(57)【要約】  本発明は、核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）−α バキュロウイルス Ｉａ群 ウイルスのゲノムの大部分が、細胞培養中の細胞の感染において、かかるゲノムを含むウイルスの有用性に悪影響を与えることなく欠失され得るという発見に基づく。従って、本発明は、それぞれの天然のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群 ゲノムと比較してサイズが縮小されたＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群 ゲノム、異種ヌクレオチドを含むかかるゲノム、これらのゲノムのいずれかを含むウイルス、かかるウイルスで感染させた細胞、ならびにかかるウイルスおよび細胞の製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基対の数が、天然のＡｃＭＮＰＶゲノムと比較して少なくとも２５．７％低減され、感染性バキュロウイルス中に組み立てられている(assemble)、オートグラファカリフォルニカ・マルチキャプシド核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）ゲノム。
【請求項２】
ａｃ８５、ａｃ１１６、ｃｇ３０、ｈｃｆ−１、ａｃ５６、およびｐｃｎａからなる群より選択される少なくとも１個の遺伝子を欠く、請求項１に記載のＡｃＭＮＰＶゲノム。
【請求項３】
ａｃ４４、ａｃ５７、ａｃ８４、ａｃ１１２／１１３ Ｃｔ、ａｃ１１２／１１３ Ｎｔ、ａｃ１１８、ａｃ１２２、ａｃ１５２、ｉｅ−０１およびｈｉｓｐＰからなる群より選択される少なくとも１個の遺伝子を欠く、請求項１または２に記載のＡｃＭＮＰＶゲノム。
【請求項４】
ａｃ１１、ａｃ３０、ｇｔａ、ａｃ６３、１５ｋ、ａｃ９７、ａｃ１２１、ａｃ１４０、ａｃ１４６およびａｃ１４９からなる群より選択される少なくとも１個の遺伝子を欠く、請求項１から３のいずれか一項に記載のＡｃＭＮＰＶゲノム。
【請求項５】
ｏｄｖ−ｅ６６、ｐ４３、ｏｄｖ−ｎｃ４２またはｏｄｖ−ｅ５６、ｐｔｐ、ｂｒｏ、ｃｔｘ、ｏｒｆ６０３、ポリヘドリン、ｅｇｔ、ｂｖ／ｏｄｖ−ｅ２６、ａｃ１８、ｐｉｆ−２、ｅｎｖ−ｐｒｏｔ、ｉａｐ−１、ｓｏｄ、ｆｇｆ、ｖｕｂｉ、ｇｐ３７、ａｃ６９、ｉａｐ−２、ｐｎｋ／ｐｎｌ、ａｃ９１、ｏｄｖ−ｅ２８ ｐｉｆ−４、ｐｉｆ−３、ｐｉｆ−１、ｐｋ−２、ｃｈｉＡ、ｖ−ｃａｔｈ、ｐｐ３４、９４Ｋ、ｐ２６、ｐ１０、ｐ７４、ａｃ１４５、およびａｃ１５０からなる群より選択される少なくとも１個の遺伝子を欠く、請求項１に記載のＡｃＭＮＰＶゲノム。
【請求項６】
ｐｉｆ−１、ｐ２６、ｐ１０、ｐ７４、ｐｉｆ−３、ａｃ１１６、ａｃ１１７、ａｃ１１８、ａｃ１２１、ａｃ１２２、ｐｋ−２、ｃｈｉＡ、ｖ−ｃａｔｈ、ｐｐ３４および９４Ｋからなる群より選択される少なくとも１個の遺伝子を欠き、ここで、ｐｉｆ−１およびｃｈｉＡが、隣接する遺伝子のプロモーター領域が残るように部分的に欠損されている、請求項１に記載のＡｃＭＮＰＶゲノム。
【請求項７】
ｐｉｆ−１、ｐ２６、ｐ１０、ｐ７４、ｐｉｆ−３、ａｃ１１６、ａｃ１１７、ａｃ１１８、ａｃ１２１、ａｃ１２２、ｐｋ−２、ｃｈｉＡ、ｖ−ｃａｔｈ、ｐｐ３４および９４Ｋからなる群より選択される少なくとも１個の遺伝子を欠き、ここで、これらのうちｐｉｆ−１およびｃｈｉＡのみが、隣接する遺伝子のプロモーター領域が残るように部分的に欠損されていてよく、感染性バキュロウイルス中に組み立てられている、オートグラファカリフォルニカ・マルチキャプシド核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）ゲノム。
【請求項８】
遺伝子の５’−ＵＴＲおよび／または３’−ＵＴＲをさらに欠く、請求項１から７のいずれか一項に記載のＡｃＭＮＰＶゲノム。
【請求項９】
遺伝子のスペーサー  ５’および／または３’を欠く、請求項１から８のいずれか一項に記載のＡｃＭＮＰＶゲノム。
【請求項１０】
異種反復配列の１つまたはそれ以上を欠く、請求項１から９のいずれか一項に記載のＡｃＭＮＰＶゲノム。
【請求項１１】
ヘリカーゼ、３８Ｋ、ｌｅｆ−５、４９Ｋおよびｏｄｖ−ｅ１８  ＋２８をコードする遺伝子の少なくとも１個を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＡｃＭＮＰＶゲノム。
【請求項１２】
ｌｅｆ−２、ｌｅｆ−１、ｐ４７、ｌｅｆ−８、ｖｐ１０５４、ｌｅｆ−９、ｄｎａｐｏｌ、ａｃ６６、ｖｌｆ−１、ｇｐ４１、ａｃ８１、ｐ９５、ｃａｐｓｉｄ、ｌｅｆ−４、ｐ３３、ｐ１８、ｏｄｖ−ｅ２５、ｐ６．９、ｏｄｖ−ｅｃ４３、ａｌｋ−ｅｘｏ、およびｏｄｖ−ｅｃ２７をコードする遺伝子の少なくとも１個を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＡｃＭＮＰＶゲノム。
【請求項１３】
ｐｋ−１、３８．７Ｋ、ｄｂｐ、ｌｅｆ−６、ａｃ２９、３９Ｋ、ｌｅｆ−１１、ａｃ３８、ａｃ５３、ｆｐ、ｌｅｆ−３、ａｃ７５、ａｃ７６、ａｃ７８、ｔｌｐ２０、ｐ４０、ｐ１２、ｐ４８、ａｃ１０６／１０７ Ｎｔ、ａｃ１０６／１０７ Ｃｔ、ａｃ１１０、ｍｅ５３およびｉｅ−１をコードする遺伝子の少なくとも１個を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のＡｃＭＮＰＶゲノム。
【請求項１４】
ａｃ１２、ａｃ３４、ａｃ５５、およびａｃ１０８をコードする遺伝子の少なくとも１個を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載のＡｃＭＮＰＶゲノム。
【請求項１５】
ａｃ４、ａｃ５、ｏｒｆ１６２９、ａｃ１７ ＋４５、ａｃ１９、ａｒｉｆ−１ Ｃｔ、ａｒｉｆ−１ Ｎｔ、ｐｋｉｐ、ａｃ２６、ｌｅｆ−１２、ａｃ４３、ａｃ４８、ｂｊｄｐ、ａｃ７２、ａｃ７３、ａｃ７４、ａｃ７９、ａｃ１１１、ａｃ１１４、ａｃ１２０、ａｃ１２４、ｌｅｆ−７、ｇｐ６７、ｇｐ１６、ａｃ１３２、ｉｅ−２、ｐｅ３８をコードする遺伝子の少なくとも１個を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載のＡｃＭＮＰＶゲノム。
【請求項１６】
ａｃ４５、ａｃ４７、ａｃ５２ ＋７１、ｈｅ６５、３５Ｋおよびａｃ１５４をコードする遺伝子の少なくとも１個を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のＡｃＭＮＰＶゲノム。
【請求項１７】
ａｃ１２０、ａｃ１２４、ｌｅｆ−７、ｇｐ６４／６７、ｐ２４、ｇｐ１６、ａｃ１３２、ａｌｋ−ｅｘｏ、および３５Ｋからなる群の遺伝子の少なくとも１個を含む、請求項１または１６に記載のＡｃＭＮＰＶゲノム。
【請求項１８】
塩基対の数が、天然のＢｍＮＰＶゲノムと比較して少なくとも１８．３１％低減され、感染性バキュロウイルス中に組み立てられている、ボンビックス・モリ核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）ゲノム。
【請求項１９】
ｂｍ４５ ａｃ５６、ｃｇ３０、およびｂｍ９５ａ ａｃ１１６からなる群より選択される少なくとも１個の遺伝子を欠く、請求項１８に記載のＢｍＮＰＶゲノム。
【請求項２０】
ｂｍ３５ ａｃ４４、ｏｄｖ−ｅ６６、ｂｍ４６ ａｃ５７、およびｂｍ９９ ａｃ１２２からなる群より選択される少なくとも１個の遺伝子を欠く、請求項１８から１９のいずれか一項に記載のＢｍＮＰＶゲノム。
【請求項２１】
ｂｍ４ ａｃ１１、ｂｍ５１ ａｃ６３、１５Ｋ、ｂｍ９８ａ ａｃ１２１、ｂｍ１２２ ａｃ１４６、およびｂｍ１２５ ａｃ１４９からなる群より選択される少なくとも１個の遺伝子を欠く、請求項１８から２０のいずれか一項に記載のＢｍＮＰＶゲノム。
【請求項２２】
ポリヘドリン、ｅｇｔ、ｂｖ／ｏｄｖ−ｅ２６、ｂｍ１０ ａｃ１８、ｐｉｆ−２、ｅｎｖ−ｐｒｏｔ、ｉａｐ−１、ｆｇｆ、ｖ−ｕｂｉ、ｂｍ５７ ａｃ６９、ｂｍ７４ ａｃ９１、ｐｉｆ−３、ｐｉｆ−１、ｃｈｉ−ａ、ｖ−ｃａｔｈ、ｐｐ３４、ｂｍ１１０ａ ９４Ｋ ａｃ１３４、ｐ２６、ｐ１０、ｐ７４、ｂｍ１２１／ａｃ１４５、ｂｍ１２６ ａｃ１５０、ｐｔｐ、ｂｒｏ−ｄ、ｇｔａ、およびｇｐ３７からなる群より選択される少なくとも１個の遺伝子を欠く、請求項１８から２１のいずれか一項に記載のＢｍＮＰＶゲノム。
【請求項２３】
遺伝子の５’−ＵＴＲおよび／または３’−ＵＴＲをさらに欠く、請求項１８から２２のいずれか一項に記載のＢｍＮＰＶゲノム。
【請求項２４】
遺伝子のスペーサーの５’および／または３’末端を欠く、請求項１８から２３のいずれか一項に記載のＢｍＮＰＶゲノム。
【請求項２５】
異種反復配列の１つまたはそれ以上を欠く、請求項１８から２４のいずれか一項に記載のＢｍＮＰＶゲノム。
【請求項２６】
ＡｖＭＮＰＶまたはＢｍＮＰＶゲノムに対して異種であるヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載に記載のＡｃＭＮＰＶゲノムまたは請求項１８から２５のいずれか一項に記載のＢｍＮＰＶゲノム。
【請求項２７】
異種ヌクレオチド配列が、Ｔｎ７部位、耐性遺伝子をコードするヌクレオチド配列、ホーミングエンドヌクレアーゼ部位、変異ｆｐ遺伝子、ｌｏｘＰ部位、ＩＥ１／ポリヘドリン／ｐ１０プロモーター、蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２６に記載のＡｖＭＮＰＶまたはＢｍＮＰＶゲノム。
【請求項２８】
請求項１から１７、および／または２６から２７のいずれか一項に記載のゲノムを含む、感染性ＡｖＭＮＰＶウイルス。
【請求項２９】
請求項１８から２７のいずれか一項に記載のゲノムを含む感染性ＢｍＮＰＶウイルス。
【請求項３０】
請求項２８および／または２９に記載のウイルスで感染させた細胞。
【請求項３１】
該細胞が、Ａｏ／Ｉ、Ｈｉ５、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ａｏ３８、ショウジョウバエＳ２、Ｔ．ｎｉ、ＦＴＲＳ−ＡｏＬ１／−ＡｏＬ２／−ＡｆＬ、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−ＡｉＯＶ−ＣＬＧ、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−ＡｉＴＳ−ＣＬＧ、ＨＣＲＬ−ＡＴＯ１０／ＡＴＯ２０、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−ＡｆＯＶ−ＣＬＧ、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−ＡｆＴＳ−ＣＬＧ、ＲＭＬ−２、ＮＩＳＥＳ−ＡｎＰｅ−４２６、ＮＩＳＥＳ−Ａｎｙａ−０６１１、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−ＡｇＥ−ＣＬＧ−１／２／３、ＵＦＬ−ＡＧ−２８６、ＦＴＲＳ−ＡｂＬ８１、ＳＥＳ−Ｂｍａ−Ｏ１Ａ／Ｒ、Ｂｍ−Ｎ／−５／−２１Ｅ−ＨＮＵ５、ＮＩＶ−ＢＭ−１２９６／−１９７、ＳＥＳ−Ｂｍ−１  ３０Ａ／３０Ｒ／ｅ  ２１Ａ／ｅ  ２１Ｂ／ｅ  ２１Ｒ、ＳＥＳ−ＢｏＭｏ−１５Ａ／−Ｃ１２９／−ＪＩ２５、ＳＰＣ−Ｂｍ３６／−Ｂｍ４０、ＷＩＶ−ＢＳ−４８１／４８４、ＦＰＭＩ−ＣＦ−１／２／３、ＦＰＭＩ−ＣＦ−２０３、ＦＰＭＩ−ＣＦ−５０／６０／７０、ＩＰＲＩ−ＣＦ−１／１０／１２、ＩＰＲＩ−Ｃｆ１２４、ＩＰＲＩ−ＣＦ−１６／−１６Ｔ、ＩＰＲＩ−ＣＦ−５／−６／−８、ＣＰ−１２６８、ＣＰ−１６９、ＣｐＤＷ１−１５、ＩＺＤ−Ｃｐ  ４／１３、ＩＺＤ−ＣＰ１５０８／−ＣＰ２２０２／−ＣＰ２５０７／−ＣＰ０５０８、ＳＩＥ−ＥＯ−８０１／−８０３、ＩＰＬＢ−Ｅｋｘ４Ｔ／−Ｅｋｘ４Ｖ、ＥＡ１１７４Ａ、ＥＡ１１７４Ｈ、ＩＡＦＥｓ−１、ＢＣＩＲＬ−ＨＡ−ＡＭ１、ＣＳＩＲＯ−ＢＣＩＲＬ−ＨＡ１−３、ＣＳＩＲＯ−ＢＣＩＲＬ−ＨＰ１−５、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−ＨｚＥ−ＣＬＧ１−９、ＢＣＩＲＬ−ＨＺ−ＡＭ１−３、ＩＭＣ−ＨＺ−１、ＩＰＬＢ−ＨＺ−１０７４−５、ＩＰＬＢ−ＨＺ−１０７９、ＩＰＬＢ−ＨＺ−１１０、ＩＰＬＢ−ＨＺ−１２４Ｑ、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−ＨｖＥ−ＣＬＧ１−３、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−ＨｖＯＶ−ＣＬＧ、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−Ｈｖ−ＴＳ−ＧＥＳ、ＢＣＩＲＬ−ＨＶ−ＡＭ１−２、ＩＰＬＢ−ＨｖＥ１ａ／−Ｉｔ、ＩＰＬＢ−ＨｖＥ１ｓ、ＩＰＬＢ−ＨｖＥ６ａ／−Ｉｔ、ＩＰＬＢ−ＨｖＥ６ｓ／−Ｉｔ、ＩＰＬＢ−ＨｖＴ１、ＦＴＲＳ−ＨｍＬ４５、ＦＴＲＳ−ＨｌＬ１−２、ＮＩＡＳ−ＬｅＳｅ−１１  ＩＰＬＢ−ＬＤ−６４  −６７、ＩＰＬＢ−ＬｄＥＧ／−ＬｄＥＩ／−ＬｄＥＩｔ／−ＬｄＥｐ／−ＬｄＦＢ、ＩＺＤ−ＬＤ１３０７／−ＬＤ１４０７、ＵＭＮ−ＭＤＨ−１、ＨＰＢ−ＭＢ、ＩＺＤ−ＭＢ０５０３／ＭＢ０５０４／ＭＢ１２０３／ＭＢ２００６／２００７／２５０６、ＭＢ−Ｈ２６０、ＭｂＬ−３、ＮＩＡＳ−ＭａＢｒ−８５／９２／９３、ＮＩＡＳ−ＭａＢｒ−９２、ＮＩＡＳ−ＭＢ−１９／２５／３２、ＳＥＳ−ＭａＢｒ−１／２／３／４／５、ＦＰＭＩ−ＭＳ−１２／４／５／７、ＭＲＲＬ−ＣＨ−１／２、ＢＰＭＮＵ−ＭｙＣｏ−１、ＩＰＬＢ−オールＥ５０５Ａ／ｓ、ＩＰＬＢ−オールＥ７、ＩＰＲＩ−オール−１２／１３／４／９、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−ＯｎＦＢ−ＧＥＳ１／２、ＵＭＣ−オン、ＦＴＲＳ−ＰｈＬ、Ｐｘ−５８／−６４、ＯＲＳ−Ｐｏｐ−９３／−９５、ＢＴＩ−ＰＲ１０Ｂ／−ＰＲ８Ａ１／−ＰＲ８Ａ２／−ＰＲ９Ａ、ＮＩＡＳ−ＰＲＣ−８１９Ａ／−８１９Ｂ／−８１９Ｃ、ＮＹＡＥＳ���ＰＲ４Ａ、ＩＡＬ−ＰＩＤ２、ＩＰＬＢ−ＰｉＥ、ＵＭＮ−ＰＩＥ−１１８１、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−ＰｘＬＰ−ＣＬＧ、ＩＰＬＢ−ＰｘＥ１／−ＰｘＥ２、ＰＸ−１１８７、ＢＣＩＲＬ−ＰＸ２−ＨＮＵ３、ＢＴＩ−Ｐｕ−２、ＢＴＩ−Ｐｕ−Ａ７／−Ａ７Ｓ、ＢＴＩ−Ｐｕ−Ｂ９、ＢＴＩ−Ｐｕ−Ｍ、ＢＴＩ−Ｐｕ−Ｍ１Ｂ、ＦＲＩ−ＳｐＩｍ−１２２９、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−ＳｅＥ−ＣＬＧ１／−ＣＬＧ４／−ＣＬＧ５、Ｓｅ３ＦＨ、Ｓｅ４ＦＨ、Ｓｅ５ＦＨ、Ｓｅ６ＦＨＡ、Ｓｅ６ＦＨＢ、ＳｅＨｅ９２０−１ａ、ＵＣＲ−ＳＥ−１、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−ＳｆＴＳ−ＧＥＳ、ＩＡＬ−ＳＦＤ１、Ｓｆ１２５４、ＩＰＬＢ−Ｓｆ２１ＡＥ、ＨＰＢ−ＳＬ、ＳＰＣ−Ｓｌ−４８／−５２、ＵＩＶ−ＳＬ−３７３／−５７３／−６７３、ＩＢＬ−ＳＬ１Ａ、ＮＩＶ−ＳＵ−８９３／−９９２、ＢＣＩＲＬ−５０３−ＨＮＵ１／５０４−ＨＮＵ４、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−ＴｎＥ−ＣＬＧ１／−ＴｎＥ−ＣＬＧ１ＭＫ、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−ＴｎＥ−ＣＬＧ２／−ＴｎＥ−ＬＧ２ＭＫ／−ＴｎＥ−ＣＬＧ３／−ＴｎＴＳ−ＧＥＳ１／−ＴｎＴＳ−ＧＥＳ３、ＢＴＩ−ＴＮ５Ｂ１−４／−ＴＮ５Ｃ１／−ＴＮ５Ｆ２／−ＴＮ５Ｇ２Ａ１／ＢＴＩ−ＴＮ５Ｇ３／−ＴＮ５Ｇ３３、ＩＡＬ−ＴＮＤ１、ＩＰＬＢ−ＴＮ−Ｒ、およびＴＮ−３６８からなる群より選択される、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３２】
ゲノムの全部または一部を化学的に合成する工程を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載のＡｖＭＮＰＶゲノム、または請求項１５から２５のいずれか一項に記載のＢｍＮＰＶゲノム、または請求項２６もしくは２７に記載のＡｖＭＮＰＶもしくはＢｍＮＰＶゲノムを製造する方法。
【請求項３３】
ゲノムの一部が、該ゲノムから欠失されている領域に隣接する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ゲノムの一部が、感染性核多角体病ウイルスを形成することができるゲノムを再構成するために天然ゲノムの一部に挿入される、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
細胞において、（ｉ）請求項１から２７のいずれか一項に記載のゲノム、または（ｉｉ）請求項３２から３４のいずれか一項に記載の方法により製造可能なゲノム、を導入することによりＡｃＭＮＰＶまたはＢｍＮＰＶウイルスを製造するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）−α バキュロウイルス Ｉａ群ウイルスのゲノムの大部分が、細胞培養中の細胞の感染において、かかるゲノムを含むウイルスの有用性に悪影響を与えることなく欠失され得るという発見に基づく。従って、本発明は、それぞれの天然のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群 ゲノムと比較してサイズが縮小されたＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群 ゲノム、異種ヌクレオチドを含むかかるゲノム、これらのゲノムのいずれかを含むウイルス、かかるウイルスに感染した細胞、ならびにかかるウイルスおよび細胞の製造方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細胞機構の理解は、主に、‘オミクス(omics)’（ゲノミクス、プロテオミクスおよびグライコミクス）リサーチにおける飛躍的な進歩により、近年、驚異的に増進されている（Nie Y, et al (2009) Curr. Genomics 10:558−72）。総合的ゲノミクスデータセットは、現在、ヒトを含む多種の生物について利用可能であり、生細胞の機能性および形態性との相関における細胞プロテオームの解明に焦点が当てられている。得られた１つの本質的な知識は、真核細胞内のタンパク質が、典型的に、単独では作用せず、１０またはそれ以上の連結サブユニットの大規模かつ高度に多様な集合体で共に存在しているということである。これらの安定的にまたは一過性に結合するマルチタンパク質集合体はさらに、シグナル伝達、エネルギー産生、および食料、水または排泄物の輸送を含む本質的な細胞プロセスを実行するために別個のタンパク質またはマルチタンパク質集合体と共に作用する。
【０００３】
相当数のアクセサリータンパク質が、典型的に、その製造、輸送、活性状態および分解の種々の段階で、個々のマルチタンパク質複合体に付随している。例えば、シャペロンは、多くの場合、複合体の適切な集合のために重要であり、他のタンパク質は、翻訳後修飾による適切な標的化および活性化のために必要とされている。複合体の活性は、多くの場合、例えば、組織特異的機能を仲介するために、個々のサブユニットのイソ型を組み込むことによって微調整される。生物学を完全に理解するために、新規方法は、我々の細胞中に存在する複合体の全てのアセンブリ、構造および機序を解明するために必要とされることが明らかである。これは、基礎研究のためだけに必要とされるのではなく、より特異的に細胞機能を調節する、新規かつより有効な医薬の開発を推進するために、製薬およびバイオテクノロジー業界における新規アプローチを可能にするために重要である。これらの分野において進展を妨げる障害は、典型的には、天然の細胞におけるタンパク質複合体の低含有量および高い不均一性に起因する。一部の例外を除いて、ほとんどのヒトマルチタンパク質複合体は、今日まで実質的に入手し難いままである。
【０００４】
組換え体の過剰発現は、この問題に対する解決策を提供し得る。しかしながら、最近まで、真核生物（とりわけ、ヒト）のマルチタンパク質複合体の製造の課題は、体系的に対処されてこなかった。機序研究および薬物設計に必要な質および量のヒトマルチタンパク質複合体の提供は、我々の細胞における動作での機構の複雑さに起因する特定の課題を提起する。タンパク質収量、サブユニット間の化学量論比、翻訳後修飾、折り畳み、および安定性を含む異種タンパク質生産のための技術的な要因は、すべて極めて重要であり、理想的には、広範囲のタンパク質複合体にこれらの機能を提供することができる高度に柔軟な異種発現系は、利用可能であるべきである。魅力的な解決策は、本発明の細胞で起こることを正確に反映するために必要な機能を自然に提供する哺乳動物発現系、およびとりわけ、治療用抗体のような分泌タンパク質について益々一般的となっている哺乳動物における異種発現系であり得る（Nettleship JE, et al. (2010) J Struct. Biol. 172:55−65）。しかしながら、哺乳動物系は、多くの場合、細胞内タンパク質の許容される収量を提供せず、哺乳動物細胞のためのマルチタンパク質発現技術は、最近進歩はしたが、未だ初期段階にあり、哺乳動物細胞においてこれまで達成され得なかった高精度の全経路を記載するための、例えば、薬理学的スクリーニング研究のための、まだ始まったばかりの興味深い選択肢である（Kriz A, et al. (2010) Nat. Commun. 2010; 1:120）。
【０００５】
哺乳動物系の魅力的な代替系は、昆虫細胞培養物を感染させるために組み換えバキュロウイルスを用いる異種発現である。この方法は、３０年前に開発され（Summers MD (2006) Adv. Virus Res. 68:3−73）、医薬目的の多数のタンパク質を含む多くの真核タンパク質を高レベルで生産するための最適な方法となっている（Kost TA, et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:567−75 および Jarvis DL (2009) Methods Enzymol. 463:191−222）。既存のバキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）を超える顕著な利点は、構造的および機能的研究のために真核生物のマルチタンパク質複合体の生産に特に適合させた、ＭｕｌｔｉＢａｃ、改良型ＢＥＶＳの導入に至った（Bieniossek C et al. (2012) Trends Biochem. Sci. 37:49−57; Bieniossek C, et al. (2009) Nat. Methods 6:447−50; Bieniossek C, et al. (2008) Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5: Unit 5.20 および Fitzgerald DJ, et al. (2006) Nat. Methods 3:1021−32）。ＭｕｌｔｉＢａｃは、プロテアーゼおよびアポトーシス活性を低減することにより最適化されたタンパク質生産のために設計されたバキュロウイルスゲノムからなる（Berger I, et al. (2004) Nat. Biotechnol. 22:1583−7）。該システムのその後の改良では、トランスファーベクターの新しい組み合わせ（suite）が、配列−および−ライゲーション−非依存性クローニング（sequence−and−ligation−independent cloning：ＳＬＩＣ）ならびにＣｒｅ−ＬｏｘＰ組換えを含む、タンデムリコンビニアリング（ＴＲ）と呼ばれる方法により、１つの組み換えＭｕｌｔｉＢａｃバキュロウイルス中への多くの異種遺伝子の導入を促進するために導入された（Trowitzsch S, et al. (2010) J. Struct. Biol. 172:45−5414; Vijayachandran LS, et al. (2011) J. Struct. Biol. 2011; 175:198−208）。ごく最近では、トランスファープラスミドの設計はさらに精密化されてきており、その結果、縮小され、タンパク質発現、発現カセット増幅およびＴＲによるプラスミド連結に必要とされる機能的ＤＮＡエレメントのみを含むプラスミドの取り扱いが容易になっている（Vijayachandran LS, et al. (2011) J. Struct. Biol. 175:198−208）。この方法で作製されたＭｕｌｔｉｇｅｎｅトランスファーベクターは、この目的のために改変された大腸菌株において、Ｔｎ７トランスポゾンによりＭｕｌｔｉＢａｃバキュロウイルスゲノム中に導入されている（Trowitzsch S, et al. (2010) 上記）。
【０００６】
従来のシステムに比べて一段前進したように、元々のＭｕｌｔｉＢａｃシステムは、Ｔｎ７転移に依存する組込みの主な部位とは独立の、かつ遠位であるウイルスゲノム内に作成された第二の挿入部位により、マルチタンパク質複合体の適当な機能のために必要とされ得る付属的機能を組み込むためのオプションを既に提供している。この特徴は、翻訳後修飾酵素、ならびにトランスフェクション後およびウイルス増幅中のウイルス性能およびタンパク質生産のモニタリングを容易に行うことが可能となる、蛍光タンパク質を含むウイルスゲノムへの追加の機能的モジュールを組み込むために利用されている（Vijayachandran LS, et al. (2011) and Fitzgerald DJ, et al. (2007) Structure 15:275−9）。ごく最近では、この方法は、昆虫細胞における哺乳動物様糖タンパク質の生産を可能にするために、ＳｗｅｅｔＢａｃを作製するために用いられている（Palmberger D et al. (2012) PloS One 7:e34226 and Palmberger D et al. (2012) Bioengineered 2012; 4）。ＭｕｌｔｉＢａｃは、現在、大学および産業界で、世界中で６００以上の研究室で用いられ、広範なマルチタンパク質複合体が、ＭｕｌｔｉＢａｃシステムを使用することにより種々の適用のために高品質で、かつ多量に生産されている（Trowitzsch S et al. (2012) supra; Nettleship JE et al. (2010) supra; Kriz A et al. (2010) supra; Summers MD (2005) supra; Jarvis DL (2009) Methods Enzymol. 463:191−222 and Bieniossek C (2012) Trends Biochem. Sci. 37:49−57）。
【０００７】
現在では、異種発現カセットをバキュロウイルスゲノムへ組み込むための２つの方法が、当技術分野で主に用いられている。これらの方法の１つは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）上のＴｎ７結合部位に組み換えトランスファープラスミドを再組み換えする、これらの同じ細胞中に存在するＴｎ７トランスポゼース活性と共に、大腸菌細胞内にＢＡＣとしてのバキュロウイルスゲノムの存在を必要とする。InvitrogenのＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステムおよびまたより高度のＭｕｌｔｉＢａｃシステムは、両方とも、この方法を利用する。その後、組み換え合成バキュロウイルスＤＮＡは、これらの大腸菌細胞からアルカリ溶解により精製され、昆虫細胞にトランスフェクトするために使用される。これに対して、バキュロウイルスゲノムへ異種発現カセットを組み込むために選択される元の方法は、不活性化されているバキュロウイルスｐｏｌｈ遺伝子座に隣接するバキュロウイルスゲノム上の２個の遺伝子（Ｏｒｆ１６２９およびｌｅｆ２／６０３）に相同であったトランスファープラスミドにおける複数領域により仲介される相同組換えに依存していた。この方法は、多数の商業的供給者により提供されている（Novagen BacVectorシリーズ、Pharmingen BaculoGold、Abvector等）。この方法では、相同組換えは、バキュロウイルスゲノムＤＮＡをトランスファーベクターと共にトランスフェクションした後に昆虫細胞にて起こる。組換え効率は、バキュロウイルスゲノムの線形化により増加したが、依然として、Ｔｎ７により製造されたＢＡＣ複合体を形質転換するよりも、組み換えバキュロウイルスを迅速に作製するための非効率な方法のままである。昆虫細胞法における相同組換えのさらなる改善は、バキュロウイルスゲノム上の必須遺伝子Ｏｒｆ１６２９の欠失およびその後の完全Ｏｒｆ１６２９含有トランスファーベクターの同時トランスフェクションによる修復によってもたらされた（FlashBac system, Oxford Expression Technologies, UK）。
【０００８】
現在、ＭｕｌｔｉＢａｃを含むＢＥＶＳの適用は、野生型オートグラファカリフォルニカ・マルチカプシド核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）に由来する大きなバキュロウイルスゲノム（〜１３０ｋｂ）に依存している。このゲノムは、長年に亘って集中的に研究されてきた。細胞培養における増殖に必須の遺伝子および外来タンパク質の生産に有害な遺伝子が、いくつかの研究グループにより発表されている（Harrison RL et al. (2003) J. Gen. Virol. 2003; 84:1827−42; Pijlman GP et al. (2001) Virology 283:132−8; Pijlman GP et al. (2002) J. Virol. 76:5605−11; Pijlman GP et al. (2003) J. Gen. Virol. 84:2041−9; Pijlman GP et al. (2006) , J. Biotechnol. 123:13−21; Pijlman GP et al. (2003) J. Gen. Virol. 2003; 84:2669−78 および Pijlman GP et al. (2003) J. Invertebr. Pathol. 84:214−9）。
【０００９】
現在使用されているバキュロウイルスゲノムの固有のＤＮＡ不安定性は、特に医薬品製造に関連する発現スケールにおいて問題となる。簡単に言えば、ウイルスが発現のスケールアップ中に複製するに従い、好ましくは、高度に発現される（非必須の）異種タンパク質発現カセットにおいて、そのゲノムの断片の欠失が徐々に増えるもので、このことは実験室規模の生産について既に示されている（Fitzgerald DJ (2006) Nat. Methods 3:1021−32; Pijlman GP (2001) Virology 283:132−8; Pijlman GP et al. (2002), J. Virol. 76:5605−11）。これは、Ｔｎ７トランスポゾンにより標的とされる挿入部位が、実際に変異ホットスポットであるという事実によって、ＢＡＣ／Ｔｎ７タイプのウイルスに悪影響を及ぼす（Carstens EB et al. (1987) J. Gen. Virol. 68:901−5; Roelvink PW et al. (1992) J. Gen. Virol. 73 (Pt 6):1481−9）。
【００１０】
従って、当技術分野において、効率的なタンパク質発現を可能とし、大きな異種ヌクレオチド挿入を可能とし、例えば複数のタンパク質を発現し、そしてゲノムの再構築が低い傾向にある、すなわち、改善されたゲノムの安定性を有する、発現システムを提供することが必要とされる。
【発明の概要】
【００１１】
発明の概要
第一の面において、本発明は、塩基対の数が、天然のＮＰＶ−αバキュロウイルスＩａ群ゲノムと比較して１８％以上少ない、核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）−αバキュロウイルスＩａ群ゲノム、好ましくは、ゲノムの塩基対の数が、天然のＢｍＮＰＶゲノムと比較して少なくとも２５．７％少ない、オートグラファカリフォルニカ多カプシド核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）ゲノム、またはゲノムの塩基対の数が、天然のＢｍＮＰＶゲノムと比較して少なくとも１８．３１％少ない、ボンビックス・モリ核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）ゲノムに関し、それぞれの場合に、それらは感染性バキュロウイルス中に組み立てられる。
【００１２】
第二の面において、本発明は、ＮＰＶ α バキュロウイルスＩａ群ゲノムに対して異種のヌクレオチド配列をさらに含む、本発明の第一の面のＮＰＶ α バキュロウイルスＩａ群ゲノムに関する。
【００１３】
第三の面において、本発明は、本発明の第一または第二の面のゲノムを含む、感染性ＮＰＶαバキュロウイルスＩａ群ウイルスに関する。
【００１４】
第四の面において、本発明は、本発明の第三の面のウイルスに感染した細胞に関する。
【００１５】
第五の面において、本発明は、ゲノムの全てまたは一部を化学的に合成する工程を含む、本発明の第一または第二の面のＮＰＶ α バキュロウイルスＩａ群ゲノムを製造する方法に関する。
【００１６】
第六の面において、本発明は、細胞内へ第一もしくは第二の面のゲノムまたは第五の面の方法により製造されるゲノムを導入することによる、ＮＰＶ α バキュロウイルスＩａ群ゲノムを生産するための方法に関する。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明を以下に詳細に記載する前に、本発明は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコールおよび試薬に限定されることなく、それらは変更可能であることが理解されるべきである。また、本明細書で用いる用語は、特定の態様のみを記載する目的のためであり、本発明の範囲を添付の特許請求の範囲のみに限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。特に他に記載しない限り、本明細書で用いる全ての技術的および科学的用語は、当技術分野の当業者に通常理解されるのと同様の意味を有する。
【００１８】
以下に、本発明の構成要素について記載する。これらの要素は、特定の態様を記載しているが、さらなる態様を作成するために任意の方法で、かつ任意の種類を組み合わせてもよいことが理解されるべきである。種々の記載の例示および好ましい態様は、明示的に記載された態様のみに本発明を限定するものと解釈されるべきではない。この説明は、任意の数の記載された、および／または好ましい要素を、明示的に記載された態様と組み合わせる態様を支持し、包含するものと理解されるべきである。さらに、本明細書中の全ての記載された要素の変更および組合せは、本明細書中において否定されていない限り、本明細書の記載によって開示されたとみなされるべきである。
【００１９】
いくつかの文献が、本明細書の文脈中に引用されている。本明細書で引用した文献の各々（すべての特許、特許出願、科学文献、製造者の取扱説明書、指示書などを含む）は、上記または下記に関わらず、本明細書中にその全体が引用により包含される。本発明が先行文献の発明により、かかる開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。
【００２０】
定義
本発明を実施するため、他に特記しない限り、当技術分野の文献（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989）中に記載されている常套の化学的方法、生化学的方法、および組み換えＤＮＡ技術を用いる。
【００２１】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、他に特記しない限り、用語“含む（comprise）”、ならびに“含む（comprises）”および“包含する（comprising）”のような変形は、単数形の整数もしくはステップまたは複数形の整数もしくはステップを含むことを意図するが、他の単数形の整数もしくはステップまたは複数形の整数もしくはステップを排除しないことが理解され得る。本明細書および添付の特許請求の範囲に記載の通り、単数形“ａ”、“ａｎ”、および“ｔｈｅ”は、他に明示的に記載されない限り、複数形も含む。
【００２２】
用語“ポリヌクレオチド”および“核酸”は、本明細書において互換的に用いられ、ヌクレオチドモノマーから製造されたポリマーまたはオリゴマー高分子と理解される。ヌクレオチドモノマーは、核酸塩基、五炭糖（例えば、これに限定されないが、リボースまたは２’−デオキシリボース）、および１〜３個のリン酸基で構成されている。典型的には、ポリヌクレオチドは、個々のヌクレオチドモノマー間のホスホジエステル結合により形成される。本発明の文脈中において、核酸分子への言及は、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、およびそれらの混合物、例えば、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドが含まれるが、これらに限定されない。核酸は、例えば、ホスホトリエステル法に従い、化学的に合成され得る（例えば、Uhlmann, E. ＆ Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543−584を参照のこと）。“アプタマー”は、高い親和性でポリペプチドに結合する核酸である。アプタマーは、ＳＥＬＥｍｉｒ１４６−ａのような選択方法によって、異なる一本鎖ＲＮＡ分子の大きな集合体から単離することができる（例えば、Jayasena (1999) Clin. Chem., 45, 1628−50; Klug and Famulok (1994) M. Mol. Biol. Rep., 20, 97−107; US 5,582,981を参照のこと）。アプタマーは合成することもでき、それらの鏡像体形態中で、例えばＬ−リボヌクレオチドとして選択することもできる（Nolte et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1116−9; Klussmann et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1112−5）。この方法で単離された形態は、天然に存在するリボヌクレアーゼで分解されないために、より高い安定性を有するという利点がある。
【００２３】
用語“タンパク質”および“ポリペプチド”は、本明細書中で互換的に用いられ、長さまたは翻訳後修飾に関わらず、アミノ酸のペプチド結合による結合鎖を意味する。本発明に使用可能なタンパク質（タンパク質誘導体、タンパク質変異体、タンパク質フラグメント、タンパク質断片、タンパク質エピトープおよびタンパク質ドメインを含む）は、化学的修飾によってさらに修飾され得る。このことは、かかる化学的に修飾されたポリペプチドが、２０種の天然に存在するアミノ酸以外の化学基を含むことを意味する。かかる他の化学基の例には、グリコシル化アミノ酸およびリン酸化アミノ酸が含まれるが、これに限定されない。ポリペプチドの化学的修飾は、親ポリペプチドと比較して有利な特性、例えば、増強された安定性、延長された生物学的半減期、または増強された水溶性の１つまたはそれ以上を提供し得る。
【００２４】
用語“配列同一性”は、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列の比較に関して、本明細書全体で使用される。２個の配列が比較され、対照配列が、配列同一性割合を計算すべきものと比べて特定されていない場合、配列同一性は、他に具体的に記載されないとき、比較されるべき２個の配列のより長い配列を参照して計算される。対照配列が指示されている場合、配列同一性は、他に具体的に記載されないときは、配列番号で示される対照配列の完全長に基づいて決定される。例えば、３００アミノ酸長の対照ポリペプチド配列と比較した２００アミノ酸からなるポリペプチド配列は、６６．６％（２００／３００）の配列同一性の最大割合を示すが、１５０アミノ酸長の配列は、５０％（１５０／３００）の配列同一性の最大割合を示す。その１５０アミノ酸のうち１５アミノ酸が、３００アミノ酸長の対照配列の各アミノ酸と異なる場合、配列同一性のレベルは４５％に低下する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の類似性、すなわち、配列同一性の割合は、配列アラインメントによって決定することができる。このようなアラインメントは、いくつかの当技術分野で公知のアルゴリズムを用いて、好ましくは、カーリンおよびアルチュールの数学的アルゴリズム（Karlin ＆ Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873−5877）と共に、例えばhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ または http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html または http://npsa−pbil.ibcp.fr/cgi−bin/npsa_automat.pl−page=/NPSA/npsa_clustalw.htmlにより利用可能な、ｈｍｍａｌｉｇｎ（HMMER package, http://hmmer.wustl.edu/）またはＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズム（Thompson, J. D., Higgins, D. G. ＆ Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673−80）により行うことができる。用いる好ましいパラメーターは、http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ または http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.htmlに記載されるデフォルトパラメーターである。配列同一性（配列マッチング）の程度(グレード)は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＴまたはＢｌａｓｔＺ（またはＢｌａｓｔＸ）を用いて計算することができる。同様のアルゴリズムは、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403−410に記載のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴポリヌクレオチド探索は、ＢＬＡＳＴＮプログラムを、スコア＝１００、ワード長＝１２で実行される。ＢＬＡＳＴタンパク質探索は、ＢＬＡＳＴＰプログラムを、スコア＝５０、ワード長＝３で実行される。比較目的でギャップ付きアラインメントを得るために、ギャップ付きＢＬＡＳＴが、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389−3402に記載の通りに用いられる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーターが用いられる。配列マッチング分析は、Ｓｈｕｆｆｌｅ−ＬＡＧＡＮ（Brudno M., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1:I54−I62）またはマルコフランダムフィールド（Markov Random Field）のような確立された相同性マッピング技術により補足され得る。配列同一性の割合が本明細書で言及されるとき、他に特に記載されないとき、これらの割合は、より長い配列の全長に照らして計算される。“ハイブリダイゼーション”はまた、２つの核酸配列間の配列同一性または相同性の尺度として用いられ得る。Ｆ、Ｎ、またはＭ２��１、またはこれらの何れかの一部をコードする核酸配列は、標準的ハイブリダイゼーション技術に従い、ハイブリダイゼーションプローブとして用いられ得る。ハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知であり、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, N. Y., 6.3.1−6.3.6, 1991に見出され得る。“中程度のハイブリダイゼーション条件”は、２Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、３０℃でハイブリダイゼーション後、１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃での洗浄に相当すると定義される。“高度にストリンジェントな条件”は、６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、４５℃でハイブリダイゼーション後、０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃での洗浄に相当すると定義される。
【００２５】
本明細書で用いる用語“耐性遺伝子”は、毒素および／または抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子を意味する。従って、かかる遺伝子は、“毒素耐性遺伝子”または“抗生物質耐性遺伝子”とも称され得る。毒素または抗生物質の機能的不活性化は、毒素または抗生物質に非感受性のそれぞれの遺伝子産物を提供する突然変異（複数可）を担持するマーカー遺伝子を発現することにより達成され得る。あるいは、毒素または抗生物質の機能的不活性化は、毒素または抗生物質を、例えば、それらに相互作用または結合することにより阻害するマーカー遺伝子を発現することにより達成され得る。毒素または抗生物質の機能的不活性化はまた、毒素または抗生物質の効果を打ち消すマーカー遺伝子を発現することによっても達成され得る。抗生物質化合物としては、テトラサイクリン、スルホンアミド、ペニシリン、セファロスポリン、アンサマイシン、カルバペネム、マクロライド、キノロン、アミノヌクレオシド、アミノグリコシド、ペプチド、グリコペプチド、およびリポペプチドが含まれるが、これらに限定されない。例示として、ハイグロマイシンＢ、ネオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、およびＧ４１８（ジェネティシンとしても公知）は、構造が類似しているアミノグリコシド抗生物質である。一般的には、ネオマイシンおよびカナマイシンは、原核生物に対して使用され、Ｇ４１８は、真核生物に対して要される。カナマイシンは、ストレプトマイセス・カナマイセティカスから単離され、原核生物のリボソームの３０Ｓサブユニットと相互作用し、それにより、誤翻訳を誘発し、間接的にタンパク質合成中の転座を阻害する。ネオマイシンは、細菌ストレプトマイセス・フラジアエにより天然に生成され、Ｇ４１８は、ミクロモノスポラ・エキノスポラにより生成される。ネオマイシンは、７０Ｓ−リボソームの３０Ｓサブユニットに結合することによりタンパク質生合成を阻害する。Ｇ４１８は、８０Ｓ−リボソームに結合することによりポリペプチド合成を阻害し、それにより、原核細胞および真核細胞の両方において伸長工程を阻害する。ネオマイシンおよびＧ４１８に対する耐性は、ネオマイシンまたはジェネテシンをヒドロキシ基においてリン酸化し、それにより、その機能を阻害する、アミノグリコシド ３'−ホスホトランスフェラーゼ、ＡＰＨ ３' ＩＩをコードするトランスポゾンＴｎ５由来のＮｅｏｒ遺伝子によって付与される。ハイグロマイシンＢは、細菌ストレプトマイセス・ハイグロスコピカスにより生成され、細菌、真菌および高等真核細胞を、タンパク質合成を阻害することにより殺す。ハイグロマイシン耐性遺伝子Ｈｐｈは、リン酸化を介してハイグロマイシンＢを不活性化する、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼをコードする。ブラスチシジンは、ストレプトミセス・グリセオクロモゲネスにより生成され、リボソームによるペプチド結合形成を阻害することにより、真核および原核細胞の両方の増殖を阻止する抗生物質である。ストレプトベルチシリウム種由来の遺伝子ｂｌｓ、セレウス菌（Bacillus cereus）由来のｂｓｒ、およびアスペルギルス・テレウス由来のＢＳＤの３つの遺伝子は、細胞が、ブラストサイジンの存在下でもタンパク質生産を継続可���にすることにより、ブラストサイジンに対する抵抗性を付与する。ピューロマイシンは、ストレプトマイセス・アルボニガーに由来するアミノヌクレオシド抗生物質であり、リボソームで行われている翻訳中に早期の連鎖停止(chain termination)を引き起こす。レポート遺伝子Ｐｕｒｏｒの発現は、抗生物質ピューロマイシンに対する耐性を与える、ピューロマイシン Ｎ−アセチル−トランスフェラーゼをコードする。本発明の文脈中、抗生物質耐性を付与する遺伝子としては、特に好適には、ネオマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジンおよびハイグロマイシンに対する耐性を付与する遺伝子が含まれるが、これに限定されない。
【００２６】
具体的態様
改善された発現系を提供するために、本発明者らは、バキュロウイルスゲノムの性能を最大化するために、そのゲノム全体を再構成することを決定した。その目的は、種々の利点のうち、特に増強されたＤＮＡ安定性および効率的なタンパク質生産を提供するための、バキュロウイルスゲノムの再設計および再構築であった。実験室の培養条件下で不必要であり、効率的な発芽ウイルス（細胞培養におけるタンパク質発現（上記Bieniossek C et al. (2008)および Fitzgerald DJ et al (2006) Nat. Methods 3:1021−32）に使用される主なウイルスタイプである）産生に必須ではない遺伝子およびＤＮＡ要素が、本発明者らによって決定された。これは、非必須遺伝子および変異を受けやすい領域を除去することにより、改善されたバキュロウイルスゲノムの設計を可能にした。そのような操作されたウイルスは、取り扱いの容易性および優れたタンパク質生産特性を損なうことなく、種々の利点のうち、改善されたウイルスＤＮＡの安定性、顕著に大きな外来遺伝子の挿入に対応する増加された能力を提供する。
【００２７】
本発明者らは、驚くべきことに、ＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群 ゲノムのゲノムサイズが、感染および細胞中で増殖する能力に影響を与えることなく、顕著に低減され得ることを見出した。このような最適化されたゲノムを含むウイルスは、増強されたＤＮＡの安定性、およびより効率的なタンパク質産生を提供する。このように、第一の面において、本発明は、塩基対の数が、天然のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群 ゲノムと比較して１８％以上低減され、そして感染性バキュロウイルス中に、例えば以下に記載の条件下で組み立てられている、核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）−α バキュロウイルス Ｉａ群 ウイルスのゲノム、好ましくは、ゲノムの塩基対の数が、天然のＡｃＭＮＰＶゲノムと比較して少なくとも２５．７％低減される、オートグラファカリフォルニカ・マルチキャプシド核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）のゲノム、またはゲノムの塩基対の数が、天然のＢｍＮＰＶゲノムと比較して少なくとも１８．３１％低減され、そして感染性バキュロウイルス中に組み立てられている、ボンビックス・モリ核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）ゲノムを提供する。
【００２８】
好ましくは、ゲノムは、一旦、許容される細胞に感染すると異種タンパク質を発現することが可能な感染性バキュロウイルス中に組み立てられる。
【００２９】
ＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群に属するバキュロウイルスのゲノムは、高度に保存されている。従って、以下の欠失または維持されるべきコーディング領域（ＣＤＳ）、５’ 非翻訳領域（ＵＴＲ）、スペーサーおよび／または反復配列（ｈｒ）は、通常、ＡｃＭＮＰＶまたはＢｍＮＰＶのゲノムを参照して示される。ヌクレオチドの位置が示されているとき、これらは、配列番号１のＡｃＭＮＰＶまたは配列番号４のＢｍＮＰＶのゲノムの何れかを参照している。この情報に基づき、当業者は、別のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ウイルスの対応するＣＤＳ、ＵＴＲ、スペーサーまたはｈｒ配列を、上記のような標準的アライメントツールを用いて、過度の負担を要することなく決定することができる。かかるアプローチの結果として、ＡｃＭＮＰＶのタンパク質チロシンホスファターゼをコードするｐｔｐ遺伝子（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ２４６５６、配列番号１３）が例示的に記載される。配列番号１３のアミノ酸配列が、非重複タンパク質配列のＰＢＬＡＳＴ検索で使用されるとき、他のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ウイルス由来のＡｃＭＮＰＶのタンパク質チロシンホスファターゼのホモログ配列が同定され、例えば、Rachiplusia ou multiple nucleopolyhedrovirus（ＲｏＭＮＰＶ）のホモログ（受託番号：ＮＰ＿７０２９９３；配列番号１４）、ＢｍＮＰＶのホモログ（受託番号：ＡＡＧ３１６５７；配列番号１５）、マメノメイガ（Maruca vitrata）の複数の核多角体病ウイルス（ＭａｖｉＭＮＰＶ）のホモログ（受託番号：ＹＰ＿９５０８５３；配列番号１６）、Choristoneura fumiferanaの欠損型核多角体病ウイルス（ＣｆＤｅｆＭＮＰＶ）のホモログ（受託番号：ＮＰ＿９３２６１７；配列番号１７）、Anticarsia gemmatalisの複数の核多角体病ウイルス（ＡｇＭＮＰＶ）のホモログ（受託番号：ＹＰ＿８０３４０３；配列番号１８）、リンゴウスチャイロハマキ（Epiphyas postvittana ）の核多角体病ウイルス（ＥｐｐｏＮＰＶ）のホモログ（受託番号：ＮＰ＿２０３１７６；配列番号１９）、Antheraea pernyiの核多角体病ウイルス（ＡｎｐｅＮＰＶ）のホモログ（受託番号：ＹＰ＿６１１１０４；配列番号２０）、Choristoneura fumiferanaのマルチヌクレオカプシド核多角体病ウイルス（ＣｆＭＮＰＶ）のホモログ（受託番号：ＮＰ＿８４８３２１；配列番号２１）、Orgyia pseudotsugataのマルチキャプシド核多角体病ウイルス（ＯｐＭＮＰＶ）のホモログ（受託番号：ＮＰ＿０４６１６６；配列番号２２）、およびHyphantria cuneaの核多角体病ウイルス（ＨｙｃｕＮＰＶ）のホモログ（受託番号：ＹＰ＿４７３３３０；配列番号２３）である。ＣＬＵＳＴＡＬＷ２を用いる、これらの配列のアライメントを図２に示す。ｐｔｐタンパク質が、異なるＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ウイルス間で高度に保存されていることは明らかである。従って、ｐｔｐ遺伝子がＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ウイルスにおいて欠失された場合、これは、少なくとも、それぞれのＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ウイルスにおいてｐｔｐタンパク質をコードするＣＤＳが欠失されたことを意味する。また、それぞれのＣＤＳの５’−ＵＴＲが欠失されることが好ましい。以下において、参照は、常に、特定のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ウイルスタンパ���質をコードする遺伝子になされる。それぞれの遺伝子を明確に同定するために、ＡｃＭＮＰＶまたはＢｍＮＰＶのタンパク質のＵｎｉＰｒｏｔ参照番号が示される。それにもかかわらず、他のＮＰＶ−αバキュロウイルスＩａ群ウイルスにおけるその遺伝子のホモログもまた参照される。同様に、ＣＤＳ、５’−ＵＴＲ、ｈｒまたはスペーサーの５’および３’末端は、常に、配列番号１のＡｃＭＮＰＶゲノムまたはＢｍＮＰＶゲノムを参照して示されるが、他のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ウイルス由来の相同領域を含み、それらは、当業者により、過度の負担を要することなく、参照されたＣＤＳ、５’ＵＴＲ、ｈｒｓおよびスペーサーそれぞれ、（ｉ）配列番号１のＡｃＭＮＰＶゲノム、（ｉｉ）配列番号４のＢｍＮＰＶゲノム、または（ｉｉｉ）配列番号１のＡｃＭＮＰＶゲノム、および配列番号４のＢｍＮＰＶゲノムの、他のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ウイルスのゲノムとのアライメントにより、同定され得る。ＮＰＶ−α バキュロウイルスは、互いに高度に保存されているが、欠失されるべき所定のＡｃＭＮＰＶまたはＢｍＮＰＶ ＣＤＳ、５’−ＵＴＲ、ｈｒおよび／またはスペーサー領域について、修飾されるべきバキュロウイルス内で同定され得る相同領域がないこともある。これは、特定のＮＰＶ−Ｉａ群ウイルスが、自然にこのゲノムセグメントを欠失している可能性があり、それ故に、ＡｃＭＮＰＶおよび／またはＢｍＮＰＶの基準セグメント（reference segment）に相同性のゲノムセグメントの欠失が可能ではないという事実に起因し得る。相同セグメントの決定において、欠失または維持されるべき参照ヌクレオチド配列および別のＩａ群のバキュロウイルス由来のヌクレオチド配列は、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％のアミノ酸同一性を示すことが好ましい。ＣＤＳの相同セグメントが決定されたとき、配列比較は、コーディング配列に基づいて行われるよりも、コードされたアミノ酸に基づいて行われることが好ましい。さらに、相同タンパク質は、ＡｃＭＮＰＶまたはＢｍＮＰＶタンパク質の参照アミノ酸配列と少なくとも７０％、７５、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％のアミノ酸同一性を示すことが好ましい。
【００３０】
好ましくは、ＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ゲノムのサイズは、本出願の記載に従い、少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも２２％、少なくとも２４％、少なくとも２６％、少なくとも２８％、少なくとも３０％、少なくとも３２％、少なくとも３４％、少なくとも３６％、少なくとも３８％、または少なくとも４０％減少し、それらのゲノムは、本発明のサイズを小さくしたゲノムに達するために、それぞれのウイルスの天然ゲノムに対して維持および欠失されている。
【００３１】
好ましくは、ＡｃＭＮＰＶのゲノムサイズは、少なくとも２６％、少なくとも２８％、少なくとも３０％、少なくとも３２％、少なくとも３４％、少なくとも３６％、少なくとも３８％、少なくとも４０％低減されている。
【００３２】
好ましくは、ＢｍＮＰＶのゲノムサイズは、少なくとも２０％、より好ましくは、少なくとも２２％、少なくとも２４％、少なくとも２６％、少なくとも２８％、少なくとも３０％、少なくとも３２％、少なくとも３４％、少なくとも３６％、少なくとも３８％、または少なくとも４０％低減されている。
【００３３】
好ましくは、ＲｏＭＮＰＶのゲノムサイズは、少なくとも２０％、より好ましくは、少なくとも２２％、少なくとも２４％、少なくとも２６％、少なくとも２８％、少なくとも３０％、少なくとも３２％、少なくとも３４％、少なくとも３６％、少なくとも３８％、または少なくとも４０％低減されている。
【００３４】
好ましくは、ＭａｖｉＭＮＰＶのゲノムサイズは、少なくとも２０％、より好ましくは、少なくとも２２％、少なくとも２４％、少なくとも２６％、少なくとも２８％、少なくとも３０％、少なくとも３２％、少なくとも３４％、少なくとも３６％、少なくとも３８％、または少なくとも４０％低減されている。
【００３５】
好ましくは、ＣｆＤｅｆＭＮＰＶのゲノムサイズは、少なくとも２０％、より好ましくは、少なくとも２２％、少なくとも２４％、少なくとも２６％、少なくとも２８％、少なくとも３０％、少なくとも３２％、少なくとも３４％、少なくとも３６％、少なくとも３８％、または少なくとも４０％低減されている。
【００３６】
好ましくは、ＡｇＭＮＰＶのゲノムサイズは、少なくとも２０％、より好ましくは、少なくとも２２％、少なくとも２４％、少なくとも２６％、少なくとも２８％、少なくとも３０％、少なくとも３２％、少なくとも３４％、少なくとも３６％、少なくとも３８％、または少なくとも４０％低減されている。
【００３７】
好ましくは、ＥｐｐｏＮＰＶのゲノムサイズは、少なくとも２０％、より好ましくは、少なくとも２２％、少なくとも２４％、少なくとも２６％、少なくとも２８％、少なくとも３０％、少なくとも３２％、少なくとも３４％、少なくとも３６％、少なくとも３８％、または少なくとも４０％低減されている。
【００３８】
好ましくは、ＡｎｐｅＮＰＶのゲノムサイズは、少なくとも２０％、より好ましくは、少なくとも２２％、少なくとも２４％、少なくとも２６％、少なくとも２８％、少なくとも３０％、少なくとも３２％、少なくとも３４％、少なくとも３６％、少なくとも３８％、または少なくとも４０％低減されている。
【００３９】
好ましくは、ＣｆＭＮＰＶのゲノムサイズは、少なくとも２０％、より好ましくは、少なくとも２２％、少なくとも２４％、少なくとも２６％、少なくとも２８％、少なくとも３０％、少なくとも３２％、少なくとも３４％、少なくとも３６％、少なくとも３８％、または少なくとも４０％低減されている。
【００４０】
好ましくは、ＯｐＭＮＰＶのゲノムサイズは、少なくとも２０％、より好ましくは、少なくとも２２％、少なくとも２４％、少なくとも２６％、少なくとも２８％、少なくとも３０％、少なくとも３２％、少なくとも３４％、少なくとも３６％、少なくとも３８％、または少なくとも４０％低減されている。
【００４１】
好ましくは、ＨｙｃｕＮＰＶのゲノムサイズは、少なくとも２０％、より好ましくは、少なくとも２２％、少なくとも２４％、少なくとも２６％、少なくとも２８％、少なくとも３０％、少なくとも３２％、少なくとも３４％、少なくとも３６％、少なくとも３８％、または少なくとも４０％低減されている。
【００４２】
好ましくは、プルテラキシロステラ（Plutella xylostella）核多角体病ウイルス（ＰｌｘｙＮＰＶ）のゲノムサイズは、少なくとも２０％、より好ましくは、少なくとも２２％、少なくとも２４％、少なくとも２６％、少なくとも２８％、少なくとも３０％、少なくとも３２％、少なくとも３４％、少なくとも３６％、少なくとも３８％、または少なくとも４０％低減されている。
【００４３】
明細書の上記および下記部分において、ゲノムサイズの低下は、通常、天然のバキュロウイルスゲノムと比較して減少した割合として表される。あるいは、サイズの低下はまた、絶対値、すなわち、Ｘ塩基対のサイズの低下でも示され得る。ＣＤＳ、５’−ＵＴＲ、スペーサーおよびｈｒセグメントのそれぞれの塩基対での長さは、ＡｃＭＮＰＶおよびＢｍＮＰＶについて以下の表１から表１２に詳しく記載される（各表中、“ｂｐ”と示されるカラムを参照のこと）。それぞれ示される要素のｂｐの和は、バキュロウイルスゲノムが天然のバキュロウイルスゲノム、好ましくは配列番号１または１５のゲノムに対して短縮されている塩基対の数を決定し得る。他のＩａ群ウイルスにおける相同領域を配列アライメントにより同定する方法についての記載を用いて、当業者は、他のＩａ群ウイルス中の相同セグメントの長さを決定し、欠失されるべき相同配列の塩基対数を追加して、特定のＩａ群のバキュロウイルスの天然ゲノムの長さの絶対的低減値に達することができる。
【００４４】
本発明者らは、以下に示されるＣＤＳ／タンパク質が、それぞれのＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ウイルスに対して有害な影響を与えることなく欠失され得ることを見出した（全てのＣＤＳおよびタンパク質は、ＡｃＭＮＰＶおよびＢｍＮＰＶのそれぞれのゲノムを参照している）。
【００４５】
本発明者らは、以下の表１ａに示すＣＤＳが、ＡｃＭＮＰＶに有害な影響を与えることなく欠失され得ることを見出した。さらに、以下の表１ｂに示すＣＤＳは、ＢｍＮＰＶに有害な影響を与えることなく欠失され得る。これらのＣＤＳは、それぞれのＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群のウイルスのタイプＩと称されるグループに属すると考えられている（全てのＣＤＳおよびタンパク質は、ＡｃＭＮＰＶを参照している）。従って、これらのＣＤＳ（および、好ましくは、それぞれの５’−ＵＴＲ、スペーサーおよび／またはｈｒ領域）の欠失は、タイプＩの欠失と称される。
【００４６】
【表１】
2016509484.tif 000002
【表２】
2016509484.tif 000003
【００４７】
【表３】
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【００４８】
これらのタンパク質をコードするＣＤＳの全長は、配列番号１のＡｃＭＮＰＶ中、およそ３４，３６２塩基対である。従って、１３３，８９４塩基対長の配列番号１の天然のＡｃＭＮＰＶゲノムは、好ましくは、これらのタンパク質をコードするＣＤＳの欠失により短くされ、それ故に、本発明のＡｃＭＮＰＶゲノムは、好ましくは、天然のＡｃＭＮＰＶゲノムよりも少なくとも３４，３６３塩基対短い。これらのタンパク質をコードするＣＤＳの全長は、ＢｍＮＰＶにおいて、およそ２４，５３１塩基対である。従って、１２８，４１３塩基対長を有する天然のＢｍＮＰＶゲノムは、好ましくは、これらのタンパク質をコードするＣＤＳの欠失により短く、それ故に、本発明のＢｍＮＰＶゲノムは、好ましくは、天然のＢｍＮＰＶゲノムよりも、少なくとも２５，１２１塩基対短い。
【００４９】
従って、本発明のＡｃＭＮＰＶゲノムは、天然のＡｃＭＮＰＶゲノムよりも少なくとも２５．７％短い。従って、本発明のＢｍＮＰＶゲノムは、天然のＢｍＮＰＶゲノムよりも少なくとも１８．３１％短い。
【００５０】
ＭｖＭＮＰＶについて、本発明のゲノムは、好ましくは、天然のＭｖＭＮＰＶゲノムよりも少なくとも２１，６８８塩基対短い。ＢｍａＭＮＰＶについて、本発明のゲノムは、好ましくは、天然のＢｍａＭＮＰＶゲノムよりも少なくとも２０，２３５塩基対短い。ＢｍＮＰＶについて、本発明のゲノムは、好ましくは、天然のＢｍＮＰＶゲノムよりも少なくとも２４，５３１塩基対短い。ＰｌｘｙＭＮＰＶについて、本発明のゲノムは、好ましくは、天然のＰｌｘｙＭＮＰＶゲノムよりも少なくとも２６，７２４塩基対短い。ＲｏＭＮＰＶについて、本発明のゲノムは、好ましくは、天然のＲｏＭＮＰＶゲノムよりも少なくとも２６，３７９塩基対短い。
【００５１】
これらのＣＤＳの５’−ＵＴＲの１つまたはそれ以上もまた欠失されることがより好ましい。ＡｃＭＮＰＶでは、これらのＣＤＳの５’−ＵＴＲは、２，１１３塩基対長を有する。ＢｍＮＰＶにおいて、これらのＣＤＳの５’−ＵＴＲは、１，６１４塩基対長を有する。以下の表２ａおよび２ｂは、本発明の好適なゲノムにおいて欠失されるＣＤＳの５’ＵＴＲの位置を示す。５’−ＵＴＲは、塩基対の示された数字によりそれぞれ示されるＣＤＳ開始コドンに先行する。
【００５２】
【表４】
2016509484.tif 000005
【表５】
2016509484.tif 000006
【００５３】
ＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ウイルスのゲノム由来のこれらの５’−ＵＴＲの１つまたはそれ以上の欠失は、天然ゲノムと比較して、ゲノムサイズの１．５８％までのさらなる低下をもたらす。従って、さらにより好ましい態様において、本発明のＡｃＭＮＰＶウイルスのゲノムのサイズは、少なくとも２７．２４％低減されている。従って、より好ましい態様において、本発明のＢｍＮＰＶウイルスのゲノムサイズは、少なくとも１９．５６％低減されている。
【００５４】
あるいは、またはさらに、ＡｃＭＮＰＶ  ＣＤＳのスペーサーが欠失されてよく、それは、３，０００ｂｐのさらなる欠失を意味する。ＢｍＮＰＶにおいて、これらのＣＤＳのスペーサーは、３，０４７塩基対の長さを有する。ＡｃＭＮＰＶのヌクレオチド配列を参照して、欠失されていてよいスペーサーは、以下の通りである。
【００５５】
【表６】
2016509484.tif 000007
【表７】
2016509484.tif 000008
【００５６】
【表８】
2016509484.tif 000009
【００５７】
ＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ウイルスのゲノムからのこれらのスペーサーの欠失は、天然ゲノムと比較して、ゲノムサイズのさらなる低減をもたらす。具体的には、ＡｃＭＮＰＶウイルスのゲノムからのこれらのスペーサーの欠失は、天然のゲノムと比較して、ゲノムサイズの２．２４％のさらなる低減をもたらす。従って、さらにより好ましい態様において、本発明のＡｃＭＮＰＶウイルスのゲノムサイズは、少なくとも２９．４８％低減されている。
【００５８】
ＢｍＮＰＶウイルスのゲノムからのこれらのスペーサーの欠失は、天然ゲノムと比較して、ゲノムサイズの２．３３％のさらなる低減をもたらす。従って、さらにより好ましい態様において、本発明のＢｍＮＰＶウイルスのゲノムサイズは、少なくとも２０．３６％低減されている。
【００５９】
一部のスペーサーは、表２ａまたは２ｂに記載の５’ＵＴＲと重複して上記に記載されることが特記される。従って、５’−ＵＴＲが所定の遺伝子について欠失され、スペーサーがさらに欠失されているとき、これは、５’−ＵＴＲと重複していないスペーサーの一部のみが欠失されることを意味する。これとは逆に、５’−ＵＴＲと部分的に重複するスペーサーが欠失されるとき、重複部分も欠失される。
【００６０】
上記のＣＤＳ、５’−ＵＴＲ、スペーサーおよび／またはｈｒ領域が欠失されているＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ゲノムは、ＡｃＭＮＰＶ、ＰｌｘｙＮＰＶ、ＲｏＭＮＰＶ、ＢｍＮＰＶ、ＭａｖｉＭＮＰＶ、ＣｆＤｅｆＭＮＰＶ、ＡｇＭＮＰＶ、ＥｐｐｏＮＰＶ、ＡｎｐｅＮＰＶ、ＣｆＭＮＰＶ、ＯｐＭＮＰＶ、およびＨｙｃｕＮＰＶからなる群より選択されるバキュロウイルスのゲノムに基づくことが好ましい。これらのバキュロウイルスの例示されるゲノムは、ＮＩＨおよびＥＢＩデータバンクにてアクセス可能である。語句“ゲノムに基づく”は、それぞれ記載したバキュロウイルスの天然ゲノムが、対照点(reference point)として用いられており、本発明のゲノムが、ＣＤＳおよび／または５’ＵＴＲ、および好ましくは、遺伝子ｏｄｖ−ｅ６６、ｐ４３、ｏｄｖ−ｎｃ４２またはｏｄｖ−ｅ５６、ｐｔｐ、ｂｒｏ、ｃｔｘ、ｏｒｆ６０３、ポリヘドリン、ｅｇｔ、ｂｖ／ｏｄｖ−ｅ２６、ａｃ１８、ｐｉｆ−２、ｅｎｖ−ｐｒｏｔ、ｉａｐ−１、ｓｏｄ、ｆｇｆ、ｖｕｂｉ、ｇｐ３７、ａｃ６９、ｉａｐ−２、ｐｎｋ／ｐｎｌ、ａｃ９１、ｏｄｖ−ｅ２８ ｐｉｆ−４、ｐｉｆ−３、ｐｉｆ−１、ｐｋ−２、ｃｈｉＡ、ｖ−ｃａｔｈ、ｐｐ３４、９４Ｋ、ｐ２６、ｐ１０、ｐ７４、ａｃ１４５、およびａｃ１５０のスペーサー、および／またはｈｒ領域を欠失するヌクレオチド配列を有することを意味する。
【００６１】
本発明のゲノムの欠失の程度を決定するために、対照ゲノムが用いられ、それは、“天然のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群 ゲノム”と称される。この用語は、天然に存在するＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ウイルスのゲノムを指称するために用いられ、ＤＮＡ要素の機能を損なわないオープンリーディングフレーム内のすべてのサイレント変異を含む。好ましくは、この用語は、天然に存在するＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ゲノム、例えばＮＩＨまたはＥＢＩデータバンクでアクセス可能なもののヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を示すＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ／ｂ群ゲノム配列を含む。天然に存在するＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ゲノムのヌクレオチド配列としては、（ｉ）１３３，８９４塩基対の長さを有する配列番号１に記載のＡｃＭＮＰＶ（ＮＣ＿００１６２３）、（ｉｉ）１３３，４１７塩基対の長さを有する配列番号２に記載のＰｌｘｙＮＰＶ（ＮＣ＿００８３４９）、（ｉｉｉ）１３１，５２６塩基対の長さを有する配列番号３に記載のＲｏＭＮＰＶ（ＮＣ＿００４３２３）、（ｉｖ）１２８，４１３塩基対の長さを有する配列番号４に記載のＢｍＮＰＶ（ＮＣ＿００１９６２）、（ｖ）１１１，９５３塩基対の長さを有する配列番号５に記載のＭａｖｉＭＮＰＶ（ＮＣ＿００８７２５．１）、（ｖｉ）１３１，１６０塩基対の長さを有する配列番号６に記載のＣｆＤｅｆＭＮＰＶ（ＮＣ＿００５１３７．２）、（ｖｉｉ）１３２，２３９塩基対の長さを有する配列番号７に記載のＡｇＭＮＰＶ（ＮＣ＿００８５２０．１）、（ｖｉｉｉ）１１８，５８４塩基対の長さを有する配列番号８に記載のＥｐｐｏＮＰＶ（ＮＣ＿００３０８３．１）、（ｉｘ）１２６，６２９塩基対の長さを有する配列番号９に記載のＡｎｐｅＮＰＶ（ＮＣ＿００８０３５．３）、（ｘ）１２９，５９３塩基対の長さを有する配列番号１０に記載のＣｆＭＮＰＶ（ＮＣ＿００４７７８．３）、（ｘｉ）１３１，９９５塩基対の長さを有する配列番号１１に記載のＯｐＭＮＰＶ（ＮＣ＿００１８７５．２）、および（ｘｉｉ）１３２，９５９塩基対の長さを有する配列番号１２に記載のＨｙｃｕＮＰＶ（ＮＣ＿００７７６７．１）、であることが好ましい。従って、対照の天然ＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群 ゲノムは、好ましくは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２からなる群より選択される配列の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有し、より好ましくは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２からなる群より選択される配列の１つと少なくとも９２％の配列同一性を有し、より好ましくは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２からなる群より選択される配列の１つと少なくとも９４％の配列同一性を有し、より好ましくは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２からなる群より選択される配列の１つと少なくとも９６％の配列同一性を有し、さらにより好ましくは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２からなる群より選択される配列の１つと少なくとも９８％の配列同一性を有し、最も好ま���くは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２からなる群より選択される配列の１つと１００％の配列同一性を有する。最も好ましいゲノムは、配列番号１のＡｃＭＮＰＶのゲノムである。
【００６２】
本発明者らは、表４ａおよび４ｂに示されるＣＤＳが、それぞれのＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ウイルスに悪影響を与えることなく欠失され得ることを見出した（全てのＣＤＳおよびタンパク質は、ＡｃＭＮＰＶを基準にしている）。これらのＣＤＳは、タイプＩＩと称されるグループに属すると考えられている。従って、これらのＣＤＳ（および、好ましくはまた、それぞれの５’−ＵＴＲ、スペーサーおよび／またはｈｒ領域）の欠失は、タイプＩＩの欠失と称される。
【００６３】
【表９】
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【表１０】
2016509484.tif 000011
【００６４】
これらのタンパク質をコードするＣＤＳの全長は、配列番号１のＡｃＭＮＰＶにおいて、およそ６，２４６塩基対である。従って、天然のＡｃＭＮＰＶゲノムは、好ましくは、表４ａのタンパク質をコードする全てのＣＤＳの１つまたはそれ以上の欠失により短縮されていてよい。全てのこれらのＣＤＳがＡｃＭＮＰＶゲノムから欠失されているとき、本発明のゲノムは、好ましくは、天然のＡｃＭＮＰＶゲノムよりも、少なくとも６，２４６塩基対短い。１つの特定のＣＤＳの欠失に起因するそれぞれの短縮は、“ｂｐ”と示されるカラムから導かれ得る。これらのＣＤＳは、ＡｃＭＮＰＶの天然のゲノムのおよそ４．７％に相当する。
【００６５】
天然のＢｍＮＰＶゲノムは、好ましくは、表４ｂのタンパク質をコードするＣＤＳの全ての１つまたはそれ以上の欠失によって短縮され得る。全てのこれらのＣＤＳがＢｍＮＰＶゲノムから欠失されたとき、本発明のゲノムは、好ましくは、天然ＢｍＮＰＶゲノムよりも少なくとも２，９６７塩基対短い。１つの特定のＣＤＳの欠失に起因するそれぞれの短縮は、“ｂｐ”と示されるカラムから導かれ得る。これらのＣＤＳは、ＢｍＮＰＶの天然ゲノムのおよそ２．３％に相当する。
【００６６】
ＣＤＳの５’−ＵＴＲの１つまたはそれ以上も欠失されることがより好ましい。ＡｃＭＮＰＶにおいて、これらのＣＤＳの５’−ＵＴＲは、４４６塩基対の長さを有する。ＢｍＮＰＶにおいて、これらのＣＤＳの５’−ＵＴＲは、１９塩基対の長さを有する。以下の表５ａおよび５ｂは、本発明の好ましいゲノムにおいて欠失されたＣＤＳの５’ＵＴＲの位置を示す。５’−ＵＴＲは、塩基対の示された数字によりそれぞれ示されるＣＤＳ開始コドンに先行する。
【００６７】
【表１１】
2016509484.tif 000012
【表１２】
2016509484.tif 000013
【００６８】
ＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ウイルスのゲノムからのこれらの５’−ＵＴＲの１つまたはそれ以上の欠失は、天然ゲノムと比較して、ゲノムのサイズのさらなる低減を引き起こす。ＡｃＭＮＰＶウイルスのゲノムからのこれらの５’−ＵＴＲの１つまたはそれ以上の欠失は、天然ゲノムと比較して、ゲノムサイズの０．３５％までのさらなる低減をもたらす。ＢｍＮＰＶウイルスのゲノムからのこれらの５’−ＵＴＲの１つまたはそれ以上の欠失は、天然ゲノムと比較して、ゲノムサイズの０．０２％までのさらなる低減をもたらす。
【００６９】
あるいは、またはさらに、ＡｃＭＮＰＶにおいて、ＣＤＳのスペーサーが欠失されてよく、それは、２，５４３ｂｐのさらなる欠失を意味する。ＢｍＮＰＶにおいて、これらのＣＤＳのスペーサーは、３，０２８塩基対の長さを有する。ＡｃＭＮＰＶのヌクレオチド配列を参照して、欠失されていてよいスペーサーは、以下の通りである。
【００７０】
【表１３】
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【表１４】
2016509484.tif 000015
【００７１】
ＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ウイルスのゲノムからのこれらのスペーサーの欠失は、天然ゲノムと比較して、ゲノムのサイズのさらなる低減をもたらす。従って、さらにより好ましい態様において、上記の本発明のＡｃＭＮＰＶウイルスのゲノムサイズは、さらに１．８９％まで低減されている。さらに好ましい態様において、本発明のＢｍＮＰＶウイルスのゲノムサイズは、さらに２．３６％まで低減されている。
【００７２】
従って、好ましい態様において、本発明のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群  ゲノムは、タイプＩＩ欠失に加えて、タイプＩ欠失を含む。
【００７３】
本発明のＡｃＭＮＰＶゲノムは、好ましくは、天然のＡｃＭＮＰＶゲノムよりも少なくとも３０．２３％短く（タイプＩおよびＩＩ  ＣＤＳのみが欠失されているとき）、より好ましくは、３５．１６％短く（タイプＩおよびＩＩ  ＣＤＳならびに５’−ＵＴＲが欠失されている）、より好ましくは、３７．０５％短い（タイプＩおよびＩＩ  ＣＤＳ、５’−ＵＴＲならびにスペーサーが欠失されている）。
【００７４】
本発明のＢｍＮＰＶゲノムは、好ましくは、天然ＢｍＮＰＶゲノムよりも少なくとも２１．６２％短く（タイプＩおよびＩＩ  ＣＤＳのみが欠失されているとき）、より好ましくは、２２．０７％短く（タイプＩおよびＩＩ  ＣＤＳならびに５’−ＵＴＲが欠失されている）、より好ましくは、２４．３８％短い（タイプＩおよびＩＩ  ＣＤＳ、５’−ＵＴＲならびにスペーサーが欠失されている）。
【００７５】
本発明者らは、表７ａおよび７ｂに示されるＣＤＳが、それぞれのＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ウイルスに悪影響を与えることなく欠失され得ることを見出した（全てのＣＤＳおよびタンパク質は、ＡｃＭＮＰＶを基準にしている）。これらのＣＤＳは、タイプＩＩＩと称されるグループに属すると考えられている。従って、これらのＣＤＳ（および、好ましくはまた、それぞれの５’−ＵＴＲ、スペーサーおよび／またはｈｒ領域）の欠失は、タイプＩＩＩの欠失と称される。
【００７６】
【表１５】
2016509484.tif 000016
【表１６】
2016509484.tif 000017
【００７７】
これらのタンパク質をコードするＣＤＳの全長は、配列番号１のＡｃＭＮＰＶにおいて、およそ５，６２５塩基対である。従って、天然のＡｃＭＮＰＶゲノムは、好ましくは、これらのタンパク質をコードする全てのＣＤＳの１つまたはそれ以上の欠失により短縮されていてよい。全てのこれらのＣＤＳがＡｃＭＮＰＶゲノムから欠失されているとき、本発明のゲノムは、好ましくは、天然のＡｃＭＮＰＶゲノムよりも、少なくとも５，６２５塩基対短い。１つの特定のＣＤＳの欠失に起因するそれぞれの短縮は、“ｂｐ”と示されるカラムから導かれ得る。これらのＣＤＳは、ＡｃＭＮＰＶの天然のゲノムのおよそ４．２％に相当する。
【００７８】
これらのタンパク質をコードするＣＤＳの全長は、ＢｍＮＰＶにおいて、およそ３，１７３塩基対である。従って、天然のＢｍＮＰＶゲノムは、好ましくは、これらのタンパク質をコードする全てのＣＤＳの１つまたはそれ以上の欠失により短縮されていてよい。全てのこれらのＣＤＳがＢｍＮＰＶゲノムから欠失されているとき、本発明のゲノムは、好ましくは、天然のＢｍＮＰＶゲノムよりも、少なくとも３，１７３塩基対短い。１つの特定のＣＤＳの欠失に起因するそれぞれの短縮は、“ｂｐ”と示されるカラムから導かれ得る。これらのＣＤＳは、ＢｍＮＰＶの天然のゲノムのおよそ２．４７％に相当する。
【００７９】
従って、好ましい態様において、本発明のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群  ゲノムは、（ｉ）タイプＩＩＩの欠失、（ｉｉ）タイプＩおよびタイプＩＩＩの欠失、（ｉｉｉ）タイプＩＩおよびタイプＩＩＩの欠失、または（ｉｖ）タイプＩ、ＩＩおよびＩＩＩの欠失を含む。
【００８０】
本発明のＡｃＭＮＰＶゲノムは、好ましくは、天然ＡｃＭＮＰＶゲノムよりも少なくとも２５．６６％短く（タイプＩ  ＣＤＳのみが欠失されており、タイプＩＩ  ＣＤＳ、５’−ＵＴＲおよびスペーサーは保持されている）、より好ましくは、２７．２４％短く（タイプＩ  ＣＤＳおよび５’−ＵＴＲが欠失されており、タイプＩＩ  ＣＤＳ、５’−ＵＴＲおよびスペーサーは保持されている）、より好ましくは、３４．１４％短い（タイプＩおよびＩＩ  ＣＤＳ、５’−ＵＴＲならびにスペーサーが欠失されている）。
【００８１】
本発明のＢｍＮＰＶゲノムは、好ましくは、天然のＢｍＮＰＶゲノムよりも少なくとも１８．３％短く（タイプＩ  ＣＤＳのみが欠失されており、タイプＩＩ  ＣＤＳ、５’−ＵＴＲおよびスペーサーは保持されている）、より好ましくは、１９．５５％短く（タイプＩ  ＣＤＳおよび５’−ＵＴＲが欠失されており、タイプＩＩ  ＣＤＳ、５’−ＵＴＲおよびスペーサーは保持されている）、より好ましくは、２４．２０％短い（タイプＩおよびＩＩ  ＣＤＳ、５’−ＵＴＲならびにスペーサーが欠失されている）。
【００８２】
これらのＣＤＳの５’−ＵＴＲもまた欠失されることがより好ましい。ＡｃＭＮＰＶにおいて、これらのＣＤＳの５’−ＵＴＲは、３５１塩基対の長さを有する。ＢｍＮＰＶにおいて、これらのＣＤＳの５’−ＵＴＲは、７塩基対の長さを有する。以下の表８ａおよび８ｂは、本発明の好ましいゲノムにおいて欠失されたＣＤＳの５’ＵＴＲの位置を示す。５’−ＵＴＲは、塩基対の示された数字によりそれぞれ示されるＣＤＳ開始コドンに先行する。
【００８３】
【表１７】
2016509484.tif 000018
【表１８】
2016509484.tif 000019
【００８４】
ＡｃＭＮＰＶのゲノムからのこれらの５’−ＵＴＲの１つまたはそれ以上の欠失は、天然ゲノムと比較して、ゲノムサイズの０．２６％までのさらなる低減をもたらす。
【００８５】
ＢｍＮＰＶのゲノムからのこれらの５’−ＵＴＲの１つまたはそれ以上の欠失は、天然ゲノムと比較して、ゲノムサイズの０．０１％までのさらなる低減をもたらす。あるいは、またはさらに、ＡｃＭＮＰＶにおいて、ＣＤＳのスペーサーが欠失されてよく、それは、２，１８３ｂｐのさらなる欠失を意味する。ＢｍＮＰＶにおいて、これらのＣＤＳのスペーサーは、３０２１塩基対の長さを有する。ＡｃＭＮＰＶのヌクレオチド配列を参照して、欠失されていてよいスペーサーは、以下の通りである。
【００８６】
【表１９】
2016509484.tif 000020
【表２０】
2016509484.tif 000021
【００８７】
ＡｃＭＮＰＶウイルスのゲノムからのこれらのスペーサーの欠失は、天然ゲノムと比較して、ゲノムのサイズの１．６３％のさらなる低減をもたらす。従って、さらにより好ましい態様において、ＡｃＭＮＰＶウイルスのゲノムサイズは、さらに１．６３％まで低減されている。
【００８８】
ＢｍＮＰＶウイルスのゲノムからのこれらのスペーサーの欠失は、天然ゲノムと比較して、ゲノムのサイズの２．３５％のさらなる低減をもたらす。従って、さらにより好ましい態様において、ＢｍＮＰＶウイルスのゲノムサイズは、さらに２．３５％まで低減されている。
【００８９】
本発明者らは、表１０ａおよび１０ｂに示されるＣＤＳが、それぞれのＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ウイルスに悪影響を与えることなく欠失され得ることを見出した（全てのＣＤＳおよびタンパク質は、ＡｃＭＮＰＶを基準にしている）。これらのＣＤＳは、タイプＩＶと称されるグループに属すると考えられている。従って、これらのＣＤＳ（および、好ましくはまた、それぞれの５’−ＵＴＲ、スペーサーおよび／またはｈｒ領域）の欠失は、タイプＩＶの欠失と称される。
【００９０】
【表２１】
2016509484.tif 000022
【表２２】
2016509484.tif 000023
【００９１】
これらのタンパク質をコードするＣＤＳの全長は、ＡｃＭＮＰＶにおいて、およそ３，０２７塩基対であり、ＢｍＮＰＶにおいて、およそ１，２３０塩基対である。従って、天然のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群  ゲノムは、好ましくは、これらのタンパク質をコードする全てのＣＤＳの１つまたはそれ以上の欠失により短縮されていてよい。
【００９２】
全てのこれらのＣＤＳがＡｃＭＮＰＶゲノムから欠失されているとき、本発明のゲノムは、好ましくは、天然のＡｃＭＮＰＶゲノムよりも、少なくとも３，０２７塩基対短い。１つの特定のＣＤＳの欠失に起因するそれぞれの短縮は、“ｂｐ”と示されるカラムから導かれ得る。これらのＣＤＳは、ＡｃＭＮＰＶの天然のゲノムのおよそ２．２６％に相当する。
【００９３】
全てのこれらのＣＤＳがＢｍＮＰＶゲノムから欠失されているとき、本発明のゲノムは、好ましくは、天然のＢｍＮＰＶゲノムよりも、少なくとも８２３塩基対短い。１つの特定のＣＤＳの欠失に起因するそれぞれの短縮は、“ｂｐ”と示されるカラムから導かれ得る。これらのＣＤＳは、ＢｍＭＮＰＶの天然のゲノムのおよそ０．６４％に相当する。
【００９４】
これらのＣＤＳの５’−ＵＴＲの１つまたはそれ以上もまた欠失されることがより好ましい。ＡｃＭＮＰＶにおいて、これらのＣＤＳの５’−ＵＴＲは、４４６塩基対の長さを有する。ＢｍＮＰＶにおいて、これらのＣＤＳの５’−ＵＴＲは、２６３塩基対の長さを有する。以下の表１１ａおよび１１ｂは、本発明の好ましいＡｃＭＮＰＶおよびＢｍＮＰＶゲノムにおいて欠失されたＣＤＳの５’ＵＴＲの位置を示す。５’−ＵＴＲは、塩基対の示された数字によりそれぞれ示されるＣＤＳ開始コドンに先行する。
【００９５】
【表２３】
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【表２４】
2016509484.tif 000025
【００９６】
ＡｃＭＮＰＶウイルスのゲノムからのこれらの５’−ＵＴＲの欠失は、天然ゲノムと比較して、ゲノムサイズの０．２５％までのさらなる低減をもたらす。
【００９７】
ＢｍＮＰＶウイルスのゲノムからのこれらの５’−ＵＴＲの欠失は、天然ゲノムと比較して、ゲノムサイズの０．２０％までのさらなる低減をもたらす。
【００９８】
あるいは、またはさらに、ＡｃＭＮＰＶにおいて、ＣＤＳのスペーサーが欠失されてよく、それは、１，８４７ｂｐのさらなる欠失を意味する。ＢｍＮＰＶにおいて、これらのＣＤＳのスペーサーは、２，７６０塩基対の長さを有する。ＡｃＭＮＰＶのヌクレオチド配列を参照して、欠失されていてよいスペーサーは、以下の通りである。
【００９９】
【表２５】
2016509484.tif 000026
【表２６】
2016509484.tif 000027
【０１００】
ＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ウイルスのゲノムからのこれらのスペーサーの欠失は、天然ゲノムと比較して、ゲノムのサイズのさらなる低減をもたらす。従って、さらにより好ましい態様において、本発明のＡｃＭＮＰＶウイルスのゲノムサイズは、さらに１．３８％まで低減されている。さらに好ましい態様において、ＢｍＮＰＶウイルスのゲノムサイズは、２．１５％低減されている。
【０１０１】
好ましい態様において、本発明のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ゲノム、好ましくはＡｃＭＮＰＶまたはＢｍＮＰＶゲノムは、（ｉ）タイプＩ、（ｉｉ）タイプＩおよびタイプＩＩ、（ｉｉｉ）タイプＩおよびタイプＩＩＩ、（ｉｖ）タイプＩおよびタイプＩＶ、（ｖ）タイプＩＩおよびタイプＩＩＩ、（ｖｉ）タイプＩＩおよびタイプＩＶ、（ｖｉｉ）タイプＩＩＩおよびタイプＩＶ、（ｖｉｉｉ）タイプＩ、タイプＩＩおよびタイプＩＩＩ、（ｉｘ）タイプＩ、タイプＩＩおよびタイプＩＶ、（ｘ）タイプＩ、タイプＩＩＩおよびタイプＩＶ、（ｘｉ）タイプＩＩ、タイプＩＩＩおよびタイプＩＶ、または（ｘｉｉ）タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩおよびタイプＩＶの遺伝子の全ての５’−ＵＴＲおよび／または３’−ＵＴＲをさらに欠失する。
【０１０２】
好ましい態様において、本発明のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群  ゲノム、好ましくはＡｃＭＮＰＶまたはＢｍＮＰＶゲノムは、（ｉ）タイプＩ、（ｉｉ）タイプＩおよびタイプＩＩ、（ｉｉｉ）タイプＩおよびタイプＩＩＩ、（ｉｖ）タイプＩおよびタイプＩＶ、（ｖ）タイプＩＩおよびタイプＩＩＩ、（ｖｉ）タイプＩＩおよびタイプＩＶ、（ｖｉｉ）タイプＩＩＩおよびタイプＩＶ、（ｖｉｉｉ）タイプＩ、タイプＩＩおよびタイプＩＩＩ、（ｉｘ）タイプＩ、タイプＩＩおよびタイプＩＶ、（ｘ）タイプＩ、タイプＩＩＩおよびタイプＩＶ、（ｘｉ）タイプＩＩ、タイプＩＩＩおよびタイプＩＶ、または（ｘｉｉ）タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩおよびタイプＩＶの遺伝子のスペーサー５’および／または３’をさらに欠く。
【０１０３】
好ましい態様において、本発明のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ゲノム、好ましくは、ＡｃＭＮＰＶまたはＢｍＮＰＶゲノムは、１つまたはそれ以上の異種反復（ＨＲ）配列をさらに欠く。
【０１０４】
好ましいＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ゲノム、好ましくは、ＡｃＭＮＰＶまたはＢｍＮＰＶゲノムは、以下の異種反復配列を欠く。
（ｉ）ＡｃＭＮＰＶについて、配列番号１のゲノム配列のヌクレオチド１〜４４５、７，７４７〜７，８６４、２６，２９３〜２６，９６１、４８，６７９〜４８，７０８、７０，４６８〜７１，１３３、９３，４５６〜９３，６０５、９７，３９６〜９７，８８１、１０２，６０６〜１０２，６３５、１１７，４７９〜１１７，９８７および１３３，８８３〜１３３，８９４にまたがる領域に対応する異種反復配列の、１つまたはそれ以上、好ましくは全て、
（ｉｉ）ＰｌｘｙＮＰＶについて、配列番号２のゲノム配列のヌクレオチド１〜４４１、７，７２５〜７，８４２、２７，３９１〜２８，２５５、４９，９５２〜４９，９８１、５０，４３９〜５１，２５５、７２，５８０〜７３，０４６、９４，０６１〜９４，２１０、９８，０１６〜９８，４０９、１０３，１３４〜１０３，１６３、１１７，９４３〜１１８，４５６、および１３４，４０６〜１３３，４１７にまたがる領域に対応する異種反復配列の、１つまたはそれ以上、好ましくは全て、
（ｉｉｉ）ＲｏＭＮＰＶについて、配列番号３のゲノム配列のヌクレオチド１〜３２６、６，４５４〜６，４９１、２４，８０５〜２５，１４１、４６，８２６〜４６，８５５、６８，６２８〜６９，２７９、９１，５９４〜９１，６２３、９５，３９４〜９５，７５０、１００，４７０〜１００，４９９、１１５，３２１〜１１５，７１４、および１３１，５１５〜１３１，５２６にまたがる領域に対応する異種反復配列の、１つまたはそれ以上、好ましくは全て、
（ｉｖ）ＢｍＮＰＶについて、配列番号４のゲノム配列のヌクレオチド２２，４９７〜２３，２００、２４，０１２〜２４，２７８、２９，４８５〜２９５６６、４３８２１〜４３８５７、６４８０２〜６５３５０、６５４９９〜６５５７３、８６４３１〜８６６４８、８９５５２〜９０１４２、９４４２６〜９４４８３、１０６９４７〜１０７５６１およいｂ１２３７０６〜１２４２９７にまたがる領域に対応する異種反復配列の、１つまたはそれ以上、好ましくは全て、
（ｖ）ＭａｖｉＭＮＰＶについて、配列番号５のゲノム配列のヌクレオチド２０４３６〜２１１６２、５６２６４〜５７３１３、７７１４８〜７７８７８、９２８７７〜９３６５２、および１０９２７２〜１１００７１にまたがる領域に対応する異種反復配列の、１つまたはそれ以上、好ましくは全て、
【０１０５】
（ｖｉ）ＣｆＤｅｆＭＮＰＶについて、配列番号６のゲノム配列のヌクレオチド６４５０−６７２３、１５７１４−１６０１３、２２１６４〜２２９５９、３７０２０〜３７１７５、６５９３０〜６５９５９、７６８８６〜７７０７２、８６４７９〜８６７２０、９６６９８〜９６９３６、１００５６６〜１００７１６および１０５４５６〜１０５４８５にまたがる領域に対応する異種反復配列の、１つまたはそれ以上、好ましくは全て、
（ｖｉｉ）ＡｇＭＮＰＶについて、配列番号７のゲノム配列のヌクレオチド１９６４８〜１９６８５、５２００９〜５２０６４、１２６４０２〜１２６４４７、１２６５６８〜１２７００８および１２８７５４〜１２８９６０にまたがる領域に対応する異種反復配列の、１つまたはそれ以上、好ましくは全て、
（ｖｉｉｉ）ＥｐｐｏＮＰＶについて、配列番号８のゲノム配列のヌクレオチド３９９２〜４０９４、１８９５６〜１９１２１、８８４３８〜８８９５０、９５４１５〜９５７１５、および１０３２７５〜１０３７２２にまたがる領域に対応する異種反復配列の、１つまたはそれ以上、好ましくは全て、
（ｉｘ）ＡｎｐｅＮＰＶについて、配列番号９のゲノム配列のヌクレオチド１８６３６〜１９２４１、４１０４０〜４１１３４、４８３７８〜４８５２１、６５７６８〜６５８６２、６５８９４〜６６０１９、７５１２８〜７５２２０、７８７７８〜７９０４８、９２６４９〜９２６５５、１１０５５２〜１１０９０５、１１７５４８〜１１７６３１、１２０７７８〜１２０８３８、１２２２２０〜１２２２５９および１２５４９２〜１２５５０６にまたがる領域に対応する異種反復配列の、１つまたはそれ以上、好ましくは全て、
（ｘ）ＣｆＭＮＰＶについて、配列番号１０のゲノム配列のヌクレオチド６４６０〜６７２３、１５７１４〜１６０１３、２２１６４〜２２９５９、３７０２０〜３７１７５、６５９３０〜６５９５９、７６８８６〜７７０７２、８６４７９〜８６７２０、９６６９８〜９６９３６、１００５６６〜１００７１６、１０５４５６〜１０５４８５、１１３４２４〜１１３７７９、１２５４４８〜１２５４７７および１２６９８５〜１２７１４６にまたがる領域に対応する異種反復配列の、１つまたはそれ以上、好ましくは全て、
（ｘｉ）ＯｐＭＮＰＶについて、配列番号１１のゲノム配列のヌクレオチド１０３５２８〜１０３８３３、１２７４５９〜１３０２７０および１４１５８７〜１４２１８５にまたがる領域に対応する異種反復配列の、１つまたはそれ以上、好ましくは全て、ならびに
（ｘｉｉ）ＨｙｃｕＮＰＶについて、配列番号１２のゲノム配列のヌクレオチド４７１０〜５６０２、１８６４２〜１９８１０、２７４６５〜２８９１８、３５６４５〜３６３７９、６６０９５〜６６７７８、および１１２８６９〜１１３６０１にまたがる領域に対応する異種反復配列の、１つまたはそれ以上、好ましくは全て。
【０１０６】
天然のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群 ゲノムと比較して達成され得る、本発明のゲノムのゲノムサイズの相対的な低減は、表１３ａおよび１３ｂに百分率で示され、すなわち、以下の表は、本発明のゲノムについて達成されるサイズの好適な低減を示す。絶対的な低減は、ＡｃＭＮＰＶについて上記に例示されるそれぞれの要素の長さに基づいて、本発明のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群 ゲノムのそれぞれについて計算され得る。
【０１０７】
【表２７】
2016509484.tif 000028
【表２８】
2016509484.tif 000029
【０１０８】
【表２９】
2016509484.tif 000030
【表３０】
2016509484.tif 000031
【０１０９】
表１３ａおよび１３ｂにおいて上記されるそれぞれの場合において、ｈｒ領域の１つまたはそれ以上、好ましくはまた、全てが欠失される。ＡｃＭＮＰＶについて、これは、３，１１５塩基対まで（４８，６７９〜４８，７０８の位置でのＣＤＳとの重複を含む）または３，０８５塩基対まで（ＣＤＳとの重複を除く）のサイズのさらなる低減をもたらし、それは、それぞれ２．３３％および２．３０％までのサイズ低減に等しい。ＢｍＮＰＶについて、ｈｒ領域の１つまたはそれ以上、好ましくは全ての欠失によるサイズ低減は、３，７６６塩基対までの低減をもたらし、それは、２．９３％までの相対的なサイズ低減に相当する。
【０１１０】
本発明者らはまた、ＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ゲノムの特定の遺伝子が、該ウイルスの生活機能を維持するために重要であることを発見した。これらの遺伝子は、種々の面、例えば、転写、複製、アセンブリ、パッケージング、および該ウイルスの感染に関与する。これらの遺伝子は、本発明のゲノム内に無傷のまま残っていることが好ましい。
【０１１１】
従って、好ましい態様において、本発明のＡｃＭＮＰＶゲノムは、ヘリカーゼ、３８Ｋ、ｌｅｆ−５、４９Ｋおよびｏｄｖ−ｅ１８  ＋２８をコードする遺伝子の少なくとも１個を含む。好ましくは、本発明のゲノムは、これらの遺伝子の全てを含む。これらの遺伝子は、ＡｃＭＮＰＶのゲノムを参照して表１４ａに示されており、カテゴリーＩの重要な遺伝子として指定されている。
【０１１２】
【表３１】
2016509484.tif 000032
【０１１３】
従って、好ましい態様において、本発明のＢｍＮＰＶゲノムは、ヘリカーゼ、３８Ｋ、ｌｅｆ−５、４９Ｋおよびｏｄｖ−ｅ１８  ＋２８をコードする遺伝子の少なくとも１個を含む。好ましくは、本発明のゲノムは、これらの遺伝子の全てを含む。これらの遺伝子は、ＢｍＮＰＶのゲノムを参照して表１４ｂに示されており、カテゴリーＩの重要な遺伝子として指定されている。
【０１１４】
【表３２】
2016509484.tif 000033
【０１１５】
ヘリカーゼは、複製のために必要とされ、ｌｅｆ５は、転写のために必要とされ、そして３８Ｋ、４９Ｋおよびｏｄｖ−ｅ１８は、ウイルスの構造、パッケージングおよびアセンブリのために必要とされる。
【０１１６】
本発明者らは、ウイルスの機能のために重要であるさらなる遺伝子を同定した。従って、好ましい態様において、本発明のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群のゲノムは、ｌｅｆ−２、ｌｅｆ−１、ｐ４７、ｌｅｆ−８  ｖｐ１０５４、ｌｅｆ−９、ｄｎａｐｏｌ、ａｃ６６、ｖｌｆ−１、ｇｐ４１、ａｃ８１、ｐ９５、ｃａｐｓｉｄ、ｌｅｆ−４、ｐ３３、ｐ１８、ｏｄｖ−ｅ２５、ｐ６．９、ｏｄｖ−ｅｃ４３、ａｌｋ−ｅｘｏ、およびｏｄｖ−ｅｃ２７をコードする遺伝子の少なくとも１個を含む。好ましくは、本発明のゲノムは、これらの遺伝子の全てを含む。これらの遺伝子は、ＡｃＭＮＰＶのゲノムを参照して、表１５ａに示されており、カテゴリーＩＩの重要な遺伝子として指定されている。
【０１１７】
【表３３】
2016509484.tif 000034
【０１１８】
従って、好ましい態様において、本発明のＢｍＮＰＶゲノムは、ｌｅｆ−１、ｐｉｆ−２、ｐ４７、ｌｅｆ−８、ｖｐ１０５４、ｌｅｆ−９、ｄｎａｐｏｌ、ｂｍ５６  ａｃ６８、ｖｌｆ−１、ｇｐ４１、ｂｍ６７ ａｃ８１、ｐ９５、カプシド、ｌｅｆ−４、ｐ３３、ｐ６．９、ｏｄｖ−ｅｃ４３、ｐｉｆ−３、ｐｉｆ−１、ａｌｋ−ｅｘｏ、ｐ７４、ｏｄｖ−ｅｃ２７、ｏｄｖ−ｅ５６、およびｌｅｆ−２をコードする遺伝子の少なくとも１個を含む。好ましくは、本発明のゲノムは、これらの遺伝子の全てを含む。これらの遺伝子は、ＢｍＮＰＶのゲノムを参照して、表１５ｂに示されており、カテゴリーＩＩの重要な遺伝子として指定されている。
【０１１９】
【表３４】
2016509484.tif 000035
【０１２０】
Ｌｅｆ−２、ｌｅｆ−１およびｄｎａｌは、ＤＮＡ複製に必要とされ、ｐ４７、ｌｅｆ−８、ｌｅｆ−９およびｌｅｆ−４は、転写に必要とされ、ｖｐ１０５４、ｖｌｆ−１、ｇｐ４１、ｐ９５、カプシド、ｐ３３、ｐ６．９、ｏｄｖ−ｅｃ４３およびａｌｋ−ｅｘｏは、ウイルスのパッケージングおよびアセンブリに必要とされ、ａｃ６６、ａｃ８１、およびｏｄｖ−ｅｃ２７は、宿主相互作用に必要とされ、そしてｏｄｖ−ｅ２５は、ウイルス構造（ＯＤＶエンベロープ）に必要とされる。
【０１２１】
本発明者らは、ウイルス機能に重要なさらなる遺伝子を同定した。従って、好ましい態様において、本発明のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ゲノムは、ｐｋ−１、３８．７Ｋ、ｄｂｐ、ｌｅｆ−６、ａｃ２９、３９Ｋ、ｌｅｆ−１１、ａｃ３８、ａｃ５３、ｆｐ、ｌｅｆ−３、ａｃ７５、ａｃ７６、ａｃ７８ ｔｌｐ２０、ｐ４０、ｐ１２、ｐ４８、ａｃ１０６／１０７ Ｎｔ、ａｃ１０６／１０７ Ｃｔ、ａｃ１１０、ｍｅ５３およびｉｅ−１をコードする遺伝子の少なくとも１個を含む。好ましくは、本発明のゲノムは、これらの遺伝子の全てを含む。これらの遺伝子は、ＡｃＭＮＰＶのゲノムを参照して、表１６ａに示されており、カテゴリーＩＩＩの重要な遺伝子として指定されている。
【０１２２】
【表３５】
2016509484.tif 000036
【０１２３】
従って、好ましい態様において、本発明のＮＰＶ α バキュロウイルス Ｉａ群ゲノムは、ポリヘドリン、ｐｋ−１、３８．７Ｋ ａｃ１３、ｅｎｖ−ｐｒｏｔ、ｄｂｐ、ｌｅｆ−６、ｂｍ２０ ａｃ２９、ｖ−ｕｂｉ、３９ｋ、ｌｅｆ−１１、ｂｍ２９ ａｃ３８、ｂｍ４２ ａｃ５３、ｆｐ、ｂｍ５４ ａｃ６６、ｌｅｆ−３、ｂｍ６１ ａｃ７５、ｂｍ６２ ａｃ７６、ｂｍ６４ ａｃ７８、ｔｌｐ２０、ｐ１８、ｏｄｖ−ｅ２５、ｐ４０、ｐ１２、ｐ４５ Ａｃ ｐ４８、ｂｍ９０ ａｃ１０６／１０７、ｂｍ９２ａ ａｃ１１０、ｍｅ５３、ｂｍ１２１ ａｃ１４５、ｂｍ１２２ ａｃ１４６およびｉｅ−１をコードする遺伝子の少なくとも１個を含む。好ましくは、本発明のゲノムは、これらの遺伝子の全てを含む。これらの遺伝子は、ＢｍＮＰＶのゲノムを参照して、表１６ｂに示されており、カテゴリーＩＩＩの重要な遺伝子として指定されている。
【０１２４】
【表３６】
2016509484.tif 000037
【０１２５】
Ｄｂｐ、ｌｅｆ−１１、ａｃ３８、ｌｅｆ−３、ｍｅ５３およびｉｅ−１は、複製に必要とされ、３８．７Ｋ、ｌｅｆ−６および３９Ｋは、転写に必要とされ、ｆｐ、ａｃ７５、ｐ４０は、ウイルス構造に必要とされ、ｐｋ−１、ａｃ５３およびｐ１２は、宿主相互作用に必要とされ、そしてａｃ２９ ａｃ７６、ａｃ７８、ｔｌｐ２０、ｐ４８、ａｃ１０６／１０７ Ｎｔ、ａｃ１０６／１０７ Ｃｔ、およびａｃ１１０は、機能が未知である。
【０１２６】
本発明者らは、ウイルス機能に重要なさらなる遺伝子を同定した。従って、好ましい態様において、本発明のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ゲノムは、ａｃ１２、ａｃ３４、ａｃ５５、およびａｃ１０８をコードする遺伝子の少なくとも１個を含む。好ましくは、本発明のゲノムは、これらの遺伝子の全てを含む。これらの遺伝子は、ＡｃＭＮＰＶのゲノムを参照して、表１７ａに示されており、カテゴリーＩＶの重要な遺伝子として指定されている。
【０１２７】
【表３７】
2016509484.tif 000038
【０１２８】
従って、好ましい態様において、本発明のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ゲノムは、ｅｇｔ、ｂｍ２５ ａｃ３４、ｌｅｆ−１０、ｂｍ４４ ａｃ５５、ｃｈａＢ、ｂｍ４８ ａｃ６０、ｖｐ８０、ｂｍ９１ ａｃ１０８、ｐ２４、ｐｐ３４およびｉｅ−０をコードする遺伝子の少なくとも１個を含む。好ましくは、本発明のゲノムは、これらの遺伝子の全てを含む。これらの遺伝子は、ＢｍＮＰＶのゲノムを参照して、表１７ｂに示されており、カテゴリーＩＶの重要な遺伝子として指定されている。
【０１２９】
【表３８】
2016509484.tif 000039
【０１３０】
これらの遺伝子は、機能未知である。
本発明者らは、ウイルス機能に重要なさらなる遺伝子を同定した。従って、好ましい態様において、本発明のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ゲノムは、ａｃ４、ａｃ５、ｏｒｆ１６２９、ａｃ１７ ＋４５、ａｃ１９、ａｒｉｆ−１ Ｃｔ、ａｒｉｆ−１ Ｎｔ、ｐｋｉｐ、ａｃ２６、ｌｅｆ−１２、ａｃ４３、ａｃ４８、ｂｊｄｐ、ａｃ７２、ａｃ７３、ａｃ７４、ａｃ７９、ａｃ１１１、ａｃ１１４、ａｃ１２０、ａｃ１２４、ｌｅｆ−７、ｇｐ６７、ｇｐ１６、ａｃ１３２、ｉｅ−２、ｐｅ３８をコードする遺伝子の少なくとも１個を含む。好ましくは、本発明のゲノムは、これらの遺伝子の全てを含む。これらの遺伝子は、ＡｃＭＮＰＶのゲノムを参照して、表１８ａに示されており、カテゴリーＶの重要な遺伝子として指定されている。
【０１３１】
【表３９】
2016509484.tif 000040
【０１３２】
本発明者らは、ウイルス機能に重要なさらなる遺伝子を同定した。従って、好ましい態様において、本発明のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ゲノムは、遺伝子の少なくとも１個を含み、好ましくは、本発明のゲノムは、これらの遺伝子、ｏｒｆ１６２９、ｂｍ４ ａｃ１１、ｂｖ／ｏｄｖ−ｅ２６、ｂｍ９ ａｃ１７、ｂｍ１０ ａｃ１８、ｂｍ１１ ａｃ１９、ａｒｉｆ−１、ｐｋｉｐ、ｂｍ１７ ａｃ２６、ｉａｐ−１、ｂｍ２１ ａｃ３０、ｌｅｆ−１２、ｂｍ３４ ａｃ４３、ｂｊｄｐ、ｇｐ３７、ｉａｐ−２、ｂｍ５８ａ ａｃ７２、ｂｍ５９ ａｃ７３、ｂｍ６０ ａｃ７４、ｂｍ６５ ａｃ７９、ｂｍ９３ ａｃ１１１、ｂｍ９４ ａｃ１１４、ｂｍ９６、ｂｍ９８ ａｃ１２０、ｂｍ１０１ ａｃ１２４、ｌｅｆ−７、ｇｐ６４／６７、ｇｐ１６、ｂｍ１０９ ａｃ１３２、ｐ２６、ｐ１０、ｉｅ−２、ｐｅ３８、ｐｔｐ、ｂｍ１３３ ａｃ４およびｂｍ１３４ ａｃ５の全てを含む。これらの遺伝子は、ＢｍＮＰＶのゲノムを参照して、表１８ｂに示されており、カテゴリーＶの重要な遺伝子として指定されている。
【０１３３】
【表４０】
2016509484.tif 000041
【０１３４】
Ａｃ７９およびｌｅｆ−７は、複製に必要とされ、ｌｅｆ−１２およびｂｊｄｐは、転写に必要とされ、ｏｒｆ１６２９は、ウイルス構造に必要とされ、ａｃ４、ａｒｉｆ−１  Ｃｔ／Ｎｔ、ｐｋｉｐ、ｇｐ６７、ｉｅ−２およびｐｅ３８は、宿主相互作用に必要とされ、そしてａｃ５、ａｃ１７ ＋４５、ａｃ１９、ａｃ２６、ａｃ４３、ａｃ４８、ａｃ７２、ａｃ７３、ａｃ７４、ａｃ１１１、ａｃ１１４、ａｃ１２０、ａｃ１２４、ｇｐ１６、およびａｃ１３２は、機能未知である。
【０１３５】
本発明者らは、ウイルス機能に重要なさらなる遺伝子を同定した。従って、好ましい態様において、本発明のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ゲノムは、ａｃ４５、ａｃ４７、ａｃ５２ ＋７１、ｈｅ６５、３５Ｋおよびａｃ１５４をコードする遺伝子の少なくとも１個を含む。好ましくは、本発明のゲノムは、これらの遺伝子の全てを含む。これらの遺伝子は、ＡｃＭＮＰＶのゲノムを参照して、表１９ａに示されており、カテゴリーＶＩの重要な遺伝子として指定されている。
【０１３６】
【表４１】
2016509484.tif 000042
【０１３７】
これらの遺伝子は、ＢｍＮＰＶのゲノムを参照して、表１９ｂに示されており、カテゴリーＶＩの重要な遺伝子として指定されている。
【０１３８】
【表４２】
2016509484.tif 000043
【表４３】
2016509484.tif 000044
【０１３９】
ａｃ５２ ＋７１およびｈｅ６５は、複製に必要とされることが明らかであり、３５Ｋは、宿主相互作用に必要とされることが明らかであり、そしてａｃ４５、ａｃ４７、およびｈｅ６５は、機能が未知である。
【０１４０】
本発明のゲノムは、以下の遺伝子の１つまたは全て、好ましくは全てを含むことが好ましい。（ｉ）カテゴリーＩの重要な遺伝子；（ｉｉ）カテゴリーＩＩの重要な遺伝子；（ｉｉｉ）カテゴリーＩＩＩの重要な遺伝子；（ｉｖ）カテゴリーＩＶの重要な遺伝子；（ｖ）カテゴリーＶの重要な遺伝子；（ｖｉ）カテゴリーＶＩの重要な遺伝子；（ｖｉｉ）カテゴリーＩおよびＩＩの重要な遺伝子；（ｖｉｉｉ）カテゴリーＩおよびＩＩＩの重要な遺伝子；（ｉｘ）カテゴリーＩおよびＩＶの重要な遺伝子；（ｘ）カテゴリーＩおよびＶの重要な遺伝子；（ｘｉ）カテゴリーＩおよびＶＩの重要な遺伝子；（ｘｉｉ）カテゴリーＩ、ＩＩおよびＩＩＩの重要な遺伝子；（ｘｉｉｉ）カテゴリーＩ、ＩＩおよびＩＶの重要な遺伝子；（ｘｉｖ）カテゴリーＩ、ＩＩおよびＶの重要な遺伝子；（ｘｖ）カテゴリーＩ、ＩＩおよびＶＩの重要な遺伝子；（ｘｖｉ）カテゴリーＩ、ＩＩＩおよびＩＶの重要な遺伝子；（ｘｖｉｉ）カテゴリーＩ、ＩＩＩおよびＶの重要な遺伝子；（ｘｖｉｉｉ）カテゴリーＩ、ＩＩＩおよびＶＩの重要な遺伝子；（ｘｉｘ）カテゴリーＩ、ＩＶおよびＶの重要な遺伝子；（ｘｘ）カテゴリーＩ、ＩＶおよびＶＩの重要な遺伝子；（ｘｘｉ）カテゴリーＩ、ＶおよびＶＩの重要な遺伝子；（ｘｘｉｉ）カテゴリーＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの重要な遺伝子；（ｘｘｉｉｉ）カテゴリーＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶの重要な遺伝子；（ｘｘｉｖ）カテゴリーＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶＩの重要な遺伝子；（ｘｘｖ）カテゴリーＩ、ＩＩ、ＩＶおよびＶの重要な遺伝子；（ｘｘｖｉ）カテゴリーＩ、ＩＩ、ＩＶおよびＶＩの重要な遺伝子；（ｘｖｉｉ）カテゴリーＩ、ＩＩ、ＶおよびＶＩの重要な遺伝子；（ｘｘｉｘ）カテゴリーＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶの重要な遺伝子；（ｘｘｘ）カテゴリーＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶＩの重要な遺伝子；（ｘｘｘｉ）カテゴリーＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩの重要な遺伝子；（ｘｘｘｉｉ）カテゴリーＩ、ＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩの重要な遺伝子；（ｘｘｘｉｉ）カテゴリーＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＶおよびＶＩの重要な遺伝子；（ｘｘｘｉｉｉ）カテゴリーＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩの重要な遺伝子。
【０１４１】
上記の各場合において、ゲノムは、ＣＤＳならびにＣＤＳに隣接する何れかの５’−ＵＴＲおよび／または３’−ＵＴＲの両方を含むことが好ましい。
【０１４２】
本発明者らはまた、ｈｒ４−５セクションの以下のＣＤＳ（ｂｐ９９１８２−１２１０７２）：ｐ２６、ｐ１０、ｐ７４、ｐｉｆ−３、ａｃ１１６、ａｃ１１７、ａｃ１１８、ａｃ１２１、ａｃ１２２、ｐｋ−２、ｖ−ｃａｔｈ、ｐｐ３４および／または９４Ｋが、ＡｃＭＮＰＶに有害な作用を及ぼすことなく完全に欠失され得ることを見出した。また、ｈｒ４−５セクションの遺伝子ｐｉｆ−１およびｃｈｉＡのＣＤＳは、ＡｃＭＮＰＶに有害な作用を及ぼすことなく、部分的に欠失（短縮）され得る。これは、これらの遺伝子が、ウイルス感染および増殖に必須ではないが、隣接する遺伝子のプロモーター領域がそれらのＣＤＳと重複しているために、ｐｉｆ−１およびｃｈｉＡの一部が残っているためである。ｐｉｆ−１について、欠失され得る部分は、ＡｃＭＮＰＶゲノムのｂｐ１００６９９からｂｐ１０２１９９であり（ｐｉｆ−１自体は、ＡｃＭＮＰＶゲノムのｂｐ１００６９９からｂｐ１０２２９１である）、ｃｈｉＡについて、この部分は、ＡｃＭＮＰＶゲノムのｂｐ１０５５６０からｂｐ１０６９３７である（ｃｈｉＡ自体は、ＡｃＭＮＰＶゲノムのｂｐ１０５２８２からｂｐ１０６９３７である）。言い換えると、ゲノム中ｐｉｆ−１の残すべき部分は、ＡｃＭＮＰＶゲノムのｂｐ１０２２００からｂｐ１０２２９１であり、ゲノム中ｃｈｉＡの残すべき部分は、ＡｃＭＮＰＶゲノムのｂｐ１０５２８２からｂｐ１０５５５９である。従って、ｐｉｆ−１およびｃｈｉＡは、隣接する遺伝子のプロモーター領域が残るように部分的に欠失される。これは、ｐｉｆ−１および／またはｃｈｉＡに関係する、本明細書に記載の全ての態様に適用される。さらなる一般的態様において、本明細書で削除可能であると考えられる遺伝子は、必須であるとされている遺伝子のＣＤＳまたは５’／３’  ＵＴＲの配列の一部である部分が残っている限りにおいてのみ、削除され得る。
【０１４３】
従って、さらなる態様において、本発明の第一の面によるＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群  ゲノムは、ｐｉｆ−１、ｐ２６、ｐ１０、ｐ７４、ｐｉｆ−３、ａｃ１１６、ａｃ１１７、ａｃ１１８、ａｃ１２１、ａｃ１２２、ｐｋ−２、ｃｈｉＡ、ｖ−ｃａｔｈ、ｐｐ３４および９４Ｋからなる群のうち、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個または１４個の遺伝子、好ましくは全ての遺伝子を欠く（ここで、ｐｉｆ−１およびｃｈｉＡは、隣接する遺伝子のプロモーター領域が残るように部分的に欠失されている。）。隣接する遺伝子は、ｐｉｆ−１についてａｃ１２０であり、ｃｈｉＡについてｌｅｆ−７であり、ｐｉｆ−１およびｃｈｉＡとそれぞれ重複するこれらの遺伝子のプロモーター領域は、上記で定義される。好ましくは、該ゲノムはまた、これらの遺伝子の少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個または好ましくは全ての、（ｉ）５’−ＵＴＲおよび／または３’−ＵＴＲ（上記に定義の通り）および／または（ｉｉ）スペーサー  ５’および／または３’（上記に定義の通り）を欠く。
【０１４４】
本発明者らはまた、ｈｒ４−５セクションの以下のＣＤＳ（ｂｐ９９１８２−１２１０７２）：ａｃ１２０、ａｃ１２４、ｌｅｆ−７、ｇｐ６４／６７、ｐ２４、ｇｐ１６、ａｃ１３２、ａｌｋ−ｅｘｏ、および３５Ｋが、ＡｃＭＮＰＶの重要な機能を維持するのに重要であることを見出した。従って、さらなる態様において、本発明の第一面のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群  ゲノムは、ａｃ１２０、ａｃ１２４、ｌｅｆ−７、ｇｐ６４／６７、ｐ２４、ｇｐ１６、ａｃ１３２、ａｌｋ−ｅｘｏ、および３５Ｋからなる群の少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、好ましくは全ての遺伝子を含む。好ましくは、該ゲノムはまた、これらの遺伝子の少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または好ましくは全ての、（ｉ）５’−ＵＴＲおよび／または３’−ＵＴＲ（上記に定義の通り）および／または（ｉｉ）スペーサー  ５’および／または３’（上記に定義の通り）を含む。
【０１４５】
従って、好ましい態様において、本発明の第一面のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群  ゲノムは、（ａ）ｐｉｆ−１、ｐ２６、ｐ１０、ｐ７４、ｐｉｆ−３、ａｃ１１６、ａｃ１１７、ａｃ１１８、ａｃ１２１、ａｃ１２２、ｐｋ−２、ｃｈｉＡ、ｖ−ｃａｔｈ、ｐｐ３４および９４Ｋからなる群の少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個または１４個の遺伝子、好ましくは全ての遺伝子を欠き（ここで、ｐｉｆ−１およびｃｈｉＡは、隣接する遺伝子のプロモーター領域が残るように部分的にのみ欠失されている）、そして（ｂ）ａｃ１２０、ａｃ１２４、ｌｅｆ−７、ｇｐ６４／６７、ｐ２４、ｇｐ１６、ａｃ１３２、ａｌｋ−ｅｘｏ、および３５Ｋからなる群の少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、または好ましくは全ての遺伝子を含む。好ましくは、該ゲノムはまた、これらの遺伝子の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２３個、または好ましくは全ての（ｉ）５’−ＵＴＲおよび／または３’−ＵＴＲおよび／または（ｉｉ）スペーサー  ５’および／または３’を欠く／含む。
【０１４６】
第二の面において、本発明は、ＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ゲノムに対して異種のヌクレオチド配列をさらに含む、本発明の第一面のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ゲノムを提供する。本明細書中、用語“異種”は、それぞれのＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ゲノムのゲノム中に天然に生じないか、またはその位置に生じない、ヌクレオチド配列を意味する。従って、ゲノム内に再構成されているバキュロウイルスの天然のプロモーターもまた、異種であると考えられる。好ましくは、該用語は、バキュロウイルスに天然に含まれないヌクレオチド配列、より好ましくは、真核遺伝子またはｃＤＮＡを意味する。特に、好ましい遺伝子またはｃＤＮＡは哺乳動物のものであり、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒト起源のものである。異種ヌクレオチド配列が２以上の遺伝子を含むことは特に好ましい。大きいサイズの欠失のために、本発明のゲノムは、異種ヌクレオチド配列の大きなセクションを収容することができる。挿入物は、除去された天然配列と同程度の大きさであり得る。従って、表９は、本発明のゲノム中に存在し得る異種ヌクレオチド配列のサイズの指標として役立ち得る。異種ヌクレオチド配列に含まれる遺伝子の発現は、好ましくはＩＥ１またはポリヘドリンまたはｐ１０プロモーターにより実行される。
【０１４７】
ゲノム中に含まれてもよい他の好ましい異種ヌクレオチド配列は、Ｔｎ７部位、耐性遺伝子をコードするヌクレオチド配列、ホーミングエンドヌクレアーゼ部位、変異ｆｐ遺伝子、ｌｏｘＰ部位、ＩＥ１／ポリヘドリン／ｐ１０プロモーター、蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。好適な蛍光タンパク質には、緑色、赤色または黄色蛍光タンパク質またはｍＣｈｅｒｒｙが含まれる
。
【０１４８】
第三の面において、本発明は、本発明の第一または第二の面のゲノムを含む感染性ＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ウイルスを提供する。
【０１４９】
スミスらによって発表された改善された方法（Smith HO et al PNAS 2003）を〜１０Ｋｂ  ＤＮＡセグメントの正確なアセンブリに用いて、本発明者らは、ＤＮＡアセンブリのための分子生物学的技術を用いて、本発明者らの長鎖合成ポリヌクレオチドフラグメントから計算上特定された組み立てられた遺伝子セグメントをアセンブルする（組み立てる）ことを目的とする（Stemmer WPC et al., Gene 1995, Gibson et al., Nature Methods 2009）。その後、ＰＣＲ増幅を、純粋な完全長ゲノム（１５−Ｋｂ  ＤＮＡセグメント）を大量に得るために用い、最終的に、増幅された遺伝子セグメントを精製するためにゲル電気泳動を用い得る。目的の遺伝子セグメントを操作し、かつ増幅することにより、この合成ＤＮＡフラグメントを含む野生型配列は、元の“野生型”バキュロウイルスゲノム（それ自体が、既に古典的手段によって操作されている）において置換され得る。原則として、合成遺伝子セグメントは、大腸菌／酵母ベースの組換えおよびインビトロのライゲーションを用いてバキュロウイルス中に挿入され得る（Zhao Y. et al., Nucleic Acids Res 2003）。酵母における合成ゲノムアセンブリ方法について、ギブソンらにより発表された方法（Gibson DG et al., Science 2010）を、３段階のゲノムアセンブリを酵母における形質転換および相同組換えに用いた。第一段階として、１０ｋｂの合成遺伝子セグメントおよびベクターを、酵母／大腸菌中で組み換えて、大腸菌に移す。その後、組み立てられたセグメントを有するベクターを、陽性の選択のために単離する。第二および第三の段階で、複数の１０ｋｂフラグメントおよび野生型ゲノムフラグメントを、第二および第三段階でのアセンブリ中間体をより大量に製造するために、酵母／大腸菌中に形質転換する。ここで、半合成ゲノムアセンブリを生成させるために、酵母／大腸菌を、バキュロウイルス野生型遺伝子フラグメントおよび合成挿入物の重複末端を含むＰＣＲ増幅したベクターを用いて同時形質転換する。ハイブリッドゲノムが構築され、酵母から単離されると、マルチプレックスＰＣＲを用いてスクリーニングすることにより特徴付けられ得る。さらに比較するために、酵母／大腸菌およびバキュロウイルス（野生型）から抽出された天然のゲノムは、特性分析のために用いることができる。一旦特徴付けられると、半合成ゲノム移植法を用いることができ、ここで、酵母クローン由来の半合成ゲノムは、既に記載されたレシピエント細胞に移植され得る（Benders GA et al., Nucleic Acids Res. 2010）。さらに、合成遺伝子セグメントを含むハイブリッドウイルスの機能は、その自己複製特性に基づいて、また試験タンパク質および複合体を発現させることにより有効とされ得る。
【０１５０】
第四の面において、本発明は、本発明の第三の面のウイルスで感染させた細胞を提供する。好適な細胞の多くは、公共に利用可能である（例えば、Lynn, D.E. (2007) Methods in Molecular Biology. Vol 338, Chapter 6 Baculovirus and Insect Cell Expression Protocols, Editor: Murhammer D.W., Humanan Press Inc.を参照のこと）。好ましくは、細胞は、Ａｏ／Ｉ、Ｈｉ５、Ｓｆ９. Ｓｆ２１、Ａｏ３８、ショウジョウバエ  Ｓ２細胞、Ｔ．ｎｉ、ＦＴＲＳ−ＡｏＬ１／−ＡｏＬ２／−ＡｆＬ、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−ＡｉＯＶ−ＣＬＧ、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−ＡｉＴＳ−ＣＬＧ、ＨＣＲＬ−ＡＴＯ１０／ＡＴＯ２０、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−ＡｆＯＶ−ＣＬＧ、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−ＡｆＴＳ−ＣＬＧ、ＲＭＬ−２、ＮＩＳＥＳ−ＡｎＰｅ−４２６、ＮＩＳＥＳ−Ａｎｙａ−０６１１、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−ＡｇＥ−ＣＬＧ−１／２／３、ＵＦＬ−ＡＧ−２８６、ＦＴＲＳ−ＡｂＬ８１、ＳＥＳ−Ｂｍａ−Ｏ１Ａ／Ｒ、Ｂｍ−Ｎ／−５／−２１Ｅ−ＨＮＵ５、ＮＩＶ−ＢＭ−１２９６／−１９７、ＳＥＳ−Ｂｍ−１ ３０Ａ／３０Ｒ／ｅ ２１Ａ／ｅ  ２１Ｂ／ｅ  ２１Ｒ、ＳＥＳ−ＢｏＭｏ−１５Ａ／−Ｃ１２９／−ＪＩ２５、ＳＰＣ−Ｂｍ３６／−Ｂｍ４０、ＷＩＶ−ＢＳ−４８１／４８４、ＦＰＭＩ−ＣＦ−１／２／３、ＦＰＭＩ−ＣＦ−２０３、ＦＰＭＩ−ＣＦ−５０／６０／７０、ＩＰＲＩ−ＣＦ−１／１０／１２、ＩＰＲＩ−Ｃｆ１２４、ＩＰＲＩ−ＣＦ−１６／−１６Ｔ、ＩＰＲＩ−ＣＦ−５／−６／−８、ＣＰ−１２６８、ＣＰ−１６９、ＣｐＤＷ１−１５、ＩＺＤ−Ｃｐ  ４／１３、ＩＺＤ−ＣＰ１５０８／−ＣＰ２２０２／−ＣＰ２５０７／−ＣＰ０５０８、ＳＩＥ−ＥＯ−８０１／−８０３、ＩＰＬＢ−Ｅｋｘ４Ｔ／−Ｅｋｘ４Ｖ、ＥＡ１１７４Ａ、ＥＡ１１７４Ｈ、ＩＡＦＥｓ−１、ＢＣＩＲＬ−ＨＡ−ＡＭ１、ＣＳＩＲＯ−ＢＣＩＲＬ−ＨＡ１−３、ＣＳＩＲＯ−ＢＣＩＲＬ−ＨＰ１−５、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−ＨｚＥ−ＣＬＧ１−９、ＢＣＩＲＬ−ＨＺ−ＡＭ１−３、ＩＭＣ−ＨＺ−１、ＩＰＬＢ−ＨＺ−１０７４−５、ＩＰＬＢ−ＨＺ−１０７９、ＩＰＬＢ−ＨＺ−１１０、ＩＰＬＢ−ＨＺ−１２４Ｑ、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−ＨｖＥ−ＣＬＧ１−３、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−ＨｖＯＶ−ＣＬＧ、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−Ｈｖ−ＴＳ−ＧＥＳ、ＢＣＩＲＬ−ＨＶ−ＡＭ１−２、ＩＰＬＢ−ＨｖＥ１ａ／−Ｉｔ、ＩＰＬＢ−ＨｖＥ１ｓ、ＩＰＬＢ−ＨｖＥ６ａ／−Ｉｔ、ＩＰＬＢ−ＨｖＥ６ｓ／−Ｉｔ、ＩＰＬＢ−ＨｖＴ１、ＦＴＲＳ−ＨｍＬ４５、ＦＴＲＳ−ＨｌＬ１−２、ＮＩＡＳ−ＬｅＳｅ−１１  ＩＰＬＢ−ＬＤ−６４−６７、ＩＰＬＢ−ＬｄＥＧ／−ＬｄＥＩ／−ＬｄＥＩｔ／−ＬｄＥｐ／−ＬｄＦＢ、ＩＺＤ−ＬＤ１３０７／−ＬＤ１４０７、ＵＭＮ−ＭＤＨ−１、ＨＰＢ−ＭＢ、ＩＺＤ−ＭＢ０５０３／ＭＢ０５０４／ＭＢ１２０３／ＭＢ２００６／２００７／２５０６、ＭＢ−Ｈ  ２６０、ＭｂＬ−３、ＮＩＡＳ−ＭａＢｒ−８５／９２／９３、ＮＩＡＳ−ＭａＢｒ−９２、ＮＩＡＳ−ＭＢ−１９／２５／３２、ＳＥＳ−ＭａＢｒ−１／２／３／４／５、ＦＰＭＩ−ＭＳ−１２／４／５／７、ＭＲＲＬ−ＣＨ−１／２、ＢＰＭＮＵ−ＭｙＣｏ−１、ＩＰＬＢ−オールＥ５０５Ａ／ｓ、ＩＰＬＢ−オールＥ７、ＩＰＲＩ−オール−１��／１３／４／９、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−ＯｎＦＢ−ＧＥＳ１／２、ＵＭＣ−オン、ＦＴＲＳ−ＰｈＬ、Ｐｘ−５８／−６４、ＯＲＳ−Ｐｏｐ−９３／−９５、ＢＴＩ−ＰＲ１０Ｂ／−ＰＲ８Ａ１／−ＰＲ８Ａ２／−ＰＲ９Ａ、ＮＩＡＳ−ＰＲＣ−８１９Ａ／−８１９Ｂ／−８１９Ｃ、ＮＹＡＥＳ−ＰＲ４Ａ、ＩＡＬ−ＰＩＤ２、ＩＰＬＢ−ＰｉＥ、ＵＭＮ−ＰＩＥ−１１８１、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−ＰｘＬＰ−ＣＬＧ、ＩＰＬＢ−ＰｘＥ１／−ＰｘＥ２、ＰＸ−１１８７、ＢＣＩＲＬ−ＰＸ２−ＨＮＵ３、ＢＴＩ−Ｐｕ−２、ＢＴＩ−Ｐｕ−Ａ７／−Ａ７Ｓ、ＢＴＩ−Ｐｕ−Ｂ９、ＢＴＩ−Ｐｕ−Ｍ、ＢＴＩ−Ｐｕ−Ｍ１Ｂ、ＦＲＩ−ＳｐＩｍ−１２２９、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−ＳｅＥ−ＣＬＧ１／−ＣＬＧ４／−ＣＬＧ５、Ｓｅ３ＦＨ、Ｓｅ４ＦＨ、Ｓｅ５ＦＨ、Ｓｅ６ＦＨＡ、Ｓｅ６ＦＨＢ、ＳｅＨｅ９２０−１ａ、ＵＣＲ−ＳＥ−１、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−ＳｆＴＳ−ＧＥＳ、ＩＡＬ−ＳＦＤ１、Ｓｆ１２５４、ＩＰＬＢ−Ｓｆ２１ＡＥ、ＨＰＢ−ＳＬ、ＳＰＣ−Ｓｌ−４８／−５２、ＵＩＶ−ＳＬ−３７３／−５７３／−６７３、ＩＢＬ−ＳＬ１Ａ、ＮＩＶ−ＳＵ−８９３／−９９２、ＢＣＩＲＬ−５０３−ＨＮＵ１／５０４−ＨＮＵ４、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−ＴｎＥ−ＣＬＧ１／−ＴｎＥ−ＣＬＧ１ＭＫ、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ−ＴｎＥ−ＣＬＧ２／−ＴｎＥ−ＬＧ２ＭＫ／−ＴｎＥ−ＣＬＧ３／−ＴｎＴＳ−ＧＥＳ１／−ＴｎＴＳ−ＧＥＳ３、ＢＴＩ−ＴＮ５Ｂ１−４／−ＴＮ５Ｃ１／−ＴＮ５Ｆ２／−ＴＮ５Ｇ２Ａ１／ＢＴＩ−ＴＮ５Ｇ３／−ＴＮ５Ｇ３３、ＩＡＬ−ＴＮＤ１、ＩＰＬＢ−ＴＮ−Ｒ、およびＴＮ−３６８からなる群より選択される。
【０１５１】
第五の面において、本発明は、本発明の第一または第二の面のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ゲノムを製造する方法であって、該ゲノムの全てまたは一部を化学的に合成する工程を含む方法を提供する。
【０１５２】
本発明において、ゲノムから除去される領域に隣接するゲノムの一部が合成されることが好ましい。これらの部分は、好ましくは、天然のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群 ゲノムの一部に挿入されて、感染性核多角体病ウイルスを形成することができるゲノムを再構成する。これは、天然のＮＰＶ−α バキュロウイルスゲノムの一部にこれらの合成ＤＮＡをアセンブルして機能的ウイルスを生産するために、ＥＴ組換え法（インビトロおよびインビボ）（Zhang, Y, et al., (1998) Nature Genet., 20, 123−128, Hill, F. et al., (2000) Genomics, 64, 111−113.）のような高度な組み換え技術を用いて達成され得る。
【０１５３】
第六の面において、本発明は、第一もしくは第二の面のゲノムまたは本発明の第五の面の方法に従って生産可能なゲノムを、細胞に、好ましくは、第四の面に関して上記の細胞の１つに導入することにより、ＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ウイルスを生産するための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】図１：バキュロウイルスゲノムの青写真(blueprint)。オートグラファカリフォルニカマルチキャプシド核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の注釈付きのゲノムは、配置地図（上）に示される。遺伝子は、保存されている必須遺伝子（削除されない部分、緑色の濃淡から黒色）から非必須遺伝子（おそらく削除可能であることを赤色の濃淡で示される）のスケールでスコアされる（下）。適用される分類は、凡例中に詳述される（下）。注釈付きのゲノム地図は、自己開発のＰｅｒｌプログラムによって作成された。必須および非必須遺伝子はゲノム中にランダムに分布するが、クラスタ化されていない。上部の半円は、５６％の必須遺伝子（および４４％の非必須遺伝子）で構成され、下部は、より保存された半円であり、７１％の必須遺伝子（および２９％の非必須遺伝子）からなる。
【図２】図２：１１種の異なるＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ウイルスからＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ウイルス中に存在するタンパク質チロシンホスファターゼの相同体のアライメントを示す。このアライメントのためにタンパク質を編集(コンパイル)するために、配列番号１３のＡｃＭＮＰＶのタンパク質チロシンホスファターゼのアミノ酸配列を、非冗長（non−redundant）なタンパク質配列のＰＢＬＡＳＴ検索に用いた。同定された他のＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ウイルスからのタンパク質チロシンホスファターゼの相同体のアミノ酸配列は、以下から構成される：ＲｏＭＮＰＶの相同体（配列番号１４）、ＢｍＮＰＶの相同体（配列番号１５）、ＭａｖｉＭＮＰＶの相同体（配列番号１６）、ＣｆＤｅｆＭＮＰＶの相同体（配列番号１７）、ＡｇＭＮＰＶの相同体（配列番号１８）、ＥｐｐｏＮＰＶの相同体（配列番号１９）、ＡｎｐｅＮＰＶの相同体（配列番号２０）、ＣｆＭＮＰＶの相同体（配列番号２１）、ＯｐＭＮＰＶの相同体（配列番号２２）、およびＨｙｃｕＮＰＶの相同体（配列番号２３）。かかるアライメントを使用して、全てのＮＰＶ−α バキュロウイルス Ｉａ群ウイルスのゲノムにおけるｐｔｐ遺伝子の位置を決定し、その後削除することができる。
【図３】図３：ｈｒ４およびｈｒ５を含む領域（バキュロウイルスゲノムのｂｐ９９．１８２から１２１．０７２）。元の（野生型）ゲノム領域は、必須（黒矢印）および非必須（縞模様の矢印）遺伝子領域をハイライトして示す。遺伝子は、注釈が付され、ｈｒ領域が示される。
【図４】図４：最小化したｈｒ４およびｈｒ５を含む領域。元のＤＮＡセグメントを置換するために合成され設計されたＤＮＡ断片が、削除された遺伝子座および保持された必須遺伝子と共に示される。ＹＦＰ発現カセットならびに相同組換えのための２つの部位により隣接されている抗生物質マーカー（Ａｍｐ）が導入される。
【図５】図５：野生型配列をデザイナーＤＮＡと置換するためのゲノム移植の実験手順。初めに、野生型ゲノム領域を相同組換えにより除去し、ゲンタマイシンマーカーで置換する（左および中央）。次に、合成デザイナーＤＮＡを、３つの合成前駆体ＤＮＡ（右下）からbiobrick (バイオブリック)法により組み立てる。第二の相同組換え工程により、合成ＤＮＡを野生型ゲノム中に導入し、ゲンタマイシンマーカーを置換し（左、下）、一部が野生型および一部が合成のハイブリッドゲノム（ＳｙｎＢａｃ１．０）を概念実証（ＰｏＣ）として作製する。
【図６】図６：ＳｙｎＢａｃ１．０のゲノム解析。再構成されたデザイナーＤＮＡ領域を含む部分的に合成のバキュロウイルスゲノムを、分析的ＰＣＲによりＤＮＡレベルで分析し、除去された該遺伝子が実際に存在しないことを示す。左側のアガロースゲルは、野生型ＢＶゲノムの選択された遺伝子のＰＣＲ増幅を示し、右側のアガロースゲルは、ＳｙｎＢａｃ１．０  ゲノムのＰＣＲ増幅を示す。遺伝子の選択は、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡのサンプリングを示し、ＰＣＲ実験での明確な不存在または存在が、元のＤＮＡが合成ＤＮＡによって置換されることを示している。
【図７】図７：生(live)ＳｙｎＢａｃ１．０の分析。連続的に継代したＳｙｎＢａｃ１．０ウイルスで感染させた昆虫細胞における、ＹＦＰ発現のＹＦＰ蛍光発光スペクトル。Ｘ軸は、発光シグナルの波長（λ）を示し、Ｙ軸は、任意の単位で蛍光強度を示す。Ｂ  感染細胞のタンパク質含有量のクマシーブルー染色。１：対照細胞、２：マーカー、３および４：ＳｙＢａｃ１．０、５：ウイルス対照。野生型ウイルス対照感染細胞中で強力に発現されるｐ１０（１０ｋＤａ  タンパク質は、強いバンドとしてゲルの下部に見られる）は、ＳｙｎＢａｃ１．０感染細胞中には存在しない。
【実施例】
【０１５５】
実施例
実施例は、本発明をさらに説明するため、かつ本発明をより理解するのを可能にする目的で設計されている。それらは、いかなる意味においても本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。
【０１５６】
実施例１：
図１に示すバキュロウイルスゲノムマップを作成するために用いるデータは、ＮＣＢＩ  ＰｕｂＭｅｄで見出される検索された１２５３の関連する文献に由来し、例えば、ゲノム配列、遺伝子の必須性および保存性、タンパク質産物の機能および局在化、タンパク質−タンパク質相互作用、ｍＲＮＡ発現および遺伝子調節のための情報を２０１１年１０月までに公表された。遺伝子産物の機能の全ての利用可能なデータベースのアノテーション(annotation)は、NCBI Genebank、NCBI Protein、関連するウイルスタンパク質のNCBI VOG clustersおよびPerl programsによるＵｎｉＰｒｏｔデータベースから収集された。さらに、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ヌクレオチドデータベースにおいて２０１１年１０月に利用可能な５３種のバキュロウイルスゲノムは、クラスタリングプログラムブラストクラスト、ＮＣＢＩ  Ｃ−ツールキットレガシーブラストパッケージの一部を伴う、Perl programsを含むNCBI Proteinデータベースからダウンロードされたタンパク質配列をクラスタリングすることによりオーソロガスタンパク質遺伝子について分析された（Vijayachandran LS, Thimiri Govinda Raj DB, et al (2013) Bioengineered 4:5, 1−9）。保存性／可変性についてのカテゴリーは、以下の異なる系統のバキュロウイルス類：保存されたシンテニーを有する全てのバキュロウイルス類（ｃｏｒｅ＋）、全てのバキュロウイルス類（ｃｏｒｅ）、鱗翅目（レピドプテラ（Lepidoptera））バキュロウイルス類、ＮＰＶ（αバキュロウイルス類）、ＮＰＶ  Ｉ群、ＮＰＶ  Ｉａ群、ＡｃＭＮＰＶの近位の可変株（variable for next neighbours of AcMNPV）、ＡｃＭＮＰＶの特異型を特定する。遺伝子の必須性の分類のために、遺伝子保存性の程度を、ｍＲＮＡ発現（ｎｍＲＮＡが観察されない）、異なる発生段階における発現（即時、早期、後期、最後期）、上流領域での段階特異的なプロモーターモチーフの含有量ならびに細胞培養におけるウイルス増殖のための非必須性を示す遺伝子産物機能および局在（例えば、宿主の相互作用因子、経口感染因子、封入体由来ウイルス、または封入体局在化、他の補助タンパク質、宿主ゲノムから取得したいくつかの遺伝子）について公表された情報と統合した。必須ではないと既に記載されているタンパク質遺伝子は、既知のｍＲＮＡ発現を有していない、タイプ１（I）の欠失カテゴリー（欠失は無害である）、またはＡｃＭＮＰＶの次の関連株（ＢｍＮＰＶのような）にて必須ではないと証明されており、おそらく必須の機能を有さず、かつαバキュロウイルスにおいて可変である、タイプ２（II）（欠失はおそらく無害である）であるか、または、かかるタンパク質遺伝子は、未知の機能を有し、近位の株において可変である、タイプ３（III）（欠失はおそらく無害である）、および非必須の機能を有し、他のαバキュロウイルスゲノムにおいて可変であるが、次の関連株において保存されているタイプ４（IV）（欠失はおそらく無害である）に分類された。ゲノム地図は、分類された遺伝子データの表をインポートし、ＰｅｒｌのパッケージＧＤおよびＧＤ::シンプルにより作成された画像をエクスポートする、Ｐｅｒｌプログラムを設計することにより描かれた。
【０１５７】
実施例２：
実施例１に従い、本発明者らは、比較ゲノム解析およびデータ検索により、創薬目的のために改良されたバキュロウイルスを作製するのに有利に再構成され得るバキュロウイルスゲノム内の領域を同定した。
【０１５８】
この方法の概念実証のために、ｈｒ４およびｈｒ５を含む領域を選択した。この領域は、バキュロウイルスゲノムの塩基対９９，１８２から１２１，０７２の間に位置し、本発明者らの実験に基づき、ｈｒ４、ｈｒ５領域に加えて、２２個の遺伝子を含み、このうち１２個は非必須遺伝子であり、１０個は必須遺伝子である。サイズに関して、この２２ｋｂセグメントは、遺伝子、プロモーターおよびターミネーターを含む１０ｋｂ未満の必須ＤＮＡ部分、ならびにその欠失が許容され得るか、または細胞培養においてウイルスの性能を増強させ得る、約２０ｋｂの機能的なＤＮＡを含む。ｈｒ４、ｈｒ５領域ならびにそれらの必須および非必須部分を図３に示す。
【０１５９】
本発明者らは、再構成され、かつ最小化されたこのセグメントに対応する合成ＤＮＡを設計した（図４参照）。本発明者らは、ＢｉｏＢｒｉｃｋ法を適用することにより、カスタム合成されたＤＮＡ断片からＤＮＡのこの断片を作製した（Sleight C.S. et al Nucleic Acids Res. 2010参照）。次に、相同組換え技術（Zhang Y et al Nat. Biotechnology (2000)参照）を用いて、この合成ＤＮＡを野生型バキュロウイルスゲノムへ移植し、元の野生型配列をデザイナーＤＮＡを含むこの断片に置き換えた（図５参照）。再構成されたデザイナーＤＮＡ領域を含む部分的合成バキュロウイルスゲノムを、分析的ＰＣＲによりＤＮＡレベルを分析し、除去された遺伝子が実際に存在しないことを示した（図６参照のこと）。ウイルスの生存性を評価するために、昆虫細胞を連続的に継代されたＳｙｎｂａｃ１．０ウイルスで感染させ、ウイルス骨格からのＹＦＰの発現を測定した（図７Ａ参照）。これは、ＳｙｎＢａｃ１．０が、感染性かつ生存性であることを示している。また、感染細胞のタンパク質含有量を、例示的タンパク質について調査した。ｐ１０（代表例として示される１０ｋＤの質量）は、感染細胞中に明らかに存在しないが、このタンパク質は、野生型バキュロウイルスで強力に発現されるタンパク質である（図７Ｂ参照）。
【０１６０】
従って、得られたハイブリッド（すなわち、部分的に合成され、部分的に野生型の）バキュロウイルスゲノム（ＳｙｎＢａｃ１．０）は、完全に機能的な、感染性の、かつ異種タンパク質を生産可能なことが証明された。これは、本発明の方法が実施可能であることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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