(57)【要約】【課題】天然成分から果実細胞を作製するための大規模プロセスを提供する。【解決手段】本発明は、増殖させたブドウ果実細胞の細胞株カルス培養物の大規模インビトロ生産プロセスに関し、当該プロセスにより製造される生成物に関し、かつレスベラトロールを含む複数のポリフェノールの複合体を含む組成物であって、レスベラトロール対ポリフェノールの比率が、自然に成長したブドウにおけるレスベラトロール対ポリフェノールの比率よりも大きい組成物に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで増殖したブドウ果実細胞の細胞株カルス培養物の大規模生産プロセスであって、
フラスコ内でブドウ細胞を増殖させるステップと、
前記フラスコから最初のバイオリアクタ内へ前記ブドウ細胞を植菌するステップと、
前記ブドウ細胞を、前記最初のバイオリアクタから、最後のバイオリアクタまたは中間のバイオリアクタである別のバイオリアクタ内へ植菌するステップと、
前記最後のバイオリアクタから前記ブドウ細胞を収穫するステップとを含み、
前記最初のバイオリアクタまたは前記別のバイオリアクタのうちの少なくとも一方が使い捨てであり、
前記最後のバイオリアクタから収穫された前記ブドウ細胞が、乾燥されることを特徴とする大規模プロセス。
【請求項２】
前記プロセスにおいて用いられる各バイオリアクタの大きさが、その前に前記ブドウ細胞を増殖させたバイオリアクタよりも大きいことを特徴とする請求項１に記載の大規模プロセス。
【請求項３】
前記別のバイオリアクタが中間のバイオリアクタである場合には、前記ブドウ細胞を別の中間のバイオリアクタまたは前記最後のバイオリアクタに植菌する追加ステップを行うことを特徴とする請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
前記最初のバイオリアクタまたは前記別のバイオリアクタが、４〜１０リットルのバイオリアクタであることを特徴とする請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
前記最初のバイオリアクタまたは前記別のバイオリアクタが、１０〜５０リットルのバイオリアクタであることを特徴とする請求項１に記載のプロセス。
【請求項６】
前記最初のバイオリアクタまたは前記別のバイオリアクタが、５０〜２００リットルのバイオリアクタであることを特徴とする請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】
前記最初のバイオリアクタまたは前記別のバイオリアクタが、２００〜５００リットルのバイオリアクタであることを特徴とする請求項１に記載のプロセス。
【請求項８】
前記最初のバイオリアクタまたは前記別のバイオリアクタが、２００〜１０００リットルのバイオリアクタであることを特徴とする請求項１に記載のプロセス。
【請求項９】
前記ブドウ細胞をガンボーグＢ５培地で増殖させることを特徴とする請求項１に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記ガンボーグＢ５培地が、マグネシウム塩、リン酸塩及び硝酸塩、またはそれらの組合せで強化されたものであることを特徴とする請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記ガンボーグＢ５培地が、ＫＮＯ３、ＭｇＳＯ４、ＭｇＮＯ３またはＮａＨ２ＰＯ４、あるいはそれらの組合せで強化されたものであることを特徴とする請求項９に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記使い捨てバイオリアクタが、１若しくは複数のポリエチレン層から作られたものであることを特徴とする請求項１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記使い捨てバイオリアクタが、ポリエチレンの内層及び外層並びにナイロンの中間層から作られたものであることを特徴とする請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記ガンボーグＢ５培地が、植物ホルモンを含まないことを特徴とする請求項８に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記ガンボーグＢ５培地が、植物ホルモンを含むことを特徴とする請求項８に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記ガンボーグＢ５培地が、２〜４％のスクロースで強化されたものであることを特徴とする請求項９に記載のプロセス。
【請求項１７】
大規模スケールアッププロセスにおいてインビトロで増殖したブドウ果実細胞の細胞株カルス培養物を含む粉末状の組成物であって、
前記ブドウ果実細胞の細胞株カルス培養物が、ブドウ果実横断切片、ブドウ果皮、ブドウ果実果肉、ブドウ種子、有核または無核の品種のブドウ胚、あるいはブドウ種皮のうちの１つ若しくは複数に由来するものであり、
前記ブドウ果実細胞の細胞株カルス培養物が、粉末１ｋｇ当たり少なくとも１０００ｍｇの量のレスベラトロールを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１８】
当該組成物の単回投与後における、血漿中のレスベラトロールの２つの濃度ピークによって特徴付けられることを特徴とする請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
レスベラトロールを含む複数のポリフェノールの複合体を含む組成物であって、
レスベラトロール対ポリフェノールの比率が１：２０以上であることを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、果実細胞の大規模生産プロセスに関する。本発明の一実施形態は、一次及び二次代謝産物を含む果実細胞の大量インビトロ生産プロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
大規模プロセスは、当技術分野において知られており、かつ様々な原料の工業生産のために必要とされている。小規模プロセスと同じ手段によって大規模プロセスを行うことはできないので、たとえ小規模プロセスが存在する場合でも、原料の大規模生産のための特有のプロセスを設計しなければならない。
【０００３】
栄養補助食品は、果実細胞に天然に含まれている例えばポリフェノールなどの所望の有効成分を提供する合成プロセスを用いて作製される場合がある。しかし、合成プロセスを用いると、有効成分とともに天然成分が提供されない。天然成分は、常にではないが製剤の有効性に寄与する。
【０００４】
他の種類の栄養補助食品は、天然植物から作製される。しかし、植物から栄養補助食品を作製する既知の大規模プロセスは全て、所望の有効成分を得るために、作製された植物細胞を抽出することを含む。しかし、例えばポリフェノール含有植物を抽出するとき、最終生成物は苦い場合がある。また、植物の特定部分のみが所望の量の有効成分を含むので、当該特定部分のみをうまく抽出することもできる。
【０００５】
果実細胞の作製のための小規模プロセスは当技術分野において知られているが、大規模プロセスは、一次代謝産物の生産を増大させる一方で二次代謝産物の生産を最小限に抑える傾向があるため、設計がより困難である。ポリフェノールなどの有効成分は二次代謝産物であるので、大規模プロセスでの生産は手間がかかる。
【０００６】
ポリフェノール含有果実抽出物由来の栄養補助食品は、有益な効果があることで有名である。これらの制御的な構成物質の原料としての赤ワインの使用は、アルコール含有量及び糖含有量が高いために制限されている。さらに、ワイン及びワイン用ブドウの治療効果は、品種、生産地、収穫年（年間気候）、加工などに依存し、したがって、これらの制御的な化合物の原料としての赤ワイン、ブドウまたはブドウ種子への依存が一様な、または一貫した原料供給をもたらさないということが明らかにされている。さらに、果実は、多くの場合、残留殺菌剤、病原体、農薬及び汚染物質によって汚染されている。
【０００７】
さらに、赤ワイン及び果実抽出物から得られるポリフェノールの胃腸送達の潜在的有効性は、標的組織及び細胞に対する当該ポリフェノールのバイオアベイラビリティによって制限される。腸を通過する間のバイオアベイラビリティに顕著な相違があるために、所与の食物に含まれる特定のポリフェノールの存在量と、生体内での活性化合物としてのその濃度との間に、相関関係を指摘することはできない。例えばフラボノイドは用量の０〜６０％が小腸で吸収され、排出半減期は２〜４８時間である。ほとんどのポリフェノールは、腸内で広く代謝され、主に血清及び尿中にグルクロン酸抱合物、メチルまたは硫酸塩として存在する。既知のポリフェノールの中でも、赤ブドウ、赤ワイン及び他の食品、例えば異なる種類のベリー類及びピーナッツに含まれるファイトアレキシン・レスベラトロール（トランス−３，５，４'−トリヒドロキシスチルベン）（ＲＥＳ）は、注目の大部分を集めていた。これは、節度をもって赤ワインを消費している結果として高脂肪食を摂取しているにもかかわらず冠状動脈性疾患の発生が少ないことに関連する現象である「フレンチパラドックス」の原因であると考えられている。しかし、ＲＥＳのバイオアベイラビリティは、水溶性の低さや肝取り込みの高さなどのＲＥＳの物理化学的特性によって低下させられる。さらに、ＲＥＳの経口バイオアベイラビリティは、迅速かつ広範な代謝及び結果として生じる様々な代謝産物の形成に起因して非常に低い。
【０００８】
ＲＥＳ活性及び効果を調べる研究は、主に３つのレスベラトロール源に依存している。３つのレスベラトロール源とは、純粋な合成ＲＥＳと、天然植物由来のＲＥＳ（例えばイタドリ抽出物）生成物と、それには及ばないものの、赤ブドウそのものまたは赤ブドウ生成物（赤ワイン、ブドウジュース、ブドウ抽出物）である。赤ブドウ細胞（ＲＧＣ；イスラエル国フルーチュラ・バイオサイエンス社（Fruitura Bioscience Ltd）製）は、レスベラトロール及び赤ブドウに天然に存在する他の成分を含むポリフェノールの全マトリックスを含むブドウ属ヴィニフェラ種（Vitis Vinifera L.）品種の果実に由来する培養細胞の、自然のままの特許で保護された製剤である。
【０００９】
ＲＥＳ構造の芳香族基は、ＲＥＳが抗酸化物質として機能することを可能にしかつ、アテローム性動脈硬化において生じるＬＤＬ酸化など、疾患過程における重要な反応を防止する。また、ＲＥＳは、癌や糖尿病などの慢性疾患の根底にある炎症反応を調節することも分かっている。動物実験は、急性炎症及び痛みの和らぎにおけるＲＥＳの関与を示した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、天然成分から果実細胞（果実細胞の一次代謝産物及び二次代謝産物の両方の生産を含む）を作製するための大規模プロセスが必要とされている。また、大規模プロセスで作製され得る天然（植物性）組成物であって、有効成分量が一貫して繰り返し起こり（例えばクローンの作製）、非常に生物学的に利用可能であり、かつ様々な疾患及び疾病の治療及び予防のために容易に投与されるような組成物が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一実施形態では、インビトロで増殖したブドウ果実細胞の細胞株カルス培養物の生産のための大規模プロセスであって、フラスコ内でブドウ細胞を増殖させるステップと、ブドウ細胞をフラスコから最初のバイオリアクタに植菌するステップと、ブドウ細胞を最初のバイオリアクタから別のバイオリアクタに植菌するステップ（ここで、別のバイオリアクタは最後のバイオリアクタまたは中間のバイオリアクタであり、最初のバイオリアクタまたは別のバイオリアクタのうちの少なくとも一方が使い捨てである）と、最後のバイオリアクタからブドウ細胞を収穫するステップとを含み、最後のバイオリアクタから収穫されたブドウ細胞が、乾燥されることを特徴とする大規模プロセスが提供される。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態では、本プロセスにおいて用いられる各バイオリアクタの大きさは、それよりも前にブドウ細胞を増殖させたバイオリアクタの大きさよりも大きい。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態では、別のバイオリアクタが中間のバイオリアクタである場合には、ブドウ細胞を別の中間のバイオリアクタまたは最後のバイオリアクタに植菌する追加ステップを行う。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態では、最初のバイオリアクタまたは別のバイオリアクタは、４〜１０、１０〜５０、５０〜２００、２００〜１０００または１０００〜５０００リットルのバイオリアクタである。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態では、ブドウ細胞をガンボーグＢ５培地で増殖させる。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態では、ガンボーグＢ５培地は、マグネシウム塩、リン酸塩または硝酸塩、あるいはそれらの組合せで強化されたものである。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態では、ガンボーグＢ５培地は、ＫＮＯ３、ＭｇＳＯ４、ＭｇＮＯ３またはＮａＨ２ＰＯ４、あるいはそれらの組合せで強化されたものである。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態では、使い捨てバイオリアクタは、１若しくは複数のポリエチレン層から作られたものである。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態では、使い捨てバイオリアクタは、ポリエチレンの内層及び外層並びにナイロンの中間層から作られたものである。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態では、ガンボーグＢ５培地は植物ホルモンを含まない。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態では、ガンボーグＢ５培地は植物ホルモンを含む。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態では、ガンボーグＢ５培地は、２〜４％のスクロースで強化されたものである。
【００２３】
本発明の一実施形態では、大規模スケールアッププロセスにおいてインビトロで増殖したブドウ果実細胞の細胞株カルス培養物を含む粉末状の組成物であって、ブドウ果実細胞の細胞株カルス培養物が、ブドウ果実横断切片、ブドウ果皮、ブドウ果実果肉、ブドウ種子、有核または無核の品種のブドウ胚、あるいはブドウ種皮のうちの１つ若しくは複数に由来するものであり、かつブドウ果実細胞の細胞株カルス培養物が、粉末１ｋｇ当たり少なくとも１０００ｍｇの量（１０００ｍｇ／ｋｇ）のレスベラトロールを含む組成物が提供される。
【００２４】
本発明については、本明細書において、添付の図面を参照して単に例として説明されている。ここで、具体的に図面を詳細に参照して、示されている特定の形態は例として本発明の好適実施形態を説明するためのものであり、本発明の原理及び概念的側面の最も有用で容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために示されていることを強調する。これに関して、本発明の基本的な理解のために必要である以上に詳細に本発明の構造細部を説明することはない。本明細書の説明及び図面は、本発明のいくつかの形態を如何にして実行し得るかを当業者に明らかにしている。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】カラギーナン注射の前に、ＲＧＣ製剤、インドメタシン及び対照として水でそれぞれ処理したラットにおける足浮腫の測定結果（体積パーセント）を示している。反復測定のための二元配置分散分析法を用いて統計分析を行い、次にボンフェローニ・ポストホックテスト（ボンフェローニ法）を用いた。対照群（１Ｍ）と陽性対照群（２Ｍ）との比較は、２時間及び４時間に統計的に有意な差（ｐ＜０．００１）を示した。対照群とＲＧＣ製剤（３Ｍ）群との比較は、２時間及び４時間に統計的に有意な差（ｐ＜０．００１）を示した。
【図２】本研究中にホットプレートによって測定された群の痛覚過敏作用の分布を示す（結果は、時間の関数としての「ベースラインからのホットプレート潜時，％」として表されている）。反復測定のための二元配置分散分析法を用いて統計分析を行い、次にボンフェローニ法を用いた。対照群（１Ｍ）と陽性対照群（２Ｍ）との比較は、２時間及び４時間に統計的に有意な差（ｐ＜０．０５−０．０１）を示した。対照群とＲＧＣ（３Ｍ）との比較は、４時間に統計的に有意な差（ｐ＜０．０１）を示した。
【図３】ホットプレートで測定された群の痛覚過敏作用の分布を示す（結果は、時間の関数としての「ホットプレート潜時Δ，ベースライン−実時間」として表されている）。反復測定のための二元配置分散分析法を用いて統計分析を行い、次にボンフェローニ法を用いた。対照群（１Ｍ）と陽性対照群（２Ｍ）との比較は、２時間及び４時間に統計的に有意な差（ｐ＜０．０５−０．０１）を示した。対照群とＲＧＣ処理マウス（３Ｍ）との比較は、４時間に統計的に有意な差（ｐ＜０．０１）を示した。
【図４】大規模使い捨てバイオリアクタ内において強化ガンボーグＢ５培地で増殖させた４つの異なるバッチの赤ブドウ細胞の増殖曲線を示す。赤ブドウ細胞は指数増殖し、２０日後から最大４０日後に５００ｇ／１の新鮮（生）バイオマスが得られた。
【図５】水へのレスベラトロール（ＲＥＳ）の溶解度の結果を、ＲＧＣ−ＲＥＳ、合成−ＲＥＳ及び植物−ＲＥＳの溶解度と比較して示す。
【図６Ａ】全トランス型ＲＥＳの、１回分の用量のＲＧＣ−ＲＥＳを投与した後の血漿含有量を表している。示されている値は平均値である（ｎ＝１５）。
【図６Ｂ】遊離トランス型ＲＥＳの、１回分の用量のＲＧＣ−ＲＥＳを投与した後の血漿含有量を表している。示されている値は平均値である（ｎ＝１５）。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明を十分に理解するために、以下の詳細な説明において数々の具体的詳細を説明する。しかし、これらの具体的詳細なしでも本発明を実施することができることは、当業者には理解されるであろう。他の例では、本発明を不明瞭にしないように、公知の方法、手順及び成分についての詳細説明はしない。
【００２７】
本発明の種々の実施形態は、果実細胞の大規模インビトロ生産プロセスに関する。本発明のいくつかの実施形態では、本プロセスは、果実細胞の抽出を含まない。驚いたことに、本明細書に記載されている大規模プロセスにより製造された生成された果実細胞は、大量のポリフェノール、とりわけ二次代謝産物レスベラトロールを含むことが示された。本発明は、プロセスのスケールアッププロセスの結果として、ポリフェノールの全マトリックス及び他の、赤ブドウ細胞に天然に存在する健康に良い成分を含み、かつ生のブドウよりもブドウレスベラトロール濃度が非常に高い（４０〜８００倍またはそれ以上）、赤ブドウ細胞（ＲＧＣ）固有の組成物を提供する（実験９及び表９を参照）。
【００２８】
本明細書において、「ポリフェノール」なる語は、２以上のフェノール基を有する天然の植物有機化合物を指す。ポリフェノールは、フェノール酸などの単純な分子からタンニンなどの大きな高分子化合物まで様々であり得る。ポリフェノールのフェノール環は、通常、様々な糖分子、有機酸及び／または脂質に共役する。この共役化学構造の相違が、様々なポリフェノール化合物の健康上の特性及び作用機序の化学的分類及びバリエーションの原因である。ポリフェノールの例には、アントシアニン、バイオフラボノイド（下位分類のフラボン、フラボノール、イソフラボン、フラバノール、及びフラバノンを含む）、プロアントシアニン、キサントン、フェノール酸、スチルベン及びリグナンが含まれるが、これらに限定されるものではない。レスベラトロール（３，４，５−トリヒドロキシスチルベン）は、ポリフェノールの一種であり、モノマー形態で現れるポリフェノールのスチルベンである；トランス型レスベラトロール、シス型レスベラトロール、トランス型グルコシド及びシス型グルコシド。
【００２９】
本発明の一実施形態によれば、果実はブドウである。ブドウは、色づいたブドウ（例えば、赤色、黒色、紫色、青色及びそれらの間の色の変化）であってよい。あるいは、ブドウは、色づいていないブドウ（例えば、緑色または白色、またはそれらの間の色の変化）であってよい。
【００３０】
本発明のこの態様の果実は、野生品種または栽培（培養）品種のものであり得る。栽培ブドウの例には、ブドウ属に属するブドウが含まれる。ブドウ属の品種の例には、ブドウ属ヴィニフェラ種（Vitis vinifera）、シルべストリス種（V. silvestris）、ムスカディニア種（V. muscadinia）、ロトゥンディフォリア種（V. rotundifolia）、リパリア種（V. riparia）、シャトルウォーシー種（V. shuttleworthii）、ラブルスカ種（V. lubrisca）、ダビディ種（V. daviddi）、アムレンシス種（V. amurensis）、ロマネリ種（V. romanelli）、エースティバリス種（V. aestivalis）、シンシアナ種（V. Cynthiana）、シネリア種（V. cineria）、パルメイト種（V. palmate）、ムンソニアーナ種（V. munsoniana）、コルディフォリア種（V. cordifolia）、ハイブリッドＡ２３−７−７１、アセリフォリア種（V. acerifolia）、トレレアシー種（V. treleasei）及びベチュリフォリア種（V. betulifolia）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
いくつかの実施形態によれば、果実細胞は、色づいたブドウまたは色づいていないブドウから得られる。本明細書において説明されているように、いくつかの実施形態によれば、果実細胞は、果実細胞培養物から作成される。本発明のいくつかの実施形態によれば、果実細胞は、ブドウ果実細胞の培養物から作成される。いくつかの実施形態によれば、ブドウ果実細胞の培養物は、ブドウ果実横断切片、ブドウ果皮、ブドウ果実果肉、ブドウ種子、有核または無核の品種のブドウ胚、あるいはブドウ種皮のうちの１つ若しくは複数に由来する。別の実施形態によれば、果実細胞培養物は、植物の任意の部分に由来するものであってよい。植物の任意の部分には、胚乳、アリューロン層、胚（または胚盤及び子葉としての胚の一部）、果皮、茎、葉、塊茎、毛状突起及び根が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ポリフェノールを含む原料の量は果実によって異なり得るが、果実細胞培養物を作製するための培養プロトコールの使用は、製剤及びその含有量の再現性を保証する。したがって、同じ培養物から作製した果実細胞の様々なバッチは、類型的なＨＰＬＣフィンガープリントを有する。いくつかの実施形態によれば、各バッチにおける様々な原料の濃度は変化し得るが、上記したように、同じ培養物から作製した場合、ＨＰＬＣフィンガープリントは全てのバッチで一貫している。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態では、大規模スケールアッププロセスにおいてインビトロで増殖したブドウ果実細胞の細胞株カルス培養物を含む粉末形態の組成物であって、ブドウ果実細胞の細胞株カルス培養物が、ブドウ果実横断切片、ブドウ果皮、ブドウ果実果肉、ブドウ種子、有核または無核の品種のブドウ胚、あるいはブドウ種皮のうちの１つ若しくは複数に由来するものであり、かつブドウ果実細胞の細胞株カルス培養物が、粉末１ｋｇ当たり少なくとも１０００ｍｇの量（１０００ｍｇ／ｋｇ）のレスベラトロールを含む組成物が提供される。本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に記載の大規模プロセスの種々の実施形態により製造されるブドウ細胞におけるレスベラトロールの少なくとも９０％は、トランス型グルコシドレスベラトロールである。
【００３４】
いくつかの実施形態によれば、本発明のプロセスで作製された果実細胞に含まれる様々なポリフェノールの相対量は、農業により生産されたブドウ果実に含まれる様々なポリフェノールの相対量とは異なる。このことは、例３の表９にはっきりと見られる。表９は、本発明の種々の実施形態により大規模プロセスで生成された乾燥ブドウ細胞培養物における全レスベラトロールを、ブドウ中のレスベラトロールの量と比較したものである。いくつかの実施形態によれば、本発明のプロセスで作製される果実細胞においては、農業により生産されるブドウ果実に比べて、特定のポリフェノールの量が増大される。いくつかの実施形態によれば、果実細胞中のレスベラトロールの量が増大される。いくつかの実施形態によれば、果実細胞（ブドウ細胞であり得る）を乾燥させて粉末にした後の、果実細胞（ブドウ細胞であり得る）に含まれるレスベラトロールの量は、１０００〜５００００ｍｇ／ｋｇである。本発明のいくつかの実施形態によれば、果実細胞を乾燥させて粉末にした後のレスベラトロールの量は１０００ｍｇ／ｋｇ以上である。本発明のいくつかの実施形態によれば、果実細胞を乾燥させて粉末にした後のレスベラトロールの量は３０００ｍｇ／ｋｇ以上である。本発明のいくつかの実施形態によれば、果実細胞を乾燥させて粉末にした後のレスベラトロールの量は５０００ｍｇ／ｋｇ以上である。本発明のいくつかの実施形態によれば、果実細胞を乾燥させて粉末にした後のレスベラトロールの量は、１００００ｍｇ／ｋｇ以上である。本発明のいくつかの実施形態によれば、果実細胞を乾燥させて粉末にした後のレスベラトロールの量は２００００ｍｇ／ｋｇ以上である。本発明のいくつかの実施形態によれば、果実細胞を乾燥させて粉末にした後のレスベラトロールの量は３００００ｍｇ／ｋｇ以上である。本発明のいくつかの実施形態によれば、果実細胞を乾燥させて粉末にした後のレスベラトロールの量は４００００ｍｇ／ｋｇ以上である。本発明のいくつかの実施形態によれば、果実細胞を乾燥させて粉末にした後のレスベラトロールの量は５００００ｍｇ／ｋｇ以上である。本発明のいくつかの実施形態によれば、果実細胞を乾燥させて粉末にした後のレスベラトロールの量は６００００ｍｇ／ｋｇ以上である。本発明のいくつかの実施形態によれば、果実細胞を乾燥させて粉末にした後のレスベラトロールの量は７００００ｍｇ／ｋｇ以上である。
【００３５】
いくつかの実施形態によれば、本発明のプロセスで作製された果実細胞中の様々な成分の相対量は、農業により生産されたブドウ果実中の様々な成分の相対量とは異なる。いくつかの実施形態によれば、果実細胞中の糖の相対量は、農業により生産されたブドウ果実中の糖の相対量に比べて低下している。
【００３６】
いくつかの実施形態によれば、本発明の大規模方法により作製した果実細胞は、１０％ｗ／ｖ未満の甘味料を含む。いくつかの実施形態によれば、果実細胞は５％ｗ／ｖ未満の甘味料を含む。いくつかの実施形態によれば、果実細胞は３％ｗ／ｖ未満の甘味料を含む。いくつかの実施形態によれば、果実細胞は２％ｗ／ｖ未満の甘味料を含む。いくつかの実施形態によれば、果実細胞は１％ｗ／ｖ未満の甘味料を含む。いくつかの実施形態によれば、果実細胞は約１％ｗ／ｖの甘味料を含む。本明細書において、「甘味料」なる語は、例えばスクロース（ショ糖）、グルコース（ブドウ糖）、フルクトース（果糖）などの、甘味を与える糖を指す。
【００３７】
いくつかの実施形態によれば、果実細胞は乾燥させられるので、果実細胞に含まれる原料（糖を含む）が濃縮される。いくつかの実施形態によれば、原料は５倍濃縮される。いくつかの実施形態によれば、原料は１０倍濃縮される。いくつかの実施形態によれば、原料は１５倍濃縮される。いくつかの実施形態によれば、原料は２０倍濃縮される。いくつかの実施形態によれば、原料は２５倍濃縮される。いくつかの実施形態によれば、原料は３０倍濃縮される。
【００３８】
一実施形態によれば、乾燥果実（ドライフルーツ）細胞には最大１０％ｗ／ｖの甘味料が含まれる。本発明のいくつかの実施形態によれば、乾燥果実細胞には最大１５％ｗ／ｖの甘味料が含まれる。一実施形態によれば、乾燥果実細胞には１０〜１５％ｗ／ｖの甘味料が含まれる。一実施形態によれば、乾燥果実細胞には１５〜２０％ｗ／ｖの甘味料が含まれる。
【００３９】
一実施形態によれば、乾燥果実細胞には２０％ｗ／ｖ未満の甘味料が含まれる。一実施形態によれば、乾燥果実細胞には３０％ｗ／ｖ超の甘味料が含まれる。
【００４０】
いくつかの実施形態によれば、本発明の大規模プロセスにより作製した果実細胞は味が悪い。他の実施形態によれば、本発明の大規模プロセスにより作製した果実細胞は味が良い。
【００４１】
本発明の一実施形態では、増殖させたブドウ果実細胞の細胞株カルス培養物の大規模インビトロ生産プロセスであって、フラスコ内でブドウ細胞を増殖させるステップと、ブドウ細胞をフラスコから最初のバイオリアクタに植菌するステップと、生成されたブドウ細胞を収穫するステップとを含む大規模プロセスが提供される。本発明のいくつかの実施形態では、増殖させたブドウ果実細胞の細胞株カルス培養物の大規模インビトロ生産プロセスであって、フラスコ内でブドウ細胞を増殖させるステップと、ブドウ細胞をフラスコから最初のバイオリアクタに植菌するステップと、ブドウ細胞を最初のバイオリアクタから別のバイオリアクタに植菌するステップ（ここで、別のバイオリアクタは最後のバイオリアクタまたは中間のバイオリアクタであり、１つ以上の中間のバイオリアクタによるさらにいくつかのステップが行われ得る、かつ最初のバイオリアクタまたは別のバイオリアクタのうちの少なくとも一方が使い捨てである）と、最後のバイオリアクタからブドウ細胞を収穫するステップとを含み、最後のバイオリアクタから収穫されたブドウ細胞が、乾燥されることを特徴とする大規模プロセスが提供される。
【００４２】
「使い捨てバイオリアクタ」とは、使い捨てのバッグ（袋）を備えたバイオリアクタを意味し、培養容器の代わりに単回使用バッグであり得る。使い捨てバッグは、通常、３層以上のプラスチック箔で作られている。本発明のいくつかの実施形態では、１つの層は、機械的安定性を提供するために、ポリエチレン製、ポリエチレンテレフタレート製またはＬＤＰＥ製である。第２の層は、ガスバリアとして働くナイロン、ＰＶＡまたはＰＶＣを用いて作られている。最後に、接触層は、ＰＶＡまたはＰＰ、あるいは別のポリエチレン、ポリエチレンテレフタレートまたはＬＤＰＥの層から作られている。医療用の場合、生成物に接触する単回使用材料は、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）、または他の領域を統括する同様の当局による認定を受けたものでなければならない。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、使い捨てバイオリアクタは、１若しくは複数のポリエチレン層から作られたものである。本発明のいくつかの実施形態では、使い捨てバイオリアクタは、ポリエチレンの内層及び外層並びにナイロンの中間層から作られたものである。
【００４４】
一般的に、単回使用バイオリアクタを作製するための２つの異なる手法が存在し、両者は培地を撹拌するために用いる手段が異なる。
【００４５】
いくつかの単回使用バイオリアクタは、従来のバイオリアクタと同様に撹拌器を用いるが、撹拌器はプラスチック製のバックに組み込まれている。閉じられたバック及び撹拌器は、事前に滅菌される。使用時には、バックはバイオリアクタに取り付けられ、撹拌器は駆動機構に機械的または磁気的に接続される。
【００４６】
他の単回使用バイオリアクタは、揺動（ロッキングモーション）によって撹拌される。他の単回使用バイオリアクタは、エアリフト型バイオリアクタである。エアリフト型バイオリアクタでは、反応培地は撹拌され、空気の導入によって通気される。この型のバイオリアクタは、単回使用バック内で機械撹拌器を必要としない。
【００４７】
いくつかの実施形態によれば、果実細胞を作製するための大規模プロセスは、複数の後続ステップからなる。本発明のいくつかの実施形態によれば、各ステップで作製される果実細胞の量は、その前のステップで作製されたものよりも多いかまたは多くない。さらに、各ステップで作製された果実細胞は、植菌されるかまたは収穫されて、大規模プロセスの次のステップのための発端（スタータ）として用いられる。大規模プロセスの最後のステップでは、通常、果実細胞を、増殖プロフィールの平坦域に到達するまで増殖させる。
【００４８】
本発明の大規模プロセスを用いる利点は明らかであり、実施例の項に示されている。例２の実験２に見られるように、強化ガンボーグＢ５培地による赤ブドウ細胞（ＲＧＣ）バイオマスは、非強化ガンボーグＢ５培地の存在下で得られるバイオマスに比べて遥かに大きかった。さらに、種々の濃度のマグネシウム塩、硝酸塩及びリン酸塩（ＫＮＯ３、ＭｇＳＯ４、ＭｇＮＯ３、ＮａＨ２ＰＯ４）を含有するガンボーグＢ５培地を使用することにより、大規模バイオリアクタにおいてさえ、生成された細胞中に高いレスベラトロールレベルが得られた。
【００４９】
表４及び例２の実験３は、大規模使い捨てバイオリアクタ内において強化培地で増殖させたブドウ細胞に含まれる全ポリフェノール及びレスベラトロールのレベルが、三角フラスコで増殖させたブドウ細胞において得られたレベルよりも高かったこと、すなわち、それぞれ９１０ｍｇ／ｌ及び２０３ｍｇ／ｌであったことを示している。他者によって行われた測定とは対照的に、１０００〜５０００リットルの大規模使い捨てバイオリアクタでの果実植物細胞の増殖の成功（高レベルのレスベラトロール及びポリフェノール生産量を伴う）を実証するのはこれが初めてである。
【００５０】
いくつかの実施形態によれば、レスベラトロールを含む複数のポリフェノールの複合体を含む組成物が提供され、ここで、レスベラトロール対ポリフェノールの量の比率は１：２０以上である。いくつかの実施形態では、この比率は１：１０以上である。いくつかの実施形態では、この比率は１：５以上である。いくつかの実施形態では、この比率は以上である。いくつかの実施形態では、この比率は１：３以上である。いくつかの実施形態では、この比率は１：２以上である。いくつかの実施形態によれば、上記組成物は天然源に由来する。いくつかの実施形態によれば、上記組成物は天然源に由来する。いくつかの実施形態によれば、上記組成物は、大規模使い捨てバイオリアクタで増殖させたブドウ細胞に由来する。いくつかの実施形態によれば、上記組成物は、本明細書に記載のプロセスによる大規模使い捨てバイオリアクタで増殖させたブドウ細胞に由来する。
【００５１】
表７及び例２の実験７は、ブドウ細胞によって生成されるレスベラトロールの量に対する２つの培地（ＩＭ１培地並びに、マグネシウム塩、リン酸塩及び硝酸塩で強化されたガンボーグＢ５培地）の効果を示している。この効果を、滅菌された使い捨ての透明なプラスチック容器でできた２０Ｌバイオリアクタ内で評価した。さらに、A. Decendit (1996) Biotechnology Lettersに公表されたデータ（ここでは、２０Ｌのガラス容器内においてＩＭ１培地で細胞を増殖させた）と比較した。結果は、使い捨てバイオリアクタ内においてＩＭ１培地で増殖させた赤ブドウ細胞が、同じ培地（Decendit）を用いて撹拌型ガラス製バイオリアクタ内において生成されたレベルよりも約３倍高い９３ｍｇ／ｌのレスベラトロールを生成した（表７）ことを示している。さらに、これらの細胞を使い捨てバイオリアクタ内の強化ガンボーグＢ５培地で増殖させると、非常に高レベルのレスベラトロール３８７ｍｇ／ｌが生成された。このように、本実験は、１若しくは複数の使い捨てバイオリアクタと、様々な濃度のマグネシウム塩、硝酸塩及びリン酸塩（ＫＮＯ３、ＭｇＳＯ４、ＭｇＮＯ３、ＮａＨ２ＰＯ４）を含有するガンボーグＢ５培地とを用いることの利点、並びに１若しくは複数の使い捨てバイオリアクタ及び強化ガンボーグＢ５培地の組合せを用いることの利点を示している。
【００５２】
いくつかの実施形態によれば、果実細胞はバイオリアクタ内で増殖させられる。いくつかの実施形態によれば、バイオリアクタは、せん断応力及び流体力学的圧力の強さを最小限に抑える一方で適切な混合及び物質移動を可能にするように設計されている。本発明のいくつかの実施形態によれば、バイオリアクタのうちの少なくとも１つは使い捨てバイオリアクタである。これは、最初のバイオリアクタ、または中間のバイオリアクタ、または最後のバイオリアクタ、あるいはそれらの組合せであり得る。本発明のいくつかの実施形態によれば、使い捨てバイオリアクタは最後のバイオリアクタであり、その後、細胞は、収穫されて乾燥されることにより粉末が形成される。
【００５３】
本発明の或る例示的な実施形態によれば、第１のステップは、三角フラスコなどのフラスコまたはバイオリアクタ内での果実細胞培養物の作成を含む。いくつかの実施形態によれば、第１のステップは、最大１．０Ｌの果実細胞培養物の作成を含む。さらなる実施形態によれば、第１のステップは、最大１．５Ｌの果実細胞培養物の作成を含む。さらなる実施形態によれば、第１のステップは、最大２．０Ｌの果実細胞培養物の作成を含む。
【００５４】
いくつかの実施形態によれば、第１のステップは、ガラス製、金属製またはプラスチック製のフラスコを用いて行われる。いくつかの実施形態によれば、フラスコは使い捨てである。さらなる実施形態によれば、フラスコは何回も再使用してよい。いくつかの実施形態によれば、フラスコは、使用後に次の使用までの間に任意の適切な手段によって滅菌される。
【００５５】
いくつかの実施形態によれば、第１のステップは、果実細胞を増殖させるための任意の適切な培地の使用を含む。いくつかの実施形態によれば、果実細胞を増殖させるために用いられる培地には、細胞増殖培地、塩、ビタミン、糖、ホルモン、またはそれらの任意の組合せが含まれる。いくつかの実施形態によれば、細胞増殖培地は、ガンボーグＢ５培地（Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50: 151, 1968）またはその変更形態である。いくつかの実施形態によれば、ガンボーグＢ５培地には、マグネシウム塩、リン酸塩、硝酸塩などの塩、またはそれらの任意の組合せが含まれる。本発明のいくつかの実施形態によれば、ガンボーグＢ５培地には、ＫＮＯ３、ＭｇＳＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、またはそれらの組合せが含まれる。いくつかの実施形態によれば、培地には、ガンボーグＢ５ビタミン群、またはそれらの任意の組合せが含まれる。さらなる実施形態によれば、培地には、スクロースなどの糖、ガンボーグＢ５培地、またはそれらの任意の組合せが含まれる。
【００５６】
本発明の一実施形態では、ガンボーグＢ５培地に添加されるＫＮＯ３の濃度は２５〜４５ｍＭである。
【００５７】
本発明の一実施形態では、ガンボーグＢ５培地に添加されるＭｇＳＯ４の濃度は１〜１５ｍＭである。
【００５８】
本発明の一実施形態では、ガンボーグＢ５培地に添加されるＭｇＮＯ３の濃度は５〜３５ｍＭである。
【００５９】
本発明の一実施形態では、ガンボーグＢ５培地に添加されるＫＮＯ３の濃度は１５ｍＭ〜６０ｍＭである。
【００６０】
本発明の一実施形態では、ガンボーグＢ５培地に添加されるＭｇＳＯ４の濃度は０．５〜２５ｍＭである。
【００６１】
本発明の一実施形態では、ガンボーグＢ５培地に添加されるＭｇＮＯ３の濃度は１〜５０ｍＭである。
【００６２】
本発明の一実施形態では、ガンボーグＢ５培地に添加されるＫＮＯ３の濃度は３０〜４０ｍＭである。
【００６３】
本発明の一実施形態では、ガンボーグＢ５培地に添加されるＭｇＳＯ４の濃度は５〜１０ｍＭである。
【００６４】
本発明の一実施形態では、ガンボーグＢ５培地に添加されるＭｇＮＯ３の濃度は２０〜３０ｍＭである。
【００６５】
本発明の一実施形態では、ガンボーグＢ５培地にミオイノシトールが添加される。
【００６６】
本発明の一実施形態では、ガンボーグＢ５培地にＨ３ＢＯ３が添加される。
【００６７】
本発明の一実施形態では、ガンボーグＢ５培地にＭｎＳＯ４が添加される。
【００６８】
本発明の一実施形態では、ガンボーグＢ５培地にＮａＨ２ＰＯ４が添加される。
【００６９】
本発明の一実施形態では、ガンボーグＢ５培地にビオチンが添加される。
【００７０】
本発明の一実施形態では、ガンボーグＢ５培地にＤ−パントテン酸カルシウムが添加される。
【００７１】
本発明の一実施形態では、ガンボーグＢ５培地に約０．５ｍＭのミオイノシトールが添加される。
【００７２】
本発明の一実施形態では、ガンボーグＢ５培地に約０．０５ｍＭのＨ３ＢＯ３が添加される。
【００７３】
本発明の一実施形態では、ガンボーグＢ５培地に約０．０４ｍＭのＭｎＳＯ４が添加される。
【００７４】
本発明の一実施形態では、ガンボーグＢ５培地に約１ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４が添加される。
【００７５】
本発明の一実施形態では、ガンボーグＢ５培地に約０．００４ｍＭのビオチンが添加される。
【００７６】
本発明の一実施形態では、ガンボーグＢ５培地に約０．２ｍＭのＤ−パントテン酸カルシウムが添加される。
【００７７】
本発明の一実施形態では、ガンボーグＢ５培地に約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍＭのミオイノシトールが添加される。
【００７８】
本発明の一実施形態では、ガンボーグＢ５培地に約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１ｍＭのＨ３ＢＯ３が添加される。
【００７９】
本発明の一実施形態では、ガンボーグＢ５培地に約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１ｍＭのＭｎＳＯ４が添加される。
【００８０】
本発明の一実施形態では、ガンボーグＢ５培地に０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４が添加される。
【００８１】
本発明の一実施形態では、ガンボーグＢ５培地に約０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１ｍＭのビオチンが添加される。
【００８２】
本発明の一実施形態では、ガンボーグＢ５培地に約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２、３、４ｍＭのＤ−パントテン酸カルシウムが添加される。
【００８３】
本発明の一実施形態では、ガンボーグＢ５培地に添加されるスクロースの濃度は２〜４％である。別の実施形態では、濃度は約３％である。
【００８４】
さらなる実施形態によれば、細胞増殖培地にカゼイン、カゼイン加水分解物またはカゼインペプトンを含有させることができる。さらなる実施形態によれば、細胞増殖培地に成長ホルモンを含有させることができる。さらなる実施形態によれば、増殖培地はホルモンを含む。いくつかの実施形態によれば、ホルモンの追加なしで果実細胞を増殖させる。
【００８５】
いくつかの実施形態によれば、本プロセスの１つ以上のステージにおいて用いられ得る植物培地の例には、次に挙げるものが含まれるが、これらに限定されるものではない。Anderson (Anderson, In Vitro 14:334, 1978; Anderson, Act. Hort., 112: 13, 1980), Chee and Pool (Sci. Hort. 32:85, 1987), CLC/Ipomoea (CP) (Chee et al., J. Am. Soc. Hort. Sci. 117:663, 1992), Chu (N.sub.6) (Chu et al., Scientia Sinic. 18:659, 1975; Chu, Proc. Symp. Plant Tiss. Cult., Peking 43, 1978), DCR (Gupta and Durzan, Plant Cell Rep. 4: 177, 1985), DKW/Juglans (Driver and Kuniyuki, HortScience 19:507, 1984; McGranahan et al., in: Bonga and Durzan, eds., Cell and Tissue Culture in Forestry, Martinus Nijhoff, Dordrecht, 1987), De Greef and Jacobs (De Greef and Jacobs, Plant Sci. Lett. 17:55, 1979), Eriksson (ER) (Eriksson, Physiol. Plant. 18:976, 1965), Gresshoff and Doy (DBM2) (Gresshoff and Doy, Z Pflanzenphysiol. 73 : 132, 1974), Heller's (Heller, Ann. Sci. Nat. Bot. Biol. Veg. 11th Ser. 14: 1, 1953), Hoagland's (Hoagland and Arnon, Circular 347, Calif. Agr. Exp. Stat., Berkeley, 1950), Kao and Michayluk (Kao and Michayluk, Planta 126: 105, 1975), Linsmaier and Skoog (Linsmaier and Skoog, Physiol. Plant. 18: 100, 1965), Litvay's (LM) (Litvay et al., Plant Cell Rep. 4:325, 1985), Nitsch and Nitsch (Nitsch and Nitsch, Science 163 :85, 1969), Quoirin and Lepoivre (Quoirin et al., C. R. Res. Sta. Cult. Fruit Mar., Gembloux 93, 1977), Schenk and Hildebrandt (Schenk and Hildebrandt, Can. J. Bot. 50: 199, 1972), White's (White, The Cultivation of Animal and Plant Cells, Ronald Press, NY, 1963), など。
【００８６】
いくつかの他の例示的な実施形態によれば、果実細胞及び培地は第１のステップ中に連続的に混合される。さらなる実施形態によれば、果実細胞及び培地は第１のステップ中に時々混合される。いくつかの実施形態によれば、第１のステップ中の温度は２０〜３０℃である。いくつかの実施形態によれば、第１のステップ中の温度は２２〜２８℃である。いくつかの実施形態によれば、第１のステップ中に５日間以上、果実細胞を増殖させる。いくつかの実施形態によれば、第１のステップ中に７日間以上、果実細胞を増殖させる。いくつかの実施形態によれば、第１のステップ中に５日間以上かつ２週間未満、果実細胞を増殖させる。いくつかの実施形態によれば、第１のステップ中に５日間以上かつ１２日間未満、果実細胞を増殖させる。
【００８７】
いくつかの例示的な実施形態によれば、本発明のプロセスで用いられるバイオリアクタには、第１のステップから得られた果実細胞、培地及び任意の追加の原料をバイオリアクタに入れるための入口が含まれる。さらなる実施形態によれば、本発明のプロセスで用いられるバイオリアクタには、所望の原料を取り出すための出口が含まれる。いくつかの実施形態によれば、出口は、バイオリアクタの余剰ガスを軽減するように設計されたガス出口を含む。いくつかの実施形態によれば、ガス出口は手動で操作される。他の実施形態によれば、ガス出口は自動的に操作され、フラスコ内の気圧が規定圧力に達したらフラスコからガスが放出される。いくつかの実施形態によれば、規定圧力は最大８ＰＳＩである。
【００８８】
果実細胞増殖の第１のステップが終了したら、いくつかの例示的な実施形態によれば、果実細胞を小規模バイオリアクタ（本明細書において、最初のバイオリアクタとも称する）に植菌する。大規模プロセスの第２のステップのために。いくつかの実施形態によれば、小規模バイオリアクタは４Ｌのリアクタである。さらなる実施形態によれば、小規模バイオリアクタは３〜５Ｌのリアクタである。さらなる実施形態によれば、小規模バイオリアクタは３〜１０Ｌのリアクタである。さらなる実施形態によれば、小規模バイオリアクタは４−８Ｌのリアクタである。
【００８９】
小規模バイオリアクタは、任意の適切な材料、例えば、ガラス、金属、プラスチック及び／または任意の種類のポリマーなどから製造することができる。いくつかの実施形態によれば、小規模バイオリアクタは使い捨てである。小規模バイオリアクタは、使い捨てでない場合には、いくつかの実施形態によれば、使用後に次の使用までの間に任意の適切な手段によって洗浄及び滅菌される。
【００９０】
上記したように、より大量の果実細胞をバイオリアクタで増殖させる場合には、レスベラトロールなどのポリフェノールを含む二次代謝産物の生産は、例えば三角フラスコなどのガラス製フラスコを用いる小規模生産における同じ代謝産物の量に比べて著しく減少することが分かっている。しかし、本明細書で詳述する大規模プロセスは、バイオリアクタで増殖させた場合に二次代謝産物の量が減少しない果実細胞を提供する。さらに、特定の二次代謝産物の生産を増大させることすらできる。
【００９１】
したがって、本発明の種々の実施形態によれば、小規模バイオリアクタで増殖させた果実細胞に含まれる二次代謝産物の相対量は、本プロセスの第１のステップにおける相対量と比べて著しく減少してはいない。いくつかの実施形態によれば、第１のステップにおいて増殖培地で用いるための上記成分を本プロセスの第２のステップにおいても用いることができる。いくつかの実施形態によれば、小規模バイオリアクタで用いられる増殖培地は、大規模プロセスの第１のステップで用いたものと同じである。いくつかの実施形態によれば、第２のステップにおいて増殖培地に存在する種々の成分の相対量は、第１のステップにおける相対量と同じである。他の実施形態によれば、第２のステップにおいて増殖培地に存在する種々の成分の相対量は、第１のステップで用いられる相対量とは異なる。いくつかの実施形態によれば、本プロセスの第２のステップにおいて増殖培地に追加の原料を添加する。
【００９２】
いくつかの実施形態によれば、小規模バイオリアクタには、第１のステップから得られた果実細胞、空気、培地及び任意の追加の原料をバイオリアクタに入れるための入口が含まれる。さらなる実施形態によれば、小規模バイオリアクタには、所望の原料を取り出すための出口が含まれる。いくつかの実施形態によれば、出口は、バイオリアクタの余剰ガスを軽減するように設計されたガス出口を含む。いくつかの実施形態によれば、ガス出口は手動で操作される。他の実施形態によれば、ガス出口は自動的に操作され、バイオリアクタ内の気圧が規定圧力に達したらバイオリアクタからガスが放出される。いくつかの実施形態によれば、規定圧力は８ＰＳＩである。
【００９３】
いくつかの実施形態によれば、果実細胞及び培地は第２のステップ中に連続的に混合される。さらなる実施形態によれば、果実細胞及び培地は第２のステップ中に時々混合される。いくつかの実施形態によれば、第２のステップ中の温度は２０〜３０℃である。いくつかの実施形態によれば、第２のステップ中に１週間以上かつ２週間未満、果実細胞を増殖させる。本発明のいくつかの実施形態では、果実細胞を、次のバイオリアクタに植菌する前に９〜１６日間増殖させる。
【００９４】
大規模プロセスの第３のステップのために、収穫した果実細胞を大規模バイオリアクタに入れる。いくつかの実施形態によれば、大規模バイオリアクタは３０〜５０Ｌのリアクタである。さらなる実施形態によれば、大規模バイオリアクタは４０〜６０Ｌのリアクタである。さらなる実施形態によれば、大規模バイオリアクタは３０〜７０Ｌのリアクタである。さらなる実施形態によれば、大規模バイオリアクタは２０〜１００Ｌのリアクタである。
【００９５】
大規模バイオリアクタは、任意の適切な材料、例えば、ガラス、金属、プラスチック及び／または任意の種類のポリマーなどから製造することができる。いくつかの実施形態によれば、大規模バイオリアクタは使い捨てである。大規模バイオリアクタは、使い捨てでない場合には、いくつかの実施形態によれば、使用後に次の使用までの間に任意の適切な手段によって洗浄及び滅菌される。
【００９６】
小規模バイオリアクタと同様に、本発明の種々の実施形態によれば、大規模バイオリアクタで増殖させた果実細胞に含まれる二次代謝産物の相対量は、本プロセスの先行ステップにおける相対量と比べて著しく減少してはいない。いくつかの実施形態によれば、先行ステップのうちのいずれかにおいて増殖培地で用いるための上記成分を本プロセスの第３のステップにおいても用いることができる。いくつかの実施形態によれば、大規模バイオリアクタで用いる増殖培地は、大規模プロセスの先行ステップのうちのいずれかで用いる増殖培地と同じである。いくつかの実施形態によれば、第３のステップにおいて増殖培地中に存在する種々の成分の相対量は、本プロセスの先行ステップのうちのいずれかにおける相対量と同じである。他の実施形態によれば、第３のステップにおいて増殖培地中に存在する種々の成分の相対量は、本プロセスの先行ステップのうちのいずれかで用いた相対量とは異なる。いくつかの実施形態によれば、本プロセスの第３のステップにおいて、増殖培地に追加の原料を添加する。
【００９７】
いくつかの実施形態によれば、大規模バイオリアクタには、第２のステップから得られた果実細胞、培地、空気及び任意の追加の原料をバイオリアクタに入れるための入口が含まれる。さらなる実施形態によれば、大規模バイオリアクタには、所望の原料を取り出すための出口が含まれる。いくつかの実施形態によれば、出口は、バイオリアクタの余剰ガスを軽減するように設計されたガス出口を含む。いくつかの実施形態によれば、ガス出口は手動で操作される。他の実施形態によれば、ガス出口は自動的に操作され、バイオリアクタ内の気圧が規定圧力に達したらバイオリアクタからガスが放出される。いくつかの実施形態によれば、規定圧力は最大８ＰＳＩである。
【００９８】
いくつかの例示的な実施形態によれば、果実細胞及び培地は第３のステップ中に連続的に混合される。さらなる実施形態によれば、果実細胞及び培地は第３のステップ中に時々混合される。いくつかの実施形態によれば、第３のステップ中の温度は２０〜３０である。いくつかの実施形態によれば、第３のステップ中に約２〜３週間、果実細胞を増殖させる。いくつかの実施形態によれば、第３のステップ中に約３〜５週間、果実細胞を増殖させる。いくつかの実施形態によれば、第３のステップ中に約１２〜３０日間、果実細胞を増殖させる。
【００９９】
果実細胞増殖の第３のステップが終了したら、通常は任意の適切な手段によって中規模バイオリアクタから果実細胞を植菌する。大規模プロセスの４つの例示的なステップのために、収穫した果実細胞をより大規模なバイオリアクタに入れる。いくつかの実施形態によれば、より大規模なバイオリアクタは１０００Ｌのリアクタである。さらなる実施形態によれば、より大規模なバイオリアクタは２００〜５００Ｌのリアクタである。さらなる実施形態によれば、大規模バイオリアクタは５００〜１０００Ｌのリアクタである。さらなる実施形態によれば、大規模バイオリアクタは１０００〜１５００Ｌのリアクタである。さらなる実施形態によれば、大規模バイオリアクタは５００〜１１００Ｌのリアクタである。
【０１００】
より大規模なバイオリアクタは、任意の適切な材料、例えば、ガラス、金属、プラスチック及び／または任意の種類のポリマーなどから製造することができる。いくつかの実施形態によれば、大規模バイオリアクタは使い捨てである。大規模バイオリアクタは、使い捨てでない場合には、いくつかの実施形態によれば、使用後に次の使用までの間に任意の適切な手段によって洗浄及び滅菌される。
【０１０１】
小規模バイオリアクタと同様に、本発明の種々の実施形態によれば、より大規模なバイオリアクタで増殖させた果実細胞に含まれる二次代謝産物の相対量は、本プロセスの先行ステップにおける相対量と比べて著しく減少してはいない。いくつかの実施形態によれば、先行ステップのうちのいずれかにおいて増殖培地で用いるための上記成分を本プロセスの第４のステップにおいても用いることができる。いくつかの実施形態によれば、より大規模なバイオリアクタで用いられる増殖培地は、先行ステップのうちのいずれかで用いたものと同じである。いくつかの実施形態によれば、第４のステップにおいて増殖培地中に存在する種々の成分の相対量は、先行ステップのうちのいずれかにおける相対量と同じである。他の実施形態によれば、第４のステップにおいて増殖培地中に存在する種々の成分の相対量は、先行ステップのうちのいずれかで用いた相対量とは異なる。いくつかの実施形態によれば、本プロセスの第４のステップにおいて、増殖培地に追加の原料を添加する。
【０１０２】
いくつかの実施形態によれば、より大規模なバイオリアクタには、第３または第２のステップから得られた果実細胞、培地及び任意の追加の原料をバイオリアクタに入れるための入口が含まれる。さらなる実施形態によれば、より大規模なバイオリアクタには、所望の原料を取り出すための出口が含まれる。いくつかの実施形態によれば、出口は、バイオリアクタの余剰ガスを軽減するように設計されたガス出口を含む。いくつかの実施形態によれば、ガス出口は手動で操作される。他の実施形態によれば、ガス出口は自動的に操作され、バイオリアクタ内の気圧が規定圧力に達したらバイオリアクタからガスが放出される。
【０１０３】
いくつかの実施形態によれば、果実細胞及び培地は第４のステップ中に連続的に混合される。さらなる実施形態によれば、果実細胞及び培地は第４のステップ中に時々混合される。いくつかの実施形態によれば、第４のステップ中の温度は２０〜３０℃である。いくつかの実施形態によれば、第３または第４のステップ中に果実細胞を１０〜７０％の細胞バイオマスに達するまで増殖させる。
【０１０４】
いくつかの実施形態によれば、大規模プロセスが終わった後、果実細胞をより大規模なバイオリアクタで増殖させる。当該実施形態によれば、より大規模なバイオリアクタで果実細胞を１０〜７０％の細胞バイオマスに達するまで増殖させる。１０〜７０％の細胞バイオマスに達したら、任意の適切な手段によって大規模バイオリアクタから果実細胞を収穫し、さらに加工する。いくつかの実施形態によれば、果実細胞は、乾燥、凍結乾燥、フリーズドライ及び噴霧乾燥によってさらに加工される。いくつかの実施形態によれば、果実細胞の加工には、そこからの有効成分の抽出は含まれない。
【０１０５】
いくつかの実施形態によれば、大規模プロセスは、細胞をフラスコから任意の大きさであり得るバイオリアクタに植菌しかつ細胞を収穫する１ステップを含み得る。他の実施形態によれば、一連のバイオリアクタ（各バイオリアクタは、通常、その前に使用したバイオリアクタよりも大きい）で果実細胞を植菌することができる。大規模プロセスによれば、任意の数の追加的なステップを行う。追加的なステップは、可能な中間ステップを含み、該中間ステップにおいて、細胞は収穫または植菌されてより大規模なバイオリアクタに入れられ、そこで収穫または植菌されるまで増殖させられて、より大規模なバイオリアクタへ移される。さらなる実施形態によれば、本プロセスは、大規模バイオリアクタから収穫した果実細胞を増殖させる追加的なステップを含む。
【０１０６】
本発明の一実施形態では、本発明の大規模プロセスにおいて製造されたブドウ細胞を含む医薬組成物または栄養補助食品組成物または食品添加物が提供される。医薬組成物または栄養補助食品組成物または食品添加物は、経口投与によって被験者に投与することができる。
【０１０７】
本明細書において、「医薬組成物」なる語は、生理学的に適切な担体や賦形剤などの他の化学成分の有無にかかわらず果実細胞培養物の製剤を指し、果実細胞培養物は、上記でさらに説明したブドウ細胞培養物であり得る。
【０１０８】
本発明の一実施形態では、本発明の種々の実施形態による大規模プロセスにおいて製造されたブドウ細胞の細胞培養物を含む医薬組成物または栄養補助食品組成物または食品添加物を、それを必要とする被験者に投与することによって炎症性疾患を治療する方法が提供される。
【０１０９】
本明細書において、「治療（する）」なる語は、炎症性の疾患、病気または疾病に関連する種々の症状のうちのいくつかまたは全ての予防を指す。「治療（する）」なる語はまた、炎症性疾患の症状または根本原因の軽減、疾患患者の平均寿命の延長、及び疾患からの完全な回復を指す。
【０１１０】
本明細書において、「炎症性疾患」なる語には、慢性炎症性疾患及び疾病並びに急性炎症性疾患及び疾病が含まれるが、これらに限定されるものではない。これは例４において例示されている。例４は、ラットにおけるカラギーナンによって誘発される後足炎症と関連する足浮腫及び行動痛覚過敏が、本明細書に記載されている大規模プロセスにより製造した赤ブドウ細胞（ＲＧＣ）の経口投与によって実際的に軽減されたことを示しており、このことは、大規模プロセスで作製されたＲＧＣの抗炎症作用を示している。
【０１１１】
本発明の様々な態様について以下の実施例においてより詳細に説明する。これらは、本発明の種々の実施形態を示すものであるが、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１１２】
実施例
【０１１３】
例１
製造−産業レベルの大規模化
【０１１４】
１．原料及び方法
生産プロセスには、５つのステージを有する漸進的プロセスにおけるブドウ細胞の増殖が含まれる。振盪三角フラスコ内でのブドウ細胞の増殖から始めて、小規模及び大規模使い捨てバイオリアクタでさらに増殖させる。重要な鍵となる因子は、異なる規模のバイオリアクタでの増殖中に、細胞に含まれる高レベルの二次代謝産物であるレスベラトロールを維持することである。増殖の最後の大規模ステージの最後に、所要のバイオマスで、ブドウ細胞を収穫して乾燥させることにより、種々の医療用途に用いられる乾燥細胞（ＲＧＣ）のバイオマスをもたらすピンクがかった紫の微粉末が生成される。
【０１１５】
ブドウ細胞株の形成
ブドウ横断切片から得られるカルス：野外生育のブドウ植物から開花の２０〜５０日後に長さ４〜８ｃｍの若いブドウの房を収穫し、水道の蛇口から流した水でよく洗った。無核ブドウのヴィニフェラ種（Vitis vinifera cv.）「ＡＶＮＩＲ  ８２５」（Ａｇｒａｍａｎとガメイレッドの交配種）の緑色の未熟な果粒を、１．３％ｗ／ｖの次亜塩素酸ナトリウムと、湿潤剤として（０．１％ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０とを含有する溶液中で１０分間滅菌した。フィルタ滅菌された１．７ｍＭのアスコルビン酸及び０．８ｍＭのクエン酸、１００ｍｇ／ｌのＤＴＴ（ジチオトレイトール）及び５０ｍｇ／ｌのアセチルシステインを補足した１／２  ＭＳ（Murashige and Skoog, 1962, Physiol Plant 15:473-497）液体基礎培地下で、メスを用いて外植片を長さ２〜３ｍｍの横断断片に切断した。細胞の神経発生を阻害するため、及び緑色の健全な果粒ディスクの回復を可能にするために、上記の切断培地に以下の抗酸化物質を添加した：ＰＶＰ（０．５及び１ｇ／１）、Ｌ−システイン（１５０ｍｇ／ｌ）、没食子酸（１．５ｍｇ／ｌ）、ＤＴＴ（７０ｍｇ／ｌ）、ビオプテリン（１５ｍｇ／ｌ）、アスコルビン酸（１５０ｍｇ／ｌ）及びクエン酸（１５０ｍｇ／ｌ）。
【０１１６】
果粒ディスクを、２５ｍｌのオートクレーブ滅菌したムラシゲスクーグ（ＭＳ）培地を含有する１００?１５ｍｍの培養皿に置き、０．２５％のゲルライト（登録商標）で固化した。１０２ｋｐａで１５分間オートクレーブ滅菌する前に、ｐＨをｐＨ５．９になるように調整した。各々が２５個の果粒ディスクを含む３０枚の培養皿をパラフィルムで密閉し、２６℃で３日間にわたって暗所で培養した。培養物を、白色蛍光灯による１５〜３０μｍｏｌ−２ｓ−１の放射照度の１６時間の日長下で、２５℃で培養した。ＭＳ塩及びビタミン培地には、２５０ｍｇ／ｌのカゼイン加水分解物、２％のスクロース及び１００ｍｇ／ｌのイノシトールをも補足した。カルス誘導のために、０．２ｍｇ／ｌのカイネチン及び０．１ｍｇ／ｌのＮＡＡ（α−ナフタレン酢酸）をも補足した（ＲＤ１と呼ばれる培地）。
【０１１７】
培養開始から３〜４週間後に、果粒ディスクに沿って緑色及び赤色のカルスの混合物が見えた。カルスは、脆くて細長い細胞からなり、そのうちのいくつかはアントシアニンの濃い色素を示していた。アントシアニンが豊富なカルス部分を選択して、個々に継代培養して増殖させた。緑色のカルス部分を別々に培養した。
【０１１８】
ブドウ皮細胞から得られるカルス：野外生育のブドウ植物から開花の２０〜５０日後に長さ４〜８ｃｍの若いブドウの房を収穫し、水道の蛇口から流した水でよく洗った。無核ブドウのヴィニフェラ種「ＡＶＮＩＲ  ８２５」（Ａｇｒａｍａｎとガメイレッドの交配種）の緑色の未熟な果粒を、１．３％ｗ／ｖの次亜塩素酸ナトリウムと、湿潤剤として（０．１％ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０とを含有する溶液中で１０分間滅菌した。果皮に３〜８ｍｍの切り込みを入れ、滅菌したピンセットを用いて皮のみを剥くことによって、果皮を分離した。フィルタ滅菌された１．７ｍＭのアスコルビン酸及び０．８ｍＭのクエン酸、１００ｍｇ／ｌのＤＴＴ（ジチオトレイトール）及び５０ｍｇ／ｌのアセチルシステインを補足した１／２  ＭＳ（Murashige and Skoog, 1962）液体基礎培地下で、皮の分離を行った。
【０１１９】
果皮をＲＤ−１培地に置いた。約１０〜１４日後に、皮ピル（skin pill）の切断面において細胞の塊が発生し始めた。アントシアニンが豊富な細胞を選択して、さらに新鮮培地に継代培養してさらに増殖させた。
【０１２０】
ブドウ種皮から得られるカルス：野外生育のブドウ植物から開花の２０〜５０日後に長さ４〜８ｃｍの若いブドウの房を収穫し、水道の蛇口から流した水でよく洗った。無核ブドウのヴィニフェラ種「ＡＶＮＩＲ  ８２５」の緑色の未熟な果粒を、１．３％ｗ／ｖの次亜塩素酸ナトリウムと、湿潤剤として（０．１％ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０とを含有する溶液中で１０分間滅菌した。若い緑色の生育中の種子が見えるように果粒を切り開いた。未熟な種皮を切断し、培地に置いた。フィルタ滅菌された１．７ｍＭのアスコルビン酸及び０．８ｍＭのクエン酸、１００ｍｇ／ｌのＤＴＴ（ジチオトレイトール）及び５０ｍｇ／ｌのアセチルシステインを補足した１／２  ＭＳ（Murashige and Skoog, 1962）液体基礎培地下で、皮の分離を行った。
【０１２１】
種皮部分をＲＤ−１培地に置いた。約１２〜２０日後、種皮は褐色に変色し、種皮外植片の上部にカルスが現れ始めた。赤褐色の色素に富んだ細胞を選択し、さらに新鮮培地に継代培養してさらに増殖させた。
【０１２２】
液体培養の確立：５０ｍｇ／ｌの種々の培地（ＲＤ１〜ＲＤ６−下記参照）に１０ｇのカルスを添加することによって、液体培養を確立した。固形培地上でうまく確立された全ての細胞株が、同じ培地の組合せ（ただしゲル化剤を含まない）で均質な細胞懸濁液を作った。７０ｍｇ／ｌのＤＴＴまたは１５０ｍｇ／ｌの、アスコルビン酸またはクエン酸のいずれかの添加により、増殖が向上し、果粒由来の懸濁培養物の細胞の神経発生が阻害された。液体培養の確立のために、全ての外植片の種類をうまく利用した。７〜１０日毎にルーチン的に培養物を新鮮増殖培地に継代培養した。
【０１２３】
果粒由来のカルス細胞株を確立するために導入された追加のブドウ属の種：上記のプロトコールを用いて、下記のブドウ属の種を培養した。
【０１２４】
ブドウ属シルべストリス種、ムスカディニア種、ロトゥンディフォリア種、リパリア種、シャトルウォーシー種、ラブルスカ種、ダビディ種、アムレンシス種、ロマネリ種、エースティバリス種、シンシアナ種、シネリア種、パルメイト種、ムンソニアーナ種、コルディフォリア種、ハイブリッドＡ２３−７−７１、アセリフォリア種、トレレアシー種、ベチュリフォリア種。
【０１２５】
ヴィニフェラ種のブドウ横断切片、ブドウ皮及びブドウ種子のカルスの生産効率を下表１に例示する。
【表１】
2016500520.tif 000003
【０１２６】
本研究において使用したブドウ属の種のうちのいくつかの種からの、異なるカルス「タイプ」の生産効率を下表２にまとめた。
【表２】
2016500520.tif 000004
【０１２７】
ステージ１：振盪三角フラスコ
オービタルシェーカー上の１リットルの三角フラスコ内で、蛍光灯連続照明下（１０００ｌｘ）で温度２５±５℃で懸濁液中において赤ブドウ細胞を増殖させる。増殖培地には、ガンボーグＢ５培地及びビタミン培地が含まれ、２５０ｍｇ／ｌのカゼイン加水分解物、２〜４％のスクロース、１００ｍｇ／ｌのミオイノシトール、０．２ｍｇ／ｌのカイネチン及び０．１ｍｇ／ｌのＮＡＡ（１−ナフタレン酢酸）、２５〜４５ｍＭのＫＮＯ３、１〜１５ｍＭのＭｇＳＯ４または５〜３５ｍＭのＭｇＮＯ３及び１ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ５．８）が補足されている。６〜１１日毎に細胞を継代培養する。
【０１２８】
ステージ２：小規模バイオリアクタ
小規模バイオリアクタ培養は、ステージ１の三角フラスコで増殖させた７〜１６日齢の細胞懸濁液を、温度２５±５℃で、４〜８リットルの使い捨てバイオリアクタに植菌することによって行う。強化ガンボーグＢ５塩及びビタミン培地を含みかつ、２５０ｍｇ／ｌのカゼイン加水分解物、２〜４％のスクロース、１００ｍｇ／ｌのミオイノシトール、２５〜４５ｍＭのＫＮＯ３、１〜１５ｍＭのＭｇＳＯ４または５〜３５ｍＭのＭｇＮＯ３及び１ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．２ｍｇ／ｌのカイネチン及び０．１ｍｇ／ｌのＮＡＡ（１−ナフタレン酢酸）（ｐＨ５．４〜５．８）が補足されている増殖培地で、蛍光灯連続照明下（１０００ｌｘ）で、細胞懸濁液中において細胞を増殖させる。９〜１６日毎に細胞を継代培養する。
【０１２９】
ステージ３：大規模バイオリアクタ
小規模バイオリアクタで増殖させた細胞懸濁液を、３０〜５０リットルの使い捨てバイオリアクタに植菌する。蛍光灯連続照明下（１０００ｌｘ）で温度２５±５℃で細胞懸濁液中において細胞を増殖させる。増殖培地には、強化ガンボーグＢ５塩及びビタミン培地が含まれ、かつ２５０ｍｇ／ｌのカゼイン加水分解物、２〜４％のスクロース、１００ｍｇ／ｌのミオイノシトール、２５〜４５ｍＭのＫＮＯ３、１〜１５ｍＭのＭｇＳＯ４または５〜３５ｍＭのＭｇＮＯ３及び１ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．２ｍｇ／ｌのカイネチン及び０．１ｍｇ／ｌのＮＡＡ（１−ナフタレン酢酸）（ｐＨ５．４〜５．８）が補足されている。１２〜３０日毎に細胞を継代培養する。
【０１３０】
ステージ４：より大規模なバイオリアクタ
小規模または大規模バイオリアクタで増殖させた細胞懸濁液を３００〜１０００リットルの使い捨てバイオリアクタに植菌する。蛍光灯連続照明下（１０００ｌｘ）で温度２５±５℃で細胞懸濁液中において細胞を増殖させる。増殖培地には、強化ガンボーグＢ５塩及びビタミン培地が含まれ、かつ２５０ｍｇ／ｌのカゼイン加水分解物、２〜４％のスクロース、１００ｍｇ／ｌのミオイノシトール、２５〜４５ｍＭのＫＮＯ３、１〜１５ｍＭのＭｇＳＯ４または５〜３５ｍＭのＭｇＮＯ３及び１ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．２ｍｇ／ｌのカイネチン及び０．１ｍｇ／ｌのＮＡＡ（１−ナフタレン酢酸）（ｐＨ５．４〜５．８）が補足されている。
【０１３１】
ステージ５：収穫
細胞が１０％〜７０％（ｗ／ｖ）の細胞バイオマスに到達した時点で細胞を収穫する。収穫した細胞を乾燥させて、典型的な組成物、味及び匂いを有するピンクがかった紫の微粉末を生成する。
【０１３２】
例２
大規模バイオリアクタで増殖させた赤ブドウ細胞におけるレスベラトロールのレベルに対する培地組成及びバイオリアクタデザインの効果
【０１３３】
２．１  培地組成
実験１：振盪三角フラスコで増殖させた赤ブドウ細胞におけるレスベラトロールの量に対する培地組成の効果
【０１３４】
例１のステージ１で説明したように、赤ブドウ細胞を振盪三角フラスコ内において種々の培地組成、すなわち、ＭＳ培地、ＷＰ培地、ＷＰ＋カゼイン加水分解物（カゼインペプトン）ガンボーグＢ５培地で増殖させた。表１に示す結果は、ガンボーグＢ５培地の存在下で増殖させた細胞が、ＭＳ培地、ＷＰ培地及びＷＰ＋カゼイン加水分解物（カゼインペプトン）培地の存在下で増殖させた細胞よりも約４〜１５倍高いレスベラトロールレベルを生じさせることを示している。
【表３】
2016500520.tif 000005
【０１３５】
実験２：大規模使い捨てバイオリアクタで増殖させた赤ブドウ細胞におけるレスベラトロールのレベル及び増殖に対する培地組成の効果
【０１３６】
例１のステージ３で説明したように、赤ブドウ細胞を大規模使い捨てバイオリアクタ内において種々の培地組成で増殖させた。
【０１３７】
赤ブドウ細胞を２種類の培地、すなわちガンボーグＢ５培地及び強化ガンボーグＢ５培地で増殖させた。下表２に示すように、ガンボーグＢ５培地に高レベルのマグネシウム塩、リン酸塩及び硝酸塩または硫酸塩（ＫＮＯ３、ＭｇＳＯ４、ＭｇＮＯ３、ＮａＨ２ＰＯ４）を補足したことによって、非強化ガンボーグＢ５培地の存在下で得られるバイオマスに比べて、高い赤ブドウ細胞のバイオマスが得られた。
【表４】
2016500520.tif 000006
【０１３８】
さらに、大規模使い捨てバイオリアクタで増殖させた赤ブドウ細胞におけるレスベラトロール及び全ポリフェノールのレベルに対する培地組成の効果を調べた。赤ブドウ細胞は、ＷＰ培地及び、種々の濃度のマグネシウム塩、硝酸塩及びリン酸塩（結果的に、ＫＮＯ３、ＭｇＳＯ４、ＭｇＮＯ３、ＫＮＯ３及びＮａＨ２ＰＯ４）を含有するガンボーグＢ５培地で増殖させた。表３は、これらの塩が、とりわけ強化ガンボーグＢ５培地に添加される場合に、高レベルのポリフェノール及び高レベルのレスベラトロールの生産のために必要であることを示している。ＷＰ培地と対照的に、全ポリフェノール及びレスベラトロールのレベルは非常に低い。
【０１３９】
図４は、大規模使い捨てバイオリアクタ内において強化ガンボーグＢ５培地で増殖させた赤ブドウ細胞の増殖曲線を示している。赤ブドウ細胞は指数増殖し、２０日後から最大４０日後に５００ｇ／１の新鮮（生）バイオマスが得られた。これらの細胞は増殖し続けてより高いバイオマスに到達することもできる。
【表５】
2016500520.tif 000007
【０１４０】
実験３：振盪三角フラスコから大規模バイオリアクタまで異なる増殖ステージで増殖させたＲＧＣのレスベラトロールレベル及び全ポリフェノールレベルの一貫性
【０１４１】
振盪三角フラスコから大規模使い捨てバイオリアクタまで異なる規模のステージにおいて、例１のステージ１〜４で説明したように、強化ガンボーグＢ５培地の存在下で赤ブドウ細胞を増殖させた。
【０１４２】
表４の結果は、赤ブドウ細胞が三角フラスコ内で良好に増殖し、大量のレスベラトロール及び全ポリフェノールを合成したことを示している。５０リットルまたは３００〜１０００リットルの規模のいずれかの使い捨てバイオリアクタで細胞を増殖させた場合には、三角フラスコで増殖させた場合と比較して、細胞の生重量及び乾燥重量によって示される増殖率がより高かった。表４のデータを参照されたい。三角フラスコでの生重量１６６ｇ／１と比較すると、スケールアップバイオリアクタの全ての大きさで生重量は２３０ｇ／１を上回っていた（表４）。さらに、大規模使い捨てバイオリアクタ内の強化培地中の全ポリフェノールのレベル及びレスベラトロールのレベルは、三角フラスコで得られたレベルよりも高く、それぞれ９０１ｍｇ／ｌ及び２００ｍｇ／ｌであった（表４）。他者によって行われた測定とは対照的に、大規模使い捨てバイオリアクタ内での果実植物細胞の増殖の成功（高レベルのレスベラトロール及びポリフェノール生産量を伴う）を実証するのはこれが初めてである。
【表６】
2016500520.tif 000008
【０１４３】
実験４：大規模使い捨てバイオリアクタで増殖させた赤ブドウ細胞におけるレスベラトロール及び全ポリフェノールのレベルに対するカゼイン加水分解物の効果
【０１４４】
例１のステージ３で説明したように、大規模使い捨てバイオリアクタ内において強化ガンボーグＢ５培地の存在下で赤ブドウ細胞を増殖させた。
【０１４５】
表５に見られるように、使い捨て大規模バイオリアクタ内において強化培地で増殖させた場合には、２５０ｍｇ／ｌのカゼイン加水分解物の有無にかかわらず、赤ブドウ細胞におけるレスベラトロール及び全ポリフェノールのレベルは類似していた。
【表７】
2016500520.tif 000009
【０１４６】
実験５：大規模使い捨てバイオリアクタで増殖させた赤ブドウ細胞のレスベラトロール及び全ポリフェノールのレベルに対する植物ホルモン添加の効果
【０１４７】
例１のステージ３で説明したように、赤ブドウ細胞を、大規模使い捨てバイオリアクタ内の強化ガンボーグＢ５培地で増殖させた。表６に見られるように、使い捨て大規模バイオリアクタで増殖させた場合には、０．５ｍｇ／ｌのＮＡＡ及び０．２ｍｇ／ｌのカイネチンの有無にかかわらず、赤ブドウ細胞におけるレスベラトロール及び全ポリフェノールの生成のレベルは類似していた（表６）。
【表８】
2016500520.tif 000010
【０１４８】
実験６：大規模使い捨てバイオリアクタで増殖させた赤ブドウ細胞に対するスクロース濃度の効果
【０１４９】
例１のステージ３で説明したように、赤ブドウ細胞を、大規模使い捨てバイオリアクタ（５０リットル）内において種々のスクロース濃度の強化ガンボーグＢ５培地で増殖させた。
【０１５０】
赤ブドウ細胞を、２、３、４及び６％のスクロースを含有する強化ガンボーグＢ５培地で増殖させた。下表６Ａに示すように、２〜４％のスクロース（１４３〜２６０ｇ／Ｌ）で細胞を増殖させた場合に、最適な細胞増殖及びバイオマスが達成される。それよりも高いスクロース濃度では、例えば６％のスクロースは、細胞増殖を１０倍阻害する（２４ｇ／Ｌ）。
【表９】
2016500520.tif 000011
【０１５１】
実験７：大規模使い捨てバイオリアクタで増殖させた赤ブドウ細胞におけるレスベラトロール及び全ポリフェノールのレベルに対するバイオリアクタ構成、設計及び構造の効果
【０１５２】
赤ブドウ細胞によって生成されるレスベラトロールの量に対する２つの培地（ＩＭ１培地並びに、マグネシウム塩、リン酸塩及び硝酸塩で強化されたガンボーグＢ５培地）の効果を、滅菌された使い捨ての透明なプラスチック容器から製造された２０Ｌバイオリアクタ内で評価し、さらに、A. Decendit (1996) Biotechnology Lettersに公表されたデータ（ここでは、２０Ｌのガラス容器内においてＩＭ１培地で細胞を増殖させた）と比較した。
【０１５３】
結果は、使い捨てバイオリアクタ内においてＩＭ１培地で増殖させた赤ブドウ細胞が９３ｍｇ／ｌのレスベラトロール（表７）を生成し、これは、同じ培地（Decendit）を用いて撹拌型ガラス製バイオリアクタ内で生成されたレスベラトロールよりも約３倍高いレベルであることを示していた。さらに、これらの細胞を使い捨てバイオリアクタ内において強化ガンボーグＢ５培地で増殖させた場合には、３８７ｍｇ／ｌという非常に高レベルのレスベラトロールが生成された（表７）。
【表１０】
2016500520.tif 000012
【０１５４】
さらに、強化ガンボーグＢ５培地を含む特定の培地組成と使い捨てバイオリアクタデザインとの組合せにより、細胞は、ＩＭ１培地及び撹拌型ガラス製バイオリアクタで生産されたレベルよりも１０〜１２倍のレスベラトロールを生産し、使い捨てバイオリアクタ内においてＩＭ１培地で増殖させた細胞の４倍のレスベラトロールを生産した（表７）。
【０１５５】
これらの結果は、２０Ｌ以上のバイオリアクタで生成されるＲＧＣ中のレスベラトロールを高レベルに維持するためには、バイオリアクタの種類及び培地組成の両方が必要であることを示している。
【０１５６】
例３
組成物：
【０１５７】
赤色及び紫色のブドウはともに強力なポリフェノール、抗酸化物質及びレスベラトロールを含んでおり、動脈の狭窄及び硬化の両方を予防するのに役立つ。増加の一途をたどる研究によれば、赤色及び紫色のブドウ中に存在し、最終的には赤ワイン中にも存在するレスベラトロールは、体内の重要な代謝経路に影響を与えるものであり、我々の健康に寄与し得ることが示されている。しかし、これらは糖含量が非常に高く、したがって適度に摂取すべきである。
【０１５８】
大規模使い捨てバイオリアクタで増殖させた赤ブドウ細胞の組成物は、他に類のないものである。
【０１５９】
赤ブドウ細胞の化学組成物は、糖及びレスベラトロールのレベル以外は、標準的な農業のやり方を用いて増殖させたブドウと同様である。
【０１６０】
実験８：ブドウ園で成長させた赤ブドウとの比較における、大規模使い捨てバイオリアクタで増殖させた赤ブドウ細胞における全糖、グルコース及びフルクトースのレベルの低さ
【０１６１】
例１のステージ３及び４で説明したように、大規模使い捨てバイオリアクタ内において強化ガンボーグＢ５培地で増殖させた赤ブドウ細胞に含まれる全糖、グルコース及びフルクトースの量は、農業手段によって増殖させた異なる種類の赤ブドウから得られるこれらの糖のレベルと比較して２５分の１〜５０分の１であった（表８）。
【表１１】
2016500520.tif 000013
【０１６２】
実験９：大規模使い捨てバイオリアクタで増殖させた赤ブドウの全ポリフェノール及びレスベラトロール組成物のレベル
【０１６３】
赤ブドウ細胞に含まれる全ポリフェノールのレベルは、露地で成長させた赤ブドウに含まれる量と同様であるが、レスベラトロールは例外で、４０〜８００倍高いレベルで存在している（表９及び表１０）。例１のステージ３及び４で説明したように大規模使い捨てバイオリアクタで増殖させた赤ブドウ細胞５バッチ中のレスベラトロールのレベルは、生重量１ｋｇ当たり７２６〜９１６ｍｇであり、それに対して農業により生産された赤ブドウではｌ〜１２ｍｇ／ｋｇである（表９Ａ、９Ｂ）。乾燥プロセス後の赤ブドウ細胞の乾燥粉末中のレスベラトロールのレベルは、粉末１ｋｇ当たり６０００〜３１０００ｍｇである（表１０）。
【０１６４】
方法：２８０、５２０及び３０６ｎｍにおけるＵＶ／ＶＩＳ検出を伴うＨＰＬＣを用いて赤ブドウ細胞中のポリフェノール及びレスベラトロールのレベルを分析した。
【表１２】
2016500520.tif 000014
【表１３】
2016500520.tif 000015
【０１６５】
例４
インビボでカラギーナンによって誘発される足浮腫ラットモデルにおける培養ブドウ細胞の効果
【０１６６】
本研究の目的は、本発明により生産した細胞の生産効率を検証するために、本発明の大規模プロセスにより製造したＲＧＣ（赤ブドウ細胞）のインビボ抗炎症活性をラットの急性炎症モデルにおいて評価することであった。げっ歯類の急性炎症を研究するために最も広く用いられている実験モデルの１つは、カラギーナンの足底内投与に基づくものである。
【０１６７】
本研究では、ＲＧＣの有効性を次の２つの方法によって評価した。
１．足体積の測定
２．自由に動き回るラットの炎症性痛覚
【０１６８】
原料及び方法：
例１に従って作製した赤ブドウ細胞（ＲＧＣ）。
カラギーナン注射の２時間前に、ＲＧＣを、滅菌飲料水中に懸濁させた懸濁液として体重１ｋｇ当たり４００ｍｇ（４００ｍｇ／ｋｇ）の用量で経口投与した。用量レベルは４０ｍｇ／ｍｌであった。各ラットに対して体重１００ｇ当たり１ｍｌの懸濁液を投与した。
ＲＧＣ組成物：各ラットに注射したポリフェノール及びレスベラトロールの量は、それぞれ体重当たり１４ｍｇ及び４．８ｍｇであった（カラギーナンはラットの足浮腫を誘発した：ラットを８匹ずつ３つの群に分けた。全ての群のラットに対し、各ラットの左後足の足底下組織に１％のカラギーナン（０．１ｍｇ／足）または滅菌食塩水（０．９％ＮａＣｌ）を注射した。
【０１６９】
以下の検査を行った：
足体積の測定
・カラギーナン注射の直前、注射の０、１、２、４時間後の時点で、１時間毎にキャリパを用いて足体積を測定した。
・２つの軸線で足寸法を測定し、足体積を計算した。このモデルの足浮腫体積は、炎症の重症度を示すものであった。
・各時点に対して、ベースライン足体積を減算することによって、またはベースライン足体積の％として、足体積の変化を計算した。
【０１７０】
自由に動き回るラットの炎症性痛覚を測定するためのホットプレート法
ホットプレート法を用いて、自由に動き回るラットの炎症性痛覚を測定した。浮腫を誘発し、かつ溶媒、インドメタシンまたはＲＧＣ製剤で処理した後、ラットを５５±０．５℃の温度に維持したホットプレート上に置いた。ベースラインに比べて、後足を動かしたり舐めたりするまでの潜時、あるいはホットプレートからジャンプするまでの潜時を反応時間と考えた。注射の１、２及び４時間後に反応時間を書き留めた。反応がない場合は、組織損傷を防ぐために、カットオフ時間を６０秒とした。
【０１７１】
群の割当：
溶媒投与対照（１Ｍ）群：対照ラットには、カラギーナン注射の２時間前に、滅菌飲料水（溶媒）を投与した。
陽性対照群（「２Ｍ」）：陽性対照群のラットには、カラギーナン注射の２時間前に、体重１ｋｇ当たり２ｍｇのインドメタシンを投与した。
実験群（「３Ｍ」）：ラットには、カラギーナン注射の２時間前に、ＲＧＣを、滅菌飲料水中に懸濁させた懸濁液として体重１ｋｇ当たり４００ｍｇの用量（体重１００ｇ当たり１ｍｌ／４０ｍｇのＲＧＣ）で経口投与した。
【０１７２】
結果
足の腫れ：
図１は、ＲＧＣ製剤、インドメタシン及び対照として水でそれぞれ処理したラットにおける足浮腫の結果（体積パーセント）を示している。反復測定のための二元配置分散分析法を用いて統計分析を行い、次にボンフェローニ・ポストホックテスト（ボンフェローニ法）を用いた。対照群（１Ｍ）と陽性対照群（２Ｍ）との比較は、２時間及び４時間に統計的に有意な差（ｐ＜０．００１）を示した。対照群とＲＧＣ製剤（３Ｍ）群との比較は、２時間及び４時間に統計的に有意な差（ｐ＜０．００１）を示した。
【０１７３】
図１に示したように、ラットをＲＧＣ製剤で処理した場合、１または２時間後に足の腫れが少なくとも陽性対照のレベルまで減少した。さらに、４時間後、ＲＧＣ製剤で処理したラットは、対照よりもさらに大きな足の腫れの減少を示した。
【０１７４】
炎症性痛覚 
図２は、ＲＧＣ製剤、インドメタシン及び対照として水でそれぞれ処理した後の、各群の痛覚過敏作用を示している。反復測定のための二元配置分散分析法を用いて統計分析を行い、次にボンフェローニ法を用いた。対照群（１Ｍ）と陽性対照群（２Ｍ）との比較は、２時間及び４時間に統計的に有意な差（ｐ＜０．０５−０．０１）を示した。対照群とＲＧＣ（３Ｍ）との比較は、４時間に統計的に有意な差（ｐ＜０．０１）を示した。
【０１７５】
図２に見られるように、溶媒投与対照群（１Ｍ）（滅菌飲料水を投与）は、カラギーナン注射の２時間及び４時間後に、熱刺激に対する潜時Δ（時間）の著しい増加を示した。このことは、この群におけるラットの足底熱刺激に対する反応性の低下によって裏付けられた。
【０１７６】
図３に見られるように、陽性対照群（インドメタシン処理ラット，２Ｍ）は、カラギーナン注射の２時間及び４時間後に、溶媒投与対照群と比較して熱刺激に対する反応の潜時Δの著しい減少を示した。
【０１７７】
ＲＧＣ処理ラット（３Ｍ）は、カラギーナン注射の４時間後に、熱刺激に対する反応の潜時Δの減少を示した。これは、溶媒投与対照群と比較して統計的に有意であった。
【０１７８】
結論として、この例において示された結果は、ラットにおけるカラギーナンによって誘発される後足炎症と関連する足浮腫及び行動痛覚過敏が、例１に記載したプロセスにより製造したＲＧＣの経口投与によって実際的に軽減されたことを示しており、このことは、ＲＧＣ製剤の抗炎症作用が大規模プロセスで作製されるＲＧＣ中においてさえも回復されることを示している。
【０１７９】
例５
他の源から得られるＲＥＳと比較してのＲＧＣ−ＲＥＳの化学的特性、及びＲＧＣ−ＲＥＳのヒトのバイオアベイラビリティ特性
【０１８０】
原料及び方法
例１に従って赤ブドウ細胞（ＲＧＣ）を作製した。ＲＧＣのレスベラトロール（ＲＥＳ）含有量を、合成ＲＥＳ較正曲線を用いて３０６ｎｍでＨＰＬＣ分析によって測定した。
【０１８１】
ＲＧＣ−ＲＥＳのＬＣ−ＭＳ分析
ＲＧＣ 粉末を８０％メタノールに溶解させた。試料の液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を、Ａｃｃｅｌａ ＬＣシステム／エレクトロスプレーイオン化源を備えた四重極トラップ（ＬＴＱ）型Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＤｉｓｃｏｖｅｒｙハイブリッドＦＴ質量分析計（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Thermo Fisher Scientific Inc.）製）を用いて行った。質量分析計を負イオン化モードで作動させ、ｍ／ｚ１５０〜２０００の範囲で質量スペクトルを得た。
【０１８２】
溶解度アッセイ
ＲＧＣ、合成レスベラトロール（Ｓ−ＲＥＳ；シグマアルドリッチ社）及び植物イタドリからのレスベラトロール抽出物（植物−ＲＥＳ）を８０％メタノールに溶解させることにより１００％の溶解を達成した。その後、全てのＲＥＳ源をｐＨ２及びｐＨ７の水に溶解させ、水への溶解度のパーセンテージをメタノールへの溶解度と比較した。全ての試料中のＲＥＳをその特性吸収プロフィールに基づいて３０６ｎｍで測定し、レスベラトロール分析標準の較正曲線によって濃度を決定した。
【０１８３】
結果
ＬＣ−ＭＳ
ＲＧＣ粉末のための負イオンモード及び代表的ＬＣ／ＭＳクロマトグラムでの質量スペクトルを図６Ａ及び図６Ｂに示す。ＬＣ−ＭＳ分析によって、ＲＧＣにおいてレスベラトロールの４つの誘導体が検出され（ｍ／ｚ−２２７．０７０１−２２７．０７３７）、これらは全て３０６ｎｍでのＵＶ吸光度を示している。これらの誘導体のうち３つは、４．６分、５．３分及び６．１分の保持時間に検出されたトランス型ＲＥＳ異性体のヘキソース配糖体であった。第４の誘導体は、６．９分の保持時間に検出されたトランス型ＲＥＳのものであった（表１２）。ＥＳＩマススペクトル（図７）に示すように、４つの誘導体の同一性を確認した。
【表１４】
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【０１８４】
溶解度
ＲＧＣ−ＲＥＳの溶解度を２つのトランス型ＲＥＳ生成物、すなわち合成−ＲＥＳ及び植物イタドリ−ＲＥＳの溶解度と比較した。検査した３つの生成物は全て、８０％メタノール溶液に完全に溶解した。しかし、３つのＲＥＳ生成物を、胃のｐＨ状態を再現する酸性化した水（ｐＨ＝２）及びｐＨ７．０の水に溶解させたとき、ＲＧＣ−ＲＥＳの溶解度は、ＲＧＣ−ＲＥＳに関しては６倍以上高い４４％であり、他の２つのＲＥＳ源に関しては７％であった（図５）。
【０１８５】
ヒトバイオアベイラビリティの研究
本研究は、単回用量無作為化クロスオーバ比較薬物動態研究であった。１５人の成人の健常な絶食男性被験者に対して、少なくとも７日間のウォッシュアウト期間を隔てて、治験中の生成物ＲＧＣ（５０ｍｇまたは１５０ｍｇのトランス−ＲＥＳに相当する経口用量）を投与した。投与の４時間後に標準食を与えた。本研究は、イスラエル国保健省（ＭＯＨ）の全ての規則及び規制に準拠して、かつＩＣＨ ＧＣＰガイダンスに従って行った。このプロトコールは、ソロカ大学医療センターＩＲＢによって承認されたものであり、各患者に対する５０または１５０ｍｇの単回用量の投与と、その後の７日間のウォッシュアウトと、１回目の用量とは異なる（最初に５０ｍｇを投与された患者は２回目の投与で１５０ｍｇを投与され、逆の場合も同様であるように投与される）２回目の単回用量とが含まれる。本研究へは１５人の健常な非喫煙男性ボランティアを募集した。ボランティア適格条件は、年齢１８〜５５歳；ＢＭＩ＞１９及び＜３０であった。被験者は、１回目の投与の７日前から、及び本研究期間全体を通して、ＲＥＳ含有食品、栄養サプリメントまたはドリンクを控え、かつ一般用医薬品を含む全ての薬物を控えるように依頼された。
【０１８６】
試料の採取及び管理
投与の前（ｔ０）及び投与の０．３３、０．６７、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、８、１０及び１２時間後に、Ｋ２ＥＤＴＡ含有チューブに様々な血液試料を採取した。血液試料を氷浴中に保持し、黄色光の下で直ちに処理した。
【０１８７】
血漿中のレスベラトロール含有量の分析
試料作製及び血漿試料中の遊離ＲＥＳ（free RES）及び全ＲＥＳ（total RES）のＬＣ−ＭＳ分析は、ＰＲＡＣＳインスティテュート（Toronto, Canada）が行った。血漿試料を液液抽出し、の分析のためにＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムに用いた。定量下限値（ＬＬＯＱ）は、遊離ＲＥＳ及び全ＲＥＳに関してそれぞれ０．５及び２０ｎｇ／ｍＬであった。全ＲＥＳの分析のために、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に先立って、酵素加水分解及びタンパク質沈殿抽出を行った。
【０１８８】
薬物動態解析
ノンコンパートメントモデル薬物動態手法を用いて遊離ＲＥＳ及び全ＲＥＳ（遊離及び共役）に関する以下の薬物動態変数、すなわち、最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）及び最大血漿濃度時間（Ｔｍａｘ）、全収集期間の平均濃度、台形法による時間（０）から最後の定量化可能な濃度（Ｃｌａｓｔ，ＬＯＱを超えている）までの血漿濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。
【０１８９】
結果
人口統計学的特性及び安全性：１５人の健常な男性ボランティアが本研究に参加した。被験者の年齢範囲は２８〜５５歳（平均４２．１歳）、ＢＭＩ範囲は２１．４〜３０（平均２５．８）であった。全ての被験者は、スクリーン時及び投与時の検査パラメータ及びバイタルサイン測定値に関して臨床的に有意な異常がなく、薬物及びアルコールに対して陰性であることをテストした。本研究を通して有害事象は観察も報告もされなかった。
【０１９０】
遊離及び全レスベラトロールの血漿薬物動態：全ＲＥＳ及び遊離ＲＥＳに関する平均のトランス型ＲＧＣ−ＲＥＳの血漿濃度−時間曲線を図６に示す。図に見られるように、両濃度におけるＲＧＣプロフィールは、２つの明瞭な濃度ピーク、すなわち１時間後の第１のピークと、５時間後の第２の（より高い）ピークを示している。
【０１９１】
ｔ−ＲＥＳの平均薬物動態パラメータを表１２Ａ及び表１２Ｂにまとめた。
【表１５】
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【０１９２】
最初の２つの測定時点である０．３３時間及び０．６７時間で分析を行ったところ、測定可能な量のＲＧＣを投与された被験者の血漿中のＲＥＳが明らかになった（表１３）。さらに、０．３３時間の時点では、ＲＧＣ群の全ての被験者（ＲＧＣを１５０ｍｇ投与した群の１人を除く）は、測定可能な濃度の全ＲＥＳを有していた（表１３及び表１４）。
【表１６】
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【表１７】
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【０１９３】
結論
ＲＧＣに由来するＲＥＳは、１つのヘキソース部分の追加によって特徴付けられる。ヘキソースの正確な種類及び正確な位置は特定されていないが、ＲＧＣ−ＲＥＳはピセイド（赤ブドウに天然に存在する最もよく見られる種類のＲＥＳ）である可能性が最も高い。遊離ＲＥＳ及び全ＲＥＳの両形態において実証された２つのピークの現象は独特なものであり、他の種類のＲＥＳには見られなかった。溶解度試験において観察されたように（溶解度試験では、ＲＧＣ−ＲＥＳは合成及び植物由来ＲＥＳ源よりも水溶性が高かった）、ＲＧＣ−ＲＥＳ中のグリコシド基の存在がＲＧＣ−ＲＥＳをより溶解しやすくした可能性がある。この独特な２つの濃度ピークパターンは、赤ブドウのポリフェノールの全マトリックス及び高レベルの配糖体レスベラトロールを含有しかつ両者の相乗効果をもたらすＲＧＣ固有の組成物にも起因し得る。この特徴は、投与の２０分後という早さでＲＥＳが高い率で、高濃度で存在することに現れていたであろう。
【０１９４】
濃度／時間曲線（図６Ａ）にはっきりと見られるように、ＲＧＣ−ＲＥＳは、１時間後及び５時間後に現れる２つの非常に明白な濃度ピークを生じさせた。
【０１９５】
重要なことには、ＲＥＳの合成または酵母発酵源の濃度時間曲線（Poulsen, MM., Vestergaard, PF., Clasen, BF., Radko, Y., et al., High-dose resveratrol supplementation in obese men: an investigator-initiated, randomized, placebo-controlled clinical trial of substrate metabolism, insulin sensitivity, and body composition. Diabetes 2013, 62, 1186-1195）及び植物由来ＲＥＳの濃度時間曲線（Amiot, M.J., Romier, B., Dao, T.M., Fanciullino, R., et al., Optimization of trans-Resveratrol bioavailability for human therapy. Biochimie 2013, 95, 1233-1238）は、明白な１つの濃度ピークを示している。このことは、持続効果を得るために１日に１回のＲＧＣの補足で十分であることを示しており、その一方で、他の製品では、同じ効果を得るために１日に２回以上の補足またはより高いレベルが必要とされ得る。
【０１９６】
本明細書において本発明の特定の特徴について図示及び説明してきたが、当業者は、本発明の多くの変更形態、置換形態、変形形態及び等価形態を想到するであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨に含まれる全てのそのような変更形態及び変形形態を網羅するものであることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【国際調査報告】
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