(57)【要約】本開示は、サンプルにおいて複数の分析対象の検出のための方法、組成物およびキットを提供する。いくらかの例では、本開示は、分析対象、遺伝的変動の検出、反応プロセスのモニタリング、および分析対象-分析対象の相互作用のモニタリングのための信号測定による方法、組成物、およびキットを提供する。いくらかの例では、信号の存在または信号における変化は、分析対象の存在または不存在を定めるのに用いることができる信号プロファイルを構築するために使用されうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルにおいて少なくとも一のポリヌクレオチド分析対象を検出する方法であって、
a）サンプルを、第一プライマーおよび第一オリゴヌクレオチドと組み合わせることであり、第一プライマーに第一発色団は取り付けられ、第一オリゴヌクレオチドに第二発色団は取り付けられ、第一プライマーおよび第一オリゴヌクレオチドは第一ポリヌクレオチド分析対象のために特異的であり、および第一発色団は第二発色団とは異なり、
b）第一および第二発色団によって生成される第一信号を測定すること、
c）鋳型として第一ポリヌクレオチド分析対象を用いて第一プライマーとの少なくとも一の重合反応を実行すること、および
d）第一および第二発色団によって生成される第二信号を測定すること
を含み、
第一および第二信号は第一ポリヌクレオチド分析対象を検出するために使用される、方法。
【請求項２】
第一オリゴヌクレオチドは第二プライマーである、請求項1の方法。
【請求項３】
第一発色団は第一プライマーの5'端に取り付けられる、請求項1の方法。
【請求項４】
第一発色団は無機または有機染料、フルオロフォアまたはクエンチャーである、請求項1の方法。
【請求項５】
第一発色団はフルオロフォアである、請求項4の方法。
【請求項６】
フルオロフォアは6-FAM（フルオレセイン）、6-FAM（NHSエステル）、フルオレセインdT、HEX、JOE（NHSエステル）、MAX、TET、ROX、TAMRA、TARMA（NHSエステル）、TEX 615、ATTO 488、ATTO 532、ATTO 550、ATTO 565、ATTO Rho101、ATTO 590、ATTO 633、ATTO 647N、TYE 563、TYE 665またはTYE 705である、請求項5の方法。
【請求項７】
第二発色団は第二プライマーの5'端に取り付けられる、請求項2の方法。
【請求項８】
第二発色団は無機または有機染料、フルオロフォアまたはクエンチャーである、請求項1または7の方法。
【請求項９】
第二発色団はクエンチャーである、請求項8の方法。
【請求項１０】
クエンチャーはアイオワブラックFG、アイオワブラックRG、BHQ1、BHQ2またはBHQ3である、請求項9の方法。
【請求項１１】
第一発色団はフルオロフォアであり、および第二発色団はクエンチャーである、請求項1-10のいずれかの方法。
【請求項１２】
さらに、第一および第二信号を比較することを含み、第一および第二信号における変化は、第一ポリヌクレオチド分析対象の存在を指し示す、請求項1-11のいずれかの方法。
【請求項１３】
第一および第二信号における変化は蛍光強度における低下である、請求項1-12のいずれかの方法。
【請求項１４】
蛍光強度における低下は信号における少なくともおよそ30％の減少である、請求項13の方法。
【請求項１５】
第二信号は第二重合反応後に測定される、請求項1-14のいずれかの方法。
【請求項１６】
重合反応はポリメラーゼ連鎖反応プロセスまたは等温プロセスである、請求項1-15のいずれかの方法。
【請求項１７】
ポリメラーゼ連鎖反応プロセスはエンドポイントポリメラーゼ連鎖反応プロセス、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応プロセス、デジタルポリメラーゼ連鎖反応プロセス、液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応プロセス、または定量的ポリメラーゼ連鎖反応プロセスである、請求項16の方法。
【請求項１８】
第一プライマーはフォワードプライマーであり、および第二プライマーはリバースプライマーである、請求項1-17のいずれかの方法。
【請求項１９】
第一プライマーはリバースプライマーであり、および第二プライマーはフォワードプライマーである、請求項1-18のいずれかの方法。
【請求項２０】
第一および第二発色団は電子移動プロセスを通して相互作用する、請求項1-19のいずれかの方法。
【請求項２１】
第一ポリヌクレオチド分析対象は長さがおよそ10からおよそ500ヌクレオチドまでである、請求項1-20のいずれかの方法。
【請求項２２】
第一ポリヌクレオチド分析対象の濃度はおよそ10μMからおよそ10aMである、請求の請求項1-21のいずれかの方法。
【請求項２３】
第一ポリヌクレオチド分析対象はDNAポリヌクレオチド分析対象である、請求項1-22のいずれかの方法。
【請求項２４】
第一ポリヌクレオチド分析対象はRNAポリヌクレオチド分析対象である、請求項1-22のいずれかの方法。
【請求項２５】
第一ポリヌクレオチド分析対象には、遺伝的変動が含まれる、請求項1-24のいずれかの方法。
【請求項２６】
遺伝的変動には、置換、付加、欠失または転座が含まれる、請求項25の方法。
【請求項２７】
遺伝的変動には、一塩基多型（SNP）が含まれる、請求項25に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも一のポリヌクレオチド分析対象は、ヒト、非ヒト哺乳動物、植物、細菌、真菌、古細菌、寄生体、またはウイルスから選ばれるソースからのものである、請求項1の方法。
【請求項２９】
ウイルスはヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザA型ウイルス、インフルエンザB型ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスA型（RsvA）、呼吸器合胞体ウイルスB型ウイルス（RsvB）、ヒトライノウイルス（Hrv）、ヒトメタニューモウイルス（Hmpv）またはヒトパラインフルエンザウイルス3型（PIV-3）である、請求項28の方法。
【請求項３０】
サンプルは、法医学的サンプル、臨床サンプル、食物サンプル、環境サンプル、製薬サンプル、または消費者製品からのサンプルである、請求項1-29のいずれかの方法。
【請求項３１】
さらに、サンプル内での少なくとも一の追加のポリヌクレオチド分析対象を、プライマーに取り付けられる追加のフルオロフォアを用いて検出することが含まれ、第一発色団は追加のフルオロフォアと同じ色を有するフルオロフォアである、請求項1-30のいずれかの方法。
【請求項３２】
第一プライマーは二またはそれよりも多くの発色団に取り付けられない、請求項1-31のいずれかの方法。
【請求項３３】
第一オリゴヌクレオチドは二またはそれよりも多くの発色団に取り付けられない、請求項1-32のいずれかの方法。
【請求項３４】
ステップb）には、さらに、第一変性ステップでの第一信号および第一アニールステップでの第三信号を測定することが含まれ、
ステップd）には、さらに、第二変性ステップでの第二信号および第二アニールステップでの第四信号を測定することが含まれ、および
さらに、第一の比を得るために第一信号を第二信号と比較すること、および第二の比を得るために第三信号を第四信号と比較することが含まれ、
第一の比がおよそ1であり、および第二の比が1よりも大きいかまたは1未満であるとき、第一ポリヌクレオチド分析対象の存在が指し示される、
請求項1の方法。
【請求項３５】
ステップa）には、さらに、サンプルを第三プライマーおよび第二オリゴヌクレオチドと組み合わせることが含まれ、第三プライマーに第三発色団は取り付けられ、および第二オリゴヌクレオチドに第四発色団は取り付けられ、および第三プライマーおよび第二オリゴヌクレオチドは第二ポリヌクレオチド分析対象のために特異的であり、
ステップb）には、さらに、第三および第四発色団によって生成される第五信号を測定することが含まれ、
ステップd）には、さらに、第三および第四発色団によって生成される第六信号を測定することが含まれ、
第五および第六信号は第二ポリヌクレオチド分析対象を検出するために使用される、請求項1-33のいずれかの方法。
【請求項３６】
さらに、第五および第六信号を比較することが含まれ、第五および第六信号における変化は第二ポリヌクレオチド分析対象の存在を指し示す、請求項35の方法。
【請求項３７】
第二オリゴヌクレオチドは第四プライマーである、請求項35または36の方法。
【請求項３８】
分析対象において少なくとも一の遺伝的変動を検出する方法であって、
a）第一分析対象を第一プライマーおよび第二プライマーと組み合わせることであり、第一プライマーに第一発色団は取り付けられ、第二プライマーに第二発色団は取り付けられ、少なくとも一の第一および第二プライマーは第一分析対象において第一の遺伝的変動のために特異的であり、および第一発色団は第二発色団と異なり、
b）第一および第二発色団によって生成される第一信号を測定すること、
c）鋳型として第一分析対象を用いて第一プライマーおよび第二プライマーとの少なくとも一の重合反応を実行すること、および
d）第一および第二発色団によって生成される第二信号を測定すること
を含み、
第一および第二信号は第一分析対象における第一の遺伝的変動を検出するために使用される、方法。
【請求項３９】
さらに、第一および第二信号を比較することが含まれ、第一および第二信号における変化は第一分析対象において遺伝的変動の存在を指し示す、請求項38の方法。
【請求項４０】
分析対象はポリヌクレオチド分析対象である、請求項38または39の方法。
【請求項４１】
遺伝的変動には、置換、付加、欠失または転座が含まれる、請求項38-40のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
遺伝的変動には、一塩基多型（SNP）が含まれる、請求項38-40のいずれかの方法。
【請求項４３】
第一プライマーには、SNPをコードする配列が含まれ、または第一プライマーはSNPをコードする分析対象の領域に結合する、請求項42の方法。
【請求項４４】
第二プライマーには、SNPをコードしない配列が含まれ、または第二プライマーには、SNPをコードしない分析対象の領域に相補的な配列が含まれる、請求項42または43の方法。
【請求項４５】
第一プライマーは分析対象の領域を第二プライマーによってコードされる分析対象の領域から500塩基対未満離れてコードする、請求項38-44のいずれかの方法。
【請求項４６】
信号においての変化はUU、UT、UG、UC、UA、AA、TT、GG、CC、AG、AC、TGおよびTCからなる群より選ばれるミスマッチ塩基対の少なくとも二について別個のものである、請求項38-45のいずれかの方法。
【請求項４７】
ミスマッチ塩基対からの信号においての変化は相補的塩基対からの信号においての変化とは別個である、請求項38-46のいずれかの方法。
【請求項４８】
ステップa）には、さらに、第一分析対象を第三プライマーおよび第四プライマーと組み合わせることが含まれ、第三プライマーに第三発色団は取り付けられ、第四プライマーに第四発色団は取り付けられ、第三および第四プライマーは第一分析対象においての第二の遺伝的変動のために特異的であり、および第三発色団は第四発色団とは異なり、
ステップb）には、さらに、第三信号を測定することが含まれ、
ステップd）には、さらに、第四信号を測定することが含まれ、および
さらに、第三および第四信号を比較することが含まれ、
第三および第四信号においての変化は第一分析対象においての第二の単一遺伝的変動の存在を指し示す、請求項38-47のいずれかの方法。
【請求項４９】
ステップa）には、さらに、第二分析対象を第三プライマーおよび第四プライマーと組み合わせることが含まれ、第三プライマーに第三発色団は取り付けられ、第四プライマーに第四発色団は取り付けられ、第三および第四プライマーは第二分析対象においての第二の遺伝的変動に特異的であり、および第三発色団は第四発色団とは異なり、
ステップb）には、さらに、第三信号を測定することが含まれ、
ステップd）には、さらに、第四信号を測定することが含まれ、および
さらに、第三および第四信号を比較することが含まれ、
第三および第四信号においての変化は第二分析対象においての第二の単一遺伝的変動の存在を指し示す、請求項38-48のいずれかの方法。
【請求項５０】
ステップa）には、さらに、第二分析対象を第三プライマーおよび第四プライマーと組み合わせることが含まれ、第三プライマーに第一発色団は取り付けられ、第四プライマーに第二発色団は取り付けられ、および第三および第四プライマーは第二分析対象においての第二の遺伝的変動のために特異的である、請求項38-49のいずれかの方法。
【請求項５１】
重合反応はPCRプロセスまたは等温プロセスである、請求項38-50のいずれかの方法。
【請求項５２】
PCRプロセスはエンドポイントPCRプロセス、デジタルPCRプロセス、リアルタイムPCRプロセス、液滴デジタルPCRプロセス、または定量的PCRプロセスである、請求項51の方法。
【請求項５３】
重合反応は定量的PCRプロセスである、請求項38-52のいずれかの方法。
【請求項５４】
検出することには、定量的PCR法が含まれる、請求項38-53のいずれかの方法。
【請求項５５】
検出することには、定量的PCR法および第二の方法が含まれる、請求項38-54のいずれかの方法。
【請求項５６】
第二の方法はデジタルPCRプロセスである、請求項55の方法。
【請求項５７】
少なくとも一のSNPは遺伝子において検出される、請求項38-56のいずれかの方法。
【請求項５８】
少なくとも一のSNPは疾患と関係する、請求項38-57のいずれかの方法。
【請求項５９】
疾患は遺伝性疾患、自己免疫疾患、神経疾患、循環器疾患、またはガンである、請求項58の方法。
【請求項６０】
複数の分析対象を検出する方法であって、
a）複数の分析対象を複数のプライマー対と組み合わせることであり、各プライマー対は、単一の分析対象に特異的であり、およびプライマー対の各プライマーは少なくとも一の発色団に取り付けられ、
b）発色団によって生成される信号の第一セットを測定すること、
c）鋳型として複数の分析対象を用いて複数のプライマー対との少なくとも一の重合反応を実行すること、および
d）発色団によって生成される信号の第二セットを測定すること
を含み、
信号の第一および第二セットは複数の分析対象の各分析対象を検出するために使用される、方法。
【請求項６１】
さらに、
e）ステップcおよびdを少なくとも一回繰り返すこと、および
f）シグナチャープロファイルのセットを生成すること
が含まれ、
複数の分析対象の各分析対象の存在はシグナチャープロファイルのセットをシグナチャープロファイルのコントロールセットに比較することによって検出される、請求項60の方法。
【請求項６２】
シグナチャープロファイルはエンドポイントシグナチャープロファイルまたはシグナチャー曲線である、請求項61の方法。
【請求項６３】
複数の分析対象は異なる長さをもつ、請求項60-62のいずれかの方法。
【請求項６４】
複数のプライマー対の各々には、フォワードプライマーおよびリバースプライマーが含まれる、請求項60-63のいずれかの方法。
【請求項６５】
一、二またはそれらよりも多くの発色団はフォワードプライマーに取り付けられる、請求項64の方法。
【請求項６６】
一の発色団はフォワードプライマーの5'端に取り付けられる、請求項65の方法。
【請求項６７】
少なくとも一の発色団はリバースプライマーに取り付けられる、請求項64の方法。
【請求項６８】
一の発色団はリバースプライマーの5'端に取り付けられる、請求項67の方法。
【請求項６９】
発色団は無機または有機染料、フルオロフォアまたはクエンチャーである、請求項60-68のいずれかの方法。
【請求項７０】
発色団はフルオロフォアである、請求項69の方法。
【請求項７１】
発色団はクエンチャーである、請求項69の方法。
【請求項７２】
ポリヌクレオチド分析対象のためのシグナチャー曲線プロファイルを生成する方法であって、
a）ポリヌクレオチド分析対象を、第一プライマーおよび第二プライマーと接触させることであり、第一プライマーに第一発色団は取り付けられ、および第二プライマーに第二発色団は取り付けられ、第一プライマーおよび第二プライマーはポリヌクレオチド分析対象のために特異的であり、および第一発色団は第二発色団とは異なり、
b）第一信号を第一温度で測定すること、
c）鋳型としてポリヌクレオチド分析対象を用いて第一プライマーおよび第二プライマーとの少なくとも一の重合反応を実行すること、
d）第二信号を第一温度で測定すること、および
e）ステップcおよびdを少なくとも一回繰り返すこと
を含み、
信号はポリヌクレオチド分析対象のシグナチャー曲線プロファイルを作り出す、方法。
【請求項７３】
さらに、f）温度を変化させること、g）第三信号を第二温度で測定すること、およびh）ステップfおよびgを少なくとも一回繰り返すことが含まれ、信号はポリヌクレオチド分析対象のシグナチャー曲線プロファイルを作り出す、請求項72の方法。
【請求項７４】
シグナチャー曲線は長さ曲線、形態曲線、融解曲線、またはSNP曲線である、請求項72または73の方法。
【請求項７５】
重合反応はポリメラーゼ連鎖反応プロセスである、請求項72-74のいずれかの方法。
【請求項７６】
ポリメラーゼ連鎖反応プロセスはエンドポイントポリメラーゼ連鎖反応プロセス、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応プロセス、デジタルポリメラーゼ連鎖反応プロセスまたは定量的ポリメラーゼ連鎖反応プロセスである、請求項75の方法。
【請求項７７】
第一発色団は無機または有機染料、フルオロフォアまたはクエンチャーである、請求項72-76のいずれかの方法。
【請求項７８】
第一発色団はフルオロフォアである、請求項77の方法。
【請求項７９】
フルオロフォアは6-FAM（フルオレセイン）、6-FAM（NHSエステル）、フルオレセインdT、HEX、JOE（NHSエステル）、MAX、TET、ROX、TAMRA、TARMA（NHSエステル）、TEX 615、ATTO 488、ATTO 532、ATTO 550、ATTO 565、ATTO Rho101、ATTO 590、ATTO 633、ATTO 647N、TYE 563、TYE 665またはTYE 705である、請求項78の方法。
【請求項８０】
第二発色団は無機または有機染料、フルオロフォアまたはクエンチャーである、請求項72-79のいずれかの方法。
【請求項８１】
第二発色団はクエンチャーである、請求項80の方法。
【請求項８２】
クエンチャーはアイオワブラックFG、アイオワブラックRG、BHQ1、BHQ2またはBHQ3である、請求項81の方法。
【請求項８３】
ポリヌクレオチド分析対象はDNAポリヌクレオチド分析対象である、請求項72-82のいずれかの方法。
【請求項８４】
ポリヌクレオチド分析対象はRNAポリヌクレオチド分析対象である、請求項72-82のいずれかの方法。
【請求項８５】
ポリヌクレオチド分析対象はヒト、非ヒト哺乳動物、植物、細菌、古細菌、真菌、寄生体、およびウイルスからなる群より選ばれるソースからのものである、請求項72の方法。
【請求項８６】
ウイルスはヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザA型ウイルス、インフルエンザB型ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスA型（RsvA）、呼吸器合胞体ウイルスB型ウイルス（RsvB）、ヒトライノウイルス（Hrv）、ヒトメタニューモウイルス（Hmpv）またはヒトパラインフルエンザウイルス3型（PIV-3）である、請求項85の方法。
【請求項８７】
増幅反応をモニタリングする方法であって、
a）第一ポリヌクレオチド分析対象を、i）第一プライマーおよび第二プライマーで、第一ポリヌクレオチド分析対象のために特異的である第一プライマーおよび第二プライマー、およびii）第一ポリヌクレオチド分析対象から増幅される生成物への特異的な取り込みが可能な少なくとも二の発色団と接触させること、
b）ステップ（a）においての組み合わせを二本鎖DNAの変性が可能な温度に供すること、
c）少なくとも二の発色団によって生成されるステップ（b）においての第一信号を測定すること、
d）ステップb）においての組み合わせをポリヌクレオチドのアニーリングが可能な温度に供すること、
e）少なくとも二の発色団によって生成されるステップ（d）においての第二信号を測定すること、および
f）第三信号および第四信号を得るためにステップb）-e）を繰り返すこと、および
g）第一の比を得るために第一および第三信号を、および第二の比を得るために第二および第四信号を比較すること
を含み、
増幅反応は、第一の比がおよそ1であり、および第二の比が1よりも大きいか、またはそれ未満であるときに起こる、方法。
【請求項８８】
一、二またはそれらよりも多くの発色団は第一プライマーに取り付けられる、請求項87の方法。
【請求項８９】
一の発色団は第一プライマーの5'端に取り付けられる、請求項88の方法。
【請求項９０】
一、二またはそれらよりも多くの発色団は第二プライマーに取り付けられる、請求項87の方法。
【請求項９１】
一の発色団は第二プライマーの5'端に取り付けられる、請求項90の方法。
【請求項９２】
発色団は無機または有機染料、フルオロフォアまたはクエンチャーである、請求項87-91のいずれかの方法。
【請求項９３】
分析対象の形態を検出する方法であって、
a）分析対象を含むサンプルを用意することであり、分析対象に第一発色団、第二発色団および第三発色団は取り付けられ、第一、第二および第三発色団は異なり、
b）第一発色団、第二発色団および第三発色団からの信号を第一および第二温度で測定することであり、第一および第二温度が異なり、および
c）分析対象の形態を検出するために測定された信号を使用すること
を含む、方法。
【請求項９４】
分析対象はタンパク質、ポリペプチド、脂質またはポリヌクレオチドである、請求項93の方法。
【請求項９５】
分析対象はポリヌクレオチドである、請求項94の方法。
【請求項９６】
ポリヌクレオチドはDNAポリヌクレオチドである、請求項95の方法。
【請求項９７】
ポリヌクレオチドはRNAポリヌクレオチドである、請求項95の方法。
【請求項９８】
第一発色団は無機または有機染料、フルオロフォアまたはクエンチャーである、請求項93-97のいずれかの方法。
【請求項９９】
第一発色団は第一フルオロフォアである、請求項98の方法。
【請求項１００】
第一フルオロフォアは6-FAM（フルオレセイン）、6-FAM（NHSエステル）、フルオレセインdT、HEX、JOE（NHSエステル）、MAX、TET、ROX、TAMRA、TARMA（NHSエステル）、TEX 615、ATTO 488、ATTO 532、ATTO 550、ATTO 565、ATTO Rho101、ATTO 590、ATTO 633、ATTO 647N、TYE 563、TYE 665またはTYE 705である、請求項99の方法。
【請求項１０１】
第二発色団は無機または有機染料、フルオロフォアまたはクエンチャーである、請求項93-100のいずれかの方法。
【請求項１０２】
第二発色団は第二フルオロフォアである、請求項101の方法。
【請求項１０３】
第二フルオロフォアは6-FAM（フルオレセイン）、6-FAM（NHSエステル）、フルオレセインdT、HEX、JOE（NHSエステル）、MAX、TET、ROX、TAMRA、TARMA（NHSエステル）、TEX 615、ATTO 488、ATTO 532、ATTO 550、ATTO 565、ATTO Rho101、ATTO 590、ATTO 633、ATTO 647N、TYE 563、TYE 665またはTYE 705である、請求項102の方法。
【請求項１０４】
第三発色団は無機または有機染料、フルオロフォアまたはクエンチャーである、請求項93-103のいずれかの方法。
【請求項１０５】
第三発色団はクエンチャーである、請求項104の方法。
【請求項１０６】
クエンチャーはアイオワブラックFG、アイオワブラックRG、BHQ1、BHQ2またはBHQ3である、請求項105の方法。
【請求項１０７】
分析対象は一よりも多くのフルオロフォアを含む、請求項93-106のいずれかの方法。
【請求項１０８】
分析対象は一よりも多くのクエンチャーを含む、請求項93-106のいずれかの方法。
【請求項１０９】
ポリヌクレオチドはその3'端にクエンチャーを含む、請求項93-108のいずれかの方法。
【請求項１１０】
ポリヌクレオチド分析対象を検出する方法であって、
a．ポリヌクレオチド分析対象を少なくとも二の発色団と組み合わせることであり、少なくとも二の発色団は各々、ポリヌクレオチド分析対象内での領域に相補的である別個のポリヌクレオチドに取り付けられ、
b．少なくとも二の発色団を重合反応の生成物に組み込むために少なくとも一の重合反応を実行すること、および
c．第一時点および第二時点にて少なくとも二の発色団からの蛍光強度を検出することであり、第二時点は第一時点よりも遅く、および第二時点での第一時点と比較した蛍光強度においての低下がポリヌクレオチド分析対象の存在を指し示すこと
を含む、方法。
【請求項１１１】
重合反応はポリメラーゼ連鎖反応である、請求項110の方法。
【請求項１１２】
第一時点はステップa）の後であり、および第二時点はステップb）の後である、請求項110の方法。
【請求項１１３】
少なくとも一の重合反応の生成物は各々、第一ポリヌクレオチド鎖および第二ポリヌクレオチド鎖を含み、第一ポリヌクレオチド鎖および第二ポリヌクレオチド鎖は相補的である、請求項110の方法。
【請求項１１４】
少なくとも二の発色団は異なる、請求項110の方法。
【請求項１１５】
少なくとも二の発色団はフルオロフォアを含む、請求項110の方法。
【請求項１１６】
少なくとも二の発色団はフルオロフォアおよびクエンチャーを含む、請求項110の方法。
【請求項１１７】
フルオロフォアは第一ポリヌクレオチド鎖に組み込まれ、およびクエンチャーは第二ポリヌクレオチド鎖に組み込まれる、請求項116の方法。
【請求項１１８】
フルオロフォアは第一ポリヌクレオチド鎖の5'端で組み込まれ、およびクエンチャーは第二ポリヌクレオチド鎖の5'端で組み込まれる、請求項116の方法。
【請求項１１９】
（a）第一発色団に取り付けられる第一プライマー、および（b）第二発色団に取り付けられる第二プライマーを含み、第一および第二発色団は異なる発色団である、キット。
【請求項１２０】
第一発色団は第一フルオロフォアである、請求項119のキット。
【請求項１２１】
第二発色団は第二フルオロフォアである、請求項119または120のキット。
【請求項１２２】
第二発色団はクエンチャーである、請求項119または120のキット。
【請求項１２３】
第一または第二フルオロフォアは6-FAM（フルオレセイン）、6-FAM（NHSエステル）、フルオレセインdT、HEX、JOE（NHSエステル）、MAX、TET、ROX、TAMRA、TARMA（NHSエステル）、TEX 615、ATTO 488、ATTO 532、ATTO 550、ATTO 565、ATTO Rho101、ATTO 590、ATTO 633、ATTO 647N、TYE 563、TYE 665またはTYE 705である、請求項120または121のキット。
【請求項１２４】
クエンチャーはアイオワブラックFG、アイオワブラックRG、BHQ1、BHQ2またはBHQ3である、請求項122のキット。
【請求項１２５】
キットには、少なくとも三のプライマーが含まれ、各プライマーは異なる発色団に取り付けられる、請求項119-124のキット。
【請求項１２６】
第一プライマーには、標的分析対象に相補的な配列が含まれる、請求項119-125のいずれかのキット。
【請求項１２７】
第二プライマーには、標的分析対象に相補的な配列が含まれる、請求項119-125のいずれかのキット。
【請求項１２８】
正確に一の第一発色団に取り付けられる第一オリゴヌクレオチドプローブおよび正確に一の第二発色団に取り付けられる第二オリゴヌクレオチドプローブを含み、第一および第二発色団が異なる、キット。
【請求項１２９】
第一発色団はフルオロフォアである、請求項128のキット。
【請求項１３０】
第二発色団はフルオロフォアである、請求項128または129のキット。
【請求項１３１】
第二発色団はクエンチャーである、請求項128のキット。
【請求項１３２】
第一または第二の発色団は、第一または第二フルオロフォアが6-FAM（フルオレセイン）、6-FAM（NHSエステル）、フルオレセインdT、HEX、JOE（NHSエステル）、MAX、TET、ROX、TAMRA、TARMA（NHSエステル）、TEX 615、ATTO 488、ATTO 532、ATTO 550、ATTO 565、ATTO Rho101、ATTO 590、ATTO 633、ATTO 647N、TYE 563、TYE 665またはTYE 705であるものからなる群より選ばれるフルオロフォアである、請求項129、または130のキット。
【請求項１３３】
クエンチャーはアイオワブラックFG、アイオワブラックRG、BHQ1、BHQ2またはBHQ3である、請求項131のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
この出願は2013年1月24日付け出願の米国仮出願第61/756343号の利益を請求し、それをここに参照することによって全体として組み込む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
本発明の背景  
核酸分析対象の同定は、たとえば、研究および臨床診断環境などにおけるような、様々な生物医学的用途において決定的な手順である。分析対象の同定は、主に、配列決定によってか、または増幅ベースの検出によって行われる。たとえば、後者のスキームにおいては、ポリメラーゼ連鎖反応が、多くの場合、存在する核酸分析対象の量を増加させるために使用される。次いで、核酸分析対象は、蛍光強度測定（例は、蛍光プローブまたはインターカレーティング染料）、長さ判別（length discrimination）〔例は、ゲル電気泳動または融解曲線分析（melt curve analysis）を用いて〕、またはクロマトグラフィー〔例は、ハプチン（haptin）ベース核酸捕捉〕を含むいくつかの追加の技術のいずれかを使用して判別される。このように、目下の増幅ベースの検出技術は、間接的に分析対象を検出し、そして分析対象検出のための二次的技術（たとえば、ゲル電気泳動または質量分析などのようなもの）を必要とする。直接分析対象を検出する増幅または重合ベースの技術は、効率、時間とコストを改善するであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００３】
ここで開示するのは、分析対象（被分析物などとも言う）、特に、ポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドを検出するための方法、組成物、およびキットである。本方法は、大体において、ポリヌクレオチド分析対象を検出するために、増幅または重合反応において発色団（例は、フルオロフォア、クエンチャー、など）に取り付けられ（付着し）たオリゴヌクレオチド（例は、プライマー、プローブ）を使用することを含む。いくらかの実施態様において、ここで提供されるのは、サンプル（試料、検体などとも言う）において少なくとも一のポリヌクレオチド分析対象を検出する方法であり、それには、（a）サンプルを第一プライマーおよび第一オリゴヌクレオチドと組み合わせることであり、そこでは、第一プライマーに第一発色団は取り付けられ、第一オリゴヌクレオチドに第二発色団は取り付けられ、第一プライマーおよび第一オリゴヌクレオチドは、第一ポリヌクレオチド分析対象のために特異的であり、および第一発色団は第二発色団とは異なり、（b）第一および第二発色団によって生成される第一信号を測定すること、（c）鋳型として第一ポリヌクレオチド分析対象を用いて第一プライマーとの少なくとも一の重合反応を実行すること、および（d）第一および第二発色団によって生成される第二信号を測定することを含み、第一および第二信号は第一ポリヌクレオチド分析対象を検出するために使用される。
【０００４】
いくらかのケースでは、第一オリゴヌクレオチドは第二プライマーである。いくらかの場合において、第一発色団は第一プライマーの5'端に取り付けられる。いくらかの場合において、第一発色団は無機または有機染料（色素）、フルオロフォア（蛍光団、蛍光色素分子）またはクエンチャー（消光剤、失活剤）である。いくらかの場合において、第一発色団はフルオロフォアである。いくらかのケースでは、フルオロフォアは6-FAM（フルオレセイン）、6-FAM（NHSエステル）、フルオレセインdT、HEX、JOE（NHSエステル）、MAX、TET、ROX、TAMRA、TARMA（タルマ）（NHSエステル）、TEX 615、 ATTO 488、ATTO 532、ATTO 550、ATTO 565、ATTO Rho101、ATTO 590、ATTO 633、ATTO 647N、TYE 563、TYE 665またはTYE 705である。いくらかの場合には、第二発色団は第二プライマーの5'端に取り付けられる。いくらかのケースでは、第二発色団は、無機または有機染料、フルオロフォアまたはクエンチャーである。いくらかのケースでは、第二発色団はクエンチャーである。いくらかのケースでは、クエンチャーはアイオワブラック（Iowa Black）FG、アイオワブラックRG、BHQ1、BHQ2またはBHQ3である。いくらかのケースにおいて、第一発色団はフルオロフォアであり、および第二発色団はクエンチャーである。
【０００５】
いくらかのケースにおいて、ここで記載する方法はさらに、第一および第二信号を比較することを含み、そこでは、第一および第二信号における変化は、第一ポリヌクレオチド分析対象の存在を指し示す。いくらかのケースでは、第一および第二信号における変化は蛍光強度での低下である。いくらかのケースでは、変化は強度における上昇である。いくらかのケースでは、蛍光強度における低下は、信号（シグナル）において少なくともおよそ30％（または少なくともおよそ10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、または75％）の減少である。いくらかのケースでは、第二信号が第二重合反応後に測定される。いくらかのケースにおいて、重合反応はポリメラーゼ連鎖反応プロセスまたは等温プロセス（等温過程）である。いくらかのケースでは、ポリメラーゼ連鎖反応プロセスはエンドポイントポリメラーゼ連鎖反応プロセス、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応プロセス、デジタルポリメラーゼ連鎖反応プロセス、液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応プロセス、または定量的ポリメラーゼ連鎖反応プロセスである。いくらかのケースにおいて、第一プライマーはフォワード（順方向）プライマーであり、および第二プライマーはリバース（逆方向）プライマーである。いくらかのケースにおいて、第一プライマーはリバースプライマーであり、および第二プライマーはフォワードプライマーである。いくらかのケースにおいて、第一および第二発色団は電子移動プロセスを介して相互作用する。いくらかのケースにおいて、第一ポリヌクレオチド分析対象は長さがおよそ10からおよそ500ヌクレオチドまでである。いくらかのケースにおいて、第一ポリヌクレオチド分析対象の濃度はおよそ10μMからおよそ10aMである。いくらかのケースにおいて、第一ポリヌクレオチド分析対象はDNAポリヌクレオチド分析対象である。いくらかのケースにおいて、第一ポリヌクレオチド分析対象はRNAポリヌクレオチド分析対象である。
【０００６】
いくらかのケースでは、第一ポリヌクレオチド分析対象は遺伝的変動（遺伝的バリエーション）を含む。いくらかのケースでは、遺伝的変動には、置換、付加、欠失またはトランスロケーション（転座）が含まれる。いくらかのケースでは、遺伝的変動には、単一ヌクレオチド多型（SNP）が含まれる。いくらかのケースでは、少なくとも一のポリヌクレオチド分析対象はヒト、非ヒト哺乳動物、植物、細菌、真菌、古細菌、寄生体、またはウイルスから選ばれるソース（供給源）からのものである。いくらかのケースにおいて、ウイルスはヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザA型ウイルス、インフルエンザB型ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスA型（RsvA）、呼吸器合胞体ウイルスB型ウイルス（RsvB）、ヒトライノウイルス（Hrv）、ヒトメタニューモ（ヒトメタ肺炎）ウイルス（Hmpv）またはヒトパラインフルエンザウイルス3型（PIV-3）である。いくらかのケースにおいて、サンプルは、法医学的サンプル、臨床サンプル、食物サンプル、環境サンプル、製薬サンプル、または消費者製品からのサンプルである。いくらかのケースにおいて、ここで開示する本方法はさらに、プライマーに取り付けられる追加のフルオロフォアを用いてサンプル内で少なくとも一の追加のポリヌクレオチド分析対象を検出することが含まれ、第一発色団は追加のフルオロフォアと同じ色を有するフルオロフォアである。いくらかのケースにおいて、第一プライマーは、二またはそれよりも多く（二以上）の発色団に取り付けられない。いくらかのケースでは、第一オリゴヌクレオチドは二以上の発色団に取り付けられない。いくらかのケースでは、本方法のステップb）にはさらに、第一変性ステップでの第一信号および第一アニーリングステップでの第三信号を測定することが含まれ、ステップd）には、さらに、第二変性ステップでの第二信号および第二アニーリングステップでの第四信号を測定することが含まれ、および本方法にはさらに、第一の比を得るために第一信号を第二信号と比較すること、および第二の比を得るために第三信号を第四信号と比較することが含まれ、そこでは第一の比がおよそ1であり、および第二の比が1よりも大きいか、またはそれ未満であるとき、第一ポリヌクレオチド分析対象の存在が指し示される。
【０００７】
いくらかのケースにおいて、ここで記載の方法のステップa）には、サンプルを第三プライマーおよび第二オリゴヌクレオチドと組み合わせることが含まれ、そこで、第三発色団は第三プライマーに取り付けられ、および第四発色団は第二オリゴヌクレオチドに取り付けられ、および第三プライマーおよび第二オリゴヌクレオチドは第二ポリヌクレオチド分析対象に特異的であり、ステップb）にはさらに、第三および第四発色団によって生成される第五信号を測定することが含まれ、ステップd）にはさらに、第三および第四発色団によって生成される第六信号を測定することが含まれ、そこで、第五および第六信号は第二ポリヌクレオチド分析対象を検出するために使用される。いくらかのケースでは、ここで開示する方法にはさらに、第五および第六信号を比較することが含まれ、そこでは、第五および第六信号での変化は第二ポリヌクレオチド分析対象の存在を指し示す。いくらかのケースにおいて、第二オリゴヌクレオチドは第四プライマーである。
【０００８】
また、ここで開示するものは、分析対象において少なくとも一の遺伝的変動を検出する方法であり、それには、以下のことが含まれ、（a）第一分析対象を第一プライマーおよび第二プライマーと組み合わせることであり、そこで、第一発色団は第一プライマーに取り付けられ、第二発色団は第二プライマーに取り付けられ、第一および第二プライマーの少なくとも一方は第一分析対象において第一の遺伝的変動に特異的であり、および第一発色団は第二発色団とは異なり、（b）第一および第二発色団によって生成される第一信号を測定すること、（c）テンプレート（鋳型）として第一分析対象を用いて、第一プライマーおよび第二プライマーとの少なくとも一の重合反応を実行すること、および（d）第一および第二発色団によって生成された第二信号を測定することであり、そこでは、第一および第二信号は第一分析対象において第一の遺伝的変動を検出するために使用されることである。いくらかのケースにおいて、ここで記載の方法にはさらに、第一および第二信号を比較することが含まれ、そこでは、第一および第二信号における変化は第一分析対象における遺伝的変動の存在を指し示す。
【０００９】
いくらかのケースでは、分析対象はポリヌクレオチド分析対象である。いくらかのケースでは、遺伝的変動には、置換、付加、欠失または転座が含まれる。いくらかのケースでは、遺伝的変動には、単一ヌクレオチド多型（SNP）が含まれる。いくらかのケースにおいて、第一プライマーには、SNPをコードする配列が含まれるか、または第一プライマーはSNPをコードする分析対象の領域に結合する。いくらかのケースでは、第二プライマーはSNPをコードしない配列を含むか、または第二プライマーはSNPをコードしない分析対象の領域に相補的な配列を含む。いくらかのケースにおいて、第一プライマーは分析対象の領域を、第二プライマーによってコードされる分析対象の領域から500塩基対未満離れてコードする。いくらかのケースにおいては、信号における変化は、UU、UT、UG、UC、UA、AA、TT、GG、CC、AG、AC、TGおよびTCからなる群より選ばれるミスマッチ塩基対の少なくとも二について別個のものである。いくらかのケースでは、ミスマッチ塩基対からの信号における変化は、相補的塩基対からの信号における変化とは別個である。
【００１０】
いくらかのケースでは、ここで記載される方法のステップa）にはさらに、第一分析対象を第三プライマーおよび第四プライマーと組み合わせることが含まれ、そこでは、第三発色団は第三プライマーに取り付けられ、および第四発色団は第四プライマーに取り付けられ、第三および第四プライマーは第一分析対象における第二の遺伝的変動に特異的であり、および第三発色団は第四発色団とは異なり、ステップb）にはさらに、第三信号を測定することが含まれ、ステップd）にはさらに、第四信号を測定することが含まれ、本方法にはさらに、第三および第四信号を比較することが含まれ、そこでは、第三および第四信号における変化は第一分析対象における第二の単一の遺伝的変動の存在を指し示す。いくらかのケースでは、本方法のステップa）には、第二分析対象を、第三プライマーおよび第四プライマーと組み合わせることが含まれ、そこでは、第三発色団は第三プライマーに取り付けられ、第四発色団は含まれる第四プライマーに取り付けられ、第三および第四プライマーは第二分析対象における第二の遺伝的変動に特異的であり、および第三発色団は第四発色団と異なり、ステップb）にはさらに、第三信号を測定することが含まれ、ステップd）にはさらに第四信号を測定することが含まれ、および本方法にはさらに、第三および第四信号を比較することが含まれ、そこでは、第三および第四信号の変化は第二分析対象における第二の単一の遺伝的変動の存在を指し示す。いくらかのケースにおいて、本方法のステップa）にはさらに、第二分析対象を、第三プライマーおよび第四プライマーと組み合わせることが含まれ、そこでは、第一発色団は第三プライマーに取り付けられ、および第二発色団は第四プライマーに取り付けられ、および第三および第四プライマーは第二分析対象における第二の遺伝的変動に特異的である。いくらかのケースにおいて、重合反応はPCRプロセスまたは等温反応である。いくらかのケースでは、PCRプロセスはエンドポイントPCRプロセス、デジタルPCRプロセス、リアルタイムPCRプロセス、液滴デジタル（droplet digital）PCRプロセス、または定量的PCRプロセスである。いくらかのケースにおいて、重合反応は定量的PCRプロセスである。いくらかのケースにおいて、検出することには、定量的PCR法が含まれる。いくらかのケースにおいて、検出することには、定量的PCR法および第二の方法が含まれる。いくらかのケースにおいて、第二の方法はデジタルPCRプロセスである。いくらかのケースにおいて、少なくとも一のSNPは遺伝子において検出される。いくらかのケースにおいては、少なくとも一のSNPは疾患と関係する。いくらかのケースにおいて、疾患は、遺伝（的）障害、自己免疫疾患、神経疾患、循環器（心臓血管）疾患、またはガンである。
【００１１】
また、ここで開示されるものは、複数の分析対象を検出する方法であり、それには、以下のことが含まれ、a）複数の分析対象を、複数のプライマー対と組み合わせることであり、そこでは、各プライマー対は、単一の分析対象に特異的であり、およびプライマー対の各プライマーは少なくとも一の発色団に取り付けられ、b）発色団によって生成される信号の第一のセットを測定すること、c）鋳型として複数の分析対象を用いて複数のプライマー対との少なくとも一の重合反応を実行すること、およびd）発色団によって生成される信号の第二のセットを測定することであり、そこでは、信号の第一および第二のセットは複数の分析対象の各分析対象を検出するために使用されることである。いくらかのケースにおいて、ここで記載する方法にはさらに、以下のことが含まれ、e）少なくとも1回ステップcおよびdを繰り返すこと、およびf）シグナチャー（符号）プロファイルのセットを生成することであり、そこでは、複数の分析対象の各分析対象の存在はシグナチャープロファイルのセットをシグナチャープロファイルのコントロール（制御）セットに比較することによって検出されることである。
【００１２】
いくらかのケースでは、シグナチャープロファイルはエンドポイントシグナチャープロファイルまたはシグナチャー曲線である。いくらかのケースにおいて、複数の分析対象は異なる長さをもつ。いくらかのケースにおいて、複数のプライマー対の各々はフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む。いくらかのケースでは、一、二またはそれよりも多くの発色団はフォワードプライマーに取り付けられる。いくらかのケースでは、一の発色団はフォワードプライマーの5'端に取り付けられる。いくらかのケースにおいて、少なくとも一の発色団はリバースプライマーに取り付けられる。いくらかのケースでは、一の発色団はリバースプライマーの5'端に取り付けられる。いくらかのケースにおいて、発色団は無機または有機染料、フルオロフォアまたはクエンチャーである。いくらかのケースでは、発色団はフルオロフォアである。いくらかのケースでは、発色団はクエンチャーである。
【００１３】
また、ここで開示されるものは、ポリヌクレオチド分析対象のためのシグナチャー曲線プロファイルを生成する方法であり、それには、次のことが含まれ、（a）ポリヌクレオチド分析対象を、第一プライマーおよび第二プライマーと接触させることであり、そこでは、第一発色団は第一プライマーに取り付けられ、および第二発色団は第二プライマーに取り付けられ、第一プライマーおよび第二プライマーはポリヌクレオチド分析対象のために特異的であり、および第一発色団は第二発色団と異なり、（b）第一信号を第一温度で測定すること、（c）鋳型としてポリヌクレオチド分析対象を用いて第一プライマーおよび第二プライマーとの少なくとも一の重合反応を実行すること、（d）第二信号を第一温度で測定すること、および（e）少なくとも一回ステップcおよびdを繰り返すことであり、信号はポリヌクレオチド分析対象のシグナチャー曲線プロファイルを作り出すことである。いくらかのケースでは、ここで開示する本方法にはさらに、以下のことが含まれ、f）温度を変化させること、g）第三信号を第二温度で測定すること、およびh）少なくとも一回ステップfおよびgを繰り返すことであり、信号はポリヌクレオチド分析対象のシグナチャー曲線プロファイルを作り出すことである。
【００１４】
いくらかのケースでは、シグナチャー曲線は、長さ曲線（length curve）、形態曲線（morphology curve）、融解曲線（melt curve）、またはSNP曲線である。いくらかのケースにおいて、重合反応は、ポリメラーゼ連鎖反応プロセスである。いくらかのケースでは、ポリメラーゼ連鎖反応プロセスは、エンドポイントポリメラーゼ連鎖反応プロセス、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応プロセス、デジタルポリメラーゼ連鎖反応プロセスまたは定量的ポリメラーゼ連鎖反応プロセスである。いくらかのケースにおいて、第一発色団は無機または有機の染料、フルオロフォアまたはクエンチャーである。いくらかのケースにおいて、第一発色団はフルオロフォアである。いくらかのケースでは、フルオロフォアは6-FAM（フルオレセイン）、6-FAM（NHSエステル）、フルオレセインdT、HEX、JOE（NHSエステル）、MAX、TET、ROX、TAMRA、TARMA（NHSエステル）、TEX 615、ATTO 488、ATTO 532、ATTO 550、ATTO 565、ATTO Rho101、ATTO 590、ATTO 633、ATTO 647N、TYE 563、TYE 665またはTYE 705である。いくらかのケースでは、第二発色団は、無機または有機染料、フルオロフォアまたはクエンチャーである。いくらかのケースにおいて、第二発色団がクエンチャーである。いくらかのケースでは、クエンチャーはアイオワブラックFG、アイオワブラックRG、BHQ1、BHQ2またはBHQ3である。いくらかのケースでは、ポリヌクレオチド分析対象はDNAポリヌクレオチド分析対象である。いくらかのケースでは、ポリヌクレオチド分析対象はRNAポリヌクレオチド分析対象である。いくらかのケースでは、ポリヌクレオチド分析対象は、ヒト、非ヒト哺乳動物、植物、細菌、古細菌、真菌、寄生体、およびウイルスからなる群より選ばれるソースからのものである。いくらかのケースにおいて、ウイルスはヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザA型ウイルス、インフルエンザB型ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスタイプA（RSVA）、呼吸器合胞体ウイルスB型ウイルス（RsvB）、ヒトライノウイルス（Hrv）、ヒトメタニューモウイルス（Hmpv）またはヒトパラインフルエンザウイルス3型（PIV-3）である。
【００１５】
また、ここで開示されるものは、増幅反応をモニタリング（監視）する方法であり、それには、以下のことが含まれ、（a）第一ポリヌクレオチド分析対象を以下のものと接触させることであり、i）第一プライマーおよび第二プライマーであり、そこでは、第一プライマーおよび第二プライマーは第一ポリヌクレオチド分析対象に特異的であるもの、およびii）第一ポリヌクレオチド分析対象から増幅される生成物への特異的な取り込みが可能な少なくとも二の発色団；（b）ステップ（a）における組合せを、二本鎖DNAを変性させることが可能な温度に曝すこと；（c）少なくとも二の発色団によって生成されるステップ（b）における第一信号を測定すること；（d）ステップb）における組合せを、ポリヌクレオチドをアニーリングすることが可能な温度に供する（曝す）こと；（e）少なくとも二の発色団によって生成されるステップ（d）における第二信号を測定すること；および（f）第三信号および第四信号を得るために、ステップb）-e）を繰り返すこと；および（g）第一の比を得るために第一および第三信号を、および第二の比を得るために第二および第四信号を比較することであり、そこでは、第一の比がおよそ1であり、および第二の比は1よりも大きいか、またはそれよりも小さいときに増幅反応が起こることである。いくらかのケースでは、少なくとも一の発色団は第一プライマーに取り付けられ、たとえば、正確に一の発色団は第一プライマーに取り付けることができる。いくらかのケースでは、一の発色団（または正確に一の発色団）は、第一プライマーの5'端に取り付けられる。いくらかのケースでは、一、二またはそれらよりも多くの発色団は第二プライマーに取り付けられる。いくらかのケースでは、一の発色団は第二プライマーの5'端に取り付けられる。いくらかのケースにおいて、発色団は無機または有機染料、フルオロフォアまたはクエンチャーである。
【００１６】
また、ここで開示されるものは、分析対象の形態を検出する方法であり、それには、次のことが含まれ、（a）分析対象が含まれるサンプルを用意することであり、そこでは、第一発色団、第二発色団および第三発色団は分析対象に取り付けられ、そこでは、第一、第二および第三発色団は異なること；（b）第一発色団、第二発色団および第三発色団からの信号を第一および第二温度で測定することであり、そこでは、第一および第二温度は異なること；および（c）分析対象の形態を検出するために測定された信号を使用することである。いくらかのケースにおいて、分析対象は、タンパク質、ポリペプチド、脂質またはポリヌクレオチドである。いくらかのケースにおいて、分析対象はポリヌクレオチドである。いくらかのケースにおいて、ポリヌクレオチドはDNAポリヌクレオチドである。いくらかのケースにおいて、ポリヌクレオチドはRNAポリヌクレオチドである。いくらかのケースにおいて、第一発色団は、無機または有機染料、フルオロフォアまたはクエンチャーである。いくらかのケースにおいて、第一発色団は第一フルオロフォアである。いくらかのケースでは、第一フルオロフォアは、6-FAM（フルオレセイン）、6-FAM（NHSエステル）、フルオレセインdT、HEX、JOE（NHSエステル）、MAX、TET、ROX、TAMRA、TARMA（NHSエステル）、TEX 615、ATTO 488、ATTO 532、ATTO 550、ATTO 565、ATTO Rho101、ATTO 590、ATTO 633、ATTO 647N、TYE 563、TYE 665またはTYE 705である。いくらかのケースでは、第二発色団は、無機または有機染料、フルオロフォアまたはクエンチャーである。いくらかのケースにおいて、第二発色団は第二フルオロフォアである。いくらかのケースでは、第二フルオロフォアは、6-FAM（フルオレセイン）、6-FAM（NHSエステル）、フルオレセインdT、HEX、JOE（NHSエステル）、MAX、TET、ROX、TAMRA、TARMA（NHSエステル）、TEX 615、ATTO 488、ATTO 532、ATTO 550、ATTO 565、ATTO Rho101、ATTO 590、ATTO 633、ATTO 647N、TYE 563、TYE 665またはTYE 705である。いくらかのケースにおいて、第三発色団は、無機または有機染料、フルオロフォアまたはクエンチャーである。いくらかのケースにおいて、第三発色団はクエンチャーである。いくらかのケースでは、クエンチャーはアイオワブラックFG、アイオワブラックRG、BHQ1、BHQ2またはBHQ3である。いくらかのケースにおいて、分析対象は一よりも多くのフルオロフォアを含む。いくらかのケースにおいて、分析対象は一よりも多くのクエンチャーを含む。いくらかのケースにおいて、ポリヌクレオチドはその3'端にクエンチャーを含む。
【００１７】
また、ここで開示されるものは、ポリヌクレオチド分析対象を検出する方法であり、それには、以下のことが含まれ、（a）ポリヌクレオチド分析対象を少なくとも二の発色団と組み合わせることであり、そこでは、少なくとも二の発色団は各々、ポリヌクレオチド分析対象内の領域に相補的である別々のポリヌクレオチドに取り付けられること；（b）重合反応の生成物中に少なくとも二の発色団を組み込むために少なくとも一の重合反応を実行すること；および（c）第一時点および第二時点で少なくとも二の発色団からの蛍光強度を検出することであり、そこでは、第二時点は第一時点よりも後にあり、およびそこでは、第二時点で第一時点と比較して蛍光強度における変化（特に、減少）はポリヌクレオチド分析対象の存在の指標であること。いくらかのケースにおいて、重合反応はポリメラーゼ連鎖反応である。いくらかのケースでは、第一時点はステップa）の後にあり、および第二時点はステップb）の後にある。いくらかのケースにおいて、少なくとも一の重合反応の生成物は各々、第一ポリヌクレオチドストランド（鎖）および第二ポリヌクレオチドストランドを含み、そこでは、第一ポリヌクレオチドストランドおよび第二ポリヌクレオチドストランドは相補的である。いくらかのケースにおいて、少なくとも二の発色団は異なる。いくらかのケースでは、少なくとも二の発色団はフルオロフォアを含む。いくらかのケースにおいては、少なくとも二の発色団はフルオロフォアおよびクエンチャーを含む。いくらかのケースでは、フルオロフォアは、第一ポリヌクレオチドストランド中に組み込まれ、およびクエンチャーは第二ポリヌクレオチドストランド中に組み込まれる。いくらかのケースにおいて、フルオロフォアは第一ポリヌクレオチドストランドの5'端に組み込まれ、およびクエンチャーは第二ポリヌクレオチドストランドの5'端に組み込まれる。
【００１８】
また、ここで開示されるものは、とりわけ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド分析対象を検出するための、組成物およびキットである。いくらかのケースでは、キットには、発色団（例は、フルオロフォア、クエンチャー）に取り付けられるオリゴヌクレオチド（例は、プライマー、プローブ、等）が含まれる。いくらかのケースでは、キットには、（a）フルオロフォアに取り付けられる第一プライマーまたはプローブ、および（b）クエンチャーに取り付けられる第二プライマーまたはプローブが含まれる。いくらかのケースでは、キットには、（a）正確に一の第一発色団に取り付けられる第一プライマーまたはプローブであり、そこでは、第一発色団はフルオロフォアであるもの、および（b）正確に一の第二発色団に取り付けられる第二プライマーまたはプローブであり、そこでは、第一発色団は第二発色団と異なるものが含まれる。いくらかのケースにおいて、第二発色団はクエンチャーである。いくらかのケースにおいて、第二発色団はフルオロフォアである。いくらかのケースにおいて、第一プライマーまたはプローブはあるプライマーである。いくらかのケースにおいて、第二プライマーまたはプローブはあるプライマーである。いくらかのケースにおいて、第一プライマーまたはプローブには、標的分析対象の配列に相補的であるオリゴヌクレオチド配列が含まれる。いくらかのケースにおいて、第二プライマーまたはプローブには、標的分析対象の配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列が含まれる。いくらかのケースでは、フルオロフォアは、6-FAM（フルオレセイン）、6-FAM（NHSエステル）、フルオレセインdT、HEX、JOE（NHSエステル）、MAX、TET、ROX、TAMRA、TARMA（NHSエステル）、TEX 615、ATTO 488、ATTO 532、ATTO 550、ATTO 565、ATTO Rho101、ATTO 590、ATTO 633、ATTO 647N、TYE 563、TYE 665またはTYE 705である。いくらかのケースでは、クエンチャーはアイオワブラックFG、アイオワブラックRG、BHQ1、BHQ2またはBHQ3である。いくらかのケースにおいては、キットには、少なくとも三のプライマーが含まれ、そこでは、各プライマーは異なる発色団に取り付けられる。
【００１９】
いくらかのケースでは、キットには、以下のものが含まれ、（a）第一発色団に取り付けられる第一プライマーまたはプローブであり、そこでは、第一発色団はフルオロフォアであるもの、および（b）第二発色団に取り付けられる第二プライマーまたはプローブであり、そこでは、第一発色団は第二発色団と異なるものである。いくらかのケースでは、キットには、以下のものが含まれ、（a）正確に一の第一発色団に取り付けられる第一プライマーまたはプローブ、および（b）正確に一の第二発色団に取り付けられる第二プライマーまたはプローブであり、そこでは、第一発色団は第二発色団と異なるものである。いくらかのケースでは、キットには、以下のものが含まれ、（a）正確に一の第一発色団に取り付けられる第一プライマーまたはプローブであり、そこでは、第一発色団はフルオロフォアであり、および（b）正確に一の第二発色団に取り付けられる第二プライマーまたはプローブであり、そこでは、第一発色団は第二発色団と異なるものである。いくらかのケースにおいて、第二発色団はクエンチャーである。いくらかのケースにおいて、第二発色団はフルオロフォアである。いくらかのケースにおいて、第一プライマーまたはプローブはあるプライマーである。いくらかのケースにおいて、第二プライマーまたはプローブはあるプライマーである。いくらかのケースにおいて、第一プライマーまたはプローブには、標的分析対象の配列に相補的であるオリゴヌクレオチド配列が含まれる。いくらかのケースにおいて、第二プライマーまたはプローブには、標的分析対象の配列に相補的であるオリゴヌクレオチド配列が含まれる。いくらかのケースにおいては、フルオロフォアは、6-FAM（フルオレセイン）、6-FAM（NHSエステル）、フルオレセインdT、HEX、JOE（NHSエステル）、MAX、TET、ROX、TAMRA、TARMA（NHSエステル）、TEX 615、ATTO 488、ATTO 532、ATTO 550、ATTO 565、ATTO Rho101、ATTO 590、ATTO 633、ATTO 647N、TYE 563、TYE 665またはTYE 705である。いくらかのケースでは、クエンチャーはアイオワブラックFG、アイオワブラックRG、BHQ1、BHQ2またはBHQ3である。いくらかのケースにおいては、キットには、少なくとも三のプライマーが含まれ、そこでは、各プライマーは異なる発色団に取り付けられる。
【００２０】
参照による組込み
この明細書に言及するすべての刊行物、特許、および特許出願は、ここで参照することにより、各個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的に、かつ、個々に参照により組み込まれることが示されたかのように同じ程度に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
本発明の種々の態様を添付の請求の範囲において詳細に記載する。本発明の特色および利益のより一層良好な理解は、本発明の原理を利用する例示的な実施形態、および添付の図面を説明する以下の詳細な説明を参照することによって得られるであろう。
【図１】ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の間に発色団付きプライマー〔フルオロフォア付きフォワード（FWD）プライマーおよびクエンチャー付きリバース｛または巻き戻し（RWD）｝プライマー〕を用いて核酸分析対象の検出のためのメカニズムを例証する。図1A-1Bは二本鎖ポリヌクレオチド分析対象の変性を示す。図1C-1Dは分析対象の逆鎖（反対ストランド）への発色団付きプライマーのアニーリング、およびPCR反応中にプライマーを伸長するためにポリメラーゼについて示す。図1E-1Fは、信号（例は、フルオレセンスのクエンチング）の生成をもたらす双方の発色団（フルオロフォアおよびクエンチャー）を含む二本鎖PCR生成物の形成を例示する。
【図２】電子移動状態を例証する。図2Aはエネルギー伝達式を示す。図2Bは、指し示された典型的な時間スケールと共にForster（フェルスター）共鳴エネルギー移動を示すJablonski（ヤブロンスキー）ダイヤグラムを説明する。
【図３】ここで記載される検出方法と共に使用するための判断プロトコルおよび処置方法を示す。
【図４】ここで記載される方法を処理するために使用される模範的なコンピュータサーバーの概念図を示す。
【図５Ａ】図5は、定量的PCR（qPCR）を使用して様々な濃度でのHIV TPP分析対象の検出を例証する。図5Aは10nMの濃度で80bp HIV TPP分析対象のqPCR検出を示す。
【図５Ｂ】1nMの濃度で80bp HIV TPP分析対象のqPCR検出を示す。
【図５Ｃ】100pMの濃度で80bp HIV TPP分析対象のqPCR検出を示す。
【図５Ｄ】10pMの濃度で80bp HIV TPP分析対象のqPCR検出を示す。すべての好首尾な検出曲線は逆S字状の特性（inverse-sigmoidal characteristic）を見せる。
【図６Ａ】図6は模範的な検出方法を用いてHIV TPPの検出の感度を示す。図6Aは1pMの濃度で80bp HIV TPP分析対象のqPCR検出を示す。
【図６Ｂ】100fMの濃度で80bp HIV TPP分析対象のqPCR検出を示す。
【図６Ｃ】10fMの濃度で80bp HIV TPP分析対象のqPCR検出を示す。
【図６Ｄ】1fM濃度で80bp HIV TPP分析対象のqPCR検出を示す。
【図７Ａ】図7は信号生成（クエンチング）の程度がクエンチャーおよびフルオロフォア間の距離に強く相関することを示す。分析対象はプライマーの単一セットのために40bpから120bpまでの長さで変動した。図7Aは40merの分析対象を用いるクエンチングの範囲を示す。
【図７Ｂ】60merの分析対象を用いるクエンチングの範囲を示す。
【図７Ｃ】80merの分析対象を用いるクエンチングの範囲を示す。
【図８Ａ】図8は信号生成における単一ヌクレオチド多型の影響を示す。ミスプライミングイベントが発生するとき信号レベルは著しく変化する（図8Aおよび図8B）。
【図８Ｂ】図8Aと同様である。
【図９】図9は分析対象のバイナリーコーディングを例証する。3-プレックス（重）CY3アッセイにおける分析対象はバイナリー離間プライマー濃度（binary spaced primer concentrations）を用いてコードされた。TaqMan陽性コントロール配列はPCRが好首尾に実行されたことを確認するために各反応において増幅された。
【図１０】図10は分析対象を検出するためにポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用する増幅または重合反応を例証する。図10Aは検出されるべき分析対象（分析対象01）の配列を示す。図10Bは分析対象01のために特異的なフォワード（FWD）およびリバース（RWD）プライマー対を示す。図10CはPCR反応の最初のサイクル間のアニーリングステップを示す。図10DはPCR反応の第2サイクル間のアニーリングステップを示す。図10Eは第二伸長サイクル後の伸長されたPCR生成物を示す。
【図１１】ここで記載される検出方法が、三つのチャネルにおいてクエンチングされた信号を検出するためにマルチプレックス（多重）反応においてどのように使用することができるかを例証する。
【図１２】分析対象中への、その形態を決定するために複数の発色団を取り込むことを例証する。
【図１３】マルチプルな発色団を含む分析対象について温度の関数として信号生成を例証する。図13Aは、第一温度（T1）でのオリゴヌクレオチドの形態を示す。三つのフルオロフォア（F1、F2およびF3）はオリゴヌクレオチドに取り付けられ、および一つのクエンチャー（Q1）はオリゴヌクレオチドの3'端に取り付けられる。図13Bは、T1でのオリゴヌクレオチドの蛍光シグナチャー（蛍光サイン）プロファイルを示す。T1では、Q1はF3に最も近く、およびクエンチング効果が観察される（図13B）。図13Cは第二温度（T2）でのオリゴヌクレオチドの形態を示す。図13DはT2でのオリゴヌクレオチドの蛍光シグナチャープロファイルを示す。T2では、オリゴヌクレオチドは十分に変性され、およびQ1はF3からさらに離れる。結果として、F3の蛍光信号は増加した（図13D）。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以降に本発明の詳細な記載を述べる。
ここで提供されるものは、分析対象に特異的な発色団付きオリゴヌクレオチド（例は、プライマーおよび/またはプローブ）を用いる一またはそれよりも多く（一以上）の分析対象の検出のための方法、システム、組成物、およびキットである。たとえば、増幅または重合生成物への発色団の取り込み（例は、たとえば、図1において示すように、異なる発色団に取り付けられるフォワードおよびリバースプライマーの使用を通したもの）は多数の利益を提供する。
【００２３】
たとえば、ここで記載される方法は、単一の反応〔たとえば、増幅反応（たとえば、PCR反応またはPCR反応プロセスなどのようなもの）または重合反応などのようなもの〕における一以上の分析対象の直接検出を提供することができる。加えて、増幅または重合生成物（例は、分析対象）への発色団の直接取り込みは、分析対象のより一層正確な定量化を、および増幅または重合反応の進行のリアルタイムモニタリングを可能にする。たとえば、一旦分析対象が二の異なる発色団を組み込むために増幅されると、一の発色団の励起の際、電子は第二発色団と相互作用するためにDNA主鎖のパイ結合ネットワークを通して移動することができ、それによって検出可能な信号、または信号においおての変化が生成される。
【００２４】
ここで記載される方法は特に、遺伝的変動（遺伝的バリエーション）、たとえば、分析対象の一塩基多型（SNPs）または他の定性的情報などのようなものを検出するのに適する。いくらかのケースにおいて、発色団付きプライマーおよび分析対象間の単一の塩基対ミスマッチは分析対象の増幅または重合（またはプライマーの重合または伸長）の際に検出することができる。たとえば、信号における変化は、SNPが存在するとき、分析対象の増幅または重合〔またはプライマー（SNPに特異的なプライマー）の重合または伸長〕の際に隣接する（contiguous）二本鎖DNA配列のディスラプション（以下、混乱と言うことがある）がある場合、発生することがある。単一塩基対のミスアライメント（位置ずれ）〔例は、内部ミスアラインメント（たとえば、SNPなどのようなもの）または末端オーバーハング〕は、塩基対ミスアラインメントを含む分析対象中に組み込まれる発色団間で電子伝達における混乱に起因する塩基対ミスアラインメントを伴わずに分析対象の増幅または重合（またはプライマーの重合または伸長）の際に生成される信号と比較して信号において著しい減少を招くことができる。
【００２５】
加えてここで記載するものは、たとえば、PCR反応（またはPCR反応プロセス）などのような、増幅または重合反応の間に信号を標準（正規）化するための方法である。いくらかのケースにおいて、ここで記載される方法は、PCR反応またはプロセスのサイクルごとの標準化（例は、個別のサイクルを基準値に対してリセットするところのチョッパー安定化）を提供することができる。たとえば、いくらかのケースにおいて、サイクルの変性ステップの間に測定される信号が基準信号範囲内にあるとき、変性信号は同じサイクルのアニーリングステップの間に測定される信号を標準化するために使用することができる。それによって、サイクルごとの標準化はPCR反応の信頼性を決定するために手段を提供することができ、そして特に、分析対象の正確な検出および測定を提供するためにここで記載の検出方法と共に使用することができる。
【００２６】
また、ここで記載される方法は低濃度で存在する分析対象の検出を可能にする。いくらかのケースにおいて、ここで記載する方法の感度はおよそ10uMないしおよそ1aMの濃度で分析対象を検出することができる。いくらかのケースにおいて、ここで提供される方法はさらに、検出を向上させるために、デジタル増幅または重合プロセス（例は、液滴デジタルPCR）と組み合わせることができる。いくらかのケースにおいて、ここで提供される方法は、サンプルにおいて微量濃度で存在する分析対象（例は、レアSNP）を検出するために使用することができる。
【００２７】
さらに、ここで記載されるのは、追加の実験または材料（例は、試薬）に頼る必要がない、単一の反応または実験においてマルチプルな（多重の）分析対象を検出するための方法である。それによって、開示された方法は、追加の試薬または材料の関連するコストを低減または排除し、および時間や効率を高めることができる。
【００２８】
I.一定の用語
【００２９】
上記の一般的な説明および以下の詳細な記載は、模範的および説明的に過ぎず、そして請求される任意の主題を制限するものではないことを理解すべきである。この出願において、特に明記しない限り、単数形の使用には、複数形が含まれる。単数形、「ある（a）」、「ある（an）」および「その（the）」は、本明細書および添付の請求の範囲において使用されるように、文脈が明確に他に指図しない限り、複数の指示対象を含むことことに留意しなければならない。この出願では、「または」の使用は、特に別に定めない限り、「および/または」を意味する。さらに、用語「含む（including）」ならびに他の形態、たとえば、「含む」、「含まれる」、および「含んだ」などのようなものの使用は、制限的なものではない。
【００３０】
ここで使用されるように、用語「およそ（about）」は、概して、特定の使用の文脈内で述べられた数値よりも15％多いか、小さい範囲に言及する。たとえば、「およそ10」は8.5から11.5までの範囲を含むことになるであろう。
【００３１】
ここで使用するように、用語「プライマー」は大抵、核酸合成反応をプライムする（下準備する）ために標的核酸配列（例は、増幅すべきDNA鋳型）にハイブリダイズする短い線状オリゴヌクレオチドに言及する。プライマーは、RNAオリゴヌクレオチド、DNAオリゴヌクレオチド、またはキメラ配列であることができる。プライマーは、自然、合成、またはヌクレオチド類似体（例は、Tmを増加させるもの）を含んでもよい。プライマーの長さの双方の上限および下限値は、経験的に決定される。プライマーの長さにおける下限値は、核酸増幅または重合反応条件下で標的核酸とのハイブリダイゼーションの際に安定な二重鎖（duplex）を形成するのに必要とされる最小限の長さである。非常に短いプライマー（通常、3未満のヌクレオチド長）は、そのようなハイブリダイゼーション条件下で標的核酸と熱力学的に安定な二重鎖を形成しない。上限値は、多くの場合、標的核酸において予め定められた核酸配列以外の領域において二重鎖形成をもつことの可能性によって定められる。大抵は、適切なプライマーの長さは、およそ3ヌクレオチド長さないしおよそ40ヌクレオチド長さの範囲である。ここで記載される標的核酸の増幅または重合の方法において使用される「プライマー」は、実験条件の特定のセットのための適切な長さであろう。プライマーの長さの決定は、この技術における熟練の者（当業者と言うことがある）の日常的な能力の十分な範囲内である。
【００３２】
ここで使用されるように、用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、または「核酸」は、複数のヌクレオチドを含む生物学的分子を指すためにここで使用される。模範的なポリヌクレオチドには、ペプチド核酸を含め、デオキシリボ核酸、リボ核酸、およびそれらの合成類似体が含まれる。
【００３３】
II．検出の方法
【００３４】
ここで記載するのは、サンプルにおいて少なくとも一のポリヌクレオチド分析対象の存在または不存在を検出するための方法である。ここで提供される検出方法は、生成物（例は、分析対象）の鋳型上に直接発色団を組み込むために増幅または重合技術（例は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）またはPCRプロセス）を使用することができる。模範的な検出方法は図1に示され、そこでは、プライマーの対は、それぞれ、フルオロフォアまたはクエンチャーのいずれかにそれぞれその5'端で取り付けられ、増幅または重合プロセスによって分析対象を検出するために使用される。いくらかのケースにおいて、第一信号は増幅または重合反応の開始に先立って測定される。初期の増幅または重合のサイクルの間、二重鎖DNAは分離し、プライマーが個々の鋳型ストランドの特定の領域に結合することが可能にされる（図1A-1C）。ポリメラーゼ（例は、Taqポリメラーゼ）は鋳型鎖（図1D）に沿ってプライマーを伸長するために使用することができる。いくらかのケースにおいて、第二信号は初期のサイクルの後に測定することができる。いくらかのケースでは、信号においての変化は、単一の発色団が鋳型に組み込まれるので、初期のサイクルの後に観察されない（図1E）。いくらかのケースにおいて、第二サイクルの完了の際に、信号においての変化は、合成された鋳型において双方の発色団の取り込みのために観察することができる（図1F）。いくらかのケースにおいて、第二信号は第二サイクルの後に測定することができる。いくらかのケースでは、第一および第二信号は、増幅された生成物（例は、ポリヌクレオチド分析対象）の存在または不存在を検出するために使用される。いくらかのケースでは、変化は第一および第二信号間で観察される。いくらかのケースでは、信号においての変化は増幅された生成物の存在を指し示す（例は、ポリヌクレオチド分析対象）。
【００３５】
いくらかのケースでは、信号においての変化は信号においての増加である（例は、フルオロフォアおよびクエンチャーが増幅された生成物に組み込まれるときの蛍光の増加したクエンチング）。いくらかのケースでは、信号においての変化は信号においての減少である（例は、蛍光強度においての低下）。いくらかのケースにおいて、信号においての増加は生成物または分析対象の存在を指し示す。いくらかのケースでは、信号においての減少は生成物または分析対象の存在を指し示す。いくらかのケースでは、信号においての変化の欠如（例は、蛍光強度の無有意な変化）は生成物または分析対象が存在しないことを指し示す。いくらかのケースにおいては、変性信号は、変性ステップの前、間または後のいずれかでも測定される。いくらかのケースにおいて、アニーリング信号は、アニーリングステップの前、間または後のいずれかで測定される。いくらかのケースでは、アニーリング信号は、伸長ステップの前、間または後のいずれかで測定される。いくらかのケースにおいて、変性信号は、増幅または重合反応が確実に、または正確に進行したかどうかを決定するためにここでの他のどこかに記載されるように、基準信号または基準信号範囲と比較される。いくらかのケースでは、変性信号が基準信号範囲から外れるとき、反応が失敗したことを指し示すことができる。いくらかのケースにおいて、変性信号が基準信号範囲内に入るとき、変性信号はアニーリング信号を標準化するために使用することができる。いくらかのケースにおいて、各サイクルからの変性信号は、アニーリング信号のサイクルごとの標準化のために使用することができる（例は、チョッパー安定化）。いくらかのケースにおいて、アニーリング信号においての変化は信号の相対定量と呼ばれる。いくらかのケースでは、信号はフルオロフォアおよびクエンチャーの対によって生成される信号に制限されるものではない。いくらかのケースにおいて、信号は異なる発色団によって生成されることができる。
【００３６】
いくらかのケースでは、信号においての変化は割合の変化によって規定することができる。いくらかのケースでは、信号においての変化は、およそ0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％またはそれらよりも多いことができる。いくらかのケースでは、信号においての変化は、0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％または1000％よりも大きいことができる。いくらかのケースでは、信号においての変化は、0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％または1000％よりも少ないことができる。いくらかのケースでは、信号においての変化はおよそ50％であることができる。
【００３７】
オリゴヌクレオチドの種々の組み合わせ（例は、プライマーおよび/またはプローブ）は、分析対象を検出するために使用することができる。いくらかのケースにおいて、プライマーはプローブまたは複数のプローブと共に使用される。いくらかのケースにおいて、複数のプライマーは複数のプローブと一緒に使用される。いくらかのケースにおいて、複数のプライマーは単一のプローブと共に使用される。いくらかのケースにおいて、プライマー対は分析対象を検出するために使用される。いくらかのケースにおいて、プライマー対はマルチプルな分析対象を検出するために使用される。いくらかのケースでは、マルチプルなプライマー対は分析対象を検出するために使用される。いくらかのケースでは、プライマーおよびプローブは分析対象を検出するために使用される。いくらかのケースでは、プライマーおよびプローブはマルチプルな分析対象を検出するために使用される。いくらかのケースにおいて、プライマーおよびプローブの組合せは分析対象を検出するために使用される。いくらかのケースにおいて、プライマーおよびプローブの組合せはマルチプルな分析対象を検出するために使用される。いくらかのケースにおいて、プローブは分析対象を検出するために使用される。いくらかのケースにおいて、プローブはマルチプルな分析対象を検出するために使用される。いくらかのケースにおいて、マルチプルなプローブは分析対象を検出するために使用される。
【００３８】
いくらかのケースでは、少なくとも一の発色団（例は、フルオロフォア、クエンチャー、インターカレーティングダイ）は、分析対象を検出するために使用される。いくらかのケースにおいて、発色団の対（例は、フルオロフォア/クエンチャーの対）は分析対象を検出するために使用される。いくらかのケースでは、単一の発色団の対は分析対象を検出するために使用される。いくらかのケースにおいては、単一の発色団の対はマルチプルな分析対象を検出するために使用される。いくらかのケースにおいて、マルチプルな発色団の対は分析対象を検出するために使用される。いくらかのケースにおいて、発色団の対には、第一発色団および第二発色団が含まれる。いくらかのケースにおいて、プライマー対においての各プライマーには、第一発色団（例は、フルオロフォア）または第二発色団（例は、クエンチャー）のいずれかでも含まれる。いくらかのケースにおいて、プライマー対においての各プライマーには、第一および第二の双方の発色団が含まれない。いくらかのケースにおいて、発色団の対は分析対象を検出するために使用されない。いくらかのケースにおいて、発色団は分析対象を検出するために使用されない。いくらかのケースにおいて、発色団はインターカレーティングダイである。いくらかのケースにおいては、インターカレーティングダイは分析対象を検出するために使用されない。いくらかのケースにおいて、第一発色団および第二発色団は同じである。いくらかのケースにおいては、第一発色団および第二発色団は同じフルオロフォアである。
【００３９】
いくらかのケースでは、複数のプライマーは検出方法において使用される。いくらかのケースにおいては、プライマーはオリゴヌクレオチド（例は、プローブ）または複数のオリゴヌクレオチド（例は、複数のプローブ）と共に使用される。いくらかのケースにおいて、プライマーはプローブまたは複数のプローブと共に使用される。いくらかのケースにおいて、複数のプライマーは複数のプローブと一緒に使用される。いくらかのケースにおいて、複数のプライマーは単一のプローブと共に使用される。いくらかのケースでは、使用されるプライマーの数は検出方法において使用されるプローブの数に等しい。いくらかのケースにおいて、プライマーはオリゴヌクレオチドに取り付けられない。
【００４０】
いくらかのケースでは、プローブは検出方法において使用されない。いくらかのケースでは、取り付けられる発色団を有するプローブは、検出方法において使用されない。いくらかのケースにおいては、取り付けられるフルオロフォアおよびクエンチャーの対を有するプローブ〔たとえば、セルフクエンチング（自己消光）プローブなどのようなもの〕は、検出方法において使用されない。いくらかのケースでは、プローブで、その5'端に取り付けられるフルオロフォアおよびその3'端に取り付けられるクエンチャーを有するものは、検出方法において使用されない。
【００４１】
いくらかのケースでは、本方法は第二方法と共に使用される。いくらかのケースにおいて、第二方法は、増幅または重合法、電気泳動（例は、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動）、質量分析法、クロマトグラフィー法またはアッセイ（例は、インビトロでの細胞ベースアッセイ）である。いくらかのケースにおいて、増幅または重合の方法は等温反応法またはポリメラーゼ連鎖反応法である。いくらかのケースでは、ポリメラーゼ連鎖反応プロセスは、マルチプレックス（多重）PCR、定量的PCR（qPCR）、エンドポイントPCRまたはデジタルPCR（例は、液滴デジタルPCR）プロセスである。いくらかのケースでは、ポリメラーゼ連鎖反応は液滴デジタルPCRである。いくらかのケースにおいて、第二方法は液滴デジタルPCR法である。いくらかのケースでは、第二方法は電気泳動法である（例は、DNA配列決定のためのゲル電気泳動法）。いくらかのケースでは、本方法は第二および第三方法と組み合わせて使用される。いくらかのケースでは、第三方法は、増幅または重合法、電気泳動（例は、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動）、質量分析法、クロマトグラフィー法またはアッセイ（例は、インビトロでの細胞ベースアッセイ）である。いくらかのケースでは、本方法は、第二または第三方法を伴わずに使用される。いくらかのケースでは、本方法は第二方法なしで使用される。いくらかのケースでは、本方法は電気泳動法なしで使用される。いくらかのケースでは、本方法は配列決定法なしで使用される。
【００４２】
A．強度-長さ関係からの分析対象の検出
【００４３】
ここで記載されるものは、サンプルにおいて一以上の分析対象の存在を検出する方法である。ここで提供される方法には、少なくとも二の発色団が互いに相互作用するとき、例は、信号強度においての変化の測定が含まれる。たとえば、フルオロフォアおよびクエンチャーの相互作用のケースでは、より一層多くのフルオロフォアがクエンチャーからのものであれば、特定の核酸分析対象の蛍光シグナチャーは典型的により一層明るくなる。分析対象の長さが小である限り、核酸分析対象の持続長は典型的に蛍光の強度を決定する。たとえば、与えられたフルオロフォア-クエンチャー対について、蛍光の強度は持続長と相関することができる。さらに、蛍光の強度は、フルオロフォアおよびクエンチャー間のエネルギー伝達を指示することが多い。このエネルギー移動の効率は次式で記述される。
【数１】
2016509480.tif 000002
（1）
式中、rはフルオロフォアおよびクエンチャー間の距離（図2）であり、およびR0は、各発色団の吸収スペクトルおよび発光スペクトルの一定のパラメータから算出することができるところの、各フルオロフォア/クエンチャー対に関連する定数である。〔Biophysical Chemistry（生物物理化学）、D. Freifelder（フライフェルダー）編、W.H. Freeman and Company（フリーマン・アンド・カンパニー）、San Francisco（サンフランシスコ）(1976)第426-28頁参照）。また、R0は以下の式によって記述される。
【数２】
2016509480.tif 000003
（2）
式中、Q0はアクセプターの不存在下でのドナーの蛍光量子収量であり、κ2は双極子配向因子（dipole orientation factor）であり、nは媒体の屈折率であり、NAはアボガドロ数であり、およびJはスペクトルの重なり積分である（図2）。
【００４４】
したがって、蛍光信号においての変化は典型的に合成されたストランド（鎖）の長さと共に変動する。いくらかのケースでは、蛍光信号においての減少は、合成された鎖の長さに反比例する。この関係を利用して、分析対象の存在はその長さに相関する信号に基づいて検出することができる。たとえば、DNAの長さに基づいて分子量ラダー（ladders）を連想させる蛍光信号ラダーのセットは、コントロールとして確立することができる。サンプルにおいては、同じフルオロフォア/クエンチャー対と共に取り付けられるプライマーのマルチプルな対が増幅される。増幅または重合プロセスが完了すると、観察された信号はコントロールと相関付けられることができ、それによって特定の分析対象の存在または不存在が検出される。いくらかのケースにおいては、特定の分析対象の存在または不存在は、それぞれの増幅または重合のサイクルの間に測定を行うこと、およびコントロールラダーと比較することにより、増幅または重合プロセスの全体にわたって監視することができる。いくらかのケースでは、ラダーには、複数の信号が含まれる。いくらかのケースでは、複数の信号はマルチプルな曲線を生成する。いくらかのケースでは、ラダーは複数の曲線で表される。いくらかのケースでは、ラダーには、エンドポイント蛍光のマルチプルなセットが含まれる。いくらかのケースでは、ラダーには、初期およびエンドポイント蛍光のマルチプルなセットが含まれる。いくらかのケースでは、ラダーの各ステップは複数の信号が含まれる。いくらかのケースでは、複数の信号は曲線を生成する。いくらかのケースでは、ラダーの各ステップは曲線で表される。いくらかのケースでは、ラダーの各ステップには、エンドポイント（終点）蛍光測定が含まれる。いくらかのケースでは、ラダーの各ステップには、初期およびエンドポイント蛍光測定値のセット（組）が含まれる。いくらかのケースでは、ラダーの各ステップは初期およびエンドポイント蛍光が含まれる。いくらかのケースでは、曲線はその長さに基づき分析対象のシグナチャープロファイルを表す。いくらかのケースでは、エンドポイント蛍光はその長さに基づき分析対象のシグナチャープロファイルを表す。いくらかのケースでは、初期およびエンドポイント蛍光のセットはその長さに基づき分析対象のシグナチャープロファイルを表す。いくらかのケースでは、初期およびエンドポイント蛍光はその長さに基づき分析対象のシグナチャープロファイルを表す。いくらかのケースでは、ラダーの各ステップはその長さに基づき分析対象のシグナチャープロファイルを生成する。いくらかのケースでは、ラダーには、分析対象のマルチプルなステップまたはマルチプルなシグナチャープロファイルが含まれる。いくらかのケースでは、ラダーには、分析対象の単一ステップまたは単一シグナチャープロファイルが含まれる。いくらかのケースでは、ラダーには、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500またはそれらよりも多くのステップが含まれる。いくらかのケースでは、ラダーには、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450または500よりも多くのステップが含まれる。いくらかのケースでは、ラダーには、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450または500よりも少ないステップしか含まれない。いくらかのケースでは、マルチプルな分析対象が単一のフルオロフォア/クエンチャー対によって検出される。いくらかのケースでは、単一分析対象は単一のフルオロフォア/クエンチャー対によって検出される。いくらかのケースでは、信号はフルオロフォアおよびクエンチャーの対によって生成される信号に制限されるものではない。いくらかのケースでは、信号は異なる発色団によって生成することができる。
【００４５】
B．遺伝的変動の検出
【００４６】
ここで開示するものは、たとえば、信号の変化で、例は、ここで記載の電子伝達機構においての混乱によるものに基づいて、遺伝的変動の存在または不存在を決定する方法である。遺伝的変動には、一以上のヌクレオチドの欠失および挿入、異なるヌクレオチド出現の転座（例は、たとえば、SNPs、または塩基対の置換のような、単一の点変異）、またはマルチプルなヌクレオチド反復の回数における変異が含まれる。たとえば、鋳型（例は、分析対象）における単一の欠失または改変（オルタレーション）（例は、SNP）の存在を検出するために、第一プライマーは欠失を含む領域にハイブリダイズするように設計される。第二プライマーには、第一プライマーからおよそ500bpより少なくしか離れてない分析対象の領域に相補的な配列が含まれる。増幅または重合の際に、信号においての変化が観察される。しかし、たとえば、遺伝的変動なしに分析対象について観察される信号においての変化と比較するとき、キンク（ねじれ）が生成物の鋳型において存在するので、信号の変化においての減少を非効率的な電子伝達がもたらす。
【００４７】
いくらかのケースでは、検出された遺伝的変動は分析対象においての異なるヌクレオチド出現である。いくらかのケースでは、異なるヌクレオチドの出現は一塩基多型（SNP）である。SNPは、ゲノムにおいての単一のヌクレオチド（例は、A、T、CまたはG）が変動したときに生じるDNA配列変異である。いくらかのケースにおいて、この変動は、いずれかの疾患の存在をもたらし、または疾患または疾患群の存在（またはそのためのマーカー）に関連付けられる。たとえば、ヘモグロビンをコードするβグロビン遺伝子におけるGAGからGTGへの単一ヌクレオチド変異は鎌状赤血球貧血の発生を招く。
【００４８】
大抵、各個体は独特なヒトDNAパターンを作り出す多くのSNPsをもつ。いくらかのケースでは、SNPはコモン（普通の）SNPまたはレア（稀な）SNPである。いくらかのケースにおいては、SNPはコモンSNPである。いくらかのケースにおいて、コモンSNPは、およそ1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％またはそれらより多くのマイナー対立遺伝子頻度をもつ。いくらかのケースにおいて、コモンSNPは、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％または20％を超えるマイナー対立遺伝子頻度をもつ。いくらかのケースにおいて、コモンSNPは、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％または20％よりも少ないマイナー対立遺伝子頻度をもつ。いくらかのケースでは、SNPはレアSNPである。いくらかのケースでは、レアSNPは、およそ1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％またはそれよりも多くのマイナー対立遺伝子頻度をもつ。いくらかのケースにおいては、レアSNPは、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％または20％よりも多くのマイナー対立遺伝子頻度をもつ。いくらかのケースでは、レアSNPは、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％または20％よりも少ないマイナー対立遺伝子頻度しかもたない。
【００４９】
いくらかのケースにおいては、ここで提供されるものは、SNPの存在を検出するための方法である。いくらかのケースにおいて、ここで記載される方法はコモンSNPの存在を検出するために使用される。いくらかのケースにおいて、ここで記載される方法はレアSNPの存在を検出するために使用される。いくらかのケースでは、ここで記載される方法は、コモンおよびレアSNPsの組合せの存在を検出するために使用される。
【００５０】
いくらかのケースでは、ここで記載される方法はサンプルにおいてのSNPの存在を検出するために使用される。いくらかのケースでは、ここで記載される方法はサンプルにおいてマルチプルなSNPsを検出するために使用される。いくらかのケースにおいては、ここで記載される方法は、サンプルにおいてマルチプルなコモンSNPsを検出するために使用される。いくらかのケースにおいて、ここで記載される方法はサンプルにおいてマルチプルなレアSNPsを検出するために使用される。いくらかのケースでは、ここで記載される方法はサンプルにおいてコモンおよびレアSNPsの組合せを検出するために使用される。いくらかのケースでは、ここで記載される方法はサンプルにおいて単一のSNPを検出するために使用される。いくらかのケースでは、ここで記載される方法はサンプルにおいて単一のコモンSNPを検出するために使用される。いくらかのケースでは、ここで記載される方法はサンプルにおいて単一のレアSNPを検出するために使用される。
【００５１】
いくらかのケースでは、複数のSNPsは単一の発色団ペア（対）（例は、フルオロフォア/クエンチャー対）を使用してサンプルにおいて検出される。いくらかのケースでは、複数のSNPsは、特定のSNPを含む各分析対象の長さに部分的に基づいて検出することができる。いくらかのケースにおいて、ここで記載のように、既知の長さのSNP分析対象（少なくとも一のSNPを含む分析対象）が含まれる蛍光ラダーのセットが生成される。いくらかのケースにおいて、蛍光ラダーのセットはコントロールとして使用される。いくらかのケースにおいて、特定のSNPの分析対象の存在または不存在は、増幅または重合反応の間に測定を行うこと、およびコントロールラダーと比較することによって決定することができる。いくらかのケースでは、特定のSNP分析対象の存在または不存在は、それぞれの増幅または重合のサイクルの間に測定を行うこと、およびコントロールラダーと比較することにより、増幅または重合プロセスの全体にわたってモニタリング（監視）することができる。いくらかのケースでは、複数のSNPsはサンプルにおいて相対的定量法を用いて検出される。
【００５２】
いくらかのケースでは、SNPsの存在は疾患の発症と直接相関します。いくらかのケースでは、SNPsの存在は疾患を発症する可能性を増大させる。いくらかのケースでは、疾患には、遺伝性疾患、自己免疫疾患、神経疾患、循環器疾患およびガンが含まれる。
【００５３】
C．増幅および重合反応のモニタリング
【００５４】
ここで開示するものは、反応をモニタリングするために発色団のセットによって生成される信号においての変化を検出するための方法である。いくらかのケースにおいて、ここで記載される方法は、PCR反応の進行をモニタリングするために使用することができる。たとえば、サイクル1では、蛍光シグナルのセットが測定され、変性ステップでは一つの測定が、およびアニールステップでは一つの測定がある。サイクル2の間、蛍光信号の第二セットは変性およびアニーリングステップで測定される。二のアニーリングステップにて取られる信号の間の蛍光においての変化は、PCR反応の発生を指し示すが、その一方、変性ステップの間に取られた信号は双方が、コントロールおよび正規化パラメータとして使用される。
【００５５】
いくらかのケースにおいては、アニーリングステップから測定される信号は、反応の進行をモニターするために使用される。いくらかのケースでは、二のアニーリングステップからの信号においての変化が測定される。信号においての変化は、例は、信号においての増加または信号においての減少であることができる。いくらかのケースでは、信号においての変化は変化率によって規定される。いくらかのケースでは、信号においての変化は、およそ0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％またはそれらより多くであることができる。いくらかのケースでは、信号においての変化は、0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％または1000％よりも大きくすることができる。いくらかのケースでは、信号においての変化は、0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％または1000％よりも少ないことができる。いくらかのケースでは、信号は、アニーリングステップの前、間または後に測定される。
【００５６】
いくらかのケースにおいては、伸長ステップからの測定される信号は反応の進行をモニターするために使用される。いくらかのケースでは、二の伸長ステップからの信号においての変化が測定される。信号においての変化は、例は、信号においての増加または信号においての減少であることができる。いくらかのケースでは、信号においての変化は変化率により規定される。いくらかのケースにおいては、信号においての変化は、およそ0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％またはそれよりも多くであることができる。いくらかのケースでは、信号においての変化は、0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％または1000％よりも大きくすることができる。いくらかのケースでは、信号においての変化は、0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％または1000％よりも少ないことができる。いくらかのケースでは、信号は、伸長ステップの前、間または後に測定される。
【００５７】
いくらかのケースでは、変性ステップからの測定された信号は反応の進行をモニタリングするために使用される。いくらかのケースにおいて、変性の信号は、基準信号または基準信号範囲と比較される。ここでは他で説明するように変性信号が基準信号の範囲外であるとき、変性信号は反応が失敗したことを指し示すことができる。いくらかのケースにおいて、変性信号が基準信号の範囲内にあるとき、変性信号は反応が成功したことを指し示すことができる。いくらかのケースでは、変性信号は各増幅または重合のサイクルのためのコントロールとして役立つ。いくらかのケースにおいては、変性信号は増幅または重合の実験の間に標準化のために使用される。ここでは他で説明するように、変性信号が基準信号範囲内にあるとき、それぞれの増幅または重合サイクルからの変性信号はそのサイクルからのアニーリング信号を標準化するために使用することができる。いくらかのケースにおいて、変性シグナルは反応のサイクル毎の自己標準化（self-normalization）のために使用される。いくらかのケースでは、信号は変性ステップの前、間または後に測定される。
【００５８】
いくらかのケースでは、マルチプルな反応が監視される。いくらかのケースでは、単一のサンプルからマルチプルな反応が監視される。いくらかのケースでは、マルチプルなサンプルからのマルチプルな反応が監視される。いくらかのケースでは、単一の反応が監視される。いくらかのケースでは、単一試料からの単一の反応が監視される。いくらかのケースにおいて、反応は遺伝的変動の存在を検出するために使用される。いくらかのケースでは、遺伝的変動の存在を検出するための反応が監視される。いくらかのケースにおいて、反応はSNPの存在を検出するために使用される。いくらかのケースにおいて、SNPの存在を検出するための反応が監視される。いくらかのケースでは、マルチプルなオリゴヌクレオチド（例は、プライマーおよび/またはプローブ）が使用される。いくらかのケースでは、マルチプルなプライマーが使用される。いくらかのケースにおいて、マルチプルなプローブが使用される。いくらかのケースにおいて、プライマーの数はプローブの数に等しい。
【００５９】
D．形態学的変化の検出
【００６０】
ここで開示するものは、信号においての変化に基づく分析対象においての形態学的変化を検出またはモニタリングするための方法である。いくらかの場合において、分析対象は、タンパク質、ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物（糖質）または抗体である。いくらかの場合において、分析対象はポリヌクレオチドである。いくらかの場合において、ポリヌクレオチドはDNAまたはRNAである。いくらかの場合において、DNAおよびRNAは、たとえば、ヘアピン、テトラループ（tetraloop）またはシュードノットなどのような異なる構造を採用することができる。たとえば、ヘアピンを含むDNAの異なる形態学的状態を検出するために、フルオロフォア/クエンチャー対をそれぞれのヘアピンのステムに取り付けることができる。フルオロフォアがクエンチャーにごく接近しているので、信号が観察されないことがある。温度が上昇すると、DNAヘアピンは巻き戻し、および蛍光信号を観察することができる。いくらかの場合では、DNAを巻き戻すようにマルチプルな信号が測定される。いくらかのケースでは、DNAを巻き戻すように唯一の初期およびエンドポイントの信号だけが測定される。いくらかのケースでは、マルチプルな信号は曲線を生成することができる。いくらかのケースでは、マルチプルな信号はヘアピンを含むDNAのシグナチャープロファイルを生成するために使用される。いくらかの場合において、シグナチャープロファイルは曲線である。いくらかのケースでは、初期およびエンドポイントの信号はシグナチャープロファイルを生成するために使用される。いくらかのケースでは、DNAの変性研究から得られるシグナチャープロファイルは、標的DNAにおいてヘアピンの存在を検出するためにコントロールとして使用される。いくらかの場合において、ここで記載される方法は、DNAまたはRNA内で付加、欠失、置換または塩基修飾の導入後にDNAまたはRNAコンフォメーション（立体配座）の安定性（例は、不自然塩基）を監視するために使用される。いくらかの場合において、安定性は外的要因に影響される。いくらかのケースにおいては、外的要因には、pH、有機または無機薬剤〔例は、塩、インターカレーティングダイ（挿入色素）〕、または追加の分析対象が含まれる。いくらかのケースでは、追加の分析対象は、DNA、RNA、タンパク質または抗体である。いくらかの場合において、ここで記載される方法は、外的要因の導入後に、DNAまたはRNA立体配座の安定性を監視するために使用される。
【００６１】
いくらかのケースにおいて、ここで記載される方法はタンパク質の形態学的変化を監視するために使用される。たとえば、自然の状態で存するタンパク質は折り畳まれたタンパク質、部分的に折り畳まれたタンパク質または無秩序なタンパク質であることができる。フォールディング（折り畳み構造）またはアンフォールディング（折り畳み構造がほどけること）は、結合パートナー、有機または無機の薬剤、pH、および温度の存在のために発生する。折り畳まれたタンパク質について、温度の上昇はタンパク質がアンフォールディング状態を受けるよう誘導する。タンパク質を複数のフルオロフォアおよび/またはクエンチャーに取り付けることによって、蛍光信号は各イテラティブ（繰り返し）温度上昇と共に測定することができ、およびその自然状態で取られる信号と比較することができる。いくらかのケースでは、マルチプルな信号はタンパク質アンフォールドとして測定される。いくらかのケースでは、唯一の初期およびエンドポイントの信号だけがタンパク質アンフォールドとして測定される。いくらかのケースでは、マルチプルな信号は曲線を生成することができる。いくらかのケースでは、マルチプルな信号はタンパク質のシグナチャープロファイルを生成するために使用される。いくらかの場合において、シグナチャープロファイルは曲線である。いくらかのケースでは、初期およびエンドポイントの信号はシグナチャープロファイルを生成するために使用される。いくらかの場合において、タンパク質のアンフォールディングの研究から得られるシグナチャープロファイルは類似のフォールドを含むタンパク質の形態を検出するためにコントロールとして使用される。いくらかの場合において、ここで記載される方法はタンパク質の安定性を監視するために使用されます。いくらかの場合において、タンパク質のアンフォールディングは外的因子の添加により誘導されることができる。いくらかのケースでは、外的要因には、pH、有機または無機の薬剤（例は、塩、インタカレーティングダイ）または追加の分析対象が含まれる。いくらかのケースでは、追加の分析対象はDNA、RNA、タンパク質または抗体である。
【００６２】
いくらかの場合において、ここで記載される方法は、たとえば、タンパク質-タンパク質、タンパク質-抗体またはタンパク質-ポリヌクレオチド（例は、タンパク質-DNAまたはタンパク質-RNA）相互作用などのような分析対象-分析対象の相互作用の形態を監視するために使用される。たとえば、タンパク質-DNA相互作用の間、タンパク質はDNAの結合の際に異なる立体配置を採用することができる。いくらかの場合において、結合に関係する信号においての変化は、タンパク質と、そのアポ状態または非結合状態で比較するために使用することができる。いくらかのケースでは、マルチプルな信号はタンパク質-DNA複合体の形態として測定される。いくらかのケースでは、唯一の初期およびエンドポイントの信号だけは複合体形態として測定される。いくらかのケースでは、マルチプルな信号は曲線を生成することができる。いくらかのケースでは、マルチプルな信号はタンパク質のシグナチャープロファイルを生成するために使用される。いくらかの場合において、シグナチャープロファイルは曲線である。いくらかのケースでは、初期およびエンドポイント信号は、シグナチャープロファイルを生成するために使用される。いくらかの場合において、タンパク質-DNA研究から得られるシグナチャープロファイルは追加のDNAsとのタンパク質複合体の形成を検出するためにコントロールとして使用される。いくらかの場合において、ここで記載される方法は、別の外的要因を伴ってタンパク質複合体の安定性を監視することができる。いくらかの場合において、ここで記載される方法はマルチプルな結合パートナーを伴う分析対象の形態学的変化を監視するために使用することができる。
【００６３】
III．マルチプレックス検出
【００６４】
ここで開示されものは、複数の分析対象の存在を、これらの分析対象の存在または不存在を指し示すために複数の発色団を用いて定める例である。たとえば、マルチプレックス検出法は、縮退を回避し、および発生の任意の組み合わせにおいて曖昧さを残さずに復号することができるユニークなコードの無限数を確実にするために、色、信号、および/または数学的戦略の使用を組み合わせることができる。たとえば、四つの分析対象を含むサンプルの検出において、各分析対象は、フルオロフォア（青、緑、黄または赤）、および分析対象特異的オリゴヌクレオチドに取り付けられるクエンチャー（例は、フォワードPCRプライマーおよびリバースPCRプライマー）を割り当てることができる。増幅または重合の際、分析対象の存在または不存在はその特定の色においての信号の存在または不存在に基づいて定められる。
【００６５】
いくらかのケースでは、マルチプルなカラーコードは複数の発色団を使用して生成される。いくらかのケースでは、マルチプルなカラーコードは複数のフルオロフォアおよびクエンチャーを使用して生成される。いくらかのケースでは、マルチプルなカラーコードはフルオロフォア/クエンチャー対の組合せを使用して生成される。いくらかのケースでは、マルチプルな発色団はマルチプルな分析対象に割り当てられる。いくらかのケースでは、単一の発色団はマルチプルな分析対象に割り当てられる。いくらかのケースでは、単一の発色団は一つの分析対象に割り当てられる。
【００６６】
いくらかのケースでは、一の色コードまたは発色団の組合せは一の分析対象に割り当てられる。いくらかのケースでは、一の色コードまたは発色団の組合せはマルチプルな分析対象（例は、単一の検出反応において様々な長さのマルチプルな分析対象を識別するために）に割り当てられる。いくらかのケースでは、一の色コードまたは発色団の組合せは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、100、500、1000、5000、10000、100000の分析対象に割り当てられる。いくらかのケースでは、マルチプルなカラーコードまたは発色団の組合せは一以上の分析対象に割り当てられる。いくらかのケースでは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、100、500、1000、5000、10000、100000のカラーコードまたは発色団の組合せは、一以上の分析対象（例は、1、5、10、100、500、10000分析対象）に割り当てられる。いくらかのケースでは、最大で1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、100、500、1000、5000、10000、100000のカラーコードまたは発色団の組合せは、一以上の分析対象（例は、1、5、10、100、500、10000の分析対象）に割り当てられる。
【００６７】
いくらかのケースでは、一の色がコントロールとして割り当てられる。いくらかのケースでは、コントロールはポジティブコントロールまたはネガティブコントロールである。
【００６８】
A．遺伝的変動についてのマルチプレックス検出
【００６９】
いくらかの場合において、ここで開示される方法は、マルチプルな遺伝子変動（例は、SNPs）の存在を検出するために使用することができる。いくらかの場合において、分析対象には、複数の遺伝的変動が含まれる。いくらかの場合においては、分析対象には、一の遺伝的変動が含まれる。いくらかの場合では、一の色は一の遺伝的変動に割り当てられる。いくらかのケースでは、サンプルには、複数の遺伝的変動が含まれ、そこでは、カラーコードまたは発色団の組合せは各遺伝的変動に割り当てられる。いくらかのケースでは、サンプルには、一の遺伝的変動が含まれる。
【００７０】
B．SNPについてのマルチプレックス検出
【００７１】
いくらかのケースでは、ここで開示されるものは、分析対象においてSNPの存在または不存在を検出する方法である。いくらかの場合において、分析対象には、複数のSNPが含まれる。いくらかの場合において、分析対象には、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500またはそれらよりも多くのSNPsが含まれる。いくらかの場合において、分析対象には、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、または500のSNPsが含まれる。いくらかのケースにおいて、分析対象には、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、または500を超えないSNPが含まれる。いくらかの場合において、分析対象には、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500またはそれらよりも多くのコモンSNPsが含まれる。いくらかの場合においては、分析対象には、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、または500のコモンSNPsが含まれる。いくらかのケースでは、分析対象には、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、または500を超えないコモンSNPsが含まれる。いくらかの場合において、分析対象には、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500またはそれらよりも多くのレアSNPsが含まれる。いくらかの場合において、分析対象には、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、または500のレアSNPsが含まれる。いくらかのケースでは、分析対象には、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、または500を超えないレアSNPsが含まれる。
【００７２】
いくらかのケースでは、サンプルには、複数の分析対象が含まれる。いくらかのケースでは、マルチプルなSNPsはサンプルにおいて複数の分析対象から検出される。いくらかのケースでは、マルチプルなコモンSNPsはサンプルにおいて複数の分析対象から検出される。いくらかのケースでは、マルチプルなレアSNPsはサンプルにおいて複数の分析対象から検出される。いくらかのケースにおいて、マルチプルなSNPsはサンプルにおいて分析対象から検出される。いくらかのケースでは、マルチプルなコモンSNPsはサンプルにおいて分析対象から検出される。いくらかのケースでは、マルチプルなレアSNPsはサンプルにおいて分析対象から検出される。いくらかのケースでは、一のSNPはサンプルにおいて分析対象から検出される。いくらかのケースでは、一のコモンSNPはサンプルにおいて分析対象から検出される。いくらかのケースでは、一のレアSNPはサンプルにおいて分析対象から検出される。いくらかのケースでは、一のSNPはサンプルにおいて検出される。いくらかのケースでは、一のコモンSNPはサンプルにおいて検出される。いくらかのケースにおいて、一のレアSNPはサンプルにおいて検出される。
【００７３】
いくらかの場合において、サンプルには、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、5000、10,000、50,000、100,000またはそれらよりも多くのSNPsが含まれる。いくらかの場合において、サンプルには、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、5000、10,000、50,000、100,000またはそれらよりも多くのSNPsが含まれる。いくらかのケースでは、サンプルには、せいぜい1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、5000、10,000、50,000、100,000を超えないか、またはそれらよりも多くのSNPsが含まれる。いくらかのケースでは、サンプルには、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、5000、10,000、50,000、100,000またはそれらよりも多くのコモンSNPsが含まれる。いくらかの場合において、サンプルには、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、5000、10,000、50,000、100,000またはそれらよりも多くのコモンSNPsが含まれる。いくらかのケースでは、サンプルには、せいぜい1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、5000、10,000、50,000、100,000を超えないか、またはそれらよりも多くのコモンSNPsが含まれる。いくらかのケースでは、サンプルには、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、5000、10,000、50,000、100,000またはそれらよりも多くのレアSNPsが含まれる。いくらかの���合において、サンプルには、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、5000、10,000、50,000、100,000またはそれらよりも多くのレアSNPsが含まれる。いくらかのケースでは、サンプルには、せいぜい1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、5000、10,000、50,000、100,000を超えないか、またはそれらよりも多くのレアSNPsが含まれる。
【００７４】
いくらかの場合において、ここで記載される方法には、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、5000、10,000、50,000、100,000またはそれらよりも多くのSNPsを検出することが含まれる。いくらかの場合において、ここで記載される方法には、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、5000、10,000、50,000、100,000またはそれらよりも多くのSNPsを検出することが含まれる。いくらかの場合において、ここで記載される方法には、せいぜい1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、5000、10,000、50,000、100,000を超えないか、またはそれらよりも多くのSNPsを検出することが含まれる。いくらかの場合において、ここで記載される方法には、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、5000、10,000、50,000、100,000またはそれらよりも多くのコモンSNPsを検出することが含まれる。いくらかの場合において、ここで記載される方法には、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、5000、10,000、50,000、100,000またはそれらよりも多くのコモンSNPsを検出することが含まれる。いくらかの場合において、ここで記載される方法には、せいぜい1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、5000、10,000、50,000、100,000を超えないか、またはそれらよりも多くのコモンSNPsを検出することが含まれる。いくらかの場合において、ここで記載される方法には、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、5000、10,000、50,000、100,000またはそれらよりも多くのレアSNPsを検出することが含まれる。いくらかの場合において、ここで記載される方法には、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、5000、10,000、50,000、100,000またはそれらよりも多くのレアSNPsを検出することが含まれる。いくらかの場合において、ここで記載される方法には、せいぜい1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、5000、10,000、50,000、100,000を超えないか、またはそれらよりも多くのレアSNPsを検出することが含まれる。
【００７５】
いくらかのケースでは、検出の方法は増幅または重合法を利用する。いくらかの場合において、増幅または重合法（またはプロセス）には、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法、等温反応法が含まれる。いくらかの場合において、PCR反応プロセスには、マルチプレックスPCR、リアルタイムPCR、定量的PCRおよびデジタルPCR（例は、液滴デジタルPCR）プロセスが含まれる。いくらかのケースでは、検出の方法は定量的PCR法を利用する。いくらかのケースでは、定量的PCR法は第二の方法と組み合わせて使用される。いくらかの場合において、第二の方法はデジタルPCR法である。いくらかの場合において、第二の方法は液滴デジタルPCR法である。
【００７６】
いくらかのケースでは、シグナチャープロファイルはSNPの存在を検出するために使用される。いくらかのケースでは、シグナチャープロファイルはヌクレオチド変異を正確に示すために使用される。いくらかのケースでは、シグナチャープロファイルは各ヌクレオチドミスマッチ、UU、UT、UG、UC、UA、AA、TT、GG、CC、AG、AC、TC、TCについてユニークで、および野生型とは異なる。いくらかの場合において、ヌクレオチドミスマッチのシグナチャープロファイルは野生型のものと比較される。いくらかの場合には、SNPのシグナチャープロファイルは野生型のものと比較される。いくらかの場合には、SNPの蛍光信号は野生型の蛍光信号と比較される。いくらかのケースでは蛍光信号においての変化はSNPの信号および野生型間で検出される。いくらかのケースでは、信号においての変化はパーセントとして算出することができる。いくらかのケースでは、信号変化の割合は、0.01、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または100％である。いくらかのケースでは、信号変化の割合は、およそ0.01、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または100％である。いくらかのケースでは、信号においての変化は、AGミスマッチの蛍光信号および野生型間で検出される。いくらかのケースでは、信号においての変化は割合として算出される。いくらかのケースでは、信号変化の割合は、0.01、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または100％である。いくらかのケースでは、信号変化の割合は、約0.01、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または100％である。いくらかのケースでは、信号においての変化はACミスマッチの蛍光信号および野生型間で検出される。いくらかのケースでは、信号においての変化は割合として算出される。いくらかのケースでは、信号変化の割合は、0.01、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または100％である。いくらかのケースでは、信号変化の割合は、およそ0.01、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または100％である。いくらかのケースでは、信号においての変化は、TGミスマッチの蛍光信号および野生型間で検出���れる。いくらかのケースでは、信号においての変化は割合として計算される。いくらかのケースでは、信号変化の割合は、0.01、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または100％である。いくらかのケースでは、信号変化の割合は、およそ0.01、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または100％である。いくらかのケースでは、信号においての変化はTCミスマッチの蛍光信号および野生型間で検出される。いくらかのケースでは、信号においての変化は割合として計算される。いくらかのケースでは、信号変化の割合は、0.01、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または100％である。いくらかのケースでは、信号変化の割合は、およそ0.01、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または100％である。
【００７７】
いくらかのケースでは、一対のプライマーはSNPを検出するために利用される。いくらかの場合において、第一プライマーには、SNPをコードする配列が含まれる。いくらかの場合において、第一プライマーはSNPをコードする分析対象の領域にハイブリダイズする。いくらかの場合において、第二プライマーには、SNPをコードしない配列が含まれる。いくらかの場合において、第二プライマーには、SNPをコードしない分析対象の領域に相補的な配列が含まれる。いくらかの場合において、第一プライマーは、第二プライマーによってコードされる分析対象の領域から500塩基対より大きく離れて分析対象上の領域をコードする。いくらかの場合において、第一プライマーは、第二プライマーによってコードされる領域から500塩基対未満離れて分析対象上の領域をコードする。いくらかの場合において、第一プライマーは、第二プライマーによってコードされる領域から490、480、470、460、450、440、430、420、410、400、390、380、370、360、350、340、330、320、310、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、195、190、185、180、175、170、165、160、155、150、145、140、135、130、125、120、115、110、105、100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20塩基対離れて分析対象上の領域をコードする。いくらかの場合において、第一プライマーは、第二プライマーによってコードされる領域から490、480、470、460、450、440、430、420、410、400、390、380、370、360、350、340、330、320、310、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、195、190、185、180、175、170、165、160、155、150、145、140、135、130、125、120、115、110、105、100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20塩基対を超えないで離れて分析対象上の領域をコードする。いくらかの場合において、第一プライマーは、第二プライマーによってコードされる領域からおよそ490、480、470、460、450、440、430、420、410、400、390、380、370、360、350、340、330、320、310、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、195、190、185、180、175、170、165、160、155、150、145、140、135、130、125、120、115、110、105、100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20塩基対離れて分析対象上の領域をコードする。
【００７８】
IV．分析対象
【００７９】
分析対象は、本開示の方法および組成物を用いて分析することができる任意の適切な分析対象であってもよく、そこでは、分析対象は、測定可能な信号を生成するために、試薬（例は、オリゴヌクレオチドで、たとえば、発色団に取り付けられるプライマーまたはプローブのようなもの）と相互作用することが可能である。分析対象は自然発生または合成であってもよい。分析対象はこの技術で知られる任意の方法を用いて得られるサンプルにおいて存在することができる。いくらかの場合において、サンプルは分析対象のためにそれを分析する前に処理することができる。この開示で提示される方法および組成物は、粒子（たとえば、ビーズなどのようなもの）または固形支持体を必要とせずに、液相アッセイにおいて用いることができる。
【００８０】
いくらかのケースでは、分析対象は、ポリヌクレオチドで、たとえば、DNA、RNA、ペプチド核酸、およびそれらの任意のハイブリッドのようなものであってもよく、そこでは、ポリヌクレオチドには、デオキシリボおよび/またはリボヌクレオチドの任意の組み合わせが含まれる。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖でよく、または双方が二本鎖または一本鎖配列の部分を含んでいてもよい。ポリヌクレオチドは、たとえば、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンおよびそれらの任意のヌクレオチド誘導体を含めて、ヌクレオチドまたは塩基のいずれかの組合せを含むことができる。ここで使用するように、用語「ヌクレオチド」には、ヌクレオチドおよびヌクレオシド、ならびにヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体、および修飾されたヌクレオチドが含まれてよく、双方には合成および自然に発生する種が含まれる。ポリヌクレオチドは任意の適切なポリヌクレオチドでありえ、ここで記載されるように、一またはそれよりも多くの試薬のために生成することができ、それには、制限されないが、cDNA、ミトコンドリアDNA（mtDNA）、メッセンジャーRNA（mRNA）、リボソームRNA（rRNA）、トランスファーRNA（tRNA）、核RNA（nRNA）、低分子干渉RNA（siRNA）、核内低分子RNA（snRNA）、核小体低分子RNA（snoRNA）、小カハール体特異的（small Cajal body-specific）RNA（scaRNA）、マイクロRNA（miRNA）、二本鎖RNA（dsRNA）、リボザイム、リボスイッチまたはウイルスRNAが含まれる。ポリヌクレオチドは、任意の適切なベクターで、たとえば、プラスミド、コスミド、フラグメント、染色体、またはゲノムなどのようなものの内に含まれてもよい。いくらかの場合において、分析対象はポリヌクレオチド分析対象と称される。いくらかの場合において、分析対象は核酸分析対象と称される。いくらかの場合において、分析対象は核酸ターゲット（核酸標的）と称される。
【００８１】
ゲノムDNAは、自然に発生するか、または遺伝的に修飾された有機体から、または人工的または合成的に作り出したゲノムから得ることができる。ゲノムDNAを含む分析対象は任意のソース（供給源）から、この技術において知られる任意の方法を使用して得ることができる。たとえば、ゲノムDNAは、増幅または重合を伴うか、または伴わずに分離することができる。増幅または重合には、PCR増幅、マルチプルな置換増幅（MDA）、ローリングサークル増幅、および他の増幅または重合方法が含まれることができる。ゲノムDNAはまた、クローニングまたは組換え法で、たとえば、プラスミドおよび人工染色体または他の慣習的な方法を包含するもののようなものによって得ることができる〔Sambrook（サムブルック）およびRussell（ラッセル）、Molecular Cloning: A Laboratory Manual.（分子クローニング：ラボラトリーマニュアル）、前掲参照〕。ポリヌクレオチドはこの技術において知られる他の方法を用いて分離しえ、たとえば、Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV)〔ゲノム解析：ラボラトリーマニュアルシリーズ（第I-IV巻）〕またはMolecular Cloning: A Laboratory Manual.（モレキュラークローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル）に開示されているようなものである。分離されたポリヌクレオチドがmRNAである場合、SambrookおよびRussellのMolecular Cloning: A Laboratory Manual.前掲において説明されるように、それは慣習的な技術を用いてcDNA中に逆転写することができる。
【００８２】
分析対象はタンパク質、ポリペプチド、脂質、糖質、糖、小分子、またはここで提供される方法および組成物により検出することができる任意の他の適切な分子でありうる。分析対象は酵素または他のタンパク質であることができる。分析対象は薬物または代謝物であってよい〔例は、抗ガン薬、化学療法薬、抗ウイルス薬、抗菌性薬（antibiotic drug）、またはバイオロジック（生物製剤）。分析対象は、任意の分子で、たとえば、補因子、受容体、受容体リガンド、ホルモン、サイトカイン、血液因子、抗原、ステロイド、または抗体などのようなものでよい。
【００８３】
分析対象は、任意の病原体で、たとえば、ウイルス、細菌、寄生体、真菌、古細菌またはプリオン（例は、PrPSc）などのようなものからの任意の分子でありうる。模範的なウイルスには、ファミリーのアデノウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、オルトミクソウイルス科、パポバウイルス科、パラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、ポリオーマウイルス、レトロウイルス科、ラブドウイルス科、およびトガウイルス科からのものが含まれる。ウイルスの特定の例には、アデノウイルス、アストロウイルス、ボカウイルス、BKウイルス、コクサッキーウイルス、サイトメガロウイルス、デング（熱）ウイルス、エボラウイルス、エンテロウイルス、エプスタイン-バーウイルス、ネコ白血病ウイルス、肝炎ウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（HSV）、HSV 1型、HSV 2型、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、HIV 1型、HIV 2型、ヒトパピローマウイルス（HPV）、HPV 1型、HPV 2型、HPV 3型、HPV 4型、HPV 6型、HPV 10型、HPV 11型、HPV 16型、HPV 18型、HPV 26型、HPV 27型、HPV 28型、HPV 29型、HPV 30型、HPV 31型、HPV 33型、HPV 34型、HPV 35型、HPV 39型、HPV 40型、HPV 41型、HPV 42型、HPV 43型、HPV 44型、HPV 45型、HPV 49型、HPV 51型、HPV 52型、HPV 54型、HPV 55型、HPV 56型、HPV 57型、HPV 58型、HPV 59型、HPV 68型、HPV 69型、インフルエンザA型ウイルス、インフルエンザB型ウイルス、JC型ウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、メタニューモウイルス、ムンプスウイルス、ノーウォークウイルス、パロウイルス（parovirus）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、A型およびB型を含む呼吸器合胞体ウイルス、レトロウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、およびヒトパラインフルエンザウイルス3型が含まれる。
【００８４】
模範的な細菌には、属のボルデテラ、ボレリア、ブルセラ、カンピロバクター、クラミジア、クロストリジウム、コリネバクテリウム、エンテロコッカス（腸球菌）、エシェリキア（大腸菌）、フランシセラ、ヘモフィルス、ヘリコバクター、レジオネラ、レプトスピラ、リステリア、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、ナイセリア、シュードモナス、リケッチア、サルモネラ、シゲラ（赤痢菌）、スタフィロコッカス（ブドウ球菌）、ストレプトコッカス（連鎖球菌）、トレポネーマ、ビブリオ、およびエルシニアからのものが含まれる。細菌の具体例には、Bordetella par apertussis（ボルデテラ・パラパーツシス）、Bordetella pertussis（ボルデテラ・パーツシス、百日咳菌）、Borrelia burgdorferi（ボレリア・ブルグドルフェリ、ライム病ボレリア）、Brucella abortus（ブルセラ・アボルタス、ウシ流産菌）、Brucella canis（ブルセラ・カニス、イヌ流産菌）、Brucella melitensis（ブルセラ・メリテンシス、ヤギ流産菌）、Brucella suis（ブルセラ・スイス、ブタ流産菌）、Campylobacter jejuni（カンピロバクター・ジェジュニ）、Chlamydia pneumoniae（クラミジア・ニューモニエ、肺炎クラミジア）、Chlamydia psittaci（クラミジア・シタッシ、オウム病クラミジア）、Chlamydia trachomatix（クラミジア・トラコマチックス、トラコーマ病原体）、Clostridium botulinum（クロストリジウム・ボツリヌム、ボツリヌス菌）、Clostridium difficile（クロストリジウム・ディフィシル）、Clostridium perfringens（クロストリジウム・パーフリンジェンス、ウェルシュ菌）、Clostridium tetani（クロストリジウム・テタニ、破傷風菌）、Corynebacterium diphtheriae（コリネバクテリウム・ジフテリエ、ジフテリア菌）、Enterococcus faecalis（エンテロコッカス・フェカリス）、Enterococcus faecium（エンテロコッカス・フェシウム）、Escherichia coli（エシェリキア・コリ、大腸菌）、Francisella tularensis（フランシセラ・ツラレンシス、野兎病菌）、Haemophilus influenzae（ヘモフィルス・インフルエンザエ、インフルエンザ菌）、Helicobacter pylori（ヘリコバクター・ピロリ）、Legionella pneumophila（レジオネラ・ニューモフィラ）、Leptospira interrogans（レプトスピラ・インターロガンス）、Listeria monocytogenes（リステリア・モノサイトゲネス、リステリア菌）、Mycobacterium leprae（マイコバクテリウム・レプレ、らい菌）、Mycobacterium tuberculosis（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、結核菌）、Mycobacterium ulcerans（マイコバクテリウム・ウルセランス）、Mycoplasma pneumoniae（マイコプラズマ・ニューモニエ、肺炎マイコプラズマ）、Neisseria gonorrhoeae（ナイセリア・ゴノレー、淋菌）、Neisseria meningitidis（ナイセリア・メニンギティディス、髄膜炎菌）、Pseudomonas aeruginosa（シュードモナス・エルジノーサ、緑膿菌）、Rickettsia rickettsii（リケッチア・リケッチイ）、Salmonella choleraesuis（サルモネラ・コレレスイス、豚コレラ菌）、Salmonella dublin（サルモネラ・ダブリン）、Salmonella enteritidis（サルモネラ・エンテリティディス、腸炎菌）、Salmonella typhi（サルモネラ・チフィ、チフス菌）、Salmonella typhimurium（サルモネラ・チフィリウム、ネズミチフス菌）、Shigella sonnei（シゲラ・ソネイ、ソンネ菌）、Staphylococcus aureus（スタフィロコッカス・アウレウス、黄色ブドウ球菌）、Staphylococcus epidermidis（スタフィロコッカス・エピデルミデス、表皮ブ���ウ球菌）、Staphylococcus saprophyticus（スタフィロコッカス・サプロフィチカス）、Streptococcus agalactiae（ストレプトコッカス・アガラクチア）、Streptococcus pneumoniae（ストレプトコッカス・ニューモニエ、肺炎連鎖球菌）、Streptococcus pyogenes（ストレプトコッカス・ピオゲネス、化膿連鎖球菌）、Treponema pallidum（トレポネーマ・パリダム、梅毒トレポネーマ）、Vibrio cholerae（ビブリオ・コレラエ、コレラ菌）、Yersinia pestis（エルシニア・ペスチス、ペスト菌）、およびYersinia enterocolitica（エルシニア・エンテロコリチカ、腸炎エルシニア）が含まれる。
【００８５】
模範的な寄生体には、属のアカントアメーバ、バベシア、バラムチア、バランチジウム、ブラソシスチス（Blasocystis、Blastocystis）、クリプトスポリジウム、ジエントアメーバ（二核アメーバ）、エントアメーバ、ジアルジア、イソスポラ、リーシュマニア、ネグレリア、ペディクルス（シラミ）、プラスモジウム（マラリア原虫）、リノスポリジウム、サルコシスチス、シストソーマ（住血吸虫）、トキソプラズマ、トリコモナス、およびトリパノソーマからのものが含まれる。寄生体の具体例には、Babesia divergens（バベシア・ダイバージェンス）、Babesia bigemina（バベシア・ビゲミナ）、Babesia equi（バベシア・エクイ）、Babesia microfti（バベシア・ミクロフティ）、Babesia duncani（バベシア・ダンカニ）、Balamuthia mandrillaris（バラムチア・マンドリルリス）、Balantidium coli（バランチジウム・コリ）、Dientamoeba fragilis（ジエントアメーバ・フラジリス）、Entamoeba histolytica（エントアメーバ・ヒストリティカ、赤痢アメーバ）、Giardia lamblia（ジアルジア・ラムリア、ランブル鞭毛虫）、Isospora belli（イソスポーラ・ベリ）、Naegleria fowleri（ネグレリア・フォーレリ）、Pediculus humanus（ペーディクルス・フーマーヌス）、Plasmodium falciparum（プラスモジウム・ファルチパールム、熱帯熱マラリア原虫）、Plasmodium knowlesi（プラスモジウム・ノールシ、二日熱マラリア原虫）、Plasmodium malariae（プラスモジウム・マラリエ、四日熱マラリア原虫）、Plasmodium ovale（プラスモジウム・オバーレ、卵形マラリア原虫）、Plasmodium vivax（プラスモジウム・バイバックス、三日熱マラリア原虫）、Rhinosporidium seeberi（リノスポリジウム・セーベリ）、Sarcocystis bovihominis（サルコシスチス・ボビホミニス）、Sarcocystis suihominis（サルコシスチス・スイホミニス）、Schistosoma mansoni（シストソーマ・マンソーニ、マンソン住血吸虫）、Toxoplasma gondii（トキソプラズマ・ゴンディ、トキソプラズマ原虫）、Trichomonas vaginalis（トリコモナス・バギナリス、膣トリコモナス）、Trypanosoma brucei（トリパノソーマ・ブルセイ）、およびTrypansoma cruzi（Trypanosoma cruzi、トリパノソーマ・クルージ）が含まれる。
【００８６】
模範的な菌類には、属のApophysomyces（アポフィソミセス）、アスペルギルス、ブラストミセス、カンジダ、クラドスポリウム、Coddidioides（コディディオイデス）、Cryptococcos（クリプトコッカス）、エキセロヒルム、フザリウム、ヒストプラズマ、ピキア、ニューモシスチス、サッカロミセス、スポロトリクス、スタキボトリス、およびトリコフィトン（白癬菌）からのものが含まれる。菌類の具体例には、Aspergillus fumigatus（アスペルギルス・フミガーツス）、Aspergillus flavus（アスペルギルス・フラバス）、Aspergillus clavatus（アスペルギルス・クラバタス）、Blastomyces dermatitidis（ブラストミセス・デルマチチジス）、Candida albicans（カンジダ・アルビカンス）、Coccidioides immitis（コクシジオイデス・イミチス）、Crytptococcus neoformans（Cryptococcus neoformans、クリプトコッカス・ネオフォルマンス）、Exserohilum rostratum（エクセロヒルム・ロストラツム）、Fusarium verticillioides（フザリウム・バーティシリオイデス）、Histoplasma capsulatum（ヒストプラスマ・カプスラーツム）、Pneumocystis jirovecii（ニューモシスチス・ジロベシ）、Sporothrix schenckii（スポロトリックス・シェンキィ）、Stachybotrys chartarum（スタキボトリス・チャータラム）、およびTrichophyton mentagrophytes（トリコフィトン・メンタグロフィテス、毛瘡白癬菌）が含まれる。
【００８７】
模範的な古細菌には、属のAcidilobus（アシディロブス）、Acidococcus（アシッドコッカス）、Aeropyrum（アエロピルム）、Archaeoglobus（アーキオグロブス）、Caldisphaera（カルディスパエラ）、Caldococcus（カルドコッカス）、Cenarchaeum（ケナルカエウム）、Desulfurococcus（デスルフロコッカス）、Geogemma（ゲオーゲンマ）、Geoglubus（Geoglobus、ゲオグロブス）、Haladaptatus（ハルアダプタトゥス）、Halomicrobium（ハロミクロビウム）、Hyperthermus（ハイパーサーマス）、Ignicoccus（イグニコッカス）、Ignisphaera（イグニスファエラ）、Methanobacterium（メタノバクテリウム）、Natronococcus（ナトロノコッカス）、Nitrosopumilus（ニトロソプミルス）、Picrophilus（ピクロフィラス）、Pyrodictium（ピロディクチウム）、Pyrolobus（ピロロブス）、Staphylothermus（スタフィロテルムス）、Stetteria（ステテリア）、Sulfophobococcus（スルホフォボコッカス）、Thermodiscus（サーモディスカス）、Thermosphaera（サーモスファエラ）およびThermoplasma（サーモプラズマ）からのものが含まれる。古細菌の具体例には、A. aceticus（アセチクス）、A. camini（カーミニ）、A. fulgidus（フルギダス）、A. infectus（インフェクタス）、A. lithotrophicus（リソトロフィカス）、A. pernix（ペルニックス）、A. profundus（プロフンダス）、A. veneficus（ベネフィカス）、A. saccharovorans（サッカロボランス）、A. sulfurreducens（スルフレデュセンス）、C. dracosis（ドラコシス）、C. lagunensis（ラグネンシス）、C. noboribetus（ノボリベツ）、C. symbiosum（シンビオサム）、D. amylolyticus（アミロリティカス）、D. fermentans（フェルメンタンス）、D. mobilis（モビリス）、D. mucosus（ムコサス）、G. barossii（バロシイ）、G. indica（インディカ）、G. pacifica（パシフィカ）、H. butylicus（ブチリカス）、N. maritimus（マリティマス）、G. ahangari（アハンガリ）、H. paucihalophilus（パウシハロフィルス）、H. mukohataei（ムコハタエイ）、H. katesii（カテシ）、H. zhouii（チョウイ）、I. aggregans（アグレガンス）、I. islandicus（アイランディカス）、I. pacificus（パキフィクス）、I. hospitalis（ホスピタリス）、M. aarhusense（オーフセンス）、M. alcaliphilum（アルカリフィラム）、M. beijingense（ベイジンゲンス）、M. bryantii（ブライアンティイ）、M. congolense（コンゴレンス）、M. curvum（キュルバム）、M. espanolae（エスパノラエ）、M. formicicum（フォルミシカム）、M. ivanovii（イバノビイ）、M. oryzae（オリザエ）、M. palustre（パルストレ）、M. subterraneum（サブテラネウム）、M. thermaggregans（サーマグレガンス）、M. uliginosum（ユリギノーサム）、N. amylolyticus（アミロリティカス）、N. jeotgali（ジェトガリ）、N. occultus（オクルタス）、P. abyssi（アビシ）、P. brockii（ブロッキイ）、P. occultum（オクルツム）、P. fumarii（フマリイ）、P. oshimae（オシマエ）、P. torridus（トッリダス）、S. hellenicus（ヘレニカス）、S. marinus（マリヌス）、S. hydrogenophila（ハイドロゲノフィラ）、S. zilligii（ジリジイ）、T. maritimus（マリティマス）、T. aggregans（アグレガンス）、T. acidophilum（アシドフィルム）、T. sp. （菌種） P61、T. sp. S01、T. sp. S02、T. sp. XT101、T. sp. XT102、T. sp. XT103、T. sp. XT107およびT. volcanium（ボルカニウム）が含まれる。
【００８８】
いくらかのケースでは、分析対象は哺乳動物に由来する任意の分子であってもよい。いくらかの場合において、哺乳動物はヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ラビット、ヤギ、イヌ、ネコ、またはウシである。いくらかの実施態様において、哺乳動物はヒトである。いくらかの場合において、ヒトは患者である。
【００８９】
いくらかのケースでは、分析対象は植物に由来する任意の分子であってよい。いくらかのケースでは、植物は、胚を特徴的に生成する植物界の任意の様々な光合成、真核生物、多細胞生物で、葉緑体を含み、セルロース細胞壁を有し、および運動力を欠くものである。
【００９０】
いくらかのケースでは、この開示において、または本明細書において他で提供される方法は、上述した分析対象のいずれか一つを検出するために使用することができる。いくらかのケースでは、本開示において、または本明細書において他で提供される方法は、上述した分析対象のパネルを検出するために使用することができます。たとえば、パネルは、任意の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、500、1000、5000、10000、100000またはそれらよりも多くの上記または本明細書において他のどこかで説明する分析対象からなる群より選ばれる分析対象を含むことができる。
【００９１】
分析対象は、任意の有機体、組織、細胞、または環境からの有機体、全細胞、細胞調製物および細胞を含まない組成物からのものを含め、任意の適切な位置から得ることができる。分析対象は、環境サンプル、法医学的サンプル、生検、吸引物、ホルマリン固定された包埋組織、空気、農業サンプル、土壌サンプル、石油サンプル、水サンプル、またはダストサンプルから得られてよい。いくらかの例では、分析対象は、血液、尿、糞便、血清、リンパ液、唾液、粘膜の分泌物、汗、中枢神経系の流体、膣液、または精液を含むことができる体液から得ることができる。分析対象はまた、たとえば、化粧品、食物、パーソナルケアプロダクトなどのような生産品から得ることができる。分析対象は、組換えクローニング、ポリヌクレオチドの増幅または重合、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅または重合、等温増幅または重合、精製方法（たとえば、ゲノムDNAまたはRNAの精製などのようなもの）、および合成反応を含む実験操作の生成物であってもよい。
【００９２】
分析対象の一よりも多くのタイプは、各多重化アッセイ（each multiplexed assay）において検出することができる。たとえば、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、脂質、糖質、糖、小分子、または他の任意の適切な分子は、適切な試薬の使用を伴って、同じ多重化アッセイにおいて同時に検出することができる。分析対象の任意の組合せは同時に検出することができる。
【００９３】
分析対象の検出は、研究、臨床、診断、予後、法医学、および監視のアプリケーション（用途）を含め、任意の適切なアプリケーションのために有用でありうる。模範的なアプリケーションには、遺伝性疾患の検出、遺伝子指紋の識別、感染性疾患の判断、遺伝子のクローニング、パターニティー・テスト（親子鑑定）、犯罪鑑識、系統発生研究（phylogeny）、反バイオテロリズム、環境調査（environmental surveillance）、およびDNAコンピューティングを含む。たとえば、分析対象は、疾患または状態の指示であることができる。分析対象は、治療の決定を行うために、または疾患の状態を評価するために使用することができる。分析対象の存在は、特定の病原体を伴う感染、または任意の他の疾患、たとえば、癌、自己免疫疾患、心肺疾患、肝疾患、消化器疾患、およびその他などのようなものを指し示すことができる。こうして、ここで提供される方法は、診断を行うために、およびその診断に基づく臨床的決定を行うために使用することができる。たとえば、対象から採取したサンプルにおいて細菌ポリヌクレオチドの存在を指し示す結果は、抗生物質を伴う対象の治療につながる可能性がある。
【００９４】
いくらかの場合において、本開示の方法および組成物は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、100000またはそれらよりも多くの分析対象を検出するために使用されうる。いくらかの場合において、本開示の方法および組成物は、およそ1-10,000、1-1000、1-100、1-50、1-40、1-30、1-20、1-10、または1-5の分析対象を検出するために使用されうる。
【００９５】
いくらかの場合において、本開示は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、または100,000の分析対象のそれぞれの存在または不存在を、存在下または不存在下のいずれかの組合せにおいて、単一のサンプル容量において、明白に検出することが可能なアッセイを提供する。いくらかの場合において、この開示は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000または100,000の分析対象のそれぞれの存在または不存在を、存在または不存在のいずれかの組合せにおいて、単一のサンプル容量において明白に検出することが可能なアッセイを提供する。いくらかの場合において、この開示は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000または100,000よりも少ない分析対象の存在または不存在を、存在または不存在のいずれかの組合せにおいて、単一のサンプル容量において明白に検出することが可能なアッセイを提供する。
【００９６】
A．間隔
【００９７】
一態様では、ここで提供される方法は、およそ1-1000塩基対（bp）が含まれるポリヌクレオチド分析対象を検出するために使用することができる。いくらかの場合において、ここで提供される方法は、1-500bp、10-450bp、15-400bp、20-350bp、25-300bp、30-250bp、35-200bp、または40-190bpが含まれるポリヌクレオチド分析対象を検出するために使用されうる。いくらかのケースでは、方法は、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190またはそれらよりも多くの塩基対が含まれるポリヌクレオチド分析対象を検出するために使用されうる。いくらかのケースでは、方法は、少なくとも40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189または190塩基対が含まれるポリヌクレオチド分析対象を検出するために使用されうる。いくらかのケースでは、方法は、せいぜい40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189または190を超えない塩基対が含まれるポリヌクレオチド分析対象を検出するために使用されうる。
【００９８】
B．感度
【００９９】
いくらかの場合において、ここで開示される方法は、およそ100uMないしおよそ1fMの濃度でポリヌクレオチド分析対象を検出するために使用することができる。いくらかの場合において、ここで提供される方法は、およそ10uM-20fM、1uM-40fM、500nM-60fM、100nM-70fM、50nM-80fM、30nM-90fM、10nM-100fMの濃度でポリヌクレオチド分析対象を検出するために使用されうる。いくらかのケースでは、方法は、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、950pM、900pM、850pM、800pM、750pM、700pM、650pM、600pM、550pM、500pM、450pM、400pM、350pM、300pM、250pM、200pM、180pM、160pM、140pM、120pM、100pM、95pM、90pM、85pM、80pM、75pM、70pM、65pM、60pM、55pM、50pM、45pM、40pM、35pM、30pM、25pM、20pM、18pM、16pM、14pM、12pM、10pM、8pM、6pM、4pM、2pM、1pM、900fM、800fM、700fM、600fM、500fM、400fM、300fM、200fM、100fM、50fM、10fM、1fM、100aM、10aM、または1aMの濃度でポリヌクレオチド分析対象を検出するために使用されうる。いくらかのケースでは、方法は、少なくとも10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、950pM、900pM、850pM、800pM、750pM、700pM、650pM、600pM、550pM、500pM、450pM、400pM、350pM、300pM、250pM、200pM、180pM、160pM、140pM、120pM、100pM、95pM、90pM、85pM、80pM、75pM、70pM、65pM、60pM、55pM、50pM、45pM、40pM、35pM、30pM、25pM、20pM、18pM、16pM、14pM、12pM、10pM、8pM、6pM、4pM、2pM、1pM、900fM、800fM、700fM、600fM、500fM、400fM、300fM、200fM、100fM、50fM、10fM、1fM、100aM、10aM、または1aMの濃度でポリヌクレオチド分析対象を検出するために使用されうる。いくらかのケースでは、方法は、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、950pM、900pM、850pM、800pM、750pM、700pM、650pM、600pM、550pM、500pM、450pM、400pM、350pM、300pM、250pM、200pM、180pM、160pM、140pM、120pM、100pM、95pM、90pM、85pM、80pM、75pM、70pM、65pM、60pM、55pM、50pM、45pM、40pM、35pM、30pM、25pM、20pM、18pM、16pM、14pM、12pM、10pM、8pM、6pM、4pM、2pM、1pM、900fM、800fM、700fM、600fM、500fM、400fM、300fM、200fM、100fM、50fM、10fM、1fM、100aM、10aM、または1aMを超えない濃度でポリヌクレオチド分析対象を検出するために使用されうる。
【０１００】
C．特異性
【０１０１】
ここで提供されるいくらかの方法において、プライマー対は一または複数の分析対象に特異的であることができる。いくらかのケースにおいて、プライマー対は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50の分析対象に特異的である。いくらかの場合において、プライマー対は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50の分析対象に特異的である。いくらかの場合において、プライマー対は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50よりも少ない分析対象に特異的である。いくらかの場合において、プライマー対は一の分析対象に特異的である。いくらかの場合において、プライマー対はすべての分析対象に対して普遍的である。
【０１０２】
V．プローブおよびプライマー
【０１０３】
この開示において提供される方法のいくらかは、分析対象の存在下で信号を生成することができる試薬（例は、オリゴヌクレオチドで、たとえば、発色団に取り付けられるプライマーまたはプローブのようなもの）を利用する。任意の適切な試薬は本開示と共に使用することができる。大抵、試薬は、分析対象特異的な成分および分析対象の存在下で信号を生成する成分をもつ。いくらかの場合において、これらの試薬は、プローブおよびプライマーと称される。いくらかのケースにおいて、プローブはハイブリダイゼーションプローブである。いくらかのケースにおいては、ハイブリダイゼーションプローブは、発色団に取り付けられるオリゴヌクレオチドプローブである。いくらかの場合において、プローブは、放出され、または分析対象への抗体の結合時にクエンチ（消光）される蛍光標識を用いて、分析対象を検出する抗体である。いくらかのケースでは、試薬はプライマーである。いくらかの場合において、プライマーは発色団に取り付けられる。いくらかの場合において、プライマーはフルオロフォアに取り付けられる。いくらかの場合において、プライマーはクエンチャーに取り付けられる。
【０１０４】
本開示の方法は、各分析対象の存在または不存在を検出するために一以上の試薬（例は、オリゴヌクレオチドで、たとえば、発色団に取り付けられるプライマーまたはプローブ）を使用することができる。たとえば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれらよりも多くの試薬は、各分析対象の存在または不存在を検出するために使用されうる。いくらかのケースでは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50の試薬は、各分析対象の存在または不存在を検出するために使用されうる。いくらかの場合において、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50より少ない試薬は、各分析対象の存在または不存在を検出するために使用されうる。
【０１０５】
いくらかの場合において、サンプルは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれらよりも多くの試薬と、すべての分析対象の存在または不存在を検出するために接触される。いくらかの場合において、サンプルは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれらよりも多くの試薬と、すべての分析対象の存在または不存在を検出するために接触させる。いくらかの場合において、サンプルは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50よりも少ない試薬と、すべての分析対象の存在または不存在を検出するために接触される。
【０１０６】
上述したように、フルオロフォアまたはクエンチャーに取り付けられるプライマーは、ポリヌクレオチドの増幅または重合アッセイにおいて分析対象の存在を検出するために使用することができる。クエンチャーは、クエンチャーおよびフルオロフォアがごく接近しているとき、光源による励起の際、フルオロフォアによって放出される蛍光を消光することができる。プライマーの配列は、分析対象に存在するポリヌクレオチド配列に対して相補的であるように設計することができ、またはそれに対してヌクレオチド変異を含んでもよく、そしてプライマーは分析対象にハイブリダイズすることが可能である。また、プライマーの配列は分析対象のポリヌクレオチド配列において一以上のヌクレオチド変動を含むために設計することができ、そしてプライマーは分析対象にハイブリダイズすることが可能である。フルオロフォアはプライマー対の一方の5'端に取り付けられることができる。クエンチャーはプライマー対の第二のプライマーの5'端に取り付けられることができる。プライマーのハイブリダイゼーションは、プライマーを含む核酸増幅反応または重合反応（例は、ポリメラーゼ連鎖反応）において行うことができる。DNAポリメラーゼによるプライマーの伸長の際、フルオロフォアおよびクエンチャーは、アンプリコンまたは増幅（または重合）生成物（例は、分析対象）において組み込まれる。クエンチャーの取り込みおよび新しく生成されたアンプリコンにおけるフルオロフォアは、信号生成を導くことができる（例は、フルオロフォアからの蛍光強度のクエンチング）。各反復の増幅または重合反応により、蛍光強度がおよそ2倍だけ低減される。検出される蛍光の量は、存在する分析対象の量を直接決定するために用いることができる。いかなる分析対象も存在しない場合、ほとんどまたはまったくクエンチングが観察されない。
【０１０７】
いくらかのケースでは、分析されるサンプルは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれらよりも多くのプライマーの組（例は、フォワードプライマーおよびリバースプライマー）と組み合わされる。いくらかのケースでは、分析されるサンプルは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれらよりも多くの組のプライマーと接触される。いくらかのケースでは、分析されるサンプルは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50より少ないプライマーの組と接触される。いくらかの場合において、プライマー対の数は2-10、3-15、4-20、3-10、4-10、5-10、6-8、または6-10である。いくらかのケースでは、分析されるサンプルはプライマーの1対と接触される。
【０１０８】
いくらかの場合において、サンプルは一以上の分析対象を含むことができる。いくらかのケースでは、一のプライマー対は各分析対象の存在または不存在を検出するために使用されうる。いくらかの場合において、サンプルは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、100、500、1000、5000、10,000またはそれらよりも多くの異なるプライマー対と、各プライマー対が単一の分析対象を検出させながら接触させる。いくらかの場合において、サンプルは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、100、500、1000、5000、10,000またはそれらよりも多くの異なるプライマー対と、各プライマー対が単一の分析対象を検出しながら接触させる。いくらかの場合において、サンプルは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、100、500、1000、5000、10,000よりも少ない、またはそれらよりも多くの異なるプライマー対と、各プライマー対が単一の分析対象を検出しながら接触させる。いくらかの場合において、プライマー対の数は2-10、3-15、4-20、3-10、4-10、5-10、6-8、または6-10である。
【０１０９】
いくらかの場合において、プライマーは、特定の分析対象に特異的であり、およびプローブに相補的な領域を増幅することが可能である。いくらかのケースにおいては、使用されるプライマーの数はプローブの数に相当する。他の場合に、使用されるプローブの数は使用されるプライマーの数を超えることがある。いくらかの場合において、プライマーおよびプローブの数は比によって規定される。いくらかのケースにおいては、プライマーのプローブに対する比は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000である。いくらかの場合では、プローブのプライマーに対する比は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000である。
【０１１０】
ここでの他のどこかに開示されるように、プライマーは、プライマーあたり、一または複数のフルオロフォアまたはクエンチャーを有していてもよい。たとえば、いくらかの場合において、プライマーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれらよりも多くのフルオロフォアが含まれてもよい。プライマーは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50のフルオロフォアが含まれてもよい。プライマーは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50よりも少ないフルオロフォアが含まれてもよい。
【０１１１】
プライマーには、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれらよりも多くのクエンチャーが含まれうる。プライマーには、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50のクエンチャーが含まれてもよい。プライマーには、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50より少ないクエンチャーが含まれてもよい。
【０１１２】
プローブまたはプライマーへのフルオロフォアおよびクエンチャーの取り付けは、同じ反応において、またはシリアル（連続）反応で行うことができる。一連の反応は少なくとも一のフルオロフォアに対しプローブまたはプライマーを取り付けるために実行されてよく、および反応生成物は異なるフルオロフォアを有するプローブまたはプライマーの混合物を生成するために混合することができる。
【０１１３】
本開示の多くの態様は核酸ベースのプローブおよびプライマーを用いて例示されるが、当業者には、プローブおよびプライマーの他の形態が、この開示において説明した例と共に等しく良好に作用するであろうことを容易に理解するであろう。たとえば、分析対象に特異的な結合性分子は、プローブとして使用することができる。非制限的で例示的な結合性分子は、抗体が含まれ、分析対象を認識し、そして分析対象の存在下で信号を生成する。
【０１１４】
本開示の蛍光標識は、任意の位置でプローブまたはプライマーに取り付けられることができる。いくらかのケースにおいて、単一の発色団は5'端でプライマーに取り付けられる。いくらかの例では、マルチプルな発色団は5'端で取り付けられる少なくとも一の発色団を有するプライマーに取り付けられる。発色団ラベリング（標識化）の方法はこの技術において十分に規定される。例は、Pesce（ペッシェ）ら、編集者、Fluorescence Spectroscopy（蛍光分光法）、Marcel Dekker（マルセル・デッカー）、New York（ニューヨーク）、（1971）；White（ホワイト）ら、Fluorescence Analysis: A Practical Approach（蛍光分析：実践的アプローチ）、Marcel Dekker、New York、（1970）；およびその他を参照。さらに、オリゴヌクレオチドに付加することができる普通の反応基を介する共有結合のためのレポーターおよびクエンチャー分子を誘導体化するための文献において豊富なガイダンスがある。例は、米国特許第3,996,345号；および米国特許第4,351,760号を参照。ここで記載のように、発色団標識を利用する例では、任意の適切な標識技術を用いることができる。
【０１１５】
VI．発色団
【０１１６】
発色団は、化合物を含有するこれらの分子の着色をもたらす選択的光吸収が可能な分子である。励起状態にある分子が規定されたスペクトルを有する光の形態でエネルギーを放出するとき、色が生じる。模範的な発色団には、制限されないが、蛍光色素、非蛍光色素の発色団、クエンチャー（例は、蛍光クエンチャーおよびダーククエンチャー）、アブソープションクロモフォア（吸収発色団）、フルオロフォア、任意の有機または無機染料、金属キレート、または任意の蛍光酵素基質が含まれる。いくらかの場合において、発色団は蛍光色素である。いくらかの場合において、蛍光色素はフルオロフォアである。いくらかの場合には、発色団はクエンチャーである。いくらかのケースでは、発色団はダーククエンチャーである。
【０１１７】
いくつかの発色団は、当技術において記載され、例は、Berlman（バールマン）、Handbook of Fluorescence Sprectra of Aromatic Molecules（芳香族分子の蛍光スプレクトラのハンドブック）、第2版、Academic Press（アカデミックプレス）、New York、（1971）である。ここに記載されるように蛍光標識を利用する例では、任意の適切な蛍光標識を用いることができる。
【０１１８】
本開示と共に使用するのに適した模範的なフルオロフォアには、ローダミン、ロドール、フルオレセイン、チオフルオレセイン、アミノフルオレセイン、カルボキシフルオレセイン、クロロフルオレセイン、メチルフルオレセイン、スルホフルオレセイン、アミノロードール（aminorhodol）、カルボキシロードール、クロロロードール、メチルロードール、スルホロードール；アミノローダミン、カルボキシローダミン、クロロローダミン、メチルローダミン、スルホローダミン、およびチオローダミン；シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、メロシアニン、シアニン2、シアニン3、シアニン3.5、シアニン5、シアニン5.5、シアニン7、オキサジアゾール誘導体、ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾール、ベンゾオキサジアゾール、ピレン誘導体、カスケードブルー、オキサジン誘導体、ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン170、アクリジン誘導体、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー、アリールメチン誘導体、オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン、テトラピロール誘導体、ポルフィン、フタロシアニンおよびビリルビン；1-ジメチルアミノナフチル-5-スルホナート（1-dimethylaminonaphthyl-5-sulfonate）、1-アニリノ-8-ナフタレンスルホナート、2-p-トウイジニル（touidinyl）-6-ナフタレンスルホナート、3-フェニル-7-イソシアナトクマリン、N-(p-(2-ベンゾオキサゾリル)フェニル)マレイミド、スチルベン、ピレン、6-FAM（フルオレセイン）、6-FAM（NHSエステル）、フルオレセインdT、HEX、JOE（NHSエステル）、MAX、TET、ROX、TAMRA、TARMATM（NHSエステル）、TEX 615、ATTOTM 488、ATTOTM 532、ATTOTM 550、ATTOTM 565、ATTOTM Rho101、ATTOTM 590、ATTOTM 633、ATTOTM 647N、TYETM 563、TYETM 665、TYETM 705およびその他同種類のものが含まれる。
【０１１９】
本開示と共に使用するのに適した模範的なクエンチャーは、たとえば、BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3などのようなブラックホールクエンチャー；たとえば、ATTO 540Q、ATTO580Q、およびATTO612QなどのようなATTOクエンチャー；Qx1クエンチャー；アイオワブラック（Iowa Black）FG、アイオワブラックRG、アイオワブラックFQおよびアイオワブラックRQ；IRDye（IRダイ）QC-1；1.4nmのNanogold（ナノゴールド）；およびその他同種類のものが含まれる。
【０１２０】
本開示と共に使用することができるフルオロフォアは、ここで記載されるフルオロフォアのいずれかに制限されない。たとえば、優れた特性を有するフルオロフォアが絶えず開発され、およびこれらのフルオロフォアは、この開示において提供される方法と共に容易に使用することができる。そのような改良されたフルオロフォアには、量子ドットが含まれ、単一の波長で励起された後、異なる波長でエネルギーを放出することができる。
【０１２１】
A．発色団の組合せ
【０１２２】
いくらかの場合には、複数の発色団はオリゴヌクレオチドに取り付けられる（例は、プローブまたはプライマー）。いくらかのケースでは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれらよりも多くの発色団は、オリゴヌクレオチドに取り付けられる。いくらかの場合において、およそ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれらよりも多くの発色団は、オリゴヌクレオチドに取り付けられる。いくらかの場合において、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50よりも少ない発色団は、オリゴヌクレオチドに取り付けられる。いくらかのケースでは、一の発色団はオリゴヌクレオチドに取り付けられる。
【０１２３】
いくらかのケースでは、オリゴヌクレオチドには、プローブが含まれる。いくらかのケースでは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれらよりも多くの発色団は、プローブに取り付けられる。いくらかの場合において、およそ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれらよりも多くの発色団は、プローブに取り付けられる。いくらかの場合において、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50よりも少ない発色団は、プローブに取り付けられる。いくらかのケースでは、一の発色団はプローブに取り付けられる。
【０１２４】
いくらかのケースでは、オリゴヌクレオチドはプライマーである。いくらかのケースでは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれらよりも多くの発色団はプライマーに取り付けられる。いくらかのケースでは、およそ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれらよりも多くの発色団はプライマーに取り付けられる。いくらかの場合において、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50よりも少ない発色団はプライマーに取り付けられる。いくらかのケースでは、一つの発色団はプライマーに取り付けられる。いくらかのケースでは、一つの発色団は、プライマーの5'端に取り付けられる。いくらかの場合には、複数の発色団はプライマーの5'端に取り付けられた少なくとも一つの発色団を有するプライマーに取り付けられる。
【０１２５】
いくらかのケースでは、複数のフルオロフォアおよびクエンチャーはプローブに取り付けられる。いくらかのケースでは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれらよりも多くのフルオロフォアはプローブに取り付けられる。いくらかの場合において、およそ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれらよりも多くのフルオロフォアはプローブに取り付けられる。いくらかの場合において、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50よりも少ないフルオロフォアはプローブに取り付けられる。いくらかのケースでは、一のフルオロフォアはプローブに取り付けられる。いくらかのケースでは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれらよりも多くのクエンチャーはプローブに取り付けられる。いくらかの場合において、およそ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれらよりも多くのクエンチャーはプローブに取り付けられる。いくらかの場合において、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50よりも少ないクエンチャーはプローブ上に取り付けられる。いくらかのケースでは、一のクエンチャーはプローブに取り付けられる。
【０１２６】
いくらかのケースでは、フルオロフォアおよびクエンチャーの組合せはプローブに取り付けられる。いくらかの場合においては、プローブ上のフルオロフォアおよびクエンチャーの数は比によって規定される。いくらかのケースでは、フルオロフォアのクエンチャーに対する比は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000である。いくらかの場合では、フルオロフォアのクエンチャーに対する比はおよそ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000である。いくらかのケースでは、クエンチャーのフルオロフォアに対する比は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000である。いくらかの場合では、クエンチャーのフルオロフォアに対する比は、およそ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000である。
【０１２７】
いくらかのケースでは、複数のフルオロフォアおよびクエンチャーはプライマーに取り付けられる。いくらかのケースでは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれらよりも多くのフルオロフォアはプライマーに取り付けられる。いくらかの場合において、およそ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれらよりも多くのフルオロフォアはプライマーに取り付けられる。いくらかのケースでは、一のフルオロフォアはプライマーに取り付けられる。いくらかの場合において、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50よりも少ないフルオロフォアはプライマーに取り付けられる。いくらかのケースでは、一のフルオロフォアはプライマーの5'端に取り付けられる。いくらかのケースでは、複数のフルオロフォアはプライマーの5'端に取り付けられた少なくとも一つのフルオロフォアを有するプライマーに取り付けられる。いくらかのケースでは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれらよりも多くのクエンチャーはプライマーに取り付けられる。いくらかの場合において、およそ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれらよりも多くのクエンチャーはプライマーに取り付けられる。いくらかの場合において、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50よりも少ないクエンチャーはプライマーに取り付けられる。いくらかのケースでは、一のクエンチャーはプライマーに取り付けられる。いくらかのケースでは、一のクエンチャーはプライマーの5'端に取り付けられる。いくらかの場合において、複数のクエンチャーはプライマーの5'端に取り付けられた少なくとも一のクエンチャーを有するプライマーに取り付けられる。
【０１２８】
いくらかのケースでは、フルオロフォアおよびクエンチャーの組合せはプライマーに取り付けられる。いくらかの場合には、プライマー上のフルオロフォアおよびクエンチャーの数は比によって規定される。いくらかのケースでは、フルオロフォアのクエンチャーに対する比は、およそ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000である。いくらかの場合には、クエンチャーのフルオロフォアに対する比は、およそ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000である。
【０１２９】
いくらかのケースでは、マルチプルなフルオロフォアは一のクエンチャーと対になる。いくらかのケースでは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれらよりも多くのフルオロフォアは一のクエンチャーと対になる。いくらかの場合において、およそ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれらよりも多くのフルオロフォアは一のクエンチャーと対になる。いくらかの場合において、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50よりも少ないフルオロフォアは一のクエンチャーと対になる。いくらかのケースでは、マルチプルなフルオロフォアおよびクエンチャーの対が使用される。いくらかのケースでは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれらよりも多くのフルオロフォアおよびクエンチャーの対が使用される。いくらかの場合において、およそ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれらよりも多くのフルオロフォアおよびクエンチャーの対が使用される。いくらかの場合において、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50よりも少ないか、またはそれらよりも多くのフルオロフォアおよびクエンチャーの対が使用される。いくらかのケースでは、1のフルオロフォアおよびクエンチャーのペアが使用される。
【０１３０】
いくらかの場合において、プライマーの対には、第一プライマーおよび第二プライマーが含まれる。いくらかの場合では、マルチプルなフルオロフォアは第一プライマーに取り付けられ、および一のクエンチャーは第二プライマーに取り付けられる。いくらかの場合において、少なくとも一のフルオロフォアは第一プライマーの5'端に取り付けられる。いくらかのケースでは、クエンチャーは第二プライマーの5'端に取り付けられる。いくらかのケースにおいては、マルチプルなフルオロフォアは第二プライマーに結合され、および一のクエンチャーは第一プライマーに取り付けられる。いくらかの場合において、少なくとも一のフルオロフォアは第二プライマーの5'端に取り付けられる。いくらかの場合において、クエンチャーは第一プライマーの5'端に取り付けられる。いくらかのケースでは、フルオロフォアおよびクエンチャーは同じプライマーに取り付けられない。
【０１３１】
熟練した専門家は、本開示のプローブまたはプライマーの利益がその構造の様々な態様を修正しながらも保持されうることを理解するであろう。たとえば、制限する目的ではないが、ドナー/クエンチャー対の数は修飾されてもよい。より一層多くのドナー/クエンチャー対のプローブまたはプライマーへの付加は、増幅または重合反応の開始に先立ち観察可能な合計蛍光の量を増加すると予想される。プローブまたはプライマーに添加することができるドナー/クエンチャー対の数に対して上限はない。一例では、ドナー/クエンチャー対の数は少なくとも二である。他の例では、検出機は少なくとも三またはそれよりも多くのドナー/クエンチャー対を含む。いくらかの例においては、検出機は少なくとも10、20、30、または50のペアを含んでよく、またはそれは、何百ものドナー/クエンチャー対、生産するために必要に応じて、たとえば、最適な信号対雑音比およびアッセイ感度を含んでもよい。
【０１３２】
いくらかのケースでは、この開示において提供される方法には、コントロールとしてフルオロフォア/クエンチャー対の使用が含まれることができる。コントロールのフルオロフォア/クエンチャー対は、正のコントロールの分析対象、およびサンプルにおいて、検出されるべき各分析対象を結合する一またはそれよりも多くのプローブまたはプライマー対に取り付けられてよい。同じ配列が正のコントロールの分析対象および検出されるべき各分析対象において生じる場合、単一のコントロールのプライマー対を使用することができる。同じ配列が正のコントロールの分析対象および検出すべき各分析対象において発生しない場合、異なるプライマー対を使用することができるが、各プライマー対は依然としてコントロールフルオロフォア/クエンチャー対に取り付けられてもよい。
【０１３３】
たとえば、上記の方法にて構築するように、一のフルオロフォア/クエンチャー対は、サンプルにおいて常に存在するコントロール分析対象の存在をコードするために使用することができる。コントロール分析対象は、サンプルに加えてもよく、またはサンプルにおいて本質的に存在することができる。追加のフルオロフォア/クエンチャー対は、追加の分析対象の存在をコード化するために使用することができる。
【０１３４】
B．信号
【０１３５】
ここで開示されるものは、分析対象の存在または不存在を識別するために信号を利用する方法である。いくらかのケースでは、その信号は信号においての増加である。いくらかのケースでは、信号は信号においての減少である。いくらかの場合において、シグナチャープロファイルは、特定の間隔での信号においての変化に基づいて生成される。いくらかのケースでは、分析対象の長さが知られたら、追加の情報を外挿することができる。いくらかのケースでは、追加の情報には、分析対象の分子量が含まれる。
【０１３６】
いくらかのケースでは、信号は閾値と比較することができる。閾値は調整可能なファクターを乗じたベースライン（またはバックグラウンド）信号の平均標準偏差として規定することができる。いくらかのケースでは、PCR実験の間に、各チューブに関連した反応および環境条件は蛍光に影響を与えることができ、および蛍光信号はバックグラウンド信号またはベースライン信号を作り出す時間にわたって上下することができる。このベースライン信号は、例は、分析対象を検出するために使用されるPCR実験の初期のサイクルを用いて定めることができる。あるいはまた、バックグラウンドまたはベースライン信号は別々の実験を用いて定めることができる。ベースライン信号の平均から算出した標準偏差は次いで、閾値を確立するために使用することができる。いくらかの場合には、調節可能な係数は、およそ1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100またはそれらよりも多くの因数であることができる。いくらかの場合には、調節可能なファクターは実験の開始に先立って計算することができる。いくらかのケースにおいては、調整可能なファクターは使用される発色団のタイプに応じて変動することができる。いくらかの場合には、調節可能な因子は実験によって変動させることができる。いくらかのケースでは、調整可能なファクターは計器によって変えることができる。いくらかの場合には、調節可能なファクターは、各計器のために計算される。いくらかのケースでは、閾値はベースライン信号より上で確立される。いくらかのケースでは、閾値はベースライン信号より下で確立される。いくらかのケースでは、観察された信号（例は、被分析物を検出するために測定される信号）は閾値レベルを横切る。いくらかのケースでは、観察された信号は閾値レベルと交差しない。いくらかのケースでは、閾値を横切る観察された信号は生成物の分析対象の存在を指し示す。いくらかのケースでは、閾値を超えない観察信号は生成物の分析対象の不存在を指し示す。
【０１３７】
いくらかのケースでは、レファレンス（基準）信号または基準信号の範囲は、たとえば、ここで記載される任意の方法のためのコントロールとして使用することができ、確立される。いくらかのケースでは、基準信号または基準信号の範囲はここで記載される増幅または重合反応が好首尾に行われるかどうかを定めるために使用することができる。たとえば、発色団の使用を伴うPCR実験を開始するのに先立ち、発色団のための基準信号範囲を生成することができる。基準信号の範囲は、基準信号の範囲がX±Yであるように、二つの成分、XおよびYの値を定めることによって生成することができる。いくらかの場合において、X成分は温度および時間に関して発色団の平均蛍光信号であり、およびY成分はXの標準偏差である。PCR反応の間にコントロールとして使用するとき、各変性ステップからの信号は基準信号または基準信号範囲と比較することができる。基準信号範囲外の信号は反応が失敗したことを指し示すことができ、その一方、基準信号範囲内の信号は反応が成功したことを指し示すことができる。いくらかのケースでは、基準信号または基準信号範囲は、サイクルごとのコントロールとして使用することができる。いくらかのケースでは、基準信号または基準信号の範囲は内部コントロールとして使用することができる。いくらかのケースでは、基準信号または基準信号範囲を算出する方法は、ベースライン信号の計算と同じで、例は、蛍光信号の平均を確立すること、およびその標準偏差を算出することである。
【０１３８】
いくらかの場合において、変性信号は増幅または重合実験中に標準化のために使用される。たとえば、変性信号が基準信号範囲内にあるとき、変性信号を標準化のために使用することができる。それぞれの増幅または重合サイクルの過程の間に、変性信号はアニーリングステップ中に測定される信号を標準化するために使用することができ、それによって、各サイクルのための内部標準化が生成され、例は、信号が特定の値または単位、たとえば、1の値にリセットされることができるところのチョッパー安定化と同様である。いくらかの場合において、変性信号は内部または自己標準化のために使用される。いくらかの場合において、ここで記載される方法はサイクルごとの自己標準化のために、各サイクルの変性信号を用いる。
【０１３９】
いくらかの場合において、アニーリング信号は分析対象の存在または不存在を定めるために使用される。いくらかのケースでは、アニーリング信号が前述のサイクルごとの自己標準化法を使用する引き続くステップ間で比較されるとき、信号においての相対的変化は定められることができる。いくらかのケースでは、相対的な信号変化は信号の相対的な定量化と呼ぶことができる。いくらかのケースでは、信号の相対的な定量化は分析対象の存在または不存在を定めるために使用される。いくらかの場合において、アニーリング信号は分析対象の存在を定めるために標準に対して比較される。いくらかの場合において、標準は標準的なラダーまたは本開示においてのここでの他のどこかで記載されるコントロールシグナチャープロファイルと呼ばれる。いくらかのケースでは、標準ラダーに対するアニーリング信号の比較は分析対象の相対的定量化とも呼ばれる。いくらかの場合において、ここで記載される方法は分析対象の存在または不存在を定めるために相対的定量方法を用いる。
【０１４０】
いくらかの場合において、この開示において提示される方法は、任意の定量化可能な信号と共に使用することができる。ここで、およびここにおいて他のどこかで説明するように、コード体系（coding scheme）は、色に基づく信号のマルチプリシティー（多様性）を指し示すために利用することができる。いくらかの場合において、コード体系は電気信号および化学発光信号を含め、定量可能な信号を提供する任意の他の方法にも等しく適用可能である。
【０１４１】
いくらかのケースでは、蛍光信号が採用される場合、コード化することができる分析対象の数は追加のフルオロフォアを利用することによってさらに拡張することができる。たとえば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれらよりも多くのフルオロフォアを使用することができる。いくらかのケースでは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50のフルオロフォアを使用することができる。いくらかの場合において、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50より少ないフルオロフォアを使用することができる。
【０１４２】
信号は、ここで記載される検出方法の間の種々の点で測定し、および比較することができる。たとえば、増幅または重合反応（例は、PCR反応またはプロセス）の間に、ペアをなす信号を測定することができる。いくらかのケースでは、信号を測定することができ、すなわち、アニーリング前、プライマーを鋳型（例は、分析対象）にアニーリングする間、またはその後；二本鎖鋳型を変性する前、その間またはその後；またはアニーリングステップの前または変性ステップの後である。ここで記載されるように、信号シグナチャーはこれらの測定値を用いて生成することができる。
【０１４３】
C．シグナチャープロファイル
【０１４４】
シグナチャープロファイルには、典型的に、複数の信号が含まれる。いくらかのケースでは、信号には、電気化学的シグナル、化学発光シグナルおよび蛍光シグナルが含まれる。いくらかの場合において、シグナチャープロファイルは複数の蛍光シグナルを含む。いくらかの場合には、プロファイル曲線は複数の蛍光シグナルから生成される。いくらかの場合において、シグナチャープロファイルは初期蛍光シグナルおよびエンドポイント蛍光シグナルを含む。いくらかの場合において、シグナチャープロファイルは、増幅または重合反応のアニーリングステップ間に測定される信号を含む。いくらかの場合において、蛍光シグナルは外的要因によって影響される。いくらかのケースにおいては、外的要因には、温度、pH、有機および無機薬剤（例は、塩、尿素、DMSO）および発色団の追加または除去が含まれる。
【０１４５】
いくらかのケースにおいて、シグナチャープロファイルは異なるタイプの検出実験から生成される。いくらかのケースにおいては、ポリヌクレオチドの形態研究から生成されるシグナチャープロファイルは形態曲線と称される。いくらかのケースでは、変性研究から生成されるシグナチャープロファイルは融解曲線と称される。いくらかのケースでは、持続長研究から生成されるシグナチャープロファイルは長曲線と称される。いくらかのケースでは、一塩基多型（SNP）研究から生成されるシグナチャープロファイルはSNP曲線と称される。
【０１４６】
いくらかのケースでは、信号においての変化は変化率として計算することができる。いくらかのケースでは、信号変化の割合は、0.01、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、10,000％である。いくらかのケースでは、信号変化の割合は、およそ0.01、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、10,000％である。
【０１４７】
VII．分析技術および計測
【０１４８】
この開示において記載された方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、レプリカーゼ媒介性増幅、鎖置換増幅（SDA）、増幅の「ローリングサークル」タイプ、および様々な転写関連増幅または重合方法を含めて、増幅または重合の種々の方法と互換性がある。例は、PCR増幅：米国特許第4683195、4683202、および4800159号；LCR増幅：米国特許第5516663号および欧州特許第EP 0320308 B1号；レプリカーゼ仲介増幅：米国特許第4786600号；SDA増幅：米国特許第5422252および5547861号；増幅のローリングサークル：米国特許第5714320および5834252号；および転写関連増幅：米国特許第5399491、5554516、5130238、5437990、4868105、および5124246号、PCT国際公開WO1988/010315 A1号および米国特許出願公開第2006-0046265 A1号を参照し、およびそれらはここで参照することによって組込まれる、。
【０１４９】
いくらかの場合には、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）はマルチプレックスPCR、タンデムリピート（縦列反復）の可変数（VNTR）PCR、非対称PCR、ロングPCR、ネステッド（入れ子状態）PCR、ホットスタートPCR、タッチダウンPCR、アセンブリーPCR、コロニーPCR、定量的PCR（qPCR）、エンドポイントPCR、逆転写酵素PCR、デジタルPCRまたは液滴デジタルPCRである。いくらかのケースでは、PCRプロセスは定量的PCRプロセスである。
【０１５０】
いくらかの場合において、本開示のPCR増幅または重合ステップは、当技術においてよく知られる標準的な技術によって実行することができる〔例は、Sambrook（サンブルック）、E.F. Fritsch（フリッチュ）およびT. Maniatis（マニアティス）、Molecular Cloning：A Laboratory Manual（分子クローニング：ラボラトリーマニュアル）、Second Edition（第2版）、Cold Spring Harbor Laboratory Press（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）(1989)；米国特許第4,683,202号；およびPCR Protocols（プロトコルズ）：A Guide to Methods and Applications（方法および応用へのガイド）、Innis（イニス）ら編、Academic Press, Inc.（アカデミック・プレス社）、San Diego（サンディエゴ）（1990）を参照し、それらは参照することによりここで組み込まれる）。PCRサイクリング条件は典型的に、初期の変性ステップからなり、それはPCR反応混合物を、およそ1からおよそ10分までの範囲にわたる時間の間、およそ80℃からおよそ105℃までの範囲にわたる温度に加熱することによって実行することができる。熱変性は次いで典型的に、およそ1からおよそ80サイクルまでの範囲にわたる多数のサイクルが続き、通常、各サイクルには、初期の変性ステップが含まれ、次いでプライマーアニーリングステップが続き、およびプライマー伸長ステップに終わる。核酸ポリメラーゼ、例は、Taqポリメラーゼによるプライマーの酵素的伸長は、その後のサイクルにおいてテンプレートとして使用することができる鋳型（例は、分析対象）のコピーを生成する。いくらかの場合において、変性温度はおよそ85℃ないしおよそ100℃である。いくらかの場合において、変性温度は85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃または100℃である。いくらかの場合において、変性温度は、少なくとも85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃または100℃である。いくらかの場合において、変性温度はせいぜい85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃または100℃を超えない。いくらかの場合において、アニーリング温度はおよそ25℃ないしおよそ80℃である。いくらかの場合において、アニーリング温度は25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃または80℃である。いくらかの場合において、アニーリング温度は、少なくとも25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃または80℃である。いくらかの場合において、アニーリング温度はせいぜい25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃または80℃を超えない。いくらかのケースでは、伸長温度は25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃または80℃である。いくらかのケースでは、伸長温度は、少なくとも25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃または80℃である。いくらかのケースでは、伸長温度はせいぜい25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃または80℃を超えない。いくらかの場合において、サイクル数は、およそ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75からおよそ80サイクルまでの範囲におよぶ。
【０１５１】
ここで提供される方法は様々な検出方法での使用に適する。たとえば、方法は、蛍光信号を測定する分析技術を用いて適用することができる。たとえば、多くのリアルタイムPCR、定量的PCRおよび液滴デジタルPCR機器は、蛍光信号の検出を可能にする励起光源が含まれ、使用することができる。したがって、本開示の方法は、容易に当技術において広く使用される機器を使用して適用することができる。
【０１５２】
VIII．疾患
【０１５３】
ここで記載される方法は、疾患または一以上の疾患に関連する遺伝的変動（例は、SNP）に関係する一以上の分析対象を検出するために使用することができる。疾患は生物の異常な状態である。いくらかの場合において、生物は、哺乳動物で、たとえば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、またはウシなどのようなものである。いくらかの場合において、哺乳動物はヒトである。いくらかのケースでは、人間は患者または対象である。いくらかの場合において、疾患は、遺伝的障害、自己免疫疾患、神経疾患、心血管疾患またはガンである。
【０１５４】
遺伝的障害はゲノムにおいて一以上の異常性によって引き起こされる疾患である。模範的な遺伝的障害には、22q11.2欠失症候群、尖頭症、急性脳ゴーシェ病（Acute cerebral Gaucher's disease）、副腎疾患、副腎性器症候群、アルツハイマー病、エナメル質形成不全症（Amelogenesis imperfect）、アンドロゲン不応症、貧血、アンジェルマン症候群、アペール症候群、毛細血管拡張運動失調、カナバン病、シャルコー・マリー・トゥース病、色覚異常、猫鳴き症候群、嚢胞性線維症、ダウン症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ヘモクロマトーシス、血友病、クラインフェルター症候群、神経線維腫症、フェニルケトン尿、多発性嚢胞腎疾患、プラダー・ウィリー症候群、鎌状赤血球症、テイ・サックス病およびターナー症候群が含まれる。
【０１５５】
自己免疫疾患は、免疫系が誤って健康な体組織を攻撃し、および破壊するときに生じる疾患である。模範的な自己免疫疾患には、円形脱毛症（lopecia areata）、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、糖尿病（1型）、若年性特発性関節炎のいくつかの形態、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、心筋炎のいくつかの形態、多発性硬化症、天疱瘡/類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症/全身性硬化症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎のいくつかの形態、ぶどう膜炎のいくつかの形態、白斑、および多発血管炎性肉芽腫症〔Wegener's（ウェゲナーの）〕が含まれる。
【０１５６】
模範的な神経疾患には、注意欠陥多動性障害（ADHD）、ALS、アルツハイマー病、双極性障害ベル麻痺、脳と脊髄の先天性欠損、脳性麻痺、慢性疲労症候群、失読症、てんかん、ギラン-バレー症候群、多発性硬化症、筋ジストロフィー、神経障害、神経筋および関連疾患、パーキンソン病、統合失調症、脊柱側弯症および脊柱変形が含まれる。
【０１５７】
模範的な循環器（心血管）疾患には、急性心筋梗塞、アンギナ（狭心症）、不整脈、アテローム性動脈硬化、心肥大、心筋症、頚動脈疾患、先天性心疾患、うっ血性心不全、冠動脈疾患、心内膜炎、心臓の周りの流体（fluid around the heart）、高血圧、感染性心内膜炎、僧帽弁逸脱（mitral valve prolapsed）、末梢動脈疾患、脳卒中、および心臓弁膜症が含まれる。
【０１５８】
ガンは細胞の異常増殖を特徴とする。模範的なガンには、ブラダー、脳、ブリート（breat）、膀胱、骨、（子宮）頸部、結腸、食道、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、近位または遠位胆管、前立腺、皮膚、胃、甲状腺、および子宮の癌が含まれる。
【０１５９】
いくらかのケースでは、分析対象または分析対象（analye）の遺伝的変動（例は、SNP）の存在は疾患マーカーとして役立ちうる。いくらかの場合において、ここで開示される方法は疾患マーカーを検出するために使用することができる。いくらかの場合において、ここで開示される方法はペイシェント（受動体）に影響する疾患の存在または不存在またはタイプを定めるのに適用することができる。たとえば、図3は、ここで記載される検出方法と組み合わせて処置を提供する方法の概要を例証する。601は、ペイシェントからのサンプルを取るために用意をする臨床医を図解する。いくらかのケースでは、サンプルは血液サンプルであってよい。いくらかの場合において、サンプルは組織サンプルでありうる。602は三つの濃度（例は、各チューブにおいて別々の濃度）に希釈されるサンプルを図解する。603は増幅または重合ステップ（例は、PCR）を示す。604は増幅または重合ステップからの生成物を示す。605は分析の結果をペイシェントに返す臨床医を示す。
【０１６０】
IX．組成物およびキット
【０１６１】
本開示はまた、ここで記載される方法で使用するための組成物およびキットを提供する。組成物には、ここで記載される任意の成分、反応混合物および/または中間体、ならびにそれらの任意の組合せが含まれうる。たとえば、本開示は、ここで提供される方法と共に使用するための検出試薬を提供する。任意の適切な検出試薬は、本明細書において他のどこかで説明されるように、二つの異なる発色団（例は、フルオロフォアおよびクエンチャー）に取り付けられるプライマー対を含め、提供することができる。
【０１６２】
いくらかの場合において、組成物には、少なくとも一の分析対象の検出のための第一および第二プライマーまたはプローブを含み、そこでは、プライマーはその5'端でフルオロフォアまたはクエンチャーのいずれかに取り付けられる。いくらかの場合において、組成物には、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、100、500、1000、5000、または10000の分析対象の検出のためのフルオロフォアまたはクエンチャーのいずれかと共に5'端で取り付けられるプライマーが含まれる。いくらかの場合において、組成物には、マルチプルな異なるフルオロフォアまたはクエンチャーに取り付けられるプライマーが含まれ、そこでは、少なくとも一のフルオロフォアまたはクエンチャーは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、100、500、1000、5000、または10000の分析対象の検出のために5'端にある。いくらかの場合において、組成物には、第一および第二ライマーのマルチプルな対が含まれ、そこでは、第一および第二プライマーの各対には、5'端でフルオロフォアまたはクエンチャーのいずれかが含まれる。いくらかの場合において、第一および第二プライマーの各対には、プライマーの残りのセットとは異なるフルオロフォアおよびクエンチャーが含まれる。いくらかの場合には、組成物には、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、100、500、1000、5000、または10000の第一および第二プライマーの対が含まれる。
【０１６３】
本開示はまた、本発明の方法を遂行するためのキットを提供する。したがって、様々なキットは適切なパッケージングにおいて提供される。キットはここで記載される使用のいずれか一以上のために使用することができ、そして、それに応じて、各分析対象または複数の分析対象の存在または不存在を検出するためのインストラクション（命令）を含んでもよい。キットは、診断キットであってもよく、たとえば、ここで記載される分析対象を含め、一以上の分析対象の検出に適した診断キットである。キットは、上記のものを含め、この開示において提供される任意の組成物を含むことができる。
【０１６４】
X．サービス
【０１６５】
ここで提供される方法はまた、サービスとして実行することができる。たとえば、サービスプロバイダーは、顧客が分析するのを希望する複数の分析対象のアイデンティティーを取得しうる。サービスプロバイダーは次に、ここで記載される任意の方法によって検出される各分析対象をエンコード（暗号化）し、およびアッセイのために顧客に適切な試薬を提供しうる。顧客は、アッセイを実行し、およびデコーディング（復号化）のためにサービスプロバイダーに結果を提供しうる。サービスプロバイダーは次に、顧客にデコード化した結果を提供することができる。また、顧客は、ローカルで（顧客の位置で）、またはリモートで（例は、ネットワークを介して到達可能なサーバー上に）インストールしたソフトウェアと相互作用することによって、分析対象をエンコードし、プローブを生成し、および/または結果をデコードしうる。模範的な顧客には、臨床研究所、医師や、食物および消費者製品の製造者、産業上の製造業者（例は、石油会社）および同様のたのものなどが含まれる。顧客または当事者は、本発明の方法、システム、組成物、およびキットを使用するために必要性または願望を有する任意の適切な顧客または関係者であってもよい。
【０１６６】
A．サーバー
【０１６７】
ここで提供される方法は、サーバーまたはコンピュータサーバーで処理することができる（図4）。サーバー1101には、シングルコアプロセッサー、マルチコアプロセッサー、または並列処理のために複数のプロセッサーであることができる中央処理ユニット（CPU、また、「プロセッサー」）1105が含まれる。コントロールアセンブリーの一部として使用されるプロセッサーは、マイクロプロセッサーであってもよい。サーバー1101にはまた、メモリ1110（例は、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリ、フラッシュメモリ）；電子記憶ユニット1115（例は、ハードディスク）；一以上の他のシステムと通信するための通信インターフェース1120（例は、ネットワークアダプター）；キャッシュ、他のメモリ、データ記憶装置、および/または電子ディスプレイアダプターを含むことができる周辺装置1125が含まれる。メモリ1110、記憶ユニット1115、インターフェース1120、および周辺装置1125は通信バス、たとえば、マザーボードなどのようなものを介してプロセッサー1105と通信する（実線）。記憶ユニット1115はデータを記憶するためのデータ記憶ユニットであることができる。サーバー1101は、通信インターフェース1120の助けを借りて、コンピュータネットワーク（「ネットワーク」）1130に動作可能なように結合される。追加のハードウェアの助けを借りてプロセッサーはまた、ネットワークに動作可能なように結合することができる。ネットワーク1130は、インターネットイントラネットおよび/またはエクストラネットや、インターネット、電気通信またはデータネットワークと通信するイントラネットおよび/またはエクストラネットであることができる。いくらかの場合には、ネットワーク1130は、サーバー1101の助けを借りて、クライアントまたはサーバーとして機能するためにサーバー1101に接合されたデバイスを有効にすることができるピア・ツー・ピアネットワークを実装することができる。大抵は、サーバーは、コンピュータ読み取り可能な命令（例は、装置/システム操作プロトコルまたはパラメータ）またはデータ（例は、センサ測定、核酸を検出することから得られる生データ、核酸を検出することから得られる生データの解析、核酸を検出することから得られる生データの解釈、など）を、ネットワーク1130を介して輸送する電子信号を介して送受信することが可能である。また、ネットワークは、たとえば、国境線を横切ってデータを送信または受信するために使用されてもよい。
【０１６８】
サーバー1101は、一以上の出力装置1135、たとえば、ディスプレイまたはプリンタなどのようなものと、および/または１以上の入力装置1140、たとえば、キーボード、マウス、ジョイスティックなどののようなものと通信するすることができる。ディスプレイは、タッチスクリーンディスプレイであってもよく、その場合、それは表示装置および入力装置の両方として機能しうる。異なる、および/または追加の入力装置は、そのようなエナンシエーター（発音器）、スピーカ、マイクで存在してもよい。サーバーは、多様なオペレーティングシステム、たとえば、いくつかのバージョンのWindowsの、またはMacOSの、またはUnixの、またはLinuxのいずれか一つなどのようなものを使用することができる。
【０１６９】
記憶ユニット1115は、ここで記載される装置または方法の操作に関係するファイルまたはデータを蓄えることができる。
【０１７０】
サーバーはネットワーク1130を介し一以上のリモートコンピュータシステムと通信することができる。一以上のリモートコンピュータシステムは、たとえば、パーソナルコンピュータ、ラップトップ、タブレット、電話、スマートフォン、またはパーソナルデジタルアシスタント（携帯端末）であることができる。
【０１７１】
いくらかの状況では、コントロールアセンブリーには、単一のサーバー1101が含まれる。他の状況では、システムは、イントラネット、エクストラネットおよび/またはインターネットを介して相互に通信するマルチプルなサーバーが含まれる。
【０１７２】
サーバー1101は、記憶装置操作パラメータ、プロトコル、ここで記載される方法、および潜在的関連性の他の情報に適合させることができる。そのような情報は、記憶ユニット1115またはサーバー1101上に蓄えることができ、およびそのようなデータはネットワークを介して送信することができる。
【実施例】
【０１７３】
例1：DNA配列、プライマーおよびプローブ
【０１７４】
ヒト免疫不全ウイルス1（HIV-1）ポリプロテアーゼ遺伝子からの合成核酸分析対象を、増幅または重合技術を使用して模範的な検出試験のために選定した。この遺伝子からのテンプレートは、40bp-80bpから様々な長さのもので、それらを合成した。
【０１７５】
臨床的関連性の生物から七つの核酸分析対象を、マルチプレックスPCR技術を使用して模範的な検出試験のために選んだ。これらの分析対象は、インフルエンザA型（InfA）、インフルエンザB型（InfB）、呼吸器合胞体ウイルスA型（RsvA）、呼吸器合胞体ウイルスB型（RsvB）、ヒトライノウイルス（Hrv）、およびヒトメタニューモウイルス（Hmpv）が含まれる。ヒトパラインフルエンザウイルス3型（PIV-3）のための追加の分析対象は、直交コントロールとして実行するように含まれた。マルチプレックス分析対象は、ここでのこの開示において他のどこかで記載されるバイナリースキームを用いてコードされた。
【０１７６】
すべてのオリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies（インテグレーテッドDNAテクノロジーズ）〔Coralville（コラルビレ）、Iowa（アイオワ州）〕によって合成された。診断の配列は、IDTのOligoAnalyzer（オリゴアナライザー）3.1ツールに入力された。各分析対象のためのプローブおよびプライマー対は、意図されたものでない分析対象、プローブおよびプライマーとの相同性を最小にするために、生成されたシ配列のOligoAnalyzerのセットから選定された。すべての分析対象のためのフォワードプライマーは、5フルオロフォアを用い5'端で合成され、その一方、すべての分析対象のためのリバースプライマーはクエンチャーを用いて5'端で合成された。配列情報は、表1ないし8にまとめる。核酸生成物はIDTによって合成し、および凍結乾燥された。すべての核酸分析対象をTEバッファー、ph7中で再構成した〔Life Technologies（ライフテクノロジー社）、Carlsbad（カールズバッド）、CA（カリフォルニア州）〕。希釈はUltraPure RNAse-free Water（超純粋RNaseフリー水）（Life Technologies、Carlsbad、CA）を用いて行った。
【０１７７】
例2：プライマーデザイン
【０１７８】
特定のプライマーおよびプローブは分析対象の遺伝子の保存領域を用いて設計した。インフルエンザAおよびBのためのプライマーは、核タンパク質の遺伝子において設計された。RSV AおよびRSV Bのためのプライマーは、保存された融合タンパク質遺伝子において設計された。HRVのためのプライマーは、5'-UTR領域において設計され；HMPVのためのプライマーは融合タンパク質遺伝子において設計された。ヒトPIV-3のためのプライマーはヘマグルチニン遺伝子の保存領域において設計された。
【０１７９】
確立されたGenBank（ジェンバンク）受入番号は、インフルエンザA、インフルエンザB、HRV、HMPV、およびPIV-3のために使用された。RSV AおよびRSV Bについては、以前の研究で使用したプライマー〔Jansen（ジャンセン）ら、「Development and evaluation of a four-tube real time multiplex PCR assay covering fourteen respiratory viruses, and comparison to its corresponding single target counterparts（一四の呼吸器系ウイルスをカバーする四チューブリアルタイムマルチプレックスPCRアッセイの開発と評価、およびその対応する単一ターゲット対応物との比較）」、Journal of Clinical Virology（ジャーナル・オブ・クリニカル・バイオロジー）、51.3、（2011）：179-185；およびChun（チョン）ら、「Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene（呼吸器系ウイルスのマルチプレックス検出およびCYP2C19遺伝子のSNP遺伝子型決定のための二重プライミングオリゴヌクレオチドシステム）」、Nucleic Acids Research（ヌクレイック・アシッズ・リサーチ）、35.6（2007）：e40〕はBLAST中に入力され、および完全なコード配列情報との高い相同性に対応する受入番号は選定された。プライマーの設計に使用されるウイルス配列のための受入番号は表2-8に見出すことができる。配列は、アカウントのプライマーサイズ、アンプリコンサイズ、G-C％、反応速度論の類似性を考慮するためにパラメータセットと共にPrimer Quest（プライマー・クエスト）ソフトウェア中にアップロードした（Integrated DNA Technologies、Coralville、Iowa）。BLAST検索は、プライマーおよびプローブの配列の特異性を確認するために実行した。選定されたプライマー対はOligoAnalyzer 3.1に入れられ、およし自己二量体化およびヘテロ二量体化のために分析された。プライマー配列およびそれらの特性は表2-8に見出すことができる。
【０１８０】
【表１】
2016509480.tif 000004
【０１８１】
【表２】
2016509480.tif 000005
【０１８２】
【表３】
2016509480.tif 000006
【０１８３】
【表４】
2016509480.tif 000007
【０１８４】
【表５】
2016509480.tif 000008
【０１８５】
【表６】
2016509480.tif 000009
【０１８６】
【表７】
2016509480.tif 000010
【０１８７】
【表８】
2016509480.tif 000011
【０１８８】
例3：ポリメラーゼ連鎖反応
【０１８９】
PCR反応はRoche 480 LightCycler（ロッシュ480ライトサイクラー）機器〔Roche Applied Science（ロシュ・アプライド・サイエンス）、Penzberg（ペンツベルク）、Germany（ドイツ）〕にて実行した。PCRサイクリング反応は、95℃で60秒間ホットスタートを用い、45サイクルの間行った。サイクリング条件は以下の通りであった：45秒間の95℃での変性、120秒間45℃でのアニーリング、および120秒間58℃での伸長である。各実験は、15μLの反応容量を用いで、6通りで行った。523nm-568nm（Cy3）および615nm-670nm（Cy5）においての蛍光測定値は、あらゆるサイクルについてアニーリングの終了時に取得した。最初および最後の測定値（反応停止信号）の間の蛍光強度においての変化を、各実験について測定した。
【０１９０】
ポジティブコントロール実験は、各分析対象についてのベースラインクエンチングレベルを定めるために実行し、およびプライマーを設定した。唯一の分析対象はそれらに関連するプローブを用いて実験1-10においてサイクルに供し、および表9-18にまとめた。
【０１９１】
各実験では、サイクリングデータの不確定性は特定の増幅反応の最後の5サイクルにおいての値の広がりによって定めた。この不確定性は、合計信号の値に対応せず、それは、不確定性の源が実験的であるというよりインストルメンタルであることを暗示した。1×フルオロフォア（200nm）ベースラインは200nMの濃度でのデータのセットの統計分析によって定められた。期待された乗法信号レベルはマルチプリシティーによりこのベースラインを乗ずることによって定められた。蛍光強度においての変化は図5-9に描かれるクロマトグラムにおける期待された信号レベルを組み立てるために用いられた。。
【０１９２】
例4：HIV TPP分析対象の検出
【０１９３】
図5は、例1-3において記載される分析対象、プライマーおよび方法を用いるHIV TPP分析対象の好首尾な検出を示す。初期の実験は、10nMから10pM（A-D）までの変動する濃度での80bp HIV TPP分析対象の定量的PCR（qPCR）検出を示した。すべての好首尾な検出曲線は、インバースシグモイド（逆S字形状）の特性を見せた。図6は、検出アッセイがHIV TPPの低濃度を検出するために使用することができることを示す。実験は、検出アッセイが、1pMおよび100fMの間（図6Aおよび図6B）のHIV TPPを検出することが可能であったことを証明した。図7はクエンチングの長さ依存性を示す。実験は、クエンチングの程度がクエンチャーおよびフルオロフォアの間の分離長さに強く相関することを示した（図7A-7C）。分析対象はプライマーの単一セットのための40bpから120bpまでの長さにおいて変動した。
【０１９４】
例5：一塩基多型の検出
【０１９５】
図8は一塩基多型の検出を示す。ミスプライミングイベントが発生したとき信号レベルが有意に変化した（信号において約35％減少）（図8Aおよび図8B）。観察された効果は信号変化のメカニズムが標識された分析対象の発色団の間で電子移動に関与したことを示唆する。
【０１９６】
例6：分析対象のバイナリーコーディングを使用するマルチプレックス検出
【０１９７】
図9は分析対象のバイナリーコーディング（二値化）を示す。3プレックスCY3アッセイにおける分析対象はバイナリー離間プライマー濃度を用いてコードされた。TaqMan陽性コントロール配列は、PCRが好首尾に完了したことを確認するために、あらゆる反応で増幅された。
【０１９８】
例7：タグ付きプライマーPCR
【０１９９】
この例は、プライマーにて発色団を組み込むこと、およびPCR反応を行うことにより、サンプルにおいてDNA分析対象を直接検出する方法を記載する。この方法は、PCR生成物を直接検出し、およびたとえば、ゲル電気泳動などのような二次検出技術を必要としない。例として、模範的な分析対象を図10Aに示す。フォワード（FWD）およびリバースまたは巻き戻し（RWD）プライマーは、クエンチャーおよびフルオロフォアが、それぞれ、各プライマーの5'に連結されるように設計される（図10B）。プライマーは、非結合クエンチングを制限するために適切な濃度で選定される。PCR反応の最初のサイクルが行われる前に、全蛍光強度は10である。PCRの最初のサイクルの間、この強度レベルは、フルオロフォアおよびクエンチャーの両方を組み込んだDNA分析対象が存在しないので、典型的に不変である（図10C）。信号においての減少は第二PCRサイクルの完了の際観察される（図10D及び10E）。サイクルが進行するとき、平均して、合計蛍光信号はサイクルごとに2倍に減少する。サイクルの二つの終点での蛍光強度は約10/2であり、それはアンチセンス鎖上のフルオロフォアがセンス鎖上のクエンチャーによってクエンチングされるからである。その分析対象のためのプライマーの供給が消耗されるまで、蛍光信号のこの減衰は継続される。このように、DNA分析対象のための「暗視野」測定は各サイクル後の蛍光の強度を調べることにより得られる。
【０２００】
例8：種々の発色団の組合せを使用するマルチプレックス検出
【０２０１】
この例は、分析対象特異的プライマーの各対のための種々の発色団の組合せを使用して単一のPCR反応においてマルチプルなDNA分析対象を区別するための技術を記載する。図11に示すような色のマルチプレックスの異なる鎖は、マルチプルな分析対象間を区別するために使用される。暗視野曲線はPCR実行後に生成される。これら暗視野曲線から、初期濃度が補間される。
【０２０２】
例9：単一の発色団の組合せを使用するマルチプレックス検出
【０２０３】
この例は、分析対象特異的プライマーの各対のための同じ発色団の組合せを使用して単一のPCR反応において様々な長さのマルチプルなDNA分析対象を区別するための技術を記載する。異なる長さ（例は、40bp、60bp、および80bp）の分析対象は、単一のフルオロフォア/クエンチャーの組合せを用いて検出される。より一層長い分析対象は、クエンチャーおよびフルオロフォア間のより一層大きな分離を有し、そしてそれ故、異なるエンドポイント蛍光レベルを見せる。重ね合わせにおいて、分析対象の異なる組合せは異なる蛍光レベルをコードする。核酸分析対象のさらなる識別は、溶融曲線分析を用いて実行される。より一層低い分子量の分析対象はより一層低い温度で変性する。温度上昇の関数として蛍光を測定することにより、単一のカラーチャネルにおいてのマルチプルな分析対象が定量される。
【０２０４】
例10：形態の検出
【０２０５】
この例は、マルチプルな発色団を使用して分析対象（例は、DNA分析対象）の形態の特徴を説明する。図12に示したDNA分析対象は、所定の温度で特定の形態を有する。この形態は蛍光シグナチャーをもたらす。温度を変化させることはDNA分析対象の異なる形態を招き、それは次には別の蛍光シグナチャーをもたらす（図13）。分析対象（たとえば、図12に示されるDNA分子などのようなもの）の形態のためのシグナチャーは、温度のランピング（傾斜）および蛍光シグナチャーを定めることによって得られる。これらのシグナチャーをスーパーインポーズ（重畳）することにより、DNA分子のための三次元折り畳みモデルが得られる。
【０２０６】
本開示の好適な開示をここで示し、および説明してきたが、そのような開示が例としてのみ提供されるものであることは、当業者には明らかであろう。多数の変形、変化、および置換が、本開示から離れることなく当業者にすぐに思い浮かぶであろう。ここで記載される開示に対する様々な代替物が本発明を実践する際に使用されてもよいことが理解されるべきである。次の請求の範囲が本発明の範囲を規定し、およびこれらの請求の範囲の視野およびそれらの等価物の範囲内の方法および構造がそれによりカバーされることが意図される。
【０２０７】
【表９】
2016509480.tif 000012
【０２０８】
【表１０】
2016509480.tif 000013
【０２０９】
【表１１】
2016509480.tif 000014
【０２１０】
【表１２】
2016509480.tif 000015
【０２１１】
【表１３】
2016509480.tif 000016
【０２１２】
【表１４】
2016509480.tif 000017
【０２１３】
【表１５】
2016509480.tif 000018
【０２１４】
【表１６】
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【０２１５】
【表１７】
2016509480.tif 000020
【０２１６】
【表１８】
2016509480.tif 000021
【図２】
2016509480.tif 000022
【図４】
2016509480.tif 000023
【図１２】
2016509480.tif 000024
【図１３Ａ】
2016509480.tif 000025
【図１３Ｂ】
2016509480.tif 000026
【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
2016509480.tif 000028
【図１】
2016509480.tif 000029
【図３】
2016509480.tif 000030
【図５Ａ】
2016509480.tif 000031
【図５Ｂ】
2016509480.tif 000032
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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