(57)【要約】インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニストの腫瘍内投与による癌治療のための方法及び組成物が開示される。いくつかの実施形態では、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニストの有効量を対象者に投与することを含む、当該対象者における癌治療のための方法に関する組成物及び方法が提供され、ここで、当該ＳＴＩＮＧアゴニストは、腫瘍内に投与される。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニストの有効量を対象者へ投与することを含む、前記対象者における癌の治療方法であって、前記ＳＴＩＮＧアゴニストが腫瘍内投与される治療方法。
【請求項２】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストが核酸、タンパク質、ペプチド、または小分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストが小分子である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記小分子が環状ジヌクレオチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストが下記式の化合物である、請求項３に記載の方法。
【化１】
2016538344.tif 000019
【請求項６】
癌治療が、腫瘍のサイズ縮小化または腫瘍の成長抑制としてさらに定義される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストが前記対象者へ少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回投与される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記対象者が、異なる癌治療をさらに施される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストが投与され、その後に前記異なる癌治療が施される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記異なる癌治療が前記ＳＴＩＮＧアゴニストの３日以内に施される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記異なる癌治療が前記ＳＴＩＮＧアゴニストの２４時間以内に施される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記異なる癌治療が前記ＳＴＩＮＧアゴニストの３時間以内に施される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記異なる癌治療が施され、その後に前記ＳＴＩＮＧアゴニストが投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストが前記異なる癌治療の３日以内に投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストが前記異なる癌治療の２４時間以内に投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストが前記異なる癌治療の３時間以内に投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記異なる癌治療が、手術、放射線療法、化学療法、毒素療法、免疫療法、寒冷療法、または遺伝子療法を含む、請求項８〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記癌がメラノーマ、子宮頸癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、尿路上皮癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肉腫、結腸直腸腺癌、消化管間質腫瘍、食道癌、結腸直腸癌、膵臓癌、腎臓癌、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ）、悪性中皮腫、白血病、リンパ腫、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、移行上皮癌、神経芽細胞腫、形質細胞腫瘍、ウィルムス腫瘍、または肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）である、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記癌がメラノーマである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記癌が化学療法または放射線抵抗性の癌である、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記対象者が少なくとも約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、もしくは３００μｇ／ｋｇまたはｍｇ／ｋｇで前記アゴニストを投与される、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストが天然に存在しない環状ジヌクレオチドである、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストが下記式の化合物：
【化２】
2016538344.tif 000020
であって、式中、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立に９−プリン、９−アデニン、９−グアニン、９−ヒポキサンチン、９−キサンチン、９−尿酸、もしくは９−イソグアニンのいずれか１つである、化合物、またはそのプロドラッグもしくは医薬的に許容可能なその塩である、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物が主にＲｐ，ＲｐまたはＲｐ，Ｓｐジアステレオマーの形態である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストがジチオ−（Ｒｐ，Ｒｐ）−［環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］］（２’−５’、３’−５’混合ジホスホジエステル結合（ＭＬ）ＲＲ−Ｓ２  ｃ−ｄｉ−ＡＭＰもしくはＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡとも呼ばれる））、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２−ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ（ＭＬ−ＣＤＧ）、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ｃＧＡＭＰ、またはそれらのいずれかの混合物である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストがＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
天然に存在しない下記式の化合物：
【化３】
2016538344.tif 000021
【請求項２８】
前記化合物がＲｐ，Ｒｐジアステレオマーの形態である、請求項２７に記載の化合物。
【請求項２９】
前記化合物がＲｐ，Ｓｐジアステレオマーの形態である、請求項２７に記載の化合物。
【請求項３０】
前記化合物がＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２−ＣＤＧ、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２−ｃＧＡＭＰ、またはそれらのいずれかの混合物である、請求項２７に記載の化合物。
【請求項３１】
前記化合物がＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡである、請求項２８に記載の化合物。
【請求項３２】
請求項２７〜３１のいずれかによる化合物の有効量を対象者に投与することを含む、前記対象者における癌の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１１月１９日出願の米国仮特許出願第６１／９０６，３３０号の優先権の利益を主張するものであり、この全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
Ｉ．発明の分野
本発明は、一般に生物学、化学、及び医薬の分野に関する。より具体的には、腫瘍学及び癌処置に関する方法及び組成物に関する。
【０００３】
ＩＩ．関連技術の説明
１９８０年代に、フラボン酢酸が、いくつかの腫瘍マウスモデルにおいて、抗腫瘍効果を有し、腫瘍内において出血壊死を起こすことが示された。腫瘍血管内でのその効果から、血管破壊剤（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ）と呼ばれた。血管内での効果に加え、フラボン酢酸は、いくつかの先天性サイトカインの産生を増加させた。
【０００４】
より強力な化合物を得るために、本薬剤の構造は、改変され、その中で最も強力な誘導体は、ＤＭＸＡＡであり、壊死及びサイトカイン放出の誘導において、１６倍の効力を示した。マウスモデルや前臨床試験での有望な結果により、腫瘍処置のためにＤＭＸＡＡを使用した臨床試験がいくつか実施されたが、すべて失敗した。
【０００５】
したがって、癌及び腫瘍を処置するＤＭＸＡＡといった血管破壊剤を使用する有効な様式を特定する必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【０００６】
いくつかの実施形態では、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニストの有効量を対象者に投与することを含む、当該対象者における癌治療のための方法に関する組成物及び方法が提供され、ここで、当該ＳＴＩＮＧアゴニストは、腫瘍内に投与される。
【０００７】
当該ＳＴＩＮＧアゴニストは、何らかの適したアゴニストであってもよい。いくつかの実施形態では、当該ＳＴＩＮＧアゴニストは、核酸、タンパク質、ペプチド、または小分子である。いくつかの実施形態では、当該小分子は、環状ジヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、当該ＳＴＩＮＧアゴニストは、下記式の化合物である。
【化１】
2016538344.tif 000003
【０００８】
いくつかの実施形態では、当該小分子は、改変された環状ジヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、当該改変環状ジヌクレオチドは、天然に存在しなくてもよく、化学的に合成されてもよい。いくつかの実施形態では、当該改変環状ジヌクレオチドは、下記式（Ａ）の化合物である。
【化２】
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【０００９】
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、それぞれが独立に９−プリン、９−アデニン、９−グアニン、９−ヒポキサンチン、９−キサンチン、９−尿酸、または９−イソグアニンであってよく、それらの構造は以下に示されるとおりである。
【化３】
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【００１０】
Ｒ１及びＲ２は、同一であっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、当該化合物は、主にＲｐ，ＲｐもしくはＲｐ，Ｓｐの立体異性体、またはそのプロドラッグもしくは医薬的に許容可能なその塩の形態で提供されてもよい。いくつかの実施形態では、当該化合物は、主にＲｐ，Ｒｐ立体異性体の形態で提供されてもよい。具体的ないくつかの実施形態では、当該化合物は、下記式（Ｂ）の化合物または主にそのＲｐ，Ｒｐ立体異性体の形態であってもよい。
【化４】
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【００１１】
いくつかの実施形態では、当該化合物は、ジチオ−（Ｒｐ，Ｒｐ）−［環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］］（２’−５’、３’−５’混合ホスホジエステル結合（ＭＬ）ＲＲ−Ｓ２  ｃ−ｄｉ−ＡＭＰもしくはＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡとも呼ばれる））（上式（Ｂ）に示すとおり）、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２−ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ（ＭＬ−ＣＤＧ）、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ｃＧＡＭＰ、またはそれらのいずれかの混合物であってもよい。
【００１２】
本明細書中で開示される化合物は、１つまたは複数の既知のヒトＳＴＩＮＧ対立遺伝子を活性化し得るため、天然の環式ジヌクレオチド（ＣＤＮ）または他の改変されたＣＤＮを超えるいくつかの利点を有する。さらなる実施形態は、対象者の癌を治療するために提供されてもよく、本明細書中で説明されるように、化合物の有効量を当該対象者に投与することを含む。そのような化合物は、ＳＴＩＮＧアゴニストとして使用されてもよい。
【００１３】
そのような化合物の調製方法をさらに提供することができる。当該調製方法は、少なくともスルホン化反応、及び／またはＲＳ−及びＲＳ−ジアステレオマーの分離を含んでいてもよい。
【００１４】
さらなる実施形態では、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニストの有効量を対象者に投与することを含む、当該対象者における癌治療のための方法に関する組成物及び方法が提供され、ここで、当該ＳＴＩＮＧアゴニストは、腫瘍内に投与される。
【００１５】
「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」には、（１）病気の病態もしくは症候を経験もしくは示している対象者または患者の当該病気の抑制（例えば、病態及び／もしくは症状のさらなる進行の阻止）、（２）病気の病態もしくは症候を経験もしくは示している対象者または患者の当該病気の回復（例えば、病態及び／もしくは症状の好転）、ならびに／あるいは（３）病気の病態もしくは症候を経験もしくは示している対象者または患者の当該病気における何らかの測定可能な軽減効果が含まれる。いくつかの実施形態では、癌の治療は、腫瘍のサイズの縮小化、または腫瘍の成長抑制としてさらに定義される。具体的ないくつかの実施形態では、当該対象者はヒトである。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本明細書中で説明される組成物または化合物は、それらを必要とする対象者へ、医薬的に許容可能な担体、アジュバント、及び媒体を含む製剤で、様々な非経口及び経口経路により投与してもよい。投与経路は、限定はされないが、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、くも膜下、及び硬膜外投与の内の１つまたは複数を含む、腫瘍内または非経口経路であってよい。
【００１７】
用量は、必要に応じて、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、もしくは２４時間毎（もしくは、その中で導き出せる何らかの範囲）または１日あたり１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは回（またはその中で導き出せる何らかの範囲）投与されてもよい。用量が最初に投与されるのは、感染の徴候を患者が示す、もしくは感じる前もしくは後、または臨床医が、当該患者が感染していると診断した後であってもよい。いくつかの実施形態では、当該患者が感染の徴候もしくは症状を経験もしくは示してから、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２時間（もしくはその中で導き出せる何らかの範囲）後または１、２、３、４、もしくは５日（もしくはその中で導き出せる何らかの範囲）後にレジメンの最初の用量が当該患者へ投与される。当該患者は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはより長い日数（またはその中で導き出せる何らかの範囲）、あるいは感染の症状が消失または軽減されるまで、あるいは感染の症状が消失もしくは軽減された後６、１２、１８、もしくは２４時間、または１、２、３、４、もしくは５日間処置されてもよい。
【００１８】
当該組成物は、１回または複数回投与されてもよい。いくつかの実施形態では、当該組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回またはこれらより多い回数投与される。特定の実施形態では、当該ＳＴＩＮＧアゴニストは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回またはこれらより多い回数投与される。
【００１９】
方法は、付加的な癌治療と組み合わせてもよい。いくつかの実施形態では、当該異なる癌治療には、手術、放射線療法、化学療法、毒素療法、免疫療法、寒冷療法、または遺伝子療法が含まれる。いくつかの実施形態では、当該癌は、化学療法抵抗性または放射線抵抗性の癌である。組み合わせ治療は、双方の薬剤を含む１つの医薬組成物の使用、または二つの別々の組成物の同時投与によって達成されてもよく、１つの組成物には、当該ＳＴＩＮＧアゴニストが含まれ、及びもう一方の組成物には、第二の１つまたは複数の薬剤が含まれる。
【００２０】
二つの当該治療は、どちらを先に実施してもよく、数分から数週間の間隔でもう一方の処置の先または後に実施してもよい。もう一方の薬剤が別々に適用される実施形態では、当該患者において当該薬剤が有利な組み合わせ効果を依然として発揮できるよう、一般に、それぞれの投与期間の間で長期間経過しないことを確実にすることになる。そのような例では、双方の様式をお互いの約１２〜２４時間以内、さらに、より好ましくは、お互いの約６〜１２時間以内に実施してもよいことが企図される。場合によっては、処置期間を大幅に延長することが望ましいかもしれないが、その場合は、それぞれの処置実施の間を数日間（２、３、４、５、６または７日）〜数週間（１、２、３、４、５、６、７または８週）あける。いくつかの実施形態では、当該ＳＴＩＮＧアゴニストは、当該異なる癌治療の実施より先に投与される。いくつかの実施形態では、当該別個の癌処置は、当該ＳＴＩＮＧアゴニストの投与より先に実施される。
【００２１】
当該癌は、どのような適した癌であってもよく、限定はされないが、メラノーマ、子宮頸癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、尿路上皮癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肉腫、結腸直腸腺癌、消化管間質腫瘍、食道癌、結腸直腸癌、膵臓癌、腎臓癌、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ）、悪性中皮腫、白血病、リンパ腫、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、移行上皮癌、神経芽細胞腫、形質細胞腫瘍、ウィルムス腫瘍、または肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）が含まれる。いくつかの実施形態では、当該癌はメラノーマである。いくつかの実施形態では、当該癌は、化学療法または放射線抵抗性の癌である。
【００２２】
「有効量」または「治療上有効量」または「医薬的有効量」は、病気の治療のために対象者または患者に投与した際、当該病気のためのそういった処置をもたらすのに十分な量を意味する。いくつかの実施形態では、当該対象者に、少なくとも約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｍｇ／ｋｇ（またはその中で導き出せる何らかの範囲）の当該アゴニストが投与される。
【００２３】
本明細書中で使用される、「水素」は−Ｈを意味し、「ヒドロキシ」は−ＯＨを意味し、「オキソ」は＝Ｏを意味し、「ハロ」は独立に−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉを意味し、「アミノ」は−ＮＨ２（例えば、アルキルアミノといったアミノという用語を含む基の定義は以下参照）を意味し、「ヒドロキシアミノ」は−ＮＨＯＨを意味し、「ニトロ」は−ＮＯ２を意味し、「イミノ」は＝ＮＨ（例えば、アルキルアミノといったイミノという用語を含む基の定義は以下参照）を意味し、「シアノ」は−ＣＮを意味し、「アジド」は−Ｎ３を意味し、「メルカプト」は−ＳＨを意味し、「チオ」は＝Ｓを意味し、「スルホンアミド」は−ＮＨＳ（Ｏ）２−（例えば、アルキルスルホンアミドといったスルホンアミドという用語を含む基の定義については以下参照）を意味し、「スルホニル」は−Ｓ（Ｏ）２−（例えば、アルキルスルホニルといったスルホニルという用語を含む基の定義については以下参照）を意味し、及び「シリル」は−ＳｉＨ３（例えば、アルキルシリルといったシリルという用語を含む基の定義については以下参照）を意味する。
【００２４】
以下の基は、次の括弧付きの添え字によりさらに次のように定義される。「（Ｃｎ）」は、その基に存在する炭素原子の正確な数（ｎ）を定義し、「（Ｃ≦ｎ）」は、その基に存在し得る最大炭素原子数（ｎ）を定義し、（Ｃｎ−ｎ’）は、その基に属する炭素原子の最小数（ｎ）及び最大数（ｎ’）の両方を定義する。例えば、「アルコキシ（Ｃ≦１０）」は、１〜１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０、またはその中で導き出せる何らかの範囲（例えば、３〜１０の炭素原子））の炭素原子を有するアルコキシ基を表す。同様に、「アルキル（Ｃ２−１０）」は、２〜１０の炭素原子（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０、またはその中で導き出せる何らかの範囲（例えば、３〜１０の炭素原子））を有するアルキル基を表す。
【００２５】
用語「アルキル」が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、結合点として飽和炭素原子を有する非芳香族の一価の基を意味し、直鎖または分岐、シクロ、環式または非環式構造を有し、炭素−炭素二重結合または三重結合を有さず、炭素及び水素以外の原子を有さない。−ＣＨ３（Ｍｅ）、−ＣＨ２ＣＨ３（Ｅｔ）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３（ｎ−Ｐｒ）、−ＣＨ（ＣＨ３）２（イソ−Ｐｒ））、−ＣＨ（ＣＨ２）２（シクロプロピル）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３（ｎ−Ｂｕ）、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３（ｓｅｃ−ブチル））、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２（イソブチル）、−Ｃ（ＣＨ３）３（ｔｅｒｔ−ブチル）、−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）３（ネオペンチル）、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、及びシクロヘキシルメチルといった基は、アルキル基の非限定例である。用語「置換アルキル」は、結合点として飽和炭素原子を有する非芳香族の一価の基を意味し、直鎖または分岐、シクロ、環式または非環式構造を有し、炭素−炭素二重結合または三重結合は有さず、Ｎ、Ｏ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｓｉ、Ｐ、及びＳからなる群から独立に選択される原子を少なくとも１つ有する。次の基は、置換アルキル基の非限定例である。−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２ＳＨ、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｈ、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ３、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＦ３、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＮＨＣＨ３、−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯ２Ｃ（ＣＨ３）３、及び−ＣＨ２Ｓｉ（ＣＨ３）３。
【００２６】
用語「アルカンジイル」が「置換」修飾語句無しで使用される場合は、非芳香族の二価の基を意味し、当該アルカンジイル基は、２つのσ結合で結合し、結合点として１つまたは２つの飽和炭素原子を有しており、直鎖または分岐、シクロ、環式または非環式構造を有し、炭素−炭素二重結合または三重結合を有さず、炭素及び水素以外の原子を有さない。−ＣＨ２−（メチレン）、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、及び
【化５】
2016538344.tif 000007
といった基は、アルカンジイル基の非限定例である。用語「置換アルカンジイル」は、非芳香族の一価の基を意味し、当該アルカンジイル基は、２つのσ結合で結合し、結合点として１つまたは２つの飽和炭素原子を有しており、直鎖または分岐、シクロ、環式または非環式構造を有し、炭素−炭素二重結合または三重結合を有さず、Ｎ、Ｏ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｓｉ、Ｐ、及びＳからなる群から独立に選択される原子を少なくとも１つ有する。次の基は、置換アルカンジイル基の非限定例である。−ＣＨ（Ｆ）−、−ＣＦ２−、−ＣＨ（Ｃｌ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−ＣＨ（ＯＣＨ３）−、及び−ＣＨ２ＣＨ（Ｃｌ）−。
【００２７】
用語「アルケニル」が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、結合点として非芳香族炭素原子を有する一価の基を意味し、直鎖または分岐、シクロ、環式または非環式構造を有し、少なくとも１つの非芳香族炭素−炭素二重結合を有するが、炭素−炭素三重結合は有さず、炭素及び水素以外の原子を有さない。アルケニル基の非限定例には、−ＣＨ＝ＣＨ２（ビニル）、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２（アリル）、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ３、及び−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ６Ｈ５が含まれる。用語「置換アルケニル」は、結合点として非芳香族炭素原子を有する一価の基を意味し、少なくとも１つの非芳香族炭素−炭素二重結合を有するが、炭素−炭素三重結合は有さず、直鎖または分岐、シクロ、環式または非環式構造を有し、Ｎ、Ｏ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｓｉ、Ｐ及びＳからなる群より独立に選択される原子を少なくとも１つ有する。−ＣＨ＝ＣＨＦ、−ＣＨ＝ＣＨＣｌ、及び−ＣＨ＝ＣＨＢｒといった基は、置換アルケニル基の非限定例である。
【００２８】
用語「アルケンジイル」が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、非芳香族の二価の基を意味し、当該アルケンジイル基は、２つのσ結合で結合し、結合点として２つの炭素原子を有し、直鎖または分岐、シクロ、環式または非環式構造を有し、少なくとも１つの非芳香族炭素−炭素二重結合を有するが、炭素−炭素三重結合は有さず、炭素及び水素以外の原子を有さない。−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ２−、及び
【化６】
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といった基は、アルケンジイル基の非限定例である。用語「置換アルケンジイル」は、非芳香族の二価の基を意味し、当該アルケンジイル基は、２つのσ結合で結合し、結合点として２つの炭素原子を有し、直鎖または分岐、シクロ、環式または非環式構造を有し、少なくとも１つの非芳香族炭素−炭素二重結合を有するが、炭素−炭素三重結合は有さず、Ｎ、Ｏ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｓｉ、Ｐ、及びＳからなる群から独立に選択される原子を少なくとも１つ有する。次の基は、置換アルケンジイル基の非限定例である。−ＣＦ＝ＣＨ−、−Ｃ（ＯＨ）＝ＣＨ−、及び−ＣＨ２ＣＨ＝Ｃ（Ｃｌ）−。
【００２９】
用語「アルキニル」が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、結合点として非芳香族炭素原子を有する一価の基を意味し、直鎖または分岐、シクロ、環式または非環式構造を有し、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有し、炭素及び水素以外の原子は有さない。−Ｃ≡ＣＨ、−Ｃ≡ＣＣＨ３、−Ｃ≡ＣＣ６Ｈ５、及び−ＣＨ２Ｃ≡ＣＣＨ３といった基は、アルキニル基の非限定例である。用語「置換アルキニル」は、結合点として非芳香族炭素原子を有する一価の基を意味し、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有し、直鎖または分岐、シクロ、環式、または非環式構造を有し、Ｎ、Ｏ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｓｉ、Ｐ、及びＳからなる群から独立に選択される原子を少なくとも１つ有する。−Ｃ≡ＣＳｉ（ＣＨ３）３といった基は、置換アルキニル基の非限定例である。
【００３０】
用語「アルキンジイル」が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、非芳香族の二価の基を意味し、当該アルキンジイル基は、２つのσ結合で結合し、結合点として２つの炭素原子を有し、直鎖または分岐、シクロ、環式、または非環式構造を有し、少なくとも１つの炭素−炭素三重を有し、炭素及び水素以外の原子は有さない。−Ｃ≡Ｃ−、−Ｃ≡ＣＣＨ２−、及び−Ｃ≡ＣＣＨ（ＣＨ３）−といった基は、アルキンジイル基の非限定例である。用語「置換アルキンジイル」は、非芳香族の二価の基を意味し、当該アルキンジイル基は、２つのσ結合で結合し、結合点として２つの炭素原子を有し、直鎖または分岐、シクロ、環式または非環式構造を有し、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有し、Ｎ、Ｏ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｓｉ、Ｐ、及びＳからなる群から独立に選択される原子を少なくとも１つ有する。−Ｃ≡ＣＣＦＨ−及び−Ｃ≡ＣＨＣＨ（Ｃｌ）−といった基は、置換アルキンジイル基の非限定例である。
【００３１】
用語「アリール」が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、結合点として芳香族炭素原子を有する一価の基を意味し、当該炭素原子は、６員芳香族環構造の一部を形成しており、当該環原子はすべて炭素であり、当該一価の基には、炭素または水素以外の原子は存在しない。アリール基の非限定例には、フェニル（Ｐｈ）、メチルフェニル、（ジメチル）フェニル、−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＣＨ３（エチルフェニル）、−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３（プロピルフェニル）、−Ｃ６Ｈ４ＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｃ６Ｈ４ＣＨ（ＣＨ２）２、−Ｃ６Ｈ３（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３（メチルエチルフェニル）、−Ｃ６Ｈ４ＣＨ＝ＣＨ２（ビニルフェニル）、−Ｃ６Ｈ４ＣＨ＝ＣＨＣＨ３、−Ｃ６Ｈ４Ｃ≡ＣＨ、−Ｃ６Ｈ４Ｃ≡ＣＣＨ３、ナフチル、及びビフェニル由来の一価の基が含まれる。用語「置換アリール」は、結合点として芳香族炭素原子を有する一価の基を意味し、当該炭素原子は６員芳香族環構造の一部を形成しており、当該環原子はすべて炭素であり、当該一価の基はさらにＮ、Ｏ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｓｉ、Ｐ、及びＳからなる群から独立に選択される原子を少なくとも１つ有する。置換アリール基の非限定例には、−Ｃ６Ｈ４Ｆ、−Ｃ６Ｈ４Ｃｌ、−Ｃ６Ｈ４Ｂｒ、−Ｃ６Ｈ４Ｉ、−Ｃ６Ｈ４ＯＨ、−Ｃ６Ｈ４ＯＣＨ３、−Ｃ６Ｈ４ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｃ６Ｈ４ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ６Ｈ４ＮＨ２、−Ｃ６Ｈ４ＮＨＣＨ３、−Ｃ６Ｈ４Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＮＨ２、−Ｃ６Ｈ４ＣＦ３、−Ｃ６Ｈ４ＣＮ、−Ｃ６Ｈ４ＣＨＯ、−Ｃ６Ｈ４ＣＨＯ、−Ｃ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）Ｃ６Ｈ５、−Ｃ６Ｈ４ＣＯ２Ｈ、−Ｃ６Ｈ４ＣＯ２ＣＨ３、−Ｃ６Ｈ４ＣＯＮＨ２、−Ｃ６Ｈ４ＣＯＮＨＣＨ３、及び−Ｃ６Ｈ４ＣＯＮ（ＣＨ３）２が含まれる。
【００３２】
用語「アレンジイル」が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、二価の基を意味し、当該アレンジイル基は、２つのσ結合で結合しており、結合点として２つの芳香族炭素原子を有し、当該炭素原子は、１つまたは複数の６員芳香族環構造の一部を形成しており、当該環原子はすべて炭素であり、当該一価の基には、炭素または水素以外の原子は存在しない。アレンジイル基の非限定例には、
【化７】
2016538344.tif 000009
が含まれる。
用語「置換アレンジイル」は、二価の基を意味し、当該アレンジイル基は、２つのσ結合で結合しており、結合点として二つの芳香族炭素原子を有し、当該炭素原子は、１つまたは複数の６員芳香族環構造の一部を形成しており、当該環原子はすべて炭素であり、当該二価の基はさらにＮ、Ｏ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｓｉ、Ｐ、及びＳからなる群から独立に選択される原子を少なくとも１つ有する。
【００３３】
用語「アラルキル」が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、一価の基である−アルカンジイル−アリールを意味し、用語アルカンジイル及びアリールはそれぞれが先に示した定義と同様に使用される。アラルキルの非限定例は、フェニルメチル（ベンジル、Ｂｎ）、１−フェニル−エチル、２−フェニル−エチル、インデニル、及び２，３−ジヒドロ−インデニルであり、ただし、インデニル、及び２，３−ジヒドロ−インデニルは、それぞれの場合において結合点が飽和炭素原子の内の１つである場合に限り、アラルキルの例である。用語「アラルキル」が、「置換」修飾語句と共に使用される場合は、当該アルカンジイル及び当該アリールのいずれか１つまたは両方が置換されている。置換アラルキルの非限定例は、（３−クロロフェニル）−メチル、２−オキソ−２−フェニル−エチル（フェニルカルボニルメチル）、２−クロロ−２−フェニル−エチル、クロマニルであり、当該結合点が当該飽和炭素原子の内の１つである。また、テトラヒドロキノリニルも置換アラルキルの非限定例であり、結合点が飽和原子の内の１つである。
【００３４】
用語「ヘテロアリール」が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、結合点として芳香族炭素原子または窒素原子を有する一価の基を意味し、当該炭素原子または窒素原子は芳香族環構造の一部を形成しており、当該環原子の少なくとも１つが窒素、酸素または硫黄であり、当該一価の基には、炭素、水素、芳香族窒素、芳香族酸素及び芳香族硫黄以外の原子は存在しない。アリール基の非限定例には、アクリジニル、フラニル、イミダゾイミダゾリル、イミダゾピラゾリル、イミダゾピリジニル、イミダゾピリミジニル、インドリル、インダゾリニル、メチルピリジル、オキサゾリル、フェニルイミダゾリル、ピリジル、ピロリル、ピリミジル、ピラジニル、キノリル、キナゾリル、キノキサリニル、テトラヒドロキノリニル、チエニル、トリアジニル、ピロロピリジニル、ピロロピリミジニル、ピロロピラジニル、ピロロトリアジニル、ピロロイミダゾリル、クロメニル（結合点が芳香族原子の内の１つ）、及びクロマニル（結合点が芳香族原子の内の１つ）が含まれる。用語「置換ヘテロアリール」は、結合点として芳香族炭素原子または窒素原子を有する一価の基を意味し、当該炭素原子または窒素原子は、芳香族環構造の一部を形成しており、当該環原子の少なくとも１つが窒素、酸素、または硫黄であり、当該一価の基はさらに、非芳香族窒素、非芳香族酸素、非芳香族硫黄、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｓｉ、及びＰからなる群から独立に選択される原子を少なくとも１つ有する。
【００３５】
用語「ヘテロアレンジイル」が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、二価の基を意味し、当該ヘテロアレンジイル基は、２つのσ結合で結合しており、結合点として芳香族炭素原子または窒素原子を有し、結合点として当該炭素原子または窒素原子２つの芳香族原子、当該炭素原子は、１つまたは複数の６員芳香族環構造の一部を形成しており、当該環原子はすべて炭素であり、当該一価の基には、炭素及び水素以外の原子は存在しない。ヘテロアレンジイル基の非限定例には、
【化８】
2016538344.tif 000010
が含まれる。用語「置換ヘテロアレンジイル」は二価の基を意味し、当該ヘテロアレンジイル基は、２つのσ結合で結合しており、結合点として２つの芳香族炭素原子を有し、当該炭素原子は１つまたは複数の６員芳香族環構造の一部を形成しており、当該環原子はすべて炭素であり、当該二価の基はさらに、Ｎ、Ｏ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｓｉ、Ｐ、及びＳからなる群から独立に選択される原子を少なくとも１つ有する。
【００３６】
用語「ヘテロアラルキル」が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、一価の基である−アルカンジイル−ヘテロアリールを意味し、当該用語アルカンジイル及びヘテロアリールは、それぞれが先に示した定義と同様に使用される。アラルキルの非限定例は、ピリジルメチル及びチエニルメチルである。用語「ヘテロアラルキル」が、「置換」修飾語句と共に使用される場合は、当該アルカンジイル及び当該ヘテロアリールのいずれかまたは両方が置換されている。
【００３７】
用語「アシル」が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、結合点としてカルボニル基の炭素原子を有する一価の基を意味し、さらに直鎖または分岐、シクロ、環式または非環式構造を有し、さらに炭素または水素以外の他の原子は、カルボニル基の酸素原子以外には有さない。−ＣＨＯ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｃ６Ｈ５、−Ｃ（Ｏ）Ｃ６Ｈ４ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＯＣ６Ｈ３（ＣＨ３）２、及び−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ６Ｈ５といった基は、アシル基の非限定例である。したがって、用語「アシル」には、限定はされないが、「アルキルカルボニル」及び「アリールカルボニル」基と表現されることがある基を含む。用語「置換アシル」は、結合点としてカルボニル基の炭素原子を有する一価の基を意味し、さらに直鎖または分岐、シクロ、環式または非環式構造を有し、さらに当該カルボニル基の酸素に加えて、Ｎ、Ｏ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｓｉ、Ｐ、及びＳからなる群から独立に選択される原子を少なくとも１つ有する。−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＦ３、−ＣＯ２Ｈ（カルボキシル）、−ＣＯ２ＣＨ３（メチルカルボキシル）、−ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＯ２Ｃ６Ｈ５、−ＣＯ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＯ２ＣＨ（ＣＨ２）２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２（カルバモイル）、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ３、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＨ２）２、−ＣＯＮ（ＣＨ３）２、−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＦ３、−ＣＯ−ピリジル、−ＣＯ−イミダゾイル、及び−Ｃ（Ｏ）Ｎ３といった基は、置換アシル基の非限定例である。用語「置換アシル」には、限定はされないが、「ヘテロアリールカルボニル」基が含まれる。
【００３８】
用語「アルキリデン」が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、二価の基である＝ＣＲＲ’を意味し、当該アルキリデン基は、一つのσ結合及び１つのπ結合で結合しており、Ｒ及びＲ’は独立に水素、アルキルであるか、またはＲ及びＲ’は、一緒になってアルカンジイルを表す。アルキリデン基の非限定例には、＝ＣＨ２、＝ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）、及び＝Ｃ（ＣＨ３）２が含まれる。用語「置換アルキリデン」は、基である＝ＣＲＲ’を意味し、当該アルキリデン基は、１つのσ結合及び１つのπ結合で結合しており、Ｒ及びＲ’は独立に水素、アルキル、置換アルキルであるか、またはＲ及びＲ’は一緒になって置換アルカンジイルを表す。但し、Ｒ及びＲ’のいずれかは置換アルキルであるか、またはＲ及びＲ’は一緒になって置換アルカンジイルを表すことを条件とする。
【００３９】
用語「アルコキシ」が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、基である−ＯＲを意味し、Ｒはアルキルであり、当該用語は先に定義したとおりである。アルコキシ基の非限定例には、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ（ＣＨ２）２、−Ｏ−シクロペンチル、及び−Ｏ−シクロヘキシルが含まれる。用語「置換アルコキシ」は、基である−ＯＲを意味し、Ｒは置換アルキルであり、当該用語は先に定義したとおりである。例えば、−ＯＣＨ２ＣＦ３は置換アルコキシ基である。
【００４０】
同様に、用語「アルケニルオキシ」、「アルキニルオキシ）」、「アリールオキシ」、「アラルコキシ」、「ヘテロアリールオキシ」、「ヘテロアラルコキシ」、及び「アシルオキシ」が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、−ＯＲで定義される基を意味し、Ｒはそれぞれ、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、及びアシルであり、これらの用語は先に定義したとおりである。用語、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、アラルキルオキシ、及びアシルオキシのいずれかが「置換」により修飾される場合、基である−ＯＲを意味し、Ｒはそれぞれ置換アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、及びアシルである。
【００４１】
用語「アルキルアミノ」が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、基である−ＮＨＲを意味し、Ｒはアルキルであり、当該用語は先に定義したとおりである。アルキルアミノ基の非限定例には、−ＮＨＣＨ３、−ＮＨＣＨ２ＣＨ３、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＮＨＣＨ（ＣＨ３）２、−ＮＨＣＨ（ＣＨ２）２、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＮＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＮＨＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＮＨＣ（ＣＨ３）３、−ＮＨ−シクロペンチル、及び−ＮＨ−シクロヘキシルが含まれる。用語「置換アルキルアミノ」は、基である−ＮＨＲを意味し、Ｒは置換アルキルであり、当該用語は先に定義したとおりである。例えば、−ＮＨＣＨ２ＣＦ３は置換アルキルアミノ基である。
【００４２】
用語「ジアルキルアミノ」が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、基である−ＮＲＲ’を意味し、Ｒ及びＲ’は同じか、もしくは異なるアルキル基になり得、またはＲ及びＲ’は一緒になって２つ以上の飽和炭素原子を有するアルカンジイルを表すことができ、それらの少なくとも２が当該窒素原子に結合している。ジアルキルアミノ基の非限定例には、−ＮＨＣ（ＣＨ３）３、−Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２、Ｎ−ピロリジニル、及びＮ−ピペリジニルが含まれる。用語「置換ジアルキルアミノ」は、基である−ＮＲＲ’を意味し、Ｒ及びＲ’は同じか、もしくは異なった置換アルキル基になり得、ＲもしくはＲ’の１つはアルキルかつもう一方は置換アルキルであるか、またはＲ及びＲ’は一緒になって２つ以上の飽和炭素原子を有する置換アルカンジイルを表すことができ、それらの少なくとも２つ以上が当該窒素原子に結合している。
【００４３】
用語「アルコキシアミノ」、「アルケニルアミノ」、「アルキニルアミノ」、「アリールアミノ」、「アラルキルアミノ」、「ヘテロアリールアミノ」、「ヘテロアラルキルアミノ」、及び「アルキルスルホニルアミノ」が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、−ＮＨＲとして定義される基を意味し、Ｒは、それぞれアルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、及びアルキルスルホニルであり、これらの用語は、先に定義したとおりである。アリールアミノ基の非限定例は、−ＮＨＣ６Ｈ５である。用語、アルコキシアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、ヘテロアリールアミノ、ヘテロアラルキルアミノ及びアルキルスルホニルアミノのいずれかが「置換」によって修飾される場合、基である−ＮＨＲを意味し、Ｒは、それぞれ置換アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、及びアルキルスルホニルである。
【００４４】
用語「アミド」（アシルアミノ）が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、基である−ＮＨＲを意味し、Ｒはアシルであり、当該用語は先に定義したとおりである。アシルアミノ基の非限定例は、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である。用語、アミドが「置換」修飾語句と共に使用された場合は、−ＮＨＲで定義される基を意味し、Ｒは置換アシルであり、当該用語は先に定義したとおりである。基、−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＣＨ３及び−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＣＨ３は、置換アミド基の非限定例である。
【００４５】
用語「アルキルイミノ」が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、基である＝ＮＲを意味し、当該アルキルイミノ基は、１つのσ結合及び１つのπ結合で結合しており、Ｒはアルキルであり、当該用語は、先に定義したとおりである。アルキルイミノ基の非限定例には、＝ＮＣＨ３、＝ＮＣＨ２ＣＨ３及び＝Ｎ−シクロヘキシルが含まれる。用語「置換アルキルイミノ」は基である＝ＮＲを意味し、当該アルキルイミノ基は１つのσ結合及び１つのπ結合で結合しており、Ｒは置換アルキルであり、当該用語は、先に定義したとおりである。例えば、＝ＮＣＨ２ＣＦ３は、アルキルイミノ基の非限定例である。
【００４６】
同様に、用語「アルケニルイミノ」、「アルキニルイミノ」、「アリールイミノ」、「アラルキルイミノ」、「ヘテロアリールイミノ」、「ヘテロアラルキルイミノ」、及び「アシルイミノ」が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、＝ＮＲで定義される基を意味し、当該アルキルイミノ基は、１つのσ結合及び１つのπ結合で結合しており、Ｒはそれぞれアルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、及びアシルであり、これらの用語は先に定義したとおりである。用語、アルケニルイミノ、アルキニルイミノ、アリールイミノ、アラルキルイミノ、及びアシルイミノのいずれかが、「置換」により修飾される場合、基である＝ＮＲを意味し、当該アルキルイミノ基は、１つのσ結合及び１つのπ結合で結合しており、Ｒはそれぞれ置換アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル及びアシルである。
【００４７】
用語「アルキルチオ」が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、基である−ＳＲを意味し、Ｒはアルキルであり、当該用語は先に定義したとおりである。アルキルチオ基の非限定例には、−ＳＣＨ３、−ＳＣＨ２ＣＨ３、−ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＳＣＨ（ＣＨ３）２、−ＳＣＨ（ＣＨ２）２、−Ｓ−シクロペンチル、及び−Ｓ−シクロヘキシルが含まれる。用語「置換アルキルチオ」は、基である−ＳＲを意味し、Ｒは置換アルキルであり、当該用語は先に定義したとおりである。例えば、−ＳＣＨ２ＣＦ３は、置換アルキルチオ基である。
【００４８】
同様に、用語「アルケニルチオ」、「アルキニルチオ」、「アリールチオ」、「アラルキルチオ」、「ヘテロアリールチオ」、「ヘテロアラルキルチオ」及び「アシルチオ」が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、−ＳＲで定義される基を意味し、Ｒはそれぞれアルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、及びアシルであり、これらの用語は先に定義したとおりである。用語、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、アラルキルチオ、ヘテロアリールチオ、ヘテロアラルキルチオ、及びアシルチオのいずれかが「置換」により修飾される場合、基である−ＳＲを意味し、Ｒはそれぞれ置換アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、及びアシルである。
【００４９】
用語「チオアシル」が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、結合点としてチオカルボニル基の炭素原子を有する一価の基を意味し、さらに直鎖または分岐、シクロ、環式または非環式構造を有し、さらに炭素または水素以外の原子は、カルボニル基の硫黄原子を除いて、有さない。−ＣＨＳ、−Ｃ（Ｓ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｓ）ＣＨ２ＣＨ３、−Ｃ（Ｓ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−Ｃ（Ｓ）ＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｃ（Ｓ）ＣＨ（ＣＨ２）２、−Ｃ（Ｓ）Ｃ６Ｈ５、−Ｃ（Ｓ）Ｃ６Ｈ４ＣＨ３、−Ｃ（Ｓ）Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＣＨ３、−Ｃ（Ｓ）Ｃ６Ｈ３（ＣＨ３）２、及び−Ｃ（Ｓ）ＣＨ２Ｃ６Ｈ５といった基は、チオアシル基の非限定例である。したがって、用語「チオアシル」には、限定はされないが、「アルキルチオカルボニル」及び「アリールチオカルボニル」基と表現されることがある基が含まれる。用語「置換チオアシル」は、結合点として炭素原子を有するラジカルを意味し、当該炭素原子はチオカルボニル基の一部であり、さらに直鎖または分岐、シクロ、環式または非環式構造を有し、さらにカルボニル基の硫黄原子に加えて、Ｎ、Ｏ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｓｉ、Ｐ、及びＳからなる群から独立に選択される原子を少なくとも１つ有する。−Ｃ（Ｓ）ＣＨ２ＣＦ３、−Ｃ（Ｓ）Ｏ２Ｈ、−Ｃ（Ｓ）ＯＣＨ３、−Ｃ（Ｓ）ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｃ（Ｓ）ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−Ｃ（Ｓ）ＯＣ６Ｈ５、−Ｃ（Ｓ）ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｃ（Ｓ）ＯＣＨ（ＣＨ２）２、−Ｃ（Ｓ）ＮＨ２、及び−Ｃ（Ｓ）ＮＨＣＨ３は、置換チオアシル基の非限定例である。用語「置換チオアシル」には、限定はされないが、「ヘテロアリールチオカルボニル」基が含まれる。
【００５０】
用語「アルキルスルホニル」が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、基である−Ｓ（Ｏ）２Ｒを意味し、Ｒはアルキルであり、当該用語は先に定義したとおりである。アルキルスルホニル基の非限定例には、−Ｓ（Ｏ）２ＣＨ３、−Ｓ（Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ３、−Ｓ（Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−Ｓ（Ｏ）２ＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｓ（Ｏ）２ＣＨ（ＣＨ２）２、−Ｓ（Ｏ）２−シクロペンチル、及び−Ｓ（Ｏ）２−シクロヘキシルが含まれる。用語「置換アルキルスルホニル」は、基である−Ｓ（Ｏ）２Ｒを意味し、Ｒは置換アルキルであり、当該用語は先に定義したとおりである。例えば、−Ｓ（Ｏ）２ＣＨ２ＣＦ３は置換アルキルスルホニル基である。
【００５１】
同様に、用語「アルケニルスルホニル」、「アルキニルスルホニル」、「アリールスルホニル」、「アラルキルスルホニル」、「ヘテロアリールスルホニル」、及び「ヘテロアラルキルスルホニル」が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、−Ｓ（Ｏ）２Ｒで定義される基を意味し、Ｒはそれぞれアルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、及びヘテロアラルキルであり、これらの用語は先に定義したとおりである。用語、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、及びヘテロアラルキルスルホニルのいずれかが「置換」により修飾される場合、基である−Ｓ（Ｏ）２Ｒを意味し、Ｒはそれぞれ置換アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、及びヘテロアラルキルである。
【００５２】
用語「アルキルアンモニウム」が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、−ＮＨ２Ｒ＋、−ＮＨＲＲ’＋、または−ＮＲＲ’Ｒ’’＋で定義される基を意味し、Ｒ、Ｒ’及びＲ’’は同じか、もしくは異なるアルキル基であり、またはＲ、Ｒ’及びＲ’’の内の２つのどのような組み合わせも一緒になってアルカンジイルを表すことができる。アルキルアンモニウムカチオン基の非限定例には、−ＮＨ２（ＣＨ３）＋、−ＮＨ２（ＣＨ２ＣＨ３）＋、−ＮＨ２（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）＋、−ＮＨ（ＣＨ３）２＋、−ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２＋、−ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）２＋、−Ｎ（ＣＨ３）３＋、−Ｎ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）２＋、−Ｎ（ＣＨ３）２（ＣＨ２ＣＨ３）＋、−ＮＨ２Ｃ（ＣＨ３）３＋、−ＮＨ（シクロペンチル）２＋、及び−ＮＨ２（シクロヘキシル）＋が含まれる。用語「置換アルキルアンモニウム」は、−ＮＨ２Ｒ＋、−ＮＨＲＲ’＋、または−ＮＲＲ’Ｒ’’＋を意味し、Ｒ、Ｒ’及びＲ’’の少なくとも１つは置換アルキルであるか、またはＲ、Ｒ’及びＲ’’の内の２つは一緒になって置換アルカンジイルを表すことができる。Ｒ、Ｒ’及びＲ’’の１つ以上が置換アルキルである場合、同じであっても異なっていてもよい。置換アルキルまたは置換アルカンジイルのいずれでもないＲ、Ｒ’及びＲ’’のいずれかは、同一、もしくは異なるアルキルでもよく、または一緒になって複数の炭素原子を有するアルカンジイルを表すことができ、それらの少なくとも２つは、当該式で示した窒素原子に結合している。
【００５３】
用語「アルキルスホニウム」が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、基である−ＳＲＲ’＋を意味し、Ｒ及びＲ’は同一もしくは異なるアルキル基であってよく、またはＲ及びＲ’は一緒になってアルカンジイルを表すことができる。アルキルスルホニウム基の非限定例には、−ＳＨ（ＣＨ３）＋、−ＳＨ（ＣＨ２ＣＨ３）＋、−ＳＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）＋、−Ｓ（ＣＨ３）２＋、−Ｓ（ＣＨ２ＣＨ３）２＋、−Ｓ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）２＋、−ＳＨ（シクロペンチル）＋、及び−ＳＨ（シクロヘキシル）＋が含まれる。用語「置換アルキルスルホニウム」は、基である−ＳＲＲ’＋を意味し、Ｒ及びＲ’は同一もしくは異なる置換アルキル基であってよく、ＲもしくはＲ’のいずれかはアルキルであり、かつもう一方は置換アルキルであるか、またはＲ及びＲ’は一緒になって置換アルカンジイルを表すことができる。例えば、−ＳＨ（ＣＨ２ＣＦ３）＋は置換アルキルスルホニウム基である。
【００５４】
用語「アルキルシリル」が、「置換」修飾語句無しで使用される場合は、−ＳｉＨ２Ｒ、−ＳｉＨＲＲ’、または−ＳｉＲＲ’Ｒ’’として定義される一価の基を意味し、Ｒ、Ｒ’、及びＲ’’は、同一もしくは異なるアルキル基であってよく、またはＲ、Ｒ’、及びＲ’’の内の２つのどのような組み合わせも一緒になってアルカンジイルを表すことができる。−ＳｉＨ２ＣＨ３、−ＳｉＨ（ＣＨ３）２、−Ｓｉ（ＣＨ３）３及び−Ｓｉ（ＣＨ３）２Ｃ（ＣＨ３）３といった基は、非置換アルキルシリル基の非限定例である。用語「置換アルキルシリル」は、−ＳｉＨ２Ｒ、−ＳｉＨＲＲ’、または−ＳｉＲＲ’Ｒ’’を意味し、Ｒ、Ｒ’、及びＲ’’の少なくとも１つが置換アルキルであるか、またはＲ、Ｒ’、及びＲ’’の内の２つは一緒になって置換アルカンジイルを表すことができる。Ｒ、Ｒ’、及びＲ’’の内の１つ以上が置換アルキルである場合、それらは同一であっても異なっていてもよい。置換アルキルでも置換アルカンジイルでもないＲ、Ｒ’、及びＲ’’のいずれかは、同一、もしくは異なるアルキルでもよく、または一緒になって複数の飽和炭素原子を有するアルカンジイルを表すことができ、それらの少なくとも２つがシリコン原子に結合している。
【００５５】
さらに、本発明の実施形態の化合物を構成している原子には、そのような原子のすべての同位体形態も含まれることが意図される。本明細書で使用される同位体には、同一の原子番号を有するが異なる質量数を有する原子が含まれる。限定はされないが、一般的な例として、水素の同位体には、トリチウム及び重水素が含まれ、炭素の同位体には、１３Ｃ及び１４Ｃが含まれる。同様に、本明細書の化合物の１つまたは複数の炭素原子は、シリコン原子に置き換えられてもよいことが企図される。さらに、本明細書のいずれかの化合物において説明されるいずれかの酸素原子も硫黄またはセレン原子と置き換えてもよいことが企図される。
【００５６】
破線の結合で表される式を有する化合物には、任意選択で、１つも二重結合を有さないか、１つまたは複数の二重結合を有する式が含まれることが意図される。したがって、例えば、構造
【化９】
2016538344.tif 000011
が含まれる。
当業者であれば理解されるように、そのような環の１つの原子が、１つより多くの二重結合の一部を形成することはない。
【００５７】
本願で示される構造の原子における何らかの未定義の結合価は、非明示的に当該原子に結合している水素原子を表す。
【００５８】
結合していない「Ｒ」基と共に示される環構造は、当該環上のいずれの非明示的な水素原子も当該Ｒ基で置換可能であることを示す。二価Ｒ基（例えば、オキソ、イミノ、チオ、アルキリデン等）の場合は、当該環の１つの原子に結合している非明示的な水素原子のいずれの組み合わせも当該Ｒ基で置き換え可能である。本概念の例を以下に示す。
【化１０】
2016538344.tif 000012
を表す。
【００５９】
本明細書で使用のとおり、「キラル補助」は、反応の立体選択性に影響を及ぼすことができる除去可能なキラル基を意味する。当業者であればそのような化合物を把握しており、多くが市販されている。
【００６０】
単語「ａ」または「ａｎ」の使用が、特許請求の範囲及び／または本明細書で用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と共に使用される場合、「１つ」を意味する場合があるが、「１つまたは複数」、「少なくとも１つ」、及び「１つまたは複数」の意味とも一致する。
【００６１】
本願をとおして、用語「約」は、値には、当該値を決定するために使用する装置、方法の誤差の固有変動、または当該試験対象者間に存在する変動が含まれることを示すために使用される。
【００６２】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」は、非限定の連結動詞である。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」といった、これらの動詞の１つまたは複数の何らかの型または時制も同様に非限定である。例えば、１つまたは複数の手順を、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」、または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」何らかの方法には、それら１つまたは複数の手順のみが含まれることに限定されず、他の記載されていない手順も含まれる。
【００６３】
用語「有効な」は、当該用語が本明細書及び／または特許請求の範囲で使用される場合、望ましい、予想される、または意図される結果を達成するために妥当であることを意味する。
【００６４】
用語「水和物」が化合物に対する修飾語句として使用される場合、当該化合物の固体形態でみられるように、当該化合物が、それぞれの化合物に関連する１つ未満（例えば、半水和物）、１つ（例えば、一水和物）、または１つより多くの（例えば、二水和物）水分子を有することを意味する。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、用語「ＩＣ５０」は、得られる最大の応答の５０％となる阻害用量を意味する。
【００６６】
第一化合物の「異性体」は、それぞれの分子が、第一化合物と同一の構成原子を含む別の化合物であるが、三次元におけるそれら原子の立体配置が異なる。
【００６７】
本明細書で使用される際、用語「患者」または「対象者」は、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、またはそれらのトランスジェニック種といった、生きている哺乳動物を意味する。いくつかのある実施形態では、当該患者または対象者は、霊長類である。ヒトの対象者の非限定例は、成人、未成年、乳幼児、及び胎児である。
【００６８】
「医薬的に許容可能な」は、一般に安全、非毒性であり、生物学的にもそれ以外にも望ましくないものではない医薬組成物を調製することにおいて有用であることを意味し、ヒト医薬用途に加えて、獣医学的用途でも許容可能なことを含む。
【００６９】
「医薬的に許容可能な塩」は、先に定義したように、医薬的に許容され、望ましい医薬活性を有する化合物の塩を意味する。そのような塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などといった無機酸、または１，２-エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、３−フェニルプロピオン酸、４，４’−メチレンビス（３−ヒドロキシ−２−エン−１−カルボン酸）、４−メチルビシクロ［２．２．２］オクト−２−エン−１−カルボン酸、酢酸、脂肪族モノもしくはジカルボン酸、脂肪族硫酸、芳香族硫酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、炭酸、桂皮酸、クエン酸、シクロペンタンプロピオン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸酸、グリコール酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、ヒドロキシナフトエ酸、乳酸、ラウリル硫酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムコン酸、ｏ−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、シュウ酸、ｐ−クロロベンゼンスルホン酸、フェニル置換アルカン酸、プロピオン酸、ｐ-トルエンスルホン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、第三級ブチル酢酸、トリメチル酢酸などといった有機酸で形成される酸付加塩が含まれる。医薬的に許容可能な塩には、存在する酸性プロトンが無機または有機塩基と反応可能な場合に形成され得る塩基付加塩も含まれる。許容可能な無機塩基には、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アルミニウム及び水酸化カルシウムが含まれる。許容可能な有機塩基には、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミンなどが含まれる。当該塩が、全体として、医薬的に許容可能である限り、説明される実施形態の何らかの塩の一部を形成する具体的なアニオンまたはカチオンも重大な意味をもたないことを留意されるべきである。医薬的に許容可能な塩及びそれらの調製法及び使用のさらなる例は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ  Ｕｓｅ（Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ  ＆  Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ  ｅｄｓ．，Ｖｅｒｌａｇ  Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，２００２）に示されている。
【００７０】
本明細書で使用の「主に単一な光学異性体」は、化合物が１つの光学異性体（例えば、エナンチオマーまたはジアステレオマー）を少なくとも約８５％含有することを意味する。例えば、ある実施形態では、化合物は、１つの光学異性体を少なくとも約９０％含有していてもよい。ある実施形態では、化合物は、１つの光学異性体を少なくとも約９５％含有していてもよい。ある実施形態では、化合物は、１つの光学異性体を少なくとも約９９％含有していてもよい。同様に、語句「実質的に他の光学異性体を含有しない」は、当該化合物が別の光学異性体を最大で約１５％含有することを意味する。例えば、ある実施形態では、化合物は、別の光学異性体を最大で約１０％含有していてもよい。ある実施形態では、化合物は、別の光学異性体を最大で約５％含有していてもよい。ある実施形態では、化合物は、別の光学異性体を最大で約１％含有していてもよい。
【００７１】
「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」または「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」には、（１）病気に対して危険及び／もしくは罹りやすい状態にある可能性があるが、当該病気の病態もしくは症候のいずれかもしくはすべてを未だ経験または示していない対象者または患者の当該病気の発症を抑制すること、ならびに／あるいは（２）病気に対して危険及び／もしくは罹りやすい状態にある可能性があるが、当該病気の病態もしくは症候のいずれかもしくはすべてを未だ経験または示していない対象者または患者の当該病気の発症を遅延させることが含まれる。
【００７２】
「プロドラッグ」は、生体内で本明細書記載の実施形態の阻害剤へ代謝的に変換可能な化合物を意味する。当該プロドラッグ自体も、所与の標的タンパク質に対して活性を有しても、いなくてもよい。例えば、ヒドロキシ基を有する化合物は、加水分解によりヒドロキシ化合物へと生体内で変換されるエステルとして投与されてもよい。生体内においてヒドロキシ化合物へと変換され得る適したエステルには、アセテート、シトレート、ラクテート、ホスフェート、タートレート、マロネート、オキサレート、サリチレート、プロピオネート、スクシネート、フマレート、マレート、メチレン−ビス−β−ヒドロキシナフトエート、ゲンチセート（ｇｅｎｔｉｓａｔｅ）、イセチオネート、ジ−ｐ−トルオイルタートレート、メタンスルホネート、エタンスルホネート、ベンゼンスルホネート、ｐ−トルエンスルホネート、シクロヘキシルスルファメート、キネート（ｑｕｉｎａｔｅ）、アミノ酸のエステルなどが含まれる。同様に、アミン基を有する化合物が、生体内で加水分解によりアミン化合物へ変換されるアミドとして投与されてもよい。
【００７３】
用語「飽和」が原子に関して使用される場合、当該原子が他の原子と単結合のみによって結合していることを意味する。
【００７４】
「立体異性体」または「光学異性体」は、所与の化合物の異性体であり、同一の原子が同一の他の原子と結合しているが、それらの原子の三次元における立体配置が異なる。「エナンチオマー」は、所与の化合物の立体異性体であり、左手と右手のようにお互いに鏡像である立体異性体である。「ジアステレオマー」は、所与の化合物の立体異性体であるが、エナンチオマーではない立体異性体である。
【００７５】
「生体内で水素へ変換可能な置換基」は、限定はされないが、加水分解及び水素化分解を含む酵素学的または化学的手段により水素原子へと変換可能な任意の基を意味する。例には、アシル基、オキシカルボニル基を有する基、アミノ酸残基、ペプチド残基、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル、トリメチルシリル、テトラヒドロピラニル、ジフェニルホスフィニルなどといった加水分解性基が含まれる。アシル基の例には、ホルミル、アセチル、トリフルオロアセチルなどが含まれる。オキシカルボニル基を有する基の例には、エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（−Ｃ（Ｏ）ＯＣ（ＣＨ３）３）、ベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ビニルオキシカルボニル、β−（ｐ−トルエンスルホニル）エトキシカルボニルなどが含まれる。適したアミノ酸残基には、限定はされないが、Ｇｌｙ（グリシン）、Ａｌａ（アラニン）、Ａｒｇ（アルギニン）、Ａｓｎ（アスパラギン）、Ａｓｐ（アスパラギン酸）、Ｃｙｓ（システイン）、Ｇｌｕ（グルタミン酸）、Ｈｉｓ（ヒスチジン）、Ｉｌｅ（イソロイシン）、Ｌｅｕ（ロイシン）、Ｌｙｓ（リシン）、Ｍｅｔ（メチオニン）、Ｐｈｅ（フェニルアラニン）、Ｐｒｏ（プロリン）、Ｓｅｒ（セリン）、Ｔｈｒ（スレオニン）、Ｔｒｐ（トリプトファン）、Ｔｙｒ（チロシン）、Ｖａｌ（バリン）、Ｎｖａ（ノルバリン）、ＨＳＥ（ホモセリン）、４−Ｈｙｐ（４-ヒドロキシプロリン）、５−Ｈｙｌ（５−ヒドロキシリジン）、Ｏｒｎ（オルニチン）及びβ−Ａｌａの残基が含まれる。適したアミノ酸残基の例には、保護基で保護されたアミノ酸残基も含まれる。適した保護基の例には、アシル基（ホルミル及びアセチルなど）、アリールメチルオキシカルボニル基（ベンジルオキシカルボニル及びｐ−ニトロベンジルオキシカルボニルなど）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（−Ｃ（Ｏ）ＯＣ（ＣＨ３）３）などを含む、ペプチド合成において典型的に使用される保護基が含まれる。適したペプチド残基の例には、２〜５個のアミノ酸残基、及びさらに任意選択で複数のアミノ酸残基を有するペプチド残基が含まれる。これらのアミノ酸またはペプチドの残基は、Ｄ体、Ｌ体、またそれらの混合物の立体化学的配置で存在していてもよい。さらに、当該アミノ酸またはペプチド残基は、不斉炭素原子を有していてもよい。不斉炭素原子を有する適したアミノ酸残基の例には、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｎｖａ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、及びＴｙｒの残基が含まれる。不斉炭素原子を有するペプチド残基には、不斉炭素原子を有する１つまたは複数の構成アミノ酸残基を有するペプチド残基が含まれる。適したアミノ酸保護基の例には、アシル基（ホルミル及びアセチルなど）、アリールメチルオキシカルボニル基（ベンジルオキシカルボニル及びｐ−ニトロベンジルオキシカルボニルなど）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（−Ｃ（Ｏ）ＯＣ（ＣＨ３）３）などを含む、ペプチド合成において典型的に使用される保護基が含まれる。「生体内で水素へ変換可能な」置換基の他の例には、還元的に脱離できる水素化分解可能な基が含まれる。適した還元的に脱離できる水素化分解可能な基の例には、限定は���れないが、アリールスルホニル基（ｏ−トルエンスルホニルなど）、フェニルまたはベンジルオキシで置換されたメチル基（ベンジル、トリチル、及びベンジルオキシメチルなど）、アリールメトキシカルボニル基（ベンジルオキシカルボニル及びｏ−メトキシ−ベンジルオキシカルボニル）、及びハロエトキシカルボニ基（β，β，β−トリクロロエトキシカルボニル及びβ−ヨードエトキシカルボニル）が含まれる。
【００７６】
本明細書で使用される際、用語「水溶性」は、当該化合物が少なくとも０．０１０モル／リットル程度水に溶解する、または先行文献により可溶性であると分類されることを意味する。
【００７７】
本願をとおして、用語「約」は、値が測定または定量方法の固有の誤差変動を含むことを示す。
【００７８】
単語「ａ」または「ａｎ」の使用が、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と共に使用される場合、「１つ」を意味する場合があるが、「１つまたは複数」、「少なくとも１つ」、及び「１つまたは複数」の意味とも一致する。
【００７９】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」といった含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の何らかの型）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「有する（ｈａｖｅ）」及び「有する（ｈａｓ）」といった有する（ｈａｖｉｎｇ）の何らかの型）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」といった含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の何らかの型）、または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」といった含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の何らかの型）は、包括的または非限定的であり、付加的、記載されていない要素または方法の手順を排除しない。
【００８０】
当該組成物及び方法は、自体の使用のために、本明細書にわたって開示される成分または手順のいずれか「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「から実質的になる」、または「からなる」ことができる。開示される成分または手順のいずれか「から実質的になる」組成物及び方法は、当該特許請求の範囲を、当該請求発明の基礎及び新規の性質に実質的に影響しない特定の材料または手順に限定する。
【００８１】
本明細書で論じられるいずれかの実施形態は、本発明のいずれかの方法または組成物に関して実施され得ることが企図され、逆もまた同様である。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために使用することができる。
【００８２】
本発明の他の目的、特徴、及び利点は、次の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかしながら、本詳細説明により、本発明の趣旨及び範囲に入る様々な改変及び修正が当業者に明らかになるであろうから、当該詳細説明及び特定の実施例は、本発明の特定の実施形態を示すが、説明のためだけに与えられるものであることを留意されるべきである。特定の化合物が、１つの特定の一般式に帰するということだけで、それが別の一般式に属することができないことは意味しないことに留意されたい。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】ＳＴＩＮＧ及びＩＲＦ３は、生体内におけるＣＤ８＋Ｔ細胞プライミングのために必要である。（ａ）ＣＦＳＥ標識した２Ｃ  Ｔ細胞を、ＷＴ（ｎ＝６）またはＭｙＤ８８−／−（ｎ＝６）マウスに移植し、Ｂ１６．ＳＩＹメラノーマ細胞を１日後に接種した。６日後、マウスを屠殺し、脾細胞を抗ＣＤ８及びクロノタイプｍＡｂ  １Ｂ２で染色し、ＣＦＳＥ希釈についてフローサイトメトリーで分析した。（ｂ）Ｔｒｉｆ−／−（ｎ＝５）、（ｃ）ＴＬＲ４−／−（ｎ＝４）、（ｄ）ＴＬＲ９−／−（ｎ＝５）、（ｅ）Ｐ２Ｘ７Ｒ−／−（ｎ＝５）、（ｆ）ＭＡＶＳ−／−（ｎ＝５）、（ｇ）ＳＴＩＮＧ−／−（ｎ＝５）または（ｈ）ＩＲＦ３−／−（ｎ＝５）マウスに１０６個のＢ１６．ＳＩＹメラノーマ細胞を接種した。７日後、脾細胞のＳＩＹ特異的ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞頻度をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより分析した。ＷＴマウスは対照として使用した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントｔ検定）。データは、平均±ＳＥＭを意味し、２回（ｂ〜ｆ）または３回（ａ）の独立した実験の代表である。
【図２】腫瘍由来のＤＮＡは、ＳＴＩＮＧ及びＩＲＦ３依存経路によるＩＦＮ−βの産生を誘導する。（ａ）培養したＢ１６メラノーマ腫瘍細胞を（方法）に示すように処理し、ＢＭ−ＤＣと共に１８時間インキュベートした。分泌されたＩＦＮ−βの量はＥＬＩＳＡで測定した。（ｂ）ＷＴまたはＳＴＩＮＧ−／−マウス由来のＢＭ−ＤＣ細胞を、図中に示す時点で１μｇ／ｍｌの腫瘍由来のＤＮＡで刺激した。全細胞抽出物は、ｐＴＢＫ１、全ＴＢＫ１、ｐＩＲＦ３、及び全ＩＲＦ３に対する抗体と共にインキュベートした。画像は、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｓｃａｎ（Ｌｉｃｏｒ）を使用して取得し、Ｉｍａｇｅ  Ｓｔｕｄｉｏ（Ｌｉｃｏｒ）を使用して解析した。（ｃ、ｄ）ＳＴＩＮＧ−／−またはＩＲＦ３−／−マウスによって生成されたＢＭ−ＤＣを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して腫瘍ＤＮＡで刺激した。ＩＦＮ−βの量は、ＥＬＩＳＡにより測定した。ＷＴマウス由来のＢＭ−ＤＣは、対照として使用した。（ｅ、ｆ）ＩＦＮ−βレポーター細胞は、ＳＴＩＮＧまたはＩＲＦ３特異的ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、その後、腫瘍ＤＮＡで刺激した。レポーター活性は、方法で説明されるとおりに評価した（ｅ、ｆ）。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントｔ検定）。データは、平均±ＳＥＭを意味し、２回（ａ）または３回（ｂ〜ｆ）の独立した実験の代表である。
【図３】ＳＴＩＮＧ−／−マウスでは、免疫原性腫瘍の拒絶が損なわれ、抗腫瘍Ｔ細胞の蓄積がみられない。（ａ）ＷＴまたはＳＴＩＮＧ−／−マウス（１２９バックグラウンド）に１０６個のＢ１６．ＳＩＹメラノーマ細胞を接種した。腫瘍細胞の成長は、図中に示す日に測定した。（ｂ）７日後、脾臓を摘出し、ＳＩＹ特異的ペンタマー特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞頻度をフローサイトメトリー分析により測定した。（ｃ）１９６９腫瘍細胞をＷＴまたはＳＴＩＮＧ−／−マウスへ接種し、図中に示す日に腫瘍細胞の成長を記録した。（ｄ、ｅ）ＣＦＳＥ標識した２Ｃ  Ｔ細胞をＷＴまたはＳＴＩＮＧ−／−マウスに移植し、１日後にＢ１６．ＳＩＹメラノーマ細胞をレシピエントマウスへ接種した。６日目にマウスを屠殺し、脾臓及び腫瘍灌流リンパ節を摘出した。細胞は抗ＣＤ８及びクロノタイプｍＡｂ  １Ｂ２で染色し、ＣＦＳＥ希釈についてフローサイトメトリーで分析した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントｔ検定）。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）を意味し、２回の独立した実験の代表である。
【図４】腫瘍ＤＮＡによる刺激は、樹状細胞活性化を示す幅広い遺伝子スペクトラムを誘導する。（ａ）ＷＴまたはＳＴＩＮＧ−／−マウス由来のＢＭ−ＤＣを腫瘍ＤＮＡで７時間刺激し、ＲＮＡを単離した。単離したＲＮＡは方法で説明されているＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ分析によって分析した。（ｂ〜ｄ）ＷＴまたはＳＴＩＮＧ−／−マウス由来のＢＭ−ＤＣを腫瘍ＤＮＡで刺激し、図中に示すサイトカインをＥＬＩＳＡで測定した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（スチューデントｔ検定）。データは、平均±ＳＥＭを意味し、３回の独立した実験の代表である。
【図５】生体内において腫瘍浸潤宿主ＡＰＣは、腫瘍由来のＤＮＡを取り込む。（ａ、ｄ）Ｂ１６．ＳＩＹ腫瘍細胞をＤＲＡＱ５で１５分間染色した。腫瘍細胞を十分洗浄した後、それをマウスの皮下に接種した。翌日、マウスを屠殺し、腫瘍隆起部を回収した。単離した腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を染色し、方法で説明されるＩｍａｇｅｓｔｒｅａｍを使用して単一細胞画像を取得した。取得した画像は、ＩＤＥＡＳソフトウェアを使用して解析した。（ｂ）Ｂ１６．ＳＩＹ腫瘍細胞を、一晩Ｅｄｕ存在下での腫瘍細胞の培養によりＥｄｕで標識化した。標識した腫瘍細胞を洗浄した後、腫瘍細胞をマウスへ接種した。翌日、腫瘍隆起部を回収し、方法で説明されるＣｌｉｃｋ−ｉＴ  Ｅｄｕイメージングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＥｄｕを検出した。得られた画像は、先に説明したとおり分析した。非標識腫瘍細胞は陰性対照として使用した。（ｃ）ヒトメラノーマ６２４腫瘍細胞をマウスの皮下に接種した。翌日、腫瘍隆起部を回収し、ヒト抗ＨＬＡ、マウス抗ＣＤ４５、及び抗ＣＤ１１ｃ抗体で染色した。ＤＡＰＩ染色によって生存細胞をゲート後に、ＣＤ４５及びＣＤ１１ｃ陽性細胞をセルソーティングにより回収し、ＤＮＡを単離した。方法で説明されるように、ゲノム（ｇ）またはミトコンドリア（ｍ）配列用のマウス（Ｍ）またはヒト（Ｈ）特異的プライマーを使用してＰＣＲを実施した。（ｄ）（ｃ）で説明したソートした細胞は、段階希釈（１０細胞／サンプル）し、ＲＥＰＬＩ−ｇ（登録商標）Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ゲノム増幅を実施し、（ｃ）で説明したとおり、ＰＣＲを実施した。＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントｔ検定）。データは、平均±ＳＥＭを意味し、少なくとも３回の独立した実験の代表である。
【図６】腫瘍浸潤宿主ＡＰＣは、ＳＴＩＮＧ依存的にＩＦＮ−βを産生する。  （ａ）Ｂ１６．ＳＩＹ腫瘍細胞をマウスの皮下に接種した。翌日、腫瘍突起部を回収し、懸濁細胞を固定、透過処理し、図中に示す抗体で染色した。Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍで得られた画像は、ＩＤＥＡＳソフトウェアを使用して解析した。（ｂ）Ｂ１６．ＳＩＹ腫瘍細胞をＷＴまたはＳＴＩＮＧ−／−マウスへ接種した。翌日、腫瘍細胞、リンパ節、及び脾臓を先のように単離し、抗マウスＣＤ４５抗体（ｂ）及びＣＤ１１ｂ及びＣＤ１１ｃ（ｃ）抗体で染色した。染色細胞はセルソーティングで回収した。全ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成した。ＩＦＮ−βの転写産物の発現はｑ−ＰＣＲを使用して測定した。リンパ節または脾臓由来のＣＤ１１ｂまたはＣＤ１１ｃ陽性細胞は、対照として使用した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（スチューデントｔ検定）。データは、平均±ＳＥＭを意味し、３回の独立した実験の代表である。
【図７】ＴＬＲ４−／−及びＴＬＲ９−／−マウスにおける抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ＷＴマウスと同等である。Ｂ１６．ＳＩＹメラノーマ細胞をＷＴまたはＴＬＲ４−／−（ａ）またはＴＬＲ９−／−（ｂ）マウスへ注入した。一週間後、マウスの脾臓を単離し、方法で説明されるように、ＳＩＹペプチド特異的ペンタマー染色を実施した。データは、平均±ＳＥＭを意味し、２回の独立した実験の代表である。
【図８】腫瘍由来のＤＮＡは、マウスマクロファージ細胞におけるＩＦＮ−βの産生を誘導する。不死化マクロファージ細胞株を腫瘍由来のＤＮＡ＋Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、生存腫瘍細胞、またはＢ１６腫瘍細胞の培養上清のいずれかで刺激し、産生されたＩＦＮ−βの量をＥＬＩＳＡで測定した。
【図９】正常脾細胞由来のＤＮＡは、腫瘍由来のＤＮＡと同等のＩＦＮ−β産生を誘導した。ＷＴ  Ｂ６マウスの脾臓またはＢ１６メラノーマ腫瘍細胞由来のＤＮＡは、ＤＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。ＢＭＤＣは、図中に示す濃度のＤＮＡで刺激し、ＩＦＮ−β産生は、細胞培養上清を使用してＥＬＩＳＡで測定した。データは、平均±ＳＥＭを意味し、３回の独立した実験の代表である。
【図１０】腫瘍由来のＤＮＡによる刺激は、ＷＴ  ＢＭＤＣにおけるＴＢＫ１及びＩＲＦ３のリン酸化を誘導するが、ＳＴＩＮＧ−／−  ＢＭＤＣでは誘導しない。ＢＭＤＣは、図中に示す時間、腫瘍由来のＤＮＡ（１μ／ｍｌ）またはＬＰＳ（２０ｎｇ／ｍｌ）のいずかで刺激した。全細胞抽出物は、ｐＴＢＫ１、全ＴＢＫ１、ｐＩＲＦ３及び全ＩＲＦ３に対する抗体と共にインキュベートした。画像は、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｓｃａｎ（Ｌｉｃｏｒ）を使用して取得し、Ｉｍａｇｅ  Ｓｔｕｄｉｏ（Ｌｉｃｏｒ）で分析した。
【図１１】ＤＮＡ刺激は、実質的なＮＦ−κｂ活性化を誘導しないようである。ＷＴマウス由来のＢＭ−ＤＣ細胞は、１μｇ／ｍｌの腫瘍由来のＤＮＡ、２０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで異なる時点で刺激した。全細胞抽出物は、ｐＩＫＫβ、全ＩＫＫβ、ｐＩｋＢα及び全ＩｋＢαに対する抗体で分析した。データは、３回の独立した実験の代表である。
【図１２】ｃＧＡＳノックダウンは、ＤＮＡ刺激したマウスマクロファージ細胞からのＩＦＮ−β産生を減少させる。マウスマクロファージ細胞は、対照またはｃＧＡＳ特異的ｓｉＲＮＡで処理した。３６時間後、腫瘍ＤＮＡ刺激無しでｓｉＲＮＡ処理した細胞は、ＲＮＡの単離及びｑＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現の確認に使用した（ａ）。ｓｉＲＮＡ処理した細胞の別セットは、腫瘍ＤＮＡで刺激し、細胞培養上清中のＩＦＮ−β産生をＥＬＩＳＡで測定した（ｂ）。データは、平均±ＳＥＭを意味し、３回の独立した実験の代表である。
【図１３】Ｂ１６メラノーマ腫瘍の成長は、ＷＴマウスと比較して、ＳＴＩＮＧ−／−（ａ）またはＩＲＦ３−／−マウス（ｂ）においてより促進されたが、Ｔｒｉｆ−／−マウス（ｃ）では促進されなかった。Ｂ１６．ＳＩＹ腫瘍細胞（１０６個の細胞／マウス）を図中に示すマウスの皮下に注入し、腫瘍の成長を図中に示す日に測定した。データは、平均±ＳＥＭを意味し、２回の独立した実験の代表である。
【図１４】ＳＴＩＮＧ−／−マウスは、皮膚移植片を野生型レシピエントと類似した動態で拒絶する。雄性ＳＴＩＮＧ−／−マウス由来の皮膚を雌性ＳＴＩＮＧ−／−レシピエント（ｎ＝６）に移植した。野生型雄性マウスのものを雌の皮膚に移植し、陽性対照として使用した（ｎ＝３）。生存している移植片の割合（パーセント）を期間にわたって評価した。
【図１５】１９６９腫瘍細胞のＤＮＡは、生体内で宿主ＡＰＣへ移行可能である。１９６９腫瘍細胞をＥｄｕで標識化し、マウスに注入した。１日後、腫瘍浸潤免疫細胞を含む腫瘍細胞を単離し、方法で説明されるように細胞表面マーカー及びＥｄｕについて染色した。画像はＡｍｎｉｓ  ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍシステムで取得し、データはＩＤＥＡＳソフトウェアで解析した。データは、２回の独立した実験の画像の１つの代表的なセットを示す。
【図１６】ソートされたマウスＣＤ４５＋ＣＤ１１ｃ＋細胞においてヒトゲノムＤＮＡ配列は検出されない。ヒトメラノーマ６２４細胞をマウスの皮下に注入した。翌日、腫瘍突起部を単離し、単一細胞懸濁液を調製した。ＤＡＰＩ、抗ヒトＨＬＡ（Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８）、抗マウスＣＤ４５（ＰＥ）及び抗マウスＣＤ１１ｃ（Ｐｅｒｃｐ−Ｃｙ５．５）抗体で染色後、抗ヒトＨＬＡ−抗マウスＣＤ４５＋ＣＤ１１ｃ＋生存細胞をセルソーティングによって精製した。ソートした細胞からＤＮＡを単離し、図に示すヒトゲノムＤＮＡ（ＳＴＩＮＧ、ＡＩＭ−２、及びＡＴＧ１４）及びミトコンドリアＤＮＡ（ＡＴＰ６）に特異的なプライマーセットを使用してＰＣＲを実施した。ＰＣＲ産物は、１．５％アガロースゲル中で電気泳動させ、ＥｔＢｒで可視化した。
【図１７】ミトコンドリアＤＮＡは、Ｉ型ＩＦＮの産生を誘導する。ゲノムＤＮＡをＢ１６メラノーマ細胞からＢｌｏｏｄ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＤＮＡ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。ミトコンドリアＤＮＡは、Ｂ１６メラノーマ細胞のミトコンドリアからＱｐｒｏｔｅｏｍｅ（商標）Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。（ａ）ＴＨＰ−１  ＩＳＧレポーター細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）は、図中に示す量のゲノムまたはミトコンドリアＤＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（０．５μｌ／ウェル）と組み合わせて刺激した。一晩インキュベートした後、上清を回収し、ＱＵＡＮＴＩ−ｂｌｕｅ基質（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を添加した。Ｉ型インターフェロンの産生量は、プレートリーダーで吸光度を読むことにより測定した。（ｂ）ＢＭＤＣは、図中に示すＤＮＡ量で刺激し、マウスＩＦＮ−βのＥＬＩＳＡでＩＦＮ−βを測定した。データは、平均±ＳＥＭを意味し、３〜４回の独立した実験の代表である。
【図１８】腫瘍浸潤宿主ＡＰＣは、生体内においてＴＢＫ１のリン酸化を示す。Ｂ１６メラノーマ細胞をマウスに注入した。１日後、腫瘍浸潤宿主免疫細胞を含む腫瘍細胞を単離し、方法で説明されるように染色した。画像は、Ａｍｎｉｓ  ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍシステムを使用して取得し、データはＩＤＥＡＳソフトウェアで解析した。データは、２回の独立した実験の１つの代表の画像を示す。
【図１９】腫瘍浸潤宿主ＡＰＣは、生体内において、腫瘍注入後１週間でＩＲＦ３のリン酸化を示す。Ｂ１６メラノーマ細胞をマウスに注入した。１週間後に、腫瘍浸潤宿主免疫細胞を含む腫瘍細胞を単離し、方法で説明されるように染色した。画像は、Ａｍｎｉｓ  ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍシステムを使用して取得し、データはＩＤＥＡＳソフトウェアで解析した。データは、２回の独立した実験の１つの代表の画像を示す。
【図２０】ＤＭＸＡＡは、ＳＴＩＮＧ経路を活性化し、Ｉ型ＩＦＮ産生を引き起こす。
【図２１】ＤＭＸＡＡによるＢＭ−ＤＣにおけるサイトカインの誘導は、ＳＴＩＮＧ依存的である。
【図２２】ＤＭＸＡＡによるＢＭ−ＤＣにおける同時刺激リガンドの誘導は、ＳＴＩＮＧ依存的である。
【図２３】腫瘍内ＤＭＸＡＡは、ＷＴマウスにおけるＢ１６．ＳＩＹ腫瘍の拒絶を引き起こす。
【図２４】ＤＭＸＡＡは、腫瘍発現ＳＩＹ抗原に対する強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を引き起こす。
【図２５】ＤＭＸＡＡは、動物を第二の腫瘍再負荷から保護する。
【図２６】ＤＭＸＡＡは、ＳＴＩＮＧ−／−及びＲＡＧ−／−マウスにおける腫瘍の成長を制御できない。
【図２７】ＤＭＸＡＡは、ＷＴマウスにおけるＢ１６．ＳＩＹ腫瘍拒絶を引き起こす。
【図２８】ＤＭＸＡＡは、ＳＩＹ抗原に対する強力な免疫応答を引き起こす。
【図２９】ＤＭＸＡＡは、ＳＴＩＮＧ経路を活性化し、ＡＰＣの活性化を促進する。（ａ）ＳＴＩＮＧ−ＨＡタグを発現するよう形質導入されたＳＴＩＮＧ−／−マウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）を５０μｇ／ｍｌのＤＭＸＡＡで１時間刺激し、ＨＡタグに対して特異的な抗体、ＣＤ１１ｂ、及びＤＡＰＩで染色した。単一細胞画像をＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍで取得し、データは、ＩＤＥＡＳソフトウェア（Ａｍｎｉｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で解析した。グラフ中のデータは、３回の独立した実験から得られた凝集を有する細胞の平均割合を示す。（ｂ）ＷＴまたはＳＴＩＮＧ−／−ＢＭＭを、５０μｇ／ｍｌのＤＭＸＡＡで、図中に示す時間刺激した。ｐＴＢＫ１、全ＴＢＫ１、ｐＩＲＦ３、全ＩＲＦ３、ＳＴＩＮＧ、及びＧＡＰＤＨの量は、ウエスタンブロットによって測定した。（ｃ）ＷＴまたはＳＴＩＮＧ−／−ＢＭＭを、５０μｇ／ｍｌのＤＭＸＡＡで１２時間刺激した。分泌されたＩＦＮ−βは、ＥＬＩＳＡにより測定した。（ｄ）ＷＴまたはＳＴＩＮＧ−／−マウスの骨髄由来ＤＣ（ＢＭ−ＤＣ）を、図中に示す時間２５μｇ／ｍｌのＤＭＸＡＡで刺激した。ｐＴＢＫ１、全ＴＢＫ１、ｐＩＲＦ３、全ＩＲＦ３及びＧＡＰＤＨの量はウエスタンブロットで測定した。（ｅ）ＷＴまたはＳＴＩＮＧ−／−マウス由来のＢＭ−ＤＣを、５０μｇ／ｍｌのＤＭＸＡＡで１２時間刺激した。上清のＩＦＮ−β量はＥＬＩＳＡで測定した。（ｆ〜ｇ）ＷＴまたはＳＴＩＮＧ−／−マウス由来のＢＭ−ＤＣを２５μｇ／ｍｌのＤＭＸＡＡで４時間刺激した。先天性サイトカインの発現は、ｑ−ＲＴ−ＰＣＲで測定した（ｆ）。細胞膜上の共刺激性分子の発現は、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８６、及びＭＨＣクラスＩＩに対する特異的抗体による染色で測定した（ｇ）。細胞は、ＬＳＲＩＩ−Ｂｌｕｅ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒにて取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）で解析した。
【図３０】ＤＭＸＡＡ応答性腫瘍拒絶は、ＳＴＩＮＧ依存的である。（ａ）ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスの左側腹部に１０６個のＢ１６．ＳＩＹ細胞を接種した（ｎ＝５）。腫瘍の体積が１００〜２００ｍｍ３であるときに、それらへ５００μｇのＤＭＸＡＡまたは生理食塩水を単回ＩＴ投与した。腫瘍体積は図中に示す時点で測定した。（ｂ〜ｃ）ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスは（ａ）と同様に処置し、５日後に脾細胞を回収し、培養液または可溶性ＳＩＹペプチド存在下で１６時間、試験管内で再度刺激した。腫瘍特異的ＩＦＮ−γ産生細胞の頻度は、ＥＬＩＳＰＯＴで評価し（ｂ）、ＳＩＹ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は、ＴＣＲβ、ＣＤ４、ＣＤ８及びＳＩＹペンタマーに対する特異的抗体で脾細胞を染色することにより評価した（ｃ）。細胞は、ＬＳＲＩＩ−Ｂｌｕｅサイトメーターにおいて取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析した。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．で示されている。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（ｃ）。（ｄ）Ｂ１６．ＳＩＹ腫瘍を拒絶したＷＴマウスの反対側の側腹部に、１０６個のＢ１６．ＳＩＹを再負荷した。未処置マウスを対照として使用した。腫瘍のサイズは、図中に示す時点で測定した。（ｅ）ＷＴマウスの左及び右側腹部に１０６個のＢ１６．ＳＩＹ細胞を接種した（ｎ＝５）。腫瘍の体積が１００〜２００ｍｍ３であるときに、５００μｇのＤＭＸＡＡまたは生理食塩水を右側腹部のみにＩＴ注入し、腫瘍体積を図中に示す時点で測定した。データは、少なくとも３回の独立した実験、または対側性の腫瘍モデルでは２回の独立した実験の代表である。結果は、平均腫瘍体積±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。＊Ｐ＜０．５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３１】生体内におけるＤＭＸＡＡの治療効果の大部分には、獲得免疫応答が必要である。（ａ）ＷＴ及びＳＴＩＮＧ−／−Ｃ５７ＢＬ／６マウスの左側腹部に１０６個のＢ１６．ＳＩＹ細胞を接種した（ｎ＝５）。腫瘍体積が１００〜２００ｍｍ３であるときに、それらへ５００μｇのＤＭＸＡＡまたは生理食塩水を単回ＩＴ投与した。腫瘍サイズは図中に示す異なる時点で測定した。（ｂ〜ｃ）ＷＴ及びＳＴＩＮＧ−／−Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、（ａ）と同様に処置し、５日後に脾細胞を回収し、培養液または可溶性ＳＩＹペプチド存在下で１６時間、試験管内で再度刺激した。腫瘍特異的ＩＦＮ−γ産生細胞の頻度は、ＥＬＩＳＰＯＴで評価し（ｂ）、特異的ＳＩＹＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は、ＴＣＲβ、ＣＤ４、ＣＤ８及びＳＩＹペンタマーに対する特異的抗体で脾細胞を染色することにより評価した（ｃ）。細胞は、ＬＳＲＩＩ−Ｂｌｕｅサイトメーターにおいて取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析した。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．で示されている。＊Ｐ＜０．５、＊＊Ｐ＜０．０１。ＷＴ及びＲＡＧ−／−Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｄ）またはＷＴ及びＴＣＲα−／−マウス（ｅ）の左側腹部に１０６個のＢ１６．ＳＩＹ細胞を接種した（ｎ＝５）。腫瘍体積が１００〜２００ｍｍ３であるときに、それらへ５００μｇのＤＭＸＡＡまたは生理食塩水を単回ＩＴ投与した。腫瘍の体積は図中に示す時点で測定した。（ｆ）２５０μｇの抗ＣＤ８抗体（クローン２．４３）を毎週１回注入することでＷＴＣ５７ＢＬ／６マウスのＣＤ８＋Ｔ細胞を欠乏させた。アイソタイプであるＩｇＧ２ｂを対照として使用した。抗ＣＤ８またはＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照の最初の注入から２日後に、マウスの左側腹部に１０６個のＢ１６．ＳＩＹ細胞を負荷した（ｎ＝５）。７日後に、腫瘍が１００〜２００ｍｍ３であるときに、それらへ５００μｇのＤＭＸＡＡまたは生理食塩水を単回ＩＴ投与した。腫瘍体積は、異なる時点で測定した。データは、少なくとも２回の独立した実験の代表である。結果は平均腫瘍体積±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。＊Ｐ＜０．５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３２】改変ＣＤＮは、すべてのヒトＳＴＩＮＧ対立遺伝子を通じて、ＳＴＩＮＧ及びシグナルを強力に活性化する。（ａ）ｈＳＴＩＮＧのドメイン構造をアミノ酸変異位置と共に示す（下部）。左側の列に示されるｈＳＴＩＮＧアイソフォームの対立遺伝子頻度は、以前に説明したように１０００ゲノムプロジェクトのデータベースから得られたものである３５。図中に示す全長ＳＴＩＮＧ−ＨＡタンパク質を安定発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の全細胞可溶化液は、抗ＨＡ抗体を使用してウエスタンブロットで分析した。（ｂ）図中に示すＳＴＩＮＧ対立遺伝子を安定発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＩＦＮ−β−ルシフェラーゼレポーターコンストラクトをトランスフェクトした。２４時間後、ルシフェラーゼ遺伝子レポーター活性を測定する前に、細胞を１００μｇ／ｍｌのＤＭＸＡＡで６時間刺激した。（ｃ）図中に示すＳＴＩＮＧ対立遺伝子を発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、（ｂ）と同様に処理し、図中に示すＣＤＮ化合物（１０μＭ）で６時間刺激し、ＩＦＮ−β−レポーター活性を評価した。（ｄ）Ｃ５７ＢＬ／６またはＳＴＩＮＧ−／−マウスから単離したＢＭＭに５μＭのＣＤＮを添加した。６時間インキュベートした後、リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲで誘導されたＩＦＮ−βの発現を評価し、刺激していないＣ５７ＢＬ／６  ＢＭＭと比較することで、相対的に正規化された発現量を決定した。（ｅ）図中に示すＳＴＩＮＧ対立遺伝子を有するドナー由来のヒトＰＢＭＣを１０μＭの図中に示すＣＤＮまたは１００μｇ／ｍｌのＤＭＸＡＡで刺激した。６時間の刺激後に、ＩＦＮ−βの倍率誘導をｑＲＴ−ＰＣＲで測定し、未処理の対照と比較することで、相対的に正規化された発現量を決定した。
【図３３】合成によるＣＤＮ改変は、確立されたＢ１６腫瘍における抗腫瘍効果を有意に改善する。５×１０４個のＢ１６．Ｆ１０細胞をＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスの左側腹部に接種した（ｎ＝８）。腫瘍の体積が１００ｍｍ３であるときに、それらに、２５μｇのＭＬ−ＣＤＡ、ＭＬ−ＣＤＧ、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＧ、もしくはＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡを３回ＩＴ投与（ａ）、ＤＭＸＡＡ（１５０μｇ）、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＧ（２５μｇ）、もしくはＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ（５０μｇ）を３回ＩＴ投与（ｂ）、またはＭＬ−ｃＧＡＭＰ（５０μｇ）、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ｃＧＡＭＰ（５０μｇ）、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＧ（２５μｇ）、もしくはＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ（５０μｇ）を３回ＩＴ投与（ｃ）した。対照群は、ＨＢＳＳ媒体で処置した。（ｄ）ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＳＴＩＮＧ−／−マウスは、ＣＤＮ  ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ（５０μｇ）、マウスＢ型ＣｐＧ  ＯＤＮ  １６６８（５０μｇ）、またはＨＢＳＳ媒体対照で３回ＩＴ投与処置した。（ｅ）ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ（５０μｇ）または５０μｇの次に示すＴＬＲアゴニストで３回ＩＴ投与処置した：ＴＬＲ３（及びＲＩＧ−Ｉ）アゴニスト、ポリＩ：Ｃ；ＴＬＲ４アゴニスト、グルコプラノシルリピドＡ（ＧＬＡ）；ＴＬＲ７／８アゴニスト、レシキモド（Ｒ８４８）；ＴＬＲ９アゴニストＣｐＧ  １６６８。化合物は、図中に矢印で示す日に投与し、週に２回、腫瘍の測定を実施した。データは、少なくとも２回の独立した実験の代表である。結果は、平均腫瘍体積±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３４】ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡは、免疫媒介性の腫瘍拒絶を促進する。（ａ）ＷＴ  ＢＡＬＢ／ｃマウスの左側腹部に１０５個のＣＴ２６結腸癌細胞を接種した。腫瘍の体積が１００ｍｍ３であるときに、それにＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ（５０μｇ）またはＨＢＳＳ媒体対照（左グラフ）を３回ＩＴ投与した。最初の腫瘍移植後から５５日目に反対側の側腹部に１０５個の腫瘍細胞を再度移植した。未処置マウスを対照として使用した（右グラフ）（ｎ＝８）。（ｂ）ＷＴ  ＢＡＬＢ／ｃマウスの左側腹部に１０５個のＣＴ２６結腸癌細胞を接種し、１１、１４、及び１８日目にＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＧまたはＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ（それぞれ２５μｇ）、またはＨＢＳＳ媒体対照のＩＴ注入処置を実施した（ｎ＝４）。ＣＴ２６移植後２１日間、ＰＢＭＣはＡＨ１（ｇｐ７０４２３−４３１）で刺激し、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで評価した。（ｃ）ＷＴ  ＢＡＬＢ／ｃマウスの両側腹部に１０５個のＣＴ２６腫瘍細胞を移植した。図中に示す日に、マウスの片方の側腹部のみ、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ（５０μｇ）、またはＨＢＳＳ媒体対照で処置した（ｎ＝８）。（ｄ）０日目にＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６の右側腹部に５×１０４個のＢ１６．Ｆ１０メラノーマ細胞を接種し、７日目に１０５個の細胞をＩＶ移植した。未処置のマウスには対照として細胞ＩＶ移植のみ実施した。側腹部の腫瘍は、図中で示す日にＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ（５０μｇ）、ＤＭＸＡＡ（１５０μｇ）、またはＨＢＳＳ対照で処置した（ｎ＝８）。２８日目に、肺を回収し、肺腫瘍結節を数えた。ヒストグラムは、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、ＤＭＸＡＡ、またはＨＢＳＳ対照処置されたマウスの全肺癌結節数を示し、ＩＶのみで腫瘍移植された未処置マウスと比較したものである。画像は、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ及びＨＢＳＳ対照処置されたマウスを示す。データは、少なくとも２回の独立した実験の代表である。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３５】生体内におけるＤＭＸＡＡ用量応答。（ａ）ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスの左側腹部に１０６個のＢ１６．ＳＩＹ細胞を接種した（ｎ＝５）。腫瘍体積が１００〜２００ｍｍ３であるときに、それらへ６２５、５００、３００、または１５０μｇのＤＭＸＡＡ、または生理食塩水を単回ＩＴ投与した。異なる時点で腫瘍体積を測定した。結果は、平均腫瘍体積±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。（ｂ）ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、（ａ）と同様に処置し、ＤＭＸＡＡ処置の５日後に、脾細胞を回収し、試験管内で培養液または可溶性ＳＩＹペプチド存在下で１６時間再刺激した。腫瘍特異的ＩＦＮ−γ産生細胞の頻度をＥＬＩＳＰＯＴで評価した。（ｃ）ＳＩＹ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は、ＴＣＲβ、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＳＩＹテトラマーに対する特異的抗体を使用して脾細胞を染色することにより評価した。細胞をＬＳＲＩＩ−Ｂｌｕｅサイトメーターで取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析した。データは、少なくとも２回の独立した実験を示す。
【図３６】異なるマウス腫瘍モデルにおけるＤＭＸＡＡの治療効果。ＷＴマウスに１０６個のＢ１６．Ｆ１０を接種（ａ）、ＴＲＡＭＰ−Ｃ２をＣ５７ＢＬ／６マウスへ（ｂ）、４Ｔ−１をＢＡＬＢ／Ｃマウスへ（ｃ）、及びＡｇ１０４ＬをＣ３Ｈマウスへ（ｄ）。腫瘍体積が１００〜２００ｍｍ３であるときに、それらへ５００μｇのＤＭＸＡＡまたは生理食塩水を単回ＩＴ投与した。腫瘍体積は、異なる時点で測定した。結果は、平均腫瘍体積±ｓ．ｅ．ｍ．で示されている。データは少なくとも二つの独立した実験を示す。
【図３７】抗ＣＤ８で処置されたマウス血液中におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度。図中に矢印で示すように２５０μｇの抗ＣＤ８抗体（クローン２．４３）を毎週１回注入することにより、ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＣＤ８を欠乏させた。アイソタイプＩｇＧ２ｂを対照として使用した。グラフは、０、２、９、及び１３日目における血液中のＴＣＲβ＋細胞からゲートされたＣＤ８＋細胞の割合を示す。
【図３８】環状ジヌクレオチドの構造。（ａ）（上パネル）ＭＬ−ＲＲ−ＣＤＡを９５％以上まで精製した際のＨＰＬＣクロマトグラムであり、Ｃ−１８カラムを使用し、１０ｍＭのトリエチルアンモニウムアセタートを含む２％〜２０％のアセトニトリルによる勾配を実施したものであり、１２．４分の保持時間を示している。（下パネル）合成したＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡの二次元１Ｈ−３１Ｐ  Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｂｏｎｄ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ（ＨＭＢＣ）である。二次元１Ｈ−３１Ｐ  ＨＭＢＣにより、リン原子核であるＰ−１が５’リボースのメチレンプロトン（Ｈ−５Ｂ）に加えて、２’−リボースのプロトン（Ｈ−２Ａ）とも相関していることが明らかとなった。もう一方のリン原子核であるＰ−２は、もう一方のアデノシンの３’リボースのプロトン（Ｈ−３Ｂ）及びもう一方のアデノシンの５’リボースのメチレンプロトン（Ｈ−５Ａ）と相関している。１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ及び２Ｄ−ＨＭＢＣの結果を組み合わせることで、ホスホジエステル結合の位置化学は、示されている構造に一致する２’，５’−３’，５’であるという直接的な証拠が得られた。（ｂ）（上パネル）ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡのＸ線結晶構造（スティックモデル）であり、Ｒ，Ｒジアステレオマーの立体配置及び２’−５’−３’−５’ホスホジエステル結合の位置化学を確認するものである。配色は次のとおり。炭素（白）、窒素（青）、酸素（赤）、硫黄（黄）。（下パネル）ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡの静電ポテンシャル面を青（正）、黄（中性）、及び赤（負）で示した。
【図３９】ＣＤＮによる炎症誘発性サイトカインの誘導は、ＳＴＩＮＧ依存である。Ｃ５７ＢＬ／６またはＳＴＩＮＧ−／＋マウスから単離したＢＭＭへ５μＭのＣＤＮを添加した。６時間インキュベートした後、炎症誘発性サイトカインであるＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−６の誘導された発現量をリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲで評価し、刺激していない参照遺伝子であるＣ５７ＢＬ／６  ＢＭＭ及びＧＵＳＢ及びＰＧＫ１と比較することで、相対的に正規化された発現量を決定した。
【図４０】環状ジヌクレオチドによるＳＴＩＮＧ経路の活性化。（ａ）ＳＴＩＮＧ−ＨＡを発現しているＳＴＩＮＧ−／−マクロファージを５０ｍｇ／ｍｌのＤＭＸＡＡまたは５０μＭのＭＬ  ＲＲＳ２  ＣＤＡで１時間刺激し、その後、ＨＡタグに対して特異的な抗体、ＣＤ１１ｂ、及びＤＡＰＩで染色した。単一細胞画像をＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍで取得し、データはＩＤＥＡＳソフトウェア（Ａｍｎｉｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で解析した。（ｂ）図中に示す時間、ＷＴマクロファージを５０μｇ／ｍｌのＤＭＸＡＡまたは５０μＭのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡで刺激した。ｐＴＢＫ１、全ＴＢＫ１、ｐＩＲＦ３、全ＩＲＦ３、ＳＴＩＮＧ及びＧＡＰＤＨの量はウエスタンブロットで測定した。（ｃ）ＷＴまたはＳＴＩＮＧ−／−マウス由来のＢＭ−ＤＣを、１０μＭの図中に示すＣＤＮ、１μｇ／ｍｌのＬＰＳまたは１００μｇ／ｍｌのＤＭＸＡＡを使用して培養液中で刺激した。２４時間後に、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣゲートで、ＭＨＣクラスＩＩまたはＣＤ８６の発現量をＦＡＣＳで測定した。
【図４１】リードＣＤＮ分子は、４Ｔ−１マウスモデルにおける免疫媒介性腫瘍拒絶を促進する。ＷＴ  ＢＡＬＢ／ｃマウスの左側腹部に１０５個の４Ｔ−１細胞を接種した。腫瘍細胞が１００ｍｍ３であるときに、それらへＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ（５０μｇ）またはＨＢＳＳ媒体対照を３回ＩＴ投与した。最初の腫瘍移植から５５日目に、マウスの反対側の側腹部に腫瘍細胞（それぞれ１×１０５個）を再移植した。未処置対照マウスにも同時に移植した（右グラフ）（ｎ＝８）。（ｂ）ＷＴ  ＢＡＬＢ／ｃマウスの両側腹部に、１×１０５個の４Ｔ−１腫瘍細胞を移植した。図中に示す日に、マウスの片方の側腹部のみ、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ（５０μｇ）またはＨＢＳＳ媒体対照で処置した（ｎ＝８）。データは、少なくとも独立した２回の実験の代表である。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．で示されている。＊＊Ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
発明者らは、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニストである、キサンテノン誘導体ＤＭＸＡＡが、ＡＰＣにおけるＳＴＩＮＧ経路の強力な活性化を引き起こすことをつきとめた。ＳＴＩＮＧ経路の活性化は、ＩＦＮ−βに加え、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１２の高産生、ならびにＤＣによるＣＤ４０及びＣＤ８６のアップレギュレーションにつながる。同様に、ＤＭＸＡＡの単回腫瘍内投与は、マウスにおいて、確立された腫瘍の拒絶を促進する。
【００８５】
完全な腫瘍の拒絶は、宿主ＳＴＩＮＧ及び獲得Ｔ細胞応答に依存しており、ＤＭＸＡＡでの腫瘍の処置は、Ｔ細胞免疫応答を強力に亢進し、免疫記憶を生成することも発見された。試験は、マウスモデル及びヒト分子の使用の両方で実施された。
【００８６】
Ａ．ＳＴＩＮＧ経路
ＳＴＩＮＧ経路は、細胞基質ＤＮＡの検出に関連する経路である。インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）は、膜貫通型タンパク質１７３（ＴＭＥＭ１７３）及びＭＰＹＳ／ＭＩＴＡ／ＥＲＩＳとしても知られており、ヒトにおいてはＴＭＥＭ１７３遺伝子にコードされているタンパク質である。ＳＴＩＮＧは、自然免疫において重要な役割を担う。ウイルス、マイコバクテリア及び細胞内寄生虫といった細胞内病原体に細胞が感染するとＳＴＩＮＧは、Ｉ型インターフェロン産生を誘導する。ＳＴＩＮＧにより媒介されるＩ型インターフェロンは、オートクリン及びパラクライン様式で感染細胞及び近傍の細胞を局所感染から保護する。
【００８７】
ＳＴＩＮＧは、ＴＭＥＭ１７３遺伝子によってコードされる。それは、直接的な細胞基質ＤＮＡセンサー（ＣＤＳ）、及び様々な分子メカニズムを介するＩ型インターフェロンシグナル伝達におけるアダプタータンパク質の両方としてはたらく。それは、細胞内病原体に対する抗ウイルス応答及び自然免疫応答を担っている下流の転写制御因子であるＳＴＡＴ６及びＩＲＦ３を、ＴＢＫ１を介して活性化することが示されている。
【００８８】
ＳＴＩＮＧは小胞体内に存在するが、細胞基質にＤＮＡが存在すると、センサーであるｃＧＡＳが当該ＤＮＡに結合し、環状ジヌクレオチドを形成する。このジヌクレオチドは、ＳＴＩＮＧに結合し、その凝集及びゴルジを介するＥＲから核周囲部への転座を促進する。そこで、ＳＴＩＮＧはＴＢＫ１と複合体を形成し、そのリン酸化を促進する。一旦ＴＢＫ１がリン酸化されると、転写因子であるＩＲＦ３をリン酸化することで、ＩＲＦ３は二量体化して核へと転座し、そこでＩ型ＩＦＮ及び他の自然免疫遺伝子の転写を活性化する。
【００８９】
Ｂ．ＳＴＩＮＧアゴニスト
本明細書で開示されるいくつかの実施形態は、この経路を直接的に活性化するアゴニストであり、限定はされないが、以下に詳細に説明されるＤＭＸＡＡまたは環状ジヌクレオチドまたはそのいずれかの誘導体である。
【００９０】
１．ＤＭＸＡＡ
いくつかの腫瘍マウスモデルにおいて、フラボン酢酸が抗腫瘍効果を有し、腫瘍内において出血性壊死を起こすことが以前に示された。腫瘍の血管におけるその効果により、血管破壊剤（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ）として説明された。しかしながら、血管での効果以外に、いくつかの先天性サイトカイン産生の増加も起こした。
【００９１】
ＶａｄｉｍｅｚａｎまたはＡＳＡ４０４（ＤＭＸＡＡとも呼ばれる）は、癌性の腫瘍への血液供給を攻撃し、腫瘍退縮を起こす腫瘍血管破壊剤（腫瘍ＶＤＡ）である。このフラボン酢酸誘導体［５，６−ジメチルＸＡＡ（キサンテノン−４−酢酸）］は、血管破壊活性を示し、前臨床動物モデルにおいて出血性壊死及び腫瘍退縮を誘導した。免疫媒介及び非免疫媒介効果の両方が当該腫瘍退縮に貢献した。
【００９２】
ＤＭＸＡＡは次の構造を有する。
【化１１】
2016538344.tif 000013
【００９３】
２．環状ジヌクレオチドまたはその誘導体
ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路は、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）により活性化される。環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）は、細菌によって産生される場合があり、または細胞基質ＤＮＡのセンシングに応答した抗原提示細胞によって産生される場合もある。未改変のＣＤＮは、Ｉ型インターフェロン及び他の同時制御遺伝子を誘導し、続いて特異的免疫応答の発達を促進することが示されている。
【００９４】
特定の実施形態では、当該環状ジヌクレオチドには、次の式の化合物のような、改変された環状ジヌクレオチドが含まれていてもよい。
【化１２】
2016538344.tif 000014
【００９５】
当該化合物は、天然に存在しなくてもよく、または化学的に合成されてもよい。さらなる実施形態では、以下に示すように、Ｒ１及びＲ２は、独立に９−プリン、９−アデニン、９−グワニン、９−ヒポキサンチン、９−キサンチン、９−尿酸、または９−イソグアニンであってよい。
【化１３】
2016538344.tif 000015
【００９６】
いくつかの実施形態では、当該化合物は、主にＲｐ，ＲｐまたはＲｐ，Ｓｐ立体異性体、またはそのプロドラッグまたは医薬的に許容可能なその塩の形態で提供されてもよい。いくつかの実施形態では、当該化合物は、主にＲｐ，Ｒｐ立体異性体の形態で提供されてもよい。いくつかの実施形態では、当該化合物は、次式の化合物またはその主にＲｐ，Ｒｐ立体異性体の形態であってもよい。
【化１４】
2016538344.tif 000016
【００９７】
いくつかの実施形態では、当該化合物は、ジチオ−（Ｒｐ，Ｒｐ）−［環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］］（２’−５’、３’−５’混合ホスホジエステル結合（ＭＬ）ＲＲ−Ｓ２  ｃ−ｄｉ−ＡＭＰもしくはＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡとも呼ばれる））、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２−ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ（ＭＬ−ＣＤＧ）、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ｃＧＡＭＰ、またはそれらのいずれかの混合物であってもよい。
【００９８】
Ｃ．医薬組成物及び方法
いくつかの実施形態では、医薬組成物が、対象者に投与される。異なる態様では、対象者に有効量の組成物を投与することが含まれる。いくつかの実施形態では、阻害剤を含む組成物が、癌を処置または腫瘍のサイズを縮小させるために当該対象者または患者に対して投与されてもよい。さらに、そのような化合物は、他の癌治療と組み合わせて投与されてもよい。
【００９９】
組成物は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、または腹腔内経路を介する注入のための製剤化といった、非経口的投与のための製剤化がなされてもよい。典型的には、そのような組成物は、注射剤として調製されてもよく、液状溶液または懸濁液のいずれとしてでもよい。注入前に液体を加えて溶液または懸濁液を調製するための使用に適した固形形態として調製されてもよい。当該調製物は、乳化していてもよい。そのような製剤の調製方法は、本開示により、当業者の知るところとなるであろう。
【０１００】
注入使用に適した当該医薬形態には、滅菌水溶液または分散液と、ゴマ油、ピーナッツ油、または水溶性プロピレングリコールを含む製剤と、滅菌注射用溶液または分散液の即時調製用滅菌粉末とが含まれていてもよい。すべての場合において、当該形態は、滅菌されていなくてはならず、容易に注入できる程度に流動的でなくてはならない。同様に、製造及び貯蔵条件下で安定であるべきであり、細菌や真菌といった微生物の汚染活動に対処して保存されなくてはならない。
【０１０１】
当該担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレン、グリコール、及び脂質ポリエチレングリコールなど）、適したその混合物、及び野菜油を含む溶液または分散媒体であってもよい。例えば、レシチンといったものをコーティングしたり、分散液の場合は、必要な粒子径を維持したり、界面活性剤を使用したりすることで、適した流動性は、維持することができる。例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどといった様々な抗細菌及び抗真菌剤を使用することによって、微生物活動は阻止できる。多くの場合、例えば、糖または塩化ナトリウムといった等張剤を含むことが好ましい。例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンといった吸収遅延剤の組成物を使用することで、注射用組成物の吸収を延長させることが可能になる。
【０１０２】
注射用滅菌溶液は、必要に応じて先に列挙した様々な他の成分を含む適切な溶媒に必要量の活性剤を加えて調製され、その後、ろ過滅菌される。一般に分散液は、基礎的な分散媒体及び先に列挙した成分から必要となる他の成分を含む滅菌媒体へ様々な滅菌活性成分を加えることで調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合は、活性成分の粉末に加えて、事前にろ過滅菌されたその溶液由来の何らかの付加的な望ましい成分を与える減圧乾燥及び凍結乾燥技術が調製方法として好ましい。
【０１０３】
本明細書の用語「医薬的に許容可能な」は、健全な医学的判断の範囲内で、過剰毒性、刺激、アレルギー反応、もしくは妥当な利点／危険の比率に応じた他の問題となる合併症無しで、ヒト及び動物の組織に接触する上で適した化合物、材料、組成物、及び／または投与量形態を意味する。用語「医薬的に許容可能な担体」は、化学的薬剤の運搬や移送に関する液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶剤、またはカプセル化材料といった、医薬的に許容可能な材料、組成物、または媒体を意味する。
【０１０４】
本明細書の用語「医薬的に許容可能な塩」は、開示化合物の誘導体を意味し、当該親化合物は、存在する酸または塩基部分をその塩の形態へと変換することで改変される。医薬的に許容可能な塩の例には、限定はされないが、アミンといった塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩、カルボン酸といった酸性残基のアルカリまたは有機塩、及び同様のものが含まれる。医薬的に許容可能な塩には、例えば、非毒性無機または有機酸から形成される親化合物の通常の非毒性塩または四級アンモニウム塩が含まれる。当該医薬的に許容可能な塩は、塩基または酸性部分を有する親化合物から、通常の化学的な方法で合成することができる。
【０１０５】
当該対象者の状態に基づき、投与量を幾分か変更する必要も生じるであろう。投与の責任者が、何らかの事象において、個々の対象者向けの適切な投与量を決定するであろう。治療用または予防用組成物の有効量は、意図される目的に基づき決定される。用語「単位用量」または「投与量」は、対象者において使用するために適した物理的に別々の単位を意味し、それぞれの単位には、その投与、すなわち適した経路及びレジメン、に関して、先に説明した望ましい応答を与えるために計算された所定量の当該組成物が含まれる。当該投与量は、所望の効果に基づき、処置の回数及び単位用量の両方に従って、投与されることになる。当該組成物の詳細な量は、実施者の判断にも基づくものであり、それぞれの個人に特有である。用量に影響する要因には、当該対象者の身体的及び臨床的状態、投与経路、意図される処置の目標（治癒に対する症状の緩和）、及び効力、ならびに特定の組成物の安定性及び毒性が含まれる。
【０１０６】
製剤に関して、溶液は、投与量の製剤と適合する様式で、治療または予防的に有効となる量で投与されるであろう。当該製剤は、先に説明した注射用溶液の種類といった、様々な投与量形態で容易に投与される。
【０１０７】
典型的には、ヒトの成人（体重約７０キログラム）向けに、約０．１ｍｇ〜約３０００ｍｇ（この範囲の間に入るすべての値及び範囲を含む）、約５ｍｇ〜約１０００ｍｇ（この範囲の間に入るすべての値及び範囲を含む）、または約１０〜１００ｍｇ（この範囲の間に入るすべての値及び範囲を含む）の化合物が投与される。これらの投与量範囲は、例示のみが目的であり、当業者が知る要因に基づき、投与は調製可能であると理解される。
【０１０８】
ある実施形態では、対象者は約、少なくとも約、または最大で約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０．０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４１０、４２０、４２５、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４７５、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５２５、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５７５、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６２５、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６７５、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７２５、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７７５、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８２５、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８７５、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９２５、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９７５、９８０、９９０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００ミリグラム（ｍｇ）またはマイクログラム（ｍｃｇ）またはμｇ／ｋｇまたはマイクログラム／ｋｇ／分またはｍｇ／ｋｇ／分またはマイクログラム／ｋｇ／時またはｍｇ／ｋｇ／時、またはその中で導き出せる何らかの範囲で投与される。特定の実施形態では、阻害剤であるイピリムマブが５０ｍｇ／１０ｍＬ（５ｍｇ／ｍＬ）で投与される。特定の実施形態では、阻害剤であるイピリムマブが２００ｍｇ／４０ｍＬ（５ｍｇ／ｍＬ）で投与される。
【０１０９】
用量は、必要に応じて、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、もしくは２４時間毎（もしくはその中で導き出せる何らかの範囲）または１日に１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは回（もしくはその中で導き出せる何らかの範囲）投与されてもよい。用量の最初の投与は、感染の徴候を患者が示すもしくは感じる前もしくは後、または臨床医が、当該患者が感染していると診断した後であってもよい。いくつかの実施形態では、当該患者が感染の徴候または症状を経験または示してから、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２時間（もしくはその中で導き出せる何らかの範囲）後または１、２、３、４、もしくは５日（もしくはその中で導き出せる何らかの範囲）後にレジメンの最初の用量が当該患者に投与される。当該患者は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日、もしくはそれを超える日数（もしくはその中で導き出せる何らかの範囲）、あるいは感染の症状が消失もしくは軽減されるまで、あるいは感染の症状が消失もしくは軽減してから６、１２、１８、もしくは２４時間、または１、２、３、４、もしくは５日間処置されてもよい。特定のいくつかの実施形態では、阻害剤であるイピリムマブが３週間毎に投与される。
【０１１０】
本明細書記載の「腫瘍」は、悪性または良性を問わず、すべての腫瘍性の細胞の成長及び増殖、ならびに前癌性及び癌性細胞、及び組織を意味する。用語「癌（ｃａｎｃｅｒ）」、「癌性の」、「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」、及び「腫瘍」は、本明細書では相互に排他的ではない。
【０１１１】
処置可能な癌には、限定はされないが、メラノーマ、癌（Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、リンパ種、芽腫、肉腫、及び白血病またはリンパ性悪性疾患が含まれる。そのような癌のより具体的な例には、乳癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、腎臓または腎癌、及び明細胞癌と、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌を含む肺癌と、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒ）（例えば、扁平上皮癌（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒ））、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、前立腺腫瘍、肝癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌、腹膜癌、及び肝細胞癌と、消化器癌を含む胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）または胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）と、消化管間質腫瘍、脾癌、頭部及び頭頸部癌、膠芽腫、網膜芽細胞腫、星細胞腫、莢膜細胞腫、卵巣男性胚腫、及び肝細胞腫（ｈｅｐａｔｏｍａ）と、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫、骨髄異形性症候群、骨髄増殖性疾患、慢性骨髄性白血病、及び急性血液悪性腫瘍を含む血液悪性腫瘍と、子宮内膜または子宮癌、子宮内膜症、子宮内膜間質肉腫、繊維肉腫、絨毛癌、唾液腺癌、外陰部癌、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ  ｃａｎｃｅｒ）、食道癌、肝癌（ｈｅｐａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肛門癌、陰茎癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、カポジ肉腫、マスト細胞肉腫、卵巣肉腫、子宮肉腫、メラノーマ、悪性中皮腫、皮膚癌、シュワン細胞腫、乏突起神経膠腫、神経芽細胞腫、神経外胚葉性腫瘍、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、ユーイング肉腫、末梢性未分化神経外胚葉性腫瘍、尿路癌、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）、腎芽細胞腫、ならびに母斑症に関連した血管増殖、（脳腫瘍関連といった）浮腫、及びメイグス症候群に関連する異常血管増殖とが、含まれる。場合によっては、当該癌は、メラノーマである。処置が可能な癌性の状態には、転移性癌が含まれる。本明細書で使用される「処置」は、処置される個人または細胞の自然経過を変更しようとする臨床的介入であり、予防または臨床病理経過の間のどちらにおいて実施されてもよい。処置の望ましい効果には、病気の発生または再発の阻止、症状の緩和、何らかの直接的または非直接的な病気の病理学的結果の軽減、病気の進行率の軽減、病態の寛解または緩和、ならびに予後の寛解または好転が含まれる。いくつかの実施形態では、当該組成物は、病気または疾患発生を遅延させるために使用される。非制限例では、当該組成物は、腫瘍の成長率または癌の転移リスクを軽減するために使用されてもよい。
【０１１２】
本明細書で使用される「処置」は、処置される個人または細胞の自然経過を変更しようとする臨床的介入であり、予防または臨床病理経過の間のどちらにおいて実施されてもよい。処置の望ましい効果には、病気の発生または再発の阻止、症状の緩和、何らかの直接的または非直接的な病気の病理学的結果の軽減、病気の進行率の軽減、病態の寛解または緩和、ならびに予後の寛解または好転が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、病気または疾患発生を遅延させるために使用される。非制限例では、当該組成物は、腫瘍の成長率または癌の転移リスクを軽減するために使用されてもよい。
【０１１３】
本明細書で開示される組成物は、治療において単独または他の組成物と組み合わせて使用されてもよい。例えば、組成物は、化学療法の薬剤（化学療法の薬剤の混合組成物を含む）、他の細胞毒性薬、抗血管新生薬、サイトカイン、血栓剤、及び／または成長阻害剤と同時投与されてもよい。先に説明したそのような組み合わせ療法には、組み合わせ投与（同一または別々の製剤に複数の薬剤が含まれている場合）、及び別々の投与が含まれ、いずれの場合においても、当該抗体の投与は、１つまたは複数の当該補助療法の実施の前及び／または後であってもよい。
【０１１４】
組み合わせ療法は、両方の薬剤を含む医薬組成物の単回投与での使用、または二つの異なる組成物の同時投与によって達成されてもよく、一つの組成物は当該抗体を含み、残りの組成物には、第二の薬剤が含まれる。
【０１１５】
二つの当該治療は、どちらを先に実施してもよく、数分から数週間の間隔でもう一方の処置の先または後に実施してもよい。もう一方の薬剤が別々に適用される実施形態では、当該患者において当該薬剤が有利に組み合わせ効果を依然として発揮できるよう、１つが、一般に、それぞれの投与期間の間で長期間経過しないことを確実にすることになる。そのような例では、１つが、双方の様式をお互いに約１２〜２４時間以内、さらに、より好ましくは、お互いに約６〜１２時間以内に実施してもよいことが企図される。場合によっては、治療期間を大幅に延長することが望ましいかもしれないが、その場合は、それぞれの治療の実施間の数日間（２、３、４、５、６または７日）〜数週間（１、２、３、４、５、６、７または８週）あける。
【０１１６】
当該組成物は、本明細書で説明される病気または疾患のいずれかといった血管増殖に関係する病気または疾患の処置のために、放射線療法、外科療法、免疫療法（具体的には放射免疫療法）、遺伝子療法、または当業者に知られる何らかの他の治療と組み合わせて投与されてもよい。
【実施例】
【０１１７】
次の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために記載される。次の実施例中で開示される技術によって、発明者によって発見された技術が、本発明の実施にあたり、よく機能するよう説明され、したがって、その実施のための好ましい形態を構成するものである考えられることを当業者においては認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示を踏まえて、本開示の範囲で、開示される特定の実施例において多くの変更が可能であると共に、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、依然として同様または類似の結果を得られることを認識されるべきである。
【０１１８】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、開示の発明が属する分野で当業者により一般的に理解されるのと同様の意味を有する。本明細書で引用される出版物及び材料は、参照により具体的に組み込まれる。
【０１１９】
当業者は、所定の実験方法を採用するだけで、本発明の具体的な実施例と同等の多くのものを認識または明らかにすることができるであろう。そのような同等のものも特許請求の範囲により含まれることが意図される。
【０１２０】
実施例１
材料及び方法
マウス及び細胞
Ｃ５７ＢＬ/６、１２９、ＭｙＤ８８−/−、Ｔｒｉｆ−/−、Ｐ２Ｘ７Ｒ−/−、ＩＰＳ−１−/−、ＴＬＲ４−/−、ＴＬＲ９−/−、Ｔｍｅｍ１７３−/−（ＳＴＩＮＧ欠損）、Ｉｒｆ３−/−、及び２Ｃ  ＴＣＲ  Ｔｇマウスを使用した。Ｃ５７ＢＬ６由来メラノーマ細胞株Ｂ１６．Ｆ１０．ＳＩＹ（以後Ｂ１６．ＳＩＹと記載）を使用した（Ｆｕｅｒｔｅｓ，ｅｔ  ａｌ．２０１１）。すべての細胞は、熱非働化ＦＣＳを１０％含む完全ＤＭＥＭ培地で培養した。Ｉ型インターフェロンレポーター活性の測定のために、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎからＢ１６−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＦＮ−α／βレポーター細胞を購入し、製造者の指示書に従い維持管理した。
【０１２１】
２Ｃ  ＣＤ８＋Ｔ細胞精製、ＣＦＳＥ染色及び養子移入
２Ｃ  ＴＣＲ  Ｔｇ  ＣＤ８＋Ｔ細胞は、磁気ビーズを使用して２Ｃ／ＲＡＧ２−／−マウスの脾臓及びリンパ節より単離した。Ｔ細胞に２．５ｍＭのＣＦＳＥを負荷し、ＷＴまたは指定の遺伝子を標的とするマウスへ移植した（４×１０６個の細胞／マウス）。１日後、レシピエントマウスに１０６個のＢ１６．ＳＩＹ細胞を接種し、５日後にレシピエントマウス由来の脾細胞を、抗マウスＣＤ８α−ＡＰＣ、及びビオチン標識抗２Ｃ−ＴＣＲ（１Ｂ２）を使用して染色後に、ＣＦＳＥ希釈を評価するためにＳＡ−ＰＥを用いてフローサイトメトリーで分析した。
【０１２２】
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ及びペンタマー染色
脾細胞を１０６個の細胞／ウェルでプレートに蒔き、ＳＩＹペプチド（８０ｎＭ）または陽性対照としてイオノマイシン（０．５μＭ）を含むＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）で一晩刺激した。ＢＤマウスＩＦＮ−γキットを使用してスポットを発生させ、スポット数をＩｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  Ｓｅｒｉｅｓ  ３  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して測定し、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔソフトウェア（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ）を使用して解析した。ペンタマー染色のために、細胞は、ＳＩＹＲＹＹＧＬ（ＳＩＹ）ペプチドに複合体化しているマウスＨ−２ＫｂからなるＰＥ−ＭＨＣクラスＩペンタマー（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ）、抗ＣＤ８−ＡＰＣ（５３−６．７）、抗ＣＤ１９−ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５（６Ｄ５）、及び抗ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＲＭ４−５）を使用して標識化した。染色した細胞は、ＦＡＣＳｃａｎｔｏまたはＬＳＲＩＩサイトメーターを使用して、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ）で分析した。データ解析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）で実施した。
【０１２３】
試験管内での潜在的ＩＦＮ−β誘導のためのＢ１６メラノーマ抽出物の調製
Ｂ１６メラノーマ由来の抽出物を得るために、培養腫瘍細胞をスタウロスポリン（０．５μＭ）で４時間処理、または照射（１５，０００ラド）、または熱死滅のために５５℃で１時間インキュベート、またはシリンジもしくは針を１０回通過させる物理的死滅処理、または液体窒素及び３７℃の水浴を使用して凍結／解凍サイクル処理を３回実施した。腫瘍由来のゲノムＤＮＡを単離するために、Ｂ１６腫瘍細胞をＤＭＥＭで洗浄し、ＤＮＡをＢｌｏｏｄ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＤＮＡ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。ミトコンドリアＤＮＡを単離するために、Ｂ１０メラノーマ細胞からＱｐｒｏｔｅｏｍｅ（商標）  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してミトコンドリアを単離し、ミトコンドリアＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。ＤＮＡの濃度／純度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で決定した。それぞれの細胞抽出物は、ＢＭ−ＤＣへ添加し、３７℃で１８時間インキュベートし、ＥＬＩＳＡでＩＦＮ−β量を測定した。
【０１２４】
試験菅内でのＩＦＮ−β測定
ＩＦＮ−βレポーター細胞株を、９６ウェルプレートで培養し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（０．７５μｌ／ウェル）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む腫瘍由来のＤＮＡ（２０ｎｇ／ウェル）で１８時間刺激した。骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）は、骨髄細胞をｒｍＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の存在下で９日培養して生成させた後、腫瘍由来のＤＮＡ（２０ｎｇ／ウェル）で７時間刺激した。インキュベーション後、上清を回収し、ＩＦＮ−βをＥＬＩＳＡ（ＰＢＬ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ）で、レポーター細胞株の場合は、基質（ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を添加して測定した。
【０１２５】
ウエスタンブロット及びＳｉＲＮＡ媒介性インターフェロン
ＷＴまたはＳＴＩＮＧノックアウトＢＭ−ＤＣを１μｇ／ｍｌの腫瘍由来のＤＮＡで１、３または６時間刺激した。タンパク質は、プロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ）を含むＴｒｉｔｏｎ−Ｘ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、ｐＨ８．０）を使用して抽出した。３０μｇのタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で電気泳動し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上へ転写した。ブロットは、リン酸化ＴＢＫ１（Ｓｅｒ１７２）、リン酸化ＩＲＦ３（Ｓｅｒ３９６）、全ＴＢＫ１、及び全ＩＲＦ３に特異的な抗体と共にインキュベートした（抗全ＩＲＦ３抗体のみＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより、残りのすべての抗体はＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇより入手）。抗ウサギＩＲＤｙｅ６８０ＲＤ標識二次抗体をＯｄｙｓｓｅｙ  Ｓｃａｎ（Ｌｉｃｏｒ）でのバンドの可視化のために使用し、それぞれのバンドの濃度測定は、Ｌｉ−ｃｏｒソフトウェアを使用して計算し、実施した。
【０１２６】
ＳＴＩＮＧ及びＩＲＦ３用のｓｉＲＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ  ｓｉＲＮＡ）。ＩＦＮ−βレポーター細胞は、９６ウェルプレートでウェルあたり５×１０４個の細胞の密度で培養した後、マウスＩＲＦ−３（センス鎖：５’−ＧＧＡＡＡＧＡＡＧＵＧＵＵＧＣＧＧＵＵｔｔ−３’［配列番号１］）、マウスＳＴＩＮＧ（センス鎖：５’-ＧＧＡＵＣＣＧＡＡＵＧＵＵＣＡＡＵＣＡｔｔ-３’［配列番号２］）を標的とするｓｉＲＮＡでＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅの存在下でトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡトランスフェクションは、２４時間実施し、インキュベーション後に全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。ｃＤＮＡは、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標））を使用して合成し、それぞれの遺伝子のノックダウンを以下の特異的プライマー／プローブを使用して定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。マウスＳＴＩＮＧ（フォワード  ５’−ＡＡＣＡＣＣＧＧＴＣＴＡＧＧＡＡＧＣＡＧ−３’（配列番号３）、リバース  ５’−ＣＡＴＡＴＴＴＧＧＡＧＣＧＧＴＧＡＣＣＴ−３’（配列番号４）及びプローブ  ５’−ＣＡＴＣＣＡＧＣ−３’）（配列番号５）、マウスＩＲＦ−３（フォワード  ５’−ＣＡＡＧＡＧＧＣＴＴＧＴＧＡＴＧＧＴＣＡ−３’（配列番号６）、リバース  ５’−ＧＣＡＡＧＴＣＣＡＣＧＧＴＴＴＴＣＡＧＴ−３’（配列番号７）及びプローブ  ５’−ＡＧＧＡＧＣＴＧ−３’（配列番号８））。ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞は、腫瘍由来のＤＮＡで刺激し、ＩＦＮ−β量は、先に説明したように測定した。ＷＴマクロファージは、ウェルあたり５×１０４個の細胞の密度で、９６ウェルプレートで培養し、マウスｃＧＡＳを標的とする１０ｎＭのｓｉＲＮＡ（センス鎖：５’−ＧＡＵＵＵＣＵＧＣＵＣＣＵＡＡＵＧＡＡｔｔ−３’（配列番号９）、アンチセンス鎖：３’−ＵＵＣＡＵＵＡＧＧＡＧＣＡＧＡＡＡＵＣｔｔ−５’（配列番号１０））、またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸと複合体化したスクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡトランスフェクションは、４８時間実施し、全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。ｃＤＮＡは、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標））を使用して合成し、ｃＧＡＳのノックダウンは、特異的プライマー／プローブセット（マウスｃＧＡＳ――フォワード：５’−  ＧＡＡ  ＴＣＴ  ＴＣＣ  ＧＧＡ  ＧＣＡ  ＡＡＡ  ＴＧ−３’（配列番号１１）、リバース：３’−ＧＧＣ  ＡＧＴ  ＴＴＴ  ＣＡＣ  ＡＴＧ  ＧＴＡ  ＧＧＡ−５’  （配列番号１２）及びプローブ：５’−ＣＡＴＣＣＡＧＣ−３’（配列番号１３））を使用して定量ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞は、ウェルあたり２０または２００ｎｇの腫瘍細胞由来ＤＮＡで刺激した。１２時間後、上清を回収し、ＩＦＮ−β量をＥＬＩＳＡ（ＰＢＬ  Ｉｎｔｅ��ｆｅｒｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ）で評価した。ＩＦＮ−βの転写産物アッセイのために、それぞれの腫瘍細胞を、マウスへ注入し、ＣＤ４５＋細胞をセルソーティングで回収した。Ｑ−ＰＣＲ分析は、先に説明したとおり実施した。
【０１２７】
樹状細胞のサイトカイン及びマイクロアレイ分析
ＢＭＤＣは、先に説明したとおり、ＷＴまたはＳＴＩＮＧ−／−マウスから生成させた。腫瘍細胞由来のＤＮＡで７時間刺激後、上清を回収し、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、及びＴＮＦ−αの量をＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で測定した。腫瘍由来のＤＮＡで刺激したＢＭＤＣは溶解し、全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。単離したＲＮＡは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ分析を実施するためにシカゴ大学のＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｆａｃｉｌｉｔｙへ提出した。ＲＮＡの完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）はＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で評価し、ＲＮＡの濃度／純度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で決定した。マイクロアレイ分析に使用した全てのＲＮＡサンプルは、ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒは８．０より大きく、ＯＤ２６０／２８０及びＯＤ２６０／２３０比は１．８より大きかった。アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４３０  ２．０＿  は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｅ  Ｃｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００  ７Ｇ及びＣＥＬでスキャンした。強度ファイルは、Ｇｅｎｅ  Ｃｈｉｐ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ．１．４（ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  ５．０）により得た。マイクロアレイデータの解析には、ｄＣｈｉｐソフトウェアを使用した。ｄＣｈｉｐソフトウェアを使用し、「存在せず（ａｂｓｅｎｔ）」と点数付けされるか、またはシグナル強度が１００未満の遺伝子は、最初に除いた。遺伝子発現量の倍率変化は、ＷＴまたはＳＴＩＮＧ−／−腫瘍由来のＤＮＡをトランスフェクトしたＢＭＤＣの遺伝子シグナル強度値を培地処理したＷＴ  ＢＭＤＣのそれで除算することで計算した。
【０１２８】
皮膚移植
皮膚移植は、以前に説明したとおり実施した（Ｍｏｌｉｎｅｒｏ，ｅｔ  ａｌ．，２００８）。簡潔には、ドナー側腹部の全層皮膚片（０．５〜１ｃｍ２）は、レシピエントの側腹部上に調製した移植母床へ配置した。移植片の完全壊死を拒絶時点であると定義した。
【０１２９】
ＩＦＮ−βのＰＣＲ及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析
ヒトメラノーマ６２４腫瘍細胞をＤＲＡＱ５（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）で染色し、マウスの皮下へ接種した。一晩の後、腫瘍細胞を単離し、単一細胞懸濁液を調製した。抗マウスＣＤ４５−ＰＥ（３０−Ｆ１１）の後に、ＣＤ１１ｃ−Ｐｅｒｃｐ−Ｃｙ５．５（Ｎ４１８）及び抗ヒトＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ−ＡＦ  ４８８（Ｗ６／３２）を染色に使用した。ＤＡＰＩ染色により、生存細胞をゲートした後、ＣＤ４５−ＰＥ及びＣＤ１１ｃ−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５５陽性細胞を、シカゴ大学のＦｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩ（ＢＤ）を使用してセルソーティングにより回収した。全ＤＮＡを、Ａｌｌ  Ｐｒｅｐ（登録商標）ＤＮＡ/ＲＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で単離し、ＤＮＡ濃度はＮＤ−１００分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）で測定した。ＰＣＲプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ−ＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩ）でデザインした。ＰＣＲ反応混合液は、Ｍａｘｉｍａ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して調製し、ＰＴＣ−２００  Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  （ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して実施した。ＰＣＲ産物は、１．５％アガロースゲルで泳動させ、ＥｔＢｒで可視化した。ゲル画像は、紫外トランスイルミネーター（Ｋｏｄａｋ）を使用して取得した。ＩＦＮ−βのＲＴ−ＰＣＲ解析のためにＢ１６．ＳＩＹメラノーマ細胞をマウスへ接種した（群あたり５匹のマウス）。単一細胞懸濁液は、先に説明したとおり調製し、抗マウスＣＤ４５−ＰＥ（３０−Ｆ１１）、抗マウスＣＤ１１ｂ−ＰａｃＢｌｕｅ（Ｍ１/７０）、及び抗マウスＣＤ１１ｃ−ＰＥｃｙ７（Ｎ４１８）抗体で染色した。染色した細胞は、ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩＩ（ＢＤ）を使用してセルソーティングにより回収した。全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。ｃＤＮＡはＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標））を使用して合成した。Ｑ−ＰＣＲ反応は、ＴａｇＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａ＆Ｂ）及び７３００  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ａ＆Ｂ）を使用して実施した。
【０１３０】
ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ分析
回収した細胞は、コラゲナーゼ（５０単位/ｍｌ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と共に３７℃で２時間インキュベートした。腫瘍由来細胞の単一懸濁液は、シリンジプランジャー及び細胞ストレーナーを使用して、均質化することで調製した。抗体染色の後、単一細胞画像は、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍｘＭａｒｋ  ＩＩ（Ａｍｎｉｓ）で取得した。収集データは、ＩＤＥＡＳ５．０ソフトウェア（Ａｍｎｉｓ）で解析した。１回染色の対照細胞を、補正のために使用した。単一細胞はエリアとアスペクト比で、フォーカスされた細胞は、Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ＲＭＳの特性で細胞をゲートした。ＤＲＡＱ５取り込みアッセイのために、Ｂ１６メラノーマ細胞をＤＲＡＱ５（５μＭ）と共に１５分間インキュベートした。ＰＢＳで十分洗浄した後、染色した腫瘍細胞をマウスの皮下に接種した。翌日、腫瘍の突起部を回収して、腫瘍由来の細胞を単離し、先に説明したとおり単一細胞懸濁液を調製した。細胞は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｄｅａｄ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗マウスＣＤ４５−ＰＥＣｙ５（３０−Ｆ１１）、及びＣＤ１１ｃ−ＰＥＣｙ７（Ｎ４１８）で染色した後、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍｘＭａｒｋＩＩ（Ａｍｎｉｓ）で解析した。ＥＤｕの実験のために、Ｂ１６メラノーマまたは１９６９肉腫細胞をＥｄｕ（１０μＭ）と共に一夜完全ＤＭＥＭ培地でインキュベートした。十分洗浄した後、腫瘍細胞は、ＤＲＡＱ５または、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ  ＣＭＦＤＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、マウスへ接種した。翌日、腫瘍隆起部を回収し、先に説明したとおり、単一細胞懸濁液を調製し、抗マウスＣＤ４５−ＰＥＣｙ５及びＣＤ１１ｃ−ＰＥＣｙ７で染色した。Ｅｄｕ検出（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７のいずれか）は、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（登録商標）ＥｄＵ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｋｉｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して実施した。非標識腫瘍細胞は、同様の染色手順をとおして、陰性対照として使用した。ｐＩＲＦ３染色のために、腫瘍単一細胞懸濁液は、ＬＩＶＥ/ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｄｅａｄ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｉｎ、抗マウスＣＤ４５−ＰＥＣｙ５、ＣＤ１１ｃ−ＰＥＣｙ７で染色し、Ｆｏｘｐ３  Ｆｉｘａｔｉｏｎ/Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で透過処理した。Ｎｏｒｍａｌ  Ｍｏｕｓｅ  Ｓｅｒｕｍでブロッキングした後、細胞は、ｐＩＲＦ３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、  カタログ番号４９４７）で染色し、その後に抗ウサギＩｇＧ−ＰＥ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。核染色のために、染色細胞は、ＮｕｃＢｌｕｅ（商標）Ｆｉｘｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に５分間インキュベートした。ｐＴＢＫ１染色は、ｐＴＢＫ１特異的抗体（ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号５４８３）を使用した以外は、先と同様の手順を使用した
【０１３１】
統計解析
スチューデントｔ検定を統計解析に使用した。Ｐ値が０．０５未満を統計的に有意であるとした。
【０１３２】
実施例２
生体内における腫瘍に対する自発的Ｔ細胞活性化には、ＳＴＩＮＧ及びＩＲＦ３が必要である
発明者らは、宿主において、自然免疫センシング経路が腫瘍由来因子を検出し、Ｉ型ＩＦＮ産生を誘導し、及び腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のクロスプライミングを導出する可能性のある実用モデルを追及した（Ｆｕｅｒｔｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｄｉａｍｏｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。自然抗腫瘍Ｔ細胞応答のための宿主必要要件の解明を始めるため、特定経路の遺伝子標的欠損マウスを利用した。宿主Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）経路が自発的ＣＤ８＋Ｔ細胞プライミングに必要であるか確定するために、発明者らは、ＭｙＤ８８−/−またはＴＲＩＦ−/−マウスを利用した。ＭｙＤ８８は、Ｔ細胞固有的に機能し得るので（Ｚｈｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，２００９）、発明者らは、野生型ＣＦＳＥ標識２Ｃ  ＴＣＲ  Ｔｇ  Ｔ細胞（モデル抗原ＳＩＹに特異的）のＷＴまたはＭｙＤ８８−／−マウスへの養子移入を実施し、Ｂ１６．ＳＩＹ腫瘍で負荷した（Ｚｈｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ＭｙＤ８８−/−において、Ｔ細胞増殖及び分裂細胞の蓄積は損なわれていなかった（図１ａ）。同様に、ＴＲＩＦ−／−マウスにおいて、腫瘍由来ＳＩＹに対する内因性ＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングに変化はなかった（図１ｂ）。これは、生体内において抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞の自発的プライミングには、ＴＬＲシステムが必須ではないことを示唆している。（Ｓｔｅｔｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｉｓｈｉｉ，ｅｔ  ａｌ．，２００６）発明者らは、ＴＬＲ４またはＴＬＲ９を特異的に欠損しているマウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞応答も調べたが、ＩＦＮ−γ、ＥＬＩＳＰＯＴ（図１ｃ、ｄ）またはＳＩＹペプチド／Ｋｂペンタマー染色のいずれを使用した場合でも、欠損は観察されなかった（図７）。死滅中の腫瘍細胞はＡＴＰを放出する可能性があり、放出ＡＴＰは、ＡＰＣ上のＰ２Ｘ７Ｒによって感知され得ることが示されたように（Ｇｈｉｒｉｎｇｈｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，２００９）、自然免疫センシングメカニズムの第二の候補は、細胞外ＡＴＰを介するものである。しかしながら、発明者らは、Ｐ２Ｘ７Ｒ-/-マウスにおいて、腫瘍関連抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の自発的プライミングが損なわれていないことを発見した（図１ｅ）。発明者らは、定義されたＲＮＡセンシング経路の役割もＭＡＶＳ-/-マウスを使用して調べた。ＭＡＶＳ-/-マウスは、ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５依存性の自然免疫活性化のための重要なアダプター分子を欠損している。しかしながら、ＭＡＶＳ-/-マウスにおいてＣＤ８＋Ｔ細胞プライミングの欠損は観察されなかった（図１ｆ）。
【０１３３】
したがって、発明者らは、Ｉ型ＩＦＮ産生をもたらし得る、自然免疫センシングの残りの定義経路に注目した。それは、ＳＴＩＮＧ経路を介する細胞基質ＤＮＡセンシングである。最近の病原体センシングの研究により、小胞体に存在するＳＴＩＮＧと呼ばれるタンパク質が関わる経路が同定された。ＳＴＩＮＧは、ＩＲＦ３の活性化及びＩＦＮ−βの転写をもたらす（Ｉｓｈｉｋａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＳＴＩＮＧは、ＤＮＡ認識経路でアダプター分子として機能することが示され、最近のデータによって、これは、酵素ｃＧＡＳを介して代謝されたＤＮＡから生成し得る環状ジヌクレオチドの結合を介して間接的に起きることが示されている（Ｗｕ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ａｂｅ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｂｕｒｄｅｔｔｅ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。発明者らは、ＳＴＩＮＧ−/−及びＩＲＦ３−/−マウスの両方を使用して、生体内において、腫瘍関連抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答が実質的に消失することを観察した（図１ｇ、ｈ）。これらのデータは、宿主細胞においてＳＴＩＮＧ及びＩＲＦ３が腫瘍に対する自発的なＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミング応答に必要であることを示している。
【０１３４】
実施例３
腫瘍由来のＤＮＡは、ＳＴＩＮＧ及びＩＲＦ−３依存経路によるＩＦＮ−Ｂ産生を誘導する
発明者らは、どのような調製物がＤＣｓからＩＦＮ−βを誘導し得る可能性があるのか確定するために、Ｂ１６腫瘍細胞抽出物及び様々な手法を使用して死滅させた腫瘍細胞の分画をスクリーニングする試験管内システムに注目した。物理的破壊を含む様々な方法で死滅させた腫瘍細胞、またはＢ１６の培養に使用した培地の培養上清は、骨髄由来ＤＣによるＩＦＮ−β産生を誘導しなかった（図２ａ）。細胞内のウイルス、細菌、及び熱帯熱マラリア原虫を検出でき、Ｉ型ＩＮＦ産生を起し得る細胞基質ＤＮＡセンシング経路を特徴づけている最近の研究に基づき（Ｕｎｔｅｒｈｏｌｚｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｔａｋａｏｋａ，ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｓｈａｒｍａ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｈｅｎｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，２００７）、発明者らは、腫瘍由来のＤＮＡが同様にはたらくか調べた。実際、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅと組み合わせたＢ１６メラノーマ由来の全ＤＮＡは、ＤＣによるＩＮＦ−β産生を誘発した（図２ａ）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅの添加が必要であったことは、ＤＮＡが細胞基質へ入る必要があったことを示している。腫瘍由来のＤＮＡの調製物をＤＮＡｓｅ  Ｉで処理すると、この刺激効果が消失したことは、この調製物中のＤＮＡが機能本体であるという主張を支持している（データは示されていない）。対照的に、腫瘍由来のＲＮＡは、最小限度の刺激性であった（データは示されていない）。不死化マクロファージ細胞においても、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅと組み合わせた腫瘍由来のＤＮＡは、ＩＦＮ−βの生産を誘導した（図８）。腫瘍由来のＤＮＡに加えて、脾細胞から単離された正常細胞由来のＤＮＡも試験管内において、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅと組み合わせたときにマウスのＢＭＤＣにおいて、ＩＦＮ−βの産生を誘導（図９）したことは、形質転換細胞由来のＤＮＡには、その刺激性を増強するような特有の性質は無いようであることを示している。むしろ、生体内で癌が確立されていく上で、宿主ＡＰＣへのＤＮＡの移行を有利にする腫瘍細胞の状況に特徴がいくつか存在するに違いない。
【０１３５】
ＳＴＩＮＧ経路の活性化を評価するために、発明者らは、ＷＴまたはＳＴＩＮＧ-/-マウスの骨髄由来ＤＣを腫瘍由来のＤＮＡで刺激した後、ＴＢＫ１及びＩＲＦ−３のリン酸化を評価するために、ウエスタンブロット分析を実施した。発明者らは、実際に、ＷＴマウス由来のＤＣにおいてＴＢＫ１及びＩＲＦ３のリン酸化が増加することを観察した。このことは、ＳＴＩＮＧ−／−マウス由来のＤＣでは見られなかったことである。それぞれのタンパク質量は、負荷対照であるＧＡＰＤＨで正規化し、全タンパク質量に対するリン酸化の比率を定量した（ｐＴＢＫ１／ＴＢＫ１：ＷＴ（２．０７６）対ＳＴＩＮＧ−／−（０．７０５）、ｐＩＲＦ３／ＩＲＦ３：ＷＴ（０．３０８）対ＳＴＩＮＧ−／−（０．００９）、ｐ＜０．０５１、ｐ＜０．０００１）（図２ｂ）。ＬＰＳ刺激時のＴＢＫ１及びＩＲＦ３のリン酸化は、ＳＴＩＮＧ−／−のＤＣで保たれていたが（図１０）、このＴＢＫ１及びＩＲＦ３のリン酸化量は、発明者らがＬＰＳ刺激で観察したものと同等であった。並行して、発明者らは、ＮＦκＢ経路の活性化の指標として、ＤＮＡ刺激後にＩＫＫβ及びＩκＢαのリン酸化を測定した。しかしながら、ＬＰＳ刺激と比較して、観察されたＩＫＫβ及びＩＫＢαのリン酸化誘導は、最小限度にすぎず（図１１）、これは、ＮＦκＢ経路の活性化は、腫瘍由来のＤＮＡによって誘導されるＡＰＣ活性化経路の主要な構成要素ではないことを示している。
【０１３６】
ＳＴＩＮＧ経路が腫瘍由来のＤＮＡによるＤＣの活性化に必要であるかを確認するために、発明者らは、ＷＴ、ＳＴＩＮＧ−／−、またはＩＲＦ３−／−マウスの骨髄由来ＤＣをＢ１６由来ＤＮＡで刺激し、ＩＦＮ−βの産生を測定した。実際、ＩＦＮ−β産生は、ＳＴＩＮＧ−／−またはＩＲＦ３−／−  ＤＣにおいて著しく鈍った（図２ｃ、ｄ）。確認手法として、発明者らは、ＩＦＮ−β誘導性のＩＳＧ５４プロモーターにより促進されるＳｅｃｒｅｔｅｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＳＥＡＰ）酵素を発現しているレポーター細胞株を利用した。この系において、ＳＴＩＮＧまたはＩＲＦ３に特異的なｓｉＲＮＡは、腫瘍由来のＤＮＡによる刺激後のＩＦＮ−β誘導性ＩＳＧ５４プロモーター活性の大幅な阻害をもたらした（図２ｅ、ｆ）。これらのデータは、腫瘍由来のＤＮＡが、試験管内でＡＰＣへ取り込まれた際、ＳＴＩＮＧ及びＩＲＦ３に依存するメカニズムを介してＩＦＮ−βの産生を誘導し得ることを示している。
【０１３７】
最近のデータは、ＳＴＩＮＧの最終的な直接のリガンドは、環状ジヌクレオチドであることを示しており、環状ジヌクレオチドは、ＤＮＡが、酵素であるｃＧＡＳによる代謝を受けることにより生成する（Ｗｕ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｓｕｎ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。腫瘍由来のＤＮＡによるＳＴＩＮＧ経路の活性化もこのメカニズムを介して起きているのかを評価するために、発明者らは、試験管内でのマクロファージにおけるｃＧＡＳのｓｉＲＮＡによるノックダウンを利用した。実際、ｃＧＡＳレベルが減少した際、腫瘍ＤＮＡ刺激応答のＩＦＮ−βの産生は顕著に減少することが観察された（図１２）。このことは、ＡＰＣの細胞基質へ取り込まれた腫瘍ＤＮＡがＳＴＩＮＧ経路をｃＧＡＳ依存的に活性化したことを示している。
【０１３８】
実施例４
ＳＴＩＮＧ−／−マウスは、腫瘍の制御が損なわれており、Ｔ細胞の増殖を維持できないことを示す
腫瘍の成長制御での宿主ＳＴＩＮＧ経路の効果を確定するために、発明者らは、いくつかのモデルシステムを利用した。第一に、Ｂ１６メラノーマは、免疫欠損ＲＡＧ−／−マウスと比べて免疫能力のあるＣ５７ＢＬ／６マウスにおいてより遅く成長した。このことは、部分的な腫瘍制御を媒介する宿主免疫に適度な効果が存在することを示す。したがって、発明者らは、同系の野生型、ＳＴＩＮＧ−／−、及びＩＲＦ３−／−マウスにおける腫瘍の成長率を測定した。予測どおり、腫瘍の成長は、ＳＴＩＮＧ−／−、及びＩＲＦ３−／−マウスにおいてより急速であった。対照的に、Ｔｒｉｆ−／−マウスにおいては腫瘍の成長は変化しておらず、抗腫瘍Ｔ細胞の自発的なプライミングにおいてＴＬＲ経路が明確な必要性を欠いていることと一致している（図１３）。発明者らは、免疫原性腫瘍が正常かつ自発的に完全拒絶される条件も探索した。１つの手法として、腫瘍特異的抗原に加え、僅かな組織適合性抗原の違いによっても腫瘍拒絶が可能でありそうな、１２９遺伝子バックグラウンドのＷＴまたはＳＴＩＮＧ−／−マウスへＢ１６．ＳＩＹ腫瘍を移植した。ＷＴマウスにおける拒絶とは対照的に、宿主ＳＴＩＮＧが欠損している場合、腫瘍は進行的に成長した（図３ａ）。この系においてＳＩＹペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答もＳＴＩＮＧ−／−マウスにおいて有意に減少した（図３ｂ）。完全に同系の系を利用するために、発明者らは、１９６９と呼ばれる免疫原性腫瘍を利用した。この腫瘍は、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドの免疫欠損マウスをメチルコラントレンで処理することによって誘発された腫瘍である。この腫瘍も野生型マウスで拒絶されたが、ＳＴＩＮＧ−／−マウスでは拒絶されなかった（図３ｃ）。まとめると、これらのデータは、内因性Ｔ細胞プライミングのような、免疫媒介性の腫瘍制御には、宿主のＳＴＩＮＧ経路が必要であることを示している。
【０１３９】
発明者らは、ＳＴＩＮＧ−／−マウスが、もっぱら細胞基質ＤＮＡセンシングでの影響を介することに基づく、予想されるより、さらに包括的な免疫欠損を示す可能性を懸念した。このために、発明者らは、組織適合性抗原の僅かな違いにおける皮膚移植片拒絶を調べた。皮膚を、雄性マウスＳＴＩＮＧ−／−ドナーから雌性マウスＳＴＩＮＧ−／−レシピエントへ移植したところ、拒絶率は、野生型ドナー及びレシピエントの組み合わせでみられたものと同等であった（図１４）。これらのデータは、組織に基づくすべてのＴ細胞の拒絶過程がＳＴＩＮＧ−／−マウスで欠損しているわけではないことを示し、腫瘍細胞の状況が、宿主Ｔ細胞プライミングをＳＴＩＮＧ経路依存にするという、特有の性質を有していることを立証する。
【０１４０】
生体内において、宿主ＳＴＩＮＧのどんな欠損によるメカニズムが抗腫瘍Ｔ細胞応答の障害をもたらすのかをより詳細に評価するために、発明者らは、ＣＦＳＥ−標識２Ｃ  ＴＣＲ  Ｔｇ  Ｔ細胞をＷＴ及びＳＴＩＮＧ−／−マウスへ養子性に移植し、Ｂ１６．ＳＩＹ負荷の後、ＣＦＳＥ希釈によってＴ細胞の増殖を測定した。興味深いことに、脾臓及びリンパ節で、両レシピエントにおいて同様の数の細胞分裂が観察されたが、ＣＦＳＥ希釈２Ｃ細胞は、ＳＴＩＮＧ−／−マウスにおいて蓄積しなかった（図３ｄ）。これは、非生産的なＴ細胞活性化をもたらす不十分なＴ細胞同時刺激の他の障害モデルでみられたパターンであり、ＳＴＩＮＧ経路は、ＩＦＮ−β産生だけでなく、さらに他のＴ細胞同時刺激因子の発現にも必要である可能性を示している（Ａｂｅ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｈｏｅｂｅ，ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＤＮＡの潜在的な幅広いＤＣ活性特性を評価するために、ＤＣを、ＷＴまたはＳＴＩＮＧ−／−マウスから生成させ、腫瘍由来のＤＮＡで刺激し、遺伝子発現プロファイリングを実施した。実際、腫瘍由来のＤＮＡは、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１２）、ケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ９）、及び同時刺激分子（例えば、ＣＤ４０、図４ａ）を含むＴ細胞活性化のための複数の重要な補助因子をコードする広範囲の遺伝子の発現を誘導した。これらは、ＷＴにおいて誘導されたが、ＳＴＩＮＧ−／−ＤＣでは誘導されなかった。ＥＬＩＳＡにより腫瘍ＤＮＡによるＩＬ−６、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−１２のＳＴＩＮＧ依存的誘導が確認された（図４ｂ〜ｄ）。これらの因子のＤＮＡによる誘導は、ＭｙＤ８８及びＴｒｉｆノックアウトマウスの骨髄由来ＤＣにおいて変化がなかった。このことは、このＤＣ活性化のメカニズムが、ＴＬＲに依存しないことを示している（データは示されていない）。発明者らは、これらの遺伝子のいくつかの誘導は、ＳＴＩＮＧ経路を介して直接的に誘導されるのではなく、むしろ分泌される誘導されたＩ型ＩＦＮに応答して誘導される可能性があると考えた。
【０１４１】
実施例５
腫瘍由来ＤＮＡは、生体内で宿主ＡＰＣへ移行する
ＤＮＡが、生体内においてＳＴＩＮＧ経路の関与を開始する関連のある腫瘍由来材料であるのであれば、腫瘍の微小環境で宿主ＡＰＣ内において腫瘍由来のＤＮＡを検出することが可能なはずである。この可能性を３つの相補的な手法を使用して調べた。第一の手法として、発明者らは、ＤＮＡにインターカレートするＤＲＡＱ５色素を使用して試験管内で腫瘍細胞を染色し、その後、その腫瘍細胞を生体内に移植した。細胞分裂の結果、当該色素が希釈されることを回避するために、発明者らは腫瘍注入から１日後に宿主の炎症性細胞を分析した。早期腫瘍隆起部を回収し、崩壊させ単一細胞懸濁液とした後、サイトメトリーで分析した。融合ヘテロカリオンまたは細胞凝集物ではなく、宿主骨髄性細胞に焦点をあてた分析を確実にするために、Ａｍｎｉｓ  ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ装置を使用した単一細胞分析を利用した。宿主ＤＣは、ＣＤ１１ｃ及びＣＤ４５の染色に基づき分析した。実際、拡散性染色パターンにおいてＣＤ４５＋ＣＤ１１ｃ＋細胞の約６０％が腫瘍由来のＤＲＡＱ５による染色で陽性を示した（図５ａ）。同一の単一細胞懸濁液において、腫瘍細胞は、ＣＤ４５及びＣＤ１１ｃ染色には陰性であったが、ＤＲＡＱ５には陽性であった。このＤＲＡＱ５染色は、正常脾細胞においてはみられず、腫瘍注入マウスから得られた脾細胞の小集団のみで観察された（図５ａ）。試験管内でのトランスウェルシステムを使用し、発明者らは、ＤＲＡＱ５の移行が膜で区切られた非標識細胞において検出されないことを発見した。このことは、ＤＣでの検出は、腫瘍細胞からＤＲＡＱ５色素が漏出した結果ではないことを立証するものであった（データは示されていない）。
【０１４２】
第二の手法として、発明者らは、マウスへの注入前にヌクレオチドアナログであるＥｄＵで腫瘍細胞を標識し、ＥｄＵ染色の単一細胞分析のためにＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍを利用した。非標識腫瘍細胞を陰性対照として使用した。ＤＲＡＱ５と同様に、発明者は、腫瘍浸潤ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｃ＋細胞の大集団がＥｄＵで染色されることを観察した（図５ｂ）。発明者らは、１９６９腫瘍細胞系を使用して、腫瘍由来ＤＮＡが宿主ＡＰＣへ移行することを観察した。このことは、この現象はＢ１６メラノーマ特有ではないことを立証している（図１５）。ＤＲＡＱ５染色と比較し、宿主ＡＰＣにおけるＥｄＵ陽性細胞の割合は、ＤＲＡＱ５陽性細胞のそれより一貫して低かった。この違いは、このストラテジーでは、腫瘍ＤＮＡの１つのサブセットのみがＥｄＵを取り込むからかもしれない。
【０１４３】
第三の手法として、発明者らは、宿主ＤＣに腫瘍由来のＤＮＡが存在するかを調べるために、種特異的ＰＣＲが利用可能なヒト異種移植片モデルを利用した。この手法により、ゲノムＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡのどちらが優位に検出されたかを評価可能であった。ヒトメラノーマ細胞株６２４を皮下に移植し、フローサイトメトリーソーティングの１日後に腫瘍浸潤ＣＤ４５＋細胞を単離した。高純度を確実にするため、ヒトＨＬＡ＋細胞に対して陰性ソーティング、マウスＣＤ４５及びＣＤ１１ｃを発現している細胞に対して陽性ソーティングを実施した。１０，０００のソートされた細胞の再分析から、検出可能なヒトメラノーマ細胞は無かったことが明らかになった（データは示されていない）。ヒトミトコンドリアＤＮＡ（ＡＴＰシンターゼ６）及びゲノムＤＮＡ（ＴＭＥＭ１７３）に特異的なプライマー、同様に対照としてマウスの配列に特異的なプライマー（ｉｆｉ２０４及びＡＴＰシンターゼ６）も使用して、ＰＣＲを実施した。この方法を使用し、発明者らは、ソートしたマウスＡＰＣにおいてヒトミトコンドリアＤＮＡ配列を実際に検出した（図５ｃ）。しかしながら、この手法を使用して、ゲノムＤＮＡは検出されなかった。発明者らは、同様に、こうした高度に精製した宿主ＡＰＣにおいて、２つの他のヒトゲノムＤＮＡ配列（ＡＩＭ２及びＡＴＧ１４、図１６）の存在をＰＣＲで検出できなかった。１０，０００の宿主ＡＰＣ中に混入した１つの腫瘍細胞が検出されるという、万が一の可能性のため、発明者らは、ソートしたＡＰＣの希釈をＰＣＲのウェルあたり１０細胞にまで絞ることで、このアッセイをより厳密なものとした。この手法を使用しても、ミトコンドリアＤＮＡがすべてのサンプルで検出された（図５ｄ）。このことは、それが宿主ＡＰＣ内に実際に存在しており、ヒトの腫瘍細胞の混入によるものではないことを立証している。一方、ゲノムＤＮＡは検出されなかったが、発明者らは、その移行を完全に否定できない。なぜなら、宿主ＡＰＣにおいて、部分分解が起きる可能性があるからである。ミトコンドリアＤＮＡが、それ自体でＩ型ＩＦＮ産生を誘導可能かどうか評価するために、発明者らは、Ｂ１６メラノーマ細胞からミトコンドリア及びゲノムＤＮＡを別々に精製し、ＴＨＰ−１  ＩＳＧレポーター細胞及びＢＭＤＣに導入したときにそれらの両方がＩ型インターフェロン産生を刺激することを発見した（図１７）。総合すると、これらのデータは、腫瘍由来のＤＮＡは、少なくともミトコンドリア源由来のものは、生体内における腫瘍移植後早期に、宿主ＡＰＣにおいて検出可能であり、ＳＴＩＮＧ経路の活性化に十分であろうということを示している。
【０１４４】
実施例６
腫瘍浸潤宿主ＡＰＣ細胞は、生体内において、ＳＴＩＮＧ依存的メカニズムを介してＩＦＮ−βを産生する
宿主ＤＣへのＤＮＡ移行は、生体内において迅速に起きるようであるので、発明者らは、こうした宿主ＡＰＣが同じ時間枠内でＳＴＩＮＧ経路を活性化し、ＩＦＮ−βを産生し得るか調査した。このために、Ｂ１６メラノーマ細胞を皮下に移植し、１日後に腫瘍浸潤ＣＤ４５＋細胞のリン酸−ＩＲＦ３誘導をＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍで分析した。図６ａに示すように、これは、早期時点に合わせたスナップショットであるにもかかわらず、約１０％の腫瘍浸潤ＣＤ４５＋細胞が、核へ転座したと思われるｐＩＲＦ３染色を示した。対照として、同一の単一細胞懸濁液において、腫瘍細胞は、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｃ、及びｐＩＲＦ３染色が陰性であった。脾臓のＣＤ４５＋細胞もｐＩＲＦ３の最小限の染色を示した（図６ａ）。並行して、上流のキナーゼＴＢＫ１の活性化もリン酸化の状態により同様に評価した。ｐＩＲＦ３と類似して、腫瘍微小環境由来のＣＤ１１ｃ＋細胞のサブセットにおいてｐＴＢＫ１が生体外で検出された（図１８）。発明者らは、もしかすると、調べている早期時点は、触知可能な腫瘍における安定した腫瘍微小環境の状況を反映していないのではないかと懸念した。したがって、発明者らは、７日間確立されたＢ１６メラノーマにおいて、ＣＤ１１ｃ＋細胞のｐＩＲＦ３染色を調べた。早期時点と類似して、ＣＤ１１ｃ＋細胞のｐＩＲＦ３染色が、こうしたより大きく確立された腫瘍においても観察された（図１９）。
【０１４５】
ＩＦＮ−βが早期腫瘍浸潤ＡＰＣにより産生されるかどうか評価するために、発明者らは、Ｂ１６．ＳＩＹメラノーマの注入後にフローサイトメトリーでのソーティングにより、腫瘍浸潤ＣＤ４５＋細胞をＷＴまたはＳＴＩＮＧ−／−マウスから単離し、ｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＷＴマウス由来のＣＤ４５＋細胞においては、ＩＦＮ−β転写の有意な誘導が観察されたが、ＳＴＩＮＧ−／−マウス由来のものにおいては、確認されなかった（図６ｂ）。ＩＦＮ−βを産生した亜集団をフローサイトメトリーでのソーティングによってさらに追及して調べたところ、ＣＤ１１ｃのみが陽性またはＣＤ１１ｃ／ＣＤ１１ｂの両方が陽性の細胞は、ＩＦＮ−β産生の主要源であるようだったが、一方、ＣＤ１１ｂのみ陽性の細胞は、主要な産生者ではなかった（図６ｃ）。これらのデータを合わせると、腫瘍の自然免疫センシングは、ＴＢＫ１及びＩＲＦ３のリン酸化を誘導することができ、生体内において、腫瘍微小環境で宿主ＤＣによるＳＴＩＮＧ依存経路を介したＩＦＮ−βの産生をもたらすことが示されている。
【０１４６】
実施例７
ＤＭＸＡＡは、核周辺部位でのＳＴＩＮＧ凝集を促進する
この第一の実験では、発明者らは、ＳＴＩＮＧの活性化について研究するため、単一細胞の分析が可能になる、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ、サイトメーター、及び顕微鏡を使用した。発明者らは、核外の分散パターンを確認した。ＤＭＸＡＡ添加後わずか１５分後に、ＳＴＩＮＧは各周辺部位で凝集した。発明者らは、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍのソフトウェアを使用してＳＴＩＮＧの活性化を定量することができ、約７０％の細胞がこうした凝集を示すのにわずか１５分しか要しなかった。
【０１４７】
ＤＭＸＡＡは、ＳＴＩＮＧ経路を活性化し、Ｉ型ＩＦＮ産生を引き起こす
発明者らは、ＴＢＫ１及びＩＲＦ３のリン酸化ならびにＷＴ及びＳＴＩＮＧマクロファージにおけるＩＦＮ−βの産生を評価することにより、ＳＴＩＮＧ凝集経路の下流も調べた。発明者らは、ＷＴ細胞においてＴＢＫ１及びＩＲＦ３の迅速かつ強力なリン酸化を観察したが、ＳＴＩＮＧ欠損細胞では観察しなかった。これは、ＷＴマクロファージのみにおいて、ＩＦＮ−βの高産生をもたらすということである。産生されたＩＦＮ−β量は、環状ジヌクレオチドでの刺激後の産生量と同等であり、ＤＮＡ刺激により産生された量より多かった。ＷＴまたはＳＴＩＮＧノックアウトマウス由来のＢＭ−ＤＣを使用して、発明者らは、当該経路の同様の強力な活性化及びＩＦＮ−βの高産生を観察した。図２０参照。
【０１４８】
ＤＭＸＡＡによるＢＭ−ＤＣにおけるサイトカインの誘導はＳＴＩＮＧ依存である
ＷＴ  ＡＰＣにより、ＤＭＸＡＡ添加後にＳＴＩＮＧ経路が強く活性化されることが示されたので、発明者らは、こうした細胞が活性化されたかどうか確認が必要であると考えた。ＩＦＮ−β以外に、ＢＭ−ＤＣは、ＴＮＦａ、ＩＬ６、ＩＬ１、ＩＬ１０、及びＩＬ１２といった他のサイトカインもＳＴＩＮＧ依存的にアップレギュレートした。図２１参照。
【０１４９】
ＤＭＸＡＡによるＢＭ−ＤＣでの同時刺激リガンドの誘導は、ＳＴＩＮＧ依存である
さらに、ＷＴ  ＤＣは、ＣＤ４０及びＣ８６といった活性化マーカーもＳＴＩＮＧ依存的にアップレギュレートした。ＳＴＩＮＧ欠損細胞は機能性を示すために、ＬＰＳで刺激した。この場合、ＷＴ細胞との違いはなかった。図２２参照。
【０１５０】
腫瘍内ＤＭＸＡＡは、ＷＴマウスにおけるＢ１６．ＳＩＹ腫瘍の拒絶を引き起こす
ＤＭＸＡＡがメラノーマのマウスモデルにおいて、強力な免疫応答を起こすかどうか確定するために、発明者らは、ＳＩＹペプチドを過剰発現しているＢ１６メラノーマ細胞株をＢ６マウスの側腹部へ注入した。１週間後、腫瘍が体積で約１００〜２００ｍｍ３であるときに、発明者らは、これらのマウスにＤＭＸＡＡまたは生理食塩水を腫瘍内への単回投与処置をし、腫瘍の成長を測定した。ＤＭＸＡＡ処置されたマウスの大部分（８０〜９０％）が腫瘍を拒絶した。図２３参照。同様の結果がヒト分子を使用した試験においても得られた。
【０１５１】
ＤＭＸＡＡは、腫瘍発現ＳＩＹ抗原に対する強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を引き起こす
発明者らは、ＤＭＸＡＡ注入後１週間にＳＩＹ抗原に対する特異的応答も測定した。ＳＩＹ刺激でＩＦＮ−ｇを産生する特異的Ｔ細胞の数をＩＦＮ−ｇ  ＥｌＩＳＰＯＴを使用して測定し、ＤＭＸＡＡ処置された動物において１０倍の増加が観察された。さらに、ＳＩＹのペンタマー染色を使用して、発明者らは、ＤＭＸＡＡ処置した動物の脾臓及び腫瘍内において、ＣＤ８＋ＳＩＹ特異的Ｔ細胞の量が増加していることを観察した。図２４参照。
【０１５２】
ＤＭＸＡＡは、二回目の腫瘍再負荷に対して動物を保護する
腫瘍を拒絶したＤＭＸＡＡ群のすべての動物の内、その大部分が、同様の腫瘍細胞株で再負荷された場合、全く腫瘍を形成しなかった。このことは、それらが、免疫記憶を生成していたことを暗示している。図２５参照。
【０１５３】
ＳＴＩＮＧ−／−及びＲＡＧ−／−マウスでのＤＭＸＡＡによる腫瘍成長制御の欠如
最終的に、発明者らは、ＳＴＩＮＧノックアウトまたはＲＡＧノックアウト動物でＤＭＸＡＡがいくらか効果を有しているかどうか問うた。発明者らが予想したとおり、ＤＭＸＡＡはＳＴＩＮＧ欠損動物において全く効果を有さず、ＤＭＸＡＡは、ＲＡＧノックアウトマウスでは部分的効果を有していた。これは、ＤＭＸＡＡの治療効果において、Ｔ細胞活性化以外の別のメカニズムが関係していることを示している。図２６参照。
【０１５４】
ＤＭＸＡＡは、ＷＴマウスにおいてＢ１６．ＳＩＹ腫瘍の拒絶を引き起こす
図２７参照。
【０１５５】
ＤＭＸＡＡは、ＳＩＹ抗原に対する強力な免疫応答を引き起こす
ＤＭＸＡＡ注入の１週間後に、発明者らは、ＩＦＮ−ｇ  ＥＬＩＳＰＯＴにより、及び脾臓及び腫瘍内のＣＤ８  ＳＩＹ陽性細胞の評価により、ＳＩＹに対する内因性Ｔ細胞応答を測定した。Ｔ細胞応答は、ＤＭＸＡＡ処置した動物において高度に増加した。図２８参照。
【０１５６】
実施例８
マウス腫瘍モデルにおいて癌免疫治療ストラテジーとしてＡｄｕｒｏから環状ジヌクレオチドを研究するための簡単な提唱
動物腫瘍モデル及び生体内注入
８〜１０週齢のＢ６ＷＴマウス（Ｊａｃｋｓｏｎより）の右側腹部皮下に１×１０６個のＢ１６．ＳＩＹ．ｄｓＲｅｄ細胞を含む１００μＬのＰＢＳを注入する。注入の１週間後、腫瘍をノギスで測定し、式［長さ×（幅）２］／２を使用し、体積を計算する。腫瘍のサイズが約１００〜２００ｍｍ３であるときに、７．５％の炭酸水素ナトリウムで再懸濁したＤＭＸＡＡを、体重ｇあたり２５マイクログラムで、マウスの腫瘍内へ単回投与処置する。対照動物には、７．５％の炭酸水素ナトリウム（生理食塩水）を単回注入処置する。比較として、Ａｄｕｒｏから環状ジヌクレオチド化合物がマウスの平行セットにおける腫瘍へ注入されることになるであろう。腫瘍の体積は、先に説明したように当該式を使用して週に２回測定される。
【０１５７】
ＤＭＸＡＡ腫瘍内注入のためのＤＭＸＡＡストックの調製
ＤＭＸＡＡ（Ｖａｄｉｍｅｚａｎ）は、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍから粉末形態で購入する。届いてから、ＤＭＸＡＡは、７．５％の炭酸水素ナトリウムで再懸濁し、最終濃度を６．２５ｍｇ／ｍｌとし、−２０℃で遮光して保存する。
【０１５８】
ＳＩＹ抗原に対する免疫応答の測定
ＤＭＸＡＡまたは生理食塩水でマウスを処置し７日後に、動物をＣＯ２で屠殺し、脾細胞によるＩＦＮ−γの産生を分析するために、脾臓を摘出する。ＢＤより入手したマウスＩＦＮ−γ酵素免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）を製造者のプロトコルに沿って使用する。簡潔には、１０６個の細胞／ウェルで脾細胞を播き、陽性対照としてＳＩＹペプチド（１６０ｎＭ）、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）、及びイオノマイシン（０．５μＭ）、または陰性対照として培地（１０％熱非働化ＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、葉酸、及びＬ−アスパラギンを含むＤＭＥＭ）で一晩刺激する。ＩＦＮ−γのスポットは、ビオチン化抗体及びアビジン−ペルオキシダーゼを使用して検出し、ＡＥＣ基質（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して形成する。プレートは、Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  Ｓｅｒｉｅｓ  ３  Ａｎａｌｙｚｅｒで読み、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔソフトウェア（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ）で解析する。
【０１５９】
脾細胞及び腫瘍浸潤物のテトラマー染色
ＤＭＸＡＡまたは環状ジヌクレオチドでマウスを処置し、７日後に、脾細胞及び腫瘍浸潤物をＳＩＹ／Ｋｂペンタマー染色により検出したＳＩＹ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を分析する。５×１０６個の細胞／サンプルを、ＳＩＹＲＹＹＧＬ（ＳＩＹ）ペプチドまたは陰性対照としてＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ）ペプチドと複合体化しているマウスＨ−２ＫｂからなるＰＥ−ＭＨＣクラスＩテトラマー（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＣｏｕｌｔｅｒまたはＰｒｏｉｍｍｕｎｅ）、抗体ＴＣＲβ−ＡＦ７００（クローンＨ５７−５９７）、抗体ＣＤ８−ＰＯ（クローン５Ｈ１０）、抗ＣＤ４−ＰＢ（クローンＲＭ４−５）、抗ＣＤ６２Ｌ−ＰＥ＿Ｃｙ７（クローンＭＥＬ−１４）、抗ＣＤ４４−ＡＰＣ（クローンＩＭ７）ならびにＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ７８０（ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）で標識する。ＦＡＣＳＣａｎｔｏまたはＬＳＲ  ＩＩサイトメーターを使用してＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ）でＦＡＣＳ分析を実施する。データ分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を使用して実施する。
【０１６０】
実施例９
腫瘍微小環境におけるＳＴＩＮＧの直接活性化は、強力かつ全身性の腫瘍退縮と免疫をもたらす。
結果
ＤＭＸＡＡは、試験管内にてＳＴＩＮＧ経路を刺激する
発明者らは、第一にＤＭＸＡＡがＳＴＩＮＧ経路の機能性アゴニストであるかどうか、試験管内でマウスのマクロファージを使用して評価した。ＳＴＩＮＧ凝集は、ｍＳＴＩＮＧ−ＨＡを発現しているＳＴＩＮＧ−／−マクロファージを使用して評価した。対照マクロファージは、細胞基質において、ＳＴＩＮＧの散在性パターンを示したが、ＤＭＸＡＡと共に１時間インキュベートした後は、約６０％の細胞が、核周辺部位においてＳＴＩＮＧの凝集を示した（図２９ａ）。ＴＢＫ１及びＩＲＦ３の下流リン酸化が観察され、これはＳＴＩＮＧ−／−細胞においては消失していた（図２９ｂ）（Ｃｏｎｌｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。これは、ＳＴＩＮＧの見かけの分子量の増加と相関しており、そのリン酸化によるものであると報告されている（Ｋｏｎｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ｍＳＴＩＮＧ−ＨＡで再構築されたＳＴＩＮＧ−／−マクロファージでは、ＴＢＫ１及びＩＲＦ３のリン酸化が回復していることが示された。ＤＭＸＡＡに応答して、野生型（ＷＴ）からＩＦＮ−β分泌が検出されたが、ＳＴＩＮＧ−／−マクロファージからは検出されなかった（図２９ｃ）。骨髄由来ＤＣ（ＢＭ−ＤＣ）において、ＷＴ対ＳＴＩＮＧ−／−マウスで同様の結果が観察された（図２９ｄ〜ｅ）。発明者らは、こうした細胞を様々なサイトカインの発現を調べるためにも使用した。ＤＭＸＡＡによる刺激後、ＩＦＮ−β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＩＬ１２ｐ３５がＷＴ細胞では誘導されたが、ＳＴＩＮＧ−／−ＢＭ−ＤＣでは誘導されなかった（図２９ｆ）。発明者らは、ＤＭＸＡＡまたはＬＰＳで刺激したＢＭ−ＤＣにおける同時刺激分子の誘導も比較した。ＬＰＳは、ＷＴ及びＳＴＩＮＧ欠損ＤＣの両方でＣＤ４０、ＣＤ８６、及びＭＨＣクラスＩＩを誘導した一方、ＤＭＸＡＡによる誘導は、ＷＴ細胞のみで観察された（図２９ｇ）。まとめると、これらのデータは、ＤＭＸＡＡは、ｍＳＴＩＮＧの強力なアゴニストであり、ＩＦＮ−β及び他の先天性サイトカインの産生とＤＣの活性化をもたらすことを示している。
【０１６１】
ＤＭＸＡＡは、生体内において強力な抗腫瘍免疫を誘導する
ＳＴＩＮＧの刺激が生体内において抗腫瘍免疫を増強するか評価するために、発明者らは、腫瘍抗原を取り込んでいるＡＰＣに活性化を集中させるため、投与において腫瘍内（ＩＴ）経路を選択した。抗原特異的免疫応答を評価するために、発明者は、モデル抗原であるＳＩＹＲＹＹＧＬを発現するよう形質導入されたＢ１６メラノーマ細胞株を利用した（Ｂ１６．ＳＩＹ）（Ｂｌａｎｋ，ｅｔ  ａｌ．，２００４）。Ｂ１６．ＳＩＹ腫瘍細胞をマウスの側腹部へ接種し、７日目にＤＭＸＡＡをＩＴ注入した。１５０〜６２５μｇの範囲の１回用量を調べたのち、ＤＭＸＡＡの５００μｇ用量を選択した。最も高用量である６２５μｇでは、容認不可能な毒性を示している（図３５）。選択された用量によって、すべての動物で強力な腫瘍退縮及び大部分のマウスで完全な腫瘍の拒絶が誘導された（図３０ａ）。処置後５日の脾細胞の分析により、ＳＩＹ特異的ＩＦＮ−γ生産Ｔ細胞頻度の顕著な増加（図３０ｂ）、及びＳＩＹ／Ｋｂペンタマー染色によって検出されたＳＩＹ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞頻度の増加が示された（図３０ｃ）。
【０１６２】
免疫記憶が誘導されたかを確定するために、Ｂ１６．ＳＩＹを拒絶したマウスに最初の接種から６０日後に同一の腫瘍細胞を再負荷した。再負荷した動物のいずれも腫瘍を生成しなかった（図３０ｄ）。次に発明者らは、ＤＭＸＡＡ投与後に誘導された抗腫瘍免疫応答が、非注入による第二の腫瘍を拒絶するのに十分強力であり得るかを調べた。Ｂ１６．ＳＩＹ細胞をマウスの両側腹部へ注入したが、片側の腫瘍のみＤＭＸＡＡで処置した。腫瘍の退縮が両部位で観察された（図３０ｅ）。このことは、ＤＭＸＡＡのＩＴ投与は、離れた腫瘍にも治療効果を有し得ることを示している。この効果は、当該薬剤が全身に広がったことによる二次的なものではなさそうだ。なぜなら、ＤＭＸＡＡを腹腔内（ＩＰ）投与で意図的に全身投与した際は、治療効果は低かったためである（データは示されていない）。
【０１６３】
ＤＭＸＡＡのＩＴ投与によりもたらされる強力な抗腫瘍活性が幅広く適用できるかどうかを評価するために、発明者らは、さらに同系の腫瘍モデルを試験した。ＤＭＸＡＡでの処置は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにけるＢ１６．Ｆ１０（ＳＩＹの発現無し）及びＴＲＡＭＰ−Ｃ２腫瘍、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける４Ｔ−１腫瘍、ならびにＣ３ＨマウスにおけるＡｇ１０４Ｌ腫瘍の成長を有意に減少させた。このことは、ＤＭＸＡＡの治療効果が、特定の腫瘍組織学またはマウスの遺伝的背景に制限されないことを示している（図３６）。
【０１６４】
生体内におけるＤＭＸＡＡの作用メカニズム
ＤＭＸＡＡの治療効果がＳＴＩＮＧ依存であるかどうかを試験するために、Ｂ１６．ＳＩＹ腫瘍を有するＳＴＩＮＧ−／−マウスを使用した。宿主ＳＴＩＮＧが欠損している場合、ＤＭＸＡＡに応答して腫瘍成長は低下しないことが観察され（図３１ａ）、ＳＩＹ特異的Ｔ細胞の頻度は顕著に減少した（図３１ｂ、ｃ）。適応免疫応答が腫瘍制御に必要であるかどうかを確定するために、Ｂ１６．ＳＩＹ細胞を、成熟Ｔ及びＢ細胞を欠いているＲＡＧ２−／−マウスへ接種した。腫瘍の部分的な制御は存在していたものの、ＤＭＸＡＡ処置による治療効果の大部分は、ＲＡＧ２−／−宿主において失われた（図３１ｄ）。同様の治療効果の消失が、ＴＣＲα−／−（図３１ｅ）及びＣＤ８＋Ｔ細胞を欠乏させたマウス（図３１ｆ及び図３７）で観察された。これらの結果は、ＤＭＸＡＡの治療効果の主要な構成要素がＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介されていることを示している。
【０１６５】
新規合成ヒトＳＴＩＮＧ活性化分子の同定
ＳＴＩＮＧ経路が、有意な治療効果につながる腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋細胞プライミングを促進するために利用されている可能性が示されたので、発明者らは、ｈＳＴＩＮＧを強力に活性化し得る化合物の同定を目指し、したがって、臨床への応用を目指した。環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）は、運動性及びバイオフィルムの形成を含む多様なプロセスを制御するバクテリアによって合成される小分子セカンドメッセンジャーとして研究されてきた。組み換えタンパク質抗原の免疫原性は、ＣＤＮをアジュバントして使用することで増大させることができ、ＣＤＮに対しワクチン開発への潜在的な応用を与えている。発明者らは、すべての既知の多型ＳＴＩＮＧ分子をはたかせる能力に加えて、ヒトの細胞において活性の上昇を伴う新規の合成ＣＤＮ化合物の開発を目指した。ｈＳＴＩＮＧの対立遺伝子／ＣＤＮ依存性シグナリングの関連性を説明している最近の結果と共に、ＣＤＮ−ＳＴＩＮＧ結晶構造が利用可能であったので、活性上昇を伴うＣＤＮ化合物をデザインするための構造を基盤とした研究は容易であった。発明者らは、プリンヌクレオチド塩基、リン酸架橋結合構造、及びリン酸架橋部の非架橋酸素原子の硫黄原子による置換という、これらにおける変更を実施した化合物を合成した。天然のＣＤＮ分子は、宿主細胞または全身性の循環に存在するホスホジエステラーゼによる分解に感受性を有する。発明者らは、Ｒｐ，Ｒｓ（Ｒ，Ｓ）ジチオ置換ジアステレオマーまたは非改変ＣＤＮと比較し、Ｒｐ，Ｒｐ（Ｒ，Ｒ）ジチオ置換ジアステレオマーＣＤＮがヘビ毒のホスホジエステラーゼでの消化に抵抗性を有すると共に、ヒトＴＨＰ−１細胞においてＩＦＮ−βの高発現を誘導することを発見した。
【０１６６】
ＳＴＩＮＧに対するそれらの親和性を増加させるため、ｃＧＡＳにより産生される内因性ヒトＣＤＮにみられるように、「混合結合（ｍｉｘｅｄ  ｌｉｎｋａｇｅ）」（ＭＬ）と名付けた２’−５’及び３’−５’結合の両方を有するリン酸架橋配置でもＣＤＮを合成した。文献の調製法の改変によるジチオ混合結合ＣＤＮの合成で、Ｒ，Ｒ及びＲ，Ｓジチオジアステレオマーを得て、シリカゲル及びＣ１８逆相分取ＨＰＬＣクロマトグラフィーの組みあわせにより精製、分離し、図３８Ａ、上パネルにＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡで示されるように、９５％以上の純度でＣＤＮを得た。１Ｈ  ＮＭＲ（データは示されていない）及び３１Ｐ  ＮＭＲ（図３８Ａのｙ軸、下パネル）の両スペクトルは、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡと一致していた。ホスホジエステル結合の位置化学の直接的な証拠は、１Ｈ−３１Ｐ  ＨＭＢＣ（異核多結合相関分光法）二次元ＮＭＲ（図３８Ａ、下パネル）と組み合わせた１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ（図３８Ａ（下パネル）のｘ軸に示されるリボースプロトンの帰属のための相関分光法）によって得られた。ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡの三次元Ｘ線結晶構造により、２’−５’及び３’−５’結合ホスホジエステル結合及びジチオ［ＲＰ，ＲＰ］ジアステレオマー配置の存在を確認した（図３８Ｂ）。
【０１６７】
新規合成ＣＤＮは、すべての既知のヒトＳＴＩＮＧ対立遺伝子を活性化する
ｈＳＴＩＮＧ遺伝子における単一ヌクレオチド多型は、細菌由来の標準ＣＤＮに対する応答性に影響を与えることが示されている（Ｄｉｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ｈＳＴＩＮＧの５つのハプロタイプが同定されており（ＷＴ、ＲＥＦ、ＨＡＱ、ＡＱ及びＱ対立遺伝子）、アミノ酸位置７１、２３０、２３２、及び２９３で変異している（図３２Ａ、左）（Ｊｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｙｉ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。当該５つのｈＳＴＩＮＧ変異体の合成ＣＤＮに対する応答性を試験するために、発明者らは、全長ｈＳＴＩＮＧ変異体のそれぞれを発現している安定ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を作成した（内因性ＳＴＩＮＧ欠損）。同様のレベルのＳＴＩＮＧタンパク質がそれぞれの細胞株で発現された（図３２Ａ、右）。予想どおり、ＤＭＸＡＡは、ｍＳＴＩＮＧを強力に活性化したが、５つのｈＳＴＩＮＧ対立遺伝子のいずれも活性化しなかった（図３２Ｂ）。ｈＳＴＩＮＧＲＥＦを発現している細胞は、細菌のＣＤＮ化合物ｃＧＡＭＰ、ＣＤＡ、及びＣＤＧによる刺激への応答は不十分であったが、内因的に生成されたｃＧＡＳ産物であるＭＬ−ｃＧＡＭＰには、応答性であった（Ｄｉｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３）（図３２Ｃ）。興味深いことに、ｈＳＴＩＮＧＱ対立遺伝子も細菌のＣＤＮに応答しなかった。ｍＳＴＩＮＧを発現している細胞は、試験したＣＤＮのすべてに応答した。空のベクターを形質導入された細胞、または非機能性変異体（Ｉ１９９Ｎ）ＳＴＩＮＧタンパク質（Ｇｏｌｄｅｎｔｉｃｋｅｔ）（Ｓａｕｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１）を発現している細胞は、いずれの化合物にも応答しなかった（データは示されていない）。対照的に、天然のリガンドであるＭＬ−ｃＧＡＭＰ、及びジチオ混合結合ＣＤＮ誘導体（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＧ、及びＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ｃＧＡＭＰ）は、不応性のｈＳＴＩＮＧＲＥＦ及びｈＳＴＩＮＧＱ対立遺伝子を含めて、５つすべてのｈＳＴＩＮＧ対立遺伝子を強力に活性化した（図３２Ｃ）。
【０１６８】
ＣＤＮ誘導体は、マウス及びヒト免疫細胞においてＳＴＩＮＧ依存シグナリングを強力に誘導する
ＣＤＮが下流のＳＴＩＮＧシグナリングを活性化するかを確定するために、発明者らは、ＩＦＮ−β及びその他のサイトカインの誘導をＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６及びＳＴＩＮＧ−／−（Ｇｏｌｄｅｎｔｉｃｋｅｔ）マウスから単離したマウス骨髄マクロファージ（ＢＭＭ）で評価した。内因性ＭＬ−ｃＧＡＭＰならびにＴＬＲ３及びＴＬＲ４アゴニストであるポリＩ：Ｃ及びＬＰＳ（それぞれ）と比較して、合成ジチオ混合結合ＣＤＮ（ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ及びＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＧ）は、モル当量相当で最も高い炎症促進性サイトカインの発現を誘導した（図３２Ｄ）。当該改変ＣＤＮは、ＳＴＩＮＧ−／−ＢＭＭでのシグナリングを誘導しなかったが、一方で、予想どおり、ＴＬＲアゴニストは依然として活性を有していた。ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＭＣＰ−１の誘導を測定したときに同様の結果が示された（図３９）。プライマリーヒト細胞におけるＳＴＩＮＧシグナリングの活性化を調べるために、発明者らは、異なるＳＴＩＮＧ対立遺伝子を有するヒトドナー団由来のＰＢＭＣを刺激し、ＩＦＮ−βの誘導を測定した。ＤＭＸＡＡとは対照的に、ジチオ改変混合結合ＣＤＮは、複数のヒトドナーにわたって、ＩＦＮ−β発現を誘導した（図３２Ｅ）。ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡは、マウスＢＭＭにおいてＳＴＩＮＧの凝集を誘導し、ＴＢＫ１及びＩＲＦ３のリン酸化も誘導することが明らかとなった（図４０Ａ〜４０Ｂ）。試験した改変ＣＤＮのすべてがＭＨＣクラスＩ及び同時刺激マーカーの発現をＳＴＩＮＧ依存的に増強した（図４０Ｃ）。したがって、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＮは、ヒトＳＴＩＮＧ経路の活性化できる、実行可能な臨床上の候補である。
【０１６９】
合成ＣＤＮ誘導体の腫瘍内送達は、確立されたＢ１６メラノーマにおいて、顕著な抗腫瘍効果をもたらす
改変ジチオＭＬ  ＣＤＮ化合物が抗腫瘍活性も有しているか評価するために、確立されたＢ１６．Ｆ１０腫瘍（ＳＩＹ発現無し）を有するマウスを１週間にわたってＣＤＮ誘導体で３回ＩＴ注入処置した。ＭＬ  ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ（ＭＬ−ＣＤＡ）及びＭＬ  ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ（ＭＬ−ＣＤＧ）での処置は、腫瘍成長に対して中程度の効果を有していた一方、Ｒ，Ｒジチオ誘導体は、顕著に腫瘍の成長を抑制し（図３３Ａ）、ＤＭＸＡＡ（図３３Ｂ）及び内因性ＭＬ−ｃＧＡＭＰ（図３３Ｃ）と比べて優位により強力であった。しかしながら、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＧは、反応源性であり、マウスによっては、処置した腫瘍に開いた傷ができ、治癒しなかった。より低用量レベルのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＧは、効果的ではなかった。このことは、この分子が狭い治療インデックスを有していることを示している。対照的にＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡでは、注入部位の反応源性は観察されず、マウスによっては、処置した腫瘍細胞の完全根絶後に、再成長した毛皮上に白斑ができた（データは示されていない）。
【０１７０】
ＣＤＮ誘導抗腫瘍効果がＳＴＩＮＧ依存的であるかを確定するために、発明者らは、Ｂ１６腫瘍を有するＷＴ（Ｃ５７ＢＬ／６）及びＳＴＩＮＧ−／−マウスにおける活性を比較した。ＣＤＮの治療効果はＳＴＩＮＧ−／−マウスにおいて完全に消失した（図３３Ｄ）。ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡは、ＣｐＧに基づくＴＬＲ９アゴニスト（Ｋａｗａｒａｄａ，ｅｔ  ａｌ．，２００１）と比較して、また、同一用量でＩＴ投与された複数の他のＴＬＲアゴニストと比較しても、Ｂ１６腫瘍を有するマウスにおいて有意な効力の増加を示した（図３３Ｅ）。
【０１７１】
ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡは、複数の腫瘍型において持続性の免疫媒介腫瘍拒絶を誘導する
異なる遺伝背景をテストするために、確立されたＣＴ２６結腸または４Ｔ１乳腺癌を有するＢＡＬＢ／ｃマウスをＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡで処置した。処置したすべての動物が、有意かつ耐久性のある腫瘍退縮を示した。最初の腫瘍から治癒したマウスは、両腫瘍モデルにおいて、再負荷に対して完全に拒絶性を有しており（図３４Ａ及び図４１Ａ）、内因性ＣＴ２６拒絶抗原ＡＨ１に対する免疫応答にも改善がみられた（Ｓｌａｎｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，２０００）（図３４Ｂ）。両側にＣＴ２６または４Ｔ１腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスにおける片側の腫瘍へのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡのＩＴ注入も、反対側の処置していない細胞の有意な退縮を示した（図３４Ｃ及び図４１Ｂ）。発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにもＢ１６メラノーマを接種し、７日後に静脈内にＢ１６メラノーマ細胞を注入した。２週間確立された側腹部の腫瘍をＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、ＤＭＸＡＡ、またはＨＢＳＳ対照で処置し、３週間後に肺転移を数えた。側副腫瘍をＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡで処置されたマウスは、離れた肺転移の成長に対して、ＤＭＸＡＡと比べて、より有意な阻害を示した（図３４Ｄ）。まとめると、これらの結果は、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡのＩＴ注入が複数の腫瘍型を根絶し、遠位の未処置病巣の成長を有意に抑制する、有効な全身性のＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を刺激することを示している。
【０１７２】
方法
細胞及び細胞単離
試験管内の実験に使用した細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６由来メラノーマ細胞株Ｂ１６．Ｆ１０及びＢ１６．Ｆ１０．ＳＩＹ（以後Ｂ１６．ＳＩＹと記載）、乳癌ＯＴ−１及び４Ｔ１細胞株、前立腺癌ＴＲＡＭＰ−Ｃ２細胞株、結腸癌ＣＴ２６細胞株であり、すべて元はＡＴＣＣから購入したものである。線維肉腫Ａｇ１０４Ｌ細胞株は、シカゴ大学のＨａｎｓ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ博士より供与された。すべての細胞は、１０％熱非働化ＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、葉酸、及びＬ−アスパラギンを含むＤＭＥＭ中で、７．５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で維持管理した。
【０１７３】
不死化ＷＴ及びＳＴＩＮＧ−／−マクロファージは、Ｒｏｂｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｒｏｂｅｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８８）の説明に従って得た。ＷＴマクロファージは、Ｋ  Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ博士（マサチューセッツ大学）より供与された。非不死化マクロファージは、ＷＴ（Ｃ５７ＢＬ／６）またはＳＴＩＮＧ−／−マウスの骨髄から取得し、ＢＭＭ培地（５％ＣＳＦ、５％ＦＢＳ、１ＸＬ−グルタミン、１Ｘペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ培地）で使用前に７日培養した。ＷＴ及びＳＴＩＮＧ−／−マウスの骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）は、脛骨及び大腿骨由来の細胞をｒｍＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）存在下で９日間培養することで作成した。インキュベーション後、特異的抗体を使用した細胞の表現系は、細胞の９０％超がＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ１１ｂ＋またはＣＤ１１ｂ−、ならびにＣＤ８−、ＣＤ４−及びＣＤ１９−であることを確認した。ヒトＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した密度勾配遠心により単離した。
【０１７４】
ＳＴＩＮＧ−／−マクロファージにおけるＨＡ−ＳＴＩＮＧの安定過剰発現のために、全長ｍＳＴＩＮＧをコードする配列をｐＵＮＯＩ−ｍＳＴＩＮＧプラスミド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）から増幅し、空のｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターへクローン化した。安定ＨＥＫ  ２９３Ｔ  ＳＴＩＮＧ発現細胞株は、ＩＲＥＳの上流にＧＦＰと共にクローン化されたＳＴＩＮＧのｃＤＮＡをフレーム内に含むＭＳＣＶ２．２レトロウイルスプラスミドで作成した。ｈＳＴＩＮＧ（ＲＥＦ）−ＨＡ、ｈＳＴＩＮＧ（ＷＴ）−ＨＡ、ｈＳＴＩＮＧ（ＨＡＱ）−ＨＡ、ｈＳＴＩＮＧ（Ｑ）−ＨＡ及びｍＳＴＩＮＧ（ＷＴ）−ＨＡのレトロウイルスプラスミドは、カリフォルニア大学バークレー校のＶａｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより供与された。ｈＳＴＩＧＮ（ＡＱ）−ＨＡは、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してｈＳＴＩＮＧ（Ｑ）−ＨＡから得た。レトロウイルスベクターは、広宿主性のＰｈｏｅｎｉｘパッケージング細胞株へＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトランスフェクトした。２日後にウイルス上清を回収し、ＳＴＩＮＧ−／−マクロファージまたはＨＥＫ２９７細胞の形質導入に使用した。ＧＦＰ＋細胞は、ＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ）またはＭｏＦｌｏｗセルソーターにおいてソートした。
【０１７５】
ＳＴＩＮＧ凝集体のＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ分析
ＳＴＩＮＧ−ＨＡタグを過剰発現しているＳＴＩＮＧ−／−マクロファージを７．５％のＮａＨＣＯ３で再懸濁した５０μｇ／ｍｌのＤＭＸＡＡ、ＨＢＳＳで再懸濁した５０μＭのＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ、または対照として媒体のみで１時間刺激した。インキュベーション後に、細胞を抗ＣＤ１１ｂ−ＡＰＣ（Ｍ１／７０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ウサギ抗ＨＡタグ（Ｃ２９Ｆ４、Ｃｅｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及び抗ウサギＩｇＧ−ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ならびにＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞を染色した。単一細胞画像は、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍｘＭａｒｋ  ＩＩ（Ａｍｎｉｓ）で取得し、データは、ＩＤＥＡＳソフトウェアを使用して解析した。
【０１７６】
ウエスタンブロット分析
ＷＴ、ＳＴＩＮＧ−／−マクロファージ、ならびにＳＴＩＮＧ−ＨＡまたは空のベクターを発現しているＳＴＩＮＧ−／−マクロファージを５０μｇ／ｍｌのＤＭＸＡＡで０、１５、６０または１８０分刺激した。ＷＴまたはＳＴＩＮＧ−／−マウス由来のＢＭ−ＤＣは、２５μｇ／ｍｌのＤＭＸＡＡで刺激し、その際、当該刺激時間条件は、マクロファージ刺激時と同一である。タンパク質は、プロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ）を含むＴｒｉｔｏｎ−Ｘ緩衝液（１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ、ｐＨ８．０）で抽出した。３０μｇのタンパク質を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で電気泳動し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上へ転写した。ブロットは、リン酸化ＴＢＫ１（Ｓｅｒ１７２）、リン酸化ＩＲＦ３（Ｓｅｒ３９６）、全ＴＢＫ１、ＳＴＩＮＧならびにＧＡＰＤＨ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）または全ＩＲＦ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）特異的抗体と共にインキュベートした。ＳＴＩＮＧを安定発現しているＨＥＫ２９３Ｔ株由来のタンパク質は、Ｍ−ＰＥＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抽出した。６μｇのタンパク質を４−１２％ＭＥＳ  ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）へ負荷し、ニトロセルロースへ転写した後、抗ＨＡ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）で探索した。抗ウサギＩＲＤｙｅ  ６８０ＲＤ標識二次抗体をＯｄｙｓｓｅｙ  Ｉｍａｇｉｎｇシステム（ＬＩ−ＣＯＲ）でのバンドの可視化に使用した。
【０１７７】
マウスＩＦＮ−βＥＬＩＳＡ
ＷＴまたはＳＴＩＮＧ−／−マクロファージ、及びＷＴまたはＳＴＩＮＧ−／−マウス由来のＢＭ−ＤＣを５０μｇ／ｍｌのＤＭＸＡＡで刺激した。条件培地を４時間後に回収した。ＩＦＮ−β濃度は、ＶｅｒｉＫｉｎｅ（商標）  Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｂｅｔａ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（ＰＢＬ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｓｏｕｒｃｅ）を使用して評価した。
【０１７８】
サイトカインの定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析
ＷＴまたはＳＴＩＮＧ−／−マウス由来のＢＭ−ＤＣを２５μｇ／ｍｌのＤＭＸＡＡまたは１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで４時間刺激した。全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離し、Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ、Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｇｒａｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にインキュベートした。ｃＤＮＡは、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用して合成し、７３００  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用して、マウスＩＮＦ−β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＩＬ−１２ｐ４０に特異的なプライマー／プローブによるリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲで、サイトカインの発現を測定した。結果は、１８ｓを内因性対照として使用し、２−ΔＣｔとして示した。
【０１７９】
ＷＴ  ＢＭＭは、ＨＢＳＳ中で５μＭのＣＤＮで、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ）遺伝子導入試薬（キットプロトコルあたり）を添加して刺激した。ヒトＰＢＭＣは、１０μＭのそれぞれのＣＤＮまたは１００μｇ／ｍｌのＤＭＸＡＡを使用して通常ＲＰＭＩ培地中で刺激した。６時間のインキュベーションの後、細胞を回収し、ＰｒｉｍｅＰＣＲ  ＲＮＡ精製及びｃＤＮＡ分析システムを使用し、リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲでＩＦＮ−β１、ＭＣＰ−１、ＴＮＦα、及びＩＬ−６の遺伝子発現を評価し、ＣＦＸ９６  ｇｅｎｅ  ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）にかけた。相対的に正規化された発現量は、参照遺伝子であるＧａｐｄｈ及びＹｗｈａｚを使用して、誘導された標的遺伝子発現量を非刺激対照と比較することにより決定した。係数変数（ＣＶ）が０．５未満かつＭ値が１未満であると確認された遺伝子は、したがって、さまざまな処置条件で変化がなかった。
【０１８０】
フローサイトメトリーによる活性化マーカーの発現
ＷＴまたはＳＴＩＮＧ−／−マウス由来のＢＭ−ＤＣを２５μｇ／ｍｌのＤＭＸＡＡまたは１００ｎｇのＬＰＳで１２時間、または５０μＭのそれぞれのＣＤＮで２４時間刺激した。刺激後、細胞を抗ＣＤ１６／３２モノクローナル抗体（９３）で１５分間事前にインキュベートして潜在的な非特異的結合をブロックし、次に以下の特異的抗体を使用した。抗ＣＤ１１ｃ−Ｐｅ−Ｃｙ７またはＡＰＣ（Ｎ４１８）、抗ＣＤ１１ｂ−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（Ｍ１／７０）、抗ＣＤ４０−ＰＥ（３／２３）、抗ＣＤ８０−ＡＰＣ（１６−１０Ａ１）、抗ＣＤ８６−ＦＩＴＣまたはＰＥ（ＧＬ１）ならびに抗ＩＡ／ＩＥ−ＰＢまたはＦＩＴＣ（Ｍ５／１１４．１５．２）。染色した細胞は、ＬＳＲ  ＩＩサイトメーターを使用して、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ）またはＦＡＣＳＶｅｒｓｅを使用してＦＡＣｓｕｉｔｅソフトウェアで解析した。データ解析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）で実施した。
【０１８１】
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ３Ｈ/Ｈｅ及びＴＣＲα−/−マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒより入手した。ＲＡＧ２−／−マウスはＴａｃｏｎｉｃより入手した。Ｔｍｅｍ１７３−／−（ＳＴＩＮＧ欠損）マウスは、Ｇ．Ｂａｒｂｅｒ博士（マイアミ大学）より供与され、ＳＴＩＮＧ−／−（ｇｏｌｄｅｎｔｉｃｋｅｔ）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎから購入した。
【０１８２】
生体内での腫瘍実験
１０６個のＢ１６−ＳＩＹ腫瘍細胞、５×１０４個のＢ１６．Ｆ１０腫瘍細胞、１０５の４Ｔ１及びＣＴ２６、または１０６個の他の腫瘍細胞を含む１００μｌのＤＰＢＳまたはＨＢＳＳをマウスの右側腹部の皮下に注入した。腫瘍移植後、マウスは処置群へと無作為化した。腫瘍が体積で１００〜２００ｍｍ３（５〜７ｍｍ幅）であるときに、７．５％のＮａＨＣＯ３に再懸濁したＤＭＸＡＡ、またはＨＢＳＳもしくは媒体対照中で調製されたＣＤＮを１回もしくは３回投与のいずれかでＩＴ注入した。腫瘍の測定は、ノギスを使用して週に２回実施し、腫瘍体積は、式：Ｖ＝（長さ×幅２）／２を使用し、計算した。実施例によっては、腫瘍が無い生き残りに、最初の腫瘍の注入から数週間後に反対側の側腹部に腫瘍細胞を再負荷した。未処置のマウスを対照として使用した。対側性の実施例では、マウスの両側腹部へ移植し、片方の腫瘍のみ処置した。Ｂ１６メラノーマの肺転移の実施例では、０日目にマウスの側腹部に、５×１０４個の細胞のＢ１６．Ｆ１０を移植し、７日目に静脈内に１×１０５個の細胞を静脈内に注入した。肺は２８日目に回収した。化合物の投与、腫瘍の測定、及び肺腫瘍のカウントは、盲検方式で実施した。
【０１８３】
ＣＤ８+Ｔ細胞欠乏
ＣＤ８+Ｔ細胞の欠乏のために、マウスＣＤ８（４３．２）に対するラットのモノクローナル抗体またはアイソタイプ対照であるＩｇＧ２ｂ（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を、マウスあたり２５０μｇの用量でマウスへ毎週ＩＰ投与した。異なる抗ＣＤ８のクローン（５３−６．７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用したフローサイトメトリーで評価したように、この投与レジメンは、末梢血でＣＤ８+Ｔ細胞の約９９％欠乏をもたらした、
【０１８４】
ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ及びＳＩＹペンタマー染色
脾細胞は、ＤＭＸＡＡの最初のＩＴ注入から５日後に分析した。ＥＬＩＳＰＯＴのために、脾細胞をウェルあたり１０６個でプレートに播き、ＳＩＹペプチド（１６０ｎＭ）もしくはＡＨ１（１μＭ）、陽性対照としてイオノマイシン（０．５μＭ）を添加したＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）、または陰性対照として培地で一晩刺激した。スポットは、製造者の指示書に従ってＢＤマウスＩＦＮ−γキットを使用して生成させ、スポットの数をＩｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  Ｓｅｒｉｅｓ  ３  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して測定し、Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔソフトウェア（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ）を使用して解析した。ＳＩＹペンタマー染色のために、脾細胞を抗ＣＤ１６／３２モノクローナル抗体（９３）で１５分間事前にインキュベートしてして潜在的な非特異的結合をブロックし、ＳＩＹＲＹＹＧＬ（ＳＩＹ）ペプチドと複合体化したマウスＨ−２ＫｂからなるＰＥ−ＭＨＣクラスＩペンタマー（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ）、抗ＴＣＲβ−ＡＦ７００（Ｈ５７−５９７）、抗体ＣＤ８−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（５３−６．７）、抗ＣＤ４−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ（ＲＭ４−５）（すべての抗体はＢｉｏＬｅｇｅｎｄより入手）及びＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して標識した。染色細胞は、ＬＳＲ  ＩＩサイトメーターを使用してＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ）で解析した。データ解析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を使用して実施した。
【０１８５】
天然の環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧリガンド及び合成誘導体分子の調製
改変したＣＤＮ誘導体分子は、以前に説明されている（Ｇａｆｆｎｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、Ｇａｆｆｎｅｙの「ワンポット（ｏｎｅ−ｐｏｔ）」調製方法の変法に従って合成した。ＣＤＮ分子の合成には、ホスホラミダイト鎖状カップリング及びＨ−ホスホネート環化反応を利用した。ジチオＣＤＮの合成は、分子間リン酸架橋の非架橋酸素原子を硫黄原子で置換する硫黄化反応によって実現した。例えば、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡとして図３８Ｂに示されている、ジチオ−（Ｒｐ，Ｒｐ）−［環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］］の５ミリモルスケールでの合成は、５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−３’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−アデノシン（Ｎ−Ｂｚ）−２’−ＣＥＰ及び５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−アデノシン（Ｎ−Ｂｚ）−３’−ＣＥＰのＨ−ホスホネートで実施した。直鎖二量体の形成で生成したリンＩＩＩ中間体（ホスファイトトリエステル段階）及び環状ジヌクレオチド（Ｈ−ホスホネートジエステル段階）は、それぞれ３−（（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチオアゾール−５−チオン（ＤＤＴＴ）及び３−Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オンで処理した。２回目の硫黄化後の粗反応液は、シリカゲルでのクロマトグラフィーに供し、完全保護されたＭＬ  Ｓ２  ＣＤＡのＲＲ及びＲＳ−ジアステレオマー混合物を得た。メタノール及び濃縮アンモニア水を使用したベンゾイル及びシアノエチルの脱保護により、ビス−ＴＢＳ−ＭＬ−Ｓ２  ＣＤＡをＲＲ及びＲＳ−ジアステレオマーの混合物として取得し、Ｃ−１８分取ＨＰＬＣにより分離した。精製されたビス−ＴＢＳ−ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡは、ＴＥＡ−３ＨＦで脱保護し、１Ｍの重炭酸トリエチルアンモニウムで中和してＣ１８  ＳｅｐＰａｋで脱塩し、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡをビス−トリエチルアンモニウム塩として９５％を超える純度で得た。もう一つの方法として、ＴＥＡ基をナトリウムまたはアンモニウムカウンターイオンのいずれかでイオン交換により交換し、凍結乾燥してから、１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７／１ｍＭのＥＤＴＡ緩衝液へ５ｍｇ／ｍＬ近くとなるよう再懸濁し、０．２ミクロンフィルターを通過させてろ過滅菌することで、最終産物を、分析ＨＰＬＣで決定されたとおり（図３８Ａ）、９５％以上の純度で得た。高分解能フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＦＴ−ＩＣＲ）により、予想組成式を以下のとおり確認した。［Ｍ−Ｈ］−  Ｃ２０Ｈ２３Ｎ１０Ｏ１０Ｐ２Ｓ２での算出値６８９．０５２１、測定値６８９．０５１４。１Ｈ  ＮＭＲ（データは示されていない）及び３１Ｐ  ＮＭＲ（図３８Ａのｙ軸）の両スペクトルは、ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡと一致していた。ホスホジエステル結合の位置化学の直接的な証拠は、１Ｈ−３２Ｐ  ＨＭＢＣ（異核多結合相関分光法）実験と、リボースプロトン（図３８Ａのｘ軸に示されている）の帰属のための１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ（相関ＮＭＲ分光法）との組み合わせにより得られた。実施例において使用前には、すべての合成調製物は、ＬＡＬアッセイによりエンドトキシンが存在しない（＜１ＥＵ／ｍｇ）ことを確認した。
【０１８６】
ヒトＳＴＩＮＧ配列
ゲノムＤＮＡは、１０４のＰＢＭＣからＱｕｉｃｋ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して単離し、ｈＳＴＩＮＧのエクソン３、６、及び７の領域を増幅するために使用した。増幅及びシークエンスのためのプライマーを表１に収載する。
【表１】
2016538344.tif 000017
【０１８７】
ルシフェラーゼアッセイ
１０４個ののＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートに播き、ヒトＩＦＮ−βホタルレポータープラスミド４６及び基準化のためのＴＫ−Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼレポーターを一過性にトランスフェクトした（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００）。翌日、均一な取り込みを保つため、ジギトニン透過処理（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＫＣＬ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、８５ｍＭ  スクロース、０．２%  ＢＳＡ、１ｍＭ  ＡＴＰ、０．１ｍＭ  ＧＴＰ、１０ｕｇ／ｍｌジギトニン）を使用して、細胞を１０μＭのそれぞれのＣＤＮまたは１００μｇ／ｍｌのＤＭＸＡＡで刺激した。２０分後、刺激に使用した混合液を除き、通常培地を添加した。全部で６時間後に、細胞の可溶化液を調製し、Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ３ルミノメーターでレポーター遺伝子活性を測定した。
【０１８８】
ＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡ結晶構造及び静電ポテンシャル面
Ｘ線構造は、カリフォルニア大学バークレー校のＣｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｘ−ｒａｙ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ａｎｔｏｎｉｏ  ＤｉＰａｓｑｕａｌｅ，ＰｈＤ）で決定された。Ｘ線品質の結晶は、飽和ウェットエタノール溶液から成長させた後、アセトンの緩慢蒸気拡散を実施し、その後ヘキサンの緩慢蒸気拡散を実施し、結晶材料を析出させた。サイズ０．０５０×０．０４０×０．０１０ｍｍの無色のプレートをＰａｒａｔｏｎｅオイルと共にＣｒｙｏｌｏｏｐにマウントした。データは、１００（２）Ｋで、ファイ及びオメガスキャンを使用して窒素ガスストリームにおいて収集した。結晶対検出器の距離は、６０ｍｍであり、１．０°の走査幅を使用し、露光時間はフレームあたり１０秒であった。データ収集は、θで６７．０００°までで１００％完了した。全部で１１３２８５反射を収集し、指数、−１９＜＝ｈ＜＝１９、−２４＜＝ｋ＜＝２４、−２６＜＝ｌ＜＝２９をカバーしている。１４９２９の反射は、０．０４４５のＲｉｎｔで非対称であった。指数及び単位格子の精密化は、基本、斜方格子を示した。空間群は、Ｐ  ２１  ２１  ２１（Ｎｏ．１９）であった。データは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＳＡＩＮＴソフトウェアプログラムを使用して統合し、ＳＡＤＡＢＳソフトウェアプログラムを使用して調整した。反復法（ＳＨＥＬＸＴ）による解は、完全な重原子位相モデルを与え、提唱モデルと一致した。すべての非水素原子は、ｆｕｌｌ−ｍａｔｒｉｘ  ｌｅａｓｔ  ｓｑｕａｒｅｓ（ＳＨＥＬＸＴ−２０１４）を使用し、異方性精密化を実施した。すべての非水素原子は、ライディングモデルを使用して配置した。それらの位置は、ＳＨＥＬＸＴ−２０１４において適切なＨＦＩＸコマンドを使用し、それらの親原子に対して固定した。絶対的な立体化学は、すべてのキラル中心で明確にＲであると決定した。Ｘ線回折実験より得た座標から開始するＢ３ＬＹＰ／６−３１Ｇ（ｄ）レベルの理論を使用し、ジアニオンモノマーの構造を最適化するためにＧａｕｓｓｉａｎ０９（ＲｅｖｉｓｉｏｎＡ．０２）を使用した。最適化において定常点がみつかると、最適化構造の静電ポテンシャル面が計算された。
【０１８９】
統計解析
Ｓｔｕｄｅｎｔの対応ｔ検定を両側ｐ値の計算に使用し、Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアを使用し、２つの処置群における差異の統計的有意性を推定した。統計的に有意なｐ値は、図及び説明文においてアスタリスクで標識した。
【化１５】
2016538344.tif 000018
【０１９０】
本明細書で開示及び請求される方法及び装置のすべては、本開示を踏まえて、過度の実験を伴うことなく、作成及び実施することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態に関して説明されている一方で、当業者には、本発明の概念、趣旨、及び範囲から逸脱することなく、当該方法及び装置、ならびに本明細書で説明される方法の手順または手順の順序において、変更を加え得ることが明らかとなるであろう。より具体的には、化学的にも生理的にも両方に関係する一定の薬剤が、同一または類似の結果を達成しつつ、本明細書で説明される薬剤に置き換わり得ることが明らとなるであろう。当業者に明らかなすべてのそのような類似した置き換え及び改変は、添付の特許請求の範囲によって定義されるように、本発明の趣旨、範囲、及び概念の範囲内であるとみなされる。
【０１９１】
参考文献
次の参考文献は、例示的な手順上の、またはその他の詳細補足を本明細書記載事項に対して与える限りにおいて、参照により具体的に本明細書に組み込まれる。
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Ｂｌａｎｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：１１４０−１１４５，２００４．
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Ｇｒａｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２７８：１１３−１１９，２０１２．
Ｈａｍｉｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．９：２０４，２０１１．
Ｈａｒｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６９（７）：３０７７−３０８５，２００９．
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Ｊｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１２：２６３−２６９，２０１１．
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Ｋｏｎｏ  ＆  Ｒｏｃｋ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．８（４）：２７９−２８９，２００８．
Ｋｒｏｅｍｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：５１−７２，２０１３．
Ｌａｎｄｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４４９（７１６２）：５６４−５６９，２００７．
Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８（１７）：６８８９−６８９５，２００８．
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【図１Ｅ−１Ｈ】
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【図３Ａ−３Ｃ】
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【図１３Ａ−１３Ｃ】
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【図１Ａ−１Ｄ】
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【図２Ａ−２Ｆ】
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【図３Ｄ−３Ｅ】
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【図４Ａ−４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ−５Ｄ】
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【図６Ａ−６Ｃ】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ−１２Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ−１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ−２９Ｃ】
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【図２９Ｄ−２９Ｇ】
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【図３０Ａ−３０Ｅ】
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【図３１Ａ−３１Ｆ】
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【図３２Ａ−３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ−３２Ｅ】
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【図３３Ａ−３３Ｅ】
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【図３４Ａ−３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３５Ａ−３５Ｃ】
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【図３６Ａ−３６Ｄ】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９】
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【図４０Ａ−４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４１Ａ−４１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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