(57)【要約】  本発明は、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを含む組成物、および宿主生物内に該ポリヌクレオチドを導入して、現存する遺伝的または生化学的機構または経路を破壊するかまたは改変する望ましい表現型変化を同定し、したがって形質転換細胞の新規特性を生成するための方法を提供する。生物集団内で多様性を増加させるための組成物を用いるための方法もまた提示する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ランダムに融合したポリヌクレオチドのコレクションであって、ランダムに融合したポリヌクレオチドの各々はユニークなコード領域を含み、ここでユニークなコード領域はインフレームでともに融合した少なくとも２つの非相同ポリヌクレオチドコード領域を含む、前記コレクション。
【請求項２】
（ａ）生物から、部分的または完全コード領域を含む相同および非相同ポリヌクレオチド配列を単離し；
（ｂ）工程（ａ）の単離ポリヌクレオチド配列を場合によって増幅し；そして
（ｃ）工程（ａ）または（ｂ）の増幅ポリヌクレオチド配列を、互いに機能可能であるようにランダムに連結して、ユニークなコード領域を含むランダムに融合されたポリヌクレオチドを生成する、ここでユニークなコード領域は、少なくとも２つの非相同コード領域のインフレーム連結によって形成される；
工程を含む方法にしたがって得られる、請求項１のコレクション。
【請求項３】
ユニークなコード領域が２つの非相同コード領域を含む、請求項１または２記載のコレクション。
【請求項４】
ユニークなコード領域が完全非相同コード領域を含む、請求項１〜３のいずれか一項記載のコレクション。
【請求項５】
リンカー配列が、少なくとも２つの非相同コード領域を機能可能であるように連結する、請求項１〜４のいずれか一項記載のコレクション。
【請求項６】
リンカー配列が長さ３〜３，０００ヌクレオチドである、請求項１〜５のいずれか一項記載のコレクション。
【請求項７】
単離相同および非相同ポリヌクレオチドが、長さ９０〜２，５０２ヌクレオチドのコード領域を含む、請求項１〜６のいずれか一項記載のコレクション。
【請求項８】
ランダム融合ポリヌクレオチドが、発現ベクターに対する同一性を有する配列をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項記載のコレクション。
【請求項９】
少なくとも１つの制御配列をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項記載のランダム融合ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
制御配列がプロモーターである、請求項１〜９のいずれか一項記載のランダム融合ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
制御配列がターミネーターである、請求項１〜１０のいずれか一項記載のランダム融合ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
生物が酵母である、請求項１〜１１のいずれか一項記載のランダム融合ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項記載のランダム融合ポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか一項記載のランダム融合ポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１４の宿主細胞から再生される生物。
【請求項１６】
新規表現型を同定するための、請求項１〜１５のいずれか一項記載のランダム融合ポリヌクレオチドの使用。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか一項記載のランダム融合ポリヌクレオチドを産生する方法であって：
（ａ）生物から、部分的または完全コード領域を含む相同および非相同ポリヌクレオチド配列を単離し；
（ｂ）工程（ａ）の単離ポリヌクレオチド配列を場合によって増幅し；そして
（ｃ）工程（ａ）または（ｂ）の増幅ポリヌクレオチド配列を、互いに機能可能であるようにランダムに連結して、ユニークなコード領域を含むランダムに融合されたポリヌクレオチドを生成する、ここでユニークなコード領域は、少なくとも２つの非相同コード領域のインフレーム連結によって形成される；
工程を含む、前記方法。
【請求項１８】
（ｉ）工程（ａ）の単離非相同ポリヌクレオチド配列および（ｉｉ）発現ベクターに対する同一性を有する５’プライマーで増幅を行う、請求項７６の方法。
【請求項１９】
（ｉ）工程（ａ）の単離非相同ポリヌクレオチド配列および（ｉｉ）発現ベクターに対する同一性を有する３’プライマーで増幅を行う、請求項１７または１８の方法。
【請求項２０】
新規表現型を産生する方法であって：
（ａ）請求項１３記載のベクターを宿主細胞内に導入し；
（ｂ）細胞において、ランダム融合ポリヌクレオチドを発現させ；
（ｃ）ベクターを欠く、同じ種の対照細胞に比較した際に、異なる表現型を示す細胞を、複数の細胞から選択し、そして同じ条件下で培養し；そして
（ｄ）選択した細胞から生物を、場合によって再生する；
工程を含む、前記方法。
【請求項２１】
生物が酵母である、請求項１７〜２０のいずれか一項の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
[0001]多くの農業および産業生産系およびプロセスは、有用な物質および化合物、例えば食品、繊維、構造材料、燃料、化学薬品、薬剤、またはその原材料の産生のため、特定の生物、例えば植物、藻類、細菌、真菌、酵母、原生動物および培養動物細胞に頼る。多様な化学薬品および燃料のための生物学的生産系への現在のシフトのプロセスにおいて、生物の広い種類が産生のために用いられ、その大部分は微生物であり、光合成生物が増加する傾向があるであろう（Dismukes 2008）。頑強に（robustly）増殖する能力、ならびに関心対象の物質および化合物を効率的に産生する能力は、これらの生物の望ましい特性である。
【０００２】
[0002]これらの生物の増殖、ならびに有用な物質および化合物の収率増大の最適化は、多くの企業および個人の進行しつつある活動であり、商業的に重要な物質および化合物のより高い生産性または収率、あるいはより低い生産コストを達成することを目的とする。こうした改善は、生産系の修飾を通じて、または生物自体の修飾を通じて起こりうる。
【０００３】
[0003]生物における遺伝子的またはエピジェネティック的変化は、生物の性能を改善し、そして生産性を高める、特に強力な方法でありうる。人間が使用するすべての生物は、生産性および有用性を最大限にする特定の遺伝的組成に関して選択されてきている。さらに、多様な技術を使用して、これらの生物によって示される特性または表現型の範囲を増加させ、優れた株および変種の選択を可能にすることも可能でありうる。これらの技術の中には、突然変異誘発、遺伝子操作、遺伝子組換え、代謝操作、育種、適応突然変異等がある。こうした技術の適用は、生物改善における迅速な進展を可能にしてきている。
【０００４】
[0004]遺伝子チェックポイントの脱制御は、有用な生物の増殖特性および収率を修飾するための一般的な戦略である。遺伝子チェックポイントは、一般的に、生物がその増殖、代謝または細胞周期を通じた進行を改変することを可能にするよう進化してきており、ストレスまたは栄養制限の期間を生き抜くことを可能にしてきた。多細胞生物において、チェックポイントはまた、ひとたび組織または臓器が成熟し、そして完全に形成された際に、細胞分裂を阻害するためにも配置されている。ストレス条件が調節可能であり、そして回避可能である、培養されているかまたは培養中で増殖している生物の増殖、収率および生産性を最大限にするために、これらのチェックポイントを緩めることが、しばしば、望ましい。
【０００５】
[0005]過去開発された遺伝子操作法の中には、１またはそれより多い相同または異種ポリヌクレオチドを生物のゲノム内に導入することを通じた、機能獲得型アプローチがある。典型的には、こうしたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド産物が生物において過剰発現され、したがって、その生物に新規機能または機能改変を分与するであろう方式で構築される。突然変異誘発もまた、細胞または生物において、機能獲得型変化を生じうるが、こうした変化は、突然変異誘発に反応する場合は、機能喪失型変化よりもよりまれであり、機能喪失型では、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド産物の活性が、遺伝子変化によって、損なわれるかまたは破壊される。
【０００６】
[0006]ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列の、そしてコードされるＲＮＡまたはタンパク質の生化学的特性の産物である、特異的機能を有する傾向がある。タンパク質またはＲＮＡの配列および生化学的特性が、その構造、生化学的活性、細胞内の局在化、および他の細胞構成要素の関連を支配し、タンパク質またはＲＮＡの適切な活性、およびその活性の適切な制御を可能にする。コードされるタンパク質またはＲＮＡの異常な特性を生じ、その生化学的および構造特性、細胞内局在化、および／または他のタンパク質またはＲＮＡとの会合に影響を及ぼすポリヌクレオチド配列の改変は、生物の特性または表現型に顕著な結果を有しうる。別個のポリヌクレオチドによってコードされる、損なわれていない（intact）または部分的なオープンリーディングフレームの連結を伴う、ポリヌクレオチド融合は、ポリヌクレオチド配列を改変して、コードされるＲＮＡまたはタンパク質の特性を変化させ、そして生物の表現型を改変する既知の方法である。
【０００７】
[0007]ポリヌクレオチド融合が生物の表現型を改変しうる、２つの一般的な機構がある。これらの２つの機構は、タンパク質ＡおよびＢが異なる機能または活性を有し、そして／または細胞の異なる部分に局在する、ポリヌクレオチドＢ（タンパク質Ｂ’をコードする）に融合したポリヌクレオチドＡ（タンパク質Ａ’をコードする）の場合で例示されうる。第一の機構は、２つのタンパク質の細胞内局在に当てはまる。２つのポリヌクレオチドのポリヌクレオチド融合によってコードされる融合タンパク質は、タンパク質Ａ’が通常存在する細胞部分、またはタンパク質Ｂ’が通常存在する細胞部分、またはその両方に局在しうる。タンパク質Ａ’およびＢ’にコードされる活性の細胞分布のこの改変は、生物における表現型変化を引き起こしうる。融合の結果としての２つのタンパク質の局在改変の模式図を図１に例示する。
【０００８】
[0008]融合タンパク質が細胞または生物の表現型特性を改変する、第二の一般的な機構は、同じタンパク質における、２つの異なる、通常は別個の機能または活性の直接の会合に関する。タンパク質Ａ’およびＢ’の場合、これらの融合は、タンパク質Ａ’またはタンパク質Ｂ’またはこれらのタンパク質が通常存在する多タンパク質複合体、あるいはその組み合わせの活性改変を導きうる。改変される活性には、限定されるわけではないが：活性の定性的改変；活性のレベル改変；活性の特異性改変；細胞による活性の制御の改変；細胞の生化学的または遺伝的経路の変化を導く、細胞におけるタンパク質と他のタンパク質またはＲＮＡ分子の会合改変が含まれる。融合タンパク質を発現した結果、細胞で生じる表現型変化の模式図を図１に示す。
【０００９】
[0009]技術の元となる機能生成原理である、遺伝子融合は、通常生じる生物学的機構ではない（Ashby 2006、Babushok 2007、Whitworth 2009、Zhang 2009、Eisenbeis 2010）が、戦略の妥当性を確認するために十分にしばしば観察されてきている。進化的な時間に起こるもの、例えばエクソン・シャッフリング（Gilbert 1978）による新規遺伝子配列進化におけるものとは別に、遺伝子融合は、２つの癌原遺伝子の融合が癌細胞の制御されない細胞増殖に寄与する、発癌における頻繁な事象である（Mitelman 2004、Mitelman 2007、Rabbitts 2009、Inaki 2012）。ポリヌクレオチド融合の活性改変の例は、慢性骨髄性白血病において、調節されない細胞増殖を促進する際に関与するＢＣＬ−ＡＢＬ癌遺伝子（Sawyers 1992、Melo 1996）、侵襲性急性白血病に関与するヒストン−リジンＮ−メチルトランスフェラーゼをコードする混合細胞系譜白血病（ＭＬＬ）ポリヌクレオチド（Marshalek 2011）、原核２構成要素シグナル伝達タンパク質（Ashby 2006、Whitworth 2009）、ならびに多機能細菌抗生物質耐性ポリヌクレオチド（Zhang 2009）である。しかし、これらの例にもかかわらず、ポリヌクレオチド融合は、点突然変異などの他の遺伝子変化に比較して、生物学においては比較的まれであり、そして細胞世代あたりというよりも、進化的な時間に渡って、より適切に測定される頻度で生じる傾向がある（Babushok 2007、Eisenbeis 2010）。その結果、人工的なポリヌクレオチド融合を生成するための系は、自然界でまれにしかまたはまったく見られない多くの表現型を生成する潜在能力を有する。多様な有用な生物において、多様な遺伝子チェックポイントをバイパスすることが可能な融合タンパク質は、より迅速に増殖し、そしてより収率が高い株および変種の単離を可能にするであろう。
【００１０】
[0010]今日まで、大規模でそして体系的な方式で、融合遺伝子またはポリペプチドの機能生成能を利用する試みはなされてきていない。ランダム化インフレーム・ポリヌクレオチド融合の大規模コレクションの公表された例はない。融合タンパク質の以前の例は、特定の結果を想定した、限定され、そして指示された方式で、生成されてきている。本発明は、生物学的生物における、遺伝子機能改変、新規遺伝子機能生成、新規タンパク質機能生成および／または関心対象の新規表現型生成の目的で、体系的な、ランダム化された、大規模の、およびインフレームの遺伝子融合またはポリヌクレオチド融合の生成および使用を記載する。
【００１１】
[0011]本発明は、特定の遺伝子およびタンパク質の新規変異体を生成するために、相同配列をランダムに組み換える、遺伝子シャッフリング（Stemmer 1994、Stemmer 1994a）などの遺伝子およびタンパク質進化法とは異なる。本発明は、ランダム組換えおよび新規コード配列を生成するため、インプット配列として実質的に非相同である配列のコレクションを用いる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Dismukes 2008
【非特許文献２】Ashby 2006
【非特許文献３】Babushok 2007
【非特許文献４】Whitworth 2009
【非特許文献５】Zhang 2009
【非特許文献６】Eisenbeis 2010
【非特許文献７】Gilbert 1978
【非特許文献８】Mitelman 2004
【非特許文献９】Mitelman 2007
【非特許文献１０】Rabbitts 2009
【非特許文献１１】Inaki 2012
【非特許文献１２】Sawyers 1992
【非特許文献１３】Melo 1996
【非特許文献１４】Marshalek 2011
【非特許文献１５】Stemmer 1994
【非特許文献１６】Stemmer 1994a
【発明の概要】
【００１３】
[0012]本発明は、生物ゲノム内へのランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの導入を通じて、生物において、表現型の変化を達成する方法および組成物に関する。多数の配列のランダム会合は、細胞または生物において、既存の遺伝子または生化学的機構または経路を破壊するかまたは改変し、したがって、形質転換された細胞または生物の新規特性を生成する、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを生じる。この方法は、生物集団内の多様性を増加させ、そしてこうした生物における新規のおよび有用な表現型または特性を生成するのに有用である。
【００１４】
[0013]本発明は、ターゲット細胞または生物において、以前は知られていなかった表現型を生成するために、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを用いる。本発明は、少なくとも１つのランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを形成する、インフレームでランダムに融合された少なくとも２つの別個のランダムポリヌクレオチドを含む組成物に関する。ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドは、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの発現を制御する少なくとも１つの制御配列に機能可能であるように連結されていてもよく、ここで、制御配列は、プロモーター、ターミネーター、または非翻訳配列である。１つの態様において、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドは、ベクターに機能可能であるように連結されている。ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入してもよい。いくつかの場合、宿主細胞を、宿主細胞が得られた生物に再生することも可能である。ランダム化融合ポリペプチドは、対照細胞または対照生物に存在しない表現型を引き起こす。
【００１５】
[0014]本発明はまた、生物からポリヌクレオチドを単離し、場合によってこれらのポリヌクレオチドをランダムに断片化し、そして次いで断片をインフレームでランダムに連結することによって、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを産生する大規模法にも関する。別の態様は、宿主細胞内に、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを含有する組成物を導入する工程を含む、細胞表現型を改変する方法を提示する。さらに別の態様は、宿主細胞内に、ランダム化インフレーム融合ポリペプチドを導入し、そして次いで、その細胞から生物を再生することによって、生物の表現型を改変するための方法を提示する。さらに別の態様は、ランダム化インフレーム融合ポリペプチドを含有する細胞または生物の生活環を、対照細胞または生物に比較し、対照生物に存在しない表現型を示す、ランダム化インフレーム融合ポリペプチドを含有する細胞または生物を選択し、選択した生物からランダム化インフレーム融合ポリペプチドをコードするランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを単離し、単離されたランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入し、そして適切な場合、その宿主細胞から生物を再生し、そして次いで、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド含有細胞または再生生物を、対照生物に比較して、観察された表現型改変が残っていることを確認することによって、改変された表現型の原因であるランダム化インフレーム融合ポリペプチドを同定するための方法を提示する。
【００１６】
[0015]いくつかの態様において、コード配列（オープンリーディングフレームまたはＯＲＦ）のコレクションを生成し、そしてＯＲＦのランダム対をランダム化翻訳融合として発現ベクター内にクローニングする。これは、出発コレクションに存在する各ＯＲＦが、融合するＯＲＦに対して５’配向で、または３’配向で配置可能であるような方式で行われる。ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの生じたライブラリーをターゲット生物内に導入し、そしてランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの存在に関して選択する。別の態様において、形質転換生物集団を、新規表現型に関して選択するか、またはスクリーニングする。望ましい表現型を持つ形質転換生物は、ターゲット生物を典型的に用いるプロセスにおいて、直接有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】[0016]ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを発現している細胞の表現型変化の例示。天然細胞（図の上部）は、２つの仮説上のタンパク質、タンパク質Ａおよびタンパク質Ｂ（小さい丸い物体として示す、図の下部のレジェンドを参照されたい）を発現し、この例では、細胞の異なる部分に局在し、そして異なる機能を有する。集団細胞をランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・ライブラリーで形質転換し、そして改変された表現型を有する細胞変異体を選択する。この特定の例において、改変された特性を有する細胞は、タンパク質Ａおよびタンパク質Ｂの間のランダム化融合をコードするポリヌクレオチドを発現する（図の下部でＡ−Ｂ融合タンパク質を発現する細胞）。ランダム化融合タンパク質は、タンパク質Ａが通常占める細胞内位置、ならびにタンパク質Ｂが通常占める位置に存在する。その結果、ランダム化融合タンパク質を発現している細胞は、細胞形状の変化、陰影および細胞内小器官の変化によってこの模式図中に示される、改変された特性を有する。
【図２】[0017]ＯＲＦのコレクションをランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドにランダム化し、そしてこれらを用いて生物を表現型的に改変する例。ＯＲＦのコレクション（Ａ）を、ベクターＤＮＡ分子（Ｂ）と、ＯＲＦがランダム化対形式で組み合わされて、ランダム化融合ＯＲＦの大コレクション（Ｃ）を生じる方式で、組み合わせる。この例におけるベクター分子は、ＯＲＦ（二重線）の発現を仲介する配列を含有する。ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドのコレクションを生物に導入し（Ｄ）、そして形質転換体を単離し（Ｅ）、このうちあるものは改変された表現型を有する。関心対照の表現型を持つ修飾生物を、この集団から単離する（Ｆ）。改変された表現型を有する形質転換体において発現されるランダム化融合ポリヌクレオチドを再単離し、そして元来の細胞集団への再形質転換によって検証することも可能である（この図には提示しない）。
【図３】[0018]相同性依存性クローニングによって、単一工程で、発現ベクター内に２つのＯＲＦを組み立てる例。５’ＯＲＦおよび３’ＯＲＦ（Ａ）を、配列特異的プライマー（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４）を用いてＰＣＲ増幅する。各プライマーは、他のＯＲＦまたはベクター中の配列に対する相同性を特定する余分な配列を５’端に含有し、これは断片を組み立てようとする順序に対応する（Ｂを参照されたい）。互いに、そしてクローニングベクター（Ｃ）に相同な配列を含有するＰＣＲ増幅ＯＲＦ（Ｂ）をクローニングベクターと組み合わせ、そして３つの断片間の相同性領域が各断片を正しい位置および配向にすることを可能にすることによって、最終構築物（Ｄ）に組み立てる。単純化するため、図は、単一の５’ＯＲＦおよび単一の３’ＯＲＦしか示さないが、同じ方法は、任意の数のＯＲＦを含有する混合物でも働くであろう。
【図４】[0019]ランダム化インフレーム・ポリヌクレオチド融合ライブラリーのための配列の出発コレクションとして用いた、長さ９３〜２６０４ｂｐである、選択された大腸菌（Escherichia coli）遺伝子のサイズ分布。
【図５】[0020]ランダム化インフレーム・ポリヌクレオチド融合ライブラリーのための配列の出発コレクションとして用いた、長さ１０２〜２５９８ｂｐである、選択されたサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）遺伝子のサイズ分布。
【図６】[0021]ランダム化インフレーム・ポリヌクレオチド融合ライブラリーのための配列の出発コレクションとして用いた、長さ１０１〜２５９８ｂｐである、選択されたシネココッカス・エロンガトゥス（Synechococcus elongatus）遺伝子のサイズ分布。
【図７】[0022]３’ＯＲＦ（Ａ）および５’ＯＲＦ（Ｂ）のために産生されたＯＲＦ大プールのうち２４個を示す１％アガロースゲル。各レーンは、大プール由来のＤＮＡ  １μｇを含有する。各大プールは、サイズによってグループ分けされた８つの異なる第二段階多重化ＰＣＲ反応の産物を含有し、各大プール中には、総数２０８〜２１６の異なるＳ．セレビシエＯＲＦアンプリコンが存在する。各ゲルの左側および右側のＤＮＡマーカーのサイズは以下の通りである（下部から、ｂｐ）：７５、２００、３００、４００、５００、７００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、７０００、１００００、２００００。
【図８】[0023]融合遺伝子ライブラリーへのin vitro組み立ておよび大腸菌におけるクローニング後の、ＯＲＦスーパープール組み合わせ１〜１７および１９〜２４を示す１％アガロースゲル。各レーンは、ＮｈｅＩ、ＸｈｏＩおよびＰｆｌＭＩ制限酵素で消化された、１μｇのライブラリーＤＮＡを示す。ＮｈｅＩは、５’ＯＲＦの上流で、完全に組み立てられた融合遺伝子プラスミドを制限処理し；ＸｈｏＩは、３’ＯＲＦ下流を制限処理し、そしてＰｆｌＭＩは２つのＯＲＦの間を制限処理する。したがって、各ＯＲＦは、プロセスにおいて、融合遺伝子構築物から切除される。各レーンは、多様なサイズの多くのＤＮＡ断片が存在することを示す、特徴的なスメアを示し、これはＤＮＡライブラリーに特徴的である。ゲル上部で、主要なベクターバンドが明らかに可視である（５５３８ｂｐ）。やはり可視であるのは、約３ｋｂのより小さいバンドであり、これは、組み立て反応においてある程度の規則性を生じる、再編成されたベクターに相当する。ゲル上部の不鮮明なバンドは、大腸菌染色体ＤＮＡである。最初のおよび最後のレーンは、以下のサイズのマーカーＤＮＡを含む（下部から、ｂｐ）：７５、２００、３００、４００、５００、７００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、７０００、１００００、２００００。
【図９−１】[0024]熱許容性に関するスクリーニングにおいて、サッカロミセス・セレビシエにおいて単離された融合タンパク質を列挙する表。表の各列は、実施例２に記載するスクリーニングにおいて単離された別個の融合遺伝子を列挙する。融合遺伝子は、名称、配列番号によって同定され、そしてその構成要素５’および３’ＯＲＦを、その長さ、配列番号および知られている場合はその細胞機能の簡単な説明を含めて列挙する。列挙する融合遺伝子は、すべて、完全全長５’および３’ＯＲＦを有し、そしてインフレームで融合される。すべてのクローニング接合部は完全である。２つのＯＲＦを分離するリンカー配列は、融合遺伝子のこの部分が完全に配列決定されているすべての場合で、完全であり、そして完璧であり；いくつかの場合で、配列は不完全であり（ＳＩ）、そしてリンカー配列が正しいかどうかの決定は可能ではなかった。
【図９−２】熱許容性に関するスクリーニングにおいて、サッカロミセス・セレビシエにおいて単離された融合タンパク質を列挙する表。表の各列は、実施例２に記載するスクリーニングにおいて単離された別個の融合遺伝子を列挙する。融合遺伝子は、名称、配列番号によって同定され、そしてその構成要素５’および３’ＯＲＦを、その長さ、配列番号および知られている場合はその細胞機能の簡単な説明を含めて列挙する。列挙する融合遺伝子は、すべて、完全全長５’および３’ＯＲＦを有し、そしてインフレームで融合される。すべてのクローニング接合部は完全である。２つのＯＲＦを分離するリンカー配列は、融合遺伝子のこの部分が完全に配列決定されているすべての場合で、完全であり、そして完璧であり；いくつかの場合で、配列は不完全であり（ＳＩ）、そしてリンカー配列が正しいかどうかの決定は可能ではなかった。
【図１０】[0025]図９に列挙する融合遺伝子の熱許容性を立証するスポットアッセイの合成画像。各融合遺伝子を酵母株ＢＹ４７４１内に再形質転換し、そしてプラスミドの存在に関して選択した。形質転換細胞を脱イオン水中に懸濁し、均一な細胞密度に調整し、そして炭素供給源としてガラクトースを含有する、合成完全ウラシルドロップアウト培地を用いて、二つ組プレート上、４連続１０倍希釈でスポットした。プレートを、図中に示すように、３０℃および４０℃でインキュベーションした。融合遺伝子名をスポットの各列の左側に示す。熱許容性は、対照（プラスミドｐ４１６−ＧＡＬ１で形質転換した株ＢＹ４７４１）に比較して４０℃での増殖増進によって可視である。合成画像を得た多数のプレートから、多数の対照を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
[0026]本発明は、望ましい表現型に関する、多数の生化学的、遺伝的および相互作用的機能をスクリーニングし、そしてサンプリングするための方法を提供する。本発明は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、またはその断片のランダム化された融合を生成して、有用な生物において新規表現型および特性を生成するために使用可能な、ポリヌクレオチドの組み合わせの大ライブラリーを生成することによって、改変されたまたは改善された細胞または生物を産生する新規方法を開示する。本発明は、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドのコレクションを生成する方法を記載する。
【００１９】
[0027]一連のコドンとしてタンパク質またはペプチドをコードする核酸におけるヌクレオチドの任意の配列として、ＯＲＦを定義する。出発コレクション中のＯＲＦは、任意の特定のアミノ酸で始まるかまたは終わる必要はない。タンパク質またはペプチドをコードするＯＲＦまたはポリヌクレオチド配列は、連続していても、またはイントロンによって中断されていてもよい。
【００２０】
[0028]用語「インフレーム」は、本発明において、そして特に句「インフレーム融合ポリヌクレオチド」において、上流または５’ポリヌクレオチド、遺伝子またはＯＲＦに融合された、上流ポリヌクレオチド、遺伝子またはＯＲＦの下流または３’に配置されたポリヌクレオチド、遺伝子またはＯＲＦにおけるコドンの読み枠と同じであるような、上流または５’ポリヌクレオチド、遺伝子またはＯＲＦにおけるコドンの読み枠を指す。こうしたインフレーム融合ポリヌクレオチドのコレクションは、互いに関してインフレームである上流および下流ポリヌクレオチドを含有する融合ポリヌクレオチドの割合に関して、多様でありうる。コレクション全体の割合は、少なくとも１０％であり、そして数値１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％あるいはその間の任意の数値であることも可能である。
【００２１】
[0029]ＯＲＦのコレクションは、別々のＤＮＡ断片、またはより大きなＤＮＡ断片上の別々の配列として生成される。次いで、組み合わされたポリヌクレオチドが、ランダム化インフレーム融合ペプチドまたはポリペプチドとして、ターゲット細胞中で発現されうるような方式で、２またはそれより多いランダムポリヌクレオチド、またはその断片を組み合わせることによって、ＯＲＦをコードするポリヌクレオチドの１またはそれより多いコレクションまたはプールから、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドのライブラリーを生成する。ありうる配列の組み合わせの多くまたはすべてが形成されることを可能にする様式で、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドのライブラリーを生成する。次いで、ライブラリーを生物内に導入し、そして発現を可能にする。ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを発現する生物の生じたコレクションを、望ましい表現型または特性に関して選択するかまたはスクリーニングする。特定の形質転換体の特性変化に関与するポリヌクレオチドを回収し、そして反復使用することも可能である。このアプローチの一般的な概念を図２に例示する。例えば、生物にコードされるすべてのポリヌクレオチドを、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・ライブラリーの構築に使用してもよい。実験室細菌大腸菌の場合、例えば大腸菌にコードされる５，２８６タンパク質のうちのすべての１つが、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・ライブラリーを作製するために用いられるＯＲＦの最初のコレクションであることも可能である。したがって、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・ライブラリーは、非常に多数のポリヌクレオチドの組み合わせ（５，２８６ｘ５，２８６＝２．８ｘ１０７組み合わせ総数）を含有し、そしてその結果、ポリヌクレオチドのこの組み合わせセット内での新規機能の存在は高い。
【００２２】
[0030]ＯＲＦの最初のセットを構成するために用いられるポリヌクレオチド、またはその断片は、任意の供給源（ゲノム、メタゲノム、ｃＤＮＡ等）由来であることも可能であり、そして配列組成、機能または他の基準によって選択されるこうした供給源由来のポリヌクレオチドの任意のサブセットであってもよい。したがって、方法をあつらえて、特定の生化学的機能、あるいは特定の供給源生物または供給源環境由来の機能を捕捉することも可能である。本明細書に開示する発明は、したがって、新規ポリヌクレオチド機能および表現型が生成可能である方式で、非常に柔軟である。
【００２３】
[0031]最初のセットのＯＲＦを構成するために用いられるポリヌクレオチドは、徹底的な配列相同性を共有するＯＲＦとは対照的に、互いに主に非相同であり、そして異なる配列からなるであろう。用語「非相同」は、本発明において、５０％未満のヌクレオチドレベルでの配列同一性を有すると定義される。
【００２４】
[0032]配列同一性パーセント：用語「配列同一性パーセント」は、任意の所定のクエリー配列、例えば配列番号１０２、および対象配列の間の同一性の度合いを指す。対象配列は、典型的には、クエリー配列の長さの約８０パーセント〜２００パーセントである長さ、例えばクエリー配列の長さの８０、８２、８５、８７、８９、９０、９３、９５、９７、９９、１００、１０５、１１０、１１５、または１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００パーセントの長さを有する。クエリー核酸またはポリペプチドに対して、任意の対象核酸またはポリペプチドに関する同一性パーセントは以下のように決定可能である。クエリー配列（例えば核酸またはアミノ酸配列）を、全長に渡って、核酸またはタンパク質配列の整列を可能にする、コンピュータプログラムClustalW（バージョン１．８３、デフォルトパラメーター）を用いて、１またはそれより多い対象核酸またはアミノ酸配列に整列させる（全体整列、Chenna 2003）。
【００２５】
[0033]ClustalWは、クエリーおよび１またはそれより多い対象配列の間の最適マッチを計算し、そして同一性、類似性および相違が決定可能になるように、これらを整列させる。１またはそれより多い残基のギャップをクエリー配列内、対象配列内、または両方に挿入して、配列整列を最大限にしてもよい。核酸配列を迅速に対整列させるため、以下のデフォルトパラメータを用いる：ワードサイズ：２；ウィンドウサイズ：４；スコアリング法：パーセント；トップ対角線の数：４；およびギャップペナルティ：５。核酸配列の複数整列のため、以下のパラメータを用いる：ギャップオープニングペナルティ：１０．０；ギャップ伸張ペナルティ：５．０；および加重遷移：あり。タンパク質配列を迅速に対整列させるため、以下のパラメータを用いる：ワードサイズ：１；ウィンドウサイズ：５；スコアリング法：パーセント；トップ対角線の数：５；ギャップペナルティ：３。タンパク質配列の複数整列のため、以下のパラメータを用いる：加重マトリックス：ｂｌｏｓｕｍ；ギャップオープニングペナルティ：１０．０；ギャップ伸張ペナルティ：０．０５；親水性ギャップ：あり；親水性残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、およびＬｙｓ；残基特異的ギャップペナルティ：あり。ClustalWアウトプットは、配列間の関係を反映する配列整列である。ClustalWは、例えば、ワールドワイドウェブ上のベイラー医科大学検索ランチャー・ウェブサイトで、そして欧州バイオインフォマティクス研究所ウェブサイト（ebi.ac.uk/clustalw）で実行可能である。
【００２６】
[0034]対象核酸またはアミノ酸配列のクエリー配列に対する同一性パーセントを決定するため、ClustalWを用いて配列を整列させ、整列中の同一マッチの数をクエリーの長さで割り、そして結果に１００を乗じる。同一性パーセント値は、小数第２位で四捨五入することも可能であることに留意する。例えば、７８．１１、７８．１２、７８．１３、および７８．１４は、７８．１に切り捨てられ、一方、７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８、および７８．１９は、７８．２に切り上げられる。
【００２７】
[0035]出発コレクション中のＯＲＦは、少なくとも５またはそれより大きい数字であり、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、１００００００またはそれより大きい数値が含まれうる。ライブラリー中のランダム化融合ポリヌクレオチドの数は、典型的には、出発コレクション中のＯＲＦの数と少なくとも等しく、そして出発コレクション中のＯＲＦの数の平方と同程度に多い可能性もあり、これは、各ＯＲＦが両方のありうる位（５’および３’）に存在し、そして互いにＯＲＦと組み合わせられると仮定した際の、すべてのありうるポリヌクレオチドの組み合わせの予期される数値である。ＯＲＦの断片から生成されるライブラリー中の、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの数は、組み合わせのより大きい数を有すると予期されるであろう。
【００２８】
[0036]出発コレクション中のＯＲＦは、単一の生物にまたは複数の生物に由来してもよい。ＯＲＦの供給源には、限定されるわけではないが：任意のウイルス、細菌、古細菌、原核生物、真核生物、原生動物、酵母、真菌、動物、藻類または植物あるいはその混合集団由来のゲノムＤＮＡまたは増幅ゲノムＤＮＡのランダム片；１またはそれより多い細菌、古細菌または他の原核生物のゲノム由来のタンパク質コード配列の完全もしくは部分的コレクションまたはプールとして存在する細菌ＯＲＦ；細菌、古細菌、任意の原核生物または任意の真核生物由来のタンパク質コード配列の個々のクローンまたはプールとして存在するｃＤＮＡのコレクション；ランダム化または部分的ランダム化オリゴヌクレオチド；増幅によるランダム化オリゴヌクレオチド由来の部分的または完全ランダムＤＮＡ配列が含まれる。
【００２９】
[0037]出発コレクション中のＯＲＦは、生物のゲノム由来のＯＲＦの完全コレクションまたはその一部を含んでもよい。コレクションまたはプール中のＯＲＦは、既知の機能、配列組成、配列内容、配列相同性、コードされるタンパク質のアミノ酸組成、コードされるタンパク質のアミノ酸内容、コードされるタンパク質の配列相同性、長さ、特定のモチーフの存在、電荷、疎水性、等電点、三次元構造またはフォールディング、他のタンパク質と会合する能力、あるいは任意の他の特性に基づいて、あらかじめ選択されることも可能である。
【００３０】
[0038]出発コレクション中のＯＲＦは、天然配列または突然変異誘発配列を含有してもよく、これには、機能獲得または機能喪失、あるいは機能改変を有することが知られる特定のポリヌクレオチドの既知の変異体が含まれる。これらはまた、縮重配列または突然変異誘発によって改変された配列も含有しうる。この場合の縮重配列は、集団中の異なる分子またはクローンの間で、特定の配列位が異なる場合、配列集団として定義される。配列相違は、単一ヌクレオチド中または任意の数の複数のヌクレオチド、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００ヌクレオチド中であってもよい。多数の縮重ヌクレオチドは、隣接していても、あるいは縮重していない定常または固定配列によって分離されていてもよい。縮重配列における配列相違は、配列、分子またはクローンの集団内の位において、２、３または４つの異なるヌクレオチドの存在を伴うことも可能である。配列の特定の位における縮重ヌクレオチドの例は：ＡまたはＣ；ＡまたはＧ；ＡまたはＴ；ＣまたはＧ；ＣまたはＴ；ＧまたはＴ；Ａ、ＣまたはＧ；Ａ、ＣまたはＴ；Ａ、ＧまたはＴ；Ｃ、ＧまたはＴ；Ａ、Ｃ、ＧまたはＴである。
【００３１】
[0039]出発コレクション中のＯＲＦは、原核生物に典型的に見られるＯＲＦのように、イントロン不含であってもよく、または真核生物のＯＲＦに典型的に見られるように、イントロンを含有してもよい。
【００３２】
[0040]出発コレクション中のＯＲＦは、ＰＣＲ断片、ＰＣＲ断片プール、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのランダム片、合成ＤＮＡ、クローニングされたＤＮＡ、供給源生物からもしくは環境から、または任意の他の環境から直接単離されたＤＮＡ、あるいは供給源の任意の組み合わせから得られてもよい。
【００３３】
[0041]出発コレクション中のＯＲＦを、他のＯＲＦの濃度に対応するモル量で、あるいは最終ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・ライブラリー内の提示を変化させる、より少量またはより多量で添加してもよい。例えば、望ましい表現型を与える特定のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ターゲット生物において、その表現型を与える特に高い確率を有すると推測される場合、ＯＲＦコレクション中のこの配列を過剰提示して、大部分またはすべてのポリヌクレオチド融合組み合わせを、優先される配列と組み合わせて試験することを確実にすることも可能である。
【００３４】
[0042]ＯＲＦの上流（５’）の最後のコドンおよびＯＲＦの下流（３’）の最初のコドンの間（またはその逆）に挿入されるいかなる配列も伴わずに、ＯＲＦが直接互いに融合する方式で、ランダム化インフレーム融合ポリペプチドを設計することも可能である。あるいは、２つのＯＲＦの間にさらなるアミノ酸をコードする配列挿入を有する、ランダム化インフレーム融合ポリペプチドを設計する。これらの配列挿入は、長さ３〜３０００ヌクレオチドの間の範囲であることも可能であり、そしてランダム化融合ポリヌクレオチドの２つの部分を分離するために適した「リンカー」ペプチドまたはポリペプチド配列をコードすることも可能である。小さいアミノ酸、例えばグリシン、アラニン、セリン、プロリン、スレオニン、アスパラギン酸またはアスパラギンは、柔軟でそして構造化されていないドメイン、またはかさばる側鎖を欠くアルファらせんドメインを形成する傾向があるため、リンカーペプチドとして適しており、コードされるランダム化融合ポリペプチドの２つの部分間の分離を可能にし、そしてコードされるランダム化融合ポリペプチドの各部分が、互いに対して独立に動くことを可能にする。したがって、２つの融合したＯＲＦを分離する配列挿入は、これらのアミノ酸を特定するコドンを含有することも可能である。あるいは、特定の二次構造、例えばアルファらせん、ベータシート、コイルドコイルまたはターン、あるいはその組み合わせなどの、コードされるランダム化融合ポリペプチドが、特定の構造または特定の構造の組み合わせによって分離されることを可能にする、リンカーペプチド配列を設計してもよい。
【００３５】
[0043]各ＯＲＦは、出発コレクション中の他のＯＲＦの５’および３’端にマッチする、保存された５’および３’隣接配列を含有してもよい。これらの配列は、天然ＯＲＦの一部ではなく、そしてＯＲＦが増幅され、クローニングされ、単離され、そして／または他のＯＲＦまたはベクターＤＮＡ片に連結されることを可能にする。保存された５’および３’隣接配列は、制限部位、組換え部位、あるいは他のＯＲＦ、ベクター配列、または生物内へのトランスファーを補助する他の配列への特異的な連結、生物内での複製、その生物における安定性、またはその生物内での発現を可能にする任意の他の配列を含有することも可能である。
【００３６】
[0044]出発コレクション中のＯＲＦは、全長ＯＲＦまたは部分的ＯＲＦであってもよく、そして１５ヌクレオチドから１００，０００ヌクレオチドの範囲のサイズであることも可能である。
【００３７】
[0045]出発コレクション中のＯＲＦは、生じるランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの５’端または３’端、あるいはランダムにいずれかの末端に配置されることを可能にするよう設計されることも可能である。ＯＲＦ末端の保存された配列は、こうした特異的または非特異的配置を可能にするよう設計されることも可能である。ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドのライブラリーは、３’端と５’端で同じＯＲＦのコレクションを含有してもよいし、各端でＯＲＦの別個のコレクションを含有してもよい。
【００３８】
[0046]限定されるわけではないが、制限酵素およびＤＮＡリガーゼを用いた伝統的クローニング（連結依存性クローニング）、アガロースゲル不使用クローニング、連結独立（または連結不使用）クローニング、部位特異的組換え、相同性依存性クローニング、組換えクローニング、相同性依存性末端連結、一本鎖末端のアニーリング、リンカーテーリング、トポイソメラーゼ触媒クローニング、酵素不使用クローニング等を含む、当業者に知られるＤＮＡ分子の多様な連結またはクローニング法によって、ランダム化ポリヌクレオチド融合ポリヌクレオチドを生成することも可能である。「核酸分子連結」は、本明細書において、室温で機能可能であるように連結された分子を生じる任意の方法を指す。こうした方法には、限定されるわけではないが、共有連結（連結）、核酸分子の相補鎖のアニーリング、および２またはそれより多い核酸分子を会合させる他の方法が含まれる。
【００３９】
[0047]本発明の特定の態様において、連結しようとする５’および３’ポリヌクレオチドの末端の相同配列を用いて、連結事象を導くかまたは仲介することも可能である。こうした相同性依存性組み立て（Lobban 1973）を達成するために使用可能な多数の方法が存在し、これには、連結テーリング（Lathe 1984）、融合内クローニング（Zhu 2007、Irwin 2012）、配列および連結独立性クローニング（ＳＬＩＣ、Li 2007、Li 2012）、迅速クローニング（Li 2011）、環状ポリメラーゼ伸張クローニング（Quan 2009、Quan 2011）、ギブソン組み立て法（Gibson 2009、Gibson 2010）、迅速およびクリーンクローニング（Thieme 2011）およびその他（Vroom 2008）が含まれる。
【００４０】
[0048]この種のランダム化インフレーム融合ポリペプチドは、生物に新規機能を与え、そして生物の表現型（単数または複数）を多くの異なる方式で変化させることを可能にする。こうした表現型変化を達成するため、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・ライブラリーをターゲット生物内に形質転換する。ターゲット生物は、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・ライブラリーを作製するために用いられるポリヌクレオチド、配列、またはＯＲＦのいくつかまたはすべての供給源生物であることも可能であるし、あるいは異なる生物であってもよい。ターゲット生物には、限定されるわけではないが：大腸菌、酵母、任意の種の細菌、古細菌、酵母、真菌、藻類、培養藻類細胞、昆虫、線虫、脊椎動物、動物、培養動物細胞、植物、または培養植物細胞が含まれる。ターゲット生物は、一般的に、限定されるわけではないが、産業または農業における、あるいは化学薬品、食品、繊維、構造材料、燃料、薬剤、農業化学品、染料、化粧品または他の有用な物質の産生における使用を含めて、特定の目的のために用いられる生物である。
【００４１】
[0049]ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・ライブラリーのメンバーを発現するターゲット生物の形質転換体を生成する。ランダム化融合ポリペプチドをコードするランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの存在に関して、形質転換体を選択するかまたはスクリーニングして、そして該ポリペプチドを発現させる。次いで、形質転換体の集団を、任意の観察可能、選択可能または測定可能表現型に関して選択するかまたはスクリーニングする。こうした表現型には、限定されるわけではないが、以下の特性の変化または改変が含まれる：増殖速度；細胞分裂速度；世代時間；サイズ；色；テクスチャー；形態；集団密度；生産性；収率；形状；生育習性；組成；代謝；栄養素、ミネラル、塩、イオン、毒素または水の取り込みまたは利用；光合成効率；温度、浸透力、塩分、ｐＨ、電磁放射、有機溶媒、酸化、酸化剤、界面活性剤、渇水、風、乾燥、洪水、栄養素制限、飢餓、酸素制限、光、圧力、圧縮、剪断または電離放射線などの非生物的なストレスに対する感度または耐性；疾患、有害生物、ファージ、ウイルス、感染性病原体、寄生虫または病原体などの生物ストレスに対する許容性または耐性；外見；反射特性；蛍光特性；屈折度；光伝達特性；電気抵抗、インピーダンスまたは伝導度；特定の栄養素の存在下での増殖；結合または接着特性；浸透性；他の生物との関連または共生；病原性；密度、強度、硬度、脆性、柔軟性、強剛性、膨圧、電気インピーダンス、電気抵抗、電気伝導度、磁性、浸透性、粘度、色、テクスチャーまたはグレインなどの物理的特性；行動；環境刺激に対する応答；ポリヌクレオチドの発現；酵素の活性；遺伝子的またはエピジェネティック的変化または突然変異の率；相同または異種核酸配列を取り込み、そして／または組み込む能力；集団の表現型多様度；色素または色変化を誘発する化合物によって染色される能力；抗生物質または毒素に対する耐性；浸透に対する耐性；食品、餌、燃料、繊維、構造材料、薬学的化合物、化粧品、染料、化学薬品、タンパク質、脂質、核酸、肥料、あるいはその組み合わせ、または前駆体、またはその生産のための原材料。
【００４２】
[0050]１またはそれより多い特定のランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを発現している生物を、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの同じライブラリー、類似のライブラリー、または異なるライブラリーで再形質転換してもよく、そして生物の特性改変に関して、選択するかまたはスクリーニングするプロセスを反復してもよい。この方式で、形質転換、選択、再形質転換、再選択等の反復アプローチを用いて、生物の特性または表現型を改変し続けることも可能である。
【００４３】
[0051]また、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドで形質転換された生物から、再単離してもよい。限定されるわけではないが、ＰＣＲ増幅およびプラスミド・レスキュー（Ward 1990）、その後、大腸菌などの実験室生物内へのプラスミド形質転換を含む、いくつかの方法のいずれを用いて、再単離を行ってもよい。再単離後、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを、同じ生物内に、そして／または異なる生物内に再形質転換して、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドが、反復実験において、同じ表現型を再現可能に与えることを確認することが可能である。
【００４４】
[0052]ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを発現し、そしてランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの結果として改変された表現型を有する生物を、この生物を再びランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドで形質転換することによるさらなる表現型変化の出発点として用いることも可能である。改善の第二周期の融合ポリヌクレオチドのライブラリーは、改変された表現型を持つ生物を生成するために用いたものと同じライブラリーであってもよいし、または異なるライブラリーであってもよい。ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・ライブラリーでの生物の形質転換および表現型選択のこうした反復周期は、多数の表現型変化、あるいは単一周期の形質転換および選択で達成可能であるよりもより顕著な表現型変化を生じることも可能である。
【００４５】
[0053]本発明の別の態様において、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドのライブラリーで形質転換された生物のコレクションを、空のベクター配列で形質転換された対照生物に比較して、生物に対して相同であるかまたは異種であるかいずれかのポリヌクレオチド配列の発現における改変に関して選択するかまたはスクリーニングする。この方式で、例えば、通常は発現されないであろう多くのポリヌクレオチド配列が発現される、乱雑な発現の表現型を得ることが可能である。こうした表現型は、新規遺伝的または生化学的経路を単離するか、あるいは、新規遺伝的または生化学的経路を異種生物内に移入するために有用である。あるいは、このアプローチは、通常発現される多くのポリヌクレオチド配列の発現が減少するかまたはサイレントになる、乱雑な抑制の表現型を可能にする。あるいは、ゲノムに天然に存在するトランスポゾンを活性化するかまたは不活性化することが可能である。
【００４６】
[0054]本発明の別の態様において、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドのライブラリーで形質転換された生物のコレクションを、ゲノムまたは遺伝的変化率の改変に関して選択するかまたはスクリーニングする。これらのゲノムおよび遺伝子変化には、限定されるわけではないが：点突然変異；配列挿入、欠失、または反転；反復コピー数変動；染色体転位置；染色体クロスオーバー；遺伝子変換；トランスポゾンの分布、蔓延、位置または発現の改変；外来（foreign）核酸配列の取り込み；外来核酸配列の組み込み；あるいは複雑な配列変化およびゲノム再編成を生じるその組み合わせが含まれる。特異的ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドによって与えられるこうした発展表現型は、高率の進化、ならびに生物の遺伝的および表現型的多様性増加を伴う生物を生成するために、あるいはターゲティングされる遺伝子変化を導入するために適した生物、または特定のタイプの遺伝子変化に素因がある生物を生成するために、有用でありうる。
【００４７】
[0055]本発明のさらに別の態様において、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドのライブラリーで形質転換された生物のコレクションを、生物によって産生される物質または化合物のより高い収率に関して選択するかまたはスクリーニングする。
【００４８】
[0056]本発明のさらなる態様において、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドのライブラリーで形質転換された生物のコレクションを、増殖率、生産性、あるいは細胞または生物の他の特性を制限する、遺伝子チェックポイントの非存在に関して選択するかまたはスクリーニングする。特に、これによって、特定の生理学的または増殖状態においてのみ天然に産生される、あるいは特定の生理学的または増殖状態においてのみ最大レベルで産生される物質または化合物の恒常的産生を伴う生物の単離が可能になる。
【００４９】
[0057]本発明の別の態様において、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドのライブラリーで形質転換された生物のコレクションを、細胞によって発現される酵素または生化学的経路の活性または特異性改変に関して選択するかまたはスクリーニングする。
【００５０】
[0058]本発明のさらにさらなる態様において、１または少数の関心対象のポリヌクレオチドを、より多数のポリヌクレオチドのコレクションとランダムに融合させることによって、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドのコレクションを作製する。この方式で、特定の特性に関してスクリーニング可能な、関心対象のポリヌクレオチドの変異体または突然変異体のコレクションを生成することが可能である。特に、この方式で、より高い活性、改変された活性、改変された温度最適性、改変されたｐＨ最適性、高温または極端なｐＨに対する耐性、酸または塩基に対する耐性、乾燥に対する耐性、有機溶媒に対する耐性、高塩濃度に対する耐性、プロテアーゼに対する耐性、あるいは酵素の他の望ましい特性を持つ酵素に関して、スクリーニングすることが可能である。
【実施例】
【００５１】
[0059]実施例１：大腸菌に対するストレス許容性を与えることが可能なランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの単離
細菌株およびゲノムＤＮＡ調製：
[0060]大腸菌株Ｋ−１２  ＭＧ１６５５の参照配列（ウィスコンシン大学ウェブサイトのゲノムセクションを通じて、インターネット上で入手可能）に基づいて、大腸菌ＯＲＦの完全コレクションを生成する。この株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能であり、そして関心対象のＯＲＦを増幅する高純度ゲノムＤＮＡの供給源として用いられる。このゲノムの配列注釈を用いて、各ＯＲＦの開始および停止コドンを同定する。例えば、Ｊ．クレイグ・ベンター研究所によって用意される１つの特定の注釈（インターネット上でcmr-jcviウェブサイトから入手可能）は、総数５，２８６のタンパク質コードＯＲＦを列挙し、これには、検証されたおよび仮説上のタンパク質コード遺伝子の両方が含まれ、サイズは９３ｂｐ（３１アミノ酸をコードする）から７１５２ｂｐ（２３８４アミノ酸をコードする）の範囲である。
【００５２】
[0061]インプット配列として用いる遺伝子の長さは、２６０４ｂｐを上限とし、これによって、ＰＣＲ増幅の成功、および生じるインフレーム融合ポリペプチドまたはタンパク質の正しいフォールディングの可能性が増加する。結果は、ＰＣＲ増幅用の総数５０９５のＯＲＦのため、検証され、そして性質決定されていないＯＲＦの最終コレクションである。この配列コレクションの平均の長さは、７９１ｂｐであり、そして長さの中央値は７１１ｂｐである。これらの大腸菌ＯＲＦのサイズ分布を図４に示す。
【００５３】
[0062]大腸菌において、特定の表現型を与えるポリヌクレオチドに関してスクリーニングする際、スクリーニングしようとするＯＲＦのコレクションに関心対象の表現型における既知の役割を持つポリヌクレオチドを含めることが好適でありうる。例には、ゲノムが配列決定されている生物において、ストレス耐性に関与することが知られるポリヌクレオチドが含まれる。配列決定されている微生物ゲノムの現在のコレクションには、多数の好熱菌が含まれ、該菌は、シャペロニン、熱ショックタンパク質、または他の生物に、そして他のＯＲＦと組み合わせて、ストレス許容性を与える、他のストレス許容性ポリヌクレオチドの優れた供給源である可能性もある。
【００５４】
[0063]ＯＲＦの供給源として働く細菌株を、液体培養中で増殖させ、遠心分離によって細胞をペレットとし、そして次いで２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１００ｍＭグルコースを用いて、元来の培養体積の１／１０に再懸濁する。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中に溶解した１／１００体積の１０ｍｇ／ｍｌニワトリ（hen）卵リゾチームを添加することによって細胞を溶解し、そして１／２０体積の１０ｍｇ／ｍｌＤＮＡｓｅ不含ＲＮＡｓｅ  Ａを添加し、よく混合し、そして室温で１５分間インキュベーションした。プロテイナーゼＫで処理することによって、細胞溶解およびゲノムＤＮＡ放出を完了する。溶解した細胞に、１／１０体積の１Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ９．５および１／１００体積の２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ溶液を添加する。試験管に蓋をし、そして反転させることによって、溶解した細胞を穏やかに混合し、そして混合物を時々穏やかに混合しながら５０℃で２時間インキュベーションする。次いで、等体積のフェノール−クロロホルム（ｐＨ７．０）で、ＤＮＡを２回抽出し、その後、等体積のクロロホルムでさらに１回抽出する。１／１０体積の３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．５および２．５体積のエタノール（または１体積のイソプロパノール）を添加することによって、ＤＮＡを沈殿させる。アルコールを添加した後、試験管を直ちに反転させ、そしてＤＮＡは紐状の白色沈殿物として可視である。細胞由来の他の不純物（残渣タンパク質または炭水化物）が同時に沈殿するのを回避するため、清浄なピペットチップまたはパスツールピペットを用いてアルコール溶液から沈殿したＤＮＡを取り除き、そして７０％エタノールを含有する清浄な試験管に移す。試験管に蓋をし、そして複数回反転させて、ＤＮＡ沈殿物から塩を除去する。遠心分離によってペレットを収集し、吸引によってエタノールを除去し、そしてエアフローフード中でペレットを乾燥させ、過剰なエタノールを取り除く。ペレットを１ｘＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に溶解する。カラムクロマトグラフィまたは塩化セシウム密度遠心分離（Sambrook 1989）を用いて、ＤＮＡのさらなる精製を行ってもよい。
【００５５】
発現ベクター
[0064]単純なそして標準的な発現ベクターを用いて、すべての融合タンパク質を発現させる。大腸菌ｌａｃプロモーター／オペレーターは、大部分の標準的クローニングベクター上に存在し、そしてラクトースまたはラクトース類似体の存在下で、異種ポリヌクレオチドを高レベルで発現することが可能である。ｐＵＣ１９ベクター（Vieira 1982）は、プラスミド骨格（ｐＭＢ１レプリコン）、抗生物質耐性ポリヌクレオチド（例えばアンピシリン耐性を与えるＴｎ３由来のβ−ラクタマーゼ）、ならびに大腸菌ｌａｃプロモーター／オペレーターおよびターミネーター配列の好適な供給源である。図３に例示するように、これらの配列をｐＵＣ１９からＰＣＲ増幅し、そしてランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドのクローニングおよび発現のためのプラスミド主鎖供給源として用いる。例えば、配列番号２５１２４および配列番号２５１２５に列挙するＰＣＲプライマーを用いて、ｐＵＣ１９由来のこうした断片をＰＣＲ増幅して、２３９１ｂｐ直鎖ベクター断片（配列番号２５１２６）を生じることも可能である。５’ＯＲＦの５’端および３’ＯＲＦの３’端に含まれる、この発現ベクター断片に対する相同性領域（図３を参照されたい）は、このベクター配列の末端と相同性を共有する（配列番号２５１２６）。
【００５６】
[0065]ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの発現のためのｌａｃプロモーター系の代替物として、他の大腸菌プロモーター、例えばｃｙｃＧプロモーター（Belyaeva 1992）、Ｔｎ３  β−ラクタマーゼプロモーター、Ｐｓｐｃリボソームタンパク質プロモーターまたはファージラムダＰＬおよびＰＲプロモーター（Liang 1999、Menart 2002）を用いてもよい。ストレス誘導性大腸菌ｐｓｐオペロンのプロモーター（Brisette 1990、Brisette 1991、Weiner 1991、Weiner 1995、Jovanovic 1996、Model 1997、Beekwilder 1999）は、非生物ストレスの条件下で、植物性細胞増殖に依存する恒常性プロモーターが非常に活性でない可能性もある場合、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの発現のために特に適している可能性もある。あるいは、細菌発現のためのコンセンサス要素を含有する部分的ランダム化配列から、合成プロモーターを発展させてもよい（Jensen 1998a、Jensen 1998b、Hammer 2006、De May 2007）。
【００５７】
[0066]ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの発現のための適切性に関して、候補プロモーターを試験するため、選択したプロモーターおよびその会合５’ＵＴＲを２５０ｂｐ  ＤＮＡ断片として合成し、そしてｐＵＣ１９などの高コピー数プラスミド中のｌａｃＺ  α断片の上流にクローニングする。大腸菌ターミネーターを、プロモーター断片の上流に配置して、プラスミド上の別の箇所に存在するプロモーターからのリードスルー転写を防止する。ｌａｃＺ  α断片の発現の指標となる、発色原基質Ｘ−Ｇａｌの存在下で、青色コロニー色表現型を与える能力に関して、生じた構築物を大腸菌において試験する。
【００５８】
[0067]本明細書記載のプラスミドは、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの発現のため、ｐＭＢ１複製起点を含有するものなどの高コピー数プラスミドに基づく。しかし、他のプラスミド系もまた、この研究に適している。例えば、Ｆ’に基づくプラスミド、例えばｐＢｅｌｏＢＡＣ１１（Shizuya 1992）を用い、上記と同じプロモーターを用いて、または異なるプロモーターセットを用いて、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを発現させてもよい。
【００５９】
融合遺伝子構造およびＯＲＦ増幅戦略：
[0068]２つの異なるプライマーセットを各ＯＲＦに関して設計し、１つはＯＲＦをランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの５’位にクローニングするためのものであり、そしてもう一方は３’に配置するためのものである。５’端に１５〜１００塩基の保存配列を含有するようにプライマーを設計する。この保存配列は、対形成するであろう他のＯＲＦの末端の配列に相同であるか、またはベクター配列の末端に相同である。この配列相同性を図３に例示する。各ＯＲＦは、すべての他のＯＲＦと組み合わせて、５’および３’位の両方に配置されるはずであるため、各ＯＲＦに関して、２つの異なるＰＣＲアンプリコンが生成され、１つは５’位に、そしてもう一方は３’位に向けられる（図３を参照されたい）。
【００６０】
[0069]例えば、ペプチドまたはタンパク質をコードする仮説上のポリヌクレオチド配列Ａは、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドのコレクションの構築のために用いられるよう意図される、ポリヌクレオチドの出発コレクションの一部であってもよい。ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドのコレクションを生成する目的は、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドシリーズの５’位に存在する、ポリヌクレオチドＡを含めた出発コレクション中の各ポリヌクレオチドを有すること、そしてランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの異なるシリーズの３’位に存在する同じ配列を有することである。これらの２つのシリーズのランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの各々において、ポリヌクレオチドＡは、こうした融合を生成するために利用可能な方法で実現可能であるような出発コレクションの出来る限り多くの他のメンバーと融合するであろう。出発コレクションに存在する他のポリヌクレオチドに対して５’または３’位のポリヌクレオチドＡを含む、これらの別個のシリーズの融合を可能にするため、２つの異なるバージョンのポリヌクレオチド配列Ａを生成する。５’位で使用するために意図されるポリヌクレオチド配列Ａのバージョンは、停止コドンを含有しないであろうし、そして発現ベクターのプロモーター領域に５’相同性（またはクローニング目的のための他の配列適合性）を有するであろう。３’ 位で使用するために意図されるポリヌクレオチド配列Ａのバージョンは、停止コドンを含有するであろうし、そして発現ベクターのターミネーター領域に３’相同性（またはクローニング目的のための他の配列適合性）を有するであろう。
【００６１】
[0070]ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドにおいて、２つのＯＲＦを分離する配列（図３において、「リンカー配列」と示される）は、グリシンおよびセリン残基が豊富な短いペプチドをコードする。こうしたペプチドは、非構造であることが予期され、そしてランダム化融合タンパク質の２つのメンバーを分離する柔軟なタンパク質スペーサーを提供する一方、タンパク質分解には比較的耐性であろう。適切なリンカーペプチド配列の例は、GGGGSGGSGGSGGGGS（配列番号２５１１７）またはSGGSSAAGSGSG（配列番号２５１１８）またはSAGSSAAGSGSG（配列番号２５１１９、Wang 2010）である。あるいは、アルファらせんリンカー配列を用いてもよく、例えば配列A（EAAAAK）ｎA、ｎ＝２〜５（配列番号２５１２０〜２５１２３、Arai 2001）がある。
【００６２】
[0071]各プライマーは、２つの目的を持つ、１６塩基の保存配列を５’に含有する。まず、余分な配列は、互いに関して異なるＯＲＦの提示にバイアスを掛けることなく、コレクション中のＯＲＦすべてを増幅することが可能な、保存されたＰＣＲプライマー配列を用いた、ＯＲＦプールの効率的なＰＣＲ増幅を可能にする（Dahl 2005、Myllykangas 2011、Natsoulis 2011）。第二に、これらは、発現ベクター（クローニングおよび発現ベクターｐＵＣ１９の誘導体（Vieira 1982、配列番号２５１２６））に、そしてランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・パートナーの末端の保存配列に相同性を含有し、ベクター中での、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの、迅速でそして効率的な、相同性依存性組み立てを可能にする（図３を参照されたい）。各ＯＲＦの２つのアンプリコンは、停止コドンの存在（ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・ライブラリーの３’位に関して向けられるＯＲＦにのみ存在する）、および保存隣接配列のみが異なる。
【００６３】
[0072]融合遺伝子の５’位に向けられるＯＲＦのすべての５’ＰＣＲプライマーに付加される保存された配列は、GCTGGATCCTGCTAGC（配列番号２５１２７）である。融合遺伝子の５’位に向けられるＯＲＦのすべての３’ＰＣＲプライマーに付加される保存された配列は、CAGGAGCTGCACTTCC（配列番号２５１２８）である。融合遺伝子の３’位に向けられるＯＲＦのすべての５’ＰＣＲプライマーに付加される保存された配列は、TGGAAGTGGTTCAGGA（配列番号２５１２９）である。融合遺伝子の３’位に向けられるＯＲＦのすべての３’ＰＣＲプライマーに付加される保存された配列は、CTACTCGAGACTGCAG（配列番号２５１３０）である。
【００６４】
[0073]融合遺伝子の５’位に向けられるＯＲＦの３’ＰＣＲプライマー中の５’末端１６ヌクレオチド、および融合遺伝子の３’位に向けられるＯＲＦの５’ＰＣＲプライマー中の５’末端１６ヌクレオチドは、２つのＯＲＦを分離するリンカー配列の一部を形成する。この６０ｂｐリンカー配列（配列番号２５１０３）は、融合遺伝子中の２つのＯＲＦを連結する際に他の研究者が用いた配列（Arai 2001、Eldridge 2009、Wang 2010）に大まかに基づく、グリシン、セリンおよびアラニンが豊富な２０アミノ酸ペプチド（配列番号２５１０４）をコードする。このリンカー配列は、ＰＣＲ増幅の第二のまたは保存される段階で完全にコードされ（以下を参照されたい）、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの５’位に向けられるＯＲＦの３’端およびランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの３’位に向けられるＯＲＦの５’端への、保存されたコード配列の付加を生じる。
【００６５】
[0074]１つは融合遺伝子の５’位そしてもう一方は３’位である、大腸菌ＯＲＦの２つの完全なセットが生成される必要があるため、以下に記載するすべての方法は、２つのＯＲＦ位に関して、２つ組で行われる。
【００６６】
配列増幅：
[0075]３’端の２０〜３０ポリヌクレオチド特異的塩基を含有するポリヌクレオチド特異的プライマーおよび５’端の保存配列を含有するプライマーを用いて、各ＯＲＦをＰＣＲ増幅する。各ポリヌクレオチドに関して個々に、またはポリヌクレオチドプールに関して同時に、増幅を行う。
【００６７】
[0076]個々の増幅のため、各々、最終濃度０．５〜５μＭの２つのプライマーを、１０〜１０００ｎｇの大腸菌ゲノムＤＮＡ、ＰＣＲ緩衝液および熱安定性ポリメラーゼと、１〜５０μｌの総反応体積中で合わせる。高忠実度熱安定性ポリメラーゼ、例えばPhusion（登録商標）ポリメラーゼが使用可能である。Phusion（登録商標）ポリメラーゼに関しては、９５℃２分間の変性、その後、９５℃２０秒間、６０℃２０秒間の１０〜３５周期、および７２℃１分／ｋｂ（７２℃で最低３０秒間）によって、ＰＣＲアンプリコンを生成する。アガロース電気泳動によって、または蛍光計、例えばQubit（登録商標）蛍光計（Life Technologies）を用いた蛍光分光測定によって、ＰＣＲ産物形成の効率を測定する。ＤＮＡ精製に適したシリカ樹脂を用いて、成功したＰＣＲ反応を精製することも可能である。成功しなかった反応を、ＰＣＲ反応中のＭｇ＋２濃度および／または他の反応条件を変化させることによって反復する。各ＯＲＦの増幅成功後、各ＰＣＲ産物濃度を規準化し、そして特定のサイズ範囲に対応する産物をクローニングのためにプールする。
【００６８】
[0077]個々の増幅は、各ＯＲＦの増幅が別個に行われ、そして監視され、ＯＲＦの最終プール中の各ＯＲＦがほぼ同等の提示であることを可能にする利点を有する。多数のＰＣＲ反応を平行して行い、そしてアッセイする必要があり、ロボット装置および多数の増幅の最適化を必要とする、不都合な点がある。
【００６９】
[0078]プールした増幅に関しては、ＰＣＲ増幅の効率は、非常にサイズ依存性であるため、そしてＰＣＲ条件（７２℃での伸張時間、上記を参照されたい）はアンプリコンのサイズに応じるため、ＯＲＦは、サイズによってプールされる。ＯＲＦは、任意の数のサイズプールに分離される。より少数のサイズプールは、増幅をより少数の試料で行うことが可能であり、時間および試薬を節約する利点を有する。多数のサイズプールは、各プールの複雑性がより低く、より高い濃度の各プライマー対、そしてしたがって、各ポリヌクレオチドの増幅成功の可能性がより高いことを意味する。好適な数のサイズプールは、１または２の９６ウェルプレート中のウェルの数に対応する。例えば各２６〜２７のＯＲＦの１９２プール（１９２プールｘ平均２６．５４  ＯＲＦ＝総数５０９５  ＯＲＦ；これは、各２７プライマー対を含有する１０３プール、および各２６プライマー対を含有する８９プールに対応する）。
【００７０】
[0079]ＰＣＲ増幅を３工程で行う：１）遺伝子特異的プライマーを用いた最初の増幅、その後、２）保存されたプライマーを用いた各ＯＲＦプールの増大、その後、さらなるプーリング、ゲル上でのサイズ選択、および３）最終長ＰＣＲ産物を生じる第三の増幅工程。３つの増幅工程は、それぞれ、第一段階、第二段階および第三段階増幅と称される。
【００７１】
[0080]PhusionＴＭホットスタートＩＩ熱安定性高忠実度ポリメラーゼ（Thermo ScientificＴＭ）を用いて、すべてのＰＣＲ増幅を行う。５ｘＨＦ増幅緩衝液とともに酵素を供給し、すべての反応に用いる。増幅は、以下に示すように、２０μＬまたは５０μＬ反応体積で行う。すべての増幅を、９６ウェルブロックを含有するＴ１００サーマルサイクラー（Bio-Rad Laboratories）上で行う。すべての増幅で用いるデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）は、各ｄＮＴＰ  １０ｍＭを含有するストックであり、やはりThermo Scientific（登録商標）より得られる。すべての反応に脱イオン水を用い、そしてポリメラーゼとともに供給されないすべての溶液を作るためにも脱イオン水を用いる。
【００７２】
[0081]すべてのＰＣＲ増幅は、同じ一般的な方法にしたがう：
[0082]１．  ＰＣＲ反応の各段階のため、以下に記載するようなＰＣＲ混合物を調製し、そしてサーマルサイクラーに挿入するまで低温で維持する。
【００７３】
[0083]２．  試料を完全に混合し、そして次いで、４０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、試験管またはプレートウェルの底に反応産物を集める。
[0084]３．  プレートまたは試験管をサーマルサイクラー内に挿入する。
【００７４】
第一段階増幅：
[0085]上述のような配列特異的ＰＣＲプライマープールを用いて、第一段階増幅を行う。反応あたり２μＬの１０ｎｇ／μＬ大腸菌株ＭＧ１６５５ゲノムテンプレートＤＮＡを用いて、２０μＬ総体積中、各増幅を行う。各反応に、１００μＭストックから２．５μＬプライマープールを添加して、１２．５μＭの最終総プライマー濃度を提供する。各プライマープールは、２６または２７プライマー対のいずれかを含有し；そして最終の個々のプライマー濃度は、およそ０．２３〜０．２４μＭである。
【００７５】
[0086]第一段階のＰＣＲ反応混合物は、２０μｌ総体積中で設定され、そして以下の構成要素から混合される：４μｌ  ５ｘ Phusion（登録商標）ＨＦ緩衝剤、０．４μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０．７μｌ脱イオンＨ２Ｏ、２μｌ  １０ｎｇ／μｌゲノムテンプレートＤＮＡ、２．５μＬプライマープール（１００μＭ）、０．４μｌ  ＰｈｕｓｉｏｎＴＭホットスタートＩＩ熱安定性ポリメラーゼ（２単位／μｌ）。ＰＣＲサイクリング条件は以下の通りである：９８℃４５秒間の最初の変性、各３工程（９８℃１０秒間、６０℃３０秒間および７２℃３分間）からなる１０周期、７２℃３分間の最終伸張工程、およびサーマルサイクラーから試料を取り出すまでの４℃での浸漬。ＰＣＲ増幅が完了した後、試料をサーマルサイクラーから取り出し、完全に混合し、そして４０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、第一段階増幅産物を提供する。
【００７６】
第二段階増幅：
[0087]第二段階の増幅で用いるプライマーは、第一段階の増幅プライマーの保存された部分に相同性を持つ単一のプライマーである。第二段階のプライマーは、対の混合物として調製され、各々、等モル量の２つのプライマーを含有し、そして２０μＭの総プライマー濃度を含有する。
【００７７】
[0088]第二段階ＰＣＲ反応混合物を５０μｌ総体積中にセットアップし、そして以下の構成要素から混合する：１０μｌ  ５ｘ Phusion（登録商標）ＨＦ緩衝剤、１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ、２２μｌ脱イオンＨ２Ｏ、１０μｌ第一段階反応産物、６μｌ第二段階プライマー混合物（２０μＭ）および１μｌ  PhusionＴＭホットスタートＩＩ熱安定性ポリメラーゼ（２単位／μｌ）。ＰＣＲサイクリング条件は以下の通りである：９８℃４５秒間の最初の変性、各２工程（９８℃２０秒間および７２℃３分間）からなる２５周期、７２℃３分間の最終伸張工程、およびサーマルサイクラーから取り出すまでの４℃での浸漬。
【００７８】
[0089]ＰＣＲ増幅が完了した後、試料をサーマルサイクラーから取り出し、完全に混合し、そして４０００ｒｐｍで１分間遠心分離する。
[0090]試料のより効率的な下流プロセシングを可能にするため、８試料を１つにプールすることによって、１９２多重ＰＣＲ試料を２４のより大きいプールに統合する。各多重ＰＣＲ反応中の産物の量をまず定量化して、異なるサイズの断片コレクションの等モルプールを可能にする。これは、各多重反応に対してゲル電気泳動を行い、そして予期されるサイズの各バンド中の蛍光を定量化することによって、あるいはApplied Biosystems（登録商標）３７３０  ＤＮＡ分析装置またはQIAGEN（登録商標）QIAxcel（登録商標）装置などのキャピラリー電気泳動によってのいずれかで、行う。各多重プールの平均サイズを考慮に入れ、一緒にプールされて、プールに添加される各産物の等モル量を生じる、各多重ＰＣＲ反応の相対量を計算するために、各多重反応中の望ましい産物の濃度を用いる。産物をサイズによってグループ分けし、そしてプールして、下流ＰＣＲ増幅における増幅バイアスを最小限にする。
【００７９】
[0091]１９２多重反応を、以下のように２４のより大きいプールに合わせる。大プール１：多重プール１〜８；大プール２：多重プール９〜１６；大プール３：多重プール１７〜２４；大プール４：多重プール２５〜３２；大プール５：多重プール３３〜４０；大プール６：多重プール４１〜４８；大プール７：多重プール４９〜５６；大プール８：多重プール５７〜６４；大プール９：多重プール６５〜７２；大プール１０：多重プール７３〜８０；大プール１１：多重プール８１〜８８；大プール１２：多重プール８９〜９６；大プール１３：多重プール９７〜１０４；大プール１４：多重プール１０５〜１１２；大プール１５：多重プール１１３〜１２０；大プール１６：多重プール１２１〜１２８；大プール１７：多重プール１２９〜１３６；大プール１８：多重プール１３７〜１４４；大プール１９：多重プール１４５〜１５２；大プール２０：多重プール１５３〜１６０；大プール２１：多重プール１６１〜１６８；大プール２２：多重プール１６９〜１７６；大プール２３：多重プール１７７〜１８４；および大プール２４：多重プール１８５〜１９２。構成要素ＯＲＦのサイズに基づいて、各大プールの生じた平均ＯＲＦサイズ（添加されるプライマー配列を伴うおよび伴わない）を計算する。
【００８０】
[0092]ひとたびプーリングが完了したら、製造者の推奨にしたがって、シリカ樹脂カラムまたはMacherey Nagel NucleoSpin（登録商標）９６ＰＣＲクリーンアップキットなどのプレートを用いて、１０μｇの望ましい産物総量に対応する各ＯＲＦ大プールの量を精製する。精製ＰＣＲ産物の溶出後、各試料を完全に混合し、そしてその濃度を分光光度測定で決定する。
【００８１】
[0093]４８の大プールから望ましくないサイズの産物およびプライマー二量体を取り除くため、２μｇの各プールを１％アガロースゲル上で電気泳動し、そしてエチジウムブロミドで染色し、バンドをＵＶまたは青い光の下で視覚化し、そしてより大きいプール各々の正しいサイズに対応するゲル断片をゲルから切り出す。ゲル断片の重量を測定し、そして製造者の推奨にしたがって、Macherey Nagel NucleoSpin（登録商標）ゲルおよびＰＣＲクリーンアップキットなどのシリカ樹脂ゲル精製法を用いて、そこからＤＮＡを精製する。精製が完了したら、すべての試料の濃度を分光光度測定で決定し、そして精製第二段階大プール増幅産物各々の濃度を、第三段階増幅のため、１０ｎｇ／μＬに調整する。
【００８２】
第三段階増幅
[0094]第三段階増幅は、各ＰＣＲ産物に最終配列を付加して、末端相同性によって効率的な組み立てを可能にし、そして各大プールの量を増加させる。第三段階増幅に用いるプライマーは、第一段階および第二段階増幅プライマーの保存された部分に相同性を持つ単一プライマーである。第三段階プライマーは、対の混合物として調製され、各々、等モル量の２つのプライマーを含有し、そして２０μＭの総プライマー濃度を含有する。
【００８３】
[0095]第三段階ＰＣＲ反応混合物を５０μｌ総体積中にセットアップし、そして以下の構成要素から混合する：１０μｌ  ５ｘ Phusion（登録商標）ＨＦ緩衝剤、１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ、２２μｌ脱イオンＨ２Ｏ、１０μｌゲル精製したプール第二段階反応産物（１０ｎｇ／μｌ）、６μｌ第三段階プライマー混合物（２０μＭ）および１μｌ  Phusion（登録商標）ホットスタートＩＩ熱安定性ポリメラーゼ（２単位／μｌ）。ＰＣＲサイクリング条件は以下の通りである：９８℃４５秒間の最初の変性、各２工程（９８℃２０秒間および７２℃３分間）からなる２５周期、７２℃３分間の最終伸張工程、およびサーマルサイクラーから取り出すまでの４℃での浸漬。
【００８４】
[0096]第三段階増幅が完了した後、試料を完全に混合し、遠心分離し、そして製造者の推奨にしたがって、Macherey Nagel NucleoSpin（登録商標）９６  ＰＣＲクリーンアップキットなどのシリカ樹脂精製を用いて、精製する。溶出後、各試料を完全に混合し、そしてその濃度を分光光度で測定する。
【００８５】
[0097]より効率的な下流プロセシングのため、次いで、４つの最小の大プールを１つのスーパープールに合わせ、そして５つの大プールの続くセットを合わせて、さらなるスーパープールを形成することによって、２４の大プールを５つの「スーパープール」に統合する。各スーパープールに添加される各大プールの相対量は、第三段階増幅および精製後の各大プールの最終濃度、ならびに各大プールの最終平均サイズ（プライマーによって付加される配列を含む）と、等モル量の各大プールを各スーパープールに添加する目的とを考慮することによって、計算される。
【００８６】
[0098]この実施例の先の工程におけるように、スーパープールをＯＲＦサイズに基づいて調製し、同様のサイズのＯＲＦのより大きいプールを同じスーパープールにグループ分けする。挿入物サイズに基づくクローニングバイアスを最小限にするため、各々の場合に、クローニングベクターと一緒に、５’ＯＲＦの各サイズプールを３’ＯＲＦの各サイズプールと対で合わせることによって、サイズ分画を別個に発現ベクターにクローニングする。
【００８７】
ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・ライブラリー構築
[0099]増幅およびスーパープールへのプーリング後、ＯＲＦの相対濃度を、ＤＮＡ分子のモル濃度（質量濃度ではなく）に関して規準化する。上述のような個々のまたはプールされたＰＣＲ増幅によって生成されたＯＲＦコレクションに添加される、他の生物由来のクローニングされたポリヌクレオチドまたはＯＲＦ由来のＯＲＦを含めた、特定のＯＲＦを、多様な量でＯＲＦコレクションに添加してもよい。例えば、特定のＯＲＦを、他のＯＲＦの濃度に対応するモル量で、あるいは最終ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・ライブラリー内の提示を変化させる、より低いまたはより高い量で、添加する。例えば、ストレス耐性を与える特定のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、大腸菌におけるストレス許容性を与える特に高い可能性を有すると推測される場合、ＯＲＦコレクション中にこの配列を過剰提示して、大部分のまたはすべてのランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの組み合わせが、この優先される配列とともに試験されることを確実にすることも可能である。
【００８８】
[00100]２つのＯＲＦのｐＵＣ１９発現ベクター分子内への一工程組み立ては、各断片の５’および３’端に位置し、そして図３に示す環状の組み立てられた産物の構造を特定する、保存された／相同配列によって指示される。多数の方法のいずれか１つを用いて、この相同性依存性組み立てを達成することも可能であり、これらのすべては、相同一本鎖ＤＮＡ端のアニーリングに基づくクローニング法、例えばリンカーテーリング法（Lathe 1984）またはＤＮＡ分子の末端の相補的ホモポリマー性一本鎖テールに依存する方法（Lobban 1973）に由来する。さらに、現代の相同性依存性クローニング技術は、１９９０年代初期に記載される連結独立性クローニング法（Aslanidis 1990、Aslanidis 1994）に概念的に関連する。こうした相同性依存性クローニング法には、限定されるわけではないが：融合内クローニング（Zhu 2007、Irwin 2012）、配列および連結独立性クローニング（ＳＬＩＣ、Li 2007、Li 2012）、迅速クローニング（Li 2011）、環状ポリメラーゼ伸張クローニング（Quan 2009、Quan 2011）、ギブソン組み立て法（Gibson 2009、Gibson 2010）、迅速およびクリーンクローニング（Thieme 2011）およびその他（Vroom 2008）が含まれる。
【００８９】
[00101]in vitroで、５つの５’および５つの３’ＯＲＦスーパープールの各組み合わせを用いて、総数２５の組み立て反応に関して、ライブラリー組み立てを行う。各反応において、１５０ｆｍｏｌの５’ＯＲＦスーパープールＤＮＡおよび１５０ｆｍｏｌの３’ＯＲＦスーパープールＤＮＡ（平均サイズに基づくモル濃度）を、７５ｆｍｏｌのＰＣＲ増幅単一断片ｐＵＣ１９ベクターＤＮＡ（配列番号２５１２６）と合わせる。ＤＮＡ混合物の体積を１０μｌに調整し、これに１０μｌの組み立て混合物（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各０．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、２０ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭニコチンアミドアデニン二ヌクレオチド、０．０２単位／μｌ  Ｔ５エキソヌクレアーゼ、０．０５単位／μｌ  Phusion（登録商標）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、０．４単位／μｌ  Ｔａｑリガーゼ）を添加する。反応を穏やかに混合し、そして５０℃で１〜２時間インキュベーションする。次いで、反応を氷上に維持するか、または大腸菌形質転換に使用する前に凍結する。
【００９０】
[00102]このin vitro組み立て法を記載するように実行するか、またはこの方法に適している可能性もあるエキソヌクレアーゼ活性を持つ他の酵素、例えばＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、ラムダエキソヌクレアーゼ、Ｔ５エキソヌクレアーゼまたはＴ７エキソヌクレアーゼを用いて行ってもよい。活性の５’から３’の方向性を持つエキソヌクレアーゼ（すなわちＴ４ポリメラーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、Ｔ５エキソヌクレアーゼまたはＴ７エキソヌクレアーゼ）は、各クローニング接合部の２つのニックの間に、より多数のアニーリング配列塩基対を生じ、したがって、望ましい産物を安定化させるため、こうしたエキソヌクレアーゼが好ましい。Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼを添加せずに、この方法を実行して、満足出来る結果を得ることも可能である。反応に、最終濃度５〜１０％でポリエチレングリコール（分子量４０００〜１００００）を補充して、一本鎖ＤＮＡ端のアニーリングを促進することも可能である。しかし、上述のような十分に高いＤＮＡ濃度が与えられていれば、ＰＥＧは必要ではない。
【００９１】
[00103]１μｌの組み立て反応と２５μｌのエレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ細胞（Life Technologies社）またはＥＣ１００細胞（Epicentre Technologieｓ）を氷上で混合することによって、エレクトロポレーションによって組み立て反応を大腸菌に形質転換する。次いで、細胞／ＤＮＡ混合物を１ｍｍギャップ幅エレクトロポレーション・キュベット内に移し、そしてBio-Rad Micropulserエレクトロポレーターを用いて、１．５ｋＶでエレクトロポレーションする。細胞を１ｍｌ  ＬＢブロス中に再懸濁し、１０ｍｌ培養試験管中、℃で１時間、２５０ｒｐｍで培養し、そして５０〜１００μｇ／μｌカルベニシリンを含有するＬＢ寒天上にプレーティングする。組み立て反応を、エタノールでのＤＮＡ沈殿によって、または微小透析によって、または製造者の推奨にしたがってBio-Rad Micro Bio-Spin P6ゲルカラムを通じて遠心分離することによってのいずれかで、組み立て反応を脱塩することによって、形質転換効率を改善することも可能である。
【００９２】
ライブラリー形質転換およびスクリーニング
[00104]組み立て後、大腸菌内への形質転換のため、異なるライブラリーをプールして、扱う必要がある形質転換および試料の総数を減少させる。特定のＯＲＦプールの組み立てから生じる別個の連結／ライブラリーは、ほぼ５’ＯＲＦの数ｘ３’ＯＲＦの数ｘ２に対応する配列組み合わせの数を含有する。例えば、１０００の５’ＯＲＦを１０００の３’ＯＲＦと組み合わせる場合、総数２００万の組み合わせがある。典型的には、スクリーニングプロジェクトの目的は、ＤＮＡプールの中に等しい配列提示があると仮定して、形質転換体間で各組み合わせが提示される＞９０％の可能性を達成するために、ライブラリー複雑性の３倍多いクローンまたは形質転換体をスクリーニングすることである。上記の例では、これは、６００万の形質転換体を選択するかまたはスクリーニングする必要があることを意味する。
【００９３】
[00105]ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを含有する、プールされたライブラリーを大腸菌の実験室株に形質転換し、プラスミドの存在に関して選択し、そしてコードされるランダム化融合ペプチドまたはポリペプチドを発現することを可能にする。形質転換体をＩＰＴＧまたはラクトースの存在下で固形培地上にプレーティングし、ｌａｃプロモーターからのランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの発現を誘導する。プレート上のコロニー増殖を監視し、改変された増殖および耐性特性を持つコロニーのスクリーニングまたは選択を可能にする。固形培地上で選択またはスクリーニング可能な特質には、限定されるわけではないが：増殖率（細胞数または細胞量のいずれかまたは両方の増加率）、増殖収率（培養が定常期に到達した後の最終細胞密度または最終細胞量）、ストレス許容性（高温または低温あるいは高い浸透力の条件下で、増殖するかまたは生存する能力）および産物許容性（エタノールおよびブタノールなどの有機溶媒または毒性化学薬品の存在下で増殖するかまたは生存する能力）が含まれる。
【００９４】
[00106]あるいは、形質転換体をバルクで、液体培養中、細胞の多様なタイプの増殖および耐性特性に関して選択する条件下で培養する。固形培地上で選択またはスクリーニング可能な特質には、限定されるわけではないが：増殖率（細胞数または細胞量のいずれかまたは両方の増加率）、ストレス許容性（高温または低温あるいは高い浸透力の条件下で、増殖するかまたは生存する能力）および産物許容性（エタノールおよびブタノールなどの有機溶媒または毒性化学薬品の存在下で増殖するかまたは生存する能力）が含まれる。固形および液体培地を用いた選択およびスクリーニングの例を以下に提供する。
【００９５】
[00107]固形培地上での選択およびスクリーニングのため、ランダム化融合ポリペプチド・ライブラリーの形質転換後、形質転換体を、抗生物質を欠く液体培地中であらかじめ、３７℃で１時間培養する。次いで、抗生物質およびＩＰＴＧを液体培養に添加して、プラスミドの存在に関して選択し、そしてランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの発現を誘導し、そして形質転換体をさらに１時間培養する。次いで、培養を適切に希釈して、プレートあたりの形質転換体数をほぼ管理可能であるようにする（選択するかまたはスクリーニングする特質に応じて、１０ｃｍプレートあたり、およそ２０００〜２００００コロニー）。培養を固形培地上でプレーティングし、この組成は、選択する特質に応じ、例えばＬＢ寒天、または表１に列挙する添加物を含有するＬＢ寒天である。プレートを１２時間から数日インキュベーションし、そしてコロニー摘み取り、プラスミド単離、表現型検証および活性ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの性質決定のため、その時点で選択する（以下を参照されたい）。コロニー選択は、コロニーサイズ（増殖率および増殖収率を反映し、増殖率、低温増殖および増殖収率特性に影響を及ぼすポリヌクレオチドを同定するために用いられる）に基づいて、または陽性選択に基づいて、すなわち大多数の形質転換体がプレート上で増殖するのに失敗し、そして増殖するのが、関心対象のランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを含有するもののみである場合（高温、塩または有機溶媒の耐性に影響を及ぼすランダム化融合ポリヌクレオチドを同定するために用いられる）に基づいて行われる。
【００９６】
[00108]固形培地上のスクリーニングは、個々のクローンまたは形質転換体の可視化を可能にするため、より大きいコロニーとして明らかに可視である、迅速な増殖に寄与するランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを発現している形質転換体を同定するために、特に柔軟である。倍加時間の数パーセント程度の小さい相違が、定常期前のコロニーサイズの測定可能な相違を導きうる。例えば、３０分間の平均倍加時間の株の１２時間の増殖期間は、２４回の倍加を可能にし、一方、２８．５分間の、５％より迅速な平均倍加時間を持つ株は、２５．３回倍加し、コロニーサイズに明らかに反映される、細胞数の２．５倍の相違を導く。こうしたスクリーニングを任意の培地条件で行ってもよく、例えば、致死量以下の量の阻害剤、例えば塩、エタノールまたはブタノールの存在下で、あるいは致死量以下の高温または低温下で、増殖率に関してスクリーニングすることが可能である。
【００９７】
[00109]液体培地中の選択およびスクリーニングは、一般的に、バルク選択として行われる。ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・ライブラリーのコンピテント細胞への形質転換後、形質転換体を、抗生物質を欠く液体培地中であらかじめ、３７℃で１時間培養する。次いで、抗生物質およびＩＰＴＧを培養に添加して、プラスミドの存在に関して選択し、そしてランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの発現を誘導する。次いで、培養を、抗生物質およびＩＰＴＧを含有し、そして適切な場合、表１に列挙するものなどの選択剤を含有する新鮮な培地中、２〜１０倍希釈する。細胞に課される選択のタイプに応じて、培養は３７℃または選択する温度で、さらに１２時間から数日間、増殖することを可能にされる。その時点で、細胞を遠心分離によって採取し、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを含有するプラスミドＤＮＡを、標準的ミニプレッププラスミド単離法を用いて抽出し、次いでプラスミドを新鮮なコンピテント細胞バッチに導入し、そして選択を反復する。形質転換体を、個々の形質転換体の選択を可能にする固形培地上にプレーティングする前に、この方式で、２〜１０周期のバッチ選択を行った後、コロニーを摘み取り、プラスミドを単離し、表現型を検証し、そして活性融合ポリヌクレオチドの性質決定をしてもよい（下記参照）。
【００９８】
[00110]生存選択または迅速に分裂している細胞の選択のいずれかとして、液体中の選択を行ってもよい。致死濃度の選択剤（例えば塩、エタノールまたはブタノール）の存在下で、あるいは致死性の高温または低温で、そして特定の期間（一般的に６〜１２時間）、生存選択を行う。選択期間後、選択培養を新鮮な非選択性培地中で希釈するか、または温度を３７℃に戻して、いかなる生存細胞も正常増殖を再開することを可能にする。上述のように、生存細胞を含有するこの培養を増殖させ、プラスミドを抽出し、そして必要であれば、バッチ選択を反復する。
【００９９】
[00111]あるいは、液体培養中での選択を行って、致死量以下の濃度の選択剤（本実施例では、塩、エタノールまたはブタノール）の存在下で、あるいは致死性でない高温または低温で、迅速な増殖に関して選択する。この場合、選択条件下で維持された、形質転換体の液体培養は、対数中期（一般的に、選択条件の重度に応じて、増殖の６〜２４時間）までの増殖を可能にされる。この時点で、培養中の細胞の大部分は、生存していることが期待されるが、培養は、選択条件下で、正常で迅速な増殖が可能である細胞に関して濃縮されている。細胞を遠心分離によってペレットにし、プラスミドを抽出し、そして必要であれば、バッチ選択を反復する。
【０１００】
【表１】
2016501039.tif 000003
【０１０１】
活性ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドのプラスミド単離および表現型検証
[00112]望ましい増殖または許容性表現型を与えるランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを含有するクローンの単離後、個々のコロニーを小規模培養に置き、増殖させ、そしてそこからプラスミドを単離する。これは、小規模培養を含有する個々の試験管（１〜５ｍｌ）で、または１００〜２０００μｌの液体培地を含有する９６ウェルプレート中で行うことが可能である。標準的プラスミド単離法を用いて、各クローンからプラスミドＤＮＡを抽出する。必要な場合、制限消化ゲル電気泳動によってプラスミドＤＮＡを性質決定して、プラスミド構造およびランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド挿入物の存在を確認する。次いで、候補プラスミドを大腸菌内に再形質転換して、表現型を検証する。再形質転換は、選択に用いたものと同じ細菌株内、または異なる株内で行ってもよい。９６ウェルまたは３８４ウェル形式で、同じ時間および試薬で、再形質転換を行ってもよい。
【０１０２】
[00113]次いで、増殖または許容性表現型に関して、再形質転換を試験する。増殖率および増殖収率特性に関して、これは、形質転換体を低細胞密度でプレーティングし、そして対照形質転換体に比較して、生じたコロニーのサイズを観察するか、あるいは液体培養中で、選択条件を伴いまたは伴わず、倍加時間または細胞ペレットサイズを、対照株の増殖率に比較する工程を伴う。耐性表現型（温度、エタノールおよびブタノール）に関して、再スクリーニングは、形質転換体の固形培地上への複製プレーティング（すなわち９６ピンツールを用いたプレート上への９６ウェルプレートからの複製）および選択条件下での増殖を伴い、各形質転換の増殖の度合いを対照に比較する。あるいは、形質転換を液体培養中の選択条件に曝露した後、非選択固形培地上にピンツールによって複製して、生存コロニーの数に反映される、各培養中の細胞生存の度合いを評価する。
【０１０３】
[00114]特定の候補ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを、元来選択していた表現型の授与に関して、または別の表現型に関してのいずれかで、試験してもよい。細胞増殖およびストレス許容性に関連する多様な表現型は、交差反応性でありうる。例えば、温度耐性の授与に関して選択されるランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドはまた、塩耐性等も与えうる。多様な条件下でランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを徹底的に交差試験することによって、多様な非生物ストレス条件下で、細胞増殖を前進させる広範囲の能力を持つランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを発見することが可能である。
【０１０４】
[00115]上述のように、この実施例に記載するスクリーニングは、高コピー数のプラスミド、例えばｐＭＢ１複製起点を含有するものの使用に基づく。しかし、他のプラスミド系もまたこの研究に適切であり；ここで発見されたポリヌクレオチドの最大複製性のため、他のプラスミド型で試験することが有用である。例えば、Ｆ’に基づくプラスミド、例えばｐＢｅｌｏＢＡＣ１１（Shizuya 1992）を用い、高コピー数プラスミド上で用いられるものと同じプロモーターまたは異なるプロモーターセットを用いて、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを発現させることも可能である。
【０１０５】
陽性クローンの性質決定およびさらなるスクリーニング
[00116]最も劇的なまたは広い表現型を与えるランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド発現構築物を配列決定して、活性ポリヌクレオチドを同定する。結果を表にし、そして最適な融合ポリヌクレオチドを将来の研究のために選択する。別個のランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド内に反復して同定される配列を、ＯＲＦコレクションの部分として、将来のスクリーニングに用いる。望ましい表現型を与えることが可能なＯＲＦを含有することがすでに知られるランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを含有するＯＲＦコレクションは、大腸菌に関して上述する全ゲノムＯＲＦコレクションよりも小さい可能性もある。
【０１０６】
ＯＲＦコレクションのサイズを限定すると多くの利点があり、その最も重要なものは、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの生じるライブラリー中に提示される対の組み合わせの数がより小さいことである。より低い複雑性のライブラリーは、より複雑なライブラリーよりも、より迅速にそしてより安価にスクリーニング可能であり、そして可視スクリーニングおよび陽性選択を伴う、上に列挙したものより複雑な表現型に関してスクリーニング可能である。より低い複雑性のライブラリーはまた、（数千の数のＯＲＦコレクションから生じる）数千万の配列の組み合わせを含有するライブラリーをスクリーニングすることが現実的でないかまたは妥当に可能ではない可能性もあるが、（数百の数のＯＲＦコレクションから生じる）数十万の配列の組み合わせを含有するライブラリーをスクリーニングするために適している可能性もある、より低い形質転換効率を持つ生物における試験も可能にする。
【０１０７】
実施例２：サッカロミセス・セレビシエに熱、塩、ＵＶおよびブタノール許容性を与えることが可能なランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの単離
[00117]産生微生物の産物許容性特質は、発酵産物の最大収率および力価に寄与する重要な要因である（Ding 2009、Jia 2009、Dunlop 2011）。微生物が毒性化合物の存在下で耐性を示し、そして増殖し続ける能力は、多数の経路の大きな組の遺伝子に依存しており、遺伝子的に複雑である（Liu 2009、Dunlop 2011）。細菌、シアノバクテリアおよび酵母における産物許容性を操作する、以前の努力は、ある程度の成功を収めてきた（Alper 2006、Tomas 2003、Atsumi 2010、Dunlop 2011a、Liu 2012、Tian 2013）。耐性特質は、生成することが本質的に困難であり、そして生じる耐性株のいくつかは、より低い収率に苦しむ（Baer 1987、Zhao 2003、Atsumi 2010）。これは、問題の複雑さと組み合わされて、そして産物許容性のための解決の経路の必要性を強調し、これらをまず、個々に、そして次いで組み合わせて試験して、細胞増殖および産物力価に対する影響を決定することも可能である。ブタノールは、多くが高い毒性を有し、そして微生物におけるその産生が試みられ、そして最適化されている、中鎖燃料および化学薬品の代表であるため、この例のターゲットとして特徴付けられる（Dunlop 2011、Jang 2012、Lee 2012）。ブタノールは、多くの他の化学薬品の産生のために用いられる化学的原材料である（Mascal 2012）。
【０１０８】
配列同定およびＰＣＲプライマー設計：
[00118]サッカロミセス・セレビシエ遺伝子配列の完全コレクションを、酵母ゲノムウェブサイト上で入手可能な酵母株Ｓ２８８Ｃの参照配列に基づいて生成する。やはり酵母ゲノムウェブページ上で入手可能なこのゲノムの配列注釈は、各遺伝子の開始および停止コドンを同定するために用いられる。
【０１０９】
[00119]この特定の注釈は、総数６６０７のタンパク質コード遺伝子を列挙し、このうち５８２０が２，５９８ｂｐ以下の長さである。インプット配列として用いる遺伝子の長さは、２５０２ｂｐ、好ましくは２５９８ｂｐを上限とし、これは、生じるインフレーム融合ポリペプチドまたはタンパク質のＰＣＲ増幅成功および正しいフォールディングの可能性を増加させる。予備的分析において、すべての転位性要素遺伝子、シュード遺伝子、注釈に「疑わしい」と示されるＯＲＦ、および長さ１０２ｂｐ未満、好ましくは長さ９０ｂｐ未満のＯＲＦは、排除される。重複ＯＲＦは、ＡＴＧ開始コドンで始まる最初の２４ｂｐ、および停止コドンで終わる最後の２４ｂｐの同一配列の存在に基づいて排除される。目的が、出来る限り多くの酵母ＯＲＦを含める一方で、多数の同一ＰＣＲプライマー対の冗長な合成を回避することであるため、内部相同性は重複排除においては考慮されない。
【０１１０】
[00120]結果は、ＰＣＲ増幅用の５，０９５  ＯＲＦの最終コレクションである。この配列コレクションの平均の長さは１１４６ｂｐであり、そして長さ中央値は１０７４ｂｐである。これらのＯＲＦのサイズ分布を図５に示す。ＯＲＦを配列番号１〜配列番号５０１９に列挙する。
【０１１１】
[00121]各端から２４ｂｐのコード配列を含めて、各ＯＲＦの既知の開始コドンおよび停止コドンに基づいて、ＰＣＲプライマーを設計する。酵母ゲノムウェブサイト上で入手可能な酵母株Ｓ２８８Ｃの注釈に基づいて、コード領域の５’端にＡＴＧを欠く、いくつかの酵母ＯＲＦに、ＡＴＧ開始コドンを付加する。２つの異なるプライマーセットを各ＯＲＦに関して設計して、１つはＯＲＦを融合遺伝子の５’位にクローニングするため、そしてもう一方は３’位に配置するため、２つの異なるＰＣＲ産物が生成されるようにする。
【０１１２】
[00122]各プライマーは、２つの目的に役立つ５’端の１６塩基の保存配列を含有する。まず、過剰な配列は、互いに関して異なるＯＲＦの提示にバイアスを掛けることなく、コレクション中のすべてのＯＲＦを増幅することが可能な保存されたＰＣＲプライマー配列を用いたＯＲＦプールの効率的なＰＣＲ増幅を可能にする（Dahl 2005、Myllykangas 2011、Natsoulis 2011）。第二に、これらは発現ベクターに（酵母発現ベクターｐ４２６−ＧＡＬ１の誘導体（Funk 2002）、配列番号２５０９６）に、そしてランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・パートナー末端の保存された配列に、相同性を含有し、ベクター中のランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの迅速でそして効率的な相同性依存性組み立てを可能にする（図３を参照されたい）。各ＯＲＦの２つのアンプリコンは、停止コドンの存在（ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・ライブラリーの３’位に向けられるＯＲＦにのみ存在）および保存された隣接配列の存在のみが異なる。
【０１１３】
[00123]融合遺伝子の５’位に向けられるＯＲＦのすべての５’ＰＣＲプライマーに付加される、保存された配列は、GGATCCAGCTAGCAAA（配列番号２５０９９）である。融合遺伝子の５’位に向けられるＯＲＦのすべての３’  ＰＣＲプライマーに付加される、保存された配列は、CAGGAGCTGCACTTCC（配列番号２５１００）である。融合遺伝子の３’位に向けられるＯＲＦのすべての５’  ＰＣＲプライマーに付加される、保存された配列は、TGGAAGTGGTTCAGGA（配列番号２５１０１）である。融合遺伝子の３’位に向けられるＯＲＦのすべての３’  ＰＣＲプライマーに付加される、保存された配列は、AATTACATGACTCGAG（配列番号２５１０２）である。
【０１１４】
[00124]すべての５’ＯＲＦを増幅するために用いられる５’プライマーを、ＯＲＦと同じ順序で、配列番号５０２０から配列番号１００３８に列挙する。すべての５’ＯＲＦを増幅するために用いられる３’プライマーを、ＯＲＦと同じ順序で、配列番号１００３９から配列番号１５０５７に列挙する。すべての３’ＯＲＦを増幅するために用いられる５’プライマーを、ＯＲＦと同じ順序で、配列番号１５０５８から配列番号２００７６に列挙する。すべての３’ＯＲＦを増幅するために用いられる３’プライマーを、ＯＲＦと同じ順序で、配列番号２００７７から配列番号２５０９５に列挙する。したがって、配列番号１に列挙するＯＲＦを、５’位用に増幅する場合には配列番号５０２０および配列番号１００３９のプライマーでＰＣＲ増幅することが可能であり；３’位用に増幅する場合には、同じＯＲＦを配列番号１５０５８および配列番号２００７７のプライマーでＰＣＲ増幅することが可能である。配列番号２に列挙するＯＲＦを、５’位用に増幅する場合には配列番号５０２１および配列番号１００４０のプライマーでＰＣＲ増幅することが可能であり；３’位用に増幅する場合には、同じＯＲＦを配列番号１５０５９および配列番号２００７８のプライマーでＰＣＲ増幅することが可能である。配列番号３に列挙するＯＲＦを、５’位用に増幅する場合には配列番号５０２２および配列番号１００４１のプライマーでＰＣＲ増幅することが可能であり；３’位用に増幅する場合には、同じＯＲＦを配列番号１５０６０および配列番号２００７９のプライマーでＰＣＲ増幅することが可能である。以下同様である。
【０１１５】
[00125]融合遺伝子中の５’位に向けられるＯＲＦの３’ＰＣＲプライマー中の５’末端１６ヌクレオチド、および融合遺伝子中の３’位に向けられるＯＲＦの５’ＰＣＲプライマー中の５’末端１６ヌクレオチドは、２つのＯＲＦを分離するリンカー配列の一部を形成する。この６０ｂｐリンカー配列（配列番号２５１０３）は、融合遺伝子中の２つのＯＲＦを連結する際に他の研究者が用いる配列（Arai 2001、Eldridge 2009、Wang 2010）に大まかに基づく、グリシン、セリンおよびアラニンが豊富な２０アミノ酸ペプチド（配列番号２５１０４）をコードする。このリンカー配列は、ＰＣＲ増幅の第二のまたは保存される段階で完全にコードされ（以下を参照されたい）、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの５’位に向けられるＯＲＦの３’端およびランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの３’位に向けられるＯＲＦの５’端に、保存されたコード配列の付加を生じる。
【０１１６】
[00126]１つは融合遺伝子の５’位そしてもう一方は３’位である、酵母ＯＲＦの２つの完全なセットが生成される必要があるため、以下に記載するすべての方法は、２つのＯＲＦ位に関して、２つ組で行われる。
【０１１７】
ＰＣＲ増幅のためのゲノムＤＮＡ：
[00127]選択したサッカロミセス・セレビシエ遺伝子を株Ｓ２８８ＣからＰＣＲ増幅する。この株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ワールドワイドウェブ上、ＡＴＣＣ：エラー。ハイパーリンク参照は有効でない）から入手可能であり、そして関心対象の遺伝子およびポリヌクレオチドを増幅可能である高純度ゲノムＤＮＡの供給源として用いられる。
【０１１８】
[00128]高純度ゲノムＤＮＡを生成するため、商業的に入手可能な酵母ゲノムＤＮＡ精製キット、例えばZymo Research社YeaStarＴＭゲノムＤＮＡキットを、さらなるクリーンアップ工程とともに用いて、十分な純度のゲノムＤＮＡを生成する。５０ｍｌ  ＹＰＤ培地（培地１リットルあたり：２０ｇ  Difco BactoＴＭペプトン、１０ｇ  BactoＴＭ酵母エキスおよび２０ｇグルコース）に、プレートまたは液体培養由来のＳ２８８Ｃ細胞を接種することによって、Ｓ．セレビシエ株Ｓ２８８Ｃの５０ｍｌ培養を生成し、そして３０℃で振盪しながら２日間増殖させる。細胞を３０００ｇで５分間遠心分離し、そしてキットとともに供給される３．５ｍｌ  ＹＤ消化緩衝液中に再懸濁し；次いで、キットとともに供給される１５０μｌのザイモリアーゼ溶液を添加し、そして細胞懸濁物を混合する。細胞懸濁物を３７℃で振盪せずに１．５時間インキュベーションする。次いで、３．５ｍｌのＹＤ溶解緩衝液（およびここ）を添加し、そして溶液を完全に混合する。
【０１１９】
[00129]細胞溶解物に７．５ｍｌのクロロホルムを添加し、２分間激しく混合し、そして４０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって、有機抽出を実行する。上清を新鮮な５０ｍｌ試験管内に取り除き、そしてZymo Research社YeaStarＴＭゲノムＤＮＡキットの１０のスピンカラムに分配して、QIAGEN（登録商標）ＱIAvac 24 Plus真空マニホールド内に挿入する。真空を用いて、溶解物をカラムに抜き取り、これを次いで、３００μｌ  ＤＮＡ洗浄緩衝液で２回洗浄する。スピンカラムをマニホールドから取り除き、キャッチ試験管内に挿入し、そして１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、残渣エタノールを取り除く。ゲノムＤＮＡを１００μｌ  ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、０．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に溶出させ、そしてすべての溶出物をプールする（〜総量１．０ｍｌ）。等体積の２５：２４：１フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで１回、そして等体積のクロロホルムで１回抽出することによって、ＤＮＡ調製物をさらに精製する。１／１０体積の３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．０および２．５体積のエタノールを添加することによって、ゲノムＤＮＡを沈殿させる。試験管を１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ペレットを８００μｌの７０％エタノールで１回洗浄し、そして再び５分間遠心分離し；上清を吸引によって取り除き、そしてペレットを２００μｌ  ＴＥ緩衝液中に溶解する。ＤＮＡ濃度を分光光度測定で決定し、そしてＴＥ緩衝液を添加することによって、ＤＮＡ濃度を１０ｎｇ／μｌに調整する。
【０１２０】
遺伝子増幅：
[00130]時間および試薬を節約するため、ＯＲＦを各２６〜２７のＯＲＦの１９２プール中でＰＣＲ増幅する（１９２プールｘ平均２６．１４  ＯＲＦ＝総数５０１９  ＯＲＦ；これは、各２７プライマー対を含有する２７プール、および各２６プライマー対を含有する１６５プールに対応する）。ＰＣＲ増幅の効率は、非常にサイズ依存性であるため、そしてＰＣＲ伸張時間はアンプリコンのサイズに依存するため、ＯＲＦをサイズによってプールにグループ分けする。各多重プールの平均ＯＲＦサイズは、表２に以下に示すとおりである。
【０１２１】
表２：サッカロミセス・セレビシエ多重ＯＲＦプールの平均ＯＲＦ長
【０１２２】
【表２】
2016501039.tif 000004
【０１２３】
[00131]ＰＣＲ増幅を３工程で行う：１）遺伝子特異的プライマーを用いた最初の増幅、その後、２）保存されたプライマーを用いた各ＯＲＦプールの増大、その後、さらなるプーリング、ゲル上でのサイズ選択、および３）最終長ＰＣＲ産物を生じる第三の増幅工程。３つの増幅工程は、それぞれ、第一段階、第二段階および第三段階増幅と称される。
【０１２４】
[00132]PhusionＴＭホットスタートＩＩ熱安定性高忠実度ポリメラーゼ（Thermo ScientificＴＭ）を用いて、すべてのＰＣＲ増幅を行う。５ｘＨＦ増幅緩衝液とともに酵素を供給し、すべての反応に用いる。増幅は、以下に示すように、２０μＬまたは５０μＬ反応体積で行う。すべての増幅を、９６ウェルブロックを含有するＴ１００サーマルサイクラー（Bio-Rad Laboratories）上で行う。すべての増幅で用いるデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）は、各ｄＮＴＰ  １０ｍＭを含有するストックであり、やはりThermo Scientific（登録商標）より得られる。すべての反応に脱イオン水を用い、そしてポリメラーゼとともに供給されないすべての溶液を作るためにも脱イオン水を用いる。
【０１２５】
[00133]すべてのＰＣＲ増幅は、同じ一般的な方法にしたがう：
[00134]１．  ＰＣＲ反応の各段階のため、以下に記載するようなＰＣＲ混合物を調製し、そしてサーマルサイクラーに挿入するまで低温で維持する。
【０１２６】
[00135]２．  試料を完全に混合し、そして次いで、４０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、試験管またはプレートウェルの底に反応産物を集める。
[00136]３．  プレートまたは試験管をサーマルサイクラー内に挿入する。
【０１２７】
第一段階増幅：
[00137]上述のような配列特異的ＰＣＲプライマープールを用いて、第一段階増幅を行う。反応あたり２μＬの１０ｎｇ／μＬサッカロミセス・セレビシエ株Ｓ２８８ＣゲノムテンプレートＤＮＡを用いて、２０μＬ総体積中、各増幅を行う。各反応に、１００μＭストックから２．５μＬプライマープールを添加して、１２．５μＭの最終総プライマー濃度を提供する。各プライマープールは、２６または２７プライマー対のいずれかを含有し；そして最終の個々のプライマー濃度は、およそ０．２３〜０．２４μＭである。
【０１２８】
[00138]第一段階のＰＣＲ反応混合物は、２０μｌ総体積中で設定され、そして以下の構成要素から混合される：４μｌ  ５ｘ Phusion（登録商標）ＨＦ緩衝剤、０．４μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０．７μｌ脱イオンＨ２Ｏ、２μｌ  １０ｎｇ／μｌ酵母ゲノムテンプレートＤＮＡ、２．５μＬプライマープール（１００μＭ）、０．４μｌ  PhusionＴＭホットスタートＩＩ熱安定性ポリメラーゼ（２単位／μｌ）。ＰＣＲサイクリング条件は以下の通りである：９８℃４５秒間の最初の変性、各３工程（９８℃１０秒間、６０℃３０秒間および７２℃３分間）からなる１０周期、７２℃３分間の最終伸張工程、およびサーマルサイクラーから試料を取り出すまでの４℃での浸漬。ＰＣＲ増幅が完了した後、試料をサーマルサイクラーから取り出し、完全に混合し、そして４０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、第一段階増幅産物を提供する。
【０１２９】
第二段階増幅：
[00139]第二段階の増幅で用いるプライマーは、第一段階の増幅プライマーの保存された部分に相同性を持つ単一のプライマーである。融合遺伝子中の５’位に向けられるＯＲＦを増幅するために用いた第二段階プライマーはＰＧ００８５（配列番号２５１０５）およびＰＧ００９５（配列番号２５１０６）である。融合遺伝子中の３’位に向けられるＯＲＦを増幅するために用いた第二段階プライマーはＰＧ００９６（配列番号２５１０７）およびＰＧ００８８（配列番号２５１０８）である。第二段階のプライマーは、対の混合物として調製され、各々、等モル量の２つのプライマーを含有し、そして２０μＭの総プライマー濃度を含有する。上に列挙するように、５’ＯＲＦプライマー混合物は、プライマーＰＧ００８５およびＰＧ００９５を含有し；３’ＯＲＦプライマー混合物は、プライマーＰＧ００９６およびＰＧ００８８を含有する。
【０１３０】
[00140]第二段階ＰＣＲ反応混合物を５０μｌ総体積中にセットアップし、そして以下の構成要素から混合する：１０μｌ  ５ｘ Phusion（登録商標）ＨＦ緩衝剤、１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ、２２μｌ脱イオンＨ２Ｏ、１０μｌ第一段階反応産物、６μｌ第二段階プライマー混合物（２０μＭ）および１μｌ  PhusionＴＭホットスタートＩＩ熱安定性ポリメラーゼ（２単位／μｌ）。ＰＣＲサイクリング条件は以下の通りである：９８℃４５秒間の最初の変性、各２工程（９８℃２０秒間および７２℃３分間）からなる２５周期、７２℃３分間の最終伸張工程、およびサーマルサイクラーから取り出すまでの４℃での浸漬。
【０１３１】
[00141]ＰＣＲ増幅が完了した後、試料をサーマルサイクラーから取り出し、完全に混合し、そして４０００ｒｐｍで１分間遠心分離する。
[00142]試料のより効率的な下流プロセシングを可能にするため、８試料を１つにプールすることによって、１９２多重ＰＣＲ試料を２４のより大きいプールに統合する。各多重ＰＣＲ反応中の産物の量をまず定量化して、異なるサイズの断片コレクションの等モルプールを可能にする。これは、各多重反応に対してゲル電気泳動を行い、そして予期されるサイズの各バンド中の蛍光を定量化することによって、あるいはApplied Biosystems（登録商標）３７３０  ＤＮＡ分析装置またはQIAGEN（登録商標）QIAxcel（登録商標）装置などのキャピラリー電気泳動によってのいずれかで、行う。各多重プールの平均サイズを考慮に入れ、一緒にプールされて、プールに添加される各産物の等モル量を生じる、各多重ＰＣＲ反応の相対量を計算するために、各多重反応中の望ましい産物の濃度を用いる。産物をサイズによってグループ分けし、そしてプールして、下流ＰＣＲ増幅における増幅バイアスを最小限にする。
【０１３２】
[00143]１９２多重反応を、以下のように２４のより大きいプールに合わせる。大プール１：多重プール１〜８；大プール２：多重プール９〜１６；大プール３：多重プール１７〜２４；大プール４：多重プール２５〜３２；大プール５：多重プール３３〜４０；大プール６：多重プール４１〜４８；大プール７：多重プール４９〜５６；大プール８：多重プール５７〜６４；大プール９：多重プール６５〜７２；大プール１０：多重プール７３〜８０；大プール１１：多重プール８１〜８８；大プール１２：多重プール８９〜９６；大プール１３：多重プール９７〜１０４；大プール１４：多重プール１０５〜１１２；大プール１５：多重プール１１３〜１２０；大プール１６：多重プール１２１〜１２８；大プール１７：多重プール１２９〜１３６；大プール１８：多重プール１３７〜１４４；大プール１９：多重プール１４５〜１５２；大プール２０：多重プール１５３〜１６０；大プール２１：多重プール１６１〜１６８；大プール２２：多重プール１６９〜１７６；大プール２３：多重プール１７７〜１８４；および大プール２４：多重プール１８５〜１９２。各大プールの生じた平均ＯＲＦサイズ（添加されるプライマー配列を伴わない）を計算する。
【０１３３】
[00144]ひとたびプーリングが完了したら、製造者の推奨にしたがって、シリカ樹脂カラムまたはMacherey Nagel NucleoSpin（登録商標）９６  ＰＣＲクリーンアップキットなどのプレートを用いて、１０μｇの望ましい産物総量に対応する各ＯＲＦ大プールの量を精製する。精製ＰＣＲ産物の溶出後、各試料を完全に混合し、そしてその濃度を分光光度測定で決定する。図７は、４８の精製サッカロミセス・セレビシエ５’および３’ＯＲＦの、より大きいプール各々を含むアガロースゲルを示す。
【０１３４】
[00145]４８の大プールから望ましくないサイズの産物およびプライマー二量体を取り除くため、２μｇの各プールを１％アガロースゲル上で電気泳動し、そしてエチジウムブロミドで染色し、バンドをＵＶまたは青い光の下で視覚化し、そしてより大きいプール各々の正しいサイズに対応するゲル断片をゲルから切り出す。ゲル断片の重量を測定し、そして製造者の推奨にしたがって、Macherey Nagel NucleoSpin（登録商標）ゲルおよびＰＣＲクリーンアップキットなどのシリカ樹脂ゲル精製法を用いて、そこからＤＮＡを精製する。精製が完了したら、すべての試料の濃度を分光光度測定で決定し、そして精製第二段階大プール増幅産物各々の濃度を、第三段階増幅のため、１０ｎｇ／μＬに調整する。
【０１３５】
第三段階増幅：
[00146]第三段階増幅は、各ＰＣＲ産物に最終配列を付加して、末端相同性によって効率的な組み立てを可能にし、そして各大プールの量を増加させる。第三段階の増幅で用いるプライマーは、第一段階および第二段階の増幅プライマーの保存された部分に相同性を持つ単一のプライマーである。融合遺伝子中の５’位に向けられるＯＲＦを増幅するために用いた第三段階プライマーはＰＧ００５５（配列番号２５１０９）およびＰＧ０００３（配列番号２５１１０）である。融合遺伝子中の３’位に向けられるＯＲＦを増幅するために用いた第三段階プライマーはＰＧ０００４（配列番号２５１１１）およびＰＧ０００６（配列番号２５１１２）である。第三段階のプライマーは、対の混合物として調製され、各々、等モル量の２つのプライマーを含有し、そして２０μＭの総プライマー濃度を含有する。上に列挙するように、５’ＯＲＦプライマー混合物は、プライマーＰＧ００５５およびＰＧ０００３を含有し、一方、３’ＯＲＦプライマー混合物は、プライマーＰＧ０００４およびＰＧ０００６を含有する。
【０１３６】
[00147]第三段階ＰＣＲ反応混合物を５０μｌ総体積中にセットアップし、そして以下の構成要素から混合する：１０μｌ  ５ｘ Phusion（登録商標）ＨＦ緩衝剤、１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ、２２μｌ脱イオンＨ２Ｏ、１０μｌゲル精製したプール第二段階反応産物（１０ｎｇ／μｌ）、６μｌ第三段階プライマー混合物（２０μＭ）および１μｌ  Phusion（登録商標）ホットスタートＩＩ熱安定性ポリメラーゼ（２単位／μｌ）。ＰＣＲサイクリング条件は以下の通りである：９８℃４５秒間の最初の変性、各２工程（９８℃２０秒間および７２℃３分間）からなる２５周期、７２℃３分間の最終伸張工程、およびサーマルサイクラーから取り出すまでの４℃での浸漬。
【０１３７】
[00148]第三段階増幅が完了した後、試料を完全に混合し、遠心分離し、そして製造者の推奨にしたがって、Macherey Nagel NucleoSpin（登録商標）９６  ＰＣＲクリーンアップキットなどのシリカ樹脂精製を用いて、精製する。溶出後、各試料を完全に混合し、そしてその濃度を分光光度で測定する。
【０１３８】
[00149]より効率的な下流プロセシングのため、次いで、４つの最小の大プールを１つのスーパープールに合わせ、そして５つの大プールの続くセットを合わせて、さらなるスーパープールを形成することによって、２４の大プールを５つの「スーパープール」に統合する。各スーパープールに添加される各大プールの相対量は、第三段階増幅および精製後の各大プールの最終濃度、ならびに各大プールの最終平均サイズ（プライマーによって付加される配列を含む）と、等モル量の各大プールを各スーパープールに添加する目的とを考慮することによって、計算される。表３は、大プールおよびスーパープール各々におけるＯＲＦの平均サイズを列挙する。ＯＲＦサイズは、純粋ＯＲＦサイズおよびＰＣＲ増幅中にプライマーによって付加される配列を含む最終ＰＣＲ断片サイズの両方として提供される。
【０１３９】
表３：サッカロミセス・セレビシエＯＲＦ大プールおよびスーパープールにおける平均ＯＲＦサイズ
【０１４０】
【表３】
2016501039.tif 000005
【０１４１】
[00150]例えばハイスループットIllumina（登録商標）またはIon Torrent（登録商標）配列決定系を用いた多重化短区画読み取り配列決定によって、ＰＣＲ産物の増幅プールを分析して、各増幅反応中のＯＲＦの相対存在量を決定する。
【０１４２】
[00151]この特定の例において、第一段階および第二段階多重ＰＣＲ増幅から生じる個々のＯＲＦの相対量を決定するため、総数４１８  ＯＲＦを含む１６の多重プール（プール番号８、１７、２８、４１、５６、７０、８６、１０１、１１３、１２５、１３６、１４６、１５６、１６４、１７１、１７８）に対して３’ＯＲＦの試験増幅を行い、そして総数４１９  ＯＲＦを含む１６の多重プール（プール番号７、１６、２７、４０、５５、６９、８５、１００、１１２、１２４、１３５、１４５、１５５、１６３、１７０、１７７）に対して、５’ＯＲＦの試験増幅を行った。１６の多重プールの各群の第二段階増幅産物を上記のように調製し、そして合わせて、そしてIon TorrentＴＭ  Ion 318ＴＭチップを用いて配列決定した。ＣＬＣゲノムワークベンチ配列分析ソフトウェア（CLC Bio（登録商標））を用いて、これらのプールにおけるターゲットＯＲＦ配列に、１６の多重プールの各組み合わせから得られる配列を整列させることによって、結果を分析した。３’ＯＲＦ多重プールにおいて、３９５／４１８（９４％）のＯＲＦが少なくとも単一の配列反応によって検出され、そして非常に少数の読み取り値によって含まれる外れ値を排除した後、３７４／４１８  ＯＲＦ（８９％）が、妥当なレベルで提示された。５’ＯＲＦ多重プールにおいて、４０５／４１９（９７％）のＯＲＦが少なくとも単一の配列反応によって検出され、そして非常に少数の読み取り値によって含まれる外れ値を排除した後、３８６／４１９  ＯＲＦ（９２％）が、妥当なレベルで提示された。多重化ＰＣＲ戦略から予期されるように、各プール中の個々のＯＲＦの提示は変動し：３’ＯＲＦ多重プール間の平均標準偏差は平均読み取り値の７５％であり、そしてこの数値は、外れ値を排除すると６２％に低下した。５’ＯＲＦ多重プール間の平均標準偏差は平均読み取り値の６９％であり、そして５’ＯＲＦ間で、この数値は、外れ値を排除すると６０％に低下した。これらの結果は、各試料内の高い割合のＯＲＦの多重化増幅成功を示し、これらのＯＲＦコレクションから作製される融合遺伝子ライブラリー中のＯＲＦの対応する高い割合の提示を確実にする。
【０１４３】
ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・ライブラリー構築
[00152]酵母中心体発現プラスミドｐ４１６−ＧＡＬ１（Funk 2002）を、すべてのランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・クローニングおよび発現研究に用いる。このプラスミド発現ベクターは、ＧＡＬ１ガラクトース誘導性プロモーターを用いて、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの発現を指示する。全発現ベクター（５５３８ｂｐ）を、ＰＣＲプライマーＰＧ００８９（配列番号２５１１３）およびＰＧ００９０（配列番号２５１１４）を用いてＰＣＲによって増幅する。増幅された直鎖ベクターを以下に記載するように、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの複雑なライブラリーをクローニングするために用いる。あるいは、２つの別個の断片；プライマーＰＧ００８９（配列番号２５１１３）＋ＰＧ００９７（配列番号２５１１５）で増幅される４２９５ｂｐの第一の断片、およびプライマーＰＧ００９０（配列番号２５１１４）＋ＰＧ００９８（配列番号２５１１６）で増幅される１６２６ｂｐの第二の断片として、ベクターを増幅する。これらの２つの断片は、ベクター配列中に存在するＵＲＡ３遺伝子内の３８３ｂｐの末端相同性を共有する。２つのベクター断片を使用すると、単一のベクター断片とは異なり、ベクターのみで得られるコロニーのバックグラウンドを低下させる利点がある可能性があり、そしてより高い率の融合遺伝子組み立てを生じることも可能である。
【０１４４】
[00153]ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・ライブラリー構築工程の効率はまた、挿入物サイズに依存すると予期されるため、配列は、長さに基づいて分離され続ける、表３を参照されたい。インフレーム融合遺伝子のランダム化ライブラリーの組み立てのため、各５’スーパープール中のＯＲＦを、各３’スーパープール中のＯＲＦと、総数２５のスーパープール組み立てのために組み合わせる。ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・ライブラリー組み立て工程中で形成される２５のライブラリーに関して予期される平均挿入物サイズは、表３に示すスーパープール各々の平均アンプリコンサイズの合計である。
【０１４５】
[00154]２つのＯＲＦの発現ベクター分子内への一工程組み立ては、各断片の５’および３’端に位置し、そして図３に示す環状の組み立てられた産物の構造を特定する、保存された／相同配列によって指示される。こうした相同性依存性組み立て（Lobban 1973）を達成するために使用可能な多数の方法が存在し、融合内クローニング（Zhu 2007、Irwin 2012）、配列および連結独立性クローニング（ＳＬＩＣ、Li 2007、Li 2012）、迅速クローニング（Li 2011）、環状ポリメラーゼ伸張クローニング（Quan 2009、Quan 2011）、ギブソン組み立て法（Gibson 2009、Gibson 2010）、迅速およびクリーンクローニング（Thieme 2011）、酵母における直接組み立て（Ma 1987、Degryse 1995、Raymond 1999、Raymond 2002、Shao 2009、Wingler 2011、Eckert 2012、Kuijpers 2013）およびその他（Vroom 2008）が含まれる。
【０１４６】
[00155]この特定の例において、２つの異なる組み立て法を用いる：酵母における直接組み立て（Kuijpers 2013）および相同性依存性in vitro組み立て法の修飾法（Gibson 2010、Li 2012）。
【０１４７】
ライブラリー組み立ておよび大腸菌におけるクローニング
[00156]in vitroで、５つの５’および５つの３’ＯＲＦスーパープールの各組み合わせを用いて、総数２５の組み立て反応に関して、ライブラリー組み立てを行う。各反応において、１５０ｆｍｏｌの５’ＯＲＦスーパープールＤＮＡおよび１５０ｆｍｏｌの３’ＯＲＦスーパープールＤＮＡ（平均サイズに基づくモル濃度、表３を参照されたい）を、７５ｆｍｏｌのＰＣＲ増幅単一断片ベクターＤＮＡ（５５３８ｂｐ）と合わせる。ＤＮＡ混合物の体積を１０μｌに調整し、これに１０μｌの組み立て混合物（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各０．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、２０ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭニコチンアミドアデニン二ヌクレオチド、０．０２単位／μｌ  Ｔ５エキソヌクレアーゼ、０．０５単位／μｌ  PHUSION熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、０．４単位／μｌ  Ｔａｑリガーゼ）を添加する。反応を穏やかに混合し、そして５０℃で１〜２時間インキュベーションする。次いで、反応を氷上に維持するか、または大腸菌形質転換に使用する前に凍結する。
【０１４８】
[00157]１μｌの組み立て反応と２５μｌのエレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ細胞（Life Technologies社）またはＥＣ１００細胞（Epicentre Technologies）を氷上で混合することによって、エレクトロポレーションによって組み立て反応を大腸菌に形質転換する。次いで、細胞／ＤＮＡ混合物を１ｍｍギャップ幅エレクトロポレーション・キュベット内に移し、そしてBio-Rad Micropulserエレクトロポレーターを用いて、１．５ｋＶでエレクトロポレーションする。細胞を１ｍｌ  ＬＢブロス中に再懸濁し、１０ｍｌ培養試験管中、℃で１時間、２５０ｒｐｍで振盪しながら培養し、そして５０〜１００μｇ／μｌカルベニシリンを含有するＬＢ寒天上にプレーティングする。組み立て反応を、エタノールでのＤＮＡ沈殿によって、または微小透析によって、または製造者の推奨にしたがってBio-Rad Micro Bio-Spin P6ゲルカラムを通じて遠心分離することによってのいずれかで、組み立て反応を脱塩することによって、形質転換効率を改善することも可能である。
【０１４９】
[00158]５’スーパープールＳＰ−３と３’スーパープールＳＰ−３およびｐ４１６−ＧＡＬ１ベクター（配列番号２５０９６）の組み立て由来の２０のランダムクローンを摘み取り、そして配列決定することによって、この組み立て法の品質を評価した。２０のクローンのうち、１２がインフレームで融合した全長５’および３’ＯＲＦを示し、すべてのクローニング接合部は完全であり、そして完全なリンカー配列によって分離されており、いずれのＯＲＦも１回より多くは見られなかった。残りの８つのクローンは、損なわれていない５’または３’ＯＲＦのいずれかを含有したが、第二のＯＲＦ内に、再編成、フレームシフトまたは未知の配列を示した。これらの結果によって、in vitro組み立て後の大腸菌におけるクローニングは、インフレームで融合したランダムＯＲＦからなる融合遺伝子で実質的に構成されるライブラリーを産生可能であることを示す。
【０１５０】
[00159]小体積の形質転換混合物をプレーティングし、そして翌日コロニーを計数することによって、パイロットエレクトロポレーションにおいて、各組み立て反応の形質転換効率を試験する。次いで、エレクトロポレーションをスケールアップして、ＯＲＦプール組み合わせあたり１００万またはそれより多いライブラリークローンの生成を可能にする。大腸菌において、Ｓ．セレビシエ機能生成ライブラリーをクローニングする際は、各ＯＲＦスーパープール組み合わせに関して、総数５回のエレクトロポレーションを行って、６５００万クローンを超える総ライブラリー複雑性に関して、表４に列挙するクローン数を生じた。
【０１５１】
表４：in vitro組み立て機能生成ライブラリーの大腸菌クローニング
【０１５２】
【表４】
2016501039.tif 000006
【０１５３】
[00160]エレクトロポレーション後、表４に列挙する各ＯＲＦスーパープール組み合わせを２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で１時間回復させて、そして次いで、軟ゲル中のライブラリー増幅のため、０．３％超低融点アガロース（Lonza SeaPrepアガロース）を含有する５００ｍｌ  ＬＢブロス中に細胞を希釈する（Elsaesser 2004）。各ＯＲＦスーパープール組み合わせのための５００ｍｌ細胞懸濁物を、３枚の２．５ｃｍ深型１５ｃｍペトリプレートに分配し、そして４℃で１時間インキュベーションして、アガロースが半固形ゲルを形成することを可能にする。次いで、プレートを３７℃にトランスファーし、そして１６時間増殖させる。次いで、１０，０００ｇで３０分間遠心分離することによって、細胞を採取する。Machery Nagel NucleoSpin 96プラスミド精製キット（Clontech）に用いる１２ｍｌ再懸濁緩衝液Ａ１に、各細胞ペレットを再懸濁する。各ＯＲＦスーパープール組み合わせに関して、次いで、製造者の推奨にしたがって、キットを用いて０．２５ｍｌの細胞懸濁物をプロセシングする。残った細胞を将来の使用のため、−８０℃で凍結する。
【０１５４】
[00161]溶出後、分光光度測定によって、プラスミドＤＮＡを定量化する。ライブラリー品質をチェックするため、各スーパープール組み合わせ由来の１μｇのＤＮＡを、完全に組み立てられた融合遺伝子ベクター中、５’ＯＲＦの上流、２つのＯＲＦ間、および３’ＯＲＦの３’で切断する制限酵素であるＮｈｅＩ、ＰｆｌＭＩおよびＸｈｏＩで消化して、こうしてプロセスにおいて、両方の融合遺伝子を切除する。図８は、２５のＯＲＦの組み合わせのうち２３に関するこの消化の結果を示す。
【０１５５】
[00162]酵母を形質転換するため、in vitro組み立ておよび大腸菌クローニングライブラリーのいずれかを、別個のスーパープールの組み合わせとして、またはすべての組み合わせが混合された単一プールとして、形質転換することも可能である。最終融合遺伝子プラスミドのサイズは、ベクターＤＮＡ（５５３８ｂｐ）によって優先的に占められているため、異なるスーパープール間のサイズ相違は、個々のＯＲＦで実施するより少ないサイズバイアスを生じ、そしてその結果、すべてのスーパープールの組み合わせを、酵母形質転換のための単一試料にプールすることが安全である。
【０１５６】
[00163]上述のいずれかの組み立て法での形質転換によって生成された酵母形質転換体が、インフレームで融合されたランダムＯＲＦからなる融合遺伝子を含有することを検証するため、酵母形質転換体に含有されるプラスミドを大腸菌内にレスキューし（Ward 1990、および以下に記載する通り）、そしてこれらのプラスミドの挿入物を配列決定して、構造を確認することによって、in vitroで生成され、そして大腸菌においてクローニングされたランダム化インフレーム融合遺伝子ライブラリーで形質転換された１１のランダム酵母クローン、ならびに酵母における組み立てのため、別個の５’および３’ＯＲＦプールおよびベクター断片で形質転換された１０のランダム酵母クローンをさらに分析した。この分析の結果によって、in vitroで生成され、そして大腸菌においてクローニングされたランダム化インフレーム融合遺伝子ライブラリーでの形質転換によって生成され、そして大腸菌においてクローニングされた１１の酵母クローンのうち４つ、ならびに酵母における組み立てのため、別個の５’および３’ＯＲＦプールおよびベクター断片での形質転換によって生成された１０の酵母クローンのうち６つが、インフレームで融合され、そして損なわれていないリンカー配列によって分離された２つの損なわれていない全長酵母ＯＲＦを含有する融合遺伝子を含有することが確認された。残りのクローンは、いずれかの組み立て法を用いた際に、ある程度の頻度で生じるようである、未知の起源の一部切除５’ＯＲＦ、ならびに損なわれていない、そして全長のリンカー配列および３’ＯＲＦを含有した。これらの２１クローンにおいて観察されるＯＲＦのいずれも、１回より多くは現れなかった。これらの結果は、上述のどちらの組み立て法も、インフレームで融合したランダムＯＲＦの対からなる融合遺伝子を含有する酵母形質転換体をかなりの比率で生じることを確認する。
【０１５７】
酵母におけるライブラリー組み立ておよび酵母へのライブラリー形質転換
[00164]酵母株ＢＹ４７４１（mat a his 3D1 leu2D0 met15D0 ura3D0）をすべての形質転換およびスクリーニングに用いる（Brachmann 1998）。酵母における融合遺伝子ライブラリーの組み立てを達成するため、この酵母株を別個に各々２５の組み合わせの５’および３’ＯＲＦスーパープールで形質転換する。各形質転換において、２００ｆｍｏｌの５’ＯＲＦスーパープールを、２００ｆｍｏｌの３’ＯＲＦスーパープールと、そして１００ｆｍｏｌの単一ベクターＰＣＲ断片（５５３８ｂｐ）または上述のようにＵＲＡ３遺伝子内で重複する各１００ｆｍｏｌの２つのベクター断片（４２９５および１６２６ｂｐ）のいずれかと組み合わせる。酵母内への形質転換前に、各２５の組み合わせをあらかじめ混合する。こうした形質転換は、典型的には、以下に記載するように、形質転換あたり、４０００〜５０００コロニーの酵母を生じ、このうち＞９０％がｐ４１６−ＧＡＬ１ベクター内で正しく組み立てられた融合遺伝子を含有する。大腸菌において、すでにクローニングされ、そして拡大されたライブラリーでの形質転換のため、以下に要約する形質転換法は、クローニングされたプラスミドライブラリーＤＮＡのマイクログラムあたり、約２５０，０００〜３００，０００形質転換体を生じる。２つのアプローチ各々（in vitro組み立ておよび大腸菌におけるライブラリークローニング対酵母の形質転換によるライブラリーの組み立て）は、異なる配列バイアスを生じると予期される（すなわち、あるＯＲＦが他のもののに比較して、クローンまたは形質転換体のコレクション内に優先して取り込まれる）ため、特定の表現型に関してスクリーニングする際、両方の方法を使用することが好適である。にもかかわらず、in vitroで組み立てられそして大腸菌にクローニングされたライブラリーの酵母の形質転換効率は、５０〜６０倍高いため、非常に多数の形質転換体を生成するためには、この方法が好ましい。
【０１５８】
[00165]酵母形質転換体は、酢酸リチウム−熱ショック法によって行われる（Gietz 2002、Gietz 2006、Gietz 2007）。プレートまたは一晩培養からの酵母株ＢＹ４７４１（Brachmann 1998）を５０ｍｌのＹＰＤ培地（１リットルあたり、２０ｇ  Bactoペプトン、１０ｇ  Bacto酵母エキスおよび２０ｇグルコース）に、３０℃で２２５ｒｐｍの振盪装置上、出発密度５ｘ１０６細胞／ｍｌ〜２ｘ１０７細胞／ｍｌで、接種する。３０００ｇで５分間遠心分離することによって細胞を採取し、次いで細胞を２５ｍｌの無菌脱イオン水に再懸濁し、再び遠心分離し、１ｍｌの無菌水中に再懸濁し、１．５ｍｌの微量遠心管に移し、３０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、そして上清を吸引する。次いで、細胞ペレットを０．４ｍｌの無菌脱イオン水中に再懸濁した。細胞懸濁物を３．２６ｍｌの形質転換混合物（２．４ｍｌの５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ３３５０、３６０μｌ  １Ｍ酢酸リチウムおよび５００μｌ  １０ｍｇ／ｍｌの剪断煮沸したサケ精子ＤＮＡ）と合わせ、そしてよく混合する。ＤＮＡのアリコット（１００ｎｇ〜１μｇ）を別個の１．５ｍｌ微量遠心管にピペッティングし、そして３６０μｌの形質転換緩衝液中の細胞懸濁物と組み合わせる。細胞／ＤＮＡ混合物を徹底的に混合し、そして振盪装置上、４２℃、２５０ｒｐｍで４０分間、インキュベーションする。次いで、形質転換体を３０００ｒｐｍで１分間、微量遠心管中で遠心分離し、上清を吸引し、そして各細胞アリコットを０．５〜１ｍｌの無菌脱イオン水中に再懸濁する。コロニーの望ましい密度に応じて、１０μｌ〜１ｍｌの細胞懸濁物を、無菌４ｍｍガラスビーズを用いて、炭素供給源としてグルコースを含有する合成完全ウラシルドロップアウト培地（１Ｌに関しては、６．７ｇ酵母窒素塩基、０．７７ｇウラシルドロップアウト混合物、１５ｇ  Ｂａｃｔｏ寒天、ｐＨを５．６〜５．８に調整する１２０μｌ  １０Ｎ  ＮａＯＨ、および２０ｇグルコース）、炭素供給源としてガラクトースを含有する合成完全ウラシルドロップアウト培地（１Ｌに関しては、６．７ｇ酵母窒素塩基、０．７７ｇウラシルドロップアウト混合物、ｐＨを５．６〜５．８に調整する１２０μｌ  １０Ｎ  ＮａＯＨ、１５ｇ  Bacto寒天、およびオートクレーブ後に添加される１００ｍｌ無菌濾過２０％ガラクトース）を含有する１０ｃｍまたは１５ｃｍプレート上にプレーティングする。プレートをベンチトップ上で開放して、液体が乾燥することを可能にし、そして次いで、蓋をし、そして３０℃で、または選択的温度で数日間、インキュベーションする。
【０１５９】
[00166]５０１９  ＯＲＦのランダムの対の組み立てから生じる配列組み合わせのありうる総数は、この数値の平方＝２５２０万である。典型的には、スクリーニングプロジェクトの目的は、（ＤＮＡプール内に等しい配列の提示があると仮定して）各々の組み合わせが形質転換体間で示される＞９０％の可能性を有するライブラリー複雑性の３倍より多いクローンをスクリーニングすることである。本発明者らの場合、これは、ほぼ７４００万の形質転換体に相当し、酵母においては、ＤＮＡのμｇあたり１０６形質転換体に近づく形質転換効率と仮定することが可能であり、これは特定の株に関していくつかのプロトコル最適化でルーチンに達成可能であり（Gietz 2007）、特に、in vitroで組み立てられそして大腸菌にクローニングされているライブラリを用いた際に達成可能である。
【０１６０】
熱および塩許容性を与える融合遺伝子に関するスクリーニング
[00167]形質転換後、細胞を５０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、そして上清を吸引する。ペレットを、炭素供給源としてグルコースを含有する１ｍｌ合成完全培地（１Ｌに関しては、６．７ｇ酵母窒素塩基、０．７７ｇウラシルドロップアウト混合物、ｐＨを５．６〜５．８に調整する１２０μｌ  １０Ｎ  ＮａＯＨ、および２０ｇグルコース）中に再懸濁し、そして各形質転換を３０℃で２〜３時間、２５０ｒｐｍの振盪装置上で培養した後、細胞を遠心分離し、１ｍｌ無菌脱イオン水中に再懸濁し、そして適切な選択培地上でプレーティングする。
【０１６１】
[00168]熱選択のため、細胞を、炭素供給源としてガラクトースを含有する合成完全培地ウラシルドロップアウト培地（１Ｌに関しては、６．７ｇ酵母窒素塩基、０．７７ｇウラシルドロップアウト混合物、ｐＨを５．６〜５．８に調整する１２０μｌ  １０Ｎ  ＮａＯＨ、１５ｇ  Bacto寒天、およびオートクレーブ後に添加される、１００ｍｌ無菌濾過２０％ガラクトース）上にプレーティングする。１０〜１５の４ｍｍ無菌ガラスビーズを用いて、細胞をプレート上に広げる。プレートを開放したまま放置して乾燥させ、そして３０℃で２４時間インキュベーションし、その後、４０℃で４日間インキュベーションする。高温に抵抗することが可能な個々のコロニーは、プレーティング５日後に可視である。
【０１６２】
[00169]塩選択のため、細胞を回転振盪装置上、３０℃で１．５時間置き、そして次いで、炭素供給源としてガラクトースを含み、そして１Ｍ  ＮａＣｌを含有する合成完全ウラシルドロップアウト培地（１Ｌに関しては、６．７ｇ酵母窒素塩基、０．７７ｇウラシルドロップアウト混合物、ｐＨを５．６〜５．８に調整する１２０μｌ  １０Ｎ  ＮａＯＨ、１５ｇ  Bacto寒天、５８．４４ｇ  ＮａＣｌおよびオートクレーブ後に添加される１００ｍｌ無菌濾過２０％ガラクトース）上にプレーティングする。１０〜１５の４ｍｍ無菌ガラスビーズを用いて、細胞をプレート上に広げる。プレートを開放したまま放置して乾燥させ、そして３０℃で５日間インキュベーションする。高温に抵抗することが可能な個々のコロニーは、プレーティング５日後に可視である。
【０１６３】
[00170]選択的増殖条件下で生じるコロニーを摘み取り、そして炭素供給源としてグルコースを含有する合成完全ウラシルドロップアウト培地（１Ｌに関しては、６．７ｇ酵母窒素塩基、０．７７ｇウラシルドロップアウト混合物、１５ｇ  Bacto寒天、ｐＨを５．６〜５．８に調整する１２０μｌ  １０Ｎ  ＮａＯＨ、および２０ｇグルコース）上に再ストリークする。３０℃で数日増殖させた後、増殖を示すクローンを、炭素供給源としてグルコースを含有する１ｍｌ合成完全ウラシルドロップアウト液体培地（１Ｌに関しては、６．７ｇ酵母窒素塩基、０．７７ｇウラシルドロップアウト混合物、ｐＨを５．６〜５．８に調整する１２０μｌ  １０Ｎ  ＮａＯＨ、および２０ｇグルコース）内、深型ウェル９６ウェルプレート中に摘み取り、そして振盪装置上、８００ｒｐｍ、３０℃で２日間増殖させる。次いで、ベンチトップ遠心分離装置中、細胞を４０００ｒｐｍ５分間の遠心分離によってペレットにし、上清をこぼし、そして製造者の指示にしたがって、商業的キット（例えばZymo ResearchのZymoprep酵母プラスミドミニプレップキット）を用いて、酵母プラスミドＤＮＡを精製する。２μｌのＤＮＡと２０μｌのエレクトロコンピテント細胞を氷上で合わせ、１ｍｍギャップサイズ・エレクトロポレーション・キュベット内に移し、そしてBio-Rad MicroPulserエレクトロポレーターを用いて、１．５ｋＶでエレクトロポレーションし、細胞を０．５ｍｌ  ＬＢブロス中に再懸濁し、振盪装置上、３７℃で１時間、細胞を回復させ、そして５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＬＢ寒天培地を含有する１０ｃｍプレート上に形質転換細胞０．２ｍｌアリコットをプレーティングすることによって、大腸菌のＤＨ１０Ｂ細胞（Life Technologies）またはＥＣ１００細胞（Epicentre Technologies）株内に、再懸濁ＤＮＡを導入する。
【０１６４】
[00171]プレート上に現れてきた細菌コロニーを摘み取り、各酵母クローンに関して２つのコロニーをＤＮＡ単離に用い、そして標準法（Sambrook 1989）を用いて、これらからプラスミドＤＮＡを調製する。プラスミドＤＮＡを５’ＯＲＦの５’（ＮｈｅＩ）、３’ＯＲＦの３’（ＸｈｏＩ）で、そして２つのＯＲＦの間（ＰｆｌＭ１）で切断する制限酵素で消化して、レスキューされたプラスミドが融合タンパク質を含有することを検証する。
【０１６５】
[00172]クローニングされたプラスミドＤＮＡを、上述のような酢酸リチウム−熱ショック形質転換（Gietz 2006）によって酵母内に再導入し、形質転換から生じる個々のコロニーを摘み取り、脱イオン水に懸濁し、そして５μｌアリコットを、炭素供給源としてガラクトースを含む合成完全ウラシルドロップアウト混合物上に、または炭素供給源としてガラクトースを含有するＹＰＧａｌリッチ培地（１リットルあたり、２０ｇ  Bactoペプトン、１０ｇ  Bacto酵母エキスおよび２０ｇガラクトース）上に、連続１０倍希釈でスポットし、そして４０℃でインキュベーションして熱許容性を検証するか、あるいは炭素供給源としてガラクトースを含み、そして１Ｍ  ＮａＣｌを含有する同じ培地上に連続１０倍希釈でスポットして、そして３０℃でインキュベーションして塩許容性を検証する。候補融合遺伝子構築物で形質転換した酵母クローンを、ｐ４１６−ＧＡＬ１空ベクターでの形質転換体に、選択条件下で、増殖に関して比較して、融合遺伝子構築物の活性を確立する。
【０１６６】
[00173]熱許容性（４０℃で増殖する能力）に関するスクリーニングから単離された融合遺伝子の例を図９に列挙し、そしてこれらのクローンで形質転換された酵母細胞が、上昇した温度で増殖する能力を図１０に示す。図１０に示すプレート上にスポットした細胞は、図９に列挙する融合遺伝子クローンでの株ＢＹ４７４１の再形質転換体に相当し、そして熱許容性を与える能力を確認する。
【０１６７】
ブタノール許容性表現型を与える融合遺伝子に関するスクリーニング：
[00174]ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを含有するプールしたライブラリーを酵母の実験室株内に形質転換し、そして次いで、プラスミドの存在に関して選択し、そしてランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドにコードされるランダム化インフレーム融合ポリペプチドの発現が誘導される条件下で、増殖させる。４つの異なるアプローチを用いて、ブタノール許容性形質転換体に関して選択するかまたはスクリーニングする。これらのうちの２つは、生存選択を伴い、致死濃度のブタノールを用いて、アルコールで生き延びる能力を持つ細胞を単離する。他の２つのアプローチは、ブタノールの致死量以下の濃度の存在下で改善された増殖特性を持つ細胞を単離することを目的とする。選択に際して、２回の生存選択および２回の増殖許容性選択の各々は、固形培地上の増殖および選択を伴い、一方、もう一方は、液体培地中での増殖後、固形培地上の選択またはスクリーニングを用いる。３つの選択およびスクリーニング・アプローチを、公表された情報に基づくブタノール濃度範囲とともに、表５に要約する（Knoshaug 2008）。
【０１６８】
【表５】
2016501039.tif 000007
【０１６９】
[00175]４つの選択スキームには、各選択のための最適なブタノール濃度に到達するため、後にバルク酵母形質転換体とともに用いる正確なプレーティングまたは培養条件および細胞密度のもとでの、注意深い力価決定が先行する。キャリアーＤＮＡと組み合わせ、そしてそのほかは実際の形質転換におけるように処理した偽形質転換を、これらの力価決定実験に用いる。注意深く制御された一定の条件下で、すべての培養を３０℃で増殖させて、選択における均一性を維持する。
【０１７０】
[00176]固形培地上での生存選択のため、特定の最適増殖密度で酵母培養を再採取し、そしてランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・ライブラリーＤＮＡで形質転換した。形質転換培養を形質転換後２時間、ガラクトースを含有する液体培養中、ウラシルドロップアウト培地中で増殖させて、細胞が形質転換ショックから回復し、そしてコードされるランダム化インフレーム融合ポリペプチドの発現を誘導し始めることを可能にする。次いで、細胞密度を決定し、そして一定の細胞密度で、そしてセントロメア・プラスミドの存在に関して選択するために用いる、特定の栄養素を欠き、そしてガラクトースおよびブタノールを含有する、固形最少培地を含有する１５ｃｍの選択プレートあたりおよそ５０，０００形質転換体の予期されるコロニー密度でプレーティングする。形質転換の小規模アリコットを、対照として、同じ培地であるが、ブタノールを欠くプレート上にプレーティングする。プレートを密封し、そして生存コロニーが可視になるまで３０℃でインキュベーションする。
【０１７１】
[00177]あるいは、酵母細胞を上記と同じ方式で、融合遺伝子ライブラリーＤＮＡで形質転換する。細胞を、炭素供給源としてグルコースを含有する合成完全ウラシルドロップアウト培地（１Ｌに関しては、６．７ｇ酵母窒素塩基、０．７７ｇウラシルドロップアウト混合物、１５ｇ  Bacto寒天、ｐＨを５．６〜５．８に調整する１２０μｌ  １０Ｎ  ＮａＯＨ、および２０ｇグルコース）上にプレーティングし、そして形質転換されたコロニーが可視になるまで、３０℃でインキュベーションする。次いで、掻き取ることによって、またはプレートの上部に添加される液体中で、コロニーを懸濁するためのガラスビーズを用いることによって、細胞をプレートから取り除く。細胞を０．１のＯＤ６００まで希釈し、そして炭素供給源としてラフィノースを含有する液体合成完全ウラシルドロップアウト培地（１Ｌに関して、６．７ｇ酵母窒素塩基、０．７７ｇウラシルドロップアウト混合物、ｐＨを５．６〜５．８に調整するための１２０μｌ  １０Ｎ  ＮａＯＨ、および２０ｇラフィノース）中で４時間増殖させて、細胞が残りのグルコースを代謝し、そしてＧＡＬ１プロモーターの異化抑制を取り除くことを可能にする。次いで、炭素供給源としてガラクトースを含有するＹＰＧａｌリッチ培地内に、細胞を再びＯＤ６００＝０．１の密度に希釈して、そして振盪装置上、３０℃で２時間増殖させて、ＧＡＬ１プロモーターを通じた融合遺伝子の発現を誘導する。血球計算板で計数することによって、生じた懸濁物の細胞密度を決定し、そして１５ｃｍプレートあたり２．５ｘ１０７細胞の密度で（平方ｃｍあたりおよそ１５０，０００細胞）、２〜３％ブタノールを含有するＹＰＧａｌ寒天培地上にプレーティングし、２％は致死量以下であり、そして３％は致死量である。プレートを３０℃で４〜１０日間インキュベーションし、そして次いで、コロニーに関して（プレート中で致死濃度のブタノールを用いた場合）、またはバックグラウンドより大きいコロニーに関して（プレート中で致死量未満のブタノールを用いた場合）、調べる。
【０１７２】
[00178]固形培地上のスクリーニングは、個々のクローンまたは形質転換体の可視化を可能にするため、より大きいコロニーとして明らかに可視である、迅速な増殖に寄与する遺伝子を発現している形質転換体を同定するために、特に有用である。倍加時間の数パーセント程度の小さい相違が、コロニーサイズの測定可能な相違を導きうる。例えば、２時間の平均倍加時間の株の４８時間増殖期間は、２４回の倍加を可能にし、一方、１１４分間の、５％より迅速な平均倍加時間を持つ株は、２５．３回倍加し、コロニーサイズに明らかに反映される、細胞数の２．５倍の相違を導く。したがって、致死量以下の濃度のブタノールを含有する固形培地上でのプレーティングは、ブタノールの存在下で増殖利点を有する形質転換体の同定を可能にし、ブタノール許容性の指標となる。こうしたスクリーニングは、エタノール許容性に寄与する遺伝子の単離のため、他の研究者によって用いられてきている（Hong 2010）。
【０１７３】
[00179]液体培地中の耐性選択のため、酵母培養を上述と同じ方式で、融合遺伝子ライブラリーＤＮＡで形質転換する。細胞を、炭素供給源としてグルコースを含有する合成完全ウラシルドロップアウト培地（１Ｌに関しては、６．７ｇ酵母窒素塩基、０．７７ｇウラシルドロップアウト混合物、２０ｇ  Bacto寒天、ｐＨを５．６〜５．８に調整する１２０μｌ  １０Ｎ  ＮａＯＨ、および２０ｇグルコース）上にプレーティングし、そして形質転換されたコロニーが可視になるまで、３０℃でインキュベーションする。掻き取ることによって、またはプレートの上部に添加される液体中で、コロニーを懸濁するためのガラスビーズを用いることによって、細胞をプレートから取り除き、そして次いで、０．１のＯＤ６００まで希釈し、そして炭素供給源としてラフィノースを含有する液体合成完全ウラシルドロップアウト培地（１Ｌに関して、６．７ｇ酵母窒素塩基、０．７７ｇウラシルドロップアウト混合物、ｐＨを５．６〜５．８に調整するための１２０μｌ  １０Ｎ  ＮａＯＨ、および２０ｇラフィノース）中で４時間増殖させて、細胞が残りのグルコースを代謝し、そしてＧＡＬ１プロモーターの異化抑制を取り除くことを可能にする。次いで、炭素供給源としてガラクトースを含有するＹＰＧａｌリッチ培地内に、細胞を再びＯＤ６００＝０．１の密度に希釈して、そして振盪装置上、３０℃で２時間増殖させて、ＧＡＬ１プロモーターを通じた融合遺伝子の発現を誘導する。次いで、ブタノールを培養に３％まで添加し、培養に蓋をして蒸発を防止し、そしてさらに２〜７日間、穏やかに振盪しながら３０℃で増殖させる。次いで、選択期間の終了時に残った細胞を回転して落とし、そして大腸菌内へのクローニングのため、プラスミドＤＮＡを単離し、そして酵母内に再度形質転換し、そして別の選択周期を行うか、あるいは炭素供給源としてグルコースを含有する合成完全ウラシルドロップアウト混培地上に細胞をプレーティングして、生存細胞を単離する。
【０１７４】
[00180]選択プレート上に生じるコロニーを摘み取るか、または液体培地中の選択を生き延びる酵母細胞プールを遠心分離によって収集し、必要であれば選択培地中で拡大し、そしてプラスミド抽出および大腸菌におけるプラスミド増加に用いる。２つの大腸菌コロニーを各酵母形質転換体に関して摘み取り、そして液体選択から２０の大腸菌コロニーを生存酵母細胞の各プールに関して摘み取り、ＤＮＡを単離し、そして制限消化によってチェックする。次いで、表現型確認のため、プラスミドＤＮＡを酵母に再導入する。
【０１７５】
[00181]単純化するため、９６ウェル形式で行う２つの標準的ブタノール許容性アッセイを用いて、すべてのプラスミドをチェックする。２つのアッセイは、液体培養中で、それぞれ、致死および致死量以下の濃度のブタノールを用いる。致死条件下での培養期間後、または致死量以下の条件下での増殖の数継代後、培養を連続希釈し、そして固形培地上で複製プレーティングして、生存細胞の密度を評価する。これらのアッセイによって、必要な対照を用いたすべての単離プラスミドの迅速でそして均質な試験が可能になり、そしてブタノールの存在下で、生存または増殖利点を与えるランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの迅速な検証が可能になる。
【０１７６】
陽性クローンの性質決定
[00182]最も劇的であるかまたは広い表現型を与えるランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド発現構築物を配列決定して、活性遺伝子を同定する。結果を表にして、そして最適なランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを将来の研究のために選択する。別個のランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド内に反復して同定される配列を、将来のスクリーニングに用いるか、またはＯＲＦコレクションの部分として用いる。望ましい表現型を与えることがすでに知られるＯＲＦコレクションを含有するランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドは、大腸菌に関して上述する全ゲノムＯＲＦコレクションよりも小さい可能性もあり、これは、より小さいライブラリーサイズ、より安価でそして迅速なスクリーニング、ならびに藻類および植物を含めて、より低い形質転換効率の生物における従順性を含めて、多くの利点を有する。
【０１７７】
実施例３：シアノバクテリア、すなわちシネココッカス・エロンガトゥス（Synechococcus elongatus）に、より高いバイオマス、増殖率加速またはアルコール耐性を与えることが可能なランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの単離
序論：
[00183]シアノバクテリアは、エタノール（Deng 1999、Dexter 2009、Gao 2012）、イソブチルアルデヒド（Atsumi 2009）、イソブタノール（Atsumi 2009）、ｎ−ブタノール（Lan 2011、Lan 2012）、１，３−ブタンジオール（Oliver 2013）、アセトン（Zhou 2012）、エチレン（Takahama 2003）、イソプレン（Lindberg 2010）、脂肪酸および脂肪族アルコール（Liu 2011、Tan 2011）ならびに糖（Ducat 2011、Ducat 2012）を含む、多様な化学薬品を産生するように操作されてきており、いくつかの場合、有望な結果が得られている（すなわち、Ducat 2011、Oliver 2013）。植物および真核藻類と比較して、相対的に遺伝子が単純であり、培養のためのインプット必要性が低く、ストレスに抵抗する能力があり、そして遺伝子操作に対して従順であるため、シアノバクテリアは、生物学的産生に向かうこの全般的なシフトにおいて、主要な役割を果たすであろう光合成生物の１つである（Ducat 2011、Robertson 2011、Ruffing 2011)。
【０１７８】
[00184]シアノバクテリアはまた、増殖および炭素固定率が生得的に高いため、関心対象でもあり；その結果、これらの生物は、燃料および化学薬品産生のための原材料として利用可能なバイオマスの供給源として、非常に有望である。にもかかわらず、バイオマス生産性は、遺伝的に複雑で、そしてほとんど理解されておらず、そしてしたがって操作が困難である。産業的に有望なシアノバクテリア種におけるバイオマス集積率を増加させることは、シアノバクテリアを経済的産生生物に発展させる試みにおいて、シアノバクテリア・バイオテクノロジー産業が直面する障害の１つである。
【０１７９】
[00185]本実施例は、ランダム化インフレーム・ポリヌクレオチド融合を用いた、シアノバクテリア、シネココッカス・エロンガトゥスにおいて、より高いバイオマス、増殖率加速またはアルコール耐性を操作することを記載する。Ｓ．エロンガトゥスは、迅速に増殖し、そして容易に培養され、容易にそして効率的に形質転換可能な、重要な実験シアノバクテリアである（Golden 1987、Tsinoremas 1994、Elhai 1994、Vioque 2007、Clerico 2007、Flores 2008、Heidorn 2011）。
【０１８０】
配列同定およびＰＣＲプライマー設計：
[00186]シネココッカス・エロンガトゥス遺伝子配列の完全コレクションを、J. Craig Venter研究所（ＪＣＶＩ）包括的微生物リソースゲノムデータコレクション（インターネット上、ＣＭＲ−ＪＣＶＩウェブサイト上で入手可能）から入手可能なＳ．エロンガトゥス株ＰＣＣ７９４２の参照配列に基づいて生成する。各遺伝子の開始および停止コドンを同定するため、このゲノムの配列注釈を用いる。
【０１８１】
[00187]ＪＣＶＩ注釈は、７アミノ酸のタンパク質をコードする２１ｂｐから、１５９５アミノ酸のタンパク質をコードする４，７８５ｂｐの間の長さの範囲の、２９９１の総タンパク質コード遺伝子を列挙する。これらのＯＲＦのうち、２９５８は、長さ１００ｂｐ〜３０００ｂｐの間である。インプット配列として用いる遺伝子の長さは、３０００ｂｐを上限とし、好ましくは２６０４ｂｐであり、これによって、ＰＣＲ増幅の成功、および生じるインフレーム融合ポリペプチドまたはタンパク質の正しいフォールディングの可能性が増加する。結果は、ＰＣＲ増幅用の長さ１００〜２６０４ｂｐの間である総数２，９２５のＯＲＦの最終コレクションである。この配列コレクションの平均の長さは７８５ｂｐであり、そして長さの中央値は６９３ｂｐである。これらのＳ．エロンガトゥスＯＲＦのサイズ分布を図６に示す。
【０１８２】
[00188]各端から２４ｂｐのコード配列を含めて、各ＯＲＦの既知の開始コドンおよび停止コドンに基づいて、ＰＣＲプライマーを設計する。２つの異なるプライマーセットを各ＯＲＦに関して設計して、１つはＯＲＦを融合遺伝子の５’位にクローニングするため、そしてもう一方は３’位に配置するため、２つの異なるＰＣＲ産物が生成されるようにする。各ＯＲＦに関する２つのアンプリコンは、停止コドンの存在（ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・ライブラリーの３’位に向けられるＯＲＦのみに存在）および保存される隣接配列に関してのみ異なる。
【０１８３】
[00189]各プライマーは、２つの目的に役立つ５’端の１６塩基の保存配列を含有する。まず、過剰な配列は、互いに関して異なるＯＲＦの提示にバイアスを掛けることなく、コレクション中のすべてのＯＲＦを増幅することが可能な保存されたＰＣＲプライマー配列を用いたＯＲＦプールの効率的なＰＣＲ増幅を可能にする（Dahl 2005、Myllykangas 2011、Natsoulis 2011）。第二に、これらは発現ベクター（詳細は以下を参照されたい）に、そしてランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・パートナー末端の保存された配列に、相同性を含有し、ベクター中のランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの迅速でそして効率的な相同性依存性組み立てを可能にする（図３を参照されたい）。
【０１８４】
[00190]融合遺伝子中の５’位に向けられるＯＲＦの３’ＰＣＲプライマー中の５’末端１６ヌクレオチド、および融合遺伝子中の３’位に向けられるＯＲＦの５’ＰＣＲプライマー中の５’末端１６ヌクレオチドは、２つのＯＲＦを分離するリンカー配列の一部を形成する。この６０ｂｐリンカー配列は、グリシン、セリンおよびアラニンが豊富な２０アミノ酸ペプチド（配列番号２５１０４）をコードし、該配列は、融合遺伝子中の２つのＯＲＦを連結する際に他の研究者が用いる配列（Arai 2001、Eldridge 2009、Wang 2010）に大まかに基づく。このリンカー配列は、ＰＣＲ増幅の第二のまたは保存される段階で完全にコードされ（以下を参照されたい）、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの５’位に向けられるＯＲＦの３’端およびランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの３’位に向けられるＯＲＦの５’端に、保存されたコード配列の付加を生じる。
【０１８５】
[00191]１つは融合遺伝子の５’位そしてもう一方は３’位である、シアノバクテリアＯＲＦの２つの完全なセットが生成される必要があるため、以下に記載するすべての方法は、２つのＯＲＦ位に関して、２つ組で行われる。
【０１８６】
シアノバクテリア株およびゲノムＤＮＡ調製：
[00192]選択したシネココッカス・エロンガトゥス遺伝子を、株ＰＣＣ７９４２からＰＣＲ増幅する。この株は、パスツール研究所シアノバクテリア培養コレクションから入手可能であり、そして関心対象の遺伝子を増幅可能な高純度ゲノムＤＮＡの供給源として使用可能である。
【０１８７】
[00193]ＯＲＦの供給源として働くシアノバクテリア株を、ＢＧ１１培地または修飾ＢＧ１１培地中で、標準的増殖条件（Bustos 1992、Kulkarni 1997、Mutsuda 2003、Clerico 2007）を用いて、液体培養中で増殖させる。修飾ＢＧ−１１液体培地（ＢＧ１１Ｍ、Clerico 2007）を以下のように作製する：  １．５ｇ／Ｌ  ＮａＮＯ３、０．０３９ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、０．０７５ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４  ７Ｈ２Ｏ、０．０２ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＣＯ３、０．０２７ｇ／Ｌ  ＣａＣ１２、０．００１ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、０．０１２ｇ／Ｌ  ＦｅＮＨ４クエン酸塩、および１ｍＬの以下の微量要素溶液：  ２．８６ｇ／Ｌ  Ｈ３ＢＯ３、１．８１ｇ／Ｌ  ＭｎＣ１２・４Ｈ２Ｏ、０．２２２ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．３９１ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＭｏＯ４、０．０７９ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、および０．０４９４ｇ／Ｌ  Ｃｏ（ＮＯ３）２・６Ｈ２Ｏ。別個にオートクレーブした等体積の２倍濃縮ＢＧ−１１Ｍ液体培地およびＤｉｆｃｏ寒天溶液（無菌水中、３％）を合わせ、そしてともに混合することによって固形培地を作製し；濾過滅菌したＮａ２ＳＯ３を１ｍＭまで添加する。
【０１８８】
[00194]遠心分離によって細胞をペレットにし、そして次いで、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１００ｍＭグルコースを用いて、元来の培養体積の１／１０に再懸濁する。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中に溶解した１０ｍｇ／ｍｌニワトリ卵リゾチームの１／１００体積を添加し、そして１０ｍｇ／ｍｌ  ＤＮアーゼ不含ＲＮアーゼＡの１／２０体積を添加し、よく混合し、そして室温で１５分間インキュベーションすることによって、細胞を溶解する。プロテイナーゼＫで処理することによって、細胞溶解およびゲノムＤＮＡ放出を完了させる。溶解した細胞に、１／１０体積の１Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ９．５および１／１００体積の２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ溶液を添加する。試験管に蓋をし、そして反転させることによって、溶解した細胞を穏やかに混合し、そして混合物を時々穏やかに混合しながら、５０℃で２時間インキュベーションする。次いで、等体積のフェノール−クロロホルム（ｐＨ７．０）で２回、ＤＮＡを抽出し、その後、等体積のクロロホルムでさらに１回抽出する。１／１０体積の３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．５および２．５体積のエタノール（または１体積のイソプロパノール）を添加することによって、ＤＮＡを沈殿させる。アルコールを添加した後、試験管を直ちに反転させ、そしてＤＮＡは紐状の白色沈殿物として可視である。細胞由来の他の不純物（残渣タンパク質または炭水化物）が同時に沈殿するのを回避するため、清浄なピペットチップまたはパスツールピペットを用いてアルコール溶液から沈殿したＤＮＡを取り除き、そして７０％エタノールを含有する清浄な試験管に移す。試験管に蓋をし、そして複数回反転させて、ＤＮＡ沈殿物から塩を除去する。遠心分離によってペレットを収集し、吸引によってエタノールを除去し、そしてエアフローフード中でペレットを乾燥させ、過剰なエタノールを取り除く。ペレットを１ｘＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に溶解する。カラムクロマトグラフィまたは塩化セシウム密度遠心分離（Sambrook 1989）を用いて、ＤＮＡのさらなる精製を行ってもよい。
【０１８９】
[00195]本明細書に記載したものと同等の結果を生じる他のＤＮＡ調製法が、文献に記載されてきている（Clerico 2007、Heidorn 2011）。
発現ベクター
[00196]単純なそして標準的な発現ベクターを用いて、すべての融合タンパク質を発現させる。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、Geerts 1995、Kutsuna 1998）によって誘導可能なＳ．エロンガトゥスＰｔｒｃプロモーターは、頻繁に用いられ、そしてＳ．エロンガトゥスにおける遺伝子発現のために有効である。さらに、発現ベクターは、Ｓ．エロンガトゥス染色体内への部位特異的組み込みを指示するＮＳ１またはＮＳ２中性部位要素（Matsuda 2003）、適切なターミネーター（Wang 2012）、ｐＵＣ１９由来の抗生物質耐性マーカー遺伝子（単数または複数）および高コピー数ｐＭＢ１プラスミドレプリコン（Yanish-Perron 1985）を含有する。ｐＵＣ１９ベクターは、プラスミド主鎖（ｐＭＢ１レプリコン）、抗生物質耐性ポリヌクレオチド（例えばアンピシリン耐性を与えるＴｎ３由来のβ−ラクタマーゼ）、ならびに大腸菌ｌａｃプロモーター／オペレーターおよびターミネーター配列の好適な供給源である。図３に例示するように、これらの配列をｐＵＣ１９からＰＣＲ増幅し、そしてランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドのクローニングおよび発現のためのプラスミド主鎖供給源として用いる。例えば、ＰＣＲプライマー５’−agctgtttcctgtgtgaaattgtt−３’および５’−ttaagccagccccgacacccgccａ−３’を用いて、ｐＵＣ１９からのこうした断片をＰＣＲ増幅することも可能である。５’ＯＲＦの５’端および３’ＯＲＦの３’端に含まれる、この発現ベクター断片に対する相同性領域（図３を参照されたい）は、これらの２つのＰＣＲプライマーによって特定される同じＤＮＡ配列に相当する。
【０１９０】
[00197]ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの発現のためのＰｔｒｃプロモーター系の代替物として、文献（Ruffing 2011、Wang 2012）に記載されるような他のシアノバクテリア・プロモーターを用いてもよい。あるいは、細菌発現のためのコンセンサス要素を含有する部分的ランダム化配列から合成プロモーターを発展させてもよい（Jensen 1998a、Jensen 1998b、Hammer 2006、De May 2007）。
【０１９１】
[00198]ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの発現のための適切性に関して、候補プロモーターを試験するため、選択したプロモーターおよびその関連５’ＵＴＲを２５０ｂｐ  ＤＮＡ断片として合成し、そして選択可能マーカーを含有するベクター中、大腸菌ｌａｃＺベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子の上流にクローニングする（Heidorn 2011、Ruffing 2011）。プロモーター断片の上流にターミネーターを配置して、プラスミド上の別の箇所に存在するプロモーターからのリードスルー転写を防止する。生じた構築物をＳ．エロンガトゥスに形質転換し、そして形質転換体をベータ−ガラクトシダーゼ活性に関してアッセイする（Bustos 1991）。ホタル（firefly）ルシフェラーゼもまた、アッセイ可能マーカー遺伝子として適切であり、そしてｌａｃＺの代わりにプロモーター試験に使用可能である（Kondo 1993、Andersson 2000)。
【０１９２】
[00199]ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの発現のための本明細書記載のプラスミドは、ｐＭＢ１複製起点を含有するものなどの高コピー数プラスミドに基づく。しかし、他のプラスミド系もまた、この研究に適している。例えば、Ｆ’に基づくプラスミド、例えばｐＢｅｌｏＢＡＣ１１（Shizuya 1992）または広宿主域プラスミド系（Heidorn 2011）を用い、上記と同じプロモーターを用いて、または異なるプロモーターセットを用いて、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを発現させてもよい。クローニングおよびプラスミド精製後、Ｓ．エロンガトゥスの形質転換には、任意の適切な宿主細胞において、関心対象の配列のクローニングおよび増加を可能にする任意のプラスミド主鎖が使用可能である（Heidorn 2011）。
【０１９３】
融合遺伝子設計：
[00200]例えば、ペプチドまたはタンパク質をコードする仮説上のポリヌクレオチド配列Ａは、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドのコレクションの構築のために用いられるよう意図される。ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドのコレクションを生成する目的は、ポリヌクレオチドＡを含めた出発コレクション中の各ポリヌクレオチドをランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドシリーズの５’位に存在させること、そして同じ配列を、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの異なるシリーズの３’位に存在させることである。これらの２つのシリーズのランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの各々において、ポリヌクレオチドＡは、こうした融合を生成するために利用可能な方法で実現可能であるような出発コレクションの出来る限り多くの他のメンバーと融合するであろう。出発コレクションに存在する他のポリヌクレオチドに対して５’または３’位のポリヌクレオチドＡを含む、これらの別個のシリーズの融合を可能にするため、２つの異なるバージョンのポリヌクレオチド配列Ａを生成する。５’位で使用するために意図されるポリヌクレオチド配列Ａのバージョンは、停止コドンを含有せず、そして発現ベクターのプロモーター領域に５’相同性（またはクローニング目的のための他の配列適合性）を有する。３’ 位で使用するために意図されるポリヌクレオチド配列Ａのバージョンは、停止コドンを含有し、そして発現ベクターのターミネーター領域に３’相同性（またはクローニング目的のための他の配列適合性）を有する。
【０１９４】
[00201]ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドにおいて、２つのＯＲＦを分離する配列（図３において、「リンカー配列」と示される）は、グリシンおよびセリン残基が豊富な短いペプチドをコードする。こうしたペプチドは、非構造であることが予期され、そしてランダム化融合タンパク質の２つのメンバーを分離する柔軟なタンパク質スペーサーを提供する一方、タンパク質分解には比較的耐性であろう。適切なリンカーペプチド配列の例は、GGGGSGGSGGSGGGGS（配列番号２５１１７）またはSGGSSAAGSGSG（配列番号２５１１８）またはSAGSSAAGSGSG（配列番号２５１１９、Wang 2010）である。あるいは、アルファらせんリンカー配列を用いてもよく、例えば配列A（EAAAAK）ｎA、ｎ＝２〜５（配列番号２５１２０〜２５１２３、Arai 2001）がある。
【０１９５】
配列増幅：
[00202]３’端の２４ポリヌクレオチド特異的塩基を含有するポリヌクレオチド特異的プライマーおよび５’端の１６ｂｐの保存配列を含有するプライマーを用いて、各ＯＲＦをＰＣＲ増幅する。各ポリヌクレオチドに関して個々に、またはポリヌクレオチドプールに関して同時に、増幅を行う。
【０１９６】
[00203]個々の増幅のため、各々、最終濃度０．５〜５μＭの２つのプライマーを、１０〜１０００ｎｇの大腸菌ゲノムＤＮＡ、ＰＣＲ緩衝液および熱安定性ポリメラーゼと、１〜５０μｌの総反応体積中で合わせる。高忠実度熱安定性ポリメラーゼ、例えばPhusion（登録商標）ポリメラーゼが使用可能である。Phusion（登録商標）ポリメラーゼに関しては、９５℃２分間の変性、その後、９５℃２０秒間、６０℃２０秒間の１０〜３５周期、および７２℃１分／ｋｂ（７２℃で最低３０秒間）によって、ＰＣＲアンプリコンを生成する。アガロース電気泳動によって、または蛍光計、例えばQubit（登録商標）蛍光計（Life Technologies）を用いた蛍光分光測定によって、ＰＣＲ産物形成の効率を測定する。ＤＮＡ精製に適したシリカ樹脂を用いて、成功したＰＣＲ反応を精製することも可能である。成功しなかった反応を、ＰＣＲ反応中のＭｇ＋２濃度および／または他の反応条件を変化させることによって反復する。各ＯＲＦの増幅成功後、各ＰＣＲ産物濃度を規準化し、そして特定のサイズ範囲に対応する産物をクローニングのためにプールする。
【０１９７】
[00204]個々の増幅は、各ＯＲＦの増幅が別個に行われ、そして監視され、ＯＲＦの最終プール中の各ＯＲＦがほぼ同等の提示であることを可能にする利点を有する。多数のＰＣＲ反応を平行して行い、そしてアッセイする必要があり、ロボット装置および多数の増幅の最適化を必要とする、不都合な点がある。
【０１９８】
[00205]プールした増幅に関しては、ＰＣＲ増幅の効率は、非常にサイズ依存性であるため、そしてＰＣＲ条件（７２℃での伸張時間、上記を参照されたい）はアンプリコンのサイズに応じるため、ＯＲＦは、サイズによってプールされる。ＯＲＦは、任意の数のサイズプールに分離される。より少数のサイズプールは、増幅をより少数の試料で行うことが可能であり、時間および試薬を節約する利点を有する。多数のサイズプールは、各プールの複雑性がより低く、より高い濃度の各プライマー対、そしてしたがって、各ポリヌクレオチドの増幅成功の可能性がより高いことを意味する。
【０１９９】
[00206]遺伝子増幅に用いる、妥当で、そして好適なプール数は、各３０〜３１遺伝子の９６プールであり、１つの９６ウェルプレートを満たす（９６プールｘ平均３０．８１遺伝子＝総数２９５８遺伝子）。プールへの各遺伝子の割り当てに到達するため、遺伝子およびその対応するプライマー対を、遺伝子サイズに基づいてソーティングし、そしてソーティングしたリスト由来の連続したプライマーセットから、プライマーを各プールに割り当てる。増幅総数を９６プールに分割する際、同一のまたは類似のサイズの３１遺伝子＝６２プライマーを７８プール各々に割り当て、そして残った１８プールは各々、３０遺伝子に対応する６０プライマーを含有する。
【０２００】
[00207]３’端の２０〜３０ポリヌクレオチド特異的塩基を含有するポリヌクレオチド特異的プライマーおよび５’端の保存配列を含有するプライマーを用いて、各ＯＲＦをＰＣＲ増幅する。各ポリヌクレオチドに関して個々に、またはポリヌクレオチドプールに関して同時に、増幅を行う。
【０２０１】
[00208]個々の増幅のため、各々、最終濃度０．５〜５μＭの２つのプライマーを、１０〜１０００ｎｇの大腸菌ゲノムＤＮＡ、ＰＣＲ緩衝液および熱安定性ポリメラーゼと、１〜５０μｌの総反応体積中で合わせる。高忠実度熱安定性ポリメラーゼ、例えばPhusion（登録商標）ポリメラーゼが使用可能である。Phusion（登録商標）ポリメラーゼに関しては、９５℃２分間の変性、その後、９５℃２０秒間、６０℃２０秒間の１０〜３５周期、および７２℃１分／ｋｂ（７２℃で最低３０秒間）によって、ＰＣＲアンプリコンを生成する。アガロース電気泳動によって、または蛍光計、例えばQubit（登録商標）蛍光計（Life Technologies）を用いた蛍光分光測定によって、ＰＣＲ産物形成の効率を測定する。ＤＮＡ精製に適したシリカ樹脂を用いて、成功したＰＣＲ反応を精製することも可能である。成功しなかった反応を、ＰＣＲ反応中のＭｇ＋２濃度および／または他の反応条件を変化させることによって反復する。各ＯＲＦの増幅成功後、各ＰＣＲ産物濃度を規準化し、そして特定のサイズ範囲に対応する産物をクローニングのためにプールする。
【０２０２】
[00209]個々の増幅は、各ＯＲＦの増幅が別個に行われ、そして監視され、ＯＲＦの最終プール中の各ＯＲＦがほぼ同等の提示であることを可能にする利点を有する。多数のＰＣＲ反応を平行して行い、そしてアッセイする必要があり、ロボット装置および多数の増幅の最適化を必要とする、不都合な点がある。
【０２０３】
[00210]プールした増幅に関しては、ＰＣＲ増幅の効率は、非常にサイズ依存性であるため、そしてＰＣＲ条件（７２℃での伸張時間、上記を参照されたい）はアンプリコンのサイズに応じるため、ＯＲＦは、サイズによってプールされる。ＯＲＦは、任意の数のサイズプールに分離される。より少数のサイズプールは、増幅をより少数の試料で行うことが可能であり、時間および試薬を節約する利点を有する。多数のサイズプールは、各プールの複雑性がより低く、より高い濃度の各プライマー対、そしてしたがって、各ポリヌクレオチドの増幅成功の可能性がより高いことを意味する。好適な数のサイズプールは、１または２の９６ウェルプレート中のウェルの数に対応する。例えば各１５〜１６のＯＲＦの１９２プール（１９２プールｘ平均１５．２３  ＯＲＦ＝総数２９２５のＯＲＦ；これは、各１６プライマー対を含有する４５プール、および各１５プライマー対を含有する１４７プールに対応する）。
【０２０４】
[00211]プールしたＰＣＲ増幅を３工程で行う：１）遺伝子特異的プライマーを用いた最初の増幅、その後、２）保存されたプライマーを用いた各ＯＲＦプールの増大、その後、さらなるプーリング、ゲル上でのサイズ選択、および３）最終長ＰＣＲ産物を生じる第三の増幅工程。３つの増幅工程は、それぞれ、第一段階、第二段階および第三段階増幅と称される。
【０２０５】
[00212]PhusionＴＭホットスタートＩＩ熱安定性高忠実度ポリメラーゼ（Thermo ScientificＴＭ）を用いて、すべてのＰＣＲ増幅を行う。５ｘＨＦ増幅緩衝液とともに酵素を供給し、すべての反応に用いる。増幅は、以下に示すように、２０μＬまたは５０μＬ反応体積で行う。すべての増幅を、９６ウェルブロックを含有するＴ１００サーマルサイクラー（Bio-Rad Laboratories）上で行う。すべての増幅で用いるデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）は、各ｄＮＴＰ  １０ｍＭを含有するストックであり、やはりThermo Scientific（登録商標）より得られる。すべての反応に脱イオン水を用い、そしてポリメラーゼとともに供給されないすべての溶液を作るためにも脱イオン水を用いる。
【０２０６】
[00213]すべてのＰＣＲ増幅は、同じ一般的な方法にしたがう：
[00214]１．  ＰＣＲ反応の各段階のため、以下に記載するようなＰＣＲ混合物を調製し、そしてサーマルサイクラーに挿入するまで低温で維持する。
【０２０７】
[00215]２．  試料を完全に混合し、そして次いで、４０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、試験管またはプレートウェルの底に反応内容物を集める。
[00216]３．  プレートまたは試験管をサーマルサイクラー内に挿入する。
【０２０８】
第一段階増幅：
[00217]上述のような配列特異的ＰＣＲプライマープールを用いて、第一段階増幅を行う。反応あたり２μＬの１０ｎｇ／μＬシネココッカス・エロンガトゥス株ＰＣＣ７９４２ゲノムテンプレートＤＮＡを用いて、２０μＬ総体積中、各増幅を行う。各反応に、１００μＭストックから２．５μＬプライマープールを添加して、１２．５μＭの最終総プライマー濃度を提供する。各プライマープールは、１５または１６プライマー対のいずれかを含有し；そして最終の個々のプライマー濃度は、およそ０．３９〜０．４２μＭである。
【０２０９】
[00218]第一段階のＰＣＲ反応混合物は、２０μｌ総体積中で設定され、そして以下の構成要素から混合される：４μｌ  ５ｘ Phusion（登録商標）ＨＦ緩衝剤、０．４μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０．７μｌ脱イオンＨ２Ｏ、２μｌ  １０ｎｇ／μｌゲノムテンプレートＤＮＡ、２．５μＬプライマープール（１００μＭ）、０．４μｌ  PhusionＴＭホットスタートＩＩ熱安定性ポリメラーゼ（２単位／μｌ）。ＰＣＲサイクリング条件は以下の通りである：９８℃４５秒間の最初の変性、各３工程（９８℃１０秒間、６０℃３０秒間および７２℃３分間）からなる１０周期、７２℃３分間の最終伸張工程、およびサーマルサイクラーから試料を取り出すまでの４℃での浸漬。ＰＣＲ増幅が完了した後、試料をサーマルサイクラーから取り出し、完全に混合し、そして４０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、第一段階増幅産物を提供する。
【０２１０】
第二段階増幅：
[00219]第二段階の増幅で用いるプライマーは、第一段階の増幅プライマーの保存された部分に相同性を持つ単一のプライマーである。第二段階のプライマーは、対の混合物として調製され、各々、等モル量の２つのプライマーを含有し、そして２０μＭの総プライマー濃度を含有する。
【０２１１】
[00220]第二段階ＰＣＲ反応混合物を５０μｌ総体積中にセットアップし、そして以下の構成要素から混合する：１０μｌ  ５ｘ Phusion（登録商標）ＨＦ緩衝剤、１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ、２２μｌ脱イオンＨ２Ｏ、１０μｌ第一段階反応産物、６μｌ第二段階プライマー混合物（２０μＭ）および１μｌ  PhusionＴＭホットスタートＩＩ熱安定性ポリメラーゼ（２単位／μｌ）。ＰＣＲサイクリング条件は以下の通りである：９８℃４５秒間の最初の変性、各２工程（９８℃２０秒間および７２℃３分間）からなる２５周期、７２℃３分間の最終伸張工程、およびサーマルサイクラーから取り出すまでの４℃での浸漬。
【０２１２】
[00221]ＰＣＲ増幅が完了した後、試料をサーマルサイクラーから取り出し、完全に混合し、そして４０００ｒｐｍで１分間遠心分離する。
[00222]試料のより効率的な下流プロセシングを可能にするため、８試料を１つにプールすることによって、１９２多重ＰＣＲ試料を２４のより大きいプールに統合する。各多重ＰＣＲ反応中の産物の量をまず定量化して、異なるサイズの断片コレクションの等モルプールを可能にする。これは、各多重反応に対してゲル電気泳動を行い、そして予期されるサイズの各バンド中の蛍光を定量化することによって、あるいはApplied Biosystems（登録商標）３７３０  ＤＮＡ分析装置またはQIAGEN（登録商標）QIAxcel（登録商標）装置などのキャピラリー電気泳動によってのいずれかで、行う。各多重プールの平均サイズを考慮に入れ、一緒にプールされて、プールに添加される各産物の等モル量を生じる、各多重ＰＣＲ反応の相対量を計算するために、各多重反応中の望ましい産物の濃度を用いる。産物をサイズによってグループ分けし、そしてプールして、下流ＰＣＲ増幅における増幅バイアスを最小限にする。
【０２１３】
[00223]１９２多重反応を、以下のように２４のより大きいプールに合わせる。大プール１：多重プール１〜８；大プール２：多重プール９〜１６；大プール３：多重プール１７〜２４；大プール４：多重プール２５〜３２；大プール５：多重プール３３〜４０；大プール６：多重プール４１〜４８；大プール７：多重プール４９〜５６；大プール８：多重プール５７〜６４；大プール９：多重プール６５〜７２；大プール１０：多重プール７３〜８０；大プール１１：多重プール８１〜８８；大プール１２：多重プール８９〜９６；大プール１３：多重プール９７〜１０４；大プール１４：多重プール１０５〜１１２；大プール１５：多重プール１１３〜１２０；大プール１６：多重プール１２１〜１２８；大プール１７：多重プール１２９〜１３６；大プール１８：多重プール１３７〜１４４；大プール１９：多重プール１４５〜１５２；大プール２０：多重プール１５３〜１６０；大プール２１：多重プール１６１〜１６８；大プール２２：多重プール１６９〜１７６；大プール２３：多重プール１７７〜１８４；および大プール２４：多重プール１８５〜１９２。構成要素ＯＲＦのサイズに基づいて、各大プールの生じた平均ＯＲＦサイズ（添加されるプライマー配列を伴うおよび伴わない）を計算する。
【０２１４】
[00224]ひとたびプーリングが完了したら、製造者の推奨にしたがって、シリカ樹脂カラムまたはMacherey Nagel NucleoSpin（登録商標）９６  ＰＣＲクリーンアップキットなどのプレートを用いて、１０μｇの望ましい産物総量に対応する各ＯＲＦ大プールの量を精製する。精製ＰＣＲ産物の溶出後、各試料を完全に混合し、そしてその濃度を分光光度測定で決定する。
【０２１５】
[00225]４８の大プールから望ましくないサイズの産物およびプライマー二量体を取り除くため、２μｇの各プールを１％アガロースゲル上で電気泳動し、そしてエチジウムブロミドで染色し、バンドをＵＶまたは青い光の下で視覚化し、そしてより大きいプール各々の正しいサイズに対応するゲル断片をゲルから切り出す。ゲル断片の重量を測定し、そして製造者の推奨にしたがって、Macherey Nagel NucleoSpin（登録商標）ゲルおよびＰＣＲクリーンアップキットなどのシリカ樹脂ゲル精製法を用いて、そこからＤＮＡを精製する。精製が完了したら、すべての試料の濃度を分光光度測定で決定し、そして精製第二段階大プール増幅産物各々の濃度を、第三段階増幅のため、１０ｎｇ／μＬに調整する。
【０２１６】
第三段階増幅
[00226]第三段階増幅は、各ＰＣＲ産物に最終配列を付加して、末端相同性によって効率的な組み立てを可能にし、そして各大プールの量を増加させる。第三段階増幅に用いるプライマーは、第一段階および第二段階増幅プライマーの保存された部分に相同性を持つ単一プライマーである。第三段階プライマーは、対の混合物として調製され、各々、等モル量の２つのプライマーを含有し、そして２０μＭの総プライマー濃度を含有する。
【０２１７】
[00227]第三段階ＰＣＲ反応混合物を５０μｌ総体積中にセットアップし、そして以下の構成要素から混合する：１０μｌ  ５ｘ Phusion（登録商標）ＨＦ緩衝剤、１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ、２２μｌ脱イオンＨ２Ｏ、１０μｌゲル精製したプール第二段階反応産物（１０ｎｇ／μｌ）、６μｌ第三段階プライマー混合物（２０μＭ）および１μｌ  Phusion（登録商標）ホットスタートＩＩ熱安定性ポリメラーゼ（２単位／μｌ）。ＰＣＲサイクリング条件は以下の通りである：９８℃４５秒間の最初の変性、各２工程（９８℃２０秒間および７２℃３分間）からなる２５周期、７２℃３分間の最終伸張工程、およびサーマルサイクラーから取り出すまでの４℃での浸漬。
【０２１８】
[00228]第三段階増幅が完了した後、試料を完全に混合し、遠心分離し、そして製造者の推奨にしたがって、Macherey Nagel NucleoSpin（登録商標）９６  ＰＣＲクリーンアップキットなどのシリカ樹脂精製を用いて、精製する。溶出後、各試料を完全に混合し、そしてその濃度を分光光度で測定する。
【０２１９】
[00229]より効率的な下流プロセシングのため、次いで、４つの最小の大プールを１つのスーパープールに合わせ、そして５つの大プールの続くセットを合わせて、さらなるスーパープールを形成することによって、２４の大プールを５つの「スーパープール」に統合する。各スーパープールに添加される各大プールの相対量は、第三段階増幅および精製後の各大プールの最終濃度、ならびに各大プールの最終平均サイズ（プライマーによって付加される配列を含む）と、等モル量の各大プールを各スーパープールに添加する目的とを考慮することによって、計算される。
【０２２０】
[00230]この実施例の先の工程におけるように、スーパープールをＯＲＦサイズに基づいて調製し、同様のサイズのＯＲＦのより大きいプールを同じスーパープールにグループ分けする。挿入物サイズに基づくクローニングバイアスを最小限にするため、各々の場合に、クローニングベクターと一緒に、５’ＯＲＦの各サイズプールを３’ＯＲＦの各サイズプールと対で合わせることによって、サイズ分画を別個に発現ベクターにクローニングする。
【０２２１】
ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・ライブラリー構築
[00231]増幅後、ＯＲＦの相対濃度を、ＤＮＡ分子のモル濃度（質量濃度ではなく）に関して規準化する。上述のような個々のまたはプールされたＰＣＲ増幅によって生成されたＯＲＦコレクションに添加される、他の生物由来のクローニングされたポリヌクレオチドまたはＯＲＦ由来のＯＲＦを含めた、特定のＯＲＦを、多様な量でＯＲＦコレクションに添加してもよい。例えば、特定のＯＲＦを、他のＯＲＦの濃度に対応するモル量で、あるいは最終ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・ライブラリー内の提示を変化させる、より低いまたはより高い量で、添加する。例えば、ストレス許容性を与える特定のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、Ｓ．エロンガトゥスにおけるストレス許容性を与える特に高い可能性を有すると推測される場合、ＯＲＦコレクション中にこの配列を過剰提示して、大部分のまたはすべてのランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの組み合わせが、この優先される配列とともに試験されることを確実にすることも可能である。
【０２２２】
ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・ライブラリー構築
[00232]増幅およびスーパープールへのプーリング後、ＯＲＦの相対濃度を、ＤＮＡ分子のモル濃度（質量濃度ではなく）に関して規準化する。上述のような個々のまたはプールされたＰＣＲ増幅によって生成されたＯＲＦコレクションに添加される、他の生物由来のクローニングされたポリヌクレオチドまたはＯＲＦ由来のＯＲＦを含めた、特定のＯＲＦを、多様な量でＯＲＦコレクションに添加してもよい。例えば、特定のＯＲＦを、他のＯＲＦの濃度に対応するモル量で、あるいは最終ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・ライブラリー内の提示を変化させる、より低いまたはより高い量で、添加する。例えば、ストレス許容性を与える特定のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、大腸菌におけるストレス許容性を与える特に高い可能性を有すると推測される場合、ＯＲＦコレクション中にこの配列を過剰提示して、大部分のまたはすべてのランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの組み合わせが、この優先される配列とともに試験されることを確実にすることも可能である。
【０２２３】
[00233]２つのＯＲＦのｐＵＣ１９発現ベクター分子内への一工程組み立ては、各断片の５’および３’端に位置し、そして図３に示す環状の組み立てられた産物の構造を特定する、保存された／相同配列によって指示される。多数の方法のいずれか１つを用いて、この相同性依存性組み立てを達成することも可能であり、これらのすべては、相同一本鎖ＤＮＡ端のアニーリングに基づくクローニング法、例えばリンカーテーリング法（Lathe 1984）またはＤＮＡ分子の末端の相補的ホモポリマー性一本鎖テールに依存する方法（Lobban 1973）に由来する。さらに、現代の相同性依存性クローニング技術は、１９９０年代初期に記載される連結独立性クローニング法（Aslanidis 1990、Aslanidis 1994）に概念的に関連する。こうした相同性依存性クローニング法には、限定されるわけではないが：融合内クローニング（Zhu 2007、Irwin 2012）、配列および連結独立性クローニング（ＳＬＩＣ、Li 2007、Li 2012）、迅速クローニング（Li 2011）、環状ポリメラーゼ伸張クローニング（Quan 2009、Quan 2011）、ギブソン組み立て法（Gibson 2009、Gibson 2010）、迅速およびクリーンクローニング（Thieme 2011）およびその他（Vroom 2008）が含まれる。
【０２２４】
[00234]in vitroで、５つの５’および５つの３’ＯＲＦスーパープールの各組み合わせを用いて、総数２５の組み立て反応に関して、ライブラリー組み立てを行う。各反応において、１５０ｆｍｏｌの５’ＯＲＦスーパープールＤＮＡおよび１５０ｆｍｏｌの３’ＯＲＦスーパープールＤＮＡ（平均サイズに基づくモル濃度）を、７５ｆｍｏｌのＰＣＲ増幅単一断片ｐＵＣ１９ベクターＤＮＡ（配列番号２５１２６）と合わせる。ＤＮＡ混合物の体積を１０μｌに調整し、これに１０μｌの組み立て混合物（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各０．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、２０ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭニコチンアミドアデニン二ヌクレオチド、０．０２単位／μｌ  Ｔ５エキソヌクレアーゼ、０．０５単位／μｌ  Phusion（登録商標）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、０．４単位／μｌ  Ｔａｑリガーゼ）を添加する。反応を穏やかに混合し、そして５０℃で１〜２時間インキュベーションする。次いで、反応を氷上に維持するか、または大腸菌形質転換に使用する前に凍結する。
【０２２５】
[00235]このin vitro組み立て法を記載するように実行するか、またはこの方法に適している可能性もあるエキソヌクレアーゼ活性を持つ他の酵素、例えばＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、ラムダエキソヌクレアーゼ、Ｔ５エキソヌクレアーゼまたはＴ７エキソヌクレアーゼを用いて行ってもよい。活性の５’から３’の方向性を持つエキソヌクレアーゼ（すなわちＴ４ポリメラーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、Ｔ５エキソヌクレアーゼまたはＴ７エキソヌクレアーゼ）は、各クローニング接合部の２つのニックの間に、より多数のアニーリング配列塩基対を生じ、したがって、望ましい産物を安定化させるため、こうしたエキソヌクレアーゼが好ましい。Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼを添加せずに、この方法を実行して、満足出来る結果を得ることも可能である。反応に、最終濃度５〜１０％でポリエチレングリコール（分子量４０００〜１００００）を補充して、一本鎖ＤＮＡ端のアニーリングを促進することも可能である。しかし、上述のような十分に高いＤＮＡ濃度が与えられていれば、ＰＥＧは必要ではない。
【０２２６】
[00236]１μｌの組み立て反応と２５μｌのエレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ細胞（Life Technologies社）またはＥＣ１００細胞（Epicentre Technologies）を氷上で混合することによって、エレクトロポレーションによって組み立て反応を大腸菌に形質転換する。次いで、細胞／ＤＮＡ混合物を１ｍｍギャップ幅エレクトロポレーション・キュベット内に移し、そしてBio-Rad Micropulserエレクトロポレーターを用いて、１．５ｋＶでエレクトロポレーションする。細胞を１ｍｌ  ＬＢブロス中に再懸濁し、１０ｍｌ培養試験管中、℃で１時間、２５０ｒｐｍで培養し、そして５０〜１００μｇ／μｌカルベニシリンを含有するＬＢ寒天上にプレーティングする。組み立て反応を、エタノールでのＤＮＡ沈殿によって、または微小透析によって、または製造者の推奨にしたがってBio-Rad Micro Bio-Spin P6ゲルカラムを通じて遠心分離することによってのいずれかで、組み立て反応を脱塩することによって、形質転換効率を改善することも可能である。
【０２２７】
ライブラリー形質転換およびスクリーニング
[00237]産業的にならびに研究目的のために用いられているＳ．エロンガトゥス株ＰＣＣ７９４２またはＰＣＣ７００２（Ruffling 2011）をすべての形質転換およびスクリーニングに用いる。
【０２２８】
[00238]組み立て後、異なるライブラリーを直接用いて、Ｓ．エロンガトゥス形質転換体を生成するか、または大腸菌への形質転換によって最初に増幅する。
[00239]２９２５のＯＲＦのランダム対組み立てから生じる配列組み合わせのありうる総数は、この数字の平方＝８６０万に等しい。典型的には、スクリーニングプロジェクトの目的は、各組み合わせが提示される＞９０％の可能性を達成するために、ライブラリー複雑性の３倍多いクローンまたは形質転換体をスクリーニングすることである。この例では、これは、およそ２６００万の形質転換体に対応し、これはＳ．エロンガトゥスにおいて、多様な実験室株で達成されてきている高い形質転換効率のために可能である。１０００万のＳ．エロンガトゥス形質転換体の生成は、１０リットルの培地中で増殖させる細胞を用いて、およそ１０００の形質転換を実行することに対応する。
【０２２９】
[00240]相同性依存性クローニング法を用いたプラスミド組み立て反応は非常に効率的である可能性があり（Li 2007、Quan 2009、Gibson 2010、Li 2011、Quan 2011、Thieme 2011、Li 2012）、インプットＤＮＡの正しい産物への組み立てを高率で生じるため、Ｓ．エロンガトゥスをＦＧプールＤＮＡで直接形質転換することも可能である。Ｓ．エロンガトゥスの形質転換効率を、ＤＮＡ  μｇあたり、１Ｅ６形質転換体と仮定すると、これは＞１０μｇの組み立てＦＧプールＤＮＡを必要とし、各組み立て反応は、全部で約０．５μｇのＤＮＡを含有することを考慮すると、これは達成可能な数値である。パイロットＳ．エロンガトゥス形質転換実験を用いて、ＦＧプールＤＮＡから生成可能な形質転換体の数を測定し、そしてこれらの形質転換体が正しい構造の組み込み配列を含有するかどうかを調べる。
【０２３０】
[00241]観察されるＳ．エロンガトゥス形質転換効率が、ＦＧプールＤＮＡから直接、十分な数の形質転換体を生成するには限定されている場合、ＦＧプールをまず、大腸菌において増幅することも可能である。単一の２０μｌ相同性仲介組み立て反応は、およそ２００万の大腸菌形質転換体を生じることも可能であり、これは、液体ゲル培地（Elsaesser 2004）において、または液体増殖およびｐｈｉ２９ポリメラーゼを用いた増幅の組み合わせ（Fullwood 2008）によってのいずれかで増幅可能である。プラスミド増幅を、２５の組み立てプール各々に関して別個に行い、各プール中に提示される配列組み合わせの比率を維持する。
【０２３１】
[00242]以下の方法（Clerico 2007）を用いて、形質転換を達成する。Ｓ．エロンガトゥス細胞を１００ｍＬの液体ＢＧ−１１Ｍ中で、０．７のＯＤ７５０まで増殖させる。１５ｍＬのシアノバクテリア細胞懸濁物を、６０００ｇ１０分間の遠心分離によって採取する。細胞ペレットを１０ｍＬの１０ｍＭ  ＮａＣｌ中で再懸濁し、そして６０００ｇ１０分間の遠心分離によって再びペレットにする。細胞ペレットを０．３ｍＬのＢＧ−１１Ｍに再懸濁し、そして微量遠心管に移す。０．３ｍＬの細胞の各アリコットに、５０ｎｇ〜２μｇの間のＤＮＡを、１〜２０μＬの体積で添加する。試験管をアルミニウムホイルで包み、細胞を光から遮蔽して、そして３０℃で穏やかに攪拌しながら一晩インキュベーションする。全０．３ｍＬ細胞懸濁物を、適切な抗生物質または選択剤を含有するＢＧ−１１Ｍプレート上にプレーティングする。プレートを一定の光の中、３０℃で、単一コロニーが出現するまで、およそ５日間インキュベーションする。
【０２３２】
[00243]また、Ｓ．エロンガトゥス内に、融合タンパク質遺伝子のライブラリーを送達する効率的な方法として、大腸菌およびＳ．エロンガトゥスの間の細菌コンジュゲート化を用いてもよい（Tsinoremas 1994、Elhai 1994）。
【０２３３】
[00244]単離されたコロニーを再ストリークするか、または抗生物質の存在下で液体培養中で増殖させて、挿入物に関して選択し続けることも可能である。形質転換細胞を誘導剤の存在下で増殖させて、融合タンパク質の発現を活性化させることも可能である（すなわち、Ｐｔｒｃプロモーターを用いる場合、ＩＰＴＧの存在下で）。
【０２３４】
迅速増殖／高バイオマス表現型に関するスクリーニング
[00245]Ｓ．エロンガトゥスのＰＣＣ７９４２実験室株（Ruffing 2011）に、融合遺伝子を含有するプールされたライブラリーを形質転換し、そして次いで、プラスミドの存在に関して選択し、そして融合タンパク質の発現を誘導する条件下で増殖させる。すべての培養を、光照射されたラックおよび光照射された軌道プラットフォーム振盪装置中の注意深く調節された一定条件下で増殖させて、選択の均一性を維持する。
【０２３５】
[00246]２つの異なるアプローチを用いて、より高い増殖率および／またはより高いバイオマス集積率を持つ形質転換体に関して、選択するかまたはスクリーニングする。これらのうちの一方は、より大きいサイズのコロニーに関して形質転換プレートをスクリーニングする工程を伴い、一方、他方は、アルギン酸ビーズ中に被包し、そして増殖させた、シアノバクテリア微小コロニーを、ＦＡＣＳソーティングを用いて単離する。
【０２３６】
[00247]より大きいコロニー：固形培地上のスクリーニングは、個々のクローンまたは形質転換体の可視化を可能にするため、より大きいコロニーとして明らかに可視である、迅速な増殖に寄与する遺伝子を発現している形質転換体を同定するために、特に有用である。倍加時間の数パーセント程度の小さい相違が、コロニーサイズの測定可能な相違を導きうる。例えば、６時間＝３６０分間の平均倍加時間の株の６日間＝１４４時間の増殖期間は、２４回の倍加を可能にし、一方、３４２分間の、５％より迅速な平均倍加時間を持つ株は、２５．３回倍加し、コロニーサイズに明らかに反映される、細胞数の２．５倍の相違を導く。こうしたスクリーニングは、他の研究者によって用いられてきており、酵母においてエタノール耐性に寄与する遺伝子の単離のため、用いられてきている（Ｈｏｎｇ  ２０１０）。
【０２３７】
[00248]より大きいコロニーに関してスクリーニングする際、偽陽性が生じる可能性があり、これは、細胞分裂速度の増加または平均細胞サイズの増加以外の理由のためにコロニーサイズが改変されるものであろう。こうした偽陽性の例は、より平らなコロニーまたはコロニーの縁から広がる傾向を持つ、高い運動性を持つ細胞を含有するコロニーである。これらの偽陽性を迅速に排除するため、各候補コロニーを、針金またはプラスチックループでスクリーニングプレートから持ち上げるかまたは掻き取り、そして少量の液体培地に懸濁する。細胞懸濁物の半量を、フローサイトメーターで計数し、細胞数、および細胞サイズの指標である細胞の光散乱特性を決定する。１０の対照コロニー中に見られる平均細胞数よりも２標準偏差を超える細胞数のコロニー、または細胞サイズの比例的に類似の増加を持つ細胞を含有するコロニーのみが、さらなる性質決定および検証のために保持される。＊
[00249]ゲル微小ビーズ中の被包：アルギン酸またはアガロースゲル微小ビーズまたは微小滴中の被包は、多様な環境条件における増殖が可能な微生物の単離に、高い栄養素濃度では増殖不可能な微生物の培養に、あるいは微生物株または微生物混合物の増殖アッセイの実行に、成功裡に用いられてきている。ゲル微小ビーズ内に被包された個々の微生物は、増殖するにつれて、ビーズ内に微小コロニーを形成し、そして微小ビーズ内部の微小コロニーサイズを反映する、微小ビーズの側方散乱特性に基づく蛍光活性化細胞ソーティングによって分離可能である。
【０２３８】
[00250]液体培地でプレートを湿らせ、そして４〜５ｍｍガラスビーズの延展作用を用いて、寒天マトリックスからコロニーを分離することによって、シアノバクテリア形質転換体をプレートから除去する。懸濁された形質転換細胞を、産生に用いたサブライブラリーに対応してプールし、そして各プールの一部を凍結保存する。公表されたプロトコル、ならびにOne Cell Systems Incによって販売される被包材料および装置を用いて、個々のシアノバクテリア細胞をゲル微小滴中に被包する。微小滴組成物を調整して、細胞分裂の正常な速度での滴内のＳ．エロンガトゥス細胞の均質な増殖を可能にする。
【０２３９】
[00251]細胞を、５０ｍｌあたり１０７微小滴の密度で、照明バイオリアクターまたは増殖フラスコ中、一定の振盪を加えながら増殖させる。多数の細胞が同じ微小滴内に被包される可能性を減少させるため、細胞密度を調整して、およそ１０％の微小滴が細胞を含有するようにし、＞９０％提示信頼性で１０７形質転換体の全ライブラリーを提示するには、およそ３ｘ１０８微小滴（培地総体積１．５Ｌ中）を必要とする。
【０２４０】
[00252]数日間増殖させた後、遠心分離によってゲル微小ビーズを収集し、そして蛍光活性化細胞ソーティングによってソーティングする。側方散乱において平均より２標準偏差高い微小コロニーを含有するゲル微小小滴を単離し、液体培養に戻し、そしてさらに数日間増殖させて、シアノバクテリア細胞が過剰増殖して微小小滴を破裂させるのを可能にする。こうした培養からＤＮＡを単離し、そして大腸菌におけるプラスミド・レスキューに用いる（Dolganov 1993）。レスキューされたプラスミドを分子の集団として精製し、そしてＳ．エロンガトゥスに再導入し、そして被包、増殖およびソーティング・プロセスを反復する。
【０２４１】
バイオマスおよび増殖率に関する活性融合遺伝子の性質決定および検証
[00253]プレート上で、または微小滴培養中で生じる関心対象の表現型を持つ細胞のコロニーまたは集団を摘み取り、拡大し、そして大腸菌におけるプラスミド・レスキューに用いる（Dolganov 1993）。４つの大腸菌コロニーを各Ｓ．エロンガトゥス形質転換体に関して摘み取るか、または２００の大腸菌コロニーを微小小滴の各集団から摘み取る。ＤＮＡを単離し、そして制限消化によってチェックする。次いで、表現型確認のため、プラスミドＤＮＡをＳ．エロンガトゥスに再導入する。
【０２４２】
[00254]単純化するため、９６ウェル形式で行う標準増殖率およびバイオマスアッセイを用いて、この方式で単離したすべてのプラスミドを検証する。検証しようとする各Ｓ．エロンガトゥス形質転換体由来の細胞を、自動化フローサイトメーターを用いて計数し、そして同じ標準的細胞密度に希釈する。各細胞培養１００μｌアリコットを９６ウェルプレート中のウェルに添加し、これを覆い、そして蒸発を最小限にする条件下、照明下で穏やかに攪拌しながらインキュベーションする。数日増殖させた後、各培養の少量のアリコットをフローサイトメトリーによって分析して、細胞密度および平均細胞サイズを決定する。各培養の残りを水で洗浄して塩を取り除き、細胞ペレットを乾燥させて、そして重量測定し、乾燥重量を測定する。結果を表にして、生じた培養の細胞数、細胞サイズ、または乾燥重量に対して最大の影響を持つ、最も有望な融合遺伝子構築物の選択を可能にする。
【０２４３】
アルコール耐性に関するスクリーニング
[00255]４つの異なるアプローチを用いて、ブタノールまたはエタノール許容性形質転換体に関して選択するかまたはスクリーニングする。これらの２つは、生存選択を伴い、致死濃度のブタノールを用いて、アルコールで生き延びる能力を持つ細胞を単離する。他の２つのアプローチは、ブタノールまたはエタノールの致死量以下の濃度の存在下で改善された増殖特性を持つ細胞を単離することを目的とする。選択／スクリーニングは、固形培地上での増殖および選択を伴うか、または固形培地上でのスクリーニングと液体培地中での増殖を組み合わせるかいずれかを伴う。ブタノールに関する選択およびスクリーニング・アプローチを表６の例として要約し、ブタノール濃度範囲は、イソブタノールおよびｎ−ブタノールに関する公表された情報に基づいて概算される（Atsumi 2009、Kamarainen 2012）。列「インキュベーション時間」は、ブタノールの存在下で形質転換体が培養された時間の量を指す。また、アルコール耐性またはアルコール許容性細胞を単離するために用いるのと同じ方法を用いて、ブチルアルデヒドなどの他の毒性化合物に対する、または高塩および高温などの非生物ストレスの他の条件に対する許容性に関して選択し、そしてスクリーニングすることも可能である。
【０２４４】
[00256]あるいは、形質転換体を、バルクで、液体培養中、細胞の増殖および耐性特性の多様なタイプに関して選択する条件下で培養する。４つの選択スキームには、正確なプレーティングまたは培養条件、および各選択のための最適なブタノール濃度に到達するため、後にバルクＳ．エロンガトゥス形質転換体とともに用いる細胞密度のもとでの、注意深い力価決定が先行する。注意深く制御された一定の条件下で、すべての培養を増殖させて、選択における均一性を維持する。
【０２４５】
【表６】
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【０２４６】
[00257]固形培地上での選択およびスクリーニングのため、ランダム化融合ポリペプチド・ライブラリーの形質転換後、形質転換体を、抗生物質を欠く液体培地中、３０℃で６時間、照明下であらかじめ培養する。次いで、抗生物質およびＩＰＴＧを液体培養に添加して、プラスミドの存在に関して選択し、そしてランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの発現を誘導し、そして形質転換体をさらに１時間培養する。次いで、培養を希釈して、プレートあたりの形質転換体数をほぼ管理可能であるようにする（選択するかまたはスクリーニングする特質に応じて、１０ｃｍプレートあたり、およそ２０００〜２００００コロニー）。培養を固形培地上でプレーティングし、この培地組成は、選択する特質に応じ、例えばブタノールを含有するＢＧ１１Ｍ寒天である。表６を参照されたい。プレートを３０℃で数日間インキュベーションし、そしてコロニー摘み取り、プラスミド単離、表現型検証および活性ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの性質決定のため、その時点で選択する（以下を参照されたい）。コロニー選択は、コロニーサイズ（増殖率および増殖収率を反映し、増殖率、低温増殖および増殖収率特性に影響を及ぼすポリヌクレオチドを同定するために用いられる）に基づいて、または陽性選択に基づいて、すなわち大多数の形質転換体がプレート上で増殖するのに失敗し、そして関心対象のランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを含有するもののみが増殖する場合（高温、塩または有機溶媒の許容性に影響を及ぼすランダム化融合ポリヌクレオチドを同定するために用いられる）のいずれかで行われる。
【０２４７】
[00258]固形培地上のスクリーニングは、個々のクローンまたは形質転換体の可視化を可能にするため、より大きいコロニーとして明らかに可視である、迅速な増殖に寄与するランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを発現している形質転換体を同定するために、特に有用である。倍加時間の数パーセント程度の小さい相違が、コロニーサイズの測定可能な相違を導きうる。例えば、６時間＝３６０分間の平均倍加時間の株の６日間＝１４４時間の増殖期間は、２４回の倍加を可能にし、一方、３４２分間の、５％より迅速な平均倍加時間を持つ株は、２５．３回倍加し、コロニーサイズに明らかに反映される、細胞数の２．５倍の相違を導く。こうしたスクリーニングを任意の培地条件で行ってもよく、例えば、致死量以下の量の阻害剤、例えば塩、エタノールまたはブタノールの存在下で、あるいは致死量以下の高温または低温下で、増殖率に関してスクリーニングすることが可能である。類似のスクリーニングが、エタノール許容性に寄与する遺伝子の単離に関して、他の研究者によって用いられてきている（Hong 2010）。
【０２４８】
[00259]液体培地中の選択およびスクリーニングは、一般的に、バルク選択として行われる。ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・ライブラリーのコンピテント細胞への形質転換後、形質転換体を、抗生物質を欠く液体培地中であらかじめ、３０℃で６時間、照明下で培養する。次いで、抗生物質およびＩＰＴＧを液体培養に添加して、プラスミドの存在に関して選択し、そしてランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの発現を誘導し、そして形質転換体をさらに１時間培養する。次いで、培養を、抗生物質およびＩＰＴＧを含有し、そして表６に列挙するようなブタノールなどの選択剤を含有する新鮮な培地中、２〜１０倍希釈する。細胞に課される選択のタイプに応じて、培養を３０℃で、またはさらに２４時間から数日間、増殖させる。その時点で、細胞を遠心分離によって採取し、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを含有するＤＮＡを、染色体ＤＮＡ単離法（Clerico 2007）を用いて抽出し、プラスミドを大腸菌においてクローニングし、バルクで調製し、そしてＳ．エロンガトゥスの形質転換および選択を反復する。形質転換を固形培地上にプレーティングし、個々の形質転換体の選択を可能にする前に、この方式で２またはそれより多い周期のバッチ選択を行い、その後、コロニー摘み取り、プラスミド単離、表現型検証および活性融合ポリヌクレオチドの性質決定を行ってもよい（以下を参照されたい）。
【０２４９】
[00260]生存選択または迅速分裂細胞のための選択のいずれかとして、液体中の選択を行ってもよい。致死濃度の選択剤（すなわち、本実施例では、塩、エタノールまたはブタノール）の存在下で、あるいは致死性の高温または低温で、そして特定の期間（一般的に１２時間またはそれより長い）、生存選択を行う。選択期間後、選択培養を新鮮な非選択性培地中で希釈するか、または温度を３７℃に戻して、いかなる生存細胞も正常増殖を再開するようにする。上述のように、生存細胞を含有するこの培養を増殖させ、染色体ＤＮＡを抽出し、プラスミドを大腸菌においてクローニングし、そして必要であれば、バッチ選択を反復する。
【０２５０】
[00261]あるいは、液体培養中での選択を行って、致死量以下の濃度の選択剤（すなわち、本実施例では、塩、エタノールまたはブタノール）の存在下で、迅速な増殖に関して選択する。この場合、選択条件下で維持された、形質転換体の液体培養は、対数中期（一般的に、選択条件の重度に応じて、増殖の２〜５日間）までの増殖を可能にされる。この時点で、培養中の細胞の大部分は、生存していることが期待されるが、選択条件下で、培養は、正常の迅速な増殖が可能である細胞に関して濃縮される。細胞を遠心分離によってペレットにし、染色体ＤＮＡを抽出し、プラスミドを大腸菌においてクローニングし、そして必要であれば、バッチ選択を反復する。あるいは、致死量以下の増殖条件から採取した細胞を、致死量または致死量以下の濃度のブタノールまたは別の選択剤を含有する固形培地上でプレーティングして、選択剤の存在下で増殖が可能な、または増殖が加速しているコロニーの視覚的選択を可能にしてもよい。
【０２５１】
アルコール許容性に関する活性融合遺伝子の性質決定
[00262]選択プレート上で生じるブタノール耐性表現型を持つコロニーを摘み取り、拡大し、そして大腸菌におけるプラスミド・レスキューに用いる（Dolganov 1993）。４つの大腸菌コロニーを各Ｓ．エロンガトゥス形質転換体に関して摘み取り、ＤＮＡを単離し、そして制限消化によってチェックする。次いで、表現型確認のため、プラスミドＤＮＡをＳ．エロンガトゥスに再導入する。
【０２５２】
[00263]単純化するため、９６ウェル形式で行う２つの標準的ブタノール許容性アッセイを用いて、すべてのプラスミドをチェックする。２つのアッセイは、液体培養中で、それぞれ、致死および致死量以下の濃度のブタノールを用いる。致死条件下での培養期間後、または致死量以下の条件下での増殖の数継代後、培養を連続希釈し、そして固形培地上にスポットして、生存細胞の密度を評価する。これらのアッセイによって、必要な対照を用いたすべての単離プラスミドの迅速でそして均質な試験が可能になり、そしてブタノールの存在下での生存または増殖利点を与える融合遺伝子の迅速な検証が可能になる。
【０２５３】
[00264]また、より広く、増殖または許容性表現型に関して、活性プラスミドの再形質転換を試験する。増殖率および増殖収率特性に関して、これは、形質転換体を低細胞密度でプレーティングし、そして対照形質転換体に比較して、生じたコロニーのサイズを観察するか、あるいは液体培養中で、選択条件を伴いまたは伴わず、倍加時間または細胞ペレットサイズを、対照株の増殖率に比較する工程を伴う。耐性表現型（温度、エタノールおよびブタノール）に関して、再スクリーニングは、形質転換体の固形培地上への複製プレーティング（すなわち９６ピンツールを用いた、プレート上への９６ウェルプレートからの複製）および選択条件下での増殖を伴い、各形質転換の増殖の度合いを対照に比較する。あるいは、形質転換を液体培養中の選択条件に曝露した後、非選択固形培地上にピンツールによって複製して、生存コロニーの数に反映される、各培養中の細胞生存の度合いを評価する。
【０２５４】
[00265]特定の候補ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを、元来選択していた表現型の授与に関して、または別の表現型に関してのいずれかで、試験してもよい。細胞増殖およびストレス耐性に関連する多様な表現型は、交差反応性でありうる。例えば、ブタノール許容性の授与に関して選択されるランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドはまた、エタノール許容性、温度許容性、塩許容性等も与えうる。多様な条件下でランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを徹底的に交差試験することによって、多様な非生物ストレス条件下で、細胞増殖を前進させる広範囲の能力を持つランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを発見することが可能である。
【０２５５】
[00266]最も劇的なまたは広い表現型を与える融合遺伝子発現構築物を配列決定して、活性遺伝子を同定する。結果を表にし、そして最適な融合遺伝子を将来の研究のために選択する。別個の融合遺伝子内に反復して同定される配列を、ＯＲＦコレクションの部分として、将来のスクリーニングに用いてもよい。望ましい表現型を与えることがすでに知られる遺伝子を含有するＯＲＦコレクションは、本提案に記載する全ゲノムＯＲＦコレクションよりも小さい可能性もあり、より小さいライブラリー・サイズ、より安価でそしてより迅速なスクリーニング、ならびに、真核藻類および植物を含む、より複雑なゲノムおよびより低い形質転換効率を持つ生物への適用可能性を含めて、多くの利点が生じる。
【０２５６】
[00267]ＯＲＦコレクションのサイズを限定すると多くの利点があり、その最も重要なものは、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドの生じるライブラリー中に提示される対の組み合わせの数がより小さいことである。より低い複雑性のライブラリーは、より複雑なライブラリーよりも、より迅速にそしてより安価にスクリーニング可能であり、そして可視スクリーニングおよび陽性選択を伴う、上に列挙したものよりも、より複雑な表現型に関してスクリーニング可能である。より低い複雑性のライブラリーはまた、（数千の数のＯＲＦコレクションから生じる）数千万の配列の組み合わせを含有するライブラリーをスクリーニングすることが現実的でないかまたは妥当に可能ではない可能性もあるが、（数百の数のＯＲＦコレクションから生じる）数十万の配列の組み合わせを含有するライブラリーをスクリーニングするために適している可能性もある、より低い形質転換効率を持つ生物における試験も可能にする。
【０２５７】
結果の評価および結論
[00268]ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチドを構築しそして試験するこのアプローチを実施する際、結果を、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド・ライブラリーを構築するために用いたものと同じ遺伝子コレクションの単純な過剰発現から得られたものに比較することが可能である。こうした実験の経過で生じたデータによって、各アプローチで単離される活性遺伝子の数、活性遺伝子の頻度（すなわちスクリーニングする１０００遺伝子あたり）および生じる表現型の性質の比較が可能になる。これらの３つの計量は、ランダム化インフレーム融合ポリヌクレオチド技術がシアノバクテリアの有用な表現型を操作する有望性を保持するかどうかを決定する際に非常に重要である。
【０２５８】
参考文献
【０２５９】
【化１−１】
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【０２６０】
【化１−２】
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【０２６１】
【化１−３】
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【０２６２】
【化１−４】
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【０２６３】
【化１−５】
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【０２６４】
【化１−６】
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【０２６５】
【化１−７】
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【０２６６】
【化１−８】
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【０２６７】
【化１−９】
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【０２６８】
【化１−１０】
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【０２６９】
【化１−１１】
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【０２７０】
[00397]本明細書に引用するすべての刊行物、データベース、GenBank配列、特許および特許出願は、本明細書において、各々が特にそして個々に本明細書に援用されると示されるように、本明細書に援用される。
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１】
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【図３】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年10月20日(2015.10.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
互いに異なる配列を有する複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド・ライブラリーであって、それぞれのポリヌクレオチドは、１つのオープンリーディングフレームは単一の生物の配列決定されたゲノムから同定および単離された非相同配列を有する複数のポリヌクレオチドを含む完全長オープンリーデングフレームの第一のポリヌクレオチド・コレクションに由来し、そして、１つのオープンリーディングフレームは単一の生物の配列決定されたゲノムから同定および単離された非相同配列を有する複数のポリヌクレオチドを含む完全長オープンリーディングフレームの第二のポリヌクレオチド・コレクションに由来する、２つの非相同の完全長オープンリーディングフレームをランダムな様式でインフレームで融合することにより形成される単一の融合ポリペプチドをコードする単一のオープンリーディングフレームを含み、ここでオープンリーディングフレームの第一または第二のコレクションの少なくとも１つは、当該単一の生物によってコードされたオープンリーディングフレームの少なくとも７５％を含む、前記ポリヌクレオチド・ライブラリー。
【請求項２】
２つの完全長非相同オープンリーディングフレームは、リンカー配列を介して連結されている、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項３】
リンカーが配列番号２５１０４をコードする、請求項２に記載のライブラリー。
【請求項４】
ポリヌクレオチドが、さらに少なくとも１つの制御配列を含む、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項５】
少なくとも１つの制御配列がプロモーターである、請求項４に記載のライブラリー。
【請求項６】
少なくとも１つの制御配列がターミネーターである、請求項４に記載のライブラリー。
【請求項７】
以下：
（ａ）単一の生物の配列決定されたゲノムから同定された完全長オープンリーディングフレームを増幅及び単離することにより、非相同配列を有する複数のポリヌクレオチドを含む完全長オープンリーディングフレームの第一のポリヌクレオチド・コレクションを生成する；
（ｂ）単一の生物の配列決定されたゲノムから同定された完全長オープンリーディングフレームを増幅及び単離することにより、複数の非相同ポリヌクレオチドを含む完全長オープンリーディングフレームの第二のポリヌクレオチド・コレクションを生成する；および
（ｃ）工程（ａ）のコレクションを工程（ｂ）のコレクションとランダムな様式でインフレームで融合して、互いに異なる配列を有する複数のポリヌクレオチドを含むライブラリーを産生する、ここでそれぞれのポリヌクレオチドは、１つの完全長オープンリーディングフレームは工程（ａ）に由来し、そして１つの完全長オープンリーディングフレームは工程（ｂ）に由来する、２つの完全長オープンリーディングフレームにより形成される単一の融合ポリペプチドをコードする単一のオープンリーディングフレームを含み、ここで、工程（ａ）からのオープンリーディングフレーム及び工程（ｂ）からのオープンリーディングフレームは相同ではない；
を含む方法により得られる、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項８】
工程（ａ）のプライマーセットが、配列番号２５０９９を含む５’プライマーおよび配列番号２５１００を含む３’プライマーを含み；そして、工程（ｂ）のプライマーセットが配列番号２５１０１を含む５’プライマーおよび配列番号２５１０２を含む３’プライマーを含む、請求項７に記載のライブラリー。
【請求項９】
工程（ａ）のプライマーセットが、配列番号２５１２７を含む５’プライマーおよび配列番号２５１２８を含む３’プライマーを含み；そして、工程（ｂ）のプライマーセットが配列番号２５１２９を含む５’プライマーおよび配列番号２５１３０を含む３’プライマーを含む、請求項７に記載のライブラリー。
【請求項１０】
請求項１に記載の単一の融合ポリペプチドをコードする単一のオープンリーディングフレームを含むベクター。
【請求項１１】
ベクターが発現ベクターである、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１に記載の単一の融合ポリペプチドをコードする単一のオープンリーディングフレームを含む宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１に記載のライブラリーを産生する方法であって、以下：
（ａ）生物の完全長オープンリーディングフレームをプライマーセットを用いて増幅することにより、互いに異なる配列を有する複数のポリヌクレオチドを含む第一のコレクションを生成する、ここで当該プライマーセットは、発現ベクターのプロモーター領域と相同な１６ヌクレオチドの配列を含む５’プライマーおよび配列番号２５１０３と相同な２４ヌクレオチドの配列を含む３’プライマーを含む；
（ｂ）生物の完全長オープンリーディングフレームをプライマーセットを用いて増幅することにより、互いに異なる配列を有する複数のポリヌクレオチドを含む第二のコレクションを生成する、ここで当該プライマーセットは、配列番号２５１０３と相同な１６ヌクレオチドの配列を含む５’プライマーおよび発現ベクターのターミネーター領域と相同な２４ヌクレオチドの配列を含む３’プライマーを含む；および、
（ｃ）工程（ａ）のコレクションを工程（ｂ）のコレクションとランダムな様式で融合して、互いに異なる配列を有する複数のランダムに組み合わされたポリヌクレオチドを含むライブラリーを産生する、ここでそれぞれのランダムに組み合わされたポリヌクレオチドは、２つの完全長非同一オープンリーディングフレームをインフレームでともに連結することにより産生される単一の融合ポリペプチドをコードする単一のオープンリーディングフレームを含み、ここで、１つの完全長オープンリーディングフレームは工程（ａ）に由来し、そして１つの完全長オープンリーディングフレームは工程（ｂ）に由来する；
を含む、前記方法。
【請求項１４】
工程（ａ）および工程（ｂ）の５’プライマーが、ＡＴＧ開始コドンをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｂ）の５’プライマーが、配列番号２５１０１をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｂ）の３’プライマーが、配列番号２５１０２をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ａ）の３’プライマーが、配列番号２５１００をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ａ）のプライマーセットが配列番号２５０９９を含む５’プライマーおよび配列番号２５１００を含む３’プライマーを含み、そして工程（ｂ）のプライマーセットが配列番号２５１０１を含む５’プライマーおよび配列番号２５１０２を含む３’プライマーを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ａ）のプライマーセットが配列番号２５１２７を含む５’プライマーおよび配列番号２５１２８を含む３’プライマーを含み、そして工程（ｂ）のプライマーセットが配列番号２５１２９を含む５’プライマーおよび配列番号２５１３０を含む３’プライマーを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
新規表現型を産生する方法であって、以下：
（ａ）請求項１に記載の組成物を酵母細胞に導入する；および
（ｂ）同じ条件下で培養した同じ種の対照細胞と比較した際に、異なる表現型を示す細胞を単離する；
ことを含む、前記方法。
【請求項２１】
表現型がブタノール許容性である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
表現型が熱許容性である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
互いに異なる配列を有する複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド・ライブラリーであって、それぞれのポリヌクレオチドは、１つのオープンリーディングフレームは単一の生物の配列決定されたゲノムから同定および単離された非相同配列を有する複数のポリヌクレオチドを含む完全料オープンリーディングフレームの第一のポリヌクレオチド・コレクションに由来し、そして、１つのオープンリーディングフレームは単一の生物の配列蹴ってイズら得たゲノムから同定および単離された非相同配列を有する複数のポリヌクレオチドを含む完全長オープンリーディングフレームの第二のポリヌクレオチド・コレクションに由来する、２つの非相同の完全長オープンリーディングフレームをランダムな様式でインフレームで融合することにより形成される単一の融合ポリペプチドをコードする単一のオープンリーディングフレームを含み、第一のコレクションに由来する１つのオープンリーディングフレームはそれに融合される第二のコレクションに由来する１つのオープンリーディングフレームに関して上流側または下流側に位置し、ここで当該上流側のオープンリーディングフレーム及び下流側のオープンリーディングフレームは、配列番号２５１０４をコードするリンカー配列を介して連結されている、前記ライブラリー。
【請求項２４】
以下：
（ａ）単一の生物の配列決定されたゲノムから同定された完全長オープンリーディングフレームを増幅及び単離することにより、非相同配列を有する複数のポリヌクレオチドを含む完全長オープンリーディングフレームの第一のポリヌクレオチドコレクションを生成する；
（ｂ）単一の生物の配列決定されたゲノムから同定された完全長オープンリーディングフレームを増幅及び単離することにより、複数の非相同ポリヌクレオチドを含む完全長オープンリーディングフレームの第二のポリヌクレオチド・コレクションを生成する；および
（ｃ）工程（ａ）のコレクションを工程（ｂ）のコレクションとランダムな様式でインフレームで融合して、互いに異なる配列を有する複数のポリヌクレオチドを含むライブラリーを産生する、ここでそれぞれのポリヌクレオチドは、１つの完全長オープンリーディングフレームは工程（ａ）に由来し、そして１つの完全長オープンリーディングフレームは工程（ｂ）に由来する、同一ではない２つの完全長オープンリーディングフレームにより形成される単一の融合ポリペプチドをコードする単一のオープンリーディングフレームを含み、ここで工程（ａ）からのオープンリーディングフレーム及び工程（ｂ）からのオープンリーディングフレームは相同ではない；
を含む方法により得られる請求項２３に記載のライブラリー。
【請求項２５】
生物が、酵母、大腸菌（E. coli）、またはシネココッカス属（Synechococcus）である、請求項２３に記載のライブラリー。
【国際調査報告】
2016501039.tif 000032
2016501039.tif 000033
2016501039.tif 000034
2016501039.tif 000035