとに行った群（４０％）、３日ごとに行った群（７０％）、および２日ごとに行った群（４０％）で見られた。完全な腫瘍退縮が、ｑｄｘ７およびｑ２ｄ投薬群で、それぞれ動物の１０％および２０％で見られた。このことが示唆するのは、ＣＥＰ−４０７８３を非連続的および断続的に投薬しても、腫瘍薬力学的プロフィールと矛盾しない顕著な抗腫瘍活性を保持することである。
【００５１】
ＣＥＰ−４０７８３は、４Ｔ１−Ｌｕｃ２の全身転移を阻害する
ＳＶ４０プロモーターから発現されるホタルルシフェラーゼ遺伝子を安定的にトランスフェクションして作製された、マウス乳がん細胞株４Ｔ１−ルシフェラーゼタグ付き細胞株を、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入した。細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、カタログ＃ＳＨ３００７００３、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）を添加したＤＭＥＭ培地中で増殖させた。ホタルＤ−ルシフェリン／カリウム塩（カタログ＃Ｌ−８２２０）を、Ｂｉｏｓｙｎｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、Ｉｔａｓｃａ、ＩＬから購入した。雌Ｂａｌｂ−ｃマウス（６〜８週齢）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ＰＥＧ−４００またはＰＥＧ−４００中に処方されたＣＥＰ−４０７８３（１、１０、および３０ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ、ｑｄで投薬されるもの）のいずれかで処置を開始２日後に、ｉｖ（尾静脈から）で、０．５×１０５の４Ｔ１−Ｌｕｃ２培養腫瘍細胞を、Ｂａｌｂ／ｃマウスに注射した。２日後から、マウスの体重を週２回測定し、マウスを週３回全身インビボイメージングした。処置は、腫瘍細胞接種後２１日を含む合計２３日間実施した。生体発光イメージ解析を、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）スペクトルインビボイメージング装置を使用して、試験の最後に実施した。各ケージの５匹のマウスを、イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）で麻酔し、０．５〜最大５分の一連の時点でイメージングした。イメージ解析を、主観的であるが、同サイズのゲートまたは各動物イメージ上の目的領域（ＲＯＩ）を用いて、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウエア（ｖｓ．４．０、２０１０）を使用して実施した。カウントを、平均放射輝度または平均光量子束（表面積のｃｍ２当たりの秒当たり光子（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）として表されるもの）に変換した。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙノンパラメトリック一元または二元配置ＡＮＯＶＡを、統計検定として使用し、０．０５未満のｐ値を、有意と見なした。使用した統計ソフトウエアは、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ｖｓ．５．０１、２００７）であり、計算はマイクロソフトＯｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ（Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ、２００３）を使用して実行した。
【００５２】
図８に見られるように、ＣＥＰ−４０７８３の経口投与は、１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇの用量で全身性４Ｔ１乳腺腫瘍転移の非常に有意な減少を生じ、１ｍｇ／ｋｇ用量であっても、程度は少ないが、腫瘍の転移の有意な減少を生じる。
【００５３】
ＣＥＰ−４０７８３は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１２  Ｌｅｕ正所性乳がん移植片のリンパ節転移を減少させる
ヒト乳がん細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｌｅｕ−Ｄ３Ｈ２ＬＮ−ルシフェラーゼ発現細胞株を、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。ＳＶ４０プロモーターから発現されるホタルルシフェラーゼ遺伝子の安定的トランスフェクションにより、この腫瘍細胞株を作製した。そして、その細胞株を、免疫不全マウス中のＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｌｕｃ細胞の自発的リンパ節転移から単離して、その転移能に関して選択した。細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、カタログ＃ＳＨ３００７００３、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）を添加したＤＭＥＭ培地中で増殖させた。ホタルＤ−ルシフェリン／カリウム塩（カタログ＃Ｌ−８２２０）を、Ｂｉｏｓｙｎｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、Ｉｔａｓｃａ、ＩＬから購入した。雌ｎｕ／ｎｕマウス（６〜８週齢）を、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ−Ｄ３Ｈ２ＬＮ（２×１０６）細胞を、ｎｕ／ｎｕマウスの乳房の脂肪パッド中に正所性に移植した。そして、２日後に、マウスをグループ分けし（群あたり１０匹のマウス）、ビヒクル（ＰＥＧ−４００）または１０および３０ｍｇ／ｋｇでＰＥＧ−４００中に処方したＣＥＰ４０７８３を、一日一回経口投与した。マウスの体重を、ｄａｙ０およびその後７日ごとに測定した。そして、生体発光イメージ解析を、図６で詳細に記載したＣａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）スペクトルイメージ装置を使用して、試験の最後に実施した。原発性腫瘍とリンパ節中の潜在的転移性腫瘍のイメージを、細胞移植後７日に開始して週に一度撮影した。イメージ取得前に、各マウスに、ホタルＤ−ルシフェリン／カリウム塩の０．２ｍｌを腹腔内に注射し、その基質投与後６〜１０分でイメージを取得した。原発性腫瘍を、絶縁テープまたは厚い黒色紙でカバーして、リンパ節中にある転移性腫瘍のイメージングとの干渉を避けた。第一回目のイメージングで腹腔内に広がる生体発光イメージを有するマウスは排除した。原発性腫瘍からの生体発光シグナルが強すぎて、リンパ節内の転移性腫瘍の検出が効果的に評価できなくなった場合に、試験を終了した。試験の最後に、マウスを屠殺して、血漿と原発性腫瘍を、ＬＣ／ＭＳ解析のために回収した。全てのイメージを撮影後に、イメージ解析を、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウエア（ｖｓ．４．０、２０１０）を使用して実施した。カウントを、平均放射輝度または平均光量子束（秒当たり光子（ｐ／ｓ）として表されるもの）に変換した。
【００５４】
図９Ａは、接種後１４日での原発性腫瘍中の放射輝度値の定量を示す。図９Ｂは、接種後２１日での、リンパ節転移に関する放射輝度値の定量を示す。値は、放射輝度値の平均±ＳＥＭを示す。統計解析を、処置群間の有意差に関して、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ検定または一元若しくは二元配置ＡＮＯＶＡを使用して実施した。＊ｐ＜０．０５：ＣＥＰ−４０７８３処置群に対してビヒクルを比較した場合。これらのデータ（図８、９Ａ、および９Ｂ）は、経口投与が、これらのモデル中で、自発的リンパ節および肺転移性腫瘍量（ｔｕｍｏｒ  ｂｕｒｄｅｎ）を減少させるのに効力があることを示す。
【００５５】
ＡＸＬ／ｃ−Ｍｅｔデュアル阻害：治療的有用性
ＡＸＬとｃ−Ｍｅｔ活性化は、ＥＧＦＲに変異のあるＮＳＣＬＣ患者の５０％までにおける抗ＥＧＦＲ耐性を獲得する原因となる基礎メカニズムとなることが推定されている。恒常的ＡＸＬおよび／またはｃ−Ｍｅｔ活性化の有病率が高い他のがん型には、乳がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、膵臓がん、胃がん、食道がん、および卵巣がんが含まれる。
【００５６】
表２（下表）は、ＣＥＰ−４０７８３が、多数のエルロチニブ非感受性ＮＳＣＬＣモデルにおいて効力を示し、最適なパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）投薬計画よりも優れていた多数の実験結果をまとめたものである。
【００５７】
【表２】
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【００５８】
表２に示されるように、ＣＥＰ−４０７８３の経口投与により、全てのヒト原発性ＮＳＣＬＣ  ＴｕｍｏｒＧｒａｆｔにおいて有意な効力（ＴＧＩおよび／または腫瘍退縮）を生じる。ＣＴＧ−０１９２は、パクリタキセルに比べて最もＣＥＰ−４０７８３に感度の低い腫瘍であることが判明したエルロチニブ感受性モデルである。
【００５９】
エルロチニブ非感受性原発性ＮＳＣＬＣヒトＴｕｍｏｒＧｒａｆｔｓ（商標）における効力
図１０は、２種類のエルロチニブ非感受性ヒトＴｕｍｏｒＧｒａｆｔモデル（ＣＴＧ−０１６５およびＣＴＧ−０１７０）からのデータを示している。ＡＸＬおよびｃ−Ｍｅｔは、これらのモデル中で、恒常的に活性化されていて、示されるように、経口のＣＥＰ−４０７８３は、標準的ケア（ＳｏＣ）治療法、つまりパクリタキセル１０ｍｇ／ｋｇ、ｉｖ、ｑ４ｄｘ２と比べた場合、１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇの用量で腫瘍退縮することを証拠として、この両モデルで優れた効力を示す。
【００６０】
活性化ＡＸＬおよびｃ−Ｍｅｔを有する「エルロチニブ感受性」ＮＳＣＬＣのＴｕｍｏｒＧｒａｆｔ（商標）におけるＣＥＰ−４０７８３およびエルロチニブの活性
図１１は、活性化ＡＸＬおよびｃ−Ｍｅｔを有するエルロチニブ感受性ＮＳＣＬＣのＴｕｍｏｒＧｒａｆｔ（商標）モデル（ＣＴＧ−０１９２）からのデータを示している。グラフ（図１１）に見られるように、エルロチニブを投薬（３５ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ、ｑｄｘ３４）した動物中で、初期感受性があった後、（約）ｄａｙ２９にエルロチニブへの抵抗性を獲得した。投薬は、ｄａｙ３４に中止した。さらに、投薬を中止すると、腫瘍の再増殖率は、コントロール／ビヒクルと似ていた。
【００６１】
組み合わせ処置群（ＣＥＰ−４０７８３／エルロチニブ）およびＣＥＰ−４０７８３を単剤として処置した群において、腫瘍退縮が達成された。有意なＴＧＩ／腫瘍停滞が、投薬を中止（ｄａｙ３４）後においてさえも維持された。
【００６２】
エルロチニブと違って、実験の処置フェーズの間に、ＣＥＰ−４０７８３への抵抗性を獲得することはなかった。さらに、処置中止後でさえも、ＣＥＰ−４０７８３（単独）群中で、長く継続する抗腫瘍効果があった。
【００６３】
方法（図１０および１１に示される実験用のもの）
・６〜９週齢の雌免疫不全ｎｕ／ｎｕマウス（Ｈａｒｌａｎ）を、滅菌したペーパーツイスト（ｐａｐｅｒｔｗｉｓｔ）で強化した１／８’’コーンコブ床じき上で、個々にＨＥＰＡを通して換気されたケージ（Ｉｎｎｏｃａｇｅ（登録商標）、ＩＶＣ、Ｉｎｎｏｖｉｖｅ  ＵＳＡ）中に、１２時間の明暗サイクルで、６８〜７４°Ｆ（２０〜２３℃）および３０〜７０％の湿度で飼育した。動物は、水（逆浸透圧法、２ｐｐｍのＣｌ２）を自由に与え、１９％タンパク質、９％脂肪、および４％繊維からなる滅菌Ｔｅｓｔげっ歯類飼料（Ｔｅｋｌａｄ２９１９）を与えた。
【００６４】
・腫瘍モデル：ＮＳＣＬＣのＣｈａｍｐｉｏｎｓ  ＴｕｍｏｒＧｒａｆｔモデルは、Ｃｈａｍｐｉｏｎｓ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙのものである。この試験では、動物に、宿主動物から回収された腫瘍断片を右わき腹に片側移植した。腫瘍が約１５０〜２５０ｍｍ３に達したら、動物を腫瘍体積を合わせて、処置群とコントロール群とに分けて、投薬を開始した（０日）。マウスは耳標識を付け、実験の期間を通して個々にフォローした。
【００６５】
・ＣＥＰ−４０７８３を、Ｃｈａｍｐｉｏｎｓから供給されたビヒクル成分（ＰＥＧ４００）を使用して処方した。エルロチニブ（製造者：ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ナショナルドラッグコード：５０２４２−０６２−０１；ロット＃：ＵＳ０００２）を、製造者の仕様書に沿って１００％ＰＥＧ−４００をビヒクルとして使用して処方した。
【００６６】
効力測定：０日から開始して、腫瘍の大きさを、週２回デジタルカリパス（Ｆｏｗｌｅｒ  Ｕｌｔｒａ−Ｃａｌ  ＩＶ）で測定した。個々のおよび平均予想腫瘍体積（平均ＴＶ±ＳＥＭ）を含むデータを、各群に関して記録した。腫瘍体積は、式：ＴＶ＝幅２×長さ×０．５２を使用して計算した。試験完了時には、コントロール（Ｃ）に対する各処置群（Ｔ）について、初期（ｉ）および最終（ｆ）腫瘍測定値を、式：％ＴＧＩ＝１−Ｔｆ−Ｔｉ／Ｃｆ−Ｃにより、パーセント腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）値として計算し、報告した。試験完了時にＴＧＩ＞５０であった単剤治療または併合治療は、ＮＣＩガイドラインによると、評価対象の処置計画で試験されたモデル中で、効果があると考えらえる。７日間に渡る２回連続した測定で、０日測定値の≦５０％の腫瘍体積が報告された個々のマウスは、部分的レスポンダー（ＰＲ）と見なされた。もし、ＰＲが試験完了まで継続するならば、パーセント腫瘍退縮（％ＴＲ）を、式：％ＴＲ＝１−Ｔｆ／Ｔｉ×１００を使用して決定した。もし、複数のＰＲマウスが一つの群に発生したら、平均値を計算した。触診可能な腫瘍を欠く（７日間に渡る２回連続した測定で＜４×４ｍｍ２の）個々のマウスは、完全レスポンダー（ＣＲ）として分類された。試験完了まで続いたＣＲは、腫瘍フリーサバイバー（ＴＦＳ）と見なされた。ＴＦＳ動物は、効力計算から除外した。腫瘍体積の統計学的差異を、可能ならば、標準薬剤単独と、コントロールおよび併合剤との処置群と比較して、両側一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、その後、Ｄｕｎｅｔｔ多重比較検定を使用して決定した。この試験で得られた全てのデータを電子的に管理し、重複するサーバーシステム上に保存した。
【００６７】
本明細書中に記載されるデータは、ＣＥＰ−４０７８３が、強力なＡＸＬおよびｃ−Ｍｅｔ薬力学と抗腫瘍効力を、確立された腫瘍異種移植モデル中で示すことを、明確に実証する。上記試験の全てにおいて、ＣＥＰ−４０７８３はよく許容されて、化合物関連体重喪失はなかった。そのようなので、ＣＥＰ−４０７８３は、ｃ−ＭｅｔおよびＡＸＬ活性が腫瘍形成、局所浸潤、および転移に重要な役割を果たす複数のヒト腫瘍タイプにおいて、潜在的治療有用性を有する可能性がある。このデータは、ＣＥＰ−４０７８３が、標準的ケアである化学療法と組み合わせて補助／ネオアジュバント治療として使用されて、全体効力を増強および／または原発性腫瘍（切除可能もしくは切除不能なもの）の転移性播種を限定もしくは予防することができることを、さらに示唆する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年3月28日(2016.3.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＸＬまたはｃ−Ｍｅｔが過剰発現される固形または血液がんを治療するための、
【化１】
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である化合物またはその塩の使用であって、前記がんが、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん、胃がん、および膵臓がんから選択される、使用。
【請求項２】
前記化合物またはその塩が、一日１回〜４回の投与用である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記化合物またはその塩が、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５５ｍｇ／ｋｇの量での投与用である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記化合物またはその塩が、別の治療剤と組み合わせた投与用である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
他の治療剤がエルロチニブまたはゲフィチニブである、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記がんがＮＳＣＬＣである、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記ＮＳＣＬＣがＥＧＦＲ阻害剤を用いる治療に抵抗性または非感受性である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記ＮＳＣＬＣがエルロチニブまたはゲフィチニブを用いる治療に抵抗性または非感受性である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記がんが乳がんである、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
前記がんが胃がんである、請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
前記がんが膵臓がんである、請求項１に記載の使用。
【国際調査報告】
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