(57)【要約】  本発明は、特定の種類の炭素質材料を組み込み、所望のタンパク質生成物の収率に悪影響を及ぼすことなくタンパク質フラグメントの効果的で選択的な除去をもたらす、新規で改良されたタンパク質精製プロセスを提供する。
2016527201.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製される標的タンパク質を含むサンプル中のフラグメントの量を低減する方法であって、
（ａ）標的タンパク質および標的タンパク質のフラグメントを含むサンプルを用意するステップであって、フラグメントが標的タンパク質の量の少なくとも０．２％以上の量である、ステップ、
（ｂ）サンプルを活性炭に接触させるステップであって、活性炭がフラグメントと結合する、ステップ、
（ｃ）サンプルから活性炭を除去し、それによりサンプル中のフラグメントの量を低減するステップ
を含む方法。
【請求項２】
標的タンパク質がＦｃ領域含有タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｆｃ領域含有タンパク質が抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
活性炭がデバイス内に充填される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
デバイスがカラム、ポッド、カートリッジまたはカプセルである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
フラグメントが標的タンパク質の量の少なくとも０．５％以上の量で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
フラグメントが標的タンパク質の量の少なくとも１％以上の量で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
フラグメントが標的タンパク質の量の少なくとも２％以上の量で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｃ）が、サンプルから活性炭を除去するために、ろ過もしくは遠心分離またはこれらの組合せを用いることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
精製される抗体を含むサンプル中の抗体フラグメントの量を低減する方法であって、
（ａ）抗体および抗体フラグメントを含むサンプルを用意するステップであって、フラグメントが抗体の量の少なくとも０．２％以上の量である、ステップ、
（ｂ）サンプルを活性炭に接触させるステップであって、活性炭が抗体フラグメントと結合する、ステップ、
（ｃ）サンプルから活性炭を除去し、それによりサンプル中のフラグメントの量を低減するステップ
を含む方法。
【請求項１３】
フラグメントがプロテインＡと結合する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
フラグメントがプロテインＡと結合しない、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
サンプルがプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムから収集された溶出液である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
活性炭がカラム、ポッド、カートリッジまたはカプセルに充填される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
フラグメントが抗体の量の少なくとも０．５％以上の量である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
フラグメントが抗体の量の少なくとも１％以上の量である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
フラグメントが抗体の量の少なくとも２％以上の量である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
活性炭が、ろ過もしくは遠心分離またはこれらの組合せを用いて除去される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
フラグメントの量の低減後、サンプル中の標的タンパク質の純度が高められる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
標的タンパク質の純度が、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％またはそれより高い割合だけ高められる、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプルから標的タンパク質のフラグメントを除去するための活性炭の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
最も一般的に用いられるモノクローナル抗体などのタンパク質の精製プロセスは、典型的に、細胞培養培地にタンパク質を分泌する能力を有する組換え細胞株（例えばＣＨＯ細胞株）を用いる。次いで、細胞、細胞破片、ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質などの種々の不純物からタンパク質を分離するために、目的のタンパク質を含有する培地または細胞培養フィードが、一連の精製ステップに供される。
【０００３】
典型的な精製プロセスは、通常、タンパク質を含有する細胞培養フィードまたは培地を清澄化ステップに供し、続いて、清澄化された細胞培養フィードを抗体捕捉ステップ（例えばプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーステップ）に供し、続いて、陽イオン交換結合／溶出クロマトグラフィーステップおよび／または陰イオン交換クロマトグラフィーステップに供することを伴う。
【０００４】
精製プロセスにおける種々のステップは、タンパク質を含有する細胞培養フィード中の不純物を除去することを目的としているが、望ましくないタンパク質フラグメントはインタクトなタンパク質と同じ性質を多く共有するため、一般に、除去するのが困難である。
【０００５】
活性炭は、これまで、エアフィルタ（例えば米国特許第６，４１３，３０３号明細書参照）、ガス精製（例えば米国特許第７，９１８，９２３号明細書参照）、カフェイン除去（例えば米国特許第４，４８１，２２３号明細書参照）、金精製（例えば米国特許第５，０１９，１６２号明細書参照）、燃料精製（例えば米国特許出願公開第２００６／０２２３７０５号明細書参照）、血液潅流（例えば米国特許第４，０４８，０６４号明細書参照）、中毒および過量服用の処置（例えば米国特許第４，４５３，９２９号明細書参照）、下水処理（例えば米国特許第８，３２９，０３５号明細書参照）、流出油除去（例えば米国特許第４，７７０，７１５号明細書参照）、地下水浄化（例えば米国特許第６，１１６，８１６号明細書参照）、自動車燃料系統からの揮発性有機化合物の捕捉（例えば米国特許第７，０４４，１１２号明細書参照）、化学精製（例えば米国特許第４，９０６，４４５号明細書参照）、蒸留アルコール飲料精製（例えば米国特許出願公開第２００７／０２４８７３０号明細書参照）、糖質の脱色（例えば米国特許第２，０８２，４２５号明細書参照）、呼吸用マスク（例えば米国特許第５，７１４，１２６号明細書参照）、ガスマスク（例えば米国特許第４，９９２，０８４号明細書参照）、対化学兵器防護服（例えば米国特許第７，８７７，８１９号明細書参照）および浄水処理（例えば米国特許第７，５３７，６９５号明細書参照）に用いられてきた。
【０００６】
さらに、活性炭は、脂肪酸およびビリルビンなどの低分子不純物を血清アルブミンから除去するために用いられてきた（例えば、Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４２：１７３−１８１頁（１９６７年）；Ｎａｋａｎｏら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１２９：６４−７１頁（１９８３年）；Ｎｉｋｏｌａｅｖら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｒｔ．Ｏｒｇ．、１４：１７９−１８５頁（１９９１年）参照）。活性炭はまた、植物ウイルス精製時に色素ならびに宿主タンパク質、プロテアーゼおよびリボヌクレアーゼを除去するためにも用いられてきた（例えば、Ｐｒｉｃｅ、Ａｍ．Ｊ．Ｂｏｔａｎｙ、３３：４５−５４頁（１９４６年）；Ｃｏｒｂｅｔｔ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１５：８−１５頁（１９６１年）；ＭｃＬｅａｎａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３１：５８５−５９１頁（１９６７年）；米国特許出願公開第２００６／０２８１０７５号明細書参照）。さらに、活性炭は、プラスミドＤＮＡからの低分子量プラスミドフラグメントの除去にも有用であると記載されている。Ｋｉｍら、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．、１１０：６０８−６１３頁（２０１０年）を参照されたい。
【０００７】
さらに、参照により本明細書に全体を組み込まれる、２０１２年８月２日が出願日の米国特許出願第１３／５６５，４６３号明細書は、目的の生体分子（例えば抗体）を含有するサンプルからタンパク質不純物（例えば宿主細胞タンパク質）およびＤＮＡを除去するために、活性炭を他の培地と組み合わせて使用することについて記載している。
【０００８】
最後に、参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年２月２６日が出願日の米国特許仮出願第６１／７６９，２６９号明細書が、溶液条件の変更によりタンパク質混合物からタンパク質を選択的に除去するための活性炭の使用について記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第６，４１３，３０３号明細書
【特許文献２】米国特許第７，９１８，９２３号明細書
【特許文献３】米国特許第４，４８１，２２３号明細書
【特許文献４】米国特許第５，０１９，１６２号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００６／０２２３７０５号明細書
【特許文献６】米国特許第４，０４８，０６４号明細書
【特許文献７】米国特許第４，４５３，９２９号明細書
【特許文献８】米国特許第８，３２９，０３５号明細書
【特許文献９】米国特許第４，７７０，７１５号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，１１６，８１６号明細書
【特許文献１１】米国特許第７，０４４，１１２号明細書
【特許文献１２】米国特許第４，９０６，４４５号明細書
【特許文献１３】米国特許出願公開第２００７／０２４８７３０号明細書
【特許文献１４】米国特許第２，０８２，４２５号明細書
【特許文献１５】米国特許第５，７１４，１２６号明細書
【特許文献１６】米国特許第４，９９２，０８４号明細書
【特許文献１７】米国特許第７，８７７，８１９号明細書
【特許文献１８】米国特許第７，５３７，６９５号明細書
【特許文献１９】米国特許出願公開第２００６／０２８１０７５号明細書
【特許文献２０】米国特許出願第１３／５６５，４６３号明細書
【特許文献２１】米国特許仮出願第６１／７６９，２６９号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４２：１７３−１８１頁（１９６７年）
【非特許文献２】Ｎａｋａｎｏら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１２９：６４−７１頁（１９８３年）
【非特許文献３】Ｎｉｋｏｌａｅｖら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｒｔ．Ｏｒｇ．、１４：１７９−１８５頁（１９９１年）
【非特許文献４】Ｐｒｉｃｅ、Ａｍ．Ｊ．Ｂｏｔａｎｙ、３３：４５−５４頁（１９４６年）
【非特許文献５】Ｃｏｒｂｅｔｔ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１５：８−１５頁（１９６１年）
【非特許文献６】ＭｃＬｅａｎａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３１：５８５−５９１頁（１９６７年）
【非特許文献７】Ｋｉｍら、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．、１１０：６０８−６１３頁（２０１０年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、精製される標的タンパク質（例えばモノクローナル抗体）を含有するサンプルからのフラグメントの除去に活性炭を用いることができるという驚くべき予想外の発見に、少なくとも一部は基づく。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
いくつかの実施形態において、精製される標的タンパク質を含むサンプル中のフラグメントの量を低減する方法であって、（ａ）標的タンパク質およびフラグメントを含むサンプルを用意するステップであって、フラグメントが標的タンパク質の量の少なくとも０．２％以上の量で存在するステップ；（ｂ）サンプルを活性炭に接触させるステップであって、活性炭がフラグメントと結合するステップ；ならびに（ｃ）サンプルから活性炭を除去し、それによりサンプル中のフラグメントの量を低減するステップを含む方法が提供される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、Ｆｃ領域含有タンパク質である。他の実施形態において、標的タンパク質は、非免疫グロブリンタンパク質である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域含有タンパク質は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などの抗体である。
【００１５】
いくつかの実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。他の実施形態において、抗体はポリクローナル抗体である。
【００１６】
いくつかの実施形態において、フラグメントは標的タンパク質の量の少なくとも０．５％以上の量である。さらに他の実施形態において、フラグメントは標的タンパク質の量の少なくとも１％以上の量である。さらに他の実施形態において、フラグメントは標的タンパク質の量の少なくとも２％以上の量である。
【００１７】
いくつかの実施形態において、精製される抗体を含むサンプル中の抗体フラグメントの量を低減する方法であって、（ａ）抗体および抗体フラグメントを含むサンプルを用意するステップであって、抗体フラグメントが抗体の量の少なくとも０．２％以上の量で存在するステップ；（ｂ）サンプルを活性炭に接触させるステップであって、活性炭が抗体フラグメントと結合するステップ；ならびに（ｃ）サンプルから活性炭を除去し、それによりサンプル中のフラグメントの量を低減するステップを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、抗体フラグメントは、抗体の量の少なくとも０．５％以上の量で存在する。さらに他の実施形態において、抗体フラグメントは、抗体の量の少なくとも１％以上の量で存在する。さらに他の実施形態において、抗体フラグメントは、抗体の量の少なくとも２％以上の量で存在する。
【００１８】
いくつかの実施形態において、抗体フラグメントは、プロテインＡと結合するフラグメントを含む。他の実施形態において、抗体フラグメントは、プロテインＡと結合しない。
【００１９】
いくつかの実施形態において、サンプルはプロテインＡクロマトグラフィーカラムから収集された溶出液である。
【００２０】
いくつかの実施形態において、活性炭はデバイス内に充填される。代表的デバイスとしては、例えば、カラム（クロマトグラフィーカラムなど）、ポッド、ディスク、カートリッジおよびカプセルが挙げられる。
【００２１】
各種実施形態において、本明細書記載の方法は、標的タンパク質または（場合によっては）抗体の純度上昇をもたらす。標的タンパク質または抗体の純度は、活性炭と接触していないサンプルと比較して、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれより高い割合だけ高めることができる。
【００２２】
いくつかの実施形態において、標的タンパク質含有サンプル（または抗体含有サンプル）は、細胞培養フィードである。他の実施形態において、細胞培養液はまず、活性炭と接触する前に清澄化および／または精製される。清澄化方法としては、遠心分離、沈降、深層ろ過、スクリーンろ過、軟凝集、刺激原応答性ポリマー使用およびｐＨ変更が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
いくつかの実施形態において、サンプルは、本明細書記載の方法に供される前に、１つ以上の精製ステップまたは方法に供される。かかる精製ステップまたは方法としては、結合溶離（ｂｉｎｄ  ａｎｄ  ｅｌｕｔｅ）モードまたはフロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）モードのいずれかで操作されるカラムおよび／またはメンブレンクロマトグラフィー；結晶化；二相および三相分離；ならびにろ過が挙げられるが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】モノクローナル抗体フラグメントを、活性炭のカラムに通すことで、モノクローナル抗体溶液から除去することを実証する代表的実験の結果を表すグラフである。５．０１ｍｇ／ｍＬのＭＡＢ  Ｉおよび２．０１％のフラグメントを含有するフラグメント混入ＭＡＢ  Ｉ溶液が、活性炭を充填したカラムに通された。Ｘ軸は、カラムに通されたモノクローナル抗体の質量を活性炭の容積で除算した値（ｋｇ／Ｌ）を示し、左側Ｙ軸は累積画分プール中のフラグメントの百分率を示し、右側Ｙ軸は累積画分プール中のモノクローナル抗体の濃度をフィード中のモノクローナル抗体の濃度で除算した値を示している。
【図２】プロテインＡと結合するモノクローナル抗体フラグメントを、活性炭のカラムに通すことで、モノクローナル抗体溶液から除去することを実証する代表的実験の結果を表すグラフである。７．１３ｍｇ／ｍＬのＭＡＢ  ＩＩＩおよび３．５０％のフラグメントを含有するフラグメント混入ＭＡＢ  ＩＩＩ溶液が、活性炭を充填したカラムに通された。Ｘ軸はカラムに通されたモノクローナル抗体の質量を活性炭の容積で除算した値（ｍｇ／ｍＬ）を示し、左側Ｙ軸は特定のカラム画分における収集されたモノクローナル抗体中のフラグメントの百分率を示し、右側Ｙ軸は特定のカラム画分中のモノクローナル抗体の濃度をフィード中のモノクローナル抗体の濃度で除算した値を示している。
【図３】プロテインＡと結合しないモノクローナル抗体フラグメントを、活性炭を充填したカラムに通すことで、モノクローナル抗体溶液から除去することを実証する代表的実験の結果を表すグラフである。１．２７ｍｇ／ｍＬのＭＡＢ  ＩＩＩおよび４．８４％のフラグメントを含有するフラグメント混入ＭＡＢ  ＩＩＩ溶液が、活性炭のカラムに通された。Ｘ軸はカラムに通されたモノクローナル抗体の質量を活性炭の容積で除算した値（ｍｇ／ｍＬ）を示し、左側Ｙ軸は特定のカラム画分における収集されたモノクローナル抗体中のフラグメントの百分率を示し、右側Ｙ軸は特定のカラム画分中のモノクローナル抗体の濃度をフィード中のモノクローナル抗体の濃度で除算した値を示している。
【図４】静的結合条件下で活性炭を用いた処理を行い、低溶液伝導率および高溶液伝導率両方で、溶液ｐＨ４．０−９．０の範囲にて、モノクローナル抗体溶液からモノクローナル抗体フラグメントを除去することを実証する代表的実験の結果を表すグラフである。活性炭で処理されたｐＨ４．０、５．０、６．０、７．０、８．０または９．０のフラグメント混入ＭＡＢ  ＩＩ溶液は、低伝導率および高伝導率両方で、６．３８−７．４４ｍｇ／ｍＬのＭＡＢ  ＩＩおよび１．５−１．７％のフラグメントを含有していた。Ｘ軸は溶液ｐＨを示し、Ｙ軸は、モノクローナル抗体溶液から除去されたフラグメントの百分率であって、処理済み溶液中のフラグメントの百分率を未処理溶液中のフラグメントの百分率で除算した値を１００％から引いて計算した値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、精製される標的タンパク質を含有するサンプルからフラグメントを除去するための新規および改良されたプロセスを提供する。
【００２６】
タンパク質、特に抗体の精製プロセスは十分に確立されている。タンパク質（例えばモノクローナル抗体）の精製時によく用いられる重要なステップの１つは、精製されるタンパク質と特異的に結合するリガンドまたは化合物を通常用いる、捕捉またはアフィニティーステップである。例えば、モノクローナル抗体の場合、かかるステップは通常、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いる。
【００２７】
捕捉ステップは、高い割合の望ましくない種々の物質（例えば不純物）から標的タンパク質を分離するのに有用であるが、フラグメントの多くがアフィニティーリガンドと相互作用し標的タンパク質と同じ画分がもたらされるため、捕捉ステップは一般に、標的タンパク質を含有する画分における標的タンパク質のフラグメントの量を低減することには効果がない。上記フラグメントは、望ましくない不純物であり、特に規制認可を必要とする治療用タンパク質の場合、精製タンパク質から除去する必要がある。
【００２８】
フラグメントを除去するには一般に３つの手段が記載されている。これらの手段の１つは、フラグメントの流体力学的容積の違いに基づいてフラグメントをタンパク質（例えばモノクローナル抗体）全体から分離する、サイズ排除クロマトグラフィーである。しかし、サイズ排除クロマトグラフィーは分析評価に最も一般的に用いられるものであり、モノクローナル抗体などのタンパク質の実用的な精製にスケールアップすることは困難である。フラグメントを含む種々の不純物の除去に有用であると記載される別の手段は、セラミックハイドロキシアパタイトである（例えば米国特許出願公開第２０１００２３４５７７号明細書参照）。セラミックハイドロキシアパタイトは、ほとんどの場合、結合溶離モードにて凝集した抗体不純物を除去するために用いられる。最後に、混合モードリガンドが、結合溶離モードで疎水性電荷誘導クロマトグラフィーを用いたフラグメントの分離において有用であると記載された（例えばＪ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．、７５５：３７−４６頁（２００１年）参照）。
【００２９】
活性炭はこれまで浄水処理に用いられてきた。さらに、活性炭は、脂肪酸およびビリルビンなどの低分子不純物を血清アルブミンから除去するために用いられてきた（例えば、Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４２：１７３−１８１頁（１９６７年）；Ｎａｋａｎｏら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１２９：６４−７１頁（１９８３年）；Ｎｉｋｏｌａｅｖら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｒｔ．Ｏｒｇ．、１４：１７９−１８５頁（１９９１年）参照）。活性炭はまた、植物ウイルス精製時に色素ならびに宿主タンパク質、プロテアーゼおよびリボヌクレアーゼを除去するためにも用いられてきた（例えば、Ｐｒｉｃｅ、Ａｍ．Ｊ．Ｂｏｔａｎｙ、３３：４５−５４頁（１９４６年）；Ｃｏｒｂｅｔｔ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１５：８−１５頁（１９６１年）；ＭｃＬｅａｎａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３１：５８５−５９１頁（１９６７年）参照）。
【００３０】
したがって、活性炭は、溶液中の分子（例えば、水サンプル中の不純物）に非特異的に結合することが報告されてきた。
【００３１】
最近では、活性炭がタンパク質精製プロセスに用いられることが記載されている。例えば、参照により本明細書に全体を組み込まれる、２０１２年８月２日が出願日の米国特許出願第１３／５６５，４６３号明細書は、目的の生体分子（例えば抗体）を含有するサンプルからタンパク質不純物（例えば宿主細胞タンパク質）およびＤＮＡを除去するため、活性炭を他の培地と組み合わせて使用することについて記載している。さらに、参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年２月２６日が出願日の米国特許仮出願第６１／７６９，２６９号明細書は、溶液条件の変更によりタンパク質混合物からタンパク質を選択的に除去するための活性炭の使用について記載している。
【００３２】
本明細書の実施例に実証されるように、活性炭は、精製される標的タンパク質を含有するサンプル中の標的タンパク質のフラグメントの量を低減することに用いることができる。さらに、活性炭は、本明細書に記載されるように、標的タンパク質およびタンパク質のフラグメントを含有する溶液中の標的タンパク質の純度を高めるために用いることができ、活性炭を使用したフラグメントの除去により、サンプル中の標的タンパク質の純度は上昇する。
【００３３】
本開示をより容易に理解できるように、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は詳細な説明の中で記述する。
【００３４】
Ｉ．定義
本明細書において互換的に用いられる用語「活性炭素」または「活性炭」とは、その細孔構造を増強する処理が施された炭素質材料を指す。活性炭は、場合により、活性チャコールとも呼ばれる。活性炭は非常に大きな表面積を有する多孔質固体である。活性炭は、石炭、木材、ヤシ殻、堅果殻および泥炭を含む種々の原料源に由来し得る。活性炭は、制御雰囲気下での加熱を含む物理的活性化、または強酸、塩基もしくは酸化剤を使用した化学的活性化を用いて、上記材料から製造することができる。活性化プロセスは、不純物除去のための高い能力を活性炭に付与する表面積の大きな多孔質構造をもたらす。活性化プロセスを変更して表面の酸性度を制御することができる。
【００３５】
典型的な活性化プロセスは、樹脂廃棄物、石炭、石炭コークス、石油コークス、褐炭、ポリマー材料、ならびにパルプおよび紙、パルプ生産残渣、木材（木材チップ、おがくずおよび木粉など）、堅果殻（アーモンド殻およびヤシ殻など）、穀粒、ならびに果実核（オリーブおよびサクランボの種など）を含むリグノセルロース材料などの炭素源を、熱プロセス（例えば酸化性ガスを用いるもの）または化学的プロセス（例えばリン酸または塩化亜鉛などの金属塩を用いるもの）に供することを含む。リン酸（Ｈ３ＰＯ４）を用いる木材ベースの炭素の化学的活性化を含む代表的プロセスは、炭素の脱色およびガス吸着能力の改善をもたらした米国再発行特許第３１，０９３号明細書に開示されている。また、米国特許第５，１６２，２８６号明細書は、特に高密度であり比較的高い（３０％）リグニン含量を含有する、堅果殻、果実核および穀粒などの木材ベース材料のリン酸活性化を教示している。リグノセルロース材料のリン酸活性化は、高活性および高密度の炭素を調製するステップとして、米国特許第５，２０４，３１０号明細書でも考察されている。この段落に列挙されたそれぞれの特許の教示は、参照により本明細書にその全体を組み込む。
【００３６】
他のほとんどの吸着材料とは異なり、活性炭は、比較的弱いファンデルワールス力またロンドン分散力により分子と相互作用すると考えられる。典型的な市販の活性炭製品は、当該技術分野において周知の方法である窒素吸着に基づくＢｒｕｎａｕｅｒ−Ｅｍｍｅｔｔ−Ｔｅｌｌｅｒ（「ＢＥＴ」）法により測定した場合、少なくとも３００ｍ２／ｇの表面積を示す。
【００３７】
活性炭素または活性炭はこれまで、液体および気体精製プロセス、ならびに宿主細胞タンパク質などの不純物に結合させることによる、他の不純物から組換え発現された抗体の精製プロセスに用いられてきた（例えば米国特許出願公開第１３／５６５，４６３号明細書参照）が、サンプルからのフラグメント（例えば抗体フラグメント）の除去にはこれまで用いられてこなかった。
【００３８】
いくつかの実施形態において、精製されるタンパク質（例えばモノクローナル抗体）および精製中の標的タンパク質の量の少なくとも０．２％以上の量のフラグメントを含むサンプルが用意される。他の実施形態において、フラグメントは、精製される標的タンパク質の量の少なくとも０．５％以上または少なくとも１％以上の量で存在する。一般に、フラグメント除去後に残る標的タンパク質の純度は、フラグメント除去後に高められる。純度が高められたタンパク質は、標的タンパク質と呼ばれる。標的タンパク質は、免疫グロブリンタンパク質であっても、非免疫グロブリンタンパク質であってもよい。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、モノクローナル抗体などの免疫グロブリンタンパク質である。
【００３９】
以下は、本発明に従って精製することができるタンパク質の例である。上述のように、いくつかの実施形態において、標的タンパク質はモノクローナル抗体である。標的タンパク質の他の例としては、組換えタンパク質が挙げられ、組換えヒト成長ホルモン、組換えヒトインスリン、組換え卵胞刺激ホルモン、組換え第ＶＩＩ因子（抗血友病因子）、組換えヒトエリスロポエチン、組換え顆粒球コロニー刺激因子、組換えαガラクトシダーゼａ、組換えイズロニダーゼ、組換えガルスルファーゼ、組換えドルナーゼα、組換え組織プラスミノーゲン活性化因子、組換えヒトインターフェロン、組換えインスリン様成長因子１および組換えアスパラギナーゼを含むが、これらに限定されない。
【００４０】
本発明の他の実施形態において、標的タンパク質は、ヒト血液または他の生理液に由来するタンパク質である。かかるタンパク質の例としては、免疫グロブリンＧおよびＭ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、アンチトロンビンＩＩＩ、ならびにα１−アンチトリプシン（ａｌｐｈａ−Ｉ−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
用語「免疫グロブリン」、「Ｉｇ」もしくは「ＩｇＧ」または「抗体」（本明細書において互換的に用いられる。）とは、２本の重鎖および２本の軽鎖からなる基本的な４本のポリペプチド鎖構造を有し、これらの鎖が例えば鎖間ジスルフィド結合により安定化されており、抗原と特異的に結合する能力を有するタンパク質を指す。用語「一本鎖免疫グロブリン」または「一本鎖抗体」（本明細書において互換的に用いられる。）は、重鎖および軽鎖からなる２本のポリペプチド鎖構造を有し、これらの鎖が例えば鎖間ペプチドリンカーにより安定化されており、抗原と特異的に結合する能力を有するタンパク質を指す。用語「ドメイン」とは、例えばβ−プリーツシートおよび／または鎖内ジスルフィド結合により安定化されたペプチドループ（例えば３−４本のペプチドループ）を含む重鎖または軽鎖ポリペプチドの球状領域を指す。本明細書において、ドメインはさらに「定常」または「可変」と呼ばれ、「定常」ドメインでは、各種クラスメンバーのドメイン内での配列変動が相対的に小さく、「可変」ドメインでは、各種クラスメンバーのドメイン内での変動が大きいことに基づく。当該技術分野において、抗体またはポリペプチド「ドメイン」は、多くの場合、抗体またはポリペプチド「領域」と互換的に呼ばれる。抗体軽鎖の「定常」ドメインは、「軽鎖定常領域」、「軽鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域または「ＣＬ」ドメインと互換的に呼ばれる。抗体重鎖の「定常」ドメインは、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域または「ＣＨ」ドメインと互換的に呼ばれる。抗体軽鎖の「可変」ドメインは、「軽鎖可変領域」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域または「ＶＬ」ドメインと互換的に呼ばれる。抗体重鎖の「可変」ドメインは、「重鎖可変領域」、「重鎖可変ドメイン」、「ＶＨ」領域または「ＶＨ」ドメインと互換的に呼ばれる。
【００４２】
免疫グロブリンまたは抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよく、モノマーまたはポリマーの形態で存在してよく、例えば、ペンタマーの形態で存在するＩｇＭ抗体および／またはモノマー、ダイマーもしくはマルチマーの形態で存在するＩｇＡ抗体であり得る。免疫グロブリンまたは抗体は、多特異的抗体（例えば二特異的抗体）も含んでよい。
【００４３】
用語「Ｆｃ領域」および「Ｆｃ領域含有タンパク質」とは、タンパク質が免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖定常領域またはドメイン（上記で定義されたＣＨおよびＣＬ領域）を含有することを意味する。「Ｆｃ領域」を含有するタンパク質は、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を有し得る。ＣＨ２／ＣＨ３領域などの「Ｆｃ領域」は、プロテインＡまたはこの機能的変異体などのアフィニティーリガンドに選択的に結合することができる。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域含有タンパク質は、プロテインＡまたはこの機能的誘導体、変異体もしくはフラグメントに特異的に結合する。他の実施形態において、Ｆｃ領域含有タンパク質は、プロテインＧもしくはプロテインＬまたはこの機能的誘導体、変異体もしくはフラグメントと特異的に結合する。
【００４４】
上述のように、いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、免疫グロブリンなどの、Ｆｃ領域含有タンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域含有タンパク質は、別のポリペプチドまたはこのフラグメントに融合された免疫グロブリンのＦｃ領域を含む、組換えタンパク質である。
【００４５】
一般に、免疫グロブリンまたは抗体は、目的の「抗原」に対応する。好ましくは、抗原は生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患または障害に罹患している哺乳動物への抗体の投与は、当該哺乳動物において治療効果をもたらし得る。
【００４６】
本明細書において互換的に用いられる用語「モノクローナル抗体」または「Ｍａｂ」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、集団内の個々の抗体は、少量存在し得る自然発生可能な突然変異を除いて、同一のものである。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対応する。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対応する異なる抗体を典型的に含む通常の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対応する。修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を要するものと解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５頁（１９７５年）により初めて記載されたハイブリドーマ方法により作製してもよく、組換えＤＮＡ法（例えば米国特許第４，８１６，５６７号明細書参照）により作製してもよい。「モノクローナル抗体」は、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８頁（１９９１年）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１−５９７頁（１９９１年）に記載の技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。モノクローナル抗体は、「ＭＡｂ」、「ｍａｂ」、「ｍＡｂ」または「ＭＡＢ」と呼ばれることもある。
【００４７】
モノクローナル抗体は「キメラ」抗体（免疫グロブリン）をさらに含んでもよい。キメラ抗体においては、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の生物種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応配列と同一または相同であり、前記鎖の残部が、別の生物種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびに所望の生物活性を示す場合に限りかかる抗体のフラグメント中の対応配列と同一または相同である（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１−６８５５頁（１９８４年））。
【００４８】
用語「超可変領域」とは、本明細書で用いられるとき、抗原と結合する役割を担う、抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」もしくは「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）および８９−９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）および９５−１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年））および／または「超可変ループ」に由来する残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）および９１−９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）および９６−１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７頁（１９８７年））を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義された超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００４９】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最少配列を含有するキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）由来の超可変領域残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体中には見出されない残基を含んでもよい。これらの改変は、抗体の性能をさらに高めるために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのほぼ全部を含み、その中の超可変ループの全部またはほぼ全部は非ヒト免疫グロブリンのものと一致し、ＦＲ領域の全部またはほぼ全部はヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでよい。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２−５２５頁（１９８６年）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３−３２９頁（１９８８年）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６頁（１９９２年）を参照されたい。
【００５０】
本明細書で用いられるとき、用語「フラグメント」とは、部分的に標的タンパク質で構成され、当該標的タンパク質の質量未満の質量を有する不純物を指す。標的タンパク質の化学結合の破壊は、１つ以上のフラグメントの形成をもたらす。標的タンパク質の不正確または不完全な合成も、フラグメントをもたらし得る。フラグメントは、標的タンパク質の精製時に除去する必要のある一般的な不純物である。フラグメントは、多くの場合、疎水性および等電点などの特性が標的タンパク質と非常によく似ているため、標的タンパク質から分離するのが困難な不純物である。例えば、標的タンパク質の捕捉にアフィニティークロマトグラフィーが用いられる場合、アフィニティーリガンドのための結合ドメインを含有するフラグメントも捕捉されるため、後のステップで除去されなければならない。
【００５１】
用語「溶液」、「組成物」または「サンプル」とは、本明細書で用いられるとき、精製される少なくとも１種の標的タンパク質と、標的タンパク質の量の少なくとも０．２％以上の量で存在する、標的タンパク質のフラグメントとの混合物を指す。いくつかの実施形態において、サンプルは、細胞培養フィード、例えば、標的タンパク質（モノクローナル抗体など）を含有する哺乳類細胞培養液（ＣＨＯ細胞など）からのフィードを含む。いくつかの実施形態において、サンプルは、清澄化が行われた細胞培養フィードを含む。特定の実施形態において、サンプルは、アフィニティークロマトグラフィーカラム（例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラム）からの溶出液を含む。サンプルはまた、目的のタンパク質または標的タンパク質の産生に用いられる非哺乳類発現系をも包含する。
【００５２】
用語「非哺乳類発現系」とは、本明細書で用いられるとき、治療用タンパク質を作製するのに用いられる、非哺乳動物起源の全ての宿主細胞または生物を指す。目的のタンパク質または標的タンパク質の産生に用いられる非哺乳類発現系の例としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）などの細菌、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞、バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）感染昆虫細胞などの昆虫細胞、ならびに藻類細胞が挙げられる。
【００５３】
本明細書において互換的に用いられる用語「目的のタンパク質」および「標的タンパク質」とは、標的タンパク質と当該タンパク質のフラグメントとの混合物から精製されるタンパク質またはポリペプチドを指す。特定の実施形態において、標的タンパク質は免疫グロブリンである。
【００５４】
本明細書において互換的に用いられる用語「プロテインＡ」または「ＰｒｏＡ」とは、その天然の供給源（例えばスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ））から回収されるプロテインＡ、（例えば、ペプチド合成または組換え技術により）合成的に作製されたプロテインＡ、ならびにＦｃ領域などのＣＨ２／ＣＨ３領域を有するタンパク質と結合する能力を保持する、そのフラグメントおよび変異体を包含する。プロテインＡは、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＥＭＤ  ＭｉｌｌｉｐｏｒｅおよびＦｅｒｍａｔｅｃｈから市販品として購入することができる。プロテインＡは一般に固相支持体材料上に固定される。用語「ＰｒｏＡ」とはまた、プロテインＡと共有結合したクロマトグラフィー固体担体マトリックスを含有するアフィニティークロマトグラフィー樹脂またはカラムをも指す。
【００５５】
本明細書において互換的に用いられる用語「精製すること」、「純度を高めること」、「分離すること」または「単離すること」とは、本明細書記載の方法を用いてフラグメントを選択的に除去することにより、標的タンパク質のフラグメントに対する標的タンパク質の比率を大きくすることを指す。典型的には、標的タンパク質の純度は、標的タンパク質を含有するサンプル中のフラグメントの除去後に、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより高い割合だけ高められる。
【００５６】
本明細書で用いられるとき、本明細書において互換的に用いられる用語「除去する（ｒｅｍｏｖｅ）」、「除去すること（ｒｅｍｏｖｉｎｇ）」、「除去（ｒｅｍｏｖａｌ）」、「低減する（ｒｅｄｕｃｅ）」、「低減すること（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」または「低減（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」とは、精製される標的タンパク質を含有するサンプル中のフラグメントおよび標的タンパク質の量の少なくとも０．２％以上の量の標的タンパク質のフラグメントの量を、本明細書記載の方法を用いて、減らすことを指す。いくつかの実施形態において、サンプルは、標的タンパク質の量の少なくとも０．５％以上の量のフラグメントを含有する。他の実施形態において、サンプルは、標的タンパク質の量の少なくとも１％以上の量または標的タンパク質の量の少なくとも２％以上の量のフラグメントを含有する。本明細書において実証されるように、活性炭はフラグメントと選択的に結合し、フラグメントに結合した活性炭をサンプルから除去したとき、サンプル中のフラグメントのレベルは低減される。
【００５７】
本明細書において互換的に用いられる用語「選択的に除去する（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｍｏｖｅ）」、「選択的に除去された（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｍｏｖｅｄ）」および「選択的除去（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｍｏｖａｌ）」とは、精製される標的タンパク質を含有するサンプル中の標的タンパク質のフラグメントおよび標的タンパク質の量の少なくとも０．２％以上の量の標的タンパク質のフラグメントと特異的に結合する活性炭の能力を指す。したがって、活性炭は標的タンパク質のフラグメントと結合するが、標的タンパク質自体とは結合せず、そのため、サンプルからの活性炭の除去後に、サンプルからのフラグメントの選択的除去がもたらされる。
【００５８】
本明細書で用いられるとき、用語「清澄化する（ｃｌａｒｉｆｙ）」、「清澄化（ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」および「清澄化ステップ（ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ）」とは、懸濁粒子および／またはコロイドを除去し、それにより、ＮＴＵ（比濁計濁度単位）で測定される標的タンパク質含有溶液の濁度を低減するためのプロセスステップを指す。清澄化は、遠心分離またはろ過を含む種々の手段によって達成することができる。遠心分離はバッチモードまたは連続モードにて実施することができ、ろ過はノーマルフロー（例えば深層ろ過）またはタンジェンシャルフローモードにて実施することができる。現在の工業で用いられるプロセスでは、通常、遠心分離に続いて、遠心分離では除去されなかった可能性のある不溶性不純物の除去を目的として深層ろ過が行われる。さらに、沈殿などの清澄化効率を促進するための方法を用いることができる。不純物の沈殿は、軟凝集、ｐＨ調整（酸沈殿）、温度シフト、刺激応答性ポリマーもしくは低分子による相変化、またはこれらの方法の任意の組合せなどの種々の手段により実施することができる。本明細書に記載されたいくつかの実施形態において、清澄化には、遠心分離、ろ過、深層ろ過および沈殿のうち２つ以上の任意の組合せが含まれる。
【００５９】
本明細書において互換的に用いられる用語「フロースループロセス」、「フロースルーモード」および「フロースルークロマトグラフィー」とは、サンプル中の少なくとも１種の生成物が炭素質媒体内を通過して流れ、少なくとも１種の潜在的成分が炭素質媒体（例えば活性炭）に結合することが意図された生成物分離技術を指す。
【００６０】
通過させることが意図されたサンプルは一般に「移動相」と呼ばれる。「フロースルーモード」は一般に、アイソクラティック操作（すなわち、移動相の組成が変化しないプロセス）である。フロースルーに用いられる媒体は通常、標的タンパク質分子を含有する同じ緩衝液により予備平衡化（ｐｒｅ−ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅｄ）される。精製後、同じ緩衝液を追加して媒体を洗浄し、生成物回収率を上げることができる。
【００６１】
用語「緩衝液」とは、その酸−塩基共役成分の作用によりｐＨの変化を緩やかにする溶液を指す。本明細書記載の方法に用いることができる種々の緩衝液が、Ｂｕｆｆｅｒｓ．Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｂｕｆｆｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｕｅｆｆｒｏｙ，Ｄ．編、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１９７５年）に記載されている。それぞれの緩衝液が、異なる範囲のｐＨを維持し、例えば、６．０から８．０の間のｐＨでは、通常、リン酸緩衝液が用いられ、より高いｐＨでは、ホウ酸緩衝液を用いることができ、より低いｐＨでは、炭酸緩衝液を用いることができる。当業者であれば、維持しようとするｐＨに応じて用いるべき好適な緩衝液を容易に特定することができる。本発明の方法で用いることができる緩衝液の非限定的例としては、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、トリス、ＨＥＰＥＳ、リン酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、炭酸、ホウ酸およびアンモニウム緩衝液、ならびにこれらの組合せが挙げられる。
【００６２】
用語「洗浄緩衝剤」または「平衡化緩衝剤」とは、本明細書において互換的に用いられ、サンプルと炭素質材料とを接触させる前に、炭素質材料（例えば活性炭）の洗浄または再平衡化に用いられる緩衝液を指す。
【００６３】
用語「伝導率」とは、２つの電極間に電流を通す水溶液の能力を指す。溶液中では、イオン輸送により電流が流れる。したがって、水溶液中に存在するイオンの量が増加すると、溶液の伝導率は高くなる。伝導率の測定単位は、ミリジーメンス／センチメートル（ｍＳ／ｃｍまたはｍＳ）であり、市販の伝導率計（例えば、Ｏｒｉｏｎにより販売）を用いて測定することができる。溶液の伝導率は、その中のイオンの濃度を変化させることにより変更することができる。例えば、溶液中の緩衝剤の濃度および／または塩（例えば、ＮａＣｌまたはＫＣｌ）の濃度を変更して、所望の伝導率を得ることができる。種々の緩衝液の塩濃度を変更し、以下の実施例のように所望の伝導率を得ることが好ましい。
【００６４】
ＩＩ．本明細書記載の方法において用いる代表的炭素質材料
本発明の方法では、活性炭などの特定の炭素質材料が、フラグメントの選択的除去に使用される。活性炭は、表面積の非常に大きな多孔質固体として説明できる。いくつかの実施形態において、活性炭は活性チャコールを含む。活性炭は、石炭、木材、ヤシ殻、堅果殻および泥炭を含むが、これらに限定されない種々の原料源に由来し得る。活性炭は、制御雰囲気下での加熱を含む物理的活性化により、または強酸、塩基もしくは酸化剤を用いる化学的活性化により、上記材料から製造することができる。活性化プロセスは、不純物除去のための高い能力を活性炭に付与する表面積の大きな多孔質構造をもたらす。活性化プロセスを変更して表面の酸性度を制御することができる。
【００６５】
活性炭は多種多様な民間の供給元から入手可能であり、多数のグレードおよび形状で販売されている。活性炭の民間供給業者の一部として、ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ  Ｃｏｒｐ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ、ＵＳＡ；Ｎｏｒｉｔ  Ａｍｅｒｉｃａｓ  Ｉｎｃ．、Ｍａｒｓｈａｌｌ、ＴＸ、ＵＳＡ；Ｃａｌｇｏｎ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡなどの企業が挙げられる。
【００６６】
本明細書に記載されたいくつかの実施形態において、活性炭は、本明細書に記載の通り、セルロース含有繊維質媒体に組み込まれる。
【００６７】
本発明の方法に用いてよい市販の活性炭材料としては、Ｎｕｃｈａｒ  ＨＤ活性炭（ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ、ＵＳＡ）；Ｎｕｃｈａｒ  ＳＡ２０（ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ、ＵＳＡ）；Ｎｕｃｈａｒ  ＳＮ（ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ、ＵＳＡ）；Ｎｕｃｈａｒ  ＷＶ−Ｂ３０（ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ、ＵＳＡ）；ＲＧＣ  Ｐｏｗｄｅｒ活性炭（ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ、ＵＳＡ）；Ｎｏｒｉｔ  Ｄａｒｃｏ  ＫＢ−Ｇ活性炭（Ｎｏｒｉｔ  Ａｍｅｒｉｃａｓ  Ｉｎｃ．、Ｍａｒｓｈａｌｌ、Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）；Ｎｏｒｉｔ  ＣＧＰ  Ｓｕｐｅｒ活性炭（Ｎｏｒｉｔ  Ａｍｅｒｉｃａｓ  Ｉｎｃ．、Ｍａｒｓｈａｌｌ、Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）；Ｎｏｒｉｔ  Ａ  Ｓｕｐｒａ  ＵＳＰ（Ｎｏｒｉｔ  Ａｍｅｒｉｃａｓ  Ｉｎｃ．、Ｍａｒｓｈａｌｌ、Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）；Ｎｏｒｉｔ  Ｅ  Ｓｕｐｒａ  ＵＳＰ（Ｎｏｒｉｔ  Ａｍｅｒｉｃａｓ  Ｉｎｃ．、Ｍａｒｓｈａｌｌ、Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）；Ｎｏｒｉｔ  Ｃ  ＧＲＡＮ（Ｎｏｒｉｔ  Ａｍｅｒｉｃａｓ  Ｉｎｃ．、Ｍａｒｓｈａｌｌ、Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）；Ｎｏｒｉｔ  ＳＸ  Ｕｌｔｒａ（Ｎｏｒｉｔ  Ａｍｅｒｉｃａｓ  Ｉｎｃ．、Ｍａｒｓｈａｌｌ、Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）；およびＣｈｅｍｖｉｒｏｎ  Ｐｕｌｓｏｒｂ  ＰＧＣ活性炭（Ｃｈｅｍｖｉｒｏｎ  Ｃａｒｂｏｎ、Ｆｅｌｕｙ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
活性炭の２つの主な形状は、粉末状および顆粒状である。粉末状活性炭は、小さく通常は直径１ｍｍ未満の粒子を含有し、液体の精製に用いられるのが最も一般的である。顆粒状活性炭は、より大きい粒径およびその結果としてより小さい表面積を有し、したがって拡散速度がより速い気体精製における使用が好ましい。
【００６９】
民生用途（水、食品、飲料および医薬品精製など）における活性炭の使用に伴う安全性に関する重要な問題は、抽出可能化合物の削減および制御である。飲料水および食品接触用途が意図された活性炭は通常、水に対する全ての間接的添加剤に関する安全規格であるＡＮＳＩ／ＮＳＦ６１規格に準拠して製造される。また、ＡＳＴＭ標準試験方法Ｄ６３８５は、灰化による活性炭中の酸抽出物の定量について記載しており、活性炭からの抽出物のレベルの検討および最小化に用いることができる。
【００７０】
幅広い種類の活性炭が種々の用途に利用可能である。例えば、ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ  Ｃｏｒｐ．は、能力、表面酸性度、標的分子に対する細孔アクセシビリディ（ｐｏｒｅ  ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）および意図される用途が異なる、少なくとも１２種類の粉末状活性炭を供給する。一般に、不純物除去のためには活性炭の能力を最大にすることが望ましい。
【００７１】
ＩＩＩ．サンプル中のフラグメントの量の測定方法
サンプルにおける標的タンパク質のフラグメントの量を測定する一般的技術として、いくつかの異なる分析クロマトグラフィープロセスが挙げられる。サイズ排除またはゲル透過クロマトグラフィーは、フラグメントの流体力学的容積の差に基づいて、フラグメントを標的タンパク質から分離する。逆相ＨＰＬＣおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、疎水性の差に基づいて標的タンパク質からフラグメントを分離する。陰イオン交換（ＡＥＸ）および陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーは、電荷量の差に基づいて、フラグメントを標的タンパク質から分離する。混合モードクロマトグラフィーは、電荷量および疎水性両方の差に基づいて、標的タンパク質からフラグメントを分離する。
【００７２】
クロマトグラフィーカラムから回収された溶液中のタンパク質の相対量は典型的にインライン紫外検出器を用いて測定されるが、示差屈折率検出器、蛍光検出器などの他の種類のインライン検出器が用いられてもよい。得られたクロマトグラムにおける異なるピークが積分され、標的タンパク質ピークおよび標的タンパク質のフラグメントに対応するピークの面積が求められる。次いで、全てのフラグメントピークの面積の総和を、標的タンパク質ピークの面積および全てのフラグメントピークの面積の総和で除算することにより、サンプル中のフラグメントの百分率が計算される。
【００７３】
標的タンパク質を含有するサンプル中のフラグメントの量を測定する一般的技術としては、さらに、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）電気泳動法、フリーフロー電気泳動法、等電点電気泳動法、等速電気泳動法、アフィニティー電気泳動法、免疫電気泳動法、逆電気泳動法およびキャピラリー電気泳動法などのいくつかの異なるゲル電気泳動分析法も挙げられる。次いで、多くの場合、染料を用いて、ゲルの一区画におけるタンパク質の量が視覚化される。染色部分の強度が定量され、次いで、フラグメントピークの強度を、標的タンパク質ピークの強度およびフラグメントピークの強度の総和で除算することにより、サンプル中のフラグメントの百分率が計算される。
【００７４】
ＩＶ．フラグメント除去における炭素質材料の使用
標的タンパク質を含有するサンプルからフラグメントを選択的に除去するために用いてよい１つの基本手順が以下で説明される。
【００７５】
いくつかの実施形態において、活性炭を用いた溶液の静的処理による本明細書記載の方法を用いて、標的タンパク質の溶液からフラグメントが選択的に低減される。
【００７６】
この実施形態において、活性炭が、乾燥状態または懸濁液の状態で、標的タンパク質および除去しようとするフラグメントを含有する溶液に添加される。上記溶液は、次に、最長４８時間にわたり活性炭と相互作用できる状態に置かれる。タンパク質不純物吸着率を最大にするため、活性炭は溶液中に浮遊した状態に保たれるのが好ましい。上記溶液は溶液容器を動かすことにより、マグネチックスターラーバーで溶液を撹拌することにより、または機械撹拌器で溶液を撹拌することにより撹拌することができる。
【００７７】
次に、活性炭が溶液から取り出される。このとき活性炭は選択的に除去しようとするフラグメントに結合している。結合した活性炭は、溶液をろ過し、ろ過液を回収することにより分離できる。別法として、結合した活性炭は、溶液を遠心分離することにより、または結合した活性炭に沈降させ上澄み液を回収することにより、分離できる。遠心分離または沈降後、上澄みに粒子が残留している場合、ろ過によってこれらの粒子を除去することができる。残りの溶液は低減されたレベルのフラグメントを含有しており、これらのフラグメントは選択的に除去される。
【００７８】
いくつかの実施形態において、カラムなどのクロマトグラフィーデバイスに活性炭の水性スラリーが添加される。活性炭はまた、乾燥粉末としてカラムなどのデバイスに添加した後、水溶液で湿潤させてもよい。ただし、カラムを乾式充填するとき、活性炭粒子間の小さな気泡を除去することが困難な場合がある。次いで、カラムは、標的タンパク質を含有する溶液に類似した緩衝液により平衡化される。次いで、上記溶液はその後、カラム滞留時間が１５秒から１０．０分の間になる流速で、活性炭カラムに通される。次に、活性炭カラムに通された溶液が収集されるが、当該溶液は、活性炭を用いて選択的に除去されたフラグメントを含有していないまたは低減されたレベルで含有する。
【００７９】
各種実施形態において、フラグメントに結合した活性炭は、ろ過もしくは遠心分離または遠心分離とろ過両者の組合せにより、標的タンパク質を含有するサンプルから除去されてよい。標的タンパク質溶液中のフラグメントの初期レベルは、分析クロマトグラフィー（ＳＥＣ、ＨＩＣ、ＡＥＸ、ＣＥＸ、混合モード）またはゲル電気泳動分析法（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、フリーフロー電気泳動法、等電点電気泳動法、等速電気泳動法、アフィニティー電気泳動法、免疫電気泳動法、逆電気泳動法、キャピラリー電気泳動法）により測定することができる。
【００８０】
本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、これらは本発明を制限するものと解釈されるべきではない。本出願において引用された全ての参考文献、特許および公開特許出願の内容ならびに図面は、参照により本明細書に組み込む。
【実施例】
【００８１】
［実施例１］  静的結合条件下にてモノクローナル抗体フラグメントを除去するための活性炭の使用
本代表的実施例は、モノクローナル抗体フラグメントが、活性炭を用いた静的処理により、モノクローナル抗体を含有するサンプルから選択的に除去され得ることを実証する。
【００８２】
ＭＡＢ  ＩおよびＭＡＢ  ＩＩと呼ばれる２つのモノクローナル抗体の溶液が、約１％のモノクローナル抗体フラグメントを含有するように調製され、後述のように、静的結合条件下にて活性炭で処理される。
【００８３】
ＭＡＢ  ＩおよびＭＡＢ  ＩＩフラグメント混入溶液の調製は、モノクローナル抗体の一部をパパイン酵素で消化しフラグメントを産生することから開始した。消化後、前記酵素は、０．３Ｍヨードアセテートの溶液の添加により不活性化される。パパイン消化モノクローナル抗体溶液は、透析用チューブ（標準ＲＣ透析トライアルキット、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ１−３、３．５Ｋ  ＭＷＣＯ、５４ｍｍ平面幅、品番：１３２７２５、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ、９０２２０  ＵＳＡ）により水に透析され、緩衝塩が除去される。前記透析用チューブに、約０．１５Ｌのパパイン消化モノクローナル抗体溶液が添加され、４．０Ｌの水中に２４時間浸される。その後、透析用チューブは、４．０Ｌの新鮮な水を入れた新しい容器に移され、さらに２４時間浸されたままになる。
【００８４】
フラグメント混入ＭＡＢ  Ｉ原液が、ｐＨ７．０の２５ｍＭトリス中の０．５ｍＬのパパイン消化ＭＡＢ  Ｉおよび８．０ｍＬの未消化ＭＡＢ  ＩプロテインＡ溶出液から調製される。フラグメント混入ＭＡＢ  ＩＩ原液が、１．０ｍＬのパパイン消化ＭＡＢ  ＩＩ、８．０ｍＬの未消化ＭＡＢ  ＩＩ水溶液およびｐＨ７．０の２．０ｍＬの５０ｍＭトリスから調製される。前記溶液は、０．２２μｍメンブレン（Ｓｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ  ０．２２μｍ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＰＬＵＳメンブレン、２５０ｍＬ、カタログ番号：ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、０１８２１、ＵＳＡ）に通され、ろ過される。フラグメント混入ＭＡＢ  Ｉ溶液は、１．０６％のフラグメントを有する５．５２ｍｇ／ｍＬのＭＡＢ  Ｉを含有し、フラグメント混入ＭＡＢ  ＩＩ溶液は、０．８５％のフラグメントを有する５．７２ｍｇ／ｍＬのＭＡＢ  ＩＩを含有する。
【００８５】
両方のモノクローナル抗体溶液について、１５ｍＬの遠心管に０ｍｇ、５ｍｇまたは１０ｍｇのＮｕｃｈａｒ  ＨＤ活性炭（ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ、ＵＳＡ）を添加する。２．０ｍＬのフラグメント混入ＭＡＢ  Ｉ原液またはフラグメント混入ＭＡＢ  ＩＩ原液を遠心管に加える。前記遠心管を２０時間にわたり回転させる。その後、全ての遠心管を遠心分離にかけ、上澄みを０．２２μｍメンブレン（ＭｉｌｌｅｘシリンジフィルターユニットＭｉｌｌｅｘ−ＧＶ、０．２２μｍ、ＰＶＤＦ、３３ｍｍ、γ線滅菌済み、カタログ番号：ＳＬＧＶ０３３ＲＢ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、０１８２１、ＵＳＡ）に通してろ過し、溶液中に浮遊した状態で残存している可能性のある活性炭粒子を除去する。サンプル中に残存しているＭＡＢ  ＩまたはＭＡＢ  ＩＩの量は、プロテインＡ  ＨＰＬＣによるＩｇＧ定量を用いて測定される。サンプル中のフラグメントの百分率は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定される。
【００８６】
下記表Ｉにまとめたように、本実験は、モノクローナル抗体を含有するサンプルに対する活性炭を用いた静的処理が、望ましくないと考えられるモノクローナル抗体フラグメントの選択的除去をもたらすことを実証している。モノクローナル抗体溶液に添加される活性炭の量が増大するほど、フラグメントの百分率は低下する。１０ｍｇの活性炭を用いてサンプルを処理すると、ＭＡＢ  Ｉ溶液中のフラグメントの量は１．０６％からＳＥＣでの検出限界未満へと減少する。１０ｍｇの活性炭を用いて処理すると、ＭＡＢ  ＩＩ溶液中のフラグメントの量は０．８５％から０．１５％へと減少する。このデータは、活性炭を使用して、静的結合条件下にてサンプルからモノクローナル抗体フラグメントを選択的に除去できることを実証している。
【００８７】
【表１】
2016527201.tif 000003
【００８８】
［実施例２］  活性炭を充填したクロマトグラフィーカラムに通すことによる、モノクローナル抗体を含有するサンプルからのモノクローナル抗体フラグメントの除去
本代表的実施例は、モノクローナル抗体フラグメントが、活性炭を充填したクロマトグラフィーカラムにサンプルを通すことにより、モノクローナル抗体を含有するサンプルから選択的に除去され得ることを実証する。
【００８９】
後述のように、ＭＡＢ  Ｉの溶液が、約２％のモノクローナル抗体フラグメントにより調製され、活性炭を充填したクロマトグラフィーカラムに通される。
【００９０】
ＭＡＢ  Ｉフラグメント混入溶液の調製は、モノクローナル抗体の一部をパパイン酵素で消化しフラグメントを産生することから開始した。消化後、前記酵素は０．３Ｍヨードアセテートの添加により不活性化される。パパイン消化モノクローナル抗体溶液は、透析用チューブ（標準ＲＣ透析トライアルキット、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ１−３、３．５Ｋ  ＭＷＣＯ、５４ｍｍ平面幅、品番：１３２７２５、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ、９０２２０  ＵＳＡ）により水に透析され、緩衝塩が除去される。前記透析用チューブに、約０．１５Ｌのパパイン消化モノクローナル抗体溶液が添加され、４．０Ｌの水中に２４時間浸される。透析用チューブは、次に、４．０Ｌの新鮮な水を入れた新しい容器に移され、さらに２４時間浸されたままにされる。
【００９１】
フラグメント混入ＭＡＢ  Ｉ溶液が、ｐＨ７．０の２５ｍＭトリス中の２０ｍＬのパパイン消化ＭＡＢ  ＩＩ水溶液および１６０ｍＬの未消化ＭＡＢ  ＩプロテインＡ溶出液から調製される。前記溶液は、０．２２μｍメンブレン（Ｓｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ  ０．２２μｍ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＰＬＵＳメンブレン、２５０ｍＬ、カタログ番号：ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、０１８２１、ＵＳＡ）に通され、ろ過される。フラグメント混入ＭＡＢ  Ｉ溶液は、２．０１％のフラグメントを有する５．０１ｍｇ／ｍＬのＭＡＢ  Ｉを含有する。
【００９２】
ガラスクロマトグラフィーカラム（Ｏｍｎｉｆｉｔ標準カラム１０ｍｍ／１００ｍｍ、直径１０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、ＳＫＵ：００６ＢＣＣ−１０−１０−ＡＦ、Ｄｉｂａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｄａｎｂｕｒｙ、ＣＴ  ０６８１０、ＵＳ）に、水中に懸濁させた２００ｍｇのＮｕｃｈａｒ  ＨＤ活性炭（ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ、ＵＳＡ）が添加される。前記カラムに水を通して充填すると、０．８ｍＬの充填カラム容量が得られる。前記カラムはｐＨ７．０の２５ｍＭトリスにより平衡化される。
【００９３】
次に、フラグメントが混入した１５４ｍＬのＭＡＢ  Ｉ溶液に、０．４０ｍＬ／分で活性炭カラムを通過させ、カラム滞留時間が２．０分となるようにする。６個の２５ｍＬ画分が収集される。その後、ｐＨ７．０の１０ｍＬの２５ｍＭトリスに前記カラムを通過させ、追加の１０ｍＬ画分が収集される。個々の画分中のＭＡＢ  Ｉおよび比例して累積される全７画分のサンプルの量は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムを備えたＨＰＬＣシステム（「プロテインＡ  ＨＰＬＣ」）によりＩｇＧ定量を用いて測定される。個々の画分中のフラグメントおよび比例して累積される全７画分のサンプルの百分率は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定される。
【００９４】
下記表ＩＩおよび図１にまとめたように、本実験は、モノクローナル抗体フラグメントが、活性炭を充填したクロマトグラフィーカラムに通すことにより、モノクローナル抗体サンプルから選択的に除去され得ることを実証している。
【００９５】
【表２】
2016527201.tif 000004
【００９６】
［実施例３］  モノクローナル抗体を含有するサンプルからの、プロテインＡと結合するモノクローナル抗体フラグメントの選択的除去
本代表的実施例は、プロテインＡと結合するモノクローナル抗体フラグメントが、活性炭を充填したクロマトグラフィーカラムに通すことにより、モノクローナル抗体を含有するサンプルから選択的に除去され得ることを実証する。
【００９７】
ＭＡＢ  ＩＩＩのサンプルが、プロテインＡと結合する約３．５％のモノクローナル抗体フラグメントにより調製される。このサンプルは次に、後述のように、活性炭を充填したクロマトグラフィーカラムに通される。
【００９８】
プロテインＡと結合するモノクローナル抗体フラグメントが、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液およびシステインで希釈された２４．３ｍｇ／ｍＬのＭＡＢ  ＩＩＩ溶液４０ｍｌから調製される。次に、最終濃度である０．１１ｍｇ／ｍＬまで、パパイン酵素が添加される。前記溶液は３７℃で３時間培養され、続いて、ヨードアセテートの添加によりパパイン酵素の不活性化が行われ、ヨードアセテート溶液の最終濃度は２０ｍＭとなる。完全な酵素不活性化を確保するため、前記溶液は、３７℃でさらに１時間培養された後、室温になるまで冷却される。消化後、前記溶液は、ポリエーテルスルホン膜（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬフィルター、カットオフ値３０ＫＤａ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ  ０１８２１）を用いた限外ろ過／透析ろ過により濃縮される。次に、濃縮されたＭＡＢ  ＩＩＩ消化物は、ｐＨ７．４の２０ｍＭのＰＢＳへの緩衝液交換に供される。ｐＨ７．４の濃縮ＭＡＢ  ＩＩＩ消化物は、プロテインＡカラム（ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ、１０＊１００ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に送られる。プロテインＡと結合するＭＡＢ  ＩＩＩフラグメントは、ｐＨ７．４の２０ｍＭのＰＢＳ緩衝液で洗浄した後、ｐＨ２．９の１００ｍＭグリシン緩衝液によりカラムから溶出される。次に、溶出画分のｐＨは、２．０Ｍトリス塩基溶液の添加により、ｐＨ５．４に上げられる。
【００９９】
フラグメント混入ＭＡＢ  ＩＩＩサンプルが、ｐＨ７．０の１２０ｍＬのＭＡＢ  ＩＩＩ溶液および１２ｍＬのＭＡＢ  ＩＩＩフラグメント溶液から調製される。フラグメント混入ＭＡＢ  ＩＩＩサンプルは、０．２２μｍメンブレン（Ｓｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ  ０．２２μｍ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＰＬＵＳメンブレン、２５０ｍＬ、カタログ番号：ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、０１８２１、ＵＳＡ）に通され、ろ過される。フラグメント混入ＭＡＢ  ＩＩＩ溶液は、３．５０％のフラグメントを有する７．１３ｍｇ／ｍＬのＭＡＢ  ＩＩＩを含有する。
【０１００】
ガラスクロマトグラフィーカラム（Ｏｍｎｉｆｉｔ標準カラム１０ｍｍ／１００ｍｍ、直径１０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、ＳＫＵ：００６ＢＣＣ−１０−１０−ＡＦ、Ｄｉｂａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｄａｎｂｕｒｙ、ＣＴ  ０６８１０、ＵＳ）に、水中に懸濁させた２５０ｍｇのＮｕｃｈａｒ  ＨＤ活性炭（ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ、ＵＳＡ）が添加される。前記カラムに水を通して充填すると、１．０ｍＬの充填カラム容量が得られる。前記カラムはｐＨ７．０の２５ｍＭトリスにより平衡化される。
【０１０１】
フラグメントを混入した３０．５ｍＬのＭＡＢ  ＩＩＩ溶液に、０．３０ｍＬ／分で活性炭カラム内を通過させ、活性炭カラム内での滞留時間は３．３分となるようにする。１７個の１．９ｍＬ画分が収集される。個々の画分におけるＭＡＢ  ＩＩＩの量は、プロテインＡ  ＨＰＬＣによるＩｇＧ定量を用いて測定される。個々の画分におけるフラグメントの百分率は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定される。
【０１０２】
下記表ＩＩＩおよび図２にまとめたように、本実験は、プロテインＡと結合するモノクローナル抗体フラグメントが、活性炭を充填したクロマトグラフィーカラムに通すことにより、モノクローナル抗体含有サンプルから選択的に除去され得ることを実証している。この結果が実証するのは、一般的に見出され、精製中の抗体と同じプロテインＡ溶出プールをもたらすため除去が困難であることが多いフラグメントを除去するために、活性炭を使用できるということである。
【０１０３】
【表３】
2016527201.tif 000005
【０１０４】
［実施例４］  モノクローナル抗体を含有するサンプルからの、プロテインＡと結合しないモノクローナル抗体フラグメントの除去
本代表的実施例は、プロテインＡと結合しないモノクローナル抗体フラグメントもまた、活性炭を充填したクロマトグラフィーカラムに通すことにより、モノクローナル抗体を含有するサンプルから選択的に除去され得ることを実証する。
【０１０５】
ＭＡＢ  ＩＩＩの溶液が、プロテインＡと結合しない約４．８４％のモノクローナル抗体フラグメントにより調製され、次いで、後述のように、活性炭を充填したクロマトグラフィーカラムに通される。
【０１０６】
プロテインＡと結合しないモノクローナル抗体フラグメントが、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液およびシステインで希釈された２４．３ｍｇ／ｍＬのＭＡＢ  ＩＩＩ溶液４０ｍｌから調製される。次に、最終濃度である０．１１ｍｇ／ｍＬまで、パパイン酵素が添加される。前記溶液は３７℃で３時間培養され、続いて、ヨードアセテートの添加によりパパイン酵素の不活性化が行われ、ヨードアセテート溶液の最終濃度は２０ｍＭとなる。完全な酵素不活性化を確保するため、前記溶液は、３７℃でさらに１時間培養された後、室温になるまで冷却される。消化後、前記溶液は、ポリエーテルスルホン膜（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬフィルター、カットオフ値３０ＫＤａ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ  ０１８２１）を用いた限外ろ過／透析ろ過により濃縮される。次に、濃縮されたＭＡＢ  ＩＩＩ消化物は、ｐＨ７．４の２０ｍＭのＰＢＳへの緩衝液交換に供される。ｐＨ７．４の濃縮ＭＡＢ  ＩＩＩ消化物は、プロテインＡカラム（ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ、１０＊１００ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に添加される。プロテインＡと結合しないフラグメントは、濃縮されたＭＡＢ  ＩＩＩ消化物をプロテインＡカラムに通すことにより単離される。
【０１０７】
フラグメント混入ＭＡＢ  ＩＩＩ溶液は、ｐＨ７．０の１５０ｍＬのＭＡＢ  ＩＩＩ溶液、および上記で生成された、プロテインＡと結合しないＭＡＢ  ＩＩＩフラグメントを含有する２０ｍＬの溶液から調製される。フラグメント混入ＭＡＢ  ＩＩＩ原液は、０．２２μｍメンブレン（Ｓｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ  ０．２２μｍ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＰＬＵＳメンブレン、２５０ｍＬ、カタログ番号：ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、０１８２１、ＵＳＡ）に通され、ろ過される。フラグメント混入ＭＡＢ  ＩＩＩ溶液は、１．２７ｍｇ／ｍＬのＭＡＢ  ＩＩＩおよび４．８４％のフラグメントを含有していた。
【０１０８】
ガラスクロマトグラフィーカラム（Ｏｍｎｉｆｉｔ標準カラム１０ｍｍ／１００ｍｍ、直径１０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、ＳＫＵ：００６ＢＣＣ−１０−１０−ＡＦ、Ｄｉｂａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｄａｎｂｕｒｙ、ＣＴ  ０６８１０、ＵＳ）に、水中に懸濁させた２５０ｍｇのＮｕｃｈａｒ  ＨＤ活性炭（ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ、ＵＳＡ）が添加される。前記カラムに水を通して充填すると、１．０ｍＬの充填カラム容量が得られる。前記カラムはｐＨ７．０の２５ｍＭトリスにより平衡化される。
【０１０９】
次に、フラグメントを混入した１３０．５ｍＬのＭＡＢ  ＩＩＩ溶液に、０．３０ｍＬ／分で活性炭カラムを通過させ、活性炭カラム内での滞留時間が３．３分となるようにする。３０個の４．５ｍＬ画分が収集される。個々の画分におけるＭＡＢ  ＩＩＩの量は、プロテインＡ  ＨＰＬＣによるＩｇＧ定量を用いて測定される。個々の画分におけるフラグメントの百分率は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定される。
【０１１０】
表ＩＶおよび図３にまとめたように、本実験は、プロテインＡと結合しないモノクローナル抗体フラグメントもまた、活性炭を充填したクロマトグラフィーカラムに通すことにより、モノクローナル抗体を含有するサンプルから選択的に除去され得ることを実証している。
【０１１１】
【表４】
2016527201.tif 000006
【０１１２】
［実施例５］  静的結合条件下にてモノクローナル抗体を含有するサンプルからモノクローナル抗体フラグメントを除去するための各種活性炭の使用
本代表的実施例は、モノクローナル抗体フラグメントが、各種活性炭を用いた静的処理により、モノクローナル抗体を含有するサンプルから選択的に除去され得ることを実証する。
【０１１３】
ＭＡＢ  ＩＩの溶液が、約１．７％のモノクローナル抗体フラグメントにより調製され、後述のように、静的結合条件下にて３つの異なる種類の活性炭のうち１種で処理される
ＭＡＢ  ＩＩフラグメント混入溶液の調製は、モノクローナル抗体の一部をパパイン酵素で消化し抗体フラグメントを産生することから開始した。消化後、前記酵素は、０．３Ｍヨードアセテートの溶液の添加により不活性化される。パパイン消化モノクローナル抗体溶液は、透析用チューブ（標準ＲＣ透析トライアルキット、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ１−３、３．５Ｋ  ＭＷＣＯ、５４ｍｍ平面幅、品番：１３２７２５、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ、９０２２０  ＵＳＡ）により水に透析され、緩衝塩が除去された。前記透析用チューブに、約０．１５Ｌのパパイン消化モノクローナル抗体溶液が添加され、４．０Ｌの水中に２４時間浸される。透析用チューブは、次に、４．０Ｌの新鮮な水を入れた新しい容器に移され、さらに２４時間浸されたままにされる。
【０１１４】
モノクローナル抗体フラグメントを混入したＭＡＢ  ＩＩ溶液は、１８．０ｍＬのパパイン消化ＭＡＢ  ＩＩ、７２．０ｍＬの未消化ＭＡＢ  ＩＩ水溶液およびｐＨ７．０の９．０ｍＬの２５０ｍＭトリスから調製される。前記溶液は、次いで、０．２２μｍメンブレン（Ｓｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ  ０．２２μｍ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＰＬＵＳメンブレン、２５０ｍＬ、カタログ番号：ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、０１８２１、ＵＳＡ）に通され、ろ過される。フラグメント混入ＭＡＢ  ＩＩ溶液は、７．８６ｍｇ／ｍＬのＭＡＢ  ＩＩおよび１．７２％のフラグメントを含有する。
【０１１５】
１５ｍＬ遠心管に、５ｍｇまたは１０ｍｇのＮｕｃｈａｒ  ＨＤ活性炭（ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ、ＵＳＡ）、Ｄａｒｃｏ  ＫＢ−Ｇ活性炭（Ｎｏｒｉｔ  Ａｍｅｒｉｃａｓ  Ｉｎｃ．、Ｍａｒｓｈａｌｌ、Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）またはＣＧＰ  Ｓｕｐｅｒ活性炭（Ｎｏｒｉｔ  Ａｍｅｒｉｃａｓ  Ｉｎｃ．、Ｍａｒｓｈａｌｌ、Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）が添加される。対照として用いられる１５ｍＬ遠心管の追加セットに、培地は添加されない。次に、５．０ｍＬのフラグメント混入ＭＡＢ  ＩＩが遠心管に添加される。前記遠心管を２０時間にわたり回転させる。前記遠心管は次に遠心分離にかけられ、サンプルは０．２２μｍメンブレン（ＭｉｌｌｅｘシリンジフィルターユニットＭｉｌｌｅｘ−ＧＶ、０．２２μｍ、ＰＶＤＦ、３３ｍｍ、γ線滅菌済み、カタログ番号：ＳＬＧＶ０３３ＲＢ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、０１８２１、ＵＳＡ）に通されてろ過され、溶液中に浮遊した状態で残存している可能性のある活性炭粒子が除去される。サンプル中に残存しているＭＡＢ  ＩＩの量は、プロテインＡ  ＨＰＬＣによるＩｇＧ定量を用いて測定される。サンプル中のフラグメントの百分率は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定される。
【０１１６】
下記表Ｖにまとめられたように、本実験は、モノクローナル抗体フラグメントが、静的結合条件下にて各種活性炭を用いた処理により、モノクローナル抗体を含有するサンプルから選択的に除去され得ることを実証している。モノクローナル抗体溶液に添加される活性炭の量が増大するほど目下のフラグメントの百分率は低下する。データは、各種活性炭を使用して、静的結合条件下にてモノクローナル抗体を含有するサンプルからモノクローナル抗体フラグメントを選択的に除去できることを示している。
【０１１７】
【表５】
2016527201.tif 000007
【０１１８】
［実施例６］  静的結合条件下で中性および酸性ｐＨにてモノクローナル抗体を含有するサンプルからモノクローナル抗体フラグメントを除去するための活性炭の使用
本代表的実施例は、モノクローナル抗体フラグメントが、活性炭を用いた酸性および中性ｐＨ溶液条件での静的処理により、モノクローナル抗体を含有するサンプルから選択的に除去され得ることを実証する。
【０１１９】
ＭＡＢ  ＩＩの溶液が、ｐＨ４．１またはｐＨ７．５にて約１．７２％のモノクローナル抗体フラグメントにより調製され、静的結合条件下にて活性炭で処理される。
【０１２０】
ＭＡＢ  ＩＩフラグメント混入溶液の調製は、モノクローナル抗体の一部をパパイン酵素で消化しフラグメントを産生することから開始した。消化後、前記酵素は、０．３Ｍヨードアセテートの溶液の添加により不活性化される。パパイン消化モノクローナル抗体溶液は、透析用チューブ（標準ＲＣ透析トライアルキット、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ１−３、３．５Ｋ  ＭＷＣＯ、５４ｍｍ平面幅、品番：１３２７２５、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ、９０２２０  ＵＳＡ）により水に透析され、緩衝塩が除去される。前記透析用チューブに、約０．１５Ｌのパパイン消化モノクローナル抗体溶液が添加され、４．０Ｌの水中に２４時間浸される。その後、透析用チューブは、４．０Ｌの新鮮な水を入れた新しい容器に移され、さらに２４時間浸されたままになる。
【０１２１】
フラグメント混入ＭＡＢ  ＩＩ溶液が、１８ｍＬのパパイン消化ＭＡＢ  ＩＩ水溶液、７２ｍＬの未消化ＭＡＢ  ＩＩ水溶液およびｐＨ７．０の９ｍＬの２５０ｍＭトリスから調製される。この溶液の一部は、３．０Ｍの酢酸の添加により、ｐＨ４．１に下げられる。前記溶液のｐＨは、トリス塩基の添加により、７．５に上げられる。前記溶液は次に、０．２２μｍメンブレン（Ｓｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ  ０．２２μｍ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＰＬＵＳメンブレン、２５０ｍＬ、カタログ番号：ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、０１８２１、ＵＳＡ）に通され、ろ過される。ｐＨ４．１のフラグメント混入ＭＡＢ  ＩＩ溶液は、１．７６％のフラグメントを有する７．８８ｍｇ／ｍＬのＭＡＢ  ＩＩを含有し、ｐＨ７．５のフラグメント混入ＭＡＢ  ＩＩ溶液は、１．７２％のフラグメントを有する７．７８ｍｇ／ｍＬのＭＡＢ  ＩＩを含有していた。
【０１２２】
１５ｍＬ遠心管に、２０ｍｇのＮｕｃｈａｒ  ＨＤ活性炭（ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ、ＵＳＡ）が添加される。対照として使用される１５ｍＬ遠心管の第２のセットに、活性炭は添加されない。ｐＨ４．１またはｐＨ７．５の５．０ｍＬのフラグメント混入ＭＡＢ  ＩＩ原液が、適切な遠心管に添加される。前記遠心管を２４時間にわたり回転させる。前記溶液は、０．２２μｍメンブレン（ＭｉｌｌｅｘシリンジフィルターユニットＭｉｌｌｅｘ−ＧＶ、０．２２μｍ、ＰＶＤＦ、３３ｍｍ、γ線滅菌済み、カタログ番号：ＳＬＧＶ０３３ＲＢ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、０１８２１、ＵＳＡ）に通されてろ過され、溶液中に浮遊した状態で残存している可能性のある粒子が除去される。溶液中に残存しているＭＡＢ  ＩＩの濃度は、２８０ｎｍでの吸光度を測定することで定量される。サンプル中のフラグメントの百分率は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定される。
【０１２３】
下記表ＶＩにまとめたように、本実験は、モノクローナル抗体フラグメントが、中性および酸性ｐＨ条件における活性炭を用いた静的処理により、モノクローナル抗体溶液から選択的に除去され得ることを実証している。
【０１２４】
【表６】
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【０１２５】
［実施例７］  静的結合条件下にて、低伝導率および高伝導率両方で、４．０から９．０のｐＨ範囲にて、モノクローナル抗体を含有するサンプルからモノクローナル抗体フラグメントを除去するための活性炭の使用
本代表的実施例は、モノクローナル抗体フラグメントが、低溶液伝導率および高溶液伝導率両方で、４．０から９．０のｐＨ範囲にて活性炭を用いた静的処理により、モノクローナル抗体溶液から選択的に除去され得ることを実証する。
【０１２６】
４．５ｍＳ／ｃｍまたは２２ｍＳ／ｃｍの溶液伝導率を有し、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０または９．０の溶液ｐＨにて、１．４９％から１．７４％の間のモノクローナル抗体フラグメントを含有するＭＡＢ  ＩＩの溶液が調製される。その後、後述のように、それらの各種溶液は静的結合条件下にて活性炭で処理される。
【０１２７】
ＭＡＢ  ＩＩフラグメント混入溶液の調製は、モノクローナル抗体の一部をパパイン酵素で消化しフラグメントを産生することから開始した。消化後、前記酵素は、０．３Ｍヨードアセテートの溶液の添加により不活性化される。パパイン消化モノクローナル抗体溶液は、透析用チューブ（標準ＲＣ透析トライアルキット、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ１−３、３．５Ｋ  ＭＷＣＯ、５４ｍｍ平面幅、品番：１３２７２５、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ、９０２２０  ＵＳＡ）により水に透析され、緩衝塩が除去される。前記透析用チューブに、約０．１５Ｌのパパイン消化モノクローナル抗体溶液が添加され、４．０Ｌの水中に２４時間浸される。透析用チューブは、次に、４．０Ｌの新鮮な水を入れた新しい容器に移され、さらに２４時間浸されたままにされる。
【０１２８】
フラグメント混入ＭＡＢ  ＩＩの原液が、１４４ｍＬのＭＡＢ  ＩＩ水溶液、３６ｍＬのパパイン消化ＭＡＢ  ＩＩ水溶液および１８ｍＬの２５０ｍＭトリス塩基を組み合わせることにより調製される。前記溶液は、１．８Ｍトリス塩基の添加により、ｐＨ９．０に調整される。前記溶液は、０．２２μｍメンブレン（Ｓｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ  ０．２２μｍ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＰＬＵＳメンブレン、２５０ｍＬ、カタログ番号：ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、０１８２１、ＵＳＡ）に通され、ろ過される。得られた溶液は４．５ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する。溶液伝導率が２２ｍＳ／ｃｍに達するまで、４．０Ｍ塩化ナトリウムが、ｐＨ９．０のフラグメント混入ＭＡＢ  ＩＩ溶液の一部に添加される。
【０１２９】
次に、４．５ｍＳ／ｃｍまたは２２ｍＳ／ｃｍにおけるｐＨ９．０のフラグメント混入ＭＡＢ  ＩＩ溶液の一部のｐＨが、３．０Ｍの酢酸の添加により、ｐＨ８．０に下げられる。次に、ｐＨ８．０の上記溶液の一部のｐＨが、３．０Ｍの酢酸の添加により、ｐＨ７．０に下げられる。ｐＨ７．０の上記溶液の一部のｐＨが、３．０Ｍの酢酸の添加により、ｐＨ６．０に下げられる。次に、ｐＨ６．０の上記溶液の一部のｐＨが、３．０Ｍの酢酸の添加により、ｐＨ５．０に下げられる。ｐＨ５．０の上記溶液の一部のｐＨが、３．０Ｍの酢酸の添加により、ｐＨ４．０に下げられる。したがって、上記方法を用いると、ｐＨ４．０、５．０、６．０、７．０、８．０または９．０で、４．５ｍＳ／ｃｍまたは２２ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する、１２種類のフラグメント混入ＭＡＢ  ＩＩ溶液が得られる。前記フラグメント混入ＭＡＢ  ＩＩ溶液は、６．３８から７．４４ｍｇ／ｍＬのＭＡＢ  ＩＩおよび１．５から１．７％のフラグメントを含有する。
【０１３０】
各溶液ｐＨおよび伝導率ごとの１５ｍＬ遠心管に、２０ｍｇのＮｕｃｈａｒ  ＨＤ活性炭（ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ、ＵＳＡ）が添加される。１５ｍＬ遠心管の追加セットが対照として用いられ、培地は添加されない。各遠心管には、適切なｐＨおよび伝導率を有する５．０ｍＬのフラグメント混入ＭＡＢ  ＩＩ原液が添加される。前記遠心管は２４時間にわたり回転させ、その後、サンプルは０．２２μｍメンブレン（ＭｉｌｌｅｘシリンジフィルターユニットＭｉｌｌｅｘ−ＧＶ、０．２２μｍ、ＰＶＤＦ、３３ｍｍ、γ線滅菌済み、カタログ番号：ＳＬＧＶ０３３ＲＢ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、０１８２１、ＵＳＡ）に通されてろ過され、溶液中に浮遊した状態で残存している可能性のある活性炭粒子が除去される。サンプル中に残存しているＭＡＢ  ＩＩの濃度が、２８０ｎｍにて紫外線分光光度計により測定される。サンプル中に残存しているフラグメントの百分率は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定される。
【０１３１】
表ＶＩＩおよび図４にまとめたように、本実験は、活性炭を用いると、モノクローナル抗体フラグメントが、低溶液伝導率および高溶液伝導率両方で、４．０から９．０という広範囲のｐＨにて、モノクローナル抗体溶液から選択的に除去され得ることを実証している。
【０１３２】
【表７】
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【０１３３】
本明細書は、参照により本明細書に組み込まれる本明細書内に引用された参考文献の教示を考慮することにより完全に理解される。本明細書内の実施形態は、本発明における実施形態を説明するものであり、その範囲を限定するものと解釈されるべきではない。当業者であれば、他の多くの実施形態が本発明に包含されることを容易に認識できる。全ての刊行物および発明は、参照によりその全体を組み込む。参照により組み込まれる資料と本明細書との間に矛盾または不整合がある限りにおいて、本明細書がかかる資料に優先する。本明細書における参考文献の引用は、かかる参考文献が本発明に対する先行技術であることを承認するものではない。
【０１３４】
特に指示がない限り、特許請求の範囲を含む本明細書において用いられる成分の量、細胞培養液、処理条件などを表す全ての数字は、全ての場合において用語「約」により修飾されていると理解されるべきである。したがって、別段の指示がない限り、数値パラメーターは近似値であり、本発明が得ようとする所望の特性に応じて変化し得る。特に指示がない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、あらゆる一連の要素について言及していると理解されるべきである。当業者であれば、通常の実験のみを用いて、本明細書に記載された発明の特定の実施形態と同等の多くの実施形態を理解または把握することができる。以下の特許請求の範囲には、かかる同等の実施形態が包含されることが意図されている。
【０１３５】
当業者にとって明白であるように、本発明はこの趣旨および範囲から逸脱することなく多くの修正および改変が可能である。本明細書に記載された特定の実施形態は、例示のみを目的に提供されたものであり、いかなる点においても限定を意図するものではない。本明細書および実施例は単なる例示とみなされ、本発明の真の範囲および趣旨は以下の特許請求の範囲により示されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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