(57)【要約】  本発明は、メチロバクテリウム属の細菌の培養方法を提供する。特に、前記方法は、それらの細菌の効率的で安価な培養のための方法を提供する。さらに、本発明は植物農業を改良するためのこれらの細菌培養の使用のための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
連続相と、連続相中で不混和性であるか又は部分的にのみ混和性である分散相とを含むエマルション中でメチロバクテリウム（Methylobacterium）を成長させ、それによってメチロバクテリウム調製物を得ることを含む、メチロバクテリウム調製物を得るための方法。
【請求項２】
前記メチロバクテリウムが、メチロバクテリウムの単独培養物又は共生培養物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）分散相が非水性液体を含み、かつ連続相が水性液体を含み、又は（ｂ）分散相が水性液体を含み、かつ連続相が非水性液体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記非水性液体が、２５℃でｎ−ペンタノールの混和性以下である水中での混和性を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記連続相に相応する液体を含む非エマルション中で成長させることを除いて同一の条件下でメチロバクテリウムを成長させることによって得られる収率と比較して、分散相が前記メチロバクテリウムの増加した収率を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
さらに、培地中で成長させたメチロバクテリウムを採収することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記エマルションが、さらに、エマルションを安定化するために十分な量で乳化剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記乳化剤が、増粘剤、界面活性剤及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記非水性液体が、アルコール、アルデヒド、ケトン、脂肪酸、リン脂質、又はそれらのあらゆる組合せを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記アルコールが、少なくとも５個の炭素を含む脂肪族アルコール及びステロールからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記非水性液体が、動物油、微生物油、合成油又は植物油の１つ以上を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記植物油が、トウモロコシ、大豆、綿、ピーナッツ、ヒマワリ、オリーブ、亜麻、ココナッツ、ヤシ、菜種、ゴマ種子、ベニバナ、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記エマルションが、光合成微生物を含まず、又は前記エマルションが、さらに、メチロバクテリウム以外の予め決められた同一性の光合成微生物でない微生物の１種以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記分散相が、少なくとも約０．０２質量％〜約２０質量％のエマルションを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記非水性液体が、農業的に認容性の助剤又は農業的に認容性の付形剤である、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
前記成長が、前記メチロバクテリウムを前記エマルションに接種し、前記接種されたエマルションを、前記メチロバクテリウムの成長を提供するために十分な条件下でインキュベートするステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記メチロバクテリウムが、Ｍ．アミノボランス（M. aminovorans）、Ｍ．クロロメタニカム（M. chloromethanicum）、Ｍ．ジクロロメタニカム（M. dichloromethanicum）、Ｍ．エキストロクエンス（M. extorquens）、Ｍ．フジサワエンス（M. fujisawaense）、Ｍ．メソフィリカム（M. mesophilicum）、Ｍ．オルガノフィラム（M. organophilum）、Ｍ．ラジオトレランス（M. radiotolerans）、Ｍ．ロデシアナム（M. rhodesianum）、Ｍ．ロジナム（M. rhodinum）、Ｍ．チオシアナツム（M. thiocyanatum）、Ｍ．ノデュランス（M.nodulans）、Ｍ．セラスチイ（M. cerastii）、Ｍ．ゴジピコーラ（M. gossipiicola）、メチロバクテリウム種の株ＬＭＧ６３７８、Ｍ．フィロスフェラ（M. phyllosphaerae）、Ｍ．オリゼ（M. oryzae）、Ｍ．プラタニ（M. platani）、Ｍ．ポプリ（M. populi）、及びＭ．ザトマニイ（M. zatmanii）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記エマルションが、実質的に微生物の混入を有さない、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記採取が、メチロバクテリウムの全て又は一部をエマルションから回収することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が、さらに、回収したメチロバクテリウムの一部を脱水することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１から２０までのいずれか１項に記載の方法によって得られるメチロバクテリウム調製物であって、分散相又は連続相のいずれかが、２５℃でｎ−ペンタノールの混和性以下である水中での混和性を有する非水性液体を含む、前記メチロバクテリウム調製物。
【請求項２２】
植物又は植物の一部に、請求項２１に記載のメチロバクテリウム調製物を含有する組成物を適用するステップを含む、植物又は植物の一部をメチロバクテリウムで処理するための方法。
【請求項２３】
前記組成物が、さらに、農業的に認容性の助剤又は農業的に認容性の付形剤を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物は固体物質がない、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記植物の一部が種子であり、かつ前記組成物が、前記組成物１グラムあたり少なくとも約５×１０8コロニー形成単位〜前記組成物１グラムあたり約５×１０13コロニー形成単位のメチロバクテリウム価を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記植物の一部が、種子、茎、根、花、子葉、子葉鞘、果実又は葉である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記植物又は植物の一部が、トウモロコシ、アブラナ種、アルファルファ、米、ライ麦、モロコシ、トウジンヒエ、キビ、アワ、シコクビエ、ヒマワリ、ベニバナ、大豆、タバコ、ジャガイモ、ピーナッツ、綿、サツマイモ、キャッサバ、コーヒー、ココナッツ、パイナップル、シトラスツリー、カカオ、茶、バナナ、アボカド、イチジク、グァバ、マンゴー、オリーブ、パパイア、カシュー、マカダミア、アーモンド、テンサイ、サトウキビ、オート麦、大麦、トマト、レタス、グリーンビーンズ、ライマメ、エンドウ、ウリ科、観葉植物、又は針葉樹の植物又は植物の一部である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２２から２７のいずれか１項に記載の方法によって得られる植物又は植物の一部であって、メチロバクテリウム調製物で少なくとも部分的に被覆されている、前記植物又は植物の一部。
【請求項２９】
請求項２８に記載の植物又は植物の一部から得られる加工された植物生成物であって、エマルションを含む、前記加工された植物生成物。
【請求項３０】
前記生成物が、ミール、ペースト、粉、フレーク又は飼料である、請求項２９に記載の加工された植物生成物。
【請求項３１】
請求項２９又は３０に記載の加工された植物生成物であって、再生可能ではない、前記加工された植物生成物。
【請求項３２】
連続相と、連続相中で不混和性であるか又は部分的にのみ混和性である分散相とを含むエマルション、及びメチロバクテリウムの単独培養物又は共生培養物を含む発酵生成物。
【請求項３３】
（ａ）分散相が非水性液体を含み、かつ連続相が水性液体を含み、又は（ｂ）分散相が水性液体を含み、かつ連続相が非水性液体を含む、請求項３２に記載の発酵生成物。
【請求項３４】
前記非水性液体が、２５℃でｎ−ペンタノールの混和性以下である水中での混和性を有する、請求項３３に記載の発酵生成物。
【請求項３５】
前記発酵生成物が、実質的に微生物の混入を有さない、請求項３２に記載の発酵生成物。
【請求項３６】
前記発酵生成物が、さらに、メチロバクテリウム以外の予め決められた同一性の微生物の１種以上を含む、請求項３２に記載の発酵生成物。
【請求項３７】
前記発酵生成物は固体物質がない、請求項３２に記載の発酵生成物。
【請求項３８】
前記生成物が、光合成微生物を含まない、請求項３２に記載の発酵生成物。
【請求項３９】
連続相と分散相とを含むエマルション、及びメチロバクテリウムの単独培養物又は共生培養物を含有する組成物であって、（ａ）分散相が非水性液体を含み、かつ連続相が水性液体を含み、又は（ｂ）分散相が水性液体を含み、かつ連続相が非水性液体を含み、前記非水性液体が、２５℃でｎ−ペンタノールの混和性以下である水中での混和性を有する、前記組成物。
【請求項４０】
前記組成物が、実質的に微生物の混入を有さない、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記組成物が、さらに、農業的に認容性の助剤及び／又は農業的に認容性の付形剤の少なくとも１つを含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４２】
前記組成物は固体物質がない、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４３】
第二の液体が、アルコール、アルデヒド、ケトン、脂肪酸、リン脂質、又はそれらのあらゆる組合せを含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４４】
前記アルコールが、少なくとも５個の炭素を含む脂肪族アルコール及びステロールからなる群から選択される、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４５】
第二の液体が、動物油、微生物油、合成油又は植物油の１つ以上を含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４６】
前記植物油が、トウモロコシ、大豆、綿、ピーナッツ、ヒマワリ、オリーブ、亜麻、ココナッツ、ヤシ、菜種、ゴマ種子、ベニバナ、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記固体物質が、さらに、農業的に認容性の助剤又は農業的に認容性の付形剤を含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４８】
前記組成物が、光合成微生物を含まない、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４９】
前記組成物が、さらに、少なくとも１つの農薬及び／又は少なくとも１つの静菌剤を含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項５０】
前記農薬が、殺虫剤、殺真菌剤、殺線虫剤、及び殺菌剤からなる群から選択され、前記農薬が、実質的に前記メチロバクテリウムの成長を阻害しない、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
植物又は植物の一部に、請求項３２から３８のいずれか１項に記載の発酵生成物又は請求項３９から５０のいずれか１項に記載の組成物を適用するステップを含む、植物又は植物の一部をメチロバクテリウムで処理するための方法。
【請求項５２】
前記植物の一部が、種子、茎、根、花、子葉、子葉鞘、果実又は葉である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記植物又は植物の一部が、トウモロコシ、アブラナ種、アルファルファ、米、ライ麦、モロコシ、トウジンヒエ、キビ、アワ、シコクビエ、ヒマワリ、ベニバナ、大豆、タバコ、ジャガイモ、ピーナッツ、綿、サツマイモ、キャッサバ、コーヒー、ココナッツ、パイナップル、シトラスツリー、カカオ、茶、バナナ、アボカド、イチジク、グァバ、マンゴー、オリーブ、パパイア、カシュー、マカダミア、アーモンド、テンサイ、サトウキビ、オート麦、大麦、トマト、レタス、グリーンビーンズ、ライマメ、エンドウ、ウリ科、観葉植物、又は針葉樹の植物又は植物の一部である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
請求項５１に記載の方法によって得られる植物であって、前記植物が、前記組成物の発酵生成物で少なくとも部分的に被覆される、前記植物。
【請求項５５】
請求項５１に記載の方法によって得られる植物の一部であって、前記植物が、前記組成物の発酵生成物で少なくとも部分的に被覆される、前記植物の一部。
【請求項５６】
第一の水性液体、２５℃でｎ−ペンタノールの混和性以下である水中での混和性を有する第二の液体、及び外因性メチロバクテリウムの単独培養物又は共生培養物を含有するエマルションで少なくとも部分的に被覆される、植物又は植物の一部。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年５月３１日に出願された米国特許出願通し番号６１／８２９，９８７号の利益を請求するものであり、その全体の開示は、参照をもって本明細書に組み込まれたものとする。
【０００２】
背景技術
一炭素有機化合物、例えばメタン及びメタノールは、広範に自然に見出され、かつメタノトローフ及びメチロトローフとして分類される細菌による炭素源として使用される。メタノトローフ細菌は、メチロバクテリア（Methylobacter）属、メチロモナス（Methylomonas）属、メチロミクロビウム（Methylomicrobium）属、メチロコッカス（Methylococcus）属、メチロサイナス（Methylosinus）属、メチロシスチス（Methylocystis）属、メチロスフェラ（Methylosphaera）属、メチロカルダム（Methylocaldum）属、及びメチロセラ（Methylocella）属における種を含む（Ｌｉｄｓｔｒｏｍ， ２００６）。メタノトローフは、Ｏ2からの酸素原子をメタンに組込みメタノールを形成する、メタンモノオキシゲナーゼ酵素を有する。全てのメタノトローフは、炭素−炭素結合を含む化合物を使用することができない偏性一炭素利用種である。一方で、メチロトローフは、より複雑な有機化合物、例えば有機酸、高級アルコール、糖等も使用できる。従って、メチロトローフ細菌は、通性メチロトローフである。メチロトローフ細菌は、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、ハイフォミクロビウム（Hyphomicrobium）属、メチロフィルス（Methylophilus）属、メチロバチルス（Methylobacillus）属、メチロファーガ（Methylophaga）属、アミノバクター（Aminobacter）属、メチロラブダス（Methylorhabdus）属、メチロピラ（Methylopila）属、メチロスルホノモナス（Methylosulfonomonas）属、マリノスルホノモナス（Marinosulfonomonas）属、パラコッカス（Paracoccus）属、キサントバクター（Xanthobacter）属、アンシロバクター（Ancylobacter）属（ミクロシクルス（Microcyclus）属として公知でもある）、チオバチルス（Thiobacillus）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、アセトバクター（Acetobacter）属、バチルス（Bacillus）属、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属、アルトバクター（Arthobacter）属及びノカルディア（Nocardia）属における種を含む（Ｌｉｄｓｔｒｏｍ， ２００６）。
【０００３】
メチロバクテリウム属のほとんどのメチロトローフ細菌は、ピンク色素性である。それらは、通常ＰＰＦＭ細菌（ｐｉｎｋ−ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ ｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈ（ピンク色素通性メチロトローフ））といわれる。Ｇｒｅｅｎ（２００５、２００６）は、メチロバクテリウム属における１２種の確認された種、特に、Ｍ．アミノボランス（M. aminovorans）、Ｍ．クロロメタニカム（M. chloromethanicum）、Ｍ．ジクロロメタニカム（M. dichloromethanicum）、Ｍ．エキストロクエンス（M. extorquens）、Ｍ．フジサワエンス（M. fujisawaense）、Ｍ．メソフィリカム（M. mesophilicum）、Ｍ．オルガノフィラム（M. organophilum）、Ｍ．ラジオトレランス（M. radiotolerans）、Ｍ．ロデシアナム（M. rhodesianum）、Ｍ．ロジナム（M. rhodinum）、Ｍ．チオシアナツム（M. thiocyanatum）、及びＭ．ザトマニイ（M. zatmanii）を同定した。しかしながら、Ｍ．ニデュランス（M. nidulans）は、ＰＰＦＭではない窒素固定メチロバクテリウムである（Ｓｙ ｅｔ ａｌ．， ２００１）。メチロバクテリウムは、自然に遍在し、土壌、粉塵、淡水、堆積物及び葉の表面において、並びに工業及び臨床的な環境において見出される（Ｇｒｅｅｎ， ２００６）。
【０００４】
ほとんど（全てとは言わなくても）の植物（藻類、蘚類及び苔類、並びに被子植物類及び裸子植物類に及ぶ）の葉の表面の生着菌としてのＰＰＦＭ細菌の存在は、ＰＰＦＭ細菌が、植物生理学において重要な役割を果たしうることを示唆している（Ｃｏｒｐｅ ａｎｄ Ｒｈｅｅｍ， １９８９； Ｈｏｌｌａｎｄ及びＰｏｌａｃｃｏ， １９９４； Ｈｏｌｌａｎｄ， １９９７； Ｋｕｔｓｃｈｅｒａ， ２００７）。植物が、おそらく植物細胞壁の成長におけるペクチン代謝の老廃物として、メタノールを生成及び放出することは、植物が生成するメタノールを供給し、順に植物に対する正の利益を提供するＰＰＦＭ細菌との共生関係が存在することがこれらの研究者に示唆された。植物生理学に対するＰＰＦＭ細菌の示唆された利益は、ＰＰＦＭで生じるサイトカイニン植物ホルモンの供給によって窒素代謝、種子発芽、及び植物成長の刺激に対する正の効果を含む。植物成長、植物収率、種子発芽、雄株の繁殖力、及び植物栄養の質を改良するためのＰＰＦＭ細菌の使用は、米国特許５，５１２，０６９号、米国特許５，９６１，６８７号、米国特許６，１７４，８３７号、米国特許６，３２９，３２０号、米国特許７，４３５，８７８号、及び米国特許出願番号第２００６／０２２８７９７号において開示されている。さらに、ＰＰＦＭ細菌は、栽培した海藻の収率を増加することを見出しており、海藻由来のバイオ燃料の製造にそれらを適用することを示唆している（米国特許出願番号第２０１１／０２６９２１９号）。
【０００５】
条植え作物、野菜及び他の栽培した植物に対する、並びに海藻に基づくバイオ燃料の製造におけるメチロバクテリウムの広範な適用は、莫大な量のメチロバクテリウム培養菌の効率的な及び安価な培養を要求する。メチロバクテリウムの他の工業適用は、効率的なメチロバクテリウムの製造技術から利益を有してもよい。かかる工業適用は、環境汚染指示薬としての（あるメチロバクテリウムが煤上で成長できるため）、及び包装食品工業における放射品質管理モニターとしての（あるメチロバクテリウムがガンマ放射線に高い耐性を呈するため）、メチロバクテリウムの使用を含む。他の工業適用は、環境汚染物質を分解するためのメチロバクテリウムの使用（米国特許番号ＵＳ ５，４１８，１６１号、ＵＳ ５，４８７，８３４号、ＵＳ ６，１０７，０６７号、ＵＳ ７，２１４，５０９号）、有用な工業化合物、ポリマー前駆体、又はバイオポリマーを製造するためのメチロバクテリウムの使用（ＵＳ ５，２３６，９３０号、ＵＳ ５，６８６，２７６号、ＵＳ ６，１０７，０６７号）、及び組換えタンパク質を製造するためのメチロバクテリウムの使用（米国特許出願番号第２００６０２３４３３６号）を含む。
【０００６】
しかしながら、ＰＰＦＭ培養の対象範囲における種々の刊行物は、これらの細菌の効率的及び安価なラージスケールの培養を達成するために克服する重要な障害があることを示唆している。Ｈｏｌｌａｎｄ及びＰｏｌａｃｃｏ（１９９４）は、栄養が豊富である培地である“単離されたＰＰＦＭは、植物組織培地上で良好に成長しない”こと、及び“ＰＰＦＭが晩成植物である”ことを報告している。Ｍａｄｈａｉｙａｎら（２００４）は、ＰＰＦＭ細菌について、“それらのゆっくりと成長する性質及び全体の植物に及ぶ分布が、成長点から離れて植物組織が拡大するために、それらの数が希釈によって単純に調整されることを示唆する”ことを挙げている。Ａｂａｎｄａ−Ｎｋｐｗａｔｔら（２００６）は、得られた力価（力価は１ミリリットルあたりの細菌細胞数又はコロニー形成単位を言う）を指定せずに“液体培地中で、その溶液が４〜５日以内に混濁する”ＰＰＦＭ細菌の成長を報告している。
【０００７】
晩成植物のこれらの一致した報告は、ＰＰＦＭ細菌が比較的低い力価に対して成長できるのみであることを示す他の研究によって、さらに確認及び詳説される。これらの成長の研究は、“無色透明”であるように故意に製造した標準液体微生物培地中であった。かかる培地は、肉眼で見える混濁度の発生として明白な、所望の及び所望でない（すなわち汚濁している）微生物成長の視覚的観察及び検出を可能にする。
【０００８】
Ｃｏｒｐｅ及びＢａｓｉｌｅ（１９８２）は、広範な炭素源に対する種々のＰＰＦＭ細菌の成長応答の組織的な調査を示している。彼らは、Ｓｔａｎｉｅｒら（１９６６）によって使用した標準ミネラルベースをそれらのベース培地として使用した。この文献において、Ｓｔａｎｉｅｒらは、それらのベース培地が“ニトロ酢酸及びＥＤＴＡで多量にキレート化し、オートクレーブで豊富な沈殿物を形成する。その沈殿物は、培地冷却として再融解して、透明な溶液を形成する。”ことを挙げている。
【０００９】
この“無色透明な”溶液をそれらのベース培地として使用して、Ｃｏｒｐｅ及びＢａｓｉｌｅ（１９８２）は、ＰＰＦＭ細菌の成長を指示するそれらの能力について種々の炭素源で試験した。それらは、他の全てより比較的良好であるいくつかの炭素源、すなわち、グリセロール、グルタメート、メタノール、グルコース、アスパルテート、スクシネート及びマレートを見出した。しかしながら、７日のインキュベート（それぞれの成長試験に割り当てられた時間）後でさえ、培養物は、０．７光学単位より大きい光学密度（６６０ナノメートルで、微生物成長を測定するための標準波長）を達成しない。Ｓｙら（２００５）は、約０．０５光学単位の光学密度を有するＰＰＦＭ細菌の懸濁液は、１ミリリットルあたり約５×１０6コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含むことを報告している。従って、Ｃｏｒｐｅ及びＢａｓｉｌｅが彼らによって同定した最良の炭素源で１週間インキュベートした後に得た最大の力価は、１ミリリットルあたり約７×１０7コロニー形成単位であった。
【００１０】
Ｓｙら（２００５）は、炭素源としてスクシネートを含む最小塩培地で、１ミリリットルあたり約２．５×１０8コロニー形成単位のＭ．エキストロクエンスの最終力価を達成したことも報告している。
【００１１】
Ｃｏｒｐｅ及びＲｈｅｅｍ（１９８９）は、ＰＰＦＭ細菌が“栄養ブイヨン及び他の通常の従属栄養培地中で、他の葉従属栄養生物よりも非常に長い倍加時間を有した”ことが報告され、かつ植物により製造されたメタノールが、は表面上で他の細菌で“ＰＰＦＭをうまく競合させることを可能にする”と推論した。Ｃｏｒｐｅ及びＲｈｅｅｍが（明示されていないインキュベート期間後に）達成した最大力価は、１ミリリットルあたり約３×１０8コロニー形成単位であった。
【００１２】
従って、これらの文献は、標準の“無色透明な”微生物成長培地において、ＰＰＦＭ細菌の成長がゆっくりであり、典型的に、１ミリリットルあたり約３×１０8コロニー形成単位の比較的低い最終力価で安定状態に達することを示す。
【００１３】
条植え作物、野菜及び他の栽培した植物における、並びに藻類を基礎としたバイオ燃料の製造における通常の適用のためのＰＰＦＭ細菌についての潜在的な要求を満たすために、製造能力は、膨大な量のこれらの細菌を製造する必要がある。
【００１４】
単に一例としてトウモロコシについて、アメリカに年ごとに成長する約４０００万ヘクタールのトウモロコシがある。単民族における及びこの一毛作での市場参入のそれぞれ１％（４０００００ヘクタール）について、ＰＰＦＭ細菌の必要性は、１ミリリットルあたり約３×１０8コロニー形成単位の力価でＰＰＦＭ栽培の１ヘクタールあたり約３０リットルの範囲で、種子処理として又は葉面散布として適用されることが推定される。これは、アメリカのトウモロコシ収穫物の１％を処理するために年ごとに要求される力価で、ＰＰＦＭ栽培の約１２００万リットルに等しい。一回あたりの生産時間が７日であった場合に、全生産力（１年あたり約２５０日）で操作する市場に出ている最も多い容量の発酵槽（一回あたり６００００リットル）を有する設備でさえ、これらの巨大な発酵槽の５個又は６個を必要とする（さらに、アメリカにおけるトウモロコシの１％の市場参入のための要求を満たすために）。かかる設備は、おそらく、商業的に現実的な方法で建築及び操作できない。
【００１５】
従って、効率的で安価なメチロバクテリウムをラージスケールで生産する必要性が存在する。
【００１６】
発明の要約
本明細書において、大量のメチロバクテリウムの効率的な製造のための方法が提供される。これらの方法は、高い力価のメチロバクテリウム培養をもたらすことができ、その際、１回あたりの製造時間は著しく減少する。本明細書において提供されるメチロバクテリウム製造の方法は、安価で容易に入手できる成分から構成される培地を使用することもできる。本明細書において、有用な、メチロバクテリウムを含む発酵ブロス、発酵ブロス生成物、発酵生成物及び組成物も提供される。植物又は植物の一部を処理するために、メチロバクテリウムを含む発酵ブロス、発酵ブロス生成物、発酵生成物及び組成物を使用する方法も本明細書において提供される。本明細書において提供される方法及び組成物を、植物又は植物の一部に適用するために、バイオレメディエーションにおける接種物として使用するために、有用な生成物の製造のために、及び組換えタンパク質の製造のために、大量のメチロバクテリウムを製造するために使用することができる。本明細書において提供される方法及び組成物によって得られる有用な生成物は、制限されることなく、ポリ−３−ヒドロキシ酪酸、１，３−プロパンジオール、及びオキサゾピロロキノリンを含む。
【００１７】
連続相と、連続相中で不混和性である又は部分的にのみ混和性である分散相とを含むエマルション中でメチロバクテリウムを成長することを含むメチロバクテリウム調製物を得るための方法が本明細書において提供される。ある実施態様において、前記メチロバクテリウムは、メチロバクテリウムの単独培養物又は共生培養物である。ある実施態様において、（ａ）分散相は非水性液体を含み、かつ連続相は水性液体を含み、又は（ｂ）分散相は水性液体を含み、かつ連続相は非水性液体を含む。ある実施態様において、非水性液体は、２５℃でｎ−ペンタノールの混和性以下である水中での混和性を有する。ある実施態様において、分散相は、連続相に対応する液体を含む非エマルション中で成長させることを除いて同一の条件下で、メチロバクテリウムを成長させることによって得られる収率に関してメチロバクテリウムの増加した収率を提供する。ある実施態様において、前記方法は、さらに、培地中で成長させたメチロバクテリウムを採収することを含む。ある実施態様において、エマルションは、さらに、エマルションを安定化するために十分な量で乳化剤を含む。ある実施態様において、乳化剤は、増粘剤、界面活性剤及びそれらの組合せからなる群から選択される。前記方法のいずれかのある実施態様において、非水性液体は、アルコール、アルデヒド、ケトン、脂肪酸、リン脂質、又はそれらのあらゆる組合せを含む。ある実施態様において、アルコールは、少なくとも５個の炭素を含む脂肪族アルコール及びステロールからなる群から選択される。前記方法のいずれかのある実施態様において、非水性液体は、１つ以上の動物油、微生物油、合成油又は植物油を含む。ある実施態様において、植物油は、トウモロコシ、大豆、綿、ピーナッツ、ヒマワリ、オリーブ、亜麻、ココナッツ、ヤシ、菜種、ゴマ種子、ベニバナ、及びそれらの組合せからなる群から選択される。前記方法のいずれかのある実施態様において、エマルションは、光合成微生物を含まない。前記方法のいずれかのある実施態様において、エマルションは、さらに、メチロバクテリウム以外の予め決められた同一性の１種以上の光合成でない微生物を含む。前記方法のいずれかのある実施態様において、分散相は、少なくとも約０．０２％〜約２０％（質量）のエマルションを含む。前記方法のいずれかのある実施態様において、非水性液体は、農業的に認容性の助剤又は農業的に認容性の付形剤である。前記方法のいずれかのある実施態様において、成長は、前記メチロバクテリウムを前記エマルションに接種し、前記接種されたエマルションを、前記メチロバクテリウムの成長のために提供するために十分な条件下でインキュベートするステップを含む。前記方法のいずれかのある実施態様において、メチロバクテリウムは、Ｍ．アミノボランス、Ｍ．クロロメタニカム、Ｍ．ジクロロメタニカム、Ｍ．エキストロクエンス、Ｍ．フジサワエンス、Ｍ．メソフィリカム、Ｍ．オルガノフィラム、Ｍ．ラジオトレランス、Ｍ．ロデシアナム、Ｍ．ロジナム、Ｍ．チオシアナツム、Ｍ．ノデュランス（M. nodulans）、Ｍ．セラスチイ（M. cerastii）、Ｍ．ゴジピコーラ（M. gossipiicola）、メチロバクテリウム種の株ＬＭＧ６３７８、Ｍ．フィロスフェラ��M. phyllosphaerae）、Ｍ．オリゼ（M. oryzae）、Ｍ．プラタニ（M. platani）、Ｍ．ポプリ（M. populi）、及びＭ．ザトマニイからなる群から選択される。前記方法のいずれかのある実施態様において、エマルションは、実質的に微生物の混入がない。前記方法のいずれかのある実施態様において、前記方法は、さらに、メチロバクテリウムの全て又は一部をエマルションから回収することを含む。前記方法のいずれかのある実施態様において、前記方法は、さらに、回収したメチロバクテリウムの一部を脱水することを含む。
【００１８】
前記方法のいずれかによって得られたメチロバクテリウム調製物も提供され、その際分散相又は連続相は、２５℃でｎ−ペンタノールの混和性以下である混和性を有する非水性液体を含む。
【００１９】
植物又は植物の一部に、前記メチロバクテリウム調製物のいずれかを含む組成物を適用するステップを含む、植物又は植物の一部をメチロバクテリウムで処理するための方法も提供される。ある実施態様において、前記組成物は、さらに、農業的に認容性の助剤又は農業的に認容性の付形剤を含む。前記方法のいずれかのある実施態様において、前記組成物は、固体物質を欠く。ある実施態様において、植物の一部は種子であり、前記組成物は、前記組成物１グラムあたり少なくとも約５×１０8コロニー形成単位〜前記組成物１グラムあたり約５×１０13コロニー形成単位のメチロバクテリウム価を有する。ある実施態様において、前記植物の一部は、種子、茎、根、花、子葉、子葉鞘、果実又は葉である。ある実施態様において、植物又は植物の一部は、トウモロコシ、アブラナ種、アルファルファ、米、ライ麦、モロコシ、トウジンヒエ、キビ、アワ、シコクビエ、ヒマワリ、ベニバナ、大豆、タバコ、ジャガイモ、ピーナッツ、綿、サツマイモ、キャッサバ、コーヒー、ココナッツ、パイナップル、シトラスツリー、カカオ、茶、バナナ、アボカド、イチジク、グァバ、マンゴー、オリーブ、パパイア、カシュー、マカダミア、アーモンド、テンサイ、サトウキビ、オート麦、大麦、トマト、レタス、グリーンビーンズ、ライマメ、エンドウ、ウリ科、観葉植物、又は針葉樹の植物又は植物の一部である。ある実施態様において、植物又は植物の一部は、少なくとも部分的に前記メチロバクテリウム調製物で被覆される。本明細書において、前記植物又は植物の一部のいずれかから得られる加工された植物生成物も提供され、その際加工された生成物は、エマルションを含む。ある実施態様において、加工された植物生成物は、ミール、ペースト、粉、フレーク又は飼料である。ある実施態様において、加工された生成物は再生可能ではない。
【００２０】
本明細書において、連続相と、連続相中で不混和性である又は部分的にのみ混和性である分散相とを含むエマルション、及びメチロバクテリウムの単独培養物又は共生培養物を含む発酵生成物が提供される。ある実施態様において、（ａ）分散相は非水性液体を含み、かつ連続相は水性液体を含み、又は（ｂ）分散相は水性液体を含み、かつ連続相は非水性液体を含む。ある実施態様において、非水性液体は、２５℃でｎ−ペンタノールの混和性以下である水中での混和性を有する。ある実施態様において、発酵生成物は、実質的に微生物の混入がない。ある実施態様において、発酵生成物は、さらに、メチロバクテリウム以外の予め決められた同一性の１種以上の微生物を含む。ある実施態様において、発酵生成物は、固体物質を欠く。ある実施態様において、発酵生成物は、光合成微生物を含まない。ある実施態様において、メチロバクテリウムは、１ミリリットルあたり少なくとも約５×１０7コロニー形成単位、１ミリリットルあたり少なくとも約５×１０8コロニー形成単位、１ミリリットルあたり少なくとも約１×１０9コロニー形成単位、１ミリリットルあたり少なくとも約１×１０10コロニー形成単位、又は１ミリリットルあたり少なくとも約３×１０10コロニー形成単位の力価である。ある実施態様において、メチロバクテリウムは、１ミリリットルあたり少なくとも約５×１０7コロニー形成単位から１ミリリットルあたり少なくとも約６×１０10コロニー形成単位の力価である。ある実施態様において、メチロバクテリウムの少なくとも１つは、ピンク色素性通性メチロトローフ（ＰＰＦＭ）である。ある実施態様において、ピンク色素性通性メチロトローフ（ＰＰＦＭ）は、Ｍ．アミノボランス、Ｍ．クロロメタニカム、Ｍ．ジクロロメタニカム、Ｍ．エキストロクエンス、Ｍ．フジサワエンス、Ｍ．メソフィリカム、Ｍ．オルガノフィラム、Ｍ．ラジオトレランス、Ｍ．ロデシアナム、Ｍ．ロジナム、Ｍ．チオシアナツム、Ｍ．セラスチイ、Ｍ．ゴジピコーラ、メチロバクテリウム種の株ＬＭＧ６３７８、Ｍ．フィロスフェラ、Ｍ．オリゼ、Ｍ．プラタニ、Ｍ．ポプリ、及びＭ．ザトマニイからなる群から選択される。ある実施態様において、メチロバクテリウムの少なくとも１つは、Ｍ．ノデュランスである。
【００２１】
連続相及び分散相を含むエマルション、並びにメチロバクテリウムの単独培養物又は共生培養物を含む組成物も提供される。ある実施態様において、（ａ）分散相は非水性液体を含み、かつ連続相は水性液体を含み、又は（ｂ）分散相は水性液体を含み、かつ連続相は非水性液体を含む。ある実施態様において、非水性液体は、２５℃でｎ−ペンタノールの混和性以下である水中での混和性を有する。ある実施態様において、前記組成物は、実質的に微生物の混入がない。ある実施態様において、前記組成物は、さらに、農業的に認容性の助剤及び／又は農業的に認容性の付形剤の少なくとも１つを含む。ある実施態様において、前記組成物は、固体物質を欠く。ある実施態様において、第二の液体は、アルコール、アルデヒド、ケトン、脂肪酸、リン脂質、又はそれらのあらゆる組合せを含む。ある実施態様において、アルコールは、少なくとも５個の炭素を含む脂肪族アルコール及びステロールからなる群から選択される。ある実施態様において、非水性液体は、１つ以上の植物油を含む。ある実施態様において、植物油は、トウモロコシ、大豆、綿、ピーナッツ、ヒマワリ、オリーブ、亜麻、ココナッツ、ヤシ、菜種、ゴマ種子、ベニバナ、及びそれらの組合せからなる群から選択される。ある実施態様において、前記固体物質は、さらに、農業的に認容性の助剤又は農業的に認容性の付形剤を含む。ある実施態様において、前記組成物は、光合成微生物を含まない。ある実施態様において、前記組成物は、さらに、少なくとも１つの農薬及び／又は少なくとも１つの静菌剤を含む。ある実施態様において、農薬は、殺虫剤、殺真菌剤、殺線虫剤、及び殺菌剤からなる群から選択され、その際農薬は、実質的にメチロバクテリウムの成長を阻害しない。
【００２２】
本明細書において、植物又は植物の一部に、発酵生成物又は組成物のいずれかを適用するステップを含む、植物又は植物の一部をメチロバクテリウムで処理するための方法も提供される。前記方法のある実施態様において、前記植物の一部は、種子、茎、根、花、子葉、子葉鞘、果実又は葉であり、又は前記方法のある実施態様において、植物又は植物の一部は、トウモロコシ、アブラナ種、アルファルファ、米、ライ麦、モロコシ、トウジンヒエ、キビ、アワ、シコクビエ、ヒマワリ、ベニバナ、大豆、タバコ、ジャガイモ、ピーナッツ、綿、サツマイモ、キャッサバ、コーヒー、ココナッツ、パイナップル、シトラスツリー、カカオ、茶、バナナ、アボカド、イチジク、グァバ、マンゴー、オリーブ、パパイア、カシュー、マカダミア、アーモンド、テンサイ、サトウキビ、オート麦、大麦、トマト、レタス、グリーンビーンズ、ライマメ、エンドウ、ウリ科、観葉植物、又は針葉樹の植物又は植物の一部である。前記方法のある実施態様において、植物の一部は種子であり、前記組成物は、前記組成物１グラムあたり少なくとも約５×１０7コロニー形成単位〜前記組成物１グラムあたり約６×１０10、３×１０12、５×１０12、１×１０13又は５×１０13コロニー形成単位のメチロバクテリウム価を有する。
【００２３】
前記組成物の発酵組成物で被覆された少なくとも一部である、前記方法によって得られた植物又は植物の一部も提供される。
【００２４】
植物又は植物の一部は、第一の水性液体、ｎ−ペンタノールの混和性以下である水中での混和性を有する第二の液体、及び外因性メチロバクテリウムの単独培養物又は共生培養物を含むエマルションで少なくとも部分的に被覆される。前記エマルション、発酵生成物、発酵ブロス、又は組成物のいずれかを含む、前記植物又は植物の一部のいずれかによって得られた植物又は植物の一部から得られた加工された生成物も、本明細書において提供される。ある実施態様において、加工された植物生成物は、ミール、ペースト、粉、フレーク又は飼料である。ある実施態様において、加工された植物生成物は再生可能ではない。
【００２５】
連続相と連続相中で不混和性である又は部分的にのみ混和性である分散相とを含むエマルション中でメチロバクテリウムの単独培養物又は共生培養物を成長させること、及びメチロバクテリウムを成長させた後に工業製品を栽培することを含む、工業製品の製造方法も提供される。ある実施態様において、前記エマルションは、第一の水性液体と、第一の水性液体中で不混和性又は部分的にのみ混和性である第二の非水性液体とを含む。ある実施様において、前記エマルションは、実質的に、固相、液相、又はそれらの組合せから、微生物の混入がない。前記方法のいずれかのある実施態様において、前記工業製品は、ポリ−３−ヒドロキシ酪酸、１，３−プロパンジオール、ピロロキノリンキノン、又はオキサゾピロロキノリンである。前記方法のいずれかのある実施態様において、エマルションは、光合成微生物を含まない。
【００２６】
説明
定義
本明細書において使用されるように、“それらに付着する（ａｄｈｅｒｅｄ ｔｈｅｒｅｔｏ）”及び“付着性（ａｄｈｅｒｅｎｔ）”の語句は、固体物質上で成長することにより又は成長されることにより固体物質に関連したメチロバクテリウムをいう。
【００２７】
本明細書において使用されるように、“農業的に認容性の助剤”の語句は、植物及び／又は植物の一部の処理のために、組成物中で活性剤の性能を高める物質をいう。ある組成物において、活性剤は、メチロバクテリウムの単独培養物又は共生培養物である。
【００２８】
本明細書において使用されるように、“農業的に認容性の付形剤”の語句は、植物の処理のための組成物中で活性剤のための希釈液及び／又はキャリヤーとして使用できる実質的に不活性の物質をいう。ある組成物において、活性剤は、メチロバクテリウムの単独培養物又は共生培養物である。
【００２９】
本明細書において使用されるように、“藻類”の用語は、微小藻類又は大型藻類のいずれかのタイプをいう。
【００３０】
本明細書において使用されるように、“メチロバクテリウム”の用語は、メチロバクテリウム属の通性メチロトローフである細菌をいう。本明細書において使用されるように、メチロバクテリウムの用語は、偏性メタノトローフであるメチロバクテリア属、メチロモナス属、メチロミクロビウム属、メチロコッカス属、メチロサイナス属、メチロシスチス属、メチロスフェラ属、メチロカルダム属、及びメチロセラ属における種を含まない。
【００３１】
本明細書において使用されるように、“メチロバクテリウムの共生培養物”の語句は、少なくとも２株のメチロバクテリウム又は少なくとも２種のメチロバクテリウムを含むメチロバクテリウム培養物をいう。
【００３２】
本明細書において使用されるように、“微生物の混入”の語句は、培養物、発酵ブロス、発酵ブロス生成物、組成物中に導入する前に同定されなかった、培養物、発酵ブロス、発酵ブロス生成物、組成物中の微生物をいう。
【００３３】
本明細書において使用されるように、“エマルション”の用語は、２つの不混和性液体のコロイド状混合物をいい、その際一方の液体は連続相であり、他方の液体は分散相である。ある実施態様において、連続相は水性液体であり、かつ分散相は、水性液体中で混和性でない非水性液体である。
【００３４】
本明細書において使用されるように、“実質的に微生物の混入がない”の語句は、量又はタイプで、培養物、発酵ブロス、発酵生成物又は組成物中に存在する微生物の少なくとも約９５％が、所望のメチロバクテリウム又は予め定義された同一性を有する他の所望の微生物である、培養物、発酵ブロス、発酵生成物又は組成物をいう。
【００３５】
本明細書において使用されるように、“無生物の固体物質”の語句は、水中又は水溶液中で不溶性又は部分的に可溶性であり、誘導されるまだ生きている生物の一部ではない物質をいう。
【００３６】
本明細書において使用されるように、“メチロバクテリウムの単独培養物”は、メチロバクテリウムの単一株からなるメチロバクテリウム培養物をいう。
【００３７】
本明細書において使用されるように、“農薬”の用語は、殺虫剤、殺真菌剤、殺線虫剤、殺菌剤、又はそれらの組合せである作用剤をいう。
【００３８】
本明細書において使用されるように、“静菌剤”の語句は、細菌の成長を阻害するが、細菌を殺さない作用剤をいう。
【００３９】
本明細書において使用されるように、“農薬は実質的にメチロバクテリウムの成長を阻害しない”の語句は、メチロバクテリウムの単独培養物又は共生培養物である発酵生成物を含む組成物中で提供される場合に、該組成物が植物又は植物の一部に適用される場合に農薬を欠いた組成物と比較してメチロバクテリウムの成長を５０％以下阻害することをもたらす、あらゆる農薬をいう。ある実施態様において、農薬は、前記組成物が植物又は植物の一部に適用される場合に農薬を欠いた組成物と比較して、メチロバクテリウムの成長を４０％、２０％、１０％、５％、又は１％以下阻害することをもたらす。
【００４０】
本明細書において使用されるように、“ＰＰＦＭ細菌”の用語は、制限されることなく、Ｍ．ノデュランス以外のメチロバクテリウム属における細菌種をいう。
【００４１】
本明細書において使用されるように、“固体物質”の語句は、水中又は水溶液中で不溶性又は部分的に可溶性である物質をいう。
【００４２】
本明細書において使用されるように、“それらに懸濁されうる固体相”の語句は、撹拌によって液体中に分散できる固体物質をいう。
【００４３】
本明細書において使用されるように、“再生可能でない”の用語は、植物全体中に再生できない植物の一部又は加工された植物生成物をいう。
【００４４】
本明細書において使用されるように、“実質的に固体相の全てが液体相中に懸濁される”の語句は、固体相を含有する固体物質の少なくとも９５％、９８％又は９９％が、撹拌によって液体中に分散されている媒体をいう。
【００４５】
本明細書において使用されるように、“実質的に固体相の全てが液体相中に懸濁されない”の語句は、固体の５％、２％又は１％未満が、特に、撹拌によって媒体中に分散されている媒体をいう。
【００４６】
本明細書において使用されるように、“収率”の用語は、発酵において得られるメチロバクテリウムに関して使用する場合に、得られたメチロバクテリウムの数をいう。かかる収率を測定するための方法は、制限されることなく、得られた材料の単位体積又は単位質量あたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を測定すること、得られたメチロバクテリウムの湿潤質量を測定すること、及び／又は得られたメチロバクテリウムの乾燥質量を測定することを含む。
【００４７】
前記定義のいずれかは、参照をもって本明細書に組み込まれるあらゆる特許文献又は非特許文献において、本明細書において挙げられたあらゆる特許文献又は非特許文献にいて、又はその他で見出されるあらゆる特許文献又は非特許文献において提供される定義に矛盾する範囲まで、前記定義を本明細書において使用することが理解される。
【００４８】
メチロバクテリウムを培養するための方法、それらの組成物、及びそれらの使用
メチロバクテリウムを、エマルションを含有する培地中で培養する方法は、メチロバクテリウムを液体培地のみで培養する方法と比較して、メチロバクテリウムの生じた収率を著しく増加することが見出されている。ある実施態様において、前記方法は、成長したメチロバクテリウムについて提供する条件下で、エマルション中でメチロバクテリウムを成長することを含んでよい。エマルション及びメチロバクテリウムを含む培地は、制限されることなく、（ａ）エマルションを含む培地にメチロバクテリウムを接種すること、（ｂ）水性液体にメチロバクテリウムを接種し、非水性液体を導入し、そして混合してエマルションを形成すること、（ｃ）水性液体にメチロバクテリウムを接種し、非水性液体を導入し、そして混合してエマルションを形成すること、又は（ｄ） （ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）のいずれかの組合せのいずれかを含む種々の方法によって得られる。ある実施態様において、成長は、培地にメチロバクテリウムを接種するステップ、及び接種された培地をメチロバクテリウムの成長のために提供されるために十分な条件下でインキュベートするステップを含む。ある実施態様において、メチロバクテリウムは、１ミリリットルあたり少なく約５×１０4コロニー形成単位から１ミリリットルあたり少なくとも約１×１０5コロニー形成単位の力価で、培地中に接種される。ある実施態様において、メチロバクテリウムは、Ｍ．アミノボランス、Ｍ．クロロメタニカム、Ｍ．ジクロロメタニカム、Ｍ．エキストロクエンス、Ｍ．フジサワエンス、Ｍ．メソフィリカム、Ｍ．オルガノフィラム、Ｍ．ラジオトレランス、Ｍ．ロデシアナム、Ｍ．ロジナム、Ｍ．チオシアナツム、Ｍ．ノデュランス、Ｍ．セラスチイ、Ｍ．ゴジピコーラ、メチロバクテリウム種の株ＬＭＧ６３７８、Ｍ．フィロスフェラ、Ｍ．オリゼ、Ｍ．プラタニ、Ｍ．ポプリ、及びＭ．ザトマニイからなる群から選択される。前記方法は、さらに、メチロバクテリウムの単独培養物又は共生培養物を採取するステップも含んでよい。メチロバクテリウムを採取するための方法は、制限されることなく、濾過、遠心分離、デカンテーション等によって、液相からメチロバクテリウムを分離することを含んでよい。
【００４９】
使用されうるかき混ぜ方法は、制限されることなく、撹拌、往復振盪、回転振盪、及びそれらの組合せを含む。ある実施態様において、かき混ぜは、少なくとも２５、５０、１００、２００、２５０、５００、又は１０００毎分回転数（ＲＰＭ）を提供する回転振盪器上にエマルションを含む培地を置くことを含んでよい。少なくとも２５、５０、１００、２００、２５０、５００、又は１０００毎分回転数（ＲＰＭ）に設定した回転振盪器によって提供されるに等しいかき混ぜも、撹拌、往復振盪、及び他の方法によって得られる。ある実施態様において、エマルション中の水性液体又は非水性液体の分離は、少なくとも２５、５０、１００、２００、２５０、５００、又は１０００毎分回転数（ＲＰＭ）に設定した回転撹拌機によって提供されるに等しいかき混ぜで除去又は減少できる。
【００５０】
本明細書において提供される方法において使用されるエマルションを含有する発酵ブロスは、実質的に微生物の混入がない純粋培養であってよい。ある実施態様において、培地、発酵ブロス、発酵生成物又は本明細書において提供される組成物中で量又はタイプにより存在する少なくとも約９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、又は１００％の微生物は、所望のメチロバクテリウム又は予め決定した同一性の他の所望の微生物である。所望のメチロバクテリウム又は予め決定した同一性の他の所望の微生物は、純粋培養から得られる微生物である。かかる純粋培養を提供するために、エマルションを含有する培地中で使用される成分は、メチロバクテリウム及び／又は単独培養又は共生培養でのあらゆる追加の所望される微生物を接種する前に、滅菌されるか、又は実質的に滅菌形で得られる。エマルションを含有する培地の種々の成分の滅菌は、制限されることなく、オートクレーブ、放射線照射、濾過滅菌（液体について）等を含む方法によって達せられる。実質的に微生物の混入がない培地、発酵ブロス、発酵生成物、又は組成物は、予め決定された同一性の所望の微生物の接種又は供給前に滅菌した培地、発酵ブロス、発酵生成物、又は組成物の液体又は液体及びあらゆる追加の固体成分を、所望の微生物の成長中の培地のコンタミネーション又は組成物のコンタミネーションを避けるために実施する場合に得られる。
【００５１】
エマルションを含有する培地中でメチロバクテリウムを培養する、本明細書において提供される方法を、バッチ式発酵、フェドバッチ式発酵、又は連続発酵のいずれかで実施してよい。本明細書において提供される発酵ブロス、発酵ブロス生成物、及び組成物は、バッチ式発酵、フェドバッチ式発酵、又は連続発酵のいずれかからも得られる。ある実施態様において、因子、例えばｐＨ及び酸素濃度は、本明細書において提供される方法において使用されるバッチ式発酵、フェドバッチ式発酵、又は連続発酵のプロセスのいずれかにおいて制御されうる。
【００５２】
本明細書において提供される、メチロバクテリウムの単独培養物又は共生培養物、並びに得られた発酵ブロス、発酵ブロス生成物及び組成物は、制限されることなく、Ｍ．アミノボランス、Ｍ．クロロメタニカム、Ｍ．ジクロロメタニカム、Ｍ．エキストロクエンス、Ｍ．フジサワエンス、Ｍ．メソフィリカム、Ｍ．オルガノフィラム、Ｍ．ラジオトレランス、Ｍ．ロデシアナム、Ｍ．ロジナム、Ｍ．チオシアナツム、Ｍ．ノデュランス、Ｍ．セラスチイ、Ｍ．ゴジピコーラ、メチロバクテリウム種の株ＬＭＧ６３７８、Ｍ．フィロスフェラ、Ｍ．オリゼ、Ｍ．プラタニ、Ｍ．ポプリ、及びＭ．ザトマニイを含む１つ以上のメチロバクテリウムを含んでよい。ある実施態様において、本明細書において提供される、メチロバクテリウムの単独培養物又は共生培養物、並びに得られた発酵ブロス及び発酵ブロス生成物は、１つ以上のメチロバクテリウムからなってよい。しかしながら、本明細書において提供される方法は、他のメチロバクテリウムで使用されてもよい。メチロバクテリウムは、種々の公表された方法（Ｍａｄｈａｉｙａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００７）によっても得られる。ある実施態様において、使用されうるかかる他のメチロバクテリウムは、他の公知のメチロバクテリウムの１６Ｓ ＲＮＡ配列に対して、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の配列同一性の１６Ｓ ＲＮＡを有するメチロバクテリウムである。１６Ｓ ＲＮＡ配列比較の使用によるメチロバクテリウムの型は、少なくとも、Ｃａｏ ｅｔ ａｌ， ２０１１によって記載されている。ある実施態様において、単独培養物又は共生培養物及び得られた生成物は、植物及び／又は植物の一部をコロニー化できるメチロバクテリウムを含みうる。植物及び／又は植物の一部をコロニー化できるメチロバクテリウムは、制限されることなく、Ｍ．エキストロクエンス、Ｍ．ノデュランス、及びＭ．メソフィリカムを含む。植物及び／又は植物の一部をコロニー化できるメチロバクテリウムは、制限されることなく、メチロバクテリウム・セラスチイ種（Ｌｅｉｂｎｉｚ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＤＳＭＺ−Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（“ＤＳＭＺ”）、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ＧｅｒｍａｎｙからＤＳＭ ２３６７９として入手できる代表的な株で）、メチロバクテリウム・ゴジピコーラ（ＵＳＤＡ ＡＲＳ， Ｐｅｏｒｉａ， ＩＬ．， ＵＳＡからＮＲＲＬ Ｂ−５１６９２として入手できる代表的な株で）、メチロバクテリウム種株ＬＭＧ６３７８（Ｂｅｌｇｉａｎ Ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ／Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ ｖｏｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ（“ＢＣＣＬＭ”）Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから入手できる）、メチロバクテリウム・フィロスフェラ種（ＤＳＭＺからＤＳＭ １９７７９Ｔとして入手できる代表的な株で）、メチロバクテリウム・オリゼ種（ＤＳＭＺからＤＳＭ １８２０７Ｔとして入手できる代表的な株で）、メチロバクテリウム・ノデュランス種（ＢＣＣＬＭからＬＭＧ ２１９６７として入手できる代表的な株で）、メチロバクテリウム・プラタニ種（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ， Ｙｕｓｏｎｇ−Ｋｕ， Ｔａｅｊｏｎ， ＫＲ（“ＫＣＴＣ”）からＫＣＴＣ １２９０１として入手できる代表的な株で）、及びメチロバクテリウム・ポプリ種（ＡＴＣＣからＡＴＣＣ ＢＡＡ−７０５として入手できる代表的な株で）も含む。従って、メチロバクテリウムが、Ｍ．エキストロクエンス、Ｍ．ノデュランス、Ｍ．メソフィリカム、Ｍ．セラスチイ、Ｍ．ゴジピコーラ、メチロバクテリウム種の株ＬＭＧ６３７８、Ｍ．フィロスフェラ、Ｍ．オリゼ、Ｍ．プラタニ及びＭ．ポプリからなる群から選択される、植物及び／又は植物の一部をコロニー化できるメチロバクテリウムである、発酵ブロス、発酵ブロス生成物、組成物、それらの製造方法、及び制限されることなく、植物を処理する方法を含むそれらの使用方法が提供される。植物及び／又は植物の一部をコロニー化できる他のメチロバクテリウムを単離する方法は、種々の刊行物において記載されており、使用もできる（Ｍａｄｈａｉｙａｎら、及びそれらに挙げられた参考文献を参照）。理論に限定されることなく、本明細書において提供されるエマルションを含有する培地中でメチロバクテリウムを培養する方法は、植物及び／又は植物の一部、又は植物及び／又は植物の一部の表面から単離されたものをコロニー化できるメチロバクテリウムを成長するために特に有利であってよい。
【００５３】
本明細書において提供される、発酵ブロス、発酵ブロス生成物、組成物及び関連する方法は、制限されることなく、表１のメチロバクテリウムを含む。
【００５４】
【表１−１】
2016521980.tif 000002
【表１−２】
2016521980.tif 000003
【表１−３】
2016521980.tif 000004
受託キー
ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ， ＵＳＡ
ＣＣＵＧ：Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｏｅｔｅｂｏｒｇ， Ｓｗｅｄｅｎ
ＣＩＰ：Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｄｅ ｌ’Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ， Ｐａｒｉｓ， ＦＲ
ＤＳＭ：ＤＳＭＺ−Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（“ＤＳＭＺ”）， Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ
ＪＣＭ：Ｊａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ， Ｓａｉｔａｍａ， Ｊａｐａｎ
ＬＭＧ：Ｂｅｌｇｉａｎ Ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ／Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ ｖｏｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ（“ＢＣＣＬＭ”） Ｇｈｅｎｔ， Ｂｅｌｇｉｕｍ
ＮＢＲＣ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＢＲＣ）， Ｃｈｉｂａ， Ｊａｐａｎ
ＮＣＩＭＢ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ， Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ， ＵＫ
ＮＲＲＬ：ＵＳＤＡ ＡＲＳ， Ｐｅｏｒｉａ， ＩＬ．， ＵＳＡ。
【００５５】
ある実施態様において、単独培養物又は共生培養物並びに得られた発酵ブロス及び発酵ブロス生成物は、増加したレベルの有用な栄養物又は植物成長調節因子をもたらす、１つ以上のメチロバクテリウム単離物又は突然変異体を含んでよい。米国特許番号第８，１５３，１１８号は、本明細書において提供される方法及び組成物において使用できる増加したレベルのビタミンＢ−１２及びアミノ酸をもたらす種々のメチロバクテリウムを開示している。１つ以上のメチロバクテリウム、例えば、ビタミンＢ−１２を過剰生成する受託番号ＡＴＣＣ ＰＴＡ−１５６１を有するメチロバクテリウム突然変異体Ｂ１２−１１、アミノ酸（トレオニン）を過剰生成するメチロバクテリウム・ロジナム（ＡＴＣＣ＃ ４３２８２）、アミノ酸（Ｌ−グルタミン酸）を過剰生成するメチロバクテリウム種（ＡＴＣＣ＃ ２１３７１）、アミノ酸（Ｌ−グルタミン酸）を過剰生成するメチロバクテリウム種（ＡＴＣＣ＃ ２１３７２）、アミノ酸（Ｌ−リジン）を過剰生成するメチロバクテリウム種（ＡＴＣＣ＃ ２１９２６）、アミノ酸（Ｌ−グルタミン酸）を過剰生成するメチロバクテリウム種（ＡＴＣＣ＃ ２１９６９）、アミノ酸（Ｌ−リジン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、及びＬ−アルギニン）を過剰生成するメチロバクテリウム種（ＡＴＣＣ＃ ２１９２７）、及び／又は単細胞タンパク質を生成するメチロバクテリウム種（ＡＴＣＣ＃ ２１４３８）を含む、発酵ブロス、発酵ブロス生成物、及び組成物も提供される。
【００５６】
ある実施態様において、本明細書において提供される発酵ブロス、発酵ブロス生成物、又は組成物は、さらに、メチロバクテリウム以外の予め決められた同一性の１種以上の導入された微生物を含んでよい。添加されうる他の微生物は、制限されることなく、植物又は植物の一部に適用される場合にバイオ農薬であり又はいくつかの他の利益を提供する微生物を含む。従って、バイオ農薬又は他の効果的な微生物は、制限されることなく、バチルス（Bacillus）種、シュードモナス（Pseudomonas）種、コニオチリウム（Coniothyrium）種、パンテア（Pantoea）種、ストレプトミセス（Streptomyces）種、及びトリコデルマ（Trichoderma）種を含む。微生物バイオ農薬は、細菌、真菌、ウィルス、又は原生動物であってよい。特に有用な生物農薬微生物は、種々のバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）、バチルス・プミリス（Bacillus pumilis）、シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・ヴィレンス（Trichoderma virens）及びストレプトミセス・リディカス（Streptomyces lydicus）の株を含む。追加される他の微生物は、遺伝子操作されてよく、又は純粋培養物として入手できる天然に生じる単離物であってよい。ある実施態様において、細菌微生物又は真菌微生物は、胞子の形で、発酵ブロス、発酵ブロス生成物、又は組成物中で提供されてよい。添加されうるさらに他の微生物は、制限されることなく、光合成微生物である微生物を含む。かかる光合成生物は、制限されることなく、藻類を含む。かかる藻類は、制限されることなく、プロトコッカス属（Protococcus）、アオサ（Ulva）、ミル属（Codium）、アオノリ（Enteromorpha）、ネオクロリス属（Neochloris）及び／又はクラミドモナス属（Chlamydomonas）を含んでよい。
【００５７】
ある実施態様において、培地中で使用されるエマルションの水性液体成分は、制限されることなく、無機塩、例えばリン酸カリウム、硫酸マグネシウム等、炭素源、例えばグリセロール、メタノール、グルタミン酸、アスパラギン酸、コハク酸等、及びアミノ酸ブレンド、例えばペプトン、トリプトン等を含む、安価で容易に入手できる成分から製造される。使用されうる液体培地の例は、制限されることなく、アンモニウムミネラル塩（ＡＭＳ）培地（Ｗｈｉｔｔｅｎｂｕｒｙら、１９７０）、Ｖｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒ（ＶＢ）培地（Ｖｏｇｅｌ ａｎｄ Ｂｏｎｎｅｒ， １９５６）及びＬＢ培地（“Ｌｕｒｉａ −Ｂｅｒｔａｎｉ Ｂｒｏｔｈ”）を含む。
【００５８】
ある実施態様において、前記エマルションは、水性液体と、水性液体中で不混和性又は部分的にのみ混和性である液体とを含む。水中で不混和性又は部分的にのみ混和性である非水性液体は、制限されることなく、次のいずれかを含む：（１）２５℃でｎ−ペンタノール、ｎ−ヘキサノール、又はｎ−ヘプタノールの混和性以下である水中での混和性を有する液体；（２）アルコール、アルデヒド、ケトン、脂肪酸、リン脂質、又はそれらの任意の組合せを含む液体；（３）少なくとも５個、６個又は７個の炭素原子を含む脂肪族アルコール及びステロールからなる群から選択されるアルコール；（４）動物油、微生物油、合成油、植物油、又はそれらの組合せ；及び／又は（５）トウモロコシ、大豆、綿、ピーナッツ、ヒマワリ、オリーブ、亜麻、ココナッツ、ヤシ、菜種、ゴマ種子、ベニバナ、及びそれらの組合せからなる群から選択される植物油。ある実施態様において、不混和性又は部分的にのみ混和性の非水性液体は、少なくとも約０．０２％〜約２０％（質量）のエマルションを含みうる。ある実施態様において、不混和性又は部分的にのみ混和性の非水性液体は、少なくとも約０．０５％、０．１％０．５％、又は１％〜約３％、５％、１０％、又は２０％（質量）のエマルションを含みうる。
【００５９】
一般に、メチロバクテリウムの効率的な成長のために提供されるエマルションで使用される非水性液体成分は、水又は水溶液中で不混和性又は部分的にのみ混和性であるあらゆる非水性液体であってよい。かかる適した非水性液体は、液体培地中で提供される場合にメチロバクテリウムに関して、非殺菌性又は非静菌性でもある。ある実施態様において、かかる適した非水性液体は、滅菌の形で容易に得られ又は滅菌させた非水性液体でもある。本明細書において使用される非水性液体は、微生物の混入の除去を提供し、かつ従って、制限されることなく、オートクレーブ、照射、化学処理及びそれらの任意の組合せの方法を含むあらゆる方法によって滅菌されうる。
【００６０】
本明細書において提供されるある実施態様において、固体物質を、本明細書において提供される方法、発酵生成物、又は組成物のエマルションに添加できる。液体及び固体を含有する二相性媒体中でメチロバクテリウムを成長するための方法及び組成物は、共同出願した米国特許番号第１３／９０７，１６１号（参照をもって本明細書中にその全体を組込まれたものとする）、及び共同出願したＰＣＴ／ＵＳ １３／４３７２２号（参照をもって本明細書中にその全体を組込まれたものとする）において記載されている。これらの固体物質は、動物、植物、微生物、真菌、又は資源、人工物質、又は天然物質及び人工物質の組合せを含む。ある実施態様において、固体物質は、無生物固体物質である。動物、植物、微生物、又は真菌の起源の無生物固体物質は、生存不能（すなわちもはや生きていない）であるか又は生存不能にさせた、動物、植物、微生物又は真菌から得られる。従って、ケイ藻シェルは、以前に関連する珪藻類が除去されたか、そうでなければ生存不能になった場合に、無生物固体物質である。ケイ藻シェルが無生物固体物質である場合に、それらは、光合成生物又は光合成微生物であるとは考えられない。ある実施態様において、固体物質は、制限されることなく、砂、シルト、土、粘土、灰、炭、珪藻土及び他の類似した鉱物、研磨ガラス又はガラスビーズ、セラミック材料、セラミックビーズ、ベントナイト、カオリン、タルク、パーライト、雲母、バーミキュライト、シリカ、石英粉末、モンモリロナイト、及びそれらの組合せを含む。ある実施態様において、固体物質は、ポリマー又はポリマービーズであってよい。固体物質として使用できるポリマーは、制限されることなく、水又は水溶液中で不溶性又は部分的にのみ可溶性である種々の多糖、例えばセルロースポリマー及びキチン質ポリマー、寒天（すなわちガラクタン）、及びそれらの組合せを含む。ある実施態様において、固体物質は、不溶性又は部分的にのみ可溶性の食塩結晶であってよい。使用できる食塩結晶は、制限されることなく、不溶性又は部分的にのみ可溶性の炭酸塩、クロム酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、水酸化物、酸化物及び硫化物を含む。ある実施態様において、固体物質は、微生物細胞、真菌細胞、微生物胞子又は真菌胞子であってよい。ある実施態様において、固体物質は、微生物細胞又は微生物胞子であってよく、その際微生物細胞又は微生物胞子は光合成微生物ではない。ある実施態様において、微生物細胞又は微生物胞子は、光合成微生物ではなく、その際、光合成微生物は、藻類、シアノバクテリア、ケイ藻、ボツリオコッカス・ブラウニー（Botryococcus braunii）、クロレラ、デュナリエラ・ターティオレクタ（Dunaliella tertiolecta）、オゴノリ（Gracilaria）、プリュウロクリシス・カルテラ（Pleurochrysis carterae）、アカモク（Sargassum）、及びアオサ（Ulva）からなる群から選択される。さらに他の実施態様において、ある実施態様において、固体物質は、不活性な（すなわち生存不能な）微生物細胞、真菌細胞、微生物胞子又は真菌胞子であってよい。さらに他の実施態様において、ある実施態様において、固体物質は、静止している（すなわち生きているが活発に分裂しない）微生物細胞、真菌細胞、微生物胞子又は真��胞子であってよい。さらに他の実施態様において、固体物質は、微生物起源の細胞デブリであってよい。さらに他の実施態様において、固体物質は、植物の任意の部位からの特定の物質であってよい。固体物質を得るために使用できる植物部分は、制限されることなく、軸、殻皮、外皮、葉、根、花、茎、樹皮、種子、及びそれらの組合せを含む。制限されることなく、バガス、ふすま、大豆グリッツ、粉砕シードケーキ、わら等を含む加工した植物の一部から得られる生成物も使用できる。かかる植物の一部、加工した植物、及び／又は加工した植物の一部を、使用されうる特定の形で固体材料を得るために粉砕してよい。ある実施態様において、制限されることなく、木材パルプ、おがくず、かんなくず等を含む木材又は木材生成物を使用できる。ある実施態様において、固体物質は、制限されることなく、骨粉、ゼラチン、粉砕した貝殻又は粉末状貝殻、髪、ふやかした獣皮等を含む、動物からの特定の材料であってよい。
【００６１】
ある実施態様において、エマルションに添加される固体物質は、培地中で固体物質の分散を提供する特定の形で提供される。ある実施態様において、固体物質は、平均長さ又は平均直径で約２ミクロン〜約１０００ミクロンの粒子から構成される。ある実施態様において、固体物質は、平均長さ又は平均直径で約１ミクロン〜約１０００ミクロンの粒子から構成される。ある実施態様において、固体物質は、平均長さ又は平均直径で約１、２、４、１０、２０、又は４０ミクロン〜約１００、２００、５００、７５０、又は１０００ミクロンの粒子である。本明細書において提供される方法及び組成物において使用される粒子の所望の特徴は、撹拌に対して培地中で粒子を懸濁できるために適した湿潤性を含む。
【００６２】
ある実施態様において、本明細書において提供される発酵生成物、組成物、及び方法においてエマルションに添加される液体又は固体は、エマルションの安定化のために提供される乳化剤である。かかる乳化剤は、制限されることなく、界面活性剤及び増粘剤を含んでよい。界面活性剤は、制限されることなく、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤、オルガノシリケート界面活性剤、及び／又は酸性化界面活性剤を含む種々のイオン性洗剤又は非イオン性洗剤を含んでよい。本明細書において提供される発酵生成物、組成物、及び方法において乳化剤として使用される浸水コロイドポリマーは、制限されることなく、寒天、アルギン酸塩、アラビノキシラン、カラゲナン、カルボキシメチルセルロース、セルロース、カードラン、ゼラチン、ジェラン、β−グルカン、グアーゴム、アラビアゴム、ローカストビーンガム、ペクチン、デンプン、キサンタンゴム、及びそれらの混合物を含む。他の乳化剤は、制限されることなく、種々の粘土及びタンパク質を含む。本明細書及びその他において開示されている、ある農業的に認容性の助剤及び付形剤を、乳化剤として使用してもよい。
【００６３】
ある実施態様において、乳化剤に添加される固体物質は、培地中で、発酵生成物又は組成物をコロイドとして提供し、その際連続相は液体であり、かつ不連続相は固体である。メチロバクテリウムを成長させるために使用される液体培地中でコロイドを形成するために使用できる適した固体は、制限されることなく、浸水コロイドともいわれる種々の固体を含む。本明細書において提供される培地、方法及び組成物において使用されるかかる浸水コロイドは、植物、動物、微生物又は合成源の親水性ポリマーであってよい。前記方法において使用される浸水コロイドポリマーは、多くのヒドロキシル基を含んでよく、及び／又は高分子電解質であってよい。本明細書において提供される組成物及び方法において使用される浸水コロイドポリマーは、制限されることなく、寒天、アルギン酸塩、アラビノキシラン、カラゲナン、カルボキシメチルセルロース、セルロース、カードラン、ゼラチン、ジェラン、β−グルカン、グアーゴム、アラビアゴム、ローカストビーンガム、ペクチン、デンプン、キサンタンゴム、及びそれらの混合物を含む。ある実施態様において、本明細書において提供される培地、方法、及び組成物において使用されるコロイドは、浸水コロイドポリマー及び１種以上のタンパク質を含んでよい。
【００６４】
ある実施態様において、エマルションに添加される固体物質は、固体物質上でのメチロバクテリウムの付着成長を提供する固体物質であってよい。固体物質に付着するメチロバクテリウムは、成長培地で付着したメチロバクテリウムを有する固体物質を単純に洗浄することにより実質的に除去できないメチロバクテリウムであり、一方で付着していないメチロバクテリウムは、液体成長培地で固体物質を洗浄することにより実質的に除去できる。本記載内容において、“実質液に除去される”は、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％の存在するバクテリウムが、固体物質を液体成長培地の３容量で線上する場合に除去されることを意味する。かかる洗浄は、制限されることなく、洗浄される固体相から液体をデカンテーションすること、又は液体中で細菌の流通を可能にするフィルター上で固体相を通して液体を通過することを含む種々の方法によって実施してよい。ある実施態様において、固体に関連して付着するメチロバクテリウムは、固体に直接接着されるメチロバクテリウム、及び／又は固体物質に間接的に接着されるメチロバクテリウムの双方を含んでよい。固体物質に間接的に付着されるメチロバクテリウムは、制限されることなく、固体物質に接着される他のメチロバクテリウムに又は他の微生物に接着されるメチロバクテリウム、固体物質に付着される他の物質に付着されることにより固体物質に付着されるメチロバクテリウム等を含む。ある実施態様において、発酵ブロス、発酵ブロス生成物、又は組成物中で少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％又は９９．９％のメチロバクテリウムが、固体物質に付着されるメチロバクテリウムである。ある実施態様において、付着するメチロバクテリウムは、発酵ブロス、発酵ブロス生成物、又は組成物中で、固体物質の表面に対して、少なくとも約１のメチロバクテリウム／２０平方ミクロメートルの、少なくとも約１のメチロバクテリウム／１０平方ミクロメートルの、少なくとも約１のメチロバクテリウム／１０平方ミクロメートルの、少なくとも約１のメチロバクテリウム／５平方ミクロメートルの、少なくとも約１のメチロバクテリウム／２平方ミクロメートルの、又は少なくとも約１のメチロバクテリウム／１平方ミクロメートルの密度で存在する。ある実施態様において、付着するメチロバクテリウムは、発酵ブロス、発酵ブロス生成物、又は組成物中で、固体物質の表面に対して、少なくとも約１のメチロバクテリウム／２０平方ミクロメートル〜約１のメチロバクテリウム／２平方ミクロメートルの、少なくとも約１のメチロバクテリウム／１０平方ミクロメートル〜約１のメチロバクテリウム／２平方ミクロメートルの、少なくとも約１のメチロバクテリウム／１０平方ミクロメートル〜約１のメチロバクテリウム／２平方ミクロメートルの、少なくとも約１のメチロバクテリウム／５平方ミクロメートル〜約１のメチロバクテリウム／１平方ミクロメートルの、少なくとも約１のメチロバクテリウム／２平方ミクロメートル〜約１のメチロバクテリウム／１平方ミクロメートルの密度で存在する。ある実施態様において、付着するメチロバクテリウムは、発酵ブロス、発酵ブロス生成物、又は組成物中で、固体物質の表面に対して、少なくとも約１のメチロバクテリウム／２０平方ミクロメートル〜約１のメチロバクテリウム／２平方ミクロメートルの、少なくとも約１のメチロバクテリウム／１０平方ミクロメートル〜約１のメチロバクテリウム／２平方ミクロメートルの、少なくとも約１のメチロバクテリウム／１０平方ミクロメートル〜約１のメチロバクテリウム／２平方ミクロメートルの、少なくとも約１のメチロバクテリウム／５平方ミクロメートル〜約１のメチロバクテリウム／２平方ミクロメートルの密度で存在する。本明細書において提供される発酵生成物及び発酵ブロスは、付着していないメチロバクテリウムを含む液相を含有してよい。ある実施態様において、液相中の付着していないメチロバクテリウムの力価は、約１０００００、１００００又は１０００ＣＦＵ／ｍｌ未満である。
【００６５】
提供される培養方法は、１ミリリットルあたり少なくとも約５×１０7コロニー形成単位より多い力価、１ミリリットルあたり少なくとも約５×１０8コロニー形成単位より多い力価、１ミリリットルあたり少なくとも約１×１０9コロニー形成単位より多い力価、１ミリリットルあたり少なくとも約１×１０10コロニー形成単位より多い力価、１ミリリットルあたり少なくとも約３×１０10コロニー形成単位の力価で、メチロバクテリウムを有する発酵生成物を得ることができる。ある実施態様において、本明細書において提供される発酵ブロスは、１ミリリットルあたり少なくとも約５×１０7コロニー形成単位〜１ミリリットルあたり少なくとも約３×１０10コロニー形成単位、１ミリリットルあたり少なくとも約５×１０7コロニー形成単位〜１ミリリットルあたり少なくとも約４×１０10コロニー形成単位、又は１ミリリットルあたり少なくとも約５×１０7コロニー形成単位〜１ミリリットルあたり少なくとも約６×１０10コロニー形成単位の力価でメチロバクテリウムを含有してよい。ある実施態様において、本明細書において提供される発酵ブロスは、１ミリリットルあたり少なくとも約１×１０9コロニー形成単位〜１ミリリットルあたり少なくとも約３×１０10コロニー形成単位、１ミリリットルあたり少なくとも約１×１０9コロニー形成単位〜１ミリリットルあたり少なくとも約４×１０10コロニー形成単位、又は１ミリリットルあたり少なくとも約１×１０9コロニー形成単位〜１ミリリットルあたり少なくとも約６×１０10コロニー形成単位の力価でメチロバクテリウムを含有してよい。ある実施態様において、本明細書において提供される発酵ブロスは、１ミリリットルあたり少なくとも約１×１０10コロニー形成単位〜１ミリリットルあたり少なくとも約３×１０10コロニー形成単位、１ミリリットルあたり少なくとも約１×１０10コロニー形成単位〜１ミリリットルあたり少なくとも約４×１０10コロニー形成単位、又は１ミリリットルあたり少なくとも約１×１０10コロニー形成単位〜１ミリリットルあたり少なくとも約６×１０10コロニー形成単位の力価でメチロバクテリウムを含有してよい。ある実施態様において、本明細書において提供される発酵ブロスは、１ミリリットルあたり少なくとも約３×１０10コロニー形成単位〜１ミリリットルあたり少なくとも約４×１０10コロニー形成単位、又は１ミリリットルあたり少なくとも約３×１０10コロニー形成単位〜１ミリリットルあたり少なくとも約６×１０10コロニー形成単位の力価でメチロバクテリウムを含有してよい。
【００６６】
メチロバクテリウムを有するエマルションを含有する発酵ブロス、発酵ブロス生成物、発酵生成物、又は他の組成物を、植物又は植物の一部を処理するために有用な種々の組成物を製造するために使用してよい。代わりに、メチロバクテリウムを有するエマルションを含有する発酵ブロス、発酵ブロス生成物、発酵生成物、又は他の組成物を、植物又は植物の一部を処理するために使用してよい。従って、発酵ブロス生成物又は組成物で少なくとも部分的に覆われている植物、植物の一部、及び特に植物種子が提供される。発酵ブロス生成物又は組成物を含む加工した植物の一部も提供される。メチロバクテリウムを有するエマルションを含有する発酵ブロス、発酵ブロス生成物、発酵生成物、又は他の組成物は、植物種子を処理するために特に有用である。従って、発酵ブロス生成物又は組成物で少なくとも部分的に覆われている種子が提供される。制限されることなく、本明細書において提供される発酵ブロス生成物又は組成物を含む、ミール、粉、飼料、及びフレークを含む加工した種子生成物も提供される。ある実施態様において、加工した植物生成物は再生可能ではない（植物に発育することができない）。ある実施態様において、植物、植物の一部又は植物種子を少なくとも部分的に被覆する、又は加工した植物、植物の一部又は植物種子中で含まれる、発酵生成物又は組成物において使用されるエマルションは、処理した及び未処理の植物、植物の一部、植物種子、又は加工したそれらの生成物を比較することによって容易に同定されうる関連するメチロバクテリウムを含有する。
【００６７】
メチロバクテリウムを有するエマルションを含有する発酵ブロス、発酵ブロス生成物、発酵生成物、又は他の組成物を、工業製品又は組換えタンパク質を製造するために、又はバイオレメディエーションにおいて使用してよい。
【００６８】
メチロバクテリウムを含有するエマルションを含有する植物又は植物の一部を処理するために有用な組成物は、農業的に認容性の助剤又は農業的に認容性の付形剤を含んでもよい。農業的に認容性の助剤又は農業的に認容性の付形剤は、典型的に、植物又は植物の一部に曝される場合に、不相応な植物毒性又は他の逆効果を生じない成分である。ある実施態様において、エマルションは、メチロバクテリウムに対して殺菌性又は静菌性でない限り、それ自体、農業的に認容性の助剤又は農業的に認容性の付形剤であってよい。他の実施態様において、前記組成物は、さらに、農業的に認容性の助剤又は農業的に認容性の付形剤の少なくとも１つを含む。前記組成物のいずれかは、さらに殺虫剤も含んでもよい。組成物中で使用される殺虫剤は、制限されることなく、殺虫剤、殺真菌剤、殺線虫剤及び殺菌剤を含む。ある実施態様において、前記組成物中で使用される殺虫剤は、実質的にメチロバクテリウムの成長を阻害しない殺虫剤である。メチロバクテリウムがグラム陰性細菌であるため、前記組成物中で使用される適した殺菌剤は、制限されることなく、グラム陽性菌に対して活発に阻害するが、グラム陰性菌は阻害しない殺菌剤を含んでよい。本明細書において提供される組成物は、実質的にメチロバクテリウムの成長を阻害しない静菌剤も含んでよい。本明細書において提供される組成物中での使用に適した静菌剤は、制限されることなく、グラム陽性菌に対して活発に阻害するが、グラム陰性菌は阻害しない静菌剤を含む。前記組成物のいずれかは、本質的に乾燥生成物（すなわち、約５質量％以下の含水率を有する）、組成物とエマルションと混合物、又は懸濁液であってもよい。
【００６９】
前記組成物中で使用される農学的に認容性の助剤は、制限されることなく、生成物効果を高める成分、及び／又は製品適用の容易さを高める生成物を含む。生成物効果を高める助剤は、植物の一部への接着を促進し植物の一部上で組成物を拡げる種々の湿潤剤／スプレッダー、植物の一部への接着を促進するステッカー、活性剤と内部組織との接触を促進できる浸透剤、環境悪化を阻害することにより活性剤の半減期を増加するエキステンダー、及び拡げた組成物の密度又は乾燥時間を増加する保湿剤を含んでよい。組成物中で使用される水／スプレッダーは、制限されることなく、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤、オルガノシリケート界面活性剤、及び／又は酸性化界面活性剤を含んでよい。組成物中で使用したステッカーは、制限されることなく、ラテックスベースの界面活性剤、テルペン／ピノレン、及びピロリドンベースの界面活性剤を含んでよい。浸透剤は、鉱物油、野菜油、エステル化野菜油、オルガノシリケート界面活性剤、及び酸性化界面活性剤を含んでよい。前記組成物中で使用されるエキステンダーは、制限されることなく、硫酸アンモニウム、又はメンテンベースの物質を含んでよい。前記組成物中で使用される保湿剤は、グリセロール、プロピレングリコール、及びジエチルグリコールを含んでよい。生成物適用を容易に改良する助剤は、制限されることなく、酸性化剤／緩衝剤、消泡剤／脱泡剤、相溶剤、ドリフト低減剤、染料、及び水質調節剤を含む。前記組成物中で使用される消泡剤／脱泡剤は、制限されることなく、ジメトポリシロキサンを含んでよい。前記組成物中で使用される相溶剤は、制限されることなく、硫酸アンモニウムを含んでよい。前記組成物中で使用されるドリフト低減剤は、制限されることなく、ポリアクリルアミド、及び多糖を含んでよい。前記組成物中で使用される水質調節剤は、制限されることなく、硫酸アンモニウムを含んでよい。
【００７０】
発酵ブロス、発酵ブロス生成物、及び組成物で植物及び／又は植物の一部を処理する方法も本明細書において提供される。処理した植物、及びそれらから得られた処理した植物の一部は、制限されることなく、トウモロコシ、アブラナ種（セイヨウアブラナ（B. napus）、Ｂ．ラパ（B. rapa）、セイヨウカラシナ（B. juncea））、アルファルファ、米、ライ麦、モロコシ、雑穀（例えばトウジンヒエ（ペニセタム・グラカム（Pennisetum glaucum））、キビ（Panicum miliaceum）、アワ（Setaria italica）、シコクビエ（Eleusine coracana））、ヒマワリ、ベニバナ、大豆、タバコ、ジャガイモ、ピーナッツ、綿、サツマイモ（Ipomoea batatus）、キャッサバ、コーヒー、ココナッツ、パイナップル、シトラスツリー、カカオ、茶、バナナ、アボカド、イチジク、グァバ、マンゴー、オリーブ、パパイア、カシュー、マカダミア、アーモンド、テンサイ、サトウキビ、オート麦、大麦、トマト、レタス、グリーンビーンズ、ライマメ、エンドウ、ウリ科、例えばキュウリ、カンタロープ及びマスクメロン、観葉植物、及び針葉樹を含む。処理される植物の一部は、制限されることなく、葉、茎、花、根、種子、果実、塊茎、子葉鞘等を含む。処理されうる観葉植物及び植物の一部は、制限されることなく、アザレア、アジサイ、ハイビスカス、バラ、チューリップ、スイセン、ツクバネアサガオ、カーネーション、ポインセチア及びキクを含む。処理されうる針葉樹植物及び植物の一部は、制限されることなく、マツ、例えばタエダマツ、スラッシュマツ、ポンデローサマツ、及びモントレーマツ；アメリカトガサワラ；ベイツガ；シトカトウヒ；アメリカスギ；トドマツ、例えばヨーロッパモミ及びバルサムモミ；並びにヒマラヤスギ、例えばベイスギ及びアラスカヒノキを含む。処理されうる芝草植物及び植物の一部は、制限されることなく、スズメノカタビラ、一年生ライグラス、カナダブルーグラス、フェスキュ、ベントグラス、ウィートグラス、ケンタッキーブルーグラス、オーチャードグラス、ライグラス、レッドトップ、バミューダグラス、セントオーガスチングラス、及びノシバを含む。前記植物のいずれかの種子又は他の珠芽は、本明細書において提供される発酵ブロス、発酵ブロス生成物、発酵生成物、及び／又は組成物で処理されうる。
【００７１】
ある実施態様において、植物及び／又は植物の一部は、噴霧で、発酵ブロス、発酵ブロス生成物、発酵生成物、及び組成物を適用することにより処理される。かかる噴霧適用は、制限されることなく、単独の植物の一部、又は植物の一部のあらゆる組合せの処理を含む。噴霧は、発酵ブロス、発酵ブロス生成物、発酵生成物、及び組成物を植物及び／又は植物の一部に分布するあらゆる装置で達成できる。有用な噴霧装置は、ブーム噴霧器、手動噴霧器又は背負式噴霧器、クロップダスター（すなわち空中噴霧）等を含む。発酵ブロス、発酵ブロス生成物、発酵生成物及び組成物を、向軸表面及び／又は背軸表面のいずれか又は双方に適用するために提供される噴霧装置及び噴霧方法を使用してもよい。メチロバクテリウムを有するエマルションを含有する発酵ブロス、発酵ブロス生成物、発酵生成物又は組成物のいずれかで少なくとも部分的に被覆された植物及び／又は植物の一部も本明細書において提供される。本明細書において、加工した植物生成物に付着するメチロバクテリウムを有する固体物質を含有する加工した植物生成物も提供される。
【００７２】
ある実施態様において、種子は、本明細書において提供さえるエマルションを含有する発酵ブロス、発酵ブロス生成物、発酵生成物、及び組成物に種子を曝すことによって処理される。種子を、制限されることなく、吸水、被覆、噴霧等を含む方法によって、本明細書において提供される発酵ブロス、発酵ブロス生成物、及び組成物で処理してよい。種子の処理を、連続及び／又はバッチ式の種子処理装置で実施してよい。ある実施態様において、被覆した種子を、メチロバクテリウムを有するエマルションを含有する提供される発酵ブロス、発酵ブロス生成物又は組成物で種子を覆うことによって、及び得られた生成物を空気乾燥することによって製造してよい。空気乾燥を、種子に又はメチロバクテリウムに有害ではない任意の温度で実施してよいが、しかし典型的には３０℃以下である。エマルション及びメチロバクテリウムを含有するコーティングの割合は、制限されることなく、０．１〜２５質量％の種子、０．５〜５質量％の種子、及び０．５〜２．５質量％の種子の範囲を含む。ある実施態様において、さらに種子のコーティング又は処理において使用される固体物質を含有するエマルションは、それらに付着したメチロバクテリウムを有する。ある実施態様において、さらに種子のコーティング又は処理において使用される固体物質を含有するエマルションは、メチロバクテリウムに関連し、かつ本明細書において提供される方法によって得られる発酵ブロス、発酵ブロス生成物、又は組成物である。米国特許番号第５，１０６，６４８号、第５，５１２，０６９号、及び第８，１８１，３８８号において開示されている種々の種子処理組成物及び種子の処理のための方法は、参照をもってその全体を本明細書に組込まれたものとし、かつ本明細書において提供される発酵ブロス、発酵ブロス生成物又は組成物を含有する活性剤との使用に適していてよい。ある実施態様において、種子を処理するために使用される組成物は、制限されることなく、木粉、粘土、活性炭、ケイ藻土、微粒無機固体、炭酸カルシウム等を含む、農業的に認容性の付形剤を含んでよい。本明細書において提供される発酵ブロス、発酵ブロス生成物、又は組成物と使用されうる粘土及び無機固体は、制限されることなく、カルシウムベントナイト、カオリン、陶土、タルク、パーライト、雲母、バーミキュライト、シリカ、石英粉末、モンモリロナイト及びそれらの混合物を含む。使用されうる種子への粘着を促進する農業的に認容性の助剤は、制限されることなく、ポリ酢酸ビニル、ポリ酢酸ビニルコポリマー、加水分解ポリ酢酸ビニル、ポリビニルピロリドン−酢酸ビニルコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルコールコポリマー、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルメチルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、ロウ、ラテックスポリマー、エチルセルロース及びメチルセルロースを含むセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸塩、デキストリン、マルトデキストリン、多糖、脂肪、油状物、タンパク質、カラヤゴム、ジャガーゴム（ｊａｇｕａｒ ｇｕｍ）、トラガカントゴム、多糖ゴム、ゴム糊、ア��ビアゴム、シェラック、塩化ビニリデンポリマー及びコポリマー、大豆ベースのタンパク質ポリマー及びコポリマー、リグニンスルホン酸塩、アクリル酸コポリマー、デンプン、ポリビニルアクリレート、ゼイン、ゼラチン、カルボキシメチルセルロース、キトサン、ポリエチレンオキシド、アクリルアミドポリマー及びコポリマー、ポリヒドロキシエチルアクリレート、メチルアクリルアミドモノマー、アルギン酸塩、エチルセルロース、ポリクロロプレン及びそれらのシロップ又は混合物を含む。コーティングを促進しうる他の有用な農業的に認容性の助剤は、制限されることなく、酢酸ビニルのポリマー及びコポリマー、ポリビニルピロリドン−酢酸ビニルコポリマー、及び水溶性ロウを含む。本明細書及び米国特許番号第８，１８１，３８８号において開示されている種々の界面活性剤、分散剤、固化防止剤、発泡調節剤、及び染料は、本明細書において提供される発酵ブロス、発酵ブロス生成物又は組成物を含有する活性剤との使用に適していてよい。
【００７３】
実施例
次の実施例は、本発明の好ましい実施態様を証明するために含まれる。次の実施例において開示されている技術は、本発明の実施に良好に機能することが発明者によって発見された技術を示し、従ってその実施のために好ましい方法を構築すると考えられることが、当業者によって認識されている。しかしながら、当業者は、即時の開示を考慮して、多くの変更が開示されている特定の実施態様において実施できる一方で、本発明の範囲から逸脱することなく、同様の又は類似した結果をさらに得ることを認識すべきである。
【００７４】
実施例１  板状固体寒天培地上でのＰＰＦＭ細菌の成長
板状固体寒天培地上でＰＰＦＭ細菌を成長させるために、種々の標準培地で試験した。
【００７５】
使用した１つの培地は、アンモニウムミネラル塩（ＡＭＳ）培地（Ｗｈｉｔｔｅｎｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９７０）であった。ＡＭＳ培地は、１リットルあたり、７００ミリグラムの二塩基リン酸カリウム無水物、５４０ミリグラムの一塩基リン酸カリウム無水物、１グラムの硫酸マグネシウム七水和物、５００ミリグラムの塩化アンモニウム無水物、２００ミリグラムの塩化カルシウム脱水物、４ミリグラムの硫酸第二鉄七水和物、１００マイクログラムの硫酸亜鉛七水和物、３０マイクログラムの塩化マンガン四水和物、３００マイクログラムのホウ酸無水物、２００マイクログラムの塩化コバルト六水和物、１０マイクログラムの塩化銅二水和物、２０マイクログラムの塩化ニッケル六水和物、及び６０マイクログラムのモリブデン酸ナトリウム二水和物を含む。
【００７６】
ＡＭＳ培地を、以下で挙げた４つのストック溶液から製造した。
2016521980.tif 000005
【００７７】
ストック溶液Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩを別々にオートクレーブにかけた。微量金属ストック溶液は、オートクレーブ工程中にほとんどの塩を沈澱させるためオートクレーブにかけず、０．２ミクロメートルの濾過装置を介して濾過滅菌した。これらの工程は、溶液中の全ての成分を有する無色透明なＡＭＳ培地の製造を確実にするために必須であった。Ｗｈｉｔｔｅｎｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９７０）によって当初に記載されているように、ＡＭＳ培地のリン酸塩含有成分を、培地製造の仕上げ工程まで、他の成分から隔離し、不溶性リン酸マグネシウム及びリン酸カルシウム結晶の形成を妨げた。
【００７８】
ＡＭＳベースで１リットルの板状固体寒天培地を製造するために、１５グラムの寒天を、９４０ｍｌの蒸留水に添加し、そしてこの混合物をオートクレーブにかけた。オートクレーブ後に、それぞれ２０ｍｌのストック溶液Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩを、１ｍｌの濾過滅菌した微量金属ストック溶液と共に、添加した。
【００７９】
他の培地成分、例えば炭素源を導入すべきである場合に、ほとんどの部分について、これらを、オートクレーブ前に水と寒天の混合物に添加した。この例外の１つはメタノールであり、０．２ミクロメートルの濾過装置を介して滅菌し、そしてベース培地をオートクレーブした後に添加した。
【００８０】
使用した第二の培地は、Ｖｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒ（ＶＢ）ミネラル培地（Ｖｏｇｅｌ ａｎｄ Ｂｏｎｎｅｒ， １９５６）であった。ＶＢ培地は、１リットルあたり、２９８ミリグラムの硫酸マグネシウム七水和物、１４．９３グラムの無水二塩基硫酸カリウム、５．２２グラムの硫酸アンモニウムナトリウム四水和物、及び２．７３グラムの無水クエン酸（遊離酸形）を含む。
【００８１】
Ｖｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒミネラル培地を、塩及びクエン酸の２５倍のストック溶液から製造した。この２５倍ストック溶液を、挙げられた順序で、１リットルの蒸留水中で次の成分の以下の量を溶解し、そしてそれぞれが次を添加する前に完全に溶解したことを確認することによって製造した：７．４６グラムの硫酸マグネシウム七水和物、６８．２３グラムの無水クエン酸、３７３．１３グラムの無水二塩基硫酸カリウム、及び１３０．６０グラムの硫酸アンモニウムナトリウム四水和物。硫酸マグネシウムを最初に溶解し、そしてクエン酸を添加することによって、マグネシウムイオンを、クエン酸イオンによってキレート化し、リン酸塩を添加した場合に不溶性リン酸マグネシウム結晶の形成を妨げた。これは、溶液中で全ての成分を有する無色透明な培地を製造することを確実にした。
【００８２】
ＶＢベースで１リットルの板状固体寒天培地を製造するために、１５グラムの寒天を、９６０ｍｌの蒸留水に添加し、そしてこの混合物をオートクレーブにかけた。オートクレーブ後に、４０ｍｌの２５倍のＶＢストック溶液を添加した。
【００８３】
他の培地成分、例えば炭素源を導入すべきである場合に、ほとんどの部分について、これらを、オートクレーブ前に水と寒天の混合物に添加した。この例外の１つはメタノールであり、０．２ミクロメートルの濾過装置を介して滅菌し、そしてベース培地をオートクレーブした後に添加した。
【００８４】
使用した第三の培地はＬＢブロスであった。ＬＢブロスは、１リットルあたり、１０グラムのトリプトン、５グラムの酵母抽出物、及び１０グラムの塩化ナトリウムを含む。全ての成分を１リットルの蒸留水中で溶解し、そしてオートクレーブにかけた。溶液中で全ての成分を有するこの培地は無色透明であった。
【００８５】
ＬＢベースで１リットルの板状固体寒天培地を製造するために、１５グラムの寒天を、１リットルのＬＢブロスに添加し、そしてこの混合物をオートクレーブにかけた。
【００８６】
Ｃｏｒｐｅ及びＢａｓｉｌｅ（１９８２）は、種々の炭素源を含むＡＭＳ培地中で種々の株のＰＰＦＭ細菌の成長の組織的な調査を実施した。試験した物質の多くは、ＰＰＦＭ細菌のどの成長にもほとんど支持しなかった。Ｃｏｒｐｅ及びＢａｓｉｌｅは、グリセロール及びグルタメートが、ＰＰＦＭ細菌について比較的良好な炭素源であり、かつメタノール、グルコース、アスパラギン酸塩、コハク酸塩及びリンゴ酸塩を、ＰＰＦＭ細菌についての炭素源として中間体であった。
【００８７】
出願人は、ＬＢプレート上で、並びに種々の炭素源を補ったＡＭＳ及びＶＢプレート上で、メチロバクテリウム・エキストロクエンスの成長を測定した。以下に挙げた炭素源を、ＡＭＳベース又はＶＢベースの塩培地に１リットルあたり１０グラムで全て添加した。さらに、１リットルあたり１０グラムでペプトンを含むいくつかの培地組成物を試験した。メチロバクテリウム・エキストロクエンスを、種々の寒天プレート上で画線培養し、そしてそれらを２週間までの間３０℃でインキュベートした。成長を、完全サイズ（直径約２ミリメートル）になるまでコロニーが要求したインキュベート日数として測定し、それらの成長条件について、延長したインキュベート後にさらに完全サイズのコロニーが形成しなかった場合に、コロニーが、中間サイズ（直径で約１ミリメートル）又は小さいサイズ（直径で０．５ミリメートル以下）として記録した。観察した全てのコロニーは、ＰＰＦＭ細菌の特徴である、深い、飽和度に達したピンク色であった。
【００８８】
結果は以下であった：
2016521980.tif 000006
【００８９】
試験した板状固体寒天培地上でのＰＰＦＭ細菌メチロバクテリウム・エキストロクエンスの最も早く最も豊富な成長は、ＡＭＳとグリセロール及びペプトン、又はＡＭＳとグルタメート及びペプトンであり、次に、ＡＭＳとメタノール又はＶＢとグリセロール及びペプトンが近かった。他の試験した培地に対する成長は著しく遅かった。
【００９０】
実施例２  透明な単相液体培地中でのＰＰＦＭ細菌の成長
ＰＰＦＭ細菌メチロバクテリウム・エキストロクエンスの最も早く最も豊富な成長を支持していた実施例１において見出された４つの板状固体寒天培地について、相応する液体の種類（すなわち寒天を添加していないもの）を製造し、試験した。溶液中で全ての成分を有する、実施例１において記載されたように製造したこれらの４つの液体培地（唯一の例外はあらゆる寒天を含まないことであった）は、全て無色透明の液体であった。
【００９１】
１００ミリリットルのこれらの４つの液体培地を含むフラスコに、ＰＰＦＭ細菌メチロバクテリウム・エキストロクエンスを添加して、１ミリリットルあたり約１×１０5コロニー形成単位（ＣＦＵ）の初期力価を得た。そのフラスコを、回転撹拌インキュベーター上に置き、そして３０℃及び２５０ｒｐｍで５日間成長させた。５日のインキュベートの終了時点で、フラスコ中のＰＰＦＭ細菌の力価を測定した。結果は以下であった：
2016521980.tif 000007
【００９２】
これらの結果の著しい態様は、ＰＰＦＭ細菌が急速に豊富に成長する（実施例１において記載されたような）これらの培地の固体寒天プレート形で存在した、厳密に同じ栄養物の存在下での、全てのこれらの無色透明な培地中でのＰＰＦＭ細菌の非常に乏しい成長である。代わりに、これらのフラスコの全てにおいて、混濁度がわずか又は見られず（細菌成長の典型的な徴候）、かつどんなピンクの色相も見られなかった。
【００９３】
実施例３  不溶性塩の結晶を含有する二相培地中でのＰＰＦＭ細菌の成長
二相培地の製造のために、液体ＡＭＳ＋グリセロール及びペプトンの培地を、リン酸マグネシウム及び／又はリン酸カルシウムの不溶性結晶を故意に形成することによって混濁させた（すなわち固体物質を提供した）。培地中で不溶性結晶を故意に形成するために、実施例１に記載された製造方法を以下のように変更した。微量金属ストック溶液を除く全ての成分を、オートクレーブ前に一緒に混合した。すなわち、９４０ｍｌの蒸留水に、それぞれ２０ｍｌのストック溶液Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩを、１０グラムのグリセロール及び１０グラムのペプトンに加えて添加した。オートクレーブ後に、培地を、１ｍｌの濾過滅菌した微量金属ストック溶液の添加によって完成させた。オートクレーブ前に共に混合したストック溶液Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩの成分のオートクレーブは、不溶性塩の結晶、おそらく主に二塩基性リン酸マグネシウム及び／又は二塩基性リン酸カルシウムの形成をもたらした。オートクレーブ後に、ＡＭＳ＋グリセロール及びペプトンの培地を、この製造方法によって製造し、これらの塩の結晶を有する非常に混濁した液体培地を得た。この新たな液体培地を、“混濁ＡＭＳ＋グリセロール及びペプトン”と表した。
【００９４】
１００ミリリットルの混濁ＡＭＳ＋グリセロール及びペプトンを含むフラスコに、ＰＰＦＭ細菌メチロバクテリウム・エキストロクエンスを添加して、１ミリリットルあたり約１×１０5コロニー形成単位（ＣＦＵ）の初期力価を得た。そのフラスコを、回転撹拌インキュベーター上に置き、そして３０℃及び２５０ｒｐｍで３日間成長させた。ちょうど２日後に、フラスコは、ＰＰＦＭ細菌の早く豊富な成長を示す、濃く、飽和したピンク色の混濁度を生じた。インキュベートの２日及び３日後に、フラスコ中のＰＰＦＭ細菌の力価を測定した。結果は以下であった：
2016521980.tif 000008
【００９５】
この結果の２つの顕著な態様は、ＰＰＦＭ細菌の非常に早い成長であり、透明なＡＭＳ＋グリセロール及びペプトンの液体培地（実施例２において示されている）で得られた力価よりも、１００００倍高い力価までＰＰＦＭ細菌は成長した。
【００９６】
実施例４  不溶性塩の結晶を含有する二相培地中でのＰＰＦＭ細菌の成長
ケイ藻土が、ＰＰＦＭ細菌の早く豊富な成長の促進に効果的であるかどうかを試験するために、少量のケイ藻土を、ＡＭＳ＋グリセロール及びペプトンの液体培地に添加した。この液体培地を、実施例１において記載したように、すなわち、リン酸マグネシウム及びリン酸カルシウムの不溶性塩の結晶の形成を妨げることを設計した製造方法によって製造した。ケイ藻土を、オードクレーブ前に水に添加した。試験したケイ藻土の量は、１リットルあたり、５００ミリグラム、１グラム、１．５グラム、及び２グラムであった。これらの新たな液体培地を、“ＡＭＳ＋グリセロール及びペプトン及びケイ藻土”と表した。
【００９７】
１００ミリリットルのＡＭＳ＋グリセロール及びペプトン及びケイ藻土を含むフラスコに、ＰＰＦＭ細菌メチロバクテリウム・エキストロクエンスを添加して、１ミリリットルあたり約１×１０5コロニー形成単位（ＣＦＵ）の初期力価を得た。そのフラスコを、回転撹拌インキュベーター上に置き、そして３０℃及び２５０ｒｐｍで３日間成長させた。ちょうど２日後に、フラスコは、ＰＰＦＭ細菌の早く過剰な成長を示す、濃く、飽和したピンク色の混濁度を全て生じた。インキュベートの２日及び３日後に、フラスコ中のＰＰＦＭ細菌の力価を測定した。結果は以下であった：
2016521980.tif 000009
【００９８】
この結果の２つの顕著な態様は、ＰＰＦＭ細菌の非常に早い成長であり、透明なＡＭＳ＋グリセロールとペプトンの液体培地（実施例２において示されている）で得られた力価よりも、１００００倍高い力価までＰＰＦＭ細菌は成長した。２日の成長後に得られたデータは、増加した量の成長を、培地１００ｍｌあたり０．５グラム〜１．５グラムの範囲内での観点の増加量に対応する。
【００９９】
実施例５  培地中で種々の固体の存在下及び不在下での種々のメチロバクテリウムの力価
メチロバクテリウム属の１４株を、ＤＳＭＺ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ， ＵＳＡ）から購入した。これらの１４株は、異なる１２種からなり、これらは以下のセットにおいて３種のＭ．エキストロクエンスがあった。
2016521980.tif 000010
【０１００】
以下の試験のために、接種物は、無色透明なＡＭＳ−ＧＰ培地中で成長させた培養物から得た。これらの培養物を、２００ｍｌの無色透明なＡＭＳ−ＧＰ培地中で成長させ、力価を測定し、そして１０倍濃縮した。固体物質が存在しないこれらのＰＰＦＭ培養物を使用して、１０ｍｌの無色透明なＡＭＳ−ＧＰ培地、又は種々の固体物質添加したＡＭＳ−ＧＰ培地を含有する試験管に植え付けた。２０ｍｇの種々の固体物質を、それぞれ１０ｍｌの管に添加し、１リットルあたり２グラム当量の固体物質濃度を得た。それぞれの管における標的物の初期濃度は、１ｍｌあたり約１×１０5ＰＰＦＭ（細胞）であった。植え付けた試験管を、回転撹拌機上に置き、そして３０℃及び２５０ｒｐｍで３日間成長させた。成長の３日後に、ＰＰＦＭ培地の力価を測定した。
【０１０１】
無色透明なＡＭＳ−ＧＰ液体培地中でのＰＰＦＭ株の成長
2016521980.tif 000011
【０１０２】
不溶性塩の結晶を含有する混濁ＡＭＳ−ＧＰ液体培地でのＰＰＦＭ株の成長
2016521980.tif 000012
【０１０３】
実施例６  エマルション中でのメチロバクテリウムの成長
メチロバクテリウムＰＰＦＭ株を、２００ｍｌの無色透明なＡＭＳ−ＧＰ培地中で成長させ、力価を測定し、そして１０倍濃縮した。固体物質が存在しないこれらのＰＰＦＭ培養物を使用して、無色透明なＡＭＳ−ＧＰ培地及び油状物で製造したエマルションを含有する１０ｍｌの無色透明なＡＭＳ−ＧＰ培地を含有する試験管に植え付けた。エマルションについて、油状物を、１リットルあたり２０ミリリットル当量の濃度で添加した。それぞれの管における標的物の初期濃度は、１ｍｌあたり約１×１０5ＰＰＦＭコロニー形成単位であった。
【０１０４】
エマルションを製造するために、２つの滅菌した６０ミリリットルのルアーローク注射器を、滅菌した３方向ルアーロークストップコック（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．社（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）のカタログ番号Ｓ７５２１）に取り付けた。１つの注射器を空にし、そして他は、４９ミリリットルの滅菌した無色透明なＡＭＳ−ＧＰ液体培地及び１ミリリットルの滅菌油状物を含んだ。その液体を、２つの注射器間で強制的に押し戻し、そして押し出した。ストップコックの小さい穴を介したこの強制的な混合は、２つの液体のエマルションを製造した。
【０１０５】
植え付けた試験管を、回転撹拌機上に置き、そして３０℃及び２５０ｒｐｍで３日間成長させた。
【０１０６】
ａ．  ゴマ油で（１リットルあたり２０ミリリットルで）エマルション中に製造したＡＭＳ−ＧＰ液体培地中でのＰＰＦＭ株の成長
2016521980.tif 000013
【０１０７】
３日間の成長後に、エマルションは、ＰＰＦＭがエマルション中で良好に成長したことを示す、豊富なピンク色であった。それらを激しくボルテックスし、そして力価を測定した。得られたＰＰＦＭ細胞の力価は、透明なＡＭＳ−ＧＰ液体培地中でのＰＰＦＭの成長によって得られた力価よりも高かった（実施例５の比較結果を参照、無色透明なＡＭＳ−ＧＰ液体中で３日間のＰＰＦＭの成長は、１ｍｌあたり１０6コロニー形成単位を超えなかった）。
【０１０８】
ｂ．  ココナッツオイルで（１リットルあたり２０ミリリットルで）エマルション中に製造したＡＭＳ−ＧＰ液体培地中でのＰＰＦＭ株の成長
2016521980.tif 000014
【０１０９】
３日間の成長後に、エマルションは、ＰＰＦＭがエマルション中で良好に成長したことを示す、豊富なピンク色であった。それらを激しくボルテックスし、そして力価を測定した。得られたＰＰＦＭ細胞の力価は、透明なＡＭＳ−ＧＰ液体培地中でのＰＰＦＭの成長によって得られた力価よりも高かった（実施例１０の比較結果を参照、無色透明なＡＭＳ−ＧＰ液体中で３日間のＰＰＦＭの成長は、１ｍｌあたり１０6コロニー形成単位を超えなかった）。
【０１１０】
実施例７  制御したバイオリアクター中でのＰＰＦＭ細菌の成長
回転撹拌機でインキュベートしたフラスコ中の細菌の成長を、成長培地中で炭素源の代謝によってもたらされるｐＨの変化により制限する。制御したバイオリアクター（“発酵槽”又は“発酵容器”としても公知である）は、適宜、酸又は塩基の制御された添加によって所望のレベルでｐＨを維持することによってこの制限を避ける。細菌の成長を制限できる他の要因は、溶存酸素の可能性である。制御されたバイオリアクターは、反応容器中への空気流の制御された調整、容器の撹拌速度、及び容器内の空気圧によって、溶存酸素の適切なレベルを維持することによってこの制限を避ける。
【０１１１】
本明細書において開示された又は請求された、又は実施例６において記載された方法のいずれかによってエマルションを形成するために、さらに第二の不混和性液体を補った、実施例１において記載されたＡＭＳ＋グリセロール及びペプトンの液体培地を含有する制御されたバイオリアクター中で成長させる場合に、得られたＰＰＦＭ細菌の最終力価は、フラスコ中で得られた最終力価よりも少なくとも約１０倍、又は少なくとも約３０倍高い。
【０１１２】
実施例８  メチロバクテリウムを有するエマルションを含有する植物種子又は葉処理組成物
植物種子又は葉の処理に適した組成物を得るために、メチロバクテリウムを、本明細書において開示された又は請求された、又は実施例６において記載された方法のいずれかによってエマルション中で培養する。典型的に、メチロバクテリウムを、高い力価（すなわち、１ｍｌあたり少なくとも約５×１０7コロニー形成単位）まで培養する。そしてエマルション中でメチロバクテリウムを採取する。採取は、濾過、遠心分離、デカンテーション、及びそれらの組合せによって達せられる。採取した材料を、ある例において種子又は植物に直接適用できる。他の例において、採取した材料を、適用前に、凍結乾燥又は噴霧乾燥することによって乾燥させる。乾燥させた材料を、植物又は種子に適用する前に必ず又は望ましくは、液体で再構成してもよい。メチロバクテリウムを含むエマルションを含有する発酵ブロスのいずれかに、又は採取したメチロバクテリウムに、農業的に認容性の付形剤及び／又は助剤をさらに添加することも可能である。添加される付形剤は、木粉、粘土、活性炭、ケイ藻土、微粒無機固体、炭酸カルシウム等を含んでよい。付形剤として組成物中に添加してよい粘土及び無機固体は、カルシウムベントナイト、カオリン、陶土、タルク、パーライト、雲母、バーミキュライト、シリカ、石英粉末、モンモリロナイト及びそれらの混合物を含む。組成物に添加されうる種子又は他の植物の一部への粘着を促進する農業的に認容性の助剤は、ポリ酢酸ビニル、ポリ酢酸ビニルコポリマー、加水分解ポリ酢酸ビニル、ポリビニルピロリドン−酢酸ビニルコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルコールコポリマー、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルメチルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、ロウ、ラテックスポリマー、エチルセルロース及びメチルセルロースを含むセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸塩、デキストリン、マルトデキストリン、多糖、脂肪、油状物、タンパク質、カラヤゴム、ジャガーゴム、トラガカントゴム、多糖ゴム、ゴム糊、アラビアゴム、シェラック、塩化ビニリデンポリマー及びコポリマー、大豆ベースのタンパク質ポリマー及びコポリマー、リグニンスルホン酸塩、アクリル酸コポリマー、デンプン、ポリビニルアクリレート、ゼイン、ゼラチン、カルボキシメチルセルロース、キトサン、ポリエチレンオキシド、アクリルアミドポリマー及びコポリマー、ポリヒドロキシエチルアクリレート、メチルアクリルアミドモノマー、アルギン酸塩、エチルセルロース、ポリクロロプレン及びそれらのシロップ又は混合物を含む。種子又は他の植物の一部のコーティングを促進しうる他の有用な農業的に認容性の助剤は、酢酸ビニルのポリマー及びコポリマー、ポリビニルピロリドン−酢酸ビニルコポリマー、及び水溶性ロウを含む。これらの組成物を、乾燥形又は半乾燥形で維持してよく、又は所望される液体の添加によってスラリー中に配合してよい。そして、組成物を使用して、植物又は種子に噴霧又は被覆して、メチロバクテリウムの植物への適用に関連する有益な効果を得る。
【０１１３】
参考
2016521980.tif 000015
2016521980.tif 000016
2016521980.tif 000017
【０１１４】
例証及び記載した本発明の原理について、かかる原理から逸脱せずに、本発明を並び替えて及び詳細に改変できることが当業者に明らかであるべきである。
【０１１５】
本発明の材料及び方法は、種々の実施態様及び実施例に記載されているが、本発明の概念、趣旨及び範囲から逸脱せずに、本明細書において記載された材料及び方法にその変更を適用できることが当業者に明らかである。当業者に明らかである全てのかかる小さな置換及び改変は、付属の特許請求の範囲によって定義された本発明の趣旨、範囲及び概念の範囲内であると考える。
【国際調査報告】
2016521980.tif 000018