(57)【要約】抗体及びその他のタンパク質をタンパク質製剤から精製するための改良された方法であって、タンパク質製剤を多価有機イオンと接触させてタンパク質製剤をコンディショニングする工程と、次いで前記コンディショニングした製剤を吸着クロマトグラフィー媒体にアプライする工程とを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）不純タンパク質製剤を少なくとも１つの種の可溶性又は不溶性多価有機イオンと接触させることによって前記不純タンパク質製剤をコンディショニングし、その後固体を除去することによって、少なくとも９５％のクロマチン除去を得る工程と；次いで（ｉｉ）前記コンディショニングしたタンパク質製剤を、任意で緩衝剤平衡化工程の後に、所望のタンパク質を精製するための吸着クロマトグラフィー媒体にアプライする工程とを含む、少なくとも１つの所望のタンパク質をタンパク質製剤から精製するための方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの種の有機多価イオンを用いたタンパク質製剤のコンディショニングが、前記タンパク質製剤を電気陽性有機添加剤と接触させる工程を含む、請求項１、工程（ｉ）に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの種の有機多価イオンを用いたタンパク質製剤のコンディショニングが、前記タンパク質製剤を可溶性電気陽性有機添加剤と接触させる工程を含む、請求項１、工程（ｉ）に記載の方法。
【請求項４】
可溶性電気陽性有機多価イオンが、メチレンブルー、エタクリジン、クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、セチルトリメチルアンモニウムブロミドからなる可溶性カチオンの群からの１つ以上である、請求項１、工程（ｉ）に記載の方法。
【請求項５】
メチレンブルー、エタクリジン、セチルトリメチルアンモニウムブロミドからなる群からの１つを含む可溶性電気陽性有機多価が、０．０２０％〜０．０２５％、０．０１％〜０．０５％、０．００５％〜１％、０．００１％〜２％の群からの濃度範囲で存在する、請求項１、工程（ｉ）に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの種の有機多価イオンを用いたタンパク質製剤のコンディショニングが、表面に固定された電気陽性有機イオンの形態の不溶性電気陽性有機添加剤に前記タンパク質製剤を接触させる工程を含む、請求項１、工程（ｉ）に記載の方法。
【請求項７】
不溶性電気陽性有機多価イオンが、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基、四級アミノ基、１種以上のアミノ基によって供与される１個を超える正電荷を含有する錯カチオンからなる群からの１つ以上の添加剤である、請求項１、工程（ｉ）に記載の方法。
【請求項８】
不溶性電気陽性有機多価イオンがトリス（２−アミノエチル）アミン又はその誘導体である、請求項１、工程（ｉ）に記載の方法。
【請求項９】
不溶性有機多価イオンが２％、又は１％、又は３％、又は４％、又は５％の量、より少ない量、より多い量、及び中間量で存在する、請求項１、工程（ｉ）に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの種の有機多価イオンを用いたタンパク質製剤のコンディショニングが、電気陰性有機添加剤に前記タンパク質製剤を接触させる工程を含む、請求項１、工程（ｉ）に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの種の有機多価イオンを用いたタンパク質製剤のコンディショニングが、可溶性電気陰性有機添加剤に前記タンパク質製剤を接触させる工程を含む、請求項１、工程（ｉ）に記載の方法。
【請求項１２】
可溶性電気陰性有機多価イオンが、ノナン酸、ノネン酸、ヘプタン酸、へプテン酸、オクタン酸、オクテン酸、デカン酸、メチルブルーからなる可溶性カチオンの群からの１つ以上である、請求項１、工程（ｉ）に記載の方法。
【請求項１３】
可溶性有機多価イオンが、ヘプタン酸、へプテン酸、オクタン酸、オクテン酸、ノナン酸、ノネン酸、デカン酸からなる群からの１つ以上を含み、０．２０％〜０．５％、０．１％〜１％、０．０５％〜５％の群からの濃度範囲で存在する、請求項１、工程（ｉ）に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの種の有機多価イオンを用いたタンパク質製剤のコンディショニングが、表面に固定された電気陰性有機イオンの形態の不溶性電気陰性有機添加剤に前記タンパク質製剤を接触させる工程を含む、請求項１、工程（ｉ）に記載の方法。
【請求項１５】
不溶性電気陰性有機多価イオンが、ホスフェート基、スルホ基、カルボキシル基、イミノ二酢酸基、ニトリロ酢酸基、アスパラギン酸基、グルタミン酸基からなる群からの１つ以上である、請求項１、工程（ｉ）に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つの種の多価有機イオンが、０．６〜５０％、０．７〜２０％、０．８〜１０％、０．９〜５％、１〜２％、中間値からなる群からの範囲でアラントインと共存する、請求項１、工程（ｉ）に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、不純製剤を少なくとも１つの可溶性種の電気陰性有機多価イオン、又は少なくとも１つの可溶性種の有機多価イオンと組み合わせるが、両方とは組み合わせない工程；その後のインキュベーション工程、次いで少なくとも１種の不溶性多価有機多価イオンの添加からなる、請求項１、工程（ｉ）に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が、不純製剤を、アラントイン及び少なくとも１つの可溶性種の電気陰性有機多価イオン、又はアラントイン及び少なくとも１つの可溶性種の有機多価イオンと組み合わせるが、両方とは組み合わせない工程；その後のインキュベーション工程、次いで少なくとも１種の不溶性有機多価イオンの添加、その後のインキュベーション工程からなる、請求項１、工程（ｉ）に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法が、不純製剤を、金属親和性官能性を有する少なくとも１つの種の不溶性電気陽性有機多価イオンと組み合わせる工程からなる、請求項１、工程（ｉ）に記載の方法。
【請求項２０】
所望のタンパク質と可溶性有機多価イオンとの共沈を実質的に防止する条件、又は所望のタンパク質が不溶性多価有機イオンに結合するのを実質的に防止する条件、又はその両方の条件下で実施される、請求項１、工程（ｉ）に記載の方法。
【請求項２１】
固体の除去が遠心分離若しくは濾過、又はその両方によって達成され、濾過は電気陽性濾過媒体上での濾過により達成されてもよい、請求項１、工程（ｉ）に記載の方法。
【請求項２２】
前記コンディショニングした製剤をアプライする吸着クロマトグラフィー媒体が、生物学的アフィニティークロマトグラフィー媒体、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー媒体、合成アフィニティークロマトグラフィー媒体、カチオン交換クロマトグラフィー媒体、アニオン交換クロマトグラフィー媒体、疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体、マルチモーダルクロマトグラフィー媒体からなる群からの１つである、請求項１、工程（ｉｉ）に記載の方法。
【請求項２３】
前記コンディショニングした製剤をアプライする吸着クロマトグラフィー媒体が、モノリス、膜、複数の流動化粒子、複数のカラムに充填された粒子からなる群から選択される媒体である、請求項１、工程（ｉｉ）に記載の方法。
【請求項２４】
前記コンディショニングした製剤が、任意で、所与のクロマトグラフィー方法の実施に好適な化学的条件にするためのｐＨ及び導電率に平衡化されてもよい、請求項１、工程（ｉｉ）に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｉ）及び工程（ｉｉ）の後の所望のタンパク質が、任意追加的に、所望であれば追加の濾過方法によって更に精製されてもよい、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
所望のタンパク質を含有する不純製剤が、細胞培養採取物であり、任意で無細胞又は細胞含有である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に開示される実施形態は、ＩｇＧモノクロナール抗体の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質の精製は、一般的に、いわゆる一次捕獲工程から始まり、この工程では、細胞及びデブリが除去され、残った上清を、細胞及びデブリの存在によって阻害又は無効化される方法によって処理することができる。細胞及びデブリの除去は、一般的に遠心分離及び濾過を伴う。時には、アニオン交換能力を有する膜若しくはデプスフィルタの使用、又は抗体含有採取物へのアニオン交換粒子の直接添加を伴うこともあり（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）、こうした事例の全てで、宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）のレベル低下が報告されている。Ｂｒｏｄｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ（非特許文献４）は、後続のプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製の前駆体としてのカプリル酸によるＨＣＰ精製を記載している。Ｇａｎ  ｅｔ  ａｌ（非特許文献５）は、主にヒストンタンパク質及びＤＮＡからなるクロマチンから誘導される宿主細胞汚染物質のサブセットを特異的に標的とすることにより、異なる方法を用いて後のクロマトグラフィー精製のために採取物を調製した。上記の方法の１つは特に、凝集を解離するために可溶性多価有機カチオンの組み合わせを使用し、残りの凝集体及びその他の汚染物質を除去するために不溶性（表面固定化された）多価有機イオンを使用する。結果を得るために活性成分としてアラントインを含めることも記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｇａｇｎｏｎ，Ｐ．，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖａｌｉｄａｔｅｄ  Ｂｉｏｓｙ  ｓｔｅｍｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，１９９６
【非特許文献２】Ｋｕｃｚｅｗｓｋｉ，Ｍ，．ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｐｈａｒｍ  Ｉｎｔ．２３（３）（２０１０）２０−２５
【非特許文献３】Ｋｕｃｚｅｗｓｋｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．，６（２０１１）５６−６５
【非特許文献４】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０９（２０１２）２５８９−２５９８
【非特許文献５】Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ  １２９１（２０１３）３３−４０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
いくつかの態様では、本明細書に開示される実施形態は、少なくとも１つの所望のモノクロナール抗体を細胞培養採取物の形の不純製剤から精製する方法であって、（ｉ）抗体製剤を可溶性及び／又は不溶性（表面固定化）多価有機イオンと接触させ、次いで固体を除去することによってクロマチンの大部分を除去するために、抗体製剤をコンディショニングする工程と、（ｉｉ）コンディショニングした抗体製剤を、所望の抗体を不要汚染物質から分画する吸着性クロマトグラフィー媒体にアプライする工程とを含む方法を提供する。
【０００５】
いくつかの実施形態において、抗体が結合されていない条件下での可溶性有機多価イオン及び／又は固体表面に固定された有機多価イオンへの曝露による抗体含有タンパク質製剤のコンディショニングは、その後のプロテインＡによる分画の性能を予想外に高い程度まで向上することが発見されている。例示として、いくつかの実施形態において、有機多価イオンコンディショニング工程が宿主タンパク質由来の汚染を３０〜７０％削減する場合、驚くべきことに、後のプロテインＡクロマトグラフィー工程が宿主タンパク質汚染を低減する能力を、最大で１０００倍近く増大することができる。いくつかの実施形態において、この方法は、単に全汚染物質負荷を低減することによって後続の精製を補佐するだけでなく、プロテインＡ精製工程のような後続の精製工程を妨げる汚染物質を特に除去する。いくつかの実施形態において、この方法は、驚くべきことに、プロテインＡアフィニティーカラムの最大結合容量を１０〜２０％又はそれ以上増大する。特定の信念又は理論を採用するものではないが、本明細書に開示される実施形態によってアフィニティークロマトグラフィー媒体に付与される増大された能力は、これらのコンディショニング方法が粒子の外表面に結合した大きなヌクレオソーム−抗体凝集体を特に除去し、意図する結合表面積の大部分が属する孔に所望の抗体が自由に入ることができるのを防ぐという事実の結果であると考えられる。いくつかの実施形態において、これらのコンディショニング方法は更に、非特異的結合によってその表面を汚す可能性のある化合物への曝露を防止することによって、プロテインＡカラムの使用寿命を延長する場合もある。加えて、これらのコンディショニング方法は、ウイルスの除去を過度に増大する場合がある。注目すべきことに、かつ最も驚くべきことには、本開示の清澄化方法は、精製能力が劣る吸着クロマトグラフィー法、例えば、カチオン交換、アニオン交換、及びマルチモーダル法が、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーと実質的に同じ精製能力を達成できる程度にまで、妨害物質を除去する。具体的には、本開示の精製方法は、上記のクロマトグラフィー方法の全てについて、市販の宿主タンパク質ＥＬＩＳＡで測定したときの宿主タンパク質汚染物質を１０ｐｐｍ未満に低減することを可能にする。
【０００６】
互いに化学的に拮抗する物質の組み合わせは、その物質のいずれか１つを個別に利用するコンディショニング方法よりも高いレベルのクロマチン除去を達成するという予想外の効果を有することが発見された。拮抗物質の組み合わせは、互いの個別の作用を打消し、より劣ったクロマチン削減、より劣った抗体回収、又はその両方を生じると予想された。しかし、本実施形態は、物質が相乗的に作用して、個々の成分のいずれかが提供する能力を実質的に超えるレベルのクロマチン削減及び抗体回収を達成する範囲の明確なウインドウを提供する。加えて、実験結果は、組み合わせの成分のそれぞれに関する反応性曲線が、個別に使用したときの反応性曲線と異なることを示す。このことは、本明細書に開示する実施形態の有益性は、個別成分の既知の特性又は利用から予測できなかったことを強調する。いくつかのこのような実施形態において、細胞培養採取物のコンディショニングのために組み合わされる成分としては、特に、７個又は８個又は９個又は１０個の炭素原子を含有する脂肪酸、及び正電荷を帯びた可溶性又は固体物質が挙げられる。更に、金属結合官能基を含む、１つ以上の固体又は可溶材料が挙げられる。成分には、更に、アラントインが挙げられる。本明細書に開示の方法において、物質は１種の抗体を含有する液体製剤に組み合わされ、次いで、適切な時間のインキュベーションの後に固体を除去することで、抗体を含み、最大で９９％以上の宿主細胞汚染物質が存在せず、平均ＩｇＧ回収率が約９０〜約９５％であり、濁度が約５ＮＴＵ（ネフェロ分析濁度単位）である、溶液を提供する。
【０００７】
実験データは、かかる成分間の相互拮抗作用を記録している。例えば、カチオン性（電気陽性）成分と、脂肪酸のようなアニオン性（電気陰性）成分は、互いに強力な引力を有するはずであり、その相互作用は、いずれかが細胞培養採取物のような抗体製剤中の他の成分と相互作用する能力を低減する傾向があるはずである。これは、特定の汚染物質、例えば抗体Ｌ鎖が、ある比率での成分の組み合わせによって除去されるが、カチオン性成分の割合が増すと抗体含有液に再度現れることを表すデータによって示される。特定の実施例において、これは、沈殿内で汚染物質に結合した脂肪酸が汚染物質よりもカチオン性固体に強く引き付けられ、その結果、カチオン性固体の量が増大したときに脂肪酸はその固体に移動し、これは汚染物質を沈殿から遊離し、汚染物質が可溶性抗体製剤を再汚染する原因となるために起こると考えられる。相互拮抗の別の例において、結晶アラントインは、細胞培養採取物中で脂肪酸の９９％超に結合することが実験的に証明されており、添加された脂肪酸に同様の形で作用する可能性が高いことを示す。これは、非抗体汚染物質を沈殿させる目的で抗体含有細胞培養採取物に添加された脂肪酸の有効性を低下させると予想される。反対に、本方法のこの態様は、科学文献で最適として報告されたレベルの半分未満の濃度における脂肪酸の有効使用に寄与する。特定の理論に帰するものではないが、水素結合によって未溶解アラントインと複合体化した脂肪酸は、その負電荷、疎水性、及び汚染物質への結合能力を保持するが、未溶解アラントインの密度は沈降によるその除去を増強する可能性がある。相互拮抗の別の実施例において、アニオン性キレート化固体（これは脂肪酸に対して不活性なはずである）を脂肪酸とカチオン性キレート化固体の混合物に添加することで、汚染物質が放出されて、カチオン性固体と脂肪酸という既に拮抗性の組み合わせによって除去に成功した抗体溶液へと戻る。通常は拮抗性の成分を正しいバランスの割合で組み合わせたとき、個々の成分のいずれでも有効に除去されない特定の抗体フラグメントのような汚染物質を除去できる範囲のウインドウを生じる。多くの場合、本開示の方法の全体的な精製性能は、利用可能な最高性能の抗体精製方法であると一般的に考えられているプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの能力を超える。
【０００８】
別のこのような実施形態において、１つ以上の正に帯電した表面との接触によって採取物をコンディショニングしてもよい。別のこのような実施形態において、本清澄化方法は、所望の製品製剤を可溶性及び／又は不溶性多価有機イオンと接触させる工程を伴い（該イオンのいずれもアニオン性でもカチオン性でもよい）、それによってコンディショニング成分間の固有の拮抗作用の追加の例を示すことができる。
【０００９】
前記実施例の１つ以上において、タンパク質製剤の有機多価イオンによるコンディショニングは、試料を電気陽性有機添加剤と接触させる工程を含む。いくつかのこのような実施形態において、電気陽性有機添加剤は、エタクリジン、メチレンブルー、セチルトリメチルアンモニウムブロミドからなる群からの少なくとも１つの種を含む。いくつかのこのような実施形態において、かかる種の濃度、又は種の組み合わせの凝集体濃度は、０．００１〜１％、又は０．０１〜０．１％、又は０．０２〜０．０５％の範囲である。いくつかのこのような実施形態において、製剤のｐＨは、所望のタンパク質の回収の有意な低減を引き起こさないアルカリ性の値まで調節してもよい。このような実施形態の１つにおいて、所望のタンパク質がＩｇＧモノクロナール抗体である場合、ｐＨは、抗体等電点の２分の１ｐＨ単位のｐＨ値まで、又は実験結果が、抗体回収が許容可能であることを示す場合にはそれ以上の値まで調節してもよいが、かかる調節は一般的には不要である。何らかのｐＨ調節が行われる範囲で、タンパク質等電点の１ｐＨ単位の範囲内の値、又は１．５ｐＨ単位の範囲内で十分であると考えられる。
【００１０】
前記実施形態の１つ以上において、有機多価イオンを用いたタンパク質製剤のコンディショニングは、試料を電気陰性有機添加剤と接触させる工程を含む。いくつかのこのような実施形態において、電気陰性有機添加剤は、ヘプタン酸、へプテン酸、オクタン酸、オクテン酸、ノナン酸、ノネン酸、デカン酸、メチルブルーからなる群からの少なくとも１つの種を含む。いくつかのこのような実施形態において、かかる種の濃度、又は種の組み合わせの全濃度は、０．００１〜１０％、又は０．０１〜１％、又は０．１〜０．５％である。いくつかのこのような実施形態において、製剤のｐＨは、所望のタンパク質の回収の有意な低減を引き起こさない酸性値まで下方に調節してもよい。いくつかのこのような実施形態において、製剤のｐＨは、３．５〜６．５、４．０〜６．０、４．５〜５．５、５．０〜５．３、５．１５〜５．２５、若しくは５．２、又は別の中間値に調節されてもよい。
【００１１】
前記実施形態の１つ以上において、有機多価イオンを用いたタンパク質製剤のコンディショニングは、試料を溶解したアラントインと接触させる工程を含む。いくつかのこのような実施形態において、タンパク質製剤中に存在する添加アラントインは、約０．６％〜５０％、又は０．７〜２０％、又は０．８〜１０％、又は０．９〜５％、若しくは１〜２％、又は中間値の量であってもよい。粒径が小さいほど、単位質量当たりの表面積が大きいことは明らかであり、本プロセスは粒子表面で媒介されることから、平均粒径が小さいほど、単位質量当たりの効率が大きくなる。
【００１２】
前記実施形態の１つ以上において、タンパク質製剤の有機多価イオンによるコンディショニングは、試料を、その臨界ミセル濃度よりも低い濃度で、陰イオン性又は双性イオン性界面活性剤と接触させる工程を含む。
【００１３】
前記実施形態の１つ以上において、有機多価イオンを用いたタンパク質製剤のコンディショニングは、（ｉ）電気陰性表面を有する第１の固体基質である、第１成分を提供する工程と；（ｉｉ）タンパク質製剤を第１成分と接触させる工程であって、その操作条件が所望のタンパク質が第１成分に結合するのを実質的に防止する、工程と；（ｉｉｉ）クロマチン含有量が低減した所望のタンパク質を第１成分から分離する工程とを含む。いくつかのこのような実施形態において、第１の電気陰性表面は、第２の電気陰性表面を伴ってもよい。
【００１４】
前記実施形態の１つ以上において、有機多価イオンを用いたタンパク質製剤のコンディショニングは、（ｉ）電気陽性表面を有する第１の固体基質である第１成分を提供する工程と；（ｉｉ）タンパク質製剤を第１成分と接触させる工程であって、その操作条件が所望のタンパク質が第１成分に結合するのを実質的に防止する、工程と；（ｉｉｉ）クロマチン含有量が低減された所望のタンパク質を第１成分から分離する工程とを含む。いくつかのこのような実施形態において、第１の電気陽性表面は、トリス（２−アミノエチル）アミンの残基を有する。いくつかのこのような実施形態において、第１の電気陽性表面は第２の電気陽性表面を伴ってもよい。
【００１５】
前記実施形態の１つ以上において、有機多価イオンを用いたタンパク質製剤のコンディショニングは、（ｉ）電気陽性表面を有する第１の固体吸基質である第１成分を提供する工程と；（ｉｉ）電気陰性表面を有する第２の固体基質である第２成分を提供する工程と；（ｉｉｉ）前記タンパク質製剤を第１及び第２成分と接触させる工程であって、第１及び第２成分は、タンパク質製剤が両成分に同時に接触し得るように構成され、その操作条件が所望のタンパク質が第１又は第２成分に結合するのを実質的に防止する、工程と；（ｉｖ）クロマチン含有量が低減された所望のタンパク質を第１及び第２成分から分離する工程と、を含む。いくつかのこのような実施形態において、第１の電気陽性表面は、トリス（２−アミノエチル）アミンの残基を有する。
【００１６】
前記実施形態の１つ以上において、有機多価イオンを用いたタンパク質製剤のコンディショニングは、（ｉ）タンパク質製剤を、金属を結合できる少なくとも１つの表面結合リガンドを含む少なくとも１つの固体表面と接触させる工程であって、前記金属を結合できる表面結合リガンドが最初に金属を実質的に有さず、所望のタンパク質が少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように操作条件が選択される、工程と、（ｉｉ）タンパク質製剤を少なくとも１つの表面結合リガンドから分離する工程と、を含む。
【００１７】
前記実施形態の１つ以上において、可溶性の電気陽性又は電気陰性有機添加剤及び／又は電気陰性、電気陽性、若しくは金属親和性リガンドを有する固体表面で既に処理されたタンパク質製剤は、続いてデバイス内に流され、その流体接触面は正電荷を備える。
【００１８】
クロマチン指向の清澄化方法の応用を例示する１つの実施形態において、アラントインは、細胞培養採取物に、１％（ｖ／ｖ）の量で添加される。細胞培養物は細胞を含有してもよく、又は細胞は事前に除去されていてもよい。メチレンブルーは、０．０２５％（ｗ／ｖ）の濃度に添加される。あるいは、エタクリジンが０．０２５％の濃度に添加されてもよい。あるいは、０．０２５％セチルトリメチルアンモニウムブロミドが０．０２５％の濃度に添加されてもよい。あるいは、０．０１％クロルヘキシジンが添加される。あるいは、その他の電気陽性有機添加剤又はこれらの組合せを使用してもよい。続いて、この混合物を撹拌しながら２時間インキュベートする。電気陽性金属親和性リガンドのトリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）を担持する粒子を、２〜５％ｖ：ｖの量で添加する。混合物を撹拌しながら４時間インキュベートした後、任意の適切な手段によって固体を除去する。所望のタンパク質を含有する残液を、任意で、流体接触面に正電荷を帯びたデプスフィルタ―に通す。
【００１９】
クロマチン指向のコンディショニング方法の応用を例示する１つの実施形態において、アラントインは、細胞培養採取物に、１％（ｖ／ｖ）の量で添加される。細胞培養物は細胞を含有してもよく、又は細胞は事前に除去されていてもよい。０．６％ヘプタン酸が添加される。あるいは、０．５％へプテン酸が添加される。あるいは、０．４％オクタン酸が添加される。あるいは、０．４％オクテン酸が添加される。あるいは、０．３％ペラルゴン（ノナン）酸が添加される。あるいは、０．４％ノネン酸が添加される。あるいは、０．２％カプリン酸が添加される。あるいは、０．５％メチルブルーが添加される。あるいは、これらの又はその他の電気陰性有機添加剤の組み合わせが使用されてもよい。続いて、この混合物を撹拌しながら２時間インキュベートする。電気陰性金属親和性リガンドのトリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）を担持する粒子を、２〜５％ｖ：ｖの量で添加する。混合物を、撹拌しながら４時間インキュベートし、次いで固体を任意の適切な方法で除去する。所望のタンパク質を含有する残液を流体接触面に正電荷を帯びたデプスフィルタ―に通す。
【００２０】
クロマチン指向のコンディショニング方法の応用を例示する別の実施形態において、電気陽性金属親和性リガンドのような金属親和性リガンドを担持する粒子を、２〜５％（ｖ／ｖ）の量で細胞培養採取物に添加する。いくつかのこのような実施形態において、電気陽性金属親和性リガンドは、トリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）である。いくつかのこのような実施形態において、金属親和性リガンドは、ＴＲＥＮの構造的類似体、又は粒子表面上の多層ＴＲＥＮデンドリマーのような複数のＴＲＥＮである。いくつかのこのような実施形態において、他の化学的相互作用への参加を可能にするリガンドを担持する粒子が、ＴＲＥＮ粒子と共に又は逐次的に（他の粒子が最初に添加される場合を含む）含まれる。混合物を撹拌しながら４時間インキュベートした後、固体を任意の適切な方法で除去する。所望のタンパク質を含有する残液を、任意で、流体接触面に正電荷を帯びたデプスフィルタに通す。
【００２１】
前記実施形態の１つ以上において、可溶性又は不溶性の多価有機イオンとの過度の相互作用による所望のタンパク質の損失を防止するために、塩をコンディショニング混合物に添加してもよい。いくつかのこのような実施形態において、ＩｇＭ抗体又は非抗体タンパク質がコンディショニング成分に結合するのを防止する目的で、ＮａＣｌを添加して、おおよその当量導電率が約２０ｍＳ／ｃｍで、約２００ｍＭに相当するレベルまで導電率を増大してもよい。その他のこのような実施形態において、ＮａＣｌ濃度は特定の組換えタンパク質に適応するために多少上昇してもよい。任意の特定のタンパク質に適応するための適切な塩濃度は、所望のタンパク質の試料をカチオン交換体又はアニオン交換体にアプライし、漸増塩勾配で溶出し、所望のタンパク質ピークの中心で導電率を測定することによって素早く容易に推定することができ、その導電率の値を清澄化プロセスに使用する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの所望のタンパク質をタンパク質製剤から精製する方法であって、（ｉ）タンパク質製剤を多価有機イオンと接触させることによってコンディショニングする工程と；次いで（ｉｉ）得られたタンパク質製剤を、所望のタンパク質に特異的なアフィニティークロマトグラフィー媒体にアプライする工程とを含む方法が提供される。いくつかのこのような実施形態において、クロマトグラフィー媒体上の親和性リガンド媒体は、プロテインＡ、若しくはプロテインＧ、若しくは固定化ＶＨＨドメイン、又は生物学的クロマトグラフィー媒体の合成類似体、又は生物学的親和性リガンド上でモデル化されていない合成親和性リガンドである。
【００２３】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの所望のタンパク質をタンパク質製剤から精製する方法であって、（ｉ）タンパク質製剤を多価有機イオンと接触させることによってコンディショニングする工程と；次いで（ｉｉ）得られたタンパク質製剤を、アニオン交換クロマトグラフィー媒体にアプライする工程とを含む方法が提供される。特定のこのような実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、電気陽性粒子のパックドカラムである。特定のこのような実施形態において、アニオン交換カラムをボイド排除モードで操作する（Ｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ  １２８２  （２０１３）１２７−１３２）。かかる実施形態は、本開示方法の驚くべき性質を強調する。アニオン交換クロマトグラフィーは、供給流からの汚染物質を結合することによってカラムが激しく汚れることから、ＩｇＧ抗体の初期精製ツールとしては無視されてきた。実験データは、汚れの原因となる汚染物質は、ほぼ全てがクロマチンに由来すること、及びその除去により、アニオン交換クロマトグラフィーにプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの精製性能に匹敵する能力が付与されることを示す。ボイド排除モードのアニオン交換クロマトグラフィーは、小分子の汚染物質と塩の同時除去を可能にし、それによって事前の試料平衡を不要にする。
【００２４】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの所望のタンパク質をタンパク質製剤から精製する方法であって、（ｉ）タンパク質製剤を多価有機イオンと接触させることによってコンディショニングする工程と；次いで（ｉｉ）得られたタンパク質製剤を、カニオン交換クロマトグラフィー媒体にアプライする工程とを含む方法が提供される。実験データは、遠心分離及び／又は濾過という従来方法でコンディショニングした細胞培養採取物をカチオン交換クロマトグラフィー処理した場合、一般的に宿主タンパク質汚染が５，０００〜１５，０００ｐｐｍ低減されることを示す。実験データは、本開示方法による細胞培養採取物のコンディショニングにより、カチオン交換クロマトグラフィーは宿主細胞タンパク質を１０ｐｐｍ未満まで、場合によっては１ｐｐｍ以下まで低減することができるようになることを示す。実験データで明らかになった別の予想外の効果は、クロマチンが、カチオン交換体を汚し、その精製性能を低下させる汚染物質であることである。開示されるコンディショニング方法は、この問題を特に排除する。この解決策は、過度の疎水性を有するカチオン交換材料を用いたマルチモーダルクロマトグラフィーにも適用され、この場合も本開示方法によるコンディショニングで、宿主タンパク質汚染が１ｐｐｍに低減する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの所望のタンパク質をタンパク質製剤から精製する方法であって、（ｉ）タンパク質製剤を多価有機イオンと接触させることによってコンディショニングする工程と；次いで（ｉｉ）得られたタンパク質製剤を、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、又はいずれかのカルシウム誘導体化物などのアパタイトクロマトグラフィー媒体にアプライする工程とを含む方法が提供され、その採取物のコンディショニングの効果は、上記の他のクロマトグラフィー媒体に関して記載した効果に匹敵する。
【００２６】
いくつかの実施形態において、工程（ｉ）の有機多価イオンを用いたタンパク質製剤のコンディショニングは、タンパク質製剤を可溶性の電気陽性有機添加剤と接触させる工程を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、工程（ｉ）の有機多価イオンを用いたタンパク質製剤のコンディショニングは、電気陰性表面を有する第１の固体基質である第１成分を提供する工程と、電気陽性表面を有する第２の固体基質である第２成分を提供する工程と、前記タンパク質製剤を第１及び第２成分と接触させる工程であって、第１及び第２成分は、タンパク質製剤が両成分に同時に接触し得るように構成され、その操作条件が所望のタンパク質が第１及び第２成分に結合するのを実質的に防止する工程と、コンディショニングしたタンパク質製剤中の所望のタンパク質を第１及び第２成分から分離する工程と、を含む。特定のこのような実施形態において、工程（ｉ）の有機多価イオンを用いたタンパク質製剤のコンディショニングは、タンパク質製剤を第１及び第２成分と接触させる前に、タンパク質製剤を可溶性電気陽性有機添加剤と接触させる工程を含む。他の実施形態では、工程（ｉ）の有機多価イオンを用いたタンパク質製剤のコンディショニングは、タンパク質製剤を第１及び第２成分と接触させる工程の少なくとも一部の間に、タンパク質製剤を可溶性電気陽性有機添加剤と接触させる工程を含む。特定のこのような実施形態において、工程（ｉ）の有機多価イオンを用いたタンパク質製剤のコンディショニングは、タンパク質製剤を第１及び第２成分と接触させる工程の少なくとも一部の間に、金属を結合できる少なくとも１つの表面結合リガンドを含む少なくとも１つの固体表面にタンパク質製剤を追加的に接触させる工程を含み、前記金属を結合できる表面結合リガンドは最初に金属を実質的に有さず、その操作条件は、所望のタンパク質が前記少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止し、得られたコンディショニングしたタンパク質製剤を少なくとも１つの表面結合リガンドから分離するように選択され、１つを超える表面結合リガンドが存在する場合、各表面結合リガンドは独立して同電荷又は電荷中性のいずれかである。
【００２８】
いくつかの実施形態において、工程（ｉ）の有機多価イオンを用いたタンパク質製剤のコンディショニングは、タンパク質製剤を、金属を結合できる少なくとも１つの表面結合リガンドを含む少なくとも１つの固体表面と接触させる工程を含み、前記金属を結合できる表面結合リガンドは最初に金属を実質的に有さず、その操作条件は、所望のタンパク質が前記少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止し、得られたコンディショニングしたタンパク質製剤を少なくとも１つの表面結合リガンドから分離するように選択され、１つを超える表面結合リガンドが存在する場合、各表面結合リガンドは独立して同電荷又は電荷中性のいずれかである。特定のこのような実施形態において、工程（ｉ）の有機多価イオンを用いたタンパク質製剤のコンディショニングは、タンパク質製剤を、金属を結合できる少なくとも１つの表面結合リガンドを含む少なくとも１つの固体表面と接触させる前に、タンパク質製剤を可溶性電気陽性有機添加剤と接触させる工程を含む；他の実施形態では、工程（ｉ）の有機多価イオンを用いたタンパク質製剤のコンディショニングは、タンパク質製剤を、金属を結合できる少なくとも１つの表面結合リガンドを含む少なくとも１つの固体表面と接触させる工程の少なくとも一部の間にタンパク質製剤を可溶性電気陽性有機添加剤と接触させる工程を含む。特定のこのような実施形態において、工程（ｉ）の有機多価イオンを用いたタンパク質製剤のコンディショニングは、タンパク質製剤を、金属を結合できる少なくとも１つの表面結合リガンドを含む少なくとも１つの固体表面と接触させる工程の少なくとも一部の間に、タンパク質製剤を、電気陰性表面を有する第１の固体基質である第１成分と接触させる工程と、電気陽性表面を有する第２の固体基質である、第２成分を提供する工程と、前記タンパク質製剤を第１及び第２成分と接触させる工程とを含み、前記第１及び第２成分は、タンパク質製剤が両成分に同時に接触し得るように構成され、その操作条件が所望のタンパク質が第１又は第２成分に結合するのを実質的に防止する工程と、コンディショニングしたタンパク質製剤中の所望のタンパク質を第１及び第２成分から分離する工程と、を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態において、工程（ｉ）タンパク質製剤のコンディショニングは、開示された要素の任意の組み合わせ又はこれらの任意の部分を含む。いくつかの実施形態において、工程（ｉ）のタンパク質製剤のコンディショニングが、細胞及び細胞培養プロセスで生じたその他の物理的デブリ残留物の除去を含む場合、そのような粒子は、本開示方法の機能化固体を構成しないと理解される。
【００３０】
いくつかの実施形態において、工程（ｉ）のタンパク質製剤のコンディショニングは、工程（ｉ）の少なくとも一部の間に、タンパク質製剤を未溶解ウレイドと接触させる工程を含む。特定のこのような実施形態において、未溶解ウレイドはアラントインである。特定のこのような実施形態において、アラントインは、約１％〜約２％の過飽和量、又は約０．６％〜約６％の過飽和量、又は約６％〜約１０％の過飽和量で存在する。特定のこのような実施形態において、アラントインは、０．６〜５０％、又は０．７〜２５％、又は０．８〜１０％、又は０．９〜５％、又は１〜２％の範囲、又は中間値の量で存在する。
【００３１】
いくつかの実施形態において、可溶性電気陽性有機添加剤は、エタクリジン、クロルヘキシジン、ポリエチレンイミン、メチレンブルー、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、及び塩化ベンザルコニウムからなる群から選択される。特定のこのような実施形態において、電気陽性添加剤はエタクリジンであり；エタクリジンは約０．０１％〜０．０５％の濃度で存在してもよい。特定のこのような実施形態において、電気陽性添加剤はメチレンブルーであり；メチレンブルーは約０．０１％〜０．０５％の濃度で存在してもよい。いくつかの実施形態において、メチレンブルー又はエタクリジは、０．０２０％〜０．０２５％の濃度で存在してもよい。いくつかの実施形態において、セチルトリメチルアンモニウムブロミドは、０．０１〜０．０５％又は０．０２０％〜０．０２５％の濃度で存在する。
【００３２】
いくつかの実施形態において、第１の基質は粒子状である。いくつかの実施形態において、第２の基質は粒子状である。特定のこのような実施形態において、１個又は複数の粒子状基質は、それぞれが複数の粒子として提供される。特定のこのような実施形態において、第１の基質、第２の基質又はその両方の粒子は非多孔質である。他の実施形態において、第１の基質、第２の基質又はその両方の粒子は多孔質であり；特定のこのような実施形態において、多孔質粒子の孔径は、タンパク質製剤中のタンパク質の侵入を許すのに十分な大きさであるが、他の実施形態では、多孔質粒子の孔径は、小さすぎてタンパク質製剤中のタンパク質の侵入を許さない。いくつかの実施形態において、多孔質粒子の平均孔径は約１ｎｍ〜約１００ｎｍである。いくつかの実施形態において、粒子は多孔質の膜又はモノリスの間に挟まれ、又は粒子は織布フィルタ又は非晶質繊維フィルタの間に挟まれ、又は粒子は結晶性フリットの間に挟まれ、又は記粒子は網状ポリマーネットワークの中に埋め込まれる。
【００３３】
前記実施形態の１つにおいて、タンパク質製剤は、第１及び第２成分を通るように製剤を流すことによって第１及び第２成分と接触する。したがって、前記実施形態の１つにおいて、タンパク質製剤は、その流体接触面に多価有機イオンを担持する１つ以上のデバイス内に製剤を流すことによって、１つ以上の不溶性多価有機イオンと接触する。
【００３４】
前記実施形態の１つにおいて、第１成分の表面の電気陰性は、１つを超える化学的官能性を包含する１種以上の複合化学部分を介して、又は表面上に混在する単純及び複雑な化学基の組合せ、又は異なる化学組成の表面の組合せを介して与えられる。
【００３５】
前記実施形態の１つにおいて、第１成分の表面の電気陰性は、部分的には、イミノ二酢酸、エチレングリコール（アミノエチルエーテル）二酢酸、ニトリロ酢酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、カルボン酸、亜硫酸、スルホナート、及びリン酸からなる群からの部分によって与えられる。
【００３６】
前記実施形態の１つにおいて、第２成分の表面の電気陽性は、１つを超える化学的官能性を包含する１種以上の複合化学基を介して、又は表面上に混在する単純及び複雑な化学基の組合せ、又は異なる化学組成の表面の組合せを介して与えられる。
【００３７】
前記実施形態の１つにおいて、第２成分の表面の電気陽性は、部分的には、トリス（２−アミノエチル）アミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラミン、ＰＡＭＡＭデンドリマー（エチレンジアミンコア）、デフェロキサミン、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基、及び四級アミノ基からなる群からの部分によって与えられる。前記実施形態の１つにおいて、第１成分の表面電気陰性は、部分的にはイミノ二酢酸によって与えられ、第２成分の表面電気陽性は、部分的にはトリス（２−アミノエチル）アミンによって与えられる。前記実施形態の１つにおいて、第１成分は金属親和性官能性を保持する表面結合した化学部分を有する。前記実施形態の１つにおいて、第２成分の電気陽性表面は、金属親和性官能性を保持する表面結合した化学部分を含む。前記実施形態の１つにおいて、少なくとも一つの基質は、金属親和性官能性を有する表面結合した化学部分に加えて１以上の化学部分を有し、かかる追加の化学部分は前記１以上の成分が、前記タンパク質製剤のタンパク質との水素結合、疎水性相互作用又はπ−π結合に関与する能力を高める。特定のこのような実施形態において、金属親和性官能性を有する表面結合した化学部分は、多座配位の金属キレート化部分である。
【００３８】
前記実施形態の１つにおいて、第１成分の電気陽性表面は、金属親和性官能性を保持する表面結合した化学部分を有し、第２成分の電気陰性表面は、金属親和性官能性を保持する表面結合した化学部分を含み、別の表面は、高い疎水性官能基を保持する表面結合化学部分を含む。
【００３９】
前記実施形態の１つにおいて、金属を結合できる表面結合リガンドは、静電相互作用、疎水性相互作用、π−π相互作用、水素結合、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される更なる化学官能性を提供する。
【００４０】
前記実施形態の１つにおいて、工程（ｉ）のタンパク質製剤を、金属を結合できる少なくとも１つの表面結合リガンドを含む少なくとも１つの固体表面と接触させる工程は、タンパク質製剤を、金属の結合を含まない化学官能性を提供する少なくとも１つの表面結合リガンドと接触させる工程を更に含む。特定のこのような実施形態において、金属の結合を含まない化学官能性を提供する少なくとも１つの表面結合リガンドは、金属を結合できる少なくとも１つの表面結合リガンドと同じ固体表面上にある；他の実施形態において、金属の結合を含まない化学官能性を提供する少なくとも１つの表面結合リガンドは、金属を結合できる少なくとも１つの表面結合リガンドと別の表面上にある。特定のこのような実施形態において、金属の結合を含まない化学官能性は、静電相互作用、疎水性相互作用、π−π結合、水素結合、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される化学官能性を提供する。
【００４１】
前記実施形態の１つにおいて、金属を結合できる表面結合リガンド上の正味の電荷は正である。特定のこのような実施形態において、金属を結合できる表面結合リガンドは、トリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラミン、デフェロキサミン（デスフェロキサミン）、ヒスチジン、ヒスタミン、ポリヒスチジン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるものを含む。
【００４２】
前記実施形態の１つにおいて、金属を結合できる表面結合リガンドの正味の電荷は負である。このような実施形態において、金属を結合できる表面結合リガンドは、イミノ二酢酸（２−（カルボキシメチルアミノ）酢酸）、エチレングリコール（アミノエチルエーテル）二酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、ニトリロ酢酸（２，２’，２’’−ニトリロ三酢酸）、アスパラギン酸、グルタミン酸、ポリアスパラギン酸、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるものを含む。
【００４３】
前記実施形態の１つにおいて、少なくとも１つの固体表面は、粒子若しくは粒子の複合体、又は繊維若しくは繊維の複合体、又は膜若しくは膜の複合体、又はモノリス若しくはモノリスの複合体を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において、異なる表面結合リガンドは、金属に結合できる少なくとも１つの表面結合リガンドを含む少なくとも１つの固体表面と構造的に類似しているが別個の固体表面上に存在する。いくつかの実施形態において、異なる表面結合リガンドは、金属に結合できる少なくとも１つの表面結合リガンドを含む少なくとも１つの固体表面と構造的に異なる固体表面上に存在する。
【００４５】
いくつかの実施形態において、工程（ｉ）におけるタンパク質製剤の導電率は、工程（ｉ）の間に試料から所望のタンパク質が沈殿するのを実質的に防止するのに十分に高いレベルである。特定のこのような実施形態において、試料の導電率は２０ｍＳ／ｃｍ超であり、又は試料の導電率は、３０ｍＳ／ｃｍ超であり、又は試料の導電率は約４０ｍＳ／ｃｍ超であり、又は試料の導電率は約１００ｍＳ／ｃｍ超であり、又は試料の導電率は、工程（ｉ）中の所望のタンパク質の沈殿を実質的に防止するのに十分な導電率よりも少なくとも５％、１０％、２０％、５０％、１００％又は２００％高い。
【００４６】
いくつかの実施形態において、陰イオン性有機ポリマーは、グリセロール、ポリエチレングリコール，ポリプロピレングリコール及びポリブチレングリコールからなる群から選択される。特定のこのような実施形態において、陰イオン性有機ポリマーは、平均分子量が２ｋＤａ〜１２ｋＤａ、又は４ｋＤＡ〜１０ｋＤａ、又は４ｋＤａ〜８ｋＤａのポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態において、ポリエチレングリコールの平均分子量は、約６ｋＤａ、又は１２ｋＤａ、又は１０ｋＤａ、又は８ｋＤａ、又は４ｋＤａ、又は２ｋＤａである。いくつかの実施形態において、陰イオン性有機ポリマーは、所望のタンパク質がアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合する前に沈殿を引き起こさない量のポリエチレングリコールである。特定のこのような実施形態において、ポリエチレングリコールは、８％、７％、６％、及び５％からなる群から選択される限度を超えない濃度のＰＥＧ−６０００である。
【００４７】
いくつかの実施形態において、非タンパク質沈殿塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、塩化グアニジン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。特定のこのような実施形態において、１種を超える非タンパク質沈殿塩が存在し、非タンパク質沈殿塩を合わせた凝集体導電率は、約３０ｍＳ／ｃｍ〜約２００ｍＳ／ｃｍの範囲である。いくつかの実施形態において、非タンパク質沈殿塩は、導電率が約５０〜１００ｍＳ／ｃｍの範囲、又は導電率が約３０〜１６０ｍＳの範囲、又は導電率が１６０ｍＳ／ｃｍを超える、塩化ナトリウムである。
【００４８】
いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィー媒体は、天然プロテインＡ、組換えタンパク質Ａ、又は組換え体由来のプロテインＡ類似体が固定化される固体材料を含む。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィー媒体は、所望のタンパク質に対する親和性を有する抗体又はそのフラグメントが固定化される材料である。他の実施形態において、アフィニティークロマトグラフィー媒体は、所望のタンパク質に対する親和性を有する細菌タンパク質若しくはその組換え変異体、又は所望のタンパク質に対する親和性を有する天然若しくは合成リガンドが固定化される材料である。
【００４９】
いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィー媒体は、クロマトグラフィーの実施に適したデバイスに収容され、モノリス、１つ又は複数の膜、１つ又は複数の粒子からなる群から選択される物理的形態である。
【００５０】
いくつかの実施形態において、所望のタンパク質は、抗体若しくは抗体フラグメント又はＦｃ融合タンパク質である。特定のこのような実施形態において、所望のタンパク質はＩｇＧ抗体である。他の実施形態では、所望のタンパク質は非ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、所望のタンパク質は組換えタンパク質である。
【００５１】
いくつかの実施形態において、タンパク質製剤は細胞培養採取物、細胞培養上清、細胞培養由来の抗体含有溶液、又はタンパク質精製の前段階からの抗体含有溶液である。
【００５２】
本明細書に開示する総合的コンディショニング方法の具体的な処理工程を、以下の一般的な実施例によって例示する。ＩｇＧモノクロナール抗体の一種のような特定の所望のタンパク質を含有する細胞含有又は無細胞の細胞培養採取物を、１〜２％のアラントインを添加することによって処理し、続いて、任意選択で、エタクリジン、メチレンブルー、又はセチルトリメチルアンモニウムブロミドを０．０２〜０．０３％の濃度で添加する。混合物を撹拌しながら１〜２時間インキュベートし、次いで水素結合及び金属親和性相互作用に参加する能力のある電気陽性粒子を混合物に添加する。このような実施形態の１つにおいて、電気陽性粒子をトリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）でコーティングし、２％〜５％ｖ／ｖの範囲の量で添加する。固体を、遠心分離又は膜濾過のような任意の簡便な方法によって除去する。コンディショニングした液体を、別の方法として若しくは更に、デプスフィルタのような、正に帯電したクロマトグラフィーデバイスに通すことによって処理する。いくつかの実施形態において、タンパク質製剤は、必要であれば、所望のタンパク質が有機多価イオン種に実質的に結合するのを防止するのに十分な量の非沈殿塩（例えば、ＮａＣｌ）と、任意の時点で組み合わされてもよい。いくつかのこのような実施形態において、所望のタンパク質はＩｇＭモノクロナール抗体である。
【００５３】
本明細書に開示される総合的コンディショニング方法の具体的な処理工程を、以下の一般的実施例により例示する。ＩｇＧモノクロナール抗体の一種のような所望のタンパク質を含有する細胞含有又は無細胞の細胞培養採取物を１〜２％のアラントインを添加することによって処理する。ｐＨを５．２まで低下させる。ノナン酸を０．３％の量で添加する。固体を遠心分離又は膜濾過によって除去し、上清を、金属親和性官能性も組み込むか又は伴ってもよい１つ以上の不溶性有機多価イオンに、例えば上記特性を有する固体表面を含有するカラム又はその他のデバイスに上清を通すことによって曝露する。このような実施形態の１つにおいて、水素結合及び金属親和性相互作用に参加する能力を有する電気陽性粒子を混合物に添加する。このような実施形態の１つにおいて、電気陽性粒子をトリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）でコーティングし、２％〜５％ｖ／ｖの量で添加する。タンパク質製剤は、必要であれば、所望のタンパク質が有機多価イオン種に実質的に結合するのを防止するのに十分な量の非沈殿塩（例えば、ＮａＣｌ）と、任意の時点で組み合わせてもよい。
【００５４】
前記実施形態の１つ以上において、抗体はＩｇＧである。このような実施形態の１つにおいて、抗体はモノクロナールＩｇＧである。密接に関係する実施形態において、所望のタンパク質は、いわゆるＦｃ融合タンパク質の必須成分であるＦｃフラグメントを含む。
【００５５】
前記実施形態の１つ以上において、本方法は、ｎｏｎ−ＩｇＧ抗体を精製するために使用される。このような実施形態の１つにおいて、抗体はＩｇＭである。
【００５６】
前記実施形態の１つ以上において、未精製試料の有機多価イオン処理は、具体的には試料への可溶性有機多価カチオンの添加を伴い、いくつかの実施形態において、添加は、０．０２〜０．０３％の最終濃度まで、所望のタンパク質の有機多価カチオンへの結合を実質的に防止する導電率において、及び任意で有機モジュレータ、特にアラントインを１〜２％のような過飽和濃度で含む有機モジュレータの存在下で行われる。
【００５７】
前記実施形態の１つ以上において、未精製試料の有機多価イオン処理は、具体的には試料への可溶性有機多価アニオンの添加を伴い、いくつかの実施形態において、添加は、０．２〜０．５％の最終濃度まで、所望のタンパク質の有機多価カチオンへの結合を実質的に防止する導電率において、及び任意で有機モジュレータ、特に１〜２％のような過飽和濃度でアラントインを含む有機モジュレータの存在下で行われる。
【００５８】
前記実施形態の１つ以上において、未精製試料の有機多価イオン処理は、具体的には表面に共有結合した有機多価カチオンへの曝露を伴い、その場合、有機多価カチオンは金属親和性及び／又は疎水官能性などの他の官能性を組み込んだ他の表面によって担持又は付随されてもよい。いくつかのこのような実施形態において、試料は事前に有機モジュレータ、特に１〜２％の過飽和濃度のアラントイン、及び／又はエタクリジンのような可溶性有機多価カチオンを含む有機モジュレータで処理されていてもよい。かかる実施形態の全てで、塩濃度は、少なくとも所望のタンパク質の荷電表面への静電結合を防止するのに十分なレベルに調節される。
【００５９】
前記実施形態の１つ以上において、所望のタンパク質をそこから精製するタンパク質製剤は、細胞含有細胞培養採取物を含む。
【００６０】
前記実施形態の１つ以上において、所望のタンパク質をそこから精製するタンパク質製剤は、細胞及びその他の物理的デブリが既に除去された培養採取物を含む。
【００６１】
前記実施形態の１つ以上において、本方法の少なくとも１つの段階は、ウイルスの不活化を意図する作用剤、例えば、リン酸トリ（ｎ）ブチル、オクタン酸、メチレンブルー、エタクリジン、クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、又は関連化合物を、潜在的に上記のような他の作用剤、特に有機溶媒及び界面活性剤などと組み合わせて、追加的に含んでもよい。
【００６２】
前記実施形態の１つ以上において、操作ｐＨは、５〜９、又は６〜８、又は７〜８、又は５、又は６、又は７、又は８の範囲であってもよい。
【００６３】
前記実施形態のいずれかにおいて、工程（ｉｉ）のクロマトグラフィー媒体は、固定化された天然プロテインＡ、組換えタンパク質Ａ、又はプロテインＡ由来の組換え類似体を担持する固体支持体からなってもよい。
【００６４】
前記実施形態のいずれかにおいて、工程（ｉｉ）のクロマトグラフィー媒体は、いわゆるアニオン交換体などの正電荷を担持する固体支持体からなってもよい。いくつかのこのような実施形態において、正電荷を担持する固体支持体は、疎水性基も担持してもよい。その他のこのような実施形態において、正電荷を担持する固体支持体は、水素結合残基、又は疎水性基と水素結合残基の組み合わせも担持してもよい。その他のこのような実施形態において、正電荷を担持する固体支持体は、金属イオンとの配位結合を形成する能力も有してもよい。
【００６５】
前記実施形態のいずれかにおいて、工程（ｉｉ）のクロマトグラフィー媒体は、いわゆるカチオン交換体などの負電荷を担持する固体支持体からなってもよい。いくつかのこのような実施形態において、負電荷を担持する固体支持体は、疎水性基も担持してもよい。その他のこのような実施形態において、負電荷を担持する固体支持体は、アパタイト材料の場合のように、カルシウムなどの不可欠金属部分も担持してもよい。
【００６６】
前記実施形態のいずれかにおいて、工程（ｉｉ）のクロマトグラフィー媒体は、モノリス、１つ若しくは複数の膜、１つ若しくは複数の粒子、又は複数の磁性粒子からなる群から選択される物理的形態であるか、又はその他の物理的形態で、クロマトグラフィーの実施に適したデバイスに収容されてもよい。
【００６７】
本開示の方法がより容易に理解されるように用語を定義する。追加の定義は、詳細な説明の全体を通して与えられる。
【００６８】
「タンパク質」とは、炭素、水素、酸素、窒素、及び通常は硫黄を含有し、主にペプチド結合で連結されたアミノ酸の１つ以上の鎖で構成された、一群の複雑な有機マクロ分子を指す。該タンパク質は、天然由来でも組換え由来でもよい。タンパク質は、グリコシル化、ＰＥＧ化、又は他の化学部分との結合を介したような、非アミノ酸部分で修飾されてよい。タンパク質の例には、抗体、凝固因子、酵素、及びペプチドホルモンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
「宿主汚染物質」又は「宿主細胞汚染物質」とは、対象となる産生物がその中で成長する細胞によって産生される生体分子を指す。この用語は、宿主タンパク質及び宿主ＤＮＡなどの様々なクラスの宿主汚染物質を包含してもよい。
【００７０】
「宿主タンパク質」又は「宿主細胞タンパク質」又は「ＨＣＰ」とは、対象となる産生物がその中で成長する細胞によって産生されるタンパク質を指す。かかるタンパク質は、対象の産生物から除去しなければならない汚染物質の１分類を表す。
【００７１】
「抗体」とは、ヒト又は他の哺乳動物細胞株由来のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥクラスの免疫グロブリンを指し、ヒト化、ヒト、単鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、突然変異、グラフト化、及びインビトロ生成抗体のような天然若しくは遺伝子改変された形態を含む。「抗体」には複合体の形態も包含され、その例としては、限定するものではないが、免疫グロブリン部分を含有する融合タンパク質、又は別の抗体、酵素、フルオロフォア若しくはその他の信号発生部分、ビオチン、薬物、又はその他の官能性部分などの別の官能性部分へのＩｇＧの合成結合によって生成する免疫複合体が挙げられる。
【００７２】
「エンドトキシン」とは、グラム電気陰性菌の外膜に存在し、溶解の際に細胞から放出される有毒な熱安定性リポ多糖物質を指す。エンドトキシンは、それらのリン酸及びカルボキシ残基の含有量が高いために、一般的に酸性となることができ、またリピドＡ領域の脂肪酸含有により、高度に疎水性となることができる。エンドトキシンは、水素結合のための広範な機会を提供することができる。
【００７３】
「電気陽性有機添加剤」は、少なくとも１つの正電荷を担持し、複数の正電荷を含有し得る天然又は合成由来の有機分子、カチオン又は塩を指す。電気陽性有機添加剤は、負電荷も担持する場合があるが、そのような場合、添加剤が使用される操作条件下で正味の正電荷を維持すると考えられる。電気陽性有機添加剤が正味で正の場合、該添加剤は、塩化物イオン、臭化物イオン、硫酸イオン、有機酸イオン、乳酸イオン（lactactes）、グルコン酸イオン、及び本方法に不適合ではない任意のその他のアニオンのような対イオン（アニオン）と共に提供されてもよい。いくつかの実施形態において、電気陽性有機添加剤の正電荷のいくらかはアミン、イミン又はその他の窒素部分によって提供される。電気陽性有機添加剤は、追加的に疎水性残基、金属親和性残基、水素結合残基、その他の官能性部分を包含してもよく、及び／又は他の種類の化学的相互作用に参加する能力を保持してもよい。いくつかの実施形態における電気陽性有機添加剤の例としては、限定するものではないが、ジアミノ酸、ジ−、トリ、又はそれ以上のホモ−又はヘテロ−ペプチド、例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン；ポリエチレンイミン；ポリアリルアミン；ポリジメトリン、ポリメチルアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニア；ポリジアリルジメチルアンモニア；ポリビニルベンジルトリメチルアンモニア；ポリビニルグアニジン；ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジン；ＤＥＡＥ−デキストラン；ＤＥＡＥ−セルロース；エタクリジン（ＣＡＳ番号４４２−１６−０；７−エトキシアクリジン−３，９−ジアミン）；トリス（２−アミノエチル）アミン；グアニジン；クロルヘキシジン；アレキシジン；シトリシダル、プロタミン；スペルミン；スペルミジン；サルミン；キトサン；及び上記のものの変異体及び誘導体が挙げられる。例えば、エタクリジンの変異体及び誘導体は、９−アミノアクリジン（アミナクリン）、３，６−アクリジンジアミン（プロフラビン）、アクリゾルシン、アクリザン（フェナクリダン）、アクリジンオレンジ、キナクリン、アクリサイド、アクリドン、アクリジン−９−カルボン酸、アクラニル（１−［（６−クロロ−２−メトキシ−９−アクリジニル）アミノ］−３−（ジエチルアミノ）−２−プロパノール二塩酸塩）、フェノサフラニン、フェノキサジン、フェノチアジン、アクリフラビン（３，６−ジアミノ−１０−メチルアクリジニウム、塩化物、及び３，６−アクリジンジアミン）、及びそれらの塩（例えば塩化物、臭化物、硫酸塩、乳酸塩、グルコン酸塩）；メチレンブルー、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、クロルヘキシジン、及び塩化ベンザルコニウムを含むと理解される。
【００７４】
「アニオン交換クロマトグラフィー」は、酸性（電気陰性）汚染物質は正電荷に結合する傾向があり、アルカリ性（電気陽性）汚染物質は正電荷からはね返される傾向があり、非荷電又は電気的中性の汚染物質は正電荷に結合しない傾向があるなど、異なる電荷特性の試料成分間の分画を仲介する表面に関して、固体表面に共有結合した正電荷を用いるプロセスを指す。かかるシステムの選択性は、一般的にｐＨ及び導電率によって制御され、一般的に、ｐＨの上昇及び／又は塩濃度の低下と共に、結合が強くなる。
【００７５】
「アニオン交換膜」又は「電気陽性膜」は、多孔膜で、その表面が正電荷で支配されている膜を指す。膜の孔は、５ｎｍ以下〜１μｍ以上の範囲である。２００ｎｍ未満の孔を有する膜は限外濾過膜と呼ばれることが多く、２００ｎｍを超える孔を有する膜は精密濾過膜と呼ばれることが多い。電気陽性は、アミノ、エチレンジアミノ、ジエチルアミノエチル、ポリアリルアミン、ポリベンザリルアミン（ｐｏｌｙｂｅｎｚａｌｌｙｌａｍｉｎｅ）、ポリエチレンイミンのような弱いアニオン交換基；四級アミノ基のような強いアニオン交換基；弱い交換体と強い交換体の組み合わせ、例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、又はトリス（２−アミノエチル）アミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラミン、ＰＡＭＡＭデンドリマー（エチレンジアミンコア）、又は前記の任意の組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない化学基によって付与される。正に帯電した膜上に種々の化学的特性を作り出す二次的官能基は、負又は正に帯電した基、疎水性基、π−π結合基、水素結合基、又は金属キレート化基からなってもよい。二次的官能基は、粒子を合成する製造材料又はプロセスの偶発的副生成物として膜表面上に存在してもよく、又は意図的な設計によって存在してもよい。二次的官能基の濃度は、粒子１ｍＬ当たり１ミリ当量未満から、１ｍＬ当たり１００ミリ当量超までの範囲であってもよい。
【００７６】
「アニオン交換粒子」又は「電気陽性粒子」は、多孔質又は非多孔質の粒子で、その表面が正電荷で支配されている粒子を指す。粒径は、５０ｎｍ未満〜２００μｍ超の範囲である。粒子は、ポリマー、結晶、又はセラミック構造を備えてもよく、本明細書に開示される方法を実施する能力を必要としないか又は妨害しない手段による該粒子の隔離を可能とするが、何らかの全体的な強化を提供する特徴も組み込んでもよい。例としては、限定するものではないが、浮上分離を可能とする低密度、急速沈降を強化する高密度、及び／又は磁場での回収を可能にする磁気を付与する特徴が挙げられる。電気陽性は、アミノ、エチレンジアミノ、ジエチルアミノエチル、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミンのような弱アニオン交換基；四級アミノ基のような強アニオン交換基；弱交換体と強交換体の組み合わせ、例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、又はトリス（２−アミノエチル）アミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラミン、ＰＡＭＡＭデンドリマー（エチレンジアミンコア）、又はこれらの任意の組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない化学基によって付与されてもよい。正に帯電した膜上に混在した化学的特徴を形成する二次的官能基は、負又は正に帯電した基、疎水性基、π−π結合基、水素結合基、又は金属キレート化基からなってもよい。二次的官能基は、粒子を合成する製造材料又はプロセスの偶発的生成物として膜表面上に存在してもよく、又は意図的な設計によって存在してもよい。二次的官能基の濃度は、粒子１ｍＬ当たり１ミリ当量未満から、１ｍＬ当たり１００ミリ当量超までの範囲であってもよい。
【００７７】
「電気陽性表面」とは、正電荷によって支配される基質又は固体材料の表面を指す。表面の電気陽性は、アミノ、エチレンジアミノ、ジエチルアミノエチル、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミンのような弱いアニオン交換基、四級アミノ基のような強いアニオン交換基；ポリリジン、ポリアルギニン、若しくはトリス（２−アミノエチル）アミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラアミン、ＰＡＭＡＭデンドリマー（エチレンジアミンコア）、デフェロキサミン又は上記の任意の組合せのような弱い交換体と強い交換体の組み合わせなどであるが、これらに限定されない化学基によって与えられてもよい。正に帯電した表面上に混在した化学的特徴を形成する二次的官能基は、負又は正に帯電した基、疎水性基、π−π結合基、水素結合基、又は金属キレート化基からなってもよい。二次的官能基は、それによって当該粒子が合成される製造材料又はプロセスの偶発的副生成物として電気陽性表面上に存在してよく、又は意図的な設計によって存在してもよい。二次的官能基の濃度は、１粒子１ｍＬ当たり１ミリ当量未満から１ｍＬ当たり１００ミリ当量超までの範囲であってもよい。
【００７８】
「電気陰性表面」とは、負電荷によって支配される基質又は固体材料の表面を指す。表面の電気陰性は、カルボキシル、アミノカルボキシル（イミノ二酸又はニトリロアセチル）、又はホスホリルのような、いわゆる弱いカチオン交換体、又はスルホ若しくはサルフェート部分、ＳＯ３−のような強い交換体などであるが、これらに限定されない化学基によって与えられてもよい。負に帯電した表面上に混在した化学的特徴を形成する二次的官能基は、負又は正に帯電した基、疎水性基、π−π結合基、水素結合基、若しくは金属キレート化基からなってもよい。二次的官能基は、粒子が合成される製造プロセスの偶発的副生成物として電気陰性表面に存在してもよく、又は意図的な設計により存在してもよい。二次的官能基の濃度は、粒子１ｍＬ当たり１ミリ当量未満から１ｍＬ当たり１００ミリ当量超までの範囲であってもよい。
【００７９】
「電気陰性有機添加剤」は、少なくとも１つの負電荷を担持し、複数の負電荷を含有し得る天然又は合成由来の有機分子、アニオン又は塩を指す。電気陰性有機添加剤は、正電荷も担持する場合があるが、そのような場合、添加剤が使用される操作条件下で正味の負電荷を維持すると考えられる。電気陰性有機添加剤が正味で負の場合、カリウム、ナトリウム、アンモニウム、本方法に不適合ではない任意のその他のカチオンのような対イオン（アニオン）と共に提供されてもよい。いくつかの実施形態において、電気陰性有機添加剤の負電荷のいくらかは、カルボキシル、スルホ、又はホスホ部分によって供給される。電気陰性有機添加剤は、追加的に疎水性残基、金属親和性残基、水素結合残基、その他の官能性部分を包含してもよく、及び／又は他の種類の化学的相互作用に参加する能力を保持してもよい。いくつかの実施形態における負に帯電した有機多価イオンの例としては、限定するものではないが、メチルブルー及び脂肪酸、例えば、ヘプタン酸、へプテン酸、オクタン酸、オクテン酸、ノナン酸、ノネン酸、デカン酸、及びこれらの塩（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム）が挙げられる。
【００８０】
「リガンド」又は「表面結合リガンド」は、他の化学物質に結合する１つ以上の化学的部分又は官能基からなる集合を指す。いくつかの実施形態において、リガンドは凝集の形成又は安定化に寄与する試料（タンパク質製剤）成分の結合を意図して表面上に固定化される。リガンドは、負電荷、正電荷、又は疎水性基のように、組成がかなり単純であってもよく、又はより複雑な構成であって、成分が個別に行うことができない相互作用を通じて化学物質に結合する能力をリガンドに付与する２つ以上の別個の成分を包含してもよい。更に、所与のリガンドは、その主要又は優勢な機構以外の機構を通じて他の物質と相互作用する能力を付与する場合がある。例えば、金属親和性リガンドのイミノ二酢酸は、ほとんどの操作条件下で負に帯電する２個のカルボキシル基と、低ｐＨで正に帯電し得る窒素基とを含有する。イミノ二酢酸は、金属親和性を組み込むことに加え、静電相互作用及び水素結合によっても他の化学物質と相互作用し得る。金属親和性リガンドのＴＲＥＮは、表面上で固定化されたときに、２つの一級アミン、１つの二級アミン、１つの三級アミンを含有する。ＴＲＥＮは全体として、水溶液中に溶解された金属と強力な会合を形成することができる一方で、個々のアミンは静電及び／又は水素結合に参加することができる。
【００８１】
「金属親和性官能性」とは、いくつかの実施形態においては１：１の形で、金属イオンを結合するために表面に固定化され得る化学部分の能力を指す。このような部分は、金属イオンとの配位結合を形成する能力を有してもよく、特定のそのような部分は二座配位又は多座配位の性質であってもよい。この能力を備えた電気陰性部分の非限定的な例には、イミノ二酢酸（２−（カルボキシメチルアミノ）酢酸）及びニトリロ酢酸（２，２’，２”−ニトリロ三酢酸）が挙げられる。電気陽性化合物の例には、トリス（２−アミノエチル）アミン若しくはジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラミン、及びデフェロキサミンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００８２】
「有機多価イオン」とは、少なくとも一つの電荷及び少なくとも一つの追加の化学官能性を有し、それゆえ多価になった、天然若しくは合成由来の有機分子、イオン又は塩を指す。かかるイオンを特徴付ける別の用語は、マルチモーダル有機イオンである。有機多価イオンが関与するいくつかの実施形態において、有機多価イオンが２つ以上の同様又は異なる電荷を担持するように、有機多価イオンの少なくとも一つの追加の化学官能性は追加の電荷である。有機多価イオンは、正味の正電荷、正味の負電荷、又は正味の中性電荷を担持してもよく、ここで中性は有機多価イオンの双性イオン性組成物を示す。有機多価イオンが正味の正電荷である場合、該イオンは塩化物イオン、臭化物イオン、硫酸イオン、有機酸イオン、乳酸イオン、グルコン酸イオンのようなアニオン、及び本方法に不適合ではない任意の他のアニオンと共に提供されてもよい。いくつかの実施形態において、有機多価イオンの正電荷のいくらかは、アミン、イミン又はその他の窒素部分によって供給される。有機多価イオンは追加的に化学的特徴が混在し、疎水性残基その他の官能性部分を包含してもよく、及び／又は他の種類の化学的相互作用に参加する能力、例えば、水素結合、疎水性相互作用、π−π結合、金属配位及びインターカレーションに参加する能力を有してもよい。いくつか実施形態における正に帯電した有機多価イオンの例としては、限定するものではないが、ジアミノ酸、ジ−、トリ−又はそれ以上のホモ−若しくはヘテロ−ペプチド、例えばポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン；ポリエチレンイミン；ポリアリルアミン；ポリジメトリン、ポリメチルアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニア；ポリジアリルジメチルアンモニア；ポリビニルベンジルトリメチルアンモニア；ポリビニルグアニジン；ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジン；ＤＥＡＥ−デキストラン；ＤＥＡＥ−セルロース；エタクリジン（ＣＡＳ番号４４２−１６−０；７−エトキシアクリジン−３，９−ジアミン）；トリス（２−アミノエチル）アミン；グアニジン；クロルヘキシジン；アレキシジン；シトリシダル、プロタミン；スペルミン；スペルミジン；サルミン；キトサン；並びに上記のものの変異体及び誘導体が挙げられる。例えば、エタクリジンの変異体及び誘導体には、９−アミノアクリジン（アミナクリン）、３，６−アクリジンジアミン（プロフラビン）、アクリゾルシン、アクリザン（フェナクリダン）、アクリジンオレンジ、キナクリン、アクリサイド、アクリドン、アクリジン−９−カルボン酸、アクラニル（１−［（６−クロロ−２−メトキシ−９−アクリジニル）アミノ］−３−（ジエチルアミノ）−２−プロパノール二塩酸塩）、フェノサフラニン、フェノキサジン、フェノチアジン、アクリフラビン（３，６−ジアミノ−１０−メチルアクリジニウム、塩化物、及び３，６−アクリジンジアミン）、及びそれらの塩（例えば塩化物、臭化物、硫酸塩、乳酸塩、グルコン酸塩）が包含されると理解される。有機多価イオンが正味で負の場合、カリウム、ナトリウム、アンモニウム、又は本方法に不適合ではない任意のその他のカチオンと共に提供されてもよい。いくつかの実施形態において、有機��価イオンの負電荷のいくらかは、カルボキシル、ホスホ、又はスルホ部分によって供給される。有機多価イオンは追加的に化学的特徴が混在し、疎水性残基その他の官能性部分を包含してもよく、及び／又は他の種類の化学的相互作用に参加する能力、例えば、水素結合、疎水性相互作用、π−π結合、金属配位及びインターカレーションに参加する能力を有してもよい。いくつかの実施形態における正に帯電した有機多価イオンの例としては、限定するものではないが、エタクリジン、メチレンブルー、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、カチオン性ポリマー、及びこれらの塩（例えば塩化物、臭化物、硫酸塩、乳酸塩、グルコン酸塩）が挙げられる。いくつかの実施形態における負に帯電した有機多価イオンの例としては、限定するものではないが、メチルブルー及び脂肪酸、例えば、ヘプタン酸、へプテン酸、オクタン酸、オクテン酸、ノナン酸、ノネン酸、デカン酸、及びこれらの塩（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム）が挙げられる。
【００８３】
「ポリヌクレオチド」とは、鎖状に共有結合された複数のヌクレオチドモノマーで構成されるバイオポリマーを指す。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）及びＲＮＡ（リボ核酸）は、ポリヌクレオチドの例である。ポリヌクレオチドは、高い水素結合形成傾向を有することができる。
【００８４】
「タンパク質製剤」とは、対象の細胞を含有する任意の水性又はほぼ水性の溶液、例えば、細胞含有細胞培養採取物、（実質的に）無細胞の細胞培養上清、又は精製段階からの得た対象のタンパク質を含有する溶液を指す。
【００８５】
「基質」又は「固体材料」とは、粒子状、結晶質、ポリマー、繊維状、多孔質中空繊維状、モノリシック、膜の性質であってもよい不溶性有機固体を指す。また、非多孔質又は多孔質の粒子、多孔質膜、多孔質フィルタ、又は多孔質モノリスからなってもよい。粒子状の場合、粒子はほぼ球状であってもよく、球状でなくてもよく、１００ｎｍ未満から１００ミクロン超の範囲のサイズであってよい。多孔質粒子の平均孔径は、１０ｎｍ未満（微孔質）から１００ｎｍ超（マクロ孔質）の範囲であってもよい。膜における平均孔径は、１００ｎｍ未満から１ミクロン超の範囲であってもよい。膜又はモノリスにおける平均チャンネル径は、１ミクロン未満から１０ミクロン超の範囲であってもよい。更に、固体材料は複合構造からなっていてよく、例えば、網目状マトリックス内に粒子が埋め込まれるか、膜の間に挟まれるか、又はその両方であってよい。
【００８６】
「過飽和ウレイド」とは、特にタンパク質製剤に一般的な条件下で、最大溶解度を超える量のウレイドを含有する溶液を指す。いくつかの実施形態において、本発明は、かかるウレイドのいくらかの画分が試料中に未溶解の形態で存在するような、かかる試料の条件下で、かかる試料中のかかるウレイドの溶解度を超える量でウレイドが存在する試料を提供する。
【００８７】
「界面活性剤」とは、一般に、それらを両親媒性に疎水性部分及び親水性部分を有することから両親媒性と呼ばれる有機分子の分類のような「表面活性化剤」を包含する。界面活性剤は、いずれも水性溶液中で十分な濃度において、疎水性部分を中心に集中して水との接触を最小化し、親水性部分を放射状に外側に向けて水との接触を最大化した状態で、クラスターへと自己会合することができる。生物学的製剤、特に疎水性の特徴を有するか、又は疎水性の特徴領域を保有する生物学的製剤の存在下で、界面活性剤の疎水性部分は、疎水性材料のいくらかの部分と自然に会合し、界面活性剤の親水性部分の影響によってその溶解度が増大する傾向がある。界面活性剤は、水性溶媒中に溶解された異なる疎水性材料の間で生じる疎水性相互作用を調節するためにも使用できる。本開示の方法の実施に好適な界面活性剤の例としては、限定するものではないが、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ２０、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、及びＴｗｅｅｎ８０、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレアート）、及びＴｒｉｔｏｎ（例えば、ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）、並びに双性イオン性界面活性剤、例えばＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート）、ＣＨＡＰＳＯ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート）、及びオクチルグルコシド（例えば、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−（ヒドロキシメチル）−６−オクトキシオキサン−３，４，５−トリオール）が挙げられる。
【００８８】
「ウレイド」とは、天然若しくは合成由来の環状又は非環状の有機分子であって、１つ以上の尿素部分又はその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、本方法に、尿素、尿酸、ヒダントイン、アラントイン（ＣＡＳ番号９７−５９−６；アルクロキサ、アルジオキサ、ヘモケイン（ｈｅｍｏｃａｎｅ）、ウレイドヒダントイン、５−ウレイドヒダントイン、グリオキシルウレイド、グリオキシル酸ジウレイド、２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル尿素）、プリン、及びこれらの誘導体のようなウレイドが提供される。一定の実施形態において、本方法には、式Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ２又はＲ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ’又はＲ’Ｒ’’ＮＨ−ＣＯ−ＮＲ’’’Ｒ’’’’の有機分子が提供され、ここで関連の「Ｒ基」はＨ又は任意の有機部分である。
【００８９】
「ウイルス」又は「ビリオン」は、生きた宿主、主にバクテリア、植物、及び動物の細胞内でのみ複製する超微視的（直径がおおよそ２０〜３００ｎｍ）で、代謝的に不活性な感染物質であり：ＲＮＡ又はＤＮＡコア、タンパク質コート、及び更に複雑な種類では周囲の外皮で構成される。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
いくつかの実施形態において、細胞あり又はなしでの、ＩｇＧ含有細胞培養採取物のコンディショニングにおける有用な出発点は、１％アラントインを細胞含有又は無細胞の細胞培養上清に添加し、続いてメチレンブルー、又はエタクリジン、又はセチルトリメチルアンモニウムブロミドを最終濃度０．０２５％にて添加する工程である。この混合物を、撹拌しながら１〜２時間インキュベートする。正に帯電した金属親和性粒子、例えば、ＢｉｏＷｏｒｋｓ  ＴＲＥＮ  ｈｉｇｈを近生理学的条件（一般的にｐＨ約６．８〜７．２、及び導電率１２〜１７ｍＳ／ｃｍを表すと理解される）に平衡化する。試料体積の２〜５％の量の平衡化粒子を前記混合物に添加し、撹拌しながら２〜４時間インキュベートする。続いて、遠心分離及び／又は深層濾過等の濾過のような簡便な方法によって固体を除去する。深層濾過を使用してもよい場合、デプスフィルタは正電荷を担持してもよい。ＩｇＧの場合、生理学的導電率は、ほとんどの場合は粒子への結合によるＩｇＧ損失を防止するのに十分であるが、かかる結合を防止するために必要な最小導電率を決定するために実験が必要な場合があることは理解されるべきである。ＩｇＭ及びその他のタンパク質の場合、プロセスのいかなる所与の工程でも損失を防止するために、導電率を実質的に高くする必要がある場合がある。ＩｇＭでは、しばしば、塩の添加によって導電率を２０ｍＳ／ｃｍ、又は２５ｍＳ／ｃｍまで増大する必要がある。他のタンパク質種の場合、導電率を３０ｍＳ／ｃｍ以上まで増大する必要がある場合がある。驚くべきことに、本方法は、生理学的導電率の３倍を超える高さの導電率値、例えば約４５ｍＳ／ｃｍでも有効である。ＴＲＥＮ粒子の代わりに、他の種類のリガンドで官能化された粒子、又はそのような粒子の組み合わせ、潜在的には例えば、Ｃｈｅｌｅｘ１００、Ｍａｃｒｏｒｅｐ  Ｈｉｇｈ−Ｓ、及びＭａｃｒｏｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ−Ｑなどを探索することは有用である。特別に合成した粒子などの多種多様な代替材料を使用してもよいこと、及び所与の所望のタンパク質に最善の条件については個別に実験が必要であると考えられることは、当業者には明らかであろう。
【００９１】
いくつかの実施形態において、細胞あり又はなしでの、ＩｇＧ含有細胞培養採取物のコンディショニングにおける有用な出発点は、ｐＨを５．２に調節し、１％アラントインを細胞含有又は無細胞の細胞培養上清に添加し、続いてノナン酸を０．３％の最終濃度まで添加する工程である。実験結果は、ノナン酸が最も良い全体的結果を支持することを示すが、０．７％のヘプタン酸、０．４％のオクタン酸、及び０．２％のデカン酸などの他の脂肪酸も評価してもよい。メチルブルーも０．５％で評価してもよい。この混合物を、撹拌しながら１〜２時間インキュベートする。正に帯電した金属親和性粒子、例えば、ＢｉｏＷｏｒｋｓ  ＴＲＥＮ  ｈｉｇｈをｐＨ５．２及び導電率１２〜１７ｍＳ／ｃｍに平衡化する。試料体積の２〜５％の量の平衡化粒子を前記混合物に添加し、撹拌しながら２〜４時間インキュベートする。実験データは、過剰な粒子は、不十分な量の場合と同様に、本方法の性能を低下させることを示す。最善の結果は、ほとんどの場合、約５％で得られたが、２％という少量でも十分な結果が支持される場合がある。続いて、遠心分離及び／又は深層濾過等の濾過のような簡便な方法によって固体を除去する。いくつかの実施形態において、粒子をカラムに充填し、タンパク質製剤をその中に通してもよい。深層濾過を使用する場合、デプスフィルタは正電荷を担持してもよい。ＩｇＧの場合、生理学的導電率は、ほとんどの場合は粒子への結合によるＩｇＧ損失を防止するのに十分であるが、かかる結合を防止するために必要な最小導電率を決定するために実験が必要な場合があることは理解されるべきである。ＴＲＥＮ粒子の代わりに、他の種類のリガンドで官能化された粒子、又はそのような粒子の組み合わせ、潜在的には例えば、Ｃｈｅｌｅｘ  １００、Ｍａｃｒｏｒｅｐ  Ｈｉｇｈ−Ｓ、及びＭａｃｒｏｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ−Ｑなどを探索することは有用である。特別に合成した粒子などの多種多様な代替材料を使用してもよいこと、及び所与の所望のタンパク質に最善の条件については個別に実験が必要であると考えられることは、当業者には明らかであろう。
【００９２】
いくつかの実施形態において、ＩｇＧ含有細胞培養採取物のコンディショニングにおける有用な出発点は、電気陽性金属親和性粒子を試料体積の２〜５％の量で添加し、撹拌しながら２〜４時間インキュベートする工程である。かかる実施形態においては、粒子を事前に生理学的条件に平衡化する必要がある。いくつかのこのような実施形態において、開示される方法は、ＢｉｏＷｏｒｋｓ  ＴＲＥＮ  ｈｉｇｈのような、金属アフィニティークロマトグラフィー用に販売されているクロマトグラフィーを用いて実施できる。インキュベーション後、粒子を簡便な方法、任意追加的には例えば、電気陽性濾過媒体を用いた深層濾過を用いて、除去する。
【００９３】
いくつかの実施形態において、細胞あり又はなしでの、ＩｇＧ含有細胞培養採取物のコンディショニングにおける有用な出発点は、１％アラントインを細胞含有又は無細胞の細胞培養上清に添加し、続いてエタクリジン酸を０．０２５％の最終濃度まで添加する工程である。予備実験結果は、エタクリジン酸は最善の全体的結果を支持することを示すが、メチレンブルー及び／又はセチルトリメチルアンモニウムのような他の電気陽性有機イオンは、同じ濃度で有用な効果を与える。この混合物を、撹拌しながら１〜２時間インキュベートする。正に帯電した金属親和性粒子、例えば、ＢｉｏＷｏｒｋｓ  ＴＲＥＮ  ｈｉｇｈを、中性のｐＨ及び導電率１２〜１７ｍＳ／ｃｍに平衡化し、あるいは、又は任意により、負に帯電したポリマー粒子上の疎水性部分を含む電気陰性固体基質、又は疎水性ポリマー上の負に帯電した金属キレート化部分と組み合わせる。試料体積の２〜５％の量の平衡化粒子を前記混合物に添加し、撹拌しながら２〜４時間インキュベートする。実験データは、過剰な粒子は、不十分な量の場合と同様に、本方法の性能を低下させることを示す。最善の結果は、ほとんどの場合、約５％で得られたが、２％という少量でも十分な結果が支持される場合がある。続いて、遠心分離及び／又は深層濾過等の濾過のような簡便な方法によって固体を除去する。いくつかの実施形態において、粒子をカラムに充填し、タンパク質製剤をその中に通してもよい。深層濾過を使用する場合、デプスフィルタは正電荷を担持してもよい。ＩｇＧの場合、生理学的導電率は、ほとんどの場合は粒子への結合によるＩｇＧ損失を防止するのに十分であるが、かかる結合を防止するために必要な最小導電率を決定するために実験が必要な場合があることは理解されるべきである。ＴＲＥＮ粒子の代わりに、他の種類のリガンドで官能化された粒子、又はそのような粒子の組み合わせ、潜在的には例えば、Ｃｈｅｌｅｘ１００、Ｍａｃｒｏｒｅｐ  Ｈｉｇｈ−Ｓ、及びＭａｃｒｏｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ−Ｑなどを探索することは有用である。特別に合成した粒子などの多種多様な代替材料を使用してもよいこと、及び所与の所望のタンパク質に最善の条件については個別に実験が必要であると考えられることは、当業者には明らかであろう。
【００９４】
開示されるコンディショニング方法の全てが所望のタンパク質の不純製剤のクロマチン含有量の低減を明確に目的とすること、クロマチンの組成は所望の生成物に依存しないこと、及び死んだ宿主細胞由来のクロマチンは細胞培養に遍在する汚染物質であることから、開示される方法は、任意の細胞培養プロセスで産生されたいかなる所望のタンパク質にも適用できることは、理解されるであろう。微生物細胞であっても、哺乳類細胞と同様に、本開示方法に対応するクロマチン類似体を含有することは、注目に値する。
【００９５】
上記のようにコンディショニングされた不純製剤を、タンパク質の精製に使用される公知の吸着クロマトグラフィー法に適用することは、適切なクロマトグラフィー媒体の選択方法、及び特定の所望のタンパク質に合わせた条件設定方法を含めて、当業者の経験の範囲内である。
【００９６】
本明細書に開示される方法を使用することによって得られる結果は化学プロセスの関数であることから、全ての物理的フォーマットが類似の結果を達成することができるが、異なるレベルの効率、異なる流体体積、及び異なる時間間隔でそれを達成する場合があることは理解されるべきである。多孔質粒子、又は吸着膜ユニット、又はモノリスが充填されたカラムに対応するようにプロセスを適合させる方法を決定することは当業者の活動の範囲内である。
【実施例】
【００９７】
実施例１  コンディショニング方法の比較。約１．２ｇ／Ｌの抗−ＨＥＲ２モノクロナールＩｇＧを含有する細胞含有採取物を３種の方法でコンディショニングした。第１は、遠心分離の後、０．２２μｍ膜を通して濾過する構成からなった。第２は、遠心分離の後、アニオン交換デプスフィルタを通して濾過する構成からなった。第３は、１％アラントイン（１０ｇ）を１リットルの採取物に添加した後、エタクリジンを０．０２５％の最終濃度まで添加する構成からなった。混合物を撹拌しながら１５分間インキュベートした後、固体を濾過により除去した。等しい割合の、正に帯電した金属親和性粒子（ＢｉｏＷｏｒｋｓ  ＴＲＥＮ  ｈｉ−ｓｕｂ）、負に帯電した金属親和性粒子（Ｃｈｅｌｅｘ−１００）、及び正に帯電した疎水性粒子（Ｄｏｗｅｘ  ＡＧ  １ｘ２  ４００メッシュ）を組み合わせた。２０ｍＬの粒子混合物を１．６×１０ｃｍカラムに充填し、近生理学的条件に平衡化し、試料を３００ｃｍ／時の線流速でカラムに通した。上記３種の方法のそれぞれによってコンディショニングした材料を、固定化プロテインＡ（ｒＡＦ  プロテインＡ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍ）のカラムにアプライし、１Ｍ  ＮａＣｌ  ２００ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．７で洗った後、１００ｍＭアルギニン、１００ｍＭアセタート、ｐＨ３．７で溶出した。第１の試料の宿主タンパク質汚染は、９７２ｐｐｍのＩｇＧであり；第２は、７６ｐｐｍ；第３は、１ｐｐｍ未満であった。
【００９８】
実施例２  コンディショニング方法がプロテインＡの最大結合容量に与える影響。実施例１の方法１〜３によって作製した細胞培養上清を、別のタンパク質カラムに、カラム溶出液からＩｇＧが検出されるまでアプライした。第１の方法によってコンディショニングした材料で５％漏出の時点でカラムに結合したＩｇＧの量は約２７．３ｍｇ／ｍＬであった。第３の方法でコンディショニングした材料の場合、これに対応する量は約３３．７ｍｇ／ｍＬであった。精製ＩｇＧを使用して理論的最大結合容量を決定するための別の実験において、５％漏出は３４．０ｍｇ／ｍＬで検出された。
【００９９】
実施例３  異なるプロテインＡ製品の影響。実施例１の方法３でコンディショニングした抗体をＵＮＯｓｐｈｅｒｅＳｕＰｒＡ組換えタンパク質Ａ（組換えタンパク質Ａ）、及びカラムＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ（プロテインＡ由来の組換え誘導体）のカラムにもアプライした。ｒＡＦプロテインＡ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌは宿主タンパク質を１ｐｐｍ未満まで低減したのに対し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔカラムは７ｐｐｍまで、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅは１１ｐｐｍまで低減した。
【０１００】
実施例４  後続の最終精製工程の結果。実施例１で得られた１ｐｐｍ未満を含有する精製抗体を、アニオン交換カラムのＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑにアプライし、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．２で平衡化し、ボイド排除モードで操作した。精製抗体中に検出可能な宿主タンパク質は存在しなかった。他の分析方法及び実験からのデータをまとめると、更に以下の結果が明らかになった。ＤＮＡは、コンディショニング工程で５ｌｏｇ低減し、プロテインＡ工程で３ｌｏｇ、アニオン交換工程で３ｌｏｇ低減した。マウスの混合ウイルスは、コンディショニング工程で５ｌｏｇ、プロテインＡ工程で３．５ｌｏｇ、アニオン交換工程で３．５ｌｏｇ低減した。マウス白血病ウイルスは、コンディショニング工程で４ｌｏｇ、プロテインＡ工程で４．５ｌｏｇ、アニオン交換工程で４ｌｏｇ低減した。ＩｇＧ回収率はコンディショニング工程で９９％、プロテインＡ工程で９５％、アニオン交換工程で９９％であり、全プロセス回収率は９３％であった。他のコンディショニング−プロテインＡ−アニオン交換プロセスによるＩｇＧ収率は８０％を超えることがまれであることから、上記は、この総合的方法の別の重要な利益を強調する。
【０１０１】
実施例５  吸着クロマトグラフィー方法の比較。１．５ｇ／Ｌの抗ＨＥＲ２モノクロナールＩｇＧを含有する無細胞採取物を、１％アラントインを添加した後、ｐＨを５．２に下げることによってコンディショニングした。ノナン酸を約０．４％の最終濃度まで添加し、撹拌しながら２時間インキュベートした。Ｂｉｏｗｏｒｋｓ  ＴＲＥＮ粒子を、５０ｍＭＨｅｐｅｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に平衡化した。沈降したＴＲＥＮ粒子を、５％（体積対体積；ｖ：ｖ）の量で製剤に添加し、混合物を撹拌しながら４時間インキュベートした。固体を深層濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＰＣＩ）によって除去した。宿主タンパク質汚染はＩｇＧ４８５ｐｐｍまで低減され、当初採取物の２５９，０００ｐｐｍから９９％を超える低減を示した。ＤＮＡは６ｌｏｇ低減した。試料の一部を５０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０に平衡化し、同じ条件に平衡化したカチオン交換クロマトグラフィーカラム（ＰＯＲＯＳ  ＨＸＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にアプライした後、漸増ＮａＣｌ勾配で溶出した。宿主タンパク質汚染は１ｐｐｍ未満に低減された。試料の別の一部を、５０ｍＭリン酸、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７に平衡化した混合モード疎水性カチオン交換カラム（Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＨＣＸ）にそのままアプライし、漸増塩勾配で溶出した。宿主タンパク質汚染は１ｐｐｍ未満に低減された。試料の別の一部を、５０ｍＭリン酸、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７に平衡化したプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ  ６５０Ｆ、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にそのままアプライし、１００ｍＭ酢酸、ｐＨ３．５で溶出した。宿主タンパク質汚染は１ｐｐｍ未満に低減された。試料の別の一部を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．２に平衡化したアニオン交換カラムのＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にそのままアプライし、ボイド排除モード（Ｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ，ｓｕｐｒａ），Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で操作した。ボイド画分中の宿主タンパク質汚染は６ｐｐｍに低減された。
【０１０２】
実施例６  ２５９，２１８ｐｐｍの宿主タンパク質汚染物質及び２１％の凝集体を含有するＩｇＧ含有細胞培養採取物に、１％アラントイン、０．４％カプリル酸、ｐＨ５．２を添加することによってコンディショニングし；２時間インキュベートし、その後電気陽性金属親和性粒子（ＴＲＥＮ  ４０  ｈｉｇｈ、Ｂｉｏ−Ｗｏｒｋｓ）を４％の量で添加して、撹拌しながら更に４時間インキュベートし、続いて電気陽性デプスフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＰＣＩ）を通して固体を除去した。宿主タンパク質は３０８ｐｐｍまで、凝集体は０．０５％未満まで低減した。流体力学的径が５０ｋＤａの仮想球状タンパク質に相当する平均孔径を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて接線流濾過サブユニットをセットした。強力なアニオン交換モノリス（ＣＩＭ  ＱＡ、ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を用いて単一吸着クロマトグラフィーサブユニットをセットした。コンディショニングした採取物を、吸着クロマトグラフィーユニットがオフラインの状態で限外濾過サブユニットに通して約２０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。吸着クロマトグラフィーサブユニットを接線流濾過サブユニットと共にラインに入れ、緩衝剤を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に交換した。システムを流れる緩衝剤が流入緩衝剤と同じｐＨ及び導電率に達したら、吸着クロマトグラフィーサブユニットのラインをすすぎ、ＩｇＧを回収した。凝集体は０．０１％未満まで低減し、宿主タンパク質は１１ｐｐｍまで低減した。
【０１０３】
実施例７  実施例６のコンディショニングした採取物を、同じ接線流濾過サブユニットを有するが、吸着クロマトグラフィーサブユニットをＳａｒｔｏｂｉｎｄフェニル膜吸着剤（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）に置き換えたシステムにアプライした。コンディショニングした採取物を、ラインに吸着クロマトグラフィーがない状態で、約２０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。上記フェニル吸着クロマトグラフィーサブユニットをラインに入れ、緩衝剤を５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１．７Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に交換した。システムを流れる緩衝剤が流入緩衝剤と同じｐＨ及び導電率に達したら、フェニル吸着クロマトグラフィーサブユニットのラインをすすぎ、ＩｇＧを回収した。凝集体は０．０１％未満まで低減し、宿主タンパク質は９ｐｐｍまで低減した。
【０１０４】
実施例８  実施例６のコンディショニングした採取物を、同じ接線流濾過サブユニット、及び同じ吸着クロマトグラフィーサブユニットを有するが、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄフェニル膜吸着剤（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）の形態の追加の吸着クロマトグラフィーサブユニットを有するシステムにアプライした。コンディショニングした採取物を、ラインに吸着クロマトグラフィーがない状態で、約２０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。上記フェニル吸着クロマトグラフィーサブユニットをラインに入れ、緩衝剤を５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１．７Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に交換した。システムを流れる緩衝剤が流入緩衝剤と同じｐＨ及び導電率に達したら、フェニル吸着クロマトグラフィーサブユニットのラインをすすぎ、オフラインに切り替えると同時に、ＱＡモノリス吸着クロマトグラフィーサブユニットをオンラインにした。緩衝剤を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に交換した。システムを流れる緩衝剤が流入緩衝剤と同じｐＨ及び導電率に達したら、ＱＡモノリス吸着クロマトグラフィーサブユニットラインをすすぎ、ＩｇＧを回収した。凝集体は０．０１％未満まで低減し、宿主タンパク質は１ｐｐｍまで低減した。
【０１０５】
実施例９  実施例８の実験を、ＱＡモノリスをアニオン交換吸着クロマトグラフィーユニットに置換したことを除き、同じ材料及び条件で実施した。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ膜吸着剤（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）の置換の結果、宿主タンパク質は１ｐｐｍに低減した。耐塩性相互作用クロマトグラフィー膜吸着剤（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）の置換の結果、宿主タンパク質は１ｐｐｍに低減した。ＤＥＡＥ（ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）の置換の結果、宿主タンパク質は１ｐｐｍに低減した。ＥＤＡモノリス（ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）の置換の結果、宿主タンパク質は１ｐｐｍに低減した。凝集体のレベルは、全ての実験で０．０１％未満に低減した。
【０１０６】
実施例１０  流体力学的径が３０ｋＤａの仮想球状タンパク質に相当する平均孔径を有する膜のセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて接線流濾過サブユニットをセットしたことを除いて、実施例８の実験フォーマットを再現した。フェニル吸着クロマトグラフィーサブユニットは同じであった。精製ＩｇＧ中の宿主タンパク質汚染は２ｐｐｍまで低減した。凝集体は０．０１％未満であった。
【０１０７】
実施例１１  ＥＤＡモノリスの形態の第２の吸着クロマトグラフィーサブユニットを含むことを除いて、実施例９の実験枠組みを再現した。宿主タンパク質は検出不可能であった。凝集体は０．０１％未満であった。
【０１０８】
実施例１２  ２４３，９９７ｐｐｍの宿主タンパク質汚染物質及び２４％の凝集体を含有するＩｇＧ含有細胞培養採取物を、１％アラントイン、０．４％カプリル酸、ｐＨ５．２を添加することによってコンディショニングし；２時間インキュベートし、その後電気陽性金属親和性粒子（ＴＲＥＮ  ４０  ｈｉｇｈ、Ｂｉｏ−Ｗｏｒｋｓ）を４％の量で添加して、撹拌しながら更に４時間インキュベートし、続いて電気陽性デプスフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＰＣＩ）を通して固体を除去した。宿主タンパク質は３０５ｐｐｍまで低減し、凝集体は０．０５％未満まで低減した。抗体をカチオン交換クロマトグラフィーによって更に精製し、宿主タンパク質を５ｐｐｍまで低減し、これを、流体力学的径が３０ｋＤａの仮想球状タンパク質に相当する平均孔径を有するセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた接線流濾過サブユニット、及び強力なアニオン交換モノリス（ＣＩＭ  ＱＡ、ＢＩＡＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を用いた単一吸着クロマトグラフィーサブユニットを用いた本開示装置の一形態にアプライした。宿主タンパク質は検出不可能であった。凝集体は０．０１％未満であった。
【０１０９】
実施例１３  ２４３，９９７ｐｐｍの宿主タンパク質汚染物質及び２４％の凝集体を含有するＩｇＧ含有細胞培養採取物を、１％アラントイン、０．４％カプリル酸、ｐＨ５．６を添加することによってコンディショニングし；２時間インキュベートし、その後電気陽性金属親和性粒子（ＴＲＥＮ  ４０  ｈｉｇｈ、Ｂｉｏ−Ｗｏｒｋｓ）を４％の量で添加して、撹拌しながら更に４時間インキュベートし、続いて電気陽性デプスフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＰＣＩ）を通して固体を除去した。宿主タンパク質は３，５５１ｐｐｍまで低減し、凝集体は０．５％未満まで低減した。抗体を、１．８Ｍ硫酸アンモニウムで沈殿させることによって更に精製して、宿主タンパク質を１，４２３ｐｐｍに低減し、これを、流体力学的径が５０ｋＤａの仮想球状タンパク質に相当する平均孔径を有するＰＥＳ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた接線流濾過サブユニット、及び強力なアニオン交換モノリス（ＣＩＭ  ＱＡ、ＢＩＡＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を用いた単一吸着クロマトグラフィーサブユニットを用いた本開示装置の一形態にアプライした。宿主タンパク質は１２ｐｐｍに低減された。凝集体は０．０５％未満であった。
【０１１０】
実施例１４  ＨＥＲ２抗原に対して特異的なＩｇＧモノクロナール抗体を約１ｇ／Ｌ含有する細胞培養採取物１Ｌを、１％アラントインで処理した。導電率は約１３ｍＳ／ｃｍで、ｐＨは約６．８であった。この添加剤は、沈降を加速する効果があった。固体材料を濾過によって除去し、輝きのある透明な抗体含有濾液を得た。抗体回収率は９９％であった。２０ｍＬのＢｉｏＷｏｒｋｓ  ＴＲＥＮ  ｈｉ−ｓｕｂ（アガロース多孔性粒子をベースとした電気陽性金属親和性材料）をカラム（１．６×１０ｃｍ）に充填し、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に平衡化した。清澄化した濾液を、２００ｃｍ／時の線流速で上記カラムに通した。当初の採取物は、２０％を超える凝集体を含有し、特に少なくとも１０％のいわゆる高分子量凝集体を含有した。処理後の試料は０．０５％未満の高分子量凝集体及び４％未満の全凝集体を含有した。蛍光色素試験による測定では、ＤＮＡは９８％超低減していたが、ｑＰＣＲは、低減は実際には９９．９９９％を超えることを示した。ヒストンタンパク質は少なくとも９８％低減し、Ｃｙｇｎｕｓ  ＥＬＩＳＡで測定した全体的な宿主タンパク質レベルは６２％低減した。抗体回収率は９９％であった。
【０１１１】
実施例１５  ＴＲＥＮを、ＴＲＥＮにＤｏｗｅｘＡＧ  １ｘ２（疎水性電気陽性粒子状材料）を加えた１：１混合物に置き換えたことを除いて、実施例１４の手順を繰り返した。抗体回収率が９５％に低減されたことを除き、全ての結果がほぼ同じであり、分析用サイズ排除クロマトグラフィーは実施例１５の後に明白であった２つの強疎水性汚染物質が排除されたことを示した。
【０１１２】
本方法は、任意のアフィニティークロマトグラフィー方法及びアフィニティークロマトグラフィー方法によって精製できる任意の所望のタンパク質に対して有益な効果を共に適用できることは、当業者に明らかであろう。本方法に適した技術としては、特に、その名前にアフィニティー（親和性）の語を有するもの、例えば、免疫親和性、生物学的親和性、生体親和性、疑似生体親和性、生体模倣親和性が挙げられる。
【０１１３】
本明細書に開示される方法は、より高いレベルの精製を達成するために、他の精製方法と組み合わされてもよい。そのような他の精製方法の例としては、限定するものではないが、タンパク質の精製に通常使用される他の方法、例えば、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、及び追加的な混合モードクロマトグラフィー法が挙げられる。様々な方法にとって適切な条件を開発すること、及び特定の抗体の必要な精製を達成するためにそれらを本明細書中の本発明と統合することは、当業者の範囲内である。
【０１１４】
本明細書に引用された全ての参考文献は、各個別の刊行物又は特許又は特許出願が、明確に及び個別に、それらの全体があらゆる目的のために参照により援用されることが示された場合と同程度に、その全体があらゆる目的のために参照により援用される。参照により援用される刊行物及び特許又は特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する範囲について、本明細書が、そのような任意の矛盾する材料に取って代わる及び／又は優先するものとする。
【０１１５】
本明細書及び請求項で使用される、成分の量、クロマトグラフィー条件などを表す全ての数は、全ての場合において用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、反対の表示がない限り、本明細書及び添付の請求項に示される数値パラメータは、本発明によって得ようとする所望の性能に応じて変動し得る近似値である。
【０１１６】
本発明の多くの改変及び変形は、当業者に明らかであるように、その精神及び範囲から逸脱することなく実施することができる。本明細書中に記載される特定の実施形態は、単なる例として提供されるものであって、何ら限定を意味するものではない。本明細書及び実施例は、単なる例示と考えられることが意図されており、本明細書に開示される方法の真の範囲及び精神は、以下の請求項によって示される。
【国際調査報告】
2016509068.tif 000002
2016509068.tif 000003
2016509068.tif 000004