(57)【要約】  不活性化プロテインＣに結合することなくまたは不活性化プロテインＣを阻害することなく、活性化プロテインＣに選択的に結合するおよび活性化プロテインＣを阻害するヒト化抗体が提供される。これらの抗体を使用する治療方法が本明細書に記載される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１、２および３により表された重鎖ＣＤＲを含む重鎖と、
（ｂ）配列番号４、５および６により表された軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖と
を含む抗体。
【請求項２】
前記重鎖のフレームワーク領域が配列番号７、８、９および１０により表されるか、または５個以下の保存的アミノ酸置換を有している、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記軽鎖のフレームワーク領域が配列番号１１、１２、１３および１４により表されるか、または５個以下の保存的アミノ酸置換を有している、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
配列番号８の残基１４がＡｌａで置換されている、請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
配列番号９の残基１１、１３および３１が、１つ以上のセリン（残基１１）、バリン（残基１３）およびイソロイシン（残基３１）で置換されている、請求項２に記載の抗体。
【請求項６】
前記重鎖が配列番号１６〜２４を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
配列番号１１の残基４がロイシンで置換されている、請求項３に記載の抗体。
【請求項８】
配列番号１３の残基１２がアルギニンで置換されている、請求項３に記載の抗体。
【請求項９】
前記軽鎖が配列番号２６〜３０を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体が一本鎖抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体が抗体断片である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体断片がＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体、Ｆｖ、またはｓｃＦｖとしてさらに定義される、請求項９に記載の抗体。
【請求項１３】
（ａ）配列番号１、２および３により表された重鎖ＣＤＲを含む重鎖と、
（ｂ）配列番号４、５および６により表された軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖と
を含む抗体をコードする核酸を含む細胞または細胞系。
【請求項１４】
前記重鎖のフレームワーク領域が配列番号７、８、９および１０により表されるか、または５個以下の保存的アミノ酸置換を有している、請求項１３に記載の細胞または細胞系。
【請求項１５】
前記軽鎖のフレームワーク領域が配列番号１１、１２、１３および１４により表されるか、または５個以下の保存的アミノ酸置換を有している、請求項１３または１４に記載の細胞または細胞系。
【請求項１６】
配列番号８の残基１４がＡｌａで置換されている、請求項１４に記載の細胞または細胞系。
【請求項１７】
配列番号９の残基１１、１３および３１が１つ以上のセリン（残基１１）、バリン（残基１３）およびイソロイシン（残基３１）で置換されている、請求項１４に記載の細胞または細胞系。
【請求項１８】
前記重鎖が配列番号１６〜２４を含む、請求項１３に記載の細胞または細胞系。
【請求項１９】
配列番号１１の残基４がロイシンで置換されている、請求項１５に記載の細胞または細胞系。
【請求項２０】
配列番号１３の残基１２がアルギニンで置換されている、請求項１５に記載の細胞または細胞系。
【請求項２１】
前記軽鎖が配列番号２６〜３０を含む、請求項１３に記載の細胞または細胞系。
【請求項２２】
前記抗体が一本鎖抗体である、請求項１３に記載の細胞または細胞系。
【請求項２３】
前記抗体が抗体断片である、請求項１３に記載の細胞または細胞系。
【請求項２４】
前記抗体断片がＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体、Ｆｖ、またはｓｃＦｖとしてさらに定義される、請求項２３に記載の細胞または細胞系。
【請求項２５】
医薬的に許容可能な担体中に分散した、請求項１〜１２に記載の前記抗体を含む医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１〜１２に記載の抗体を有効量、被験者に投与するステップを含む、前記被験者における活性化プロテインＣ抗凝固活性を阻害する方法。
【請求項２７】
請求項１〜１２に記載の抗体を有効量、被験者に投与するステップを含む、前記被験者における活性化プロテインＣアミド分解活性を阻害する方法。
【請求項２８】
請求項１〜１２に記載の抗体を有効量、被験者に投与するステップを含む、血液凝固を必要とする前記被験者を治療する方法。
【請求項２９】
請求項１〜１２に記載の抗体を有効量、投与するステップを含む、敗血症を罹患している被験者を治療する方法。
【請求項３０】
活性化プロテインＣの投与をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１〜１２に記載の抗体を有効量、投与するステップを含む、血友病を罹患している被験者を治療する方法。
【請求項３２】
請求項１〜１２に記載の抗体を有効量、投与するステップを含む、被験者における止血を調節する方法。
【請求項３３】
前記被験者が外傷患者である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１〜１２に記載の抗体を有効量、投与するステップを含む、被験者における血栓症を調節する方法。
【請求項３５】
請求項１〜１２に記載の抗体を含むキット。
【請求項３６】
前記抗体が標識されている、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記標識がフルオロフォア、放射標識、化学発光標識、色素、量子ドット、ビーズまたは発色団である、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
緩衝液または希釈剤をさらに含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項３９】
前記抗体の使用に関する説明書をさらに含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項４０】
前記抗体が水性懸濁液中に存在する、請求項３６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
連邦規則集第３７編１．８２１条（ｃ）項に従い、配列表は、２０１３年１１月２５日に作成されたサイズ約２５キロバイトを有する「ＢＡＹＲＰ０００２ＵＳＰ１＿ＳＴ２５」という名前のＡＳＣＩＩ対応テキストファイルとして、本明細書と共に提出される。前述のファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
優先権の主張
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０１２年１１月２９日に出願された米国仮出願第６１／７３１，３６８号の優先権の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００３】
血液凝固は、最終的にフィブリン塊を生じさせる様々な血液成分、または因子の複雑な相互作用から成る過程である。一般的に、凝固「カスケード」に関与する血液成分は、酵素前駆体またはチモーゲン−活性化因子の作用により活性型に変換される酵素的に不活性なタンパク質である。血液凝固の調節は主として、活性化プロテインＣ（ａＰＣ）により達成される凝固促進因子ＶａおよびＶＩＩＩａのタンパク質分解性不活性化により、酵素的に実現される（Ｅｓｍｏｎ、１９８９）。
【０００４】
プロテインＣは、強力な天然の抗凝固剤、ａＰＣの前駆体である。プロテインＣは、トロンボモジュリン（ＴＭ）と複合体形成されたトロンビンにより活性化される。活性化は、内皮細胞プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）により増大される。ＴＭおよびＥＰＣＲは、腫瘍壊死因子などのＥｓｍｏｎ（１９９９）により概説された炎症性メディエーターによりダウンレギュレートされ得る。ＴＭおよびＥＰＣＲはまた、敗血性ショックの幾つかの形態、特に髄膜炎菌血症において減少することも見出されている。ＥＰＣＲおよびＴＭは内皮で発現されるため、これらがいかに十分に機能しているかを、血管を取り除くことなく直接判定することは不可能である。
【０００５】
ａＰＣは、凝固促進因子をタンパク質分解的に切断およびダウンレギュレートすることにより抗凝固剤として機能する。ａＰＣはまた、抗アポトーシス剤、抗炎症分子および細胞保護剤としても重要な機能を果たす。血友病における第ＶＩＩＩ因子の欠乏などの主要な因子の喪失により、または創傷過程が止血の一時的喪失をもたらす外傷患者において恒常性が調節不全となる出血性障害は、ａＰＣの除去により治療することができる。しかし、このような治療は、抗凝固活性の除去に加えて、ａＰＣの有益な機能を除去する不要な有害結果をもたらし得る。したがって、ａＰＣの抗凝固活性を選択的に標的にすると同時に、該分子の他の機能をそのままに残す治療薬を有することが望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｅｓｍｏｎ、１９８９
【非特許文献２】Ｅｓｍｏｎ、１９９９
【発明の概要】
【０００７】
故に、（ａ）配列番号１、２および３により表された重鎖ＣＤＲを含む重鎖と、（ｂ）配列番号４、５および６により表された軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖とを含む抗体が提供される。抗体はヒト化抗体であってもよく、以下の配列組成を有し得る：
【表１】
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【０００８】
重鎖フレームワーク領域は、配列番号７、８、９および１０により表され得、もしくは５個以下の保存的アミノ酸置換を有し得、ならびに／または軽鎖フレームワーク領域は、配列番号１１、１２、１３および１４により表され得、もしくは５個以下の保存的アミノ酸置換を有し得る。例えば配列番号８の残基１４はＡｌａで置換されてもよく、ならびに／または配列番号９の残基１１、１３および３１は、それぞれセリン、バリンおよびイソロイシンで置換されてもよく、ならびに／または重鎖は配列番号１６〜２４を含んでもよい。同様に例えば、配列番号１１の残基４はロイシンで置換されてもよく、および／または配列番号１３の残基１２はアルギニンで置換されてもよく、および／または軽鎖は配列番号２６〜３０を含む。抗体は、一本鎖抗体またはＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２などの抗体断片、単一ドメイン抗体、Ｆｖ、またはｓｃＦｖであってもよい。また提供されるのは、医薬的に許容可能な担体に分散された前述の実施形態のいずれかを含む医薬組成物である。
【０００９】
本開示はまた、（ａ）配列番号１、２および３により表された重鎖ＣＤＲを含む重鎖と、（ｂ）配列番号４、５および６により表された軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖とを含む抗体をコードする核酸を含む発現構築物、細胞または細胞系も提供する。抗体はヒト化抗体であってもよい。重鎖フレームワーク領域は、配列番号７、８、９および１０により表され得、もしくは５個以下の保存的アミノ酸置換を有し得、ならびに／または軽鎖フレームワーク領域は、配列番号１１、１２、１３および１４により表され得、もしくは５個以下の保存的アミノ酸置換を有し得る。例えば配列番号８の残基１４はＡｌａで置換されてもよく、ならびに／または配列番号９の残基１１、１３および３１は、それぞれセリン、バリンおよびイソロイシンで置換されてもよく、ならびに／または重鎖は配列番号１６〜２４を含んでもよい。同様に例えば、配列番号１１の残基４はロイシンで置換されてもよく、および／または配列番号１３の残基１２はアルギニンで置換されてもよく、および／または軽鎖は配列番号２６〜３０を含む。抗体は、一本鎖抗体またはＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２などの抗体断片、単一ドメイン抗体、Ｆｖ、またはｓｃＦｖであってもよい。
【００１０】
また提供されるのは、上記記載による抗体を有効量、投与するステップを含む、被験者における活性化プロテインＣ抗凝固活性を阻害する方法である。
【００１１】
また提供されるのは、上記記載による抗体を有効量、投与するステップを含む、被験者における活性化プロテインＣアミド分解活性を阻害する方法である。
【００１２】
また提供されるのは、上記記載による抗体を有効量、投与するステップを含む、血液凝固を必要とする被験者を治療する方法である。
【００１３】
また提供されるのは、上記記載による抗体を有効量、投与するステップを含む、敗血症を罹患している被験者を治療する方法である。方法は、活性化プロテインＣの投与をさらに含んでもよい。
【００１４】
また提供されるのは、上記記載による抗体を有効量、投与するステップを含む、血友病を罹患している被験者を治療する方法である。
【００１５】
また提供されるのは、上記記載による抗体を有効量、投与するステップを含む、被験者における止血を調節する方法である。被験者は外傷患者であってもよい。
【００１６】
また提供されるのは、上記記載による抗体を有効量、投与するステップを含む、被験者における血栓症を調節する方法である。
【００１７】
さらに別の実施形態は、上記記載による抗体を含むキットを含む。抗体は、フルオロフォア、放射標識、化学発光標識、色素、量子ドット、ビーズまたは発色団などで標識することができる。キットは、緩衝液もしくは希釈剤、および／または前記抗体の使用に関する説明書をさらに含んでもよい。抗体は、水性懸濁液中に存在してもよく、または凍結乾燥されてもよい。
【００１８】
本明細書に開示されたいずれの実施形態も、任意の化合物、方法、または組成物に関して実施することができ、逆もまた同様であることが企図される。
【００１９】
他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な記載から明らかとなろう。しかし、趣旨および範囲内の様々な変更および修正がこの詳細な記載から当業者に明らかになることから、詳細な記載および特定の例は、特定の実施形態を示しているとき、実例としてのみ示されていることが理解されるべきである。
【００２０】
以下の図面は本明細書の部分を形成し、本開示の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本開示は、本明細書に示された特定の実施形態の詳細な記載と組み合わせて、１つ以上のこれらの図面を参照してより良く理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】１５７３ヒト化抗体のＳＥＣ分析を示す図である。
【図２】アミン結合方法を用いたＣＭ５チップへの捕捉抗体の固定化を示す図である。９２００  ＲＵの抗マウスＦＣ  ＩｇＧシグナル（上図）および６４００  ＲＵの抗ヒトＦＣ  ＩｇＧ（下図）がそれぞれ生成された。ランニング緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰランニング緩衝液：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０であった。
【図３】１５７３抗体へのヒトａＰＣの結合のＳＰＲセンサーグラムを示す図である。ヒトａＰＣは０、１．２５、２．５、５、１０、２０ｎｍの濃度で、それぞれ３０μｌ／分、結合段階１８０秒、および解離段階５００秒で１５７３抗体に注入された。
【図４】１５７３抗体へのｃｙｎｏ  ａＰＣの結合のＳＰＲセンサーグラムを示す図である。ｃｙｎｏ  ａＰＣは０、５、１０、２０、４０、８０ｎｍの濃度で、それぞれ３０μｌ／分、結合段階１８０秒、および解離段階４２０秒で１５７３抗体に注入された。
【図５】ヒトＰＣおよびａＰＣの１５７３ヒト化抗体結合ＥＬＩＳＡを示す図である。
【図６】サルＰＣおよびａＰＣの１５７３ヒト化抗体結合ＥＬＩＳＡを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本開示は、活性化プロテインＣに選択的に結合するが、不活性化プロテインＣには結合せず、活性化プロテインＣの抗凝固活性を特異的に阻害するモノクローナル抗体の発見に関する。
【００２３】
適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語は複数形も含み、逆もまた同様である。下記に記載された任意の定義が、参照により本明細書に組み込まれている任意の文書を含む任意の他の文書においてその語の用法と矛盾する場合、反対の意味が（例えば用語がもともと使用された文書において）明らかに意図されない限り、下記に記載された定義は、本明細書およびその関連する特許請求の範囲を解釈するために常に調節するものとする。「または」の使用は、特に指定のない限り「および／または」を意味する。本明細書において「ａ」の使用は、特に指定のない限り、または「１つ以上」の使用が明らかに不適切でない限り、「１つ以上」を意味する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、互換可能であり制限的でない。例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「含むが、限定されない」を意味するものとする。
【００２４】
「プロテインＣ」または「ＰＣ」という用語は本明細書で使用されるとき、細胞により天然に発現され、血漿中に存在し、活性型のプロテインＣと異なる、チモーゲン型でのプロテインＣの任意のバリアント、アイソフォーム、および／または種相同体を指す。
【００２５】
「活性化プロテインＣ」または「ａＰＣ」という用語は本明細書で使用されるとき、トロンビン切断部位の結果としてプロテインＣに存在する１２アミノ酸活性化ペプチドが除去され欠乏することを特徴とする、活性型のプロテインＣを指す。
【００２６】
本明細書で使用されるとき、「抗体」は、抗体全体および任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）またはそれらの一本鎖を指す。該用語は、自然発生した、もしくは通常の免疫グロブリン遺伝子断片組換え過程により形成された完全長免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）、または特異的結合活性を保持する免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（抗体断片などの）を含む。構造にかかわらず、抗体断片は、完全長抗体により認識される同じ抗原と結合する。例えば、抗ａＰＣモノクローナル抗体断片は、ａＰＣのエピトープに結合する。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片により行われ得る。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから成る一価断片、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一腕のＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインから成るｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６頁）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；（ｖｉｉ）ミニボディ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｉｄｉｅｓ）、トリアボディ、テトラボディ、およびカッパボディ（例えば、Ｉｌｌら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １９９７；１０：９４９〜５７頁参照）；（ｖｉｉｉ）ラクダＩｇＧ；ならびに（ｉｘ）ＩｇＮＡＲが含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によりコードされているが、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６頁；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３頁参照）として作製できるようにする合成リンカーにより、組換え方法を用いて結合することができる。このような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されると意図される。これらの抗体断片は当業者に公知の従来の手法を用いて得られ、断片は、インタクトな抗体と同じやり方で有用性について分析される。
【００２７】
さらに、抗原結合断片が抗体模倣体に包含され得ることが企図される。「抗体模倣体」または「模倣体」という用語は本明細書で使用されるとき、抗体と類似した結合を示すがより小さい代替抗体または非抗体タンパク質であるタンパク質が意味される。このような抗体模倣体は、スカフォールドに含まれてもよい。「スカフォールド」という用語は、目的に合わせた機能および特徴を有する新たな生成物を改変するためのポリペプチドプラットフォームを指す。
【００２８】
本明細書で使用されるとき、「抗ａＰＣ抗体」という用語は、ａＰＣのエピトープに特異的に結合する抗体を指す。ａＰＣのエピトープにインビボで結合される場合、本明細書に開示された抗ａＰＣ抗体は、血液凝固カスケードの１つ以上の側面を増大させる。
【００２９】
本明細書で使用されるとき、「結合を阻害する」および「結合をブロックする」（例えば、ａＰＣに対するａＰＣ基質の結合の阻害／ブロックを指す）という用語は互換可能に使用され、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の阻害またはブロックなどの、基質によるタンパク質の部分的および完全な阻害またはブロックの両方を包含する。本明細書で使用されるとき「約」は、示された数値の＋／−１０％を意味する。
【００３０】
ａＰＣに対するａＰＣ基質の結合の阻害および／またはブロックに関して、阻害およびブロックという用語はまた、抗ａＰＣ抗体と接触していないａＰＣと比較した、抗ａＰＣ抗体と接触している場合の生理的基質に対するａＰＣの結合親和性のいずれの測定可能な低下（例えば、ａＰＣと第Ｖａ因子または第ＶＩＩＩａ因子を含むその基質との相互作用の、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％のブロック）も含む。
【００３１】
「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は本明細書で使用されるとき、単一分子組成物の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体を指す。ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発、またはインビボでの体細胞変異により導入された変異）を含むことができる。
【００３２】
「単離抗体」は本明細書で使用されるとき、異なる抗原特異性を有する抗体を含む他の生体分子を実質的に含まない抗体を指すと意図される（例えば、ａＰＣに結合する単離抗体は、ａＰＣ以外の抗原を結合する抗体を実質的に含まない）。幾つかの実施形態において、単離抗体は、乾燥重量で少なくとも約７５％、約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９９％、約９９．９％または約１００％純度である。幾つかの実施形態において、純度は、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析などの方法により測定することができる。しかし、ヒトａＰＣのエピトープ、アイソフォームまたはバリアントに結合する単離抗体は、例えば他の種由来の他の関連抗原に対する交差反応性を有することができる（例えば、ａＰＣ種相同体）。さらに、単離抗体は、他の細胞性物質および／または化学物質を実質的に含み得ない。本明細書で使用されるとき、「特異的結合」は、所定の抗原に結合する抗体を指す。典型的には、「特異的結合」を示す抗体は、少なくとも約１０５Ｍ−１の親和性で抗原に結合し、無関係な抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に対する結合親和性より高い、例えば少なくとも２倍大きい親和性でその抗原に結合する。「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という語句は、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と本明細書において互換可能に使用される。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、「最小の結合」という用語は、特定抗原に結合しないおよび／または特定抗原に対して低い親和性を示す抗体を指す。典型的には、抗原に対して最小の結合を有する抗体は、約１０２Ｍ−１より低い親和性でその抗原に結合し、無関係な抗原に結合するより高い親和性で所定の抗原に結合しない。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、ＩｇＧ抗体などの抗体に対する「高い親和性」という用語は、少なくとも約１０７Ｍ−１、少なくとも１つの実施形態において少なくとも約１０８Ｍ−１、幾つかの実施形態において少なくとも約１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１以上、例えば、最大１０１３Ｍ−１以上の結合親和性を指す。しかし、「高い親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに変わり得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高い親和性」結合は、少なくとも約１０７Ｍ−１の結合親和性を指す。本明細書で使用されるとき「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。
【００３５】
「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、結合された抗原の３次元構造に相補的なＮ末端抗原結合表面を形成する、抗体分子の重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域内の３つの超可変領域の１つを指す。重鎖または軽鎖のＮ末端から進んでこれらの相補性決定領域は、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」として示される［Ｗｕ  ＴＴ、Ｋａｂａｔ  ＥＡ、Ｂｉｌｏｆｓｋｙ  Ｈ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９７５  Ｄｅｃ；７２（１２）：５１０７頁およびＷｕ  ＴＴ、Ｋａｂａｔ  ＥＡ、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９７０  Ａｕｇ  １；１３２（２）：２１１頁］。ＣＤＲは抗原−抗体結合に関与し、ＣＤＲ３は抗原−抗体結合に特異的な固有の領域を含む。したがって、抗原−結合部位は、重鎖および軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲ領域を含む６つのＣＤＲを含み得る。
【００３６】
用語「エピトープ」は、抗体が特異的に結合または相互作用する抗原のエリアまたは領域を指し、幾つかの実施形態において、抗原がどこで抗体と物理的に接触しているかを示す。反対に、「パラトープ」という用語は、抗原が特異的に結合する抗体のエリアまたは領域を指す。競合結合を特徴とするエピトープは、対応する抗体の結合が互いに排他的である場合、すなわち、１つの抗体の結合が別の抗体の同時結合を排除する場合、重複していると言われる。エピトープは、抗原が両方の対応する抗体の結合に同時に対応できる場合、別個（固有）であると言われる。
【００３７】
「競合抗体」という用語は、本明細書で使用されるとき、本明細書に記載されたａＰＣに対する抗体と大体、実質的にもしくは本質的に同じ、または全く同じエピトープに結合する抗体を指す。「競合抗体」には、重複エピトープ特異性を有する抗体が含まれる。故に競合抗体は、本明細書に記載された抗体とａＰＣへの結合を効果的に競合することができる。幾つかの実施形態において、競合抗体は、本明細書に記載された抗体と同じエピトープに結合することができる。見方を変えれば、競合抗体は、本明細書に記載された抗体と同じエピトープ特異性を有する。
【００３８】
本明細書で使用されるとき、「保存的置換」は、類似の生化学的特性を有するアミノ酸の、ポリペプチドの生物学的または生化学的機能の喪失をもたらさない１つ以上のアミノ酸での置換を伴うポリペプチドの修飾を指す。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。本開示の抗体は、１つ以上の保存的アミノ酸置換を有することができるが、それでも抗原結合活性を保持することができる。
【００３９】
核酸およびポリペプチドに関して、「実質的な相同性」という用語は、２つの核酸もしくは２つのポリペプチド、またはそれらの示された配列が、最適に整列され比較された場合、適切なヌクレオチド挿入もしくは欠失またはアミノ酸挿入もしくは欠失により、ヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約８０％、通常は少なくとも約８５％、幾つかの実施形態において約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％、少なくとも１つの実施形態においてヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、または９９．５％において同一であることを示す。あるいは、核酸に関して実質的な相同性は、セグメントが、選択的なハイブリダイゼーション条件下で鎖の相補鎖にハイブリダイズする場合に存在する。また含まれるのは、本明細書に列挙された特定の核酸配列およびアミノ酸配列に対して実質的な相同性を有する核酸配列およびポリペプチド配列である。
【００４０】
２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列により共有された同一の位置の数の関数（すなわち、％相同性＝同一の位置の＃／位置の合計＃×１００）である。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、これに限定しないがＶｅｃｔｏｒＮＴＩ（商標）のＡｌｉｇｎＸ（商標）モジュール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、カールスバッド、ＣＡ）などの数学的アルゴリズムを用いて実現することができる。ＡｌｉｇｎＸ（商標）に関して、マルチプルアライメントのデフォルトパラメータは、ギャップオープニングペナルティ：１０、ギャップ伸長ペナルティ：０．０５、ギャップ分離ペナルティ範囲：８、アライメントディレイの同一性％：４０である。（さらなる詳細は、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ＬＩＮＮＥＡ−Ｏｎｌｉｎｅ−Ｇｕｉｄｅｓ／ＬＩＮＮＥＡ−Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ／ｖｅｃｔｏｒ−ＮＴＩ−Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ／配列−ａｎａｌｙｓｉｓ−ａｎｄ−ｄａｔａ−ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ−ｓｏｆｔｗａｒｅ−ｆｏｒ−ＰＣｓ／ＡｌｉｇｎＸ−Ｍｏｄｕｌｅ−ｆｏｒ−Ｖｅｃｔｏｒ−ＮＴＩ−Ａｄｖａｎｃｅ．ｒｅｇ．ｕｓ．ｈｔｍｌのワールドワイドウェブで見出される）。
【００４１】
グローバル配列アライメントとも呼ばれるクエリー配列（本開示の配列）とサブジェクト配列の間の最良の全体的一致を決定する別の方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡＢＩＯＳ）、１９９２、８（２）：１８９〜１９１頁のアルゴリズムに基づくＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１９９４、２（２２）：４６７３〜４６８０頁）を用いて決定することができる。配列アライメントにおいて、クエリーおよびサブジェクト配列はいずれもＤＮＡ配列である。前記グローバル配列アライメントの結果は、同一性パーセントである。ペアワイズアライメントにより同一性パーセントを計算するためにＤＮＡ配列のＣＬＵＳＴＡＬＷアライメントにおいて使用され得るパラメータは、マトリックス＝ＩＵＢ、ｋ−タプル＝１、トップダイアゴナル数＝５、ギャップペナルティ＝３、ギャップオープンペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．１である。マルチプルアライメントには、以下のＣＬＵＳＴＡＬＷパラメータが使用され得る：ギャップオープニングペナルティ＝１０、ギャップ伸長パラメータ＝０．０５、ギャップ分離ペナルティ範囲＝８、アライメントディレイの同一性％＝４０。
【００４２】
核酸は、細胞溶解物中の全細胞に存在し得、または部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、天然の環境において通常は結合されている他の細胞成分から精製されるとき、「単離され」または「実質的に純粋にされる」。核酸を単離するために、以下のような標準的手法が使用され得る：アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当技術分野でよく知られた他の手法。
【００４３】
Ｉ．活性化プロテインＣ（ａＰＣ）および抗体
Ａ．活性化プロテインＣ
プロテインＣは、内皮においてトロンボモジュリンと複合体形成されたトロンビンにより活性化される。インビボでの活性トロンビンの数秒のはかない寿命と異なり、ヒトａＰＣは、その生成後約２０分の循環中の半減期を有する（Ｂｅｒｇら、２００３）。したがって、様々な病態生理的条件下のａＰＣの調節を研究するために、血漿中のａＰＣのレベルを容易に測定することができる。
【００４４】
Ｂ．ａＰＣに対する抗体
以前に、内皮細胞でのＦＬ−ａＰＣ結合を増大させるマウス抗体ＨＡＰＣ１５７３が開発された。ＨＡＰＣ１５７３は、該細胞でのａＰＣおよびＥＰＣＲのＧｌａドメインの相互作用により、内皮におけるａＰＣ内在化を促進し、この内在化はＥＰＣＲブロッキングＡｂまたはＧｌａドメインブロッキングＡｂ（ＨＰＣ１５７５）のどちらかによりブロックすることができた。ＨＡＰＣ１５７３はまた、色素産生基質、Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ  ＰＣａに対するａＰＣの動態パラメータも劇的に変えた。ＨＡＰＣ１５７３の存在下の小さなペプチド基質に対するａＰＣのこの重大な変化は、このｍＡｂがａＰＣの活性部位近くのエピトープを認識すること、Ａｂおよび抗原の相互作用は、小さなペプチド基質に対するＡＰＣの親和性を劇的に増加させるが、ａＰＣ触媒部位からの生成物の解離速度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）を低下させることを示すものであった。ＨＡＰＣ１５７３はまた、第Ｘａ因子開始１ステージ血漿凝固アッセイにおいてａＰＣの延長作用もほぼ完全に減少させた。これは、ＨＡＰＣ１５７３およびａＰＣの相互作用が、第Ｖａ因子をａＰＣが切断するのを妨げることを示している。驚くべきことに、ＨＡＰＣ１５７３は、ヒストンＨ３およびＨ４を切断するａＰＣを阻害せず、実際は増大させた。一貫して、ＨＡＰＣ１５７３は、内皮でのヒストンＨ３およびＨ４に対するａＰＣ細胞保護活性を阻害せず、わずかに増大させた。最後に、これらの結果は、ＨＡＰＣ１５７３はａＰＣを認識するがプロテインＣを認識しないことを示している。米国特許第８，１５３，７６６号参照。
【００４５】
最近の研究は、ａＰＣの抗凝固活性は、その細胞保護機能にとって重要でないが、ＰＡＲ１に対するａＰＣ切断活性は、その抗アポトーシス作用にとって不可欠である可能性があることを示した（Ｍｏｓｎｉｅｒら、２００４）。しかし、ａＰＣの細胞保護作用は、ＥＰＣＲを発現する内皮細胞だけでなく、細胞表面でＥＰＣＲを発現しないニューロンおよびケラチノサイトなどの他の細胞においても示された（Ｇｕｏら、２００４；Ｂｅｒｇら、２００３）。これは、ＰＡＲ１媒介ａＰＣシグナル伝達以外の機構が存在する可能性を示すものである。
【００４６】
Ｃ．技術の適用
プロテインＣとａＰＣを区別する能力は、インビボで血漿中のａＰＣレベルを測定する簡便なＥＬＩＳＡ方法における抗体の有用性を実証する。典型的には、酵素捕捉アッセイによる１９時間またはさらには数週間（ＧｒｕｂｅｒおよびＧｒｉｆｆｅｎ、１９９２；Ｌｉａｗら、２００３）と比べて、この方法で１ｎｇ／ｍｌ  ＡＰＣを含有する血漿試料を測定するのに４時間未満を要する。
【００４７】
また、上記に論じられている通り、ＨＡＰＣ１５７３は、色素産生ペプチド基質に対するａＰＣ切断活性を変え、血漿凝固アッセイにおいてａＰＣ抗凝固活性もブロックした。これは、このｍＡｂが、ａＰＣ活性部位近くのエピトープを認識し、抗体−抗原結合に対するその触媒活性を変えることを示唆している。同時に、ＨＡＰＣ１５７３は細胞外ヒストンを切断するａＰＣを実際は増大させ、内皮でのヒストンに対するＡＰＣ細胞保護活性を増大させた。これは、活性化第Ｖ因子および第ＶＩＩＩ因子を切断するためのＡＰＣ抗凝固活性が、細胞外ヒストンの切断によるその細胞保護活性には必要とされないことを示している。抗凝固活性から独立した細胞外ヒストンの切断は、ａＰＣ調節炎症および細胞保護の分子機構の１つであると考えられる。
【００４８】
故に、ａＰＣに対するこのような抗体は、例えば、血友病Ａ患者の治療において使用することができる。ａＰＣは、第ＶＩＩＩａ因子および第Ｖａ因子の両方を切断し、故に血液凝固に負の影響を与える。血友病Ａ患者において、第ＶＩＩＩ因子レベルは低く、ａＰＣによる第Ｖａ因子の不活性化が、恐らくこれらの患者における止血および血栓症を調節する主要経路である。最近の臨床報告は、ａＰＣ切断に耐性である第Ｖ因子ライデン変異体が、出血症状に関して血友病Ａ患者に有益であることを実証した（ｖａｎ’ｔ  Ｚａｎｔら、１９９７）。第Ｖａ因子に対するａＰＣ抗凝固活性を抗体によりインビボでブロックすることは、血友病Ａ治療に対する、特に、高レベルの第ＶＩＩＩ因子インヒビターを有するため第ＶＩＩＩ因子補充療法があまり有効でない患者のための代替アプローチである。
【００４９】
他の実施形態において、ａＰＣに対する抗体に関する別の考えられる臨床応用は、恒常性が撹乱され、出血過多が起こり得、恒常性を取り戻すために外科的介入が延期される外傷患者の治療である。抗体による治療は、ＡＰＣの細胞保護活性または抗炎症活性を排除することなく凝固促進状態を選択的に回復させることができる。
【００５０】
ａＰＣに対する抗体のさらに別の臨床応用は、敗血症治療におけるａＰＣとの併用である。患者におけるａＰＣの出血副作用は、ａＰＣ抗凝固活性によるものである。ＨＡＰＣ１５７３がａＰＣ細胞保護作用を維持し、さらには増大させる一方で、ａＰＣ抗凝固活性をブロックしたことから、ｍＡｂ−ａＰＣ複合体は、ａＰＣの出血副作用に関してａＰＣ単独より良好な治療薬になり得る。
【００５１】
ＩＩ．抗体構造
抗体は、共通の構造的特徴を有する糖タンパク質の大きなファミリーを含む。抗体は、３次元構造を形成する４つのポリペプチドから成る。典型的には、抗体は２つの異なるポリペプチド、重鎖および軽鎖から成る。抗体分子は、１つ以上のこれらの単位から成り、各単位は２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。抗体分子は典型的には、３つの機能的ドメイン、すなわちＦｃ、Ｆａｂ、および抗原結合部位から成る。
【００５２】
α、δ、ε、γ、およびμとして表される５つの異なるタイプの重鎖ポリペプチドがある。κおよびλとして表される２つの異なるタイプの軽鎖ポリペプチドがある。抗体は典型的には、１つのタイプのみの重鎖および１つのタイプのみの軽鎖を含有するが、任意の軽鎖は任意の重鎖と結合することができる。
【００５３】
各重鎖ポリペプチドのカルボキシル末端は、定常（Ｆｃ）領域として知られる。各重鎖および軽鎖ポリペプチドのアミノ末端は、可変（Ｖ）領域として知られる。鎖の可変領域内に、相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られる超可変領域がある。１つの重鎖および１つの軽鎖の可変領域は、結合して抗原結合部位を形成する。各重鎖および各軽鎖は、３つのＣＤＲを含む。抗原結合部位の６つのＣＤＲは、抗原に対する実際の結合部位を形成するアミノ酸残基を規定する。ＣＤＲ可変性は、抗原認識の多様性の主な要因である。
【００５４】
ａＰＣに対する抗体は、以下の表に記載された配列により定義することができる：
【表２】
2016501875.tif 000004
【００５５】
ＩＩＩ．ａＰＣに対する抗体
Ａ．抗体断片
故に、１つの実施形態において、このような分子は、例えば、ｍＡｂのタンパク質分解性切断により生成される断片（（Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２など）、または例えば組換え手段により生成可能な一本鎖免疫グロブリンを含むであろう。このような抗体誘導体は一価である。１つの実施形態において、このような断片は、互いにまたは他の抗体断片もしくは受容体リガンドと組み合わされて、「キメラ」結合分子を形成することができる。意義深いことに、このようなキメラ分子は、同じ分子の異なるエピトープに結合できる置換基を含有することができ、または該分子は、活性化プロテインＣエピトープおよび「不活性化プロテインＣ」エピトープに結合することができる。
【００５６】
一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、抗体断片の別の形態である。該断片は、短い（通常はセリン、グリシン）リンカーと一緒に連結された、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域の融合を含む。このキメラ分子は、定常領域の除去およびリンカーペプチドの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。これらの分子は歴史的には、単一ペプチドとして抗原結合ドメインを発現するのに非常に簡便なファージディスプレイを容易にするために作製された。あるいは、ｓｃＦｖは、ハイブリドーマに由来するサブクローニングされた重鎖および軽鎖から直接作製することができる。一本鎖可変断片は、完全な抗体分子に見出される定常Ｆｃ領域を欠き、故に、抗体を精製するのに使用される一般的な結合部位（例えば、プロテインＡ／Ｇ）を欠く。これらの断片は多くの場合、プロテインＬがカッパ軽鎖の可変領域と相互作用することから、プロテインＬを用いて精製／固定化することができる。
【００５７】
フレキシブルリンカーは一般的に、アラニン、セリンおよびグリシンなどのヘリックスおよびターン促進アミノ酸残基から成る。しかし、他の残基も同様に機能することができる。Ｔａｎｇら（１９９６）は、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）に適合したリンカーをタンパク質リンカーライブラリーから迅速に選択する手段としてファージディスプレイを使用した。重鎖および軽鎖可変ドメインの遺伝子が、可変組成の１８個のアミノ酸のポリペプチドをコードするセグメントにより連結されているランダムリンカーライブラリーが構築された。ｓｃＦｖレパートリー（約５×１０６の異なるメンバー）が繊維状ファージ上に提示され、ハプテンによる親和性選択に供された。選択されたバリアントの集団は、結合活性の著しい増加を示したが、かなりの配列多様性を保持した。１０５４個の個々のバリアントのスクリーニングは、その後触媒的に活性な、可溶形態で効率的に生成されるｓｃＦｖをもたらした。配列分析は、選択されたテザーの唯一の共通する特徴として、ＶＨ  Ｃ末端２残基後のリンカー中の保存されたプロリン、ならびに他の位置での豊富なアルギニンおよびプロリンを明らかにした。
【００５８】
ａＰＣに対する組換え抗体は、受容体の二量体化または多量体化を可能にする配列または部分も含むことができる。このような配列には、ＩｇＡに由来するものが含まれ、Ｊ鎖と共に多量体の形成を可能にする。別の多量体化ドメインは、Ｇａｌ４二量体化ドメインである。他の実施形態において、鎖は、２つの抗体の組み合わせを可能にするビオチン／アビジンなどの作用物質で修飾することができる。
【００５９】
別個の実施形態において、一本鎖抗体は、非ペプチドリンカーまたは化学単位を用いて、受容体軽鎖および重鎖を結合させて作製することができる。一般的に、軽鎖および重鎖は、異なる細胞において生成され、精製され、その後適切な方法で共に連結される（すなわち、適切な化学架橋により重鎖のＮ末端が軽鎖のＣ末端に付加される）。
【００６０】
架橋試薬は、２つの異なる分子の官能基を結び付ける分子架橋を形成するのに使用される（例えば安定化剤および凝固剤）。しかし、同じアナログの二量体もしくは多量体、または異なるアナログから成るヘテロメリック複合体が作製され得ることが企図される。２つの異なる化合物を段階的なやり方で連結するために、不要なホモポリマー形成を排除するヘテロ二官能性架橋剤が使用されてもよい。例示的なヘテロ二官能性架橋剤は２つの反応基を含有し、一方は一級アミン基と反応し（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、他方はチオール基と反応する（例えば、ピリジルジスルフィド、マレイミド、ハロゲンなど）。一級アミン反応基を通じて、架橋剤は１つのタンパク質（例えば、選択された抗体または断片）の（１または複数の）リジン残基と反応することができ、チオール反応基を通じて、第一のタンパク質に既に結び付けられた架橋剤は、他方のタンパク質（例えば、選択剤）のシステイン残基（遊離スルフヒドリル基）と反応する。
【００６１】
血中で妥当な安定性を有する架橋剤が使用され得る。標的剤および治療／予防剤をコンジュゲートするのに成功裏に使用することができる多くのタイプのジスルフィド結合含有リンカーが知られている。立体的に障害されたジスルフィド結合を含有するリンカーは、作用部位に達する前の標的ペプチドの放出を防ぎ、インビボでより大きな安定性をもたらすことを証明することができる。故にこれらのリンカーは、連結剤の１つの群である。
【００６２】
別の架橋試薬はＳＭＰＴである。これは、隣接するベンゼン環およびメチル基により「立体的に障害された」ジスルフィド結合を含有する二官能性架橋剤である。ジスルフィド結合の立体障害は、組織および血液中に存在し得るグルタチオンなどのチオレートアニオンによる攻撃から該結合を保護する機能を果たし、これにより、付加された薬剤が標的部位に送達される前のコンジュゲートのデカップリングを防ぐのに役立つと考えられている。ＳＭＰＴ架橋試薬は、多くの他の公知の架橋試薬と同じように、システインのＳＨまたは一級アミン（例えば、リジンのイプシロンアミノ基）などの官能基を架橋する能力を与える。別の考えられるタイプの架橋剤には、スルホスクシンイミジル−２−（ｐ−アジドサリチルアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネートなどの切断可能なジスルフィド結合を含有するヘテロ二官能性光反応性フェニルアジドが含まれる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル基は一級アミノ基と反応し、フェニルアジド（光分解時）はいずれのアミノ酸残基とも非選択的に反応する。
【００６３】
障害された架橋剤に加えて、非障害リンカーもそれに沿って使用することができる。保護されたジスルフィドを含有するまたは生成すると見なされない他の有用な架橋剤には、ＳＡＴＡ、ＳＰＤＰおよび２−イミノチオラン（ＷａｗｒｚｙｎｃｚａｋおよびＴｈｏｒｐｅ、１９８７）が含まれる。このような架橋剤の使用は、当技術分野で十分に理解されている。別の実施形態は、フレキシブルリンカーの使用を伴う。米国特許第４，６８０，３３８号は、リガンドとアミン含有ポリマーおよび／またはタンパク質とのコンジュゲートを生成するのに、特にキレート剤、薬物、酵素、検出可能な標識などとの抗体コンジュゲートを形成するのに有用な二官能性リンカーを記載する。米国特許第５，１４１，６４８号および同第５，５６３，２５０号は、様々な穏和な条件下で切断可能な不安定結合を含有する切断可能なコンジュゲートを開示している。このリンカーは、目的とする薬剤がリンカーに直接結合され得、切断が活性剤の放出をもたらすという点で特に有用である。特定の使用は、抗体などのタンパク質または薬物への遊離アミノまたは遊離スルフヒドリル基の付加を含む。
【００６４】
米国特許第５，８５６，４５６号は、融合タンパク質、例えば一本鎖抗体を作製するためにポリペプチド成分を結合するのに使用するペプチドリンカーを提供する。該リンカーは、最大約５０アミノ酸長であり、荷電アミノ酸（例えば、アルギニンまたはリジン）とこれに続くプロリンの少なくとも１回の発生を含有し、より大きな安定性および凝集の低下を特徴とする。米国特許第５，８８０，２７０号は、様々な免疫診断法および分離法において有用なアミノオキシ含有リンカーを開示している。
【００６５】
Ｂ．抗体コンジュゲート
さらに提供されるのは抗体コンジュゲートである。診断および治療目的の両方で、薬剤を抗体に連結または共有結合または複合体形成することができる。このような分子または部分は、少なくとも１つのエフェクターまたはレポーター分子であってもよいが、これらに限定されない。レポーター分子は、アッセイを用いて検出することができる任意の部分として定義される。抗体にコンジュゲートされたレポーター分子の非限定例には、酵素、放射標識、ハプテン、蛍光標識、リン光分子、化学発光分子、発色団、発光分子、光親和性分子、着色粒子、またはビオチンなどのリガンドが含まれる。
【００６６】
抗体コンジュゲートの特定の例は、抗体が検出可能な標識に連結されているようなコンジュゲートである。「検出可能な標識」は、特定の機能特性、および／または化学的特徴により検出することができる化合物および／またはエレメントであり、その使用は、それらが付加される抗体を検出できるようにし、および／または所望であればさらに定量できるようにする。別のこのような例は、細胞毒性剤または抗細胞剤に連結された抗体を含むコンジュゲートの形成であり、「免疫毒素」と呼ぶことができる。
【００６７】
抗体コンジュゲートは、診断剤として使用される。抗体診断薬は一般的に２つのクラス、すなわち様々な免疫アッセイなどのインビトロ診断で使用するためのもの、および／または一般的に「抗体イメージング（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｉｍａｇｉｎｇ）」として知られるインビボ診断プロトコルで使用するためのものに含まれる。
【００６８】
多くの適切なイメージング剤が、それらを抗体に付加する方法と同様に当技術分野で知られている（例えば、米国特許第５，０２１，２３６号；同第４，９３８，９４８号；および同第４，４７２，５０９号参照。各々は参照により本明細書に組み込まれている）。使用されるイメージング部分は、常磁性イオン、放射性同位体、蛍光色素、ＮＭＲ検出可能物質、Ｘ線イメージングであり得る。
【００６９】
常磁性イオンの場合、例として、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）および／またはエルビウム（ＩＩＩ）などのイオンを挙げることができる。Ｘ線イメージングなどの他の文脈で有用なイオンには、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）、特にビスマス（ＩＩＩ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７０】
治療適用および／または診断適用のための放射性同位体の場合、アスタチン２１１、１４炭素、５１クロム、３６塩素、５７コバルト、５８コバルト、銅６７、１５２Ｅｕ、ガリウム６７、３水素、ヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、インジウム１１１、５９鉄、３２リン、レニウム１８６、レニウム１８８、７５セレニウム、３５硫黄、テクネチウム９９ｍ、および／またはイットリウム９０を挙げることができる。１２５Ｉは、特定の実施形態において多くの場合一般に使用されており、テクネチウム９９ｍおよび／またはインジウム１１１も、その低エネルギーおよび長距離検出に対する適合性により、しばしば使用される。放射活性標識モノクローナル抗体は、当技術分野でよく知られた方法により生成することができる。例えば、モノクローナル抗体は、ヨウ化ナトリウムおよび／もしくはヨウ化カリウム、ならびに次亜塩素酸ナトリウムなどの化学酸化剤、またはラクトペルオキシダーゼなどの酵素酸化剤との接触によりヨウ素化することができる。モノクローナル抗体は、リガンド交換過程により、例えば、スズ溶液でパーテクネートを還元し、還元テクネチウムをセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）カラム上でキレート化し、このカラムに抗体を適用することにより、テクネチウム９９ｍで標識されてもよい。あるいは、直接標識法が、例えば、パーテクネート、ＳＮＣｌ２などの還元剤、フタル酸ナトリウム−カリウム溶液などの緩衝溶液、および抗体をインキュベートして使用されてもよい。金属イオンとして存在する放射性同位体を抗体に結合させるのにしばしば使用される中間官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）である。
【００７１】
コンジュゲートとしての使用に企図される蛍光標識には、Ａｌｅｘａ  ３５０、Ａｌｅｘａ  ４３０、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃｙ３、Ｃｙ５，６−ＦＡＭ、フルオレセインイソチオシアネート、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、オレゴグリーン４８８、オレゴグリーン５００、オレゴグリーン５１４、パシフィックブルー、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、レノグラフィン、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、テトラメチルローダミン、および／またはテキサスレッドが含まれる。
【００７２】
別のタイプの企図される抗体コンジュゲートは、色素産生基質と接触すると着色生成物を生成する二次結合リガンドおよび／または酵素（酵素タグ）に抗体が連結される、インビトロでの使用に対して主に意図されたものである。適切な酵素の例には、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（西洋ワサビ）水素ペルオキシダーゼまたはグルコースオキシダーゼが含まれる。二次結合リガンドは、ビオチンならびに／またはアビジンおよびストレプトアビジン化合物である。このような標識の使用は、当業者によく知られており、例えば、米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号および同第４，３６６，２４１号（各々は、参照により本明細書に組み込まれている）に記載されている。
【００７３】
抗体への分子の部位特異的付加のさらに別の公知の方法は、抗体とハプテンベースの親和性標識との反応を含む。本質的に、ハプテンベースの親和性標識は抗原結合部位でアミノ酸と反応し、これによりこの部位を破壊し、特異的抗原反応をブロックする。しかし、これは、抗体コンジュゲートによる抗原結合の喪失をもたらすため、有利でない可能性がある。
【００７４】
アジド基を含有する分子も、低強度紫外線により生成される反応性ナイトレン中間体を通じてタンパク質への共有結合を形成するのに使用することができる（ＰｏｔｔｅｒおよびＨａｌｅｙ、１９８３）。特に、プリンヌクレオチドの２−および８−アジドアナログが、粗細胞抽出物中のヌクレオチド結合タンパク質を同定するための部位特異的光プローブとして使用されている（ＯｗｅｎｓおよびＨａｌｅｙ、１９８７；Ａｔｈｅｒｔｏｎら、１９８５）。２−および８−アジドヌクレオチドはまた、精製タンパク質のヌクレオチド結合ドメインをマッピングするのにも使用されており（Ｋｈａｔｏｏｎら、１９８９；Ｋｉｎｇら、１９８９；およびＤｈｏｌａｋｉａら、１９８９）、抗体結合剤として使用されてもよい。
【００７５】
抗体をそのコンジュゲート部分に付加またはコンジュゲートするための幾つかの方法が、当技術分野で知られている。幾つかの付加方法は、米国特許第４，４７２，５０９号および同第４，９３８，９４８号、各々は参照により本明細書に組み込まれている）に記載されているような、例えば有機キレート剤を使用する、金属キレート錯体の使用を伴う。モノクローナル抗体はまた、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩などのカップリング剤の存在下で酵素と反応することもできる。フルオレセインマーカーとのコンジュゲートは、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応により調製される。米国特許第４，９３８，９４８号において、乳房腫瘍のイメージングはモノクローナル抗体を用いて達成され、検出可能なイメージング部分は、メチル−ｐ−ヒドロキシベンズイミデートまたはＮ−スクシンイミジル−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネートなどのリンカーを用いて抗体に結合される。
【００７６】
他の実施形態において、抗体結合部位を変えない反応条件を用いて、免疫グロブリンのＦｃ領域にスルフヒドリル基を選択的に導入することによる免疫グロブリンの誘導体化が企図される。この方法論により生成された抗体コンジュゲートは、改善された寿命、特異性および感受性を示すことが開示されている（参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，１９６，０６６号）。レポーターまたはエフェクター分子がＦｃ領域における炭水化物残基にコンジュゲートされるエフェクターまたはレポーター分子の部位特異的付加も、文献に開示されている（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙら、１９８７）。このアプローチは、現在臨床評価中の診断的および治療的に有望な抗体を生成すると報告されている。
【００７７】
別の実施形態において、インビボでの安定性および半減期を改善するために免疫グロブリンを修飾することを選択してもよい。ＰＥＧ化は、抗体へのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー鎖の共有結合を伴う１つのこのような過程である。ＰＥＧ化は、ＰＥＧの反応性誘導体を標的分子とインキュベートして日常的に達成される。ＰＥＧの共有結合は、宿主の免疫系から抗体を「マスク」し得（免疫原性および抗原性の低下）、薬剤の流体力学的サイズ（溶液中のサイズ）を増加させ得、薬剤の腎クリアランスを減少させて循環時間を延長する。ＰＥＧ化はまた、水溶性も提供することができる。抗体を修飾するのに使用される他のポリマーには、コハク酸基を通じてしばしば連結されるポリエチレンイミンおよびポリリジンが含まれる。
【００７８】
Ｃ．免疫検出方法
さらなる実施形態において、また提供されるのは、生物学的成分を、このような成分と免疫学的に反応する抗体を用いて、結合し、精製し、除去し、定量しおよび／またはさもなければ一般的に検出するための免疫検出方法である。幾つかの免疫検出方法には、例を挙げるだけでも酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射線測定アッセイ、蛍光免疫アッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイ、およびウエスタンブロットが含まれる。様々な有用な免疫検出方法のステップは、例えば、ＤｏｏｌｉｔｔｌｅおよびＢｅｎ−Ｚｅｅｖ（１９９９）、ＧｕｌｂｉｓおよびＧａｌａｎｄ（１９９３）、Ｄｅ  Ｊａｇｅｒら（１９９３）、ならびにＮａｋａｍｕｒａら（１９８７）（各々は参照により本明細書に組み込まれている）などの科学文献に記載されている。
【００７９】
一般に、免疫結合方法は、目的とする標的を含有する試料を得るステップ、および免疫複合体の形成を可能にする有効な条件下で標的と免疫学的に反応する一次抗体と試料を接触させるステップを含む。次いで標的への抗体の結合は、様々な異なるフォーマットを用いて評価することができる。
【００８０】
１つのフォーマットにおいて、抗体は、カラムマトリックスの形態などの固体担体に連結されてもよく、標的を含有していると疑われる試料が固定化抗体に適用される。不要な成分はカラムから洗浄され、固定化抗体に免疫複合体形成された溶出される標的を残す。
【００８１】
免疫結合方法はまた、試料中の標的の量を検出および定量する方法、ならびに結合過程中に形成された任意の免疫複合体の検出および定量方法も含む。ここでは、標的を含有すると疑われる試料を得、標的に対する抗体と試料を接触させ、次いで特定の条件下で形成された免疫複合体の量を検出および定量することになる。
【００８２】
抗原検出に関して、分析される生物学的試料は、例えば血液、血清、血漿、粘膜、尿、唾液、涙または精液のような体液などの、標的を含有すると疑われる任意の試料であってもよい。あるいは、組織が使用されてもよい。免疫複合体（一次免疫複合体）の形成を可能にする有効な条件下および十分な期間、選択された生物学的試料を抗体と接触させるステップは一般的に、抗体組成物を試料に単に添加し、抗体が、存在する抗体と免疫学的に反応する標的と免疫複合体を形成する、すなわち該標的に結合するのに十分な期間、混合物をインキュベートするだけの問題である。この期間後、組織切片、ＥＬＩＳＡプレート、ドットブロットまたはウエスタンブロットなどの試料−抗体組成物は、いずれの非特異的結合種も除去するために一般的に洗浄され、一次免疫複合体内の特異的に結合された分子のみを検出できるようになる。
【００８３】
一般に、免疫複合体形成の検出は当技術分野でよく知られており、多くのアプローチの適用により達成することができる。これらの方法は一般的に、任意の放射性タグ、蛍光タグ、生物学的タグおよび酵素タグなどの標識またはマーカーの検出に基づく。このような標識の使用に関する米国特許には、米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号および同第４，３６６，２４１号（各々は参照により本明細書に組み込まれている）が含まれる。当然のことながら、当技術分野で知られているように、二次抗体および／またはビオチン／アビジンリガンド結合配置などの二次結合リガンドの使用により、追加の利点を見出すことができる。
【００８４】
検出に使用される抗体は、検出可能な標識にそれ自体連結され得、次いでこの標識を単純に検出し、これにより組成物中の一次免疫複合体の量を決定できるようになる。あるいは、一次免疫複合体内に結合されるようになる一次抗体は、該抗体に対して結合親和性を有する二次結合リガンドを用いて検出されてもよい。これらの場合、二次結合リガンドは、検出可能な標識に連結され得る。二次結合リガンドはそれ自体しばしば抗体であり、故に「二次」抗体と呼ばれ得る。一次免疫複合体は、二次免疫複合体の形成を可能にする有効な条件下および十分な期間、標識された二次結合リガンド、すなわち抗体と接触される。次いで二次免疫複合体は、いずれの非特異的結合標識二次抗体またはリガンドも除去するために一般的に洗浄され、次いで二次免疫複合体中の残りの標識が検出される。
【００８５】
さらなる方法は、二段階のアプローチによる一次免疫複合体の検出を含む。抗体に対して結合親和性を有する抗体などの二次結合リガンドが使用されて、上記のように二次免疫複合体を形成する。洗浄後、二次免疫複合体は、この場合もやはり免疫複合体（三次免疫複合体）の形成を可能にする有効な条件下および十分な期間、二次抗体に対して結合親和性を有する三次結合リガンドまたは抗体と接触される。三次リガンドまたは抗体は、検出可能な標識に連結され、故に形成された三次免疫複合体の検出を可能にする。このシステムは、必要であればシグナル増幅を提供することができる。
【００８６】
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｃａｎｔｏｒにより設計された免疫検出の１つの方法は、２つの異なる抗体を使用する。第一ステップビオチン化モノクローナルまたはポリクローナル抗体は、（１または複数の）標的抗原を検出するのに使用され、次いで第二ステップ抗体は、複合体化ビオチンに付加されたビオチンを検出するのに使用される。その方法ではテストされる試料が、第一ステップ抗体を含有する溶液中で最初にインキュベートされる。標的抗原が存在すれば、抗体の幾つかが抗原に結合してビオチン化抗体／抗原複合体を形成する。次いで抗体／抗原複合体は、ストレプトアビジン（またはアビジン）、ビオチン化ＤＮＡ、および／または相補的ビオチン化ＤＮＡの一連の溶液中でインキュベーションにより増幅され、各ステップは、さらなるビオチン部位を抗体／抗原複合体に添加する。増幅ステップは、適切なレベルの増幅が達成されるまで反復され、適切なレベルの増幅が達成された時点で、ビオチンに対する第二ステップ抗体を含有する溶液中で試料がインキュベートされる。この第二ステップ抗体は、例えば、クロモゲン基質を用いた色素酵素学により抗体／抗原複合体の存在を検出するのに使用され得る酵素で標識される。適切な増幅により、肉眼で見ることができるコンジュゲートが生成され得る。
【００８７】
免疫検出の別の公知の方法は、免疫−ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）方法論を利用する。ＰＣＲ方法は、ビオチン化ＤＮＡとのインキュベーションまではＣａｎｔｏｒ方法と類似しているが、複数回のストレプトアビジンおよびビオチン化ＤＮＡインキュベーションを用いる代わりに、抗体を放出する低ｐＨまたは高塩緩衝液でＤＮＡ／ビオチン／ストレプトアビジン／抗体複合体が洗い流される。得られた洗浄溶液は、次いで適切な対照と共に適切なプライマーを用いたＰＣＲ反応を実施するのに使用される。少なくとも理論的には、単一の抗原分子を検出するのにＰＣＲの膨大な増幅能力および特異性が利用され得る。
【００８８】
抗原が固定化される別のＥＬＩＳＡは、検出における抗体競合の使用を伴う。このＥＬＩＳＡでは、抗原に対する標識抗体がウェルに添加され、結合するままにされ、および／またはその標識を用いて検出される。次いで未知の試料中の抗原の量は、被覆されたウェルとのインキュベーション中に、抗原に対する標識抗体と試料を混合して決定される。試料中の抗原の存在は、ウェルへの結合に利用可能な抗原に対する抗体の量を減少させるように働き、故に最終的なシグナルを減少させる。これはまた、非標識抗体が抗原被覆ウェルに結合する、未知の試料中の抗原に対する抗体の検出にも適しており、標識抗体を結合するのに利用可能な抗原の量も減少させる。
【００８９】
上記に詳述されている通り、最も単純および／または直接的な意味において、免疫アッセイは結合アッセイである。特定の免疫アッセイは、当技術分野で公知の様々なタイプの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および／または放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）である。組織切片を用いた免疫組織化学的検出も、特に有用である。しかし、検出はこのような手法に限定されず、および／またはウエスタンブロット、ドットブロット、ＦＡＣＳ分析なども使用できることが容易に理解されよう。使用されるフォーマットにかかわらず、ＥＬＩＳＡは、被覆、インキュベートおよび結合、非特異的結合種を除去するための洗浄、ならびに結合した免疫複合体の検出などの特定の特徴を共有する。これらは以下に記載される。
【００９０】
抗原または抗体のいずれかによるプレートの被覆では、一般的に、プレートのウェルを抗原または抗体の溶液と一晩または一定時間インキュベートする。プレートのウェルは、不完全に吸着した材料を除去するために次いで洗浄される。ウェルのいずれの残りの利用可能な表面も、テスト抗血清に関して抗原的に中立である非特異的タンパク質で次いで「被覆」される。これらには、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインまたは乳粉溶液が含まれる。被覆は、固定化表面上の非特異的吸着部位のブロッキングを可能にし、したがって表面上への抗血清の非特異的結合により引き起こされるバックグラウンドを低下させる。
【００９１】
ＥＬＩＳＡでは、直接的な手順よりも、二次または三次検出手段を使うことが恐らくより通例である。したがって、タンパク質または抗体のウェルへの結合、バックグラウンドを低下させるための非反応性材料での被覆、および非結合材料を除去するための洗浄後、免疫複合体（抗原／抗体）形成を可能にする有効な条件下で、固定化表面がテストされる生物学的試料と接触される。次いで免疫複合体の検出は、標識された二次結合リガンドまたは抗体、および標識された三次抗体または三次結合リガンドと併用した二次結合リガンドまたは抗体を必要とする。
【００９２】
「免疫複合体（抗原／抗体）形成を可能にする有効な条件下」は、条件が、ＢＳＡ、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎなどの溶液で抗原および／または抗体を希釈することを含み得ることを意味する。これらの添加剤はまた、非特異的バックグラウンドの低下も助ける傾向がある。
【００９３】
「適切な」条件はまた、インキュベーションが、有効な結合を可能にする十分な温度または期間であることも意味する。インキュベーションステップは典型的には、約２５℃から２７℃の温度で約１から２から４時間ほどであり、または約４℃ほどで一晩であってもよい。
【００９４】
Ｄ．精製
特定の実施形態において、ａＰＣに対する抗体は精製され得る。「精製された」という用語は本明細書で使用されるとき、自然に得られる状態と比べてタンパク質がいかなる程度でも精製されている、他の成分から単離可能な組成物を指すと意図される。したがって精製タンパク質は、自然に生じ得る環境から遊離したタンパク質も指す。「実質的に精製された」という用語が使用される場合、この名称は、組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％またはこれ以上を占めるなどの、タンパク質またはペプチドが組成物の主要成分を形成する組成物を指す。
【００９５】
タンパク質精製法は、当業者によく知られている。これらの手法は、あるレベルでポリペプチドおよび非ポリペプチド画分に細胞環境を粗分画することを伴う。他のタンパク質からポリペプチドを分離した後、目的とするポリペプチドは、クロマトグラフ法および電気泳動法を用いてさらに精製されて、部分的または完全な精製（または均一になるまで精製）を達成することができる。
【００９６】
純粋なペプチドの調製に特に適した分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；等電点電気泳動である。タンパク質精製の他の方法には、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体などまたは熱変性による沈殿と、それに続く遠心分離；ゲル濾過、逆相、ヒドロキシアパタイトおよび親和性クロマトグラフィー；ならびにこのようなおよび他の手法の組み合わせが含まれる。
【００９７】
ａＰＣに対する抗体の精製では、原核生物または真核生物発現系においてポリペプチドを発現させ、変性条件を用いてタンパク質を抽出することが望ましい場合がある。ポリペプチドは、ポリペプチドのタグ化部分に結合する親和性カラムを用いて、他の細胞成分から精製することができる。当技術分野で一般的に知られているように、様々な精製ステップを行う順番は変更され得ること、または特定のステップが省かれ得、実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの調製に適した方法を依然としてもたらし得ることが考えられる。
【００９８】
一般に、完全な抗体は、抗体のＦｃ部分を結合する作用物質（すなわち、プロテインＡ）を利用して分画される。あるいは、抗原が、適切な抗体を同時に精製および選択するのに使用されてもよい。このような方法は、カラム、フィルターまたはビーズなどの担体に結合された選択剤をしばしば利用する。抗体が担体に結合され、混入物が除去され、条件（塩、熱など）の適用により抗体が放出される。
【００９９】
タンパク質またはペプチドの精製程度を定量する様々な方法が、本開示に照らして当業者に公知であろう。これらには、例えば、活性画分の比活性の決定、または画分内のポリペプチド量のＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析による評価が含まれる。画分の純度を評価する別の方法は、画分の比活性を計算すること、それを最初の抽出物の比活性と比較すること、故に純度を計算することである。活性の量を表すのに使用される実際の単位は、当然のことながら、精製を追うために選択された特定のアッセイ法、および発現タンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すかどうかに依存する。
【０１００】
ポリペプチドの移動は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥの異なる条件により（時として著しく）変わり得ることが知られている（Ｃａｐａｌｄｉら、１９７７）。したがって、異なる電気泳動条件下で、精製されたまたは部分的に精製された発現生成物の見かけの分子量は変わり得ることが理解されよう。
【０１０１】
ＩＶ．医薬組成物および使用
Ａ．組成物
医薬組成物は、医薬的に許容可能な担体に溶解または分散された１つ以上の抗体、治療剤または追加の薬剤を有効量含むことができる。水性組成物は、医薬的に許容可能な担体または水性媒体に溶解または分散された抗体を有効量含む。「医薬的にまたは薬理学的に許容可能な」という語句は、必要に応じて動物、またはヒトに投与された場合に、有害反応（ａｄｖｅｒｓｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、アレルギー反応または他の有害反応（ｕｎｔｏｗａｒｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を生じさせない分子実体および組成物を指す。
【０１０２】
本明細書で使用されるとき、「医薬的に許容可能な担体」には、当業者に知られているように、ありとあらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素、そのような同様の材料およびこれらの組み合わせが含まれる（例えば、参照により本明細書に組み込まれているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版  Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０、１２８９〜１３２９頁参照）。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野でよく知られている。任意の従来の媒体または薬剤が活性成分と不適合である場合を除いて、治療組成物におけるその使用が企図される。補足的活性成分も組成物に組み込むことができる。ヒト投与のために、製剤は、ＦＤＡ生物製剤基準局（ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）により要求されているような滅菌性、発熱原性、全般的安全性および純度基準を満たすべきである。
【０１０３】
生物学的材料は、望ましくない低分子量分子を除去するために広く透析されるべきであり、および／または適切な場合、所望のビヒクルにより素早く製剤化されるように凍結乾燥されるべきである。次いで活性化合物は一般的に、非経口投与のために製剤化され、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、鼻内、または腹腔内経路を介した注射のために製剤化される。典型的には、このような組成物は、注射剤として（液体溶液または懸濁液のどちらかとして）調製することができ；注射前の液体の添加時に溶液または懸濁液を調製するための使用に適した固体形態も調製することができ；および製剤は乳化することもできる。
【０１０４】
注射可能な用途に適した薬学的形態には、滅菌水溶液または分散液；ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、該形態は滅菌されていなければならず、および容易に注射できる程度に流動性でなければならない。該形態は製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。
【０１０５】
遊離塩基または薬理学的に許容可能な塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。分散液も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中、ならびに油中で調製することができる。貯蔵および使用の通常の条件下で、これらの製剤は微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含有する。
【０１０６】
ａＰＣに対する抗体は、遊離塩基、中性または塩の形態で組成物に製剤化することができる。医薬的に許容可能な塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成された）および例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸で形成された酸付加塩が含まれる。遊離カルボキシル基で形成された塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基に由来し得る。
【０１０７】
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤の使用、分散の場合は必要とされる粒径の維持、および界面活性剤の使用により維持することができる。微生物作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムが含まれ得る。注射用組成物の吸収の延長は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中で使用することによりもたらされ得る。
【０１０８】
滅菌注射用溶液は、必要に応じて、上記に列挙された様々な他の成分と共に、必要とされる量で活性化合物を適切な溶媒に組み込み、その後濾過滅菌して調製される。一般的に、分散液は、様々な滅菌活性成分を、塩基性分散媒および上記に列挙されたものからの必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込んで調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製方法は、以前に滅菌濾過された溶液から活性成分プラス任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす、真空乾燥および凍結乾燥法である。直接注射のためのよりまたは高度に濃縮された溶液の調製も企図され、極めて迅速な浸透をもたらし高濃度の活性剤を小さな領域に送達するために、溶媒としてのＤＭＳＯの使用が想定される。
【０１０９】
製剤化すると、溶液は、投与製剤と適合可能な様式で、および治療的に有効であるような量で投与される。製剤は、上記に記載された注射用溶液のタイプなどの様々な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用することができる。
【０１１０】
水溶液での非経口投与のために、例えば、溶液は必要ならば適切に緩衝されるべきであり、先ず液体希釈剤が、十分な生理食塩水またはブドウ糖で等張にされるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、鼻内、および腹腔内投与に特に適している。これに関して、使用され得る滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に公知であろう。例えば、１回投与量が１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解され得、および１０００ｍｌの皮下注入流体に添加され得るまたは計画された注入部位で注射され得る（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁参照）。治療される被験者の状態に応じて、投与量の幾らかの変更が必然的に生じることになる。投与に関与する者は、いずれにしても、個々の被験者に適した用量を決定することになる。
【０１１１】
静脈内または筋肉内注射などの非経口投与用に製剤化された化合物に加えて、他の医薬的に許容可能な形態に、例えば、経口投与用の錠剤または他の固体、リポソーム製剤、持続放出カプセル、およびクリームを含む同時使用される任意の他の形態が含まれる。
【０１１２】
特定の実施形態において、リポソームおよび／またはナノ粒子の使用が、抗体および／またはこのアナログの製剤化および投与に対して企図される。リポソームの形成および使用は、当業者に一般的に知られており、また下記に記載される。
【０１１３】
ナノカプセルは一般的に、安定で再現可能な方法で化合物を封入することができる。細胞内ポリマー過負荷による副作用を避けるために、このような超微細粒子（サイズ約０．１μｍ）が、インビボで分解することができるポリマーを用いて設計されるべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子が使用に企図され、このような粒子は容易に作製される。
【０１１４】
リポソームは、水性媒体に分散され多重ラメラ同心二層小胞（多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自発的に形成するリン脂質から形成される。ＭＬＶは一般的に、２５ｎｍから４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、中心部に水溶液を含有する、２００〜５００Ａの範囲の直径を有する小さな単ラメラ小胞（ＳＵＶ）の形成をもたらす。
【０１１５】
以下の情報もリポソーム製剤の生成において利用することができる。リン脂質は水に分散されたとき、脂質対水のモル比に応じてリポソーム以外の様々な構造を生成することができる。低い比では、リポソームが推奨される構造である。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度および二価陽イオンの存在に依存する。リポソームは、イオン性および極性物質に対し低い透過性を示し得るが、高温ではその透過性を著しく変える相転移を起こす。相転移は、ゲル状態として知られる最密充填された秩序構造から、流体状態として知られるゆるく充填された低秩序構造への変化を伴う。これは特徴的な相転移温度で生じ、イオン、糖および薬物に対する透過性の増加をもたらす。
【０１１６】
リポソームは、４つの異なる機構、すなわち、マクロファージおよび好中球などの細網内皮系の食細胞によるエンドサイトーシス；非特異的な弱い疎水性力もしくは静電力、または細胞表面成分との特異的相互作用のいずれかによる細胞表面への吸着；血漿膜へのリポソームの脂質二層の挿入による血漿細胞膜との融合と、細胞質へのリポソーム内容物の同時放出；およびリポソーム内容物のいずれの結合もない、細胞膜もしくは細胞小器官膜へのリポソーム脂質の移動（またはその逆）を介して、細胞と相互作用する。リポソーム製剤を変更することは、作動する機構を変える可能性があるが、１つを超える機構が同時に作動することができる。
【０１１７】
治療剤は、固体、液体またはエアロゾル形態で投与されるかどうか、および注射のような投与経路に関して滅菌される必要があるかどうかに応じて、異なるタイプの担体を含むことができる。ａＰＣに対する抗体は、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、膀胱内、粘膜的、心膜内、臍帯内、眼内、経口的、局所的、局部的、吸入（例えば、エアロゾル吸入）により、注射により、注入により、連続注入により、標的細胞を直接浸漬する局所灌流、カテーテルを介して、洗浄を介して、クリームで、脂質組成物（例えば、リポソーム）で、または当業者に公知であるような他の方法もしくは前述のものの任意の組み合わせにより投与することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版  Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０参照）。
【０１１８】
動物患者に投与される組成物の実際の投与量は、体重、状態の重症度、治療される疾患のタイプ、以前または同時の治療的介入、患者の突発性疾患および投与経路などの物理的および生理学的要因により決定することができる。いずれにしても、投与に関与する医師が、個々の被験者に対する組成物中の（１または複数の）活性成分の濃度および（１または複数の）適切な用量を決定することになる。
【０１１９】
特定の実施形態において、医薬組成物は、例えば、活性化合物の少なくとも約０．１％を含んでもよい。他の実施形態において、活性化合物は、単位の重量の約２％から約７５％、または例えば約２５％から約６０％、およびこの中で導き出せる任意の範囲を含んでもよい。他の非限定例において、用量はまた、１投与当たり、約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重から、約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重またはこれ以上、およびこの中で導き出せる任意の範囲を含んでもよい。本明細書に列挙された数から導き引き出せる範囲の非限定例において、約５ｍｇ／ｋｇ／体重から約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重から約５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲が、上記に記載された数に基づき投与されてもよい。
【０１２０】
いずれの場合も、組成物は、１つ以上の成分の酸化を遅らせる様々な抗酸化剤を含むことができる。
【０１２１】
組成物が液体形態にある実施形態において、担体は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、脂質（例えば、トリグリセリド、植物油、リポソーム）およびこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない溶媒または分散媒を含むことができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤の使用；例えば液体ポリオールまたは脂質などの担体における分散により必要とされる粒径の維持；例えばヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤の使用；またはこれらの組み合わせにより維持することができる。多くの場合、例えば、糖、塩化ナトリウムまたはこれらの組み合わせなどの等張剤が含まれ得る。
【０１２２】
他の実施形態において、点眼薬、点鼻液またはスプレー、エアロゾルまたは吸入薬を使用してもよい。このような組成物は、一般的に標的組織タイプと適合可能であるように設計される。非限定例において、点鼻液は通常、液滴またはスプレーにおいて鼻腔に投与されるように設計された水溶液である。点鼻液は、正常な線毛作用が維持されるように、多くの点で鼻汁に類似するように調製される。故に、幾つかの実施形態において水性点鼻液は、通常は等張性であり、または約５．５から約６．５のｐＨを維持するようにわずかに緩衝される。さらに、必要であれば、眼科製剤、薬物、または適切な薬物安定剤において使用されるものと類似した抗菌性防腐剤が、製剤に含まれてもよい。例えば、様々な市販の点鼻剤が知られており、抗生物質または抗ヒスタミン薬などの薬物を含む。
【０１２３】
特定の実施形態において抗体は、経口摂取のような経路による投与のために調製される。これらの実施形態において、固体組成物は、例えば、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、ピル、カプセル（例えば、ハードまたはソフトシェルゼラチンカプセル）、持続放出製剤、口腔組成物、トローチ、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハー、またはこれらの組み合わせを含むことができる。経口組成物は、食事の食品と直接配合されてもよい。経口投与のための担体は、不活性希釈剤、吸収可能な食用担体またはこれらの組み合わせを含む。他の実施形態において、経口組成物は、シロップまたはエリキシル剤として調製されてもよい。シロップまたはエリキシル剤は、例えば、少なくとも１つの活性剤、甘味剤、防腐剤、香味剤、色素、防腐剤、またはこれらの組み合わせを含むことができる。
【０１２４】
特定の実施形態において経口組成物は、１つ以上の結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、香味剤、およびこれらの組み合わせを含むことができる。特定の実施形態において、組成物は、以下の１つ以上を含むことができる：例えば、ガムトラガカント、アカシア、コーンスターチ、ゼラチンまたはこれらの組み合わせなどの結合剤；例えば、リン酸二カルシウム、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムまたはこれらの組み合わせなどの賦形剤；例えば、コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸またはこれらの組み合わせなどの崩壊剤；例えば、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；例えば、スクロース、ラクトース、サッカリンまたはこれらの組み合わせなどの甘味剤；例えばペパーミント、冬緑油、サクラ香味料、オレンジ香味料などの香味剤；または前述のものの組み合わせ。投与単位形態がカプセルである場合、カプセルは、上記のタイプの材料に加えて、液体担体などの担体を含有することができる。様々な他の材料が被覆剤として、またはさもなければ投与単位の物理的形態を修飾するために存在してもよい。例えば、錠剤、ピル、またはカプセルは、セラック、糖または両方で被覆されてもよい。
【０１２５】
他の投与方法に適切である追加の製剤には、座薬が含まれる。座薬は、直腸、膣または尿道に挿入するために通常は投薬される、様々な重量および形状の固体剤形である。挿入後、座薬は腔体液中で軟化、融解または溶解する。一般に、座薬に関して、伝統的な担体には、例えば、ポリアルキレングリコール、トリグリセリドまたはこれらの組み合わせが含まれ得る。特定の実施形態において、座薬は、例えば、約０．５％から約１０％、および約１％から約２％の範囲で活性成分を含有する混合物から形成することができる。
【０１２６】
組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。エンドトキシン汚染は、安全なレベル、例えば、タンパク質１ｍｇ当たり０．５ｎｇ未満で最小限に保たれるべきであることが理解されよう。
【０１２７】
特定の実施形態において、注射用組成物の吸収の延長は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンまたはこれらの組み合わせなどの組成物中で使用することによりもたらされ得る。
【０１２８】
Ｂ．薬学的使用
モノクローナル抗体は、凝固における遺伝性および後天性欠乏症または障害を治療する治療目的で使用することができる。例えば、上記に記載された実施形態においてモノクローナル抗体は、ａＰＣとその基質（第Ｖａ因子または第ＶＩＩＩａ因子を含み得る）との相互作用をブロックするのに使用することができる。
【０１２９】
モノクローナル抗体は、血小板減少症、血小板障害および出血性障害（例えば、血友病Ａ、血友病Ｂおよび血友病Ｃ）などの止血障害の治療において治療用途を有する。このような障害は、抗ａＰＣモノクローナル抗体の治療的に有効な量を、これを必要とする患者に投与して治療することができる。モノクローナル抗体はまた、外傷および出血性脳卒中などの適応症における制御されない出血の治療においても治療用途を有する。故に、また提供されるのは、抗ａＰＣモノクローナル抗体の治療的に有効な量を、これを必要とする患者に投与するステップを含む、出血時間を短縮する方法である。
【０１３０】
別の実施形態において、抗ａＰＣ抗体は、例えばａＰＣが敗血症または出血性障害の治療に使用されるａＰＣ治療患者に対する解毒剤として有用であり得る。
【０１３１】
該抗体は、止血障害に対処するための単剤療法としてまたは他の療法と併用して使用することができる。例えば、１つ以上の抗体と第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子などの凝固因子との共投与は、血友病の治療に有用と考えられる。１つの実施形態において、提供されるのは、（ａ）ヒト組織因子経路インヒビターに結合するモノクローナル抗体の第一の量、および（ｂ）第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の第二の量を投与するステップを含む、凝固における遺伝性および後天性欠乏症または障害を治療する方法である。前記第一および第二の量は合わせて、前記欠乏症または障害を治療するのに有効である。別の実施形態において、提供されるのは、（ａ）ヒト組織因子経路インヒビターに結合するモノクローナル抗体の第一の量、および（ｂ）第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の第二の量を投与するステップを含む、凝固における遺伝性および後天性欠乏症または障害を治療する方法である。前記第一および第二の量は合わせて、前記欠乏症または障害を治療するのに有効であり、さらに第ＶＩＩ因子は共投与されない。また含まれるのは、モノクローナル抗体および第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の組み合わせの治療的に有効な量を含む医薬組成物である。該組成物は第ＶＩＩ因子を含有しない。「第ＶＩＩ因子」には、第ＶＩＩ因子および第ＶＩＩａ因子が含まれる。これらの併用療法は、凝固因子の必要な注入頻度を低下させる可能性がある。共投与または併用療法は、各々が別個に製剤化された、または１つの組成物に一緒に製剤化された２つの治療薬の投与が意味され、別個に製剤化された場合は、ほぼ同時または異なる時間に投与されるが、同じ治療期間にわたって投与される。
【０１３２】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載された１つ以上の抗体は、止血障害に対処するために併用して使用することができる。例えば、本明細書に記載された２つ以上の抗体の共投与は、血友病または他の止血障害の治療に有用と考えられる。
【０１３３】
該医薬組成物は、血友病ＡまたはＢを罹患している被験者に、出血エピソードの重症度により異なり得る、または予防的治療の場合は患者の凝固欠乏症の重症度により異なり得る投与量および頻度で、非経口的に投与することができる。
【０１３４】
該組成物は、必要としている患者に、ボーラスとしてまたは連続注入により投与することができる。例えば、Ｆａｂ断片として存在している本発明抗体のボーラス投与は、０．００２５から１００ｍｇ／ｋｇ体重、０．０２５から０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０１０から０．１０ｍｇ／ｋｇまたは０．１０〜０．５０ｍｇ／ｋｇの量であってもよい。連続注入に関して、Ｆａｂ断片として存在している本発明抗体は、０．００１から１００ｍｇ／ｋｇ体重／分、０．０１２５から１．２５ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０から０．７５ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０から１．０ｍｇ／ｋｇ／分または０．１０〜０．５０ｍｇ／ｋｇ／分で、１〜２４時間、１〜１２時間、２〜１２時間、６〜１２時間、２〜８時間、または１〜２時間の期間に投与されてもよい。（完全な定常領域を有する）完全長抗体として存在している本発明抗体の投与に関して、投与量は、約１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、２〜８ｍｇ／ｋｇ、または５〜６ｍｇ／ｋｇであってもよい。このような完全長抗体は、典型的には３０分から３時間の期間にわたる注入により投与されるであろう。投与の頻度は、状態の重症度に依存するであろう。頻度は、１週間に３回から２週間から６ヵ月ごとに１回に及ぶであろう。
【０１３５】
さらに、該組成物は、皮下注射により患者に投与することができる。例えば、１０から１００ｍｇ抗ａＰＣ抗体の用量が、週１回、週２回または月１回、皮下注射により患者に投与されてもよい。
【０１３６】
本明細書で使用されるとき、「治療的に有効な量」は、インビボでの凝固時間を効果的に増加させるため、またはさもなければ必要としている患者にインビボでの測定可能な利益をもたらすために必要とされる抗ａＰＣモノクローナル抗体の量、またはこのような抗体および第ＶＩＩＩ因子もしくは第ＩＸ因子の組み合わせの量を意味する。正確な量は、治療組成物の成分および物理的特徴、意図される患者集団、個々の患者の検討などを含むがこれらに限定されない多数の要因に依存し、当業者により容易に決定され得る。
【０１３７】
Ｖ．キット
本明細書に記載された組成物のいずれかがキットに含まれてもよい。故にキットは、適切な容器中に抗体および／または追加の薬剤を含む。他の成分がキットに含まれてもよい。診断キットおよび治療キットは、適切な容器中に、医薬的に許容可能な製剤中の抗体の医薬的に許容可能な製剤を含む。キットは単一容器を有してもよく、および／またはキットは化合物ごとに異なる容器を有してもよい。
【０１３８】
キットの構成要素が１つおよび／または複数の液体溶液において提供される場合、液体溶液は水溶液であり、滅菌水溶液は特定の実施形態の一例である。抗体はまた、注射可能な組成物に製剤化することもでき、その場合容器は、それ自体がシリンジ、ピペット、および／または他のこのような器具であってもよく、そこから製剤が身体の感染部位に適用され得、動物に注射され得、ならびに／またはさらにはキットの他の成分に適用され得および／もしくはキットの他の成分と混合され得る。
【０１３９】
しかし、キットの構成要素は、（１または複数の）乾燥した粉末として提供されてもよい。試薬および／または成分が乾燥粉末として提供される場合、粉末は適切な溶媒の添加により再構成することができる。溶媒は、別の容器でも提供され得ることが想定される。
【０１４０】
容器は一般的に、抗体／抗体製剤が入れられ、適切に配置される少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジおよび／または他の容器を含む。キットはまた、滅菌した医薬的に許容可能な緩衝液および／または他の希釈剤を含有するための第二の容器を含むこともできる。
【０１４１】
キットはまた、例えば、所望のバイアルが保持されている注射および／またはブロー成形プラスチック容器などの、商業販売用に密閉した状態でバイアルを含有するための手段も含むことができる。
【０１４２】
数および／または容器のタイプにかかわらず、キットはまた、動物の体内に最終的な抗体を注射／投与および／もしくは配置することを支援する器具を含み得、ならびに／または該器具と共に包装され得る。このような器具は、シリンジ、ピペット、鉗子、および／またはこのような医学的に承認された送達ビヒクルであってもよい。
【０１４３】
［実施例］
以下の例は、実施形態を実証するために含まれる。以下の例に開示される手法は、実践において十分に機能することが本発明者らにより発見された手法を代表すること、および故に実践のための方法を構成し得ることが当業者により理解されるべきである。しかし、当業者は、多くの変更が、開示される特定の実施形態において行われ得ること、ならびに本趣旨および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果を依然として得ることができることを本開示に照らして理解すべきである。
【０１４４】
［実施例１］−材料および方法
ヒト化１５７３  ＶＨ／ＶＬの設計。マウスａＰＣモノクローナル抗体のタンパク質およびＤＮＡ配列情報を得た。ヒト化設計は以下の方法を用いて行った：ＶＨ／ＶＬ  ＣＤＲ残基を、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／＃ｋａｂａｔｎｕｍのワールドワイドウェブ）により決定し、注釈を付けた。ＶＨ／ＶＬ  ＣＤＲのカノニカル構造を、文献（１〜２）の報告に基づき決定した。ＶＨ／ＶＬ  ＣＤＲカノニカル構造に基づき、同じカノニカル構造を有するヒト生殖細胞系列フレームワークアクセプターを選択した。
【０１４５】
１５７３配列を使用してＰＤＢデータベースをｂｌａｓｔ検索し、標的抗体と最も高い配列同一性を共有する既知の抗体構造を得た。検索および配列同一性比の出力に基づき、１Ｍ７１、１Ｍ７Ｄ、および１Ｍ７ＩをＶＨモデリングのテンプレートとして選択し、一方、１ＩＱＷ、１ＩＴ９および２ＧＣＹをＶＬ鎖モデリングのテンプレートとして選択した。Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒスイートソフトウェアを使用して、ループ最適化によりＶＬおよびＶＨ鎖の相同性モデルを構築した。次いで、出力モデルをＣＣＰ４スイートのソフトウェア「コンタクト」で分析して、４Ａ内のＣＤＲ領域からの残基と相互作用するフレームワーク領域内の全ての残基のリストを得た。ソフトウェアの出力およびモデルを用いた目視検査に基づき、ＣＤＲループの支持に寄与する残基としてフレームワーク中の以下の残基を同定した。それらは：軽鎖残基Ａｓｐ７０、Ｔｙｒ３６、Ｔｈｒ６９、Ｐｈｅ７１、Ｉｌｅ２およびＴｙｒ４９；重鎖残基Ａｒｇ９４、Ａｒｇ３８、Ｇｌｕ４６、Ｔｒｐ４７、Ａｓｐ７３、Ａｒｇ７１、およびＴｒｐ１０２であった。ヒト化ＶＨの設計のために、ループ構造およびＶＨ／ＶＬ接触面を支持する残基を同定した（国際出願第ＷＯ２００８０２１１５６号）。ループコンフォメーションに重要な残基およびＶＨ／ＶＬ接触面を復帰変異させた。次いで、復帰変異を有するＶＨ配列を、選択した生殖細胞系列サブファミリーと整列させた。同じ標準サブセット内の個々のヒト生殖細胞系列フレームワーク配列との同一性および類似性を分析し、マウスＶＨ配列と最良の全体的相同性を有する生殖細胞系列配列を同定した。それを、ＶＨ  ＣＤＲを移植するためのアクセプターヒト生殖細胞系列フレームワークとして選択した。変異に関するさらなる検討には、Ｎ末端ピログルタミン酸形成を排除するのに使用したＱ１Ｅ変異が含まれた。変異は、ＣＤＲカノニカル構造およびＶＨ／ＶＬ接触面に関して、選択したＶＨファミリー内のコンセンサスを維持するものも含んだ。変異は、分子モデリングによりＣＤＲ結合領域から４Ａ内として同定されたものも含み得る。分析を行って、計画したヒト化構築物中にＮ−連結グリコシル化パターン（Ｎ−｛Ｐ｝−Ｓ／Ｔ）が見出されないことを確認した。
【０１４６】
ヒトＪＨ領域を、最良の配列相同性に基づき選択した。ヒト化ＶＬ配列も、上述されたような方法に基づき設計した。
【０１４７】
ＨＣおよびＬＣ発現プラスミドの生成。ヒト化Ｖ領域配列を、遺伝子デノボ合成アプローチを用いて構築した。ＰＣＲ増幅ＶＨを、相同組換えによりｐＣＰ−ｈＣｇ１発現ベクターにクローニングした。同じ方法を用いて増幅ＶｋをｐＣＰ−ｈｃｋベクターにクローニングした。
【０１４８】
キメラＨＣおよびＬＣ（ＶＨおよびＶＬ）の可変領域を、１５７３からＰＣＲ増幅した。ゲル精製したＰＣＲ生成物を、相同組換えによりヒト化Ｖ領域と同じベクターにクローニングした。
【０１４９】
ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクション。トランスフェクションの約２４時間前に、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３Ｅを０．５×１０６細胞／ｍｌで継代し、細胞を３７℃、８％ＣＯ２、１２０ｒｐｍ／分で振盪した。トランスフェクション当日、細胞密度は約１．０〜１．２×１０６／ｍｌとなるはずである。細胞を増殖培地と共に１×１０６／ｍｌに分けた。最適トランスフェクションを確保するために、細胞の生存率を＞９５％に決定した。ＤＮＡを、トランスフェクトした培養物の１０分の１に等しい容量でＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（２９３Ｅ）に希釈した。ＰＥＩをＤＮＡに添加し、混合物を直ちにボルテックスし、細胞に添加する前に室温で１０分間インキュベートした。最終濃度のＤＮＡ対ＰＥＩ比は１：２であった。
【０１５０】
ヒト化１５７３  ＩｇＧ抗体の精製。６日目の上記の馴化培地を、１０ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７．０により予め平衡化した１ｍｌプロテインＡカラムに充填した。次いでカラムを、試料充填後のベースラインまで緩衝液を平衡化しながら洗浄した。洗浄後、カラムを１００ｍＭ  グリシン−ＨＣｌ  ｐＨ３．０で溶出し、その後直ちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液を添加してｐＨ値を８．０に調整した。最終生成物をＰＢＳ溶液に対して透析した。タンパク質純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣにより分析し、その濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ方法により決定した。
【０１５１】
精製抗体のサイズ排除クロマトグラフィー分析。精製抗体を分析するためのＳＥＣは、周囲温度でＨＰＬＣシステム（ＬＣ−２０ＡＤ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を用いてＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ５／１５０、ＧＬカラムで実施した。ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．０、流速０．３ｍＬ／分を移動相として使用した。タンパク質検出は２８０ｎｍ未満であった。
【０１５２】
ＣＭ５チップへの抗マウスＦＣ抗体の固定化。ＣＭ５センサーチップを、新しく調製した１：１  ５０ｍＭ  ＮＨＳ：２００ｍＭ  ＥＤＣを６分間注入（１０μｌ／分）してＦＣ２において活性化させた。次いで、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中の抗マウスＦＣ抗体、ＰＨ５．０（９０μｌ  ＮａＡｃ、ｐＨ５．０に希釈した１．４μｌ）を、５μｌ／分で活性化チップに注入した（ＨＢＳ−ＥＰランニング緩衝液：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）。残りの活性な結合部位は、１Ｍエタノールアミンを１０μｌ／分で７分間注入してブロックした。約９２００  ＲＵを生成した。
【０１５３】
ＣＭ５チップへの抗ヒトＦＣ抗体の固定化。ＣＭ５センサーチップを、新しく調製した１：１  ５０ｍＭ  ＮＨＳ：２００ｍＭ  ＥＤＣを７分間注入（１０μｌ／分）してＦＣ２において活性化した。次いで、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中の抗ヒトＦＣ抗体、ＰＨ５．０中の抗ヒトＦＣ抗体（９０μｌ  ＮａＡｃ、ｐＨ５．０で希釈した２．５μｌ）を、５μｌ／分で活性化チップに注入した（ＨＢＳ−ＥＰランニング緩衝液：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）。残りの活性な結合部位は、１Ｍエタノールアミンを１０μｌ／分で７分間注入してブロックした。約６４００  ＲＵを生成した。
【０１５４】
１５７３抗体へのヒトａＰＣ結合のＢｉａｃｏｒｅ分析。先ず１５７３抗体を抗ヒトＦＣ  ＩｇＧ被覆ＣＭ５チップに捕捉し、その後、抗原ヒトａＰＣを０、１．２５、２．５、５、１０および２０ｎＭの濃度で注入した。サイクル条件は次の通りであった：３０μｌ／分、結合段階１８０秒、および解離段階５００秒。Ｇｌｙ、ｐＨ１．５を１０μｌ／分で３０秒間注入して表面を再生した。ＨＢＳ−ＥＰランニング緩衝液：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０。動態をＢｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００評価ソフトウェア、バージョン２．０を用いて計算した。
【０１５５】
１５７３抗体へのｃｙｎｏ  ａＰＣ結合のＢｉａｃｏｒｅ分析。先ず１５７３抗体を抗ヒトＦＣ  ＩｇＧ被覆ＣＭ５チップに捕捉し、その後、抗原ｃｙｎｏ  ａＰＣを０、５、１０、２０、４０、８０ｎＭの濃度で注入した。サイクル条件は次の通りであった：３０μｌ／分、結合段階１８０秒、および解離段階４２０秒。Ｇｌｙ、ｐＨ１．５を１０μｌ／分で４５秒間注入して表面を再生した。動態をＢｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００評価ソフトウェア、バージョン２．０を用いて計算した。
【０１５６】
精製抗体の結合ＥＬＩＳＡ。プレート（Ｎｕｎｃ、カタログ＃４４２４０４）を、ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ＃１４０４０）で一晩（ｏ／ｎ）、４℃で希釈した１００μｌのヒトａＰＣ（１μｇ／ｍｌ）、ｈＰＣ（２μｇ／ｍｌ）、サルａＰＣ（２μｇ／ｍｌ）、またはサルＰＣ（２μｇ／ｍｌ）により被覆した。洗浄後、ＥＬＩＳＡプレートを２００μｌ  ＭＰＢＳＴで１時間、室温でブロックし、大量のペーパータオル上で軽く叩いて乾燥させた。各ウェルにテストする１００μｌのＩｇＧを添加し、室温で１時間インキュベートした（ＥＣ５０決定のために２０ｎＭで開始し、１：３希釈を行った）。
【０１５７】
プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。ＰＢＳＴで１：１００００希釈した抗ｈＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ａ０１７０）１００μｌを各ウェルに添加した。プレートを洗浄し、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質を添加し、室温で５分間インキュベートした。１００μｌ／ウェルの１Ｎ  ＨＣｌを添加して反応を停止した。プレートをＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｅｌｘ４０５）を用いて４５０ｎｍ波長で読み取った。
【０１５８】
［実施例２］−結果
キメラおよびヒト化１５７３抗体の設計および配列分析。Ｋａｂａｔ番号付け（ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／＃ｋａｂａｔｎｕｍのワールドワイドウェブ）ＣＤＲ残基を有する可変領域配列アノテーションに下線が引かれている：
ＶＨ：
2016501875.tif 000005
【０１５９】
ＶＬ：
2016501875.tif 000006
【０１６０】
１５７３  ＶＨカノニカル構造：１−４−Ｈ１およびＨ２カノニカル構造に基づき、ＶＨをＶＨ３生殖細胞系列フレームワーク配列のサブセットにヒト化することができる。１５７３  Ｖｋカノニカル構造：４−１−１−４−１−１  Ｖｋ  ＣＤＲカノニカル構造に基づき、ＶｋをＶＫＩＩ生殖細胞系列フレームワーク配列のサブセットにヒト化することができる。
【０１６１】
１５７３  ＶＨヒト化設計。生殖細胞系列ＶＨ３−７２は、１５７３  ＶＨ配列と最良の全体的相同性を有した。生殖細胞系列ＶＨ３−７２を、１５７３  ＶＨ  ＣＤＲ配列を移植するためのアクセプターヒト生殖細胞系列フレームワークとして選択した。ｈＪＨ６を最良の相同性により１５７３ヒト化に使用する。全ての可能性のある復帰変異を以下にリストする。
【０１６２】
Ｇ４９Ａ−バーニアゾーン残基、カノニカル残基（効果ＣＤＲ  Ｈ２、スコア３）、ヒト残基。
【０１６３】
Ｎ７６Ｓ−カノニカル残基（効果ＣＤＲＨ１、スコア３）、ヒト残基
Ｌ７８Ｖ−バーニアゾーン残基、カノニカル残基（効果ＣＤＲＨ１、スコア３）、ヒト残基
Ａ９３Ｉ−バーニアゾーン残基。カノニカル残基（効果ＣＤＲ  Ｈ３、スコア３）、ヒト残基。
【０１６４】
ＣＤＲを有するヒト化１５７３  ＶＨ設計に下線が引かれ、復帰変異に二重下線が引かれている：
１５７３  ＶＨ（配列番号１５）                  
2016501875.tif 000007
【０１６５】
Ｈ１５７３  ＶＨ．１（配列番号１６）            
2016501875.tif 000008
【０１６６】
Ｈ１５７３  ＶＨ．１Ａ（配列番号１７）          
2016501875.tif 000009
【０１６７】
Ｈ１５７３  ＶＨ．１Ｂ（配列番号１８）          
2016501875.tif 000010
【０１６８】
Ｈ１５７３  ＶＨ．１Ｃ（配列番号１９）          
2016501875.tif 000011
【０１６９】
Ｈ１５７３  ＶＨ．１Ｄ（配列番号２０）          
2016501875.tif 000012
【０１７０】
Ｈ１５７３  ＶＨ．１Ｅ（配列番号２１）          
2016501875.tif 000013
【０１７１】
Ｈ１５７３  ＶＨ．１Ｆ（配列番号２２）
2016501875.tif 000014
【０１７２】
ＶＨ３−７２（配列番号２３）
2016501875.tif 000015
【０１７３】
ＶＨ３−７２／ＪＨ６（配列番号２４）
2016501875.tif 000016
【０１７４】
１５７３  Ｖｋヒト化設計。Ｖｋ生殖細胞系列Ａ２は、１５７３  Ｖｋ配列と最良の全体的相同性を有した。Ｖｋ生殖細胞系列Ａ２を、１５７３  Ｖｋ  ＣＤＲ配列を移植するためのアクセプターヒト生殖細胞系列フレームワークとして選択した。ｈＪｋ２を最良の相同性により１５７３ヒト化に使用する。ループコンフォメーションおよびＶＨ／ＶＬ接触面に重要な残基が黄色で、Ｋａｂａｔ番号を有するＣＤＲが赤でハイライトされている。
【０１７５】
１５７３Ｖｋヒト化設計において可能性のある復帰変異：
Ｍ４Ｌ−バーニアゾーン残基（効果ＣＤＲＬ１、３、スコア３）、ヒト残基
Ｇ６８Ｒ−バーニアゾーン残基
ＣＤＲを有するヒト化１５７３  Ｖｋ設計に下線が引かれ、および復帰変異に二重下線が引かれている：
１５７３  Ｖｋ（配列番号２５）
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【０１７６】
Ｈ１５７３Ｖｋ．２（配列番号２６）
2016501875.tif 000018
【０１７７】
Ｈ１５７３Ｖｋ．２Ａ（配列番号２７）
2016501875.tif 000019
【０１７８】
Ｈ１５７３Ｖｋ．２Ｂ（配列番号２８）
2016501875.tif 000020
【０１７９】
Ｈ１５７３Ｖｋ．２Ｃ（配列番号２９）
2016501875.tif 000021
【０１８０】
Ａ２（配列番号３０）
2016501875.tif 000022
【０１８１】
ＶＨおよびＶＬの両方で、計画したヒト化構築物中にＮ−連結グリコシル化パターン（Ｎ−｛Ｐ｝−Ｓ／Ｔ）は見出されなかった。
【０１８２】
ヒト化ＶＨおよびＶＬクローニング。全てのヒト化ＶＨおよびＶＬを、遺伝子デノボ合成アプローチにより構築し、それらを２９３発現ベクターｐＣｐにクローニングした。ヒト化抗体の構築物を表２にまとめる：
【表３】
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【０１８３】
キメラおよびヒト化１５７３抗体の発現および精製。２９３トランスフェクション設計を表３にまとめた。６日目の馴化培地（方法３．３）を１ｍｌプロテインＡカラムに充填した。組換え１５７３抗体を回収し、精製した。キメラおよびヒト化１５７３  ＩｇＧタンパク質は全て、良好な発現レベルを示した。
【表４】
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【０１８４】
精製キメラおよびヒト化１５７３抗体のＳＥＣ特徴付け。精製キメラ１５７３およびヒト化抗体の純度および凝集のパーセンテージを評価するために、試料をそれぞれＳＥＣに充填した（図１）。全てのＣＰ生成抗体を、５．７５分頃の単一の急なピークとしてＰＢＳ、ｐＨ７．０緩衝液で溶出した。溶出時間は、タンパク質マーカーの１つ（１５８ｋＤａ、溶出時間は５．８５分）に極めて近く、それらのほとんどが９０％を超える単量体を、２つの抗体が８０％を超える単量体を示すことを示唆している。
【０１８５】
ヒト化抗体への１５７３結合のＢｉａｃｏｒｅ分析。アミン結合方法を用いて、ａＰＣを新たなＣＭ５チップに直接固定化した。一晩の平衡後、１００ｎｍ  １５７３抗体を表面に注入し、強いシグナルを検出した。したがって、親和性決定はこのチップを用いて行った。各抗体を、３０μｌ／分、結合段階１８０秒および解離段階３００秒でそれぞれチップ表面に注入した。
【表５】
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【０１８６】
精製抗体の結合ＥＬＩＳＡ。ヒトＰＣおよび陰性対照としてのサルＰＣに関して、異なる濃度のヒト化抗体は、極めて弱い反応を示した。それらは、ヒトＰＣおよびサルＰＣ抗原への結合がない。結果を図５および図６に示した。ヒトａＰＣおよびサルａＰＣに関して、全てのヒト化抗体は良好な結合親和性を示し、Ｂｉａｃｏｒｅ分析（表４）を裏付けた。ヒト化抗体の希釈曲線を用いて、本発明者らは各抗体のＥＣ５０も計算し、表５に示す。
【０１８７】
キメラおよびヒト化１５７３をＣＰの発現ベクターにクローニングし、ＣＰにおいて生成した。キメラおよびヒト化抗体を含むａＰＣと抗体の相互作用を、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにより迅速結合および迅速解離として特徴付ける。さらに、全てのヒト化１５７３バリアントは親和性基準を満たした。Ｈｕ１５７３−１、２、５、８、１０は、５ｎＭより高い親和性を有し、２〜３の復帰変異のみであることから良好な候補となり得る。
【表６】
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【０１８８】
本明細書に開示され、特許請求された全ての組成物および／または方法は、本開示に照らして過度な実験をすることなく作製および実行することができる。組成物および方法は、特定の実施形態に関して記載されているが、本開示の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された組成物および／または方法、ならびに方法のステップまたはステップの順序において、変形形態が適用され得ることが当業者に明らかとなろう。より詳細には、化学的および生理学的に関連した特定の薬剤が、本明細書に記載された薬剤に対して置換され得るが、同じまたは類似の結果が達成されることが明らかとなろう。当業者に明らかな全てのこのような類似の置換および修飾は、添付の特許請求の範囲により定義された趣旨、範囲および概念の範囲内と見なされる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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