(57)【要約】  簡単に入手可能な幹細胞からのメラノサイトの誘導は、白斑などの色素異常又はメラノサイト機能障害の治療に注目されている。本発明者らは、ヒト皮膚線維芽細胞中の特徴的な幹細胞型であるＭｕｓｅ（ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｓｔｒｅｓｓ−ｅｎｄｕｒｉｎｇ）細胞が、機能性メラノサイトに容易に分化し得ることを見出した。この技術は、Ｍｕｓｅ細胞を用いることによって入手可能なヒト線維芽細胞からメラノサイトの効率的な産生に適用され得て、それによって色素異常のための移植に貢献するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシナーゼを発現し、メラニンを産生するＭｕｓｅ−メラノサイト。
【請求項２】
Ｍｕｓｅ−メラノサイトが、ＤＣＴ、Ｋｉ−６７及びＳ１００からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーをさらに発現する、請求項１に記載のＭｕｓｅ−メラノサイト。
【請求項３】
チロシナーゼを発現し、メラニンを産生するＭｕｓｅ−メラノサイトを含む医薬組成物。
【請求項４】
Ｍｕｓｅ−メラノサイトが、ＤＣＴ、Ｋｉ−６７及びＳ１００からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーをさらに発現する、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ナイーブなＭｕｓｅ細胞が組成物に残存することを特徴とする、請求項３又は４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
Ｍｕｓｅ−メラノサイト及び場合によりケラチノサイトを含む三次元皮膚。
【請求項７】
ナイーブＭｕｓｅ細胞が皮膚に残っている、請求項６に記載の三次元皮膚。
【請求項８】
三次元皮膚を生成するための方法であって、以下：
（ａ）間葉系組織からＭｕｓｅ細胞を用意し；
（ｂ）分化培地中でＭｕｓｅ細胞を培養し；
（ｃ）ゲル層でケラチノサイトとともにＭｕｓｅ細胞由来のメラノサイトを培養し；及び
（ｄ）三次元皮膚を得る
工程を含む上記方法。
【請求項９】
前記間葉系組織が皮膚（ｄｅｒｍａｌ）組織である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｍｕｓｅ細胞が前記間葉系組織中の線維芽細胞から分離される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記分化培地が、Ｗｎｔ３ａ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、エンドセリン−３（ＥＴ−３）  、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）、リノール酸、コレラ毒素、Ｌ−アスコルビン酸、１２−Ｏ−テトラデカノイル−ホルボール１３−アセテート（ＴＰＡ）、インスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）、及びデキサメタゾンからなる群から選択される、２種以上の因子及び／又はサイトカインを含む、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載のＭｕｓｅ−メラノサイト、請求項２に記載の医薬組成物、又は請求項３に記載の三次元皮膚を、障害によって引き起こされた患部に適用することを含む、このような治療を必要とする対象における色素異常を治療するための方法。
【請求項１３】
Ｗｎｔ３ａ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、エンドセリン−３（ＥＴ−３）  、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）、リノール酸、コレラ毒素、Ｌ−アスコルビン酸、１２−Ｏ−テトラデカノイル−ホルボール１３−アセテート（ＴＰＡ）、インスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）、及びデキサメタゾンからなる群から選択される２種以上の因子及び／又はサイトカインを用いてＭｕｓｅ細胞を分化させることによってＭｕｓｅ−メラノサイトを得るための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年４月２日に出願した米国仮特許出願第６１／８０７，４６５号の利益を主張する米国特許出願に対応し、その米国仮特許出願第６１／８０７，４６５号の全内容は、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、再生医療におけるＭｕｓｅ−メラノサイトの使用に関する。具体的には、本発明は、Ｍｕｓｅ−メラノサイト及びケラチノサイトを含む医薬組成物、並びに色素異常を治療するための方法を提供する。本発明は、各種因子及びサイトカインの特定の組み合わせを用いることによって、機能性メラノサイトに容易に分化される、ヒト皮膚線維芽細胞において新たに同定されたＭｕｓｅ細胞の発見に基づく。
【背景技術】
【０００３】
メラノサイトは、メラニンを産生し、紫外線（ＵＶ）から皮膚を保護するために、近接するケラチノサイトにメラニンを届ける（Ｋｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１１；Ｓｌｏｍｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ，２００４）。メラノサイト機能不全は、色素欠乏症や白斑などの様々な色素異常をもたらし、これは、美容上の問題だけでなく、紫外線からの不完全な保護に起因した皮膚癌のリスクを増加させる（Ｍａｂｕｌａ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）。
【０００４】
白斑の現在の治療としては、コルチコステロイド又は免疫調節剤を用いた局所治療；ＵＶ処置、及び自家皮膚移植が挙げられる（Ａｌｉｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１１；Ｆｅｌｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）。しかしながら、これらの治療の有効性は不十分である。自家培養のメラノサイト移植は、潜在的な細胞療法であるが（Ｆｉｏｒａｍｏｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１２；ｖａｎ  Ｇｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ，２００１）であるが、成人メラノサイトを培養し、インビトロで大規模に増幅することが困難であるため、広範には使用されていない。最近、いくつかの研究グループは、胚性幹（ＥＳ）細胞又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞からメラノサイト誘導を成功させたことを報告している（Ｎｉｓｓａｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１１；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１１；Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００６；Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，２００６；Ｏｈｔａ  ｅｔ  ａｌ，２０１１；Ｙａｍａｎｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）。実際に、これらは、メラノサイト誘導のための魅力的な細胞源ではあるが、ＥＳ細胞を得るための倫理的な問題（Ｋｎｏｐｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，２００９；Ｍａｎｚａｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）やＥＳ細胞とｉＰＳ細胞の腫瘍形成のリスクが臨床使用への障害となっている（Ｆｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１０；Ｇｏｌｄｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１１；Ｂｅｎ−Ｄａｖｉｄ  ２０１１；Ｏｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。
【０００５】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は成人幹細胞であり、腫瘍形成のリスクは低く、骨髄、皮膚、脂肪組織及び歯髄などの間葉系組織に存在し、多種多様の疾患を治療するために使用される（Ｓｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１２；Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ，２００９；Ｍａｃｃｈｉａｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ，２００８；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）。ＭＳＣは、幅広い領域の細胞に分化する能力があるため、注目を集めている。ＭＳＣは、中胚葉系細胞に分化し得るだけでなく、外胚葉系細胞又は内胚葉系細胞にも分化し得る（Ｐｈｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ，２００７；Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９９；Ｄｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ，２００４；Ｓａｋａｉｄａ  ｅｔ  ａｌ，２００４）。また、メラノサイトは歯髄幹細胞（ＤＰＳＣ）から誘導されている（Ｓｔｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ，２００８，Ｐａｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１０）。しかしながら、ＭＳＣは、一般的に、粗細胞集団を含み、それらの細胞表面抗原に基づいて異なる細胞型を含む。これは、ＭＳＣが、通常、間葉系組織から接着細胞と全く同様に回収されるためである。したがって、中胚葉と外胚葉間のオリゴ系統の境界を越えて分化に関与する細胞（すなわち、間葉系からメラノサイト）は、これまで知られていない。
【０００６】
本発明者らは、最近、Ｍｕｓｅ細胞（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｓｔｒｅｓｓ  ｅｎｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌ）と命名した成人ＭＳＣ中に存在する新しいタイプの幹細胞を報告した（Ｋｕｒｏｄａ  ｅｔ  ａｌ，２０１０；  Ｗａｋａｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）。Ｍｕｓｅ細胞は、通常、皮膚線維芽細胞及び骨髄間質細胞などのヒト間葉系培養細胞において存在し、さらに、皮膚及び骨髄などの間葉系組織にも存在する。Ｍｕｓｅ細胞は、多能性幹細胞とＭＳＣの両方に類似した特性を有する：蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって、多能性［ステージ特異的胎児抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、未分化ヒトＥＳ細胞に関するマーカー］と間葉系マーカー（ＣＤ１０５）についてのダブル陽性の細胞として単離することができ、セルフリニューアルし、単一の細胞から内胚葉系細胞、中胚葉系細胞、及び外胚葉系細胞へと分化する能力を有する。しかしながら、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの他の多能性幹細胞とは異なり、Ｍｕｓｅ細胞は、低いテロメラーゼ活性を有し、インビボで腫瘍を形成しない。したがって、Ｍｕｓｅ細胞は、臨床応用に高い可能性を有する。最近では、皮膚由来の前駆細胞（ＳＫＰ）は、ヒト包皮における多能性間葉系幹細胞として報告されている（Ｔｏｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。しかしながら、ＳＫＰとは異なり、Ｍｕｓｅ細胞は、真皮組織及び脂肪組織の結合組織に疎らに配置され、皮膚乳頭、結合組織鞘、又は毛包上皮などの任意の特定の構造に関連付けられない。さらに、Ｍｕｓｅ細胞は、ＳＫＰマーカーであるＳｎａｉｌ及びＳｌｕｇ（Ｗａｋａｏ，  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）を発現しない。これらのデータは、Ｍｕｓｅ細胞がＳＫＰとは異なるものであることを示す。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、最近、ヒト皮膚線維芽細胞におけるＭｕｓｅ細胞が、ある種の因子及びサイトカインの組み合わせを用いることによって機能性メラノサイトに容易に分化されることを発見した。Ｍｕｓｅ細胞由来のメラノサイト（Ｍｕｓｅ−メラノサイト）は、小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ−１）、ドーパクローム異性化酵素（ＤＣＴ）、ＫＩＴ、ｇｐ１００、及びチロシナーゼなどのメラノサイトマーカーを発現したＭｕｓｅ細胞由来のメラノサイト（Ｍｕｓｅ−メラノサイト）は、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）反応アッセイに対して陽性であり、メラニンを産生し、表皮の基底層に組み込まれる。他方、Ｍｕｓｅ細胞をメラノサイ誘導前にヒト線維芽細胞から除去すると、残りの細胞（すなわち、「非Ｍｕｓｅ細胞」）は、メラノサイトにはならず、メラニンを産生しない。この発見は、すでに三胚葉分化能を有する細胞であるＭｕｓｅ細胞が、中胚葉系統と外胚葉系統間のオリゴ系統の境界を超えることができるため、メラノサイトに分化されるが、一方、残りの線維芽細胞はこの事象に関与しない。したがって、Ｍｕｓｅ細胞は、色素異常のための自家移植又は同種移植に適用され得る成人線維芽細胞から機能性メラノサイトを生じさせる理想的な細胞供給源である。
【０００８】
第一の実施形態において、本発明は、チロシナーゼを発現し、メラニンを産生するＭｕｓｅ−メラノサイトを提供する。一態様において、Ｍｕｓｅ−メラノサイトは、ＤＣＴ、Ｋｉ−６７及びＳ１００からなる群から選択される、少なくとも１つのマーカーをさらに発現することができる。本発明によれば、Ｍｕｓｅ−メラノサイトは、Ｗｎｔ３ａ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、エンドセリン−３（ＥＴ−３）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）、リノール酸、コレラ毒素、Ｌ−アスコルビン酸、１２−Ｏ−テトラデカノイル−ホルボール  １３−アセテート（ＴＰＡ）、インスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）、及びデキサメタゾンからなる群から選択される、２種以上の因子及び／又はサイトカインの使用によって、Ｍｕｓｅ細胞から誘導されてもよい。
【０００９】
第二の実施形態において、本発明は、第一の実施形態において定義されたＭｕｓｅ−メラノサイトを含む医薬組成物を提供する。一態様において、本発明は、ナイーブＭｕｓｅ細胞が残っている医薬組成物を提供する。
【００１０】
第三の実施形態において、本発明は、上記Ｍｕｓｅ−メラノサイトを含む三次元皮膚を提供する。場合により、ケラチノサイトは、三次元皮膚に含まれてもよい。一態様において、本発明は、ナイーブＭｕｓｅ細胞が残っている三次元皮膚を提供する。
【００１１】
第四の実施形態において、本発明は、（ａ）間葉系組織からＭｕｓｅ細胞を用意し；（ｂ）分化培地中でＭｕｓｅ細胞を培養し；（ｃ）ゲル層でケラチノサイトとともにＭｕｓｅ細胞由来のメラノサイトを培養し；及び（ｄ）三次元皮膚を得るステップを含む、三次元皮膚を生成するための方法を提供する。一態様において、間葉系組織は真皮組織であってもよい。別の態様において、Ｍｕｓｅ細胞は、間葉系組織における線維芽細胞から分離されてもよい。さらに、上記方法において使用される分化培地は、Ｗｎｔ３ａ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、エンドセリン−３（ＥＴ−３）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）、リノール酸、コレラ毒素、Ｌ−アスコルビン酸、１２−Ｏ−テトラデカノイル−ホルボール  １３−アセテート（ＴＰＡ）、インスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）、及びデキサメタゾンからなる群から選択される、２種以上の因子及び／又はサイトカインを含有してもよい。
【００１２】
第五の実施形態において、本発明は、第一の実施形態によるＭｕｓｅ−メラノサイト、第二の実施形態による医薬組成物、又は第三の実施形態による三次元皮膚を、障害によって引き起こされた患部に適用することを含む、このような治療を必要とする対象における色素異常を治療するための方法を提供する。
【００１３】
第六の実施形態において、本発明は、Ｗｎｔ３ａ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、エンドセリン−３（ＥＴ−３）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）、リノール酸、コレラ毒素、Ｌ−アスコルビン酸、１２−Ｏ−テトラデカノイル−ホルボール  １３−アセテート（ＴＰＡ）、インスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）、及びデキサメタゾンからなる群から選択される、２種以上の因子及び／又はサイトカインを用いて、Ｍｕｓｅ細胞を分化させることによってＭｕｓｅ−メラノサイトを得るための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、Ｍｕｓｅ細胞の特徴付けを示すデータである。（ａ）ナイーブな正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）におけるステージ特異的胚抗原−３（ＳＳＥＡ−３）発現についての蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析。（ｂ）７日目の単一細胞の懸濁培養において形成したＭ−クラスター。（ｃ）Ｍ−クラスターのＡＬＰ染色。（ｄ−ｆ）単一のＭ−クラスター由来の細胞における、ニューロフィラメント（ｄ）、アルファ平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）（ｅ）、及びＧＡＴＡ４（ｆ）についての免疫細胞化学。（ｇ）Ｍｕｓｅ細胞と非Ｍｕｓｅ細胞からのメラノサイト分化の概略図。（スケールバー：ｂ−ｆ、５０μｍ）。略語：ｂ−ＦＧＦ、塩基性線維芽細胞増殖因子；ＥＴ−３、エンドセリン−３；ＳＣＦ、幹細胞因子；ＴＰＡ、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール  １３−アセテート。
【図２】図２は、分化後のＭｕｓｅ細胞と非Ｍｕｓｅ細胞の形態を示すデータである。（ａ）分化前と分化の３、５、及び６週後のＭｕｓｅ細胞と非Ｍｕｓｅ細胞の顕微鏡画像。ナイーブな正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）及びヒトメラノサイトの顕微鏡画像もまた与えられる（スケールバー：１００μｍ）。（ｂ）分化から６週後のＭｕｓｅ細胞と非Ｍｕｓｅ細胞の拡大画像。正常ヒトメラノサイト及びＮＨＤＦもまた示す。
【図３】図３は、Ｍｕｓｅ−メラノサイトの特徴付けを示すデータである。（ａ）Ｍｕｓｅ細胞と非Ｍｕｓｅ細胞の両方における分化から３、５、及び６週後の小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）、ＫＩＴ、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ−１）、ドーパクローム異性化酵素（ＤＣＴ）、ｇｐ１００、及びチロシナーゼのＲＴ−ＰＣＲ分析。陽性対照はヒトメラノサイトであり、陰性対照はナイーブな正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）及びテンプレートなしであった。（ｂ）分化から６週後、Ｍｕｓｅと非Ｍｕｓｅ細胞におけるメラノサイトマーカーであるＭＩＴＦ、ｇｐ１００、及びチロシナーゼの免疫細胞化学分析。陽性対照はヒトメラノサイトであり、陰性対照は一次抗体なしのナイーブＭｕｓｅ細胞であった。（スケールバー：５０μｍ）。（ｃ）Ｍｕｓｅ−メラノサイト（６週）、ヒトメラノサイト、及びナイーブＮＨＤＦのＬ−ＤＯＰＡ反応アッセイ。色素沈着細胞はＬ−ＤＯＰＡ陽性の細胞である。（スケールバー：１００μｍ）。
【図４】図４は、メラノサイト分化に対する因子の効果を示すデータである。（ａ）７つの異なる培地中で培養したＭｕｓｅ細胞の増殖能とメラノサイトマーカー発現の概要。（ｂ）４つの異なる培地中での培養６週目のＭｕｓｅ細胞における、小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）、ＫＩＴ、チロシン−タンパク質１（ＴＲＰ−１）、ドーパクローム異性化酵素（ＤＣＴ）、ｇｐ１００、及びチロシナーゼのＲＴ−ＰＣＲ。陽性対照はヒトメラノサイトであり、陰性対照はテンプレートなしであった。（ｃ）培養６週目の４つの異なる培地中のＭｕｓｅ細胞の形態。略語：ｂ−ＦＧＦ、塩基性線維芽細胞増殖因子；ＥＴ−３、エンドセリン３；ＩＴＳ、インスリン−トランスフェリン−セレン；ＲＡ、レチノイン酸；ＳＣＦ、幹細胞因子。
【図５】図５は、三次元培養皮膚の組織学的分析を示すデータである。（ａ）ヒトメラノサイト、Ｍｕｓｅ−メラノサイト、非Ｍｕｓｅ細胞、及びケラチノサイトのみを含む三次元培養皮膚のヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色。（ｂ）Ｍｕｓｅ−メラノサイトを含む三次元培養皮膚のＨＥ染色。（矢頭はＭｕｓｅ−メラノサイトを示す）。（ｃ）三次元培養皮膚の小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ−１）、ｇｐ１００、及びＳ−１００の免疫組織化学分析、並びにフォンタナ・マッソン染色。（スケールバー：５０μｍ）。
【図６】図６は、ＳＣＩＤマウスの背中の皮膚への移植後のＭｕｓｅ−メラノサイトの機能的特徴を示すデータである。（ａ）移植からたった１０日後のＭｕｓｅ−メラノサイト、ヒトメラノサイト、及びケラチノサイトを含む皮膚移植片の巨視的観察。（ｂ）各皮膚移植片のヘマトキシリン・エオシン染色（スケールバー：上段パネル、１００μｍ、下段パネル、５０μｍ）。（ｃ）皮膚移植片における小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ−１）、ｇｐ１００、及びＳ−１００の免疫組織化学分析、並びにフォンタナ・マッソン染色。（ｄ）抗ＧＦＰ抗体によって検出される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とＡｌｅｘａ−５６８（赤色）で標識されたＭｕｓｅ−メラノサイトの局在化が観察された（矢印）。（スケールバー：５０μｍ）。
【図７】図７は、表皮用にナイーブＭｕｓｅ細胞とヒトケラチノサイトを混合することによって作製される三次元（３Ｄ）培養ヒト皮膚の組織学的分析を示すデータである。（ａ）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で標識したナイーブＭｕｓｅ細胞の局在化は、表皮で観察された（矢印）。（ｂ）ＧＦＰで標識されたナイーブＭｕｓｅ細胞における、チロシナーゼ（ＴＹＲ）、Ｓ１００、およびチロシナーゼ関連タンパク質−１（ＴＲＰ−１）の免疫組織化学的分析。陽性対照はヒトメラノサイトである。（スケールバー：５０μｍ）。略語：ＤＡＰＩ、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール。
【図８】図８は、真皮同等物にナイーブＭｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ−メラノサイトを含ませることによって作製された三次元（３Ｄ）培養皮膚の組織学的分析を示すデータである。（ａ）ＧＦＰで標識したナイーブＭｕｓｅ細胞の局在化は、真皮同等物にナイーブＭｕｓｅ細胞を含ませることによって作製した３Ｄ培養ヒト皮膚の表皮と真皮において観察された（矢印）。これらのナイーブＭｕｓｅ細胞は、Ｓ１００とチロシナーゼ関連タンパク質−１（ＴＲＰ−１）の両方について陰性であった（データを示さず）。（ｂ）真皮同等物にＭｕｓｅ−メラノサイトを含ませることによって作製された３Ｄ培養ヒト皮膚のＳ１００及びＴＲＰ−１の免疫組織化学分析。Ｓ１００及びＴＲＰ−１について陽性であるＭｕｓｅ−メラノサイトは、表皮の基底膜において検出された。（スケールバー：５０μｍ）。略語：ＤＡＰＩ、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール。
【図９】図９は、Ｍｕｓｅ−メラノサイトを含む皮膚移植片における抗Ｋｉ−６７抗体（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）及び抗Ｓ１００抗体を用いた免疫組織化学的解析を示すデータである。Ｋｉ−６７発現は、ＨＰＲ−ＤＡＢシステム（茶色）（Ｗａｋｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）によって検出された。Ｓ１００発現は、アルカリホスファターゼ・パーマネントレッドキット（赤色）（ＤＡＫＯ）によって検出された。Ｋｉ−６７とＳ１００のダブル陽性の細胞は、表皮の基底層で検出された（挿入図）。  （スケールバー：５０μｍ）。略語：ＨＲＰ、西洋ワサビペルオキシダーゼ；ＤＡＢ、ジアミノベンジジン。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、メラノサイト及びケラチノサイトを含む医薬組成物を提供し、ここで、メラノサイトは、ある種の因子及びサイトカインの組み合わせを用いることによって、Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｓｔｒｅｓｓ−ｅｎｄｕｒｉｎｇ（Ｍｕｓｅ）細胞から誘導される。本発明はまた、Ｍｕｓｅ細胞を用いて三次元皮膚を作製するための方法、及び色素異常を治療するための方法を提供する。
【００１６】
本発明によれば、Ｍｕｓｅ細胞由来のメラノサイト（すなわち、Ｍｕｓｅ−メラノサイト）とケラチノサイトを含む医薬組成物が提供され、ここで、Ｍｕｓｅ−メラノサイトは、限定されないが、Ｗｎｔ３ａ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、エンドセリン−３（ＥＴ−３）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）、リノール酸、コレラ毒素、Ｌ−アスコルビン酸、１２−Ｏ−テトラデカノイル−ホルボール  １３−アセテート（ＴＰＡ）、インスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）、及びデキサメタゾンを含む、２種以上の因子及び／又はサイトカインの使用によって、Ｍｕｓｅ細胞から誘導される。
【００１７】
本発明によれば、Ｍｕｓｅ−メラノサイト及び場合によりケラチノサイトを含む三次元皮膚が提供される。三次元皮膚は、それを構築するために必要な細胞及び／又はタンパク質を含んでもよい。
【００１８】
本発明によれば、Ｍｕｓｅ−メラノサイト及びケラチノサイトを含む三次元皮膚を生成するための方法が提供される。該方法は、
（ａ）正常な皮膚線維芽細胞又は他の間葉系組織からＭｕｓｅ細胞を用意し；
（ｂ）限定されないが、Ｗｎｔ３ａ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、エンドセリン−３（ＥＴ−３）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）、リノール酸、コレラ毒素、Ｌ−アスコルビン酸、１２−Ｏ−テトラデカノイル−ホルボール  １３−アセテート（ＴＰＡ）、インスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）、及びデキサメタゾンを含む、２種以上の因子及び／又はサイトカインを含む分化培地中でＭｕｓｅ細胞を培養して、Ｍｕｓｅ−メラノサイトを得て；
（ｃ）ゲル層でＭｕｓｅ−メラノサイトとケラチノサイトを培養し；及び
（ｄ）三次元皮膚を得る
工程を含む。
【００１９】
本発明によれば、治療を必要とする対象において、色素異常を治療するための方法であって、該障害によって引き起こされた患部に上記皮膚を適用することを含む上記方法が提供される。
【００２０】
本発明によれば、Ｍｕｓｅ細胞からＭｕｓｅ−メラノサイトを得るための方法が提供され、該方法は、限定されないが、Ｗｎｔ３ａ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、エンドセリン−３（ＥＴ−３）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）、リノール酸、コレラ毒素、Ｌ−アスコルビン酸、１２−Ｏ−テトラデカノイル−ホルボール  １３−アセテート（ＴＰＡ）、インスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）、及びデキサメタゾンを含む、２種以上の因子及び／又はサイトカインを用いて、Ｍｕｓｅ細胞を分化する工程を含む。
【００２１】
本発明に使用されるＭｕｓｅ細胞は、皮膚線維芽細胞又は他の間葉系組織に由来し得る。
【００２２】
１．治療のための適用症例
本発明は、再生医療におけるＭｕｓｅ−メラノサイトの使用に関する。具体的には、本発明は、Ｍｕｓｅ−メラノサイトを用いて、皮膚の色素異常を治療及び／又は予防するための医薬組成物及び三次元皮膚を提供する。本明細書で使用するとき、用語「色素異常」は、皮膚が正常と比べて明るく見え若しくは暗く見え、又は染みが現れ、変色している状態を指す。色素異常は、美容上の問題を引き起こすだけでなく、紫外線からの不完全な保護のために皮膚癌のリスクを高める色素欠乏症や白斑を含む。さらに、色素異常には、皮膚火傷、熱傷、火傷の瘢痕、創傷及びケロイド瘢痕の傷跡が含まれる。
【００２３】
２．Ｍｕｓｅ−メラノサイト
本発明によれば、Ｍｕｓｅ−メラニン細胞は、特定の因子及び／又はサイトカインを用いて、Ｍｕｓｅ細胞を分化させることによって得ることができる。
【００２４】
２−１．Ｍｕｓｅ細胞（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｓｔｒｅｓｓ−ｅｎｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌ）
本発明によれば、メラノサイトを誘導するために使用されるＭｕｓｅ細胞は、骨髄液、脂肪組織（Ｏｇｕｒａ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．，Ｎｏｖ  ２０，２０１３（Ｅｐｕｂ））（２０１４年１月１７日公開））、真皮結合組織などの皮膚組織、又は間葉系組織から得ることができる。Ｍｕｓｅ細胞は、臓器において結合組織周囲に散在する。さらに、Ｍｕｓｅ細胞は、多能性幹細胞と間葉系幹細胞の両方の性質を有し、例えば、「ＳＳＥＡ−３（Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ−３）」と「ＣＤ１０５」のダブル陽性細胞として同定され得る。ＳＳＥＡ−３及びＣＤ１０５は、それぞれ、多能性幹細胞と間葉系細胞の細胞表面マーカーである。したがって、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、これらの抗原マーカーを指標として生体組織から分離することができる。Ｍｕｓｅ細胞の分離法、同定法、及び特徴などの詳細は、国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号に開示されている。また、Ｗａｋａｏら（２０１１、上述）によって報告されているように、骨髄、皮膚などから間葉系細胞を培養し、それをＭｕｓｅ細胞の母集団として用いる場合、ＳＳＥＡ−３陽性細胞の全てがＣＤ１０５陽性細胞であることが分かっている。したがって、本発明における医薬組成物において、生体の間葉系組織又は培養間葉系幹細胞からＭｕｓｅ細胞を分離する場合は、単にＳＳＥＡ−３を抗原マーカーとしてＭｕｓｅ細胞を精製することができる。本明細書においては、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織から分離された多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を「ＳＳＥＡ−３陽性細胞」と称することがある。また、本明細書において使用するとき、「非Ｍｕｓｅ細胞」なる用語は、生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に含まれる（「ＳＳＥＡ−３陽性細胞」以外の）細胞を指す。
【００２５】
簡単には、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、ＳＳＥＡ−３に対する抗体を用いて、又はＳＳＥＡ−３とＣＤ１０５に対するそれぞれの抗体を両方用いて、生体組織（例えば、間葉系組織）から分離することができる。用語「生体」は、哺乳動物の生体を指す。生体には、受精卵や胞胚期より発生段階が前の胚は含まれないが、胎児や胞胚を含む胞胚期以降の発生段階の胚は含まれる。哺乳動物の例としては、限定されないが、ヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等のげっ歯類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、フェレット等が挙げられる。本発明の医薬組成物に使用されるＭｕｓｅ細胞は、生体の組織からマーカー（単数又は複数）を用いて分離される点で、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）やｉＰＳ細胞と明確に区別される。また、「間葉系組織」なる用語は、骨、滑膜、脂肪、血液、骨髄、骨格筋、真皮、靭帯、腱、歯髄、臍帯、臍帯血などの組織及び各種臓器に存在する組織をいう。例えば、Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄、皮膚、又は脂肪組織から得ることができる。生体の間葉系組織を採取し、この組織からＭｕｓｅ細胞を分離し、利用することが好ましい。また、上記分離手段を用いて、線維芽細胞又は骨髄間葉系幹細胞などの培養間葉系細胞からＭｕｓｅ細胞を分離してもよい。本発明の医薬組成物においては、使用されるＭｕｓｅ細胞は、レシピエントに対して自家であってもよく、又は他家であってもよい。
【００２６】
上記のように、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、ＳＳＥＡ−３陽性、及びＳＳＥＡ−３とＣＤ１０５の二重陽性を指標にして分離することができる。さらに、ヒト成人皮膚には、種々のタイプの幹細胞及び前駆細胞を含むことが知られているしかしながら、Ｍｕｓｅ細胞は、これらの細胞と同じではない。このような幹細胞及び前駆細胞には、皮膚由来前駆細胞（ＳＫＰ）、神経堤幹細胞（ＮＣＳＣ）、メラノブラスト（ＭＢ）、血管周囲細胞（ＰＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰ）、及び脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）が挙げられる。これらの細胞に固有のマーカーの「非発現」を指標として、Ｍｕｓｅ細胞を分離することができる。具体的には、Ｍｕｓｅ細胞は、ＣＤ３４（ＥＰ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ２７１（ＮＧＦＲ）（ＮＣＳＣのマーカー）、ＮＧ２（ＰＣのマーカー）、ｖＷＦ因子（フォンビルブランド因子）（ＥＰのマーカー）、Ｓｏｘ１０（ＮＣＳＣのマーカー）、Ｓｎａｉ１（ＳＫＰのマーカー）、Ｓｌｕｇ（ＳＫＰのマーカー）、Ｔｙｒｐ１（ＭＢのマーカー）、及びＤｃｔ（ＭＢのマーカー）からなる群から選択される少なくとも１個、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又は１１個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。例えば、ＣＤ１１７及びＣＤ１４６の非発現を指標に分離することができ、さらに、ＣＤ１１７、ＣＤ１４６、ＮＧ２、ＣＤ３４、ｖＷＦ及びＣＤ２７１の非発現を指標に分離することができ、さらに、上記の１１個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。
【００２７】
医薬組成物に使用される上記特徴を有するＭｕｓｅ細胞は、（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ、からなる群から選択される少なくとも１つの性質を有してもよい。本発明の一局面では、医薬組成物に使用されるＭｕｓｅ細胞は、上記性質を全て有する。ここで、上記（ｉ）について、「テロメラーゼ活性が低いか又は無い」とは、例えば、ＴＲＡＰＥＺＥ  ＸＬ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いてテロメラーゼ活性を検出した場合に、低いか又は検出できないことをいう。テロメラーゼ活性が「低い」とは、ヒト線維芽細胞と同程度のテロメラーゼ活性を有しているか、又はＨｅｌａ細胞に比べて１／５以下、好ましくは１／１０以下のテロメラーゼ活性を有していることをいう。上記（ｉｉ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、三胚葉細胞（内胚葉細胞系列、中胚葉細胞系列、及び外胚葉細胞系列）に分化する能力を有し、肝細胞、神経細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、骨細胞、脂肪細胞に分化し得る。また、精巣に移植した場合にも三胚葉細胞に分化することができる。さらに、静注により生体に移植することで損傷を受けた臓器（例えば、皮膚、脊髄、肝臓、筋肉）に遊走及び生着し、分化することができる。上記（ｉｉｉ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、浮遊培養では増殖速度約１．３日で増殖するが、１細胞から増殖し、胚様体様細胞塊を作り１４日間程度で増殖が止まる、という性質を有する。しかしながら、胚様体様細胞塊を接着培養に持っていくと、再び細胞増殖が開始され、細胞塊から増殖した細胞が広がっていく。さらに精巣に移植した場合、Ｍｕｓｅ細胞は、少なくとも半年間は癌化しないという性質を有する。また、上記（ｉｖ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、セルフリニューアル（自己複製）能を有する。「セルフリニューアル」なる用語は、１個のＭｕｓｅ細胞から浮遊培養により得られる胚様体様細胞塊に含まれる細胞が３胚葉性の細胞に分化することができるのと同時に、次世代の胚様体様細胞塊が、先の胚様体様細胞塊に含まれていた１つの細胞の懸濁培養によって形成することができ、次に、懸濁培養によりそこに含まれていた細胞が３胚葉性の細胞に分化し得て、胚様体様細胞塊が形成され得る。セルフリニューアルは、１回又は複数回のサイクルを繰り返せばよい。
【００２８】
２−２．メラノサイトへのＭｕｓｅ細胞の分化
本発明によれば、Ｍｕｓｅ細胞は、特定の組み合わせの因子及びサイトカインの使用によって、メラノサイト（本明細書では、「Ｍｕｓｅ−メラノサイト」と称する）に分化し得る。これらの因子及びサイトカインとしては、限定されないが、Ｗｎｔ３ａ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、エンドセリン−３（ＥＴ−３）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）、リノール酸、コレラ毒素、Ｌ−アスコルビン酸、幹細胞因子（ＳＣＦ）、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール  １３−アセテート（ＴＰＡ）、インスリントランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）、及びデキサメタゾンが挙げられる。メラノサイトにＭｕｓｅ細胞を分化させるために、上記の１０個の因子からなる群から選択される２つ以上の因子及び／又はサイトカインを使用することが好ましい。本明細書で使用するとき、用語「のＷｎｔ３ａ」は、分泌性シグナル伝達タンパク質をコードする、構造的に関連した遺伝子からなるＷＮＴ遺伝子ファミリーのメンバーを指す。用語「幹細胞因子（ＳＣＦ））は、ｃ−Ｋｉｔ受容体（ＣＤ１１７）に結合するサイトカインを指す。用語「エンドセリン−３（ＥＴ−３）」は、産生され、血管内皮細胞から放出される強力な血管収縮因子を指す。用語「塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）」は、血管形成、創傷治癒及び胚発生に関連する増殖因子を指す。用語「リノール酸」は、天然に存在する不飽和遊離酸である。用語「コレラ毒素」は、コレラ菌によって分泌されるタンパク質複合体を指す。用語「Ｌ−アスコルビン酸」は、抗酸化性を有する天然に存在する有機化合物を指す。用語「１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール  １３−アセテート（ＴＰＡ）」は、腫瘍プロモーターを指す。用語「インスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）」は、細胞培養用の基礎培地補足剤を指す。用語「デキサメタゾン」は、抗炎症作用及び免疫抑制作用を有する、グルココルチコイドクラスのステロイド剤の強力な合成メンバーを指す。本発明によれば、上述の因子及びサイトカインの組み合わせは、Ｍｕｓｅ細胞が、Ｗｎｔ３ａ、ＳＣＦ、ＥＴ−３、ｂ−ＦＧＦ、リノール酸、コレラ毒素、Ｌ−アスコルビン酸、ＴＰＡ、ＩＴＳ、及びデキサメタゾンからなる群から選択される２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個）を用いて、メラノサイトに分化され得る限り、特定の組み合わせに限定されない。
【００２９】
本発明によれば、Ｍｕｓｅ細胞は、例えば、以下のようにメラノサイトに分化され得る：１〜１０００ｎｇ／ｍｌ  Ｗｎｔ３ａ、０．１〜５００ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、０．１〜１００ｎＭ  ＥＴ−３、０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ  ｂ−ＦＧＦ、０．０１〜１００ｍｇ／ｍｌリノール酸、１〜１０００ｐＭコレラ毒素、１０-6〜１０-2Ｍ  Ｌ−アスコルビン酸、１〜５００ｎＭ  ＴＰＡ、０．１〜１０×ＩＴＳ、及び／又は０．０１〜１Ｍデキサメタゾンを含む分化培地中でＭｕｓｅ細胞を培養する。細胞の生存に必須の基礎培地は、限定されないが、α−最小必須培地（α−ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ  １６４０、基礎培地イーグ（ＢＭＥ）、ダルベッコ改変イーグル培地：栄養混合物Ｆ−１２（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２）、グラスゴー最小必須培地（グラスゴーＭＥＭＥ）、ハンクス平衡溶液、及びＭＣＤＢ  １５３培地が挙げられる。上記の因子及び／又はサイトカインが溶解している上記の基礎培地は、分化培地として使用することができる。加えて、Ｍｕｓｅ細胞は、１〜１２週間、分化培地中に維持され、さらに、Ｍｕｓｅ細胞からのこのようなメラノサイト誘導は、少なくとも２回、好ましくは３回繰り返されてもよい。あるいは、メラノサイト誘導は、１日３回、１日２回、１日１回、２日に１回、３日に１回、週１回、２週に１回、３週に１回、又は４週に１回、上記の因子及び／又はサイトカインを基礎培地に添加することによって行われてもよい。
【００３０】
本発明によれば、Ｍｕｓｅ細胞がメラノサイトに分化した（すなわち、Ｍｕｓｅ−メラノサイトが得られた）ことを確認するために、メラノサイトに関連したマーカーの発現を逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）及びＦＡＣＳなどの様々な検出法により調べることができる。メラノサイトに関連したマーカーとしては、限定されないが、ＭｉＴＦ、ｃ−ｋｉｔ、ＴＲＰ−１、ｇｐ１００、ＤＣＴ、及びチロシナーゼが挙げられる。誘導されたＭｕｓｅ細胞は、ＭｉＴＦ、ｃ−ｋｉｔ、ＴＲＰ−１、ｇｐ１００、ＤＣＴ、及びチロシナーゼのうちの少なくとも１つを発現している場合、細胞は、Ｍｕｓｅ−メラノサイトと考えることができる。
【００３１】
３．本発明に係る医薬組成物の調製及び使用
本発明に係る医薬組成物は、例えば、通常の生理食塩水又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの適切な緩衝液中でＭｕｓｅ−メラノサイトとケラチノサイトを懸濁させることによって得ることができる。これに関連して、Ｍｕｓｅ−メラノサイトの数は、治療又は移植のための使用には十分でない場合、Ｍｕｓｅ−メラノサイト又は（誘導されていない）Ｍｕｓｅ細胞は、細胞の所望数になるまで、細胞培地中で増殖され得る。ＷＯ２０１１／００７９００に記載されているように、Ｍｕｓｅ細胞は腫瘍化しないため、生体組織から得られた未分化細胞が細胞培養に含まれる場合でさえ、細胞の癌化の可能性は低く、安全であり得る。
【００３２】
医薬組成物にＭｕｓｅ−メラノサイトを用いる場合、医薬組成物は、細胞を保護するためにＤＭＳＯ及び／又は血清アルブミン、及び／又は細菌による汚染から細胞を防ぐために抗生物質を含んでもよい。さらに、担体、賦形剤、崩壊剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定化剤、保存剤、防腐剤、及び通常の生理食塩水などの医薬として許容される様々な種類の成分を医薬組成物に含ませることができる。
【００３３】
４．三次元皮膚及びその製造
一実施形態において、本発明は、Ｍｕｓｅ−メラノサイトを含む三次元皮膚を提供する。さらに、三次元皮膚は、ケラチノサイト、並びにコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、及びマトリゲル（登録商標）などの細胞外マトリックスを含むことができる。本発明によれば、このような三次元皮膚を製造する方法は、以下の工程を含む：
（ａ）正常な皮膚線維芽細胞又は他の間葉系組織からＭｕｓｅ細胞を用意し；
（ｂ）Ｗｎｔ３ａ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、エンドセリン−３（ＥＴ−３）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）、リノール酸、コレラ毒素、Ｌ−アスコルビン酸、１２−Ｏ−テトラデカノイル−ホルボール  １３−アセテート（ＴＰＡ）、インスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）、及びデキサメタゾンからなる群から選択される２つ以上の因子及び／又はサイトカインを含む分化培地中でＭｕｓｅ細胞を培養し、Ｍｕｓｅ−メラノサイトを得て；
（ｃ）ゲル層でケラチノサイトとともにＭｕｓｅ−メラノサイトを培養し；及び
（ｄ）三次元皮膚を得る。
【００３４】
具体的には、細胞外マトリックス（例えば、コラーゲン）及び正常皮膚線維芽細胞を含むゲル層は、真皮を模倣するように生成されてもよい。その後、Ｍｕｓｅ−メラノサイトは、必要に応じて、ケラチノサイトと組み合わせて、ゲル層上に播種されてもよく、次に、所望の組織構築物が得られるまで培養されてもよい。
【００３５】
Ｍｕｓｅ−メラノサイトがインビボで所定期間、生存し、メラノサイトの機能を維持し得るかどうかを調べるために、本発明による三次元皮膚を動物モデルに移植し、評価することができる。Ｍｕｓｅ細胞の多能性の評価は、例えば、免疫細胞化学、Ｌ−ＤＯＰＡ反応アッセイ、免疫組織化学、及びフォンタナ・マッソン染色によって行うことができ、これらは全て当業者に知られている。
【００３６】
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、一般的に、本開示が属する技術分野の当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中で使用するとき、続く用語は以下の意味を有する。
【００３７】
本明細書で使用するとき、用語「含んでいる」又は「含む」は、他を排除するわけではなく、本組成物及び方法が、引用された要素を含むことを意味することが意図される。組成物及び方法を定義するために使用するとき、「本質的に含む」とは、記述された目的の組み合わせに何らかの本質的に重要な他の要素を他の要素を排除することを意味する。したがって、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、請求されている開示の基本的であり、新規な特徴（単数又は複数）に実質的に影響を及ぼさない他の材料又は工程を排除しない。「からなる」とは、他の成分及び実質的な方法工程の微量成分よりも多くを除外することを意味する。これらの移行用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本開示の範囲内である。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、文脈が特に明確に指示しない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他に明確に記述していない限り、複数の対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「スレッド（ｔｈｒｅａｄ）」への言及は、複数のスレッドを含む。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明は、実施例を参照してより詳細に説明されるが、本発明は実施例に限定されない。
【００３９】
材料及び方法
全ての動物実験は、東北大学医学部の動物実験と実験委員会によって承認された。
【００４０】
細胞培養
ＮＨＤＦ（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）は、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を含有するα−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で培養された。ヒトメラノサイト（ＬｉｆｅＬｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）は、ＤｅｒｍａＬｉｆｅ（登録商標）Ｍ  ＬｉｆｅＦａｃｔｏｒｓ培地（ＬｉｆｅＬｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中に維持された。
【００４１】
メラノサイト誘導
ソーティング後、Ｍｕｓｅ細胞及び非Ｍｕｓｅ細胞を別々に、６ウェルプレートあたり１０，０００細胞の密度で播種し、α−ＭＥＭ中で１日培養した。次に、０．０５Ｍデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１×ＩＴＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍｇ／ｍｌリノール酸−ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、３０％低グルコースＤＭＥＭ、２０％ＭＣＤＢ−２０１培地、１０-4ＭのＬ−アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｌ−Ｗｎｔ３ａ細胞によって馴らされた５０％ＤＭＥＭ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、１０ｎＭのＥＴ−３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２０ｐＭコレラ毒素（Ｗａｋｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）、５０ｎＭのＴＰＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び４ｎｇ／ｍｌのｂ−ＦＧＦ（Ｗａｋｏ）を含有する分化培地中で細胞を培養した。すべての化学試薬は、製品情報シートに従って取り扱われた。この分化培地中で６週間、細胞を維持した。培地を２日ごとに交換した。細胞が５０％〜８０％のコンフルエントに達したとき、培養物を継代した。Ｍｕｓｅ細胞と非Ｍｕｓｅ細胞の両方からのメラノサイト誘発を少なくとも３回繰り返した。
【００４２】
細胞培養方法、ＦＡＣＳ、Ｍｕｓｅ細胞の多能性の評価、Ｗｎｔ３ａ馴化培地の調製、ＲＴ−ＰＣＲ、免疫細胞化学、Ｌ−ＤＯＰＡ反応アッセイ、免疫組織化学、フォンタナ・マッソン染色、インビトロでの３Ｄ培養皮膚の作製及び皮膚移植は、補足資料オンラインに記載されている。
【００４３】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）
Ｍｕｓｅ細胞を得るために、正常なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ、Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）をＦＡＣＳ抗体希釈物中のラットステージ特異的胎児抗原−３（ＳＳＥＡ−３）ＩｇＭ抗体（１：５０；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ；蛍光イソチオシアネート結合した抗ラットＩｇＭによって検出される）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）とともにインキュベートされ、従来報告されているＳｐｅｃｉａｌ  Ｏｒｄｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰｒｏｄｕｃｔであるＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）によって分類された。
【００４４】
Ｍｕｓｅ細胞の多能性の評価
以前の報告（Ｋｕｒｏｄａら、２０１０）に従って、分類されたＭｕｓｅ細胞を個々にα−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いた細胞の限界希釈によって９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、単一細胞の懸濁培養において７日間培養した。ディッシュは、細胞接着を防止するために、ポリＨＥＭＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でコーティングされた。Ｍ−クラスター形成を７日目に観察した。次に、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色は、白血球アルカリホスファターゼキット（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて行われた。インビトロでのＭ−クラスターの分化能力を分析するために、Ｍ−クラスターをゼラチンコートしたディッシュに個別に移した。以前に記載（Ｋｕｒｏｄａら、２０１０）されているように、培養の７日後、免疫細胞化学を行った。本研究で用いた抗体は、α−ＳＭＡ（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）、ニューロフィラメント（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、及びＧＡＴＡ−４（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）であった。
【００４５】
Ｌ−のＷｎｔ３ａ細胞からの馴化培地（Ｗｎｔ３ａ−ＣＭ）
Ｌ−のＷｎｔ３ａ細胞株をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。最初に、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）及び０．４ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む高グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｌ−Ｗｎｔ３ａ細胞を１０ｃｍディッシュで培養した。約９０％コンフルエントになるまで細胞を増殖させた後、１０ｃｍ培養ディッシュにおいて１０％ＦＢＳを含む１０ｍｌの高グルコースＤＭＥＭ中で１：５に分割し、４日間増殖させた。次に、ディッシュの馴化培地を回収し、０．２２μｍフィルターで濾過後、４℃にて保存した。これは、第１バッチの培地であった。続いて、１０ｍｌの高グルコースＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳをディッシュに添加し、さらに３日間培養した。３日後、馴化培地を回収し、濾過した。これは、第２バッチの培地であった。第１及び第２のバッチを混合した。これは、４週間まで４℃で保存することができるＷｎｔ３ａ馴化培地であった。馴化培地中のＷｎｔ３ａタンパク質の存在をウエスタンブロット分析においてシグナルを検出することによって確認した。
【００４６】
ＭＣＤＢ２０１培地
ＭＣＤＢ２０１培地をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手した。ＭＣＤＢ２０１培地は、ホルモン、増殖因子、微量成分、及び低レベルのウシ胎児血清タンパク質を用いて、ニワトリ胚線維芽細胞のクローン増殖用に設計されたＨａｍ栄養混合Ｆ−１２の変形である。ＭＣＤＢ２０１培地は、ＤＭＥＭ及び１０種の分化誘導因子を含む分化培地を作成するために使用された。
【００４７】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖｅｎｌｏ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて総ＲＮＡを精製した。ｃＤＮＡ合成は、オリゴ（ｄＴ）15プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてプライミングされたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行われた。次のようにＰＣＲを行った：１サイクル、９４℃、５分間、続く、３６又は４０サイクル、９４℃、１分；遺伝子特異的アニーリング温度、１分；７２℃、１分；次に、７２℃、７分にて伸長。
【００４８】
プライマーを次のように設計した：ＫＩＴフォワードプライマー、５’−ＧＡＡＡＧＴＧＡＣＧＴＣＴＧＧＴＣＣＴＡＴＧＧ−３’；リバースプライマー、５’−ＧＴＧＣＴＣＴＣＴＧＡＡＡＴＣＴＧＣＴＴＣＴＣＡ−３’；ドーパクローム異性化酵素（ＤＣＴ）フォワードプライマー、５’−ＴＣＣＴＴＣＣＴＧＡＡＣＧＧＧＡＣＡＡＡ−３’；リバースプライマー、５’−ＴＧＧＣＡＴＡＧＣＴＧＴＡＧＣＣＡＡＧＴＴＧ−３’。ＭＩＴＦフォワードプライマー、５’−ＣＧＧＧＡＡＣＡＧＧＡＣＣＡＴＧＧＴＴＡ−３’；リバースプライマー、５’−ＡＧＣＴＡＧＣＣＣＣＴＧＡＡＡＴＧＡＡＴＣＣ−３’；ｇｐ１００フォワードプライマー、５’−ＣＣＡＧＴＧＴＡＴＣＣＣＣＡＧＧＡＡＡＣＴＧ−３’；リバースプライマー、５’−ＧＡＡＴＧＡＧＣＡＡＧＡＧＧＣＡＣＡＴＡＧＣＴ−３’；ＴＲＰ−１、フォワードプライマー、５’−ＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＡＧＡＴＧＣＡ−３’；リバースプライマー、５’−ＡＡＧＣＧＣＣＡＡＣＴＡＣＴＧＣＴＡＴＧＧ−３’；チロシナーゼフォワードプライマー、５’−ＧＡＧＧＴＣＡＧＣＡＣＣＣＣＡＣＡＡＡＴ−３’；リバースプライマー、５’−ＧＣＡＧＣＴＴＴＡＴＣＣＡＴＧＧＡＡＣＣＡ−３’。
【００４９】
免疫細胞化学
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、ＭＩＴＦ（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ）、チロシナーゼ（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ）、及びｇｐ１００（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）に特異的な一次抗体とともにインキュベートした。洗浄後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でコンジュゲートした二次抗体とともに細胞をインキュベートし、ＤＡＰＩとともに対比染色した。次に、ｃ１ｓｉニコン共焦点顕微鏡システム（Ｎｉｋｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて細胞を調べた。
【００５０】
Ｌ−ＤＯＰＡ反応アッセイ
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で細胞を２回洗浄し、２０分間室温で４％パラホルムアルデヒドを用いて固定した。その後、リン酸緩衝液で細胞を３回洗浄し、リン酸ナトリウム緩衝液中、３７℃にて１８時間、暗所で５ｍＭのＬ−ＤＯＰＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに細胞をインキュベートした。インキュベーション後、細胞を蒸留水で洗浄し、２０分間、４％パラホルムアルデヒドで固定し、光学顕微鏡下で撮影した。
【００５１】
インビトロでの３Ｄ培養皮膚
組織培養トレイ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｔｏｎ，ＰＡ）の挿入物は、１型コラーゲン（Ｎｉｔｔａ  Ｇｅｌａｔｉｎ  Ｉｎｃ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）、ハンクス緩衝塩（Ｎｉｔｔａ  Ｇｅｌａｔｉｎ  Ｉｎｃ．）を含む最小必須培地、及び３．５×１０5ＮＨＤＲ細胞／ｍｌを含む混合溶液を用い層状にされた。３７℃で３日間インキュベート後、Ｍｕｓｅ−メラノサイト又は非Ｍｕｓｅ細胞由来の細胞（メラノサイト誘導のために処理された非Ｍｕｓｅ細胞）は、Ｍｕｓｅ−メラノサイトとケラチノサイトを１：２．５の比率で、ヒト表皮ケラチノサイトとともにコラーゲン層上に播種された。細胞をＨｕｍｅｄｉａ  ＫＧ２培地（Ｋｕｒａｂｏ）中で５日間培養した。Ｃａ++濃度は徐々に増加した。Ｃａ++濃度は、１日目で０．１５ｍＭであり、２日目で１．０ｍＭであり、３〜５日目で１．５ｍＭであった。気液界面でさらに７日間、３Ｄ培養皮膚を培養し、次に、評価のために１０％ホルムアルデヒドで固定し、ＳＣＩＤマウスに移植した。ヒトメラノサイトを含む３Ｄ培養皮膚を陽性対照として使用し、ヒトメラノサイトを含まない３Ｄ培養皮膚を陰性対称として使用した。
【００５２】
３Ｄ培養皮膚及び皮膚移植片の免疫組織化学
３Ｄ培養皮膚及び皮膚移植片を１０％ホルムアルデヒドで固定し、パラフィン中に包埋し、３μｍ厚の切片に切断した。切片をメタノール中の０．３％過酸化水素で１２分間処理し、固有のペルオキシダーゼ活性を不活性化し、その後、標準的な免疫ペルオキシダーゼ技術を用いて、Ｓ１００（ポリクローナル、ＤＡＫＯ）、ＴＲＰ−１（ポリクローナル、Ｓｉｇｍａ）、ＭＩＴＦ、チロシナーゼ、及びｇｐ１００抗体を用いて染色した。
【００５３】
ＧＦＰで標識されたＭｕｓｅ−メラノサイトを含む皮膚移植片は、新たに調製されたヨウ素酸−リシン−パラホルムアルデヒドで６時間、４℃にて固定され、ＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｃｈｎｉｃａｌ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に包埋され、８μｍ厚の凍結切片に切断された。試料をＰＢＳで洗浄し、室温で３０分間、ブロッキング溶液とともにインキュベートした。次に、スライドを４℃で一晩、抗ＧＦＰ抗体（Ａｂｃａｍ）で染色した。スライドをＰＢＳで３回洗浄し、室温で２時間、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をコンジュゲートした二次抗体とともにインキュベートした。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、３０分間、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で対比染色し、ニコン蛍光顕微鏡を用いて調べた。
【００５４】
フォンタナ・マッソン染色
３Ｄ培養皮膚及び皮膚移植片をメラニンの組織学的検出のために、フォンタナ・マッソン染色を用いて調べた。パラフィン包埋切片を脱パラフィンし、蒸留水で濯いだ。スライドは、フォンタナ硝酸銀溶液（Ｍｕｔｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、暗所にて２４時間、室温で処理された。蒸留水で洗浄後、スライドを５秒間、金塩化物溶液（Ｍｕｔｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）で処理し、１分間、酸硬化定着液（Ｍｕｔｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）に入れた。スライドを洗浄し、１分間、ニュートラルレッド（Ｍｕｔｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）で対比染色した。
【００５５】
皮膚移植
３Ｄ培養皮膚は、８〜１４週齢のＳＣＩＤマウスの背部皮膚に移植された。トリブロモエタノール（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）の腹腔内注射によってマウスを麻酔し、移植片ベッド（８ｍｍ×８ｍｍ）をマウス背部皮膚に調製した。３Ｄ培養皮膚は、移植片ベッド上に適用され、ワセリンガーゼ、Ｓｔｅｒｉ−Ｓｔｒｉｐ（３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）、及び包帯で覆われた。包帯を３日目に除いた。移植片の生存について、さらに７日間観察した。インビボでのＭｕｓｅ−メラノサイトを追跡するために、以前の報告（Ｋｕｒｏｄａら、２０１０）に従って、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むレンチウイルスでＭｕｓｅ細胞を感染し、次に、細胞をＭｕｓｅ−メラノサイトに分化し、３Ｄ培養に供し、ＳＣＩＤマウスの背部皮膚に移植した。本発明者らは、Ｍｕｓｅ−メラノサイトを用いた皮膚移植片の移植について４匹のＳＣＩＤマウスを使用し、ヒトメラノサイトを用いた皮膚移植片について２匹のＳＣＩＤマウスを使用し、ケラチノサイトのみで２匹を使用した。皮膚移植片試料を１０日目に１０％ホルムアルデヒドで固定した。
【００５６】
ＧＦＰで標識したＭｕｓｅ細胞（Ｍｕｓｅ−ＧＦＰ）を調製する方法
プラスミドｐＭＤ．２Ｇ、ｐＣＭＶ−ｄＲ８．７４、及びｐＷＰＸＬ−ＧＦＰをＴｒｏｎｏ博士（Ｇｅｎｅｖａ，ＣＨ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の好意で入手した。高力価ＧＦＰレンチウイルス上清は、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地（ＧＩＢＣＯ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、２９３ＦＴ細胞における３つのプラスミドの一過性同時移植によって作製された。２９３ＦＴ細胞（１００ｍｍディッシュで９０％〜９５％コンフルエント）は、３μｇのｐＷＰＸＬ−ＥＧＦＰ、３μｇのｐＣＭＶ−ｄＲ８．７４、及び３μｇのｐＭＤ．２Ｇとともにトランスフェクトされた。トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の上清をトランスフェクションから２日及び３日後に回収した。上清を０．４５ｍｍポアサイズのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過し、Ａｍｉｃｏｎ−Ｕｌｔｒａ１５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した。ウイルス溶液を１０％ＦＢＳを含む１０ｍｌのαＭＥＭと混合した。ＧＦＰでＮＨＤＦを標識するために、ＮＨＤＦを２４〜４８時間、混合培地中で培養した。Ｍｕｓｅ−ＧＦＰは、ＦＡＣＳを用いてＳＳＥＳ−３／ＧＦＰの二重陽性細胞としてＮＨＤＦ−ＧＦＰから単離された。
【００５７】
実施例１：ヒト線維芽細胞からのＭｕｓｅ細胞の単離
Ｍｕｓｅ細胞は、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ，Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から回収された。従来報告されているように（Ｋｕｒｏｄａら、２０１０）、ＮＨＤＦからの１００％のＳＳＥＡ−３陽性細胞はＣＤ１０５に陽性であるため、本発明者らは、ＳＳＥＡ−３陽性細胞としてＦＡＣＳによってＭｕｓｅ細胞を単離した。ＮＨＤＦにおけるＳＳＥＡ−３陽性細胞の比率は、２％〜３％の範囲であり、以前の報告と一致していた（図１ａ）。
【００５８】
本発明者らは、回収したＭｕｓｅ細胞の分化能を評価した。限界希釈後、各Ｍｕｓｅ細胞を単一細胞の懸濁培養において培養したとき、ＥＳ細胞由来の胚様体に非常に類似した細胞クラスター、すなわちＭｕｓｅ細胞由来の細胞クラスター（Ｍクラスター）が７日目までに生じた（図１ｂ）。これらのクラスターは、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色について陽性であり（図１ｃ）；Ｎａｎｏｇ、ＯＣＴ３／４、Ｓｏｘ２などの多能性マーカーを発現し；従前に報告されているように（Ｗａｋａｏら、２０１１）、セルフリニューアルを行うことができた（データ示さず）。それらの分化能を観察するために、単一のＭクラスターを個別にゼラチンコートしたディッシュに移した。７日後、Ｍクラスターから増殖した細胞の、神経フィラメント（外胚葉マーカー）、α平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ、中胚葉マーカー）、及びＧＡＴＡ４（内胚葉マーカー）に陽性である細胞への自発的分化を検出した（図１ｄ−ｆ）。一方、非Ｍｕｓｅ細胞は、単一細胞懸濁培養においてクラスターを形成しなかった。したがって、内胚葉、中胚葉及び外胚葉系統細胞への非Ｍｕｓｅ細胞の分化は観察されなかった。これらの結果は、本発明者らの以前の報告（Ｗａｋａｏら、２０１１）と一致していた。
【００５９】
実施例２：Ｍｕｓｅ細胞のメラノサイトへの分化
ＮＨＤＦをＦＡＣＳによってＭｕｓｅ細胞と非Ｍｕｓｅ細胞に分離し、両者を１０個の因子：Ｗｎｔ３ａ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、エンドセリン−３（ＥＴ−３）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）、リノール酸、コレラ毒素、Ｌ−アスコルビン酸、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール  １３−アセテート（ＴＰＡ）、インスリン−トランスフェリン−セレニウム（ＩＴＳ）、及びデキサメタゾンを含む特定の分化培地で別々に培養した（図１ｇ）。Ｍｕｓｅ細胞の形態が変化し始め、樹状突起を有する細胞が３週間以内に出現した。細胞の大きさは、５週までに僅かに減少し、６週間で、細胞はヒトメラノサイトに類似した形態を有した（図２）。しかしながら、このような変化は、非Ｍｕｓｅ細胞では起こらなかった。非Ｍｕｓｅ細胞由来の細胞のほとんどが、分化の６週間後でさえ線維芽細胞様のままであった（図２）。
【００６０】
実施例３：Ｍｕｓｅ−メラノサイトの特徴付け
メラノサイト関連マーカーの発現は、分化の６週間後、Ｍｕｓｅ−メラノサイト及び非Ｍｕｓｅ細胞由来の細胞において調べられた。ヒトメラノサイトを陽性対照として使用した。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）において、Ｍｕｓｅ細胞から誘導された細胞は、３週間でＭＩＴＦ、ＫＩＴ、ＴＲＰ−１、及びｇｐ１００を発現した（図３ａ）。また、Ｍｕｓｅ細胞は、５週でＤＣＴを発現し、６週でチロシナーゼを発現した。本発明者らは、以前に、ナイーブＭｕｓｅ細胞がＤＣＴ又はＴＲＰ−１のいずれも発現しないことを報告した（Ｗａｋａｏら、２０１１）；したがって、Ｍｕｓｅ細胞におけるこれらのメラノサイト関連マーカーの発現は、分化によって誘導されると考えられる。非Ｍｕｓｅ細胞由来の細胞は、３週後にＭＩＴＦ、ＫＩＴ、及びＴＲＰ−１を発現したが、ＤＣＴ、ｇｐ１００、及びチロシナーゼは、分化の６週後でさえ、これらの細胞において発現されなかった（図３ａ）。
【００６１】
免疫細胞化学において、チロシナーゼ、ｇｐ１００、及びＭＩＴＦに陽性の細胞は、ヒトメラノサイトの場合のように、Ｍｕｓｅ−メラノサイト（６週）において検出され、一方、これらのメラノサイトマーカーに陽性の細胞のいずれも同時点で非Ｍｕｓｅ細胞由来の細胞において観察されなかった（図３ｂ）。ＭＩＴＦシグナルは、ＲＴ−ＰＣＲでは非Ｍｕｓｅ細胞由来の細胞において検出されたが、タンパク質の発現レベルは、免疫細胞化学によって検出されるには十分に高くなかった。
【００６２】
Ｍｕｓｅ−メラノサイトは、メラニンの生産性を調べるために、Ｌ−ＤＯＰＡ反応アッセイによってさらに評価された。多くの細胞は、Ｌ−ＤＯＰＡ反応アッセイについて陽性であった（図３ｃ）。これらの結果は、ヒトメラノサイトと類似した特徴を有する細胞が、Ｍｕｓｅ細胞から誘導されるが、非Ｍｕｓｅ細胞からは誘導されないことを示唆した。
【００６３】
実施例４：メラノサイト分化における因子の影響
メラノサイト誘導に必須の因子を調べ、及び因子の数が１０から現象され得るのかどうかを推定するために、因子の７つの組み合わせを作製した（図４ａ）。Ｍｕｓｅ細胞は、培地１、２、３、４及び７で培養し、十分に増殖させたが、それらは真正のヒトメラノサイトに類似していなかった。培地５及び６中で培養したＭｕｓｅ細胞は十分に増殖せず、すべてが２０日目以内に死滅した（図４ａ）。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、６週目で、全７セットの培地にチロシナーゼ発現を示さなかった。したがって、これらの培地は、メラノサイト誘導において、１０因子を含む培地よりも優れていなかった（図４ａ、ｂ）。培地１及び２中で培養したＭｕｓｅ細胞は、ＭＩＴＦ及び／又はＫＩＴのみを発現した。培地３、４、及び７において、Ｍｕｓｅ細胞は、いくつかのメラノサイト関連マーカーを発現したが、チロシナーゼを発現しなかった（図４ａ、ｂ）。
【００６４】
実施例５：Ｍｕｓｅ−メラノサイトの使用による３Ｄ培養皮膚の作製
本発明者らは、Ｍｕｓｅ−メラノサイト及び他の細胞型を用いた３Ｄ培養皮膚を構築することを試みた。真皮を模倣するために、１型コラーゲンとＮＨＤＦを含むゲル層を作製した。表皮の構築のために、培養１）：ケラチノサイト＋Ｍｕｓｅ−メラノサイト、培養２）：ケラチノサイトのみ、培養３）：ケラチノサイト＋ヒトメラノサイト、又は培養４）ケラチノサイト＋非Ｍｕｓｅ細胞由来の細胞のいずれかをゲル層上に播種した。１５日後、色素沈着細胞を培養１）及び３）の表皮の基底層において観察した（図５ａ−ｂ）。培養１）はヒトケラチノサイトとＭｕｓｅ−メラノサイトを含み、ケラチノサイトは、通常、メラニンを産生しないため、培養１）においてメラニンを産生する細胞は、Ｍｕｓｅ−メラノサイトでると考えられた（図５ｂ）。さらに、ＭＩＴＦ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ｇｐ１００、及びＳ１００に陽性である細胞を培養１）と３）の両方において同定し、フォンタナ・マッソン染色によって、両培養物の表皮においてメラニンの存在を明らかにした（図５ｃ）。対照的に、色素沈着細胞、及びメラニン細胞関連マーカーに陽性である細胞は、培養２）及び４）からの培養皮膚において観察されなかった（図５ａ、ｃ）。
【００６５】
また、３Ｄ培養皮膚におけるＭｕｓｅ細胞の自発的分化能を調べた。本発明者らは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で標識した未分化Ｍｕｓｅ細胞（ナイーブＭｕｓｅ細胞）とケラチノサイトを混合し、３Ｄ培養皮膚の表皮を構築した。１５日後、ＧＦＰ陽性のナイーブＭｕｓｅ細胞を表皮において同定したが、それらのいずれもメラノサイト関連マーカーであるＳ１００、ＴＲＰ−１、及びチロシナーゼを発現しなかった（図７ａ−ｂ）。この結果は、ナイーブＭｕｓｅ細胞が３Ｄ培養皮膚の表皮層に組み込まれたとしても、メラノサイトに自発的に分化しないことを示した。
【００６６】
いくつかのグループは、３Ｄ培養ヒト皮膚モデルが、マウス皮膚を用いることによって、実験よりも正確にヒト皮膚におけるヒトメラノサイトの生理学的状況を反映することを報告しているため（Ｈａａｋｅ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，１９９１；Ｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０００）、本発明者らは、３Ｄ培養皮膚を用いて、ナイーブＭｕｓｅ細胞とＭｕｓｅ−メラノサイトの移動能を評価した。ＧＦＰ陽性のナイーブＭｕｓｅ細胞をＮＨＤＦと混合し、３Ｄ培養皮膚の真皮同等物に埋め込み、次に、該真皮同等物の上部のみにヒトケラチノサイトを播種した。１５日後、ＧＦＰ標識したナイーブＭｕｓｅを３Ｄ培養皮膚の表皮に検出したが（図８ａ）、上述したように、Ｓ１００、ＴＲＰ−１、及びチロシナーゼを発現しなかった（図７）。Ｍｕｓｅ−メラノサイトのうちのいくつかは、真皮同等物から移動し、表皮層に組み込み、Ｓ１００とＴＲＰ−１を発現した（図８ｂ）。これは、ヒトメラノサイトが通常存在する表皮に、Ｍｕｓｅ−メラノサイトが移動する能力を有することを示す。
【００６７】
実施例６：インビボにおけるＭｕｓｅ−メラノサイトの機能評価
インビボにおいて所定期間、Ｍｕｓｅ−メラノサイトが生存し、メラノサイト機能を維持し得るかどうかを調べるために、本発明者らは、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの背中にＭｕｓｅ−メラノサイトを含む３Ｄ培養皮膚を移植した。ヒトメラノサイトを含む３Ｄ培養皮膚と、ケラチノサイトのみを含む３Ｄ培養皮膚をそれぞれ、陽性対照及び陰性対照として移植した。ヒトメラノサイトを含む皮膚の移植から１０日後、いくらかのメラノサイトを移植片の基底層において組織学的に検出した（図６ａ、ｂ）。陰性対照において、皮膚移植片は色素沈着されているようではなく、色素沈着細胞は組織学的に観察されなかった（図６ａ、ｂ）。組織学的評価は、Ｍｕｓｅ−メラノサイトを有する皮膚移植片が、茶色の基底層に局在化してＭｕｓｅ−メラノサイトを含んでいたことを示し（図６ａ、ｂ）、免疫組織学的分析は、該皮膚移植片が、ヒトメラノサイトを移植した場合と同様に、ＭＩＴＦ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ｇｐ１００、及びＳ１００に陽性であることを示した（図６ｃ）。さらに、Ｍｕｓｅ−メラノサイト及び近接するケラチノサイトは、ヒトメラノサイトにおいて観察されたように、フォンタナ・マッソン染色に陽性であった（図６ｃ）。ＧＦＰ標識したＭｕｓｅ−メラノサイトを含む３Ｄ培養皮膚の移植後、ＧＦＰ陽性Ｍｕｓｅ−メラノサイトは、移植された皮膚内に局在化していることが確認され、これは、これらのＧＦＰ陽性細胞が、移植された細胞であって、宿主に由来しないことを示している（図６ｄ）。これらの知見は、Ｍｕｓｅ−メラノサイトが、インビボにおいて、表皮の基底層にホーミングし、メラニンを産生し、近接するケラチノサイトにメラニンを輸送することを示した。陰性対照であるケラチノサイトのみを有する皮膚片は、全てのメラノサイト関連マーカー及びフォンタナ・マッソン染色に陰性であった（図６ｃ）。
【００６８】
本発明者らは、メラノサイトマーカーであるＳ１００と増殖マーカーであるＫｉ−６７について二重染色を行い、Ｍｕｓｅ−メラノサイトの増殖能について調べた；Ｍｕｓｅ−メラノサイトの９．５％がＫｉ−６７とＳ１００の両方を発現した（図９）。
【００６９】
考察
本研究の知見は、ＮＨＤＦうち、特定型の幹細胞であるＭｕｓｅ細胞は、特定の組み合わせの因子及びサイトカインを用いることによって、機能性メラノサイトに容易に分化し得るが、ＮＨＤＦのうち他の細胞である非Ｍｕｓｅ細胞は分化し得ないことを示した。Ｍｕｓｅ−メラノサイトは、免疫細胞化学においてメラノサイトマーカーを発現し、ＲＴ−ＰＣＲは、インビトロでＬ−ＤＯＰＡに陽性反応を示し、３Ｄ培養皮膚において成長することができ、インビボにおいて生存し、メラノサイトマーカーを発現し、ＳＣＩＤマウスの背部皮膚に移植後にメラニンを産生した。したがって、Ｍｕｓｅ−メラノサイトは、メラノサイトに匹敵すると考えられる。
【００７０】
間葉系幹細胞型であるＤＰＳＣは、メラノサイトに分化することが報告されている（Ｓｔｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ，２００８；Ｐａｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１０）。Ｓｔｅｖｅｎｓらは、ＣＤ３４（−）／ＣＤ２７１（＋）ＤＰＳＣから、Ｔ細胞１によって認識され、メラノサイトマーカーであるメラノーマ抗原（Ｍａｒｔ−１）を発現する細胞を首尾よく誘導した。ＮＨＤＦにおけるＭｕｓｅ細胞はまたＣＤ３４（−）であるが、ＮＨＤＦ由来のＭｕｓｅ細胞は、従前に報告されているように、ＣＤ２７１に陰性であるため、Ｍｕｓｅ細胞は歯髄細胞とは異なっていてもよい。Ｐａｉｎｏらは、ＤＰＳＣが、何ら刺激を与えずに、自発的にメラノサイトに分化することを報告した。自然発生的に分化した細胞は、ＤＣＴ、ＴＲＰ−１、及びＭＡＲＴ−１を発現し、Ｌ−ＤＯＰＡ反応アッセイにおいて陽性である。自発的分化は確かに魅力的である一方で、１５０日を超える日数を必要とした。ＤＰＳＣ由来のメラノサイトと比較して、Ｍｕｓｅ細胞は、６週間以内にメラノサイトに分化し、メラニンを生成するための必須の酵素であるチロシナーゼを発現した。
これらの理由から、Ｍｕｓｅ−メラノサイトは、臨床用途に実用的であることが予想される。
【００７１】
いくつかのグループは、メラノサイトがＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞から誘導され得ることをすでに報告している（Ｎｉｓｓａｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１１；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１１；Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００６；Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，２００６；Ｏｈｔａ  ｅｔ  ａｌ，２０１１；Ｙａｍａｎｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）。これらのメラノサイトは、Ｍｕｓｅ−メラノサイトのように、チロシナーゼを含むいくつかのメラノサイト関連マーカーを発現し、三次元培養皮膚においてメラニンを生成する。Ｍｕｓｅ細胞からメラノサイトを誘導する技術は、臨床応用に関連して重要である。ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞は腫瘍形成のリスクを増加させる（Ｆｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１０；Ｇｏｌｄｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１１；Ｂｅｎ−Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ，２０１１；Ｏｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。一方、Ｍｕｓｅ細胞を含むＭＳＣは腫瘍形成のリスクが低く、すでに多くの臨床試験において患者に適用されている（Ｋｕｒｏｄａ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）。したがって、Ｍｕｓｅ細胞は癌にならない性質を有するため、分化したＭｕｓｅ−メラノサイトと、メラノサイトに分化しなかったＭｕｓｅ細胞の両方は、三次元皮膚を構築するために使用することができ、そこに含まれる分化していないＭｕｓｅ細胞を取り除くことなしに、生体に投与することができる。ＥＳ細胞は受精卵から取得されるため、ＥＳ細胞の処理には、非常に多くの労力を必要とし、より多くの倫理的な問題を提起する（Ｋｎｏｐｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，２００９；Ｍａｎｚａｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）。ｉＰＳ細胞は、線維芽細胞などの体細胞から得られるため、倫理的な問題は回避されるが、多能性幹細胞を生成するために人工的な遺伝子を導入する必要がある（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，２００６；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。一方、Ｍｕｓｅ細胞は、通常、真皮などの利用し易い間葉系組織及び市販の線維芽細胞に存在するため、臨床用途及び産業用途に魅力的な細胞供給源である。さらに、Ｍｕｓｅ細胞は、セルソーティングシステムにおいて、ＳＳＥＡ−３で単に標識することによって間葉系細胞から容易に単離され、これは、特に産業用途に有益である。Ｍｕｓｅ細胞は利用し易い間葉系組織から得ることができるため、Ｍｕｓｅ−メラノサイトの自家移植又は同種移植もまた期待できる。
【００７２】
ヒトメラノサイト幹細胞は、毛嚢に存在し、セルフリニューアル能を有し、表皮においてメラニン細胞の数を維持するための役割を果たす。ＤＣＴとＰＡＸ３の両方は、メラノサイト幹細胞のマーカーとして知られていた。本発明者らは、ｍＲＮＡレベルでＭｕｓｅ−メラノサイトのＤＣＴ発現を実証した。Ｍｕｓｅ−メラノサイトの増殖能を調査するために、本発明者らは、Ｍｕｓｅ−メラノサイトのＫｉ−６７発現を調べた（図９）。結果は、９．５％のＭｕｓｅ−メラノサイトがＫｉ−６７を発現したことを示した。また、これらのＫｉ−６７陽性細胞は、メラノサイトのマーカーであるＳ−１００に対しても陽性であった。これらの結果は、移植後のＭｕｓｅ−メラノサイトのセルフリニューアル能を間接的に示唆した。
【００７３】
分化培地において使用されるＷｎｔ３ａ、ＥＴ−３、ＳＣＦ、ｂ−ＦＧＦ、及びｃＡＭＰ誘導物質（コレラ毒素およびＴＰＡ）は、細胞内シグナル伝達を介して、転写因子ＰＡＸ３、ＳＯＸ１０、ＣＲＥＢ、ＬＥＦ１の発現を促進することが知られていた（Ｓｔｅｉｎｇｒｉｍｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２００４，Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１２，Ｋｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）。これら４つの転写因子は、メラノサイトに特異的なＭＩＴＦ変異体の１つであるＭＩＴＦ−Ｍのプロモーターを調節し、メラノサイトの分化、増殖、生存、およびメラニン形成において重要な役割を有する。この点から見て、分化培地中のＷｎｔ３ａ、ＥＴ−３、ＳＣＦ、ｂ−ＦＧＦ及びｃＡＭＰ誘導物質は、ＭＩＴＦ−Ｍの活性化を通じて、Ｍｕｓｅ細胞においてメラノサイト関連因子を誘導するものと考えられる。アスコルビン酸は、チロシナーゼの活性及び合成を刺激することが知られている（Ｌｅｅ  ＳＡ，ｅｔ  ａｌ，２０１１）。最近、デキサメタゾンは、マウスＥＳ細胞からのメラニン細胞の発生を促進することが報告された（Ｙａｍａｎｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）。リノール酸とＩＴＳサプリメントの両方が、低血清培地中で補足因子として使用された。総合的に、これらの因子は、Ｍｕｓｅ細胞のメラノサイトへの効率的な誘導において協調的に作用していることが想定される。メラノサイトの分化に不可欠な因子を調査するために、本発明者らは、様々な幹細胞からのメラノサイト誘導について報告している記事（Ｙａｍａｎｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９９；Ｐａｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１０；Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，２００７）に基づいて、７つの因子の組み合わせを想到した。Ｆａｎｇらは、３つの因子（Ｗｎｔ３ａ、ＥＴ−３、及びＳＣＦ）の組み合わせが、多能性幹細胞からメラノサイトを誘導するのに十分であることを報告した。本発明者らの実験において、Ｍｕｓｅ細胞をこれらの３つの因子のいずれかを欠損した培地中で培養したとき、Ｍｕｓｅ細胞は、非常に僅かであるがメラノサイト関連マーカーを発現し、それらの形態は真正メラノサイトの形態と異なっていた。さらに、それらの３つの因子を含有する培地中で培養したＭｕｓｅ細胞は、ＭＩＴＦ、ＫＩＴ、ＴＲＰ−１、ＤＣＴ、及びｇｐ１００を発現したが、チロシナーゼを発現しなかった。これは、これらの３つの因子がメラノサイトへの分化に望ましい一方で、コレラ毒素、ＴＰＡ、及びリノール酸などのさらなる分化増強因子が、Ｍｕｓｅ細胞を成熟メラノサイトに分化するために使用され得ることを示唆している。
【００７４】
すべての参考資料及び対応する出願の全開示は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００７５】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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