(57)【要約】  本発明は、膣感染症を評価するための診断方法に関し、この方法は、特異的タンパク質の使用を含む。本発明はさらに、膣感染症の抗生物質による治療後の感染からの回復を評価するため、及びこの感染の回復及び寛解を予測するための診断方法における特異的タンパク質の使用に関する。本発明はまた、リファキシミンによる治療後の膣感染症からの回復を評価するため、及びこの感染の回復及び寛解を予測するための特異的タンパク質の使用を含む診断方法に関する。
2016516988.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膣内細菌感染の検査を受ける個体において前記感染を診断する方法であって、
・前記個体から得られた膣液サンプルをプロテオーム解析に供する工程、
・健康な又は感染されていない個体由来の膣液を表す参照サンプルにおけるタンパク質の発現レベルと比較して、検査膣液サンプルにおいて発現レベルが変化したタンパク質を決定する工程であって、参照サンプルに対して検査サンプルにおける１又は複数のタンパク質の発現レベルの減少又は増大により膣感染症を診断する、工程、及び
・診断の結果を用いて前記個体に治療を提供できるように前記診断の結果を報告する工程、又は前記診断の結果に基づいて前記個体を治療する工程
を含む方法。
【請求項２】
参照サンプルに対して検査サンプルにおいて減少又は増大する１又は複数のタンパク質が、ビタミンＤ結合タンパク質、デスモコリン−２、カルシウム依存性塩素チャネル制御因子４、カタラーゼ、低分子プロリンリッチタンパク質３、ガレクチン−３−結合タンパク質、ヘモペキシン、免疫グロブリンファミリー、中間径フィラメントファミリー、リポカリンファミリー、α１−酸性糖タンパク質１、α１−酸性糖タンパク質２、好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン、リンパ球特異的タンパク質１、ミエロブラスチン、ペリリピン−３、ペリプラキン、タンパク質Ｓ１００−Ａ９、タンパク質Ｓ１００−Ａ７、及びスーパーオキシドディスムターゼ［Ｃｕ−Ｚｎ］からなる群より選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
参照サンプルに対して検査サンプル液において増大する１又は複数のタンパク質が、デスモコリン−２、低分子プロリンリッチタンパク質３、免疫グロブリンＪ鎖、ケラチンＩ型細胞骨格１０、ケラチンＩＩ型細胞骨格１、上皮ケラチンＩＩ型細胞骨格２、ケラチンＩＩ型細胞骨格５、好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン、リンパ球特異的タンパク質１、ペリリピン−３及びペリプラキンからなる群より選択される請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
参照サンプルに対して検査サンプルにおいて減少する１又は複数のタンパク質が、ビタミンＤ結合タンパク質、カルシウム依存性塩素チャネル制御因子４、カタラーゼ、ガレクチン−３−結合タンパク質、ヘモペキシン、免疫グロブリンＭ鎖定常領域、α１−酸性糖タンパク質１、α１−酸性糖タンパク質２、ミエロブラスチン、タンパク質Ｓ１００−Ａ９、タンパク質Ｓ１００−Ａ７及びスーパーオキシドディスムターゼ［Ｃｕ−Ｚｎ］からなる群より選択される請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
検査サンプルと参照サンプルとの発現増大の比率が、約１．５〜約４０の範囲にある請求項１記載の方法。
【請求項６】
検査サンプルと参照サンプルとのタンパク質発現減少の比率が、約−１．５〜約−５６５０の範囲にある請求項１記載の方法。
【請求項７】
抗生物質による治療後に寛解の検査を受ける個体の細菌性膣感染症からの寛解の状態を診断する方法であって、
・抗生物質による治療後に検査を受ける前記個体から得られた膣液サンプルをプロテオーム解析に供する工程、
・ＢＶ感染を患う個体由来の膣液サンプルにおけるタンパク質の発現レベルと比較して、検査液サンプルにおいて発現レベルが変化したタンパク質を決定する工程であって、ＢＶ感染サンプルに対して検査サンプルにおける少なくとも１つのタンパク質の発現レベルの減少又は増大により、抗生物質による治療後のＢＶからの寛解の状態を診断する、工程、及び
・診断の結果を用いて前記個体に治療を提供できるように前記診断の結果を報告する工程、又は前記診断の結果に基づいて前記個体を治療する工程
を含む方法。
【請求項８】
ＢＶ感染したサンプル液に対して検査サンプル液において減少する少なくとも１つのタンパク質が、ビタミンＤ結合タンパク質、カルシウム依存性塩素チャネル制御因子４、カタラーゼ、ガレクチン−３−結合タンパク質、ヘモペキシン、免疫グロブリンＭ鎖Ｃ領域、α１−酸性糖タンパク質１、α１−酸性糖タンパク質２、タンパク質Ｓ１００−Ａ９、タンパク質Ｓ１００−Ａ７及びスーパーオキシドディスムターゼ［Ｃｕ−Ｚｎ］からなる群より選択される請求項７記載の方法。
【請求項９】
抗生物質による治療後のＢＶ感染したサンプル液に対して検査サンプル液において増大する少なくとも１つのタンパク質が、デスモコリン−２、低分子プロリンリッチタンパク質３、免疫グロブリンＪ鎖、ケラチンＩ型細胞骨格１０、ケラチンＩＩ型細胞骨格１、上皮ケラチンＩＩ型細胞骨格２、ケラチンＩＩ型細胞骨格５、好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン、リンパ球特異的タンパク質１、ペリリピン−３及びペリプラキンからなる群より選択される請求項７記載の方法。
【請求項１０】
抗生物質がリファキシミンである請求項７記載の方法。
【請求項１１】
さらに、ＢＶ感染したサンプルに対して検査サンプルにおけるタンパク質発現レベルの減少又は増大に基づいて、抗生物質の最適な又は有効な用量及び治療の時間を選択する工程を含む請求項７記載の方法。
【請求項１２】
抗生物質療法に反応しない患者であって、抗生物質による治療後のＢＶからの寛解の状態が同定されていない患者を評価するための請求項７〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
サンプルが頚膣液のサンプルである請求項１又は７記載の方法。
【請求項１４】
請求項１の方法に従って膣内細菌感染を診断するための検査キットであって、膣感染症を同定するために有用な少なくとも１つのタンパク質と、質量分析を用いて膣感染症を診断する方法を実施するための説明書とを含む、キット。
【請求項１５】
請求項７の方法に従って細菌性膣感染症からの寛解の状態を決定するための検査キットであって、抗生物質、特にリファキシミンによる治療後の膣感染症からの寛解を決定するために有用な少なくとも１つのタンパク質と、タンパク質決定のための解析技術を用いて膣感染症を診断する方法を実施するための説明書とを含む、キット。
【請求項１６】
膣感染症を診断するための方法であって、
・膣液の検査サンプルにおいて発現されたタンパク質のプロテオームプロファイルを、膣液の正常又は参照サンプルにおいて発現されたタンパク質のプロテオームプロファイルと比較する工程、
・検査サンプルと正常又は参照サンプルとの間で発現が異なるタンパク質の総数が３又はそれ以上であれば、膣感染症が存在すると決定する工程、及び
・診断の結果を用いて個体に治療を提供できるように前記診断の結果を報告する工程、又は前記診断の結果に基づいて前記個体を治療する工程
を含む方法。
【請求項１７】
発現が異なるタンパク質が、１．５に等しいか又はそれより大きい比率の絶対値を有すると同定される請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
発現が異なるタンパク質が、３に等しいか又はそれより大きい比率の絶対値を有すると同定される請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
膣感染症の治療の有効性を評価するための方法であって、
・治療のクール中又は治療のクール後の膣液の検査サンプルのプロテオームプロファイルを、治療のクール前又は治療のクールの初期に採取された膣液のサンプルと比較する工程、
・発現が異なる１又は複数のタンパク質の同定に基づいて寛解の状態を決定する工程、及び
・評価の結果を用いて個体に治療を提供できるように前記評価の結果を報告する工程、又は前記評価の結果に基づいて前記個体を治療する工程
を含む方法。
【請求項２０】
治療のクールがリファキシミンを投与することである請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
２５ｍｇ〜１００ｍｇの量のリファキシミンが、１日１回、５日間投与される請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
発現が異なるタンパク質が、１．５に等しいか又はそれより大きい比率の絶対値を有すると同定される請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
発現が異なるタンパク質が、３に等しいか又はそれより大きい比率の絶対値を有すると同定される請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
非応答状態（non responder status）であると判断された場合に、治療のクールが、投与される抗生物質、用量サイズ、又は投与の頻度を変更するように修正される請求項１９記載の方法。
【請求項２５】
膣感染症の有効な治療を同定するための方法であって、
・細菌性膣感染症と診断された個体群を同定する工程、
・各個体から得られた膣液サンプルをプロテオーム解析に供する工程、
・前記個体群を２又はそれ以上のプールに分ける工程、
・各プールに別個の治療を与える工程、
・各プール中の各個体から治療後に得られた膣液サンプルをプロテオーム解析に供する工程、
・各プールについて、治療前後で発現が異なるタンパク質を決定する工程、
・発現が異なるタンパク質の最大数を有する患者プールを同定することによって、有効な治療を決定する工程、及び
・研究の結果を用いて細菌性膣感染症を患う個体に治療を提供できるように前記研究の結果を報告する工程、又は前記研究の結果に基づいて前記個体を治療する工程
を含む、方法。
【請求項２６】
発現が異なるタンパク質が、１．５に等しいか又はそれより大きい比率の絶対値を有すると同定される請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
膣内細菌感染の検査を受ける個体において前記感染の寛解を予測するための方法であって、
・個体から得られた膣液サンプルをプロテオーム解析に供する工程、及び
・健康な又は感染されていない個体由来の膣液を表す参照サンプルにおけるタンパク質の発現レベルと比較して、検査液サンプルにおいて発現レベルが変化したタンパク質を決定する工程であって、表１及び／又は表２から選択される１又は複数のタンパク質の発現レベルにおける変化が、１に等しいか又はそれより大きい比率の絶対値を有する場合に治療後の寛解が予測される、工程
を含む、方法。
【請求項２８】
治療が、リファキシミンを含む医薬処方物が検査を受ける個体に投与されることによる請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
感染の診断が請求項１記載の方法によって決定されている個体の膣内細菌感染の治療に使用するためのリファキシミンを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、特異的タンパク質の使用を含む、膣感染症を評価するための診断方法に関する。本発明は、さらに、膣感染症の抗生物質による治療後の感染症からの回復を評価するため、及び感染症の回復及び寛解を予測するための診断方法における特異的タンパク質の使用に関する。本発明はまた、リファキシミンによる治療後の膣感染症からの回復を評価するため、及び感染症の回復及び寛解を予測するための特異的タンパク質の使用を含む診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
リファキシミン（ＩＮＮ；メルクインデックス第１３版（The Merck Index, XIII ed.）, 8304, CAS No. 80621-81-4（非特許文献１）参照）、ＩＵＰＡＣ命名法（２Ｓ，１６Ｚ，１８Ｅ，２０Ｓ，２１Ｓ，２２Ｒ、２３Ｒ，２４Ｒ，２５Ｓ，２６Ｓ，２７Ｓ，２８Ｅ）−５，６，２１，２３，２５  ペンタヒドロキシ−２７−メトキシ−２，４，１１，１６，２０，２２，２４，２６−オクタメチル−２，７−（エポキシペンタデカ−（１，１１，１３）トリエンイミノ）ベンゾフロ（４，５−ｅ）ピリド（１，２，−ａ）ベンズイミダゾール−１，１５（２Ｈ）−ジオン，２５−アセテート）は、リファンピシン群に属する半合成抗生物質である。より正確には、リファキシミンは、イタリア国特許第１１５４６５５号（特許文献１）に記載のピリド−イミダゾ−リファマイシンである。欧州特許第０１６１５３４号（特許文献２）には、リファマイシンＯ（メルクインデックス第１３版（The Merck Index, XIII ed.）, 8301（非特許文献２））を出発物質としてリファキシミンを製造する方法が記載されている。
【０００３】
米国特許第７，０４５，６２０号（特許文献３）、欧州特許第１５５７４２１Ｂ１号（特許文献４）、欧州特許第１６７６８４７Ｂ１号（特許文献５）、欧州特許第１６７６８４８Ｂ１号（特許文献６）、ＷＯ２００５／０４４８２３（特許文献７）、ＷＯ２００６／０９４６６２（特許文献８）には、リファキシミンの結晶形α、β、γ、δ及びεが記載されており、これらの各々は、参照することによりその全体が本明細書に組み入れられる。ＷＯ２００８／１５５７２８（特許文献９）及び米国特許出願公開第２００９／３１２３５７号（特許文献１０）には、無定形を得るための方法が記載されており、これらの各々は、参照することによりその全体が本明細書に組み入れられる。ＷＯ２００９／１０８７３０（特許文献１１）には、ζ形、η形、α−乾燥形、ι形、β−１形、β−２形及びε−乾燥形と名付けられたリファキシミンの多形が記載されており、これらの各々は、参照することによりその全体が本明細書に組み入れられる。ＷＯ２０１１／１５３４４４（特許文献１２）には多形κ及びθが記載され、ＷＯ２０１１／１５６８９７（特許文献１３）にはＡＰＯ−１及びＡＰＯ−２と名付けられた多形が記載されており、これらの各々は、参照することによりその全体が本明細書に組み入れられる。ヴィスコミ  Ｇ．（Viscomi G.）らは、Cryst. Eng Comm., 2008, 10 1074-1081 (2008)（非特許文献３）において、多形α、β、γ、δ、ε、それらを得るための方法並びにそれらの化学物理学的特性及び生物学的特性を記載しており、これは、参照することによりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００４】
リファキシミンは、グラム陽性及びグラム陰性細菌に対して活性な抗生物質であり、デコンブ  Ｊ．Ｊ．（Descombe J. J.）ら、Int. J. Clin. Pharmacol. Res., 14 (2), 51-56, (1994)（非特許文献４）に記載のように、経口経路を介して投与されたとき、無視できる低い全身性吸収によって特徴付けられる。リファキシミンは、例えば、腸感染、下痢及び過敏性腸症候群（ＩＢＳ）並びに小腸における細菌増殖、すなわち、「小腸細菌過剰増殖（ＳＩＢＯ）」を引き起こす、胃腸管に局在化した細菌に対して発揮される抗菌活性で知られており、小腸細菌過剰増殖（ＳＩＢＯ）は、クローン病（ＣＤ）、膵不全、腸炎、線維筋肉痛に関係することも知られている。リファキシミンは、感染性及び炎症性腸疾患の治療において、急性期及び慢性期の両方で適切な役割を果たす。
【０００５】
異なる形態のリファキシミンは、異なるレベルの全身性吸収に関連している。リファキシミンは、現在、病因がグラム陽性及びグラム陰性腸内細菌に部分的に又は完全に関係する急性及び慢性病状［腸微生物フローラの均衡変化によって生じる下痢症候群（例えば、夏季下痢、旅行者下痢症及び全腸炎など）など］の治療に認可されている。リファキシミンは、胃腸管の外科的処置後の感染性合併症の手術前及び手術後の予防において；高アンモニア血症の治療における補助剤として；及び肝性脳症の急性エピソードのリスクの低減においても有用である。
【０００６】
リファキシミンはまた、「下肢静止不能症候群」の治療において；肝不全患者における突発性細菌性腹膜炎の予防のため；及びプロトンポンプ阻害剤の連用（慢性的使用）によって誘発される感染の予防のために役立たせることができる。
【０００７】
さらに、リファキシミンが全身性吸収に乏しいという事実は、前述の適用に有利である。なぜなら、リファキシミンは高用量であっても有毒ではなく、望まれない副作用［例えば、抗生物質耐性（抗生物質抵抗性）細菌株（系統）の選択及び起こり得る薬理学的相互作用のリスクなど］の発生率を低減させるからである。
【０００８】
リファキシミンは、その特徴により、局所治療に有用な化合物、例えば、膣感染症（例えば、細菌性膣症の治療に有用な化合物になる。
【０００９】
膣感染症は、妊娠可能年齢の女性の間で頻度の高い病状であり、４０〜５０％の割合が細菌性膣症に相当する。症候的であり合併症を有さない場合、細菌性膣症は、悪臭のある膣分泌物によって特徴付けられ、炎症性臨床像（膣症）に関連せず、膣内生態系（vaginal ecosystem）の変化に帰される。
【００１０】
細菌性膣症は、正常な微生物相（microbiota）の生態における不均衡によって特徴付けられ、この生態において、乳酸桿菌（ラクトバチルス）属（lactobacilli）の枯渇及び嫌気性細菌の増殖が生じる。
【００１１】
健康な女性の正常な膣内フローラ（膣内微生物叢（vaginal flora））は、乳酸桿菌属（Lactobacilli）、特にラクトバチルス  クリスパタス（Lactobacillus crispatus）及びガセリ（gasseri）が優勢に存在していることから、過酸化水素を産生して酸性膣内ｐＨを維持する。そのため、ほとんどの病原性微生物の増殖が阻害される。
【００１２】
細菌性膣症において、乳酸桿菌属の細菌が、正常値より千倍も高く過剰増殖する通性嫌気性及び好気性細菌により置き換えられる。通性嫌気性及び好気性細菌は、主に、ガードネレラ  バギナリス（Gardnerella vaginalis）（これは細菌性膣症を患うほぼすべての女性に存在する）、マイコプラズマ  ホミニス（Mycoplasma hominis）、グラム陰性嫌気性細菌［バクテロイデス属（Bacteroides）及びプレボテラ属（Prevotella）など］、嫌気性菌［ペプトストレプトコッカス属（Peptostreptococcus）など］、グラム陽性嫌気性菌［５０％のケースにおいて存在するモビルンカス属（Mobiluncus）など］、及びグラム陽性桿菌（バチルス（bacilli））［細菌性膣症の９５％のケースにおいて存在するアトポビウム  バギナーレ（Atopobium vaginale）など］に代表される。
【００１３】
女性が細菌性膣症を発病しやすくなる要因としては、妊娠可能な年齢であること、人種、社会経済的地位、膣洗浄の常習的な使用、喫煙及び複数のパートナーとの性的行為が挙げられる。一方、エストロプロゲスチン薬（estroprogestinic drugs）を摂取することにより、保護的役割が果たされるようである。また、この病状は主に妊娠可能な年齢の女性にみられるので、ホルモン成分が細菌性膣症の原因病理に関与することがわかった。
【００１４】
細菌性膣症は、例えば、不妊及び子宮外妊娠のよくある原因である骨盤炎症性疾患、婦人科医学的外科的処置後の外科的損傷の感染、妊婦の早期破水、早産及び流産などのいくつかの重大な婦人科医学的及び産科学的合併症に関連し得る。性感染症とはみなされないが、細菌性膣症は、妊娠していない女性及び妊婦の両方について、性行為でうつる流行病（ＨＩＶウイルス感染を含む）にかかるリスクの増大に関連する。妊婦においては、母親から胎児へのＨＩＶウイルス感染のリスクの増大をも左右する。
【００１５】
細菌性膣症の病因は完全には理解されていないが、その治療は、臨床的回復及び微生物学的回復の両方を促すこと、そして可能であれば感染の再発を回避することを目的とする。したがって、理想的な治療は、病原種の低減に有効であると同時に、起こり得る疾患再発の予防を目的として乳酸桿菌属保護種（Lactobacillus protective species）の復元及び増殖をも促進すべきである。
【００１６】
米国疾病予防管理センター（Center of Disease Control (CDC)）、2010, 59, NoRR-12のガイドライン（非特許文献５）には、症候的でありかつ妊娠していない細菌性膣症のすべての女性は、抗生物質療法により治療されるべきであると述べられている。この点において、ＣＤＣは、最初の治療的アプローチとして、例えば、メトロニダゾール、経口錠剤５００ｍｇを１日２回７日間；又はメトロニダゾール、膣用ゲル、０．７５％、アプリケータ（５ｇ）を１日１回５日間もしくはクリンダマイシン、膣用クリーム、２％、アプリケータ（５ｇ）を１日１回７日間などの抗生物質療法を提案している。メトロニダゾール及びクリンダマイシンはともに、全身性経路を介して（経口的）又は局所的経路を介して（経膣的）のいずれかで投与され、細菌性膣症の治療に有効である。しかし、シモンイス  ＪＡ（Simoes JA）ら、Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 2001, 9(1), 41-45（非特許文献６）に記載のように、乳酸桿菌属保護フローラに対するこれら両方の薬物の阻害作用により、再発の予防においてその有効性が制限される。
【００１７】
さらに、たとえ膣経路を介して投与された場合でも、上記抗生物質はともに全身性副作用に関連し、副作用のいくつか、例えば、メトロニダゾールの場合は神経反応、クリンダマイシンの場合は偽膜性大腸炎などが、特に関連する。また、繰り返し投与されると、メトロニダゾール及びクリンダマイシンはともに、膣投与されたとしても全身に吸収されるので、膣レベルのみならず全身レベルで微生物学的抵抗性を誘発し得る。
【００１８】
欧州特許第０５４７２９４号（特許文献１４）には、５０〜５００ｍｇの量でリファキシミンを含む組成物が記載され、リファキシミンに感受性の微生物によって生じた膣感染症の治療に有用であると述べられている。特に、欧州特許第０５４７２９４号（特許文献１４）には、リファキシミン２００ｍｇを含むリファキシミン膣用泡剤（フォーム剤）及びクリーム剤の製剤により行われた臨床試験が記載されており、カプセル剤、膣坐剤（ovule）及び錠剤中にリファキシミンを含む細菌性膣症治療用組成物も記載されている。欧州特許第０５４７２９４号（特許文献１４）の表１には、ガードネレラ  バギナリス、バクテロイデス  ビビウス−ディシエンス（Bacteroides bivious-disiens）、モビルンカス属などの病原菌及び乳酸桿菌属などの非病原菌の両方に対するリファキシミンの重要な抗菌活性が報告されている。これらの細菌は、膣分泌物中に一般に存在する。
【００１９】
乳酸桿菌属の存在は健康な膣環境を維持するために有益であるので、乳酸桿菌属の阻害は治療有効性に関して有害な事象であるとみなされなければならない。実際には、既に述べたように、乳酸桿菌属によって生じた酸環境は、病原菌の定着（colonization）を予防するための必須条件である。
【００２０】
欧州特許第０５４７２９２号（特許文献１５）の表１には、乳酸桿菌属に対するリファキシミンの阻害作用（ＭＩＣ５０及びＭＩＣ９０）が、病原菌［例えば、ガードネレラ  バギナリス、モビルンカス属種（Mobiluncus spp）、バクテロイデス  ビビウス−ディシエンス（Bacteroides bivius-disiens）など］に対する阻害作用と等しいか又はさらに高いことも示されている。したがって、膣経路を介して投与される場合、リファキシミンは、乳酸桿菌属を含む細菌フローラ全体に対して無差別に作用する。
【００２１】
デッビア  Ａ．（Debbia A.）ら、J. Chemother. 20, (2), 186-194, 2008（非特許文献７）には、リファキシミンが時間依存的な細菌活性を示すことが報告されている。
【００２２】
米国特許出願第１３／５５９，６１３号（特許文献１６）には、膣感染症の治療に有用なリファキシミンへの適切な曝露時間及びリファキシミンの局所濃度を提供する、膣感染症の治療に有効なリファキシミン医薬組成物が記載されており、この組成物は、膣感染症の再発予防に重要な乳酸桿菌属の濃度を減少させない。また、米国特許出願第１３／５５９，０１３号（特許文献１７）には、リファキシミンが１日用量１００ｍｇ／日未満で膣感染症の治療に有効であるという臨床試験が記載されている。
【００２３】
細菌性膣症の診断は、臨床的及び／又は微生物学的基準に基づいて行うことができる。臨床的診断は、アムセル  Ｒ．（Amsel R.）ら、Am. J. Med. 1983; 74(1): 14-22（非特許文献８）に記載のアムセル（Amsel）の臨床的診断基準に従って行われる。この診断では、以下の４つの症状のうち少なくとも３つが示された場合に陽性となる：（１）均質でかつ膣壁に付着する膣分泌物、（２）臭気試験陽性（膣分泌物に１０％水酸化カリウムを添加すると「魚臭」を発する）、（３）４．５より高い膣内ｐＨ、及び（４）２０％を超える量のクルー細胞（新鮮標本の顕微鏡検査によって同定される、細菌で被覆された扁平上皮膣細胞）。
【００２４】
微生物学的診断は、グラム染色による膣分泌物の顕微鏡検査を含むニュージェント（Nugent）のスコアの計算に基づく。３つの異なる膣内細菌種の存在及び量が決定される。特に、乳酸桿菌属の濃度が高いと低いスコアが得られ、ガードネレラ属（Gardnerella）及びバクテロイデス属の存在が確認されるとスコアが増え、そしてモビルンカス属の存在が確認されるとスコアはさらに高くなる。ニュージェント  ＲＰ（Nugent RP）ら、J. Clin. Microbiol. 1991, 29(2), 297-301（非特許文献９）に記載のように、スコア結果０〜３は健康な女性の膣内フローラを表し、スコア４〜６は膣内フローラが変わり始めていることを示し、スコア７〜１０は細菌性膣症感染の確実な診断を示す。
【００２５】
近年、チョウ  Ｘ（Zhou X）ら、Microbiology 2004, 150 (Pt8), 2565-2573（非特許文献１０）及びAppl. Environ. Microbiol. 2004, 70(6), 3575-3581（非特許文献１１）に記載のように、ＤＮＡの配列分析に基づくＰＣＲ−ＤＧＧＥ及びリアルタイムＰＣＲなどのさらなる診断的分子技術が開発されており、膣内生態系の微生物組成の同定が可能になっている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、単一の又は少数のＤＮＡの複製を数桁にわたって増幅して特定のＤＮＡ配列の複製を何千〜何百万生成するものであり、他の方法を用いると検出レベル未満の遺伝子（単数又は複数）を同定するために有用である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２６】
【特許文献１】イタリア国特許第１１５４６５５号
【特許文献２】欧州特許第０１６１５３４号
【特許文献３】米国特許第７，０４５，６２０号
【特許文献４】欧州特許第１５５７４２１Ｂ１号
【特許文献５】欧州特許第１６７６８４７Ｂ１号
【特許文献６】欧州特許第１６７６８４８Ｂ１号
【特許文献７】ＷＯ２００５／０４４８２３
【特許文献８】ＷＯ２００６／０９４６６２
【特許文献９】ＷＯ２００８／１５５７２８
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００９／３１２３５７号
【特許文献１１】ＷＯ２００９／１０８７３０
【特許文献１２】ＷＯ２０１１／１５３４４４
【特許文献１３】ＷＯ２０１１／１５６８９７
【特許文献１４】欧州特許第０５４７２９４号
【特許文献１５】欧州特許第０５４７２９２号
【特許文献１６】米国特許出願第１３／５５９，６１３号
【特許文献１７】米国特許出願第１３／５５９，０１３号
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】メルクインデックス第１３版（The Merck Index, XIII ed.）, 8304, CAS No. 80621-81-4
【非特許文献２】メルクインデックス第１３版（The Merck Index, XIII ed.）, 8301
【非特許文献３】Cryst. Eng Comm.、2008、10 1074-1081 (2008)
【非特許文献４】Int. J. Clin. Pharmacol. Res., 14 (2), 51-56, (1994)
【非特許文献５】米国疾病予防管理センター（Center of Disease Control (CDC)）, 2010, 59, NoRR-12のガイドライン
【非特許文献６】Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 2001, 9(1), 41-45
【非特許文献７】J. Chemother. 20, (2), 186-194, 2008
【非特許文献８】Am. J. Med. 1983; 74(1): 14-22
【非特許文献９】J. Clin. Microbiol. 1991, 29(2), 297-301
【非特許文献１０】Microbiology 2004, 150 (Pt8), 2565-2573
【非特許文献１１】Appl. Environ. Microbiol. 2004, 70(6), 3575-3581
【発明の概要】
【００２８】
（発明の概要）
本発明は、膣感染症、特に細菌性膣症（ＢＶ）を診断するための新たな方法に関する。本発明の診断方法は低侵襲性であり、特異的タンパク質の使用によって、例えば、患者の膣液中のタンパク質の数及び型（タイプ）を、健康な又は感染されていない状態を示す膣液の参照サンプル中のタンパク質の数及び型（タイプ）と比較して決定することによって、ＢＶの評価を可能にする。本発明の一実施形態は、膣液中に存在する特異的タンパク質を特徴付けることによって膣感染症を診断するための方法である。一実施形態は、患者がＢＶから寛解（回復）するため、又は患者のＢＶを根絶するために最も有効な抗生物質及び投薬量を選択するために、前記特徴付けられたタンパク質を使用することに関する。
【００２９】
一実施形態において、本発明は、膣内細菌感染を診断する方法を提供し、この方法は、膣液サンプルをプロテオーム解析に供する工程、及び参照サンプルにおけるタンパク質の発現レベルと比較して、検査液サンプルにおいて発現レベルが変化したタンパク質を決定する工程であって、１又は複数のタンパク質の発現レベルの減少又は増大により膣感染症を診断する工程を含む。特定の実施形態において、１又は複数のタンパク質は、表１及び２に列挙されたタンパク質から選択される。いくつかの実施形態において、検査サンプルと参照サンプルとの発現増大の比率は、約１．５〜約４０の範囲にある。他の実施形態において、検査サンプルと参照サンプルとのタンパク質発現減少の比率は、約−１．５〜約−５６５０の範囲にある。
【００３０】
別の実施形態において、寛解及び回復の状態は、感染後の治療に反応した個体由来のサンプルにおけるタンパク質の発現のレベルを、健康な個体を表す参照サンプルにおけるタンパク質のレベルと比較することによって評価されてもよい。
【００３１】
別の実施形態において、本発明は、抗生物質による治療後に寛解の検査を受ける個体の細菌性膣感染症からの寛解の状態を診断する方法を提供し、この方法は、抗生物質による治療後に検査を受ける個体から得られた膣液サンプルをプロテオーム解析に供すること、及びＢＶ感染した個体（好ましくは、治療前の同じ個体）由来の液体を表す参照サンプルにおけるタンパク質の発現レベルと比較して、検査液サンプルにおいて発現レベルが変化したタンパク質を決定することであって、参照サンプルに対して検査サンプルにおける少なくとも１つのタンパク質の発現レベルの減少又は増大により、抗生物質による治療後のＢＶからの寛解の状態を診断することによる。
【００３２】
さらなる実施形態において、本発明は、感染された女性の膣サンプルのプロテオーム解析に基づいてＢＶの寛解及び回復を予測するための診断方法を提供し、この方法において、健康な又は感染されていない女性と比較して、発現されたタンパク質のレベルの比率が１より大きい場合にＢＶが同定される。いくつかの実施形態において、抗生物質の最適な又は有効な用量及び治療の時間を選択する方法は、参照サンプルに対して検査サンプルにおけるタンパク質発現レベルの減少又は増大に基づいて提供される。有効な治療は、種々の治療の前後のタンパク質発現における変化を比較して同定することもでき、最も有効な治療は、発現が異なるタンパク質が最大数であるプール（pool）に対応している。非応答（無反応）患者は、抗生物質（例えば、リファキシミン）による治療後の寛解などで特徴付けられない患者として同定される。
【００３３】
別の実施形態において、本発明は、膣内細菌感染を診断するため、又は寛解を評価するための検査キットを提供し、本明細書に開示された方法によって治療の有効性も提供される。前記キットは、膣感染症を同定するために有用な少なくとも１つのタンパク質（例えば、表７及び８において同定されたタンパク質、好ましくは表１又は２において同定されたタンパク質）と、質量分析を用いて膣感染症を診断する方法を実施するための説明書とを含む。
【００３４】
別の実施形態において、本発明は、個体における膣内細菌感染を治療するための抗生物質の使用を提供し、この使用は、膣液サンプルをプロテオーム解析に供することを含む感染診断に基づいて医薬組成物を個体に治療的に有効な量で投与すること、及び参照サンプルにおけるタンパク質の発現レベルと比較して、検査液サンプルにおいて発現レベルが変化したタンパク質を決定することであって、１又は複数のタンパク質の発現レベルにおける減少又は増大により膣感染症を診断することを含む。
【００３５】
本明細書で同定された特異的タンパク質は、（i）検査される個体において細菌性膣感染症からの寛解を評価すること、（ii）細菌性膣感染症が抗生物質による治療を行うことによって寛解になる可能性を診断の際に予測又は決定すること、及び（iii）感染症からの寛解を得るために最も有効な抗生物質及び／又は投薬量を選択又は同定することにおいて有用である。特に、本発明には、リファキシミンによる治療後のＢＶの寛解を評価するための特異的タンパク質の使用が記載されている。また、検査を受ける患者が抗生物質による治療後に感染症から寛解になる可能性を予測又は決定することが可能である。
【００３６】
別の実施形態において、本発明はまた、ＢＶに罹患した女性のリファキシミンによる治療の有効性を評価及び予測するための方法も提供する。
【００３７】
特定の実施形態において、本発明は、リファキシミンによる治療の有効性を、治療中及び治療前に評価するための診断方法を提供する。
【００３８】
別の特定の実施形態において、本発明は、膣液中の特異的タンパク質の存在によって、ＢＶに罹患した女性が寛解するか否かを予測するための診断方法を提供する。
【００３９】
本発明は、膣感染症を診断するための方法を提供し、膣感染症を治療する方法の有効性を評価し、そして膣感染症を治療するための治療のクール（一連の治療）前、クール中及びクール後の種々の時点でサンプリングされた膣液のプロテオームプロファイル（proteomic profiles）の比較に基づいて特定の治療のクールに対する非応答（無反応）者（non-responder）を同定することによって、当該分野の欠点及び問題を解決する。
【００４０】
別の実施形態において、膣感染症を診断するための方法が提供され、この方法は、膣液の検査サンプルのプロテオームプロファイルを膣液の正常又は参照サンプルのプロテオームプロファイルと比較する工程、及び表１又は表２のタンパク質の総数が少なくとも１又は複数である場合に膣感染症の存在を決定する工程を含む。
【００４１】
別の実施形態において、膣感染症の治療の有効性を評価するための方法が提供され、この方法は、治療のクール中又は治療のクール後の膣液の検査サンプルのプロテオームプロファイルを、治療のクール前又は治療のクールの初期に採取した膣液のサンプルのプロテオームプロファイルと比較する工程、及び表１又は表２のタンパク質の総数が少なくとも１である場合に膣感染症の寛解を決定する工程を含む。
【００４２】
別の実施形態において、膣感染症の最も有効な治療を同定するための方法が提供され、この方法は、膣感染症と診断された患者の各プールに別個の治療のクールを与える工程、治療のクール中又は治療のクール後の膣液の検査サンプルのプロテオームプロファイルを比較する工程、及び発現が異なるタンパク質が最大数であるプロテオームプロファイルを有する患者プールを同定することによって最も有効な治療を決定する工程を含む。とりわけ、比較されるサンプルは、意義のある比較を提供するように同じ時間間隔で採取されるべきである。
【００４３】
別の実施形態において、膣感染症の治療中又は治療後の寛解及び回復を予測するための方法が提供され、この方法は、膣感染症と診断された患者由来の膣液の検査サンプルのプロテオームプロファイルを、膣液の正常又は参照サンプルのプロテオームプロファイルと比較する工程、及び表１、表２又は両方の表から選択されるタンパク質の総数が少なくとも１又は１０以上である場合に膣感染症の寛解を予測する工程を含む。
【００４４】
記載された方法によると、表１、表２又はこれらの組み合わせに示される特異的タンパク質は、「バイオマーカー」とも称される。膣液中に存在するこれらのタンパク質は表７及び８によって選択され、健康な女性に対して膣感染症に罹患した女性の膣液における最も重要なタンパク質を表す。「バイオマーカー」とも定義される特定の好ましいタンパク質としては、ビタミンＤ結合タンパク質、デスモコリン−２、カルシウム依存性塩素チャネル制御因子４、カタラーゼ、低分子プロリンリッチタンパク質３、ガレクチン−３−結合タンパク質、ヘモペキシン、免疫グロブリンファミリー、中間径フィラメントファミリー、リポカリンファミリー、α１−酸性糖タンパク質１、α１−酸性糖タンパク質２、好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン、リンパ球特異的タンパク質１、ミエロブラスチン、ペリリピン−３、ペリプラキン、タンパク質Ｓ１００−Ａ９、タンパク質Ｓ１００−Ａ７及びスーパーオキシドディスムターゼ［Ｃｕ−Ｚｎ］が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、収集した膣液のサンプルの計画である。
【図２】図２は、ＭＳ／ＭＳデータの多変量解析。膣内微生物相の比較の分子解析である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
（実施形態の詳細な説明）
特に規定されない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は、本発明の属する分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。シングルトン（Singleton）ら、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994)は、本出願で使用される多くの用語に対する一般的な指針を当業者に提供する。
【００４７】
用語「プロテオーム」は、本明細書において、所定の時間での生体サンプル中の重要な（大部分の）タンパク質を記述するために用いられる。プロテオームの概念は、ゲノムとは根本的に異なる。用語「プロテオーム」又は「プロテオームプロファイル」は、所定の時間での生体サンプル（例えば、膣液）中の複数のタンパク質の発現パターンの表示を言及するために用いられる。プロテオームプロファイルは、例えば、質量スペクトルとして表すことができるが、他の表示（例えば、同定又は発現されたタンパク質又はそのフラグメントのスペクトルを含む、タンパク質の物理化学的又は生化学的特性に基づくクロマトグラフスペクトル）も含まれる。したがって、プロテオームプロファイルは、例えば、二次元ゲル電気泳動（例えば、２−Ｄ  ＰＡＧＥ）によって測定されるタンパク質の電気泳動的特性における差異に基づいていてもよく、二次元電気泳動ゲル中の複数の点（スポット）として表すこともできる。あるいは、プロテオームプロファイルは、二次元液体クロマトグラフィーによって測定されるタンパク質の等電点及び疎水性における差異に基づいていてもよく、例えば、コンピュータで作成された視覚的二次元地図（マップ）として表すこともでき、又は、系中のタンパク質の分子量に基づいて（例えば、分子量の異なるタンパク質を分離できる様々な多孔度を有する膜に基づいて）分離されてもよい。
【００４８】
用語「タンパク質」又は「バイオマーカー」は、特に重要な診断的価値を有する。膣液中のタンパク質は、病理学的状態（例えば、膣感染症）の徴候で、経過中に、及び／又は寛解において、増大又は減少し得る。発現が異なるタンパク質又はバイオマーカーの数は、特に重要な診断的、評価的及び予測的価値を有する。例えば、抗生物質による治療の有効性を評価する本発明の方法において、発現が異なるタンパク質の数が多いほど、治療が効果的であることをより強く示す。発現が異なるタンパク質が少なすぎる場合、患者は非応答者と同定することができ、その患者に疾患の寛解を達成させるために治療のクールの調整（例えば、抗生物質の変更、投薬量の変更、投与の頻度の変更など）が必要であろう。また、最も有効な治療は、異なる治療法によって治療された異なる患者プール間で、発現が異なるタンパク質の数を比較することによって同定されてもよい。発現が異なるタンパク質の最大数が得られる治療法を、最も有効であるとして選択できる。
【００４９】
健康な膣液（参照サンプル、正常な又は感染されていないサンプル）及び細菌性膣症と診断された患者から得られた膣液（検査サンプル）などの異なる供給源由来のサンプルを比較して、上方制御（up-regulated）又は下方制御（down-regulated）されたタンパク質（「バイオマーカー」）を検出できる。これらのタンパク質は、例えば、ペプチドマスフィンガープリンティング及び／又は質量分析及びシークエンシング法を用いて同定及び十分なキャラクタリゼーション（特徴付け）のために摘出でき、あるいは、正常な及び／又は疾患特異的なプロテオームマップは、当該疾患（細菌性膣症））の診断のために、又は疾患の存在、非存在もしくは状態を確認するために直接的に用いることができる。ダサリ  Ｓ．（Dasari S.）ら、J Proteome Res 2007, 6, 1258-68及びゼーヘルス（Zegels）ら、Proteome Sci 2010, 8, 63に記載のように、膣液（ＶＦ、頚膣液（ＣＶＦ）とも称する）は、水、電解質、低分子量有機化合物（グルコース、アミノ酸及び脂質）並びに血漿漏出液、頚／膣上皮細胞、子宮頚内膜、絨毛膜及び膣内微生物相から生じるありとあらゆるタンパク質及びタンパク質分解酵素からなる複雑な生体液である。ビゲロー（Bigelow）、Hum Reprod 2004, 19, 884-92に記載のように、膣液は、外部病原体に対する最初の防御線を形成し、受精能力（fertility）を知らせ、受精、妊娠及び出産を促進する。
【００５０】
患者からの膣液の収集は低侵襲性であり、かつ比較的安全であるので、膣感染症（例えば、ＢＶ）などの病理学的状態の診断のため、並びに治療、診断及び予防戦略の開発のためのバイオマーカー源として特に便利かつ有用である。
【００５１】
膣感染症の診断は、「患者の反応（patient response）」の同定を含み、この同定は、膣感染症状態の変化を示す任意のエンドポイントを用いて評価でき、このような状態の変化としては、（１）膣感染症の進行の少なくともある程度までの阻害、（２）膣感染症の予防、（３）膣感染症と関連する１又は複数の症状又は指標（ニュージェントのスコア又はアムセルの診断基準など）の少なくともある程度までの寛解、並びに／又は（４）病的状態と関連する全ての症状又は指標が存在しないか、及び／もしくは個体とその膣液とが治療後の所定の時点で健康な状態に戻る治癒が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
用語「治療」又は「治療のクール」とは、治療上の処置及び予防的又は防止的手段の両方をいい、この目的は、標的とされた病的状態又は障害を予防し、又は鈍化（寛解）もしくは回復（病理学的状態の全ての指標を消去）させることである。治療には、１又は複数の薬理学的に活性な物質（薬物）、その投薬量及び頻度の選択及び管理、並びに最善の有効性のための剤形の選択を含む。治療を必要とする人としては、前記障害（例えば、ＢＶ）を既に患っている人、並びに前記障害（再発性感染）を有する傾向のある人又は前記障害が予防されるべき人が挙げられる。
【００５３】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、個体の膣内細菌感染を治療することは、膣液サンプルをプロテオーム解析に供することを含む感染診断に基づいて医薬組成物を個体に治療的に有効な量で投与することを含む。リファキシミン及びリファキシミンの医薬組成物の形態は、米国特許第７，０４５，６２０号；同第８，１５８，７８１号；同第８，１７３，８０１号；同第７，９０２，２０６号；同第８，２１７，０５４号；同第７，９２３，５５３号；同第８，１５８，６４４号；同第８，１９３，１９６号；及び同第６，１４０，３５５号に記載されており、これらの文献は、参照することによりその全体が本明細書に全て組み入れられる。
【００５４】
本発明は、膣感染症の非侵襲性診断のための方法及び手段に関し、この方法及び手段は、患者又は異なる患者プール（例えば、健康な患者、疾患を有する患者及び治療の様々なステージの患者）から得られた膣液のプロテオームプロファイルの比較によって決定される異なったタンパク質発現に基づく。
【００５５】
本明細書に記載の方法によって同定されるように、膣液中に存在し、膣感染症の徴候及び／又は寛解とともに増大又は減少する特異的タンパク質及びタンパク質ファミリーを、「バイオマーカー」と称する。これらのバイオマーカーは、（i）膣感染症を診断するため、（ii）膣感染症の治療の有効性を予測及び／又は評価するため、並びに（iii）抗生物質、投薬量及び頻度などの最も有効な治療を同定するために、客観的にかつ本明細書に記載の方法に従って測定できる。これらのタンパク質は、当業者に公知のプロテオーム技術などのタンパク質決定のための分析技術（例えば、質量分析）を用いて決定できる。
【００５６】
本明細書には、寛解及び治癒を含む疾患の様々なステージで細菌性膣症の状態を診断及び／又は評価するために、膣液中に存在する特異的タンパク質（バイオマーカー）を使用することが記載されている。特異的タンパク質は、プロテオーム解析の分野で公知の技術を用いて膣液のプロテオームプロファイルを解析することによって特徴付けられる。
【００５７】
一態様において、本発明は、特異的タンパク質の発現の差異又は変化を決定することによって女性の膣感染症を診断するための新たな低侵襲性の方法を有利に提供する。記載された特異的タンパク質はまた、抗生物質によるＢＶの治療の有効性を予測及び評価するため、並びにＢＶの治癒及び寛解のための有効な抗生物質投薬量を同定するために有用である。
【００５８】
本発明の方法に従って見出された特異的タンパク質の存在の評価によって、膣感染症における抗生物質による治療の有効性を、その治療中又は治療前にも予測することが可能である。特異的タンパク質の発現レベル又は発現レベルの変化は、リファキシミンによる治療後の膣感染症の治癒、回復及び寛解を評価及び予測するために使用できる。さらに、前記方法によると、所定の患者のための最も有効なリファキシミン投薬量の同定、並びに治療のクール（例えば、リファキシミン療法）に反応していない患者の同定が可能である。膣液中に存在する特異的タンパク質を同定することによって、抗生物質による治療（特に、リファキシミンによる治療）後の感染症の寛解、回復又は除去（elimination）を高い成功率で予測可能である。本発明の方法はまた、プロテオミクス、質量分析、Ｅｌｉｓａ（酵素結合免疫吸着法）、ウェスタンブロッティング、核磁気共鳴（ＮＭＲ）などの分析技術を用いて、膣感染症を診断するため、膣感染症からの寛解又は回復を評価するため、及び抗生物質による治療を終了して患者が寛解に至る可能性及びこの寛解を得るために最適な投薬量を診断の際に評価するために有用な、特異的タンパク質のセットを提供する。
【００５９】
本発明の方法によると、プロテオーム技術は、バイオマーカーとして同定された特異的タンパク質を分析及び／又は特徴付けることによってＢＶを診断するために有用である。質量分析、Ｅｌｉｓａ、ウェスタンブロッティング、ＮＭＲなどの当該分野で利用可能な他の分析技術もまた、タンパク質の量を分析及び決定するために有用である。
【００６０】
膣感染症の状態を同定するために有用な少なくとも１つのタンパク質の特徴付けに使用するための診断キットも、提供される。前記キットは、質量分析を用いて膣感染症を診断する方法を実施するための説明書を含む。
【００６１】
本発明の診断方法は、臨床試験に登録された女性から収集された膣液に対して検査され、１８歳〜５０歳の閉経前の妊娠していないベルギー人女性８０名について分析された。スクリーニング来院（Ｖ１）において、アムセルの診断基準とグラム染色によるニュージェントのスコアリングとの両方を用いて、健康であるかＢＶであるかの診断がなされた。ニュージェントのスコアが３より大きく、かつ４つのアムセルの診断基準のうち少なくとも３つが陽性である患者は、ＢＶ陽性であるとみなされた。この臨床的評価に従って、女性を、健康な被験体（Ｈ）（ｎ＝４１）及びＢＶと診断された患者（ｎ＝３９）の２つの群に分類した。試験来院（study visit）Ｖ１でＢＶと診断された患者を、米国特許出願第１３／５５９，０１３号に報告された多施設二重盲検無作為プラシーボ対照試験（multicenter, double-blind, randomised, placebo-controlled study）（ＥｕｄｒａＣＴ：２００９−０１１８２６−３２）に含めた。この試験は、ＢＶの治療について、プラシーボに対する様々な用量のリファキシミン膣錠（膣用錠剤）の有効性を比較するために実施された。これらの患者は、無作為化来院を行って４つの治療群に分類された。
・Ａ群は、１００ｍｇリファキシミン膣錠を１日１回５日間投与された（ｎ＝１０）。
・Ｂ群は、２５ｍｇリファキシミン膣錠を１日１回５日間投与された（ｎ＝１０）。
・Ｃ群は、１００ｍｇリファキシミン膣錠を１日１回最初の２日間、次いでプラシーボ膣錠を残りの３日間投与された（ｎ＝９）。
・Ｄ群は、プラシーボ膣錠を１日１回５日間投与された（ｎ＝１０）。
【００６２】
この治療の終了から７〜１０日後、追跡来院（Ｖ３）を実施した。寛解は、アムセルの診断基準（３未満）及びグラム染色によるニュージェントのスコア（３以下）に従ってＶ３で評価された。
【００６３】
２ｍＬの生理食塩水による標準化膣洗浄物（standardized vaginal rinsings）（すなわち、膣液又はＶＦ）を分析のためにＶ１及びＶ３において収集し、ＤＮＡ及びタンパク質をさらなる分析のために膣液から分離した（すなわち、膣分離物）。
【００６４】
定量ＰＣＲ（リアルタイム定量ＰＣＲ）を、膣内微生物相がもたらす不均衡に関与する細菌群の同定及び定量化のため、特に、ＢＶの存在下において影響を及ぼすことが知られている主な細菌群［乳酸桿菌属（Lactobacillus）、アトポビウム属（Atopobium）、ガードネレラ  バギナリス、プレボテラ属、ベイヨネラ属（Veillonella）、モビルンカス属及びマイコプラズマ  ホミニスなど］の濃度を決定するために使用した。
【００６５】
定量ＰＣＲを、健康な女性（Ｈ）、Ｖ１においてＢＶに罹患していた女性（ＢＶ）、Ｖ３においてリファキシミンによる治療後に寛解していた女性（Ｒ）、及びＶ３において抗生物質又はプラシーボによる治療後に寛解していなかった女性（Ｎ）のＣＶＦから抽出したＤＮＡサンプルについて実施した。
【００６６】
膣内微生物相組成の分子解析を表５に示す。この表において、被験体の臨床的状態［健康（Ｈ）又はＢＶ罹患（ＢＶ）、及び抗生物質による治療に対する反応性について、寛解（Ｒ）又は非寛解（Ｎ）］に関して、分析された細菌群を保有する女性の割合が示されている。乳酸桿菌属、アトポビウム属、Ｇ．バギナリス、プレボテラ属、ベイヨネラ属、モビルンカス属及びＭ．ホミニスの定量化を、表６に示す。このデータは、定量ＰＣＲ解析において膣サンプルから抽出された総細菌ＤＮＡ（μｇ）あたりの標的属又は種のＤＮＡ（ｎｇ）として表される。
【００６７】
このデータから、乳酸桿菌属はＨ群よりもＢＶ群で有意に低いことが確認される。抗生物質による治療後、Ｒ群における乳酸桿菌属の中央値はＢＶ群よりも約１０倍高い。これに対して、Ｎ群で測定された乳酸桿菌属は、ＢＶ群と非常に類似しており、Ｈ群及びＲ群の両方と比較して有意に低かった。Ｒ群におけるアトポビウム属の濃度は、Ｈ群と比較して依然として高いとはいえ、ＢＶ群において検出された濃度よりも有意に低かった。Ｎ群は、Ｈ群及びＲ群の両方と比較してアトポビウム属の量が有意に高かった。アトポビウム属と同様に、Ｇ．バギナリス及びプレボテラ属は、Ｈ群及びＲ群において非常に低い濃度で存在しており、ＢＶ群及びＮ群においては有意に高い濃度が認められた。ベイヨネラ属及びモビルンカス属は、Ｈ群及びＲ群に属するいずれの女性においても定量化されなかった一方、ＢＶ群及びＮ群に属する女性のほとんどは、これらの細菌群を保有していなかった。Ｒ群において、ＢＶ群と比較してＭ．ホミニスの有意な低減が認められた。
【００６８】
臨床試験に登録された女性から収集した標準化膣液を、定性的及び定量的プロテオーム技術（例えば、定量ＰＣＲ）によって解析し、膣液中に存在するタンパク質を特徴付けた。例えば、タンパク質を膣液から分離し、そしてこれらの膣分離物を必要に応じて分画（例えば、クロマトグラフィー）し、次いで質量分析技術（ＭＳ／ＭＳ）を用いて、あるサンプル又はサンプルプール由来の特異的タンパク質の量と比較した他のサンプル又はサンプルプール由来の特異的タンパク質の量の変化を検出した。プロテオームプロファイルを比較して、プロテオームの差異、例えば、健康な患者と疾患を有する患者との間、又は治療及び寛解の異なるステージの患者間のプロテオームの差異を同定した。
【００６９】
プロテオーム解析を、ＢＶ感染の状態に従ってグループ分けした以下の９プールの膣分離物について実施した。
・Ｈプール（４１名の健康な女性由来）；ＢＶプール（３９名のＢＶ罹患女性由来）
・Ａ−Ｒプール（Ａ群のリファキシミン治療後に寛解していた２名の女性由来）
・Ａ−Ｎプール（Ａ群のリファキシミン治療後に寛解してなかった８名の女性由来）
・Ｂ−Ｒプール（Ｂ群のリファキシミン治療後に寛解していた５名の女性由来）
・Ｂ−Ｎプール（Ｂ群のリファキシミン治療後に寛解してなかった５名の女性由来）
・Ｃ−Ｒプール（Ｃ群のリファキシミン治療後に寛解していた４名の女性由来）
・Ｃ−Ｎプール（Ｃ群のリファキシミン治療後に寛解してなかった５名の女性由来）
・Ｄ−Ｎプール（Ｄ群のプラシーボ治療後に寛解していなかった１０名の女性由来）
診断方法を検査するために収集した膣液の一覧（スキーム）を、図１に示す。
【００７０】
データベース検索は、獲得した質量分析データを用いて実施し（Ｍａｓｃｏｔ検索エンジン、Matrix Scienceによって提供されたデータベース）、健康な女性（Ｈ）及びＢＶに罹患した女性（ＢＶ）から得られた分画プール中の合計１３１のヒト及び微生物タンパク質を同定した。興味深いことに、ＢＶプールに対応するヒトタンパク質の大部分（すなわち、約７０％）における発現変化は、比率（割合）の中央値５．５（範囲１．５〜５２１．１倍）で上方制御された。５０倍より大きい発現変化は、ＮＳＦＬ１補因子ｐ４７（５２１．１倍）、ＥＲＯ１様タンパク質α（９０．２倍）、デスモグレイン−３（５９．５倍）及びグリシン開裂系Ｈタンパク質（５３．５倍）について認められた。注目すべきことは、ＨＰＡによると、これらのタンパク質は全て、正常な女性組織において中程度から強度に発現されることである。−１．５〜−５６４５．４倍の範囲（中央値−７．０）の有意な下方制御は、約２５％のヒトタンパク質について生じた。最も高い発現変化はカルシウム依存性塩素チャネル制御因子４について観察され、ＨＰＡによると、この制御因子は主に消化管において発現され、泌尿生殖器官中に少量のみ存在する。
【００７１】
スーパーオキシドディスムターゼ（−４９．２倍）及びセルピンＢ４（−４３．５倍）もまた、有意に過少発現されたことが認められた。
【００７２】
ＭＳ／ＭＳによって同定された発現が異なるタンパク質のデータを用いて、多変量解析（multivariance analysis）を実行した。
【００７３】
多変量解析は、主成分分析（Principal Component Analysis（ＰＣＡ））として公知であり、ＰＣＡの結果を図２ａ及び図２ｂに示す。これらの図では、健康な女性及びＢＶに罹患した女性の分画プール中のペプチド並びにリファキシミンで治療された女性のペプチドが示される。リファキシミンによる治療は、１００ｍｇ／日の投薬量で５日間（寛解、Ａ−Ｒ；非寛解、Ａ−Ｎ）、２５ｍｇ／５日間（寛解、Ｂ−Ｒ；非寛解、Ｂ−Ｎ）、１００ｍｇ／２日間（寛解、Ｃ−Ｒ；非寛解、Ｃ−Ｎ）、及びプラシーボ５日間（Ｄ−Ｎ）であった。２つのタイプの比較を行った：（i）健康な女性の膣液（ＨＦ）由来のタンパク質の分画プールと、細菌性膣症に罹患した女性の膣液（ＢＶＦ）由来のタンパク質の分画プールとの比較；（ii）様々な用量のリファキシミン又はプラシーボの投与によって治療されたＢＶ罹患女性の膣液由来のタンパク質の全プールの治療前（ＢＶ）と治療後（Ａ−Ｒ、Ａ−Ｎ、Ｂ−Ｒ、Ｂ−Ｎ、Ｃ−Ｒ、Ｃ−Ｎ、Ｄ−Ｎ）との比較。タンパク質の分画プールは、例えば、ＭＳ／ＭＳによる解析に先立って、様々な膜多孔度を有する膜濾過による分離でタンパク質を分離することによって得られる。
【００７４】
プロテオーム技術によって同定されたタンパク質を、遺伝子オントロジー（Gene Ontology（ＧＯ））解析（ＡｍｉＧＯ  バージョン１．８、データベース公開２０１２−１１−０３）に供し、同定されたタンパク質と関連する生物学的プロセス、分子機能及び細胞内局在を同定した。ＭＳ／ＭＳデータについて、さらに、公に利用可能なHuman Protein Atlasデータベース（ＨＰＡ）を用いて組織発現パターンを評価した。
【００７５】
表９、１０及び１１は、健康な女性とＢＶに罹患した女性との間で発現が異なるとＭＳ／ＭＳで同定されたタンパク質の遺伝子オントロジー（ＧＯ）カテゴリー化に関する割合を示す。この分類は、生物学的プロセス、細胞の構成要素、分子機能のようなキーワードカテゴリーに従って行った。タンパク質が２以上の機能的カテゴリーと関連する場合、１つのＧＯ用語を任意に選択した。
【００７６】
各ヒトタンパク質について、ＧＯデータベースからの情報に基づいて、生物学的プロセス、細胞局在及び分子機能を定めた。発現が異なるタンパク質の最大群（約２３％）は、先天性免疫応答及び補体活性化に関与していた。興味深いことに、このＧＯカテゴリーは１４の免疫グロブリン鎖領域をグループ分けし、これらの領域は、免疫グロブリン（Ｉｇ）ｍｕ鎖Ｃ領域（−６．１倍の発現変化）を唯一の例外として、全てＢＶにおいて過剰に発現した（比率の中央値７．１）。ＢＶにおける顕著な上方制御は、補体Ｃ３（比率３４．５）、インター−α−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ１（比率３６．９）及びリンパ球特異的タンパク質１（比率２１．４）についても観察され、これらは、同じ生物学的プロセスカテゴリーに分類された。
【００７７】
上皮発達及び角質化は同定されたタンパク質の１５％を占めたのに対し、１４％が低分子代謝プロセスに関与すると分類された。タンパク質の５％のみが炎症反応に関与した。
【００７８】
制御異常の（dysregulated）タンパク質の半数以上は、細胞外空間に局在化（３７％）又は形質膜と関連（結合）（１６％）していた。
【００７９】
同定されたタンパク質の４分の１近くは、細胞質（２３％）であった。分子機能によると、発現が異なるタンパク質の５３％もが結合活性を有すると分類された。これらのうち、タンパク質結合（２０％）が最も多く示されたＧＯカテゴリーであり、次いでカルシウムイオン（１４％）及び抗原結合（１３％）であった。同定されたタンパク質の２０％が酵素活性に関連し、１７％が構造分子（細胞骨格分子）活性に関連していた。
【００８０】
発現が異なるヒトタンパク質を伴う経路及びネットワークは、機能解析用統合ソフトウェアであるＭｅｔａＣｏｒｅ（登録商標）（Thomson Reuter）を用いて解析された。濃縮解析（enrichment analysis）により、濃縮経路（enriched pathways）の大部分が細胞骨格再構成（cytoskeleton remodelling）、補体活性化（古典経路、副経路及びレクチン経路）及び血液凝固（データは示さず）に関連したことが明らかになった。タンパク質間のマップ相互作用のために、最短経路を「analyze network」アルゴリズムを用いて解析した。構築された機能的サブネットワーク（functional sub-networks）に基づくと、ＨＦプール及びＢＶＦにプールおいて発現が異なるタンパク質は、発達プロセス（Ｐ＝１．２２×１０−３１）、免疫系プロセス（Ｐ＝３．９３×１０−２２）及び化学的刺激に対する反応（Ｐ＝１．７１×１０−２０）に主に関与していた。
【００８１】
ＨＦプールとＢＶＦプールとで発現が異なっていた１３個の微生物タンパク質のうち、９個（約６９％）が乳酸桿菌属菌株（系統）に由来しており、Ｌ．アシドフィルス（L. acidophilus）、Ｌ．カゼイ（L. casei）、Ｌ．ガセリ（L. gasseri）及びＬ．ヘルベティカス（L. helveticus）種に属し、主にグルコース代謝及びタンパク質合成に関与していた。これら９個のうち、５個はＢＶＦプールにおいて比率の中央値−７．７で下方制御され、Ｌ．アシドフィルスに由来する４個のタンパク質を含む。Ｌ．アシドフィルスは、主なＨ２Ｏ２産生乳酸桿菌属種の１つであり、乳酸桿菌属が健康な膣内微生物相の保護に関与していることを支持する。
【００８２】
ＢＶにおいて過剰に発現された４個のタンパク質のうち、２個は、膣内に最も高い頻度で生じる乳酸桿菌属種の１つであるＬ．ガセリ由来である（比率の中央値３．２）。残りのタンパク質はＬ．カゼイ（ｎ＝１）及びＬ．ヘルベティカス（ｎ＝２）由来であり、これらの種は、直腸膣の交差汚染（cross-contamination）の結果として膣内生態系において認めることができる。興味深いことに、対照的な発現パターンを有する異なる乳酸桿菌属種から３個のエノラーゼ及び２個のトリオースリン酸イソメラーゼが同定され、このことは、これらのタンパク質とＢＶ状態との間に相関性がないことを示唆した。スタフィロコッカス  アウレウス（黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus））（低温ショックタンパク質ｃｓｐＡ）、Ｓ．エピデルミディス（表皮ブドウ球菌（S.epidermidis））（Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ）及びカンジダ  グラブラタ（Candida glabrata）（細胞質ｔＲＮＡ２−チオール化タンパク質２（Cytoplasmic tRNA 2-thiolation protein 2））由来の３個のタンパク質は、これらの細菌がどれもＢＶと関連していることが知られていないにもかかわらず、ＢＶＦプールにおいて有意に増大した（それぞれ、比率４８．０、３．６及び２．７）。サッカロミセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来の１個のタンパク質（転写因子ＰＤＲ８）は、ＢＶＦプールにおいて下方制御された（比率−３６．２）。
【００８３】
質量分析（ＭＳ／ＭＳ）によると、ＢＶに罹患した女性の膣液中で発現が異なると同定された２８４個のヒトタンパク質のほとんどは、リファキシミンで治療された患者において下方制御されたので、ＢＶに罹患した女性において観察されたタンパク質プロファイルの変化を妨げて膣内生態系に健康な状態を戻すことにリファキシミンが影響を与えることを示す。
【００８４】
表１０は、ＭＳ／ＭＳにより同定されたタンパク質の遺伝子オントロジー（ＧＯ）のカテゴリー化の割合を示し、前記同定されたタンパク質は、ＢＶに罹患した女性においてリファキシミン／プラシーボ治療の前後で発現が異なる。分類は、（ａ）生物学的プロセス、（ｂ）細胞の構成要素、（ｃ）分子機能などのキーワードカテゴリーに従って行い、タンパク質が２以上の機能的カテゴリーと関連する場合、１つのＧＯ用語を任意に選択した。
【００８５】
ＢＶと健康な女性（Ｈ）との比較と同様に、ＧＯ分類によって同定された主なカテゴリーは先天性免疫応答、補体活性化及び低分子代謝プロセスと関連しているのに対し、炎症反応に関与しているのはほんのわずかな割合（３％未満）のみである。しかし、免疫グロブリン及び他の免疫分子は、過少発現する傾向を示した。この所見は、ＢＶ対Ｈのデータセットについての結果の比較において認められた所見とは逆であり、抗生物質による治療後に免疫応答が全般的にシャットダウンする（general shutdown）ことを示す。
【００８６】
このプロテオミクス研究は、膣内プロテオームの調節における抗生物質投薬量の重要性も強調する。
【００８７】
このタンパク質解析において、プラシーボの投与は異なるタンパク質（発現が異なるタンパク質）の最小数と関連しており、その発現の変化は、リファキシミンで治療された女性において観察された傾向と逆の方向にある。
【００８８】
興味深いことに、Ａ−Ｎプール及びＢ−Ｎプールは、ＢＶプール並びにＣ−Ｒプール及びＣ−Ｎプールと一致していた。このことは、ＢＶに罹患した女性、リファキシミンによる治療後に寛解しなかった女性、及び２日間のみ抗生物質を投与された女性のプロテオームプロファイルの類似性を示唆する。
【００８９】
発現が異なるタンパク質の最大数は、２５ｍｇのリファキシミンを１日１回５日間投与した後に同定された。この投薬量は、タンパク質発現においても最高倍の変化をもたらしたので、ＢＶに関するプロテオームに対してこの治療レジメンが最も大きな影響を与えることも確認された。
【００９０】
いくつかの特異的タンパク質は、細菌感染を評価するために有意義である。表１及び表２は、健康な女性からサンプリングされた膣液を表す参照サンプルに対して、膣感染症に罹患した女性からサンプリングされた膣液中に存在する最も有意なタンパク質を選択する表７及び表８から得られた重要なタンパク質のセットを示す。これらのタンパク質は、感染症（例えば、細菌性膣症）の状態を診断及び評価するために有意義である。
【００９１】
これらの特異的タンパク質は、細菌性膣症（ＢＶ）に影響を受け、ＢＶの診断に有用であるので、「ＢＶ用の特異的バイオマーカー」と称される。表１は、健康な女性（例えば、感染していない女性）からサンプリングされた膣液を表す参照サンプルに対してＢＶに罹患した女性において増大する、重要なタンパク質のセットを示し、一方、表２は、健康な女性からサンプリングされた膣液を表す参照サンプルに対してＢＶに罹患した女性において減少する、重要なタンパク質のセットを示す。健康な状態又は感染（例えば、ＢＶ）の状態に対して減少又は増大する特異的タンパク質の例としては、ビタミンＤ結合タンパク質、デスモコリン−２、カルシウム依存性塩素チャネル制御因子４、カタラーゼ、低分子プロリンリッチタンパク質３、ガレクチン−３−結合タンパク質、ヘモペキシン、免疫グロブリンファミリー、中間径フィラメントファミリー、リポカリンファミリー、α１−酸性糖タンパク質１、α１−酸性糖タンパク質２、好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン、リンパ球特異的タンパク質１、ミエロブラスチン、ペリリピン−３、ペリプラキン、タンパク質Ｓ１００−Ａ９、タンパク質Ｓ１００−Ａ７、スーパーオキシドディスムターゼ［Ｃｕ−Ｚｎ］が挙げられる。
【００９２】
健康な女性からサンプリングされた膣液を表す参照サンプルに対して膣感染症患者からサンプリングされた膣液中に存在する特異的タンパク質の量の変化は、感染症（例えば、細菌性膣症）の存在を決定するために診断上有用である。
【００９３】
例えば、発現が異なるタンパク質が、表１において同定された特異的タンパク質の少なくとも１つであって、かつ１．５より大きい比率を有する場合、細菌感染が陽性であると診断される。好ましくは、表１において同定された特異的タンパク質の少なくとも２つが１．５より大きい比率を有する。より好ましくは、表１において同定された特異的タンパク質の３又はそれ以上が１．５より大きい比率を有する。本発明の方法のいくつかの実施形態において、前記比率は３より大きく、好ましくは５、１０又は２０より大きい。
【００９４】
別の例において、発現が異なるタンパク質が、表２において同定された特異的タンパク質の少なくとも１つであって、かつ−１．５未満の比率を有する場合、細菌感染は陽性であると診断される。好ましくは、表２において同定された特異的タンパク質の少なくとも２つが−１．５未満の比率を有する。より好ましくは、表２において同定された特異的タンパク質の３又はそれ以上が−１．５未満の比率を有する。上記方法のいくつかの実施形態において、前記比率は−３未満であり、好ましくは−５、−１０又は−２０より大きい。特定の例において、細菌感染は、−５０００未満（好ましくは−５５００未満）の比率でカルシウム依存性塩素チャネル制御因子４が低減することによって、陽性であると診断される。
【００９５】
【表１】
2016516988.tif 000003
【００９６】
【表２】
2016516988.tif 000004
【００９７】
表３及び４は、異なる投薬量及び異なる治療時間でのリファキシミンによる治療後において、寛解（Ｒ）にある女性に対するＢＶに罹患した女性（ＢＶ）の膣液中のタンパク質比率を示す。
【００９８】
表３は、以下の比較において、異なるリファキシミン投薬量での治療後のタンパク質の減少を示す：異なる投薬量のリファキシミンによって誘発された（Ｒ）（Ａ−Ｒ、Ｂ−Ｒ、Ｃ−Ｒ）に対するリファキシミンＢＶに罹患した女性（ＢＶ）。
【００９９】
治療後の患者からサンプリングされた膣液に対する、膣感染症（例えば、細菌性膣症）患者由来の膣液サンプル中に存在する特異的タンパク質の量の変化は、例えば、感染症が持続しており患者が治療に対して非応答者であるかどうか、感染症が寛解にあるかどうか、又は感染症が治癒しているかどうかなど、感染症の状態を評価するために診断上有用である。
【０１００】
例えば、発現が異なるタンパク質が、表３において同定された特異的タンパク質の少なくとも１つであって、かつ１．５より大きい比率を有する場合、細菌感染の寛解が積極的に（positively）決定される。好ましくは、表１において同定された少なくとも２つの特異的タンパク質が１．５より大きい比率を有する。より好ましくは、表１において同定された特異的タンパク質の３又はそれ以上が１．５より大きい比率を有する。本発明の方法のいくつかの実施形態において、前記比率は２より大きく、好ましくは３、５又は１０より大きい。特定の実施形態において、寛解は、１．５より大きな比率でヘモペキシン又はタンパク質Ｓ１００−Ａ７が増大することによって判断される。
【０１０１】
別の例において、発現が異なるタンパク質が、表４において同定された特異的タンパク質の少なくとも１つであって、かつ−１．５未満の比率を有する場合、細菌感染の寛解が積極的に決定される。好ましくは、表２において同定された特異的タンパク質の少なくとも２つが−１．５未満の比率を有する。より好ましくは、表２において同定された特異的タンパク質の３又はそれ以上が−１．５未満の比率を有する。上記方法のいくつかの実施形態において、前記比率は−３未満であり、好ましくは−５、−１０又は−２０より大きい。特定の例において、細菌感染の寛解は、−１．５未満、好ましくは−２未満、より好ましくは−３未満の比率で低分子プロリンリッチタンパク質３、ペリリピン−３、ペリプラキン及び／又は免疫グロブリンＪ鎖が低減することによって、積極的に決定される。
【０１０２】
様々な治療後の膣感染症患者のプールからサンプリングされた膣液中に存在する特異的タンパク質の量の差異は、感染症の状態を評価するための最も有効な治療を同定するために有用である。一般に、治療の有効性は、特定の治療について（治療前後のプロテオームプロファイルの比較によって決定される）発現が異なるタンパク質の総数によって評価できる。発現が異なるタンパク質（特に、表３及び４において同定されたタンパク質）の数が多いほど、治療の有効性が大きい。
【０１０３】
【表３】
2016516988.tif 000005
【０１０４】
表４は、以下の比較において、リファキシミンによる治療後に増大するタンパク質を示す：異なる投薬量のリファキシミンによって誘発された（Ｒ）（Ａ−Ｒ、Ｂ−Ｒ、Ｃ−Ｒ）に対するＢＶ。
【０１０５】
【表４】
2016516988.tif 000006
【０１０６】
米国特許出願第１３／５５９，６１３号（参照することによりその全体が本明細書に組み入れられる）に記載の臨床試験には、Ｂ群が２５ｍｇリファキシミンによる５日間の治療後に感染から寛解したことが示されている。本明細書に記載の方法の一態様は、ＢＶの治療の有効性を評価することであり、例えば、ＢＶの寛解を同定することは、本明細書に記載の特異的タンパク質の発現における変化によって示される。別の態様は、抗生物質による治療（特に、リファキシミン療法）に対する患者の反応（応答）を評価することである。非応答患者の同定は、投薬量を変更するか又は抗生物質療法を変更するかのいずれかによってＢＶが寛解にある積極的な臨床的反応をもたらすように治療を修正するために特に重要である。
【０１０７】
表３及び４は、ビタミンＤ結合タンパク質、免疫グロブリンファミリー、リポカリンファミリー、ミエロブラスチンファミリーが、リファキシミンによる治療後のＢＶの寛解を評価するための好ましい特異的バイオマーカーであることを示す。免疫グロブリンファミリー（免疫グロブリンｍｕ鎖Ｃ領域及び免疫グロブリンＪ鎖）；リポカリンファミリー（α１−酸性糖タンパク質１、α１−酸性糖タンパク質２）；中間径フィラメントファミリー（ケラチンＩＩ型細胞骨格１、上皮ケラチンＩＩ型細胞骨格２及びケラチンＩＩ型細胞骨格５）における特異的タンパク質も好ましい。
【０１０８】
本発明の方法の開示によると、プロテオーム技術は、バイオマーカーとして同定された特異的タンパク質を分析及び／又は特徴付けることによってＢＶを診断するために有用である。Ｅｌｉｓａ、ウェスタンブロッティング、ＮＭＲなどの当該分野で利用可能な他の分析技術もまた、タンパク質の量を分析及び決定するために有用である。
【０１０９】
膣感染症を同定するために有用な少なくとも１つのタンパク質の特徴付けに使用するための診断キットも、提供される。前記キットは、質量分析を用いて膣感染症を診断する方法を実施するための説明書を含む。
【０１１０】
実施例１には、ＤＮＡの配列分析に基づくリアルタイムＰＣＲが記載され、健康な女性及びＢＶに罹患した女性において収集されたサンプルの膣内生態系の微生物組成を示す。
【０１１１】
実施例２には、質量分析を用いて膣液中に存在するタンパク質の決定（プロテオームプロファイル）が記載されており、表７は、質量分析による解析によって同定される、健康な女性（ＨＦ）とＢＶに罹患した女性（ＢＶＦ）とで発現が異なるタンパク質を示す。
【０１１２】
表８は、質量分析による解析によって同定される、治療前（ＢＶ）と治療後（Ａ−Ｒ、Ａ−Ｎ、Ｂ−Ｒ、Ｂ−Ｎ、Ｃ−Ｒ、Ｃ−Ｎ、Ｄ−Ｎ）とでＢＶに罹患した女性において発現が異なるタンパク質を示す。
【０１１３】
リファキシミン及びプラシーボによる治療後、２８４個のヒトタンパク質が、ＢＶに罹患した女性由来の膣液中に存在すると同定され、４８個（約１７％）が、ＢＶプールと比べて、抗生物質の投薬量にも臨床的成果にも関係なく、リファキシミン治療された女性由来の全プールにおいて存在した。特に、２３個のタンパク質が治療後に増大し、１７個のタンパク質が治療後に減少したのに対して、残りの８個のタンパク質については、タンパク質存在量の対照的な変化が観察された。とりわけ、リファキシミン治療群において、ケラチンＩＩ型細胞骨格７４（範囲７８９．６〜１３４２４．４倍）、タンパク質ＦＡＭ２５（範囲４３７．６〜８９４４．５倍）及びウェルナー症候群ＡＴＰ依存性ヘリカーゼ（範囲１２．４〜７５０．５倍）について数百〜千倍以上の増大が認められた。興味深いことに、これらのタンパク質について最も高い変化は、Ｂ−Ｒプール、次いでＡ−Ｒプールにおいて生じた一方、プラシーボ投与後には、ほとんど又は全く変化が観察されなかった。ＨＰＡによると、これらのタンパク質は全て、女性組織及び消化管の両方において中程度から強度に発現される。注目すべきことは、タンパク質ＦＡＭ２５は、以前に、ＨＦプールに対してＢＶＦにおいて有意に下方制御される（比率−１１．２）と同定されていたことである。同様の逆の傾向は、両方のプロテオーム比較データセットにおいて発現が異なる８９個のタンパク質のうち残りの４５個について得られた。特に、ＢＶ対Ｈの比較において認められたものとは逆に、これらのタンパク質のうち２５個は、リファキシミンにより治療された女性由来の６つのプールのうち少なくとも４つにおいて上方制御（５個）又は下方制御（２０個）された。２５個のうち１７個（６８％）のタンパク質について、最も高い比率はＢ−Ｒプールと関連していた。興味深いことに、Ｂ群は、発現が異なるヒトタンパク質の最大総数を示し、発現が異なるタンパク質の数は、Ｂ−Ｒプールにおいて２１４個、Ｂ−Ｎプールにおいて１５５個であった。また、Ｂ−Ｒプール中の８３個のタンパク質の比率変化（倍数変化）が、プール間で最も高く、ＢＶに関連するプロテオームに対してこの治療レジメンが大きな影響を与えることを示唆した。特に、ケラチンＩＩ型細胞骨格７４、タンパク質ＦＡＭ２５及びウェルナー症候群ＡＴＰ依存性ヘリカーゼに加えて、スタニオカルシン−１（比率１１３．１）、キニノーゲン−１（比率−８８．６）及び前立腺幹細胞抗原（比率６３．８）について、５０倍より大きい発現変化が認められた。Ｚｎ−α−２−糖タンパク質（比率−９．４）、免疫グロブリン重鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＢＵＴ（比率−１．６）及びＶＨ２６（比率−１．５）、カリクレイン−１３（比率１．５）並びに好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（比率１．５）は、Ｂ−Ｒプールにおいてのみ発現が異なると同定された。注目すべきことは、１７４個のタンパク質がＡ−ＲプールとＢ−Ｒプールとの間で共有され、１６８個（９７％）が同じ発現傾向を示したことである。逆に、１３８個のタンパク質のみがＢ−Ｒプール及びＣ−Ｒプールに共通し、２４個（１７％）が逆の変化（逆の倍数変化）を有していた。
【０１１４】
プラシーボの投与は、異なるタンパク質（発現が異なるタンパク質）の最小数（２０７個）と関連していた。Ｄ−Ｎプールにおいて５０倍を超える発現変化は、タンパク質ＮＤＲＧ１（比率−１３１７．２）、免疫グロブリンλ−７鎖Ｃ領域（比率−９５７．１）、タンパク質Ｓ１００−Ｐ（比率−４４３．４）、ロイシンリッチ反復含有タンパク質８Ｅ（比率−２０５．８）、免疫グロブリンκ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＰＯＭ（比率−８３．６）及び免疫グロブリンＪ鎖（比率−５０．８）について認められた。とりわけ、免疫グロブリンκ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＰＯＭを除いて、タンパク質発現の変化は、他のプールにおいて観察された傾向とは逆の方向にあった。
【０１１５】
同定された発現が異なるヒトタンパク質の各々について、ＧＯデータベースからの情報に基づいて、生物学的プロセス、細胞局在及び分子機能を定めた。ＢＶ対Ｈの比較と同様に、たいていのタンパク質が先天性免疫応答及び補体活性化（２２％）及び低分子代謝プロセス（１６％）に関与していたのに対し、炎症反応に関与していたのはわずか３％であった。興味深いことに、最も多く示されたＧＯカテゴリーにおいて、約１４％のタンパク質のみがリファキシミンによる治療後に増大し、３２個（５４％）が減少した一方、１９個（３２％）のタンパク質について対照的な変化が認められた。
【０１１６】
注目すべきことは、このカテゴリーは、Ｈプールに対するＢＶプールにおいても発現が異なると同定された１７個のタンパク質をグループ分けしたことである。これらのタンパク質のうちの１０個、すなわち、アネキシンＡ３、補体Ｃ３、免疫グロブリンγ−２鎖Ｃ領域、免疫グロブリン重鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＶＨ２６、免疫グロブリンκ鎖Ｃ領域、免疫グロブリンκ鎖Ｖ−ＩＶ領域（フラグメント）、免疫グロブリンλ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＬＯＩ、免疫グロブリンλ鎖Ｖ−ＩＶ領域Ｈｉｌ、免疫グロブリンλ−１鎖Ｃ領域及びラクトトランスフェリンは、ＢＶ対Ｈのデータセットにおいて認められたものとは逆に、過少発現する傾向を示した。大量のタンパク質が、細胞外空間（３９％）及び形質膜（１２％）に局在化していた。発現が異なるタンパク質の２０％もが、細胞質であった。示された主な分子機能は、構造分子活性（１９％）、抗原結合（１５％）及びタンパク質結合（１４％）であった。
【０１１７】
発現が異なるヒトタンパク質を伴う経路及びネットワークは、ＭｅｔａＣｏｒｅ（登録商標）データベース検索（Thomson Reuter）を用いて解析された。濃縮解析によると、最も濃縮した経路は、ＨＦプール及びＢＶＦプールの以前の分析と同様に、細胞骨格再構成、血液凝固及び補体活性化と関連していた。
【０１１８】
ＢＶ、Ａ−Ｒ、Ａ−Ｎ、Ｂ−Ｒ、Ｂ−Ｎ、Ｃ−Ｒ、Ｃ−Ｎ及びＤ−Ｎプールにおいて発現が異なる３０個の微生物タンパク質の半分以上（すなわち、約５３％）は、乳酸桿菌属種［Ｌ．アシドフィルス、Ｌ．ブレビス（L. brevis）、Ｌ．カゼイ、Ｌ．デルブレッキイ亜種ブルガリクス（L. delbrueckii subsp. bulgaricus）、Ｌ．ガセリ、Ｌ．ヘルベティカス、Ｌ．ジョンソニ（L. johnsonii）］由来であり、主にグルコース代謝、複製及びタンパク質合成に関与していた。興味深いことに、Ｌ．ブレビス由来のトリガーファクターのみが、リファキシミンによる治療後に全てのプールにおいて比率の中央値−２．５で下方制御されたことが認められた。６個の乳酸桿菌属タンパク質は、抗生物質により治療された女性由来の６つのプールのうち少なくとも２つにおいて、過剰発現（２個）又は過少発現（４個）されたのに対し、Ｌ．デルブレッキイ亜種ブルガリクス由来のピルビン酸キナーゼ（比率１．５）及びトリオースリン酸イソメラーゼ（比率２．４）は、それぞれ、Ａ−Ｒプール及びＢ−Ｎプールにおいてのみ影響した。プール間で対照的な発現パターンは、乳酸桿菌属由来の残り７個のタンパク質について観察された。とりわけ、Ｌ．アシドフィルス、Ｌ．デルブレッキイ亜種ブルガリクス、Ｌ．ガセリ及びＬ．ヘルベティカス由来の４個のエノラーゼが同定されたが、最初の３個のみが、抗生物質投与に対して、比率の中央値−２．７で下方制御の傾向を示した。最大の比率変化はＡ−ＲプールにおいてＬ．ガセリ由来のホスホグリセリン酸キナーゼについて観察された（−２２．１倍）が、このタンパク質はＡ−Ｎ、Ｂ−Ｒ、Ｃ−Ｒ及びＤ−Ｎプールにおいて過剰発現されたことが認められ、このことは、抗生物質による治療と相関性がないことを示唆した。
【０１１９】
１４個（４７％）の発現が異なる微生物タンパク質は、膣環境と関連し得る他の微生物に由来していた。すなわち、オエノコッカス  オエニ（Oenococcus oeni）、ピキア  ギリエルモンディ（Pichia guilliermondii）、ビフィドバクテリウム  ロンガム亜種インファンティス（Bifidobacterium longum subsp. infantis）、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．エピデルミディス、ウレアプラズマ  パルバム（Ureaplasma parvum）、マイコプラズマ  ゲニタリウム（Mycoplasma genitalium）、エシェリキア  コリ（大腸菌（Escherichia coli））及びＳ．アウレウス。特に、ホスホグリセリン酸キナーゼ及び確実なＤＮＡＩＩヘリカーゼホモログ（probable DNA helicase II homolog）は、それぞれ、ＢＶと関連していることが知られているＵ．パルバム及びＭ．ゲニタリウムに由来していた。３個のタンパク質は１又は複数の乳酸桿菌属種においても同定されたが、対照的な変化を示した：６０ｋＤａシャペロニン（Ｌ．ガセリ及びＯ．オエニ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｌ．ガセリ、Ｌ．ヘルベティカス及びＵ．パルバム）及びピルビン酸キナーゼ（Ｌ．デルブレッキイ亜種ブルガリクス及びＳ．アウレウス）。Ｕ．パルバム由来のホスホグリセリン酸キナーゼ（比率の中央値５．１）及びＳ．アウレウス由来のＵＰＦ００８２タンパク質ＳＡＢ０６１８（比率の中央値８．９）は全てのプールで上方制御された一方、中央値−２．３倍の下方制御がＳ．セレビシエ由来のリンゴ酸デヒドロゲナーゼについて観察された。
【０１２０】
表８は、質量分析による解析によって同定される、治療前（ＢＶ）と治療後（Ａ−Ｒ、Ａ−Ｎ、Ｂ−Ｒ、Ｂ−Ｎ、Ｃ−Ｒ、Ｃ−Ｎ、Ｄ−Ｎ）とでＢＶに罹患した女性において発現が異なるタンパク質を示す。
【０１２１】
リファキシミン及びプラシーボによる治療後、２８４個のヒトタンパク質が、ＢＶに罹患した女性由来のＣＶにおいて発現が異なると同定され、４８個（約１７％）が、ＢＶプールと比べて、抗生物質の投薬量にも臨床的成果にも関係なく、リファキシミン治療された女性由来の全プールにおいて発現が異なっていた。特に、２３個のタンパク質が治療後に増大し、１７個のタンパク質が治療後に減少したのに対して、残りの８個のタンパク質については、タンパク質存在量の対照的な変化が観察された。とりわけ、リファキシミン治療群において、ケラチンＩＩ型細胞骨格７４（範囲７８９．６〜１３４２４．４倍）、タンパク質ＦＡＭ２５（範囲４３７．６〜８９４４．５倍）及びウェルナー症候群ＡＴＰ依存性ヘリカーゼ（範囲１２．４〜７５０．５倍）について数百〜千倍以上の増大が認められた。興味深いことに、これらのタンパク質について最も高い変化は、Ｂ−Ｒプール、次いでＡ−Ｒプールにおいて生じた一方、プラシーボ投与後には、ほとんど又は全く変化が観察されなかった。
【０１２２】
ＨＰＡによると、これらのタンパク質は全て、女性組織及び消化管の両方において中程度から強度に発現される。注目すべきことは、タンパク質ＦＡＭ２５は、以前に、Ｈプールに対してＢＶにおいて有意に下方制御される（比率−１１．２）と同定されていたことである。同様の逆の傾向は、両方のプロテオーム比較データセットにおいて発現が異なる８９個のタンパク質のうち残りの４５個について得られた。特に、ＢＶ対Ｈの比較において認められたものとは逆に、これらのタンパク質のうち２５個は、リファキシミンにより治療された女性由来の６つのプールのうち少なくとも４つにおいて上方制御（５個）又は下方制御（２０個）された。２５個のうち１７個（６８％）のタンパク質について、最も高い比率はＢ−Ｒプールと関連していた。興味深いことに、Ｂ群は、発現が異なるヒトタンパク質の最大総数を示し、発現が異なるタンパク質の数は、Ｂ−Ｒプールにおいて２１４個、Ｂ−Ｎプールにおいて１５５個であった。また、Ｂ−Ｒプール中の８３個のタンパク質の比率変化（倍数変化）が、プール間で最も高く、ＢＶに関連するプロテオームに対してこの治療レジメンが大きな影響を与えることを示唆した。特に、ケラチンＩＩ型細胞骨格７４、タンパク質ＦＡＭ２５及びウェルナー症候群ＡＴＰ依存性ヘリカーゼに加えて、スタニオカルシン−１（比率１１３．１）、キニノーゲン−１（比率−８８．６）及び前立腺幹細胞抗原（比率６３．８）について、５０倍より大きい発現変化が認められた。Ｚｎ−α−２−糖タンパク質（比率−９．４）、免疫グロブリン重鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＢＵＴ（比率−１．６）及びＶＨ２６（比率−１．５）、カリクレイン−１３（比率１．５）並びに好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（比率１．５）は、Ｂ−Ｒプールにおいてのみ発現が異なると同定された。注目すべきことは、１７４個のタンパク質がＡ−ＲプールとＢ−Ｒプールとの間で共有され、１６８個（９７％）が同じ発現傾向を示したことである。逆に、１３８個のタンパク質のみがＢ−Ｒプール及びＣ−Ｒプールに共通し、２４個（１７％）が逆の変化（逆の倍数変化）を有していた。
【０１２３】
プラシーボの投与は、異なるタンパク質（発現が異なるタンパク質）の最小数（２０７個）と関連していた。Ｄ−Ｎプールにおいて５０倍を超える発現変化は、タンパク質ＮＤＲＧ１（比率−１３１７．２）、免疫グロブリンλ−７鎖Ｃ領域（比率−９５７．１）、タンパク質Ｓ１００−Ｐ（比率−４４３．４）、ロイシンリッチ反復含有タンパク質８Ｅ（比率−２０５．８）、免疫グロブリンκ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＰＯＭ（比率−８３．６）及び免疫グロブリンＪ鎖（比率−５０．８）について認められた。とりわけ、免疫グロブリンκ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＰＯＭを除いて、タンパク質発現の変化は、他のプールにおいて観察された傾向とは逆の方向にあった。
【０１２４】
同定された発現が異なるヒトタンパク質の各々について、ＧＯデータベースからの情報に基づいて、生物学的プロセス、細胞局在及び分子機能を定めた。ＢＶ対Ｈの比較と同様に、たいていのタンパク質が先天性免疫応答及び補体活性化（２２％）及び低分子代謝プロセス（１６％）に関与していたのに対し、炎症反応に関与していたのはわずか３％であった。興味深いことに、最も多く示されたＧＯカテゴリーにおいて、約１４％のタンパク質のみがリファキシミンによる治療後に増大し、３２個（５４％）が減少した一方、１９個（３２％）のタンパク質について対照的な変化が認められた。
【０１２５】
注目すべきことは、このカテゴリーは、ＨＦプールに対するＢＶプールにおいても発現が異なると同定された１７個のタンパク質をグループ分けしたことである。これらのタンパク質のうちの１０個、すなわち、アネキシンＡ３、補体Ｃ３、免疫グロブリンγ−２鎖Ｃ領域、免疫グロブリン重鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＶＨ２６、免疫グロブリンκ鎖Ｃ領域、免疫グロブリンκ鎖Ｖ−ＩＶ領域（フラグメント）、免疫グロブリンλ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＬＯＩ、免疫グロブリンλ鎖Ｖ−ＩＶ領域Ｈｉｌ、免疫グロブリンλ−１鎖Ｃ領域及びラクトトランスフェリンは、ＢＶ対Ｈのデータセットにおいて認められたものとは逆に、過少発現する傾向を示した。大量のタンパク質が、細胞外空間（３９％）及び形質膜（１２％）に局在化していた。発現が異なるタンパク質の２０％もが、細胞質であった。示された主な分子機能は、構造分子活性（１９％）、抗原結合（１５％）及びタンパク質結合（１４％）であった。
【０１２６】
発現が異なるヒトタンパク質を伴う経路及びネットワークは、ＭｅｔａＣｏｒｅ（登録商標）データベース検索（Thomson Reuter）を用いて解析された。濃縮解析によると、最も濃縮した経路は、Ｈプールの以前の分析と同様に、細胞骨格再構成、血液凝固及び補体活性化と関連しており、ＢＶ、Ａ−Ｒ、Ａ−Ｎ、Ｂ−Ｒ、Ｂ−Ｎ、Ｃ−Ｒ、Ｃ−Ｎ及びＤ−Ｎプールにおいて乳酸桿菌属種（Ｌ．アシドフィルス、Ｌ．ブレビス、Ｌ．カゼイ、Ｌ．デルブレッキイ亜種ブルガリクス、Ｌ．ガセリ、Ｌ．ヘルベティカス、Ｌ．ジョンソニ）に由来し、主にグルコース代謝、複製及びタンパク質合成に関与していた。興味深いことに、Ｌ．ブレビス由来のトリガーファクターのみが、リファキシミンによる治療後に全てのプールにおいて比率の中央値−２．５で下方制御されたことが認められた。６個の乳酸桿菌属タンパク質は、抗生物質により治療された女性由来の６つのプールのうち少なくとも２つにおいて、過剰発現（２個）又は過少発現（４個）されたのに対し、Ｌ．デルブレッキイ亜種ブルガリクス由来のピルビン酸キナーゼ（比率１．５）及びトリオースリン酸イソメラーゼ（比率２．４）は、それぞれ、Ａ−Ｒプール及びＢ−Ｎプールにおいてのみ影響した。プール間で対照的な発現パターンは、乳酸桿菌属由来の残り７個のタンパク質について観察された。とりわけ、Ｌ．アシドフィルス、Ｌ．デルブレッキイ亜種ブルガリクス、Ｌ．ガセリ及びＬ．ヘルベティカス由来の４個のエノラーゼが同定されたが、最初の３個のみが、抗生物質投与に対して、比率の中央値−２．７で下方制御の傾向を示した。最大の比率変化はＡ−ＲプールにおいてＬ．ガセリ由来のホスホグリセリン酸キナーゼについて観察された（−２２．１倍）が、このタンパク質はＡ−Ｎ、Ｂ−Ｒ、Ｃ−Ｒ及びＤ−Ｎプールにおいて過剰発現されたことが認められ、このことは、抗生物質による治療と相関性がないことを示唆した。
【０１２７】
１４個（４７％）の発現が異なる微生物タンパク質は、膣環境と関連し得る他の微生物に由来していた。すなわち、オエノコッカス  オエニ、ピキア  ギリエルモンディ、ビフィドバクテリウム  ロンガム亜種インファンティス、サッカロミセス  セレビシエ、サッカロミセス  エピデルミディス、ウレアプラズマ  パルバム、マイコプラズマ  ゲニタリウム、エシェリキア  コリ及びスタフィロコッカス  アウレウス。特に、ホスホグリセリン酸キナーゼ及び確実なＤＮＡＩＩホモログは、それぞれ、ＢＶと関連していることが知られているウレアプラズマ  パルバム及びマイコプラズマ  ゲニタリウムに由来していた。３個のタンパク質は１又は複数の乳酸桿菌属種においても同定されたが、対照的な変化を示した：６０ｋＤａシャペロニン（ラクトバチルス  ガセリ及びアシドフィルス）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ラクトバチルス  ガセリ、ラクトバチルス  ヘルベティカス及びウレアプラズマ  パルバム）及びピルビン酸キナーゼ（ラクトバチルス  デルブレッキイ亜種ブルガリクス及びスタフィロコッカス・  アウレウス）。ウレアプラズマ  パルバム由来のホスホグリセリン酸キナーゼ（比率の中央値５．１）及びスタフィロコッカス  アウレウス由来のＵＰＦ００８２タンパク質ＳＡＢ０６１８（比率の中央値８．９）は全てのプールで上方制御された一方、中央値−２．３倍の下方制御がサッカロミセス  セレビシエ由来のリンゴ酸デヒドロゲナーゼについて観察された。
【０１２８】
本発明の一実施形態は、膣内細菌感染の検査を受ける個体においてこの感染を診断する方法であって、この方法は、個体から得られた膣液サンプルをプロテオーム解析に供する工程、及び健康な又は感染していない個体由来の膣液サンプルにおけるタンパク質の発現レベルと比較して、検査液サンプルにおいて発現が変化したタンパク質を決定する工程であって、健康なサンプルに対して検査サンプルにおけるタンパク質の発現レベルの増大又は減少により膣感染症を診断する工程を含む。特定のタンパク質の増大又は減少は、好ましくは、絶対値が１．５、２、３、４、５、１０、１５又は２０より大きい比率である。
【０１２９】
一実施形態は、膣内細菌感染を診断する方法であって、この方法において、健康なサンプルに対して検査サンプルにおいて減少又は増大するタンパク質は、ビタミンＤ結合タンパク質、デスモコリン−２、カルシウム依存性塩素チャネル制御因子４、カタラーゼ、低分子プロリンリッチタンパク質３、ガレクチン−３−結合タンパク質、ヘモペキシン、免疫グロブリンファミリー、中間径フィラメントファミリー、リポカリンファミリー、α１−酸性糖タンパク質１、α１−酸性糖タンパク質２、好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン、リンパ球特異的タンパク質１、ミエロブラスチン、ペリリピン−３、ペリプラキン、タンパク質Ｓ１００−Ａ９、タンパク質Ｓ１００−Ａ７及びスーパーオキシドディスムターゼ［Ｃｕ−Ｚｎ］からなる群より選択される。
【０１３０】
別の実施形態は、診断方法であって、この方法において、健康なサンプル液に対して検査サンプル液において増大するタンパク質は、デスモコリン−２、低分子プロリンリッチタンパク質３、免疫グロブリンＪ鎖、ケラチンＩ型細胞骨格（keratin type I cytoskeletal）１０、ケラチンＩＩ型細胞骨格１、上皮ケラチンＩＩ型細胞骨格２（keratin type II cytoskeletal 2 epidermal）、ケラチンＩＩ型細胞骨格５、好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン、リンパ球特異的タンパク質１、ペリリピン−３、ペリプラキン又はこれらの組み合わせから選択される。
【０１３１】
別の実施形態は、膣感染症の診断方法であって、この方法において、健康なサンプル液に対して検査サンプル液において減少するタンパク質は、ビタミンＤ結合タンパク質、カルシウム依存性塩素チャネル制御因子４、カタラーゼ、ガレクチン−３−結合タンパク質、ヘモペキシン、免疫グロブリンＭ鎖定常領域、α１−酸性糖タンパク質１、α１−酸性糖タンパク質２、ミエロブラスチン、タンパク質Ｓ１００−Ａ９、タンパク質Ｓ１００−Ａ７、スーパーオキシドディスムターゼ［Ｃｕ−Ｚｎ］又はこれらの組み合わせから選択される。
【０１３２】
特に、膣感染症の診断方法において、検査サンプルと参照サンプルとのタンパク質発現比率の増大は、約１．５〜約４０の範囲にあり、また、検査サンプルと参照サンプルとのタンパク質発現比率の減少は、約−１．５〜約−５６５０の範囲にある。
【０１３３】
特定の一実施形態は、膣感染症の診断方法であって、この方法において、抗生物質による治療後、ＢＶ感染したサンプル液に対して検査サンプル液において減少するタンパク質は、ビタミンＤ結合タンパク質、カルシウム依存性塩素チャネル制御因子４、カタラーゼ、ガレクチン−３−結合タンパク質、ヘモペキシン、免疫グロブリンＭ鎖Ｃ領域、α１−酸性糖タンパク質１、α１−酸性糖タンパク質２、タンパク質Ｓ１００−Ａ９、タンパク質Ｓ１００−Ａ７、スーパーオキシドディスムターゼ［Ｃｕ−Ｚｎ］又はこれらの組み合わせから選択される。
【０１３４】
特定の一実施形態は、膣感染症の診断方法であって、この方法において、抗生物質による治療後、ＢＶ感染したサンプル液に対して検査サンプル液において増大するタンパク質は、デスモコリン−２、低分子プロリンリッチタンパク質３、免疫グロブリンＪ鎖、ケラチンＩ型細胞骨格１０、ケラチンＩＩ型細胞骨格１、上皮ケラチンＩＩ型細胞骨格２、ケラチンＩＩ型細胞骨格５、好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン、リンパ球特異的タンパク質１、ペリリピン−３、ペリプラキン又はこれらの組み合わせから選択される。
【０１３５】
特定の一実施形態は、膣感染症の診断方法であって、この方法において、診断された感染症を治療する方法は、リファキシミンを投与することである。
【０１３６】
特定の一実施形態は、リファキシミンによる治療の有効性を、その治療前に評価するための診断方法である。
【０１３７】
特定の一実施形態は、リファキシミンによる治療中及び治療前に、ＢＶに冒された患者が寛解するか否かを評価するための診断方法である。
【実施例】
【０１３８】
実施例１
この実施例には、ＤＮＡの配列分析に基づくリアルタイムＰＣＲが記載され、健康な及びＢＶに罹患した女性において収集されたサンプルの膣内生態系の微生物組成を示す。
【０１３９】
膣内細菌群のリアルタイムＰＣＲ分析
（ａ）サンプル収集
１８歳〜５０歳の閉経前の妊娠していないベルギー人女性合計８０名を本試験に含めた。スクリーニング来院（Ｖ１）において、アムセルの診断基準とグラム染色によるニュージェントのスコアリングとの両方を用いて、健康であるかＢＶであるかの診断がなされた。ニュージェントのスコアが３より大きく、かつ４つのアムセルの診断基準のうち少なくとも３つが陽性である患者は、ＢＶ陽性であるとみなされた。この臨床的評価に従って、女性を、膣管感染の徴候を有さなかった健康な被験体（Ｈ）（ｎ＝４１）及びＢＶ患者（ｎ＝３９）の２つの群に分けた。
【０１４０】
試験来院Ｖ１でＢＶと診断された患者を、多施設二重盲検無作為プラシーボ対照試験（ＥｕｄｒａＣＴ：２００９−０１１８２６−３２）に含めた。この試験は、ＢＶの治療について、プラシーボに対する様々な用量のリファキシミン膣錠の有効性を比較するために実施された。これらの患者は、無作為化来院を行って４つの治療群に分類された：Ａ群は、１００ｍｇリファキシミン膣錠を１日１回５日間投与され（ｎ＝１０）、Ｂ群は、２５ｍｇリファキシミン膣錠を１日１回５日間投与され（ｎ＝１０）、Ｃ群は、１００ｍｇリファキシミン膣錠を１日１回最初の２日間、次いでプラシーボ膣錠を残りの３日間投与され（ｎ＝９）、Ｄ群は、プラシーボ膣錠を１日１回５日間投与された（ｎ＝１０）。試験投薬は、就寝前に膣内投与された。治療の終了から７〜１０日後、追跡来院（Ｖ３）を実施した。寛解は、アムセルの診断基準（３未満）及びグラム染色によるニュージェントのスコア（３以下）に従ってＶ３で評価された（表１）。
【０１４１】
２ｍＬの生理食塩水による標準化膣洗浄物を、左、中央及び右上膣円蓋（left, central and right upper vaginal vaults）に２２番径針から液を流して再吸引することによって、分析のためにＶ１及びＶ３において収集した。その後、この膣洗浄物は使用するまで−８０℃で保管した。
【０１４２】
サンプル収集は、図１にも示されている。
【０１４３】
（ｂ）ＤＮＡ及びタンパク質の抽出
各膣洗浄物１ｍＬを９５００ｇで１５分間遠心分離してペレットを上澄みから分離し、タンパク質抽出のために使用した。このペレットを細菌ＤＮＡ分離のために処理した。
【０１４４】
ＤＮＡ量は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００（NanoDrop(R) Technologies、デラウェア州ウィルミントン）を用いて定量した。
【０１４５】
９容量部のアセトン：ＨＣｌ（１０：１）を膣洗浄物の上澄みに添加し、１２０００ｇで１０分間遠心分離することによってタンパク質を沈殿させた。タンパク質のペレットを、７０％エタノール１ｍＬに溶解し、サンプルを１２０００ｇで１０分間回転させた。アセトン１ｍＬを添加し、１２０００ｇで５分間遠心分離することによってタンパク質をさらに沈殿させた。上澄みを除去した後、ペレットをＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮装置（Thermo Savant ISS110, Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム）によって乾燥し、次いで−２０℃で保管した。
【０１４６】
タンパク質抽出物を、２−Ｄ  Ｑｕａｎｔキット（GE Healthcare、スウェーデン、ウプサラ）を用いて、製造業者の説明書に従って定量した。
【０１４７】
（ｃ）リアルタイムＰＣＲ
４１名の健康な女性（Ｈ）、並びに３９名のＢＶに罹患した女性のリファキシミン／プラシーボによる治療前（ＢＶ）、リファキシミン／プラシーボによる治療後Ｒ（寛解した１１名の女性）及びＮ（寛解しなかった２８名の女性）から収集された頚膣液（ＣＶＦ）から抽出されたＤＮＡサンプルについて、リアルタイムＰＣＲを実施した。
【０１４８】
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子又は１６Ｓ−２３Ｓ  ｒＲＮＡスペーサー領域に標的された特異的プライマーセットを用いて、以下の属又は種を定量した：乳酸桿菌属、ガードネレラ  バギナリス、アトポビウム属、プレボテラ属、ベイヨネラ属、マイコプラズマ  ホミニス及びモビルンカス属。
【０１４９】
標的属及び種の大部分の分布はＲ群及びＨ群において類似していた一方、Ｎ群はＢＶ群に非常に類似したプロファイルを示した。このことは、健康なような状態を取り戻すことにおいてリファキシミンが有効であることを示唆する。表５は、試験群Ｈ、ＢＶ、Ｒ又はＮに属する女性が、分析された各細菌群を有する割合を示す。
【０１５０】
【表５】
2016516988.tif 000007
【０１５１】
試験群Ｈ、ＢＶ、Ｒ及びＮに属する女性における乳酸桿菌属、アトポビウム属、ガードネレラ  バギナリス、プレボテラ属、ベイヨネラ属、モビルンカス属及びモビルンカス  ホミニスの中央値濃度（median concentration）を、表４に示す。このデータは、膣サンプルから抽出した総ＤＮＡ（μｇ）あたりの標的属又は種のＤＮＡ（ｎｇ）として表される。
【０１５２】
【表６】
2016516988.tif 000008
【０１５３】
実施例２
膣液のプロテオーム解析
この実施例には、質量分析を用いて膣液中に存在するタンパク質を決定すること（プロテオームプロファイル）が記載される。表７は、質量分析による解析によって同定される、健康な女性（Ｈ）とＢＶに罹患した女性（ＢＶ）とで発現が異なるタンパク質を示す。
【０１５４】
（ａ）サンプルの収集
１８歳〜５０歳の閉経前の妊娠していないベルギー人女性合計８０名を本試験に含めた。スクリーニング来院（Ｖ１）において、アムセルの診断基準とグラム染色によるニュージェントのスコアリングとの両方を用いて、健康であるかＢＶであるかの診断がなされた。ニュージェントのスコアが３より大きく、かつ４つのアムセルの診断基準のうち少なくとも３つが陽性である患者は、ＢＶ陽性であるとみなされた。この臨床的評価に従って、女性を、膣管感染の徴候を有さなかった健康な被験体（Ｈ）（ｎ＝４１）及びＢＶ患者（ｎ＝３９）の２つの群に分けた。
【０１５５】
試験来院Ｖ１でＢＶと診断された患者を、多施設二重盲検無作為プラシーボ対照試験（ＥｕｄｒａＣＴ：２００９−０１１８２６−３２）に含めた。この試験は、ＢＶの治療について、プラシーボに対する様々な用量のリファキシミン膣錠の有効性を比較するために実施された。これらの患者は、無作為化来院を行って４つの治療群に分類された：Ａ群は、１００ｍｇリファキシミン膣錠を１日１回５日間投与され（ｎ＝１０）、Ｂ群は、２５ｍｇリファキシミン膣錠を１日１回５日間投与され（ｎ＝１０）、Ｃ群は、１００ｍｇリファキシミン膣錠を１日１回最初の２日間、次いでプラシーボ膣錠を残りの３日間投与され（ｎ＝９）、Ｄ群は、プラシーボ膣錠を１日１回５日間投与された（ｎ＝１０）。試験投薬は、就寝前に膣内投与された。治療の終了から７〜１０日後、追跡来院（Ｖ３）を実施した。寛解は、アムセルの診断基準（３未満）及びグラム染色によるニュージェントのスコア（３以下）に従ってＶ３で評価された（表１）。
【０１５６】
２ｍＬの生理食塩水による標準化膣洗浄物を、左、中央及び右上膣円蓋に２２番径針から液を流して再吸引することによって、分析のためにＶ１及びＶ３において収集した。その後、この膣洗浄物は使用するまで−８０℃で保管した。
【０１５７】
（ｂ）タンパク質のＭＦ１０分画
分画に先立って、タンパク質１ｍｇを含むＨプール及びＢＶプールをそれぞれ、実施例１の工程（ａ）及び（ｂ）に従って調製した。これらのプールを構成するために、各膣サンプルからの等量のタンパク質を混合し、ドライダウン（dry down）し、９０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１０ｍＭ  ＥＡＣＡ緩衝液（ｐＨ１０．２）及び尿素１Ｍの２８０μＬ中に再懸濁させた。タンパク質のＭＦ１０分画を、５ｋＤａ制限膜並びに１ｋＤａ、５ｋＤａ、２５ｋＤａ、５０ｋＤａ及び１２５ｋＤａ分離膜を備えた５−カートリッジアセンブリを用いて実施した。チャンバーアセンブリ後、９０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１０ｍＭ  ＥＡＣＡ緩衝液（ｐＨ１０．２）１００ｍＬを緩衝液リザーバに添加し、電極に行き渡らせ（循環させ）た。タンパク質プール（１４０μＬ）を、別々の運転（separate runs）のためにカソードに最も近いチャンバーに添加した。分画は、２５０Ｖで３０分間実施した。画分収集後、低分子量画分（１〜５ｋＤａ及び５〜２５ｋＤａ）を、Ｓｔａｇｅ  ｔｉｐｓ（登録商標）Ｃ１８、２００ｍＬを用いて製造業者の説明書に従って脱塩し、ＭＳ／ＭＳによる解析のために用いた（ＨＦプール及びＢＶプール）。
【０１５８】
（ｃ）質量分析による解析
ＭＳ／ＭＳによる解析は、タンパク質をそれぞれ５０μｇ含む、Ｈ及びＢＶプール並びにＢＶ、Ａ−Ｒ、Ａ−Ｎ、Ｂ−Ｒ、Ｂ−Ｎ、Ｃ−Ｒ、Ｃ−Ｎ及びＤ−Ｎプール全てについて実施した。各画分又はプールを、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８）５０μＬ中に再懸濁した。１μｇ／μＬのトリプシンを添加し、反応を３７℃で一晩行った（incubated）。ギ酸の添加によって反応を停止した後、サンプルをボルテックスに供し、ドライダウンした。消化されたサンプルのペレットを緩衝液Ａ（０．１％ギ酸）１０μＬ中に再懸濁し、ブランク（緩衝液Ａ）を間に挟んで、各サンプル０．２μＬを３回流した。
【０１５９】
消化されたペプチドを、Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００  ＨＰＬＣ及び自動サンプリングシステム（Dionex、オランダ、アムステルダム）を用いてｎａｎｏ−ＬＣによって分離した。サンプル（０．２μＬ）を濃縮し、Ｈ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ（９８：２、０．０５％トリフルオロ酢酸、ｖ／ｖ）を用いて１０μＬ／分でマイクロＣ１８プレカラム（５００μｍ×２ｍｍ、Michrom Bioresources、カリフォルニア州オーバーン）上で脱塩した。４分洗浄した後、プレカラムを、ガットリン（Gatlin）らに従って製造されたフリットレスＣ１８ナノカラム（７５μｍ  ｉ．ｄ．×１０ｃｍ、５μｍ、２００Å）のラインに切り換えた（Valco 10 port valve, Dionex）。
【０１６０】
ペプチドを、Ｈ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ（９８：２、０．１％ギ酸、ｖ／ｖ）からＨ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ（６４：３６、０．１％ギ酸、ｖ／ｖ）への直線勾配を用いて２５０ｎＬ／分で３０分かけて溶離した。高圧（２０００Ｖ）を、低容量Ｔ字管（low volume tee）並びにカラムチップ（ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ質量分析計の加熱したキャピラリー（Ｔ＝２８０℃）から０．５ｃｍに位置する）に加えた。陽イオンをエレクトロスプレーによって生成させ、Ｏｒｂｉｔｒａｐをデータ依存測定モード（data-dependent acquisition mode（ＤＤＡ））において作動させた。３５０〜１７５０ｍ／ｚのサーベイスキャンを取得した（累積ターゲット値１００００００イオンを有し、４００ｍ／ｚでの分解能＝３００００）。荷電状態２以上を有する最も豊富な（５０００カウントより大きい）イオン１０個までを、活性化ｑ＝０．２５及び活性化時間３０ミリ秒（ｍｓ）、ターゲット値３００００イオンで、衝突誘起解離を用いるリニアイオントラップ内で連続的に分離してフラグメント化した。ＭＳ／ＭＳについて選択された質量電荷比は、４５秒間動的に排除された。
【０１６１】
ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＶｅｌｏｓからのＭＳ／ＭＳファイルについてのピークリストを、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ＬＣ−ＭＳ  ｖ４を用いて処理した。このソフトウェアは、ＬＣ−ＭＳ運転の生ファイルを２Ｄプロファイルに変換し、ユーザー定義及び自動ベクターを用いて、これらのプロファイルを任意に選択された運転に並べる。ペプチド強度を、独自コード（proprietary code）を用いて標準化し、統計的分析に使用して、ＡＮＯＶＡ及びｑ−値を計算し、かつ実験プール間で発現が異なるペプチドを推論した（Ｐ＜０．０５）。Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｔａｔｓパッケージを使用して、Ｐ＜０．０５のペプチドを用いて主成分分析（ＰＣＡ）を実施した。ペプチドを区別するＭＳ／ＭＳスペクトルを、データベース検索プログラムＭＡＳＣＯＴ（Matrix Science、イギリス、ロンドン）を用いるスイス・プロット（Swiss-Prot）データベース（バージョン１５）に対して検索した。親イオン及びフラグメントイオンを、それぞれ、公差±４ｐｐｍ及び±０．５Ｄａで検索した。ペプチドの電荷状態は、＋２及び＋３で設定した。「酵素なし」を特定した。マッチングが高いイオンスコアを有し、かつ統計的に有意（Ｐ＜０．０５）及び（半）トリプシン消化性（(semi)tryptic）であった場合に、タンパク質及びペプチドは確信して同定されたと見なされた。同定後、フィルターを適用して、ヒト起源のタンパク質及び膣環境と関連する微生物によって産生されたタンパク質を選択した。実験プール間で１．５倍以上の変化を示したタンパク質のみを考慮した。結果を表７及び表８に示す。
【０１６２】
【表７】
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【０１６３】
【表８】
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【０１６４】
【表９】
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【０１６５】
【表１０】
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【０１６６】
【表１１】
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【０１６７】
【表１２】
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【０１６８】
【表１３】
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【０１６９】
【表１４】
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【０１７０】
【表１５】
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【０１７１】
【表１６】
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【０１７２】
【表１７】
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【０１７３】
【表１８】
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【０１７４】
【表１９】
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【０１７５】
【表２０】
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【０１７６】
【表２１】
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【０１７７】
【表２２】
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【０１７８】
【表２３】
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【０１７９】
【表２４】
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【０１８０】
【表２５】
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【０１８１】
【表２６】
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【０１８２】
【表２７】
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【０１８３】
プロテオーム技術によって同定されたタンパク質を、遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析（ＡｍｉＧＯ  バージョン１．８、データベース公開２０１２−１１−０３）に供し、同定されたタンパク質と関連する生物学的プロセス、分子機能及び細胞内局在を同定した。ＭＳ／ＭＳデータについて、さらに、公に利用可能なHuman Protein Atlasデータベース（ＨＰＡ）を用いて組織発現パターンを評価した。表９は、健康な女性とＢＶに罹患した女性との間で発現が異なるとＭＳ／ＭＳで同定されたタンパク質の遺伝子オントロジー（ＧＯ）カテゴリー化を示す。分類は、キーワードカテゴリーとして「生物学的プロセス」に従って実施した。
【０１８４】
【表２８】
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【０１８５】
表１０は、健康な女性とＢＶに罹患した女性との間で発現が異なるとＭＳ／ＭＳにより同定されたタンパク質の遺伝子オントロジー（ＧＯ）のカテゴリー化を示す。分類は、キーワードカテゴリーとして「細胞の構成要素」に従って実施した。
【０１８６】
【表２９】
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【０１８７】
表１１は、健康な女性とＢＶに罹患した女性との間で発現が異なるとＭＳ／ＭＳにより同定されたタンパク質の遺伝子オントロジー（ＧＯ）のカテゴリー化を示す。分類は、キーワードカテゴリーとして「分子機能」に従って実施した。
【０１８８】
【表３０】
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【０１８９】
多変量解析（ＰＣＡ）は、発現が異なるタンパク質のＭＳ／ＭＳデータを用いて行い、図２に示した。図２ａは、来院Ｖ１における健康な女性（Ｈ）及びＢＶに罹患した女性の分画プール中のペプチドのＰＣＡを示す。図２ｂは、ＢＶに罹患した女性のリファキシミンにより治療前後の全プール中のペプチドのＰＣＡを示し、それぞれ、１００ｍｇの投薬量を５日間で寛解（Ａ−Ｒ）及び非寛解（Ａ−Ｎ）；２５ｍｇを５日間で寛解（Ｂ−Ｒ）及び非寛解（Ｂ−Ｎ）；１００ｍｇを２日間で寛解（Ｃ−Ｒ）及び非寛解（Ｃ−Ｎ）；並びにプラシーボを５日間（Ｄ−Ｎ）である。データは、サンプルにつき３回行ったときの解析から得る。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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