(57)【要約】  ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質に対する免疫応答を生成するためのタンパク質抗原及び前記タンパク質抗原に共有結合した免疫原性担体を含むタンパク質コンジュゲートであって、前記タンパク質抗原が（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列の３００又はそれ以上の連続アミノ酸の配列セグメントを有する；又は（ｉｉ）３００又はそれ以上のアミノ酸残基の変異体配列セグメントを有し、前記変異体配列セグメントのアミノ酸配列が、配列番号１からの配列部分と少なくとも８５％の配列同一性を有する；又は（ｉｉｉ）３００又はそれ以上のアミノ酸残基の変異体配列セグメントを有し、配列番号１又は２のアミノ酸配列の３００又はそれ以上のアミノ酸残基の配列セグメントと比較して、前記変異体配列セグメントにおいて１〜１０の置換、欠失、又は付加を有しているタンパク質コンジュゲート。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質抗原及び前記タンパク質抗原に共有結合した免疫原性担体を含むタンパク質コンジュゲートであって、前記タンパク質抗原が
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列の３００又はそれ以上及び最大で４００の連続アミノ酸の配列セグメントを有する；又は
（ｉｉ）３００又はそれ以上及び最大で４００のアミノ酸残基の変異体配列セグメントを有し、前記変異体配列セグメントのアミノ酸配列が、配列番号１からの配列部分と少なくとも８５％の配列同一性を有する；又は
（ｉｉｉ）３００又はそれ以上及び最大で４００のアミノ酸残基の変異体配列セグメントを有し、配列番号１又は２のアミノ酸配列の３００又はそれ以上のアミノ酸残基の配列セグメントと比較して、前記変異体配列セグメントにおいて１〜２０の置換、欠失、又は付加を有している、上記タンパク質コンジュゲート。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列の３００又はそれ以上の連続アミノ酸残基のタンパク質抗原の配列セグメントが、配列番号１のアミノ酸３３２から６３１までのアミノ酸配列セグメント又は項目（ｉｉ）若しくは（ｉｉｉ）において定義する通りの変異体配列セグメントを含む、請求項１に記載のタンパク質コンジュゲート。
【請求項３】
前記タンパク質抗原が、配列番号２のアミノ酸配列の３００又はそれ以上の連続アミノ酸残基の配列セグメントを有する、又は
前記タンパク質抗原が、３００又はそれ以上のアミノ酸残基の変異体配列セグメントを有し、前記変異体配列セグメントのアミノ酸配列が、配列番号２からの配列部分と少なくとも８５％の配列同一性を有する、
請求項１又は２に記載のタンパク質コンジュゲート。
【請求項４】
前記タンパク質抗原又は前記タンパク質コンジュゲートが、以下のさらなるアミノ酸配列セグメント：
配列番号１８のアミノ酸１から２５３、好ましくは１から２８３からの配列部分からの、又はアミノ酸６７０から、好ましくはアミノ酸６５４から開始する配列部分からの２０又はそれ以上、好ましくは１０又はそれ以上の連続アミノ酸残基のさらなるアミノ酸配列セグメント；或いは、
配列番号１８のアミノ酸１から２５３、好ましくは１から２８３からの配列部分、又はアミノ酸６７０から開始する配列部分と５０％を上回る配列同一性を有する２０を上回る連続アミノ酸残基のさらなるアミノ酸配列セグメント
を含まない、請求項１から３までのいずれか一項に記載のタンパク質コンジュゲート。
【請求項５】
前記タンパク質抗原又は前記タンパク質コンジュゲートが、配列番号１８のＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質の膜貫通ドメイン又は細胞内ドメインからの１０又はそれ以上、好ましくは５又はそれ以上の連続アミノ酸残基のアミノ酸配列セグメントを含まない、請求項１から４までのいずれか一項に記載のタンパク質コンジュゲート。
【請求項６】
前記タンパク質抗原が、さらなるセグメントとして、そのＮ又はＣ末端の６Ｘ−Ｈｉｓタグなど精製タグ、又は抗体軽鎖の定常領域、及び、任意選択で、前記精製タグと前記タンパク質抗原の配列セグメントを連結するリンカーを含む、請求項１から５までのいずれか一項に記載のタンパク質コンジュゲート。
【請求項７】
前記タンパク質抗原の少なくとも７アミノ酸残基長の任意のさらなる配列セグメントが、配列番号１８の同一の長さの任意の配列部分と５０％未満のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１から６までのいずれか一項に記載のタンパク質コンジュゲート。
【請求項８】
前記免疫原性担体が、免疫原性タンパク質又は免疫原性タンパク質凝集体であるか、又はそれを含み、好ましくは、前記免疫原性タンパク質が、破傷風毒素フラグメントＣ又はそのＤＯＭ１フラグメントであるか、又はそれを含み、或いは、前記タンパク質凝集体が、ウイルス粒子、例えば植物ウイルス粒子などである、請求項１から７までのいずれか一項に記載のタンパク質コンジュゲート。
【請求項９】
免疫原性担体タンパク質は、その配列セグメントが、配列番号１８の同一の長さの任意の配列部分と５０％を上回るアミノ酸配列同一性を有する、２０又はそれ以上の、好ましく１０又はそれ以上の連続アミノ酸残基のアミノ酸配列セグメントを有さない、請求項１から８までのいずれか一項に記載のタンパク質コンジュゲート。
【請求項１０】
項目（ｉｉｉ）の前記変異体配列セグメントは、配列番号１又は２の前記アミノ酸配列と比較して、前記変異体配列セグメントにおいて１〜１０の置換、欠失、又は付加を有している；又は
項目（ｉｉｉ）の前記変異体配列セグメントは、配列番号１又は２の前記アミノ酸配列と比較して、前記変異体配列セグメントにおいて１〜１０の欠失又は付加を有している、
請求項１から９までのいずれか一項に記載のタンパク質コンジュゲート。
【請求項１１】
前記タンパク質抗原と前記免疫原性担体が、化学的架橋剤を使用した化学的架橋により共有結合されている、請求項１から１０までのいずれか一項に記載のタンパク質コンジュゲート。
【請求項１２】
前記タンパク質抗原が、哺乳動物においてＨＥＲ２タンパク質に対する免疫応答を誘発するための第１の配列セグメント及び、任意選択で、さらなる配列セグメントからなり、前記第１の配列セグメントは
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列の３００又はそれ以上の連続アミノ酸残基のアミノ酸配列を有する；又は
（ｉｉ）３００又はそれ以上のアミノ酸残基の変異体アミノ酸配列を有し、前記変異体配列セグメントのアミノ酸配列は、配列番号２からの配列部分と少なくとも８５％の配列同一性を有する；又は
（ｉｉｉ）３００又はそれ以上のアミノ酸残基の変異体アミノ酸配列を有し、配列番号２のアミノ酸配列の３００又はそれ以上のアミノ酸残基の配列セグメントと比較して、前記変異体配列において１〜２０の置換、欠失、又は付加を有し；
前記タンパク質抗原又は前記タンパク質コンジュゲートは、配列番号１８のアミノ酸１から２５３、好ましくは１から２８３からの配列部分からの、又はアミノ酸６７０から、好ましくはアミノ酸６５４から開始する配列部分からの２０又はそれ以上、好ましくは１０又はそれ以上の連続アミノ酸残基のさらなるアミノ酸配列セグメントを含まず；
並びに、前記タンパク質抗原及び前記免疫原性担体は、化学的架橋剤を使用した化学的架橋により共有結合されている、
請求項１から１１までのいずれか一項に記載のタンパク質コンジュゲート。
【請求項１３】
請求項１から１１までのいずれか一項に記載のタンパク質抗原。
【請求項１４】
配列番号１８のアミノ酸１から２５３、好ましくは１から２８３からの配列部分からの、又はアミノ酸６７０から、好ましくはアミノ酸６５４から開始する配列部分からの２０又はそれ以上、好ましくは１０又はそれ以上の連続アミノ酸残基のさらなるアミノ酸配列セグメントを含まない、請求項１３に記載のタンパク質抗原。
【請求項１５】
第１の配列セグメント及び、任意選択で、さらなる配列セグメントからなるタンパク質抗原であって、
前記第１の配列セグメントが、３００又はそれ以上の連続アミノ酸残基の配列セグメント又は請求項１から１２までのいずれか一項に記載の前記変異体配列セグメントであり、及び
配列番号１８の同一の長さの任意の配列部分と５０％未満のアミノ酸配列同一性を有する、少なくとも２０、好ましくは少なくとも１０アミノ酸残基長の前記さらなる配列セグメントのいずれかである、上記タンパク質抗原。
【請求項１６】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質のアミノ酸配列とアミノ酸配列類似性を有する第１のアミノ酸配列セグメント、及び、任意選択で、１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列セグメントからなるタンパク質抗原であって、前記第１の配列セグメントが、
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列の３００又はそれ以上の連続アミノ酸残基のアミノ酸配列を有する；又は
（ｉｉ）３００又はそれ以上のアミノ酸残基の変異体アミノ酸配列を有し、前記変異体配列セグメントのアミノ酸配列が、配列番号２からの配列部分と少なくとも８５％の配列同一性を有する；又は
（ｉｉｉ）３００又はそれ以上のアミノ酸残基の変異体アミノ酸配列を有し、配列番号２のアミノ酸配列の３００又はそれ以上のアミノ酸残基の配列セグメントと比較して、前記変異体配列において１〜２０の置換、欠失、又は付加を有し；及び
２０又はそれ以上、好ましくは１０又はそれ以上の連続アミノ酸残基の任意のさらなるアミノ酸配列セグメントが、配列番号１８のアミノ酸１から２５３、好ましくは１から２８３からの配列部分、又はアミノ酸６７０から、好ましくはアミノ酸６５４から開始する配列部分を含まず；或いは、
２０を上回る連続アミノ酸残基のさらなる任意のアミノ酸配列セグメントが、配列番号１８のアミノ酸１からアミノ酸２５３、好ましくは１から２８３からの配列部分、又はアミノ酸６７０から、好ましくはアミノ酸６５４から開始する配列部分と５０％を上回る配列同一性を有さない、上記タンパク質抗原。
【請求項１７】
請求項１３から１６までのいずれか一項に記載のタンパク質抗原をコードする核酸配列。
【請求項１８】
請求項１から１６までのいずれか一項に記載のタンパク質抗原及びタンパク質コンジュゲートを形成するために前記タンパク質抗原と架橋するための免疫原性タンパク質又はタンパク質凝集体を含むキット。
【請求項１９】
請求項１から１２までのいずれか一項に記載のタンパク質コンジュゲート又は請求項１３から１６までのいずれか一項に記載のタンパク質抗原を含む抗癌ワクチン。
【請求項２０】
前記タンパク質コンジュゲートが分散している水、及び、任意選択で、さらに、薬学的に許容される添加剤をさらに含む、請求項１９に記載の抗癌ワクチン。
【請求項２１】
免疫学的アジュバントをさらに含む、請求項１９又は２０に記載の抗癌ワクチン。
【請求項２２】
請求項１から１２までのいずれか一項に記載のタンパク質コンジュゲート、又は、請求項１３から１６までのいずれか一項に記載のタンパク質抗原、又は、請求項１９から２１までのいずれか一項に記載の抗癌ワクチンを、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ陽性癌に罹患している患者に１から複数回投与することを含む、そのような癌に罹患している患者においてＨＥＲ２／Ｎｅｕ陽性癌を処置する方法。
【請求項２３】
ＨＥＲ２／Ｎｅｕ陽性癌を処置する方法における使用のための、請求項１から１２までのいずれか一項に記載のタンパク質コンジュゲート、又は、請求項１３から１６までのいずれか一項に記載のタンパク質抗原、又は、請求項１９から２１までのいずれか一項に記載の抗癌ワクチン。
【請求項２４】
前記タンパク質抗原又は前記変異体を準備すること、前記タンパク質抗原又は前記変異体を前記免疫原性担体と架橋することを含む、請求項１から１２までのいずれか一項に記載のタンパク質コンジュゲートを生成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕの細胞外ドメインからのタンパク質抗原又はＨｅｒ２／Ｎｅｕの細胞外ドメインの特定の部分に対して高い配列同一性若しくは類似性を有するタンパク質抗原を含むタンパク質コンジュゲートに関する。本発明は、また、タンパク質抗原に関する。タンパク質コンジュゲートは、タンパク質抗原、及びタンパク質抗原に共有結合した免疫原性担体を含む。タンパク質コンジュゲート又はタンパク質抗原は、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ陽性癌のための癌ワクチンとして使用することができる。本発明は、さらに、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ陽性癌に対する癌ワクチンを提供する。癌ワクチンは、タンパク質コンジュゲート又はタンパク質抗原並びに適切なアジュバント及び／又は薬学的に許容される添加剤を含む。本発明は、また、癌ワクチンを用いたＨｅｒ２／ｎｅｕ陽性癌を予防及び／又は処置する方法を提供する。タンパク質コンジュゲートを産生するプロセスがさらに提供される。さらに、本発明は、タンパク質抗原をコードする核酸、及びタンパク質コンジュゲートを産生するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト上皮成長因子受容体Ｈｅｒ２は、Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２、又はｐ１８５としても公知であり、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ）ファミリーのメンバーであり、ＥＲＢＢ２遺伝子によりコードされる。本明細書において、用語「ＨＥＲ２」又は「Ｈｅｒ２」及び「Ｈｅｒ２／ｎｅｕ」は互換的に使用される。ＥｒｂＢファミリーの他のメンバーとしては、Ｈｅｒ２が、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び下流のシグナル伝達分子と相互作用することができる細胞内ドメインで構成される膜結合型受容体チロシンキナーゼである。他のファミリーのメンバーとは異なり、ＨＥＲ２は、それが公知のリガンドを有さないため、オーファン受容体であると考えられる。ＨＥＲ２は、他のＥｒｂＢファミリー受容体とヘテロ二量体化することができ、それらの好ましい二量体化パートナーであると考えられる。二量体化は、受容体の細胞質ドメイン内のチロシン残基の自己リン酸化をもたらし、増殖及びアポトーシスの阻害に導く種々のシグナル伝達経路を開始する。
【０００３】
ＥＲＢＢ２遺伝子の増幅は、ヒトの乳癌及び卵巣癌の２０〜３０％において発生し、より侵襲性の疾患経過及び予後不良に関連付けられる（Ｂａｎｇｅ，Ｊ．、Ｚｗｉｃｋ  Ｅ．＆Ｕｌｌｒｉｃｈ  Ａ．、２００１、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、７：５４８−５５２；Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．Ｊ．、Ｃｌａｒｋ，Ｇ．Ｍ．、Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｇ．ら、１９８７’  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５：１７７−１８２；Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．Ｊ．、Ｇｏｄｏｌｐｈｉｎ，Ｗ．、Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ａ．ら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：７０７−７１２；Ｂｅｒｃｈｕｃｋ，Ａ．、Ｋａｍｅｌ，Ａ．、Ｗｈｉｔａｋｅｒ．Ｒ．、ら、１９９０，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０：４０８７−４０９１）。ＥＲＢＢ２＋腫瘍細胞において、受容体が独自に機能することができ、及び／又は、それは、細胞の腫瘍性挙動に関与する脱制御増殖シグナルを伝達するために、別のＥｒｂＢメンバーとヘテロ二量体化する必要がある。
【０００４】
近年では、ＨＥＲ２は、特にモノクローナル抗体治療による乳癌の治療のための重要な標的として進化しており、例えば、ハーセプチン（トラスツズマブ）は、この表面標的に対するヒト化モノクローナル抗体であり、１９９８年にＦＤＡにより承認されている。ハーセプチンは、ＨＥＲ２陽性乳癌患者の生存率に有意な影響を有する（Ｔａｎ，Ａ．Ｒ．＆Ｓｗａｉｎ，Ｓ．Ｍ．、２００２、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、３０：５４−６４）。ＨＥＲ２ホモダイマーに対して活性であるが、トラスツズマブは、リガンド誘導性ＨＥＲ２ヘテロ二量体に対して効果的ではない（Ａｇｕｓ，Ｄ．Ｂ．、Ａｋｉｔａ，Ｒ．Ｗ，、Ｆｏｘ，Ｗ．Ｄ．、ら、２００２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、２：１２７−１３７；Ｃｈｏ，Ｈ．Ｓ．、Ｍａｓｏｎ，Ｋ．、Ｒａｍｙａｒ，Ｋ．Ｘ，、ら、２００３、Ｎａｔｕｒｅ、４２１：７５６−６０）。また、癌は、通常、トラスツズマブへの耐性を発生する（Ｃｈｏ，Ｈ．Ｓ．、Ｍａｓｏｎ，Ｋ．、Ｒａｍｙａｒ，Ｋ．Ｘ．、ら、２００３、Ｎａｔｕｒｅ，４２１：７５６−７６０）。トラスツズマブは、末期の転移性癌の処置のために効率的であるが、それが初期段階の癌に効果的であるか否かは明らかではない（Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ、２００５、Ｌａｎｃｅｔ、３６６：１６７３）。
【０００５】
２０１２年６月、ＦＤＡは、転移性疾患のために先行する抗ＨＥＲ２療法又は化学療法を受けていない患者のために、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）とドセタキセル化学療法の組み合わせにおいて、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性転移性乳癌の処置のために、さらに別のモノクローナル抗体ペルツズマブ（ＵＳ７４４９１８４；ＵＳ７９８１４１８）を承認した（２０１２年６月８日のＧｅｎｅｎｔｅｃｈ  プレスリリースｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅ．ｃｏｍ／ｇｅｎｅ／ｎｅｗｓ／ｐｒｅｓｓ−ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｄｉｓｐｌａｙ．ｄｏ？ｍｅｔｈｏｄ＝ｄｅｔａｉｌ＆ｉｄ＝１４００７）。このアプローチによって、中央値６．１ヶ月間にわたり患者の癌無進行期間を延長することが可能であった。
【０００６】
治療用抗体を用いたＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性癌の処置の代替又は補完として、異なる癌ワクチンが現在テスト中である。このアプローチは、癌治療において最も劇的なシフトを提供する。なぜなら、患者自身の免疫系が訓練され、ＨＥＲ２陽性癌細胞を認識し、除去することができうるからである。異なるワクチン設計（単純なペプチド、ＨＥＲ２領域をコードするＤＮＡ、ＨＥＲ２タンパク質フラグメント、及び全細胞ワクチン）は、ヒト臨床治験においてテストされ、耐久性のある体液性又はＴ細胞ＨＥＲ２免疫の有意なレベルを、能動免疫を用いて生成することができることが示されてきた（Ｌａｄｊｅｍｉ，Ｍ．Ｚ．、Ｊａｃｏｔ，Ｗ．、Ｃｈａｒｄｅ’ｓ，Ｔ．ら、２０１０、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、５９：１２９５−１３１２）。最も先進的な臨床試験では、ペプチドベースのワクチン、特にＥ７５ペプチドベースのワクチンが用いられている（Ｄｉｓｉｓ，Ｍ．Ｌ．、＆ＫＳｃｈｉｆｆｍａｎ，Ｋ．、２００１、Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．、２８：１２−２０；Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｌ．、Ｇｉｌｌｏｇｌｙ，Ｍ．Ｅ．、Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａ，Ｄ．ら、２００２、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、８：３４０７−３４１８；Ｐｅｏｐｌｅｓ，Ｇ．Ｅ．、Ｇｕｒｎｅｙ，Ｊ．Ｍ．、Ｈｕｅｍａｎ，Ｍ．Ｔ．、ら、２００５，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２３：７５３６−７５４５；Ｒｏｓｓ，Ｊ．Ｓ．、Ｓｌｏｄｋｏｗｓｋａ，Ｅ．Ａ．、Ｓｙｍｍａｎｓ，Ｗ．Ｆ．、ら、２００９、Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ，１４：３２０−３６８；ＵＳ  ８，２２２，２１４；ｆｏｒ  ｒｅｖｉｅｗ  ｓｅｅ  Ｌａｄｊｅｍｉ，ＭＺ．、Ｊａｃｏｔ，Ｗ．、Ｃｈａｒｄｅｓ，Ｔ．ら、２０１０、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、５９：１２９５−１３１２）。このワクチン接種は、内在性ＨＥＲ２受容体に対する寛容を破壊することができる。ワクチンの重要な成分は、ペプチドＥ７５（９個のアミノ酸残基のペプチド）である（ＵＳ  ８，２２２，２１４；Ｍｉｔｔｅｎｄｏｒｆ，Ｅ．Ａ．、Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｇ．Ｔ．、Ｈｏｌｍｅｓ，Ｊ．Ｐ．ら、２０１２，Ｃａｎｃｅｒ，１１８：２５９４−６０２）。癌ワクチンは、通常、治療用抗体又は化学療法剤の使用と典型的に関連する毒性を起こさない（例、Ｐｅｏｐｌｅｓ，Ｇ．Ｅ．、Ｇｕｒｎｅｙ，Ｊ．Ｍ．、Ｈｕｅｍａｎ，Ｍ．Ｔ．、ら、２００５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２３：７５３６−７５４５；Ｒｏｓｓ，Ｊ．Ｓ．、Ｓｌｏｄｋｏｗｓｋａ，Ｅ．Ａ．、Ｓｙｍｍａｎｓ，Ｗ．Ｆ．、ら、２００９、Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ、１４：３２０−３６８；Ｄａｂｎｅｙ，Ｒ．Ｓ．、Ｈａｌｅ，Ｄ．Ｆ．、Ｖｒｅｅｌａｎｄ，Ｔ．Ｊ．、ら、２０１２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ、３０（ＡＳＣＯ  ｓｕｐｐｌ；ａｂｓｔｒ  ２５２９）；Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｅ．、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｋ．、Ｈｏｂｅｉｋａ，Ａ．Ｃ．、ら、２０１２、Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．、１０：２８）。
【０００７】
また、正常組織に対する有意な毒性自己免疫はワクチンでは遭遇されていない（Ｂｅｒｎｈａｒｄ，Ｈ．、Ｓａｌａｚａｒ，Ｌ．、Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ，Ｋ．ら、２００２，Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ９：３３−４４；Ｌａｄｊｅｍｉ，Ｍ．Ｚ．、Ｊａｃｏｔ，Ｗ．、Ｃｈａｒｄｅ’ｓ，Ｔ．ら、２０１０、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、５９：１２９５−１３１２）。これらのワクチンの大半が、Ｔ細胞免疫に焦点を当てており、ペプチド又は少数のエピトープの混合物からなり、登録時にＨＬＡが一致する患者コホートを必要とし、結果的に、狭い免疫応答を示す（Ｌａｄｊｅｍｉ，Ｍ．Ｚ．、Ｊａｃｏｔ，Ｗ．、Ｃｈａｒｄｅ’ｓ，Ｔ．ら、２０１０，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、５９：１２９５−１３１２）。
【０００８】
ペプチドワクチンのための標的部位の狭いスペクトルに加えて、ペプチドベースのワクチンの使用は、最も有望なペプチドの同定において困難に悩まされうる。ペプチドワクチンは、組成物中の１つ又は少数のペプチドに限定された免疫応答を起こす。有望な代替は、製造が簡単で、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導する際にペプチドよりも優れているＤＮＡワクチンであり（Ｃｈａｉｓｅ，Ｃ．、Ｂｕｃｈａｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｒｉｃｅ，Ｊ．ら、２００８、Ｂｌｏｏｄ，１１２：２９５６−２９６４；Ｒｏｌｌａ，Ｓ．、Ｍａｒｃｈｉｎｉ，Ｃ．、Ｍａｌｉｎａｒｉｃｈ，Ｓ．ら、２００８，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９：２２９−２３９；ＵＳ８２０７１４１）、それらは、典型的には、抗体応答を誘導する際に、タンパク質ワクチンほど効果的ではない。
【０００９】
ＨＥＲ２タンパク質ベースのワクチンを用いた臨床治験も行われた。１つの場合において、ＨＥＲ２  ＩＣＤ（細胞内ドメイン、ａａ  ６７６−１２５５）がアジュバントワクチンとして使用された（Ｄｉｓｉｓ，Ｍ．Ｌ．、Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ，Ｋ．、Ｇｕｔｈｒｉｅ，Ｋ．ら、２００４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２２：１９１６−１９２５）。ワクチンは良好に寛容され、最高用量で処置された患者は、より迅速に免疫を発生することが示された。治療効果は報告されなかった。アジュバントの複雑な混合物とチロシンキナーゼ阻害剤ラパチニブを組み合わせた、完全細胞外ドメイン（ＥＣＤ）及び細胞内ドメイン（ＩＣＤ）の部分からなるｄＨＥＲ２を用いた第Ｉ相臨床治験では、（心臓）毒性効果は示されなかったが、また、弱いＴ細胞応答及び進行期間の中央値５５日間が示された（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｅ．、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｋ．、Ｈｏｂｅｉｋａ，Ａ．Ｃ．ら、２０１２、Ｊ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．、１０：２８、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ−ｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０／１／２８）。コレステリルプルランナノゲル（ＣＨＰ−ＨＥＲ２）と複合体化したＨＥＲ２  ＥＣＤドメイン（アミノ酸１−１４６）の部分の使用は、患者により良好に寛容され、切断ＨＥＲ２タンパク質へのＴ細胞応答を誘導した（Ｋｉｔａｎｏ，Ｓ．、Ｋａｇｅｙａｍａ，Ｓ．、Ｎａｇａｔａ，Ｙ．ら、２００６、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．、１２：７３９７−７４０５）。しかし、同じ抗原を用いた第２治験では、誘導されたＡｂ（抗体）が、癌細胞の表面で、その天然形態において発現されたＨＥＲ２抗原を認識しなかったことが示された（Ｋａｇｅｙａｍａ，Ｓ．、Ｋｉｔａｎｏ，Ｓ．、Ｈｉｒａｙａｍａ，Ｍ．ら、２００８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．、９９：６０１−６０７０）。ＣＨＰ−ＨＥＲ２と、さらに別の腫瘍特異的抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１との組み合わせは、免疫応答の改善に導かなかった。逆に、ＣＨＰ−ＨＥＲ２単独と比較して、混合ワクチン中のＨＥＲ２に弱い抗体応答があった（Ａｏｋｉ，Ｍ．、Ｕｅｄａ，Ｓ．、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｈ．ら、２００９、Ｖａｃｃｉｎｅ、２７：６８５４−６８６１）。
【００１０】
要約すると、開発中の既存のワクチンは、いくつかの限界に悩まされる（Ｌａｄｊｅｍｉ，Ｍ．Ｚ．、Ｊａｃｏｔ，Ｗ．、Ｃｈａｒｄｅ’ｓ，Ｔ．ら、２０１０、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、５９：１２９５−１３１２）：全腫瘍細胞ワクチンは個別に作製されなければならず、免疫応答はモニターするのが困難であり、アジュバントの存在下での自己免疫誘導のリスクがある。ＤＮＡワクチンは、細胞ゲノム中へのＤＮＡ組込みに起因して、悪性腫瘍を促進するリスクを伴う。ペプチドワクチンは、１つ又は数個のエピトープに限定される免疫応答を生成し、アジュバントの非存在下で分解する可能性があり、ＨＬＡ集団が制限される。現在までのＨＥＲ２タンパク質ベースのワクチンでは、有意な治療効果が示されていない。
【００１１】
Ｅｓｓｅｒｍａｎ  ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（１９９９）４７：３３７−３４２は、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を用いたｎｅｕトランスジェニックマウスのワクチン接種に関する。著者らは、Ｎｅｕ  ＥＣＤでの免疫化が、腫瘍成長の発症を遅延することを報告している。しかし、著者らは、また、一度、腫瘍が成長し始めたら、それらは、対照免疫マウスにおける、即ち、Ｎｅｕ  ＥＣＤ抗原を用いないマウスと同じ速度で成長するように見えたことを報告している。
【００１２】
Ｓｃｈｗａｎｉｎｇｅｒ  ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（２００４）５３：１００５−１０１７には、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ癌ワクチン用の担体系としてビロソームが記載されている。ビロソームに結合したＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）でワクチン接種したマウスは、体液性及び細胞傷害性免疫応答を生成した。しかし、一度、腫瘍がそれらのマウスモデルにおいて形成された場合、ワクチン接種は、腫瘍進行に対して影響を有さなかった、即ち、治療効果を有さなかった。
【００１３】
したがって、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性癌のための癌ワクチンとして、適切なタンパク質コンジュゲートを提供することが本発明の目的である。タンパク質抗原及びＨＥＲ２陽性癌に対する治療効果を有するタンパク質コンジュゲートを提供することが別の目的である。長期のＴ細胞依存性免疫応答を誘発することが可能であるタンパク質コンジュゲート又は癌ワクチンを提供することが別の目的である。強力な防御体液性及び細胞性免疫応答を誘導することができるワクチンを使用して、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性癌を処置する方法を提供することが別の目的である。前記ワクチンの製剤を提供することが本発明の別の目的である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
これらの目的は、以下により達成される：
（１）タンパク質抗原及び前記タンパク質抗原に共有結合した免疫原性担体を含む
タンパク質コンジュゲートであって、前記タンパク質抗原が
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列の３００又はそれ以上の連続アミノ酸の配列セグメントを有する；又は
（ｉｉ）３００又はそれ以上のアミノ酸残基の変異体配列セグメントを有し、前記変異体配列セグメントのアミノ酸配列が、配列番号１からの配列部分と少なくとも８５％の配列同一性を有する；又は
（ｉｉｉ）３００又はそれ以上のアミノ酸残基の変異体配列セグメントを有し、配列番号１又は２のアミノ酸配列の３００又はそれ以上のアミノ酸残基の配列セグメントと比較して、前記変異体配列セグメントにおいて１〜２０の置換、欠失、又は付加を有している、タンパク質コンジュゲート。
（２）前記タンパク質抗原が、配列番号２のアミノ酸配列の３００又はそれ以上の連続アミノ酸残基の配列セグメントを有する、又は
前記タンパク質抗原が、３００又はそれ以上のアミノ酸残基の変異体配列セグメントを有し、前記変異体配列セグメントのアミノ酸配列が、配列番号２からの配列部分と少なくとも８５％の配列同一性を有する、項目１に記載のタンパク質コンジュゲート。
（３）前記タンパク質抗原が、前記配列セグメント又は前記変異体配列セグメントにおいて、最大で５００、好ましくは最大で４００の、配列番号１又は２からの連続アミノ酸残基を有する、項目１又は２に記載のタンパク質コンジュゲート。
（４）前記配列セグメントが、配列番号２、４、又は５のアミノ酸配列からなり、好ましくは、前記タンパク質抗原が、配列番号２、４、又は５のアミノ酸配列及び、任意選択で、精製タグからなる、項目２に記載のタンパク質コンジュゲート。
（５）前記タンパク質抗原が、さらなるセグメントとして、そのＮ又はＣ末端の６Ｘ−Ｈｉｓタグなどの精製タグ、又は抗体軽鎖の定常領域、及び、任意選択で、精製タグとタンパク質抗原の配列セグメントを連結するリンカーを含み、好ましくは、前記タンパク質抗原が、前記配列セグメント又は変異体配列セグメント、前記精製タグ、及び、任意選択で、前記リンカーからなる、項目１〜４のいずれか１つに記載のタンパク質コンジュゲート。
（６）前記免疫原性担体が、免疫原性タンパク質又は免疫原性タンパク質凝集体である、又はそれを含む、項目１〜５のいずれか１つに記載のタンパク質コンジュゲート。
（７）前記免疫原性タンパク質が、破傷風毒素フラグメントＣ又はそのＤＯＭ１フラグメントである、又はそれを含む、項目６に記載のタンパク質コンジュゲート。
（８）前記タンパク質凝集体が、ウイルス粒子、例えば植物ウイルス粒子などである、又はそれを含む、項目６に記載のタンパク質コンジュゲート。
（９）前記変異体が、さらに、配列番号１又は２の前記アミノ酸配列と比較して、前記変異体配列セグメントにおいて１〜１０の欠失又は付加を有している、項目１〜８のいずれか１つに記載のタンパク質コンジュゲート。
（１０）前記変異体が、配列番号１又は２の前記アミノ酸配列と比較して、前記配列セグメントにおいて１〜１０の置換、欠失、又は付加を有している、項目１〜８のいずれか１つに記載のタンパク質コンジュゲート。
（１１）項目１〜１０のいずれか１つに記載のタンパク質コンジュゲート又はタンパク質抗原を含む抗癌ワクチン。
（１２）前記タンパク質コンジュゲートが分散している水、及び、任意選択で、さらに、薬学的に許容される添加剤をさらに含む、項目１１に記載の抗癌ワクチン。
（１３）免疫学的アジュバントをさらに含む、項目１１又は１２に記載の抗癌ワクチン。
（１４）ＨＥＲ２／Ｎｅｕ陽性癌を処置する方法における使用のための、項目１〜１０のいずれか１つにおいて定義する通りのタンパク質コンジュゲート。
（１５）本発明のタンパク質抗原、又は、好ましくは、本発明のタンパク質コンジュゲートを、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ陽性癌に罹患している患者に１から複数回投与することを含む、そのような癌に罹患している患者においてＨＥＲ２／Ｎｅｕ陽性癌を処置する方法。
（１６）植物の真核細胞において前記タンパク質抗原又は前記変異体を発現させ、前記タンパク質抗原又は前記変異体を精製し、精製されたタンパク質抗原又は前記変異体を前記担体と架橋することを含む、本発明のタンパク質コンジュゲートを生成する方法。
（１７）変異体配列セグメントのアミノ酸配列が、配列番号１からの配列部分と少なくとも８５％の配列同一性を有する、配列番号１のアミノ酸配列の３００又はそれ以上の連続アミノ酸の配列セグメントを有するタンパク質抗原、又は３００又はそれ以上のアミノ酸残基の変異体配列セグメントを有するタンパク質抗原。
（１８）Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質のアミノ酸配列と類似性を有する第１のアミノ酸配列セグメント、及び、任意選択で、１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列セグメントからなるタンパク質抗原であって、前記第１の配列セグメントが、
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列の３００又はそれ以上の連続アミノ酸のアミノ酸配列を有する；又は
（ｉｉ）３００又はそれ以上のアミノ酸残基の変異体アミノ酸配列を有し、前記変異体配列セグメントのアミノ酸配列が、配列番号２からの配列部分と少なくとも８５％の配列同一性を有する；又は
（ｉｉｉ）３００又はそれ以上のアミノ酸残基の変異体アミノ酸配列を有し、配列番号２のアミノ酸配列の３００又はそれ以上のアミノ酸残基の配列セグメントと比較して、前記変異体配列において１〜２０の置換、欠失、又は付加を有し；
２０又はそれ以上、好ましくは１０又はそれ以上の任意のさらなるアミノ酸配列セグメントが、配列番号１８のアミノ酸１〜２５３、好ましくは１〜２８３、より好ましくは１〜３００の配列部分、又は、アミノ酸６７０から、好ましくはアミノ酸６５４から開始する配列部分を含まず；或いは
２０を上回る連続アミノ酸の任意のさらなるアミノ酸配列セグメントが、配列番号１８のアミノ酸１〜２５３、好ましくは１〜２８３、より好ましくは１〜３００の配列部分、又は、アミノ酸６７０から、好ましくはアミノ酸６５４から開始する配列部分と５０％を上回る配列同一性を有さないタンパク質抗原；及び、そのようなタンパク質抗原を含むタンパク質コンジュゲート。
（１９）項目１７又は１８のタンパク質抗原をコードする核酸配列。
（２０）項目１〜１０のいずれか１つにおいて定義されたタンパク質抗原及び前記タンパク質抗原と架橋するための免疫原性タンパク質又はタンパク質凝集体を含むキット。
【００１５】
本発明の癌ワクチンは、ヒトＨＥＲ２  ＥＣＤに応答して広範なポリクローナル抗体を誘導し、加えて、外来Ｔ細胞を動員し、担体、例えば破傷風フラグメントＣ又は植物ＲＮＡウイルス粒子などへのコンジュゲーションを介した体液性応答を増強するのを助ける能力を有する。本発明は、腫瘍が、癌発生のための予防効果だけでなく、腫瘍が既に発生している場合、ワクチン接種による治療効果も提供する。そのような治療効果は、従来技術において達成されなかった。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｈｅｒ２−ＥＤ４４のアミノ酸配列の図である。Ａ）ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＡＡ７５４９３）の残基３１０−６５３を包含するヒトＨｅｒ２−ＥＤ４４（配列番号２）のアミノ酸配列。より短いＨｅｒ２−ＥＤ４４バージョン中の除去された残基は太字で書かれている（Ｃにおけるバージョンについて）又は下線が引かれている（Ｄにおけるバージョンについて）。Ｂ）ラットＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿０５８６９９）の残基３１４−６５７を包含するラットＨｅｒ２−ＥＤ４４（配列番号３）のアミノ酸配列。Ｃ）ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質の残基３１２−６４９を包含する、Ｈｅｒ２−ＥＤ４４（配列番号４）の短縮バージョン。Ｄ）ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質の残基３４０−６４９を包含する、Ｈｅｒ２−ＥＤ４４（配列番号５）の短縮バージョン。
【図２】ラット（配列番号３）及びヒト（配列番号２）Ｈｅｒ２−ＥＤ４４アミノ酸配列のアライメントの図である。ラットＨｅｒ２−ＥＤ４４（ラットＥＤ４４）をイタリック体で、ヒトＨｅｒ２−ＥＤ４４（ヒトＥＤ４４）を太字で示す。配列は、ＢＬＡＳＴＰを使用して整列させた。同一のアミノ酸残基を両方の配列の間で示し、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスに従った類似の残基を「＋」で示す。２つの配列は８６％の同一性及び９１％の類似性を示す。
【図３】Ｈｅｒ２−ＥＤ４４及び破傷風毒素フラグメントＣの構築ブロック並びにワクチンの構造の模式図である。（Ａ）Ｈｉｓタグ付きＨｅｒ２−ＥＤ４４、（Ｂ）リンカー領域及びヒトカッパ定常領域を含むＨｅｒ２−ＥＤ４４及び破傷風毒素フラグメントＣ（免疫原担体）融合タンパク質、又は（Ｃ）リンカー及びタバコ・モザイク・ウイルス粒子（免疫原性担体）にコンジュゲートされたヒトカッパ定常領域を含むＨｅｒ２−ＥＤ４４融合タンパク質を含むワクチンの設計。２つの成分、即ち、Ｈｅｒ２−ＥＤ４４及び破傷風毒素フラグメントＣ又はタバコ・モザイク（Ｍｏｓｉｃ）・ウイルス粒子を伴うワクチン又はタンパク質抗原を、グルタルジアルデヒドを使用して架橋する。タバコ・モザイク・ウイルスのコートタンパク質は、そのＮ末端領域中にリシン残基を導入することにより改変し、より効率的な架橋を可能にした。
【図４】ラットＨｅｒ２−ＥＤ４４構築物のためのクローニングスキームである。（Ａ）Ｈｉｓタグ及び（Ｂ）ヒトカッパ定常領域への融合物を伴うラットＨｅｒ２−ＥＤ４４構築物のためのクローニングスキーム。シグナルペプチド、ラットＨｅｒ２−ＥＤ４４、及び６ｘ  Ｈｉｓタグ又は（ＧＧＧＧＳ）３リンカー、及びヒトカッパ定常領域用の配列モジュールを、タイプＩＩＳ酵素ＢｓａＩを使用して、ＴＭＶベースのウイルスバイナリー発現ベクター中にクローニングする。ＢｓａＩ制限消化後のモジュールに隣接するオーバーハングを示す。
【図５】ラットＨｅｒ２−ＥＤ４４−Ｈｉｓ構築物（配列番号６）の配列及びアミノ酸配列（配列番号７）。コメのαアミラーゼシグナルペプチドの配列（太字、斜体）、ラットＨｅｒ２−ＥＤ４４及び６ｘ  Ｈｉｓタグ（太字、斜体）を示す図である。ＢｓａＩクローニングのために使用されるオーバーハング配列を太字で示し、下線が引かれている。ＴＭＶベースのウイルスバイナリー発現ベクター中でのクローニング後、ＢｓａＩ認識部位はもはや存在しない。
【図６】ラットＨｅｒ２−ＥＤ４４−カッパ構築物（配列番号８）及びアミノ酸配列（配列番号９）の配列。コメのαアミラーゼシグナルペプチド（太字、斜体）、ラットＨｅｒ２−ＥＤ４４、（ＧＧＧＧＳ）３リンカー（太字、斜体）、及びヒトカッパ定常領域の配列の図である。ＢｓａＩクローニングのために使用されるオーバーハング配列を太字で示し、下線が引かれている。ＴＭＶベースのウイルスバイナリー発現ベクター中でのクローニング後、ＢｓａＩ認識部位はもはや存在しない。
【図７】ヒトＨｅｒ２−ＥＤ４４の構築物用のクローニングスキームである。（Ａ）Ｈｉｓタグ及び（Ｂ）ヒトカッパ定常領域への融合物を用いたヒトＨＥＲ２−ＥＤ４４構築物用のクローニングスキーム。シグナルペプチド、ラットＨｅｒ２−ＥＤ４４及び６ｘ  Ｈｉｓタグ又は（ＧＧＧＧＳ）３リンカー、並びにヒトカッパ定常領域用の配列モジュールを、タイプＩＩＳ酵素ＢｓａＩを使用して、ＴＭＶベースのウイルスバイナリー発現ベクター中にクローニングする。ＢｓａＩ制限消化後のモジュールに隣接するオーバーハングを示す。
【図８】ヒトＨｅｒ２−ＥＤ４４−Ｈｉｓ構築物の配列（配列番号１０）及びアミノ酸配列（配列番号１１）。コメのαアミラーゼシグナルペプチド（太字、斜体）、ヒトＨｅｒ２−ＥＤ４４及び６ｘ  Ｈｉｓタグ（太字、斜体）の配列の図である。ＢｓａＩクローニング用に使用したオーバーハング配列を太字で示し、下線を引いている。ＴＭＶベースのウイルスバイナリー発現ベクター中でのクローニング後、ＢｓａＩ認識部位はもはや存在しない。
【図９】ヒトＨｅｒ２−ＥＤ４４−カッパ構築物の配列（配列番号１２）及びアミノ酸配列（配列番号１３）。コメのαアミラーゼシグナルペプチド（太字、斜体）、ヒトＨｅｒ２−ＥＤ４４、（ＧＧＧＧＳ）３リンカー（太字、斜体）、及びヒトカッパ定常領域の配列の図である。ＢｓａＩクローニング用に使用したオーバーハング配列を太字で示し、下線を引いている。ＴＭＶベースのウイルスバイナリー発現ベクター中でのクローニング後、ＢｓａＩ認識部位はもはや存在しない。
【図１０】破傷風毒素フラグメントＣ構築物用のクローニングスキームである。ヒトカッパ定常領域への破傷風毒素フラグメントＣの融合用のクローニングスキームを示す。シグナルペプチド、破傷風毒素フラグメントＣ、（ＧＧＧＧＳ）３リンカー、及びヒトカッパ定常領域用の配列モジュールを、タイプＩＩＳ酵素ＢｓａＩを使用して、ＴＭＶベースのウイルスバイナリー発現ベクター中にクローニングする。ＢｓａＩ制限消化後のモジュールに隣接するオーバーハングを示す。
【図１１】破傷風毒素フラグメントＣ−カッパ構築物（配列番号１４）の配列及びアミノ酸配列（配列番号１５）の図である。コメのαアミラーゼシグナルペプチド（太字、斜体）、破傷風毒素フラグメントＣ、（ＧＧＧＧＳ）３リンカー（太字、斜体）、及びヒトカッパ定常領域の配列。ＢｓａＩクローニング用に使用したオーバーハング配列を太字で示し、下線を引いている。ＴＭＶベースのウイルスバイナリー発現ベクター中でのクローニング後、ＢｓａＩ認識部位はもはや存在しない。
【図１２】タバコ・モザイク・ウイルス粒子を含むＴＭＶ−ＣＰＬｙｓの図である。ＴＭＶ−ＣＰＬｙｓを含むタバコ・モザイク・ウイルス粒子の産生用のＴＭＶベースのベクターの概略図。ＣＰＬｙｓの配列（配列番号１６）（野生型ＣＰについての受託番号：Ｑ８８９２２）を示し、リシン残基を含むＮ末端での伸長（ＡＤＦＫ）を太字で示し、下線を引いている。ニコチアナ・ベンタミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）におけるこのウイルス構築物の発現は、タバコ・モザイク・ウイルス粒子を含むＣＰＬｙｓの形成に導く。
【図１３】ＴＭＶベースのウイルスバイナリーベクター（ｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）システム）の概略マップである。バイナリーベクターの骨格エレメントは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにおけるプラスミド複製用のｐＶＳ１起点、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるプラスミド複製用のｃｏｌＥ１起点、及び選択用のｎｐｔＩＩＩカナマイシン抗生物質耐性遺伝子である。植物細胞へのＴＭＶベースのウイルスベクターの送達のために、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを使用する。したがって、完全なウイルス構築物を、Ｔ−ＤＮＡの左とバイナリーベクターの右の境界の間にクローニングした。ウイルス構築物は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）及び移行タンパク質（ＭＰ）をコードするウイルスｃＤＮＡからなる。効率的な発現のために、植物イントロンをＲｄＲＰ配列とＭＰ配列内に加えた。コートタンパク質についての遺伝子を除去し、最終的な発現ベクター中で、目的の遺伝子により置換する。ウイルス構築物は、また、複製のために必須である５’及び３’非翻訳（ＮＴＲ）ウイルス配列を含む。植物細胞中でのウイルスＲＮＡの効率的な発現のために、ウイルスｃＤＮＡを、植物プロモーターと植物ターミネーター（Ａｃｔ２及びｎｏｓ）の間にクローニングしている。青色／白色選択を容易にするために、ｌａｃＺαカセットを、目的の遺伝子のフレームクローニングにおいてシームレスを可能にする２つのＢｓａＩ制限部位の間に挿入した。全ての天然のＢｓａＩ認識部位を除去した。
【図１４】ニコチアナ・ベンタミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）において作製されたＨｅｒ２−ＥＤ４４ベースのワクチンの評価のための実験計画の概略図である。Ｂａｌｂ／ｃマウスの別々の群を、５０μｇのラットＨｅｒ２−ＥＤ４４−Ｈｉｓワクチン又はコンジュゲートワクチンＨｅｒ２ＥＤ４４−ＦｒＣ又はＨｅｒ２ＥＤ４４−ＴＭＶ（両方とも同等量のＨｅｒ２−ＥＤ４４を含む）で免疫化する。全てのＨｅｒ２ＥＤ４４含有ワクチンを、等量のミョウバンアジュバント（Ｓｉｇｍａ）と組み合わせ、合計２００μＬのミョウバン吸着ワクチンを、脇腹における２つの部位に皮下投与した。対照ワクチンについては、１３０μｇの植物で発現された無関係なタンパク質（ＩＣＯＮにより作製された５Ｔ３３Ｉｇ−ｈｋａｐｐａ−フラグメントＣ融合タンパク質）を上の通りに与える。Ｈｅｒ２／ｎｅｕの全長細胞外＋膜貫通ドメイン（ＥＣ−ＴＭ）をコードするＤＮＡワクチン（５０μｇ）（Ｐｒｏｆ．Ｆｏｒｎｉ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｕｒｉｎ，Ｉｔａｌｙ；Ｑｕａｇｌｉｉｎｏ，Ｅ．、Ｍａｓｔｉｎｉ，Ｃ．、Ｆｏｒｎｉ，Ｇ．ら、２００８、Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、Ｃｈ．２０：Ｕｎｉｔ  ２０．９．１−２０．９−１０）を、マウスの別々の群中に筋内投与し、比較ワクチンとしての役割を果たした。１群当たり少なくとも５匹のマウスを、各実験毎にワクチン接種した。マウスの各群は、最初の注射後３週目（Ｄ２１）に、同量の相同ワクチンの２回目の注射を受けた。マウスを、最初の注射後３週目と２回目の注射の前に、並びに２週間の間隔（５週目及び７週目）で２回目の注射後に２回採血した。試料は、Ｈｅｒ２−ＥＤ４４に対する反応性について、及び膜結合Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに対する反応性について、ラットＨｅｒ２（Ｎｅｕ）を発現するＴＵＢＯ腫瘍細胞系又はヒトＨｅｒ２を発現するＤ２Ｆ２／Ｅ２腫瘍細胞系を使用して、ＥＬＩＳＡにより分析した。腫瘍攻撃実験において、以前に２用量のワクチンで注射されたマウスを、ＴＵＢＯ細胞又はＤ２Ｆ２／Ｅ２細胞のいずれかで攻撃した。マウス１匹当たり１０５個の細胞を、それぞれの例において、ワクチンの最後の注射後７週目に脇腹中に皮下注射した。
【図１５】ラットＨｅｒ２−ＥＤ４４ベースのワクチン、ｒＨｅｒ２−ＥＤ４４−ＴＭＶ（ＥＤ４４−ＴＭＶ）、ｒＨｅｒ２−ＥＤ４４−フラグメントＣ（ＥＤ４４−ＦｒＣ）、又はｒＨｅｒ２−ＥＤ４４−Ｈｉｓ（ＥＤ４４）でのワクチン接種に続いてＢａｌｂ／ｃマウスで誘導される全ＩｇＧ抗体応答及び抗体アイソタイプ。抗体アイソタイプを５週目に測定した。
【図１６】ＴＵＢＯ癌細胞系の表面上に発現されたラットＨｅｒ２／Ｎｅｕへの結合の図である。ヒストグラム上のＦＡＣＳプロットの数字は、蛍光強度（ＭＦＩ）の平均値を表す。Ｔｕｂｏ癌細胞系での攻撃に対するラットＨｅｒ２−ＥＤ４４ワクチン接種マウスの防御。
【図１７】Ｄ２Ｆ２／Ｅ２癌細胞系の表面上に発現されたヒトＨｅｒ２／ｎｅｕへの結合の図である。ヒストグラム上のＦＡＣＳプロットの数字は、蛍光強度（ＭＦＩ）の平均値を表す。Ｄ２Ｆ２／Ｅ２細胞系での攻撃に対するラットＨｅｒ２−ＥＤ４４ワクチン接種マウスの防御。
【図１８】ヒトＥＤ４４  Ｈｅｒ２−ＦＲＣ試験Ｄ２Ｆ２／Ｅ２乳癌モデル：予防的設定の図である。ヒト（ｈｕ）ＥＤ４４−ＦｒＣコンジュゲートワクチン又は非コンジュゲートｈｕＥＤ４４による防御免疫の誘導。Ａ．予防的設定におけるＤ２Ｆ２／Ｅ２乳癌に対する防御。Ｂ．５週目での２回の注射（０日目及び２１日目）後の抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体のレベル。Ｃ．フローサイトメトリーにより測定した、Ｄ２Ｆ２／Ｅ２腫瘍細胞上での天然Ｈｅｒ２／ｎｅｕへの誘導抗体の結合。
【図１９】ｈｕＥＤ４４−ＦｒＣコンジュゲートワクチンで誘導された抗体によるＨｅｒ２／ｎｅｕ媒介性シグナル伝達（Ａｋｔリン酸化）の阻害の図である。ハーセプチン及びＰＩ３Ｋ（Ｈｅｒ２シグナル伝達の下流）阻害剤ＬＹ２９４００２と比較した、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨｅｒ２媒介性シグナル伝達を阻害する、ｈｕＥＤ４４−ＦｒＣコンジュゲートワクチンにより誘導された抗体の能力の評価。Ｈｅｒ２陽性ヒト乳癌細胞系ＢＴ４７４を、示した希釈でのｈｕＥＤ４４−ＦＲＣ、対照ワクチン、ハーセプチン又はＬＹ２９４００２（３０μＭ）でワクチン接種したマウスからの血清を用いて別々に処理し、Ａｋｔリン酸化（細胞シグナル伝達）を阻害する。ウェスタンブロット分析を、リン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３、上パネル）、全Ａｋｔ（中央パネル）、又はＢアクチン（下パネル）のいずれかに対する抗体を使用して、示す通りに、処置後に行った。ヒトＨＥＲ２陽性乳癌細胞系ＢＴ４７４を、別々に、示した希釈でのワクチン接種マウスからのプール血清試料、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ、ＵＫ）、又は３０μＭ  ＬＹ２９４００２阻害剤（ｉｎｈｉｂｏｔｏｒ）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｎｏｌｏｇｙ、米国マサチューセッツ州）で１時間にわたりインキュベートした。全ての処置を、３７℃、１０％ＣＯ２で、１０％ＦＣＳを添加した完全ＤＭＥＭ培地中で行った。インキュベーション後、細胞を収集し、溶解し、１試料当たり１０μｇのタンパク質を、９５℃で５分間にわたり変性した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜１２％ビス−トリスゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州）に供した。電気泳動に続き、タンパク質をポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｂｏｎｄ（商標）Ｐ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国バッキンガムシャー）に移し、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を伴うトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中の５％無脂肪ミルク中でブロッキングした後、（ＴＢＳ−Ｔ）を、抗ｐＡｋｔ（ウサギ抗リン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ  ４７３）抗体、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ａｋｔ（ウサギ抗Ａｋｔ抗体、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、又はβアクチン（マウス抗ヒトβアクチン抗体、クローン２Ｆ１−１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）抗体と、１／１，０００希釈で連続的にインキュベートした。その後の各抗体を適用する前に、以前の抗体を除去した。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、膜を、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体（抗ウサギ  ＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ又は抗マウスＩｇＧ（Ｇａｍｍａ）（ＡＦＦ）−ＰＥＲＯＸ，  Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ、英国バーミンガム）のＴＢＳ−Ｔ中での１／１，０００で、１時間にわたり室温でインキュベートした。膜をＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）ウェストピコ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国イリノイ州）を用いて、ｃ検出前に、再びＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。化学発光シグナルを、Ｂｉｏ−Ｒａｄイメージング���ステム（Ｆｌｕｏｒ−Ｓ（登録商標）ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して捕捉した。
【図２０】ラットＥＤ４４  Ｈｅｒ２−ＦｒＣ試験ＴＵＢＯモデル：予防的設定の図である。予防設定のＴＵＢＯモデルにおけるラットＥＤ４４−ＦｒＣコンジュゲートワクチン及び非コンジュゲートラットＥＤ４４の実験計画及びテスト。両方のワクチンが、ＥＣ−ＴＭ  ＤＮＡワクチン（Ｆｏｒｎｉ教授（トリノ大学、イタリア）からの寄贈；Ｑｕａｇｌｉｉｎｏ，Ｅ．、Ｍａｓｔｉｎｉ，Ｃ．、Ｆｏｒｎｉ，Ｇ．ら、２００８、Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、Ｃｈ．２０：Ｕｎｉｔ  ２０．９．１−２０．９−１０）と同様の、腫瘍攻撃に対する高度に有意な防御を誘導した（左上パネル）。この防御は、両方のワクチンによるＨｅｒ２  ＥＤ４４に対する抗体の誘導を伴い、それぞれの場合におけるレベルが、ＤＮＡワクチンにより誘導されるものよりも有意に高かった（右上パネル）。誘導された抗体は、また、ＴＵＢＯ細胞の表面上で発現された天然Ｈｅｒ２に結合した（下パネル）。
【図２１】自然発症の転移性乳癌のＢａｌｂ−ＮｅｕＴモデルにおけるＥＤ４４−ＦｒＣワクチンのテストの実験計画及び結果の図である。Ａ．転移性乳癌（Ｂａｌｂ−ＮｅｕＴモデル）の治療設定における実験のためのワクチン接種及び試料回収のためのプロトコール。治療設定における実験の概略図。１０〜１１週齢のＢａｌｂ−ＮｅｕＴ雌マウス（それらが、骨髄及び肺において微小の複数の癌腫を発生する齢）を、示したワクチン接種及び出血のためのプロトコールに従ったＴＵＢＯモデルについて、ラットＥＤ４４、ＥＤ４４−ＦｒＣワクチン、又はＥＣ−ＴＭ  ＤＮＡの同じ量及び製剤でワクチン接種した（対照ワクチン、Ｑｕａｇｌｉｉｎｏ，Ｅ．、Ｍａｓｔｉｎｉ，Ｃ．、Ｆｏｒｎｉ，Ｇ．ら、２００８、Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、Ｃｈ．２０：Ｕｎｉｔ  ２０．９．１−２０．９−１０）。合わせた腫瘍の大きさが１５ｍｍに達した場合、Ｂａｌｂ−ＮｅｕＴマウスを終了した。実験の結果をＢに示す。Ｂ．Ｂａｌｂ−ＮｅｕＴモデルトランスジェニック：転移を伴う乳癌の治療設定ＥＤ４４−ＦｒＣが、腫瘍からの有意な防御を生成したのに対し、非コンジュゲートワクチンのＥＤ４４又はＥＣ−ＴＭ  ＤＮＡワクチンは、有意な防御を生成することができなかった（上パネル）。ＥＤ４４−ＦｒＣワクチンは、また、ＥＤ４４又はＥＣ−ＴＭ  ＤＮＡワクチンよりも有意に高いＩｇＧ抗体レベルを誘導した（左下パネル）。ＥＤ４４−ＦｒＣワクチン接種マウスにおけるＨｅｒ２ＥＤ４４特異的抗体の親和性は、ＥＤ４４ワクチン接種マウスよりも有意に高かった（右下パネル）。抗体親和性は、カオトロピックＥＬＩＳＡを使用して測定した。故に、治療設定におけるコンジュゲートＥＤ４４−ＦｒＣワクチンは、非コンジュゲート又はＥＣ−ＴＭ  ＤＮＡワクチンよりも高い抗Ｈｅｒ２抗体レベル及び親和性を誘導する。ＥＣ−ＴＭ  ＤＮＡワクチンは、Ｇ．Ｆｏｒｎｉの研究室（トリノ大学、イタリア）からである。
【図２２】図２１Ａにおける通りの実験計画（転移を伴う乳癌の治療設定）を使用した、自然発生の転移性乳癌のＢａｌｂ−ＮｅｕＴモデルにおけるＥＤ４４−ＴＭＶワクチンのテストの結果の図である。１０〜１１週齢のＢａｌｂ−ＮｅｕＴ雌マウス（それらが、骨髄及び肺において微小の複数の癌腫を発生する齢）を、ＴＵＢＯモデルについてのワクチン接種及び出血のためのプロトコールに従って、ミョウバンを伴う、５０μｇのラットＥＤ４４又は７０μｇのＥＤ４４−ＴＭＶでワクチン接種した。ＥＤ４４−ＴＭＶワクチンはＥＤ４４よりも高いＩｇＧ抗体レベルを誘導した。ＥＤ４４−ＴＭＶワクチン接種マウスにおけるＨｅｒ２ＥＤ４４特異的抗体の親和性は、また、ＥＤ４４−ワクチン接種したマウスよりも高かった。ＩｇＧレベル及び抗体親和性の両方を、最初の注射後５週目に測定した。抗体親和性を、カオトロピックＥＬＩＳＡを使用して測定した。Ｑｕａｇｌｉｎｏ  Ｅ，Ｍａｓｔｉｎｉ  Ｃ，Ｆｏｒｎｉ  Ｇ，Ｃａｖａｌｌｏ  Ｆ．（２００８）のＥｒｂＢ２トランスジェニックマウス：乳癌の免疫予防及び処置の研究用のツール。Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８年８月；２０章：Ｕｎｉｔ  ２０．９．１−２０．９−１０．ｄｏｉ：１０．１００２／０４７１１４２７３５．ｉｍ２００９ｓ８２．
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明のタンパク質コンジュゲートは、タンパク質抗原と免疫原性担体（単に「担体」という）とのコンジュゲートである。本発明のコンジュゲートにおいて、タンパク質抗原及び担体は架橋されており、それらが、少なくとも１つの共有化学結合により連結されていることを意味する。しかし、タンパク質抗原の１つの分子と担体粒子又は担体分子の間に複数の共有結合が存在しうる。タンパク質抗原は、１つのアミノ酸配列からなりうるタンパク質である。タンパク質抗原の目的は、ＨＥＲ２／Ｎｅｕの細胞外ドメインに対するポリクローナル免疫応答を生成することである。担体の目的は、ＨＥＲ２／Ｎｅｕに対する耐久性のある体液性又はＴ細胞依存性免疫を生成し、ＨＥＲ２／Ｎｅｕに対する寛容性を克服することである。このように、タンパク質コンジュゲートは、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ陽性癌に対する広範且つ耐久性のある体液性又はＴ細胞依存性免疫をもたらすことができる。
【００１８】
１２５５アミノ酸（配列番号１８）のヒトＨＥＲ２タンパク質は、アミノ酸６５３まで、及びそれを含むように拡張されるように本明細書において定義されるＮ末端細胞外ドメイン、アミノ酸６５４から６７５の膜貫通ドメイン、並びに配列番号１８のアミノ酸６７６から１２５５までのＣ末端細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を有する。
【００１９】
本発明において、タンパク質抗原は、タンパク質コンジュゲート又はタンパク質抗原をワクチンとして患者に投与した場合に、ＨＥＲ２／Ｎｅｕタンパク質に対する免疫応答を誘発することができるセグメントを含む、又はそれからなるタンパク質である。このセグメントは、また、本明細書において「第１のセグメント」として言及される。本明細書において、セグメントは、タンパク質の線形アミノ酸配列の部分である。タンパク質抗原は、ＨＥＲ２／Ｎｅｕタンパク質に対する免疫応答を誘発することができるセグメントからなりうる。しかし、一般的に、タンパク質抗原は、ＨＥＲ２／Ｎｅｕタンパク質に対する免疫応答を誘発することができるセグメントに加えて、さらなる部分又はセグメントを含む。そのようなさらなる部分又はセグメントは、シグナルペプチド、又は発現されたタンパク質抗原の簡単な精製を可能にする部分（例えば精製タグなど）として機能する部分でありうる。精製タグ、及び他の部分は、タンパク質抗原の残りの部分にリンカーペプチドを介して連結されてもよく、それにより、リンカーによってタグの切断が可能になりうる。精製タグの例は、６×Ｈｉｓタグ又は抗体軽鎖の定常部分である。軽鎖は、カッパ軽鎖又はラムダ軽鎖でありうる。軽鎖は、好ましくは、ワクチン接種される種から採取される。本発明の主な目的は、ヒトのワクチン接種であるため、ヒト抗体の軽鎖が、好ましくは、精製タグとして使用される。好ましい精製タグは、抗体軽鎖からの定常領域である。なぜなら、それらは患者の血流中に豊富であり、したがって、一般的に、任意の有害反応を起こさないからである。このように、そのような精製タグは、タンパク質抗原の発現及び精製後にタンパク質抗原から切断する必要はない。
【００２０】
本明細書において、ＨＥＲ２／Ｎｅｕタンパク質に対する免疫応答を誘発することができる（タンパク質抗原の）セグメントは、好ましくは、ＨＥＲ２／ＮｅｕのＥＣＤの複数のエピトープに対するポリクローナル免疫応答を生成するために、実質的な長さを有する。この目的のために、タンパク質抗原は、ＨＥＲ２／Ｎｅｕタンパク質のＥＣＤ又はＨＥＲ２／Ｎｅｕタンパク質のＥＣＤからのセグメントに対して高い配列類似性又は同一性を有する実質的な長さのセグメントから取られた、実質的な長さのセグメントを有する。セグメントの長さは、少なくとも３００アミノ酸残基、好ましくは少なくとも３２０アミノ酸残基である。長さは、好ましくは最大６００アミノ酸、好ましくは最大５００、より好ましくは最大４００のアミノ酸残基である。他の好ましい実施形態において、長さは、３００から４００までのアミノ酸、又は３２０から３７０までのアミノ酸である。さらにより好ましい実施形態において、このセグメントの長さは、３３０から３６０まで、又は３３７から３５０までのアミノ酸残基である。実施例において、３４４アミノ酸を有するセグメントが使用され、それは本明細書において「ＥＤ４４」として言及され、「４４」は、４４ｋＤａの分子を示し、「ＥＤ」は、「細胞外ドメイン」を表す。
【００２１】
ＨＥＲ２／Ｎｅｕに対する免疫応答を誘発することができるセグメントは、配列番号１に与えられるＨＥＲ２／ＮｅｕのＥＤから取られたアミノ酸配列を有しうる。配列番号１のアミノ酸配列の３００又はそれ以上の連続アミノ酸配列のタンパク質抗原の配列セグメントは、好ましくは、配列番号１のアミノ酸３３２から６３１まで、より好ましくはアミノ酸３２５から６４０まで、さらにより好ましくはアミノ酸３１７から６４７までのアミノ酸配列セグメント又は項目（ＩＩ）若しくは（ＩＩＩ）において定義する通りの変異体配列セグメントを含む。以下にさらに説明する通り、タンパク質抗原は、一般的に、ＨＥＲ２タンパク質の任意の配列セグメントと５０％を上回る配列同一性を有するさらなる配列セグメントを含まない。
【００２２】
別の実施形態において、タンパク質抗原は、配列番号２のアミノ酸配列の３００、好ましくは３３０、より好ましくは３３７又はそれ以上の連続アミノ酸残基の配列セグメントを有する。また、本実施形態において、タンパク質抗原は、一般的に、ＨＥＲ２タンパク質の任意の配列セグメントと５０％を上回る配列同一性を有するさらなる配列セグメントを含まない。
【００２３】
タンパク質抗原がＨＥＲ２に対する所望の免疫応答を誘発するために、配列番号１又は配列番号２の配列部分への配列同一性は、１００％である必要はない。代わりに、配列セグメントは、配列番号１又は配列番号２からの配列部分と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体でありうる。アミノ酸配列の同一性は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％でありうる。配列同一性パーセントを計算する際、２つの配列を整列させて、２つの配列間でのヌクレオチド又はアミノ酸残基の同一のマッチ数を決定する。同一のマッチ数は、整列された領域の長さ（即ち、整列されたヌクレオチド又はアミノ酸残基の数）により分割され、１００を乗じ、パーセント配列同一性の値に達する。配列セグメント（整列された領域）の可能性のある、好ましい長さは、上に定義した通りである。
【００２４】
別の実施形態においては、配列セグメントは、配列番号１又は配列番号２からの配列部分と少なくとも９１％の配列類似性を有するアミノ酸配列を有する変異体でありうる。アミノ酸配列同一性は、少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９９％でありうる。整列された領域の可能性のある、好ましい長さは、上で定義する通りである。アミノ酸配列の類似性及び同一性は、ＢＬＡＳＴＸ２．２．１４を使用して、標準的な設定を使用して決定されうる。標準設定は、例えば、アラインメント中の配列ギャップについて可能である。
【００２５】
或いは、タンパク質抗原の変異体配列セグメントは、変異体配列が、動物（例えばラット又はマウスなど）に注入された場合、依然としてヒトＨＥＲ２タンパク質のＥＣＤに対する抗体の形成を誘発すると仮定し、セグメントの長さにわたり、配列番号１又は配列番号２からの配列部分と比較して、アミノ酸のいくつかの付加、置換、又は欠失を有しうる。アミノ酸の付加、置換、又は欠失の最大数は、最大２０、好ましくは最大１０、より好ましくは最大５の付加、置換、及び付加でありうるが、それにより、付加、置換及び付加の総数は、一緒に、「アミノ酸付加、置換、又は欠失」の数を決定する。付加、置換、及び付加のこれらの数は、３００又はそれ以上のアミノ酸残基の配列セグメントの長さにわたり生じる。好ましい長さは、上に与える長さである。置換は、例えば図１に示すアライメントのように、整列させたラット及びヒトＨＥＲ２タンパク質が逸脱するアミノ酸配列中のこれらの位置で起こりうる。これは、ラットＨＥＲ２タンパク質のＥＣＤに対する抗体が、ヒトＨＥＲ２タンパク質のＥＣＤと交差反応性である、及びその逆もあるとの事実に基づく。好ましくは、配列番号１の以下の位置：３１７、３１８、３５２、３５３、３５６、３５３、３５９、３６１、３６５、３８７、３９８、３９０、３９４、４２０、４２９、４３０、４５１、４５２、４７０、４７２、４９７、４９８、５０２、５０３、５０５、５０６、５１０、５１２、５１３、５１７、５３３、５４７、５４８、５５６から５５９、５７２、５７４、５７９、５８５、５９３〜５９５、６２２、６３９、６４０、６５１の１つ又は複数でのアミノ酸が、他のアミノ酸の残基により置換されうる。
【００２６】
最小の配列同一性又は類似性による、及び付加又は欠失の最大数による変異体配列セグメントの定義を組み合わせてもよい。このように、変異体配列セグメントは、配列番号１又は２との最小配列同一性又は類似性、及び１から２０まで、好ましくは１から１０まで、より好ましくは１から５までの付加及び／又は欠失を有してもよく、配列同一性又は類似性を決定する際に、最適化されたアライメントを可能にする。好ましくは、変異体配列セグメントは、配列番号１又は２の最小配列同一性、及び１から１０までの付加及び／又は欠失を有しうる。
【００２７】
或いは、タンパク質抗原の変異体配列セグメントは、配列番号１又は配列番号２をコードする核酸配列に相補的である核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされうる。ハイブリダイゼーション条件は、ＤＮＡプローブのＧ／Ｃ組成及びハイブリダイゼーション緩衝液中の塩濃度に依存する。ハイブリダイゼーションのために、通常、異なる濃度のＳＳＣ緩衝液が使用される。１×ＳＳＣ緩衝液は、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、ｐＨ７．０を含む。ハイブリダイゼーションの結果は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー、例えば、実験が実施されるＤＮＡのＴｍ（融解温度）を下回る度数に直接的に関連する。Ｔｍよりも高い度数は、より弱いハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに対応する。ＤＮＡの水溶液（無塩）について、Ｔｍ用の式は、Ｔｍ＝６９．３℃＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）℃である。ここで、ストリンジェントな条件は、例えば、ハイブリダイゼーションが、６０℃で、０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中で起こる条件である。
【００２８】
本発明のタンパク質抗原、及び、好ましくは、タンパク質コンジュゲートは、好ましくは、以下の通りの、さらなるアミノ酸配列セグメントを含まない：
配列番号１８のアミノ酸１から２５３、好ましくは１から２８３、より好ましくは１から３００からの配列部分からの、又はアミノ酸６７０から、好ましくはアミノ酸６５４から開始し、アミノ酸１２５５までの配列部分からの２０又はそれ以上、好ましくは１０又はそれ以上の連続アミノ酸残基のさらなるアミノ酸配列セグメント；或いは、配列番号１８のアミノ酸１から２５３、好ましくは１から２８３、より好ましくは１から３００からの配列部分、又はアミノ酸６７０から、好ましくはアミノ酸６５４から開始し、アミノ酸１２５５までの配列部分と５０％を上回る、好ましくは４０％を上回る配列同一性を有する２０を上回る連続アミノ酸残基のさらなるアミノ酸配列セグメント。
【００２９】
一実施形態において、タンパク質抗原、及びタンパク質抗原を含むタンパク質コンジュゲートは、配列番号１８のＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質の膜貫通ドメイン又は細胞内ドメインからの１０又はそれ以上、好ましくは５又はそれ以上の連続アミノ酸残基のアミノ酸配列セグメントを含まない。
【００３０】
別の実施形態において、前記タンパク質抗原の少なくとも７つのアミノ酸残基の長さの（タンパク質抗原の）任意のさらなる配列セグメントは、配列番号１８の同一の長さの任意の配列部分とアミノ酸配列同一性５０％未満を有する。
【００３１】
さらなる実施形態において、タンパク質抗原は、ＨＥＲ２タンパク質に対する免疫応答を誘発することができる第１の配列セグメント及び任意選択でさらなる配列セグメントからなり、前記第１の配列セグメントは、
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列の３００、好ましくは３３０、より好ましくは３３７のアミノ酸配列又はより多くの連続アミノ酸残基を有し；又は
（ｉｉ）３００、好ましくは３３０、より好ましくは３３７又はそれ以上のアミノ酸残基の変異体アミノ酸配列を有し、前記変異体配列セグメントのアミノ酸配列は、配列番号２からの配列部分と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９５％の配列同一性を有し；又は
（ｉｉｉ）３００の、好ましくは３３０の、より好ましくは３３７又はそれ以上のアミノ酸残基の変異体アミノ酸配列を有し、３００又はそれ以上のアミノ酸残基、又はアミノ酸残基の数に関して同じ長さのアミノ酸配列の、配列番号２のアミノ酸配列の配列セグメントと比較して、１から２０の置換、欠失、又は付加を前記変異体配列中に有し；
前記タンパク質抗原（又はタンパク質抗原を含むタンパク質コンジュゲート）が、配列番号１８のアミノ酸１から２５３、好ましくは１から２８３からの配列部分からの、又はアミノ酸６７０から、好ましくはアミノ酸６５４から開始する配列部分からの２０又はそれ以上、好ましくは１０又はそれ以上の連続アミノ酸残基のさらなるアミノ酸配列セグメントを含まない。
【００３２】
タンパク質抗原を含むタンパク質のコンジュゲートにおいて、タンパク質抗原及び免疫原性担体は、好ましくは、化学的架橋剤を使用した化学的架橋により共有結合されている。
【００３３】
タンパク質抗原は、一般的に公知である方法に従ってクローニングし、発現させることができる。しかし、発現は、好ましくは、真核細胞中で行われる。ＨＥＲ２／Ｎｅｕの細胞外ドメインからの所望の部分又は第１セグメントをコードする核酸を、ＨＥＲ２遺伝子の公知の遺伝子配列を使用して、そのような部分のために設計されたプライマーを使用してクローニングすることができる。ＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子についてのＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＡＡ７５４９３（配列番号１８）である。安定なトランスジェニック又は一過性発現のいずれかのために設計された異なる産生宿主（細菌、真菌、動物、昆虫、及び植物細胞）及び発現ベクターに基づく、多くの異なる発現系を使用することができる。全てのそのような系は、当業者に周知であり、記載されており（総説については、Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｊ．、Ｌｉｎ，Ｈ．＆Ｙａｎｇ，Ｘ．２０１２、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３９：３８３−３９９；Ｈｏｕ，Ｊ．、Ｔｙｏ，Ｋ．Ｅ．、Ｌｉｕ，Ｚ．ら、２０１２、ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．、１２：４９１−５１０；Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｊ．Ｌ，、Ｌｉｕ，Ｌ．、Ｐｅｔｒａｎｏｖｉｃ，Ｄ．ら、２０１２、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、Ａｐｒ  １２．［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］；Ｓｕ，Ｘ．、Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｇ．、Ｚｈａｎｇ，Ｍ．ら、２０１２、Ａｄｖ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、８１：１−６１；Ｇｈａｄｅｒｉ，Ｄ．、Ｚｈａｎｇ，Ｍ．、Ｈｕｒｔａｄｏ−Ｚｉｏｌａ，Ｎ．＆Ｖａｒｋｉ，Ａ．２０１２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．、２８：１４７−１７５；Ｅｇｅｌｋｒｏｕｔ，Ｅ．、Ｒａｊａｎ，Ｖ．＆Ｈｏｗａｒｄ，Ｊ．Ａ．、２０１２、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．、１８４：８３−１０１を参照のこと）、系の選択は、因子、例えば材料のコスト又はタンパク質産生のために要求されるスピードなどに依存する。本発明者らの好ましい選択は、モノクローナル抗体などのヘテロオリゴマータンパク質を含む、異なる型の組換えタンパク質の産生におけるスピード、収率、及び普遍性に起因して、植物発現系、特に植物ウイルスベースの一過性発現系である。植物発現系の別の重要な利点は、発現ベクターからの植物ウイルスコートタンパク質又は融合タンパク質の発現を可能にすることにより、植物ウイルス粒子の産生を提供する能力である（Ｗｅｒｎｅｒ，Ｓ．ら、２００６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：１７６７８−１７６８３；ＷＯ２００７０３１３３９）。そのような系は、多数の研究論文、総説、及び特許において詳細に記載されている（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，Ｓ．、Ｔｈｏｅｒｉｎｇｅｒ，Ｃ．、Ｋａｎｄｚｉａ，Ｒ．ら、２００５、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３：７１８−７２３；Ｇｉｒｉｔｃｈ，Ａ．、Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，Ｓ．、Ｅｎｇｌｅｒ，Ｃ．、ら、２００６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：１４７０１−１４７０６；Ｇｌｅｂａ，Ｙ．、Ｋｌｉｍｙｕｋ，Ｖ．＆Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，Ｓ．２００７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８：１３４−１４１；Ｋｌｉｍｙｕｋ，Ｖ．、Ｐｏｇｕｅ，Ｇ．、Ｈｅｒｚ，Ｓ．ら、２０１２、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、Ａｐｒ  １５；ＷＯ２００５０４９８３９；ＷＯ２００６０７９５４６）。ＷＯ２００５０４９８３９には、その可能な植物ウイルス発現ベクター、その改変、及びその配列情報の詳細情報が含まれている。ウイルスベクターの設計、クローニング戦略、並びに組換えタンパク質及びウイルス粒子の発現は、例１において、本明細書において詳細に記載される。異なるＤＮＡフラグメントを一緒にシームレスに繋ぐためのモジュラークローニング戦略が、本発明者らの研究室において確立され、構築物の操作のために使用された（Ｅｎｇｌｅｒ，Ｃ．、Ｋａｎｄｚｉａ，Ｒ．＆Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，Ｓ．、２００８，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，３：ｅ３６４７；Ｗｅｂｅｒ  Ｅ．、Ｅｎｇｌｅｒ，Ｃ．、Ｇｕｅｔｚｎｅｒ，Ｒ．ら、２０１１、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、６：ｅ１６７６５；Ｅｎｇｌｅｒ，Ｃ．＆Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，Ｓ．２０１１、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、７２９：１６７−８１；Ｔｈｉｅｍｅ，Ｆ．、Ｅｎｇｌｅｒ，Ｃ．、Ｋａｎｄｚｉａ，Ｒ．ら、２０１１，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，６：ｅ２０５５６）。この系は、シンプルで、信頼でき、使用するのが便利であり、任意の複雑度の速い構造操作を可能にする。ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕのＥＤ４４（アミノ酸３１０〜６５３残基；図１Ａ）及びその２つの切断変異体（アミノ酸残基３１０〜６４９及び３４０〜６４９；図１Ｃ、Ｄ）をウイルスベクター中にクローニングし、発現レベルについてテストしており、コンジュゲート生成及びワクチン製剤のために使用した。
【００３４】
好ましくは真核生物宿主におけるタンパク質抗原の発現後、それは、一般的に公知である方法を使用して精製される。一実施形態において、タンパク質抗原は、精製タグを有する。精製は、次に、精製タグに対する親和性を有するマトリクスを使用したカラムクロマトグラフィーを含むことができる。
【００３５】
免疫原性担体は、少なくとも５ｋＤａの、好ましくは少なくとも１０ｋＤａの、より好ましくは少なくとも１５ｋＤａの、さらにより好ましくは少なくとも２０ｋＤａの分子量を有しうる。分子量は、しかし、依然として２０ｋＤａのよりもずっと大きくてもよく、１００ｋＤａよりも高くてもよい。担体はタンパク質であってもなくてもよい。好ましくは、しかし、担体はタンパク質でもある。担体タンパク質は、単量体タンパク質、例えば破傷風毒素フラグメントＣ若しくはＤＯＭ１フラグメント（配列番号１７）など、又はその多量体タンパク質でありうる。多量体タンパク質は、タンパク質サブユニットのジ、トリ又はそれよりも高いオリゴマー又はポリマーでありうる。高分子タンパク質であり、広く使用されている担体の例は、キーホールリンペットヘモヘモシアニン（ＫＬＨ）である（Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｒ．＆Ｍａｒｋｌ，Ｊ．１９９９、Ｍｉｃｒｏｎ．、３０：５９７−６２３；Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｒ．＆Ｍａｒｋｌ，Ｊ．２０００，Ｅｕｒ．Ｕｒｏｌ．、３：２４−３３）。他の高分子タンパク質の例は、多数の単量体タンパク質分子又はサブユニット、一般的には、コートタンパク質単量体の多量体からなる、又はそれを含みうるウイルス粒子である。そのようなウイルス粒子は、ウイルスＲＮＡ又はＤＮＡを含みうる。ウイルス粒子が好ましい担体である。なぜなら、それらが、特に哺乳動物、例えばヒトなどにおいて高度に免疫原性であり、強い免疫応答を起こすことができるからである。一実施形態において、ウイルス粒子は、例えば植物トバモウイルスなどの植物ウイルス粒子である。本発明のタンパク質コンジュゲートにおいて免疫原性担体として使用されうるウイルス粒子、特に植物ウイルス粒子が、以下においてより詳細に記載される。
【００３６】
ウイルス粒子は、複数のウイルスコートタンパク質分子を含む多量体粒子である。Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３３３（２００４）２３０−２３５に記載されている通りに電子顕微鏡法において決定されるウイルス粒子のサイズは、最短寸法で少なくとも１０ｎｍ、より好ましくは最短寸法で少なくとも１３ｎｍでありうる。
【００３７】
以前に言及した通り、ウイルス粒子は、一般的に、多くのコートタンパク質分子で形成される。ウイルス粒子、特に植物ウイルス粒子は、ＷＯ  ２００７／０３１３３９において記載される通り、適切な宿主、例えば植物又はその細胞などにおいてコートタンパク質分子を発現させることにより、又は植物ウイルスで感染された植物宿主から植物ウイルス粒子を精製することにより形成することができる。
【００３８】
植物ウイルス（その植物ウイルス粒子が、本発明のタンパク質コンジュゲートにおいて使用されうる）が公知であり、例えば、Ｄｒｅｗｓ，Ａｄａｍ，Ｈｅｉｎｚｅ，“Ｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ  Ｐｆｌａｎｚｅｎｖｉｒｏｌｏｇｉｅ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  ２００４の書籍を参照のこと。ウイルス粒子は、細菌宿主又は植物宿主においてウイルス粒子を形成するために集合する（単量体）タンパク質、一般的に、コートタンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現させることにより産生されうる。植物宿主は、植物細胞、植物組織、又は植物全体でありうる。コートタンパク質をコードすることとは別に、前記ポリヌクレオチドは、選ばれた宿主においてコートタンパク質の発現のために要求される調節エレメントを有するであろう。ポリヌクレオチドを発現させる際、本発明のウイルス粒子は、一般的に、宿主細胞内で集合する、又は適切な条件下で宿主細胞からのコートタンパク質を単離した後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで集合しうる。
【００３９】
植物ウイルスコートタンパク質は、例えば、任意の植物ウイルス、例えば以下に列挙する植物ウイルスなどに由来しうる。一実施形態において、前記植物ウイルスコートタンパク質は、桿状のウイルス粒子を形成する植物ウイルスに由来する。他の例は、糸状及び二十面体植物ウイルス粒子である。「由来する」は、植物ウイルス粒子を形成するコートタンパク質が、植物ウイルスの天然コートタンパク質と同一である必要はないことを意味する。代わりに、使用されるコートタンパク質は、植物ウイルスの天然コートタンパク質と比べて、付加、欠失、挿入、又は変異を有しうる。一実施形態において、天然植物ウイルスコートタンパク質の最大で２０のアミノ酸残基が欠失及び／又は変異している。別の実施形態において、最大で２０のアミノ酸残基が、コートタンパク質が由来する植物ウイルスの植物ウイルスコートタンパク質の天然配列中に挿入される。
【００４０】
植物ウイルス粒子（及び植物ウイルス粒子を形成する植物ウイルスコートタンパク質）、及び植物ウイルス粒子は、ＲＮＡウイルス、例えば植物プラスセンス一本鎖ＲＮＡウイルスなど、又はＤＮＡウイルスに由来しうる。本発明のために使用されうるコートタンパク質を提供する植物ウイルスの例は、前記フラグメント又は相同体がウイルス粒子を形成することができるという条件で、トバモウイルス、例えばタバコ・モザイク・ウイルス（ＴＭＶ）、カブ葉脈透化ウイルス（ＴＶＣＶ）、ジャガイモウイルスＸ、ジャガイモウイルスＹ、及びそのフラグメント又はホモログを含む。一実施形態において、使用されるコートタンパク質は、カブ静脈クリアリングウイルスのコートタンパク質、タバコ・モザイク・ウイルス、ジャガイモウイルスＸ、又はジャガイモウイルスＹと少なくとも５０％の配列同一性を有する。別の実施形態において、前記の配列同一性は、少なくとも６０％である；さらなる実施形態において、前記の配列同一性は、少なくとも７０％である。重要な実施形態において、コートタンパク質は、少なくとも９０％のタバコ・モザイク・ウイルスのコートタンパク質との配列同一性を有する。
【００４１】
ウイルス粒子を形成する別の分類群に属する植物ウイルスは、本発明の原理に従った免疫原性担体として使用することができる。これは、ＲＮＡ含有ウイルス及びＤＮＡ含有ウイルスの両方について右側であり、それらの例を以下に与える。目、科、及び属の名称は、それらがＩＣＴＶにより承認された場合、イタリック体である。引用中の分類群名（イタリック体ではない）は、この分類群がＩＣＴＶの国際承認名を有さないことを示す。種（固有）名を、通常のスクリプト中に与える。属又は科に正式に割り当てられていないウイルスを示す：
ＤＮＡウイルス：
環状ｄｓＤＮＡウイルス：科：カリモウイルス科（Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｉｄａｅ）、属：バドナウイルス（Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ）、基準種：コメリナ・イエロー・モット・ルウイルス（ｃｏｍｍｅｌｉｎａ  ｙｅｌｌｏｗ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、属：カリモウイルス（Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ）、基準種：カリフラワー・モザイク・ウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、属「ＳｂＣＭＶ様ウイルス」、基準種：ダイズ・クロロティック斑紋ウイルス（Ｓｏｙｂｅａｎ  ｃｈｌｏｒｏｔｉｃｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、属「ＣｓＶＭＶ様ウイルス」、基準種：キャッサバ・ベイン・モザイクウイルス（Ｃａｓｓａｖａ  ｖｅｉｎ  ｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ）、属「ＲＴＢＶ様ウイルス」、基準種：ライス・ツングロ・バシリホルムウイルス（Ｒｉｃｅ  ｔｕｎｇｒｏ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｖｉｒｕｓ）、属「ペチュニア・ベイン・クリアリング様ウイルス（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｖｅｉｎ  ｃｌｅａｒｉｎｇ−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ）」、基準種：ペチュニア・ベイン・クリアリングウイルス（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｖｅｉｎ  ｃｌｅａｒｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ）；
環状ｓｓＤＮＡウイルス：科：ジェミニウイルス科（Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ）、属：マストレウイルス（Ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ）（サブグループＩジェミニウイルス（Ｓｕｂｇｒｏｕｐ  Ｉ  Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ））、基準種：メイズ・ストリーク・ウイルス（ｍａｉｚｅ  ｓｔｒｅａｋ  ｖｉｒｕｓ）、属：カートウイルス（Ｃｕｒｔｏｖｉｒｕｓ）（サブグループＩＩジェミニウイルス（Ｓｕｂｇｒｏｕｐ  ＩＩ  Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ））、基準種：ビート・カーリー・トップ・ウイルス（ｂｅｅｔ  ｃｕｒｌｙ  ｔｏｐ  ｖｉｒｕｓ）、属：ベゴモウイルス（Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ）（サブグループＩＩＩジェミニウイルス（Ｓｕｂｇｒｏｕｐ  ＩＩＩ  Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ））、基準種：ビーン・ゴールデン・モザイク・ウイルス（ｂｅａｎ  ｇｏｌｄｅｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）；
ＲＮＡウイルス：
ｓｓＲＮＡウイルス：科：ブロモウイルス科（Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）、属：アルファモウイルス（Ａｌｆａｍｏｖｉｒｕｓ）、基準種：アルファルファ・モザイク・ウイルス、属：イラルウイルス（Ｉｌａｒｖｉｒｕｓ）、基準種：タバコ・モザイク・ウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ  ｓｔｒｅａｋ  ｖｉｒｕｓ）、属：ブロモウイルス（Ｂｒｏｍｏｖｉｒｕｓ）、基準種：ブロム・モザイク・ウイルス（ｂｒｏｍｅ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、属：ククモウイルス（Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓ）、基準種：キュウリ・モザイク・ウイルス（ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）；科：クロステロウイルス科（Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、属：クロステロウイルス（Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）、基準種：ビート萎黄ウイルス（ｂｅｅｔ  ｙｅｌｌｏｗｓ  ｖｉｒｕｓ）、属：クリニウイルス（Ｃｒｉｎｉｖｉｒｕｓ）、基準種：レタス感染性イエローズ・ウイルス（Ｌｅｔｔｕｃｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｙｅｌｌｏｗｓ  ｖｉｒｕｓ）、科：コモウイルス科（Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）、属：コモウイルス（Ｃｏｍｏｖｉｒｕｓ）、基準種：カウピー・モザイク・ウイルス（ｃｏｗｐｅａ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、属：ファバウイルス（Ｆａｂａｖｉｒｕｓ）、基準種：ソラマメ・ウイルト・ウイルス１（ｂｒｏａｄ  ｂｅａｎ  ｗｉｌｔ  ｖｉｒｕｓ  １）、属：ネポウイルス（Ｎｅｐｏｖｉｒｕｓ）、基準種：タバコ輪点ウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ  ｒｉｎｇｓｐｏｔ  ｖｉｒｕｓ）；科：ポティウイルス科（Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ）、属：ポティウイルス（Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）、基準種：ジャガイモＹウイルス（ｐｏｔａｔｏ  ｖｉｒｕｓ  Ｙ）、属：リモウイルス（Ｒｙｍｏｖｉｒｕｓ）、基準種：ライグラス・モザイク・ウイルス（ｒｙｅｇｒａｓｓ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、属：ビモウイルス（Ｂｙｍｏｖｉｒｕｓ）、基準種：オオムギ縞萎縮ウイルス（ｂａｒｌｅｙ  ｙｅｌｌｏｗ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）；科：セキウイルス科（Ｓｅｑｕｉｖｉｒｉｄａｅ）、属：セキウイルス（Ｓｅｑｕｉｖｉｒｕｓ）、基準種：パースニップ・イエロー・フレック・ウイルス（ｐａｒｓｎｉｐ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｅｃｋ  ｖｉｒｕｓ）、属：ワイカウイルス（Ｗａｉｋａｖｉｒｕｓ）、基準種：ライス・ツングロ・スフェリカル・ウイルス（ｒｉｃｅ  ｔｕｎｇｒｏ  ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  ｖｉｒｕｓ）、科：トムブスウイルス科（Ｔｏｍｂｕｓｖｉｒｉｄａｅ）、属：カルモウイルス（Ｃａｒｍｏｖｉｒｕｓ）、基準種：カーネーション斑紋ウイルス（ｃａｒｎａｔｉｏｎ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、属：ディアンソウイルス（Ｄｉａｎｔｈｏｖｉｒｕｓ）、基準種：カーネーション・リングスポット・ウイルス（ｃａｒｎａｔｉｏｎ  ｒｉｎｇｓｐｏｔ  ｖｉｒｕｓ）、属：マクロモウイルス（Ｍａｃｈｌｏｍｏｖｉｒｕｓ）、基準種：メイズ・クロロティック斑紋ウイルス（ｍａｉｚｅ  ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、属：ネクロウイルス（Ｎｅｃｒｏｖｉｒｕｓ）、基準種：タバコ・ネクロシス・ウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、属：トムブスウイルス（Ｔｏｍｂｕｓｖｉｒｕｓ）、基準種：トマト・ブッシィ・スタント・ウイルス��ｔｏｍａｔｏ  ｂｕｓｈｙ  ｓｔｕｎｔ  ｖｉｒｕｓ）、未帰属のｓｓＲＮＡウイルス属、属：カピロウイルス（Ｃａｐｉｌｌｏｖｉｒｕｓ）、基準種：リンゴ・ステム・グルービング・ウイルス（ａｐｐｌｅ  ｓｔｅｍ  ｇｒｏｏｖｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ）；属：カルラウイルス（Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ）、基準種：カーネーション潜在ウイルス（ｃａｒｎａｔｉｏｎ  ｌａｔｅｎｔ  ｖｉｒｕｓ）、属：エナモウイルス（Ｅｎａｍｏｖｉｒｕｓ）、基準種：ピー・エネーション・モザイク・ウイルス（ｐｅａ  ｅｎａｔｉｏｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）；属：フロウイルス（Ｆｕｒｏｖｉｒｕｓ）、基準種：ムギ類萎縮ウイルス（ｓｏｉｌ−ｂｏｒｎｅ  ｗｈｅａｔ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、属：ホルデイウイルス（Ｈｏｒｄｅｉｖｉｒｕｓ）、基準種：ムギ斑葉モザイク・ウイルス（ｂａｒｌｅｙ  ｓｔｒｉｐｅ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、属：イダエオウイルス（Ｉｄａｅｏｖｉｒｕｓ）、基準種：ラズベリ・ブッシィ・ドワーフ・ウイルス（ｒａｓｐｂｅｒｒｙ  ｂｕｓｈｙ  ｄｗａｒｆ  ｖｉｒｕｓ）；属：ルテオウイルス（Ｌｕｔｅｏｖｉｒｕｓ）、基準種：オオムギ黄萎ウイルス（ｂａｒｌｅｙ  ｙｅｌｌｏｗ  ｄｗａｒｆ  ｖｉｒｕｓ）；属：マラフィウイルス（Ｍａｒａｆｉｖｉｒｕｓ）、基準種：メイズ・ラヤド・フィノ・ウイルス（ｍａｉｚｅ  ｒａｙａｄｏ  ｆｉｎｏ  ｖｉｒｕｓ）；属：ポテックスウイルス（Ｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓ）、基準種：ジャガイモＸウイルス（ｐｏｔａｔｏ  ｖｉｒｕｓ  Ｘ）；属：ソベモウイルス（Ｓｏｂｅｍｏｖｉｒｕｓ）、基準種：インゲンマメ南部モザイク・ウイルス（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｅａｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、属：テヌイウイルス（Ｔｅｎｕｉｖｉｒｕｓ）、基準種：イネ縞葉枯ウイルス（ｒｉｃｅ  ｓｔｒｉｐｅ  ｖｉｒｕｓ）、属：トバモウイルス（Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ）、基準種：タバコ・モザイク・ウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、属：トブラウイルス（Ｔｏｂｒａｖｉｒｕｓ）、基準種：タバコ茎えそウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ  ｒａｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、属：トリコウイルス（Ｔｒｉｃｈｏｖｉｒｕｓ）、基準種：リンゴ・クロロティック・リーフ・スポット・ウイルス（ａｐｐｌｅ  ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ  ｌｅａｆ  ｓｐｏｔ  ｖｉｒｕｓ）；属：ティモウイルス（Ｔｙｍｏｖｉｒｕｓ）、基準種：ターニップ・イエロー・モザイク・ウイルス（ｔｕｒｎｉｐ  ｙｅｌｌｏｗ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）；属：ウムブラウイルス（Ｕｍｂｒａｖｉｒｕｓ）、基準種：キャロット斑紋ウイルス（ｃａｒｒｏｔ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ）；
マイナスｓｓＲＮＡウイルス：目：モノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）、科：ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、属：シトラブドウイルス（Ｃｙｔｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、基準種：レタス・ネクロティック・イエローズ・ウイルス（ｌｅｔｔｕｃｅ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｙｅｌｌｏｗｓ  ｖｉｒｕｓ）、属：ヌクレオラブドウイルス（Ｎｕｃｌｅｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、基準種：ポテト・イエロー・ドワーフ・ウイルス（ｐｏｔａｔｏ  ｙｅｌｌｏｗ  ｄｗａｒｆ  ｖｉｒｕｓ）；
マイナスｓｓＲＮＡウイルス：科：ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、属：トスポウイルス（Ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓ）、基準種：トマト黄化えそウイルス（ｔｏｍａｔｏ  ｓｐｏｔｔｅｄ  ｗｉｌｔ  ｖｉｒｕｓ）；
ｄｓＲＮＡウイルス：科：パルティティウイルス科（Ｐａｒｔｉｔｉｖｉｒｉｄａｅ）、属：アルファクリプトウイルス（Ａｌｐｈａｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓ）、基準種：シロクローバ潜伏ウイルス１（ｗｈｉｔｅ  ｃｌｏｖｅｒ  ｃｒｙｐｔｉｃ  ｖｉｒｕｓ  １）、属：ベータクリプトウイルス（Ｂｅｔａｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓ）、基準種：シロクローバ潜伏ウイルス２（ｗｈｉｔｅ  ｃｌｏｖｅｒ  ｃｒｙｐｔｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ２）、科：レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）、属：フィジーウイルス（Ｆｉｊｉｖｉｒｕｓ）、基準種：フィジー・ディジーズ・ウイルス（Ｆｉｊｉ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、属：フィトレオウイルス（Ｐｈｙｔｏｒｅｏｖｉｒｕｓ）、基準種：ウンド・テュモア・ウイルス（ｗｏｕｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓ）、属：オリザウイルス（Ｏｒｙｚａｖｉｒｕｓ）、基準種：イネ・ラギット・スタント・ウイルス（ｒｉｃｅ  ｒａｇｇｅｄ  ｓｔｕｎｔ  ｖｉｒｕｓ）；
未帰属のウイルス：ゲノムｓｓＤＮＡ：種：バナナ・バンチー・トップ・ウイルス（ｂａｎａｎａ  ｂｕｎｃｈｙ  ｔｏｐ  ｖｉｒｕｓ）、種：ココヤシ葉腐食ウイルス（ｃｏｃｏｎｕｔ  ｆｏｌｉａｒ  ｄｅｃａｙ  ｖｉｒｕｓ）、種：サブタレニアン・クローバー・スタント・ウイルス（ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ  ｃｌｏｖｅｒ  ｓｔｕｎｔ  ｖｉｒｕｓ）、ゲノム：ｄｓＤＮＡ、種：キュウリ葉脈黄化ウイルス（ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｖｅｉｎ  ｙｅｌｌｏｗｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ）；ゲノム：ｄｓＲＮＡ、種：タバコ・スタント・ウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ  ｓｔｕｎｔ  ｖｉｒｕｓ）、
ゲノム：ｓｓＲＮＡ：種：ガーリックＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄウイルス（Ｇａｒｌｉｃ  ｖｉｒｕｓｅｓ  Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）；種：グレープバイン・フレック・ウイルス（ｇｒａｐｅｖｉｎｅ  ｆｌｅｃｋ  ｖｉｒｕｓ）；種：メイズ・ホワイト・ライン・モザイク・ウイルス（ｍａｉｚｅ  ｗｈｉｔｅ  ｌｉｎｅ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）；種：オリーブ・ラテント・ウイルス２（ｏｌｉｖｅ  ｌａｔｅｎｔ  ｖｉｒｕｓ  ２）；種：オールミア・メロン・ウイルス（ｏｕｒｍｉａ  ｍｅｌｏｎ  ｖｉｒｕｓ）；種：ペラルゴニューム・ゾネート・スポット・ウイルス（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ  ｚｏｎａｔｅ  ｓｐｏｔ  ｖｉｒｕｓ）。
【００４２】
選択された植物ウイルスの大きさ及び形状の例は、以下の通りである。
桿状ウイルス−ＴＭＶ：ビリオンは、長さ≒３００ｎｍ及び直径≒１８ｎｍを有する。ＰＶＸ（糸状；通常は屈曲性；明確なモード長）：長さ５１５ｎｍ、直径１３ｎｍ；ブロムモザイク・ウイルス：直径２６ｎｍ。
対称／形状−正二十面体：アルファルファ・モザイク・ウイルス（ヌクレオカプシド桿菌、又は準アイソメトリック伸長）：長さ３５ｎｍ（Ｔｂ）又は長さ３０ｎｍ；桿状（Ｔａ−ｂ）形状又は楕円（Ｔａ−ｔ）形状のいずれかで生じた）明確なモード長なし：長さ５６ｎｍ（Ｂ）；長さ４３ｎｍ（Ｍ）；直径１８ｎｍ。
【００４３】
好ましい植物ウイルス粒子は、一本鎖プラスセンスＲＮＡゲノムを有する植物ウイルスからである。ウイルス（タバコ・モザイク・ウイルス及びジャガイモウイルスＸ）が、前記ウイルスのための十分に確立された発現系（ヘテロオリゴマータンパク質の発現のために非常に最近開発された系（ＥＰ出願第０５  ００１  ８１９．１号；ＷＯ２００６／０７９５４６）を含む）を使用して発現されうる（Ｄｏｎｓｏｎ  ら、１９９１、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８８：７２０４−７２０８；Ｓｈｉｖｐｒａｓａｄ  ら、１９９９、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２５５：３１２−３２３；Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ  ら、２００４、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０１：６８５２−６８５７；Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ  ら、２００５、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３：７１８−７２３；Ｃｈａｐｍａｎ，Ｋａｖａｎａｇｈ＆Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，１９９２，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、２：５４９−５５７；Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、１９９５、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、７：１０４５−１０５３；Ａｎｇｅｌｌ＆Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，１９９７，ＥＭＢＯ  Ｊ．、１６：３６７５−３６８４）。ＤＮＡウイルスを含む他のウイルスからの植物ウイルス粒子を、本発明を実施するために使用することができる（総説については、以下を参照のこと：Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ  ら、１９９２、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、ｐｐ１８７−２１５；Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ  ら、１９９４、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４５：７９−１１２；Ｐｏｒｔａ＆Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ、２００２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｒｅｖ．、１９：２４５−２９１）。
【００４４】
このように、免疫原性担体は、ＲＮＡウイルス（例えばトバモウイルスなど）に由来しうる植物ウイルス粒子でありうる。別の実施形態において、免疫原性担体（ｃａｒｒｉｒ）は、ポティウイルス科からのウイルスの植物ウイルス粒子である。他の選択肢を上に言及する。
【００４５】
多量体担体タンパク質が、例えば、図３Ｃに例示する通り、複数のタンパク質抗原分子に共有結合されうる。注目すべきことに、担体としてのウイルス粒子は、タンパク質抗原の複数の分子に共有結合されうる。
【００４６】
非タンパク質性担体の最も公知である例は、リポソームである（総説については、以下を参照のこと：Ｆｅｌｎｅｒｏｖａ，Ｄ．、Ｖｉｒｅｔ，Ｊ．Ｆ．、Ｇｌｕｃｋ，Ｒ．、ら、２００４，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５：５１８−２９；Ｔｉｗａｒｉ，Ｓ．、Ａｇｒａｗａｌ，Ｇ．Ｐ．＆Ｖｙａｓ，Ｓ．Ｐ．２０１０、Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，５：１６１７−１６５０）。
【００４７】
担体タンパク質を、当技術分野において一般的に公知の通りに、例えば、上に言及するような発現系を使用して、発現させることができる。植物ウイルスコートタンパク質の発現及び植物ウイルス粒子の産生は、ＷＯ２００７０３１３３９に詳細に記載されている。他の担体は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｔ３６９４  Ｓｉｇｍａ）から、又はＭｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（５８２２３５号）からの破傷風毒素フラグメントＣとして商業的に入手可能である。さらなる代替として、ＤＯＭ１と呼ばれる破傷風毒素フラグメントＣの一部（配列番号１７を参照のこと）を使用することができる。それは、破傷風フラグメントＣとは異なり、ＤＯＭ１は患者におけるＢ細胞のための新規抗原であり、故に、破傷風の予防接種（それは、恐らくは、免疫応答を遅らせうる）（Ｌｏｗ，Ｌ．、Ｍａｎｄｅｒｒ，Ａ．、ＭｃＣａｎｎ，Ｋ．ら、２００９、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２０：１２６９−１２７８）のために誘導される既存の抗体により認識されないであろうことが示された。
【００４８】
担体は、タンパク質担体である本発明の一実施形態において、タンパク質抗原と担体タンパク質を含むタンパク質コンジュゲートは、融合タンパク質として、即ち、１つのアミノ酸配列の部分として発現されうる。そのような実施形態において、タンパク質抗原と担体タンパク質の間での共有結合は、融合タンパク質のペプチド結合である。リンカーペプチドを、融合タンパク質のタンパク質抗原ドメイン及び担体タンパク質ドメインの独立したフォールディングを可能にするために、タンパク質抗原と担体タンパク質の間で使用してもよい。ＷＯ２００７０３１３３９には、組換えタンパク質としてのタンパク質抗原を、植物ウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてどのように同時発現させるのかが記載されている。コートタンパク質ドメインは、次に、任意選択で遊離ウイルスコートタンパク質の存在下で集合し、それらの表面上にタンパク質抗原ドメインを呈示する植物ウイルス粒子を形成しうる。
【００４９】
免疫原性担体タンパク質は、好ましくは、ＨＥＲ２タンパク質との類似性を有さない。このように、担体タンパク質は、好ましくは、５０又はそれ以上の、好ましくは３０又はそれ以上の、より好ましくは２０又はそれ以上の、さらにより好ましくは１０又はそれ以上の連続アミノ酸残基のアミノ酸配列セグメントを有さず、その配列セグメントは、配列番号１８の同一の長さ（アミノ酸残基の数に関して）の任意の配列部分と５０％を上回るアミノ酸配列同一性を有する。
【００５０】
１つ又は複数の共有結合によるタンパク質抗原と担体のコンジュゲーションを次に記載する。２つ又はそれ以上の異なるタンパク質又はペプチドの共有結合的な連結は、いくつかの周知のアプローチを使用して達成することができる。これらは、以下に限定されない：翻訳融合；インテイン媒介性のシス又はトランススプライシング、ジスルフィド結合形成を介したヘテロオリゴマータンパク質集合、架橋剤を使用した化学的コンジュゲーション。最も一般に使用されるアプローチの１つは、目的のタンパク質又はそのフラグメントの翻訳（インフレーム）融合であり、そこでは、それらは、単一のプロモーターの制御下で、１つの転写ユニットから発現される。異なるタンパク質又はその部分の間での翻訳融合物の生成は、周知の先行技術であり、標準的な分子生物学技術（Ｓａｍｂｒｏｏｃｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を使用して行うことができる。アプローチは、組換えタンパク質の発現を改善し、その精製を促進する（Ｂｕｔｔ，Ｔ．Ｒ．、Ｅｄａｖｅｔｔａｌ，Ｓ．Ｃ．、Ｈａｌｌ，Ｊ．Ｐ．ら、２００５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．、４３：１−９；Ｆａｚｅｎ，Ｃ．Ｈ．、Ｋａｈｋｏｓｋａ，Ａ．．Ｒ，Ｄｏｙｌｅ，Ｒ．Ｐ．、２０１２、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．、８５：５１−５９；ｆｏｒ  ｒｅｖｉｅｗ  ｓｅｅ：Ｌｉｃｈｔｙ，Ｊ．Ｊ．、Ｍａｌｅｃｋｉ，Ｊ．Ｌ．、Ａｇｎｅｗ，Ｈ．Ｄ．、ら、２０１１、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．、Ｓｅｐ  ３．［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］）、目的のタンパク質の組織、細胞、又は細胞内区画を決定する、又はそれらの相互作用を試験する（例、ＧＦＰ  ｏｒ  ＧＵＳ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ｆｕｓｉｏｎｓ−Ｓｅｐｕｌｖｅｄａ−Ｇａｒｃｉａ，Ｅ．＆Ｒｏｃｈａ−Ｓｏｓａ，Ｍ．２０１２、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．、１９５：３６−４７；Ａｈｎ，Ｃ．Ｓ．、Ｈａｎ，Ｊ．Ａ．＆Ｐａｉ，Ｈ．Ｓ．２０１２，Ｐｌａｎｔａ，Ｓｅｐｔ  ２２，［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］）又はキメラタンパク質を作製するために異種ドメインを融合させるなどの任意の他の用途のために（Ｍｅｎｇ，Ｚ．Ｆ．、Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｊ．、Ｙａｏ，Ｘ．ら、２０１２、Ｃｈｉｎ．Ｍｅｄ．Ｊ．、１２５：３２６６−３２７２；Ｅｏｎ−Ｄｕｖａｌ，Ａ．，Ｖａｌａｘ，Ｐ．、Ｓｏｌａｃｒｏｕｐ，Ｔ．ら、２０１２、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．、１０１：３６０４−３６１８）頻繁に使用される。
【００５１】
２つ又はそれ以上の異なるタンパク質又はタンパク質フラグメントの共有結合的なインフレーム融合は、インテイン媒介性トランススプライシングを使用することにより達成することができる。インテインは、最初に、タンパク質前駆体中にインフレームで埋め込まれたタンパク質配列として同定され、タンパク質の成熟過程の間に切除された（Ｐｅｒｌｅｒ，Ｆ．Ｂ．、Ｄａｖｉｓ，Ｅ．Ｏ．、Ｄｅａｎ，Ｇ．Ｅ．ら、１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２２：１１２５−１１２７；Ｐｅｒｌｅｒ，Ｆ．Ｂ．、１９９８、Ｃｅｌｌ、９２：１−４）。自己スプライシング反応を実施するために必要な全ての情報及び触媒基が、インテイン及び２つの隣接アミノ酸中に存在する。タンパク質スプライシングの化学的機構が、Ｐｅｒｌｅｒらにより詳細に記載されている（１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、１：２９２−２９９）及びＳｈａｏ＆Ｋｅｎｔ（１９９７、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、４：１８７−１９４）。インテインは、通常、Ｎ末端及びＣ末端スプライシング領域並びに中央のホーミングエンドヌクレアーゼ領域又は小さなリンカー領域からなる。１００を超えるインテインが、真核生物、古細菌、及び真正細菌を含む異なる生物の核及びオルガネラゲノムの間で分布していることがこれまでに公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｎｅｂ／ｉｎｔｅｉｎｓ．ｈｔｍｌ）。分割インテインの操作が、例えば、Ｂｒｅｎｚｅｌ，Ｓ．、Ｋｕｒｐｉｅｒｓ，Ｔ．＆Ｍｏｏｔｚ，Ｈ．Ｄ．２００６、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５：１５７１−１５７８において記載されている。新たな自然分割インテインの発見が、Ｃａｒｖａｊａｌ−Ｖａｌｌｅｊｏｓ，Ｐ．、Ｐａｌｌｉｓｓｅ，Ｒ．、Ｍｏｏｔｚ，Ｈ．Ｄ．ら、２０１２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８７：２８６８６−９６において記載されている。これは、インテイン分子はトランス−スプライシングすることが可能であることが示された。中央のホーミングエンドヌクレアーゼ領域の除去は、インテインの自己スプライシングに対する任意の効果を有さない。これによって、また、トランス−スプライシング系の設計が可能になり、それにおいて、インテインのＮ末端及びＣ末端フラグメントは別々のフラグメントとして同時発現され、エクステインに融合した場合（インテインの助けで一緒に連結されたタンパク質フラグメント）、ｉｎ  ｖｉｖｏでのトランス−スプライシングを実施することができる（Ｓｈｉｎｇｌｅｄｅｃｋｅｒ，Ｋ．、Ｊｉａｎｇ，Ｓ．Ｑ．＆Ｐａｕｌｕｓ，Ｈ．、１９９８、Ｇｅｎｅ、２０７：１８７−１９５）。また、結核菌ＲｅｃＡインテインのＮ末端及びＣ末端セグメントを用いて、タンパク質トランス−スプライシングがｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こりうることが示された（Ｍｉｌｌｓ，Ｋ．Ｖ．、Ｌｅｗ，Ｂ．Ｍ．、Ｊｉａｎｇ，Ｓ．、ら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：３５４３−３５４８）。この現象は、また、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株のＤｎａＥタンパク質について同定された（Ｗｕ，Ｈ．、Ｈｕ，Ｚ．＆Ｌｉｕ，Ｘ．Ｑ．、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：９��２６−９２３１）。反対側のＤＮＡ鎖上で７００Ｋｂ．ｐ．を上回り離れて位置づけられる２つの異なる遺伝子が、このタンパク質をコードする。また、これらの遺伝子によりコードされる２つのインテイン配列が、分割ミニインテインを再構成し、大腸菌細胞においてテストした場合、タンパク質トランス−スプライシング活性を媒介することができることが示された。大腸菌で、同じ起源のインテイン分子（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株からのＤｎａＥインテイン）を使用して、２つの裏地のないフラグメントからの機能的な除草剤耐性アセト乳酸合成酵素１１（Ｓｕｎ，Ｌ．、Ｇｈｏｓｈ，Ｉ．、Ｐａｕｌｕｓ，Ｈ．ら、２００１、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６７：１０２５−２９）及び５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）（Ｃｈｅｎ，Ｌ．，Ｐｒａｄｈａｎ，Ｓ．＆Ｅｖａｎｓ，Ｔ．Ｃ．、２００１、Ｇｅｎｅ，２６３；３９−４８）を産生した。
【００５２】
２つ又はそれ以上のポリペプチドを一緒に連結させるさらに別の方法は、ジスルフィド結合の形成を介したそれらの集合である。これを達成するための最も簡単な方法は、好ましくは、ジスルフィド結合を形成するために、互いの間に相互作用することが公知であるタンパク質のフラグメントを使用することである。そのようなフラグメントの例は、免疫グロブリン軽鎖（例、「カッパ」又は「ラムダ」）及び重鎖（例、ＩｇＧのＦｃ）の定常領域である。このアプローチは、定常領域、重鎖（ＵＳ７０６７１１０）への抗原融合及び二重特異性ＩｇＧ設計からなるホモ二量体の形成のために使用することができる（Ｚｕｏ，Ｚ．、Ｊｉｍｅｎｅｚ，Ｘ．、Ｗｉｔｔｅ，Ｌ．＆Ｚｈｕ，Ｚ．２０００、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、１３：３６１−３６７；Ｄａｖｉｓ，Ｊ．Ｈ．、Ａｐｅｒｌｏ，Ｃ．、Ｌｉ，Ｙ．ら、２０１０、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．、２３：１９５−２０２；総説については、Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．２００１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４８：７−１５０；Ｔｈａｋｕｒ，Ａ．、Ｌｕｍ，Ｌ．Ｇ．２０１０、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１２：３４０−３４９０を参照のこと）。
【００５３】
２つ又はそれ以上の異なるタンパク質を共有結合的に連結するための最も普遍的なアプローチは、化学的架橋剤を使用することであり、それは、本発明においてタンパク質抗原及び担体タンパク質を連結するために好ましい。種々の公知の架橋剤は、この目的のために適用することができる。頻繁に用いられる架橋剤は、グルタルアルデヒド（Ｍａｌｏｎｅｙ，Ｄ．Ｇ．、Ｋａｍｉｎｓｋｉ，Ｍ．Ｓ．、Ｂｕｒｏｗｓｋｉ，Ｄ．ら、１９８５、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、４：１９２−２０９；Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍ．＆Ｌｅｖｙ，Ｒ．、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６４：４７９７−４７８０３；Ｂｅｎｄａｎｄｉ，Ｍ．、Ｇｏｃｋｅ，Ｃ．Ｄ．、Ｋｏｂｒｉｎ，Ｃ．Ｂ．ら、１９９９，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、５：１１７１−１１７７；Ｂｅｎｄａｎｄｉ，Ｍ．、Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，Ｓ．、Ｋａｎｄｚｉａ，Ｒ．ら、２０１０、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２１：２４２０−２４２７）、マレイミド（Ｂｅｔｔｉｎｇ，Ｄ．Ｊ．、Ｋａｆｉ，Ｋ．、Ａｂｄｏｌｌａｈ−Ｆａｒｄ，Ａ．ら、２００８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８１：４１３１−４１４０；Ｋａｆｉ，Ｋ．、Ｂｅｔｔｉｎｇ，Ｄ．Ｊ．、Ｙａｍａｄａ，Ｒ．Ｅ．ら、２００９、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４６：４４８−４５６０）、及び多くの他のものである。グルタルアルデヒドは、主にリシン残基を介してタンパク質を架橋し、システイン、チロシン、及びヒスチジン残基での二次反応を伴う（Ｍｉｇｎｅａｕｌｔ，Ｉ．、Ｄａｒｔｉｇｕｅｎａｖｅ，Ｃ．、Ｂｅｒｔｒａｎｄ，Ｍ．Ｊ．＆Ｗａｌｄｒｏｎ，Ｋ．Ｃ．、２００４、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３７：７９０−７９６）。マレイミドは、（還元型）システインスルフヒドリル基に作用する（Ｂｅｔｔｉｎｇ，Ｄ．Ｊ．、Ｋａｆｉ，Ｋ．、Ａｂｄｏｌｌａｈ−Ｆａｒｄ，Ａ．ら、２００８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８１：４１３１−４１４０）。架橋の技術並びに多数の架橋剤が、当業者に周知であり、多くの総説及びプロトコールにおいて記載されている（Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．＆Ｗｏｎｇ，Ｌ．Ｊ．１９９３，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１４：８６６−８７４；Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．＆Ｊａｍｅｓｏｎ，Ｄ．Ｍ．２００９、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、２００９、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ｆｏｒ  ｄｏｗｎｌｏａｄｉｎｇ  ｍｏｒｅ  ｉｎｆｏ  ｏｒ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ−ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏ．ｃｏｍ／ｐｉｅｒｃｅ）。架橋剤は、また、商業的に入手可能であり、製造者の架橋タンパク質のプロトコールに従ってもよい。このように、そのような実施形態において、タンパク質コンジュゲートは、タンパク質抗原及び免疫原性担体を、別々のタンパク質分子として提供し、化学的架橋剤（グルタルアルデヒドなど）を使用してリンカーを介してタンパク質抗原と免疫原性担体を架橋することを含む過程により産生することができる。
【００５４】
本発明のキットは、本明細書において定義するタンパク質抗原及びタンパク質コンジュゲートを形成するための前記タンパク質抗原との架橋のための免疫原性タンパク質又はタンパク質凝集体を含む。キットは、さらに、化学的架橋剤を含みうる。
【００５５】
上に記載する通りに得られたタンパク質コンジュゲートは、一般的に、水性媒質中で保存される。より長い保存時間のために、それは、凍結又は凍結乾燥することができる。水性媒質は、ｐＨを制御するための緩衝液を含んでもよく、生理食塩水及び／又は他の添加剤を含んでもよい。
【００５６】
本発明の抗癌ワクチンは、本発明のタンパク質コンジュゲート及び適切な薬理学的に許容される添加剤を含む。別の実施形態において、抗癌ワクチンは、タンパク質抗原を含み、それにより、タンパク質抗原が、免疫原性担体又は免疫原性担体タンパク質、及び適切な薬理学的に許容される添加剤に共有結合的に連結されないであろう。本発明は、また、本明細書に記載する通りのタンパク質抗原を含むワクチンを提供し、それにおいて、項目（ｉｉ）又は項目（ｉｉｉ）のタンパク質抗原は、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ陽性癌に対する防御、特に、Ｂａｌｂ−ＮｅｕＴ転移性乳癌モデルにおいて決定される通りの、腫瘍形成後での治療防御を提供することが可能である。
【００５７】
抗癌ワクチンは、一般的に、注射により患者に投与されるため、抗癌ワクチンは、一般的に、液体水性製剤である。しかし、抗癌ワクチンは、また、投与前に水性媒質で再構成される、固体形態中（例えば凍結乾燥形態など）でありうる。添加剤の例は、滅菌水性溶液、懸濁液、及びエマルションを含むが、これらに限定されない。水性添加剤は、水、アルコール、生理食塩水、及び緩衝溶液を含むが、これらに限定されない。保存剤及び他の添加剤（例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤など）も存在してもよい。
【００５８】
ＵＳ  ８，２２２，２１４に記載されているのと同様に、抗癌ワクチンは、ワクチンの防御効力を増強する薬剤（例えばアジュバントなど）を含むことができる。アジュバントは、タンパク質コンジュゲートへの防御免疫応答を増加させるように作用する任意の化合物又は化合物を含み、それにより、ワクチンにおいて必要な抗原の量、及び／又は防御免疫応答を生成するために必要な投与の頻度を低下させる。アジュバントは、例えば、乳化剤、ムラミルジペプチド、ピリジン、水性アジュバント、例えば水酸化アルミニウム、アルミニウム塩、キトサンベースのアジュバントなど、並びに種々のサポニン、油、及び当技術分野において公知の他の物質（例えばＡｍｐｈｉｇｅｎなど）、ＬＰＳ、細菌細胞壁抽出物、細菌ＤＮＡ、ＣｐＧ配列、合成オリゴヌクレオチド及びそれらの組み合わせ（Ｓｃｈｉｊｎｓ  ら（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４５６）、マイコバクテリウムフレイ（Ｍ．フレイ）細胞壁抽出物（ＭＣＷＥ）（米国特許第４，７４４，９８４号）、Ｍ．フレイＤＮＡ（Ｍ−ＤＮＡ）、及びＭ−ＤＮＡ−Ｍ．フレイ細胞壁複合体（ＭＣＣ）のいずれかを含むことができる。乳化剤として役立つことができる化合物は、天然及び合成の乳化剤、並びにアニオン性、カチオン性、及び非イオン性化合物を含む。合成化合物の間で、アニオン性乳化剤は、例えば、ラウリン酸及びオレイン酸のカリウム塩、ナトリウム塩、及びアンモニウム塩、脂肪酸のカルシウム塩、マグネシウム塩、及びアルミニウム塩、並びに有機スルホン酸（例えばラウリル硫酸ナトリウムなど）を含む。合成カチオン性剤は、例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ｃｅｔｙｌｔｒｈｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｌｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）を含み、合成非イオン性薬剤は、グリセリルエステル（例、グリセリルモノステアレート）、ポリオキシエチレングリコールエステル及びエーテル、並びにソルビタン脂肪酸エステル（例、ソルビタンモノパルミテート）及びそれらのポリオキシエチレン誘導体（例、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート）により例示される。天然乳化剤は、アカシア、ゼラチン、レシチン、及びコレステロールを含む。
【００５９】
他の適切なアジュバントは、油成分、例えば単一の油、油の混合物、油中水型エマルション、又は水中油型エマルションを用いて形成することができる。油は、鉱物油、植物油、又は動物油でありうる。鉱物油は、蒸留技術を介してワセリンから得られる液体炭化水素であり、また、当技術分野において、液体パラフィン、液体ワセリン、又は白色鉱油として言及される。適切な動物油は、例えば、タラ肝油、オヒョウ油、ニシン油、オレンジラフィー油、及びサメ肝油を含み、それらの全てが商業的に入手可能である。適切な植物油は、例えば、キャノーラ油、アーモンド油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ピーナッツ油、ベニバナ油、ゴマ油、又は大豆油を含む。フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）は、ワクチン製剤中で一般に使用される２つの一般のアジュバントであり、また、本発明における使用のために適切である。ＦＣＡとＦＩＡの両方が、鉱物油中水滴形エマルションである；しかし、ＦＣＡは、また、殺したマイコバクテリウム属を含む。
【００６０】
免疫調節性サイトカインを、ワクチンの有効性を増強するために、例えば、アジュバントとして、ワクチン組成物において使用することができる。そのようなサイトカインの非限定的な例は、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、又はそれらの組み合わせを含む。ＧＭ−ＣＳＦは、サイトカインとして好ましい。
【００６１】
本発明の抗癌ワクチンは、哺乳動物において、好ましくはヒトにおいてＨＥＲ２／Ｎｅｕ陽性癌を処置又は防止するために使用することができる。ＨＥＲ２／Ｎｅｕ陽性癌を処置することは、その防止よりも好ましい。処置は、ワクチンが、癌を有する対象に投与されることを意味する。本発明の好ましい抗癌ワクチンは、治療効果を有し、それは、ワクチンが、癌が患者において既に形成された際に投与された場合でさえ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ陽性癌のさらなる発生を防止又は減速させることができることを意味する。実施例において、治療が研究されており、「治療設定」として言及される実験において実証されている。癌の多くの異なる型は、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ陽性でありうる（例えば乳癌、肝臓癌、腎臓癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、膀胱癌、精巣癌、胃癌、食道癌、又は甲状腺癌など）。これらの癌におけるＨＥＲ２遺伝子又はタンパク質の検出は、例えば、抗ＨＥＲ２／Ｎｅｕモノクローナル又はポリクローナル抗体を使用した生検における免疫応答によりうる、又はＨＥＲ２遺伝子からの発現ＲＮＡの決定によりうる。ＨＥＲ２遺伝子の増幅は、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５（１９８７）１７７−１８２においてテストされ、乳癌の予後と相関した。
【００６２】
例えば、そのような癌に罹患している患者においてＨＥＲ２／Ｎｅｕ陽性癌を処置する際、抗癌ワクチンが患者に投与される。ワクチンの投与は、注入又は注射（例、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、髄腔内、十二指腸内、腹腔内など）によることができる。好ましくは、組成物又はワクチンは、皮内注射により投与される。
【００６３】
抗癌ワクチンは、治療有効量で患者に投与される。量は、いくつかの変数、例えば患者の大きさ又は体重及び患者の状態などに依存する。ワクチンの毒性及び治療効力は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順により決定することができる。毒性と治療効果の間の用量比率が、治療指数であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、患者における使用のための用量の範囲で製剤化する際に使用することができる。そのようなワクチン組成物の投与量は、好ましくは、ほとんど又は全く毒性を伴わないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる投薬形態及び利用される投与経路に依存して、この範囲内で変動しうる。
【００６４】
ワクチンは、癌に対する防御免疫を誘導及び／又は持続させ、より具体的には、タンパク質抗原への体液性、好ましくは細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導及び／又は持続させるために適当な任意のスケジュールで患者に投与することができる。例えば、患者には、本明細書に記載及び例示する一次免疫としてワクチン組成物を投与することができ、防御免疫を強化及び／又は維持するためのブースターの投与が続く。一部の態様において、患者には、１ヶ月当たり１、２、又はそれ以上、ワクチン組成物を投与することができる。連続６ヶ月にわたり１ヶ月当たり１回が、防御免疫応答（特に一次免疫化スケジュールに関して）を確立するために好ましい。一部の態様において、ブースターは、一次免疫化スケジュールの終了後、６ヶ月又はそれ以上毎に定期的な期間で投与することができる。ブースターの投与は６ヶ月毎でよい。一次免疫及びブースター投与を含むワクチン投与スケジュールは、患者のために必要とされる限り、例えば、数年の経過にわたり、患者の寿命にわたり継続することができる。一部の態様において、ワクチンスケジュールは、ワクチン計画の開始時でのより高頻度の投与を含み、防御免疫を維持するための時間にわたり、より少ない頻度の投与（例、ブースター）を含む。
【００６５】
本発明のワクチンは、１投与当たり、ＨＥＲ２タンパク質の、又はタンパク質抗原の変異体配列セグメントＥＣＤからの３００又はそれ以上の連続アミノ酸の配列セグメントの０．１ｍｇから５０ｍｇまでの投与量においてヒト患者に投与されうる。そのような投与量は、また、その後の投与において使用されうる。
【実施例】
【００６６】
以下において、本発明を、さらに、実施例を使用して例証する。本発明は、しかし、これらの実施例に限定されない。
【００６７】
（例１）
構築物の設計
ラットのＨｅｒ２−ＥＤ４４配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿０５８６９９、アミノ酸残基３１４−６５７＝３４４残基、図１−２）を、隣接するＢｓａＩ部位を付加し、２つの内部のＢｓａＩ部位を除去することにより、それぞれのｃＤＮＡから、ＰＣＲを使用して生成した。ヒトＨＥＲ２−ＥＤ４４配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＡＡ７５４９３、アミノ酸残基３１０−６５３＝３４４残基、図１−２）を、ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）のコドン使用頻度を用いた遺伝子合成を使用して生成した。ラット及びヒトＨｅｒ２−ＥＤ４４から、異なるバージョン（モジュール）を、ＰＣＲを使用して生成した。これらのモジュールは、クローニングのために使用される、隣接するＢｓａＩ制限部位により作製されたオーバーハングにおいて異なる（図４−９）。
【００６８】
フラグメントＣは、ＨＥＲ２についての自己寛容を破壊するのを助ける、ワクチン中の免疫原性担体タンパク質としての役割を果たす。破傷風毒素は、破傷風菌（破傷風の原因物質）により産生される、強力な神経毒である。フラグメントＣは、ニューロンへの結合を付与する、破傷風毒素の非毒性Ｃ末端部分である（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｐ０４９５８、アミノ酸残基８６５−１３１５＝４５１残基）。破傷風毒素フラグメントＣ配列を、遺伝子合成により生成した。また、ここで、本来合成されたフラグメントＣ配列から、異なるモジュールを、ＰＣＲを使用して生成した（図１０−１１）。
【００６９】
Ｈｅｒ２−ＥＤ４４と破傷風毒素フラグメントＣモジュールは、タイプＩＩＳ制限酵素ＢｓａＩ（それぞれのモジュールについて異なるカスタマイズされたオーバーハングを生成し、それにより、これらの制限部位を除去することによる最終構築物の組み立てを可能にする）を使用して、ＴＭＶベースのウイルス発現ベクター（ｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）システム、下記を参照）中にクローニングした（Ｅｎｇｌｅｒ，Ｃ．、Ｋａｎｄｚｉａ，Ｒ．＆Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，Ｓ．２００８、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，３：ｅ３６４７；図４、図７、図１０）。ＴＭＶベースのウイルスベクター構築物は、また、コメのαアミラーゼ３Ａシグナルペプチド（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｐ２７９３２）を含み、それは、植物体において切断され、それが蓄積するアポプラスト植物において目的のタンパク質を送達するのに役立つ。コメのαアミラーゼのシグナルペプチドは、オリザ・サチバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）のゲノムＤＮＡから増幅され、シグナルペプチドの最後の２つのアミノ酸が、クローニングの理由に起因して、ＨＡからＳＧに改変される（野生型：ＭＧＫＱＭＡＡＬＣＧＦＬＬＶＡＬＬＷＬＴＰＤＶＡＨＡ；改変：ＭＧＫＱＭＡＡＬＣＧＦＬＬＶＡＬＬＷＬＴＰＤＶＡＳＧ）。加えて、Ｈｅｒ２−ＥＤ４４及び破傷風毒素フラグメントＣを、（ＧＧＧＧＳ）３リンカー及び６×Ｈｉｓタグ又は、Ｎ．タバクムコドン使用頻度について遺伝子合成により最適化したヒトカッパ軽鎖定常領域（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｐ０１８３４）に融合した（図４−１１）。
【００７０】
代替免疫原性担体として、タバコ・モザイク・ウイルス（ＴＭＶ）粒子を用いた。ＴＭＶ粒子は、長さが約３００ｎｍ及び直径１８ｎｍの桿状構造を有する。粒子は、ウイルスのゲノム一本鎖ＲＮＡの周囲に集合するコートタンパク質（ＣＰ）サブユニットで構築される。グルタルジアルデヒドによるコンジュゲーション効率を改善するために、コートタンパク質を改変した。ＴＶＣＶコートタンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ８８９２２）のＮ末端改変、即ち、４つのアミノ酸残基ＡＤＦＫの付加は、ＰＣＲ（プライマー配列：ＴＴＴ  ＧＧＴＣＴＣ  Ａ  ＡＡＴＧ  ＧＣＴ  ＧＡＣ  ＴＴＴ  ＡＡＧ  ＡＧＣ  ＴＡＴ  ＡＡＣ  ＡＴＣ  ＡＣＧ  ＡＡＴ  ＣＣＴ  ＡＡＣ  Ｃ；ＢｓａＩ制限部位、オーバーハングを生成し、追加コドンを導入した）により、野生型配列において導入した。ＣＰＬｙｓタンパク質をコードする、結果として得られたＤＮＡモジュールも、タイプＩＩＳ酵素ＢｓａＩを使用して、ｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）ＴＭＶベースのウイルス発現ベクター中にクローニングした（図１２）。
【００７１】
ウイルスバイナリー発現ベクターは、ｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）技術（Ｇｌｅｂａ，Ｙ．、Ｋｌｉｍｙｕｋ，Ｖ．＆Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，Ｓ．、２００５、Ｖａｃｃｉｎｅ、２００５、２３：２０４２−２０４８；Ｇｌｅｂａ，Ｙ．、Ｋｌｉｍｙｕｋ，Ｖ．＆Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，Ｓ．２００７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８：１３４−１４１）に基づいて、タバコウイルスからの、即ち、２つの密接に関連する植物ウイルスであるＴＶＣＶ（カブ葉脈透化ウイルス；Ｌａｒｔｅｙ，Ｒ．Ｔ．、Ｌａｎｅ，Ｌ．Ｃ．＆Ｍｅｌｃｈｅｒ，Ｕ．１９９４、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．、１３８：２８７−２９８；Ｌａｒｔｅｙ，Ｒ．Ｔ．、Ｖｏｓｓ，Ｔ．Ｃ．＆Ｍｅｌｃｈｅｒ，Ｕ．１９９５、Ｇｅｎｅ、１６６：３３１−３３２）及びｃｒＴＭＶ（アブラナ感染トバモウイルス；Ｄｏｒｏｋｈｏｖ，Ｙ．Ｌ．、Ｉｖａｎｏｖ，Ｐ．Ａ．、Ｎｏｖｉｋｏｖ，Ｖ．Ｋ．、ら、１９９４、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、３５０：５−８）のｃＤＮＡからのエレメントを使用して開発された。結果として得られたベクターは、「ＴＭＶ系」と呼ばれる。なぜなら、両方の親ウイルスが、トバモウイルスであり、周知のタバコ・モザイク・ウイルス（ＴＭＶ）に関連するからである。全ての３つのウイルス（ＴＶＣＶ、ｃｒＴＭＶ、及びＴＭＶ）が、プラス鎖ＲＮＡウイルスであり、同じ全体構造と複製様式を有する。基本的に、ウイルスは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）、移行タンパク質（ＭＰ）、及びコートタンパク質（ＣＰ）をコードする。ＲｄＲＰは、完全なウイルスＲＮＡ転写産物（ゲノムＲＮＡ）並びに２つの他のウイルスタンパク質ＭＰ及びＣＰの発現のために要求される２つのサブゲノムＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を複製する。ＭＰは、浸透した葉内でのウイルスゲノムＲＮＡの短距離細胞間移行のために要求される。ＣＰは、ウイルス粒子の形成及び血管系を介した葉から葉への長距離全身移動のために要求される。ウイルス粒子の形成は、細胞間移動のために要求されない。したがって、ＣＰは、ウイルスベクターから除去し、目的の遺伝子で置換した。このように、ウイルスベクターは、ウイルス粒子を産生することができず、目的の遺伝子が高レベルで発現される。ウイルスタンパク質及び目的の遺伝子に加えて、ウイルスベクターには、複製のために必須である５’及び３’非翻訳（５’ｎｔｒ及び３’ｎｔｒ）ウイルス配列も含まれなければならない（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，Ｓ．、Ｇｉｒｉｔｃｈ，Ａ．、Ｇｉｌｓ，Ｍ．ら、２００４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、１０１：６８５２−７；図１３）。
【００７２】
植物細胞におけるＴＭＶベースのウイルスベクターの効率的な発現のために、ウイルスベクターのｃＤＮＡを、植物プロモーターと植物ターミネーター（Ａｃｔ２及びｎｏｓ）の間にクローニングし（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，Ｓ．、Ｇｉｒｉｔｃｈ，Ａ．、Ｇｉｌｓ，Ｍ．ら、２００４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、１０１：６８５２−６８５７）、植物イントロンをＲｄＲＰ配列及びＭＰ配列内に加えた（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，Ｓ．、Ｔｈｏｅｒｉｎｇｅｒ，Ｃ．、Ｋａｎｄｚｉａ，Ｒ．ら、２００５、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３：７１８−７２３）。ＴＭＶベースのウイルスベクターの効率的な送達のために、植物細胞に、本発明者らは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを使用する。したがって、完全なウイルスベクター（植物プロモーター、目的の遺伝子を伴うＴＭＶベースのウイルスベクター配列、植物ターミネーター）が、バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡの左境界と右境界の間にクローニングされている。バイナリーベクターのエレメントは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにおけるプラスミド複製のためのＰＶＳ１起点である（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，Ｐ．、Ｓｖａｂ，Ｚ．＆Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．、１９９４、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、２５：９８９−９９４）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるプラスミド複製のためｃｏｌＥ１起点、ｎｐｔＩＩＩカナマイシン抗生物質耐性遺伝子（Ｆｒｉｓｃｈ，Ｄ．Ａ．、Ｈａｒｒｉｓ−Ｈａｌｌｅｒ，Ｌ．Ｗ．、Ｙｏｋｕｂａｉｔｉｓ，Ｎ．Ｔ．ら、１９９５、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７：４０５−４０９）、並びに植物細胞に移されるＤＮＡの末端を区切るためのＴ−ＤＮＡの左境界及び右境界（Ｆｒｉｓｃｈ，Ｄ．Ａ．、Ｈａｒｒｉｓ−Ｈａｌｌｅｒ，Ｌ．Ｗ．、Ｙｏｋｕｂａｉｔｉｓ，Ｎ．Ｔ．ら、１９９５、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７：４０５−４０９）である。青色／白色選択を促進するために、ｐＵＣ１９から増幅したｌａｃＺαカセットを、目的の遺伝子のシームレスなフレームクローニングを可能にする２つのＢｓａＩ制限部位間に挿入した。したがって、ウイルスベクターの初期構築の間に、全ての天然ＢｓａＩ認識部位を、目的の遺伝子の簡単で頑強なクローニングを可能にするために除去した（図１３）。
【００７３】
（例２）
ワクチン成分の発現、精製、及びコンジュゲーション
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物におけるＨｅｒ２−ＥＤ４４−ｈＫａｐｐａ、Ｈｅｒ２−ＥＤ４４−Ｈｉｓ、破傷風毒素フラグメントＣ−ｈＫａｐｐａ、及びＴＭＶ粒子の異種発現（ｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）システム）
組換えタンパク質の産生のために、ＴＭＶベースの発現ベクターを保有する選択されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株を、トリプトンを置換する大豆ペプトン（Ｄｕｃｈｅｆａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ、ハーレム、オランダ）を伴う、５０μｇ／ｍＬリファンピシン及び５０μｇ／ｍＬカナマイシンが添加された液体ＬＢＳ培地中で増殖させた。アグロバクテリウム培養物を、ＯＤ６００が２から４に達するまで、２８℃で増殖させる。浸潤溶液を、定義された細胞濃度（１．０のＯＤ６００を伴う培養物の２００倍希釈物と等価である）まで浸潤緩衝液（１０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．５、１０ｍＭ硫酸マグネシウム）中にアグロバクテリウム培養物を希釈することにより調製する。
【００７４】
約４０から８０のニコチアナ・ベンタミアナ植物（ＴＭＶ粒子の収集のための５から１０）を、制御された標準化条件下で６〜８週間にわたり増殖させ、アグロバクテリウム浸潤溶液を用いて真空浸潤させ、次に、組換えタンパク質の発現及び蓄積のために、温室中で７〜１２日間にわたり保った。植物の葉を、次に、液体窒素中で、収集し、細かい葉の粉末になるまで粉砕し、タンパク質抽出まで−８０℃で保ち、精製が続いた。
【００７５】
Ｎｉ−ＮＴＩアフィニティークロマトグラフィーを使用したＨｅｒ２−ＥＤ４４−Ｈｉｓタグの精製
葉粉末（０．６から１ｋｇ）を、抽出緩衝液の約２倍容量（ｗ／ｖ）を伴う、２０  ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、０．５  Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール中で抽出した。抽出は、４０分間にわたり振盪することにより＋  ４℃で実施する。ホモジネートを、１０分間にわたる１５．０００×ｇでの遠心分離により清澄化し、ＭｉｒａＣｌｏｔｈフィルターを通した濾過が続いた。ペレット化した植物組織を、同じ抽出条件を使用して再抽出した。抽出液を合わせ、ｐＨ調整に供する。清澄化ホモジネートのｐＨを、ルビスコを含む、宿主細胞タンパク質の除去のために、５Ｎ  ＨＣｌを使用して５．０まで低下させる。約３０分間にわたる撹拌を伴うｐＨ５でのインキュベーション後、粗抽出物のｐＨを、５Ｎ  ＮａＯＨを用いてｐＨ７．４に再調整する。粗抽出物を、次に、細胞破片及び沈殿物を除去するために遠心分離する（１５分間にわたり２０．０００ｘｇ）。粗抽出物をアフィニティークロマトグラフィーカラムに適用する前に、粗抽出物を、いくつかの濾過膜（２０μｍ−８μｍ−３μｍ−０．４５μｍ）で濾過する。透明な濾液を、２０  ＣＶの洗浄緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）で平衡化した５ｍｍ  ＨｉｓＴｒａｐ（商標）ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−５２５５−０１）に適用する。ロード後、カラムを２０ＣＶの洗浄緩衝液で洗浄する。Ｈｅｒ２−ＥＤ４４−Ｈｉｓを、２０ＣＶの溶出緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５、０．５ＭＮａＣｌ、０．５Ｍイミダゾール）で溶出する。研磨ステップを適用し、ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、及び内毒素を除去する。溶出されたＨｅｒ２−ＥＤ４４−Ｈｉｓ溶液を、強塩基性陰イオン交換体であるＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ（登録商標）ＳｉｎｇｌｅＳｅｐミニカプセル（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、＃９２ＩＥＸＱ４２Ｄ４−ＳＳ）に供する。ＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ（登録商標）ＳｉｎｇｌｅＳｅｐミニカプセルを１Ｎ  ＮａＯＨで清浄し、ＰＢＳ  ｐＨ５．０での平衡化が続く。Ｈｅｒ２−ＥＤ４４−Ｈｉｓ溶出液をＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ（登録商標）ＳｉｎｇｌｅＳｅｐミニカプセルにロードする前に、Ｈｅｒ２−ＥＤ４４−Ｈｉｓ溶出液のｐＨを、５Ｎ  ＨＣｌを使用してｐＨ５．０に調整する。ＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ（登録商標）ＳｉｎｇｌｅＳｅｐミニカプセルのフロースルーを回収し、カプセルを、ベースラインのＵＶ  ２８０ｎｍに達するまで、ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ５．０で洗浄する。精製されたＨｅｒ２−ＥＤ４４−Ｈｉｓは、スピン−Ｘ  ＵＦ濃縮器３０Ｋ  ＭＷＣＯ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃４３１４８９）を使用して濃縮する。最後に、濃縮物を、０．２μｍフィルターを使用して滅菌濾過する。
【００７６】
精製されたＨｅｒ２−ＥＤ４４−Ｈｉｓのタンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃２３２２５）を使用して決定する。Ｈｉｓタグ付きＨｅｒ２−ＥＤ４４のイムノブロット分析を、一次抗ｔｅｔｒａ−Ｈｉｓ抗体（ＱＩＡＧＥＮ、＃３４６７０）及び二次抗マウスＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ４４１６）を使用して行った。エンドトキシンの決定は、Ｅｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）ＰＴＳカートリッジ、感度１０−０．１ＥＵ／ｍｌ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、＃ＰＴＳ２０１）を伴うＥｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）ＰＴＳシステム（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、＃ＰＴＳ１００）を使用して行った。
【００７７】
ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ上でのアフィニティークロマトグラフィーを使用した精製Ｈｅｒ２−ＥＤ４４−Ｋａｐｐａ及び破傷風毒素フラグメントＣカッパ
タンパク質抽出のために、凍結した葉の粉末（約６００ｇから１ｋｇ）を、約２容量（ｗ／ｖ）の抽出緩衝液（２００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）と混合し、約４０分間にわたり振盪しながらインキュベートする。ホモジネートを、１０分間にわたる１５．０００×ｇでの遠心分離により清澄化し、ＭｉｒａＣｌｏｔｈフィルターを通して濾過する。抽出を、発現された組換えタンパク質の最大収率を確実にするために繰り返した。
【００７８】
清澄化ホモジネートのｐＨを、次に、ルビスコを含む宿主細胞タンパク質の除去のために、クエン酸ナトリウム溶液を使用してｐＨ５．０まで低下させる。約３０分間にわたるｐＨ５でのインキュベーション後、粗抽出物のｐＨを、５  Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７．４に再調整する。抽出物を、１５分間にわたり２０．０００×ｇで遠心分離し、沈殿物及び細胞破片を除去し、その後、いくつかの膜フィルター（２０μｍ−８μｍ−３μｍ及び０．４５μｍ）を通して濾過し、その後のカラムクロマトグラフィーに適した抽出物を得る。
【００７９】
全てのクロマトグラフィーステップを、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して室温で行う。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−５４５８−０１）を用いたアフィニティークロマトグラフィーを実施し、精製タグとしてカッパ定常領域を含む組換え融合タンパク質を精製する。
【００８０】
カラム材料を、濾過したタンパク質抽出液をロードする前に、２０カラム（ＣＶ）容量のＰＢＳ  ｐＨ７．３４で平衡化する。ロード後、カラムを、２０  ＣＶの洗浄緩衝液ＰＢＳ、ｐＨ７．３４で洗浄する。カラムに結合したタンパク質は、ピークベースの分画を介して、低ｐＨ緩衝液（０．１ＭグリシンｐＨ２．９）で溶出し、０．４  Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４で中性ｐＨに調整する。
【００８１】
ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔアフィニティークロマトグラフィーの後、溶出液を、さらに、ＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ（登録商標）ＳｉｎｇｌｅＳｅｐミニカプセル、強塩基性陰イオン交換体（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、＃９２ＩＥＸＱ４２Ｄ４−ＳＳ）で精製する（研磨ステップ）。ＳａｒｔｏＢｉｎＱカラムは、使用前に、１  Ｎ  ＮａＯＨで清浄し、ＰＢＳ  ｐＨ５．０での平衡化が続いた。溶出液のｐＨを、ＳａｒｔｏＢｉｎｄＱカラム中へのロードの前に、４．８に調整した。フロースルーを回収し、カラムを、ベースラインのＵＶ  ２８０ｎｍに達するまで、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ５．０）で洗浄した。
【００８２】
精製されたＨｅｒ２−ＥＤ４４−Ｋａｐｐａを、Ｓｐｉｎ−Ｘ  ＵＦ濃縮器３０Ｋ  ＭＷＣＯ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃４３１４８９）を使用して濃縮し、精製された破傷風毒素フラグメントＣ−Ｋａｐｐａを、Ｓｐｉｎ−Ｘ  ＵＦ濃縮器５０Ｋ  ＭＷＣＯ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃４３１４９０）を使用して濃縮した。濃縮物を、次に、０．２μｍフィルターを使用して滅菌濾過した。精製されたタンパク質の濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃２３２２５）を使用して決定する。エンドトキシンの決定は、Ｅｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）ＰＴＳカートリッジ、感度１０−０．１ＥＵ／ｍｌ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、＃ＰＴＳ２０１）を伴うＥｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）ＰＴＳシステム（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、＃ＰＴＳ１００）を使用して行った。
【００８３】
ＴＭＶウイルス粒子の精製
凍結葉粉末を、３〜５容量（ｗ／ｖ）の０．１  Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０と混合する。ホモジネートを、シェーカー上で、氷上で約３０分間にわたりインキュベートする。次に、ホモジネートを、予冷チューブ中に、ＭｉｒａＣｌｏｔｈフィルターを通して濾過する。濾液を遠心分離管に移し、１／４容量のクロロホルムを添加し、溶液を穏やかに、しかし完全に、２０分間にわたり氷上で混合する。混合物を４℃で１５分間にわたり１０，０００×ｇで遠心分離する。上の水相を新たな遠心チューブに移し、１／１０容量の１２％塩化ナトリウム及び１／５容量の２５％ＰＥＧ−６０００を添加する。混合物を、氷上で約１時間にわたりインキュベートし、４℃で１５分間にわたり１０，０００×ｇで遠心分離する。上清を注意深く除去し、１／５容量の０．１  Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０を添加する。最後に、混合物を、ペレットが溶解するまで、氷上でインキュベートする。ウイルス粒子の品質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。約１２ｍｇの精製されたＴＭＶ粒子を、６ｇの新鮮な葉材料から得ることができる。
【００８４】
グルタルアルデヒドを使用したＨｅｒ２−ＥＣ−Ｋａｐｐａと破傷風毒素フラグメントＣ−Ｋａｐｐａ又はＴＭＶウイルス粒子とのコンジュゲーション
Ｈｅｒ２−ＥＤ４４−Ｋａｐｐａ及び破傷風毒素フラグメントＣ−Ｋａｐｐａ又はＴＭＶウイルス粒子を、コンジュゲーション反応のために混合する（それぞれの３ｍｇ）。グルタルアルデヒド（２５％）を、０．１％の最終濃度までタンパク質混合物に添加する。混合物を、２時間にわたり穏やかに撹拌しながら、室温でインキュベートする。反応を、２Ｍグリシンを最終濃度２０ｍＭまで添加することにより停止させ、インキュベーションを３０分間にわたり継続する。全体の反応物を、残りのグルタルジアルデヒド及び非コンジュゲートタンパク質を除去するために、ゲル濾過に供する。最大容量２ｍｌの反応混合物を、流速１ｍｌ／分でＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃１７−１０４３−０２）にロードした。移動相はＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．３４であり、フロースルーを、全ピーク面積にわたり１０画分中に回収した。コンジュゲーション効率を、抗ヒトカッパ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ａ７１６４）を使用して、還元条件及びイムノブロット分析下での８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する（各画分の１５μｌ）。全てのコンジュゲート含有画分（分子量＞７０  ｋＤａ）をプールし、Ｓｐｉｎ−Ｘ  ＵＦ濃縮器５０Ｋ  ＭＷＣＯ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃４３１４９０）を使用して濃縮した。コンジュゲートのタンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃２３２２５）を使用して決定する。エンドトキシンの決定は、Ｅｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）ＰＴＳカートリッジ、感度１０−０．１ＥＵ／ｍｌ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、＃ＰＴＳ２０１）を伴うＥｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）ＰＴＳシステム（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、＃ＰＴＳ１００）を使用して行った。
【００８５】
（例３）
マウス及び実験プロトコール
手順の開始時に６〜１０週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを、Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓに従って飼育した。実験は、Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｌｉｃｅｎｃｅ  ＪＲ  ７０／６４０１又はＡＭ  ３０／３０２８及びＰｅｒｓｏｎａｌ  Ｌｉｃｅｎｃｅ  ＰＩＬ  ７０／２００８４（ＵｏＳ）下で実施した。マウスは、等量のＨｅｒ２−ＥＤ４４を含む５０μｇのＨｅｒ２−ＥＤ４４−Ｈｉｓ又はコンジュゲートワクチンを用いて注射した。各マウスは、等容量のミョウバンアジュバント（Ｓｉｇｍａ）と組み合わせた１００μＬの生理食塩水中の５０μｇのＨｅｒ２−ＥＤ４４、又は１３０マイクログラムのＨｅｒ２−ＥＤ４４−ＫａｐｐａフラグメントＣカッパ、又は９１μｇのＨｅｒ２−ＥＤ４４−Ｋａｐｐａ−ＴＭＶのいずれかを受けた。注射の前に、ミョウバンと組み合わせたワクチンを、周囲温度で１時間にわたり転倒で混合した。注射は、脇腹において２つの部位中に皮下で行った。１群当たり少なくとも５匹のマウスが、各実験毎にワクチン接種された（群のサイズが小さかったＢａｌｂ−ＮｅｕＴを除く）。対照ワクチンのために、無関係なタンパク質（ＩＣＯＮにより作製された５Ｔ３３Ｉｇ−ｈｋａｐｐａ−フラグメントＣ融合タンパク質）を発現する１３０μｇの植物を与えた。比較ワクチンであるＨｅｒ２／Ｎｅｕ−ＥＣ−ＴＭ  ＤＮＡワクチン（５０μｇ）を、２つの部位中に筋肉内注射した。野生型マウスに、同量のワクチンで２回注入し、第２の注射を、第１の注射から３週間後に与えた（図１４）。マウスを、第１の注射から３週間後、第２の注射後に２回出血させ、出血間に２週間の間隔を伴った（５週目及び７週目）。Ｂａｌｂ−ＮｅｕＴトランスジェニックマウスは、１０週齢目に与えた第１の注射を用いて５回ワクチン接種し、その後の注射は３週間毎に与えた。血液試料を、各注射から２週間後に採取した。試料を、Ｈｅｒ２−ＥＤ４４に対する反応性について、及び膜結合Ｈｅｒ２／ｎｅｕに対する反応性について、並びにＩｇＧアイソタイプ及び親和性について、ＥＬＩＳＡにより分析した。
【００８６】
連続血液採取
ワクチン誘導性の抗体応答を検出するために、血液試料を、ワクチン接種マウスから尾の出血により採取した。局所麻酔（Ｉｎｓｔｉｌｌａｇａｌ（登録商標）、ＦＡＲＣＯ−ＰＨＡＲＭＡ  ＧｍｂＨ、ケルン、ドイツ）を尾の先に適用し、マウスを３７℃で５分間にわたり温めた。尾の先端１〜２ｍｍ切片を、メスで切断し、最大２００μＬの血液を、マウス１匹当たり除去した。凝固後、全血を１０分間にわたり１０，０００ｒｐｍで遠心分離し、血清を収集した。血清試料を、１ｍＬの１ｍＭアジ化ナトリウムの添加により保存し、−２０℃で保存した。
【００８７】
ＥＬＩＳＡによる総ＩｇＧ抗体及び抗体アイソタイプの抗Ｈｅｒ２−ＥＤ４４レベルの評価
ＥＬＩＳＡのために、９６ウェルの平底Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏｓ（商標）ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ）を、Ｈｅｒ２−ＥＤ４４−Ｈｉｓ（炭酸塩／重炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６中３μｇ／ｍＬ）で終夜コーティングした。翌日、プレートを周囲温度で１時間にわたりＰＢＳ中の１％ＢＳＡでブロックした。３週目の試料について１／１００から１／６４００までの範囲の、その後の各時間点について１／１０００から１／６４０００までの範囲の試料の連続４×希釈物を、プレートに添加して、シェーカー上で３７℃で１．５時間にわたりインキュベートした。ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ  ＃ｐ１３７９）での４回洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＫ；＃  ＡＰ２７２；１／１０００希釈）で標識された検出抗マウスＩｇＧ抗体を、プレートと１．５時間にわたりインキュベートした。ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎでのさらに４回の洗浄後、ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド基質（Ｓｉｇｍａ，＃Ｐ４６６４）を添加して、反応物を発色させ、次に、２．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加により停止させた。光学密度を、Ｄｙｎｅｘ  ＭＲＸ  Ｐｌａｔｅリーダーを使用して４９０ｎｍで測定した。測定の結果を図１５Ａ；１８Ｂ；２０及び２１Ｂに示す。
【００８８】
抗体アイソタイプの評価のために、同様のプロトコールを適用したが、以下の通り、異なる検出抗体を使用した：抗ＩｇＧ１（Ｂｉｏｒｂｙｔ  Ｌｔｄ．、カタログ番号ｏｒｂ２７０７４）、抗ＩｇＧ２ａ（Ｓｅｒｏｔｅｃ  ＃ＳＴＡＲ１３３１３、１／４０００希釈）及び抗ＩｇＧ２ｂ（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｅｒａ−Ｌａｂ  ｌｔｄ＃ＳＢＡ  １０９０−０５；１／１０００希釈）。血清抗体レベルを、標準曲線から算出し、１ｍＬ当たりの任意の単位として表現した（図１５、パネルＢ）。
【００８９】
哺乳動物癌細胞系
ＴＵＢＯ細胞は、形質転換ｒ−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ癌遺伝子についてトランスジェニックであるＢＡＬＢ／ｃマウスに由来するクローン系であり（Ｂａｌｂ−ＮｅｕＴ）（Ｒｏｖｅｒｏ、２０００年）、ラットＨｅｒ２／ｎｅｕとの反応性を評価するための結合アッセイにおいて使用した。ＴＵＢＯ細胞を、ペニシリン−ストレプトマイシン及び２０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ高グルコース（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で培養した。細胞が６０〜７０％コンフルエントに達した際、それらを３７℃で５〜１０分間にわたりＴＲＹＰＳＩＮ−ＥＤＴＡ（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、パッシング、オーストリア）とインキュベートし、次に、トリプシンを、分割希釈により停止させる。分割希釈は１：３から１：６又は１：８の範囲でありうる。
【００９０】
Ｄ２Ｆ２／Ｅ２細胞は、ヒトＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）遺伝子を安定的に発現するベクターでトランスフェクトされたＢＡＬＢ／ｃマウスからの乳腺腫瘍系に属する（Ｐｉｅｃｈｏｃｋｉ，Ｍ．Ｐ．、Ｐｉｌｏｎ，Ｓ．Ａ．＆Ｗｅｉ，Ｗ．Ｚ．２００１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６７：３３６７−３３７４）。Ｄ２Ｆ２／Ｅ２細胞を、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕとの反応性を評価するための結合アッセイにおいて使用した。Ｄ２Ｆ２／Ｅ２細胞を、ペニシリン−ストレプトマイシン、２０％ＦＣＳ、及び８００μｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ）を補充した高グルコースＤＭＥＭ中で培養した。コンフルエント時、細胞をトリプシン処理し、１：４〜１：８の間で希釈することにより分割した。ＦＡＣＳ分析及び腫瘍攻撃実験のために、単一細胞懸濁液を、トリプシン処理した後、シリンジを通じて細胞を通過させることにより調製する。
【００９１】
ＦＡＣＳ分析による表面Ｈｅｒ２／ｎｅｕへの結合についての誘導マウス抗体の評価
誘導抗体の結合を、改変を伴う、以前に公開されたプロトコールを使用したＦＡＣＳ染色（Ｒｏｖｅｒｏ、２０００）により分析した。簡単に説明すると、２×１０５個（Ｔｕｂｏ又はＤ２Ｆ２／Ｅ２のいずれか）細胞を、最初に、非特異的結合とを減少させるために、ナイーブマウスからの血清と、次に、ワクチン接種マウス由来の免疫血清の１／１００希釈物とプレインキュベートした。染色は、１００μＬの総容量で行った。ｅＦｌｕｏｒ６６０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃５０−４０１０−８２、１／２００希釈）で標識された二次抗マウスＦ（ａｂ’）２  ＩｇＧを使用して、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｌｉｂｕｒ及びＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアを使用して、その後のＦＡＣＳ分析を用いて、誘導された抗体結合のレベルを検出した。測定結果を図１６〜１８及び２０に示す。
【００９２】
腫瘍攻撃実験
防御実験は、ＴＵＢＯ細胞系又はＤ２Ｆ２／Ｅ２細胞系を使用して実施した。ワクチンの２用量後、マウスを、１０５個の腫瘍細胞で攻撃した。攻撃は、最後のワクチン注射から４−６週間後であった。注射を受けなかったマウスの群を、追加の対照として使用した。マウスは、腫瘍の徴候について観察した。一度、腫瘍が目に見えた後、マウスを一日おきに測定し、腫瘍≧１．５ｃｍを伴うマウスは、人道的見地から終了した。生存グラフを、Ｇｒａｐｈｐａｄ  ＰＲＩＳＭ  ４．０３ソフトウェアを使用して作成した。異なるワクチンで注射された群を比較するための統計分析を、ノンパラメトリックデータについてのマン−ホイットニー検定を使用して実施した。
【００９３】
ｈｕ  Ｈｅｒ  ２  ＥＤ４４−ＦｒＣコンジュゲートワクチンで誘導された抗体によるＨｅｒ２／ｎｅｕ媒介性シグナル伝達の阻害
ヒトＨＥＲ２陽性乳癌細胞系ＢＴ４７４を、示した希釈でワクチン接種されたマウスからのプール血清、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ、ＵＫ）又は３０μＭのＰＩ３Ｋ（Ｈｅｒ２シグナル伝達の下流）阻害剤ＬＹ２９４００２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、マサチューセッツ州、米国）を用いて、１時間にわたり別々にインキュベートした。全ての処置を、３７℃、１０％ＣＯ２で、１０％ＦＣＳを補充した完全ＤＭＥＭ培地中で行った。インキュベーション後、細胞を収集し、溶解し、１試料当たり１０μｇのタンパク質を、９５℃で５分間にわたる変性後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州、米国）に供した。電気泳動後、タンパク質をポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｂｏｎｄ（商標）−Ｐ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、バッキンガムシャー、ＵＫ）に移し、０．１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を伴うトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中の５％無脂肪ミルク中でのブロッキング後、（ＴＢＳ−Ｔ）を、抗ｐＡｋｔ（ウサギ抗リン酸Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）抗体、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ａｋｔ（ウサギ抗Ａｋｔ抗体、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又はβアクチン（マウス抗ヒトβアクチン抗体、クローン２Ｆ１−１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）抗体（１／１，０００希釈）と連続的にインキュベートした。それぞれのその後の抗体を適用する前に、前の抗体を除去した。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、膜をＨＲＰ−コンジュゲート二次抗体（抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ又は抗マウスＩｇＧ（ガンマ）（ＡＦＦ）ＰＥＲＯＸ、Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ、バーミンガム、英国）のＴＢＳ−Ｔ中（１／１，０００）で、室温で１時間にわたりインキュベートした。膜を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、イリノイ州、米国）を用いて検出する前に、再びＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。化学発光シグナルを、Ｂｉｏ−Ｒａｄイメージングシステム（Ｆｌｕｏｒ−Ｓ（登録商標）ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して捕捉した。ウェスタンブロットの結果を図１９に示す。
【００９４】
ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の概要
配列番号１：ヒトＨＥＲ２タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＡ７５４９３からのアミノ酸１〜６５３）：
ｍｅｌａａｌｃｒｗｇ  ｌｌｌａｌｌｐｐｇａ  ａｓｔｑｖｃｔｇｔｄ  ｍｋｌｒｌｐａｓｐｅ  ｔｈｌｄｍｌｒｈｌｙ  ｑｇｃｑｖｖｑｇｎｌ
ｅｌｔｙｌｐｔｎａｓ  ｌｓｆｌｑｄｉｑｅｖ  ｑｇｙｖｌｉａｈｎｑ  ｖｒｑｖｐｌｑｒｌｒ  ｉｖｒｇｔｑｌｆｅｄ  ｎｙａｌａｖｌｄｎｇ
ｄｐｌｎｎｔｔｐｖｔ  ｇａｓｐｇｇｌｒｅｌ  ｑｌｒｓｌｔｅｉｌｋ  ｇｇｖｌｉｑｒｎｐｑ  ｌｃｙｑｄｔｉｌｗｋ  ｄｉｆｈｋｎｎｑｌａ
ｌｔｌｉｄｔｎｒｓｒ  ａｃｈｐｃｓｐｍｃｋ  ｇｓｒｃｗｇｅｓｓｅ  ｄｃｑｓｌｔｒｔｖｃ  ａｇｇｃａｒｃｋｇｐ  ｌｐｔｄｃｃｈｅｑｃ
ａａｇｃｔｇｐｋｈｓ  ｄｃｌａｃｌｈｆｎｈ  ｓｇｉｃｅｌｈｃｐａ  ｌｖｔｙｎｔｄｔｆｅ  ｓｍｐｎｐｅｇｒｙｔ  ｆｇａｓｃｖｔａｃｐ
ｙｎｙｌｓｔｄｖｇｓ  ｃｔｌｖｃｐｌｈｎｑ  ｅｖｔａｅｄｇｔｑｒ  ｃｅｋｃｓｋｐｃａｒ  ｖｃｙｇｌｇｍｅｈｌ  ｒｅｖｒａｖｔｓａｎ
ｉｑｅｆａｇｃｋｋｉ  ｆｇｓｌａｆｌｐｅｓ  ｆｄｇｄｐａｓｎｔａ  ｐｌｑｐｅｑｌｑｖｆ  ｅｔｌｅｅｉｔｇｙｌ  ｙｉｓａｗｐｄｓｌｐ
ｄｌｓｖｆｑｎｌｑｖ  ｉｒｇｒｉｌｈｎｇａ  ｙｓｌｔｌｑｇｌｇｉ  ｓｗｌｇｌｒｓｌｒｅ  ｌｇｓｇｌａｌｉｈｈ  ｎｔｈｌｃｆｖｈｔｖ
ｐｗｄｑｌｆｒｎｐｈ  ｑａｌｌｈｔａｎｒｐ  ｅｄｅｃｖｇｅｇｌａ  ｃｈｑｌｃａｒｇｈｃ  ｗｇｐｇｐｔｑｃｖｎ  ｃｓｑｆｌｒｇｑｅｃ
ｖｅｅｃｒｖｌｑｇｌ  ｐｒｅｙｖｎａｒｈｃ  ｌｐｃｈｐｅｃｑｐｑ  ｎｇｓｖｔｃｆｇｐｅ  ａｄｑｃｖａｃａｈｙ  ｋｄｐｐｆｃｖａｒｃ
ｐｓｇｖｋｐｄｌｓｙ  ｍｐｉｗｋｆｐｄｅｅ  ｇａｃｑｐｃｐｉｎｃ  ｔｈｓｃｖｄｌｄｄｋ  ｇｃｐａｅｑｒａｓｐ  ｌｔｓ
配列番号２：ヒトＨＥＲ２−ＥＤ４４のアミノ酸配列（ヒトＨＥＲ２／Ｎｅｕのアミノ酸３１０〜６５３）
配列番号３：ラットＨＥＲ２−ＥＤ４４のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿０５８６９９のラットＨＥＲ２／Ｎｅｕのアミノ酸３１４〜６５７）
配列番号４：ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質の残基３１２〜６４９を包含するヒトＨｅｒ２−ＥＤ４４の短縮バージョン
配列番号５：ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質のアミノ酸残基３４０〜６４９を包含するヒトＨｅｒ２−ＥＤ４４の短縮バージョン
配列番号６：ラットＨｅｒ２−ＥＤ４４−Ｈｉｓ構築物
配列番号７：ラットＨｅｒ２−ＥＤ４４−Ｈｉｓ
配列番号８：ラットＨｅｒ２−ＥＤ４４−ｋａｐｐａ構築物
配列番号９：ラットＨｅｒ２−ＥＤ４４−ｋａｐｐａ
配列番号１０：ヒトＨｅｒ２−ＥＤ４４−Ｈｉｓ構築物
配列番号１１：ヒトＨｅｒ２−ＥＤ４４−Ｈｉｓ
配列番号１２：ヒトＨｅｒ２−ＥＤ４４−ｋａｐｐａ構築物
配列番号１３：ヒトＨｅｒ２−ＥＤ４４−ｋａｐｐａ
配列番号１４：破傷風毒素フラグメントＣ−ｋａｐｐａ構築物
配列番号１５：破傷風毒素フラグメントＣ−ｋａｐｐａ
配列番号１６：ＴＭＶ−ＣＰＬｙｓアミノ酸配列
配列番号１７：破傷風毒素フラグメントＣのＤＯＭ１ドメインのアミノ酸配列
ｍｇｗｓｃｉｉｆｆｌ  ｖａｔａｔｇｖｈｓｋ  ｎｌｄｃｗｖｄｎｅｅ  ｄｉｄｖｉｌｋｋｓｔ  ｉｌｎｌｄｉｎｎｄｉ  ｉｓｄｉｓｇｆｎｓｓ  ｖｉｔｙｐｄａｑｌｖ  ｐｇｉｎｇｋａｉｈｌ  ｖｎｎｅｓｓｅｖｉｖ  ｈｋａｍｄｉｅｙｎｄ  ｍｆｎｎｆｔｖｓｆｗ  ｌｒｖｐｋｖｓａｓｈ  ｌｅｑｙｇｔｎｅｙｓ  ｉｉｓｓｍｋｋｈｓｌ  ｓｉｇｓｇｗｓｖｓｌ  ｋｇｎｎｌｉｗｔｌｋ  ｄｓａｇｅｖｒｑｉｔ  ｆｒｄｌｐｄｋｆｎａ  ｙｌａｎｋｗｖｆｉｔ  ｉｔｎｄｒｌｓｓａｎ  ｌｙｉｎｇｖｌｍｇｓ  ａｅｉｔｇｌｇａｉｒ  ｅｄｎｎｉｔｌｋｌｄ  ｒｃｎｎｎｎｑｙｖｓ  ｉｄｋｆｒｉｆｃｋａ  ｌｎｐｋｅｉｅｋｌｙ  ｔｓｙｌｓ
配列番号１８：ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＡ７５４９３からのヒトＨＥＲ２タンパク質のアミノ酸配列
１  ｍｅｌａａｌｃｒｗｇ  ｌｌｌａｌｌｐｐｇａ  ａｓｔｑｖｃｔｇｔｄ  ｍｋｌｒｌｐａｓｐｅ  ｔｈｌｄｍｌｒｈｌｙ  ｑｇｃｑｖｖｑｇｎｌ
６１  ｅｌｔｙｌｐｔｎａｓ  ｌｓｆｌｑｄｉｑｅｖ  ｑｇｙｖｌｉａｈｎｑ  ｖｒｑｖｐｌｑｒｌｒ  ｉｖｒｇｔｑｌｆｅｄ  ｎｙａｌａｖｌｄｎｇ
１２１  ｄｐｌｎｎｔｔｐｖｔ  ｇａｓｐｇｇｌｒｅｌ  ｑｌｒｓｌｔｅｉｌｋ  ｇｇｖｌｉｑｒｎｐｑ  ｌｃｙｑｄｔｉｌｗｋ  ｄｉｆｈｋｎｎｑｌａ
１８１  ｌｔｌｉｄｔｎｒｓｒ  ａｃｈｐｃｓｐｍｃｋ  ｇｓｒｃｗｇｅｓｓｅ  ｄｃｑｓｌｔｒｔｖｃ  ａｇｇｃａｒｃｋｇｐ  ｌｐｔｄｃｃｈｅｑｃ
２４１  ａａｇｃｔｇｐｋｈｓ  ｄｃｌａｃｌｈｆｎｈ  ｓｇｉｃｅｌｈｃｐａ  ｌｖｔｙｎｔｄｔｆｅ  ｓｍｐｎｐｅｇｒｙｔ  ｆｇａｓｃｖｔａｃｐ
３０１  ｙｎｙｌｓｔｄｖｇｓ  ｃｔｌｖｃｐｌｈｎｑ  ｅｖｔａｅｄｇｔｑｒ  ｃｅｋｃｓｋｐｃａｒ  ｖｃｙｇｌｇｍｅｈｌ  ｒｅｖｒａｖｔｓａｎ
３６１  ｉｑｅｆａｇｃｋｋｉ  ｆｇｓｌａｆｌｐｅｓ  ｆｄｇｄｐａｓｎｔａ  ｐｌｑｐｅｑｌｑｖｆ  ｅｔｌｅｅｉｔｇｙｌ  ｙｉｓａｗｐｄｓｌｐ
４２１  ｄｌｓｖｆｑｎｌｑｖ  ｉｒｇｒｉｌｈｎｇａ  ｙｓｌｔｌｑｇｌｇｉ  ｓｗｌｇｌｒｓｌｒｅ  ｌｇｓｇｌａｌｉｈｈ  ｎｔｈｌｃｆｖｈｔｖ
４８１  ｐｗｄｑｌｆｒｎｐｈ  ｑａｌｌｈｔａｎｒｐ  ｅｄｅｃｖｇｅｇｌａ  ｃｈｑｌｃａｒｇｈｃ  ｗｇｐｇｐｔｑｃｖｎ  ｃｓｑｆｌｒｇｑｅｃ
５４１  ｖｅｅｃｒｖｌｑｇｌ  ｐｒｅｙｖｎａｒｈｃ  ｌｐｃｈｐｅｃｑｐｑ  ｎｇｓｖｔｃｆｇｐｅ  ａｄｑｃｖａｃａｈｙ  ｋｄｐｐｆｃｖａｒｃ
６０１  ｐｓｇｖｋｐｄｌｓｙ  ｍｐｉｗｋｆｐｄｅｅ  ｇａｃｑｐｃｐｉｎｃ  ｔｈｓｃｖｄｌｄｄｋ  ｇｃｐａｅｑｒａｓｐ  ｌｔｓｉｖｓａｖｖｇ
６６１  ｉｌｌｖｖｖｌｇｖｖ  ｆｇｉｌｉｋｒｒｑｑ  ｋｉｒｋｙｔｍｒｒｌ  ｌｑｅｔｅｌｖｅｐｌ  ｔｐｓｇａｍｐｎｑａ  ｑｍｒｉｌｋｅｔｅｌ
７２１  ｒｋｖｋｖｌｇｓｇａ  ｆｇｔｖｙｋｇｉｗｉ  ｐｄｇｅｎｖｋｉｐｖ  ａｉｋｖｌｒｅｎｔｓ  ｐｋａｎｋｅｉｌｄｅ  ａｙｖｍａｇｖｇｓｐ
７８１  ｙｖｓｒｌｌｇｉｃｌ  ｔｓｔｖｑｌｖｔｑｌ  ｍｐｙｇｃｌｌｄｈｖ  ｒｅｎｒｇｒｌｇｓｑ  ｄｌｌｎｗｃｍｑｉａ  ｋｇｍｓｙｌｅｄｖｒ
８４１  ｌｖｈｒｄｌａａｒｎ  ｖｌｖｋｓｐｎｈｖｋ  ｉｔｄｆｇｌａｒｌｌ  ｄｉｄｅｔｅｙｈａｄ  ｇｇｋｖｐｉｋｗｍａ  ｌｅｓｉｌｒｒｒｆｔ
９０１  ｈｑｓｄｖｗｓｙｇｖ  ｔｖｗｅｌｍｔｆｇａ  ｋｐｙｄｇｉｐａｒｅ  ｉｐｄｌｌｅｋｇｅｒ  ｌｐｑｐｐｉｃｔｉｄ  ｖｙｍｉｍｖｋｃｗｍ
９６１  ｉｄｓｅｃｒｐｒｆｒ  ｅｌｖｓｅｆｓｒｍａ  ｒｄｐｑｒｆｖｖｉｑ  ｎｅｄｌｇｐａｓｐｌ  ｄｓｔｆｙｒｓｌｌｅ  ｄｄｄｍｇｄｌｖｄａ
１０２１  ｅｅｙｌｖｐｑｑｇｆ  ｆｃｐｄｐａｐｇａｇ  ｇｍｖｈｈｒｈｒｓｓ  ｓｔｒｓｇｇｇｄｌｔ  ｌｇｌｅｐｓｅｅｅａ  ｐｒｓｐｌａｐｓｅｇ
１０８１  ａｇｓｄｖｆｄｇｄｌ  ｇｍｇａａｋｇｌｑｓ  ｌｐｔｈｄｐｓｐｌｑ  ｒｙｓｅｄｐｔｖｐｌ  ｐｓｅｔｄｇｙｖａｐ  ｌｔｃｓｐｑｐｅｙｖ
１１４１  ｎｑｐｄｖｒｐｑｐｐ  ｓｐｒｅｇｐｌｐａａ  ｒｐａｇａｔｌｅｒａ  ｋｔｌｓｐｇｋｎｇｖ  ｖｋｄｖｆａｆｇｇａ  ｖｅｎｐｅｙｌｔｐｑ
１２０１  ｇｇａａｐｑｐｈｐｐ  ｐａｆｓｐａｆｄｎｌ  ｙｙｗｄｑｄｐｐｅｒ  ｇａｐｐｓｔｆｋｇｔ  ｐｔａｅｎｐｅｙｌｇ  ｌｄｖｐｖ
配列番号１９：野生型コメαアミラーゼシグナルペプチド
配列番号２０：改変コメαアミラーゼシグナルペプチド
配列番号２１：（ＧＧＧＧＳ）３リンカー
配列番号２２：ＴＶＣＶコートタンパク質のＮ末端中にＡＤＦＫを導入するためのプライマー
【００９５】
２０１３年３月１１日に出願された欧州特許出願第１３  ００１  ２１１．５号の内容（説明、特許請求の範囲、及び図面を含む）が、参照により本明細書に組み入れられる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ−１】
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【図２１Ｂ−２】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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