(57)【要約】  本発明は、広くは人工内部共生体を含む宿主細胞に関し、該人工内部共生体と宿主細胞とは互いに情報伝達を行い、宿主細胞の表現型を変化させる。いくつかの実施形態では、情報伝達は人工内部共生体から宿主細胞内へのポリペプチドの分泌を含む。分泌ポリペプチドは、選択マーカー、レポータータンパク質、転写因子、シグナル経路タンパク質、受容体、成長因子、サイトカイン、エフェクター分子、または宿主細胞において表現型を形成することのできるその他の因子であってよい。
2016528928.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工内部共生体を含む宿主細胞であって、前記人工内部共生体は、異種タンパク質を宿主細胞内に分泌することで、前記宿主細胞に表現型を付与する、宿主細胞。
【請求項２】
前記タンパク質は選択マーカーである、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
前記タンパク質はレポータータンパク質である、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項４】
前記レポータータンパク質はＧＦＰである、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項５】
前記人工内部共生体はα−プロテオバクテリアを含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項６】
前記人工内部共生体は走磁性微生物を含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項７】
前記宿主細胞は哺乳類細胞を含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項８】
前記哺乳類細胞は、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ブタ、ウシ、ネコ科、イヌ科、またはヒトの細胞から選択される、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
宿主細胞に表現型を付与する方法であって、
人工内部共生体を含む宿主細胞を培養する工程を含み、
前記人工内部共生体は、異種核酸によってコードされる分泌タンパク質を発現し、前記タンパク質は前記宿主細胞内へ分泌されて前記宿主細胞内において表現型を形成する、方法。
【請求項１０】
前記タンパク質は選択マーカーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記タンパク質はレポータータンパク質である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記レポータータンパク質はＧＦＰである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記人工内部共生体はα−プロテオバクテリアを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記人工内部共生体は走磁性微生物を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記宿主細胞は哺乳類細胞を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳類細胞は、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ブタ、ウシ、ネコ科、イヌ科、またはヒトの細胞から選択される、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年９月３日に出願された米国特許仮出願６１／８７３，３０８の利益を主張するものであり、その内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表、表、またはコンピュータプログラムへの言及
配列表の正式な写しは、ＡＳＣＩＩフォーマットのテキストファイルの形式で、「ＢＥＬＬ．０１８＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」なるファイル名で、ＥＦＳ−ウェブで本明細書とともに提出したものである。該ファイルの作成日は２０１４年９月３日、ファイルサイズは９６２キロバイトである。このＥＦＳ−ウェブで提出した配列表は、本明細書の一部をなすものであり、その内容のすべては参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００３】
技術分野
本発明は、広くは人工内部共生体を含む宿主細胞に関し、該宿主細胞の人工内部共生体は、宿主細胞と情報を伝達し、宿主細胞の態様を変化させるものである。
【背景技術】
【０００４】
背景
組換えＤＮＡ技術の出現は、非近縁種間での遺伝物質の伝達を防いできた自然界の障壁を排除し、生物の遺伝的構成を変えることを可能にした。微生物は生育および操作が容易であることや、異種遺伝子導入に利用可能な技術が多くあることから、組換えＤＮＡ技術を用いた遺伝子操作に使用するモデル微生物が作成されている。組換えＤＮＡ技術を用いたグラム陰性菌及びグラム陽性菌の操作が成功している。微生物細胞の形質転換技術は十分に確立されており、異なる微生物の遺伝子操作が比較的容易であること、増殖時間が短いこと、およびゲノムが比較的小さいことから、微生物は、新規な人工的生物学的経路、新規人工生物、もしくは新規人工装置の創造、または既存の自然の生物学的システムの再設計を目的とする合成生物学用途の目的達成手段として使用されてきた。さらに、微生物は多様な機能、例えば固有の代謝経路（例えば光合成や化学合成）、走磁性（Ｂｌａｋｅｍｏｒｅ，Ｒ．，“Ｍａｇｎｅｔｏｔａｃｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４：３７７−３７９，１９７５）、好極限性（例えば好熱性）を有しており、この多様な機能は、宿主微生物に存在する特性を有する組換え微生物の作製を可能にするものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
組換えＤＮＡ技術はまた、真核細胞の遺伝子構成を一過性に、または遺伝性の特徴として操作するのにも使用されてきた。例えば、標的相同組換えによって、異種遺伝子を含む組換え動物を作製することができる。技術の進歩にも拘わらず、組換えＤＮＡ技術による真核細胞の操作は、微生物の操作に比べ困難である。組換えＤＮＡ操作標的となるいくつかの真核細胞、例えば哺乳類細胞は、微生物細胞に比べて成長速度が遅く、異種核酸を含む真核細胞の選択により多くの時間が必要となる。長期間維持される改変、例えば遺伝性の改変を包含する真核細胞の作製には、典型的には相同組換えの使用を必要とする。この相同組換えは、技術が進歩したとはいえ、効率が低いままである。加えて、複数の異なる異種核酸の導入は、真核生物がより高い複雑性を有する（例えば細胞小器官が存在する）こと、複数の異種因子に対する応答の予測不能性がより大きいこと、および様々な遺伝的／表現型変化を有する真核細胞の選択が技術的に不利なことによって、複雑なものとなっている。したがって、真核細胞に新たな機能を付与する、これまでとは異なる真核細胞の操作方法の発見が望まれている。そのような方法は、単独で使用しても、真核細胞を改変するための組換えＤＮＡ技術と組み合わせて使用してもよい。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
本発明は、人工内部共生体との情報伝達および／または化学的情報の伝達によって改変または再プログラムされた宿主細胞に関する。いくつかの実施形態では、本発明の人工内部共生体はポリペプチド、核酸、脂質、炭水化物、アミノ酸、およびその他因子を、宿主細胞に分泌する、および／または宿主細胞から輸送する。いくつかの実施形態では、人工内部共生体はタンパク質を宿主細胞内へ分泌する。いくつかの実施形態では、分泌タンパク質は、人工内部共生体にとって異種タンパク質である。いくつかの実施形態では、人工内部共生体から分泌されたタンパク質は宿主細胞の表現型を形成する。いくつかの実施形態では、本発明の人工内部共生体は、核酸を宿主細胞内に分泌する。いくつかの実施形態では、該核酸は組換え核酸である。いくつかの実施形態では、人工内部共生体から分泌された核酸は、宿主細胞の表現型を形成する。
【０００７】
本発明はまた、ポリペプチド、核酸、脂質、炭水化物、アミノ酸、またはその他因子を宿主細胞に分泌、および／または宿主細胞から輸送する人工内部共生体を導入することによって該宿主細胞を改変する方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法は、人工内部共生体から宿主細胞へとタンパク質を導入する。いくつかの実施形態では、本方法は、人工内部共生体から宿主細胞へと核酸を導入する。いくつかの実施形態では、本方法は、人工内部共生体から導入されたポリペプチドおよび／または核酸によって得られる宿主細胞の表現型を形成する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本発明の宿主細胞および方法は、治療、生物薬剤、農業、および工業用途に有用な、医学的および工業的に重要な組換えペプチド／タンパク質を作成するために使用される。いくつかの実施形態では、本発明の人工内部共生体および方法は、複数の因子および／または複数の遺伝子の導入を必要とする表現型を宿主細胞に導入するために使用される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は哺乳類の細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はヒト、マウス、ラット、イヌ科、霊長目、またはげっ歯目の細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、線維芽細胞、表皮細胞、ケラチン生成細胞、肝細胞、脂肪細胞、または内皮細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、幹細胞、多能性ＥＳ細胞、多能性ｉＰＳ細胞、多能性間葉系幹細胞、または多能性造血幹細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、前駆細胞であり、その例として、神経前駆細胞、血管芽細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞、膵前駆細胞、および表皮前駆細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、固形腫瘍細胞、または造血器がん細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、がん腫、肉腫、白血病、リンパ腫、または神経膠腫由来である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、前立腺がん、乳がん、肺がん、大腸がん、膵がん、黒色腫、膠芽腫、肝がん、またはＮＣＩ６０がん細胞株パネルから作製されたものである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】マグネトスピリラム・マグネティカム（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ）ＡＭＢ−１株由来のＶ型分泌経路のアドヘシンＡｉｄＡのアミノ酸配列（配列番号１）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。検索で得られた、検索クエリとしてマグネトスピリラム・マグネティカム、ＡＭＢ−１、アドヘシン、ＡｉｄＡを含む、相同領域の配列例は、配列番号１〜１０３に示される。
【図１Ｂ】マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株由来のＶ型分泌経路のアドヘシンＡｉｄＡのアミノ酸配列（配列番号１）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。検索で得られた、検索クエリとしてマグネトスピリラム・マグネティカム、ＡＭＢ−１、アドヘシン、ＡｉｄＡを含む、相同領域の配列例は、配列番号１〜１０３に示される。
【図１Ｃ】マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株由来のＶ型分泌経路のアドヘシンＡｉｄＡのアミノ酸配列（配列番号１）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。検索で得られた、検索クエリとしてマグネトスピリラム・マグネティカム、ＡＭＢ−１、アドヘシン、ＡｉｄＡを含む、相同領域の配列例は、配列番号１〜１０３に示される。
【図１Ｄ】マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株由来のＶ型分泌経路のアドヘシンＡｉｄＡのアミノ酸配列（配列番号１）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。検索で得られた、検索クエリとしてマグネトスピリラム・マグネティカム、ＡＭＢ−１、アドヘシン、ＡｉｄＡを含む、相同領域の配列例は、配列番号１〜１０３に示される。
【図２Ａ】マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株由来のＲＴＸ毒素と称される、アクセション番号ＹＰ＿４２０６４０のタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１０４）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。検索で得られた、検索クエリとしてマグネトスピリラム・マグネティカム、ＡＭＢ−１、ＲＴＸ毒素、ＹＰ＿４２０６４０を含む、相同領域の配列例は、配列番号１０４〜１２２に示される。
【図２Ｂ】マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株由来のＲＴＸ毒素と称される、アクセション番号ＹＰ＿４２０６４０のタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１０４）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。検索で得られた、検索クエリとしてマグネトスピリラム・マグネティカム、ＡＭＢ−１、ＲＴＸ毒素、ＹＰ＿４２０６４０を含む、相同領域の配列例は、配列番号１０４〜１２２に示される。
【図２Ｃ】マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株由来のＲＴＸ毒素と称される、アクセション番号ＹＰ＿４２０６４０のタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１０４）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。検索で得られた、検索クエリとしてマグネトスピリラム・マグネティカム、ＡＭＢ−１、ＲＴＸ毒素、ＹＰ＿４２０６４０を含む、相同領域の配列例は、配列番号１０４〜１２２に示される。
【図２Ｄ】マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株由来のＲＴＸ毒素と称される、アクセション番号ＹＰ＿４２０６４０のタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１０４）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。検索で得られた、検索クエリとしてマグネトスピリラム・マグネティカム、ＡＭＢ−１、ＲＴＸ毒素、ＹＰ＿４２０６４０を含む、相同領域の配列例は、配列番号１０４〜１２２に示される。
【図３Ａ】マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株由来のＲＴＸ毒素と称される、アクセション番号ＹＰ＿４２３４１９のタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１２３）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。検索で得られた、検索クエリとしてマグネトスピリラム・マグネティカム、ＡＭＢ−１、ＲＴＸ毒素、ＹＰ＿４２３４１９を含む、相同領域を含む配列例は、配列番号１２３〜１２９に示される。
【図３Ｂ】マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株由来のＲＴＸ毒素と称される、アクセション番号ＹＰ＿４２３４１９のタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１２３）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。検索で得られた、検索クエリとしてマグネトスピリラム・マグネティカム、ＡＭＢ−１、ＲＴＸ毒素、ＹＰ＿４２３４１９を含む、相同領域を含む配列例は、配列番号１２３〜１２９に示される。
【図３Ｃ】マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株由来のＲＴＸ毒素と称される、アクセション番号ＹＰ＿４２３４１９のタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１２３）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。検索で得られた、検索クエリとしてマグネトスピリラム・マグネティカム、ＡＭＢ−１、ＲＴＸ毒素、ＹＰ＿４２３４１９を含む、相同領域を含む配列例は、配列番号１２３〜１２９に示される。
【図３Ｄ】マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株由来のＲＴＸ毒素と称される、アクセション番号ＹＰ＿４２３４１９のタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１２３）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。検索で得られた、検索クエリとしてマグネトスピリラム・マグネティカム、ＡＭＢ−１、ＲＴＸ毒素、ＹＰ＿４２３４１９を含む、相同領域を含む配列例は、配列番号１２３〜１２９に示される。
【図４Ａ】マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株由来の巨大細胞外タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１３０）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。
【図４Ｂ】マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株由来の巨大細胞外タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１３０）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。
【図４Ｃ】マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株由来の巨大細胞外タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１３０）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。
【図４Ｄ】マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株由来の巨大細胞外タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１３０）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。
【図５Ａ】マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株由来のＶ型分泌経路のタンパク質（アクセション番号ＹＰ＿４２０６３８）のアミノ酸配列（配列番号１３１）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。
【図５Ｂ】マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株由来のＶ型分泌経路のタンパク質（アクセション番号ＹＰ＿４２０６３８）のアミノ酸配列（配列番号１３１）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。
【図５Ｃ】マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株由来のＶ型分泌経路のタンパク質（アクセション番号ＹＰ＿４２０６３８）のアミノ酸配列（配列番号１３１）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。
【図５Ｄ】マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株由来のＶ型分泌経路のタンパク質（アクセション番号ＹＰ＿４２０６３８）のアミノ酸配列（配列番号１３１）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。
【図６Ａ】マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株由来のＲＴＸ毒素と称される、アクセション番号ＹＰ＿４２２６６２のタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１３２）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。検索で得られた、検索クエリであるマグネトスピリラム・マグネティカム、ＡＭＢ−１、ＲＴＸ毒素、ＹＰ＿４２２６６２を含む、相同領域の配列例は、配列番号１３２〜１４０に示される。
【図６Ｂ】マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株由来のＲＴＸ毒素と称される、アクセション番号ＹＰ＿４２２６６２のタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１３２）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。検索で得られた、検索クエリであるマグネトスピリラム・マグネティカム、ＡＭＢ−１、ＲＴＸ毒素、ＹＰ＿４２２６６２を含む、相同領域の配列例は、配列番号１３２〜１４０に示される。
【図６Ｃ】マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株由来のＲＴＸ毒素と称される、アクセション番号ＹＰ＿４２２６６２のタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１３２）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。検索で得られた、検索クエリであるマグネトスピリラム・マグネティカム、ＡＭＢ−１、ＲＴＸ毒素、ＹＰ＿４２２６６２を含む、相同領域の配列例は、配列番号１３２〜１４０に示される。
【図６Ｄ】マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株由来のＲＴＸ毒素と称される、アクセション番号ＹＰ＿４２２６６２のタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１３２）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。検索で得られた、検索クエリであるマグネトスピリラム・マグネティカム、ＡＭＢ−１、ＲＴＸ毒素、ＹＰ＿４２２６６２を含む、相同領域の配列例は、配列番号１３２〜１４０に示される。
【図７】マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株由来のＹＰ  ４２２７８５のＣ末端から９４９番目までのアミノ酸配列（配列番号１４１）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。検索で得られた、ＹＰ  ４２２７８５を含む相同領域の配列例は、配列番号１４１〜２５３に示される。
【図８Ａ】マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株由来の、ＡＢＣ型プロテアーゼ／リパーゼ輸送システムの構成要素であるＡＴＰ分解酵素および透過酵素（パーミアーゼ）のアミノ酸配列（配列番号２５４）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。検索で得られた、検索クエリであるマグネトスピリラム・マグネティカム、ＡＭＢ−１  ＡＴＰ分解酵素（ＡＴＰアーゼ）および透過酵素を含む、相同領域の配列例は、配列番号２５４〜２６８に示される。
【図８Ｂ】マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株由来の、ＡＢＣ型プロテアーゼ／リパーゼ輸送システムの構成要素であるＡＴＰ分解酵素および透過酵素のアミノ酸配列（配列番号２５４）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。検索で得られた、検索クエリであるマグネトスピリラム・マグネティカム、ＡＭＢ−１  ＡＴＰ分解酵素および透過酵素を含む、相同領域の配列例は、配列番号２５４〜２６８に示される。
【図８Ｃ】マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株由来の、ＡＢＣ型プロテアーゼ／リパーゼ輸送システムの構成要素であるＡＴＰ分解酵素および透過酵素のアミノ酸配列（配列番号２５４）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。検索で得られた、検索クエリであるマグネトスピリラム・マグネティカム、ＡＭＢ−１  ＡＴＰ分解酵素および透過酵素を含む、相同領域の配列例は、配列番号２５４〜２６８に示される。
【図８Ｄ】マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株由来の、ＡＢＣ型プロテアーゼ／リパーゼ輸送システムの構成要素であるＡＴＰ分解酵素および透過酵素のアミノ酸配列（配列番号２５４）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。検索で得られた、検索クエリであるマグネトスピリラム・マグネティカム、ＡＭＢ−１  ＡＴＰ分解酵素および透過酵素を含む、相同領域の配列例は、配列番号２５４〜２６８に示される。
【図９Ａ】シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｓ）由来の耐熱性リパーゼＴｌｉＡのアミノ酸配列（配列番号２６９）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。検索で得られた相同領域の配列例は、配列番号２７０〜２８６に示される。
【図９Ｂ】シュードモナス・フルオレッセンス由来の耐熱性リパーゼＴｌｉＡのアミノ酸配列（配列番号２６９）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。検索で得られた相同領域の配列例は、配列番号２７０〜２８６に示される。
【図９Ｃ】シュードモナス・フルオレッセンス由来の耐熱性リパーゼＴｌｉＡのアミノ酸配列（配列番号２６９）のＢＬＡＳＴ検索結果を示す図である。検索で得られた相同領域の配列例は、配列番号２７０〜２８６に示される。
【図１０】ＡＣ１６細胞の細胞外上清（ＮＣＢＩアクセション番号ＹＰ＿４２２７８５のＣ末端輸送配列に融合したＧＦＰを含むＭ．マグネティカムＡＭＢ−１株）の緑色蛍光強度を、Ｍ．マグネティカムＡＭＢ−１株のネガティブコントロール（ＡＭＢ−１  Ｎｅｇ  Ｃｔｒｌと記載）と比較した図である（実施例４を参照）。
【図１１】ＡＣ１６細胞の培養上清の緑色蛍光タンパク質の蛍光強度を、ＡＣ１６細胞懸濁液の蛍光強度と比較した図である。図１１はまた、Ｍ．マグネティカムＡＭＢ−１株のＮｅｇ  Ｃｔｒｌ細胞の上清の蛍光強度と、Ｍ．マグネティカムＡＭＢ−１株のＮｅｇ  Ｃｔｒｌ細胞懸濁液の蛍光強度との比較も示している。
【図１２】ＡＭＢ−１標識されたＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の蛍光顕微鏡画像を示す図である（倍率４０倍）。ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞はＡＭＢ−１で標識された。ここでＡＭＢ−１は、（Ａ）ＧＦＰプラスミドのみを含むか、または（Ｂ）ＹＰ＿４２２７８５（つまりＡＣ１６）Ｃ末端の２００アミノ酸に融合したＧＦＰを含む。次いで、ＧＦＰおよびＡＭＢ−１による二重染色を、微生物を用いた１日間のポストラベリングによって行い、蛍光顕微鏡法によって観察した（詳細は、実施例４を参照）。両パネルは、ＧＦＰ（赤）、ＡＭＢ−１（緑）、およびＤＡＰＩ（青）の染色画像を重ね合わせたものである。
【図１３】ＡＭＢ−１標識されたＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の蛍光顕微鏡画像を示す図である（シングルチャンネルの重ね合わせ画像）（倍率４０倍）。ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞は、ＧＦＰプラスミドのみを含むＡＭＢ−１で標識された後、１日間のポストラベリングによって二重染色され、蛍光顕微鏡法で観察された。左上パネル（Ａ）は、ＡＭＢ−１染色（緑色チャンネル）、右上パネル（Ｂ）はＧＦＰ染色（赤色チャンネル）、左下パネル（Ｃ）はＤＡＰＩ染色（青色チャンネル）、（Ｄ）はＡＭＢ−１染色（緑色チャンネル）、ＧＦＰ染色（赤色チャンネル）、およびＤＡＰＩ染色（青色チャンネル）の重ね合わせ画像である。
【図１４】ＡＭＢ−１標識されたＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の蛍光顕微鏡画像を示す図である（シングルチャンネルの重ね合わせ画像）（倍率４０倍）。ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞は、ＹＰ＿４２２７８５（ＡＣ１６）Ｃ末端の２００アミノ酸に融合したＧＦＰを含むＡＭＢ−１で標識された後、１日間のポストラベリングによって二重染色され、蛍光顕微鏡法で観察された。左上パネル（Ａ）はＡＭＢ−１染色（緑色チャンネル）、右上パネル（Ｂ）はＧＦＰ染色（赤色チャンネル）、左下パネル（Ｃ）はＤＡＰＩ染色（青色チャンネル）、右下パネル（Ｄ）はＡＭＢ−１染色（緑色チャンネル）、ＧＦＰ染色（赤色チャンネル）、およびＤＡＰＩ染色（青色チャンネル）の重ね合わせ画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
詳細な説明
本発明は、人工内部共生体を含む宿主細胞に関し、該人工内部共生体は、ポリペプチド、核酸、またはその他の因子を、宿主細胞内に分泌する、および／または宿主細胞から輸送するものである。いくつかの実施形態では、タンパク質や核酸等の因子は宿主細胞内に分泌され、宿主細胞の表現型、特に人工内部共生体の宿主細胞への導入以前には存在しなかった表現型を形成する。いくつかの実施形態では、人工内部共生体は２種類以上の因子（つまり複数の因子）を、宿主細胞内に分泌する、および／または宿主細胞から輸送する。いくつかの実施形態では、宿主細胞内への分泌は、人工内部共生体の内因性分泌装置および分泌シグナル（例えば配列）、または、宿主細胞への因子の輸送を行う分泌システムを含むよう操作された人工内部共生体を用いて行うことができる。
【００１２】
本発明の多様な実施形態をさらに説明するに先立って、本開示は、記載された具体的な実施形態に限定されるものではなく、種々の変形が可能であると理解されるべきであることをここに注記する。また、本明細書で使用される用語は、具体的な実施形態を説明する目的のみにおいて使用されるものであり、本発明を限定する意図で用いるものではない。
【００１３】
本開示および添付の特許請求の範囲において記載される単数形を示す「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、明らかに複数の態様を含まない文脈を除いて、複数の態様も示すものとする。また、「または（ｏｒ）」なる語は、明らかに「および（ａｎｄ）」の意を含まない文脈を除いて、「および」の意も含むものとする（逆も同様）。さらに、「または（ｏｒ）」の使用は、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」の意でないと記載される場合を除き、「および／または」の意で使用するものとする。
【００１４】
加えて、「含む（「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、および「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」）」なる語は相互変換可能であり、限定を意図しないものとする。種々の実施形態に関する記載で「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」なる語を使用するが、当業者は、ある特定の例においては、「〜から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「〜からなる（ｃｏｎｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」の語を用いてある実施形態を別の形で記載することができると理解するであろう。
【００１５】
物質の濃度またはレベルに関する数値の限定は、おおよその数値であるとする。したがって、濃度が少なくとも（例えば）１０μｇと記載される場合、濃度が少なくとも約またはおおよそ１０μｇであることを表す。
【００１６】
本明細書に記載される各節の題名は、構成上の目的のみで使用され、記載する発明の主題を限定する目的で使用するものではない。
【００１７】
定義
本明細書で使用する「人工内部共生体」なる用語は、人為的に宿主細胞に導入される、または導入された単細胞の生物を意味する。該単細胞生物は、１種または複数種のポリペプチド、核酸、脂質、炭水化物、アミノ酸、またはその他因子を、宿主細胞内に分泌する、または宿主細胞から輸送する。そして、単細胞生物と宿主細胞とのこのような情報伝達によって、宿主細胞および／または人工内部共生体の表現型が形成される。
【００１８】
本明細書で使用する「細胞周期」なる用語は、真核細胞の成長、複製、および細胞分裂を含む一連の事象を意味する。「細胞周期」は一般に５つの段階に分けられ、それぞれ、細胞の静止期であるＧ０期、細胞がその大きさを増すＧ１およびＧ２期、細胞のＤＮＡの複製が起こるＳ期、ならびに細胞の有糸分裂および細胞分裂が起こるＭ期として知られている。
【００１９】
本明細書で使用する「娘細胞」なる用語は、細胞の分裂によって形成される細胞を意味する。
【００２０】
本明細書で使用する「必須分子」なる用語は、細胞の成長または生存に必要な分子を意味する。
【００２１】
本明細書で使用する「遺伝子操作」なる用語は、細胞の所望の性質または特徴が変化するように、該細胞のＤＮＡを改変することを意味する。
【００２２】
本明細書で使用する「マグネトソーム」なる用語は、鞘または膜で包まれたマグネタイト（つまりＦｅ３Ｏ４）またはグライガイト（Ｆｅ３Ｓ４）の粒子を意味する。該粒子は、独立した粒子でも、粒子鎖を形成していてもよい。
【００２３】
本明細書で使用する「走磁性微生物」または「ＭＴＢ」なる用語は、磁場に指向性を有しうる微生物を意味する。
【００２４】
本明細書で使用する「哺乳類」なる用語は、温血の脊椎動物であって、体毛を皮膚上に有し、メスにおいては、乳を生成する乳腺を有することを特徴とする動物を意味する。
【００２５】
本明細書で使用する「表現型」なる用語は、環境と個体の遺伝子型との相互作用の結果として現れる、個体の観察可能な一群の特徴を意味する。
【００２６】
本明細書で使用する「分泌」なる用語は、分子またはシグナルが膜の片側からもう片側へと通過することを意味する。
【００２７】
本明細書で、核酸またはポリペプチドに関する記載で使用する「異種」なる用語は、通常は天然に存在しない核酸またはポリペプチドを意味する。したがって、宿主細胞にとっての異種核酸または異種ポリペプチド、例えば人工内部共生体とは、天然にはその宿主細胞内に存在しない核酸またはポリペプチドを意味する。例えば、プロモーターを含む宿主の核酸に作動可能に連結されたポリペプチドをコードする非宿主核酸を含む核酸分子は、異種核酸分子とみなされる。逆に、異種核酸分子は、非宿主（外因性）プロモーターに作動可能に連結された内因性構造遺伝子を含んでいてよい。同様に、非宿主核酸分子にコードされるペプチドまたはポリペプチド、もしくは非宿主ポリペプチドに融合した内因性ポリペプチドも、異種ペプチドまたは異種ポリペプチドである。
【００２８】
具体的な定義を記載しない限り、本明細書で使用されるその他のすべての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解している意味と同様の意味を有する。分子生物学の一般的な用語の定義は、例えば、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｋｅｎｄｒｅｗ編，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．（１９９４）；およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ編，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．（１９９５）に見出すことができる。
【００２９】
人工内部共生体
ある１つの態様において、本発明の人工内部共生体は、真核細胞内で生存可能な単細胞の生物、例えば微生物を含み、該人工内部共生体は、１種以上のポリペプチド、核酸、またはその他因子を宿主細胞内に分泌する、および／または宿主細胞から輸送するものである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドおよび／または核酸は、人工内部共生体にとって組換えまたは異種のものである。いくつかの実施形態では、人工内部共生体は、宿主細胞と該人工内部共生体間における分泌および／または輸送によって、宿主細胞に表現型を導入するものである。いくつかの実施形態では、人工内部共生体によって宿主細胞に付与された表現型は、宿主細胞の娘細胞においても維持されるものである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、その機能を少なくとも１日間、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０日間維持する。いくつかの実施形態では、人工内部共生体は、宿主の娘細胞において、表現型を、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、または、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回もしくはそれ以上の回数の細胞分裂の間、安定的に維持できるものである。いくつかの実施形態では、人工内部共生体は、宿主の娘細胞において、表現型を、３〜５回、５〜１０回、１０〜１５回、または１５〜２０回の細胞分裂の間、安定的に維持できるものである。
【００３０】
いくつかの実施形態では、人工内部共生体は、プロテオバクテリア、特にα−プロテオバクテリアである。現在の１６Ｓ  ｒＲＮＡに基づく分類法においては、α−プロテオバクテリアはプロテオバクテリア門の１つの綱とみなされ、さらに７つの主な下位群または目に分類される（カウロバクター目、リゾビウム目、ロドバクター目、ロドスピリルム目、リケッチア目、スフィンゴモナス目、およびパルヴルアーキュラ目）（Ｇｕｐｔａ，Ｒ．Ｓ．，“Ｐｈｙｌｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ  Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｍａｉｎ  ｇｒｏｕｐｓ，”  ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７：１０６，２００７；これは、参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００３１】
α−プロテオバクテリアの主要な群をすべて網羅する、数多くのα−プロテオバクテリアゲノムの配列が決定されており、これら配列は、α−プロテオバクテリア内の種々の上位分類群（例えば門、目など）に特有の特徴である固有の遺伝子またはタンパク質群を識別するために使用できる情報を提供する（Ｇｕｐｔａ、前掲）。これらの配列決定されたゲノムの分析によって、α−プロテオバクテリアの多くの種が本発明に有用な輸送システムを有していることが判明している。図１〜９は、ＮＣＢＩのタンパク質ＢＬＡＳＴウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）において行ったＢＬＡＳＴ相同性検索結果を示すものである。これらの検索によって、α−プロテオバクテリアの多くの種が、１型および５型分泌システムのタンパク質と相同性を有するタンパク質コード配列を有していることが分かっている。したがって、いくつかの実施形態では、人工内部共生体は、α−プロテオバクテリアを含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、走磁性微生物（ＭＴＢ）の例としてα−プロテオバクテリアが挙げられる。ＭＴＢとは、プロテオバクテリアおよびニトロスピラ門下の複数の下位群に属する様々な微生物の群であって、多くはα−プロテオバクテリアに属する。ＭＴＢは、グラム陰性型の細胞壁構造（例えば、内膜、ペリプラズム、および外膜）を有する。ＭＴＢは、垂直方向に化学濃度勾配を有する水域または堆積物中、主に酸素−無酸素の境界面に存在し、したがって、いくつかの場合においては、微好気性、嫌気性、通性嫌気性、またはこれら３種の性質を組み合わせた性質を有する微生物に分類される。海洋株のＭＴＢのいくつかは化学独立栄養成長もするものの、すべてのＭＴＢは化学合成有機従属栄養である（Ｂａｚｙｌｉｎｓｋｉら、“Ｃｈｅｍｏｌｉｔｈｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｒｉｎｅ，ｍａｇｎｅｔｏｔａｃｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｔｒａｉｎｓ  ＭＶ−１  ａｎｄ  ＭＶ−２，”  Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８２（５）：３７３−８７，２００４；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、“Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｙ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｙｃｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｒｉｎｅ  ｍａｇｎｅｔｏｔａｃｔｉｃ  ｃｏｃｃｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＭＣ−１，”  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７２（２）：１３２２−９，２００６）。すべてのＭＴＢは、リン脂質二重膜で覆われた鉄の磁性結晶を含む細胞内構造であるマグネトソームを含む（Ｇｏｒｂｙら、“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍａｇｎｅｔｏｓｏｍｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ，”  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０（２）：８３４−４１，１９８８）。いくつかの実施形態では、ＭＴＢの輸送経路は、内因性および外因性のタンパク質および／または核酸を宿主細胞へと送達する。
【００３３】
最初のＭＴＢ種の発見以来、多くのＭＴＢ種が当業者に知られている（Ｂｌａｋｅｍｏｒｅ，Ｒ．，“Ｍａｇｎｅｔｏｔａｃｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４：３７７−７９，１９７５；Ｆａｉｖｒｅ，Ｄ．およびＳｃｈｕｅｌｅｒ，Ｄ．，“Ｍａｇｎｅｔｏｔａｃｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ｍａｇｎｅｔｏｓｏｍｅｓ，”  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．１０８：４８７５−４８９８，２００８；これらの文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）。ＭＴＢは、プロテオバクテリアおよびニトロスピラ門下の複数の下位群に見出されてきており、ほとんどの系統型はα−プロテオバクテリアに分類される。現在、１６Ｓ  ｒＲＮＡの配列相同性に基づいてα−プロテオバクテリアに分類される培養可能なＭＴＢ株は、１９７５年にＢｌａｋｅｍｏｒｅによって最初に単離された株である、マグネトスピリラム・マグネトタクチウム（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｍａｇｎｅｔｏｔａｃｔｉｕｍ）（旧呼称はアクワスピリルム・マグネトタクチウム（Ａｑｕａｓｐｒｉｌｌｉｕｍ  ｍａｇｎｅｔｏｔａｃｔｉｕｍ））、Ｍ．グリフィスワルデンス（Ｍ．ｇｒｙｐｈｉｓｗａｌｄｅｎｓｅ）、Ｍ．マグネティカムＡＭＢ−１株、Ｍ．ポリモルファム（Ｍ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｍ）、マグネトスピリラム種（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．）のＭＳＭ−４およびＭＳＭ−６、マグネトコッカス・マリナス（Ｍａｇｎｅｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）、海洋性ビブリオ株であるＭＶ−１およびＭＶ−２、海洋性らせん菌株であるＭＭＳ−１、およびマグネトコッカス種であるＭＣ−１株、その他を含む。いくつかの実施形態では、このようなＭＴＢのすべてを本発明に使用する。
【００３４】
人工内部共生体として有用なその他の微生物の例として、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、ネンジュモ属（Ｎｏｓｔｏｃ）、ジアゾ栄養生物（Ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈ）、藍色細菌（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、トリコデスミウム属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ）、ベイエリンキア属（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、緑色硫黄細菌、アゾトバクター科（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、根粒菌（Ｒｈｉｚｏｂｉａ）、フランキア属（Ｆｒａｎｋｉａ）、フラボバクテリウム属、メタノサルシナ目（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ）、ハロバクテリウム目の好気性好塩性古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）、ハロアナエロビウム目（Ｈａｌａｎａｅｒｏｂｉａｌｅｓ）の発酵性嫌気性微生物（フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の低ＧＣ種）、赤色好気性細菌のサリニバクター（バクテロイデス門の枝（ｂｒａｎｃｈ））、マリノバクター属（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ）、ハロモナス属（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ）、デルマコッカス属（Ｄｅｒｍａｃｏｃｃｕｓ）、コクリア属（Ｋｏｃｕｒｉａ）、ミクロモノスポラ属（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ウィリアムシア属（Ｗｉｌｌｉａｍｓｉａ）、ツカムレラ属（Ｔｓｋａｍｕｒｅｌｌａ）、アルテロモナス属（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）、コルウェリア属（Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ）、グラシエコラ属（Ｇｌａｃｉｅｃｏｌａ）、シュードアルテロモナス属（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）、シュワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、ポラリバクター属（Ｐｏｌａｒｉｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サイクロバクター属（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、アスロバクター属（Ａｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、フリゴリバクテリウム属（Ｆｒｉｇｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サブテルコラ属（Ｓｕｂｔｅｒｃｏｌａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドッカ属（Ｒｈｏｄｏｃｃｕ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、レシチナーゼ陽性クロストリジウム属、ベイロネラ属（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、フソバクテリウム門（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ）、クロマチウム科（Ｃｈｒｏｍａｔｉａｃｅａｅ）、クロロビウム科（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｃｅａｅ）、ロドスピリラム科（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）、チオバシラス属（ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｉ）、ニトロソモナス属（ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、ニトロバクター属（ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、メタン菌、酢酸菌、硫酸還元菌、および乳酸菌が挙げられる。
【００３５】
数々の人工内部共生体のゲノムは既に配列決定されたか、配列決定が行われているところである。その例として、Ｍ．フリギドゥム（Ｍ．ｆｒｉｇｉｄｕｍ）、Ｍ．ブルトニ（Ｍ．ｂｕｒｔｏｎｉｉ）、Ｃ．シンビオサム（Ｃ．ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ）、Ｃ．サイクレリスラエ（Ｃ．ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ）、Ｐ．ハロプランクチス（Ｐ．ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ）、ハロラブラム・ラクスプロファンディ（Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ  ｌａｃｕｓｐｒｏｆｕｎｄｉ）、ビブリオ・サルモニシダ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、フォトバクテリウム・プロフォンドゥム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ）、Ｓ．ビオラセア（Ｓ．ｖｉｏｌａｃｅａ）、Ｓ．フリギディマリナ（Ｓ．ｆｒｉｇｉｄｉｍａｒｉｎａ）、サイクロバクター属（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ．２７３−４、Ｓ．ベンシカ（Ｓ．ｂｅｎｔｈｉｃａ）、サイクロモナス属（Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．ＣＮＰＴ３、モリテーラ属（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ）ｓｐ．、デスルフォタレア・サイクロフィラ（Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ  Ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ）、イグジォバクテリウム属（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）２５５−１５、フラボバクテリウム・サイクロフィラム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ）、サイクロフレクサス・トークイス（Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ  ｔｏｒｑｕｉｓ）、ポラリバクター・フィラメンタス（Ｐｏｌａｒｉｂａｃｔｅｒ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ）、Ｐ．イルジェンシー（Ｐ．ｉｒｇｅｎｓｉｉ）、レニバクテリウム・サルモニナルム（Ｒｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｌｍｏｎｉｎａｒｕｍ）、レイフソニア属（Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ）関連ＰＨＳＣ２０−ｃ１、アシドチオバシラス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）、テルモプラズマ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、ピクロフィルス・トリダス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ  ｔｏｒｒｉｄｕｓ）、スルフォロブス・トコダイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ）、およびフェロプラズマ・アシダルマヌス（Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄａｒｍａｎｕｓ）が挙げられる。
【００３６】
人工内部共生体の分泌システム
本発明において、人工内部共生体、具体的にはα−プロテオバクテリア、さらに具体的には走磁性微生物からの１種以上のタンパク質、核酸、その他分子、およびその他因子の分泌は、該人工内部共生体の内因性分泌システムを利用することができる。いくつかの実施形態では、人工内部共生体は、これら標的分子の指向性の分泌のために、異種分泌システムまたはその一部によって操作されてよい。いくつかの実施形態では、本発明のこれらの輸送システムは、医学的および工業的に重要な遺伝子、組換えペプチド／タンパク質、および／または治療、生物医薬、農業、および工業用途に有用なその他の因子の輸送に使用される。ここで、様々な分泌システムが当該技術分野において知られており、本開示に記載されているが、本発明の実施に際しては特定の分泌システムに関する知識または理解は必要ない。一般に、様々な単細胞生物のポリペプチドまたはその他の因子の分泌を引き起こすシグナルまたは配列が知られている。このようなシグナルまたは配列は、既知のタンパク質または核酸についても発見可能であり、また、分泌タンパク質または核酸中に見出された配列との相同性に基づいて同定可能である。このような分泌シグナルは、特に融合体として、特定の分泌シグナルを用いて分泌の方向を決める特定の輸送システムに関する事前知識がなくとも、人工内部共生体内で目的の分子を宿主細胞に向けて分泌させるために使用可能である。
【００３７】
様々な分泌システムを、ここに開示される、走磁性微生物などの人工内部共生体に使用することができる。例えば、α−プロテオバクテリアは、ＡＢＣ輸送体（トランスポーター）が関与する経路（Ｉ型分泌システム、Ｔ１ＳＳを含む）、ＩＩ型分泌システム（Ｔ２ＳＳ）、ＩＩＩ型分泌システム（Ｔ３ＳＳ）、ＩＶ型分泌システム（Ｔ４ＳＳ）、Ｖ型分泌システム（Ｔ５ＳＳ）、ＶＩ型分泌システム（Ｔ６ＳＳ）、ＶＩＩ型分泌システム（Ｔ７ＳＳ）、および当該技術分野において知られるその他の分泌システムを有している。いくつかの実施形態では、これらのα−プロテオバクテリアの輸送システムは、タンパク質、核酸、およびその他因子を人工内部共生体から宿主細胞内へ輸送するのに使用される。グラム陰性菌においては、分泌されたタンパク質は、Ｔ１ＳＳ、Ｔ３ＳＳ、Ｔ４ＳＳ、およびＴ６ＳＳ経路を介した単一過程で、内膜および外膜を通過して排出される。タンパク質は、Ｓｅｃ経路またはＴａｔ（双アルギニン）経路を介して、内膜を通過してペリプラズム（細胞周囲腔）へと排出される。タンパク質は、Ｔ２ＳＳもしくはＴ５ＳＳ、または多くはないがＴ１ＳＳもしくはＴ４ＳＳを介して、外膜を通過して細胞周囲腔から輸送される。
【００３８】
Ｔ１ＳＳは３つのタンパク質、すなわち、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体として機能する細胞質ＡＴＰ分解酵素ドメインを有する内膜タンパク質（大腸菌のＨｌｙＢ）、ペリプラズムアダプター（膜融合タンパク質ＭＦＰとしても知られる、大腸菌のＨｌｙＤ）、およびＴｏｌＣファミリーの外膜チャンネルタンパク質（大腸菌のＴｏｌＣ）からなる（Ｄｅｌｅｐｅｌａｉｒｅ，Ｐ．，“Ｔｙｐｅ  Ｉ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ，”Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙ  Ａｃｔａ  １６９４：１４９−６１，２００４に概説されている）。これらのタンパク質は、変性タンパク質が移行の際に通過すると考えられるペリプラズムを貫通する孔を形成する。Ｔ１ＳＳタンパク質基質は、典型的には、カルボキシ末端、および毒素内反復（ＲＴＸ）として知られるグリシンに富む反復配列およびアスパラギン酸に富む反復配列（Ｌｉｎｈａｒｔｏｖａら、“ＲＴＸ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，”  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．３４：１０７６−１１１２，２０１０；この文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）を含み、ＡＢＣ遺伝子およびＭＦＰ遺伝子の近傍に位置することが多い。Ｔ１ＳＳは単純な構造をしているため、異種タンパク質の輸送に使用されてきた。いくつかの研究によって、Ｔ１ＳＳが外因性タンパク質の細胞外培地への輸送に有用であることが示されてきた（例えば、Ｄｅｌｅｐｅｌａｉｒｅ，Ｐ．，前掲；Ｒｅｅｄ，ＢおよびＣｈｅｎ，Ｒ．，“Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ：ｆｒｏｍ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｔｏ  ｂｉｏｆｕｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”  Ｒｅｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６４：６７５−６８２，２０１３参照；これらの文献はすべて、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｌｏｗらは、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの分泌を、大腸菌のα−ヘモリシン輸送体の過剰発現によって改善できることを発見した（Ｌｏｗ，Ｋ．Ｏ．ら、“Ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ  ｇｌｕｃａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”  Ｊ  Ｉｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１５８７−９７，２０１１；これらの文献は、参照によって全体が本明細書に組み込まれる）。Ｓｕらも、大腸菌のα−ヘモリシン分泌システムを使用したタンパク質の分泌を行った。Ｓｕらは、Ｔ１ＳＳの２つの株特異的な構成要素であるＨｌｙＢＤを過剰発現させ、組換えＴ１ＳＳが大腸菌から多量（１リットル当たり１．５グラム）のタンパク質を分泌したことを示した（Ｓｕ，Ｌ．ら、“Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ  ｃｕｔｉｎａｓｅ  ｂｙ  ａｌｐｈａ−ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３），”  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．１１：８，２０１２；本文献は、参照によって全体が本明細書に組み込まれる）。大腸菌のヘモリシン輸送体は、大腸菌内で発現したその他の異種Ｔ１ＳＳ基質を分泌することも知られており、その例として、百日咳菌（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の外毒素Ｃｙａ（Ｓｅｂｏ，Ｐ．，およびＬａｄａｎｔ，Ｄ．，“Ｒｅｐｅａｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｔｏｘｉｎ  ｃａｎ  ｂｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ａｓ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｃａｒｂｏｘｙ−ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｌｐｈａ−ｈａｅｍｏｌｙｓｉｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ，”  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：９９９−１００９，１９９３）、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）のＬｔｋＡ（Ｌａｌｌｙ，Ｅ．Ｔ．ら、“Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ  ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎ  ｇｅｎｅ，Ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｉｑｕｅ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｏ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｏｘｉｎｓ，”  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６４：１５４５１−４５６，１９８９）、パスツレラ・エロゲネス（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）のＰａｘＡ（Ｋｕｈｎｅｒｔ，Ｐ．ら、“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰａｘＡ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｏｐｅｒｏｎ：ａ  ｃｏｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ＲＴＸｔｏｘｉｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ，”  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８：６−１２，２０００）、および髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＦｒｐＡ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｓ．Ａ．およびＳｐａｒｌｉｎｇ，Ｐ．Ｅ．，“Ｔｈｅ  ＲＴＸ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＦｒｐＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｉｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  ｉｓ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｌｙ  ｂｙ  ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉ  ａｎｄ  ｂｙ  ＨｌｙＢＤ＋  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．”  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．６１：２９０６−１１，１９９３；以上の文献はすべて、参照によって本明細書にその全体が組み込まれる）が挙げられる。Ｔ１ＳＳ複合体の集合（最も代表的な例として、大腸菌ヘモリシン（Ｈｌｙ）分泌システムが挙げられる）は、ヌクレオチド非依存性であり、ＨｌｙＡ（Ｔ１ＳＳ基質）の移行は、ＨｌｙＢによるＡＴＰの加水分解が必要である（Ｔｈａｎａｂａｌｕ，Ｔ．ら、“Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｏｒｔ  ｆｒｏｍ  Ｅ．ｃｏｌｉ：ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｂｒｉｄｇｉｎｇ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｎｅｒ−ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ  ｔｏ  ａｎ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｘｉｔ  ｐｏｒｅ，”  ＥＭＢＯ  Ｊ．１７：６４８７−９６，１９９８；本文献は、参照によって全体が本明細書に組み込まれる）。ＨｌｙＡはＲＴＸ（毒素内反復）タンパク質ファミリーの一員であり、コンセンサス配列ＧＧＸＧＸＤ（Ｘは任意のアミノ酸を表す）（配列番号２８７）を有するグリシンに富むペプチド反復配列をＣ末端ドメインに有し、そして、Ｃａ２＋イオンの結合に重要である。これは、細胞外培地におけるＨｌｙＡの折りたたみを引き起こして、次いで毒素を生物学的に活性な形で生成する。このＴ１ＳＳの基質は、移行シグナルをＣ末端に含む（ＨｌｙＡの末端から２７〜２１８番目のアミノ酸断片。最小の分泌シグナルは、Ｃ末端アミノ酸の最後から６０アミノ酸に存在し、分泌の方向を決定するのに必要かつ十分なものである）（Ｋｅｎｎｙ，Ｂ．ら、“Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈａｅｍｏｌｙｓｉｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｏｆ  ＰＣＭ，ＣＡＴ  ｏｒ  ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｆｕｓｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｉｇｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ，”  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：２５５７−６８，１９９１；本文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。この輸送体を標的とするタンパク質は、切断しておらず、あまり保存されていない分泌シグナルをＣ末端に有し（分泌に絶対不可欠）、このシグナルは、ＨｌｙＡの移行チャンネルへの初期移動およびＨｌｙＡの細胞外培地への迅速移動に似たＡＴＰによる可逆反応において、ＡＢＣ−ＡＴＰ分解酵素（大腸菌のＨｌｙＢ）のヌクレオチド結合ドメインに結合するものである（Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｂ．ら、“Ｔｙｐｅ  １  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ，ｔｈｅ  ＡＢＣ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ（Ｒｅｖｉｅｗ），”  Ｍｏｌ  Ｍｅｍｂｒ  Ｂｉｏｌ．２２：２９−３９，２００５；本文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００３９】
シュードモナス・フルオレッセンス由来のＴ１ＳＳも知られており、組換えタンパク質の分泌に使用されてきた。Ｐａｒｋらは、リパーゼのＡＢＣ輸送体による認識と輸送のための最小領域として、１０５アミノ酸からなるポリペプチドを見出した。標的タンパク質とこの最小領域との融合体は、組換えタンパク質の分泌を引き起こした（Ｐａｒｋ，Ｙ．ら、“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｒｅｇｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｐａｓｅ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ｆｏｒ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｏｆ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ，”  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ．Ｆａｃｔ．１１：６０，２０１２；本文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｔ１ＳＳの輸送基質の多様性に、そのタンパク質分泌に関する多用途性を見ることができる。輸送基質は、ヘモフォアＨａｓＡ（１９ｋＤａ）のような低分子タンパク質から、大きさが９００ｋＤａまでの巨大表層タンパク質にわたる（Ｌｉｎｈａｒｔｏｖａら、“ＲＴＸ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，”ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．３４：１０７６−１１１２，２０１０；Ｓａｔｃｈｅｌｌ，Ｋ．Ｊ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＡＲＴＸ  ｔｏｘｉｎｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｌａｒｇｅ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＲＴＸ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：７１−９０，２０１１；これらの文献はすべて、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｔ１ＳＳによって分泌されるその他のタンパク質の例として、アデニル酸シクラーゼ、リパーゼ、およびプロテアーゼが挙げられる。
【００４０】
本発明に使用可能な別のＴ１ＳＳシステムとして、イネ白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅ  ｐｖ．ｏｒｙｚａｅ）由来のＲａｘＡＢＣが挙げられる。系統解析によって、ＲａｘＢがＡＢＣ輸送体として同定され（ｄａ  Ｓｉｌｖａ，Ｆ．Ｇ．ら、“Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｌｆａｔｉｏｎ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｔｏ  ｅｌｉｃｉｔ  ｔｈｅ  ｒｉｃｅ  Ｘａ２１−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ，”  Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．１７：５９３−６０１，２００４；本文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）、大腸菌由来のＨｌｙＢと同等のものであると判明している。ＲａｘＡＢＣ輸送システムは、ＡｖｒＸａ２１分子（硫酸化された低分子ポリペプチド）、メタロプロテアーゼ、接着因子、およびグリカナーゼの分泌に使用される（Ｄｅｌｅｐｅｌａｉｒｅ，Ｐ．，“Ｔｙｐｅ  Ｉ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ，”  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １６９４：１４９−１６１，２００４；Ｒｅｄｄｙ，Ｊ．Ｄ．ら、“ＴｏｌＣ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏａ  ｉｎ  Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  ｇｒａｐｅ−ｖｉｎｅｓ，”  Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．２０：４０３−４１０，２００７；これらの文献はすべて、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００４１】
Ｔ５ＳＳの一部であるオートトランスポーターシステムは、組換えタンパク質の細胞外分泌のための最も単純な機構である可能性がある。オートトランスポーターは、Ｎ末端のＳｅｃ依存性シグナル配列、パッセンジャードメイン、およびＣ末端のベータモチーフからなる。移行は２段階で行われる。標的タンパク質は、Ｓｅｃ依存性の輸送によってペリプラズム内へ輸送された後、すぐにベータモチーフが膜貫通孔を形成して、パッセンジャードメインがその孔からペリプラズム外に分泌される（Ｄａｕｔｉｎ，Ｎ．およびＢａｒｎｓｔｅｉｎ，Ｈ．Ｄ．，“ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｐａｔｈｗａｙ，”  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１：８９−１１２，２００７；Ｔｈａｎａｓｓｉ，Ｄ．Ｇ．ら“ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ＡＴＰ：ｔｈｅ  ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，ｔｗｏ−ｐａｒｔｎｅｒ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ／ｕｓｈｅｒ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ（Ｒｅｖｉｅｗ），”  Ｍｏｌ  Ｍｅｍｂｒ  Ｂｉｏｌ．２２：６３−７２，２００５；これらの文献はすべて、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。ベータモチーフは開裂可能であり、標的タンパク質を細胞外へと移行させる（Ｌｅｙｔｏｎ，Ｄ．Ｌ．ら、“Ｆｒｏｍ  ｓｅｌｆ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｔｏ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，”Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：２１３−２５，２０１２；本文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００４２】
Ｔ５ＳＳシステムにおける輸送では、標的タンパク質は、それぞれ組換えタンパク質の内膜および外膜の通過による移行を仲介する、Ｎ末端シグナル配列およびＣ末端シグナルベータドメインと融合する。このキメラ遺伝子は、標的遺伝子のＮ末端とインフレーム融合し、かつ標的遺伝子のＣ末端のベータドメイン配列をコードするＤＮＡとインフレーム融合したＮ末端シグナル配列を有している。いくつかの実施形態では、パッセンジャードメインは融合タンパク質内で置換されてよい。例えば、Ｊｏｎｇらは、大腸菌のオートトランスポーターであるヘモグロビン結合タンパク質（Ｈｂｐ）のパッセンジャードメインが、融合タンパク質内で置換でき、完全なベータドメインと連動して、分泌を促進することを明らかにした（Ｊｏｎｇ，Ｗ．Ｓ．ら、“Ａ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  ｉｎｆｏｒｍｅｄ  ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｙ，”  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．１１：８５，２０１２；本文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。したがって、異種タンパク質と置換可能なＨｂｐ（ＮＣＢＩアクセション番号Ｏ８８０９３、１３７７アミノ酸）のパッセンジャードメインの例として、（１）５３−３０８；（２）５３３−６０８；（３）６５７−６９７；（４）７３５−７６６；（５）８９８−９２２アミノ酸が挙げられる。
【００４３】
【数１】
2016528928.tif 000003
【００４４】
本発明には、大腸菌の様々なオートトランスポーターも使用可能である。Ｋｏらは、オートトランスポーターであるＹｆａＬ（ＮＣＢＩアクセション番号Ｐ４５５０８）を使用して、２５．３から１４３ｋＤａのタンパク質を大腸菌から分泌させた（Ｋｏ，Ｈ．Ｊ．ら、“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ａｇａｒｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｂｙ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ＹｆａＬ，”  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７８：３０５１−５８，２０１２；本文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。オートトランスポーターＹｆａＬは、下記の配列を含む。
【００４５】
【数２】
2016528928.tif 000004
【００４６】
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ（例えば、タバコエッチ病ウイルスのプロテアーゼ）が、融合タンパク質のＣ末端を切断してベータドメインとオートトランスポーターとを分離することで細胞からの分泌を起こすために使用される。Ｓｅｖａｓｔｓｙａｎｏｖｉｃｈらは、大腸菌のセリンプロテアーゼであるＰｅｔを使用して融合タンパク質を切断し、タンパク質複合体などの、様々な大きさおよび構造の多様なタンパク質を完全に分泌させた（Ｓｅｖａｓｔｓｙａｎｏｖｉｃｈ，Ｙ．Ｒ．ら、“Ａ  ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ｍｏｄｕｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．１１：６９，２０１２；本文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｐｅｔとは、ベータドメインからパッセンジャードメインを遊離させる、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）（ＳＰＡＴＥ）のセリンプロテアーゼオートトランスポーターの１種である。
【００４７】
オートトランスポーターを統合バイオプロセスに使用する際、標的タンパク質の分泌用に操作された大腸菌のオートトランスポーター抗原４３（Ａｇ４３）が使用される。このオートトランスポーターシステムでは、分泌されたドメインはベータドメインと共有結合ではない形で結合しており、内在性の外膜タンパク質を形成しているにも拘わらず、パッセンジャードメインであるＡｇ４３アルファが自己切断するという特有の性質を有する。組換えタンパク質を分泌するために、Ａｇ４３アルファの、切断機構を含むセグメントを標的配列と融合させた。大腸菌内に操作された場合、自己切断性のオートトランスポーターは標的タンパク質を細胞外に分泌した（Ｗａｒｇａｃｋｉ，Ａ．Ｊ．ら、“Ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔ  ｂｉｏｆｕｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｂｒｏｗｎ  ｍａｃｒｏａｌｇａｅ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３５：３０８−１３，２０１２；本文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００４８】
非常に多くのタンパク質が、Ｔ２ＳＳよりもＴ５ＳＳによって分泌される（Ｊａｃｏｂ−Ｄｕｂｕｉｓｓｏｎ，Ｆ．ら、“Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ａｎｄ  ｔｗｏ−ｐａｒｔｎｅｒ  ｐａｔｈｗａｙ，”  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙ  Ａｃｔａ  １６９４：２３５−５７，２００４；Ｄａｕｔｉｎ，Ｎ．およびＢｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｈ．Ｄ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｖｉａ  ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｐａｔｈｗａｙ，”  Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１：８９−１１２，２００７）。現在までにその特性が明らかにされた、Ｔ５ＳＳによって分泌されるタンパク質のほとんどは、病原性因子である。Ｔ５ＳＳによって分泌されるタンパク質の例として、大腸菌のＡＩＤＡ−ＩおよびＡｇ４３、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のＨｉａ、エルシニア・エンテロリチコラ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｌｉｔｉｃｏｌａ）のＹａｄＡ、ならびに百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のＰｒｎなどの付着因子（アドヘシン）；ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）のＶａｃＡなどの毒素；淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ）および髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）のＩｇＡプロテアーゼ、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）のＳｅｐＡ、およびセラチア菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）のＰｒｔＳなどのプロテアーゼ；ならびに、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐ．）のｒＯｍｐＢおよびヘリコバクター・ピロリのＨｓｒなどのＳ層タンパク質が挙げられる。また、Ｔ５ｂＳＳ（ＴＰＳ）によって分泌されるタンパク質の例として、植物病原体であるディケヤー・ダダンティイ（Ｄｉｃｋｅｙａ  ｄａｄａｎｔｉｉ）（黒あし病菌、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉｉ）のＨｅｃＡ／ＨｅｃＢなどのアドヘシン、セラチア菌のＳｈｌＡ／ＳｈｌＢ、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）のＨｐｍＡ／ＨｐｍＢ、およびエドワジェラ・タルダ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌｌａ  ｔａｒｄａ）のＥｔｈＡ／ＥｔｈＢなどの細胞溶解素が挙げられる。
【００４９】
ＩＶ型分泌システム（Ｔ４ＳＳ）は、多用途かつ多成分の分泌システムであり、グラム陰性菌およびグラム陽性菌の両方において、タンパク質、ＤＮＡ、タンパク質−ＤＮＡ複合体を、様々な標的真核細胞および微生物細胞内に分泌するのに使用され（Ｆｒｏｎｚｅｓ，Ｒ．ら、“Ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ  ＩＶ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，”  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７（１０）：７０３−１４，２００９；Ｂａｃｋｅｒｔ，Ｓ．およびＴ．Ｆ．Ｍｅｙｅｒ．“Ｔｙｐｅ  ＩＶ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，”  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ９（２）：２０７−１７，２００６；これらの文献はすべて、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）、３つの群に分類できる（Ｆｒｏｎｚｅｓ，Ｒ．ら、前掲；本文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。群１のＴ４ＳＳは、プラスミドＤＮＡまたはトランスポゾンの様々な微生物種内への接合伝達を仲介する。例えば、大腸菌およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）は、ＤＮＡ基質を菌類、ヒト細胞または植物に送達することができる（Ｇｒｏｈｍａｎｎ，Ｅ．ら、“Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，”  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ６７（２）：２７７−３０１，２００３；Ｌａｗｌｅｙ，Ｔ．Ｄ．ら、“Ｆ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｉｓ  ａ  Ｔｒｕｅ  Ｔｙｐｅ  Ｉｖ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，”  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．２２４（１）：１−１５，２００３；Ｔｒｉｅｕ−Ｃｕｏｔ，Ｐ．ら、“Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｇｒａｍ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，”  ＥＭＢＯ  Ｊ．４（１３Ａ）：３５８３−７，１９８５；これらの文献はすべて、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。ヘリコバクター・ピロリおよび淋菌に見出されるＴ４ＳＳのような群２のＴ４ＳＳは、ＤＮＡの取り込みおよび細胞外環境への放出を仲介する（Ｓｍｅｅｔｓ，Ｌ．Ｃ．およびＪ．Ｇ．Ｋｕｓｔｅｒｓ，“Ｎａｔｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  Ｐｙｌｏｒｉ：ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  ａｎ  Ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ  Ｗａｙ，”  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０（４）１５９−６２，２００２（ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  １６２）；Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｈ．Ｌ．およびＪ．Ｐ．Ｄｉｌｌａｒｄ，“Ｎａｔｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  Ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ：Ｆｒｏｍ  ＤＮＡ  Ｄｏｎａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，”  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９（２）：３７６−８５，２００６；これらの文献はすべて、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。群３のＴ４ＳＳは、���染に際しエフェクター分子を真核細胞内に送達する。自身のＴ４ＳＳを用いて病原性タンパク質を哺乳類宿主細胞内に注入する微生物の例として、ヘリコバクター・ピロリ、ブタ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ）、およびレジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）が挙げられる（Ｂａｃｋｅｒｔ，Ｓ．およびＭｅｙｅｒ，Ｔ．Ｆ．，“Ｔｙｐｅ  ＩＶ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，”  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９（２）：２０７−１７，２００６；Ｃｏｒｂｅｌ，Ｍ．Ｊ．，“Ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ：Ａｎ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ，”  Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ３（２）：２１３−２１，１９９７；Ｎｉｎｉｏ，Ｓ．およびＣ．Ｒ．Ｒｏｙ，“Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｄ  ｂｙ  Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  Ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ：Ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｉｎ  Ｎｕｍｂｅｒｓ，”  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５（８）：３７２−８０，２００７；これらの文献はすべて、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。アグロバクテリウム・ツメファシエンスは、自身の群３のＴ４ＳＳを用いて、発がん性のＤＮＡおよびタンパク質を植物細胞内に送達する（Ｆｒｏｎｚｅｓ，Ｒ．ら、“Ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ  ＩＶ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，”  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７（１０）：７０３−１４，２００９；本文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００５０】
Ｔ４ＳＳの構成要素をコードする遺伝子は、通常、１個または数個のオペロン内に配置される。複数のＴ４ＳＳをコードする微生物の例として、ヘリコバクター・ピロリが挙げられる。ヘリコバクター・ピロリは、ｃａｇ病原性アイランドにコードされるエフェクタータンパク質送達システム、ならびにｃｏｍＢ遺伝子クラスターにコードされるＤＮＡ放出および取り込みシステムを有する（Ｂａｃｋｅｒｔ，Ｓ．およびＴ．Ｆ．Ｍｅｙｅｒ，“Ｔｙｐｅ  ＩＶ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，”  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９（２）２０７−１７，２００６；Ｓｍｅｅｔｓ，Ｌ．Ｃ．およびＫｕｓｔｅｒｓ，Ｊ．Ｇ．，“Ｎａｔｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  Ｐｙｌｏｒｉ：ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  ａｎ  Ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ  Ｗａｙ，”  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０（４）：１５９−６２，２００２；これらの文献はすべて、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００５１】
Ｔ４ＳＳを構成する構造要素によって、これらのシステムは、ＩＶＡ型システムかＩＶＢ型システムに大別される（Ｖｏｔｈ，Ｄ．Ｅ．ら、“Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｔｙｐｅ  ＩＶ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ，”  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７（２）：２４１−５７，２０１１；本文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。Ａ．ツメファシエンスのＴ４ＳＳ、およびこれに類似するＴ４ＳＳは、ＩＶＡ型分泌システムに分類される。Ａ．ツメファシエンスの典型的なＴ−ＤＮＡまたはＶｉｒＢ分泌システムは、最もよく特徴づけられているＴ４ＳＳである。Ａ．ツメファシエンスのＴ４ＳＳ輸送体複合体、およびそれに類似するものは、典型的には１１個のＶｉｒＢタンパク質（ＶｉｒＢ１−ＶｉｒＢ１１遺伝子にコードされる）、および共役タンパク質であるＶｉｒＤ４、ＮＴＰアーゼからなる（Ｔｅｇｔｍｅｙｅｒ，Ｎ．，Ｓ．ＷｅｓｓｌｅｒおよびＳ．Ｂａｃｋｅｒｔ，“Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃａｇ−Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  Ｉｓｌａｎｄ  Ｅｎｃｏｄｅｄ  Ｔｙｐｅ  Ｉｖ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  Ｐｙｌｏｒｉ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，”  ＦＥＢＳ  Ｊ．２７８（８）：１１９０−２０２，２０１１；本文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。アグロバクテリウムのＶｉｒＢタンパク質は、３種、すなわち、コア構成要素、線毛関連要素、およびエネルギー要素に分類される。ＩＶＢ型に分類されるＴ４ＳＳは、レジオネラ・ニューモフィラの研究によって、２２個の構造タンパク質および５個のシャペロンタンパク質からなることが示されている（Ｖｏｇｅｌ，Ｊ．Ｐ．ら、“Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  Ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９（５３５２）：８７３−６，１９９８；Ｓｅｇａｌ，Ｇ．，Ｍ．ら、“Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｋｉｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｒｅｑｕｉｒｅ  Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  Ｓｅｔｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ａ  ２２−Ｋｂ  Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  Ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  Ｇｅｎｏｍｅ，”  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５（４）：１６６９−７４，１９９８；これらの文献はすべて、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００５２】
ＩＶＡおよびＩＶＢ型分泌システムが認識する移行シグナルは、異なるが重複する。最近の研究によって、２つのブルセラ属のエフェクターは、Ｌ．ニューモニアによって移行可能であることが示されており、したがって、ＩＶＢ型分泌システムがＩＶＡ型分泌システムのエフェクター由来の移行シグナルを認識できることが判明している（ｄｅ  Ｊｏｎｇ，Ｍ．Ｆ．ら、“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｃｅａ  ａｎｄ  Ｖｃｅｃ，Ｔｗｏ  Ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖｊｂｒ  Ｒｅｇｕｌｏｎ  Ｔｈａｔ  Ａｒｅ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｄ  ｉｎｔｏ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｂｒｕｃｅｌｌａ  Ｔｙｐｅ  Ｉｖ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，”  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０（６）：１３７８−９６，２００８；本文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００５３】
以下に記載するのは、Ｔ４ＳＳ移行シグナルの例である。Ａ．ツメファシエンスの移行シグナルは、コンセンサスＲ−Ｘ（７）−Ｒ−Ｘ−Ｒ−Ｘ−Ｒ−Ｘ−Ｘ（ｎ）モチーフを有する親水性のＣ末端領域内に含まれる（配列番号２９０）（Ｖｅｒｇｕｎｓｔ，Ａ．Ｃ．ら、“Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｈａｒｇｅ  Ｉｓ  ａｎ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｓｉｇｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖｉｒｂ／Ｄ４−Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，”  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０２（３）：８３２−７，２００５；本文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。バルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）は、ＢＩＤドメインと、このドメインとともに２連のＣ末端移行シグナルを形成する正に帯電した短い末端配列とを有する（Ｓｃｈｕｌｅｉｎ，Ｒ．ら、“Ａ  Ｂｉｐａｒｔｉｔｅ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ  ＩＶ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｏｆ  Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  Ｈｅｎｓｅｌａｅ  ｉｎｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ，”  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２（３）：８５６−６１，２００５；本文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。ヘリコバクター・ピロリにおいては、ＣａｇＡタンパク質のＮ末端およびＣ末端の両方に移行シグナルが存在することが証明されている。Ｈｏｈｌｆｅｌｄらは、ＣａｇＡの６〜２６残基が移行にとって重要であることを見出している（Ｈｏｈｌｆｅｌｄ，Ｓ．ら、“Ａ  Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｉｓ  Ｎｅｃｅｓｓａｒｙ，ｂｕｔ  Ｎｏｔ  Ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  ＩＶ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  Ｐｙｌｏｒｉ  Ｃａｇａ  ｐｒｏｔｅｉｎ，”  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９（５）：１６２４−３７，２００６；本文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。また、Ｈｏｈｌｆｅｌｄらは、このＣａｇＡが関与する移行は、そのＣ末端の２０個のアミノ酸の有無に依存することも示している（Ｈｏｈｌｆｅｌｄ，Ｓ．ら、前掲）。
【００５４】
１型、４型、および５型分泌システムの遺伝子も、配列アライメントによって、ＭＴＢのマグネトスピリラム属ＡＭＢ−１株のゲノム中に同定されている。ＡＭＢ−１株は、細胞運動性および分泌に関与する８３個の遺伝子を含む（Ｍａｔｓｕｎａｇａ，Ｔ．ら、“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅ  ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｍａｇｎｅｔｏｔａｃｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．ＡＭＢ−１，”  ＤＮＡ  Ｒｅｓ．１２：１５７−１６６，２００５；本文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。ＭＴＢには、ＲＴＸタンパク質をコードする少なくとも７個の遺伝子が存在する。また、ＭＴＢ（Ｍ．マグネティカムＡＭＢ−１株）において、Ｔ１ＳＳ基質と推定されるいくつかの物質（ＹＰ＿４２０６３１．１、ＹＰ＿４２０６３８．１、ＹＰ＿４２０６４０．１、ＹＰ＿４２１３６４．１、ＹＰ＿４２２６６２．１、ＹＰ＿４２２７８５．１、およびＹＰ＿４２３４１９．１）が同定されている（Ｌｉｎｈａｒｔｏｖａら、“ＲＴＸ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，”  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．３４：１０７６−１１１２，２０１０；本文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。これらの基質は、巨大細胞外タンパク質、５型分泌経路、毒素内反復（ＲＴＸ）毒素および関連Ｃａ２＋結合タンパク質、接着因子であるＡｉｄＡ、およびアミノメチル転移酵素、接着因子、カドヘリンなどの機能を有すると推定される機能未知タンパク質のａｍｂ３４２２などであると注釈されており、他の微生物の１型分泌の基質と一致している。代表的な配列は、配列表に記載されている。さらに、ＭＴＢのゲノムには、Ｔ１ＳＳ複合体の構成に関与する遺伝子が含まれている（例えば、ＹＰ＿４２２８３８、ＹＰ＿４２１７３９、大腸菌のＨｌｙＢ相同体；ＭＴＢに含まれる、大腸菌のＨｌｙＤ膜融合タンパク質相同体である、ローカスタグａｍｂ２３７８；ａｍｂ３１５９；ａｍｂ３４７６；ａｍｂ４０５７；を有するｇｉ：８３３１１４７７、８３３１２２５８、８３３１２５７５、８３３１３１５６；ＭＴＢに含まれる、大腸菌のＴｏｌＣ外膜タンパク質相同体であり、ローカスタグａｍｂ２２４５；ａｍｂ３０６１；ａｍｂ３１５７を有する、ｇｉ：８３３１１３４４；８３３１２１６０；８３３１２２５６）。
【００５５】
図１〜９は、細胞のＴ１ＳＳ分泌装置の分泌物または装置の一部である９個のＭＴＢタンパク質と、他のα−プロテオバクテリアおよび他の生物の配列既知の遺伝子との、ＢＬＡＳＴアライメントを示す。各配列はアクセション番号で表され、例示された配列（例えば、配列番号１〜２８６）は本発明に使用可能である。
【００５６】
いくつかの実施形態では、分泌されるタンパク質は、ＹＰ＿４２０６４０（ＲＴＸ毒素および関連Ｃａ２＋結合タンパク質）、ＹＰ＿４２３４１９（ＲＴＸ毒素および関連Ｃａ２＋結合タンパク質）、ＹＰ＿４２２７８５（ａｍｂ３４２２）、またはその他のＭＴＢＴ１ＳＳ基質のＣ末端の２００アミノ酸に融合可能である。別法として、ＭＴＢのＹＰ＿４２０５０２、ＹＰ＿４２０６３１．１、ＹＰ＿４２０６３８．１、ＹＰ＿４２０６４０．１、ＹＰ＿４２１３６４．１、ＹＰ＿４２２６６２．１、ＹＰ＿４２２７８５．１、およびＹＰ＿４２３４１９．１のタンパク質も、組換え融合タンパク質を分泌システムに標的化するために、これらのＣ末端（例えば、分泌シグナルを含む、Ｃ末端の２００アミノ酸）を融合に使用してよい。分泌シグナルを含むＣ末端の２００アミノ酸の配列例として、下記の配列を有する、ＹＰ＿４２２７８５の配列が挙げられる。
【００５７】
【数３】
2016528928.tif 000005
【００５８】
以上に例示したように、微生物は、タンパク質を分泌する多様な装置を、環境、内部共生体の場合には宿主細胞の環境を含む環境との相互作用手段として用いている。いくつかの実施形態では、本発明は、分泌システムを介して人工内部共生体から分泌された１種以上のタンパク質、核酸、および／またはその他の因子によって、宿主細胞（および生物）の形態または生理を改変するものである。
【００５９】
改変人工内部共生体
いくつかの実施形態では、α−プロテオバクテリアなどの人工内部共生体は、さらに多量の組換えタンパク質を分泌するように改変されたものである。人工内部共生体の遺伝子改変方法として、当該技術分野においてよく知られる、単細胞生物を組換えによって改変する方法を使用してよい。典型的には、人工内部共生体の遺伝子改変は、人工内部共生体から宿主細胞内への標的分子の分泌を改善するために行われる。別法として、人工内部共生体は、宿主から人工内部共生体内への標的分子の輸送を増加させるように操作される。タンパク質またはＲＮＡの産生を増加させるような改変を行ってもよく、この増加は、プロモーターもしくはリボソーム結合配列を変更する、または人工内部共生体の特定の遺伝子を削除または抑制することによって行われる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、人工内部共生体の鞭毛タンパク質の改変を行い、鞭毛タンパク質をもう発現しないようにする。鞭毛タンパク質は、微生物の分泌システムと高い相同性を有し、進化上の共通祖先の存在が示唆される。いくつかの実施形態では、人工内部共生体の鞭毛タンパク質は、分泌システムを製造するように改変されたものである。いくつかの実施形態では、単細胞生物は、好ましくは真核宿主細胞によって提供される必須分子をもう合成できないように改変されたものである。いくつかの実施形態では、単細胞生物は、そのコピー数が娘細胞に表現型を付与できる程度に十分な水準に維持されるように単細胞生物の細胞周期が真核宿主細胞の細胞周期と調和するよう、遺伝子改変されたものである。
【００６１】
ＭＴＢ、特にＡＭＢ−１およびＭ．グリフィスワルデンス（Ｍ．ｇｒｙｐｈｉｓｗａｌｄｅｎｓｅ）のＭＳＲ−１株の遺伝子操作のための分子生物学的ツールが開発されてきた（Ｊｏｇｌｅｒ，Ｃ．およびＳｃｈｔｉｌｅｒ，Ｄ．ｉｎ  Ｍａｇｎｅｔｏｒｅｃｅｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｇｎｅｔｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ｐ１３４−１３８，２００７で概説されている；本文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）。近年になって、マグネトスピリラムの別の株２種およびマグネトコッカス属のＭＣ−１株のゲノム配列も決定されている。いくつかの実施形態では、現時点で培養可能または不可能な、配列決定または未決定の、既知または未知の、これらの株またはその他のＭＴＢ株由来の遺伝子を本発明に使用してよい。
【００６２】
人工内部共生体を改変するいくつかの工学的手段の例として、（１）人工内部共生体に特化し、他の微生物に生来存在する分泌システムへと操作する；（２）人工内部共生体の細胞膜の変異によって、その人工内部共生体の外膜またはペプチドグリカン層の透過性を変化させる（例えば、Ｓｈｉｎ，Ｈ．およびＣｈｅｎ，Ｒ．Ｒ．，“Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａｎｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｌｐｐ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔ，”  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．１０１：１２８８−９６，２００８；本文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）；および（３）外膜を除去する溶菌促進タンパク質の共発現（Ｎｉ，Ｙ．およびＣｈｅｎ，Ｒ．，“Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａｎｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，”  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．３１：１６６１−７０，２００９；本文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）が挙げられる。
【００６３】
いくつかの実施形態では、大腸菌のα−ヘモリシン輸送遺伝子であるＨｌｙＢおよびＨｌｙＤを、遺伝子組換えによって人工内部共生体内で発現させる。その際、標的タンパク質は、ＨｌｙＡのＣ末端に存在するＴ１ＳＳ基質分泌シグナルと融合するように設計され、それらの標的タンパク質がα−ヘモリシン輸送システムへと標的化されるようにする。ＨｌｙＡ分泌シグナルは、下記の配列を含む。
【００６４】
【数４】
2016528928.tif 000006
【００６５】
いくつかの実施形態では、シュードモナス・フルオレッセンス由来のＴ１ＳＳを、組換えタンパク質の輸送に使用する。リパーゼＡＢＣ輸送体のＴｌｉＡなどのＴ１ＳＳ遺伝子が、人工内部共生体に組み込まれる。標的タンパク質は、Ｎ末端から１０４番目の残基までの領域に融合され、最小領域は以下を含む。
【００６６】
【数５】
2016528928.tif 000007
【００６７】
この標的タンパク質と最小領域との融合によって、組換えタンパク質の分泌が可能となる。興味深いことに、いくつかのタンパク質が、ＹＰ＿４２０６４０、ＹＰ＿４２２７８５、ＹＰ＿４２１３６４、ＹＰ＿４２０６３１などのＰ．フルオレッセンスのリパーゼＴｌｉＡ、およびＭＴＢゲノム中に存在する配列と実質的な配列相同性を示す（例えば、図９および配列表に記載の配列を参照）。この相同性は、ほとんどがタンパク質のＣ末端ドメイン内に存在し、これは輸送シグナルを含んでいる。いくつかの実施形態では、ＭＴＢのリパーゼＡＢＣ輸送システムは、ＭＴＢのリパーゼＡＢＣ輸送システムの基質のＣ末端シグナルと標的タンパク質とを融合させることで組換えタンパク質を輸送するために使用される（図９も参照。配列相同性については、配列表に記載されるアクセション番号および対応する配列を参照。）。いくつかの実施形態では、Ｃ末端のシグナル配列は以下を含む。
【００６８】
【数６】
2016528928.tif 000008
【００６９】
いくつかの実施形態では、イネ白葉枯病菌のＲａｘＡ、ＲａｘＢ、およびＲａｘＣ遺伝子を、遺伝子組換えによって人工内部共生体内で発現させる。標的タンパク質は、ＲａｘＡＢＣ分泌システムの認識配列であるＲａｘＳＴに融合する。いくつかの実施形態では、ＲａｘＳＴ認識配列は以下を含む。
【００７０】
【数７】
2016528928.tif 000009
【００７１】
いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、そのＮ末端がＳｅｃ依存性シグナル配列と融合し、標的タンパク質のＣ末端はβ−モチーフと融合する。このような標的タンパク質融合体の移行は、２段階の過程を経て行われる。標的タンパク質は、Ｓｅｃ依存性の輸送によってペリプラズム内に輸送され、その後すぐに、β−モチーフが、標的タンパク質が細胞周囲腔から分泌される際に通過する膜貫通孔を、外膜に形成する。β−モチーフは切断され、標的タンパク質の移行が行われる。
【００７２】
いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＹｆａＬオートトランスポーターなどのオートトランスポーター（標的タンパク質はパッセンジャードメイン領域（２９から６８５番目までのアミノ酸）と置換される）に融合される（Ｋｏ，Ｈ．Ｊ．ら、“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ａｇａｒｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｂｙ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ＹｆａＬ，”  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７８：３０５１−３０５８，２０１２；本文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。ＹｆａＬオートトランスポーター配列は以下を含む。
【００７３】
【数８】
2016528928.tif 000010
【００７４】
いくつかの実施形態では、外因性プロテアーゼを必要とせずにβ−ドメインからパッセンジャードメインを遊離させるプロテアーゼを使用し、標的タンパク質からβ−モチーフを切断する。そのようなプロテアーゼの例として、タバコエッチ病ウイルスのプロテアーゼ、大腸菌のセリンプロテアーゼＰｅｔ、および腸内細菌科（ＳＰＡＴＥ）のセリンプロテアーゼオートトランスポーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、大腸菌のオートトランスポーターである抗原４３（Ａｇ４３）が標的タンパク質とともに使用される。オートトランスポーターである抗原４３の配列は以下を含む。
【００７５】
【数９】
2016528928.tif 000011
【００７６】
いくつかの実施形態では、ミトコンドリア外膜のトランスロカーゼ（ＴＯＭ複合体）が人工内部共生体に組み込まれる。ＴＯＭ複合体は、受容体Ｔｏｍ２０、Ｔｏｍ２２、およびＴｏｍ７０、チャンネル形成タンパク質であるＴｏｍ４０、ならびにその他のいくつかの小さいサブユニットを含む（Ｈｏｏｇｅｎｒａａｄ，Ｎ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙ  Ａｃｔａ  １５９２：９７−１０５，２００２；Ｎｅｕｐｅｒｔ  Ｗ．およびＨｅｒｒｍａｎｎ，Ｊ．Ｍ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７６：７２３−７４９，２００７；およびＣｈａｃｉｎｓｋａ，Ａ．ら、Ｃｅｌｌ  １３８：６２８−４４，２００９に概説されている；これらの文献はすべて、参照によって本明細書に組み込まれる）。Ｔｏｍ２０は、基質を認識して、中央部に位置するＴｏｍ２２に基質を移動させる。Ｔｏｍ２２では、基質がＴｏｍ４０チャンネルに挿入される。基質が取り込まれると、ＴＯＭ複合体は内膜のトランスロカーゼとともに複合体を形成する（ＴＩＭ複合体）（Ｃｈａｃｉｎｓｋａ，Ａ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ  ２２：５３７０−８１，２００３；本文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）。ＴＩＭ複合体は、４種の内在性膜タンパク質、すなわちＴｉｍ２３、Ｔｉｍ１７、Ｔｉｍ５０、およびＴｉｍ２１からなる。Ｔｉｍ２３はトランスロカーゼのタンパク質透過チャンネルを形成し、Ｔｏｍ１７と密接に関連している。一方で、Ｔｉｍ５０はＴｉｍ２３チャンネルの調節因子として機能し、Ｔｉｍ２１はＴｏｍ２２を介して一時的にＴＯＭ複合体と相互作用する（Ｍｉｌｉｓａｖ，Ｉ．ら、“Ｍｏｄｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｉｍ２３  ｐｒｅｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ，”  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６：２５８５６−２５８６１，２００１；本文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００７７】
核酸
別の態様では、本発明は、本発明の方法において分泌された個々のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を少なくとも部分的にコードする核酸に関する。いくつかの実施形態では、核酸は、天然物、合成物、またはそれらの組み合わせであってよい。いくつかの実施形態では、本発明の核酸は、人工内部共生体から宿主細胞内へと分泌された核酸も含む。本発明の核酸は、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｃＤＮＡであってよい。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸は、プラスミド、ウイルスベクター、線状ベクター、または染色体ＤＮＡ中に組み込まれるベクターなどの発現ベクターも含む。発現ベクターは、選択した１種以上の宿主細胞内における該ベクターの複製を可能にする核酸配列を含んでよい。そのような配列は、様々な細胞についてよく知られている。ほとんどのグラム陰性菌について、プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点が適している。真核宿主細胞、例えば哺乳類細胞の場合は、発現ベクターは宿主細胞の染色体に組み込まれ、次いで宿主染色体とともに複製されてよい。ベクターは原核細胞の染色体に同様に組み込まれてもよい。
【００７９】
発現ベクターは、一般には選択遺伝子、別名選択マーカーも含む。選択マーカーは、本発明の宿主細胞を含め、原核細胞についても真核細胞についても当該技術分野においてよく知られている。一般には、選択遺伝子は、選択培地における形質転換宿主細胞の生存または成長に必須のタンパク質をコードするものである。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されていない宿主細胞は、そのような培地で生存することはない。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質またはアンピリシン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリンなどその他の毒素への耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子、（ｂ）栄養要求性に由来する欠乏を補完するタンパク質をコードする遺伝子、または（ｃ）複合培地から入手できない必須の栄養素を供給するタンパク質をコードする遺伝子、例えば桿菌の場合にはＤ−アラニンラセミ化酵素をコードする遺伝子である。いくつかの実施形態では、代表的な選択機構は、宿主細胞の成長を停止する薬剤を使用するものである。異種遺伝子による形質転換が成功した細胞は、薬剤耐性を付与するタンパク質を産生するので、選択レジメン下でも生存できる。微生物系または真核（哺乳類を含む）系に使用されるその他の選択マーカーも、当該技術分野においてよく知られている。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、標的タンパク質であるか、または人工内部共生体によって宿主細胞内へと分泌された核酸にコードされるものである。
【００８０】
いくつかの実施形態では、異種ポリペプチドを産生するための発現ベクターは、構成的または誘導性プロモーターでありうるプロモーターも含む。このようなプロモーターは、宿主のＲＮＡポリメラーゼに認識されるものであり、標的タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されている。適切なエンハンサー、イントロン、およびその他の調節配列を伴う誘導性または構成的プロモーター（または調節領域）は、当該技術分野においてよく知られている。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドを改変することが望ましい場合がある。当業者には、ある核酸コンストラクトに改変を加えてポリペプチド変異体を作製する多くの方法があると認識されている。そのようなよく知られた方法の例として、部位特異的突然変異法、変性オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅法、核酸を含む細胞を突然変異性物質または放射線に暴露する方法、所望のオリゴヌクレオチドの化学合成法（例えば、ライゲーションおよび／またはクローニングと併せて行って大きな核酸を生成する）、およびその他のよく知られた技術（例えば、ＧｉｌｌａｍおよびＳｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ  ８：８１−９７，１９７９；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：７３１−７３４，１９８７を参照）が挙げられる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドをコードする組換え核酸は、選択した生物内における該核酸の翻訳を促進する好適コドンを提供するように改変されたものである。
【００８３】
本発明のポリヌクレオチドには、本発明のポリヌクレオチドと実質的に同様であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも含まれる。本発明に係るそのようなポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドに対して、少なくとも約８０％、より典型的には少なくとも約９０％、さらに典型的には少なくとも約９５％の配列同一性を有する。本発明は、前述のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも約８０％、より典型的には少なくとも約９０％、さらに典型的には少なくとも約９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの相補体をも提供するものである。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、増幅ＤＮＡ、もしくは合成ＤＮＡ）またはＲＮＡであってよい。このようなポリヌクレオチドを得る方法およびアルゴリズムは、当業者によく知られており、その例として、所望の配列同一性を有するポリヌクレオチドをいつも単離可能なハイブリダイゼーション条件を決定するための方法が挙げられる。
【００８４】
本発明によるタンパク質類似体または変異体（すなわち、１個以上のアミノ酸が野生型のポリペプチドと異なるように設計されているもの）をコードする核酸は、部位特異的突然変異法、または所望の点変異を有するプライマーを使用したＰＣＲ増幅法によって作製してよい。好適な突然変異技術の詳細については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、および／またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）を参照のこと。このような核酸の調製方法として、当該技術分野でよく知られる方法を用いた化学合成、例えばＥｎｇｅｌｓら、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ  Ｅｄ．２８：７１６−３４，１９８９に記載される方法を用いてもよい。
【００８５】
いくつかの実施形態では、核酸は本発明のポリペプチドの変異体（すなわち、組換え変異体）をコードするものである。本明細書において、「変異体」または「組換え変異体」とは、組換えＤＮＡ技術によるアミノ酸の挿入、欠失、および置換によって天然ポリペプチドとは異なる、任意のポリペプチドを意味する。目的の活性、例えば酵素活性または結合活性などの喪失を引き起こさないためにどのアミノ酸残基を置換、追加、または欠失させるべきかについては、特定のポリペプチドの配列とその相同ペプチドの配列とを比較し、高い相同性を有する領域内におけるアミノ酸配列の変化の数を最小限に抑えることによって決定すればよい。
【００８６】
いくつかの実施形態では、変異体を作製するためのアミノ酸「置換」は、１個のアミノ酸を、そのアミノ酸と類似した構造および／または化学的特性を有する別のアミノ酸と置き換えること、すなわち保存的アミノ酸置換によることが好ましい。アミノ酸置換は、関与している残基同士の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて行ってよい。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれ、極性中性アミノ酸にはグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ、正に荷電した（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リシン、およびヒスチジンが含まれ、負に荷電した（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、変異体のためのアミノ酸「挿入」または「欠失」は、典型的には約１から５個のアミノ酸について行われる。どのような変異が許容可能かについては、組換えＤＮＡ技術を用い、ポリペプチド分子に対してアミノ酸の挿入、欠失、または置換を系統的に行い、得られた組換え変異体の活性を評価することで、実験的に決定することができる。
【００８８】
あるいは、機能の改変が望ましいいくつかの実施形態では、改変ポリペプチドまたはキメラポリペプチド、例えば変異ポリペプチドを作製するために、核酸に挿入、欠失、また非保存的置換を行うことができる。このような改変によって、例えば、本発明のポリペプチドの生物学的機能または生化学的特性の１つ以上を改変することができる。例えば、このような改変によって、ポリペプチドの、リガンド結合親和性または分解／代謝回転率などの特徴を変えることができる。さらには、このような改変を、発現のために選択された宿主細胞における発現やスケールアップなどにより適したポリペプチドを生成するように選択することができる。
【００８９】
あるいは、これらの同じまたは類似のポリペプチドをコードする組換え核酸を、遺伝子コードの「冗長性」を利用することで合成または選択してもよい。多様な制限部位を生み出すサイレント変異などの様々なコドン置換を導入して、プラスミドもしくはウイルスベクターへのクローニング、または特定の原核もしくは真核細胞系における発現を最適化してもよい。ポリヌクレオチド配列の変異は、ポリペプチドまたはそのポリペプチドに付加された他のペプチドのドメインに反映されうるので、ポリペプチドの任意の部分の特性を改変して、リガンド結合親和性または分解／代謝回転率などの特徴を変えることもできる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、核酸または新規核酸をコードするポリヌクレオチドは、部位特異的突然変異によって改変される。この方法では、所望の変異アミノ酸のポリヌクレオチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列および改変アミノ酸の両端の十分に隣接したヌクレオチドを用いて、改変されている部位の両端において安定的な二本鎖を形成する。一般には、部位特異的突然変異技術は、当業者にはよく知られた技術であり、例えば、Ｅｄｅｌｍａｎら、ＤＮＡ  ２：１８３，１９８３にその例が記載されている。ポリヌクレオチド配列に部位特異的変異を生じさせる汎用的で効率のよい方法の１つは、ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−５００，１９８２に記載されている。
【００９１】
いくつかの実施形態では、ＰＣＲによって新規核酸によるアミノ酸配列変異を得てもよい。出発物質である鋳型ＤＮＡが少量の場合、鋳型ＤＮＡの対応領域の配列とわずかに配列が異なるプライマーを用いることで、所望のアミノ酸変異が得られる。ＰＣＲ増幅によって、プライマーによって特定された位置において、標的をコードする鋳型ポリヌクレオチドと異なるＤＮＡ断片産物の集団が得られる。ＤＮＡ断片産物はプラスミド内の対応する領域と置換され、これによって所望のアミノ酸変異が得られる。
【００９２】
アミノ酸変異を得るその他の技術として、Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ  ３４：３１５，１９８５に記載されたカセット変異法、およびその他の当該技術分野においてよく知られた変異導入法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（前掲）やここに参照するＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙに記載される変異導入技術が挙げられる。
【００９３】
宿主細胞
別の態様においては、本発明は、人工内部共生体を含む真核宿主細胞を提供するものであり、該人工内部共生体は、タンパク質、核酸、および／またはその他の因子を人工内部共生体から宿主細胞内へと分泌することで、宿主細胞に表現型を付与する。いくつかの実施形態では、人工内部共生体は遺伝性である。
【００９４】
本発明において、様々な真核細胞を宿主細胞として使用できる。いくつかの実施形態では、本発明の宿主細胞は動物細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ブタ、ウシ、ネコ科、またはイヌ科などの哺乳類の細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、霊長目の細胞であり、霊長目の例としてサル、チンパンジー、ゴリラ、およびヒトが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、マウスが通常他の哺乳動物、特にヒトのモデル動物として使用されていることから、哺乳類細胞はマウス細胞である（例えば、Ｈａｎｎａ，Ｊ．ら、“Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ａｎｅｍｉａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｗｉｔｈ  ｉＰＳ  ｃｅｌｌｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｋｉｎ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１９２０−２３，２００７；Ｈｏｌｔｚｍａｎ，Ｄ．Ｍ．ら、“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ａｍｙｌｏｉｄ−β  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ，”  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１０３（６）：Ｒ１５−Ｒ２１，１９９９；Ｗａｒｒｅｎ，Ｒ．Ｓ．ら、“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，”  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１７８９−１７９７，１９９５を参照；各文献は参照によって本明細書に組み込まれる）。動物細胞の例として、線維芽細胞、表皮細胞（例えば、腎細胞、乳房細胞、前立腺細胞、肺細胞）、ケラチン生成細胞、肝細胞、脂肪細胞、内皮細胞、および造血細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、動物細胞は、成熟細胞（例えば、末端分化細胞、分裂または非分裂細胞）、または胚細胞（例えば、胚盤胞など）である。
【００９５】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、がん細胞であり、例えばヒトがん細胞である。当業者に周知の様々ながん細胞株を宿主細胞として使用することができる。その例として、Ｃｏｃｏ−２、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、およびＭＣＦ７などの一般的な上皮性腫瘍細胞株、ならびにＨＴ−１０８０およびＨＬ６０などの非上皮性腫瘍細胞株、ＮＣＩ６０細胞株パネルが挙げられる（例えば、Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｒ．，“Ｔｈｅ  ＮＣＩ６０  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｓｃｒｅｅｎ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ６：８１３−２３，２００６を参照のこと；本文献は参照によって本明細書に組み込まれる）。加えて、当業者間で熟知されているように、原発腫瘍からがん細胞を作製することもできる。がん細胞のさらなる例として、固形腫瘍細胞型、造血がん細胞、がん腫、肉腫、白血病、リンパ腫、神経膠腫、前立腺がん、乳がん、肺がん、大腸がん、すい臓がん、黒色腫、膠芽細胞腫、肝がんなどの特定組織のがん、およびＮＣＩ６０がん細胞株パネルが挙げられる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は幹細胞である。当該技術分野において、様々な幹細胞が知られている。それらは宿主細胞として使用することができ、例として、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、表皮神経堤幹細胞、乳房幹細胞、腸幹細胞、間葉系幹細胞、嗅神経成体幹細胞、精巣細胞、および前駆細胞（例えば、神経細胞、血管芽細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞、すい臓細胞、表皮細胞など）が挙げられる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ヒトなどの哺乳類の循環系に見出される細胞である。循環系細胞の例として、特に、赤血球、血小板、形質細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞など、そしてこれらの前駆体細胞が挙げられる。これらの細胞を、まとめて本発明の循環宿主細胞と定義する。本発明には、これらの循環細胞のいずれも用いることができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はＢ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は好中球である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は巨核球である。
【００９８】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は植物細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は単子葉または双子葉植物の細胞であり、例として、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、イネ、ダイズ、ラッカセイ、エンドウ、レンズマメおよびアルファルファ、ワタ、ナタネ、キャノーラ、コショウ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、ナス、ユーカリ、樹木、観賞植物、多年生牧草、および飼料作物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、宿主細胞は藻類細胞であり、例として、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属、イカダモ（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、ハプト藻（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）属、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）属、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）属、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属、およびプロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）属の藻類が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、宿主細胞は真菌細胞であり、例として、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイウェロマイセス（Ｋｌｙｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、デバロミセス（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ジゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、およびシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の真菌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９９】
いくつかの実施形態では、宿主細胞由来の遺伝子の少なくとも１つが遺伝子操作されている。いくつかの実施形態では、標的の宿主細胞の種類に特異的な、当業者に既知の分子生物学的技術を用いて、宿主細胞の遺伝子組換えを行い、宿主細胞に、人工内部共生体に対して必須高分子に関する依存性を付与して寄生性に関する環境圧を構築することで、人工内部共生体と宿主細胞とが、相互に栄養依存的（寄生的（ｂｉｏｔｒｏｐｈｙ））となるようにすることができる。いくつかの実施形態では、人工内部共生体の宿主細胞に対する栄養依存性は、宿主細胞の遺伝子操作を行い、宿主細胞から各種代謝産物、補因子、ビタミン、ヌクレオチド、またはその他の必須分子の合成能を奪うことによって獲得できる。そのような実施形態では、必須分子は人工内部共生体によって提供されてよい。組換え対象の宿主細胞遺伝子の例として、アミノ酸生成のための３−ホスホグリセリン酸生合成経路の終点においてセリンをグリシンに変換する酵素セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が挙げられる。宿主細胞におけるこの遺伝子の不活性化によって、グリシンを産生する人工内部共生体への依存性を有する、またはそれを好む宿主細胞を作製することができると考えられる。
【０１００】
人工内部共生体の宿主細胞への導入方法
本発明の単細胞生物を宿主細胞内に導入するには、当業者に知られた様々な方法を用いることができる。例として、顕微注入法、天然の食作用、誘発食作用、マクロピノサイトーシス、その他の細胞取り込み過程、リポソーム融合、赤血球ゴースト融合、電気穿孔法、受容体を介在させる方法などが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｅｌｌｅ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｃｅｌｉｓら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８６）、及びこれらの文献に記載の参考文献を参照のこと；これらの文献は、参照によって全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、単細胞生物は、顕微注入法による宿主細胞の細胞質への注入によって、宿主細胞内に導入される。様々な顕微注入法が当業者に知られている。顕微注入法は、効率のよい導入法（本質的に１００％）であり、細胞の種類に制限はない（上記文献、Ｘｉ，Ｚ．およびＤｏｂｓｏｎ，Ｓ．，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｏｌｂａｃｈｉａ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏ  ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ，”  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１（６）：３１９９−２０４，２００５；Ｇｏｅｔｚ，Ｍ．ら、“Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｓｏｌ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌｓ，”  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１２２２１−６，２００１；各文献は参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１０２】
天然の食細胞は微生物、例えばＭＴＢを取り込むことが示されてきた（Ｂｕｒｄｅｔｔｅ，Ｄ．Ｌ．ら、“Ｖｉｂｒｉｏ  ＶｏｐＱ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＰＩ３−ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ａｎｄ  ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ，”  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７３：６３９，２００９；Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ，Ａ．ら、“Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ  ｉｎｖａｓｉｎ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｖｉａ  β１  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ，ＣＤＣ４２Ｈｓ  ａｎｄ  ＷＡＳｐ  ｉｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，”  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：６９３，２００１；Ｈａｃｋａｍ，Ｄ．Ｊ．ら、“Ｒｈｏ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｂｙ  Ｆｃγ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，”  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１８６（６）：９５５−６６，１９９７；Ｍａｔｓｕｎａｇａ，Ｔ．ら、“Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍａｇｎｅｔｉｔｅ  ｂｙ  ｌｅｕｃｏｃｙｔｅｓ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．３１（４）：４０１−５，１９８９；これらの文献はすべて、参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、非食作用細胞型を様々な因子、すなわち培地、化学的因子、および生物学的因子（例えば、バキュロウイルス、タンパク質因子、遺伝子ノックインなど）と共培養することで誘起して微生物のエンドサイトーシスを行うことができる（例えば、Ｓａｌｍｉｎｅｎ，Ｍ．ら、“Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｎｔｒｙ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｂｙ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ，”  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７９（５）：２７２０−８，２００５；Ｍｏｄａｌｓｌｉ，Ｋ．Ｒ．ら、“Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＥｐ−２  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｘｓａｃｋｉｅ  Ｂ１  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ｏｎｌｙ  ａｆｔｅｒ  ｐｒｅｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＵＶ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ，”  ＡＰＭＩＳ  １０１：６０２−６，１９９３；Ｈａｙｗａｒｄ，Ｒ．Ｄ．およびＫｏｒｏｎａｋｉｓ，Ｖ．，“Ｄｉｒｅｃｔ  ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｕｎｄｌｉｎｇ  ｏｆ  ａｃｔｉｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＳｉｐＣ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，”  ＥＭＢＯ  Ｊ．１８：４９２６−３４，１９９９；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｓ．ら、“Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｅｌｉｖｅｒ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ｈｏｓｔ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｒａｃ１  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ，”  ＥＭＢＯ  Ｊ．２１：２９２３−３５，２００２；Ｂｉｇｉｌｄｅｅｖら、Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．３９：１８７，２０１１；Ｆｉｎｌａｙ，Ｂ．Ｂ．およびＦａｌｋｏｗ，Ｓ．，“Ｃｏｍｍｏｎ  ｔｈｅｍｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．６１：１３６−６９，１９９７を参照のこと；各文献は、参照によって全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、数々の微生物およびウイルスが細胞内取り込みに利用しているマクロピノサイトーシスに関連する過程、または「細胞飲作用」を、人工内部共生体の宿主細胞内への導入に使用してもよい（Ｚｈａｎｇ，Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ａｇｅｎｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＩＣＡＤ）［オンラインデータベース］（２００４）；Ｂｅｔｈｅｓｄａ（ＭＤ）：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＵＳ），ＮＣＢＩ  ２００４−２０１１；各文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）。細胞を誘起して微生物を取り込ませるために、様々な実験手法を用いることができる。核酸、タンパク質、薬剤、および細胞小器官などの数種の物質や物体をリポソーム内に封入し、細胞に送達する手法が行われてきた（Ｂｅｎ−Ｈａｉｍ，Ｎ．ら、“Ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ，”  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．８（５）：１３６８−７３，２００８；Ｌｉａｎ，Ｗ．ら、“Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｃａｎ  ｂｅ  ａｃｈｉｅｖｅｄ  ｂｙ  ｂｏｍｂａｒｄｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｏｒ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｔｈｅ  ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，”  Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．３１３（１）：５３−６４，２００７；Ｈｅｎｇ，Ｂ．Ｃ．およびＣａｏ，Ｔ．，“Ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｅｏｍｙｃｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌｉｎｅａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ／ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｅｓ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｄｖａｎｔａｇｅｓ  ｏｖｅｒ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｍａｒｋｅｒ  ｇｅｎｅｓ，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｎｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｅｌｌ−ｓｏｒｔｉｎｇ，”  Ｍｅｄ．Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ  ６５（２）：３３４−６，２００５；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ．Ｖｏｌ．１  ５４：１９８，１９９０；各文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）。この手法は安価であり、比較的単純で規模拡大も可能である。また、インキュベーション条件の操作、リポソームの荷電の変更、受容体の介在、および磁気強化によって、リポソームの取り込みを促進することができる（例えば、Ｐａｎら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ．３５８：２６３，２００８；Ｓａｒｂｏｌｏｕｋｉ，Ｍ．Ｎ．およびＴｏｌｉａｔ，Ｔ．，“Ｓｔｏｒａｇｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ＭＬＶ  ａｎｄ  ＲＥＶ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｓｏｄｉｕｍ  ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ（ａｑｕｅｏｕｓ  ＆  ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ），”  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏ．５２（１０）：２３−２７，１９９８；Ｅｌｏｒｚａ，Ｂ．ら、“Ｃ��ｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．”  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１０（２）：２３７−４８，１９９３；Ｍｙｋｈａｙｌｙｋ，Ｏ．ら、“Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏ．６０５：４８７−５２５，２０１０を参照のこと；各文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１０５】
赤血球を介在させる伝達は、リポソーム融合に類似するものであり、高い効率と試験されたすべての細胞に対する有効性を有することが示されている（Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｅｌｌｅ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ｃｅｌｉｓら編；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８６）、本文献は参照によって本明細書に組み込まれる）。典型的な赤血球への導入は、浸透圧衝撃法または電気穿孔法によるものである（Ｓｃｈｏｅｎ，Ｐ．ら、“Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｉｎ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ，”  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：８２３−３２，１９９９；Ｌｉ，Ｌ．Ｈ．ら、“Ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ−ｓｉｚｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａ  ｐｅｌｌｅｔ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，”  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊ．７１：４７９−８６，１９９６；Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ａ．およびＭｅｌｃｈｉｏｒ，Ｄ．Ｌ．，“Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｓｕｇａｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：２７１２−１８，１９８４；各文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）。別法として、赤血球の導入は、単細胞生物を用いた造血前駆細胞の導入、ならびに造血前駆細胞の単細胞生物を含む赤血球への分化および増殖の誘起による、間接的手法によって行ってもよい。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、細胞に因子を送達する慣用の安価な方法である電気穿孔法を用いて人工内部共生体を宿主細胞内に導入することができる（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．，“Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｌａｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ，”  Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ  １５４：１９８−２０８；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ２０８−１１２，１９９０；Ｗｏｌｂａｎｋ，Ｓ．ら、“Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｃｋｉｎｇ，”  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋ  ８：１６３−１７７，２００７；各文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、自然的に微生物のエンドサイトーシスを行う宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）を使用する。いくつかの実施形態では、改変された単細胞微生物は、ＣＨＯ培養物に直接添加される。ＭＴＢの感染前、ＣＨＯ細胞を、１０％ウシ胎児血清培地とハムＦ−１２培地との併用のような、標準的な手法を用いて培養する。感染の後には、培地に鉄（４０から８０μＭ）をリンゴ酸鉄またはＦｅＣｌ３として追加的に加える。その他の多くの細胞型も、エンドサイトーシス、具体的には食作用によって、微生物を内在化する。例えば、内部共生体または寄生体は細胞内侵入のための固有の方法を有しており、その自然的な侵入過程を人工内部共生体の内在化に利用して、いわゆるシンビオソームを作出することができる。いくつかの実施形態では、単一細胞由来のシンビオソームを、顕微注入法、細胞小器官移植法、およびキメラ化法を用いて、別の種類の細胞（すなわち、人工内部共生体のエンドサイトーシスが不可能な細胞）に移植することができる。このような宿主細胞は、標準的な培地において、具体的な細胞の種類に応じた技術を用いて培養される。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、リポソームを介在させる方法によって、単細胞生物を宿主細胞に導入する。ＭＴＢより大きい器官であるミトコンドリアおよび葉緑体は、リポソームに封入した場合、真核細胞に効率よく導入されてきた（例えば、Ｂｏｎｎｅｔｔ，Ｈ．Ｔ．，Ｐｌａｎｔａ  １３１：２２９，１９７６；Ｇｉｌｅｓ，Ｋ．ら、“Ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ  ｂｙ  ｐｌａｎｔ  ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，”  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｐｌａｎｔ  １６（７）：５８１−５８４を参照；各文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）。リポソーム融合のための多くの手法および薬剤が入手可能であり、当業者が実施するにあたり過度の実験をすることなく利用できるものである（例えば、Ｂｅｎ−Ｈａｉｍ，Ｎ．ら、“Ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ，”  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．８（５）：１３６８−７３，２００８；Ｌｉａｎ，Ｗ．ら、“Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｃａｎ  ｂｅ  ａｃｈｉｅｖｅｄ  ｂｙ  ｂｏｍｂａｒｄｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｏｒ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｔｈｅ  ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，”  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１３（１）：５３−６４，２００７；Ｈｅｎｇ，Ｂ．Ｃ．およびＣａｏ，Ｔ．，“Ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｅｏｍｙｃｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌｉｎｅａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ／ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｅｓ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｄｖａｎｔａｇｅｓ  ｏｖｅｒ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｍａｒｋｅｒ  ｇｅｎｅｓ，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｎｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｅｌｌ−ｓｏｒｔｉｎｇ，”  Ｍｅｄ．Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ  ６５（２）：３３４−６，２００５；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ，Ｖｏｌ．１  ５４：１９８，１９９０を参照；各文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１０９】
再プログラムされた宿主細胞の使用
本発明の人工内部共生体は、宿主細胞にペプチド／タンパク質、核酸、および／またはその他の因子を導入する。これらのタンパク質、核酸、またはその他の因子は、遺伝子転写もしくは翻訳、翻訳後修飾、宿主細胞分化、再モデリング、増殖、外部および／または内部刺激への感受性もしくは応答性、または代謝、同化、もしくはその他の生化学的過程を変化させることができる。いくつかの実施形態では、人工内部共生体は、特定の転写因子、成長因子、サイトカイン、シグナル経路の分子、またはその他の組換えタンパク質の発現、利用可能性、および送達によって宿主細胞を制御することができる。人工内部共生体は、また、人工内部共生体から宿主細胞内へ分泌されたタンパク質、核酸、またはその他の因子によって、宿主細胞に所望の表現型を付与することができる。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、人工内部共生体から宿主細胞内へ分泌されたタンパク質、核酸、またはその他の因子によって、細胞生存能、増殖、分化、脱分化、成長、血管新生、神経新生、骨形成、および解毒に影響を与えることができる。いくつかの実施形態では、人工内部共生体を、細胞の標識、病態もしくは欠乏症の治療、細胞死の誘導、創傷治癒の誘導、細胞シグナル伝達の改変、遺伝子発現の改変、細胞内タンパク質もしくは核酸の中和、またはバイオ燃料もしくは新たなエネルギー源創出のための経路の提供に使用することができる。いくつかの実施形態では、人工内部共生体は、特に栄養素、成長因子、タンパク質、無機物、核酸、治療剤、小分子、イオン、ケモカイン、多糖類、脂質、金属、補因子、およびホルモンの提供による細胞機能の改変に使用される。いくつかの実施形態では、人工内部共生体は、宿主細胞とともに、バイオレメディエーション用試薬、酵素、神経伝達物質、ポリペプチド、炭水化物、農薬、肥料、およびその他の所望の化合物の製造に用いることができる。いくつかの実施形態では、内部共生体は、ヒドロゲナーゼ、ニトロゲナーゼ、およびラッカーゼのような、エネルギー生成または交換に関連するタンパク質を分泌するものであってよい。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、人工内部共生体は、宿主細胞内へアミノ酸を分泌するものであってよい。アミノ酸の例として、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンが挙げられる。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、人工内部共生体は、核酸、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ＳｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＤＮＡを宿主細胞内に分泌するものであってよい。人工内部共生体と宿主細胞との間の遺伝物質の交換を遺伝子治療に利用して、遺伝子サイレンシング、遺伝子転写、遺伝子置換、遺伝子発現改変、遺伝子改変、遺伝子または核酸断片の導入、核酸同士の結合、または核酸との相互作用を起こしてもよい。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、人工内部共生体は、受容体、リガンド（ホルモン、神経伝達物質、サイトカイン、ケモカイン）、イオンチャンネル、キナーゼ、ホスファターゼ、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、転写因子、転写抑制因子、転写促進因子）などの分子を宿主細胞のシグナル経路に導入するものであってよい。細胞の再プログラミング化のためのタンパク質群の例として、Ｏｃｔ４、Ｏｃｔ３、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、ＮＡＮＯＧ、およびＬｉｎ２８を含む山中因子が挙げられる。山中因子のすべてまたは一部の発現によって、成熟細胞をｉＰＳ細胞へと再プログラムすることができる（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、“Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｆａｃｔｏｒｓ，”  Ｃｅｌｌ  １３１（５）：８６１−７２，２００７を参照）。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、人工内部共生体を、細胞内部分の感知による該部分の細胞内量の定量、物質の放出の発動、細胞死の発動、遺伝子発現の発動、細胞の標識、または細胞生存性、分化、もしくは細胞周期ステージの感知に使用することができる。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、人工内部共生体は、細胞の再プログラムに使用される転写因子、例えばＯｃｔ４を分泌するものであってよい。いくつかの実施形態では、人工内部共生体は、リソソーム蓄積症またはＡＬＤＨ２などにおける酵素欠乏を補填する酵素を分泌するものであってよい。いくつかの実施形態では、人工内部共生体は、細胞を標識する成分、例えばカルセイン、超常走磁性酸化鉄、ガドリニウムを含む試薬、蛍光タンパク質、発光タンパク質、磁気レポーター、その他のレポータータンパク質などの成分を分泌するものであってよい（Ｇｉｌａｄら、“ＭＲＩ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅｓ，”  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．４９：１９０５−０８，２００８；この文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、人工内部共生体は、発光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰなど）および／またはルシフェラーゼなどの、レポーターからのビーコンを宿主細胞に提供するタンパク質またはその他の因子を分泌するものであってよい。分泌されてよいその他のレポーターとしては、例えば特に酵素、エピトープ標識、および通常宿主細胞で発現されない異種タンパク質などが挙げられる。
【０１１６】
原核生物は多様な生態的ニッチで生存するよう進化してきており、驚くほどの生物学的多様性を示す。逆に、真核生物は、これよりも大きく限定された生化学的性質を有する一方で、複雑な構造、組織、および生物を形成する能力を有する。したがって、いくつかの実施形態では、原核生物の生物学的多様性を真核生物の生物複雑性に組み入れるために本発明を使用することができる。この能力は、人工内部共生体と宿主細胞との間で相互の情報伝達または多様な物質もしくはシグナルの伝達が可能であることによるものである。人工内部共生体によって解決される宿主細胞が遭遇する特有の問題に基づいて、多様な新規宿主細胞の作出が可能である。例えば、現代の栽培農業における諸問題として、特に肥料の使用、淡水供給量の先細り、気温および気候の変動、昆虫、疫病および真菌への感染、毒性を有する土壌環境、および栄養価の減少が挙げられるが、これらはすべて微生物によって解決された問題である。
【０１１７】
本発明の適用例として、植物および真菌類の生育に使用する、肥料の主要成分である固定窒素源の提供が挙げられる。酵素、すなわちニトロゲナーゼによって大気中の窒素を固定する様々な綱に属する細菌が存在する。そのような細菌として、特に、アナベナ属、ネンジュモ属、ジアゾ栄養生物、藍色細菌、例えば、非常に重要な細菌である、トリコデスミウム属、ベイエリンキア属、クロストリジウム属、緑色硫黄細菌、アゾトバクター科、根粒菌、およびフランキア属が挙げられる。したがって、いくつかの実施形態では、このような生物に由来する人工内部共生体を、空気中の窒素の固定、および宿主細胞の代謝に適合する窒素含有化合物の輸送に使用することができる。
【０１１８】
本発明の別の適用例として、淡水供給に関する懸念への対応が挙げられる。このような懸念は、作物の海水灌漑または海水による水耕栽培が可能であれば、原理的に緩和可能である。海水使用は、植物細胞に大きな浸透圧を与える。高塩濃度下での生存は、フラボバクテリウム綱（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ）、藍色細菌、プロテオバクテリア門（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フィルミクテス門、メタノサルキナ目、およびハロバクテリウム目に属する微生物などの好塩性微生物類が生存する生態的ニッチである。一般に２種類の浸透圧適応が報告されてきた。すなわち、無機イオンの蓄積、または浸透圧性の有機溶質の合成である。人工内部共生体がもたらす前者の「高濃度塩の包含（“ｈｉｇｈ−ｓａｌｔ  ｉｎ”）」戦略によって、植物細胞が受ける浸透圧を軽減し、人工内部共生体内に塩イオンを集めて、宿主細胞の細胞質塩濃度を致死レベルより下にすることで、その作物が海水灌漑下でも生存できると考えられる。この戦略は、ハロバクテリウム目に属する嫌気性好塩古細菌、ハロアナエロビウム目に属する発酵を行う嫌気性菌（フィルミクテス門の低ＧＣ種）、および赤色好気性細菌のサリニバクター（バクテロイデス門の枝）において利用されている。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、人工内部共生体を、極限環境への耐性などの分子および生理学的適応を付与するために使用することができる。例えば、好熱および好冷微生物は、極限の温度および気候環境においてコロニーを形成した。好熱菌は、最も極限の状態では１００℃を超える温度に耐えるよう、自身のタンパク質、膜、および細胞構成要素を進化させてきた。人工内部共生体によって、いくつかの作物に適用可能な温度範囲を拡大することができると考えられる。また、好冷菌または低温菌由来の人工内部共生体によって、植物および真菌類に低温耐性を付与することができると考えられる。これらの微生物は、広範囲の分子および生理学的適応を示す。例えば、低温に適応した酵素、低温で流動性を維持する特有の膜脂質、菌体外多糖、低温ショックまたは不凍性タンパク質などの凍結保護物質が挙げられる。宿主細胞内への凍結保護物質の分泌によって、低温耐性という表現型が付与されると考えられる。このような微生物の属の例として、特に、マリノバクター属、ハロモナス属、デルマコッカス属、コクリア属、ミクロモノスポラ属、ストレプトマイセス属、ウィリアムシア属、ツカムレラ属、クロストリジウム属、アルテロモナス属、コルウェリア属、グラシエコラ属、シュードアルテロモナス属、シュワネラ属、ポラリバクター属、シュードモナス属、サイクロバクター属、アスロバクター属、フリゴリバクテリウム属、サブテルコラ属、マイコバクテリウム属、ロドッカ属、およびバシラス属が挙げられる。これらの微生物のゲノム配列の多くが既に決定されているか、現在決定中である。例えば、Ｍ．フリギドゥム、Ｍ．ブルトニ、Ｃ．シンビオサム、Ｃ．サイクレリスラエ、Ｐ．ハロプランクチス、ハロラブラム・ラクスプロファンディ、ビブリオ・サルモニシダ、フォトバクテリウム・プロフォンドゥム、Ｓ．ビオラセア、Ｓ．フリギディマリナ、サイクロバクター属ｓｐ．２７３−４、Ｓ．ベンシカ、サイクロモナス属ｓｐ．ＣＮＰＴ３、モリテーラ属ｓｐ．、デスルフォタレア・サイクロフィラ、イグジォバクテリウム属２５５−１５、フラボバクテリウム・サイクロフィラム、サイクロフレクサス・トークイス、ポラリバクター・フィラメンタス、Ｐ．イルジェンシー、レニバクテリウム・サルモニナルム、およびレイフソニア属関連ＰＨＳＣ２０−ｃ１が挙げられる。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、人工内部共生体は、環境の汚染源およびその他の毒性成分に対する修復手段として使用される。例えば、重金属またはその他の汚染物質が毒性を呈する量含まれている土壌環境は、農業には不適となりうる。これらの物質を代謝または濃縮する人工内部共生体は、したがって、宿主植物に抵抗性の表現型を付与する。好酸菌として知られる微生物綱は、高濃度の金属（例えば、ヒ素、水銀、銅、鉄など）および半金属に対する耐性を有している。アシドチオバシラス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）、サーモプラズマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、ピクロフィルス・トリドゥス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ  ｔｏｒｒｉｄｕｓ）、スルフォロブス・トコダイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ）、およびフェロプラズマ・アシダルマヌス（Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄａｒｍａｎｕｓ）のゲノム配列が既に決定されており、これらの生物を宿主細胞内に導入して、上記のような有毒環境に対する耐性を付与することができる。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、人工内部共生体を、Ｂ１２、ビオチン、葉酸、およびパントテン酸などの必須ビタミンを産生し宿主細胞に送達するために使用することができる。このような栄養素は、バクテロイデス属、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム属、およびフソバクテリウム属などのいくつかの腸内細菌によって合成される（Ｈｏｏｐｅｒ，Ｌ．Ｖ．ら、“Ｈｏｗ  ｈｏｓｔ−ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｓｈａｐｅ  ｔｈｅ  ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ，”  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ．２２：２８３−３０７，２００２）。シュードモナス属、クレブシエラ属、レシチナーゼ陽性クロストリジウム属、ベイロネラ属、およびフソバクテリウム門は、相当量のビタミンＢ１２様物質を産生する（Ａｌｂｅｒｔ，Ｍ．Ｊ．ら、“Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ１２  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｂａｃｔｅｒｉａ，”  Ｎａｔｕｒｅ  ２８３：７８１−８２，１９８０；この文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本発明を合成生物学用途に適用することができる。過去数十年にわたり、遺伝学、合成生物学、および微生物学の発展によって、生物産業、生物医薬、その他の商業用途において使用する多くの人工微生物が作出されてきた。これらのシステムの限界として、そのような人工微生物は、細胞生存性（例えばハウスキーピング機能）および人工経路の機能の両方のための遺伝的特徴および代謝を支持する必要がある、という点が挙げられる。人工内部共生体の場合、ハウスキーピング機能が宿主から提供されるために、人工内部共生体における人工的機能に投資できる資源がより多くなるため、代替的戦略を提供する。医療の場においては、薬剤溶出人工内部共生体によって、多くの疾病に潜在する細胞機能を置き換えることができる。その例として、膵細胞におけるインシュリン産生の回復、ホルモンまたは代謝物欠乏の回復などが挙げられる。工業的には、人工内部共生体によって、多くの生合成材料、バイオ燃料などの収量を上げることができるであろう。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、炭素、エネルギー（例えば、内共生由来のミトコンドリア、ハイドロジェノソーム、プラスチド、マイトソーム、およびミトコンドリア由来の細胞小器官）、またはその他の代謝物を提供する人工内部共生体は、商業的に有用でありうる。例えば、動物細胞が、カルビン回路および光合成によって炭素および／またはＡＴＰを得られるようにして、研究室内で生育した貯蔵食料の使用を可能にする。また以前に、植物細胞の葉緑体を動物細胞に移す試みが報告されている（Ｂｏｎｎｅｔｔ，  Ｈ．Ｔ．，“Ｏｎ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  Ｖａｕｃｈｅｒｉａ；ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ  ｂｙ  ｃａｒｒｏｔ  ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ，”  Ｐｌａｎｔａ  １３１：２２９−３３，１９７６；Ｇｉｌｅｓ，Ｋ．ら、“Ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ  ｂｙ  ｐｌａｎｔ  ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，”  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｐｌａｎｔ  １６：５８１−４，１９８０；これらの文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）。葉緑体タンパク質の大部分は核ゲノムにコードされているため、このような試みが未だ成功していないことは当然予想されることである。実際、内共生由来の細胞小器官の定義は、遺伝物質を宿主の核ゲノムに移行させるということである。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、酸素以外の電子供与体を用いたＡＴＰ産生を利用して、様々な宿主細胞を新たなニッチで生育させることもできると考えられる。そのようなニッチは、地球外である可能性さえある。微生物は、様々なＡＴＰ産生方法を有している。例えば、光合成生物、化学合成生物、光無機栄養生物（例えば、藍色細菌、クロマチウム科、クロロビウム科）、光有機栄養生物（例えば、ロドスピリラム科）、化学合成無機栄養生物（例えば、水素酸化細菌、硫黄菌属、ニトロソモナス属、ニトロバクター属、メタン菌、酢酸菌）、化学合成有機栄養生物（例えば、シュードモナス属菌、バシルス属、硫酸還元菌、クロストリジウム属、乳酸菌）、および上記のような代謝経路を有する人工内部共生体または上記のような代謝経路を人工的に導入した人工内部共生体を、適切な宿主細胞に導入することができる。
【０１２５】
近年、電気を産生または伝導する微生物が記載されている。そのような微生物由来の人工内部共生体によって、電子機器と直接相互作用可能な複合組織を得ることができると考えられる。
【０１２６】
本発明は、以下に記載する実験の詳細によってよりよく理解されると考えられる。しかし、当業者であれば、記載された特定の方法および結果は、上述の本発明の単なる例であって、本発明を開示された形態そのものに包括する、または限定する意図はないと容易に理解するであろう。
【０１２７】
実施例
【実施例１】
【０１２８】
実施例１  Ｉ型分泌システムを用いた人工内部共生体から宿主細胞内へのタンパク質の移行
グラム陰性菌のＩ型分泌システム（Ｔ１ＳＳ）は、様々な大きさの広範な機能を有する様々なタンパク質（これらの同種基質）排出に用いることができる。ＭＴＢのゲノムはＴ１ＳＳ遺伝子をコードしている（Ｍａｔｓｕｎｇａ，Ｔ．ら、“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅ  ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｍａｇｎｅｔｏｔａｃｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．ＡＭＢ−１，”  ＤＮＡ  Ｒｅｓ．１２：１５７−６６，２００５；この文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１２９】
標的タンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）のＮ末端を、ＹＰ＿４２０６４０（ＲＴＸ毒素および関連Ｃａ２＋結合タンパク質）、ＹＰ＿４２３４１９（ＲＴＸ毒素および関連Ｃａ２＋結合タンパク質）、ＹＰ＿４２２７８５（ａｍｂ３４２２）、またはその他のＭＴＢのＴ１ＳＳ基質のＣ末端の２００アミノ酸に融合させる。または別法として、ＭＴＢのＹＰ＿４２０５０２、ＹＰ＿４２０６３１．１、ＹＰ＿４２０６３８．１、ＹＰ＿４２０６４０．１、ＹＰ＿４２１３６４．１、ＹＰ＿４２２６６２．１、ＹＰ＿４２２７８５．１、およびＹＰ＿４２３４１９．１のタンパク質Ｃ末端（例えば、分泌シグナルを含む、Ｃ末端の２００アミノ酸）を上記融合に用いて、組換え融合タンパク質を分泌システムに標的化してもよい。ＧＦＰまたはＲＦＰと、ＹＰ＿４２０６４０（ＲＴＸ毒素および関連Ｃａ２＋結合タンパク質）、ＹＰ＿４２３４１９（ＲＴＸ毒素および関連Ｃａ２＋結合タンパク質）、ＹＰ＿４２２７８５（ａｍｂ３４２２）、またはその他のＭＴＢのＴ１ＳＳ基質のＣ末端の２００アミノ酸との融合体をコードするＤＮＡを、ｐＢＢＲ−ＭＳＣ（Ｋｏｖａｃｈ，Ｍ．Ｅ．ら、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ：ａ  ｂｒｏａｄ−ｈｏｓｔ−ｒａｎｇｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ，”  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １６：８００−２，１９９４）にクローニングする。この融合タンパク質の人工内部共生体外への移行は、蛍光、または免疫蛍光および／もしくは免疫ブロット法で検出される。
【０１３０】
別の具体例として、大腸菌のヘモリシン（Ｈｌｙ）分泌システムが、最もよく研究されたＩ型分泌システム（Ｔ１ＳＳ）の１つである。ヘモリシンＡ毒素（ＨｌｙＡ）の分泌は、膜タンパク質複合体によって触媒され（Ｂａｋｋｅｓ，Ｐ．Ｊ．ら、“Ｔｈｅ  ｒａｔｅ  ｏｆ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｄｉｃｔａｔｅｓ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  ｔｙｐｅ  １  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ，”  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８５（５２）：４０５７３−８０，２０１０）、この酵素は、ＡＴＰ結合カセット輸送体である内膜タンパク質のＨｌｙＢ（Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ａ．Ｌ．およびＪ．Ｃｈｅｎ“ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ，”  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７３：２４１−６８，２００４）、外膜タンパク質であるＴｏｌＣ（Ｋｏｒｏｎａｋｉｓ，Ｖ．ら、“Ｃｒｙｓｔａ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＴｏｌＣ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｔｏ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｅｆｆｌｕｘ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｏｒｔ，”  Ｎａｔｕｒｅ  ４０５（６７８９）：９１４−９，２０００）、および内膜に固定された膜融合タンパク質であるＨｌｙＤ（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．およびＧ．Ｍ．Ｃｈｕｒｃｈ，“Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｉｅｓ：ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｆｆｌｕｘ  ｐｕｍｐｓ，”  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２８７（３）：６９５−７１５，１９９９）からなる。ＨｌｙＡの排出は、ＨｌｙＢによるＡＴＰ加水分解を必要とする（Ｔｈａｎａｂａｌｕ，Ｔ．ら、“Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｏｒｔ  ｆｒｏｍ  Ｅ．ｃｏｌｉ：ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｂｒｉｄｇｉｎｇ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｎｅｒ−ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ  ｔｏ  ａｎ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｘｉｔ  ｐｏｒｅ，”  ＥＭＢＯ  Ｊ．１７（２２）：６４８７−９６，１９９８）。ＨｌｙＡのＣ末端の最後の２１８アミノ酸が、Ｔ１ＳＳによる多様なポリペプチドの分泌を方向付けることが既に示されている（Ｋｅｎｎｙ，Ｂ．ら、“Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈａｅｍｏｌｙｓｉｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｏｆ  ＰＣＭ，ＣＡＴ  ｏｒ  ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｆｕｓｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｈｌｙ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｉｇｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ，”  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：２５５７−６８，１９９１；Ｍａｃｋｍａｎ，Ｎ．ら、“Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ  ��ｆ  ｈａｅｍｏｌｙｓｉｎ，”  ＥＭＢＯ  Ｊ．６，２８３５−４１，１９８７；Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｉ．Ｂ．ら、“Ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ，”  Ｊ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．２２（３）：４７３−９１，１９９０）。
【０１３１】
ＧＦＰまたはＲＦＰなどのタンパク質をＴ１ＳＳによって微生物細胞外に移行させて標的宿主細胞内へ導入するために、例えば、タンパク質、ＧＦＰ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＧ７８０３７．１）は、ＨｌｙＡのＣ末端の最後の２１８アミノ酸（ＨｌｙＡ  Ｎ末端２１８、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０９９８３．１、太字下線部分の配列）に融合される。
【０１３２】
【数１０】
2016528928.tif 000012
【０１３３】
例えば、上記ＧＦＰ−ＨｌｙＡＣ末端２１８融合体は、ＨｌｙＢ−ＨｌｙＤ−ＴｏｌＣ複合体を介して、微生物細胞外に分泌され宿主細胞へと移行する。上記ＧＦＰ−ＨｌｙＡＣ末端２１８融合体およびＨｌｙＢ−ＨｌｙＤ−ＴｏｌＣ複合体は、プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２に導入され、ｔａｃプロモーターの制御下で発現される。標的宿主細胞内への上記ＧＦＰ−ＨｌｙＡＣ末端２１８融合体の移行は、蛍光顕微鏡法でモニタリングされる。
【０１３４】
移行／分泌分析（タンパク質のＭＴＢから分泌の証明）
適切な組換えプラスミドを含むＭＴＢ株の一晩培養物の希釈液（１：１０）を、抗生物質を添加した新しいＭＧに播種する（培養条件に付いては、Ｇｒｅｅｎｅ，Ｓ．Ｅ．ら、“Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣｔｒＡ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａｎ  ａｎｃｅｓｔｒａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ａｌｐｈａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ，”  Ｊ  Ｂａｃｔ．１９４：２９７３−８６，２０１２を参照）。規定のプラスミドの組み合わせを保持する細胞を、４００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ４００）が０．２になるまで培養し、次いでＩＰＴＧまたはアラビノースを添加して、標的のタンパク質融合体の発現を誘導する。上清中のタンパク質を、１０〜２０％のトリクロロ酢酸で３０分間４℃で沈殿させる。沈殿したタンパク質を、遠心分離によって回収し、８０％アセトンで洗浄する。細胞のペレットを、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）−１ｍＭのＥＤＴＡで１回洗浄する。細胞のペレットおよび沈殿処理後の上清を、１×ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ローディングバッファーに再懸濁し、０．２ＯＤ単位となる量をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット法によって分析する。そして、タンパク質の、クマシーブリリアントブルーによる染色および／または特異的抗体を用いた免疫ブロッティングによる標識を行う。ＧＦＰを分泌するＭＴＢ分離株を、磁気を利用した導入法によって、哺乳類細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ２３１に導入する。こうして人工内部共生体を含む細胞が得られ、移行されたタンパク質は蛍光によって、または免疫蛍光法もしくは免疫ブロット法を用いて検出される。
【実施例２】
【０１３５】
実施例２  ＩＶ型分泌システムを用いた人工内部共生体から宿主細胞内へのタンパク質の移行
ＣａｇＡタンパク質の末端の２０アミノ酸を、ＲＳＦ１０１０  ＭｏｂＡタンパク質のＣ末端の２４アミノ酸（６８４〜７０９番目の残基）と置換することによって、ＣａｇＡは、Ｔ４ＳＳシステムによって分泌される。ＣａｇＡ−ＭｏｂＡの宿主細胞内への移行は、宿主細胞内のＣａｇＡによるハミングバード表現型の観察によって確認される。このハミングバード表現型は、Ｓｅｇａｌらによって記載されており、「広がりかつ伸びるような細胞の成長、膜状仮足（細胞縁に存在するアクチン薄膜）、およびフィラポディア（アクチンフィラメントの密な束を含む指状突起）を特徴とする」と説明されている（Ｓｅｇａｌ，Ｅ．Ｄ．ら、“Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ：Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  Ｃａｇａ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃｈａｎｇｅｓ  ｂｙ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  Ｐｙｌｏｒｉ，”  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６（２５）：１４５５９−６４，１９９９を参照）。
【０１３６】
ハミングバード表現型は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）または血小板由来成長因子（ＰＧＤＦ）によって誘導される上皮細胞の形態的変化に似たものである（Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｔ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，”  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５４（Ｓｕｐｐｌ  １）：Ｓ１２−２０，２００４）。肝細胞増殖因子は細胞分散因子の名でも知られ、例えば、肝臓または乳腺由来上皮細胞におけるコラーゲンゲルからなる三次元的分岐ダクトを形成するなど、特有の形態形成活性を惹起する（Ｏｈｍｉｃｈｉ，Ｈ．ら、“Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）  ａｃｔｓ  ａｓ  ａ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｄｕｒｉｎｇ  ｆｅｔａｌ  ｌｕｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，”  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５：１３１５−１３２４，１９９８）。
【０１３７】
ＧＦＰなどのその他のタンパク質と、ＭｏｂＡのＣ末端残基（下記配列を参照）とを融合し、Ｔ４ＳＳによって該タンパク質をヘリコバクター・ピロリから宿主細胞ＭＤＭ−ＭＢ２３１内へ移行させる。ＧＦＰの場合、宿主細胞ＭＤＭ−ＭＢ２３１内へのこのタンパク質の移行は、人工内部共生体外におけるＧＦＰ蛍光の有無の観察によってモニタリングすることができる。
【０１３８】
ＭｏｂＡの６８４〜７０９残基（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ２６４４５．１、太字下線で示す配列）と融合するＧＦＰのアミノ酸配列（配列はＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＧ７８０３７．１）を以下に示す。
【０１３９】
【数１１】
2016528928.tif 000013
【０１４０】
あるいは、ＧＦＰなどのその他のタンパク質と、ＶｉｒＤ５のＣ末端の５０アミノ酸残基とを融合し、Ｔ４ＳＳによって該タンパク質をＡ．ツメファシエンスから宿主細胞ＭＤＭ−ＭＢ２３１内へ移行させる。ＧＦＰの場合、宿主細胞ＭＤＭ−ＭＢ２３１内へのこのタンパク質の移行は、ＧＦＰ蛍光の有無の観察によってモニタリングすることができる。
【０１４１】
ＶｉｒＤ５の７８７〜８３６残基（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＹＰ＿００１９６７５４９．１、太字下線で示す配列）と融合するＧＦＰのアミノ酸配列（配列はＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＧ７８０３７．１）を以下に示す。
【０１４２】
【数１２】
2016528928.tif 000014
【実施例３】
【０１４３】
実施例３  ＩＶ型分泌システムを用いた人工内部共生体から宿主細胞内への核酸の移行
ＣａｇＡ４型分泌システム（Ｔ４ＳＳ）を用いて、プラスミドＤＮＡを人工内部共生体から宿主哺乳類細胞に移行させることができる。配列分析によって、このＴ４ＳＳシステムの各要素がＭＴＢに存在することが分かっている。
【０１４４】
Ｔ４ＳＳシステムによるプラスミドの移行を行うため、プラスミドｐＢＢＲ−ＭＳＣに、（ｏｒｉＴ＋ｔｒｗＡＢＣ）を挿入し、該プラスミドに、ＨＣＭＶ  ＩＥ１プロモーター−エンハンサー第１イントロンの制御下にある標的タンパク質をコードする発現カセットを挿入する。ここで、標的タンパク質は、ＤＨＦＲもしくはグルタミン酸合成酵素などの選択マーカー、ＧＦＰなどのレポーター、またはｃＭｙｃなどの転写因子である。
【０１４５】
哺乳類の選択マーカーも、標的遺伝子として使用できる。例として、ピューロマイシン耐性を与えるピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性を与えるブラストサイジンＳデアミナーゼ、およびＧ４１８耐性を与えるアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼが挙げられる。ＭＤＡ−ＭＢ２３１を宿主細胞株として使用する場合、選択には、２μｇ／ｍｌのピューロマイシン、５μｇ／ｍｌのブラストサイジンＳ、または１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を使用する。
【０１４６】
抗生物質耐性カセット（どのようなカセットを使用するかは、必要条件に応じて変わる）とともに目的のＤＮＡ断片を保持するプラスミドＤＮＡを、ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）栄養要求性の大腸菌接合株（ｍａｔｉｎｇ  ｓｔｒａｉｎ）との接合によって、ＭＴＢ内に導入することができる。プラスミドＤＮＡのＭＴＢへの移行が成功すると、ＭＴＢが抗生物質の存在下でＭＧ寒天平板培地で生育できるようになる。ＤＡＰを含まない培地では大腸菌コロニーは生存できないので、（ＤＡＰ）栄養要求性の大腸菌接合株は、抗生物質を含むＭＧ寒天平板培地で生育した場合、それは厳密にＭＴＢであることを示す。プラスミドＤＮＡを保持するＭＴＢコロニーは、ＭＴＢを哺乳類細胞に導入する後続実験で使用するＭＧ液体生育培地で培養される。そして、プラスミドを含むＭＴＢを哺乳類細胞、例えばヒト乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１内に導入する。そうすると、プラスミドは宿主細胞の染色体に非相同組換えによって組み込まれる。人工内部共生体であるＭＴＢから宿主細胞（ＭＤＡ−ＭＢ２３１）内へのプラスミド核酸の移行は、２μｇ／ｍｌのピューロマイシン、５μｇ／ｍｌのブラストサイジンＳ、または１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で生育する宿主細胞の選択によって検出される。選択された細胞を生育し、プラスミドの宿主細胞ゲノムへの染色体組み込みを、適切な分析法、例えばｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションまたはサザンブロット法で検出する。
【実施例４】
【０１４７】
実施例４  レポータータンパク質の真核宿主細胞への輸送
レポータータンパク質輸送コンストラクト。マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１にネイティブなＩ型分泌システム（Ｔ１ＳＳ）タンパク質と推定されるタンパク質ａｍｂ３４２２（アクセション番号ＹＰ＿４２２７８５）のＣ末端の２００アミノ酸（配列番号２９１）である、４２２７８５と記載される輸送配列（ＹＰ＿４２２７８５由来）をコードする６００塩基対のポリヌクレオチドを、停止コドンを含まないＧＦＰをコードするポリヌクレオチドと融合した。後者のポリヌクレオチドはＧＦＰｍｕｔ３遺伝子と称する。この融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをｌａｃプロモーターと作動可能に連結し、染色体外プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２を用いて融合タンパク質を発現させた。このコンストラクトの配列を確認し、Ｍ．マグネティカムＡＭＢ−１に接合して、Ｍ．マグネティカムＡＭＢ−１株ＡＣ１６を作出した。
【０１４８】
微生物細胞および細胞外上清の緑色蛍光の測定。Ｍ．マグネティカムＡＭＢ−１株ＡＣ１６および非蛍光性のＭ．マグネティカムＡＭＢ−１を、標準培地（例えば、米国特許公報ＵＳ２０１３／０１８３７５８を参照）で生育させた。Ｍ．マグネティカムＡＭＢ−１株ＡＣ１６、非蛍光性のＭ．マグネティカムＡＭＢ−１、およびこれらの細胞外上清の各アリコートの緑色蛍光を、ＢｉｏＴｅｋ（登録商標）製のＳｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１  マイクロプレートリーダーを用いて、４８５／２０ｎｍの励起波長および５２８／２０ｎｍの発光波長で測定した。評価されたＭ．マグネティカムＡＭＢ−１の上記２つの株を、波調４００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ４００）が０．１９５となるように調整し、すべての試料中の単位容量当たりの微生物細胞量を同一にした。Ｍ．マグネティカムＡＭＢ−１から細胞外空間へと輸送された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の存在を確認するため、１３，０００ｒｐｍで１０分間の遠心処理によって、Ｍ．マグネティカムＡＭＢ−１の各株の、細胞を含まない上清のアリコート１ｍｌを得た。微生物のペレットを撹拌しないよう、上清２００μｌをピペットで分取し、９６穴の黒色マイクロプレートのウェルに分注した。並行して、細胞内および細胞外ＧＦＰの両方から発せられる緑色蛍光の総強度を評価するため、Ｍ．マグネティカムＡＭＢ−１の各株の細胞懸濁液２００μｌを、マイクロプレートのウェルに分注した。この実験では、生物学的３連試験および技術的３連試験を行った。ＡＣ１６およびＡＭＢ−１（ネガティブコントロール）の上清のＧＦＰ蛍光測定結果を、図１０に示す。この測定結果に示されるように、ＡＣ１６の細胞外上清の緑色蛍光強度は、Ｍ．マグネティカムＡＭＢ−１ネガティブコントロール（ＡＭＢ−１  Ｎｅｇ  Ｃｔｒｌと記載）に比べて顕著に高かった。ＡＣ１６細胞の上清の蛍光強度と、ＡＣ１６細胞懸濁液の蛍光強度との比較を図１１に示す。この比較結果に示されるように、ＡＣ１６細胞の上清とＡＣ１６細胞懸濁液との間に、検出された緑色蛍光強度の大きな違いはなく、このことは、ＧＦＰシグナルのほとんどは細胞外培地由来のものであることを示している。また、ＡＭＢ−１  Ｎｅｇ  Ｃｔｒｌの上清で検出された緑色蛍光と該微生物細胞の懸濁液で検出された緑色蛍光の強度にも大きな違いはなく、よってこの低い蛍光強度はバックグラウンド由来であることが示唆される。
【０１４９】
ＧＦＰの移行を検出するための免疫組織化学法。走磁性微生物のマグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１から真核細胞（ヒト乳がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ２３１）への融合タンパク質（ＹＰ＿４２２７８５のＣ末端２００アミノ酸と融合したＧＦＰ）の移行を確認するため、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を標準培地（例えば、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地）で生育させ、例えば、ＡＣ１６細胞とＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞とを混合した後、Ｍ．マグネティカムＡＭＢ−１細胞のＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞への導入を促進するためにＮ５２磁石であるＮｄＦｅＢを使用するなどして、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞をＭ．マグネティカムＡＭＢ−１株ＡＣ１６で標識した。走磁性微生物から細胞外環境への融合タンパク質の移行は、免疫蛍光顕微鏡法によってモニタリングした。簡潔に説明すると、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞は走磁性微生物によって標識されており、標識後の様々な時点における標識ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および１％ウシ血清アルブミンを用いて透過処理およびブロッキング処理を行った。そして、ＧＦＰおよびＡＭＢ−１抗体を用いて、室温で１時間、真核細胞の染色を行った。切片を洗浄し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識抗ウサギ・ロバ抗体およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４抗マウス・ロバＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体とともに３０分間インキュベートした。そして、切片を洗浄し、ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄで封入した後、蛍光顕微鏡を用いて、蛍光画像を得た。
【０１５０】
図１２は、Ｍ．マグネティカムＡＭＢ−１細胞による標識および上記抗体による二重染色から１日後の、（Ａ）ＧＦＰプラスミドのみを含むＡＭＢ−１で標識されたＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞、および（Ｂ）ＹＰ＿４２２７８５のＣ末端の２００アミノ酸に融合したＧＦＰを含むＡＭＢ−１で標識されたＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の、蛍光顕微鏡画像（４０倍）を示す。両パネルは、抗ＧＦＰ（赤）、抗ＡＭＢ−１（緑）、およびＤＡＰＩ（青）の各画像の重ね合わせ画像である。ＧＦＰ融合タンパク質（パネルＢ）の細胞外環境への移行は、ＡＭＢ−１標識ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の免疫蛍光二重染色によって確認され、ＡＭＢ−１が、１型分泌システムによってタンパク質を宿主細胞内へ移行させる能力を示している。
【０１５１】
図１３は、ＡＭＢ−１標識ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の蛍光顕微鏡画像（単一チャンネル画像および重ね合わせ画像）（４０倍）を示す。ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を、ＧＦＰプラスミドのみ（分泌配列を含まない）を含むＡＭＢ−１で標識した後、その標識から１日後に細胞を二重染色して、蛍光顕微鏡法で観察した。それぞれ、（Ａ）ＡＭＢ−１のみ（緑色チャンネル）、（Ｂ）ＧＦＰ（赤色チャンネル）、（Ｃ）ＤＡＰＩ（青色チャンネル）、および（Ｄ）ＡＭＢ−１（緑色チャンネル）、ＧＦＰ（赤色チャンネル）、およびＤＡＰＩ（青色チャンネル）の重ね合わせ画像である。ＧＦＰのみを含むＡＭＢ−１細胞を含むＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の免疫蛍光二重染色を行ったが、ＧＦＰタンパク質（パネルＢ）の細胞外環境への移行は観察されなかった。
【０１５２】
図１４は、ＡＣ１６細胞で標識されたＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の蛍光顕微鏡画像（単一チャンネル画像および重ね合わせ画像）（４０倍）を示す。ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞は、ＡＣ１６細胞（ＹＰ＿４２２７８５のＣ末端２００アミノ酸に融合したＧＦＰを含むＡＭＢ−１）で標識されており、標識の１日後、二重染色を行い、蛍光顕微鏡法で観察した。それぞれ、（Ａ）ＡＭＢ−１（緑色チャンネル）、（Ｂ）ＧＦＰ（赤色チャンネル）、（Ｃ）ＤＡＰＩ（青色チャンネル）、および（Ｄ）ＡＭＢ−１（緑色チャンネル）、ＧＦＰ（赤色チャンネル）、およびＤＡＰＩ（青色チャンネル）の重ね合わせ画像である。ＧＦＰ融合タンパク質（パネルＢ）の細胞外環境への移行は、ＡＭＢ−１標識ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の免疫蛍光二重染色によって確認され、ＡＭＢ−１が、１型分泌システムを用いてタンパク質を宿主細胞内へ移行させる能力を示している。
【０１５３】
本発明に係る上記の具体的な実施形態は、例示および説明のために記載したものである。これらの実施形態は、本発明を総括するまたは本発明を開示された形態そのものに限定する意図はなく、本明細書の教示に基づいた様々な改変および変型が可能である。
【０１５４】
本明細書に引用したすべての特許、特許出願、刊行物、および参考文献は、各刊行物や特許出願が参照によって本明細書に組み込まれると具体的かつ個別に記載された場合と同様に、参照によって本明細書に組み込まれるものであることを明記する。
【図１Ａ】
2016528928.tif 000015
【図１Ｂ】
2016528928.tif 000016
【図１Ｃ】
2016528928.tif 000017
【図１Ｄ】
2016528928.tif 000018
【図２Ａ】
2016528928.tif 000019
【図２Ｂ】
2016528928.tif 000020
【図２Ｃ】
2016528928.tif 000021
【図２Ｄ】
2016528928.tif 000022
【図３Ａ】
2016528928.tif 000023
【図３Ｂ】
2016528928.tif 000024
【図３Ｃ】
2016528928.tif 000025
【図３Ｄ】
2016528928.tif 000026
【図４Ａ】
2016528928.tif 000027
【図４Ｂ】
2016528928.tif 000028
【図４Ｃ】
2016528928.tif 000029
【図４Ｄ】
2016528928.tif 000030
【図５Ａ】
2016528928.tif 000031
【図５Ｂ】
2016528928.tif 000032
【図５Ｃ】
2016528928.tif 000033
【図５Ｄ】
2016528928.tif 000034
【図６Ａ】
2016528928.tif 000035
【図６Ｂ】
2016528928.tif 000036
【図６Ｃ】
2016528928.tif 000037
【図６Ｄ】
2016528928.tif 000038
【図７】
2016528928.tif 000039
【図８Ａ】
2016528928.tif 000040
【図８Ｂ】
2016528928.tif 000041
【図８Ｃ】
2016528928.tif 000042
【図８Ｄ】
2016528928.tif 000043
【図９Ａ】
2016528928.tif 000044
【図９Ｂ】
2016528928.tif 000045
【図９Ｃ】
2016528928.tif 000046
【図１２Ａ】
2016528928.tif 000047
【図１２Ｂ】
2016528928.tif 000048
【図１３Ａ】
2016528928.tif 000049
【図１３Ｂ】
2016528928.tif 000050
【図１３Ｃ】
2016528928.tif 000051
【図１３Ｄ】
2016528928.tif 000052
【図１４Ａ】
2016528928.tif 000053
【図１４Ｂ】
2016528928.tif 000054
【図１４Ｃ】
2016528928.tif 000055
【図１４Ｄ】
2016528928.tif 000056
【図１０】
2016528928.tif 000057
【図１１】
2016528928.tif 000058
【配列表】
2016528928000001.app
【国際調査報告】
2016528928.tif 000059