(57)【要約】標的とされた口腔場所、例えば、口のがん細胞への薬剤の局所および全身送達のための送達デバイスが開発されてきた。製剤は、送達される１種または複数の治療剤および／または診断剤、味マスキング剤、浸透増強剤、および親水性ポリマーコーティング、例えば、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を含有する、粘膜付着性ポリマーマトリックス、例えば、キトサンを含む。一局面において、粘膜腔内の部位へ薬剤を送達するための製剤が提供され、ここで上記製剤は、ナノ粒子を有する粘膜付着性ポリマーマトリックスを含み、上記ナノ粒子は、上記ナノ粒子中に組み込まれた治療剤、予防剤、診断剤、または栄養補助剤を含有し、ここで、上記治療剤、上記予防剤、上記診断剤、または上記栄養補助剤は、味マスキングされるか、または上記粘膜腔における放出の際に組織を標的とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
粘膜腔内の部位へ薬剤を送達するための製剤であって、
前記製剤は、ナノ粒子を有する粘膜付着性ポリマーマトリックスを含み、前記ナノ粒子は、前記ナノ粒子中に組み込まれた治療剤、予防剤、診断剤、または栄養補助剤を含有し、ここで、前記治療剤、前記予防剤、前記診断剤、または前記栄養補助剤は、味マスキングされるか、または前記粘膜腔における放出の際に組織を標的とし、
前記マトリックスは、少なくとも２つの表面、前記薬剤の送達のために口内の前記部位と接触するための第１の表面および口腔に曝露される第２の表面を有し、
前記マトリックスの前記第１の表面は、前記口腔の粘膜を通る前記ナノ粒子の通過を促進する、ある分子量および密度を有するポリマー材料を前記マトリックスの前記表面上に含み、
前記マトリックスの前記第２の表面は、送達される前記薬剤の通過に対して不浸透性のコーティングまたはフィルムを含む、製剤。
【請求項２】
前記マトリックスが、キトサンまたはシクロデキストリンのナノ粒子を含み、前記ナノ粒子は、前記ナノ粒子中に組み込まれた薬剤を有する、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記コーティングまたは前記フィルムが、ヒドロプロピルメチルセルロース、酢酸セルロース、およびポリアクリルアミドからなる群より選択されるポリマーで形成されている、請求項１に記載の製剤。
【請求項４】
前記ナノ粒子が、約６０ｎｍ〜４５０ｎｍの間の直径を有する、請求項１に記載の製剤。
【請求項５】
前記ナノ粒子が、送達のための前記部位への粘膜を通る透過を増強するように、ポリアルキレングリコール部分でコーティングされている、請求項１に記載の製剤。
【請求項６】
前記ナノ粒子が、前記ナノ粒子の表面上に、薬剤の送達のための前記部位に前記ナノ粒子を誘導する標的化部分を含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項７】
前記マトリックスが、前記薬剤が送達される前記部位の前記組織に前記マトリックスを付着させるのに有効な接着ペプチドを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項８】
前記薬剤が、化学療法剤、抗感染症剤、抗炎症剤、免疫調節剤、ワクチン、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の製剤。
【請求項９】
前記抗感染症剤が、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項８に記載の製剤。
【請求項１０】
前記診断剤が、酸化鉄、ガドリニウム錯体、放射性同位体、金およびこれらの組合せからなる群より選択される造影剤である、請求項１に記載の製剤。
【請求項１１】
前記薬剤が、白金をベースとする化学療法剤である、請求項１に記載の製剤。
【請求項１２】
１種または複数の浸透増強剤をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項１３】
前記浸透増強剤が、２−ジメチルアミノプロピオン酸ドデシルエステル、ポリエチレングリコール、クエン酸、胆汁酸塩、およびベータ−シクロデキストリンからなる群より選択される、請求項１２に記載の製剤。
【請求項１４】
１種または複数の味マスキング剤を含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項１５】
前記味マスキング剤が、クエン酸、甘味剤、および食品矯味矯臭剤からなる群より選択される、請求項１４に記載の製剤。
【請求項１６】
抗炎症剤または抗酸化剤をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項１７】
前記ポリアルキレングリコール部分が、１０，０００Ｄａ未満の分子量を有するポリエチレングリコールである、請求項５に記載の製剤。
【請求項１８】
前記部分が、ＲＧＤペプチドである、請求項６に記載の製剤。
【請求項１９】
前記ポリマーマトリックス材料が、キトサンであり、前記キトサンは、送達される前記薬剤を味マスキングし、そして前記キトサンは、前記口腔のｐＨへの曝露によって前記ナノ粒子を放出する、請求項１に記載の製剤。
【請求項２０】
前記ナノ粒子が、前記口腔のｐＨへの曝露によって化学療法剤または診断剤を放出する、請求項１９に記載の製剤。
【請求項２１】
領域に請求項１から２０のいずれかに記載の製剤を投与することを含む、粘膜腔内の部位に薬剤を送達する方法。
【請求項２２】
前記部位が、がん細胞を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記部位が、口腔粘膜、頬粘膜または舌下粘膜を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記薬剤が、前記薬剤の全身的に有効なレベルをもたらさない投与量で送達される、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
この発明は、概して口腔粘膜への薬剤、例えば、口腔がんを処置するための抗腫瘍剤の標的化送達のための製剤の分野にある。
【０００２】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１３年２月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／７６７，５８９号への優先権を主張する。
【０００３】
連邦政府の助成を受けた研究についての記載
アメリカ合衆国政府は、本発明に権利を有さない。
【背景技術】
【０００４】
口腔がん（ＯＣ）財団によると、約４０，０００人の米国人が今年のみで口腔がんおよび咽頭がんと診断され、８，０００件の死亡がもたらされ、１日２４時間で１時間毎におおよそ１人が死亡している。この問題は世界中で有意により大きく、毎年６４０，０００超の新規な症例を伴う。多くのがんの発生率が減少している一方で、ＯＣの発生率は５年連続で増大している。現在、シスプラチン、ｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）（ＣＩＳ）は、ＯＣについての最も一般的な抗腫瘍処置である。
【０００５】
全身薬剤送達に伴う問題は周知である。特に、薬剤が疾患と殆ど同じぐらい有害であるがんの症例において、高い投与必要量および処置を必要としていない体の領域への偶発的な処置による副作用は、薬剤の局所投与に対する強い必要を生み出している。
【０００６】
診断の５年後に生存しているのはこれらのＯＣ患者の半分のみである。特定の国、例えば、スリランカ、インド、パキスタン、およびバングラデシュにおいて、ＯＣは最も一般的ながんである。インドの一部において、ＯＣは全てのがんの５０％超を表す。米国のみにおいて、ＯＣ発生率は、２００２年から２００７年の間に１１％増大した。２０２０年までに、世界的な年間の発生率は８４０，０００件超に増大し（３０％の上昇）、年間の死亡数は４８０，０００件近くまで増大する（概ね３７％の増大）ことが予想される。
【０００７】
ＯＣ財団によると、３週間超継続するあらゆる口腔病変は、臨床医によって検査され、処置される必要がある。患者が利用しやすい安全で、有効で、好都合な処置は存在しない。化学療法剤の毒性が有意に低減すれば、臨床医は患者をできるだけ早く低用量で処置する可能性が高いであろう。
【０００８】
口への治療剤の局所送達は、非常に困難である。粘膜は、付着に対して強力なバリアを形成し、この粘性の滑りやすい材料を透過して、下の口腔上皮細胞に達することができるものは僅かであり、有効量の治療剤を送達するのに十分に長く細胞に接着したままのものが少ないことは言うまでもない。
【０００９】
Ｌａｉら、Ａｄｖ  Ａｇｅｎｔ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．、２７巻：６１巻（２号）：１５８〜１７１頁（２００９年）によって報告されているように、粘液は、さもなければ外部環境に曝露される組織を保護する粘弾性ゲル層である。粘液は、主に杯細胞および粘膜下腺によって分泌される架橋されもつれたムチン繊維からなる。ムチンは、典型的には、それぞれが約０．３〜０．５ＭＤａの多数のムチンモノマーの連結によって形成される、サイズが０．５〜４０ＭＤａの大型分子であり、複雑で高度に多様な一連のプロテオグリカンによってコーティングされている。少なくとも２０種のムチンタイプの糖タンパク質が、ＭＵＣ遺伝子ファミリーに割り当てられてきており、いくつかのムチンタイプはそれぞれの粘膜表面において発現している。ムチンは一般に、２つのファミリーに分割することができる。膜貫通ドメインを含有する長さが１００〜５００ｎｍの間の範囲の細胞結合型ムチン、および数ミクロン長までである分泌型ムチンである。生化学的研究および電子顕微鏡研究によって決定すると、個々のムチン繊維は直径がおおよそ３〜１０ｎｍである。これらは高度に柔軟な分子であり、おおよそ１５ｎｍの持続長を有する。特定の病態（例えば、ＣＯＰＤおよびＣＦ）を除いて、ムチン含量は、頸管粘液、鼻粘液、および肺粘液について２〜５重量％の間の範囲であり、グリコシル化されたオリゴ糖は、ムチン質量の４０〜８０％を表す。大部分の粘液タイプ（すなわち、肺、胃、頸腟部）における水分含有率は一般に、９０〜９８％の範囲内である。ムチンに加えて、粘液ゲルは、細胞、細菌、脂質、塩、タンパク質、巨大分子、および細胞残屑が充填されている。粘液のｐＨは、粘膜表面によって大きく変化し得、高度に酸性の環境は、ムチン繊維を凝集させ、粘液の粘弾性を非常に増大し得る。肺および鼻の粘液は、一般に中性ｐＨであり、目の粘液は約ｐＨ７．８で僅かに塩基性である。対照的に、胃の粘液は、広範囲のｐＨに曝露される。同じ粘液の横断面内に大きなｐＨ勾配が存在し、ｐＨは管腔の約１〜２のｐＨから上皮表面において約７に上昇する。膣分泌物は典型的には、嫌気性条件下でｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉによって産生される乳酸からの酸性化によって３．５〜４．５の範囲のｐＨを示す。生化学的差異を越えて、粘液ブランケットの厚さはまた、異なる粘膜表面について異なる。限定された厚さの粘液層を有する鼻道は、他の粘膜表面と比較して容易に到達可能であり、高度に浸透性であると考えられる。ヒトＧＩ管において、粘液層は胃および結腸において最も厚いが、有意なバリエーションを示す。
【００１０】
粘液は連続的に分泌され、次いで、流され、廃棄され、または消化され、再循環される。その寿命は短く、数分から数時間で測定されることが多い。様々な粘膜表面における粘液層の厚さおよびクリアランス時間の理解は、粘膜のクリアランス機構を克服するために設計される粒子の開発にとって重要である。粒子はバリアを克服するために粘液の再生およびクリアランスより著しく速い速度で粘液を透過しなくてはならないからである。口腔粘膜については殆ど知られていない。
【００１１】
薬剤の送達は、口腔粘膜腔内で３つのカテゴリーに分類される。（ｉ）口腔底を裏打ちする粘膜を通る全身薬剤送達のための舌下送達、（ｉｉ）薬剤送達のための頬の内側層（頬粘膜）を通る頬側送達、および（ｉｉｉ）口腔中への薬剤送達である局所経口送達。
【００１２】
上皮細胞に対して直接適用されない治療剤は嚥下によって失われるため、口腔組織への送達は困難である。薬剤が口腔上皮細胞に達するために、接触エリアのみが有効な導管を形成することができる。この領域への薬剤送達において、味はまた主要な挑戦である。薬剤の味マスキング（ｔａｓｔｅ  ｍａｓｋｉｎｇ）は、送達手段の設計において重要な要因である。例えば、腸内の他の粘膜に対して、口腔粘膜を通した治療剤の送達に伴う別の主要な困難は、口腔の上皮が約４０〜５０の細胞層の深さがあり、薬剤の浸透を防止するタイトジャンクションを伴うことである。対照的に、腸の上皮は、単一の細胞層のみである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｌａｉら、Ａｄｖ  Ａｇｅｎｔ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．（２００９年）２７巻：６１巻（２号）：１５８〜１７１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、本発明の１つの目的は、厚くて堅固な口腔上皮を透過することができる、口腔上皮細胞を介して局所および全身投与のための治療用または診断用送達デバイスを提供することである。
【００１５】
送達される治療剤または診断剤を味マスキングする治療用または診断用送達デバイスを提供することはまた、本発明の１つの目的である。
【００１６】
本発明の別の目的は、経口送達と関連する絶え間ない唾液および洗い流しの問題に関わらず有効な治療用または診断用送達デバイスを提供することである。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、口腔上皮の特定の領域へ治療剤または診断剤を投与する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
標的とされた口腔の場所、例えば、口のがん細胞への薬剤の局所および全身送達のための送達デバイスが開発されてきた。製剤は、１種または複数の治療剤および／または診断剤、味マスキング剤、浸透増強剤ならびに薬剤カプセル化ナノ粒子を含有する粘膜付着性ポリマーマトリックスを含む。ナノ粒子は、標的化分子、例えば、ＲＧＤペプチド、フォレート、抗体またはグルコース類似体；送達される治療剤または診断剤、および送達のための部位への粘膜を介した透過を増強する親水性ポリマーコーティング、例えば、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）と任意選択で組み合わせた、粘膜付着性ポリマー、例えば、キトサンまたはシクロデキストリンで形成される。一実施形態において、製剤は、シスプラチン（「ＣＩＳ」）または他の化学療法剤または抗炎症剤、ナノ粒子の粘膜透過を増強するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コーティング、および標的とされた細胞への生体付着を増大させる、ＰＥＧに結合している標的化モチーフ（ＲＧＤペプチドまたはグルコース類似体）の送達のための、キトサンまたはシクロデキストリンナノ粒子を含む。粘膜付着性ポリマーは、これをがん細胞の部位において保持する一方で、治療剤を味マスキングするために使用される。大きな充填投与量、例えば、２０％シスプラチンの充填を達成することができる。
【００１９】
好ましい実施形態において、マトリックスは、１つのサイドが、口または他の粘膜のエリア中の上皮細胞またはがん細胞上への局所設置のために曝露されたＰＥＧ−粘膜付着性ポリマーを有し、口腔の内側に面したサイド（複数可）が、送達される治療剤および／または診断剤（複数可）に対して不浸透性である生体適合性で不活性な膜によってカバーされるように製剤化される。マトリックスは、さらなる成分、例えば、治療剤の苦味および不快な味を防止する味マスキング剤、例えば、クエン酸または他の風味に富んだ香味料（ｆｌａｖｏｒｉｎｇ）；浸透増強剤、例えば、ＰＥＧ、胆汁酸塩、クエン酸またはその他；および抗炎症性または抗酸化薬剤、例えば、クルクミンを含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、送達デバイス、製造および使用の略図である。
【図２】図２は、シスプラチン充填ナノ粒子についての異なる充填能力パーセントでのカプセル化効率を示すグラフである。
【図３】図３は、異なるｐＨでのシスプラチン充填ナノ粒子のサイズおよび電荷を示すグラフである。
【図４】図４は、ｐＨ６でのシスプラチン充填ナノ粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの放出プロファイルを示すグラフである。
【図５】図５は、キトサンスポンジからのシスプラチンカプセル化ナノ粒子の時間をわたっての放出を示すグラフである。
【図６−１】図６Ａは、２４時間の、異なる濃度のシスプラチン充填ナノ粒子（●）、ブランクナノ粒子（■）、遊離シスプラチン（▲）または処理なし（▼）に応答したＦａＤｕ細胞の生存率を示す。図６Ｂは、４８時間の、異なる濃度のシスプラチン充填ナノ粒子（●）、ブランクナノ粒子（■）、遊離シスプラチン（▲）または処理なし（▼）に応答したＦａＤｕ細胞の生存率を示す。図６Ｃは、４８時間の、異なる濃度のシスプラチン充填ナノ粒子（●）、ブランクナノ粒子（■）または遊離シスプラチン（▲）に応答したＨＣＰＣ１細胞の生存率を示す。
【図６−２】図６Ａは、２４時間の、異なる濃度のシスプラチン充填ナノ粒子（●）、ブランクナノ粒子（■）、遊離シスプラチン（▲）または処理なし（▼）に応答したＦａＤｕ細胞の生存率を示す。図６Ｂは、４８時間の、異なる濃度のシスプラチン充填ナノ粒子（●）、ブランクナノ粒子（■）、遊離シスプラチン（▲）または処理なし（▼）に応答したＦａＤｕ細胞の生存率を示す。図６Ｃは、４８時間の、異なる濃度のシスプラチン充填ナノ粒子（●）、ブランクナノ粒子（■）または遊離シスプラチン（▲）に応答したＨＣＰＣ１細胞の生存率を示す。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、２４時間（図７Ａ）または７２時間（図７Ｂ）の、シスプラチン充填ナノ粒子（１５％）に曝露されたＫＢ細胞の生存率を示す。
【図８】図８は、ＦａＤｕ細胞を異種移植したマウスモデルを使用した、シスプラチン充填ナノ粒子のｉｎ  ｖｉｖｏでの治療有効性研究を示す。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、局所的にＣＩＳ−ＮＰを包埋したスポンジで、および腹腔内に遊離シスプラチンで処置されたハムスター頬袋癌（ｃｈｅｅｋ  ｐｏｕｃｈ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（ＨＣＰＣ１）細胞系を同種異型移植されたハムスターの腫瘍阻害研究のグラフである。結果は、４回の処置の後に、ＣＩＳ−ＮＰを包埋したスポンジで処置されたハムスターの腫瘍消失の完了を示す（図９Ａ）。処置を通したＨＣＰＣ１を同種異型移植されたハムスターの体重変化のプロットは、健康な群と比較して僅かな体重減少を示し、一方、遊離シスプラチン、腹腔内群は、有意な体重減少を示す（図９Ｂ）。
【図１０】図１０は、ＴＲ−１４６細胞によるｎｐの細胞の取込みのグラフである。
【図１１】図１１は、チオール修飾されたキトサンポリマーである。
【図１２】図１２は、フルオロフォアが結合体化したキトサンである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
送達デバイスが、口腔粘膜への口腔内の送達のために特に開発されてきた。送達デバイスについての要件は、下記を含む：
デバイスは、バイオフィルムにも関わらず頬側組織に付着しなくてはならない
デバイスは、患者のコンプライアンスのために強力な味マスキング要素を有さなければならない
デバイスは、薬剤が咽頭から洗い流されることを防止しなくてはならない
デバイスは、全身送達のために、全身循環に達する前に概ね５０層の細胞を通して浸透する十分な浸透能力を有さなくてはならない
浸透は、局所送達のために、所望の深さまで調節可能でなければならない。
【００２２】
Ｉ．定義
「キロカウント毎秒」（Ｋｃｐｓ）」とは、（キロカウント毎秒（ｋｃｐｓ）での）カウントレートを意味する。試料のカウントレートが１００より低い場合、測定は中断すべきであり、試料の濃度は測定のために低すぎることを意味する。適切なＫｃｐｓを有する試料は、測定のための理想的な濃度を有する安定的な試料であると考えることができる。
【００２３】
「多分散性指数」（ＰＤＩ）または単純に「分散度」は、混合物中の粒子のサイズの不均一性の尺度を指すために本明細書において使用される。ＰＤＩは、ナノ粒子のサイズ分散度を測定する。
【００２４】
「ゼータ電位」（ＺＰ）は、特定の媒体においてナノ粒子が得る全体的電荷を指すために本明細書において使用され、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ機器で測定することができる。
【００２５】
「粘膜付着性」は、人体における粘膜に付着する能力を有する材料の特性である。
【００２６】
「生体適合性」は、この治療のレシピエントまたは受益者において相当な望ましくない局所または全身効果を誘発することはないが、その特定の状況において最も妥当で有益な細胞または組織の応答を作り出し、この治療の臨床的に関連性のある性能を最適化する、薬物療法に関してその所望の機能を行う生体材料の能力を指す。
【００２７】
「生分解性」は、生物の作用によって特に無害の生成物に分解することができる材料の特性を指す。
【００２８】
Ｉ．薬剤送達デバイス
代表的な送達デバイスを図１に示す。
【００２９】
デバイス１０は、ナノ粒子充填粘膜付着性マトリックス１２および不浸透性裏打ち層１４を含む。ナノ粒子１６は、粘膜付着性マトリックス１２に分散している。ナノ粒子１６は、その中に分散またはカプセル化された治療剤、予防剤、診断剤または栄養補助剤２０を有するポリマー１８を含む。任意選択で、ナノ粒子１６は、標的化リガンド２４および／またはさらなる薬剤２０をナノ粒子１６にカップリングし得る、化学的リンカー２２を含むことができる。粘膜付着性マトリックス１２は、１種または複数の透過増強剤２６ａ、２６ｂを含むことができる。
【００３０】
デバイス１０の粘膜付着性マトリックス１２は、口腔に、好ましくは粘液層３０上へと適用され、下にある口腔上皮３２への薬剤２０の送達を可能とする。ナノ粒子１６は粘膜を透過し、組織中に直接薬剤２０を放出する。標的化リガンド２４は、例えば、腫瘍細胞３４への優先的送達のために使用する。
【００３１】
マトリックスは、生体付着性ポリマー、最も好ましくは、粘膜付着性ポリマーで形成される。マトリックスはその中に分散したナノ粒子を有し、可塑剤を含み得る。粘膜付着性、および多孔性構造中にポリマー送達系および味マスキング剤を組み合わせる能力のために周知の生体付着性ポリマーが、マトリックスのために選択される。薬剤拡散に対して不活性および不浸透性である膜を、薬剤送達のために使用されない表面に適用する。これによって、薬剤の一方向性送達を伴う粘膜付着性材料を生じる。浸透増強剤および味マスキング剤を加えて、薬剤の透過を増強させることができる。
【００３２】
ナノスケールサイズの粒子は、口腔の組織に浸透する。２００ｎｍ未満のサイズを有するＮＰは粘膜を透過し、がん細胞によって取り込まれる。このサイズは、十分な治療剤または診断剤、例えば、化学療法剤、例えば、シスプラチン（ＣＩＳ）を担持し、高い充填およびカプセル化効率（８０％超）を得るのに適当であり、これはスケールアップおよび商業化のために望ましい。
【００３３】
カプセル化は、口内の味蕾を薬剤、例えば、シスプラチンの不快な金属的フレーバーから保護し、粘液中への制御された透過のための親水性ポリマー、例えば、ＰＥＧのコーティングを可能とし、標的化リガンドを加えることを可能とし、薬剤の制御放出を可能とする。さらに、全身的な透過の場合、カプセル化はまた、体の細網内皮系による取込みを低減させる。より小さな粒子は、より大きな表面積対体積比を有し、これによって粒子の溶解速度がより大きな粒子の溶解速度より高くなることがもたらされ、溶解性要因による浸透限度を克服できることがもたらされる。大きな表面積対体積は、生体付着力を増大させる。組み合わせたこれらの要因は、薬剤のがん細胞中への深い透過をもたらし、明確な利益を実現する。
【００３４】
局所的送達の達成を助ける標的化の３つの主要な態様が存在する：
１．直接：がん腫瘍上に直接薬剤充填ナノ粒子を置くことによって達成される
２．能動的：がん細胞にさらに焦点を合わせ、健康な細胞に対する毒性を低減させるための分子標的化薬剤、例えば、ＲＧＤを使用して取得される
３．受動的：組織へのより高い薬剤取込みをもたらす腫瘍における血管の構造によって自然に起こる。これは、増強された浸透性および保持効果（ＥＰＲ）として公知である。
【００３５】
Ａ．粘膜付着性ポリマーナノ粒子
いくつかの生体付着性および粘膜付着性ポリマーが公知である。好ましい実施形態において、ポリマーは、口腔の粘膜領域に結合することができるように粘膜付着性である。好ましくは、ポリマーは、ポリカチオン性、生体適合性、および生分解性である。好ましいポリマーは、キトサンである。
【００３６】
キトサンは、ポリカチオン性、無毒性、生体適合性および生分解性のポリマーである。さらに、キトサンは、幅広いリガンドで修飾することができる異なる官能基を有する。その独特の物理化学的特性によって、キトサンは、生物医学的適用の範囲内の大きな可能性を有する。キトサン（ＣＨＩ）は、その生体付着性および浸透性特性によって粘膜薬剤送達機構として一般に使用されてきた。口腔上皮におけるバリアは、キトサン粒子によって容易に撹乱され、頬粘膜を通る浸透性を増強させることができる。
【００３７】
キトサンの第一級アミン基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド化学反応を使用したビオチン化によるキトサン修飾のために利用することができる。これに、ビオチンに強く結合するアビジンの添加が続く。次いで、ビオチン化リガンド、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＲＧＤペプチド配列、またはビオチン化酵素を加えて、キトサンの表面特性を修飾することができる。異なる要因、例えば、調製物のｐＨ、ポリアニオンの包含、電荷比、脱アセチル化の程度、およびキトサンの分子量は、キトサン粒子の作製に影響を与える。
【００３８】
キトサンナノ粒子は、低ｐＨに対するキトサンの感受性のため、化学療法剤、例えば、ドキソルビシンとの使用のために好ましい。なぜなら、がん組織は酸性であり、粒子は酸性環境において薬剤をより速く放出するためである。キトサンナノ粒子からの薬剤の制御放出は、周囲の健常組織に対する毒性の副作用を最小化する一方で、安定した量の薬剤ががん組織を標的とすることを確実にする。
【００３９】
他の有用な天然ポリマーは、シクロデキストリンおよびペクチンである。いくつかの研究は、合成生体付着性ポリマーについて報告している。ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ハロゲン化ポリビニル、ポリホスファジン、ポリアクリルアミド、ポリ（ビニルアルコール）、ポリシロキサン、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリビニルフェノール、アクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステルのポリマー、ポリラクチド、ポリラクチドおよびポリグリコリドのコポリマー、ポリ（酪酸）（ｐｏｌｙ（ｂｕｔｉｃ  ａｃｉｄ））、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ［ラクチド−ｃｏ−グリコリド］、これらのポリ無水物、ポリオルトエステル、ブレンドおよびコポリマーは、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚらによる米国特許第６，２１７，９０８号によって記載されている。Ｎａｆｅｅら、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．  Ｉｎｄ．  Ｐｈａｒｍ．、３０巻（９号）：９８５〜９８３頁（２００４年）は、ｃａｒｂｏｐｏｌｓ（ＣＰ９３４、およびＣＰ９４０）、ポリカルボフィル（ＰＣ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＳＣＭＣ）および、アニオン性ポリマー、カチオン性ポリマーとしてキトサン（Ｃｈ）、ならびに非イオン性ポリマーとしてヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）が全て有用であるが、ポリアクリル酸誘導体（ＰＡＡ）が、最も高い生体付着力、延長された滞留時間および高い表面酸性度を示したことを報告した。ＳＣＭＣおよびキトサンはまた、良好な生体付着性特徴を有し、一方、ＨＰＭＣおよびペクチンは、より弱い生体付着を示す。
【００４０】
Ｂ．粘膜透過を増強する親水性ポリマー
好ましい実施形態において、低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の密なコーティング、最も好ましくは、約５０００ダルトンのもの、またはＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）、ＢＡＳＦによって販売されているポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖が側面に位置するポリオキシプロピレン（ポリ（酸化プロピレン））の中央の疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマーは、キトサンナノ粒子表面上に共有結合的に結合しており、粒子をより親水性とし、それによって粘膜をより容易に透過する。粘膜上皮の浸透性の他の有用なポリマー増強剤は、Ｄｉ  Ｃｏｌｏら、Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．、９７巻（５号）：１６５２〜１６８０頁（２００８年）によって報告された。活性ポリマーは、ポリカチオン（キトサンおよびその第四級アンモニウム誘導体、ポリ−Ｌ−アルギニン（ポリ−Ｌ−Ａｒｇ）、アミノ化ゼラチン）、ポリアニオン（Ｎ−カルボキシメチルキトサン、ポリ（アクリル酸））、およびチオール化ポリマー（カルボキシメチルセルロース−システイン、ポリカルボフィル（ＰＣＰ）−システイン、キトサン−チオブチルアミジン、キトサン−チオグリコール酸、キトサン−グルタチオン結合体）に分類することができる。
【００４１】
Ｃ．組織付着性分子
多数の組織標的化部分が公知である。標的化部分は、タンパク質（主に、抗体およびこれらのフラグメント）、ペプチド、核酸（アプタマー）、小分子、またはその他（ビタミンもしくは炭水化物）として分類される。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ナノ粒子の標的化された送達のためのエスコート分子として広範に使用されてきているが、大きなサイズ、およびナノ粒子への結合体化が困難なことを含めたいくつかの制限によって、これらの使用は妨げられてきた。このように、可能であれば、ペプチドを含めた他のより小さなサイズのリガンドを使用する。ペプチドをベースとする標的化リガンドは、いくつかの方法によって同定し得る。最も一般に、これらは目的のタンパク質の結合領域から得られる。ファージディスプレイ技術をまた使用して、ペプチド標的化リガンドを同定することができる。ファージディスプレイスクリーニングにおいて、バクテリオファージは、ファージディスプレイライブラリーにおいて種々の標的化ペプチド配列（約１０１１の異なる配列）を示し、標的ペプチドは、結合アッセイを使用して選択される。インテグリン結合親和性を有する環状ペプチドであるシレンジタイド（ｃｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅ）は現在、非小細胞肺がんおよび膵臓がんの処置のための第ＩＩ相臨床試験の最中である。アミノ酸４０個の熱安定性およびプロテアーゼ安定性オリゴペプチドである、ヒトＶＥＧＦ受容体２のためのＡｄｎｅｃｔｉｎ（Ａｎｇｉｏｃｅｐｔ）は、２００６年に進行固形腫瘍および非ホジキンリンパ腫の処置のための第Ｉ相臨床試験に入った。ペプチドは欠点、例えば、低い標的親和性、およびタンパク質分解的切断の受けやすさを有し得るが、これらの問題は、ペプチドを多価的に示すことによって、またはＤ−アミノ酸を使用してこれらを合成することによって改善し得る。Ｙｕら、Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ．２巻（１号）：３〜４４頁（２０１２年）を参照されたい。標的とすることができる粘膜上皮の特異的エピトープについて、Ｓｎｏｏｋら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、６１巻（５号）：７１３〜７２３頁（２０１２年）をまた参照されたい。
【００４２】
がん細胞標的化部分の１つは、インテグリン受容体を標的とする腫瘍血管系ホーミングペプチドであるＲＧＤである。これは血管新生（血管形成）の間に高度に発現する細胞付着タンパク質であり、腫瘍増殖にとって欠かせない。キトサンナノ粒子に直接結合して、薬剤送達のための組織付着を増大させるＲＧＤは公知であり（Ｈａｎら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１６巻：３９１０頁（２０１０年））、キトサン−ＰＥＧ粒子に結合して、腫瘍への化学療法剤の送達を増大させるＲＧＤは公知である（Ｌｖら、Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、９巻：１７３６〜１７４７頁（２０１２年））。
【００４３】
インテグリン、α（２）β（１）およびα（３）β（１）は、ＲＧＤによって認識されることができる。データはまた、ＲＧＤ配列がインテグリンヘテロ二量体の少なくとも１２を認識することができ、実際、口腔ＳＣＣ細胞系において、α（２）β（１）およびα（３）β（１）が高度に発現しており、これは大きなトランスフェクションの効率をもたらすことを示唆する。
【００４４】
ナノ粒子上のＲＧＤの表面被覆は、ナノ粒子の表面上のＰＥＧ鎖およびＰＥＧ−ＲＧＤ鎖の比を変化させることによって調節することができる。ナノ粒子の標的化特異性および送達性能は、ＲＧＤモチーフの密度によって影響されることができる。一般に、５〜１０％のＲＧＤ被覆が、有効であると考えられる。
【００４５】
口腔がんを標的化するために使用することができるバイオマーカーは、文献、例えば、Ｈｓｕら、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０巻（１１号）：１４３０〜９頁（２０１２年）に記載されている。研究は、ＩＬ−２０が、口腔腫瘍成長、移動、および腫瘍関連炎症を促進したことを示し、これは口腔がんを処置するための標的となり得る。ＩＬ−６は、口腔扁平上皮癌のための別の特異的マーカーである（Ｃｕｌｉｇ、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ、１７巻（１号）：５３〜９頁（２０１３年）。
【００４６】
抗ＩＬ−２０または抗ＩＬ−６モノクローナル抗体は、代替の標的化モチーフとしてＰＥＧ鎖の末端上に結合体化し、送達系の特異性および有効性を増大させることができる。
【００４７】
１８Ｆ−ＦＤＧ（２−デオキシ−２−［１８Ｆ］フルオロ−ｄ−グルコース）ＰＥＴ（ポジトロン放出断層撮影）は、組織代謝についての情報を提供する機能イメージング技術であり、頭頸部がんの評価に首尾よく適用されてきた（Ｎａｋａｇａｗａら、Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．、４９巻（７号）：１０５３〜１０５９頁（２００８年））。グルコース類似体１８Ｆ−ＦＤＧは、促進性グルコース輸送体によって細胞中に輸送される（Ｍｕｅｃｋｌｅｒ、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１９巻：７１３〜７２５頁（１９９４年））。悪性腫瘍における遍在性のグルコース輸送体１型（ＧＬＵＴ１）の過剰発現は、１８Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴが腫瘍学において有用な役割を有することを可能とする（Ｓｍｉｔｈ、Ｂｒ  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ．、５６巻：２８５〜２９２頁（１９９９年）。
【００４８】
グルコース類似体は、がん細胞代謝におけるこれらの役割の結果として、がん細胞への標的化モチーフとして有用である。黒色腫についての特異的プローブであることが実証されてきた１−チオ−β−Ｄ−グルコース（Ｃａｓｔｅｌｌｉら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、４巻（４号）：３５５〜３６０頁（２０１２年）；およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨｅｌａ細胞標的化のために酸化鉄ナノ粒子上へと結合体化されたＤ−グルコサミン（２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース）塩酸塩（Ｘｉｏｎｇら、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．、２９巻：１０８７〜１０９７頁（２０１２年））などの様々なグルコース類似体が開発されてきた。
【００４９】
グルコース分子−（１または２）−（官能基）−β−Ｄ−グルコースにおける１位または２’位における通常のヒドロキシル基に代えて用いられる異なる官能基を有するグルコース類似体（例えば：１−アジド−β−Ｄ−グルコース、１−アジド−β−Ｄ−グルコーステトラアセテート、２−アジド−β−Ｄ−グルコース、２−アジド−β−Ｄ−グルコーステトラアセテート、１−チオ−β−Ｄ−グルコース、２−チオ−β−Ｄ−グルコース）を、ペグ化されたキトサンナノ粒子のＰＥＧ鎖に結合体化することによって、口腔がんの標的化特異性を向上させることができる。
【００５０】
Ｄ．生体適合性不浸透性の膜またはコーティング
マトリックスは、噴霧し、浸漬し、または膜もしくは不浸透性コーティング、例えば、生体付着性錠剤およびデバイスを裏打ちするために使用されるものと接触させることによってコーティングされる。例えば、Ｂｏｄｄｕｐａｌｌｉら、Ｊ  Ａｄｖ  Ｐｈａｒｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｒｅｓ．、１巻（４号）：３８１〜３８７頁（２０１０年）；ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＩｒｏｎｓ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａ．  ＰｉｚｚｉおよびＫ．  Ｌ．  Ｍｉｔｔａｌ編（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、２００３年）をまた参照されたい。
【００５１】
非浸透性裏打ちは、二重の機能：（１）薬剤喪失の防止および（２）薬剤の味マスキングの提供を行う。
【００５２】
一般に、不浸透性コーティングは、ポリマー、例えば、酢酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはＥｕｄｒａｇｉｔ（ポリアクリルアミド）で形成される。これらはまた、生体付着性であり得る。材料を嚥下することができる可能性によって、生分解性材料が好ましい。
【００５３】
Ｅ．カプセル化される薬剤
任意の治療剤、予防剤、診断剤または栄養補助剤（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｇｅｎｔ）をカプセル化し得る。代表的な薬剤には、化学療法剤、抗感染症剤、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、免疫調節剤、ワクチン、およびこれらの組合せが含まれる。
【００５４】
好ましい薬剤は、白金をベースとする化学療法剤、例えば、シスプラチン（ＣＩＳ）である。歴史的に、ＣＩＳは白金をベースとする化学療法剤の最前線にあり、ＯＣを含めた多くのがんの処置において標準療法である。ＣＩＳは多くのがんについての有力な治療である一方、伝統的なボーラス全身ＩＶ用量の結果として、その相当な全身毒性によって妨害されることが多い。この系は、この毒性を回避する。
【００５５】
診断剤は、放射線不透過性、放射性またはその他であり得る。例えば、診断剤は、造影剤、例えば、酸化鉄、ガドリニウム錯体、放射性同位体、金およびこれらの組合せであり得る。
【００５６】
Ｆ．さらなる添加物
含むことができる他の化合物は、味マスキング剤、例えば、香味料（ミント、バブルガム、オレンジまたは柑橘類の香味料など）、および細菌汚染を防止するのに有用な抗酸化剤である。代表的な血管形成阻害剤は、クルクミンおよびその精製された成分、抗生物質、例えば、テトラサイクリンおよびその誘導体、ならびに化学療法剤、例えば、サリドマイドである。これらはまた、処置の部位におけるがんまたは感染症の処置を助け得る。
【００５７】
これらの薬剤は、マトリックスもしくはナノ粒子上にコーティングし、マトリックスもしくはナノ粒子内に分散し、またはマトリックスもしくはナノ粒子内にカプセル化し得る。
【００５８】
ＩＩ．製造の方法
キトサン粒子を作るのに利用可能な少なくとも４つの方法が存在する。向イオン性ゲル化（ｉｏｎｏｔｒｏｐｉｃ  ｇｅｌａｔｉｏｎ）、マイクロエマルジョン、乳化溶媒拡散および高分子電解質複合体（ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ）である。最も広範に開発された方法は、向イオン性ゲル化および自己集合高分子電解質である。これらの方法は、多くの利点、例えば、有機溶媒または高い剪断力の使用を伴わない単純で穏やかな調製方法を提供する。これらは、不安定な薬剤として悪評の高い巨大分子を含めた薬剤の広範なカテゴリーに適用可能である。一般に、粒径および表面電荷を含めたナノ粒子形成に影響を与えることが見出された要因は、キトサンの分子量および脱アセチル化の程度である。捕捉の効率は、捕捉された薬剤のｐＫａおよび溶解度によって決まることが見出される。
【００５９】
向イオン性ゲル化方法が一般に使用され、キトサンナノ粒子が調製される。酸性溶液中で、キトサン分子のアミン基はプロトン化され、イオン相互作用によってアニオン、例えば、トリポリホスフェート（ＴＰＰ）と相互作用して、粒子を形成させる（Ｌｅｅら、Ｐｏｌｙｍｅｒ、４２巻：１８７９〜１８９２頁（２００１年））。この方法は非常に単純で穏やかである。化学的架橋に代わる、静電相互作用による可逆的物理的架橋を適用し、試薬のあり得る毒性および他の望ましくない効果を防止する（Ｓｈｕら、Ｉｎｔｅｒｎａｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．、２０１巻：５１〜５８頁（２０００年））。
【００６０】
環状Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドとグラフトされたペグ化Ｏ−カルボキシメチル−キトサン（ＣＭＣ）ナノ粒子による、不溶性薬剤（パクリタキセル、ＰＴＸ）についての腫瘍標的化送達系について記載しているＬｖら、Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、９巻：１７３６〜１７４７頁（２０１２年）をまた参照されたい。充填の効率（ＬＥ）を向上するために、Ｏ／Ｗ／Ｏ二重エマルジョン方法を、ｉｎ  ｓｉｔｕでのナノ結晶子形態のように、温度プログラム化凝固技術およびマトリックスネットワーク内の制御されたＰＴＸと組み合わせた。さらに、これらのＣＭＣナノ粒子はペグ化されたが、これは細網内皮系（ＲＥＳ）による認識を低減させ、血液中の循環時間を延長することができた。
【００６１】
マイクロエマルジョンによってキトサン粒子を作る方法は公知である。例えば、キトサン（ＣＳ）を親水性主鎖として使用し、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）を疎水性側鎖として使用する両親媒性グラフトコポリマーは、エマルジョン自己集合合成によって調製される。ＣＳ水溶液は水相として使用され、クロロホルム中のＰＬＧＡは油相としての機能を果たす。油中水型（Ｗ／Ｏ）エマルジョンは、界面活性剤ｓｐａｎ−８０の存在下で作製される。ＣＳ−ｇ−ＰＬＧＡ両親媒性物質は、自己集合して、約１００〜３００ｎｍの範囲のサイズのミセルを形成することができ、これによって様々な標的化された薬物放出および生体材料の分野において適用することが容易となる。キトサンは、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールと一緒に脱イオン水に溶解することができる。油中水型（Ｗ／Ｏ）キトサンおよびポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）マイクロエマルジョンを調製し、次いで、キトサン−グラフト−ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）刺激応答性両親媒性物質を作製する。得られた両親媒性物質は自己集合して、適切な溶媒中でミセルを形成することができる。Ｃａｉ、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ、６巻：３４９９〜５０８頁（２０１１年）は、インテグリンを過剰発現した腫瘍細胞のためのＲＧＤペプチドが媒介するキトサンをベースとするポリマーミセル標的化送達について記載している。
【００６２】
キトサン微粒子は、油中水型エマルジョン溶媒拡散方法によって調製することができる。キトサン溶液を、撹拌しながら４５分間酢酸エチルに滴下して添加する。乳化拡散後、キトサン微粒子を遠心分離によって回収し、真空オーブン中で３０℃にて２４時間乾燥させる。
【００６３】
キトサンの繰り返しグルコピラノース単位のＣ２位上のカチオン性アミノ基は、他のポリイオンのアニオン基（通常、カルボン酸基）と静電気的に相互作用して、高分子電解質複合体を形成することができる。天然由来の多くの異なるポリアニオン（例えば、ペクチン、アルギネート、カラギーナン、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、コンドロイチンスルフェート、デキストランスルフェート、ヒアルロン酸）、または合成由来の多くの異なるポリアニオン（例えば、ポリ（アクリル酸））、ポリリン酸、ポリ（Ｌ−ラクチド）を使用して、特定の薬物送達システムの設計のために必要とされる物理化学的特性を実現するために、キトサンを有する高分子電解質複合体が形成されてきた（Ｂｅｒｇｅｒら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ．、２００４年；５７巻：３５〜５２頁）。
【００６４】
実施例５によって実証されるように、キトサンスポンジは、キトサンの溶液を作り、酸を加え、次いで、キトサンを冷凍および凍結乾燥することによって調製することができる。好ましい実施形態において、薬物含有ナノ粒子をキトサン溶液に懸濁し、その中に分散した薬物ナノ粒子を有するキトサンスポンジを生じさせる。
【００６５】
ＩＩ．投与の方法
平均生理的プロファイルを仮定して、口腔がんのための２つの一般に報告されている投与レジメンは１５〜４０μｇ／ｍｌの範囲の治療剤濃度を生じさせる。これらの濃度範囲は、ＮＰ送達系を使用して得ることができる。しかし、薬剤のバイオアベイラビリティーを理解することは、これが口腔粘膜を通して吸収されるため重要である。局所組織に薬剤を送達することが意図することであり、これは送達される薬剤の総濃度において直接的な関係を有する。全身的治療剤で得られるもの未満の濃度が必要とされる。例えば、ＣＩＳは、従来静脈内ボーラス用量として送達され、その全身毒性によって制限されている。この毒性は特に、腎毒性（腎臓）および聴器毒性（聴覚性）、ならびに骨髄抑制、悪心、および嘔吐をもたらす。神経毒性は、２００ｍｇ／ｍ２の蓄積用量で観察される。ＣＩＳの最近のリポソーム形態は、３００ｍｇ／ｍ２の最大耐用量を有することが見出された。平均生理的プロファイルを仮定して、血漿濃度は７６μｇ／ｍｌ未満であるべきである。蓄積用量を報告された許容される範囲内に維持することによって、このアプローチは、全身毒性およびその関連する効果を回避する。唾液の洗い流しの結果として薬剤が胃腸（ＧＩ）管に達する場合、これはまた全身毒性を回避するはずである。大部分の白金をベースとする抗がん剤のＧＩ管における吸収は低いため、最後にＧＩ管に行く大部分の薬剤は排泄される。
【実施例】
【００６６】
本発明は、下記の非限定的実施例を参照することによってさらに理解される。
【００６７】
実施例１：薬物を含有しないキトサンをベースとするナノ粒子の調製
下記のような低分子量の研究等級のキトサンを使用して、ナノ粒子を調製した。
【００６８】
材料および方法
手短に言えば、様々なｗ／ｖ（０．１％〜１％）の精製水中のトリポリホスフェート（ＴＰＰ）溶液５ｍＬを、激しく撹拌しながら、様々な濃度の低分子量、中重量、および脱アセチル化キトサン（０．１％〜１％ｗ／ｖ）を含有する酢酸溶液（０．１７５％ｖ／ｖ）１０ｍＬに加えた。混合物を室温で１０分間連続的に撹拌し、様々なサイズを有するキトサン−ナノ粒子（ＣＨＩ−ＮＰ）のコレクションを得た。
【００６９】
ナノ粒子を特徴付けた。ナノ粒子のサイズ、多分散性指数（ＰＤＩ）、キロカウント毎秒（ＫＣＰＳ）およびゼータ電位（ＺＰ）を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｌｔｄ．、ＵＫ）によって測定した。
【００７０】
結果
表１は、低分子量キトサンから調製したナノ粒子の特性を要約する。間違いなく、特定の試料の最も重要な物理的特性は粒径である。粒径分布の測定は、広範囲の産業にわたり日常的に行われ、多くの生成物の製造における重大なパラメーターであることが多い。ＮＰは、粘膜を通して透過し、がん細胞によって取り込まれるのに２００ｎｍ未満でなければならない。
【００７１】
Ｈｅｕｒｔａｕｌｔら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２４巻：４２８３〜４３００頁（２００３年）に記載されているように、ゼータ電位は、粒子表面電荷の重要で有用な指標であり、これはコロイド懸濁物またはエマルジョンの安定性を予想および制御するために使用することができる。液体と接触する殆ど全ての粒子は、それらの表面上に電荷を生じる。剪断面における電位は、ゼータ電位と称される。剪断面は、動いている固体表面に結合している液体の薄層（対イオンから構成される液体層）を分割する想像上の表面である。ゼータ電位が大きいほど、懸濁物は安定的となる可能性が多い。なぜなら、荷電している粒子は互いに反発し、したがって、凝集する自然な傾向に打ち勝つためである。ゼータ電位の測定は、コロイド状分散物の保存安定性についての予想を可能とする。
【００７２】
ナノ粒子の電荷は、これらの粘膜付着特性にとって重大な意味を持つ（Ｂｉｏｌ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ．２００３年５月；２６巻（５号）：７４３〜６頁。Ｔｈｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｚｅｔａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｎｄ  ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｏｎ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｏｎ  ｐｉｇ  ｖｅｓｉｃａｌ  ｍｕｃｏｓａ）。正に荷電しているナノ材料は、より良好な粘膜付着強度を有する。したがって、必要とされるゼータ電位は、１０〜５０ｍＶの範囲内の正の電荷であり、これは安定的であると見なされる。
【００７３】
【表１】
2016510001.tif 000002
中分子量の研究等級のキトサンをまた使用して、低分子量の研究等級のキトサンについて上記したように、ナノ粒子を調製した。ナノ粒子は、表２に示すように特徴付けた。
【００７４】
【表２】
2016510001.tif 000003
別の実験において、ナノ粒子をまた、医薬等級のキトサン：ＰＲＯＴＡＳＡＮ（商標）ＵＰ  ＣＬ１１３（塩化キトサン）を使用して上記のように調製した。ＰＲＯＴＡＳＡＮ（商標）ＵＰ  ＣＬ１１３（塩化キトサン）は、アセチル基の７５〜９０パーセントが除去されているキトサンをベースとする。カチオン性ポリマーは、高度に精製され、よく特徴付けられた水溶性クロリド塩である。機能特性は、分子量および脱アセチル化の程度によって記載される。典型的には、ＰＲＯＴＡＳＡＮ（商標）ＵＰ  ＣＬ１１３（塩化キトサン）についての分子量は、５０，０００〜１５０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲内（キトサンアセテートとして測定）である。超低レベルの内毒素およびタンパク質は、大きな多様性のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの適用を可能とする。
【００７５】
【表３】
2016510001.tif 000004
高純度キトサン（カチオン性ポリマーは、高度に精製され、よく特徴付けられた水溶性クロリド塩である）を使用することによって、表３に示すようにより良好な質のキトサンナノ粒子を得た。最適な製剤は、ＴＰＰおよびキトサン溶液の間の異なる比（０．６：１；０．５：１；０．４：１）を最適化することによって得た。表３において示すように、最良の形成は、約０．５：１のＴＰＰとキトサンの比によるものであり、これは理想的なサイズおよびゼータ電位を有する。
【００７６】
実施例２：シスプラチンカプセル化ナノ粒子の調製および特徴付け
材料および方法
シスプラチン充填ナノ粒子を、低分子量の研究用キトサンを使用して、異なる濃度の下記のようなシスプラチンを使用して調製した。
【００７７】
手短に言えば、シスプラチン（０．１〜２ｍｇ）を含有する０．１％ｗ／ｖのトリポリホスフェート（ＴＰＰ）溶液５ｍＬを、激しく撹拌しながら、０．１％ｗ／ｖのキトサンを含有する酢酸溶液（０．１７５％ｖ／ｖ）１０ｍＬに加えた。混合物を室温にて１０分間連続的に撹拌し、異なるシスプラチン充填量を有するシスプラチンカプセル化ＣＨＩ−ＮＰのコレクションを得た。
【００７８】
０．１％ｗ／ｖの精製水中のトリポリホスフェート（ＴＰＰ）溶液５ｍＬであるブランクナノ粒子のための最適な製剤を、０．１％ｗ／ｖのキトサンを含有する酢酸溶液（０．１７５％ｖ／ｖ）１０ｍＬに激しく撹拌しながら加えた。混合物を室温にて連続的に１０分間撹拌し、１１３ｎｍのＮＰを含有するキトサン−ナノ粒子（ＣＨＩ−ＮＰ）溶液を得た。
【００７９】
シスプラチン充填ナノ粒子を下記のように調製した。異なる量のシスプラチン（０．１〜５ｍｇ）を含有する０．１％ｗ／ｖトリポリホスフェート（ＴＰＰ）溶液５ｍＬを、激しく撹拌しながら０．１％ｗ／ｖのキトサンを含有する酢酸溶液（０．１７５％ｖ／ｖ）１０ｍＬに加えた。混合物を室温にて１０分間連続的に撹拌し、シスプラチンの異なる充填量を伴うシスプラチンカプセル化ＣＨＩ−ＮＰのコレクションを生じさせた。
【００８０】
シスプラチン充填ナノ粒子中のシスプラチンの量をＩＣＰ−ＡＥＳ（誘導結合プラズマ原子発光分光法）によって定量し、充填の効率を計算した。
【００８１】
安定性試験のために、シスプラチンカプセル化ナノ粒子を合成し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏによってサイズ分布について特徴付けた。次いで、５ｍＬのＮＰ溶液を１０ｍＬのＰＢＳ、培養培地および水中に加えた。次いで、このように得られた個々の溶液を再び特徴付けた。ＮＰ溶液の保存安定性試験を室温にて３週間後に行った。
【００８２】
結果
上記のように調製したナノ粒子を特徴付け、表４において要約した。
【００８３】
【表４】
2016510001.tif 000005
低分子量の研究用キトサンを使用して調製した異なる量のシスプラチンを含有するシスプラチン充填ナノ粒子を表４に示す。低分子量の研究等級のキトサンを使用したＰＤＩおよびサイズ制御性は、うまく行えなかった。
【００８４】
より良好な質の薬物充填ナノ粒子を得るために、ＰＲＯＴＡＳＡＮ  ＵＰ（登録商標）ＣＬ１１３（塩化キトサン）を使用してシスプラチン充填ナノ粒子を調製した。上記のように調製したこれらのシスプラチンカプセル化ナノ粒子を特徴付け、表５において要約した。
【００８５】
【表５】
2016510001.tif 000006
最良の製剤は、３３．３％シスプラチン充填キトサンナノ粒子によって得られたが、これをさらなるｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの研究のために選択した。手短に言えば、シスプラチン（５ｍｇ）を含有する０．１％ｗ／ｖのトリポリホスフェート（ＴＰＰ）溶液５ｍＬを、激しく撹拌しながら、０．１％ｗ／ｖのキトサンを含有する酢酸溶液（０．１７５％ｖ／ｖ）１０ｍＬに加えた。混合物を室温で連続的に１０分間撹拌し、１４３ｎｍのサイズを有する３３．３％シスプラチン充填ＣＨＩ−ＮＰを得た。
【００８６】
ＩＣＰ−ＡＥＳ（誘導結合プラズマ原子発光分光法）によって定量したシスプラチン充填ナノ粒子中のシスプラチンの量を表５において示し、充填の効率を表６に示す。カプセル化効率に対してプロットされた充填の効率を図２に示す。
【００８７】
【表６】
2016510001.tif 000007
表５のＰＲＯＴＡＳＡＮ（商標）ＵＰ  ＣＬ１１３から調製したシスプラチン充填キトサンナノ粒子の安定性を、表７に示すように、０日目および２１日目におけるシスプラチン充填キトサンナノ粒子の直径、ＰＤＩおよびゼータ電位を測定することによって決定した。
【００８８】
【表７】
2016510001.tif 000008
データは、ナノ粒子が３週間まで安定的であったことを示す。
【００８９】
実施例３：シスプラチンカプセル化キトサンナノ粒子特性に対するｐＨの効果
材料および方法
上記の３３．３％シスプラチン充填キトサンナノ粒子のサイズおよびゼータ電位に対するｐＨの効果を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｎａｎｏ  ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）を使用して研究した。ナノ粒子の水性分散物（１２ｍｌ）を、絶えず撹拌しながら、一連のｐＨ（３．７〜８）にわたり０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液（ＮａＯＨ）で滴定した。滴定した分散物を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ測定のために測定キャピラリーセルに移した。ｐＨの関数としてナノ粒子の特性（サイズおよび電荷の両方）の変化を測定した。
【００９０】
材料および方法
３．７〜８．０のｐＨ範囲にわたるナノ粒子のゼータ電位における変化を（黒で）図３に示す。より低いｐＨにおける架橋キトサンについての高い正の表面電荷密度は、キトサンの遊離表面アミン基によるものである。ナノ粒子懸濁物のｐＨが増大すると、アミン基のより大きな割合が脱プロトン化され、粒子の測定した正のゼータ電位の減少がもたらされた。
【００９１】
ナノ粒径に対するｐＨの影響を図３に示す。３．７〜５のｐＨ範囲で、平均ナノ粒径は一定であった。酸性媒体中のキトサンの正の電荷は、ナノ粒子の間の反発をもたらす。しかし、ｐＨが増大すると、測定した平均粒径が増大したが、ナノ粒子が膨張し、凝集したことを示唆する。ナノ粒子の膨張は、ｐＨ６またはそれ超での薬物の放出をもたらし、これによってシスプラチン充填キトサンナノ粒子はｐＨ感受性薬物放出系となる。
【００９２】
実施例４：ｐＨ＝６でのシスプラチンカプセル化キトサンナノ粒子のＩｎ  Ｖｉｔｒｏでの模倣薬物放出研究。
【００９３】
材料および方法
３３％シスプラチン充填キトサンナノ粒子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの薬物放出研究に供した。３ｍＬのナノ粒子溶液をｐＨ６の緩衝液に対して透析した。回転スピードは１００ｒｐｍに固定した。それぞれ５ｍｌの試料を、特定の時間間隔（１０分、３０分、１時間、１．５時間、２時間および２４時間）で取り出した。試料を集め、シスプラチン濃度をＩＣＰ−ＡＥＳによって定量した。
【００９４】
結果
ナノ粒子からのシスプラチンの放出百分率を計算し、図４において要約する。シスプラチンの概ね６０％が、２４時間後にナノ粒子から放出された。
【００９５】
実施例５：シスプラチンカプセル化キトサンナノ粒子を包埋したキトサンスポンジの調製
材料および方法
１％キトサンｗ／ｖを含有する１％ｗ／ｖクエン酸０．６ｍＬを、１６ｍＬのＣＨＩ−ＮＰまたはシスプラチン充填ＣＨＩ−ＮＰ（１６：６ｗ／ｗのＮＰおよびキトサン）に加えた。このように得られた溶液を−８０℃にて冷凍し、２日間凍結乾燥し、ナノ粒子を包埋したスポンジを得た。クエン酸を、浸透増強剤および味マスキング剤の両方として使用した。
【００９６】
スポンジ様マトリックスからのナノ粒子の放出プロファイルを理解するために、ＦＩＴＣ標識したナノ粒子を合成した。手短に言えば、２５ｍｇのキトサンを、２５ｍｌの（０．１７５％、ｖ／ｖ）酢酸水溶液に溶解し、１ＭのＮａＯＨでｐＨ値を６．０に調節した。１ｍｇのフルオレセインナトリウム塩を、１００μｌのエタノールに溶解し、キトサン溶液中に加えた。アミド結合の形成を触媒するために、ＥＤＡＣ［１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ｃａｒｂｏｄｉｍｉｄｅ）塩酸塩］を０．０５Ｍの最終濃度まで加えた。反応混合物を、室温にて暗所中１２時間持続的に撹拌しながらインキュベートした。このように得られたＦＩＴＣが結合体化したキトサンを、脱塩水に対する透析（セルロース透析チューブ、孔径１２，４００Ｄａ；Ｓｅａｍｌｅｓｓ）によって単離した。誘導体化プロセスの評価は、対照として修飾されていないキトサン（ｃｈｉｔｓｏａｎ）およびフルオレセインを使用して、赤外分光法（ＩＲ）によって、および分光蛍光分析によって行った。
【００９７】
次いで、ＦＩＴＣ標識したナノ粒子を、ＦＩＴＣが結合体化したキトサンを使用して同じプロトコールに従うことによって得た。次いで、ＦＩＴＣ標識したナノ粒子を、上記のようなスポンジ中に包埋した。スポンジを１ｍＬのＰＢＳ中に入れ、溶液を様々な時点で集めた。キトサンスポンジからのナノ粒子の放出プロファイルを、集めた溶液の蛍光強度を測定することによって時間をわたって測定した。
【００９８】
ＦＩＴＣ標識したシスプラチンカプセル化ナノ粒子を包埋したスポンジを調製し、２つのｐＨ条件、すなわち、ｐＨ５．５およびｐＨ７を有する６ウェルプレートに入れた。スポンジからのナノ粒子の放出を、プレートリーダーを使用して異なる時点におけるこれらの蛍光強度によって測定した。
【００９９】
結果
図５に示すように、スポンジからのナノ粒子放出は時間と共に増大した。概ね２０分以内に、ナノ粒子の９０％がスポンジから放出された。
【０１００】
結果は、ｐＨ７よりｐＨ５．５においてより速い放出プロファイルを示し、これは腫瘍細胞（健康な細胞より酸性）上での本発明者らのプラットフォームの好ましい放出を示す。
【０１０１】
実施例６：シスプラチン充填キトサン（ｃｈｉｓｔｏｓａｎ）ナノ粒子を使用した細胞生存率研究
材料および方法
３３％シスプラチン充填ナノ粒子の細胞生存率研究を、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイを使用して行った。咽頭由来のシスプラチン感受性扁平上皮癌細胞系であるＦａＤｕ（ＨＴＢ−４３、アメリカ培養細胞系統保存機関、ＡＴＣＣから）細胞系［Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１０巻：８００５〜８０１７頁（２００４年）］を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの研究のために利用した。
【０１０２】
３３％シスプラチン充填ナノ粒子の細胞生存率研究をまた、テトラゾリウム化合物（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム分子内塩、ＭＴＳを使用して行った。細胞によって組み込まれるとき、ＭＴＳは、代謝的に活性な細胞によって生体内還元される。発光の量は、培養物中の生細胞の量に直接比例している。
【０１０３】
別々のセットの実験において、ＫＢ細胞（ＨｅＬａ亜系）を、１５％シスプラチン充填キトサンナノ粒子による２４時間の処理に続いてＭＴＴアッセイを使用して調べた。
【０１０４】
ＣＩＳ−ＮＰがどのようにシスプラチン耐性細胞系をもたらしているかを理解するために、シスプラチン感受性卵巣細胞系、Ａ２６７０、およびシスプラチン耐性卵巣細胞系、Ａ２６７０の細胞生存率研究を行った。
【０１０５】
結果
２４時間および４８時間のインキュベーション後にＦａＤｕ細胞系に対するＭＴＴアッセイによって評価された、遊離シスプラチン、３３％シスプラチン充填ナノ粒子、およびブランクナノ粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの治療有効性を示す結果をそれぞれ図６Ａおよび６Ｂに示す。
【０１０６】
ＨＣＰＣ１（ハムスター頬袋癌）細胞に対して３３％シスプラチン充填ナノ粒子、ブランクナノ粒子または遊離シスプラチンの４８時間のＭＴＳアッセイを使用した細胞生存率を、図６Ｃに示す。細胞成長の５０％阻害が起こる濃度であるＩＣ５０値は、遊離シスプラチンについておよそ０．０６μＭ、ブランクナノ粒子について０．２６μＭ、および３３％シスプラチン充填ナノ粒子について概ね２．３ｎＭであった。
【０１０７】
図７Ａおよび図７Ｂは、別々のセットの実験の結果を示すが、ここで１５％シスプラチン充填キトサンナノ粒子による２４時間（図７Ａ）および７２時間（図７Ｂ）の処理に続いて、ＭＴＴアッセイを使用してＫＢ細胞（ＨｅＬａ亜系）を調べた。結果は、シスプラチン充填キトサンナノ粒子の治療有効性をさらに確証した。ヒト口腔表皮であるＫＢ細胞系以外に、他のタイプの細胞系（例えば：３Ｔ３：マウス線維芽細胞；Ａ４３１：皮膚癌）をまた調査した。
【０１０８】
シスプラチン感受性細胞系および非感受性細胞系による研究は、感受性細胞系について遊離ＣＩＳよりＣＩＳ−ＮＰについてはるかに低いＩＣ５０を示す。しかし、耐性細胞系に対してＣＩＳ−ＮＰおよび遊離ＣＩＳ群の間に有意差は存在しない。細胞は、高濃度の薬物を使用することによって耐性細胞系について両方の群において破壊されることができるが、ｉｎ  ｖｉｖｏの場合において遊離ＣＩＳについて用量を限定する毒性の問題が存在する。
【０１０９】
実施例８：シスプラチン充填キトサンナノ粒子を使用したｉｎ  ｖｉｖｏでのマウス研究
Ａ．ＦａＤｕ腫瘍
材料および方法
４〜５週齢のヌードマウスを、腫瘍細胞の埋込みのために麻酔し、剪毛し、準備した。ＦａＤｕ細胞を培養物から集め、次いで、ＰＢＳ緩衝液およびＭａｔｒｉｇｅｌの１：１混合物に懸濁させた３×１０５個の細胞をマウスの背中の皮下に注射した。２１日後、腫瘍が概ね１５０ｍｍ３のサイズに達したとき、マウスを５匹のマウスの３群に分け、重量および腫瘍サイズの差異を最小化した。腫瘍担持マウスを、ＰＢＳ、シスプラチン充填ナノ粒子、または薬物非含有キトサンナノ粒子（１．１５ｍｇ／ｋｇのシスプラチン当量）の皮下注射によって処置した。２回の用量を、３日の間隔で、すなわち、それぞれ、２１日目、２４日目、２７日目および３０日目に投与した。注射の後、動物を密接にモニターし、各動物についての腫瘍サイズおよび体重の測定を、どの注射を各動物が受容したかを知ることなく、カリパスを使用して規則的な間隔で行った。各時点についての腫瘍体積は、式、（長さ）×（幅）２／２（長軸は長さであり、短軸は幅である）によって計算した。
【０１１０】
結果
各群について調製したメジアン腫瘍成長曲線（ｍｅｄｉａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｕｒｖｅ）は、時間の関数としてメジアン腫瘍サイズを表した（図７）。結果は、シスプラチン充填ナノ粒子が腫瘍サイズを低減させたことを実証する。
【０１１１】
３つの群（ＣＩＳ−ＮＰ腫瘍内、遊離シスプラチン腫瘍内、および遊離シスプラチン静脈内）の腫瘍組織を、処置のエンドポイント（３週間）において集め、ＩＣＰ−ＭＳを使用して分析した。結果は、他の２つの群、すなわち、遊離シスプラチンの腫瘍内および静脈内に対して、ナノ粒子で処置した群が腫瘍において最も多い薬物の蓄積を有することを示す。マウスの血液中の毒性研究は、遊離シスプラチン群（腫瘍内および静脈内の両方）と比較して２４時間以内に、ナノ粒子腫瘍内群の血流中に最小量の化学薬物が存在することを示し、これは送達系の最小化された毒性を示唆する。
【０１１２】
Ｂ．ＨＣＰＣ１腫瘍
材料および方法
７１〜８０ｇのゴールデンシリアンハムスターを、腫瘍細胞の埋込みのために麻酔し、調製した。ハムスター頬袋癌（ＨＣＰＣ１）細胞を培養物から集め、次いで、ＰＢＳ緩衝液に懸濁した１×１０８個の細胞をハムスターの頬袋中に皮下へと注射した。７日後、腫瘍のサイズが概ね１００ｍｍ３に達したとき、ハムスターを４つの群に分け、重量および腫瘍サイズの差異を最小化した。
【０１１３】
腫瘍担持ハムスターを、遊離シスプラチンの腹腔内注射、およびナノ粒子を包埋したスポンジ（１．１５ｍｇ／ｋｇのシスプラチン当量）の局所設置によって処置した。３日の間隔で２用量を投与した。処置後、動物を密接にモニターし、各動物についての腫瘍サイズおよび体重の測定を、どの注射を各動物が受容したかを知ることなく、カリパスを使用して規則的な間隔で行った。各時点についての腫瘍体積を、式、（長さ）×（幅）２／２（長軸は長さであり、短軸は幅である）によって計算した。ＣＩＳ−ＮＰを包埋したスポンジで局所的に、および遊離シスプラチンで腹腔内に処置された、ＨＣＰＣ１を同種異型移植されたハムスターの腫瘍阻害および体重変化百分率。
【０１１４】
結果
図９Ａおよび９Ｂにおいて示した結果は、腫瘍サイズの同程度の減少が両方の処置によって得られたが、体重減少はナノ粒子において有意に少なかったことを実証し、これは、同じ有効性を伴うより大きな安全性を実証する。
【０１１５】
実施例９：ＰＥＧが結合体化したキトサンおよびペグ化されたキトサンナノ粒子の合成
材料および方法
ＰＥＧが結合体化したキトサンを、下記のように合成した。０．１％ｗ／ｖのキトサンを含有する５ｍＬの酢酸溶液（０．１７５％ｖ／ｖ）を調製し、１ＭのＮａＯＨを使用してｐＨを６に調節した。続いて、５ｍｇのＮＨＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨを、キトサン溶液中に室温にて磁気撹拌しながら３時間加えた。次いで、混合物をｐＨ７に調節した。反応をアルゴン雰囲気下で一晩行った。次いで、このように得られた溶液を凍結乾燥し、ＰＥＧが結合体化したキトサンを得た。
【０１１６】
ＰＥＧに結合体化したキトサンの化学構造を評価するために、特性付けのために偏光フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）スペクトルを得た。ＰＥＧ−ＮＨＳ中のエステル−Ｃ＝Ｏに特徴的な１７１３ｃｍ−１におけるピークは、エステル結合がＰＥＧ−キトサン中へのアミド結合に変換されるため、ＰＥＧ−キトサンのＦＴ−ＩＲスペクトルにおいて消失する。さらに、約１４６６ｃｍ−１、約１６５７ｃｍ−１、約３３６５ｃｍ−１でのピークの強度は、ＰＥＧへの架橋キトサンにおけるアミド結合形態によって増大した。結果は、キトサンへのＰＥＧの成功した結合体化を示す。
【０１１７】
ペグ化されたキトサンナノ粒子を、下記のようなＰＥＧが結合体化したキトサンから調製した。手短に言えば、５ｍＬのトリポリホスフェート（ＴＰＰ）溶液を、激しく撹拌しながら０．１％ｗ／ｖのＰＥＧ−キトサンを含有する１０ｍＬの酢酸溶液（０．１７５％ｖ／ｖ）に加えた。混合物を室温で連続的に１０分間撹拌し、ペグ化されたＣＨＩ−ＮＰを得た。
【０１１８】
実施例１０：大きいスケールでのＮＰの最適化
プロセスの自動化は、バッチ毎のバリエーションおよび人的ミスを排除することによってより速くより安価な製造、および生成物特性の標準化の両方を可能とするため、工業生産の不可欠な部分である。生成物特性を非常に限定された許容範囲内に維持しなければならないナノテクノロジー適用において、これは特に必要である。
【０１１９】
自動化したＮＰ合成のための材料および方法：
使用した全ての試薬および化学物質は、賦形剤または医薬等級である；
溶液Ａ：溶液Ａ：０．１％トリポリホスフェート（ＴＰＰ）溶液中の０．１％シスプラチン
溶液Ｂ：０．１７５％酢酸溶液中の０．１％キトサン（ＣＬ１１３）
１０ｍＬの溶液Ｂをガラス製ビーカーに入れ、磁気撹拌子で６００ｒｐｍにて撹拌する。一定流量を、本明細書において使用する場合、１．５ｍＬ／分で提供することができる蠕動ポンプまたは任意の他のポンプの補助の下、全部で１０ｍＬの溶液Ａを撹拌した溶液Ｂ上に滴下で移したが、この流量を修正して、異なるサイズ、電荷、多分散性、ＮＰ収率、および薬物カプセル化効率の特性を生じさせることができる。
【０１２０】
溶液Ａと溶液Ｂ（Ａ：Ｂ）の異なる比は、１：１（上記の場合におけるように）から１．１：０．８５で使用した。異なる混合比は、異なるＮＰ特性を生じさせる。溶液Ａの半分を移したときに、溶液Ｂの撹拌スピードを６５０ｒｐｍに徐々に増大させる。溶液Ａの移動が完了するとき、撹拌スピードを７００ｒｐｍに徐々に増大させ、次いで、二糖トレハロースを溶液に徐々に加え、２％の最終トレハロース濃度を得る。全ての加えたトレハロースが溶解するまで（または少なくとも１０分間）撹拌を続け、溶液を平衡化する。
【０１２１】
各ピークのＺ−平均、多分散性指数（ＰｄＩ）、平均直径、および得られたＮＰのＮＰ収率（カウントレート）を測定する。
【０１２２】
必要とされる最終生成物によると、下記のステップのいずれか１つを行う。
【０１２３】
保存のために、最終ＮＰ溶液を妥当な容器中に入れ、完全な冷凍が得られるまで、液体窒素を使用して、ドライアイス中で、または超低温フリーザー中で冷凍し、次いで、完全な溶媒の排除が得られるまでこれらをフリーズドライする。
【０１２４】
担体ウエハー（ＣｈｅｍｏＴｈｉｎウエハーまたはＣＴＷ）における設置のために、次いで、最終ＮＰ溶液に、１％酢酸（または１％クエン酸）中の２ｍＬの１％キトサンＧ１１３溶液を、徐々に撹拌しながら加え、混合物の撹拌を１０分間続ける。次いで、この混合物を妥当な容器中に入れ、フリーズドライする。溶液Ａと溶液Ｂの比が１：１と異なる場合、加えるＧ１１３キトサンの量は、これの体積が総ＮＰ溶液の１０％であるように調節しなくてはならない。
【０１２５】
大量生成のために、スケーラビリティ（ｓｃａｌａｂｉｌｉｔｙ）は必須である。薬物を担持するナノ粒子は、正しい化学条件下でのみ起こる動的プロセスである自己集合によって溶液環境中で形成される。この技術は、引き続く溶液の混合速度ならびにこれらの濃度、鮮度、および純度を含めて製造の変数に対して極度に感受性である。引き続く溶液の混合速度は、ナノ粒子特性を犠牲にすることなしに、特定の値を超えて増大させることができない。さらに、自己集合の動的性質によって、混合プロセスは、限られた時間で終了させなければならない。なぜなら、この期間におけるあらゆる遅延は、最適な値からのナノ粒子の特性または収率の偏差の変化を増大させるためである。自己集合製造方法論の感受性の性質は、厳密に制御されたバッチタイプの製造プロセスを採用することを強制し、バッチ毎の高い生成体積を可能としない。チームが開発した自動化システムを使用することによって、本発明者らは、当初の手作業のナノ粒子生成プロセスを自動化したバージョンに首尾よく適合させ、これは今やサイズ、多分散性、およびカプセル化効率を含めた、このように得られたナノ粒子の特性を厳密に制御することができる。これらのパラメーターは、薬物送達システムの有効性、および原料費に関して最も重要である。パラメーターを調節して、ナノ粒子の特性を狭い許容範囲内に維持する一方で、最大バッチ体積およびナノ粒子収率（特定の生産バッチにおいて形成されるナノ粒子の数）の間のバランスを得ることができる。得られたナノ粒子の多分散性は、十分に許容される範囲内であることが見出された。最初の結果は、ナノ粒子特性または収率を犠牲にすることなく、７０ｍＬまでのバッチ体積が得ることができたことを証明した。さらに、これらのバッチ生成プロセスを平行して行って、生成スピードを促進することが可能である。
【０１２６】
ナノ粒子製剤の安定性は必須である。ナノ粒子製剤の安定性試験は、媒体中のナノ粒子の収率を減少させることなく、生成から３時間まで生成媒体中でこれらが安定的であることを示した。さらに、天然二糖トレハロースを生成媒体中に加えることによって、収率を全く減少させることなく、これを少なくとも４時間まで延ばすことが可能である。
【０１２７】
この方法は、フリーズドライステップが関与する。プロセスの後のＮＰの安定性に関して言えば、これは懸念であり得る。ＮＰがフリーズドライ後に同様の構造および特性を保つことを証明するために、フリーズドライ後に得たＮＰの粉末形態を、異なるｐＨ中に再懸濁した。異なるｐＨの溶液でのＮＰのサイズを、３０分後にＺｅｔａｓｉｚｅｒによって測定した。ＮＰサイズの百分率の増大は、下記のように計算した。（異なるｐＨでのＮＰのサイズ−フリーズドライ前のＮＰのサイズ）／（フリーズドライ前のＮＰのサイズ）＊１００。
【０１２８】
ＮＰ溶液の精製、すなわち、全ての過剰な化合物、例えば、ＴＰＰおよび遊離シスプラチンを除去する。３０Ｋ  ＰＡＬＬ  Ｎａｎｏｓｅｐ濾過デバイスを使用する小スケールプロセスは、成功であることが証明された。過剰な成分の９０％超を除去し、高度に精製されたＮＰ生成物をもたらす。大きなスケールでの精製に関して、チームは、Ｍｉｎｉｍａｔｅ  ＴＦＦ（接線流濾過）システム上でＰＡＬＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅを使って作業した。結果は、過剰な遊離化合物が１時間以内に１００ｍｌから除去されることを示す。
【０１２９】
実施例１１：シスプラチン含有ＮＰの充填能力および細胞の取込み
材料および方法
ＮＰの製剤を最適化して、より良好な薬物充填能力およびカプセル化効率を達成した。カプセル化効率（％ＥＥ）は、ＩＣＰ−ＡＥＳによって決定した。手短に言えば、４００ｕＬのＮＰを、Ｐａｌｌ  Ｎａｎｏｓｅｐ３０Ｋフィルターを使用して遠心分離した（１１００ｒｃｆ、８分、２５℃）。遠心分離の後、底部の溶液（遊離シスプラチンに対応する）および頂部の溶液（ＮＰに対応する）を集め、これらの溶液中のＰｔの量を、硝酸２％中での１／１００希釈の後にＩＣＰ−ＡＥＳによって測定した。ＥＥ％を下記の式を使用して計算した。
１００−（底部のＰｔ（ｍｇ）×１００／総Ｐｔ、理論上（ｍｇ））
ＴＲ−１４６細胞を、５２ｕＭにてＦＩＴＣ標識したＮＰで３０分間処理し、ＮＰの細胞の取込みを、フローサイトメトリーによって測定した。
【０１３０】
結果
結果は、８１％のカプセル化効率を伴う３０％までの充填能力を実証する。
【０１３１】
結果は、図１０に示すように、およそ７５％のＮＰが細胞によって取り込まれたことを示す。
【０１３２】
実施例１２：キトサンの修飾
キトサンナノ粒子の細胞の取込み機構、および細胞質コンパートメントにおけるこれらのＮＰの輸送の理解を深めるために、キトサンポリマーを、様々なフルオロフォアと合成した。フルオロフォア（ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ）を、エステル化学反応によってキトサンポリマー上のアミン基を介して結合体化した（図１１）。キトサンポリマーのアミン基がナノ粒子製剤および薬物カプセル化において主要な役割を果たすため、アミン基の約５％のみをフルオロフォアで官能化した。キトサンポリマーをまたチオール基で官能化して、粘膜付着特性を向上させた。２−イミノチオラン（図１２）を使用した。キトサン−フルオロフォアとは異なり、２−イミノチオランを使用することによって、正の電荷はポリマー上で保持され、チオール末端基が導入された。
【０１３３】
フルオレセインナトリウム塩（ＦＩＴＣ）、２−イミノチオランＨＣＬ、およびＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７カルボン酸、スクシンイミジルエステル（Ａｌｅｘａ６４７）は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。
【０１３４】
キトサン−ＦＩＴＣ結合体の合成：２５ｍｇのキトサンを、２５ｍｌの酢酸水溶液（０．１７５％、ｖ／ｖ）に溶解し、溶液のｐＨを１ＭのＮａＯＨで６に調節した。この溶液に、エタノール中の１ｍｇのフルオレセインナトリウム塩（１０ｍｇ／ｍｌ）、および２１ｍｇのＥＤＣを加え、室温にて１２時間撹拌した。１２時間後、反応混合物を脱塩水に対して２日間透析し、フリーズドライし、所望のキトサン−ＦＩＴＣ結合体を達成した。
【０１３５】
キトサン−Ａｌｅｘａ結合体の合成：２５ｍｇのキトサンを２５ｍｌの酢酸水溶液（０．１７５％、ｖ／ｖ）に溶解し、溶液のｐＨを１ＭのＮａＯＨで６に調節した。この溶液に５０ｕｌのＤＭＳＯ中のＡｌｅｘａ６４７（１ｍｇ／ｍｌ）および２１ｍｇのＥＤＣを加え、室温にて１２時間撹拌した。１２時間後、反応混合物を脱塩水に対して２日間透析し、フリーズドライし、所望のキトサン−Ａｌｅｘａ結合体を達成した。
【０１３６】
チオール化キトサンの合成：５０ｍｇのキトサンを５ｍｌの１％酢酸に溶解し、１ＭのＮａＯＨで溶液のｐＨを６に調節した。この溶液に、２０ｍｇの２−イミノチオランＨＣｌを加え、反応混合物を室温にて２４時間撹拌した。反応が完了した後、反応混合物を、５ｍＭのＨＣｌに対して、１％ＮａＣｌを含有する５ｍＭのＨＣｌ、５ｍＭのＨＣｌに対して２回、および最後に０．４ｍＭのＨＣｌに対して透析した。透析の後、反応混合物をフリーズドライし、チオール修飾された固体キトサンを得た。
【０１３７】
実施例１３：ハイスループット様式でのＮＰを包埋したウエハーの迅速な合成
凍結乾燥のための様々なフォーマットを使用して実験を行い、最適なものは１２ウェルプレートであると見出された。
【０１３８】
材料および方法
試薬：ウエハー溶液、液体窒素、１２ウェルプレート、凍結乾燥器。
【０１３９】
プロトコール：シスプラチンカプセル化ＮＰを、キトサン溶液中へのシスプラチンの滴下添加によるイオン性ゲル化方法によって最初に合成した。次いで、混合物を１０分間撹拌した。撹拌プロセスに続いて、１％酢酸溶液中のキトサングルタメート（Ｇ１１３）溶液を次いでこれに加え、さらに１分撹拌した。次いで、この混合物を、各ウェル中４ｍｌで１２ウェルプレートに移した。液体窒素中で３０分間冷凍プロセスを行い、それに続いて２日間凍結乾燥した。
【０１４０】
結果
このプラットフォームは、再現性を最大化し、ウエハーの形状、および各ウエハー中の薬物の量の両方の正確な制御を可能とする。さらに、ウエハーを冷凍させる代替方法を探索する実験を行った。ウエハー溶液を液体窒素中で３０分間冷凍させることは、これをドライアイス上で３時間冷凍させることと同じ効果を生じさせたことが見出された。このプロセスは、単一のものとして１２のウエハー、および冷凍時間において８３％の低減をもたらす。
【０１４１】
実施例１４：ＮＰを包埋したウエハーへの甘味剤および味マスキング剤の最適化された製剤の組込み
シスプラチンと関連する不快な金属味が存在する。この不快でしばしば耐えられない味は、化学療法患者の生活の質を劇的に低下させ、シスプラチンの局所投与に対して相当な障害を引き起こし得る。厳密な実験法を行って、修飾を最小化する一方で、ＮＰを包埋したウエハープロトコールに組み込むことができる甘味剤および味マスキング剤の最適な製剤を決定した。多くのフレーバーおよび甘味剤製剤を、様々な条件下で試験した。この実験の目標は、シスプラチンの金属味を隠すためのフレーバー／マスキング剤の最良の組合せを決定することであった。
【０１４２】
材料および方法
６種の異なるフレーバー試料および１種の分割剤は、ＷＩＬＤ  Ｆｌａｖｏｒｓから得た。粉末状スクラロースおよびＥＺ−Ｓｗｅｅｔｚは、Ａｍａｚｏｎ．ｃｏｍから購入し、Ｇｅｎｔｌｅ  Ｉｒｏｎサプリメントは、Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｓｈｏｐｐｅから購入した。
【０１４３】
使用した試薬および設備：
フルーツパンチフレーバー
トロピカルパンチフレーバー
オレンジクリームフレーバー
オレンジＣｒｅａｍｓｉｃｌｅフレーバー
ペパーミントフレーバー
バニラミントフレーバー
分割剤
２５ｍｇのＧｅｎｔｌｅ  Ｉｒｏｎカプセル（シスプラチンフレーバーを試験するため）
ＥＺ−Ｓｗｅｅｔｚ
粉末状スクラロース  。
【０１４４】
結果
各フレーバーを、６つの異なるパラメーター下で試験した。
１滴のフレーバー＋２ｍｌの５％鉄溶液
１滴のフレーバー＋２ｍｌの５％鉄溶液＋１滴のＥＺ−Ｓｗｅｅｔｚ
１滴のフレーバー＋２ｍｌの５％鉄溶液＋１滴の４２ｍｇ／ｍｌのスクラロース溶液
１滴のフレーバー＋２ｍｌの５％鉄溶液＋１滴の分割剤
１滴のフレーバー＋２ｍｌの５％鉄溶液＋１滴のＥＺ−Ｓｗｅｅｔｚ＋１滴の分割剤
１滴のフレーバー＋２ｍｌの５％鉄溶液＋１滴の４２ｍｇ／ｍｌのスクラロース溶液＋１滴の分割剤  。
【０１４５】
組合せの殆ど全ては、強い金属味が完全に隠された溶液をもたらした。ＥＺ−Ｓｗｅｅｔｚがフレーバーの大部分に加えられたとき、ＥＺ−Ｓｗｅｅｔｚは、甘味しかしないところまでフレーバーを圧倒した。いくつかは甘すぎであり、これらは嚥下することが困難であった。さらに、分割剤は、ＥＺ−Ｓｗｅｅｔｚと組み合わせたときに、フレーバーのいくつかに対して魅力的な効果を有した。試験した６つの組合せの５つは、甘味を和らげるばかりでなく、Ｒｅｓｏｌｖｅｒによってそれらのコアとなるフレーバーが増強された（例えば、ペパーミントは非常によりはっきりしていた）。６つのフレーバーの５つにおける最良の結果は、ＥＺ−Ｓｗｅｅｔｚおよび分割剤の組合せから得られた。
【０１４６】
実施例１５：浸透増強剤の最適化およびウエハー中への浸透増強剤の組込み
この研究は、ウエハー中に包埋されたシスプラチンカプセル化ＮＰがブタ舌に透過することができるところまでの浸透深さを決定することであった。プラットフォーム技術は、ナノ粒子の表面上に様々なタイプの浸透増強剤を加え、またはスポンジマトリックス中に混合することができる。プラットフォームの柔軟性は、組織の異なる深さに浸透することができる浸透増強剤の様々な組合せのライブラリーを作り出すことができる。負に荷電している浸透増強剤、例えば、胆汁酸は、交互積層方法（ｌａｙｅｒ−ｂｙ−ｌａｙｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用してナノ粒子の表面上に加えることができる。
【０１４７】
材料および方法
ＦＩＴＣ標識したキトサンＮＰを使用した。
【０１４８】
下記の浸透増強剤（「ＰＥ」）を使用した：
ａ）ＰＥなし（ＰＢＳのみ）
ｂ）エタノール（５０％ＰＢＳで希釈した１００％エタノール）
ｃ）２−ジメチルアミノプロピオン酸ドデシルエステル（ＤＤＡＩＰ）（「ＤＤＡＩＰ」）（２ｇ／１００ｍｌ、ＰＢＳに希釈）
ｄ）エタノール＋ＤＤＡＩＰ（それぞれ、（ｂ）および（ｃ）において使用されたようにエタノールおよびＤＤＡＩＰの同じ最終作業濃度を達成するために４ｇ／１００ｍｌのＤＤＡＩＰで希釈した１００％エタノール）
ｅ）ＴＤＣＡ（１００ｍＭ、ＰＢＳに希釈）  。
【０１４９】
一例として、ナトリウムデオキシコール酸（ＤＣＡ）を選択した。シスプラチン（１ｍｇ／ｍＬ）を含有する２．４ｍＬのＴＰＰ溶液を、３ｍＬのキトサン溶液（酢酸溶液０．１７５％ｖ／ｖ）中にゆっくりと加えた。浸透増強剤（この場合、ＤＣＡ）の交互積層コーティングは、混合物中に６０ｕＬのＤＣＡ（１．６ｍｇ／ｍＬ）を急速に加えることによって行った。次いで、溶液を室温にて１０分間激しく撹拌し、ＤＣＡコーティングされたシスプラチンカプセル化ナノ粒子（ＤＣＡコーティングされたＣＩＳ−ＮＰ）を得た。
【０１５０】
代わりに、１％キトサンおよび１０ｍｇのナトリウムデオキシコール酸（ＤＣＡ）を含有する１ｍＬの１％ｗ／ｖクエン酸溶液を、１ｍＬのＣＨＩ−ＮＰ溶液中に加えた。次いで、このように得られた溶液を−８０℃にて冷凍し、ＤＣＡ／ＣＩＳ−ＮＰを包埋したスポンジを得るために２日間凍結乾燥した。
【０１５１】
新鮮なブタの舌は、ケンブリッジの肉屋から得た。舌の中央部分をこれらの研究のために選択した。この部分上で５つの指定したセクションを選択し、０．７５ｍＬのこれらのＰＥのそれぞれを、これらのセクションのそれぞれにおいて適用し、それに続いてウエハー（それぞれ２５ｍｇ）を加え、ウエハーの頂部にさらに０．７５ｍＬのＰＥを加えた。インキュベーションを暗所中でＲＴにて１時間行った。次いで、舌を水で洗浄し、全てのウエハーをこれらの指定したセクションから除去した。それぞれのセクションを個々に切断し、ミクロトームを使用した切片作成のためにＯＣＴ中に包埋した。５０ミクロンのスライスをこれらのセクションのそれぞれから切断し、２つのスライスをスライド上に置いた。結合したＯＣＴは画質に干渉するため、スライドを水中に３時間浸し続け、これを除去した。これに続いて、異なるセクションからのスライドのそれぞれを、ＤＡＰＩ含有封入媒体を使用してカバーガラスとともにマウントし、蛍光顕微鏡を使用して像を取得した。像は、ＦＩＴＣおよびＤＡＰＩチャネルの両方において４×、１０×および２０×で撮影した。さらに、未処理の舌のスライスをまた切断し、像を取得し、舌の固有の蛍光を得た。しかし、浸透研究を行う前に、多くの実験を行い、本発明者らの現在のウエハー合成プロトコールに対して相当な修飾をもたらさずに、ウエハー中への途切れのない統合を可能とするＰＥの最適濃度を発見した。
【０１５２】
結果
研究の結果は、ＤＤＡＩＰが最も有効な浸透増強剤であることを示した（表８）。
【０１５３】
【表８】
2016510001.tif 000009
頬側医薬送達における主要な挑戦の１つは、薬物が口のバリアを首尾よく迂回して、その標的部位に達することを確実にすることである。２つの最も顕著なバリアは、類脂質性（ｌｉｐｏｉｄａｌ）バリアおよび基底膜である。類脂質性バリアは上面上皮中に存在し、膜コーティング顆粒およびタイトジャンクションからなり、一方、基底膜は上皮のより深くにあり、大型分子が入ることを防止する細胞外マトリックスタンパク質で構成されている。キトサンはそれ自体が浸透増強剤である一方、十分な薬物送達のために、上皮中に十分に深く透過することができない（表８に示すように７０μｍ）。そのカチオン性特性は、負に荷電している細胞膜と相互作用し、類脂質性バリアを撹乱し、かつ浸透を増大させる。ＤＤＡＩＰ−ＨＣｌがＰＥとして使用されたとき、ＮＰが浸透する最大深さは、基底膜バリア（およそ１００μｍ）をはるかに超えて２００μｍである。ＤＤＡＩＰ−ＨＣｌは、細胞の脂質二重層の動態を変化させ、細胞の間のタイトジャンクションをゆるめ、浸透を増大させることが示されてきた親水性分子である。研究はまた、ＤＤＡＩＰ  ＮＰが浸透の傍細胞経路をたどることを示し、これは、ＮＰが細胞の間の細胞内空間を使用し、上皮中により深く移行することを意味する。
【０１５４】
これらの結果は、キトサンおよびＤＤＡＩＰ−ＨＣｌが、類脂質性バリアおよび基底膜の両方を克服し、深い腫瘍にさえ達するのに十分に上皮を透過することができることを示す。
【図１】
2016510001.tif 000010
【図２】
2016510001.tif 000011
【図３】
2016510001.tif 000012
【図４】
2016510001.tif 000013
【図５】
2016510001.tif 000014
【図６−１】
2016510001.tif 000015
【図６−２】
2016510001.tif 000016
【図７】
2016510001.tif 000017
【図８】
2016510001.tif 000018
【図９】
2016510001.tif 000019
【図１０】
2016510001.tif 000020
【図１１】
2016510001.tif 000021
【図１２】
2016510001.tif 000022
【国際調査報告】
2016510001.tif 000023
2016510001.tif 000024
2016510001.tif 000025