(57)【要約】本発明は、例えば、分離および分析目的で、ＲＮＡの５’キャップを修飾する作用物質および方法を提供する。一実施態様において、本発明は修飾酵素、すなわち、ランブル鞭毛虫の修飾トリメチルグアノシンシンターゼ２（ＧｌａＴｇｓ２）を提供する。ＧｌａＴｇｓ２の酵素活性は、野生型酵素と比較して、ＡｄｏＭｅｔ類似体を補因子としてうまく利用できるよう変化されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離タンパク質または合成タンパク質であって、
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列を示す、もしくは含む、または
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を示し、もしくは含み、このとき条件として、前記相同なアミノ酸配列において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される３４位に相当する位置にバリンが存在しない、または
ｃ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を示し、もしくは含み、前記アミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列と８５％超、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％同一であり、このとき条件として、前記相同なアミノ酸配列において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される３４位に相当する位置にバリンが存在しない、または
ｄ．ａ、ｂ、またはｃに示される前記アミノ酸配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、６５、７０、８０、９０、もしくは少なくとも１００種のアミノ酸、好ましくは少なくとも１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは少なくとも２００種のアミノ酸、特に好ましくは少なくとも２１０、２２０、２３０、２４０、もしくは少なくとも２５０種のアミノ酸の連続部分配列を示し、もしくは含み、このとき条件として、前記部分配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される３４位にアミノ酸もしくは対応する相同なアミノ酸を含む、および
ｅ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１で示されるアミノ酸配列を示さない
タンパク質。
【請求項２】
以下の一般式（Ｉ）の化合物の残基Ｒの、ｍ7ＧＴＰ、つまりｍ7ＧｐｐｐＮのグアノシン、または以下の式（ＩＩ）の化合物のＮ２への転移を酵素的に触媒するタンパク質であって、
2016501879.tif 000023
上式で、ＲＮＡはリボ核酸を意味し、Ｒ1はＯＨまたはＯＣＨ3を意味し、Ｎはヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオシド類似体、またはヌクレオチド類似体を意味し、Ｂは核酸塩基を表し、そしてＲは、置換または非置換Ｃ2-10アルキル、置換または非置換Ｃ2-10アルケニル、置換または非置換Ｃ2-10アルキニル、置換または非置換Ｃ4-10アルケニニル、置換または非置換Ｃ3-12シクロアルキル、置換または非置換Ｃ3-12シクロアルケニル、置換または非置換Ｃ5-12シクロアルキニル、置換または非置換Ｃ5-12シクロアルケニニル、置換または非置換Ｃ1-10ヘテロアルキル、置換または非置換Ｃ2-10ヘテロアルケニル、置換または非置換Ｃ2-10ヘテロアルキニル、置換または非置換Ｃ4-10ヘテロアルケニニル、置換または非置換Ｃ1-10アジドアルキル、置換または非置換Ｃ2-10アジドアルケニル、置換または非置換Ｃ2-10アジドアルキニル、置換または非置換Ｃ4-10アジドアルケニニル、置換または非置換ベンジル、プロペニルＣＨ2＝ＣＨ−ＣＨ2−、プロピニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ2−、ブチニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ2−ＣＨ2−、ペンテニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−、およびアジドブテニルＮ3−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−から成る基から選択される、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、または１０で示されるアミノ酸配列を示す、もしくは含む、または
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、または１０で示されるアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を示し、もしくは含み、このとき条件として、前記相同なアミノ酸配列において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、または１０で示される３４位に相当する位置にバリンが存在しない、または
ｃ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、または１０で示されるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を示し、もしくは含み、前記相同なアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、または１０で示されるアミノ酸配列と８５％超、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％同一であり、このとき条件として、前記相同なアミノ酸配列において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、または１０で示される３４位に相当する位置にバリンが存在しない、または
ｄ．ａ、ｂ、またはｃに示される前記アミノ酸配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、６５、７０、８０、９０、もしくは少なくとも１００種のアミノ酸、好ましくは少なくとも１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは少なくとも２００種のアミノ酸、特に好ましくは少なくとも２１０、２２０、２３０、２４０、もしくは少なくとも２５０種のアミノ酸の連続部分配列を示し、もしくは含み、このとき条件として、前記部分配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、または１０で示される３４位にアミノ酸もしくは相当する相同なアミノ酸、を含む、および
ｅ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１で示されるアミノ酸配列を示さない、
請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列の３４位に、アラニン、グリシン、またはメチオニン、好ましくはアラニンが存在する、請求項１〜３のうちいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列の７６位に、アスパラギン酸、トレオニン、ロイシン、もしくはバリン、好ましくはアスパラギン酸が存在し、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列の９２位に、アルギニンもしくはアラニンが存在する、請求項１〜４のうちいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６】
ＲがプロペニルＣＨ2＝ＣＨ−ＣＨ2−、プロピニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ2−、ブチニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ2−ＣＨ2−、ペンテニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−、ベンジルＰｈ−ＣＨ2−、またはアジドブテニルＮ3−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−、好ましくはプロペニルＣＨ2＝ＣＨ−ＣＨ2−、ベンジルＰｈ−ＣＨ2−、またはペンテニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−である、請求項１〜５のうちいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のうちいずれか一項によるタンパク質をコードする核酸。
【請求項８】
ＲＮＡ分子、特にｍＲＮＡ分子のｍ7ＧｐｐｐＮキャップを修飾する方法であって、ｍ7ＧｐｐｐＮキャップを持つＲＮＡ分子を、以下の式（Ｉ）で示されるＡｄｏＭｅｔ類似体の存在下で、請求項１〜６のうちいずれか一項によるタンパク質に接触させるステップを含む方法であって、
2016501879.tif 000024
上式で、Ｒは、置換または非置換Ｃ2-10アルキル、置換または非置換Ｃ2-10アルケニル、置換または非置換Ｃ2-10アルキニル、置換または非置換Ｃ4-10アルケニニル、置換または非置換Ｃ3-12シクロアルキル、置換または非置換Ｃ3-12シクロアルケニル、置換または非置換Ｃ5-12シクロアルキニル、置換または非置換Ｃ5-12シクロアルケニニル、置換または非置換Ｃ1-10ヘテロアルキル、置換または非置換Ｃ2-10ヘテロアルケニル、置換または非置換Ｃ2-10ヘテロアルキニル、置換または非置換Ｃ4-10ヘテロアルケニニル、置換または非置換Ｃ1-10アジドアルキル、置換または非置換Ｃ2-10アジドアルケニル、置換または非置換Ｃ2-10アジドアルキニル、置換または非置換Ｃ4-10アジドアルケニニル、置換または非置換ベンジルＰｈ−ＣＨ2−、プロペニルＣＨ2＝ＣＨ−ＣＨ2−、プロピニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ2−、ブチニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ2−ＣＨ2−、ペンテニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−、およびアジドブテニルＮ3−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−から成る基から選択され、このとき、ｍ7ＧｐｐｐＮキャップのグアノシンのＮ２への残基Ｒの転移が行われることを条件とする方法。
【請求項９】
前記ＲＮＡを、ＡｄｏＰｒｏｐｅｎまたはＡｄｏＥｎＹｎの存在下でタンパク質と接触させ、前記タンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列を示し、かつ、前記タンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される３４位にアラニン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される７６位にアスパラギン酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される９２位にアルギニンまたはアラニンを持つ、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ｍ7ＧｐｐｐＮキャップのグアノシンのＮ２に転移された残基Ｒを、続いて化学修飾するステップを含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記残基Ｒの化学修飾を、光クリック反応を用いて行う、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のうちいずれか一項によるタンパク質と、以下の式（Ｉ）で示されるＡｄｏＭｅｔ類似体とを含む検査キットであって、
2016501879.tif 000025
上式で、Ｒは、置換または非置換Ｃ2-10アルキル、置換または非置換Ｃ2-10アルケニル、置換または非置換Ｃ2-10アルキニル、置換または非置換Ｃ4-10アルケニニル、置換または非置換Ｃ3-12シクロアルキル、置換または非置換Ｃ3-12シクロアルケニル、置換または非置換Ｃ5-12シクロアルキニル、置換または非置換Ｃ5-12シクロアルケニニル、置換または非置換Ｃ1-10ヘテロアルキル、置換または非置換Ｃ2-10ヘテロアルケニル、置換または非置換Ｃ2-10ヘテロアルキニル、置換または非置換Ｃ4-10ヘテロアルケニニル、置換または非置換Ｃ1-10アジドアルキル、置換または非置換Ｃ2-10アジドアルケニル、置換または非置換Ｃ2-10アジドアルキニル、置換または非置換Ｃ4-10アジドアルケニニル、置換または非置換ベンジルＰｈ−ＣＨ2−、プロペニルＣＨ2＝ＣＨ−ＣＨ2−、プロピニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ2−、ブチニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ2−ＣＨ2−、ペンテニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−、およびアジドブテニルＮ3−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−から成る基から選択される検査キット。
【請求項１３】
前記ＡｄｏＭｅｔ類似体が、ＡｄｏＰｒｏｐｅｎ、ＡｄｏＥｎＹｎ、またはＡｄｏＢｅｎｚｙｌであり、前記タンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列を示し、かつ、前記タンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される３４位にアラニン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される７６位にアスパラギン酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される９２位にアルギニンまたはアラニンを持つ、請求項１２に記載の検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡの５’キャップを修飾するための作用物質および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の遺伝型を研究することにより、その状態に関する情報、例えば、細胞の調節過程が正確に進行しているか、または、正常状態と比べてここに変化が存在するかなどに関する重要な情報を得ることができる。こうした情報は、例えば、細胞が変性しているか、ウイルスに感染したか、または、不規則な状態、すなわち病的状態であるかの確認に利用できる。このように、例えば、場合によって疾患があるかどうかの帰納的推理が可能である。
【０００３】
このために、例えば、遺伝子の発現を、細胞内に存在するｍＲＮＡ分子の分離および分析によって調べることが知られている。このとき、信頼できる情報を得るには、ｍＲＮＡ調製の質がとりわけ重要である。しかしながら、細胞にはｍＲＮＡの他に数多くのその他の分子やその他のＲＮＡ種、特に非コードＲＮＡ（例えば、ｓＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）が存在するため、固有の特徴に基づいて選択的な濃縮を行う必要がある。真核生物からｍＲＮＡを特異的に分離するには、その特徴、すなわち、いわゆる３’末端のポリＡ尾部と、５’末端のキャップ構造を利用する（非特許文献１〜８）。これらの特徴を介して、ｍＲＮＡを、例えば、対応するカラム材料に固定化されている他の分子に通常は非共有的に結合させる（例えば、ポリＡ尾部を介してオリゴｄＴカラムに、または５’キャップを介してタンパク質ｅＩＦ４Ｅに結合）。ｍＲＮＡを分離するには、現在、含まれるポリＡ尾部を主に用いる。これは、キャップ同様、成熟ｍＲＮＡ分子およびｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）の特徴的な構造である。この領域を介して、分子を、固定化された相補的デオキシヌクレオチド（オリゴｄＴ）プローブにハイブリダイズさせ、それにより複合プローブから分離することができる。これに必要なカラム材料（「ビーズ」）は、先行技術で公知であり、一般的に用いられている。
【０００４】
ＢａｊａｋおよびＨａｇｅｄｏｒｎ（非特許文献７）は、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅの変異体を、キャップ構造を介したＲＮＡの分離に利用する方法を確立した（特許文献１、非特許文献９も参照）。この方法の利点は、ＲＮＡ分子が、ポリＡ尾部の長さに関係なく、含まれるキャップ構造のみに基づいて特定および濃縮され、それにより、ポリＡ尾部が短いＲＮＡも（ｍＲＮＡもｍｉＲＮＡの前駆体も）その後の分析に使用できることである。アッセイの実施には、標的分子に対し野生型タンパク質より最大１０倍も高い親和性を有するｅＩＦ４Ｅ変異体を、タンパク質親和性タグ（特にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ［ＧＳＴ］）を介してグルタチオンビーズに固定化し、プローブを用いて培養する。キャップ構造を有するＲＮＡは、固定化タンパク質に非共有的に結合するため、ビーズを用いて複合プローブから分離できる。このようにして、ポリＡ尾部の多様な輸送性とは無関係に、Ｃ型肝炎ウイルス感染細胞のＲＮＡ分子を分離できた。「次世代塩基配列」実験の実施により、ウイルス感染後の宿主細胞内での遺伝子調節の変化に関して、新たな証言が可能となった（非特許文献１０）。
【０００５】
この方法の欠点は、ＲＮＡ分子を直接、共有的にキャリアーに結合させられないことであり、そのため、不純物を分離する際に、洗浄条件の選択が制限されることである。さらに、結合分子とＲＮＡ分子との間に１：１の関係があることが多いのも、この方法の使用を制限している。Ｄａｌｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（非特許文献１１）は、３つのＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）依存性ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによる、この補因子の対応する類似体を用いた、エチル基、プロピル基、プロペニル基、および２−ブチニル基の、２'−デオキシシチジンおよび２'−デオキシアデノシンへの直接転移について記載している。この場合、ＡｄｏＭｅｔ類似体は、硫黄原子のメチル基の代わりに対応する基を運ぶ。Ｌｕｋｉｎａｖｉｃｉｕｓ ｅｔ ａｌ．（非特許文献１２）は、適切なＤＮＡメチルトランスフェラーゼを用いて、この基をＤＮＡヌクレオシドに転移するために、さらに別のＮＨ2基含有ＡｄｏＭｅｔ類似体を用いている。Ｍｏｔｏｒｉｎ ｅｔ ａｌ．も類似のアプローチをとっており、生物物理学的研究用にｔＲＮＡ分子の部位特異的マーキングを行うために、酵素転移とクリックケミストリーを組み合わせて使用することを記述している（非特許文献１３）。ここでは、同様に補助基質Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの類似体であるＡｄｏＥｎＹｎを使用し、ｔＲＮＡ：メチルトランスフェラーゼ（Ｔｒｍ１）を用いて、ペンテニル残基ＣＨ≡Ｃ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−を、ｔＲＮＡPheの２６位にあるグアノシンの環外Ｎ２原子に酵素的に転移させている。次いで、Ｃｕ（Ｉ）触媒によるアジド−アルキン−１，３−双極性環状付加（ＣｕＡＡＣ）を用いて、蛍光体を修飾ｔＲＮＡPheに結合させる。同様に、Ｂｏｘ Ｃ／Ｄ ＲＮＰメチルトランスフェラーゼを用いることによって、ＲＮＡの配列特異的なクリック標識を実現している（非特許文献１４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６８４１３６３号明細書
【特許文献２】国際公開２００６／１０８６７８号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊ．Ｐｅａｓｅ，Ｒ．Ｓｏｏｋｎａｎａｎ，Ｎａｔ Ｍｅｔｈ ２０１２，９
【非特許文献２】Ｊ．Ｓ．Ｍａｒｃｕｓ，Ｗ．Ｆ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ｒ．Ｑｕａｋｅ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００６，７８，３０８４−３０８９
【非特許文献３】Ｚ．Ｙ．Ｙａｎｇ，Ｈ．Ｊ．Ｅｄｅｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ｌ．Ｄａｖｉｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００５，３３
【非特許文献４】Ｍ．Ｅ．Ｆｏｌｋｅｒｓ，Ｄ．Ａ．Ｄｅｌｋｅｒ，Ｃ．Ｉ．Ｍａｘｗｅｌｌ，Ｃ．Ａ．Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｊ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｄ．Ａ．Ｎｉｘ，Ｃ．Ｈ．Ｈａｇｅｄｏｒｎ，Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ２０１１，６
【非特許文献５】Ｚ．Ｇａｏ，Ｑ．Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｃａｏ，Ｐ．Ｐａｎ，Ｆ．Ｂａｉ，Ｇ．Ｂａｉ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ ２００９，１２１６，７６７０−７６７６
【非特許文献６】Ｕ．Ｓｃｈｉｂｌｅｒ，Ｄ．Ｒｉｆａｔ，Ｄ．Ｊ．Ｌａｖｅｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００１，２４，３−１４
【非特許文献７】Ｅ．Ｚ．Ｂａｊａｋ，Ｃ．Ｈ．Ｈａｇｅｄｏｒｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）２００８，４１９，１４７−１６０
【非特許文献８】Ａ．Ｋ．Ｓｈｕｋｌａ，Ａ．Ｋ．Ｓｈａｓａｎｙ，Ｓ．Ｐ．Ｓ．Ｋｈａｎｕｊａ，Ｉｎｄｉａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ２００５，４３，１９７−２０１
【非特許文献９】Ｇｏｗｄａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，３８，２１，７５５８−７５６９
【非特許文献１０】Ｍ．Ｆｏｌｋｅｒｓ，ＰＬＯＳ ｏｎｅ，２０１１，６，２，ｅｌ４６９７，Ｐａｐｉｃ，２０１２，Ｖｉｒｕｓｅｓ，２０１２，４，５８１．６１２
【非特許文献１１】Ｄａｌｈｏｆｆ Ｃ，Ｌｕｋｉｎａｖｉｃｉｕｓ Ｇ，Ｋｌｉｍａｓａｕｓｋａｓ Ｓ，Ｗｅｉｎｈｏｌｄ Ｅ．，２００６，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２（１）：３１−３２
【非特許文献１２】Ｇ．Ｌｕｋｉｎａｖｉｃｉｕｓ，Ｖ．Ｌａｐｉｅｎｅ，Ｚ．Ｓｔａｓｅｖｓｋｉｊ，Ｃ．Ｄａｌｈｏｆｆ，Ｅ．Ｗｅｉｎｈｏｌｄ，Ｓ．Ｋｌｉｍａｓａｕｓｋａｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００７，１２９，２７５８−２７５９
【非特許文献１３】Ｙ．Ｍｏｔｏｒｉｎ，Ｊ．Ｂｕｒｈｅｎｎｅ，Ｒ．Ｔｅｉｍｅｒ，Ｋ．Ｋｏｙｎｏｖ，Ｓ．Ｗｉｌｌｎｏｗ，Ｅ．Ｗｅｉｎｈｏｌｄ，Ｍ．Ｈｅｌｍ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，１−１０，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ８２５
【非特許文献１４】Ｍ．Ｔｏｍｋｕｖｉｅｎｅ，Ｂ．Ｃｌｏｕｅｔ−ｄ'Ｏｒｖａｌ，Ｉ．Ｃｅｒｎｉａｕｓｋａｓ，Ｅ．Ｗｅｉｎｈｏｌｄ，Ｓ．Ｋｌｉｍａｓａｕｓｋａｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０１２
【非特許文献１５】Ｓ．Ｈａｕｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００８，２８３，３１７０６−３１７１８
【非特許文献１６】Ｓ．Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０
【非特許文献１７】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／
【非特許文献１８】Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．およびＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．，Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｌｏｃｋｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１０９１５−１０９１９，１９９２
【非特許文献１９】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ．ｈｔｍｌ
【非特許文献２０】Ｈ．Ｃ．Ｋｏｌｂ，Ｍ．Ｇ．Ｆｉｎｎ，Ｋ．Ｂ．Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，２００１，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１１３，１１，２０５６−２０７５
【非特許文献２１】Ｈ．Ｃ．Ｋｏｌｂ，Ｍ．Ｇ．Ｆｉｎｎ，Ｋ．Ｂ．Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，２００１，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４０、１１，２００４−２０２１
【非特許文献２２】Ｃ．Ｎ．ＢｏｗｍａｎおよびＣ．Ｅ．Ｈｏｙｌｅ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１０、４９、１５４０−１５７３
【非特許文献２３】Ｓ．Ｓ．ｖａｎ Ｂｅｒｋｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．２０１１，１２３，８９６８−８９８９
【非特許文献２４】Ｅ．Ｌａｌｌａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．２０１１、１２３、８９５６−８９６６
【非特許文献２５】Ａ．Ｈ．Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒａｂ，Ｔ．Ｂｒｏｗｎ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２０１０，３９，１３８８−１４０５
【非特許文献２６】Ｃ．Ｓ．ＭｃＫａｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０，４６，９３１−９３３
【非特許文献２７】Ｗ．Ｓｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，９６５４−９６５５
【非特許文献２８】Ｐ．Ｍ．Ｅ．Ｇｒａｍｌｉｃｈ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００８，４７，８３５０−８３５８
【非特許文献２９】Ｃ．Ｒ．Ｂｅｃｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００９，４８，４９００−４９０８
【非特許文献３０】Ｔ．Ｒ．Ｃｈａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００４，６，２８５３−２８５５
【非特許文献３１】Ｃ．Ｕｔｔａｍａｐｉｎａｎｔ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１２，５１，５８５２−５８５６
【非特許文献３２】Ｙ．Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００９，４８，５３３０−５３３３
【非特許文献３３】Ｙ．Ｗａｎｇ，Ｗ．Ｓｏｎｇ，Ｗ．Ｊ．Ｈｕ，Ｑ．Ｌｉｎ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２００９，４８，５３３０−３
【非特許文献３４】ＫＳ−ＤＦＴ−Ｋａｌｋｕｌａｔｉｏｎｅｎ，Ｗ．Ｋｏｈｎ，Ｌ．Ｊ．Ｓｈａｍ，Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．１９６５、１４０、Ａ１１３３−１１３８
【非特許文献３５】Ｃ．Ｄａｌｈｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００６，２，３１−３２
【非特許文献３６】Ｗ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ｓ．Ｗｉｌｌｎｏｗ，Ｍ．Ｄｕｉｓｋｅｎ，Ｈ．Ｋｌｅｉｎｅ，Ｔ．Ｍａｃｈｅｒｅｙ，Ｋ．Ｅ．Ｄｕｎｃａｎ，Ｄ．Ｗ．Ｌｉｔｃｈｆｉｅｌｄ，Ｂ．Ｌｕｓｃｈｅｒ，Ｅ．Ｗｅｉｎｈｏｌｄ，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ２０１０，４９，５１７０
【非特許文献３７】Ｓ．Ｈａｕｓｍａｎｎ，Ｓ．Ｓｈｕｍａｎ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００５，２８０，３２１０１−３２１０６
【非特許文献３８】Ｍ．Ｔｏｍｋｕｖｉｅｎｅ，Ｂ．Ｃｌｏｕｅｔ−ｄ'Ｏｒｖａｌ，Ｉ．Ｃｅｒｎｉａｕｓｋａｓ，Ｅ．Ｗｅｉｎｈｏｌｄ，Ｓ．Ｋｌｉｍａｓａｕｓｋａｓ，Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌｉｃｋ−ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ ＲＮＡ ｕｓｉｎｇ ａｒｃｈａｅａｌ ｂｏｘ Ｃ／Ｄ ＲＮＰ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，４０，１４，６７６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、依然として、特定のＲＮＡ分子、とりわけｍＲＮＡ分子を細胞から分離し、分析に供するさらなる方法が必要とされている。
【０００９】
したがって、本発明の課題は、そうしたさらなる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この課題は独立請求項の主題によって解決される。本発明の目的にかなった実施態様は従属請求項に記載する。驚くことに、特定の位置で変化した酵素、すなわち、野生型塩基配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）由来のトリメチルグアノシンシンターゼ２（以下、略して「ＧｌａＴｇｓ２」という）が、５'ｍ7ＧｐｐｐＮキャップを持つＲＮＡ種のマーキングおよび／または分離の新たな可能性を開くことが明らかとなった。このｍ7ＧｐｐｐＮキャップ（英語「ｍ7ＧｐｐｐＮ ｃａｐ」）は、Ｎ７の位置でメチル化されたグアノシン残基であり、この残基が、以下の式（ＩＩ）から明らかなように、三リン酸エステル架橋を介してＲＮＡ分子の５'末端に結合している（５'−５'結合）。
【００１１】
【化１】
2016501879.tif 000002
【００１２】
上式で、Ｒ1はＯＨまたはＯＣＨ3である。上式のＢは任意の核酸塩基である。用語ｍ7ＧｐｐｐＮにおけるＮは、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオシド類似体、またはヌクレオチド類似体であり、ｐｐｐは三リン酸塩架橋、Ｇはグアノシン、ｍ7はＮ７のメチル基である。
【００１３】
そのようなキャップを有するのは、例えば真核生物のｍＲＮＡ分子であるが、特定の非コードＲＮＡ種、例えばｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、およびテロメラーゼＲＮＡも同様である。
【００１４】
野生型ＧｌａＴｇｓ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を参照）は２５８種のアミノ酸を含有し、補因子であるＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）を用いて、Ｎ２の位置のキャップ−グアノシンのさらなるメチル化（過剰メチル化）を触媒する（非特許文献１５）。２つのメチル残基のＮ２への転移を触媒できるヒトのトリメチルグアノシンシンターゼｈＴｇｓとは異なり、ランブル鞭毛虫の酵素は、基質であるジメチル化ヌクレオチドを受容しないようであり、酵素によって、１つのメチル残基のみがＮ２に転移される。そのため、本明細書では、実際はジメチルグアノシンシンターゼが関係し、トリメチルグアノシンシンターゼは関係ないと思われる。しかしながら、誤解を避けるために、本明細書では、この酵素について、それでもトリメチルグアノシンシンターゼ、または略してＴｇｓという用語を用いる。
【００１５】
ＡｄｏＭｅｔは「ＳＡＭ」とも略され、硫黄原子が存在するメチル基を転移する補因子として多様な酵素に寄与する。ＣＨ3基が脱離すると、「ＡｄｏＨｃｙ」または「ＳＡＨ」とも略されるＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインが残る。
【００１６】
驚くことに現在になってわかったのが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される野生型ＧｌａＴｇｓ２の３４位におけるアミノ酸交換により、この位置にあるアミノ酸、バリンが、別のアミノ酸と、好ましくは無極性／疎水性、または極性／中性アミノ酸と、特に好ましくはアラニン、グリシン、またはメチオニンと交換されるに至り、このアミノ酸交換が、結果として生じる酵素の酵素活性を変化させ、ＡｄｏＭｅｔ類似体を補因子として利用できる、すなわち、野生型酵素より有効に利用できるようにするということである。好ましくは、バリンの代わりに導入されるアミノ酸は、トリプトファンまたはロイシンではない。それにより、ｍ7ＧｐｐｐＮキャップを持つＲＮＡ種の５’末端の標的修飾の可能性が開け、場合によっては、その後のステップでそこにレポーター基を付加、および／または、このＲＮＡ種を特異的に固定化することができる。
【００１７】
無極性／疎水性アミノ酸の例には、アラニン、バリン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、およびフェニルアラニンがある。極性／中性アミノ酸の例には、チロシン、トレオニン、グルタミン、グリシン、セリン、システイン、およびアスパラギンがある。
【００１８】
用語「ＡｄｏＭｅｔ類似体」は、本明細書では、以下の式（Ｉ）の化合物と理解される。
【００１９】
【化２】
2016501879.tif 000003
【００２０】
上式は、メチル基ではない残基Ｒを硫黄原子に持つ。したがって、ＡｄｏＭｅｔ（Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン）と同じ基本構造を持つ化合物であり、硫黄原子にはメチル基の代わりに別の残基が結合している。ＡｄｏＭｅｔ類似体は、例えば特許文献２に記載されている。
【００２１】
そのような残基の一例に、プロペニルＣＨ2＝ＣＨ−ＣＨ2−がある。メチルの代わりにこの残基を持つ対応するＡｄｏＭｅｔ類似体（５’−［（Ｓ）−［（３Ｓ）−３−アミノ−３−カルボキシプロピル］プロプ−２−エニルスルフォニオ］−５'−デオキシアデノシン）は「ＡｄｏＰｒｏｐｅｎ」と表され、以下の式（Ｉａ）で示される。
【００２２】
【化３】
2016501879.tif 000004
【００２３】
残基Ｒのこの他の例として、プロピニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ2−、ブチニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ2−ＣＨ2−、ペント−２−エン−４−イニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−、ベンジルＰｈ−ＣＨ2−（Ｐｈ＝Ｃ6Ｈ5）、およびアジドブテニルＮ3−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−がある。本明細書では、プロピニル残基ＣＨ≡Ｃ−ＣＨ2−の場合、ＡｄｏＭｅｔ類似体を「ＡｄｏＰｒｏｐｉｎ」と呼び、ブチニル残基ＣＨ≡Ｃ−ＣＨ2−ＣＨ２−の場合、「ＡｄｏＢｕｔｉｎ」、ペント−２−エン−４−イニル-残基ＣＨ≡Ｃ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−の場合、「ＡｄｏＥｎＹｎ」、ベンジル残基の場合、「ＡｄｏＢｅｎｚｙｌ」、アジドブテニル残基Ｎ3−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−の場合、「ＡｄｏＡｚｉｄ」と呼ぶ。ペント−２−エン−４−イニル残基については、本明細書では、用語「ペンテニル残基」を用いる。
【００２４】
したがって、第１の実施態様において、本発明は、以下のような分離タンパク質または合成タンパク質を提供する。
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列を示す、もしくは含む、または
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を示し、もしくは含み、このとき条件として、その相同なアミノ酸配列において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される３４位に相当する位置にバリンが存在しない、または
ｃ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を示し、もしくは含み、そのアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列と８５％超、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％同一であり、このとき条件として、その相同なアミノ酸配列において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される３４位に相当する位置にバリンが存在しない、または
ｄ．ａ、ｂ、またはｃに示されるアミノ酸配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、６５、７０、８０、９０、もしくは少なくとも１００種のアミノ酸、好ましくは少なくとも１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは少なくとも２００種のアミノ酸、特に好ましくは少なくとも２１０、２２０、２３０、２４０、もしくは少なくとも２５０種のアミノ酸の連続部分配列を示し、もしくは含み、このとき条件として、その部分配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される３４位にアミノ酸もしくは対応する相同なアミノ酸を含む、および
ｅ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１（ランブル鞭毛虫ＡＴＣＣ５０５８１のＧＬ５０５８１＿２６３５、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＥＥＴ００１２０．１）で示されるアミノ酸配列を示さない。
【００２５】
タンパク質が「あるアミノ酸配列を示す」という表現は、タンパク質がその配列から成る、すなわち、Ｃ末端および／またはＮ末端にそれ以上のアミノ酸がないことを意味している。タンパク質が「あるアミノ酸配列を含む」という表現は、Ｃ末端および／またはＮ末端にそれ以上のアミノ酸を持たないタンパク質に限定することなく、タンパク質がその配列を含有することを意味しているが、この用語は、タンパク質があるアミノ酸配列を「示す」、すなわち、配列に並ぶアミノ酸のみから成り、かつ、配列に現れる順序で存在するという表現も包括している。
【００２６】
本明細書で使用する用語「タンパク質」は、ペプチド結合により互いに結び付いている任意の数のアミノ酸から成るポリマーを指し、用語「ペプチド」および「ポリペプチド」を含む。タンパク質におけるアミノ酸の直鎖状配列は「アミノ酸配列」と呼ぶ。
【００２７】
用語「合成」は、本明細書では、「人工的に作られた」ことを意味し、そのままでは、すなわち、それが有するアミノ酸配列が、自然に存在しないタンパク質を含む。「分離する」は、本明細書では、タンパク質がその本来の、すなわち自然な環境から、例えば、真核生物細胞または原核生物細胞から取り出されたことを意味する。
【００２８】
タンパク質に関する用語「相同（な）」は、あるタンパク質のアミノ酸配列が、それと比較される別のタンパク質のそれと、大幅に一致するが完全には同一でないということを意味する。本明細書では、例えば、あるタンパク質が、１種のアミノ酸を除いて、ランブル鞭毛虫のトリメチルグアノシンシンターゼと同一のアミノ酸配列を示すことを意味する。本明細書では、同一または類似の残基が存在するかどうかを、ある配列における位置を、別の配列における対応する位置とそのつど比較および確認することによって、２つのタンパク質間に相同性が存在することが確認できる。同一または類似のアミノ酸が特定の最小限部分を占めていれば、互いに比較した２つの配列は相同である。同一性とは、２つの配列を比較したときに、同等部分にそれぞれ同じアミノ酸があることを言う。このとき、場合によっては、配列の隙間の考慮し、参照配列をできるだけうまく整列させる必要があるかもしれない。これに関して、類似のアミノ酸とは、化学物理的性質が同じ、または同等であるアミノ酸である。あるアミノ酸を、化学物理的性質が同じ、または同等の別のアミノ酸と交換することは、「保存的交換」と言う。アミノ酸の物理化学的性質の例には、例えば、疎水性や電荷がある。特に、そのような同一でないアミノ酸、つまりコンピュータープログラム「Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ」、略してＢＬＡＳＴ（非特許文献１６；例えば、非特許文献１７参照）に基づいたＢＬＯＳＵＭ６２置換行列（非特許文献１８）で「Ｐｏｓｉｔｉｖｅ」とされる、すなわちＢＬＯＳＵＭ６２置換行列に正のスコアを持つアミノ酸が、類似のアミノ酸と見なされる。本発明の目的のために、アミノ酸の少なくとも４５％、好ましくは少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％が同一または類似、好ましくは同一であれば、２つの配列間に相同関係があるものとする。特に、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ（非特許文献１６；例えば、非特許文献１７参照）を使用し、標準初期設定パラメーター（「Ｅｘｐｅｃｔ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」＝１０、「Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ」＝３、「Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ」＝１１、「Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ」＝１）とＢＬＯＳＵＭ６２置換行列（非特許文献１８）とを用いて、同一性または類似性（「Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ」）、好ましくは、少なくとも４５％、好ましくは少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性が得られる場合に、２つの配列間に相同関係があるものとする。このとき、好ましくは、最小長が２０、好ましくは最小長が２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、８０、もしくは１００、さらに好ましくは最小長が１２０、１４０、１６０、１８０、もしくは２００アミノ酸、また��最小長が各アミノ酸配列のアミノ酸の２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％であるものとする。特に好ましくは、各タンパク質の完全な長さであるものとする。当業者には、その専門知識に基づいて、利用可能なＢＬＡＳＴプログラムのどれが、例えばＢＬＡＳＴｐが、相同関係の確認のために考慮されるか容易に明らかである。さらに、必要に応じて、比較すべき２つ以上の配列の相同関係の判断に用いることのできる、当業者には既知のこの他のプログラムも存在する。そのようなプログラムは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＭＢＬ）のウェブサイトで利用できる（例えば、非特許文献１９参照）。特に、本出願における「相同」は、一致、すなわちアミノ酸配列における少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％、特に好ましくは少なくとも９９．５％の同一性を意味する。「相同」は、特に、トリメチルグアノシンシンターゼを別のタンパク質と比較して、６０以下、好ましくは５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、または１１以下、特に好ましくは９、８、７、６、５、４、３、２以下、または１つの位置で、何らかのアミノ酸が不足している、または追加されていることも意味し得る。
【００２９】
用語「アルキル」は、直鎖アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、およびオクチル）ならびに分岐鎖アルキル基（例えば、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル）などの飽和脂肪族（非芳香族）基を含む。この用語は、Ｏ−、Ｎ−、Ｓ−、またはＰ−アルキル基（例えば、−Ｏ−メチル）、すなわち、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、またはリン原子を介して化合物に結合しているアルキル基も含む。
【００３０】
表現「Ｃn−Ｃm」では、ｎおよびｍがそれぞれ正の整数であり、かつ、ｍがｎより大きいが、この「Ｃn−Ｃm」は、ある化合物または残基の炭素（Ｃ）原子の数の範囲を意味する。この表現は、本明細書において、範囲限界値ｎとｍとの間の整数の中間値全体を、詳しく言うと互いに独立して、明示的に含むものとする。したがって、表現「Ｃ1−Ｃ10」（ｎ＝１、ｍ＝１０）は、１〜１０、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の炭素原子を持つ化合物、基、または残基を意味する。したがって、「Ｃ1−Ｃ10」は、同時に例えば「Ｃ2−Ｃ6」、すなわち２、３、４、５、もしくは６個の炭素原子、または「Ｃ1−Ｃ4」、すなわち１、２、３、もしくは４個の炭素原子、または「Ｃ4−Ｃ9」、すなわち４、５、６、７、８、または９個の炭素原子を含む。相応に、用語「Ｃ2−Ｃ10アルキル」は、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の炭素原子を持つアルキル基を意味し、ｎ＝２からｍ＝１０までの範囲にある、ｎおよびｍの値の組み合わせ全体、例えば、「Ｃ5−Ｃ7アルキル」、すなわち５、６、または７個の炭素原子を持つアルキルを含む。
【００３１】
用語「アルケニル」は、直鎖および分岐鎖アルケニル基を含む、少なくとも１つのＣ−Ｃ二重結合を持つ不飽和脂肪族（非芳香族）基を意味する。この用語は、Ｏ−、Ｎ−、Ｓ−、またはＰ−アルケニル基（例えば、−Ｏ−プロペニル）、すなわち、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、またはリン原子を介して化合物に結合しているアルケニル基も含む。用語「Ｃ2−Ｃ10アルケニル」は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の炭素原子を持つアルケニル基を意味する。
【００３２】
用語「アルキニル」は、直鎖および分岐鎖アルキニル基を含む、少なくとも１つのＣ−Ｃ三重結合を持つ不飽和脂肪族（非芳香族）基を意味する。この用語は、Ｏ−、Ｎ−、Ｓ−、またはＰ−アルケニル基（例えば、−Ｏ−ブチニル）、すなわち、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、またはリン原子を介して化合物に結合しているアルキニル基も含む。用語「Ｃ2−Ｃ10アルキニル」は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の炭素原子を持つアルキニル基を意味する。
【００３３】
用語「アルケニニル」は、直鎖および分岐鎖アルケニニル基を含む、少なくとも１つのＣ−Ｃ二重結合および少なくとも１つのＣ−Ｃ三重結合を持つ不飽和脂肪族（非芳香族）基を意味する。この用語は、Ｏ−、Ｎ−、Ｓ−、またはＰ−アルケニニル基、すなわち、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、またはリン原子を介して化合物に結合しているアルケニニル基も含む。用語「Ｃ4−Ｃ10アルケニニル」は、４、５、６、７、８、９、または１０個の炭素原子を持つアルケニニル基を意味する。
【００３４】
用語「シクロアルキル」は、脂環式基、すなわち環状飽和脂肪族（非芳香族）基、例えば、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルを意味する。この用語は、Ｏ−、Ｎ−、Ｓ−、またはＰ−シクロアルキル基、すなわち、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、またはリン原子を介して化合物に結合しているシクロアルキル基も含む。用語「シクロアルケニル」、「シクロアルキニル」、および「シクロアルケニニル」は、相応に、上述の定義に従って、環状脂肪族（非芳香族）アルケニル、アルキニル、またはアルケニニルを意味し、二重結合および／または三重結合が、環、すなわち環系の内部または外部に存在し得る。
【００３５】
用語「ヘテロアルキル」は、炭化水素構造の１つまたは複数の炭素原子が、別の原子（ヘテロ原子）、例えば、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、またはリン原子と置換されているアルキル基を意味する。この用語は、Ｏ−、Ｎ−、Ｓ−、またはＰ−ヘテロアルキル基、すなわち、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、またはリン原子を介して化合物に結合しているヘテロアルキル基も含む。用語「ヘテロアルキル」は、炭化水素構造の１つまたは複数の炭素原子が、別の原子、例えば、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、またはリン原子と置換されているシクロアルキルも含む。用語「ヘテロアルケニル」、「ヘテロアルキニル」、「ヘテロアルケニニル」は、相応に、炭化水素構造の１つまたは複数の炭素原子が、別の原子（ヘテロ原子）、例えば、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、またはリン原子と置換されているアルケニル、アルキニル、およびアルケニニル、ならびにシクロアルケニル、シクロアルキニル、およびシクロアルケニニルと理解される。用語「Ｃ1−Ｃ10ヘテロアルキル」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の炭素原子および少なくとも１つのヘテロ原子を持つアルキル基を意味する。相応のことが、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、およびヘテロアルケニニルについても該当する。
【００３６】
「アジドアルキル」は、本明細書では、アジド基−Ｎ3を持つアルキルと理解される。この用語は、アジド基を持つ環状アルキルおよびヘテロアルキルも含む。「アジドアルケニル」、「アジドアルキニル」、および「アジドアルケニニル」は、相応に、アルケニル、アルキニル、およびアルケニニル、環状アルケニル、環状アルキニル、および環状アルケニニル、ならびにヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、およびヘテロアルケニニルと理解される。
【００３７】
用語「置換（された）」は、炭化水素構造の１つまたは複数の炭素原子において水素原子と置き換えられた１つまたは複数の置換基が存在することを意味する。そうした置換基の例には、オキソ基、ヒドロキシル基、リン酸基、シアン基、およびアミノ基のほか、例えば、ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、アルキル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールがある。
【００３８】
「核酸」は、そのモノマーがヌクレオチドであるポリマーと理解される。ヌクレオチドは、糖残基と、窒素含有複素環式有機塩基（ヌクレオチド塩基または核酸塩基）と、リン酸基とから成る化合物である。糖残基は、通常、５炭糖、つまりＤＮＡではデオキシリボース、ＲＮＡではリボースである。ヌクレオチドの結合は、リン酸基を介して、通常、ヌクレオシド（核酸塩基および糖から成る化合物）の糖成分の３'炭素原子と、隣のヌクレオシドの糖成分の５'炭素原子との間のホスホジエステル架橋によって行われる。本明細書で使用する用語「核酸」は、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＤＮＡ／ＲＮＡ混合配列を含む。
【００３９】
「核酸塩基」は、ＲＮＡまたはＤＮＡ中に存在する有機塩基と理解される。核酸塩基は、プリン（Ｒ）とピリミジン（Ｙ）に大別される。プリンは、グアニン（Ｇ）およびアデニン（Ａ）であり、ピリミジンは、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）である。リン酸化ヌクレオシド、例えばヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）、およびヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）も、ヌクレオチドと言う。一リン酸基、二リン酸基（ピロリン酸基）、または三リン酸基は、通常、ヌクレオシドの糖成分５'炭素原子に結合しているが、例えば３'炭素原子と結合していてもよい。
【００４０】
「ヌクレオシド」は、本明細書では、グリコシド結合を介して結合している、糖残基（糖成分）と有機塩基（塩基成分）、例えば複素環式有機塩基、特に窒素含有複素環式有機塩基とから成る有機分子と理解される。糖残基はたいていの場合５炭糖、例えばデオキシリボースまたはリボースであるが、別の糖、例えば３炭糖、４炭糖、または６炭糖であってもよい。したがって、特に、ヌクレオシドは以下の一般式（ＩＩＩ）の化合物と理解される。
【００４１】
【化４】
2016501879.tif 000005
【００４２】
上式で、Ｂは窒素含有複素環式有機塩基、例えば核酸塩基であり、Ｒ3およびＲ4は、互いに独立したＨまたはＯＨである。
【００４３】
「ヌクレオシド類似体」は、本明細書では、ヒトの体内に自然には存在しないが、ヒトの体内に自然に存在するヌクレオシドに構造的に類似するため、例えば細胞および／またはウイルスの酵素から、基本的に天然のヌクレオシドに応じて加工、例えばリン酸化し、ＲＮＡ鎖またはＤＮＡ鎖に挿入できる化合物と理解される。ヌクレオシド類似体はそれ自体がヌクレオシドであってよい。しかしながら、例えば、上述の性質を有する別の化合物、例えば、複素環式塩基、ならびに糖でない非環式残基および／もしくは残基から成る化合物、または炭素環式化合物と糖残基とから成る化合物であってもよい。ヌクレオシド類似体は、上述の意味においてそれ自体がヌクレオシドであるか、またはヌクレオシドに構造的および／または機能的に類似している。ヌクレオシド類似体は、狭義の意味では、糖成分または塩基成分を必ずしも含有する必要はないため、本明細書では、塩基成分に類似する成分（塩基類似体）または糖成分に類似する成分（糖類似体）についても述べる。本明細書で糖成分または塩基成分について述べる場合、文脈から明確に他のものが示されない限り、ヌクレオシド類似体の対応する類似成分を含むものとする。ヌクレオシド類似体の例には、例えば、ＡＺＴ（３'−アジド−２'，３'−ジデオキシチミジン、アジドチミジン）、２'，３'−ジデオキシイノシン（ジダノシン）、２'，３'−ジデオキシシチジン（ザルシタビン）、および２−アミノ−９−（（２−ヒドロキシエトキシ）メチル）−１Ｈ−プリン−６（９Ｈ）−オン（アシクロビル）がある。ヌクレオシドホスホネートもヌクレオシド類似体であってよい。
【００４４】
「ヌクレオチド」は、本明細書では、リン酸化ヌクレオシド、例えばヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）、およびヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）と理解される。一リン酸基、二リン酸基（ピロリン酸基）、または三リン酸基は、通常、ヌクレオシドの糖成分５'炭素原子に結合しているが、例えば３'炭素原子と結合していてもよい。「ヌクレオチド類似体」は、相応に、リン酸化ヌクレオシド類似体と理解される。
【００４５】
「総代謝回転数」（英語：Ｔｏｔａｌ Ｔｕｒｎｏｖｅｒ Ｎｕｍｂｅｒ［ＴＴＮ］）は、1モルの補因子または酵素から総反応時間の間に作られる生成物のｍｏｌ数と理解される。
【００４６】
本発明によるタンパク質は、好ましくは、以下の式（Ｉ）に示す化合物の残基Ｒの、ｍ7ＧＴＰ、つまりｍ7ＧｐｐｐＮのグアノシン、または以下の式（ＩＩ）の化合物のＮ２への転移を酵素的に触媒する。
【００４７】
【化５】
2016501879.tif 000006
【００４８】
【化６】
2016501879.tif 000007
【００４９】
上式で、ＲＮＡはリボ核酸を意味し、Ｒ1はＯＨまたはＯＣＨ3を意味し、Ｎはヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオシド類似体、またはヌクレオチド類似体を意味し、Ｂは核酸塩基を表し、そしてＲは、置換または非置換Ｃ2-10アルキル、置換または非置換Ｃ2-10アルケニル、置換または非置換Ｃ2-10アルキニル、置換または非置換Ｃ4-10アルケニニル、置換または非置換Ｃ3-12シクロアルキル、置換または非置換Ｃ3-12シクロアルケニル、置換または非置換Ｃ5-12シクロアルキニル、置換または非置換Ｃ5-12シクロアルケニニル、置換または非置換Ｃ1-10ヘテロアルキル、置換または非置換Ｃ2-10ヘテロアルケニル、置換または非置換Ｃ2-10ヘテロアルキニル、置換または非置換Ｃ4-10ヘテロアルケニニル、置換または非置換Ｃ1-10アジドアルキル、置換または非置換Ｃ2-10アジドアルケニル、置換または非置換Ｃ2-10アジドアルキニル、置換または非置換Ｃ4-10アジドアルケニニル、置換または非置換ベンジル、プロペニルＣＨ2＝ＣＨ−ＣＨ2−、プロピニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ2−、ブチニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ2−ＣＨ2−、ペンテニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−、およびアジドブテニルＮ3−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−から成る基から選択される。ベンジルの場合、パラ配位での置換が好ましく、アルケン、アルキン、またはアジドによる置換が特に好ましい。
【００５０】
本発明によるタンパク質が、式（Ｉ）に示すＡｄｏＭｅｔ類似体の残基Ｒの転移を触媒するということは、ＡｄｏＭｅｔを補因子としても利用できず、メチル基をｍ7ＧｐｐｐＮキャップのＮ２に転移することを意味するわけではない。むしろ、生理学的条件下でのＡｄｏＭｅｔ類似体との反応が、本発明によるタンパク質によって、少なくとも同様に、好ましくは、野生型酵素と比べて、より高い割合で、補因子に対してより高い親和性で、より大きい収量で、および／またはより高い総代謝回転数（Ｔｏｔａｌ Ｔｕｒｎｏｖｅｒ Ｎｕｍｂｅｒ［ＴＴＮ］）で触媒されることを意味する。
【００５１】
好ましくは、本発明によるタンパク質の総代謝回転数ＴＴＮが、５より大きく、好ましくは、≧６、≧７、≧８、≧９、または≧１０、および／または、本発明によるタンパク質の総代謝回転数ＴＴＮが、それぞれ平均値および同一のＡｄｏＭｅｔ類似体、好ましくはＡｄｏＰｒｏｐｅｎに関して、野生型酵素の総代謝回転数の少なくとも２倍である。さらに好ましくは、本発明によるタンパク質では、ＡｄｏＰｒｏｐｅｎに対するＡｄｏＭｅｔの総代謝回転数、すなわちＴＴＮAdoMet：ＴＴＮAdoPropenが、≦２０、特に好ましくは、≦１５、さらに好ましくは、≦１４、≦１３、≦１２、≦１１、または≦１０である。
【００５２】
本発明によるタンパク質によって触媒される、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン類似体の残基Ｒの、ｍＲＮＡへの転移は、以下の再現図で示される。
【００５３】
【化７】
2016501879.tif 000008
【００５４】
本発明によるタンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の部分配列のみを示す、または含む場合、特に好ましくは、そのタンパク質が、上述の転移反応の少なくとも１つを触媒する。
【００５５】
好ましくは、本発明によるタンパク質が以下である。
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、または１０で示されるアミノ酸配列を示す、もしくは含む、または
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、または１０で示されるアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を示し、もしくは含み、このとき条件として、その相同なアミノ酸配列において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、または１０で示される３４位に相当する位置にバリンが存在しない、または
ｃ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、または１０で示されるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を示し、もしくは含み、その相同なアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、または１０で示されるアミノ酸配列と８５％超、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％同一であり、このとき条件として、そのアミノ酸配列において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、または１０で示される３４位に相当する位置にバリンが存在しない、または
ｄ．ａ、ｂ、またはｃに示されるアミノ酸配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、６５、７０、８０、９０、もしくは少なくとも１００種のアミノ酸、好ましくは少なくとも１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは少なくとも２００種のアミノ酸、特に好ましくは少なくとも２１０、２２０、２３０、２４０、もしくは少なくとも２５０種のアミノ酸の連続部分配列を示し、もしくは含み、このとき条件として、その部分配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、または１０で示される３４位にアミノ酸もしくは対応する相同なアミノ酸、を含む、および
ｅ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１で示されるアミノ酸配列を示さない。
【００５６】
好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列の３４位に、イソロイシンまたはトレオニンが存在しない。特に好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列の３４位に、アラニン、グリシン、またはメチオニン、好ましくはアラニンが存在する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列の７６位に、好ましくはアスパラギン酸、トレオニン、ロイシン、もしくはバリン、特に好ましくはアスパラギン酸が存在し、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列の９２位に好ましくはアルギニンもしくはアラニンが存在する。特に好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列の３４位にアラニン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列の７６位にアスパラギン酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列の９２位にアルギニンまたはアラニンが存在する。
【００５７】
残基Ｒは、好ましくはプロペニルＣＨ2＝ＣＨ−ＣＨ2−、プロピニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ2−、ブチニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ2−ＣＨ2−、ペンテニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−、ベンジルＰｈ−ＣＨ2−、またはアジドブテニルＮ3−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−、特に好ましくはプロペニルＣＨ2＝ＣＨ−ＣＨ2−、ベンジルＰｈ−ＣＨ2−、またはペンテニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−である。
【００５８】
別の実施態様では、本発明は、本発明によるタンパク質をコードする核酸にも関係する。
【００５９】
さらに別の実施態様では、本発明は、ＲＮＡ分子、特にｍＲＮＡ分子のｍ7ＧｐｐｐＮキャップを修飾する方法に関係し、ｍ7ＧｐｐｐＮキャップを持つＲＮＡ分子を、以下の式（Ｉ）で示されるＡｄｏＭｅｔ類似体の存在下で、本発明の第１の実施態様によるタンパク質に接触させるステップを含む。
【００６０】
【化８】
2016501879.tif 000009
【００６１】
上式で、Ｒは、置換または非置換Ｃ2-10アルキル、置換または非置換Ｃ2-10アルケニル、置換または非置換Ｃ2-10アルキニル、置換または非置換Ｃ4-10アルケニニル、置換または非置換Ｃ3-12シクロアルキル、置換または非置換Ｃ3-12シクロアルケニル、置換または非置換Ｃ5-12シクロアルキニル、置換または非置換Ｃ5-12シクロアルケニニル、置換または非置換Ｃ1-10ヘテロアルキル、置換または非置換Ｃ2-10ヘテロアルケニル、置換または非置換Ｃ2-10ヘテロアルキニル、置換または非置換Ｃ4-10ヘテロアルケニニル、置換または非置換Ｃ1-10アジドアルキル、置換または非置換Ｃ2-10アジドアルケニル、置換または非置換Ｃ2-10アジドアルキニル、置換または非置換Ｃ4-10アジドアルケニニル、置換または非置換ベンジルＰｈ−ＣＨ2−、プロペニルＣＨ2＝ＣＨ−ＣＨ2−、プロピニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ2−、ブチニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ2−ＣＨ2−、ペンテニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−、およびアジドブテニルＮ3−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−から成る基から選択され、このとき、ｍ7ＧｐｐｐＮキャップのグアノシンのＮ２への残基Ｒの転移が行われることを条件とする。
【００６２】
残基Ｒは、好ましくはプロペニルＣＨ2＝ＣＨ−ＣＨ2−、プロピニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ2−、ブチニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ2−ＣＨ2−、ペンテニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−、ベンジルＰｈ−ＣＨ2−、またはアジドブテニルＮ3−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−、特に好ましくはプロペニルＣＨ2＝ＣＨ−ＣＨ2−、ベンジルＰｈ−ＣＨ2−、またはペンテニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−である。
【００６３】
特に好ましいのは、この方法において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列を示す本発明によるタンパク質を使用し、かつ、このタンパク質において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列の３４位にアラニン、グリシン、またはメチオニンが、好ましくはアラニンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列の７６位にアスパラギン酸、トレオニン、ロイシン、またはバリンが、好ましくはアスパラギン酸が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列の９２位にアルギニンまたはアラニンが存在し、かつ、ＡｄｏＭｅｔ類似体として、ＡｄｏＰｒｏｐｅｎ、ＡｄｏＥｎＹｎ、またはＡｄｏＢｅｎｚｙｌが用いられる場合である。さらに好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される３４位にアラニン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される７６位にアスパラギン酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される９２位にアルギニンまたはアラニンが存在するタンパク質を、ＡｄｏＰｒｏｐｅｎ、ＡｄｏＥｎＹｎ、またはＡｄｏＢｅｎｚｙｌの存在下で、適切な条件のもとで、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡと接触させ、酵素反応を進行させる。
【００６４】
ｍ7ＧｐｐｐＮキャップの酵素修飾に続いて、グアノシンのＮ２に転移させた残基Ｒを、例えば酵素的方法または非酵素的化学的方法でさらに修飾することができる。
【００６５】
好ましい手段は、生体直交型化学反応、好ましくは生体直交型クリック反応を用いて、残基Ｒの化学修飾を行うことである。そのような反応は、当業者には既知であり、例えば、光クリック法、チオール−エン クリック法、および環状付加反応、例えばＣｕ（Ｉ）触媒によるヒュスゲン付加環化がある（例えば、非特許文献２０〜３２参照）。
【００６６】
「光クリック反応」は、ピラゾリン環状付加物の形成下での、アルケンとニトリル−イミンとの１，３−双極性環状付加と理解される。このとき、シクロ付加物の形成の基本的な前提条件として、用いられた遊離体の類似のフロンティア軌道エネルギーが受け入れられる。そのため、光クリック反応では、ニトリル−イミンにおける最高被占軌道のエネルギーの変化によって反応性に影響が及ぶため、タイプＩの環状付加の１つと見なすことができることが示されている（非特許文献３３参照）。光クリック反応は、生体直交性だけでなく、非蛍光遊離体からの蛍光生成物の形成も傑出しており、これはとりわけ、生細胞で適用する際に背景信号を回避するのに有利である。ｍＲＮＡキャップの光クリックに基づく機能付与が可能かどうかの手掛かりは、当業者は例えば、コーン−シャム密度汎関数理論計算（非特許文献３４）を用いて得ることができる。
【００６７】
本発明による方法のこの好ましい実施形態を用いて、５’末端にキャップ構造を持つ、またはそのようなキャップ構造を付加することができるＲＮＡの５’末端のキャップ構造を、２つのステップ、または、場合によってはそれより多いステップから成る方法で、化学酵素的手段によって特異的に修飾することができる。第１のステップでは、本発明によるタンパク質を用いて、メチル残基の代わりに残基Ｒをｍ7ＧｐｐｐＮキャップのＮ２に転移させることにより、キャップ構造を酵素的に修飾する。第２のステップ、つまり化学的ステップで、この残基で修飾したＲＮＡを適切な分子、例えば適切なバイオマーカー（例えば、ビオチン）を用いて、例えばクリックケミストリーの公知の方法で置換し、さらに修飾できる。キャップ構造を介したＲＮＡの固定化を可能にするカラム材料も、この分子に数えられる。この固定化は、例えば、非共有の相互作用により、対応するマトリックスを用いて、直接的または間接的に行うことができる。固定化は、共有結合を用いて行うこともできる。そうすることで、相互作用は例えばマトリックスで安定が増し、これにより、例えば、別の成分をより効率的に分離できる厳重な洗浄ステップが可能になる。それと同時に、例えば、複雑な細胞溶解物からｍＲＮＡを特異的に分離できる。
【００６８】
さらに別の実施態様において、本発明は、本発明の第１の実施態様によるタンパク質と、以下の式で示されるＡｄｏＭｅｔ類似体とを含む検査キットに関する。
【００６９】
【化９】
2016501879.tif 000010
【００７０】
上式で、Ｒは、置換または非置換Ｃ2-10アルキル、置換または非置換Ｃ2-10アルケニル、置換または非置換Ｃ2-10アルキニル、置換または非置換Ｃ4-10アルケニニル、置換または非置換Ｃ3-12シクロアルキル、置換または非置換Ｃ3-12シクロアルケニル、置換または非置換Ｃ5-12シクロアルキニル、置換または非置換Ｃ5-12シクロアルケニニル、置換または非置換Ｃ1-10ヘテロアルキル、置換または非置換Ｃ2-10ヘテロアルケニル、置換または非置換Ｃ2-10ヘテロアルキニル、置換または非置換Ｃ4-10ヘテロアルケニニル、置換または非置換Ｃ1-10アジドアルキル、置換または非置換Ｃ2-10アジドアルケニル、置換または非置換Ｃ2-10アジドアルキニル、置換または非置換Ｃ4-10アジドアルケニニル、置換または非置換ベンジルＰｈ−ＣＨ2−、プロペニルＣＨ2＝ＣＨ−ＣＨ2−、プロピニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ2−、ブチニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ2−ＣＨ2−、ペンテニルＣＨ≡Ｃ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−、およびアジドブテニルＮ3−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−から成る基から選択される。
【００７１】
本発明による検査キットの特に好ましい実施形態では、ＡｄｏＭｅｔ類似体が、ＡｄｏＰｒｏｐｅｎ、ＡｄｏＥｎＹｎ、またはＡｄｏＢｅｎｚｙｌであり、タンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列を示し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される３４位にアラニン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される７６位にアスパラギン酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される９２位にアルギニンまたはアラニンを持つ。
【００７２】
以下に、具体的に説明することのみを目的として、本発明を実施例に基づいて詳述する。
【００７３】
１．Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン類似体の合成
１．１  ５'−［（Ｓ）−［（３Ｓ）−３−アミノ−３−カルボキシプロピル］プロプ−２−エニルスルフォニオ］−５'−デオキシアデノシン（ＡｄｏＰｒｏｐｅｎ）の合成
ＡｄｏＭｅｔ類似体ＡｄｏＰｒｏｐｅｎは、Ｄａｌｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．の方法（非特許文献３５）に従って生成した。ＡｄｏＰｒｏｐｅｎを合成するために、２０ｍｇのＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（５２μｍｏｌ）を、撹拌しながら１：１のギ酸：酢酸３ｍＬに溶解した。この溶液を氷浴で１０分間撹拌して冷却してから、２６４μＬ（３．１２ｍｍｏｌ）の３−ブロモプロペンを加えた。次いで、この反応液を４日間室温で撹拌し、冷たい脱塩水３０ｍＬを加えて反応を止めた。水相は、３回、それぞれ５ｍＬのジエチルエーテルで抽出し、次いで、減圧下で脱水した。得られた固体を、５ｍＬの脱塩水＋０．０１％ＴＦＡに溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。
【００７４】
１．２  ５'−［（Ｓ）−［（３Ｓ）−３−アミノ−３−カルボキシプロピル］ペント−２−エン−４−イニルスルフォニオ］−５'−デオキシアデノシン（ＡｄｏＥｎＹｎ）の合成
ＡｄｏＭｅｔ類似体ＡｄｏＥｎＹｎは、Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．の方法（非特許文献３６）に従って生成した。
【００７５】
ＡｄｏＭｅｔ類似体ＡｄｏＥｎＹｎを合成するために、ペント−２−エン−４イン−１−オールを、第１のステップで、メタンスルホン酸エステルに置換した。そのために、２４０ｍｇ（６．００ｍｍｏｌ）の水酸化ナトリウムを６ｍＬのジクロルメタンで再懸濁し、４２６μＬ（５．５０ｍｍｏｌ）のメタンスルホニルクロライドを添加して、この懸濁液を氷浴で冷却した。次いで、（Ｅ）−および（Ｚ）−ペント−２−エン−４イン−１−オール（４７２μＬ、６．０２ｍｍｏｌ）の混合物を添加し、反応混合物を１６時間室温で撹拌した。５０ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で抽出を行った。溶媒を真空で取り除き、活性アルコールを、メタン酸およびエタン酸（１：１）の１ｍＬ溶液に直接溶解した。この溶液を、７．２ｍｇ（１９μｍｏｌ）のＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインに添加し、室温で１４時間撹拌した。次いで、これを３０ｍＬのｄｄＨ2Ｏに加え、５０ｍＬのジエチルエーテルで３回抽出した。水相を凍結乾燥させた。残渣を、０．０１％ＴＦＡを加えた２．５ｍＬのｄｄＨ2Ｏに入れ、ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳを用いて分析した。次いで、分取ＨＰＬＣで精製を行った。
【００７６】
１．３  ５'−［（Ｓ）−［（３Ｓ）−３−アミノ−３−カルボキシプロピル］ベンジル］−５'−デオキシアデノシン（ＡｄｏＢｅｎｚｙｌ）の合成
ＡｄｏＭｅｔ類似体ＡｄｏＢｅｎｚｙｌは、Ｄａｌｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．の方法（非特許文献３５）に従って生成した。ＡｄｏＢｅｎｚｙｌを合成するために、９．２ｍｇのＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（２４μｍｏｌ）を、撹拌しながら１：１のギ酸：酢酸１．３８ｍＬに溶解した。この溶液を氷浴で１０分間撹拌して冷却してから、１７１．２μＬ（１．４４ｍｍｏｌ）の臭化ベンジルを加えた。次いで、この反応液を４日間室温で撹拌し、冷たい脱塩水１５ｍＬを加えて反応を止めた。水相は、３回、それぞれ２．５ｍＬのジエチルエーテルで抽出し、次いで、減圧下で脱水した。得られた固体を、２．５ｍＬの脱塩水＋０．０１％ＴＦＡに溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。
【００７７】
２．ＨＰＬＣと組み合わせた活性アッセイ
ＷＴ−ＧｌａＴｇｓ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４〜１０で示される本発明によるタンパク質により酵素的に触媒された転移であって、合成によって生成されたＡｄｏＭｅｔ類似体に存在する残基プロペニル（ＡｄｏＰｒｏｐｅｎ）、ペンテニル（ＡｄｏＥｎＹｎ）、およびベンジル（ＡｄｏＢｅｎｚｙｌ）の、ｍ7ＧｐｐｐＡ（Ａ＝アデニン）のグアノシンのＮ２原子への転移を、ＨＰＬＣと組み合わせた活性アッセイを用いて調べた。容量８μＬを用いた一般的な調合物を表１にまとめる。
【００７８】
表１：ｍ7ＧｐｐｐＡを使用した活性アッセイに用いた成分
【００７９】
【表１】
2016501879.tif 000011
【００８０】
反応緩衝液２：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ；１０ｍＭ ＭｇＣｌ2；１００ｍＭ ＮＨ4ＯＡｃ；ｐＨ８．４
ＭＴＡＮは５'−メチルチオアデノシン／Ｓ−アデノシルホモシステインヌクレオシダーゼを指す。ＬｕｘＳはＳ−リボシルホモシステインリアーゼを指す。
【００８１】
より容量の多い１０μＬまたは２０μＬの調合物では、それに応じて適合させた。使用するＡｄｏＭｅｔ類似体の量は、ＡｄｏＭｅｔ類似体のジアステレオマーのクロマトグラム上のピーク面積が、ｍ7ＧｐｐｐＡによって引き起こされたシグナルの面積に一致するように合わせた。反応は、通常、反応開始直後（ｔ０）および３７℃で３時間後（ｔ１８０）に止め、分析ＨＰＬＣとＭＡＬＤＩ−ＴＯＦとを用いて調べた。
【００８２】
以下の表２では、ＧｌａＴｇｓ２−ＷＴの活性を、調べたＧｌａＴｇｓ２変異体と比較している。ここでは、ＡｄｏＭｅｔ類似体としてＡｄｏＰｒｏｐｅｎを用いた。
【００８３】
表２：ＡｄｏＰｒｏｐｅｎを用いた、ＧｌａＴｇｓ２−ＷＴおよびＧｌａＴｇｓ２変異体の活性。
【００８４】
【表２】
2016501879.tif 000012
【００８５】
ＴＴＮ＝Ｔｏｔａｌ Ｔｕｒｎｏｖｅｒ Ｎｕｍｂｅｒ（総代謝回転数）。アミノ酸交換は、当業者に既知の方法（元のアミノ酸−位置−新しいアミノ酸）で記載しており、アミノ酸は1文字コードを用いた。例えば、Ｖ３４Ａは、元のアミノ酸バリンが、３４位でアラニンに置換されたことを意味する。
【００８６】
本発明によるタンパク質は、野生型酵素に匹敵する、またはそれより高い活性を少なくとも１つの活性を有することが示される。
【００８７】
酵素量が同じ場合、例えば、変異体ＧｌａＴｇｓ２−Ｖ３４Ａから、ＡｄｏＰｒｏｐｅｎではｍ7ＧｐｐｐＡの９５％が、ＡｄｏＥｎＹｎでは１０％が置換された。例えば、変異体ＧｌａＴｇｓ２−Ｖ３４Ａでは、ベンジルの転移も確認できた。
【００８８】
ＡｄｏＰｒｏｐｅｎに関してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるＧｌａＴｇｓ２変異体の酵素パラメーターを表３に示す。
【００８９】
表３：ＡｄｏＰｒｏｐｅｎに関するＧｌａＴｇｓ２−ＷＴおよびＧｌａＴｇｓ２−Ｖ３４Ａの酵素パラメーター
【００９０】
【表３】
2016501879.tif 000013
【００９１】
ＧｌａＴｇｓ２変異体ＧｌａＴｇｓ２-Ｖ３４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）は、野生型酵素ＧｌａＴｇｓ２−ＷＴと比べて、ＡｄｏＰｒｏｐｅｎに対する親和性が高く、ＡｄｏＰｒｏｐｅｎとの活性が高い。熱安定性は野生型酵素と同程度である。ＡｄｏＭｅｔに関する動力学的パラメーターは野生型酵素と同程度である（非特許文献３７参照）。
【００９２】
３．熱安定性
タンパク質の安定性は、一定の範囲内での周囲温度の上昇といった変性影響に耐える能力、および天然立体配座を維持する能力を示す。熱安定性の尺度として、Ｔ50値を用いることができる。Ｔ15／50は、１５分間保温した後に酵素がその活性を５０％失う温度である。Ｔ50を測定するために、分析対象のタンパク質をサーマルサイクラーで１５分間さまざまな温度で加熱し、その一方で、タンパク質のプローブを氷上で培養した。次いで、先に加熱したタンパク質で活性試験を実施した。このとき、氷上で培養したプローブを活性が１００％の基準として用いた。値を標準化した後、Ｔ15／50を、ボルツマン−フィットを用い、ソフトウェアＯｒｉｇｉｎを使って測定した。
【００９３】
表４から明らかなように、ＧｌａＴｇｓ２変異体ＧｌａＴｇｓ２−Ｖ３４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ＧｌａＴｇｓ２−Ｖ３４Ｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、およびＧｌａＴｇｓ２−Ｖ３４Ｍ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）は類似の熱安定性を有したか、または、より高い熱安定性、すなわちより高温に対する高い安定性を示した。
【００９４】
表４：野生型と比較した、ＧｌａＴｇｓ２変異体ＧｌａＴｇｓ２−Ｖ３４Ａ、ＧｌａＴｇｓ２−Ｖ３４Ｍ、ＧｌａＴｇｓ２−Ｖ３４Ｇの熱安定性
【００９５】
【表４】
2016501879.tif 000014
【００９６】
４．クリックケミストリーを用いた、酵素的に修飾したＲＮＡキャップの化学修飾
４．１  チオール−エンクリック（ＴＥＣ）を用いたビオチン化
８００μΜのｍ7ＧｐｐｐＡを、酵素的にプロペニル2ｍ7ＧｐｐｐＡ １（ａ2ｍ7ＧｐｐｐＡ；ｍ7ＧｐｐｐＡのＮ２がプロペニル）にアルケニル化し、１／１０容量の１Ｍ過塩素酸の添加、または６８℃で５分間保温して反応を止めた。
【００９７】
調合物を遠心分離機にかけ、置換にビオチン−チオール２を用いた。これを約３０秒間アルゴンで脱気し、空気がない状態で、１ｍＭラジカル開始剤ＶＡ−０４４およびビオチン−チオール２（約５０倍モル過剰）と混合した。調合物を４４℃で８時間培養し、ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した。
【００９８】
【化１０】
2016501879.tif 000015
Katalysator：触媒
【００９９】
ＶＡ０４４＝２，２'−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］ジヒドロクロリド
【０１００】
４．２  Ｃｕクリック反応を用いた蛍光標識
Ｃｕクリック反応を、Ｔｏｍｋｕｖｉｅｎｅ ｅｔ ａｌ．（非特許文献３８）に従って実施した。まず、約１００μΜペント−２−エン−４−イニル2ｍ7ＧｐｐｐＡ（ｐ2ｍ7ＧｐｐｐＡまたはＥｎＹｎ2ｍ7ＧｐｐｐＡ）４を酵素的に生成し、１／１０容量の１Ｍ過塩素酸を添加して反応を止めた。
【０１０１】
Ｃｕクリック反応では、３００ｍＭ ＣｕＢｒ溶液（ＤＭＳＯ／ｔＢｕＯＨ ３：１中）を新たに添加し、１１１ｍＭ ＴＢＴＡ溶液（ＤＭＳＯ／ｔＢｕＯＨ ３：１中）で１：１０に希釈した。
【０１０２】
次いで、１０μＬの酵素触媒反応に対し、８μＬのＤＭＳＯ／ｔＢｕＯＨ、３μＬの３０ｍＭ ＣｕＢｒ溶液（ＴＢＴＡ中）、２，５μＬのＥｔｅｒｎｅｏｎアジド５（Ｅｔｅｒｎｅｏｎ−Ａｚｉｄ ４８０／６３５、Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ，Ｋａｔ．Ｎｒ．ＣＬＫ−ＦＡ１５−１）（ＤＭＳＯ／ｔＢｕＯＨ中、２．５ｍＭ）を用いた。反応は、適宜ボルテックスしながら３７℃で１時間培養し、ゲル電気泳動分析を行った。ＴＢＴＡ＝トリス［（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル］アミン）、ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド。
【０１０３】
【化１１】
2016501879.tif 000016
【０１０４】
４．３  交差メタセシスを用いた蛍光標識
交差メタセシスを用いて、以下の一般的な図に従ってアリル修飾ｍＲＮＡキャップの蛍光標識を行った。この蛍光標識では、フルオレセインｏ−アクリレート８、または他の蛍光標識化アクリレートと、第二世代Ｈｏｖｅｙｄａ−Ｇｒｕｂｂｓ触媒１０を用いた。
【０１０５】
【化１２】
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30%tBuOH in H2O, 2-5 h：Ｈ2Ｏ中３０％ｔＢｕＯＨ、２〜５時間
RT bis 37°C：室温３７℃以下
【０１０６】
このために、例えばアリル修飾ｍＲＮＡキャップ７と、ＤＭＳＯに溶解したフルオレセインｏ−アクリレート８、ならびに３０％ｔＢｕＯＨ水溶液に加えた２ｍｏｌ％のＨｏｖｅｙｄａ−Ｇｒｕｂｂｓ触媒１０の２つの同等物とを、同様に３０％ｔＢｕＯＨ水溶液中で、室温または３７℃にて５時間、遮光して培養した。分析は、２０％のポリアクリルアミドゲル電気泳動分析と、インゲル蛍光検出とを用いて行った。
【０１０７】
４．４  光クリック反応を用いたキャップ構造の機能付与
以下に、一例として、光クリック反応を用いたアルケニル化ｍＲＮＡキャップ、およびアルキニル化ｍＲＮＡキャップの蛍光標識について説明する。これは、テトラゾール１１および１２のニトリル−イミン１１ａおよび１２ａをキャップ類似体ｍ7ＧｐｐｐＡで置換した。
【０１０８】
【化１３】
2016501879.tif 000018
【０１０９】
４．４．１  アルケニル化ｍＲＮＡキャップの蛍光標識
【０１１０】
【化１４】
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5 min, 254nm：5分、２５４ｎｍ
20 h, 4°C：２０時間、４℃
【０１１１】
まず、１ｍＭ ｍ7ＧｐｐｐＡを、ＡｄｏＰｒｏｐｅｎおよびＧｌａＴｇｓ２−Ｖ３４Ａの存在下でａ2ｍ7ＧｐｐｐＡに置換し、次いで、結果として生じる混合物を６８℃に加熱し、透析して、置換されなかったＡｄｏＰｒｏｐｅｎを取り除く。置換されなかったＡｄｏＰｒｏｐｅｎを取り除くことで、これが次の光クリック反応で同様にニトリル−イミンと反応するのを防げる。このステップの後、ａ2ｍ7ＧｐｐｐＡの水溶液を、アセトニトリルおよびテトラゾール１１（６１７μΜ）と混ぜ、丁寧に混合した後、黒いマイクロタイタープレートで５分間、２５４ｎｍで照射した。このとき、反応物と光源との距離を最低限にして照射することが、効果的な実施のために必須であり、間隔を広げると、反応性の高いニトリル−イミンが形成されなかった、または最小限しか形成されなかったと見られることが示された。プローブで得られた成分は、最大２０時間４℃で保温した後、ゲル電気泳動的に分離し、蛍光生成物の形成に関して分析した。このとき、ゲルは３６５ｎｍの波長で照らして撮影した。アルケニル化キャップａ2ｍ7ＧｐｐｐＡの存在下で実施した反応では、青緑色の蛍光を発する生成物が検出できた。ＵＶシャドウイングを用いたゲルの平行分析により、検出された蛍光生成物は、電気泳動の移動度が小さく、そのため、おそらくキャップより分子量が大きいことが示された。これは、対応するバンドが、期待された光クリック生成物（Ｐ１−アデノシン（５'）−Ｐ３−［Ｎ２−エチル−２−（４−（４−メトキシフェニル）−２−フェニルピラゾリン），７−メチルグアノシン（５'）］三リン酸；別名：Ｎ２−メトキシピラゾリンエチル−ｍ7ＧｐｐｐＡ）１４を示す可能性と一致しており、その理由は、この生成物が、電荷が同じ場合、キャップ類似体ａ2ｍ7ＧｐｐｐＡ １３よりも分子量が大きいからと思われる。対照調合物では、相応する蛍光シグナルは検出されなかった。対照は、酵素なし、ＡｄｏＰｒｏｐｅｎなし、ｍ7ＧｐｐｐＡなし、および変性酵素の存在下で生物交換を実施した。したがって、これらの対照すべてで、光クリック反応の基質を意味するはずのアルケニル化キャップの形成が確認できなかった。したがって、ａ2ｍ7ＧｐｐｐＡが非存在下で、光クリック反応後に蛍光生成物が観察できなかったことから、テトラゾール１１を用いてのアルケニル化キャップの蛍光標識は、効果的かつ特異的に実施することができた。
【０１１２】
これは、ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いた質量分光分析でも検証した。この分析では、反応混合物において、期待された光クリック生成物１４の質量が検出できた（ｂｅｒ．［Ｍ］+＝１０５１．２３ｍ／ｚ；ｄｅｔ．［Ｍ］+＝１０５１．２３ｍ／ｚ）。
【０１１３】
細胞における適用可能性に関しても、テトラゾール１１およびａ2ｍ7ＧｐｐｐＡ１３の光クリック反応をさらに特徴付けるために、最初の動力学的分析を実施した。反応は上述のように実施したが、プローブの一部を、それぞれ保温の５、３０、１２０、および２４０分後に、蛍光生成物の検出によって分析した。この際、光クリック生成物１４が５分後に早くも検出された。検出された蛍光強度に基づいて、それより後の時点ではさらなる置換は認められなかった。そのことから、その動力学に基づいて、この反応が、生細胞におけるｍＲＮＡの可視化にも適しているということがわかる。というのも、保温後短時間で早くも目に見えるシグナルが得られるからである。その他の点では、５分後にＵＶ光（λ＝２５４ｎｍ）を照射してＰＣ３細胞を調べると、細胞の形態への影響は認められたものの、その活力への影響は認められなかったことから、検査時にＵＶ照射によって細胞を死滅させることなく、適用が可能であることが明らかとなった。したがって、遊離体であるａ2ｍ7ＧｐｐｐＡを用いて、高い反応速度で蛍光生成物を形成するのに加え、テトラゾールの活性化のために照射を持続することも、生細胞における適用に適合している。
【０１１４】
上述した光クリック反応は、ニトリル−イミン１２ａとａ2ｍ7ＧｐｐｐＡ １３との組み合わせについても効果的に実施でき、対応する光クリック生成物（Ｐ１−アデノシン（５'）−Ｐ３−［Ｎ２−エチル−２−（４−（４−メチルベンゾエート）−２−フェニルピラゾリン），７−メチルグアノシン（５'）］三リン酸；別名：Ｎ２−ベンゾナートピラゾリンエチル−ｍ７ＧｐｐｐＡ）１６を得た。
【０１１５】
この際、テトラゾール１１と１２の光クリック生成物は、ａ2ｍ7ＧｐｐｐＡと発光極大において見たところ異なることが観察された。したがって、ｉｎ ｖｉｖｏでも任意の波長で放射蛍光体を発生させるために、場合によっては、光クリック反応を用いることができる。
【０１１６】
【化１５】
2016501879.tif 000020
Adenin：アデニン
【０１１７】
４．４．２  アルキニル化ｍＲＮＡキャップの蛍光標識
ニトリル−イミン１１ａとｐ2ｍ7ＧｐｐｐＡ １５との組み合わせについても光クリック反応を行った。
【０１１８】
【化１６】
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Adenin：アデニン
【０１１９】
上述した、テトラゾール１１を用いてａ2ｍ7ＧｐｐｐＡを蛍光標識するための光クリック反応を、アルキニル化キャップ類似体ｐ2ｍ7ＧｐｐｐＡ １５を修飾するために使用した。そのために、ＡｄｏＥｎＹｎを用いたｍ7ＧｐｐｐＡの生物交換を、ＧｌａＴｇｓ２−Ｖ３４Ａを用いて、かつ、対照として、変性酵素の存在下で実施した。これにより、両方の調合物に同じ成分が存在するが、対照では光クリック遊離体ｐ2ｍ7ＧｐｐｐＡの形成が生じないことが保証された。２５４ｎｍの波長の照射により光クリック反応を開始した後、反応調合物および対照調合物を４℃で２０時間培養し、得られた成分をゲル電気泳動的に分離してから、蛍光シクロ付加物の形成に関して特徴付けた。３６５ｎｍの波長でゲルを照射すると、反応混合物で蛍光バンドが検出できた。これは対照では出現せず、対応するピラゾリン（Ｐ１−アデノシン（５'）−Ｐ３−［Ｎ２−ブト−２−エン−４−（４−（４−メトキシフェニル）−２−フェニルピラゾリン）イル，７−メチルグアノシン（５'）］三リン酸；別名：Ｎ２−メトキシピラゾリンブテニル−ｍ7ＧｐｐｐＡ）１７に分類できた。
【０１２０】
【化１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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