(57)【要約】  本発明は、線虫Gタンパク質共役受容体(GPCR)を発現し、これにより、GPCRとのリガンドの結合が、検出可能なシグナルをもたらす酵母細胞に関する。特に、本発明は、一連の異なるGPCRを発現する酵母ライブラリー、及び前記ライブラリーをスクリーニングする方法に関する。
2016516422.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
i)構成的プロモーターに作動可能に連結した線虫Gタンパク質共役受容体(GPCR)をコードする第1のポリヌクレオチドを含む第1の高コピー数染色体外ポリヌクレオチドと、
ii)酵母MAPキナーゼ経路により活性化されるプロモーターに作動可能に連結したガラクトシダーゼ又は選択可能な成長マーカーをコードする第2のポリヌクレオチドを含む第2の高コピー数染色体外ポリヌクレオチドであって、プロモーターがFUS-1プロモーターでない、第2の高コピー数染色体外ポリヌクレオチドと、
iii)変異酵母gpa-1遺伝子と、
iv)プロモーターに作動可能に連結した、酵母gpa-1のN末端と線虫Gタンパク質の少なくとも4つのC末端アミノ酸とを含むキメラGタンパク質をコードする第3のポリヌクレオチドと
を含み、
各プロモーターが、細胞でのポリヌクレオチドの発現を指示する酵母細胞。
【請求項２】
酵母が、変異sst-1遺伝子及び変異far-1遺伝子をさらに有する、請求項1に記載の酵母細胞。
【請求項３】
酵母が、変異ste-2遺伝子をさらに有する、請求項1又は請求項2に記載の酵母細胞。
【請求項４】
酵母MAPキナーゼ経路により活性化されるプロモーターが、FIG-1又はFIG-2プロモーターである、請求項1から3のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項５】
第1のポリヌクレオチドに作動可能に連結した構成的プロモーターが、PGKプロモーター、ADH-1プロモーター、ENOプロモーター、PYK-1プロモーター及びCYC-1プロモーターから選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項６】
少なくとも100コピー数のそれぞれ第1及び第2の高コピー数染色体外ポリヌクレオチドを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項７】
酵母が、サッカロマイセス・セレビシエである、請求項1から6のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項８】
酵母が、一倍体である、請求項1から7のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項９】
酵母が、a接合型である、請求項1から8のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１０】
第3のポリヌクレオチドが、酵母細胞のゲノムに安定的に組み込まれている、請求項1から9のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１１】
線虫が、カエノラブディティス・エレガンスである、請求項1から10のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１２】
線虫GPCRが、化学受容体、嗅覚受容体又は味覚受容体である、請求項1から11のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１３】
線虫GPCRが、配列番号1から297の1つ又は複数と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１４】
キメラGタンパク質が、線虫Gタンパク質の約5つのC末端アミノ酸を含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１５】
選択可能な成長マーカーが、栄養マーカー又は抗生物質耐性マーカーである、請求項1から14のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１６】
栄養マーカーが、HIS3、ADE2、URA2、LYS2、ARG2、LEU2、TRP1、MET15、HIS4、URA3、URA5、SFA1、LYS5、ILV2、FBA1、PSE1、PDI1及びPGK1から選択される、請求項15に記載の酵母細胞。
【請求項１７】
ガラクトシダーゼが、β-ガラクトシダーゼ又はα-ガラクトシダーゼである、請求項1から16のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１８】
β-ガラクトシダーゼが、LacZである、請求項17に記載の酵母細胞。
【請求項１９】
キメラGタンパク質をコードする第3のポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターが、内因性gpa-1プロモーターである、請求項1から18のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項２０】
第1及び第2の染色体外ポリヌクレオチドが、プラスミドである、請求項1から19のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項２１】
請求項1から20のいずれか一項に記載の酵母細胞の集団又はライブラリーであって、少なくとも10の酵母細胞が異なる線虫GPCRを有する、集団又はライブラリー。
【請求項２２】
平均で、各酵母細胞が、少なくとも100コピー数のそれぞれ第1及び第2の高コピー数染色体外ポリヌクレオチドを含む、請求項21に記載の集団又はライブラリー。
【請求項２３】
配列番号1から297として示されるアミノ酸配列を含む線虫GPCRを少なくとも10、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも250又は全て含む、請求項21又は請求項22に記載の集団又はライブラリー。
【請求項２４】
請求項1から20のいずれか一項に記載の酵母細胞、又は請求項21から23のいずれか一項に記載の酵母細胞の集団を含む組成物。
【請求項２５】
線虫Gタンパク質共役受容体と結合しそれを活性化するリガンドについてスクリーニングする方法であって、
i)請求項1から20のいずれか一項に記載の酵母細胞を候補リガンドと接触させる工程と、
ii)細胞がガラクトシダーゼ又は選択可能な成長マーカーを発現するかどうかを決定する工程と
を含み、
ガラクトシダーゼ活性又は選択可能な成長マーカーの活性の存在が、リガンドが線虫Gタンパク質共役受容体と結合しそれを活性化することを示す方法。
【請求項２６】
リガンドが線虫Gタンパク質共役受容体と結合しそれを活性化する場合の方法のzファクターが、約0.5から1である、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
リガンドが揮発性である、請求項25又は請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
リガンドが、化合物のライブラリー由来である、請求項25から27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
請求項21から23のいずれか一項に記載の集団又はライブラリーをスクリーニングする工程を含む、請求項25から28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
試料中のリガンドを検出する方法であって、
i)リガンドと結合しそれにより活性化される線虫Gタンパク質共役受容体を含む請求項1から20のいずれか一項に記載の少なくとも1つの酵母細胞を接触させる工程と、
ii)細胞がガラクトシダーゼ又は選択可能な成長マーカーを発現するかどうかを決定する工程と
を含み、
ガラクトシダーゼ活性又は選択可能な成長マーカーの活性の存在が、リガンドが試料中に存在することを示す方法。
【請求項３１】
試料中のシクロヘキサノンを検出する方法であって、
i)試料を、配列番号26若しくは配列番号287として示されるアミノ酸配列又はシクロヘキサノンと結合するそのバリアントを含むポリペプチドと接触させる工程と、
ii)ポリペプチドがシクロヘキサノンと結合するかどうかを検出する工程と
を含む方法。
【請求項３２】
ポリペプチドが、検出可能に標識されている、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
バリアントが、配列番号26若しくは配列番号287と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列又はそのシクロヘキサノン結合性断片を含む、請求項31又は請求項32に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線虫Gタンパク質共役受容体(GPCR)を発現し、これにより、GPCRとのリガンドの結合が、検出可能なシグナルをもたらす酵母細胞に関する。特に、本発明は、一連の異なるGPCRを発現する酵母ライブラリー、及び前記ライブラリーをスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
典型的に、酵母でのGタンパク質共役受容体(GPCR)スクリーニングは、治療活性又は選択的毒性のための潜在的な標的として同定及び確認されている単一(又は少数)のGPCRについて行われる。これらは、次いで、臨床化学及び薬物開発のためのリード化合物を同定するために、大きいかつ/又は多様な化学ライブラリーを用いてスクリーニングされる。次いで、スクリーニングアッセイを、リード化合物の最適化のプロセスを支援するために、用いる。
【０００３】
対照的に、酵母で発現されたタンパク質ライブラリーの、新しいタンパク質-リガンド相互作用についてのスクリーニングは、酵母で確実に発現される多数の異なる分子に依拠する。このことは、アッセイの感度及び頑健性における難題を導く。このことは、線虫GPCRのような比較的特徴づけられていないクラスのタンパク質を用い、揮発性リガンドを用いてスクリーニングすることを考慮する場合に、特に当てはまる。これらの態様は、使用可能な十分に大きいzファクターをスクリーニングアッセイが有するならば、安定した高レベルの線虫GPCRの発現と、厳密に調節されているがリガンドによって強く誘導可能なレポーター発現とを必要とする。
【０００４】
Minicら(2005)は、ラット嗅覚受容体I7及びヒトOR17-40を用いた結果に基づく、哺乳動物化学受容体についてのスクリーニングアッセイに関する。彼らの方法論は、ラットORの発現を駆動するための誘導性galプロモーター、受容体活性化を酵母の内因性GPCR伝達カスケードに共役させるためのラットGαolf及びレポーター遺伝子であるホタルルシフェラーゼの発現を駆動するためのfus-1プロモーターを用いたものである。しかし、哺乳動物Gαolfを線虫-酵母キメラGαであるgpa-1/odr-3で置き換えることを含む、このアッセイを再現するための努力は、成功しなかったことが示された(未発表の結果)。
【０００５】
新規な受容体-リガンド対を同定するために、特にリガンドが揮発性化合物である場合に、線虫GPCRを発現する酵母ライブラリーをスクリーニングする方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO 99/14344
【特許文献２】WO 99/18211
【特許文献３】WO 00/024878
【特許文献４】WO 99/049019
【特許文献５】US 5,229,285
【特許文献６】US 5,219,737
【特許文献７】US 5,843,746
【特許文献８】US 5,196,524
【特許文献９】US 5,670,356
【特許文献１０】WO 2007/019634
【特許文献１１】WO 01/46691
【特許文献１２】WO 2010/085844
【特許文献１３】WO 2013/155553
【特許文献１４】WO 2004/057333
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J. Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning、  John Wiley and Sons(1984)
【非特許文献２】J. Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)
【非特許文献３】T.A. Brown(編)、Essential Molecular Biology: A Practical Approach、第1巻及び第2巻、IRL Press(1991)
【非特許文献４】D.M. Glover及びB.D. Hames(編)、DNA Cloning: A Practical Approach、第1〜4巻、IRL Press(1995及び1996)
【非特許文献５】F.M. Ausubelら(編)、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience(1988、現在までの全ての改訂版を含む)
【非特許文献６】Roseら、1990、Methods in Yeast Genetics、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
線虫受容体は、独特なGPCRクレードを含む(Fredriksson及びSchioth、(2005))。様々な酵母発現異種GPCRアッセイが記載されているが、本発明者らは、驚くべきことに、線虫GPCRを用いてはこれらのいずれも有用に働かないことを見出した。したがって、本発明者らは、独自のアッセイを開発する必要があった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第1の態様では、本発明は、
i)構成的プロモーターに作動可能に連結した線虫Gタンパク質共役受容体(GPCR)をコードする第1のポリヌクレオチドを含む第1の高コピー数染色体外ポリヌクレオチドと、
ii)酵母MAPキナーゼ経路により活性化されるプロモーターに作動可能に連結したガラクトシダーゼ又は選択可能な成長マーカーをコードする第2のポリヌクレオチドを含む第2の高コピー数染色体外ポリヌクレオチドであって、プロモーターがFUS-1プロモーターでない、第2の高コピー数染色体外ポリヌクレオチドと、
iii)変異酵母gpa-1遺伝子と、
iv)プロモーターに作動可能に連結した、酵母gpa-1のN末端と線虫Gタンパク質の少なくとも4つのC末端アミノ酸とを含むキメラGタンパク質をコードする第3のポリヌクレオチドと
を含み、
各プロモーターが、細胞でのポリヌクレオチドの発現を指示する酵母細胞を提供する。
【００１０】
好ましい実施形態では、酵母は、変異sst-1遺伝子及び変異far-1遺伝子をさらに有する。
【００１１】
さらに好ましい実施形態では、酵母は、変異ste-2遺伝子をさらに有する。
【００１２】
ある実施形態では、リガンドがGPCRと結合する場合、得られるzファクターは、約0.5から1、又は約0.70から1、又は約0.8から1、又は約0.9から1、又は約0.8から約0.98の間、又は約0.9から約0.98の間、又は約0.94である。
【００１３】
ある実施形態では、酵母MAPキナーゼ経路により活性化されるプロモーターは、FIG-1又はFIG-2プロモーターである。
【００１４】
さらなる実施形態では、第1のポリヌクレオチドに作動可能に連結した構成的プロモーターは、PGKプロモーター、ADH-1プロモーター、ENOプロモーター、PYK-1プロモーター及びCYC-1プロモーターから選択される。
【００１５】
なおさらなる実施形態では、細胞は、少なくとも約75、又は少なくとも約100、又は少なくとも約150、又は約75から約500の間、又は約100から約400の間、又は約100から約250の間のコピー数の第1及び第2の高コピー数染色体外ポリヌクレオチドを含む。
【００１６】
好ましい実施形態では、酵母は、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である。
【００１７】
好ましくは、酵母は、一倍体である。ある実施形態では、酵母は、a接合型である。酵母がα接合型である場合、ste-2遺伝子ではなくste-3遺伝子が変異されていることが好ましい。
【００１８】
ある実施形態では、第3のポリヌクレオチドは、酵母細胞のゲノムに安定的に組み込まれている。
【００１９】
ある実施形態では、線虫は、カエノラブディティス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)である。
【００２０】
ある実施形態では、線虫GPCRは、化学受容体、嗅覚受容体又は味覚受容体である。
【００２１】
当業者が認識するように、広く多様な異なる線虫GPCRを本発明において用いることができる。ある実施形態では、線虫GPCRは、配列番号1から297の1つ若しくは複数と少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%若しくは少なくとも99%同一であり、かつ/又は配列番号310から606の1つ若しくは複数と少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%若しくは少なくとも99%同一であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含む。
【００２２】
ある実施形態では、キメラGタンパク質は、線虫Gタンパク質の約5つのC末端アミノ酸を含む。ある実施形態では、キメラGタンパク質は、配列番号298から303の1つ若しくは複数と少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%若しくは少なくとも99%同一であり、かつ/又は配列番号304から309の1つ若しくは複数と少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%若しくは少なくとも99%同一であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含む。
【００２３】
ある実施形態では、選択可能な成長マーカーは、栄養マーカー又は抗生物質耐性マーカーである。当業者が認識するように、それらに限定されないが、HIS3、ADE2、URA2、LYS2、ARG2、LEU2、TRP1、MET15、HIS4、URA3、URA5、SFA1、LYS5、ILV2、FBA1、PSE1、PDI1及びPGK1を含む広く多様な栄養マーカーが、本発明のために有用である。
【００２４】
ある実施形態では、ガラクトシダーゼは、β-ガラクトシダーゼ又はα-ガラクトシダーゼである。
【００２５】
ある実施形態では、β-ガラクトシダーゼは、LacZである。
【００２６】
ある実施形態では、キメラGタンパク質をコードする第3のポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターは、内因性gpa-1プロモーターである。
【００２７】
ある実施形態では、染色体外ポリヌクレオチドは、プラスミド、コスミド又はウイルスである。好ましい実施形態では、染色体外ポリヌクレオチドは、プラスミドである。
【００２８】
本発明の酵母細胞の集団又はライブラリーであって、少なくとも10、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも100の酵母細胞が異なる線虫GPCRを有する、集団又はライブラリーも提供される。
【００２９】
ある実施形態では、平均で、各酵母細胞は、少なくとも100コピー数のそれぞれ第1及び第2の高コピー数染色体外ポリヌクレオチドを含む。
【００３０】
ある実施形態では、集団又はライブラリーは、配列番号1から297として示されるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号1から297の1つ若しくは複数と少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%若しくは少なくとも99%同一である線虫GPCRを少なくとも10、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも250又は全て含む。
【００３１】
本発明の酵母細胞又は本発明の酵母細胞の集団を含む組成物も提供される。
【００３２】
本発明の酵母細胞は、新しいリガンド/受容体の対を同定するために用いることができる。
【００３３】
よって、別の態様では、本発明は、線虫Gタンパク質共役受容体と結合しそれを活性化するリガンドについてスクリーニングする方法であって、
i)本発明の酵母細胞を候補リガンドと接触させる工程と、
ii)細胞がガラクトシダーゼ又は選択可能な成長マーカーを発現するかどうかを決定する工程と
を含み、
ガラクトシダーゼ活性又は選択可能な成長マーカーの活性の存在が、リガンドが線虫Gタンパク質共役受容体と結合しそれを活性化することを示す方法を提供する。
【００３４】
ある実施形態では、リガンドが線虫Gタンパク質共役受容体と結合しそれを活性化する場合の方法のzファクターは、約0.5から1、又は約0.70から1、又は約0.8から1、又は約0.9から1、又は約0.8から約0.98の間、又は約0.9から約0.98の間、又は約0.94である。
【００３５】
ある実施形態では、リガンドは揮発性である。
【００３６】
さらなる実施形態では、リガンドは化合物のライブラリー由来である。
【００３７】
さらなる実施形態では、方法は、本発明の集団又はライブラリーをスクリーニングする工程を含む。
【００３８】
ある実施形態では、同じGタンパク質共役受容体を発現する少なくとも2又は3つの別々の酵母コロニー/培養物を、リガンド結合についてスクリーニングする。
【００３９】
さらなる態様では、本発明は、試料中のリガンドを検出する方法であって、
i)リガンドと結合しそれにより活性化される線虫Gタンパク質共役受容体を含む本発明の少なくとも1つの酵母細胞を接触させる工程と、
ii)細胞がガラクトシダーゼ又は選択可能な成長マーカーを発現するかどうかを決定する工程と
を含み、
ガラクトシダーゼ活性又は選択可能な成長マーカーの活性の存在が、リガンドが試料中に存在することを示す方法を提供する。
【００４０】
本発明者らは、シクロヘキサノンと結合し、よってこの化合物を検出するための方法に用いることができる特定のポリペプチドも同定した。
【００４１】
したがって、さらなる態様では、本発明は、試料中のシクロヘキサノンを検出する方法であって、
i)試料を、配列番号26若しくは配列番号287として示されるアミノ酸配列又はシクロヘキサノンと結合するそのバリアントを含むポリペプチドと接触させる工程と、
ii)ポリペプチドがシクロヘキサノンと結合するかどうかを検出する工程と
を含む方法を提供する。
【００４２】
ある実施形態では、バリアントは、配列番号26若しくは配列番号287と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%若しくは少なくとも99%同一であるアミノ酸配列又はそのシクロヘキサノン結合性断片を含む。
【００４３】
ある実施形態では、ポリペプチドは、検出可能に標識されている。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、シクロヘキサノンが標識ポリペプチドと結合した場合にアクセプター分子に対するドナー分子の空間的位置及び/又は双極子配向が変化するように、共鳴エネルギー移動(RET)アクセプター及びドナーの対で標識されている。なおさらなる実施形態では、アクセプター分子は、生物発光タンパク質である。さらなる実施形態では、生物発光タンパク質は、ポリペプチドの5番目の非膜貫通ループに組み込まれ、アクセプター分子は、ポリペプチドのC末端に組み込まれているか、又はb)アクセプター分子は、受容体の5番目の非膜貫通ループに組み込まれ、生物発光タンパク質は、C末端に組み込まれている。
【００４４】
特に好ましい実施形態では、生物発光タンパク質は、ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ又はその生物活性バリアント(例えばRLuc2又はRLuc8)若しくは断片であり、アクセプター分子は、緑色蛍光タンパク質2(GFP2)であり、基質は、セレンテラジン400aである。
【００４５】
ある実施形態では、試料は、気体又は空気試料である。
【００４６】
ある実施形態では、シクロヘキサノンは、微少流体技術を用いて検出される。
【００４７】
本明細書におけるいずれの実施形態も、そうでないと明記しない限り、いずれの他の実施形態に必要な変更を加えて当てはめることができる。
【００４８】
本発明は、例示の目的のみを意図する本明細書に記載する具体的な実施形態により範囲が限定されるものではない。機能的に等価な生成物、組成物及び方法は、明らかに本明細書に記載する本発明の範囲内である。
【００４９】
本明細書を通して、そうでないと明記しない限り又は文脈がそうでないことを必要としない限り、単一の工程、物質の組成物、工程の群又は物質の組成物の群についての言及は、これらの工程、物質の組成物、工程の群又は物質の組成物の群の1つ及び複数(すなわち1つ以上)を包含すると見なされる。
【００５０】
本発明を、以下の非限定的な実施例及び添付の図面に対する言及により以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】スクリーニングアッセイの開発のための目的の重要な分子を示す、酵母フェロモン応答性経路のまとめを示す図である。
【図２】リガンドを用いる線虫化学受容体のスクリーニングを支持するように改変された酵母GPCR伝達カスケードのまとめを示す図である。図1と比較されたい。
【図３】S.セレビシエが線虫化学受容体のスクリーニングを支持するようにするために必要な染色体及びプラスミドベースの遺伝子改変のまとめを示す図である。Gα-KAGMMキメラは、酵母gpa-1と他の線虫Gαタンパク質との間のキメラで置き換えてよい。
【図４】S.セレビシエ(ste-2、sst-2、far-1 3重変異体)細胞における構成的PGKプロモーターの制御下でのGFP2タグ付加線虫ODR-10化学受容体(OGO)の発現を示す複合蛍光画像である。20μlの酵母培養物の滴を清潔なガラススライドに載せ、細胞膜特異的色素であるエバンスブルー色素(培養培地中に0.01%、Sigma社)で1分間染色し、カバーガラスで覆い、Leica SP2レーザ共焦点顕微鏡で観察した。試料を488nmで励起し、画像を、GFP2発光について510nm、及びエバンスブルー発光について660nmで取得した。尺度バー10μm。
【図５】50μM又は500μMのジアセチルへの曝露の後のODR-10受容体を発現するCyb-KAGMMの蛍光発光スキャンを示す図である。A:Fus1:GFPを用いるpGK:Odr10、B:同じ条件下での「A」の生物学的反復、C:Fig2:GFPを用いるpGK:Odr10。励起は420nmであった。50μMのジアセチルは、パネル「C」における非誘導条件未満であることに注意されたい。VC=ベクター対照。
【図６】5-ブロモ-4-クロロ-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド(X-Gal)を基質として用いるレポーター遺伝子Lac-Zの定性アッセイを示す図である。Lac-Z発現は、FUS-1プロモーターにより駆動した。UN=非誘導。
【図７】オルソニトロフェニル-βD-ガラクトピラノシド(ONPG)を基質として用いるLacZの揮発性物質誘導発現の定性アッセイを示す図である。アッセイは、FIG1、FIG2及びFUS1プロモーターを用いて行った。ベクター対照は、odr-10遺伝子を含まなかった。FIG-1及びFIG-2プロモーターと共に(しかし、FUS-1プロモーターは用いない)アセトインも陰性リガンド対照として用いた。
【図８】11種の異なる濃度のジアセチルに対する、FIG2プロモーターにより駆動されるLacZレポーター遺伝子の応答の、ONPGを基質として用いる定量アッセイを示す図である。PGK::Odr-10(緑色のバー);PGK::H110Y odr-10変異体(赤色のバー);空のベクター対照(青色のバー)。値は、3回の技術的反復の平均及び標準偏差である。
【図９】11種の異なる濃度のジアセチルに対する、FUS1プロモーターにより駆動されるLacZレポーター遺伝子の応答の、ONPGを基質として用いる定量アッセイを示す図である。PGK::Odr-10(緑色のバー);空のベクター対照(赤色のバー)。値は、3回の技術的反復の平均及び標準偏差である。
【図１０】C.エレガンスのstr化学受容体スーパーファミリーの578種のメンバーの分子学的系統樹(配列の関係)を示す図である。以前に特徴決定されたある嗅覚受容体(odr-10)の位置を矢印で示す。
【図１１】実施例2及び本文を通して記載する方法に従う、S.セレビシエのlacZ/Odr10/gpa1-KAGMM/ste2- sst2- far1- gpa1-株におけるジアセチル誘導lac-Z発現に対する、開始培養希釈率及びウェルの容量の影響を示す図である。Lac-Z発現は、細胞溶解及び30分間の基質インキュベーションの後のAbs414nmでのONPG変換のレベルにより評価する。
【図１２】酵母で発現し、シクロヘキサノンを用いて試験した(誘導した)線虫GPCRのプレートアッセイを示す図である。異なるウェルについての凡例は、Table 2(表2)に示す。コロニーB7、D2及びH9は、他のウェルと比較して、著しく黄色い色を示した。H9〜12は対照コロニーであり、500μMのジアセチルに対して試験したが、他の全てのコロニーは、5mMのシクロヘキサノンに対して試験した。
【図１３】シクロヘキサノンに対して試験した(シクロヘキサノンを用いて誘導した)プレートの標準化したスペクトルを示す図である。ウェルB7(●)、D2(■)及び陽性対照H9(▲)は、420nmにて明確なピークを示し、これらが試験したリガンドで活性化されたことを示した。他のウェル、例えばウェルG6(*)及び陰性対照H11(×)は、いずれも420nmにて著しいピークを示さなかった。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
配列表についての凡例
配列番号1は、Srn-1のカエノラブディティス・エレガンスGタンパク質共役受容体(GPCR)のアミノ酸配列である。
配列番号2は、Str-1のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号3は、Str-102のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号4は、Str-108のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号5は、Str-111のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号6は、Str-112のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号7は、Str-113のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号8は、Str-114のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号9は、Str-114SVのC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号10は、Str-12のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号11は、Str-120のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号12は、Str-120SVのC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号13は、Str-123のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号14は、Str-124のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号15は、Str-125のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号16は、Str-129のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号17は、Str-13のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号18は、Str-130のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号19は、Str-131のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号20は、Str-134VのC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号21は、Str-135のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号22は、Str-139のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号23は、Str-14のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号24は、Str-141のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号25は、Str-143のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号26は、Str-144のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号27は、Str-146のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号28は、Str-148のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号29は、Str-151のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号30は、Str-153のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号31は、Str-155のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号32は、Str-159のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号33は、Str-162のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号34は、Str-163のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号35は、Str-164のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号36は、Str-165のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号37は、Str-166のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号38は、Str-168のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号39は、Str-169aのC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号40は、Str-170のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号41は、Str-171のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号42は、Str-172のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号43は、Str-173のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号44は、Str-174aのC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号45は、Str-174SVのC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号46は、Str-177のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号47は、Str-178のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号48は、Str-180aのC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号49は、Str-180bのC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号50は、Str-181のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号51は、Str-182のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号52は、Str-183のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号53は、Str-185のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号54は、Str-19のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号55は、Str-190のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号56は、Str-193のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号57は、Str-198のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号58は、Str-2のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号59は、Str-20のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号60は、Str-20SVのC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号61は、Str-204のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号62は、Str-205のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号63は、Str-207のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号64は、Str-211のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号65は、Str-214のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号66は、Str-220SVのC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号67は、Str-221のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号68は、Str-222のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号69は、Str-224SVのC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号70は、Str-225のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号71は、Str-227のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号72は、Str-229のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号73は、Str-23のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号74は、Str-230のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号75は、Str-231のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号76は、Str-232のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号77は、Str-233SVのC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号78は、Str-243のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号79は、Str-245のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号80は、Str-246のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号81は、Str-247のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号82は、Str-248SVのC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号83は、Str-25のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号84は、Str-250のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号85は、Str-252のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号86は、Str-253のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号87は、Str-256のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号88は、Str-257のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号89は、Str-258のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号90は、Str-260のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号91は、Str-261のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号92は、Str-262のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号93は、Str-264のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号94は、Str-267のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号95は、Str-27SVのC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号96は、Str-3のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号97は、Str-30のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号98は、Str-31のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号99は、Str-32のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号100は、Str-37のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号101は、Str-38のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号102は、Str-4のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号103は、Str-41のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号104は、Str-44のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号105は、Str-45のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号106は、Str-46のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号107は、Str-47のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号108は、Str-5のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号109は、Str-55のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号110は、Str-56のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号111は、Str-6のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号112は、Str-63のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号113は、Str-64のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号114は、Str-66のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号115は、Str-7のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号116は、Str-71のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号117は、Str-77のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号118は、Str-78のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号119は、Str-79SVのC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号120は、Str-8SVのC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号121は、Str-82のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号122は、Str-84のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号123は、Str-85のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号124は、Str-87のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号125は、Str-88のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号126は、Str-89のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号127は、Str-9のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号128は、Str-90のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号129は、Str-92のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号130は、Str-93のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号131は、Str-94のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号132は、Str-96のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号133は、Str-97のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号134は、Str-99SVのC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号135は、Srh-1のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号136は、Srh-10のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号137は、Srh-104のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号138は、Srh-112のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号139は、Srh-115-2のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号140は、Srh-118のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号141は、Srh-120のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号142は、Srh-123のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号143は、Srh-128のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号144は、Srh-129のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号145は、Srh-130のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号146は、Srh-132のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号147は、Srh-133のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号148は、Srh-134のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号149は、Srh-138のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号150は、Srh-142のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号151は、Srh-147のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号152は、Srh-149のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号153は、Srh-149-2のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号154は、Srh-15のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号155は、Srh-159のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号156は、Srh-166のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号157は、Srh-167のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号158は、Srh-17のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号159は、Srh-174のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号160は、Srh-178のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号161は、Srh-179のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号162は、Srh-18のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号163は、Srh-182のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号164は、Srh-183のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号165は、Srh-184のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号166は、Srh-190のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号167は、Srh-192のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号168は、Srh-193のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号169は、Srh-195のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号170は、Srh-199のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号171は、Srh-2のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号172は、Srh-201のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号173は、Srh-207のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号174は、Srh-208のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号175は、Srh-209のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号176は、Srh-21のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号177は、Srh-211のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号178は、Srh-212のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号179は、Srh-213のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号180は、Srh-214のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号181は、Srh-215のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号182は、Srh-218のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号183は、Srh-233のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号184は、Srh-234のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号185は、Srh-235のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号186は、Srh-239のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号187は、Srh-24のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号188は、Srh-241のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号189は、Srh-255のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号190は、Srh-269のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号191は、Srh-270のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号192は、Srh-271のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号193は、Srh-275のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号194は、Srh-276のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号195は、Srh-277のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号196は、Srh-278のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号197は、Srh-279のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号198は、Srh-281のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号199は、Srh-282のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号200は、Srh-296のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号201は、Srh-30のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号202は、Srh-31のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号203は、Srh-33のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号204は、Srh-37のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号205は、Srh-46のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号206は、Srh-48のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号207は、Srh-50のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号208は、Sri-1のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号209は、Sri-2のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号210は、Sri-7のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号211は、Sri-10のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号212は、Sri-20のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号213は、Sri-21のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号214は、Sri-25のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号215は、Sri-28のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号216は、Sri-29のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号217は、Sri-30のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号218は、Sri-31のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号219は、Sri-38のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号220は、Sri-42のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号221は、Sri-43のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号222は、Sri-46のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号223は、Sri-48のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号224は、Sri-51のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号225は、Sri-54のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号226は、Sri-57のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号227は、Sri-60のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号228は、Sri-63のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号229は、Sri-66のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号230は、Sri-70のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号231は、Sri-73のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号232は、Sri-77のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号233は、Srd-1のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号234は、Srd-3のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号235は、Srd-5のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号236は、Srd-9のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号237は、Srd-10のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号238は、Srd-11のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号239は、Srd-12のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号240は、Srd-13のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号241は、Srd-15のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号242は、Srd-16のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号243は、Srd-17のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号244は、Srd-18のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号245は、Srd-19のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号246は、Srd-20のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号247は、Srd-23のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号248は、Srd-26のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号249は、Srd-27のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号250は、Srd-30のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号251は、Srd-32のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号252は、Srd-33のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号253は、Srd-38のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号254は、Srd-39SVのC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号255は、Srd-40SVのC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号256は、Srd-41のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号257は、Srd-42のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号258は、Srd-43SVのC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号259は、Srd-45のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号260は、Srd-49のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号261は、Srd-50SVのC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号262は、Srd-51のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号263は、Srd-53のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号264は、Srd-55のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号265は、Srd-59のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号266は、Srd-60のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号267は、Srd-61のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号268は、Srd-63のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号269は、Srd-64のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号270は、Srd-65のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号271は、Srd-66のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号272は、Srd-67のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号273は、Srd-71のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号274は、Srd-72のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号275は、Srd-74のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号276は、Srj-1のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号277は、Srj-4のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号278は、Srj-5のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号279は、Srj-6のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号280は、Srj-7のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号281は、Srj-8のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号282は、Srj-9のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号283は、Srj-11のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号284は、Srj-14のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号285は、Srj-15のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号286は、Srj-19のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号287は、Srj-22のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号288は、Srj-26のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号289は、Srj-27のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号290は、Srj-37のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号291は、Srj-39のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号292は、Srj-44のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号293は、Srm-1のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号294は、Srm-2のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号295は、Srm-3のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号296は、Srm-4のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号297は、Srm-5のC.エレガンスGPCRのアミノ酸配列である。
配列番号298は、Gpa1/Odr3の人工キメラGタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号299は、Gpa1/ Gpa3の人工キメラGタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号300は、Gpa1/ Gpa13の人工キメラGタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号301は、Gpa1/ Gpa2の人工キメラGタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号302は、Gpa1/ Gpa5の人工キメラGタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号303は、Gpa1/ Gpa6の人工キメラGタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号304は、Gpa1/ Odr3の人工キメラGタンパク質のヌクレオチド配列である。
配列番号305は、Gpa1/ Gpa3の人工キメラGタンパク質のヌクレオチド配列である。
配列番号306は、Gpa1/ Gpa13の人工キメラGタンパク質のヌクレオチド配列である。
配列番号307は、Gpa1/ Gpa2の人工キメラGタンパク質のヌクレオチド配列である。
配列番号308は、Gpa1/ Gpa5の人工キメラGタンパク質のヌクレオチド配列である。
配列番号309は、Gpa1/ Gpa6の人工キメラGタンパク質のヌクレオチド配列である。
配列番号310は、Srn-1のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号311は、Str-1のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号312は、Str-102のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号313は、Str-108のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号314は、Str-111のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号315は、Str-112のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号316は、Str-113のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号317は、Str-114のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号318は、Str-114SVのC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号319は、Str-12のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号320は、Str-120のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号321は、Str-120SVのC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号322は、Str-123のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号323は、Str-124のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号324は、Str-125のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号325は、Str-129のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号326は、Str-13のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号327は、Str-130のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号328は、Str-131のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号329は、Str-134VのC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号330は、Str-135のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号331は、Str-139のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号332は、Str-14のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号333は、Str-141のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号334は、Str-143のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号335は、Str-144のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号336は、Str-146のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号337は、Str-148のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号338は、Str-151のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号339は、Str-153のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号340は、Str-155のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号341は、Str-159のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号342は、Str-162のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号343は、Str-163のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号344は、Str-164のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号345は、Str-165のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号346は、Str-166のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号347は、Str-168のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号348は、Str-169aのC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号349は、Str-170のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号350は、Str-171のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号351は、Str-172のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号352は、Str-173のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号353は、Str-174aのC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号354は、Str-174SVのC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号355は、Str-177のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号356は、Str-178のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号357は、Str-180aのC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号358は、Str-180bのC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号359は、Str-181のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号360は、Str-182のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号361は、Str-183のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号362は、Str-185のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号363は、Str-19のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号364は、Str-190のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号365は、Str-193のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号366は、Str-198のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号367は、Str-2のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号368は、Str-20のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号369は、Str-20SVのC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号370は、Str-204のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号371は、Str-205のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号372は、Str-207のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号373は、Str-211のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号374は、Str-214のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号375は、Str-220SVのC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号376は、Str-221のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号377は、Str-222のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号378は、Str-224SVのC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号379は、Str-225のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号380は、Str-227のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号381は、Str-229のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号382は、Str-23のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号383は、Str-230のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号384は、Str-231のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号385は、Str-232のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号386は、Str-233SVのC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号387は、Str-243のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号388は、Str-245のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号389は、Str-246のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号390は、Str-247のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号391は、Str-248SVのC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号392は、Str-25のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号393は、Str-250のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号394は、Str-252のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号395は、Str-253のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号396は、Str-256のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号397は、Str-257のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号398は、Str-258のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号399は、Str-260のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号400は、Str-261のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号401は、Str-262のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号402は、Str-264のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号403は、Str-267のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号404は、Str-27SVのC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号405は、Str-3のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号406は、Str-30のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号407は、Str-31のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号408は、Str-32のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号409は、Str-37のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号410は、Str-38のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号411は、Str-4のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号412は、Str-41のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号413は、Str-44のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号414は、Str-45のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号415は、Str-46のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号416は、Str-47のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号417は、Str-5のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号418は、Str-55のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号419は、Str-56のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号420は、Str-6のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号421は、Str-63のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号422は、Str-64のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号423は、Str-66のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号424は、Str-7のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号425は、Str-71のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号426は、Str-77のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号427は、Str-78のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号428は、Str-79SVのC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号429は、Str-8SVのC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号430は、Str-82のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号431は、Str-84のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号432は、Str-85のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号433は、Str-87のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号434は、Str-88のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号435は、Str-89のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号436は、Str-9のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号437は、Str-90のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号438は、Str-92のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号439は、Str-93のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号440は、Str-94のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号441は、Str-96のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号442は、Str-97のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号443は、Str-99SVのC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号444は、Srh-1のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号445は、Srh-10のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号446は、Srh-104のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号447は、Srh-112のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号448は、Srh-115-2のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号449は、Srh-118のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号450は、Srh-120のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号451は、Srh-123のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号452は、Srh-128のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号453は、Srh-129のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号454は、Srh-130のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号455は、Srh-132のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号456は、Srh-133のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号457は、Srh-134のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号458は、Srh-138のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号459は、Srh-142のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号460は、Srh-147のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号461は、Srh-149のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号462は、Srh-149-2のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号463は、Srh-15のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号464は、Srh-159のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号465は、Srh-166のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号466は、Srh-167のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号467は、Srh-17のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号468は、Srh-174のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号469は、Srh-178のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号470は、Srh-179のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号471は、Srh-18のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号472は、Srh-182のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号473は、Srh-183のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号474は、Srh-184のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号475は、Srh-190のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号476は、Srh-192のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号477は、Srh-193のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号478は、Srh-195のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号479は、Srh-199のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号480は、Srh-2のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号481は、Srh-201のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号482は、Srh-207のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号483は、Srh-208のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号484は、Srh-209のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号485は、Srh-21のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号486は、Srh-211のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号487は、Srh-212のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号488は、Srh-213のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号489は、Srh-214のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号490は、Srh-215のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号491は、Srh-218のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号492は、Srh-233のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号493は、Srh-234のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号494は、Srh-235のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号495は、Srh-239のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号496は、Srh-24のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号497は、Srh-241のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号498は、Srh-255のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号499は、Srh-269のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号500は、Srh-270のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号501は、Srh-271のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号502は、Srh-275のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号503は、Srh-276のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号504は、Srh-277のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号505は、Srh-278のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号506は、Srh-279のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号507は、Srh-281のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号508は、Srh-282のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号509は、Srh-296のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号510は、Srh-30のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号511は、Srh-31のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号512は、Srh-33のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号513は、Srh-37のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号514は、Srh-46のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号515は、Srh-48のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号516は、Srh-50のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号517は、Sri-1のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号518は、Sri-2のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号519は、Sri-7のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号520は、Sri-10のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号521は、Sri-20のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号522は、Sri-21のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号523は、Sri-25のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号524は、Sri-28のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号525は、Sri-29のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号526は、Sri-30のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号527は、Sri-31のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号528は、Sri-38のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号529は、Sri-42のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号530は、Sri-43のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号531は、Sri-46のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号532は、Sri-48のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号533は、Sri-51のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号534は、Sri-54のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号535は、Sri-57のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号536は、Sri-60のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号537は、Sri-63のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号538は、Sri-66のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号539は、Sri-70のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号540は、Sri-73のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号541は、Sri-77のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号542は、Srd-1のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号543は、Srd-3のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号544は、Srd-5のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号545は、Srd-9のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号546は、Srd-10のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号547は、Srd-11のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号548は、Srd-12のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号549は、Srd-13のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号550は、Srd-15のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号551は、Srd-16のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号552は、Srd-17のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号553は、Srd-18のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号554は、Srd-19のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号555は、Srd-20のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号556は、Srd-23のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号557は、Srd-26のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号558は、Srd-27のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号559は、Srd-30のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号560は、Srd-32のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号561は、Srd-33のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号562は、Srd-38のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号563は、Srd-39SVのC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号564は、Srd-40SVのC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号565は、Srd-41のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号566は、Srd-42のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号567は、Srd-43SVのC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号568は、Srd-45のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号569は、Srd-49のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号570は、Srd-50SVのC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号571は、Srd-51のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号572は、Srd-53のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号573は、Srd-55のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号574は、Srd-59のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号575は、Srd-60のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号576は、Srd-61のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号577は、Srd-63のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号578は、Srd-64のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号579は、Srd-65のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号580は、Srd-66のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号581は、Srd-67のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号582は、Srd-71のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号583は、Srd-72のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号584は、Srd-74のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号585は、Srj-1のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号586は、Srj-4のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号587は、Srj-5のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号588は、Srj-6のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号589は、Srj-7のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号590は、Srj-8のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号591は、Srj-9のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号592は、Srj-11のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号593は、Srj-14のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号594は、Srj-15のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号595は、Srj-19のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号596は、Srj-22のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号597は、Srj-26のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号598は、Srj-27のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号599は、Srj-37のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号600は、Srj-39のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号601は、Srj-44のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号602は、Srm-1のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号603は、Srm-2のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号604は、Srm-3のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号605は、Srm-4のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
配列番号606は、Srm-5のC.エレガンスGPCRのヌクレオチド配列である。
【００５３】
発明の詳細な説明
一般的な技術及び定義
そうでないと明確に定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術的及び科学的用語は、当業者(例えば細胞培養、酵母遺伝学、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学及び生化学)により通常理解されるものと同じ意味を有する。
【００５４】
そうでないと示さない限り、本発明で利用する組換えタンパク質及び酵母生物学の技術は、当業者に公知の標準的な手順である。このような技術は、J. Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning、John Wiley and Sons(1984)、J. Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)、T.A. Brown(編)、Essential Molecular Biology: A Practical Approach、第1巻及び第2巻、IRL Press(1991)、D.M. Glover及びB.D. Hames(編)、DNA Cloning: A Practical Approach、第1〜4巻、IRL Press(1995及び1996)、並びにF.M. Ausubelら(編)、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience(1988、現在までの全ての改訂版を含む)のような出典において文献を通して記載及び説明されている。
【００５５】
用語「及び/又は」、例えば「X及び/又はY」は、「X及びY」又は「X又はY」を意味すると理解され、両方の意味又はいずれかの意味についての明示的な支持を示す。
【００５６】
本明細書で用いる場合、そうでないと記載しない限り、用語「約」は、示す値の+/-10%、より好ましくは+/-5%、より好ましくは+/-1%のことをいう。
【００５７】
本明細書を通して、語句「含む(comprise)」又は「含む(comprises)」若しくは「含み(comprising)」のような変形は、記載する要素、整数若しくは工程、又は要素、整数若しくは工程の群を含むことを意味するが、いずれの他の要素、整数若しくは工程、又は要素、整数若しくは工程の群を排除することを意味しない。
【００５８】
本明細書で用いる場合、用語「zファクター」は、所定の線虫GPCRについてのリガンドに対する本発明の酵母の応答(感度)の尺度のことをいう(Zhangら、1999)。Zファクターは、4つのパラメータ、すなわち陽性(p)及び陰性(n)対照の両方の平均及び標準偏差(μp、σp、μn及びσn)に関して定義される。これらの値に鑑みて、Zファクターは、以下のように定義される。
【００５９】
【数１】
2016516422.tif 000003
【００６０】
一般的に、Zファクターは、試料平均及び試料標準偏差から推定する。
【００６１】
【数２】
2016516422.tif 000004
【００６２】
「試料」は、検出されるリガンドを含むことが疑われる任意の物質又は組成物であり得る。試料としては、例えば、空気、気体、液体、生体材料及び土壌が挙げられる。試料は、環境又は起源から直接得ることができるか、又は本発明の方法を行う前に適切な手順により少なくとも部分的に精製してもよい。例えば、本発明の方法を用いて、農業生産の背景において関連する化学物質に対して応答する受容体、特にナノモル又は10億分率(v/v;w/v;又はモル比)のレベル以下で存在するものを同定及び単離できる。このような化学物質は、病原体の存在若しくは非存在、害虫若しくは寄生体の存在若しくは非存在、農作物若しくは動物の活力、成熟度、又は農業経済学的に有用な特性の揮発性又は非揮発性の指標を含む。ヒトの健康分野では、本発明の方法を用いて、感染症(例えばマラリア、結核、インフルエンザ、リーシュマニア症、菌血症、軟部組織感染症、尿路感染症、肺感染症など)又は非感染性疾患(例えば肺癌、膵癌、卵巣及びその他の癌並びに非感染性状態及び遺伝子欠損状態、変性疾患及び代謝性状態、例えばI型又はII型糖尿病、メタボリックシンドロームなど、或いは処置の質又は任意の感染性若しくは非感染性の健康状態の管理)の揮発性又は非揮発性マーカーに対して選択的に応答する受容体を同定及び単離できる。食品の安全性及び質に関して、本発明の方法を用いて、食品中の微生物混入、マイコトキシン若しくは他の毒素の混入、又は不注意による混入物の存在、又は意図的な混ぜ物の存在を示す揮発性又は非揮発性化学物質に対して応答する受容体を同定及び単離できる。本発明の方法を用いて、特定の望ましい又は望ましくない感覚受容特性、例えば果実、チーズ及び他の製品の成熟度若しくは完熟度、又は混入物及びテイント(taint)、例えばワインのコルクテイント、ブタの雄豚テイント、ワイン及び他のアルコール飲料の「Bret」テイント、又は乳及び乳製品の硫黄若しくは他のテイントを示す化合物についての受容体を同定及び単離できる。本発明の方法を、安全性スクリーニング、プロセス制御、環境モニタリング、屋内気候制御、消費財開発及び製造などを含む、広範囲の他の経済的又は社会的活動に関連する同様の目的のために用いることができる。さらに、同定及び単離された受容体を、本発明の他の方法において用いて、上記の化合物(リガンド)を検出できる。
【００６３】
「リガンド」は、それらに限定されないが、ペプチド、タンパク質、ホルモン、脂質、炭素ベースの小分子、炭水化物、油、匂い物質、ポリマーのような、特定のGタンパク質共役受容体と結合しそれを活性化する任意の化合物であり得る。
【００６４】
本明細書で用いる場合、共鳴エネルギー移動(RET)は、ドナー分子とアクセプター分子との間のエネルギーの非放射活性移動に基づく近接アッセイである。
【００６５】
本明細書で用いる場合、用語「アクセプター分子」は、ドナーの活性化の結果として放射されるエネルギーを受容して、それを光エネルギーとして再放射できる任意の化合物のことをいう。
【００６６】
本明細書で用いる場合、用語「空間的位置」は、アクセプター分子に対するドナー分子の3次元的位置のことをいい、本明細書に定義するポリペプチドに化合物が結合した結果として変化する。
【００６７】
本明細書で用いる場合、用語「双極子配向」は、3次元空間におけるドナー分子及びアクセプター分子の配向に対する、ドナー分子及び/又はアクセプター分子のいずれかと関連する双極子モーメントの3次元空間における方向のことをいう。双極子モーメントは、分子での電荷の変動の結果である。
【００６８】
本明細書で用いる場合、用語「生物発光タンパク質」は、適当な基質に作用して発光を生じることができる任意のタンパク質のことをいう。
【００６９】
本明細書で用いる場合、用語「基質」は、生物発光タンパク質と共に用いて発光を生じるか又は吸収できる任意の分子のことをいう。
【００７０】
線虫Gタンパク質共役受容体
本明細書で用いる場合、そうでないと明記しない限り、用語「Gタンパク質共役受容体」は、Gタンパク質を介してシグナル伝達する7回膜貫通型受容体のことをいう。受容体は、単一サブユニット、又は2つ以上の受容体サブユニットであってよい。2つ以上の受容体サブユニットが存在する場合、これらは、同じか、異なるか、又はそれらの組合せ(例えば、あるサブユニットが2つと別のサブユニットが1つ)であってよい。一実施形態では、本発明の酵母細胞は、同じGPCRサブユニットのホモ二量体を含む。別の実施形態では、本発明の酵母細胞は、異なるGPCRサブユニットのヘテロ二量体を含む。酵母細胞で発現される場合、GPCRは、酵母細胞膜にある。さらに、酵母細胞で発現される場合、GPCRは、フェロモン応答経路のような細胞内シグナル伝達経路と機能的に共役する。さらに、そうでないと明記又は意図しない限り、用語「Gタンパク質共役受容体」及び「Gタンパク質共役受容体のサブユニット」又はそれらの変形は、交換可能に用いられる。
【００７１】
線虫受容体は、独特のGPCRクレードを含む(Fredriksson及びSchioth、2005)(図10)。本発明のために有用なGPCRは、それらに限定されないが、以下の属のもの:C.エレガンスのようなカエノルハブディティス(Caenorhabdits)、イヌ鉤虫(Ancylostoma caninum)のようなアンシロストーマ(Ancylostoma)、アングイナ(Anguina)、ディティレンチュス(Ditylenchus)、ティレンコリンチュス(Tylenchorhynchus)、パラティレンチュス(Pratylenchus)、ラドフォラス(Radopholus)、ヒルシュマニエラ(Hirschmanniella)、ナコバス(Nacobbus)、ホプロライムス(Hoplolaimus)、スクテロネーマ(Scutellonema)、ロティレンチュス(Rotylenchus)、ヘリコティレンチュス(Helicotylenchus)、ロティレンチュラス(Rotylenchulus)、ベロノライムス(Belonolaimus)、ダイズシスト線虫(Heterodera glycines)のようなヘテロデラ(Heterodera)、メロイドジン・ジャバニカ(Meloidogyne javanica)、メロイドジン・インコグニータ(Meloidogyne incognita)及びメロイドジン・アレナリア(Meloidogyne arenaria)のようなメロイドジン(Meloidogyne)、クリコネモイデス(Criconemoides)、ヘミシクリオフォラ(Hemicycliophora)、パラティレンチュス(Paratylenchus)、ティレンチュラス(Tylenchulus)、アフェレンコイデス(Aphelenchoides)、ブルサフェレンチュス(Bursaphelenchus)、ラディナフェレンチュス(Rhadinaphelenchus)、ロンジドラス(Longidorus)、シフィネマ(Xiphinema)、トリコドーラス(Trichodorus)、パラトリコドーラス(Paratrichodorus)、イヌ糸状虫(Dirofilaria immitis)、ディロフィラリア・テヌイス(Dirofilaria tenuis)、ディロフィラリア・レペンス(Dirofilaria repens)及びディロフィラリア・ウルシ(Dirofilari ursi)のようなディロフィラリア(Dirofiliaria)、オンコセルカ(Onchocerca)、ブルギア(Brugia)、アカントケイロネマ(Acanthocheilonema)、エルロストロンギルス(Aelurostrongylus)、アンギオストロンギルス(Angiostrongylus)、アスカリス(Ascaris)、ブノストマム(Bunostomum)、カピラリア(Capillaria)、カベルティア(Chabertia)、クーペリア(Cooperia)、クレノソーマ(Crenosoma)、ディクティオカウラス(Dictyocaulus)、ディオクトファイム(Dioctophyme)、ディペタロネーマ(Dipetalonema)、ドラクンクルス(Dracunculus)、エンテロビウス(Enterobius)、フィラロイデス(Filaroides)、捻転胃虫(Haemonchus contortus)のようなヘモンクス(Haemonchus)、ラゴチラスカリス(Lagochilascaris)、ロア(Loa)、マンセオネラ(Manseonella)、ムエレリウス(Muellerius)、ネカトール(Necator)、ネマントディルス(Nematodirus)、エソファゴストマム(Oesophagostomum)、オステルタギア(Ostertagia)、パラフィラリア(Parafilaria)、パラスカリス(Parascaris)、フィサロプテラ(Physaloptera)、プロトストロンギルス(Protostrongylus)、セタリア(Setaria)、スピロセルカ(Spirocerca)、ステファノギラリア(Stephanogilaria)、ストロンギロイデス(Strongyloides)、ストロンギルス(Strongylus)、テラジア(Thelazia)、トキサスカリス(Toxascaris)、イヌ回虫(Toxocara canis)及びネコ回虫(Toxocara cati)のようなトキソカラ(Toxocara)、旋毛虫(Trichinella spiralis)及びトリチュルス・ムリス(Trichurs muris)のようなトリキネラ(Trichinella)、トリコストロンギルス(Trichostrongylus)、トリチュリス(Trichuris)、ウンシナリア(Uncinaria)並びにウチェレリア(Wuchereria)を含む多様な線虫から得ることができる。
【００７２】
ある実施形態では、GPCRは、Robertsonら(1998及び2001)により同定される、化学受容体(又は推定上の化学受容体)、嗅覚受容体(又は推定上の嗅覚受容体)又は味覚受容体(又は推定上の味覚受容体)である。
【００７３】
GPCRは、自然に存在するか又はその変異体/バリアント、その生物活性断片若しくはその融合体であるアミノ酸配列を有してよい。自然に存在するGタンパク質共役受容体のアミノ酸配列変異体/バリアントは、適当なヌクレオチド変化を、コードポリヌクレオチドに導入することにより、又は所望のポリペプチドのin vitro合成により調製できる。このような変異体は、例えば、アミノ酸配列内の残基の欠失、挿入又は置換を含む。最終ポリペプチド生成物が所望の特徴を有することを条件として、欠失、挿入及び置換の組合せを作製して、最終構築物に到達できる。
【００７４】
変異体(バリアント)ポリペプチドは、当該技術において知られる任意の技術を用いて調製できる。例えば、本明細書に記載するポリヌクレオチドは、in vitro突然変異誘発に供することができる。このようなin vitro突然変異誘発技術は、ポリヌクレオチドを適切なベクターにサブクローニングする工程、ベクターを大腸菌(E. coli)XL-1 red(Stratagene)のような「ミューテーター」株に入れて形質転換する工程、及び形質転換細菌を適切な世代数繁殖させる工程を含んでよい。別の例では、Gタンパク質共役受容体をコードするポリヌクレオチドを、Harayama(1998)により広く記載されるDNAシャッフリング技術に供する。変異/バリアントDNAに由来する生成物は、本明細書に記載する技術を用いて容易にスクリーニングして、これらが本発明の方法に有用であるかどうかを決定できる。
【００７５】
アミノ酸配列変異体の設計では、変異部位の位置及び変異の性質は、改変される特徴に依存する。変異のための部位は、例えば(1)まず保存的アミノ酸選択肢で、次いで達成される結果に依存してより過激な選択肢で置換するか、(2)標的残基を欠失させるか、又は(3)その位置に隣接して他の残基を挿入することにより、個別に又は連続して改変できる。
【００７６】
アミノ酸配列欠失は、通常、約1から15残基、より好ましくは約1から10残基、典型的に約1から5の連続した残基の範囲である。
【００７７】
置換変異体は、Gタンパク質共役受容体中の少なくとも1つのアミノ酸残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されている。置換突然変異誘発についての最も目的とする部位は、機能のために重要であると同定された部位を含む。他の目的の部位は、様々な株又は種から得られる特定の残基が同一であるものである。これらの位置は、生物活性のために重要であることがある。これらの部位、特に、少なくとも3つの他の同様に保存された部位の配列内にあるものは、相対的に保存された様式で置換されることが好ましい。このような保存的置換をTable 1(表1)に示す。
【００７８】
【表１】
2016516422.tif 000005
【００７９】
合成中又は合成の後に、例えばビオチン化、ベンジル化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護/遮断基による誘導体化、タンパク質分解性切断、抗体分子又は他の細胞性リガンドへの連結などにより様々に改変されたポリペプチドも、本発明の範囲内に含まれる。これらの改変は、ポリペプチドの安定性及び/又は生物活性を増加させることがある。
【００８０】
さらに、GPCRは、2つ以上の異なるGPCRの自然に存在しないキメラであってよい。特に、このことにより、検出する化合物に依存して、ある受容体の部分がキメラ中に常に存在し、その中に広い多様性のGPCRの他の部分を挿入する形質導入カセットを生成できる。
【００８１】
一実施形態では、サブユニットは、第1のGタンパク質共役受容体サブユニットの1番目の膜貫通ドメインのN末端及び少なくとも大部分と、第2のGタンパク質共役受容体サブユニットの1番目の非膜貫通ループの少なくとも大部分から5番目の膜貫通ドメインの少なくとも大部分までと、第1のGタンパク質共役受容体サブユニットの5番目の非膜貫通ループの少なくとも大部分からC末端の端までとを含む。
【００８２】
別の実施形態では、サブユニットは、第1のGタンパク質共役受容体サブユニットの5番目の膜貫通ドメインのN末端から少なくとも大部分までと、第2のGタンパク質共役受容体サブユニットの5番目の非膜貫通ループの少なくとも大部分からC末端の端までとを含む。
【００８３】
当業者は、Gタンパク質共役受容体のN末端の端、膜貫通ドメイン、非膜貫通ループ(ドメイン)及びC末端を容易に決定できる。例えば、様々なバイオインフォマティクスのアプローチを用いて、膜貫通ドメインのアミノ酸配列及びGタンパク質共役受容体の既知の膜貫通ドメインとの類似性に基づいて、タンパク質中の膜貫通ドメインの場所及び位相幾何学を決定してよい。アラインメント及びアミノ酸配列比較は、例えばBLASTプログラム又はCLUSTAL Wプログラムを用いることにより、当該技術において日常的に行われている。既知の膜貫通ドメイン含有タンパク質とのアラインメントに基づいて、当業者は、膜貫通ドメインの場所を予測できる。さらに、いくつかの膜に広がるタンパク質の3次元構造が既知であり、例えば7回膜貫通型Gタンパク質共役ロドプシン光受容体構造が、x線結晶学により解明されている。このような3D構造との分析及び比較に基づいて、他の膜タンパク質における膜貫通ドメインの場所及び位相幾何学を予測することが可能である。タンパク質中の膜貫通ドメインの場所及び位相幾何学を予測するために利用可能な多くのプログラムも存在する。例えば、膜に広がるタンパク質セグメントを予測するTMpred(Hofmann及びStoffel、1993);膜タンパク質の位相幾何学を予測するTopPred(von Heijneら、1992);単一及び複数の配列から2次構造を予測するPREDATOR(Frishman及びArgos、1997);多様に整列させた配列からタンパク質の膜貫通領域を予測するTMAP(Persson及びArgos、1994);並びに単一配列から膜貫通領域を予測するALOM2(Kleinら、1984)の1つ又は組合せを用いてよい。
【００８４】
ある実施形態では、線虫GPCRは、配列番号1から297の1つ又は複数と少なくとも40%同一である配列を含む。
【００８５】
ある定義されたポリペプチドに関して、上記のものよりも高い%同一性の値は好ましい実施形態を包含することが認識される。よって、当てはまる場合には、最小限の%同一性の値に鑑みて、ポリペプチドが、関連する指定された配列番号と少なくとも50%、より好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも91%、より好ましくは少なくとも92%、より好ましくは少なくとも93%、より好ましくは少なくとも94%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%、より好ましくは少なくとも99.1%、より好ましくは少なくとも99.2%、より好ましくは少なくとも99.3%、より好ましくは少なくとも99.4%、より好ましくは少なくとも99.5%、より好ましくは少なくとも99.6%、より好ましくは少なくとも99.7%、より好ましくは少なくとも99.8%、及びさらにより好ましくは少なくとも99.9%同一であるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００８６】
ポリペプチドの%同一性は、ギャップ創出ペナルティ=5及びギャップ伸長ペナルティ=0.3でGAP(Needleman及びWunsch、1970)分析(GCGプログラム)により決定する。クエリ配列は、少なくとも25アミノ酸の長さであり、GAP分析は、少なくとも25アミノ酸の領域にわたって2つの配列を整列させる。より好ましくは、クエリ配列は、少なくとも50アミノ酸の長さであり、GAP分析は、少なくとも50アミノ酸の領域にわたって2つの配列を整列させる。より好ましくは、クエリ配列は、少なくとも100アミノ酸の長さであり、GAP分析は、少なくとも100アミノ酸の領域にわたって2つの配列を整列させる。さらにより好ましくは、クエリ配列は、少なくとも250アミノ酸の長さであり、GAP分析は、少なくとも250アミノ酸の領域にわたって2つの配列を整列させる。さらにより好ましくは、GAP分析は、2つの配列の全長にわたってそれらの配列を整列させる。GPCRが2種以上の異なる線虫GPCRのキメラであるならば、異なる分子からのGPCRのそれぞれの異なる区画について独立してアラインメントを行うことが好ましい。
【００８７】
本明細書で用いる場合、「生物活性断片」は、全長ポリペプチドの規定される活性を維持する、本明細書に記載するポリペプチドの一部分である。例えば、Gタンパク質共役受容体の生物活性断片は、レポーター遺伝子と連結する酵母細胞におけるシグナル伝達経路の活性化をもたらす標的リガンドと結合できなければならない。生物活性断片は、規定される活性を維持する限り、いずれのサイズでもあり得る。好ましくは、生物活性断片は、少なくとも150、より好ましくは少なくとも250アミノ酸の長さである。
【００８８】
本明細書で用いる場合、「生物活性バリアント」は、自然に存在する及び/又は規定する分子とは1つ又は複数のアミノ酸が異なるが、生物活性断片について上で規定するような規定する活性を維持する分子である。生物活性バリアントは、典型的に、自然に存在する及び/又は規定する分子と少なくとも50%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも97%、及びさらにより好ましくは少なくとも99%同一である。
【００８９】
本発明で用いる線虫Gタンパク質共役受容体は、翻訳後の受容体を細胞膜に向けるために、疎水性N末端シグナル配列のような適切なシグナル配列を必要とする。このようなシグナル配列は、当該技術において公知である。ある実施形態では、線虫Gタンパク質共役受容体の天然シグナル配列を用いる。代替の実施形態では、線虫Gタンパク質共役受容体は、細胞膜への受容体の輸送中に切断される可能性がある酵母N末端シグナル配列を含む。このような酵母シグナル配列としては、それらに限定されないが、例えば酵母α-接合因子シグナル配列又は酵母インベルターゼシグナル配列が挙げられる。
【００９０】
Gタンパク質
G-タンパク質は、細胞内シグナル伝達のための2次メッセンジャーカスケードに関与するタンパク質のファミリーである。Gタンパク質は、「分子スイッチ」として機能して、不活性なグアノシン2リン酸(GDP)結合状態と活性なグアノシン3リン酸(GTP)結合状態との間を交互にする。最終的に、Gタンパク質は、シグナル伝達ネットワークのカスケードを開始することにより、下流の細胞プロセスを調節する(Hofmannら、2009;Oldham及びHamm、2008)。
【００９１】
2つの異なるGタンパク質ファミリー、Gタンパク質共役受容体により活性化され、アルファ(α)、ベータ(β)及びガンマ(γ)サブユニットで構成される、「大」Gタンパク質と時折呼ばれるヘテロ3量体Gタンパク質と、小GTPアーゼのRasスーパーファミリーに属する「小」Gタンパク質(20〜25kDa)がある。これらのタンパク質は、ヘテロ3量体Gタンパク質で見出されるアルファ(α)サブユニットと相同であり、これもまたGTP及びGDPと結合し、シグナル伝達に関与する。細胞膜と会合するために、多くのGタンパク質は、脂質で共有的に改変されており、例えばヘテロ3量体Gタンパク質サブユニットは、ミリストイル化、パルミトイル化又はプレニル化されることがあるが、小Gタンパク質は、プレニル化されることがある。
【００９２】
当業者が認識するように、多くの既知の線虫Gタンパク質と、未知の線虫Gタンパク質を同定するための日常的な方法とが存在する。例えば、C.エレガンスは、21個のGα、2つのGβ及び2つのGγ遺伝子を有する(Jansenら、1999;Cuppenら、2003)。C.エレガンスは、哺乳動物ファミリーのそれぞれの1つのオルソログ、GSA-1(Gs)、GOA-1(Gi/o)、EGL-30(Gq)及びGPA-12(G12)を発現する。残りのC.エレガンスαサブユニット(GPA-1〜11、GPA-13〜17及びODR-3)は、分類を可能にするのに十分な相同性を有さない。GPA-12を除く保存されたGαサブユニットは広く発現されるが、新しいGα遺伝子のうち14個は、化学受容性ニューロンの部分集合で発現される。
【００９３】
GβサブユニットであるGPB-1、及びGγサブユニットであるGPC-2は、伝統的なGタンパク質ヘテロ3量体中のαサブユニットと共に機能すると見られる。残りのGβサブユニットであるGPB-2は、ある種のRGSタンパク質の機能を調節し、残りのGγサブユニットであるGPC-1は、化学受容性において制限された役割を有すると考えられている。C.エレガンスにおけるほとんどのGタンパク質経路の機能的な違いは、よって、αサブユニットにある。
【００９４】
Gタンパク質は、自然に存在するか又はその変異体/バリアント、若しくはその生物活性断片、その融合体であるアミノ酸配列を有することができる。これらの概念は、当該技術において公知であり、GPCRに関して既に記載した。好ましい実施形態では、シグナル伝達カスケードの一部分として、Gaタンパク質は酵母Gβγタンパク質から解離し、このことは、MAPキナーゼシグナル伝達経路の活性化を導き、レポーター遺伝子発現をもたらす。
【００９５】
本発明は、部分的に、酵母gpa-1のN末端と線虫Gタンパク質の少なくとも4つのC末端アミノ酸とを含むキメラGタンパク質の酵母における発現に依拠する。このようなキメラタンパク質の生成及び異種発現されたGPCRを介するシグナル伝達を検出するためのその使用は、例えばBrownら(2000)、WO 99/14344及びWO 99/18211により以前に記載されている。ある実施形態では、キメラGタンパク質は、キメラのC末端にて線虫Gタンパク質の約5つのC末端アミノ酸を含む。別の実施形態では、キメラGタンパク質は、キメラのC末端にて線虫Gタンパク質の約5〜約11個のC末端アミノ酸を含む。
【００９６】
ある実施形態では、線虫Gタンパク質は、gpa-1、gpa-2、gpa-3、gpa-6、gpa-13又はgpa-15である。
【００９７】
組換え酵母
本発明は、組換え酵母細胞、及び異種発現されたGPCRとのリガンド結合を同定するためのその使用に関する。
【００９８】
本明細書で用いる場合、GPCRと結合するリガンドに関しての「活性化する」又はその変形は、リガンドが受容体と結合すると、Gタンパク質が関与する細胞内シグナル伝達カスケード及び酵母におけるMAPキナーゼ経路がオンになり、最終的にレポーター遺伝子の発現をもたらすことを意味する。
【００９９】
酵母細胞は、本発明のために適切な任意の細胞であり得る。特に好ましい実施形態では、酵母細胞は、天然の未改変状態では、機能的Gタンパク質共役受容体シグナル伝達経路、例えばフェロモン応答性経路を有する。酵母細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・ウベ(Saccharomyces uvae)又はサッカロマイセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)のようなサッカロマイセス属、トウモロコシ黒穂病菌(Ustilago maydis)のようなウスチラゴ(Ustilago)属、クリベロマイセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)又はクリベロマイセス・ドロソフィラルム(Kluyveromyces drosophilarum)のようなクリベロマイセス(Kluyveromyces)属、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)及びピキア・メンブランファシエンス(Pichia membranaefaciens)のようなピキア(Pichia)属、シゾサッカロマイセス・ポンべ(Schizosaccharomyces pombe)のようなシゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)のようなヤロウィア(Yarrowia)属、トルラ酵母(Candida utilis)又はカンジダ・カカオイ(Candida cacaoi)のようなカンジダ(Candida)属、或いはザイゴサッカロマイセス・ロキシイ(Zygosaccharomyces rouxii)、ザイゴサッカロマイセス・バイリイ(Zygosaccharomyces bailii)及びザイゴサッカロマイセス・ファーメンタティ(Zygosaccharomyces fermentati)のようなザイゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属のメンバーであってよい。
【０１００】
好ましい実施形態では、酵母細胞は、サッカロマイセス種であり、より好ましくはサッカロマイセス・セレビシエである。
【０１０１】
好ましい実施形態では、酵母細胞は、一倍体である。さらに好ましい実施形態では、酵母細胞は、a又はα接合型である。
【０１０２】
本発明の酵母細胞は、変異gpa-1遺伝子を有する。内因性酵母遺伝子、例えばgpa-1、far-1、sst-1及びste-2遺伝子に言及する場合の用語「変異」は、発現が低減され、かつ/又は対応する通常(野生型)遺伝子を有する酵母細胞と比較して、コードされる通常(野生型)タンパク質の機能が減少する(好ましくは廃止される)ことを意味する。好ましくは、遺伝子により通常コードされる機能的タンパク質を酵母細胞内で見出すことができない。このような変異遺伝子は、広く多様な日常的手順、例えば突然変異誘発又は遺伝子ノックアウトにより生成できる。ある実施形態では、far-1、sst-1及びste-2遺伝子の1つ、複数又は全てが欠失されている。
【０１０３】
変異酵母gpa-1遺伝子の例は、Iguchiら(2010)、Dowell及びBrown(2009)、Brownら(2000)、Fukutaniら(2012)、WO 99/14344及びWO 99/18211に記載されている。far-1、sst-2及びste-2変異遺伝子の例は、Fukutaniら(2012)に記載されている。
【０１０４】
本明細書で用いる場合、「作動可能に連結した」とは、2つ以上の核酸(例えばDNA)セグメントの間の機能的関係のことをいう。典型的に、これは、転写調節エレメントと転写される配列との機能的関係のことをいう。例えば、プロモーターが適当な宿主細胞発現系においてコード配列の転写を刺激又はモジュレートするならば、該プロモーターは、コード配列、例えば本明細書に規定するポリヌクレオチドに作動可能に連結している。一般的に、転写される配列に作動可能に連結したプロモーター転写調節エレメントは、転写される配列と物理的に連続しており、すなわち、これらはシス作用性である。しかし、いくつかの転写調節エレメント、例えばエンハンサーは、転写が増進されるコード配列と物理的に連続しているか又はその近傍にある必要はない。
【０１０５】
「構成的プロモーター」とは、酵母において、特定の成長条件により誘導される必要なく、作動可能に連結した転写される配列の発現を指示するプロモーターのことをいう。例えば第1のポリヌクレオチドに作動可能に連結した、本発明のために有用な構成的プロモーターとしては、それらに限定されないが、例えば、酵母PGK(ホスホグリセリン酸キナーゼ)プロモーター、酵母ADH-1(アルコール脱水素酵素)プロモーター、酵母ENO(エノラーゼ)プロモーター、酵母グリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素(GPD)プロモーター、酵母PYK-1(ピルビン酸キナーゼ)プロモーター、酵母翻訳鎖伸長因子-1-アルファ(TEF)プロモーター及び酵母CYC-1(チトクロムc酸化酵素)プロモーターが挙げられる。好ましい実施形態では、酵母プロモーターは、S.セレビシエプロモーターである。別の実施形態では、構成的プロモーターは、酵母に由来しないことがある。本発明のために有用なこのようなプロモーターとしては、それらに限定されないが、例えばカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、グルココルチコイド応答エレメント及びアンドロゲン応答エレメントが挙げられる。構成的プロモーターは、自然に存在する分子、又はプロモーター機能を廃止しない(かつ好ましくは増進する)1、2又は3ヌクレオチド置換を例えば含むそのバリアントであってよい。
【０１０６】
本明細書で用いる場合、用語「酵母MAPキナーゼ経路により活性化されるプロモーター」とは、GPCRとのリガンドの結合により活性化された酵母MAPキナーゼ経路に応答して、作動可能に連結したポリヌクレオチド(核酸)の遺伝子転写を駆動するプロモーターのことをいう(図1及び図2を参照されたい)。本発明で用いる酵母MAPキナーゼ経路により活性化されるプロモーターとしては、それらに限定されないが、例えばFIG2(接合誘導に関与する酵母タンパク質)、FIG1(効率的な接合のために必要な酵母タンパク質)、FIG4(酵母Dac1pホモログ)、PRM1(酵母フェロモン調節性膜タンパク質)、ERG24(酵母C-14ステロール還元酵素)、FUS3(接合フェロモンシグナル伝達を媒介する酵母MAPK)、PEP1(液胞への選別のための酵母受容体)、YOR129C、HYM1、FAR1(細胞周期停止に関与する酵母タンパク質)及びPCL2(酵母サイクリンタンパク質)が挙げられる。ある実施形態では、プロモーターは結合しており、転写は、酵母Ste12転写因子により活性化される。上記のように、酵母MAPキナーゼ経路により活性化されるプロモーターは、FUS-1プロモーターでない。酵母MAPキナーゼ経路により活性化されるプロモーターは、自然に存在する分子、又はプロモーター機能を廃止しない(かつ好ましくは増進する)1、2又は3ヌクレオチド置換を例えば含むそのバリアントであってよい。
【０１０７】
キメラGタンパク質をコードする第3のポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターは、任意の適切なプロモーター、例えば上記の構成的プロモーターであり得る。簡便には、ある実施形態では、プロモーターは、内因性gpa-1プロモーターである。この点で、キメラタンパク質をコードする遺伝子は、線虫Gタンパク質のC末端アミノ酸を発現するように変異された内因性遺伝子である。
【０１０８】
本明細書で用いる場合、用語「高コピー数」は、酵母細胞が、少なくとも約75、又は少なくとも約100、又は少なくとも約150、又は約75から約500の間、又は約100から約400の間、又は約100から約250の間のコピー数の染色体外ポリヌクレオチドを含むことを意味する。ある実施形態では、染色体外ポリヌクレオチドは、プラスミド、コスミド又はウイルス、好ましくはプラスミドである。或いは、本発明の酵母細胞の集団(及び/又はライブラリー)に言及する場合、用語「高コピー数」は、平均で、各酵母細胞が、少なくとも約75、又は少なくとも約100、又は少なくとも約150、又は約75から約500の間、又は約100から約400の間、又は約100から約250の間のコピー数の染色体外ポリヌクレオチドを含むことを意味する。ある実施形態では、本発明のために有用な高コピー数プラスミドは、2ミクロン複製起点を有する(当該技術においてYEpプラスミドとして知られる)。酵母高コピー数プラスミドとしては、それらに限定されないが、例えばGateway(商標)pENTR(Invitrogen社)及びpRS420(Christiansonら、1992)が挙げられる。
【０１０９】
本明細書に記載する酵母染色体外ポリヌクレオチド、例えばプラスミドは、典型的に、酵母の複製起点、抗生物質耐性遺伝子、細菌の複製起点(細菌細胞での増殖のため)、マルチクローニング部位及び酵母細胞での維持のための酵母栄養遺伝子を含む。栄養遺伝子(又は「栄養要求性マーカー」)は、ほとんどの場合、以下のうちの1つである:1)TRP1(アントラニル酸ホスホリボシル異性化酵素);2)URA3(オロチジン-5'-リン酸脱炭酸酵素);3)LEU2(3-イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素);4)HIS3(イミダゾールグリセロールリン酸脱水酵素又はIGP脱水酵素);又は5)LYS2(α-アミノアジピン酸セミアルデヒド脱水素酵素)。しかし、本明細書で言及するものを含む多くの既知の栄養マーカーが存在する。さらに、プラスミドのための栄養遺伝子マーカーは、酵母MAPキナーゼ経路により活性化されるプロモーターに作動可能に連結したレポーター遺伝子のためのものとは異なる。
【０１１０】
本発明の組換え酵母は、ガラクトシダーゼ又は選択可能な成長マーカーのいずれかをコードするレポーター遺伝子を含む。
【０１１１】
「ガラクトシダーゼ」は、多様な基質から末端ガラクトース残基を切断し、基質を切断して検出可能なシグナルを生成することもできる任意の酵素であってよい。ある実施形態では、ガラクトシダーゼは、β-ガラクトシダーゼ、例えば細菌(例えば大腸菌)LacZである。代替の実施形態では、ガラクトシダーゼは、α-ガラクトシダーゼ、例えば酵母(例えばS.セレビシエ)Mel-1である(Melcherら、2000;Ahoら、1997)。β-ガラクトシダーゼ活性は、酵素のための基質、例えば切断後に濃い青色生成物を形成するX-gal(5-ブロモ-4-クロロ-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド)、切断後に約420nmの最大吸収を有する水溶性黄色色素を形成するONPG(o-ニトロフェニルガラクトシド)、及び切断後に分光学的に測定可能な水溶性赤色生成物を生じるCPRG(クロロフェノールレッド-β-D-ガラクトピラノシド)を用いて検出してよい。α-ガラクトシダーゼ活性は、酵素のための基質、例えば切断後にインディゴ色素を形成するo-ニトロフェニルα-D-ガラクトピラノシド、及び切断後に分光学的に測定可能な水溶性赤色生成物を生じるクロロフェノールレッド-α-D-ガラクトピラノシドを用いて検出してよい。酵母でのガラクトシダーゼ発現を検出するためのキット、例えばThermo Scientific社からのβ-ガラクトシダーゼ(LacZ)発現キットは、市販で入手可能である。
【０１１２】
好ましくは、選択可能な成長マーカーは、栄養マーカー又は抗生物質耐性マーカーである。
【０１１３】
典型的な酵母選択栄養マーカーとしては、それらに限定されないが、LEU2、TRP1、HIS3、HIS4、URA3、URA5、SFA1、ADE2、MET15、LYS5、LYS2、ILV2、FBA1、PSE1、PDI1及びPGK1が挙げられる。当業者は、pgk1酵母株においてPGK1について証明されるように(Piper及びCurran、1990)、例えばプラスミド上に機能的遺伝子がもたらされるならば、その遺伝子の染色体欠失又は不活性化が生存不可能な宿主をもたらす任意の遺伝子、いわゆる必須遺伝子を選択可能なマーカーとして用いることができることを認識している。適切な必須遺伝子は、Stanford Genome Database(SGD)(http:://db.yeastgenome.org)で見出すことができる。欠失又は不活性化された場合に栄養要求性(生合成)の要件をもたらさない任意の必須遺伝子生成物(例えばPDI1、PSE1、PGK1又はFBA1)を、プラスミドの非存在下では遺伝子生成物を生成できない酵母宿主細胞において例えばプラスミド上の選択可能なマーカーとして用いて、細胞を特定の選択条件下で培養するという不都合の必要なく、プラスミド安定性の増加を達成することができる。「栄養要求性(生合成)の要件」により、我々は、成長培地への添加又は成長培地の改変により補完できる欠乏性を含む。
【０１１４】
抗生物質耐性遺伝子(マーカー)としては、それらに限定されないが、例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子及びカナマイシン耐性遺伝子が挙げられる。
【０１１５】
酵母細胞は、化学的方法(例えばRoseら、1990、Methods in Yeast Genetics、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.及びKawaiら、2010により記載されるとおり)により典型的に形質転換される。細胞を、典型的に、酢酸リチウムで処理して、ほぼ104コロニー形成単位(形質転換細胞)/μgのDNAの形質転換効率を達成する。酵母の形質転換のための他の標準的な手順としては、i)名称が示唆するように、酵母スフェロプラストの生成に依拠するスフェロプラスト法、ii)DNA被覆金属微粒子を細胞に向けて発射する遺伝子銃法、及びiii)ガラスビーズ及び細胞に送達されるDNAを用いる酵母細胞の撹拌に依拠するガラスビーズ法が挙げられる。もちろん、酵母細胞に核酸を導入するための任意の適切な手段を用いることができる。
【０１１６】
生物、例えば酵母を外因性プラスミドで形質転換することにより、コピー数又はその他の要因における違いのために形質転換遺伝子の浸透率がクローンによって異なることがあり得ることが公知である。よって、スクリーニング中に適切な受容体=リガンドの対を同定する可能性を最大限にするために、各形質転換受容体について2つ以上の独立した単離クローンをスクリーニングすることが推奨される。異なる単離クローンを独立してスクリーニングしてよいか、又はスクリーニングのために単一ウェル中で組み合わせてよい。後者の選択肢は、比色レポーターではなく栄養レポーターを用いる場合に特に簡便であることができる。
【０１１７】
ライブラリースクリーニング
本発明の酵母を用いて、GPCRとの結合及びその活性化について少数の候補化合物(リガンド)を試験できるか、又は化合物のライブラリーをスクリーニングできる。本発明は、試験化合物の「ライブラリー」、種々のGPCRのライブラリー、又はその組合せを用いることができる。
【０１１８】
本明細書で用いる場合、「ライブラリー」又は「集団」とは、多くの異なる化合物又は酵母細胞、例えば少なくとも10、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも500、少なくとも1,000又は少なくとも10,000個の異なる化合物又は酵母細胞の収集物のことをいう。一般的に、集団は、単一容器(例えば培養物)中に種々の酵母細胞のそれぞれを含むが、ライブラリーは、一般的に、異なるGPCRを発現する異なる酵母のそれぞれについて別々の容器(例えばマイクロタイタープレート上のウェル)を有する。ライブラリー内の化合物は、構造的に関係するか、完全に異なるか、又はそれらの混合物であってよい。関係する化合物としては、例えば、互いに少なくとも75%、又は少なくとも90%、又は少なくとも95%同一であるポリペプチドのライブラリーが挙げられる。当業者が認識するように、ライブラリー内のいくつかの化合物は同じであってよい。ある実施形態では、ライブラリーは、本発明の異なる酵母の集団である。別の実施形態では、可能性のあるリガンドのライブラリーを用いて、特定の線虫GPCRを発現する酵母に対してスクリーニングする。さらなる実施形態では、2種以上の可能性のあるリガンドを、2種以上の異なる線虫GPCRに対してスクリーニングする。
【０１１９】
スクリーニングは、マイクロウェルにおいて、標識細胞選別により、又はレポーターが栄養マーカーである場合に培地(例えば寒天プレート)上(又は中)での成長によるような当業者に公知の方法の1つを用いることにより行ってよい。
【０１２０】
好ましい実施形態では、ガラクトシダーゼ活性を測定する場合、酵母を、例えば48、96、384個以上のウェルを含むマイクロウェルプレート中で培養する。
【０１２１】
代替の実施形態では、選択可能な成長マーカーの発現を測定する場合、レポーターの発現を検出するために必要な、適切な試薬を含む(例えば抗生物質)か又は欠く(例えばレポーターの発現により補完される栄養素)寒天プレート上で酵母を培養できる。当業者が認識するように、このような選択は、液体培養で行うこともでき、例えば細胞のO.D.を測定する。
【０１２２】
アッセイ条件を変動して、目的の異なる結合リガンド又は他の生物活性について最適結合条件を考慮してよい。よって、結合のpH、温度、塩濃度、容量及び期間などは全て変動して、目的の環境のものに類似する条件下でのGPCRとのリガンドの結合を達成してよい。
【０１２３】
一実施形態では、試験化合物は、有機非ペプチド小分子である。別の実施形態では、試験化合物は、ペプチド又は模擬ペプチドである。分子ライブラリーの合成のための例示的な方法は、当該技術において、例えばErbら(1994)及びGallopら(1994)で見出すことができる。
【０１２４】
ある実施形態では、試験化合物は揮発性である。揮発性化合物のライブラリーのスクリーニングのために、化合物を含む空気若しくは他の混合気体に酵母を曝露できるか、又は化合物がそれぞれ水溶性若しくは水混和性であるならば、酵母培養培地中(例えば化合物を酵母培養培地中に溶解できる)の揮発性化合物の溶液若しくは懸濁物に化合物を曝露できるか、又は適切な基質を化合物に浸し、培養中の酵母に載せるか、又は任意の他の適切な手段を用いることができる。
【０１２５】
一部の実施形態では、試験化合物の混合物を用いてよいか、又は試験化合物は、化合物(それらのうちいくつかだけがスクリーニングの目的のために関係する)の複合混合物中に存在してよい。このような混合物は、ヒトの呼気、唾液、尿、血清、血漿、全血、涙、汗、便及び一連の他の生検試料、並びに飲料及びワインのような他の種類の混合物を含む可能性がある。
【０１２６】
ある種の実施形態では、組換え受容体を発現する酵母細胞に試験化合物を外から加えて、受容体を介してシグナル伝達をモジュレートする化合物を選択する。他の実施形態では、酵母細胞は、試験される化合物も発現する。
【０１２７】
一実施形態では、形質転換酵母の複数の独立クローンを、目的の受容体のそれぞれについて試験する。これらは、ウェルあたり1つのクローンとしてスクリーニングしてよいか、又は複数のクローンを単一ウェル中で組み合わせてよい。
【０１２８】
シクロヘキサノンの検出
シクロヘキサノンは、いくつかの爆発物のマーカーであり、よって、この分子を検出するための手段を有することが望ましい。
【０１２９】
本明細書に示すように、Str-144(配列番号26)及びSrj-22(配列番号287)はともにシクロヘキサノンと結合する。よって、これらのポリペプチド(受容体)又はそのシクロヘキサノン結合バリアントは、シクロヘキサノンを検出する方法で用いることができる。
【０１３０】
当業者が認識するように、広く多様な異なる検出系を用いて、受容体タンパク質と結合するリガンドを検出できる。
【０１３１】
一実施形態では、方法は、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)又は蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を例えば用いて共鳴エネルギー移動(RET)を検出することに依拠する。
【０１３２】
発光系が知られており、細菌、原生動物、腔腸動物、軟体動物、魚類、ヤスデ、ハエ、真菌、蠕虫、甲殻類及びカブトムシ、特にパイロフォラス(Pyrophorus)属のコメツキムシ並びにフォティナス(Photinus)、フォチュリス(Photuris)及びルシオラ(Luciola)属のホタルを含む多くの発光性生物から単離されている。生物発光を示すさらなる生物は、WO 00/024878、WO 99/049019及びViviani(2002)に列挙されている。
【０１３３】
ある非常によく知られた例は、特定の生化学的物質であるルシフェリン(自然に存在するフルオロフォア)がルシフェラーゼ活性を有する酵素により酸化されるエネルギー発生化学反応を触媒する(Hastings、1996)ルシフェラーゼとして知られるクラスのタンパク質である。細菌、藻類、真菌、昆虫、魚類及び他の海洋の形態の種を含む原核生物及び真核生物の両方の非常に多様な生物がこの様式で光エネルギーを放射でき、それぞれが、特定のルシフェラーゼ活性及び他の生物のものとは化学的に異なるルシフェリンを有する。ルシフェリン/ルシフェラーゼ系は、形態、化学及び機能が非常に多様である。ルシフェラーゼ活性を有する生物発光タンパク質の例は、US 5,229,285、5,219,737、5,843,746、5,196,524及び5,670,356で見出すことができる。最も広く用いられるルシフェラーゼのうちの2つは、(i)セレンテラジンを基質として用い、480nmにて光を放射する35kDaタンパク質であるウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ[R.レニフォルミス(reniformis)から](Lorenzら、1991)、及び(ii)ルシフェリンを基質として用い、560nmにて光を放射する61kDaタンパク質であるホタルルシフェラーゼ[フォティナス・ピラリス(Photinus pyralis)から](de Wetら、1987)である。
【０１３４】
ガウシア(Gaussia)ルシフェラーゼ[ガウシア・プリンセプス(Gaussia princeps)から]は、生化学アッセイにおいて用いられている(Verhaegenら、2002)。ガウシアルシフェラーゼは、セレンテラジンを迅速な反応で酸化して470nmにて明るい光の放射をもたらす20kDaタンパク質である。
【０１３５】
本発明のために有用なルシフェラーゼは、アナチャノカンパsp.(Anachnocampa sp)からも特徴決定されている(WO 2007/019634)。これらの酵素は、約59kDaのサイズであり、スペクトルの青色部分内での発光スペクトルを有する発光反応を触媒するATP依存性ルシフェラーゼである。
【０１３６】
或いは、本発明で採用できる非ルシフェラーゼ生物発光タンパク質は、適切な基質に対して作用して発光シグナルを生じることができる任意の酵素である。このような酵素の具体例は、β-ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-グルクロニダーゼ及びβ-グルコシダーゼである。これらの酵素のための合成発光基質は、公知であり、Tropix Inc.社(Bedford、MA、USA)のような会社から市販で入手可能である。
【０１３７】
本発明のために有用なペルオキシダーゼの例は、Hushpulianら(2007)により記載されている。
【０１３８】
基質の選択は、生物発光タンパク質により生じる光の波長及び強度に影響し得る。広く知られる基質は、刺胞動物、橈脚類、毛顎動物、有節動物、十脚類のエビ、アミ、放散虫類及びいくつかの魚類で生じるセレンテラジンである(Greer及びSzalay、2002)。ウミシイタケルシフェラーゼについて、例えば418から512nmの間の発光をもたらすセレンテラジン類似体/誘導体が利用可能である(Inouyeら、1997)。セレンテラジン類似体/誘導体(400A、DeepBlueC)は、ウミシイタケルシフェラーゼを用いて400nmで光を放射することが記載されている(WO 01/46691)。セレンテラジン類似体/誘導体の他の例は、EnduRen及びViviRenである。
【０１３９】
本明細書で用いる場合、用語「ルシフェリン」は、酵素ルシフェラーゼの存在下で酸化されてオキシルシフェリン及び光の形のエネルギーを生成する、生物発光できる生物で見出されるクラスの光放射性生物学的色素のことをいう。ルシフェリン又は2-(6-ヒドロキシベンゾチアゾール-2-イル)-2-チアゾリン-4-カルボン酸は、ホタル、フォティナス・ピラリスから最初に単離された。それ以来、主に海洋からの様々な異なる生物、例えば魚類及びイカから様々な形のルシフェリンが見出され、研究されているが、多くは陸上生物、例えば蠕虫、カブトムシ及び様々な昆虫で同定されている(Dayら、2004;Viviani、2002)。
【０１４０】
本発明において採用できるいくつかの異なるアクセプター分子が存在する。アクセプター分子は、タンパク質又は非タンパク質性であってよい。タンパク質であるアクセプター分子としては、それらに限定されないが、例えば緑色蛍光タンパク質(GFP)、GFPの青色蛍光バリアント(BFP)、GFPのシアン蛍光バリアント(CFP)、GFPの黄色蛍光バリアント(YFP)、増強GFP(EGFP)、増強CFP(ECFP)、増強YFP(EYFP)、GFPS65T、エメラルド、トパーズ、GFPuv、不安定化EGFP(dEGFP)、不安定化ECFP(dECFP)、不安定化EYFP(dEYFP)、HcRed、t-HcRed、DsRed、DsRed2、t-dimer2、t-dimer2(12)、mRFP1、ポシロポリン、ウミシイタケGFP、Monster GFP、paGFP、カエデタンパク質若しくはフィコビリタンパク質、又はそれらのいずれか1つの生物活性バリアント若しくは断片が挙げられる。タンパク質でないアクセプター分子としては、それらに限定されないが、例えばAlexa Fluor色素、Bodipy色素、Cy色素、フルオレセイン、ダンシル、ウンベリフェロン、蛍光マイクロスフェア、発光マイクロスフェア、蛍光ナノクリスタル、マリーナブルー、カスケードブルー、カスケードイエロー、パシフィックブルー、オレゴングリーン、テトラメチルローダミン、ローダミン、テキサスレッド、希土類元素キレート、又はそれらのいずれかの組合せ若しくは誘導体が挙げられる。
【０１４１】
ある非常によく知られた例は、クラゲ、オワンクラゲ(Aequorea victoria)からの緑色蛍光タンパク質及び分子生物学、例えば突然変異誘発及びキメラタンパク質技術(Tsien、1998)の適用により得られる多数のその他のバリアント(GFP)を含むフルオロフォアの群である。GFPは、それらの発色団の特異な成分に基づいて分類され、各クラスは、特異な励起及び発光波長を有する:クラス1、中性フェノール及びアニオン性フェノラートの野生型混合物:クラス2、フェノラートアニオン:クラス3、中性フェノール:クラス4、積層s電子系を有するフェノラートアニオン:クラス5、インドール:クラス6、イミダゾール:並びにクラス7、フェニル。
【０１４２】
変異された自然に存在するアクセプター分子(バリアント)も、本発明のために有用であり得る。BRETのために適切な工学的に操作された系のある例は、媒介タンパク質(この場合、Gタンパク質共役受容体)の非存在下では単独で互いに著しく直接相互作用しない、ウミシイタケルシフェラーゼとGFPの増強黄色変異体(EYFP)との対である(Xuら、1999)。
【０１４３】
別の実施形態では、アクセプター分子は、蛍光ナノクリスタルである。代替の実施形態では、アクセプター分子は、蛍光マイクロスフェアである。
【０１４４】
ある実施形態では、受容体は、WO 2010/085844に全般的に記載されるようにして標識される。例えば、a)生物発光タンパク質は、受容体の5番目の非膜貫通ループに組み込まれ、アクセプター分子は、受容体のC末端に組み込まれるか、又はb)アクセプター分子は、受容体の5番目の非膜貫通ループの一部を形成し、生物発光タンパク質は、C末端の一部を形成する。生物発光タンパク質のための基質の存在下でシクロヘキサノンが標識受容体と結合する際に、生物発光タンパク質とアクセプター分子との間のBRETのモジュレーションが、アクセプター分子に対する生物発光タンパク質の空間的位置及び/又は双極子配向の変化のために生じる。
【０１４５】
WO 2010/085844に記載される方法のさらなる実施形態では、生物発光タンパク質は、ウミシイタケルシフェラーゼ、又はその生物活性バリアント(例えばRLuc2又はRLuc8)若しくは断片であり、アクセプター分子は、緑色蛍光タンパク質2(GFP2)であり、基質は、セレンテラジン400aである。
【０１４６】
標識受容体は、リポソーム又は細胞膜調製物(例えば酵母細胞膜調製物)のような脂質二重層に埋め込まれた受容体を含む無細胞組成物中に存在してよい。
【０１４７】
さらなる実施形態では、本発明のシクロヘキサノンを検出する方法は、微少流体技術を用いて行われる。例えば、WO 2013/155553に記載される方法を用いて、シクロヘキサノンを検出できる。より具体的には、シクロヘキサノンを含む可能性がある試料を、a)化学発光ドナードメイン及びアクセプタードメインで標識された受容体であって、シクロヘキサノンの存在及び/又は非存在下での化学発光ドナードメイン及びアクセプタードメインの分離及び相対的配向が、フォースター距離の±50%以内である受容体と、b)化学発光ドナーの基質と共に、1つ又は複数のマイクロチャネルを含む微少流体デバイスに流す。標識受容体分子、試料及び基質をデバイスにおいて混合し、ここで、アクセプタードメインに対する化学発光ドナードメインの空間的位置及び/又は双極子配向は、シクロヘキサノンが標識ポリペプチドと結合する場合に変化する。化学発光ドナーによるいずれの基質の改変も、電気光学検知デバイスを用いて検出される。
【０１４８】
本明細書で定義する、シクロヘキサノンが標識ポリペプチド(受容体)と結合した結果として共鳴エネルギー移動(RET)を検出するために用いることができる系の他の例は、WO 2004/057333に全般的に記載されているものであり得る。
【０１４９】
或いは、標識受容体は、インタクトな細胞の細胞膜に存在してよい。任意の細胞発現系、例えば酵母又は哺乳動物(例えばHEK293、CHO又はCOS細胞)細胞発現系を用いることができる。嗅覚受容体を通常発現する細胞を用いることができる。このような細胞の単離及び/又は培養並びに本発明の嗅覚受容体発現配列でのそれらの形質転換は、日常的な方法を用いて行うことができる(Vargas、1999;Coonら、1989)。
【０１５０】
それらに限定されないが、細胞内のカルシウム濃度又は環状AMP濃度の測定を含むGタンパク質活性を測定するいくつかの方法が当業者に知られており、本発明の方法と共に用いることができる。このような方法は、Howardら(2001)、Krautwurstら(1999)、Chandrashekarら(2000)、Odaら(2000)及びKielyら(2007)に記載されている。
【０１５１】
細胞発現受容体とのシクロヘキサノンの結合の電気生理学的影響を評価するために、個別の細胞のパッチクランプを行うことができる。受容体細胞膜のパッチクランプの記録は、膜コンダクタンスを測定できる。いくつかのコンダクタンスは、繊毛中の匂い物質によりゲートで制御され、種に応じてcAMP-又はIP3-感受性チャネルを介して細胞を脱分極する。その他のコンダクタンスは、膜脱分極及び/又は細胞内Ca2+濃度の増加により活性化される(Trotier、1994)。
【０１５２】
細胞をシクロヘキサノンに曝露した後の細胞でのカルシウムイオンレベルの変化は、様々な手段により検出できる。例えば、細胞に、カルシウムイオン過渡応答に感受性がある試薬を予め負荷できる。カルシウム過渡応答を測定するための技術は、当該技術において知られている。例えば、Kashiwayanagi(1996)は、カエル嗅覚受容体細胞において、イノシトール1,4,5-三リン酸により誘導された内向きの流れ及びCa2+取り込みの両方を測定した。
【０１５３】
ある種の具体的な実施形態では、細胞内カルシウム濃度を、蛍光イメージングプレートリーダー(「FLIPR」)システム(Molecular Devices, Inc.社)を用いることにより測定する。他の生理活性機構、例えば細胞膜恒常性パラメータ(脂質2次メッセンジャーを含む)及び細胞pH変化(例えばSilver、1998を参照されたい)も測定できる。
【０１５４】
或いは、受容体をコードするin vitro合成mRNAをアフリカツメガエル(Xenopus)卵母細胞に注入して、シクロヘキサノンにより駆動される細胞励起の電気生理学的又はカルシウムイメージングを可能にすることができる。
【０１５５】
さらなる例では、シクロヘキサノンは、本発明の酵母細胞に依拠する方法、及びそのような酵母細胞を使用する方法を用いて検出される(例えば実施例3を参照されたい)。
【実施例】
【０１５６】
(実施例1)
酵母における線虫GPCRライブラリーの作製
酵母株
用いた一倍体酵母(サッカロマイセス・セレビシエ)の親の株の遺伝子型は、BY4741;MATa;his3Δ1;leu2Δ0;met15Δ0;ura3Δ0;ste2::kanMX4であった。
【０１５７】
感度が高く堅牢なスクリーニング系を作製するために、sst-2遺伝子をノックアウトしてMAPキナーゼ伝達カスケードの感度を増加させ、far-1遺伝子をノックアウトしてこの伝達経路の過剰刺激による細胞死を回避することが重要である(図1〜図3)。内因性Gα(gpa-1)遺伝子も、そのタンパク質が外因性GαサブユニットとGβγへのアクセスについて競合しないように、欠失させなければならない。ste-2、sst-2及びfar-1は、株の表現型に対するいずれの有害な影響もなしにノックアウトできる。しかし、gpa-1は、酵母生存性のために必要な必須遺伝子であり、GPA1タンパク質の非存在は、遊離のGβγを導き、伝達経路を活性化し、G1での成長停止をもたらす。よって、本発明者らは、相同組換えを用いて線虫嗅覚Gαからの対応するアミノ酸(odr-3、KAGGM)で酵母gpa-1の最後の5アミノ酸を置き換えることにより、内因性Gα(gpa-1)をキメラGβγで置き換えた。
【０１５８】
最終的に得られた株を、Cyb-KAGMMと称した。
【０１５９】
線虫化学受容性Gタンパク質共役受容体活性化のレポーターのために適当なプロモーターの選択
FUS-1プロモーターは、異種発現されたGPCRによるMAPキナーゼ伝達経路の活性化に応答してレポーターの発現を駆動するために一般的に用いられている。しかし、本発明者らが線虫化学受容体のために同定した系では、レポーター発現は漏出性であった(例えば図5〜図7を参照されたい)。このことは、スクリーニングアッセイにとっては特に問題である。なぜなら、高くかつ/又は変動するバックグラウンドは、アッセイの識別力を損なうからである。例えば、漏出性の発現は、アッセイの質の定量的尺度であるzファクターを減少させる。
【０１６０】
本発明者らは、よって、他のMAP-キナーゼ依存性プロモーターであるFIG-1及びFIG-2プロモーターを試験し、これらは、図7a及び図7bに示すように、レポーター遺伝子のバックグラウンドの漏出性の発現を著しく低減させた。このことは、従来技術についての知見から本発明者らが予期することができなかったFIG-1及びFIG-2プロモーターの驚くべき利点であった。
【０１６１】
線虫化学受容性Gタンパク質共役受容体の発現のためのプロモーターの選択
本発明者らは、線虫化学受容性GPCRを、信頼性をもって発現するために適切なプロモーターについて調査した。本発明者らは、2つの強いプロモーター、Minicら(2005)によりラットI7嗅覚受容体を発現するために用いられたガラクトース誘導性GAL-1プロモーターと、Dowellのグループ(Dowell及びBrown、2002及び2009)により非化学受容性哺乳動物GPCRのために用いられた構成的PGK-1プロモーターとを取り上げた。PGK-1プロモーターを用いる系についてグルコースを炭素源として用い、ラフィノース/ガラクトース混合物を用いて、標準的なプロトコールに従ってGAL-1プロモーターを誘導した。
【０１６２】
GAL-1プロモーターを用いる最も近い従来技術(Minicら、2005)に鑑みて驚くべきことに、本発明者らは、ウェスタンブロッティングによって再現可能なODR-10発現を観察することも、このプロモーターを用いて機能的な受容体応答を再現可能に得ることもできなかった(結果は示さず)が、構成的PGK-1プロモーターの制御下で発現させたときに、本発明者らは、レーザ共焦点顕微鏡を用いて、ODR-10のGFP2標識バリアントの一貫した発現を観察できた(図4)。本発明者らは、よって、陽性及び陰性対照受容体並びに既知のリガンド(ジアセチル)及び既知の非リガンド(アセトイン)の両方を用いてこの系を試験することにした。
【０１６３】
線虫化学受容性Gタンパク質共役受容体のクローニング
受容体cDNAを、Gateway(登録商標)pENTRベクター、次いで上記のようにPGK-1プロモーターの制御下で改変Gateway(登録商標)pDEST-Hisプラスミドに挿入した。この系が正しく機能することを確認するために、これを、Cyb-KAGMM酵母株中のodr-10 cDNAで試験した。ODR-10は、ブタン-2,3-ジオン(ジアセチル)に対して選択的かつ高い親和性で応答する線虫化学受容体GPCRである。ODR-10のH110Yバリアントは、ジアセチル応答性を切除する単一点突然変異を有する。よって、これは、優れた陰性対照であり、他の非応答性GPCRの代理である。本発明者らは、odr-10 cDNAの野生型及びH110Y変異体バリアントの両方をPGK-1プロモーターの下流にてGateway(登録商標)カセットにクローニングした。GFP及びLacZレポーターを、pESC-Leuプラスミド中のFIG-2又はFUS-1プロモーターのいずれかの下でクローニングした。線虫ODR-3の最後の5アミノ酸を含むgpa-1/odr-3キメラは、gpa-1遺伝子座にて染色体に組み込んだ。
【０１６４】
厳密な方法は、以下のとおりであった。
【０１６５】
成長
単一コロニーを採取し、ロイシン及びヒスチジンを含まず、2%(w/v)グルコースを補った10mLの標準酵母ドロップアウト選択培地(SD)に接種した。これを、50mLファルコンチューブ中で、180rpmで振とうしながら、30℃にて16時間インキュベートした。
【０１６６】
代替レポーターの評価
i)GFP2
GFPは、いくつかの哺乳動物GPCRのためのレポーターとしてうまく用いられている(Fukutaniら、2012)。実行可能であれば、これは、誘導/発現の後に後処理する必要なく、単純な読み出しを提供するという利点を有する。
【０１６７】
細胞を、ABS600nm≒1になるように調整した。2mL以上のチューブ中の1mLの培地中に1〜1000μMの範囲の濃度でジアセチルを加え、130rpmにて30℃で7時間振とうした後に、GFPについて420nmの励起波長を用いて450から650nmの間の蛍光発光を走査した。しかし、GFP発現は、図5に示すように、同じ実験の生物学的反復間で大きく変動した。さらに、最もよい場合でも(図5a)、ODR-10発現がある場合の500μMジアセチルに対するピークGFP応答とベクター対照との間には2倍未満の差が存在した。既知のリガンドと受容体との対のこの理想的な状況でさえ応答の変動性と狭いダイナミックレンジとが組み合わさっているので、多様な受容体を用いてリガンドを発見するためのこのようなアッセイを実用的に用いることが非実際的又は不可能になる。
【０１６８】
ii)Lac-Z
本発明者らは、β-ガラクトシダーゼをコードするので、誘導/発現の後に酵素的発色工程を必要とするLac-Zマーカーの適切性も試験した。本発明者らは、同じ成長及び誘導手順を反復したが、7時間の誘導の後に、以下のプロトコールの1つを行った。
【０１６９】
a)X-gal後処理
Dualsystems Biotech社からのHTXキット(Cat# P01002)を指示書に従って用いて発色させた。
【０１７０】
b)ONPG後処理
-  細胞を遠心分離し、上清を廃棄した。
-  0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを含む100μlの100mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.5をチューブに加えた。
-  チューブを室温にて10分間、200rpmで振とうした。
-  1/4容量の2.5mMオルソニトロフェニル-βD-ガラクトピラノシド(ONPG)を室温にて加えて、最終ONPG濃度を0.5mMとした。
-  1M Na2CO3を最終濃度0.3Mで加えることにより、反応を停止した。
-  吸光度を414nmで測定した。
【０１７１】
FUS-1又はFIG-2プロモーターのいずれかの制御下でLacZを用いて行ったアッセイはともに、対照から目視で容易に区別でき(図6及び図7)、別の日に行った生物学的反復にわたって再現可能な(データは示さず)強いシグナルを生じた。X-gal(図6)及びONPG(図7)基質はともに、測定可能なシグナルを生じた。しかし、ONPGは、より費用効果がよい基質であり、定量実験は、よって、この基質を用いて行った。FUS-2により駆動される場合に700μMのジアセチルを用いて観察されたシグナルの最大限の増加は、バックグラウンドのほぼ6倍であった。バックグラウンドは非常に安定していた(図8)。FUS-1プロモーターの下では、シグナルの最大限のリガンド誘導性の増加は1mMで生じ、ほぼ2.5倍だけの倍数であった(図9)。さらに、バックグラウンドはより高く、変動がより大きかった。
【０１７２】
スクリーニングのための線虫化学受容体遺伝子ライブラリー
爆発性の標的に対する応答についてスクリーニングできるC.エレガンス受容体の大きいライブラリーを構築した。578個の推定上の受容体を含む5つの推定上の化学受容体のサブファミリーを、ライブラリーの供給源材料として選択した(図10)。
【０１７３】
これらの遺伝子の配列は、C.エレガンスについてのオンラインデータベースであるWormbaseから入手した。それぞれ個別の遺伝子をクローニングするために、市販で入手可能なRNA抽出キットを用いて、C.エレガンスの様々なライフステージが混ざった培養物からトータルRNAを調製した。cDNAは、Invitrogen社のスーパースクリプトIII逆転写酵素を用いて調製した。それぞれ個別の遺伝子の増幅のためのプライマーは、全長遺伝子が確実に増幅されるように、ATG開始コドン(フォワードプライマー)及び停止コドン(リバースプライマー)を含むように設計した。校正ポリメラーゼを標準的なPCR反応で用いて、遺伝子を増幅した。
【０１７４】
適当なサイズの増幅生成物を、Invitrogen社のGateway(登録商標)クローニングシステムを用いて、pENTR/D-TOPOベクターにクローニングした。Gateway(登録商標)システムは、効率が高く、伝統的な制限酵素クローニングの制限を回避するとともに、異なる下流科学的研究のために多くのベクターへの単純なサブクローニングを可能にする。
【０１７５】
本発明者らは、驚くべきことに、遺伝子の多くのスプライスバリアントがcDNA試料中に存在して、C.エレガンスの推定上の化学受容体GPCRの転写がかなり乱雑であることを見出した。正しい配列がクローニングされたことを確実にするために、複数のコロニーを各遺伝子について採取し、それらの正しい挿入断片サイズを制限消化により確認した。正しいサイズのクローンの配列を、Wormbaseで入手可能な配列に戻して比較し、誤りがないクローンを、C.エレガンス化学受容体ライブラリーに含めるために選択した。
【０１７６】
各クローンの配列及び詳細な情報は、電子的に記録し、クローンを-20℃にて貯蔵した。578のプールから合計で297個の誤りがない受容体クローンを単離したが、これは、strサブファミリー内の、発現され、アクセス可能でありかつ有用な配列の大部分である。
【０１７７】
pENTR D Topoベクターから酵母発現ベクターへの受容体のサブクローニングを完了した。発現ベクターをpDEST PGK-HISと称した。これは、酵母発現ベクターpESC-HIS(Stratagene社)に基づき、GAL1及びGAL10プロモーターが単一(700bp)酵母PGKプロモーターで置き換えられ、Gateway(登録商標)attR1-attR2カセットがPGKプロモーターのすぐ下流に挿入されていた。導入は、InVitrogen社の指示書に従って、標準的なGateway(登録商標)LRクロナーゼ反応を用いて達成した。
【０１７８】
294個の受容体で形質転換された酵母の独立クローンを、8×96の位置のマスタープレート(陽性及び陰性対照のための余地を設けて、プレートあたり1点につき2つの検体で最大37受容体)上に、1点につき2つの検体で選択した。8枚のマスタープレートのうち7枚を陽性及び陰性対照と共に96ウェルスクリーニングプレートに移し、少なくとも1つの化学標的に対してスクリーニングした。
【０１７９】
(実施例2)
酵母における線虫GPCRライブラリーのスクリーニング
単一化学物質に対して若しくは化学物質の混合物に対して同時に複数の受容体を、又は複数の化学物質若しくは混合物に対して単一の受容体をスクリーニングできるようにするために、マルチウェルプレートのフォーマット、例えば48、96、384以上の密度のフォーマットでアッセイを行うことが簡便かつ効率的である。原理を証明するものとして、本発明者らは、48及び96ウェルフォーマットにおいて対照アッセイを行った。
【０１８０】
方法
方法は、以下のとおりであった(Brouchon-Macariら、2003から改変):
・1mLのサッカロマイセス・セレビシエ最小培地(SCMM)-His、-Leuに、Abs600nm=1にてodr-10(lacZ/Odr10/gpa1-KAGMM/ste2-sst2-far1-gpa1-)で形質転換したスクリーニング株の単一コロニーを、96ウェルディープウェルプレート中で接種した。
・プレートを、900rpmで振とうしながら30℃にて一晩(18時間)インキュベートした。
・ウェルからの培養液を新しいウェル(96又は48ウェルプレート)に、以下の酵母細胞光学密度にて1mLの最終容量まで希釈した:
1.Abs600=1
2.Abs600=0.5
3.Abs600=0.5。
・上記のウェル1及び2を、500μMのジアセチル溶液で誘導した(新しく調製し、氷上で維持した;1M:87μLジアセチル+913μL水、次いで、水で1/10に希釈し、5μLを500μMの最終濃度のために1mLの細胞に加えた)。全てのウェル900rpmで振とうしながら30℃にて18時間インキュベートした。
・プレートを遠心分離して細胞をペレットにし、上清を吸引して廃棄し、ペレットを120μLの溶解緩衝液(100mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.5(0.1%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウムを含む82mM Na2HPO4及び12mM NaH2PO4からなる)に再懸濁した。初期吸光度を、プレート読み取り分光光度計で414nmにて読み取った。
・プレートを900rpmにて30℃にて10分間振とうした。
・30マイクロリットルの2.5mM o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド(ONPG)(130μLのジメチルホルムアミドに溶解した10mgのONPGは250mMであり、次いで水で2.5mMである最終濃度のために1/100に希釈)を加え、プレートを室温にて5分から3時間の間インキュベートした。
・80マイクロリットルの1M Na2CO3溶液を加え、プレートベースの分光光度計で吸光度を414nmにて読み取ったか、又は可視領域にわたって各ウェルについてスペクトルを記録した。
【０１８１】
結果
いくつかの場合では、発色は、基質を加えてから5分後と早くに目視可能であった。3時間後のAbs414の読み取りは、Abs600nm=1の開始条件+ジアセチルについて0.247、Abs600nm=0.5の開始条件+ジアセチルについて0.521、及びAbs600nm=0.5の開始条件でジアセチルの添加なしについて0.165であった。
【０１８２】
96または48のいずれかのディープウェルプレート(前者は合計2mL、後者は5mLを含有できる)のウェル中で、開始酵母培養物の一連の異なる希釈率(1/4〜1/20)を用いて、アッセイを反復した。通常、Abs600nm=1に達するために必要な希釈率は、1/2〜1/4の範囲である。この実験は、一連のより高い希釈率について調べた。インキュベーションは、900rpmの振とうで30℃にて17時間であった。lacZのジアセチル誘導は、48ウェルプレートでの1/20細胞希釈率以外の全ての条件で検出された。96ウェルプレートは、対照に対するジアセチル誘導のAbs414nmの比率が、全ての希釈率について48ウェルプレートよりも一貫して高かった。96ウェルプレートでは、より高い細胞希釈率は、対照に対するジアセチル誘導の比率が一貫してより高かった(図11)。最良の比率は、96ウェルプレートで1/20の希釈率の場合であり、ここでは、ジアセチル誘導の吸光度が0.481であり、非誘導対照が0.079であった。
【０１８３】
結論
本発明者らは、多数の発表された手順を試験し、驚くべきことに、異種発現線虫GPCRとのリガンドにより誘導される結合が、レポーターを介して適切に信頼でき、感度が高いシグナルを生じる酵母を生成するためにいずれも有用でないことを見出した。機能しなかった既に発表された手順の例は、キメラGα、受容体についてGal誘導性プロモーター、酵母Gαを置き換える線虫Gαを用い、線虫GPCRカセット及びレポーター構築物を同じプラスミド上に有するMinicら(2005)により記載されたものを含んだが、GFPをレポーターとして用いることは非常に信頼性が低く、レポーターのためのプロモーターとして一般的に用いられるFUS-1は、弱いシグナル及び高いバックグラウンドをもたらした。その結果、信頼性及び感度の点で本発明者らの要求に合致した新しいアッセイを開発しなければならなかった。この点で、初期の実験は0.94のzファクターを示し、これは優れており、驚くべきことである。
【０１８４】
(実施例3)
酵母における線虫GPCRライブラリーの、シクロヘキサノンに対するスクリーニング
複数の線虫GPCRをシクロヘキサノンに対して同時にスクリーニングするために、ハイスループット96ウェルプレートアッセイを設計した。
【０１８５】
方法
方法は、(Brouchon-Macariら、2003)から改変した。
【０１８６】
2%グルコースを含む500μLの分割量のサッカロマイセス・セレビシエ最小培地(SCMM)-尿素、-His、-Leu(SCMM-UHL)に、96ウェルディープウェルプレート中で、選択した線虫GPCR(pFIG2:LacZ/pPGK:GPCRx/gpa1-KAGMM/ste2- sst2- far1- gpa1-)で形質転換したスクリーニング株の単一コロニーを接種した。コロニーH9、H10は、ジアセチルに応答するodr-10で形質転換した陽性対照であり、H11及びH12は、ジアセチルに応答しない変異odr-10で形質転換した陰性対照であった。
【０１８７】
プレートを、1000rpmで振とうしながら30℃にて一晩(24時間)インキュベートした。
【０１８８】
各培養物を、96ウェルプレートの新しいウェルに、最終容量1mLまで1:10に希釈した。
【０１８９】
対照ウェルH9〜12以外の全てのウェルを、5mMシクロヘキサノン(51.77μLのシクロヘキサノンを、2%グルコースを含む100mL SCMM-U-H-L培地に加えた)で誘導した。対照として、H9〜12は、500μMジアセチル(1Mジアセチルを新しく調製し、8.7μLジアセチル+91.3μL水、次いで水で1:100に希釈し、500μMの最終のために50μLを1mLの細胞に加えた)で誘導した。全てのウェルを1000rpmで振とうしながら30℃にて18時間インキュベートした。
【０１９０】
プレートを遠心分離し(1500×g、5分)、上清を廃棄し、ペレットを120μLの溶解緩衝液[0.1%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む100mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.5(82mM Na2HPO4及び12mM NaH2PO4からなる)]に再懸濁した。プレートを1000rpmで30℃にて10分間振とうした。
【０１９１】
40μLの2.5mM o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド(ONPG)を加え、プレートを室温にて10分間インキュベートした。80μLの1M Na2CO3溶液を加えて反応を停止した。プレートを遠心分離し(1500×g、5分)、100μLの上清を各ウェルから注意してピペットで取り出し、新しい透明96ウェルプレートのウェルに入れた。異なるウェルについての凡例は、Table 2(表2)に示す。
【０１９２】
結果を写真で記録し、各ウェルのスペクトルを、可視光スペクトルの380nmから500nmの領域にわたってプレート読み取り分光光度計で記録した。
【０１９３】
結果
ウェルB7、D2及びH9において黄色が観察され(図12)、このことは、これらが試験したリガンドにより誘導されたことを示した。380nmから500nmまでのスペクトルの読み取りを測定して分析した(図13)。B7、D2及びH9のスペクトルは420nmにて明確なピークを示し、これは他のウェルでは観察されなかった。
【０１９４】
予期されたように、陽性対照H9(odr-10)はジアセチルに応答し、よって、黄色及び420nmでのスペクトルピークを示した。H9とは違って、他方の陽性対照H10は、このアッセイにおいてジアセチルに対していずれの応答(色又はスペクトル)も示さなかった。このことは、同じ受容体で形質転換された異なるクローン酵母株が、誘導リガンドに対して異なる応答を示し得るという、発明者らの通常の観察結果を反映する。このことは、発明者らがなぜ、我々のライブラリーにおいて全ての受容体について2つの独立したクローンをスクリーニングするように選択したかも説明する。本明細書の他の場所で言及したように、論理的に管理できるならば、各受容体について多数のクローンをスクリーニングすることが有利である。
【０１９５】
【表２】
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【０１９６】
予期されたように、陰性対照H11及びH12(変異odr-10)は、500μMジアセチルに対していずれの応答も示さなかった(図13)。ウェルG5は、スペクトルにおいてもいずれのピークを示さなかったウェルの例である(図13)。逆に、ウェルB7及びD2は、シクロヘキサノンに対して明確な応答を示した。Table 2(表2)によると、ウェルB7は、線虫GPCR Str144で形質転換された酵母株を含み、D2は、GPCR Srj22で形質転換された酵母株である。このアッセイを少なくとも3回反復して、結果が一貫していたことを確認した。
【０１９７】
結論
本実施例では、本発明者らは、シクロヘキサノンを検知するための候補GPCRを同定しただけでなく、目的の化合物に対して酵母において複数の線虫GPCRをスクリーニングするためのハイスループットアッセイを証明することにも成功した。色の変化の目視観察の他に、本発明者らは、このアッセイの結果を分析し、目的のリガンドのための候補受容体を同定する助けとなる信頼できるスペクトル分析法も開発した。
【０１９８】
(実施例4)
他のマーカー
本発明者らは、lacZ又は他の可視マーカーではないレポーター遺伝子が、スクリーニング緩衝液中で酵母の成長に必要とされる選択可能な成長マーカー、例えば、可能であればLEU2、TRP1、HIS3、HIS4、URA3、URA5、SFA1、ADE2、MET15、LYS5、LYS2、ILV2、FBA1、PSE1、PDI1及びPGK1から選択される栄養マーカー又は抗生物質耐性マーカーである、上記の型のアッセイも構想している。この場合、単一受容体配列の複数の独立したクローンを、スクリーニングウェルのそれぞれに入れる。誘導の際に、陽性に応答できるクローンだけが成長し、いずれの成長の程度もリガンド-受容体「ヒット」を示す。このような構成は、より多様なクローンを同時にスクリーニングでき、実施例3で示す37個ではなく、96ウェルプレートあたり少なくとも74個の異なる型の受容体までのスクリーニングを可能にするという、本明細書に示す他の例を超えるさらなる利益を有する。
【０１９９】
本出願は、2013年4月16日に出願したAU2013901329及び2013年5月30日に出願したAU2013901925(これらの全体の内容はともに参照により本明細書に組み込まれている)の優先権を主張する。
【０２００】
広く記載される本発明の精神又は範囲を逸脱することなく、具体的な実施形態に示すように、多数の変形及び/又は改変を本発明に対して行うことができることが当業者により認識される。本実施形態は、よって、あらゆる点で、説明のためであり、限定するためでないと見なされる。
【０２０１】
本明細書で論じかつ/又は参照する全ての出版物は、それらの全体が本明細書に組み込まれている。
【０２０２】
本明細書に含まれる文献、条例、材料、デバイス、物体などについてのいずれの議論も、本発明についての状況を説明する目的のためだけである。これらの事項のいずれもが従来技術の基礎の一部を形成するか、又は本出願の各請求項の優先日前に存在した本発明に関係する分野における一般常識であったことを認めるものではない。
(参考文献)
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【図４】
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【図５（Ａ）】
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【図５（Ｂ）】
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【図５（Ｃ）】
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【図６】
2016516422.tif 000013
【図７】
2016516422.tif 000014
【図８】
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【図９】
2016516422.tif 000016
【図１０】
2016516422.tif 000017
【図１２】
2016516422.tif 000018
【図１３】
2016516422.tif 000019
【図１】
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【図２】
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【図３】
2016516422.tif 000022
【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2016516422.tif 000025
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