(57)【要約】本発明は、（植物）細胞、（植物）細胞小器官又は（植物）組織を凍結保存するための方法であって、抗凍結効果を有する１つ以上の添加剤の存在下で、非生物材料から形成されるマトリックス内に、前記（植物）細胞、（植物）細胞小器官又は（植物）組織を封入する方法に関する。本発明の方法は、生物材料を凍結保存するためのより高速、より有効及びより安価な方法を提供する。
2016521568.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（遺伝子改変）植物細胞、植物細胞小器官又は植物組織を凍結保存するための方法であって、
−  １つ以上のシリカ前駆体及び１つ以上の凍結保護物質を含む多孔質シリカマトリックス内に、前記植物細胞、植物細胞小器官又は植物組織を封入する工程；
−  得られた混合物を、４℃〜２０℃に含まれる温度で１時間超インキュベーションする工程；
−  得られたハイブリッドシリカゲルを、−３０℃〜−１９６℃に含まれる温度のフリーザー内に移す工程
を含む、方法。
【請求項２】
フリーザーが−８０℃の温度である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
凍結保護物質が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、サッカライド、アミノ酸、両性イオン性化合物（ベタイン）、グリコール、ポリオール又はそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
サッカライドが、スクロース又はトレハロースである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
アミノ酸が、プロリン又はグリシンである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
グリコールが、（ポリ）エチレングリコールである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
ポリオールが、ソルビトール、マルチトール、グリセロール、エリスリトール、キシリトール、アラビトール、マンニトール、ラクチトール、イソマルチトール又はそれらの混合物からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
シリカマトリックス中のシリカ前駆体の濃度が、５％〜１０％で変動し得る、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
シリカ前駆体が、ポリケイ酸（Ｈ２ＳｉＯ３）ｎ（好ましくは、メタケイ酸Ｈ２ＳｉＯ３）、水酸化シリカ、シリカアルコキシド（例えば、テトラメチルオルトシリカート（ＴＭＯＳ）、テトラエチルオルトシリカート（ＴＥＯＳ）、テトラプロピルオルトシリカート（ＴＰＯＳ）、テトラキス（２−ヒドロキシエチル）オルトシリカート（ＥＧＭＳ）、テトラキス（２−ヒドロキシプロピル）オルトシリカート（ＰＧＭＳ）及びテトラキス（２，３−ジヒドロキシプロピル）オルトシリカート（ＧＬＭＳ））、シリカート（例えば、ケイ酸ナトリウム又はケイ酸カリウム）、シリカナノ粒子、ソルビチルシラン、オルモシル（有機修飾シリカ）、トリメトキシメチルシラン、ジメトキシジメチルシラン、ＴＭＯＳ（テトラメトキシシラン）、ＤＧＳ（ジグリセリルシラン）又はそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
凍結保護物質が、それぞれ、０．２M〜１．０M（スクロース）及び１％〜１０％（ＤＭＳＯ）に含まれる濃度でシリカ前駆体と混合されたスクロース及びＤＭＳＯである、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
１つ以上のシリカ前駆体及び１つ以上の凍結保護物質を含む、植物細胞、植物細胞小器官又は植物組織のための凍結保存キット。
【請求項１２】
シリカ前駆体が、ポリケイ酸（Ｈ２ＳｉＯ３）ｎ（好ましくは、メタケイ酸Ｈ２ＳｉＯ３）、水酸化シリカ、シリカアルコキシド（例えば、テトラメチルオルトシリカート（ＴＭＯＳ）、テトラエチルオルトシリカート（ＴＥＯＳ）、テトラプロピルオルトシリカート（ＴＰＯＳ）、テトラキス（２−ヒドロキシエチル）オルトシリカート（ＥＧＭＳ）、テトラキス（２−ヒドロキシプロピル）オルトシリカート（ＰＧＭＳ）及びテトラキス（２，３−ジヒドロキシプロピル）オルトシリカート（ＧＬＭＳ））、シリカート（例えば、ケイ酸ナトリウム又はケイ酸カリウム）、シリカナノ粒子、ソルビチルシラン、オルモシル（有機修飾シリカ）、トリメトキシメチルシラン、ジメトキシジメチルシラン、ＴＭＯＳ（テトラメトキシシラン）、ＤＧＳ（ジグリセリルシラン）又はそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
凍結保護物質が、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、サッカライド、アミノ酸、両性イオン性化合物（ベタイン）、グリコール又はポリオール又はそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１０に記載のキット。
【請求項１４】
サッカライドが、スクロース又はトレハロースである、請求項１２に記載のキット。
【請求項１５】
アミノ酸が、プロリン又はグリシンである、請求項１２に記載のキット。
【請求項１６】
グリコールが、（ポリ）エチレングリコールである、請求項１２に記載のキット。
【請求項１７】
ポリオールが、ソルビトール、マルチトール、グリセロール、エリスリトール、キシリトール、アラビトール、マンニトール、ラクチトール、イソマルチトール又はそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細胞、特に植物性細胞（藻類を含む）、（植物）細胞の細胞小器官及び（植物）組織の冷凍保存（凍結保存）の分野に関する。
【０００２】
本発明の背景及び最先端技術
植物細胞及び組織培養物は、基礎研究及び応用研究の両方で広く使用されている重要なツールである。それらは、遺伝子の機能及びレギュレーションなどのハイスループット研究、代謝分析又はバイオ農薬の発見を可能にする。それらはまた、バイオリアクター内でファインケミカルを生産するための魅力的で強力なバイオマシンである。特に、適切にグリコシル化及びフォールディングされた薬学的に活性なタンパク質（例えば、免疫グロブリン、インターロイキン）を生産するために、植物細胞培養物は興味深い。それらは、ヒト病原体をホストすることもなく、内毒素を産生することもないため、哺乳動物又は微生物生産プラットフォームとは反対に本質的に安全である。それにもかかわらず、植物生物学を取り扱う全ての研究室において、多くの野生型及びトランスジェニック細胞株の維持は、非常に手間及び費用がかかるだけではなく、微生物の混入、望ましくない遺伝子変化（例えば、倍数性の変化、エピジェネティックな不安定性を含む染色体の改変）及び最終的には培養物の損失に関するリスクも引き起こす。
【０００３】
自然界では、動物及び陸上植物の大部分は、過酷な環境条件下における生存を強化するために様々な機構を使用している。例えば、植物は、それらの成長及び発達を適合させるために、わずかな温度変化（１℃）を検知し得る。また、温帯及び寒冷気候帯に生育する植物の大部分は、それらの生活環の温度で凍結する傾向がある。これらの環境条件下では、細胞死の主な原因は細胞内脱水及び機械的ストレスに関係するものであり、これらは、細胞外の氷形成と、細胞小器官又は細胞それ自体を取り囲む生体膜の重度の損傷とが組み合わさって引き起こされる。したがって、植物では、軽度の凍結条件下における細胞損傷を防止するための複雑な戦略が発達している。生存するために、植物は、一般的に、非致死温度への前曝露（すなわち、低温順化工程）を必要とする。このプロセスには、凍結保護代謝産物及び不凍タンパク質の蓄積を含む複数の機構が関係する。温度限界は植物にとって重要なストレスに相当するため、耐凍性は依然として、グローバルな植物分布を制限する重要な要因である。
【０００４】
材料内への生細胞の組み込みは、強力なバイオテクノロジーツールとして５０年以上認められている。基剤上への接着による固定化、材料中への捕捉又は封入は、バイオリアクター、バイオセンサー、バイオ燃料電池又は人工臓器などの新たなデバイスの構築において全細胞の利点を利用することができる方法である。実際のところ、ネイティブな環境から単離された細胞は、一般的に脆弱である。したがって、細胞ベースのバイオテクノロジーデバイスは、非生物材料への細胞の組み込みを必要とする。
【０００５】
植物材料の一般的な保存戦略は、成長条件下の植物組織のin vitroコレクション又はフィールドにおける植物コロニーの確立を含む。長期保存の場合、保存した植物組織の費用及び品質に関する問題があるため、これらの方法は適切ではない。現在、高濃度の凍結保護剤（これは、細胞傷害性であり得る）又は脱水手順を用いなければ、ほとんどの植物は凍結融解サイクルを生き残ることができない。また、これらの手順の成功は、複雑な冷却プログラムと密接に関係する。例えば、細胞を（凝固点をわずかに下回る）中間温度に最適速度で冷却し、次いで、液体窒素中でガラス化する。実際、これらの予防措置は、細胞内空間における細胞脱水及び氷結晶化（これらは、不可逆的な細胞損傷の原因である）を最小限に抑えることを可能にする。最後に、−１９６℃の温度を維持するために、このようにして得られた生物材料を、液体窒素で満たされた高価なタンク内に保存する。これらの条件下では、ほとんど全ての代謝活性が停止するため、生体組織を長期間保存することができる。
【０００６】
現在のところ、植物細胞培養物を液体窒素中で凍結保存するために、３つの異なるアプローチが提案されている：
（ａ）徐冷技術、
（ｂ）ガラス化法、及び
（ｃ）アルギン酸ビーズ内における固定化細胞の脱水。
【０００７】
マトリックスの様々な固定化又は封入が記載されている。生体分子よりもはるかに敏感な場合、活性細胞の固定化は、脱水を防ぐために、生体適合性材料、安全な合成条件及び外部流体サポートシステム又は緩衝液浸漬の使用を含む。最も多く使用されている材料は、ポリサッカライド及び誘導体、高分子膜、活性炭並びに光重合樹脂である。しかしながら、これらの有機マトリックスは、安定性及び生体適合性の点でいくつかの限界を示す。
【０００８】
哺乳動物培養物及び微生物培養物の低温貯蔵の普及にもかかわらず、植物細胞で使用される保存方法の限られた報告は、一般的に、低い細胞生存率を特徴とする。
【０００９】
実際、大きな空胞化構造からなる植物細胞懸濁液は、他の細胞型と比較して重度の低温障害になりやすい。植物細胞死の主な原因は細胞内脱水及び機械的ストレスに関係するものであり、これらは、細胞外の氷形成と、細胞小器官又は細胞それ自体を取り囲む生体膜の重度の損傷とが組み合わさって引き起こされる。加えて、現在のプロセスでは、典型的には、高価な液体窒素、プログラム可能な冷却速度を提供する特殊な装置、及び高モル濃度の凍結保護物質（これは、細胞傷害性であり得る）が必要である。これらの理由により、凍結万能細胞バンクを作るための別の手法が望まれる。
【００１０】
本発明の目的
本発明は、（植物）細胞、（植物）細胞小器官及び（植物）組織（例えば、植物のカルス、分裂組織、頂部、芽外植片、胚珠及び根を含む）を冷凍保存又は凍結保存するための方法及びキットであって、最先端技術の欠点を示さない方法及びキットを提供することを目的とする。
【００１１】
本発明は、簡便で安価なこのような方法及びキットであって、処理される（植物）細胞、遺伝子改変（植物）細胞、（植物）細胞の細胞小器官及び（植物）組織（例えば、植物のカルス、分裂組織、頂部、芽外植片、胚珠及び根を含む）の特徴に影響を与えず、したがって、（植物）細胞、（植物）細胞の細胞小器官及び（植物）組織の培養物の維持に使用することができ、それらの遺伝的特徴を長期（特に、数週間又は数カ月間又はさらには数年間の長期間）にわたって維持することができる方法及びキットを提供することを目的とする。
【００１２】
発明の概要
本発明は、植物細胞（遺伝子改変植物細胞を含む）、この植物細胞の細胞小器官又はこの植物の組織を凍結保存するための方法であって、
−  １つ以上のシリカ前駆体及び１つ以上の凍結保護物質を含む多孔質シリカマトリックス内に、この植物細胞、細胞小器官又はこの植物細胞組織を封入する工程；
−  得られた混合物を、約４℃〜約２０℃に含まれる温度で１時間超インキュベーションする工程、並びに得られたハイブリッドシリカゲルを、−３０℃〜−１９６℃に含まれる温度、好ましくは約−８０℃の温度のフリーザー内に移す工程
を含む（からなる）方法に関する。
【００１３】
本発明の方法では、封入工程は、好ましくは、１つ以上のシリカ前駆体及び１つ以上の凍結保護物質を含む溶液を、封入すべき植物細胞、植物細胞小器官又は植物組織と混合することによって達成される。
【００１４】
本発明の別の態様は、遺伝子改変（植物細胞）、植物細胞小器官又は植物組織の（凍結保存用）凍結保存キットであって、１つ以上のシリカ前駆体及び１つ以上の凍結保護物質を含む凍結保存キットに関する。
【００１５】
本発明の方法及びキットでは、凍結保護物質は、好ましくは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、サッカライド、アミノ酸、両性イオン性化合物（ベタイン）、グリコール、ポリオール又はそれらの混合物からなる群より選択される。
【００１６】
本発明の方法及びキットでは、本発明の方法を実施するために、いくつかの異なる凍結保護物質を一緒に混合し得る。
【００１７】
好ましくは、サッカライドは、スクロース又はトレハロースであり、アミノ酸は、好ましくは、プロリン又はグリシンであり、グリコールは、好ましくは、（ポリ）エチレングリコールであり、ポリオールは、好ましくは、ソルビトール、マルチトール、グリセロール、エリスリトール、キシリトール、アラビトール、マンニトール、ラクチトール、イソマルチトール又はそれらの混合物からなる群より選択される。
【００１８】
本発明の方法では、シリカマトリックス中のシリカ前駆体の濃度は、約５％〜約１０％で変動し得る。
【００１９】
好ましくは、シリカ前駆体は、ポリケイ酸（Ｈ２ＳｉＯ３）ｎ（好ましくは、メタケイ酸Ｈ２ＳｉＯ３）、水酸化シリカ、シリカアルコキシド（例えば、テトラメチルオルトシリカート（ＴＭＯＳ）、テトラエチルオルトシリカート（ＴＥＯＳ）、テトラプロピルオルトシリカート（ＴＰＯＳ）、テトラキス（２−ヒドロキシエチル）オルトシリカート（ＥＧＭＳ）、テトラキス（２−ヒドロキシプロピル）オルトシリカート（ＰＧＭＳ）及びテトラキス（２，３−ジヒドロキシプロピル）オルトシリカート（ＧＬＭＳ））、シリカート（例えば、ケイ酸ナトリウム又はケイ酸カリウム）、シリカナノ粒子、ソルビチルシラン、オルモシル（有機修飾シリカ）、トリメトキシメチルシラン、ジメトキシジメチルシラン、ＴＭＯＳ（テトラメトキシシラン）、ＤＧＳ（ジグリセリルシラン）又はそれらの混合物からなる群より選択される。
【００２０】
好ましい実施態様として、本発明の方法では、凍結保護物質は、それぞれ約０．２M〜約１．０M（スクロース）及び約１％〜約１０％（ＤＭＳＯ）に含まれる濃度でシリカ前駆体と混合されたスクロース及びＤＭＳＯである。
【００２１】
本発明の方法では、シリカ前駆体及び凍結保護物質の溶液のｐＨは、好ましくは、約４〜約８に含まれる。
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、（藻類を含む植物）細胞、遺伝子改変（植物）細胞、細胞小器官又は組織培養物を凍結保存するための簡便、高速及び安価な方法を提供する。この技術は、低温（−３０℃以下〜−１９６℃、好ましくは−７０℃以下〜−１９６℃）におけるシリカマトリックスの保護特性に基づくものであり、一般的な実験用フリーザーにおいて（藻類を含む植物）細胞、遺伝子改変（植物）細胞、細胞小器官又は組織株を凍結保存するための独自の簡便及び効率的な技術として使用することができる。
【００２３】
シリコンは、天然では、シリカート（ＳｉＯ２．ｎＨ２Ｏ）の形態で土壌中に存在する。これらの鉱物相が水に曝されて、単量体オルトケイ酸（Ｓｉ（ＯＨ）４）及びいくつかの二ケイ酸が生成し、これが取り込まれ、輸送され、植物全体（特に、植物の液胞ではなく細胞壁）に非晶質シリカとして堆積する。いくつかの報告では、これらのＳｉ種は、細菌及び真菌の攻撃に対する植物耐性を改善し得ることが示された。加えて、シリカ種は、栄養不均衡、塩分、重金属毒性、水ストレス、紫外線放射、熱及び凍結ストレスを含む広範囲の非生物ストレスを緩和する。
【００２４】
特許請求の範囲に記載されている本発明の方法は、冷却速度及び／又は加温速度をコントロールするための特殊な装置も、高価な液体窒素も必要としない。ホスト構造は、植物細胞の生存率を維持し、凍結融解サイクル後のその増殖を妨げない。
【００２５】
（植物）細胞をシリカマトリックス内に封入することの主な利点は、捕捉された細胞が生物ストレス（例えば、細菌）又は非生物ストレス（例えば、熱、水ストレス及び重金属）に対してより耐性であるということである。
【００２６】
シリカゲルは、典型的な凍結添加剤と比較して非毒性化合物であるため、細胞を短期間又は長期間（２年間以上）にわたって良好に凍結保存することができる。
【００２７】
この技術によれば、市販の植物由来医薬品の開発は、十分に確立された認定ガイドラインに従うより便利なアプローチになり得る。
【００２８】
したがって、本方法は、低温（約−３０℃以下〜−１９６℃、好ましくは約−７０℃〜−１９６℃）におけるシリカマトリックスの予想外の保護効果に基づくものであり、標準的な実験用フリーザー内において、並びに細胞及び他の生物材料を保存（特に、凍結保存）するための専用機関（例えば、ＡＴＣＣ）において、（藻類を含む植物）細胞、遺伝子改変（植物）細胞、（藻類を含む植物）細胞株、細胞小器官（例えば、チラコイドなど）又は組織を長期間凍結保存するための独自の簡便及び効率的な技術として使用することができる。
【００２９】
３つの必須工程を含む本発明の方法によって、（植物）細胞培養物（例えば、Arabidopsis thalianaなど）を良好に凍結保存することができる。
【００３０】
本発明の方法は、連続する３つの必須工程を含む：
第１の工程は、ゾルゲル法によって、多孔質シリカマトリックス内に、（藻類を含む植物）細胞、遺伝子改変（植物）細胞、（藻類を含む植物）細胞小器官（例えば、チラコイド）又は（藻類を含む植物）組織を封入することを含む。得られたマトリックスシリカ系ゾルは、１つ以上のシリカ前駆体及び１つ以上の凍結保護物質から構成される。シリカ前駆体は、ポリケイ酸（Ｈ２ＳｉＯ３）ｎ（好ましくは、メタケイ酸Ｈ２ＳｉＯ３）、水酸化シリカ、シリカアルコキシド（例えば、テトラメチルオルトシリカート（ＴＭＯＳ）、テトラエチルオルトシリカート（ＴＥＯＳ）、テトラプロピルオルトシリカート（ＴＰＯＳ）、テトラキス（２−ヒドロキシエチル）オルトシリカート（ＥＧＭＳ）、テトラキス（２−ヒドロキシプロピル）オルトシリカート（ＰＧＭＳ）及びテトラキス（２，３−ジヒドロキシプロピル）オルトシリカート（ＧＬＭＳ））、シリカート（例えば、ケイ酸ナトリウム又はケイ酸カリウム）、シリカナノ粒子、ソルビチルシラン、オルモシル（有機修飾シリカ）、トリメトキシメチルシラン、ジメトキシジメチルシラン、ＴＭＯＳ（テトラメトキシシラン）、ＤＧＳ（ジグリセリルシラン）又はそれらの混合物からなる群より選択される。より好ましくは、シリカ前駆体は、ポリケイ酸（Ｈ２ＳｉＯ３）ｎ、トリメトキシメチルシラン、ジメトキシジメチルシラン又はそれらの混合物である。また、さらなる添加剤、例えばシリカコロイド（例えば、LUDOX（登録商標））、シリカ共前駆体又はシリカナノ粒子をシリカ前駆体溶液に追加し得る。これらの添加剤は、さらなるシリカ源として機能する。
【００３１】
凍結保護物質は、は、好ましくは、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、アミノ酸（例えば、プロリン又はグリシン）、両性イオン性化合物（ベタイン）及びサッカライド（トレハロース、スクロース）、グリコール（例えば、（ポリ）エチレングリコール又はエチレングリコール）又はポリオール（又は多価アルコール、例えばソルビトール、マルチトール、グリセロール、エリスリトール、キシリトール、アラビトール（リキシトール）、マンニトール、ラクチトール、イソマルチトールなど）又はそれらの混合物からなる群より選択される。
【００３２】
使用されるシリカ前駆体の濃度は、約５％〜約１０％（W/V）で変動し得る。シリカ前駆体の種類は、凍結保存プロセスの効率に影響を与え得る。
【００３３】
好ましくは、凍結保護物質は、それぞれ約１％〜約１０％（ＤＭＳＯ）及び約０．２M〜約１．０M（スクロース）の濃度でシリカ前駆体と混合される。
【００３４】
第２の工程（後続工程）は、得られた混合物を、室温で、好ましくはコントロールされた室内（約４℃〜約２０℃に含まれる温度）で１時間超、好ましくは約６時間〜約４８時間又はそれ以上インキュベーションすることを含む。調製されたハイブリッドゲルは、好ましくは、密閉フラスコ内で保持される。
【００３５】
最終工程は、いかなる特定の予防措置も行わずに、得られたハイブリッドシリカゲルを実験用フリーザー内（約−３０℃以下〜−１９６℃、好ましくは約−７０℃〜−１９６℃）に移すことを含む。
【００３６】
サンプルバイアルを室温で短時間（約５分間〜約１０分間）素早く加温することによって、（植物）細胞懸濁液の回収を達成し得る。次いで、解凍したシリカゲルを、固体栄養培地を含有するプレート上に広げる。ホスト構造は、（植物）細胞の生存率を維持し、凍結融解サイクル後のその増殖を妨げない。約７日間〜約１４日間の後、回収したハイブリッドシリカ−細胞材料を、新鮮な液体培地を含有するフラスコに移す。あるいは、この培養株を固体栄養培地上で維持する。この方法は、有効、迅速及び安価であるため、使用されている現在の方法（例えば、緩慢凍結技術又は固定化細胞の脱水）よりも効率的である。
【００３７】
本発明の別の態様は、本発明の方法に使用され得る凍結保存キット（特に、（藻類を含む植物）細胞、遺伝子改変（植物）細胞、（藻類を含む植物）細胞小器官（例えば、チラコイド）又は（藻類を含む植物）組織のための凍結保存キット）であって、１つ以上のシリカ前駆体（例えば、ポリケイ酸）及び１つ以上の凍結保護物質から構成されるシリカマトリックスを含む凍結保存キットに関する。本発明のキットは、本発明のマトリックスのためのこれらの要素を別々のバイアルに含み得る。シリカ前駆体は、好ましくは、ポリケイ酸（Ｈ２ＳｉＯ３）ｎ（好ましくは、メタケイ酸Ｈ２ＳｉＯ３）、水酸化シリカ、シリカアルコキシド（例えば、テトラメチルオルトシリカート（ＴＭＯＳ）、テトラエチルオルトシリカート（ＴＥＯＳ）、テトラプロピルオルトシリカート（ＴＰＯＳ）、テトラキス（２−ヒドロキシエチル）オルトシリカート（ＥＧＭＳ）、テトラキス（２−ヒドロキシプロピル）オルトシリカート（ＰＧＭＳ）及びテトラキス（２，３−ジヒドロキシプロピル）オルトシリカート（ＧＬＭＳ））、シリカート（例えば、ケイ酸ナトリウム又はケイ酸カリウム）、シリカナノ粒子、ソルビチルシラン、オルモシル（有機修飾シリカ）、トリメトキシメチルシラン、ジメトキシジメチルシラン、ＴＭＯＳ（テトラメトキシシラン）、ＤＧＳ（ジグリセリルシラン）又はそれらの混合物からなる群より選択される。凍結保護物質は、上記のもの、例えばＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、サッカライド（トレハロース、スクロース）、アミノ酸（プロリン又はグリシン）、両性イオン性化合物（ベタイン）、グリコール、ポリオール（又は多価アルコール、例えばソルビトール、マルチトール、グリセロール、エリスリトール、キシリトール、アラビトール（リキシトール）、マンニトールなど）又はそれらの混合物である。
【００３８】
好ましくは、マトリックス中のシリカ前駆体の濃度は、約５％〜約１０％（W/V）で変動し得る。好ましい実施態様では、凍結保護物質（ＤＭＳＯ及びスクロース）は、それぞれ約１％〜約１０％（ＤＭＳＯ）及び約０．２M〜約１．０M（スクロース）の濃度でシリカ前駆体と混合される。
【００３９】
本発明の非限定的な好ましい実施態様として、添付の図面を参照して、本発明を以下の実施例で説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、２０℃におけるＯ２取り込み（暗呼吸）をモニタリングすることによる、A. thalianａ細胞の最適な凍結保存条件の決定を表す。凍結保存プロセスのこれらの各工程の後に、植物細胞の代謝活性を評価した。凍結保存後の細胞活性に対する異なる温度におけるハイブリッドゲルのインキュベーション時間の効果（Ａ）。細胞保存に対するスクロース（Ｂ）及びＤＭＳＯ（Ｃ）濃度の効果。１００％は、いかなる凍結融解サイクルも受けていない細胞の酸素消費量に対応する。平均値（ｎ＝３）を標準偏差と共に示す。
【図２】図２は、A. thaliana細胞の凍結保存におけるシリカ種の役割を表す。ポリケイ酸（Ａ）又はシリカナノ粒子（Ｂ）のいずれかと共にプレインキュベーションし、回収した細胞の酸素消費量の比較。平均値（ｎ＝３）を標準偏差と共に示す。
【図３】図３は、植物細胞の長期保存を表す。解凍後の代謝活性に対する−８０℃におけるハイブリッドゲルの保存時間の効果。平均値（ｎ＝３）を標準偏差と共に示す。
【００４１】
実施例
実施例１：A. thaliana細胞の最適な凍結保存条件。
材料及び方法
シリカナノ粒子（５〜１５nm）、二カリウムトリス（１，２−ベンゼンジオラト−Ｏ，Ｏ’）シリカート、ムラシゲスクーグ培地（ＭＳＭＯ）、スクロース、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、水酸化カリウム、無水シュウ酸９９％、モリブデン酸アンモニウム四水和物９９％、４（メチルアミノ）フェノール硫酸９９％、亜硫酸ナトリウム９９％、塩酸３７％、硫酸９５％、カイネチン及び１−ナフタレン酢酸は、Sigma-Aldrichから購入した。C.F. Meunier, J. et al. (J. Mater. Chem., 2010, 20, 929-936)に記載されているように、ケイ酸ナトリウム溶液(Assay 25.5-28.5%, Merck)からポリ（ケイ酸）（Ｈ２ＳｉＯ３）を調製した。Amplex Red過酸化水素アッセイキット及び孔径０．２μmのメンブレンフィルタは、それぞれMolecular Probes Co及びSartoriusから入手した。
【００４２】
培養条件
３％スクロース、０．０５mg/Lカイネチン及び０．５mg/L １−ナフタレン酢酸を補充したＭＳＭＯ培地（４．４g/L、ｐＨ５．７）中で、Arabidopsis thaliana株Ｌ−ＭＭ１生態型Landberg erectaの葉由来の光混合懸濁培養細胞を培養した。１１５回転／分（r.p.m.）のロータリーシェーカー上、１６／８時間の明暗光周期の下で、細胞を２２℃で維持した。
【００４３】
細胞培養物の凍結保存
生体重約１２０mg／ミリリットルの細胞密度を得るために、（最後の継代培養の３日後の）細胞懸濁液 １０mLを１０倍に濃縮した。次いで、植物細胞を移し、凍結保護シリカゾル ４mL（１M〜３M Ｈ２ＳｉＯ３、１％〜１０％（v/v）ＤＭＳＯ、０．２M〜１Mスクロース、約４．４g/L ＭＳＭＯ粉末、０．２M ＫＯＨでｐＨ値を４〜８に調整）と混合し、０．２０μmのメンブレンフィルタでろ過滅菌し、４℃で冷蔵した。次いで、混合物を冷室内（４℃）で約１〜６時間インキュベーションした。その間に、ゲル化が起こった。最後に、得られたハイブリッドシリカゲルを移し、実験用フリーザー内（約−８０℃）において保存した。
【００４４】
解凍及び回収
サンプルバイアルを室温で約５〜１０分間加温することによって、ハイブリッドシリカマトリックスを急速解凍した。次いで、解凍したゲルを、固体培地（０．８％寒天、３％スクロース、０．０５mg/Lカイネチン及び０．５mg/L １−ナフタレン酢酸を補充した４．４g/L ＭＳＭＯ培地）を含有するプレート上に広げ、１６／８時間の明暗光周期の下、２２℃で約７日間インキュベーションした。この期間の後、回収したハイブリッドシリカ−細胞材料を、新鮮な液体培地 ２０mLを含有するエルレンマイヤーフラスコに移した。
【００４５】
解凍後の細胞生存率
Clark型酸素電極（Hansatech Instruments, UK製のOxy-lab）を用いて、２０℃におけるＯ２取り込みをモニタリングすることによって、解凍の約１時間〜７日後に、細胞の生理学的機能を決定した。生体染色色素染色（フルオレセインジアセタート、ＦＤＡ）によって、細胞生存率を確認した。解凍した細胞を５mM ＦＤＡと共に室温で５分間インキュベーションした。蛍光顕微鏡（Nikonから購入したMultizoom AZ100顕微鏡）を使用して４８２／３５nmの励起光をサンプルに照射することによって、カラーカメラ（DSRi1, Nikon）を用いて、５３６／４０nmで顕微鏡写真を集めた。また、回収した細胞が成長していわゆるカルス組織を形成する能力を、細胞生存率の指標として使用した。
【００４６】
凍結保存プロセスの３つの各工程（封入（固定化）、インキュベーション（４℃）及び凍結（−８０℃））後に、植物細胞の代謝活性（Ｏ２取り込みのモニタリング）を評価した。図Ａでは、凍結保存後の細胞活性に対する、異なる温度（４℃又は２０℃）におけるハイブリッドゲルのインキュベーション工程の効果を評価した。
【００４７】
次いで、細胞保存に対するスクロース（Ｂ）及びＤＭＳＯ（Ｃ）濃度の効果を評価した。１００％は、いかなる凍結融解サイクルも受けていない細胞の酸素消費量に対応する。
【００４８】
図１Ａは、本発明の方法の第２の工程の最適なインキュベーション時間に関するデータを提供する。図１Ａに報告されているように、最適なインキュベーション時間は、約６時間〜約４８時間で変動する。
【００４９】
図１Ｂは、本発明の方法の第１の工程の凍結保護シリカ溶液中のスクロースの最適濃度に関するデータを提供する。図１Ｂに報告されているように、スクロースの最適濃度は、約０．２M〜約１Mで変動する。
【００５０】
図１Ｃは、本発明の方法の第１の工程の凍結保護シリカ溶液中のＤＭＳＯの最適濃度に関するデータを提供する。図１Ｃに報告されているように、ＤＭＳＯの最適濃度は、約１％〜１０％で変動する。
【００５１】
実施例２：A. thaliana細胞の凍結保存に関するシリカ種の役割
実施例１に示されているように、実験を実施した。植物細胞を移し、異なる濃度のポリシリカ酸（約０．４％〜約１０％）、シリカナノ粒子（約１％〜約１２％）を含有する凍結保護シリカゾル ４mLと混合した。
【００５２】
図２は、ポリケイ酸（Ａ）又はシリカナノ粒子（Ｂ）のいずれかと共にプレインキュベーションし、回収した細胞の酸素消費量を比較する。
【００５３】
図２から導かれ得るように、シリカ前駆体として使用したポリケイ酸は、試験濃度範囲内において、シリカナノ粒子よりも高い代謝活性を提供する。
【００５４】
図２Ａに報告されているように、ポリケイ酸の最適濃度は、約５％〜約１０％で変動する。
【００５５】
シリカナノ粒子の最適濃度は、約１０％である。
【００５６】
実施例３：A. thaliana細胞の長期凍結保存。
実施例１に示されているように、実験を実施した。図３は、−８０℃で１カ月間〜２４カ月間保存した後に回収した細胞の酸素消費量を表す。
【００５７】
図３に報告されているように、シリカマトリックス内に２年間凍結保存した植物細胞は、依然として生存している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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