(57)【要約】  尿サンプル中のアルブミン及びクレアチニンの測定と、テストカセットからシグナルを検出し、計算し、アルブミン濃度、クレアチニン濃度及びアルブミン／クレアチニン比を表示するリーダとのための免疫クロマトグラフィシステムをここに開示する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトのサンプルのアルブミン−クレアチニン比を決定する装置であって、
固体サポート上に配置されたサンプルウェルを含む、１つのサンプル塗布パッドと、
クレアチニン特異コンジュゲート及びアルブミン特異コンジュゲートが中に配置されたコンジュゲートパッドと、
ラテラルフローメンブレンと、
サンプル中に存在し、前記クレアチニン特異コンジュゲートに結合したクレアチニンが、前記メンブレンに結合されたクレアチニン特異固定化剤によって保持される、クレアチニン特異テスト領域と、
前記クレアチニン特異テスト領域において保持されなかった前記クレアチニン特異コンジュゲートが、前記メンブレンに結合されたクレアチニンコンジュゲート特異固定化剤によって保持される、クレアチニン特異コントロール領域と、
前記サンプル中に存在し、前記アルブミン特異コンジュゲートに結合したアルブミンが、前記メンブレンに結合されたアルブミン特異固定化剤によって保持される、アルブミン特異テスト領域と、
前記アルブミン特異テスト領域において保持されなかった前記アルブミン特異コンジュゲートが、前記メンブレンに結合されたアルブミンコンジュゲート特異固定化剤によって保持される、アルブミン特異コントロール領域と、
リザーバと、
を備える、テストストリップを備えるテストカセットと、
前記サンプル中のアルブミン濃度と、サンプル中のクレアチニン濃度と、アルブミン−クレアチニン比と、を決定する測定装置と、
を備える、ことを特徴とする、装置。
【請求項２】
前記サンプルは、尿サンプルである、ことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記装置は、ラテラルフローイムノクロマトグラフィ装置である、ことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記測定装置は、反射分光装置又は蛍光光度計である、ことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記クレアチニン特異コンジュゲートは、クレアチニンに特異的な抗体である、ことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記アルブミン特異コンジュゲートは、アルブミンに特異的な抗体である、ことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記クレアチニン特異固定化剤は、クレアチニンである、ことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記クレアチニンは、キャリアに結合している、ことを特徴とする請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記クレアチニンコンジュゲート特異固定化剤は、前記クレアチニン特異抗体の種に対して特異的な抗体である、ことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
前記アルブミン特異固定化剤は、ヒト血清アルブミンである、ことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
前記アルブミンコンジュゲート特異固定化剤は、前記アルブミン特異抗体の種に対して特異的な抗体である、ことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
前記クレアチニン特異的コンジュゲート及び前記アルブミン特異的コンジュゲートは、検出可能部分によってラベルされている、ことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
前記検出可能な部分は、微粒子又は染料である、ことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
前記微粒子は、コロイド金粒子、ラテックス粒子、ポリスチレン粒子、アクリル粒子、又は他の固相微粒子である、ことを特徴とする請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記微粒子は、着色され、又は蛍光化合物がタグ付けされている、ことを特徴する請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記１つのサンプル塗布パッド、前記コンジュゲートパッド、前記クレアチニン特異テスト領域、前記クレアチニン特異コントロール領域、前記アルブミン特異テスト領域、前記アルブミン特異コントロール領域、及び前記リザーバは、全て１つのテストストリップ上に配置される、ことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１７】
前記システムは、２つのテストストリップを備えることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１８】
第１のテストストリップは、クレアチニン特異コンジュゲートと、クレアチニン特異テスト領域と、クレアチニン特異コントロール領域と、第１のリザーバと、を備える第１のコンジュゲートパッドを備え、
第２のテストストリップは、アルブミン特異コンジュゲートと、アルブミン特異テスト領域と、アルブミン特異コントロール領域と、第２のリザーバと、を備える第２のコンジュゲートパッドを備え、
前記第１のテストストリップと前記第２のテストストリップとは、並列に、又は互いに対向するように、又は前記第１のテストストリップと前記第２のテストストリップとが１つのサンプル塗布パッドを共有するように互いに角度をなして配置される、ことを特徴とする請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
サンプル中のアルブミン−クレアチニン比を決定する方法であって、
請求項１に記載のテストカセットのサンプル塗布パッドにサンプルを置くことであって、前記サンプルはコンジュゲートパッド内に移動し、クレアチニン特異コンジュゲート及びアルブミン特異コンジュゲートに曝され、前記サンプル中のクレアチニンは前記クレアチニン特異コンジュゲートに結合し、前記サンプル中のアルブミンは前記アルブミン特異コンジュゲートに結合し、クレアチニンと結合した前記クレアチニン特異コンジュゲートは、クレアチニンテスト領域内のクレアチニン特異固定化剤に結合し、結合していない前記物質を、前記クレアチニン特異固定化剤に結合していない前記クレアチニン特異コンジュゲートを結合するクレアチニン特異コントロール領域に送り、アルブミンに結合した前記アルブミン特異コンジュゲートは、アルブミンテスト領域内のアルブミン特異固定化剤に結合し、結合していない前記物質を、前記アルブミン特異固定化剤に結合していない前記アルブミン特異コンジュゲートを結合するアルブミン特異コントロール領域に送り、前記サンプルが前記コンジュゲートと反応し、終点に到達する時間は、約２分から約３０分である、テストカセットのサンプル塗布パッドにサンプルを置くことと、
テストカセットを測定装置に挿入することと、
サンプルからクレアチニンの濃度、アルブミンの濃度、及びアルブミン−クレアチニン比の数値結果を提供することと、を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２０】
前記サンプルが前記コンジュゲートと反応し、終点に到達するまでの時間は約１５分である、ことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ラテラルフロークロマトグラフィを用いたアルブミン及びクレアチニンレベル、及びアルブミン−クレアチニン比を測定する方法及び装置。
【背景技術】
【０００２】
アルブミン−クレアチニン比（ＡＣＲ）アッセイは、尿中の２つの分析物であるアルブミン及びクレアチニンを同時に測定する。身体が適切に機能している場合、アルブミンは腎臓の作用によって血流中に保持されるため、通常は尿中には存在しない。少量のアルブミンが腎臓から尿中に排泄される場合、微量アルブミン尿と呼ばれる状態が存在する。微量アルブミン尿は、腎臓から尿へとアルブミンの異常な漏れがある場合に起きる。
【０００３】
クレアチニンは、筋肉中のクレアチンリン酸の副生成物である。通常に機能している身体では、それは一定の割合で尿中に排泄される。アルブミンがクレアチニンと同時に測定される場合、その結果はアルブミン−クレアチニン比として知られている。尿中のアルブミンの決定のためにＡＣＲを利用することで、利尿の産出量及び患者の水分補給状態を起因とする尿の濃度を補正する。
【０００４】
糖尿病又は高血圧の人における微量アルブミン尿は、神経障害、心疾患（ＣＶＤ）、網膜症、子癇前症及び死亡率の発症リスクの増加と関連すると明らかにされていた。ＡＣＲアッセイは、治療効果のモニタリング方法だけでなく腎臓のダメージを早期発見する方法として役立つ。ＡＣＲアッセイは、腎不全発症のリスクが増大している糖尿病及び高血圧慢性疾患の患者に、しばしば用いられる。
【０００５】
クレアチニンを測定する既存の方法は、アルカリ性ピクリン酸を用いたヤッフェ反応に基づく化学反応と、クレアチニンをクレアチナーゼに変換し、ペルオキシターゼによって生成された色の強度と反応基板とを測定する酵素法と、を含む比色アッセイを含む。
【０００６】
尿中のアルブミンは、染料が直接アルブミン分子と反応し着色アルブミン−染料複合体を形成する比色法、又はネフェロメトリー又はタービディメトリーを用いた免疫法、及び標識抗体に基づくイムノアッセイの競合法又はサンドイッチ法、を含む４つの方法のうちの１つによって測定される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
アルブミン−クレアチニン比の検査を実施する現在の方法は、実施すること又は高価な器具類が必要であることが複雑であり、一般的に臨床検査室で実施される。ポイント・オブ・ケア又は市販薬となりうる簡略化されたアッセイを開発することは、有利となる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ここでは、使い捨てのテストストリップ及び再利用可能な測定器具を用いた、分析物及び分析物比の決定のための簡略化されたポイント・オブ・ケアアッセイが開示される。開示の方法及び装置は、ラテラルフローイムノクロマトグラフィの原理を利用して、１回のアッセイで、尿アルブミンと尿クレアチニンの両方を測定し、アルブミン−クレアチニン比（ＡＣＲ）を決定する。患者の尿サンプルは、検査を実施するための試薬を含むテストカセットに置かれる。そして、テストカセットは、テストカセットリーダに挿入されて、それにより、読み取り、計算及び結果の報告がなされる。
【０００９】
１つの実施形態では、ヒトのサンプルにおけるアルブミン−クレアチニン比を決定するための装置が開示されており、固体サポート上に配置されたサンプルウェルを含む、１つのサンプル塗布パッドと、クレアチニン特異コンジュゲート及びアルブミン特異コンジュゲートが中に配置されたコンジュゲートパッドと、ラテラルフローメンブレンと、サンプル中に存在し、クレアチニン特異コンジュゲートに結合したクレアチニンが、メンブレンに結合されたクレアチニン特異固定化剤によって保持される、クレアチニン特異テスト領域と、クレアチニン特異テスト領域において保持されなかったクレアチニン特異コンジュゲートが、メンブレンに結合されたクレアチニンコンジュゲート特異固定化剤によって保持される、クレアチニン特異コントロール領域と、サンプル中に存在し、アルブミン特異コンジュゲートに結合したアルブミンが、メンブレンに結合されたアルブミン特異固定化剤によって保持される、アルブミン特異テスト領域と、アルブミン特異テスト領域において保持されなかったアルブミン特異コンジュゲートが、メンブレンに結合されたアルブミンコンジュゲート特異固定化剤によって保持される、アルブミン特異コントロール領域と、リザーバと、を備える、テストストリップを備えるテストカセットと、サンプル中のアルブミン濃度と、サンプル中のクレアチニン濃度と、アルブミン−クレアチニン比と、を決定する測定装置と、を備えることを特徴とする。
【００１０】
装置の他の実施形態では、サンプルは尿サンプルである。別の実施形態では、装置はラテラルフローイムノクロマトグラフィ装置である。更に他の実施形態では、測定装置は、読み取り、計算し、サンプル中のアルブミン濃度、サンプル中のクレアチニン濃度及びアルブミン−クレアチニン比として結果を表示する。他の実施形態では、測定装置は、反射分光計又は蛍光光度計である。
【００１１】
装置の他の実施形態では、クレアチニン特異コンジュゲートは、クレアチニンに特異的な抗体である。他の実施形態では、クレアチニン特異固定化剤は、クレアチニンである。他の実施形態では、クレアチニンは、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、又はオボアルブミンのようなキャリアタンパク質と結合する。他の実施形態では、クレアチニンコンジュゲート特異固定化剤は、クレアチニン特異抗体の種に対して特異的な抗体である。
【００１２】
装置の他の実施形態では、アルブミン特異コンジュゲートは、アルブミンに特異的な抗体である。他の実施形態では、アルブミン特異固定化剤は、ヒト血清アルブミンである。更に他の実施形態では、アルブミンコンジュゲート特異固定化剤は、アルブミン特異抗体の種に対して特異的な抗体である。
【００１３】
装置のある実施形態では、抗体のいずれも、ウサギ、ニワトリ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ウマ、マウス、ラット、又はヒツジに由来するモノクロナール抗体又はポリクロナール抗体である。
【００１４】
装置の他の実施形態では、クレアチニン特異コンジュゲート及びアルブミン特異コンジュゲートは、微小粒子又は染料の検出可能部分によってラベルされる。微小粒子は、コロイド金粒子、ポリスチレン粒子、アクリル粒子、磁性粒子、又は他の固相微小粒子であり、着色又は蛍光化合物によって標識されてもよい。
【００１５】
装置の他の実施形態では、１つのサンプル塗布パッド、コンジュゲートパッド、クレアチニン特異テスト領域、クレアチニン特異コントロール領域、アルブミン特異テスト領域、アルブミン特異コントロール領域、及びリザーバが全て、１つのテストストリップ上に設けられる。更に他の実施形態では、テストストリップは、剛性のカセットに封入される。
【００１６】
装置の他の実施形態では、装置は２つのテストストリップを備え、第１のテストストリップは、クレアチニン特異コンジュゲートと、クレアチニン特異テスト領域と、クレアチニン特異コントロール領域と第１のリザーバとを備える第１のコンジュゲートパッドを備え、第２のテストストリップは、アルブミン特異コンジュゲートと、アルブミン特異テスト領域と、アルブミン特異コントロール領域と第２のリザーバとを備える第２のコンジュゲートパッドを備え、第１のテストストリップと第２のテストストリップは、第１のテストストリップと第２のテストストリップとが１つのサンプル塗布パッドを共有するように、並列に、又は互いに対向するように、又は互いに角度をなして配置される。他の実施形態では、第１のテストストリップと第２のテストストリップとは、１つの剛性のカセットに封入される。  
【００１７】
ここでは、サンプル中のアルブミン−クレアチニン比を決定する方法も開示され、請求項１に係るテストカセットのサンプル塗布パッドにサンプルを置くことであって、サンプルはコンジュゲートパッド内に移動し、クレアチニン特異コンジュゲート及びアルブミン特異コンジュゲートに曝され、サンプル中のクレアチニンはクレアチニン特異コンジュゲートに結合し、サンプル中のアルブミンはアルブミン特異コンジュゲートに結合し、クレアチニンと結合したクレアチニン特異コンジュゲートは、クレアチニンテスト領域内のクレアチニン特異固定化剤に結合し、結合していない物質を、クレアチニン特異固定化剤に結合していないクレアチニン特異コンジュゲートを結合するクレアチニン特異コントロール領域に送り、アルブミンと結合したアルブミン特異コンジュゲートは、アルブミンテスト領域内のアルブミン特異固定化剤に結合し、結合していない物質を、アルブミン特異固定化剤に結合していないアルブミン特異コンジュゲートを結合するアルブミン特異コントロール領域に送り、サンプルがコンジュゲートと反応し、終点に到達する時間は、約２分から約３０分である、テストカセットのサンプル塗布パッドにサンプルを置くことと、テストカセットを測定装置に挿入することと、サンプルからクレアチニンの濃度、アルブミンの濃度、及びアルブミン−クレアチニン比の数値結果を提供することと、を含むことを特徴とする。
【００１８】
方法の他の実施形態では、サンプルは尿サンプルである。他の実施形態では、テストカセットはラテラルフローイムノクロマトグラフィ装置の一部である。他の実施形態では、測定装置は、読み取り、計算し、サンプル中のアルブミン濃度、サンプル中のクレアチニン濃度及びアルブミン−クレアチニン比として結果を表示する。
【００１９】
方法の他の実施形態では、サンプルがコンジュゲートと反応し、終点に到達する時間は、約７分から約２５分、約１０分から約２０分、又は約１５分である。
【００２０】
方法の他の実施形態では、クレアチニン特異コンジュゲートは、クレアチニンに特異的な抗体である。他の実施形態では、クレアチニン特異固定化剤は、クレアチニンである。他の実施形態では、クレアチニンは、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、オボアルブミン、又はデンドリマーのようなキャリア分子と結合する。他の実施形態では、クレアチニンコンジュゲート特異固定化剤は、クレアチニン特異抗体の種に対して特異的な抗体である。
【００２１】
方法の他の実施形態では、アルブミン特異コンジュゲートは、アルブミンに特異的な抗体である。他の実施形態では、アルブミン特異固定化剤は、ヒト血清アルブミンである。更に他の実施形態では、アルブミンコンジュゲート特異固定化剤は、アルブミン特異抗体の種に対して特異的な抗体である。
【００２２】
方法のある実施形態では、抗体のいずれも、ウサギ、ニワトリ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ウマ、マウス、ラット、又はヒツジに由来するモノクロナール抗体又はポリクロナール抗体である。
【００２３】
方法の他の実施形態では、クレアチニン特異コンジュゲート及びアルブミン特異コンジュゲートは、微小粒子又は染料である検出可能部分によってラベルされる。微小粒子は、コロイド金粒子、ポリスチレン粒子、アクリル粒子、磁性粒子、又は他の固相微小粒子であり、着色され、又は蛍光化合物によって標識されてもよい。
【００２４】
方法の他の実施形態では、１つのサンプル塗布パッド、コンジュゲートパッド、クレアチニン特異テスト領域、クレアチニン特異コントロール領域、アルブミン特異テスト領域、アルブミン特異コントロール領域、及びリザーバが全て、１つのテストストリップ上に設けられる。更に他の実施形態では、テストストリップは、剛性のカセットに封入される。
【００２５】
方法の別の実施形態では、装置は２つのテストストリップを備え、第１のテストストリップは、クレアチニン特異コンジュゲートを有する第１のコンジュゲートパッドと、クレアチニン特異テスト領域と、クレアチニン特異コントロール領域と、第１のリザーバを備え、第２のテストストリップは、アルブミン特異コンジュゲートを有する第２のコンジュゲートパッドと、アルブミン特異テスト領域と、アルブミン特異コントロール領域と、第２のリザーバを備え、第１のテストストリップと第２のテストストリップは、第１のテストストリップと第２のテストストリップとが１つのサンプル塗布パッドを共有するように、並列に、又は互いに対向するように、又は互いに角度をなして配置される。別の実施形態では、第１のテストストリップと第２のテストストリップとは、１つの剛性のカセットに封入される。
【００２６】
ここでは、少なくとも１つのテストカセットと、再利用可能な測定装置と、サンプルからアルブミン−クレアチニン比を決定するための器具と、を備えるアルブミン−クレアチニン比を決定するためのキットも開示される。他の実施形態では、キットは更にランニングバッファも含む。
【００２７】
キットの実施形態では、テストカセットは、テストストリップを含み、テストストリップは、固体サポート上に配置されたサンプルウェルを含む１つのサンプル塗布パッドと、クレアチニン特異コンジュゲートとアルブミン特異コンジュゲートとが設けられたコンジュゲートパッドと、ラテラルフローメンブレンと、サンプル中に存在し、クレアチニン特異コンジュゲートに結合したクレアチニンが、メンブレンに結合されたクレアチニン特異固定化剤に保持されるクレアチニン特異テスト領域と、クレアチニン特異テスト領域で保持されなかったクレアチニン特異コンジュゲートが、メンブレンに結合されたクレアチニンコンジュゲート特異固定化剤に保持される、クレアチニン特異コントロール領域と、サンプル中に存在しアルブミン特異コンジュゲートと結合したアルブミンが、メンブレンに結合されたアルブミン特異固定化剤によって保持される、アルブミン特異テスト領域と、アルブミン特異テスト領域で保持されなかったアルブミン特異コンジュゲートが、メンブレンに結合されたアルブミンコンジュゲート特異固定化剤によって保持されるアルブミン特異コントロール領域と、リザーバと、を備えることを特徴とする。
【００２８】
キットの別の実施形態では、測定装置は、テストカセットから、サンプル中のアルブミン濃度と、サンプル中のクレアチニン濃度と、アルブミン−クレアチニン比とを決定する。別の実施形態では、測定装置は、読み取り、計算し、サンプル中のアルブミン濃度、サンプル中のクレアチニン濃度、及びアルブミン−クレアチニン比として結果を表示する。更に他の実施形態では、測定装置は、反射分光計又は蛍光光度計である。
【００２９】
キットの他の実施形態では、サンプルは尿サンプルである。別の実施形態では、テストカセットは、イムノクロマトグラフィテストカセットである。
【００３０】
キットの別の実施形態では、クレアチニン特異コンジュゲートは、クレアチニンに特異的な抗体である。別の実施形態では、クレアチニン特異固定化剤は、クレアチニンである。別の実施形態では、クレアチニンは、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、オボアルブミン、又はデンドリマーのようなキャリア分子と結合する。他の実施形態では、クレアチニンコンジュゲート特異固定化剤は、クレアチニン特異抗体の種に対して特異的な抗体である。
【００３１】
キットの他の実施形態では、アルブミン特異コンジュゲートは、アルブミンに特異的な抗体である。他の実施形態では、アルブミン特異固定化剤は、ヒト血清アルブミンである。更に他の実施形態では、アルブミンコンジュゲート特異固定化剤は、アルブミン特異抗体の種に対して特異的な抗体である。
【００３２】
キットのある実施形態では、抗体のいずれも、ウサギ、ニワトリ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ウマ、マウス、ラット、又はヒツジに由来するモノクロナール抗体又はポリクロナール抗体である。
【００３３】
キットの他の実施形態では、クレアチニン特異コンジュゲート及びアルブミン特異コンジュゲートは、微小粒子又は染料である検出可能部分によってラベルされる。微小粒子は、コロイド金粒子、ポリスチレン粒子、アクリル粒子、磁性粒子、又は他の固相微小粒子であり、着色され、又はタグ付けされ、又は蛍光化合物によって標識されてもよい。
【００３４】
キットの他の実施形態では、１つのサンプル塗布パッド、コンジュゲートパッド、クレアチニン特異テスト領域、クレアチニン特異コントロール領域、アルブミン特異テスト領域、アルブミン特異コントロール領域、及びリザーバが全て、１つのテストストリップ上に設けられる。更に他の実施形態では、テストストリップは、剛性のカセットに封入される。
【００３５】
キットの別の実施形態では、装置は２つのテストストリップを備え、第１のテストストリップは、クレアチニン特異コンジュゲートを有する第１のコンジュゲートパッドと、クレアチニン特異テスト領域と、クレアチニン特異コントロール領域と、第１のリザーバを備え、第２のテストストリップは、アルブミン特異コンジュゲートを有する第２のコンジュゲートパッドと、アルブミン特異テスト領域と、アルブミン特異コントロール領域と、第２のリザーバを備え、第１のテストストリップと第２のテストストリップは、第１のテストストリップと第２のテストストリップとが１つのサンプル塗布パッドを共有するように、並列の形状、又は互いに対向するように、又は互いに角度をなすように配置される。別の実施形態では、第１のテストストリップと第２のテストストリップとは、１つの剛性のカセットに封入される。
【００３６】
ここでは、ヒトのサンプルにおけるアルブミン−クレアチニン比を決定するためのシステムも開示され、システムは、固体サポート上に配置されたサンプルウェルを含む１つのサンプル塗布パッドと、クレアチニン特異コンジュゲート及びアルブミン特異コンジュゲートが中に配置されたコンジュゲートパッドと、ラテラルフローメンブレンと、サンプル中に存在し、クレアチニン特異コンジュゲートに結合したクレアチニンが、メンブレンに結合されたクレアチニン特異固定化剤によって保持されるクレアチニン特異テスト領域と、クレアチニン特異テスト領域で保持されなかったクレアチニン特異コンジュゲートが、メンブレンに結合されたクレアチニンコンジュゲート特異固定化剤によって保持される、クレアチニン特異コントロール領域と、サンプル中に存在しアルブミン特異コンジュゲートと結合したアルブミンが、メンブレンに結合されたアルブミン特異固定化剤によって保持される、アルブミン特異テスト領域と、アルブミン特異テスト領域で保持されなかったアルブミン特異コンジュゲートが、メンブレンに付けられたアルブミンコンジュゲート特異固定化剤によって保持されるアルブミン特異コントロール領域と、リザーバと、を備える、テストストリップを備えるテストカセットと、サンプル中のアルブミン濃度と、サンプル中のクレアチニン濃度と、アルブミン−クレアチニン比とを決定する測定装置と、を備えることを特徴とする。
【００３７】
システムの別の実施形態では、サンプルは尿サンプルである。別の実施形態では、装置は、イムノクロマトグラフィ装置である。更に他の実施形態では、測定装置は、読み取り、計算し、サンプル中のアルブミン濃度、サンプル中のクレアチニン濃度、及びアルブミン−クレアチニン比として結果を表示する。他の実施形態では、測定装置は、反射分光計又は蛍光光度計である。
【００３８】
システムの別の実施形態では、クレアチニン特異コンジュゲートは、クレアチニンに特異的な抗体である。別の実施形態では、クレアチニン特異固定化剤は、クレアチニンである。別の実施形態では、クレアチニンは、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、オボアルブミン、又はデンドリマーのようなキャリア分子と結合する。他の実施形態では、クレアチニンコンジュゲート特異固定化剤は、クレアチニン特異抗体の種に対して特異的な抗体である。
【００３９】
システムの他の実施形態では、アルブミン特異コンジュゲートは、アルブミンに特異的な抗体である。他の実施形態では、アルブミン特異固定化剤は、ヒト血清アルブミンである。更に他の実施形態では、アルブミンコンジュゲート特異固定化剤は、アルブミン特異抗体の種に対して特異的な抗体である。
【００４０】
システムのある実施形態では、抗体のいずれも、ウサギ、ニワトリ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ウマ、マウス、ラット、又はヒツジに由来するモノクロナール抗体又はポリクロナール抗体である。
【００４１】
システムの他の実施形態では、クレアチニン特異コンジュゲート及びアルブミン特異コンジュゲートは、微小粒子又は染料の検出可能部分によってラベルされる。微小粒子は、コロイド金粒子、ポリスチレン粒子、アクリル粒子、磁性粒子、又は他の固相微小粒子であり、着色され、又はタグ付けされ、又は蛍光化合物によってタグ付けされてもよい。
【００４２】
システムの他の実施形態では、１つのサンプル塗布パッド、コンジュゲートパッド、クレアチニン特異テスト領域、クレアチニン特異コントロール領域、アルブミン特異テスト領域、アルブミン特異コントロール領域、及びリザーバが全て、１つのテストストリップ上に設けられる。更に他の実施形態では、テストストリップは、剛性のカセットに封入される。
【００４３】
システムの別の実施形態では、装置は２つのテストストリップを備え、第１のテストストリップは、クレアチニン特異コンジュゲートを有する第１のコンジュゲートパッドと、クレアチニン特異テスト領域と、クレアチニン特異コントロール領域と、第１のリザーバを備え、第２のテストストリップは、アルブミン特異コンジュゲートを有する第２のコンジュゲートパッドと、アルブミン特異テスト領域と、アルブミン特異コントロール領域と、第２のリザーバを備え、第１のテストストリップと第２のテストストリップは、第１のテストストリップと第２のテストストリップとが１つのサンプル塗布パッドを共有するように、並列に、又は互いに対向するように、又は互いに角度をなして配置される。別の実施形態では、第１のテストストリップと第２のテストストリップとは、１つの剛性のカセットに封入される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、開示のアッセイ及びテストカセットで用いられているテストストリップの第１の図である。
【図２】図２は、図１のテストストリップの側面図を示す。
【図３】図３は、図１及び２のテストストリップを収納するカセットの図を示す。
【図４】図４は、図３のテストカセットと共に用いる蛍光光度計の斜視図を示す。
【図５】図５は、テストカセットリーダの概略図を示す。
【図６】図６は、開示のシステムにおける２つのストリップの実施形態のテストカセット（図６Ａ）及びテストストリップ（図６Ｂ）を示す。
【図７】図７は、開示のシステムにおける２つのストリップの別の実施形態のテストカセット（図７Ａ）及びテストストリップ（図７Ｂ）を示す。
【図８】図８は、尿アルブミンの測定曲線を示すグラフである。
【図９】図９は、尿クレアチニンの測定曲線を示すグラフである。
【図１０】図１０は、免疫比濁尿アルブミンアッセイ法とイムノクロマトグラフィラテラルフロー尿アルブミンアッセイとの間の相関を示すグラフである。
【図１１】図１１は、比色分析尿クレアチニンアッセイ法とイムノクロマトグラフィラテラルフロー尿クレアチニンアッセイとの間の相関を示すグラフである。
【図１２】図１２は、免疫比濁尿アルブミン及び比色分析尿クレアチニン法の組み合わせと、イムノクロマトグラフィラテラルフロー尿アルブミンアッセイと、の間の相関を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
ここでは、使い捨てのテストストリップと再利用可能な測定器具とを用いた分析物と分析物比を決定するための簡略化されたポイント・オブ・ケアアッセイを開示する。開示された方法及び装置は、ラテラルフロークロマトグラフィ原理を利用して、１回のアッセイで、尿アルブミンと尿クレアチニンの両方を測定し、アルブミン−クレアチニン比（ＡＣＲ）を決定する。患者の尿サンプルは、検査を実施するための試薬を含むテストカセット内に置かれる。そして、テストカセットは、読み取り、計算し、結果を報告するテストカセットリーダに挿入される。
【００４６】
尿アルブミン及び尿クレアチニンのための迅速アッセイは、異なるテストストリップ又は同じテストストリップ上のアルブミン及びクレアチニン結合剤を利用したイムノクロマトグラフィ法である。尿クレアチニンに対する尿アルブミンの比を測定するために、２つの測定が同時に実施される。第１の測定は、尿アルブミンを測定するため、イムノクロマトグラフィ試薬の第１のセットを用いて実施される。第２の測定は、尿クレアチニンを測定するため、イムノクロマトグラフィ試薬の第２のセットを用いて実施される。１つの実施形態では、アルブミン及びクレアチニンを測定する両方の試薬のセットは、１つのテストストリップ及び、自動的に読み取り、計算、結果の表示を行うテストカセットリーダ（図４及び５）内に挿入される１つの外側カセット内に含まれる（図１及び２）。このように、アッセイは、単一のテストストリップから尿アルブミンとクレアチニンとのいずれも測定する。更には、ここで開示されているアッセイは、クレアチニン又はアルブミンのいずれかを検出するために、触媒、若しくは化学反応を利用しておらず、クレアチニン及びアルブミンの検出は、ここで説明されている分析物結合剤に分析物を結合させることを含む。全ての検出活動は、テストカセット内のテストストリップ上で起きており、テストカセットリーダは、単にラベル強度を測定している。テストカセットは、機械的又は可動する部分は何も有しない。更には、使用者によって行われる唯一の活動は、尿サンプルをカセットに添加するだけであり、残りの全ての検出及び測定活動は、更なる使用者の操作がなくとも実施されうる。
【００４７】
尿サンプル１０１から尿クレアチニン及びアルブミンを測定するためのテストストリップ１００の１つの実施形態を、図１及び２に示す。テストストリップ１００は、これに限られないが、ニトロセルロースメンブレンのような材料を含み、分析試薬が固体基板に固定されたラテラルフローメンブレン１０７を備える。サンプル塗布パッド１０３は、ラベルが付けられたクレアチニン特異結合剤及びアルブミン特異結合剤を含むラベルされたコンジュゲートを含むコンジュゲートパッド１０４と接している。コンジュゲートパッド１０４内では、アルブミン及びクレアチニンに対して特異的なコンジュゲートが、コンジュゲートパッド１０４の別々の部分１０５、１０６内にそれぞれ任意に設けられる。コンジュゲートは、これに限られるものではないが、蛍光染料、着色染料、又は磁性材料、金、ポリスチレン、シリカ又はアクリルを含む微小粒子のような材料、を含む検出可能なラベルを含む。
【００４８】
コントロール領域１０９、１１１は、サンプルと反応せず、テスト領域１０８、１１０で固定化されていないコンジュゲートを結合するために設けられる。リザーバーパッド１１２は、メンブレンの遠位端に設けられており、余分なサンプル液体及び非結合試薬を吸収する。テストストリップは、テスト結果の視覚化と測定とを可能にするサンプルウェル１１５と、カセット窓１１６とを含む剛性のカセット１１４内に封入される。
【００４９】
サンプルパッド１０３、コンジュゲートパッド１０４、メンブレン１０７、分析領域１０８、１０９、１１０、１１１、リサーバパッド１１２の組み合わせ全体は、剛性の支持層１１３に接着剤を用いて保持される。
【００５０】
１つの実施形態では、ランニングバッファは、サンプル塗布パッド１０３上で直接乾燥されており、ランニングバッファは、塗布の前にランニングバッファ中に尿サンプルを希釈させる必要はなく、尿サンプルをサンプル塗布パッドに直接塗布添加することで可溶化される。
【００５１】
検査を実施するため、尿サンプル１０１は、ランニングバッファ中に希釈され、サンプルパッド１０３に塗布される。バッファされた尿サンプルは、コンジュゲートパッド１０４に移動し、コンジュゲートパッド１０４内に設けられた乾燥コンジュゲートを可溶化し、溶液とする。１つの実施形態では、コンジュゲートパッドは少なくとも１つのクレアチニンに対して特異的なコンジュゲートと、少なくとも１つのアルブミンに対して特異的なコンジュゲートと、を設ける。尿サンプル中のアルブミン及びクレアチニンは、両コンジュゲートと混合し、それぞれアルブミン特異的コンジュゲート、及びクレアチニン特異的コンジュゲートと結合する。コンジュゲートパッドから、サンプル−コンジュゲート複合体が、４つの分析領域１０８、１０９、１１０、１１１を含むメンブレン１０７を通過する。４つの分析領域１０８、１０９、１１０、１１１は、メンブレン１０７上に特異的に固定化された分析物結合試薬を含む。
【００５２】
サンプルは、尿クレアチニン濃度、尿アルブミン濃度、及び／又はアルブミン−クレアチニン比を必要とする個人から採取した尿サンプルである。尿サンプルは、約５−５０μｌの体積である。ある実施形態では、尿サンプルの体積は、約８−４０μｌ、約１０−３０μｌ、約１２−２０μｌ、若しくは約１５μｌである。尿サンプルは、ランニングバッファ中に希釈され、サンプルのランニングバッファに対する希釈率（サンプル：ランニングバッファ）は、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、約１：１０、約１：１１、約１：１２、約１：１３、約１：１４、約１：１５、約１：１６、約１：１７、約１：１８、約１：１９、約１：２０、約１：２１、約１：２２、約１：２３、約１：２４、又は約１：２５である。開示のシステム、方法及びキットにおいて用いるのに好適なランニングバッファは、緩衝塩水溶液、界面活性剤、タンパク質、及び防腐剤を含むバッファを含む。１つの実施形態では、緩衝塩水溶液は、リン酸緩衝生理食塩水である。別の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート８０である。他の実施形態では、タンパク質は、カゼイン又はカゼインナトリウムである。別の実施形態では、防腐剤は、アジ化ナトリウムである。更に他の実施形態では、ランニングバッファは、ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸バッファ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０界面活性剤、１％（ｗ／ｖ）のカゼインナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムである。
【００５３】
Crt-Test（クレアチニン検査）分析領域１０８は、キャリアに結合しているか否かに関わらず、クレアチニンのような、ニトロセルロースメンブレンに固定化された第１のクレアチニンコンジュゲート特異的固定化試薬を備える。仮に尿サンプルがクレアチニンを含まない場合、コンジュゲートパッド１０４から移動してきた非結合のクレアチニン特異的コンジュゲートが、最大にCrt-Test分析領域に結合する。仮に尿サンプル中のクレアチニンにクレアチニン特異的コンジュゲートが結合した場合、クレアチニン特異的コンジュゲートの、Crt-Test分析領域１０８への結合を阻害し、これによりCrt-Test分析領域における、尿サンプル中のクレアチニン濃度に直接的に比例するシグナル強度が減少する。Crt-Con（クレアチニンコントロール）分析領域１０９は、第２のクレアチニンコンジュゲート特異的固定化試薬を用いて、尿のクレアチニンに結合しているか否かに関わらず、Crt-Test分析領域で保持されなかったクレアチニン特異的コンジュゲートを捕捉する。例えるなら、第１のクレアチニンコンジュゲート特異的固定化剤のためのキャリアは、これに限られるものではないが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、オボアルブミン（ＯＡ）、デンドリマー等である。キャリアは、どちらの分析物の測定に用いられる試薬のいずれに対して、又は患者のサンプルの非分析物に対して交差反応しない不活性な分子である。
【００５４】
Alb-Test（アルブミンテスト）分析領域１１０は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のような第１のアルブミンコンジュゲート特異的固定化試薬を備える。仮に尿サンプルがアルブミンを含まない場合、コンジュゲートパッド１０４から移動してきた非結合のアルブミン特異的コンジュゲートが、最大にAlb-Test領域に結合する。仮に尿サンプル中のアルブミンにアルブミン特異的コンジュゲートが結合した場合、アルブミン特異的コンジュゲートの、Alb-Test分析領域１１０への結合を阻害し、これによりAlb-Test分析領域における、尿サンプル中のアルブミン濃度に直接的に比例するシグナル強度が減少する。Alb-Con（アルブミンコントロール）分析領域１１１は、第２のアルブミンコンジュゲート特異的固定化試薬を用いて、尿のアルブミンに結合しているか否かに関わらず、Alb-Test分析領域で保持されなかったアルブミン特異的コンジュゲートを捕捉する。
【００５５】
テスト領域の固定化剤は、分析物（クレアチニン又はアルブミン）のような第１の分析物コンジュゲート特異的試薬、又は競合型アッセイのための分析物誘導体、又はサンドイッチアッセイのための分析物コンジュゲート特異的試薬である。１つの実施形態では、クレアチニンのためのテスト領域固定化剤は、クレアチニン、又はクレアチニンキャリアコンジュゲートのようなクレアチニン誘導体である。別の実施形態では、アルブミンのためのテスト領域固定化剤は、精製ヒトアルブミン、組換えヒトアルブミン、アルブミン特異的コンジュゲートに結合可能なヒトアルブミンフラグメント、アルブミン特異的コンジュゲートに結合可能なヒトアルブミンドメイン、又は、ＨＳＡ及び他のタンパク質、若しくはメンブレンへのＨＳＡの結合を促進させる分子を含むヒトアルブミンコンジュゲートのようなヒトアルブミン誘導体である。
【００５６】
ここで用いられている「誘導体（derivative）」という用語は、そのオリジナルの構造の少なくとも９５％を維持し、分析物と同様の親和性で分析物結合剤に結合する第２の分子にコンジュゲートされた分析物を示す。例えば、分析物誘導体は、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた分析物、又はビオチンのような官能基にコンジュゲートされた分析物である。
【００５７】
コントロール領域の固定化剤は、最初にラベルされた抗分析物コンジュゲートに結合する第２の分析物コンジュゲート特異的試薬である。１つの実施形態では、コントロール固定化剤は、クレアチニン又はアルブミン特異的コンジュゲートに対して特異的なポリクロナール抗体である。ある実施形態では、コントロール固定化剤は、クレアチニン又はヒトアルブミン特異的コンジュゲート抗体の種に対して特異的なポリクロナール抗体である。コントロール固定化剤の非限定的な例は、ヤギ抗ウサギ抗体、ヤギ抗マウス抗体、ヤギ抗ヒツジ抗体、ウサギ抗ヤギ抗体、ウサギ抗マウス抗体、ウサギ抗ヒツジ抗体、マウス抗ヤギ抗体、マウス抗ウサギ抗体、マウス抗ヒツジ抗体、ヒツジ抗ヤギ抗体、ヒツジ抗ウサギ抗体、又はヒツジ抗マウス抗体である。
【００５８】
１つの実施形態では、クレアチニン特異的コンジュゲートがウサギ抗クレアチニン抗体を備え、且つアルブミン特異的コンジュゲートがマウス抗ヒトアルブミンを備える場合、クレアチニン特異的コントロール固定化剤は、ヤギ抗ウサギ抗体であり、アルブミン特異的コントロール固定化剤は、ヤギ抗マウス抗体である。
【００５９】
リザーバーパッド１１２は、希釈された尿サンプルのテストメンブレン１０７からの吸収を促進させ、毛細管現象により、メンブレンの全長に沿ってコンジュゲートとバッファされた尿を動かし続け、メンブレンから非結合のコンジュゲートの全てを取り除くことを確かなものとする。リザーバは、分析物のテストメンブレン１０７をわたる移動が単にテストメンブレンのウィッキング体積に依存しないように、付加的なウィッキング体積を提供する。
【００６０】
図３は、２つの構成要素である、テストストリップ１００と付加的な剛性のケース１５０とを備えるテストカセット１１４の全体を示す。カセットの剛性のケースは、希釈された尿サンプルが配置されるサンプルウェル１１５と、認識する者にテストメンブレン１０７上の分析領域１０８、１０９、１１０、１１１を視認できるようにするカセット窓１１６を有する。構造サポート１１３は、テストストリップに付けられ、ストリップを正しい位置で保持する役割を持ち、テストメンブレンとテストストリップの他の部分との間の接触を維持することに関与する。テストカセットは、カセット内の場所にテストストリップを保持するための十分な圧力を提供するため、及びテストストリップ構成要素１０３、１０４、１０７及び１１２の間の重なった領域に対して、これらの構成要素が物理的な接触を維持するのに十分な圧力を提供するため、テストストリップが様々な位置で物理的に接触する内部構造を有する。テストカセットは、成形性プラスチック、熱可塑性プラスチック材料、又は積層材のような任意の剛性材料からなってもよい。
【００６１】
特定の長さの時間後、４つの分析領域１０８、１０９、１１０、１１１のそれぞれのシグナル強度は、図４及び５に示す例示的な実施形態であるテストカセットリーダ１１７を用いて数値化される。アルブミン特異的又はクレアチニン特異的コンジュゲートに付けられた標識の種類によって、テストカセットリーダ１１７は、分析領域１０８、１０９、１１０、１１１からのシグナル強度を検出及び測定するための対応する検出メカニズムを持つ。
【００６２】
反応を進め、分析物濃度の決定するために十分な強さのシグナル強度を得るために必要な時間の長さは、約２−３０分、約５−２５分、約７−２０分、約１０−１７分、又は約１５分である。他の実施形態では、時間は約３０分より少ない、約２５分より少ない、約２０分より少ない、約１５分より少ない、約１０分より少ない、又は約５分より少ない。更に他の実施形態では、時間は、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、又は約２０分である。
【００６３】
テストカセットリーダは、分析物特異的コンジュゲートに結合された標識に基づいて選択される反射分光計、蛍光光度計、又は光学式読取装置である。例えば、コンジュゲートが蛍光性の標識でラベルされている場合、テストカセットリーダは蛍光光度計である。コンジュゲートが染料又は着色ビーズでラベルされている場合、テストカセットリーダは、反射分光計、又は光学式読取装置である。ある実施形態では、コンジュゲートが染料又は着色ビーズでラベルされている場合、テストカセットは、肉眼で読み取られ得る。テストカセットを肉眼で読み取る場合、分析物の定量化は判定見本と比較することで決定される。
【００６４】
１つの実施形態では、コンジュゲートは蛍光性の標識でラベルされ、測定機器は蛍光光度計であり、これにより、テストストリップ１０１上の４つの分析領域１０８、１０９、１１０、１１１の蛍光強度を測定し、これらの測定値から、結果を計算する。各分析テスト領域１０８及び１１０の強度は、各テストライン強度を、それぞれの分析コントロール領域１０９又は１１１で割ることによって調節される。クレアチニン及びアルブミン濃度は、純粋なクレアチニン及びアルブミン基準を用いて作製され、クレアチニン及びアルブミンの両方の標準量の尿コントロールサンプルを用いて認証されたキャリブレーション曲線に対して調整された数値を比較することで、決定される。そして、結果は、アルブミン及びクレアチニン標準から生成された数学的アルゴリズムにより計算される。結果は、尿サンプル中に存在する尿アルブミン濃度、尿クレアチニン濃度、及びアルブミンのクレアチニンに対する比として表される。
【００６５】
他の実施形態では、テストカセットリーダは、アルブミン特異的及びクレアチニン特異的コンジュゲートに付けられた着色微小粒子から反射される光の特定の波長を測定する反射分光計である。テストバンド及びコントロールバンドの位置で測定された反射光の量は、各位置における塊状の微小粒子の密度に直接比例する。データ整理と結果の報告は、蛍光光度計について上述したものと同じである。
【００６６】
他の実施形態では、リーダ装置は磁場を検出し、分析物特異的コンジュゲート中で用いられている標識は、超常磁性粒子である。データ整理と結果の報告は、蛍光光度計について上述したものと同じである。
【００６７】
図５に示すリーダの１つの実施形態では、マイクロコントローラ１２１は、テストカセット１１４内のテストストリップ１００の分析領域１０８、１０９、１１０、１１１からのシグナル強度の測定処理を調整し、上述のシグナル強度を処理し、テスト結果とユーザーオプションを保存し、結果を物理的通信ポート１２４、結果のワイヤレス送信、を介して送信し、結果をオペレーターに表示し、様々なユーザーコマンドを処理する、等に関与する。
【００６８】
アルブミン濃度、クレアチニン濃度、及びアルブミン−クレアチニン比の計算は、数学的アルゴリズムと参考標準曲線とに基づく。標準曲線は、割り当てられた標準値から生成され、機器は、流通前に製造設備において予め調整されている。結果は、尿アルブミン濃度、尿クレアチニン濃度、及び尿アルブミンのクレアチニンに対する比として示され、液晶ディスプレイ１２６上に表示される。一定の時間をかけて得られた一連の結果は、機器に保存され、要求に応じて読み出され、数値形式又はグラフ形式で表示される。一般的には、結果は検査の日付に沿って表示される。ユーザは、以前に保存された検査結果の全てと、それらの日付を表示させる、又は何らかの傾向を確認可能なように全ての結果をグラフで表示させる、ことを選択可能である。内部のコンピュータにコマンドを入力するため、機器は外部にボタンもしくはキーボードを有してもよい。
【００６９】
結果は、外部ポート１２４を介して外部コンピュータにダウンロード、及び／又は外部プリンタで印刷してもよい。機器の電子部品は、内部バッテリ１２５及び／又は外部電源１２３によって電源供給される。表示モニタ１２６のための窓と、読み取り装置内にテストカセット１１４を挿入するためのテストカセットスロット１１９と、を備える剛性の外部ケース１１８内に、構成要素が収納されている。テストカセットリーダは、電源スイッチ１２２を用いて電源をオンオフされてもよい。
【００７０】
別の実施形態では、テストカセットリーダは、小型、コンパクト、軽量、ポータブルであり、及び携帯式（hand-held）装置となるようにパッケージ化されている。通常、一般的な用法の様々な携帯式血糖計と、外見及びデザインが類似する。そのような変形は、実際のところ表面的であり、本開示の範囲に含まれると理解される。
【００７１】
テストカセットの他の実施形態では、図６及び７に示すようにテストサンプル液が同時に両方のテストストリップをわたって移動するような、２つの分離されたテストストリップと１つのサンプル塗布パッドとを備えるテストカセットが開示される。２つのテストストリップの実施形態では、２つのテストストリップは並行に配置されても、放射形状でもよい。図６は、互いに正反対に対向するように配置されたテストストリップを示し、図７は、互いに角度をなすように配置されたテストストリップを示す。これらの例では、テストカセットは長方形状または正方形状である。これらのカセットを挿入するための測定機器の開口は、これらのカセットの形状に適合するように調整される。
【００７２】
図６に示すように、テストカセット２１４は、テストカセットケース２０１と、互いに正反対に対向し、且つ１つのサンプル塗布パッド２０３でつながっている２つのテストストリップ２００及び２００’と、を備える。テストカセットケースは、ユーザがそれぞれテストストリップ２００及び２００’を見ることが可能なカセット窓２１６及び２１６’も含む。サンプルウェル２１５は、サンプル塗布パッド２０３にアクセス可能としている。テストストリップ２００は、第１の分析物に対して特異的であり、コンジュゲートパッド２０４と、分析領域２０８（第１の分析物テスト領域）、２０９（第１の分析物コントロール領域）と、リザーバ２１２とを含むメンブレン２０７を有する。テストストリップ２００’は、第２の分析物に対して特異的であり、コンジュゲートパッド２０４’と、分析領域２１０（第２の分析物テスト領域）、２１１（第２の分析物コントロール領域）と、リザーバ２１２’とを含むメンブレン２０７’を有する。
【００７３】
図７に示すように、テストカセット３１４は、テストカセットケース３０１と、互いに垂直であり、且つ１つのサンプル塗布パッド３０３でつながっている２つのテストストリップ３００及び３００’と、を備える。テストカセットケースは、ユーザがそれぞれテストストリップ３００及び３００’を視認可能なカセット窓３１６及び３１６’も含む。サンプルウェル３１５により、サンプル塗布パッド３０３にアクセス可能となる。テストストリップ３００は、第１の分析物に対して特異的であり、コンジュゲートパッド３０４と、分析領域３０８（第１の分析物トテスト領域）、３０９（第１の分析物コントロール領域）と、リザーバ３１２とを含むメンブレン３０７を有する。テストストリップ３００’は、第２の分析物に対して特異的であり、コンジュゲートパッド３０４’と、分析領域３１０（第２の分析物テスト領域）、３１１（第２の分析物コントロール領域）と、リザーバ３１２’とを含むメンブレン３０７’を有する。
【００７４】
アルブミン特異的及びクレアチニン特異的コンジュゲートは、他の物質に交差反応することなくアルブミン又はクレアチニンに特異的に結合する任意の薬剤を含む。例えば結合剤は、これに限られるものではないが、抗体、アプタマー、化学物質及び／又は結合ペプチドを含む。１つの実施形態では、結合剤は、アルブミン又はクレアチニンに特異的な抗体である。
【００７５】
ここで用いられている「抗体（antibody）」という用語は、一般的に重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドを備えるタンパク質を指す。抗原の認識及び結合は、重鎖及び軽鎖の様々な領域内で生ずる。１つの重鎖と１つの軽鎖とを有する１つのドメイン抗体、及び軽鎖を欠く重鎖抗体も知られている。特定抗体は、重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいて分類された、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ及びミューと呼ばれる５タイプの重鎖のうち１つを備える。重鎖のこれらの異なるタイプは、それぞれＩｇＡ（ＩｇＡ１とＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）及びＩｇＭという、５つのクラスの抗体を生じさせる。特定抗体は、軽鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて分類された、カッパ又はラムダと呼ばれる２つのタイプの軽鎖のうち１つを備える。ＩｇＧ、ＩｇＤ及びＩｇＥ抗体は、一般に２つの同一の重鎖と２つの同一の軽鎖から構成され、それぞれ重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む２つの抗原結合ドメインを含む。一般的にＩｇＡ抗体は、２つのモノマーから構成され、各モノマーは、２つの重鎖と２つの軽鎖（ＩｇＧ、ＩｇＤ及びＩｇＥ抗体について）から構成され、このようにしてＩｇＡ分子は４個の抗原結合ドメインを有し、それぞれは更にＶＨ及びＶＬから構成される。あるＩｇＡ抗体は、それらが２つの重鎖と２つの軽鎖とから構成される点において、単量体である。分泌型ＩｇＭ抗体は、一般に５つのモノマーから構成され、それぞれのモノマーは２つの重鎖と２つの軽鎖（ＩｇＧ及びＩｇＥについて）から構成され、このようにしてＩｇＭ分子は１０個の抗体結合ドメインを有し、それぞれが更にＶＨ及びＶＬから構成される。ＩｇＭの細胞表面の形も存在し、これはＩｇＧ、ＩｇＤ及びＩｇＥ抗体と同様の２つの重鎖／２つの軽鎖構造を有する。
【００７６】
ここで用いられている「モノクロナール抗体」という用語は、いくつかの異なるＢリンパ球から生成されるポリクロナール抗体とは対照的に、全てが単一の親Ｂリンパ球のクローンである、同じＢリンパ球から生成されるため、同一な単一特異性抗体であることを指す。モノクロナール抗体は、それらが同一のエピトープに結合するという点において、一価の親和性を有する。
【００７７】
所望のモノクロナール抗体を分泌する不死化細胞株は、一般に知られているリンパ球又は脾臓細胞の不死化をもたらす標準的な方法又はその修正を用いて用意されてもよい。所望の抗体を分泌する不死化細胞株は、抗原をペプチドハプテン、ポリペプチド又はタンパク質とするイムノアッセイによってスクリーニングされる。所望の抗体を分泌する適した不死化細胞培養が確認されると、細胞はin vitro又は腹水における産出による、いずれかで培養し得る。そして、所望のモノクロナール抗体は、培養上清又は腹水上清から回収される。
【００７８】
ここで用いられている「ポリクロナール抗体」という用語は、異なるＢリンパ球から得られた抗体を指す。対照的に、モノクロナール抗体は１つのクローンＢリンパ球株から生成される。ポリクロナール抗体は、典型的には、ウサギ、ニワトリ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ウマ、マウス、ラット又はヒツジといった好適な動物への接種によって生成される。より大型の動物は、採取可能な血清の量が多くなるため、多くの場合に好まれる。
【００７９】
抗体は、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質が十分な長さの場合、又は望ましい場合、又は免疫原性を高めることが望まれる場合には、適切なキャリアにコンジュゲートされたペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を使用して、適切な免疫付与プロトコルを用いて、好適な動物ホストに免疫を付与することによって用意される。これは、Ｂリンパ球を誘発して、抗原に特異的な免疫グロブリンを生成させる。ＢＳＡ、ＫＬＨ又は他のキャリアタンパク質のような、キャリアにコンジュゲートした免疫原を用意する方法は、当技術分野でよく知られている。ある状況下では、例えばカルボジイミド試薬を用いて、直接コンジュゲートさせることが効果的であり、ある例では、Piece Chemial社（イリノイ州ロックフォード）より供給される結合試薬が、ハプテンへのアクセス容易性を提供するためには望ましい。ハプテンペプチドは、システイン残基を用いて、アミノ末端又はカルボキシル末端において延長されることが可能であり、又は、例えばキャリアへの結合を促進させるために、システイン残基を散在させることが可能である。抗原の投与は、好適な時間をかけて、当技術分野でよく理解される好適なアジュバントを利用した注射によって一般的に行われる。実験動物における抗体の生成における重要な目的は、実験又は診断検査の利用にとって、高い力価、高い親和性の抗血清が得られることである。それゆえ、アジュバントは、抗原に対する免疫反応を改善する又は高めるために、よく利用される。大半のアジュバントは、接種部位に、流入領域リンパ節内へゆっくりと抗原が放出されるようにする抗原の貯蔵庫を提供する。免疫付与スケジュールを通して、抗体の力価は、抗体の形成の適正を決定するために利用される。
【００８０】
抗体に関して、ここで用いられている「フラグメント」又は「抗体フラグメント」の用語は、抗体ポリペプチドの全長は有しないが、抗体ポリペプチドの全長の少なくとも一部をいまだに含んでいる抗体ポリペプチド分子（例えば抗体重鎖又は軽鎖ポリペプチド）から生成されたポリペプチドを指す。抗体フラグメントは、しばしば抗体ポリペプチドの全長から分割された部分を備えるポリペプチドを含むが、この用語はそのような分割フラグメントに限定されるものではない。なぜなら、抗体に関してここで用いられているフラグメントは、抗体ポリペプチド（抗原ポリペプチド重鎖又は軽鎖）から生成された１つのポリペプチド鎖を含むものであり、抗体フラグメントは、自然と抗原に結合するかもしれないし、しないかもしれない、と理解される。例えば、抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメントに含まれるであろう重鎖抗体ポリペプチドのその一部を含み得るが、そのような抗体フラグメントは、一般的に、軽鎖抗体ポリペプチド（すなわち、Ｆａｂフラグメントに含まれるであろう軽鎖抗体ポリペプチドのその一部）から生成された他の抗体フラグメントを伴って抗原結合部位が再構成されない限り、抗原に結合しない。抗体フラグメントは、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）フラグメント、ダイアボディ（diabodies）、線状抗体（linear antibodies）、二重特異性と三重特異性と多重特異性抗体（例えばダイアボディ（diabodies）、トリアボディ（triabodies）、テトラボディ（tetrabodies））のような多重特異性抗体フラグメント、ミニボディ、キレート組換え抗体、三重特異性抗体（tribodies）又は二重特異性抗体（bibodies）、細胞内抗体、ナノボディ、小モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ）、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、及びＶＨＨ含有抗体に含まれるであろうポリペプチドを含んでもよい。「抗体フラグメント」又は「抗体ポリペプチドフラグメント」が「抗原結合抗体フラグメント」及び「抗原結合抗体ポリペプチドフラグメント」を含むことが十分理解される。
【００８１】
ある実施形態では、抗クレアチニンコンジュゲートは、クレアチニンに対するポリクロナール又はモノクロナール抗体のいずれかである。他の実施形態では、抗アルブミンコンジュゲートは、ヒトアルブミンに対するポリクロナール又はモノクロナール抗体のいずれかである。ポリクロナール抗血清の全て、又はＩｇＧ精製断片、又はクレアチニン又はアルブミンに対する親和的な精製抗体、のいずれかを採用することができる。
【００８２】
抗体は、吸着によって、又は共有結合のような化学的結合、又はタンパク質Ａコート微小粒子のような中間剤への結合を通じて標識分子又は微小粒子に結合されてもよい。抗体標識コンジュゲートを用意する方法は、当業者に、よく知られた標準的な実験手順に従って実施される。
【００８３】
抗体の挙動とよく似ており、ここで開示されている抗体コンジュゲートの代用となりうる、クレアチニン及びアルブミンの他の結合剤は、本開示のテストカセット及び方法の範囲内に含まれる。
【００８４】
同様に、本質的に同じ機能をする他の物質又は化学物質も、ここで開示されたものの代わりに使用されうる。同様に読み取り及び測定装置も、外見や運転特性が異なっていてもよい。これらは主に本来表面的であり、同様に本開示の範囲内に含まれる。
【００８５】
実施例１
尿アルブミン検査
検査を実施するため、尿サンプルをランニングバッファ中に希釈させ、テストカセットのサンプル塗布パッドに塗布する。バッファされた尿サンプルは、コンジュゲートパッド内に移動し、乾燥抗アルブミン及び抗クレアチニン抗体コンジュゲートを可溶化する。尿サンプル中のアルブミン及びクレアチニンは、コンジュゲートパッド中のアルブミン特異及びクレアチニン特異コンジュゲートと混ざり、それぞれの抗体コンジュゲートと結合する。コンジュゲートパッドからコンジュゲートは、ニトロセルロースメンブレンを通過し、４つの分析領域を通過する。
【００８６】
アルブミンテスト分析領域は、ニトロセルロースメンブレンに結合された組み換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）を備える。仮に尿サンプルにアルブミンが含まれない場合、抗アルブミン抗体コンジュゲートは、アルブミンテスト領域に最大量が結合する。仮に、抗アルブミン抗体コンジュゲートが尿サンプル中のアルブミンに結合した場合、抗アルブミンコンジュゲートのアルブミンテスト分析領域への結合を阻害し、アルブミンテスト分析領域のシグナル強度が、尿中のアルブミン濃度に比例して減少することにつながる。アルブミンコントロール分析領域は、尿アルブミンに結合しているか否かに関わらず、アルブミンテスト分析領域に結合しなかった抗アルブミン抗体のみを結合させる。
【００８７】
所定長さの時間が経過後、アルブミン検査及びアルブミンコントロール分析領域のそれぞれのシグナル強度がテストカセットリーダによって数値化される。
【００８８】
実施例２
尿クレアチニン検査
尿クレアチニン検査は、実施例１の尿アルブミン検査のような同じテストストリップ上で同時に実施される。クレアチニン検査のために、抗クレアチニン抗体コンジュゲートが、コンジュゲートパッドに存在し、分析領域であるクレアチニンテスト及びクレアチニンコントロールは、尿サンプル中に存在するクレアチニンを捕捉するために、設けられる。
【００８９】
Crt-Test分析領域は、ニトロセルロースメンブレンに結合されたクレアチニン−ＢＳＡを備える。仮に尿サンプルにクレアチニンが含まれない場合、抗クレアチニン抗体コンジュゲートは、Crt-Test領域に最大量が結合する。仮に抗クレアチニン抗体コンジュゲートが尿サンプル中のクレアチニンに結合した場合、抗クレアチニンコンジュゲートのCrt-Test分析領域への結合を阻害し、Crt-Test分析領域のシグナル強度が尿サンプル中のクレアチニン濃度に比例して減少することにつながる。Crt-Con分析領域は、尿クレアチニンに結合しているか否かに関わらず、Crt-Test分析領域に結合しなかった抗クレアチニンコンジュゲートのみを結合させる。
【００９０】
所定長さの時間経過後、Crt-Test及びCrt-Con分析領域のシグナル強度が、テストカセットリーダによって数値化される。
【００９１】
実施例３
尿アルブミン及び尿クレアチニンの迅速テストの線形性
精製ヒトアルブミン標準サンプル及び精製クレアチニンサンプルのそれぞれを、様々な濃度で準備し、それぞれアルブミン（図８）及びクレアチニン（図９）について標準曲線を作成するため、実施例１及び２に説明された尿アルブミン及び尿クレアチニンの迅速テストを用いてテストした。
【００９２】
サンプルは、以下の手順で処理された。
１．それぞれのサンプル１部をランニングバッファ１４部で希釈する、
２．サンプルとランニングバッファとを混合する、
３．図１に示すテストカセットのサンプルウェルに、希釈された尿サンプルを７５μＬ添加する、
４．１５分経過後、テストカセットリーダを用いてテストカセットを読み取る、
５．尿アルブミン及びクレアチニンのテスト及びコントロール分析領域双方について、［テスト領域／（テスト領域＋コントロール領域）］を計算する。
【００９３】
図８及び図９は、アルブミン及びクレアチニンに関するＲ２値は共に０．９５を超えており、これは、アッセイが、アルブミン及びクレアチニン濃度対数に対して線形の反応を示すことを示唆する。
【００９４】
実施例４
開示の方法と尿アルブミン及びクレアチニンを検出する従来技術の方法との相関
尿アルブミン免疫比濁法と尿クレアチニン比色分析法との組み合わせと、ここで開示されているイムノクロマトグラフィラテラルフロー尿アルブミンアッセイとの間の相関を３６のヒト尿サンプルを用いて決定した（図１０−１２）。
【００９５】
各尿サンプルは、開示のテストカセット及び方法を用いて分析され、尿アルブミン濃度は、オリンパス社製ＡＵ４００ｅ自動分析装置における免疫比濁法を用いて測定し、尿クレアチニン濃度は、オリンパス社製ＡＵ４００ｅ自動分析装置における比色分析法（ヤッフェ反応）を用いて測定した。
【００９６】
３６の尿サンプルは、本方法と実施例３で作成された標準曲線とを利用した本開示の迅速検査を用いて分析された。これらの標準曲線から、尿アルブミン及び尿クレアチニン濃度が算出された。クレアチニンに対するアルブミンの比は、尿アルブミン濃度を尿クレアチニン濃度で割ることによって算出される。
【００９７】
図１０乃至１２は、尿アルブミン濃度（図１０）、尿クレアチニン濃度（図１１）、及び尿クレアチニンに対する尿アルブミンの比（図１２）に関するＲ２値が、０．８５を超えることを示しており、それは本開示の方法及びテストカセットを用いた場合の結果は尿アルブミン、尿クレアチニン及び尿アルブミン−クレアチニン比を測定する既存の方法と相関することを示唆している。
【００９８】
他が示され得るのでない限り、明細書及び請求項中で用いられている材料の量、分子量のような特性、反応条件等を示す全ての数字は、「約」という用語によって全ての例において変更されると理解されるべきである。ここで用いられている「約」及び「おおむね」の用語は、１０から１５％内であることを意味し、好ましくは５から１０％内である。従って、正反対なことが示されていない限り、明細書及び添付の請求項において説明されている数値パラメータは、本発明によって得ようとする所望の特性によって変化しうる概ねの値である。非常に少なくとも、また本請求項の範囲の範囲に対して同等物の原則の適用を制限しようとするものではなく、それぞれの数値パラメータは、報告されている重要な数値の数に照らし、通常用いられる技術を適用することによって、少なくとも理解される。本発明の範囲の広い範囲を説明する数値範囲及びパラメータはおおよその値であるのにも関わらず、特定の例で示す数値は可能な限り正確に報告されている。しかしながら、何れの数値も、それぞれの検査測定装置で見られる一般的な逸脱から必然的に生ずるある種のエラーを含んでいる。
【００９９】
本発明を説明する文中（特に以下の請求項の文中）で用いられている"a"、"an"、"the（前記）"及び類似の指示物は、ここで他が示されている又は文中で明確に否定している場合を除いて、単数及び複数の双方をカバーするものと理解されるべきである。ここでの数値範囲の指摘は、その範囲内に含まれる、それぞれの個別の数値を独立して引用する省略方法として機能させることを意図するものである。特にここで他が示されていない限り、各個別の数値は、あたかもそれがここで個別に指摘されているかのごとく、明細書中に取り込まれている。ここで開示された全ての方法は、特に他がここに指摘されている場合又は文脈中で他が明確に否定されている場合を除き、いずれの好適な順番で実施されうる。ここで提供されている何れの、及び全ての例、又は例示する単語（例えば"such as"）の使用は、単によりよく発明の理解を容易とすることを意図しており、クレーム化された以外の発明の範囲を限定するものではない。明細書中の言語は、本発明の実施に本質的であるがクレーム化されていない、いずれの要素を示しているとして理解されるべきではない。
【０１００】
ここで開示された発明の別の要素又は実施形態の分類は、限定として理解されるべきではない。それぞれのグループのメンバーは、個別に、又はここで見られる他のグループのメンバー又は他の要素と組み合わせて、引用及びクレーム化されてもよい。便宜的に及び／又は特許性の理由から、グループの１つ又は複数のメンバーが含まれる、又はグループから削除されることがあることが予想される。そのような含有又は削除が生じた場合、明細書は修正され、添付の請求項で用いられている全てのマーカッシュグループグループの明細書を満たすグループを含むと見なされる。
【０１０１】
本発明のある実施形態がここで開示されており、発明を実施するために発明者にとって知られているベストモードを含む。当然ながら、これらの説明されている実施形態における変形は、前述の説明を読んだ当業者にとっては明らかである。発明者は、当業者がそのような適した変形を採用することを予期しており、発明者は、ここで特に説明されたものとは他の方法で発明が実施されることを意図する。従って、本発明は、これに適用される法によって認められるように、添付の請求項中に示された主題の全ての修正及び同等物を含んでいる。更には、全ての可能性のある変形における、上述した要素の何れの組み合わせも、ここで他が示されている、又は他が明確に文脈から理解される場合を除き、発明に包含される。
【０１０２】
ここで開示された特定の実施形態は、"consisting of"又は"consisting essentially of"の言葉を用いて請求項内で更に限定されうる。請求項で用いられた場合、出願時又は補正によって追加されたとしても、"consisting of"という移行部の単語は、請求項で特定されていない何れの要素、ステップ、又は材料を排除する。"consisting essentially of"という移行部の単語は、特定された材料又はステップ、及び基礎的な及び新しい特性に対して物質的に影響を与えないようなものに請求項の範囲を限定する。そのように請求項化された発明の実施形態は、本質的に又は明示的に説明されており、ここに使用可能である。
【０１０３】
更に、この明細書中において特許及び刊行物について、数字による引用がなされている。上記のそれぞれの引用文献及び刊行物は、引用によってその全体を個別に取り込むものとする。
【０１０４】
最後に、ここに開示された実施形態は、本発明の原理を説明するものと理解されるべきである。採用されうる他の修正は、本発明の範囲内に入る。このように、例示によって、限定するものではなく、本発明の代わりの構成が、ここでの開示に従って用いられる。従って、本発明は、正確に示されて説明されているものに限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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