(57)【要約】  本発明は、ヒトおよび動物の癌および腫瘍の治療および／または治療における使用のための、選択的細胞死誘発バイナリ−酵素系を含有する混合製剤、方法、およびその使用に関する。
2016510324.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２を含む不活性形のグランザイムＢまたはそれをコード化する核酸またはそのいずれかの機能的変異形、およびタバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ（配列番号：４または配列番号：５）またはそれをコード化する核酸またはそのいずれかの機能的変異形を含んでなる、医薬品。
【請求項２】
前記不活性形のグランザイムＢは、グランザイムＢ前駆体（配列番号：３）またはそれをコード化する核酸またはそのいずれかの機能的変異形であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬品。
【請求項３】
前記不活性形のグランザイムＢは、配列番号：２またはそれをコード化する核酸またはそのいずれかの機能的変異形を含む融合タンパク質であり、配列番号：２またはその機能的変異形は、タバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ（配列番号：４または配列番号：５）またはその機能的変異形による開裂で得られることを特徴とする、請求項１に記載の医薬品。
【請求項４】
配列番号：２を含む不活性形のグランザイムＢまたはそれをコード化する核酸またはそのいずれかの機能的変異形、およびタバコエッチ病ウイルスプロテアーゼまたはそれをコード化する核酸またはそのいずれかの機能的変異形を含む医薬品であって、前記不活性形のグランザイムＢは、配列番号：２またはそれをコード化する核酸またはそのいずれかの機能的変異形を含む融合タンパク質であり、配列番号：２またはその機能的変異形は、ＥＮＬＹＦＱ（配列番号：６）またはＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号：７）においてタバコエッチ病ウイルスプロテアーゼによる開裂で得られる、または放出されることを特徴とする、前記医薬品。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬品、および可能ならば賦形剤および付加剤も含んでなる、混合製剤。
【請求項６】
ヒトおよび動物の癌または腫瘍疾患の治療および／または予防に使用される、請求項５に記載の混合製剤。
【請求項７】
遺伝子療法プロセスにより投与されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の混合製剤または医薬品。
【請求項８】
前記遺伝子療法プロセスはビヒクルにより実行されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の混合製剤または医薬品。
【請求項９】
前記ビヒクルはリポソーム、ナノパーティクルまたはマイクロパーティクル、ウイルスおよびリポプレックスの群から選択されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の混合製剤または医薬品。
【請求項１０】
前記ビヒクルは腫瘍マーカーを認識するリガンドを含んでなることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の混合製剤または医薬品。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の混合製剤または医薬品を導入するプロセスであって、配列番号：２をコード化する核酸またはその機能的変異形を含む不活性形のグランザイムＢおよびタバコエッチ病ウイルスプロテアーゼをコード化する核酸またはその機能的変異形は、
ｉ）少なくとも１つのビヒクル内で一緒にまたは別々に導入される、
ｉｉ）腫瘍細胞に導入され、そこで発現する、
ｉｉｉ）不活性形のグランザイムＢを生産し、腫瘍細胞の細胞死を誘発する、
ことを特徴とする、前記プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトおよび動物の癌および腫瘍の治療および／または治療における使用のための、選択的細胞死誘発バイナリ−酵素系を含有する混合製剤、方法、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌とは、体内での無秩序な細胞増殖および変性細胞の播種により特徴付けられる疾患であり、転移の場合には究極的に患者の死に至る疾患である。腫瘍および癌疾患の治療は主に発現する癌の種類に依存しており、今日では通常侵襲的な手術に加えて放射線治療または化学療法が使用される。癌疾患は、外的要因（喫煙、感染性微生物またはウイルス、変異原およびイオン化放射線）および内的原因（遺伝的素因、ホルモン、免疫組織要因および偶発体細胞変異）のよって引き起こされる。癌は免疫療法、ホルモン療法、および標的療法によっても治療できる。腫瘍細胞を殺害するための化学療法使用の利点は、細胞のＤＮＡまたはＲＮＡに破壊的効果を及ぼすことによる細胞分裂の阻害能力により正当付けられる。腫瘍細胞は分裂しなくなることにより死に至る。細胞分裂が速ければ速いほど、腫瘍細胞が化学療法剤により殺害される可能性および腫瘍が細胞死の誘発により萎縮する可能性は高くなる。従って、化学療法は分裂が速い細胞に最も効果的に作用する。しかし、化学療法は癌／腫瘍細胞と体内で急速に成長している正常細胞の区別ができないので、脱毛、疲労、疼痛、血球数の変化、吐き気などの副作用が生じる。化学療法は作用機序に基づき、アルキル化剤、植物アルカロイド、抗腫瘍抗生物質、抗代謝物質の５つのクラスに大きく分けられる。
【０００３】
いわゆる標的療法は、癌細胞と健康な正常細胞に関する我々の知識を利用する。標的療法はかかる癌細胞の特徴を利用することにより癌細胞を排除するものであるから、健康な正常細胞に損傷を与えることはない。かかる標的療法の活性成分は、特に癌細胞を特異的に認識しそれに結合するモノクローン抗体、および腫瘍に供給される血管の成長を特異的に阻害する血管形成阻害剤を含む。標的療法では、大抵、癌細胞膜に浸透し細胞代謝を阻害できる小さな有機分子、特にアポトーシスつまり細胞致死用の小さな有機分子が使用される。かかるアポトーシスを引き起こすために細胞内シグナル経路を標的にする数多くの活性成分が記載されている。他の活性成分は、細胞表面の腫瘍特異的受容体を認識しそれに結合する。
【０００４】
しかし、かかる療法は免疫組織に過度な負担を課すことになり、多くの場合に限定された範囲でしか使用できない。加えて、かかる形態の療法では、免疫組織の再生のため、大抵、治療と治療の間に長い休みが必要である。従って、最近では、特に遺伝子療法のアプローチまたは遺伝子ワクチン法が、治療法として有望視されるようになってきた。あるいは上記の標準的な手段の補助手段として使用されるようになってきた。
【０００５】
遺伝子療法および遺伝子ワクチン法は分子医学的方法であり、疾患の治療および予防におけるその一般的使用は、診療分野で大きい影響を及ぼしている。両方法とも、患者の細胞または組織への核酸またはペプチドの導入、および導入された核酸によりコード化されている情報のかかる細胞または組織上での処理、すなわち好ましいポリペプチドの発現に基づいている。
【０００６】
既存の遺伝子療法および遺伝子ワクチン法の通常のやり方は、ＤＮＡを使って必要な遺伝子情報を細胞に導入することである。これに関連して、ＤＮＡを細胞に導入するための種々の方法が記載されており、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録）トランスフェクション、原形質融合、エレクトロポレーション、微量注射、リポフェクションなどが存在する。
【０００７】
特に遺伝子ワクチン法に関連して提案されている別の方法は、ＤＮＡウイルスをＤＮＡビヒクルとして使用することである。かかるウイルスは、その感染性により、極めて高いトランスフェクション率を達成できるという利点を有している。
【０００８】
プロテアーゼは、他の物質およびタンパク質（基質）を触媒によって可逆的に変化／改変可能なペプチド分解性およびエステル分解性を有する特殊なタンパク質である。かかるプロテアーゼは、機能的に関連している触媒活性中心の分子群に基づいて４つの主なクラス、すなわちセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼおよび金属プロテアーゼに分類される。セリンプロテアーゼは、２つのファミリーつまりトゥルーセリンプロテアーゼのファミリーとスブチリシンファミリーに大別される。セリンプロテアーゼの最も良く知られた代表例には、消化管内の消化酵素（トリプシン、キモトリプシンおよび膵エラスターゼ）、好中球の殺菌性酵素およびマトリックス消化酵素（白血球エラスターゼおよびカテプシンＧ）、唾液腺のカリクレイン、および凝固系／免疫防御系のセリンプロテアーゼが挙げられる。肥満細胞、リンパ球、食細胞またはナチュラルキラー細胞の分泌顆粒に存在するセリンプロテアーゼ並びに補体系のセリンプロテアーゼは、ウイルス、寄生虫、細菌および腫瘍細胞に対する免疫防御並びに自己免疫プロセスにおいて重要な役割を演じている。セリンプロテアーゼは基質特異性を有しており、アスパラギン酸基の後のペプチド結合の加水分解（グランザイムＢ、溶解標的細胞へのＤＮＡ断片の導入）、アルギニンおよびリシン基の後のペプチド結合の加水分解（トリプシン、グランザイムＡおよびグランザイムＫ）、メチオニン基の後のペプチド結合の加水分解（グランザイムＭ、メターゼ）、あるいは疎水性アミノ酸の後のペプチド結合の加水分解（エラスターゼ、プロテイナーゼ３、膵エラスターゼ、キモトリプシン）が可能である。一連のリンパ球特異的なセリンプロテアーゼ（グランザイムと呼ばれる）が標的細胞溶解中に分泌され、それらは、標的細胞のサイトゾルに吸収された後、活性化されたキラー細胞による標的細胞の分解プロセスに直接および間接に関与する。
【０００９】
細胞のアポトーシスは、種々のアポトーシス促進性機構およびタンパク質によって誘導し得る。かかる機構およびタンパク質の共通点は、細胞に向けられた、カスパーゼと呼ばれるタンパク質分解性システインプロテアーゼのカスケードを活性化することである。このカスケードには、例えばカスパーゼ８、カスパーゼ９などの最初に活性化されるカスパーゼが関与しており、それらは例えばカスパーゼ３、カスパーゼ６などのエフェクターカスパーゼを活性化する。次にそれらは一連の細胞基質を分解し、該影響された細胞をアポトーシスに導く。
【００１０】
本発明で使用される場合、「プログラムされた細胞死」という用語は「アポトーシス」の同意語として使用できる。本発明の定義によれば、「誘発された細胞死」とは、好ましくはセリンプロテアーゼにより活性物質がアポトーシスつまりプログラムされた細胞死を引き起す細胞死のことである。
【００１１】
しかし、セリンプロテアーゼは腫瘍の治療に使用できることが知られている。
【００１２】
特定の認識配列を有する基質タンパク質にのみ酵素的に活性である一連のプロテアーゼが存在する。以下の表にはそのいくつかの例が挙げてある。Ｐ1は開裂が生じる位置の前のアミノ酸の位置を示し、Ｐ４、Ｐ３およびＰ２は制限部位Ｐ１の前のＮ末端の位置であり、Ｐ１’およびＰ２’はＰ１の後のＣ末端の位置である。つまり、プロテアーゼはＰ１とＰ１’の間のポリペプチドを開裂させる。
【００１３】
【表１】
2016510324.tif 000003
【００１４】
特に有効で特異的なセリンプロテアーゼ（表１を参照）は、配列番号：１に示されるグランザイムＢである。
【００１５】
グランザイムＢ（ＧｚｍＢ）は、細胞毒性Ｔ細胞（略字：ＣＴＬ、廃語：Ｔキラー細胞）の顆粒の主要成分の１つである。ＣＴＬはＧｚｍＢをウイルス感染細胞や主要細胞などの標的細胞へ送りアポトーシスを引き起こすことができる。ＣＴＬによる標的細胞の認識には、抗原が主要組織適合遺伝子複合体分子上に存在する樹状細胞（ＤＣ）により処理され、局所リンパ節に運ばれ、抗原特異的Ｔ細胞を活性化することが必要である。
【００１６】
ＧｚｍＢは、活性立体配座を得るのに必須かつ高度に保存されたＮ末端コンセンサス配列であるＩｌｅ−（Ｉｌｅ／Ｖａｌ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを有するセリンプロテアーゼである。ＧｚｍＢが活性形（以下「活性ＧｚｍＢ」と呼ぶ）に変わるためには、配列番号：２で与えられているＮ末端コンセンサス配列Ｉｌｅ−（Ｉｌｅ／Ｖａｌ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙが利用可能でなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明者の目標は、上記従来の技術に始まり、癌または腫瘍細胞の細胞死を活性成分により誘発することであった。
【００１８】
驚いたことに、配列番号：２を含む不活性形のグランザイムＢまたはそれをコード化する核酸およびタバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ（略語：ＴＥＶ）（配列番号：４または配列番号：５）またはそれをコード化する核酸を含有する混合物を含む細胞死誘発バイナリ−酵素系により、腫瘍細胞を死に至らしめることが可能である。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明によれば、ＴＥＶは配列番号：２のＮ末端にリンクする（結合する）非活性形の認識部位（認識配列）ＥＮＬＹＦＱ（配列番号：６）またはＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号：７）を認識する。しかし、本発明によれば、驚くほど改善された開裂が生じるという意味で、ＥＮＬＹＦＱ（配列番号：６）が配列番号：２のＮ末端にリンクしているのが好ましい。
【００２０】
従って、当該目標は、添付の特許請求の範囲により全面的に達成される。
【００２１】
不活性形のグランザイムＢおよびＴＥＶが一緒にまたは別々に腫瘍細胞に導入され発現する（該当する場合）や否や、ＴＥＶは配列番号：２を含む活性形のグランザイムＢを放出し、アポトーシスつまりプログラムされた細胞死を通して細胞死を誘発する。
【００２２】
本発明で使用されるセリンプロテアーゼおよび不活性形グランザイムＢを活性形にアンマスキングするのに使用される手段すなわちＴＥＶを選択するのが、本発明では特に有利である。かかる２つのポリペプチドが腫瘍細胞に存在するようになるや否や、完全に特異的で効率的なやり方でアンマスキングが進行する。この場合、ヒトまたは動物内でグランザイムＢ前駆体もＴＥＶも生じないのが特に有利である。
【００２３】
ＴＥＶは、Ｋａｐｕｓｔら、Ｔｈｅ  Ｐ１’ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｅｔｃｈ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｔｅａｓｅ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，  ２９４（２００２）９４９−９５５の文書に言及されている。
【００２４】
従って、本発明は、配列番号：２を含む不活性形グランザイムＢまたはそれをコード化する核酸およびＴＥＶ（例えば、配列番号：４または配列番号：５）またはそれをコード化する核酸を含む医薬品または混合製剤に関係する。ＴＥＶは非活性形グランザイムＢの認識部位（認識配列）ＥＮＬＹＦＱ（配列番号：６）またはＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号：７）を認識する。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態では、不活性形グランザイムＢはグランザイムＢ前駆体またはそれをコード化する核酸である（Ｚｈｉｎａｎ  Ｘｉａら，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ  ｉｎ  ａ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２４３（１９９８）３８４−３８９）。かかるエンコードする核酸の例は配列番号：８である。
【００２６】
本発明の別の好ましい実施形態では、不活性形グランザイムＢは配列番号：２を含む融合タンパク質またはそれをコード化する核酸であり、配列番号：２はＥＮＬＹＦＱ（配列番号：６）またはＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号：７）においてＴＥＶ（例えば、配列番号：４または配列番号：５）による開裂で得られる、または放出される。
【００２７】
従って、本発明は、不活性形グランザイムＢ、つまり配列番号：２を含む融合タンパク質またはそれをコード化する核酸に関係し、配列番号：２は認識配列ＥＮＬＹＦＱ（配列番号：６）またはＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号：７）においてＴＥＶ（例えば、配列番号：４または配列番号：５）による開裂で放出される。
【００２８】
従って、本発明は、不活性形グランザイムＢ、つまり配列番号：２およびＥＮＬＹＦＱ（配列番号：６）またはＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号：７）を
含む融合タンパク質、またはそれをコード化する核酸あるいは他の配列に関係し、ＥＮＬＹＦＱ（配列番号：６）またはＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号：７）は配列番号：２のＮ末端にリンクしている。対応する実施形態は配列番号：３、すなわちＦＬＡＧ−タグ−ＥＮＬＹＦＱ−配列番号：２で与えられる。他の融合タンパク質も対応する方法（例えば、ＨＩＳタグその他）で調製でき、その場合、サンプルのＦＬＡＧ−タグの代わりに任意のペプチド、例えば５０から１００のアミノ酸から成るペプチドが代用できる。
【００２９】
当業者は適切な融合タンパク質を生産および設計できる（Ａｕｓｕｂｅｌら（ｅｄ．），（１９８９）．  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ．  Ｉｎ：Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）。
【００３０】
本発明の混合製剤および医薬品には、適切な賦形剤および付加剤を加えることができる。適切な付加剤および／または賦形剤の例は、例えば、生理食塩水、安定化剤、プロテイナーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤などである。
【００３１】
従って、本発明は、ヒトおよび動物、特に哺乳動物の癌または腫瘍疾患の治療および／または予防に適用または使用される、上記の混合製剤および医薬品にも関係する。
【００３２】
別の好ましい実施形態では、本発明の混合製剤および医薬品は、遺伝子治療プロセスにより投与される。
【００３３】
遺伝子治療プロセスは、例えば、本発明の核酸とリポソームで複合体を形成することによって得られる。この目的に適した混合脂質は、Ｆｅｌｇｎｅｒ，  Ｐ．Ｌ．ら（１９８７）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ｓｃｉ，  ＵＳＡ  ８４，  ７４１３；Ｂｅｈｒ，  Ｊ．Ｐ．ら（１９８９）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ｓｃｉ，  ＵＳＡ  ８６，  ６９８２；Ｆｅｌｇｎｅｒ，  Ｊ．Ｈ．ら（１９９４）Ｊ，  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９，  ２５５０またはＧａｏ，  Ｘ．  ＆  Ｈｕａｎｇ，  Ｌ，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ，  Ａｃｔａ  １１８９，  １９５に記載されている。リポソームが生産されるとき、ＤＮＡはプラスの実効電荷が残る比率でリポソームの表面にイオン的に結合し、リポソームと完全に複合体を形成する。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）骨組を有する立体的に安定したリポソームでは、単核食細胞系（ＭＰＳ）による摂取が明らかに減少しており、さらに大幅に延長した血液循環時間、ペグ化された小胞の凝固の減少、およびリポソーム製剤の安定性の増大が見られる。ＰＥＧ類似の化合物である直鎖および多分岐ポリグリセロール（ｌＰＧおよびｈｂＰＧ）も優れた生物的適合性を示すが、さらに官能基を付加して誘導体を形成することも可能である。多分岐ポリグリセロール、直鎖多分岐のＰＥＧ−ｈｂＰＧ−ブロック共重合体およびランダムＰＥＧ−ＰＧ共重合体に基づく新規な脂質が、コレステロールや１，２−ビス−ｎ−アルキルグリセリルエーテルなどの親油性イニシエータを用いて、種々のエポキシドモノマーの混合アニオン重合により製造されている。協同脂質として１，２−ジオレオイル−ｓｎ−３−ホスホコリンを用いて、新規の両親媒性構造体がリポソーム膜に成功裏に導入された。
【００３４】
従って、本発明は、ビヒクルを用いて標的細胞、好ましくは腫瘍細胞に送達させる遺伝子療法プロセスにも関係している。  
【００３５】
別の実施形態では、このビヒクルはリポソーム、ナノパーティクルまたはマイクロパーティクル、ウイルスおよびリポプレックスなどの群から選択できる（Ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｂｙ  ｌｉｐｏｐｌｅｘｅｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｕｐｌｅｘｅｓ．  Ｔｒｏｓ  ｄｅ  Ｉｌａｒｄｕｙａ  Ｃ，  Ｓｕｎ  Ｙ，  Ｄｕｅｚｇｕｅｎｅｓ  Ｎ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｉ．  ２０１０  Ｊｕｎｅ  １４；４０（３）：１５９−７０．  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｊｐｓ．２０１０．０３．０１９．  Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ｍａｒ  ３０；Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｂｙ  ＥＧＦ−ｌｉｐｏｐｌｅｘｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，  Ｂｕｎｕａｌｅｓ  Ｍ，  Ｄｕｅｚｇｕｅｎｅｓ  Ｎ，  Ｚａｌｂａ  Ｓ，  Ｇａｒｒｉｄｏ  ＭＪ，  ｄｅ  Ｉｌａｒｄｕｙａ  ＣＴ．  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  （Ｌｏｎｄ）．  ２０１１  Ｊａｎ；６（１）：８９−９８．  ｄｏｉ：１０．２２１７／ｎｎｍ．１０．１００；Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ：ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｌｉｐｏｐｌｅｘｅｓ，  Ｄｕｅｚｇｕｅｎｅｓ  Ｎ，  ｄｅ  Ｉｌａｒｄｕｙａ  ＣＴ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２０１２；５０９：３５５−６７．  ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｂ９７８−０−１２−３９１８５８−１．０００１８−６）。
【００３６】
特に好ましい実施形態では、本発明のビヒクルは腫瘍マーカーを認識する表面上にリガンドを有している。かかるリガンドは、例えば、腫瘍マーカーに結合可能なポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、あるいは共有結合バインダー（アプタマー）である。
【００３７】
最後に、かかる呈示している腫瘍マーカーは以下のものではあり得ない：癌胎児抗原（ＣＥＡ）、アルファ胎児型タンパク（ＡＦＰ）、炭水化物抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、癌抗原７２−４（ＣＡ７２−４）、癌抗原１２５、癌抗原１５−３（ＣＡ１５−３）、神経細胞特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、扁平上皮癌抗原（ＳＣＣ）、サイトケラチン断片（ＣＹＦＲＡ）、ヒト柔毛膜性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ヒトサイログロブリン（ＨＴＧ）、ムチン様癌関連抗原（ＭＣＡ）など。腫瘍マーカーとそれが適する癌の例を図２に示す。
【００３８】
従って、本発明は、本発明の医薬品または混合製剤を導入するプロセスにも関係しており、その場合、配列番号：２をコード化する核酸を含む不活性形グランザイムＢおよびタバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ（配列番号：４または配列番号：５）をコード化する核酸、特に配列番号：２およびＥＮＬＹＦＱ（配列番号：６）またはＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号：７）並びにタバコエッチ病ウイルスプロテアーゼをコード化する核酸を含む融合タンパク質をコード化する核酸を含む不活性形グランザイムＢは、
ｉ）少なくとも１つのビヒクル内で一緒にまたは別々に導入される、
ｉｉ）腫瘍細胞に導入され、そこで発現する、
ｉｉｉ）不活性形のグランザイムＢを生産し、腫瘍細胞の細胞死を誘発する。
【００３９】
該プロセスは、前述の他の実施形態でも同様なやり方で採用できる。本発明の医薬品、混合製剤、特にそれらのビヒクルは、ヒトおよび動物に局所投与（例えば、皮下投与）されるのが好ましい。勿論、本発明には腫瘍治療の全ての応用が含まれる。
【００４０】
本発明で定義される場合、「機能的変異形」という用語は、本発明のペプチドに機能的に関係しているポリペプチドまたは核酸を意味する。変異形という用語は、他の有機体、細胞または組織から誘導される対立遺伝子変異形またはポリペプチドおよび核酸を意味することも了解されている。
【００４１】
さらに広い意味では、指摘された配列番号と配列相同性を有するポリペプチドまたは核酸、特に約７０％の配列同一性、好ましくは約８０％の配列同一性、特に好ましくは約９０％の配列同一性、最も好ましくは約９５％の配列同一性を有するポリペプチドまたは核酸を意味することも了解されている。
【００４２】
これには、約１〜５０、好ましくは約１〜３０、特に好ましくは約１〜１５、最も好ましくは約１〜６の範囲のアミノ酸が欠失したポリペプチドも含まれる。例えば、ポリペプチドの機能に実質的な変化を起こすことなく、最初のアミノ酸にメチオニンが欠如していてもよい。
【００４３】
加えて、これには本発明の上記ポリペプチドを含有する融合タンパク質も含まれ、その場合、融合タンパク質はそれぞれの配列番号の機能を既に持っていてもよいし、融合部分を排除した後に初めて特定の機能を獲得できてもよい。とりわけ、特に非ヒト配列の成分が約１〜５０、好ましくは約１〜３０のアミノ酸である融合タンパク質が含まれる。非ヒトペプチド配列の例は、例えば大腸菌ガラクトシダーゼから得られる原核生物のペプチド配列、あるいはいわゆるヒスチジンタグ（例えば、Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｈｉｓ６−タグ）（を有する）原核生物のペプチド配列である。いわゆるヒスチジンタグを有する融合タンパク質が適している特に有利な応用は、発現したタンパク質を金属イオン含有カラム、例えばＮｉ２＋−ＮＴＡカラムを用いて精製することである。ここで、「ＮＴＡ」はキレート化剤ニトリロトリ酢酸（キアゲン社、ヒルデン）を意味する。
【００４４】
特に、ポリペプチドの上記部分は伝統的なペプチド合成を用いて合成することも可能である（メリフィールド法）。それらは特に抗血清を得るのに適しているが、抗血清は適切な遺伝子発現ライブラリを用いて本発明のポリペプチドの他の機能的変異形を得る調査に使用できる。
【００４５】
好ましい実施形態では、各例で述べられた本発明の上記核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡであり、好ましくは二本鎖ＤＮＡであるが、ＰＮＡまたはそれと類似のものも可能である。
【００４６】
本発明の核酸は、（発現）ベクター、例えば構成ＣＭＶプロモーター等を有するベクターｐｃＤＮＡ（登録商標）３．１（インビトロゲン社）を用いて腫瘍細胞に導入することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、腫瘍細胞の死を誘発する本発明の治療戦略を示す。
【図２−１】図２は、ある種の癌疾患の腫瘍マーカーを示す。
【図２−２】図２は、ある種の癌疾患の腫瘍マーカーを示す。
【図３】図３は、実施例１におけるＴＥＶ開裂の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明で定義される場合、腫瘍、癌、癌細胞および腫瘍細胞という用語は同意語として用いられるべきであり、あらゆる良性腫瘍または悪性腫瘍、特に組織容積が局所的に増大した成長が含まれ、その中には、浮腫、急性および慢性の炎症、動脈瘤肥大（拍動性腫瘤）等により引き起こされるあらゆる局所腫脹、あるいは炎症性器官膨張（例えば、いわゆる脾腫の場合）並びに異なる範囲で抑制解除された体組織の自然成長、自律的成長および不可逆的過剰成長を伴う組織新生物（成長、芽腫、新形成）が含まれ、該組織新生物は一般的に、異なる重篤度を伴う特定の細胞および組織の喪失に関連している（Ｐｓｃｈｙｒｅｍｂｅｌ，  （２６１ｓｔ  ｅｄ．）２００７,  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ，  Ｂｅｒｌｉｎを参照）。
【実施例】
【００４９】
実施例は本発明を説明するためのみに使用されるものであり、本発明が該実施例により制限されることはない。
【００５０】
実施例１
ｐＳＴｄｎａ１０２３プラスミドの生成
タバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ配列をｐｃＤＮＡ（登録商標）３．１（インビトロゲン社）に連結した。加えて、ＦＬＡＧ配列（ＭＤＹＫＤＤＤＤＫＧＤＹＫＤＤＤＤＫＧＧＧＴ）をＮ末端に２度クローン化した。
【００５１】
ｐＳＴｄｎａ１０２４（「ＧｒｚＢ  ＷＴ」）の生成
ｐｃＤＮＡ（登録商標）３．１に基づく追加のプラスミドを以下の順序でクローン化した。つまり、クローン化は、ＴＥＶ認識部位（配列番号：６）およびグランザイムＢ  ＡＡ２１−２４０の組み合わせで２度のＦＬＡＧ配列（ＭＤＹＫＤＤＤＤＫＧＤＹＫＤＤＤＤＫＧＧＧＴ）（配列番号：９）にて行われた。
【００５２】
ｐＳＴｄｎａ１０２５プラスミドの生成
プラスミドｐＳＴｄｎａ１０２４のアミノ酸セリン２０３をアラニン２０３で置換した。この変異体は特にグランザイムＢ活性を阻害する（「ＧｒｚＢ  ｍｕｔ」）。
【００５３】
ＴＥＶによる開裂の結果は図３に示してある。認識部位（配列番号：６）がＱではなくＧの場合、ＴＥＶによる開裂は生じない（図示しない）。
【００５４】
実施例２
手順
１．ＨｅＬａ細胞をダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて５％ＣＯ２の下、摂氏３７度で７５％の集密になるまで培養した。
２．培地を慎重に吸引し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。
３．細胞はトリプシンＥＤＴＡ（２００ｍＬ／Ｌ）を用いて５分間消化し、ペトリ皿から分離した。消化はＤＭＥＭを添加することにより停止した。
４．細胞は５００ｇで５分間遠心分離し、エレクトロポレーションのため１μｇのプラスミドと一緒に培地（ロンザ社）に再懸濁した。次に、細胞はＡｍａｘａ（登録）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）ＩＩエレクトロポレータを用いてエレクトロポレーションを行い、新鮮なＤＭＥＭに再懸濁した。
５．細胞は５％ＣＯ２の下、摂氏３７度で４時間インキュベートした。
６．溶液Ａ：１．５ｍＬのチューブ中で１μｇのプラスミドを１００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録）と混合した。
７．溶液Ｂ：１．５ｍＬのチューブ中で８μＬのリポフェクタミン（登録）を混合し、室温で５分間インキュベートした。
８．溶液Ａと溶液Ｂをピペットで取り慎重に混合した。インキュベーション時間は室温で３０分である。
９．細胞培地を慎重に吸引し、細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録）で２度洗浄した。細胞は５％ＣＯ２の下摂氏３７度で、３ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録）と一緒にインキュベートする。
１０．ステップ８からの溶液ＡおよびＢの混合液を３０分間インキュベートし、次にＡＢをピペットでＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録）に移し、慎重に混合した。
１１．細胞は５％ＣＯ２の下摂氏３７度で５時間インキュベートした。
１２．５時間後、５ｍＬのＤＭＥＭを添加した。
【図２−１】
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【図２−２】
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【図１】
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【図３】
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【国際調査報告】
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