(57)【要約】  本出願は、アルケン類（例えばプロピレン、エチレン、１−ブチレン、イソブチレン、イソアミレン、ブタジエンまたはイソプレン）を３−ヒドロキシカルボン酸類から３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジル酸類を経て生産するための方法を記載する。【選択図】図３
2016538871.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式Ｉ：
【化１】
2016538871.tif 000020
［式中、Ｒ１およびＲ３は、独立して水素（−Ｈ）、メチル（−ＣＨ３）、エチル（−ＣＨ２−ＣＨ３）、イソプロピル（−ＣＨ２（ＣＨ３）２）、ビニル（−ＣＨ＝ＣＨ２）およびイソプロペニル（−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２）から選択され、式中、Ｒ２およびＲ４は、独立して水素（−Ｈ）およびメチル（−ＣＨ３）から選択される］
の３−ヒドロキシカルボキシレートが、第１段階において、次の一般式ＩＩ：
【化２】
2016538871.tif 000021
［式中、Ｘは、以下：
Ｏ−ＰＯ３Ｈ２  モノホスフェート、
Ｏ−ＰＯ２Ｈ−Ｏ−ＰＯ３Ｈ２  ジホスフェート、および
Ｏ−ＳＯ３Ｈ  サルフェート
からなる群から選択され、式中、Ｙは、以下：
ＯＨ  ヒドロキシルおよび
Ｏ−ＰＯ３Ｈ２  モノホスフェート
からなる群から選択され、そして式中、Ｚは、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群から選択され、
そして式中、Ｗは、水素（−Ｈ）、ヒドロキシル（ＯＨ）からなる群から選択される］
の補助基質と一緒に、次の一般式ＩＩＩ：
【化３】
2016538871.tif 000022
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、上記で式Ｉと関連して指定された意味と同じ意味を有し、そして式中、Ｗ、ＹおよびＺは、上記で式ＩＩと関連して指定された意味と同じ意味を有する］
の３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートに酵素的に変換されること、およびそうして生産された３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートが、続いて次の一般式ＩＶ：
【化４】
2016538871.tif 000023
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、上記で式Ｉと関連して指定された意味と同じ意味を有する］
のアルケンに酵素的に変換されることを特徴とする、３−ヒドロキシカルボキシレートからアルケンを生産するための方法。
【請求項２】
該３−ヒドロキシカルボン酸の該３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの酵素的変換が、アデニレート形成酵素の使用により達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該アデニレート形成酵素が、以下：
−ＡＭＰ依存性シンテターゼおよびリガーゼ
−非リボソームペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）のアデニル化ドメイン；
−アシル−またはアリール−ＣｏＡシンテターゼ；
−（ルシフェラーゼ）オキシドレダクターゼ；
−ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）のアデニル化ドメイン
−アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ；ならびに
−ＮＩＳ酵素
からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該アデニレート形成酵素が、以下：
アセテート：ＣｏＡリガーゼ（ＡＭＰ形成）（ＥＣ６．２．１．１）；
ブタノエート：ＣｏＡリガーゼ（ＡＭＰ形成）（ＥＣ６．２．１．２）；
長鎖脂肪酸：ＣｏＡリガーゼ（ＡＭＰ形成）（ＥＣ６．２．１．３）；
４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（ＥＣ６．２．１．１２）；
長鎖脂肪酸：［アシルキャリヤータンパク質］リガーゼ（ＡＭＰ形成）（ＥＣ６．２．１．２０）；
４−クロロベンゾエート：ＣｏＡリガーゼ（ＥＣ６．２．１．３３）；および
３−ヒドロキシプロピオネート：ＣｏＡリガーゼ（ＡＭＰ形成）（ＥＣ６．２．１．３６）
からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
該アデニレート形成酵素がカルボン酸レダクターゼ（ＣＡＲ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
該３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートの脱ヌクレオチジル化／脱カルボキシル化による該対応するアルケンへの酵素的変換が、ＯｌｅＣタンパク質を用いることにより達成される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該方法がインビトロで実施される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
該方法が、該３−ヒドロキシカルボキシレートの該３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの変換を触媒する酵素を産生し、かつ該３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートの該アルケンへの変換を触媒する酵素を産生する微生物の存在下で実施される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該反応から脱気して出るガス状アルケンを収集する工程を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
以下：
（ａ）アデニレート形成酵素；および
（ｂ）ＯｌｅＣタンパク質
を発現する、生物または微生物。
【請求項１１】
以下：
（ｉ）アデニレート形成酵素および式Ｉの３−ヒドロキシカルボキシレート；
または
（ｉｉ）（ａ）ＯｌｅＣタンパク質；および
（ｂ）式ＩＩＩの３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレート；または
（ｉｉｉ）（ａ）アデニレート形成酵素；および
（ｂ）ＯｌｅＣタンパク質
を含む、組成物。
【請求項１２】
請求項１０に記載の生物もしくは微生物の、または請求項１１に記載の組成物の、式Ｉの３−ヒドロキシカルボキシレートから式ＩＶのアルケンを生産するための使用。
【請求項１３】
請求項１０に記載の微生物、適切な培地、および式Ｉの３−ヒドロキシカルボキシレートまたは該微生物により式Ｉの３−ヒドロキシカルボキシレートに変換されることができる炭素源を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的プロセスによりアルケン類を生成するための方法に関する。より具体的には、本発明は、アルケン類（例えばプロピレン、エチレン、１−ブチレン、イソブチレン、イソアミレン、ブタジエンまたはイソプレン）を、３−ヒドロキシカルボン酸類から、３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジル酸類（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｉｃ  ａｃｉｄｓ）を経由して生産するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多数の化合物が、現在石油化学製品から得られている。アルケン類（例えばエチレン、プロピレン、様々なブテン類、または他には例えばペンテン類）が、プラスチック産業において、例えばポリプロピレンまたはポリエチレンを生産するために、ならびに化学産業の他の領域および燃料の領域において用いられている。
【０００３】
最も単純なアルケンであるエチレンは、産業的有機化学の中心にあり：それは、世界で最も広く生産されている有機化合物である。それは、特に主要なプラスチックであるポリエチレンを生産するために用いられている。エチレンは、（酸化の、ハロゲン化の)反応により、多くの産業的に有用な製品に変換されることもできる。
【０００４】
プロピレンは、同様に重要な役割を保持している：その重合は、結果としてプラスチック材料であるポリプロピレンをもたらす。この製品の、耐性、密度、固体性、変型能、および透明性に関する技術的特性は、無二である。ポリプロピレンの世界的な生産は、１９５４年におけるその発明以来継続的に成長してきた。
【０００５】
ブチレンは、４種類の形態で存在し、その１つであるイソブチレンは、自動車燃料のためのアンチノック添加剤であるメチル−ｔｅｒｔ−ブチル−エーテル（ＭＴＢＥ）の組成の一部になる。イソブチレンは、イソオクテンを生産するために用いられることもでき、それは今度は還元されてイソオクタン（２，２，４−トリメチルペンタン）になることができ；イソオクタンの非常に高いオクタン価は、それをいわゆる“ガソリン”エンジンのための最高の燃料にしている。
【０００６】
アミレン、ヘキセンおよびヘプテンは、二重結合の位置および立体配置に従って多くの形態で存在する。これらの製品は、実際の産業的用途を有するが、エチレン、プロピレンまたはブテン類ほどは重要ではない。
【０００７】
全てのこれらのアルケン類は、現在石油生成物の接触分解により（またはヘキセンの場合は石炭もしくはガスからのフィッシャー・トロプシュプロセスの派生法により）生産されている。従って、それらのコストは、油の価格に自然に連動している。さらに、接触分解は、時々、プロセスの複雑さおよび生産コストを増大させるかなりの技術的困難と関係している。アルケンの化学ファミリーにおいて、イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、テルペンモチーフであり、それは、重合を通してゴムをもたらす。他のテルペン類は、化学的、生物学的または混成経路により、使用可能な製品、例えば生物燃料として、またはプラスチックを製造するために開発され得る。国際公開第２００８／１１３０４１号は、微生物が脂肪アシル鎖を含有する基質を変換する、再生資源から炭化水素を生産するための生物学的プロセスを提案している。アルケン類、特に末端アルケン類（２位においてモノ−またはジ−置換されているエチレン：Ｈ２Ｃ＝Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２））の生産は、それほど広く研究されてこなかったようである。酵母ロドトルラ・ミヌタ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ）によるイソバレレートのイソブチレンへの変換は、記載されている(Fujii T. et al., Appl. Environ. Microbiol., 1988, 54:583)が、ターンオーバー数の非常に低い値（ｋｃａｔは１ｘ１０−５秒−１）により特性付けられるこの反応の効率は、産業的適用を可能にするには遠い。この経路によるイソブチレンの大規模生合成は、それが１分子のイソブチレンを形成するために１分子のロイシンの合成および分解を必要とすると考えられるため、非常に好ましくないように思われる。また、その反応を触媒する酵素は、ヘムを補因子として使用し、それは細菌における組換え発現および酵素パラメーターの向上に適するには不十分である。他の微生物が、天然にイソブチレンをイソバレレートから産生することがわずかに可能であることが記載されており；得られた収率は、ロドトルラ・ミヌタを用いて得られる収率よりもさらに低い(Fukuda H. et al, Agric. Biol. Chem., 1984, 48:1679)。
【０００８】
同じ研究は、プロピレンの天然産生も記載しており：多くの微生物が、プロピレンを産生することができるが、やはり収率は極めて低い。植物によるエチレンの産生も、昔から知られていた(Meigh et al, 1960, Nature, 186:902)。解明された代謝経路によれば、メチオニンがエチレンの前駆体である(Adams and Yang, PNAS, 1979, 76:170)。２−オキソグルタレートの変換も記載されている(Ladygina N et al., Process Biochemistry 2006, 41:1001)。エチレンの２炭素分子の産生は、４または５炭素分子の前駆体を消費するため、これらの経路は、それらの産業的適用には材料的およびエネルギー的に好ましくないようである。
【０００９】
国際公開第２０１０／００１０７８号は、デカルボキシラーゼの活性を有する酵素を用いた３−ヒドロキシアルカン酸の酵素的変換によりアルケン類を生産するためのプロセスを記載している。そのような方法は、それが石油製品の使用を回避するのを助けるため、プラスチックおよび燃料を生産するコストを下げるために有利であり、炭素が固体形態で貯蔵されることを可能にすることにより、かなりの地球環境的影響を有し得る。国際公開第２０１０／００１０７８号において記載されている方法は、酵素反応によりアルケン類を生産することを可能にするが、産業的規模に拡張されることができる生物学的システムにおけるアルケン類の生産を可能にするさらなる方法に関する必要性が、まだ存在する。本出願は、この必要性に取り組む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００８／１１３０４１号
【特許文献２】国際公開第２０１０／００１０７８号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Fujii T. et al., Appl. Environ. Microbiol., 1988, 54:583
【非特許文献２】Fukuda H. et al, Agric. Biol. Chem., 1984, 48:1679
【非特許文献３】Meigh et al, 1960, Nature, 186:902
【非特許文献４】Adams and Yang, PNAS, 1979, 76:170
【非特許文献５】Ladygina N et al., Process Biochemistry 2006, 41:1001
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、それが３−ヒドロキシカルボキシレートの生物学的プロセス、特に酵素的プロセスによる変換を含むことを特徴とする、アルケンを生産するための方法に関し、ここで、３−ヒドロキシカルボキシレートは、第１工程において、３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートに酵素的に変換され、ここで、そうして生産された３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートは、続いてアルケンに変換される。第１工程における３−ヒドロキシカルボキシレートの３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの酵素的変換は、ヌクレオチジル化（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌａｔｉｏｎ）反応を含む。生成された３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートのアルケンへの変換は、二酸化炭素の脱離および脱ヌクレオチジル化（ｄｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌａｔｉｏｎ）を含む。本発明において用いられる際、接尾辞“−エート／−オエート”は、互換的にカルボン酸イオン（ＣＯＯ−）またはカルボン酸（ＣＯＯＨ）のどちらを意味することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１：は、３−ヒドロキシカルボキシレートを３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートに変換するための一般的な反応スキームを示す。
【図２−１】図２：は、３−ヒドロキシカルボキシレートおよび補助基質としてのＡＴＰまたはＡＤＰを３−ヒドロキシカルボキシル−アデニレートに変換するための一般的な反応スキームを示す。
【図２−２】同上
【図３】図３：は、３−ヒドロキシカルボキシレートおよび補助基質としてのＡＴＰまたはＡＤＰを３−ヒドロキシカルボキシル−アデニレートに変換し、さらにそれをアルケンに変換するための一般的な反応スキームを示す。
【図４−１】図４：Ａ：は、３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートを対応するアルケンに変換するための一般的な反応スキームを示す。
【図４−２】Ｂ：は、３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートを３−ヒドロキシヌクレオチジル−カルボキシレートを経て対応するアルケンに変換するための反応スキームを示す。
【図５】図５：は、３−ヒドロキシカルボキシル−アデニレートを対応するアルケンに変換するための一般的な反応スキームを示す。
【図６−１】図６：Ａ：は、本発明に従う方法を用いることにより３−ヒドロキシ−３−メチルブチレートをイソブテンに変換するための一般的なスキームを示す。
【図６−２】Ｂ：は、ＡＴＰを補助基質として用いる本発明に従う方法を用いることにより３−ヒドロキシ−３−メチルブチレートをイソブテンに変換するための一般的なスキームを示す。
【図６−３】Ｃ：は、ＡＤＰを補助基質として用いる本発明に従う方法を用いることにより３−ヒドロキシ−３−メチルブチレートをイソブテンに変換するための一般的なスキームを示す。
【図７−１】図７：Ａ：は、本発明に従う方法を用いることにより３−ヒドロキシブチレートをプロピレンに変換するための一般的なスキームを示す。
【図７−２】Ｂ：は、ＡＴＰを補助基質として用いる本発明に従う方法を用いることにより３−ヒドロキシブチレートをプロピレンに変換するための一般的なスキームを示す。
【図７−３】Ｃ：は、ＡＤＰを補助基質として用いる本発明に従う方法を用いることにより３−ヒドロキシブチレートをプロピレンに変換するための一般的なスキームを示す。
【図８−１】図８：Ａ：は、本発明に従う方法を用いることにより３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートを１，３−ブタジエンに変換するための一般的なスキームを示す。
【図８−２】Ｂ：は、ＡＴＰを補助基質として用いる本発明に従う方法を用いることにより３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートを１，３−ブタジエンに変換するための一般的なスキームを示す。
【図８−３】Ｃ：は、ＡＤＰを補助基質として用いる本発明に従う方法を用いることにより３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートを１，３−ブタジエンに変換するための一般的なスキームを示す。
【図９】図９：は、３６０ｎｍにおける吸光度の増大により２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンの形成をモニターする、ジホスフェートまたはモノホスフェート定量化アッセイのスキームを示す。
【図１０】図１０：は、３６０ｎｍにおける２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンの吸光度の増大を記録することによりモニターされた、３−ヒドロキシプロピオネートに関するいくつかの研究された酵素のアデニル化活性を示す。
【図１１】図１１：は、３６０ｎｍにおける２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンの吸光度の増大を記録することによりモニターされた、Ｒ−３−ヒドロキシバレレートに関するいくつかの研究された酵素のアデニル化活性を示す。
【図１２】図１２：は、３６０ｎｍにおける２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンの吸光度の増大を記録することによりモニターされた、（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートに関するいくつかの研究された酵素のアデニル化活性を示す。
【図１３】図１３：は、３６０ｎｍにおける２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンの吸光度の増大を記録することによりモニターされた、３−ヒドロキシイソバレレートに関するいくつかの研究された酵素のアデニル化活性を示す。
【図１４】図１４：は、３６０ｎｍにおける２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンの吸光度の増大を記録することによりモニターされた、（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートに関するいくつかの研究された酵素のアデニル化活性を示す。
【図１５】図１５：は、Ｍ．アルギコラからのアシル−ＣｏＡシンターゼにより触媒される（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートのアデニル化反応に関する補助基質濃度の関数としての速度のプロットを示す。反応は、３６０ｎｍにおける２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンの吸光度の増大を記録することによりモニターされた。
【図１６】図１６：は、バークホルデリア属の種からのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼにより触媒される（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートのアデニル化反応に関する補助基質濃度の関数としての速度のプロットを示す。反応は、３６０ｎｍにおける２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンの吸光度の増大を記録することによりモニターされた。
【図１７】図１７：は、バークホルデリア属の種からのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼにより触媒される（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートのアデニル化反応のエレクトロスプレーＭＳスペクトルを示す。ＭＳ分析は、３−ヒドロキシブチリル−アデニレートのモノ−脱プロトン化形態［Ｍ−Ｈ］−に関する４３２．２のｍ／ｚ値における特徴的なピークを示した。
【図１８】図１８：は、バークホルデリア属の種からのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼにより触媒されるＲ−３−ヒドロキシバレレートのアデニル化反応のエレクトロスプレーＭＳスペクトルを示す。ＭＳ分析は、３−ヒドロキシバレリル−アデニレートのモノ−脱プロトン化形態［Ｍ−Ｈ］−に関する４４６．３のｍ／ｚ値における特徴的なピークを示した。
【図１９】図１９：は、バークホルデリア属の種からのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼにより触媒される３−ヒドロキシイソバレレートのアデニル化反応のエレクトロスプレーＭＳスペクトルを示す。ＭＳ分析は、３−ヒドロキシイソバレリル−アデニレートのモノ−脱プロトン化形態［Ｍ−Ｈ］−に関する４４６．２のｍ／ｚ値における特徴的なピークを示した。
【図２０】図２０：は、バークホルデリア属の種からのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼにより触媒される（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートのアデニル化反応のエレクトロスプレーＭＳスペクトルを示す。ＭＳ分析は、３−ヒドロキシペンタ−４−エノイル−アデニレートのモノ−脱プロトン化形態［Ｍ−Ｈ］−に関する４４４．３のｍ／ｚ値における特徴的なピークを示した。
【図２１】図２１：は、（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートを基質として、ＡＴＰを補助基質として用いた酵素反応および酵素を含まない反応に関して得られたＧＣ／ＦＩＤクロマトグラムを示す。
【図２２】図２２：は、実施例１２において概説されるような、酵素に触媒される（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートからのプロピレンの生産を示す。
【図２３】図２３：は、（Ｒ）−３−ヒドロキシバレレートを基質として、ＡＴＰを補助基質として用いた酵素反応および酵素を含まない反応に関して得られたＧＣ／ＦＩＤクロマトグラムを示す。
【図２４】図２４：は、実施例１６において概説されるような、酵素に触媒される（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートからの１，３−ブタジエンの生産を示す。
【図２５】図２５：は、（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートを基質として、ＡＴＰを補助基質として用いた酵素反応および酵素を含まない反応に関して得られたＧＣ／ＦＩＤクロマトグラムを示す。
【図２６】図２６：は、３−ヒドロキシイソバレレートを基質として、ＡＴＰを補助因子として用いた酵素反応および酵素を含まない反応に関して得られたＧＣ／ＦＩＤクロマトグラムを示す。
【図２７】図２７：は、ＡＴＰ濃度の関数としての３−ヒドロキシイソバレレートからのイソブテンの形成のプロットを示す。反応は、以下の酵素により触媒された：  Ｎ°１：バークホルデリア属の種からのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼおよびＳ．アマゾネンシスからのＯｌｅＣ。  Ｎ°２：Ｍ．アルギコラからのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼおよびＳ．アマゾネンシスからのＯｌｅＣ。
【図２８】図２８：は、ＡＤＰ濃度の関数としての３−ヒドロキシイソバレレートからのイソブテンの形成のプロットを示す。反応は、以下の酵素により触媒された：  Ｎ°１：Ｍ．アルギコラからのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼおよびＳ．アマゾネンシスからのＯｌｅＣ。  Ｎ°２：バークホルデリア属の種からのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼおよびＳ．アマゾネンシスからのＯｌｅＣ。
【図２９】図２９：は、Ｏｌｅ  ＡＢＣＤ(Wang and Lu, frontiers in Bioengineering an Biotechnology 1 (2013), 論文10)により触媒される反応のスキームを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
用語“３−ヒドロキシカルボキシレート”は、本明細書で用いられる際、次の一般式Ｉに応じる分子を意味し：
【００１５】
【化１】
2016538871.tif 000003
【００１６】
式中、Ｒ１およびＲ３は、独立して水素（−Ｈ）、メチル（−ＣＨ３）、エチル（−ＣＨ２−ＣＨ３）、イソプロピル（−ＣＨ２（ＣＨ３）２）、ビニル（−ＣＨ＝ＣＨ２）およびイソプロペニル（−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２）から選択され、式中、Ｒ２およびＲ４は、独立して水素（−Ｈ）およびメチル（−ＣＨ３）から選択される。
【００１７】
本発明の方法によれば、３−ヒドロキシカルボキシレートは、次の一般式ＩＩ：
【００１８】
【化２】
2016538871.tif 000004
【００１９】
［式中、Ｘは、以下：
Ｏ−ＰＯ３Ｈ２  モノホスフェート、
Ｏ−ＰＯ２Ｈ−Ｏ−ＰＯ３Ｈ２  ジホスフェート、および
Ｏ−ＳＯ３Ｈ  サルフェート
からなる群から選択され、式中、Ｙは、以下：
ＯＨ  ヒドロキシル、および
Ｏ−ＰＯ３Ｈ２  モノホスフェート
からなる群から選択され、そして式中、Ｚは、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシルおよびヒポキサンチンからなる群から選択され、
そして式中、Ｗは、水素（−Ｈ）およびヒドロキシル（ＯＨ）からなる群から選択される］
に応じる補助基質と一緒に、次の一般式ＩＩＩ：
【００２０】
【化３】
2016538871.tif 000005
【００２１】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、上記で式Ｉと関連して指定された意味と同じ意味を有し、そして式中、Ｗ、ＹおよびＺは、上記で式ＩＩと関連して指定された意味と同じ意味を有する］
の対応する３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートに酵素的に変換される。
【００２２】
本発明の方法によれば、そうして生産された３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートは、さらにアルケンに変換される。
本発明に従う方法により生産されるアルケンは、次の一般式ＩＶ：
【００２３】
【化４】
2016538871.tif 000006
【００２４】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、上記で式Ｉと関連して指定された意味と同じ意味を有する］
に応じた分子である。
【００２５】
好ましい態様において、本発明に従う方法において変換される３−ヒドロキシカルボキシレートは、以下の表１において指定されるような３−ヒドロキシカルボキシレートから選択され、表１において示されているような対応するアルケンに変換される。
【００２６】
【表１−１】
2016538871.tif 000007
【００２７】
【表１−２】
2016538871.tif 000008
【００２８】
【表１−３】
2016538871.tif 000009
【００２９】
【表１−４】
2016538871.tif 000010
【００３０】
【表１−５】
2016538871.tif 000011
【００３１】
【表１−６】
2016538871.tif 000012
【００３２】
【表１−７】
2016538871.tif 000013
【００３３】
【表１−８】
2016538871.tif 000014
【００３４】
上記のように、本発明の方法によれば、３−ヒドロキシカルボキシレートは、まず３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートに変換される。これは、ヌクレオチジル化反応、すなわち、ヌクレオチジル基が補助基質（式ＩＩ）から３−ヒドロキシカルボキシレートのカルボキシル基に移される反応により達成される。一般的な反応が、図１において示されている。
【００３５】
式ＩＩに従う補助基質に関する例は、リボヌクレオチド類、例えばＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰおよびＩＴＰ（ＡＴＰが好ましい）、ならびにＡＤＰ、ＣＤＰ、ＧＣＰ、ＵＤＰおよびＩＤＰ（ＡＤＰが好ましい）である。他の例は、デオキシリボヌクレオチド類、例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＩＴＰである。さらなる例は、３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホサルフェート（ＰＡＰＳ）またはアデノシン−５’−ホスホサルフェート（ＡＰＳ）である。
【００３６】
好ましい態様において、Ｚはアデニンである。別の好ましい態様において、Ｚはアデニンであり、ＷはＨである。さらなる好ましい態様において、Ｚはアデニンであり、ＷはＨであり、Ｘはモノホスフェートまたはジホスフェートである。別の好ましい態様において、Ｚはアデニンであり、ＷはＨであり、Ｘはサルフェートであり、ＹはＯＨまたはモノホスフェートである。別の特に好ましい態様において、Ｚはアデニンであり、ＷおよびＹはＯＨである。別の好ましい態様において、Ｚはアデニンであり、ＷはＨであり、ＹはＯＨである。さらなる好ましい態様において、Ｚはアデニンであり、ＷおよびＹはＯＨであり、Ｘはモノホスフェートまたはジホスフェートである。別の好ましい態様において、Ｚはアデニンであり、ＷはＯＨであり、Ｘはサルフェートであり、ＹはＯＨまたはモノホスフェートである。
【００３７】
好ましい態様において、本発明に従う方法の第１工程における３−ヒドロキシカルボキシレートの変換は、３−ヒドロキシカルボキシル−アデニレートをもたらす。
ある好ましい態様において、式ＩＩの補助基質は、ＡＴＰまたはＡＤＰであり、第１酵素変換は、アデニル化である。その反応は、図２において図式的に示されている。アルケンをもたらす全体的な反応に関するスキームは、図３において示されている。
【００３８】
本発明の方法に従う３−ヒドロキシカルボキシレートの３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの変換は、好ましくは酵素反応により、特にヌクレオチジル基の分子上への転移を触媒する酵素の使用により達成されることができる。
【００３９】
本発明に従う方法の一態様において、“アデニレート形成酵素”として分類されている酵素が、３−ヒドロキシカルボキシレートの３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの変換のために用いられる。用語“アデニレート形成酵素”は、次の反応：
基質  ＋  ＡＴＰ  →  基質−アデニレート  ＋  ジホスフェート
を触媒することができる酵素を意味することが、理解されている（例えば、Schmelz and Naismith Curr. Opin. Struc. Biol. 19 (2009), 666-671; Linne et al., FEBS Letters 581 (2007), 905-910を参照）。ＡＴＰは、補助基質として示されているが、アデニレート形成酵素は、他の補助基質、例えばＡＤＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＩＴＰを用いることができることが、知られている。従って、本発明の範囲において、用語“アデニレート形成”は、その酵素がアデニル化された生成物のみを生成するという意味において限定的であるのではなく、当該技術で用いられている確立された用語としてのみ用いられており、それぞれの酵素が式ＩＩにおいて定義されたような他の補助基質を用いることができる可能性も含んでいる。好ましくは、ヌクレオチジル部分が移される基質上の基は、カルボキシル基である。Schmelz and Naismith（上記の引用）において記載されているように、アデニル化酵素は、そうでなければ非反応性のカルボン酸を、通常のヒドロキシル脱離基をアデノシンモノホスフェートに変換することにより、活性化する。これらの酵素は、異なるデータベースにおいて参照される以下の共通の構造的特徴を共有している：
１．ＩｎｔｅｒＰｒｏデータベース（ＩｎｔｅｒＰｒｏ４４．０；２０１３年９月２５日公開）
ＩＰＲ０２０８４５、ＡＭＰ結合、保存された部位
(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR020845)
ＩＰＲ０００８７３(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR000873)
２．Ｐｒｏｓｉｔｅ
ＰＳ００４５５(http://prosite.expasy.org/PS00455)
説明：推定上のＡＭＰ結合ドメイン署名。
【００４０】
パターン：［ＬＩＶＭＦＹ］−｛Ｅ｝−｛ＶＥＳ｝−［ＳＴＧ］−［ＳＴＡＧ］−Ｇ−［ＳＴ］−［ＳＴＥＩ］−［ＳＧ］−ｘ−［ＰＡＳＬＩＶＭ］−［ＫＲ］。
（登録名ＡＭＰ＿ＢＩＮＤＩＮＧ；受け入れ番号ＰＳ００４５５；登録型ＰＡＴＴＥＲＮ；日付１９９１年５月（作製）；２００４年１２月（データの更新）；２０１３年１０月（情報の更新）。パターン［ＬＩＶＭＦＹ］−｛Ｅ｝−｛ＶＥＳ｝−［ＳＴＧ］−［ＳＴＡＧ］−Ｇ−［ＳＴ］−［ＳＴＥＩ］−［ＳＧ］−ｘ−［ＰＡＳＬＩＶＭ］−［ＫＲ］）
３．Ｐｆａｍ
Ｐｆａｍデータベースにおけるこれらの酵素に関する受け入れ番号は、ＰＦ００５０１である。
【００４１】
アデニレート形成酵素は、例えばSchmelz and Naismith (Curr. Opin. Struc. Biol. 19 (2009), 666-671)において記載されている。配列分析に基づいて、アデニレート形成酵素のスーパーファミリーが同定されおり、それは３つの密接に関連するサブファミリーに細分されることができる。
【００４２】
第１サブファミリー（クラスＩと呼ばれる）は、以下のサブクラスを含む：
−非リボソームペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）のアデニル化ドメイン；
−アシル−またはアリール−ＣｏＡシンテターゼ；
−（ルシフェラーゼ）オキシドレダクターゼ；および
−ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）のアデニル化ドメイン。
【００４３】
本明細書においてさらに下記で記載されるＡＭＰ依存性シンテターゼおよびリガーゼも、このクラス中に分類されることができる。
第２のサブファミリー（クラスＩＩと呼ばれる）は、以下のものを含む：
−アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ。
【００４４】
第３のサブファミリー（クラスＩＩＩと呼ばれる）は、以下のものを含む：
−ＮＩＳ酵素
ＮＩＳ酵素は、ＮＲＰＳ非依存性シデロフォア（ＮＩＳ）合成に関わる酵素である。
【００４５】
好ましい態様において、本発明に従う方法は、上記で言及されたクラスＩに属する酵素を用いる。
一態様において、酵素は、クラスＩに属し、非リボソームペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）のアデニル化ドメインを含むサブクラスに属する(Marahiel, Chem. Rev. 97 (1997), 2651-2673; Sundlov et al., Chem Biol. 19 (2012), 188-198; Sundlov et al., Acta Cryst. D69 (2013). 1482-1492; May et al., PNAS 99 (2002), 12120-12125; Keating, Biochemistry 39 (2000), 4729-4739)。
【００４６】
別の態様において、酵素は、クラスＩに属し、アシル−またはアリール−ＣｏＡシンテターゼを含むサブクラスに属する(Soupene and Kuypers, Exp Biol Med 233 (2008), 507-521; Mashek et al., Future Lipidol. 2 (2007), 465-476; Ehlting et al., The Plant Journal 27(2001), 455-465)。
【００４７】
別の態様において、酵素は、クラスＩに属し、（ルシフェラーゼ）オキシドレダクターゼを含むサブクラスに属する。そのような酵素の１つの代表的な例および本発明に従う方法において用いられるべき好ましい酵素は、ホタルルシフェラーゼである(Oba et al., FEBS Letters 540 (2003), 251-254)。
【００４８】
別の態様において、酵素は、アデニレート形成酵素のクラスＩに属し、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）のアデニル化ドメインを含むサブクラスに属する。この群の酵素の代表的な例は、ザントモナス・アルビリネアンス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｌｂｉｌｉｎｅａｎｓ）のポリケチド−ペプチドシンターゼである(Huang et al., Microbiology 147 (2001), 631-642)。
【００４９】
上記で言及されたアデニレート形成酵素のクラスＩに属する酵素は、ＥＣ６．２．１スーパーファミリーに分類される。原則として、ＥＣ６．２．１として分類されるあらゆる酵素は、本発明に従う方法において用いられることができる。そのようなアデニレート形成酵素の例は、以下の酵素である：
ＥＣ６．２．１．１  アセテート：ＣｏＡリガーゼ（ＡＭＰ形成）；
ＥＣ６．２．１．２  ブタノエート：ＣｏＡリガーゼ（ＡＭＰ形成）；
ＥＣ６．２．１．３  長鎖脂肪酸：ＣｏＡリガーゼ（ＡＭＰ形成）；
ＥＣ６．２．１．１２  ４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ；
ＥＣ６．２．１．２０  長鎖脂肪酸：［アシルキャリヤータンパク質］リガーゼ（ＡＭＰ形成）；
ＥＣ６．２．１．３３  ４−クロロベンゾエート：ＣｏＡリガーゼ；および
ＥＣ６．２．１．３６  ３−ヒドロキシプロピオネート：ＣｏＡリガーゼ（ＡＭＰ形成）。
【００５０】
この群の全ての酵素は、ＩｎｔｅｒＰｒｏ（ＩｎｔｅｒＰｒｏ４４．０；２０１３年９月２５日公開）においてＩｎｔｅｒＰｒｏ  ＩＰＲ０２０８４５、ＡＭＰ結合、保存された部位(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR020845)およびＩＰＲ０００８７３(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR000873)として参照されている共通の構造モチーフを共有している。Ｐｆａｍデータベースにおけるこれらの酵素に関する受け入れ番号は、ＰＦ００５０１である。
【００５１】
従って、ある好ましい態様において、３−ヒドロキシカルボキシレートの対応する３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの酵素的変換は、例えば、アセテート：ＣｏＡリガーゼ（ＡＭＰ形成）（６．２．１．１）の使用により達成されることができる。アセテート：ＣｏＡリガーゼは、次の反応を触媒する酵素である：
ＡＴＰ  ＋  アセテート  ＋  ＣｏＡ  →  ＡＭＰ  ＋  ジホスフェート  ＋  アセチル−ＣｏＡ
その反応は、アセチル−ＡＭＰ中間体のアセテートおよびＡＴＰからの形成ならびにアセチル基のＣｏＡへの転移を含む２段階反応である。これらの酵素は、細菌からヒトまでのほとんどの生きた生物中に存在する。
【００５２】
これらの酵素の存在は、原核生物および真核生物、特に細菌、藻類、真菌、植物および動物を含む多数の生物に関して、例えば出芽酵母、ムーレラ・サーモアセチカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）、ピュロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、メタノサーモバクター・サーマオートトロフィクス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｉｃｕｓ）、メタノサエタ・コンシリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｃｏｎｃｉｌｉｉ）、メタノサルキナ属の種（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｓｐ．）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃ）、アリイビブリオ・フィシェリ（Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、大腸菌、ハロアーキュラ・マリスモルツイ（Ｈｏｌｏａｒｃｕｌａ  ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ）、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、オリクトラグス・クニクルス（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）、オウィス・アリエース（Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、フィコマイセス・ブラケスレーアヌス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ  ｂｌａｋｅｓｌｅｅａｎｕｓ）、クリプトスポリジウム・パルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、エメリセラ・ニデュランス（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、パイロバキュラム・アエロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロゼオバリウス属の種（Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ  ｓｐ．）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ピヌス・ラジアータ（Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔｅ）、スピナシア・オレラセア（Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、タクスス属の種（Ｔａｘｕｓ  ｓｐ．）、ゼア・マイス（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、ピースム・サティウム（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）、アマランサス属の種（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ  ｓｐ．）、ホルデウム・ウルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、ラッタス・ノルベギカス（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、マルモタ・モナクス（Ｍｏｒｍｏｔａ  ｍｏｎａｘ）、ボース・タウルス（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）およびヒトに関して記載されてきた。出芽酵母からの酵素に関して、結晶構造が、例えばJogl and Tong (Biochemistry 43 (2004), 1425-1431)において開示されている。原則として、あらゆる既知のアセテート：ＣｏＡリガーゼは、本発明に従う方法において用いられることができる。本発明��一側面において、出芽酵母からのアセテート：ＣｏＡリガーゼが用いられる（Jogl and Tong；上記の引用）。
【００５３】
別の好ましい態様において、３−ヒドロキシカルボキシレートの対応する３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの酵素的変換は、例えば、ブタノエート：ＣｏＡリガーゼ（ＡＭＰ形成）（６．２．１．２）の使用により達成されることができる。ブタノエート：ＣｏＡリガーゼは、次の反応を触媒する酵素である：
ＡＴＰ  ＋  カルボキシレート  ＋  ＣｏＡ  →  ＡＭＰ  ＋  ジホスフェート  ＋  アシル−ＣｏＡ
これらの酵素は、ブタノエート代謝に参加している。これらの酵素の存在は、原核生物および真核生物、特に細菌、藻類、真菌、植物および動物を含む多数の生物に関して、例えばストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）、ペニシリウム・クリソゲナム、パエシロマイセス・バリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｖａｒｉｏｔｉｉ）、シュードモナス・エルギノーサ、ディクトヨステリウム・ディスコイデウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）、カビア・ポルセルス（Ｃａｖｉａ  ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ）、オウィス・アリエス（Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ）、スース・スクロファ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）、ボース・タウルス、ムス・ムスクルス、ラッタス・ノルベギカスおよびヒトに関して記載されてきた。
【００５４】
別の好ましい態様において、３−ヒドロキシカルボキシレートの対応する３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの酵素的変換は、例えば、長鎖脂肪酸：ＣｏＡリガーゼ（ＡＭＰ形成）（６．２．１．３）（脂肪アシル−ＣｏＡシンテターゼ；ＦＡＣＳとしても知られている）の使用により達成されることができる。これらの酵素は、次の反応を触媒する：
ＡＴＰ  ＋  長鎖脂肪酸  ＋  ＣｏＡ  →  ＡＭＰ  ＋  ジホスフェート  ＋  アシル−ＣｏＡ
この触媒の重要な特徴の１つは、アデニル化された中間体、すなわち脂肪アシル−ＡＭＰの形成である。この活性化段階は、脂肪酸のカルボキシル基の、ＡＭＰのホスホリル基へのアシル結合による連結を含む。
【００５５】
これらの酵素は、脂肪アシル−ＣｏＡの形成を触媒することにより、中間代謝における中心的な役割を果たしている。従って、それらは基本的に全ての生物に存在し、例えば出芽酵母、大腸菌、シュードモナス・エルギノーサ、シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、カウロバクター・ビブリオイデス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｂｒｉｏｉｄｅｓ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）、エメリセラ・ニデュランス、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、プラスモジウム・ファルシパラム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、プラスモジウム・ノウレシ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ）、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃｅａｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）、タラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）、フォティナス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）、トリボリウム・カスタネウム（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ  ｃａｓｔａｎｅｕｍ）、オリクトラグス・クニクルス（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）、コマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ルキオラ・クルキアタ（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａ）、ノトテニア・コリイセプス（Ｎｏｔｏｔｈｅｎｉａ  ｃｏｒｉｉｃｅｐｓ）、ピースム・サティウム、ゼア・マイス、アラビドプシス・サリアナ、ウルムス属の種（Ｕｌｍｕｓ  ｓｐ．）、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、アグリプヌス・ビノデュルス（Ａｇｒｙｐｎｕｓ  ｂｉｎｏｄｕｌｕｓ）、バベシア・ボビス（Ｂｅｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ）、ムス・ムスクルス、ラッタス・ノルベギカス、スース・スクロファおよびヒトに関して記載されてきた。原則として、あらゆる既知の長鎖脂肪酸：ＣｏＡリガーゼは、本発明に従う方法において用いられることができる。本発明の一側面において、大腸菌からの長鎖脂肪酸：ＣｏＡリガーゼが用いられる。大腸菌におけるその酵素は、ｆａｄＤ遺伝子によりコードされている(Weimar et al., J. Biol. Chem. 277 (2002), 29369-29376)。
【００５６】
別の好ましい態様において、３−ヒドロキシカルボキシレートの対応する３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの酵素的変換は、例えば、４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（ＥＣ６．２．１．１２）の使用により達成されることができる。４−クマレート−ＣｏＡリガーゼは、次の反応を触媒する酵素である：
ＡＴＰ  ＋  ４−クマレート  ＋  ＣｏＡ  →  ＡＭＰ  ＋  ジホスフェート  ＋  ４−クマロイル−ＣｏＡ
４−クマレート−ＣｏＡリガーゼは、４−クマレートおよび他のヒドロキシシンナメート類のＣｏＡチオールエステルの形成を、アデニレート中間体の形成を含む２段階の反応で触媒する。これらの酵素は、フェニルプロパノイドの生合成に関わっている。これらの酵素の存在は、多数の生物、特に真核生物、特に真菌および植物に関して、例えば出芽酵母、フラガリア  ｘ  アナナッサ（Ｆｒａｇａｒｉａ  ｘ  ａｎａｎａｓｓａ）、オリュザ・サティウァ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、リトスペルマム・エリスロリゾン（Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎ）、エリオボティラ・ジャポニカ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、アラビドプシス・サリアナ、フィスコミトレラ  パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）、ルタ・グラベオレンス（Ｒｕｔａ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）、ロビニア・シュードアカシア（Ｒｏｂｉｎｉｓ  ｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａ）、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、ヴィティス・ヴィニフェラ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）、ラリクス・カジャンデリ（Ｌａｒｉｘ  ｃａｊａｎｄｅｒｉ）、ラリクス・グメリニイ（Ｌａｒｉｘ  ｇｍｅｌｉｎｉｉ）、ラリクス・カエムプフェリ（Ｌａｒｉｘ  ｋａｅｍｐｆｅｒｉ）、ラリクス・カムチャティカ（Ｌａｒｉｘ  ｋａｍｔｓｃｈａｔｉｃａ）、ラリクス・シベリカ（Ｌａｒｉｘ  ｓｉｂｉｒｉｃａ）、ラリクス・スカチェウィー（Ｌａｒｉｘ  ｓｕｋａｃｚｅｗｉｉ）、ココス・ヌシフェラ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）、ピヌス・ラジアータ（Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔｅ）、カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、センタウリウム・エリスラエア（Ｃｅｎｔａｕｒｅｕｍ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ）、ケファロケレウス・セニリス（Ｃｅｐｈａｌｏｃｅｒｅｕｓ  ｓｅｎｉｌｉｓ）、フォーシシア・サスペンサ（Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ  ｓｕｓｐｅｎｓａ）、グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、ゴッシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、ロリウム・ペレネ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ）、ニコチアナ・タバカム、メタセコイア・グリプトストロボイデス（Ｍｅｔａｓｅｑｕｏｉａ  ｇｌｙｐｔｏｓｔｒｏｂｏｉｄｅｓ）、パウロウニア・トメントサ（Ｐａｕｌｏｗｎｉａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）、ペトロセリヌム・クリスプム（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）、フィロスタキス・バンブソイデス（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｃｈｕｓ  ｂａｍｂｕｓｏｉｄｅｓ）、ピセア・アビエス（Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）、ピヌス・タエダ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｓａ）、ピースム・サティウム（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）、プラティクラダス・オリエンタリス（Ｐｌａｔｙｃｌａｄｕｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、ポリポルス・ヒスピダス（Ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｓ  ｈｉｓｐｉｄｕｓ）、ポプルス・トメントサ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）、ポプルス・トレムロイデス（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）、ポプルス・トリコカルパ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）、ポプルス・カナデンシス（Ｐｏｐｕｌｕｓ  Ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、プルナス・アビウム（Ｐｒｕｎ��ｓ  ａｖｉｕｍ）、ソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、サリクス・バビロニカ（Ｓａｌｉｘ  ｂａｂｙｌｏｎｉｃａ）およびトリーティクム・アエスティウム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）に関して記載されている。原則として、あらゆる既知の４−クマレート−ＣｏＡリガーゼは、本発明に従う方法において用いられることができる。一態様において、Ａ・サリアナからの４−クマレート−ＣｏＡリガーゼが用いられる(Ehlting et al., Plant J. 27 (2001), 455-465)。
【００５７】
別の好ましい態様において、３−ヒドロキシカルボキシレートの対応する３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの酵素的変換は、例えば、長鎖脂肪酸：［アシルキャリヤータンパク質］リガーゼ（ＡＭＰ形成）（ＥＣ６．２．１．２０）の使用により達成されることができる。これらの酵素は、次の反応を触媒する：
ＡＴＰ  ＋  酸  ＋  ［アシルキャリヤータンパク質］  →  ＡＭＰ  ＋  ジホスフェート  ＋  アシル−［アシルキャリヤータンパク質］
この触媒の重要な特徴の１つは、アデニル化された中間体、すなわちアシル−ＡＭＰの形成である。この活性化段階は、酸のカルボキシル基のＡＭＰのホスホリル基へのアシル結合による連結を含む。
【００５８】
これらの酵素は、脂肪酸代謝に関わっており、それらは、様々な生物に存在する。それらは、例えばビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ）、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、大腸菌、シネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｅｓ）、シネココッカス属の種、ロドトルラ・グラティニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、アラビドプシス・サリアナおよびアリウム・アンペロプラズム（Ａｌｌｉｕｍ  ａｍｐｅｌｏｐｒａｓｕｍ）に関して記載されてきた。ビブリオ・ハーベイにおいて、その酵素は、ａａｓＳ遺伝子によりコードされている(Jiang et al., Biochemistry 45 (2006), 10008-10019)。原則として、あらゆる既知の長鎖脂肪酸：［アシルキャリヤータンパク質］リガーゼが、本発明に従う方法において用いられることができる。一態様において、ビブリオ・ハーベイからの長鎖脂肪酸：［アシルキャリヤータンパク質］リガーゼが用いられる。
【００５９】
別の好ましい態様において、３−ヒドロキシカルボキシレートの対応する３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの酵素的変換は、例えば、４−クロロベンゾエート：ＣｏＡリガーゼ（ＡＭＰ形成）（ＥＣ６．２．１．３３）の使用により達成されることができる。４−クロロベンゾエート：ＣｏＡリガーゼは、次の反応を触媒する酵素である：
ＡＴＰ  ＋４−クロロベンゾエート＋  ＣｏＡ  →  ＡＭＰ  ＋  ジホスフェート  ＋  ４−クロロベンゾイル−ＣｏＡ
これらの酵素は、２，４−ジクロロベンゾエートの分解に参加している。それらは、４−クロロベンゾイル−ＣｏＡの形成を、４−クロロベンゾエートのＡＴＰを用いたアデニル化、続いて４−クロロベンゾイル−ＡＭＰ中間体からＣｏＡへのアシル転移からなる２段階反応で触媒する。これらの酵素の存在は、例えばアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）およびアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属（ｇｅｎｉ）の細菌に関して記載されてきた。シュードモナス属の種の株ＣＢＳ３からの酵素は、例えばChang et al. (Biochemistry 36 (1997), 15650-15659)において記載されている。
【００６０】
別の好ましい態様において、３−ヒドロキシカルボキシレートの対応する３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの酵素的変換は、例えば、３−ヒドロキシプロピオネート：ＣｏＡリガーゼ（ＡＭＰ形成）（ＥＣ６．２．１．３６）の使用により達成されることができる。３−ヒドロキシプロピオネート：ＣｏＡリガーゼは、次の反応を触媒する酵素である：
ＡＴＰ  ＋３−ヒドロキシプロピオネート＋  ＣｏＡ  →  ＡＭＰ  ＋  ジホスフェート  ＋  ４−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ
これらの酵素は、３−ヒドロキシプロピオネート／４−ヒドロキシブチレート回路における段階を触媒している。これらの酵素の存在は、例えば細菌に関して、特にスルフォロブス・トコダイイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ）およびメタロスファエラ・セデュラ（Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａ）に関して記載されてきた(Alber et al., J. Bacteriol. 190 (2008), 1383-1389)。シュードモナス属の種の株ＣＢＳ３からの酵素は、例えばChang et al. (Biochemistry 36 (1997), 15650-15659)において記載されている。Chang et al.において、その酵素はプロピオネート、アクリレート、アセテートおよびブチレートも活性化することが記載されている。
【００６１】
さらなる好ましい態様において、３−ヒドロキシカルボキシレートの対応する３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの酵素的変換は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２において示されているアミノ酸配列を示すマリノバクター・アルギコラ（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｇｉｃｏｌａ）からのアシル−ＣｏＡシンテターゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ受け入れ番号Ａ６ＥＺ５４も参照）の使用により達成されることができる。当然、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２において示されているようなアミノ酸配列を有する酵素だけでなく、アシル−ＣｏＡシンテターゼの活性を示す関連する配列を有する酵素を使用することも可能である。従って、ある好ましい態様において、本発明に従う方法は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２において示されているアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に少なくともｘ％（ｘは、２５〜１００の整数、好ましくは３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）同一であり、アシル−ＣｏＡシンテターゼの活性を示し、かつ本明細書において上記で記載されたように３−ヒドロキシカルボキシレートを３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートに変換することができる配列を含むアシル−ＣｏＡシンテターゼを利用する。
【００６２】
添付された実施例は、この酵素が、例えば３−ヒドロキシプロピオネートおよびＡＴＰ、３−ヒドロキシバレレートおよびＡＴＰ、３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートおよびＡＴＰ、３−ヒドロキシイソバレレートおよびＡＴＰ、ならびに３−ヒドロキシブチレートおよびＡＴＰを、対応する３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートに変換することができることを実証している。実施例において、この酵素はＡＴＰまたはＡＤＰを補助基質として用いることができることも、示されている。
【００６３】
別の好ましい態様において、３−ヒドロキシカルボキシレートの対応する３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの酵素的変換は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３において示されているアミノ酸配列を示すマリノバクター・マンガノキシダンス（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｎｇａｎｏｘｉｄａｎｓ）からのアシル−ＣｏＡシンテターゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ受け入れ番号Ｇ６ＹＰＱ６も参照）の使用により達成されることができる。当然、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３において示されているようなアミノ酸配列を有する酵素だけでなく、アシル−ＣｏＡシンテターゼの活性を示す関連する配列を有する酵素を使用することも可能である。従って、ある好ましい態様において、本発明に従う方法は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３において示されているアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に少なくともｘ％（ｘは、２５〜１００の整数、好ましくは３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）同一であり、アシル−ＣｏＡシンテターゼの活性を示し、かつ本明細書において上記で記載されたように３−ヒドロキシカルボキシレートを３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートに変換することができる配列を含むアシル−ＣｏＡシンテターゼを利用する。
【００６４】
さらなる好ましい態様において、３−ヒドロキシカルボキシレートの対応する３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの酵素的変換は、例えば、ＡＭＰ−依存性シンテターゼおよびリガーゼの使用により達成されることができる。ＡＭＰ−依存性シンテターゼおよびリガーゼは、ＩｎｔｅｒＰｒｏ（ＩｎｔｅｒＰｒｏ４４．０；２０１３年９月２５日公開）においてＩｎｔｅｒＰｒｏ  ＩＰＲ０２０８４５、ＡＭＰ結合、保存された部位(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR020845)およびＩＰＲ０００８７３(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR000873)として参照されている共通の構造モチーフを共有している。原則として、あらゆるＡＭＰ−依存性シンテターゼおよびリガーゼが、本発明に従う方法において用いられることができる。
【００６５】
ある好ましい態様において、ＡＭＰ−依存性シンテターゼおよびリガーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１において示されているアミノ酸配列を示すマリノバクター・アクアエオレイ（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｑｕａｅｏｌｅｉ）のＡＭＰ−依存性シンテターゼおよびリガーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ受け入れ番号Ａ１Ｕ２Ｆ４も参照）である。当然、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１において示されているようなアミノ酸配列を有する酵素だけでなく、ＡＭＰ−依存性シンテターゼおよびリガーゼの活性を示す関連する配列を有する酵素を使用することも可能である。従って、ある好ましい態様において、本発明に従う方法は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１において示されているアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に少なくともｘ％（ｘは、２５〜１００の整数、好ましくは３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）同一であり、ＡＭＰ−依存性シンテターゼおよびリガーゼの活性を示し、かつ本明細書において上記で記載されたように３−ヒドロキシカルボキシレートを３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートに変換することができる配列を含むＡＭＰ−依存性シンテターゼおよびリガーゼを利用する。
【００６６】
添付された実施例は、この酵素が、例えば３−ヒドロキシプロピオネートおよびＡＴＰ、３−ヒドロキシバレレートおよびＡＴＰ、３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートおよびＡＴＰ、３−ヒドロキシイソバレレートおよびＡＴＰ、ならびに３−ヒドロキシブチレートおよびＡＴＰを、対応する３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートに変換することができることを実証している。対応する３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートは、その酵素が、下記でさらに記載されるようなＯｌｅＣタンパク質、好ましくはシュワネラ・アマゾネンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ）からの、ザントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）からの、またはクロロフレクサス・オウランティアカス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）からのＯｌｅＣタンパク質との組み合わせで用いられる場合、対応するアルケンにさらに変換されることができることも、示されている。これは、例えば、３−ヒドロキシブチレートからのプロピレンの生産に関して、または３−ヒドロキシバレレートからの１−ブテンの生産に関して、または３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートからの１，３−ブタジエンの生産に関して、または３−ヒドロキシイソバレレートからのイソブテンの生産に関して示されている。従って、好ましい態様において、本発明に従う方法は、本明細書において上記で記載されたようなマリノバクター・アクアエオレイのＡＭＰ−依存性シンテターゼおよびリガーゼならびに本明細書において下記で記載されるようなシュワネラ・アマゾネンシスからの、ザントモナス・カンペストリスからの、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）からの、またはクロロフレクサス・オウランティアカスからのＯｌｅＣタンパク質を利用する。より好ましくは、そのような方法は、３−ヒドロキシブチレートからプロピレンを生産するため、または３−ヒドロキシバレレートから１−ブテンを生産するため、または３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートから１，３−ブタジエンを生産するため、または３−ヒドロキシイソバレレートからのイソブテンの生産のためのものである。
【００６７】
さらなる好ましい態様において、３−ヒドロキシカルボキシレートの対応する３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの酵素的変換は、ＡＭＰ−依存性シンテターゼおよびリガーゼ、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４において示されているアミノ酸配列を示すバークホルデリア属の種（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）のＡＭＰ−依存性シンテターゼおよびリガーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ受け入れ番号Ｒ４ＷＲＪ４も参照）の使用により達成されることができる。当然、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４において示されているようなアミノ酸配列を有する酵素だけでなく、ＡＭＰ−依存性シンテターゼおよびリガーゼの活性を示す関連する配列を有する酵素を使用することも可能である。従って、ある好ましい態様において、本発明に従う方法は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４において示されているアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に少なくともｘ％（ｘは、２５〜１００の整数、好ましくは３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）同一であり、ＡＭＰ−依存性シンテターゼおよびリガーゼの活性を示し、かつ本明細書において上記で記載されたように３−ヒドロキシカルボキシレートを３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートに変換することができる配列を含むＡＭＰ−依存性シンテターゼおよびリガーゼを利用する。
【００６８】
添付された実施例は、この酵素が、例えば３−ヒドロキシプロピオネートおよびＡＴＰ、３−ヒドロキシバレレートおよびＡＴＰ、３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートおよびＡＴＰ、３−ヒドロキシイソバレレートおよびＡＴＰ、ならびに３−ヒドロキシブチレートおよびＡＴＰを、対応する３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートに変換することができることを実証している。実施例において、この酵素がＡＴＰまたはＡＤＰを補助基質として用いることができることも、示されている。さらに、対応する３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートは、その酵素が、下記でさらに記載されるようなＯｌｅＣタンパク質、好ましくはシュワネラ・アマゾネンシスからの、またはシュワネラ・ロイヒカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｌｏｉｈｉｃａ）からのＯｌｅＣタンパク質との組み合わせで用いられる場合、対応するアルケンにさらに変換されることができることも、示されている。これは、例えば、３−ヒドロキシブチレートからのプロピレンの、または３−ヒドロキシイソバレレートからの１−ブテンの、または３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートからの１，３−ブタジエンの生産に関して示されている。従って、好ましい態様において、本発明に従う方法は、本明細書において上記で記載されたようなバークホルデリア属の種のＡＭＰ−依存性シンテターゼおよびリガーゼならびに本明細書において下記で記載されるようなシュワネラ・アマゾネンシスからの、またはシュワネラ・ロイヒカからのＯｌｅＣタンパク質を利用する。より好ましくは、そのような方法は、３−ヒドロキシブチレートからプロピレンを生産するため、または３−ヒドロキシバレレートからの１−ブテンの生産のため、または３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートからの１，３−ブタジエンの生産のためのものである。
【００６９】
さらなる好ましい態様において、３−ヒドロキシカルボキシレートの対応する３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの酵素的変換は、ＡＭＰ−依存性シンテターゼおよびリガーゼ、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５において示されているアミノ酸配列を示すシュードモナス・プチダのＡＭＰ−依存性シンテターゼおよびリガーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ受け入れ番号Ａ５Ｗ２Ｋ０も参照）の使用により達成されることができる。当然、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５において示されているようなアミノ酸配列を有する酵素だけでなく、ＡＭＰ−依存性シンテターゼおよびリガーゼの活性を示す関連する配列を有する酵素を使用することも可能である。従って、ある好ましい態様において、本発明に従う方法は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５において示されているアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に少なくともｘ％（ｘは、２５〜１００の整数、好ましくは３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）同一であり、ＡＭＰ−依存性シンテターゼおよびリガーゼの活性を示し、かつ本明細書において上記で記載されたように３−ヒドロキシカルボキシレートを３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートに変換することができる配列を含むＡＭＰ−依存性シンテターゼおよびリガーゼを利用する。
【００７０】
添付された実施例は、この酵素が、例えば３−ヒドロキシプロピオネートおよびＡＴＰ、３−ヒドロキシバレレートおよびＡＴＰ、３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートおよびＡＴＰ、３−ヒドロキシイソバレレートおよびＡＴＰ、ならびに３−ヒドロキシブチレートおよびＡＴＰを、対応する３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートに変換することができることを実証している。
【００７１】
さらなる好ましい態様において、３−ヒドロキシカルボキシレートの対応する３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの酵素的変換は、中鎖脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６において示されているアミノ酸配列を示すシュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）の中鎖脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ（van Beilen et al., Mol. Biol. 6 (1992), 3121-3136およびＵｎｉｐｒｏｔ受け入れ番号Ｑ００５９４も参照）の使用により達成されることができる。当然、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６において示されているようなアミノ酸配列を有する酵素だけでなく、中鎖脂肪酸−ＣｏＡリガーゼの活性を示す関連する配列を有する酵素を使用することも可能である。従って、ある好ましい態様において、本発明に従う方法は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６において示されているアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に少なくともｘ％（ｘは、２５〜１００の整数、好ましくは３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）同一であり、中鎖脂肪酸−ＣｏＡリガーゼの活性を示し、かつ本明細書において上記で記載されたように３−ヒドロキシカルボキシレートを３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートに変換することができる配列を含む中鎖脂肪酸−ＣｏＡリガーゼを利用する。
【００７２】
添付された実施例は、この酵素が、例えば３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートおよびＡＴＰを、対応する３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートに変換することができることを実証している。
【００７３】
別の好ましい態様において、本発明に従う方法は、上記で言及されたアデニレート形成酵素のクラスＩＩに属する酵素を用いる。このクラスは、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを含む。このクラスに属する酵素は、ＥＣ６．１．１として分類される(Woese et al., Microbiology and Molecular Biology Reviews, 64 (2000), 202-236)。
【００７４】
別の好ましい態様において、本発明に従う方法は、上記で言及されたアデニレート形成酵素のクラスＩＩＩに属する酵素を用いる。このクラスは、ＮＲＰＳ非依存性シデロフォア（ＮＩＳ）アデニル化酵素(Challis, Chem. Bio. Chem, 6 (2005), 601-611)を含む。
【００７５】
本発明に従う方法の別の態様において、“カルボン酸レダクターゼ（ＣＡＲ）”として分類される酵素が、３−ヒドロキシカルボキシレートの３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの変換のために用いられる。
【００７６】
用語“カルボン酸レダクターゼ”は、以下の反応：
脂肪酸  ＋  ＡＴＰ  ＋  ＮＡＤＰＨ  →  脂肪アルデヒド  ＋  ＡＭＰ  ＋  ジホスフェート  ＋  ＮＡＤＰ＋
を触媒することができる酵素を意味することが理解されている。
【００７７】
これらの酵素の一般的な機能は、例えばAkhtar et al. (PNAS 110 (2013), 87-92)において記載されている。これらの酵素は、異なるデータベースにおいて参照される以下の共通の構造的特徴を、上記で言及されたアデニレート形成酵素と共有している：
１．ＩｎｔｅｒＰｒｏデータベース（ＩｎｔｅｒＰｒｏ４４．０；２０１３年９月２５日公開）
ＩＰＲ０２０８４５、ＡＭＰ結合、保存された部位
(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR020845)
ＩＰＲ０００８７３(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR000873)
２．Ｐｒｏｓｉｔｅ
ＰＳ００４５５(http://prosite.expasy.org/PS00455)
説明：推定上のＡＭＰ結合ドメイン署名。
【００７８】
パターン：［ＬＩＶＭＦＹ］−｛Ｅ｝−｛ＶＥＳ｝−［ＳＴＧ］−［ＳＴＡＧ］−Ｇ−［ＳＴ］−［ＳＴＥＩ］−［ＳＧ］−ｘ−［ＰＡＳＬＩＶＭ］−［ＫＲ］。
（登録名ＡＭＰ＿ＢＩＮＤＩＮＧ；受け入れ番号ＰＳ００４５５；登録型ＰＡＴＴＥＲＮ；日付１９９１年５月（作製）；２００４年１２月（データの更新）；２０１３年１０月（情報の更新）。パターン［ＬＩＶＭＦＹ］−｛Ｅ｝−｛ＶＥＳ｝−［ＳＴＧ］−［ＳＴＡＧ］−Ｇ−［ＳＴ］−［ＳＴＥＩ］−［ＳＧ］−ｘ−［ＰＡＳＬＩＶＭ］−［ＫＲ］）
３．Ｐｆａｍ
Ｐｆａｍデータベースにおけるこれらの酵素に関する受け入れ番号は、ＰＦ００５０１である。
【００７９】
さらに、ＣＡＲ酵素は、それらが第１段階においてアデニレート形成酵素を特性付ける反応を触媒する、すなわち、それらはそうでなければ非反応性の脂肪酸のカルボン酸を、通常のヒドロキシル脱離基をアデノシンモノホスフェートに変換することにより、活性化するため、アデニレート形成酵素として分類されることができる。特に、ＣＡＲ酵素により触媒される反応は、次のスキームに従う反応全体を触媒する：
脂肪酸  ＋  ＡＴＰ  ＋  ＮＡＤＰＨ  →  脂肪−アシル−アデニレート  ＋  ＰＰｉ  ＋  ＮＡＤＰＨ  →  脂肪アルデヒド  ＋  ＡＭＰ  ＋  Ｐｉ  ＋  ＮＡＤＰ＋
ある好ましい態様において、カルボン酸レダクターゼは、ＥＣ１．２．９９．６に分類されている酵素である。別の好ましい態様において、ＮＡＤＰＨ依存性カルボン酸レダクターゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７において示されているアミノ酸配列を示すノカルジア・イオウェンシス（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｉｏｗｅｎｓｉｓ）からのカルボン酸レダクターゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ６ＲＫＢ１；Venkitasubramanian et al., Enzyme and Microbial Technology 42 (2008), 130-137）である。当然、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７において示されているようなアミノ酸配列を有する酵素だけでなく、ＮＡＤＰＨ依存性カルボン酸レダクターゼの活性を示す関連する配列を有する酵素を使用することも可能である。従って、ある好ましい態様において、本発明に従う方法は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７において示されているアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に少なくともｘ％（ｘは、２５〜１００の整数、好ましくは３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）同一であり、ＮＡＤＰＨ依存性カルボン酸レダクターゼの活性を示し、かつ本明細書において上記で記載されたように３−ヒドロキシカルボキシレートをアルケンに変換することができる配列を含むＮＡＤＰＨ依存性カルボン酸レダクターゼを利用する。
【００８０】
実施例は、ノカルジア・イオウェンシスからのＮＡＤＰＨ依存性カルボン酸レダクターゼの、３−ヒドロキシブチレートからのプロピレンの、３−ヒドロキシバレレートからの１−ブテンの、および３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートからの１，３−ブタジエンの生産における使用を示す。従って、好ましい態様において、本発明に従う方法は、３−ヒドロキシブチレートからのプロピレンの、３−ヒドロキシバレレートからの１−ブテンの、または３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートからの１，３−ブタジエンの生産のためのものであり、用いられる酵素は、下記でさらに記載されるようなＯｌｅＣタンパク質、最も好ましくはシュワネラ・アマゾネンシスからのＯｌｅＣタンパク質との組み合わせでの、カルボン酸レダクターゼ、特にＮＡＤＰＨ依存性カルボン酸レダクターゼ、最も好ましくは上記のようなノカルジア・イオウェンシスからの酵素である。
【００８１】
上記で言及されたように、式ＩＩにおいて示されているようなあらゆる補助基質が、本発明に従う方法において用いられることができる。Ｚがアデニン、特に補助基質ＡＴＰまたはＡＤＰである補助基質が、好ましい。しかし、他の態様において、補助基質は、Ｚが別のヌクレオ塩基、例えばグアニン、チミン、シトシン、ウラシルまたはヒポキサンチンである補助基質であることが、十分に可能である。Tanaka et al (Eur. J. Biochem. 98 (1979), 165-172)において、そしてAlber et al. (J. Bacteriol. 190 (2007), 1383-1389)において、アデニレート形成酵素は、ＡＴＰの他に、他の補助基質、例えばＡＤＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＩＴＰを用いることもできることが、報告されている。
【００８２】
上記のように、得られた３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートは、本発明の方法に従って、対応するアルケンにさらに変換される。この変換は、二酸化炭素の脱離、すなわち、ヌクレオチド部分およびＣＯ２が遊離状態になる脱カルボキシル反応により達成される。この反応の一般的なスキームが、図４Ａにおいて示されている。
【００８３】
特に、３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートの対応するアルケンへの変換は、酵素的脱カルボキシルにより達成され、すなわち、その脱カルボキシルは、酵素を用いることにより達成される。好ましい態様において、３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートは、３−ヒドロキシカルボキシル−アデニレートである。対応する反応スキームが、図５において示されている。
【００８４】
適切な酵素は、特に、一般にＯｌｅＣタンパク質と呼ばれる酵素である。
ある好ましい態様において、本発明に従う方法の第１段階、すなわち、３−ヒドロキシカルボキシレートの３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの変換において用いられる酵素は、本発明に従う方法の第２段階、すなわち、３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートの対応するアルケンへの変換において用いられる酵素とは異なる。特に、ある好ましい態様において、本発明に従う方法の第１段階、すなわち、３−ヒドロキシカルボキシレートの３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの変換において用いられる酵素は、本明細書において下記で定義されるようなＯｌｅＣタンパク質ではない。
【００８５】
３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートの対応するアルケンへの変換は、３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートのアルケンへの直接的な変換により達成されることができる。代替の方法では、３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートがまず３−ヒドロキシヌクレオチジル−カルボキシレートに変換され、次いでそれがさらに対応するアルケンに変換されることも可能である（図４Ｂ参照）。特にＯｌｅＣタンパク質はおそらく、カルボキシル−ヌクレオチジレートがまずヌクレオチジル−カルボキシレートに変換された後さらに変換される反応を触媒していることが、Janice Alina Frias(2011;米国ミネソタ大学)の博士論文において記載されていた。
【００８６】
従って、好ましい態様において、本発明に従う方法の第２段階において用いられる酵素は、ＯｌｅＣタンパク質である。ＯｌｅＣタンパク質は、ＡＭＰ依存性リガーゼ／シンターゼスーパーファミリーのメンバーであり（ＬｕｘＥ；アシル−アデニレート／チオエステル形成、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ様(Sukovich et al., Appl. Environ. Microbiol. 76 (2010), 3850-3862)）、ポリオレフィン性炭化水素の生合成に関わっていることが知られている(Frias et al., Acta Cryst. F6 (2010), 1108-1110)。ポリオレフィン性炭化水素は、ｏｌｅという名称の遺伝子、特にｏｌｅ  ＡＢＣＤ遺伝子クラスターに依存するヘッドトゥーヘッド脂肪酸縮合生合成経路（オレフィン生合成）の産物であることが示された(Sukovich et al., Appl. Environ. Microbiol. 76 (2010), 3842-3849およびSukovich et al., Appl. Environ. Microbiol. 76 (2010), 3850-3862)。ｏｌｅＡＢＣＤにより触媒される反応の一般的なスキームが、図２９において示されている。WangおよびLu(frontiers in Bioengineering and Biotechnology 1 (2013);論文10)は、脂肪酸誘導体のクライゼン縮合がＯｌｅＡにより触媒されてβ−ケト酸を生成し、それは自発的に脱カルボキシルしてケトンを生成することができることを、記載している。ＯｌｅＣは、ＯｌｅＡにより生成されたβ−ケト酸中間体を用いたさらなる反応に関わっている(Frias et al., J. Biol. Chem. 286 (2011) 10930-10938; Sukovich et al., Appl. Environ. Microbiol. 76 (2010), 3842-3849)。
【００８７】
従って、用語“ＯｌｅＣタンパク質”は、本明細書で用いられる際、ＡＭＰ依存性リガーゼ／シンターゼを指す。より好ましくは、それは、ＬｕｘＥ／ＡＭＰリガーゼファミリーに割り当てられることができるＡＭＰ依存性リガーゼ／シンターゼを指す。ＬｕｘＥ／ＡＭＰリガーゼファミリーへの割り当ては、一般にそのタンパク質の構造的特徴、例えばそのより大きいＮ末端ドメイン配列に基づく。
【００８８】
ＯｌｅＣタンパク質は、それらがＡＭＰ結合ドメインを有するという特徴により構造的に特性付けられる。好ましくは、ＯｌｅＣタンパク質は、以下のデータベース項目のいずれかにおいて定義されるようなＡＭＰ結合ドメインを示す：
１．ＩｎｔｅｒＰｒｏデータベース（ＩｎｔｅｒＰｒｏ４４．０；２０１３年９月２５日公開）
ＩＰＲ０２０８４５、ＡＭＰ結合、保存された部位
(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR020845)
ＩＰＲ０００８７３(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR000873)
２．Ｐｒｏｓｉｔｅ
ＰＳ００４５５(http://prosite.expasy.org/PS00455)
説明：推定上のＡＭＰ結合ドメイン署名。
【００８９】
パターン：［ＬＩＶＭＦＹ］−｛Ｅ｝−｛ＶＥＳ｝−［ＳＴＧ］−［ＳＴＡＧ］−Ｇ−［ＳＴ］−［ＳＴＥＩ］−［ＳＧ］−ｘ−［ＰＡＳＬＩＶＭ］−［ＫＲ］。
（登録名ＡＭＰ＿ＢＩＮＤＩＮＧ；受け入れ番号ＰＳ００４５５；登録型ＰＡＴＴＥＲＮ；日付１９９１年５月（作製）；２００４年１２月（データの更新）；２０１３年１０月（情報の更新）。パターン［ＬＩＶＭＦＹ］−｛Ｅ｝−｛ＶＥＳ｝−［ＳＴＧ］−［ＳＴＡＧ］−Ｇ−［ＳＴ］−［ＳＴＥＩ］−［ＳＧ］−ｘ−［ＰＡＳＬＩＶＭ］−［ＫＲ］）
３．Ｐｆａｍ
Ｐｆａｍデータベースにおけるこれらの酵素に関する受け入れ番号は、ＰＦ００５０１である。
【００９０】
さらに、用語“ＯｌｅＣタンパク質”は、ｏｌｅ  ＡＢＣＤ遺伝子クラスター／オペロンによりコードされているタンパク質を指す。
機能的に、ＯｌｅＣタンパク質は、それが上記のようなポリオレフィン性炭化水素生合成に、特に長鎖オレフィンのアルキル−ＣｏＡからの生合成に関わっていることを特徴とする（図２９参照）。
【００９１】
好ましくは、ＯｌｅＣタンパク質は、シュワネラ、シクロモナス（Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ）、ステノトロホモナス、ザントモナスおよびクロロフレクサスからなる群から選択される属に属する生物に、より好ましくはシュワネラ・アマゾネンシス、シュワネラ・ロイヒカ、ステノトロホモナス・マルトフィリア、ザントモナス・カンペストリスおよびクロロフレクサス・オウランティアカスからなる群から選択される種に属する生物に由来するタンパク質である。さらにもっと好ましくは、その生物は、シュワネラ・アマゾネンシス（株ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１０９８／ＳＢ２Ｂ）、シュワネラ・ロイヒカ（株ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１０８８／ＰＶ−４）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（株Ｒ５５１−３）、ザントモナス・カンペストリス・パソバー・カンペストリス（株ＡＴＣＣ  ３３９１３／ＮＣＰＰＢ  ５２８／ＬＭＧ５６８）またはクロロフレクサス・オウランティアカス（株ＡＴＣＣ  ２９３６４／ＤＳＭ  ６３７／Ｙ−４−ｆｌ）である。特に好ましい態様において、その酵素は、その配列がＵｎｉｐｒｏｔ  Ａ１Ｓ４Ｔ５、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ａ３ＱＤＮ４、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｂ４ＳＳＪ３、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ８ＰＤＷ６およびＵｎｉｐｒｏｔ  Ｂ９ＬＥＩ２において示されているＯｌｅＣ酵素である。
【００９２】
好ましい態様において、３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートの対応するアルケンへの酵素的変換は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８において示されているアミノ酸配列を示すシュワネラ・アマゾネンシスのＯｌｅＣタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ受け入れ番号Ａ１Ｓ４Ｔ５も参照）の使用により達成されることができる。当然、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８において示されているようなアミノ酸配列を有する酵素だけでなく、ＯｌｅＣタンパク質の活性を示す関連する配列を有する酵素を使用することも可能である。従って、ある好ましい態様において、本発明に従う方法は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８において示されているアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に少なくともｘ％（ｘは、３０〜１００の整数、好ましくは３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）同一であり、ＯｌｅＣタンパク質の活性を示し、かつ本明細書において上記で記載されたように３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートをアルケンに変換することができる配列を含むＯｌｅＣタンパク質を利用する。
【００９３】
さらなる好ましい態様において、３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートの対応するアルケンへの酵素的変換は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９において示されているアミノ酸配列を示すシュワネラ・ロイヒカのＯｌｅＣタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ受け入れ番号Ａ３ＱＤＮ４も参照）の使用により達成されることができる。当然、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９において示されているようなアミノ酸配列を有する酵素だけでなく、ＯｌｅＣタンパク質の活性を示す関連する配列を有する酵素を使用することも可能である。従って、ある好ましい態様において、本発明に従う方法は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９において示されているアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に少なくともｘ％（ｘは、３０〜１００の整数、好ましくは３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）同一であり、ＯｌｅＣタンパク質の活性を示し、かつ本明細書において上記で記載されたように３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートをアルケンに変換することができる配列を含むＯｌｅＣタンパク質を利用する。
【００９４】
さらなる好ましい態様において、３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートの対応するアルケンへの酵素的変換は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０において示されているアミノ酸配列を示すステノトロホモナス・マルトフィリアのＯｌｅＣタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ受け入れ番号Ｂ４ＳＳＪ３も参照）の使用により達成されることができる。当然、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０において示されているようなアミノ酸配列を有する酵素だけでなく、ＯｌｅＣタンパク質の活性を示す関連する配列を有する酵素を使用することも可能である。従って、ある好ましい態様において、本発明に従う方法は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０において示されているアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に少なくともｘ％（ｘは、３０〜１００の整数、好ましくは３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）同一であり、ＯｌｅＣタンパク質の活性を示し、かつ本明細書において上記で記載されたように３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートをアルケンに変換することができる配列を含むＯｌｅＣタンパク質を利用する。
【００９５】
さらなる好ましい態様において、３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートの対応するアルケンへの酵素的変換は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１において示されているアミノ酸配列を示すザントモナス・カンペストリスのＯｌｅＣタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ受け入れ番号Ｑ８ＰＤＷ６も参照）の使用により達成されることができる。当然、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１において示されているようなアミノ酸配列を有する酵素だけでなく、ＯｌｅＣタンパク質の活性を示す関連する配列を有する酵素を使用することも可能である。従って、ある好ましい態様において、本発明に従う方法は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１において示されているアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に少なくともｘ％（ｘは、３０〜１００の整数、好ましくは３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）同一であり、ＯｌｅＣタンパク質の活性を示し、かつ本明細書において上記で記載されたように３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートをアルケンに変換することができる配列を含むＯｌｅＣタンパク質を利用する。
【００９６】
さらなる好ましい態様において、３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートの対応するアルケンへの酵素的変換は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２において示されているアミノ酸配列を示すクロロフレクサス・オウランティアカスのＯｌｅＣタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ受け入れ番号Ｂ９ＬＥＩ２も参照）の使用により達成されることができる。当然、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２において示されているようなアミノ酸配列を有する酵素だけでなく、ＯｌｅＣタンパク質の活性を示す関連する配列を有する酵素を使用することも可能である。従って、ある好ましい態様において、本発明に従う方法は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２において示されているアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に少なくともｘ％（ｘは、３０〜１００の整数、好ましくは３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）同一であり、ＯｌｅＣタンパク質の活性を示し、かつ本明細書において上記で記載されたように３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートをアルケンに変換することができる配列を含むＯｌｅＣタンパク質を利用する。
【００９７】
ある好ましい態様において、本発明に従う方法は、イソブテンの生産のための方法であり、３−ヒドロキシカルボキシレートは、３−ヒドロキシ−３−メチルブチレート（３−ヒドロキシイソバレレート）である。変換全体に関する一般的な反応スキームが、図６Ａにおいて示されている。好ましい態様において、３−ヒドロキシ−３−メチルブチレートの対応する３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの変換は、ＡＴＰまたはＡＤＰを補助基質として用いることにより実施され、結果として生じる３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートは、３−ヒドロキシ−３−メチルブチリル−アデニレート（３−ヒドロキシイソバレリル−アデニレート）である。対応する反応スキームが、図６ＢおよびＣにおいてそれぞれ示されている。
【００９８】
別の好ましい態様において、本発明に従う方法は、プロピレンの生産のための方法であり、３−ヒドロキシカルボキシレートは、３−ヒドロキシブチレートである。変換全体に関する一般的な反応スキームが、図７Ａにおいて示されている。好ましい態様において、３−ヒドロキシブチレートの対応する３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの変換は、ＡＴＰまたはＡＤＰを補助基質として用いることにより実施され、結果として生じる３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートは、３−ヒドロキシブチリル−アデニレートである。対応する反応スキームが、図７ＢおよびＣにおいてそれぞれ示されている。
【００９９】
別の好ましい態様において、本発明に従う方法は、１，３−ブタジエンの生産のための方法であり、３−ヒドロキシカルボキシレートは、３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートである。変換全体に関する一般的な反応スキームが、図８Ａにおいて示されている。好ましい態様において、３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートの対応する３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの変換は、ＡＴＰまたはＡＤＰを補助基質として用いることにより実施され、結果として生じる３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートは、３−ヒドロキシペンタ−４−エノイル−アデニレートである。対応する反応スキームが、図８ＢおよびＣにおいてそれぞれ示されている。
【０１００】
本発明に従うプロセスにおいて用いられる酵素は、天然に存在する酵素であることができ、またはそれは、例えば、例えば酵素活性、安定性等を変化させる、または向上させる変異または他の変更の導入により天然に存在する酵素から派生した酵素であることもできる（より詳細な記載に関して、さらに下記も参照）。
【０１０１】
本発明が、上記のような３−ヒドロキシカルボキシレートの３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの変換のために用いられるべきアデニレート形成酵素に言及する場合、そのようなアデニレート形成酵素への言及は、上記のような３−ヒドロキシカルボキシレートの３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの変換を触媒することができるが、それらの天然の基質に対して低い親和性しか有しない、またはもはやそれらの天然の基質を受け入れない、そのようなアデニレート形成酵素から派生した酵素も含む。
【０１０２】
本発明が、上記のような３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートの対応するアルケンへの変換のために用いられるべき特定の酵素に言及する場合、そのような酵素への言及は、上記のような３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートの対応するアルケンへの変換を触媒することができるが、それらの天然の基質に対して低い親和性しか有しない、またはもはやそれらの天然の基質を受け入れない、そのような酵素から派生した酵素も含む。
【０１０３】
本発明に従う方法において用いられるべき酵素の好ましい基質のそのような改変は、本発明に従う方法の反応のそれぞれの基質の変換を向上させること、および酵素のそれらの天然の基質（単数または複数）への作用による望ましくない副産物（単数または複数）の生成を低減することを可能にする。タンパク質の望ましい酵素活性を改変する、および／または向上させるための方法は、当業者には周知であり、例えばランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発およびそれに続く望ましい特性を有する酵素の選択、またはいわゆる“指向性進化”のアプローチを含む。
【０１０４】
例えば、原核細胞における遺伝子工学に関して、酵素をコードする核酸分子は、変異誘発またはＤＮＡ配列の組み換えによる配列の改変を可能にするプラスミド中に導入されることができる。標準的な方法（Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, 米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照）が、塩基交換が実施されること、または天然もしくは合成配列が追加されることを可能にする。ＤＮＡ断片は、アダプターおよびリンカーをその断片に適用することにより、互いに連結されることができる。さらに、適切な制限部位を提供する、または余分なＤＮＡもしくは制限部位を除去する工学的手段が、用いられることができる。挿入、欠失または置換が可能である場合、インビトロ変異誘発、“プライマー修復”、制限またはライゲーションが、用いられることができる。一般に、配列分析、制限分析ならびに生化学および分子生物学の他の方法が、分析法として実施される。次いで、結果として得られた酵素バリアントは、それらの酵素活性に関して、特に、本発明に従う方法の状況において用いられることができる異なる酵素の記載と関連して上記で記載されたように、それらの天然の基質（単数または複数）ではなく、本発明に従う方法のそれぞれの反応において示されているような基質を基質として変換するそれらの能力に関して、試験される。本発明に従う方法の反応と関連して示されたような反応を触媒する酵素の能力を測定するためのアッセイが、実施例において記載されている。
【０１０５】
その天然の基質に対して低い親和性を有する、またはその天然の基質をもはや受け入れない酵素の改変版は、天然に存在する酵素から、または既に改変された、最適化された、もしくは合成的に生成された酵素から派生することができる。
【０１０６】
本発明に従うプロセスにおいて用いられる酵素は、そのタンパク質の天然版、または合成タンパク質、ならびに化学的に合成された、もしくは生物学的系において、もしくは組み換えプロセスにより生成されたタンパク質であることができる。その酵素は、その／それらの例えば温度に対する安定性、耐性を向上させるために、その精製またはその支持体上での固定化を容易にするために、化学修飾されることもできる。その酵素は、単離された形態、精製された形態で、固定化された形態で、その酵素を合成している細胞から得られた粗製のまたは部分的に精製された抽出物として、化学合成された酵素として、組み換えで生成された酵素として、それらを産生している微生物の形態で、等で用いられることができる。従って、本発明で用いられる酵素は、天然または合成的なものであることができ、化学的、生物学的または遺伝学的手段により生成されることができる。それは、例えばその活性、耐性、特異性、精製を向上させるために、またはそれを支持体上に固定化するために、化学修飾されることもできる。
【０１０７】
本発明に従う方法において、一方に３−ヒドロキシカルボキシレートの３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの変換を達成するために必要とされるアデニレート形成酵素の触媒ドメインを含有し、他方にＯｌｅＣタンパク質を含有する融合タンパク質を用いることも、考えられる。
【０１０８】
本発明に従う方法は、インビトロまたはインビボで実施されることができる。インビトロの反応は、細胞が用いられない反応、すなわち無細胞反応であることが理解されている。従って、インビトロは、好ましくは無細胞系におけることを意味する。用語“インビトロ”は、一態様において、単離された酵素（または場合によりおそらく必要とされる補因子を含む酵素系）の存在下を意味する。一態様において、その方法において用いられる酵素は、精製された形態で用いられる。別の態様において、その方法において用いられる酵素は、タンパク質精製コストを節約するために、その反応中に、精製されていない抽出物として、または未溶解の細菌の形態で存在する。
【０１０９】
プロセスをインビトロで実施するため、反応のための基質および酵素は、その酵素が活性であり、酵素的変換が起こることを可能にする条件（緩衝剤、温度、補助基質、補因子等）の下でインキュベートされる。反応は、対応するアルケンを生成するために十分な時間の間進行させられる。アルケンの生成は、当該技術で既知の方法、例えば、おそらく質量分析検出または炎イオン化検出（ＦＩＤ）に連結されたガスクロマトグラフィーにより測定されることができる。
【０１１０】
酵素は、酵素反応が起こることを可能にするあらゆる適切な形態であることができる。それらは、精製される、もしくは部分的に精製されることができ、または粗製の細胞抽出物もしくは部分的に精製された抽出物の形態であることができる。酵素が適切なキャリヤー上に固定化されていることも、可能である。
【０１１１】
本発明に従うインビトロの方法は、ワンポット反応で実施されることができ、すなわち、基質は、１つの反応混合物中で、対応するアルケンへの変換に必要な上記の酵素と組み合わせられ、アルケンを生成するために十分な時間の間反応が進行することが可能にされる。あるいは、その方法は、異なる段階を連続する様式で達成することにより、すなわち、まず３−ヒドロキシカルボキシレートを１種類以上の酵素と混合し、反応を３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへと進行させ、次いで１種類以上のさらなる酵素を添加して３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートをさらに対応するアルケンに変換することにより実施されることもできる。
【０１１２】
生成されたアルケンの回収は、１工程または多工程を含むことができる。例えば、アルケンは、標準的な技法、例えば吸着／脱着、ガスストリッピング、分画を用いて回収されることができる。生成されたアルケンのＣＯ２からの分離は、ＣＯ２の低温での凝縮により達成されることができる。ＣＯ２は、極性溶媒、例えばエタノールアミンにより除去されることもできる。
【０１１３】
別の態様において、本発明に従う方法は、培養物中で、３−ヒドロキシカルボキシレートを３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートに変換することができる上記の酵素を産生し、さらに本明細書で上記で記載されたように３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートを対応するアルケンに変換するために必要な酵素も産生する生物、好ましくは微生物の存在下で実施される。そのような生物または微生物も、本発明の対象である。
【０１１４】
必要とされる酵素活性の１つを天然に発現する（微）生物が用いられる場合、そのような（微）生物を、この活性がその（微）生物中で過剰発現されるように改変することが可能である。これは、例えば、対応する遺伝子のプロモーター領域において、その遺伝子のより高い発現を確実にするプロモーターをもたらすように、変異をもたらすことにより、達成されることができる。あるいは、その遺伝子自体を、より高い活性を示す酵素をもたらすように変異誘発することも、可能である。３−ヒドロキシカルボキシレートを３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートに変換するために必要である酵素を発現し、さらに本明細書で上記で記載されたように３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートを対応するアルケンに変換するために必要な酵素も産生する（微）生物を用いることにより、酵素を分離または精製する必要なく、本発明に従う方法を培地中で直接実施することが可能である。
【０１１５】
しかし、本発明は、好ましくは、上記のような酵素をそれらが天然に存在するレベルで発現している天然にあるままの天然存在微生物を除外する。代わりに、本発明の、本発明の方法において用いられる微生物は、好ましくは、それがそのゲノム中に通常は存在しない本発明の外因性の酵素を発現する（過剰発現を含む）ように遺伝子改変されていようと、またはそれが外因性の酵素を過剰発現するように操作されていようと、非天然存在微生物である。
【０１１６】
従って、本発明と関連して用いられる酵素および（微）生物は、好ましくは非天然存在酵素または（微生物）であり、すなわち、それらは、天然に存在する酵素または微生物とは有意に異なり、天然に存在しない酵素または微生物である。その酵素に関して、それらは好ましくは、それ自体は天然に存在しない天然存在酵素のバリアントである。そのようなバリアントは、例えば、向上した特性、例えばより高い酵素活性、より高い基質特異性、より高い温度耐性等を示す変異体、特に分子生物学的方法により調製された変異体を含む。その（微）生物に関して、それらは、好ましくは、遺伝子改変により天然存在生物と異なる本明細書において上記で記載されたような遺伝子改変生物である。遺伝子改変生物は、天然に存在しない、すなわち天然において見付けられることができない、外来核酸分子の導入により天然存在生物と実質的に異なる生物である。
【０１１７】
本明細書において上記で記載されたような外因性または内因性の酵素を過剰発現することにより、その酵素の濃度は、天然において見られる濃度よりも実質的に高く、従ってそれは、それぞれの酵素に関する非天然型を用いる本発明の反応を予想外に押し進めることができる。好ましくは、過剰発現された酵素の濃度は、総宿主細胞タンパク質の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％または４０％である。
【０１１８】
“非天然”基質は、たとえそれが実際にその微生物中でその内因性の酵素と共に同時に存在している可能性があるとしても、天然におけるそれぞれの酵素により作用されない分子であることが、理解されている。この“非天然”基質は、他の基質（例えば“天然基質”）が好まれるため、天然ではその微生物により変換されない。従って、本発明は、非天然基質を天然には見られない環境において上記の酵素と共に利用することを意図している。
【０１１９】
一態様において、本発明に従う、または本発明に従う方法において用いられる（微）生物は、３−ヒドロキシカルボキシレートの３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの変換と関連して上記で記載されたような酵素の１種類以上をコードする１個以上の外来核酸分子を含有するように遺伝子改変されており、さらに本明細書において上記で記載されたような３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートを対応するアルケンに変換するために必要な酵素も産生する生物、好ましくは微生物である。この文脈における用語“外来の”または“外因性の”は、その核酸分子が、前記の生物／微生物中に天然に存在しないことを意味する。これは、それがその生物／微生物において同じ構造においても同じ位置にも存在しないことを意味する。ある好ましい態様において、外来核酸分子は、プロモーターおよびそれぞれの酵素をコードするコード配列を含む組み換え分子であり、ここで、コード配列の発現を駆動するプロモーターは、コード配列に関して異種性である。この文脈における異種性は、そのプロモーターが、前記のコード配列の発現を天然に駆動しているプロモーターではなく、異なるコード配列の発現を天然に駆動しているプロモーターである、すなわち、それが別の遺伝子に由来する、または合成プロモーターもしくはキメラプロモーターであることを意味する。好ましくは、そのプロモーターは、その生物／微生物に対して異種性のプロモーター、すなわち、それぞれの生物／微生物中に天然に存在しないプロモーターである。さらにもっと好ましくは、そのプロモーターは、誘導可能なプロモーターである。異なるタイプの生物において、特に微生物において発現を駆動するためのプロモーターは、当業者に周知である。
【０１２０】
さらなる態様において、核酸分子は、コードされる酵素がその生物／微生物に対して内因性ではない、すなわちそれが遺伝子改変されていない場合にその生物／微生物により天然に発現されない点で、その生物／微生物に対して外来性である。換言すると、コードされる酵素は、その生物／微生物に関して異種性である。外来核酸分子は、その生物／微生物中に、染色体外の形態で、例えばプラスミドとして存在することができ、または染色体中に安定に組み込まれることもできる。安定な組み込みが好ましい。従って、遺伝子改変は、例えば、酵素（単数または複数）をコードする対応する遺伝子（単数または複数）を染色体中に組み込むこと、または酵素（単数または複数）をその酵素をコードする配列の上流にプロモーターを含有するプラスミドから発現させること（そのプロモーターおよびコード配列は、好ましくは異なる生物に由来する）、または当業者に既知のあらゆる他の方法にあることができる。
【０１２１】
本発明において用いられる生物は、原核生物または真核生物であることができ、好ましくは、それらは、微生物、例えば細菌、酵母、真菌もしくはカビ、または植物細胞もしくは動物細胞である。特定の態様において、微生物は、細菌、好ましくはエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アルカリゲネスまたはバチルス属の細菌、さらにもっと好ましくは大腸菌、アルカリゲネス・ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）またはバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）種の細菌である。
【０１２２】
さらなる好ましい態様において、微生物は、真菌、より好ましくはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）またはクルイウェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属の真菌、さらにもっと好ましくは出芽酵母、分裂酵母、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）種の真菌、またはクルイウェロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）種の真菌である。
【０１２３】
別の好ましい態様において、本発明に従う方法は、３−ヒドロキシカルボキシレートの３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの変換を触媒することができる酵素を発現し、本明細書で上記で記載されたような３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートの対応するアルケンへの変換を触媒することができる酵素も産生する光合成微生物を利用する。好ましくは、その微生物は、光合成細菌または微少藻類である。さらなる態様において、その微生物は、藻類、より好ましくは珪藻類に属する藻類である。
【０１２４】
本発明に従う方法において、上記のような３−ヒドロキシカルボキシレートの３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの変換を触媒する酵素を産生するある微生物および上記のような３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートの対応するアルケンへの変換を触媒する酵素を産生する別の微生物を用いることも、考えられる。
【０１２５】
別の好ましい態様において、本発明に従う方法は、３−ヒドロキシカルボキシレートの３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの変換を触媒することができ、本明細書で上記で記載されたような３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートの対応するアルケンへの変換を触媒することができる酵素も産生する多細胞生物を利用する。そのような生物に関する例は、植物または動物である。
【０１２６】
本発明は、本発明に従う方法と関連して本明細書において上記で記載されたような（微）生物にも関する。
特に好ましい態様において、その方法は、微生物を標準的な培養条件（１気圧において３０〜３７℃、細菌の好気性増殖を可能にする発酵槽中）または標準的ではない条件（例えば好熱性生物の培養条件に対応するためのより高い温度）で培養することを含む。
【０１２７】
一態様において、本発明に従う方法は、中温性であり、約３０℃〜３７の温度で培養されることができる生物、好ましくは微生物を用いる。
別の好ましい態様において、本発明に従う方法は、好熱性であり、より高い温度、例えば６０℃より高い温度で培養されることができる生物、好ましくは微生物を用いる。
【０１２８】
別の態様において、本発明の方法は、それぞれの酵素活性（単数または複数）を有する生物、好ましくは微生物を、（細胞）培養物の形態で、好ましくは液体細胞培養物の形態で提供する工程、その生物、好ましくは微生物を発酵槽（しばしばバイオリアクターとも呼ばれる）中で、それぞれの酵素の発現を可能にする適切な条件下で培養するその後の工程を含み、さらに、本明細書において上記で記載されたような本発明の方法の酵素的変換をもたらす工程を含む。適切な発酵槽またはバイオリアクター装置および発酵条件は、当業者には既知である。バイオリアクターまたは発酵槽は、生物学的に活性な環境を支持する当該技術で既知のあらゆる製造または設計された装置またはシステムを指す。従って、バイオリアクターまたは発酵槽は、生物、好ましくは微生物および／または生化学的に活性な物質、すなわちそのような生物に由来する上記の酵素（単数または複数）または上記の酵素（単数または複数）を有する生物を含む本発明の方法のような化学的／生化学的方法が実施される容器であることができる。バイオリアクターまたは発酵槽において、このプロセスは、好気性であることも嫌気性であることもできる。これらのバイオリアクターは、一般に円筒状であり、リットルから立方メートルまでの範囲の大きさであることができ、しばしばステンレス鋼で作られている。この点で、理論により束縛されるわけではないが、発酵槽またはバイオリアクターは、それが生物、好ましくは微生物を、例えばバッチ培養、流加バッチ培養、灌流培養またはケモスタット培養で培養するために適しているように設計されることができ、その全部が当該技術で一般的に知られている。
【０１２９】
培地は、それぞれの生物または微生物を培養するために適したあらゆる培地であることができる。
さらなる態様において、本発明の方法は、生産されたアルケンがガス状態である条件下で実施される。そのような場合、その方法は、微好気性条件下で実施されることが、さらに好ましい。これは、注入される空気の量が、アルケンを含有するガス状流出物中の残留酸素濃度を最小限にするために限られていることを意味する。
【０１３０】
別の態様において、本発明に従う方法は、さらに、反応から脱気して出るガス状アルケンを収集する工程を含む。従って、好ましい態様において、方法は、アルケンを反応の間にガス形態の下で収集するためのシステムの存在下で実施される。
【０１３１】
実際、短鎖アルケン、特にエチレン、プロピレン、ブテン異性体および１，３−ブタジエンは、室温および大気圧においてガス状態をとる。従って、本発明に従う方法は、産業的規模で実施された場合常に非常に費用がかかる工程である、液体培地からの生成物の抽出を、必要としない。ガス状炭化水素の排気および貯蔵ならびにそれらの可能なその後の物理的分離および化学変換は、当業者に既知のあらゆる方法に従って実施されることができる。
【０１３２】
特定の態様において、その方法は、ガス相中に存在するアルケン（例えばプロピレン、エチレン、イソブチレンまたは１，３−ブタジエン）を検出することも含む。空気または別のガスの環境中で生産されるべき化合物の存在は、たとえ少量であっても、様々な技法を用いることにより、特にガスクロマトグラフィーシステムを赤外もしくは炎イオン化検出と共に用いることにより、または質量分析と組み合わせることにより、検出されることができる。
【０１３３】
特定の態様において、本発明に従う方法により生産されたアルケンは、凝縮され、次いで場合により、当業者に既知の技法を用いることにより、より長鎖のアルケンまたはより長鎖のアルカンを生産するために還元される。例えば、イソブチレンは、イソオクタンを合成するために用いられることができ：この反応をうまく実施するための触媒的方法は、既に完全に記載されている。
【０１３４】
別の態様において、本発明に従う方法において用いられる生物は、植物である。原則として、あらゆる可能な植物、すなわち、単子葉植物または双子葉植物が、用いられることができる。農業的に意味のある規模で栽培されることができ、大量のバイオマスを生産することを可能にする植物を用いることが、好ましい。例は、草、例えばロリウム属（Ｌｏｌｉｕｍ）、穀草、例えばライムギ、コムギ、オオムギ、エンバク、キビ、トウモロコシ、他のデンプンを蓄えている植物、例えばジャガイモ、または糖を蓄えている植物、例えばサトウキビもしくはテンサイである。タバコの、または野菜植物、例えばトマト、コショウ、キュウリ、ナス等の使用も、考えられる。別の可能性は、油を蓄えている植物、例えばナタネ、オリーブ等の使用である。樹木、特に早生樹、例えばユーカリ、ポプラまたはゴムノキ（ヘベア・ブラジリエンシス（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ））の使用も、考えられる。
【０１３５】
本発明に従うプロセスが、インビボで、それぞれの酵素活性を提供する生物／微生物を用いることにより実施される場合、その生物、好ましくは微生物は、酵素反応が起こることを可能にする適切な培養条件下で培養される。具体的な培養条件は、用いられる特定の生物／微生物に依存するが、当業者には周知である。培養条件は、一般に、それらがそれぞれの反応に関する酵素をコードする遺伝子の発現を可能にするような様式で選択される。培養の特定の段階における特定の遺伝子の発現を向上させ、微調整するための様々な方法、例えば化学的誘導物質による、または温度シフトによる遺伝子発現の誘導が、当業者に既知である。
【０１３６】
特定の好ましい態様において、本発明に従う方法は、本発明の方法に従って変換されるべき式Ｉに従う３−ヒドロキシカルボキシレートを産生する生物、好ましくは微生物を利用することにより実施される。３−ヒドロキシアルカノエート類は、３−ヒドロキシカルボン酸類の一部であり、いくつかの生物、特に微生物、例えばバークホルデリア属(Rocha et al., World J. Microbiol. Biotechnol. 24 (2008), 427-431)、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）(Steinbuechel et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 39 (1993), 443-449)、およびバチルス属(Singh et al., Microbial Cell Factories 8 (2009), 38)の細菌により天然に産生される。従って、例えば、Steinbuechelら（上記の引用）は、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）における３−ヒドロキシブチレートの産生に関して報告している。さらに、３−ヒドロキシカルボン酸類、例えば３−ヒドロキシ酪酸につながる代謝経路は、十分に確立されている（例えば、Tokiwa and Ugwu (J. Biotechnol. 132 (2007), 264-272)およびJian et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 82 (2009), 995-1003)を参照）。それに加えて、いくつかの対応する合成経路が、既に他の生物、例えば大腸菌に導入されている（例えば、Zhao et al. (FEMS Microbiol. Lett. 218 (2003), 59-64); Madison and Huisman (Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63 (1999), 21-53); Tseng et al. (Appl. Environ. Microbiol. 75 (2009), 3137-3145)を参照）。
【０１３７】
本発明に従う方法において用いられる酵素は、天然存在酵素、または例えば、例えば酵素活性、安定性等を変化させる、もしくは向上させる変異もしくは他の変更の導入により天然に存在する酵素から派生した酵素であることができる。
【０１３８】
タンパク質の所望の酵素活性を改変する、および／または向上させるための方法は、当業者には周知であり、例えばランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発およびそれに続く所望の特性を有する酵素の選択、またはいわゆる“指向性進化”のアプローチを含む。
【０１３９】
例えば、原核細胞における遺伝子改変のために、対応する酵素をコードする核酸分子が、変異誘発またはＤＮＡ配列の組み換えによる配列の改変を可能にするプラスミド中に導入されることができる。標準的な方法（Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, 米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照）が、塩基交換が実施されること、または天然もしくは合成配列が追加されることを可能にする。ＤＮＡ断片は、その断片に相補的なアダプターおよびリンカーを用いることにより、ライゲーションされることができる。さらに、適切な制限部位を提供する、または余分なＤＮＡもしくは制限部位を除去する工学的手段が、用いられることができる。挿入、欠失または置換が可能である場合、インビトロ変異誘発、“プライマー修復”、制限またはライゲーションが、用いられることができる。一般に、配列分析、制限分析ならびに生化学および分子生物学の他の方法が、分析法として実施される。次いで、結果として得られた酵素バリアントは、所望の活性、例えば酵素活性に関して、上記のようなアッセイにより、特にそれらの増大した酵素活性に関して、試験される。
【０１４０】
上記のように、本発明の方法において用いられる、または本発明の組成物中に含有される微生物は、対応する酵素をコードする核酸分子の導入により遺伝子改変されている微生物であることができる。従って、好ましい態様において、微生物は、本発明に従う方法の変換に関して上記で記載された少なくとも１種類の酵素の増大した活性を有するように遺伝子改変されている組み換え微生物である。これは、例えば、その微生物を、対応する酵素をコードする核酸を用いて形質転換することにより達成されることができる。微生物の遺伝子改変の詳細な記載は、下記でさらに与えられるであろう。好ましくは、微生物中に導入される核酸分子は、その微生物に関して異種性／外因性である核酸分子であり、すなわち、それは前記の生物中に天然には存在しない。
【０１４１】
本発明の文脈において、“増大した活性”は、遺伝子改変された微生物における酵素の発現および／または活性が、対応する改変されていない微生物におけるよりも、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％または５０％、さらにもっと好ましくは少なくとも７０％または８０％、特に好ましくは少なくとも９０％または１００％高いことを意味する。さらにもっと好ましい態様において、発現および／または活性における増大は、少なくとも１５０％、少なくとも２００％または少なくとも５００％であることができる。特に好ましい態様において、発現は、対応する改変されていない微生物におけるよりも、少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、さらにもっと好ましくは少なくとも１０００倍高い。
【０１４２】
用語“増大した”発現／活性は、対応する改変されていない微生物が、対応する酵素を、その改変されていない微生物における対応する発現／活性がゼロであるように発現しない状況も含む。好ましくは、過剰発現された酵素の濃度は、総宿主細胞タンパク質の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、または４０％である。
【０１４３】
細胞における所与のタンパク質の発現のレベルを測定するための方法は、当業者には周知である。一態様において、発現のレベルの測定は、対応するタンパク質の量を測定することにより行われる。対応する方法は、当業者には周知であり、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ等を含む。別の態様において、発現のレベルの測定は、対応するＲＮＡの量を測定することにより行われる。対応する方法は、当業者には周知であり、例えばノーザンブロットを含む。
【０１４４】
本発明の文脈において、用語“組み換え”は、微生物が、野生型または改変されていない微生物と比較した場合に、上記で定義されたような酵素をコードする核酸分子を含有するように遺伝子改変されていることを意味する。上記で定義されたような酵素をコードする核酸分子は、単独で、またはベクターの一部として用いられることができる。
【０１４５】
核酸分子は、さらに、核酸分子中に含まれるポリヌクレオチドに作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結された発現制御配列を含むことができる。用語“作動的に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結された”または“作動可能に連結された”は、本記載全体を通して用いられる際、発現が発現制御配列と適合性の条件下で達成されるような方式での、１個以上の発現制御配列および発現されるべきポリヌクレオチド中のコード領域の間の連結を指す。
【０１４６】
発現は、異種性ＤＮＡ配列の、好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの転写を含む。真菌における、ならびに細菌における発現を確実にする調節エレメントは、当業者に周知である。それらは、プロモーター、エンハンサー、終結シグナル、標的化シグナル等を包含する。例が、ベクターに関する説明と関連して、下記でさらに与えられている。
【０１４７】
核酸分子と関連する使用のためのプロモーターは、その由来に関して、および／または発現されるべき遺伝子に関して、同種であることも異種であることもできる。適切なプロモーターは、例えば構成的発現に適しているプロモーターである。しかし、外的影響により決定される時点においてのみ活性化されるプロモーターが用いられることもできる。人工および／または化学的に誘導可能なプロモーターが、この状況において用いられることができる。
【０１４８】
ベクターは、さらにベクター中に含有される前記のポリヌクレオチドに作動可能に連結された発現制御配列を含むことができる。これらの発現制御配列は、細菌または真菌における翻訳可能なＲＮＡの転写および合成を確実にするのに適していることができる。
【０１４９】
加えて、異なる変異をポリヌクレオチド中に、分子生物学において普通の方法（例えば、Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, 米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照）により挿入することが可能であり、それは改変された生物学的特性を有する可能性のあるポリペプチドの合成をもたらす。点変異の導入が、アミノ酸配列の改変が例えばポリペプチドの生物学的活性または制御に影響を及ぼす位置において考えられる。
【０１５０】
さらに、改変された基質または生成物特異性を有する変異体が、調製されることができる。好ましくは、そのような変異体は、増大した活性を示す。あるいは、その触媒活性が基質結合活性を失うことなく消滅している変異体が、調製されることができる。
【０１５１】
さらに、上記で定義されたような酵素をコードしているポリヌクレオチド中への変異の導入は、遺伝子発現速度および／または前記のポリヌクレオチドによりコードされている酵素の活性を、低減または増大させる。
【０１５２】
細菌または真菌を遺伝子改変するため、上記で定義されたような酵素またはこれらの分子の一部をコードするポリヌクレオチドが、変異誘発またはＤＮＡ配列の組み換えによる配列改変を可能にするプラスミド中に導入されることができる。標準的な方法（例えば、Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, 米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照）は、塩基交換が実施されることを、または天然もしくは合成配列が追加されることを可能にする。ＤＮＡ断片は、アダプターおよびリンカーを断片に適用することにより、互いに連結されることができる。さらに、適切な制限部位を提供する、または余分なＤＮＡもしくは制限部位を除去する工学的手段が、用いられることができる。挿入、欠失または置換が可能である場合、インビトロ変異誘発、“プライマー修復”、制限またはライゲーションが、用いられることができる。一般に、配列分析、制限分析ならびに生化学および分子生物学の他の方法が、分析法として実施される。
【０１５３】
従って、本発明に従って、上記のポリヌクレオチド、核酸分子またはベクターを真菌または細菌中に導入することを含む、真菌または細菌の遺伝子改変により、組み換え微生物が生成されることができる。
【０１５４】
それぞれの酵素をコードするポリヌクレオチドは、上記の活性のいずれかを有するポリペプチドの産生をもたらすように、発現される。異なる発現系の概要が、例えばMethods in Enzymology 153 (1987), 385-516に、Bitter et al. (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544)に、そしてSawers et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), 1-9)、Billman-Jacobe (Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-4)、Hockney (Trends in Biotechnology 12 (1994), 456-463)、Griffiths et al., (Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427-440)に含まれている。酵母発現系の概要が、例えばHensing et al. (Antonie van Leuwenhoek 67 (1995), 261-279)、Bussineau et al. (Developments in Biological  Standardization 83 (1994), 13-19)、Gellissen et al. (Antonie van Leuwenhoek 62 (1992), 79-93)、Fleer (Current Opinion in Biotechnology 3 (1992), 486-496)、Vedvick (Current Opinion in Biotechnology 2 (1991), 742-745)およびBuckholz (Bio/Technology 9 (1991), 1067-1072)により与えられている。
【０１５５】
発現ベクターは、文献において広く記載されている。一般に、それらは、選択マーカー遺伝子および選択された宿主中での複製を確実にする複製起点だけでなく、細菌またはウイルスプロモーター、およびほとんどの場合において転写に関する終結シグナルも含有する。プロモーターおよび終結シグナルの間に、一般にコードＤＮＡ配列の挿入を可能にする少なくとも１個の制限部位またはポリリンカーが存在する。対応する遺伝子の転写を天然に制御しているＤＮＡ配列が、それが選択された宿主生物中で活性である場合、プロモーター配列として用いられることができる。しかし、この配列は、他のプロモーター配列と交換されることもできる。遺伝子の構成的発現を確実にするプロモーターおよび遺伝子の発現の計画的な制御を可能にする誘導可能なプロモーターを用いることが、可能である。これらの特性を有する細菌およびウイルスのプロモーター配列は、文献において詳細に記載されている。微生物（例えば大腸菌、出芽酵母）における発現のための制御配列は、文献において十分に記載されている。下流の配列の特に高い発現を可能にするプロモーターは、例えばＴ７プロモーター(Studier et al., Methods in Enzymology 185 (1990), 60-89)、ｌａｃＵＶ５、ｔｒｐ、ｔｒｐ−ｌａｃＵＶ５(DeBoer et al., in Rodriguez and Chamberlin (編者), Promoters, Structure and Function; Praeger, ニューヨーク, (1982), 462-481; DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), 21-25)、ｌｐ１、ｒａｃ(Boros et al., Gene 42 (1986), 97-100)である。誘導可能なプロモーターは、好ましくはポリペプチドの合成のために用いられる。これらのプロモーターは、しばしば構成的プロモーターがもたらすよりも高いポリペプチド収率をもたらす。最適な量のポリペプチドを得るため、２工程プロセスがしばしば用いられる。最初に、宿主細胞が最適条件下で比較的高い細胞密度まで培養される。第２工程において、用いられるプロモーターのタイプに応じて転写が誘導される。この点において、ｔａｃプロモーターは特に適切であり、それは、ラクトースまたはＩＰＴＧ（＝イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）により誘導されることができる(deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 21-25)。転写に関する終結シグナルも、文献において記載されている。
【０１５６】
宿主細胞の上記のようなポリヌクレオチドまたはベクターによる形質転換は、例えばSambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, 米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー；Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990において記載されているような標準的な方法により実施されることができる。宿主細胞は、特にｐＨ値、温度、塩濃度、通気、抗生物質、ビタミン類、微量元素等に関する用いられる特定の宿主細胞の要求を満たす栄養培地中で培養される。
【０１５７】
本発明は、本明細書において上記で記載されたような３−ヒドロキシカルボキシレートの３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの変換に、さらに３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートを対応するアルケンに変換するために必要な酵素を産生する生物、好ましくは微生物にも関する。従って、本発明は、特に、本明細書において上記で定義されたような：
（ａ）アデニレート形成酵素；および
（ｂ）ＯｌｅＣタンパク質
を発現する（微）生物に関する。
【０１５８】
そのような微生物において発現されるべき酵素の好ましい態様に関して、上記で本発明に従う方法と関連して述べられてきたことと同じことが当てはまる。ある好ましい態様において、（ａ）のアデニレート形成酵素は、ＯｌｅＣタンパク質ではない。好ましい態様において、そのような生物は、それが上記で言及された酵素の少なくとも１つをコードする少なくとも１個の核酸分子の導入により遺伝子改変されているという意味で、組み換え生物である。好ましくは、そのような核酸分子は、その生物に関して異種性であり、それは、それが前記の生物中に天然には存在しないことを意味する。
【０１５９】
従って、本発明は、上記の（ａ）において定義されたような酵素をコードする核酸分子を含み、かつ上記の（ｂ）において定義されたような酵素をコードする核酸分子を含む生物、好ましくは微生物にも関する。好ましい態様において、核酸分子の少なくとも１つは、その生物に関して異種性であり、それは、それが前記の生物中に天然には存在しないことを意味する。微生物は、好ましくは細菌、酵母または真菌である。別の好ましい態様において、生物は、植物または非ヒト動物である。他の好ましい態様に関して、上記で本発明に従う方法と関連して述べられてきたことと同じことが当てはまる。
【０１６０】
好ましい態様において、本発明に従う微生物は、本発明に従う方法に従って変換されるべきである式Ｉに従う３−ヒドロキシカルボキシレートも産生する。
さらに、本発明は、本発明に従う微生物、適切な培地および式Ｉの３−ヒドロキシカルボキシレートまたは微生物により式Ｉの３−ヒドロキシカルボキシレートに変換されることができる炭素源を含む組成物にも関する。
【０１６１】
本発明は、アデニレート形成酵素および式Ｉの３−ヒドロキシカルボキシレートを含む組成物にも関し、ただし、そのアデニレート形成酵素は、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡシンテターゼではなく、かつ３−ヒドロキシカルボキシレートは、３−ヒドロキシプロピオネートではない。
【０１６２】
本発明は、以下：
（ａ）ＯｌｅＣタンパク質；および
（ｂ）式ＩＩＩの３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレート
を含む組成物にも関する。
【０１６３】
さらに、本発明は、本明細書において上記で定義されたような：
（ａ）アデニレート形成酵素；および
（ｂ）ＯｌｅＣタンパク質
を含む組成物にも関する。
【０１６４】
好ましい態様において、そのような組成物は、式Ｉの３−ヒドロキシカルボキシレートも含む。別の好ましい態様において、（ａ）のアデニレート形成酵素は、ＯｌｅＣタンパク質ではない。
【０１６５】
本発明は、本明細書において上記で記載されたような式Ｉの３−ヒドロキシカルボキシレートの式ＩＩＩの３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートへの変換のためのアデニレート形成酵素の使用にも関する。
【０１６６】
さらに、本発明は、本明細書において上記で記載されたような式ＩＩＩの３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートの式ＩＶのアルケンへの変換のためのＯｌｅＣタンパク質の使用に関する。
【０１６７】
本発明は、以下：
（ａ）アデニレート形成酵素；および
（ｂ）ＯｌｅＣタンパク質
を含む組み合わせの、本明細書において上記で記載されたような式Ｉの３−ヒドロキシカルボキシレートの式ＩＶのアルケンへの変換のための使用にも関する。ある好ましい態様において、（ａ）のアデニレート形成酵素は、ＯｌｅＣタンパク質ではない。
【０１６８】
列挙された異なる構成要素の好ましい態様に関して、上記で本発明に従う方法と関連して述べられてきたことと同じことが当てはまる。
本発明の他の側面および利点が、以下の実施例において記載されると考えられ、それは、説明の目的のために与えられており、限定としてではない。
【０１６９】
この出願において引用されたそれぞれの刊行物、特許、特許出願または他の文書は、参照により本明細書にそのまま援用される。
図１：は、３−ヒドロキシカルボキシレートを３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートに変換するための一般的な反応スキームを示す。
【０１７０】
図２：は、３−ヒドロキシカルボキシレートおよび補助基質としてのＡＴＰまたはＡＤＰを３−ヒドロキシカルボキシル−アデニレートに変換するための一般的な反応スキームを示す。
【０１７１】
図３：は、３−ヒドロキシカルボキシレートおよび補助基質としてのＡＴＰまたはＡＤＰを３−ヒドロキシカルボキシル−アデニレートに変換し、さらにそれをアルケンに変換するための一般的な反応スキームを示す。
【０１７２】
図４：Ａ：は、３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートを対応するアルケンに変換するための一般的な反応スキームを示す。
Ｂ：は、３−ヒドロキシカルボキシル−ヌクレオチジレートを３−ヒドロキシヌクレオチジル−カルボキシレートを経て対応するアルケンに変換するための反応スキームを示す。
【０１７３】
図５：は、３−ヒドロキシカルボキシル−アデニレートを対応するアルケンに変換するための一般的な反応スキームを示す。
図６：Ａ：は、本発明に従う方法を用いることにより３−ヒドロキシ−３−メチルブチレートをイソブテンに変換するための一般的なスキームを示す。
【０１７４】
Ｂ：は、ＡＴＰを補助基質として用いる本発明に従う方法を用いることにより３−ヒドロキシ−３−メチルブチレートをイソブテンに変換するための一般的なスキームを示す。
【０１７５】
Ｃ：は、ＡＤＰを補助基質として用いる本発明に従う方法を用いることにより３−ヒドロキシ−３−メチルブチレートをイソブテンに変換するための一般的なスキームを示す。
【０１７６】
図７：Ａ：は、本発明に従う方法を用いることにより３−ヒドロキシブチレートをプロピレンに変換するための一般的なスキームを示す。
Ｂ：は、ＡＴＰを補助基質として用いる本発明に従う方法を用いることにより３−ヒドロキシブチレートをプロピレンに変換するための一般的なスキームを示す。
【０１７７】
Ｃ：は、ＡＤＰを補助基質として用いる本発明に従う方法を用いることにより３−ヒドロキシブチレートをプロピレンに変換するための一般的なスキームを示す。
図８：Ａ：は、本発明に従う方法を用いることにより３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートを１，３−ブタジエンに変換するための一般的なスキームを示す。
【０１７８】
Ｂ：は、ＡＴＰを補助基質として用いる本発明に従う方法を用いることにより３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートを１，３−ブタジエンに変換するための一般的なスキームを示す。
【０１７９】
Ｃ：は、ＡＤＰを補助基質として用いる本発明に従う方法を用いることにより３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートを１，３−ブタジエンに変換するための一般的なスキームを示す。
【０１８０】
図９：は、３６０ｎｍにおける吸光度の増大により２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンの形成をモニターする、ジホスフェートまたはモノホスフェート定量化アッセイのスキームを示す。
【０１８１】
図１０：は、３６０ｎｍにおける２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンの吸光度の増大を記録することによりモニターされた、３−ヒドロキシプロピオネートに関するいくつかの研究された酵素のアデニル化活性を示す。
【０１８２】
図１１：は、３６０ｎｍにおける２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンの吸光度の増大を記録することによりモニターされた、Ｒ−３−ヒドロキシバレレートに関するいくつかの研究された酵素のアデニル化活性を示す。
【０１８３】
図１２：は、３６０ｎｍにおける２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンの吸光度の増大を記録することによりモニターされた、（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートに関するいくつかの研究された酵素のアデニル化活性を示す。
【０１８４】
図１３：は、３６０ｎｍにおける２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンの吸光度の増大を記録することによりモニターされた、３−ヒドロキシイソバレレートに関するいくつかの研究された酵素のアデニル化活性を示す。
【０１８５】
図１４：は、３６０ｎｍにおける２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンの吸光度の増大を記録することによりモニターされた、（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートに関するいくつかの研究された酵素のアデニル化活性を示す。
【０１８６】
図１５：は、Ｍ．アルギコラからのアシル−ＣｏＡシンターゼにより触媒される（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートのアデニル化反応に関する補助基質濃度の関数としての速度のプロットを示す。反応は、３６０ｎｍにおける２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンの吸光度の増大を記録することによりモニターされた。
【０１８７】
図１６：は、バークホルデリア属の種からのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼにより触媒される（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートのアデニル化反応に関する補助基質濃度の関数としての速度のプロットを示す。反応は、３６０ｎｍにおける２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンの吸光度の増大を記録することによりモニターされた。
【０１８８】
図１７：は、バークホルデリア属の種からのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼにより触媒される（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートのアデニル化反応のエレクトロスプレーＭＳスペクトルを示す。ＭＳ分析は、３−ヒドロキシブチリル−アデニレートのモノ−脱プロトン化形態［Ｍ−Ｈ］−に関する４３２．２のｍ／ｚ値における特徴的なピークを示した。
【０１８９】
図１８：は、バークホルデリア属の種からのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼにより触媒されるＲ−３−ヒドロキシバレレートのアデニル化反応のエレクトロスプレーＭＳスペクトルを示す。ＭＳ分析は、３−ヒドロキシバレリル−アデニレートのモノ−脱プロトン化形態［Ｍ−Ｈ］−に関する４４６．３のｍ／ｚ値における特徴的なピークを示した。
【０１９０】
図１９：は、バークホルデリア属の種からのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼにより触媒される３−ヒドロキシイソバレレートのアデニル化反応のエレクトロスプレーＭＳスペクトルを示す。ＭＳ分析は、３−ヒドロキシイソバレリル−アデニレートのモノ−脱プロトン化形態［Ｍ−Ｈ］−に関する４４６．２のｍ／ｚ値における特徴的なピークを示した。
【０１９１】
図２０：は、バークホルデリア属の種からのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼにより触媒される（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートのアデニル化反応のエレクトロスプレーＭＳスペクトルを示す。ＭＳ分析は、３−ヒドロキシペンタ−４−エノイル−アデニレートのモノ−脱プロトン化形態［Ｍ−Ｈ］−に関する４４４．３のｍ／ｚ値における特徴的なピークを示した。
【０１９２】
図２１：は、（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートを基質として、ＡＴＰを補助基質として用いた酵素反応および酵素を含まない反応に関して得られたＧＣ／ＦＩＤクロマトグラムを示す。
【０１９３】
図２２：は、実施例１２において概説されるような、酵素に触媒される（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートからのプロピレンの生産を示す。
図２３：は、（Ｒ）−３−ヒドロキシバレレートを基質として、ＡＴＰを補助基質として用いた酵素反応および酵素を含まない反応に関して得られたＧＣ／ＦＩＤクロマトグラムを示す。
【０１９４】
図２４：は、実施例１６において概説されるような、酵素に触媒される（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートからの１，３−ブタジエンの生産を示す。
図２５：は、（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートを基質として、ＡＴＰを補助基質として用いた酵素反応および酵素を含まない反応に関して得られたＧＣ／ＦＩＤクロマトグラムを示す。
【０１９５】
図２６：は、３−ヒドロキシイソバレレートを基質として、ＡＴＰを補助因子として用いた酵素反応および酵素を含まない反応に関して得られたＧＣ／ＦＩＤクロマトグラムを示す。
【０１９６】
図２７：は、ＡＴＰ濃度の関数としての３−ヒドロキシイソバレレートからのイソブテンの形成のプロットを示す。反応は、以下の酵素により触媒された：
Ｎ°１：バークホルデリア属の種からのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼおよびＳ．アマゾネンシスからのＯｌｅＣ。
【０１９７】
Ｎ°２：Ｍ．アルギコラからのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼおよびＳ．アマゾネンシスからのＯｌｅＣ。
図２８：は、ＡＤＰ濃度の関数としての３−ヒドロキシイソバレレートからのイソブテンの形成のプロットを示す。反応は、以下の酵素により触媒された：
Ｎ°１：Ｍ．アルギコラからのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼおよびＳ．アマゾネンシスからのＯｌｅＣ。
【０１９８】
Ｎ°２：バークホルデリア属の種からのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼおよびＳ．アマゾネンシスからのＯｌｅＣ。
図２９：は、Ｏｌｅ  ＡＢＣＤ(Wang and Lu, frontiers in Bioengineering an Biotechnology 1 (2013), 論文10)により触媒される反応のスキームを示す。
【０１９９】
本発明は、特に、一般的なおよび／または好ましい特徴／パラメーターのあらゆる組み合わせを含め、本明細書で記載される特徴およびプロセスパラメーターのそれぞれのおよび全ての組み合わせに関することは、理解されるべきである。特に、本発明は、特に本明細書で提供されるプロセスの好ましい特徴（全ての好みの程度を含む）の全ての組み合わせに関する。
【０２００】
本明細書において、特許出願を含むいくつかの文書が引用されている。これらの文書の開示は、本発明の特許性に関連するとは考えられないが、参照により本明細書にそのまま援用される。より具体的には、全ての参照される文書は、それぞれの個々の文書が具体的かつ個々に参照により援用されたことが示された場合と同程度まで、参照により援用される。
【０２０１】
本発明は、ここで、以下の実施例への参照により記載されると考えられ、それは、単に説明的なものであり、本発明の範囲の限定として解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２０２】
実施例１：酵素のクローニング、発現および精製
組み換えタンパク質の遺伝子合成、クローニングおよび発現
原核生物および真核生物のゲノムから推測された研究される酵素の配列を、大腸菌のコドン使用頻度に適合させるように、オリゴヌクレオチド連結（ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｉｏｎ）により生成した（遺伝子はＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）により商業的に合成された）。精製のための親和性タグを提供するため、６個のヒスチジンコドンの一続きを、メチオニン開始コドンの後に挿入した。このように合成された遺伝子を、ノカルジア・イオウェンシスのカルボン酸レダクターゼ遺伝子を除いて、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）発現ベクター（ベクターはＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）により構築された）中にクローニングした。
【０２０３】
コンピテント大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、標準的な熱ショック手順に従って、これらのベクターで形質転換した。形質転換された細胞を、ＺＹＭ−５０５２自動誘導（ａｕｔｏ−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）培地(Studier FW, Prot. Exp. Pur. 41, (2005), 207-234)を用いて３７℃で６時間振盪しながら（１６０ｒｐｍ）増殖させ、タンパク質発現を、２８℃または１８℃で一夜（おおよそ１６時間）継続した。細胞を４℃、１０，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により集め、ペレットを−８０℃で保管した。
【０２０４】
ノカルジア・イオウェンシスからのカルボン酸レダクターゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ６ＲＫＢ１）をコードする遺伝子を、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりコドン最適化した。ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）により提供された遺伝子コンストラクトは、ＰａｃＩおよびＮｏｔＩ制限部位により隣接されており、マスターベクターｐＭＫ内で提供された。次いで、このように合成された遺伝子を、改変されたマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）（国際公開第２０１３／００７７８６号）を含有するｐＵＣ１８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）の改変版中にサブクローニングした。
【０２０５】
コンピテントＭＧ１６５５大腸菌細胞を、標準的な熱ショック手順を用いて、このベクターで形質転換した。形質転換された細胞を、ＬＢ−アンピシリン培地中で、３０℃、１６０ｒｐｍの振盪において２４時間増殖させた。
【０２０６】
細胞を４℃、１０，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により集め、ペレットを−８０℃で保管した。
タンパク質精製および濃縮
２００ｍｌの培養細胞からのペレットを、氷上で融解させ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、１０ｍＭイミダゾールおよび１ｍＭ  ＤＴＴを含有する５ｍｌの５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中で再懸濁した。２０マイクロリットルのｌｙｓｏｎａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を添加した。細胞を室温で１０分間インキュベートし、次いで氷に２０分間戻した。細胞溶解を、２×３０秒間の超音波処理により完了させた。次いで、細菌抽出物を、４℃、１０，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により澄ませた。澄んだ細菌溶解物を、６−Ｈｉｓタグ化タンパク質の吸着を可能にするＰＲＯＴＩＮＯ−２０００  Ｎｉ−ＴＥＤカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）上に装填した。カラムを洗浄し、対象の酵素を、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５０ｍＭイミダゾールを含有する６ｍｌの５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で溶離した。次いで溶離液を濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  １０ｋＤａフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で脱塩し、酵素を１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴを含有する５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含有する溶液中で再懸濁した。ＯｌｅＣ酵素の場合、この再懸濁緩衝液に１ｍＭ  ＡＭＰを補った。
【０２０７】
タンパク質濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上での直接的な紫外２８０ｎｍ測定により定量化した。こうして精製されたタンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により概算した際に、７０％から９０％まで異なっていた。
【０２０８】
実施例２：３−ヒドロキシプロピオネートを基質として、ＡＴＰを補助基質として用いたアデニル化酵素活性に関する連続的分光光度アッセイ
アデニレート形成酵素をコードする遺伝子を合成し、対応する酵素を、実施例１において記載された手順に従ってさらに生成した。３−ヒドロキシプロピオン酸（ＴＣＩ）ストック溶液を、水中で調製し、ｐＨを１Ｍ  ＮａＯＨで７．５に調節した。３−ヒドロキシプロピオネートからの３−ヒドロキシプロピオニル−アデニレートの形成と関係するジホスフェートの遊離を、ＥｎｚＣｈｅｃｋ（登録商標）ピロホスファターゼアッセイキット（Ｅ６６４５、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて定量化した。
【０２０９】
このアッセイにおいて、ジホスフェートは、無機ピロホスファターゼにより加水分解されて無機ホスフェートになり、ホスフェートの生成は、酵素プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）により触媒される２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンリボヌクレオシド（ＭＥＳＧ）の加リン酸分解に共役していた。発色団性生成物である２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンを、３６０ｎｍにおける吸光度によりモニターした（図９）。
【０２１０】
標準的な反応混合物は、以下：
１００ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５
５ｍＭ  ３−ヒドロキシプロピオネート
２ｍＭ  ＭｇＣｌ２
０．１ｍＭ  ＤＴＴ
２ｍＭ  ＡＴＰ
０．１ｍｇ／ｍｌの研究される酵素
を含有していた。
【０２１１】
２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンリボヌクレオシド（ＭＥＳＧ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）および無機ピロホスファターゼを、ＥｎｚＣｈｅｃｋ（登録商標）ピロホスファターゼアッセイキットにおいて記載されている手順に従って反応混合物に添加した。アデニレート形成酵素が添加されていないか、または３−ヒドロキシプロピオネートが添加されていないかの両方の対照反応を実施した。それぞれの反応を、ＡＴＰの添加により開始した。反応は、９６ウェルプレートにおいて３７℃で実施された。それぞれの試料を、２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンの増大に関して、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４紫外／可視マルチプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で３６０ｎｍにおいて連続的にモニターした。
【０２１２】
いくつかの酵素は、３−ヒドロキシプロピオネートに関するアデニル化活性を示した（図１０）。
実施例３：３−ヒドロキシバレレートを基質として、ＡＴＰを補助基質として用いたアデニル化酵素活性に関する連続的分光光度アッセイ
分光光度アッセイを、実施例２において記載された手順に従って実施した。Ｒ−３−ヒドロキシ吉草酸を、ＥＭＰＡ（スイス）から購入した。Ｒ−３−ヒドロキシ吉草酸ストック溶液を、水中で調製し、ｐＨを１Ｍ  ＮａＯＨで７．５に調節した。反応混合物の組成は、実施例２において記載された組成と同じであり、５ｍＭ  Ｒ−３−ヒドロキシバレレートを３−ヒドロキシプロピオネートの代わりに基質として用いた。アデニレート形成酵素が添加されていないか、または３−ヒドロキシバレレートが添加されていないかの両方の対照反応を実施した。それぞれの反応を、ＡＴＰの添加により開始した。反応は、９６ウェルプレートにおいて３７℃で実施された。それぞれの試料を、２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンの増大に関して、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４紫外／可視マルチプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で３６０ｎｍにおいて連続的にモニターした。いくつかの酵素は、３−ヒドロキシバレレートに関するアデニル化活性を示した（図１１）。
【０２１３】
実施例４：３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートを基質として、ＡＴＰを補助基質として用いたアデニル化酵素活性に関する連続的分光光度アッセイ
分光光度アッセイを、実施例２において記載された手順に従って実施した。（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシペンタ−４−エン酸（Ｅｐｓｉｌｏｎ  Ｃｈｉｍｉｅ）ストック溶液を水中で調製し、ｐＨを１Ｍ  ＮａＯＨで７．５に調節した。反応混合物の組成は、実施例２において記載された組成と同じであり、５ｍＭ  （Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートを３−ヒドロキシプロピオネートの代わりに基質として用いた。アデニレート形成酵素が添加されていないか、または３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートが添加されていないかの両方の対照反応を実施した。反応は、９６ウェルプレートにおいて３７℃で実施された。それぞれの試料を、２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンの増大に関して、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４紫外／可視マルチプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で３６０ｎｍにおいて連続的にモニターした。いくつかの酵素は、３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートに関するアデニル化活性を示した（図１２）。
【０２１４】
実施例５：３−ヒドロキシイソバレレートを基質として、ＡＴＰを補助基質として用いたアデニル化酵素活性に関する連続的分光光度アッセイ
分光光度アッセイを、実施例２において記載された手順に従って実施した。３−ヒドロキシイソ吉草酸（３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸）（ＴＣＩ）ストック溶液を水中で調製し、ｐＨを１Ｍ  ＮａＯＨで７．５に調節した。反応混合物の組成は、実施例２において記載された組成と同じであり、５ｍＭ  ３−ヒドロキシイソバレレートを３−ヒドロキシプロピオネートの代わりに基質として用いた。アデニレート形成酵素が添加されていないか、または３−ヒドロキシイソバレレートが添加されていないかの両方の対照反応を実施した。反応は、９６ウェルプレートにおいて３７℃で実施された。それぞれの試料を、２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンの増大に関して、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４紫外／可視マルチプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で３６０ｎｍにおいて連続的にモニターした。いくつかの酵素は、３−ヒドロキシイソバレレートに関するアデニル化活性を示した（図１３）。
【０２１５】
実施例６：３−ヒドロキシブチレートを基質として、ＡＴＰを補助基質として用いたアデニル化酵素活性に関する連続的分光光度アッセイ
分光光度アッセイを、実施例２において記載された手順に従って実施した。（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシ酪酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）ストック溶液を水中で調製し、ｐＨを１Ｍ  ＮａＯＨで７．５に調節した。反応混合物の組成は、実施例２において記載された組成と同じであり、５ｍＭ  （Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートを３−ヒドロキシプロピオネートの代わりに基質として用いた。アデニレート形成酵素が添加されていないか、または３−ヒドロキシブチレートが添加されていないかの両方の対照反応を実施した。反応は、９６ウェルプレートにおいて３７℃で実施された。それぞれの試料を、２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンの増大に関して、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４紫外／可視マルチプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で３６０ｎｍにおいて連続的にモニターした。いくつかの酵素は、３−ヒドロキシブチレートに関するアデニル化活性を示した（図１４）。
【０２１６】
実施例７：ＡＴＰまたはＡＤＰを補助基質として用いた３−ヒドロキシブチレートのアデニル化の研究
分光光度アッセイを、実施例２において記載された手順に従って実施した。Ｍ．アルギコラからのアシル−ＣｏＡシンターゼおよびバークホルデリア属の種からのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼの補助基質に関する特異性を、分析した。標準的な反応は、以下：
１００ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５
５ｍＭ  （Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシブチレート
２ｍＭ  ＭｇＣｌ２
０．１ｍＭ  ＤＴＴ
０〜３．２ｍＭ  ＡＴＰまたはＡＤＰ
０．１ｍｇ／ｍｌの精製された酵素
を含有していた。
【０２１７】
２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンリボヌクレオシド（ＭＥＳＧ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）および無機ピロホスファターゼを、ＥｎｚＣｈｅｃｋ（登録商標）ピロホスファターゼアッセイキットにおいて記載されている手順に従って反応混合物に添加した。無機ピロホスファターゼを含まない反応混合物を、ＡＤＰを補助基質として用いるアッセイに関して用いた。酵素が添加されていないか、または３−ヒドロキシブチレートが添加されていないかの両方の対照アッセイを実施した。それぞれのアッセイを、補助基質（ＡＴＰまたはＡＤＰ）の添加により開始した。それぞれの試料を、２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンの増大に関して、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４紫外／可視マルチプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で３６０ｎｍにおいて連続的にモニターした。
【０２１８】
２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリン形成の速度の、補助基質濃度の関数としてのプロットを、図１５および１６において示す。Ｍ．アルギコラからのアシル−ＣｏＡシンターゼおよびバークホルデリア属の種からのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼは、ＡＴＰまたはＡＤＰを補助基質として用いることにより、３−ヒドロキシブチリル−アデニレートの形成を触媒することができた。
【０２１９】
実施例８：異なる３−ヒドロキシカルボキシレートの酵素に触媒されるアデニル化反応の質量分析
研究された酵素反応は、以下の条件下で実施された：
５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
２ｍＭ  ３−ヒドロキシカルボキシレート
２ｍＭ  ＡＴＰ
２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１００ｍＭ  ＮａＣｌ
１ｍＭ  ＤＴＴ
２ｍｇ／ｍｌ  精製されたバークホルデリア属の種からのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼ
それぞれの反応を、ＡＴＰの添加により開始し、３７℃で４０分間インキュベートした。インキュベーション後、反応混合物を、ネガティブイオンモードを用いた質量分析（ＭＳ）により分析した。典型的には、それぞれのアッセイの分割量（ａｌｉｑｕｏｔ）を、１５分ごとに取り出し、遠心分離して清浄なバイアル中に移した。次いで、５μｌの分割量を、質量分析計中に直接注入した。検出を、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源にインターフェースで接続されたＰＥ  ＳＣＩＥＸ  ＡＰＩ  ２０００四重極型分光計により実施した。３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシイソバレレートおよび３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートを基質として用いた酵素反応の質量スペクトルを、それぞれ図１７、１８、１９、２０において示す。酵素に触媒される反応の間の３−ヒドロキシカルボキシル−アデニレートの形成が、研究された３−ヒドロキシカルボキシレートのそれぞれに関して実証された。
【０２２０】
実施例９：マリノバクター・アクアエオレイからのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼにより触媒される３−ヒドロキシカルボキシレートのアデニル化の反応の速度論パラメーター
速度論パラメーターを、実施例２において記載されている分光光度アッセイを用いることにより決定した。アデニル化活性のアッセイに関する反応混合物は、以下：
１００ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５
０〜１０ｍＭ  ３−ヒドロキシカルボキシレート
２ｍＭ  ＡＴＰ
２ｍＭ  ＭｇＣｌ２
０．１ｍＭ  ＤＴＴ
０．１ｍｇ／ｍｌの精製されたＭ．アクアエオレイからのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼ
を含有していた。
【０２２１】
２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンリボヌクレオシド（ＭＥＳＧ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）および無機ピロホスファターゼを、ＥｎｚＣｈｅｃｋ（登録商標）ピロホスファターゼアッセイキットにおいて記載されている手順に従って反応混合物に添加した。異なる３−ヒドロキシカルボキシレートを用いたアデニル化反応に関する速度論パラメーターを、表２において示す。
【０２２２】
【表２】
2016538871.tif 000015
【０２２３】
実施例１０：マリノバクター・アクアエオレイからのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼおよびＯｌｅＣタンパク質の組み合わせられた作用による３−ヒドロキシブチレートからのプロピレン生成の分析
研究された酵素は、実施例１において記載された手順に従って生成および精製された。研究された反応は、以下の条件下で実施された：
５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
５０ｍＭ  （Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシブチレート
１０ｍＭ  ＡＴＰ
２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１００ｍＭ  ＮａＣｌ
１ｍＭ  ＤＴＴ
２ｍｇ／ｍｌ  精製されたＭ．アクアエオレイからのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼ
２ｍｇ／ｍｌ  精製されたシュワネラ・アマゾネンシスからの、またはクロロフレクサス・オウランティアカスからのＯｌｅＣタンパク質
反応体積は、０．３ｍｌであった。
【０２２４】
無酵素対照に関して、緩衝液を酵素の代わりに用いた。
ＡＴＰを含まない対照反応を並行して実施した。
反応混合物を、２ｍｌの密封されたバイアル（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）中で３７℃で振盪しながら１８時間インキュベートした。プロピレンの生成を、炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたＢｒｕｋｅｒ  ４５０−ＧＣガスクロマトグラフを用いるガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により分析した。窒素をキャリヤーガスとして６ｍｌ／分の流速で用いた。揮発性化合物を、ＧＳ−Ａｌｕｍｉｎａカラム（３０ｍ  ｘ  ０．５３ｍｍ  ＩＤ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）上で、１３０℃の等温モードを用いてクロマトグラフィー分離した。酵素反応生成物を、プロピレンの標準（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）との比較により同定し、これらの条件におけるプロピレンの保持時間は１．５７分であった。
【０２２５】
プロピレンの３−ヒドロキシブチレートからの著しい生成が、Ｍ．アクアエオレイからのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼおよびＯｌｅＣタンパク質を含有する酵素反応において観察された（表３）。上記の対照反応においてはプロピレンのシグナルは観察されなかった（図２１）。
【０２２６】
【表３】
2016538871.tif 000016
【０２２７】
これらのデータは、アッセイ中に存在する２種類の酵素が、３−ヒドロキシブチレートからプロピレンを生成するための反応の２つの段階：ＡＴＰのアデニリル基の３−ヒドロキシブチレートのカルボキシル基への転移、続いてその反応中間体のプロピレンへの組み合わせられた脱アデニル化／脱カルボキシル化を相補的に実施していることを示した。
【０２２８】
実施例１１：ノカルジア・イオウェンシスからのカルボン酸レダクターゼおよびシュワネラ・アマゾネンシスからのＯｌｅＣタンパク質の組み合わせられた作用による３−ヒドロキシブチレートからのプロピレン生成の分析
研究された反応は、以下の条件下で実施された：
５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
５０ｍＭ  （Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシブチレート
２ｍＭ  ＡＴＰ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１００ｍＭ  ＮａＣｌ
１ｍＭ  ＤＴＴ
２ｍｇ／ｍｌ  精製されたＮ．イオウェンシスからのカルボン酸レダクターゼ
２ｍｇ／ｍｌ  精製されたシュワネラ・アマゾネンシスからのＯｌｅＣタンパク質
反応体積は、０．３ｍｌであった。
【０２２９】
無酵素対照に関して、緩衝液を酵素の代わりに用いた。
反応を、２ｍｌの密封されたバイアル（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）中で３７℃で３時間インキュベートし、次いで８０℃での１分間のインキュベーションにより停止させた。プロピレンの生成を、実施例１０において記載されたＧＣ−ＦＩＤ手順に従って分析した。プロピレンの３−ヒドロキシブチレートからの著しい生成が、Ｎ．イオウェンシスからのカルボン酸レダクターゼおよびＳ．アマゾネンシスからのＯｌｅＣタンパク質を含有する酵素反応において観察された。プロピレンのピーク面積は、１６．７任意単位であると測定された。対照反応ではプロピレンのシグナルは観察されなかった。
【０２３０】
実施例１２：バークホルデリア属の種からのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼおよびシュワネラ属からのＯｌｅＣタンパク質の組み合わせられた作用による３−ヒドロキシブチレートからのプロピレン生成の分析
研究された反応は、以下の条件下で実施された：
５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
１０ｍＭ  （Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシブチレート
２ｍＭ  ＡＴＰ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１００ｍＭ  ＮａＣｌ
１ｍＭ  ＤＴＴ
２ｍｇ／ｍｌ  精製されたバークホルデリア属の種からのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼ
２ｍｇ／ｍｌ  精製されたＳ．アマゾネンシスまたはＳ．ロイヒカからのＯｌｅＣタンパク質
反応体積は、０．３ｍｌであった。
【０２３１】
反応を、２ｍｌの密封されたバイアル（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）中で３７℃で３時間インキュベートし、次いで８０℃での１分間のインキュベーションにより停止させた。
プロピレンの生成を、実施例１０において記載されたＧＣ−ＦＩＤ手順に従って分析した。著しいプロピレンの生成が、共役した酵素反応において観察された（図２２）。
【０２３２】
実施例１３：マリノバクター・アクアエオレイからのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼおよびシュワネラ・アマゾネンシスからのＯｌｅＣタンパク質の組み合わせられた作用による３−ヒドロキシバレレートからの１−ブテン生成の分析
研究された反応は、以下の条件下で実施された：
５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
１０ｍＭ  Ｒ−３−ヒドロキシバレレート
４ｍＭ  ＡＴＰ
２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１００ｍＭ  ＮａＣｌ
１ｍＭ  ＤＴＴ
２ｍｇ／ｍｌ  精製されたＭ．アクアエオレイからのＡＭＰ−依存性シンテターゼおよびリガーゼ
２ｍｇ／ｍｌ  精製されたＳ．アマゾネンシスからのＯｌｅＣタンパク質
反応体積は、０．３ｍｌであった。
【０２３３】
無酵素対照に関して、緩衝液を酵素の代わりに用いた。
アッセイを、２ｍｌの密封されたバイアル（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）中で３７℃で振盪しながら１６時間インキュベートした。
【０２３４】
次いで、１−ブテンの生成を、炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたＢｒｕｋｅｒ  ４５０−ＧＣガスクロマトグラフを用いるガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により分析した。窒素をキャリヤーガスとして６ｍｌ／分の流速で用いた。揮発性化合物を、ＧＳ−Ａｌｕｍｉｎａカラム（３０ｍ  ｘ  ０．５３ｍｍ  ＩＤ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）上で、１３０℃の等温モードを用いてクロマトグラフィー分離した。酵素反応生成物を、１−ブテンの標準（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）との比較により同定し、これらの条件における１−ブテンの保持時間は２．６５分であった。
【０２３５】
１−ブテンの３−ヒドロキシバレレートからの著しい生成が、Ｍ．アクアエオレイからのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼおよびＳ．アマゾネンシスからのＯｌｅＣタンパク質を含有する酵素反応において観察された。１−ブテンのピーク面積は、３２任意単位であることが測定された。酵素を含まない対照反応においては１−ブテンのシグナルは観察されなかった。
【０２３６】
これらのデータは、アッセイ中に存在する２種類の酵素が、３−ヒドロキシバレレートから１−ブテンを生成するための反応の２つの段階：ＡＴＰのアデニリル基の３−ヒドロキシバレレートのカルボキシル基への転移、続いてその反応中間体の１−ブテンへの組み合わせられた脱アデニル化／脱カルボキシル化を相補的に実施していることを示した。
【０２３７】
実施例１４：ノカルジア・イオウェンシスからのカルボン酸レダクターゼおよびシュワネラ・アマゾネンシスからのＯｌｅＣタンパク質の組み合わせられた作用による３−ヒドロキシバレレートからの１−ブテン生成の分析
研究された反応は、以下の条件下で実施された：
５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
１０ｍＭ  Ｒ−３−ヒドロキシバレレート
２ｍＭ  ＡＴＰ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１００ｍＭ  ＮａＣｌ
１ｍＭ  ＤＴＴ
２ｍｇ／ｍｌ  精製されたＮ．イオウェンシスからのカルボン酸レダクターゼ
２ｍｇ／ｍｌ  精製されたＳ．アマゾネンシスからのＯｌｅＣタンパク質
反応体積は、０．３ｍｌであった。
【０２３８】
無酵素対照に関して、緩衝液を酵素の代わりに用いた。
反応を、２ｍｌの密封されたバイアル（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）中で３７℃で３時間インキュベートし、次いで８０℃での１分間のインキュベーションにより停止させた。
【０２３９】
次いで、１−ブテンの生成を、実施例１３において記載されたＧＣ−ＦＩＤ手順に従って分析した。酵素に触媒される反応および対照反応のクロマトグラムを、図２３において示す。
【０２４０】
実施例１５：バークホルデリア属の種からのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼおよびシュワネラ門からのＯｌｅＣタンパク質の組み合わせられた作用による３−ヒドロキシバレレートからの１−ブテン生成の分析
研究された反応は、以下の条件下で実施された：
５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
１０ｍＭ  Ｒ−３−ヒドロキシバレレート
２ｍＭ  ＡＴＰ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１００ｍＭ  ＮａＣｌ
１ｍＭ  ＤＴＴ
２ｍｇ／ｍｌ  精製されたバークホルデリア属の種からのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼ
２ｍｇ／ｍｌ  精製されたＳ．アマゾネンシスまたはＳ．ロイヒカからのＯｌｅＣタンパク質
反応体積は、０．３ｍｌであった。アッセイを、実施例１４において記載されたようにインキュベートし、実施例１３において記載されたＧＣ−ＦＩＤ手順に従って分析した。
【０２４１】
【表４】
2016538871.tif 000017
【０２４２】
実施例１６：マリノバクター・アクアエオレイからのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼおよびＯｌｅＣタンパク質の組み合わせられた作用による３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートからの１，３−ブタジエン生成の分析
研究された反応は、以下の条件下で実施された：
５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
５０ｍＭ  （Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシペンタ−４−エノエート
１０ｍＭ  ＡＴＰ
２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１００ｍＭ  ＮａＣｌ
１ｍＭ  ＤＴＴ
反応体積は、０．３ｍｌであった。
【０２４３】
０．６ｍｇのＭ．アクアエオレイからのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼおよび０．６ｍｇのＯｌｅＣタンパク質を、０．３ｍｌの反応混合物に添加した。０．６ｍｇのＭ．アクアエオレイからのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼのみを含有する反応混合物を、参照として用いた。
【０２４４】
反応を、２ｍｌの密封されたバイアル（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）中で３７℃で振盪しながら１８時間インキュベートした。１，３−ブタジエンの生成を、炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたＢｒｕｋｅｒ  ４５０−ＧＣガスクロマトグラフを用いるガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により分析した。窒素をキャリヤーガスとして６ｍｌ／分の流速で用いた。揮発性化合物を、ＧＳ−Ａｌｕｍｉｎａカラム（３０ｍ  ｘ  ０．５３ｍｍ  ＩＤ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）上で、１３０℃の等温モードを用いてクロマトグラフィー分離した。酵素反応生成物を、１，３−ブタジエンの標準（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）との比較により同定し、これらの条件における１，３−ブタジエンの保持時間は３．２２分であった。
【０２４５】
１，３−ブタジエンの著しい生成が、Ｍ．アクアエオレイからのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼおよびＯｌｅＣタンパク質を含有する酵素反応において観察された。３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートの自然分解に対応する１，３−ブタジエンの無視できるほどのシグナルが、対照反応において観察された（図２４）。
【０２４６】
これらのデータは、アッセイ中に存在する２種類の酵素が、３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートから１，３−ブタジエンを生成するための反応の２つの段階：ＡＴＰのアデニリル基の３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートのカルボキシル基への転移、続いてその反応中間体のブタジエンへの組み合わせられた脱アデニル化／脱カルボキシル化を相補的に実施していることを示した。
【０２４７】
実施例１７：ノカルジア・イオウェンシスからのカルボン酸レダクターゼおよびシュワネラ・アマゾネンシスからのＯｌｅＣタンパク質を組み合わせることによる３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートからの１，３−ブタジエン生成の分析
研究された反応は、以下の条件下で実施された：
５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
１０ｍＭ  （Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシペンタ−４−エノエート
２ｍＭ  ＡＴＰ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１００ｍＭ  ＮａＣｌ
１ｍＭ  ＤＴＴ
２ｍｇ／ｍｌ  精製されたＮ．イオウェンシスからのカルボン酸レダクターゼ
２ｍｇ／ｍｌ  精製されたＳ．アマゾネンシスからのＯｌｅＣタンパク質
反応体積は、０．３ｍｌであった。
【０２４８】
無酵素対照に関して、緩衝液を酵素の代わりに用いた。反応を、２ｍｌの密封されたバイアル（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）中で３７℃で３時間インキュベートし、８０℃での１分間のインキュベーションにより反応を停止させた。１，３−ブタジエン生成を、実施例１６において記載されたＧＣ−ＦＩＤ手順に従って分析した。著しい量のブタジエンが、酵素反応において生成された。バックグラウンドレベルのブタジエンが、３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートの自然分解により、酵素を含まない対照反応において観察された（図２５）。
【０２４９】
実施例１８：バークホルデリア属の種からのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼおよびシュワネラ門からのＯｌｅＣタンパク質の組み合わせられた作用による３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートからの１，３−ブタジエン生成の分析
研究された反応は、以下の条件下で実施された：
５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
１０ｍＭ  （Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシペンタ−４−エノエート
２ｍＭ  ＡＴＰ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１００ｍＭ  ＮａＣｌ
１ｍＭ  ＤＴＴ
２ｍｇ／ｍｌ  精製されたバークホルデリア属の種からのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼ
２ｍｇ／ｍｌ  精製されたＳ．アマゾネンシスまたはＳ．ロイヒカからのＯｌｅＣタンパク質
反応体積は、０．３ｍｌであった。アッセイを、実施例１６において記載された手順に従ってインキュベートおよび分析した。１，３−ブタジエンの著しい生成が、共役した酵素反応において観察され、３−ヒドロキシペンタ−４−エノエートの自然分解によるブタジエンの無視できるほどのシグナルが、酵素を含まない対照反応において観察された（表５）。
【０２５０】
【表５】
2016538871.tif 000018
【０２５１】
実施例１９：マリノバクター・アクアエオレイからのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼおよびＯｌｅＣタンパク質の組み合わせられた作用による３−ヒドロキシイソバレレートからのイソブテン生成の分析
研究された反応は、以下の条件下で実施された：
５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
５０ｍＭ  ３−ヒドロキシイソバレレート
１０ｍＭ  ＡＴＰ
２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１００ｍＭ  ＮａＣｌ
１ｍＭ  ＤＴＴ
反応体積は、０．３ｍｌであった。
【０２５２】
０．６ｍｇのＭ．アクアエオレイからのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼおよび０．６ｍｇのＯｌｅＣタンパク質を、０．３ｍｌの反応混合物に添加した。０．６ｍｇのＭ．アクアエオレイからのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼのみを含有する反応混合物を、参照として用いた。アッセイを、２ｍｌの密封されたバイアル（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）中で３７℃で振盪しながら１８時間インキュベートした。イソブテンの生成を、炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたＢｒｕｋｅｒ  ４５０−ＧＣガスクロマトグラフを用いるガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により分析した。窒素をキャリヤーガスとして６ｍｌ／分の流速で用いた。揮発性化合物を、ＧＳ−Ａｌｕｍｉｎａカラム（３０ｍ  ｘ  ０．５３ｍｍ  ＩＤ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）上で、１３０℃の等温モードを用いてクロマトグラフィー分離した。酵素反応生成物を、イソブテンの標準（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）との比較により同定し、これらの条件におけるイソブテンの保持時間は２．４０分であった。
【０２５３】
イソブテンの著しい生成が、Ｍ．アクアエオレイからのＡＭＰ−依存性シンテターゼ／リガーゼおよびＯｌｅＣタンパク質を含有する組み合わせられた酵素反応において観察された（表６）。３−ヒドロキシイソバレレートの自然分解に対応するイソブテンの無視できるほどのシグナルが、酵素を含まない対照アッセイにおいて観察された。
【０２５４】
【表６】
2016538871.tif 000019
【０２５５】
Ｍ．アクアエオレイからの酵素およびＳ．アマゾネンシスからのＯｌｅＣタンパク質を用いた共役反応に関して得られたクロマトグラムの例を、図２６において示す。
これらのデータは、アッセイ中に存在する２種類の酵素が、３−ヒドロキシイソバレレートからイソブテンを生成するための反応の２つの段階：ＡＴＰのアデニリル基の３−ヒドロキシイソバレレートのカルボキシル基への転移、続いてその反応中間体のイソブテンへの組み合わせられた脱アデニル化／脱カルボキシル化を相補的に実施していることを示した。
【０２５６】
実施例２０：ＡＴＰ濃度の関数としてのイソブテン生成の研究
研究された反応は、以下の条件下で実施された：
５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
４０ｍＭ  −３−ヒドロキシイソバレレート
０〜３２ｍＭ  ＡＴＰ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１００ｍＭ  ＮａＣｌ
１ｍＭ  ＤＴＴ
２ｍｇ／ｍｌ  精製されたアデニレート形成酵素
２ｍｇ／ｍｌ  精製されたＳ．アマゾネンシスからのＯｌｅＣタンパク質
反応混合物を、２ｍｌの密封されたバイアル（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）中で３７℃で３時間インキュベートし、８０℃での１分間のインキュベーションにより反応を停止させた。ＡＴＰの関数としてのイソブテン生成を、図２７において示す。
【０２５７】
実施例２１：ＡＤＰ濃度の関数としてのイソブテン生成の研究
研究された反応は、実施例２０において記載されたプロトコルに従って、ＡＴＰの代わりにＡＤＰを補助基質として用いて実施された。ＡＤＰの関数としてのイソブテン生成を、図２８において示す。
【図１】
2016538871.tif 000024
【図２−１】
2016538871.tif 000025
【図２−２】
2016538871.tif 000026
【図３】
2016538871.tif 000027
【図４−１】
2016538871.tif 000028
【図４−２】
2016538871.tif 000029
【図５】
2016538871.tif 000030
【図６−１】
2016538871.tif 000031
【図６−２】
2016538871.tif 000032
【図６−３】
2016538871.tif 000033
【図７−１】
2016538871.tif 000034
【図７−２】
2016538871.tif 000035
【図７−３】
2016538871.tif 000036
【図８−１】
2016538871.tif 000037
【図８−２】
2016538871.tif 000038
【図８−３】
2016538871.tif 000039
【図９】
2016538871.tif 000040
【図１０】
2016538871.tif 000041
【図１１】
2016538871.tif 000042
【図１２】
2016538871.tif 000043
【図１３】
2016538871.tif 000044
【図１４】
2016538871.tif 000045
【図１５】
2016538871.tif 000046
【図１６】
2016538871.tif 000047
【図１７】
2016538871.tif 000048
【図１８】
2016538871.tif 000049
【図１９】
2016538871.tif 000050
【図２０】
2016538871.tif 000051
【図２１】
2016538871.tif 000052
【図２２】
2016538871.tif 000053
【図２３】
2016538871.tif 000054
【図２４】
2016538871.tif 000055
【図２５】
2016538871.tif 000056
【図２６】
2016538871.tif 000057
【図２７】
2016538871.tif 000058
【図２８】
2016538871.tif 000059
【図２９】
2016538871.tif 000060
【国際調査報告】
2016538871.tif 000061
2016538871.tif 000062
2016538871.tif 000063
2016538871.tif 000064