(57)【要約】  NY-ESO-1関連ポリペプチドの精製方法、及びこれらの方法によって生産されたポリペプチドが本明細書に提供される。純粋かつ安定なNY-ESO-1を含む組成物も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アフィニティータグを有するNY-ESO-1関連ポリペプチドを精製する方法であって、
(a)N-ラウロイルサルコシン及びトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)を含む緩衝液中に、アフィニティータグを有する該ポリペプチドを含む組成物を可溶化して、混合物を得るステップ; 及び
(b)固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)によって該混合物を精製して、アフィニティータグを有する純粋なポリペプチドを得るステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記緩衝液が、20mM トリス pH 8.0、5％ N-ラウロイルサルコシン、20mM イミダゾール、5mM TCEPを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物が、細胞ペレットである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記アフィニティータグが、金属イオン結合アフィニティータグである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記アフィニティータグが、hisタグである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
IMACによって前記混合物を精製する前記ステップが、以下のサブステップ: 
(i)IMAC基材上に該混合物をロードするステップ; 
(ii)N-ラウロイルサルコシン及びTCEPを含む第一の緩衝液で該基材を洗浄するステップ;
(iii)尿素、NaCl、及びTCEPを含む第二の緩衝液で該基材を洗浄するステップ; 
(iv)尿素、NaCl、及びTCEPを含む溶出緩衝液で、アフィニティータグを有する前記ポリペプチドを溶出して、アフィニティータグを有する純粋なポリペプチドを得るステップ
をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記IMACが、Ni2+基材を使用して実施される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記IMACが、カラム内に含まれる基材を使用して実施される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第一の緩衝液が、20mM トリス pH 8、1％ N-ラウロイルサルコシン、1mM TCEPを含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第二の緩衝液が、20mM トリス pH 7、8M 尿素、0.5M NaCl、1mM TCEP、及び20mM イミダゾールを含む、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記溶出緩衝液が、20mM トリス pH 7、0.8M 尿素、0.5M NaCl、1mM TCEP、500mM イミダゾールを含む、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
IMACによって前記混合物を精製する前記ステップに続いて、アフィニティータグを有する前記ポリペプチドを緩衝液交換に供するステップをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記緩衝液交換ステップが、セファデックスG-25カラム上でクロマトグラフィーを使用して実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記緩衝液交換が、10mM 酢酸ナトリウム、pH 5を含む緩衝液を使用して実施される、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記緩衝液交換ステップに続いて、アフィニティータグを有する前記ポリペプチドを濃縮及び透析ろ過するステップをさらに含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記濃縮及び透析ろ過ステップが、TFFによって実施される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記濃縮及び透析ろ過が、緩衝液中で10kDa再生セルロースC-スクリーンメンブレン上で実施される、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記濃縮及び透析ろ過が、10mM 酢酸ナトリウム、pH 5を含む緩衝液中で行われる、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物を可溶化する前記ステップに続いて、前記混合物を清澄化するステップをさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記清澄化ステップが、前記混合物を遠心分離することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記清澄化ステップが、前記混合物のろ過をさらに含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記清澄化ステップが、前記混合物を遠心分離すること及び前記混合物のろ過の両方をさらに含む、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記遠心分離ステップが15,900 x gで行われる、請求項２０又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ろ過ステップが0.45/0.22μm PESフィルターを使用して行われる、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２５】
IMACによって前記混合物を精製する前に、アフィニティータグを有する前記ポリペプチドを含む細胞を破壊するステップをさらに含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
アフィニティータグを有する前記純粋なポリペプチドをろ過に供するステップをさらに含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ろ過が、滅菌ろ過である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ろ過が、0.45/0.2 ザルトブラン(Sartobran)(商標)300酢酸セルロースカプセル上で行われる、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
hisタグを有するNY-ESO-1関連ポリペプチドを精製する方法であって、
(a)以下を含むサブステップによって、hisタグを有する該ポリペプチドを含む宿主細胞を破壊するステップ:
(i)50mM トリス pH 8、150mM NaCl、10mM EDTAを含む緩衝液中に該宿主細胞を懸濁するステップ; 
(ii)細胞破壊技術を適用するステップ; 
(iii)該宿主細胞を15,900 x gで遠心分離して、ペレットを得るステップ;
(iv)50mM トリス pH 8及び150mM NaClを含む緩衝液中で該ペレットを洗浄するステップ; 
(v)遠心分離によって封入体を含有する不溶性画分を回収し、50mM トリス、5％トリトン X-100、pH 8.0でペレットを一回洗浄するステップ;
(vi)遠心分離によって封入体を含有する不溶性画分を回収し、50mM トリス、150mM NaCl、pH8.0でペレットを二回洗浄するステップ;
(b)20mM トリス pH 8.0、5％ N-ラウロイルサルコシン、20mM イミダゾール、5mM TCEPを含む緩衝液中に該ペレットを可溶化して、混合物を得るステップ; 
(c)以下のサブステップによって、該混合物を清澄化するステップ: 
(i)該混合物を15,900 x gで遠心分離して、上清を得るステップ; 
(ii)0.45/0.22μm PESフィルターを通して該上清をろ過するステップ; 
(d)以下のサブステップを含む、IMACによって該混合物を精製するステップ: 
(i)Ni2+-IMACセファロースカラム上に該混合物をロードするステップ; 
(ii)20mM トリス pH 8、1％ N-ラウロイルサルコシン、1mM TCEPを含む緩衝液で該カラムを洗浄するステップ; 
(iii)20mM トリス pH 7、8M 尿素、0.5M NaCl、1mM TCEP、20mM イミダゾールを含む緩衝液で該カラムを洗浄するステップ; 
(iv)20mM トリス pH 7、0.8M 尿素、0.5M NaCl、1mM TCEP、500mM イミダゾールを含む緩衝液で、hisタグを有する該ポリペプチドを溶出して、hisタグを有する該ポリペプチドを含む溶出液を得るステップ; 
(e)該溶出液を、10mM 酢酸ナトリウム pH 5を含む緩衝液を使用してセファデックスG-25カラム上で緩衝液交換クロマトグラフィーに供して、hisタグを有する該ポリペプチドを含む溶出液を得るステップ; 
(f)10mM 酢酸ナトリウム pH 5を含む緩衝液中で10kDa再生セルロースC-スクリーンメンブレン上でTFFによって、hisタグを有する該ポリペプチドを濃縮及び透析ろ過するステップ; 及び
(g)hisタグを有する該ポリペプチドを、0.45/0.2ザルトブラン(Sartobran)(商標)300酢酸セルロースカプセル上で滅菌ろ過に供するステップ
を含む、方法。
【請求項３０】
ポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも95％(w/w)の単量体+二量体+三量体の種を含む、組成物。
【請求項３１】
配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む組成物であって、5％以下の宿主細胞タンパク質含有量をさらに含む、組成物。
【請求項３２】
配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む組成物であって、低複雑度溶液をさらに含む、組成物。
【請求項３３】
前記ポリペプチドが、
(a)約22nmの流体力学的サイズを有する可溶性ポリペプチド凝集体; 
(b)少なくとも約2mg/mLの濃度; 
(c)約640kDaの重量平均分子量; 
(d)約23mVの正のゼータ電位; 
(e)MSによって決定される、100％遊離システイン; 及び
(f)10mM Na-Ac pH 5.0を含む低複雑度溶液
からなる群より選択される特徴の1つ以上を含む、請求項３１又は３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが、SDS-PAGEによって測定される、約77％(w/w)の単量体; 14％(w/w)の二量体; 及び2.5％(w/w)の三量体を形成する、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
N-ラウロイルサルコシン; TCEP; 及び全長NY-ESO-1を含む1種以上の癌精巣抗原を含む組成物。
【請求項３６】
前記全長NY-ESO-1が、融合パートナー又は担体タンパク質をさらに含む、請求項３５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、純粋かつ安定なNY-ESO-1関連ポリペプチド及びその生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌-精巣抗原(CT抗原)と称される、概して腫瘍細胞及び免疫特権組織においてのみ発現されるタンパク質のクラスの遺伝子調節は、癌患者において破壊されている。これは、多種多様な腫瘍においてこれらの抗原の異常な発現をもたらす。癌患者におけるいくつかのCT抗原の免疫原性のために、それらは、腫瘍ワクチンの開発のための理想的な標的となっている。癌免疫療法における使用のために現在興味深い癌精巣抗原は、NY-ESO-1である。さらなる癌精巣抗原、LAGE-1も同定されている。2種のLAGE-1転写産物、LAGE-1a及びLAGE1bが記載されている。LAGE-1bは、不完全にスプライシングされており、約210アミノ酸残基の推定タンパク質をコードし、一方、LAGE-1a遺伝子産物は、180アミノ酸残基を含有する(Sun et al. (2006) Cancer Immunol Immunother, 6: 55: 644-652)。
【０００３】
LAGE-1及びNY-ESO-1タンパク質のN末端領域は、高度に保存されており、97％超の同一性を有すると考えられている。しかし、LAGE-1は、中央領域においてNY-ESO-1とは相違し、そこはわずか62％同一である。NY-ESO-1及びLAGE-1aのC末端は高度に保存されている(97％超の同一性)。しかし、LAGE-1bのC末端は、より長く、保存されておらず、LAGE-1a/NY-ESO-1中の同じ領域と50％未満の同一性を有すると考えられている。これらのタンパク質に関する一般的な情報は、LICRウェブサイト(www.cancerimmunity.org/CTdatabaseを参照のこと)から入手できる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Sun et al. (2006) Cancer Immunol Immunother, 6: 55: 644-652
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
組換えCT抗原の精製は、CT抗原に基づく癌免疫療法剤の製造に含まれる一工程である。組換え生産したタンパク質から、宿主細胞タンパク質などの混入物質を除去するために、様々なアプローチが調べられており、大腸菌(E.coli)発現系など、宿主細胞から可溶性かつ活性な組換えタンパク質を生産するプロセスの開発を補助するためのキットが市販されている。例えば、“Tools for Enhancing Solubility of Proteins Expressed in E. coli and refolding screens for Difficult Targets, copyright 2008 EMD Chemicals Inc., an affiliate of Merck KGaA, Damstadt, Germanyを参照のこと。それにもかかわらず、いくつかの場合において、CT抗原について十分な純度レベルを達成する際に困難に直面している。
【０００６】
例えば、組換えNY-ESO-1の生産は、標準的な大腸菌ベースの組換え発現系を用いて生産することが難しいことが示されている。Murphy (2005) Prep. Biochem. Biotechnol. 35:119-134を参照のこと。そのような精製スキームは、NY-ESO-1タンパク質の多くの喪失を付随する複数のクロマトグラフィー工程を伴う。加えて、得られた低レベルの純度は、混入している大腸菌タンパク質によって引き起こされる、起こり得る遅延型過敏反応のために、公開されている方法によって精製された組換えNY-ESO-1の免疫療法用途に対して懸念を生じている。これらの問題を解決するための努力は、酵母などの代替発現系との適合性のために変異された組換えNY-ESO-1変異体の使用をもたらしている。Piatesi (2006) Protein Expression and Purification 48:232-242を参照のこと。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
NY-ESO-1関連ポリペプチドの精製方法、及びこれらの方法によって生産されたポリペプチドが本明細書に提供される。純粋かつ安定なNY-ESO-1を含む組成物も提供される。
【０００８】
いくつかの実施形態において、アフィニティータグを有するNY-ESO-1関連ポリペプチドを精製する方法であって、(a)N-ラウロイルサルコシン及びTCEPを含む緩衝液中に、アフィニティータグを有する該ポリペプチドを含む組成物を可溶化して、混合物を得るステップ; 及び(b)固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)によって該混合物を精製して、アフィニティータグを有する純粋なポリペプチドを得るステップを含む、方法が提供される。
【０００９】
いくつかの実施形態において、好適な緩衝液は、20mM トリス pH 8.0、5％ N-ラウロイルサルコシン、20mM イミダゾール、及び5mM TCEPを含む。いくつかの実施形態において、組成物は細胞ペレットである。いくつかの実施形態において、アフィニティータグは金属イオン結合アフィニティータグである。いくつかの実施形態において、アフィニティータグはhisタグである。
【００１０】
いくつかの実施形態において、アフィニティータグを有するNY-ESO-1関連ポリペプチドを精製する方法であって、(a)N-ラウロイルサルコシン及びTCEPを含む緩衝液中に、アフィニティータグを有する該ポリペプチドを含む組成物を可溶化して、混合物を得るステップ; (b)以下のサブステップを含む、IMACによって該混合物を精製するステップ: (i)IMAC基材上に該混合物をロードするステップ; (ii)N-ラウロイルサルコシン及びTCEPを含む第一の緩衝液で該基材を洗浄するステップ; (iii)尿素、NaCl、及びTCEPを含む第二の緩衝液で該基材を洗浄するステップ; (iv)尿素、NaCl、及びTCEPを含む溶出緩衝液で、アフィニティータグを有する該ポリペプチドを溶出して、アフィニティータグを有する純粋なポリペプチドを得るステップ、を含む、方法が提供される。
【００１１】
いくつかの実施形態において、IMAC基材はNi2+である。いくつかの実施形態において、、IMAC基材はカラム内に含まれる。いくつかの実施形態において、第一の緩衝液は、20mM トリス pH 8、1％ N-ラウロイルサルコシン、及び1mM TCEPを含む。いくつかの実施形態において、第二の緩衝液は、20mM トリス pH 7、8M 尿素、0.5M NaCl、1mM TCEP、及び20mM イミダゾールを含む。いくつかの実施形態において、溶出緩衝液は、20mM トリス pH 7、8M 尿素、0.5M NaCl、1mM TCEP、及び500mM イミダゾールを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、アフィニティータグを有するNY-ESO-1関連ポリペプチドを精製する方法であって、(a)N-ラウロイルサルコシン及びTCEPを含む緩衝液中に、アフィニティータグを有する該ポリペプチドを含む組成物を可溶化して、混合物を得るステップ; (b)以下のサブステップを含む、IMACによって該混合物を精製するステップ: (i)IMAC基材上に該混合物をロードするステップ; (ii)N-ラウロイルサルコシン及びTCEPを含む第一の緩衝液で該基材を洗浄するステップ; (iii)尿素、NaCl、及びTCEPを含む第二の緩衝液で該基材を洗浄するステップ; (iv)尿素、NaCl、及びTCEPを含む溶出緩衝液で、アフィニティータグを有する該ポリペプチドを溶出するステップ; (e)アフィニティータグを有する該ポリペプチドを緩衝液交換に供して、アフィニティータグを有する純粋なポリペプチドを得るステップを含む、方法が提供される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、緩衝液交換ステップは、セファデックスG-25カラム上でクロマトグラフィーを使用して実施される。いくつかの実施形態において、緩衝液交換は、10mM 酢酸ナトリウム pH 5を含む緩衝液を使用して実施される。 
【００１４】
いくつかの実施形態において、アフィニティータグを有するNY-ESO-1関連ポリペプチドを精製する方法であって、(a)N-ラウロイルサルコシン及びTCEPを含む緩衝液中に、アフィニティータグを有する該ポリペプチドを含む組成物を可溶化して、混合物を得るステップ; (b)以下のサブステップを含む、IMACによって該混合物を精製するステップ: (i)IMAC基材上に該混合物をロードするステップ; (ii)N-ラウロイルサルコシン及びTCEPを含む第一の緩衝液で該基材を洗浄するステップ; (iii)尿素、NaCl、及びTCEPを含む第二の緩衝液で該基材を洗浄するステップ; (iv)尿素、NaCl、及びTCEPを含む溶出緩衝液で、アフィニティータグを有する該ポリペプチドを溶出するステップ; (c)アフィニティータグを有する該ポリペプチドを緩衝液交換に供して、アフィニティータグを有する該ポリペプチドを含む溶出液を得るステップ; 及び(d)アフィニティータグを有する該ポリペプチドを濃縮及び透析ろ過(diafiltrate)して、アフィニティータグを有する純粋なポリペプチドを得るステップを含む、方法が提供される。
【００１５】
いくつかの実施形態において、濃縮及び透析ろ過ステップは、接線流ろ過(tangential flow filtration) (TFF)によって行われる。いくつかの実施形態において、濃縮及び透析ろ過は、緩衝液中で10kDa再生セルロースC-スクリーンメンブレン上で行われる。いくつかの実施形態において、濃縮及び透析ろ過は、10mM 酢酸ナトリウム pH 5を含む緩衝液中で行われる。
【００１６】
いくつかの実施形態において、アフィニティータグを有するNY-ESO-1関連ポリペプチドを精製する方法であって、(a)N-ラウロイルサルコシン及びTCEPを含む緩衝液中に、アフィニティータグを有する該ポリペプチドを含む組成物を可溶化して、混合物を得るステップ; (b)該混合物を清澄化するステップ; (c)以下のサブステップを含む、IMACによって該混合物を精製するステップ: (i)IMAC基材上に該混合物をロードするステップ; (ii)N-ラウロイルサルコシン及びTCEPを含む第一の緩衝液で該基材を洗浄するステップ; (iii)尿素、NaCl、及びTCEPを含む第二の緩衝液で該基材を洗浄するステップ; (iv)尿素、NaCl、及びTCEPを含む溶出緩衝液で、アフィニティータグを有する該ポリペプチドを溶出するステップ; (d)アフィニティータグを有する該ポリペプチドを緩衝液交換に供して、アフィニティータグを有する該ポリペプチドを含む溶出液を得るステップ; 及び(e)アフィニティータグを有する該ポリペプチドを濃縮及び透析ろ過して、アフィニティータグを有する純粋なポリペプチドを得るステップを含む、方法が提供される。
【００１７】
いくつかの実施形態において、清澄化ステップは、混合物を遠心分離することをさらに含む。いくつかの実施形態において、清澄化ステップは、混合物のろ過をさらに含む。いくつかの実施形態において、清澄化ステップは、混合物を遠心分離すること及び混合物のろ過の両方をさらに含む。いくつかの実施形態において、遠心分離ステップは、15,900 x gで行われる。いくつかの実施形態において、ろ過ステップは、0.45/0.22μm PESフィルターを使用して行われる。
【００１８】
いくつかの実施形態において、アフィニティータグを有するNY-ESO-1関連ポリペプチドを精製する方法であって、(a)アフィニティータグを有する該ポリペプチドを含む細胞を破壊して、組成物を得るステップ; (b)N-ラウロイルサルコシン及びTCEPを含む緩衝液中に該組成物を可溶化して、混合物を得るステップ; (c)該混合物を清澄化するステップ; (d)以下のサブステップを含む、IMACによって該混合物を精製するステップ: (i)IMAC基材上に該混合物をロードするステップ; (ii)N-ラウロイルサルコシン及びTCEPを含む第一の緩衝液で該基材を洗浄するステップ; (iii)尿素、NaCl、及びTCEPを含む第二の緩衝液で該基材を洗浄するステップ; (iv)尿素、NaCl、及びTCEPを含む溶出緩衝液で、アフィニティータグを有する該ポリペプチドを溶出するステップ; (e)アフィニティータグを有する該ポリペプチドを緩衝液交換に供して、アフィニティータグを有する該ポリペプチドを含む溶出液を得るステップ; 及び(f)アフィニティータグを有する該ポリペプチドを濃縮及び透析ろ過して、アフィニティータグを有する純粋なポリペプチドを得るステップを含む、方法が提供される。
【００１９】
いくつかの実施形態において、アフィニティータグを有するNY-ESO-1関連ポリペプチドを精製する方法であって、(a)アフィニティータグを有する該ポリペプチドを含む細胞を破壊して、組成物を得るステップ; (b)N-ラウロイルサルコシン及びTCEPを含む緩衝液中に該組成物を可溶化して、混合物を得るステップ; (c)該混合物を清澄化するステップ; (d)以下のサブステップを含む、IMACによって該混合物を精製するステップ: (i)IMAC基材上に該混合物をロードするステップ; (ii)N-ラウロイルサルコシン及びTCEPを含む第一の緩衝液で該基材を洗浄するステップ; (iii)尿素、NaCl、及びTCEPを含む第二の緩衝液で該基材を洗浄するステップ; (iv)尿素、NaCl、及びTCEPを含む溶出緩衝液で、アフィニティータグを有する該ポリペプチドを溶出するステップ; (e)アフィニティータグを有する該ポリペプチドを緩衝液交換に供して、アフィニティータグを有する該ポリペプチドを含む溶出液を得るステップ; (f)アフィニティータグを有する該ポリペプチドを濃縮及び透析ろ過するステップ; 及び(g)アフィニティータグを有する該ポリペプチドをろ過に供して、アフィニティータグを有する純粋なポリペプチドを得るステップを含む、方法が提供される。
【００２０】
いくつかの実施形態において、ろ過は滅菌ろ過である。いくつかの実施形態において、、ろ過は、0.45/0.2ザルトブラン(Sartobran)(商標)300酢酸セルロースカプセル上で行われる。
【００２１】
いくつかの実施形態において、hisタグを有するNY-ESO-1関連ポリペプチドを精製する方法であって、(a)以下を含むサブステップによって、hisタグを有する該ポリペプチドを含む細胞を破壊するステップ: (i)50mM トリス pH 8、150mM NaCl、及び10mM EDTAを含む緩衝液中に該細胞を懸濁するステップ; (ii)細胞破壊技術、例えば高圧ホモジナイザー、フレンチプレス、又は浸透圧ショック、を細胞に適用するステップ; (iii)該細胞を15,900 x gで遠心分離して、ペレットを得るステップ; (iv)50mM トリス pH 8及び150mM NaClを含む緩衝液中で該ペレットを洗浄するステップ; (b)20mM トリス pH 8.0、5％ N-ラウロイルサルコシン、20mM イミダゾール、及び5mM TCEPを含む緩衝液中に該ペレットを可溶化して、混合物を得るステップ; (c)以下のサブステップによって、該混合物を清澄化するステップ: (i)該混合物を15,900 x gで遠心分離して、上清を得るステップ; (ii)0.45/0.22μm PESフィルターを通して該上清をろ過するステップ; (d)以下のサブステップを含む、IMACによって該混合物を精製するステップ: (i)Ni2+-IMACセファロースカラム上に該混合物をロードするステップ; (ii)20mM トリス pH 8、1％ N-ラウロイルサルコシン、及び1mM TCEPを含む緩衝液で該カラムを洗浄するステップ; (iii)20mM トリス pH 7、8M 尿素、0.5M NaCl、1mM TCEP、及び20mM イミダゾールを含む緩衝液で該カラムを洗浄するステップ; (iv)20mM トリス pH 7、8M 尿素、0.5M NaCl、1mM TCEP及び500mM イミダゾールを含む緩衝液で、hisタグを有する該ポリペプチドを溶出して、hisタグを有する該ポリペプチドを含む溶出液を得るステップ; (e)hisタグを有する該ポリペプチドを、10mM 酢酸ナトリウム pH 5を含む緩衝液を使用してセファデックスG-25カラム上で緩衝液交換クロマトグラフィーに供して、hisタグを有する該ポリペプチドを含む溶出液を得るステップ; (f)10mM 酢酸ナトリウム pH 5を含む緩衝液中で10kDa再生セルロースC-スクリーンメンブレン上でTFFによって、hisタグを有する該ポリペプチドを濃縮及び透析ろ過するステップ; 及び(g)hisタグを有する該ポリペプチドを、0.45/0.2ザルトブラン(Sartobran)(商標)300酢酸セルロースカプセル上で滅菌ろ過に供するステップを含む、方法が提供される。 
【００２２】
いくつかの実施形態において、hisタグを有するNY-ESO-1関連ポリペプチドを精製する方法であって、(a)以下を含むサブステップによって、hisタグを有する該ポリペプチドを含む細胞を破壊するステップ: (i)50mM トリス pH 8、150mM NaCl、及び10mM EDTAを含む緩衝液中に該細胞を懸濁するステップ; (ii)細胞破壊技術、例えば高圧ホモジナイザー、フレンチプレス、又は浸透圧ショック、を細胞に適用するステップ; (iii)該細胞を15,900 x gで遠心分離して、ペレットを得るステップ; (iv)50mM トリス pH 8及び150mM NaClを含む緩衝液中で該ペレットを洗浄するステップ; (v)遠心分離によって封入体を含有する不溶性画分を回収し、50mM トリス、5％トリトンX-100、pH 8.0でペレットを一回洗浄するステップ; (vi)遠心分離によって封入体を含有する不溶性画分を回収し、50mM トリス、150mM NaCl、pH 8.0でペレットを二回洗浄するステップ; (b)20mM トリス pH 8.0、5％ N-ラウロイルサルコシン、20mM イミダゾール、及び5mM TCEPを含む緩衝液中に該ペレットを可溶化して、混合物を得るステップ; (c)以下のサブステップによって、該混合物を清澄化するステップ: (i)該混合物を15,900 x gで遠心分離して、上清を得るステップ; (ii)0.45/0.22μm PESフィルターを通して該上清をろ過するステップ; (d)以下のサブステップを含む、IMACによって該混合物を精製するステップ: (i)Ni2+-IMACセファロースカラム上に該混合物をロードするステップ; (ii)20mM トリス pH 8、1％ N-ラウロイルサルコシン、及び1mM TCEPを含む緩衝液で該カラムを洗浄するステップ; (iii)20mM トリス pH 7、8M 尿素、0.5M NaCl、1mM TCEP、20mM イミダゾールを含む緩衝液で該カラムを洗浄するステップ; (iv)20mM トリス pH 7、8M 尿素、0.5M NaCl、1mM TCEP、及び500mM イミダゾールを含む緩衝液で、hisタグを有する該ポリペプチドを溶出して、hisタグを有する該ポリペプチドを含む溶出液を得るステップ; (e)hisタグを有する該ポリペプチドを、10mM 酢酸ナトリウム pH 5を含む緩衝液を使用してセファデックスG-25カラム上で緩衝液交換クロマトグラフィーに供して、hisタグを有する該ポリペプチドを含む溶出液を得るステップ; (f)10mM 酢酸ナトリウム pH 5を含む緩衝液中で10kDa再生セルロースC-スクリーンメンブレン上でTFFによって、hisタグを有する該ポリペプチドを濃縮及び透析ろ過するステップ; 及び(g)hisタグを有する該ポリペプチドを、0.45/0.2ザルトブラン(Sartobran)(商標)300酢酸セルロースカプセル上で滅菌ろ過に供するステップを含む、方法が提供される。
【００２３】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドを含む組成物が提供され、ここで該ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも95％(w/w)の単量体+二量体+三量体の種を含む。いくつかの実施形態において、配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む組成物が提供され、ここで該組成物は、5％以下の宿主細胞タンパク質含有量をさらに含む。いくつかの実施形態において、配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む組成物が提供され、ここで該組成物は、低複雑度溶液(low complexity solution)をさらに含む。  
【００２４】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、(a)約22nmの流体力学的サイズを有する可溶性ポリペプチド凝集体; (b)少なくとも約2mg/mLの濃度; (c)約640kDaの重量平均分子量; (d)約23mVの正のゼータ電位; (e)MSによって決定される、100％遊離システイン; 及び(f)10mM Na-Ac pH 5.0を含む低複雑度溶液、からなる群より選択される特徴の1つ以上を含む。いくつかの実施形態において、NY-ESO-1ポリペプチド(配列番号1)は、SDS-PAGEによって測定される、約77％の単量体; 14％の二量体; 及び2.5％の三量体を形成する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、N-ラウロイルサルコシン; TCEP; 及び全長NY-ESO-1タンパク質を含む1種以上の癌精巣抗原を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、全長NY-ESO-1タンパク質は、配列番号1〜2を含む群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、全長NY-ESO-1タンパク質は、融合パートナー又は担体タンパク質をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】NY-ESO-1コンストラクトの発酵プロセスを記載するフローチャートを示す図である。
【図２】His/NY-ESO-1精製のフローチャートを示す図である。
【図３】開示されたプロセスを使用して3つの別々のランによって生産されたポリペプチドを比較する、クマシーブルー染色したSDS-PAGEを示す図である。説明(レーン毎に、左から右へ): 1. 分子量マーカー; 2. P-036 DNYEAHA005(8μg); 3. P-037 DNYEAHA006(8μg); 及び4. P-038 DNYEAHA007(8μg)。
【図４】3つの別々のランにおいて生産されたNY-ESO-1ポリペプチドを、α-大腸菌BLR DE3タンパク質に対するポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析によって分析した結果を示す図である。説明(レーン毎に、左から右へ): (1) 大腸菌BL21 DE3抽出物、20μg; (2) 大腸菌BL21 DE3抽出物、5μg; (3) 大腸菌BL21 DE3抽出物、2μg; (4) 大腸菌BL21 DE3抽出物、1μg; (5) P-036-DNYEAHA005、20μg; (6) P-036-DNYEAHA005、20μg + 1μg HCPスパイク(5％混入物質); (7) P-037-DNYEAHA006、20μg; (8) P-037-DNYEAHA006、20μg + 1μg HCPスパイク(5％混入物質); (9) P-038-DNYEAHA007、20μg; (10) P-038-DNYEAHA007、20μg + 1μg HCPスパイク(5％混入物質)。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
定義
「NY-ESO-1関連ポリペプチド」は本明細書中他の箇所で定義される。
【００２８】
「純粋な」又は「純度レベル」は、NY-ESO-1関連ポリペプチドの関連で用いる場合、選択されたアッセイ方法によって決定される、その中の総ポリペプチドの少なくとも所定の割合が、NY-ESO-1関連ポリペプチドである、NY-ESO-1関連ポリペプチド組成物を意味する。いくつかの実施形態において、NY-ESO-1関連ポリペプチドの純度レベルは、還元条件下でNuPAGE 4-12％ ビス-トリスゲル、クマシーブルーG-250を使用して決定される(Invitrogen社, 5791 Van Allen Way, PO Box 6482, Carlsbad, California 92008から入手可能)。市販のBSAを利用して検量線を作成し、市販の走査デンシトメトリー、例えばImageQuantソフトウェア、を密度測定解析のために使用する(GE Healthcareから入手可能)。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法にしたがって生産されたNY-ESO-1関連ポリペプチド組成物は、少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、99.5％(w/w)のNY-ESO-1関連ポリペプチドの単量体+二量体+三量体の種を含む。いくつかの実施形態において、NY-ESO-1ポリペプチド組成物は、少なくとも60％、65％、70％、75％、80％(w/w)、又はそれ以上の単量体NY-ESO-1種を含む。
【００２９】
「宿主細胞タンパク質含有量」は、NY-ESO-1関連ポリペプチドの関連で用いる場合、選択されたアッセイを用いてNY-ESO-1関連ポリペプチド組成物中で検出された宿主細胞タンパク質の割合を意味する。いくつかの実施形態において、宿主細胞タンパク質含有量は、還元条件下でNuPAGE 4-12％ ビス-トリスゲルを使用し、かつ宿主細胞の特定の株に対する抗大腸菌抗体を使用したウエスタンブロットによって決定される。抗体は、モノクローナルであっても、又はポリクローナルであってもよく、日常的な方法を使用して生産しても、又は商業的に購入してもよい。いくつかの実施形態において、NY-ESO-1関連ポリペプチド組成物は、選択されたアッセイ方法によって決定される、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％以下の宿主細胞タンパク質含有量を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法にしたがって生産されたNY-ESO-1関連ポリペプチド組成物は、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％未満の宿主細胞タンパク質含有量を含む。
【００３０】
「低複雑度溶液」は、本明細書で用いる場合、1種以上の添加剤を低濃度で含む溶液を指す。一般に、低複雑度溶液は、100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、10mM、5mM、4mM、3mM、2mM、又は1mM以下の任意の所定の添加剤を含むが、低複雑度溶液は2種以上の添加剤を含んでもよい。
【００３１】
生産
NY-ESO-1関連ポリペプチドを生産するための一般的アプローチは、以下のプロセスを含む:
1. アフィニティータグ化されたNY-ESO-1ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞株の調製;
2. この株に由来するシードシステム(seed system)(親、マスター及びワーキングシードバンク)の調製;
3. 20-L発酵器中での組換え宿主細胞の発酵;
4. 宿主細胞の破壊及びNY-ESO-1関連ポリペプチドを含有する粗組成物の抽出;
5. 粗組成物からのNY-ESO-1関連ポリペプチドの抽出及び精製。
【００３２】
破壊、抽出、及び精製
細胞破壊
誘導後、NY-ESO-1関連ポリペプチドを含有する宿主細胞は、単離し、日常的方法、例えば高圧ホモジナイゼイション、フレンチプレス、又は浸透圧ショック等によって破壊してよい。NY-ESO-1関連ポリペプチドを含有する破壊された細胞片は、遠心分離、TFF、振動膜(Permanneらに対する米国特許第6,939,697号に開示されるような)を含めた様々な手段によって単離できる。
【００３３】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は以下を含む工程によって破壊される:
1. 50mM トリス pH 8、150mM NaCl、10mM EDTAを含む緩衝液中に宿主細胞を懸濁すること;
2. 例えば高圧ホモジナイザーによって、宿主細胞を破壊すること;
3. 15,900 x gで宿主細胞を遠心分離して、ペレットを得ること;
4. 50mM トリス pH 8及び150mM NaClを含む緩衝液中でペレットを洗浄すること。
【００３４】
洗浄
いくつかの実施形態において、封入体を含有する不溶性画分は、遠心分離し、ペレットを50mM トリス、5％トリトンX-100、pH 8.0で一回洗浄することによって回収される。封入体を含有する不溶性画分は、遠心分離し、ペレットを50mM トリス、150mM NaCl、pH 8.0で二回洗浄することによって回収される。
【００３５】
可溶化
破壊(及び場合により洗浄ステップ)後、NY-ESO-1関連ポリペプチドを含有する単離された細胞片は可溶化される。いくつかの実施形態において、単離された細胞片は、N-ラウロイルサルコシン及びトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)を含む緩衝液中に可溶化される。いくつかの実施形態において、単離された細胞片は、5％ N-ラウロイルサルコシン及び5mM TCEPを含む緩衝液中に可溶化される。いくつかの実施形態において、単離された細胞片は、20mM トリス pH 8.0、5％ N-ラウロイルサルコシン、20mM イミダゾール、及び5mM TCEPを含む緩衝液中に可溶化される。
【００３６】
清澄化
NY-ESO-1関連ポリペプチドを含有する細胞片が可溶化された後、清澄化ステップを、遠心分離、ろ過等を含めた様々な技術によって実施してよい。いくつかの実施形態において、清澄化は、市販の0.45/0.22μmポリエーテルスルホン(PES)二重カットオフフィルターを使用して実施される。いくつかの実施形態において、清澄化は、遠心分離によって実施される。いくつかの実施形態において、遠心分離による清澄化は、15,900 X gで実施される。
【００３７】
固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)
組換えタンパク質の精製は、標的コンストラクトに対してインフレームでクローニングされたペプチド又はタンパク質-アフィニティータグが、固体支持体上に固定化されているリガンドと選択的に相互作用する、アフィニティークロマトグラフィー戦略によって単純化されている。この方法の一実施形態である固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)は、表面結合キレート剤、例えばイミノ二酢酸(IDA)又はニトリロ三酢酸(NTA)、によって固定化された二価遷移金属イオン(例えばNi2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、Mn2+、又はMg2+)に依存する。精製されるタンパク質は、固定化された遷移金属イオンの遊離配位部位と相互作用する。例えば、Lichty et al. (2005) Protein Expression and Purification 41:98-105; Knecht (2008) J. Mol. Recognit. 22:270-279を参照のこと。固体支持体に結合したニトリロ三酢酸(NTA)とのキレート化によって固定化されたNi2+を含むIMAC媒体は、C又はN末端のいずれかの金属イオンキレート化アフィニティータグを保有するタンパク質の精製のための一般的方法となっている。いくつかの実施形態において、媒体はNi2+セファロース媒体である。そのような媒体は、General Electric社の一部門であるGE Healthcareから市販されている。
【００３８】
典型的には5〜6個の連続したHis残基を含む一般的なHisタグ技術が使用された。そのようなオリゴヒスチジンセグメントが天然に生じるタンパク質において発現されることはかなり稀であるため、5His-又は6His-タグは、通常、高度な選択性をもたらす。Knecht (2008) J. Mol. Recognit. 22:270-279。それにもかかわらず、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個又はそれ以上の連続するHis残基を含む、他の長さのHisタグを使用してもよい。いくつかの実施形態において、His以外の残基がタグに含まれる。例えば、Knecht (2008) J. Mol. Recognit. 22:270-279; Charlton (2008) Methods in Molecular Biology 421:25-36を参照のこと。いくつかの実施形態において、Hisタグは(Hisx-Ry)zを含んでよく、ここでRは非His残基であり、x、y、及びzは正の整数である。いくつかの実施形態において、HAT-タグを使用してよい。Terpe (2003) Appl. Microbiol. Biotechnol. 60:523-533を参照のこと。いくつかの実施形態において、Hisタグは、1つ以上の異なるアフィニティータグと併せて使用してもよい。いくつかの実施形態において、Hisタグは、タンパク質のN末端に又はその近くに位置してもよい。他の実施形態において、Hisタグは、タンパク質のC末端に又はその近くに位置してもよい。
【００３９】
クロマトグラフィーの設定
精製されるタンパク質は、バッチ又はカラムクロマトグラフィー等の様々なアプローチによって固体支持体上に導入し得る。一般に、バッチクロマトグラフィーアプローチは、最初のタンパク質含有組成物の、ローディング緩衝液を用いた容器中の固体支持体への添加を伴い、これは混合してよい。次いで、固体支持体を残りの部分から分離し、緩衝液を固体支持体に添加する一回以上の洗浄ステップを行うことができ、次いで、固体支持体を洗浄緩衝液から分離する。別の洗浄緩衝液を、別の洗浄ステップ(複数可)のために使用してもよい。もしあれば、洗浄ステップ(複数可)の後、溶出緩衝液を固体支持体に添加し、溶出液を固体支持体から取り出す。
【００４０】
カラムアプローチでは、固体支持体をカラムに詰める。次いで、タンパク質含有組成物を、ローディング緩衝液中でカラム上に導入し、カラムを通して流し、タンパク質を固体支持体に結合させる。カラムを通して洗浄緩衝液（単数又は複数）を流す、一回以上の洗浄ステップが含まれてもよい。次いで、カラムを通して溶出緩衝液を流し、溶出液を回収する。
【００４１】
緩衝液
IMACの伝統的な使用は、タンパク質が非特異的静電相互作用に基づき固体支持体と相互作用することを妨げるために、第一の緩衝液中に0.5〜1M NaClを含ませることを伴っている。いくつかの実施形態において、ローディング緩衝液は、5％ N-ラウロイルサルコシンを含む。いくつかの実施形態において、ローディング緩衝液は、20mM トリス pH 8.0、5％ N-ラウロイルサルコシン、20mM イミダゾール、及び5mM TCEPを含む。 
【００４２】
洗浄緩衝液は、金属イオンについてヒスチジンと競合する穏やかな溶離剤等の成分; 非特異的静電又は疎水性相互作用を破壊するための非アミン塩、イミダゾール、非イオン性界面活性剤、又はカオトロピック剤を含み得る; そしてpHは所望の効果に応じて変化し得る。例えば、Methods in Molecular Biology, vol. 421: Affinity Chromatography:  Methods and Protocols, Second edition; Zachariou ed. (2007) Humana Press, Totowa, NJを参照のこと。
【００４３】
いくつかの実施形態において、第一の洗浄緩衝液は、N-ラウロイルサルコシン及びTCEPを含む。いくつかの実施形態において、第一の洗浄緩衝液は、1％ N-ラウロイルサルコシン及び1mM TCEPを含む。いくつかの実施形態において、第一の洗浄緩衝液は、20mM トリス pH 8、1％ N-ラウロイルサルコシン、及び1mM TCEPを含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において、第二の洗浄緩衝液は、尿素、NaCl、及びTCEPを含む。いくつかの実施形態において、第二の洗浄緩衝液は、8M 尿素、0.5M NaCl、及び1mM TCEPを含む。いくつかの実施形態において、第二の洗浄緩衝液は、20mM トリス pH 7、8M 尿素、0.5M NaCl、1mM TCEP、及び20mM イミダゾールを含む。いくつかの実施形態において、ローディング緩衝液は、20mM トリス pH 8.0、5％ N-ラウロイルサルコシン、20mM イミダゾール、5mM TCEPを含み、第二の洗浄緩衝液は、20mM トリス pH 8.0、5％ N-ラウロイルサルコシン、20mM イミダゾール、5mM TCEP、及び0.5M NaClを含む。いくつかの実施形態において、第二の洗浄緩衝液は、20mM トリス pH 7、8M 尿素、0.5M NaCl、1mM TCEP、及び20mM イミダゾールを含む。
【００４５】
いくつかの実施形態において、溶出緩衝液は、尿素、NaCl、及びTCEPを含む。いくつかの実施形態において、溶出緩衝液は、8M 尿素、0.5M NaCl、及び1mM TCEPを含む。いくつかの実施形態において、溶出緩衝液は、20mM トリス pH 7、8M 尿素、0.5M NaCl、1mM TCEP、500mM イミダゾールを含む。
【００４６】
緩衝液交換
緩衝液交換は、多孔性樹脂上でサイズ排除クロマトグラフィー(ゲルろ過又は分子篩クロマトグラフィー)によって達成し得る。緩衝液交換がカラム上で実施される場合、カラム樹脂は、一般に、サンプルが所望される緩衝液で予め平衡化される。タンパク質を含有する緩衝液は、カラムを通して通過させる。タンパク質は樹脂孔に入らず、すぐに通過する。緩衝塩及び他の小分子は樹脂の孔に入り、樹脂床を通した移動速度は遅くなる。流速の低減により、より速い高分子が、より遅い小分子から分離されるようになる。それらがカラムから現れたときに別々の画分を回収することによって、目的の高分子は、その後に樹脂床を出る小分子から分離して回収することができる。こうして、カラムにサンプルを保有する緩衝液成分は、カラムが予め平衡化される溶液によって置換される。タンパク質が樹脂内に保持されない限り、許容可能な樹脂は、セルロース、ポリアクリルアミド、デキストラン等を含み得る。適切な樹脂を含むカラムは市販されており、G-10、G-15、及びG25セファデックスを含む。いくつかの実施形態において、緩衝液交換は、G-25セファデックス樹脂を使用して実施される。いくつかの実施形態において、タンパク質が回収される緩衝液は10mM 酢酸ナトリウム pH 5を含む。NY-ESO-1が可溶性である他の緩衝液は以下を含む:
・10mM 酢酸Na pH 5.0、1mM EDTA、1mM TCEP、5mM NaCl
・10mM Na-PO4 pH 6.0又は6.5、1mM EDTA、1mM TCEP、500mM NaCl
・10mM Na-PO4 pH 6.5、1mM EDTA、250mM アルギニン、1mM TCEP、250mM NaCl
・10mM Na-PO4 pH 6.5又は7.0、1mM EDTA、300mM アルギニン、1mM TCEP、5％ スクロース 
・10mM KPO4 pH 7.0、350〜500mM アルギニン
・10mM Na-PO4 pH 7.0、1mM EDTA、 300mM アルギニン
・10mM Na-PO4 pH 7.0、1mM EDTA、 300mM アルギニン、1mM TCEP
・10mM K-PO4 pH 7.0、1mM EDTA、300mM アルギニン、5mM 還元グルタチオン
・10mM K-PO4 pH 7.0、1mM EDTA、300mM アルギニン、10mM グルタミン酸
・10mM K-PO4 pH 7.0、1mM EDTA、300mM アルギニン、10mM アスコルビン酸
・10mM K-PO4 pH 7.0、1mM EDTA、300mM アルギニン
・10mM トリス pH 7.0、1mM EDTA、1mM TCEP、5mM NaCl、250mM アルギニン、0.15％Tween-80
【００４７】
いくつかの実施形態において、TFFを含めた、緩衝液交換の他の方法が使用される。
【００４８】
濃縮; 透析ろ過
タンパク質を透析ろ過するステップが含まれてもよい。透析ろ過のための許容可能な方法及び装置は、遠心分離ろ過デバイス、例えばMillipore Amicon Ultra、stirred ultrafiltration cell(Millipore, 290 Concord Road, Billerica, MA 01821から入手可能)、及びカセットメンブレン(Milliporeから入手可能)若しくは中空糸タイプのメンブレン(25 Harbor Park Drive, Port Washington, NY 11050から入手可能)のいずれかを用いたTFF、を含む。このステップでは、NY-ESO-1関連タンパク質が濃縮され得る。TFFはこの目的のために好適である。
【００４９】
TFFでは、目的のタンパク質を含有する液体は、メンブレンの表面に沿って接線方向に送られる。加えられた圧力は、液体の一部を、メンブレンを通してろ液側へ押し出す働きをする。大きすぎて膜孔を通過できない微粒子及び高分子は、上流側に保持される。膜孔径は、どの粒子が通過するかを決定する。目的のタンパク質が保持される限り、様々な孔径を利用してよい。TFFに関する指針は、TFFデバイスの製造業者から入手できる。Millipore社、Billerica MA、USAから入手できる“Protein Concentration and Diafiltration by Tangential Flow Filtration,” 2003を参照のこと。様々な緩衝液が許容可能である。いくつかの実施形態において、10kDa再生セルロースC-スクリーンメンブレンは、NY-ESO-1タンパク質を保持するために利用される。いくつかの実施形態において、透析ろ過は、10mM 酢酸ナトリウム pH 5を含む緩衝液中で実施される。他の好適な緩衝液は、先行する節に記載されている。
【００５０】
ろ過
透析ろ過後、NY-ESO-1関連ポリペプチドを含む溶液は、滅菌組成物を得るために、ろ過に供してもよい。いくつかの実施形態において、0.45/0.2ザルトブラン(Sartobran)(商標)P フィルターを、溶液をろ過するために使用してもよい。
【００５１】
いくつかの実施形態において、精製されたバルクタンパク質濃度は、10mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.0)中で約1.7mg/mLに調整され、約-70℃又はそれ未満で保存される。
【００５２】
NY-ESO-1関連ポリペプチド
本明細書中に記載されるNY-ESO-1関連ポリペプチドは、全長、部分的切断型又は切断型NY-ESO-1タンパク質、又はNY-ESO-1に対する免疫応答を生じさせることができる1つ以上のエピトープを含む、任意のそのフラグメントを含み得る。
【００５３】
この明細書の関連において、NY-ESO-1タンパク質は、天然に生じるタンパク質(配列番号1)と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％又は100％同一であるタンパク質を意味することが意図される。いくつかの実施形態において、同一性は、NY-ESO-1タンパク質配列の全長にわたるものである。配列同一性を決定するためのツールは、広く利用可能であり、blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST_SPEC=blast2seq&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=blastn&BLAST_INIT=blast2seqにてNational Center for Biotechnology Informationのウェブページ上で利用可能なBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)を含む。
【００５４】
いくつかの実施形態において、NY-ESO-1関連ポリペプチドは、本明細書中他の箇所に記載されるように、アミノ酸の付加、欠失又は置換によって天然に生じるタンパク質とは異なり得る。いくつかの実施形態において、NY-ESO-1関連ポリペプチドは保存的置換を含む。保存的置換は周知であり、一般に、配列アライメントコンピュータープログラムにおいてデフォルトスコアリングマトリックスとして設定される。これらのプログラムとしては、PAM250(Dayhoft M.O. et al., (1978), "A model of evolutionary changes in proteins",  "Atlas of Protein sequence and structure" 5(3) M.O. Dayhoft (ed.), 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington、及びBlosum 62(Steven Henikoft and Jorja G. Henikoft (1992), and "Amino acid substitution matricies from protein blocks"), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919がある。  
【００５５】
いくつかの実施形態において、NY-ESO-1関連ポリペプチドは、融合タンパク質又は化学的に結合したポリペプチドである。いくつかの実施形態において、そのような融合タンパク質又は化学的に結合したポリペプチドは、2つ以上のフラグメント、切断型、部分的切断型、又は全長NY-ESO-1タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、そのような融合タンパク質又は化学的に結合したポリペプチドは、異種ポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態において、異種ポリペプチド配列は、インフルエンザ菌(Haemophilus influenza)に由来するプロテインDの全て又はフラグメントである。いくつかの実施形態において、異種ポリペプチド配列は、アフィニティー精製タグ、例えばHisタグ、又は本明細書中他の箇所に記載されるような同等物であってもよい。
【００５６】
例示的NY-ESO-1関連ポリペプチドとしては、本明細書中他の箇所に記載されるとおり、NY-ESO-1(配列番号1)及びNY-ESO-1 Hisタグコンストラクト(配列番号2)がある。NY-ESO-1関連ポリペプチドの例示的実施形態は、本明細書中他の箇所にある配列表に、及びWO2008/089074に見出すことができる。
【００５７】
いくつかの実施形態において、NY-ESO-1関連ポリペプチドは、Hisタグを含まない約8.79〜Hisタグを含む約9.10のpIを有し得る。いくつかの実施形態において、NY-ESO-1関連ポリペプチドは、20〜25nmの流体力学的サイズを有する可溶性タンパク質凝集体として存在し得る。いくつかの実施形態において、NY-ESO-1関連ポリペプチドは、500〜800kDaの重量平均分子量を提示し得る。いくつかの実施形態において、NY-ESO-1関連ポリペプチドは、約18〜25mVの正のゼータ電位を提示し得る。
【００５８】
いくつかの実施形態において、NY-ESO-1関連ポリペプチドは以下の特徴を提示する:
- 9.1のpIを有する192個のアミノ酸の組換えタンパク質(Hisタグを含めて)
- 19390.8Daの理論上のMW
- 5個のCys残基
【００５９】
いくつかの実施形態において、現在開示される方法によって生産されたNY-ESO-1関連ポリペプチド溶液は、以下の特徴を提示する:
- 約22nmの流体力学的サイズを有する可溶性タンパク質凝集体 
- 約2mg/mLの濃度
- 640kDaの重量平均分子量
- 約23mVの正のゼータ電位
- MSによって決定される、100％遊離システイン
- 低複雑度溶液(10mM Na-Ac pH 5.0)
SDS-PAGEプロファイルによって決定される多量体形態 約77％の単量体; 14％の二量体; 2.5％の三量体。
【００６０】
一実施形態において、NY-ESO-1関連ポリペプチドは、実施例に記載されるように、「His/NY-ESO-1」と称される。
【実施例】
【００６１】
[実施例1]
発酵
His/NY-ESO-1を生産するために使用されるろ過プロセスを図2にまとめる。そのプロセスは以下に詳細に記載される。培養培地の組成はm3.2.S.2.3に提示される。
【００６２】
m.3.2.S.2.2 製造プロセス及びプロセス制御の説明 
His/NY-ESO-1発酵の概要について図1を参照のこと。
【００６３】
現在の20-Lスケールの発酵プロセスは、振とうフラスコ中での液体前培養段階と、続く20-L発酵器中での流加発酵(fed-batch fermentation)を含む2工程プロセスであり、以下:
1. 組換えプラスミドpLICR100kanを有する製造業者のワーキングシードバンクB2270(RIX4486; 2008年1月24日のロットANYEAWA001)に由来する大腸菌細胞をカナマイシン及びグルコースの存在下で37℃にて、650nmで記録された光学密度の値(OD650nm)が2.0〜4.0になるまで増殖させる、前培養段階、
2. 工程1からの15mL前培養物(2.0<OD650nm<4.0)を用いた発酵培地の滅菌状態の植菌によって培養を開始し、28℃にて14時間の発酵後、pLICR100kanによってコードされる生成物His/NY-ESO-1の発現をイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)で、発酵の終了まで(37℃にて約24±1時間)誘導する、38±1時間の(20-L発酵器中での)実際の流加発酵
を含む。
【００６４】
His/NY-ESO-1生産大腸菌培養物を増殖させるために使用された全ての条件を記録するために、発酵モニタリングプラットフォームが構成される。記録されるパラメーターは、pH(塩基の添加によって6.8で調整される)、空気/O2使用、空気流及び過圧、温度及び供給速度である。全ての培養をカナマイシン(50μg/mL)の存在下で実施する。
【００６５】
m.3.2.S.2.2 製造プロセス及びプロセス制御の説明
細胞の最終体積は、プロセスを通して回収されたサンプル体積に応じて約11Lである。発酵の終了時に、細胞を30分間15,900 x gでの遠心分離によって回収する。この段階で、細胞ペーストは、さらなる処理まで-80℃にて保存してもよい。
【００６６】
37℃でのフィーディング(feeding)及び誘導相を、大腸菌培養物がOD650nm?20に到達した直後に開始する(典型的には28℃にて14時間の発酵後)。
【００６７】
発酵中に採取したインプロセス(In-process)サンプル及び回収サンプルを、SDS-PAGE解析と、続くクマシーブルー色素染色によって調べる。
【００６８】
全ての培養培地及び緩衝液は、ろ過によって滅菌され、動物由来の物質を含まない。
【００６９】
このプロセスにしたがって生産された発酵ロットについて、得られた放出試験データはm3.2.S.4.4に提示される。
【００７０】
[実施例2]
細胞の破壊、及びHIS/NY-ESO-1を含有する封入体の抽出
His/NY-ESO-1タンパク質は、誘導相の間、封入体(IB)に隔離される。IBを放出させるために、発酵の終了時に得られた大腸菌BL21 B2270細胞ペーストを、冷やした溶解緩衝液(50mM トリス pH 8.0、150mM NaCl及び10mM EDTA)中にさらに再懸濁する。再懸濁した細胞を、高圧ホモジナイザーを3回通過させることによって破壊する。細胞溶解後、封入体を、4℃にて30分間15,900 x gでの遠心分離によって回収する。次いで、得られたIBペレットを、50mM トリス pH 8.0及び150mM NaClを含有する冷やした洗浄で洗浄する。洗浄ステップは、以下のように含まれてもよい:
・封入体を含有する不溶性画分を遠心分離によって回収し、ペレットを20mM トリス、5％トリトン X-100、pH 8.0で一回洗浄する
・封入体を含有する不溶性画分を遠心分離によって回収し、ペレットを20mM トリス、150mM NaCl、pH 8.0で二回洗浄する
【００７１】
このプロセスをまとめたフローチャートは図3に提示される。 
【００７２】
[実施例3]
HIS/NY-ESO-1の抽出及び精製
精製プロセスを図3にまとめる。それはいくつかの精製ステップを含む:
・細胞破壊後に得られた、洗浄したIBペレットからのHis/NY-ESO-1タンパク質の抽出(セクション2)
・固定化金属イオン(Ni2+)アフィニティークロマトグラフィー(Ni2+-IMAC)手法
・調整、及びセファデックスG-25カラム上でのゲルろ過による緩衝液交換
・接線流透析ろ過(TFF)による濃縮及び透析ろ過
・滅菌ろ過
【００７３】
これらの精製段階のそれぞれについてのさらなる詳細は、以下のセクションm.3.2.S.2.2 製造プロセス及びプロセス制御の説明、に提供される。
図3を参照のこと。
【００７４】
m.3.2.S.2.2 製造プロセス及びプロセス制御の説明
3.1. 抽出及び精製プロセスの説明
3.1.1. 洗浄したIBペレットからのHis/NY-ESO-1タンパク質の抽出 
手短に述べると、洗浄したIBペレットを、20mM トリス(pH 8.0)、5％ N-ラウロイルサルコシン、20mM イミダゾール、5mM トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)中に再懸濁する。可溶化を室温にて穏やかな撹拌によって一晩行う。次いで、抽出物を、4℃にて30分間15,900 x gでの遠心分離によって清澄化する。上清を、0.45/0.22μmフィルターカプセル上でさらにろ過し、その後、固定化Ni2+を含有するカラム上でアフィニティークロマトグラフィーを行う。このステップで使用される緩衝液組成は、m3.2.S.2.3に提供される。 
【００７５】
3.1.2. 固定化Ni2+アフィニティークロマトグラフィー(IMAC) 
得られた上清中に存在する抗原His/NY-ESO-1を、ニッケルイオン金属アフィニティー樹脂(IMACセファロース6FF)上の直接注入によって捕捉し、精製する。樹脂は、トリス 20mM、pH 8.0中で予め平衡化され、次いで、20mM トリス pH 8.0、2％ N-ラウロイルサルコシン、20mM イミダゾール、及び1mM TCEP中で平衡化されたカラム中に詰められる。可溶化したIBをロードした後、カラムを以下の条件下で二回洗浄する: 
・第一の洗浄を、20mM トリス(pH 8.0)、1％ N-ラウロイルサルコシン及び1mM TCEPを含有する溶液で実施する; 
・第二の洗浄を、20mM トリス(pH 7.0)、8M 尿素、0.5M NaCl、1mM TCEP、及び20mM イミダゾールを含有する溶液で実施する。
【００７６】
His/NY-ESO-1を、20mM トリス(pH 7.0)、8M 尿素、0.5M NaCl、1mM TCEP、及び500mM イミダゾールを含有する緩衝溶液を使用してカラムから溶出させる。このステップで使用される緩衝液組成は、m3.2.S.2.3に提供される。 
【００７７】
3.1.3. 緩衝液交換 
His/NY-ESO-1を含有する溶出液の緩衝液を、10mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.0)で平衡化されたセファデックスG-25(中型)脱塩カラムを通過させることによって交換する。このステップで使用される緩衝液組成は、m3.2.S.2.3に提供される。
【００７８】
3.1.4. 濃縮及び透析ろ過
次いで、His/NY-ESO-1融合タンパク質を含有するセファデックスG-25フロースルー(flow-through)を、10mM 酢酸ナトリウム緩衝液 pH 5.0に対して10kDaメンブレンによって濃縮及び透析ろ過する。透析ろ過した最終物質の濃度を、10mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.0)中で約1.7mg/mLに調整する。このステップで使用される緩衝液組成は、m3.2.S.2.3に提供される。
【００７９】
m.3.2.S.2.2 製造プロセス及びプロセス制御の説明 
3.1.5. 滅菌ろ過 
精製されたバルクのそれぞれ個別のバッチは、0.45/0.22μm 酢酸セルロースメンブレンを通したろ過によって滅菌される。この段階で生産された精製バルクタンパク質は、「中間精製バルク」と命名され、250mL ポリエチレンテレフタレートグリコール(PETG)中で-70℃にて保存される。 
【００８０】
3.2. インプロセス制御(In-process control)
精製プロセスのインプロセス試験は、表1に示されるサンプルについて実施され、これは以下を含む:
・ビシンコニン酸(BCA)法による総タンパク質含有量
・λ=280nmにおけるUV測定
・クマシーブルー染色解析を伴うドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)による電気泳動プロファイル
・ウエスタンブロット解析によるHis/NY-ESO-1の同定
・生物汚染度(Bioburden) 
【００８１】
【表１】
2016501898.tif 000002
【００８２】
NY-ESO-1タンパク質の特徴
- 9.1のpIを有する192個のアミノ酸の組換えタンパク質(Hisタグを含めて)
- 19390.8Daの理論上のMW
- 5個のCys残基
【００８３】
本発明者らの方法によって生産されたNY-ESO-1タンパク質溶液の特徴
- 約22nmの流体力学的サイズを有する可溶性タンパク質凝集体 
- 約2mg/mLの濃度
- 640kDaの重量平均分子量
- 約23mVの正のゼータ電位
- MSによって決定される、100％遊離システイン
- 低複雑度溶液(10mM Na-Ac pH 5.0)
【００８４】
多量体形態
- SDS-PAGEプロファイル 約77％の単量体; 14％の二量体; 2.5％の三量体
【００８５】
SDA-PAGEデンシトメトリー解析を、NuPAGE 4-12％ ビス-トリスゲル; クマシーブルーG-250; 還元条件; 及びImageQuantソフトウェア解析を使用して実施した。図3及び以下の表を参照のこと。
【００８６】
【表２】
2016501898.tif 000003
【００８７】
宿主細胞タンパク質解析  
宿主細胞混入物質を、NuPAGE 4-12％ ビス-トリス/還元を用いたウエスタンブロットによって調べた。大腸菌BLR DE3の細胞抽出物に対して標準的技術によって生成したポリクローナル抗体を使用して、宿主細胞タンパク質を検出した。本明細書中に開示される方法を使用して3つの別々のランにおいて生産したNY-ESO-1ポリペプチド中の宿主細胞タンパク質含有量は、デンシトメトリー解析によって5％(w/w)以下であると決定された(レーン5、7、9)。図4を参照のこと。
【図１】
2016501898.tif 000004
【図２】
2016501898.tif 000005
【図３】
2016501898.tif 000006
【図４】
2016501898.tif 000007
【配列表】
2016501898000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年8月18日(2015.8.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属イオン結合アフィニティータグを有するNY-ESO-1関連ポリペプチドを精製する方法であって、
(a)N-ラウロイルサルコシン及びトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)を含む緩衝液中に、アフィニティータグを有する該ポリペプチドを含む組成物を可溶化して、混合物を得るステップ; 及び
(b)固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)によって該混合物を精製して、アフィニティータグを有する純粋なポリペプチドを得るステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記緩衝液が、20mM トリス pH 8.0、5％ N-ラウロイルサルコシン、20mM イミダゾール、5mM TCEPを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物が、細胞ペレットである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記アフィニティータグが、hisタグである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
hisタグを有するNY-ESO-1関連ポリペプチドを精製する方法であって、
(a)以下を含むサブステップによって、hisタグを有する該ポリペプチドを含む宿主細胞を破壊するステップ:
(i)50mM トリス pH 8、150mM NaCl、10mM EDTAを含む緩衝液中に該宿主細胞を懸濁するステップ; 
(ii)細胞破壊技術を適用するステップ; 
(iii)該宿主細胞を15,900 x gで遠心分離して、ペレットを得るステップ;
(iv)50mM トリス pH 8及び150mM NaClを含む緩衝液中で該ペレットを洗浄するステップ; 
(v)遠心分離によって封入体を含有する不溶性画分を回収し、50mM トリス、5％トリトン X-100、pH 8.0でペレットを一回洗浄するステップ;
(vi)遠心分離によって封入体を含有する不溶性画分を回収し、50mM トリス、150mM NaCl、pH8.0でペレットを二回洗浄するステップ;
(b)20mM トリス pH 8.0、5％ N-ラウロイルサルコシン、20mM イミダゾール、5mM TCEPを含む緩衝液中に該ペレットを可溶化して、混合物を得るステップ; 
(c)以下のサブステップによって、該混合物を清澄化するステップ: 
(i)該混合物を15,900 x gで遠心分離して、上清を得るステップ; 
(ii)0.45/0.22μm PESフィルターを通して該上清をろ過するステップ; 
(d)以下のサブステップを含む、IMACによって該混合物を精製するステップ: 
(i)Ni2+-IMACセファロースカラム上に該混合物をロードするステップ; 
(ii)20mM トリス pH 8、1％ N-ラウロイルサルコシン、1mM TCEPを含む緩衝液で該カラムを洗浄するステップ; 
(iii)20mM トリス pH 7、8M 尿素、0.5M NaCl、1mM TCEP、20mM イミダゾールを含む緩衝液で該カラムを洗浄するステップ; 
(iv)20mM トリス pH 7、0.8M 尿素、0.5M NaCl、1mM TCEP、500mM イミダゾールを含む緩衝液で、hisタグを有する該ポリペプチドを溶出して、hisタグを有する該ポリペプチドを含む溶出液を得るステップ; 
(e)該溶出液を、10mM 酢酸ナトリウム pH 5を含む緩衝液を使用してセファデックスG-25カラム上で緩衝液交換クロマトグラフィーに供して、hisタグを有する該ポリペプチドを含む溶出液を得るステップ; 
(f)10mM 酢酸ナトリウム pH 5を含む緩衝液中で10kDa再生セルロースC-スクリーンメンブレン上でTFFによって、hisタグを有する該ポリペプチドを濃縮及び透析ろ過するステップ; 及び
(g)hisタグを有する該ポリペプチドを、0.45/0.2ザルトブラン(Sartobran)(商標)300酢酸セルロースカプセル上で滅菌ろ過に供するステップ
を含む、方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法によって生産された組成物。
【請求項７】
ポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも95％(w/w)の単量体+二量体+三量体の種を含む、組成物。
【請求項８】
配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む組成物であって、5％以下の宿主細胞タンパク質含有量をさらに含む、組成物。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、
(a)約22nmの流体力学的サイズを有する可溶性ポリペプチド凝集体; 
(b)少なくとも約2mg/mLの濃度; 
(c)約640kDaの重量平均分子量; 
(d)約23mVの正のゼータ電位; 
(e)MSによって決定される、100％遊離システイン; 及び
(f)10mM Na-Ac pH 5.0を含む低複雑度溶液
からなる群より選択される特徴の1つ以上を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、SDS-PAGEによって測定される、約77％(w/w)の単量体; 14％(w/w)の二量体; 及び2.5％(w/w)の三量体を形成する、請求項８又は９に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
いくつかの実施形態において、N-ラウロイルサルコシン; TCEP; 及び全長NY-ESO-1タンパク質を含む1種以上の癌精巣抗原を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、全長NY-ESO-1タンパク質は、配列番号1〜2を含む群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、全長NY-ESO-1タンパク質は、融合パートナー又は担体タンパク質をさらに含む。
本発明はまた、以下を含む。
[１]
アフィニティータグを有するNY-ESO-1関連ポリペプチドを精製する方法であって、
(a)N-ラウロイルサルコシン及びトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)を含む緩衝液中に、アフィニティータグを有する該ポリペプチドを含む組成物を可溶化して、混合物を得るステップ; 及び
(b)固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)によって該混合物を精製して、アフィニティータグを有する純粋なポリペプチドを得るステップ
を含む、方法。
[２]
前記緩衝液が、20mM トリス pH 8.0、5％ N-ラウロイルサルコシン、20mM イミダゾール、5mM TCEPを含む、[１]に記載の方法。
[３]
前記組成物が、細胞ペレットである、[１]又は[２]に記載の方法。
[４]
前記アフィニティータグが、金属イオン結合アフィニティータグである、[１]〜[３]のいずれかに記載の方法。
[５]
前記アフィニティータグが、hisタグである、[１]〜[４]のいずれかに記載の方法。
[６]
IMACによって前記混合物を精製する前記ステップが、以下のサブステップ: 
(i)IMAC基材上に該混合物をロードするステップ; 
(ii)N-ラウロイルサルコシン及びTCEPを含む第一の緩衝液で該基材を洗浄するステップ;
(iii)尿素、NaCl、及びTCEPを含む第二の緩衝液で該基材を洗浄するステップ; 
(iv)尿素、NaCl、及びTCEPを含む溶出緩衝液で、アフィニティータグを有する前記ポリペプチドを溶出して、アフィニティータグを有する純粋なポリペプチドを得るステップ
をさらに含む、[１]〜[５]のいずれかに記載の方法。
[７]
前記IMACが、Ni2+基材を使用して実施される、[１]〜[６]のいずれかに記載の方法。
[８]
前記IMACが、カラム内に含まれる基材を使用して実施される、[１]〜[７]のいずれかに記載の方法。
[９]
前記第一の緩衝液が、20mM トリスpH 8、1％ N-ラウロイルサルコシン、1mM TCEPを含む、[６]〜[８]のいずれかに記載の方法。
[１０]
前記第二の緩衝液が、20mM トリスpH 7、8M 尿素、0.5M NaCl、1mM TCEP、及び20mM イミダゾールを含む、[６]〜[９]のいずれかに記載の方法。
[１１]
前記溶出緩衝液が、20mM トリスpH 7、0.8M 尿素、0.5M NaCl、1mM TCEP、500mM イミダゾールを含む、[６]〜[１０]のいずれかに記載の方法。
[１２]
IMACによって前記混合物を精製する前記ステップに続いて、アフィニティータグを有する前記ポリペプチドを緩衝液交換に供するステップをさらに含む、[１]〜[１１]のいずれかに記載の方法。
[１３]
前記緩衝液交換ステップが、セファデックスG-25カラム上でクロマトグラフィーを使用して実施される、[１２]に記載の方法。
[１４]
前記緩衝液交換が、10mM 酢酸ナトリウム、pH 5を含む緩衝液を使用して実施される、[１２]又は[１３]に記載の方法。
[１５]
前記緩衝液交換ステップに続いて、アフィニティータグを有する前記ポリペプチドを濃縮及び透析ろ過するステップをさらに含む、[１２]〜[１４]のいずれかに記載の方法。
[１６]
前記濃縮及び透析ろ過ステップが、TFFによって実施される、[１５]に記載の方法。
[１７]
前記濃縮及び透析ろ過が、緩衝液中で10kDa再生セルロースC-スクリーンメンブレン上で実施される、[１５]又は[１６]に記載の方法。
[１８]
前記濃縮及び透析ろ過が、10mM 酢酸ナトリウム、pH 5を含む緩衝液中で行われる、[１５]〜[１７]のいずれかに記載の方法。
[１９]
前記組成物を可溶化する前記ステップに続いて、前記混合物を清澄化するステップをさらに含む、[１]〜[１８]のいずれかに記載の方法。
[２０]
前記清澄化ステップが、前記混合物を遠心分離することをさらに含む、[１９]に記載の方法。
[２１]
前記清澄化ステップが、前記混合物のろ過をさらに含む、[１９]又は[２０]に記載の方法。
[２２]
前記清澄化ステップが、前記混合物を遠心分離すること及び前記混合物のろ過の両方をさらに含む、[１９]〜[２１]のいずれかに記載の方法。
[２３]
前記遠心分離ステップが15,900 x gで行われる、[２０]又は[２２]に記載の方法。
[２４]
前記ろ過ステップが0.45/0.22μm PESフィルターを使用して行われる、[２１]又は[２２]に記載の方法。
[２５]
IMACによって前記混合物を精製する前に、アフィニティータグを有する前記ポリペプチドを含む細胞を破壊するステップをさらに含む、[１]〜[２４]のいずれかに記載の方法。
[２６]
アフィニティータグを有する前記純粋なポリペプチドをろ過に供するステップをさらに含む、[１]〜[２５]のいずれかに記載の方法。
[２７]
前記ろ過が、滅菌ろ過である、[２６]に記載の方法。
[２８]
前記ろ過が、0.45/0.2 ザルトブラン(Sartobran)(商標)300酢酸セルロースカプセル上で行われる、[２６]又は[２７]に記載の方法。
[２９]
hisタグを有するNY-ESO-1関連ポリペプチドを精製する方法であって、
(a)以下を含むサブステップによって、hisタグを有する該ポリペプチドを含む宿主細胞を破壊するステップ:
(i)50mM トリス pH 8、150mM NaCl、10mM EDTAを含む緩衝液中に該宿主細胞を懸濁するステップ; 
(ii)細胞破壊技術を適用するステップ; 
(iii)該宿主細胞を15,900 x gで遠心分離して、ペレットを得るステップ;
(iv)50mM トリス pH 8及び150mM NaClを含む緩衝液中で該ペレットを洗浄するステップ; 
(v)遠心分離によって封入体を含有する不溶性画分を回収し、50mM トリス、5％トリトンX-100、pH 8.0でペレットを一回洗浄するステップ;
(vi)遠心分離によって封入体を含有する不溶性画分を回収し、50mM トリス、150mM NaCl、pH8.0でペレットを二回洗浄するステップ;
(b)20mM トリス pH 8.0、5％ N-ラウロイルサルコシン、20mM イミダゾール、5mM TCEPを含む緩衝液中に該ペレットを可溶化して、混合物を得るステップ; 
(c)以下のサブステップによって、該混合物を清澄化するステップ: 
(i)該混合物を15,900 x gで遠心分離して、上清を得るステップ; 
(ii)0.45/0.22μm PESフィルターを通して該上清をろ過するステップ; 
(d)以下のサブステップを含む、IMACによって該混合物を精製するステップ: 
(i)Ni2+-IMACセファロースカラム上に該混合物をロードするステップ; 
(ii)20mM トリス pH 8、1％ N-ラウロイルサルコシン、1mM TCEPを含む緩衝液で該カラムを洗浄するステップ; 
(iii)20mM トリス pH 7、8M 尿素、0.5M NaCl、1mM TCEP、20mM イミダゾールを含む緩衝液で該カラムを洗浄するステップ; 
(iv)20mM トリス pH 7、0.8M 尿素、0.5M NaCl、1mM TCEP、500mM イミダゾールを含む緩衝液で、hisタグを有する該ポリペプチドを溶出して、hisタグを有する該ポリペプチドを含む溶出液を得るステップ; 
(e)該溶出液を、10mM 酢酸ナトリウム pH 5を含む緩衝液を使用してセファデックスG-25カラム上で緩衝液交換クロマトグラフィーに供して、hisタグを有する該ポリペプチドを含む溶出液を得るステップ; 
(f)10mM 酢酸ナトリウム pH 5を含む緩衝液中で10kDa再生セルロースC-スクリーンメンブレン上でTFFによって、hisタグを有する該ポリペプチドを濃縮及び透析ろ過するステップ; 及び
(g)hisタグを有する該ポリペプチドを、0.45/0.2ザルトブラン(Sartobran)(商標)300酢酸セルロースカプセル上で滅菌ろ過に供するステップ
を含む、方法。
[３０]
ポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも95％(w/w)の単量体+二量体+三量体の種を含む、組成物。
[３１]
配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む組成物であって、5％以下の宿主細胞タンパク質含有量をさらに含む、組成物。
[３２]
配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む組成物であって、低複雑度溶液をさらに含む、組成物。
[３３]
前記ポリペプチドが、
(a)約22nmの流体力学的サイズを有する可溶性ポリペプチド凝集体; 
(b)少なくとも約2mg/mLの濃度; 
(c)約640kDaの重量平均分子量; 
(d)約23mVの正のゼータ電位; 
(e)MSによって決定される、100％遊離システイン; 及び
(f)10mM Na-Ac pH 5.0を含む低複雑度溶液
からなる群より選択される特徴の1つ以上を含む、[３１]又は[３２]に記載の組成物。
[３４]
前記ポリペプチドが、SDS-PAGEによって測定される、約77％(w/w)の単量体; 14％(w/w)の二量体; 及び2.5％(w/w)の三量体を形成する、[３１]〜[３３]のいずれかに記載の組成物。
[３５]
N-ラウロイルサルコシン; TCEP; 及び全長NY-ESO-1を含む1種以上の癌精巣抗原を含む組成物。
[３６]
前記全長NY-ESO-1が、融合パートナー又は担体タンパク質をさらに含む、[３５]に記載の組成物。
【国際調査報告】
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