(57)【要約】本発明は、治療的に有効な物質を患者に投与することを含む、脳がんを処置する方法であって、該治療的に有効な物質が、（Ｉ）または薬学的に許容されるその塩を含み、ここで、Ｘは、患者の体内で、ｐＨ依存様式で加水分解的または酵素的に切断され得る部分である、方法に関する。一部の実施形態では、部分Ｘは、患者の体内で切断され、それによって細胞傷害剤を放出する。一部の実施形態では、細胞傷害剤は、アントラサイクリンである。一部の実施形態では、アントラサイクリンは、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ピラルビシン、ゾルビシン、アクラルビシン、カルミノマイシン（ｃａｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ミトキサントロンおよびアメタントロン、または前述のいずれかの誘導体、あるいは前述のいずれかの薬学的に許容される塩からなる群から選択される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療的に有効な物質を患者に投与することを含む、脳がんを処置する方法であって、該治療的に有効な物質が、
【化６】
2016521705.tif 000008
または薬学的に許容されるその塩を含み、
ここで、Ｘは、該患者の体内で、ｐＨ依存様式で加水分解的または酵素的に切断され得る部分である、方法。
【請求項２】
部分Ｘが、前記患者の体内で切断され、それによって前記細胞傷害剤を放出する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞傷害剤が、アントラサイクリンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記アントラサイクリンが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ピラルビシン、ゾルビシン、アクラルビシン、カルミノマイシン、ミトキサントロンおよびアメタントロン、または前述のいずれかの誘導体、あるいは前述のいずれかの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アントラサイクリンが、ドキソルビシンまたは薬学的に許容されるその塩である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記共有結合によってタンパク質に結合する基が、マレイミド、ハロアセトアミド、ハロアセテート、ピリジルチオ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イソチオシアネート、ジスルフィド、ビニルカルボニル、アジリジンおよびアセチレンからなる群から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記共有結合によってタンパク質に結合する基が、マレイミドである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記リンカーが、いくつかがヘテロ原子または芳香族部分で置き換えられていてもよい１〜１２個の炭素原子を有する少なくとも１つの脂肪族炭素鎖または脂肪族炭素環を含有する有機分子残基を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記リンカーが、１〜１２個の炭素原子を有する少なくとも１つの炭素鎖を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞傷害剤および前記リンカーが、ヒドラゾン部分によってつながっている、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記治療的に有効な物質が、以下の構造
【化７】
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を有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記脳がんが、原発性脳がんである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記原発性脳がんが、神経膠腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、上衣腫、髄膜腫、頭蓋咽頭腫、胚細胞腫、松果体細胞腫、松果体芽腫および多形神経膠芽腫である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記原発性脳がんが、多形神経膠芽腫である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記脳がんが、二次性または転移性がんである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記二次性または転移性がんが、膀胱がん、乳がん、肺がん、胃がん、子宮内膜がん、卵巣がん、膵がん、膵管腺がん、副腎皮質のがん、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、軟組織肉腫、腎芽腫、前立腺がん、肝がん、骨がん、軟骨肉腫、腎がん、膀胱がん、甲状腺がんおよび胃がんから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記治療的に有効な物質が、抗がん剤と組み合わせて投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗がん剤が、ドキソルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、テモゾロミド、ニトロソウレア、ボルテゾミブ、ゲムシタビン、エトポシド、トポテカン、または薬学的に許容されるその塩から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
治療的に有効な物質を含む、脳がんの処置に使用するための医薬組成物であって、該治療的に有効な物質が、
【化８】
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または薬学的に許容されるその塩を含み、
ここで、Ｘは、患者の体内で、ｐＨ依存様式で加水分解的または酵素的に切断され得る部分である、医薬組成物。
【請求項２０】
部分Ｘが、前記患者の体内で切断され、それによって前記細胞傷害剤を放出する、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記細胞傷害剤が、アントラサイクリンである、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記アントラサイクリンが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ピラルビシン、ゾルビシン、アクラルビシン、カルミノマイシン、ミトキサントロンおよびアメタントロン、または前述のいずれかの誘導体、あるいは前述のいずれかの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記アントラサイクリンが、ドキソルビシンまたは薬学的に許容されるその塩である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記共有結合によってタンパク質に結合する基が、マレイミド、ハロアセトアミド、ハロアセテート、ピリジルチオ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イソチオシアネート、ジスルフィド、ビニルカルボニル、アジリジンおよびアセチレンからなる群から選択される、請求項１９から２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記共有結合によってタンパク質に結合する基が、マレイミドである、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記リンカーが、いくつかがヘテロ原子または芳香族部分で置き換えられていてもよい１〜１２個の炭素原子を有する少なくとも１つの脂肪族炭素鎖または脂肪族炭素環を含有する有機分子残基を含む、請求項１９から２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記リンカーが、１〜１２個の炭素原子を有する少なくとも１つの炭素鎖を含む、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記細胞傷害剤および前記リンカーが、ヒドラゾン部分によってつながっている、請求項１９から２７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記治療的に有効な物質が、以下の構造
【化９】
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を有する、請求項１９から２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記脳がんが、原発性脳がんである、請求項１９から２９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記原発性脳がんが、神経膠腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、上衣腫、髄膜腫、頭蓋咽頭腫、胚細胞腫、松果体細胞腫、松果体芽腫および多形神経膠芽腫である、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記原発性脳がんが、多形神経膠芽腫である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記脳がんが、二次性または転移性がんである、請求項１９から２９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記二次性または転移性がんが、膀胱がん、乳がん、肺がん、胃がん、子宮内膜がん、卵巣がん、膵がん、膵管腺がん、副腎皮質のがん、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、軟組織肉腫、腎芽腫、前立腺がん、肝がん、骨がん、軟骨肉腫、腎がん、膀胱がん、甲状腺がんおよび胃がんから選択される、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記治療的に有効な物質が、抗がん剤と組み合わせて投与される、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記抗がん剤が、ドキソルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、テモゾロミド、ニトロソウレア、ボルテゾミブ、ゲムシタビン、エトポシド、トポテカン、または薬学的に許容されるその塩から選択される、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
脳がんを処置するための医薬の製造における治療的に有効な物質の使用であって、該治療的に有効な物質が、
【化１０】
2016521705.tif 000012
または薬学的に許容されるその塩を含み、
ここで、Ｘは、患者の体内で、ｐＨ依存様式で加水分解的または酵素的に切断され得る部分である、使用。
【請求項３８】
部分Ｘが、前記患者の体内で切断され、前記細胞傷害剤を放出する、請求項３７にしたがって使用するための治療的に有効な物質。
【請求項３９】
前記細胞傷害剤が、アントラサイクリンである、請求項３８にしたがって使用するための治療的に有効な物質。
【請求項４０】
前記アントラサイクリンが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ピラルビシン、ゾルビシン、アクラルビシン、カルミノマイシン、ミトキサントロンおよびアメタントロン、または前述のいずれかの誘導体、あるいは前述のいずれかの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項３９にしたがって使用するための治療的に有効な物質。
【請求項４１】
前記アントラサイクリンが、ドキソルビシンまたは薬学的に許容されるその塩である、請求項４０にしたがって使用するための治療的に有効な物質。
【請求項４２】
前記共有結合によってタンパク質に結合する基が、マレイミド、ハロアセトアミド、ハロアセテート、ピリジルチオ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イソチオシアネート、ジスルフィド、ビニルカルボニル、アジリジンおよびアセチレンからなる群から選択される、請求項３７から４１のいずれか一項にしたがって使用するための治療的に有効な物質。
【請求項４３】
前記共有結合によってタンパク質に結合する基が、マレイミドである、請求項４２にしたがって使用するための治療的に有効な物質。
【請求項４４】
前記リンカーが、いくつかがヘテロ原子または芳香族部分で置き換えられていてもよい１〜１２個の炭素原子を有する少なくとも１つの脂肪族炭素鎖または脂肪族炭素環を含有する有機分子残基を含む、請求項３７から４３のいずれか一項にしたがって使用するための治療的に有効な物質。
【請求項４５】
前記リンカーが、１〜１２個の炭素原子を有する少なくとも１つの炭素鎖を含む、請求項４４にしたがって使用するための治療的に有効な物質。
【請求項４６】
前記細胞傷害剤および前記リンカーが、ヒドラゾン部分によってつながっている、請求項３７から４５のいずれか一項にしたがって使用するための治療的に有効な物質。
【請求項４７】
前記治療的に有効な物質が、以下の構造
【化１１】
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を有する、請求項３７から４６のいずれか一項にしたがって使用するための治療的に有効な物質。
【請求項４８】
前記脳がんが、原発性脳がんである、請求項３７から４７のいずれか一項にしたがって使用するための治療的に有効な物質。
【請求項４９】
前記原発性脳がんが、神経膠腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、上衣腫、髄膜腫、頭蓋咽頭腫、胚細胞腫、松果体細胞腫、松果体芽腫および多形神経膠芽腫である、請求項４８にしたがって使用するための治療的に有効な物質。
【請求項５０】
前記原発性脳がんが、多形神経膠芽腫である、請求項４９にしたがって使用するための治療的に有効な物質。
【請求項５１】
前記脳がんが、二次性または転移性がんである、請求項３７から４７のいずれか一項にしたがって使用するための治療的に有効な物質。
【請求項５２】
前記二次性または転移性がんが、膀胱がん、乳がん、肺がん、胃がん、子宮内膜がん、卵巣がん、膵がん、膵管腺がん、副腎皮質のがん、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、軟組織肉腫、腎芽腫、前立腺がん、肝がん、骨がん、軟骨肉腫、腎がん、膀胱がん、甲状腺がんおよび胃がんから選択される、請求項５１にしたがって使用するための治療的に有効な物質。
【請求項５３】
前記治療的に有効な物質が、抗がん剤と組み合わせて投与される、請求項３７にしたがって使用するための治療的に有効な物質。
【請求項５４】
前記抗がん剤が、ドキソルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、テモゾロミド、ニトロソウレア、ボルテゾミブ、ゲムシタビン、エトポシド、トポテカン、または薬学的に許容されるその塩から選択される、請求項５３にしたがって使用するための治療的に有効な物質。
【請求項５５】
治療的に有効な物質を含む脳がんの処置に使用するためのキットであって、該治療的に有効な物質が、
【化１２】
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または薬学的に許容されるその塩を含み、
ここで、Ｘは、患者の体内で、ｐＨ依存様式で加水分解的または酵素的に切断され得る部分である、キット。
【請求項５６】
部分Ｘが、前記患者の体内で切断され、前記細胞傷害剤を放出する、請求項５５に記載の使用するためのキット。
【請求項５７】
前記細胞傷害剤が、アントラサイクリンである、請求項５６に記載の使用するためのキット。
【請求項５８】
前記アントラサイクリンが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ピラルビシン、ゾルビシン、アクラルビシン、カルミノマイシン、ミトキサントロンおよびアメタントロン、または前述のいずれかの誘導体、あるいは前述のいずれかの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項５７に記載の使用するためのキット。
【請求項５９】
前記アントラサイクリンが、ドキソルビシンまたは薬学的に許容されるその塩である、請求項５８に記載の使用するためのキット。
【請求項６０】
前記共有結合によってタンパク質に結合する基が、マレイミド、ハロアセトアミド、ハロアセテート、ピリジルチオ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イソチオシアネート、ジスルフィド、ビニルカルボニル、アジリジンおよびアセチレンからなる群から選択される、請求項５５から５９のいずれか一項に記載の使用するためのキット。
【請求項６１】
前記共有結合によってタンパク質に結合する基が、マレイミドである、請求項６０に記載の使用するためのキット。
【請求項６２】
前記リンカーが、いくつかがヘテロ原子または芳香族部分で置き換えられていてもよい１〜１２個の炭素原子を有する少なくとも１つの脂肪族炭素鎖または脂肪族炭素環を含有する有機分子残基を含む、請求項５５から６１のいずれか一項に記載の使用するためのキット。
【請求項６３】
前記リンカーが、１〜１２個の炭素原子を有する少なくとも１つの炭素鎖を含む、請求項６２に記載の使用するためのキット。
【請求項６４】
前記細胞傷害剤および前記リンカーが、ヒドラゾン部分によってつながっている、請求項５５から６３のいずれか一項に記載の使用するためのキット。
【請求項６５】
前記治療的に有効な物質が、以下の構造
【化１３】
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を有する、請求項５５から６４のいずれか一項に記載の使用するためのキット。
【請求項６６】
前記脳がんが、原発性脳がんである、請求項５５から６５のいずれか一項に記載の使用するためのキット。
【請求項６７】
前記原発性脳がんが、神経膠腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、上衣腫、髄膜腫、頭蓋咽頭腫、胚細胞腫、松果体細胞腫、松果体芽腫および多形神経膠芽腫である、請求項６６に記載の使用するためのキット。
【請求項６８】
前記原発性脳がんが、多形神経膠芽腫である、請求項６７に記載の使用するためのキット。
【請求項６９】
前記脳がんが、二次性または転移性がんである、請求項５５から６５のいずれか一項に記載の使用するためのキット。
【請求項７０】
前記二次性または転移性がんが、膀胱がん、乳がん、肺がん、胃がん、子宮内膜がん、卵巣がん、膵がん、膵管腺がん、副腎皮質のがん、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、軟組織肉腫、腎芽腫、前立腺がん、肝がん、骨がん、軟骨肉腫、腎がん、膀胱がん、甲状腺がんおよび胃がんから選択される、請求項６９に記載の使用するためのキット。
【請求項７１】
前記治療的に有効な物質が、抗がん剤と組み合わせて投与される、請求項５５に記載の使用するためのキット。
【請求項７２】
前記抗がん剤が、ドキソルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、テモゾロミド、ニトロソウレア、ボルテゾミブ、ゲムシタビン、エトポシド、トポテカン、または薬学的に許容されるその塩から選択される、請求項７１に記載の使用するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
アントラサイクリンは、ある特定のタイプのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ菌に由来するクラスの抗生物質である。アントラサイクリンは、しばしば、がん治療剤として使用され、核酸インターカレート剤およびＤＮＡ修復酵素であるトポイソメラーゼＩＩの阻害剤として部分的に機能し、それによってがん細胞の核酸に損傷を与え、細胞が複製されるのを防止する。アントラサイクリンがん治療剤の一例が、ドキソルビシンであり、これは、乳がん、肺がん、卵巣がん、リンパ腫および白血病を含めた様々ながんを処置するために使用される。ドキソルビシンの６−マレイミドカプロイルヒドラゾン（アルドキソルビシンまたはＩＮＮＯ−２０６としても公知のＤＯＸＯ−ＥＭＣＨ）は、ドキソルビシンと腫瘍抗原を対象とするモノクローナル抗体とのイムノコンジュゲートを調製するために使用できる酸感受性リンカーを提供するために合成された（Ｗｉｌｌｎｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ４巻：５２１〜５２７頁（１９９３年））。この文脈では、抗体のジスルフィド結合は、ジチオトレイトールによって還元されると遊離チオール基を形成し、遊離チオール基は、ＤＯＸＯ−ＥＭＣＨのマレイミド基と反応して、安定なチオエーテル結合を形成する。ドキソルビシン−抗体コンジュゲートは、投与されると、この抗体によって認識される抗原を含有する腫瘍を標的化する。抗原抗体結合の後、コンジュゲートは、腫瘍細胞内に内部移行し、リソソームに輸送される。酸性のリソソーム環境では、ドキソルビシンは、酸感受性のヒドラゾンリンカーの加水分解によって細胞内でコンジュゲートから放出される。ドキソルビシンは、放出されると細胞核に到達し、腫瘍細胞を死滅させることができる。ドキソルビシンおよびＤＯＸＯ−ＥＭＣＨのさらなる説明については、それぞれの全体が参照によって本明細書に組み込まれる、例えば米国特許第７，３８７，７７１号および同第７，９０２，１４４号ならびに米国特許出願第１２／６１９，１６１号を参照されたい。
【０００２】
さらに、ＤＯＸＯ−ＥＭＣＨは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とコンジュゲート化して、安定なチオエーテルコンジュゲートを形成する（Ｋｒａｔｚら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４５巻：５５２３〜５５３３頁（２００２年））。
【０００３】
特に悪性神経膠腫を含めた脳腫瘍は、ヒトの最も侵襲的ながんであり、ほとんど治癒しない（ＤｅＡｎｇｅｌｉｓら、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ２００１年、３４４巻、１１４〜１２３頁；Ｎｅｌｓｏｎら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．  １９８５年、３巻、９９〜１０３頁；Ｋｏｒｎｂｌｉｔｈら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．  １９８８年、６８巻、１〜１７頁）。診断後の生存期間中央値は、約１２〜１４カ月である。ニトロソウレア、白金化合物およびテモゾロミドなどの化学療法薬物を用いて処置しても、患者の生存期間はわずかしか延長しない（Ｈｕｎｃｈａｒｅｋら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９９８年、１８巻、４６９３〜４６９７頁；Ｂｒａｎｄｅｓら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ＲＥＳ．  ２０００年、２０巻、１９１３〜１９２０頁）。脳がんの処置をさらに複雑にしているのは、多くの薬物が血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できないということである。ＢＢＢは、毛細血管の周りの密着接合からなり、イオンのようなある特定の物質のレベルの変化から、または感染から脳を保護している。内皮細胞は、アルブミンなどの大分子の拡散を制限する一方、Ｏ２またはＣＯ２などのより小さい分子を拡散させる。神経膠芽腫細胞株は、ドキソルビシンによって成長停止が誘発された後、アポトーシスに追い込まれた（Ｓｔａｎら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９９９年、１９巻、９４１〜９５０頁）。しかし、ドキソルビシンは、Ｐ−糖タンパク質排出ポンプの基質なので、ＢＢＢを通過する能力がない（Ｓａｒｄｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２０１１年、６７巻、１３３３〜１３４０頁）。神経膠腫組織における遊離ドキソルビシンの濃度は、有効レベル未満であり、ドキソルビシンは、脳内で成長する神経膠芽腫に対しては効果がない（Ｓｔｅｉｎｉｇｅｒら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ、２００４年、１０９巻、７５９〜７６７頁；Ｖｏｎ  Ｈｏｌｓｔ、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒｒ．、１９９０年、１０４巻、１３〜１６頁）。したがって、ＢＢＢを通過する薬物送達を可能とする戦略の開発は、最も重要である。したがって、ドキソルビシンなどの抗がん薬を脳内に輸送するための効率的な担体の必要性は、依然高い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第７，３８７，７７１号号明細書
【特許文献２】米国特許第７，９０２，１４４号号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｗｉｌｌｎｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ４巻：５２１〜５２７頁（１９９３年）
【非特許文献２】Ｋｒａｔｚら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４５巻：５５２３〜５５３３頁（２００２年）
【非特許文献３】ＤｅＡｎｇｅｌｉｓら、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ２００１年、３４４巻、１１４〜１２３頁
【非特許文献４】Ｎｅｌｓｏｎら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．  １９８５年、３巻、９９〜１０３頁
【非特許文献５】Ｋｏｒｎｂｌｉｔｈら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．  １９８８年、６８巻、１〜１７頁
【非特許文献６】Ｈｕｎｃｈａｒｅｋら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９９８年、１８巻、４６９３〜４６９７頁
【非特許文献７】Ｂｒａｎｄｅｓら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ＲＥＳ．  ２０００年、２０巻、１９１３〜１９２０頁
【非特許文献８】Ｓｔａｎら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９９９年、１９巻、９４１〜９５０頁
【非特許文献９】Ｓａｒｄｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２０１１年、６７巻、１３３３〜１３４０頁
【非特許文献１０】Ｓｔｅｉｎｉｇｅｒら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ、２００４年、１０９巻、７５９〜７６７頁
【非特許文献１１】Ｖｏｎ  Ｈｏｌｓｔ、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒｒ．、１９９０年、１０４巻、１３〜１６頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、治療的に有効な物質（例えば、ＤＯＸＯ−ＥＭＣＨ）が、静脈内投与される場合に腫瘍の退縮を誘発し、例えば多形神経膠芽腫腫瘍などの脳腫瘍に罹患している哺乳動物の生存を著しく増加させるという驚くべき観測に基づく。
【０００７】
本発明は、治療的に有効な物質を患者に投与することを含む、脳がんを処置するための方法であって、該治療的に有効な物質が、
【化１】
2016521705.tif 000003
または薬学的に許容されるその塩を含み、
ここで、Ｘは、患者の体内で、ｐＨ依存様式で加水分解的または酵素的に切断され得る結合である方法に関する。
【０００８】
一部の実施形態では、部分Ｘは、患者の体内で切断され、それによって細胞傷害剤を放出する。一部の実施形態では、細胞傷害剤は、アントラサイクリンである。一部の実施形態では、アントラサイクリンは、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ピラルビシン、ゾルビシン、アクラルビシン、カルミノマイシン（ｃａｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ミトキサントロンおよびアメタントロン、または前述のいずれかの誘導体、あるいは前述のいずれかの薬学的に許容される塩からなる群から選択される。一部の実施形態では、アントラサイクリンは、ドキソルビシンまたは薬学的に許容されるその塩である。一部の実施形態では、共有結合によってタンパク質に結合する基は、マレイミド、ハロアセトアミド、ハロアセテート、ピリジルチオ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イソチオシアネート、ジスルフィド、ビニルカルボニル、アジリジンおよびアセチレンからなる群から選択される。一部の実施形態では、共有結合によってタンパク質に結合する基は、マレイミドである。一部の実施形態では、リンカーは、いくつかがヘテロ原子または芳香族部分で置き換えられていてもよい１〜１２個の炭素原子を有する少なくとも１つの脂肪族炭素鎖または脂肪族炭素環を含有する、有機分子残基を含む。一部の実施形態では、リンカーは、１〜１２個の炭素原子を有する少なくとも１つの炭素鎖を含む。一部の実施形態では、細胞傷害剤およびリンカーは、ヒドラゾン部分によってつながっている。一部の実施形態では、治療的に有効な物質は、以下の構造
【化２】
2016521705.tif 000004
を有する。
【０００９】
一部の実施形態では、脳がんは、原発性脳がんである。一部の実施形態では、原発性脳がんは、神経膠腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、上衣腫、髄膜腫、頭蓋咽頭腫、胚細胞腫、松果体細胞腫、松果体芽腫および多形神経膠芽腫である。一部の実施形態では、原発性脳がんは、多形神経膠芽腫である。一部の実施形態では、脳がんは、二次性または転移性がんである。一部の実施形態では、二次性または転移性がんは、膀胱がん、乳がん、肺がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、子宮内膜がん、卵巣がん、膵がん、膵管腺がん、副腎皮質のがん、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、軟組織肉腫、腎芽腫、前立腺がん、肝がん、骨がん、軟骨肉腫、腎がん、膀胱がん、甲状腺がんおよび胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）から選択される。一部の実施形態では、がんは、テモゾロミド耐性がんである。一部の実施形態では、テモゾロミド耐性がんは、テモゾロミド耐性多形神経膠芽腫である。
【００１０】
一部の実施形態では、治療的に有効な物質は、抗がん剤と組み合わせて投与される。一部の実施形態では、抗がん剤は、ドキソルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、テモゾロミド、ニトロソウレア、ボルテゾミブ、ゲムシタビン、エトポシド、トポテカン、または薬学的に許容されるその塩から選択される。
【００１１】
治療的に有効な物質は、投与されると、タンパク質結合分子によって、体液構成要素または組織構成要素に共有結合により結合し、それによって、体内でｐＨ依存様式で加水分解的または酵素的に切断され、細胞傷害剤が放出され得る細胞傷害剤の輸送形態を作り出す。そのタンパク質結合特性のため、細胞傷害剤の薬物動態プロファイルを決定的に変え、改善する、治療的に有効な物質の注射可能な医薬調製物が得られる。本発明の治療的に有効な物質は、体液と相互作用すると、細胞傷害剤を標的部位に輸送し、かつ／または細胞傷害剤を定量的形態で放出する巨大分子プロドラッグを生じるために、体液または組織構成要素に、好ましくは血清タンパク質に、より好ましくは血清アルブミンに、共有結合により結合する。
【００１２】
一部の実施形態では、脳がんは、原発性脳腫瘍である。一部の実施形態では、原発性脳腫瘍は、多形神経膠芽腫である。他の実施形態では、脳がんは、転移性脳腫瘍である。一部の実施形態では、転移性腫瘍は、乳がん、肺がん、胃がん、子宮内膜がん、卵巣がん、膵がん、膵管腺がん、副腎皮質のがん、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、軟組織肉腫、腎芽腫、神経膠芽腫、前立腺がん、肝がん、骨がん、軟骨肉腫、腎がん、膀胱がん、甲状腺がんおよび胃がんが挙げられるが、これらに限定されないがんに由来する。一部の実施形態では、腫瘍は、テモゾロミド耐性腫瘍である。一部の実施形態では、テモゾロミド耐性腫瘍は、テモゾロミド耐性多形神経膠芽腫である。
【００１３】
一部の実施形態では、治療的に有効な物質は、例えば多形神経膠芽腫などの脳がんの処置のための医薬の製造に使用される。一部の実施形態では、本発明は、患者の脳がんの処置における使用のための治療的に有効な物質を提供する。一部の実施形態では、本発明は、患者の多形神経膠芽腫の処置における使用のための治療的に有効な物質を提供する。一部の実施形態では、本発明は、患者の脳がんの処置のための治療的に有効な物質を提供する。一部の実施形態では、本発明は、患者の脳がんの処置のための治療的に有効な物質を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、アルドキソルビシンが、マウスモデルにおける多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）腫瘍量を低減することを示す図である。雌性Ｂａｌｂ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）マウスに、５×１０５個のホタルルシフェラーゼ標識Ｕ８７ＭＧ（Ｕ８７−ｌｕｃ）神経膠腫細胞を、０日目に頭蓋内移植した。１２日後、群Ｃの対照マウス（１〜８）に、薬物ビヒクルを尾静脈注射した一方、処置群Ｄのマウス（９〜１６）に、１２０μｇ／注射のドキソルビシン（体重２０ｇに基づく）を注射し、処置群Ａのマウス（１７〜２４）に、４８０μｇ／注射のアルドキソルビシンを投与した。ドキソルビシン注射を１９日後に反復し、アルドキソルビシン注射を１９日後および２６日後に反復した。脳腫瘍の生物発光イメージングを、腫瘍細胞移植の８日後、１６日後、２２日後、２７日後、３４日後、および４１日後に実施した。これを、各写真において光子／秒／ｃｍ２／ｓｒの関数として示す（輝度単位である光子／秒／ｃｍ２／ｓｒは、組織１平方センチメートルから離れ、立体角１ステラジアン（ｓｒ）に放散する、１秒あたりの光子数である）。腫瘍量は、示されている通り比色スケールによって実証されており、ハイライトされている領域は、最大シグナル強度（最大腫瘍量）を表す。†は、動物の死亡を示す。
【００１５】
【図２】図２は、対照（Ｃ）およびドキソルビシン処置群（Ｄ）およびアルドキソルビシン処置群（Ａ）のマウスについて、図１で示された画像から得られた輝度（光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ）の関数として表される腫瘍サイズ間の関係を示す散布図である。細胞移植の８日後に、対照群と処置群の間の平均腫瘍サイズに相対的な差異はなかった（ｐ＞０．０５）（図Ａ、ＢおよびＣを比較）。移植の２２日後に、ドキソルビシン群ではなく、対照群とアルドキソルビシン群の間に差異が観測された（ｐ＝０．００５；アスタリスクによって示す、図２Ｄ）。８日と２２日との間で、アルドキソルビシン群に腫瘍成長の相対的な差異はなかった（ｐ＞０．０５）（図２Ｃ）。しかし、ドキソルビシン群では、８日と２２日との間で腫瘍成長の相対的な差異が観測され（ｐ＜０．０５）（図２Ｂ）、このことは、ドキソルビシンではなく、アルドキソルビシンによって腫瘍成長が抑制されたことを示している。
【００１６】
【図３】図３は、ＧＢＭ担持マウスについての試験日数によるカプラン−マイヤー生存曲線である。アルドキソルビシン処置を受けたマウス（ｎ＝８；実線（ｄ））は、ビヒクルを投与されたマウス（（ｃ）と標識した破線）またはドキソルビシンを投与されたマウス（（ｄ）と標識した破線）よりも長時間生存した（ｐ≦．０００１）。ビヒクルで処置したマウスとドキソルビシンで処置したマウスの間の生存曲線に差異はなかった（ｐ＝０．９４９）。本明細書に記載の通り、アルドキソルビシンを、合計６回の注射（すなわち細胞移植の１２日後、１９日後、２６日後、４２日後、５０日後、および５６日後）で静脈内投与した。細胞移植の５０日後に与えた用量がＭＴＤの５０％であったことを除き、すべての用量は、最大耐用量（ＭＴＤ）である３２ｍｇ／ｋｇ／注射の約７５％であった。ドキソルビシンを、ＭＴＤである８ｍｇ／ｋｇ／注射の約７５％で、合計２回の注射（すなわち細胞移植の１２日後および１９日後）で投与した。
【００１７】
【図４】図４は、頭蓋内ＧＢＭ腫瘍担持マウスに用量２４ｍｇ／ｋｇ（最大耐用量の７５％）を静脈内投与した後の、様々な組織におけるアルドキソルビシンの濃度−時間プロファイルを示す図である。各線は、各時点で試料採取した３匹のマウスから得られた平均データ（アルドキソルビシンｎｇ／血漿または組織抽出物ｍｌ）を表す。バーは±標準偏差を示す。脳内のアルドキソルビシン濃度は、腫瘍担持マウスの全脳組織から得られた値を表す。
【００１８】
【図５】図５は、マウスに頭蓋内移植したＧＢＭ腫瘍におけるルシフェラーゼ発現レベルを示す図である。ルシフェラーゼ遺伝子を含有する移植されたヒトＧＢＭ腫瘍細胞を、マウスの脳内で９日間成長させた後、緩衝剤対照（Ｃ）またはアルドキソルビシン（Ｔ）のいずれかで処置した。マウスに、９日目、１６日目および２３日目に緩衝剤（Ｃ）またはアルドキソルビシンのいずれかを投与した。腫瘍成長を、走査の前にマウスに投与されたルシフェラーゼ基質の生物発光を検出することによって、７日目、２１日目、２９日目および３３日目にモニタした。腫瘍細胞におけるルシフェラーゼ発現の強度を、右側のカラースキームに従って示し、濃色領域は最大発現（ほとんどが腫瘍細胞）を示し、黒色は発現がない（腫瘍細胞がない）ことを示す。７日目に、腫瘍細胞によるルシフェラーゼの発現が、対照（Ｃ）およびアルドキソルビシン処置（Ｔ）動物の両方で見られた。２１日目に、すべての対照マウスでは、腫瘍が成長していたが、アルドキソルビシンで処置したマウスでは、１匹だけに検出可能な腫瘍があった。２９日目には、すべてのＣマウスが死亡したが、アルドキソルビシンで処置したマウスでは、１匹だけが死亡し、２匹のマウスに腫瘍の再成長が観測された。３３日目には、３匹のＴマウスが死亡し、他の４匹のマウスにおいて腫瘍が再成長した。†は、動物の死亡を示す。
【００１９】
【図６】図６は、対照（Ｃ）およびアルドキソルビシン処置群（Ｔ）のマウスについて、図５で示される画像から得られた輝度（光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ）の関数として表される腫瘍サイズ間の関係を示す散布図である。７日後に、対照群と処置群の間の平均腫瘍サイズに相対的な差異はなかったが（ｐ＞０．０５）（図６Ａ）、２１日後に、対照群と処置群の間に差異が観測された（ｐ＜０．０５；図６Ｂのアスタリスクを参照のこと）。２１日〜２９日の間、処置群に相対的な差異はなかったが（ｐ＞０．０５）、腫瘍の再出現の結果として、３３日目に差異が観測された（ｐ＜０．０５；図６Ｃにおいてアスタリスクによって示される）。
【００２０】
【図７】図７は、ＧＢＭ担持マウスについての、試験日数によるカプラン−マイヤー生存曲線を示す。アルドキソルビシンを投与したマウス（ｎ＝８；破線）は、ビヒクルを投与したマウス（ｎ＝８：実線）よりも長く生存した（ｐ＝０．０００６）。
【００２１】
【図８】図８は、アルドキソルビシンの保持が、周囲の脳組織よりも腫瘍組織において３〜４倍高かったことを示す図である。マウスの腫瘍および周囲の脳組織におけるアルドキソルビシンの保持を、頭蓋内ＧＢＭ腫瘍担持マウスに用量２４ｍｇ／ｋｇ（最大耐用量の７５％）を静脈内投与した後に、ＨＰＬＣによって測定した。
【００２２】
【図９】図９は、増殖（Ｋｉ−６７）、腫瘍内脈管構造（ＣＤ３１）、中間径フィラメントタンパク質発現（ビメンチン）、およびアポトーシスエフェクターの活性化（切断されたカスパーゼ−３）に関するアルドキソルビシン（ＡＬＤＯＸ）処置の、対照（ＮＴ）に対する免疫組織化学的評価を表すグラフである。
【００２３】
【図１０】図１０は、胸腺欠損ヌードマウスの頭蓋内ヒト神経膠芽腫腫瘍において、ドキソルビシンではなくアルドキソルビシンが選択的に蓄積することを示す図である。腫瘍担持マウスに、実施例１に記載の通り、アルドキソルビシンおよびドキソルビシンを静脈内注射した。マウスを、最後の注射の２４時間後に安楽死させた。脳を回収し、明視野およびドキソルビシンに特異的な波長での落射蛍光のために装備した実体顕微鏡を使用して画像化して、薬物の蓄積を視覚化した。
【００２４】
【図１１】図１１は、腫瘍担持マウスの脳組織の凍結切片に見られる通り、ドキソルビシンではなくアルドキソルビシンが選択的に蓄積することを示す図である。微小血管密度マーカーであるＣＤ３１、および浸潤促進性（ｐｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ）のタイプＩＩＩ中間径フィラメントタンパク質であるビメンチンについての免疫組織化学染色も示す。すべての核を、ＤＡＰＩで対比染色した。
【００２５】
【図１２】図１２は、対照（対照）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏ）、およびアルドキソルビシン（ａｌｄｏｘｏ）処置群のマウスについて、図１に示す画像から得られた輝度（光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ）および時間の関数として表される腫瘍サイズ間の関係を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
本明細書において別段定義されない限り、本願で使用される科学用語および技術用語は、一般に当業者に理解される意味を有する。一般に、本明細書に記載の化学、分子生物学、細胞およびがん生物学、免疫学、微生物学、薬学、ならびにタンパク質および核酸の化学に関連して使用される命名法、およびそれらの技術は、当技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。
【００２７】
本願において言及されているすべての刊行物、特許および公開特許出願は、本明細書において参照によって具体的に組み込まれる。矛盾が生じた場合、本明細書の具体的な定義を含めて本明細書が優先する。別段特定されない限り、本発明の各実施形態は、単独で使用することができ、または本発明の任意の１つもしくは複数の他の実施形態と組み合わせて使用できることを理解されたい。
【００２８】
本明細書を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変形は、記載の整数（または構成成分）または整数（または構成成分）の群を包含することを意味するが、任意の他の整数（または構成成分）または整数（または構成成分）の群を排除することは意味しないと理解される。
【００２９】
単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈によってそうではないと明示されない限り、複数を含む。
【００３０】
用語「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「含まれるが、これらに限定されない」を意味するために使用される。「含まれる」および「含まれるが、これらに限定されない」は、交換可能に使用される。
【００３１】
用語「約」によって量を定める数については、２％、５％またはさらには１０％の変分が、量を定めた数の範囲に含まれる。
【００３２】
用語「アントラサイクリン」は、アントラセンジオン（アントラキノンまたはジオキソアントラセンとも呼ばれる）構造単位を有する、あるクラスの抗新生物性抗生物質を指す。例えば、用語「アントラサイクリン」は、具体的には、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ピラルビシン、ゾルビシン、アクラルビシン、カルミノマイシン、ミトキサントロン、およびアメタントロンを個々に含むことが意図される。
【００３３】
用語「患者」および「個体」は、交換可能に使用され、ヒトまたは非ヒト動物のいずれかを指す。これらの用語には、哺乳動物、例えばヒト、霊長類、家畜動物（例えば、ウシ、ブタ）、コンパニオン動物（例えば、イヌ、ネコ）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれる。
【００３４】
用語「薬学的に許容される」は、活性成分（複数可）の生物活性の有効性を妨害しない非毒性の材料を意味する。担体の特徴は、投与経路に依存する。
【００３５】
用語「薬学的に許容される担体」は、本発明の治療的に有効な物質と一緒に患者に投与することができ、細胞傷害剤の薬学的活性を破壊しない、非毒性の担体を指す。用語「添加剤」は、製剤または組成物における、薬学的に活性な成分ではない添加物質を指す。
【００３６】
用語「薬学的に有効な量」または「治療有効量」は、患者の脳がんを処置するのに有効な、例えば疾患（例えば、がん）に罹患している患者の全体的な健康に有益な、かつ／または望ましい変化をもたらす量を指す。当業者は、脳がんの処置として、がん細胞を死滅させること、新しいがん細胞の成長を防止すること、腫瘍の退縮を引き起こすこと（腫瘍サイズを低減すること）、転移の減少を引き起こすこと、患者の生体機能を改善すること、患者のウェルビーイングを改善すること、疼痛を低減すること、食欲を改善すること、患者の体重を改善すること、およびそれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されないことを認識される。また「薬学的に有効な量」または「治療有効量」は、患者の臨床症状を改善するのに必要な量を指す。本明細書に記載の脳がんの治療方法または処置方法は、脳がんの「治癒」と解釈されるべきではなく、または他の方法で「治癒」に限定されるべきではない。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「処置する」または「処置」は、対象の状態を改善または安定化する様式で、症状、臨床徴候、および状態の根本的な病理を逆行させ、低減し、または停止させることを含む。本明細書で使用される場合、かつ当技術分野で十分に理解されている通り、「処置」として、臨床結果を含めた有益なまたは所望の結果を得るための手法である。有益なまたは所望の臨床結果には、検出可能であろうと検出不可能であろうと、１つまたは複数の症状または状態の軽減または回復、疾患の程度の縮小、疾患の安定化（すなわち悪化しない）状態、疾患の進行の遅延または緩徐、病状の回復または緩和、および寛解（部分的であろうと全体的であろうと）が挙げられ得るが、これらに限定されない。また「処置」は、処置を受けていない場合の予測生存期間と比較して生存期間が延長することも意味し得る。
【００３８】
用語「置換」は、化合物骨格の１つまたは複数の炭素上の水素を置き換える置換基を有する部分を指す。「置換」または「で置換されている」は、このような置換が、置換された原子および置換基の可能な原子価に従うこと、ならびに置換によって、例えば転位、環化、脱離などによって自然に変換しない安定な化合物が得られることという暗黙の条件を含むことを理解される。本明細書で使用される場合、用語「置換」は、有機化合物のすべての許容できる置換基を含む。広範な一態様では、許容できる置換基として、有機化合物の非環式および環式、分岐および非分岐、炭素環式および複素環式、芳香族および非芳香族の置換基が挙げられる。許容できる置換基は、適切な有機化合物について、１つまたは複数であってもよく、同じでも異なっていてもよい。本発明の目的では、窒素などのヘテロ原子は、ヘテロ原子の価数を満たす、本明細書に記載の有機化合物の水素置換基および／または任意の許容できる置換基を有することができる。置換基には、本明細書に記載の任意の置換基、例えばハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル（例えばカルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、またはアシル）、チオカルボニル（例えばチオエステル、チオアセテート、またはチオホルメート）、アルコキシル、アルキルチオ、アシルオキシ、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、スルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロシクリル、アラルキル、または芳香族もしくは複素芳香族部分が含まれ得る。
治療的に有効な物質
【００３９】
本発明において有用な治療的に有効な物質は、構造
【化３】
2016521705.tif 000005
または薬学的に許容されるその塩を含み、
ここで、Ｘは、患者の体内で、ｐＨ依存様式で加水分解的または酵素的に切断され得る結合である。
【００４０】
一部の実施形態では、治療的に有効な物質において使用される細胞傷害剤は、アントラサイクリンである。アントラサイクリンには、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ピラルビシン、ゾルビシン、アクラルビシン、カルミノマイシン、ミトキサントロン、およびアメタントロン、またはそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、アントラサイクリンは、ドキソルビシンまたは薬学的に許容されるその塩である。
【００４１】
一部の実施形態では、切断可能な部分（「Ｘ」）は、酸で切断可能な部分である。酸で切断可能な部分には、アセタール、ケタール、イミン、ヒドラゾン、カルボキシルヒドラゾンもしくはスルホニルヒドラゾン、あるいはｃｉｓ−アコニチル部分または置換もしくは非置換トリチル基を含有する部分が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、酸で切断可能な部分は、ヒドラゾン部分である。一部の実施形態では、細胞傷害剤は、部分Ｘが患者の体内で切断されると放出される。
【００４２】
一部の実施形態では、切断可能な部分（「Ｘ」）は、酵素で切断可能である。酵素で切断可能な部分として、１つまたは複数のカルバメート結合を含むペプチドが挙げられるが、これに限定されない。ペプチド部分は、例えば１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、２〜５、２〜１０、２〜１５、２〜２０、２〜２５、２〜３０、２〜３５、または２〜４０個のアミノ酸残基を含むことができる。ペプチド部分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個のアミノ酸残基を含む部分を含むが、これらに限定されない。ペプチド部分は、１つまたは複数のプロテアーゼによって特異的に切断可能になるように設計することができる。一部の実施形態では、切断される結合は、ペプチド結合、イミド結合、またはヒドラジン部分のカルボキシル−ヒドラゾン結合である。
【００４３】
一部の実施形態では、リンカーは、有機分子である。このようなリンカーは、１〜１２個の炭素原子を有する少なくとも１つの脂肪族炭素鎖、および／または脂肪族炭素環を含むことができ、ここで炭素原子のいずれかは、−ＯＨまたは＝Ｏで置換されていてもよく、適切であり化学的に可能な場合には、炭素原子のいずれかは、ヘテロ原子または芳香族部分で置き換えられていてもよい。一部の実施形態では、ヘテロ原子は、酸素である。一部の実施形態では、脂肪族リンカーは、１〜１２個の炭素原子を含むアルキル鎖、２〜１２個の炭素原子を含むアルケニル鎖、または２〜１２個の炭素原子を含むアルキニル鎖を含むことができ、ここで炭素原子のいずれかは、−ＯＨまたは＝Ｏで置換されていてもよく、適切であり化学的に可能な場合には、炭素原子のいずれかは、酸素原子で置き換えられていてもよい。特定の実施形態では、脂肪族リンカーは、１〜１２個の炭素原子を含むアルキル鎖であり、ここで炭素原子のいずれかは、適切であり化学的に可能な場合には、＝Ｏで置換されていてもよい。さらなる他の実施形態では、脂肪族リンカーは、３〜９個、４〜８個、または５〜７個の炭素原子を含むアルキル鎖であり、ここで炭素原子のいずれかは、適切であり化学的に可能な場合には、＝Ｏで置換されていてもよい。特定の一実施形態では、脂肪族リンカーは、６個の炭素原子を含むアルキル鎖であり、ここで切断可能な部分「Ｘ」に結合している炭素原子は、＝Ｏで置換されている。
【００４４】
共有結合によってタンパク質に結合する基として、マレイミド基、ハロアセトアミド基、ハロアセテート基、ピリジルジチオ基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、およびイソチオシアネート基が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、共有結合によってタンパク質に結合する基は、マレイミド基である。共有結合によってタンパク質に結合する基として、ジスルフィド基、ビニルカルボニル基、アジリジン基またはアセチレン基も挙げられる。ジスルフィド基は、交換可能な基としてチオニトロ安息香酸（例えば５’−チオ−２−ニトロ安息香酸）によって活性化され得る。マレイミド、ピリジルジチオ、またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基は、適切な場合、アルキル基または上記の水溶性の基によって置換されていてもよい。一般に、タンパク質に結合する基は、タンパク質に結合する特性を備えており、すなわち生理的環境において、共有結合により（「共有結合によってタンパク質に結合する基」）または非共有結合により（「非共有結合によってタンパク質に結合する基」）、タンパク質の表面上の特定のアミノ酸に結合する。マレイミド基、ハロアセトアミド基、ハロアセテート基、ピリジルジチオ基、ジスルフィド基、ビニルカルボニル基、アジリジン基、および／またはアセチレン基は、好ましくは、システインのチオール（−ＳＨ）基と反応し、他方、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基および／またはイソチオシアネート基は、好ましくは、タンパク質の表面上のリシンのアミノ基（−ＮＨ）と反応する。例えば、共有結合によってタンパク質に結合する基（マレイミド基など）は、アルブミンに結合することができる。一部の実施形態では、アルブミンは、修飾されていない（例えば、正にも負にも帯電するように修飾されていない）。
【００４５】
本発明において使用される治療的に有効な物質は、１つまたは複数のアントラサイクリン、切断可能な部分、リンカー、および共有結合によってタンパク質に結合する基のいずれかおよびすべての組合せを含む。治療的に有効な物質は、アントラサイクリン、酸で切断可能な部分、アルキルリンカー、および共有結合によってタンパク質に結合する基を含むことができる。ある特定の実施形態では、治療的に有効な物質は、アントラサイクリン、酸で切断可能な部分としてのヒドラゾン、アルキルリンカー、および共有結合によってタンパク質に結合する基としてのマレイミド基を含む。他の実施形態では、治療的に有効な物質は、アントラサイクリン、酸で切断可能な部分としてのヒドラゾン部分、６−炭素アルキルリンカー（切断可能な部分に結合している炭素原子は、＝Ｏで置換されている）、および共有結合によってタンパク質に結合する基としてのマレイミド基（すなわち、アントラサイクリン−ＥＭＣＨ分子）を含む。
【００４６】
本発明において使用される例示的化合物は、ＤＯＸＯ−ＥＭＣＨである。用語「ＤＯＸＯ−ＥＭＣＨ」は、単独でまたは任意の他の用語と組み合わさって、以下の構造
【化４】
2016521705.tif 000006
によって図示される化合物を指す。
またＤＯＸＯ−ＥＭＣＨは、（Ｅ）−Ｎ’−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−（４−アミノ−５−ヒドロキシ−６−メチル−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ−２，５，１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−６，１１−ジオキソ１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロテトラセン−２−イル）−２−ヒドロキシエチリデン）−６−（２，５−ジオキソ−２Ｈ−ピロール−１（５Ｈ）イル）ヘキサンヒドラジド・ＨＣｌと呼ばれる。
医薬組成物
【００４７】
一部の実施形態では、本発明は、治療的に有効な物質を含む、患者の脳がんの処置に使用するための医薬組成物であって、該治療的に有効な物質が、
【化５】
2016521705.tif 000007
または薬学的に許容されるその塩を含み、
ここで、Ｘは、患者の体内で、ｐＨ依存様式で加水分解的または酵素的に切断され得る部分である医薬組成物を提供する。
【００４８】
本発明の方法および使用のそれぞれは、本明細書に記載の通り、脳がんを処置するために、治療的に有効な物質または薬学的に許容されるその塩もしくはエステル形態を患者に投与することを含む。一部の実施形態では、治療的に有効な物質は、単独で投与することができる。一部の実施形態では、治療的に有効な物質は、抗がん剤と組み合わせて投与することができる。一部の実施形態では、治療的に有効な物質は、アントラサイクリン、白金を含有する抗がん化合物、タキサン、アルキル化剤、プロテアソーム阻害剤、ヌクレオシド類似体、トポイソメラーゼ阻害剤、免疫媒介性脳障害を処置するための免疫抑制剤などの他の医薬品と組み合わせて投与することができる。一部の実施形態では、治療的に有効な物質は、ドキソルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、テモゾロミド、ニトロソウレア、ボルテゾミブ、ゲムシタビン、エトポシド、トポテカン、または薬学的に許容されるその塩などの他の医薬品と組み合わせて投与することができる。
【００４９】
患者に投与される組成物における治療的に有効な物質（例えば、ＤＯＸＯ−ＥＭＣＨ）の総量は、その患者に適した量である。当業者は、個体が異なると、治療的に有効な物質の総量は異なる必要があり得ることを理解される。一部の実施形態では、治療的に有効な物質の量は、薬学的に有効な量である。当業者は、例えば患者の年齢、体重および身体状態などの要因に基づいて、患者を処置するのに必要な組成物における治療的に有効な物質の量を決定することができる。治療的に有効な物質（例えばＤＯＸＯ−ＥＭＣＨ）の濃度は、静脈内投与溶液におけるその可溶性、および投与され得る流体の体積に依存する。例えば、治療的に有効な物質の濃度は、注射可能な組成物中、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌであり得る。一部の実施形態では、治療的に有効な物質の濃度は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約７ｍｇ／ｍｌ〜約１７ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、または約０．２５ｍｇ／ｍｌ〜約４．５ｍｇ／ｍｌであり得る。特定の実施形態では、治療的に有効な物質の濃度は、約０．１ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ、約１．９ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ、約２．１ｍｇ／ｍｌ、約２．２ｍｇ／ｍｌ、約２．３ｍｇ／ｍｌ、約２．４ｍｇ／ｍｌ、約２．５ｍｇ／ｍｌ、約２．６ｍｇ／ｍｌ、約２．７ｍｇ／ｍｌ、約２．８ｍｇ／ｍｌ、約２．９ｍｇ／ｍｌ、約３．０ｍｇ／ｍｌ、約３．１ｍｇ／ｍｌ、約３．２ｍｇ／ｍｌ、約３．３ｍｇ／ｍｌ、約３．４ｍｇ／ｍｌ、約３．５ｍｇ／ｍｌ、約３．６ｍｇ／ｍｌ、約３．７ｍｇ／ｍｌ、約３．８ｍｇ／ｍｌ、約３．９ｍｇ／ｍｌ、約４．０ｍｇ／ｍｌ、約４．１ｍｇ／ｍｌ、約４．２ｍｇ／ｍｌ、約４．３ｍｇ／ｍｌ、約４．４ｍｇ／ｍｌ、約４．５ｍｇ／ｍｌ、約４．６ｍｇ／ｍｌ、約４．７ｍｇ／ｍｌ、約４．８ｍｇ／ｍｌ、約４．９ｍｇ／ｍｌ、約５．０ｍｇ／ｍｌ、約５．１ｍｇ／ｍｌ、約５．２ｍｇ／ｍｌ、約５．３ｍｇ／ｍｌ、約５．４ｍｇ／ｍｌ、約５．５ｍｇ／ｍｌ、約５．６ｍｇ／ｍｌ、約５．７ｍｇ／ｍｌ、約５．８ｍｇ／ｍｌ、約５．９ｍｇ／ｍｌ、または約６．０ｍｇ／ｍｌであり得る。一部の実施形態では、治療的に有効な物質の濃度は、約７ｍｇ／ｍｌ、約８ｍｇ／ｍｌ、約９ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約１１ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１３ｍｇ／ｍｌ、約１４ｍｇ／ｍｌ、約１５ｍｇ／ｍｌ、約１６ｍｇ／ｍｌ、約１７ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約１９ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２１ｍｇ／ｍｌ、約２２ｍｇ／ｍｌ、約２３ｍｇ／ｍｌ、約２４ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌ、約２６ｍｇ／ｍｌ、約２７ｍｇ／ｍｌ、約２８ｍｇ／ｍｌ、約２９ｍｇ／ｍｌ、または約３０ｍｇ／ｍｌであり得る。
【００５０】
また、本発明の医薬組成物およびキットは、賦形剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、および当技術分野で周知の他の材料を含有することができる。
【００５１】
組成物は、様々な通常のやり方で投与することができる。使用できる例示的な投与経路には、経口、非経口、静脈内、動脈内、皮膚、皮下、筋肉内、局所、頭蓋内、眼窩内、点眼、硝子体内、脳室内、関節内、脊髄内、大槽内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾル、中枢神経系（ＣＮＳ）投与、または坐剤による投与が含まれる。一部の実施形態では、組成物は、非経口投与に適している。これらの組成物は、例えば腹腔内、静脈内、または髄腔内に投与することができる。一部の実施形態では、組成物は、静脈内注射される。一部の実施形態では、再構成された製剤は、エタノールおよび水を含む再構成用の液体で、凍結乾燥させたアントラサイクリン化合物の組成物を再構成することによって調製することができる。このような再構成は、再構成用の液体を添加する工程、および例えば混合物を回旋またはボルテックスすることによって混合する工程を含むことができる。次に、再構成された製剤は、例えば乳酸リンゲル溶液を製剤と混合して、注射可能な組成物を作り出すことによって、注射に適したものにすることができる。当業者は、治療的に有効な物質の製剤または組成物を投与する方法が、処置される患者の年齢、体重および身体状態などの要因、ならびに処置される疾患または状態依存することを理解する。したがって当業者は、個々の場合に応じて患者に最適な投与方法を選択することができる。
【００５２】
一部の実施形態では、治療的に有効な物質の組成物は、脳がんを処置するための医薬の製造に使用することができる。
【００５３】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の治療的に有効な物質、ならびに薬学的に許容される添加剤、担体および／または賦形剤を含むキットを提供する。
【００５４】
一部の実施形態では、１つまたは複数の添加剤が組成物に含まれていてもよい。当業者は、任意の１種の添加剤の選択が、任意の他の添加剤の選択に影響を及ぼし得ることを理解する。例えば、特定の添加剤の選択は、添加剤の組合せによっては望ましくない効果が生じるおそれがあるため、１種または複数の追加の添加剤の使用を避ける場合がある。当業者は、もしあれば、どの添加剤を組成物に含めるかを経験的に決定することができる。添加剤には、共溶媒、可溶化剤、緩衝剤、ｐＨ調節剤、増量剤、界面活性剤、被包剤、浸透圧調節剤、安定化剤、保護剤、および粘度調整剤が含まれ得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、組成物中に薬学的に許容される担体を含むことが有益な場合がある。
【００５５】
一部の実施形態では、可溶化剤が組成物に含まれていてもよい。可溶化剤は、治療的に有効な物質（例えば、ＤＯＸＯ−ＥＭＣＨ）または添加剤を含めた組成物の構成成分のいずれかの可溶性を増大するのに有用となり得る。本明細書に記載の可溶化剤は、網羅的な一覧を構成するものではなく、組成物に使用され得る例示的な可溶化剤として単に提示されている。ある特定の実施形態では、可溶化剤として、エチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、メチルパラベン、プロピルパラベン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ならびに任意の薬学的に許容されるそれらの塩および／または組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
組成物のｐＨは、製剤または組成物にとって望ましい特性をもたらす任意のｐＨであり得る。望ましい特性には、例えば治療的に有効な物質（例えば、ＤＯＸＯ−ＥＭＣＨ）の安定性、他のｐＨにおける組成物と比較して治療的に有効な物質の保持量の増大、および濾過効率の改善が含まれ得る。一部の実施形態では、組成物のｐＨは、約３．０〜約９．０、例えば約５．０〜約７．０であり得る。特定の実施形態では、組成物のｐＨは、５．５±０．１、５．６±０．１、５．７±０．１、５．８±０．１、５．９±０．１、６．０±０．１、６．１±０．１、６．２±０．１、６．３±０．１、６．４±０．１、または６．５±０．１であり得る。
【００５７】
一部の実施形態では、組成物に１種または複数の緩衝剤を含むことによってｐＨを緩衝することが有益となり得る。ある特定の実施形態では、緩衝剤は、例えば、約５．５、約６．０、または約６．５のｐＫａを有することができる。当業者は、適切な緩衝剤が、そのｐＫａおよび他の特性に基づいて組成物に含まれるように選択され得ることを理解する。緩衝剤は、当技術分野で周知である。したがって、本明細書に記載の緩衝剤は、網羅的な一覧を構成するものではなく、本発明の製剤または組成物に使用され得る例示的な緩衝剤として単に提示されている。ある特定の実施形態では、緩衝剤として、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムとリン酸カリウムの組合せ、Ｔｒｉｓ／Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、重炭酸ナトリウム、リン酸アルギニン、塩酸アルギニン、塩酸ヒスチジン、カコジル酸塩、コハク酸塩、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、マレイン酸塩、ｂｉｓ−ｔｒｉｓ、リン酸塩、炭酸塩、ならびに任意の薬学的に許容されるそれらの塩および／または組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
一部の実施形態では、ｐＨ調節剤が組成物に含まれていてもよい。組成物のｐＨの調整は、例えば治療的に有効な物質の安定性もしくは可溶性に対して有益な効果を有することができ、または組成物を非経口投与に適したものにするのに有用であり得る。ｐＨ調節剤は、当技術分野で周知である。したがって、本明細書に記載のｐＨ調節剤は、網羅的な一覧を構成するものではなく、組成物に使用され得る例示的なｐＨ調節剤として単に提示されている。ｐＨ調節剤として、例えば酸および塩基を含むことができる。一部の実施形態では、ｐＨ調節剤には、酢酸、塩酸、リン酸、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
一部の実施形態では、増量剤が組成物に含まれていてもよい。増量剤は、組成物に体積を加え、特に増量剤がなければ凍結乾燥ペレットを見ることが困難である場合に、組成物の可視化の一助にするために、凍結乾燥組成物において一般に使用される。また増量剤は、医薬組成物の活性構成成分（複数可）の吹き飛びに起因する薬物喪失を防止する助けにすることができ、かつ／または組成物の凍結保護の一助にすることができる。増量剤は、当技術分野で周知である。したがって、本明細書に記載の増量剤は、網羅的な一覧を構成するものではなく、組成物に使用され得る例示的な増量剤として単に提示されている。
【００６０】
例示的な増量剤として、糖類、モノサッカライド、ジサッカライド、ポリサッカライド、糖アルコール、アミノ酸、および糖酸、ならびにそれらの組合せが含まれ得る。糖類増量剤には、単糖類、二糖類または多糖類、デンプン、アルドース、ケトース、アミノ糖、グリセルアルデヒド、アラビノース、リキソース、ペントース、リボース、キシロース、ガラクトース、グルコース、ヘキソース、イドース、マンノース、タロース、ヘプトース、グルコース、フルクトース、メチルａ−Ｄ−グルコピラノシド、マルトース、ラクトン、ソルボース、エリトロース、トレオース、アラビノース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、タガトース、グルコサミン、ガラクトサミン、アラビナン、フルクタン、フカン、ガラクタン、ガラクツロナン、グルカン、マンナン、キシラン、イヌリン、レバン、フコイダン、カラギーナン、ガラクトカロロース（ｇａｌａｃｔｏｃａｒｏｌｏｓｅ）、ペクチン、アミロース、プルラン、グリコーゲン、アミロペクチン、セルロース、プスツラン、キチン、アガロース、ケラチン、コンドロイチン、デルマタン、ヒアルロン酸、キサンチンガム、スクロース、トレハロース、デキストラン、およびラクトースが挙げられるが、これらに限定されない。糖アルコール増量剤として、アルジトール、イノシトール、ソルビトール、およびマンニトールが挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸増量剤として、グリシン、ヒスチジン、およびプロリンが挙げられるが、これらに限定されない。糖酸増量剤として、アルドン酸、ウロン酸、アルダル酸、グルコン酸、イソアスコルビン酸、アスコルビン酸、グルカル酸、グルクロン酸、グルコン酸、グルカル酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、ノイラミン酸、ペクチン酸、およびアルギン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
一部の実施形態では、界面活性剤が組成物に含まれていてもよい。界面活性剤は、一般に、液体組成物の表面張力を低減する。界面活性剤は、容易に濾過できるように改善するなどの有益な特性をもたらし得る。また界面活性剤は、乳化剤および／または可溶化剤として作用し得る。界面活性剤は、当技術分野で周知である。したがって、本明細書に記載の界面活性剤は、網羅的な一覧を構成するものではなく、本発明の製剤または組成物に使用され得る例示的な界面活性剤として単に提示されている。含まれ得る界面活性剤として、ソルビタンエステル、例えばポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０）、リポポリサッカライド、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００およびＰＥＧ３０００）、ポロキサマー（すなわち、プルロニック）、エチレンオキシドおよびポリエチレンオキシド（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、サポニン、リン脂質（例えば、レシチン）、ならびにそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
一部の実施形態では、被包剤が組成物に含まれていてもよい。被包剤は、分子を封鎖し、それらを安定化もしくは可溶化する助けにすることができる。被包剤は、当技術分野で周知である。したがって、本明細書に記載の被包剤は、網羅的な一覧を構成するものではなく、組成物に使用され得る例示的な被包剤として単に提示されている。組成物に含まれ得る被包剤として、ジメチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、およびトリメチル−β−シクロデキストリン、ならびにそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
一部の実施形態では、浸透圧調節剤が組成物に含まれていてもよい。液体組成物の浸透圧は、例えば非経口投与によって患者に組成物を投与する場合、考慮すべき重要な点である。したがって、浸透圧調節剤を使用して、組成物を投与に適したものにする助けにすることができる。浸透圧調節剤は、当技術分野で周知である。したがって、本明細書に記載の浸透圧調節剤は、網羅的な一覧を構成するものではなく、組成物に使用され得る例示的な浸透圧調節剤として単に提示されている。浸透圧調節剤として、イオン性または非イオン性であり得、浸透圧調節剤には、無機塩、アミノ酸、糖類、糖、糖アルコール、および糖類が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な無機塩として、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、および硫酸カリウムが挙げられ得る。例示的なアミノ酸は、グリシンである。例示的な糖には、糖アルコール、例えばグリセロール、プロピレングリコール、グルコース、スクロース、ラクトース、およびマンニトールが含まれ得る。
【００６４】
一部の実施形態では、安定化剤が組成物に含まれていてもよい。安定化剤は、組成物における治療的に有効な物質の安定性を増大する助けになる。安定性の増大は、例えば治療的に有効な物質の分解を低減しまたはその凝集を防止することによって生じ得る。理論に拘泥するものではないが、安定性を増強する機構は、治療的に有効な物質を溶媒から封鎖し、またはアントラサイクリン化合物のフリーラジカル酸化を阻害することを含み得る。安定化剤は、当技術分野で周知である。したがって、本明細書に記載の安定化剤は、網羅的な一覧を構成するものではなく、組成物に使用され得る例示的な安定化剤として単に提示されている。安定化剤として、乳化剤および界面活性剤が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００６５】
一部の実施形態では、保護剤が組成物に含まれていてもよい。保護剤は、薬学的に活性な成分（例えば、治療的に有効な物質）を、望ましくない条件（例えば、凍結もしくは凍結乾燥によって引き起こされる不安定性、または酸化）から保護する薬剤である。保護剤として、例えば凍結保護剤、凍結乾燥保護剤、および抗酸化剤が挙げられ得る。凍結保護剤は、組成物がその凝固点未満の温度に曝露される場合、活性医薬品成分（例えば、アントラサイクリン化合物）の効力の喪失を防止するのに有用である。例えば、凍結保護剤は、製剤を凍結させた後、静脈内（ＩＶ）投与のために希釈できるように、再構成された凍結乾燥製剤に含まれ得る。凍結保護剤は、当技術分野で周知である。したがって、本明細書に記載の凍結保護剤は、網羅的な一覧を構成するものではなく、組成物に使用され得る例示的な凍結保護剤として単に提示されている。凍結保護剤として、溶媒、界面活性剤、被包剤、安定化剤、粘度調整剤、およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。凍結保護剤として、例えばジサッカライド（例えば、スクロース、ラクトース、マルトース、およびトレハロース）、ポリオール（例えば、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、およびズルシトール）、グリコール（例えば、エチレングリコール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコール）が挙げられ得る。
【００６６】
凍結乾燥保護剤は、組成物の構成成分を安定化するのに有用である。例えば、治療的に有効な物質は、凍結乾燥保護剤で凍結乾燥させた後に再構成することができる。凍結乾燥保護剤は、当技術分野で周知である。したがって、本明細書に記載の凍結乾燥保護剤は、網羅的な一覧を構成するものではなく、組成物に使用され得る例示的な凍結乾燥保護剤として単に提示されている。凍結乾燥保護剤として、溶媒、界面活性剤、被包剤、安定化剤、粘度調整剤、およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な凍結乾燥保護剤は、例えば糖およびポリオールであり得る。トレハロース、スクロース、デキストラン、およびヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンは、凍結乾燥保護剤の非限定的な例である。
【００６７】
抗酸化剤は、組成物の構成成分の酸化を防止するのに有用である。酸化は、薬物生成物を凝集させ、または薬物生成物の純度もしくはその効力に他の有害効果をもたらすおそれがある。抗酸化剤は、当技術分野で周知である。したがって、本明細書に記載の抗酸化剤は、網羅的な一覧を構成するものではなく、組成物に使用され得る例示的な抗酸化剤として単に提示されている。抗酸化剤は、例えばアスコルビン酸ナトリウム、クエン酸塩、チオール、メタ重亜硫酸塩、およびそれらの組合せであり得る。
【００６８】
一部の実施形態では、粘度調整剤が組成物に含まれていてもよい。粘度調整剤は、液体組成物の粘度を変化させる。粘度調整剤は、液体組成物の濾過され易さにおいて粘度が重要な役割を演じるため、有益となり得る。組成物は、凍結乾燥および再構成の前に、または再構成の後に濾過することができる。粘度調整剤は、当技術分野で周知である。したがって、本明細書に記載の粘度調整剤は、網羅的な一覧を構成するものではなく、組成物に使用され得る例示的な粘度調整剤として単に提示されている。粘度調整剤には、溶媒、可溶化剤、界面活性剤、および被包剤が含まれる。組成物に含まれ得る例示的な粘度調整剤として、Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファンおよびＮ−アセチル−システインが挙げられるが、これらに限定されない。
処置方法
【００６９】
本明細書で提供される処置方法は、様々な臨床適用に有用である。アントラサイクリンは、がんの処置に有用である。例えば、ドキソルビシンは、インターカレート剤ならびにトポイソメラーゼＩＩ阻害剤であり、急速に分裂する細胞、例えば腫瘍細胞を優先的に死滅させる。ＤＯＸＯ−ＥＭＣＨは、固形腫瘍ならびに血液学的悪性腫瘍を処置するために使用され得るアントラサイクリン化合物である。ＤＯＸＯ−ＥＭＣＨは、アルブミンとの共有結合によって作用し、この場合、アルブミンのシステイン−３４の遊離チオールが、マイケル付加によってＤＯＸＯ−ＥＭＣＨのマレイミドに結合する。次に、ＤＯＸＯ−ＥＭＣＨ−アルブミンコンジュゲートは、腫瘍に到達するまで血液流内を循環し、到達したら、腫瘍のｐＨがより低いためにドキソルビシンとＥＭＣＨ部分との間のヒドラゾン結合が切断され、それによってドキソルビシンが放出されると考えられる。
【００７０】
一態様では、本発明は、脳がんを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、がんは、原発性脳がんである。原発性脳がんの例には、神経膠腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、上衣腫、髄膜腫、頭蓋咽頭腫、胚細胞腫、松果体細胞腫、松果体芽腫および多形神経膠芽腫が含まれる。一部の実施形態では、原発性脳がんは、多形神経膠芽腫である。一部の実施形態では、がんは、転移性または二次性脳がんである。転移性または二次性脳がんの例には、固形腫瘍がん、乳がん、肺がん、子宮内膜がん、卵巣がん、膵がん、膵管腺がん、副腎皮質のがん、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、軟組織肉腫、腎芽腫、多形神経膠芽腫、前立腺がん、肝がん、骨がん、軟骨肉腫、腎がん、膀胱がん、および胃がんが含まれる。一部の実施形態では、転移性または二次性脳がんは、多形神経膠芽腫である。一部の実施形態では、がんは、テモゾロミド耐性がんである。一部の実施形態では、テモゾロミド耐性がんは、テモゾロミド耐性多形神経膠芽腫である。
【００７１】
別の態様では、本発明は、原発性脳腫瘍を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、原発性脳腫瘍は、多形神経膠芽腫である。他の実施形態では、脳がんは、転移性脳腫瘍である。一部の実施形態では、転移性腫瘍は、乳がん、肺がん、胃がん、子宮内膜がん、卵巣がん、膵がん、膵管腺がん、副腎皮質のがん、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、軟組織肉腫、腎芽腫、神経膠芽腫、前立腺がん、肝がん、骨がん、軟骨肉腫、腎がん、膀胱がん、甲状腺がんおよび胃がんを含むが、これらに限定されないがんに由来する。一部の実施形態では、腫瘍は、テモゾロミド耐性腫瘍である。一部の実施形態では、テモゾロミド耐性腫瘍は、テモゾロミド耐性多形神経膠芽腫である。
【００７２】
一部の実施形態では、該方法は、ＤＯＸＯ−ＥＭＣＨ（すなわち、アルドキソルビシン）を単独で、またはがんもしくは腫瘍を処置するための抗がん剤と組み合わせて投与することを含む。一部の実施形態では、該方法は、ＤＯＸＯ−ＥＭＣＨ（すなわち、アルドキソルビシン）を単独で、またはテモゾロミド耐性腫瘍を処置するための抗がん剤と組み合わせて投与することを含む。一部の実施形態では、該方法は、ＤＯＸＯ−ＥＭＣＨ（すなわち、アルドキソルビシン）を、テモゾロミド耐性腫瘍またはがんを処置するために投与することを含む。一部の実施形態では、該方法は、ＤＯＸＯ−ＥＭＣＨ（すなわち、アルドキソルビシン）を、多形神経膠芽腫を処置するために投与することを含む。他の実施形態では、該方法は、ＤＯＸＯ−ＥＭＣＨ（すなわち、アルドキソルビシン）を、テモゾロミド耐性多形神経膠芽腫を処置するために投与することを含む。
変更および改変
【００７３】
本明細書に記載されているものの変更、改変、および他の実施は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく当業者によって行われる。したがって、本発明は、上記の説明または以下の実施例に限定されるべきではない。
例証
【００７４】
ここで、本発明の態様は広く記載されているが、これらは、以下の実施例を参照することによってより容易に理解され、これらの実施例は、本発明のある特定の特徴および実施形態を単に例示する目的で含まれ、制限するものではない。
均等物
【００７５】
当業者は、ごく日常的な実験方法を使用して、本明細書に記載の化合物、組成物およびその使用方法に対する数々の均等物を認識し、または確認することができる。このような均等物は、本発明の範囲に含まれるとみなされる。
【実施例】
【００７６】
ドキソルビシン対アルドキソルビシンの前臨床有効性を、神経膠芽腫のｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルで比較した。
（実施例１）
アルドキソルビシンは、ドキソルビシンとは異なり、異種移植マウスモデルの腫瘍の退縮を誘発し、生存を有意に増加させる
マウスにおけるＵ８７−ｌｕｃ神経膠腫細胞の頭蓋内移植：Ｕ８７ＭＧ亜系統である、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を有するＵ８７−ｌｕｃを、頭蓋内ヒト神経膠芽腫腫瘍を確立するために使用した。６〜８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）マウスを、ケタミン／キシラジンカクテル溶液で麻酔した。動物をＨａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ定位頭部フレームに固定し、１ｃｍの頭皮正中切開を行い、無血清ＤＭＥＭ５μＬ中の細胞５×１０５個を、頭蓋の穿頭孔を通して、１０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用して左線条体に注射して（座標：十字縫合から２．５ｍｍ外側および０．５ｍｍ後部）、実質内深度３．５ｍｍに腫瘍細胞を送達した。頭蓋の穿頭孔を骨ろうで封止し、創傷グルーを使用して切開を閉じた。腫瘍成長を、生物発光イメージングによって評価した。
【００７７】
マウスのアルドキソルビシン処置：この試験は、ビヒクルで処置した対照マウス８匹（Ｃ群）、ドキソルビシンで処置したマウス８匹（Ｄ群）、およびアルドキソルビシンで処置したマウス８匹（Ａ群）からなっていた。処置は、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞の頭蓋内移植の１２日後に開始した。ビヒクル（１０ｍＭリン酸ナトリウム、５％Ｄ−（＋）−グルコース、ｐＨ６．４）またはアルドキソルビシンを、合計６回の注射（すなわち細胞移植の１２日後、１９日後、２６日後、４２日後、５０日後、および５６日後）で静脈内投与した。細胞移植の５０日後に与えた用量がＭＴＤの５０％であったことを除き、すべての用量は、マウスにおける最大耐用量（ＭＴＤ）である３２ｍｇ／ｋｇ／注射の約７５％であった。ドキソルビシンを、ＭＴＤである８ｍｇ／ｋｇ／注射の約７５％で、合計２回の注射（すなわち細胞移植の１２日後および１９日後）で静脈内投与した。薬物およびビヒクルの両方を、注入体積０．１５ｍｌを使用して投与した。
【００７８】
頭蓋内腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏイメージング：頭蓋内腫瘍成長を、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して生物発光イメージングによって定量化した。イメージングの１０分前に、ＤＰＢＳに懸濁した３０ｍｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）１００μｌをすべてのマウスにＩＰ注射して、ルシフェラーゼ酵素の基質を提供した。イメージングの前に、マウスをイソフルランガス吸入で麻酔した。画像を、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｉｖｉｓ  ２００イメージングシステムを使用して取り込み、マウスの頭部を含む目的の領域について、Ｘｅｎｏｇｅｎ製のＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．１ソフトウェアで定量化した。画像強度を、光子／秒／ｃｍ２／ｓｒとして表した。
【００７９】
ＨＰＬＣシステムおよび条件：励起波長および放出波長をそれぞれ４８０ｎｍおよび５６０ｎｍに設定した蛍光走査検出器を有するＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣシステム（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、ＵＳＡ）を使用した。データ取得のために、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用した。ガードカートリッジ（ＢＤＳ−Ｈｙｐｅｒｓｉｌ−Ｃ１８、５μＭ）を取り付けたＷａｔｅｒｓ  Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ  ＯＤＳ２カラム（４ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ）で分離を行った。溶出は、６５％のリン酸一ナトリウム、ｐＨ２．２、および３５％のアセトニトリルを含有する移動相を用いて実施した。分離には、一定流速１．２５ｍｌ／分を使用した。カラムは２８℃に設定し、注入体積は２５μｌであった。
【００８０】
ドキソルビシン、アルドキソルビシンおよび内部標準であるダウノルビシンは、それぞれ４．０６分、４．３９分および６．５２分の平均保持時間を示し、これらはした適用アッセイ条件下で十分に分割された。分析した臓器試料では、アルドキソルビシンは、ドキソルビシンの保持時間で溶出した。使用したクロマトグラフィー条件下では、干渉ピークは観測されなかった。
【００８１】
試料の調製：アルドキソルビシン、２４ｍｇ／ｋｇ／注射（ＭＴＤの７５％）を、尾静脈注射によって頭蓋内ＧＢＭ腫瘍担持マウスに投与し、注射の４、８、１６、および２４時間後に、マウス（各時点において動物３匹）をＣＯ２ガスで安楽死させた。血液試料を、心臓穿刺によってヘパリン管に収集し、血漿分離のために遠心分離処理した。採血直後に、臓器（脳、心臓、腎臓、肝臓および肺）を外科的に取り出した。血漿および組織を、分析まで−８０℃で保存した。
【００８２】
凍結試料を室温で解凍し、ＰｏｗｅｒＧｅｎ  Ｍｏｄｅｌ  １２５ホモジナイザー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して滅菌生理食塩水中でホモジナイズして、肝臓および脳については１５０ｍｇ／ｍｌの最終組織濃度（ｗ／ｖ）、肺、心臓および筋肉については１２５ｍｇ／ｍｌ、ならびに腎臓については１００ｍｇ／ｍｌを得た。過塩素酸（３５％、ｖ／ｖ）を、血漿または組織試料のアリクオート２０μｌに添加した後、移動相２５μｌを添加した。試料をボルテックスした後、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離処理し、上清２５μｌをＨＰＬＣカラムに適用した。
【００８３】
統計解析：ログランク検定を使用して、カプラン−マイヤー生存曲線を作成し、ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ製の統計解析ソフトウェアを使用して、対照マウスと薬物で処置したマウスの生存を比較した。群間の差異を、対応のないスチューデントｔ検定を使用して評価した。すべての値を、平均±標準偏差として示す。ｐ値≦０．０５を統計的に有意であるとみなした。
結果
【００８４】
アルドキソルビシンは、ドキソルビシンとは異なり、マウスにおける神経膠腫腫瘍の強力な阻害剤である。図１および２は、頭蓋内腫瘍細胞移植の８日後に、対照群（Ｃ群）、ドキソルビシン処置群（Ｄ群）およびアルドキソルビシン処置群（Ａ群）の間に平均腫瘍サイズの相対的な差異はなかったことを示している（ｐ＞０．０５）。２２日目までに、対照群のうち動物３匹およびドキソルビシン群のうち２匹は死亡し、他の動物は大型の腫瘍を発達させた。２週間のアルドキソルビシン処置は、腫瘍の退縮を示し、平均腫瘍サイズは、対照群の平均腫瘍サイズの２８％であり、ドキソルビシン処置群の平均腫瘍サイズの４０％であった（図２Ｄ）。さらに、対照およびドキソルビシン処置群の動物は、アルドキソルビシン処置群の動物と比較して、生存がはるかに短かった。対照群（Ｃ群）およびドキソルビシン群（Ｄ群）のすべての動物が、腫瘍移植後の３４日以内に死亡したが、処置群（Ａ群）の動物は、生存していた。４１日後でも、アルドキソルビシン群の動物８匹のうち７匹は、依然として生存していた。図１参照。
【００８５】
図３は、ビヒクル処置群またはドキソルビシン処置群と比較して、アルドキソルビシンで処置したマウスにおける生存期間が増加したことを示すカプラン−マイヤー生存曲線である（ｐ＜．０００１）。ビヒクルで処置したマウスとドキソルビシンで処置したマウスの間の生存期間に差異はなかった（ｐ＝０．９４９）。研究の終了時に、生存動物はエンドポイントに達しなかったので、生存動物のデータを打ち切った。
【００８６】
頭蓋内腫瘍担持マウスへのアルドキソルビシンの投与に関して、ＨＰＬＣを使用して、アルドキソルビシンの血漿および組織分布を決定した。濃度対時間プロファイルを、図４に示す。アルドキソルビシン（ＭＴＤの約７５％）の静脈内投与後、薬物濃度は、血漿および脳以外の他の臓器において４時間後に最も高かった。血漿濃度は、肝臓、心臓、肺および腎臓では平均濃度よりも２０倍を超えて高く、脳内の平均濃度と比較すると２００倍を超えて高かった。プロドラッグは、血漿および脳以外の他の組織において、２０時間でその濃度のほぼ５０％に達した。脳では、そのレベルは４時間〜２４時間でほぼ同じままであったが、このことは、脳における高い抗腫瘍活性が、薬物の存在時間が長いことに関連し得ることを示唆している。
結論
【００８７】
これらの結果は、静脈内投与されたアルドキソルビシンが、ドキソルビシンとは異なり、ヒトＧＢＭ腫瘍の頭蓋内移植を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ異種移植モデルにおいて、腫瘍の退縮を誘発し、生存を有意に増大させることを実証している。
（実施例２）
異種移植マウスモデルにおける、アルドキソルビシンによって誘発される腫瘍の退縮および生存の増大
【００８８】
雌性マウス（６〜８週齢）に、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を有するＵ８７−ｌｕｃ亜系統を頭蓋内移植して、ヒト神経膠芽腫腫瘍を確立した。腫瘍成長を、Ｄ−ルシフェリン基質を使用して生物発光イメージングによって評価した。マウス８匹をアルドキソルビシンで処置し、８匹をリン酸緩衝生理食塩水（ビヒクル）で処置した。処置は、ＧＢＭ細胞を移植して９日後に開始した。アルドキソルビシンまたはビヒクルを、３週間にわたって週１回ｉ．ｖ．投与した（細胞移植の９日後、１６日後および２３日後）。アルドキソルビシンの最初の２回の用量は、マウスのＭＴＤである３２ｍｇ／ｋｇ／注射の７５％であり、３回目の用量は、５０％であった。結果を図５に示す。
結論
【００８９】
これらの結果は、静脈内投与されたアルドキソルビシンが、ヒトＧＢＭ腫瘍の頭蓋内移植を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ異種移植モデルの腫瘍において、退縮を誘発し、生存を増大させることを実証している。
（実施例３）
腫瘍組織におけるアルドキソルビシンの保持
【００９０】
ＨＰＬＣシステムおよび条件：使用したＨＰＬＣシステムは、励起波長および放出波長をそれぞれ４８０ｎｍおよび５６０ｎｍに設定した蛍光走査検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、ＵＳＡ）であった。データ取得のために、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用した。ガードカートリッジ（ＢＤＳ−Ｈｙｐｅｒｓｉｌ−Ｃ１８、５μＭ）を取り付けたＷａｔｅｒｓ  Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ  ＯＤＳ２カラム（４ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ）で分離を行った。溶出は、６５％の５０ｍＭリン酸一ナトリウム、ｐＨ２．２、および３５％のアセトニトリルから構成される移動相を用いて実施した。分離には、一定流速１．２５ｍｌ／分を使用した。カラムは２８℃に設定し、注入体積は２５μｌであった。
【００９１】
ドキソルビシン、アルドキソルビシンおよび内部標準であるダウノルビシンは、それぞれ平均保持時間が４．０６分、４．３９分および６．５２分であることが実証され、これらは適用したアッセイ条件下で十分に分割された。分析した臓器試料では、アルドキソルビシンを、ドキソルビシンの保持時間で溶出した。使用したクロマトグラフィー条件下では、干渉ピークは観測されなかった。
【００９２】
試料の調製：脳組織および脳腫瘍内のアルドキソルビシンを定量化するために、マウスを、アルドキソルビシン注射（２４ｍｇ／ｋｇ／注射）の６時間後および２４時間後に、ＣＯ２吸入によって安楽死させ、脳を回収し、腫瘍を切除した。回収組織を、分析まで−８０℃で保存した。
【００９３】
凍結試料を室温で解凍し、ＰｏｗｅｒＧｅｎ  Ｍｏｄｅｌ  １２５ホモジナイザー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して滅菌生理食塩水中でホモジナイズして、１５０ｍｇ／ｍｌの最終組織濃度（ｗ／ｖ）を得た。次に、過塩素酸（３５％、ｖ／ｖ）を、２０μｌのアリクオートに添加した後、移動相２５μｌに添加した。試料をボルテックスした後、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離処理し、上清２５μｌをＨＰＬＣカラムに適用した。分析した組織試料では、アルドキソルビシンは、ドキソルビシンの保持時間で溶出した。
結論
【００９４】
アルドキソルビシンの保持量は、周囲の脳組織よりも腫瘍組織の方が３〜４倍高かった。図８参照。
（実施例４）
実験の手短な説明
【００９５】
免疫組織化学検査：組織学的分析のために、対照および薬物で処置した腫瘍担持マウスの脳組織を回収し、最適な切片作製温度（ＯＣＴ）化合物で急速凍結させ、−８０℃で保存した。クライオスタット切片をスライドに置き、亜鉛緩衝ホルマリンで固定した。スライドを、１％ＢＳＡ中５％ヤギ血清でブロックした後、ＣＤ３１（１０２４０２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ｋｉ−６７（ａｂ１５６９５６、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ビメンチン（ａｂ９２５４７、Ａｂｃａｍ）、切断されたカスパーゼ−３（ＣＰ２２９Ｂ、Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）、およびＧＦＡＰ（ＮＢ３００−１４１、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ）に対する一次抗体と共に終夜インキュベートした。次に、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８または６３５にコンジュゲートした、一次抗体源に特異的な二次抗体および核対比染色色素としてのＤＡＰＩと共にスライドをインキュベートした。使用した検出フルオロフォアは、ドキソルビシンの固有蛍光スペクトル（λｅｘ＝４８０ｎｍ、λｅｍ＝５５０〜５９０ｎｍ）（２２８７６３１３）の周りのフルオロフォアに限定して、滲み出し（ｂｌｅｅｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を回避し、ある特定の抗原に関して薬物を同時検出できるようにした。落射蛍光顕微鏡写真を、マルチアルゴン、４０５、５５９、および６３５ダイオードを備えたＦＶ１０００共焦点顕微鏡（米国、Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡのＯｌｙｍｐｕｓ）を使用して、１００倍および４００倍の拡大率で取り込んだ。定量的分析を、Ｓｌｉｄｅｂｏｏｋソフトウェア（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ、Ｄｅｎｖｅｒ、ＣＯ）を用いて実施した。図９および１１は、免疫組織化学的分析によって得られたデータの定量的分析を示している。
結論
【００９６】
アルドキソルビシンは、正常な脳組織ではなく、脳腫瘍内に蓄積する。ドキソルビシンは、腫瘍内にも正常な脳内にも、いずれの認識できる量でも見出されない。
（実施例５）
実験の手短な説明
【００９７】
脳腫瘍内のアルドキソルビシン／ドキソルビシンの検出：腫瘍担持マウスに、先の実施例１に記載の通り、アルドキソルビシンまたはドキソルビシンを静脈内注射した。マウスを、最後の注射の２４時間後に安楽死させた。脳を回収し、明視野および落射蛍光のための、ドキソルビシンに特異的な波長を含むフィルターを備えたＭＶＸ１０実体顕微鏡（米国のＯｌｙｍｐｕｓ）を使用してイメージングして、薬物の蓄積を視覚化した。図１０参照。
結論
【００９８】
アルドキソルビシンは、ドキソルビシンとは異なり、神経膠芽腫腫瘍に蓄積する。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【図１】
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【図５】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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