(57)【要約】  本開示は、プロバイオティックアルギニン分解性口腔用組成物、プロバイオティックアルギニン分解性口腔用組成物の製造方法、ならびに、プロバイオティックアルギニン分解性口腔用組成物の使用によって、口腔内でのアルギニン分解活性を増加させる方法、ならびに／または、虫歯を治療および／もしくは予防する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離細菌株の混合物と、製薬上許容されうる口腔用担体とを含有するアルギニン分解性プロバイオティック口腔用組成物であって、
前記混合物が、少なくとも２つの異なる分離アルギニン分解性細菌株を含み、それぞれの菌株はアルギニンデイミナーゼシステム（ADS）によってアンモニアを生成することができ、それぞれの菌株は下記の基準：すなわち、補給アルギニンの非存在下でADS活性を発現すること、グルコースの存在下でADS活性を発現すること、非酸性pH中でADS活性を発現すること、好気条件下でADS活性を発現すること、虫歯に関連する少なくとも１つの細菌株の増殖を阻害すること、および虫歯に関連する少なくとも１つの細菌株による増殖の阻害に抵抗すること、のうちの少なくとも１つを満たしており、
細菌株の混合物によって少なくとも２つの基準が満たされる、プロバイオティック口腔用組成物。
【請求項２】
前記混合物が、補給アルギニンの非存在下でADS活性を発現することができる少なくとも１つのアルギニン分解性細菌株、グルコースの存在下でADS活性を発現することができる少なくとも１つのアルギニン分解性細菌株、非酸性pH中でADS活性を発現することができる少なくとも１つのアルギニン分解性細菌株、好気条件下でADS活性を発現することができる少なくとも１つのアルギニン分解性細菌株、および虫歯に関連する少なくとも１つの細菌株の増殖を阻害することができるか、または虫歯に関連する少なくとも１つの細菌株による増殖の阻害に抵抗することができる少なくとも１つのアルギニン分解性細菌株を含有する、請求項１に記載のプロバイオティック口腔用組成物。
【請求項３】
前記混合物が、虫歯に関連する細菌種由来のいかなる細菌株も含まない、請求項１または２に記載のプロバイオティック口腔用組成物。
【請求項４】
前記混合物が、基本的に少なくとも２つの異なる分離アルギニン分解性細菌株からなり、それぞれの菌株はアルギニンデイミナーゼシステム（ADS）によってアンモニアを生成することができ、それぞれ菌株は下記の基準：すなわち、補給アルギニンの非存在下でADS活性を発現すること、グルコースの存在下でADS活性を発現すること、非酸性pH中でADS活性を発現すること、好気条件下でADS活性を発現すること、虫歯に関連する少なくとも１つの細菌株の増殖を阻害すること、および虫歯に関連する少なくとも１つの細菌株による増殖の阻害に抵抗すること、のうちの少なくとも１つを満たす、請求項１に記載のプロバイオティック口腔用組成物。
【請求項５】
前記基準のいずれかにおいてADS活性を発現する細菌株の能力が、同一条件下でのS. gordonii DL1のADS活性レベルに対して決定され、
同一条件下でのS. gordonii DL1の活性とほぼ同じであるか、またはより高いADS活性レベルが、その菌株がその条件下でADS活性を発現していることを示す、
請求項１〜４のいずれか１項に記載のプロバイオティック口腔用組成物。
【請求項６】
虫歯に関連する細菌株が、Streptococcus mutansおよびStreptococcus sorbrinus、Lactobacillusの種、Scardoviaの種、ならびにActinomycesの種より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロバイオティック口腔用組成物。
【請求項７】
化合物の非存在下での菌株のADS活性に対して、細菌株のADS活性を増加させることができる１つ以上の化合物を更に含有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のプロバイオティック口腔用組成物。
【請求項８】
細菌株のADS活性を増加させる１つ以上の化合物が、ガラクトース、アルギニン、および酸性化合物からなる群より選択される、請求項７に記載のプロバイオティック口腔用組成物。
【請求項９】
ガラクトース、アルギニン、および酸性化合物からなる群より選択される１つ以上の化合物を更に含有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のプロバイオティック口腔用組成物。
【請求項１０】
口腔用のアルギニン分解性細菌株の混合物を製造する方法であって、前記方法が、
（a）口腔サンプルから分離された細菌株の混合物を得るステップと；
（b）アルギニンデイミナーゼシステム（ADS）によってアンモニアを生成することができるアルギニン分解性細菌株を分離・同定するステップと；
（c）１回以上の個別のアッセイを行うことにより、下記のアッセイ条件：すなわち、環境アルギニンの非存在下、グルコースの存在下、非酸性pH中、好気条件下、および虫歯に関連する少なくとも１つの細菌株の存在下、のうちの少なくとも１つにおいてADS活性を発現できるアルギニン分解性細菌株を同定するステップと；
（d）ステップ（c）において同定された少なくとも２つの異なる分離アルギニン分解性細菌株を選択することによって、アルギニン分解性細菌の混合物を調製するステップ
とを含み、
前記混合物が、少なくとも２つの条件下でADS活性を発現している、方法。
【請求項１１】
前記アッセイ条件のいずれかにおいてADS活性を発現する細菌株の能力が、同一条件下でのS. gordonii DL1のADS活性レベルに対して決定され、
同一条件下でのS. gordonii DL1の活性とほぼ同じであるか、またはより高いADS活性レベルが、その菌株がその条件下でADS活性を発現していることを示す、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
虫歯に関連する細菌株がStreptococcus mutansである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
化合物の非存在下での菌株のADS活性に対して、細菌株のADS活性を増加させることができる１つ以上の化合物を更に含有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
細菌株のADS活性を増加させる１つ以上の化合物が、ガラクトース、アルギニン、および酸性化合物からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
宿主にプロバイオティック口腔用組成物を投与することを含む、宿主において虫歯の発生を予防するか、または減少させる方法であって、
前記プロバイオティック口腔用組成物が、分離細菌株の混合物と、製薬上許容されうる口腔用担体とを含有し、
前記混合物が、少なくとも２つの異なる分離アルギニン分解性細菌株を含み、それぞれの菌株はアルギニンデイミナーゼシステム（ADS）によってアンモニアを生成することができ、それぞれの菌株は下記の基準：すなわち、環境アルギニンの非存在下でADS活性を発現すること、グルコースの存在下でADS活性を発現すること、非酸性pH中でADS活性を発現すること、好気条件下でADS活性を発現すること、虫歯に関連する少なくとも１つの細菌株の増殖を阻害すること、および虫歯に関連する少なくとも１つの細菌株による増殖の阻害に抵抗すること、のうちの少なくとも１つを満たしており、
細菌株の混合物によって少なくとも２つの基準が満たされる、方法。
【請求項１６】
前記基準のいずれかにおいてADS活性を発現する細菌株の能力が、同一条件下でのS. gordonii DL1のADS活性レベルに対して決定され、
同一条件下でのS. gordonii DL1の活性とほぼ同じであるか、またはより高いADS活性レベルが、その菌株がその条件下でADS活性を発現していることを示す、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
虫歯に関連する細菌株がStreptococcus mutansである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
化合物の非存在下での菌株のADS活性に対して、細菌株のADS活性を増加させることができる１つ以上の化合物を更に含有し、
前記化合物がガラクトース、アルギニン、および酸性化合物からなる群より選択される、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
宿主にプロバイオティック口腔用組成物を投与することを含む、宿主において虫歯病変の進行を遅延させるか、または停止させる方法であって、
前記プロバイオティック口腔用組成物が、分離細菌株の混合物と、製薬上許容されうる口腔用担体とを含有し、
前記混合物が、少なくとも２つの異なる分離アルギニン分解性細菌株を含み、それぞれの菌株はアルギニンデイミナーゼシステム（ADS）によってアンモニアを生成することができ、それぞれの菌株は下記の基準：すなわち、環境アルギニンの非存在下でADS活性を発現すること、グルコースの存在下でADS活性を発現すること、非酸性pH中でADS活性を発現すること、好気条件下でADS活性を発現すること、虫歯に関連する少なくとも１つの細菌株の増殖を阻害すること、および虫歯に関連する少なくとも１つの細菌株による増殖の阻害に抵抗すること、のうちの少なくとも１つを満たしており、
細菌株の混合物によって少なくとも２つの基準が満たされる、方法。
【請求項２０】
前記基準のいずれかにおいてADS活性を発現する細菌株の能力が、同一条件下でのS. gordonii DL1のADS活性レベルに対して決定され、
同一条件下でのS. gordonii DL1の活性とほぼ同じであるか、またはより高いADS活性レベルが、その菌株がその条件下でADS活性を発現していることを示す、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
虫歯に関連する細菌株がStreptococcus mutansである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
化合物の非存在下での菌株のADS活性に対して、細菌株のADS活性を増加させることができる１つ以上の化合物を更に含有し、
前記化合物がガラクトース、アルギニン、および酸性化合物からなる群より選択される、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
宿主にプロバイオティック口腔用組成物を投与することを含む、宿主の口腔内のアンモニア生成細菌の量を増加させる方法であって、
前記プロバイオティック口腔用組成物が、分離細菌株の混合物と、製薬上許容されうる口腔用担体とを含有し、
前記混合物が、少なくとも２つの異なる分離アルギニン分解性細菌株を含み、それぞれの菌株はアルギニンデイミナーゼシステム（ADS）によってアンモニアを生成することができ、それぞれの菌株は下記の基準：すなわち、環境アルギニンの非存在下でADS活性を発現すること、グルコースの存在下でADS活性を発現すること、非酸性pH中でADS活性を発現すること、好気条件下でADS活性を発現すること、虫歯に関連する少なくとも１つの細菌株の増殖を阻害すること、および虫歯に関連する少なくとも１つの細菌株による増殖の阻害に抵抗すること、のうちの少なくとも１つを満たしており、
細菌株の混合物によって少なくとも２つの基準が満たされ、
前記プロバイオティック口腔用組成物の投与が、プロバイオティック口腔用組成物の投与前の宿主の口腔内のアンモニア生成細菌の量を超えて、宿主の口腔内でアンモニア生成細菌の量を増加させる、方法。
【請求項２４】
前記基準のいずれかにおいてADS活性を発現する細菌株の能力が、同一条件下でのS. gordonii DL1のADS活性レベルに対して決定され、
同一条件下でのS. gordonii DL1の活性とほぼ同じであるか、またはより高いADS活性レベルが、その菌株がその条件下でADS活性を発現していることを示す、
請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
虫歯に関連する細菌株がStreptococcus mutansである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
化合物の非存在下での菌株のADS活性に対して、細菌株のADS活性を増加させることができる１つ以上の化合物を更に含有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
細菌株のADS活性を増加させる１つ以上の化合物が、ガラクトース、アルギニン、および酸性化合物からなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
宿主への前記プロバイオティック口腔用組成物の投与が、プロバイオティック口腔用組成物の投与前のアンモニア生成量を超えて、宿主の口腔内のアンモニア生成を増加させる、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2013年2月14日に出願された、「Probiotic Oral Compositions and Methods of Using Probiotic Oral Compositions」と題する米国仮特許出願第61/764,579号に基づく優先権を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府による助成金を受けた研究開発の記載
本発明は、国立歯科・頭蓋顔面研究所（National Institute of Dental and Craniofacial Research）によって授与された契約番号DE10362の政府支援によって行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本出願は、EFS-Webを介して本出願とともに提出されている配列表を含む。配列表ファイルは、01974537.txtと名付けられ、794バイトのサイズであり、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００４】
虫歯はヒトが罹患している最も一般的な感染症および慢性疾患であり、世界中で費用のかかる治療と関連している。健康な歯から虫歯への推移は、口腔バイオフィルムの複雑な微生物群落の組成変化および代謝変化を特徴とする。しばしば歯垢と呼ばれる口腔バイオフィルムは、すべての歯の表面上に常に生じ、増殖している。口腔バイオフィルム中の細菌による酸の生成は虫歯の直接の原因であるが、耐酸性微生物の比率の増加は、より酸への耐性が低い（すなわち、低「耐酸性」の）種を犠牲にして起こると考えられることに注目すべきである。特に注目すべきことに、低耐酸性微生物のサブセットは、アルカリ生成による歯垢の酸性化からの保護をもたらし、口腔衛生にプラスの関与を示す。
【０００５】
口腔細菌によるアルカリ生成の主要経路の１つは、アルギニンデイミナーゼシステム（ADS）であり、これを介してアルギニンは、ATPの同時産生を伴って、オルニチン、アンモニアおよびCO2に異化される。従って、ADSは、細菌において重要な生理機能を果たし、増殖および維持のために低pHおよび低ATPの有害作用からの保護をもたらす。口腔バイオフィルム中のADS活性は、アンモニア生成を介したpHの緩和によって、口腔微生物群落の生態系に影響を及ぼし得る。
【０００６】
歯および口腔軟組織に定着し口腔バイオフィルムを形成する様々な細菌が、ADSを発現する。虫歯リスクの増加は、アルギニンデイミナーゼシステム（ADS）によってアルギニンからアルカリを生成する口腔バイオフィルムの能力の低下と関連している。具体的には、虫歯のない被験体由来の歯垢細菌は、虫歯のある被験体由来の歯垢細菌と比較して、高レベルのADS活性を示す。更に、アルカリ生成率には個人間で大きなばらつきがあり、ある場合には1000倍より大きい。ADS活性における被験体間のばらつきの微生物学的基礎の更なる理解、および口腔衛生の改善のためにADS活性を向上させる方法は、有益であろう。
【発明の概要】
【０００７】
簡潔に述べると、本開示の実施形態は、プロバイオティックアルギニン分解性口腔用組成物、プロバイオティックアルギニン分解性口腔用組成物の製造方法、ならびにプロバイオティックアルギニン分解性口腔用組成物の使用によって口腔内でのアルギニン分解活性を増加させる、ならびに／または、虫歯を治療および／もしくは予防する方法を提供する。
【０００８】
本開示のアルギニン分解性プロバイオティック口腔用組成物の実施形態は、分離細菌株の混合物および製薬上許容されうる口腔用担体を含む。実施形態において、その混合物は、少なくとも２つの異なる分離アルギニン分解性細菌株を含み、それぞれの菌株はアルギニンデイミナーゼシステム（ADS）によってアンモニアを生成することができ、それぞれの菌株は下記の基準：すなわち、環境アルギニンの非存在下でADS活性を発現すること、グルコースの存在下でADS活性を発現すること、非酸性pH中でADS活性を発現すること、好気条件下でADS活性を発現すること、虫歯に関連する少なくとも１つの細菌株の増殖を阻害すること、および虫歯に関連する少なくとも１つの細菌株による増殖の阻害に抵抗すること、のうちの少なくとも１つを満たしており、細菌株の混合物によって少なくとも２つの基準が満たされる。
【０００９】
口腔用のアルギニン分解性細菌株の混合物を製造する方法の実施形態は、少なくとも下記のステップ：すなわち、（a）口腔サンプルから分離された細菌株の混合物を得るステップ；（b）アルギニンデイミナーゼシステム（ADS）によってアンモニアを生成することができるアルギニン分解性細菌株を分離・同定するステップ；（c）１回以上の個別のアッセイを行うことにより、下記のアッセイ条件：すなわち、環境アルギニンの非存在下、グルコースの存在下、非酸性pH中、好気条件下、および虫歯に関連する少なくとも１つの細菌株の存在下、のうちの少なくとも１つにおいてADS活性を発現できるアルギニン分解性細菌株を同定するステップ；（d）ステップ（c）において同定された少なくとも２つの異なる分離アルギニン分解性細菌株を選択することによって、アルギニン分解性細菌の混合物を調製するステップを含み、その混合物は、少なくとも２つの条件下でADS活性を発現する。
【００１０】
実施形態において、本開示は、宿主に対して虫歯の発生を予防するか、または減少させる方法、および宿主における虫歯病変の進行を遅延させるか、または停止させる方法を提供する。その方法は、分離細菌株の混合物および製薬上許容され得る口腔用担体を含むプロバイオティック口腔用組成物を宿主に投与することを含み、その混合物は、少なくとも２つの異なる分離アルギニン分解性細菌株を含み、それぞれの菌株はアルギニンデイミナーゼシステム（ADS）によってアンモニアを生成することができ、それぞれの菌株は下記の基準：すなわち、環境アルギニンの非存在下でADS活性を発現すること、グルコースの存在下でADS活性を発現すること、非酸性pH中でADS活性を発現すること、好気条件下でADS活性を発現すること、虫歯に関連する少なくとも１つの細菌株の増殖を阻害すること、および虫歯に関連する少なくとも１つの細菌株による増殖の阻害に抵抗すること、のうちの少なくとも１つを満たしており、細菌株の混合物によって少なくとも２つの基準が満たされる。
【００１１】
本開示はまた、宿主の口腔内においてアンモニア生成細菌の量を増加させる方法の実施形態を提供し、その方法は、分離細菌株の混合物および製薬上許容され得る口腔用担体を含むプロバイオティック口腔用組成物を宿主に投与することを含み、その混合物は、少なくとも２つの異なる分離アルギニン分解性細菌株を含み、それぞれの菌株はアルギニンデイミナーゼシステム（ADS）によってアンモニアを生成することができ、それぞれの菌株は下記の基準：すなわち、環境アルギニンの非存在下でADS活性を発現すること、グルコースの存在下でADS活性を発現すること、非酸性pH中でADS活性を発現すること、好気条件下でADS活性を発現すること、虫歯に関連する少なくとも１つの細菌株の増殖を阻害すること、および虫歯に関連する少なくとも１つの細菌株による増殖の阻害に抵抗すること、のうちの少なくとも１つを満たしており、細菌株の混合物によって少なくとも２つの基準が満たされる。
【００１２】
本開示の他の方法、組成物、特徴、および利点は、下記の図面および詳細な説明の試験において、当業者にとって明白である、または明白になるであろう。このようなすべての更なる組成物、方法、特徴、および利点は、本記載に含まれ、本開示の範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本開示の更なる態様は、添付図面と合わせた場合、下記に記載されるその様々な実施形態の詳細な説明の検討において、より容易に理解される。
【図１】図１は、歯垢由来のADS陽性細菌株のスクリーニングのデジタル画像を示す。ADS陽性表現型は、ネスラー試薬が生成されたアンモニアを検出する際、橙黄色で示される。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、異なる環境条件下でのS. gordonii DL1およびADS陽性分離株のADS活性レベルを示す一連の棒グラフを表す。グラフは、異なる糖（図２Ａ）、異なるpH（図２Ｂ）、アルギニンの有無（図２Ｃ）、および好気的（w/ O2）または嫌気的（w/o O2）条件（図２Ｄ）に応じたADS活性を示す。結果は、３回の独立した実験の平均値および標準偏差（エラーバー）を表す。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、異なる環境条件下：すなわち、異なる糖（図３Ａ）、異なるpH（図３Ｂ）、アルギニンの有無（図３Ｃ）、および好気的対嫌気的条件（図３Ｄ）で培養された、虫歯のある被験体および虫歯のない被験体由来のアルギニン分解性分離株のADS活性レベルの比較を示す一連の棒グラフである。結果は、３回の独立した実験の平均値および標準偏差（エラーバー）を表す。
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、S. gordonii DL1（図４Ａ）ならびにADS陽性分離株 S. gordonii A8（図４Ｂ）、S. australis A12（図４Ｃ）、およびS. sanguinis A33 （図４Ｄ）の、S. mutans UA159の増殖に対する阻害効果を示すアッセイを説明する一連のデジタル画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
説明
本開示がより詳細に記載される前に、本開示は記載された特定の実施形態に限定されず、それ自体、当然変化しうることが理解されるべきである。本明細書において用いられる専門用語は特定の実施形態を説明する目的のためだけであり、限定を意図するものではないこともまた、理解されるべきである。
【００１５】
数値の範囲が示されている場合、その範囲の上限および下限とその所定の範囲内の他の任意の所定の値または介在値との間のそれぞれの介在値は、文脈が明らかに他を規定しない限り、下限の単位の10分の1まで、本開示に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立にそのより小さい範囲に含まれてもよく、また本開示に包含され、所定の範囲内の任意の明確に除外された限度を対象とする。所定の範囲が限度の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限度の一方または両方を除外している範囲もまた、本開示に含まれる。
【００１６】
他に定義されない限り、本明細書において用いられるすべての専門用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似のまたは同等の任意の方法および材料もまた、本開示の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料は、以下に記載される。
【００１７】
本明細書に引用された、参照により組み入れられる任意の出版物および特許は、参照により本明細書に組み入れられることにより、その出版物が関連して引用された方法および／材料を開示し、記載する。任意の出版物の引用は、出願日より前のその開示のためであり、本開示が、先の開示を理由に、このような出版物に先行する権利がないことを認めると解釈されるべきではない。更に、示された公開日は、実際の公開日とは異なる可能性があり、別に確認されることが必要でありうる。
【００１８】
本開示を読む上で当業者にとって明らかなように、本明細書に記載され、説明される個々の実施形態のそれぞれは、本開示の範囲または趣旨から逸脱することなく、任意の他のいくつかの実施形態の特性から容易に分離され、またはそれらと組み合わせられうる個別の構成要素および特性を有する。任意の列挙された方法は、列挙された事象順に、または理論的に可能な他の任意の順序で実施され得る。
【００１９】
本開示の実施形態は、他に指示されない限り、医学、歯科学、生物学、微生物学、統計学、生化学、分子生物学、薬学などの技術を用い、これらは当技術分野の技術の範囲内である。このような技術は、文献中で完全に説明される。
【００２０】
本明細書および添付の実施形態において用いられる場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明らかに他を規定しない限り、複数形の指示対象を含むことに注意しなくてはならない。従って、例えば、「細胞（a cell）」への言及には、複数の細胞が含まれる。本明細書およびその後の実施形態では、多数の用語について言及されるが、反する意図が明白でない限り、下記の意味を有すると定義されるものとする。
【００２１】
様々な実施形態の記載に先立って、下記の定義が示され、他に指示されない限り、その定義が用いられなければならない。
【００２２】
定義
開示される対象物の記載において、下記の専門用語は、下記の定義に従って用いられる。
【００２３】
「核酸」という用語は、本明細書において用いられる場合、任意の天然および合成の、直線状および連続的な、ヌクレオチドおよびヌクレオシドの配列、例えば、cDNA、ゲノムDNA、mRNA、tRNA、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよびその誘導体を指す。議論を容易にするために、このような核酸は、本明細書において「構築物」、「プラスミド」、または「ベクター」と総称されうる。本開示の核酸の代表例は、発現ベクター、クローニングベクター、コスミドベクターおよび形質転換ベクターなどの細菌プラスミドベクター（限定はされないが、例えばpBR322など）、動物ウイルスベクター（限定はされないが、例えば、改変アデノウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、昆虫ウイルス（バキュロウイルス）など）、バクテリオファージ核酸に由来するベクター、ならびに化学的に合成されたDNAまたはRNAのような合成オリゴヌクレオチドを含む。「核酸」という用語は、限定はされないが、5-ブロモウラシルだけではないがこのようなハロゲン化ヌクレオチドおよびビオチン標識化ヌクレオチドのような誘導体化ヌクレオチドなどの、修飾または誘導体化されたヌクレオチドならびにヌクレオシドを更に含む。
【００２４】
「分離された核酸」という用語は、（a）任意の天然に存在する核酸の構造と同一でないか、または（b）３つより多い個別の遺伝子にわたる天然に存在するゲノム核酸の任意の断片の構造と同一でない構造を有する核酸を指し、DNA、RNA、またはその誘導体もしくは変異体を含む。その用語は、例えば、限定はされないが、（a）天然に存在するゲノム分子の一部の配列を有するが、それが天然に存在する種のゲノム中のその分子の一部と隣接する少なくとも１つのコード配列とは隣接していないDNA；（b）結果として生じる分子が、任意のベクターまたは天然に存在するゲノムDNAと同一ではないように、ベクター中または原核生物もしくは真核生物のゲノム核酸中に組み込まれた核酸；（c）cDNA、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR）もしくは化学合成によって生成された断片、または制限断片などの個別の分子；（d）雑種遺伝子、例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組換えヌクレオチド配列、および（e）天然には存在しない雑種配列の一部である組換えヌクレオチド配列を網羅する。本開示の分離された核酸分子は、例えば、天然の対立遺伝子多型ならびにヌクレオチド欠失、挿入、逆位、または置換によって改変された核酸分子を含み得る。
【００２５】
ヌクレオチド配列が精製された形態であることは、いくつかの目的に有利である。核酸に関して「精製された」という用語は、その配列が天然の環境と比べて増加した純度を有することを示す。
【００２６】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸配列」という用語は、本明細書において同じ意味で用いられ、コード配列（適切な調節配列もしくは制御配列の制御下に置かれた時、in vitroまたはin vivoでポリペプチドに転写、翻訳されるポリヌクレオチドあるいは核酸配列）；制御配列（例えば、翻訳開始コドンおよび終止コドン、プロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写因子結合部位、転写終結配列、上流および下流の調節ドメイン、エンハンサー、サイレンサーなど）；ならびに調節配列（転写因子が結合し、プラス（誘導）またはマイナス（抑制）のいずれかに遺伝子のプロモーター活性を変えるDNA配列）を含むが、それらに限定されない。長さまたは合成起源についての制限は、本明細書に記載される用語によって示唆されない。
【００２７】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において用いられる場合、ペプチド結合によって連結された、連続した配列中の３つ以上のアミノ酸のポリマーを指す。「ポリペプチド」という用語は、タンパク質、タンパク質断片、タンパク質類似体、オリゴペプチドなどを含む。「ポリペプチド」という用語は、核酸によってコードされる、（鳥などの適切な起源から分離された）組換え技術によって生成される、または合成される、上記に定義されたようなポリペプチドを企図する。「ポリペプチド」という用語は、更に、化学修飾アミノ酸または標識リガンドと共有結合的にもしくは非共有結合的に結合したアミノ酸を含む、上記に定義されたようなポリペプチドを企図する。
【００２８】
「断片」という用語は、核酸（例えば、cDNA）に言及するために本明細書において用いられる場合、（例えば、化学合成によって）人工的に構築された、または制限エンドヌクレアーゼもしくは機械的せん断を用いて天然の生成物を複数の断片に切断することによる、対象の核酸の分離された一部分、あるいはPCR、DNAポリメラーゼもしくは当技術分野においてよく知られている他の任意の重合技術によって合成された、または当業者によく知られている組換え核酸技術によって宿主細胞で発現された核酸の一部分を指す。「断片」という用語は、本明細書において用いられる場合、またポリペプチドの分離された一部分を指してもよく、そのポリペプチドの一部分は、少なくとも１つのプロテアーゼによるタンパク質分解的切断によって天然に存在するポリペプチドから切断される、または当業者によく知られている化学的方法によって合成された天然に存在するポリペプチドの一部分である。
【００２９】
「遺伝子」という用語は、本明細書において用いられる場合、RNA全体、タンパク質全体、またはこのようなRNA全体もしくはタンパク質全体の任意の一部分を合成するための遺伝情報をコードする核酸配列（RNAとDNAとの両方を含む）を指す。天然には特定の生物のゲノムの一部ではない遺伝子は、「外来遺伝子」、「異種遺伝子」または「外因性遺伝子」と呼ばれ、天然に特定の生物のゲノムの一部である遺伝子は、「内在性遺伝子」と呼ばれる。「遺伝子産物」という用語は、遺伝子によってコードされるRNAまたはタンパク質を指す。「外来遺伝子産物」は「外来遺伝子」によってコードされるRNAまたはタンパク質であり、「内在性遺伝子産物」は内在性遺伝子によってコードされるRNAまたはタンパク質である。「異種遺伝子産物」は、「外来、異種または外因性遺伝子」によってコードされるRNAまたはタンパク質であり、従って、天然にはその細胞内で発現しない。
【００３０】
本明細書において用いられる場合、「微生物叢」は、宿主生物内の微生物の生物環境を指す。本明細書において用いられる場合、「微生物叢」は通常、宿主生物内、例えば、宿主生物の口腔内などで生存している微生物（例えば、細菌）の群落を指す。「マイクロフローラ」という用語は同様に、微生物叢内で生存している集合的な生物を指し、その用語は、本開示において同じ意味で用いられうる。天然の微生物叢という用語はまた、薬物（例えば、抗生物質もしくはプロバイオティクス）の投与によって、または天然の細菌コロニーの組成を変化させることを目的とした方法によって改変されていない（あるいはそれによって改変される前の）宿主の細菌群落を指す。宿主の天然の細菌群落は、様々な自然要因および人工要因（例えば、疾患、食事の変化、薬物、医療処置など）により経時変化し得る。
【００３１】
「分類学的カテゴリー」または「分類学的分類」または「分類」という用語は、本明細書において用いられる場合、生物の、それらが割り当てられている科学的に確立された分類学的カテゴリー（例えば、界、門、綱、目、科、属、種、株）への分類を指し、または、これまでに同定されていない生物の場合、確立された科学的な手順に従って、遺伝学的特徴および特性の類似に基づいて、恐らく割り当てられるであろうカテゴリーを指す。「分類学的カテゴリー」は、広義のカテゴリー（例えば、門、綱）または狭義のカテゴリー（例えば、属、種）であってもよく、分類行為は複数の生物またはたった１つの生物に関してでもよい。「分類」はまた、個体を類似の特性に基づくカテゴリーにグループ分けする行為をも含みうるが、通常、本開示では、「分類」は、文脈が他を指示しない限り、「分類学的分類」を指す。
【００３２】
「菌株」は、本明細書において用いられる場合、種のレベル内での分類学的サブグループ化を指し、菌株は、種内の遺伝的変異体またはサブタイプである。本開示では、「菌株」は、既知の種に対して密接な配列同一性を有する（例えば、約95％の配列同一性、約99％の配列同一性など）が、１つ以上の特性、例えば、限定はされないが、特定の環境条件でのADS活性レベルなどが異なりうる臨床分離株を指してもよい。
【００３３】
「分離細菌株」または「細菌分離株」は、自然環境、異種環境（例えば、宿主の口腔）または微生物の集団から分離され、既知の微生物学的技術を用いてその起源環境中の他の微生物群落から分離された、細菌性生物から生じた細菌株または培養物を指す。分離された株はその後、培養液中で増殖されうる。分離された細菌株または分離された細菌株の培養物は、必ずしもすべての可能性のある不純物を含まないわけではないが、実質的に均一な細菌分離株の培養物であり、天然に存在する微生物の不均一な群と区別され得る。
【００３４】
本明細書において用いられる場合、「プロバイオティック細菌」は、通常、医学界によって非病原性であると見なされ、宿主に健康上の効用をもたらす細菌を指す。例えば、高いADS活性を有すると考えられ、従って、虫歯の発生の減少を伴う口腔環境を促進し、かつ、宿主に対して毒性を持たない細菌は、本開示におけるプロバイオティック細菌の非限定的な例であろう。
【００３５】
本明細書において用いられる場合、「ADS活性」という用語は、アルギニンデイミナーゼシステム（ADS）によってアンモニアの形でアルカリを生成する細菌株の能力を指す。「ADS活性レベル」は、細菌株がADSシステムによって生成できるアンモニアの量を指す。実施形態において、ADS活性レベルは、生成されたシトルリンのnmol（分×mgタンパク質）-1として測定される。「ADS 活性を発現すること」または「十分なADS 活性を発現すること」とは、標準的な増殖条件または限定はされないが、非酸性pH、低い環境アルギニン、高糖質条件（例えば、グルコースの存在）、もしくは好気条件（例えば、酸素の存在）などの１つ以上の不利な環境要因のもとで、ADSによってアルギニンを代謝する細菌株の能力を指す。実施形態において、ADS活性を発現する菌株の能力は、既知のよく特徴付けられたADS陽性株（例えば、S. gordonii DL1）の同一環境アッセイ条件下（例えば、「標準的な増殖条件」またはいくつかの他の増殖条件の変化）でのADS活性に対して決定される。実施形態では、その菌株が、同一のアッセイ条件下でS. gordonii DL1に対してほぼ同じ活性、より高い活性、または設定された割合のADS活性を発現する場合、その菌株は「十分なADS活性を発現する」。他の実施形態では、特定の環境条件下でADS活性を発現する菌株の能力は、同一株のADS活性に対して決定され得る。このようないくつかの実施形態では、ある菌株が、標準的な増殖条件下でのその菌株のADS活性と比較して、特定の割合（例えば、少なくとも約25％のADS活性、少なくとも約40％のADS活性、少なくとも約50％のADS活性、少なくとも約75％のADS活性など）のADS活性を有する場合、菌株は、環境アッセイ条件下で「ADS活性を発現する」と言える。本開示において、「標準的な増殖条件」は、25 mMガラクトースおよび10mM補給アルギニンを含有するTY培地（トリプトン・酵母エキスブロス）、5％ CO2、37℃で、OD600+0.5-06の光学密度までである。
【００３６】
「治療する（treat）」、「治療（treating）」、および「治療（treatment）」という用語は、有益な、または望ましい臨床結果を得るための方法である。具体的には、有益な、または望ましい臨床結果は、症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の安定化（例えば、悪化しないこと）、疾患進行の減速、遅延、または停止、疾患の拡大の実質的予防、病状の減少、改善または緩和、および検知可能、検知不可能に関わらず（部分的もしくは全体的な）回復を含むが、それらに限定されない。加えて、「治療する（treat）」、「治療（treating）」、ならびに「治療（treatment）」はまた、疾患および／もしくは疾患に起因する悪影響の部分的治癒または完治において治療効果があり得る。虫歯に関して、「治療」は、虫歯病変の発症の減少および虫歯病変の進行の遅延または停止（例えば、病変の成長もしくは重症度の遅延または停止）を含む。「治療」はまた、「予防」／「予防的治療」をも含む。本明細書において用いられる場合、「予防する」、「予防的に治療する」、または「予防的治療」という用語は、宿主において疾患／症状もしくはその１つ以上の症状を完全に、実質的に、または部分的に予防することを指す。同様に、「疾患発症の遅延」もまた、「予防的治療」に含まれ、疾患の素因を有する患者において実際の疾患発症前の時間を増加させる作用を指す。虫歯に関して、「予防」または「予防的治療」は、宿主において新しい虫歯病変の発症を予防することを含み得る。
【００３７】
「投与」とは、本開示の化合物を被験体内に導入することを意味し；それはまた、本開示の組成物を被験体に（例えば、処方することによって）供給する行為を指す。本開示の組成物の好ましい投与経路は経口投与である。しかし、組成物が宿主の口腔状態を治療するよう補助する任意の投与経路が使用され得る。
【００３８】
「生物」、「被験体」、または「宿主」という用語は、ヒト、哺乳動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ、ニワトリ、ブタ(pigs, hogs)、ウシ、および他の家畜）、ならびに治療を必要とする他の生物種などの、治療を必要とする任意の生命体を指す。詳細には、「宿主」という用語は、ヒトを含む。本明細書において用いられる場合、「ヒト宿主」または「ヒト被験体」という用語は、通常ヒト宿主を指すために用いられる。本開示において、「宿主」という用語は、通常ヒト宿主を指し、従って、本開示において単独で用いられる場合、「宿主」という単語は、文脈が明らかに非ヒト宿主を指示する意図を示さない限り、ヒト宿主を指す。疾患の「素因を有する」宿主は、１つ以上のこれらの疾患の明らかな症状を示さないが、遺伝的、生理的、またはその他の点で、１つ以上のこれらの疾患を発症する危険性のある宿主と定義され得る。
【００３９】
本明細書において用いられる場合、下記の用語は、他に規定のない限り、それらに帰属する意味を有する。本開示では、「基本的に〜からなる」または「基本的に〜で構成される」または同様の語句は、本開示に包含される方法および組成物に適用される場合、本明細書に開示されるような組成物を指すが、それは付加的な構造群、組成物成分あるいは方法ステップ（または上記のようなその類似体もしくは誘導体）を含みうる。このような付加的な構造群、組成物成分または方法ステップなどは、しかし、本明細書に開示された対応する組成物または方法の特性と比較して、組成物または方法の基本的かつ新規の特性に実質的に影響を及ぼさない。「基本的に〜からなる」または「基本的に〜で構成される」または同様の語句は、本開示に包含される方法および組成物に適用される場合、米国特許法に示される意味を有し、その用語は制限なく、列挙されるその基本的なまたは新規の特性が、列挙されるそれを超える存在によって変化しない限り、列挙されるそれを超える存在を許容するが、先行技術の実施形態を除外する。具体的には、本開示のアルギニン分解性細菌株の混合物に関して、「基本的に〜からなる」とは、記載される基準を備えたもの以外の他の細菌株が少量存在しうるが、それらは混合物の全体的な機能に影響を及ぼさず、混合物のアルギニン分解活性に影響を及ぼさないことを示す。
【００４０】
考察
本開示の実施形態は、プロバイオティックアルギニン分解性口腔用組成物、口腔用のアルギニン分解性細菌株の混合物の製造方法、虫歯の治療および／または予防のため、および患者の虫歯病変の進行の遅延および／または停止のための方法および組成物、ならびに宿主の口腔内のアルギニン分解性細菌量を増加させ、宿主の口腔内でのアンモニア生成を増加させるための方法および組成物を包含する。本開示の実施形態は、アルギニン分解性細菌株の混合物を含有する組成物を含む。実施形態において、組成物は、プロバイオティック口腔用組成物である。
【００４１】
口腔生態学におけるアルカリ生成の役割および虫歯の抑制を支持するin vitroでの観察ならびに臨床観察からの証拠は、蓄積し続けている（DawesおよびDibdin, 2001; Margolisら、1988b; Nascimentoら、2009a; Petersonら、1985; Shuら、2007a; WijeyeweeraおよびKleinberg, 1989a）。口腔アルギニン代謝と齲蝕活動性の欠如との間の正の相関関係は、成人において（Nascimentoら、2009a）、およびより最近では小児において（Nascimentoら、2012）臨床的に実証されている。具体的には、虫歯のない被験体の歯垢由来の口腔細菌は、虫歯のある被験体のものと比較して、より高いADS活性を示す。また、個体間でアンモニア生成率に高度のばらつきがあり、ある場合には1000倍より大きい。口腔連鎖球菌の実験室株を用いた以前の研究は、ADS遺伝子の発現が基質誘導性であり、炭素異化代謝産物抑制（CCR）に対して感受性であり、低pHおよび嫌気条件を好むことを示す。特異的転写制御因子およびグローバル転写制御因子、複数の二成分制御系（TCS）ならびに他の因子は、転写機構および転写後の機構を介してADS活性を調節することが示されている（Burne, 1991; Dongら、2004; LiuおよびBurne, 2009; Liuら、2008）。in vitroでの研究は、虫歯病原体Streptococcus mutansの遺伝子組換え株のアンモニア生成能力におけるわずか5分の1への減少が、解糖による環境酸性化を相殺する能力の低下をもたらすことを示した（Clancyら、2000）。従って、多くの個体は、絶食期間中または齲蝕原性負荷の後に歯垢を中和するための十分なADS活性を欠如しうる。このように、歯垢細菌のADS活性は、静止期の歯垢および糖質負荷された歯垢のpHプロフィールに影響を及ぼし、従って、虫歯発症のリスクに影響を及ぼし得る。
【００４２】
口腔バイオフィルムの微生物組成の違いおよびADSの発現の差は、異なる個体からの口腔サンプルのアルギニンを代謝する能力に影響を及ぼす最も可能性の高い要因である。以前の臨床研究におけるqPCRの使用（Nascimentoら、2009a）は、２つの一般に認められているアルギニン分解性種S. sanguinisおよびS. gordoniiの割合と成人の虫歯の状況との間に、統計的に有意な関連性を示さなかった。これらの結果は、齲蝕経験と関連したADS活性の低下が、単に既知のADS陽性細菌の割合の低下によるものではないかもしれないことを示唆し、調べられたもの以外の種が総合的な口腔ADS活性に寄与しうる可能性をも提起した。環境条件および宿主要因が、虫歯のある被験体と虫歯のない被験体とのADSの発現の差を助長する可能性もある。従って、本開示では、口腔でのアルギニン分解に寄与する微生物を、より徹底的に解析し、研究した。口腔アルギニン分解性細菌群落の基礎的な微生物学および生態学に関する新たな知見、ならびに口腔衛生および虫歯とのそれらの関係を提供しながら、下記の実施例は、虫歯のない成人被験体および虫歯のある成人被験体の歯肉縁上歯垢に由来するアルギニン分解性細菌株の分離および解析ならびにこれらの分離株の環境刺激への応答を示す。
【００４３】
上記で簡潔に議論され、下記でより詳細に議論されるように、いくつかの細菌は、アルギニンデイミナーゼシステム（ADS）によってアンモニアを生成する能力を有する。このような「アルギニン分解性」細菌は、宿主（詳細には宿主の口腔）において見出される場合、宿主の口腔内でのアンモニア生成の増加に有利であり、それによって虫歯の発生を減少させるための環境要因を提供し得る。いくつかのこのような細菌株は、虫歯のない個体の口腔バイオフィルムにおいてより広く見出される。下記のように、実施例の研究は、ADS活性の能力がある様々な細菌株を同定し、ADS活性の能力がある様々な菌株を同定する方法を記載した。加えて、下記の実施例に記載される研究は、更に、従来はADS活性の低下に関連する条件の存在下でADS活性を維持することができる細菌株を同定する方法を特定し、記載した。多くのこのような条件はまた、より高い虫歯の発生とも関連している。従って、特定の基準を満たし、特定の条件の存在下でADS活性を発現している菌株を同定する能力は、宿主内のこれらの細菌のレベルの増加にとって、また患者における虫歯の発生の治療、予防、遅延、または停止させる方法にとって有益である。実施形態では、ADS活性を有し、特定の条件下でADS活性を発現するとして同定されたいくつかの菌株は、プロバイオティック口腔用組成物に含有され得る。このような組成物は、宿主の口腔内においてアンモニア生成細菌の量を増加させる本開示の方法、虫歯を治療もしくは予防する方法、および／または虫歯のある患者において虫歯病変の進行を遅延もしくは停止させる方法の実施形態において使用され得る。
【００４４】
プロバイオティック口腔用組成物：
本開示は、このように細菌株の混合物を含有しているプロバイオティック口腔用組成物を提供し、その混合物は、少なくとも２つの異なる分離アルギニン分解性細菌株を含む。混合物中の少なくとも２つの分離アルギニン分解性細菌株のそれぞれは、アルギニンデイミナーゼシステム（ADS）によってアンモニアを生成することができ、それぞれの菌株は少なくとも１つのADSに関連する基準を満たす。実施形態では、ADSに関連する基準は、下記を含むがそれらに限定されない。すなわち、補給アルギニンの非存在下でADS活性を発現すること（ここで「補給アルギニン」は、（増殖培地にもともと存在するアルギニンに加えて）、（例えば、約5 mMを超えるアルギニン）基本増殖培地に追加されるアルギニンである）、グルコースの存在下（例えば、基本培地へのグルコースの追加）でADS活性を発現すること、非酸性pH中（例えば、少なくともpH約7）でADS活性を発現すること、好気条件下（例えば、追加酸素の存在下）でADS活性を発現すること、虫歯に関連する少なくとも１つの細菌株の増殖を阻害すること、および虫歯に関連する少なくとも１つの細菌株による増殖の阻害に抵抗することである。本開示のプロバイオティック口腔用組成物の実施形態では、少なくとも２つの上記の基準が、細菌株の混合物によって満たされ、混合物中のそれぞれの細菌株は１つより多くの基準を満たしうる。
【００４５】
虫歯に関連するほとんどの細菌種はアルギニン分解性ではないため、おそらくこのような種の間でさほど重複することはないであろう。しかし、明確にするために、実施形態では、分離アルギニン分解性細菌株の混合物は、虫歯に関連する細菌種（例えば、S. mutansなど）由来の細菌のいずれの菌株も明確に排除する。本開示の口腔用組成物の組成の実施形態では、混合物は、少なくとも２つの異なる分離アルギニン分解性細菌株からなり、それぞれの菌株はADSによってアンモニアを生成することができ、それぞれの菌株は上記に記載された少なくとも１つの基準を満たす。
【００４６】
本開示のプロバイオティック組成物はまた、限定はされないが、水、他の製薬上許容されうる液体、ゲル、粉末などの製薬上許容されうる口腔用担体をも含有し得る。組成物は、限定はされないが、液体口内洗浄液、口腔噴霧剤、ゲル、ペースト（例えば、練り歯磨き）、ある種の食品、キャンディー／ミント菓子、ガム、またはチュアブル錠などの口腔用製剤に製剤化され得る。このような製剤を製造する方法は、薬理学および／または調剤の技術分野の業者にとって既知である。
【００４７】
実施形態では、混合物のための細菌株は、下記に記載される本開示の方法によって同定されたかまたは同定できる、ADS活性を示す任意のADS陽性細菌株より選択され得る。実施形態では、アルギニン分解性細菌株は、限定はされないが、下記の表１および２において同定された、ADS活性を示すものなどの菌株より選択され得る。実施形態では、ADS活性は、例えば、下記の実施例１に記載されるADSアッセイのように、標準的な増殖条件下でのADSアッセイによって測定された場合、少なくとも約225ユニット（mgタンパク質）-1、少なくとも約250ユニット（mgタンパク質）-1、少なくとも約275ユニット（mgタンパク質）-1、少なくとも約300ユニット（mgタンパク質）-1などである。簡潔には、ADSアッセイの実施形態は、下記の実施例１に記載されるように、アルギニンからのシトルリン生成を測定することによる活性の測定を含む。細胞を遠心分離によって回収し、10 mM Tris-マレイン酸バッファー（pH 6.8）で洗浄し、もとの培養液量の1/10を用いて同一バッファーに再懸濁した。細胞をトルエンとともにボルテックスすることによって透過処理し、18,000×gでの遠心分離によって回収した。上清液を捨て、沈澱を10 mM Tris-マレイン酸バッファーに再懸濁して、20nMアルギニン、10mMヘキサン酸、および50mM Tris-マレイン酸バッファー（pH 6.0）を含む反応混合物中でAD活性を測定するために使用した。それぞれのアッセイに用いられたタンパク質の濃度は、実施例１に記載されるように測定された。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ADS活性は、よく特徴付けられた実験室株Streptococcus.gordonii DL1（Streptococcus gordonii（strain Challis/ ATCC 35105/CH1DL1/V288））の標準的な増殖条件下でのADS活性と少なくともほぼ同じである。いくつかの実施形態では、ADS活性は、標準的な増殖条件下で、少なくとも約300 nmolシトルリン（分×（mgタンパク質））-1である（表１参照：S. gordonnii DL1のADS活性は約339.3 +/- 33.0）。いくつかの実施形態では、混合物のための細菌株は、標準的な増殖条件下でS. gordoniii DL1の活性の約50％〜約100％のADS活性を有する。いくつかの実施形態では、細菌株のADS活性は、標準的な増殖条件下でS. gordoniiより低いが、より詳細に下記に記載されるように、他の環境条件下でS. gordoniiのADS活性より高い。
【００４９】
本開示のプロバイオティック口腔用組成物のいくつかの実施形態では、細菌株は、Streptococcus parasanguinis、Streptococcus intermedius、Streptococcus gordonii、Streptococcus australis、Streptococcus sanguinis、およびStreptococcus cristatusを含むがそれらに限定されない種に由来する細菌のアルギニン分解性株より選択される。実施形態では、細菌株は、下記の菌株：すなわち、Streptococcus parasanguinis PTO10（受託番号GU561390.1）、Streptococcus intermedius C270（受託番号CP003858.1）、Streptococcus gordonii str. Challis sbustr. CH1（受託番号AB690250.1）、S. gordonii str. Challis sbustr. CH1（受託番号NR_074516.1）、S. gordonii ATCC 10558（受託番号AY485606.1）、Streptococcus australis Al-1（受託番号JX861483.1）、Streptococcus sanguinis JCM 5708（受託番号AB596946.1）、およびStreptococcus cristatus F0329（受託番号AY005047.1）に対して、少なくとも99％の配列類似性を有するアルギニン分解性株より選択される。いくつかの実施形態では、プロバイオティック口腔用組成物は、表１（実施例１）で同定された下記の菌株：すなわち、Streptococcus parasanguinis A1、Streptococcus intermedius A2、S. intermedius A3、S. intermedius A5、Streptococcus gordonii A7、S. gordonii A8、S. gordonii A9、S. gordonii A10、S. gordonii A11、Streptococcus australis A12、S. australis A13、Streptococcus sanguinis A41、およびStreptococcus cristatus A55より選択される細菌株を含む。
【００５０】
実施形態では、混合物中の少なくとも１つの菌株は、グルコースの存在下（例えば、増殖培地中のガラクトースの代わりにグルコース（例えば、約25 mMグルコース））でADS活性を発現する。実施形態では、グルコースの存在下でADS活性を発現する、混合物のために選択される細菌株は、同一のグルコース条件下で、少なくともほぼS. gordonii DL1と同様の、もしくはより高いADS活性のレベルを有する、または同一のグルコース条件下で、S. gordoniiの少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、少なくとも約100％のADS活性を有する。いくつかの実施形態では、添加グルコース条件下（例えば、増殖培地に添加されるガラクトースの代わりに25mMグルコース）でADS活性を発現する混合物中の少なくとも１つの菌株は、標準的な増殖条件下での同一株の少なくとも約25％のADS活性を有する。実施形態では、添加グルコース条件下でADS活性を発現する菌株は、標準的な増殖条件下での同一株の少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約75％などのADS活性を有する。実施形態では、グルコースの存在下でADS活性を発現する菌株は、Streptococcus parasanguinis、Streptococcus intermedius、Streptococcus gordonii、およびStreptococcus australisを含むがそれらに限定されない細菌種に由来する菌株より選択される。実施形態では、細菌株は、下記の菌株：すなわち、Streptococcus parasanguinis PTO10（受託番号GU561390.1）、Streptococcus intermedius C270（受託番号CP003858.1）、Streptococcus gordonii str. Challis sbustr. CH1（受託番号AB690250.1）、S. gordonii str. Challis sbustr. CH1（受託番号NR_074516.1）、S. gordonii ATCC 10558（受託番号AY485606.1）、およびStreptococcus australis Al-1（受託番号JX861483.1）に対して、少なくとも99％の配列類似性を有するアルギニン分解性株より選択される。グルコースの存在下でDL1を上回るADS活性を発現する（例えば、ADS＞約52.5ユニット）いくつかの代表的な細菌株は、下記の菌株：すなわち、S. parasanguinis A1、S. intermedius A2、S. intermedius A3、S. intermedius A5、S. gordonii A7、S. gordonii A8、S. gordonii A9、S. gordonii A10、S. gordonii A11、S. australis A12、およびS. australis A13を含むがそれらに限定されない。
【００５１】
実施形態では、混合物中の少なくとも１つの菌株は、非酸性pH（例えば、少なくともpH 7）中でADS活性を発現する。実施形態では、非酸性pH中でADS活性を発現する、混合物のために選択される細菌株は、同一のpH条件下で、少なくともほぼS. gordonii DL1と同様の、もしくはより高いADS活性のレベルを有する、または同一のpH条件下で、S. gordonii DL1の少なくとも約75％のADS活性を有する。実施形態では、細菌株は、同一のpH条件下で、S. gordonii DL1の少なくとも約50％のADS活性を有する。いくつかの実施形態では、非酸性pH中でADS活性を発現する混合物中の少なくとも１つの菌株は、標準的な増殖条件下、または約5.7の酸性pH下での同一株の少なくとも約50％のADS活性を有する。実施形態では、非酸性条件下で（under a non-acidic glucose conditions） ADS活性を発現する菌株は、標準的な増殖条件下、および／または約5.7の酸性pHでの、同一株の少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約75％などのADS活性を有する。実施形態では、非酸性pH中でADS活性を発現する菌株は、Streptococcus parasanguinis、Streptococcus intermedius、Streptococcus gordonii、およびStreptococcus australisを含むがそれらに限定されない細菌種に由来する菌株より選択される。実施形態では、細菌株は、下記の菌株：すなわち、Streptococcus parasanguinis PTO10（受託番号GU561390.1）、Streptococcus intermedius C270（受託番号CP003858.1）、Streptococcus gordonii str. Challis sbustr. CH1（受託番号NR_074516.1）、およびStreptococcus australis Al-1（受託番号JX861483.1）に対して、少なくとも99％の配列類似性を有するアルギニン分解性株より選択される。非酸性pH中でDL1を上回るADS活性を発現する（ADS＞約344.5ユニット）いくつかの代表的な細菌株は、下記の菌株：すなわち、S. parasanguinis A1、S. intermedius A2、S. intermedius A3、S. gordonii A8、およびS. australis A12を含むがそれらに限定されない。
【００５２】
実施形態では、混合物中の少なくとも１つの菌株は、補給アルギニンの非存在下（例えば、約5 mM未満アルギニンが増殖培地に添加される）でADS活性を発現する。実施形態では、補給アルギニンの非存在下でADS活性を発現する細菌株は、同一のアルギニン欠乏条件下で、少なくともS. gordonii DL1と同様の、もしくはより高いADS活性のレベルを有するか、または同一のアルギニン欠乏条件下で、S. gordonii DL1の少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも75％などのADS活性を有する。実施形態では、補給アルギニンの非存在下でADS活性を発現する菌株は、標準的な増殖条件下での同一株の少なくとも約60％のADS活性を有する。実施形態では、補給アルギニン条件の非存在下でADS活性を発現する菌株は、標準的な増殖条件下での同一株の少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約75％などのADS活性を有する。実施形態では、環境アルギニンの非存在下でADS活性を発現する菌株は、Streptococcus parasanguinis、Streptococcus intermedius、Streptococcus gordonii、およびStreptococcus australisを含むがそれらに限定されない細菌種に由来する菌株より選択される。実施形態では、細菌株は、下記の菌株：すなわち、Streptococcus parasanguinis PTO10（受託番号GU561390.1）、Streptococcus intermedius C270（受託番号CP003858.1）、Streptococcus gordonii str. Challis sbustr. CH1（受託番号NR_074516.1）、およびStreptococcus australis Al-1（受託番号JX861483.1）に対して、少なくとも99％の配列類似性を有するアルギニン分解性株より選択される。環境アルギニンの非存在下でDL1を上回るADS活性を発現する（ADS＞約232.5ユニット）いくつかの代表的な菌株は、下記：すなわち、S. parasanguinis A1、S. intermedius A2、S. intermedius A3、S. gordonii A8、S. australis A12、およびS. australis A13を含むが、必ずしもそれらに限定されない。
【００５３】
実施形態では、混合物中の少なくとも１つの菌株は、好気条件（例えば、O2の存在下、例えば、ロータリーシェーカーなどによる振とうによって引き起こされる空気混和）でADS活性を発現する。実施形態では、好気条件でADS活性を発現する細菌株は、同一の酸素供給oxygenationのもとで、少なくともS. gordonii DL1と同様の、もしくはより高いADS活性のレベルを有する、または同一の酸素供給のもとで、S. gordonii DL1の少なくとも60％、75％、90％などのADS活性を有する。実施形態では、好気条件でADS活性を発現する菌株は、（例えば、嫌気性チャンバー内で）空気混和を伴わない標準的な増殖条件下での同一株の少なくとも約60％のADS活性を有する。実施形態では、好気条件でADS活性を発現する菌株は、空気混和を伴わない標準的な増殖条件下での同一株の少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約100％などのADS活性を有する。実施形態では、好気条件でADS活性を発現する菌株は、Streptococcus parasanguinis、Streptococcus intermedius、Streptococcus gordonii、Streptococcus australis、Streptococcus sanguinis、およびStreptococcus cristatusを含むがそれらに限定されない細菌種に由来する菌株より選択される。実施形態では、細菌株は、下記の菌株：すなわち、Streptococcus parasanguinis PTO10（受託番号GU561390.1）、Streptococcus intermedius C270（受託番号CP003858.1）、S. gordonii str. Challis sbustr. CH1（受託番号NR_074516.1）、Streptococcus australis Al-1（受託番号JX861483.1）、Streptococcus sanguinis JCM 5708（受託番号AB596946.1）、およびStreptococcus cristatus F0329（受託番号AY005047.1）に対して、少なくとも99％の配列類似性を有するアルギニン分解性株より選択される。好気条件下でDL1を上回るADS活性を発現する（例えば、ADS＞14.4ユニット）代表的な細菌株は、下記：すなわち、S. parasanguinis A1、S. intermedius A2、S. intermedius A3、S. intermedius A5、S. gordonii A8、S. australis A12、S. sanguinis A41、およびS. cristatus A55を含むがそれらに限定されない。
【００５４】
細菌株が虫歯に関連する少なくとも１つの細菌株の増殖を阻害する、および／または虫歯に関連する少なくとも１つの細菌株による増殖の阻害に抵抗する、本開示のプロバイオティック口腔用組成物の実施形態では、虫歯に関連する細菌株は、Streptococcus mutansの１つ以上の菌株であり得るが、それに限定されない。虫歯に関連する他の細菌株は、Streptococcus sobrinusの菌株、Lactobacillus属の様々な種、Scardovia属のある種およびActinomyces属のいくつかの種を含むが、それらに限定されない。
【００５５】
本開示の実施形態では、プロバイオティック組成物はまた、細菌株のADS活性を増加させる1つ以上の化合物をも含みうる。例えば、このような追加化合物は、環境がADS活性をより促進するように、口腔環境の特性を変化させ得る物質でありうる。実施形態では、細菌株のADS活性を増加させる1つ以上の化合物は、ガラクトース、アルギニン、アルギニン含有ペプチドおよびタンパク質（例えば、食品に由来するもの）または酸性化合物を含み得るが、それらに限定されない。本開示の実施形態では、プロバイオティック組成物はアルギニンを含む。これらの組成物は宿主に経口投与されることになっているため、その成分は製薬上および生物学的に許容可能（例えば、一般に安全、非毒性などと認められる）でなければならないことが理解される。
【００５６】
他の成分は、組成物の性能または他の特性（例えば、味、匂い、食感など）を改善するために、本開示の口腔用プロバイオティック組成物に含まれ得る。本開示の組成物の実施形態に含まれる細菌株は、分離株であり、単に自然環境から得られ、直接口腔用組成物に加えられたサンプルではないことが理解される。
【００５７】
口腔用のアルギニン分解性細菌株を選択する方法
本開示はまた、アルギニン分解性細菌株を同定、選択し、宿主での口腔用のアルギニン分解性細菌株の混合物を製造する方法をも提供する。実施形態では、その方法は、口腔サンプル（例えば、虫歯のない宿主のような宿主から採取されたサンプル）から分離された複数の細菌株を得ることを含む。複数の細菌株から、アッセイを行うことによって、アルギニンデイミナーゼシステム（ADS）を介してアンモニアを生成することができるアルギニン分解性細菌株を同定し、分離する。このような方法の実施形態は、下記の実施例に記載される。ADS陽性株の分離および選択後、1つ以上の更なるアッセイが行われることによって、通常は宿主でのアルギニン生成を促進しない環境条件、および／または虫歯を助長する環境条件においてADS活性を発現できるアルギニン分解性細菌株を同定することができる。実施形態では、このような条件下でADS活性を発現する細菌分離株の同定および選択のために、このような環境条件を模倣するようなアッセイが用いられる。実施形態では、環境アッセイ条件は、環境アルギニンの欠如、グルコースの存在、非酸性pH、好気条件、および虫歯に関連する少なくとも１つの細菌株の存在を含むが、それらに限定されない。実施形態では、虫歯に関連する細菌株はS. mutansである。実施形態では、このような条件に対する１つ以上のアッセイは、先行ステップで同定されたADS陽性細菌の菌株に対して個別に行われる。その方法は更に、環境条件アッセイステップにおいて同定された少なくとも２つの異なる分離アルギニン分解性細菌株を選択すること、および選択された菌株を用いて、少なくとも２つの選択された環境条件においてADS活性を発現するアルギニン分解性細菌の混合物を調製することを含む。
【００５８】
菌株のADS活性および様々な条件下でADS活性を発現する菌株の能力は、上記のように（例えば、標準的な増殖条件下での同一株のADS活性の特定の％に対して、および／または選択された菌株と同一の環境条件下での実験室株S. gordonii DL1のADS活性に対して）決定される。
【００５９】
一旦菌株が選択されると、異なる環境条件下でADS活性を有する菌株の様々な混合物が調製され得る。このような混合物はその後、上述の本開示のプロバイオティック口腔用組成物を調製するために使用され得る。混合物は、細菌株のADS活性を増加させることができる１つ以上の化合物（例えば、アルギニン、ガラクトース、酸性化合物など）と組み合わされ得る。
【００６０】
使用方法
上述の組成物は、宿主の口腔環境に影響を及ぼす多数の方法に使用され得る。実施形態では、組成物は、宿主の口腔内のアンモニア生成細菌の量を増加させるため、宿主の口腔内でのアンモニア生成を増加させるため、および／または小児と成人との両方を含む患者において虫歯を治療するために使用され得る。
【００６１】
例えば、実施形態では、本開示の組成物は、宿主の口腔内のアンモニア生成アルギニン分解性細菌の量を増加させるために、宿主に投与され得る。実施形態では、組成物は、宿主の口腔環境がADS活性を最も促進しそうにない時間に、ADS活性の潜在能力を増加させ、虫歯を助長する環境を生み出す可能性を低下させるために投与されうる。例えば、組成物は、食後（例えば、糖質の多い食事）、または寝る前に投与されうる。実施形態では、プロバイオティック口腔用組成物の投与は、アンモニア生成細菌の量を、組成物の投与前に宿主の口腔内に存在するより多くの量に増加させる。アンモニア生成細菌の量の増加は、短期間（例えば、数時間）しか持続されなくてもよく、またはより長期間（例えば、数時間から数日）持続してもよい。時間の長さは、組成物の剤型（例えば、口内洗浄液または口腔噴霧剤、あるいは口腔／歯表面に塗布される唾液耐性ゲルもしくはペーストまたは長期持続性のチューインガムもしくはロゼンジ）に左右されうる。より高いレベルのADS産生細菌が比較的短時間持続したとしても、適切な時期であれば、これは、虫歯の進行を妨げるようなより健康的な口腔環境を提供する観点から、宿主に利益をもたらすのに十分なはずである。
【００６２】
実施形態では、宿主の口腔内のアンモニア生成細菌の量を増加させる方法はまた、プロバイオティック口腔用組成物の投与前のアンモニア生成量に対して、宿主の口腔内でのアンモニア生成をも増加させる。
【００６３】
他の実施形態では、組成物は、虫歯の素因を有する患者（虫歯歴のある患者、もしくは虫歯の活動性症状を有する患者）において、虫歯の治療を補助するか、または虫歯を予防するために患者に投与され得る。実施形態では、組成物は、虫歯病変の進行を遅延または停止させるために、活動性の虫歯を有する宿主に投与され得る。
【００６４】
本開示の組成物は、歯科治療従事者によって決められた投与計画に従って、患者に投与され得る。本開示の実施形態では、組成物は、単回投与で投与されてもよく、または定期的な反復投与計画で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、予防のために用いられる場合など、定期的な歯科検診の際に投与されうる。更に他の実施形態では、組成物は、毎日、週１回など一定期間の定期的な投与のため、または数週間、数か月など一定期間の他のいくつかの定期的な投与のための自己投与口腔用製剤の剤型で患者に提供されうる。いくつかの実施形態では、このような投与計画は、活動性の虫歯、虫歯歴を有するか、または虫歯発症の危険性があると考えられる患者に対して実施されうる。本開示の組成物の量、時期、投与は、それぞれの患者に対して、彼らの歯科衛生従事者によって、または歯科衛生協会またはガイドラインの推奨によって決定され得る。
【００６５】
本開示の試験および方法に関する更なる詳細は、下記の実施例において提供される。下記の具体的な実施例は、単に説明として解釈されるべきであり、どのような形であっても、開示の残りの部分の限定として解釈されるべきではない。更に詳細に説明されることなく、当業者は、本明細書の記載に基づいて、本開示を最大限に利用することができると考えられる。本明細書に引用されるすべての文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【００６６】
本開示の実施形態、詳細には、任意の「好ましい」実施形態は、単に実施の可能性のある例であり、単に本開示の原理の明確な理解のために記載されることが、強調されるべきである。多くの変形および変更が、本開示の趣旨および原理から実質的に逸脱することなく、上述の本開示の実施形態に対して行われうる。すべてのこのような変更および変形は、本明細書において本開示の範囲内に含まれ、下記の実施形態によって保護されることが意図される。
【００６７】
下記の実施例は、当業者に、本明細書に開示される方法ならびに組成物および化合物の使用を実施する方法の完全な開示ならびに記載を提供するために示される。数字（例えば、量、温度など）に関して正確さを保証するための努力が払われているが、いくらかの誤差および偏差が含まれるであろう。他に指示されない限り、部分は重量部であり、温度は℃であり、圧力は大気圧またはその付近である。標準温度および標準圧力は20℃および1気圧と定義される。
【００６８】
比率、濃度、量、および他の数値データは、本明細書において範囲の形式で表されうることに注意すべきである。このような範囲の形式は、利便性および簡便性のために使用され、従って、範囲の境界値として明確に挙げられた数値を含むだけでなく、あたかもそれぞれの数値および部分範囲が明確に列挙されているかのように、その範囲内に包含されるすべての個々の数値または部分範囲をも含むように、柔軟に解釈されるべきであることが理解される。説明すると、「約0.1％〜約5％」の濃度範囲は、明確に挙げられた約0.1 wt％から約5 wt％の濃度を含むだけでなく、示された範囲内の個々の濃度（例えば、1％、2％、3％、および4％）ならびに部分範囲（例えば、0.5％、1.1％、2.2％、3.3％、および4.4％）をも含むと解釈されるべきである。実施形態では、「約」という用語は、数値の有効数字に従った従来の数値丸め（端数処理）（rounding）を含み得る。
【実施例】
【００６９】
現在、本開示の実施形態を記載しているが、通常、下記の実施例は、本開示のいくつかの更なる実施形態を記載する。本開示の実施形態は、下記の実施例ならびに対応する文章および図面に関連して記載されるが、本開示の実施形態をこの記述に限定する意図はない。逆に、その意図は、本開示の実施形態の趣旨および範囲内に含まれるすべての代替手段、変更、ならびに同等物を網羅することである。
【００７０】
[実施例１]
ヒト口腔バイオフィルムのアルギニン分解性マイクロフローラの解析
序論
本実施例は、虫歯のない被験体および虫歯のある被験体に由来するアルギニン分解性細菌種の分離および解析を記載する。一般的に口腔衛生に関連する口腔細菌の選択された群は、アルギニンデイミナーゼシステム（ADS）によってアンモニアの形でアルカリを生成することができ、ヒト口腔バイオフィルムのpHに大きな影響を与える。虫歯リスクの増加は、口腔バイオフィルム中の細菌のADS活性の低下と関連している。本実施例では、個体間のプラークADS活性の違いに関する基礎を研究するために、虫歯のない（CF）成人および虫歯のある（CA）成人の歯垢サンプルに由来するアルギニン分解性細菌株を分離し、解析した。50株のADS陽性細菌株が16S rRNA遺伝子の配列決定によって同定され、それらのADS活性レベルを標準的な増殖条件下で比較した。細菌のAD活性の範囲は、45.2〜688.0ユニット（mgタンパク質）-1に及んだ。Streptococcus sanguinisは、最もよく見られる種／系統型であった。27株のADS陽性株を用いてADS遺伝子発現を誘導または抑制する条件下で行われた生化学的アッセイは、pH、酸素、および糖質またはアルギニンの利用性に応答したアルギニン分解活性のばらつきを示した。本研究は、臨床分離株の間で観察される広範なアルギニン分解性発現の基礎が、少なくとも一部では、種内および種間でのADSの発現調節における違いに起因することを示す。結果は、口腔バイオフィルムのADS能力における被験体間の違いに関する微生物学的基礎に知見をもたらし、生態学的に引き起こされる疾患としての虫歯への我々の理解を向上させ、その中で、アルギニン代謝は歯垢のpHを緩和し、口腔衛生を促進し、プロバイオティック組成物および使用のために細菌を同定する方法を提供する。
【００７１】
材料および方法
細菌株の分離
現在もしくは過去の虫歯経験の臨床的なまたは報告された形跡のない11人の虫歯のない（CF）被験体[虫歯、喪失歯および充填歯（DMFT）＝0]ならびに少なくとも4つの活動性、う窩性（象牙質レベル）および修復されていない虫歯病変を有する3人の虫歯のある（CA）被験体（DT≧4、MFT≧0）から、Nascimentoら、（2009a）およびSchulteら、（2009）に記載されるように、歯肉縁上歯垢を回収した。虫歯病変の活動性は、臨床的所見、歯垢の滞留、および触感によって決定された。様々な培養可能なマイクロフローラを得るために、歯垢サンプルを、合間に氷冷しながら15秒間2サイクルの外部超音波処理（W375, Sonicator Heat Systems-Ultrasonics Inc, Farmingdale, NY, USA）によって分散させた。その後、サンプルを、10 mMリン酸ナトリウムバッファー（pH 7.0）に段階希釈し、100μlの10-4〜10-7希釈サンプルを、ヒツジ血液寒天プレート（5％の抗凝固処理ヒツジ血液を含有するコロンビア寒天、Difco Laboratories, Detroit, MI, USA）上およびブレインハートインフュージョン（BHI）寒天プレート（Difco Laboratories, Detroit, MI, USA）上で培養した。プレートを37℃の嫌気ジャー内（BBL GasPakTM Systems, BD, Sparks, MD, USA）で3日間培養し、その後、37℃、5％ CO2で2日間好気培養した。培養期間後、すべての形態型を示す臨床分離株のコロニーを、純粋なコロニーが得られるまで、同一培地上で継代培養した。
【００７２】
ADS陽性株のスクリーニング
細菌株を、アルギニンからアンモニアを遊離させる能力についてマイクロタイターによるアッセイ（Schulteら、2009）でスクリーニングした。簡潔には、菌株を、0.2％ガラクトースおよび10 mMアルギニンを含有するトリプトン-ビタミン（TV）基礎培地が入った透明なポリスチレンマイクロタイタープレート（Fisher Scientific Inc., USA）中で培養した。プレートを、嫌気条件下（85％ N2、5％ CO2、10％ H2、80％相対湿度）、37℃で48時間培養した。冷蔵マイクロ遠心分離機でプレートを3分間10,000×gで遠心分離することによって、細菌細胞を回収し、10 mM Tris-マレイン酸（pH 7.0）で1回洗浄し、100μlの50 mM Tris-マレイン酸バッファー（pH 6.0）に再懸濁した。ネスラー試薬（Sigma-Aldrich Inc., USA）を用いて、50 mM アルギニン-HClの存在下、2時間37℃での細菌の培養から生成されるアンモニアを検出することによって、ADS陽性表現型を同定した（図１）。それぞれの反応には常に、バックグラウンドおよび干渉の対照が含まれた。ADS陽性株のライブラリーを、更なる分析のために-80℃で保存した。このライブラリーから、様々なCFおよびCA被験体の歯垢由来の56株のADS陽性株を無作為に選択して、16S rRNA遺伝子配列決定によって同定し、本研究において解析した。
【００７３】
PCRによる16S rRNA遺伝子の増幅および配列決定
QIAamp DNA mini kit（Qiagen Inc., CA, USA）を用い、供給業者の説明書に従って、ADS陽性細菌からのゲノムDNAを分離した。16S rRNA遺伝子を、標準化された条件下でユニバーサルプライマーセット（フォワード：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’（配列番号１）、リバース：5’- TAC GGG TAC CTT GTT ACG ACT-3（配列番号２））を用いて増幅した。精製された16S rRNAインサートのPCR産物を、ABI PCR条件を用いて配列決定し、データをAasら、（2005）；Pasterら、（2001）に記載されたように解析した。PCR配列を、Human Oral Microbiome Database (HOMD)、Ribosomal Database Project、およびGenBankデータベースに寄託されている16S rRNA配列と比較した。本研究で得られた完全な16S rRNA遺伝子配列は、EMBL、GenBank、およびDDBJヌクレオチド配列データベースからの電子データ検索で利用可能である。
【００７４】
ADS活性、増殖条件および試薬
ADS陽性として以前に報告されていない新規の系統型および既知の細菌種が、実際にアルギニンを代謝できることを確実にするために、Liuら、（2008）によって確認された方法を用いてアルギニンからのシトルリン生成を測定することによって、細菌分離株のADS活性を測定した。細菌分離株をBHI寒天の新鮮な培養物上で維持し、ADS活性測定のための生化学的アッセイの前に、37℃で24時間、トリプトン・酵母（TY）エキスブロス上に植菌した。56株の選択され同定されたADS陽性株のADS活性を、下記の標準的な増殖条件下：すなわち、25 mMガラクトースおよび10 mMアルギニンを含有するTY培地、5％ CO2、37℃、24時間で測定した（Liuら、（2008））。Pierce BCA protein assay kit（Waltham, MA, USA）を用い、標準としてウシ血清アルブミンを用いて、タンパク質の濃度を測定した。細菌分離株のADS活性レベルは、タンパク質含量に対して標準化され、生成されたシトルリンのnmol [分×(mgタンパク質)] -1と定義された。
【００７５】
ADSを誘導または抑制することが知られている環境条件に応じたAD発現を測定するために、異なる細菌種の27株の代表をTY基礎培地中で培養した。異なる糖に応答したADS活性を比較するアッセイにおいては、基礎培地はまた、10 mMアルギニンおよび25 mMガラクトースまたは25 mMグルコースのいずれかを含有した（図２Ａおよび３Ａ）。pH比較アッセイにおいては（図２Ｂおよび３Ｂ）、基礎培地はまた、25 mMガラクトースおよび10 mMアルギニンを含有し、HClによってpH 5.7に酸性化されたか、または50 mM K2HPO4-KH2PO4バッファー（TY/50mM KPB）によってpH 7.0に緩衝化された。アルギニンの有無を比較するアッセイにおいては（図２Ｃおよび３Ｃ）、基礎培地はまた、10 mMアルギニンを含み、または含まずに、25 mMガラクトースを含有した。酸素比較アッセイにおいては（図２Ｄおよび３Ｄ）、基礎培地はまた、好気条件下または嫌気条件下で培養される培養物とともに25 mMガラクトースおよび10 mMアルギニンを含有した。好気培養においては、細胞を、ガラクトースおよびアルギニンを追加した40 mlのTY培地を含む250-mlの三角フラスコに植菌し、ロータリーシェーカー（50 rpm）上、37℃で培養した（LiuおよびBurne, 2011）。嫌気培養においては、培養物を、嫌気性チャンバー（85％ N2、5％ CO2、10％ H2、80％相対湿度）内、37℃で24時間培養した。すべての細胞を、ADS活性の検出のために、OD600＝0.5〜0.6で回収した。
【００７６】
統計解析
記述的解析のために、適切な場合、割合および平均値の分布を計算した。連続変数の差を検定するためには、スチューデントのt検定またはANOVAを用い、カテゴリー変数については、カイ二乗検定を用いた。全培養可能微生物に対するADS陽性細菌株の割合と被験体の虫歯状態との間の相関は、２つの割合のZ検定を用いて解析された。有意性のレベルは、p＜0.05で決定された。
【００７７】
結果
口腔バイオフィルムのアルギニン分解性細菌株
14人の参加被験体の歯垢サンプルから、合計2328株の細菌株が分離され（11人のCFおよび3人のCA；被験体あたり166.3分離株の比率）、ADS活性の検出によってアルギニン分解能についてスクリーニングされた。これらの2328株のうち、288株はADS陽性であり、被験体あたり20.5株、CF被験体あたり15.8株（この虫歯群内で最少5 ADS+、最大51 ADS+株）、CA被験体あたり38株（この虫歯群内で最少6 ADS+、最大84 ADS+株）の比率を示した。被験体内および虫歯群内で同定されたADS陽性分離株の数の間にかなりのばらつきがあったが、被験体全体にわたって、公平な偏りのない試験された菌株の分布があった。全培養可能フローラに占めるADS陽性株の割合と被験体の虫歯状態との間には、有意な相関はなかった。
【００７８】
表１は、歯肉縁上の歯垢から分離され、16S rRNA遺伝子配列決定によって同定されたアルギニン分解性種の多様性を示す。同定された56株のADS陽性株はすべて、それらが割り当てられた細菌分類群と99％より高い配列類似性を有していた。Firmicutes門に由来する合計６つの異なる細菌分類群は、下記のように検出された。すなわち、S. sanguinis（38％）、S. gordonii（9％）、S. intermedius（9％）、S. cristatus（9％）、S. australis （9％）、およびS. parasanguinus（2％）であった。
【００７９】
【表１】
2016509025.tif 000002
2016509025.tif 000003
【００８０】
細菌細胞を標準的な増殖条件下で培養した場合、細菌のAD活性の範囲は、45.2〜688.0ユニット（mgタンパク質）-1に及んだ。虫歯群間で細菌ADS活性の平均値の間に統計的差異はなかった。
【００８１】
環境刺激に応じたADS発現
高発現株（high expressers）におけるADS活性の調節を調べるために、口腔細菌においてADS遺伝子の発現に影響を及ぼすことが知られている、低pH、酸素、アルギニンおよび糖質の利用性などの増殖条件下で、AD酵素活性を測定した。図２および３に示されるように、pH、酸素、ならびにアルギニンおよび糖質の利用性に応答して、ADS発現パターンにおけるかなりの変動が観察された。図２Ｃは、実験室株S. gordonii DL1を含むほとんどの菌株において、ADSの最適な発現は、アルギニンの存在に大きく左右されたことを示す。しかし、S. parasanguinis A1、S. intermedius A2、S. intermedius A3、S. gordonii A8、S. australis A12、およびS. australis A13などの菌株は、アルギニンの非存在下においても、S. gordonii DL1と比較して、より高いADS発現を示した。また注目すべきことに、アルギニンの利用性は、より低いADS活性レベルを示す菌株（S. sanguinis A14、S. sanguinis A16、およびS. sanguinis A20を含む）のADS発現に明確な作用を示さなかった。
【００８２】
低pH環境は、S. gordonii DL1においてADS活性を高めることが知られているが、S. parasanguinis A1、S. intermedius A2、S. intermedius A3、S. gordonii A8、およびS. australis A12は、細胞を中性pHで培養した場合でも高レベルのADS活性を発現することができ（図２Ｂ）、pH 5.7ではより低い倍率の誘導レベルが観察された。
【００８３】
S. gordonii DL1のADS活性はまた、CCRに対して非常に感受性が高く（Dongら、2004）、グルコース中での増殖は、グルコースよりCCRを誘導する効果の弱いガラクトース中で培養した細胞と比較して、ADS活性の５分の１への低下を引き起こす（Dongら、2004）。同様に、グルコースは、ガラクトース中での増殖と比較した時、多くのADS陽性株において８〜１０分の１までADS活性を低下させることができた（図２Ａ）。しかし、グルコースによるADS活性の目立った抑制は、S. parasanguinis A1、S. intermedius A2、S. intermedius A3、S. intermedius A5、S. gordonii A7、S. gordonii A8、S. gordonii A9、S. gordonii A10、S. gordonii A11、S. australis A12、およびS. australis A13では検出されなかった。
【００８４】
図２Ｄは、S. gordonii DL1のADS発現が、好気条件下での増殖によって高度に抑制され、同様の酸素による抑制が他の臨床株において観察されたことを示す。しかし、S. parasanguinis A1、S. intermedius A2、S. intermedius A3、S. intermedius A5、S. gordonii A8、S. australis A12、S. sanguinis A41、およびS. cristatus A55などのいくつかの菌株のADS活性レベルは、好気条件での増殖の抑制作用に対して非感受性であった。
【００８５】
ADS発現と虫歯状態
表１に示されたように、CF被験体およびCA被験体の歯垢から分離された同一種の菌株の間で、異なるレベルのADS活性が観察された。例えば、CF被験体由来のS. sanguinis A24株[45.2ユニット（mgタンパク質）‐1]およびCA被験体由来のA48株[221.3ユニット（mgタンパク質）‐1]は、標準的な増殖条件下で著しく異なるADS発現を示した。口腔細菌のアルギニン分解能が被験体の虫歯状態と関連しているかどうかを更に検討するために、異なる環境条件に応答したADS発現を、異なる虫歯群から分離された同一種の臨床株について比較した（図３）。選択された菌株は、S. gordonii Challis substr. CH1（A7およびA8）、S. gordonii ATCC 10558（A10およびA11）、S. sanguinis JCM 5708（A37、A41、A48およびA50）と最も高い16S rRNA配列類似性を有する菌株を含んだ。
【００８６】
S. gordoniiおよびS. sanguinisの菌株は、グルコースによって同様のADS発現の抑制を示した（図３Ａ）。ADS発現ならびに酸性pHによる誘導についての同様のパターンはまた、両方の虫歯群由来のS. gordoniiおよびS. sanguinisの菌株の間で観察された（図３Ｂ）。図３Ｃは、同一種のほとんどの菌株が、被験体の虫歯状態とは無関係に、アルギニンに応答したADS発現の同程度の差を示した。例えば、CA被験体由来のS. gordonii A7とCF被験体由来のS. gordonii A8はともに、アルギニンの非存在下での増殖と比較して、アルギニン存在下で2倍高いADS活性を示した。ほとんどの菌株は、CF被験体のS. sanguinis A41を除いて、酸素によるADSの抑制を示した（図３Ｄ）。
【００８７】
考察
口腔バイオフィルムにおけるアルギニン代謝は、歯への酸負荷の短期的な緩和、および歯垢中の望ましい細菌の持続に対する長期的な効果の観点から、新規の虫歯予防法の開発に有利な条件を提供する。アルギニン分解は、虫歯リスクを評価し虫歯を抑制する方法の開発に使用されうるため、健康および疾患における口腔バイオフィルム中のADSの分布、調節ならびに機能に関する知見が必要とされた。ゲノム配列決定および他の分子技術は、齲蝕原性マイクロフローラおよび個々の細菌種の性質における新たなレベルの複雑さを明らかにしたが（Aasら、2008; Corbyら、2005; Crielaardら、2011; Magerら、2003; Russell, 2008）、限られた試み（Sissonsら、1988a; Sissonsら、1988b; Sissonsら、1994）が行われ、アルカリを生成することができ、口腔バイオフィルムの齲蝕原性に潜在的に影響を及ぼし得る臨床的に意義のある口腔微生物が同定、解析されている。本実施例では、歯垢サンプルから分離された培養可能なアルギニン分解性細菌のスクリーニングのために、迅速かつ簡便な方法を開発した。同定されたADS陽性細菌種の大部分は、S. sanguinisおよびS. gordoniiの菌株であったが、本発明者らは、Actinomyces、Bacillus、およびNeisseriaの種などの、総口腔アルギニン分解に寄与する更なる培養可能な分類群を明らかにすることができた。本明細書で同定された共生streptococcusのヒト口腔バイオフィルムにおける豊富さを示す以前の微生物学的研究と併せて（Aasら、2008; Aasら、2005; Corbyら、2005; Crielaardら、2011; Dewhirstら、2010; Grossら、2010; Magerら、2003）、これらの実施例での結果は、これらの豊富なstreptococcusが、ヒト口腔バイオフィルムのアルギニン分解能に支配的な影響を与える可能性があることを示した。重要なことには、本研究は、臨床株のADSが、歯肉縁上のバイオフィルムの組成および生化学的活性に最大の影響を与えるそれらの特定の環境要因；例えば、糖質の利用性および糖質源、低pHおよび酸素に応答して、実際に調節されることを明示したが、それらはまた虫歯の発生に影響を及ぼし得る環境要因でもある。
【００８８】
健康および疾患に関連する口腔微生物叢の多様性は、ハイスループット手法によって説明され始めたばかりである（Aasら、2008; Corbyら、2005; Crielaardら、2011; Grossら、2010; Magerら、2003）。この種または分類群レベルの同定は非常に有益であるが（Dewhirstら、2010）、それは、口腔細菌の特定の種内に著しい不均一性があるという事実に対応しない。現在の配列決定の取り組みに基づき、ADS陽性口腔細菌種の大多数は培養可能であり、大部分は豊富な口腔streptococcusを含む。難培養性微生物もまた、口腔バイオフィルムにおいて測定される総アルギニン分解活性に寄与しうる。しかし、この理論は、上記の結果に支持されず、そこでは、歯垢サンプルを培養するために本実施例において用いられた条件下での増殖が見込めない、すなわち、通常難培養性と認識される微生物、例えば特定のスピロヘータと、アルカリ生成能力との関連はなかった。従って、総ADSに対する難培養性微生物の何らかの寄与は、恐らく無視できる程度である。難培養性細菌種は、培養可能な種と比較してはるかに低い量で歯垢中に存在するだけでなく（Aasら、2008; Corbyら、2005; Crielaardら、2011; Grossら、2010; Magerら、2003）、多くの、またはほどんどの難培養性細菌は、ADS遺伝子を持っていないように思われる。本研究は、口腔バイオフィルムのpHを調節し、ひいては齲蝕誘発性を調節するそれらの能力との関連において、口腔内でより豊富な種の表現型の不均一性を明らかにすることによって、進行中の口腔マイクロバイオーム（microbiome）の取り組みを推進する。本研究はまた、口腔微生物叢の病原性を評価し、理解する既存の手法を進歩させるであろう知識、菌株、プローブおよび試薬を生じると同時に、アルカリ生成における不均一性の分子基盤に関する新たな概念をも提供する。
【００８９】
アルカリの生成について知られていることは、口腔バイオフィルムでの糖代謝について知られているよりもごくわずかである。細菌の糖代謝と歯垢細菌の混合群による酸産生との間の因果関係は、Stephanによって1940年に最初に説明された（Stephan, 1940）。Stephanはまた、糖負荷後に検出される歯垢pHの低下の後に、歯垢pHが徐々に上昇し、最終的にプラトーに達することをも指摘した。後に、虫歯のある歯垢でのプラトーまたは静止pHは、虫歯のない歯垢でのプラトーより酸性であることが見出され（Margolisら、1988a）、更に、酸産生と虫歯との間の相関を支持している。その後の研究によって、歯垢pHの上昇は、唾液および歯垢中に存在する酸感受性微生物のサブセットによるアルギニンまたは尿素からのアンモニア産生が主因であることが示された（WijeyeweeraおよびKleinberg, 1989b）。Marquisは、口腔バイオフィルムでのアンモニア生成由来の緩衝能力が、pHの低下速度を抑え、塩基生成細菌が生存のためにそれらの生理機能を適応させる時間を与えることを示唆した（Marquis, 1995）。Kleinbergは、糖質の欠乏した歯垢が、主により多くの唾液流量の領域において、歯垢を浸している唾液よりアルカリ性であることを示し（KleinbergおよびJenkins, 1964）、従って、歯垢細菌は、拡散力が歯垢からそれらを除去できるより迅速に、唾液の基質からアンモニアを生成することが示唆された（KleinbergおよびJenkins, 1964）。Kleinbergはまた、歯垢pHが歯垢微生物の酸塩基代謝によって決定されるであろうことも示し、それが歯垢の厚さ、歯垢中の酸生成微生物と塩基生成微生物との割合、ならびに窒素および糖質基質の相対的な利用性によって影響され得ることを示した（Kleinberg, 1970）。
【００９０】
今日までの臨床研究は、齲蝕感受性が、従来想定されてきたように、単に酸産生だけでなく、アルカリ産生の欠如と関係することを支持する（Nascimentoら、2009b; Nascimentoら、2012; Shuら、2007b）。本実施例では、本発明者らは、口腔細菌株の不均一性、生来のADS遺伝子発現レベルの違い、および／または環境要因による誘導もしくは抑制に対するADS遺伝子の感受性の違いが、健康な歯において、また齲蝕活動性が明らかな場合に、検出されるアルカリ生成での高度なばらつき説明し得るかどうかを調べた。虫歯のない被験体由来のADS陽性株は、虫歯のある被験体から分離されたものよりわずかに高いレベルのADS活性を示したが、細菌のADS活性レベルと宿主の虫歯状態との間に有意な相関はなかった。しかし、アルギニン分解性歯垢細菌の収集物を調べた、またはより具体的には、近縁であるが生理的に異なる共生streptococcusのADS活性を調べた本研究は、多数の環境刺激に対して、著しい、驚くべきADS応答の範囲を示した。多くの変数が微生物の挙動に影響を与え得る口腔バイオフィルムの複雑な環境において、臨床株のアルギニン分解性発現は、増殖条件に左右されうる。従って、虫歯のない被験体と虫歯のある被験体との間で観察されるアルギニン分解の違いの基礎は、要因の組合せ：すなわち、（i）環境要因によるADS調節の先天的な違いを有する菌株の口腔バイオフィルム内での保菌、ならびに／または（ii）in vivoでのADS発現に影響を与える宿主およびバイオフィルムの微小環境要因と関連し得る可能性がある。例えば、虫歯のある被験体のバイオフィルムは、高いADS発現をもたらさない、またはADS活性を低下させるいくつかの抑制因子をもたらすと思われる。従って、生来ADS高発現の表現型を有するアルギニン分解性臨床株、ならびにADS発現が、虫歯の原因として知られている条件、例えば糖利用性および酸性環境に非感受性である菌株は、虫歯を予防し、抑制するためのプロバイオティック療法に有用である。
【００９１】
本研究は、被験体内での口腔アルギニン分解の変動についての微生物的基礎が、これまでの認識よりも複雑であり、口腔バイオフィルムのアルギニン分解能が特定の細菌株の保菌と関連しうるだけでなく、またアルギニン分解種が環境要因に応じて幅広いADS活性を呈することも示す。その結果は、ADS高発現株が歯垢のpHを抑え、虫歯リスクを低下させることにより相乗的に歯垢生態系に良い影響を及ぼしうることを支持することによって、生態学的に引き起こされる疾患としての虫歯の理解において非常に重要である。本研究は、口腔アルカリ生成細菌の多様性ならびにそれらの口腔衛生および疾患における役割に関する知識を拡大した。
【００９２】
[実施例２]
ADS活性および種間拮抗作用
序論
本実施例は、アルギニン分解性分離株のStreptococcus mutansに対する拮抗的相互作用がアルギニン分解能と相関し得るかどうかの決定を記載する。
【００９３】
材料および方法
臨床的分離およびスクリーニング
サンプルは、上記の実施例１に記載されたように得られ培養された。
【００９４】
細菌株、増殖条件および試薬
細菌株は、上記の実施例１に記載されたように維持された。
【００９５】
16S rDNA配列決定および生化学的アッセイ
配列決定およびアッセイは、上記の実施例１に記載された通りであった。
【００９６】
種間拮抗作用
アルギニン分解性分離株の齲蝕原性細菌Streptococcus mutansに対する拮抗的相互作用を調べるために、S. mutansおよびADS陽性分離株のBHIブロス培地中での一晩培養物を同一の光学密度（OD600＝0.5）に調整した。その後、S. mutansおよびADS陽性分離株の6μlアリコートを、TY-25mMガラクトース寒天プレート上に互いに隣接して下記のように植菌した。すなわち、（i）最初にADS陽性分離株を植菌し、続いて２４時間後にS. mutansを植菌した。（ii）最初にS. mutansを植菌し、続いて２４時間後にADS陽性分離株を植菌した。また（iii）ADS陽性分離株とS. mutansを同時に植菌した。プレートを更に24時間培養し、その間、相互作用を観察した。細菌は、5％ CO2および95％空気とともに37℃で培養された。AlphaEaseFCソフトウェアを用いて、増殖阻害領域を測定した。
【００９７】
結果
種間拮抗作用
ADS活性の種間拮抗作用との相関を研究するために、プレート阻害アッセイを用いて、S. mutans UA159の拮抗作用、およびS. mutans UA159による様々なADS活性分離株への拮抗作用を調べた（表２）。高ADS活性分離株は、S. mutansの存在下で生き残る能力を示した。重要なことに、S. gordonii、S. australisおよびS. sanguinisの分離株は、S. mutans UA159の増殖を阻害する強い能力を示した（表２および図４Ａ〜４Ｄ）。また注目すべきことに、多くのADS陽性分離株の増殖は、S. mutansによって阻害されなかった（図４Ａ〜４Ｄ）。従って、口腔バイオフィルムのアルギニン分解能は特定の細菌株の保菌と関連しうるだけでなく、またアルギニン分解種は、幅広いS. mutansを阻害する能力、およびS. mutansによって阻害される能力を示す。
【００９８】
【表２】
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【００９９】
結論
本研究は、口腔バイオフィルムには多様なアルギニン分解性群落が定着しており、被験体間のADS発現のばらつきの基礎は、主にADSの調節における菌株内の変動に起因する可能性が高いことを明らかにした。総合的に、結果は、高レベルのADSを発現している菌株が、歯垢pHを抑え、既知の虫歯病原体の増殖に直接拮抗することによって、歯垢生態系に対してプラスの相乗効果を有し得ることを支持する。
【０１００】
（参考文献）
下記の参考文献は、関連する部分において参照されることにより、本明細書に組み込まれる。
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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