(57)【要約】Ｌ−シスチン／システイン分解酵素活性を有するタンパク質の改変に関する方法及び組成物が記載される。たとえば、ある態様において、１以上のアミノ酸置換を含有し、Ｌ−シスチン／システインを分解することができる修飾シスタチオニン−γ−リアーゼが開示されうる。さらに、本発明のある態様は、本開示タンパク質または核酸を用いた、Ｌ−シスチン／システインで癌を治療するための組成物及び方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然型霊長類シスタチオニン−γ−リアーゼ(ＣＧＬ)アミノ酸配列（配列番号１及び７〜１０を参照のこと）と比較して少なくとも１つの置換を有する、単離された、修飾霊長類ＣＧＬ酵素であって、前記少なくとも１つの置換が、天然型霊長類ＣＧＬ配列の５９位のスレオニンを含有する、前記酵素。
【請求項２】
３３９位でバリン置換をさらに含有する、請求項１に記載の酵素。
【請求項３】
異種ペプチドセグメントをさらに含有する、請求項１に記載の酵素。
【請求項４】
前記異種ペプチドセグメントが、ＸＴＥＮペプチド、ＩｇＧ  Ｆｃ、アルブミン、またはアルブミン結合ペプチドである、請求項３に記載の酵素。
【請求項５】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に連結されている、請求項１に記載の酵素。
【請求項６】
１以上のリジンまたはシスチン残基を介してＰＥＧに連結されている、請求項５に記載の酵素。
【請求項７】
天然型霊長類シスタチオニン−γ−リアーゼ(ＣＧＬ)アミノ酸配列（配列番号１及び７〜１０を参照のこと）と比較して少なくとも２つの置換を有する、単離された、修飾霊長類ＣＧＬ酵素であって、前記少なくとも２つの置換が、天然型霊長類ＣＧＬ配列の５９位のスレオニン及び３３９位のバリンを含有する、前記酵素。
【請求項８】
請求項１に記載の酵素をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸。
【請求項９】
前記核酸が、細菌、真菌、昆虫または哺乳類での発現にコドン最適化されている、請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
請求項８または９のいずれかに記載の核酸を含有する発現ベクター。
【請求項１１】
請求項８または９のいずれかに記載の核酸を含有する宿主細胞。
【請求項１２】
細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞である、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
天然型もしくは修飾霊長類シスタチオニン−γ−リアーゼ（ＣＧＬ）酵素、天然型霊長類ＣＧＬ酵素をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸、請求項１に記載の酵素、または請求項８もしくは９のいずれかに記載の前記核酸を、薬学的に受容可能な担体中に含有する医薬製剤。
【請求項１４】
腫瘍細胞、または腫瘍細胞を有する対象を治療する方法であって、請求項１３に記載の製剤の治療有効量を、前記腫瘍細胞または前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１５】
前記対象が、Ｌ−シスチン及び／またはＬ−システイン制限食で維持されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象が、通常食で維持されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
シスタチオニン−β−シンターゼまたはシスタチオニン−γ−リアーゼ遺伝子の発現レベルが、非腫瘍細胞と比較して低下しているものとして、前記腫瘍細胞が特定されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
ｘＣＴ（−）システイン輸送体の発現レベルが、非腫瘍細胞と比較して上昇しているものとして、前記腫瘍細胞が特定されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象が、ヒト患者である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記製剤が、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、眼球内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、筋肉内、皮下、結膜下、肺胞内、経粘膜、心膜内、臍帯内、経口、吸入、注射、点滴、持続注射、標的細胞を直接浸す局所かん流、カテーテル、または洗浄液を介して、投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記製剤が、前記腫瘍細胞の栄養培地に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記栄養培地が、血液、リンパ液、または髄液である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象に少なくとも第二の抗癌治療を施すことをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記第二の抗癌治療が、外科治療、化学療法、放射線治療、寒冷療法、ホルモン療法、免疫療法またはサイトカイン療法である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
対象における腫瘍細胞の治療における使用のための、請求項１に記載の酵素または請求項８に記載の核酸を含有する、組成物。
【請求項２６】
前記酵素が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に連結されている、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記核酸が、細菌、真菌、昆虫、または哺乳類での発現にコドン最適化されている、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２８】
腫瘍内、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、眼内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、筋肉内、皮下、結膜下、肺胞内、経粘膜、心膜内、臍帯内、経口投与用に、製剤化されている、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２９】
前記腫瘍細胞の栄養培地への投与用に製剤化されている、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３０】
前記栄養培地が、血液、リンパ液、または髄液である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
少なくとも第二の抗癌治療をさらに含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３２】
前記第二の抗癌治療が、化学療法、ホルモン療法、免疫療法、またはサイトカイン療法である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
腫瘍細胞の治療のための医薬の製造における、請求項１に記載の酵素または請求項８に記載の核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２０１３年８月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／８７１，７２７号、及び２０１４年３月５日に出願された米国仮特許出願第６１／９４８，１０６号の優先権を主張し、それら全内容は、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所から与えられた助成金番号Ｒ０１  ＣＡ１５４７５４の下、政府の支持を受けて行われた。政府は、本発明にある権利を有している。
【０００３】
１．発明の分野
本発明は、概して、医学及び生物学分野に関するものである。より具体的には、Ｌ−シスチン及びＬ−システインの両方を枯渇させる酵素を用いた癌の治療のための組成物及び方法に関する。さらにより具体的には、ヒト治療に適した、高いシステイン／システイン分解活性及び安定性を有する霊長類酵素の改変に関する。
【背景技術】
【０００４】
２．関連技術の説明
様々なアミノ酸の全身的な枯渇は、非癌性組織に対しては最小限の毒性で、広範囲の腫瘍型の殺傷に有効であることが示されている。この治療効果は、薬理学的に最適化された酵素を循環系へと導入し、腫瘍が依存するアミノ酸を分解することにより達成することができる。ある種の癌（たとえば前立腺癌、小細胞肺癌、膠芽細胞腫、及び肝細胞癌）は、増殖及び生存するために、細胞外シスチン／システインに非常に依存していることが示されている。これら腫瘍の多くは、ｘＣＴ（−）シスチン／グルタミン酸対向輸送体を異常に過剰発現し、それにより、タンパク質及びグルタチオン生成のために必要とされる十分なレベルのシステインを維持していることから、それらは、天然型のシステイン生合成の能力を失っている、または下方制御されていることが示唆される。この着想を支持し、たとえばスルファサラジン等の、ｘＣＴ（−）シスチン／グルタミン酸対向輸送体の小分子阻害剤を使用することにより、前立腺癌及び小細胞肺癌の腫瘍異種移植片の増殖を遅らせることが示されている（Ｄｏｘｓｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。しかし、ｘＣＴ（−）依存性Ｌ−シスチン輸送体の阻害は有望ではあるが、Ｎａ＋依存性ＡＳＣ輸送体及び／またはＮａ＋非依存性輸送体による遊離Ｌ−システインの輸送は排除されず、一部の例では、遊離Ｌ−システインは、骨髄由来間質細胞により腫瘍細胞に提供されている（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。ゆえに、シスチン及びシステインの両方を枯渇させる治療物質が、この必須代謝物を腫瘍から完全に奪うことができる。しかしながら、ヒト治療への応用に適した特性または活性を有する、不可逆的なシスチン／システイン分解酵素は発見されておらず、及び、一般的に、特定のアミノ酸を分解することができる酵素はあまり存在しておらず、既存の酵素から、所望の活性に改変する必要がある。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、Ｌ−シスチン及びＬ−システイン（本明細書において、Ｌ−シスチン／システインと呼称する）の両方を、血清から効率的に分解する霊長類シスタチオニン−ガンマ−リアーゼ（ＣＧＬ）酵素の改変、及び、ヒト癌治療に適した剤型の修飾ＣＧＬ酵素の提供に関するものである。天然型酵素と比較し低いＫＭと高い触媒活性のｋｃａｔを示す酵素を開発するために、発明者らは、選択されたアミノ酸を修飾することにより天然型酵素を改変し、その修飾により、劇的に酵素特性が改善された酵素が作製された。よって、天然型酵素と比較し、Ｌ−シスチン／システイン分解触媒活性を有するヒトまたは霊長類のポリペプチド配列を含有する新規酵素を提供することにより、本明細書に記述される修飾ＣＧＬ酵素は、当分野の大きな課題を克服する。よって、これら修飾酵素は、癌治療に適し、及び、免疫原性が低く、血清安定性が改善され得る。
【０００６】
従って、第一の実施形態において、修飾ポリペプチド、特に、シスタチオニン−γ−リアーゼ（ＣＧＬ）酵素に関連した霊長類酵素由来の、Ｌ−シスチン／システイン分解活性を有する酵素変異体が提示される。たとえば、新規酵素変異体は、配列番号２〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有していても良い。たとえば、当該変異体は、ヒトＣＧＬ等のヒト酵素由来であっても良い。ある態様においては、Ｌ−シスチン／システインを分解することが出来る修飾霊長類ＣＧＬを含有するポリペプチドであっても良い。一部の実施形態において、当該ポリペプチドは、生理学的条件下でＬ−シスチン／システインを分解することが出来ても良い。たとえば、当該ポリペプチドは、少なくとも、または約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０４、１０５、１０６ｓ-１Ｍ-１または、それらから導き出せる任意の範囲の、Ｌ−シスチン／システインに対する触媒効率（ｋｃａｔ／ＫＭ）を有していても良い。
【０００７】
非修飾ポリペプチドは、天然型ＣＧＬ、特にヒトアイソフォームまたは他の霊長類アイソフォームであっても良い。たとえば、天然型ヒトＣＧＬは、配列番号１の配列を有していても良い。他の天然型霊長類ＣＧＬの非限定的な例としては、Ｐｏｎｇｏ  ａｂｅｌｉｉ  ＣＧＬ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ＿００１１２４６３５．１；配列番号７）、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ  ＣＧＬ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：ＡＡＷ７１９９３．１；配列番号８）、Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ  ＣＧＬ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：ＸＰ＿５１３４８６．２；配列番号９）、及び、Ｐａｎ  ｐａｎｉｓｃｕｓ  ＣＧＬ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：ＸＰ＿００３８３０６５２．１；配列番号１０）が挙げられる。例示的な天然型ポリペプチドは、配列番号１または７〜１０またはそれらの断片に対し、約、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性（または、それらから導き出せる任意の範囲）を有する配列を含有する。たとえば、天然型ポリペプチドは、配列番号１または７〜１０の配列の少なくとも、または約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４０５残基（またはそれらから導き出せる任意の範囲）までを含有しても良い。
【０００８】
一部の実施形態において、天然型ＣＧＬは、１以上の他の修飾、たとえば、化学修飾、置換、挿入、欠失、及び／または切断等により、修飾されていても良い。特定の実施形態において、天然型ＣＧＬは、置換により修飾されていても良い。たとえば、置換の数は、１、２、３、４またはそれ以上であっても良い。さらなる実施形態において、天然型ＣＧＬは、基質認識部位または、基質特異性に影響を与えうる任意の位置で修飾されていても良い。たとえば、修飾ポリペプチドは、配列番号１または７〜１０のアミノ酸５９位及び／または３３９位に相当するアミノ酸の位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を有していても良い。これらの例において、各配列の第一のメチオニンは、アミノ酸の１位に相当し、各アミノ酸は、そこから連続的に番号づけられる。
【０００９】
ある実施形態において、アミノ酸５９位及び／または３３９位の置換はスレオニン（Ｔ）またはバリン（Ｖ）である。特定の実施形態において、当該修飾は、５９Ｔ及び３３９Ｖからなる群から選択される１以上の置換である。さらなる実施形態において、当該置換は、５９Ｔ置換を含有しても良い。さらなる実施形態において、当該置換は、３３９Ｖの追加の置換を含有しても良い。
【００１０】
一部の実施形態において、天然型ＣＧＬは、ヒトＣＧＬであっても良い。特定の実施形態において、当該置換は、ヒトＣＧＬ（たとえば、配列番号２のアミノ酸配列を有する修飾ポリペプチド、それらの断片またはホモログ）のＥ５９Ｔ及びＥ３３９Ｖの組み合わせである。さらなる実施形態において、修飾ポリペプチドは、Ｐｏｎｇｏ  ａｂｅｌｉｉ  ＣＧＬ−ＴＶ変異体（配列番号３）、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ  ＣＧＬ−ＴＶ変異体（配列番号４）、Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ  ＣＧＬ−ＴＶ変異体（配列番号５）、またはＰａｎ  ｐａｎｉｓｃｕｓ  ＣＧＬ−ＴＶ変異体（配列番号６）であっても良い。
【００１１】
上述の修飾ポリペプチドは、非修飾ポリペプチド（たとえば、天然型ポリペプチド）と比較し、または、本明細書に開示される任意のポリペプチドと比較し、ある割合の同一性を有するとして特徴付けられても良い。たとえば、非修飾ポリペプチドは、天然型霊長類ＣＧＬ（すなわち、ヒト、Ｐｏｎｇｏ  ａｂｅｌｉｉ、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｇｙｔｅｓ、またはＰａｎ  ｐａｎｉｓｃｕｓのＣＧＬ）の少なくとも、または約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４０５残基（またはそれらから導き出せる任意の範囲）までを含有しても良い。同一性の割合は、修飾ポリペプチドの非修飾部分（すなわち、アミノ酸５９及び／または３３９位での任意の置換を除く、修飾ポリペプチドの配列）と、対応する天然型ポリペプチドの間で、約、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％（または、それらから導き出せる任意の範囲）であっても良い。また、上述の同一性の割合は、ポリペプチドの非修飾領域と比較し、ポリペプチドの特定の修飾領域に関連したものでありうることも企図される。たとえば、ポリペプチドは、同一種由来、もしくは、複数種由来の非修飾または変異ＣＧＬに対する、ＣＧＬの修飾または変異基質認識部位のアミノ酸配列の同一性に基づき、特徴付けられうる、ＣＧＬの修飾または変異基質認識部位を含有しても良い。たとえば、非修飾ＣＧＬに対し、少なくとも９０％の同一性を有すると特徴付けられる修飾または変異ヒトポリペプチドとは、当該修飾または変異ヒトポリペプチド中のアミノ酸の少なくとも９０％が、当該非修飾ポリペプチドのアミノ酸と同一であることを意味する。
【００１２】
一部の態様において、本発明から、異種アミノ酸配列に連結された修飾ＣＧＬを含有するポリペプチドもまた企図される。たとえば、当該修飾ＣＧＬは、融合タンパク質として異種アミノ酸配列に連結されていても良い。特定の実施形態において、当該修飾ＣＧＬは、たとえば、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長させるために、ＩｇＧ  Ｆｃ、アルブミン、アルブミン結合ペプチド、またはＸＴＥＮポリペプチド等のアミノ酸配列に連結されていても良い。
【００１３】
血清安定性を増加させるために、当該修飾ＣＧＬは、１以上のポリエーテル分子に連結されていても良い。特定の実施形態において、当該ポリエーテルは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であってもよい。当該修飾ポリペプチドは、特定のアミノ酸残基（たとえば、リジンまたはシステイン）を介して、ＰＥＧに連結されていても良い。治療用投与に関しては、当該修飾ＣＧＬを含有するポリペプチドは、薬学的に受容可能な担体中に分散されていても良い。
【００１４】
一部の態様においては、そのような修飾ＣＧＬをコードする核酸が企図される。１つの態様において、当該核酸は、細菌での発現にコドン最適化されている。特定の実施形態において、当該細菌は、大腸菌である。他の態様において、当該核酸は、真菌（たとえば、酵母）、昆虫細胞、または哺乳類細胞での発現にコドン最適化されている。本発明ではさらに、そのような核酸を含有する、たとえば発現ベクター等のベクターが企図される。特定の実施形態において、当該修飾ＣＧＬをコードする核酸は、プロモーター（限定されないが、異種プロモーターが挙げられる）に操作可能に連結されている。１つの実施形態において、修飾ＣＧＬは、ベクター（たとえば、遺伝子治療用ベクター）により、標的細胞へと送達されても良い。そのようなウイルスは、標的細胞中での当該修飾ＣＧＬコード核酸の発現が可能となるよう、組換えＤＮＡ技術により修飾されていても良い。これらベクターは、非ウイルス性（たとえば、プラスミド）またはウイルス性（たとえば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、または、ワクシニアウイルス等）起源のベクター由来であっても良い。非ウイルス性ベクターは、好ましくは、細胞膜を超えたＤＮＡの侵入が促進されるよう、剤と複合体化される。そのような非ウイルス性ベクター複合体の例としては、ポリカチオン性剤との製剤が挙げられ、それにより、ＤＮＡ凝縮及び脂質ベースの送達系が促進される。脂質ベースの送達系の例としては、リポソームベースの核酸送達が挙げられる。
【００１５】
さらなる態様において、本発明より、そのようなベクターを含有する宿主細胞もまた企図される。当該宿主細胞は、細菌（たとえば、大腸菌）、真菌細胞（たとえば、酵母）、昆虫細胞、または哺乳類細胞であっても良い。
【００１６】
一部の実施形態において、当該ベクターは、修飾ＣＧＬを発現するための宿主細胞へと導入される。当該タンパク質は、任意の適切な方法で発現されても良い。１つの実施形態において、当該タンパク質は、当該タンパク質がグリコシル化されるような宿主細胞において発現される。別の実施形態において、当該タンパク質は、当該タンパク質が非グリコシル化されるような宿主細胞において発現される。
【００１７】
一部の実施形態において、当該ポリペプチドまたは核酸は、薬学的に受容可能な担体を含有する医薬製剤中にある。当該ポリペプチドは、天然型霊長類ＣＧＬポリペプチドまたは修飾ＣＧＬポリペプチドであっても良い。当該核酸は、天然型霊長類ＣＧＬポリペプチドまたは修飾ＣＧＬポリペプチドをコードしていても良い。
【００１８】
本発明のある態様においてはまた、天然型霊長類ＣＧＬポリペプチド、遺伝子治療ベクター中に天然型霊長類ＣＧＬポリペプチドをコードする核酸、修飾ＣＧＬペプチド、遺伝子治療ベクター中に当該修飾ＣＧＬをコードする核酸、または、本発明の製剤の投与による治療法が企図され、及び、特に、腫瘍細胞、または癌を有する対象の治療方法が企図される。当該対象は、たとえばマウス等の任意の動物であっても良い。たとえば、当該対象は、哺乳類、特に霊長類、より具体的にはヒト患者であっても良い。一部の実施形態において、当該方法には、癌を有する患者を選択することが含まれても良い。ある態様において、当該対象または患者は、Ｌ−シスチン／システイン制限食または通常食で維持されていてもよい。
【００１９】
一部の実施形態において、当該癌は、Ｌ−シスチン／システイン枯渇に感受性のある任意の癌である。１つの実施形態において、本発明では、当該ポリペプチドを含有する製剤を投与することを含む、腫瘍細胞、または癌患者を治療する方法が企図される。一部の実施形態において、当該投与は、少なくとも癌の細胞の一部が殺傷されるような条件下で行われる。別の実施形態において、当該製剤は、生理学的条件下で、Ｌ−シスチン／システイン分解活性を有し、及び、付着ポリエチレングリコール鎖をさらに含有する、修飾ＣＧＬを含有する。一部の実施形態において、当該製剤は、上述のＣＧＬ変異体のうちのいずれか、及び、薬学的に受容可能な賦形剤を含有する医薬製剤である。当該薬学的に受容可能な賦形剤は、当分野の当業者に公知である。上述のＣＧＬ変異体のすべてが、ヒト治療に対し有用であると企図されうる。
【００２０】
さらなる実施形態において、非細菌性（たとえば、霊長類またはマウス等の哺乳類）の、Ｌ−シスチン／システイン分解活性を有する修飾ＣＧＬまたはそれをコードする核酸を含有する製剤を投与することを含む、腫瘍細胞を治療する方法もまた提供される。
【００２１】
腫瘍細胞は、それらの栄養培地にＬ−シスチン／システインを依存しているため、治療または投与は、当該細胞に対する栄養源を目的としてもよく、当該細胞それ自身である必要はない。それゆえ、ｉｎ  ｖｉｖｏ応用においては、腫瘍細胞の治療は、改変（すなわち、修飾）ＣＧＬと、腫瘍細胞群のための栄養培地を接触させることが含まれる。この実施形態において、当該培地は、血液、リンパ液、髄液、及び、Ｌ−シスチン／システイン枯渇が望ましい類似の体液であっても良い。
【００２２】
本発明のある態様によると、修飾ＣＧＬを含有する当該製剤は、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、滑膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、腫瘍内、筋肉内、皮下、結膜下、肺胞内、経粘膜、心膜内、臍帯内、眼球内、経口、局所、吸入により、点滴、持続注入、局所かん流、カテーテルを介して、洗浄液を介して、脂質組成物中で（たとえば、リポソーム等）、または、当分野の当業者に公知の他の方法により、または前述の任意の組み合わせにより、投与されても良い。
【００２３】
さらなる実施形態において、当該方法はまた、対象に、少なくとも第二の抗癌治療を投与することを含んでも良い。当該第二の抗癌治療は、外科的治療、化学療法、放射線治療、寒冷療法、ホルモン療法、免疫療法、またはサイトカイン療法であっても良い。
【００２４】
１つの実施形態において、修飾ＣＧＬ、または修飾ＣＧＬをコードする核酸を含有する組成物は、対象中の腫瘍の治療における使用のために提供される。別の実施形態において、腫瘍の治療のための医薬の製造における、修飾ＣＧＬまたは修飾ＣＧＬをコードする核酸の使用が開示される。前記修飾ＣＧＬは、本実施形態のうちの任意の修飾ＣＧＬであっても良い。
【００２５】
本発明の方法及び／または組成物に関して検討される実施形態は、本明細書に記述される任意の他の方法または組成物に対して用いられても良い。ゆえに、１つの方法または組成物に付随する実施形態は、本発明の他の方法及び組成物に、同様に適用されても良い。
【００２６】
本明細書において、核酸に関連する、「コードする（ｅｎｃｏｄｅ）」または「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」という用語は、当業者が容易に本発明を理解できるよう用いられている；しかしながら、これら用語は、それぞれ、「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と相互交換可能に用いられても良い。
【００２７】
本明細書において、「１つの（ａまたはａｎ）」は、１以上を意味しうる。本請求項（複数含む）において、「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という文言と併せて用いられた場合には、当該「１つの（ａまたはａｎ）」という文言は、１または２以上を意味しうる。
【００２８】
本請求項において、「または」という用語の使用は、代替物のみを指すことを明確に指示していない限り、または、当該代替物が相互排他的でない限り、「及び／または」を意味するために用いられているが、本開示は、代替物のみ、及び、「及び／または」を指す定義も支持している。本明細書において、「別の」とは、少なくとも第二以上を意味しうる。
【００２９】
本明細書を通じて、「約」という用語は、値が、当該値を測定するために用いられた装置、方法に固有の誤差変動、または、実験対象間で存在する変動を含むことを示すために用いられる。
【００３０】
本発明の他の目的、特性、及び、利点は、以下の詳細な記述から明白となるであろう。しかしながら、本明細書及び具体的な実施例が、本発明の好ましい実施形態を示している一方で、解説の目的でのみ、提示されているものであり、本発明の主旨及び範囲内の、様々な変化及び変更が、本明細書から当業者には明らかであることを理解されたい。
【００３１】
以下の図面は、本明細書の一部を形成するものであり、本発明のある態様をさらに示すために含まれているものである。本発明は、本明細書に提示されている具体的な実施形態の詳細な記述と、これら図面のうちの１以上を組み合わせて参照することにより、さらに理解されうる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】システイナーゼ（ｃｙｓｔ（ｅ）ｉｎｅａｓｅ）酵素触媒の概略図：ｈＣＧＬ及び改変ｈＣＧＬ変異体は、Ｌ−シスチンをピルビン酸、アンモニア、及びチオシステインへと転換する。チオシステインは、硫化水素及びＬ−システインへと非酵素的に分解される。Ｌ−システインはｈＣＧＬ及び改変ｈＣＧＬ変異体により、ピルビン酸、アンモニア及び硫化水素へとさらに分解される。
【図２】Ａ〜Ｂは、（Ａ）Ｌ−シスチン（○）及び（Ｂ）Ｌ−システイン（●）の、ｈＣＧＬ−ＴＶ触媒分解のミカエリス−メンテン反応速度である。
【図３】３７℃でインキュベートされた、プールされたヒト血清における、ｈＣＧＬ−ＴＶ（○）の経時的活性である（見かけ上のＴ０．５は２２８±６時間）。
【図４Ａ】様々な濃度のｈＣＧＬ−ＴＶで処置された前立腺腫瘍株ＤＵ１４５（各細胞株に対し、見かけ上のＩＣ５０値は約６０ｎＭ）。
【図４Ｂ】様々な濃度のｈＣＧＬ−ＴＶで処置された前立腺腫瘍株ＰＣ３（各細胞株に対し、見かけ上のＩＣ５０値は約６０ｎＭ）。
【図５】ｈＣＧＬ−ＴＶのアミノ酸配列（配列番号１１）。Ｎ末端Ｈｉｓ６タグ、及びＥ５９Ｔ−Ｅ３３９Ｖの変異（太字の下線）を伴う、２〜４０５残基のｈＣＧＬアミノ酸配列を含有する。
【図６】（Ａ）ＦＶＢマウス（ｎ＝５／群）における、ＰＥＧ−ｈＣＧＬ−ＴＶの単回投与（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）は、９６時間にわたりシスチンレベルが低下し、及び、（Ｂ）４８時間にわたり、システインレベルが低下した。（＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、及びＮＳ＝有意ではない）。
【図７】ＦＶＢマウス（ｎ＝５／群）における、ＰＥＧ−ｈＣＧＬ−ＴＶの単回投与（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）の薬物動態を経時的に観察した。吸収Ｔ１／２は約２３時間、排出Ｔ１／２は４０±７時間。
【図８】ＨＭＶＰ２前立腺癌同種移植片を担持するＦＶＢマウス（各群、ｎ＝８）を、ＰＥＧ−ｈＣＧＬ−ＴＶ（５０ｍｇ／ｋｇ体重、□）、ＰＥＧ−ｈＣＧＬ−ＴＶ（１００ｍｇ／ｋｇ体重、▲）、ＰＢＳ（○）、または熱不活化ＰＥＧ−ｈＣＧＬ−ＴＶ（１００ｍｇ／ｋｇ体重、◆）で、４日毎に１回、腹腔内投与で処置した。
【図９】ヒト（ＰＣ３）前立腺癌異種移植片を担持するオスのヌードマウス（各群、ｎ＝７）を、ＰＥＧ−ｈＣＧＬ−ＴＶ（５０ｍｇ／ｋｇ体重、▲）、ＰＥＧ−ｈＣＧＬ−ＴＶ（１００ｍｇ／ｋｇ体重、●）、ＰＢＳ（◆）、または熱不活化ＰＥＧ−ｈＣＧＬ−ＴＶ（１００ｍｇ／ｋｇ体重、■）で、４日毎に１回、腹腔内投与で処置した。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
実施態様の説明
システインは、含硫基移動経路（酵素のシスタチオニン−β−シンターゼ（ＣＢＳ）及びシスタチオニン−γ−リアーゼ（ＣＧＬ）を含有する）を介して、必須アミノ酸のＬ−メチオニンから誘導されるホモシステインから合成されることができるため、非必須アミノ酸であると見なされている。ゆえに、システインの枯渇は、損傷を受けていない含硫基移動経路を有する正常組織に対し、比較的、非毒性であると予測されている。ある癌は、含硫基移動経路酵素のＣＢＳ及び／またはＣＧＬの発現が異常に低い、または発現していないことがあるため、細胞外分画からＬ−システイン／Ｌ−シスチンを輸入する必要がある。さらに肝細胞癌においては、ＣＢＳの下方制御は予後不良と相関しており（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）、消化管癌もまた、ＣＢＳのエピジェネティックなサイレンシングが頻繁に発生していることが観察されている（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。他の例においては、ＣＧＬの発現の欠損が、リンパ芽急性白血病細胞株において頻繁に観察されている（Ｇｌｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１；  Ｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３）。ＣＢＳ及びＣＧＬ、ならびにｘＣＴ（−）システイン輸送体の発現レベルは、システイン／システイン枯渇レジメンを用いた治療に対する患者選択の腫瘍バイオマーカーの重要な構成要素となる。
【００３４】
本発明により、Ｌ−シスチン／システインを分解する改変治療用酵素が提供される。また、たとえば癌、リソソーム蓄積症（すなわち、シスチン症（ｃｉｓｔｉｎｏｓｉｓ））等の疾患を治療するための前記酵素の使用方法、及び様々な自己免疫疾患における有害な免疫作用を回避するための前記酵素の使用方法が提供される。ゆえに、これらアミノ酸を枯渇させることができる治療用酵素は、免疫調節剤として有用でありうる。
【００３５】
Ｉ．定義
本明細書において、「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合を介して結合されたアミノ酸を含有する化合物を指し、相互交換可能に用いられる。
【００３６】
本明細書において、「融合タンパク質」という用語は、人工的に操作可能に連結されたタンパク質またはタンパク質断片を含有するキメラタンパク質を指す。
【００３７】
本明細書において、「半減期」（１／２期）という用語は、そのポリペプチドの濃度が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて（たとえば、哺乳類への注入後）、半分にまで下がるために必要とされる時間を指す。
【００３８】
「操作可能な組み合わせで」、「操作可能な順序で」、及び、「操作可能に連結された」という用語は、そのように記述された構成要素が、意図された様式でそれらが機能できる関係性にある連結を指し、たとえば、核酸分子が、所与の遺伝子の転写及び／または所望のタンパク質分子の合成を指示することができるような様式にある核酸配列の連結、または、融合タンパク質が産生されるような様式にあるアミノ酸配列の連結等がある。
【００３９】
「リンカー」という用語は、２つの異なる分子を操作可能に連結するための分子の橋として機能する化合物または部分を指し、ここで、当該リンカーの１つの部分は、第一の分子に操作可能に連結されており、及び、当該リンカーの別の部分は、第二の分子に操作可能に連結されている。
【００４０】
「ＰＥＧ化」という用語は、生体適合性度が高く、修飾が容易であるために、薬剤の担体として広く用いられているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との結合を指す。ＰＥＧは、化学的方法を介し、当該ＰＥＧ鎖の末端で、水酸基を介して活性剤と連結（たとえば共有結合）することができる。しかしながら、ＰＥＧ自身は、１分子あたり、最大で２つの活性剤に限定される。他の方法では、ＰＥＧとアミノ酸のコポリマーが、ＰＥＧの生体適合性を保持しつつ、分子当たりの付加点は多く有し（それにより、より多くの薬剤が担持できる）、及び、様々な応用に適合するよう合成的に設計することができるという利点が加わった、新規バイオマテリアルとして研究されている。
【００４１】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたはその前駆体の産生に必要な制御配列及びコード配列を含有するＤＮＡ配列を指す。ポリペプチドは、全長コード配列によりコードされていても良く、または、所望の酵素活性が保持されるようコード配列の任意の部分によりコードされていても良い。
【００４２】
「天然型」という用語は、遺伝子、遺伝子産物、または、天然型で存在する源から単離された際の当該遺伝子もしくは遺伝子産物の特徴の通常の形態を指す。天然型形態は、天然群でもっとも頻繁に存在するものであり、それゆえに、任意で通常形態または野生型の形態に指定される。対照的に、「修飾された」、「変異型」または「変種」とは、天然型遺伝子または遺伝子産物と比較した際に、配列及び機能特性において変化（すなわち、改変された特徴）を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。
【００４３】
「ベクター」という用語は、核酸配列が、複製することができる細胞へと導入されるために挿入されうる、担体核酸分子を指す。核酸配列は、ベクターが導入される細胞に対して異種であること、または、当該配列が、細胞中の配列に対して同種であるが、当該配列が通常は存在しない宿主細胞核酸内の位置にあることを意味する、「外来性」であっても良い。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス）、及び人工染色体（たとえば、ＹＡＣ）が挙げられる。当業者であれば、標準的な組換え技術を介して、ベクターを構築することができるであろう（たとえば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４を参照のこと（両方とも、参照により本明細書に援用される））。
【００４４】
「発現ベクター」という用語は、転写されることができるＲＮＡをコードする核酸を含有する任意のタイプの遺伝的構築物を指す。一部の例において、ＲＮＡ分子は、その後、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドへと翻訳される。他の例において、これら配列は、たとえば、アンチセンス分子またはリボザイムの産生において翻訳されない。発現ベクターは、様々な「制御配列」（特定の宿主細胞中において、操作可能に連結されたコード配列の転写及び、場合によって翻訳に必要とされる核酸配列を指す）を含有しても良い。転写及び翻訳を統制する制御配列に加え、ベクター及び発現ベクターは、他の機能を果たし、以下に記述される核酸配列を含有しても良い。
【００４５】
本明細書において、「治療有効量」という用語は、治療効果を得るために本方法で用いられる治療用組成物（たとえば、治療用ポリヌクレオチド及び／または治療用ポリペプチド）の量を指す。本明細書を通じて用いられている「治療利益」または「治療的有効性」という用語は、当該状態の医学的処理に関し、当該対象の福利を促進または向上させる任意のものを指す。これには、限定されないが、疾患の兆候もしくは症状の頻度または重篤度の減少が挙げられる。たとえば、癌の治療には、たとえば、腫瘍サイズの減少、腫瘍浸潤度の低下、癌の増殖率の低下、または、転移の防止が含まれても良い。癌の治療はまた、癌を有する対象の生存期間の延長を指しても良い。
【００４６】
本明細書において、「ＫＭ」という用語は、酵素のミカエリス−メンテン定数を指し、所与の酵素が、酵素触媒反応において、その最大速度の半分を生み出す特定の基質濃度として定義される。本明細書において、「ｋｃａｔ」という用語は、各酵素部位が産物へと転換する、単位時間当たりの基質分子の数または代謝回転数を指し、当該酵素は最大効率で作用する。本明細書において、「ｋｃａｔ／ＫＭ」という用語は、特異性定数であり、酵素が基質を産物へと転換する効率の程度である。
【００４７】
「シスタチオニン−γ−リアーゼ」（ＣＧＬまたはシスタチオナーゼ）という用語は、システインへのシスタチオニンの加水分解を触媒する任意の酵素を指す。たとえば、シスタチオニン−γ−リアーゼの霊長類型、または特に、シスタチオニン−γ−リアーゼのヒト型が含まれる。
【００４８】
「治療」または「治療する」とは、対象に治療剤を投与もしくは適用すること、または、疾患または健康に関連した状態の治療的利益を得る目的で対象にモダリティもしくは治療を施すことを指す。たとえば、治療には、薬学的に有効な量のシステイナーゼを投与することを含んでも良い。
【００４９】
「対象」及び「患者」とは、たとえば、霊長類、哺乳類、及び脊椎動物等のヒトまたは非ヒトのいずれかを指す。特定の実施形態において、対象は、ヒトである。
【００５０】
ＩＩ．シスタチオニン−γ−リアーゼ
リアーゼは、様々な化学結合の分断を触媒する酵素であり、多くの場合、新たな二重結合または新たな環構造を形成する。たとえば、この反応を触媒した酵素は、リアーゼである：ＡＴＰ→ｃＡＭＰ＋ＰＰｉ。リアーゼは、１方向の反応に対しては１つの基質のみを必要とするが、逆反応に対しては２つの酵素を必要とする点で、他の酵素とは異なる。
【００５１】
多くのピリオキサル−５´−リン酸（ＰＬＰ）依存性酵素が、システイン、ホモシステイン、及びメチオニンの代謝に関与しており、これら酵素は、進化的に関連したファミリーを形成し、Ｃｙｓ／Ｍｅｔ代謝ＰＬＰ依存性酵素と指定されている。これら酵素は、約４００アミノ酸のタンパク質であり、ＰＬＰ基は、ポリペプチドの中心に位置するリジン残基に付着している。このファミリーのメンバーとしては、シスタチオニン−γ−リアーゼ（ＣＧＬ）、シスタチオニン−γ−シンターゼ（ＣＧＳ）、シスタチオニン−β−リアーゼ（ＣＢＬ）、メチオニン−γ−リアーゼ（ＭＧＬ）、Ｏ−アセチルホモセリン（ＯＡＨ）／Ｏ−アセチル−セリン（ＯＡＳ）スルフヒドリラーゼ（ＯＳＨＳ）が挙げられる。それらすべての共通しているのは、ミカエリス複合体の形成であり、それにより、末端基質アルジミンが生じる。さらなる反応経路は、特定の酵素の基質特異性により決定される。
【００５２】
たとえば、本発明者らは、ＰＬＰ依存性リアーゼファミリーのメンバー（シスタチオニン−γ−リアーゼ）に特異的変異を導入し、その基質特異性を変化させた。この方法で、本発明者らは、Ｌ−システイン及びＬ−シスチンの両方を分解する新たな能力を有する新規変異体を生み出した。他の実施形態において、新規Ｌ−シスチン／システイン分解活性をもたらすための、他のＰＬＰ依存性酵素の修飾もまた、企図されうる。
【００５３】
シスタチオニン−γ−リアーゼ（ＣＧＬまたはシスタチオナーゼ）は、シスタチオニンをシステインとα−ケト酪酸に分解する酵素である。リン酸ピリドキサルは、この酵素の補欠分子族である。実施例に示されているように、タンパク質改変を用いて、Ｌ−システイン及びＬ−シスチンの弱い分解活性のみを有しているシスタチオナーゼを、高率でこれらアミノ酸を分解することができる酵素へと転換した。
【００５４】
ＩＩＩ．システイナーゼ改変
一部の実施形態は、修飾タンパク質及びポリペプチドに関連するものである。特定の実施形態は、非修飾型と同等の、少なくとも１つの機能的活性、好ましくは、Ｌ−シスチン／システイン分解活性を示す修飾タンパク質またはポリペプチドに関するものである。さらなる態様において、当該タンパク質またはポリペプチドは、血清安定性を高めるためにさらに修飾されていても良い。ゆえに、本発明が、「修飾タンパク質」もしくは「修飾ポリペプチド」の機能または活性を指す場合、当業者であれば、これに、たとえば、非修飾タンパク質またはポリペプチドを超える追加の利点（たとえば、Ｌ−シスチン／システイン分解活性）を有するタンパク質またはポリペプチドが含まれることを理解するであろう。ある実施形態において、非修飾タンパク質またはポリペプチドは、天然型ＣＧＬ、好ましくは、ヒトＣＧＬである。「修飾タンパク質」に関連する実施形態は、「修飾ポリペプチド」に対して実行されうること、及び、その逆もまた然りであることが、具体的に企図される。
【００５５】
活性の測定は、当業者に良く知られた分析法、特に、タンパク質活性に関する分析法を用いて行われても良く、比較目的に関しては、たとえば、修飾もしくは非修飾タンパク質またはポリペプチドのいずれかの天然型及び／または組換え型の使用が含まれても良い。たとえば、Ｌ−シスチン／システイン分解活性は、Ｌ−システイン及び／またはＬ−シスチンの分解から生じる任意の基質の産生を検出する任意の分析法により測定されても良い（たとえば、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）を用いたピルビン酸の検出）。（Ｔａｋａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。
【００５６】
ある実施形態において、修飾ポリペプチド（たとえば、修飾ＣＧＬ）は、Ｌ−シスチン／システイン分解活性における増加に基づき、特定されても良い。たとえば、非修飾ポリペプチドの基質認識部位が特定されても良い。この特定は、構造解析または相同性解析に基づいても良い。そのような基質認識部位の修飾を含む変異体群が作製されても良い。さらなる実施形態において、当該変異体群からＬ−シスチン／システイン分解活性が増加した変異体が選択されても良い。所望の変異体の選択に、たとえば、Ｌ−シスチン／システイン分解からの副産物または産物の検出のための方法が含まれても良い。
【００５７】
修飾タンパク質は、アミノ酸の欠失及び／または置換を含んでも良く、ゆえに、欠失を含むタンパク質、置換を含むタンパク質、ならびに、欠失及び置換を含むタンパク質は、修飾タンパク質である。一部の実施形態において、これら修飾タンパク質はさらに、たとえば、融合タンパク質またはリンカーを有するタンパク質として、挿入または追加アミノ酸を含有しても良い。「修飾欠失タンパク質」は、天然型タンパク質のうちの１以上の残基を欠落しているが、当該天然型タンパク質の特異性及び／または活性は保有しうる。「修飾欠失タンパク質」はまた、免疫原性または抗原性が低下していても良い。修飾欠失タンパク質の例は、少なくとも１つの抗原性領域、すなわち、特定の生物体（たとえば当該修飾タンパク質が投与されうる生物型）において抗原性があると決定されたタンパク質の領域からのアミノ酸残基欠失を有しているものである。
【００５８】
置換または交換変異体は通常、タンパク質内の１以上の部位で、１つのアミノ酸と別のアミノ酸の交換を含有しており、及び、当該ポリペプチドの１以上の特性、特に、そのエフェクター機能及び／または生体利用効率が調節されるよう設計されていても良い。置換は、保存的（すなわち、１つのアミノ酸が、類似の形態及び電荷を有するものと置換される）であっても無くても良い。保存的置換は、当分野に公知であり、たとえば、アラニンからセリン、アルギニンからリジン、アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジン、アスパラギン酸からグルタミン酸、システインからセリン、グルタミンからアスパラギン、グルタミン酸からアスパラギン酸、グリシンからプロリン、ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミン、イソロイシンからロイシンまたはバリン、ロイシンからバリンまたはイソロイシン、リジンからアルギニン、メチオニンからロイシンまたはイソロイシン、フェニルアラニンからチロシン、ロイシン、またはメチオニン、セリンからスレオニン、スレオニンからセリン、トリプトファンからチロシン、チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニン、及び、バリンからイソロイシンまたはロイシンへの変更が挙げられる。
【００５９】
欠失または置換に加え、修飾タンパク質は、残基の挿入を有していても良く、通常、それは、ポリペプチド内に少なくとも１つの残基の付加を含んでいる。これは標的ペプチドまたはポリペプチドまたはシンプルに１つの残基の挿入を含んでいても良い。融合タンパク質と言われる末端付加は、以下に記述する。
【００６０】
「生物学的に機能性が等しい」という用語は、当分野において良く理解されており、本明細書にさらに詳述される。従って、当該タンパク質の生物学的機能が維持されている限り、対照ポリペプチドのアミノ酸と同一である、または機能的に等しい、約７０％〜約８０％、または、約８１％〜約９０％、または、さらには約９１％〜約９９％のアミノ酸を有する配列が含まれる。修飾タンパク質は、ある態様において、その天然型のカウンターパートと生物学的に機能性が等しくてもよい。
【００６１】
また、アミノ酸及び核酸配列は、追加の残基（たとえば、Ｎ末端アミノ酸もしくはＣ末端アミノ酸、または、５´もしくは３´配列の追加）を含んでも良く、及び、それでもなお、当該配列が、上述の基準（タンパク質発現が関係している場合、生物学的タンパク質活性の維持が挙げられる）を満たす限り、本質的に、本明細書に開示される配列のうちの１つに記載のものであることを理解されたい。末端配列の付加は特に、たとえば、コード領域の５´または３´部分のいずれかに隣接する様々な非コード配列を含み得る、または、様々な内部配列（すなわち、遺伝子内に存在することが知られているイントロン）を含み得る、核酸配列に適用される。
【００６２】
ＩＶ．治療のための酵素的Ｌ−シスチン／システイン分解
ある態様において、ポリペプチドは、Ｌ−シスチン及び／またはＬ−システインを枯渇させる新規酵素を用いた、Ｌ−シスチン／システイン枯渇に感受性のある癌（たとえば、肝細胞癌、メラノーマ、及び腎細胞癌）を含む疾患の治療に用いられても良い。本発明は、Ｌ−シスチン／システイン分解活性を有する修飾ＣＧＬを用いた治療方法を具体的に開示する。本発明のある実施形態により、治療効果の増加のためのＬ−シスチン／システイン分解活性を有する新規酵素が提示される。
【００６３】
本発明のある態様は、たとえば腫瘍等の疾患を治療するための、Ｌ−シスチン／システイン分解活性を有する修飾ＣＧＬを提供する。１つの例において、当該修飾ポリペプチドはヒトポリペプチド配列を有していてもよく、それにより、ヒト患者のアレルギー反応を防止し、反復投与を可能とし、及び、治療効果を増加させても良い。
【００６４】
本治療方法が有用な腫瘍としては、任意の悪性腫瘍細胞型が挙げられ、たとえば、固形腫瘍または血液腫瘍に見出されるものが挙げられる。例示的な固形腫瘍としては、限定されないが、膵臓、結腸、盲腸、胃、脳、頭、首、卵巣、腎臓、喉頭、肉腫、肺、膀胱、メラノーマ、前立腺、及び、乳からなる群から選択される器官の腫瘍が挙げられる。例示的な血液腫瘍としては、骨髄の腫瘍、ＴまたはＢ細胞の悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、芽細胞腫、ミエローマ等が挙げられる。本明細書に提示される方法を用いて治療されうる癌のさらなる例としては、限定されないが、上皮性悪性腫瘍、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、扁平上皮細胞癌、肺癌（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺癌、及び肺の扁平上皮細胞癌を含む）、腹膜の癌、肝細胞の癌、胃または胃部の癌（消化管癌及び消化管間質腫瘍を含む）、膵臓癌、グリア芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎癌または腎臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺がん、様々なタイプの頭頸部癌、メラノーマ、表在拡大型メラノーマ、悪性黒子型メラノーマ、末端性黒子性メラノーマ、結節型メラノーマ、ならびに、Ｂ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非開裂細胞性ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びヴァルデンストレームマクログロブリン血症を含む）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、及び、慢性骨髄芽球性白血病が挙げられる。
【００６５】
癌は、具体的に、これらに限定はされないが、以下の組織学的型のものであっても良い：新生物、悪性；上皮性悪性腫瘍；上皮性悪性腫瘍、非分化型；巨大及び紡錘型細胞癌；小細胞癌；乳頭がん；扁平上皮細胞癌；リンパ上皮性癌：基底細胞癌；石灰化上皮癌；移行上皮細胞癌；乳頭移行上皮細胞癌；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管癌；肝細胞癌；混合肝細胞癌及び胆管癌；索状腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫様ポリープの腺癌；腺癌；家族性大腸ポリポーシス；固形癌；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支−肺胞腺癌；乳頭腺癌；嫌色素性細胞癌；好酸性細胞癌；好酸性腺腫；好塩基性細胞癌；透明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞性腺腫；乳頭及び濾胞性腺腫；非被包性硬化性癌；副腎皮質癌；類内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；脂腺癌；耳垢腺癌；粘膜表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭嚢胞腺癌；乳頭漿液性嚢胞腺癌；ムチン性嚢胞腺癌；ムチン性腺腫；印環細胞癌；浸潤性導管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；パジェット病、乳房；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生を伴う腺癌；胸腺、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；卵胞膜細胞腫、悪性；顆粒層細胞腫瘍、悪性；男性胚細胞腫、悪性；セルトリ細胞癌；ライディッヒ細胞腫瘍、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；パラガングリオーマ、悪性；乳房外パラガングリオーマ、悪性；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性メラノーマ；メラニン欠乏性メラノーマ；表在拡大型メラノーマ；巨大色素性母斑の悪性メラノーマ；類上皮細胞メラノーマ；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；繊維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胚性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミューラー管混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑液肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胚性癌；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛上皮腫；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管外皮細胞腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯の腫瘍、悪性；エナメル上皮歯牙肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル芽細胞線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；原線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；グリア芽腫；乏突起膠腫；乏突起膠芽細胞腫；原始神経外胚葉性；小脳肉腫；神経節芽腫；神経芽腫；網膜芽腫；嗅覚神経性腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫瘍、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン症；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ細胞性；悪性リンパ腫、巨細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉腫；他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；マスト細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；プラズマ細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基性白血病；好酸性白血病；単球性白血病；マスト細胞性白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；及び、有毛細胞性白血病。
【００６６】
本明細書において、ＣＧＬ由来の改変霊長類システイナーゼは、Ｌ−システイン及び／またはＬ−シスチンの枯渇が望ましいと考えられている、腫瘍細胞、腫瘍組織、または癌を有する哺乳類の循環系からＬ−システイン及び／またはＬ−シスチンを枯渇させるための様々なモダリティにおける抗腫瘍剤として用いられても良く、または、Ｌ−システイン及び／またはＬ−シスチン枯渇のための様々なモダリティにおける抗腫瘍剤として用いられても良い。
【００６７】
枯渇は、哺乳類の循環系においてｉｎ  ｖｉｖｏで、組織培養または他の生物学的培地でのＬ−シスチン及び／またはＬ−システイン枯渇が望ましい場合にｉｎ  ｖｉｔｒｏで、及び、生物学的液体、細胞、または組織が身体の外側で操作され、次いで、当該患者哺乳類の身体に戻される場合にはｅｘ  ｖｉｖｏの手順で、行われても良い。循環系、培養培地、生物学的液体、または細胞からのＬ−シスチン及び／またはＬ−システインの枯渇は、処置される物質にアクセス可能なＬ−シスチン及び／またはＬ−システインの量を低下させるために行われ、及び、それゆえ、枯渇される物質と、Ｌ−シスチン及び／またはＬ−システインを分解する量の改変霊長類システイナーゼとを、Ｌ−シスチン及び／またはＬ−システイン分解条件下で接触させ、接触された物質中の環境Ｌ−シスチン及び／またはＬ−システイン量を低下させることを含む。
【００６８】
腫瘍細胞は、その栄養培地にＬ−シスチン及び／またはＬ−システインを依存し得、それゆえに枯渇は、細胞に対する栄養源を対象としており、細胞それ自身である必要はない。それゆえ、ｉｎ  ｖｉｖｏ応用において、腫瘍細胞の治療には、当該腫瘍細胞群の栄養培地と、改変システイナーゼを接触させることが含まれる。この実施形態において、当該培地は、血液、リンパ液、髄液、及び類似のＬ−シスチン及び／またはＬ−システイン枯渇が望ましい体液であっても良い。
【００６９】
Ｌ−シスチン及び／またはＬ−システイン分解の効率は、応用によって様々に変化し、通常、当該物質中に存在するＬ−シスチン及び／またはＬ−システインの量、枯渇の望ましい速度、及び、システイナーゼへの曝露に対する当該物質の耐容性に依存する。物質中のＬ−シスチン及び／またはＬ−システインのレベル、及び、当該物質からＬ−シスチン及び／またはＬ−システインが枯渇する速度は、当分野公知の様々な化学的及び生物学的方法により、容易にモニターされる。例示的なＬ−シスチン及び／またはＬ−システイン分解量は、本明細書にさらに記述されており、処置される物質ミリリットル（ｍＬ）あたり、０．００１〜１００単位（Ｕ）の改変システイナーゼ、好ましくは、約０．０１〜１０Ｕ、及び、より好ましくは約０．1〜５Ｕの改変システイナーゼの範囲であっても良い。
【００７０】
Ｌ−シスチン及び／またはＬ−システイン分解条件は、ＣＧＬ酵素の生物学的活性と適合性のある緩衝液及び温度の条件であり、当該酵素に適合性のある適度な温度、塩、ｐＨ条件が含まれる（たとえば、生理学的条件）。例示的な条件としては、約４〜４０℃、約０．０５〜０．２Ｍ  ＮａＣｌと等しいイオン強度、約５〜９のｐＨが含まれ、生理学的条件も含まれる。
【００７１】
特定の実施形態において、本発明から、抗腫瘍剤として改変システイナーゼを用いる方法が企図され、及び、ゆえに、腫瘍細胞群と、改変システイナーゼの治療有効量を、腫瘍細胞の増殖を阻害するために十分な期間、接触させることが含まれる。
【００７２】
１つの実施形態において、ｉｎ  ｖｉｖｏ接触は、本発明の改変システイナーゼを含有する、生理学的に耐容できる組成物の治療有効量を患者に静脈内注射または腹腔内注射により投与すること、それにより、患者中に存在する腫瘍細胞の循環Ｌ−シスチン及び／またはＬ−システイン源を枯渇させることにより、遂行される。改変システイナーゼの接触はまた、腫瘍細胞を含有する組織内に、改変システイナーゼを投与することによっても遂行されうる。
【００７３】
改変システイナーゼの治療有効量は、所望の効果（すなわち、腫瘍組織または患者循環系中のＬ−シスチン及び／またはＬ−システインを枯渇させ、それにより、腫瘍細胞の分裂を停止させること）を得るために算出された、既定量である。ゆえに、本発明の改変システイナーゼ投与のための用量範囲は、腫瘍細胞分裂の兆候及び細胞サイクルを低下させる所望の効果を得るために十分な大きさである。用量は、たとえば、過粘調度症候群、肺水腫、うっ血性心不全等の副作用が発生しない大きさでなければならない。通常、用量は、患者の年齢、状態、性別、疾患の程度で変化し、当業者により決定されうる。用量は、任意の合併症が発生した際に、個々の医師により調節されうる。
【００７４】
たとえば、改変システイナーゼの治療有効量は、生理学的に耐容可能な組成物で投与された際に、約０．００１〜約１００単位（Ｕ）／ｍＬ、好ましくは、約０．１Ｕ超、及びより好ましくは約１Ｕ／ｍＬ超の改変システイナーゼの血管内（血漿）濃度または局所濃度を得るために十分な量であっても良い。典型的な投与量は、体重に基づいて投与されても良く、及び、典型的な投与量は、約５〜１０００Ｕ／キログラム（ｋｇ）／日、好ましくは、約５〜１００Ｕ／ｋｇ／日、より好ましくは約１０〜５０Ｕ／ｋｇ／日、及び、より好ましくは約２０〜４０Ｕ／ｋｇ／日である。
【００７５】
改変システイナーゼは、注射により、または、経時的に、徐々に点滴を行うことにより、非経口的に投与されても良い。改変システイナーゼは、静脈内、腹腔内、経口、筋肉内、皮下、腔内、経皮、皮膚に投与されても良く、ぜん動的手段により送達されても良く、腫瘍細胞を含有する組織内に直接注入されても良く、または、電位バイオセンサーもしくはＬ−シスチン／システインを含有しうるカテーテルに連結されたポンプにより投与されても良い。
【００７６】
改変システイナーゼを含有する治療様組成物は、たとえば、単位用量の注射による等、静脈内に簡便に投与される。治療用組成物に関連して用いられる場合、「単位用量」という用語は、対象に対する統一された用量として適した、物質的な個々の単位を指し、各単位は、必要とされる希釈物質（すなわち、担体またはビヒクル）との関連で所望される治療効果が生じるよう算出された活性物質の規定量を含有する。
【００７７】
当該組成物は、投薬用製剤に適合性のある様式で、及び、治療有効量で、投与される。投与される量は、治療される対象、活性成分を利用するための対象のシステムのキャパシティ、及び、所望される治療効果の程度に依存する。投与に必要とされる活性成分の正確な量は、医師の裁量に依存し、各個人に特有のものである。しかしながら、全身適用の適切な投薬範囲が本明細書に開示され、投与経路に依存している。最初の投与、及び、追加投与のための適切なレジメンもまた企図され、及び、例としては、最初の投与の後、次の注射または他の適用により、１時間以上の間隔で反復投与が為される。例示的な反復投与が本明細書に記載され、及び、改変システイナーゼの血清レベル及び組織レベルが継続的に高く維持され、逆に、Ｌ−シスチン／システインの血清レベル及び組織レベルは低く維持されることが特に好ましい。あるいは、ｉｎ  ｖｉｖｏ治療に特定の範囲の血中濃度に維持するために十分な、継続的な静脈内への点滴が企図される。
【００７８】
Ｖ．複合体
本発明の組成物及び方法には、たとえば、異種ペプチドセグメントまたはポリマー（たとえば、ポリエチレングリコール等）との複合体の形成による等の、改変システイナーゼを含有する。さらなる態様において、改変システイナーゼは、酵素の流体力学的半径を増加させ、それにより血清持続性を増加させるために、ＰＥＧに連結されていても良い。ある態様において、開示されるポリペプチドは、任意の標的剤（たとえば、腫瘍細胞上の外部受容体または結合部位に特異的に、及び安定的に結合する能力を有するリガンド等）に結合されていても良い（米国特許出願公開第２００９／０３０４６６６号）。
【００７９】
Ａ．融合タンパク質
本発明のある実施形態は、融合タンパク質に関する。これら分子は、異種ドメインに、Ｎ末端またはＣ末端で連結された修飾シスタチオナーゼを有していても良い。たとえば、融合物はまた、異種宿主中での組換えタンパク質の発現が行えるよう、他の種由来のリーダー配列を用いても良い。別の融合な融合物としては、好ましくは、当該融合タンパク質の精製を容易に行えるように開裂可能な、タンパク質アフィニティタグ（たとえば、血清アルブミンアフィニティタグまたは６ヒスチジン残基）、または、免疫学的に活性なドメイン（たとえば、抗体エピトープ）の付加が挙げられる。非限定的なアフィニティタグの例としては、ポリヒスチジン、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、及び、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が挙げられる。
【００８０】
特定の実施形態において、システイナーゼは、たとえばＸＴＥＮポリペプチド（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、アルブミン、またはアルブミン結合ペプチド等の、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長させるペプチドに連結されていても良い。
【００８１】
融合タンパク質を作製する方法は当分野の当業者に公知である。そのようなタンパク質は、たとえば、完全融合タンパク質のｄｅ  ｎｏｖｏ合成により作製されても良く、または、異種ドメインをコードするＤＮＡ配列の付加後に、そのままの融合タンパク質を発現することにより作製されても良い。
【００８２】
元のタンパク質の機能的活性を正常な状態に戻す融合タンパク質の作製は、遺伝子と、タンデムに連結されたポリペプチド間でスプライシングされるペプチドリンカーをコードする架橋ＤＮＡセグメントとを繋げることにより、容易になりうる。当該リンカーは、得られる融合タンパク質の適正なフォールディングが可能となるような十分な長さである。
【００８３】
Ｂ．リンカー
ある実施形態において、改変システイナーゼは、二官能性架橋試薬を用いて化学的に結合されても良く、または、タンパク質レベルでペプチドリンカーと融合されていても良い。
【００８４】
二官能性架橋試薬は、アフィニティ物質の調製、多様な構造の修飾及び安定化、リガンド及び受容体結合部位の特定、及び、構造研究を含む、様々な目的に対して広く用いられている。また、たとえば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー等の適切なペプチドリンカーを用いて、改変システイナーゼを連結しても良い。
【００８５】
２つの同一の官能基を担持するホモ二官能性試薬は、同一及び異なる高分子、または高分子のサブユニット間の架橋を高い効率で誘導すること、及び、その特定の結合部位にポリペプチドリガンドを高い効率で連結することが証明されている。ヘテロ二官能性試薬は、２つの異なる官能基を含有している。２つの異なる官能基の異なる反応性を利用して、選択的、及び、連続的の両方で架橋が制御されうる。二官能性架橋試薬は、その官能基の特異性により、分けられる（たとえば、アミノ−、スルフヒドリル−、グアニジン−、インドール−、カルボキシル−特異的基）。これらの内、遊離アミノ基を指向する試薬は、市販されていること、合成が容易であること、適用されうる穏やかな反応条件が理由で、特に良く知られている。
【００８６】
主要なヘテロ二官能性架橋試薬は、１級アミン反応基及びチオール反応基を含有している。別の例においては、ヘテロ二官能性架橋試薬及び当該架橋試薬を用いる方法が記載されている（米国特許第５，８８９，１５５号。その全体が、参照により本明細書に具体的に援用される）。当該架橋試薬は、求核性ヒドラジド残基と求電子性マレイミド残基とを結合させ、１つの例では、アルデヒドの遊離チオールへのカップリングを可能にする。当該架橋試薬を修飾し、様々な官能基を架橋することができる。
【００８７】
さらに、当分野の当業者に公知の任意の他の連結／カップリング剤、及び／または、メカニズムを用いて、霊長類改変システイナーゼを結合させても良い（たとえば、抗体−抗原相互作用、アビジンビオチン結合、アミド結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ホスホエステル結合、ホスホラミド結合、無水結合、ジスルフィド結合、イオン性及び疎水性相互作用、二特異性抗体及び抗体断片、またはそれらの組み合わせ）。
【００８８】
血液中で合理的な安定性を有する架橋剤を用いることが望ましい。リンカーを含有する多くのタイプのジスルフィド結合が、標的剤及び治療／予防剤をうまく結合できることが知られている。立体的に障害されているジスルフィド結合を含有するリンカーは、ｉｎ  ｖｉｖｏでより高い安定性をもたらすことが判明しうる。これらリンカーは、ゆえに、連結剤の１つの群である。
【００８９】
障害性架橋剤に加え、非障害性リンカーもまた本明細書に従い用いることができる。保護されたジスルフィドを含有する、または生成するとみなされていない他の有用な架橋剤としては、ＳＡＴＡ、ＳＰＤＰ、及び２−イミノチオランが挙げられる（Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｐｅ，  １９８７）。そのような架橋剤の使用は、当分野に公知である。別の実施形態は、柔軟なリンカーの使用を含む。
【００９０】
化学的に結合された時点で、通常、当該ペプチドが精製され、非結合剤及び他の混入物から、当該結合物が分離される。臨床的に有用となる十分な程度の純度の結合物の提供における使用のための、多くの精製技法が利用可能である。
【００９１】
通常、サイズによる分離（たとえば、ゲルろ過、ゲル透過または高速液体クロマトグラフィー等）に基づいた精製法が、最も多く用いられている。他のクロマトグラフィー法（たとえば、Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ分離）を用いても良い。封入体から融合タンパク質を精製するための従来法（たとえば、ナトリウムＮ−ラウロイル−サルコシン（ＳＬＳ）等の弱洗剤の使用等）が有用でありうる。
【００９２】
Ｃ．ＰＥＧ化
本発明のある態様において、改変システイナーゼのＰＥＧに関連した方法及び組成物が開示される。たとえば、改変システイナーゼは、本明細書に開示される方法に従いＰＥＧ化されても良い。
【００９３】
ＰＥＧ化は、ポリ（エチレングリコール）ポリマー鎖の、別の分子（通常、薬剤または治療用タンパク質）への共有結合的付加の方法である。ＰＥＧ化は、ＰＥＧの反応性誘導体と、標的高分子のインキュベーションにより、ごく普通に行われる。薬剤または治療用タンパク質へのＰＥＧの共有結合的付加は、当該剤を、宿主の免疫システムから「隠す」ことができ（免疫原性及び抗原性を低下させる）、または、当該剤の流体力学的サイズ（溶液中のサイズ）を増加させる（腎クリアランスを低下させることにより、循環時間を延長させることができる）ことができる。ＰＥＧ化はまた、疎水性の薬剤及びタンパク質に、水溶性をもたらすこともできる。
【００９４】
ＰＥＧ化の最初のステップは、１つの末端または両末端での、ＰＥＧポリマーの適切な官能基化である。同じ反応性部分を伴い各末端で活性化されたＰＥＧは、「ホモ二官能性」として知られ、一方、もし存在する官能基が異なっている場合には、当該ＰＥＧ誘導体は、「ヘテロ二官能性」または「ヘテロ官能性」と呼称される。ＰＥＧポリマーの化学的に活性な誘導体、または活性化された誘導体を調製し、所望の分子にＰＥＧを付加させる。
【００９５】
ＰＥＧ誘導体に対する適切な官能基の選択は、ＰＥＧに連結される分子上の利用可能な反応基のタイプに基づいている。タンパク質に関しては、典型的な反応性アミノ酸として、リジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン及びチロシンが挙げられる。Ｎ末端アミノ基及びＣ末端カルボキシル基もまた用いることができる。
【００９６】
最初のＰＥＧ誘導体の生成に用いられる方法は、通常、ヒドロキシル基と反応性の基（典型的には無水物基、酸塩化物、クロロギ酸エステル、及び炭酸塩）と、ＰＥＧポリマーを反応させることである。２回目のＰＥＧ化化学反応における生成では、たとえばアルデヒド、エステル、アミド等の、より効率的な官能基が結合に利用可能となる。
【００９７】
ＰＥＧ化応用はさらに進歩し、洗練されているため、結合のためのヘテロ二官能性ＰＥＧに対する必要性が増加している。これらヘテロ二官能性ＰＥＧは、親水性で、柔軟性があり、生体適合性のあるスペーサーが必要とされる２つの部分の連結に非常に有用である。ヘテロ二官能性ＰＥＧの好ましい末端基は、マレイミド、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、アミン、カルボン酸、及びＮＨＳエステルである。
【００９８】
最も普遍的な修飾剤、またはリンカーは、メトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）分子に基づいている。それらの活性は、タンパク質修飾基のアルコール末端への付加に依存している。一部の例において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧジオール）が、前駆体分子として用いられている。当該ジオールは、その後、ヘテロ−またはホモ−二量体ＰＥＧ連結分子を作製するために両末端で修飾される。
【００９９】
タンパク質は、通常、たとえば、非プロトン化チオール（システイニル残基）またはアミノ基等の求核性の部位でＰＥＧ化される。例示的なシステイニル特異的修飾試薬としては、ＰＥＧマレイミド、ＰＥＧヨード酢酸、ＰＥＧチオール、及びＰＥＧビニルスルホンが挙げられる。４つすべてが、穏やかな条件下、及び中性からややアルカリ性のｐＨで、高度にシステイニル特異的であるが、それらはいくつか、欠点を有している。マレイミドで形成されたチオエーテルは、アルカリ条件下でやや不安定であり、このリンカーを用いた剤型選択に若干の制限が伴う。ヨードＰＥＧで形成されたカルバモチオエートはより安定であるが、ある条件下で遊離ヨウ素がチロシン残基を修飾しうる。ＰＥＧチオールはタンパク質のチオールとジスルフィド結合を形成するが、この結合はまた、アルカリ条件下で不安定でありうる。ＰＥＧ−ビニルスルホンの反応性は、マレイミド及びヨードＰＥＧと比較し、ややゆっくりであるが、当該形成されたチオエーテル結合は非常に安定である。また、そのゆっくりした反応速度により、ＰＥＧ−ビニルスルホン反応が、より制御しやすくなる。
【０１００】
天然型システイニル残基での部位特異的ＰＥＧ化は、これら残基が通常ジスルフィド結合の形態にあるため、または、生物学的活性に必要であるため、めったに行われない。他方で、部位特異的突然変異誘導を用いて、チオール特異的リンカーのためのシステイニルＰＥＧ化部位を組み込むことができる。システイン変異は、ＰＥＧ化試薬がアクセス可能であるように、及び、ＰＥＧ化後も生物学的に活性であるように設計されなければならない。
【０１０１】
アミン特異的修飾剤としては、ＰＥＧ  ＮＨＳエステル、ＰＥＧトレシレート（ＰＥＧ  ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、ＰＥＧアルデヒド、ＰＥＧイソチオシアン酸、及びその他いくつかが挙げられる。すべて、穏やかな条件下かで反応し、アミノ基に高度に特異的である。ＰＥＧ  ＮＨＳエステルは、おそらく、より反応性のある剤のうちの１つであるが、その高い反応性により、ラージスケールでのＰＥＧ化反応の制御が困難となりうる。ＰＥＧアルデヒドは、アミノ基とイミンを形成し、次いで、シアノヒドリドホウ酸ナトリウムと２級アミンに還元される。ヒドリドホウ酸ナトリウムとは異なり、シアノヒドリドホウ酸ナトリウムは、ジスルフィド結合を還元しない。しかし、この化学物質は高度に毒性があり、特に揮発性となる低ｐＨでは注意深く扱わなければならない。
【０１０２】
ほとんどのタンパク質上に複数のリジン残基があるため、部位特異的ＰＥＧ化は難しいものとなり得る。幸運なことに、これら試薬は非プロトン化アミノ基と反応するため、低ｐＨで反応を行うことにより、低ｐＫアミノ基へとＰＥＧ化を指向させることが可能である。通常、アルファ−アミノ基のｐＫは、リジン残基のイプシロン−アミノ基よりも１〜２ｐＨ単位低い。ｐＨ７以下で分子をＰＥＧ化することにより、Ｎ末端に対する高い選択性を良く得ることができる。しかしながら、これは、タンパク質のＮ末端部分が生物学的活性に必要ではない場合にのみ行うことができる。さらに、ＰＥＧ化による薬物動態的利益は、しばしば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性の著しい喪失を上回るため、ＰＥＧ化化学反応に関わらず、より高いｉｎ  ｖｉｖｏ生物活性を有する産物が生じることとなる。
【０１０３】
ＰＥＧ化方法を開発する際に検討するべきいくつかのパラメーターが存在する。幸運なことに、通常、４または５の重要なパラメーターが存在する。ＰＥＧ化条件の最適化に対する「実験デザイン」法が非常に有用である。チオール特異的ＰＥＧ化反応に対し、検討すべきパラメーターとしては以下が挙げられる：タンパク質濃度、ＰＥＧとタンパク質の比率（モルベース）、温度、ｐＨ、反応時間、及び一部の例においては酸素の除外（酸素は、タンパク質による分子間ジスルフィド形成に寄与し得、それにより、ＰＥＧ化産物の収率が低下する）。特にＮ末端アミノ基を標的とする場合にはｐＨがさらに重要であることを除き、アミン特異的修飾に対しても、同じ因子（酸素を除く）を検討しなければならない。
【０１０４】
アミン特異的修飾及びチオール特異的修飾の両方に対して、反応条件はタンパク質の安定性に影響を与えうる。これにより、温度、タンパク質濃度、及びｐＨが限定されうる。さらに、ＰＥＧ化反応を開始する前に、ＰＥＧリンカーの反応性を知らなければならない。たとえば、ＰＥＧ化剤が７０パーセントのみ活性である場合、タンパク質とＰＥＧ反応の定比性において、用いられるＰＥＧの量は、確実に活性ＰＥＧ分子のみを計数しなければならない。
【０１０５】
ＶＩ．タンパク質及びペプチド
ある実施形態において、本発明は、たとえば改変システイナーゼ等の少なくとも１つのタンパク質またはペプチドを含有する新規組成物に関する。これらペプチドは、上述の融合タンパク質で含有されていてもよく、または剤に結合されていても良い。
【０１０６】
本明細書において、タンパク質またはペプチドは通常、限定されないが、約２００アミノ酸超〜遺伝子から翻訳される全長配列までのタンパク質；約１００アミノ酸超のポリペプチド；及び／または、約３〜約１００アミノ酸のペプチドを指す。簡便には、「タンパク質」、「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、本明細書において、相互交換可能に用いられる。
【０１０７】
本明細書において、「アミノ酸残基」とは、任意の天然型アミノ酸、任意のアミノ酸誘導体、または、当分野に公知の任意のアミノ酸模倣体を指す。ある実施形態において、タンパク質またはペプチドの残基は連続的であり、いずれの非アミノ酸も、当該アミノ酸残基配列を中断しない。他の実施形態において、配列は、１以上の非アミノ酸部分を含有しても良い。特定の実施形態において当該タンパク質またはペプチド残基の配列は、１以上の非アミノ酸部分により中断されても良い。
【０１０８】
従って、「タンパク質またはペプチド」という用語は、天然型タンパク質に存在する２０の普遍的なアミノ酸のうちの少なくとも１つを含有するアミノ酸配列、または、修飾アミノ酸または異常アミノ酸を少なくとも１つ含有するアミノ酸配列を包含する。
【０１０９】
タンパク質またはペプチドは、標準的な分子生物学的技術を介したタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの発現、天然源からのタンパク質もしくはペプチドの単離、または、タンパク質もしくはペプチドの化学的合成を含む、当分野の当業者に公知の任意の技術により作製されても良い。ヌクレオチド及びタンパク質、ポリペプチド、及び様々な遺伝子に対応するペプチド配列は従前に開示されており、及び、当分野の当業者に公知のコンピューターデータベースに見出され得る。そのようなデータベースの１つは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ'ｓ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｎｄ  ＧｅｎＰｅｐｔ  ｄａｔａｂａｓｅｓである（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／で、ワールドワイドウェブ上で利用可能である）。既知の遺伝子に対するコード領域は、本明細書に開示される技術を用いて増幅及び／または発現されても良く、または、当分野の当業者に公知である。従って、様々な市販のタンパク質調製物、ポリペプチド調製物、及びペプチド調製物が当分野の当業者に公知である。
【０１１０】
ＶＩＩ．核酸及びベクター
本発明のある態様において、改変システイナーゼまたは修飾システイナーゼを含有する融合タンパク質をコードする核酸配列が開示されうる。どの発現システムが用いられているかにより、核酸配列は、標準的な方法に基づき選択されても良い。たとえば、もし改変システイナーゼが霊長類ＣＧＬ由来であり、及び、大腸菌ではまれにしか用いられない多重コドンを含有する場合、それらは発現に干渉する可能性がある。それゆえ、各遺伝子またはそれらの変異体は、大腸菌発現にコドン最適化されていても良い。また様々なベクターを用いて対象のタンパク質（たとえば改変システイナーゼ）を発現させても良い。例示的なベクターとしては、限定されないが、プラスミドベクター、ウイルスベクター、トランスポゾン、またはリポソームベースのベクターが挙げられる。
【０１１１】
ＶＩＩＩ．宿主細胞
宿主細胞は、改変システイナーゼ及びそれらの複合体の発現及び分泌が可能となるよう形質転換されたものであっても良い。宿主細胞は、細菌、哺乳類細胞、酵母、または糸状菌であっても良い。様々な細菌としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ及びＢａｃｉｌｌｕｓが挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｉｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、またはＰｉｃｈｉａ属に属する酵母は、適切な宿主細胞としての用途が見出されている。様々な種類の糸状菌が発現宿主として用いられても良く、以下の属が挙げられる：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ａｃｈｌｙａ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｅｎｄｏｔｈｉａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、及びＰｙｒｉｃｕｌａｒｉａ。
【０１１２】
使用可能な宿主生物の例としては、細菌（たとえば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＣ１０６１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＢＲＢ１の誘導体（Ｓｉｂａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＳＡＩ１２３（Ｌｏｒｄａｎｅｓｃｕ，  １９７５）またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ（Ｈｏｐｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５））；酵母（たとえば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＨ  ２２（Ｍｅｌｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３）またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）；及び糸状菌（たとえば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ（Ｗａｒｄ，  １９８９）、またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ（Ｐｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７；  Ｈａｒｋｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９））が挙げられる。
【０１１３】
哺乳類宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ラット下垂体細胞（ＧＨ１；  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８２）、ＨｅＬａ  Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２．２）、ラット肝癌細胞（Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ；ＡＴＣＣＣＲＬ  １５４８）、ＳＶ４０−形質転換サル腎細胞（ＣＯＳ−１；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、及びマウス胚性細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）が挙げられる。上述の細胞は解説であり、当分野公知の多くの可能性のある宿主生物体を限定するものではない。原核細胞または真核細胞かどうかにかかわらず、原則として、分泌することが出来る全ての宿主を用いることができる。
【０１１４】
改変システイナーゼ及び／またはそれらの融合タンパク質を発現する哺乳類細胞は、元の細胞株を培養するために通常用いられる条件下で培養される。概して、細胞は、生理的塩及び栄養素を含有する標準的な培地（たとえば、標準的なＲＰＭＩ、ＭＥＭ、ＩＭＥＭ、またはＤＭＥＭ。通常、５％〜１０％の血清（たとえばウシ胎児血清）が補充されている）中で培養される。また、培養条件も標準的である（たとえば、培養物は、所望されるレベルのタンパク質が得られるまで、固定培養中、または回転培養中で、３７℃でインキュベートされる）。
【０１１５】
ＩＸ．タンパク質精製
タンパク質精製技術は、当分野の当業者に公知である。これら技術は、あるレベルで、細胞、組織または器官の、ポリペプチド及び非ポリペプチド画分へのホモジナイゼーション及び粗分画化を含む。他で特定されない限り、部分精製または完全精製（または均質になるまでの精製）を得るために、対象のタンパク質またはポリペプチドはクロマトグラフィー法及び電気泳動法を用いてさらに精製されてもよい。純粋なペプチドの調製に特に適した解析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、免疫アフィニティクロマトグラフィー、及び等電点電気泳動である。ペプチド精製の特に効率的な方法は、高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、または、さらには高速の液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。
【０１１６】
精製されたタンパク質またはペプチドは、他の成分から単離可能な組成物を指すことが意図され、ここで、当該タンパク質またはペプチドは、天然で得られる状態と比較し、任意の程度まで精製されている。単離された、もしくは精製されたタンパク質またはペプチドは、それゆえ、天然で存在しうる環境から離れたタンパク質またはペプチドとも呼称される。一般的に「精製された」とは、様々な他の成分を除去するために分画化に供されたタンパク質またはペプチドの組成物を指し、及び、その組成物は、実質的にその発現された生物学的活性を保持している。「実質的に精製された」という用語が用いられた場合、この意味は、当該タンパク質またはペプチドが、たとえば、組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、またはそれ以上を構成する等の、組成物中の主要な成分を形成する組成物を指す。
【０１１７】
タンパク質精製における使用に適した様々な技術が当分野の当業者に公知である。たとえば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体等を用いた沈殿、または、熱変性後の遠心による沈殿；クロマトグラフィーステップ（たとえば、イオン交換、ゲルろ過、逆相、ヒドロキシアパタイト、及びアフィニティクロマトグラフィー）；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；ならびに、これら及び他の技術の組み合わせ、が挙げられる。当分野において一般的に公知であるように、様々な精製ステップの実施の順番は変更しても良く、または、あるステップを省いても良く、それでも実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの調製に適した方法となると考えられている。
【０１１８】
タンパク質またはペプチドの精製の程度を定量する様々な方法が、本発明の観点から、当業者に明らかである。たとえば、活性画分の特異的活性を測定する、または、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ解析による画分内のポリペプチドの量を評価する等が挙げられる。好ましい画分の純度の評価方法は、当該画分の特異的活性を算出すること、最初の抽出物の特異的活性とそれを比較すること、及び、それにより、「精製倍数」により評価された、その純度の程度を算出すること、である。活性量を表すために用いられた実際の単位はもちろん、選択された、精製後に行われる特定の評価法、及び、発現されたタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示しているかどうかに基づいている。
【０１１９】
タンパク質またはペプチドが常にその最高の精製状態で提供されることが、すべてに求められるわけではない。実際のところ、ある実施形態においては、実質的にあまり精製されていない製品でも有用性がありうる。部分精製は、より少ない精製ステップを組み合わせて用いることにより、または、同じ一般的精製スキームの異なる形態を利用することにより行われても良い。たとえば、通常、ＨＰＬＣ装置を利用して行われたカチオン交換カラムクロマトグラフィーにより、低圧クロマトグラフィーシステムを利用した同じ方法よりも高い「倍数」精製が得られることが認識されている。低度の相対精製を示す方法は、タンパク質生成物の総合的な回収、または、発現されたタンパク質の活性の維持では利点を有し得る。
【０１２０】
ある実施形態において、タンパク質またはペプチド（たとえば、改変システイナーゼ、改変ＡＡＤを含有する融合タンパク質、またはＰＥＧ化後の改変システイナーゼ）は単離または精製されていても良い。たとえば、精製を容易にするために、そのような改変システイナーゼ中にＨｉｓタグまたはアフィニティエピトープが含有されていても良い。アフィニティクロマトグラフィーは、単離される物質と、それが特異的に結合することが出来る分子との間の特異的アフィニティに依るクロマトグラフィー法である。これは受容体−リガンド型の相互作用である。カラム素材は、結合パートナーのうちの１つを、不溶性マトリクスへ共有結合させることにより合成される。次いで、カラム素材は溶液からの物質を特異的に吸着できるようになる。溶出は、結合が発生しない条件に変更することにより生じる（たとえば、ｐＨ、イオン強度、温度等を変える）。マトリクスはいかなる有意な程度でも分子を吸着せず、広範囲の化学的、物理的、及び温度的安定性を有している物質でなければならない。リガンドは、結合特性に影響を与えないように連結されなければならない。リガンドはまた、比較的強い結合をもたらさなければならない。試料またはリガンドを破壊することなく、物質を溶出できなければならない。
【０１２１】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、溶液中の分子がそのサイズに基づいて分離される、またはより専門的に言えば、その流体力学的体積に基づいて分離されるクロマトグラフィー法である。通常、たとえばタンパク質及び工業用ポリマー等の大きな分子または高分子複合体に適用される。典型的には、水性溶液を用いて、カラムを通じ試料を移動させる場合、当該技術は、ゲルろ過クロマトグラフィーとして知られており、対して、有機溶媒を移動相として用いた場合には、ゲル透過クロマトグラフィーという名称が用いられる。
【０１２２】
ＳＥＣの基本原理は、異なるサイズの粒子を、異なる速度で、固定相を通して溶出（ろ過）することである。これにより、サイズに基づいた粒子の溶液分離が得られる。全ての粒子が同時、またはほぼ同時にロードされたとすると、同じサイズの粒子は一緒に溶出されるはずである。各サイズ排除カラムには、分離することができる分子量の範囲がある。排除限界は、この範囲の上端の分子量と規定され、そこでは分子が大きすぎて固定相にトラップされない。浸透限界は、分離範囲の下端の分子量と定義され、そこでは十分に小さなサイズの分子は固定相の孔に完全に浸透し、この分子量以下の全ての分子はとても小さいため、１つのバンドとして溶出される。
【０１２３】
高速液体クロマトグラフィー（または高圧液体クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）は、化合物を分離、特定及び定量するために生化学及び解析化学において頻繁に用いられるカラムクロマトグラフィーの１つの形態である。ＨＰＬＣはクロマトグラフの充填材料を保持するカラム（固定相）、当該カラムを通じて移動相（複数含む）を移動させるポンプ、及び、分子の保持時間を示す検出器を利用する。保持時間は、固定相、解析される分子、及び用いた溶媒（複数含む）の間の相互作用に基づき変化する。
【０１２４】
Ｘ．医薬組成物
腫瘍細胞の増殖を阻害するために、最も好ましくは、局所進行性または転移性の癌を有する癌患者中の癌細胞を殺傷するために、新規システイナーゼが全身または局所に投与されうることが企図される。それらは、静脈内、髄腔内、及び／または腹腔内に投与されても良い。それらは単独で、または、抗増殖剤と組み合わせて投与されても良い。１つの実施形態において、それらは外科所術または他の治療の前に、患者の癌の量を減らすために投与される。あるいは、それらは、いずれの残留癌（たとえば、外科手術で排除しそこねた癌）も生き延びないことを確実にするために、外科手術後に投与されても良い。
【０１２５】
本発明は、治療用調製物の特定の状態に限定されることを意図されない。たとえば、そのような組成物は、生理学的に耐容性のある液体、ゲル、または固形の担体、希釈物質及び賦形剤と共に製剤化されて提供されても良い。これら治療用調製物は、たとえば家畜動物等の獣医学的用途のために哺乳類に投与されても良く、及び、他の治療剤と類似した様式でヒトにおける臨床使用のために投与されても良い。概して、治療効果に対し必要とされる投与量は、用途のタイプ、投与の様式、ならびに、個々の対象に特殊化された要件に従い変化する。
【０１２６】
そのような組成物は通常、注射物質として、液体溶液または懸濁液として調製される。適切な希釈物質及び賦形剤は、たとえば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール等、及びそれらの組み合わせである。さらに、もし所望であれば、当該組成物は少量の補助物質（たとえば湿潤剤もしくは乳化剤、安定剤、またはｐＨ緩衝剤等）を含有しても良い。
【０１２７】
臨床応用が企図される場合、タンパク質、抗体及び薬剤を含有する医薬組成物は、意図される応用法に適した形態で調製される必要がありうる。一般的に、医薬組成物は、薬学的に受容可能な担体に溶解または分散した、１以上のＣＧＬ変異体または追加の剤の有効量を含有しうる。「薬学的にまたは薬理学的に受容可能な」という表現は、必要に応じて、たとえばヒト等の動物に投与される際に、有害反応、アレルギー反応または他の企図されない反応を生じさせない分子実体及び組成物を指す。本明細書に開示される方法により単離されたＣＧＬ変異体または追加の活性成分を少なくとも１つ含有する医薬組成物の調製は、本開示から当業者には公知であり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  Ｅｄ．，  １９９０に例示されている（参照により本明細書に援用される）。さらに、動物（たとえばヒト）への投与に関しては、当該調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓにより要求される滅菌性、発熱性、一般的安全性及び純度の標準に合致していなければならないことが理解されるであろう。
【０１２８】
本明細書において、「薬学的に受容可能な担体」としては、ありとあらゆる溶媒、分散媒、塗膜物質、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（たとえば、抗細菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬剤、薬剤安定剤、ゲル、結合物質、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素等の物質及びそれらの組み合わせが挙げられ、当分野の当業者に公知である（たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  Ｅｄ．，  １９９０（参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。任意の標準的な担体が活性成分と不適合である場合を除き、医薬組成物におけるその使用が企図される。
【０１２９】
本発明のある実施形態は、固体、液体またはエアロゾルの形態で投与されるかどうか、及び、たとえば注射等の投与経路のために滅菌されている必要があるかどうかに依存し、異なるタイプの担体を含有しても良い。当該組成物は、静脈内、皮内、経皮、髄腔内、動脈内、腹腔内、鼻内、膣内、直腸内、筋肉内、皮下、経粘膜、経口、局所、吸入（たとえば、エアロゾル吸入）、注射、点滴、持続注入、標的細胞を直接浸す局所かん流、カテーテル、洗浄液、脂質組成物（たとえばリポソーム）、または当業者に公知の他の方法もしくは前述の内の任意の組み合わせで投与されてもよい（たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  Ｅｄ．，  １９９０（参照により本明細書に援用される）、を参照のこと）。
【０１３０】
修飾ポリペプチドは、遊離塩基、中性、または塩の形態で組成物へと製剤化されても良い。薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（たとえば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基と形成されるもの、または、たとえば塩酸塩もしくはリン酸塩等の無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸もしくはマンデル酸等の有機酸と形成されるもの）が挙げられる。また遊離カルボキシル基と形成される塩は、たとえば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化鉄等の無機塩基から誘導することができ；または、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、もしくはプロカイン等の有機塩基から誘導することができる。製剤化された時点で、溶液は、当該投与形態に適した様式、及び、治療効果がある量で投与される。当該製剤は、様々な投与形態で容易に投与される（たとえば、注射用溶液等の非経口投与、または肺への送達のためのエアロゾル、または薬剤放出カプセル等の食物投与に対して製剤化される）。
【０１３１】
さらに本発明のある態様に従い、投与に適した組成物は、不活性な希釈剤の有無にかかわらず、薬学的に受容可能な担体において提供されても良い。当該担体は吸収可能でなければならず、及び、液体、反固形（すなわち、ペースト）、または固形担体を含む。任意の標準的な培地、剤、希釈物質または担体がレシピエントに対し有害である場合、または、その中に含有される組成物の治療有効性に対して有害である場合を除き、本発明の実施における使用のための投与可能な組成物におけるその使用は、適切である。担体または希釈物質の例としては、脂肪、油、水、生理食塩水、脂質、リポソーム、樹脂、結合物質、充填物質等、またはそれらの組み合わせが挙げられる。当該組成物はまた、１以上の成分の酸化を妨害するために、様々な抗酸化物質を含有しても良い。さらに、たとえば様々な抗細菌剤及び抗真菌剤（限定されないが、たとえば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、またはそれらの組み合わせ）等の保存剤により微生物の作用を妨害しても良い。
【０１３２】
本発明のある態様に従い、当該組成物は、任意の簡便及び現実的な様式で（すなわち、溶解、懸濁、乳化、混合、カプセル化、吸収等により）担体と組み合わされる。そのような手順は、当業者にとって日常的なものである。
【０１３３】
本発明の特定の実施形態において、当該組成物は、半固形または固形の担体と完全に組み合わされ、または混合される。当該混合は、任意の簡便な様式（たとえば、すりつぶす等）で行うことができる。また安定化剤を当該混合プロセスに加え、治療活性の喪失（すなわち、胃での変性）から当該組成物を保護することができる。組成物中での使用のための安定化剤の例としては、緩衝剤、アミノ酸（たとえばグリシン及びリジン等）、炭水化物（たとえばデキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトール等）が挙げられる。
【０１３４】
さらなる実施形態において、本発明は、ＣＧＬ変異体、１以上の脂質、及び水性溶媒を含有する医薬様脂質ビヒクル組成物の使用に関するものでありうる。本明細書において、「脂質」という用語は、水中で特徴的な不溶性であり、有機溶媒中で抽出可能な広範な物質のいずれかを含むと定義される。この広範な種類の化合物は当業者に公知であり、本明細書において「脂質」という用語が用いられる場合、任意の特定の構造に限定されない。例としては、長鎖脂肪族炭水化物及びその誘導体を含有する化合物が挙げられる。脂質は、天然型または合成（すなわち、ヒトにより設計または製造された）であっても良い。しかしながら、脂質は通常、生物学的な物質である。生物学的脂質は、当分野に公知であり、たとえば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質、スフィンゴ糖脂質、糖脂質、スルファチド、エーテル結合脂肪酸及びエステル結合脂肪酸を伴う脂質、重合性脂質、及びそれらの組み合わせが挙げられる。もちろん、当業者に理解されており、本明細書に具体的に開示されたもの以外の化合物もまた、本組成物及び本方法に包含される。
【０１３５】
当業者であれば、脂質ビヒクル中に組成物を分散させるために用いられうる技術の範囲に精通している。たとえば、改変システイナーゼまたはその融合タンパク質は、脂質を含有する溶液中に分散されても良く、脂質と共に溶解されても良く、脂質と共に乳化されても良く、脂質と混合されても良く、脂質と組み合わされても良く、脂質と共有結合されても良く、脂質中に懸濁液として含有されても良く、ミセルもしくはリポソームと共に含有され、または複合体化され、またはさもなければ、当業者公知の任意の手段により脂質もしくは脂質構造と関連付けられていても良い。分散は、リポソームの形成を生じさせても、生じさせなくても良い。
【０１３６】
動物患者に投与される組成物の実際の投与量は、身体的因子及び生理学的因子（たとえば体重、状態の重大度、治療される疾患のタイプ、前もって行われた治療介入または同時に行われる治療介入、患者の特発性疾患、ならびに、投与経路）により決定されても良い。投与の量及び経路に基づき、好ましい投与量及び／または有効量の投与の回数は、対象の反応により変化しうる。投与に対し責を負う医師は、任意の事象において、組成物中の活性成分（複数含む）の濃度及び個々の対象に対する適切な投与量（複数含む）を決定する。
【０１３７】
ある実施形態において、医薬組成物は、たとえば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含有してもよい。他の実施形態において、活性化合物は、単位重量の約２％〜約７５％、または、約２５％〜約６０％、たとえば、その中から導き出される任意の範囲を構成しても良い。当然ながら、各治療的に有用な組成物中の活性化合物（複数含む）の量は、適切な用量が、化合物の任意の所与の単位用量で得られるような方法で、調製されてもよい。たとえば溶解度、生体利用効率、生物学的半減期、投与経路、製品の保管寿命、ならびに他の薬理学的検討事項等の因子が、そのような医薬製剤の調製にかかる分野の当業者により企図され、及び、同様に、様々な投薬量及び治療レジメンが望ましいであろう。
【０１３８】
他の非限定的な例において、１回投与量にはまた、投与当たり、約１マイクログラム／ｋｇ体重、約５マイクログラム／ｋｇ体重、約１０マイクログラム／ｋｇ体重、約５０マイクログラム／ｋｇ体重、約１００マイクログラム／ｋｇ体重、約２００マイクログラム／ｋｇ体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ体重、約５００マイクログラム／ｋｇ体重、約１ミリグラム／ｋｇ体重、約５ミリグラム／ｋｇ体重、約１０ミリグラム／ｋｇ体重、約５０ミリグラム／ｋｇ体重、約１００ミリグラム／ｋｇ体重、約２００ミリグラム／ｋｇ体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ体重、約５００ミリグラム／ｋｇ体重〜約１０００ミリグラム／ｋｇ体重以上、及び、それらから導き出される任意の範囲を含有しても良い。本明細書に列記される数値から導き出される範囲の非限定的な例において、上述の数値に基づき、約５ミリグラム／ｋｇ体重〜約１００ミリグラム／ｋｇ体重、約５マイクログラム／ｋｇ体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ体重等の範囲が投与されても良い。
【０１３９】
ＸＩ．併用療法
ある実施形態において、本発明の組成物及び方法は、第二の、または追加の療法と組み合わせたシステイナーゼの投与を含む。そのような療法は、シスチン／システイン依存と関連した任意の疾患の治療に適用することができる。たとえば、当該疾患は、癌であっても良い。
【０１４０】
併用療法を含む、方法及び組成物により、治療効果または予防効果が増強され、ならびに／または、別の抗癌治療もしくは抗過増殖性治療の治療効果が増大される。治療方法及び予防方法並びに組成物は、所望される効果（たとえば、癌細胞の殺傷及び／または細胞性過剰増殖の阻害等）を得るために有効な、総計の量で提供されても良い。この方法には、システイナーゼ及び第二の治療の療法の両方を、細胞に投与することが含まれても良い。組織、腫瘍または細胞は、剤（すなわち、システイナーゼまたは抗癌剤）を１以上含有する、１以上の組成物または医薬製剤（複数含む）に曝露されても良く、または、組織、腫瘍及び／または細胞は、２以上の異なる組成物または製剤と接触することにより曝露されても良く、ここで、１つの組成物により、１）システイナーゼ、２）抗癌剤、または３）システイナーゼと抗癌剤の両方が提供される。または、そのような併用治療を、化学療法、放射線療法、外科的治療または免疫治療と併せて用いうることが企図される。
【０１４１】
「接触された」及び「曝露された」という用語は、細胞に適用された場合、本明細書において、治療用構築物及び化学療法剤または放射線療法剤が、標的細胞に送達されるプロセス、または、標的細胞と直接並置されるプロセスを記述するために用いられる。細胞を殺傷するために、たとえば、当該細胞を殺傷する、または分裂を阻害するために有効な総量と組み合わせて、細胞に両剤が送達される。
【０１４２】
システイナーゼは、抗癌治療に対し、その前、その間、その後、または、様々な組み合わせで投与されても良い。投与は、同時から、分、日、週の範囲の間隔であっても良い。システイナーゼが、抗癌剤とは別に患者に投与される場合の実施形態において、通常、当該２つの化合物が、当該患者に有益な複合効果をまだもたらすことができるように、確実に、各送達の時間の間に多大な時間が経過しないようにする。そのような例において、システイナーゼと抗癌治療は、互いに、約１２〜２４または７２時間以内、より好ましくは、互いに約６〜１２時間以内に、患者に投与され得ることが企図される。一部の状況においては、治療に対する期間を著しく延長させることが望ましく、その場合、各投与の間、数日（２、３、４、５、６または７）から数週（１、２、３、４、５、６、７または８）が経過する。
【０１４３】
ある実施形態において、一連の治療は、１〜９０日以上（この範囲には、その間の日時が含まれる）継続する。１つの剤が、１日目から９０日目（この範囲には、その間の日時が含まれる）のうちの任意の日、またはそれらの任意の組み合わせで投与され、及び別の剤は、１日目から９０日目（この範囲には、その間の日時が含まれる）のうちの任意の日、またはそれらの任意の組み合わせで投与されることが企図される。１日以内（２４時間の期間）に、当該患者が、当該剤（複数含む）の１回投与または複数回投与を受けても良い。さらに、一連の治療の後、抗がん剤治療が投与されない期間があることが企図される。この期間は、患者の状態（たとえば、予後、体力、健康状態等）により、１〜７日、及び／または１〜５週、及び／または１〜１２か月以上（この範囲には、その間の日時が含まれる）継続しても良い。当該治療サイクルは、必要に応じて繰り返されることが予測される。
【０１４４】
様々な組み合わせを用いても良い。以下の例ではシステイナーゼは「Ａ」であり、抗癌治療は「Ｂ」である：
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。
【０１４５】
本実施形態の任意の化合物または療法の患者への投与は、もしあれば当該剤の毒性を考慮しながら、そのような化合物の投与に対する一般的なプロトコールに従う。それゆえ、一部の実施形態において、併用療法に起因する毒性をモニターするステップが存在する。
【０１４６】
Ａ．化学療法
広範な化学療法剤を、本実施形態に従い用いても良い。「化学療法」という用語は、癌を治療するための薬剤の使用を指す。「化学療法剤」は、癌の治療において投与される化合物または組成物を示すために用いられる。これらの剤または薬物は、細胞内でのその作用様式によりカテゴライズされ、たとえば、細胞サイクルに影響を与えるかどうか、及び、どのステージで細胞サイクルに影響を与えるか、などがある。あるいは、剤は、直接ＤＮＡに架橋する能力、ＤＮＡ内に挿入される能力、または、核酸合成に影響を与えることにより染色体異常及び有糸分裂異常を引き起こす能力に基づき特徴付けられても良い。
【０１４７】
化学療法剤の例としては、アルキル化剤（たとえばチオテパ及びシクロホスファミド）；スルホン酸アルキル（たとえばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン）；アジリジン（たとえばベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ及びウレドパ）；エチレンイミン及びメチラメラミン（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロロメラミンを含む）；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（トポテカンの合成アナログを含む）；ブリオスタチン、カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ−１０６５（アドゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシン合成アナログを含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ズオカルマイシン（合成アナログであるＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ  ｏｘｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メルファラン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード）；ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン）；抗生物質（たとえば、エンジイン抗生物質（たとえば、カリケラミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、特にカリケラミシンガンマ１Ｉ及びカリケラミシンオメガＩ１））；ダイネマイシン（ダイネマイシンＡを含む；ビスホスホン酸（たとえばクロドロネート））；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチンクロモフォア及び関連色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎ）、アクチノマイシン、オートラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（たとえば、マイトマイシンＣ）、ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、及びゾルビシン；代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ））；葉酸アナログ（例えば、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキサート）；プリンアナログ（例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、及びチオグアニン）；ピリミジンアナログ（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、及びフロクスウリジン）；アンドロゲン（例えば、カルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール（ｅｐｉｔｉｏｓｔａｎｏｌ）、メピチオスタン（ｍｅｐｉｔｉｏｓｔａｎｅ）、及びテストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ））；抗副腎ホルモン類（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌｓ）（例えば、ミトタン及びトリロスタン）；葉酸補充剤（ｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）（例えば、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ））；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸（ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）；ジアジコン；エルホルミシン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）；エポチロン；エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシノイド（たとえばマイタンシン及びアンサミトシン）；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸;トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２'，２"−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎＡ）、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド（たとえば、パクリタキセル及びドセタキセルゲムシタビン）；６−チオグアニン；メルカプトプリン；白金配位複合体（たとえばシスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチン）；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ（ｘｅｌｏｄａ）；イダンドロネート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；イリノテカン（たとえばＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド（たとえばレチノイン酸）；カペシタビン；カルボプラスチン；プロカルバジン；プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）；ゲムシタビエン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｅｎ）；ナベルビン；ファルネシル−タンパク質タンスフェラーゼ阻害剤；トランスプラチナ（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、上述のいずれかの薬学的に受容可能な塩、酸、または誘導体が挙げられる。
【０１４８】
Ｂ．放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広く用いられている他の因子としては、ガンマ線、Ｘ線、及び／または腫瘍細胞への直接的な放射性同位体の送達として普遍的に知られているものが挙げられる。他の形態のＤＮＡ損傷因子もまた企図され、たとえば、マイクロ波、陽子線照射（米国特許第５，７６０，３９５号及び第４，８７０，２８７号）、及びＵＶ照射がある。おそらく、これらすべての因子が、ＤＮＡ、ＤＮＡ前駆体、ＤＮＡの複製及び修復、ならびに、染色体のアセンブリ及び維持に対し、広範な損傷を与える。Ｘ線の被ばく量範囲は、長期間（３〜４週）に対しては５０〜２００レントゲンの１日量、単回投与は２０００〜６０００レントゲンの範囲である。放射性同位体の被ばく量範囲は、当該同位体の半減期、放出される放射線の強さ及びタイプ、ならびに、新生細胞による取り込みに依存し、広く変化する。
【０１４９】
Ｃ．免疫療法
当業者であれば、本実施形態方法と組み合わせて、または併せて、免疫療法を用い得ることを理解するであろう。癌治療に関連し、免疫療法とは通常、癌細胞を標的とし、破壊するために、免疫エフェクター細胞及び分子を用いることに依るものである。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））はそのような例である。免疫エフェクターは、たとえば、腫瘍細胞の表面上のなんらかのマーカーに特異的な抗体であっても良い。抗体単独で治療のエフェクターとして供されても良く、または、実際に細胞殺傷作用を及ぼす他の細胞をリクルートしても良い。また抗体は、薬剤または毒素（化学療法剤、放射性ヌクリド、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素等）に結合され、単なる標的化剤として供されても良い。あるいは、当該エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接または間接のいずれかで相互作用する表面分子を担持するリンパ球であっても良い。様々なエフェクター細胞として、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が挙げられる。
【０１５０】
免疫療法の１つの態様において、腫瘍細胞は、標的化に適した何らかのマーカー（すなわち、他の細胞の大部分には存在していない）を担持していなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在しており、これらの内のいずれかが、本実施形態に関連した標的化に適し得る。普遍的な腫瘍マーカーとしては、ＣＤ２０、がん胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａｎｔｉｇｅｎ、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂ  Ｂ、及びｐ１５５が挙げられる。免疫療法の他の態様は、免疫刺激効果と抗癌作用を組み合わせることである。以下を含む免疫刺激分子もまた存在している：サイトカイン（たとえばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ガンマ−ＩＦＮ、ケモカイン（たとえばＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１）、ＩＬ−８）及び増殖因子（たとえばＦＬＴ３リガンド）。
【０１５１】
現在研究中または使用中の免疫療法の例は、免疫アジュバント（たとえば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ジニトロクロロベンゼン、及び芳香族化合物）（米国特許第５，８０１，００５号及び第５，７３９，１６９号；Ｈｕｉ  ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，  １９９８；  Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）；サイトカイン療法（たとえば、インターフェロンα、β、及びγ、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＴＮＦ（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８；  Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８；  Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８））；遺伝子療法（たとえば、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、及びｐ５３（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８；  Ａｕｓｔｉｎ−Ｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｖｉｌｌａｓｅｃａ、１９９８；米国特許第５，８３０，８８０号及び第５，８４６，９４５号））；及び、モノクローナル抗体（たとえば、抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２、及び抗ｐ−１８５（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ、２０１２；  Ｈａｎｉｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８；米国特許第５，８２４，３１１号））である。１以上の抗癌治療が、本明細書に記載される抗体療法と共に用いられうることが企図される。
【０１５２】
Ｄ．外科手術
およそ６０％の癌患者が何らかのタイプの外科手術（予防手術、診断手術または病期診断手術、治療的手術及び緩和手術が挙げられる）を受けている。治療的手術には、癌性組織のすべてまたは一部を物理的に除去、摘出及び／または破壊する切除術が含まれ、及び、他の療法（たとえば、本実施形態の治療、化学療法、放射線治療、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法及び／または代替療法等）と併せて用いられても良い。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することを指す。腫瘍の切除に加え、外科手術による治療には、レーザー外科手術、寒冷外科手術、電気外科手術、及び顕微鏡下手術（モース外科手術）が含まれる。
【０１５３】
癌性細胞、組織または腫瘍の一部またはすべての摘出で、身体内に腔が形成されても良い。治療は、追加の抗癌治療を用いた当該領域のかん流、直接注入または局所塗布により成し遂げられても良い。そのような治療は、たとえば、１、２、３、４、５、６もしくは７日毎、または１、２、３、４、及び５週毎、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２か月毎に繰り返されても良い。これら治療は、同様に投与量を変化させるものであっても良い。
【０１５４】
Ｅ．他の剤
処置の治療効果を改善するために本実施形態のある態様と組み合わせて他の剤を用い得ることが企図される。これら追加の剤としては、細胞表面受容体及びＧＡＰジャンクションの上方制御に影響を与える剤、細胞増殖抑制剤及び分化剤、細胞付着阻害剤、アポトーシス誘導物質への過増殖性細胞の感受性を増加させる剤、または、他の生物学的剤が挙げられる。ＧＡＰジャンクションの数を上昇させることによる細胞内シグナル伝達の増加は、近傍の過増殖性細胞群に対する抗過増殖効果を増加させる。他の実施形態において、細胞増殖抑制剤または分化剤は、処置の抗過増殖性を改善するために本実施形態のある態様と組み合わせて用いられても良い。細胞付着阻害剤は、本実施形態の有効性の改善が企図される。細胞付着阻害剤の例としては、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤及びＬｏｖａｓｔａｔｉｎである。アポトーシスに対する過増殖性細胞の感受性を増加させる他の剤（たとえば、抗体ｃ２２５）を、治療有効性を改善するために本実施形態のある態様と組み合わせて用いられうることが企図される。
【０１５５】
ＸＩＩ．キット
本発明の有る態様において、たとえば治療用キット等のキットが開示されうる。たとえば、キットは、本明細書に開示される１以上の医薬組成物及び任意選択的にそれらの使用のための説明書を含有しても良い。また、キットは、そのような組成物の投与を成し得るためのデバイスを１以上含有しても良い。たとえば、主題のキットは、医薬組成物及び当該組成物の癌性腫瘍への直接的な静脈内注入を行うためのカテーテルを含有しても良い。他の実施形態において、主題のキットは、改変システイナーゼを前もって充填されたアンプル（任意選択的に、医薬用として製剤化され、または、送達用デバイスを用いた使用のために、凍結乾燥される）を含有しても良い。
【０１５６】
キットは、ラベルを貼った容器を含有しても良い。適切な容器としては、たとえば、瓶、バイアル、及び試験管が挙げられる。容器は、様々な物質（たとえばガラスまたはプラスチック）から形成されていても良い。容器は、たとえば上述の治療応用または非治療応用に有効な改変システイナーゼを含有する組成物を保持していても良い。容器の上のラベルは、当該組成物が、特定の治療応用または非治療応用に使用されることを示していても良く、及び、たとえば上述のような、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ用途のいずれかに対する指示を示していても良い。本発明のキットは通常、上述の容器及び、販売及びユーザーの立場から望ましい物質（緩衝液、希釈物質、フィルター、針、シリンジ及び使用に対する説明を伴う添付文書）を含有する他の容器を１以上含有する。
【実施例】
【０１５７】
ＸＩＩＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれるものである。当業者であれば、以下の実施例に開示されている技術は、本発明の実施において上手く機能することが本発明者らにより発見された技術を提示していることを認識し、ゆえに、その実施に対する好ましい様式を構成するとみなされうる。しかしながら、当業者は、本開示の観点から、開示される具体的な実施形態において、多くの変更が可能であること、及び、本発明の主旨及び範囲から逸脱することなく、良く似た、または類似の結果が得られることを認識するであろう。
【０１５８】
実施例１  ヒトシステイナーゼ酵素の足場としてのシスタチオニン−γ−リアーゼ
非ヒトタンパク質の治療物質を使用することにより、免疫原性の望ましくない作用が臨床で認められるため、発明者らは、治療的に関連のあるシスチン／システイン分解活性をヒト酵素へと導入しようと（すなわち、シスチン／システインに対し高いｋｃａｔ及び低いＫＭ値を有し、及び望ましい特異性を示す酵素を設計しようと）鋭意探索した。ヒトは、シスタチオニン−γ−リアーゼ（ｈＣＧＬ）と呼ばれる酵素を有しており、その機能は、哺乳類の含硫基移動経路の最終ステップを触媒することであり（Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）、すなわち、Ｌ−シスタチオニンをＬ−システイン、αケト酪酸及びアンモニアへと転換することである。ヒトＣＧＬはまた、Ｌ−システイン及びそのジスルフィド形態であるＬ−シスチンも若干、分解できるため、理想的な改変の候補である。構造的及び系統発生学的に誘導させた突然変異誘導を用いて、ｈＣＧＬ変異体を、Ｌ−システイン及びＬ−シスチンの両方を効率的に加水分解するよう改変した。
【０１５９】
実施例２  ヒトシスチオニン−γ−リアーゼ及びヒトシステイナーゼの遺伝子合成及び発現
ｈＣＧＬ遺伝子は、滅多に大腸菌では用いられず、発現に干渉しうる多重コドンを含有している。ゆえに、大腸菌におけるタンパク質発現を最適化するために、各遺伝子を、ＤＮＡ−Ｗｏｒｋｓソフトウェア（Ｈｏｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）を用いて設計したコドン最適化されたオリゴヌクレオチドを用いてアセンブリした。各構築物は、クローニングを単純化するための、Ｎ末端ＮｃｏＩ制限酵素部位、インフレームＮ末端Ｈｉｓ６タグ、及びＣ末端ＥｃｏＲＩ部位を含有している。ｐＥＴ２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）へのクローニングの後、適切なｈＣＧＬ発現ベクターを含有する大腸菌（ＢＬ２１）を、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地（５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有）を用いて、３７℃で、振とうフラスコ、２５０ｒｐｍにて、約０．５〜０．６のＯＤ６００に達するまで増殖させた。この時点で、培養を２５℃での振とう器に切り替え、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘導させ、さらに１２時間、タンパク質を発現させた。次いで、細胞沈殿物を遠心により回収し、ＩＭＡＣ緩衝液（１０ｍＭ  ＮａＰＯ４／１０ｍＭイミダゾール／３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）に再懸濁した。Ｆｒｅｎｃｈ圧力セルにより溶解させた後、溶解物を、４℃で２０分間、２０，０００ｘｇで遠心し、得られた上清を、ニッケルＩＭＡＣカラムへと入れ、１０〜２０カラム体積のＩＭＡＣ緩衝液で洗浄し、次いで、ＩＭＡＣ溶出緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＰＯ４／２５０ｍＭイミダゾール／３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）で溶出させた。次いで、酵素を含有する画分を、２５℃で１時間、１０ｍＭ  ピリドキサルリン酸（ＰＬＰ）でインキュベートした。１０，０００ＭＷＣＯ遠心フィルターデバイス（ＡＭＩＣＯＮ（商標））を用いて、次いで、タンパク質を、１００ｍＭ  ＰＢＳ、１０％グリセロール、ｐＨ７．３溶液へと数回、緩衝液交換を行った。ｈＣＧＬ酵素またはｈＣＧＬ変異体酵素の分注物を、次いで、液体窒素中で瞬間凍結させ、−８０℃で保存した。この方法で精製したｈＣＧＬ及びｈＣＧＬ変異体酵素は、９５％超の均一性であった（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシン染色により評価）。収率は、６Ｍグアニジン塩酸塩、２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．５の最終緩衝液濃度中、算出された吸光係数（ε２８０＝２９，８７０  Ｍ−１ｃｍ−１）に基づき、約２００〜３００ｍｇ／Ｌ培養液であると算出された（Ｇｉｌｌ  ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ，  １９８９）。
【０１６０】
実施例３  システイナーゼ活性に対する９６ウェルプレートスクリーニング及びクローンの順位付け
ヒトＣＧＬはゆっくりとＬ−システインをピルビン酸、アンモニア及びＨ２Ｓへと分解し、Ｌ−シスチンをピルビン酸、アンモニア及びチオシステインへと転換する（それぞれ、ｋｃａｔ／ＫＭ  約０．２ｓ−１ｍＭ−１及び０．５ｓ−１ｍＭ−１）（図１）。チオシステインはさらに、Ｌ−システイン及びＨ２Ｓへと非酵素的に分解される。小ライブラリーをスクリーニングし、最も高いシスチン及び／またはシステインリアーゼ活性を有するクローンを順位付けするために、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）を用いた、ピルビン酸の検出のための比色分析（Ｔａｋａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）を９６ウェルプレート形式に大きさを合わせた。このプレートスクリーニングにより、突然変異ライブラリーから最も活性のあるクローンを選択するための簡易な方法が提供される。元の対照よりも高い活性を示しているクローンをさらなる特徴解析に選択した。
【０１６１】
突然変異ｈＣＧＬ、またはｈＣＧＬ対照を含有するシングルコロニーをピックし、７５μＬのＴＢ培地／ウェル（５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有）を含有する９６ウェル培養プレートへと移した。これら培養物を、次いで、プレート振とう器上、約０．８〜１のＯＤ６００に達するまで３７℃で増殖させる。２５℃まで冷却した後、さらに７５μＬの培地／ウェル（５０μｇ／ｍｌのカナマイシン含有）及び２ｍＭ  ＩＰＴＧを加えた。少なくとも２時間、振とうさせながら２５℃で発現が行われ、その後、１００μＬの培養液／ウェルを９６ウェルアッセイプレートへと移した。次いで、アッセイプレートを遠心し、細胞を沈殿させ、培地を除去し、５０μＬ／ウェルのＢ−ＰＥＲタンパク質抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を加えることにより細胞を溶解させた。遠心による除去の後、溶解物を、インキュベーションのために２つのプレート（１つのプレートには０．８ｍＭ  Ｌ−シスチン、もう１つのプレートには１．２ｍＭ  Ｌ−システイン）で分け、３７℃で１０〜１２時間、インキュベートした。次いで、１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５中で、３部の０．０３％  ＭＢＴＨ溶液を加えることにより反応物を誘導体化した。プレートを４０分間、５０℃で加熱し、冷却した後、マイクロタイタープレートリーダーで、λ＝３２０ｎｍで読み取った。
【０１６２】
実施例４  ｈＣＧＬのＥ５９、Ｒ１１９及びＥ３３９残基に対する突然変異誘導の効果
構造解析から、Ｅ５９、Ｒ１１９及びＥ３３９残基は、その基質であるＬ−シスタチオニンに対するｈＣＧＬの認識に関与している可能性があることが示唆された。ＮＮＳコドン（Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣであっても良く、Ｓは、ＧまたはＣであっても良い）飽和ライブラリを、鋳型ＤＮＡとしてｈＣＧＬ遺伝子を用いて、以下の突然変異誘導プライマー：
2016528920.tif 000004
、ならびに、以下の特異的末端プライマー：
2016528920.tif 000005
を用いて、これらの部位で構築し、スクリーニングした。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてｐＥＴ２８ａベクターへとライゲートした。得られたライゲーション物は、大腸菌（ＢＬ２１）へと直接、形質転換し、実施例３に記述される、引き続くスクリーニングのためのＬＢ−カナマイシンプレート上に播種した。すべてのライブラリーは、その理論上のサイズの２倍超過でスクリーニングされた。活性を示すクローンを単離し、ｈＣＧＬ遺伝子変異体の配列を測定し、変異を特定した。
【０１６３】
酵素変異体を、９５％を超える均一性にまで精製した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析）。おそらく、発現に用いられた大腸菌細胞は、産生される酵素の量に対し十分なＰＬＰを産生しないため、ＰＬＰとのインキュベーションは、特異的活性を増強することが示された。酵素はＰＬＰと共にロードされた時点で、安定であり、補因子は失われず、ゆえに、数日間の保管後に活性の低下は検出されないはずである。
【０１６４】
実施例５  ヒトシステイナーゼ変異体ｈＣＧＬ−ＴＶの特徴解析
Ｌ−シスチン及びＬ−システインの両方の分解に対し、最も高い触媒活性を有すると、スクリーニングから特定された１つの特定の変異体は、以下の変異を有することが判明した：Ｅ５９Ｔ、Ｒ１１９Ｒの同義コドン変化、及びＥ３３９Ｖ。この変異体は、ｈＣＧＬ−ＴＶと呼ばれ（図５）、１ｍＬスケールのＭＢＴＨアッセイ（実施例３に記述されるものと類似）を用いて、ｐＨ７．３及び３７℃で、１００ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液中のＬ−シスチン／システイン分解の能力を解析した。これら条件下で、ｈＣＧＬ−ＴＶ変異体は、１．０±０．０５ｓ−１のｋｃａｔ、０．１６±０．０２ｍＭのＫＭ、及び、６．３±１．０ｓ−１ｍＭ−１のｋｃａｔ／ＫＭで、Ｌ−シスチンを分解することが判明した（図２Ａ）。ｈＣＧＬ−ＴＶ変異体はさらに、Ｌ−システインの分解に対し、０．８±０．０３ｓ−１のｋｃａｔ、０．２５±０．０４ｍＭのＫＭ、及び、３．２±０．６ｓ−１ｍＭ−１のｋｃａｔ／ＫＭを有することが判明した（図２Ｂ）。
【０１６５】
ｈＣＧＬ−ＴＶの血清安定性は、プールされたヒト血清中、３７℃でインキュベーションすることにより検証された。様々な時点で、分注物を採取し、基質としてＬ−シスチンを用いて残留活性を検証した。データをプロットした後、ｈＣＧＬ−ＴＶ変異体は、２２８±６時間の見かけ上のＴ０．５を有し、非常に安定であることが判明した（図３）。
【０１６６】
実施例６  前立腺腫瘍細胞株に対する、ｈＣＧＬ−ＴＶのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性
ＤＵ１４５及びＰＣ３の前立腺腫瘍細胞株を用いて、ｈＣＧＬ−ＴＶのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性を評価した。細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０培地中に約３０００細胞／ウェルで播種し、２４時間増殖させた後、０〜１０μＭの範囲の濃度のｈＣＧＬ−ＴＶの滴定物を各ウェルに添加した。３日間インキュベーションした後、生存細胞の相対数を、（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）（ＭＴＳ）アッセイを用いて比色分析により評価した。得られたデータの解析から、ＤＵ１４５細胞株及びＰＣ３細胞株の両方に対し、約６０ｎＭの見かけ上のＩＣ５０値が得られた（それぞれ、図４Ａ及び４Ｂ）。
【０１６７】
実施例７  ヒトシステイナーゼの薬理学的調製
ｈＣＧＬ−ＴＶ酵素は、１つの例外（ＩＭＡＣカラムへの結合の後、タンパク質は、試料中で、０．１％ＴＲＩＴＯＮ（商標）１１４を含有するＩＭＡＣ緩衝液（９０〜１００カラム体積）を用いてしっかりと洗浄した）を除き、実施例２に記述されるように精製した。再度、試料を、１０〜２０カラム体積のＩＭＡＣ緩衝液を用いて洗浄し、次いで、ＩＭＡＣ溶出緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＰＯ４／２５０ｍＭイミダゾール／３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）を用いて溶出した。ＴＲＩＴＯＮ（商標）１１４を用いた洗浄は、エンドトキシン除去のために行われた。精製されたタンパク質は、１０，０００ＭＷＣＯのろ過デバイス（ＡＭＩＣＯＮ（登録商標））を用いて、１００ｍＭ  ＮａＰＯ４緩衝液（ｐＨ８．３）への緩衝液交換に供された。続いて、ＰＬＰを、１０ｍＭの濃度で添加し、タンパク質を、１時間、２５℃でインキュベートした。次いで、メトキシＰＥＧスクシンイミジルカルボキシメチルエステル５０００ＭＷ（ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、８０：１のモル比率でｈＣＧＬ−ＴＶに加え、一定して攪拌しながら、１時間、２５℃で反応させた。得られた混合物は、１００，０００ＭＷＣＯのろ過デバイス（ＡＭＩＣＯＮ（登録商標））を用いて、しっかりと緩衝液交換（１０％グリセロールを伴うＰＢＳ）され、０．２ミクロンのシリンジフィルター（ＶＷＲ）を用いて滅菌された。すべてのＰＥＧ化酵素は、Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）キット（Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を用いて、リポ多糖（ＬＰＳ）含量を解析された。
【０１６８】
実施例８  霊長類システイナーゼの改変
たとえば、チンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ；配列番号９）、ボノボ（Ｐａｎ  ｐａｎｉｓｃｕｓ；配列番号１０）、オランウータン（Ｐｏｎｇｏ  ａｂｅｌｉｉ；配列番号７）、及びマカク（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ；配列番号８）等の霊長類由来のＣＧＬの配列は、それぞれ、ヒトＣＧＬ（配列番号１）に対し、アミノ酸組成で約９９．３％、９８．８％、９６％及び９５．３％の同一性である。配列類似性により、これら生物種由来の改変ＣＧＬは、治療剤としてヒトに導入されたとしても、重大な免疫反応を引き起こす可能性は低いであろう。システイナーゼ活性の増強をもたらす変異を有する霊長類ＣＧＬ酵素は、実施例４に記述される標準的な突然変異誘導技術を用いて構築される。得られた遺伝子はｐＥＴ２８ａにクローニングされ、望ましくない変異が確実に組み込まれていないよう、配列が確認される。得られた酵素を発現及び精製するために用いられる構築物は上述されている。５９Ｔ及び３３９Ｖに相当するアミノ酸の位置で改変された霊長類ＣＧＬ（配列番号３〜６）は、Ｌ−システイン及びＬ−シスチンの両方に対し、少なくとも１ｘ１０３ｓ−１Ｍ−１以上のｋｃａｔ／ＫＭ値で活性が増強されていることが予測される。システイナーゼ活性が増強された改変霊長類ＣＧＬの３７℃での血清安定性は、上述のように測定される。
【０１６９】
実施例９  マウスにおける、ＰＥＧ−ｈＣＧＬ−ＴＶの薬力学的（ＰＤ）解析
オスのＦＶＢマウスに、５０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−ｈＣＧＬ−ＴＶを用いて腹腔内投与注射し、血液及び血清採取のために、０、１、２、４及び６日目で殺処分した（各群、ｎ＝５）。血清試料は、内部標準混合物（１０ピコモルの重水素化シスチン及びシステイン）と混合され、ＮＡＮＯＳＥＰ（登録商標）ＯＭＥＧＡ（商標）遠心デバイス  ３ｋＤａカットオフ（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、限外ろ過された（Ｔｉｚｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｔｉｚｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。ろ過された極性画分を、逆相ＢＥＨ  Ｃ１８、１．７μｍ、２．１×１５０ｍｍカラム（ＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（商標）ＡＣＣＥＬＡ（登録商標）１２５０  ＵＰＬＣ、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）を用いてクロマトグラフィーを行い、エレクトロスプレーイオン化を伴うＥＸＡＣＴＩＶＥ（商標）Ｐｌｕｓ  ＯＲＢＩＴＲＡＰ（商標）質量分析機（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）へと導入した。機器に備えられたＸＣＡＬＩＢＵＲ（商標）ソフトウェアを用いて、５０〜７００ｍ／ｚ質量範囲の質量中心（ＭＳ）モードで、データを得た。シスチン及びシステインの相対濃度は、平均値±ＳＥＭとして報告される。図６Ａに示されるように、ＰＥＧ−ｈＣＧＬ−ＴＶは、９６時間にわたる間、劇的に血清シスチンレベルを低下させ（９５％超）、及び、４８時間にわたり、システインレベルを８０％低下させた（図６Ｂ）。
【０１７０】
実施例１０  マウスにおける、ＰＥＧ−ｈＣＧＬ−ＴＶの薬物動態（ＰＫ）解析
ＰＥＧ−ｈＣＧＬ−ＴＶの循環滞留性を、実施例９に記述されるものと同じ血清試料を用いて分析した。ドットブロット濃度測定法を用いて、試料を、抗ｈＣＧＬ抗体（ウサギ抗ＣＴＨ  Ｓｉｇｍａ  ＃  Ｃ８２４８）でプローブし、次いで、抗ウサギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＃  ｓｃ−２０１２）を加え、ＴＹＰＨＯＯＮ（商標）スキャナー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、４８８ｎｍで励起させることにより可視化させた。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）を用いて、標準曲線を構築するため、同じブロット内の既知の量のＰＥＧ−ｈＣＧＬ−ＴＶの滴定と、試料の濃度測定バンドを比較し、相対血清ＰＥＧ−ｈＣＧＬ−ＴＶのレベルを算出した。このデータを、投与の血管外モデル（Ｆｏｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）に当てはめることにより、ＰＥＧ−ｈＣＧＬ−ＴＶの吸収Ｔ１／２（およそ２３時間）及び排出Ｔ１／２（およそ４０±７時間）が示された（図７）。
【０１７１】
実施例１１  同種移植モデルにおける、ＨＭＶＰ２腫瘍細胞の増殖に対するＰＥＧ−ｈＣＧＬ−ＴＶの効果
ＰＥＧ−ｈＣＧＬ−ＴＶの腫瘍発生を阻害する能力は、マウス前立腺癌（ＨＭＶＰ２）同種移植モデルにおいて評価した。この実験に対し、ＨＭＶＰ２細胞をスフェロイドとして増殖させ、これを用いて、ＦＶＢ／Ｎのオスマウスの四群（８匹／群）の脇腹に、皮下注射後、腫瘍を発生させた。細胞はおよそ２週間増殖させ、その時点で、注射部位で小さな腫瘍に触れることができた。次いで、四群それぞれに、ＰＥＧ−ｈＣＧＬ−ＴＶ（５０または１００ｍｇ／ｋｇ）、ＰＢＳ（対照）、または熱不活化ＰＥＧ−ｈＣＧＬ−ＴＶ（追加対照）（１００ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを、４日毎に腹腔内投与注射により投与した。図８に示されるように、ＰＥＧ−ｈＣＧＬ−ＴＶを用いた処置により、腫瘍増殖が劇的に阻害され、両対照群（すなわち、ＰＢＳ注射のみの対照群、及び、不活化酵素注射の対照群）と比較し、両投与量（５０及び１００ｍｇ／ｋｇ）で、高い有意差があった。重要なことは、治療期間を通じ、反復投与は非常に耐容性であったことだ。この点において、実験の経過中、処置群のマウス及び対照群のマウスの間で、体重及び食物摂取に差異は無かった。最終的に、この実験の最後でマウスを剖検したが、顕微鏡的評価で、いずれの主要組織にも異常は見られなかった。
【０１７２】
実施例１２  異種移植モデルにおける、ＰＣ３前立腺腫瘍細胞の増殖に対するＰＥＧ−ｈＣＧＬ−ＴＶの効果
ＰＥＧ−ｈＣＧＬ−ＴＶの腫瘍発生を阻害する能力は、ヒト前立腺癌（ＰＣ３）異種移植モデルにおいて評価した。この実験に対し、ＰＣ３細胞を用いて、ＦＶＢ／Ｎのオスマウスの四群（７匹／群）の脇腹に、皮下注射後、腫瘍を発生させた。細胞は１０日間、増殖させ、その時点で、注射部位で腫瘍に触れることができた。次いで、四群それぞれに、ＰＥＧ−ｈＣＧＬ−ＴＶ（５０または１００ｍｇ／ｋｇ）、ＰＢＳ（対照）、または熱不活化ＰＥＧ−ｈＣＧＬ−ＴＶ（追加対照）（１００ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを、４日毎に腹腔内投与注射により投与した。図９に示されるように、ＰＥＧ−ｈＣＧＬ−ＴＶを用いた処置により、両対照群（すなわち、ＰＢＳ注射のみの対照群、及び、不活化酵素注射の対照群）と比較し、両投与量（５０及び１００ｍｇ／ｋｇ）で、腫瘍増殖が明らかに遅延された。また、治療期間を通じ、このマウス系統において、反復投与は非常に耐容性であり、実験の経過中、処置群のマウス及び対照群のマウスの間で、体重及び食物摂取に差異は無かった。この実験の最後でマウスを剖検したが、顕微鏡的評価で、いずれの主要組織にも異常は見られなかった。
【０１７３】
本明細書に開示され、請求される方法のすべては、本開示を鑑み、過度の実験を行うことなく、作製され、実行することができる。本発明の組成物及び方法が、好ましい実施形態に関して記述されているが、当業者であれば、本発明の主旨、目的、及び範囲から逸脱することなく、本明細書に開示される方法、及び、当該方法のステップまたは一連のステップに変更が適用され得ることが明らかであろう。より具体的には、化学的及び生理学的の両方に関連したある剤が、本明細書に開示される剤と置換され得、それにより同じ結果または類似の結果が得られることが明らかであろう。当業者に明らかな、そのような類似の置換及び修飾のすべてが、添付の請求項により規定される本発明の主旨、目的及び範囲内にあるとみなされる。
【０１７４】
参照文献
以下の参照文献は、本明細書に解説されるものに対する例示的な手順の補足、または、他の詳細な補足を提示する範囲において、参照により本明細書に具体的に援用される。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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