(57)【要約】  本発明は疎水化ヒアルロン酸（式I）の調製方法に関するものであり，更に生物学的に活性な疎水性物質の担体として作用する疎水化ヒアルロナンのナノミセルに生物学的活性物質をカプセル封入する方法に関する。ヒアルロナンの疎水化はヒアルロナンと長鎖カルボン酸とのエステル化反応を経て行われ，その長鎖カルボン酸は２，４，６‐トリクロロ安息香酸のハロゲン化物誘導体又は他の有機塩化物により活性化される。水性環境下では，水溶性であり疎水化された誘導体はナノミセルを形成することが可能であり，この内部では非極性物質が非共有的な物理的相互作用により結合することが可能である。ナノミセルのコアは疎水性アシル官能基により形成され，一方，ナノミセルのシェルはヒアルロン酸により形成される。ナノミセルへの物質のカプセル封入は溶媒交換法又は音波処理により行うことができる。ヒアルロン酸ナノミセルは，結合された物質が局所塗布部に浸透することを促進し，その結合された物質が個々の細胞に移行することを可能にする。疎水化ヒアルロナン誘導体から得られたナノミセルは化粧用途及び医療用途に有用である。2016500130.tif 000012
2016500130.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（I）に従ったヒアルロン酸のＣ６‐Ｃ１８‐アシル化誘導体であって：
2016500130.tif 000009
式中，ＲはＨ＋又はＮａ＋であり，Ｒ１はＨ又はＣ（＝Ｏ）ＣｘＨｙ又はＣ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨ‐ｈｅｔであり，ｘは５〜１７の整数であり，ｙは１１〜３５の整数であり，ＣｘＨｙは直鎖又は分岐の飽和又は不飽和Ｃ５‐Ｃ１７鎖であり，ｈｅｔはその内容をＮ，Ｓ又はＯ原子の中から選択できる複素環又は複素芳香族基であり，少なくとも１つの繰り返し単位は１つ以上のＲ１，‐Ｃ（＝Ｏ）ＣｘＨｙ又はＣ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨ‐ｈｅｔ基を含み，ｎは１２〜４０００の範囲であるものとする誘導体。
【請求項２】
ＲはＨ＋又はＮａ＋であり，Ｒ１は‐Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）７‐ＣＨ＝ＣＨ‐（ＣＨ２）７‐ＣＨ３であることを特徴とする請求項１に記載のヒアルロン酸のＣ６‐Ｃ１８‐アシル化誘導体。
【請求項３】
水と水混和性非プロトン性溶媒との混合液中，塩基及び触媒の存在下で，ヒアルロン酸は，２，４，６‐トリクロロ安息香酸の塩化物又はＲ３‐ＣＯ‐Ｃｌ：式中Ｒ３は脂肪族又は分岐Ｃ１‐Ｃ３０‐アルキル，複素芳香族官能基又は芳香族官能基である：の有機塩化物により活性化されたＣ６‐Ｃ１８‐カルボン酸と反応することを特徴とする一般式（I）に従ったヒアルロン酸の誘導体の調製方法。
【請求項４】
ヒアルロン酸が遊離酸の形態又は薬学的に許容可能な塩の形態であり，その分子量が好ましくは５×１０３〜１．６×１０６，より好ましくは１５×１０３〜２５０×１０３，最も好ましくは１５×１０３〜５０×１０３であることを特徴とする請求項３記載の調製方法。
【請求項５】
ヒアルロン酸を水と水混和性非プロトン性溶媒との混合液中に溶解し，前記溶媒は極性有機溶媒であり，水分は１０〜９９体積%，好ましくは５０体積%であることを特徴とする請求項３又は４記載の調製方法。
【請求項６】
前記水混和性非プロトン性溶媒がジメチルスルホキシド，テトラヒドロフラン，アセトン，アセトニトリル又はイソプロパノールであることを特徴とする請求項３〜５いずれか１項記載の調製方法。
【請求項７】
反応混合液はＲ’３Ｎ塩基：式中，Ｒ’は直鎖又は分岐ＣｎＨｍ炭化水素鎖であり，ｎは１〜４の整数であり，ｍは３〜９の整数である：例えばトリエチルアミンをヒアルロン酸の二量体に対して０．０１〜２０当量，好ましくは６当量の量で含み，触媒はジメチルアミノピリジンなどの置換ピリジンから成る基より選択され，その量はヒアルロン酸の二量体に対して０．０１〜１当量，好ましくは０．０５当量であることを特徴とする請求項３〜６いずれか１項記載の調製方法。
【請求項８】
初めにＣ６‐Ｃ１８‐カルボン酸の活性化を，塩基及び２，４，６‐トリクロロ安息香酸若しくはその誘導体の存在下，又は塩基及び有機塩化物の存在下，極性有機溶媒中で行い，次に，活性化Ｃ６‐Ｃ１８‐カルボン酸を含む混合液をヒアルロン酸に添加し，これを水，有機溶媒，塩基及び触媒の混合液に溶解し，得られた反応生成物は一般式（I）に従った誘導体であることを特徴とする請求項３〜７いずれか１項記載の調製方法。
【請求項９】
前記Ｃ６‐Ｃ１８‐カルボン酸がカプロン酸，エナント酸，カプリル酸，カプリン酸，パルミチン酸，ステアリン酸，オレイン酸，リノール酸及びリノレン酸から成る群より選択されることを特徴とする請求項３〜８いずれか１項記載の調製方法。
【請求項１０】
活性化されたＣ６‐Ｃ１８‐カルボン酸の量は，ヒアルロン酸の二量体に対して０．０１〜５当量，好ましくは０．５〜２当量であることを特徴とする請求項３〜９いずれか１項記載の調製方法。
【請求項１１】
Ｃ６‐Ｃ１８‐カルボン酸の活性化を２０〜６０℃，好ましくは２５℃で，５〜１２０分，好ましくは３０分行うことを特徴とする請求項３〜１０いずれか１項記載の調製方法。
【請求項１２】
前記活性化されたＣ６‐Ｃ１８‐カルボン酸とヒアルロン酸との反応を２０〜６０℃，好ましくは２５℃で，１〜２４時間，好ましくは２〜３時間行うことを特徴とする請求項３〜１１いずれか１項記載の調製方法。
【請求項１３】
後続して，前記ヒアルロン酸のＣ６‐Ｃ１８‐アシル化誘導体を前記反応混合液から分離し，洗浄し，乾燥し，凍結乾燥することを特徴とする請求項３〜１２いずれか１項記載の調製方法。
【請求項１４】
前記ヒアルロン酸のＣ６‐Ｃ１８‐アシル化誘導体をＮａＣｌ及びアルコールを使用した沈殿工程で反応混合液から分離することを特徴とする請求項１３記載の調製方法。
【請求項１５】
前記ヒアルロン酸のＣ６‐Ｃ１８‐アシル化誘導体をアルコール，特にイソプロパノール又はエタノールで洗浄することを特徴とする請求項１３又は１４記載の調製方法。
【請求項１６】
一般式（I）に従った前記ヒアルロン酸のＣ６‐Ｃ１８‐アシル化誘導体をベースとするナノミセル組成物であって，組成物はヒアルロン酸に結合したＣ６‐Ｃ１８‐アシル基に形成された疎水性コア及びヒアルロン酸の親水性官能基により形成された親水性シェルから成るナノミセルを含み，１種以上の生物学的活性物質が前記ナノミセル中に物理的に結合されていることを特徴とするナノミセル組成物。
【請求項１７】
前記ヒアルロン酸のＣ６‐Ｃ１８‐アシル化誘導体の質量含有量に対して０．３〜５０重量%の生物学的活性物質を含み，前記生物学的活性物質が薬学的及び美容的活性物質，特にビタミン，医薬，細胞増殖抑制剤，植物エキス，植物複合体若しくは植物活性物質，鉱物或いは植物油，又はこれらの混合物から成る群より選択されることを特徴とする請求項１６記載のナノミセル組成物。
【請求項１８】
生物学的活性物質がトコフェロール，パクリタキセル，ホスファチジルコリン又はコエンザイムＱ１０であることを特徴とする請求項１７記載のナノミセル組成物。
【請求項１９】
その臨界凝集濃度より高い濃度で前記ヒアルロン酸のＣ６‐Ｃ１８‐アシル化誘導体を含むことを特徴とする請求項１６〜１８いずれか１項記載のナノミセル組成物。
【請求項２０】
当該組成物が水溶液の状態であるとき，前記ヒアルロン酸のＣ６‐Ｃ１８‐アシル化誘導体の濃度は０．０００１mg・mL-1〜３０mg・mL-1，好ましくは１〜２０mg・mL-1の範囲であることを特徴とする請求項１６〜１９いずれか１項記載のナノミセル組成物。
【請求項２１】
前記生物学的活性物質は，前記ヒアルロン酸のＣ６‐Ｃ１８‐アシル化誘導体の質量含有量に対して０．０５〜４０重量%，好ましくは１〜２０重量%の量の鉱物又は植物油であることを特徴とする請求項１６〜２０いずれか１項記載のナノミセル組成物。
【請求項２２】
液体で水不溶性の生物学的活性物質を含み，前記物質には，そこに溶解した状態の追加的生物学的活性物質が含まれていることを特徴とする請求項１６〜２１いずれか１項記載のナノミセル組成物。
【請求項２３】
液体で水不溶性の前記生物学的活性物質は鉱物又は植物油であり，前記追加的生物学的活性物質は薬学又は美容的活性物質，特にビタミン，医薬，細胞増殖抑制剤，植物エキス，植物複合体若しくは植物活性物質，又はこれらの混合物に属することを特徴とする請求項２２記載のナノミセル組成物。
【請求項２４】
溶液，ナノエマルジョン，マイクロエマルジョン，コアセルベート又はゲルの形態を取ることを特徴とする請求項１６〜２３いずれか１項記載のナノミセル組成物。
【請求項２５】
前記一般式（I）に従った前記ヒアルロン酸のＣ６‐Ｃ１８‐アシル化誘導体を水に溶解し，前記生物学的活性物質を有機溶媒に溶解し，得られた溶液を混合し，その後，有機溶媒を除去することを特徴とする請求項１６〜２４のいずれか１項で定義したナノミセル組成物の調製方法。
【請求項２６】
前記有機溶媒を真空蒸発で除去し，その後，水相を乾燥させ，そして再水和させ，得られたナノミセル構造物を濾過し，最後に凍結乾燥させることを特徴とする請求項２５記載の調製方法。
【請求項２７】
前記有機溶媒を透析により除去し，その後，得られたナノミセル構造物を濾過し，最後に凍結乾燥させることを特徴とする請求項２４記載の調製方法。
【請求項２８】
前記有機溶媒がトリクロロメタンなどの揮発性塩化溶媒，又はエタノールやイソプロパノールなどのアルコールであることを特徴とする請求項２５〜２７いずれか１項記載の調製方法。
【請求項２９】
前記一般式（I）に従った前記ヒアルロン酸のＣ６‐Ｃ１８‐アシル化誘導体を水に溶解し，次いで液体で水不溶性の生物学的活性物質と混合し，そこで得られた混合液を音波処理によりホモジナイズし，マイクロエマルジョン又はナノエマルジョンを形成することを特徴とする請求項１６で定義したナノミセル組成物の調製方法。
【請求項３０】
前記一般式（I）に従った前記ヒアルロン酸のＣ６‐Ｃ１８‐アシル化誘導体を水に溶解し，次いで，追加的生物学的活性物質が溶解されている液体で水不溶性の生物学的活性物質と混合し，そこで得られた混合液を音波処理によりホモジナイズし，マイクロエマルジョン又はナノエマルジョンを形成することを特徴とする請求項２２又は２３で定義したナノミセル組成物の調製方法。
【請求項３１】
医療用途又は化粧用途，好ましくは局所適用での請求項１６〜２４のいずれか１項で定義したナノミセル組成物の使用。
【請求項３２】
一般式（II）に従ったＣ６‐Ｃ１８‐アシル化ヒアルロナンを調製することを特徴とする安定化ナノミセル組成物の調製方法であって：
2016500130.tif 000010
式中，ＲはＨ＋又はＮａ＋であり，１つ以上のＲ１メンバーは，不飽和結合を含むことが可能で少なくとも１つの繰り返し単位に存在する直鎖Ｃ６‐Ｃ１８鎖，及び３‐（２‐チエニル）アクリル酸若しくは３‐（２‐フリル）アクリル酸，又は別の少なくとも１つの繰り返し単位に存在する前記酸の誘導体で表され，そこで，ナノミセル組成物を前記一般式（II）に従った前記Ｃ６‐Ｃ１８‐アシル化ヒアルロナンから調製し，その後，この組成物を架橋反応で安定化する調製方法。
【請求項３３】
最初に，水及び水混和性非極性溶媒中，塩基及び触媒の存在下で，ヒアルロン酸を３‐（２‐チエニル）アクリル酸若しくは３‐（２‐フリル）アクリル酸又はそれぞれの酸の誘導体と反応させ，前記酸を２，４，６‐トリクロロ安息香酸の塩化物，又はＲ３‐ＣＯ‐Ｃｌ：式中，Ｒ３は脂肪族又は分岐Ｃ１‐Ｃ３０‐アルキルであり，場合により複素芳香族又は芳香族官能基を含む：の有機塩化物により活性化し，前記式（III）に従ったアクリル化ヒアルロナンを形成し：
2016500130.tif 000011
その後，水及び水混和性非極性溶媒中，塩基及び触媒の存在下で，前記式（III）に従ったアクリル化ヒアルロナンを２，４，６‐トリクロロ安息香酸の塩化物，又はＲ３‐ＣＯ‐Ｃｌ：式中，Ｒ３は脂肪族又は分岐Ｃ１‐Ｃ３０‐アルキルであり，場合により複素芳香族又は芳香族官能基を含む：の有機塩化物により活性化したＣ６‐Ｃ１８‐カルボン酸と反応させ，前記式（II）に従ったＣ６‐Ｃ１８‐アシル化ヒアルロナンを形成し，次に請求項２５〜３０いずれか１項で定義した方法を利用して前記式（II）に従った前記ヒアルロナンからナノミセル組成物を調製し，その後，当該組成物をラジカル反応による架橋反応に供することを特徴とする請求項３２記載の調製方法。
【請求項３４】
前記ラジカル反応が架橋剤に触媒されることを特徴とする請求項３２又は３３記載の調製方法。
【請求項３５】
前記架橋剤がペルオキシ二硫酸アンモニウムであることを特徴とする請求項３４記載の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，生物学的に活性な疎水性物質を担持する疎水化ヒアルロン酸の調製方法及びその使用に関するものであり，ここでは生物学的活性物質を疎水化ヒアルロナンのナノミセルにカプセル封入している。ヒアルロナンの疎水化は長鎖カルボン酸によるヒアルロナンのエステル化反応を経て行われ，長鎖カルボン酸は２，４，６‐トリクロロ安息香酸のハロゲン化物誘導体又はＲ３‐ＣＯ‐Ｃｌの別の有機塩化物により活性化される。好適な水性環境では，水溶性疎水化誘導体はナノミセルを形成し，この中では非極性物質が非共有物理的相互作用により結合することが可能である。ナノミセルのコアは疎水性アシル官能基により形成され，一方，ナノミセルのシェルはヒアルロン酸により形成される。ナノミセルへの物質のカプセル封入は溶媒交換法又は音波処理により行うことが可能である。ヒアルロンナノミセルは局所塗布において結合した物質の浸透を支持し，その結合した物質が個々の細胞へと移行することを可能にする。本発明は更に，安定化ナノミセル組成物を調製する方法に関する。疎水化ヒアルロナン誘導体から得たナノミセルは化粧用途及び医薬用途に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は２つの繰り返し単位β‐（１，３）‐Ｄ‐グルクロン酸及びβ‐（１，４）‐Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミンから成る重要な多糖である。それは単離の方法及び初期の使用材料に依存して５×１０４〜５×１０６の範囲の高い分子量を特徴としている。ヒアルロン酸，特にヒアルロナンとして知られるそのナトリウム塩は，結合組織及び関節液の必須構成要素である。更にそれは水和，プロテオグリカンの組織化，細胞分化，増殖及び血管形成など多数の生物学的プロセスにおいて重要な役割を担う。強い親水性を有する多糖は全てのpHの範囲内で塩の形態で水溶性である。
【０００３】
ヒアルロン酸をベースとする担体系
天然形態で親水性であることから，ヒアルロン酸は疎水性物質の効果的な担体として作用することができない。この為，疎水性官能基をヒアルロン酸のポリマー鎖に結合しなければならない。このような疎水性官能基の量と長さが十分である場合，その官能基を含む自己凝集プロセスが開始し，その結果，ヒアルロナンの構造内で疎水性ドメインが形成され得る。その後，水不溶性物質の小型分子が非共有結合により，このようなドメインに結合することができる。文献では，得られた構造はポリマーナノミセルと呼ばれることが多く，ミセルのコアは疎水性であるので，小型の非極性分子が溶解され，一方，そのシェルは親水性であるのでそのポリマーミセルは水性環境で溶解することが可能となる。寸法（直径）が２００nm未満のポリマーミセルは，ナノミセルと呼ばれる。
【０００４】
修飾されたヒアルロン酸をベースとするポリマーミセルにより形成された担体系は，ヒアルロナンとアルキルアミン(Liuら,2011年)及びギ酸との複合体で知られている。しかし，毒性が高く催奇形性であるホルムアミドの存在は，上記のヒアルロナン誘導体の調製には不可欠であると考えられている。酸化還元感受性ミセルを得る為，類似のポリマーミセル調製方法を採用した(Liら,2011年)。毒性の高い試薬が存在する為，このようなミセル系が生物学的用途に使用できないことは明らかである。
【０００５】
Ｄ‐グルクロン酸のカルボキシル基により媒介された結合を経て，また可能性として低分子物質の取り込みを経て，ヒアルロン酸と他のポリマー（乳酸又はグリコール酸のポリマー）とが共役することは，特許U.S.7,767,806で特許請求されており，ここでは，著者らはポリマーの生体適合性を述べているが，試験により説明も証明もしていない。別のケースでは，低分子ヒアルロナン（９〜４５kDa）は多様な鎖長の疎水性アミン及びカチオン性セグメントとして使用される正電荷スペルミンによって共有結合的に（グルクロン酸のカルボキシル基の位置で）修飾された（Shen,Li,Tu及びZhu,2009年）。後者の目的は，遺伝子の担体を調製することである。しかし，急性及び亜急性毒性により，上記目的の為のスペルミンの使用は制限されている（Til,Falke,Prinsen及びWillems,1997年）。直径が１２５〜５５５nmの形成されたポリマーミセルの臨界ミセル濃度は，０．０４mg・mL-1以上と測定された。臨界ミセル濃度値が過剰に高くなり，よってミセル系が（例えば血流中で）最大に希釈されないということに加えて，上記寸法のミセルは，人体内における薬物の受動的分散の好適な候補薬にはならないと考える。なぜなら，ポリマーミセルのその寸法は，腫瘍部位又は静脈壁破裂による梗塞性病変を発症させるその能力の原因であるからである。このような場合は，直径２０〜１００nmのポリマーミセルが好ましい(Wang,Mongayt及びTorchilin,2005年)。
【０００６】
負電荷ヒアルロン酸と正電荷スチリルピリジニウムとの間の静電相互作用に基づいたポリマーヒアルロナンミセルの調製に，グルクロン酸のカルボキシル基の修飾を利用した(Tao,Xu,Chen,Bai及びLiu,2012年)。しかし，このような相互作用はニューロンから神経伝達物質を放出させる調節に関して重要な役割を担ってはいるが，スチリルピリジニウムと神経末端及びムスカリン性受容体との相互作用はこれまで十分に解明されてきていないことから，このようなポリマーミセルのインビボでの使用は限定的である(Mazzone,Mori,Burman,Palovich,Belmonte及びCanning,2006年)。
【０００７】
特許文献U.S.7,993,678及びWO2007/033677では，ヒアルロナンのアルキル／アリール‐コハク酸誘導体の調製方法を請求しており，このような誘導体は活性的非極性物質のカプセル封入にも利用可能である。後者の場合，修飾はヒアルロナンの第１級ヒドロキシル基を包含し，一方，カルボキシル基は未変化のままである。上記の修飾反応の短所は，環状無水物とヒアルロナンとの反応が起こるアルカリ性pH範囲（pH８．５〜９．０）である。実際，このようなアルカリ性pH値により無水物の加水分解が開始され，これにより修飾プロセスの効率が低下する。このことは工業規模で特に顕著である。上記の方法で調製し，置換度が４４%であるヒアルロナンのアルキル／アリール‐コハク酸誘導体において，水性環境でミセルを形成（凝集）する能力は，個々の濃度が０．００３〜０．００４mg・mL-1超であるときに明らかになった。ポリマーミセルで観察された寸法は５０〜２００nmの範囲であった。しかし，このような誘導体の短所は，修飾アルキル／アリール‐コハク酸官能基中の付加的ＣＯＯ−基の存在に起因するヒアルロナンの全体的な負電荷の増加にある。分子の負電荷は細胞と個々の担体系との間の相互作用に対してかなり不利益な影響を与える可能性がある(Wang,Mongayt及びTorchilin,2005年)。上記の方法で調製した誘導体を注射に使用する際の制限因子の１つは，その低い溶解度にある(Eenschooten, Guillaumie, Kontogeorgis, Stenby及びSchwach‐Abdellaoui, 2010年)。このような誘導体の別の短所は，加圧滅菌などの加熱殺菌工程中におけるエステル結合の不安定性にある。特許文献U.S.7,993,678及びWO2007/033677では，安定的な乳液の形態などのヒアルロナンのアルキル／アリール‐コハク酸誘導体溶液中に非極性物質を直接溶解する方法が記載されているだけである。非極性物質をカプセル封入する直接的な方法の主な短所は，得られたポリマーミセルの結合能が低い所である(Kedar, Phutane, Shidhaye及びKadam,2010年)。上記特許は担体系の為の修飾ヒアルロナンの構造の利用を特許請求しているが，乳液系以外の所与のヒアルロナン構造に疎水性物質を結合できる可能性を有する更なる方法は提供していない。この理由で，適用性の現実的評価に必要である基本的な性質の一つとされている十分な結合能を有するポリマー担体系の提供が完全に欠落している。更に，細胞毒性及び細胞相互作用についての詳細は記載されておらず，よって，特許請求された構造が実際に疎水性物質の細胞内への活性的移行に適用可能であるか否かを結論付けることは不可能であり，この結論は医療への応用に不可欠である。
【０００８】
別の刊行物(Smejkalova,Hermannova,Sulakova,Prusova,Kucerik及びVelebny,2012年)には，ヒアルロナンの疎水性ドメインが記載されており，これは共有結合によりヒアルロナンに結合したＣ６‐アシル鎖の凝集から生じるものである。しかし，この刊行物に記載された誘導体には残留溶媒が完全に無いとは言えない。また，上記刊行物にはポリマーミセルの形成も特徴付けも述べられていない。更に，上記刊行物に記載された対称性無水物は長アルキル鎖間の結合形成には利用できない。脂肪族鎖が長いカルボン酸は非常に高価である上に，１モルの最終試薬の調製中，少なくとも１モルの酸が失われる。その刊行物では，調製した誘導体の細胞毒性も述べられていない。
【０００９】
同等の医薬組成物を含む多糖の酪酸エチルの調製は，特許EP0941253で特許請求されている。しかし，特許請求された調製方法は非常に低い置換度（最大３%）だけを可能にしている。非共有結合により調製された誘導体に結合した疎水性物質の量は不都合にもこのような低い置換度に影響される。非水性条件であること以外は特許WO2005/092929に従って，ヒアルロナンの酪酸エチルを更に調製した。従って，第４級アンモニウム塩へのヒアルロナンの変換はヒアルロナンの分解を伴う可能性がある。得られた置換度は０．１%未満であり，よってこのようなエステル誘導体は担体系の調製には適していない。ヒアルロナンと酪酸無水物及びレチノイン酸塩化物との同時エステル化を行ったところ，類似の結果が得られた(WO2004/056877)。
【００１０】
修飾ヒアルロナン（ＨＡ）‐［Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ‐Ｍ］Ｐ（式中，Ｍはアルキル官能基Ｃ２−１６から成る修飾単位を表し，ｐは３〜４の倍数を表す）及び薬学的活性分子をベースとするポリマーミセル組成物が特許U.S.2010/0316682及びEP1538166A1により特許請求されている。このような誘導体の主な短所は，免疫毒性及び催奇形の可能性を有する物質として知られ，ヒアルロナンの修飾を行う場合に使用されているジブチル錫ラウレートである。この物質は接着剤の製造に関連する修飾方法で使用されることが多く，急性毒性があることから欧州環境機構に収録されている(Boyer,1989年)。特許請求されたこの誘導体の別の短所は，ポリマー，例えばポリエチレングリコールと共役することであり，これは人体に対しては異質のものであり，静脈内投与又は局所投与に使用する場合，炎症反応を起こすか，或いは細胞毒性分解生成物を生じさせる。更に，ポリマーミセルを繰り返し塗布すると，ポリエチレングリコールが親水性セグメントを形成し，抗ＰＥＧ性ＩｇＭ抗体の形成により，血流からのこれらのミセルの排出が加速する(Gong,Chen,Zheng,Wang及びWang,2012年)。
【００１１】
乳酸‐グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）により修飾されたヒアルロナンのミセルにパクリタキセルをうまく取り込んだ(Kim,Lee,Jang及びPark,2009年)。この取り込みは，ポリマーと個々の結合物質両方をＤＭＳＯに溶解させ，得られた溶液をＨ２Ｏに対して透析する透析方法を利用して行った。この場合，調製したポリマーミセルの結合能は４．５重量%であった。このような担体系の主要な短所はＰＬＧＡポリマーの存在であり，これは人体に対しては異質のものであり，完全な生分解系ではない。別の短所は最終生成物中にＤＭＳＯが残留することである。
【００１２】
長鎖カルボン酸によるヒアルロナンの修飾
カルボン酸による多糖の修飾には，市販の所与の酸の無水物が必要である場合がほとんどである(WO1996/035720, WO2007/033677, (Smejkalova, Hermannova, Sulakova, Prusova, Kucerik及びVelebny, 2012年), EP0893451)。このような市販の無水物の主な短所は加水分解に対する感受性及び不純物が存在する可能性である。更に，数種の酸の無水物（例えばウンデカン‐カルボン酸）は市販されていない。入手可能な無水物の中には非常に高価なものもある（例えばオレイン酸，リノール酸又はリノレン酸の無水物）。従って，このような無水物の入手困難性，高価格及び不安定性により，修飾多糖の大規模調製が困難になる。
【００１３】
酸無水物は，ヒアルロナンのエステル化に使用できる他の酸誘導体と置換可能である。特許WO2010/105582は，非水性条件でのクロロギ酸エチルによるカルボン酸の活性化法を特許請求しており，ここではＯ‐アシル‐Ｏ’‐アルキルカーボネートが形成され，その後これはヒアルロナンのエステル化に使用できる。このような活性化の短所は，毒性で爆発する可能性を有するガスが生成される点にある。クロロギ酸エチルによる同様の活性化法が特許U.S.3,720,662及びCZ20060605に開示されている。
【００１４】
別の公知の方法は，イミダゾールの存在下でのカルボン酸による多糖のエステル化に基づく(U.S.2012/0172587)。しかし，特許請求した調製方法は，高温下ではヒアルロナンは分解されてしまうことからヒアルロナンには応用できない高い反応温度（９０〜２００℃）を必要とする。
【００１５】
欧州特許EP0893451は超臨界抽出法を用いたカルボン酸の無水物による多糖のエステル化を特許請求している。このエステル化手技の短所は，高圧が必要であること及び設備費が高い点である。
【００１６】
この理由から，原位置で利用できる方法としての長鎖カルボン酸活性化の代替法を見出すことは非常に重要である。可能な技術的解決策の１つは，無水物の形成を伴う２，４，６‐トリクロロ安息香酸の誘導体によるカルボン酸の活性化に基づく。温和な反応条件下，大環状物質を急速にエステル化する為，初めてＤＭＡＰ触媒と組み合わせて２，４，６‐トリクロロ安息香酸の無水物を使用した(Inanaga,Hirata,Saeki,Katsuki及びYamaguchi,1979年)。しかし，発熱反応には個々の多糖の分解が伴う可能性があることから，このエステル化法は特にヒアルロン酸の多糖の修飾にはまだ応用していない。
【００１７】
発明の概要
本発明の対象はヒアルロン酸の疎水化誘導体を合成すること，並びに水性環境で生物学的に活性な疎水性物質の為のポリマー担体の形態を取る前記誘導体を利用することであり，ここでは結合した物質の先天的性質及び生物学的活性は，未変化のままにしなければならない。
【００１８】
長鎖脂肪族エステルによるヒアルロナン（Ｃ６‐Ｃ１８）の疎水化は，２，４，６‐トリクロロ安息香酸の無水物の形成を伴う長鎖カルボン酸の直接的活性化に基づいている（スキーム１）。次の工程では，得られた無水物はヒアルロン酸と反応し，ヒアルロン酸のアシル化誘導体が形成される。前記活性化の主な利点は，脂肪族カルボン酸を直接的に利用できることにある。先行技術を構成する同様のヒアルロナン疎水化反応とは異なり，本発明の修飾には市販の無水物の使用は不要である。本発明の活性化の別の利点は，個々の反応が温和な条件下（室温〜５０℃）で生じ，所要時間も短いところにある。更に，特許出願WO2010/105582で開示された方法とは異なり，本願の活性化には大量の脂肪酸も特別な無水条件も不要である。活性化試薬は安定的であり，また，クロロギ酸エチルとは異なり，反応で使用する際に毒性かつ爆発性のガスが生成されることもない。本発明の活性化試薬の別の利点は，当該試薬が副産物による反応を起こさないこと，また架橋反応を誘発しないことにある。
【００１９】
２，４，６‐トリクロロ安息香酸の誘導体によるカルボン酸の活性化は，得られた活性化生成物のヒアルロン酸エステル化へのその後の利用と共に下記スキーム１に表す。
2016500130.tif 000003
スキーム１
【００２０】
更に本発明は，ナノミセル系を調製する為の疎水化ヒアルロン酸の使用，並びに皮膚，毛髪及び粘膜を治療する為のヒアルロン酸のナノミセル中で結合した物質の利用，更に可能性のある他の局所適用に関するものである。カプセル封入した生物学的活性物質は，ポリマー担体の疎水性官能基との非共有的な物理的相互作用により，ヒアルロナンのナノミセル中で結合する。上記の方法でカプセル封入すると，このような物質は表面皮膚層（表皮），毛髪の全体構造，粘膜上皮に効果的に浸透する。その利点の１つは，ナノミセル中で結合した活性物質の浸透深度が，直接に非極性溶媒に溶解された際の同物質の深度より大きい点にある。
【００２１】
類似のポリマー系（特許U.S.7,993,678及びWO2007/033677に開示されたポリマーなど）と比較して，ヒアルロナンのナノミセル抱合体は予想に反して３倍〜１０倍低い臨界ミセル濃度を示すと同時に，塩分環境及び水性環境下で比較的高い安定性を示した。このような非常に低い臨界ミセル濃度の値はヒアルロナンミセルの静脈内投与が可能であるという点で特に有利である。先行技術を参照して述べた他の大半の公知のポリマーをベースとする類似の系とは異なり，凍結前に溶液へ凍結乾燥防止剤を添加することなく目的のカプセル封入を維持することができる為，ヒアルロナンミセルの高い安定性は多様な材料を凍結乾燥するという点で有利である可能性がある。
【００２２】
特許請求されたヒアルロナンの疎水化誘導体の別の利点としては，その他の場合ではナノミセルの形成に必要であることが多く，反復投与されると抗体の形成を誘発する可能性がある合成ポリマー(PLGA,PEG等)及びコポリマーが不要であることが挙げられる(Gong,Chen,Wang&Wang)。
【００２３】
類似のポリマーミセル系とは異なり，ナノミセルの形成は全負電荷が増加した修飾ヒアルロナンをベースとしてはおらず，従って担体系と細胞との相互作用は，不都合にもこのような電荷の影響を受けない。
【００２４】
ナノミセル構造，特にヒアルロナンに結合した長めのアシル鎖を含む構造は，水性環境下でゲル相を形成し得るものもある。このようなゲル相は，個々の担体系の粘度増加を必要とする特定の用途において有利に使用し得る。
【００２５】
調製したナノミセル系の寸法は，大部分が２０〜１００nmであり，これは医療用途に最適な寸法であり，高浸透度及び保持効果（ＥＰＲ効果）の有利性が得られる。先行技術を参照して説明したポリマーミセルにおいて，このような寸法は必ずしも得られるわけではない。
【００２６】
ヒアルロナンミセルの別の利点は，結合した物質がナノミセルの疎水性ドメインから細胞へと移行することに関連している。
【００２７】
この核心的なカプセル封入法は，水中に溶解したヒアルロナンと有機溶媒に溶解した生物学的活性物質との混合物の調製，次いでヒアルロナンの水和エンベロープのエネルギー崩壊，及びその後の溶液からの溶媒の除去に基づく。一般的なカプセル封入手技とは対照的に，上記の方法は有機溶媒へのポリマーの溶解度に基づいておらず，従って，特にヒアルロナンが細胞受容体により認識されることを可能にする重要なカルボキシル基の位置で，ヒアルロン酸の先天的性質が抑制されること，及び，ポリマー鎖が大幅に修飾されることを必要としない。有機溶媒は水より低い沸点を有するものが好ましい。ヒアルロナンナノミセルの結合能は，残余水相の完全な蒸発と，その後のナノミセルの再水和によって顕著に増加する。結合していない生物学的活性物質は濾過工程で除去し，得られたナノミセルは直接凍結乾燥し，その後の再水和の時間になるまで乾燥状態で保存することが可能である。
【００２８】
本発明は特に，一般式（I）に従ったヒアルロン酸のＣ６‐Ｃ１８‐アシル化誘導体であって：
2016500130.tif 000004
式中，ＲはＨ＋又はＮａ＋であり，Ｒ１はＨ又はＣ（＝Ｏ）ＣｘＨｙ又はＣ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨ‐ｈｅｔであり，ｘは５〜１７の整数であり，ｙは１１〜３５の整数であり，ＣｘＨｙは直鎖又は分岐の飽和又は不飽和Ｃ５‐Ｃ１７鎖であり，ｈｅｔはその内容をＮ，Ｓ又はＯ原子の中から選択できる複素環又は複素芳香族基であり，少なくとも１つの繰り返し単位は１つ以上のＲ１，‐Ｃ（＝Ｏ）ＣｘＨｙ又はＣ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨ‐ｈｅｔ基を含み，ｎは１２〜４０００の範囲であるものとする誘導体に関する。好適な実施態様では，前記Ｃ６‐Ｃ１８‐アシル化誘導体は，式（I）においてＲはＨ＋又はＮａ＋であり，Ｒ１は‐Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）７‐ＣＨ＝ＣＨ‐（ＣＨ２）７‐ＣＨ３であるオレイル誘導体である。
【００２９】
更に，本発明は，前記ヒアルロン酸の誘導体の調製方法に関し，水と水混和性非プロトン性溶媒との混合液中，塩基及び触媒の存在下で，ヒアルロン酸は，２，４，６‐トリクロロ安息香酸の塩化物又はＲ３‐ＣＯ‐Ｃｌの有機塩素化合物により活性化するＣ６‐Ｃ１８‐カルボン酸と反応し，Ｒ３は，場合により複素芳香族又は芳香族官能基を含む脂肪族又は分岐Ｃ１‐Ｃ３０アルキルである。例示的な複素芳香族官能基としては（例えば式（i）に従った）ピリジンとその誘導体が挙げられ，例示的な芳香族官能基としては（例えば式（ii）に従った）ベンゼンとそのハロゲン誘導体が挙げられる。
2016500130.tif 000005
【００３０】
ヒアルロン酸は遊離酸形態，又はＮａ，Ｋ，Ｃａ，Ｍｇ，Ｚｎ若しくはＬｉ塩などの薬学的に許容可能な塩の形態を取り，分子量は好ましくは５×１０３〜１．６×１０６，より好ましくは１５×１０３〜２５０×１０３，最も好ましくは１５×１０３〜５０×１０３である。本発明に従った調製方法は，ヒアルロン酸を水と水混和性の非プロトン性溶媒との混合液に溶解することにあり，ここではその溶媒は極性有機溶媒であり，水分含量は１０〜９９体積%，好ましくは５０体積%である。水混和性の非プロトン性溶媒は，例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ），テトラヒドロフラン（ＴＨＦ），アセトン，アセトニトリル又はイソプロパノール（ＩＰＡ）であってもよい。反応混合液にはＲ’３Ｎ塩基が含まれ，Ｒ’は直鎖又は分岐ＣｎＨｍ炭化水素鎖であり，式中ｎは１〜４の整数であり，ｍは３〜９の整数であり，例えばトリエチルアミンの量はヒアルロン酸の二量体に対して０．０１〜２０当量，好ましくは６当量であり，触媒はジメチルアミノピリジンなどの置換ピリジンから成る群より選択され，その量はヒアルロン酸の二量体に対して０．０１〜１当量，好ましくは０．０５当量である。本発明に従った調製方法では，初めにＣ６‐Ｃ１８‐カルボン酸の活性化を極性有機溶媒中，塩基及び２，４，６‐トリクロロ安息香酸又はその誘導体の存在下，或いは塩基及び有機塩化物の存在下で行い，その後，活性化Ｃ６‐Ｃ１８‐カルボン酸を含む混合液をヒアルロン酸に添加し，これを水，有機溶媒，塩基及び触媒の混合液中に溶解し，その得られた反応の生成物は一般式（Ｉ）に従った誘導体である。前記Ｃ６‐Ｃ１８‐カルボン酸はカプロン酸，エナント酸，カプリル酸，カプリン酸，パルミチン酸，ステアリン酸，オレイン酸，リノール酸及びリノレン酸から成る群より選択される。活性化Ｃ６‐Ｃ１８‐カルボン酸の量はヒアルロン酸の二量体に対して０．０１〜５当量，好ましくは０．５〜２当量である。Ｃ６‐Ｃ１８‐カルボン酸の活性化は，２０〜６０℃，好ましくは２５℃で，５〜１２０分間，好ましくは３０分間行う。ヒアルロン酸と活性化Ｃ６‐Ｃ１８‐カルボン酸との反応は２０〜６０℃，好ましくは２５℃で，１〜２４時間，好ましくは２〜３時間行う。その後，ヒアルロン酸のＣ６‐Ｃ１８‐アシル化誘導体を反応混合液から分離し，洗浄し，乾燥し，凍結乾燥させることも可能である。誘導体はＮａＣｌ及びアルコールを使用して沈殿により反応混合液から分離させてもよい。その後，誘導体をアルコール，特にイソプロパノール又はエタノールで洗浄してもよい。
【００３１】
更なる態様では，本発明は一般式（I）に従ったヒアルロン酸のＣ６‐Ｃ１８‐アシル化誘導体をベースとするナノミセル組成物に関するものであり，この組成物はヒアルロン酸に結合したＣ６‐Ｃ１８‐アシル基に形成された疎水性のコアとヒアルロン酸の親水性官能基に形成された親水性のシェルから成るナノミセルを含み，ここに１種以上の生物学的活性物質が各ナノミセル中で物理的に結合している。当該組成物は更に水を含み，また塩（例えば０．９%のＮａＣｌ）を含んでもよい。好ましい実施態様では，ナノミセル組成物はヒアルロン酸のＣ６‐Ｃ１８‐アシル化誘導体の質量含有量に対して０．３〜５０重量%の生物学的活性物質を含み，該生物学的活性物質は薬学的及び美容的活性物質，特にビタミン，医薬，細胞増殖抑制剤，植物エキス，植物複合体若しくは植物活性物質，鉱物或いは植物油，又はこれらの混合物から成る群より選択される。利用可能な生物学的活性物質の例としては，例えばトコフェロール，パクリタキセル，ホスファチジルコリン又はコエンザイムＱ１０が挙げられる。好ましい実施態様では，当該組成物はその臨界凝集濃度より高い濃度でヒアルロン酸のＣ６‐Ｃ１８‐アシル化誘導体を含んでいる。当該組成物が水溶液の状態であるとき，ヒアルロン酸のＣ６‐Ｃ１８‐アシル化誘導体の濃度は，０．０００１mg・mL-1〜３０mg・mL-1，好ましくは１〜２０mg・mL-1の範囲である。別の好ましい実施態様では，生物学的活性物質は，ヒアルロン酸のＣ６‐Ｃ１８‐アシル化誘導体の質量含有量に対して０．０５〜４０重量%，好ましくは１〜２０重量%の量で含まれる鉱物又は植物油である。更に別の好ましい実施態様では，当該組成物は，液体で水不溶性の生物学的活性物質を含み，前記物質には，そこに溶解した状態の追加的生物学的活性物質が含まれている。液体で水不溶性のこのような生物学的活性物質は例えば鉱物又は植物油であってもよく，追加的生物学的活性物質は例えば薬学又は美容的活性物質，特にビタミン，医薬，細胞増殖抑制剤，植物エキス，植物複合体若しくは植物活性物質，又はこれらの混合物に属するものであってもよい。本発明に従ったナノミセル組成物は溶液，ナノエマルジョン，マイクロエマルジョン，コアセルベート又はゲルの形態を取ってもよい。
【００３２】
本発明は更に上記で定義したようなナノミセル組成物の調製方法に関連しており，ここでは，一般式（I）に従ったヒアルロン酸のＣ６‐Ｃ１８‐アシル化誘導体を水に溶解し，生物学的活性物質を有機溶媒に溶解し，得られた溶液を混合し，その後，有機溶媒を除去する。有機溶媒はトリクロロメタンなどの揮発性塩化溶媒，又はエタノールやイソプロパノールなどのアルコールであってもよく，その除去は真空蒸発で行ってもよい。次に，水相を乾燥させ，そして再水和させ，得られたナノミセル構造物を濾過し，最後に凍結乾燥させる。或いは，有機溶媒は透析により除去してもよい。その後に，再度，得られたナノミセル構造を濾過し，最後に凍結乾燥させる。好ましい実施態様では，一般式（I）に従ったヒアルロン酸のＣ６‐Ｃ１８‐アシル化誘導体を水に溶解し，次いで，液体で水不溶性の生物学的活性物質と混合し，そこで，得られた混合液を音波処理によりホモジナイズし，マイクロエマルジョン又はナノエマルジョンを形成する。別の好ましい実施態様では，一般式（I）に従ったヒアルロン酸のＣ６‐Ｃ１８‐アシル化誘導体を水に溶解し，次いで，追加的生物学的活性物質が溶解されている液体で水不溶性の生物学的活性物質と混合し，そこで得られた混合液を音波処理によりホモジナイズし，マイクロエマルジョン又はナノエマルジョンを形成する。
【００３３】
更に別の態様では，本発明は医療用途又は化粧用途，好ましくは局所適用でのナノミセル組成物の使用に関連している。
【００３４】
更に，安定化させたナノミセル組成物を調製してもよい。このような安定化ナノミセル組成物の調製方法は一般式（II）に従ったＣ６‐Ｃ１８‐アシル化ヒアルロナンを調製することにある：
2016500130.tif 000006
式中，ＲはＨ＋又はＮａ＋であり，１つ以上のＲ１メンバーは，不飽和結合を含むことが可能で少なくとも１つの繰り返し単位に存在する直鎖Ｃ６‐Ｃ１８鎖，並びに３‐（２‐チエニル）アクリル酸又は３‐（２‐フリル）アクリル酸，又は別の少なくとも１つの繰り返し単位に存在する前記酸の誘導体で表され，そこで，ナノミセル組成物を一般式（II）に従ったＣ６‐Ｃ１８‐アシル化ヒアルロナンから調製し，その後，この組成物を架橋反応で安定化する。
【００３５】
特に，安定化は以下の方法で行う：最初に，一般式（III）に従った誘導体を調製し：
2016500130.tif 000007
ここでは，ヒアルロン酸を水に溶解し，その後，塩基（ＴＥＡなど）及び触媒（ＤＭＡＰ）を溶解し；分離工程では，活性化した３‐（２‐チエニル）アクリル酸又は３‐（２‐フリル）アクリル酸又はそのいずれかの酸の誘導体を調製し，有機溶媒（例えばＴＨＦ）及び塩基（例えばＴＥＡ）に２，４，６‐トリクロロ安息香酸の塩化物を加えた混合液中で活性化を行い，最後に両混合液を混合し，式（III）に従ったアシル化ヒアルロナンを形成する。次いで，一般式（I）に従ったＣ６‐Ｃ１８‐アシル化ヒアルロナンの調製方法を参照して上述したものと類似の方法で式（III）に従った前記アシル化ヒアルロナンの活性の為に，活性化Ｃ６‐Ｃ１８‐カルボン酸を調製し，式（II）に従ったアシル化ヒアルロナンを形成する。最後に，前記方法で調製したアシル化ヒアルロナンから，ナノミセルを同様に調製することも可能である。このようなナノミセルは，その後に，例えばペルオキシ二硫酸アンモニウムを使用してラジカル反応で架橋してもよい。このような架橋ヒアルロナンは水不溶性である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】水中における，カプセル封入したナイルレッドを含むアシル化ヒアルロナン誘導体（Ｃ６）及び（Ｃ１６）での蛍光法を利用した臨界ミセル（凝集）濃度（ＣＭＣ）の測定を示す。
【図２】水中における，カプセル封入オイルレッドを含むアシル化ヒアルロナン誘導体（Ｃ６）及び（Ｃ１６）での静的光散乱法を利用した臨界ミセル（凝集）濃度（ＣＭＣ）の測定を示す。
【図３】カプセル封入したビタミンＥ（上段画像）及びパクリタキセル（下段画像）を含むヒアルロナンナノミセルのＣｒｙ‐ＳＥＭ画像である。
【図４】濃度及び細胞相互作用時間に伴うパクリタキセルの細胞毒性，並びにＨＡＣ６及びＨＡＣ１６にカプセル封入したパクリタキセルの細胞毒性を示す。
【図５】曝露から１時間後のＨＣＴ１１６及びＭＣＦ‐７細胞へのドキソルビシンの移行を示す。
【図６】カプセル封入した７ＡＡＤを含むＨＡ（Ｃ６）担体を使用した生細胞における７ＡＡＤの細胞内移行を示す。
【図７】ＨＡＣ６担体からＰＢＳ，及びＴＷＥＥＮ８０を１%添加したＰＢＳへのカプセル封入オイルレッドの放出に関するプロファイルを示す。ＨＡＣ６＋オイルレッドの濃度：１又は１０mg・mL-1。
【図８】ＨＡＣ６及びＨＡＣ１６（ｃ＝１０mg・mL-1）担体からＰＢＳへ放出されたカプセル封入パクリタキセルのプロファイルを示す。
【図９】ヒアルロナンナノミセルＨＡ（Ｃ６）及びＨＡ（Ｃ１０）からのカプセル封入ナイルレッド（ＮＲ）の皮膚への浸透と，オイルに溶解して水に分散させたナイルレッドの皮膚への浸透との対比を示す。各ナイルレッド試料は同濃度であった。
【図１０】ヒアルロナンナノミセルＨＡ（Ｃ６）及びＨＡ（Ｃ１０）からのカプセル封入ナイルレッド（ＮＲ）の毛髪への浸透と，オイルに溶解して水に分散させたナイルレッドの毛髪への浸透との対比を示す。各ナイルレッド試料は同濃度であった（顕微鏡画像は１本の毛髪の断面図を示す）。
【図１１】ポリマーヒアルロナンナノミセルＨＡ（Ｃ６）及びＨＡ（Ｃ１０）からのカプセル封入ナイルレッド（ＮＲ）の頬粘膜への浸透と，オイルに溶解して水に分散させたナイルレッドの頬粘膜への浸透との対比を示す。各ナイルレッド試料は同濃度であった。
【図１２】ポリマーヒアルロナンナノミセルＨＡ（Ｃ６）及びＨＡ（Ｃ１０）からのカプセル封入ナイルレッド（ＮＲ）の膣粘膜への浸透と，オイルに溶解して水に分散させたナイルレッドの膣粘膜への浸透との対比を示す。各ナイルレッド試料は同濃度であった。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
ＤＳ＝置換度＝結合した置換基の１００%＊モル量／全多糖二量体のモル量
特段の規定がない限り，本明細書で使用する表現「当量」(eq)はヒアルロン酸の二量体に対するものを意味する。特段の規定がない限り，百分率は重量／重量（weight/weight basis）に基づいて計算されている。
大部分のヒアルロン酸の分子量はＳＥＣ‐ＭＡＬＬＳ法により測定した（ソース：コンティプロ  ビオテック  スポレチノスト  エス  ルチェニム  オメゼニム(Contipro Biotech s.r.o)，ドルニ  ドブロウク，チェコ）。
【００３８】
実施例１  ２，４，６‐トリクロロ安息香酸及びカプロン酸の混合アルデヒドによるヒアルロン酸のカプロニル(capronyl)（Ｃ６）誘導体の調製
１gのヒアルロン酸ナトリウム（２．５mmol，１５kDa）を１０mLの脱塩水に溶解した。その後，５mLのＤＭＳＯを徐々に添加した。次にＴＥＡ（１．０５mL，３eq）及びＤＭＡＰ（８．０mg，０．０５eq）を溶液に添加した。同時にヘキサン酸（０．６３mL,２eq）を５mLのＤＭＳＯ及びＴＥＡ（１．０５mL，３eq）に溶解し，その後，２，４，６‐トリクロロベンゾイルクロリド（１．６mL，４eq）をその溶液に添加した。酸の活性化の後，沈殿物を濾過し，ＨＡの調製溶液に入れた。室温で３時間反応させた。その後，０．２５gのＮａＣｌを添加した５mLの脱塩水で反応混合液を希釈した。その後の沈殿工程において，４倍の無水イソプロパノールを使用し，アシル化誘導体を反応混合液から単離した。デカンテーションを行った後，初めに誘導体からＤＭＳＯ及びＤＭＡＰを除去する為にイソプロパノール水溶液（８５体積%）で，次いで誘導体から水を除去する為に無水イソプロパノールで沈殿物を繰り返し洗浄した。その後，沈殿物を４０℃で４８時間乾燥させ，次いで残留溶媒を除去する目的で凍結乾燥させた。
ＤＳ６０%（ＮＭＲから測定）
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）アシルのシグナル：δ２．４ppm（ｍ，２Ｈ，αＣＨ２），δ１．６ppm（ｍ，２Ｈ，βＣＨ２），δ１．３ppm（ｍ，４Ｈ，γ，δＣＨ２），δ０．８（ｍ，３Ｈ，ＣＨ３）
【００３９】
実施例２  ２，４，６‐トリクロロ安息香酸及びカプロン酸の混合アルデヒドによるヒアルロン酸のカプロニル（Ｃ６）誘導体の調製
１ｇのヒアルロン酸ナトリウム（２．５mmol，３８kDa）を１０mLの脱塩水に溶解した。その後，５mLのイソプロパノールを徐々に添加した。次にＴＥＡ（１．０５mL，３eq）及びピリジン（０．４mL，２．０eq）を溶液に添加した。同時にヘキサン酸（０．３２mL，１eq）を５mLのイソプロパノールに溶解し，その後，ＴＥＡ（１．０５mL，３eq）及び２，４，６‐トリクロロベンゾイルクロリド（０．３９１mL，１eq）をその溶液に添加した。酸の活性化の後，沈殿物を濾過し，ＨＡの調製溶液に入れた。室温で３時間反応させた。その後，０．５０gのＮａＣｌを添加した５mLの脱塩水で反応混合液を希釈した。その後の沈殿工程において，４倍の無水イソプロパノールを使用し，アシル化誘導体を反応混合液から単離した。デカンテーションを行った後，初めに誘導体からピリジンを除去する為にイソプロパノール水溶液（８５体積%）で，次いで誘導体から水を除去する為に無水イソプロパノールで沈殿物を繰り返し洗浄した。その後，沈殿物を４０℃で４８時間乾燥させ，次いで残留溶媒を除去する目的で凍結乾燥させた。
ＤＳ１５%（ＮＭＲから測定）
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）アシルのシグナル：δ２．４ppm（ｍ，２Ｈ，αＣＨ２），δ１．６ppm（ｍ，２Ｈ，βＣＨ２），δ１．３ppm（ｍ，４Ｈ，γ，δＣＨ２），δ０．８（ｍ，３Ｈ，ＣＨ３）
【００４０】
実施例３  ２，４，６‐トリクロロ安息香酸及びエナント酸の混合アルデヒドによるヒアルロン酸のエナンチル（Ｃ７）誘導体の調製
１ｇのヒアルロン酸ナトリウム（２．５mmol，１５kDa）を１０mLの脱塩水に溶解した。その後，５mLのアセトニトリルを徐々に添加した。次にＴＥＡ（０．７０mL，２eq）及びＤＭＡＰ（１５．０mg，０．０５eq）を溶液に添加した。同時にエナント酸（０．３５mL，１eq）を５mLのアセトニトリルに溶解し，その後，ＴＥＡ（０．７０mL，２eq）及び２，４，６‐トリクロロベンゾイルクロリド（０．３９mL，１eq）をその溶液に添加した。酸の活性化の後，沈殿物を濾過し，ＨＡの調製溶液に入れた。室温で３時間反応させた。その後，０．７５gのＮａＣｌを添加した５mLの脱塩水で反応混合液を希釈した。その後の沈殿工程において，４倍の無水イソプロパノールを使用し，アシル化誘導体を反応混合液から単離した。デカンテーションを行った後，初めに誘導体からアセトニトリル及びＤＭＡＰを除去する為にイソプロパノール水溶液（８５体積%）で，次いで誘導体から水を除去する為に無水イソプロパノールで沈殿物を繰り返し洗浄した。その後，沈殿物を４０℃で４８時間乾燥させ，次いで残留溶媒を除去する目的で凍結乾燥させた。
ＤＳ１２%（ＮＭＲから測定）
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）アシルのシグナル：δ２．４ppm（ｍ，２Ｈ，αＣＨ２），δ１．６ppm（ｍ，２Ｈ，βＣＨ２），δ１．３ppm（ｍ，６Ｈ，γ，δ，ε（ＣＨ２）３），δ０．８（ｍ，３Ｈ，ＣＨ３）
【００４１】
実施例４  ２，４，６‐トリクロロ安息香酸及びカプリル酸の混合アルデヒドによるヒアルロン酸のカプリリル（Ｃ８）誘導体の調製
１ｇのヒアルロン酸ナトリウム（２．５mmol，１５kDa）を１０mLの脱塩水に溶解した。その後，５mLのアセトニトリルを徐々に添加した。次にＴＥＡ（１．０５mL，３eq）及びＤＭＡＰ（８．０mg，０．０５eq）を溶液に添加した。同時にオクタン酸（０．６３g，４eq）を５mLのアセトニトリルに溶解し，その後，ＴＥＡ（１．０５mL，３eq）及び２，４，６‐トリクロロベンゾイルクロリド（０．８mL，４eq）をその溶液に添加した。酸の活性化の後，沈殿物を濾過し，ＨＡの調製溶液に入れた。室温で３時間反応させた。その後，０．５０gのＮａＣｌを添加した５mLの脱塩水で反応混合液を希釈した。その後の沈殿工程において，４倍の無水イソプロパノールを使用し，アシル化誘導体を反応混合液から単離した。デカンテーションを行った後，初めに誘導体からアセトニトリル及びＤＭＡＰを除去する為にイソプロパノール水溶液（８５体積%）で，次いで誘導体から水を除去する為に無水イソプロパノールで沈殿物を繰り返し洗浄した。その後，沈殿物を４０℃で４８時間乾燥させ，次いで残留溶媒を除去する目的で凍結乾燥させた。
ＤＳ４０%（ＮＭＲから測定）
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）アシルのシグナル：δ２．４ppm（ｍ，２Ｈ，αＣＨ２），δ１．６ppm（ｍ，２Ｈ，βＣＨ２），δ１．３ppm（ｍ，８Ｈ，（ＣＨ２）４），δ０．８（ｍ，３Ｈ，ＣＨ３）
【００４２】
実施例５  ２，４，６‐トリクロロ安息香酸及びカプリン酸の混合アルデヒドによるヒアルロン酸のカプリニル（caprinyl）（Ｃ１０）誘導体の調製
１gのヒアルロン酸ナトリウム（２．５mmol，１５kDa）を１０mLの脱塩水に溶解した。その後，５mLのＴＨＦを徐々に添加した。次にＴＥＡ（１．０５mL，３eq）及びＤＭＡＰ（８．０mg，０．０２５eq）を溶液に添加した。同時にデカン酸（０．８g，２eq）を５mLのＴＨＦに溶解し，その後，ＴＥＡ（１．０５mL，３eq）及び２，４，６‐トリクロロベンゾイルクロリド（０．８mL，２eq）をその溶液に添加した。酸の活性化の後，沈殿物を濾過し，ＨＡの調製溶液に入れた。室温で３時間反応させた。その後，０．２５gのＮａＣｌを添加した５mLの脱塩水で反応混合液を希釈した。その後の沈殿工程において，４倍の無水イソプロパノールを使用し，アシル化誘導体を反応混合液から単離した。デカンテーションを行った後，初めに誘導体からＤＭＡＰを除去する為にイソプロパノール水溶液（８５体積%）で，次いで誘導体から水を除去する為に無水イソプロパノールで沈殿物を繰り返し洗浄した。その後，沈殿物を４０℃で４８時間乾燥させ，次いで残留溶媒を除去する目的で凍結乾燥させた。
ＤＳ１５%（ＮＭＲから測定）
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）アシルのシグナル：δ２．４ppm（ｍ，２Ｈ，αＣＨ２），δ１．６ppm（ｍ，２Ｈ，βＣＨ２），δ１．３ppm（ｍ，１２Ｈ，γ，δ，ε，ζ，η，θＣＨ２），δ０．８（ｍ，３Ｈ，ＣＨ３）
【００４３】
実施例６  ２，４，６‐トリクロロ安息香酸及びカプリン酸の混合アルデヒドによるヒアルロン酸のカプリニル（Ｃ１０）誘導体の調製
１gのヒアルロン酸ナトリウム（２．５mmol，１５kDa）を１０mLの脱塩水に溶解した。その後，５mLのＴＨＦを徐々に添加した。次にＴＥＡ（１．０５mL，３eq）及びＤＭＡＰ（８．０mg，０．０２５eq）を溶液に添加した。同時にデカン酸（０．８g，４eq）を５mLのＴＨＦに溶解し，その後，ＴＥＡ（１．０５mL，３eq）及び２，４，６‐トリクロロベンゾイルクロリド（０．８mL，４eq）をその溶液に添加した。酸の活性化の後，沈殿物を濾過し，ＨＡの調製溶液に入れた。室温で３時間反応させた。その後，０．２５gのＮａＣｌを添加した５mLの脱塩水で反応混合液を希釈した。その後の沈殿工程において，４倍の無水イソプロパノールを使用し，アシル化誘導体を反応混合液から単離した。デカンテーションを行った後，初めに誘導体からＴＨＦ及びＤＭＡＰを除去する為にイソプロパノール水溶液（８５体積%）で，次いで誘導体から水を除去する為に無水イソプロパノールで沈殿物を繰り返し洗浄した。その後，沈殿物を４０℃で４８時間乾燥させ，次いで残留溶媒を除去する目的で凍結乾燥させた。
ＤＳ４０%（ＮＭＲから測定）
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）アシルのシグナル：δ２．４ppm（ｍ，２Ｈ，αＣＨ２），δ１．６ppm（ｍ，２Ｈ，βＣＨ２），δ１．３ppm（ｍ，１２Ｈ，γ，δ，ε，ζ，η，θＣＨ２），δ０．８（ｍ，３Ｈ，ＣＨ３）
【００４４】
実施例７  ２，４，６‐トリクロロ安息香酸及びパルミチン酸の混合アルデヒドによるヒアルロン酸のパルミトイル（Ｃ１６）誘導体の調製
０．５gのヒアルロン酸ナトリウム（１．２５mmol，３８kDa）を２０mLの脱塩水に溶解した。その後，１０mLのＴＨＦを徐々に添加した。次にＴＥＡ（０．５２mL，３eq）及びＤＭＡＰ（８．０mg，０．０５eq）を溶液に添加した。同時にパルミチン酸（０．１６g，０．５eq）を１０mLのＴＨＦに溶解し，その後，ＴＥＡ（０．５２mL，３eq）及び２，４，６‐トリクロロベンゾイルクロリド（０．０９８mL，０．５eq）をその溶液に添加した。酸の活性化の後，沈殿物を濾過し，ＨＡの調製溶液に入れた。室温で３時間反応させた。その後，０．２５gのＮａＣｌを添加した５mLの脱塩水で反応混合液を希釈した。その後の沈殿工程において，４倍の無水イソプロパノールを使用し，アシル化誘導体を反応混合液から単離した。デカンテーションを行った後，初めに誘導体からＤＭＡＰを除去する為にイソプロパノール水溶液（８５体積%）で，次いで誘導体から水を除去する為に無水イソプロパノールで沈殿物を繰り返し洗浄した。その後，沈殿物を４０℃で４８時間乾燥させ，次いで残留溶媒を除去する目的で凍結乾燥させた。
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）アシルのシグナル：δ２．４ppm（ｍ，２Ｈ，αＣＨ２），δ１．６ppm（ｍ，２Ｈ，βＣＨ２），δ１．３ppm（ｍ，２４Ｈ，（ＣＨ２）１２），δ０．８（ｍ，３Ｈ，ＣＨ３）．ＤＳ１４%（ＮＭＲから測定）
【００４５】
実施例８  ２，４，６‐トリクロロ安息香酸及びステアリン酸の混合アルデヒドによるヒアルロン酸のステアリル（Ｃ１８）誘導体の調製
０．５gのヒアルロン酸ナトリウム（１．２５mmol，１５kDa）を１０mLの脱塩水に溶解した。その後，５mLのＴＨＦを徐々に添加した。次にＴＥＡ（０．５２mL，３eq）及びＤＭＡＰ（８．０mg，０．０５eq）を溶液に添加した。同時にステアリン酸（０．７１１g，２eq）を５mLのＴＨＦに溶解し，その後，ＴＥＡ（０．５２mL，３eq）及び２，４，６‐トリクロロベンゾイルクロリド（０．３９１mL，２eq）をその溶液に添加した。酸の活性化の後，沈殿物を濾過し，ＨＡの調製溶液に入れた。室温で３時間反応させた後，反応混合液を５０℃で１時間加温した。その後，０．２５gのＮａＣｌを添加した５mLの脱塩水で反応混合液を希釈した。その後の沈殿工程において，４倍の無水イソプロパノールを使用し，アシル化誘導体を反応混合液から単離した。デカンテーションを行った後，初めに誘導体からＤＭＡＰを除去する為にイソプロパノール水溶液（８５体積%）で，次いで誘導体から水を除去する為に無水イソプロパノールで沈殿物を繰り返し洗浄した。その後，沈殿物を４０℃で４８時間乾燥させ，次いで残留溶媒を除去する目的で凍結乾燥させた。
ＤＳ７%（ＮＭＲから測定）
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）アシルのシグナル：δ２．４ppm（ｍ，２Ｈ，αＣＨ２），δ１．６ppm（ｍ，２Ｈ，βＣＨ２），δ１．３ppm（ｍ，２８Ｈ，（ＣＨ２）１４），δ０．８（ｍ，３Ｈ，ＣＨ３）
【００４６】
実施例９  ２，４，６‐トリクロロ安息香酸及びオレイン酸の混合アルデヒドによるヒアルロン酸のオレイル（Ｃ１８：１）誘導体の調製
０．５gのヒアルロン酸ナトリウム（１．２５mmol，１５kDa）を１０mLの脱塩水に溶解した。その後，５mLのＴＨＦを徐々に添加した。次にＴＥＡ（０．５２mL，３eq）及びＤＭＡＰ（１５．０mg，０．１eq）を溶液に添加した。同時にオレイン酸（０．１８g，０．５eq）を５mLのＴＨＦに溶解し，その後，ＴＥＡ（０．５２mL，３eq）及び２，４，６‐トリクロロベンゾイルクロリド（０．０９８mL，０．５eq）をその溶液に添加した。酸の活性化の後，沈殿物を濾過し，ＨＡの調製溶液に入れた。室温で３時間反応させた。その後，０．２５gのＮａＣｌを添加した５mLの脱塩水で反応混合液を希釈した。その後の沈殿工程において，４倍の無水イソプロパノールを使用し，アシル化誘導体を反応混合液から単離した。デカンテーションを行った後，初めに誘導体からＤＭＡＰを除去する為にイソプロパノール水溶液（８５体積%）で，次いで誘導体から水を除去する為に無水イソプロパノールで沈殿物を繰り返し洗浄した。その後，沈殿物を４０℃で４８時間乾燥させ，次いで残留溶媒を除去する目的で凍結乾燥させた。
ＤＳ１０%（ＮＭＲから測定）
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ０．８８（ｔ，３Ｈ，‐ＣＨ２‐ＣＨ３），δ１．２２‐１．３５（ｍ，２０Ｈ，（‐ＣＨ２‐）１０），
δ１．６０（ｍ，２Ｈ，‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐ＣＯ‐），δ２．０ppm（ｍ，４Ｈ，（ＣＨ２）２），δ２．４１（ｔ，２Ｈ，‐ＣＨ２‐ＣＯ‐），δ５．４１（ｄ，２Ｈ，ＣＨ＝ＣＨ）
【００４７】
実施例１０  ２，４，６‐トリクロロ安息香酸及びオレイン酸の混合アルデヒドによるヒアルロン酸のオレイル（Ｃ１８：１）誘導体の調製
０．５gのヒアルロン酸ナトリウム（１．２５mmol，１３０kDa）を５mLの脱塩水に溶解した。その後，３mLのイソプロパノールを徐々に添加した。次にＴＥＡ（０．５２mL，３eq）及びＤＭＡＰ（１５．０mg，０．１eq）を溶液に添加した。同時にオレイン酸（０．４mL，１eq）を５mLのイソプロパノールに溶解し，その後，ＴＥＡ（０．５２mL，３eq）及び２，４，６‐トリクロロベンゾイルクロリド（０．１９５mL，１eq）をその溶液に添加した。酸の活性化の後，沈殿物を濾過し，ＨＡの調製溶液に入れた。室温で３時間反応させた。その後，０．２５gのＮａＣｌを添加した５mLの脱塩水で反応混合液を希釈した。その後の沈殿工程において，４倍の無水イソプロパノールを使用し，アシル化誘導体を反応混合液から単離した。デカンテーションを行った後，初めに誘導体からＤＭＡＰを除去する為にイソプロパノール水溶液（８５体積%）で，次いで誘導体から水を除去する為に無水イソプロパノールで沈殿物を繰り返し洗浄した。その後，沈殿物を４０℃で４８時間乾燥させ，次いで残留溶媒を除去する目的で凍結乾燥させた。
ＤＳ１２%（ＮＭＲから測定）
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ０．８８（ｔ，３Ｈ，‐ＣＨ２‐ＣＨ３），δ１．２２‐１．３５（ｍ，２０Ｈ，（‐ＣＨ２‐）１０），
δ１．６０（ｍ，２Ｈ，‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐ＣＯ‐），δ２．０ppm（ｍ，４Ｈ，（ＣＨ２）２），δ２．４１（ｔ，２Ｈ，‐ＣＨ２‐ＣＯ‐），δ５．４１（ｄ，２Ｈ，ＣＨ＝ＣＨ）
【００４８】
実施例１１  塩化イソブチリル及びオレイン酸の混合アルデヒドによるヒアルロン酸のオレイル（Ｃ１８：１）誘導体の調製
１．０gのヒアルロン酸ナトリウム（２．５mmol，１５kDa）を１０mLの脱塩水に溶解した。その後，５mLのＴＨＦを徐々に添加した。次にＴＥＡ（１．０５mL，３eq）及びＤＭＡＰ（１５．０mg，０．０５eq）を溶液に添加した。同時にオレイン酸（０．７８７mL，１eq）を５mLのＴＨＦに溶解し，その後，ＴＥＡ（１．０５mL，３eq）及び塩化イソブチリル（０．２６mL，１eq）をその溶液に添加した。酸の活性化の後，沈殿物を濾過し，ＨＡの調製溶液に入れた。室温で３時間反応させた。その後，０．５０gのＮａＣｌを添加した５mLの脱塩水で反応混合液を希釈した。その後の沈殿工程において，４倍の無水イソプロパノールを使用し，アシル化誘導体を反応混合液から単離した。デカンテーションを行った後，初めに誘導体からＤＭＡＰを除去する為にイソプロパノール水溶液（８５体積%）で，次いで誘導体から水を除去する為に無水イソプロパノールで沈殿物を繰り返し洗浄した。その後，沈殿物を４０℃で４８時間乾燥させ，次いで残留溶媒を除去する目的で凍結乾燥させた。
ＤＳ１１%（ＮＭＲから測定）
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ０．８８（ｔ，３Ｈ，‐ＣＨ２‐ＣＨ３），δ１．２２‐１．３５（ｍ，２０Ｈ，（‐ＣＨ２‐）１０），
δ１．６０（ｍ，２Ｈ，‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐ＣＯ‐），δ２．０ppm（ｍ，４Ｈ，（ＣＨ２）２），δ２．４１（ｔ，２Ｈ，‐ＣＨ２‐ＣＯ‐），δ５．４１（ｄ，２Ｈ，ＣＨ＝ＣＨ）
【００４９】
実施例１２  ２，４，６‐トリクロロ安息香酸及びオレイン酸の混合アルデヒドによるヒアルロン酸のオレイル（Ｃ１８：１）誘導体の調製
０．５gのヒアルロン酸ナトリウム（１．２５mmol，１３０kDa）を５mLの脱塩水に溶解した。その後，３mLのＴＨＦを徐々に添加した。次にＴＥＡ（１．２mL，３eq）及びＤＭＡＰ（１５．０mg，０．１eq）を溶液に添加した。同時にオレイン酸（０．７８７ｇ，２eq）を１０mLのＴＨＦに溶解し，その後，ＴＥＡ（０．５２mL，３eq）及び２，４，６‐トリクロロベンゾイルクロリド（０．３９１mL，２eq）をその溶液に添加した。酸の活性化の後，沈殿物を濾過し，ＨＡの調製溶液に入れた。室温で３時間反応させた。その後，０．２５gのＮａＣｌを添加した５mLの脱塩水で反応混合液を希釈した。その後の沈殿工程において，４倍の無水イソプロパノールを使用し，アシル化誘導体を反応混合液から単離した。デカンテーションを行った後，初めに誘導体からＤＭＡＰを除去する為にイソプロパノール水溶液（８５体積%）で，次いで誘導体から水を除去する為に無水イソプロパノールで沈殿物を繰り返し洗浄した。その後，沈殿物を４０℃で４８時間乾燥させ，次いで残留溶媒を除去する目的で凍結乾燥させた。
ＤＳ１８%（ＮＭＲから測定）
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ０．８８（ｔ，３Ｈ，‐ＣＨ２‐ＣＨ３），δ１．２２‐１．３５（ｍ，２０Ｈ，（‐ＣＨ２‐）１０），
δ１．６０（ｍ，２Ｈ，‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐ＣＯ‐），δ２．０ppm（ｍ，４Ｈ，（ＣＨ２）２），δ２．４１（ｔ，２Ｈ，‐ＣＨ２‐ＣＯ‐），δ５．４１（ｄ，２Ｈ，ＣＨ＝ＣＨ）
【００５０】
実施例１３  ２，４，６‐トリクロロ安息香酸及びリノール酸の混合アルデヒドによるヒアルロン酸のリノレイル（Ｃ１８：２）誘導体の調製
０．５gのヒアルロン酸ナトリウム（１．２５mmol，１５kDa）を１０mLの脱塩水に溶解した。次にＴＥＡ（０．５２mL，３eq）及びＤＭＡＰ（８mg，０．０５eq）を溶液に添加した。同時にリノール酸（０．７７mL，２eq）を３mLのＴＨＦに溶解し，その後，ＴＥＡ（１．２mL，７eq）及び２，４，６‐トリクロロベンゾイルクロリド（０．３９１mL，２eq）をその溶液に添加した。酸の活性化の後，沈殿物を濾過し，ＨＡの調製溶液に入れた。室温で３時間反応させた。その後，０．５gのＮａＣｌを添加した５mLの脱塩水で反応混合液を希釈した。その後の沈殿工程において，４倍の無水イソプロパノールを使用し，アシル化誘導体を反応混合液から単離した。デカンテーションを行った後，初めに誘導体からＤＭＡＰを除去する為にイソプロパノール水溶液（８５体積%）で，次いで誘導体から水を除去する為に無水イソプロパノールで沈殿物を繰り返し洗浄した。その後，沈殿物を４０℃で４８時間乾燥させ，次いで残留溶媒を除去する目的で凍結乾燥させた。
ＤＳ１６%（ＮＭＲから測定）
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ０．８８（ｔ，３Ｈ，‐ＣＨ２‐ＣＨ３），δ１．２２‐１．３５（ｍ，１４Ｈ，（‐ＣＨ２‐）７），
δ１．６３（ｍ，２Ｈ，‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐ＣＯ‐），δ２．０ppm（ｍ，４Ｈ，（ＣＨ２）２），δ２．４４（ｔ，２Ｈ，‐ＣＨ２‐ＣＯ‐），δ２．８３（ｍ，２Ｈ，＝ＣＨ‐ＣＨ２‐ＣＨ＝），
δ５．４５（ｍ，４Ｈ，ＣＨ＝ＣＨ）
【００５１】
実施例１４  ２，４，６‐トリクロロ安息香酸及びリノール酸の混合アルデヒドによるヒアルロン酸のリノレイル（Ｃ１８：２）誘導体の調製
０．５gのヒアルロン酸ナトリウム（１．２５mmol，１５kDa）を１０mLの脱塩水に溶解した。次にＴＥＡ（０．５２mL，３eq）及びＤＭＡＰ（８mg，０．０５eq）を溶液に添加した。同時にリノール酸（０．７７mL，２eq）を３mLのＴＨＦに溶解し，その後，ＴＥＡ（１．２mL，７eq）及び２，４，６‐トリクロロベンゾイルクロリド（０．３９１mL，２eq）をその溶液に添加した。酸の活性化の後，沈殿物を濾過し，ＨＡの調製溶液に入れた。室温で３時間反応させた後，反応混合液を５０℃で１時間加温した。その後，０．７５gのＮａＣｌを添加した５mLの脱塩水で反応混合液を希釈した。その後の沈殿工程において，４倍の無水イソプロパノールを使用し，アシル化誘導体を反応混合液から単離した。デカンテーションを行った後，初めに誘導体からＤＭＡＰを除去する為にイソプロパノール水溶液（８５体積%）で，次いで誘導体から水を除去する為に無水イソプロパノールで沈殿物を繰り返し洗浄した。その後，沈殿物を４０℃で４８時間乾燥させ，次いで残留溶媒を除去する目的で凍結乾燥させた。
ＤＳ２０%（ＮＭＲから測定）
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ０．８８（ｔ，３Ｈ，‐ＣＨ２‐ＣＨ３），δ１．２２‐１．３５（ｍ，１４Ｈ，（‐ＣＨ２‐）７），
δ１．６３（ｍ，２Ｈ，‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐ＣＯ‐），δ２．０ppm（ｍ，４Ｈ，（ＣＨ２）２），δ２．４４（ｔ，２Ｈ，‐ＣＨ２‐ＣＯ‐），δ２．８３（ｍ，２Ｈ，＝ＣＨ‐ＣＨ２‐ＣＨ＝），
δ５．４５（ｍ，４Ｈ，ＣＨ＝ＣＨ）
【００５２】
実施例１５  ２，４，６‐トリクロロ安息香酸及びリノレン酸の混合アルデヒドによるヒアルロン酸のリノレニル（Ｃ１８：３）誘導体の調製
０．５gのヒアルロン酸ナトリウム（１．２５mmol，１５kDa）を１０mLの脱塩水に溶解した。次にＴＥＡ（０．５２mL，３eq）及びＤＭＡＰ（８mg，０．０５eq）を溶液に添加した。同時にリノレン酸（０．７６５mL，２．０eq）を５mLのＴＨＦに溶解し，その後，ＴＥＡ（０．５２mL，３eq）及び２，４，６‐トリクロロベンゾイルクロリド（０．３９１mL，２．０eq）をその溶液に添加した。酸の活性化の後，沈殿物を濾過し，ＨＡの調製溶液に入れた。室温で３時間反応させた。その後，０．７５gのＮａＣｌを添加した５mLの脱塩水で反応混合液を希釈した。その後の沈殿工程において，４倍の無水イソプロパノールを使用し，アシル化誘導体を反応混合液から単離した。デカンテーションを行った後，初めに誘導体からＤＭＡＰを除去する為にイソプロパノール水溶液（８５体積%）で，次いで誘導体から水を除去する為に無水イソプロパノールで沈殿物を繰り返し洗浄した。その後，沈殿物を４０℃で４８時間乾燥させ，次いで残留溶媒を除去する目的で凍結乾燥させた。
ＤＳ１５%（ＮＭＲから測定）
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ０．８８（ｔ，３Ｈ，‐ＣＨ２‐ＣＨ３），δ１．２２‐１．３５（ｍ，８Ｈ，（‐ＣＨ２‐）４），
δ１．６１（ｍ，２Ｈ，‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐ＣＯ‐），δ２．０ppm（ｍ，４Ｈ，（ＣＨ２）２），δ２．４３（ｔ，２Ｈ，‐ＣＨ２‐ＣＯ‐），δ２．８３（ｍ，４Ｈ，＝ＣＨ‐ＣＨ２‐ＣＨ＝），
δ５．４５（ｍ，６Ｈ，ＣＨ＝ＣＨ）
【００５３】
実施例１６  ２，４，６‐トリクロロ安息香酸及びリノレン酸の混合アルデヒドによるヒアルロン酸のリノレニル（Ｃ１８：３）誘導体の調製
０．５gのヒアルロン酸ナトリウム（１．２５mmol，１５kDa）を１０mLの脱塩水に溶解した。次にＴＥＡ（０．５２mL，３eq）及びＤＭＡＰ（８mg，０．０５eq）を溶液に添加した。同時にリノレン酸（０．３８２mL，１eq）を５mLのＴＨＦに溶解し，その後，ＴＥＡ（０．５２mL，３eq）及び２，４，６‐トリクロロベンゾイルクロリド（０．１９５mL，１eq）をその溶液に添加した。酸の活性化の後，沈殿物を濾過し，ＨＡの調製溶液に入れた。室温で３時間反応させた後，反応混合液を５０℃で１時間加温した。その後，０．２５gのＮａＣｌを添加した５mLの脱塩水で反応混合液を希釈した。その後の沈殿工程において，４倍の無水イソプロパノールを使用し，アシル化誘導体を反応混合液から単離した。デカンテーションを行った後，初めに誘導体からＤＭＡＰを除去する為にイソプロパノール水溶液（８５体積%）で，次いで誘導体から水を除去する為に無水イソプロパノールで沈殿物を繰り返し洗浄した。その後，沈殿物を４０℃で４８時間乾燥させ，次いで残留溶媒を除去する目的で凍結乾燥させた。
ＤＳ１０%（ＮＭＲから測定）
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ０．８８（ｔ，３Ｈ，‐ＣＨ２‐ＣＨ３），δ１．２２‐１．３５（ｍ，８Ｈ，（‐ＣＨ２‐）４），
δ１．６１（ｍ，２Ｈ，‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐ＣＯ‐），δ２．０ppm（ｍ，４Ｈ，（ＣＨ２）２），δ２．４３（ｔ，２Ｈ，‐ＣＨ２‐ＣＯ‐），δ２．８３（ｍ，４Ｈ，＝ＣＨ‐ＣＨ２‐ＣＨ＝），
δ５．４５（ｍ，６Ｈ，ＣＨ＝ＣＨ）
【００５４】
実施例１７  ヒアルロン酸のカプロニル（Ｃ６）誘導体へのトコフェロール（ビタミンＥ）のカプセル封入
実施例１に従って調製したヒアルロナンのアシル化誘導体１００mgを連続的に３時間撹拌しながら５mLの水に溶解した。得られた溶液に２５〜４０℃で連続的に撹拌しながらトコフェロール溶液（３mLのＣＨＣｌ３中，１０mg）を徐々に添加した後，更に３mLのＣＨＣｌ３を徐々に添加した。次に，連続的蒸発工程で溶液からＣＨＣｌ３を除去した。ＣＨＣｌ３の除去後，水相を完全に乾燥させ，水槽で再水和し，１μmのガラスフィルターで濾過した。濾過物を凍結乾燥した。
結合したトコフェロールの量（ＨＰＬＣ法により測定）は：２．３%（w/w）であった。
【００５５】
実施例１８  ヒアルロン酸のカプロニル（Ｃ６）誘導体へのナイルレッドのカプセル封入
実施例１に従って調製したヒアルロナンのアシル化誘導体１００mgを連続的に３時間撹拌しながら５mLの水に溶解した。得られた溶液に２５〜４０℃で連続的に撹拌しながらナイルレッド溶液（３mLのＣＨＣｌ３中，１０mg）を徐々に添加した後，更に３mLのＣＨＣｌ３を徐々に添加した。次に，連続的蒸発工程で溶液からＣＨＣｌ３を除去した。ＣＨＣｌ３の除去後，水相を完全に乾燥させ，水槽で再水和し，１μmのガラスフィルターで濾過した。濾過物を凍結乾燥した。
結合したナイルレッドの量（ＵＶ‐Ｖｉｓ法により測定）は：０．４%（w/w）であった。
【００５６】
実施例１９  ヒアルロン酸のカプロニル（Ｃ６）誘導体へのパクリタキセルのカプセル封入
実施例１に従って調製したヒアルロナンのアシル化誘導体１００mgを連続的に３時間撹拌しながら５mLの水に溶解した。得られた溶液に２５〜４０℃で連続的に撹拌しながらパクリタキセル溶液（３mLのＣＨＣｌ３中，１０mg）を徐々に添加した後，更に３mLのＣＨＣｌ３を徐々に添加した。次に，連続的蒸発工程で溶液からＣＨＣｌ３を除去した。ＣＨＣｌ３の除去後，水相を完全に乾燥させ，水槽で再水和し，１μmのガラスフィルターで濾過した。濾過物を凍結乾燥した。
結合したパクリタキセルの量（ＨＰＬＣ法により測定）：５%（w/w）
【００５７】
実施例２０  ヒアルロン酸のカプロニル（Ｃ６）誘導体へのホスファチジルコリンのカプセル封入
実施例１に従って調製したヒアルロナンのアシル化誘導体１００mgを連続的に３時間撹拌しながら５mLの水に溶解した。得られた溶液に連続的に撹拌しながらホスファチジルコリン溶液（５mLのＥｔＯＨ中，１０mg）を徐々に（滴下）添加した。連続的蒸発工程で溶液からＥｔＯＨを除去した。次に，残留水相を完全に乾燥させ，水槽で再水和し，１μmのガラスフィルターで濾過した。濾過物を凍結乾燥した。
結合したホスファチジルコリンの量（ＨＰＬＣ法により測定）：３．０%(w/w)
【００５８】
実施例２１  ヒアルロン酸のパルミトイル（Ｃ１６）誘導体へのコエンザイムＱ１０のカプセル封入
実施例７に従って調製したヒアルロナンのアシル化誘導体１００mgを連続的に一晩撹拌しながら１０mLの水に溶解した。得られた溶液に３０〜４０℃で連続的に撹拌しながらコエンザイムＱ１０溶液（５mLのＣＨＣｌ３中，２０mg）を徐々に添加した後，更に３mLのＣＨＣｌ３を徐々に添加した。次に，連続的蒸発工程で溶液からＣＨＣｌ３を除去した。ＣＨＣｌ３の除去後，水相を完全に乾燥させ，水槽で再水和し，１μmのガラスフィルターで濾過した。濾過物を凍結乾燥した。
結合したコエンザイムＱ１０の量（ＵＶ‐Ｖｉｓ法により測定）は：１２%(w/w)であった。
生成物をＮａＣｌの０．９%溶液に溶解すると，溶解した生成物の濃度に依存してコアセルベート又はゲル状溶液が形成される。
【００５９】
実施例２２  ヒアルロン酸のステアリル（Ｃ１８）誘導体へのトコフェロール（ビタミンＥ）のカプセル封入
実施例８に従って調製したヒアルロナンのアシル化誘導体１００mgを連続的に一晩撹拌しながら１０mLの水に溶解した。得られた溶液に２５〜４０℃で連続的に撹拌しながらトコフェロール（５mLのエタノール中，約５０mg）を徐々に添加した。次に，連続的蒸発工程で溶液からエタノールを除去した。ＥｔＯＨの除去後，水相を完全に乾燥させ，水槽で再水和し，１μmのガラスフィルターで濾過した。濾過物を凍結乾燥した。
結合したトコフェロールの量（ＵＶ‐Ｖｉｓ法により測定）は：３０%（w/w）であった。
【００６０】
実施例２３  ヒアルロン酸のオレイル（Ｃ１８：１）誘導体へのトコフェロール（ビタミンＥ）のカプセル封入
実施例９に従って調製したヒアルロナンのアシル化誘導体１００mgを連続的に一晩撹拌しながら１０mLの水に溶解した。得られた溶液に２５〜４０℃で連続的に撹拌しながらトコフェロール（５mLのイソプロパノール中，約５０mg）を徐々に添加した。次に，連続的蒸発工程で溶液からイソプロパノールを除去した。イソプロパノールの除去後，水相を完全に乾燥させ，水槽で再水和し，１μmのガラスフィルターで濾過した。濾過物を凍結乾燥した。
結合したトコフェロールの量（ＵＶ‐Ｖｉｓ法により測定）は：４０%（w/w）であった。
【００６１】
実施例２４  ヒアルロン酸のパルミトイル（Ｃ１６）誘導体へのコエンザイムＱ１０のカプセル封入
実施例７に従って調製したヒアルロナンのアシル化誘導体１００mgを連続的に一晩撹拌しながら１０mLの水に溶解した。得られた溶液に連続的に撹拌しながらコエンザイムＱ１０溶液（２mLのＥｔＯＨ中，約３０mg）を徐々に添加した。３時間撹拌した後，得られた混合液を３０分間音波処理（１００Ｗ）に供した。その後，混合液を蒸留水に対して集中的に透析し（２日間），１μmのガラスフィルターで濾過し，凍結乾燥した。
結合したコエンザイムＱ１０の量（ＵＶ‐Ｖｉｓ法により測定）は：４．６%（w/w）であった。
生成物をＮａＣｌの０．９%溶液に溶解すると，溶解した生成物の濃度に依存してコアセルベート又はゲル状溶液が形成される。
【００６２】
実施例２５  ヒアルロン酸のパルミトイル（Ｃ１６）誘導体へのパクリタキセルのカプセル封入
実施例７に従って調製したヒアルロナンのアシル化誘導体１００mgを連続的に一晩撹拌しながら１０mLの水に溶解した。得られた溶液に連続的に撹拌しながらパクリタキセル溶液（２mLのＥｔＯＨ中，約４０mg）を徐々に添加した。３時間撹拌した後，得られた混合液を３０分間音波処理（１００Ｗ）に供した。その後，混合液を蒸留水に対して集中的に透析し（３．５kDaカットオフ），Ｓ４陶磁器フリットで濾過し，凍結乾燥した。
結合したパクリタキセルの量（ＨＰＬＣ法により測定）：２５%（w/w）
【００６３】
実施例２６  ヒアルロン酸のオレイル（Ｃ１８：１）誘導体へのホップエキスのカプセル封入
実施例９に従って調製したヒアルロナンのアシル化誘導体１００mgを連続的に一晩撹拌しながら１０mLの水に溶解した。得られた溶液に連続的に撹拌しながらホップエキスブレンド（５mLのイソプロパノール中，約５０mg）を徐々に添加した。次に，連続的蒸発工程で溶液からイソプロパノールを除去した。イソプロパノールの除去後，水相を完全に乾燥させ，水槽で再水和し，１μmのガラスフィルターで濾過した。濾過物を凍結乾燥した。
結合したホップエキスの量（ＵＶ‐Ｖｉｓ法により測定）は：４０%（w/w）であった。
【００６４】
実施例２７  ヒアルロン酸のアシル化誘導体の臨界ミセル（凝集）濃度の測定
（ａ）蛍光法
溶液濃度への蛍光強度の依存度から臨界ミセル（凝集）濃度を測定した（図１）。実施例１８記載の手順に従って濃度範囲を０．００００２〜１．５mg・mL-1に調整した，ナイルレッドが結合しているアシル化誘導体ＨＡＣ６（ＤＳ＝６０%）及びＨＡＣ１６（ＤＳ＝１４%）の水溶液の発光スペクトル（５８０〜７００nm）を励起波長５４３nmで動作する蛍光測定装置ＲＦ‐５３０１(Shimadzu)において測定した。
以下の臨界ミセル（凝集）濃度が測定された：ＨＡＣ６：０．００１〜０．００３mg・mL-1，ＨＡＣ１６：０．００００６〜０．０００２mg・mL-1（図１）。０．９%ＮａＣｌ含有ＰＢＳ溶液でも同様の測定値が得られた。
（ｂ）静的光散乱法
溶液濃度への散乱光強度（Ｉ９０）の依存度から臨界ミセル（凝集）濃度を測定した（図２）。実施例１８記載の手順に従って濃度範囲を０．００００２〜０．０６mg・mL-1に調製した，ナイルレッドが結合しているアシル化誘導体ＨＡＣ６（ＤＳ＝６０%）及びＨＡＣ１６（ＤＳ＝１４%）の水溶液における散乱光強度を動作波長６３２nmの測光装置DAWN EOS(Wyatt Technology Corporation)において角度９０°で測定した。
以下の臨界ミセル（凝集）濃度が測定された：ＨＡＣ６：０．００２〜０．００４mg・mL-1，ＨＡＣ１６：０．００００６〜０．０００１mg・mL-1（図２）。０．９%ＮａＣｌ含有ＰＢＳ溶液でも同様の測定値が得られた。
【００６５】
実施例２８  ヒアルロナンナノミセルのゼータ電位の測定
Ｈｅ‐Ｎｅレーザー（６３３nm）を備えた装置Zetasizer Nano‐ZS(Malvern Instruments)でゼータ電位を測定した。カプセル封入した物質に関係なく，水溶液中のナノミセルが示したゼータ電位は５mg・mL-1では〜−５０mVであり，１０倍希釈した後では〜−６０から−７０mVであった。ＮａＣｌの０．９%溶液中，ゼータ電位の範囲が減少した（−３０から−２３mV）。従って，ゼータ電位の絶対値は，水溶液中では調製ナノミセルの高い安定性を示し，塩溶液中では比較的高い安定性を示す。
【００６６】
実施例２９  ヒアルロナンナノミセルの形態学的分析
２kVのビーム加速電圧（すなわち微細ビームモード）で走査顕微鏡ＪＥＯＬ７４０１Ｆにおいて−１３５℃で顕微鏡分析を行った。上記の分析をする為に，２〜３μLの濃縮試料（約２０mg/0.4mL）をＡｌプレートに滴下し，冷却チャンバAlta2500(Gatan)に充填した液体窒素に浸漬した。その後，それらを２分間かけてＰｔ／Ｐｄ混合液で被覆した。
カプセル封入したビタミンＥを含むヒアルロナンＣ６（実施例１７）及びカプセル封入したパクリタキセルを含むヒアルロナンＣ１６（実施例２５）のナノミセルの寸法は範囲：２０〜５０nmであった（図３）。
【００６７】
実施例３０  ヒアルロナンナノミセル中のアシル化鎖及び非極性物質の分布
カプセル封入したビタミンＥを含む疎水化ヒアルロナンのナノミセルを，フリット入口分離チャネルを使用する流動場フローフラクショネーション（ＦｌＦＦＦ）法により分離した。分析する目的で，（実施例２３に記載の手順に従って表１に収載した誘導体から調製した）ビタミンＥが結合した凍結乾燥アシル化ヒアルロナン１０mgを１mLの移動相（５０mMのＮａＮＯ３及び０．０２%のＮａＮ３）に溶解し，孔径１μmのガラスシリンジフィルターで濾過した。その後，１００μlをＦｌＦＦＦ装置に注入した。
５分間隔での２mL／分〜０．１mL／分のクロスフロー勾配により分離を行った。検出器に供給される移動相の流速の設定値を１mL／分で一定に維持した。
実験温度で分離が行われた。光散乱検出器DAWN EOS，示差屈折率計Optilab rEX（両方ともWyatt Technology Corporation製）及び動作波長２９２nmのＵＶ検出器(Shimadzu)により溶出液を観察した。
上記の方法を適用した場合，ナノミセルの内部に確実に取り込まれた結合物質及び疎水化ヒアルロナンの割合と，凝集構造の外部に存在するそれらの割合の両方を測定することが可能である（表１参照）。
表１．ヒアルロナン凝集体（ナノミセル）の内外でのアシル化鎖及びビタミンＥ（トコフェロール）の分布
【表１】
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表１に収載された結果から，ヒアルロナンナノミセル中のアシル化鎖の分布は主にアシル鎖の長さに影響されることが明らかに分かる。アシル鎖の凝集度はその長さの増加に伴って増加する。ナノミセルへの非極性物質の取り込みは，個々のアシル鎖の長さに無関係に起こる。この特定のケースでは，ミセル中の非極性物質の分布は常に完全に行き渡っている（＞９９．５%）。
【００６８】
実施例３１  パクリタキセルをベースとする細胞増殖阻害剤を担持するナノミセルの細胞毒性
それぞれ実施例１９及び２５に記載の手順に従って調製したヒアルロナンＣ６及びＣ１６のアシル化誘導体に結合したパクリタキセルを，培養液（１０%のＦＢＳを含む）に溶解し，最終濃度を１００μg/mLにした。アシル化ヒアルロナンＣ６及びＣ１６の誘導体に担持された濃度０．００１，０．０１，０．１，１．０，１０．０及び１００．０μg/mLのパクリタキセルを試験する為に，ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の細胞，ヒト乳癌細胞株（ＭＣＦ‐７）及びヒト結腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６）を使用し，細胞生存率の測定に基づいて試験した。アシル化ヒアルロナンＣ６及びＣ１６の誘導体に担持されたパクリタキセルの効果を，そのヒアルロナン自体に対するパクリタキセルの効果と比較した（図４）。細胞生存率の測定は脱水素酵素の活性の検出に基づいており，この酵素は生細胞で活性的になって黄色い物質を紫色の溶液に変えるものである。５４０nmで検出される前記酵素の吸光度は生細胞の割合に比例している。
特にＨＡＣ１６を使用した場合，担体の濃度が増加したとき，パクリタキセルの細胞増殖阻害効果がわずかに減少した（図４）。
アシル化誘導体自体は細胞増殖阻害効果を全く示さなかった。
【００６９】
実施例３２  細胞へのカプセル封入物質の移行
物質ドキソルビシン及び７‐アミノアクチノマイシンＤ（死細胞及び浸透化処理細胞にのみ浸透する物質である７‐ＡＡＤ）を，実施例１８に記載の手順に従って（ここではナイルレッドに７‐ＡＡＤを代用した）ヒアルロナンＣ６のアシル化誘導体にカプセル封入した。溶液に物質を添加したときの物質の細胞への浸透について，その物質がそれ自体で存在する場合と，ヒアルロナンＣ６のアシル化誘導体中に存在する場合とで差異があるか否かを試験する為に，ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の細胞，ヒト乳癌細胞株（ＭＣＦ‐７）及びヒト結腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６）を使用した。試験は蛍光顕微鏡法により行った（倒立顕微鏡Nikon Eclipse Ti）。ドキソルビシンは５．０μg/mLの濃度で試験し（図５），７‐ＡＡＤは１５μg/mLの濃度で試験した（図６）。
担体から細胞への物質の移行は良好であった。
【００７０】
実施例３３  ナノミセルから溶液へのカプセル封入オイルレッドの放出
実施例１８に記載の手順に従って（ここではナイルレッドにオイルレッドＯを代用した）ＨＡＣ６にカプセル封入されたオイルレッド（オイルレッドＯ，溶媒レッド２７）の溶媒への放出をインビトロで検討した。使用した標的溶液はＰＢＳ，及び１%のＴＷＥＥＮ８０を添加したＰＢＳであった。オイルレッドを結合したアシル化誘導体の水溶液（濃度１〜１０mg・mL-1）をＰＢＳ，又は１%のＴＷＥＥＮ８０を添加したＰＢＳに溶解し，透析管（ＭＷＣＯ１２〜１４kDa，Spectrum Laboratories）に定量的に移し，温度３７℃でＰＢＳ，又は１%のＴＷＥＥＮ８０を添加したＰＢＳに対して透析した。所定の時間間隔で，透析液を４mL採取し，新鮮な培地と交換した。オイルレッドの放出量はＵＶ‐Ｖｉｓ法により測定した（図７）。
結合した物質の緩徐な放出は，ＰＢＳ中で担体系の安定性が高いということの指標となる。
【００７１】
実施例３４  ナノミセルから溶液へのカプセル封入パクリタキセルの放出
それぞれ実施例１９及び２５に記載の手順に従ってＨＡＣ６及びＨＡＣ１６にカプセル封入されたパクリタキセルの溶媒への放出を３７℃の温度下，インビトロで検討した。総濃度０．２mgのパクリタキセルを含むアシル化誘導体水溶液をＰＢＳに溶解し，透析管（ＭＷＣＯ１２〜１４kDa，Spectrum Laboratories）に定量的に移し，温度３７℃で５０mLのＰＢＳに対して透析した。所定の時間間隔で，透析液を新鮮な培地と交換した。パクリタキセルの放出量は，それをクロロホルムへ抽出し，蒸発させ，次いでアセトニトリルに溶解した後にＨＰＬＣ法により測定した（図８）。
ＨＡＣ１６で記録された放出はＨＡＣ６と比較して緩徐であった。結合した物質の緩徐な放出は，ＰＢＳ中で担体系の安定性が高いということの指標となる。
【００７２】
実施例３５  ヒアルロン酸及びオレイン酸のオレイル誘導体（Ｃ１８：１）からのナノエマルジョン及びマイクロエマルジョンの調製
実施例１１に従って調製したヒアルロナンのアシル化誘導体８０mgを連続的に一晩撹拌しながら４mLの水に溶解した。得られた溶液に，連続的に撹拌しながら８mgのオレイン酸を徐々に添加した。撹拌後，得られた混合液を２段階音波処理（Ultrasonic Processor,UPS 200S，２００Ｗ出力）に供した。第１段階は連続的工程であり（５０%の振幅），その後に，脈動的工程である第２段階が続き（０．８秒のパルス，７０%の振幅），各段階は２５分間継続された。音波処理工程では，過熱から保護する為に，処理中の混合液が入った容器は氷浴に浸漬した。
粒径（Zetasizerで測定）：２００〜３００nm。寸法は混合液中の油相の量に依存していた。
【００７３】
実施例３６  コエンザイムＱ１０を溶解したヒアルロン酸及びオレイン酸のオレイル誘導体（Ｃ１８：１）からのナノエマルジョン及びマイクロエマルジョンの調製
実施例１１に従って調製したヒアルロナンのアシル化誘導体８０mgを連続的に一晩撹拌しながら４mLの水に溶解した。得られた溶液に，連続的に撹拌しながらコエンザイムＱ１０（約０．５mg）を事前に溶解させた８mgのオレイン酸を徐々に添加した。撹拌後，得られた混合液を２段階音波処理（Ultrasonic Processor,UPS 200S,200W出力）に供した。第１段階は連続的工程であり（５０%の振幅），その後に，脈動的工程である第２段階が続き（０．８秒のパルス，７０%の振幅），各段階は２５分間継続された。音波処理工程では，過熱から保護する為に，処理中の混合液が入った容器は氷浴に浸漬した。
粒径（Zetasizerで測定）：２００〜３００nm。寸法は混合液中の油相の量に依存していた。
【００７４】
実施例３７  共有的架橋を介した安定化ナノミセルの調製
１０gのヒアルロン酸ナトリウム（２５mmol，３８kDa）を２００mLの脱塩水に溶解した。その後，ＴＥＡ（６．９７mL，ＨＡの二量体に対して２eq）及びＤＭＡＰ（１５３mg，０．０５eq）を溶液に添加した。活性化：３．５gの３‐（２‐フリル）アクリル酸（２５mmol）を５０mLのテトラヒドロフラン及び１９．２mLのＴＥＡ（２eq）に溶解した。次に，得られた溶液を氷浴中で冷却し，トリクロロベンゾイルクロリド（１．２mL）を添加した。１５分間反応させた。その後，活性化した酸をヒアルロナン溶液に添加し，２５℃で２４時間反応させた。得られた反応混合液を水で希釈した。４倍の無水イソプロパノールを使用したその次の沈殿工程で，反応混合液からアクリル化誘導体を単離した。デカンテーションを行った後，イソプロパノール水溶液（８５体積%）で沈殿物を繰り返し洗浄した。その後，沈殿物を４０℃で４８時間乾燥させた。得られたアシル化誘導体をアシル化し（実施例１参照），次いで水に溶解し，残留溶媒を除去する為に凍結乾燥させた。
実施例１８に従って（ここではナイルレッドにオイルレッドを代用した），オイルレッド（Oil red O）及びアシル化誘導体から調製した担体系を溶解し，１%水溶液を形成した。得られた溶液中で，トリガーとしてペルオキシ二硫酸アンモニウム（１０eq）を使用し，担体系を架橋した。
ＤＳ２０%の光架橋用活性基（ＮＭＲから測定）
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ７．８３，６．７８（ｄ，Ｊ＝３．５），６．７８，６．６１（ｂｓ），７．８３，７．５９（Ｊtrans＝１６．０１），６．３９（Ｊtrans＝１５．８５）
【００７５】
実施例３８  ヒアルロナンナノミセルの局所塗布―皮膚，毛髪及び粘膜への浸透
ブタ皮膚，ウシ窒粘膜及びウシ頬粘膜はLetohrad,Kuncice243に拠点を置くMasoEko s.r.o.社により供与された。その取得直後に，カプセル封入したナイルレッドを含むアシル化ヒアルロナンＣ６及びＣ１０（１０mg・mL-1）溶液（実施例１８に記載の手順に従って調製）の受動的作用に試料を供し，倒立顕微鏡Nikon Eclipse Ti（対物レンズPlan Fluor4xを備える）で蛍光値を測定することで試料への浸透を比較した。その後，３７℃で：皮膚試料は２０時間（図９），毛髪試料は１５分間（図１０），粘膜試料は４時間（図１１及び図１２）でインキュベーションを行った。
油性溶媒及び水性溶媒を用いて比較したところ，担体により皮膚，毛髪及び粘膜への浸透がより効率的になっていた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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