(57)【要約】本発明は、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、およびＸ１３が本明細書で規定される、式Ｉ’の合成ポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩と、半減期延長性部分とを含み、ペプチドと半減期延長性部分は、場合によりリンカーを介して共有結合によって連結または融合するバイオコンジュゲートを提供する。ポリペプチドは、ＡＰＪ受容体のアゴニストである。本発明はまた、本発明のバイオコンジュゲートの製造方法、ならびに、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含む）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含む）、および子癇前症の治療または予防などの、その治療的使用に関する。本発明はさらに、薬理活性薬剤の組合せおよび医薬組成物を提供する。
2016527249.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．次式Ｉ’：
【化１】
2016527249.tif 000122
［式中、
Ｘ１は、ポリペプチドのＮ末端であり、かつ、存在しないか、またはｐＥ、Ｒ、ｌｓｎ、Ｑ、Ａ、Ｋ、および５−アミノ−吉草酸から選択されるかのいずれかであり、
Ｘ２は、Ｒ、Ａ、ｒ、Ｎ−Ｍｅ−Ｒ、Ｋ、Ｈ、ｈＦ、ｈＫ、Ｆ、Ｅ、またはＯｒｎであり、
Ｘ３は、Ｐ、Ａ、ａ、ｐ、４−ＰｈＰ、Ｋ、Ｄ、ピペコリン酸、またはシステインであり、ここで、システインの側鎖は、Ｘ７位にあるシステインの側鎖とジスルフィド結合を形成し、
Ｘ４は、Ｒ、Ａ、ｒ、Ｎ−Ｍｅ−Ｒ、Ｆ、Ｅ、またはシステインであり、ここで、システインの側鎖は、Ｘ７位にあるシステインの側鎖とジスルフィド結合を形成し、
Ｘ５は、Ｌ、Ｃｈａ、Ａ、Ｄ−Ｌ、Ｎ−Ｍｅ−Ｌ、Ｋ、Ｄ、４−ＰｈＦ、またはＦであり、
Ｘ６およびＸ１２は、独立して、Ｃ、ｃ、ｈＣ、Ｄ−ｈＣ、Ｋ、Ｄ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、またはＥから選択される天然または天然でないアミノ酸であり、ここで、Ｘ６およびＸ１２の側鎖は、共有結合によって連結し合って、モノスルフィド（−Ｓ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、またはアミド結合（−ＮＨＣ（Ｏ）−もしくは−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）のいずれかを形成しており；または代わりに、Ｘ６は、Ｋであり、Ｘ１３は、存在せず、かつ、Ｘ１２は、Ｆまたはｆであり、ここで、Ｘ１２のＣ末端は、Ｘ６のアミノ側鎖とアミド結合を形成し、
Ｘ７は、Ｈ、ｈ、Ａ、Ｎ−Ｍｅ−Ａ、ａ、Ａｉｂ、Ｋ、Ｎａｌ、Ｆ、Ｐ、Ｄａｐ、Ｎ、Ｅ、またはシステインであり、ここで、システインの側鎖は、Ｘ３位にあるシステインの側鎖、またはＸ４位にあるシステインの側鎖とジスルフィド結合を形成し、
Ｘ８は、Ｋ、ｋ、Ｆ、ｆ、Ａ、ｈＦ、Ｎ−Ｍｅ−Ｒ、Ｅ、または４−アミノ−ｌｓｎであり、
Ｘ９は、Ｇ、Ｎ−Ｍｅ−Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｌ、Ｒ、またはＡｉｂであり、
Ｘ１０は、Ｐ、Ａ、ｐ、４−ＰｈＰ、またはピペコリン酸であり、
Ｘ１１は、Ｍ、Ｄ−Ｎｌｅ、Ｎｌｅ、Ｎ−Ｍｅ−Ｎｌｅ、Ｍ（Ｏ）、Ａ、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｋ、３−ＰｙＡ、またはＣｈａであり、かつ、
Ｘ１３は、Ｃ末端であり、かつ、存在しないか、またはＦ、ｆ、Ｎ−Ｍｅ−Ｆ、Ｎａｌ、Ｄ−Ｎａｌ、３−Ｂｒ−Ｆ、（Ｓ）−β−３−Ｆ、Ｉ、Ａ、ａ、Ｋ、Ｄａｐ、Ｈ、およびＥから選択され、
ここで、
Ｎｌｅは、Ｌ−ノルロイシンであり、
Ｄ−ｈＣは、Ｄ−ホモシステインであり、
ｈＣは、Ｌ−ホモシステインであり、
ｈＦは、Ｌ−ホモフェニルアラニンであり、
ｈＫは、Ｌ−リシンであり、
Ｎａｌは、Ｌ−ナファタリン（L-naphathaline）であり、
Ｏｒｎは、オルニチンであり、
Ａｉｂは、α−アミノイソ酪酸であり、
Ｄａｂは、（Ｓ）−ジアミノ酪酸であり、
Ｄａｐは、（Ｓ）−２，３−ジアミノプロピオン酸であり、
Ｍ（Ｏ）は、メチオニンスルホンであり、
Ｃｈａは、（Ｓ）−β−シクロヘキシルアラニンであり、
４−アミノ−ｌｓｎは、４−アミノピペリジン−４−カルボン酸であり、
ｌｓｎは、イソニペコチノイルであり、
ｐＥは、Ｌ−ピログルタミン酸であり、
３−ＰｙＡは、３−（３−ピリジル）−Ｌ−アラニンであり、
４−ＰｈＦは、４−フェニル−Ｌ−フェニルアラニンであり、
ここで、Ｎ末端およびＣ末端は、１、２、３、または４つのグリシンアミノ酸と一緒に、場合により環を形成する、および］
を有するペプチドまたはポリペプチド、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩、またはこれらと実質的に同等なポリペプチドと、
ｂ．半減期延長性部分と
を含む、バイオコンジュゲートまたはその多量体であって、ここで、前記ペプチドまたはポリペプチドと半減期延長性部分とは、場合によりリンカーを介して、共有結合によって連結または融合する、バイオコンジュゲートまたはその多量体。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、次式：
【化２】
2016527249.tif 000123
［  Ｘ１は、存在しない、ｐＥ、Ｒ、Ｑ、またはｌｓｎであり、
Ｘ５は、ＬまたはＣｈａであり、
Ｘ７は、Ｈ、Ａｉｂ、Ｆ、Ｋであり、
Ｘ８は、Ｋ、Ｆ、または４−アミノ−ｌｓｎであり、
Ｘ９は、ＧまたはＡｉｂであり、
Ｘ１１は、ＮｌｅまたはＣｈａであり、
Ｘ１３は、存在しないか、またはＦ、ｆ、Ｋであり、
Ｘ６およびＸ１２は、独立して、Ｃ、ｃ、ｈｃ、Ｄ−ｈｃ、Ｋ、Ｄ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、またはＥから選択される天然または天然でないアミノ酸であり、ここで、Ｘ６およびＸ１２の側鎖は、共有結合によって連結し合って、ジスルフィド結合またはアミド結合のいずれかを形成しており；かつ、ここで、Ｎ末端およびＣ末端は、１、２、３、または４つのグリシンアミノ酸と一緒に、場合により環を形成する］
または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩、またはこれらと実質的に同等なポリペプチドを有する、請求項１に記載のバイオコンジュゲートまたはその多量体。
【請求項３】
Ｘ６およびＸ１２が、Ｋ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｅ、およびＤから独立して選択され、かつ、ここで、Ｘ６およびＸ１２の側鎖が、一緒にアミド結合を形成する、請求項１または２に記載のバイオコンジュゲートまたはその多量体。
【請求項４】
Ｘ６およびＸ１２が、独立して、Ｃ、ｃ、Ｄ−ｈＣ、またはｈＣであり、ここで、Ｘ６およびＸ１２の側鎖が、一緒にジスルフィド結合を形成する、請求項１または２に記載のバイオコンジュゲートまたはその多量体。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、式ＩＩＩ：
【化３】
2016527249.tif 000124
または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩を有する、請求項１、２、または４に記載のバイオコンジュゲートまたはその多量体。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、式ＩＶ：
【化４】
2016527249.tif 000125
または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたはその多量体。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、式Ｖ：
【化５】
2016527249.tif 000126
または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩を有する、請求項１、２、および４から６のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたはその多量体。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、式ＶＩ：
【化６】
2016527249.tif 000127
または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩を有する、請求項１に記載のバイオコンジュゲートまたはその多量体。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、式ＶＩＩ：
【化７】
2016527249.tif 000128
または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩を有する、請求項１に記載のバイオコンジュゲートまたはその多量体。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、式ＶＩＩＩ：
【化８】
2016527249.tif 000129
［式中、Ｘ１のＮ末端とＸ１３のＣ末端とは、リンカーＬと一緒に環を形成し、かつ、ここで、Ｌは、（Ｇ）ｒであり、Ｇは、グリシンであり、かつ、ｒは、１、２、３、または４である］
または前記ポリペプチドの塩を有し、かつ、
前記半減期延長性部分が、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ８、またはＸ１１の側鎖に、共有結合によって連結する、請求項１、２、５、６、または７に記載のバイオコンジュゲートまたはその多量体。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、式ＩＸ：
【化９】
2016527249.tif 000130
［式中、Ｘ１２は、Ｆまたはｆであり、ここで、Ｘ１２のＣ末端は、Ｘ６のアミノ側鎖とアミド結合を形成する］
または前記ポリペプチドのエステル、アミド、もしくは塩を有する、請求項１に記載のバイオコンジュゲートまたはその多量体。
【請求項１２】
Ｘ１がｐＥであり、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩、ここで、前記半減期延長性部分が、前記ポリペプチドのＣ末端、または側鎖アミノ官能基に、場合によりリンカーを介して連結する、請求項１から９および１２のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたはその多量体。
【請求項１３】
Ｘ１３がＦである、請求項１から９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたはその多量体、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
【請求項１４】
Ｘ５がＬである、請求項１から１３のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたはその多量体、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
【請求項１５】
Ｘ７がＨである、請求項１から１４のいずれか一項に記載のその多量体のバイオコンジュゲート、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
【請求項１６】
Ｘ８がＫである、請求項１から１５のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたはその多量体、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
【請求項１７】
Ｘ９がＧである、請求項１から１６のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたはその多量体、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
【請求項１８】
Ｘ１１がＮｌｅである、請求項１から１７のいずれか一項に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
【請求項１９】
前記ポリペプチドが、
【化１０】
2016527249.tif 000131
2016527249.tif 000132
2016527249.tif 000133
［式中、「＊」で印を付けた２つのアミノ酸は、それぞれ、その側鎖または末端を介したジスルフィド結合またはアミド結合を形成しているアミノ酸を表し、かつ、式中、「＊＊」で印を付けた２つのアミノ酸は、その側鎖を介したジスルフィドまたはその末端を介したアミド結合を形成しているアミノ酸を表し、かつ、式中、「＊＊＊」で印を付けた２つのアミノ酸は、その側鎖を介したモノスルフィド結合を形成しているアミノ酸を表す］
または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩から選択される、請求項１に記載のバイオコンジュゲートまたはその多量体。
【請求項２０】
前記ポリペプチドが、
【化１１】
2016527249.tif 000134
［式中、２つのシステインアミノ酸Ｃ＊の側鎖は、一緒にジスルフィド結合を形成する］
または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩から選択される、請求項１８に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２１】
前記半減期延長性部分が、ＩｇＧ定常ドメインもしくはその断片、またはヒト血清アルブミンである、前記請求項のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたはその多量体。
【請求項２２】
前記半減期延長性部分が、ＬＡＬＡ変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）を有するＦｃＬＡＬＡ改変Ｆｃ断片である、前記請求項のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２３】
前記半減期延長性部分が、式ＩおよびＩＩＩ〜ＩＸのいずれか１つに従うポリペプチドに、リンカーを介して融合するＦｃドメインであり、かつ、ここで、前記リンカーは、次式：
−［ＧＧＧＧＳ］ｎ−
を有し、ｎは、１、２、もしくは３であり、または前記リンカーは、ＧＧもしくはＧＳであり、かつ、式ＩおよびＩＩＩ〜ＩＸのいずれか１つに従うポリペプチドは、自然に存在するアミノ酸を含む、請求項１、４から７、１３から１７、２１から２２のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２４】
前記半減期延長性部分が、Ｃ末端リシンが欠失している、またはアラニンで置き換えられているＦｃ変異体である、請求項２３に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが、式Ｉのポリペプチドであり、
式中、
Ｘ１が、ポリペプチドのＮ末端であり、かつ、存在しないか、またはＲ、Ｑ、Ａ、およびＫから選択されるかのいずれかであり、
Ｘ２は、Ｒ、Ａ、Ｋ、Ｈ、Ｆ、またはＥであり、
Ｘ３が、Ｐ、Ａ、Ｋ、またはＤであり、
Ｘ４が、Ｒ、Ａ、Ｆ、またはＥであり、
Ｘ５が、Ｌ、Ａ、Ｋ、Ｄ、またはＦであり、
Ｘ６およびＸ１２が、Ｃであり、かつ、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）結合によって連結し合っており、
Ｘ７が、Ｈ、Ａ、Ｋ、Ｆ、Ｐ、Ｎ、またはＥであり、
Ｘ８が、Ｋ、Ｆ、Ａ、またはＥであり、
Ｘ９が、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｌ、またはＲであり、
Ｘ１０が、ＰまたはＡであり、
Ｘ１１が、Ｍ、Ａ、Ｆ、Ｙ、Ｌ、またはＫであり、かつ、
Ｘ１３が、Ｃ末端であり、かつ、存在しないか、またはＦ、Ｉ、Ａ、Ｋ、Ｈ、およびＥから選択される、
請求項２３または２４に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが、Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ＊−Ｈ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｍ−Ｃ＊−Ｆである、請求項２２、２３、２４、または２５に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２７】
前記半減期延長性部分がヒト血清アルブミンである、前記請求項のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたはその多量体。
【請求項２８】
前記ヒト血清アルブミンが、式Ｉ〜ＶＩＩおよびＩＸのいずれか１つのポリペプチドのＮ末端に、次式のリンカー：
【化１２】
2016527249.tif 000135
［式中、ｘは、１〜２０であり、Ｒは、線状もしくは分枝状アルキレン、シクロアルキル、ヘテロアリールのアリール、またはこれらの組合せであり、Ｒ’は、線状または分枝状アルキレン、アリール、もしくはシクロアルキル、またはこれらの組合せである］
を介して化学的に連結する、請求項２７に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２９】
前記ヒト血清アルブミンが、式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか１つのポリペプチドのＣ末端に、次式のリンカー：
【化１３】
2016527249.tif 000136
［式中、ｘは、１〜２０であり、Ｒは、線状もしくは分枝状アルキレン、シクロアルキル、ヘテロアリールのアリール、またはこれらの組合せであり、Ｒ’は、線状または分枝状アルキレン、アリール、もしくはシクロアルキル、またはこれらの組合せである］
を介して化学的に連結する、請求項２７に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項３０】
前記半減期延長性部分が脂肪酸である、請求項１から２６のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項３１】
前記脂肪酸が、
【化１４】
2016527249.tif 000137
［式中、Ａｋ２、Ａｋ３、Ａｋ４、Ａｋ５、およびＡｋ６は、独立して、（Ｃ８−２０）アルキレンであり、Ｒ６およびＲ７は、独立して、（Ｃ８−２０）アルキルである］
から選択される、請求項３０に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項３２】
次式：
【化１５】
2016527249.tif 000138
［式中、ペプチドは、ペプチドのＮ末端であり、ｍは、０または１であり、ｎは、１、２、または３であり、Ａは、アラニンであり、Ｈは、ヒスチジンであり、Ｌ２は、リンカーであり、Ｃ１は、フッ素で場合により置換されている単環式、二環式、または三環式の炭素環またはヘテロ環系であり、かつ、Ｌ１は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキレンリンカーであり、ここで、アルキレン鎖は、オキソ（＝Ｏ）で場合により置換されており、かつ、ここで、１個または複数の炭素は、ＯまたはＮＨで置き換えられている］
を有する、請求項１、３０、または３１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項３３】
その必要のある対象において、ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患または障害を治療または予防する方法であって、治療有効量の請求項１から３２のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩を前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項３４】
前記疾患または障害が、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含む）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含む）、および子癇前症から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
医薬として使用するための、請求項１から３２のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩。
【請求項３６】
ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患または障害の治療または予防において使用するための、請求項１から３２のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはそのアミド、塩のエステル。
【請求項３７】
急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含む）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含む）、または子癇前症の治療において使用するための、請求項１から３２のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはそのアミド、塩のエステル。
【請求項３８】
治療有効量の請求項１から３２のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩と、１種または複数の治療活性のある共薬剤（co-agent）とを含む組合せ。
【請求項３９】
前記共薬剤が、イノトロープ、βアドレナリン受容体遮断薬、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、カルシウムチャネル遮断薬（ＣＣＢ）、エンドセリンアンタゴニスト、レニン阻害薬、利尿薬、ＡｐｏＡ−Ｉ模倣薬、抗糖尿病薬、抗肥満薬、アルドステロン受容体遮断薬、エンドセリン受容体遮断薬、アルドステロンシンターゼ阻害薬（ＡＳＩ）、ＣＥＴＰ阻害薬、抗凝血薬、リラキシン、ＢＮＰ（ネシリチド）、および／またはＮＥＰ阻害薬から選択される、請求項３８に記載の組合せ。
【請求項４０】
治療有効量の請求項１から３２のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩と、１種または複数の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＡＰＪアゴニストポリペプチドと半減期延長性部分（half-life extending moiety）のバイオコンジュゲートである半合成生物学的分子を含む組成物に関する。特に、本発明のバイオコンジュゲートは、その対応する裸のポリペプチドに比べて、ペプチダーゼの作用によるタンパク質分解性分解に対する耐性がより高い。本発明はさらに、前記組成物の製造方法、および前記組成物を心血管疾患治療において薬学的活性剤として使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
西欧諸国における心不全の発生率は、６５才を過ぎた成人のおよそ１００人に１人である。最も一般的な病態は、心収縮性、したがって、心拍出量、すなわち、どちらかの心室によって排出される有効血液量が徐々に慢性的に不足することである。慢性心不全の患者は、代償不全、すなわち、心臓が十分な血液循環を維持できないという急性エピソードを伴う場合があり、その場合、心収縮性はさらに低下する。米国だけで、「急性非代償性心不全」（ＡＤＨＦ）での入院は、毎年約５０万件である。
【０００３】
ＡＤＨＦの現行の療法としては、利尿薬、血管拡張薬、およびイノトロープが挙げられ、これらは、心収縮性を直接増大させる。現用の静脈内イノトロープ（ドブタミン、ドーパミン、ミルリノン、レボシメンダン）は、不整脈などの有害事象および長期死亡率の増大と関連付けられているにもかかわらず、急性の状況で使用される。こうした傾向があることは、これらを慢性心不全に適用する妨げとなっている。ジゴキシンは、経口イノトロープ（oral inotrope）であるが、狭い治療指数、潜在的な催不整脈性の増大、および腎不全における禁忌による制約がある。
【０００４】
催不整脈性または死亡の傾向なしに心収縮性を増大させる心不全の療法は、ＡＤＨＦ用に差し迫って求められてはいるが、慢性心不全における未対応の膨大な医学的要求にも対処できるはずである。
【０００５】
アペリンは、アペリン受容体、アンジオテンシン様１受容体、アンジオテンシンＩＩ様１受容体などとも呼ばれる、以前はオーファンであったＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）ＡＰＪの、内因性リガンドである。アペリン／ＡＰＪ経路は、心血管系において広く発現され、アペリンは、前臨床モデルにおいて、有益な主要な心血管効果を示している。ヒトにおける急性アペリン投与は、末梢および冠動脈の血管拡張を引き起こし、心拍出量を増加させる（Circulation. 2010; 121:1818-1827）。結果として、ＡＰＪアゴニズムは、心不全患者にとっての重要な治療ターゲットとして浮上している。アペリン受容体ＡＰＪの活性化は、現行の療法の傾向を伴わずに、心収縮性を増大させ、心臓保護になると考えられている。しかし、自然のアペリンは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期および作用持続期間が非常に短い。非常に短い半減期は、急速な血清クリアランス、およびペプチダーゼの作用によるタンパク質分解性分解を原因とする、このような治療用内因性ペプチド送達の、広く認められている主要な難題である。
【０００６】
この欠点を克服するために現在使用されている一手段は、一部の治療用ペプチドが分解されるとしても、十分治療上有効なままとなるように、問題の治療用ペプチドを高い投薬量で患者に投与することである。しかし、この方法は、患者にとって快適ではない。大半の治療用ペプチドは経口投与することができないので、治療用ペプチドは、絶えず注入する、静脈内注射によって頻回注入する、または皮下注射という不便な経路によって頻回投与することのいずれかの必要があることになる。頻回投与が必要となる結果、潜在的可能性のある多くのペプチド治療薬には、許容されない非常に突出した治療コストが伴う。分解された多量のペプチドの存在は、望ましくない副作用も生じかねない。
【０００７】
投与の苦痛および高いコストは、魅力的な生物活性プロファイルを有する大半の治療用ペプチドが、薬物候補として開発されることのない、２つの理由である。
【０００８】
したがって、ペプチドの半減期を延長する１つの手法は、生物学的活性を依然として維持しながら、その分解の速度を緩めるように、治療用ペプチドを改変することである。そのような合成的に改変されたポリペプチドは、公開されていない米国特許出願第１３／７４７，６２１号（ＰＡＴ０５４９６１−ＵＳ−ＮＰ）に記載されている。別の手法としては、ペプチドを、腎臓を介したその排出を妨げる分子にコンジュゲートさせることにより、クリアランスの速度を減速することが挙げられる。しかし、そのようなバイオコンジュゲートは、依然としてプロテアーゼ活性を受けやすい場合がある。
【０００９】
したがって、改変ペプチドの治療上の利点を依然として保持しつつ低い毒性を維持しながら、ｉｎ  ｖｉｖｏでの作用持続時間をより長くするために半減期が延長されている、改変された治療用ペプチドが求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の簡単な説明
本発明は、問題の治療用ペプチドまたはポリペプチド、すなわち、ＡＰＪアゴニストを改変することにより、身体内でのペプチド分解の問題を克服することを対象とする。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、ａ）ＡＰＪアゴニストとして有用であるペプチドまたはポリペプチドと、ｂ）半減期延長性部分とを含み、このペプチドと半減期延長性部分とは、場合によりリンカーを介して、共有結合によって連結または融合する、新規のバイオコンジュゲートまたはその多量体を提供することである。
【００１２】
本発明のバイオコンジュゲートは、野生型アペリンおよび他の既知のアペリン類似体に優る次の改良点、すなわち、半減期の延長、投与後および／または可溶化後の分解に対するより強い免疫性、ならびに立体配座拘束の増強のうちの少なくとも１つを、すべて、野生型アペリンと同等またはそれを超える生物学的活性を示しながら保持する。したがって、本発明のペプチドおよびポリペプチドは、心不全などの心血管疾患、心不全と関連する障害および状態、ならびにＡＰＪ受容体活性の活性化に反応を示す障害および状態の治療または予防に特に有用である。
【００１３】
一実施形態では、本発明のバイオコンジュゲートは、心不全と関連する障害もしくは状態、またはＡＰＪ受容体活性の活性化（もしくはアゴニズム）に反応を示す障害の治療または予防に特に有用である。別の実施形態では、本発明のバイオコンジュゲートは、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含む）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作（cerebrovascular accident）、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含む）、および子癇前症の治療において特に有用である。
【００１４】
本発明は、本明細書に記載するとおりの、ペプチドまたはポリペプチドと半減期延長性部分とのバイオコンジュゲート、その医薬組成物、ならびにその製造および使用の方法に関する。
【００１５】
バイオコンジュゲートをなすペプチドまたはポリペプチドの例としては、式Ｉ〜ＩＸのいずれか１つに従うペプチドおよびポリペプチド、またはそのアミド、エステル、もしくは塩、ならびに、限定はしないが実験実施例を始めとする、本明細書において詳細に列挙するいずれかのペプチドまたはポリペプチドが挙げられる。
【００１６】
したがって、本発明は、
ａ．式（Ｉ’）：
【００１７】
【化１】
2016527249.tif 000003
［式中、
Ｘ１は、ポリペプチドのＮ末端であり、かつ、存在しないか、またはｐＥ、Ｒ、ｌｓｎ、Ｑ、Ａ、Ｋ、および５−アミノ−吉草酸から選択されるかのいずれかであり、
Ｘ２は、Ｒ、Ａ、ｒ、Ｎ−Ｍｅ−Ｒ、Ｋ、Ｈ、ｈＦ、ｈＫ、Ｆ、Ｅ、またはＯｒｎであり、
Ｘ３は、Ｐ、Ａ、ａ、ｐ、４−ＰｈＰ、Ｋ、Ｄ、ピペコリン酸、またはシステインであり、ここで、システインの側鎖は、Ｘ７位にあるシステインの側鎖とジスルフィド結合を形成し、
Ｘ４は、Ｒ、Ａ、ｒ、Ｎ−Ｍｅ−Ｒ、Ｆ、Ｅ、またはシステインであり、ここで、システインの側鎖は、Ｘ７位にあるシステインの側鎖とジスルフィド結合を形成し、
Ｘ５は、Ｌ、Ｃｈａ、Ａ、Ｄ−Ｌ、Ｎ−Ｍｅ−Ｌ、Ｋ、Ｄ、４−ＰｈＦ、またはＦであり、
Ｘ６およびＸ１２は、独立して、Ｃ、ｃ、ｈＣ、Ｄ−ｈＣ、Ｋ、Ｄ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、またはＥから選択される天然または天然でないアミノ酸であり、ここで、Ｘ６とＸ１２の側鎖は、共有結合によって連結し合って、モノスルフィド（−Ｓ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、またはアミド結合（−ＮＨＣ（Ｏ）−もしくは−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）のいずれかを形成しており；または代わりに、Ｘ６は、Ｋであり、Ｘ１３は、存在せず、Ｘ１２は、Ｆまたはｆであり、ここで、Ｘ１２のＣ末端は、Ｘ６のアミノ側鎖とアミド結合を形成し、
Ｘ７は、Ｈ、ｈ、Ａ、Ｎ−Ｍｅ−Ａ、ａ、Ａｉｂ、Ｋ、Ｎａｌ、Ｆ、Ｐ、Ｄａｐ、Ｎ、Ｅ、またはシステインであり、ここで、システインの側鎖は、Ｘ３位にあるシステインの側鎖、またはＸ４位にあるシステインの側鎖とジスルフィド結合を形成し、
Ｘ８は、Ｋ、ｋ、Ｆ、ｆ、Ａ、ｈＦ、Ｎ−Ｍｅ−Ｒ、Ｅ、または４−アミノ−ｌｓｎであり、
Ｘ９は、Ｇ、Ｎ−Ｍｅ−Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｌ、Ｒ、またはＡｉｂであり、
Ｘ１０は、Ｐ、Ａ、ｐ、４−ＰｈＰ、またはピペコリン酸であり、
Ｘ１１は、Ｍ、Ｄ−Ｎｌｅ、Ｎｌｅ、Ｎ−Ｍｅ−Ｎｌｅ、Ｍ（Ｏ）、Ａ、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｋ、３−ＰｙＡ、またはＣｈａであり、かつ、
Ｘ１３は、Ｃ末端であり、かつ、存在しないか、またはＦ、ｆ、Ｎ−Ｍｅ−Ｆ、Ｎａｌ、Ｄ−Ｎａｌ、３−Ｂｒ−Ｆ、（Ｓ）−β−３−Ｆ、Ｉ、Ａ、ａ、Ｋ、Ｄａｐ、Ｈ、およびＥから選択され、
ここで、
Ｎｌｅは、Ｌ−ノルロイシンであり、
Ｄ−ｈＣは、Ｄ−ホモシステインであり、
ｈＣは、Ｌ−ホモシステインであり、
ｈＦは、Ｌ−ホモフェニルアラニンであり、
ｈＫは、Ｌ−リシンであり、
Ｎａｌは、Ｌ−ナファタリン（L-naphathaline）であり、
Ｏｒｎは、オルニチンであり、
Ａｉｂは、α−アミノイソ酪酸であり、
Ｄａｂは、（Ｓ）−ジアミノ酪酸であり、
Ｄａｐは、（Ｓ）−２，３−ジアミノプロピオン酸であり、
Ｍ（Ｏ）は、メチオニンスルホンであり、
Ｃｈａは、（Ｓ）−β−シクロヘキシルアラニンであり、
４−アミノ−ｌｓｎは、４−アミノピペリジン−４−カルボン酸であり、
ｌｓｎは、イソニペコチノイルであり、
ｐＥは、Ｌ−ピログルタミン酸であり、
３−ＰｙＡは、３−（３−ピリジル）−Ｌ−アラニンであり、
４−ＰｈＦは、４−フェニル−Ｌ−フェニルアラニンであり、
ここで、Ｎ末端およびＣ末端は、１、２、３、または４つのグリシンアミノ酸と一緒に、場合により環を形成する］
のペプチドまたはポリペプチドまたはこのポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩、またはこれらと実質的に同等なポリペプチドと、
ｂ．半減期延長性部分と
を含み、前記ポリペプチドのペプチド（said peptide or polypeptide）と前記半減期延長性部分は、場合によりリンカーを介して、共有結合によって連結または融合する、バイオコンジュゲートまたはその多量体を提供する。
【００１８】
本明細書においてさらに説明するとおり、本発明のペプチドおよびポリペプチドを構成するアミノ酸残基を表すのには、当業界で受け入れられている３文字または１文字略語を使用する。「Ｄ」が前に付く場合を除き、アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸である。１文字略語が大文字であるとき、略語はＬ−アミノ酸を指す。１文字略語が小文字であるとき、略語はＤ−アミノ酸を指す。
【００１９】
上で挙げた式Ｉ’のアミノ酸残基のいずれか、または本明細書に記載のその関連式、たとえば、式Ｉ、ＩＩ〜ＩＸは、本発明のバイオコンジュゲートが、機能活性および構造特性（たとえば、半減期の延長、分解からの保護、立体配座拘束）を依然として保持するという前提で、保存的な様式で置換されていてもよい。許容される保存的なアミノ酸置換の原理および例は、本明細書でさらに説明する。
【００２０】
本発明の半減期延長性部分は、ペプチドまたはポリペプチド類似体に、共有結合によって融合、付着、連結、またはコンジュゲートしていてよい。半減期延長性部分は、たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー、コレステロール基、炭水化物、もしくはオリゴ糖、脂肪酸またはサルベージ受容体に結合するいずれかの天然もしくは合成タンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドでよい。半減期延長性部分は、血清半減期の長い血漿タンパク質（アルブミンおよび免疫グロブリン）に、場合によりリンカーを介して共有結合によって連結することが好ましい。他の実施形態では、半減期延長性部分は、アルブミン結合性残基である。本明細書で使用する「アルブミン結合性残基」とは、ヒト血清アルブミンに、共有結合によってでなく結合する残基を意味する。一実施形態では、アルブミン結合性残基は、親油性残基である。別の実施形態では、アルブミン結合性残基は、生理的ｐＨで負電荷を有する。アルブミン結合性残基は、通常、負電荷を有しうるカルボン酸を含む。アルブミン結合性残基の例としては、脂肪酸が挙げられる。他の実施形態では、半減期延長性部分は、ＩｇＧ定常ドメインもしくはその断片（たとえば、Ｆｃ領域）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはアルブミン結合性ポリペプチドである。バイオコンジュゲートの半減期延長性部分の部分は、ヒト血清アルブミンまたはＦｃ領域であることが好ましい。バイオコンジュゲートの半減期延長性部分の部分は、Ｆｃ領域であることが最も好ましい。
【００２１】
半減期延長性部分は、本発明のバイオコンジュゲートの構成部分、たとえば、式Ｉ’もしくは本明細書に記載のその関連式（式Ｉ〜ＩＸ）のペプチドまたはポリペプチドの生物学的機能を増強するように、かつ／またはその妨げとならないようにして付着させる。一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、半減期延長性部分に、場合によりリンカーを介して融合していてもよい。半減期延長性部分は、ＩｇＧ定常ドメインもしくはその断片（たとえば、Ｆｃ領域）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、脂肪酸またはアルブミン結合性ポリペプチドなどのタンパク質でよい。本明細書で開示するこのようなタンパク質は、多量体を形成してもよい。
【００２２】
一部の実施形態では、半減期延長性部分（たとえば、ＨＳＡ、Ｆｃ、脂肪酸など）は、式Ｉ’またはＩ〜ＩＸのペプチドまたはポリペプチドのＮ末端に、共有結合によって連結または融合する。他の実施形態では、半減期延長性部分（たとえば、ＨＳＡ、Ｆｃ、脂肪酸など）は、本発明の式Ｉ’またはＩ〜ＩＸのペプチドまたはポリペプチドのＣ末端に、共有結合によって連結または融合する。
【００２３】
本発明のバイオコンジュゲートは、ＡＰＪ受容体の活性化を介して、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含む）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含む）、および子癇前症の治療において有用である。
【００２４】
好ましい実施形態では、本発明のバイオコンジュゲートは、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）の治療において有用である。
【００２５】
別の実施形態では、本発明は、そのような治療の必要のある対象において、ＡＰＪ受容体の活性化に反応を示す障害または疾患を治療する方法であって、対象におけるＡＰＪ受容体の活性化に反応を示す障害または疾患が治療されるような有効量の本発明のバイオコンジュゲートを対象に投与する工程を含む方法に関する。
【００２６】
さらに別の実施形態では、本発明は、本発明のバイオコンジュゲートと、１種または複数の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【００２７】
さらに別の実施形態では、本発明は、本発明のバイオコンジュゲートと、１種または複数の治療活性薬剤の医薬的組合せ（pharmaceutical combination）とを含む組合せに関する。
【００２８】
別の実施形態では、本発明は、その必要のある対象においてＡＰＪ受容体を活性化させる方法であって、治療有効量の本発明のバイオコンジュゲートを対象に投与する工程を含む方法に関する。
【００２９】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の本発明の詳細な説明において解明される。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
定義
本出願を説明する目的のために、別段指定しない限り、また相応しい場合は常に、以下の定義が適用され、単数形で使用する用語は、複数形の語も包含し、逆の場合も同様である。
【００３１】
本明細書で使用するとき、「ＡＰＪ受容体の変調に反応を示す障害または疾患」、「ＡＰＪの変調に反応を示す障害および状態」、「ＡＰＪ受容体活性の変調に反応を示す障害および状態」、「ＡＰＪ受容体活性の活性化（またはアゴニズム）に反応を示す障害」および同様の用語は、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含む）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含む）、および子癇前症を包含する。
【００３２】
本明細書で使用するとき、「ＡＰＪ受容体活性の活性化」または「ＡＰＪ受容体の活性化」とは、ＡＰＪ受容体活性の増大を指す。ＡＰＪ受容体活性の活性化は、たとえば、本発明のペプチドおよびポリペプチドの投与による、ＡＰＪ受容体の「アゴニズム」とも呼ぶ。
【００３３】
本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド」および「ペプチド」は、互いに連結した２個以上のアミノ酸を指すのに、互換的に使用する。以下で表１に示す、珍しいまたは自然でないアミノ酸の略語を除き、当業界で受け入れられている３文字または１文字略語を使用して、本発明のペプチドおよびポリペプチドを構成するアミノ酸残基を表す。「Ｄ」が前に付く場合を除き、アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸である。１文字略語が大文字であるとき、略語は、Ｄ−アミノ酸を指す。１文字略語が小文字であるとき、略語は、Ｌ−アミノ酸を指す。集まりまたは連なりまたはアミノ酸略語を使用して、ペプチドを表す。ペプチドは、Ｎ末端を左側にして示し、配列は、Ｎ末端からＣ末端に向かって記す。
【００３４】
本発明のペプチドは、非天然アミノ酸（すなわち、自然界では発生しない化合物）を含んでおり、当業界で知られているような他のアミノ酸類似体をその代わりとして用いてもよい。
【００３５】
ある特定の非天然アミノ酸は、Deiters et al., J Am Chem Soc 125:11782-11783, 2003、Wang and Schultz, Science 301:964-967, 2003、Wang et al., Science 292:498-500, 2001、Zhang et al., Science 303:371-373, 2004、または米国特許第７，０８３，９７０号に記載の技術によって導入することができる。簡潔に述べると、こうした発現系の一部には、部位特異的突然変異誘発が関与して、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームに、アンバーＴＡＧなどのナンセンスコドンが導入される。次いで、このような発現ベクターは、導入されたナンセンスコドンに特異的なｔＲＮＡを利用することのできる宿主に導入され、選択された非天然アミノ酸を積み込んでいる。本発明のポリペプチドに諸部分をコンジュゲートさせる目的で有益な特定の非天然アミノ酸として、アセチレン側鎖およびアジド側鎖を有するものが挙げられる。
【００３６】
本発明のペプチド中の天然または天然でないアミノ酸の１つまたは複数は、コンジュゲーション、機能付与、または他の改変などのために、たとえば、炭水化物基、ホスフェート基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基（ＣｑＨｑ＋１Ｃ（Ｏ）２Ｈ、式中、ｑは、３〜２０である）、リンカーなどの化学的エンティティを付加して改変してもよい。前記改変は、部位特異的に行っても、または部位特異的でなく行ってもよい。好ましい実施形態では、ペプチドの改変により、より安定したペプチド（たとえば、より長いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を示すもの）が得られる。こうした改変として、追加のＤ−アミノ酸の組み込みなどを挙げることができる。いかなる改変も、ペプチドの所望の生物学的活性の実質的妨げとなるべきでなく、このような改変により、ペプチドに対して、望ましい特性、たとえば、生物学的活性の増強を付与することができる。
【００３７】
前記改変は、本発明のタンパク質の生物学的特性を、野生型タンパク質に比べて強化するだけでなく、場合によっては、たとえば、標識およびタンパク質半減期延長剤用に、また前記変異体を固体支持体の表面に固定する目的で、付着点として役立つ。
【００３８】
ある特定の実施形態では、たとえば、半減期を延長し、または前記ポリペプチドおよび／またはペプチドの生物学的特性を別な形で改善する目的で、このような改変、たとえば、部位特異的な改変を使用して、本発明のポリペプチドおよび／またはペプチドに、半減期延長性部分、たとえば、ＰＥＧ基を付着させる。前記技術については、本明細書でさらに記載する。
【００３９】
他の実施形態では、このような改変、たとえば、部位特異的改変を使用して、本発明のポリペプチドの半減期を延長する他のポリマー、小分子、および組換え型タンパク質配列を付着させる。このような一実施形態として、ポリペプチドおよび／またはペプチドに、脂肪酸または特定のアルブミン結合化合物を付着させるものが挙げられる。他の実施形態では、改変は、特定のアミノ酸タイプにおいてなされ、ポリペプチド上の１つまたは複数の部位において付着させることができる。
【００４０】
他の実施形態では、このような改変、たとえば、部位特異的改変を、野生型および／または変異体の多量体、たとえば、二量体（ホモ二量体またはヘテロ二量体）、三量体、または四量体を生成するための付着手段として使用する。こうした多量体タンパク質分子は、アミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにおいて、Ｆｃ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの他のタンパク質に付着または縮合した、ＰＥＧ、糖、および／またはＰＥＧ−コレステロールコンジュゲートなどの基をさらに有する場合もある。
【００４１】
他の実施形態では、このような部位特異的改変を使用して、部位特異的に組み込まれたピロリシンもしくはピロリシン類似体または自然に存在しないアミノ酸（ｐａｒａ−アセチル−Ｐｈｅ、ｐａｒａ−アジド−Ｐｈｅ）の位置により、配向の制御および固体支持体表面へのそのようなタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの付着、またはＰＥＧ、糖、および／もしくはＰＥＧ−コレステロールコンジュゲートなどの基を付着させることが可能になる、タンパク質、ポリペプチド、および／またはペプチドを生成する。
【００４２】
他の実施形態では、このような部位特異的改変を使用して、タンパク質、ポリペプチド、および／またはペプチドを部位特異的に架橋し、それによって、限定はしないが、ヘテロ二量体およびヘテロ三量体を始めとするヘテロオリゴマーを生成する。他の実施形態では、このような部位特異的改変を使用して、タンパク質、ポリペプチド、および／またはペプチドを部位特異的に架橋し、それによって、タンパク質−タンパク質コンジュゲート、タンパク質−ポリペプチドコンジュゲート、タンパク質−ペプチドコンジュゲート、ポリペプチド−ポリペプチドコンジュゲート、ポリペプチド−ペプチドコンジュゲート、またはペプチド−ペプチドコンジュゲートを生成する。他の実施形態では、部位特異的な改変として、１種類を越えるタイプの分子が、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの単一部位において付着するのを可能にする分岐点を挙げることができる。
【００４３】
他の実施形態では、本明細書で列挙する改変は、部位特異的でなく行われ、本発明のタンパク質−タンパク質コンジュゲート、タンパク質−ポリペプチドコンジュゲート、タンパク質−ペプチドコンジュゲート、ポリペプチド−ポリペプチドコンジュゲート、ポリペプチド−ペプチドコンジュゲート、またはペプチド−ペプチドコンジュゲートを得ることができる。
【００４４】
当業者なら、本明細書に記載のポリペプチドのいずれかの配列において、その活性を必然的に低下させることなく、種々のアミノ酸置換、たとえば、保存的アミノ酸置換がなされてもよいことは理解されよう。本明細書で使用するとき、「その置換基として一般に使用されるアミノ酸」は、保存的置換（すなわち、化学的特徴が同等であるアミノ酸での置換）を包含する。保存的置換の目的で、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。極性（親水性）天然アミノ酸としては、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正電荷を有する（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが挙げられる。負電荷を有する（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。アミノ酸置換の例としては、その対応するＤ−アミノ酸の代わりにＬ−アミノ酸を用いるもの、ホモシステインもしくは含チオール側鎖を有する他の非天然アミノ酸の代わりにシステインを用いるもの、ホモリシン、ジアミノ酪酸、ジアミノプロピオン酸、オルニチン、もしくは含アミノ側鎖を有する他の非天然アミノ酸の代わりにリシンを用いるもの、またはノルバリンの代わりにアラニンを用いるものなどが挙げられる。
【００４５】
本明細書で使用する用語「アミノ酸」とは、その構造でそうした立体異性体型が可能である場合、すべて、そのＤおよびＬ立体異性体の、自然に存在するアミノ酸、天然でないアミノ酸、アミノ酸類似体、および、自然に存在するアミノ酸と同様にして機能するアミノ酸模倣物を指す。アミノ酸は、本明細書では、その名称、一般に知られているその３文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨する１文字記号のいずれかで呼ぶ。
【００４６】
用語「自然に存在する」とは、自然界で見出され、人の手で操作されていない材料を指す。同様に、「自然に存在しない」や「自然でない」などは、本明細書で使用するとき、自然界で見出されない、または人の手で構造が改変されもしくは合成されている材料を指す。アミノ酸に関連して使用するとき、用語「自然に存在する」とは、２０種の通常のアミノ酸（すなわち、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、リシン（ＫまたはＬｙｓ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、トレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、およびチロシン（ＹまたはＴｙｒ）を指す。
【００４７】
本明細書で使用する用語「非天然アミノ酸（non-natural amino acid）」および「天然でないアミノ酸（unnatural amino acid）」は、同じであろうと異なっていようと、任意の生物中で、任意の生物からの未改変または改変遺伝子を使用して、生合成によって生成することのできないアミノ酸構造を、互換的に表すものである。これら用語は、自然に存在する（野生型）アペリンタンパク質配列または本発明の配列中に存在しないアミノ酸残基を指す。これらの用語は、限定はしないが、２０種の自然に存在するアミノ酸の１つ、セレノシステイン、ピロリシン（Ｐｙｌ）、またはピロリン−カルボキシ−リシン（Ｐｃｌ、たとえば、ＰＣＴ特許公開ＷＯ２０１０／４８５８２に記載のとおり）でない、改変アミノ酸および／またはアミノ酸類似体を包含する。このような非天然アミノ酸残基は、自然に存在するアミノ酸の置換によって、および／または自然に存在する（野生型）アペリンタンパク質配列もしくは本発明の配列への非天然アミノ酸の挿入によって導入することができる。非天然アミノ酸残基は、アペリン分子に所望の機能性、たとえば、機能性部分（たとえば、ＰＥＧ）を連結する能力が付与されるように組み込むこともできる。アミノ酸に関連して使用するとき、記号「Ｕ」は、本明細書で使用される「非天然アミノ酸」および「天然でないアミノ酸」を意味するものとする。
【００４８】
加えて、このような「天然でないアミノ酸」をタンパク質に組み込むのに、改変ｔＲＮＡおよび改変ｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）が必要であることも理解される。こうした「選択された」ｔＲＮＡ／ＲＳ直交対は、Ｓｃｈｕｌｔｚらが開発した選定方法によって、またはランダムもしくは標的変異によって生み出される。例として、ピロリン−カルボキシ−リシンは、ある生物から宿主細胞に移された遺伝子によって生合成で生成され、また天然のｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンセターゼ遺伝子を使用してタンパク質に組み込まれるので、「天然アミノ酸」であるが、ｐ−アミノフェニルアラニン（Generation of a bacterium with a 21 amino acid genetic code, Mehl RA, Anderson JC, Santoro SW, Wang L, Martin AB, King DS, Horn DM, Schultz PG. J Am Chem Soc. 2003 Jan 29;125(4):935-9を参照されたい）は、生合成で生成されるとはいえ、「選択された」ｔＲＮＡ／ｔＲＮＡシンセターゼ直交対によってタンパク質に組み込まれるので、「天然でないアミノ酸」である。
【００４９】
改変コードアミノ酸としては、限定はしないが、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、Ｏ−ホスホセリン、アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、ｂｅｔａ−アラニン、アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、第三級−ブチルグリシン、２，４−ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロプリオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ホモプロリン、ヒドロキシリシン、ａｌｌｏ−ヒドロキシリシン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、ａｌｌｏ−イソロイシン、Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルペンチルグリシン、Ｎ−メチルバリン、ナフトアラニン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、ペンチルグリシン、ピペコリン酸およびチオプロリンが挙げられる。用語「アミノ酸」は、ある特定の生物における代謝産物であるが、タンパク質への組み込みについては遺伝暗号によってコードされていない、自然に存在するアミノ酸も包含する。このようなアミノ酸として、限定はしないが、オルニチン、Ｄ−オルニチン、およびＤ−アルギニンが挙げられる。
【００５０】
本明細書で使用する用語「アミノ酸類似体」とは、自然に存在するアミノ酸と同じ基礎化学構造、すなわち、単なる例として、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合したα−炭素を有する化合物を指す。アミノ酸類似体には、可逆的もしくは不可逆的に化学的ブロックがなされ、またはそのＣ末端カルボキシ基、そのＮ末端アミノ基、および／もしくはその側鎖官能基が化学的に改変されている、天然および天然でないアミノ酸が含まれる。そのような類似体として、限定はしないが、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、Ｓ−（カルボキシメチル）−システイン、Ｓ−（カルボキシメチル）−システインスルホキシド、Ｓ−（カルボキシメチル）−システインスルホン、アスパラギン酸−（β−メチルエステル）、Ｎ−エチルグリシン、アラニンカルボキサミド、ホモセリン、ノルロイシン、およびメチオニンメチルスルホニウムが挙げられる。
【００５１】
【表１−１】
2016527249.tif 000004
【００５２】
【表１−２】
2016527249.tif 000005
【００５３】
【表１−３】
2016527249.tif 000006
Ｎａｌは、１−ナフトアラニンと２−ナフトアラニンの両方、好ましくは２−ナフトアラニンを指す。４−フェニルプロリンは、ｃｉｓとｔｒａｎｓ両方の４−フェニルプロリン、好ましくはｔｒａｎｓ−４−フェニルプロリンを指す。
【００５４】
本明細書で使用するとき、用語「アミド」とは、Ｃ末端におけるカルボン酸基のアミド誘導体（たとえば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｃ１〜６アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｃ１〜２アルキルフェニル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＮＨＢｎ、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２）を指す。
【００５５】
用語「アミド」は、Ｎ末端におけるアミノ基の誘導体（たとえば、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１〜１６アルキル、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＰｈ（ｎは、１〜６の整数である）、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＣＯ２Ｈ、４−Ｃｌ−Ｐｈ−（ＣＨ２）３Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、Ｃ１１Ｈ２３Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、Ｃ１３Ｈ２７Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、Ｃ１５Ｈ２７Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、Ｐｈ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）−ＮＨ−、またはＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）ＮＨ−（ｍは、１〜１２の整数である）も指す。
【００５６】
本明細書で使用するとき、用語「エステル」とは、Ｃ末端におけるカルボン酸基のエステル誘導体（たとえば、−ＣＯＯＲ）形態を指し、エステルのＲは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１〜６アルキル基、シクロペンチルやシクロヘキシルなどのＣ３〜８シクロアルキル基、フェニルやα−ナフチルなどのＣ６〜１０アリール基、Ｃ６〜１０アリール−Ｃ１〜６アルキル基、たとえば、ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリルなどのフェニル−Ｃ１〜２アルキル基、およびα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１〜２アルキル基などを指す。経口投与用のエステルとして一般に使用されるピバロイルオキシメチルエステルなども挙げることができる。本発明のポリペプチドが、Ｃ末端以外の位置に追加のカルボキシル基またはカルボキシレート基を有するとき、こうした基がアミド化またはエステル化されているポリペプチドも、本発明のポリペプチドの範疇に入る。そうした場合において、エステルは、たとえば、上述のＣ末端エステルと同じ種類のエステルでよい。
【００５７】
用語アルキルとは、１〜２０個の炭素原子を含む完全不飽和の分枝状または非分枝状（または直鎖状もしくは線状）炭化水素部分を指す。アルキルは、１〜７個の炭素原子、より好ましくは１〜４個の炭素原子を含むことが好ましい。
【００５８】
用語アリールとは、環部分に６〜１０個の炭素原子を有する、単環式または二環式の芳香族炭化水素基を指す。アリールの代表例は、フェニルまたはナフチルである。
【００５９】
用語ヘテロアリールは、炭素原子および１〜５個のヘテロ原子から選択される５〜１０の環員を含んでおり、各ヘテロ原子は、Ｏ、ＮまたはＳから独立して選択され、ＳおよびＮは、種々の酸化状態に酸化されていてもよい、単環式または二環式ヘテロアリールを包含する。二環式ヘテロアリール系について、系は、完全に芳香族である（すなわち、すべての環が芳香族である）。
【００６０】
用語シクロアルキルとは、３〜１２個の炭素原子、好ましくは３〜８個、または３〜７個の炭素原子の、飽和または不飽和であるが非芳香族の単環式、二環式、または三環式炭化水素基を指す。二環式および三環式シクロアルキル系については、すべての環が非芳香族である。
【００６１】
用語ヘテロシクリルとは、４−、５−、６−、または７員の単環式であり、Ｏ、ＳおよびＮから選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含んでおり、ＮおよびＳは、種々の酸化状態に場合により酸化されていてもよい、飽和または不飽和非芳香族（部分的不飽和）環を指す。一実施形態では、ヘテロシクリル部分は、５〜７個の環原子を含んでおり、Ｏ、ＳまたはＮから選択されるさらなるヘテロ原子も場合により含んでいる、飽和単環を表す。
【００６２】
用語「ＡＰＪ」（「アペリン受容体」、「アンジオテンシン様１受容体」、「アンジオテンシンＩＩ様１受容体」などとも呼ばれる）とは、３８０残基、７回膜貫通ドメインのＧｉ共役型受容体を指し、その遺伝子は、ヒトの１１番染色体の長腕上に位置する（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００５１５２．１、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００５１６１によってコードされる）。ＡＰＪは、１９９３年に、変性オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ヒトゲノムＤＮＡから初めてクローン化され（O’Dowd et al. Gene, 136:355-60、1993）、１型アンジオテンシンＩＩ受容体と有意に相同的である。しかし、この相同性にもかかわらず、アンジオテンシンＩＩは、ＡＰＪを結合しない。この内因性リガンドは、長年の間オーファンであったが、単離され、アペリンと命名された（Tatemoto et al., Biochem Biophys Res Commun 251, 471-6 (1998)）。
【００６３】
用語「アペリン」は、７７残基のプレタンパク質（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００５９１０９．３、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１７４１３．３によってコードされる）を指し、これがプロセシングを受けて、生物学的活性型のアペリンペプチド、たとえば、アペリン−３６、アペリン−１７、アペリン−１６、アペリン−１３、アペリン−１２になる。「アペリン−３６」と呼ばれる全長成熟ペプチドは、３６アミノ酸を含むが、最も強力なアイソフォームは、「Ｐｙｒ−１−アペリン−１３またはＰｙｒ１−アペリン−１３」と呼ばれる、ピログルタミン酸化型のアペリン１３量体（アペリン−１３）である。種々のアペリン型は、たとえば、米国特許６，４９２，３２４Ｂ１に記載されている。
【００６４】
用語「コンジュゲート」と「バイオコンジュゲート」は、互換的に使用され、ＡＰＪアゴニストポリペプチドまたは式Ｉ’もしくはＩ〜ＩＸのポリペプチドと半減期延長性部分とが、任意選択のリンカーを介して（via na optional linker）共有結合によって付着した結果として生成したエンティティを指すものである。用語「コンジュゲート」または「バイオコンジュゲート」はまた、ＡＰＪアゴニストポリペプチドまたは式Ｉ’もしくはＩ〜ＩＸのポリペプチドと半減期延長性部分とが融合した結果として生成したエンティティも包含するものである。
【００６５】
用語半減期延長性部分は、ペプチドまたはポリペプチド類似体に共有結合によって連結／付着または融合していてよい。半減期延長性部分は、たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー、脂肪酸、コレステロール基、炭水化物、もしくはオリゴ糖、またはサルベージ受容体に結合するいずれかの天然もしくは合成タンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドでよい。他の実施形態では、半減期延長性部分は、アルブミン結合性残基である。本明細書で使用する「アルブミン結合性残基」とは、ヒト血清アルブミンに、共有結合によってでなく結合する残基を意味する。一実施形態では、アルブミン結合性残基は、親油性残基である。別の実施形態では、アルブミン結合性残基は、生理的ｐＨで負電荷を有する。アルブミン結合性残基は、通常、負電荷を有しうるカルボン酸を含む。アルブミン結合性残基の例としては、脂肪酸が挙げられる。他の実施形態では、半減期延長性部分は、血清半減期の長い血漿タンパク質（アルブミンおよび免疫グロブリン）に、場合によりリンカーを介して共有結合によって連結する。たとえば、半減期延長性部分は、ＩｇＧ定常ドメインもしくはその断片（たとえば、Ｆｃ領域）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、アルブミン結合性ポリペプチドもしくは残基、たとえば脂肪酸である。バイオコンジュゲートの半減期延長性部分の部分は、Ｆｃ領域であることが最も好ましい。
【００６６】
用語「半減期の延長」または「血清半減期を延長する」または「半減期を延長すること」とは、改変された生物学的活性分子（たとえば、アペリン１３）の、その非改変型（または裸の形態のペプチド）と比べた、循環半減期の肯定的な変化の意味である。血清半減期は、生物学的活性分子が投与された後の様々な時点で血液サンプルを採取し、各サンプル中のその分子の濃度を求めることにより測定される。血清濃度の変化を経時的に測定することで、改変された分子（たとえば、コンジュゲートした分子）の血清半減期の算出が可能になる。改変された分子（たとえば、コンジュゲートした分子）の血清半減期を、非改変分子（たとえば、アペリン１３）と比較することにより、血清半減期またはｔ１／２の相対的な延長を明らかにすることができる。延長は、少なくとも２倍であることが望ましいが、より短い延長も有用となり得る。
【００６７】
本発明のペプチドまたはポリペプチド：
本発明の種々の実施形態を本明細書に記載する。各実施形態において明記する特色を、明記された他の特色と組み合わせて、さらなる実施形態としてもよいことは、認識されるであろう。
【００６８】
したがって、実施形態１Ａにおいて、本発明は、
ａ．ペプチドまたはポリペプチド式（Ｉ）：
【００６９】
【化２】
2016527249.tif 000007
［式中、
Ｘ１は、ポリペプチドのＮ末端であり、かつ、存在しないか、またはｐＥ、Ｒ、Ｑ、Ａ、Ｋ、５−アミノ−吉草酸、およびｌｓｎから選択されるかのいずれかであり、
Ｘ２は、Ｒ、Ａ、ｒ、Ｎ−Ｍｅ−Ｒ、Ｋ、Ｈ、ｈＦ、ｈＫ、またはＯｒｎであり、
Ｘ３は、Ｐ、Ａ、ａ、ｐ、４−ＰｈＰ、ピペコリン酸、またはシステインであり、ここで、システインの側鎖は、Ｘ７位にあるシステインの側鎖とジスルフィド結合を形成し、
Ｘ４は、Ｒ、Ａ、ｒ、Ｎ−Ｍｅ−Ｒ、またはシステインであり、ここで、システインの側鎖は、Ｘ７位にあるシステインの側鎖とジスルフィド結合を形成し、
Ｘ５は、Ｌ、Ｃｈａ、Ａ、Ｄ−Ｌ、Ｎ−Ｍｅ−Ｌ，、またはＦであり、
Ｘ６およびＸ１２は、独立して、Ｃ、ｃ、ｈＣ、Ｄ−ｈＣ、Ｋ、Ｄ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、またはＥから選択される天然または天然でないアミノ酸であり、ここで、Ｘ６とＸ１２の側鎖は、共有結合によって連結し合っており、
または代わりに、Ｘ６は、Ｋであり、Ｘ１３は、存在せず、かつ、Ｘ１２は、Ｆまたはｆであり、ここで、Ｘ１２のＣ末端は、Ｘ６のアミノ側鎖とアミド結合を形成し、
Ｘ７は、Ｈ、ｈ、Ａ、Ｎ−Ｍｅ−Ａ、ａ、Ａｉｂ、Ｋ、Ｎａｌ、Ｆ、Ｐ、Ｄａｐ、Ｎ、またはシステインであり、ここで、システインの側鎖は、Ｘ３位にあるシステインの側鎖、またはＸ４位にあるシステインの側鎖とジスルフィド結合を形成し、
Ｘ８は、Ｋ、ｋ、Ｆ、ｆ、Ａ、ｈＦ、Ｎ−Ｍｅ−Ｒ、または４−アミノ−ｌｓｎであり、
Ｘ９は、Ｇ、Ｎ−Ｍｅ−Ｇ、Ａ、またはＡｉｂであり、
Ｘ１０は、Ｐ、Ａ、ｐ、４−ＰｈＰ、またはピペコリン酸であり、
Ｘ１１は、Ｍ、Ｄ−Ｎｌｅ、Ｎｌｅ、Ｎ−Ｍｅ−Ｎｌｅ、Ｍ（Ｏ）、Ａ、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｋ、またはＣｈａであり、かつ、
Ｘ１３は、Ｃ末端であり、かつ、存在しないか、またはＦ、ｆ、Ｎ−Ｍｅ−Ｆ、Ｎａｌ、Ｄ−Ｎａｌ、３−Ｂｒ−Ｆ、（Ｓ）−β−３−Ｆ、Ｉ、Ａ、ａ、Ｋ、Ｄａｐから選択され、
ここで、
Ｎｌｅは、Ｌ−ノルロイシンであり、
Ｄ−ｈＣは、Ｄ−ホモシステインであり、
ｈＣは、Ｌ−ホモシステインであり、
ｈＦは、Ｌ−ホモフェニルアラニンであり、
ｈＫは、Ｌ−リシンであり、
Ｎａｌは、Ｌ−ナファタリン（L-naphathaline）であり、
Ｏｒｎは、オルニチンであり、
Ａｉｂは、α−アミノイソ酪酸であり、
Ｄａｂは、（Ｓ）−ジアミノ酪酸であり、
Ｄａｐは、（Ｓ）−２，３−ジアミノプロピオン酸であり、
Ｍ（Ｏ）は、メチオニンスルホンであり、
Ｃｈａは、（Ｓ）−β−シクロヘキシルアラニンであり、
４−アミノ−ｌｓｎは、４−アミノピペリジン−４−カルボン酸であり、
ｌｓｎは、イソニペコチノイルであり、
ｐＥは、Ｌ−ピログルタミン酸であり、
ここで、Ｎ末端およびＣ末端は、１、２、３、または４つのグリシンアミノ酸と一緒に、場合により環を形成する、および］
またはこのポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩、またはこれらと実質的に同等なポリペプチドと、
ｂ．半減期延長性部分と
を含み、前記ペプチドまたはポリペプチドと前記半減期延長性部分とは、場合によりリンカーを介して、共有結合によって連結または融合する、バイオコンジュゲートまたはその多量体を提供する。
【００７０】
実施形態２において、本発明は、
ａ．式ＩＩ：
【００７１】
【化３】
2016527249.tif 000008
［式中、
Ｘ１は、存在しない、ｐＥ、Ｒ、Ｑ、またはＩｓｎであり、
Ｘ５は、ＬまたはＣｈａであり、
Ｘ７は、Ｈ、Ａｉｂ、Ｆ、Ｋであり、
Ｘ８は、Ｋ、Ｆ、または４−アミノ−ｌｓｎであり、
Ｘ９は、ＧまたはＡｉｂであり、
Ｘ１１は、ＮｌｅまたはＣｈａであり、
Ｘ１３は、存在しないか、またはＦ、ｆ、Ｋであり、
Ｘ６およびＸ１２は、独立して、Ｃ、Ｋ、Ｄ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、またはＥから選択される天然または天然でないアミノ酸であり、ここで、Ｘ６とＸ１２の側鎖は、共有結合によって連結し合っており、かつ
ここで、Ｎ末端およびＣ末端は、１、２、３、または４つのグリシンアミノ酸と一緒に、場合により環を形成する］
を有する、実施形態１、２、または３に従うペプチドまたはポリペプチド、またはこのポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩、またはこれらと実質的に同等なポリペプチドと
ｂ．半減期延長性部分と
を含み、前記ペプチドまたはポリペプチドと前記半減期延長性部分とは、場合によりリンカーを介して、共有結合によって連結または融合する、バイオコンジュゲートまたはその多量体に関する。
【００７２】
先行する実施形態のいずれか１つ、より詳細には、先行する実施形態のいずれか１つのさらに別の態様において、本発明は、Ｘ６およびＸ１２が、独立して、Ｃ、Ｋ、Ｄ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、またはＥから選択される天然または天然でないアミノ酸であり、ここで、Ｘ６とＸ１２の側鎖が、共有結合によって連結し合っている、式Ｉ、Ｉ’、またはＩＩのペプチドまたはポリペプチド、またはこのポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩、またはこれらと実質的に同等なポリペプチドと、半減期延長性部分とを含み、前記ペプチドまたはポリペプチドと前記半減期延長性部分とは、場合によりリンカーを介して、共有結合によって連結または融合する、バイオコンジュゲートまたはその多量体に関する。
【００７３】
実施形態３において、本発明は、Ｘ６およびＸ１２が、独立して、Ｋ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｅ、およびＤから選択され、かつ、ここで、Ｘ６とＸ１２の側鎖が、一緒にアミド結合を形成する、先行する実施形態のいずれか１つに従う、式Ｉ、Ｉ’、またはＩＩのペプチドまたはポリペプチド、またはこのペプチドまたはポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩と、半減期延長性部分とを含み、前記ペプチドまたはポリペプチドと半減期延長性部分とは、場合によりリンカーを介して、共有結合によって連結または融合する、バイオコンジュゲートまたはその多量体に関する。この実施形態の別の態様では、Ｘ６は、Ｋ、Ｏｒｎ、またはＤａｂであり、Ｘ１２は、ＥまたはＤであり、Ｘ６とＸ１２の側鎖は、アミド結合を形成する。この実施形態のさらに別の態様では、Ｘ６は、Ｋであり、Ｘ１２は、ＥまたはＤである。
【００７４】
実施形態４において、本発明は、Ｘ６およびＸ１２が、独立して、Ｃ、ｃ、Ｄ−ｈＣ、またはｈＣであり、ここで、Ｘ６とＸ１２の側鎖が、一緒にジスルフィド結合を形成する、先行する実施形態のいずれか１つに従う、式Ｉ、Ｉ’、またはＩＩのペプチドまたはポリペプチド、またはこのペプチドまたはポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩と、半減期延長性部分とを含み、前記ペプチドまたはポリペプチドと半減期延長性部分とは、場合によりリンカーを介して、共有結合によって連結または融合する、バイオコンジュゲートまたはその多量体に関する。この実施形態のさらに別の態様では、Ｘ６およびＸ１２は、Ｃである。
【００７５】
実施形態４Ａにおいて、本発明は、Ｘ６およびＸ１２が、独立して、Ｃ、ｃ、Ｄ−ｈＣ、またはｈＣであり、ここで、Ｘ６とＸ１２の側鎖が、一緒にモノスルフィド（−Ｓ−）結合を形成する、先行する実施形態のいずれか１つに従う、より詳細には、実施形態１、２、および４のいずれか１つの、式Ｉ、Ｉ’、またはＩＩのペプチドまたはポリペプチド、またはこのペプチドまたはポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩と、半減期延長性部分とを含み、前記ペプチドまたはポリペプチドと半減期延長性部分とは、場合によりリンカーを介して、共有結合によって連結または融合する、バイオコンジュゲートまたはその多量体に関する。この実施形態のさらに別の態様では、Ｘ６およびＸ１２は、Ｃである。
【００７６】
実施形態５において、本発明のある特定のバイオコンジュゲートは、式ＩＩＩ：
【００７７】
【化４】
2016527249.tif 000009
を有する、実施形態１、２、４、４Ａ、および４Ｂのいずれか１つに従うペプチドまたはポリペプチド、またはこのポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩を含む。実施形態５Ａにおいて、本発明は、６位と１２位にある２つのシステインがジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）、モノスルフィド結合（−Ｓ−）を形成する、式ＩＩＩのペプチドまたはポリペプチドを含む、バイオコンジュゲートまたはその多量体に関する。実施形態５または５Ａの別の態様において、本発明は、６位と１２位にある２つのシステインがジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を形成する、式ＩＩＩのペプチドまたはポリペプチドを含む、バイオコンジュゲートまたはその多量体を包含する。
【００７８】
実施形態６において、ある特定のバイオコンジュゲートまたはその多量体は、半減期延長性部分とコンジュゲートされる、式ＩＶ：
【００７９】
【化５】
2016527249.tif 000010
を有する、実施形態１〜５のいずれか１つに従うペプチドまたはポリペプチド、またはこのポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩を含む。
【００８０】
実施形態７において、ある特定のバイオコンジュゲートまたはその多量体は、半減期延長性部分とコンジュゲートされる、式Ｖ：
【００８１】
【化６】
2016527249.tif 000011
を有する、実施形態１、２、および４〜６のいずれか１つに従うポリペプチド、またはこのポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩を含む。実施形態７Ａにおいて、本発明は、６位と１２位にある２つのシステインがジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）またはモノスルフィド結合（−Ｓ−）を形成する、式Ｖのペプチドまたはポリペプチドを含む、バイオコンジュゲート、その多量体に関する。実施形態７または７Ａの別の態様において、本発明は、６位と１２位にある２つのシステインがジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を形成する、半減期延長性部分とコンジュゲートされる、式Ｖのペプチドまたはポリペプチドを含む、バイオコンジュゲートを包含する。
【００８２】
実施形態８において、本発明は、Ｘ３がシステインであり、かつ、ここで、システインの側鎖は、Ｘ７位にあるシステインの側鎖とジスルフィド結合を形成する、式ＩまたはＩ’の二環式ペプチドまたはポリペプチドと、半減期延長性部分とを含み、前記ペプチドと前記半減期延長性部分とは、場合によりリンカーを介して、共有結合によって連結または融合する、バイオコンジュゲートに関する。この実施形態には、半減期延長性部分とコンジュゲートされる、式ＶＩのペプチドまたはポリペプチド：
【００８３】
【化７】
2016527249.tif 000012
またはこのポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩を含む、バイオコンジュゲートまたはその多量体が相当する。
【００８４】
実施形態９において、本発明は、Ｘ４がシステインであり、かつ、ここで、システインの側鎖は、Ｘ７位にあるシステインの側鎖とジスルフィド結合を形成する、式ＩまたはＩ’の二環式ペプチドまたはポリペプチドと、半減期延長性部分とを含み、前記ペプチドと前記半減期延長性部分とは、場合によりリンカーを介して、共有結合によって連結または融合する、バイオコンジュゲートに関する。この実施形態には、半減期延長性部分とコンジュゲートされる、式ＶＩＩのペプチドまたはポリペプチド：
【００８５】
【化８】
2016527249.tif 000013
またはこのポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩を含む、バイオコンジュゲートまたはその多量体が相当する。
【００８６】
実施形態１０において、本発明は、Ｎ末端およびＣ末端が、場合により、１、２、３、または４つのグリシンアミノ酸と一緒に環を形成する、実施形態１から７のいずれか１つに従う式Ｉ〜Ｖのいずれか１つのペプチドまたはポリペプチド、またはこのポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩、またはこれらと実質的に同等のポリペプチドと、半減期延長性部分とを含み、前記ペプチドと前記半減期延長性部分とは、場合によりリンカーを介して、共有結合によって連結または融合する、バイオコンジュゲートまたはその多量体に関する。この実施形態には、式ＶＩＩＩを有するペプチドまたはポリペプチド：
【００８７】
【化９】
2016527249.tif 000014
［式中、Ｌは、（Ｇ）ｒであり、Ｇは、グリシンであり、ｒは、１、２、３、または４である］
またはこのポリペプチドの塩が相当する。この実施形態では、半減期延長性部分は、側鎖の官能基（たとえば、Ｋ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、ｈＫ、または４−アミノ−ｌｓｎの側鎖上のアミノ基）に、場合によりリンカーを介して連結する。
【００８８】
実施形態１０の別の態様である実施形態１０Ａにおいて、本発明は、Ｘ１がＱであり、Ｘ１３がＦであり、ｒが２である、半減期延長性部分とコンジュゲートされる式ＶＩＩＩのペプチドまたはポリペプチド、またはそのエステル、アミド、もしくは塩に関する。
【００８９】
実施形態１１において、本発明は、Ｘ６がＫであり、Ｘ１３が存在せず、Ｘ１２がＦまたはｆであり、ここで、Ｘ１２のＣ末端が、Ｘ６のアミノ側鎖とアミド結合を形成する、実施形態１または２に従う、式ＩまたはＩ’によるペプチドまたはポリペプチドと、半減期延長性部分とを含み、前記ペプチドと前記半減期延長性部分とは、場合によりリンカーを介して、共有結合によって連結または融合する、バイオコンジュゲートまたはその多量体に関する。この実施形態には、半減期延長性部分とコンジュゲートされる、式ＩＸのペプチドまたはポリペプチド：
【００９０】
【化１０】
2016527249.tif 000015
またはこのポリペプチドのエステル、アミド、もしくは塩が相当する。この実施形態の特定の態様では、式ＩＸのペプチドは、半減期延長性部分に、場合によりリンカーを介して、そのＮ末端を介して連結することが好ましい。
【００９１】
以下または上で挙げた式Ｉ’のアミノ酸残基のいずれか、または本明細書に記載のその関連式およびすべての実施形態、たとえば、式Ｉ、ＩＩ〜ＩＸは、本発明のペプチドまたはポリペプチドが、機能活性および構造特性（たとえば、半減期の延長、分解からの保護、立体配座拘束）を依然として保持するという前提で、保存的な様式で置換されていてもよい。許容される保存的なアミノ酸置換の原理および例は、本明細書でさらに説明する。
【００９２】
以下の実施形態は、個別に、共同で、またはいずれかの組合せもしくは下位組合せとして使用することができる。
【００９３】
実施形態１２において、本発明は、Ｘ１がｐＥである、式Ｉ’、Ｉ〜ＶＩＩおよびＩＸのいずれか１つ、または上述した他のいずれかのクラスおよびサブクラスのいずれかに従う（すなわち、実施形態１〜９および１１のいずれか１つに従う）ペプチドまたはポリペプチド、またはそのアミド、エステル、もしくは塩を含む、バイオコンジュゲートまたはその多量体に関する。本発明の一態様では、半減期延長性部分は、ペプチドのＣ末端に、場合によりリンカーを介して連結する。本発明の別の態様では、半減期延長性部分は、ペプチドの側鎖官能基、たとえば、Ｋ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、ｈＫ、または４−アミノ−ｌｓｎの側鎖のアミノ酸官能基に、場合によりリンカーを介して連結する。ペプチドを半減期延長性部分に連結するための、特に重要な１つの側鎖アミノ酸は、８位にあるリシンである（Ｘ８がＫである）。
【００９４】
実施形態１２Ａにおいて、本発明は、Ｘ１がＡまたはＱである、式Ｉ’、Ｉ〜ＶＩＩおよびＩＸのいずれか１つ、または上述した他のいずれかのクラスおよびサブクラスのいずれかに従う（すなわち、実施形態１〜９および１１のいずれか１つに従う）ペプチドまたはポリペプチド、またはそのアミド、エステル、もしくは塩を含む、バイオコンジュゲートまたはその多量体に関する。この実施形態の別の態様において、ペプチドは、そのＡまたはＱ  Ｎ末端を介して、半減期延長性部分に融合し、または共有結合によって連結する。
【００９５】
実施形態１３Ａにおいて、本発明は、Ｘ１３がＦである、式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか１つ、または上述した他のいずれかのクラスおよびサブクラスのいずれかに従う（すなわち、実施形態１〜９のいずれか１つに従う）ペプチドまたはポリペプチド、またはそのアミド、エステル、もしくは塩を含む、バイオコンジュゲートまたはその多量体、またはこのポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩に関する。
【００９６】
実施形態１３Ｂにおいて、本発明は、Ｘ１３が存在しない、式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか１つ、または上述した他のいずれかのクラスおよびサブクラスのいずれかに従う（すなわち、実施形態１〜９のいずれか１つに従う）ペプチドまたはポリペプチド、またはそのアミド、エステル、もしくは塩を含む、バイオコンジュゲートまたはその多量体、またはこのポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩に関する。実施形態１３Ｂの一態様である実施形態１３Ｃでは、Ｃ末端は、アミドである。実施形態１３Ｃの別の態様である実施形態１３Ｄにおいて、本発明は、Ｃ末端が、式−Ｃ（Ｏ）Ｒ２のアミドであり、Ｒ２が−ＮＨ２、−ＮＨ−Ｍｅ、−ＮＨ−ＮＨＢｎ、または−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｐｈである、式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか１つ、または上述した他のいずれかのクラスおよびサブクラスのいずれかに従うペプチドまたはポリペプチド、またはそのアミド、エステル、もしくは塩を含む、バイオコンジュゲートまたはその多量体に関する。実施形態１３Ｄの好ましい態様において、本発明は、Ｃ末端が、式−Ｃ（Ｏ）Ｒ２のアミドであり、Ｒ２が−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｐｈである、式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか１つ、または上述した他のいずれかのクラスおよびサブクラスのいずれかに従うペプチドまたはポリペプチド、またはそのアミド、エステル、もしくは塩を含む、バイオコンジュゲートに関する。
【００９７】
実施形態１４において、本発明は、Ｘ５がＬである、式Ｉ〜ＩＸのいずれか１つ、または上述した他のいずれかのクラスおよびサブクラスのいずれかに従う（すなわち、実施形態１〜１２のいずれか１つに従う）ペプチドまたはポリペプチド、またはそのアミド、エステル、もしくは塩と、半減期延長性部分とを含み、前記ぺプチドと半減期延長性部分とは、場合によりリンカーを介して、共有結合によって連結または融合する、バイオコンジュゲートまたはその多量体に関する。
【００９８】
実施形態１５において、本発明は、Ｘ７がＨである、式Ｉ〜Ｖ、ＶＩＩＩおよびＩＸのいずれか１つ、または上述した他のいずれかのクラスおよびサブクラスのいずれかに従う（すなわち、実施形態１〜７および１０〜１４のいずれか１つに従う）ペプチドまたはポリペプチド、またはそのアミド、エステル、もしくは塩と、半減期延長性部分とを含み、前記ぺプチドと半減期延長性部分とは、場合によりリンカーを介して、共有結合によって連結または融合する、バイオコンジュゲートまたはその多量体に関する。
【００９９】
実施形態１６において、本発明は、Ｘ８がＫまたはＦである、この実施形態の別の態様では、Ｘ８がＫである、式Ｉ〜ＩＩＩおよびＶＩ〜ＩＸのいずれか１つ、または上述した他のいずれかのクラスおよびサブクラスのいずれかに従う（すなわち、実施形態１〜１５のいずれか１つに従う）ペプチドまたはポリペプチド、またはそのアミド、エステル、もしくは塩と、半減期延長性部分とを含み、前記ぺプチドと半減期延長性部分とは、場合によりリンカーを介して、共有結合によって連結または融合する、バイオコンジュゲートまたはその多量体に関する。
【０１００】
実施形態１７において、本発明は、Ｘ９がＧである、式Ｉ〜ＩＩＩおよびＶＩ〜ＩＸのいずれか１つ、または上述した他のいずれかのクラスおよびサブクラスのいずれかに従う（すなわち、実施形態１〜１６のいずれか１つに従う）ペプチドおよびポリペプチド、またはそのアミド、エステル、もしくは塩と、半減期延長性部分とを含み、前記ぺプチドと半減期延長性部分とは、場合によりリンカーを介して、共有結合によって連結または融合する、バイオコンジュゲートまたはその多量体に関する。
【０１０１】
実施形態１８において、本発明は、Ｘ１１がＮｌｅである、式Ｉ〜ＩＸのいずれか１つ、または上述した他のいずれかのクラスおよびサブクラスのいずれかに従う（すなわち、実施形態１〜１７のいずれか１つに従う）ペプチドまたはポリペプチド、またはそのアミド、エステル、もしくは塩と、半減期延長性部分とを含み、前記ぺプチドと半減期延長性部分とは、場合によりリンカーを介して、共有結合によって連結または融合する、バイオコンジュゲートまたはその多量体に関する。
【０１０２】
実施形態１８Ａにおいて、本発明は、アミノ酸Ｘ１〜Ｘ１３のうち３つが、Ｐｙｒ−１−アペリン−１３に存在する対応するアミノ酸と異なる、実施形態１、２、または３のペプチドまたはポリペプチドを含む、バイオコンジュゲートまたはその多量体に関する。実施形態１８Ｂにおいて、本発明は、アミノ酸Ｘ１〜Ｘ１３のうち４つが、Ｐｙｒ−１−アペリン−１３に存在する対応するアミノ酸と異なる、実施形態１、２、または３のペプチドまたはポリペプチドを含む、バイオコンジュゲートに関する。
【０１０３】
別の実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、およびＸ１３アミノ酸、リンカー、および半減期延長性部分は、以下の実施例の部における、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、およびＸ１３アミノ酸、リンカー、および半減期延長性部分によって規定されるものである。
【０１０４】
別段指定しない限り、用語「ポリペプチド」とは、式（Ｉ’）およびその下位式（式Ｉ、ＩＩ〜ＩＸ）のポリペプチド、またはそのアミド、エステル、もしくは塩を指す。
【０１０５】
別段指定しない限り、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、「ＡＰＪペプチドアゴニスト」などは、式Ｉおよびその下位式（式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩまたはＩＸ）のペプチドおよびポリペプチド、またはそのアミド、エステル、もしくは塩を指す。本発明のペプチドおよびポリペプチドのバイオコンジュゲートは、限定はしないが、野生型アペリン、アペリン−１３、およびｐｙｒ−１−アペリン−１３を含めた、本明細書に記載の既知のアペリンペプチドおよびポリペプチドと比べて、実質的に同等または改善された活性および／または血漿安定性を示す。
【０１０６】
本発明のバイオコンジュゲートは、式Ｉ’、Ｉ〜ＩＸのいずれか１つに従うペプチドおよびポリペプチド、またはそのアミド、エステル、もしくは塩、ならびに、限定はしないが実験実施例を含めた、本明細書において詳細に列挙するいずれかのペプチドまたはポリペプチドに対する同一性が少なくとも約９５％であるペプチドおよびポリペプチドを含むバイオコンジュゲートも包含する。
【０１０７】
本明細書で使用するとき、語句「相同アミノ酸配列」またはその変形形態は、アミノ酸レベルでの相同性が少なくとも指定されたパーセンテージであることを特徴とする配列を指し、「配列同一性」と互換的に使用する。相同アミノ酸配列には、保存的アミノ酸置換を含んでおり、そのポリペプチドが、同じ結合および／または活性を有する、アミノ酸配列が含まれる。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、比較配列との同一性が、９９％までの少なくとも６０％以上であれば、相同である。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、比較配列と、６０までの１以上のアミノ酸置換、付加、または欠失が共通していれば、相同である。一部の実施形態では、相同アミノ酸配列は、５以下または３以下の保存的アミノ酸置換を有する。
【０１０８】
相同性は、ポリペプチドレベルでもよい。本発明のペプチドもしくはポリペプチドまたはその一部分と、異なるアミノ酸配列との同一性の程度またはパーセンテージは、２つの配列の配列比較における正確な一致の数を、「発明配列」または「外来配列」のいずれか短い方の長さで割ったものとして算出される。結果は、同一性パーセントとして示す。
【０１０９】
詳細な実施例に記載するアミノ酸配列との相同性が約８０〜９９．９％、好ましくは９０〜９９．９％であり、アペリン−１３またはｐｙｒ−１−アペリン−１３を凌ぐ血漿安定性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドは、本発明のポリペプチドの範疇に入る。一実施形態では、血漿安定性の改善は、少なくとも２倍である。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、血漿安定性が少なくとも３０分である。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、血漿安定性が少なくとも６０分、好ましくは少なくとも１００分、より好ましくは少なくとも１５０分である。
【０１１０】
用語「実質的に同等」とは、受容体結合活性やシグナル伝達活性などの性質が同等であることを意味する。したがって、受容体結合活性の強度やポリペプチドの分子量などの度合いに差が存在しても差し支えない。
【０１１１】
本明細書に記載のポリペプチド、または１または複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、もしくは挿入によるその実質的同等物は、上の意味でのアミノ酸配列実質的同等物（複数可）を含んだポリペプチドとして挙げることができる。本明細書に記載のポリペプチド、または１〜５、好ましくは１〜３、より好ましくは１もしくは２アミノ酸の天然もしくは天然でないアミノ酸での置換によるその実質的同等物は、上の意味でのアミノ酸配列実質的同等物（複数可）を含んだポリペプチドとして挙げることができる。別の改変および変更として、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩまたはＩＸのペプチドまたはポリペプチドのＡＰＪアゴニスト活性が維持され、血漿安定性がピログルタミン酸化型のアペリン−１３より改善されている限り、Ｌ−アミノ酸のＤ−アミノ酸での置き換え、または、限定はしないが、リン酸化、カルボキシル化、アルキル化などを含めた他の変形形態を挙げることができる。たとえば、Ｄ−アミノ酸は、ポリペプチドの活性および安定性に関して、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、またはＩＸの環状ペプチドおよびポリペプチドの２位（Ｘ２）、３位（Ｘ３）、５、６、７、および８位（Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、およびＸ８）、１０位（Ｘ１０）、および１３位（Ｘ１３）において、良好な認容性を示す。
【０１１２】
一実施形態では、半減期延長性部分は、式Ｉ’、または式Ｉ〜ＶＩＩおよびＩＸのいずれか１つのペプチドのＮ末端に、場合によりリンカー部分を介して、共有結合によって連結または融合する。
【０１１３】
別の実施形態では、半減期延長性部分は、式Ｉ’、または式Ｉ〜ＩＸのいずれか１つのペプチドのＣ末端に、場合によりリンカー部分を介して、共有結合によって連結または融合する。
【０１１４】
さらに別の実施形態では、半減期延長性部分は、式Ｉ’、または式Ｉ〜ＩＸのいずれか１つのペプチドの側鎖に、共有結合によって連結または融合する、たとえば、半減期（half-life）は、Ｋ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、ｈＫ、または４−アミノ−ｌｓｎの側鎖にあるアミノ基に、場合によりリンカー部分を介して付着する。半減期延長性部分は、式Ｉ’、または式Ｉ〜ＩＸのいずれか１つのペプチドのＮ末端に、場合によりリンカー部分を介して付着することが好ましい。
【０１１５】
半減期延長性部分
本発明の半減期延長性部分は、ペプチドまたはポリペプチド類似体に共有結合によって融合、付着、連結、またはコンジュゲートしていてよい。半減期延長性部分は、たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー、脂肪酸、コレステロール基、炭水化物、もしくはオリゴ糖、またはサルベージ受容体に結合するいずれかの天然もしくは合成タンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドでよい。半減期延長性部分は、血清半減期の長い血漿タンパク質（アルブミンおよび免疫グロブリン）に、場合によりリンカーを介して、共有結合によって連結することが好ましい。たとえば、半減期延長性部分は、ＩｇＧ定常ドメインもしくはその断片（たとえば、Ｆｃ領域）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、脂肪酸、またはアルブミン結合性ポリペプチドである。バイオコンジュゲートの半減期延長性部分の部分は、ヒト血清アルブミン、脂肪酸、またはＦｃ領域であることが好ましい。
【０１１６】
半減期延長性部分は、分子量が、出所の種に応じて、その単量体の形で、およそ６５〜６７キロダルトンの間である、血漿において最も豊富なタンパク質を指す、アルブミンを包含する。用語「アルブミン」は、「血清アルブミン」と互換的に使用され、本発明の改変ペプチドとコンジュゲートを形成するアルブミンの供給源を定義することにはならない。したがって、本明細書で使用する用語「アルブミン」は、血液や漿液などの自然供給源から精製されたアルブミンを指すこともあり、または化学合成もしくは組換え生成されたアルブミンを指すこともある。本発明の改変ペプチドまたはポリペプチドは、アルブミン表面上のシステイン−３４の遊離チオール基に、場合によりリンカーを介して、つながれることが優先される。
【０１１７】
半減期延長性部分は、それぞれが、少なくとも１つのカルボン酸（たとえば、１、２、３または４つのＣＯ２Ｈ）で置換され、ヒドロキシル基で場合によりさらに置換されている、Ｃ６〜７０アルキル、Ｃ６〜７０アルケニル、またはＣ６〜７０アルキニル鎖であると定義することのできる、脂肪酸を包含する。脂肪酸の例は、式Ａ１、Ａ２、およびＡ３：
【０１１８】
【化１１】
2016527249.tif 000016
［Ｒ２は、ＣＯ２Ｈ、Ｈであり、
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、互いに独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＯ２Ｈ、−ＣＨ＝ＣＨ２、または−Ｃ＝ＣＨであり、
Ａｋ１は、分枝状Ｃ６〜Ｃ３０アルキレンであり、
ｑ、ｒ、およびｐは、互いに独立して、６〜３０の間の整数である］またはこれらのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩によって規定される。
【０１１９】
脂肪酸の例は、
【０１２０】
【化１２】
2016527249.tif 000017
［式中、Ａｋ２、Ａｋ３、Ａｋ４、Ａｋ５、およびＡｋ６は、独立して、（Ｃ８−２０）アルキレンであり、Ｒ６およびＲ７は、独立して、（Ｃ８−２０）アルキルである］から選択される。
【０１２１】
より詳細には、脂肪酸は、
【０１２２】
【化１３】
2016527249.tif 000018
から選択される。これらの脂肪酸部分は、同時出願の出願である、代理人整理番号ＰＡＴ０５６２７４−ＵＳ−ＰＳＰに記載されている。
【０１２３】
半減期延長性部分は、単量体の形であろうと多量体の形であろうと、全抗体の消化によって得られる、または他の手段によって生成された、非抗原結合性断片の配列を含む分子または配列を指す、「未変性Ｆｃ」を包含し、ヒンジ領域を含んでいてもよい。未変性Ｆｃのもともとの免疫グロブリン供給源は、ヒト起源であることが好ましく、免疫グロブリンのいずれでもよいが、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２が好ましい。未変性Ｆｃ分子は、共有結合性（すなわち、ジスルフィド結合）および非共有結合性の連係によって、二量体または多量体の形に連結されうる単量体ポリペプチドで構成されている。未変性Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ）またはサブクラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、およびＩｇＧＡ２）に応じて、１〜４の範囲である。未変性Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化によって得られる、ジスルフィド結合型の二量体である（Ellison et al., 1982, Nucleic Acids Res. 10: 4071-9を参照されたい）。本明細書で使用する用語「未変性Ｆｃ」は、単量体、二量体、および多量体形態に対して総称的である。
【０１２４】
半減期延長性部分は、未変性Ｆｃから改変されてはいるが、サルベージ受容体、すなわちＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）に対する結合部位を依然として含む分子または配列を指す、「Ｆｃ変異体」を包含する。国際公開第ＷＯ９７／３４６３１号およびＷＯ９６／３２４７８号は、典型的なＦｃ変異体、ならびにサルベージ受容体との相互作用について記載しており、参照により本明細書に援用される。したがって、用語「Ｆｃ変異体」は、非ヒト化未変性Ｆｃからヒト化された分子または配列を含みうる。さらに、未変性Ｆｃは、本発明のバイオコンジュゲートに必要とならない構造上の特色または生物学的活性をもたらすので除去してよい領域を含む。したがって、用語「Ｆｃ変異体」は、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との不適合、（３）選択された宿主細胞において発現された後のＮ末端不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、または（７）抗体依存的な細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）、に影響を及ぼす、またはこれらに関与する、１つまたは複数の未変性Ｆｃ部位もしくは残基を欠いている、または１つまたは複数のＦｃ部位もしくは残基が改変されている分子または配列を包含する。Ｆｃ変異体については、以下でさらに詳細に述べる。
【０１２５】
半減期延長性部分は、Ｃ末端リシンが欠失している、またはアラニンで置き換えられている、Ｆｃ変異体を包含する。
【０１２６】
半減期延長性部分（half-time extending moiety）とは、上で規定したとおりの未変性ＦｃならびにＦｃ変異体および配列を包含する「Ｆｃドメイン」を指す。Ｆｃ変異体および未変性Ｆｃ分子のように、用語「Ｆｃドメイン」は、全抗体から消化されていようが、他の手段によって生成されていようが、単量体または多量体の形の分子を包含する。本発明の一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、式Ｉ’、または式Ｉ〜ＩＸのいずれかのポリペプチドに、たとえば、Ｆｃドメインとペプチド配列間の共有結合を介して、コンジュゲートさせることができる。このようなＦｃタンパク質は、Ｆｃドメインの連係によって多量体を形成することができ、そうしたＦｃタンパク質およびその多量体は両方とも、本発明の態様である。
【０１２７】
半減期延長性部分は、改変配列を含む、抗体のＦｃ断片を意味するものとされる、「改変Ｆｃ断片」を包含する。Ｆｃ断片は、ＣＨ２、ＣＨ３、およびヒンジ領域の一部を含む、抗体の一部分である。改変Ｆｃ断片は、たとえば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４から導くことができる。ＦｃＬＡＬＡは、ＬＡＬＡ変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）を有する改変Ｆｃ断片であり、低下した効率でＡＤＣＣを誘発し、ヒト補体を弱く結合および活性化する。Hessell et al. 2007 Nature 449:101-104。Ｆｃ断片への追加の改変については、たとえば、米国特許第７，２１７，７９８号に記載されている。
【０１２８】
Ｆｃドメイン、またはＦｃドメインを含む分子に適用される用語「多量体」とは、共有結合性に連係した２つ以上のポリペプチド鎖を有する分子を指す。たとえば、ＩｇＧ分子は、通常は二量体を形成し、したがって、二量体ＩｇＧ分子を含むバイオコンジュゲートは、２本の式Ｉ’のポリペプチド鎖に融合することになる。
【０１２９】
リンカー
リンカー基は、任意選択である。存在するとき、リンカー基は、主としてスペーサーとして働くので、その化学構造は肝要でない。
【０１３０】
リンカーは、２つの反応性基／官能基を含んでおり、その一方がポリペプチドと、他方が半減期延長性部分と反応しうる、化学的部分である。リンカーの２つの反応性基は、連結基を介して連結され、その構造は、リンカーのペプチドおよび半減期延長性部分（half-extending moiety）とのカップリングの妨げとならない限り、肝要でない。
【０１３１】
リンカーは、ペプチド結合によって互いに連結するアミノ酸で構成されたものでよい。本発明の一部の実施形態では、リンカーは、ペプチド結合によって連結された１〜２０個のアミノ酸で構成され、アミノ酸は、２０種の自然に存在するアミノ酸から選択される。種々の実施形態において、１〜２０個のアミノ酸は、アミノ酸のグリシン、セリン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、システイン、およびリシンから選択される。一部の実施形態では、リンカーは、グリシンやアラニンなどの、立体障害のない大多数のアミノ酸で構成される。一部の実施形態では、リンカーは、ポリグリシン、ポリアラニン、グリシンとアラニンの組合せ（ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）など）、またはグリシンとセリンの組合せ（ポリ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）など）である。一部の実施形態では、リンカーは、ヒスチジン、アラニン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン、およびグリシンから選択される、大多数のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ポリヒスチジン部分を含んでいる。リンカーの例は、ＡＨ、ＭＨＡ、またはＡＨＡのモチーフを含むリンカーである。このようなモチーフは、同時係属出願および同時出願の出願である、代理人整理番号ＰＡＴ０５５４１８−ＵＳ−ＰＳＰ２、ＰＡＴ０５６２７４−ＵＳ−ＰＳＰ、およびＰＡＴ０５６２７５−ＵＳ−ＰＳＰにおいて、ペプチドまたはポリペプチドのＮ末端における選択的なコンジュゲーションに有益であると記載されている。
【０１３２】
リンカーの他の例は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ、ＧＳ、またはＧＧのモチーフを含む。
【０１３３】
他の一部の実施形態では、リンカーは、酵素のための認識モチーフを含む。一例は、Ｃ末端において含めることのできるＬＰＸＴＧ／Ａモチーフであり、Ｘは、いずれかのアミノ酸、最も一般にはＥ：グルタミン酸である。（Ｌ：ロイシン、Ｐ：プロリン、Ｔ：トレオニン、Ｇ：グリシン、Ａ：アラニン）。（Carla P. Guimaraes et al.:“Site specific C-terminal and internal loop labeling of proteins using sortase-mediated reactions”, Nature protocols, vol 8, No 9, 2013, 1787-1799）
【０１３４】
他の実施形態では、リンカーは、非天然アミノ酸から選択される１〜２０個のアミノ酸を含む。半減期延長性部分とコンジュゲートさせるには、３〜１５個のアミノ酸残基のリンカーが好ましいが、本発明は、いずれの長さまたは組成のリンカーも企図する。好ましいアミノ酸リンカーは、次式のＯ２Ｏｃ：
【０１３５】
【化１４】
2016527249.tif 000019
またはその繰返し単位である。
【０１３６】
本明細書に記載のリンカーは、例示的なものであり、はるかに長い、また他の残基を含むリンカーが、本発明によって企図される。非ペプチドリンカーも、本発明によって企図される。
【０１３７】
リンカーの連結部分は、１つまたは複数のアルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、およびヘテロ環基、またはこれらの組合せを含んでよい。たとえば、アルキルリンカー、たとえば、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｚ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−（ＣＨ２）ｚ−Ｃ（Ｏ）−または−Ｏ−（ＣＨ２）ｚ−Ｃ（Ｏ）−［式中、ｚは、２〜２０である］を使用することができる。こうしたアルキルリンカーは、限定はしないが、低級アルキル（たとえば、Ｃ１〜Ｃ６）、低級アシル、ハロゲン（たとえば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、またはフェニルを含めた、いずれかの非立体障害性基でさらに置換されていてもよい。
【０１３８】
リンカーは、ポリマーの性質のものでもよい。リンカーは、生物学的に安定または生分解性であるポリマー鎖または単位を含んでよい。連結が繰り返されているポリマーは、結合不安定性に応じて、生理的条件下で様々な程度の安定性を備えうる。ポリマーは、ポリカルボネート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）、ポリエステル（−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）、ポリウレタン（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）、ポリアミド（−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）などの結合を含んでいてよい。こうした結合は、例として示しており、本発明のポリマー鎖またはリンカーにおいて用いることのできる結合のタイプを限定するものではない。適切なポリマーとしては、たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテルマレイン酸無水物、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、デキストラン誘導体、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリン断片、多糖、セルロースおよびセルロース誘導体、デンプンおよびデンプン誘導体、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体のコポリマー、ポリビニルエチルエーテルなど、およびこれらの混合物が挙げられる。ポリマーリンカーは、たとえば、ＰＥＧである。典型的な非ペプチドリンカーは、分子量が１００〜５０００ｋＤ、たとえば、１００〜５００ｋＤである、ポリエチレングリコールリンカー：
【０１３９】
【化１５】
2016527249.tif 000020
である。
【０１４０】
連結部分は、たとえば（Ｏ２Ｏｃ）単位などの１つまたは複数のアミノ酸部分、またはグリシンもしくはセリン、Ｃ１〜４アルキレン−Ｃ（Ｏ）−、Ｃ１〜４アルキレン、−ＮＨ−Ｃ２〜６アルキレン−ＮＨ−もしくは−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−ジアミノ単位、またはこれらの組合せと、２つの反応性基または官能基を連結した連結部分とを含むことが好ましい。
【０１４１】
反応性基または官能基は、マレイミド、チオール、またはピリジン−２−イルジスルファニルであることが好ましい。
【０１４２】
コンジュゲーションのための、ペプチドまたはポリペプチド、およびペプチド−リンカー構築物の調製：
本発明のアペリンペプチドおよびポリペプチド、および／またはペプチド−リンカー構築物は、合成化学的方法もしくは組換え法のいずれかによって、または両方の方法を組み合わせて生成することができる。アペリンペプチドおよび／またはペプチド−リンカー構築物は、全長として生成してもよいし、または全長でない断片として合成し、つないでもよい。本発明のペプチドおよびポリペプチドまたはペプチド−構築物は、ペプチド合成のための、それ自体が知られている手順によって生成することができる。ペプチド合成の方法は、固相合成および液相合成のいずれかのものでよい。すなわち、問題のペプチドおよびポリペプチドは、タンパク質を構成し得る部分的なペプチドまたはアミノ酸をその残部と縮合させ、生成物が保護基を有するとき、保護基を外し、その後、所望のペプチドを製造することができる。縮合および脱保護の既知の方法としては、以下の文献（１）〜（５）に記載の手順が挙げられる。
（１）M. Bodanszky and M. A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York, 1966、
（２）Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York, 1965、
（３）Nobuo Izumiya et al. Fundamentals and Experiments in Peptide Synthesis, Maruzen, 1975、
（４）Haruaki Yajima and Shumpei Sakakibara, Biochemical Experiment Series 1, Protein Chemistry IV, 205, 1977、および
（５）Haruaki Yajima (ed.), Development of Drugs-Continued, 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten
【０１４３】
反応後、ペプチドは、溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などの従来の精製技術を組み合わせて、精製および単離することができる。上述のように単離したペプチドが遊離化合物である場合、既知の方法によってペプチドを適切な塩に変換することができる。逆に、単離された生成物が塩である場合、既知の方法によってペプチドを遊離ペプチドに変換することができる。
【０１４４】
ポリペプチドのアミドは、アミド化に適した、ペプチド合成用の樹脂を使用して得ることができる。樹脂としては、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシ樹脂、塩化２−クロロトリチル樹脂などが挙げられる。このような樹脂を使用して、α−アミノ基および側鎖の官能基が適切に保護されているアミノ酸を、目的のペプチドの配列に従い、それ自体が知られている種々の縮合技術によって樹脂上で縮合させる。一連の反応の終盤に、ペプチドまたは保護されたペプチドを樹脂から外し、必要に応じて保護基を除去し、ジスルフィド結合を形成させて、目的のポリペプチドを得る。
【０１４５】
上述の保護されたアミノ酸の縮合には、ＨＡＴＵ、ＨＣＴＵ、またはたとえばカルボジイミドなどの、ペプチド合成用の様々な活性化試薬を使用することができる。カルボジイミドとしては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、およびＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドが挙げられる。このような試薬を用いた活性化には、ラセミ化防止添加剤、たとえば、ＨＯＢｔまたはＯｘｙｍａ  Ｐｕｒｅを使用することができる。保護されたアミノ酸は、活性化試薬およびラセミ化防止剤と共に、樹脂にそのまま加えてもよいし、または対称酸無水物、ＨＯＢｔエステル、またはＨＯＯＢｔエステルとして予め活性化し、次いで樹脂に加えてもよい。保護されたアミノ酸の活性化または樹脂との縮合のための溶媒は、ペプチド縮合反応に有用であることがわかっている溶媒の中から適正に選択することができる。たとえば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、クロロホルム、トリフルオロエタノール、ジメチルスルホキシド、ＤＭＦ、ピリジン、ジオキサン、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、酢酸エチル、またはこれらの適切な混合物を挙げることができる。
【０１４６】
反応温度は、ペプチド結合形成に有用であることがこれまでにわかっている範囲から選択することができ、普通は、約−２０℃〜５０℃の範囲から選択する。活性化型アミノ酸誘導体は、一般に、１．５〜４倍過剰の割合で使用する。ニンヒドリン反応を利用した試験によって、縮合が不十分であるとわかったなら、十分な縮合を実現するために、保護基を除去せずに、縮合反応を繰り返すことができる。繰り返した縮合によって、それでも十分な程度の縮合がなされない場合、未反応のアミノ基を、無水酢酸またはアセチルイミダゾールでアセチル化することができる。
【０１４７】
出発材料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、Ｚ、Ｂｏｃ、第三級アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、ＣＩ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、またはＦｍｏｃが挙げられる。使用することのできるカルボキシ保護基としては、限定はしないが、上述のＣ１〜６アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、およびＣ６〜１０アリール−Ｃ１〜２アルキル、ならびに２−アダマンチル、４−ニトロベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、フェナシル、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド、第三級ブトキシカルボニルヒドラジド、およびトリチルヒドラジドが挙げられる。
【０１４８】
セリンおよびトレオニンのヒドロキシ基は、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。前記エステル化に適した基としては、炭素から導かれる基、たとえば、低級アルカノイル基、たとえばアセチルなど、アロイル基、たとえばベンゾイルなど、ベンジルオキシカルボニル、およびエトキシカルボニルが挙げられる。前記エーテル化に適した基としては、ベンジル、テトラヒドロピラニル、および第三級ブチルが挙げられる。チロシンのフェノール性ヒドロキシル基の保護基としては、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、および第三級ブチルが挙げられる。
【０１４９】
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリエチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、およびＦｍｏｃが挙げられる。
【０１５０】
出発アミノ酸の活性化型カルボキシル基には、対応する酸無水物、アジ化物、および活性エステル、たとえば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、ｐ−ニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔなどのアルコールとのエステルなどが含まれる。出発アミノ酸の活性化型アミノ基には、対応するホスホルアミドが挙げられる。
【０１５１】
保護基の脱離方法としては、パラジウムブラックやパラジウム炭素などの触媒の存在下で水素ガスを使用する触媒還元、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、またはこうした酸の混合物での酸処理、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンでの塩基処理、液体アンモニア中でのナトリウム金属による還元が挙げられる。上述の酸処理による脱離反応は、一般に、−２０℃〜４０℃の温度で実施され、アニソール、フェノール、チオアニソール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、硫化ジメチル、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのカチオンアクセプターを加えて、有利に行うことができる。ヒスチジンのイミダゾール基の保護に使用した２，４−ジニトロフェニル基は、チオフェノールでの処理によって脱離させることができ、トリプトファンのインドール基の保護に使用したホルミル基は、希水酸化ナトリウム溶液または希アンモニア水溶液でのアルカリ処理、ならびに１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオール存在下での上述の酸処理によって脱離させることができる。
【０１５２】
出発材料の反応に関与すべきでない官能基の保護方法、使用することのできる保護基、保護基の除去方法、および反応に関与すべき官能基を活性化する方法は、すべて、既知の基および方法の中から公正に選択することができる。
【０１５３】
アミド型のポリペプチドを得る別の方法は、Ｃ末端アミノ酸の−カルボキシル基を最初にアミド化するステップと、次いでペプチド鎖を所望の鎖長までＮ側に伸長し、次いで、Ｃ末端ペプチドのα−アミノ基、および目的ポリペプチドの残部を形成することになるアミノ酸またはペプチドのα−カルボキシ基を選択的に脱保護するステップと、α−アミノ基および側鎖官能基が上述の適切な保護基で保護されている２つの断片を、上で挙げたものなどの混合溶媒中で縮合させるステップとを含む。この縮合反応のパラメータは、上述したのと同じものでよい。縮合によって得られた保護ペプチドから、上述の方法によってすべての保護基を除去して、その結果、所望の粗製ペプチドが得られる。この粗製ペプチドを、既知の精製手順によって精製し、主画分を凍結乾燥して、目的のアミド化ポリペプチドを得ることができる。ポリペプチドのエステルを得るには、Ｃ末端アミノ酸のａ−カルボキシル基を所望のアルコールと縮合させて、アミノ酸エステルを得、次いで、アミド生成について上述した手順に従う。
【０１５４】
代わりに、組換え発現法が特に有用である。宿主細胞（ペプチドの配列をコードする核酸を含むように人工的に操作されており、転写および翻訳を行い、場合によりペプチドを細胞成長培地に分泌する細胞）を使用する組換えタンパク質発現は、当業界で日常的に使用される。組換え生成法については、通常、ペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸が、従来の方法によって合成され、発現ベクターに組み込まれることになる。このような方法は、追加のペプチド配列または他のタンパク質もしくはタンパク質断片もしくはドメインに融合したペプチドを含むポリペプチド組成物の製造に特に好ましい。宿主細胞は、場合により、大腸菌（E.Coli）、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＴ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ  Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ｈｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫、もしくは植物細胞、またはこれらのいずれかの派生、不死化、もしくは形質転換細胞から選択される少なくとも１種でよい。
【０１５５】
改変された治療用ペプチドもしくはポリペプチドおよび／またはペプチド−リンカー構築物は、半減期延長性部分上の利用可能な反応性官能基と反応して、共有結合を形成することのできる反応性基を含む。反応性基は、共有結合を形成しうる化学基である。反応性基は、一般に、カルボキシ、ホスホリル、アシル基、エステル、または混合無水物、マレイミド、イミデート、ピリジン−２−イル−ジスルファニルでよく、そのため、アルブミンまたはＦｃドメインのターゲット部位において、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシ基、またはチオール基のような官能基と共有結合を形成しうる。アルブミンとの連結に関して特に重要な反応性基として、マレイミド含有基およびピリジン−２−イル−ジスルファニル含有基が挙げられる。官能基は、アルブミンまたはＦｃドメイン上の基であり、改変ペプチドまたはポリペプチド上の反応性基がこれと反応して、共有結合を形成しうる。官能基としては、エステル反応性エンティティと結合するヒドロキシル基、マレイミド、マレイミド含有基またはピリジン−２−イルジスルファニル、イミデート、およびチオエステル基と反応するチオール基、カルボン酸、ホスホリル基、アシル基に結合するアミノ基が挙げられる。
【０１５６】
スキーム１〜３は、ペプチドが、式Ｉ〜ＩＸのいずれか１つに従うＡＰＪアゴニストペプチドまたはペプチドである、ペプチド−リンカー構築物の合成を記載するものである。
【０１５７】
スキーム１に、式Ｉ〜ＩＸのＡＰＪアゴニストポリペプチドまたはポリペプチドのＮ末端に付着したリンカーを含んでいるマレイミドの合成を記載する。
【０１５８】
【化１６】
2016527249.tif 000021
【０１５９】
ペプチドのＮ末端を、十分に確立されたアミドカップリング化学に従って、１つまたは複数のＯ２Ｏｃアミノ酸単位（ｘは、１〜２０、好ましくは１〜１０、より好ましくは３〜６である）とカップリングさせて、（１Ａ）を生成する。（１Ａ）の末端アミノ官能基を、活性化型の酸（１Ｂ）［式中、Ｒは、線状または分枝状のアルキレン、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはこれらの組合せである］と反応させて、ペプチド−マレイミドを含んでいるリンカー構築物（１Ｃ）を生成する。活性化型の酸（１Ｂ）は、市販品として入手可能であり、またはその対応するカルボン酸から、当業者に知られている技術に従って容易に入手可能である。Ｒは、線状アルキレンであることが好ましく、Ｒは、−ＣＨ２−ＣＨ２−であることがより好ましい。代わりに、側鎖にアミノ官能基を含んでいるペプチド（たとえば、リシンを含んでいるペプチド）については、カップリング反応の前に、アロックなどの直交保護基（orthogonal protecting group）が必要となり、続いて追加の脱保護ステップを経て、（１Ｃ）を得る。
【０１６０】
スキーム２Ａおよび２Ｂに、式ＩからＩＸのＡＰＪアゴニストポリペプチドまたはポリペプチドのＮ末端に付着したリンカーを含んでいるピリジン−２−イル−ジスルファニルの合成を記載する。
【０１６１】
【化１７】
2016527249.tif 000022
【０１６２】
ペプチド−リンカー構築物（１Ａ）を、スキーム１に記載のとおりに調製し、活性化した式（２Ａ）の酸［式中、Ｒ’は、線状または分枝状アルキレンである］とさらに反応させて、ペプチド−ピリジン−２−イル−ジスルファニルを含んでいるリンカー構築物（２Ｂ）を生成する。活性化型の酸（２Ａ）は、市販品として入手可能であり、またはその対応するカルボン酸から、当業者に知られている技術に従って容易に入手可能である。Ｒ’は、−ＣＨ２−ＣＨ２−であることが好ましい。代わりに、ペプチド−リンカー構築物（２Ｃ）を、ＨＯ２Ｃ−Ｒ’−ＳＨ、またはその保護された形態（たとえば、トリチルまたはＡｃｍ基、追加の脱保護ステップが必要となる）を使用して調製し、さらに（２Ｄ）と反応させて、ペプチド−ピリジン−２−イル−ジスルファニルを含んでいるリンカー構築物（２Ｂ）を生成することができる。スキーム１と同様に、カップリング反応の前に、直交官能基（リシンのアミノ基など）の保護が必要となる場合もある。
【０１６３】
ペプチドのＣ末端にも、たとえば−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−または−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−などのジアミノ単位を使用して、同様の官能基を、スキーム１、２Ａ、および２Ｂに記載したのと同様にして付着させる。このようなペプチド−リンカー構築物（conducts）の非限定的な例は、以下である。
【０１６４】
【化１８】
2016527249.tif 000023
【０１６５】
代わりに、マレイミドまたはピリジン−２−イル−ジスルファニル官能基は、ＡＰＪアゴニストポリペプチドまたは式Ｉ〜ＩＸのポリペプチドに、スキーム３Ａ、３Ｂ、および３Ｃに従って付着させることができる。
【０１６６】
【化１９】
2016527249.tif 000024
【０１６７】
ペプチドのＣ末端にあるカルボン酸基を、標準のアミドカップリング条件を使用して、１つまたは複数のＯ２Ｏｃアミノ酸単位と結合させて、（３Ａ）を生成する。末端カルボン酸官能基は、（３Ｂ）または（３Ｃ）［式中、ＲおよびＲ’は、上で規定したとおりである］のアミノ基と反応して、活性化型のペプチド−リンカー構築物（３Ｄ）または（３Ｅ）が生成される。加えて、ペプチドがカルボキシ官能基側鎖（たとえば、ＧｌｕまたはＡｓｐ）を含んでいるとき、直交保護基（たとえば、Ｏ−アリル）および追加の脱保護ステップが必要となる。
【０１６８】
【化２０】
2016527249.tif 000025
【０１６９】
システアミン２−クロロトリチル樹脂を使用して、ペプチド−リンカー構築物３Ｆを得、次いで３Ｇまたは３Ｈと反応させると、ペプチド−リンカー構築物３Ｉまたは３Ｅをそれぞれ生成することができる。
【０１７０】
【化２１】
2016527249.tif 000026
【０１７１】
ペプチド−リンカー構築物（３Ｊ）は、ジアミン樹脂から取得し、（１Ｂ）または（２Ａ）とさらに反応させて、式４Ｋまたは４Ｌのペプチド−リンカー構築物をそれぞれ生成することができる。ペプチドが、その側鎖にアミノ官能基を含んでいるとき（たとえば、リシン）、当業者なら、追加の直交保護および脱保護ステップが必要となることを認識することになる。
【０１７２】
スキーム１〜３Ｃには、より詳細には、アルブミンとのバイオコンジュゲートの調製において使用される、ペプチド−リンカー構築物を記載している。マレイミド反応性基およびピリジン−２−イル−ジスルファニル反応性基は、アルブミンのシステイン３４の−ＳＨ官能基と反応する。
【０１７３】
スキーム３Ｄおよび３Ｅには、より一般にはクリックケミストリーとして知られるアジド−アルキンＨｕｉｓｇｅｎ付加環化において使用される、ペプチド−リンカー構築物の調製を記載している。
【０１７４】
【化２２】
2016527249.tif 000027
式中、ｍは、０または１であり、Ｃ１は、フッ素で場合により置換されている単環式、二環式、または三環式の炭素環またはヘテロ環系であり、Ｌ１は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキレンリンカーであり、アルキレン鎖は、オキソ（＝Ｏ）で場合により置換されており、１個または複数の炭素は、ＯまたはＮＨで置き換えられている。シクロアルキン部分（３Ｄａ）は、市販品供給元から容易に入手可能である。加えて、タンパク質標識のためのクリックケミストリーにおける環式アルキンは、参照により本明細書に援用されるＵＳ２００９／００６８７３８に記載されている。詳細な例は、後述している（実施例２０）。クリックハンドルは、ペプチドのＮ末端において、またはリシン残基側鎖上に導入することができる。
【０１７５】
【化２３】
2016527249.tif 000028
【０１７６】
スキーム３Ｅには、場合によりリンカーＬ（たとえば、グリシンおよびセリンから選択される１つまたは複数のアミノ酸など）を介した、アペリンペプチドのＮ末端におけるアジドリシン残基の導入を記載している。アジド官能基は、クリックケミストリーのためのハンドルとして働く。詳細な例は、同時出願の出願（代理人整理番号ＰＡＴ０５５４１８−ＵＳ−ＰＳＰ２）に記載されている。
【０１７７】
半減期延長性部分−リンカー構築物の調製：
スキーム３Ｆおよび３Ｇに、脂肪酸−リンカー構築物の調製を記載する。
【０１７８】
【化２４】
2016527249.tif 000029
式中、ＦＡは、脂肪酸であり、Ｌ２は、連結部分（たとえば、ＰＥＧ）であり、ＮＨＳは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである。このような脂肪酸−リンカー構築物は、クリックケミストリーを使用するコンジュゲーションに使用される。脂肪酸が、ヒドロキシルや追加のカルボン酸などの官能基を含んでいる事例では、そのような官能基の保護が必要となる場合もある。
【０１７９】
【化２５】
2016527249.tif 000030
式中、ＦＡ、ＮＨＳ、およびＬ２は、上でスキーム３Ｆにおいて規定している。このような脂肪酸構築物は、ペプチド上、好ましくはＮ末端上のアミノ官能基とのコンジュゲーションに使用される。
【０１８０】
スキーム３Ｈに、Ｆｃ−リンカー構築物の調製を記載する。
【０１８１】
【化２６】
2016527249.tif 000031
【０１８２】
Ｆｃ−ＨＡは、ＦｃのＮ末端に配列ＡＨ−を含んでいる構築物である。この構築物は、組換え法を使用して調製される。ＡＨ−配列によって、低いｐＨでＮ末端の選択的な改変が可能になる。このような選択的な改変は、同時出願の出願（代理人整理番号ＰＡＴ０５６２７５−ＵＳ−ＰＳＰおよびＰＡＴ０５６２７４−ＵＳ−ＰＳＰ）で開示されている。したがって、クリックハンドルは、Ｆｃ構築物のＮ末端において導入される。
【０１８３】
さらに別の実施形態では、Ｆｃ構築物をＣ末端において改変して、小さいソルターゼ（Sortase）認識モチーフ（ＬＰＸＴＧ／Ａ）を導入する。
【０１８４】
このようなＦｃ−認識モチーフは、組換え法を使用して調製される。このような構築物の例は、Ｆｃ−［ＧＧＧＧ］ｎ−ＬＰＥＴＧＧＬＥＶＬＦＱＧＰであり、ＧＧＬＥＶＬＦＱＧＰは、ソルターゼ処理の際に切り詰められる。
【０１８５】
Ｆｃ  ＡＰＪペプチド融合タンパク質の調製
生物学的に作製された多量体化分子、たとえば、ヒンジとして知られる含システイン領域の少なくとも一部を含む抗体Ｆｃは、多量体化された（二量体の）形で分泌された、組換え発現させたタンパク質産物から調製することができる。本発明は、Ｆｃ領域のアミノ酸配列が、自然に存在する抗体において見られるＦｃまたは定常領域のアミノ酸配列と比べて変更されている改変Ｆｃ融合タンパク質も包含する。たとえば、Ｆｃ融合タンパク質は、ＦｃＲｎ結合親和性／または血清半減期の所望の特徴を得るために、変異によって操作（すなわち、改変）されていてもよい。改変Ｆｃ融合タンパク質の例は、参照により援用される、米国特許第７，２１７，７９８号で開示されている。
【０１８６】
本発明のＦｃ融合タンパク質は、たとえば、リンカー部分とペプチドまたはポリペプチド部分とを付着させることにより、合成的に変更されてもよい。加えて、組換え抗体由来のＦｃドメインを有する「改変」Ｆｃ融合タンパク質は、原核生物と真核生物両方の発現系を含めたいずれかの発現系において、またはファージディスプレイ法を使用して作製することができる。
【０１８７】
Ｆｃ−［ＧＧＧＧＳ］、Ｆｃ−［ＧＧＧＧＳ］２、Ｆｃ−［ＧＧＧＧＳ］３、Ｆｃ−ＧＧ、Ｆｃ−ＧＳなどのＦｃ−リンカー構築物については、実験の部で後述する。［ＧＧＧＧＳ］、［ＧＧＧＧＳ］２、［ＧＧＧＧＳ］３、ＧＳ、およびＧＧリンカーは、ＦｃドメインのＣ末端またはＦｃドメインのＮ末端のいずれかに付着しており、Ｆｃは、未変性Ｆｃまたはその変異体である。Ｆｃ変異体の例としては、Ｃ末端リシンが欠失している、またはアラニンで置き換えられているＦｃが挙げられる。
【０１８８】
コンジュゲート
本発明の一実施形態では、式Ｉ〜ＩＸのいずれか１つに従うペプチドまたはポリペプチドを、アルブミンのシステイン３４のチオール官能基にコンジュゲートさせる（化学的／共有結合性に付着させる）。
【０１８９】
本発明の別の実施形態では、式Ｉ’、または式Ｉ〜ＩＸのいずれか１つのペプチドまたはポリペプチドを、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の１つまたは複数のドメインに融合させる。抗体は、機能の独立した２つの部分、すなわち、抗原を結合する、「Ｆａｂ」として知られる可変ドメインと、補体活性化や食細胞による攻撃などのエフェクター機能に関与する、「Ｆｃ」として知られる定常ドメインとを含む。Ｆｃは、長い血清半減期を有するのに対し、Ｆａｂは、短命である（Capon et al., 1989, Nature 337:525-31）。治療用ペプチドまたはポリペプチドとつなぎ合わせたとき、Ｆｃドメインは、より長い半減期をもたらしうる（C. Huang, Curr. Opin. Biotechnol., 2009, 20, 692-699）。
【０１９０】
一実施形態では、Ｆｃ−ペプチドは、Ｆｃ配列がペプチドのＮ末端に融合するバイオコンジュゲートを指す。一方、ペプチド−Ｆｃは、Ｆｃ配列がペプチドのＣ末端に融合するバイオコンジュゲートを指す。
【０１９１】
本発明の好ましい実施形態は、本明細書で規定するとおりの式Ｉ’、式Ｉ〜ＩＸのいずれか１つのペプチドまたはポリペプチドを含む、Ｆｃ−ペプチドコンジュゲートである。この実施形態の一態様では、Ｆｃ−ペプチドは、Ｆｃ配列が、式Ｉ’〜ＩＸのいずれか１つのポリペプチドまたはペプチドに融合するバイオコンジュゲートである。
【０１９２】
Ｆｃ領域は、自然に存在するＦｃ領域でもよいし、または治療の質、循環時間、凝集の減少などの、ある特定の品質を向上させるために改変されていてもよい。
【０１９３】
抗体の「Ｆｃ」ドメインと融合させることによる、タンパク質治療薬の有用な改変は、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／０２４７８２号に詳述されている。この文書では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、Ｆｃ領域などの「ビヒクル」への連結が論じられている。
【０１９４】
本発明の好ましい実施形態は、前述の実施形態のいずれか１つに従うペプチドまたはポリペプチドと、半減期延長性部分とを含み、この半減期延長性部分が、本発明のポリペプチドにリンカーを介して融合するＦｃドメインである、バイオコンジュゲートである。本発明の一態様では、リンカーは、次式：−［ＧＧＧＧＳ］ｎ−を有し、ｎは、１、２、もしくは３であり、またはリンカーは、ＧＧもしくはＧＳであり、式ＩおよびＩＩＩ〜ＩＸのいずれか１つのポリペプチドは、自然に存在するアミノ酸を含んでいる。Ｆｃドメインとの融合に適する本発明のポリペプチドの例は、Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ＊−Ｈ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｍ−Ｃ＊−Ｆ、Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ＊−Ｈ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｍ−Ｃ＊、およびＱ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ｈ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｍ−Ｐ−Ｆである。本発明の好ましい実施形態は、改変Ｆｃ断片（たとえば、ＦｃＬＡＬＡ）と、本明細書で規定するとおりの式Ｉ’、式Ｉ〜ＩＸのいずれか１つのペプチドまたはポリペプチドとを含む、上で定義したとおりのＦｃ−ペプチド融合バイオコンジュゲートである。
【０１９５】
さらに別の実施形態では、本発明は、半減期延長性部分が、Ｃ末端リシンが欠失している、またはアラニンで置き換えられている改変Ｆｃドメインである、前述の実施形態のいずれか１つに従うバイオコンジュゲートに関する。この実施形態の代表例は、実施例９、１０、１５、および１６である。このようなＦｃ変異体によって、アペリンペプチド／ポリペプチドとのより安定した融合タンパク質が生まれている。
【０１９６】
Ｆｃ領域に融合したペプチドは、融合していない対応物より、ｉｎ  ｖｉｖｏで実質的に長い半減期を示すことがわかっている。また、Ｆｃ領域への融合によって、ポリペプチドの二量体化／多量体化が可能になる。
【０１９７】
本発明の別の実施形態は、式Ｉ〜ＩＸに従うペプチドまたはポリペプチドと、半減期延長性部分とを含み、この半減期延長性部分は、ポリペプチドに化学的に連結するＦｃドメインである、バイオコンジュゲートである。
【０１９８】
コンジュゲートの調製：
スキーム４および５は、ＡＰＪアゴニストペプチド、または式Ｉ〜ＩＸのいずれか１つに従うペプチドと、Ｆｃドメインやアルブミンなどの半減期延長性部分とをコンジュゲートさせる化学反応を説明するものである。
【０１９９】
スキーム４では、式４Ａのペプチド−リンカーの、ヒト血清アルブミンのシステイン３４とのコンジュゲーションを図解する。
【０２００】
【化２７】
2016527249.tif 000032
式中、Ｌは、ペプチドとマレイミド官能基間の連結部分を表す。詳細な実施形態では、Ｌは、スキーム１、３Ａ、３Ｂ、または３Ｃに開示のとおりの連結部分である。
【０２０１】
スキーム５では、式５Ａのペプチド−リンカー構築物の、アルブミンのシステイン３４とのコンジュゲーションを図解する。
【０２０２】
【化２８】
2016527249.tif 000033
式中、Ｌは、ペプチドと−Ｓ−Ｓ−ピリジン官能基間の連結部分を表す。詳細な実施形態では、Ｌは、スキーム２、３Ａ、３Ｂ、または３Ｃに開示のとおりの連結部分である。
【０２０３】
スキーム１〜５に記載のとおりのコンジュゲートの作製方法およびペプチド−リンカー構築物については、参照により本明細書に援用される、同時出願したＵＳ出願（代理人整理番号：ＰＡＴ０５５３２６−ＵＳ−ＰＳＰ３）においても記載および例示されている。
【０２０４】
他のコンジュゲーション方法は、同時係属および同時出願の出願（代理人整理番号ＰＡＴ０５６２７４−ＵＳ−ＰＳＰ、ＰＡＴ０５６２７５−ＵＳ−ＰＳＰ、およびＰＡＴ０５５４１８−ＵＳ−ＰＳＰ）に記載されている。そうした方法として、ペプチドの選択的なＮ−アシル化が挙げられ、スキーム６に要約される。
【０２０５】
【化２９】
2016527249.tif 000034
式中、ＡＨ−は、Ｎ末端での反応を促進するためにペプチドのＮ末端上に導入されたリンカーであり、Ｈは、ヒスチジンであり、Ａは、アラニンであり、ＦＡは、上述のとおりの脂肪酸、たとえば、式Ａ１〜Ａ３の脂肪酸であり、Ｌは、連結部分（たとえば、ＰＥＧ連結部分）である。低ｐＨ条件を使用すると、脂肪酸リンカー構築物６ａ（スキーム３Ｇに示したとおりに調製したもの）は、ペプチド上に、Ｎ末端において選択的に導入される。このような方法は、同時出願の特許出願（代理人整理番号ＰＡＴ０５６２７５−ＵＳ−ＰＳＰおよびＰＡＴ０５５４１８−ＵＳ−ＰＳＰ０２）に記載されている。
【０２０６】
スキーム７および８は、クリックケミストリーを使用する本発明に従うコンジュゲートの生成を記載するものである。
【０２０７】
【化３０】
2016527249.tif 000035
2016527249.tif 000036
【０２０８】
スキーム９は、ソルターゼ酵素を使用する、ＡＰＪペプチドのＦｃ構築物とのコンジュゲーションを記載するものである。
【０２０９】
【化３１】
2016527249.tif 000037
式中、ｎは、１、２、または３であり、Ｌは、任意選択のリンカー（たとえば、ポリグリシンリンカー）である。
【０２１０】
特に重要なのは、以下の本発明の実施形態である。
【０２１１】
実施形態２１において、本発明は、半減期延長性部分が、ＩｇＧ定常ドメインもしくはその断片、脂肪酸、またはヒト血清アルブミンである、前述の実施形態のいずれか１つに従うバイオコンジュゲートまたはその多量体に関する。
【０２１２】
実施形態２２において、本発明は、半減期延長性部分が、ＬＡＬＡ変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）を有するＦｃＬＡＬＡ改変Ｆｃ断片である、前述の実施形態のいずれか１つに従うバイオコンジュゲートに関する。
【０２１３】
実施形態２３において、本発明は、半減期延長性部分が、式ＩおよびＩＩＩ〜ＩＸのいずれか１つに従うポリペプチドに、リンカーを介して融合するＦｃドメインであり、このリンカーは、次式：
−［ＧＧＧＧＳ］ｎ−
を有し、ｎは、１、２、もしくは３であり、またはこのリンカーは、ＧＳもしくはＧＧであり、式ＩおよびＩＩＩ〜ＩＸのいずれか１つに従うポリペプチドは、自然に存在するアミノ酸を含む、実施形態１、４、〜７、１３〜１７、２１、および２２のいずれか１つに従うバイオコンジュゲートに関する。
【０２１４】
実施形態２３Ａにおいて、本発明は、半減期延長性部分が、Ｃ末端リシンが欠失している、またはアラニンで置き換えられているＦｃ変異体である、実施形態２３に従うバイオコンジュゲートに関する。
【０２１５】
実施形態２４において、本発明は、ポリペプチドが、式Ｉのポリペプチドであって、ここで、
Ｘ１が、ポリペプチドのＮ末端であり、かつ、存在しないか、またはＲ、Ｑ、Ａ、およびＫから選択されるかのいずれかであり、
Ｘ２が、Ｒ、Ａ、Ｋ、Ｈ、Ｆ、またはＥであり、
Ｘ３が、Ｐ、Ａ、Ｋ、またはＤであり、
Ｘ４が、Ｒ、Ａ、Ｆ、またはＥであり、
Ｘ５が、Ｌ、Ａ、Ｋ、Ｄ、またはＦであり、
Ｘ６およびＸ１２が、Ｃであり、かつ、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）結合によって連結し合っており、
Ｘ７が、Ｈ、Ａ、Ｋ、Ｆ、Ｐ、Ｎ、またはＥであり、
Ｘ８が、Ｋ、Ｆ、Ａ、またはＥであり、
Ｘ９が、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｌ、またはＲであり、
Ｘ１０が、ＰまたはＡであり、
Ｘ１１が、Ｍ、Ａ、Ｆ、Ｙ、Ｌ、またはＫであり、かつ、
Ｘ１３が、Ｃ末端であり、かつ、存在しないか、またはＦ、Ｉ、Ａ、Ｋ、Ｈ、およびＥから選択される、
実施形態２３に従うバイオコンジュゲートに関する。
【０２１６】
実施形態２５において、本発明は、ポリペプチドが、Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ＊−Ｈ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｍ−Ｃ＊−Ｆである、実施形態２２、２３、または２４に従うバイオコンジュゲートに関する。
【０２１７】
実施形態２６において、本発明は、半減期延長性部分がヒト血清アルブミンである、前述の実施形態のいずれか１つに従うバイオコンジュゲートまたはその多量体に関する。
【０２１８】
実施形態２７において、本発明は、ヒト血清アルブミンが、式Ｉ〜ＶＩＩおよびＩＸのいずれか１つのポリペプチドのＮ末端に、次式のリンカー：
【０２１９】
【化３２】
2016527249.tif 000038
［式中、ｘは、１〜２０であり、Ｒは、線状もしくは分枝状アルキレン、シクロアルキル、ヘテロアリールのアリール（aryl of heteroaryl）、またはこれらの組合せであり、Ｒ’は、線状または分枝状アルキレン、アリール、もしくはシクロアルキル、またはこれらの組合せである］
を介して化学的に連結する、実施形態２５または２６に従うバイオコンジュゲートに関する。
【０２２０】
実施形態２８において、本発明は、ヒト血清アルブミンが、式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか１つのポリペプチドのＣ末端に、次式のリンカー：
【０２２１】
【化３３】
2016527249.tif 000039
［式中、ｘは、１〜２０であり、Ｒは、線状もしくは分枝状アルキレン、シクロアルキル、ヘテロアリールのアリール、またはこれらの組合せであり、Ｒ’は、線状または分枝状アルキレン、アリール、もしくはシクロアルキル、またはこれらの組合せである］
を介して化学的に連結する、実施形態２６または２７に従うバイオコンジュゲートに関する。
【０２２２】
他の実施形態では、本発明のバイオコンジュゲートは、次式を有する。
【０２２３】
【化３４】
2016527249.tif 000040
式中、ペプチドは、ペプチドのＮ末端であり、Ａは、アラニンであり、Ｈは、ヒスチジンであり、ｍは、０または１であり、ｎは、０、１、２、または３であり、ＬおよびＬ２は、リンカーであり、Ｃ１は、フッ素で場合により置換されている単環式、二環式、または三環式の炭素環またはヘテロ環系であり、Ｌ１は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキレンリンカーであり、ここで、アルキレン鎖は、オキソ（＝Ｏ）で場合により置換されており、かつ、ここで、１個または複数の炭素は、ＯまたはＮＨで置き換えられている。この実施形態の特定の態様では、ＬおよびＬ２は、ＰＥＧリンカーである。
【０２２４】
医薬組成物
本発明のバイオコンジュゲートは、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、吸入、鼻腔内、経口などを始めとする様々な手段のいずれかにおいて投与することができる。本発明の特に好ましい実施形態では、本発明のバイオコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは塩の連続的な静脈内投与を用いる。本発明におけるバイオコンジュゲートは、ボーラスとして、または一定期間にわたる連続注入として投与することができる。移植可能なポンプを使用してもよい。本発明のある特定の実施形態では、断続的または連続的なバイオコンジュゲート投与を、１日〜数日間（たとえば、２〜３日間以上）またはより長期間、たとえば、数週間、数か月、もしくは数年間継続する。一部の実施形態では、断続的または連続的なバイオコンジュゲート投与を少なくとも約３日間施す。別の実施形態では、断続的または連続的なバイオコンジュゲート投与を少なくとも約１週間施す。他の実施形態では、断続的または連続的なバイオコンジュゲート投与を少なくとも約２週間施す。投与中または複数回の投与の合間に、特定の閾値を上回る平均血漿バイオコンジュゲート濃度を維持することが望ましい場合もある。望ましい濃度は、たとえば、対象の生理的状態、疾患重症度などに基づき決定することができる。そのような望ましい値（複数可）は、標準の臨床試験を実施して割り出すことができる。代わりに、ペプチドおよびそのコンジュゲートは、ＦｃＲｎ機序によって、経口的に送達することができるはずである（Nat Rev Immunol. 7(9), 715-25, 2007、Nat Commun. 3;3:610, 2012、Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 304: G262-G270, 2013）。
【０２２５】
別の態様では、本発明は、本発明のバイオコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは塩と、１種または複数の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、経口投与、非経口投与、直腸投与などの特定の投与経路用に製剤化することができる。加えて、本発明の医薬組成物は、固体形態（限定はせず、カプセル剤、錠剤、丸剤、顆粒、凍結乾燥剤、粉末、または坐剤を含む）、または液体形態（限定はせず、溶液、懸濁液、または乳濁液を含む）に仕立てることができる。医薬組成物は、無菌製造、滅菌などの従来の製薬業務にかけることができ、かつ／または、従来の不活性希釈剤、膜形成剤、等張化剤、滑沢剤、または緩衝剤、ならびに保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝液などの佐剤を含有してよい。
【０２２６】
注射用途に適する医薬組成物は、通常、滅菌注射溶液または分散液を即座に調製するための、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液と滅菌粉末を含む。
【０２２７】
静脈内の投与については、適切な担体として、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、組成物は、滅菌とすべきであり、容易な注射適用性（syringability）が存在する程度に流動的にすべきである。好ましい医薬製剤は、製造および貯蔵の条件下で安定しており、細菌や真菌などの微生物による汚染作用に対抗して保存しなければならない。一般に、妥当な担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒でよい。適正な流動度は、たとえば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散液の場合では必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物による作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって実現することができる。多くの場合、等張化剤、たとえば、糖、マンニトールなどのポリアルコール、アミノ酸、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。注射用組成物の吸収の延長は、吸収を遅らせる薬剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンを組成物に含めることにより実現できる。
【０２２８】
ある特定の注射用組成物は、水性の等張性溶液または懸濁液であり、坐剤は、脂肪質の乳濁液または懸濁液から調製することが有利である。前記組成物は、滅菌され、かつ／または保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、溶解促進剤（solution promoter）、浸透圧調節用の塩、および／または緩衝液などの佐剤を含有するものでよい。加えて、前記組成物は、治療上価値のある他の物質も含有してよい。前記組成物は、従来の混合、造粒、またはコーティング法に従って調製され、それぞれ、約０．１〜７５％、または約１〜５０％の活性成分を含有する。
【０２２９】
滅菌注射溶液は、必要に応じて、上で列挙した成分の１つまたは組合せを含有する適切な溶媒に、必要な量の活性化合物を混ぜた後、濾過滅菌することにより調製できる。分散液は、一般に、基礎の分散媒、および上で列挙したものからの他の必要な成分を含有する滅菌ビヒクルに、活性化合物を混ぜることにより調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であるが、この方法では、活性成分の粉末と、所望の任意の追加成分が、予め滅菌濾過されたその溶液から得られる。
【０２３０】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または可食担体を含む。治療的経口投与の目的では、活性化合物は、賦形剤と混ぜ、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤、たとえばゼラチンカプセル剤の形で使用することができる。経口組成物は、含嗽液として使用するために流動性担体を使用して調製することもできる。薬学的に適合する結合剤、および／または佐剤材料を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、次の成分、すなわち、微結晶性セルロース、トラガカントゴム、ゼラチンなどの結合剤、デンプンやラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、コーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムやＳｔｅｒｏｔｅｓなどの滑沢剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、スクロースやサッカリンなどの甘味剤、またはハッカ、サリチル酸メチル、オレンジ香料などの着香剤のいずれか、または同様の性質の化合物を含有してよい。経口送達用の製剤は、消化管内での安定性を向上させ、かつ／または吸収を強化するための薬剤が組み込まれていると有利な場合もある。
【０２３１】
吸入による投与について、発明治療薬は、適切な噴射剤、たとえば、二酸化炭素などの気体を含有する加圧容器もしくは計量分配装置、またはネブライザーから、エアロゾルスプレーの形で送達することが好ましい。治療薬の全身送達のために、肺が広い表面積を備えていることは注目される。
【０２３２】
薬剤は、たとえば、米国公開２００４００９６４０３に記載のものなどのポリマー系微小粒子に、または当業界で知られている他の広範な薬物送達ビヒクルのいずれかと共同して、カプセル封入することができる。本発明の他の実施形態では、たとえば、米国公開２００４００６２７１８に記載されているように、薬剤を荷電脂質と共同して送達する。後者の系は、治療用ポリペプチドであるインスリンの投与に使用されており、ペプチド剤の投与についてこの系の実益を示していることが注目される。
【０２３３】
全身投与は、経粘膜的または経皮的手段によるものでもよい。
【０２３４】
経皮的適用に適する組成物は、有効量の本発明のバイオコンジュゲートを適切な担体と共に含む。経皮送達に適する担体として、ホストの皮膚を介した透過を手助けする薬理学的に許容される被吸収性溶媒が挙げられる。経皮的デバイスは、たとえば、裏部材と、化合物を場合により担体と共に含有するレザバーと、場合により、ホストの皮膚の化合物を、長期間にわたって、制御され、予め決められた速度で送達するための速度制御バリアと、デバイスを皮膚に固定するための手段とを備えた絆創膏の形態である。
【０２３５】
たとえば皮膚および眼への局所適用に適する組成物には、水溶液、懸濁液、軟膏、クリーム、ゲル、または、たとえばエアロゾルなどによる送達のためのスプレー製剤が含まれる。このような局所送達系は、特に、皮膚への適用に相応しくなる。すなわち、こうした局所送達系は、当業界でよく知られている美容製剤を含めた局所的使用に特に適する。このような組成物は、可溶化剤、安定剤、張性増強剤（tonicity enhancing agent）、緩衝剤、および保存剤を含有してもよい。
【０２３６】
本明細書で使用するとき、局所適用は、吸入または鼻腔内適用にも関連することがある。こうした適用は、乾燥粉末吸入器から乾燥粉末（単独、混合物、たとえばラクトースとの乾燥ブレンドとして、またはたとえばリン脂質との混合型要素粒子としてのいずれか）の形で、または加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー、もしくはネブライザーからエアロゾルスプレー体裁の形で、適切な噴射剤を使用しまたは使用せずに、好都合に送達することができる。
【０２３７】
本発明はさらに、活性成分としての本発明の化合物が分解する速度を減速する１種または複数の薬剤を含む医薬組成物および剤形を提供する。本明細書では「安定剤」と呼ぶ、そのような薬剤として、限定はしないが、アスコルビン酸などの酸化防止剤、ｐＨ緩衝液、または塩緩衝液などが挙げられる。
【０２３８】
本明細書で使用するとき、用語「薬学的に許容される塩」とは、本発明のバイオコンジュゲートの生物学的有効性および特性を保持し、通常は生物学的または別な意味で望ましい塩を指す。多くの場合、本発明のバイオコンジュゲートは、アミノ基および／もしくはカルボキシル基またはそれと同様の基が存在するおかげで、酸および／または塩基の塩を形成することができる。
【０２３９】
薬学的に許容される酸付加塩、たとえば、酢酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、臭化物／臭化水素酸塩、炭酸水素塩／炭酸塩、硫酸水素塩／硫酸塩、カンファースルホン酸塩、塩化物／塩酸塩、クロルテオフィリン酸塩（chlortheophyllonate）、クエン酸塩、エタンジスルホン酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、馬尿酸塩、ヨウ化水素酸塩／ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ナフトエ酸塩、ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オクタデカン酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩／リン酸水素塩／リン酸二水素塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、スルホサリチル酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、およびトリフルオロ酢酸塩は、無機酸および有機酸に対して生成することができる。
【０２４０】
塩を導くことのできる無機酸としては、たとえば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが挙げられる。塩を導くことのできる有機酸としては、たとえば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルホサリチル酸などが挙げられる。薬学的に許容される塩基付加塩は、無機塩基および有機塩基に対して生成することができる。
【０２４１】
塩を導くことのできる無機塩基としては、たとえば、アンモニウム塩、および周期表のＩ〜ＸＩＩ列の金属が挙げられる。ある特定の実施形態では、塩は、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、銀、亜鉛、および銅から導かれ、特に適切な塩として、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム、およびマグネシウム塩が挙げられる。
【０２４２】
塩を導くことのできる有機塩基としては、たとえば、第一級、第二級、および第三級アミン、自然に存在する置換アミンを始めとする置換アミン、環状アミン、塩基性イオン交換樹脂などが挙げられる。ある特定の有機アミンとして、イソプロピルアミン、ベンザチン、コリネート（cholinate）、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、リシン、メグルミン、ピペラジン、およびトロメタミンが挙げられる。
【０２４３】
本発明の薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法によって、親化合物、塩基性または酸性部分から合成することができる。一般に、そのような塩は、遊離酸形態のこうした化合物を化学量論量の相応しい塩基（Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇ、またはＫの水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩など）と反応させる、または遊離塩基形態のこうした化合物を化学量論量の相応しい酸と反応させることにより調製できる。こうした反応は通常、水もしくは有機溶媒中または二者の混合物中で実施される。一般に、実用可能な場合、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒質の使用が望ましい。追加の適切な塩の一覧は、たとえば、“Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 20th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985)ならびにStahlおよびWermuthによる“Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use” (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002)で見ることができる。
【０２４４】
本明細書で使用するとき、用語「薬学的に許容される担体」は、当業者に知られているであろうが、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、酸化防止剤、保存剤（たとえば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、着香剤、色素など、およびこれらの組合せを包含する（たとえば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289- 1329を参照されたい）。従来のいかなる担体も、活性成分と相容れない範囲にあるものを除き、治療組成物または医薬組成物におけるその使用を企図する。
【０２４５】
本発明の方法：
アペリンファミリーのペプチドは、Ｇタンパク質共役型ＡＰＪ受容体の、知られている唯一の天然リガンドファミリーである。アペリン遺伝子は、７７アミノ酸のポリペプチドをコードし、このポリペプチドがプロセシングを受けて、生物学的活性型のアペリンペプチド、たとえば、アペリン−３６、アペリン−１７、アペリン−１６、アペリン−１３、アペリン−１２、およびピログルタミン酸改変型のアペリン−１３（Ｐｙｒ１−アペリン−１３）になる。これらアペリンペプチドのいずれでも１種が、ＡＰＪ受容体に結合すると、ＧｉおよびＧｑタンパク質を介してシグナルを伝達する。心筋細胞では、ＧｉまたはＧｑとの共役によって、細胞内ｐＨが変化し、ＰＬＣが活性化され、ＩＰ３が産生され、それにより筋フィラメントのカルシウム感受性が増強され、最終的に心収縮性が増大する。Ｇｉ共役により、活性化型Ｇｓ、アデニリルシクラーゼ、およびｃＡＭＰの産生が抑制され、ｐＡｋｔレベルが上昇して、心臓保護につながる。血管内皮細胞では、Ｇｉを介したＡＰＪ活性化、ｐＡＫＴによって、一酸化窒素（ＮＯ）産生が増大し、これにより平滑筋弛緩が増進される結果、全体として血管が拡張する。
【０２４６】
慢性安定心不全の患者は、心収縮性がさらに低下し、症状が悪化する、不定期の急性代償不全エピソードを伴う。こうした増悪は、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）と呼ばれる。ＡＤＨＦの現行の療法としては、利尿薬、血管拡張薬、およびイノトロープが挙げられ、これらは、心収縮性を直接増大させる。現用の静脈内イノトロープ（ドブタミン、ドーパミン、ミルリノン、レボシメンダン）は、不整脈などの有害事象を伴い、長期死亡率を増大させることでよく知られている。本発明の合成アペリンバイオコンジュゲート類似体は、催不整脈性または死亡の傾向なしに心収縮性を増大させるＡＤＨＦ療法となり、慢性心不全における未対応の膨大な医学的要求に対処するものである。
【０２４７】
実際に、ヒトにおける急性アペリン治療（５分）の結果、冠血管は拡張し、心拍出量は改善される。しかし、天然のアペリンは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのｔ１／２（秒）および作用持続時間（数分）が非常に短い。本発明の強力な合成バイオコンジュゲートＡＰＪアゴニストは、天然のアペリンに比べて半減期が長い。
【０２４８】
心筋細胞におけるＡＰＪ受容体の活性化により、ａ）Ｇｉ／Ｇｑ、ＰＬＣ、およびＣａ２＋を介した心収縮性が向上し、ｂ）Ｇｉ、ｐＡｋｔ活性化を介した心臓保護が講じられるが、（他のイノトロープで見られるような）ｃＡＭＰの漸増は伴わない。加えて、内皮細胞におけるＡＰＪアゴニズムによって、動脈の血管は拡張され、これが、左心室の仕事量を軽減することにより、さらに心不全のためになる。まとめると、本発明のバイオコンジュゲートは、全体としての心機能を向上させ、催不整脈を減少させ、生存利益をもたらし得る。
【０２４９】
より最近では、アペリンの糖尿病およびインスリン抵抗性への潜在的な関与に焦点を当てた前臨床研究がいくつか発表されている。アペリンは、１）筋肉、脂肪、および心臓におけるグルコースの取込みを改善することによって血糖レベルを下げ、２）膵臓β細胞をＥＲストレスおよび後続のアポプトーシスから保護し、３）β細胞におけるインスリン分泌を減少させ、４）脂肪組織において、カテコールアミンによって誘発される脂肪分解を調節することが示されている。ｐＡＫＴ経路の活性化は、こうした過程と関連付けられている。
【０２５０】
式Ｉ〜ＩＸのいずれか１つに従うポリペプチドを含むバイオコンジュゲートまたは薬学的に許容されるその塩は、遊離の形態または薬学的に許容される塩の形態で、たとえば次の部で示すとおりのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ試験において示されるような、価値のある薬理学的特性、たとえば、ＡＰＪ受容体アゴニズム特性を示し、したがって、療法に必要となる。
【０２５１】
本発明のバイオコンジュゲートまたは薬学的に許容されるその塩は、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含む）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含む）、および子癇前症から選択される適応症の治療において有用となり得る。
【０２５２】
したがって、別の実施形態として、本発明は、ＡＰＪ受容体活性と関連する疾患を治療するための、本明細書に記載のとおりのバイオコンジュゲートまたは薬学的に許容されるその塩の使用を提供する。別の実施形態では、療法は、ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患から選択される。別の実施形態では、疾患は、前述の一覧から選択され、急性非代償性心不全が適切である。この実施形態のさらに別のサブセットにおいて、本発明は、ＡＰＪ受容体活性と関連する疾患を治療するための医薬の製造における、本明細書に記載のとおりのバイオコンジュゲートまたは薬学的に許容されるその塩の使用を提供する。
【０２５３】
したがって、別の実施形態として、本発明は、バイオコンジュゲートまたは薬学的に許容されるその塩の、療法における使用を提供する。別の実施形態では、療法は、ＡＰＪ受容体の活性化（アゴニズム）によって治療することのできる疾患から選択される。
【０２５４】
別の実施形態では、本発明は、治療上許容される量の実施形態１〜３１のいずれか１つに従うバイオコンジュゲートまたはその多量体の投与を含む、ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患の治療方法を提供する。別の実施形態では、疾患は、上述の一覧から選択され、急性非代償性心不全が適切である。
【０２５５】
この実施形態のさらに別のサブセットにおいて、本発明は、治療上許容される量の実施形態１〜３１のいずれか１つに従うバイオコンジュゲートまたはその多量体の投与を含む、ＡＰＪ受容体の活性と関連する疾患の治療方法を提供する。
【０２５６】
治療に用いることになる、本発明の医薬組成物または組合せの有効量は、たとえば、治療の状況および目的に左右される。当業者には、したがって、治療に相応しい投薬量レベルが、幾分、送達される分子、バイオコンジュゲートを使用する適応症、投与経路、ならびに患者の大きさ（体重、体表面、または臓器サイズ）および状態（年齢および全般的健康状態）に応じて様々となることは理解されよう。それに応じて、臨床医は、最適な治療効果を得るために、投薬量を設定し、投与経路を変更することができる。典型的な投薬量は、上述の要因に応じて、約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲またはそれ以上となり得る。他の実施形態では、投薬量は、０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで、または１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲となり得る。
【０２５７】
投薬の頻度は、使用する製剤中の二重機能タンパク質の薬動学的パラメータに応じて決まる。通常、臨床医は、所望の効果を実現する投薬量に到達するまで組成物を投与する。したがって、組成物は、単一用量として、一定期間にわたる（同量の所望の分子を含有するかどうかは定かでない）２回以上の用量として、または移植デバイスもしくはカテーテルによる連続的な注入として、投与することができる。適切な投薬量のさらなる微調整は、当業者によって型通りになされ、当業者によって型通りに行われる作業領域の範囲内である。適切な投薬量は、適切な用量反応データを使用して突き止めることができる。
【０２５８】
本発明のバイオコンジュゲートの「治療有効量」という用語は、対象の生物学的または医学的反応、たとえば、症状の改善、状態の緩和、疾患進行の緩慢化もしくは遅延、または疾患の予防などを惹起する、本発明のバイオコンジュゲートの量を指す。非限定的な一実施形態では、用語「治療有効量」は、対象に投与されたとき、（１）（ｉ）ＡＰＪ受容体の活性化によって改善させ、（ｉｉ）ＡＰＪ受容体の活性と関連し、または（ｉｉｉ）ＡＰＪ受容体の異常な活性を特徴とする、状態、障害、もしくは疾患、またはその症状を少なくとも部分的に緩和し、抑制し、予防し、かつ／または改善させ、または（２）ＡＰＪ受容体を活性化するのに有効である、本発明のバイオコンジュゲートの量を指す。
【０２５９】
非限定的な別の実施形態では、用語「治療有効量」とは、細胞、組織、細胞でない生物材料、または培地に投与したとき、ＡＰＪ受容体を少なくとも部分的に活性化するのに有効である、本発明のバイオコンジュゲートの量を指す。当業者の認めるところとなるとおり、特定の薬剤の、有効である絶対量は、所望の生物学的終点、送達する薬剤、ターゲット組織などの要因に応じて様々となり得る。当業者には、「治療有効量」を、単一用量にして投与してもよいし、または複数回の用量の投与によって実現してもよいことは理解される。たとえば、心不全治療のための薬剤の場合、有効量は、患者の臨床的改善、たとえば、運動耐性／能力の向上、血圧の上昇、体液停留の減少、および／または心臓機能性、たとえば、駆出率、運動能力（消耗までの時間）などの定量試験に関する結果の改善をもたらすのに十分な量でよい。
【０２６０】
本明細書で使用するとき、用語「対象」とは、動物を指す。通常、動物は哺乳動物である。対象は、たとえば、霊長類（たとえば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、魚、鳥なども指す。ある特定の実施形態では、対象は霊長類である。さらに他の実施形態では、対象はヒトである。
【０２６１】
本明細書で使用するとき、用語「抑制する」、「抑制」、または「抑制すること」とは、所与の状態、症状、障害、もしくは疾患の軽減もしくは抑止、または生物学的活性もしくは過程のベースライン活性の有意な低下をいう。
【０２６２】
本明細書で使用するとき、任意の疾患または障害を「治療する」、「治療すること」、またはその「治療」という用語は、一実施形態では、疾患または障害を改善させる（すなわち、疾患またはその臨床症状の少なくとも１つの発生を緩慢にし、阻止し、または軽減する）ことをいう。別の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、または「治療」は、患者によって識別されない場合があるものを含めて、少なくとも１つの身体的パラメータを緩和し、または改善させることをいう。さらに別の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、または「治療」は、疾患または障害を、身体的に（たとえば、識別可能な症状の安定化）、生理的に（たとえば、身体的パラメータの安定化）、または両方において、変調することをいう。さらに別の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、または「治療」は、疾患または障害の発症、発生、または進行を防ぎ、または遅らせることをいう。
【０２６３】
本明細書で使用するとき、用語「予防する」、「予防すること」、および「予防」とは、療法（たとえば、治療薬）の投与または療法の組合せ（たとえば、治療薬の組合せ）の投与の結果として生じる、対象における障害の１つまたは複数の症状の再発、発症、または発生の予防をいう。
【０２６４】
本明細書で使用するとき、対象が、生物学的に、医学的に、または生活の質において治療の恩恵を受けることになる場合、その対象は、そのような治療の「必要がある」。
【０２６５】
本明細書で使用するとき、本発明の文脈で（特に特許請求の範囲の文脈で）使用する用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および同様の用語は、本明細書で別段指摘しない限り、また文脈と明らかに矛盾しない限り、単数と複数の両方を包含すると解釈される。
【０２６６】
本明細書に記載の方法はすべて、本明細書で別段指摘しない限り、またはそうでなくとも文脈と明らかに矛盾しない限り、適切などんな順序で実施してもよい。本明細書において提供される、ありとあらゆる例または例示的な言い回し（たとえば、「など」）の使用は、単に本発明をより明解にするためのものであり、別途特許請求する本発明の範囲を限定するものでない。
【０２６７】
本発明によるバイオコンジュゲートの活性は、以下に記載する次のｉｎ  ｖｉｔｒｏ法によって評価することができる。
【０２６８】
ｈＡＰＪカルシウムフラックスアッセイ：
３８４ウェルフォーマットにおいて、２５ｕｌ成長培地に、Ｃｈｅｍ−５  ＡＰＪ安定細胞（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃ＨＴＳ０６８Ｃ）を１０，０００細胞／ウェルで播き、次いで、３７℃の組織培養インキュベーターにおいて２４時間成長させた。アッセイの１時間前に、２．５ｍＭのプロベネシドを含有する２５ｕｌ／ウェルのＦＬＩＰＲ  Ｃａｌｃｉｕｍ  ４色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｒ８１４２）を加え、３７℃の組織培養インキュベーターにおいて細胞を１時間インキュベートした。バイオコンジュゲートをＨＢＳＳ、ＨＥＰＥＳ、および０．１％ＢＳＡ緩衝液に可溶化し、三通りに５０ｕＭから５ｐＭまで１０倍ずつ連続希釈した。ＦＬＩＰＲ  Ｔｅｔｒａを使用して、色素を有する細胞にバイオコンジュゲートを加えた（１：５、１０ｕＭ〜１ｐＭの範囲の最終バイオコンジュゲート濃度にする）。細胞の内側のＦＬＩＰＲ色素は、カルシウムに結合後に蛍光を発光し、細胞の外側からの蛍光は遮蔽された。ＦＬＩＰＲ  Ｔｅｔｒａにおいて４７０〜４９５の励起波長および５１５〜５７５の発光波長を使用して、蛍光を測定した。読取りは、バイオコンジュゲートを加える１０秒前に開始して、合計３分間行った。最大−最小値を算出し、各バイオコンジュゲート濃度に対してプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ  ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、バイオコンジュゲートによるカルシウムフラックス刺激について、曲線変曲点におけるＥＣ５０値を算出した。
【０２６９】
血漿安定性アッセイ：
材料：
作業溶液：１ｍｇ／ｍＬの試験物をＭｉｌｌｉ−Ｑ水中に調製する。
抽出溶液：０．１％のギ酸および４００ｎｇ／ｍＬのグリブリドを含有するメタノール：アセトニトリル：水（１：１：１）
血漿：Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ  ＬＬＣ（ニューヨーク州Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ）から購入した雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット血漿（ヘパリンナトリウム添加）
全血：Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ  ＬＬＣ（ニューヨーク州Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ）から購入した雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ全血（ヘパリンナトリウム添加）
肺ホモジネート：Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ  ＬＬＣ（ニューヨーク州Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ）から雄のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの肺を購入した。肺は、５倍体積の１倍ＰＢＳを加えた後、ポリトロンホモジナイザーを使用してホモジナイズした。ホモジネートを４℃にて９０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を３０００ｒｐｍで３０分間再び遠心分離して、澄んだ上清を作った。タンパク質濃度は、市販のキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して求めた。
【０２７０】
サンプル調製手順：（ペプチド）
試験物は、次の生物学的材料、すなわち、ヘパリン処置ラット血漿、ヘパリン処置ラット全血、または肺ホモジネートのうちの１つにおいて調製した。血漿および全血サンプルは、９９５ｕＬのラット血漿または全血に１ｍｇ／ｍＬの作業溶液５ｕＬを加えることにより、５０００ｎｇ／ｍＬで調製した。肺ホモジネートサンプルは、肺ホモジネートをリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に希釈した後、５ｕＬの作業溶液を加えて、９９５ｕＬの希釈された肺ホモジネートとすることにより調製した。サンプルは、水浴インキュベーターにおいて、穏やかに振盪（６５〜７５ｒｐｍ）しながら３７℃でインキュベートした。０分、５分、１５分、３０分、６０分、１２０分、および２４０分の時点で、インキュベートサンプルの２５ｕＬのアリコートを９６ウェルプレートに移し、１５０ｕＬの抽出溶液を使用して、直ちにタンパク質を沈殿させた。インキュベート実験が完了した後、サンプルプレートを４℃にて４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。その後、ピペット操作装置（Ｔｅｃａｎ  Ｔｅｍｏ）を使用して、上清を別のプレートに移し、すべてのサンプルに５０ｕＬの水を加えた。プレートは、ＬＣ−ＭＳ分析の前にボルテックスした。
【０２７１】
サンプル調製手順（コンジュゲート）
１ｍｇ／ｍＬの作業溶液５ｕＬをラット血漿４９５ｕＬに加えることにより、試験物を５０，０００ｎｇ／ｍＬで調製した。サンプルは、水浴インキュベーターにおいて、穏やかに振盪（６５〜７５ｒｐｍ）しながら３７℃でインキュベートした。０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、および２４時間の時点で、インキュベートサンプルの５０ｕＬのアリコートを９６ウェルプレートに移し、４０ｍＭのＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）１００ｕＬを各サンプルに加えた。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。反応が完了した後、３００ｕＬのアセトニトリルを使用して、タンパク質を沈殿させた。サンプルプレートを４℃にて４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。その後、ピペット操作装置（Ｔｅｃａｎ  Ｔｅｍｏ）を使用して、１２５ｕＬの上清を別のプレートに移し、すべてのサンプルに５０ｕＬの水を加えた。プレートは、ＬＣ−ＭＳ分析の前にボルテックスした。
【０２７２】
ＬＣ−ＭＳ安定性分析のサンプル
ＨＰＬＣ：オートサンプラーを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２９０  ＨＰＬＣ
カラム：ＭＡＣ−ＭＯＤ  ＡＣＥ  Ｃ１８、３μｍ、３０ｍｍ×内径２．１ｍｍ
移動相Ａ：０．１％のギ酸アセトニトリル溶液
移動相Ｂ：０．１％のギ酸水溶液
【０２７３】
勾配プログラム：
【０２７４】
【表２】
2016527249.tif 000041
【０２７５】
質量分析計：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｑ−ＴＯＦ６５３０
データ取得モード：１００〜１０００ｍ／ｚの質量範囲での完全走査
データ取得および分析ソフトウェア：ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ
【０２７６】
データ分析：
安定性アッセイ：安定性半減期（ｔ１／２）の値は、各時点におけるピーク面積を、初期（ｔ＝０）ピーク面積を基準とした残存パーセントに変換することにより求めた。
残存パーセント＝１００×（サンプルピーク面積）÷（ｔ＝０ピーク面積）
【０２７７】
残存パーセント値の自然対数を算出し、サンプル時間に対してプロットした（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ）。この直線の傾きｋを、線形回帰によって求めた（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ）。
【０２７８】
次いで、安定性半減期を、式ｔ１／２＝０．６９３÷ｋによって算出した。
【０２７９】
【表３】
2016527249.tif 000042
【０２８０】
【表４】
2016527249.tif 000043
【０２８１】
本発明のバイオコンジュゲートは、アペリン−１３またはｐｙｒ−１−アペリン−１３と同様のＡＰＪ受容体効力を備え得る。一実施形態では、本発明のバイオコンジュゲートは、ＥＣ５０が１００ｎＭ未満である。別の実施形態では、本発明のバイオコンジュゲートは、ＥＣ５０が５０ｎＭ未満、好ましくは２５ｎＭ未満、より好ましくは１５ｎＭ未満である。さらに別の実施形態では、本発明のバイオコンジュゲートは、ＥＣ５０が１０ｎＭ未満である。
【０２８２】
本発明のバイオコンジュゲートは、アペリン−１３またはｐｙｒ−１−アペリン−１３に優る血漿安定性を有することもある。一実施形態では、血漿安定性の改善は、少なくとも２倍である。一実施形態では、本発明のバイオコンジュゲートは、血漿安定性が少なくとも３０分である。別の実施形態では、本発明のバイオコンジュゲートは、血漿安定性が、少なくとも１０分、少なくとも４０分、より好ましくは少なくとも６０分である。
【０２８３】
本発明のバイオコンジュゲートは、他の１種または複数の治療薬と同時に投与してもよいし、またはその前もしくは後に投与してもよい。本発明のバイオコンジュゲートは、同じもしくは異なる投与経路で別々に投与してもよいし、または他の薬剤と同じ医薬組成物にして一緒に投与してもよい。
【０２８４】
一実施形態では、本発明は、実施形態１〜３１のいずれか１つに従うバイオコンジュゲートと、少なくとも１種の他の治療薬とを含む、療法において同時、別個、または順次使用するための一体型調製物としての製品を提供する。一実施形態では、療法は、ＡＰＪ受容体の活性化に反応を示す疾患または状態の治療である。
【０２８５】
一体型調製物として提供される製品としては、実施形態１〜３１のいずれか１つのバイオコンジュゲートと、他の治療薬（複数可）とを同じ医薬組成物中に一緒に、または実施形態１〜３１のいずれか１つのバイオコンジュゲートと、他の治療薬（複数可）とを別個の形態で、たとえば、キットの形で含む組成物が挙げられる。
【０２８６】
一実施形態では、本発明は、実施形態１〜３１のいずれか１つのバイオコンジュゲートと他の治療薬（複数可）とを含む、医薬組成物を提供する。場合により、医薬組成物は、上述のとおりの薬学的に許容される賦形剤を含んでもよい。
【０２８７】
一実施形態では、本発明は、２種以上の別個の医薬組成物を含み、その少なくとも１種が、実施形態１〜３１のいずれか１つに従うバイオコンジュゲートを含有する、キットを提供する。一実施形態では、キットは、容器、隔てられたボトル、分包ホイルなどの、前記組成物を別個に保持する手段を含む。このようなキットの一例は、錠剤、カプセル剤などの包装に一般に使用されるようなブリスターパックである。
【０２８８】
本発明のキットは、たとえば経口と非経口の、異なる剤形を投与する、別個の組成物を異なる投薬間隔で投与する、または別個の組成物を互いに合わせて漸増するのに使用することもできる。服薬遵守を支援するために、本発明のキットは通常、投与の説明書を含む。
【０２８９】
本発明の併用療法では、本発明のバイオコンジュゲートと他の治療薬は、同じまたは異なる製造業者によって製造および／または製剤化されたものでよい。さらに、本発明のバイオコンジュゲートと他の治療薬は、（ｉ）（たとえば、本発明のバイオコンジュゲートと他の治療薬を含むキットの場合において）組合せ製品が医師に渡る前に、（ｉｉ）投与のすぐ前に医師自身によって（または医師の指導のもとで）、（ｉｉｉ）たとえば、本発明のバイオコンジュゲートと他の治療薬が順次投与される際、患者自身で、併用療法に一体化されるものでよい。
【０２９０】
したがって、本発明は、医薬が別の治療薬との投与用に調製される、ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患または状態を治療するための、実施形態１〜３１のいずれか１つに従うバイオコンジュゲートの使用を提供する。本発明はまた、医薬が、実施形態１〜３１のいずれか１つに従うバイオコンジュゲートと投与される、アペリン受容体のアゴニズムに反応を示す疾患または状態を治療するための別の治療薬の使用も提供する。
【０２９１】
本発明はまた、バイオコンジュゲートが、別の治療薬との投与用に調製される、ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患または状態の治療方法において使用するための、実施形態１〜３１のいずれか１つに従うバイオコンジュゲートを提供する。本発明はまた、他の治療薬が、実施形態１〜３１のいずれか１つに従うバイオコンジュゲートとの投与用に調製される、ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患または状態の治療方法において使用するための、別の治療薬を提供する。
【０２９２】
本発明はまた、患者が、別の治療薬で（たとえば、２４時間以内に）予め治療を受けている、ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患または状態を治療するための、実施形態１〜３１のいずれか１つに従うバイオコンジュゲートの使用を提供する。本発明はまた、患者が、実施形態１〜３１のいずれか１つに従うバイオコンジュゲートで（たとえば、２４時間以内に）予め治療を受けている、ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患または状態を治療するための、別の治療薬の使用を提供する。
【０２９３】
一実施形態では、他の治療薬は、イノトロープ、βアドレナリン性受容体遮断薬、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、カルシウムチャネル遮断薬（ＣＣＢ）、エンドセリン拮抗薬、レニン阻害薬、利尿薬、ＡｐｏＡ−Ｉ模倣薬、抗糖尿病薬、抗肥満薬（obesity-reducing agent）、アルドステロン受容体遮断薬、エンドセリン受容体遮断薬、アルドステロンシンターゼ阻害薬（ＡＳＩ）、ＣＥＴＰ阻害薬、抗凝血薬、リラキシン、ＢＮＰ（ネシリチド）、およびＮＥＰ阻害薬から選択される。
【０２９４】
第２の薬剤または治療と「組み合わせて」という用語は、本発明のバイオコンジュゲート（たとえば、実施形態１〜３１のいずれか１つに従うバイオコンジュゲートまたは本明細書に別な形で記載するバイオコンジュゲート）を第２の薬剤または治療と同時投与すること、最初に本発明の化合物を投与した後、第２の薬剤または治療を投与すること、および最初に第２の薬剤または治療を投与した後、本発明のバイオコンジュゲートを投与することを包含する。
【０２９５】
用語「第２の薬剤」は、本明細書に記載の疾患または障害、たとえば、ＡＰＪ受容体の活性化に反応を示す障害または疾患、たとえば、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含む）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含む）、および子癇前症の症状を治療、予防、または軽減することが当業界で知られている任意の薬剤を包含する。
【０２９６】
第２の薬剤の例としては、イノトロープ、βアドレナリン性受容体遮断薬、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、カルシウムチャネル遮断薬（ＣＣＢ）、エンドセリン拮抗薬、レニン阻害薬、利尿薬、ＡｐｏＡ−Ｉ模倣薬、抗糖尿病薬、抗肥満薬、アルドステロン受容体遮断薬、エンドセリン受容体遮断薬、アルドステロンシンターゼ阻害薬（ＡＳＩ）、ＣＥＴＰ阻害薬、抗凝血薬、リラキシン、ＢＮＰ（ネシリチド）、および／またはＮＥＰ阻害薬が挙げられる。
【０２９７】
本明細書で使用するイノトロープとしては、たとえば、ドブタミン、イソプロテレノール、ミルリノン、アミリノン（amirinone）、レボシメンダン、エピネフリン、ノルエピネフリン、イソプロテレノール、およびジゴキシンが挙げられる。
【０２９８】
本明細書で使用するβアドレナリン性受容体遮断薬としては、たとえば、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、カルテオロール、メトプロロール、ナドロール、プロプラノロール、ソタロール、およびチモロールが挙げられる。
【０２９９】
本明細書で使用する抗凝血薬としては、ダルテパリン、ダナパロイド、エノキサパリン、ヘパリン、チンザパリン、ワルファリンが挙げられる。
【０３００】
用語「ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬」（β−ヒドロキシ−β−メチルグルタリル−補酵素Ａ還元酵素阻害薬とも呼ばれる）は、血中コレステロールを始めとする脂質レベルを下げるのに使用することのできる活性薬剤を包含する。例としては、アトルバスタチン、セリバスタチン、コンパクチン、ダルバスタチン、ジヒドロコンパクチン、フルインドスタチン（fluindostatin）、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、メバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、リバスタチン（rivastatin）、シンバスタチン、およびベロスタチン（velostatin）、またはこれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。
【０３０１】
用語「ＡＣＥ阻害薬」（アンジオテンシン変換酵素阻害薬とも呼ばれる）は、アンジオテンシンＩをアンジオテンシンＩＩにする酵素的分解を妨げる分子を包含する。このような化合物は、血圧の調節およびうっ血性心不全の治療に使用することができる。例としては、アラセプリル、ベナゼプリル、ベナゼプリラート、カプトプリル、セロナプリル（ceronapril）、シラザプリル、デラプリル、エナラプリル、エナプリラート（enaprilat）、ホシノプリル、イミダプリル、リシノプリル、モエキシプリル、モベルトプリル（moveltopril）、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、スピラプリル、テモカプリル、およびトランドラプリル、またはこれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。
【０３０２】
用語「エンドセリン拮抗薬」は、ボセンタン（ＥＰ５２６７０８Ａを参照のこと）、テゾセンタン（ＷＯ９６／１９４５９を参照のこと）、またはこれらの薬学的に許容される塩を包含する。
【０３０３】
用語「レニン阻害薬」は、ジテキレン（ditekiren）（化学名：［１Ｓ−［１Ｒ＊，２Ｒ＊，４Ｒ＊（１Ｒ＊，２Ｒ＊）］］−１−［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］−Ｌ−プロリル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−［２−ヒドロキシ−５−メチル−１−（２−メチルプロピル）−４−［［［２−メチル−１−［［（２−ピリジニルメチル）アミノ］カルボニル］ブチル］アミノ］カルボニル］ヘキシル］−Ｎ−α−メチル−Ｌ−ヒスチジンアミド）；テルラキレン（化学名：［Ｒ−（Ｒ＊，Ｓ＊）］−Ｎ−（４−モルホリニルカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−［１−（シクロヘキシルメチル）−２−ヒドロキシ−３−（１−メチルエトキシ）−３−オキソプロピル］−Ｓ−メチル−Ｌ−システイネアミド）；アリスキレン（化学名：（２Ｓ，４Ｓ，５Ｓ，７Ｓ）−５−アミノ−Ｎ−（２−カルバモイル−２，２−ジメチルエチル）−４−ヒドロキシ−７−｛［４−メトキシ−３−（３−メトキシプロポキシ）フェニル］メチル｝−８−メチル−２−（プロパン−２−イル）ノナンアミド）およびザンキレン（化学名：［１Ｓ−［１Ｒ＊［Ｒ＊（Ｒ＊）］，２Ｓ＊，３Ｒ＊］］−Ｎ−［１−（シクロヘキシルメチル）−２，３−ジヒドロキシ−５−メチルヘキシル］−α−［［２−［［（４−メチル−１−ピペラジニル）スルホニル］メチル］−１−オキソ−３−フェニルプロピル］−アミノ］−４−チアゾールプロパンアミド）、もしくはこれらの塩酸塩、またはＳｐｅｅｄｅｌが開発したＳＰＰ６３０、ＳＰＰ６３５、およびＳＰＰ８００、または式（Ａ）および（Ｂ）：
【０３０４】
【化３５】
2016527249.tif 000044
のＲＯ６６−１１３２およびＲＯ６６−１１６８、または
これらの薬学的に許容される塩を包含する。
【０３０５】
用語「アリスキレン」は、詳細に定義しない場合、遊離塩基とその塩の両方、特に薬学的に許容されるその塩、最も好ましくはその半フマル酸塩であると理解される。
【０３０６】
用語「カルシウムチャネル遮断薬（ＣＣＢ）」は、ジヒドロピリジン（ＤＨＰ）および非ＤＨＰ（たとえば、ジルチアゼム型およびベラパミル型ＣＣＢ）を包含する。例としては、アムロジピン、ベプリジル、ジルチアゼム、フェロジピン、リオシジン（ryosidine）、イスラジピン、ラシジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニグルジピン、ニルジピン（niludipine）、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、ベラパミル、およびニバルジピン（nivaldipine）が挙げられ、フルナリジン、プレニラミン、ジルチアゼム、フェンジリン、ガロパミル、ミベフラジル、アニパミル（anipamil）、チアパミル、およびベラパミル、またはこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される代表的非ＤＨＰであることが好ましい。ＣＣＢは、降圧薬、抗狭心症薬、または抗不整脈薬として使用することができる。
【０３０７】
用語「利尿薬」は、チアジド誘導体（たとえば、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、メチルクロチアジド（methylclothiazide）、およびクロロタリドン（chlorothalidon））を包含する。
【０３０８】
用語「ＡｐｏＡ−Ｉ模倣薬」は、Ｄ４Ｆペプチド（たとえば、式Ｄ−Ｗ−Ｆ−Ｋ−Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｋ−Ｖ−Ａ−Ｅ−Ｋ−Ｆ−Ｋ−Ｅ−Ａ−Ｆ）を包含する。
【０３０９】
アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬または薬学的に許容されるその塩は、アンジオテンシンＩＩ受容体のＡＴ１受容体サブタイプに結合するが、結果として受容体を活性化しない活性成分であると理解される。ＡＴ１受容体が抑制される結果として、こうした拮抗薬は、たとえば、降圧薬として、またはうっ血性心不全の治療に用いることができる。
【０３１０】
ＡＴ１受容体拮抗薬のクラスは、構造上の特色が異なっている化合物を含み、実用上好ましいのは、非ペプチド性化合物である。たとえば、バルサルタン、ロサルタン、カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、サプリサルタン（saprisartan）、タソサルタン、テルミサルタン、次式
【０３１１】
【化３６】
2016527249.tif 000045
のＥ−１４７７という呼称の化合物、次式
【０３１２】
【化３７】
2016527249.tif 000046
のＳＣ−５２４５８という呼称の化合物、および次式
【０３１３】
【化３８】
2016527249.tif 000047
のＺＤ−８７３１という呼称の化合物、または、各場合において、薬学的に許容されるその塩からなる群から選択される化合物を挙げることができる。
【０３１４】
好ましいＡＴ１受容体拮抗薬は、カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、テルミサルタン、バルサルタンである。他にも好ましいのは、市販されている薬剤であり、最も好ましいのは、バルサルタンまたは薬学的に許容されるその塩である。
【０３１５】
用語「抗糖尿病薬」は、膵臓細胞からのインスリンの分泌を促進するインスリン分泌増強剤を包含する。例としては、ビグアナイド誘導体（たとえば、メトホルミン）、スルホニル尿素（ＳＵ）（たとえば、トルブタミド、クロルプロパミド、トラザミド、アセトヘキサミド、４−クロロ−Ｎ−［（１−ピロリジニルアミノ）カルボニル］−ベンゼンスルホンアミド（グリコピルアミド（glycopyramide））、グリベンクラミド（グリブリド）、グリクラジド、１−ブチル−３−メタニリル尿素、カルブタミド（carbutamide）、グリボヌリド（glibonuride）、グリピジド、グリキドン、グリソキセピド、グリブチアゾール（glybuthiazole）、グリブゾール（glibuzole）、グリヘキサミド（glyhexamide）、グリミジン、グリピンアミド（glypinamide）、フェンブタニド（phenbutanide）、およびトリルシクラミド（tolylcyclamide））、またはこれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。別の例としては、フェニルアラニン誘導体（たとえば、式
【０３１６】
【化３９】
2016527249.tif 000048
のナテグリニド［Ｎ−（ｔｒａｎｓ−４−イソプロピルシクロヘキシルカルボニル）−Ｄ−フェニルアラニン］（ＥＰ１９６２２２およびＥＰ５２６１７１を参照のこと）、レパグリニド［（Ｓ）−２−エトキシ−４−｛２−［［３−メチル−１−［２−（１−ピペリジニル）フェニル］ブチル］アミノ］−２−オキソエチル｝安息香酸］（ＥＰ５８９８７４、ＥＰ１４７８５０Ａ２、詳細には、６１頁の実施例１１、およびＥＰ２０７３３１Ａ１を参照のこと）、カルシウム（２Ｓ）−２−ベンジル−３−（ｃｉｓ−ヘキサヒドロ−２−イソインドリンリカルボニル（isoindolinlycarbonyl））−プロピオネート二水和物（たとえば、ミチグリニド（ＥＰ５０７５３４を参照のこと））、およびグリメピリド（ＥＰ３１０５８を参照のこと）が挙げられる。
【０３１７】
本発明のバイオコンジュゲートと組み合わせて使用することのできる第２の薬剤の別の例として、ＤＰＰ−ＩＶ阻害薬、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１アゴニストが挙げられる。
【０３１８】
ＤＰＰ−ＩＶは、ＧＬＰ−１の不活性化を担う。より詳細には、ＤＰＰ−ＩＶは、ＧＬＰ−１受容体アンタゴニストを発生させ、それによってＧＬＰ−１に対する生理的反応が短縮される。ＧＬＰ−１は、膵臓のインスリン分泌の主要な刺激物質であり、グルコース処理に直接有益な影響を及ぼす。
【０３１９】
ＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）阻害薬は、ペプチド性でも、または好ましくは、非ペプチド性でもよい。ＤＰＰ−ＩＶ阻害薬は、各場合につき、たとえば、ＷＯ９８／１９９９８、ＤＥ１９６１６４８６Ａ１、ＷＯ００／３４２４１、およびＷＯ９５／１５３０９において、各場合につき、特に、化合物請求項および作業実施例の最終生成物において全般かつ詳細に開示されており、最終生成物、医薬調製物、および特許請求の範囲の主題は、これら刊行物を参照することにより、本明細書に援用される。好ましいのは、それぞれ、ＷＯ９８／１９９９８の実施例３およびＷＯ００／３４２４１の実施例１において詳細に開示されている化合物である。
【０３２０】
ＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド１）は、たとえば、W.E. SchmidtらによるDiabetologia, 28, 1985, 704-707およびＵＳ５，７０５，４８３に記載されているインスリン分泌性タンパク質である。
【０３２１】
用語「ＧＬＰ−１アゴニスト」は、特にＵＳ５，１２０，７１２、ＵＳ５，１１８６６６、ＵＳ５，５１２，５４９、ＷＯ９１／１１４５７、およびC. OrskovらによるJ. Biol. Chem. 264 (1989) 12826において開示されているＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の変異体および類似体を包含する。別の例としては、化合物中ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２分子の第３７位においてＡｒｇ３６のカルボキシ末端側アミド官能基がＧｌｙで置換されているＧＬＰ−１（７−３７）、ならびにＧＬＮ９−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｄ−ＧＬＮ９−ＧＬＰ−１（７−３７）、アセチルＬＹＳ９−ＧＬＰ−１（７−３７）、ＬＹＳ１８−ＧＬＰ−１（７−３７）、特にＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、ＶＡＬ８−ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＹ８−ＧＬＰ−１（７−３７）、ＴＨＲ８−ＧＬＰ−１（７−３７）、ＭＥＴ８−ＧＬＰ−１（７−３７）、および４−イミダゾプロピオニル−ＧＬＰ−１を含めたその変異体および類似体が挙げられる。GreigらによるDiabetologia 1999, 42, 45-50に記載されているＧＬＰアゴニスト類似体エキセンディン−４も、特に好まれる。
【０３２２】
定義「抗糖尿病薬」には、損なわれたインスリン受容体機能を回復させて、インスリン抵抗性を減らし、その結果としてインスリン感受性を増強するインスリン感受性増強剤も含まれる。例としては、血糖降下性チアゾリジンジオン誘導体（たとえば、グリタゾン、（Ｓ）−（（３，４−ジヒドロ−２−（フェニル−メチル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−６−イル）メチル−チアゾリジン−２，４−ジオン（エングリタゾン）、５−｛［４−（３−（５−メチル−２−フェニル−４−オキサゾリル）−１−オキソプロピル）−フェニル］−メチル｝−チアゾリジン−２，４−ジオン（ダルグリタゾン）、５−｛［４−（１−メチル−シクロヘキシル）メトキシ）−フェニル］メチル｝−チアゾリジン−２，４−ジオン（シグリタゾン）、５−｛［４−（２−（１−インドリル）エトキシ）フェニル］メチル｝−チアゾリジン−２，４−ジオン（ＤＲＦ２１８９）、５−｛４−［２−（５−メチル−２−フェニル−４−オキサゾリル）−エトキシ）］ベンジル｝−チアゾリジン−２，４−ジオン（ＢＭ−１３．１２４６）、５−（２−ナフチルスルホニル）−チアゾリジン−２，４−ジオン（ＡＹ−３１６３７）、ビス｛４−［（２，４−ジオキソ−５−チアゾリジニル）メチル］フェニル｝メタン（ＹＭ２６８）、５−｛４−［２−（５−メチル−２−フェニル−４−オキサゾリル）−２−ヒドロキシエトキシ］ベンジル｝−チアゾリジン−２，４−ジオン（ＡＤ−５０７５）、５−［４−（１−フェニル−１−シクロプロパンカルボニルアミノ）−ベンジル］−チアゾリジン−２，４−ジオン（ＤＮ−１０８）５−｛［４−（２−（２，３−ジヒドロインドール−１−イル）エトキシ）フェニル］メチル｝−チアゾリジン−２，４−ジオン、５−［３−（４−クロロ−フェニル］）−２−プロピニル］−５−フェニルスルホニル）チアゾリジン−２，４−ジオン、５−［３−（４−クロロフェニル］）−２−プロピニル］−５−（４−フルオロフェニル−スルホニル）チアゾリジン−２，４−ジオン、５−｛［４−（２−（メチル−２−ピリジニル−アミノ）−エトキシ）フェニル］メチル｝−チアゾリジン−２，４−ジオン（ロシグリタゾン）、５−｛［４−（２−（５−エチル−２−ピリジル）エトキシ）フェニル］−メチル｝チアゾリジン−２，４−ジオン（ピオグリタゾン）、５−｛［４−（（３，４−ジヒドロ−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル）メトキシ）−フェニル］−メチル｝−チアゾリジン−２，４−ジオン（トログリタゾン）、５−［６−（２−フルオロ−ベンジルオキシ）ナフタレン−２−イルメチル］−チアゾリジン−２，４−ジオン（ＭＣＣ５５５）、５−｛［２−（２−ナフチル）−ベンゾオキサゾール−５−イル］−メチル｝チアゾリジン−２，４−ジオン（Ｔ−１７４）および５−（２，４−ジオキソチアゾリジン−５−イルメチル）−２−メトキシ−Ｎ−（４−トリフルオロメチル−ベンジル）ベンズアミド（ＫＲＰ２９７））が挙げられる。
【０３２３】
これ以外の抗糖尿病薬としては、タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰアーゼ）の阻害薬、抗糖尿病性非小分子模倣化合物、グルタミン−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（ＧＦＡＴ）の阻害薬のような、インスリンシグナル伝達経路モジュレーター；グルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６Ｐアーゼ）の阻害薬、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ（Ｆ−１，６−Ｂｐアーゼ）の阻害薬、グリコーゲンホスホリラーゼ（ＧＰ）の阻害薬、グルカゴン受容体拮抗薬、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）の阻害薬のような、肝臓グルコース産生の調節不全に影響を及ぼす化合物；ピルビン酸脱水素酵素キナーゼ（ＰＤＨＫ）阻害薬；胃内容排出の阻害薬；インスリン；ＧＳＫ−３の阻害薬；レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）アゴニスト；β−３ＡＲのアゴニスト；脱共役タンパク質（ＵＣＰ）のアゴニスト；非グリタゾン型ＰＰＡＲγアゴニスト；ＰＰＡＲα／ＰＰＡＲγ二重アゴニスト；抗糖尿病性含バナジウム化合物；グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）やＧＬＰ−１アゴニストのようなインクレチンホルモン；β細胞イミダゾリン受容体アンタゴニスト；ミグリトール；α２−アドレナリンアンタゴニスト；ならびにこれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。
【０３２４】
一実施形態では、本発明は、治療有効量の実施形態１〜３１のいずれか１つに従うバイオコンジュゲートと、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、メトプロロール、ナドロール、プロプラノロール、ソタロール、チモロールなどのβ−アドレナリン受容体遮断薬；ＡＴ１遮断薬などのアンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト；ＤＰＰＩＶ阻害薬（たとえば、ビルダグリプチン）やＧＬＰ１ペプチドアゴニストなどの抗糖尿病薬から選択される１種または複数の治療活性薬剤とを含む組合せ、詳細には医薬的組合せを提供する。
【０３２５】
用語「抗肥満薬」は、リパーゼ阻害薬（たとえば、オーリスタット）および食欲抑制薬（たとえば、シブトラミンおよびフェンテルミン）を包含する。
【０３２６】
アルドステロンシンターゼ阻害薬または薬学的に許容されるその塩は、アルドステロンの産生を抑制する特性を有する活性成分であると理解される。アルドステロンシンターゼ（ＣＹＰ１１Ｂ２）は、副腎皮質におけるアルドステロン産生の最後のステップ、すなわち、１１−デオキシコルチコステロンのアルドステロンへの変換を触媒する、ミトコンドリアのシトクロムＰ４５０酵素である。いわゆるアルドステロンシンターゼ阻害薬によるアルドステロン産生の抑制は、低カリウム血症、高血圧、うっ血性心不全、心房細動、または腎不全の治療に奏効する変異形態であることが知られている。このようなアルドステロンシンターゼ抑制活性は、当業者によって、標準のアッセイ（たとえば、ＵＳ２００７／００４９６１６）に従い、容易に見極められる。
【０３２７】
アルドステロンシンターゼ阻害薬のクラスは、ステロイド性および非ステロイド性両方のアルドステロンシンターゼ阻害薬を含み、後者が最も好ましい。
【０３２８】
市販品として入手可能なアルドステロンシンターゼ阻害薬または保健当局によって承認されているアルドステロンシンターゼ阻害薬が好ましい。
【０３２９】
アルドステロンシンターゼ阻害薬のクラスは、構造上の特色が異なっている化合物を含む。非ステロイド性アルドステロンシンターゼ阻害薬の例は、式
【０３３０】
【化４０】
2016527249.tif 000049
のファドロゾールの塩酸塩（米国特許４６１７３０７および４８８９８６１）の（＋）鏡像異性体、または適切な場合、薬学的に許容されるその塩である。
【０３３１】
前記組合せにおいて有用なアルドステロンシンターゼ阻害薬は、たとえば、ＵＳ２００７／００４９６１６において、特に、化合物請求項および作業実施例の最終生成物において全般かつ詳細に開示されている化合物および類似体であり、最終生成物、医薬調製物、および特許請求の範囲の主題は、この刊行物を参照することにより、本明細書に援用される。本発明における使用に適する好ましいアルドステロンシンターゼ阻害薬としては、限定はせず、４−（６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−イル）−３−メチルベンゾニトリル；５−（２−クロロ−４−シアノフェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−カルボン酸（４−メトキシベンジル）メチルアミド；４’−フルオロ−６−（６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］アゼピン−５−イル）ビフェニル−３−カルボニトリル；５−（４−シアノ−２−メトキシフェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−カルボン酸ブチルエステル；４−（６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−イル）−２−メトキシベンゾニトリル；５−（２−クロロ−４−シアノフェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−カルボン酸４−フルオロベンジルエステル；５−（４−シアノ−２−トリフルオロメトキシフェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−カルボン酸メチルエステル；５−（４−シアノ−２−メトキシフェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−カルボン酸２−イソプロポキシエチルエステル；４−（６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−イル）−２−メチルベンゾニトリル；４−（６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−イル）−３−フルオロベンゾニトリル；４−（６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−イル）−２−メトキシベンゾニトリル；３−フルオロ−４−（７−メチレン−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−イル）ベンゾニトリル；ｃｉｓ−３−フルオロ−４−［７−（４−フルオロ−ベンジル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−イミダゾ［１，５−ａ］ピリジン−５−イル］ベンゾニトリル；４’−フルオロ−６−（９−メチル−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］アゼピン−５−イル）ビフェニル−３−カルボニトリル；４’−フルオロ−６−（９−メチル−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］アゼピン−５−イル）ビフェニル−３−カルボニトリル、または各場合において、その（Ｒ）もしくは（Ｓ）鏡像異性体、または適切な場合、薬学的に許容されるその塩が挙げられる。
【０３３２】
用語アルドステロンシンターゼ阻害薬は、ＷＯ２００８／０７６８６０、ＷＯ２００８／０７６３３６、ＷＯ２００８／０７６８６２、ＷＯ２００８／０２７２８４、ＷＯ２００４／０４６１４５、ＷＯ２００４／０１４９１４、ＷＯ２００１／０７６５７４で開示されている化合物および類似体も包含する。
【０３３３】
さらに、アルドステロンシンターゼ阻害薬は、米国特許出願ＵＳ２００７／０２２５２３２、ＵＳ２００７／０２０８０３５、ＵＳ２００８／０３１８９７８、ＵＳ２００８／００７６７９４、ＵＳ２００９／００１２０６８、ＵＳ２００９００４８２４１、およびＰＣＴ出願ＷＯ２００６／００５７２６、ＷＯ２００６／１２８８５３、ＷＯ２００６１２８８５１、ＷＯ２００６／１２８８５２、ＷＯ２００７０６５９４２、ＷＯ２００７／１１６０９９、ＷＯ２００７／１１６９０８、ＷＯ２００８／１１９７４４、および欧州特許出願ＥＰ１８８６６９５において開示されている化合物および類似体も包含する。本発明における使用に適する好ましいアルドステロンシンターゼ阻害薬として、限定はせず、Ｓｐｅｅｄｅｌが開発した８−（４−フルオロフェニル）−５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ１［１，４１オキサジン；４−（５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ］［１，４］オキサジン−８−イル）−２−フルオロベンゾニトリル；４−（５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ］［１，４］オキサジン−８−イル）−２，６−ジフルオロベンゾニトリル；４−（５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ］［１，４］オキサジン−８−イル）−２−メトキシベンゾニトリル；３−（５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ］［１，４］オキサジン−８−イル）ベンゾニトリル；４−（５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ］［１，４］オキサジン−８−イル）フタロニトリル；４−（８−（４−シアノフェニル）−５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ］［１，４］オキサジン−８−イル）ベンゾニトリル；４−（５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ］［１，４］オキサジン−８−イル）ベンゾニトリル；４−（５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ］［１，４］オキサジン−８−イル）ナフタレン−１−カルボニトリル；８−［４−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）フェニル１−５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ］［１，４］オキサジン、または各場合において、その（Ｒ）もしくは（Ｓ）鏡像異性体、または適切な場合、薬学的に許容されるその塩が挙げられる。
【０３３４】
前記組合せにおいて有用なアルドステロンシンターゼ阻害薬は、たとえば、ＷＯ２００９／１５６４６２およびＷＯ２０１０／１３０７９６において、特に、化合物請求項および作業実施例の最終生成物において全般かつ詳細に開示されている化合物および類似体、最終生成物、医薬調製物、および特許請求の範囲の主題である。本発明における組合せに適する好ましいアルドステロンシンターゼ阻害薬としては、３−（６−フルオロ−３−メチル−２−ピリジン−３−イル−１Ｈ−インドール−１−イルメチル）−ベンゾニトリルヒドロクロリド、１−（４−メタンスルホニル−ベンジル）−３−メチル−２−ピリジン−３−イル−１Ｈ−インドール、２−（５−ベンジルオキシ−ピリジン−３−イル）−６−クロロ−１−メチル−１Ｈ−インドール、５−（３−シアノ−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−ニコチン酸エチルエステル、Ｎ−［５−（６−クロロ−３−シアノ−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−ピリジン−３−イルメチル］−エタンスルホンアミド、ピロリジン−１−スルホン酸  ５−（６−クロロ−３−シアノ−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−ピリジン−３−イルエステル、Ｎ−メチル−Ｎ−［５−（１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−ピリジン−３−イルメチル］−メタンスルホンアミド、６−クロロ−１−メチル−２−｛５−［（２−ピロリジン−１−イル−エチルアミノ）−メチル］−ピリジン−３−イル｝−１Ｈ−インドール−３−カルボニトリル、６−クロロ−２−［５−（４−メタンスルホニル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−３−イル］−１−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルボニトリル、６−クロロ−１−メチル−２−｛５−［（１−メチル−ピペリジン−４−イルアミノ）−メチル］−ピリジン−３−イル｝−１Ｈ−インドール−３−カルボニトリル、モルホリン−４−カルボン酸［５−（６−クロロ−３−シアノ−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−ピリジン−３−イルメチル］−アミド、Ｎ−［５−（６−クロロ−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−ピリジン−３−イルメチル］−エタンスルホンアミド、Ｃ，Ｃ，Ｃ−トリフルオロ−Ｎ−［５−（１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−ピリジン−３−イルメチル］−メタンスルホンアミド、Ｎ−［５−（３−クロロ−４−シアノ−フェニル）−ピリジン−３−イル］−４−トリフルオロメチル−ベンゼンスルホンアミド、Ｎ−［５−（３−クロロ−４−シアノ−フェニル）−ピリジン−３−イル］−１−フェニル−メタンスルホンアミド、Ｎ−（５−（３−クロロ−４−シアノフェニル）ピリジン−３−イル）ブタン−１−スルホンアミド、Ｎ−（１−（５−（４−シアノ−３−メトキシフェニル）ピリジン−３−イル）エチル）エタンスルホンアミド、Ｎ−（（５−（３−クロロ−４−シアノフェニル）ピリジン−３−イル）（シクロプロピル）メチル）エタンスルホンアミド、Ｎ−（シクロプロピル（５−（１Ｈ−インドール−５−イル）ピリジン−３−イル）メチル）エタンスルホンアミド、Ｎ−（シクロプロピル（５−ナフタレン−１−イル−ピリジン−３−イル）メチル）エタンスルホンアミド、エタンスルホン酸［５−（６−���ロロ−１−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−２−イル）−ピリジン−３−イルメチル］−アミドおよびエタンスルホン酸｛［５−（３−クロロ−４−シアノ−フェニル）−ピリジン−３−イル］−シクロプロピル−メチル｝−エチル−アミドが挙げられる。
【０３３５】
用語「エンドセリン受容体遮断薬」は、ボセンタンおよびアンブリセンタンを包含する。
【０３３６】
用語「ＣＥＴＰ阻害薬」とは、コレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）を媒介とする、種々のコレステリルエステルおよびトリグリセリドのＨＤＬからＬＤＬおよびＶＬＤＬへの輸送を抑制する化合物を指す。このようなＣＥＴＰ抑制活性は、当業者によって、標準のアッセイ（たとえば、米国特許第６，１４０，３４３号）に従い、容易に見極められる。例として、米国特許第６，１４０，３４３号および米国特許第６，１９７，７８６号で開示されている化合物（たとえば、［２Ｒ，４Ｓ］４−［（３，５−ビス−トリフルオロメチル−ベンジル）−メトキシカルボニル−アミノ］−２−エチル−６−トリフルオロメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−キノリン−１−カルボン酸エチルエステル（トルセトラピブ）、米国特許第６，７２３，７５２号で開示されている化合物（たとえば、（２Ｒ）−３−｛［３−（４−クロロ−３−エチル−フェノキシ）−フェニル］−［［３−（１，１，２，２−テトラフルオロ−エトキシ）−フェニル］−メチル］−アミノ｝−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノール）、米国特許出願第１０／８０７，８３８号で開示されている化合物、米国特許第５，５１２，５４８号で開示されているポリペプチド誘導体、それぞれJ. Antibiot., 49(8): 815- 816 (1996)およびBioorg. Med. Chem. Lett.; 6:1951-1954 (1996)で開示されているロセノノラクトン誘導体およびコレステリルエステルの含リン酸類似体が挙げられる。さらに、ＣＥＴＰ阻害薬として、ＷＯ２０００／０１７１６５、ＷＯ２００５／０９５４０９、ＷＯ２００５／０９７８０６、ＷＯ２００７／１２８５６８、ＷＯ２００８／００９４３５、ＷＯ２００９／０５９９４３、およびＷＯ２００９／０７１５０９で開示されているものも挙げられる。
【０３３７】
用語「ＮＥＰ阻害薬」とは、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）ＥＣ３．４．２４．１１を抑制する化合物を指す。例として、カンドキサトリル、カンドキサトリラート、デキセカドトリル（Dexecadotril）、エカドトリル（Ecadotril）、ラセカドトリル、サンパトリラート（Sampatrilat）、ファシドトリル、オマパトリラート、ゲモパトリラート（Gemopatrilat）、ダグルトリル（Daglutril）、ＳＣＨ−４２４９５、ＳＣＨ−３２６１５、ＵＫ−４４７８４１、ＡＶＥ−０８４８、ＰＬ−３７、および（２Ｒ，４Ｓ）−５−ビフェニル−４−イル−４−（３−カルボキシ−プロピオニルアミノ）−２−メチル−ペンタン酸エチルエステル、またはこれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。ＮＥＰ阻害薬には、米国特許第ＵＳ５，１５５，１００号で開示されているようなホスホノ／ビアリール置換ジペプチド誘導体も含まれる。ＮＥＰ阻害薬には、ＰＣＴ出願第ＷＯ２００３／１０４２００号で開示されているようなＮ−メルカプトアシルフェニルアラニン誘導体も含まれる。ＮＥＰ阻害薬には、ＰＣＴ出願第ＷＯ２００８／１３３８９６、ＷＯ２００９／０３５５４３、またはＷＯ２００９／１３４７４１で開示されているような二重作用性降圧薬も含まれる。他の例としては、ＵＳ出願第１２／７８８，７９４号、第１２／７８８，７６６号、および第１２／９４７，０２９号で開示されている化合物が挙げられる。ＮＥＰ阻害薬として、ＷＯ２０１０／１３６４７４、ＷＯ２０１０／１３６４９３、ＷＯ２０１１／０６１２７１、ならびにＵＳ仮出願第６１／４１４１７１号および第６１／４１４１６３号で開示されている化合物も挙げられる。
【０３３８】
一実施形態では、本発明は、対象においてＡＰＪ受容体を活性化する方法であって、治療有効量の、前述の実施形態のいずれか１つに従うバイオコンジュゲート、またはその多量体を対象に投与することを含む方法を提供する。
【０３３９】
一実施形態では、本発明は、対象において、ＡＰＪ受容体の活性化に反応を示す障害または疾患を治療する方法であって、治療有効量の、前述の実施形態のいずれか１つに従うバイオコンジュゲート、またはその多量体を対象に投与することを含む方法を提供する。
【０３４０】
一実施形態では、本発明は、対象において、ＡＰＪ受容体の活性化（アゴニズム）に反応を示す障害または疾患を治療する方法であって、障害または疾患が、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含む）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含む）、および子癇前症から選択される方法を提供する。
【０３４１】
一実施形態では、本発明は、医薬として使用するための、前述の実施形態のいずれか１つに従うバイオコンジュゲートまたはその多量体を提供する。
【０３４２】
一実施形態では、本発明は、ＡＰＪ受容体の活性化に反応を示す障害または疾患を治療するための医薬の製造における、前述の実施形態のいずれか１つに従うバイオコンジュゲートまたはその多量体の使用を提供する。別の実施形態では、本発明は、ＡＰＪ受容体の活性化に反応を示す障害または疾患を治療するための医薬の製造における、前述の実施形態のいずれか１つに従うバイオコンジュゲート、またはその多量体の使用であって、前記障害または疾患が、詳細には、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含む）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含む）、および子癇前症から選択される、使用を提供する。
【実施例】
【０３４３】
【表５−１】
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【０３４４】
【表５−２】
2016527249.tif 000051
【０３４５】
以下のペプチドは、標準の固相Ｆｍｏｃ化学によって合成した。ペプチドは、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成装置（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、米国トゥーソン）において組み立てた。Ｃ末端上に遊離カルボン酸を有するペプチドは、２−クロロトリチルクロリド−ＰＳ−樹脂（ＡＢＣＲ、ドイツ国カールスルーエ）から合成した。Ｃ末端上に非置換カルボキサミドを有するペプチドは、Ｆｍｏｃ保護されたＲｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ−ＡＭ−ＰＳ樹脂（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ国ダルムシュタット）から合成した。Ｃ末端上にＮで一置換されているカルボキサミドを有するペプチドは、アミンが導入されたＢＡＬ−ＡＭ−ＰＳ樹脂（ＥＭＣ  Ｍｉｃｒｏｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ、ドイツ国チュービンゲン）から合成した。
【０３４６】
ペプチドは、分取逆相ＨＰＬＣによって精製した。次のカラムを使用した。
−  Ｗａｔｅｒｓ  ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、３０×１００ｍｍ、部品番号１８６００２５７２（カラム１本または連続したカラム２本）
−  Ｗａｔｅｒｓ  ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、３０×５０ｍｍ、部品番号１８６００２５７２
−  Ｗａｔｅｒｓ  ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、３０×１５０ｍｍ、部品番号１８６００２７９７
−  Ｗａｔｅｒｓ  Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｐｒｅｐ  ＯＢＤ  Ｔ３カラム、５μｍ、３０×１５０ｍｍ、部品番号１８６００３７０３
−  Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ８  ＯＢＤカラム、５μｍ、３０×１５０ｍｍ、部品番号１８６００３０８３
−  Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ（登録商標）１００−５  Ｃ１８、５μｍ、２５０×４０ｍｍ、部品番号７１５３４０．４００
【０３４７】
移動相は、溶離液Ａ（０．１％ＴＦＡ  Ｈ２Ｏ水溶液）と溶離液Ｂ（ＡＣＮ）からなるものとした。勾配は、分離の問題の特定の要件に基づき設計した。純粋な生成物をＡＣＮ／Ｈ２Ｏから凍結乾燥した。
【０３４８】
生成物は、λ＝２１４ｎｍでのＵＶ検出を使用するＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーイオン化を使用するＵＰＬＣ−ＭＳによって分析した。
【０３４９】
表４において例示するペプチドは、以下に記載する一般手順を使用して合成した。非置換のＮ末端またはＣ末端は、それぞれ、細いイタリック体のＨ−または−ＯＨで示す。
【０３５０】
【表６−１】
2016527249.tif 000052
【０３５１】
【表６−２】
2016527249.tif 000053
【０３５２】
【表６−３】
2016527249.tif 000054
【０３５３】
分析方法
１ａ）ＨＰＬＣ−分析方法Ａ
−  カラム：ＰｒｏｎｔｏＳｉｌ  １２０−３−Ｃ１８−Ｈ、３μｍを備えたＢｉｓｃｈｏｆｆ  ＵＨＣ−６４０（５３×４．０ｍｍ）、部品番号：０６０４Ｆ１８５ＰＳ０３０
−  溶離液Ａ：０．０７％ＴＦＡ水溶液／溶離液Ｂ：０．１％ＴＦＡ  ＡＣＮ溶液
−  流量：１．５ｍｌ／分
−  温度：４０℃
−  勾配：
【０３５４】
【表７】
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【０３５５】
１ｂ）ＵＰＬＣ−分析方法Ｂ
−  カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ３００  Ｃ１８（１００×４．６ｍｍ）、３μｍ、部品番号：１８６００３６１２
−  溶離液Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液／溶離液Ｂ：０．１％ＴＦＡ  ＡＣＮ溶液
−  流量：１．０ｍｌ／分
−  温度：４０℃
−  勾配：
【０３５６】
【表８】
2016527249.tif 000056
【０３５７】
２）ＵＰＬＣ−ＭＳ−分析方法Ｃ
−  Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ  Ｃ１８、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ、部品番号：１８６００２３５０
−  溶離液Ａ：０．１％ＦＡ水溶液、溶離液Ｂ：０．１％  ＦＡ  ＡＣＮ溶液
−  流量：０．７ｍｌ／分
−  温度：４０℃
−  勾配：
【０３５８】
【表９】
2016527249.tif 000057
【０３５９】
ペプチド１〜５４の分析データは、表５にまとめて示すが、上述の分析方法を使用して生成したものである。
【０３６０】
３）分析方法Ｄ：
−  ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８カラム、３．５μｍ、３．０×３０ｍｍ
−  溶離液：Ａ：水（０．１％ギ酸）、Ｂ：ＣＡＮ
−  流速：２ｍＬ／分
−  勾配：０分間４０％のＢ、１．７０分で４０％〜９５％のＢ、２．０分間９５％のＢ、２．１分間４０％のＢ
−  質量分析計：Ｓｉｎｇｌｅ  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ＥＳＩ  走査範囲１５０〜１６００
−  ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズ
−  温度：４０Ｃ
【０３６１】
【表１０−１】
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【０３６２】
【表１０−２】
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【０３６３】
一般合成手順
１）最初のアミノ酸の２−クロロトリチルクロリド樹脂への導入およびＦｍｏｃ除去
２−クロロトリチルクロリド樹脂（１当量、１．０〜１．６ｍｍｏｌ／ｇ）をＤＣＭで十分に洗浄した。所望のアミノ酸（通常、１．６ｍｍｏｌ／ｇの導入を考えて、樹脂に対して０．５〜２当量）を、ＤＣＭ（樹脂１グラムあたり約１０ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（１．６ｍｍｏｌ／ｇの導入を考えて、樹脂に対して４当量）に溶解させた。溶液を樹脂に加え、懸濁液を室温で１９時間振盪した。樹脂を排出し、次いで、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡ（１７：２：１）、ＤＣＭ、ＤＭＡ、ＤＣＭで順次、十分に洗浄した。
【０３６４】
Ｆｍｏｃ除去および導入量の算定については、樹脂をピペリジン／ＤＭＡ（１：４）または４−メチルピペリジン／ＤＭＡ（１：４）（最初の樹脂１グラムあたり１２×１０ｍＬ）と共に繰り返し振盪し、ＤＭＡ（最初の樹脂１グラムあたり２×１０ｍＬ）で洗浄した。合わせた溶液をＭｅＯＨで希釈して、体積Ｖを最初の樹脂１グラムあたり２５０ｍＬとした。この溶液の２ｍＬのアリコート（Ｖａ）をＭｅＯＨでさらに希釈して２５０ｍＬ（Ｖｔ）とした。ＵＶ吸収を、ＭｅＯＨを基準として２９９．８ｎｍで測定して、吸収Ａを得た。樹脂を、順次ＤＭＡ、ＤＣＭ、ＤＭＡ、ＤＣＭで十分に洗浄し、高真空中にて４０℃で乾燥させて、ｍ  ｇの樹脂を得た。
【０３６５】
樹脂への導入量は、式：
導入量［ｍｏｌ／ｇ］＝（Ａ×Ｖｔ×Ｖ）／（ｄ×ε×Ｖａ×ｍ）
（ｄ：セルの幅、ε＝７８００Ｌ  ｍｏｌ−１ｃｍ−１）
に従って算出した。
【０３６６】
２）Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）合成装置における固相ペプチド合成
２ａ）合成サイクルＡ
樹脂をＤＭＡで洗浄した。４−メチルピペリジン／ＤＭＡ（１：４）で繰り返し処理して、Ｆｍｏｃを除去した。樹脂をＤＭＡで洗浄した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸（３当量、０．２Ｍ  ＮＭＰ溶液）、ＨＣＴＵ（３当量、０．３Ｍ  ＮＭＰ溶液）、およびＤＩＰＥＡ（３．３当量、０．６６Ｍ  ＮＭＰ溶液）を加えた後、懸濁液を、窒素中にて、特定の要件に応じて通常は１５分〜４時間、室温で混合することにより、カップリングを行った。ＤＭＡで洗浄した後、カップリングステップを、特定の要件に応じて通常は１〜３回繰り返した。ＤＭＡで洗浄した後、Ａｃ２Ｏ／ピリジン／ＤＭＡ（１：１：８）の混合物を加え、引き続いて懸濁液を室温で混合することにより、キャッピングを行った。樹脂をＤＭＡで洗浄した。
【０３６７】
２ｂ）合成サイクルＢ
樹脂をＤＭＡで洗浄した。ピペリジン／ＤＭＡ（１：４）で繰り返し処理して、Ｆｍｏｃを除去した。樹脂をＤＭＡで洗浄した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸（３当量、０．３Ｍ  ＮＭＰ溶液）、ＨＣＴＵ（３当量、０．３Ｍ  ＮＭＰ溶液）、およびＤＩＰＥＡ（４．５当量、０．９Ｍ  ＮＭＰ溶液）を加えた後、懸濁液を、窒素中にて、特定の要件に応じて通常は１５分〜４時間、室温で混合することにより、カップリングを行った。ＤＭＡで洗浄した後、カップリングステップを、特定の要件に応じて通常は１〜３回繰り返した。ＤＭＡで洗浄した後、Ａｃ２Ｏ／ピリジン／ＤＭＡ（１：１：８）の混合物を加え、引き続いて懸濁液を室温で混合することにより、キャッピングを行った。樹脂をＤＭＡで洗浄した。
【０３６８】
２ｃ）合成サイクルＣ
樹脂をＤＭＡで洗浄した。ピペリジン／ＤＭＡ（１：４）での繰り返し処理によって、Ｆｍｏｃを除去した。樹脂をＤＭＡで洗浄した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸（３当量、０．３Ｍ  ＮＭＰ溶液）、ＨＣＴＵ（３当量、０．３Ｍ  ＮＭＰ溶液）、およびＤＩＰＥＡ（６当量、０．９Ｍ  ＮＭＰ溶液）を加えた後、懸濁液を、窒素中にて、特定の要件に応じて通常は１５分〜４時間、室温で混合することにより、カップリングを行った。ＤＭＡで洗浄した後、カップリングステップを、特定の要件に応じて通常は１〜３回繰り返した。ＤＭＡで洗浄した後、Ａｃ２Ｏ／ピリジン／ＤＭＡ（１：１：８）の混合物を加え、引き続いて懸濁液を室温で混合することにより、キャッピングを行った。樹脂をＤＭＡで洗浄した。
【０３６９】
２ｄ）合成サイクルＤ
樹脂をＤＭＡで洗浄した。４−メチルピペリジン／ＤＭＡ（１：４）で繰り返し処理して、Ｆｍｏｃを除去した。樹脂をＤＭＡで洗浄した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸とＯｘｙｍａ  Ｐｕｒｅ（各３当量、両方とも０．２Ｍ  ＮＭＰ溶液）の混合物、およびＤＩＣ（３当量、０．３Ｍ  ＮＭＰ溶液）を加えた後、懸濁液を、窒素中にて、特定の要件に応じて通常は１５分〜４時間、室温で混合することにより、カップリングを行った。ＤＭＡで洗浄した後、カップリングステップを、特定の要件に応じて通常は１〜３回繰り返した。ＤＭＡで洗浄した後、Ａｃ２Ｏ／ピリジン／ＤＭＡ（１：１：８）の混合物を加え、引き続いて懸濁液を室温で混合することにより、キャッピングを行った。樹脂をＤＭＡで洗浄した。
【０３７０】
３）保護基の除去を伴うまたは伴わない樹脂からの切断
３ａ）切断方法Ａ
樹脂（０．１ｍｍｏｌ）を、９５％のＴＦＡ／ＥＤＴ／ＴＩＳ（９５：２．５：２．５）水溶液（３ｍＬ）と共に室温で２時間振盪した。切断溶液を濾別し、新鮮な溶液を加えた（３ｍＬ）。懸濁液を室温で１時間振盪し、次いで切断溶液を濾別した。新鮮な溶液を加え（３ｍＬ）、懸濁液を室温で１時間振盪した。切断溶液を濾別した。合わせた切断溶液を、冷ヘプタン／ジエチルエーテル（１：１）の混合物（３５ｍＬ）上にゆっくりと注いで、沈殿を得た。懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄した。残渣を冷ヘプタン／ジエチルエーテル（１：１）（１０ｍＬ）で洗浄し、懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄した。固体を高真空中で乾燥させた。
【０３７１】
３ｂ）切断方法Ｂ
樹脂（０．１ｍｍｏｌ）を９５％ＴＦＡ／ＥＤＴ（４：１）水溶液（０．７５ｍＬ）で処理し、懸濁液を室温で１時間振盪した。９５％ＴＦＡ水溶液（２．１８ｍＬ）とＴＩＳ（７５μＬ）の混合物を加え、室温での振盪を１時間再開した。切断溶液を濾別し、次いで、樹脂に９５％ＴＦＡ／ＥＤＴ／ＴＩＳ（９５：２．５：２．５）水溶液（３ｍＬ）を加え、懸濁液を室温で１時間振盪した。切断溶液を濾別し、集め、新鮮な溶液を加えた（３ｍＬ）。懸濁液を室温で１時間振盪し、次いで切断溶液を濾別した。合わせた切断溶液を、冷ヘプタン／ジエチルエーテル（１：１）（３５ｍＬ）上に注いだ。こうして生成した沈殿を放置して沈降させ、遠心分離し、次いで上清を慎重に廃棄した。沈殿を冷ヘプタン／ジエチルエーテル（１：１）（１０ｍＬ）で１回洗浄し、懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄した。残渣を高真空中で乾燥させた。
【０３７２】
３ｃ）切断方法Ｃ
樹脂（０．１ｍｍｏｌ）にＨＦＩＰ／ＤＣＭ（３０：７０）（５ｍＬ）を加え、懸濁液を室温で１．５時間撹拌した。切断溶液を濾別し、集め、新鮮なＨＦＩＰ／ＤＣＭ（３０：７０）（５ｍＬ）を加えた。懸濁液を室温で３０分間撹拌した。切断溶液を濾別し、集めた。樹脂をＤＣＭ（２×５ｍＬ）で洗浄し、これも集めた。合わせた切断および洗浄溶液を高真空中で濃縮乾燥した。残渣をｔＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）から凍結乾燥した。
【０３７３】
４）環化方法
４ａ）環化方法Ａ（ジスルフィド生成）
完全に脱保護された線状前駆体ペプチドを、Ｈ２Ｏ／ＤＭＳＯ（９：１）または（４：１）に溶解させて、通常は１〜１５ｍｇ／ｍＬの濃度とした。次いで、反応混合物を、要件に応じて通常は４０時間、室温で撹拌し、次いで高真空中で濃縮乾燥した。
【０３７４】
４ｂ）環化方法Ｂ（ジスルフィド生成）
完全に脱保護された線状前駆体ペプチド（１当量）をＨ２Ｏに溶解させて、通常は約１０ｍｇ／ｍＬの濃度とした。撹拌した溶液に、５０ｍＭのＩ２  ＡｃＯＨ溶液（１．２当量）を一度に加え、反応液を室温で１０分間撹拌した。０．５Ｍのアスコルビン酸Ｈ２Ｏ溶液（１．５当量）を加えて、過剰のＩ２を失活させた。溶液を真空中で濃縮して、ほぼ乾燥させた。
【０３７５】
４ｃ）環化方法Ｃ（２つのジスルフィドの選択的な生成）
部分的に保護された線状前駆体ペプチド（１当量）（２つのシステインがＡｃｍで保護され、２つのシステインが保護されていない）をＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ（４：１）に溶解させて、通常は１ｍｇ／ｍＬの濃度とした。５０ｍＭのＩ２  ＡｃＯＨ溶液（２当量）を加え、反応混合物を室温で１時間撹拌した。別の５０ｍＭのＩ２  ＡｃＯＨ溶液（１０当量）を４時間かけて少量ずつ加えた。２１時間後、反応混合物を真空中で濃縮してほぼ乾燥させ、１Ｍのアスコルビン酸Ｈ２Ｏ溶液を過剰に加えて、未反応のＩ２を失活させた。
【０３７６】
４ｄ）環化方法Ｄ（側鎖間のラクタム生成）
完全に脱保護された線状前駆体ペプチド（１当量）およびＨＡＴＵ（１．５当量）を、ＮＭＰに溶解させた（ペプチド濃度：通常は１ｍｍｏｌ／Ｌ）。ＤＩＰＥＡ（３当量）を加え、溶液を室温で９０分間撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮乾燥した。
【０３７７】
４ｅ）環化方法Ｅ（側鎖とＣ末端間のラクタム生成）
ペプチド（１当量）、ＨＡＴＵ（１．３当量）、およびＨＯＡｔ（１．３当量）をＤＭＦに溶かした溶液（ペプチド濃度：２．６ｍｍｏｌ／Ｌ）を、２，６−ルチジン（２０当量）で処理し、反応液を室温で２時間撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮乾燥した。
【０３７８】
以下では、代表的な実施例の合成について記載する。
【０３７９】
ペプチド１  ｐＥ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｋ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｄ−フェネチルアミン（ラクタムＫ６−Ｄ１２）の合成
【０３８０】
【化４１】
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【０３８１】
−  中間体１ａの調製
（線状ペプチドの組み立て）
フェネチルアミン−ＢＡＬ−ＰＳ樹脂（１６７ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）を、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成装置での固相ペプチド合成にかけた。カップリングを以下のとおりに実施した。
【０３８２】
【表１１】
2016527249.tif 000061
【０３８３】
−  中間体１ｂの調製
（保護基の除去を伴う樹脂からの切断、次いで精製）
中間体１ａ（０．１ｍｍｏｌ）に、９５％ＴＦＡ／ＥＤＴ／ＴＩＳ（９５：２．５：２．５）水溶液の混合物（２ｍＬ）を加え、懸濁液を室温で２．５時間振盪した。切断溶液を濾別し、新鮮な切断溶液（２ｍＬ）を加えた。懸濁液を室温で４５分間振盪し、次いで切断溶液を濾別した。新鮮な溶液（２ｍＬ）を加え、懸濁液を室温で４５分間振盪した。切断溶液を濾別し、樹脂を９５％ＴＦＡ水溶液（１ｍＬ）で洗浄した。合わせた切断溶液を、冷ヘプタン／ジエチルエーテル（１：１）の混合物（３５ｍＬ）上へ注ぎ、沈殿を得た。懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄した。残渣を冷ヘプタン／ジエチルエーテル（１：１）（２０ｍＬ）で洗浄し、懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄した。固体を高真空中で乾燥させた。粗生成物を分取ＨＰＬＣによって精製し、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏから凍結乾燥して、中間体１ｂを、質の異なる２つのバッチ：バッチＡ（３５．９ｍｇ（純度９８％）、０．０１８ｍｍｏｌ）およびバッチＢ（５２．９ｍｇ（純度８０％）、０．０２１ｍｍｏｌ）で、白色の固体として得た。
【０３８４】
−  ペプチド１の調製
（環化および精製）
前のステップからの両方のバッチを、同じプロトコールに従って別々に処理した。
バッチＡ：ペプチド（３５．９ｍｇ（純度９８％）、０．０１８ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（１０．０ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（１８ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（９．２μＬ、０．０５３ｍｍｏｌ）に溶かした溶液を、室温で２時間撹拌した。
バッチＢ：ペプチド（５２．９ｍｇ（純度８０％）、０．０２１ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（１４．５ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（２６ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（１３．０μＬ、０．０７６ｍｍｏｌ）に溶かした溶液を、室温で２時間撹拌した。
【０３８５】
バッチそれぞれを、真空中で濃縮乾燥した。生成物を分取ＨＰＬＣによって単離した。両方の精製の純粋な画分を合わせ、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏから凍結乾燥して、ペプチド１を白色の固体（５２．０ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）として得た。
【０３８６】
純粋な生成物を、分析ＨＰＬＣ（分析方法Ａ：ｔＲ＝４．１６分）およびＵＰＬＣ−ＭＳ（分析方法Ｃ、測定値：［Ｍ＋３］３＋＝５１１．２、計算値：［Ｍ＋３］３＋＝５１１．３）によって分析した。
【０３８７】
ペプチド５  合成  ｐＥ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｋ−Ｆ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｆ（ラクタムＫ６−Ｃ末端）
【０３８８】
【化４２】
2016527249.tif 000062
【０３８９】
−  中間体５ａの調製
（２−クロロトリチルクロリド樹脂へのＦｍｏｃ−Ｆ−ＯＨの導入、Ｆｍｏｃ除去、および樹脂への導入量の算定）
２−クロロトリチルクロリド樹脂（１０．０ｇ、１６．０ｍｍｏｌ）を、上述の一般手順と同様に、Ｆｍｏｃ−Ｆ−ＯＨ（６．２４ｇ、３２．０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１００ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（１１．２ｍＬ、６４．０ｍｍｏｌ）に溶かした溶液と反応させて、中間体５ａ（１２．８ｇ、導入量＝０．７９ｍｍｏｌ／ｇ）を得た。
【０３９０】
−  中間体５ｂの調製
（線状ペプチドの組み立て）
中間体５ａ（０．１００ｍｍｏｌ）をＰｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成装置での固相ペプチド合成にかけた。カップリングを以下のとおりに実施した。
【０３９１】
【表１２】
2016527249.tif 000063
【０３９２】
−  中間体５ｃの調製
（ｉｖＤｄｅの除去および樹脂からの切断）
中間体５ｂ（０．１００ｍｍｏｌ）を、ヒドラジン一水和物（０．０８１ｍＬ、１．６７ｍｍｏｌ）のＤＭＡ（４ｍＬ）溶液で１０分間、６回処理した。次いで、樹脂を、ヒドラジン一水和物（０．０８１ｍＬ、１．６７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４ｍＬ）溶液で２０分間、３回処理した。樹脂をＤＣＭ（３回）で洗浄した。樹脂（０．１００ｍｍｏｌ）にＨＦＩＰ／ＤＣＭ（３０：７０）（５ｍＬ）を加え、懸濁液を室温で１．５時間撹拌した。切断溶液を濾別し、新鮮なＨＦＩＰ／ＤＣＭ（３０：７０）（５ｍＬ）を加えた。懸濁液を室温で３０分間撹拌した。切断溶液を濾別した。樹脂をＤＣＭ（２×５ｍＬ）で洗浄した。合わせた切断および洗浄溶液を真空中で濃縮乾燥した。残渣をｔＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）から凍結乾燥して、中間体５ｃ（１８７ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）を得た。
【０３９３】
−  ペプチド５の調製
（環化および保護基の除去）
中間体５ｃ（１８７ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（４４．６ｍｇ、０．１１７ｍｍｏｌ）、およびＨＯＡｔ（１６．０ｍｇ、０．１１７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３５ｍＬ）に溶かした溶液を、２，６−ルチジン（０．２１０ｍＬ、１．８０ｍｍｏｌ）で処理し、反応液を室温で２時間撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮乾燥した。残渣の中間体５ｄを９５％ＴＦＡ／ＥＤＴ／ＴＩＳ（９５：２．５：２．５）水溶液（５ｍＬ）に溶解させ、溶液を室温で２．５時間撹拌した。切断溶液を冷ヘプタン／ジエチルエーテル（１：１）（３０ｍＬ）上に注いで、沈殿を得た。懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄した。残渣を冷ヘプタン／ジエチルエーテル（１：１）（１０ｍＬ）で洗浄し、懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄した。洗浄ステップを１回繰り返した。残渣を高真空中で乾燥させた。生成物を分取ＨＰＬＣによって単離し、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏから凍結乾燥して、ペプチド５を白色の固体（４１．４ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）として得た。
【０３９４】
純粋な生成物を、分析ＨＰＬＣ（分析方法Ａ：ｔＲ＝３．７０分）およびＵＰＬＣ−ＭＳ（分析方法Ｃ、測定値：［Ｍ＋３］３＋＝４８４．５、計算値：［Ｍ＋３］３＋＝４８４．６）によって分析した。
【０３９５】
ペプチド７  合成  Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ−Ｆ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ（ラクタムＮ末端−Ｃ末端）
【０３９６】
【化４３】
2016527249.tif 000064
【０３９７】
−  中間体７ａの調製
（２−クロロトリチルクロリド樹脂へのＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨの導入、Ｆｍｏｃ除去、および樹脂の導入量の算定）
２−クロロトリチルクロリド樹脂（２．００ｇ、３．２０ｍｍｏｌ）を、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（０．４７６ｇ、１．６０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２０ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（２．２４ｍＬ、１２．８ｍｍｏｌ）に溶かした溶液と、上述の一般手順と同様に反応させて、中間体７ａ（２．２２ｇ、導入量＝０．６８ｍｍｏｌ／ｇ）を得た。
【０３９８】
−  中間体７ｂの調製
（線状ペプチドの組み立ておよびＦｍｏｃ除去）
中間体７ａ（１４７ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）をＰｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成装置での固相ペプチド合成にかけた。カップリングを以下のとおりに実施した。
【０３９９】
【表１３】
2016527249.tif 000065
【０４００】
ペプチドを組み立てた後、ピペリジン／ＤＭＡ（１：４）で繰り返し処理して、Ｆｍｏｃを除去した。樹脂をＤＭＡで洗浄して、中間体７ｂ（０．１００ｍｍｏｌ）を得た。
【０４０１】
−  中間体７ｃの調製
（樹脂からのＨＦＩＰ切断）
中間体７ｂ（０．１００ｍｍｏｌ）にＨＦＩＰ／ＤＣＭ（３０：７０）（３ｍＬ）を加え、懸濁液を室温で１．５時間振盪した。切断溶液を濾別し、新鮮なＨＦＩＰ／ＤＣＭ（３０：７０）（３ｍＬ）を加えた。懸濁液を室温で３０分間振盪した。切断溶液を濾別した。樹脂をＤＣＭ（２×３ｍＬ）で洗浄した。合わせた切断および洗浄溶液を真空中で濃縮乾燥した。残渣をｔＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）から凍結乾燥して、中間体７ｃ（２０３ｍｇ、０．０６７ｍｍｏｌ）を得た。
【０４０２】
−  中間体７ｄの調製
（主鎖の環化）
中間体７ｃ（２０３ｍｇ、０．０６７ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３３．３ｍｇ、０．０８８ｍｍｏｌ）、およびＨＯＡｔ（１１．９ｍｇ、０．０８８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（４０ｍＬ）に溶かした溶液を、２，６−ルチジン（０．１５７ｍｌ、１．３５ｍｍｏｌ）で処理し、反応液を室温で２時間撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮乾燥して、中間体７ｄ（０．０６７ｍｍｏｌ）を得た。
【０４０３】
−  中間体７ｅの調製
（保護基の除去、次いで精製）
中間体７ｄ（０．０６７ｍｍｏｌ）に９５％ＴＦＡ／ＥＤＴ／ＴＩＳ（９５：２．５：２．５）水溶液の混合物（３ｍＬ）を加え、懸濁液を室温で２．５時間振盪した。溶液を冷ヘプタン／ジエチルエーテル（１：１）の混合物（３０ｍＬ）上に注いで、沈殿を得た。懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄した。残渣を冷ヘプタン／ジエチルエーテル（１：１）（１０ｍＬ）で洗浄し、懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄した。洗浄ステップを１回繰り返した。固体を高真空中で乾燥させた。粗生成物を分取ＨＰＬＣによって精製し、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏから凍結乾燥して、中間体７ｅを白色の固体（３３．６ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）として得た。
【０４０４】
−  ペプチド７の調製
（環化および精製）
中間体７ｅ（３３．６ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ／ＤＭＳＯ（９：１）（３０ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を室温で４０時間撹拌し、次いで真空中で濃縮乾燥した。粗生成物を分取ＨＰＬＣによって精製し、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏから凍結乾燥して、ペプチド７を白色の固体（２１．０ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ）として得た。
【０４０５】
純粋な生成物を、分析ＨＰＬＣ（分析方法Ａ：ｔＲ＝３．８５分）およびＵＰＬＣ−ＭＳ（分析方法Ｃ、測定値：［Ｍ＋３］３＋＝５５３．６、計算値：［Ｍ＋３］３＋＝５５３．６）によって分析した。
【０４０６】
ペプチド８  ｐＥ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ−Ｈ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ−Ｆ−ＯＨ（ジスルフィドＣ６−Ｃ１２）の合成
【０４０７】
【化４４】
2016527249.tif 000066
【０４０８】
−  中間体８ａの調製
（２−クロロトリチルクロリド樹脂へのＦｍｏｃ−Ｆ−ＯＨの導入、Ｆｍｏｃ除去、および樹脂への導入量の算定）
２−クロロトリチルクロリド樹脂（４０．０ｇ、６４．０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（３回）で洗浄した。Ｆｍｏｃ−Ｆ−ＯＨ（２４．８ｇ、６４．０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（４００ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（４４．７ｍＬ、２５６ｍｍｏｌ）に溶かした溶液を加え、懸濁液を室温で２２時間振盪した。樹脂をＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡ（１７：２：１）（３回）、ＤＣＭ（３回）、ＤＭＡ（３回）、ＤＣＭ（３回）で十分に洗浄した。
【０４０９】
次いで、樹脂をピペリジン／ＤＭＡ（１：４）の混合物（４００ｍＬ）で１０分間、４回処理した後、ＤＭＡ（２×１８０ｍｌ）で洗浄した。ピペリジン／ＤＭＡ溶液およびＤＭＡ洗浄溶液を集めて、樹脂への導入量を算定した。合わせた溶液１ｍＬをＭｅＯＨで５００ｍＬに希釈し、２９９．８ｎｍでのＵＶ吸収を測定して、Ａ＝０．３６８とした。これは、４６．２ｍｍｏｌのＦｍｏｃ量に相当する。
【０４１０】
樹脂をＤＣＭ（３回）、ＤＭＡ（３回）、ＤＣＭ（３回）で十分に洗浄し、真空中で乾燥させて、中間体８ａ（５０．７ｇ、導入量＝０．９１ｍｍｏｌ／ｇ）を得た。
【０４１１】
−  中間体８ｂの調製
（線状ペプチドの組み立て）
中間体８ａ（２．６４ｍｇ、２．４０ｍｍｏｌ）をＰｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成装置での固相ペプチド合成にかけた。カップリングを以下のとおりに実施した。
【０４１２】
【表１４】
2016527249.tif 000067
【０４１３】
−  中間体８ｃの調製
（保護基の除去を伴う樹脂からの切断）
中間体８ｂ（２．４０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（４回）で慎重に洗浄した。９５％ＴＦＡ／ＥＤＴ／ＴＩＳ（９５：２．５：２．５）水溶液の混合物（５０ｍＬ）を加え、懸濁液を室温で１時間振盪した。切断溶液を濾別し、新鮮な切断溶液（３５ｍＬ）を加えた。懸濁液を室温で１時間振盪し、次いで切断溶液を濾別した。新鮮な溶液（３５ｍＬ）を加え、懸濁液を室温で１時間振盪した。切断溶液を濾別した。合わせた切断溶液を、冷ヘプタン／ジエチルエーテル（１：１）の撹拌した混合物（５００ｍＬ）上にゆっくりと注いで、沈殿を得た。懸濁液を室温で２時間撹拌し、次いで沈殿を沈降させた。上清をガラス器具（frit）で吸い出した。残渣を冷ヘプタン／ジエチルエーテル（１：１）（２×１００ｍＬ）で洗浄し、上清をガラス器具で吸い出した。固体を高真空中で乾燥させて、中間体８ｃをオフホワイト色の固体（３．７５ｇ、１．８８ｍｍｏｌ）として得た。
【０４１４】
−  ペプチド８の調製
（環化および精製）
中間体８ｃ（３．７５ｇ、１．８８ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ（３７５ｍＬ）に溶解させた。撹拌した溶液に、５０ｍＭのＩ２  ＡｃＯＨ溶液（４５．１ｍＬ、２．２６ｍｍｏｌ）を一度に加え、溶液を室温で１０分間撹拌した。０．５Ｍのアスコルビン酸Ｈ２Ｏ溶液（５．６４ｍＬ、２．８２ｍｍｏｌ）を加えて、過剰のＩ２を失活させた。溶液を濃縮してほぼ乾燥させた。反応は、０．１８８ｍｍｏｌスケールと１．６９ｍｍｏｌスケールの２部で実施した。精製に向けて粗生成物を合わせた。粗生成物を分取ＨＰＬＣによって精製し、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏから凍結乾燥して、ペプチド８を白色の固体（１．５３ｇ、０．７６７ｍｍｏｌ）として得た。
【０４１５】
純粋な生成物を、分析ＨＰＬＣ（分析方法Ａ：ｔＲ＝３．４３分）およびＵＰＬＣ−ＭＳ（分析方法Ｃ、測定値：［Ｍ＋３］３＋＝５１２．４、計算値：［Ｍ＋３］３＋＝５１２．６）によって分析した。
【０４１６】
代わりに、粗製ペプチド８を水に溶解させ（水５００ｍＬ／ポリペプチドｍｍｏｌ）、イオン交換樹脂（すなわち、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−６７（Ａｃｅｔａｔｅ−Ｆｏｒｍ）（２００ｇ／ポリペプチドｍｍｏｌ）を活用して酢酸塩に変換し、分取ＨＰＬＣ（ＤａｉｓｏｇｅｌのＣ８改良逆相シリカゲル、勾配：ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ：３％のＡＣＮおよび９７％の［０．３％酢酸／水混合物］から１２％のＡＣＮおよび８８％の［０．３％酢酸／水混合物］）によって精製し、凍結乾燥して、ペプチド８の酢酸塩を白色の固体（収率６０〜１００％）として得た。
【０４１７】
塩の化学量論性を、酢酸含有量（イオンクロマトグラフィー）および含水量の分析に基づき評価し、１：３〜１：４（ポリペプチド：酢酸塩）の間の範囲になることが明らかになった。
【０４１８】
ペプチド９  ｐＥ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ−Ａｉｂ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ−Ｆ−ＯＨ（ジスルフィドＣ６−Ｃ１２）の合成
【０４１９】
【化４５】
2016527249.tif 000068
【０４２０】
−  中間体９ａの調製
（２−クロロトリチルクロリド樹脂へのＦｍｏｃ−Ｆ−ＯＨの導入、Ｆｍｏｃ除去、および樹脂への導入量の算定）
２−クロロトリチルクロリド樹脂（１０．０ｇ、１６．０ｍｍｏｌ）を、上述の一般手順と同様に、Ｆｍｏｃ−Ｆ−ＯＨ（６．２０ｇ、１６．０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１００ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（１１．２ｍＬ、６４．０ｍｍｏｌ）に溶かした溶液と反応させて、中間体９ａ（１１．６ｇ、導入量＝０．８７ｍｍｏｌ／ｇ）を得た。
【０４２１】
−  中間体９ｂの調製
（線状ペプチドの組み立て）
中間体９ａ（３４５ｍｇ、０．３００ｍｍｏｌ）をＰｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成装置での固相ペプチド合成にかけた。カップリングを以下のとおりに実施した。
【０４２２】
【表１５】
2016527249.tif 000069
【０４２３】
−  中間体９ｃの調製
（保護基の除去を伴う樹脂からの切断、次いで精製）
中間体９ｂ（０．３００ｍｍｏｌ）に、９５％のＴＦＡ／ＥＤＴ／ＴＩＳ（９５：２．５：２．５）水溶液の混合物（９ｍＬ）を加え、懸濁液を室温で２時間振盪した。切断溶液を濾別し、新鮮な切断溶液（４ｍＬ）を加えた。懸濁液を室温で１時間振盪し、次いで切断溶液を濾別した。新鮮な溶液（４ｍＬ）を加え、懸濁液を室温で１時間振盪した。切断溶液を濾別した。合わせた切断溶液を、冷ヘプタン／ジエチルエーテル（１：１）の混合物（１００ｍＬ）中に注いで、沈殿を得た。懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄した、残渣を冷ヘプタン／ジエチルエーテル（１：１）（４０ｍＬ）で洗浄し、懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄した。固体を高真空中で乾燥させた。
【０４２４】
粗生成物を分取ＨＰＬＣによって精製し、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏから凍結乾燥しして、中間体９ｃを白色の固体（１８８ｍｇ、０．１０３ｍｍｏｌ）として得た。
【０４２５】
−  ペプチド９の調製
（環化および精製）
中間体９ｃ（１８８ｍｇ、０．１０３ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ／ＤＭＳＯ（９：１）（１８０ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を室温で４０時間撹拌し、次いで真空中で濃縮乾燥した。粗生成物を分取ＨＰＬＣによって精製し、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏから凍結乾燥して、ペプチド９を白色の固体（９７ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）として得た。
【０４２６】
純粋な生成物を、分析ＨＰＬＣ（分析方法Ａ：ｔＲ＝３．７７分）およびＵＰＬＣ−ＭＳ（分析方法Ｃ、測定値：［Ｍ＋３］３＋＝４９５．２、計算値：［Ｍ＋３］３＋＝４９５．３）によって分析した。
【０４２７】
ペプチド２２  合成  ｐＥ−Ｒ−Ｐ−Ｃ−Ｌ−Ｃ−Ｃ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ−Ｆ−ＯＨ（ジスルフィドＣ４−Ｃ７およびＣ６−Ｃ１２）
【０４２８】
【化４６】
2016527249.tif 000070
【０４２９】
−  中間体２２ａの調製
（２−クロロトリチルクロリド樹脂へのＦｍｏｃ−Ｆ−ＯＨの導入、Ｆｍｏｃ除去、および樹脂への導入量の算定）
２−クロロトリチルクロリド樹脂（１０．０ｇ、１６．０ｍｍｏｌ）を、上述の一般手順と同様に、Ｆｍｏｃ−Ｆ−ＯＨ（６．２０ｇ、１６．０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１００ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（１１．２ｍＬ、６４．０ｍｍｏｌ）に溶かした溶液と反応させて、中間体２２ａ（１１．６ｇ、導入量＝０．８７ｍｍｏｌ／ｇ）を得た。
【０４３０】
−  中間体２２ｂの調製
（線状ペプチドの組み立て）
中間体２２ａ（１１５ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）をＰｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成装置での固相ペプチド合成にかけた。カップリングを以下のとおりに実施した。
【０４３１】
【表１６】
2016527249.tif 000071
【０４３２】
−  中間体２２ｃの調製
（部分的な保護基の除去を伴う樹脂からの切断）
中間体２２ｂ（０．１００ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（４回）で慎重に洗浄した。９５％ＴＦＡ／ＥＤＴ（４：１）水溶液の混合物（０．７５０ｍＬ）を加え、懸濁液を室温で１時間振盪した。懸濁液にＴＦＡ／Ｈ２Ｏ（９５：５）の混合物（２．１８ｍＬ）およびＴＩＳ（７５μＬ）を加え、室温での振盪を１時間継続した。切断溶液を濾別し、樹脂に９５％ＴＦＡ／ＥＤＴ／ＴＩＳ（９５：２．５：２．５）水溶液の混合物（３ｍＬ）を加えた。懸濁液を室温で１時間振盪し、切断溶液を濾別した。新鮮な溶液（３ｍＬ）を加え、懸濁液を室温で１時間振盪した。切断溶液を濾別した。合わせた切断溶液を、冷ヘプタン／ジエチルエーテル（１：１）（３５ｍＬ）上に注いで、沈殿を得た。懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄した。残渣を冷ヘプタン／ジエチルエーテル（１：１）（１０ｍＬ）で洗浄し、懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄した。洗浄ステップを１回繰り返した。残渣を高真空中で乾燥させた。粗生成物を分取ＨＰＬＣによって精製し、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏから凍結乾燥して、中間体２２ｃを白色の固体（５１．１ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）として得た。
【０４３３】
−  ペプチド２２の調製
（２つのジスルフィドのワンポット生成）
中間体２２ｃ（５１．１ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）をＡｃＯＨ（４８ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１２ｍＬ）に溶解させた。５０ｍＭのＩ２  ＡｃＯＨ溶液（１．１２ｍＬ、５６μｍｏｌ）を加え、黄色の溶液を室温で撹拌した。別の５０ｍＭのＩ２  ＡｃＯＨ（５．６１ｍＬ、０．２８１ｍｍｏｌ）を４時間かけて少量ずつ加えた。２１時間後、反応混合物を真空中で２ｍＬに濃縮し、１Ｍのアスコルビン酸Ｈ２Ｏ溶液（６ｍＬ）を加えて、過剰のＩ２を失活させた。生成物を分取ＨＰＬＣによって単離し、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏから凍結乾燥して、ペプチド２２を白色の固体（１９．３ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）として得た。
【０４３４】
純粋な生成物を、分析ＨＰＬＣ（分析方法Ａ：ｔＲ＝４．１６分）およびＵＰＬＣ−ＭＳ（分析方法Ｃ、測定値：［Ｍ＋２］２＋＝７２３．７、計算値：［Ｍ＋２］２＋＝７２３．８）によって分析した。
【０４３５】
ペプチド５２  ｐＥ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ−Ｈ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ−Ｆ−ＮＨ２（ジスルフィドＣ６−Ｃ１２）の合成
【０４３６】
【化４７】
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【０４３７】
−  中間体５２ａの調製
（線状ペプチドの組み立て）
Ｆｍｏｃ保護されたＲｉｎｋ−アミド−ＡＭ−ＰＳ−樹脂（２１７ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）を、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成装置での固相ペプチド合成にかけた。カップリングを以下のとおりに実施した。
【０４３８】
【表１７】
2016527249.tif 000073
【０４３９】
−  中間体５２ｂの調製
（保護基の除去を伴う樹脂からの切断）
中間体５２ａ（０．１ｍｍｏｌ）に９５％ＴＦＡ／ＥＤＴ／ＴＩＳ（９５：２．５：２．５）水溶液の混合物（３ｍＬ）を加え、懸濁液を室温で１．５時間振盪した。切断溶液を濾別し、新鮮な切断溶液（２ｍＬ）を加えた。懸濁液を室温で４５分間振盪し、次いで切断溶液を濾別した。新鮮な溶液（２ｍＬ）を加え、懸濁液を室温で４５分間振盪した。合わせた切断溶液を、冷ヘプタン／ジエチルエーテル（１：１）の混合物（３５ｍＬ）上へ注いで、沈殿を得た。懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄した。残渣を冷ヘプタン／ジエチルエーテル（１：１）（１０ｍＬ）で洗浄し、懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄した。固体を高真空中で乾燥させた。粗生成物の中間体５２ｂを、精製せずに次のステップに使用した。
【０４４０】
−  ペプチド５２の調製
（環化および精製）
中間体５２ｂ（０．１００ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ（２０ｍＬ）に溶解させた。撹拌した溶液に、５０ｍＭのＩ２  ＡｃＯＨ溶液（２．４ｍＬ、０．１２０ｍｍｏｌ）を一度に加え、溶液を室温で３０分間撹拌した。０．５Ｍのアスコルビン酸Ｈ２Ｏ溶液（０．３０ｍＬ、０．３００ｍｍｏｌ）を加えて、過剰のＩ２を失活させた。溶液を濃縮してほぼ乾燥させた。粗生成物を分取ＨＰＬＣによって精製し、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏから凍結乾燥して、ペプチド５２を白色の固体（５０．５ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）として得た。
【０４４１】
純粋な生成物を、分析ＨＰＬＣ（分析方法Ａ：ｔＲ＝３．２２分）およびＵＰＬＣ−ＭＳ（分析方法Ｃ、測定値：［Ｍ＋３］３＋＝５１２．３、計算値：［Ｍ＋３］３＋＝５１２．３）によって分析した。
【０４４２】
他のペプチドは、似たようにして合成した。
−  ペプチド２〜４は、ペプチド１と同様に合成した。
−  ペプチド６は、ペプチド５と同様に合成した。
−  ペプチド１０〜２１は、ペプチド９と同様に合成した。
−  ペプチド２３は、ペプチド２２と同様に合成した。
−  ペプチド２４〜５１は、ペプチド８と同様に合成した。
−  ペプチド５３は、ペプチド５２と同様に合成した。
【０４４３】
ペプチド５４：６位と１２位にある２つのシステイン間にモノスルフィド連結［Ｃ６−Ｃ１２］を有するｐＥ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ−Ｈ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ−Ｆ−ＯＨ
【０４４４】
【化４８】
2016527249.tif 000074
ペプチド８である（Ｓ）−２−（（３Ｓ，６Ｒ，１１Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ，２５ａＳ）−１４−（（１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル）−１７−（４−アミノブチル）−３−ブチル−１１−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−５−グアニジノ−２−（（Ｓ）−１−（（Ｓ）−５−グアニジノ−２−（（Ｓ）−５−オキソピロリジン−２−カルボキサミド）ペンタノイル）ピロリジン−２−カルボキサミド）ペンタンアミド）−４−メチルペンタンアミド）−１，４，１２，１５，１８，２１−ヘキサオキソドコサヒドロ−１Ｈ−ピロロ［２，１−ｊ］［１，２，５，８，１１，１４，１７，２０］ジチアヘキサアザシクロトリコシン−６−カルボキサミド）−３−フェニルプロパン酸ＴＦＡ塩（３０ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ヘキサメチルホスフィントリアミン（１２．３ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）をＰＢＳ  ｐＨ９．２緩衝液（１ｍＬ）に混ぜた混合物を、室温で３日間撹拌した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ  Ｃ１８、０．１％ＴＦＡ水溶液／ＭｅＣＮ）によって２回精製し、生成物画分を凍結乾燥して、ペプチド５４を白色の粉末（４ｍｇ、１３．４％）として得た。［Ｍ＋２Ｈ］２＋（計算値）＝７５２．８８、［Ｍ＋２Ｈ］２＋（測定値）＝７５２．４０、［Ｍ＋３Ｈ］３＋（計算値）＝５０２．２６、［Ｍ＋３Ｈ］３＋（測定値）＝５０１．９４。ＨＰＬＣ（分析方法Ｂ）、ｔＲ＝６．９３分。
【０４４５】
ペプチド１〜５４は、上述のとおりに、かつ／または、溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などの従来の精製技術を組み合わせて、精製および単離することができる。上の実施例で単離されたポリペプチドが遊離化合物である場合では、既知の方法によって適切な塩に変換することができる。したがって、ペプチド１〜５４は、ポリペプチド：塩比を１：１〜１：４の範囲として、その対応する塩（たとえば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、または注入に適する他の薬学的な塩）に変換することができる。たとえば、ペプチド１〜５４を、水に溶解させ、イオン交換樹脂を使用して塩に変換することができる。逆に、単離されたペプチドが塩である場合では、既知の方法によって遊離ペプチドに、またはイオン交換樹脂を活用して異なる塩に直接変換することができる。
【０４４６】
ペプチド−リンカー構築物１および２は、以下のとおりに合成した。
ペプチド−リンカー生成物は、λ＝２１４ｎｍでのＵＶ検出を使用する分析ＨＰＬＣ（カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ３００  Ｃ１８（１００×４．６ｍｍ）、３μｍ、部品番号：１８６００３６１２）によって分析し、移動相は、溶離液Ａ（０．１％のＨ２Ｏ中ＴＦＡ）、溶離液Ｂ（０．４％のＡＣＮ中ＴＦＡ）からなるものであった。生成物の追加の特徴付けは、ダイオードアレイ検出器を備えたＵＰＬＣ−ＭＳ（カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ  Ｃ１８、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ、部品番号：１８６００２３５０）によって、エレクトロスプレーイオン化を使用して行った。移動相は、溶離液Ａ：０．０５％のＦＡ＋３．７５ｍＭの酢酸アンモニウム水溶液、溶離液Ｂ：０．０４％のＡＣＮ中ＦＡからなるものであった。
【０４４７】
ペプチドは、標準の固相Ｆｍｏｃ化学によって合成した。ペプチドは、Ｌｉｂｅｒｔｙマイクロ波ペプチド合成装置（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国ノースカロライナ州）において組み立てた。Ｃ末端上に遊離カルボン酸を有するペプチドは、２−クロロトリチルクロリド−ＰＳ−樹脂（ＡｎａＳｐｅｃ，Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州）から合成した。
【０４４８】
ペプチドは、分取逆相ＨＰＬＣによって精製した。次のカラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、３０×５０ｍｍ、部品番号１８６００２５７０を使用した。
【０４４９】
移動相は、溶離液Ａ（０．１％ＴＦＡ  Ｈ２Ｏ溶液）と溶離液Ｂ（ＡＣＮ）からなるものとした。勾配は、分離の問題の特定の要件に基づき設計した。純粋な生成物を、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏから凍結乾燥した。
【０４５０】
生成物は、λ＝２１４ｎｍでのＵＶ検出を使用する分析ＨＰＬＣ（カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ３００  Ｃ１８（１００×４．６ｍｍ）、３μｍ、部品番号：１８６００３６１２）によって分析し、移動相は、溶離液Ａ（０．１％のＨ２Ｏ中ＴＦＡ）、溶離液Ｂ（０．１％のＡＣＮ中ＴＦＡ）からなるものであった。生成物の追加の特徴付けは、ダイオードアレイ検出器を備えたＵＰＬＣ−ＭＳ（カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ  Ｃ１８、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ、部品番号：１８６００２３５０）によって、エレクトロスプレーイオン化を使用して行った。移動相は、溶離液Ａ：０．０５％のＦＡ＋３．７５ｍＭの酢酸アンモニウム水溶液、溶離液Ｂ：０．０４％のＡＣＮ中ＦＡからなるものであった。
【０４５１】
以下で例示するペプチド−リンカー構築物は、以下に記載する一般手順を使用して合成した。非置換のＮ末端またはＣ末端は、それぞれ、細いイタリック体のＨ−または−ＯＨで示す。
【０４５２】
ペプチド−リンカー構築物１および２の分析方法
１）ＵＰＬＣ−ＭＳ−分析方法Ｄ
−  Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ  Ｃ１８、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ、部品番号：１８６００２３５０
−  溶離液Ａ：０．０５％のＦＡ＋３．７５ｍＭの酢酸アンモニウム水溶液、溶離液Ｂ：０．０４％のＡＣＮ中ＦＡ
−  流量：１．０ｍｌ／分
−  温度：５０℃
−  勾配：１．７分で２〜４４％
【０４５３】
２）ＵＰＬＣ−ＨＲＭＳ−分析方法Ｅ
−  Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ  Ｃ１８、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ、部品番号：１８６００２３５０
−  溶離液Ａ：０．１％のＦＡ、溶離液Ｂ：０．１％のＡＣＮ中ＦＡ
−  流量：１．０ｍｌ／分
−  温度：５０℃
−  勾配：４．４分で２〜９８％
【０４５４】
３）ＵＰＬＣ−ＭＳ−分析方法Ｆ
−  Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ３００  ＳＥＣガードカラム、４．６×３０ｍｍ、部品番号：１８６００５７９３
−  溶離液Ａ：０．１％の水中ＦＡ、溶離液Ｂ：０．０４％のＡＣＮ中ＦＡ
−  流量：１．０ｍｌ／分
−  勾配：６分間５０％のＢ
【０４５５】
４）ＵＰＬＣ−ＭＳ−分析方法Ｇ
−  Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＰｒｏＳｗｉｆｔ  ＲＰ−３、１．７μｍ、４．６×５０ｍｍ、部品番号：０６４２９８
−  溶離液Ａ：０．１％の水中ＦＡ、溶離液Ｂ：０．０８％のＡＣＮ中ＦＡ
−  流量：２．０ｍｌ／分（２分で３〜８０％のＢ）−流量１．８ｍＬ／分
−  温度：４０℃
−  勾配：３分で２〜９８％
【０４５６】
ペプチド−リンカー構築物１および２についての一般手順
１）最初のアミノ酸の２−クロロトリチルクロリド樹脂への導入およびＦｍｏｃ除去
２−クロロトリチルクロリド樹脂（１当量、１．０〜１．６ｍｍｏｌ／ｇ）をＤＣＭで十分に洗浄した。所望のアミノ酸（通常は、１．６ｍｍｏｌ／ｇの導入量を考えて、樹脂に対して０．５〜２当量）を、ＤＣＭ（樹脂１グラムあたりおよそ１０ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（１．６ｍｍｏｌ／ｇの導入量を考えて、樹脂に対して４当量）に溶解させた。溶液を樹脂に加え、懸濁液を室温で１９時間振盪した。樹脂を排出し、次いで、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡ（１７：２：１）、ＤＣＭ、ＤＭＡ、ＤＣＭで順次、十分に洗浄した。
【０４５７】
Ｆｍｏｃ除去および導入量の算定については、樹脂をピペリジン／ＤＭＡ（１：４）または４−メチルピペリジン／ＤＭＡ（１：４）（最初の樹脂１グラムあたり１２×１０ｍＬ）と共に繰り返し振盪し、ＤＭＡ（最初の樹脂１グラムあたり２×１０ｍＬ）で洗浄した。合わせた溶液をＭｅＯＨで希釈して、体積Ｖを最初の樹脂１グラムあたり２５０ｍＬとした。この溶液の２ｍＬのアリコート（Ｖａ）をＭｅＯＨでさらに希釈して２５０ｍＬ（Ｖｔ）とした。ＵＶ吸収を、ＭｅＯＨを基準として２９９．８ｎｍで測定して、吸収Ａを得た。樹脂を、順次ＤＭＡ、ＤＣＭ、ＤＭＡ、ＤＣＭで十分に洗浄し、高真空中にて４０℃で乾燥させて、ｍｇの樹脂を得た。
【０４５８】
樹脂への導入量は、式：
導入量［ｍｏｌ／ｇ］＝（Ａ×Ｖｔ×Ｖ）／（ｄ×ε×Ｖａ×ｍ）
（ｄ：セルの幅、ε＝７８００Ｌ  ｍｏｌ−１ｃｍ−１）
に従って算出する。
【０４５９】
２）Ｌｉｂｅｒｔｙ（商標）合成装置での固相ペプチド合成
合成サイクル
樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。２０％ピペリジンまたは２０％４−Ｍｅ−ピペリジン／ＤＭＦでの処理（通常は、０．１ｍｍｏｌあたり７ｍｌ  ２回）によって、Ｆｍｏｃを除去した。樹脂をＤＭＦで洗浄した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸（５当量、０．２Ｍ  ＤＭＦ溶液）、ＨＣＴＵ（５当量、０．５Ｍ  ＤＭＦ溶液）、およびＤＩＰＥＡ（１０当量、２Ｍ  ＮＭＰ溶液）を加えた後、懸濁液を、窒素中にて、特定の要件に応じて、マイクロ波電力を０〜２０ワットとして、通常は５〜５０分間、７５または５０℃で混合することにより、カップリングを行った。ＤＭＦで洗浄した後、カップリングステップを、特定の要件に応じて１回繰り返すとよい。樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。
【０４６０】
３）保護基の除去を伴うまたは伴わない樹脂からの切断
樹脂（０．１ｍｍｏｌ）を、９５％のＴＦＡ／／ＴＩＳ／ＤＴＴ（９５：２．５：２．５）水溶液（３ｍＬ）と共に室温で３時間振盪した。切断溶液を濾別した。樹脂を９５％ＴＦＡ（１ｍＬ）水溶液で一回すすいだ。合わせた切断および洗浄溶液を冷ヘプタン／ジエチルエーテル（１：１）の混合物（１０〜１５ｍＬ）上へゆっくりと注いで、沈殿を得た。懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄した。残渣にジエチルエーテル（１０ｍＬ）を加え、懸濁液を３分間ボルテックスし、遠心分離し、上清を廃棄した。洗浄過程を２回繰り返した。固体を高真空中で乾燥させた。
【０４６１】
４）ジスルフィド生成
環化方法：
完全に脱保護された線状前駆体ペプチド（１当量）をＨ２Ｏに溶解させて、通常は約１０〜２５ｍＭの濃度とした。撹拌した溶液に、５０ｍＭのＩ２  ＡｃＯＨ溶液（１〜２当量）を一度に加え、完全な変換が実現されるまで、反応液を室温で撹拌した。０．５Ｍのアスコルビン酸Ｈ２Ｏ溶液を加えて、過剰のＩ２を失活させた。
【０４６２】
ペプチド−リンカー構築物１：ＭＰＡ−Ｏ２Ｏｃ−Ｏ２Ｏｃ−Ｏ２Ｏｃ−Ｏ２Ｏｃ−Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ＊−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ＊−ｆ−ＯＨ［ＭＰＡは、３−マレイミドプロピオン酸である］
【０４６３】
【化４９】
2016527249.tif 000075
【０４６４】
−  中間体１ａの調製
（２−クロロトリチルクロリド樹脂へのＦｍｏｃ−ｆ−ＯＨの導入、Ｆｍｏｃ除去、および樹脂への導入量の算定）
２−クロロトリチルクロリド樹脂（５．０ｇ、８．０１ｍｍｏｌ）を、上述の一般手順と同様に、Ｆｍｏｃ−ｆ−ＯＨ（３．１０ｇ、８．０１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５０ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（５．５９ｍＬ、３２．０ｍｍｏｌ）に溶かした溶液と反応させて、中間体１ａ（５．８７ｇ、導入量＝０．８９７ｍｍｏｌ／ｇ）を得た。
【０４６５】
−  中間体１ｂの調製
（線状ペプチドの組み立て）
中間体１ａ（０．２５０ｍｍｏｌ）をＬｉｂｅｒｔｙ（商標）マイクロ波ペプチド合成装置での固相ペプチド合成にかけた。カップリングを次のとおりに実施した。
【０４６６】
【表１８】
2016527249.tif 000076
【０４６７】
−  中間体１ｃの調製
（保護基の除去を伴う樹脂からの切断、次いで精製）
６ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＰＳ／水（９５：２．５：２．５）中の１．５４ｇのＤＴＴおよび０．７５ｍＬのチオアニソールでできた溶液に、中間体１ｂ（０．２５ｍｍｏｌ）を加え、懸濁液を室温で５時間振盪した。切断溶液を濾別し、樹脂を９５％ＴＦＡ水溶液（１ｍＬ）で洗浄した。合わせた切断および洗浄溶液を冷ジエチルエーテル（４０ｍＬ）へ注いで、沈殿を得た。懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄した。残渣にジエチルエーテル（４０ｍＬ）を加え、懸濁液を３分間ボルテックスし、遠心分離し、上清を廃棄した。洗浄過程を３回繰り返した。固体を高真空中で乾燥させた。粗生成物を分取ＨＰＬＣによって精製し、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏから凍結乾燥して、中間体１ｃを白色の粉末（１７８ｍｇ、７１μｍｏｌ）として得た。
【０４６８】
純粋な生成物をＵＰＬＣ−ＭＳ（分析方法Ｄ；ｔＲ＝１．３３分、測定値：［Ｍ＋２Ｈ］２＋＝１０７８．１、計算値：［Ｍ＋２Ｈ］２＋＝１０７８．３）によって分析した。
【０４６９】
中間体１ｄの調製
（環化および精製）
中間体１ｃ（１７８ｍｇ、７１μｍｏｌ）をＨ２Ｏ（２．０ｍＬ）に溶解させた。撹拌した溶液に、５０ｍＭのＩ２  ＡｃＯＨ溶液（Ｉ２（５０ｍＭ  ＨＯＡｃ溶液）（１．８５ｍＬ、９３μｍｏｌ）を一度に加え、ＬＣ／ＭＳによって、反応が完了したことが示されるまで、溶液を室温で終夜撹拌した。０．５Ｍのアスコルビン酸Ｈ２Ｏ溶液を加えて、過剰のＩ２を失活させた。粗生成物を分取ＨＰＬＣによって精製し、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏから凍結乾燥して、中間体１ｄを白色の粉末（９２ｍｇ、３５μｍｏｌ）として得た。
【０４７０】
純粋な生成物をＵＰＬＣ−ＭＳによって分析した（分析方法Ｄ、ｔＲ＝１．４４分、測定値：［Ｍ＋２］２＋＝１０７７．４、計算値：［Ｍ＋２］２＋＝１０７７．２）。
【０４７１】
ペプチド−リンカー構築物１の調製
中間体１ｄの調製物（３０ｍｇ、１２μｍｏｌ）、３−（マレイミド）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（３．０６ｍｇ、１２μｍｏｌ）、および炭酸水素ナトリウム溶液（５０μＬ、１Ｍ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に混ぜた混合物を、２５℃で２時間振盪した。反応混合物をＭｅＯＨで希釈し、濾過した。溶液を分取ＨＰＬＣによって精製し、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏから凍結乾燥して、ペプチド−リンカー構築物１を白色の粉末（１２ｍｇ、４．５４μｍｏｌ）として得た。
【０４７２】
純粋な生成物をＵＰＬＣ−ＭＳによって分析した（分析方法Ｄ、ｔＲ＝１．５９分、測定値：［Ｍ＋２］２＋＝１１５３．０、計算値：［Ｍ＋２］２＋＝１１５２．８）。
【０４７３】
ペプチド−リンカー構築物２：ＰＰＡ−Ｏ２Ｏｃ−Ｏ２Ｏｃ−Ｏ２Ｏｃ−Ｏ２Ｏｃ−Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ＊−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ＊−ｆ−ＯＨ［ＰＰＡは、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸である］
中間体１ｄの調製物（２７ｍｇ、１０．４μｍｏｌ）、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（５．７ｍｇ、１８μｍｏｌ）、および炭酸水素ナトリウム溶液（７２μＬ、１Ｍ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に混ぜた混合物を、２５℃で２時間振盪した。反応混合物をＭｅＯＨで希釈し、濾過した。溶液を分取ＨＰＬＣによって精製し、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏから凍結乾燥して、ペプチド−リンカー構築物２を白色の粉末（１０ｍｇ、３．７１μｍｏｌ）として得た。
【０４７４】
純粋な生成物をＵＰＬＣ−ＭＳによって分析した（分析方法Ｄ、ｔＲ＝１．７１分、測定値：［Ｍ＋２］２＋＝１１７５．７、計算値：［Ｍ＋２］２＋＝１１７５．９）。
【０４７５】
［実施例１］
アルブミン−ＭＰＡ−Ｏ２Ｏｃ−Ｏ２Ｏｃ−Ｏ２Ｏｃ−Ｏ２Ｏｃ−Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ＊−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ＊−ｆ−ＯＨ
ステップ１：アルブミン脱キャッピング
−  ＴＣＥＰによる脱キャッピング
１５ｍＬチューブに入った、アルブミン（５００ｍｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ、ヒト血清からの凍結乾燥粉末）を１０ｍＬのＰＢＳ  １×緩衝液に溶かした溶液に、ＴＣＥＰ塩酸塩の溶液（生物学グレード精製水中１．０７４ｍｇ）を一度に加えた。得られた溶液を室温で１時間振盪し、次いで脱塩し、２本のＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４遠心式フィルター（３０Ｋ  ＭＷＣＯ）で洗浄した。フィルターを４Ｋ  ｇで４０分間スピンにかけ、濾液を廃棄した。各フィルターに３ｍＬの生物学グレード精製水を加えてそれぞれ洗浄し（１４Ｋ  ｇで１０分間スピンにかけ）、洗浄過程を３回繰り返した。脱キャッピングされたＨＳＡを水（合計約２０ｍＬ）に溶解させた。溶液を５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに移し、凍結乾燥して、結晶質の粉末（５００ｍｇ）を得た。
【０４７６】
純粋な生成物をＵＰＬＣ−ＭＳによって分析した（分析方法Ｉ、測定値：６６４３９．０、予想値：６６４３７）。
【０４７７】
−  脱キャッピングされたＨＳＡ中の遊離チオール基の数の算定
２ｍＬチューブに入った、この脱キャッピングされたＨＳＡ（２ｍｇ）を４００μＬのＰＢＳ  ｐＨ７．４に溶かした溶液に、６−マレイミドヘキサン酸（１３μｇ）の水溶液を加えた。得られた溶液を室温で２時間振盪した。ＵＰＬＣ−ＭＳ（分析方法Ｇ）によって、単一付加物の生成だけが示された。測定値：６６６４９．０、予想値：６６６４８。
【０４７８】
−  ＤＴＴによる脱キャッピング
１５ｍＬチューブに入った、アルブミン（４００ｍｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ、ヒト血清からの凍結乾燥粉末）を５ｍＬのＰＢＳ  １×緩衝液に溶かした溶液に、ＤＴＴの溶液（０．２３２μｌ、生物学グレード精製水中２ｍｇ／ｍＬ）を一度に加えた。得られた溶液を室温で２時間振盪し、次いで脱塩し、２０本のＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５遠心式フィルター（１０Ｋ  ＭＷＣＯ）で洗浄した。フィルターを１４Ｋ  ｇで１０分間スピンにかけ、濾液を廃棄した。各フィルターの頂部に生物学グレード精製水を加えてそれぞれ洗浄し（１４Ｋ  ｇで１０分間スピンにかけ）、洗浄過程を６回繰り返した。脱キャッピングされたＨＳＡを水（合計約２０ｍＬ）に溶解させた。溶液を５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに移し、凍結乾燥して、結晶質の粉末（３７６ｍｇ）を得た。
【０４７９】
純粋な生成物をＵＰＬＣ−ＭＳによって分析した（分析方法Ｇ、測定値：６６４３８．５、予想値：６６４３７）。
【０４８０】
−  脱キャッピングされたＨＳＡ中の遊離チオール基の数の算定
２ｍＬチューブに入った、この脱キャッピングされたＨＳＡ（３ｍｇ）を４００μＬのＰＢＳ  ｐＨ７．４に溶かした溶液に、３−マレイミドプロピオン酸（２５μｇ）の水溶液を加えた。得られた溶液を室温で終夜振盪した。ＵＰＬＣ−ＭＳ（分析方法Ｇ）によって、単一付加物の生成だけが示された。測定値：６６６０８．０、予想値：６６６０６。
【０４８１】
−  システインによる脱キャッピング
２ｍＬチューブに入った、アルブミン（１２０ｍｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ、ヒト血清からの凍結乾燥粉末）を１ｍＬの５０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液ｐＨ８．０に溶かした溶液に、システイン（１０．９４ｍｇ）を一度に加えた。得られた溶液を室温で１時間振盪し、次いで脱塩し、２本のＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５遠心式フィルター（１０Ｋ  ＭＷＣＯ）で洗浄した。フィルターを１４Ｋ  ｇで１０分間スピンにかけ、濾液を廃棄した。各フィルターの頂部に生物学グレード精製水を加えてそれぞれ洗浄し（１４Ｋ  ｇで１０分間スピンにかけ）、洗浄過程を５回繰り返した。脱キャッピングされたＨＳＡを、水（合計４ｍＬ）に溶解させた。溶液を１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに移し、凍結乾燥して、結晶質の粉末（１０８ｍｇ）を得た。
【０４８２】
純粋な生成物をＵＰＬＣ−ＭＳによって分析した（分析方法Ｇ、測定値：６６４３９、予想値：６６４３７）。
【０４８３】
−  脱キャッピングされたＨＳＡ中の遊離チオール基の数の算定
２ｍＬチューブに入った、この脱キャッピングされたＨＳＡ（３ｍｇ）を５００μＬのＰＢＳ  ｐＨ７．４に溶かした溶液に、３−マレイミドプロピオン酸（１５μｇ）の水溶液を加えた。得られた溶液を室温で１時間振盪した。ＵＰＬＣ−ＭＳ（分析方法Ｇ）によって、単一付加物の生成だけが示された。測定値：６６６０８．０、予想値：６６６０６。
【０４８４】
ステップ２：ペプチド−リンカー構築物／アルブミンコンジュゲーション
脱キャッピングされたＨＳＡ（９７ｍｇ）をＰＢＳ緩衝液に溶かした溶液を、ペプチド−リンカー構築物１の溶液（水中１１．６ｍｇ）で処理した。得られた溶液を室温で終夜振盪し、次いで脱塩し、６本のＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５遠心式フィルター（１０Ｋ  ＭＷＣＯ）で洗浄した。フィルターを１３Ｋ  ｇで１０分間スピンにかけ、濾液を廃棄した。各フィルターの頂部に生物学グレード精製水を加えてそれぞれ洗浄し（１３Ｋ  ｇで１０分間スピンにかけ）、洗浄過程を６回繰り返した。コンジュゲートを水（合計４ｍＬ）に溶解させた。溶液を１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに移し、凍結乾燥して、結晶質の粉末（９０．５ｍｇ）を得た。
【０４８５】
純粋な生成物をＵＰＬＣ−ＭＳによって分析した（分析方法Ｇ、測定値：６８７４２．５、予想値：６８７４１）。
【０４８６】
［実施例２］
アルブミン−ＴＰＡ−Ｏ２Ｏｃ−Ｏ２Ｏｃ−Ｏ２Ｏｃ−Ｏ２Ｏｃ−Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ＊−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ＊−ｆ−ＯＨ［ＴＰＡは、３−メルカプトプロパン酸である］
ペプチド−リンカー構築物２（８ｍｇ）および炭酸水素ナトリウム（８．９２ｕＬ、１Ｍ）をＰＢＳ緩衝液（１ｍＬ）に溶かした溶液に、脱キャッピングされたＨＳＡ（６５．８ｍｇ）をＰＢＳ緩衝液（１ｍＬ）に溶かした溶液を少量ずつ（３０分毎に１００ｕｌ）加えた。加えた後、得られた溶液を室温で終夜振盪し、次いで脱塩し、４本のＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５遠心式フィルター（１０Ｋ  ＭＷＣＯ）で洗浄した。フィルターを１３Ｋ  ｇで１０分間回転させ、濾液を廃棄した。各フィルターの頂部に生物学グレードの精製水を加えてそれぞれ洗浄し（１３Ｋ  ｇで１０分間回転させ）、洗浄過程を５回繰り返した。コンジュゲートを水（合計４ｍＬ）に溶解させた。溶液を１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに移し、凍結乾燥して、結晶質の粉末（６５．６ｍｇ）を得た。
【０４８７】
純粋な生成物をＵＰＬＣ−ＭＳによって分析した（分析方法Ｇ、測定値：６８６７７、予測値：６８６７８）。
【０４８８】
［実施例３］
アルブミン−ＭＰＡ−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ＝Ｏ−Ａ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ｈ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｐ−Ｆ−ＯＨ
実施例３は、実施例１のように合成した。純粋な生成物をＵＰＬＣ−ＭＳによって分析した（分析方法Ｇ、測定値：６８３６７、予測値：６８３６６）
【０４８９】
Ｆｃ−アペリン構築物のクローン化：
以下のＤＮＡ断片は、次のプライマーを用い、ベクターｐＰＬ１１４６を鋳型として使用する標準のＰＣＲ技術を使用して作製した。ＮｈｅＩ部位に続いて、ベクターｐＰＬ１１４６に含まれているヒトＦｃの５’末端に対応する配列を収容する、５’プライマーを設計した。３’プライマーは、ＥｃｏＲＩ部位、適切な構築物のためのアペリン配列、グリシンセリンリンカー、および、ｐＰＬ１１４６に含まれているヒトＦｃの３’末端に相補的な配列を収容するように設計した。増幅した後、４つの断片それぞれを、ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ両方の制限酵素で制限消化し、単離および精製し、同じようにして消化および精製したベクターｐＰＬ１１４６に連結した。連結物を大腸菌（E coli）細胞に形質転換し、適正なプラスミドを含んでいるコロニーを、ＤＮＡ配列決定によって鑑別した。示す配列は、センス鎖についてのものであり、５’から３’方向に伸びている。
【０４９０】
Ｆｃ−アペリン融合物（実施例４〜実施例７）
Ｆｃ−アペリンのタンパク質発現および精製：
標準のポリエチレンイミン法を使用して、１ｍｌあたり約１０Ｅ６細胞の密度で、発現プラスミドＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入した。次いで、５００ｍｌの培養物を、３Ｌフラスコ中のＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  培地Ｇｉｂｃｏ）において３７℃で３日間成長させた。
【０４９１】
Ｆｃ−アペリンタンパク質は、清澄化した条件培地から、プロテインＡセファロースＦＦを用いて精製した。簡潔に述べると、５００ｍｌの条件培地を、２ｍｌのプロテインＡセファロースに、４℃で終夜バッチ結合させた。プロテインＡセファロースを使い捨てカラムに移し、ＰＢＳで徹底的に洗浄した。Ｆｃ−アペリンタンパク質を０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．７）で溶離させ、１Ｍ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）で中和し、ＰＢＳに対して透析した。収量は、条件培地５００ｍｌあたり１０〜２０ｍｇであり、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＥＮＤＯＳＡＦＥ  ＰＴＳ試験によって測定したとき、エンドトキシンレベルは低かった（１Ｅｕ／ｍｇ未満）。
【０４９２】
Ｆｃ−アペリンタンパク質の品質管理：
未変性Ｆｃ−アペリンタンパク質のＬＣ／ＭＳ：
ピークは、不均一であり、二量体について予想されるより約３ｋＤａ大きかった。これは、Ｎ連結型グリコシル化コンセンサス部位を有するＦｃについて予想されるＮ連結型グリコシル化の特性を示している。
【０４９３】
還元されたＮ−脱グリコシルＦｃ−アペリンタンパク質のＬＣ／ＭＳ：鋭利なピークを示す。Ｆｃ−アペリン３および４ならびにＦｃ−Ｃｙｓの分子量は、予想通りであり、Ｆｃ−アペリン１および２ならびにＣｙｓ−Ｆｃの分子量は、Ｃ末端アミノ酸の切断と矛盾がなかった。Ｃ末端のシステインは、タンパク質を切断から保護すると思われる。
【０４９４】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００での分析的サイズ排斥：Ｆｃ−アペリンタンパク質は、８９％〜１００％の間の二量体、０〜１０％の四量体、および０〜１％の凝集体を有する。
【０４９５】
還元ＳＤＳ／ＰＡＧＥ：すべてのタンパク質が、主に、予想されたサイズのモノマーとして移動した。
【０４９６】
ヌクレオチド配列：
Ｆｃ−アペリン融合物：実施例４
【０４９７】
【化５０】
2016527249.tif 000077
【０４９８】
Ｆｃ−アペリン融合物：実施例５
【０４９９】
【化５１】
2016527249.tif 000078
【０５００】
Ｆｃ−アペリン融合物：実施例６
【０５０１】
【化５２】
2016527249.tif 000079
【０５０２】
Ｆｃ−アペリン融合物：実施例７
【０５０３】
【化５３】
2016527249.tif 000080
【０５０４】
プライマー配列：
【０５０５】
【表１９】
2016527249.tif 000081
【０５０６】
［実施例４］
Ｆｃ−アペリン融合物：
【０５０７】
【化５４】
2016527249.tif 000082
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳは、リンカーを表し、ＱＲＰＲＬＳＨＫＧＰＭＰＦは、ポリペプチドである。
【０５０８】
［実施例５］
Ｆｃ−アペリン融合物：
【０５０９】
【化５５】
2016527249.tif 000083
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳは、リンカーを表し、ＱＲＰＲＬＳＨＫＧＰＭＰＦは、ポリペプチドである。
【０５１０】
［実施例６］
Ｆｃ−アペリン融合物：
【０５１１】
【化５６】
2016527249.tif 000084
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳは、リンカーを表し、ＱＲＰＲＬＣ＊ＨＫＧＰＭＣ＊Ｆは、ポリペプチドである。
【０５１２】
［実施例７］
Ｆｃ−アペリン融合物：
【０５１３】
【化５７】
2016527249.tif 000085
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳは、リンカーを表し、ＱＲＰＲＬＣ＊ＨＫＧＰＭＣ＊Ｆは、ポリペプチドである。
【０５１４】
Ｆｃ−アペリン構築物のクローン化：
以下に示すＦｃ−アペリンＤＮＡ断片は、ＣＭＶプロモーターの下流に、マウスＩｇκシグナル配列に続いてヒトＦｃを含んでいるベクターｐＰＬ１１４６を鋳型として使用する標準のＰＣＲ技術によって作製した。ＮｈｅＩ部位に続いて、ベクターｐＰＬ１１４６に含まれているシグナル配列の５’末端に対応する配列を収容する、順方向プライマー（５’−ＧＣＴ  ＴＧＣ  ＴＡＧ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＡＡ  ＣＴＧ−３’）を設計した。逆方向プライマー（５’−ＧＴＴ  ＧＡＴ  ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＣＴＴ  ＡＧＡ  ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＣＣＴ  ＴＧＴ  ＧＧＣ  ＡＣＡ  ＧＣＣ  ＧＧＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＴＴＣ  ＣＧＣ  ＣＡＣ  ＣＴＣ  ＣＧＣ  ＴＧＣ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＣＧＣ  ＣＧＣ  ＴＧＣ  ＣＴＣ  ＣＧＣ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＣＧＣ  ＣＴＧ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＧＡＧ  ＡＣＡ  ＧＧＧ−３’）は、ＥｃｏＲＩ部位、アペリン配列、グリシンセリンリンカー、および、ｐＰＬ１１４６に含まれているヒトＦｃの３’末端に相補的な配列を収容するように設計した。増幅した後、断片を、ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ両方で制限消化し、アガロースゲルから単離および精製し、同じようにして消化および精製したベクターｐＰＬ１１４６に連結した。連結物を大腸菌（E coli）ＤＨ５α細胞に形質転換し、適正なプラスミドを含んでいるコロニーを、ＤＮＡ配列決定によって鑑別した。示した他のＦｃ−アペリン融合物のＦｃ融合物、リンカー、および／またはアペリン配列の改変は、実施例９を鋳型として使用する標準の部位特異的突然変異誘発プロトコールによって生じさせた。アペリンのＣ末端にＦｃ融合物を含んでいる実施例８は、遺伝子合成（ＧｅｎｅＡｒｔ）によってコドン最適化し、挿入物を上述のとおりにベクターｐＰＬ１１４６にクローン化した。示す配列は、センス鎖についてのものであり、５’から３’方向に伸びている。
【０５１５】
Ｆｃ−アペリンのタンパク質発現および精製：
標準のポリエチレンイミン法を使用して、１ｍｌあたり１×１０６細胞の密度で、Ｆｃ−アペリン発現プラスミドＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入した。次いで、５００ｍｌの培養物を、３Ｌフラスコ中のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において３７℃で４日間成長させた。
【０５１６】
Ｆｃ−アペリンタンパク質は、清澄化した条件培地から精製した。簡潔に述べると、５００ｍｌの条件培地を、４ｍｌ／分で、５ｍｌのＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に流した。０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４を含有する２０カラム体積のＰＢＳでカラムを洗浄し、次いで、Ｆｃ−アペリンタンパク質を０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２．７）で溶離させ、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）で中和し、ＰＢＳに対して透析した。タンパク質収量は、条件培地５００ｍｌあたり１０〜２０ｍｇであり、エンドトキシンレベルは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＥＮＤＯＳＡＦＥ  ＰＴＳ試験によって測定したとき、１ＥＵ／ｍｇを下回った。
【０５１７】
Ｆｃ−アペリンタンパク質の品質管理：
未変性Ｆｃ−アペリンタンパク質のＬＣ／ＭＳ：ピークは、不均一であり、二量体について予想されるより約３ｋＤａ大きかった。これは、Ｎ連結型グリコシル化コンセンサス部位を有するＦｃについて予想されるＮ連結型グリコシル化の特性を示している。
【０５１８】
還元されたＮ−脱グリコシルＦｃ−アペリンタンパク質のＬＣ／ＭＳ：ピークは鋭利であった。実施例８の分子量は、理論上より４８８ダルトン小さかったが、そのうちの１３０ダルトンは、おそらくはＦｃのＣ末端リシン残基の損失のためである。実施例９〜実施例１９の分子量は、おそらくは、それぞれ、システイン２個分の還元、またはＣｙｓ２個分の還元と付加的な改変（すなわち、ＡｓｎのＡｓｐへの脱アミド）のために、予想されたより２または３ダルトン小さかった。
【０５１９】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００での分析的サイズ排斥：Ｆｃ−アペリンタンパク質は、８９％〜１００％の間の二量体、０〜１０％の四量体、および０〜１％の凝集体を有する。
【０５２０】
還元ＳＤＳ／ＰＡＧＥ：すべてのタンパク質が、主に、予想されたサイズのモノマーとして移動した。
【０５２１】
ヌクレオチド配列
【０５２２】
【表２０】
2016527249.tif 000086
2016527249.tif 000087
2016527249.tif 000088
2016527249.tif 000089
2016527249.tif 000090
2016527249.tif 000091
2016527249.tif 000092
【０５２３】
［実施例９］
Ｆｃ−アペリン融合物
【０５２４】
【化５８】
2016527249.tif 000093
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳは、リンカーを表し、ＱＲＰＲＬＣ＊ＨＫＧＰＭＣ＊Ｆは、ポリペプチドである。
【０５２５】
［実施例１０］
Ｆｃ−アペリン融合物
【０５２６】
【化５９】
2016527249.tif 000094
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳは、リンカーを表し、ＱＲＰＲＬＣ＊ＨＫＧＰＭＣ＊Ｆは、ポリペプチドである。
【０５２７】
［実施例１１］
Ｆｃ−アペリン融合物
【０５２８】
【化６０】
2016527249.tif 000095
ＧＳは、リンカーを表し、ＱＲＰＲＬＣ＊ＨＫＧＰＭＣ＊Ｆは、ポリペプチドである。
【０５２９】
［実施例１２］
Ｆｃ−アペリン融合物
【０５３０】
【化６１】
2016527249.tif 000096
ＧＧは、リンカーを表し、ＱＲＰＲＬＣ＊ＨＫＧＰＭＣ＊Ｆは、ポリペプチドである。
【０５３１】
［実施例１３］
Ｆｃ−アペリン融合物
【０５３２】
【化６２】
2016527249.tif 000097
ＧＧＧＧＳは、リンカーを表し、ＱＲＰＲＬＣ＊ＨＫＧＰＭＣ＊Ｆは、ポリペプチドである。
【０５３３】
［実施例１４］
Ｆｃ−アペリン融合物
【０５３４】
【化６３】
2016527249.tif 000098
ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳは、リンカーを表し、ＱＲＰＲＬＣ＊ＨＫＧＰＭＣ＊は、ポリペプチドである。
【０５３５】
［実施例１５］
Ｆｃ−アペリン融合物
【０５３６】
【化６４】
2016527249.tif 000099
ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳは、リンカーを表し、ＱＲＰＲＬＣ＊ＨＫＧＰＭＣ＊は、ポリペプチドである。
［実施例１６］
Ｆｃ−アペリン融合物
【０５３７】
【化６５】
2016527249.tif 000100
ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳは、リンカーを表し、ＱＲＰＲＬＣ＊ＨＫＧＰＭＣ＊は、ポリペプチドである。
【０５３８】
［実施例１７］
Ｆｃ−アペリン融合物
【０５３９】
【化６６】
2016527249.tif 000101
ＧＳは、リンカーを表し、ＱＲＰＲＬＣ＊ＨＫＧＰＭＣ＊は、ポリペプチドである。
【０５４０】
［実施例１８］
Ｆｃ−アペリン融合物
【０５４１】
【化６７】
2016527249.tif 000102
ＧＧは、リンカーを表し、ＱＲＰＲＬＣ＊ＨＫＧＰＭＣ＊は、ポリペプチドである。
【０５４２】
［実施例１９］
Ｆｃ−アペリン融合物
【０５４３】
【化６８】
2016527249.tif 000103
ＧＧＧＧＳは、リンカーを表し、ＱＲＰＲＬＣ＊ＨＫＧＰＭＣ＊は、ポリペプチドである。
【０５４４】
［実施例２０］
ＢＣＮ−ＰＥＧリンカーを介して脂肪酸にコンジュゲートさせたアペリン環状ペプチド
ステップ１：アペリンペプチド−ＢＣＮリンカー（ＢＣＮは、（（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメチル  Ｎ−カーボネート）である。
【０５４５】
【化６９】
2016527249.tif 000104
ｐＥ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ＊−Ｈ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ＊−Ｆ−ＯＨ（ジスルフィドＣ６−Ｃ１２、５０ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ、米国特許第８，６７３８４８号で調製されたとおり）、炭酸水素ナトリウム（１８ｍｇ、０．２１５ｍｍｏｌ）、および水（４０ｕＬ）をＤＭＦ（０．５ｍＬ）に混ぜた混合物を、室温で１０分間撹拌し、次いで（１Ｒ，８Ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメチルスクシンイミジルカーボネート（Ｂｅｒｒｙ＆ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、１８ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で９０分間撹拌した。＋１および＋２追加の混合物をＬＣＭＳによって観察したので、混合物を質量起動式ＨＰＬＣによって精製した（ペプチド方法５  ５分で２５〜５０％のＡＣＮの勾配：条件：Ｓｕｎｆｉｒｅ  ３０×５０ｍｍ  ５ｕｍカラム  ０．１％ＴＦＡ含有ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ  ７５ｍｌ／分  １．５ｍｌ注入）：ｒｔ  ３．２分（＋１）、ｒｔ  ４．６５分、４．９分（＋１および＋２混合物）。ＬＣＭＳによって、所望の＋１生成物が６１％の収率で、＋１、＋２混合物が１８％の収率で確認される。ＬＣＭＳ：（塩基性溶離液Ａ：水＋５ｍＭ水酸化アンモニウム  溶離液Ｂ：ＡＣＮ  酸性カラム：Ｓｕｎｆｉｒｅ  Ｃ１８  ３．５μｍ  ３．０×３０ｍｍ  −４０℃  塩基性カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８  ３．５μｍ  ３．０×３０ｍｍ  −４０℃）保持時間：０．９８分、ＭＳ［Ｍ＋２］２＋：実測値：８５６．０、計算値：８６５．０２４５。
【０５４６】
ステップ２：ジ−ｔｅｒｔ−ブチル２−（ウンデカ−１０−イン−１−イル）マロネート
【０５４７】
【化７０】
2016527249.tif 000105
Ｎ２中にてマロン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（８００ｍｇ、３．７０ｍｍｏｌ）を０℃でＤＭＦ（９ｍＬ）に溶解させ、ＮａＨ（１４８ｍｇ、３．７０ｍｍｏｌ）を加える。反応液を０℃で３０分撹拌し、１１−ブロモ−デカ−１−エン（３．３３ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下添加して、黄色の溶液を得る。反応液を０℃で２時間撹拌し、次いで室温に温め、１６時間撹拌する。混合物をＥｔＯＡｃ（７５ｍＬ）に溶かし、Ｈ２Ｏ（２５ｍＬ）で洗浄する。水性層をＥｔＯＡｃ（７５ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮する。混合物をフラッシュカラムで精製し（１２ｇシリカカートリッジ、０〜２０％のＥｔＯＡｃ／ヘプタン）、画分を濃縮して、所望の生成物を得る。
【０５４８】
ステップ３：１１，１１−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル１−エチルドコサ−２１−エン−１，１１，１１−トリカルボキシレート
【０５４９】
【化７１】
2016527249.tif 000106
ステップ２からの化合物（０．４４２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）に０℃で溶解させ、ＮａＨ（２１．２３ｍｇ、０．５３１ｍｍｏｌ）を加える。反応液を０℃で１５分間撹拌し、エチル１１−ブロモウンデカノエート（１４３ｍｇ、０．４８６ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下添加する。反応液を室温に温め、１６時間撹拌する。混合物をＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ）で１回洗浄する。水性層をＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）で１回抽出し、有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮する。サンプルを１ｍＬのＤＣＭに溶解させ、フラッシュカラムで精製する（１２ｇシリカカラム、０〜２０％のＥｔＯＡｃ／ヘプタン、１５分）。画分を合わせ、濃縮して、所望の生成物を得る。
【０５５０】
ステップ４：１２，１２−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）トリコサ−２２−エン酸
【０５５１】
【化７２】
2016527249.tif 000107
Ｎ２中にて、ステップ３からの化合物（０．０３７ｍｍｏｌ）のｔＢｕＯＨ（１ｍＬ）溶液に、３０℃でＫＯｔＢｕ（１１４ｍｇ、１．０１２ｍｍｏｌ）のｔＢｕＯＨ（２ｍＬ）溶液を加える。混合物を室温で撹拌し、ＴＬＣ（１：１  ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、ＫＭｎＯ４、還流）によってモニターする。反応が完了した後、反応混合物を１Ｍ  ＨＣｌ（２０ｍＬ）で失活させ、ＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ）で２回抽出する。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮する。材料をそれ以上精製せずに次のステップに持ち越した。
【０５５２】
ステップ５：ドコサ−２１−エン−１，１１，１１−トリカルボン酸
【０５５３】
【化７３】
2016527249.tif 000108
ステップ４からの化合物（０．０２２ｍｍｏｌ）にＴＦＡ（２ｍＬ）を加え、反応液を室温で１時間撹拌する。混合物をＤＣＭ（１０ｍＬ）で希釈し、濃縮する。材料をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）に溶かし、Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ）で洗浄する。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮する。未精製材料を１ｍＬのＭｅＯＨに溶解させ、ＭＳ起動式ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ  ３０×５０ｍｍ  ５ｕｍカラム  ０．１％ＴＦＡ含有ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ  ７５ｍｌ／分、１．５ｍｌ注入、３．５分かけて４５〜７０％のＡＣＮ）によって精製する。
【０５５４】
ステップ６：２−（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）カルボニル）−２−（ウンデカ−１０−エン−１−イル）トリデカン二酸
【０５５５】
【化７４】
2016527249.tif 000109
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（９９ｍｇ、０．８６２ｍｍｏｌ）およびドコサ−２１−エン−１，１１，１１−トリカルボン酸（中間体４５：４００ｍｇ、０．９０８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（７ｍＬ）およびＴＨＦ（０．７ｍＬ）に溶かした溶液に、ＤＣＭ（２ｍＬ）中のＤＣＣ（１８７ｍｇ、０．９０８ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を終夜撹拌した後、溶媒を除去した。残渣をＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ  Ｃ１８  ３０×５０ｍｍ、５５〜８０％のＡＣＮ／水＋０．１％ＴＦＡ）によって精製して、表題化合物（１５５ｍｇ、０．２８８ｍｍｏｌ、３２％）を得た。ＬＣＭＳ方法Ｄによる。Ｒｔ＝１．５分、Ｍ＋Ｈ  ５３８．３；
【数１】
2016527249.tif 000110
【０５５６】
ステップ７：脂肪酸−ＰＥＧリンカー
【０５５７】
【化７５】
2016527249.tif 000111
アジド−ｄＰＥＧ２３−アミン（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ：１６４ｍｇ、０．１４９ｍｍｏｌ）およびステップ６からの化合物（８０ｍｇ、０．１４９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２．５ｍＬ）に溶解させた。ＤＩＰＥＡ（３９μＬ、０．２３３ｍｍｏｌ）を加え、反応液を終夜撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ  Ｃ１８  ３０×５０ｍｍ、４５〜７０％のＡＣＮ／水＋０．１％ＴＦＡ）によって精製して、化合物Ａ（９７ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ、４１％）およびＢ（３２ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ、１４％）を得た。ＬＣＭＳ方法Ｄ  Ｒｔ＝１．３５分、［Ｍ＋２Ｈ］＋２  ７６１．９；
【数２】
2016527249.tif 000112
【０５５８】
ステップ８：
【０５５９】
【化７６】
2016527249.tif 000113
ｐＥ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ＊−Ｈ−Ｎ６−［［（１α，８α，９α）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメトキシ］カルボニル］−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ＊−Ｆ−ＯＨ（ジスルフィドＣ６−Ｃ１２）（２１．３３ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）とステップ７からの化合物（２４ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で約３時間撹拌した。反応は、ＬＣＭＳによって完結し、凍結乾燥して、表題の生成物（２３ｍｇ、４８％）を得た。ＬＣＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７ｕｍ  ２．１×５０ｍｍ、５０℃、溶離液Ａ：水＋０．１％ギ酸、溶離液Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ギ酸、勾配  ５．１５分かけて２％〜９８％のＢ／Ａ）：保持時間：２．２２分、ＭＳ［Ｍ＋２］２＋：実測値：１６１６．９４６４、計算値：１６１６．９７６。
【０５６０】
［実施例２１］
ソルターゼおよびソルターゼ認識モチーフを使用するＦｃのＡＰＪペプチドへのコンジュゲーション
【０５６１】
【化７７】
2016527249.tif 000114
【０５６２】
ステップ１：Ｆｃ−ソルターゼ構築物の調製：
構築物クローン化：
マウスＩｇκ鎖シグナルペプチドに続いてヒトＦｃおよびソルターゼ認識配列（ＬＰＸＴＧ）を含んでいるＤＮＡ断片を、５’−ＮｈｅＩおよび３’−ＥｃｏＲＩ制限部位を用いた遺伝子合成（ＧｅｎｅＡｒｔ）によってコドン最適化した。得られる配列を、ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩの両方を用いて制限消化し、ＣＭＶプロモーターの下流で、ベクターｐＰＬ１１４６のＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ部位に連結した。連結物を大腸菌（E coli）ＤＨ５α細胞に形質転換し、適正な挿入物を含んでいるコロニーを、ＤＮＡ配列決定によって鑑別した。示す配列は、センス鎖についてのものであり、５’から３’方向に伸びている。
【０５６３】
【化７８】
2016527249.tif 000115
【０５６４】
Ｆｃソルターゼ構築物の配列：
【０５６５】
【化７９】
2016527249.tif 000116
ＧＧＧＧＳは、リンカーを表し、ＬＰＥＴＧＧＬＥＶＬＦＱＧＰは、ソルターゼ認識モチーフである（注：ＧＧＬＥＶＬＦＱＧＰは、ソルターゼ処理の際に切り詰められる）。
【０５６６】
タンパク質発現および精製：
標準のポリエチレンイミン法を使用して、１ｍｌあたり１×１０６細胞の密度で、Ｆｃ−ソルターゼ発現プラスミドＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入した。次いで、５００ｍｌの培養物を、３Ｌフラスコ中のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において３７℃で４日間成長させた。Ｆｃ−ソルターゼタンパク質を、清澄化した条件培地から精製した。簡潔に述べると、５００ｍｌの条件培地を、４ｍｌ／分で、５ｍｌのＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に流した。０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４を含有する２０カラム体積のＰＢＳでカラムを洗浄し、次いで、Ｆｃ−ソルターゼタンパク質を、０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２．７）で溶離させ、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）で中和し、ＰＢＳに対して透析した。タンパク質収量は、条件培地５００ｍｌあたり１０〜２０ｍｇであり、エンドトキシンレベルは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＥＮＤＯＳＡＦＥ  ＰＴＳ試験によって測定したとき、１ＥＵ／ｍｇを下回った。
【０５６７】
Ｆｃ−ソルターゼタンパク質の品質管理
未変性Ｆｃ−ソルターゼンタンパク質のＬＣ／ＭＳ：ピークは、不均一であり、二量体について予想されるより約３ｋＤａ大きかった。これは、Ｎ連結型グリコシル化コンセンサス部位を有するＦｃについて予想されるＮ連結型グリコシル化の特性を示している。
【０５６８】
還元されたＮ−脱グリコシルＦｃ−ソルターゼタンパク質のＬＣ／ＭＳ：ピークは鋭利であった。分子量は、おそらくはシステイン２個分の還元のために、理論上より２ダルトン小さかった。
【０５６９】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００での分析的サイズ排斥：
Ｆｃ−ソルターゼタンパク質は、８９％〜１００％の間の二量体、０〜１０％の四量体、および０〜１％の凝集体を有する。
【０５７０】
還元ＳＤＳ／ＰＡＧＥ：タンパク質は、主に、予想されたサイズのモノマーとして移動した。
【０５７１】
ステップ２：ソルターゼコンジュゲーション用のアペリンペプチドＨ２Ｎ−ＧＧＧＧＧＱＲＰＲＬＣ＊ＨＫＧＰ（Ｎｌｅ）Ｃ＊Ｆ−ＣＯＯＨの調製
【０５７２】
【化８０】
2016527249.tif 000117
【０５７３】
ステップ２ａ：
中間体２１Ａの調製
２回分のＨ−Ｐｈｅ−２−ＣｌＴｒｔ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、０．３４２ｇ、０．２５ｍｍｏｌ、０．７３ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ａｒｇ残基に２倍の標準Ａｒｇを用いた、自動ペプチド合成装置（ＣＥＭ  ＬＩＢＥＲＴＹ）での固相ペプチド合成にかけた。アミノ酸は、０．２Ｍ  ＤＭＦ溶液として調製した。
【０５７４】
カップリングサイクルは、次のとおりに定めた。
−  アミノ酸カップリング：ＡＡ（４．０当量）、ＨＡＴＵ（４．０当量）、ＤＩＥＡ（２５当量）
−  洗浄：ＤＭＦ（３×１０ｍＬ、各回１分）
−  Ｆｍｏｃ脱保護：ピペリジン／ＤＭＦ（１：４）（１０ｍＬ、７５℃で１分間、次いで１０ｍＬ、７５℃で３分間）
−  洗浄：ＤＭＦ（４×１０ｍＬ、各回１分）
【０５７５】
【表２１】
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【０５７６】
ペプチドを組み立てた後、各回分の樹脂をＤＭＦ（３×１０ｍＬ）、ＤＣＭ（３×１０ｍＬ）で洗浄した。合わせたペプチド樹脂を真空中にて室温で乾燥させて、中間体２１Ａ（１．４５４ｇ、０．５ｍｍｏｌ）を得た。
【０５７７】
ステップ２ｂ：中間体２１Ｂ、Ｈ２Ｎ−ＧＧＧＧＧＱＲＰＲＬＣＨＫＧＰ（Ｎｌｅ）ＣＦ−ＣＯＯＨの調製
【０５７８】
【化８１】
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１）切断および保護基の除去
中間体２１Ａ（１．４５４ｇ、０．５ｍｍｏｌ）に、９５％ＴＦＡ／２．５％Ｈ２Ｏ／２．５％ＴＩＰＳの６ｍＬの溶液およびＤＴＴ（１．４５２ｍｇ、１０．００ｍｍｏｌ）を加え、得られる混合物を室温で３時間振盪し、次いで濾過した。濾液を８０ｍＬの冷エーテルに滴下し、次いで４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。溶媒を除去し、白色の固体をエーテル（３×８０ｍＬ）で洗浄し、ボルテックスし、遠心分離した。固体を高真空中にて２５℃で１時間乾燥させた。
【０５７９】
２）精製
次いで、上記の白色の固体を分取ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ（商標）Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤ（商標）３０×５０ｍｍ  ５ｕｍカラム  ０．１％ＴＦＡ含有ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ  ７５ｍｌ／分、８分で１０〜３０％のＡＣＮの勾配）によって精製した。生成物画分を凍結乾燥して、中間体２１ＢをＴＦＡ塩（２１３ｍｇ、２３％）として得た。
【０５８０】
ステップ３：Ｈ２Ｎ−ＧＧＧＧＧＱＲＰＲＬＣ＊ＨＫＧＰ（Ｎｌｅ）Ｃ＊Ｆ−ＣＯＯＨ（ジスルフィドＣ１１−Ｃ１７）、中間体２１Ｃの調製
【０５８１】
【化８２】
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３．８５ｍＬのＨ２Ｏ中の中間体２１Ｂ（２１３ｍｇ、０．１６６ｍｍｏｌ）に、Ｉ２（５０ｍＭ  ＡｃＯＨ溶液、４．６３ｍＬ、０．２３２ｍｍｏｌ）を滴下添加した。混合物を室温で終夜振盪した。ＬＣ／ＭＳによって、反応が完了したことが示された。反応混合物に、溶液の色が消失するまで、０．５Ｍのアスコルビン酸溶液（ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ＝１／１）を数滴加えた。混合物を、ＨＰＬＣ精製に向けてＭｅＯＨで希釈した。分取ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ（商標）Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤ（商標）３０×５０ｍｍ  ５ｕｍカラム  ０．１％ＴＦＡ含有ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ  ７５ｍｌ／分、８分で７．５〜２０％のＡＣＮの勾配）によって精製を行った。生成物画分を凍結乾燥して、Ｈ２Ｎ−ＧＧＧＧＧＱＲＰＲＬＣ＊ＨＫＧＰ（Ｎｌｅ）Ｃ＊Ｆ−ＣＯＯＨ（ジスルフィドＣ１１−Ｃ１７）、すなわち中間体２１ＣをＴＦＡ塩（６５ｍｇ、３１％）として得た。ＬＣ／ＭＳ（ＱＴ２、生成物分析−ＨＲＭＳ−酸性、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７ｕｍ  ２．１×５０ｍｍ、５０℃、溶離液Ａ：水＋０．１％ギ酸、溶離液Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ギ酸、勾配  ５．１５分かけて２％〜９８％のＢ／Ａ）：保持時間：０．７９分、ＭＳ［Ｍ＋２］２＋：実測値：９１９．９５６２。
【０５８２】
ステップ３：Ｆｃ−ソルターゼと中間体２１Ｃのソルターゼコンジュゲーション
１）化学酵素的ソルターゼコンジュゲーション
氷浴上で、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）緩衝液中のＦｃ−ＬＰＥＴＧＧ（１３９７μｌ、０．０８１μｍｏｌ）に、Ｈ２Ｎ−ＧＧＧＧＧＱＲＰＲＬＣ＊ＨＫＧＰ（Ｎｌｅ）Ｃ＊Ｆ−ＣＯＯＨ（ジスルフィドＣ１１−Ｃ１７）（１４８μＬ、４．０４μｍｏＬ、５０ｍｇ／ｍＬ）をＴｒｉｓ−８．０緩衝液に溶かした溶液に続いて、５２０μＭのソルターゼＡ＊（１５５μＬ、０．０８１μｍｏＬ）の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．４溶液、１５０ｍＭのＮａＣｌを加えた。混合物を室温で終夜振盪した。ＬＣ／ＭＳによって、反応が完了したことが示された。
【０５８３】
（ソルターゼＡ＊）：ソルターゼＡ変異体の配列：
【０５８４】
【化８３】
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太文字は、変異したアミノ酸を表し、下線を付した文字は、黄色ブドウ球菌（S aureus）ソルターゼＡの本来の配列（Mazmanian et al. Science (Washington, D. C.) (1999), 285(5428), 760-763）に保存されていない、記載されているアミノ酸（Chen et al., PNAS, Vol 108, No 28, 2011, 11399-11403）を表す。
【０５８５】
ソルターゼＡ変異体は、確立されたプロトコール（Carla P. Guimaraes et al.: “Site specific C-terminal and internal loop labeling of proteins using sortase-mediated reactions”, Nature protocols, vol 8, No 9, 2013, 1787-1799）に従い、大腸菌（E. coli）において発現させ、そのＣ末端に含まれたポリヒスチジンタグを探索するアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【０５８６】
２）精製および脱塩
上記溶液を、ＡＴＴＡ  ＸＰＲＥＳＳにおいて、４ｍＬ／分で、５ｍＬのＨｉＴｒａｐ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃１１−００３４−９５）に流した。カラム上で、実施例２１を２０カラム体積（ＣＶ）のＰＢＳ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  １１４で洗浄し、０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２．７）で溶離させ、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）で中和し、ＰＢＳに対して透析した。精製された溶液を、Ｚｅｂａ  Ｓｐｉｎｇ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ、５ｍＬ（８９８９１）を使用して脱塩して、２ｍＬの目的の溶液を得、平均濃度は、１．６２ｍｇ／ｍＬであり、回収率は、６８％であった。ＬＣＭＳ（ＱＴ２、タンパク質＿２０〜７０ｋＤａ＿３分、ＡｃＱｕｉｔｙ  ＰｒｏＳｗｉｆｔ  ＲＰ−３Ｕ  ４．６×５０ｍｍ、１．０ｍＬ／分、溶離液Ａ：水＋０．１％ギ酸、溶離液Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ギ酸、勾配  ３分かけて２％〜９８％のＢ／Ａ）：Ｒｔ＝１．５５分、ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］５９３４６．５０００。
【０５８７】
上記実施例におけるバイオコンジュゲートは、ＡＰＪ受容体効力について、ＥＣ５０値が、約０．０１ｎＭ〜約１１００ｎＭの範囲にあることがわかっている。上の実施例のバイオコンジュゲートは、血漿安定性が２分より長い、５分より長い、１０分より長い、２０分より長い、５０分より長い、６０分より長いことがわかった。
【０５８８】
本発明のバイオコンジュゲートは、ＡＰＪ受容体のアゴニストとして有用であり、したがって、本明細書で開示する疾患などの、ＡＰＪ受容体の活性化に反応を示す疾患および状態の治療において有用であるとみなすことができる。
【０５８９】
こうして本発明の例示的な実施形態について述べてきたが、当業者は、内部の開示が例示的なものに過ぎないこと、ならびに本発明の範囲内で他の種々の代替形態、改造形態、および変更形態を案出してもよいことを留意すべきである。したがって、本発明は、本明細書で例示するような詳細な実施形態に限定されない。
【国際調査報告】
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