(57)【要約】本発明は、それを必要とする被験体におけるリンパ球増殖を阻害するための方法及び医薬組成物に関する。特に、本発明は、それを必要とする被験体におけるリンパ球増殖を阻害するための方法で使用するためのＣＴＰシンターゼ１（ＣＴＰＳ１）阻害剤に関する。本発明はまた、それを必要とする被験体におけるリンパ球増殖を阻害するのに有用な複数の試験物質をスクリーニングするための方法であって、ｉ）ＣＴＰＳ１活性又は発現を阻害するその能力について、各該試験物質を試験すること、及びｉｉ）ＣＴＰＳ１活性又は発現を阻害する試験物質を同定し、それにより、それを必要とする被験体におけるリンパ球増殖を阻害するのに有用な試験物質を同定することからなる工程を含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする被験体におけるリンパ球増殖を軽減又は阻害するための方法であって、治療有効量の少なくとも１つのＣＴＰシンターゼ１（ＣＴＰＳ１）阻害剤を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２】
Ｔ細胞増殖を阻害又は軽減するための、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｂ細胞増殖を阻害又は軽減するための、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
被験体が移植被験体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
被験体が、心臓、腎臓、肺、肝臓、膵臓、膵島、脳組織、胃、大腸、小腸、角膜、皮膚、気管、骨、骨髄、筋肉又は膀胱からなる群より選択される移植片を移植されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
レシピエント被験体によるドナー組織、細胞、移植片又は臓器移植の拒絶に関連する免疫応答を予防又は抑制するための、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
レシピエントにおける移植の急性拒絶反応を予防するための、及び／又はレシピエントにおける移植の拒絶反応を予防する長期維持療法のための、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
宿主対移植片病（ＨＶＧＤ）又は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防するための、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の使用のためのＣＴＰＳ１阻害剤であって、被験体が自己免疫疾患若しくはリンパ増殖性疾患を患っているか、又は移植被験体である、ＣＴＰＳ１阻害剤。
【請求項１０】
移植前及び／又は移植後に、ＣＴＰＳ１阻害剤を被験体に定期的に投与する、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
被験体が自己免疫疾患を患っている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
自己免疫疾患が、アジソン病、アレルギー、円形脱毛症、アルツハイマー病、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連脈管炎、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群（ヒューズ症候群）、関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化巣、自己免疫疾患（例えば、狼瘡、ＲＡ、ＭＳ、グレーブス病など）、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ球増殖症候群、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、無精子症、ベーチェット病、ベルジェ病、水疱性類天疱瘡、心筋症、心血管疾患、セリアックスプルー／セリアック病、慢性疲労免疫不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性特発性多発神経炎、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＰＤ）、慢性再発性多発ニューロパシー（ギラン・バレー症候群）、チャーグ・ストラウス症候群（ＣＳＳ）、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症（ＣＡＤ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、円盤状狼瘡、湿疹、後天性表皮水疱症、本態性混合型クリオグロブリン血症、エヴァンス症候群、眼球突出、線維筋痛症、グッドパスチャー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、免疫増殖性疾患又は障害（例えば、乾癬）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む）、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、間質性肺疾患、若年性糖尿病、若年性関節炎、若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、川崎病、ランバート・イートン筋無力症症候群、扁平苔癬、狼瘡、ループス腎炎、リンパ球性下垂体炎、メニエール病、ミラー・フィッシャー症候群／急性散在性脳脊髄神経根障害、混合結合組織病、多発性硬化症（ＭＳ）、筋肉リウマチ、筋痛性脳脊髄炎（ＭＥ）、重症筋無力症、眼の炎症、落葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群（ホイッタカー症候群）、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変／自己免疫胆管症、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群／反応性関節炎、再狭窄、リウマチ熱、リウマチ性疾患、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、硬皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、全身硬皮症、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、甲状腺炎、１型糖尿病、２型糖尿病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎、白斑及びウェゲナー肉芽腫症からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＣＴＰＳ１阻害剤が、グルタミンのＣＴＰＳ１阻害剤結合特性を保持するアミノ酸グルタミンの任意の機能的類似体、誘導体、置換産物、異性体又は相同体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＴＰＳ１阻害剤が、ノルロイシン誘導体、例えば６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン（ＤＯＮ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＴＰＳ１阻害剤がアシビシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ＣＴＰＳ１阻害剤がＵＴＰ類似体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ＣＴＰＳ１阻害剤がデアザウリジン（deazuridine）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＣＴＰＳ１阻害剤が、シクロペンテニルシトシン（ＣＰＥＣ）、ゲムシタビン（２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン、ｄＦｄＣ）、アクチノマイシンＤ、シクロヘキシミド、ジブチリルサイクリックＡＭＰ及び６−アザウリジンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＴＰＳ１阻害剤がＣＴＰＳ１発現阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ＣＴＰＳ１阻害剤が、ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＣＴＰＳ１阻害剤を少なくとも１つの免疫抑制剤と組み合わせて使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
免疫抑制剤が、スタチン；ｍＴＯＲ阻害剤、例えばラパマイシン又はラパマイシン類似体；ＴＧＦ−βシグナル伝達剤；ＴＧＦ−βレセプターアゴニスト；ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、例えばトリコスタチンＡ；コルチコステロイド；ミトコンドリア機能阻害剤、例えばロテノン；Ｐ３８阻害剤；ＮＦ−κβ阻害剤、例えば６Ｂｉｏ、デキサメタゾン、ＴＣＰＡ−１、ＩＫＫ  ＶＩＩ；アデノシンレセプターアゴニスト；プロスタグランジンＥ２アゴニスト（ＰＧＥ２）、例えばミソプロストール；ホスホジエステラーゼ阻害剤、例えばホスホジエステラーゼ４阻害剤（ＰＤＥ４）、例えばロリプラム；プロテアソーム阻害剤；キナーゼ阻害剤；Ｇタンパク質共役レセプターアゴニスト；Ｇタンパク質共役レセプターアンタゴニスト；グルココルチコイド；レチノイド；サイトカイン阻害剤；サイトカインレセプター阻害剤；サイトカインレセプター活性化剤；ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターアンタゴニスト；ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターアゴニスト；ヒストンデアセチラーゼ阻害剤；カルシニューリン阻害剤；ホスファターゼ阻害剤；ＰＩ３  ＫＢ阻害剤、例えばＴＧＸ−２２１；オートファジー阻害剤、例えば３−メチルアデニン；アリール炭化水素レセプター阻害剤；プロテアソーム阻害剤Ｉ（ＰＳＩ）；及び酸化ＡＴＰ、例えばＰ２Ｘレセプター遮断薬からなる群より選択され、免疫抑制剤としては、ＩＤＯ、ビタミンＤ３、シクロスポリン、例えばシクロスポリンＡ、アリール炭化水素レセプター阻害剤、レスベラトロール、アザチオプリン（Ａｚａ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、６−チオグアニン（６−ＴＧ）、ＦＫ５０６、サングリフェリンＡ、サルメテロール、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、アスピリン及び他のＣＯＸ阻害剤、ニフルム酸、エストリオール及びトリプトリドも挙げられる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
本発明のＣＴＰＳ１阻害剤を抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ２アンタゴニスト又はＩＬ１５アンタゴニストと組み合わせて使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
それを必要とする被験体におけるリンパ球増殖を阻害するのに有用な複数の試験物質をスクリーニングするための方法であって、ｉ）ＣＴＰＳ１活性又は発現を阻害するその能力について、各該試験物質を試験すること、及びｉｉ）ＣＴＰＳ１活性又は発現を阻害する試験物質を同定し、それにより、それを必要とする被験体におけるリンパ球増殖を阻害するのに有用な試験物質を同定することからなる工程を含む、方法。
【請求項２５】
この特定の実施態様では、以下の工程：
ａ）ＣＴＰＳ１を発現する細胞の懸濁液を、前記細胞の代謝を支援する培養培地中で調製すること
ｂ）所定量の標識基質を前記懸濁液に追加すること、
ｃ）工程ｂ）で得られた混合物を所定温度で所定期間インキュベーションすること
ｄ）典型的には、該細胞を溶解してその細胞内含物を放出させることによって、工程で得られた前記インキュベーション混合物から、標識生成物を含む画分を分離すること、
ｅ）工程ｄ）で得られた前記画分中の標識生成物の濃度を検出すること、
ｆ）所定量の該試験物質を追加する以外は同一の条件下で、工程ｂ）、ｃ）、ｄ）及びｅ）を繰り返すこと、
ｇ）工程ｆ）で検出された標識生成物の濃度が、工程ｅ）で検出された標識生成物の濃度よりも低いかを観察することによって、ＣＴＰＳ１の阻害の存在を決定すること
を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
Ｂ細胞株又はＴ細胞株を提供すること、該細胞株を選択試験物質と接触させること、該Ｂ細胞株又はＴ細胞株の増殖レベルを決定すること、前記増殖レベルを、該試験物質の非存在下で決定した増殖レベルと比較すること、及び該試験物質の存在下で決定した増殖レベルが、該試験物質の非存在下で決定した増殖レベルよりも低い場合、該試験物質を積極的に選択することからなる工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
動物モデルにおいて試験物質を試験する工程を含む、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、それを必要とする被験体におけるリンパ球増殖を阻害するための方法及び医薬組成物に関する。
【０００２】
発明の背景：
リンパ球増殖は、抗原（例えば、病原体抗原）に対する免疫応答の正常な構成要素である。しかしながら、特定の状況では、リンパ球増殖は有害であると思われる。例えば、臓器移植は、炎症、免疫、組織修復及び損傷組織の構造的補強として一般的に分類されている複雑な一連の免疫学的プロセスを誘発する。典型的には、Ｔ細胞増殖は、炎症促進性サイトカイン、例えばインターロイキン−２（ＩＬ−２）及びＩＦＮ−ｇの分泌による炎症につながる。したがって、当業者は、免疫抑制剤を開発しようとしている。免疫抑制薬は、５つのグループに分類される：（Ｉ）遺伝子発現の調節剤；（ｉｉ）アルキル化剤；（ｉｉｉ）de novoプリン合成の阻害剤；（ｉｖ）de novoピリミジン合成の阻害剤；並びに（ｖ）キナーゼ及びホスファターゼの阻害剤。例えば、グルココルチコイドは、主に、ＩＬ−２及び他のメディエーターの遺伝子発現を阻害することによって、免疫抑制活性及び抗炎症活性を発揮する。メトトレキサート及びそのポリグルタミン酸誘導体は、アデノシンの放出によって炎症反応を抑制する。ミコフェノール酸及びミゾリビンは、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼを阻害する。ミコフェノール酸は、活性化Ｔリンパ球のアポトーシスを誘導する。シクロスポリン及びＦＫ−５０６／タクロリムスは、カルシニューリンのホスファターゼ活性を阻害する。ラパマイシンは、ＩＬ−２、上皮成長因子及び他のサイトカインレセプターからのシグナル伝達を阻害する。開発中の免疫抑制化合物及び抗炎症性化合物としては、ｐ３８キナーゼの阻害剤及びサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼＩＶ型アイソフォーム（これは、Ｔ細胞で発現している）の阻害剤が挙げられる。しかしながら、免疫抑制剤は、その非特異的な免疫抑制効果のために毒性を伴う。免疫抑制の軽減は、過免疫抑制に関連する副作用を予防し得る。しかしながら、各ドナーレシピエントペアの固有の免疫抑制要件が不明であるため、免疫抑制の最小化は、不十分な免疫抑制及びその結果として起こる急性拒絶反応、早期の移植片喪失並びに死亡の潜在的なリスクを伴う。現在使用されている薬剤は、全てが非特異的な幅広い免疫抑制効果を有するため、免疫抑制薬の有望な今後の応用は、新規機構によってリンパ球増殖を阻害する薬剤を探索することである。
【０００３】
発明の概要：
本発明は、それを必要とする被験体におけるリンパ球増殖を阻害するための方法及び医薬組成物に関する。
【０００４】
発明の詳細な説明：
抗原認識及び共シグナルによってトリガーされるリンパ球機能は、迅速かつ激しい細胞分裂及びそれ故に代謝適合を意味する１。シチジンヌクレオチド三リン酸（ＣＴＰ）は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びリン脂質の代謝に必要な前駆体である２−４。ＣＴＰは、２つの供給源に由来する：サルベージ経路及びde novo合成経路は、２つの酵素（ＣＴＰシンターゼ（又はシンテターゼ）１及び２（ＣＴＰＳ１及びＣＴＰＳ２））に依存するが、それらの各役割は不明である５−７。ＣＴＰシンターゼ活性は、リンパ球におけるＤＮＡ合成の潜在的に重要な工程である８，９。本明細書において、本発明者らは、活性化Ｔ細胞及びＢ細胞の増殖能力障害を特徴とする新規の致命的な免疫不全を引き起こす、ヒトにおけるＣＴＰＳ１の機能喪失型突然変異（ｒｓ１４５０９２２８７）の同定について報告する。ＣＴＰＳ１欠損被験体のＴ細胞及びＢ細胞では、又はｓｈＲＮＡによってＣＴＰＳ１をノックダウンした細胞では、抗原レセプター媒介活性化に応じた増殖に障害がある。対照的に、近位及び遠位のＴＣＲシグナル伝達イベント及び応答は、ＣＴＰＳ１の欠如によってわずかな影響を受けたに過ぎなかった。ＣＴＰＳ１欠損細胞では、野生型ＣＴＰＳ１を発現させることによって、又は外因性ＣＴＰ若しくはそのヌクレオシド前駆体シチジンを追加することによって、正常なＴ細胞増殖が回復した。ＣＴＰＳ１発現は、休止Ｔ細胞では低いが、ＴＣＲ活性化後に急速にアップレギュレーションされることが見出された。これらの結果は、ＣＴＰＳ１が、免疫応答中に活性化リンパ球の増殖を維持するその能力によって、免疫系における重要かつ特異的な役割を果たすことを強調している。したがって、ＣＴＰＳ１は、リンパ球の活性化を特異的に抑え得る免疫抑制薬の治療ターゲットに相当し得る。
【０００５】
したがって、本発明の第１の態様は、それを必要とする被験体におけるリンパ球増殖を軽減又は阻害するための方法であって、治療有効量の少なくとも１つのＣＴＰシンターゼ１（ＣＴＰＳ１）阻害剤を該被験体に投与することを含む方法に関する。
【０００６】
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、Ｔ細胞増殖を阻害又は軽減するのに適切である。
【０００７】
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、Ｂ細胞増殖を阻害又は軽減するのに適切である。
【０００８】
いくつかの実施態様では、被験体は、移植被験体である。典型的には、被験体は、心臓、腎臓、肺、肝臓、膵臓、膵島、脳組織、胃、大腸、小腸、角膜、皮膚、気管、骨、骨髄、筋肉又は膀胱からなる群より選択される移植片を移植されたものであり得る。実際に、本発明の方法は、レシピエント被験体によるドナー組織、細胞、移植片又は臓器移植に関連する免疫応答を予防又は抑制するのに特に適切である。移植関連疾患又は障害としては、例えば、骨髄移植に関連する移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、及び例えば、皮膚、筋肉、神経細胞、ランゲルハンス島、臓器、肝臓の実質細胞などを含む臓器、組織又は細胞の移植片の移植（例えば、組織又は細胞の同種移植片又は異種移植片）に起因又は関連する免疫障害が挙げられる。レシピエント被験体におけるドナー組織、細胞、移植片又は固形臓器の移植に関して、本発明のＣＴＰＳ１阻害剤は、レシピエントにおけるこのような移植の急性拒絶反応を予防するために、及び／又はレシピエントにおけるこのような移植の拒絶反応を予防する長期維持療法のために（例えば、糖尿病を患っている被験体レシピエントにおけるドナーからのインスリン産生膵島細胞移植の拒絶反応を阻害するために）有効であり得ると考えられる。したがって、本発明の方法は、宿主対移植片病（ＨＶＧＤ）又は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防するのに有用である。ＣＴＰＳ１阻害剤は、移植前及び／又は移植後（例えば、移植の少なくとも１日前、移植の１〜５日後など）に、被験体に投与され得る。いくつかの実施態様では、ＣＴＰＳ１阻害剤は、移植前及び／又は移植後に、被験体に定期的に投与され得る。
【０００９】
いくつかの実施態様では、被験体は、自己免疫疾患を患っている。本明細書で使用される「自己免疫疾患」は、個体自身の組織から生じ、これを対象とする疾患又は障害である。自己免疫疾患の例としては、限定されないが、アジソン病、アレルギー、円形脱毛症、アルツハイマー病、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連脈管炎、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群（ヒューズ症候群）、関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化巣、自己免疫疾患（例えば、狼瘡、ＲＡ、ＭＳ、グレーブス病など）、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ球増殖症候群、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、無精子症、ベーチェット病、ベルジェ病、水疱性類天疱瘡、心筋症、心血管疾患、セリアックスプルー／セリアック病、慢性疲労免疫不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性特発性多発神経炎、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＰＤ）、慢性再発性多発ニューロパシー（ギラン・バレー症候群）、チャーグ・ストラウス症候群（ＣＳＳ）、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症（ＣＡＤ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、円盤状狼瘡、湿疹、後天性表皮水疱症、本態性混合型クリオグロブリン血症、エヴァンス症候群、眼球突出、線維筋痛症、グッドパスチャー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、免疫増殖性疾患又は障害（例えば、乾癬）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む）、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、間質性肺疾患、若年性糖尿病、若年性関節炎、若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、川崎病、ランバート・イートン筋無力症症候群、扁平苔癬、狼瘡、ループス腎炎、リンパ球性下垂体炎、メニエール病、ミラー・フィッシャー症候群／急性散在性脳脊髄神経根障害、混合結合組織病、多発性硬化症（ＭＳ）、筋肉リウマチ、筋痛性脳脊髄炎（ＭＥ）、重症筋無力症、眼の炎症、落葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群（ホイッタカー症候群）、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変／自己免疫胆管症、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群／反応性関節炎、再狭窄、リウマチ熱、リウマチ性疾患、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、硬皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、全身硬皮症、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、甲状腺炎、１型糖尿病、２型糖尿病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎、白斑及びウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【００１０】
本明細書で使用される用語「ＣＴＰＳ１」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＣＴＰシンターゼ１を指す。ＣＴＰＳ１は、ＣＴＰシンターゼドメインと、ＵＴＰ及びグルタミンからのＣＴＰ形成を代謝するグルタミンアミド転移ドメインとを含有する６７kDaのタンパク質である（Kursula, P. et al. Structure of the synthetase domain of human CTP synthetase, a target for anticancer therapy. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 62, 613-7 (2006).）。
【００１１】
本明細書で使用される用語「ＣＴＰＳ１阻害剤」は、ＣＴＰＳ１の活性又は発現を減少又は抑制する能力を有する任意の天然化合物又は非天然化合物を指す。典型的には、ＣＴＰＳ１阻害剤は、タンパク質に結合することによって活性に対して直接的に作用し得るか、又は酵素の発現を減少若しくは阻害することによって活性に対して間接的に作用し得る。したがって、ＣＴＰＳ１阻害剤は、ＣＴＰＳ１発現阻害剤を包含する。例えば、ＣＴＰＳ１阻害剤としては、対応する触媒ドメインに対するＣＴＰＳ１の基質（例えば、ＣＴＰ又はグルタミン）と競合し得る任意の化合物も挙げられる。典型的には、前記阻害剤は、小有機分子又は生体分子（ペプチド、脂質、アプタマー）である。
【００１２】
いくつかの実施態様では、ＣＴＰＳ１阻害剤は、グルタミンのＣＴＰＳ１阻害剤結合特性を保持するアミノ酸グルタミンの任意の機能的類似体、誘導体、置換産物、異性体又は相同体である。
【００１３】
用語「グルタミン類似体」は、本明細書では、上記のいずれか１つを包含することを意図する。本発明のグルタミン類似体の調製は、当業者に周知の従来の方法によって調製され、例えば、特定の実施態様との関連で以下に言及される参考文献又は標準的な参考文献を参照のこと。
【００１４】
いくつかの実施態様では、ＣＴＰＳ１阻害剤は、ノルロイシン誘導体、例えば６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン（ＤＯＮ）である。ＤＯＮは、広範囲のグルタミン要求反応を阻害するグルタミン類似体であるが、哺乳動物細胞では、その主な効果は、de novoプリン生合成及びＣＴＰシンターゼに対するものであると思われる（Lyons, S. D., Sant, M. E., Christopherson, R. I. (1990) J. Biol. Chem. 265, 11377-11381）。それは増殖を阻止するので、抗ガン剤として多くの臨床試験を通過している（Catane, R., Von Hoff, D. D., Glaubiger, D. L. and Muggia, F. M. (1979) Cancer Treat. Rep. 63, 1033-1038;及びAhluwalia, G. S., Grem, J. L., Hao, Z., and Cooney, D. A. (1990) Pharmacol. Ther. 46, 243-271に概説されている）。米国特許第２９６５６３４号は、ＤＯＮなどのノルロイシン誘導体、及びそれらの生産方法に関する。
【００１５】
いくつかの実施態様では、ＣＴＰＳ１阻害剤は、アシビシンである。アシビシンは、米国特許第５，４８９，５６２号に記載されている。
【００１６】
いくつかの実施態様では、ＣＴＰＳ１阻害剤は、ＵＴＰ類似体である。このような類似体の例は、デアザウリジン（deazuridine）（ＣＡＳ番号２３２０５−４２−７）である。
【００１７】
他の例としては、シクロペンテニルシトシン（ＣＰＥＣ）、ゲムシタビン（２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン、ｄＦｄＣ）、アクチノマイシンＤ、シクロヘキシミド、ジブチリルサイクリックＡＭＰ及び６−アザウリジンが挙げられる。
【００１８】
「発現阻害剤」は、遺伝子の発現を阻害する生物学的効果を有する天然化合物又は合成化合物を指す。
【００１９】
いくつかの実施態様では、前記遺伝子発現阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムである。
【００２０】
本発明で使用するための遺伝子発現阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築物をベースとするものであり得る。アンチセンスＲＮＡ分子及びアンチセンスＤＮＡ分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ターゲットｍＲＮＡに結合してタンパク質翻訳を防止するか、又はｍＲＮＡ分解を増加させることによって、ターゲットｍＲＮＡの翻訳を直接遮断し、それにより、細胞内のターゲットタンパク質（すなわち、ＣＴＰＳ１）のレベル及び活性を低下させるように作用する。例えば、少なくとも約１５塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、ターゲットタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写配列のユニーク領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば通常のホスホジエステル技術によって合成し、例えば静脈内注射又は静脈内注入によって投与し得る。その配列が公知の遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためにアンチセンス技術を使用する方法は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号；米国特許第６，５６６，１３１号；米国特許第６，３６５，３５４号；米国特許第６，４１０，３２３号；米国特許第６，１０７，０９１号；米国特許第６，０４６，３２１号；及び米国特許第５，９８１，７３２号を参照のこと）。
【００２１】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もまた、本発明で使用するための遺伝子発現阻害剤として機能し得る。遺伝子発現が特異的に阻害されるように、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又は低分子二本鎖ＲＮＡの生成を引き起こすベクター若しくは構築物と腫瘍、被験体又は細胞を接触させることによって遺伝子発現を減少させ得る（すなわち、ＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉ）。その配列が公知の遺伝子について、適切なｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択するための方法は、当技術分野で周知である（例えば、Tuschi, T. et al. (1999); Elbashir, S. M. et al. (2001); Hannon, GJ. (2002); McManus, MT. et al. (2002); Brummelkamp, TR. et al. (2002); 米国特許第６，５７３，０９９号及び米国特許第６，５０６，５５９号；並びに国際公開公報第０１／３６６４６号、国際公開公報第９９／３２６１９号及び国際公開公報第０１／６８８３６号を参照のこと）。
【００２２】
リボザイムもまた、本発明で使用するための遺伝子発現阻害剤として機能し得る。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機構は、相補的ターゲットＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、それに続くエンドヌクレアーゼ切断を含む。それにより、ターゲットｍＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ切断を特異的及び効率的に触媒する人工ヘアピン又はハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、本発明の範囲内で有用である。リボザイム切断部位（これらとしては、典型的には、以下の配列ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣが挙げられる）についてターゲット分子をスキャンすることによって、任意のＲＮＡターゲット候補内の特異的リボザイム切断部位を最初に同定する。同定したら、切断部位を含有するターゲット遺伝子の領域に対応する約１５〜２０リボヌクレオチドの間の短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド配列を不適切にし得る予測構造的特徴（例えば、二次構造）について評価し得る。また、例えば、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへのアクセシビリティを試験することによって、候補ターゲットの適切性を評価し得る。
【００２３】
遺伝子発現阻害剤として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムは両方とも、公知の方法によって調製され得る。これらとしては、例えば、固相ホスホラミダイト（phosphoramadite）化学合成などによるによる化学合成技術が挙げられる。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のin vitro又はin vivo転写によって作製され得る。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７又はＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターが組み込まれた様々なベクターに組み込まれ得る。細胞内安定性及び半減期を増加させる手段として、本発明のオリゴヌクレオチドに対する様々な改変を導入し得る。可能な改変としては、限定されないが、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドフランキング配列を分子の５’及び／若しくは３’末端に付加すること、又はホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエート若しくは２’−Ｏ−メチルをオリゴヌクレオチド骨格内で使用することが挙げられる。
【００２４】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ及びリボザイムは、単独で又はベクターに結合してin vivo送達され得る。その最も広い意味において、「ベクター」は、細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ又はリボザイム核酸の運搬を促進することができる任意のビヒクルである。典型的には、ベクターは、ベクターの非存在で起こり得る分解程度と比べて低減した分解で、核酸を細胞に輸送する。一般的に、本発明に有用なベクターとしては、限定されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ又はリボザイム核酸配列の挿入又は組み込みによって操作されたプラスミド、ファージミド、ウイルス、ウイルス源又は細菌源に由来する他のビヒクルが挙げられる。ウイルスベクターが特定の種類のベクターであり、限定されないが、以下のウイルス：レトロウイルス、例えばモロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳ガンウイルス、及びラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；及びＲＮＡウイルス、例えばレトロウイルスに由来する核酸配列が挙げられる。命名されていないが当技術分野で公知の他のベクターも容易に用いることができる。
【００２５】
特定のウイルスベクターは、非必須遺伝子が目的の遺伝子で置換されている非細胞変性真核生物ウイルスをベースとするものである。非細胞変性ウイルスとしてはレトロウイルス（例えば、レンチウイルス）が挙げられ、その生活環は、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写と、それに続くプロウイルスの宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを含む。レトロウイルスは、ヒト遺伝子療法試験に承認されている。最も有用なのは、複製欠損性（すなわち、所望のタンパク質の合成を指令することはできるが、感染性粒子を製造することができない）レトロウイルスである。このような遺伝子的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、in vivoにおける高効率な遺伝子トランスダクションについて全般的な有用性を有する。複製欠損性レトロウイルスを生産するための標準的なプロトコール（外因性遺伝物質をプラスミドに組み込む工程、プラスミドでパッケージング細胞株をトランスフェクションする工程、パッケージング細胞株によってリコンビナントレトロウイルスを生産する工程、組織培養培地からウイルス粒子を回収する工程、及びウイルス粒子をターゲット細胞に感染させる工程を含む）は、KRIEGLER (A Laboratory Manual," W.H. Freeman C.O., New York, 1990)及びMURRY ("Methods in Molecular Biology," vol.7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J., 1991)に示されている。
【００２６】
特定の用途に好ましいウイルスは、遺伝子治療におけるヒトへの使用が既に承認されている二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルス及びアデノ随伴（ＡＡＶ）ウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損性となるように操作することができ、広範囲の細胞型及び種に感染することができる。それはさらに、熱安定性及び脂質溶媒安定性；造血細胞を含む多様な系統の細胞における高いトランスダクション頻度；並びに、重複感染阻害がないので複数回のトランスダクションが可能であるなどの利点を有する。報告によれば、アデノ随伴ウイルスを部位特異的にヒト細胞ＤＮＡに組み込むことにより、挿入突然変異誘発の可能性及びレトロウイルス感染に特徴的な挿入遺伝子の発現の変動性を最小限にし得る。加えて、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択圧の非存在下で１００継代回以上にわたって組織培養液中で観察されており、これは、アデノ随伴ウイルスのゲノム組み込みは、比較的安定した事象であることを意味する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外でも機能し得る。
【００２７】
他のベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクターは当技術分野で広く記載されており、当業者に周知である。例えば、SANBROOK et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照のこと。ここ数年間では、プラスミドベクターは、in vivoにおいて抗原をコードする遺伝子を細胞に送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されている。それらは、ウイルスベクターの多くと同じ安全上の懸念がないので、特に有利である。しかしながら、宿主細胞と適合性のプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内で作動可能にコードされた遺伝子からペプチドを発現し得る。いくつかの一般的に使用されるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが挙げられる。他のプラスミドは当業者に周知である。加えて、ＤＮＡの特定のフラグメントを除去及び付加する制限酵素及びライゲーション反応を使用して、プラスミドをカスタム設計し得る。プラスミドは、様々な非経口経路、粘膜経路及び局所経路によって送達され得る。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下、又は他の経路によって注射され得る。それはまた、鼻腔内スプレー又は点鼻液、直腸坐剤によって及び経口的に投与され得る。それはまた、遺伝子銃を使用して表皮又は粘膜表面に投与され得る。プラスミドを水溶液に加えてもよいし、金粒子上に乾燥してもよいし、又は別のＤＮＡ送達システム（限定されないが、リポソーム、デンドリマー、コクリエート及びマイクロカプセル化を含む）と併用してもよい。
【００２８】
典型的には、本発明のＣＴＰＳ１阻害剤は、治療有効量で被験体に投与される。
【００２９】
「治療有効量」の上記本発明のＣＴＰＳ１阻害剤は、十分な量の化合物を意味する。しかしながら、本発明の化合物及び組成物の１日総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されると理解されよう。任意の特定の被験体の具体的な治療有効用量レベルは、治療される障害及び障害の重症度；用いられる特定の化合物の活性；用いられる特定の組成物、被験体の年齢、体重、一般健康、性別、及び食事；投与時間、投与経路、及び用いられる特定の化合物の排泄速度；治療期間；用いられる特定のＣＴＰＳ１阻害剤と組み合わせて又は同時に使用される薬物；及び医療分野で周知の同様の要因を含む様々な要因に依存するであろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルよりも低レベルで化合物の投与を開始して、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることは、当業者の範囲内である。しかしながら、生成物の１日投与量は、０．０１〜１，０００mg／成人／日の広範囲で変動し得る。典型的には、治療される被験体への投与量を対症的に調整するために、組成物は、有効成分０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０、及び５００mgを含有する。医薬は、典型的には、有効成分約０．０１mg〜約５００mg、典型的には有効成分１mg〜約１００mgを含有する。有効量の薬物は、通常、０．０００２mg/kg〜約２０mg/kg体重／日、特に約０．００１mg/kg〜７mg/kg体重／日の投与量レベルで供給される。
【００３０】
本発明のＣＴＰＳ１阻害剤を薬学的に許容し得る賦形剤及び場合により持続放出マトリックス、例えば生分解性ポリマーと組み合わせて、治療組成物を形成し得る。
【００３１】
「薬学的に」又は「薬学的に許容し得る」は、必要に応じて哺乳動物、特にヒトに投与した場合に有害反応、アレルギー反応又は他の望ましくない反応を引き起こさない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容し得る担体又は賦形剤は、無毒の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、封入剤又は任意の種類の製剤化助剤を指す。
【００３２】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所又は直腸投与のための本発明の医薬組成物では、有効成分は、単独で又は別の有効成分と組み合わせて、単位投与形態で、従来の薬学的支持体との混合物として、動物及びヒトに投与され得る。適切な単位投与形態としては、経口投与形態、例えば、錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤及び経口懸濁剤又は液剤、舌下及び頬側投与形態、エアロゾル、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、くも膜下腔内、及び鼻腔内投与形態及び直腸投与形態が挙げられる。
【００３３】
典型的には、医薬組成物は、注射可能な製剤のための薬学的に許容し得るビヒクルを含有する。これらは、特に、等張滅菌生理食塩水溶液（リン酸一ナトリウム又は二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム又は塩化マグネシウムなど又はこのような塩の混合物）、又は乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物であり得、これは場合に応じて滅菌水又は生理学的食塩水が追加されると、注射液の構成が可能となる。
【００３４】
注射用途に適切な医薬形態としては、滅菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び滅菌注射液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、形態は滅菌されていなければならず、容易にシリンジが扱える程度に流動性でなければならない。それは製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して防腐されていなければならない。
【００３５】
遊離塩基又は薬理学的に許容し得る塩として本発明の化合物を含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びその混合物中で及び油中で調製され得る。通常の保存及び使用条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含む。
【００３６】
本発明のＣＴＰＳ１阻害剤は、中性形態又は塩形態の組成物に製剤化され得る。薬学的に許容し得る塩としては、無機酸（例えば、塩酸又はリン酸）又は有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）を用いて形成される（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）酸付加塩が挙げられる。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化鉄）及び有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導され得る。
【００３７】
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、適切なその混合物、及び植物油を含む、溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物作用の抑制は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に使用することによってもたらされ得る。
【００３８】
必要に応じて上に列挙されている様々な他の成分と一緒に、必要量の活性ポリペプチドを適切な溶媒に組み込み、続いて滅菌ろ過することによって、滅菌注射液を調製する。一般的に、基本分散媒体と上に列挙されている必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに様々な滅菌有効成分を組み込むことによって、分散液を調製する。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌ろ過したその溶液から有効成分と任意のさらなる所望の成分との粉末が得られる真空乾燥及び凍結乾燥技術である。
【００３９】
製剤化したら、投与製剤と適合性の方法によって治療有効量で溶液を投与する。製剤は、上記注射液型などの様々な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども用いることができる。
【００４０】
水溶液による非経口投与の場合、例えば、必要の場合には前記溶液を適切に緩衝化し、十分な生理食塩水又はグルコースを用いて液体希釈剤を最初に等張にすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適切である。これに関して、当業者であれば、本開示を考慮して、用いられ得る滅菌水性媒体を理解するであろう。例えば、１投与量を等張ＮａＣｌ溶液１mlに溶解し、皮下液１０００mlに追加し得るか、又は推奨注入部位に注射し得る。治療される被験体の症状に応じて、投与量のいくらかの変更が必ず生じるであろう。いずれにしても、投与責任者は、個々の被験体に適切な用量を決定するであろう。
【００４１】
静脈内又は筋肉内注射などの非経口投与のために製剤化された本発明の化合物に加えて、他の薬学的に許容し得る形態としては、例えば、錠剤又は経口投与のための他の固体；リポソーム製剤；徐放性カプセル；及び現在使用されている任意の他の形態が挙げられる。
【００４２】
本発明のＣＴＰＳ１阻害剤は、当技術分野で周知の任意の免疫抑制剤と組み合わせて使用され得る。免疫抑制剤としては、限定されないが、スタチン；ｍＴＯＲ阻害剤、例えばラパマイシン又はラパマイシン類似体；ＴＧＦ−βシグナル伝達剤；ＴＧＦ−βレセプターアゴニスト；ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、例えばトリコスタチンＡ；コルチコステロイド；ミトコンドリア機能阻害剤、例えばロテノン；Ｐ３８阻害剤；ＮＦ−κβ阻害剤、例えば６Ｂｉｏ、デキサメタゾン、ＴＣＰＡ−１、ＩＫＫ  ＶＩＩ；アデノシンレセプターアゴニスト；プロスタグランジンＥ２アゴニスト（ＰＧＥ２）、例えばミソプロストール；ホスホジエステラーゼ阻害剤、例えばホスホジエステラーゼ４阻害剤（ＰＤＥ４）、例えばロリプラム；プロテアソーム阻害剤；キナーゼ阻害剤；Ｇタンパク質共役レセプターアゴニスト；Ｇタンパク質共役レセプターアンタゴニスト；グルココルチコイド；レチノイド；サイトカイン阻害剤；サイトカインレセプター阻害剤；サイトカインレセプター活性化剤；ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターアンタゴニスト；ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターアゴニスト；ヒストンデアセチラーゼ阻害剤；カルシニューリン阻害剤；ホスファターゼ阻害剤；ＰＩ３  ＫＢ阻害剤、例えばＴＧＸ−２２１；オートファジー阻害剤、例えば３−メチルアデニン；アリール炭化水素レセプター阻害剤；プロテアソーム阻害剤Ｉ（ＰＳＩ）；及び酸化ＡＴＰ、例えばＰ２Ｘレセプター遮断薬が挙げられる。免疫抑制剤としては、ＩＤＯ、ビタミンＤ３、シクロスポリン、例えばシクロスポリンＡ、アリール炭化水素レセプター阻害剤、レスベラトロール、アザチオプリン（Ａｚａ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、６−チオグアニン（６−ＴＧ）、ＦＫ５０６、サングリフェリンＡ、サルメテロール、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、アスピリン及び他のＣＯＸ阻害剤、ニフルム酸、エストリオール及びトリプトリドも挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のＣＴＰＳ１阻害剤はまた、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ２アンタゴニスト又はＩＬ１５アンタゴニストと組み合わせて使用され得る。
【００４３】
本発明のさらなる態様は、それを必要とする被験体におけるリンパ球増殖を阻害するのに有用な複数の試験物質をスクリーニングするための方法であって、ｉ）ＣＴＰＳ１活性又は発現を阻害するその能力について、各該試験物質を試験すること、及びｉｉ）ＣＴＰＳ１活性又は発現を阻害する試験物質を同定し、それにより、それを必要とする被験体におけるリンパ球増殖を阻害するのに有用な試験物質を選択することからなる工程を含む方法に関する。
【００４４】
試験物質のＣＴＰＳ１活性阻害能力を試験するために、当技術分野で周知の任意のアッセイが使用され得る。特に、アッセイは、酵素の標識物質を使用し、次いで、変換（conversation）による生成物の量を決定することから構成され得る。生合成経路の生成物中の標識を検出することによってその変換を検出することができるように、基質を適切に標識すればよいだけである。基質は、典型的には、標識グルタミン又はＵＴＰである。典型的には、標識基質（susbtrate）は、非放射性又は放射性であり得る。例えば、非放射性基質の場合、Ｃ１３標識基質又はジュウテリウム標識基質であり得る。例えば、放射性基質の場合、特に、Ｃ１４標識基質又はトリチウム標識基質である。典型的には、標識物質は、ＣＴＰＳ１を含む水溶液として追加され得る。水溶液中の基質の濃度は、１μM〜１mMであり得る。Ｃ１４標識基質の場合、放射能は、典型的には少なくとも０．１μCiであり、３Ｈ標識基質の場合、典型的には少なくとも１μCiである。１４−炭素又は１３−炭素による標識は一重であり得、それにより、Ｃ位置のいずれか１つが標識され得る。あるいは、基質は、多重（例えば、二重、三重、四重又は五重）に標識され得る。全Ｃ標識は、１３−炭素標識の場合に特に好ましい。ジュウテリウム又はトリチウムによる標識は、一重又は多重であり得る。典型的には、標識基質は、酵素的又は化学的に調製され得る。基質、試験物質及び酵素は、典型的には、酵素的変換を可能にするのに十分な時間にわたってインキュベーションされる。その後、基質（subtrate）の変換（conservation）によって生成されたＣＴＰを、ＨＰＬＣ、薄層クロマトグラフィーなどによってこの溶液から分離することが可能である。放射性標識の場合、標識生成物の決定は、シンチレーションカウンターによって、ホスホイメージャーによって、ラジオ薄層カウンターによって、又はクロマトグラフィーカラムとの組み合わせた放射能検出器によって行われ得る。典型的には、ＨＰＬＣをFlow Scintillation Analyzer (Radiomatic 150 TR, Packard)に接続することにより、クロマトグラフピークの放射能を検査することが可能である。放射能測定の場合、通常通り、全サンプルをカラムにロードした。ピーク高さを測定し、それを標準曲線と比較することによって、標識生成物を定量した。非放射性標識の場合、ＮＭＲ分光法（例えば、１３Ｃ−ＮＭＲ）又は質量分析（例えば、ＨＰＬＣ−ＭＳ又はＧＣ−ＭＳ）によって、決定が行われ得る。標識生成物の量が、試験物質の非存在下で決定した標識生成物の量よりも少ない場合、試験物質をＣＴＰＳ１阻害剤とみなす。
【００４５】
いくつかの実施態様では、研究酵素を発現する細胞を使用するin vitroアッセイにおいて、酵素的変換を検討する。この特定の実施態様では、スクリーニング方法は、以下の工程：
ａ）ＣＴＰＳ１を発現する細胞の懸濁液を、前記細胞の代謝を支援する培養培地中で調製すること
ｂ）所定量の標識基質を前記懸濁液に追加すること、
ｃ）工程ｂ）で得られた混合物を所定温度で所定期間インキュベーションすること
ｄ）典型的には、該細胞を溶解してその細胞内含物を放出させることによって、工程で得られた前記インキュベーション混合物から、標識生成物を含む画分を分離すること、
ｅ）工程ｄ）で得られた前記画分中の標識生成物の濃度を検出すること、
ｆ）所定量の該試験物質を追加する以外は同一の条件下で、工程ｂ）、ｃ）、ｄ）及びｅ）を繰り返すこと、
ｇ）工程ｆ）で検出された標識生成物の濃度が、工程ｅ）で検出された標識生成物の濃度よりも低いかを観察することによって、ＣＴＰＳ１の阻害の存在を決定すること
を含む。
【００４６】
基本的には、工程ｅ）又はｆ）で検出された標識生成物の濃度は、ＣＴＰのプールを表す。細胞を試験物質と共にインキュベーションした場合のＣＴＰプールの減少は、試験物質がＣＴＰＳ１阻害剤であることを示す。
【００４７】
in vitroアッセイでは、様々な細胞が使用され得る。典型的には、細胞は、ＣＴＰＳ１を天然に発現するＴ細胞である。いくつかの実施態様では、目的の細胞でＣＴＰＳ１を発現させるために、多様な宿主−発現ベクター系が利用され得る。これらとしては、限定されないが、ヒト細胞株などの哺乳動物細胞系が挙げられる。哺乳動物細胞系は、哺乳動物細胞ゲノム由来のプロモーター又は哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター又はワクチンウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有するリコンビナント発現構築物を有し得る。当技術分野で公知のいくつかの方法、例えばリン酸カルシウム媒介性、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性、リポソーム媒介性、ウイルス媒介性、エレクトロポレーション媒介性及びマイクロインジェクション送達によって、細胞株において、アッセイすべきタンパク質（すなわち、ＣＴＰＳ１）をコードするＤＮＡを一時的又は安定的に発現させ得る。これらの各方法は、ＤＮＡ、細胞株、及びその後に用いるべきアッセイの種類に応じて、多様な実験パラメータの最適化を必要とし得る。加えて、ターゲットタンパク質の核酸配列を天然に保有及び発現するネイティブな細胞株が使用され得る。
【００４８】
また、試験物質がＣＴＰＳ１発現を阻害することができるかを決定するために、当技術分野で周知のアッセイが使用され得る。典型的には、試験物質の存在下で、ＣＴＰＳ１を発現する細胞の集団を培養し、次いで、ＣＴＰＳ１発現レベルを決定し、試験物質の非存在下で決定したレベルと比較する。試験物質の存在下で決定したＣＴＰＳ１発現レベルが、試験物質の非存在下で決定したＣＴＰＳ１発現レベルよりも低い場合、試験物質がＣＴＰＳ１阻害剤であると結論する。
【００４９】
遺伝子発現レベルの決定は、様々な技術によって実施され得る。一般的に、決定される発現レベルは、相対的な発現レベルである。より典型的には、決定は、サンプルをプローブ、プライマー又はリガンドなどの選択試薬と接触させることによって、サンプル中に本来的に存在する目的のポリペプチド又は核酸の存在を検出するか、又はそれらの量を測定することを含む。接触は、プレート、マイクロタイターディッシュ、試験管、ウェル、ガラス、カラムなどの任意の適切なデバイスにおいて実施され得る。いくつかの実施態様では、接触は、試薬でコーティングされている基材、例えば核酸アレイ又は特異的リガンドアレイ上で実施される。基材は、固形又は半固形の基材、例えばガラス、プラスチック、ナイロン、紙、金属、ポリマーなどを含む任意の適切な支持体であり得る。基材は、スライド、膜、ビーズ、カラム、ゲルなどの様々な形態及びサイズものであり得る。試薬とサンプルの核酸又はポリペプチドとの間で形成される検出可能な複合体（例えば、核酸ハイブリッド又は抗体−抗原複合体）に適切な任意の条件で、接触を行い得る。
【００５０】
いくつかの実施態様では、発現レベルは、ｍＲＮＡの量を決定することによって決定され得る。
【００５１】
ｍＲＮＡの量を決定するための方法は、当技術分野で周知である。最初に、例えば、サンプル（例えば、被験体から調製された細胞又は組織）中に含まれる核酸を、溶解酵素若しくは化学溶液を使用して標準的な方法によって抽出するか、又は製造業者の説明書にしたがって核酸結合樹脂によって抽出する。次いで、ハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンブロット分析）及び／又は増幅（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）によって、抽出したｍＲＮＡを検出する。典型的には、定量又は半定量ＲＴ−ＰＣＲが好ましい。リアルタイム定量又は半定量ＲＴ−ＰＣＲが特に有利である。
【００５２】
他の増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅（ＴＭＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）及び核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。
【００５３】
少なくとも１０ヌクレオチドを有する核酸であって、本明細書における目的のｍＲＮＡと配列相補性又は相同性を示す核酸は、ハイブリダイゼーションプローブ又は増幅プライマーとして有用であることが分かっている。このような核酸は、比較可能なサイズの相同領域と同一である必要はないが、典型的には少なくとも約８０％同一、より典型的には８５％同一、さらにより典型的には９０〜９５％同一であると理解される。特定の実施態様では、ハイブリダイゼーションを検出するための適切な手段（例えば、検出可能な標識）と組み合わせて核酸を使用することが有利であろう。蛍光リガンド、放射性リガンド、酵素リガンド又は他のリガンド（例えば、アビジン／ビオチン）を含む多種多様な適切な指標が当技術分野で公知である。
【００５４】
プローブは、典型的には、１０〜１０００ヌクレオチド長、例えば１０〜８００ヌクレオチド長、より典型的には１５〜７００ヌクレオチド長、典型的には２０〜５００ヌクレオチド長の一本鎖核酸を含む。プライマーは、典型的には、増幅すべき目的の核酸と完全に又はほぼ完全にマッチするように設計された１０〜２５ヌクレオチド長のより短い一本鎖核酸である。プローブ及びプライマーは、それらがハイブリダイゼーションする核酸に「特異的」である（すなわち、それらは、典型的には、高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件（最高融解温度Ｔｍ、例えば５０％ホルムアミド、５×又は６×ＳＣＣに対応する。ＳＣＣは、０．１５M ＮａＣｌ、０．０１５Mクエン酸Ｎａである）下でハイブリダイゼーションする）。
【００５５】
上記増幅及び検出方法で使用される核酸プライマー又はプローブは、キットとしてアセンブルされ得る。このようなキットは、コンセンサスプライマー及び分子プローブを含む。特定のキットはまた、増幅が起こったかを決定するのに必要な構成要素を含む。キットはまた、例えば、ＰＣＲ緩衝液及び酵素；ポジティブコントロール配列、反応コントロールプライマー；並びに特異的配列を増幅及び検出するための説明書を含む。
【００５６】
いくつかの実施態様では、発現レベルは、ＤＮＡチップ分析によって決定される。このようなＤＮＡチップ又は核酸マイクロアレイは、マイクロチップ、ガラススライド又はミクロスフェアサイズのビーズであり得る基材に化学的に結合した異なる核酸プローブからなる。マイクロチップは、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖、シリカ若しくはシリカ系材料、カーボン、金属、無機ガラス又はニトロセルロースから構成され得る。プローブは、約１０〜約６０塩基対であり得る核酸、例えばｃＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドを含む。発現レベルを決定するために、場合により最初に逆転写に供された被験体由来のサンプルを標識し、ハイブリダイゼーション条件でマイクロアレイと接触させて、マイクロアレイ表面に結合したプローブ配列と相補的なターゲット核酸間で複合体を形成させる。次いで、標識ハイブリダイゼーション複合体を検出し、定量又は半定量することができる。標識は、様々な方法によって、例えば放射性標識又は蛍光標識を使用することによって達成され得る。マイクロアレイハイブリダイゼーション技術の多数の変法が当業者に利用可能である（例えば、Hoheisel, Nature Reviews, Genetics, 2006, 7:200-210による総説を参照のこと）。
【００５７】
前記遺伝子の発現レベルを決定するための他の方法は、前記遺伝子によってコードされるタンパク質の量の決定を含む。このような方法は、生物学的サンプルを、そのサンプル中に存在するマーカータンパク質と選択的に相互作用することができる結合パートナーと接触させることを含む。結合パートナーは、一般的に、ポリクローナル又はモノクローナル、典型的にはモノクローナルであり得る抗体である。
【００５８】
タンパク質の存在は、競合アッセイ、直接反応アッセイ又はサンドイッチ型アッセイなどのイムノアッセイを含む標準的な電気泳動技術及び免疫診断技術を使用して検出され得る。このようなアッセイとしては、限定されないが、ウエスタンブロット；凝集試験；ＥＬＩＳＡなどの酵素標識及び酵素媒介性イムノアッセイ；ビオチン／アビジン型アッセイ；ラジオイムノアッセイ；免疫電気泳動；免疫沈降などが挙げられる。反応としては、一般的に、蛍光標識、化学発光標識、放射性標識、酵素標識若しくは色素分子などの標識の明示、又は抗原と、それと反応する１つ若しくは複数の抗体との間の複合体形成を検出するための他の方法が挙げられる。
【００５９】
上記アッセイは、一般的に、抗原−抗体複合体が結合している固相支持体から液相中に未結合タンパク質を分離することを含む。本発明の実施に使用され得る固体支持体としては、基材、例えばニトロセルロース（例えば、膜又はマイクロタイターウェルの形態）；ポリ塩化ビニル（例えば、シート又はマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズ又はマイクロタイタープレート）；ポリフッ化ビニリジン；ジアゾ化紙；ナイロン膜；活性化ビーズ、磁気応答性ビーズなどが挙げられる。
【００６０】
より具体的には、試験すべきタンパク質に対する抗体でマイクロタイタープレートのウェルをコーティングするＥＬＩＳＡ法を使用し得る。次いで、マーカータンパク質を含有するか又は含有すると疑われる生物学的サンプルをコーティングウェルに追加する。抗体−抗原複合体の形成を可能にするのに十分なインキュベーション期間後、プレートを洗浄して未結合の部分を除去し、検出可能に標識された二次結合分子を追加し得る。二次結合分子を任意の捕捉サンプルマーカータンパク質と反応させ、プレートを洗浄し、当技術分野で周知の方法を使用して二次結合分子の存在を検出する。
【００６１】
典型的には、試験物質は、ペプチド、ペプチド模倣体、小有機分子、抗体、アプタマー又は核酸からなる群より選択され得る。例えば、本発明の試験物質は、予め合成された化合物のライブラリー、又は構造がデータベースで決定される化合物ライブラリー、又はde novo合成された化合物ライブラリーから選択され得る。いくつかの実施態様では、試験物質は、小有機分子から選択され得る。本明細書で使用される用語「小有機分子」は、医薬品で一般的に適切な有機分子と同程度のサイズの分子を指す。この用語は、生体高分子（例えば、タンパク質、核酸など）を除外する；特定の小有機分子は、サイズが２０００Ｄａまで、最も典型的には約１０００Ｄａまでの範囲である。
【００６２】
本発明のスクリーニング方法は、非常に簡便である。連続的に又は平行して多数の試験物質を用いて、それを実施し得る。前記方法は、ロボット工学に容易に適合され得る。例えば、炎症性腸疾患の治療又は予防に有用であり得る薬物を開発するための試験物質を同定するために、ハイスループットスクリーニング技術を使用して、上記アッセイを実施し得る。自動ロボットシステムを使用して多重アッセイを行うために、ハイスループットスクリーニング技術は、マルチウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート、３８９ウェルプレート又は１５３６ウェルプレート）を使用して行われ得る。したがって、試験物質の大規模ライブラリーを高効率的にアッセイし得る。試験物質を同定するための特定の戦略は、ストレス応答経路によって活性化される任意の遺伝子のプロモーターに融合されたレポーター遺伝子でトランスフェクションされた培養細胞を用いて開始する。より具体的には、マイクロタイタープレート（９６ウェル又は３８４ウェル）のウェル中で成長している安定トランスフェクション細胞を、化合物ライブラリーのハイスループットスクリーニングに適合させ得る。上記トランスジェニック細胞を含有するマイクロタイターディッシュのウェルに、ライブラリー中の化合物を１つずつ自動的にアプライする。ターゲット遺伝子の１つを活性化する試験物質が同定されたら、次いで、統合ストレス応答経路におけるそれらの作用部位を決定することが好ましい。ターゲット物質を最適化するためのより精密なアッセイを開発するために、作用部位を定義することが特に有用である。
【００６３】
いくつかの実施態様では、ヒトで使用する前に、in vitroアッセイ又は動物モデル生物、例えば齧歯類動物モデル系において、所望の治療活性についてその特性をさらにアッセイする観点から、積極的に選択した試験物質をさらなる選択工程に供し得る。
【００６４】
例えば、in vitroアッセイは、Ｂ細胞株又はＴ細胞株、例えばジャーカット細胞株又はＭＯＬＴ−４細胞株の使用を含み得る。特に、前記方法は、Ｂ細胞株又はＴ細胞株を提供すること、該細胞株を選択試験物質と接触させること、該Ｂ細胞株又はＴ細胞株の増殖レベルを決定すること、前記増殖レベルを、該試験物質の非存在下で決定した増殖レベルと比較すること、及び該試験物質の存在下で決定した増殖レベルが、該試験物質の非存在下で決定した増殖レベルよりも低い場合、該試験物質を積極的に選択することからなる工程をさらに含み得る。
【００６５】
例えば、選択ＣＴＰＳ１阻害剤の投与が指示されるかを決定するのに使用され得るアッセイとしては、被験体の組織サンプルを培養液中で成長させ、ＣＴＰＳ１阻害剤に曝露し、又は別の方法でＣＴＰＳ１阻害剤と接触させ、組織サンプルに対するこのような組成物の効果を観察する細胞培養アッセイが挙げられる。組織サンプルは、被験体からの生検によって得られ得る。この試験は、治療的に最も有効なＣＴＰＳ１阻害剤の同定を可能にする。様々な特定の実施態様では、自己免疫に関与する細胞型の代表的な細胞（例えば、Ｔ細胞）を用いてin vitroアッセイを行って、試験物質がこのような細胞型に対して所望の効果を有するかを決定し得る。
【００６６】
スクリーニングしたＣＴＰＳ１阻害剤のin vivo治療効果を検討するために、任意の周知の動物モデルが使用され得る。例えば、スクリーニングしたＣＴＰＳ１阻害剤の治療活性は、Crofford L.J. and Wilder R.L., "Arthritis and Autoimmunity in Animals", in Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, McCarty et al.(eds.), Chapter 30 (Lee and Febiger, 1993)に記載されている当技術分野で公知の炎症性関節炎の様々な実験的動物モデルを使用することによって決定され得る。スクリーニングしたＣＴＰＳ１阻害剤の抗炎症活性を評価するために、炎症性関節炎及び自己免疫リウマチ疾患の実験的動物モデル及び自然発生動物モデルも使用され得る。ＣＴＰＳ１阻害剤が自己免疫疾患の１つ以上の症候を軽減する効果は、当業者に公知の標準的な技術を使用してモニタリング／評価され得る。例えば、哺乳動物から末梢血のサンプルを採取し、例えばFicoll-Hypaque (Pharmacia)勾配遠心分離を使用して末梢血の他の成分（例えば、血漿）からリンパ球を分離し、トリパンブルーを使用してリンパ球を計数することによって、哺乳動物の末梢血リンパ球数を決定し得る。例えば、Ficoll-Hypaque (Pharmacia)勾配遠心分離を使用して末梢血の他の成分（例えば、血漿）からリンパ球を分離し、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８などのＴ細胞抗原に対する抗体（これは、ＦＩＴＣ又はフィコエリトリンにコンジュゲーションされている）を用いてＴ細胞を標識し、ＦＡＣＳによりＴ細胞の数を測定することによって、哺乳動物の末梢血Ｔ細胞数を決定し得る。さらに、当業者に公知の標準的な方法（例えば、ＦＡＣＳ）を使用して、特定のＴ細胞サブセット（例えば、ＣＤ２＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋ＲＯ＋、ＣＤ８＋ＲＯ＋、ＣＤ４＋ＲＡ＋又はＣＤ８＋ＲＡ＋）細胞に対する作用を測定し得る。したがって、動物モデルにおけるリンパ球増殖を容易に評価し得る。in vivoスクリーニングに使用され得る動物モデルの他の例としては、脳脊髄炎（ＥＡＥ）動物又はｌｐｒマウスが挙げられる。
【００６７】
以下の図面及び実施例によって、本発明をさらに説明する。しかしながら、これらの実施例及び図面は、決して本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１Ａ】ＣＴＰＳ１は、ＴＣＲ−ＣＤ３活性化に応じたＴ細胞増殖に必要である。ＧＦＰ遺伝子レポーターと共に、ＣＴＰＳ１に対するｓｈＲＮＡ（Ｓｈ  ＣＴＰＳ１＃１又はＳｈ  ＣＴＰＳ１＃２）を含有するか、又はスクランブルｓｈＲＮＡ（Ｓｈスクランブル）を含有するベクターでＣＴＰＳ１発現をサイレンシングしたＴ細胞の増殖。トランスダクション細胞に対応するＧＦＰ＋細胞の代表的なドットプロット（左上のパネル）。刺激後の細胞分裂を示すviolet dye希釈の代表的なヒストグラム（左下のパネル）。反復刺激後の長期エクスパンション中のＧＦＰ＋トランスダクション細胞の割合を示す曲線（中央のパネル）。トランスダクション細胞におけるＣＴＰＳ１及びＣＴＰＳ２発現のイムノブロット（右のパネル）。アクチンは、ローディングコントロールとして機能する。２回の実験の代表的な１つ。
【図１Ｂ】空ベクター又は野生型ＣＴＰＳ１含有ベクターでトランスダクションしたコントロール（Ｃｔｒ．）及びＣＴＰＳ１欠損Ｔ細胞（患者Ｐ１．２）の増殖。violet dye希釈の代表的なヒストグラム（ｂ、左のパネル）及び刺激後の細胞分裂の指標（ｂ、右のパネル）。２回の実験の代表的な１つにおける３回反復の平均値とｓ．ｄ．。（ａ）と同じＧＦＰ＋トランスダクション細胞の割合を示す曲線（ｃ、左のパネル）。
【図１Ｃ】空ベクター又は野生型ＣＴＰＳ１含有ベクターでトランスダクションしたコントロール（Ｃｔｒ．）及びＣＴＰＳ１欠損Ｔ細胞（患者Ｐ１．２）の増殖。（ａ）と同じＧＦＰ＋トランスダクション細胞の割合を示す曲線（ｃ、左のパネル）。２回の独立した実験の１つからの代表的なデータ。（ａ）と同じイムノブロット（ｃ、右のパネル）。
【図１Ｄ】コントロール（Ｃｔｒ．）及びＣＴＰＳ−１欠損細胞（患者Ｐ１．２）の細胞分裂を示すviolet dye希釈の代表的なヒストグラム。刺激前に、示されているヌクレオチド又はヌクレオシドと共に細胞をインキュベーションした。３回の独立した実験の１つからのデータ。
【図１Ｅ】刺激前及び刺激中に、コントロールＴ細胞をデアザウリジンと共にインキュベーションした以外は（ｄ）と同じである。３回の独立した実験の代表的な１つからのデータ。
【図１Ｆ】抗ＣＤ３／ＣＤ２８コーティングビーズによる刺激後の健常コントロール（Ｃｔｒ．）及びＣＴＰＳ１欠損細胞（患者１．２）由来のＴ細胞芽球の細胞抽出物中のＣＴＰの濃度。刺激前及び刺激中に、コントロール細胞をデアザウリジンの有無の下でインキュベーションした。３回の独立した実験からのデータ。
【図１Ｇ】野生型ＣＴＰＳ１含有ベクターでトランスダクションしたか、又はトランスダクションしなかった健常コントロール（Ｃｔｒ．）及びＣＴＰＳ１欠損患者（Ｐａｔ．）由来のＥＢＶ  Ｂ細胞株の細胞抽出物中のＣＴＰの濃度。Ｐ１．１（四角）、Ｐ１．２（丸）及びＰ２．１（三角）。コントロールの場合、記号は、異なるドナー細胞に対応する。２回の独立した実験からのデータ。対応のないｔ検定。＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１Ｈ】空ベクター又は野生型ＣＴＰＳ１含有ベクターでトランスダクションしたＣＴＰＳ１欠損ＥＢＶ  Ｂ細胞株（Ｐ１．２及びＰ２．１）の増殖。培養液中のＧＦＰ＋トランスダクション細胞の割合を示す曲線。
【００６９】
実施例：ヒトにおけるＣＴＰシンターゼ１欠損は、リンパ球増殖におけるその中心的な役割を明らかにする
方法：
ドナー、患者及び患者の家族から、インフォームドコンセントを得た。本研究及びプロトコールは、１９７５年のヘルシンキ宣言並びに現地の法律及び倫理指針にしたがっている。末梢血細胞から抽出したゲノムＤＮＡを全エクソームシーケンシング（Illumina）及びＣＴＰＳ１シーケンシングに使用した。ＰＢＭＣをフィコール精製し、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）で３日間活性化し、次いで、５％ＡＢ型ヒト血清及びＩＬ−２（１００UI/ml）を補充したＲＰＭＩ培地中で培養した。様々なマイトジェンでＴ細胞芽球を再刺激し、イムノブロッティングによって、メモリーマーカー及び活性化マーカー、カルシウム流出、サイトカイン分泌、アポトーシス並びにＴＣＲ−ＣＤ３シグナル伝達カスケード分子について分析した。タンパク質の中央部（３４１〜３５５）に対して生成された抗体（#SAB111071, Sigma）を用いてイムノブロッティングによって、ＣＴＰＳ１タンパク質を検出した。増殖及び細胞周期及びアッセイのために、３日間にわたって細胞をＩＬ−２欠乏状態にし、CellTrace violet dye (Invitrogen)又は５−エチニル−２’−デオキシウリジン（ＥｄＵ）（Click-IT, Invitrogen）と共にインキュベーションしてから、抗ＣＤ３抗体（１μg/ml）のみ（clone OKT3, eBiosciences）又はＣＤ３／ＣＤ２８コーティングビーズ（Invitrogen）で再刺激した。CellTrace violet dye標識の希釈をモニタリングすることによって、９６時間後に増殖を評価した。４０時間にわたって、新たに合成されたＤＮＡへのＥｄＵの取り込みを測定することによって、細胞周期を決定した。Flowjo software (BD Biosciences)を用いて、分裂指数を計算した。ｓｈＲＮＡ発現（Openbiosystems）によるＣＴＰＳ１の遺伝子サイレンシングのために、ＰＨＡ刺激の３日目に細胞をトランスダクションした。レスキュー実験のために、ＣＴＰＳ１遺伝子を含有するレンチウイルスベクター（Invitrogen）でＣＴＰＳ１欠損細胞をトランスダクションし、トランスダクションの５日後に増殖を実施した。長期エクスパンションでは、ＣＤ３／ＣＤ２８コーティングビーズで細胞を４８時間ごとに繰り返し刺激し、培養液中のトランスダクションＧＦＰ＋細胞を２４時間ごとに決定した。液体クロマトグラフィー−質量分析（UPLC-xevoTQS, Waters）によって、ヌクレオチドの細胞内含量を測定した。PRISM software (GraphPad)を使用して両側スチューデントｔ検定によって、Ｐ値を計算した。
【００７０】
結果
本発明者らは最初に、イングランド北西部出身の無関係な２家族（家族１及び２）であって、その４人の子供が重度の再発性エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）感染症を患っており、公知の原発性免疫不全は排除された家族１０を研究した（表１）。その後、重度のＥＢＶ感染症を有する３４人の試験患者（３３個の家族）から、３個の無関係な家族（家族３〜５）出身の４人のさらなる患者を同定した。全ての患者が、ヘルペスウイルス（ＥＢＶ及び水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）を含む）によって主に引き起こされる早期発症型の重度の慢性ウイルス感染症を有しており、再発性被嚢性細菌感染症（複合型適応免疫不全（ＣＩＤ）に典型的な一連の感染症）１１も患っていた（表１）。全体としては、１人の患者が播種性ＶＺＶ感染症により４歳で死亡し、６人の患者が生涯で最初の造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受けたことから、臨床表現型は重症であった。注目すべきことに、患者はいずれも、造血外の徴候（extra-hematopoietic manifestations）を有していなかった（表１）。
【００７１】
免疫学的調査では、患者のＣＤ４：ＣＤ８  Ｔ細胞比は逆転しており、ほとんどの患者でＩｇＧが増加して免疫グロブリンレベルは正常であるか又は上昇しているが、Streptococcus pneumoniaeに対する抗体価は低くてＩｇＧ２レベルが低く、分類不能型リンパ球減少症が感染エピソード中に悪化した一方で、他の血球数は通常は正常であったことが示された。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のリンパ球減少、エフェクターメモリーＴ細胞数の増加、少数のメモリーＣＤ２７＋Ｂ細胞、不変Ｔ細胞集団（ＣＤ３＋Ｖα２４＋Ｖβ１１＋）ｉＮＫＴ及び（ＣＤ３＋ＣＤ１６１ｈｉｇｈＶα７．２＋）ＭＡＩＴ細胞の両方の完全な欠如、並びに末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のＰＨＡ誘導性及び抗原誘導性増殖の障害を示した患者Ｐ１．２において、さらなる分析を実施した。
【００７２】
これらの患者における免疫不全の原因となっている遺伝子欠損を同定するために、本発明者らは、３人の患者（Ｐ１．１、Ｐ１．２及びＰ２．１）において、全エクソームシーケンシング（ＷＥＳ）を実施した。３人の患者において見出された遺伝的変異の共通部分は、ｄｂＳＮＰデータベースの指定ｒｓＩＤ（ｒｓ１４５０９２２８７）を有する１番染色体の４１４７５８３２位において、ＣＴＰシンターゼ１をコードするＣＴＰＳ１遺伝子のユニークな共通のホモ接合型ＧＣ突然変異を示した。ＣＴＰＳ１は、ＣＴＰシンターゼドメインと、ＵＴＰ及びグルタミンからのＣＴＰ形成を促進するグルタミンアミド転移ドメインとを含有する６７kDaのタンパク質をコードする１９個のエクソンを含む１２。同定された突然変異は、イントロン１７〜１及びエクソン１８の連結部におけるスプライスドナー部位に影響を与えて（ＩＶＳ１８−１  Ｇ＞Ｃ）、エクソン１８を欠く異常な転写産物が発現される。患者由来のＥＢＶトランスフォーメーションＢ細胞及びＴ細胞芽球の溶解物中では、２つの異なる抗ＣＴＰＳ１抗体を使用することによって、ＣＴＰＳ１タンパク質を検出することができなかったので、このスプライス突然変異は有害であることが見出された。対照的に、ＣＴＰＳ２は、患者の細胞溶解物中で正常に発現していた。類似の臨床症状を有する同じ地域出身の４人のさらなる患者も、同じスプライス突然変異についてホモ接合性であることが見出された（表１）。罹患５家族では、全ての親がこの突然変異についてヘテロ接合性であり、試験した健常兄弟姉妹もＩＶＳ１８−１  Ｇ＞Ｃ突然変異についてヘテロ接合性であった。イングランド北西部出身の７５２人の健常者の配列決定により、ＩＶＳ１８−１  Ｇ＞Ｃ突然変異についてヘテロ接合性の者が２人同定されたが、これは、ホモ接合性の推定頻度が１：５６０，０００であることに相当する。これは、利用可能なエクソームデータベースから推定された頻度と比較して１０倍超の増加に相当する。Ｐ１．１、Ｐ１．２及びＰ２．１においてＷＥＳによって見出されたホモ接合性領域、並びに全ての患者における多型マイクロサテライトマーカーの分析により、それらは、ＩＶＳ１８−１  Ｇ＞Ｃ突然変異周囲の１．１Mbの同じホモ接合性領域を共有していたことが明らかになった。これらのデータは全て、創始者効果を示していた。これらの観察結果から、本発明者らは、これらの患者におけるＣＴＰＳ１突然変異に起因する免疫不全は、Ｔ細胞免疫不全に主に関連し得ると結論した。
【００７３】
本発明者らは次に、正常組織におけるＣＴＰＳ１発現を調べた。ＴＣＲ−ＣＤ３及びＣＤ２８同時刺激に応じた細胞活性化後に、ＣＴＰＳ１発現が強くアップレギュレーションされたＴ細胞を除いて、ＣＴＰＳ１  ｍＲＮＡ発現は、異なる組織間で同程度であった。興味深いことに、Ｔ細胞芽球由来の溶解物及びＰＢＭＣ由来のＴ細胞では、ＣＴＰＳ１タンパク質がほとんど検出不可能であった。対照的に、ＣＴＰＳ２発現は容易に検出された。抗ＣＤ３抗体又はホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（actate）（ＰＭＡ）及びイオノマイシン刺激によるＴ細胞の活性化は、ＣＴＰＳ１タンパク質発現を誘導したが、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−１５による活性化は、ごく弱い効果をもたらした。同じ実験条件下において、より少ない程度ではあるがＣＴＰＳ２発現も誘導された。ＴＣＲ−ＣＤ３で刺激したＴ細胞芽球では、ＣＴＰＳ１遺伝子の転写活性化の結果として、ＣＴＰＳ１タンパク質の発現が１２時間から増強し、最大９６時間にわたって持続した。予想通り、ＣＴＰＳ１欠損患者（Ｐ１．２）由来のＴ細胞芽球では、ＣＴＰＳ１  ｍＲＮＡが検出されたのとは対照的に、ＣＴＰＳ１発現は検出されなかったが、これは、タンパク質の不安定性を示唆している。これらのデータは、ＴＣＲを介したＴ細胞活性化が、迅速かつ持続的なＣＴＰＳ１タンパク質発現をもたらすことを示している。注目すべきことに、抗ＢＣＲ及びＣｐＧ、ＩＬ−４及びＣＤ４０Ｌ又はＰＭＡ及びイオノマイシンによって活性化したＢ細胞では、ＣＴＰＳ１もアップレギュレーションされることが見出された。
【００７４】
Ｔ細胞におけるＣＴＰＳ１欠損の影響をさらに特性決定するために、本発明者らは、近位のＴ細胞活性化シグナル及び後期応答を調査した。抗ＣＤ３抗体で患者Ｐ１．２由来のＴ細胞を刺激した後、ＥＲＫ１／２リン酸化の減少が見出されたことを除いて、ＣＴＰＳ１欠損細胞は、正常なグローバルタンパク質チロシンリン酸化プロファイル並びにＰＫＣ−θ、ＰＬＣγ−１、ＩκＢα及びＮＦＡＴ２ｃの正常なリン酸化を示した。さらに、Ｃａ＋＋流入及び後期応答、例えば脱顆粒及びサイトカイン産生は正常であることが見出されたが、ＣＤ２５及びＣＤ６９のアップレギュレーションが有意に減少した。本発明者らはまた、ＣＴＰＳ１欠損芽球が、コントロール細胞と比較して、基本的な活性化誘導細胞死のわずかだが有意な増加を示したことに注目した。総合すると、これらのデータは、ＣＴＰＳ１欠損が、ＴＣＲ−ＣＤ３の下流のシグナル伝達に限定的な影響を与えたことを示唆している。
【００７５】
ＣＴＰのプールは、ＤＮＡ合成の制限要因である可能性があるため８，１３、本発明者らは、ＣＴＰＳ１欠損Ｔ細胞の増殖を慎重に分析した。Ｈ３−チミジンの取り込み及びＣＦＳＥ又はviolet cell tracer dyeの希釈（細胞増殖の弱い指標となる）によって測定したところ、抗原、抗ＣＤ３抗体、又は抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体による同時刺激による活性化に応じて、３人の患者（Ｐ１．１、Ｐ１．２及びＰ２．２）由来のＣＴＰＳ１欠損細胞は、増殖反応を持続することができなかった。活性化ＣＴＰＳ１欠損Ｔ細胞では、３Ｈ−ウリジン及び３Ｈ−シチジンの取り込みが損なわれていることも見出されたが、これは、ＲＮＡ合成が影響を受けたことを示唆している。同時に試験したところ、３Ｈ−ロイシンの取り込みによって決定したタンパク質合成も減少していた。細胞の大部分がＧ１期で停止したことから、ＣＴＰＳ１欠損細胞の増殖障害は、細胞周期進行の障害にも関連していた。また、Ｂリンパ球におけるＣＴＰＳ１発現はそれらの活性化後に増加するため、抗ＢＣＲ及びＣｐＧ活性化によるＣＴＰＳ１欠損Ｂ細胞の増殖を調べたところ、それらの増殖は阻止される一方で、ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞の増殖はあまり影響を受けなかったようであることが明らかになった。
【００７６】
ＧＦＰレポーター遺伝子と共に２つの異なるｓｈＲＮＡのレンチウイルストランスダクションによって、コントロールＴ細胞においてＣＴＰＳ１発現をダウンレギュレーションすると、ＧＦＰ陽性細胞のＣＤ３媒介性増殖が特異的に減少した。非ターゲティングＧＦＰ陰性細胞、及びスクランブルｓｈＲＮＡでターゲティングした細胞では、増殖の変化が検出されなかった。ＣＴＰＳ１発現の阻害に起因する増殖の減少は、選択的な細胞成長不利益をもたらし、ＧＦＰターゲティング細胞の数が経時的に減少した（中央のパネル）。ＣＴＰＳ１発現をダウンレギュレーションしたジャーカットＴ細胞株においても、増殖速度の同様の減少が観察された。
【００７７】
総合すると、これらの結果は、ＣＴＰＳ１欠損が、ＴＣＲ−ＣＤ３活性化に応じたＴ細胞増殖障害を引き起こすことを示している。ＣＴＰＳ１欠損とＴ細胞増殖障害との間の因果関係を正式に証明するために、本発明者らは、野生型ＣＴＰＳ１を用いて、又はサルベージ経路を介してＣＴＰレベルに作用するＣＴＰ若しくはそのシチジン前駆体を直接追加することによって、再構成実験を行った。ＣＴＰＳ１欠損Ｔ細胞において異所性ＣＴＰＳ１を発現させると、ＣＤ３刺激に応じた増殖が完全に回復し、ＣＴＰＳ１を表現するＧＦＰ陽性細胞の蓄積によって示されるように、細胞は選択的にエクスパンションすることができた。空ベクターでトランスダクションしたＣＴＰＳ１欠損細胞、又はＣＴＰＳ１含有ベクターでトランスダクションしたコントロール細胞では、このような効果は検出されなかった。
【００７８】
ＣＴＰ又はシチジンの追加によって、ＣＴＰＳ１欠損細胞の増殖及びＣＤ２５発現も正常レベルに回復した。対照的に、ＵＴＰ、ＧＴＰ及びＡＴＰ又はウラシル、グアニン及びアデノシンの混合物を追加しても、ＣＴＰＳ１欠損細胞の増殖は増加しなかった。ＣＴＰＳ１欠損細胞で観察された結果と同様に、デアザウリジン（ＵＴＰ類似体であり、公知のＣＴＰシンターゼ活性阻害剤である１４）は、近位のＴＣＲ−ＣＤ３媒介性応答に影響を与えずに、ＣＤ３活性化に応じたコントロール細胞のＴ細胞増殖を完全に阻止した。予想通り、デアザウリジンによるＴ細胞増殖の阻害は、ＣＴＰの追加によって完全に元に戻り、ＵＴＰによって部分的に元に戻ったが、ＡＴＰ及びＧＴＰでは元に戻らなかった。活性化ＣＴＰＳ１欠損Ｔ細胞芽球及びＣＴＰＳ１欠損Ｂ／ＥＢＶ細胞株におけるヌクレオチドプールの分析により、デアザウリジンで処理した活性化正常細胞においても観察されたＣＴＰレベルの減少が明らかになった。また、ＣＴＰＳ１発現の障害又はデアザウリジンの追加は、活性化Ｔ細胞におけるＡＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰのプールの減少をもたらしたが、これは、ヌクレオチドプールにおける相互接続１５を示唆している。対照的に、休止細胞ではサルベージ経路が優勢であるため１６、休止ＣＴＰＳ１欠損Ｔ細胞では、ＣＴＰレベルだけではなくＡＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰも正常であるか又は増加していることが見出された。ＣＴＰＳ１欠損Ｂ／ＥＢＶ細胞株において野生型ＣＴＰＳ１を発現させると、コントロール細胞と同程度のＣＴＰレベルが回復し、培養液中での選択的な細胞成長利益が細胞にもたらされた。
【００７９】
本研究は、活性化後のヒトＴ細胞増殖の促進におけるＣＴＰＳ１の重要な役割を明らかにしている。しかしながら、Ｂ細胞の増殖もＣＴＰＳ１依存性であることが見出された。これは、ＣＴＰＳ１欠損患者において見られる被嚢性細菌感染症に対する感受性に直接関与し、S. pneumoniae抗体（これは、Ｔ非依存性のＢ細胞応答である）の力価が低いことの主要因であり得る。Ｂ細胞におけるＣＴＰＳ１の役割は、Ｔ細胞において見出された役割とは相違する可能性があり、及び／又はその役割よりも重要性が低い可能性がある。注目すべきことに、ＣＴＰＳ１欠損Ｂ細胞は、ＥＢＶによってトランスフォーメーションされてもインタクトな増殖能を保持しており、患者はＩｇレベルが正常であり、及び／又はＩｇＧが上昇していた。ＮＫ細胞、ｉＮＫＴ細胞及びＭＡＩＴ細胞は、抗ＥＢＶ応答を含む広範囲の免疫応答において役割を果たすことが提案されているので１７−２０、ＮＫ細胞のエクスパンションの減少、並びにｉＮＫＴ及びＭＡＩＴ細胞数の少なさもＣＴＰＳ１免疫不全に寄与している可能性がある。ＣＴＰＳ１欠損が他の重要な臨床的帰結を引き起こさないという知見は、他の細胞系統及び組織におけるＣＴＰＳ２活性の冗長性を支持する。興味深いことに、ＰＨＡで刺激したＴ細胞では、de novo経路（ＣＴＰＳ活性の増加を含む）を介して、ＣＴＰを含むピリミジンプールは強くエクスパンションされることが以前に示されている８，９。したがって、本明細書で報告した活性化Ｔ細胞におけるＣＴＰＳ１発現の誘導は、ＣＴＰプール増加の主な決定要因と思われる。これらのデータと一致して、ＣＴＰをＣＴＰＳ１欠損Ｔ細胞に追加することによって、増殖が正常レベルに回復した。ＴＣＲシグナル伝達がＴ細胞における迅速なＣＴＰＳ１発現を誘導する機構は未だに明らかではない。Ｔ細胞分化は、ＣＴＰＳ１欠損によって著しく損なわれないようであることに注目することは興味深いことであり、これは、胸腺細胞におけるＣＴＰプールが、ヌクレオシドサルベージ経路及び／又はＣＴＰＳ２活性から生じ得ることを示唆している８，２１−２３。しかし、特に、ウイルス感染中のＣＤ８＋Ｔ細胞の大規模な増殖及びエクスパンションによって例証されているように２４，２５、ＣＴＰＳ１活性は、抗原刺激によって誘導される激しい細胞分裂に重要である。
【００８０】
最近、de novoピリミジン合成経路は、ピリミジン合成に必要な最初の酵素段階を活性化するｍＴＯＲＣ１及びＳ６タンパク質（Ｓ６Ｋ）キナーゼによる転写後調節に依存することが示された２６−２８。したがって、異なる調節機構がde novoピリミジン合成をコントロールする。本研究に基づくと、リンパ球におけるＣＴＰ合成のＣＴＰＳ１媒介性調整は、適応免疫応答を可能にする上で重要な要素であると思われる。ＣＴＰＳ１欠損表現型のリンパ球特異性を考慮すると、ＣＴＰＳ１特異的阻害剤は、さらなる毒性を伴わずに自己特異的又は同種特異的なＴ細胞応答及びＢ細胞応答を阻害することができる高特異的な免疫抑制薬である可能性がある。結論として、本発明者らの結果は、抗原によって活性化された場合のＴリンパ球及びＢリンパ球の重要な増殖段階としてのde novoピリミジン合成経路の役割に関する最初のin vivo証拠を提供する。
【００８１】
【表１】
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【００８２】
参考文献：
本出願を通して、様々な参考文献が、本発明が関係する技術水準を説明する。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
【００８３】
【表２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【国際調査報告】
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