(57)【要約】本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける骨粗鬆症の治療もしくは予防用、またはＣａ２＋イオンの吸収の増加に用いるラクトバチルス・パラカゼイから選択される少なくとも１つのプロバイオティクス菌株、またはラクトバチルス・プランタラムから選択される少なくとも１つのプロバイオティクス菌株と併用されるラクトバチルス・パラカゼイから選択される少なくとも１つのプロバイオティクス菌株に関する。
2016521123.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物、好ましくはヒトにおける骨粗鬆症の治療もしくは予防用、またはＣａ２＋イオンの吸収の増加に用いるラクトバチルス・パラカゼイから選択される少なくとも１つのプロバイオティクス菌株、またはラクトバチルス・プランタラムから選択される少なくとも１つのプロバイオティクス菌株と併用されるラクトバチルス・パラカゼイから選択される少なくとも１つのプロバイオティクス菌株。
【請求項２】
骨粗鬆症の治療もしくは予防が、皮質骨量の減少、骨ミネラル含量の減少および骨再吸収を防止することによりなされる請求項１に記載の少なくとも１つのプロバイオティクス菌株。
【請求項３】
前記ラクトバチルス・パラカゼイから選択される少なくとも１つのプロバイオティクス菌株が、ラクトバチルス・パラカゼイ  ８７００：２，ＤＳＭ  １３４３４およびラクトバチルス・パラカゼイ  ０２：Ａ，ＤＳＭ  １３４３２から選択される請求項１に記載の少なくとも１つのプロバイオティクス菌株。
【請求項４】
前記ラクトバチルス・プランタラムから選択される少なくとも１つのプロバイオティクス菌株が、ラクトバチルス・プランタラム  ２９９，ＤＳＭ  ６５９５、ラクトバチルス・プランタラム  ２９９ｖ，ＤＳＭ  ９８４３、ラクトバチルス・プランタラム  ＨＥＡＬ  ９，ＤＳＭ  １５３１２、ラクトバチルス・プランタラム  ＨＥＡＬ  １９，ＤＳＭ  １５３１３およびラクトバチルス・プランタラム  ＨＥＡＬ  ９９，ＤＳＭ  １５３１６から選択される請求項１〜３のいずれか一項に記載の少なくとも１つのプロバイオティクス菌株。
【請求項５】
前記少なくとも１つのプロバイオティクス菌株が、さらに少なくとも１つの担体を含む組成物中に存在する請求項１〜４のいずれか一項に記載の少なくとも１つのプロバイオティクス菌株。
【請求項６】
前記組成物が含有するＣａ２＋の量が、８〜３２０ｍｇ、好ましくは１２０〜２４０ｍｇである請求項５に記載の少なくとも１つのプロバイオティクス菌株。
【請求項７】
前記組成物が、食品、補助食品、医療食、機能性食品および栄養製品から成る群から選択される請求項５または６に記載の少なくとも１つのプロバイオティクス菌株。
【請求項８】
前記菌株が、約１×１０６〜約１×１０１４ＣＦＵの量で、好ましくは１×１０８〜１×１０１２ＣＦＵの量で、より好ましくは１×１０９〜１×１０１１ＣＦＵの量で存在している請求項１〜７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのプロバイオティクス菌株。
【請求項９】
更年期と関連した骨粗鬆症の治療もしくは予防用の請求項１〜８のいずれか一項に記載の少なくとも１つのプロバイオティクス菌株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける骨粗鬆症の治療もしくは予防用、またはＣａ２＋イオンの吸収の増加に用いるラクトバチルス・パラカゼイから選択される少なくとも１つのプロバイオティクス菌株、またはラクトバチルス・プランタラムから選択される少なくとも１つのプロバイオティクス菌株と併用されるラクトバチルス・パラカゼイから選択される少なくとも１つのプロバイオティクス菌株に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨粗鬆症は、骨がこわれやすくなり、骨折しやすくなる病気である。通常、その骨では、骨の中のカルシウムとミネラルの濃度が減少している。骨粗鬆症は最もありふれたタイプの骨の病気である。５０歳以上の女性の約半数には、その生涯のうちに、腰、手首、または脊椎骨（背骨の骨）の骨折がみられる。骨は生きた組織である。既存の骨は絶えず新しい骨に置き換わっている。身体が十分な新しい骨を形成出来ないとき、既存の骨が体に再吸収されすぎたとき、またはその両方のときに、骨粗鬆症は起こる。カルシウムは、骨を形成するために必要とされる重要なミネラルの１つである。十分なカルシウムやビタミンＤを摂取しない場合、または身体が食事からの十分なカルシウムを吸収しない場合、骨は脆くなり、骨折しやすくなり得る。更年期の女性のエストロゲンの減少および男性のテストステロンの減少は、骨量の減少の主な原因である。
【０００３】
骨粗鬆症によって引き起こされる骨折は、深刻な健康問題となり、健康管理システムにおいて大きな経済的負担となる。骨粗鬆症による骨折の生涯リスクは西洋において高く（女性の約５０％、男性の約２０％）、骨折は著しく死亡率と罹患率に関係している。皮質骨は身体の骨の約８０％を構成しており、いくつかの研究では、皮質骨が骨の強度および骨折しやすさの主な決定因子であることが示されている。６５歳以降の主な骨量の低下は、小柱骨ではなく皮質骨の減少によるものである（非特許文献１）。
【０００４】
骨格は骨を形成する造骨細胞（ＯＢ）と骨を再吸収する破骨細胞（ＯＣＬ）によって再形成される。マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）は、ＯＣＬの核因子ｋＢ活性化受容体（ＲＡＮＫ）の発現上昇とともにＯＣＬ前駆細胞の増殖と生存を増加させる。これにより、ＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ）が結合し、ＯＣＬ形成につながるシグナルカスケードが開始する。ＲＡＮＫＬの作用は、ＲＡＮＫＬのデコイ受容体であるオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）によって抑制される。
【０００５】
炎症と骨量減少の関係は確立されており、自己免疫疾患における破骨細胞の骨吸収は、活性化Ｔ細胞によって産生される炎症性のサイトカインによって誘導される。さらに、いくつかの研究では、高感度Ｃ反応性タンパク（ｈｓＣＲＰ）の血清レベルを中程度に増加させることによって示される軽度な全身性の炎症は、低いＢＭＤ（骨密度）と関係しており、骨吸収を上昇させ、骨折のリスクを増加させることが示されている。閉経後に起こるエストロゲンの欠乏は破骨細胞の形成の増加と生存延長をもたらす。これは、破骨細胞生成を促進するサイトカインの産生を増加させるエストロゲンの免疫抑制作用の低下およびＯＣＬに対するエストロゲンの直接作用の低下を含む数多くの要因のためであることが示されている。これらのデータによると、炎症性サイトカインであるＴＮＦαおよびＩＬ−１の阻害は、早期の閉経後女性における骨再吸収マーカーの低下をもたらす。
【０００６】
近年、健康と病気の両方に対する腸内微生物叢（ＧＭ）の重要性が、重点的に研究されている。ＧＭは何兆ものバクテリアから成り、合計すると我々ヒトゲノムより１５０倍多くの遺伝子を含む。それは生まれた時に獲得され、全く異なるものではあるが、明らかにそれはヒトゲノムと共進化しており、多くの方法でそのホストとやりとりをして影響を与える多細胞の器官であると考えることができる。ＧＭの構成は、食事や抗生物質治療などの多くの環境要因によって変化する。腸内細菌によって生産された分子は、有益である場合も有害である場合もあり、腸内、腸神経系、腸の浸透性および免疫系において、内分泌細胞に影響することが知られている。乱れた微生物の構成は、クローン病、潰瘍性大腸炎、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、糖尿病、食品アレルギー、湿疹、喘息を含む腸の内外における炎症状態、および、肥満とメタボリック症候群に関わると想定されている。
【０００７】
プロバイオティクス菌は、適切な量が与えられた場合に健康上の利益をホストにもたらす微生物と定義されており、腸内微生物叢の構成を変えると考えられている。考えられている基本的なメカニズムは多種多様であり、ミネラルの溶解性と吸収性を増加させること、バリア機能の向上、免疫システムの調節を含んでいる。
【０００８】
非特許文献２において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ（ＵＣＣ  １１８）株とＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ（ＵＣＣ  ３５６２４）株について、ヒト腸類似Ｃａｃｏ‐２培養細胞におけるカルシウム取り込みと経上皮カルシウム輸送とが試験された。これらの菌株は、経上皮カルシウム輸送について、完全に分化した１６日Ｃａｃｏ−２細胞の中では効果はなかった。２４時間後のＣａｃｏ−２細胞単分子膜へのカルシウム取込は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓに曝露した細胞中でかなり高かった。
【０００９】
特許文献１には、カルシウム、亜鉛、鉄およびマグネシウムなどの食事からのミネラルの吸収を促進するまたは増加させる非発酵型の腸内組成物を作製するために、乳酸菌を使用することが記載されている。クレームされた該吸収を裏付ける際に行われた実験は、Ｃａｃｏ−２腸管細胞株（発癌性の細胞株）を使用するカルシウム移動のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルである。
【００１０】
特許文献２には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（寄託番号ＫＣＴＣ  １１８７０ＢＰ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（寄託番号ＫＣＴＣ  １１８６８ＢＰ）およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ（寄託番号ＫＣＴＣ  １１８６６ＢＰ）等の特定の乳酸菌の菌株に加えてカルシウムとマグネシウムを含む骨粗鬆症の予防または治療用の組成物が記載されている。
【００１１】
まだなお本技術においては、ヒトの骨粗鬆症に対して効果的な予防および治療法を探索ずる必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第９９／０２１７０号パンフレット
【特許文献２】韓国特許第１０１２７９８５２号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｌａｎｃｅｔ，２０１０，Ｍａｙ  １５；３７５（９７２７）：１７２９−３６
【非特許文献２】Ｇｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ｏｎ  Ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  Ｃａｌｃｉｕｍ  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ−ｌｉｋｅ  Ｃａｃｏ−２  ｃｅｌｌｓ，Ｃｕｒｒ．Ｉｓｓｕｅｓ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．７：１−６
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、一態様においては、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて骨粗鬆症の治療または予防に使用するための、または、Ｃａ２＋イオンの吸収を増加させるために使用するための、ラクトバチルス・パラカゼイから選ばれた少なくとも１つのプロバイオティクス菌株またはラクトバチルス・プランタラムから選ばれた少なくとも１つのプロバイオティクス菌株と併用されるラクトバチルス・パラカゼイから選ばれた少なくとも１つのプロバイオティクス菌株に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実験１と２に記載の異なった菌株を用いて試験されたＣａ２＋輸送を示す。
【図２】実験１と２に記載の２時間後の細胞中に残存する細胞内Ｃａ２＋を示す。
【図３】実験３の実験デザインと体重を示す。実験デザインのアウトライン（Ａ）。８週齢のマウスに６週間、ビヒクル（ｖｅｈ）、１種類の乳酸菌（Ｌ）株（Ｌ．ｐａｒａ）または３種類の乳酸菌株の混合物（Ｌ．ｍｉｘ）を投与した。投与は卵巣摘出手術（ｏｖｘ）または偽手術の２週間前に開始した。Ｌ株は１０９コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍｌの濃度で飲料水として与え、コントロールマウスにはビヒクルと共に水道水を与えた。マウスが１４週齢となる試験終了時に後の解析のための組織を収集した。ｏｖｘマウスの体重は予想通り偽手術マウスの体重に比べて増加し、プロバイオティクス投与後も変わらなかった（Ｂ）。結果：ｍｅａｎ±ＳＥＭ（ｎ＝９〜１０），＊＊ｐ＜０．０１．Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ  ｏｖｘ  ｖｓ．ｓｈａｍ．
【図４】プロバイオティクスがｏｖｘで誘導される皮質骨量減少を予防することを示す。ｏｖｘで誘導される骨量減少に対するプロバイオティクス投与の予防効果を試験するために、８週齢のマウスに６週間、ビヒクル（ｖｅｈ）、１種類の乳酸菌（Ｌ）株（Ｌ．ｐａｒａ）または３種類の菌株の混合物（Ｌ．ｍｉｘ）を投与した。投与はｏｖｘまたは偽手術の２週間前に開始した。実験の終了時に切断した大腿骨を高解像度マイクロＣＴ（μＣＴ）および末梢骨用定量的コンピューター断層撮影（ｐＱＣＴ）で解析した。ビヒクルおよびＬ．ｍｉｘを投与した偽手術群およびｏｖｘ群の皮質断面の代表的μＣＴ画像（Ａ）。大腿骨の中骨幹領域の皮質骨ミネラル量（ＢＭＣ）（Ｂ）および皮質面積（Ｃ）をｐＱＣＴによって測定した。測定値：ｍｅａｎ±ＳＥＭ（ｎ＝９〜１０），＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５．Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ  ｏｖｘ  ｖｓ．ｓｈａｍ．＃ｐ≦０．０５，ＡＮＯＶＡに続くＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔ  ｏｖｘ  Ｌ．ＰａｒａおよびＬ．ｍｉｘ  ｖｓ．ｏｖｘ  ｖｅｈ．
【図５】プロバイオティクスが皮質骨の炎症性サイトカインの産生およびＲＡＮＫＬ／ＯＰＧ比を減少させることを示す。骨再吸収を促進することが知られている遺伝子の発現のＱＲＴ−ＰＣＲ解析：ｏｖｘで誘導される骨量減少におけるプロバイオティクスの予防効果を検討するためのｏｖｘまたは偽手術の２週間前から、ビヒクルまたは３種のプロバイオティクス乳酸菌株の混合物（Ｌ．ｍｉｘ）を６週間投与した１４週齢マウスの皮質骨における（Ａ）腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、（Ｂ）インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、（Ｃ）インターロイキン−６（ＩＬ−６）、（Ｄ）核内因子κＢリガンドの受容体アクチベーター（ＲＡＮＫＬ）とオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）の比、（Ｅ）ＯＰＧと（Ｆ）ＲＡＮＫＬの各々のグラフ、および骨形成を促進することが知られている遺伝子（Ｇ）Ｏｓｔｅｒｉｘ、（Ｈ）コラーゲンタイプＩ，α１（Ｃｏｌ１α１）、（Ｉ）オステオカルシンの発現量。測定値：ｍｅａｎ±ＳＥＭ，ｎ＝９〜１０．＊Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  ｖｅｈ投与，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ．
【図６】ビヒクルを投与したｏｖｘマウスではカルシウム排泄率が増加するが、Ｌ．ｐａｒａまたはＬ．ｍｉｘを投与したマウスでは増加しないことを示す。ｏｖｘまたは偽手術の２週間前からビヒクル（ｖｅｈ）、１種類の乳酸菌（Ｌ）株（Ｌ．ｐａｒａ）または３種類の乳酸菌株の混合物（Ｌ．ｍｉｘ）を６週間投与した１４週齢マウスの血清および尿中のカルシウムとクレアチニンを測定した。尿中のカルシウム排泄率は以下の式から算出した。ＦＥＣａ＝（尿中カルシウム×血清クレアチニン）／（血清カルシウム×尿中クレアチニン）。測定値：ｍｅａｎ±ＳＥＭ，各群ｎ＝５〜１０．＊ｐ＜０．０５．Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ  ｏｖｘ  ｖｓ．ｓｈａｍ．＃ｐ＜０．０５，ＡＮＯＶＡに続くＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔ  ｏｖｘ  Ｌ．Ｐａｒａ群およびＬ．ｍｉｘ群ｖｓ．ｏｖｘ  ｖｅｈ群．
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、ひとつの実施態様において、哺乳動物、好ましくはヒトにおける骨粗鬆症の治療もしくは予防用、またはＣａ２＋イオンの吸収の増加に用いるラクトバチルス・パラカゼイから選択される少なくとも１つのプロバイオティクス菌株、またはラクトバチルス・プランタラムから選択される少なくとも１つのプロバイオティクス菌株と併用されるラクトバチルス・パラカゼイから選択される少なくとも１つのプロバイオティクス菌株に関する。
【００１７】
本発明は、ひとつの実施態様において、皮質骨量の減少を防止し、骨ミネラル含量の減少を防止し、そして、骨再吸収を防止することにより骨粗鬆症の治療もしくは予防を治療するために使用する少なくとも１つのプロバイオティクス菌株に関する。
【００１８】
皮質骨は身体の骨の約８０％を構成する。そしていくつかの研究が、皮質骨が骨強度とそれによる骨折感受性の主要な決定因子であることを示している。本発明の実験では、ラクトバチルス・パラカゼイ種のプロバイオティクス菌株の単独ものまたはラクトバチルス・プランタラム種の菌株と組み合わせたものが皮質骨量の減少を防ぐことを示す。また本発明の実験では、プロバイオティクスによる治療が骨の中の免疫状態を変化させて骨再吸収を軽減することを示す。さらに本発明の実験では、ビヒクルの群と比べてプロバイオティクスの群では骨ミネラル含量が減少しなかったことが示されている（図４ａ−ｃ）。ビヒクルの群と比べてプロバイオティクスの双方の群では皮質骨の中の骨ミネラル含量が両方とも高かった（ｐ＜０．０５、図４ｂ）。
【００１９】
本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける骨粗鬆症の治療もしくは予防用、骨ミネラル含量の減少の防止用、骨量減少の防止用のラクトバチルス・パラカゼイから選択される少なくとも１つのプロバイオティクス菌株、またはラクトバチルス・プランタラムから選択される少なくとも１つのプロバイオティクス菌株と併用されるラクトバチルス・パラカゼイから選択される少なくとも１つのプロバイオティクス菌株に関する。
【００２０】
本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける骨ミネラル含量の減少を防止するためのラクトバチルス・パラカゼイから選択される少なくとも１つのプロバイオティクス菌株、またはラクトバチルス・プランタラムから選択される少なくとも１つのプロバイオティクス菌株と併用されるラクトバチルス・パラカゼイから選択される少なくとも１つのプロバイオティクス菌株に関する。
【００２１】
本発明のひとつの実施態様においては、少なくとも２つ以上のラクトバチルス・プランタラム菌株が、少なくとも１つのラクトバチルス・パラカゼイ菌株と併用される。別の実施態様においては、少なくとも２つ以上、例えば３以上のラクトバチルス・パラカゼイ菌株が、少なくとも１つのラクトバチルス・プランタラム菌株と併用される。
【００２２】
本発明のひとつの実施態様においては、プロバイオティクス菌株は、活性化されているか、不活性化されているか、または死菌である。本発明のひとつの実施態様においては、前記の菌株は、さらに少なくとも１つの担体を含む組成物中に存在する。該担体は、例えば補助食品に従来使用されているどんな担体であってもよい。該担体は、機能性食品や他の種類の食物に使用できるオートミール担体または大麦担体などの穀物をベースとするどのような担体であってもよい。該担体は、摂取される前のプロバイオティクス菌株が混合されている水またはその他のどのような水性溶媒であってもよい。
【００２３】
本発明のひとつの実施態様においては、例えば、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、酸化カルシウム、硫酸カルシウムなどの塩の形でさらなるＣａ２＋が組成物に補われる。推奨されるＣａ２＋の一日摂取量（ＲＤＩ）は８００ｍｇである。組成物中のＣａ２＋の量は、ＲＤＩの１０〜４０％の範囲とすることができ、好ましくはＲＤＩの１５〜３０％の範囲である。したがって、組成物中のＣａ２＋の量は、例えば塩の形で、８〜３２０ｍｇ、好ましくは１２０〜２４０ｍｇとすることができる。組成物に加えられるＣａ２＋の量は、当該組成物がなお安定してその有益な効果を提供するように、上記範囲内の任意の量に調整できる。
【００２４】
組成物は、乾燥していてもよいし、非発酵型組成物または発酵型組成物であってもよい。乾燥している非発酵型組成物の場合、発酵は組成物の摂取後に個別に、すなわち消化管内で行われる。さらに、菌株は凍結乾燥された菌株として組成物中に存在していてもよい。
【００２５】
ラクトバチルス・パラカゼイのプロバイオティクス菌株は、ラクトバチルス・パラカゼイ  ８７００：２，ＤＳＭ  １３４３４およびラクトバチルス・パラカゼイ  ０２：Ａ，ＤＳＭ  １３４３２から選択することができ、ラクトバチルス・プランタラムのプロバイオティクス菌株は、ラクトバチルス・プランタラム  ２９９，ＤＳＭ  ６５９５、ラクトバチルス・プランタラム  ２９９ｖ，ＤＳＭ  ９８４３、ラクトバチルス・プランタラム  ＨＥＡＬ  ９，ＤＳＭ  １５３１２、ラクトバチルス・プランタラム  ＨＥＡＬ  １９，ＤＳＭ  １５３１３およびラクトバチルス・プランタラム  ＨＥＡＬ  ９９，ＤＳＭ  １５３１６から選択することができる。
【００２６】
ラクトバチルス・パラカゼイ  ８７００：２，ＤＳＭ  １３４３４およびラクトバチルス・パラカゼイ  ０２：Ａ，ＤＳＭ  １３４３２の両者は、２０００年４月１０日にｔｈｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｍｓｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに寄託された。
【００２７】
ラクトバチルス・プランタラム  ＨＥＡＬ  ９，ＤＳＭ  １５３１２、ラクトバチルス・プランタラム  ＨＥＡＬ  １９，ＤＳＭ  １５３１３およびラクトバチルス・プランタラム  ＨＥＡＬ  ９９，ＤＳＭ  １５３１６は、２００２年１１月２８日にｔｈｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｍｓｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに寄託された。
【００２８】
ラクトバチルス・プランタラム  ２９９ｖ，ＤＳＭ  ９８４３は、１９９５年３月２１日に、ラクトバチルス・プランタラム  ２９９，ＤＳＭ  ６５９５は、１９９１年７月５日にｔｈｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｍｓｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに寄託された。
【００２９】
本発明のひとつの実施態様においては、少なくとも１つの菌株を含む組成物は、食品、補助食品、医療食、機能性食品および栄養製品から成る群から選択することができる。
【００３０】
前記の組成物が食品である場合、飲料、ヨーグルト、ジュース、アイスクリーム、パン、ビスケット、シリアル、健康バーおよびスプレッドを含む群からそれを選択することができる。
【００３１】
上記の菌株のいずれかが補助食品などの組成物に使用される場合、加えられる担体は当業者に公知である。一般的に補助食品に使用される他の成分はどれも当業者に公知であり、また通常、菌株と共に加えることができる。
【００３２】
本発明のひとつの実施態様においては、上記のプロバイオティクス菌株は組成物中に約１×１０６〜約１×１０１４ＣＦＵの量で、好ましくは１×１０８〜１×１０１２ＣＦＵの量で、より好ましくは１×１０９〜１×１０１１ＣＦＵの量で存在している。菌株はまた単独で上記の量を水もしくは任意の他の水性媒体に、摂取前に菌株を加えるか混合して使用することもできる。
【００３３】
本発明は、哺乳動物、好ましくは骨量減少や、骨ミネラル含量の減少や、骨量減少もしくは骨再吸収が増加していることが問題となっているまたは問題となりそうな任意のヒト、例えば高齢者、閉経後の女性、閉経前の女性などに使用されることが適切である。
【００３４】
また健康な人々は、健康なままでいられるように自然に本発明の利益を得て、骨粗鬆症により病気になることを防ぐことができる。
【実施例】
【００３５】
実験１
材料と方法
輸送用溶液：全容積６ｍｌ
輸送用溶液には、Ｃａ、Ｍｇ、Ｈｅｐｅｓ（２％）、グルタミン（４ｍＭ）、Ｄ−Ｇｌｃ（３．５ｇ／ｌ）およびＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（１．４７ｇ／ｌ）を含むハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）が含まれる。溶液の［Ｃａ２＋］濃度は１０．６５ｍＭである。
【００３６】
基本溶液
輸送用溶液と類似であるが外在のカルシウムを添加していない。この溶液の［Ｃａ２＋］濃度は１．２２ｍＭである。
【００３７】
実験１：
１．輸送用溶液のみのコントロール
２．輸送用溶液中に４．０２×１０８菌／６ｍｌ相当の凍結乾燥した０．７８８ｍｇのラクトバチルス・プランタラム  ２９９ｖ株
３．輸送用溶液中に４．０２×１０８菌／６ｍｌ相当のラクトバチルス・プランタラム  ２９９ｖ株
４．輸送用溶液中に４．９５×１０８菌／６ｍｌ相当のラクトバチルス・プランタラム  ２９９株
５．輸送用溶液中に４．９５×１０８菌／６ｍｌ相当のラクトバチルス・プランタラム  ＨＥＡＬ  １９株
６．輸送用溶液中に４．９５×１０８菌／６ｍｌ相当のＡＭＪ  １２７７株。ＡＭＪ  １２７７はラクトバチルス・プランタラム  ２９９ｖの変異株である。
【００３８】
実験２：
１．ラクトバチルス・アシドフィルス  ＣＮＣＭ  Ｉ−２３３２株（Ｌａ１０）：輸送用溶液中に＋４．９５×１０８菌／６ｍｌ相当
２．ラクトバチルス・プランタラム  ２９９  ｖ株：輸送用溶液中に４．０２×１０８菌／６ｍｌ相当
３．コントロール：輸送用溶液のみ
【００３９】
Ｌａ１０株以外のすべて菌株は、３０ｍｌのＭＲＳで好気培養した（３０°Ｃ，２１０ｒｐｍ）。Ｌａ１０株は３７°Ｃで培養し、密閉前に無菌濾過した窒素で覆った。接種した細胞数は３×１０８／フラスコであった。その菌株を一晩、前培養し、接種の対数増殖期とした。その細胞をＯＤ６００＝０．１〜０．５で集菌し、４．０２×１０８細胞数相当の量のそれぞれの菌株を集めた。これらのサンプルを５，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を捨て、細胞をＮａＣｌ溶液（０．９％）で再懸濁した。細胞を再度遠心し、上清を捨てた。その後、新しく洗浄されたペレットを輸送用溶液で懸濁した。
【００４０】
Ｃａｃｏ−２細胞を試験の前にＰＢＳで２回洗浄した。輸送用溶液に４５ＣａＣｌ２（７４ｋＢｑ／ｍｌ）を加えた。その後、インサート上で培養したＣａｃｏ−２細胞の頂端にその混合物を０．５ｍｌの量で加えた。その後、それぞれのウェルでは６．７×１０７菌／ｍｌが得られた。ＨＢＳＳに内在性の［Ｃａ２＋］（１．２２ｍＭ）のみを含む基本溶液（１．５ｍｌ）を基底チャンバーに加えた。懸濁液およびコントロール液をＣａｃｏ−２細胞上で２時間作用させた。その後、溶液を吸引し、国際公開ＷＯ９９／０２１７０に記載された方法に従って細胞を氷冷の洗浄緩衝液で３回洗浄した。次いで、Ｃａｃｏ−２細胞を０．５ｍｌのＮａＯＨ溶液（０．５Ｍ）で溶解した。シンチレーター（Ｔｒｉ−ｃａｒｂ  ２８００ＴＲ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を利用して輸送を測定するために基底チャンバー内の溶液を回収した。溶解液中の４５Ｃａとタンパク含有量を解析した。Ｃａ２＋の輸送／取り込みの測定値はすべて各細胞のタンパク含有量で補正した。経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）について試験溶液を用いて培養前および培養後にすべてのウェルを試験した。試験前および試験後でＴＥＥＲに違いはみられなかった。ＴＥＥＲは上皮細胞に漏れがないことを確認するために測定した。試験後の抵抗性の違いにより、細胞間結合が使用した溶液によってダメージを受けているという疑いが生じる場合がある。
【００４１】
結果
実験１および２の結果を比較するために、検討した菌株の輸送データおよび取り込みデータを菌を含まないコントロール溶液で標準化した。したがって、すべての結果はコントロールに対するパーセントで示されている（国際公開ＷＯ９９／０２１７０での実施と同様）。また、実験１および２は、それぞれ細胞培養の１６日目と２１日目に実施したことに意味がある。一般的に、得られる結果の標準誤差は比較的大きい。これは菌体とＣａ２＋の凝集によるものであり、Ｃａ２＋の利用可能性のバラつきを導く。これは、標準誤差が残りのサンプルと比較して比較的小さかった凍結乾燥菌体では観察されない。
【００４２】
Ｃａ２＋の輸送
実験１の結果は、ＡＭＪ  １２７７株が存在する場合のＣａ２＋輸送が有意に改善していることを示す（１３４．７±１８．９％，ｐ＝０．００２）（図１参照）。他の菌株（Ｌｐ２９９ｖの凍結乾燥および生菌、Ｌｐ２９９，Ｌｐ  ＨＥＡＬ  １９）では、Ｃａ２＋輸送に有意な違いはなかった（表１参照）。Ｌａ１０とＬｐ２９９ｖを検討した実験２では、Ｌｐ２９９ｖと菌体を含まないコントロールのサンプルを比較した場合、Ｃａ２＋輸送に有意な差は検出されなかった（ｐ＝０．２）。Ｌａ１０に関しては、同じ菌体の存在下でＣａ２＋輸送の僅かな減少がみられ（７９．５±１９．３％）、この変化は有意なものであった（ｐ＝０，０４９）。
【００４３】
Ｃａ２＋の取り込み
ここに示す取り込みデータは、２時間後に細胞中に存在するＣａ２＋の量を示している。
実際の取り込みデータを推量するためには、細胞内のＣａ２＋量に外側部分で検出されたＣａ２＋量を加えるべきである。これらのデータの合計は、腸管側の膜を通して輸送されたＣａ２＋の総量を示している。一般的に、これらの実験の結果は、菌体を含まないコントロールと比較すると、菌体の存在下で細胞内［Ｃａ２＋］が減少していることを示している（図２参照）。しかしながら、Ｌｐ２９９ｖ凍結乾燥菌体とＬｐ２９９ｖ生菌の間にのみ有意な差が認められた（ｐ＝０．０４およびｐ＝０．０２）。備考：中間の細胞内Ｃａ２＋レベルはＣａ２＋の輸送量に比べてわずか数パーセントである。そのため、示されたＣａ２＋の取り込みへの影響は輸送への影響と同じではない。高い細胞内［Ｃａ２＋］を有しているが、輸送の改善が認められないことは、Ｌｐ  ２９９ｖの凍結乾燥菌および生菌で観察される。
【００４４】
結論
ラクトバチルス・プランタラム２９９ｖの変異株であるＡＭＪ１２７７株の存在下において、コントロールおよび他の菌株の両方に比べて、カルシウムの輸送および総取り込み量が増加した。すなわち、検討した菌株間で違いがみられた。
【００４５】
実験３
卵巣摘出マウスモデルとプロバイオティクス投与
卵巣摘出（ｏｖｘ）は免疫状態の変化に関連した骨量減少をもたらす。本実験の目的は、プロバイオティクス投与がマウスの卵巣摘出による誘導骨量減少を予防するかどうかを検討することであった。卵巣摘出手術の２週間前から開始し、６週間飲料水で与えることによって１種類の乳酸菌（Ｌ）株であるＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉ  ＤＳＭ  １３４３４株（Ｌ．ｐａｒａ）、またはＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉ  ＤＳＭ  １３４３４株、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＤＳＭ  １５３１２株およびＤＳＭ  １５３１３株の３種類の菌株の混合物のいずれかをマウスに投与した。
【００４６】
６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎ雌マウスをチャールスリバー（ドイツ）から購入した。マウスを温度（２２℃）および光周期（１２時間明所、１２時間暗所）をコントロールした標準の動物施設に収容し、新鮮な水とダイズを含まない固形飼料Ｒ７０（Ｌａｃｔａｍｉｎ  ＡＢ，ストックホルム，スウェーデン）を自由に摂取させた。骨粗鬆症のための卵巣摘出（ｏｖｘ）モデルは、閉経後骨粗鬆症の治療に使用される薬剤の前臨床評価および臨床評価のためのＦＤＡガイドラインに含まれている。卵巣摘出によって誘導される骨量減少に対するプロバイオティクス投与の予防効果を検討するためにプロバイオティクス投与を卵巣摘出手術の２週間前から開始した。１種類の乳酸菌（Ｌ）株であるＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉ  ＤＳＭ  １３４３４（Ｌ．ｐａｒａ）またはＬ．ｍｉｘと示した３種類の菌株の混合物（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ  ＤＳＭ  １３４３４，Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＤＳＭ  １５３１２およびＤＳＭ  １５３１３）をマウスに６週間投与した。プロバイオティクス株は抗炎症性に基づき選択された。乳酸菌株は１０コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍｌの濃度で飲料水で与え、コントロールマウスにはビヒクルとともに水道水を与えた。水のボトルは毎日午後に交換した。水のボトル内の乳酸菌（Ｌ）株の生存は定期的にチェックし、２４時間後にはその濃度は、約１０８ｃｆｕ／ｍｌと１対数単位低下した。各マウスは１日平均４．５ｍｌ飲水した。プロバイオティクス投与開始の２週間後にマウスに対してイソフルレン（Ｆｏｒｅｎｅ；Ａｂｂｏｔ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ，ソールナ，スウェーデン）を用いた吸入麻酔下で偽手術またはｏｖｘを実施した。手術の４週間後に、ケタラール／ドミトール  ｖｅｔを用いた麻酔下で腋窩静脈から採血し、次に、頚椎脱臼によってマウスを屠殺した。ＲＮＡを準備するために直ぐに組織を切除し、後の解析のために液体窒素中で急速凍結した。骨を切除し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。すべての動物実験はイェーテボリ大学の動物研究の地域倫理委員会で承認された。
【００４７】
末梢骨用定量的コンピューター断層撮影（ｐＱＣＴ）
７０μｍ，ａｓの解像度で作動するｐＱＣＴ  ＸＣＴ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  Ｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．５Ｂ，ノーランド，Ｆｏｒｔ  Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｗｌ，ＵＳＡ）を用いてコンピューター断層撮影スキャンを実施した。皮質骨パラメータは大腿骨の中間骨幹領域をｅｘ  ｖｉｖｏで解析した。
【００４８】
高解像度μＣＴ
高解像度μＣＴ解析は１１７２モデルμＣＴ（Ｂｒｕｋｅｒ  ｍｉｃｒｏ−ＣＴ，アールツェラール、ベルギー）を使用することによって、遠位大腿骨で実施した。Ｘ線管  電圧５０ｋＶ、電流２０１μΑ、０．５ｍｍアルミニウムフィルターを用いて大腿骨の画像を撮った。走査回転角は１８０°、増大角は０．７０°であった。ボクセルサイズは等方向的に４．４８μｍであった。スキャンの後、再構成するためにＮＲｅｃｏｎ（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．６．９）を使用した。大腿骨において遠位成長板の近位にある海綿骨を選択し、対象物（皮質骨を除く）の適合体積内で、成長板から５３８．５μｍの距離から開始し、近位方向においてさらに１３４．５μｍの縦の距離に広げて解析した。皮質の測定は大腿骨の骨幹領域において、成長板から３．５９ｍｍの距離で開始し、さらに近位方向に縦１３４．５μｍの距離に広げて実施した。ＢＭＤ解析のためにセラミックの標準サンプルを用いて装置を較正した。
【００４９】
ＲＮＡの単離とリアルタイムＰＣＲ
ＴｒｉＺｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，リディンゲ，スウェーデン）を用いて皮質骨（大腿骨の末端を切り離し、凍結前にＰＢＳで骨髄を洗い流したもの）および骨髄から全ＲＮＡを準備した。高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（＃４３６８８１４，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ストックホルム，スウェーデン）を用いて、このＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００  遺伝子配列検出システム（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＲＴ−ＰＣＲ解析を実施した。ＩＬ−６（Ｍｍ００４４６１９０＿ｍ１）、ＩＬ−１β（Ｍｍ００４３４２２８＿ｍ１）、ＴＮＦα（Ｍｍ００４４３２５８＿ｍ１）、ＲＡＮＫＬ（Ｍｍ００４４１９０８＿ｍ１）、ＯＰＧ（Ｍｍ００４３５４５２＿ｍ１）、Ｒｕｎｘ２（Ｍｍ００５０１５８０＿ｍ１）、Ｃｏｌ１α１（Ｍｍ００８０１６６６＿ｇ１）、オステオカルシン（Ｍｍ０１７４１７７１＿ｇ１  ）およびＴＧＦβ１（Ｍｍ０３０２４０５３＿ｍ１）のｍＲＮＡレベルを解析するために事前に設定されたＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（スウェーデン）のＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用した。「標準曲線法」を用いてそれぞれの遺伝子のｍＲＮＡ量を算出し（ユーザー報告２：ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１８Ｓ（４３０８３２９）リボゾームＲＮＡの発現量で補正した。
【００５０】
血液分析
血清および尿中のカルシウム量［ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ（商品名）Ｃａｌｃｉｕｍ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＤＩＣＡ−５００），Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ］並びに血清および尿中のクレアチニン量（Ｍｏｕｓｅ  Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ  Ｋｉｔ，Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ，Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ，ＵＳＡ）は、取り扱い説明書に従って解析を行った。骨吸収のマーカーとしてタイプＩコラーゲン断片の血清レベルをＲａｔＬａｐｓ  ＥＬＩＳＡキット（Ｎｏｒｄｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｈｅｒｌｅｖ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて評価した。骨形成のマーカーであるオステオカルシンの血清レベルは、マウスのオステオカルシン免疫放射測定キット（Ｉｍｍｕｔｏｐｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｃｌｅｍｅｎｔｅ，ＣＡ）を用いて測定した。
【００５１】
フローサイトメトリー
シリンジを用いて１つの大腿骨の骨腔内に５ｍｌのＰＢＳを通して洗い流すことによって骨髄細胞を採取した。５１５ｇで５分間遠心した後、赤血球を溶解するために、沈殿した細胞をＴｒｉｓ緩衝液０．８３％  ＮＨ４Ｃｌ溶液（ｐＨ  ７．２９）に５分間再懸濁した後、ＰＢＳで洗浄した。使用する前に骨髄細胞をＲＰＭＩ培養液（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，パシング、オーストリア）に再懸濁した。骨髄細胞中の総白血球数は自動細胞数測定装置（Ｓｙｓｍｅｘ，ハンブルク、ドイツ）を用いて算出した。フローサイトメトリー解析のために、ヘルパーＴ細胞を検出するためのアロフィコシアニン（ＡＰＣ）を結合したＣＤ４抗体（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）および細胞障害性Ｔ細胞を検出するためのフルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を結合したＣＤ８抗体（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、または顆粒球を測定するためのＧｒ−１／Ｌｙ−６Ｇに対するペリジニンクロロフィルタンパク（ＰｅｒＣＰ）を結合した抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＯＣＬ前駆体細胞を検出するためのＦＩＴＣを結合したＣＤ１１ｂ抗体（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて細胞を染色した。その後、その細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，フランクリン・レイクス，ＮＪ  ＵＳＡ）の蛍光活性化自動細胞測定装置（ＦＡＣＳ）で処理し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアを用いて解析した。結果は細胞比率（％）として示した。
【００５２】
統計的分析
すべての統計結果をｍｅａｎｓ±ＳＥＭとして示す。群間差は対応のないｔ検定を用いて解析した。多群間の比較は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて解析し、多重比較を補正するためにＤｕｎｎｅｔｔ検定を実施した。両側検定においてｐ≦０．０５は、有意差があると判断した。
【００５３】
結果−プロバイオティック投与は、マウスのｏｖｘによる皮質骨量減少および骨の再吸収増加を予防する
ｏｖｘによる皮質骨量減少に対するプロバイオティック投与の予防効果を検討するために、８週齢のマウスにビヒクル（ｖｅｈ）、１種類の乳酸菌（Ｌ）株（Ｌ．ｐａｒａ）、または３種類の菌株の混合物（Ｌ．ｍｉｘ）をｏｖｘまたは偽手術の２週間前から開始し、６週間投与した（図３Ａ）。子宮重量はエストロゲン状態の指標として使用でき、ｏｖｘはすべての投与群で同じように子宮重量が予想どおりに減少した。さらに、すべての投与群においてｏｖｘにより体重、脂肪量および胸腺重量が増加した（図３Ｂ、表２）。
【００５４】
ビヒクルを投与したマウスでは、ｏｖｘは大腿骨の中間骨幹領域における皮質骨無機物含量および皮質横断面骨範囲を減少させた（ｐ＜０．０１、図４ａ〜ｃ）。重要なことに、Ｌ．ｐａｒａ投与群またはＬ．ｍｉｘ投与群のマウスにおいて、ｏｖｘは皮質骨無機物含量または皮質横断面骨範囲を減少させなかった（図４ａ〜ｃ）。ビヒクルを投与したｏｖｘマウスに比べてＬ．ｐａｒａを投与したｏｖｘマウスおよびＬ．ｍｉｘを投与したｏｖｘマウスでは皮質骨無機物含量は高かった（ｐ＜０．０５、図４ｂ）。影響を受けた骨吸収によって引き起こされる皮質骨に対するプロバイオティクスの予防効果を検討するために、Ｃ末端テロペプチド（ＲａｔＬａｐｓ）の血清レベルを解析した。ｏｖｘにより、ビヒクルを投与したマウスにおいてＲａｔＬａｐｓレベルが増加したが（＋４５±１１％、偽手術群に対しｐ＜０．０５）、Ｌ．ｐａｒａ投与マウス（２０±９％、有意差なし）またはＬ．ｍｉｘ投与マウス（２３±９％、有意差なし）では増加しなかった。血清オステオカルシンによって示される骨形成は、プロバイオティクス投与によってほとんど影響を受けなかった（データ未記載）。大腿骨の遠位骨幹端領域における海綿骨パラメータ（ＢＶ／ＴＶおよび海綿骨ＢＭＤ）は、すべての投与群においてｏｖｘによって有意に減少した（ｐ＜０．０５、表１）。これらの結果から、プロバイオティクス投与により、マウスのｏｖｘによる皮質骨量の減少および骨吸収の増加を予防することが示された。
【００５５】
プロバイオティクスは、皮質骨の炎症性サイトカインの発現およびＲＡＮＫＬ／ＯＰＧ比を減少させる。
ｏｖｘ誘導性の皮質骨量減少に対するプロバイオティクス投与の効果のメカニズムを調べるために、皮質骨の骨関連のｍＲＮＡ転写物を測定した（図５）。破骨細胞形成を促進する骨髄細胞によって産生される炎症性サイトカインであるＴＮＦαおよび骨のＴＮＦαの効果を抑制制御するＩＬ−１βのｍＲＮＡレベルは、ｏｖｘマウスのビヒクル投与と比較するとプロバイオティクス投与によって有意に減少した（ＴＮＦα−４６％，ｐ＜０．０５；ＩＬ−１β−６１％，ｐ＜０．０５，図５ａおよび図５ｂ）。ＩＬ−６の発現は投与群間で差はなかったが、プロバイオティクス投与群において発現が減少する傾向にあった（−２０％，ｐ＝０．１２，図５ｃ）。
【００５６】
ＲＡＮＫＬ／オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）比は、破骨細胞形成およびそれによる骨吸収の主要決定因子である。重要なことに、プロバイオティクス投与はＲＡＮＫＬ／ＯＰＧ比を減少させ（−４５％、ビヒクルに対しｐ＜０．０５、図５ｄ）、これはＯＰＧ発現の増加によって引き起こされる（ＯＰＧ；＋２８％，ｐ＜０．０５およびＲＡＮＫＬ；＋１％，有意差なし，図５ｅ、ｆ）。反対に、Ｏｓｔｅｒｉｘ、Ｃｏｌ１α１およびオステオカルシンの３つの骨芽関連遺伝子のｍＲＮＡレベルはプロバイオティクス投与によって影響を受けなかった（図５ｇ〜ｈ）。
【００５７】
骨髄の免疫状態
プロバイオティクス菌によって生じる抗炎症効果のいくつかは制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）誘導を介していると考えられる。骨髄のＦＡＣＳ解析では、Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  Ｆｏｘｐ３＋）の発現頻度がビヒクル投与されたマウスではｏｖｘによって減少したが、プロバイオティクス投与マウスでは減少しなかった（表２）。Ｔｒｅｇ細胞は、その誘導や維持がＴＧＦβに依存しており、ＴＧＦβ１の発現はビヒクル投与したｏｖｘマウスと比較すると、プロバイオティクス投与したｏｖｘマウスの骨髄において増加した（＋７７±１９％，ｐ＜０．０１）。
【００５８】
また、プロバイオティクス投与が破骨細胞の前駆細胞（ｐｒｅＯＣＬ）の発現頻度を変化させるかどうかを検討した。骨髄中のｐｒｅＯＣＬ（ＣＤ１１ｂ＋  Ｇｒ１−）の発現は、いずれの投与群においてもｏｖｘによって影響されなかった（表２）。
【００５９】
無機質代謝
カルシウムの尿分画排泄率（ＦＥＣａ＝（尿中Ｃａ×血清クレアチニン）／（血清Ｃａ×尿中クレアチン））は、ビヒクル投与したマウスではｏｖｘによって増加した（＋８６％，ｐ＜０．０５，図６）。ｏｖｘによるＦＥＣａの増加はプロバイオティクス投与によって完全に阻害され、カルシウム増加を増大させることが示唆された（図６）。ビヒクル投与したマウスでは、ｏｖｘ後に血清カルシウムレベルの増加傾向がみられたが、プロバイオティクス投与マウスでは認められなかった（＋１３％，ｐ＝０．０５，表３）。尿中カルシウム／クレアチニン比はいずれの投与群でもｏｖｘの影響を受けなかった（表３）。
【００６０】
【表１】
2016521123.tif 000003
【００６１】
【表２】
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【００６２】
表１：８週齢マウスのエストロゲン反応性の組織重量、海綿骨および骨髄中の免疫細胞。
海綿骨パラメータは、大腿骨の遠位骨幹端領域の高解像度μＣＴによって解析された：組織体積あたりの海綿骨パーセンテージ（ＢＶ／ＴＶ）；海綿骨の無機物密度（ＢＭＤ）。大腿骨骨髄細胞をＣＤ４，Ｆｏｘｐ３，ＣＤ２５，ＣＤ１１ｂおよびＧｒ１を認識する抗体を用いて染色した。値は総骨髄細胞数中のＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋、Ｆｏｘｐ３＋、ＣＤ２５＋）またはｐｒｅ−ＯＣＬ細胞（ＣＤ１１ｂ＋、Ｇｒ１−）のパーセンテージで示す。結果は各群、ｍｅａｎ±ＳＥＭ，ｎ＝６〜１０、群間は＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ  ｏｖｘ  ｖｓ．ｓｈａｍ，＃ｐ＜０．０５，ＡＮＯＶＡ−Ｄｕｎｎｅｔｔｓで示す。
【００６３】
【表３】
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【００６４】
表２：１４週齢マウスの血清および尿中の無機質代謝カルシウムおよびクレアチニンを測定した。結果は、各群、ｍｅａｎ±ＳＥＭ，ｎ＝５〜１０、群間差は＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５，（＊）ｐ＝０．０５。Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ  ｏｖｘ  ｖｓ．ｓｈａｍ，＃ｐ＜０．０５，ＡＮＯＶＡ−Ｄｕｎｎｅｔｔｓで示す。
【００６５】
結論として、本発明に関するデータは、飲水中のプロバイオティクスによりｏｖｘ誘導による皮質骨量減少が小さくなることを示し、閉経後骨粗鬆症の治療において有効な治療であることが示唆された。さらに、この結果は骨量の制御に関する腸内細菌の役割を裏付けている。
【００６６】
Ｌ．ｐａｒａおよびＬ．ｍｉｘの両投与とも、マウスのｏｖｘによって誘導される皮質骨量減少および骨吸収の増加を予防した。皮質骨の無機質含量はビヒクル投与したｏｖｘマウスに比較し、Ｌ．ｐａｒａ投与したｏｖｘマウスおよびＬ．ｍｉｘ投与したｏｖｘマウスの両方で高かった。カルシウムの尿分画排泄と再吸収マーカーであるＲａｔＬａｐｓはビヒクル投与マウスではｏｖｘによって増加したが、Ｌ．ｐａｒａ投与マウスおよびＬ．ｍｉｘ投与マウスでは増加しなかった。したがって、プロバイオティクスはｏｖｘによって誘導される尿中カルシウム排泄を阻害する。プロバイオティクス投与はＴＮＦαおよびＩＬ−６の２つの炎症性サイトカインの発現を減少させ、ｏｖｘマウスの皮質骨のＯＰＧ発現を増加させた。さらに、ｏｖｘはビヒクル投与マウスの骨髄中の制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  Ｆｏｘｐ３＋）の発現頻度を減少させたが、プロバイオティクス投与マウスでは減少させなかった。すなわち、プロバイオティクスは、ｏｖｘが骨髄中の制御性Ｔ細胞の発現頻度を減少させることを阻害する。さらに、プロバイオティクスは、骨髄中のＴＧＦｂ１の発現を増加させ、ｏｖｘによって誘導される再吸収マーカーであるＲａｔ  Ｌａｐの増加を阻害する。結論としてＬ．ｐａｒａおよびＬ．ｍｉｘの投与はｏｖｘによって誘導される皮質骨量減少を予防する。本発明の結果は、これらのプロバイオティクス投与が炎症性サイトカインの発現の減少およびＯＰＧの発現の増加で示される骨の免疫状態を変化させ、その結果、ｏｖｘマウスの骨の再吸収を軽減させることを示す。
【００６７】
実験４
本実験では、上述のものと同じプロバイオティクスが、卵巣摘出し、それにより既に骨量が減少している雌マウスにおいて、上記と同じパラメータ（すなわち、皮質骨量、骨無機質含量、骨再吸収）に影響するかどうかを検討する。卵巣摘出雌マウスは女性の閉経後の骨量減少のモデルとして確立されている。実験のタイムラインを下記に示す。
卵巣摘出マウス→４週間→６週間のプロバイオティクス投与→終了
【００６８】
プロバイオティクスは、飲料水中で与え、卵巣摘出後４週間目からまず開始する。投与量は１０９ｃｆｕ／ｍｌ／日であり、卵巣摘出手術は９〜１０週齢時に実施する。実験終了後の解析は骨の密度および厚さの測定（ＣＴ）、並びに、血清解析および骨マーカーである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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