(57)【要約】Ｆ１０と指定されたジャガイモ品種が開示される。本発明は、ジャガイモ品種Ｆ１０の塊茎、ジャガイモ品種Ｆ１０の種、ジャガイモ品種Ｆ１０の植物及び植物部位、ジャガイモ品種Ｆ１０から作られた食品、及び、ジャガイモ品種Ｆ１０を、それ自体又は別のジャガイモ変種と交配することでジャガイモ植物を生成する方法に関する。本発明はまた、トランスジェニックジャガイモ植物を生成するための方法、及び、それらの方法により作成されたトランスジェニックジャガイモ植物並びに部位、に関する。本発明はまた、ジャガイモ品種Ｆ１０に由来するジャガイモ植物及び植物部位、ジャガイモ品種Ｆ１０に由来する他のジャガイモ植物又は植物部位を生成するための方法、及び、それらの方法の使用によりもたらされるジャガイモ植物及びそれらの部位、に関する。
2016516446.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
代表的塊茎サンプルが、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２０３７３にてデポジットされた、ジャガイモ品種Ｆ１０のジャガイモ塊茎、又は塊茎の一部。
【請求項２】
請求項１に記載の塊茎、又は前記塊茎の一部を育成することで作成されたジャガイモ植物、又はその一部。
【請求項３】
請求項２に記載の植物の生理的性質及び形態的性質のすべてを有するジャガイモ植物。
【請求項４】
請求項２に記載の植物から作成された細胞の組織培養であって、前記組織培養の前記細胞が、葉、花粉、胚、子葉、胚軸、分裂組織的細胞、根、根端、雄しべ、葯、花、茎、及び塊茎、からなる群から選択される植物部位から作成されている、請求項２に記載の植物から作成された細胞の組織培養。
【請求項５】
請求項４に記載の組織培養から再生されたジャガイモ植物であって、前記植物が、ジャガイモ品種Ｆ１０の生理的性質及び形態的性質のすべてを有する、請求項４に記載の組織培養から再生されたジャガイモ植物。
【請求項６】
請求項１に記載のジャガイモ塊茎、又は前記塊茎の一部を育成することで作成されたジャガイモの種。
【請求項７】
請求項６に記載の種を育成することで作成されたジャガイモ植物、又はその一部。
【請求項８】
請求項７に記載のジャガイモ植物の組織培養から再生されたジャガイモ植物であって、前記植物が、ジャガイモ品種Ｆ１０の生理的性質及び形態的性質のすべてを有する、請求項７に記載のジャガイモ植物の組織培養から再生されたジャガイモ植物。
【請求項９】
ジャガイモの種を生成するための方法であって、前記方法が、２つのジャガイモ植物を交配することと、結果としてのジャガイモの種を収穫することと、を含み、少なくとも１つのジャガイモ植物が、請求項２に記載のジャガイモ植物である、ジャガイモの種を生成するための方法。
【請求項１０】
ジャガイモの種を生成するための方法であって、前記方法が、２つのジャガイモ植物を交配することと、結果としてのジャガイモの種を収穫することと、を含み、少なくとも１つのジャガイモ植物が、請求項７に記載のジャガイモ植物である、ジャガイモの種を生成するための方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法により作成されたジャガイモの種。
【請求項１２】
請求項１１に記載のジャガイモの種を育成することで作成されたジャガイモ植物、又はその一部。
【請求項１３】
請求項１２に記載の植物から作成されたジャガイモの種。
【請求項１４】
前記ジャガイモ植物の１つがトランスジェニックであり、他がジャガイモ品種Ｆ１０である、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記ジャガイモ植物の１つがトランスジェニックであり、他がジャガイモ品種Ｆ１０である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法により作成されたジャガイモ植物、又はその一部。
【請求項１７】
望ましい形質をジャガイモ品種Ｆ１０内に導入する方法であって、前記方法が、
（ａ）Ｆ１０植物を交配することであって、塊茎の代表的サンプルが、子孫植物を生成するための望ましい形質を含む別のジャガイモ品種の植物とともに、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２０３７３にてデポジットされており、前記望ましい形質は、雄性不稔性、除草剤耐性、害虫耐性、修飾脂肪酸代謝、修飾炭水化物代謝及び細菌病、菌類病、又はウィルス病に対する耐性、からなる群から選択される、Ｆ１０植物を交配することと、
（ｂ）前記望ましい形質を有する１つ以上の子孫植物を選択することと、
（ｃ）戻し交配子孫植物を生成するよう、前記選択された子孫植物を、Ｆ１０植物と戻し交配することと、
（ｄ）前記望ましい形質を有する戻し交配子孫植物を選択することと、
（ｅ）前記望ましい形質を含む、選択された第３の戻し交配子孫植物、又はより高位の戻し交配子孫植物を生成するよう、ステップ（ｃ）〜ステップ（ｄ）を２回以上連続して繰り返すことと、を含む、望ましい形質をジャガイモ品種Ｆ１０内に導入する方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法により作成されたジャガイモ植物であって、前記植物が、前記望ましい形質、及びジャガイモ品種Ｆ１０の生理的性質及び形態的性質のすべてを有する、請求項１７に記載の方法により作成されたジャガイモ植物。
【請求項１９】
前記望ましい形質が除草剤耐性であり、前記耐性が、イミダゾリノン、スルホニルウレア、グリホセート、グルホシネート、Ｌ−ホスフィノトリシン、トリアジン、及びベンゾニトリル、からなる群から選択される除草剤に対して与えられる、請求項１８に記載のジャガイモ植物。
【請求項２０】
前記望ましい形質が害虫耐性であり、前記害虫耐性が、バシラスチューリンゲンシスエンドトキシンをコード化する導入遺伝子により与えられる、請求項１８に記載のジャガイモ植物。
【請求項２１】
前記望ましい形質が修飾脂肪酸代謝又は修飾炭水化物代謝であり、前記望ましい形質が、フルクトシルトランスフェラーゼ、レバンスクラーゼ、α−アミラーゼ、インベルターゼ及び澱粉分枝酵素、又はステアリル−ＡＣＰデサチュラーゼのアンチセンスをコード化するＤＮＡ、からなる群から選択されるタンパク質をコード化する核酸により与えられる、請求項１８に記載のジャガイモ植物。
【請求項２２】
請求項２に記載の植物、又はその一部を得ることと、前記植物又はその植物部位から前記コモディティ植物製品を生産することと、を含み、前記コモディティ植物製品が、フレンチフライ、ポテトチップ、乾燥ジャガイモ材料、ポテトフレーク、及びポテトグラニュール、からなる群から選択される、コモディティ植物製品を生成する方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法により生産されたコモディティ植物製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、出願日が２０１３年５月２日であり、その全体において参照により本明細書に組み入れられる、米国仮特許出願第６１／８１８，７５２号からの優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、Ｆ１０と指定された新たなジャガイモ品種、及びそのジャガイモ変種により作成された塊茎、植物、植物部位、組織培養、及び種に関する。本発明は更に、フレンチフライ、ポテトチップ、乾燥ジャガイモ材料、ポテトフレーク、及びポテトグラニュールなどの、ジャガイモ品種Ｆ１０から作成された食品に関する。本出願に引用されるすべての出版物は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００３】
ジャガイモは世界で４番目に重要な食用作物であり、最高位に重要な野菜である。ジャガイモは現在、米国のほぼすべての州にて商業的に栽培されている。ジャガイモの年間生産量は、米国では１．６×１０１０ｋｇ（１８００万トン）を超え、世界では２．７２×１０１１ｋｇ（３億トン）を超える。ジャガイモの大衆性は主に、その汎用性及び栄養価に由来する。ジャガイモは、生鮮食品、冷凍食品、又は乾燥食品に使用、若しくは粉末、澱粉、又はアルコールに加工され得る。これらは複合糖質を含み、カルシウム、ナイアシン、及びビタミンＣが豊富である。
【０００４】
食品産業におけるジャガイモの品質は、次の２つの重要な因子により悪影響を受ける。（１）ジャガイモは、フライイング又はベーキングにより、急速に酸化されて発癌性生成物であるアクリルアミドを形成する非必須遊離アミノ酸であるアスパラギンを大量に含む、及び、（２）ジャガイモは、あざのついたジャガイモの損傷した色素体からポリフェノールオキシダーゼが漏出した際に生じる望ましくない事象である、酵素的褐変及び変色に特に脆弱である。細胞質では、酵素がフェノールを酸化させ、続いて急速に重合が起こり、暗い色素を発色する。塊茎は大量のリン酸化澱粉を含み、この内のいくらかは貯蔵中に分解され、グルコース及びフルクトースを生成する。これらの還元糖は、１２０℃を超える温度に加熱されるとアミノ酸と反応し、アクリルアミドを含むメイラード生成物を形成する。澱粉のリン酸化を伴う２つの酵素は、水ジキナーゼＲ１及びホスホリラーゼ−Ｌ（Ｒ１及びＰｈＬ）である。褐変はまた、澱粉の、グルコース及びフルクトースへの部分的分解の結果として、非酵素的にトリガされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在まで、低アクリルアミド含有、黒斑あざに対する高い許容度、及び低い老化スイートニング（ｓｗｅｅｔｅｎｉｎｇ）、を伴う塊茎を生成するジャガイモ植物の変種はない。したがって、未知又は異質の核酸を使用することのない、毒性化合物が低レベルのジャガイモ変種を開発する必要がある。本発明は、この必要性を満たす。
【０００６】
前述の関連技術例及びそれらに関連する制限は例示的となることを意図し、排他的ではない。関連技術の他の制限は、本明細書を読むことで当業者に自明となるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以下の実施形態及びそれらの態様は、各システム、ツール、及び方法とともに説明されるが、これらは例示的なものを意味し、範囲において限定しない。様々な実施形態では、上述の問題の１つ以上が低減又は削減されており、他の実施形態は、他の改良を目的とする。
【０００８】
この目的を達成するため、本発明は、ジャガイモ植物ゲノムに天然であり、異質ＤＮＡ、アグロバクテリウムＤＮＡ、ウィルスマーカー、又はベクターバックボーン配列を含まない核酸配列を用いて形質転換された新たなジャガイモ変種Ｆ１０を提供する。その代りに、ジャガイモ変種Ｆ１０のゲノム内に挿入されたＤＮＡは、黒斑あざの発現、アスパラギンの蓄積、及び老化スイートニングを伴う遺伝子を抑制する、性別互換性のあるジャガイモ植物であるジャガイモ又は野生のジャガイモに天然の、ノンコーディングポリヌクレオチドである。
【０００９】
したがって、一実施形態では、本発明は、アンチセンス方向に、アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子（ｆＡｓｎ１）のフラグメント及びポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の３’非翻訳配列を含む、２つのコピーのＤＮＡセグメントを内含する第１のサイレンシングカセットと、アンチセンス方向に、ジャガイモホスホリラーゼ−Ｌ（ｐＰｈＬ）遺伝子のフラグメント及びジャガイモＲ１遺伝子のフラグメントを含む２つのコピーのＤＮＡセグメントを内含する第２のサイレンシングカセットと、を含む、ｐＳＩＭ１２７８と呼ばれる植物ベクターを提供する。ｐＳＩＭ１２７８ベクターは、植物形質転換の前に植物ＤＮＡの維持をサポートし、植物細胞の形質転換後に植物細胞に導入されない９，５１１ｂｐバックボーン領域と、形質転換後に植物細胞のゲノム内に安定して組み込まれる天然ＤＮＡを含む１０，１４７ｂｐ  ＤＮＡインサート領域と、を含む。
【００１０】
異なる一実施形態では、本発明は、本発明の植物ベクターを用いて形質転換された植物細胞を提供する。更なる一実施形態では、本発明は、本発明のベクターを用いて形質転換された１つ以上の細胞を含むジャガイモ植物変種を提供する。本発明の一態様では、ジャガイモ植物変種は、ベクターの２つのサイレンシングカセットの少なくとも１つを発現し、サイレンシングカセットの発現は、遺伝子内植物の塊茎内のアスパラギンシンテターゼ−１遺伝子及びポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子のダウンレギュレーションに至る。本発明の好適な一態様では、少なくとも１つのサイレンシングカセットを発現するジャガイモ植物変種の塊茎は、同じ変種の未形質転換の植物の塊茎内に存在しない、２つ以上の望ましい形質を示す。本発明の最も好適な態様では、２つ以上の望ましい形質は、低アスパラギン蓄積、少ない黒斑あざ、及び少ない熱誘導性アクリルアミド形成、からなる群から選択される。
【００１１】
本発明の異なる態様では、ジャガイモ植物変種は、植物ＤＮＡベクターの双方のサイレンシングカセットを発現し、サイレンシングカセットの発現は、ジャガイモ植物変種の塊茎内における、アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子、ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子、及びジキナーゼＲ１遺伝子のダウンレギュレーションに至る。本発明の好適な一態様では、植物ＤＮＡベクターの２つのサイレンシングカセットを発現するジャガイモ植物変種の塊茎は、同じ変種の未形質転換の植物の塊茎内に存在しない２つ以上の望ましい形質を示す。好ましい一実施形態では、２つ以上の望ましい形質は、低アスパラギン蓄積、少ない黒斑あざ、貯蔵中の還元糖の少ない蓄積、及び少ない熱誘導性アクリルアミド形成、からなる群から選択される。本発明の一態様では、植物ＤＮＡベクターの２つのサイレンシングカセットを発現するジャガイモ植物変種は、レンジャーラセットＦ１０変種である。
【００１２】
したがって、本発明によると、Ｆ１０と指定されたジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  Ｌ．）属及び種の新たなジャガイモ品種が提供される。本発明はしたがって、ジャガイモ品種Ｆ１０、ジャガイモ品種Ｆ１０の塊茎、ジャガイモ品種Ｆ１０の植物、ジャガイモ品種Ｆ１０の種、ジャガイモ品種Ｆ１０から作成された食品、及びジャガイモ品種Ｆ１０の自配により、又はジャガイモ品種Ｆ１０の、他のジャガイモ品種との交配により作成されたジャガイモ植物を作成するための方法、及びジャガイモ品種Ｆ１０の突然変異生成又は形質転換による変異の生成に関する。
【００１３】
したがって、品種Ｆ１０を使用する、自配、戻し交配、雑種生成、増殖交配、等、のいずれのそのような方法は、本発明の実施形態である。少なくとも１つの親としてジャガイモ品種Ｆ１０を使用して作成されたすべての植物は、本発明の範囲に入る。ジャガイモ品種は、他の異なるジャガイモ植物との交配に好適に使用され得、第１の世代（Ｆ１）のジャガイモ雑種塊茎、種、及び植物を、優れた性質を伴って作成できる。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、ジャガイモ品種Ｆ１０の単一遺伝子組み換え植物又は複数遺伝子組み換え植物を提供する。一実施形態では、導入された遺伝子（単一又は複数）は、優性対立遺伝子又は劣性対立遺伝子（単一又は複数）であってよい。いくつかの実施形態では、導入された遺伝子（単一又は複数）は、除草剤耐性、害虫耐性、細菌病、菌類病、又はウィルス病に対する耐性、雄性稔性、雄性不稔性、高い栄養価、均一性、高濃度の澱粉並びに他の炭水化物、及びあざのつきやすさの低下並びに澱粉の糖類への転化率の低下、などの形質を与える。遺伝子（単一又は複数）は、自然発生のジャガイモ遺伝子、又は遺伝子工学技術、戻し交配若しくは突然変異を通して導入された導入遺伝子であってよい。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、ジャガイモ品種Ｆ１０の組織培養に使用する再生可能細胞を提供する。一実施形態では、組織培養は、前述のジャガイモ植物のすべての生理的性質及び形態的性質を有する植物を再生することと、前述のジャガイモ植物と実質的に同じ遺伝子型を有する植物を再生することと、が可能となる。いくつかの実施形態では、そのような組織培養における再生可能細胞は、胚、プロトプラスト、分裂組織的細胞、カルス、花粉、葉、葯、雄しべ、子葉、胚軸、根、根端、花、種、葉柄、塊茎、芽、又は茎となる。依然として更に、本発明は、本発明の組織培養から再生されたジャガイモ植物を提供する。
【００１６】
更なる実施形態では、本発明は、ジャガイモ植物変種レンジャーラセットＦ１０の塊茎から作られた食品を提供する。好適には、食品は熱処理製品である。更に好適には、食品はフレンチフライ、ポテトチップ、乾燥ジャガイモ材料、ポテトフレーク、又はポテトグラニュールである。
【００１７】
上記の例示的態様及び実施形態に加えて、更なる態様及び実施形態は、以下の説明を考察することで自明となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクターを示す。左のベクターバックボーン領域は９，５１１ｂｐの長さがあり、９，９５７ｂｐの位置から開始して１９，４６８ｂｐの位置で終了する。バックボーンＤＮＡは主に細菌由来のＤＮＡからなり、植物形質転換前のＤＮＡインサートの維持のサポートを提供する。フランキングボーダー（Ｂｏｒｄｅｒ）配列を含むＤＮＡインサート領域（右側）は、１０，１４７ｂｐの長さがある（１９，４６９ｂｐから１９，６６０ｂｐまで、及び１ｂｐから９，９５６ｂｐまで）。ＤＮＡインサートは天然ＤＮＡのみからなり、形質転換後にジャガイモゲノム内に安定して組み込まれた。
【図２】ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクター内に挿入されたＤＮＡインサート内のサイレンシングカセットの概略図を提供する。それぞれのサイレンシングカセットは、スペーサーにより分離された２つの遺伝子フラグメントの２つのコピーを含む。４つの対象とされた遺伝子、すなわちＡｓｎ−１、Ｐｐｏ−５、Ｐｈｌ、及びＲ１、のフラグメントを含むＤＮＡセグメントの２つのコピーは、塊茎内で優勢にアクティブである、Ｐｒｏとして示される２つの収束プロモーター間の逆方向反復として挿入された。結果としてのサイレンシングカセットを内含する植物は、意図する標的遺伝子を動的かつ活発に抑制する、ＲＮＡ分子の多様かつ非ポリアデニル化されたアレイを塊茎に生成する。ＲＮＡ分子のサイズは一般的に、収束転写が衝突転写に至るために用いられた２つのプロモーター間の距離よりも小さい。
【図３】カテコールアッセイの結果を示す。レンジャーラセットコントロールは左であり、変種Ｆ１０は右である。濃い茶色は、黒斑あざの減少に対する形質が見られないことを示す。図３に見られるように、Ｆ１０は黒斑あざの減少に対する形質を有し、一方でコントロールはそうではない。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下の説明及び表では、数多くの用語が使用されている。明細書及び特許請求の範囲の明確かつ一貫した理解を提供するため、そのような用語が与えられる範囲を含め、以下の定義を提供する。
対立遺伝子。対立遺伝子は、１つの形質又は性質に関連する遺伝子の１つ以上の代替形態のいずれである。２倍体細胞又は生物では、所与の遺伝子の２つの対立遺伝子は、一対の相同染色体上の対応する遺伝子座を占有する。
【００２０】
アミノ酸配列。本明細書で使用される場合、植物から単離された、天然の、又は自然発生の、若しくは合成的に作られたものの、内因性対照物の核酸配列を含む、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質、及びそれらのフラグメントを含む。
【００２１】
人工的に操作された。本明細書で使用される場合、「人工的に操作された」とは、操作されていない、自然に発生した対照物に比較して、異なる生物学的、生化学的、形態的、又は生理的表現型及び／又は遺伝子型を有する植物又は植物細胞を作成するために、手、又は遺伝子工学技術などによる機械的手段若しくは組み換え手段により、植物又は植物細胞を移動、配列、操作、又は制御することを意味する。
【００２２】
無性繁殖。葉のカッティング、茎のカッティング、根のカッティング、塊茎の芽、ストロン、単一植物細胞プロトプラスト、カルス、等から、植物全体を生成することで子孫を作成すること。配偶子の融合を伴わない。
【００２３】
バックボーン。導入を意図する、ＤＮＡインサート配列を除いた、バイナリベクターの核酸配列。
【００２４】
戻し交配。戻し交配は、ブリーダーが雑種子孫を親の１つに、例えば、第１の世代の雑種Ｆ１を、Ｆ１雑種の親遺伝子型の１つと、繰り返し戻し交配するプロセスである。
【００２５】
細菌性の輪腐病。細菌性の輪腐病は、バクテリア「クラビバクターミシガネンシス細菌」（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ  ｓｓｐ）により引き起こされる病気である。細菌性の輪腐病のその名前は、塊茎内の維管束輪の機能停止の性質に由来する。この輪はしばしば、クリーミィな黄色から、明るい茶色の、チーズのような腐敗として現れる。ジャガイモの外側表面では、重篤に病変した塊茎が、少し凹んだ、乾燥して割れたエリアを示す場合がある。感染した塊茎の維管束組織内における細菌性の輪腐病の症状は上記より明確でない場合があり、連続しない、散発的に現れる暗い線、又は連続した黄色みがかった変色としてのみ現れる場合がある。
【００２６】
黒斑あざ。あざのついた塊茎組織に見られる黒斑は、細胞の損傷に続いて作られ、組織の外観に茶色、灰色、又は黒色を残すメラニンと呼ばれる色素の結果である。メラニンは、細胞損傷の結果として、フェノール基質及び特有の酵素が互いに接触すると形成される。細胞の損傷を伴わないダメージの場合もある。しかし、組織が衝撃を受けると通常、基質及び酵素の混合が起こり得る。黒斑は主に維管束輪直下の髄冠組織（ｐｅｒｉｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｔｉｓｓｕｅ）内に発生するが、皮質組織の一部を含むのに十分な大きさの場合がある。
【００２７】
境界状配列。「境界状」配列は、選択された、修飾される植物種から、又は修飾される植物種と性別互換性のある植物から単離されており、アグロバクテリウムの境界配列のように機能する。つまり、本発明の境界状配列は、連結されているポリヌクレオチドの組み込みを推進及び促進する。本発明のＤＮＡインサートは、境界状配列を好適に含む。ＤＮＡインサートの境界状配列は、５〜１００ｂｐの長さの間、１０〜８０ｂｐの長さの間、１５〜７５ｂｐの長さの間、１５〜６０ｂｐの長さの間、１５〜５０ｂｐの長さの間、１５〜４０ｂｐの長さの間、１５〜３０ｂｐの長さの間、１６〜３０ｂｐの長さの間、２０〜３０ｂｐの長さの間、２１〜３０ｂｐの長さの間、２２〜３０ｂｐの長さの間、２３〜３０ｂｐの長さの間、２４〜３０ｂｐの長さの間、２５〜３０ｂｐの長さの間、又は２６〜３０ｂｐの長さの間である。ＤＮＡインサートの左右の境界配列は、修飾される植物のゲノムから単離されている、及び／又は修飾される植物のゲノムに天然のものである。ＤＮＡインサートの境界状配列は、ヌクレオチド配列において、いずれの既知のアグロバクテリウム由来Ｔ−ＤＮＡ境界配列と同一ではない。したがって、ＤＮＡインサートの境界状配列は、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）又はアグロバクテリウムリゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）などの、アグロバクテリウム種からのＴ−ＤＮＡ境界配列とは異なる、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上のヌクレオチドを有してよい。つまり、本発明のＤＮＡインサート境界、又は境界状配列は、アグロバクテリウムツメファシエンス又はアグロバクテリウムリゾゲネスなどの、アグロバクテリウム種からのＴ−ＤＮＡ境界配列との、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、又は少なくとも５０％の配列同一性を有するが、１００％の配列同一性ではない。本明細書で使用される場合、記述的用語「ＤＮＡインサート境界」及び「ＤＮＡインサート境界状」は、交換可能である。境界状配列は、植物ゲノムから単離され、修飾され得るか、又は効率を変えるよう変異され得、それにより、ヌクレオチド配列を別のヌクレオチド配列内に組み込み可能である。他のポリヌクレオチド配列は、本発明の境界状配列に加えられるか、又は組み込まれてよい。したがって、ＤＮＡインサートの左境界又はＤＮＡインサートの右境界は、５’−及び３’−多回クローニング部位、又は付加制限部位を有するよう、修飾されてよい。ＤＮＡインサートの境界配列は、付随的なベクターからのバックボーンＤＮＡが植物ゲノム内に組み込まれない可能性を高めるよう、修飾されてよい。
【００２８】
主成分とする。特定のエレメントを「主成分とする」組成物は、それらのエレメントの内含、同様に、進歩性のある組成物の基本的性質及び新たな性質に物質的に影響しないそれらのエレメントに限定される。したがって、組成物が、本発明の基本的性質及び新たな性質に影響しない、つまり、選択された植物種からではない、又は、選択された植物種と性別互換性のある植物からではない異質のＤＮＡを含まない限りは、その組成物は、「主成分とする」という言葉から特徴付けられる進歩性のある組成物の構成要素とみなされてよい。
【００２９】
子葉。子葉は、種をつける植物の胚葉（ｓｅｅｄ  ｌｅａｆ）の一種類である。子葉は、種の食物貯蔵組織を含む。
【００３０】
縮重プライマー。「縮重プライマー」は、同様であるものの、正確に相同でない配列にハイブリダイズされた際の基質ミスマッチを順応可能な十分なヌクレオチド変種を含むオリゴヌクレオチドである。
【００３１】
双子葉植物（双子葉類）。胚が種をつける植物の胚葉又は子葉を２つ有する顕花植物。双子葉類の例は、限定するものではないが、タバコ、トマト、ジャガイモ、サツマイモ、キャッサバ、アルファルファ及びダイズを含むマメ科植物、ニンジン、イチゴ、レタス、オーク、カエデ、クルミ、バラ、ハッカ、スカッシュ、ヒナギク、及びサボテンを含む。
【００３２】
ＤＮＡインサート。本発明による、植物のゲノム内に挿入されるＤＮＡインサートは、その植物に天然のポリヌクレオチド配列を含むか、又はその植物に天然の遺伝要素を有する。一例では、例えば、本発明のジャガイモ変種Ｆ１０のＤＮＡインサートは、黒斑あざ、アスパラギンの蓄積、及び老化スイートニングの発現を伴う遺伝子の形質転換及び抑制後、植物細胞のゲノム内に安定して組み込まれる、ジャガイモ又は野生のジャガイモに天然の、ジャガイモ性別互換植物である、１０，１４７ｂｐノンコーディングポリヌクレオチドである。ＤＮＡインサートは２つの発現カセットを好適に含み、ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクターと呼ばれる形質転換ベクター内に挿入される。第１のカセットは、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ遺伝子（Ａｇｐ）のＡｇｐプロモーターと、顆粒結合シンターゼ遺伝子（Ｇｂｓｓ）のＧｂｓｓプロモーターとの間に逆方向反復として配列された、アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子（Ａｓｎ１）及びポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子（Ｐｐｏ５）の双方のフラグメントを含む。これらのプロモーターは、塊茎内で優位にアクティブである。第２のカセットの機能は、澱粉関連遺伝子ジキナーゼ−Ｒ１（Ｒ１）及びホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子（ＰｈＬ）の各プロモーターを抑制することである。このカセットは、澱粉関連遺伝子ジキナーゼ−Ｒ１（Ｒ１）及びホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子（ＰｈＬ）の各プロモーターの各フラグメントが含まれており、第１のカセットと同じＡｇｐプロモーター及びＧｂｓｓプロモーターに操作可能に連結されている。これらの発現カセットは異質ＤＮＡを含まず、選択された植物種のいずれ、又は選択された植物種と性別互換性のある植物からのＤＮＡのみからなる。
【００３３】
胚。胚は、成熟した種内に含まれる未熟の植物である。
【００３４】
異質。「異質」は、核酸に関して、その核酸が、非植物生物に由来する、又は形質転換される植物と同じ種ではない植物に由来する、若しくは、形質転換される植物と異系交配できない植物に由来せず、対象植物の種に属さない、ことを意味する。本発明によると、異質ＤＮＡ又は異質ＲＮＡは、真菌、細菌、ウィルス、哺乳類、魚類、又は鳥類の遺伝子構造内に自然発生するが、形質転換される植物内に自然発生しない核酸を表す。したがって、異質核酸は、例えば、形質転換された植物により自然に作成されていないポリペプチドをコード化するものである。異質核酸は、タンパク質生成物を必ずしもコード化しない。本発明による、望ましい遺伝子内植物は、そのゲノム内に組み込まれているいずれの異質核酸を含まないものである。
【００３５】
遺伝子。本明細書で使用される場合、「遺伝子」とはコード化領域を指し、その領域に５’−又は３’−であるヌクレオチド配列を含まない。機能遺伝子は、プロモーター又はターミネーターに操作可能に連結されたコード化領域である。遺伝子は、異なる種から、又は同じ種からであっても、形質転換又は様々なブリーディング方法を使用して、種のゲノム内に導入され得る。
【００３６】
遺伝子が組み換えられた（組み換え）。遺伝子が組み換えられた（組み換え）植物は、戻し交配技術を介して、遺伝子工学を介して、又は突然変異を介して変種内に導入された１つ以上の遺伝子に加えて、変種の望ましい形態的性質及び生理的性質の本質的にすべてが復元されている、戻し交配と呼ばれる植物ブリーディング技術により育成された植物を指す。１つ以上の遺伝子座もまた導入されてよい。
【００３７】
遺伝子再配列。生体内に、同様に、生体外に自然発生的に生じ得、遺伝物質の新たな組織を導入する遺伝要素の再結合を指す。例えば、複数のポリヌクレオチドをともに、異なる染色体の遺伝子座にて重ね継ぐことは、植物の発育及び性の組み換えの双方中に、生体内に自然発生的に生じ得る。したがって、生体外の非天然遺伝子修飾技術による遺伝要素の組み換えは、生体内の性の組み換えを通しても生じ得る組み換えイベントと同種である。
【００３８】
ゴールデンネマトーダ。ジャガイモシストセンチュウ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）は、ゴールデンネマトーダとして一般に知られる、ジャガイモ植物の根及び塊茎に影響する植物寄生線虫である。症状としては、植物の発育不良、しおれ、水ストレス、及び養分欠乏が含まれる。
【００３９】
胚軸。胚軸は、子葉と根との間の胚又は実生苗の部位である。したがって、発芽と根との間の遷移ゾーンとみなすことができる。
【００４０】
インフレーム。ヌクレオチドトリプレット（コドン）は、植物細胞内の望ましい組み換えタンパク質の初期のアミノ酸配列に翻訳される。具体的には、本発明は、第２の核酸への読み枠内に連結された第１の核酸を考慮し、ここで第１のヌクレオチド配列は遺伝子であり、第２のヌクレオチドはプロモーター又は同様の調節エレメントである。
【００４１】
組み込み。選択された植物種からの、又は選択された植物と同じ種からの植物からの、若しくは選択された植物種と性別互換性のある植物からの、選択された植物種の細胞のゲノム内への核酸配列の挿入を指す。「組み込み」は、天然の遺伝要素のみの、植物細胞ゲノム内への組み込みを指す。相同組み換えなどによる、天然の遺伝要素を組み込むため、本発明は、そのようなプロセスにおけるステップとして、非天然ＤＮＡを「使用（ｕｓｅ）」する場合がある。したがって、本発明は、特定のＤＮＡ分子の「使用（ｕｓｅ  ｏｆ）」と、特定のＤＮＡ分子の植物細胞ゲノム内への「組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）」とを区別する。
【００４２】
導入。本明細書で使用される場合、感染、トランスフェクション、形質転換又は形質導入を含む方法による、細胞内への核酸配列の挿入を指す。
【００４３】
単離された。「単離された」とは、その通常の、天然の環境から物理的に分離されているいずれの核酸又は化合物を指す。単離された材料は、例えば、溶媒、緩衝液、イオン、又は他の構成要素を内含する適切な溶液内に維持されてよく、精製形態又は未精製形態中にあってよい。
【００４４】
リーダー。遺伝子に先行して（又は遺伝子に対して５’に）転写されているものの、翻訳されていない配列。
【００４５】
遺伝子座。遺伝子座は、例えば、雄性不稔性、除草剤に対する許容度、害虫耐性、病害耐性、ワキシー澱粉、修飾脂肪酸代謝、修飾フィチン酸代謝、修飾炭水化物代謝、及び修飾タンパク質代謝などの、１つ以上の形質を与える。形質は、例えば、戻し交配、自然突然変異又は誘発突然変異により、変種のゲノム内に導入された自然発生遺伝子により、又は遺伝形質転換技術を通して導入された導入遺伝子により与えられてよい。遺伝子座は、単一の染色体にて組み込まれた１つ以上の対立遺伝子を含んでよい。
【００４６】
市場性収率。市場性収率は、直径が５〜１０ｃｍ（２〜４インチ）間の、収穫したすべて塊茎の重量である。市場性収率は、ｃｗｔ（ハンドレッドウェイト（ｈｕｎｄｒｅｄ  ｗｅｉｇｈｔ））の単位で測定される。ｃｗｔ＝４５ｋｇ（１００ポンド）である。
【００４７】
単子葉（単子葉植物）。胚が子葉又は種をつける植物の胚葉を１つ有する顕花植物。単子葉植物の例として、限定するものではないが、芝、トウモロコシ、コメ、オート麦、小麦、大麦、ソルガム、ラン、アイリス、ユリ、オニオン、及びヤシを含む。
【００４８】
天然の。「天然の」遺伝要素は、形質転換される植物のゲノムに自然に存在する核酸、由来する核酸、又は、属する核酸を指す。したがって、形質転換される植物又は植物種のゲノムのいずれかから単離された、又は、形質転換される植物種と性別互換性のある又は異系交配できる植物又は種から単離された、「天然の」植物種、つまり、生来の植物種である、いずれの核酸、遺伝子、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡ分子である。つまり、天然の遺伝要素は、クラシカルな植物ブリーディングを通しての植物の改良のために、植物ブリーダーがアクセス可能なすべての遺伝物質を表す。天然の核酸のいずれの変異はまた、本発明により、「天然」とみなされる。この点で、「天然の」核酸はまた、植物から単離された、未修飾で天然の核酸に、ヌクレオチド配列において同様に、結果としての変異が、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、又は６０％以上であるよう、植物、又はその性別互換種から単離されてよく、修飾されるか、又は変異されてよい。天然の核酸変異はまた、ヌクレオチド配列において同様に、約６０％未満、約５５％未満、又は約５０％未満であってよい。植物から単離された「天然の」核酸はまた、その核酸から転写され、翻訳された自然発生タンパク質生成物の変異をコード化してよい。したがって、天然の核酸は、核酸が単離された植物内に発現した、未修飾で天然のタンパク質に、アミノ酸配列において同様に、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、又は６０％以上のタンパク質をコード化してよい。
【００４９】
天然の遺伝要素。「天然の遺伝要素」は、本発明による、選択された植物種ゲノム内に組み入れられ、組み込まれ得る。天然の遺伝要素は、選択された植物種に属する植物から、又は選択された植物種と性別互換性のある植物から単離されている。例えば、栽培されたジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）内に組み入れられた天然ＤＮＡは、ジャガイモ（Ｓ．  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）のいずれの遺伝子型、又はジャガイモ（Ｓ．  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）（例えば、野生ジャガイモ（Ｓ．  ｄｅｍｉｓｓｕｍ））と性別互換性のある野生のジャガイモ種のいずれの遺伝子型に由来し得る。
【００５０】
自然発生核酸。自然発生核酸は、選択された植物種のゲノム内に見られ、これはＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子であってよい。植物種のゲノム内に通常存在する制限部位の配列は、その制限部位がそのゲノムから物理的に単離されていなかったとしても、ベクター又はオリゴヌクレオチドなどの、外因性のＤＮＡ分子へと遺伝子操作を受け得る。したがって、本発明は、その配列が、選択された植物種のゲノムにおいて、又は形質転換される選択された植物種と性別互換性のある植物において自然発生である限りは、制限酵素認識配列などの、ヌクレオチド配列の合成生成を許容する。
【００５１】
操作可能に連結。それらが植物細胞内で適切に機能する組み合わせであるような様式にて、２つ以上の分子を組み合わせること。例えば、プロモーターは、プロモーターが構造遺伝子の転写を制御する際に、構造遺伝子に操作可能に連結される。
【００５２】
植物。本明細書で使用される場合、用語「植物」は、限定するものではないが、ジャガイモ、トマト、タバコ、アルファルファ、レタス、ニンジン、イチゴ、砂糖ビート、キャッサバ、サツマイモ、ダイズ、トウモロコシ、芝、小麦、コメ、大麦、ソルガム、オート麦、オーク、ユーカリ、クルミ、及びヤシ、などの被子植物類及び裸子植物類を含む。したがって、植物は単子葉植物又は双子葉類であってよい。用語「植物」はまた、本明細書で使用される場合、植物細胞、種、植物子孫、有性又は無性的な発生に関わらない交配体、及び切り穂又は種などの、それらのいずれの子孫を包含する。植物細胞は、縣濁培養物、カルス、胚、成長点領域、カルス組織、葉、根、発芽、配偶体、胞子体、花粉、種、及び小胞子を含む。植物は、成熟の様々な段階にあってよく、液体培地又は固体培地、若しくは鉢、温室、又は圃場内の土壌又は適切な培地にて育成されてよい。植物内に導入されたリーダー配列、トレーラー配列、又は遺伝子配列の発現は、一時的でも永続的でよい。「選択された植物種」は、限定するものではないが、それら「植物」のいずれの１つの種であってよい。
【００５３】
植物部位。本明細書で使用される場合、用語「植物部位」（又はジャガイモ植物、又はその一部）は、限定するものではないが、プロトプラスト、葉、茎、根、根端、葯、雄しべ、種、胚、花粉、胚珠、子葉、胚軸、花、塊茎、芽、組織、葉柄、細胞、分裂組織的細胞、等、を含む。
【００５４】
植物種。少なくともいくらかの性別互換性を示す、公式な名称の様々な植物種に属する植物の群。
【００５５】
植物形質転換及び細胞培養。植物細胞が遺伝学的に修飾され、維持、更なる成長、及び／又は更なる発育に適切な植物培地に導入されるプロセスを広く指す。
【００５６】
正確な交配。選択された植物種から、又は選択された植物と同じ種内の別の植物から、若しくは選択された植物種と性別互換性のある種から単離された、天然の遺伝子及び調節エレメントなどの、個別の植物細胞内への核酸の安定導入、及び、それに続く、それら遺伝学的に修飾された植物細胞の植物全体への再生による、植物の改良を指す。未知の核酸又は異質核酸は植物ゲノム内に永続的に組み入れられないことから、進歩性のある本技術は、従来の植物ブリーディングを通してもアクセス可能である同じ遺伝物質を使用可能とする。
【００５７】
子孫。本明細書で使用される場合、２つのジャガイモ植物の交配から作成されたＦ１ジャガイモ植物を含み、ここで、少なくとも１つの植物がジャガイモ品種Ｆ１０を含み、子孫が、限定するものではないが、これに続く反復性の親系統とのＦ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９、及びＦ１０世代交配を更に含む。
【００５８】
量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）。量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）は、通常は連続的に分布する数値的に表示可能な形質を、いくらかの程度に制御する遺伝子座を指す。
【００５９】
組み換え。本明細書で使用される場合、遺伝子がクローン化され得、ＤＮＡが配列され得、及びタンパク質生成物が作成され得る様々な技術を広く説明する。本明細書で使用される場合、この用語はまた、植物宿主系の細胞内への遺伝子の導入に続いて作成されたタンパク質を説明する。
【００６０】
再生。再生は、組織培養からの植物の発育を指す。
【００６１】
制御配列。標準的であり、当業者に既知の、所望の遺伝子の転写、又は植物系における結果としてのＲＮＡの翻訳を増大及び／又は最大化するよう発現ベクター内に含まれてよい、それらの配列を指す。それらは、限定するものではないが、プロモーター、ペプチド外輸送シグナル配列、イントロン、ポリアデニル化、及び転写終結部位を含む。植物内の発現レベルを増大するための核酸構造体を修飾する方法はまた、一般的に当該技術分野において周知である（例えば、Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２６０  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７３１〜３８，１９８５；Ｃｏｒｎｅｊｏ  ｅｔ  ａｌ．，２３  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６７：８１，１９９３を参照されたい）。タンパク質の転写率に影響する植物系の遺伝子操作において、積極的又は消極的に作用する配列、エンハンサー及びサイレンサーなどの制御配列、同様にクロマチン構造を含む、当該技術分野において周知の様々な因子が影響する場合がある。本発明は、植物の、所望のタンパク質を発現させるための遺伝子操作に使用されてよいそれら因子の少なくとも１つを提供する。本発明の制御配列は天然の遺伝要素であり、つまり、選択された、修飾される植物種から単離されている。
【００６２】
選択可能マーカー。「選択可能マーカー」は一般的に、抗生物質、除草剤、又は毒性化合物に対するある種の耐性を与えるタンパク質をコード化する遺伝子であり、形質転換イベントの同定に使用される。選択可能マーカーの例としては、ストレプトマイシン耐性をコード化するストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｓｐｔ）遺伝子、マンノース−６−リン酸塩をフルクトース−６リン酸塩に変換するホスホマンノースイソメラーゼ（ｐｍｉ）遺伝子、カナマイシン及びジェネテシン耐性をコード化するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシンに対する耐性をコード化するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ又はａｐｈｉｖ）遺伝子、スルホニルウレアタイプの除草剤に対する耐性をコード化するアセトラクテートシンターゼ（ａｌｓ）遺伝子、ホスフィノトリシン又はバスタ（ｂａｓｔａ）（例えば、バー（ｂａｒ）遺伝子）などのグルタミンシンターゼの作用を抑制するよう働く除草剤に対する耐性をコード化する遺伝子、又は、当該技術分野において周知の他の同様の遺伝子、が含まれる。
【００６３】
センス抑制。トランスジェニック植物におけるその遺伝子のすべて又は一部の１つ以上の付加コピーの発現による、内因性遺伝子の発現における減少。
【００６４】
比重。本明細書で使用される場合、「比重」は濃度の発現であり、ジャガイモ品質の測定値である。塊茎及び澱粉含量の比重と、乾燥物質又は合計固体の割合との間には高い相関がある。より高い比重は、加工製品のより高いリカバリーレート及びよりよい品質に寄与する。
【００６５】
Ｔ−ＤＮＡ様。「Ｔ−ＤＮＡ様」配列は、選択された植物種から、又は選択された植物種と性別互換性のある植物から単離され、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％であるが、１００％ではない、アグロバクテリウム種Ｔ−ＤＮＡとの配列同一性を共有する核酸である。Ｔ−ＤＮＡ様配列は、ヌクレオチド配列を別のポリヌクレオチドにそれぞれ組み込み可能な１つ以上の境界又は境界状配列を含んでよい。
【００６６】
全収率。全収率は、収穫したすべての塊茎の全重量を指す。
【００６７】
トレーラー。遺伝子に続いて（又は遺伝子に対して３’に）転写されているものの、翻訳されていない配列。
【００６８】
転写されたＤＮＡ。先行するプロモーターの作用により単一のｍＲＮＡとして転写された、遺伝子、及びその遺伝子に関連付けられている非翻訳のリーダー配列及びトレーラー配列の双方を含むＤＮＡ。
【００６９】
植物細胞の形質転換。植物細胞のゲノム内にＤＮＡが安定して組み込まれるプロセス。「安定して」とは、細胞ゲノム内の、及び細胞ゲノムによるポリヌクレオチドの永続的又は非一時的な保持及び／又は発現である。したがって、安定して組み込まれたポリヌクレオチドは、形質転換された細胞ゲノム内のフィクスチャであって、細胞又は結果として形質転換された植物の連続する子孫を通して複製及び繁殖され得る。形質転換は、当該技術分野において周知の様々な方法を使用する、自然条件又は人工条件の下で発生してよい。形質転換は、アグロバクテリウム媒介形質転換プロトコル、ウィルス感染、ウィスカー、エレクトロポレーション、ヒートショック、リポフェクション、ポリエチレングリコール処理、微量注射、及び粒子衝撃を含む、原核生物の、又は真核生物の宿主細胞内への、核酸配列の挿入のためのいずれの既知の方法に依拠してよい。
【００７０】
導入遺伝子。タンパク質コード化領域を含む、宿主ゲノム内へ挿入される遺伝子。本発明のコンテキストでは、導入遺伝子を含むエレメントは、宿主ゲノムから単離されている。
【００７１】
トランスジェニック植物。少なくとも１つの導入遺伝子を含む、遺伝学的に修飾された植物。
【００７２】
変異。「変異」は、本明細書で使用される場合、特定の遺伝子又はタンパク質の標準的な、又は所与の、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列とは異なるヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を意味すると理解される。用語、「イソ型（ｉｓｏｆｏｒｍ）」、「イソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）」、及び「相似系（ａｎａｌｏｇ）」もまた、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の「変異」形態である。１つ以上のアミノ酸の付加、除去、又は置換、若しくはヌクレオチド配列における変化により変更されたアミノ酸配列は、「変異」配列とみなされてよい。変異は、「控えめな」変化、例えば、ロイシンのイソロイシンとの置換を有してよく、ここで、置換されたアミノ酸は、同様の構造特性又は化学的特性を有する。変異は、「控えめでない」変化、例えば、グリシンのトリプトファンとの置換を有してよい。類似の微量の変種はまた、アミノ酸の欠失又は挿入、若しくは双方を含んでよい。どのアミノ酸残留物が置換、挿入、又は除去され得るかを判定するガイダンスは、ベクターＮＴＩスイート（ＩｎｆｏｒＭａｘ、ＭＤ）ソフトウェアなどの、当該技術分野において周知のコンピュータープログラムを使用して閲覧することができる。
【００７３】
茎の成熟。茎の成熟は、炭水化物及び光合成の利用を継続可能な植物の能力を指す。茎の成熟は、１〜５のスケールにて点数化され、ここで、１＝死んだ茎、５＝緑色の依然として発達中の茎である。
【００７４】
ジャガイモは４倍体であり、高度に異型接合であって成育時の陥凹に脆弱なため、ジャガイモ植物のゲノム内への望ましい形質の挿入は、特定の困難を示す。したがって、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−（３−ケト−１，２−ブタンジオール）−３’−ニトロチラミン（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ７０：１０〜５，１９９５）、５−ヒドロキシメチル−２−フルフラール（Ｊａｎｚｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ３８：８０１〜９，２０００）、及び突然変異誘発特性を伴う他のメイラード反応生成物（Ｓｈｉｂａｍｏｔｏ，Ｐｒｏｇ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  ３０４：３５９〜７６，１９８９）、を含む、アクリルアミド及び有害なメイラード反応生成物をほとんど生成しないトランスジェニックジャガイモ植物を、従来のブリーディングを使用しての処理中に、効率的に開発することは非常に難しい。
【００７５】
プロセス変化、デキストロースの減少、及びアスパラギナーゼ、シトレート、及び競合アミノ酸などの添加物を通して、アクリルアミドを低減するよう様々な方法が試験され、研究が進められている。ジャガイモ産業を通してプロセス変化を実施するために必要な資本経費は、数百万ドルに上る。経費に加えて、それらのプロセス変化は、アスパラギナーゼ又はシトレートなどの添加物に関連する潜在的に否定的な風味を含む、重要な欠点を有する。一般的に、フライメーカーは、フレンチフライの加工中にデキストロースを加え、望ましい金色がかった茶色を持たせるが、デキストロースはまた、メイラード反応を通してアクリルアミドの形成物を増加させる。単にデキストロースをプロセスから省くことで、アクリルアミドの顕著な減少は生じるが、しかし、金色かがった茶色のサインを、いくつかの他の方法で持たせる必要がある（アナットーのような色の付加を通してなど）。代替色の使用は、それら褐変反応を通して見られる一般的な風味を損なう結果となる。アスパラギンのような反応物質を低減する添加物の使用を伴う別の試行は、結果としてのアスパラギンの表面への回帰及びアクリルアミドの増加を伴う冷凍貯蔵中に生じる水分移動である。最後に、ジャガイモにあざがついた後に生じる黒変は、フレンチフライ及びチップの加工中の品質及びリカバリに影響する。損傷し、あざのついたジャガイモは、トリム加工するか、又は加工前に排除する必要があり、品質課題又は経済的損失を引き起こす。
【００７６】
本発明の「天然の技術」戦略は、黒斑あざの要因であるポリフェノールオキシダーゼ−５（ＰＰＯ−５）の発現、アクリルアミド形成における前駆体である、アスパラギンの蓄積の要因であるアスパラギンシンテターゼ−１（Ａｓｎ−１）の発現、及び／又は、アスパラギンなどのアミノ酸と通常反応し、アクリルアミドを含む有毒なメイラード生成物を形成する還元糖類の蓄積に関連する酵素である、ホスホリラーゼ−Ｌ及びキナーゼ−Ｒ１の発現、を低減することで、ジャガイモの農学的性質及び栄養価を改善するよう、ジャガイモ産業の必要性に取り組む。塊茎内のそれらの遺伝子の一部のサイレンシング又は完全なサイレンシングは、アクリルアミドを生成する可能性を減少する。本発明の天然の技術の使用は、ジャガイモ植物又はジャガイモ植物と性別互換性のある植物から得、ノンコーディング制御領域のみを含む遺伝物質である、「天然の」遺伝物質のみを使用してジャガイモを転換することにより、いずれの異質遺伝物質を植物のゲノム内に組み込むことなく、商業的に価値のあるジャガイモ植物変種のゲノム内への、望ましい形質の組み込みを可能にする。望ましい形質は、衝撃による黒斑あざに対する高い許容度、アクリルアミドの前駆体のアスパラギンの少ない形成、及び還元糖類の少ない蓄積を、アクリルアミドを含む有毒なメイラード生成物の蓄積の結果としての削減、向上した品質、及び食品色の管理を伴って含む。ジャガイモは４倍体であり、高度に異型接合であってブリーディング時の陥凹に脆弱なため、既存のジャガイモ変種へのそれらの望ましい形質の組み込みは、従来のブリーディングを通しては、達成が不可能である。
【００７７】
本発明に使用されるノンコーディングジャガイモ植物ＤＮＡインサート配列は天然のジャガイモ植物ゲノムであり、いずれのアグロバクテリウムＤＮＡを含まない。ＤＮＡインサートは２つの発現カセットを好適に含み、ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクターと呼ばれる形質転換ベクター内に挿入される。第１のカセットは、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ遺伝子（Ａｇｐ）のＡｇｐプロモーターと、顆粒結合シンターゼ遺伝子（Ｇｂｓｓ）のＧｂｓｓプロモーターとの間に逆方向反復として配列された、アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子（Ａｓｎ１）及びポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子（Ｐｐｏ５）の双方のフラグメントを含む。これらのプロモーターは、塊茎内で優位にアクティブである。第２のカセットの機能は、澱粉関連遺伝子ジキナーゼ−Ｒ１（Ｒ１）及びホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子（ＰｈＬ）の各プロモーターを抑制することである。このカセットは、澱粉関連遺伝子ジキナーゼ−Ｒ１（Ｒ１）及びホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子（ＰｈＬ）の各プロモーターの各フラグメントが含まれており、第１のカセットと同じＡｇｐプロモーター及びＧｂｓｓプロモーターに操作可能に連結されている。これらの発現カセットは異質ＤＮＡを含まず、選択された植物種のいずれ、又は選択された植物種と性別互換性のある植物からのＤＮＡのみからなる。
【００７８】
本発明にて使用される商業的に価値のあるジャガイモ植物変種は、レンジャーラセットである。このフルシーズンの変種は、１９９１年にリリースされた。レンジャーラセットは、ラセットバーバンクよりも、バーティシリウム萎凋病、ウィルス、葉巻病並びに網状壊死、及びフサリウム乾燥腐敗に耐性があり、空洞病に高い耐性がある。レンジャーラセットの植物は大きく直立して拡がり、茎は太く、緑色であり、十分に太陽を浴びることで明るい茶色から明るい紫色となる。葉は大きく、広く、そして中程度の緑色である。花が多く、生命力のある花粉を生成する。芽は緑色で、基部及び小花梗は赤紫であり、及び中程度の量の短い柔毛を有する。花冠は中程度の大きさで赤紫色をしており、葯は明るい黄色である。レンジャーラセットは、高収率で良質であり、長くて少し扁平の、高比重の塊茎を有し、ベーキング及びフレンチフライへの加工に非常に適している。塊茎は、痩果病及び黒斑あざに脆弱である。レンジャーラセットは、ラセットバーバンクより早く成熟し、中期間の貯蔵変種とみなされる。変種は結実能力があり、主に北西部で成長し、特にフレンチフライの生産に適している。
【００７９】
本発明は、形質転換ベクターｐＳＩＭ１２７８と形質転換され、マーカーではなく、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して同定され、継続して繁殖する、市場価値の非常に高いジャガイモ変種、すなわちレンジャーラセットを提供する。本発明はまた、本発明のジャガイモ植物変種Ｆ１０の塊茎から作られた食品を提供する。ジャガイモ品種Ｆ１０は、経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）との次の特有の植物変種識別子を有する：ＳＰＳ−ΦΦＦ１０−７。
【００８０】
天然ＤＮＡを伴う対象の遺伝子サイレンシングは、ジャガイモ植物変種Ｆ１０の塊茎内の対象の遺伝子のＲＮＡ転写レベルを低減する。Ａｓｎ１遺伝子及びＰｐｏ５遺伝子のサイレンシングは、澱粉関連遺伝子キナーゼ−Ｒ１（Ｒ１）及びホスホリラーゼ−Ｌ（ＰｈＬ）を更に抑制することなく、アクリルアミド形成を、２〜４倍に、大幅に低減することに十分である。したがって、本発明の遺伝子内ジャガイモ植物変種Ｆ１０の塊茎は、フライイング又はベーキング後のアクリルアミド形成の低減に関連する、遊離アミドアミノ酸アスパラギン及びグルタミンの割合の低減を含め、非常に望ましい形質を組み入れる。具体的には、本発明のジャガイモ変種Ｆ１０は、遊離アスパラギン含有物の２〜４倍超の低減と、黒斑あざに関連する変色の低減と、に特徴付けられている。更に、本発明のジャガイモ変種Ｆ１０は、貯蔵中の、還元糖類グルコース及びフルクトースへの澱粉の分解における遅延を示す。澱粉から糖への変換の遅れにより、老化スイートニング及びアクリルアミド形成を更に低減し、熱誘導性の褐変を制限する。
【００８１】
本発明のジャガイモ変種Ｆ１０はしたがって、その塊茎が、熱加工後にアクリルアミドを多く生成せず、いずれの潜在的に有害な異質遺伝子を保持しないため、ジャガイモ産業及び食品市場において非常に価値がある。
【実施例】
【００８２】
本発明は、天然の技術を使用し、天然の、コード化されていないＤＮＡを、選択されたジャガイモ植物変種のゲノム内へ組み込み、新たな遺伝子内ジャガイモ植物変種を育成する。この方法は、形質の同定と、ベクターの設計と、アグロバクテリウム内へのベクターの組み込みと、レシピエントジャガイモ変種の選択と、植物形質転換と、読み枠がないことのエビデンスと、新たなジャガイモ植物変種が、天然のＤＮＡのみを含むことの確認と、を含む。本発明のジャガイモ品種Ｆ１０は、アクリルアミドを形成する可能性が低く、スクロースの量が少なく、その未形質転換の対照物よりも、黒斑あざに対してより耐性がある。
【００８３】
実施例１．ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクター
本発明にて使用する形質転換ベクターｐＳＩＭ１２７８はｐＳＩＭ１０６に由来し、これは０．４−ｋｂジャガイモ植物ＤＮＡフラグメント（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５６６５５５として保管）を、ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１（オーストラリア、Ｃａｎｂｅｒｒａに所在のＣＡＭＢＩＡ）の５．９−ｋｂ  ＳａｃＩＩ−ＳｐｈＩフラグメントと結紮することで作成されており、プラスミドｐＶＳ１及びプラスミドｐＢＲ３２２からの細菌起源の複製、及びｎｐｔＩＩＩ遺伝子を、カナマイシンに対する細菌耐性のために保有する。Ｕｂｉ−３プロモーター（Ｇａｒｂａｒｉｎｏ及びＢｅｌｋｎａｐ、１９９４）が先行し、Ｕｂｉ−３ターミネーターが続くアグロバクテリウムｉｐｔ遺伝子を含む発現カセットが、２．６−ｋｂ  ＳａｃＩＩフラグメントとして、ベクターバックボーン（Ｒｏｍｍｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）内に導入された。２つのサイレンシングカセットを保有する天然の１０−ｋｂ  ＤＮＡセグメントの、ｐＳＩＭ１０６のＤＮＡインサート内への挿入により、ｐＳＩＭ１２７８が得られた。このベクターが、すべての形質転換に使用された。ｐＳＩＭ１２７８ベクターマップを図１に示す。ベクターバックボーン領域は９，５１１ｂｐであり、９，９５７ｂｐの位置から開始して１９，４６８ｂｐの位置で終了する。バックボーンＤＮＡは主に細菌由来のＤＮＡからなり、植物形質転換前のＤＮＡインサートの維持のサポートを提供する。バックボーン部位は、植物細胞内に導入されていない。バックボーンの様々なエレメントを表１に説明する。
【００８４】
【表１】
2016516446.tif 000003
【００８５】
実施例２．植物ＤＮＡインサート及びその読み枠（ＯＲＦ）
フランキングボーダー配列を含む、ｐＳＩＭ１２７８内にて使用されるＤＮＡインサート領域は１０，１４７ｂｐの長さであり、１９，４６９ｂｐから１９，６６０ｂｐまで、及び１ｂｐから９，９５６ｂｐまでである。ＤＮＡインサートは天然ＤＮＡのみからなり、ジャガイモゲノム内に安定して組み込まれる。ＤＮＡインサート又はその機能部は、本発明のジャガイモ植物変種内に組み込まれたベクターｐＳＩＭ１２７８の唯一の遺伝物質である。以下の図２及び表２にＤＮＡインサートを説明する。
【００８６】
【表２】
2016516446.tif 000004
【００８７】
本発明のジャガイモラインＦ１０を生成するために使用された、表２に説明するＤＮＡインサートは、隣接する遺伝子に作用せず、ジャガイモ植物変種Ｆ１０の表現型に悪影響を与えない。加えて、本発明のジャガイモ植物変種Ｆ１０は、ＤＮＡインサートによりコード化された読み枠に関連する新たなタンパク質を生成しない。
【００８８】
実施例３．アグロバクテリウム株及びトランスフェクション
Ｃ５８−由来のアグロバクテリウム株ＡＧＬ１は、猛毒性のプラスミドｐＴｉＢｏ５４２の導入ＤＮＡを正確に除去することで育成された（Ｌａｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。一般的な組み換え遺伝子（ｒｅｃＡ）におけるトランスポゾン挿入は、ｐＳＩＭ１２７８などの組み換えプラスミドベクターを安定させる（図１）。ＡＧＬ１は、カルベニシリン及びリファンピシンに対する耐性を示し、チメンチンを使用して、形質転換されたジャガイモ組織から排除されている。
【００８９】
レンジャーラセット変種の母株は、３％のスクロース及び２ｇ／ｌのゲルライト（ｇｅｌｒｉｔｅ）を内含する、４０ｍｌの、半分に薄められたＭ５１６培地を伴うマゼンタボックス内に維持された（育苗用培地）。ｐＳＩＭ１２７８を保有するアグロバクテリウムＡＧＬ１株に感染し、３％のスクロース及び６ｇ／ｌの寒天（ａｇａｒ）（共培養培地）を内含する組織培養培地に導入された４週齢の植物から、４〜６ｍｍの、ジャガイモのノード間セグメントが切除された。感染した外植片が、２日後に、３％のスクロース、６ｇ／ｌの寒天、及び１５０ｍｇ／ｌのチメンチンを内含するＭ４０４培地に導入され、アグロバクテリウムが除去された（ホルモン無添加培地）。方法の詳細は、Ｒｉｃｈａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）に説明される。
【００９０】
１か月後、この感染した外植片は、いずれの合成ホルモンのない新鮮な培地に導入され、パーシバル成育箱にて、１６時間の光周期に、２４℃にて培養され、発芽の形成が始まった。多くの発芽にｉｐｔ遺伝子が発現し、サイトカイニン過剰分泌表現型が示された。それらの発芽は、更なる分析が考慮されなかった。ＰＣＲ遺伝子型判定では、約０．３〜１．５％の残りの発芽が、ｉｐｔ遺伝子を欠きながらも、Ｐ−ＤＮＡの少なくとも一部を含んでいたことが実証された。したがって、形質転換された植物の選択にマーカーは使用されなかった。ｉｐｔベースのマーカーフリー植物形質転換の詳細は、Ｒｉｃｈａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）により公表された。
【００９１】
アグロバクテリウムを除去するプロセスが、外植片感染の２日後に開始された。この目的のため、アグロバクテリウムが生存していないことが判明するまで、組織を抗生物質チメンチン（１５０ｍｇ／ｌ）にさらした。栄養素であるブロス酵母抽出物（ＮＢＹ培地）にて、２週間、２８℃（２度繰り返された）にて、形質転換されたイベントの茎フラグメントを培養することで、証拠が得られた。９７ＣＦＲの第３４０部にしたがい、形質転換された植物が移され、アグロバクテリウムが生存していない際にのみ、圃場に植えられた。
【００９２】
ジャガイモ植物変種Ｆ１０は、ＤＮＡゲルブロット解析により分析され、構造、及び組み込まれたＤＮＡインサート配列のコピー数が判定され、ベクターバックボーン配列がないことが確認された。加えて、ＤＮＡインサートをフランキングする接合部の配列の判定に分子的特性が使用され、挿入されたＤＮＡの安定性が示された。接合部の配列決定情報は、遺伝子内ジャガイモ植物変種Ｆ１０に対する特定のＰＣＲ試験を開発するための根拠を提供した。様々なＤＮＡの消化物に、ＡＧＰ分子プローブ、ＡＳＮ分子プローブ、ＰＨＬ分子プローブ及びＧＢＳ分子プローブとともにハイブリダイズされた際の、ハイブリダイゼーションの結果から推定するように、ジャガイモ品種Ｆ１０が、ＤＮＡインサートの単一の完全なコピーを含むことが見られた。
【００９３】
実施例４．ベクターバックボーンＤＮＡの欠損に対するエビデンス
多くの商用トランスジェニック作物とは異なり、本発明のジャガイモ品種Ｆ１０は、次の３つの異なる方法により、ベクターバックボーンＤＮＡなどの、形質転換に使用される、アグロバクテリウム由来ＤＮＡ配列がないことが確認された。１）はじめに、アグロバクテリウムから植物細胞への、ｉｐｔ遺伝子発現カセットを含むバックボーンＤＮＡの意図しない導入が、ｉｐｔ遺伝子の発現、その結果として、サイトカイニンタイプのホルモンイソペンテニルアデノシンの形成、をトリガすると、ベクターバックボーン内の、否定選択可能なイソペンテニルイソメラーゼ（ｉｐｔ）マーカー遺伝子の存在又は非存在が判定され、２）サザンブロットハイブリダイゼーションが続いて、第１のスクリーニング方法を合格した形質転換されたジャガイモ植物に使用され、バックボーンＤＮＡの欠損が確認され、及び３）ＰＣＲは続いて、各ＤＮＡインサート境界領域と、フランキングバックボーンＤＮＡとの間の接合部、又はＤＮＡインサートをフランキングするバックボーンＤＮＡ内の各領域間の接合部を示すフラグメントを増幅するよう設計された。この方法の効率は、ポジティブコントロールとして、ｐＳＩＭ１２７８ＤＮＡを使用して確認された。本発明のジャガイモ品種Ｆ１０は、ベクターバックボーンＤＮＡの存在を示すＰＣＲバンドを生成しなかった。
【００９４】
実施例５．挿入されたＤＮＡの安定性
ＤＮＡインサートの安定性は、元の形質転換体にて評価され、繁殖された植物原料にて、ＤＮＡゲルブロットハイブリダイゼーション及び形質評価の双方を使用して再度評価された。それらの研究は、遺伝子内イベントが、組み入れられた形質を、一貫して高い信頼性で発現したかを確かめるよう行われた。不安定性は、まれな組み換えイベントによりトリガされた場合があり、メチル化によっても生じ得た。ジャガイモは通常、クローン的に繁殖されるため、性的に繁殖された作物に対する標準的なアセスメントは直接適用可能でなく、以降の世代の画定には、種ではなく、塊茎が使用された。ＤＮＡブロットハイブリダイゼーションの結果は、一貫したバンドが複数の世代に存在し、したがって安定性があることを示した。更に、形質の有効性を１つ及び２つの塊茎の種の世代に確認することで、安定性に対するエビデンスが得られた。
【００９５】
ＤＮＡインサートの安定性は、生体外に繁殖され、土壌に植えられていない植物の葉からＤＮＡを抽出し、評価することで、元の形質転換された原料（Ｇ０）内に示された。世代−１（Ｇ１）分析について、それぞれの遺伝子内変種からの２つの繁殖された植物、及びそれぞれのコントロールからの１つの植物が、温室内に植えられた。ＤＮＡの単離及びＧ１世代の評価に使用されたＧ１植物から葉を得るよう、それぞれの植物から収穫した塊茎の１つが植えられた。この世代からの塊茎が再度植えられ、結果としてのＧ２植物の葉は、その世代の形質が見られた。
【００９６】
ＧＢＳプローブ及びＡＧＰプローブとともに、本発明のレンジャーラセットジャガイモ品種Ｆ１０から単離されたＤＮＡのハイブリダイゼーションは、実験のそれぞれにて３つの共通バンドを明らかにした（ＧＢＳプローブに対して７．４、７．７、９．４−ｋｂ、及びＡＧＰプローブに対して１．２、４．９、及び６．２−ｋｂ）。それらのバンドは、未修飾のゲノムのＤＮＡフラグメントを示す。すべての遺伝子内物質から単離されたＤＮＡ内の２つの付加バンドの存在、すなわち、１つは２．２−ｋｂのバンドで、内部ＤＮＡインサートフラグメントを示し、他の１つはＤＮＡインサート接合フラグメント（ＧＢＳを伴うＦ１０に対して７．３−ｋｂ、ＡＧＰを伴うＦ１０に対して２．５−ｋｂ）を表す、は、元の形質転換体（Ｇ０）の各インサートが、Ｇ１及びＧ２の第１の植物性世代及び第２の植物性世代内に安定して残っていたことを示した。
【００９７】
Ｐｐｏアクティビティに対するカテコールアッセイは、すべてのＦ１０塊茎が変色なく維持されており（図３）、未形質転換の対照材料が変色したとして、Ｆ１０変種内に、ＤＮＡインサートの安定性に対する付加エビデンスを提供した。これは、変種Ｆ１０が、２年の圃場での試行後でも、Ｇ２塊茎内のＰｐｏ５遺伝子を抑制するその能力を維持していたことを示した。圃場での試行材料の調整液は、挿入された遺伝物質の安定性を損なうことなく、繰り返し組織培養及び植物性世代を伴った。
【００９８】
実施例６．接合分析及び変種特有検出
少なくとも１つのＤＮＡインサート／フランキング植物ＤＮＡ接合は、アダプタライゲーション媒介ＰＣＲ又は熱非対称インターレースＰＣＲのいずれかを使用して配列された。接合配列は、ジャガイモ品種Ｆ１０に対するプライマーの設計に使用され、それらのプライマーは、変種に特有のＰＣＲに基づく検出方法に適用された。開発された方法は、圃場及び貯蔵庫内の植物及び塊茎のモニターに使用され、塊茎又は加工食品中に遺伝子内物質が存在しないことが確認され、有機種の純度が保証された。
【００９９】
実施例７．遺伝子サイレンシングの有効性及び組織特異性
遺伝子サイレンシング方法は、Ａｓｎ１天然タンパク質、Ｐｐｏ５天然タンパク質、ＰｈＬ天然タンパク質、及びＲ１天然タンパク質の活性を低下させるよう用いられ、タンパク質の量ではなく、転写レベルが評価され、分子レベルでの変化に対する新たな表現型の形質が連結された。
【０１００】
葉及び茎におけるＡＳＮ（アスパラギン）形成を伴うＡｓｎ１遺伝子の強いサイレンシングは、成長に悪影響を及ぼす場合があるため、塊茎に特有のプロモーター及びストロンに特有のプロモーターであり、光合成的にアクティブな組織及び根においてアクティブでないＡｇｐプロモーター及びＧｂｓｓプロモーターが、塊茎及びストロン内の遺伝子サイレンシングをもたらすよう使用された。植物変種Ｆ１０及びその未形質転換の対照物の様々な組織内の４つの対象遺伝子の転写レベルが、ノーザンブロット解析により判定された。
【０１０１】
未形質転換コントロールの塊茎では、転写レベルは、Ａｓｎ１遺伝子、ＰｈＬ遺伝子、及びＲ１遺伝子に対して「高」であり（ノーザンブロットハイブリダイゼーションにより容易に検知できる）、Ｐｐｏ５遺伝子に対して「低」であった。ノーザンブロットの比較は、温室及び圃場からの塊茎内に、Ａｓｎ１、Ｐｐｏ５、及びＰｈＬが同様のレベルにて発現したことを示した。対照的に、温室内にて成長したコントロール塊茎内のＲ１遺伝子は、圃場からの塊茎内のそれよりも、もう少し更に効果的に抑制された。
【０１０２】
変種Ｆ１０の塊茎内のＡｓｎ１遺伝子及びＰｐｏ５遺伝子に対して強く低減された転写レベルは、低アクリルアミドポテンシャル、黒斑あざに関連する変色の低下に関連した。
【０１０３】
ＰｈＬ遺伝子に対する転写レベルは、ラインＦ１０の塊茎内にて部分的に低減された。この変化は、グルコース及びフルクトースの低減量に連結された。Ｒ１転写は、Ｆ１０の塊茎内にて部分的に低減され（「抑えられ」）、糖類への澱粉の分解の制限が助けられた。
【０１０４】
Ａｓｎ１遺伝子、Ｐｐｏ５遺伝子、及びＲ１遺伝子は、未形質転換の植物のストロン内に低レベルにて発現した。対照的に、コントロール内の高転写レベルは、ＰｈＬ遺伝子に関連付けられた。
【０１０５】
Ａｓｎ１遺伝子及びＰｐｏ５遺伝子に対する各転写レベルは、レンジャーラセットＦ１０温室育成植物からのストロン内では、コントロールストロン内よりも更に低かった。この修飾は予期されたものであり、いずれの望ましくない新たな表現型又は異常な新たな表現型に連結されない。ＰｈＬ遺伝子の発現はまた、遺伝子内変種Ｆ１０のストロン内にて下方制御された。
【０１０６】
Ｒ１遺伝子に対する転写量は、変種Ｆ１０のストロン内にて少し低減され（「抑えられ」）た。この分子の変化は、糖類への澱粉の限定分解に寄与した。
【０１０７】
葉の組織では、Ａｓｎ１遺伝子に対する各転写レベルは、ラインＦ１０に対して、その未形質転換の対照物よりも低かった。Ｐｐｏ５遺伝子発現に対する各転写レベルは、すべてのケースにて検知できなかったが、ＰｈＬ遺伝子に対するレベルは、元の変種レンジャーラセット及び形質転換された誘導体Ｆ１０の間で一貫して高かった。Ｒ１遺伝子に対する各転写レベルは、そのコントロールに比較した際に、変種Ｆ１０にて変更はなかった。
【０１０８】
茎の組織では、Ａｓｎ１遺伝子の各転写レベルは、イベントＦ１０及びそのコントロールに対して同様であった。Ｐｐｏ５遺伝子に対する各転写レベルは、本発明の変種Ｆ１０内にて低減された。ＰｈＬ遺伝子発現は、ラインＦ１０及びそのコントロールにおいて非常に類似しており、Ｒ１遺伝子発現は低下しなかった。
【０１０９】
根の組織では、Ａｓｎ１遺伝子及びＰｐｏ５遺伝子の双方に対する転写レベルは、変種Ｆ１０において低下した。それらの結果は、サイレンシングの推進に使用されたプロモーターが、地下組織内で部分的に機能することを示した。
【０１１０】
花構成組織では、Ａｓｎ１遺伝子の各転写レベルは、本発明の変種Ｆ１０において、元の変種レンジャーラセットにおけるものよりも低かった。転写は、Ｐｐｏ５遺伝子に対して検知可能ではなく、Ｒ１遺伝子の各発現レベルはコントロールと同様であった。変種Ｆ１０は、コントロールよりも多くのＰｈＬ転写を生成した。
【０１１１】
それらの結果は、Ａｓｎ１遺伝子及びＰｐｏ５遺伝子の各発現レベルが、ジャガイモ変種Ｆ１０内の塊茎及びストロンにて下方制御され、Ｒ１遺伝子及びＰｈＬ遺伝子が、変種Ｆ１０内の塊茎及びストロンにて少なくとも部分的に抑制されたことを示した。サイレンシングは、塊茎及びストロン内にて最も効果的であった。
【０１１２】
選択されたジャガイモ変種Ｆ１０は、Ａｓｎ１遺伝子及びＰｐｏ５遺伝子の各発現レベルにて、Ｒ１遺伝子及びＰｈＬ遺伝子のそれらにおいてよりも強く影響した。それらの結果は、（１）Ｐｐｏタンパク質及び遊離ＡＳＮの形成を可能な限り最大限に防ぐことと、（２）グルコース及びフルクトースへの澱粉の変換を部分的にのみブロックすることと、の発明者の意図に一致した。
【０１１３】
塊茎及びストロン以外の組織内の各転写レベルにおけるおりおりの変化は、塊茎／ストロンに特有のプロモーターのいくらかの漏出性を示した。サイレンシングカセットの発現を通して塊茎内に生成された小さなＲＮＡは、他の組織、特に根及び茎内に移すことも可能である（Ｍｏｌｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。塊茎及びストロン以外の組織内にて変化した発現レベルの多くの場合では、差異は軽微であった。遺伝子内ジャガイモ品種Ｆ１０の特定の組織内における下方制御された各転写レベルの概要を表３に示す。表３では、Ａ＝Ａｓｎ１、Ｐ＝Ｐｐｏ５、Ｌ＝ＰｈＬ、及びＲ＝Ｒ１である。表３内の下線付き文字は、強く（２倍未満に）下方制御された遺伝子発現レベルを示す。発現レベルは、場合により２倍未満に下方制御されている。
【０１１４】
【表３】
2016516446.tif 000005
【０１１５】
実施例８．圃場での実績及び塊茎評価
２００９年、２０１０年、及び２０１１年の実験は、機械的に植えられ、収穫を促進し、遺伝子内ジャガイモが、未修飾の材料から確実に分けられたものである。２００９年の評価について、それぞれのイベントからの「核の種（ｎｕｃｌｅａｒ  ｓｅｅｄ）」である小型塊茎（ｍｉｎｉｔｕｂｅｒ）及びコントロール変種が使用され、４つ又は５つの単列プロット（２０小型塊茎／プロット）が植えられ、これによりプロットは、圃場にわたるブロック内にランダムに分配された。このランダム化された完全ブロック設計（ＲＣＢ）は、新たなジャガイモ変種及びイベントの評価に一般的である。２０１０年及び２０１１年にて採られたアプローチは、イベント毎に３つのランダムなプロット及び部位毎のコントロールを使用し、また、ＲＣＢ設計を、ブロック数に等しい数又は複製（イベント毎のプロット）とともに使用した。２０１０年におけるそれぞれのプロットは、レンジャーラセット用に２００９年にネブラスカ州Ｃｈｅｒｒｙ  Ｃｏｕｎｔｙにて生産された第１の世代（Ｇ１）の塊茎からの、それぞれが２０の種ピースの３つの列から構成された。２０１１年の実験用のレンジャーラセットの種は、２０１０年にネブラスカ州Ｃｈｅｒｒｙ  Ｃｏｕｎｔｙにて生産された第２の世代（Ｇ２）であった。すべての実験では、遺伝子内ラインの種は、その未修飾のコントロールと同様に扱われた。圃場で成長した塊茎は、よりよく、均一な植物に生育し、より高い塊茎収率及び品質を生み出したため、種としての小型塊茎にわたり望ましいものであった。
【０１１６】
それぞれのプロットは、場合によっては、昆虫、疾病、及び、成育シーズン中に、人工的ではない、自然発生的に生じる場合がある環境ストレスに対する異なる反応のために、標準化されたモニタリングスケールを使用して、定性的に評価された。シーズン中期のモニタリングは、２００９年、２０１０年、及び２０１１年に、畝が覆われた初期及び開花の直前又はその期間中に行われ（多くの蔓について６月〜７月に評価された（フロリダでの実験を除く、これは、４月に評価された））、草勢、葉の色、葉のサイズ、葉の縮れ、病徴（有／無）、及び昆虫関連の植物へのダメージを査定した。２０１１年には、成育領域に共通の特定の昆虫、疾病、及び非生物的なストレス因子が評価された。疾病及び昆虫の圧力は一般的に、シーズンの中期及び後期に最も高いが、植物は、病原体及び昆虫により引き起こされる症状について、７月〜９月にモニターされた（フロリダでの実験については３月〜５月）。シーズン後期の、茎の成熟及び疾病のモニタリングは、茎の死滅（ｖｉｎｅ  ｋｉｌｌｉｎｇ）の前に、塊茎の成熟及びシーズン後期のスキンセットを確かめることを意図したプロセスが、一度行われた。茎の死滅は、茎を刈り取る又は（収穫のために）揺する（ｆｌａｉｌｉｎｇ）かのいずれ、若しくは、メーカー（ミネソタ州Ｒｏｓｅｖｉｌｌｅに所在のＪＲ  Ｊｏｈｎｓｏｎ）の推奨による、レグロン（Ｒｅｇｌｏｎｅ）などの、認可された除草剤を使用して人工的に行われた。この時、植物はまた、病徴及び昆虫によるダメージについて査定された。病徴が同定されたいくつかの場合では、スプラウトテストも行われ、それらの発見が確認された。
【０１１７】
平均値、標準偏差、及び９０％の信頼間隔が、ＪＭＰ  ９．０．２を使用して計算された。従来の変種の範囲は、実験に含まれた従来の変種のすべての最小平均値及び最大平均値（年＊位置＊エントリ）を得ることで形成された。レンジャーラセット変種についてのすべての性質が、ＪＭＰ  ９．０．２にて、複数の年及び複数の位置からのデータを組み合わせることで、分析された。
【０１１８】
実施例９．ジャガイモ品種Ｆ１０の特性の概要
ジャガイモ変種Ｆ１０は、黒斑あざの要因である酵素の発現を低減することで品質を改良し、反応物質、すなわちアスパラギン及び還元糖類の濃度を低下させることを通してアクリルアミドを低減するという、ジャガイモ産業の必要性に対処する。ジャガイモ変種Ｆ１０は、ジャガイモ植物ゲノムに天然であり、異質ＤＮＡ、アグロバクテリウムＤＮＡ、ウィルスマーカー、又はベクターバックボーン配列を含まない核酸配列と形質転換された。加えて、農学的研究が行われ、イベントが、形質に関連付けられた性質の例外を伴って、従来のコントロールと同じように育ったことが確認された。
【０１１９】
農学的性質
２００９年、２０１０年、及び２０１１年に育成されたジャガイモ変種Ｆ１０のイベント及びコントロールの農学的性質の評価を表４〜７に示す。各結果は、可能な限り、統計的方法により分析された。データ全体として、レンジャーラセットコントロールとＦ１０レンジャーラセットイベントとの間に大きな差異がないことを示唆する。
【０１２０】
表４は、変種Ｆ１０に対して試験されたそれぞれの性質の部位年数（ｔｈｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｓｉｔｅ  ｙｅａｒｓ）を示す。Ｆ１０及びレンジャーラセットコントロールについての農学的性質を表５に示す。７つの農学的性質について、Ｆ１０とコントロールとの間には、統計的に有意な差異は検知されなかった。茎の成熟の格付けデータは、統計的に比較することができず、Ｆ１０の観察値は、組み合わされた従来の変種範囲（それぞれ、２．６５に対して、３．００〜３．５０）外であった。表５では、植物あたりの茎数のデータは２０１１年のみからであり、従来の変種（ＣｏｎＶ）の範囲は、従来のレンジャー変種、バーバンク変種、及びアトランティック変種の平均値の範囲に等しい。「なし（ＮＡ）」は、統計的比較が不可能であったことを意味する。
【０１２１】
Ｆ１０及びレンジャーラセットコントロールの収率及び粒度の性質を表６に示す。全収率、比重、高糖、又はシュガーエンドについて、統計的に有意な差異は検知されなかった。合計内部欠陥について統計分析はできなかったが、Ｆ１０に対する値は、従来の変種の範囲内にあった。全収率（それぞれ、５３．７に対して、６０．０）、４〜６ｏｚ．カテゴリ（２３．９に対して、１８．４）、及び１０〜１４ｏｚ．カテゴリ（１３．９に対して、１９．３）について、Ｆ１０とコントロールとの間に、３つの統計的に有意な差異が検知された。しかし、Ｆ１０の値は、従来の変種の範囲内にあった。表６では、比重データは、２０１１年からのみであり、従来の変種（ＣｏｎＶ）の範囲は、従来のレンジャー変種及びバーバンク変種の平均値の範囲に等しい。「なし（ＮＡ）」は、統計的比較が不可能であったことを意味する。
【０１２２】
Ｆ１０及びレンジャーラセットコントロールの花の色を表７に示す。紫／混合の花及び白い花の双方が、それぞれのエントリに対する異なるプロットにて観察された。
【０１２３】
【表４】
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【０１２４】
【表５】
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【０１２５】
【表６】
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【０１２６】
【表７】
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【０１２７】
ジャガイモ品種Ｆ１０について表４〜７に示されたデータに基づき、未形質転換のレンジャーラセット変種とジャガイモ品種Ｆ１０との間には、農学的性質、花の色、収率及び粒度、並びに生態学的相互作用において、大きな差異はないと結論付けることができる。したがって、複数年のデータに基づくと、レンジャーラセット変種Ｆ１０は、潜在的な雑草性又は病虫害の結果として、環境における持続性のある顕著なリスクを示さない。
【０１２８】
黒斑あざに対する許容度
黒斑あざは、ジャガイモ産業に対する最も重要な品質問題の１つを示す、あざのある塊茎に影響を及ぼす変色である。この状態は、損傷した色素体からの、細胞質内へのポリフェノールオキシダーゼ（Ｐｐｏ）の漏出の結果である。細胞質内では、酵素がポリフェノールを酸化させ、これは続いて暗い沈着を形成する。ｐＳＩＭ１２７８ＤＮＡインサートの２つのサイレンシングカセットの１つは、調節エレメント間に逆方向反復として位置するソラナムベルコサム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ）からの、Ｐｐｏ５遺伝子のフラグメントの２つのコピーを含む。この逆方向反復の発現は、ジャガイモＰｐｏ５遺伝子のサイレンシングをトリガし、黒斑あざの発生率を大幅に低減する。
【０１２９】
黒斑あざに脆弱である、ジャガイモ品種Ｆ１０及びコントロールレンジャーラセット変種の圃場で成長した塊茎は、黒斑あざの許容度に対して２つの方法にて分析された。
【０１３０】
塊茎の変色は、ポリフェノールオキシダーゼの活性により引き起こされ、これは、カテコールを含むフェノールを酸化させ、急速に重合する化合物を生成して色素を発色する。黒斑あざの許容度について試験する間接法は、１−ｍｌのカテコール（５０ｍＭ、ｐＨ６．５のＭＯＰＳ中に２５ｍＭ）を、塊茎の切断面にピペット操作し、Ｐｐｏに依拠する、暗い茶色の沈着の発色のモニタリングに基づく。２０分後、Ｐｐｏに依拠する、暗い茶色の沈着の発色が査定された。２００９年にアイダホ州Ｃａｎｙｏｎ  Ｃｏｕｎｔｙにて育成された３つの異なる植物から、レンジャーラセットコントロール及び変種Ｆ１０の塊茎が収穫された。ジャガイモ品種Ｆ１０に対するカテコールアッセイの結果を図３に示す。図３に見られるように、レンジャーラセットコントロールは暗い茶色に変色し、黒斑あざを示した。一方で、ジャガイモ品種Ｆ１０は、暗い茶色に変色せず、これは、Ｆ１０が、未形質転換のレンジャーラセットコントロールよりも黒斑あざに耐性があることを示す。
【０１３１】
あざの許容度を分析する第２の方法は、２００９年にアイダホ州Ｃａｎｙｏｎ  Ｃｏｕｎｔｙから収穫されたそれぞれのコントロール及びジャガイモ品種Ｆ１０の９つの塊茎を処理し、あざつけバレル（回転ドラム）を１０回転し、室温にて３日間培養し、続いて機械的に皮むきし、黒斑あざ及び線状傷（切りあざ）スポットの双方の数量を数えることによるものであった。表８に結果を示す。これは、３つの実験結果の平均として示されており、表示のエラーバーは、平均の標準的な誤差を表す。学生が終えた２つのｔ検定（ｐ＜．０５）を使用し、有意について判定された。
【０１３２】
【表８】
2016516446.tif 000010
【０１３３】
表８に示すように、バレルあざ試験は、本発明のジャガイモＦ１０における黒斑あざレベルにおいて、約５倍の減少を示した。それらの結果は、変種Ｆ１０の塊茎が、未形質転換のコントロールレンジャーラセット変種の塊茎よりも黒斑あざに耐性があり、ｐＳＩＭ１２７８のＤＮＡインサートが、黒斑あざに関連する、衝撃による変色の低減に至ったことを示す。
【０１３４】
アスパラギンレベル及びアクリルアミドレベル
アスパラギンシンテターゼ遺伝子のサイレンシングは、ジャガイモ変種Ｆ１０内の７６％の遊離アスパラギンの平均的な減少に至った。低レベルのアスパラギンは、アクリルアミドを形成するメイラード反応における還元糖類と結合し、フライ内の６０％のアクリルアミドの平均的な減少に至る。レンジャーラセットコントロールとジャガイモＦ１０との間の、アスパラギン及びアクリルアミドにおける差異を表９に示す。アクリルアミドについて試験する前に、コントロール及びＦ１０はフレンチフライに加工された。すべての結果は塊茎からのものであり、収穫時付近で分析された。
【０１３５】
【表９】
2016516446.tif 000011
【０１３６】
ジャガイモ品種Ｆ１０は、黒斑あざの要因である酵素の発現、アクリルアミドレベルが低減された、改良された品質を伴う、レンジャーラセット変種である。
【０１３７】
本発明の更なる実施形態
上記に参照する好適な性質を組み合わせるジャガイモ変種をもたらす研究は、広く実験に基づくものである。この研究は、時間、労力、及び費用という大きな投資を必要とする。ジャガイモ品種の開発は、温室から商用での使用まで、一般的に８年以上必要である。ブリーディングは、最も重要な性質を子孫に組み入れるよう、優れた親の注意深い選択から始まる。すべての望ましい形質は通常、たった１回の交配では現れないため、ブリーディングを繰り返す必要がある。
【０１３８】
本ブリーディング技術は、親クローンのコントロールされた授粉とともに続けられる。一般的には、ゼラチンカプセル内に花粉が集められ、これは後に、雌親への授粉に使用される。雑種の種が温室内に植えられ、数千の個別の実生苗から塊茎が収穫され、保存される。翌年、それぞれの収穫した実生苗から、１つ〜４つの塊茎が圃場に植えられる。ここでは、ウィルス及び疾病が蔓延しないよう細心の注意が払われる。この初年の実生苗作物より、選択プロセスを生き残ったそれぞれの雑種固体から、翌年に植えるためにいくらかの「種」塊茎を保存する。翌年以降は、サンプルを採取して密度の測定及びフライ試験を行い、商用での使用に対する塊茎の適切性を判定する。この時点まで選択プロセスを生き残った植物は続いて、３年目に量を増やして植えられ、より総合的に複数のフライ試験及び密度判定が行われる。４年目の開発段階では、生き残って選択されたものが、様々な状態にて野外試行され、異なる成長条件に対するそれらの適合性が判定される。最終的に、優れた品質の変種が他の農場に導入され、種が商用スケールに拡大された。一般的に、この時まで、栽培、収穫、及び試験に８年以上が費やされ、新規の、改良されたジャガイモ品種の開発の試行に投資が行われる。
【０１３９】
特定のタンパク質生成物をコード化する遺伝子の単離及び形質化が可能な分子生物学的技術の出現に伴い、植物生物学の分野の科学者達は、特定の方法にて植物の形質を変更するために、植物のゲノムを遺伝子操作し、異質の遺伝子、又は、天然遺伝子若しくは内因性遺伝子の付加的バージョン又は修飾バージョン（おそらくは異なるプロモーターにより進められる）、を含ませ、発現させることに強い興味を抱いた。そのような異質の、付加された遺伝子及び／又は修飾された遺伝子は、本明細書にて「導入遺伝子」と総称される。過去１５年から２０年にわたり、トランスジェニック植物を生成する様々な方法が開発されている。本発明はまた、特定の実施形態にて、形質転換されたバージョンの、特許請求の範囲とする変種又はラインに関する。
【０１４０】
植物の形質転換は、植物細胞内で機能する発現ベクターの構築を伴う。そのようなベクターは、調節エレメント（例えば、プロモーター）の制御下にある遺伝子、又はこれに操作可能に連結された遺伝子を含むＤＮＡを含む。発現ベクターは、１つ以上のそのような操作可能に連結された遺伝子／調節エレメントの組み合わせを含んでよい。ベクター（単一又は複数）はプラスミドの形態であってよく、単体又は他のプラスミドとの組み合わせで使用され得、以下に説明する形質転換方法を使用して、ジャガイモ植物（単一又は複数）の遺伝物質内に導入遺伝子を組み入れ、形質転換されたジャガイモ植物を提供する。
【０１４１】
従来の植物ブリーディングは一般的に、植物染色体のランダムな組み換えに依拠し、新規の、改良された性質を有する変種を生成する。標準的な、既知の技術によると、遺伝子及び調節エレメントを含む遺伝的「発現カセット」は、アグロバクテリウム単離導入ＤＮＡ（「Ｔ−ＤＮＡ」）の境界内に挿入され、植物ゲノム内に組み込まれる。Ｔ−ＤＮＡ物質のアグロバクテリウム媒介導入は一般的に、次の標準的な手順を含む。（１）形質転換の選択用の発現カセットを生成するための、少なくとも１つが異質の起源である遺伝要素の生体外組み換え、（２）通常は、Ｔ−ＤＮＡ境界配列によりフランキングされたアグロバクテリウムＤＮＡの数百の塩基対からなる、バイナリベクターのＴ−ＤＮＡ領域内への、異質ＤＮＡを内含する少なくとも１つの他の発現カセットを時にともにする、この発現カセットの挿入、（３）アグロバクテリウムから植物細胞への付加バイナリベクター配列のいくつか又はすべてを時に伴う、Ｔ−ＤＮＡ境界間に位置する配列の導入、及び（４）収率の向上、改良された活力、疾病及び昆虫に対する向上した耐性、又はストレス下で生存する高い能力、などの、望ましい形質を示す、安定して形質転換された植物細胞の選択。
【０１４２】
したがって、遺伝子工学の方法は、プロモーター及びターミネーターなどの調節エレメントを含む、異質の、生来でない核酸、及び、ウィルス、細菌、及び植物からの形質転換体の同定及び選択用のマーカーとしての新たな形質又は機能の発現を伴う遺伝子、の導入に依拠する。マーカー遺伝子は一般的に、細菌ソースに由来し、抗生物質耐性又は除草剤耐性を与える。従来のブリーディング方法は、面倒で時間のかかるものであり、新たな変種は一般的に、比較的控えめな改良のみを示す。
【０１４３】
「アンチセンス」技術では、天然遺伝子の配列は反転され、トランスジェニック植物内の遺伝子の発現を抑制する。しかし、反転されたＤＮＡは通常、植物の発育を阻害し、及び／又はその栄養価を下げることにより望ましくない場合がある異質アミノ酸配列をコード化するプロモーターとターミネーターとの間に挿入された、新たな、特徴付けられていない読み枠を含む。
【０１４４】
ジャガイモ形質転換用発現ベクター：マーカー遺伝子
発現ベクターは、マーカーを内含する形質転換された細胞を、ネガティブ選択、つまり、選択可能マーカー遺伝子を含まない細胞の成長を抑制することによるか、又は、ポジティブ選択、つまり、遺伝的マーカーによりコード化された生産物に対するスクリーニングを行うことによる、のいずれによりリカバリ可能とする、調節エレメント（例えば、プロモーター）に操作可能に連結された少なくとも１つの遺伝的マーカーを含む。多く一般に使用される、植物形質転換用の選択可能マーカー遺伝子は、形質転換の当業者によく知られており、これは、例えば、抗生物質又は除草剤の場合がある、選択的な薬剤を代謝的に解毒する酵素をコード化する遺伝子、又は抑制剤に反応しない、変更されたターゲットをコード化する遺伝子を含む。数種のポジティブ選択方法はまた、当該技術分野において周知である。
【０１４５】
１つの一般に使用される、植物形質転換用の選択可能マーカー遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子であり、これは、植物調節信号の制御下にある場合、カナマイシンに対する耐性を与える。Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：４８０３（１９８３）。別の一般的に使用される選択可能マーカー遺伝子は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子であり、これは、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を与える。Ｖａｎｄｅｎ  Ｅｌｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５：２９９（１９８５）。
【０１４６】
抗生物質に対する耐性を与える、細菌起源の追加的選択可能マーカー遺伝子は、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ、及びアミノグリコシド−３’−アデニルトランスフェラーゼ（ブレオマイシン耐性デターミナント）、を含む。Ｈａｙｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８６：１２１６（１９８８），Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１０：８６（１９８７），Ｓｖａｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４：１９７（１９９０）Ｈｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：１７１（１９８６）。他の選択可能マーカー遺伝子は、グリホサート、グルホシネート、又はブロモキシニル、などの除草剤に対する耐性を与える。Ｃｏｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１７：７４１〜７４４（１９８５），Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：６０３〜６１８（１９９０）ａｎｄ  Ｓｔａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４１９〜４２３（１９８８）。
【０１４７】
細菌起源ではない、植物形質転換用の選択可能マーカー遺伝子は、例えば、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ、プラント５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸塩シンターゼ、及びプラントアセト乳酸シンターゼ、を含む。Ｅｉｃｈｈｏｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１３：６７（１９８７），Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：４７８（１９８６），Ｃｈａｒｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．８：６４３（１９９０）。
【０１４８】
植物形質転換用の別のクラスのマーカー遺伝子は、抗生物質などの、有毒物質に対する耐性用に形質転換された細胞の直接の遺伝的選択ではなく、仮定的に形質転換された植物細胞のスクリーニングを必要とする。それらの遺伝子は、定量化に特に有用であり、特定の組織における遺伝子の発現の空間パターンを視覚化する。これらは、レポーター遺伝子とよく呼ばれる。なぜなら、それらは遺伝子発現の調査のために、遺伝子又は遺伝子制御配列に対して融合され得るからである。仮定的に形質転換された細胞をスクリーニングするために一般的に使用される遺伝子は、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、を含む。Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：３８７（１９８７），Ｔｅｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．８：３４３（１９８９），Ｋｏｎｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：１３１（１９８７），ＤｅＢｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１６８１（１９８４）。
【０１４９】
植物組織の破壊を必要としない、ＧＵＳアクティビティを視覚化するための生体内の方法が利用可能である。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ２９０８，ＩＭＡＧＥＮＥ  ＧＲＥＥＮ，ｐ．１〜４（１９９３）ａｎｄ  Ｎａｌｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１５：１５１ａ（１９９１）。しかし、ＧＵＳアクティビティを視覚化するためのそれらの生体内の方法は、低感度、高蛍光バックグラウンド、及び選択可能マーカーとしてのルシフェラーゼ遺伝子の使用に関連する制限により、形質転換された細胞のリカバリに有用であるかは証明されていない。
【０１５０】
最近では、遺伝子コード化緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が、原核生物の細胞及び真核生物の細胞内の遺伝子発現に、マーカーとして使用されている。Ｃｈａｌｆｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：８０２（１９９４）。スクリーン可能マーカーとして、ＧＦＰ及びＧＦＰの突然変異体を使用してよい。
【０１５１】
ジャガイモ形質転換用発現ベクター：プロモーター
発現ベクター内に含まれる遺伝子は、調節エレメント、例えば、プロモーターを含むヌクレオチド配列により活発にされなければならない。単体又はプロモーターと組み合わせて使用され得る他の調節エレメントとして、形質転換の当業者には、数種類のプロモーターが知られている。
【０１５２】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、転写の開始の上流ＤＮＡ領域への参照を含み、ＲＮＡポリメラーゼ及び他のタンパク質の認識及びバインディングを伴い、転写を開始する。「植物プロモーター」は、植物細胞内の転写を開始可能なプロモーターである。開発管理下にあるプロモーター例は、葉、根、種、繊維、木部導管、仮道管、又は厚膜組織、などの特定の組織における転写を優先的に開始するプロモーターを含む。そのようなプロモーターは、「組織に好適」と呼ばれる。特定の組織内でのみ転写を開始するプロモーターは、「組織に特有」と呼ばれる。「細胞タイプ」に特有のプロモーターは主に、１つ以上の器官、例えば、根又は葉内の維管束細胞内の特定の細胞タイプにおける発現を活発にする。「誘発可能」プロモーターは、環境制御下にあるプロモーターである。誘発可能プロモーターにより、転写に影響する場合がある環境条件例は、嫌気性条件又は光の存在を含む。組織に特有のプロモーター、組織に好適なプロモーター、細胞タイプに特有のプロモーター、及び誘発可能プロモーターは、「非構造性」プロモータークラスを構成する。「構造性」プロモーターは、多くの環境条件下でアクティブなプロモーターである。
【０１５３】
Ａ．誘発可能プロモーター
誘発可能プロモーターは、ジャガイモにおける発現のために、遺伝子に操作可能に連結される。必要に応じて、誘発可能プロモーターは、ジャガイモにおける発現のために、遺伝子に操作可能に連結されるシグナル配列をコード化するヌクレオチド配列に操作可能に連結される。誘発可能プロモーターを使用することで、誘発剤に応じて転写率が向上する。
【０１５４】
いずれの誘発可能プロモーターも、本発明に使用され得る。Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：３６１〜３６６（１９９３）、を参照されたい。例示的な誘発可能プロモーターは、限定するものではないが、銅に反応するＡＣＥＩ系からのもの（Ｍｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９０：４５６７〜４５７１（１９９３））、ベンゼンスルホンアミド除草剤毒性緩和剤に反応する、トウモロコシからのＩｎ２遺伝子（Ｈｅｒｓｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２２７：２２９〜２３７（１９９１）ａｎｄ  Ｇａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２４３：３２〜３８（１９９４））、又はＴｎ１０からのＴｅｔリプレッサ（Ｇａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２２７：２２９〜２３７（１９９１））、を含む。特に好適な誘発可能プロモーターは、植物が通常反応しない誘発剤に反応するプロモーターである。例示的な誘発可能プロモーターは、ステロイドホルモン遺伝子からの誘発可能プロモーターであり、その転写アクティビティは、グルココルチコステロイドホルモンにより誘発される。Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：０４２１（１９９１）。
【０１５５】
Ｂ．構造性プロモーター
構造性プロモーターは、ジャガイモにおける発現のために遺伝子に操作可能に連結されるか、又は構造性プロモーターは、ジャガイモにおける発現のために遺伝子に操作可能に連結されるシグナル配列をコード化するヌクレオチド配列に操作可能に連結される。
【０１５６】
多くの異なる構造性プロモーターが、本発明に使用され得る。例示的な構造性プロモーターは、限定するものではないが、ＣａＭＶからの３５Ｓプロモーターなどの、植物ウィルスからのプロモーター（Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０〜８１２（１９８５））、及びコメアクチンなどの遺伝子からのプロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１６３〜１７１（１９９０））、ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９〜６３２（１９８９）ａｎｄ  Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５〜６８９（１９９２））、ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１〜５８８（１９９１））、ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７２３〜２７３０（１９８４））、及びトウモロコシＨ３ヒストン（Ｌｅｐｅｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２３１：２７６〜２８５（１９９２）ａｎｄ  Ａｔａｎａｓｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２（３）：２９１〜３００（１９９２））、を含む。
【０１５７】
アブラナＡＬＳ３構造遺伝子に対する、ＡＬＳプロモーター、Ｘｂａ１／Ｎｃｏｌフラグメント５’（又は、当該Ｘｂａ１／Ｎｃｏｌフラグメントに類似のヌクレオチド配列）、は、特に有用な構造性プロモーターを表す。ＰＣＴ出願ＷＯ  ９６／３０５３０、を参照されたい。
【０１５８】
Ｃ．組織に特有のプロモーター、又は組織に好適なプロモーター
組織に特有のプロモーターは、ジャガイモにおける発現のために、遺伝子に操作可能に連結される。必要に応じて、組織に特有のプロモーターは、ジャガイモにおける発現のために、遺伝子に操作可能に連結されるシグナル配列をコード化するヌクレオチド配列に操作可能に連結される。組織に特有のプロモーターに操作可能に連結された所望の遺伝子と形質転換された植物は、導入遺伝子のタンパク質生成物を、特定の組織内に独占的に、又は優先的に生成する。
【０１５９】
いずれの組織に特有のプロモーター又は組織に好適なプロモーターは、本発明に使用され得る。例示的な組織に特有のプロモーター又は組織に好適なプロモーターは、限定するものではないが、ファセオリン遺伝子からのものなどの、根に好適なプロモーター（Ｍｕｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３：４７６〜４８２（１９８３）ａｎｄ  Ｓｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３３２０〜３３２４（１９８５））、キャブ（ｃａｂ）又はリブロース二リン酸カルボキシラーゼオキシゲナーゼ（ｒｕｂｉｓｃｏ）からのそれなどの、葉に特有で、光誘発可能なプロモーター（Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．４（１１）：２７２３〜２７２９（１９８５）ａｎｄ  Ｔｉｍｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５７９〜５８２（１９８５））、ＬＡＴ５２からのそれなどの、葯に特有のプロモーター（Ｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１７：２４０〜２４５（１９８９））、Ｚｍ１３からのそれなどの、花粉に特有のプロモーター（Ｇｕｅｒｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２４４：１６１〜１６８（１９９３））、又はａｐｇからのそれなどの、小胞子に好適なプロモーター（Ｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｘ．Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｐｒｏｄ．６：２１７〜２２４（１９９３））、を含む。
【０１６０】
細胞内コンパートメントへのターゲットタンパク質に対するシグナル配列
導入遺伝子により作成されたタンパク質の、葉緑体、液胞、ペルオキシソーム、グリオキシソーム、細胞壁、又はミトコンドリア、などの細胞内コンパートメントへの移送、又はアポプラスト内への分泌のために作成されたタンパク質の移送は、シグナル配列をコード化するヌクレオチド配列を、所望のタンパク質をコード化する遺伝子の５’領域及び／又は３’領域へ、操作可能に連結することにより達成される。構造遺伝子の５’エンド及び／又は３’エンドでのターゲットとする配列は、タンパク質の合成及び処理中に、コード化されたタンパク質が、最終的にどこでコンパートメント化されたかを判定してよい。
【０１６１】
シグナル配列の存在は、ポリペプチドを、細胞内の細胞小器官又は細胞内コンパートメントのいずれへと向けるか、若しくはアポプラストへの分泌を指し示す。多くのシグナル配列が、当該技術分野において周知である。例えば、Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：４９（１９９２）；Ｃｌｏｓｅ，Ｐ．Ｓ．，Ｍａｓｔｅｒ’ｓ  Ｔｈｅｓｉｓ，Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９３）；Ｋｎｏｘ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９：３〜１７（１９８７）；Ｌｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：１２４〜１２９（１９８９）；Ｆｒｏｎｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：４８３〜４９６（１９９１）；Ｍａｔｓｕｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：８３４（１９９１）；Ｇｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０８：１６５７（１９８９）；Ｃｒｅｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２：１２９（１９９１）；Ｋａｌｄｅｒｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３９：４９９〜５０９（１９８４）；Ｓｔｅｉｆｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：７８５〜７９３（１９９０）、を参照されたい。
【０１６２】
異質タンパク質遺伝子及び農学的遺伝子
本発明によるトランスジェニック植物では、異質タンパク質は、商用量にて作成され得る。したがって、当該技術分野において既知の形質転換された植物の選択及び繁殖のための技術は、従来の方法で収穫された複数のトランスジェニック植物をもたらし、異質タンパク質が続いて、所望の組織から、又は総バイオマスから抽出され得る。植物バイオマスからのタンパク質の抽出は、既知の方法により、達成され得、例えば、Ｈｅｎｅｙ  ａｎｄ  Ｏｒｒ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１４：９２〜６（１９８１）により説明されている。
【０１６３】
好ましい一実施形態によると、異質タンパク質の商用生産に提供されるトランスジェニック植物は、ジャガイモ植物である。別の好ましい実施形態では、所望のバイオマスは種又は塊茎である。より高いレベルの発現を示す、比較的少量のトランスジェニック植物については、主に従来のＲＦＬＰ分析、ＰＣＲ分析、及びＳＳＲ分析を介して、遺伝子地図が生成され得、これは、組み込まれたＤＮＡ分子のおおよその染色体の位置を同定する。これに関する例示的な方法については、Ｇｌｉｃｋ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ２６９：２８４（１９９３）、を参照されたい。染色体の位置に関するマップ情報は、対象トランスジェニック植物の独自の保護に有用である。未承認の繁殖及び他の生殖細胞質との交配が行われた場合は、組み込み領域のマップは、疑わしい植物について同様のマップと比較され、対象植物と共通の血統を後者が有しているか判定され得る。マップの比較は、ハイブリダイゼーション、ＲＦＬＰ、ＰＣＲ、ＳＳＲ、及び配列決定を伴う場合があり、これらのすべては従来の技術である。
【０１６４】
同様に、本発明を用いることにより、形質転換された植物において農学的遺伝子が発現され得る。特に、植物は、農学的利益の様々な表現型を発現するよう、遺伝学的に操作され得る。これに関与する例示的な遺伝子は、限定するものではないが、以下に分類されるそれらを含む。
【０１６５】
１．害虫又は疾病に対する耐性を与え、以下をコード化する遺伝子
Ａ．植物病害耐性遺伝子。植物の防御は時に、植物内の病害耐性遺伝子（Ｒ）の生成物と、病原体内の対応する無毒性（Ａｖｒ）遺伝子の生成物との間の特定の相互作用により有効となる。植物変種は、クローン化耐性遺伝子（単一又は複数）と形質転換され得、特定の病原体株に耐性のある植物を遺伝子操作する。例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７８９（１９９４）（ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｏｍａｔｏ  Ｃｆ−９  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）；Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４３２（１９９３）（ｔｏｍａｔｏ  Ｐｔｏ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）；Ｍｉｎｄｒｉｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ７８：１０８９（１９９４）（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＲＳＰ２  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）、を参照されたい。
Ｂ．ダイズシスト線虫などの害虫に対する耐性を与える遺伝子。例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ  ９６／３０５１７、ＰＣＴ出願ＷＯ  ９３／１９１８１、を参照されたい。
Ｃ．バシラスチューリンゲンシスタンパク質、その誘導体、又はそこにモデル化された合成ポリペプチド。例えば、Ｂｔ  δ−エンドトキシン遺伝子のクローニング及びヌクレオチド配列を開示する、Ｇｅｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ４８：１０９（１９８６）、を参照されたい。更に、δ−エンドトキシン遺伝子をコード化するＤＮＡ分子は、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓに所在のＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから、例えば、ＡＴＣＣ受入番号４００９８、６７１３６、３１９９５、及び３１９９８にて、購入可能である。
Ｄ．レクチン。例えば、数種のクリヴィアミニアタマンノースバインディングレクチン遺伝子のヌクレオチド配列を開示する、Ｖａｎ  Ｄａｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２４：２５（１９９４）、を参照されたい。
Ｅ．アビジンなどのビタミンバインディングタンパク質。害虫に対する殺虫剤としてのアビジン及びアビジン相同物の使用を教示する、ＰＣＴ出願ＵＳ  ９３／０６４８７、を参照されたい。
Ｆ．酵素抑制剤、例えば、プロテアーゼ、若しくはプロテイナーゼ抑制剤又はアミラーゼ抑制剤。例えば、Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１６７９３（１９８７）（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｒｉｃｅ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ），Ｈｕｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：９８５（１９９３）（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｉ），Ｓｕｍｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：１２４３（１９９３）（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｉｔｒｏｓｐｏｒｅｕｓ  α−ａｍｙｌａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、及び米国特許第５，４９４，８１３号（Ｈｅｐｈｅｒ  ａｎｄ  Ａｔｋｉｎｓｏｎ、１９９６年２月２７日発行）、を参照されたい。
Ｇ．エクジステロイド又は幼若ホルモンなどの、昆虫に特有のホルモン又はフェロモン、その変異、それに基づくミメティック、又はそのアンタゴニスト若しくはアゴニスト。例えば、Ｈａｍｍｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：４５８（１９９０）による、クローン化された幼若ホルモンエステラーゼのバクロウィルス発現、幼若ホルモンの不活性化剤、の開示を参照されたい。
Ｈ．発現すると、対象害虫の生理機能を破壊する、昆虫に特有のペプチド又はニューロペプチド。例えば、Ｒｅｇａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９（１９９４）（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｙｉｅｌｄｓ  ＤＮＡ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｉｎｓｅｃｔ  ｄｉｕｒｅｔｉｃ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、及びＰｒａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６３：１２４３（１９８９）（ａｎ  ａｌｌｏｓｔａｔｉｎ  ｉｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｉｎ  Ｄｉｐｌｏｐｔｅｒａ  ｐｕｎｔａｔａ）、の開示を参照されたい。また、昆虫に特有の麻痺性神経毒をコード化する遺伝子を開示する、Ｔｏｍａｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第５，２６６，３１７号、を参照されたい。
Ｉ．ヘビ、スズメバチ、等により、自然に作られた、昆虫に特有の毒液。サソリ昆虫毒性ペプチド（ｓｃｏｒｐｉｏｎ  ｉｎｓｅｃｔｏｔｏｘｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）に対してコード化する遺伝子の植物内における異種の発現の開示について、例えば、Ｐａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １１６：１６５（１９９２）、を参照されたい。
Ｊ．モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体又は、殺虫力を伴う別の非タンパク質分子の高度蓄積の要因である酵素。
Ｋ．生物学的活性分子の、翻訳後修飾を含む、修飾を伴う酵素。例えば、自然又は合成に関わらない、糖分解酵素、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素、核酸分解酵素、シクラーゼ、トランスアミナーゼ、エステラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼ、及びグルカナーゼ。カラーゼ（ｃａｌｌａｓｅ）遺伝子のヌクレオチド配列を開示する、ＰＣＴ出願ＷＯ  ９３／０２１９７（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．）、を参照されたい。キチナーゼコード化配列を含むＤＮＡ分子は、例えば、ＡＴＣＣ受入番号３９６３７及び６７１５２より入手可能である。また、ｃＤＮＡコード化タバコイモムシキチナーゼのヌクレオチド配列を教示する、Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２３：６９１（１９９３）、及び、パセリＵｂｉ４−２ポリユビキチン化遺伝子のヌクレオチド配列を提供する、Ｋａｗａｌｌｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：６７３（１９９３）、も参照されたい。
Ｌ．シグナル伝達を刺激する分子。例えば、Ｂｏｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２４：７５７（１９９４）による、緑豆カルモジュリンｃＤＮＡクローンに対するヌクレオチド配列の開示、及び、トウモロコシカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を提供する、Ｇｒｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：１４６７（１９９４）、を参照されたい。
Ｍ．疎水性モーメントペプチド。真菌植物の病原体を抑制するタキプレシンのペプチド誘導体を開示する、ＰＣＴ出願ＷＯ  ９５／１６７７６、及び、病害耐性を与える合成抗菌性ペプチドを教示する、ＰＣＴ出願ＷＯ  ９５／１８８５５、を参照されたい。
Ｎ．メンブレンパーミアーゼ、チャネルフォーマー、又はチャネルブロッカー。例えば、Ｊａｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ８９：４３（１９９３）による、シュードモナスソラナセラムに耐性のあるトランスジェニックタバコ植物を示すセクロピン−β溶解性ペプチド相似系の異種の発現の開示、を参照されたい。
Ｏ．ウィルス侵襲性タンパク質、又はそれ由来の複合毒素。例えば、形質転換された植物細胞における、ウィルス外被タンパク質の蓄積は、外被タンパク質遺伝子に由来するウィルス、同様に関連するウィルスの影響によるウィルス感染及び／又は疾病の発症に対する耐性を加える。Ｂｅａｃｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．２８：４５１（１９９０）、を参照されたい。外被タンパク質により媒介された耐性は、アルファルファモザイクウィルス、キュウリモザイクウィルス、及びタバコモザイクウィルスに対して形質転換された植物により与えられる。
Ｐ．昆虫に特有の抗体、又はそれ由来の免疫毒素。したがって、昆虫の内蔵内の重要な代謝機能を対象にした抗体は、影響する酵素を不活性にし、昆虫を殺す。Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ♯４９７，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｉｎｔ’ｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ（Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）（１９９４）（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｖｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）、を参照されたい。
Ｑ．ウィルスに特有の抗体。例えば、組み換え抗体遺伝子を発現するトランスジェニック植物が、ウィルスの攻撃から保護されることを示す、Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：４６９（１９９３）、を参照されたい。
Ｒ．病原体又は寄生生物により、自然に作られた発育遅延タンパク質。したがって、真菌エンド−α−１、４−Ｄ−ポリガラクチュロナーゼは、真菌を定着させ、植物細胞壁ホモ−α−１、４−Ｄ−ガラクチュロナーゼの可溶により、植物栄養素の放出を促進する。Ｌａｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４３６（１９９２）、を参照されたい。ビーンエンドポリガラクチュロナーゼ抑制タンパク質をコード化する遺伝子のクローニング及び特徴付けは、Ｔｏｕｂａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２：３６７（１９９２）、により説明されている。
Ｓ．植物より自然に作られた発育遅延タンパク質。例えば、Ｌｏｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：３０５（１９９２）は、大麦リボソーム不活性化遺伝子を発現するトランスジェニック植物の、菌類病に対する耐性が向上したことを示している。
Ｔ．全身性後天耐性（ＳＡＲ）反応を伴う遺伝子、及び／又は病原関連遺伝子。Ｂｒｉｇｇｓ，Ｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５（２）（１９９５）。
Ｕ．抗真菌性遺伝子。Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ｍｅｌｃｈｅｒｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０１：７０９〜７１２（１９９３）；Ｐａｒｉｊｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ  １８３：２５８〜２６４（１９９１）ａｎｄ  Ｂｕｓｈｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ．Ｊ．ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈ．２０（２）：１３７〜１４９（１９９８）、を参照されたい。
Ｖ．Ｒ１遺伝子、Ｒ２遺伝子、Ｒ３遺伝子、Ｒ４遺伝子、及び他の耐性遺伝子などの、フィトフトラブライト（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｂｌｉｇｈｔ）に対する耐性を与える遺伝子。Ｎａｅｓｓ，Ｓ．Ｋ．，ｅｔ．ａｌ．，（２０００）Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｌａｔｅ  ｂｌｉｇｈｔ  ｉｎ  Ｓｏｌａｎｕｍ  ｂｕｌｂｏｃａｓｔａｎｕｍ  ｉｓ  ｍａｐｐｅｄ  ｔｏ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ８．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０１：６９７〜７０４  ａｎｄ  Ｌｉ，Ｘ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９８）Ａｕｔｏｔｅｔｒａｐｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｍｍｏｎ  ＡＦＬＰ  ｍａｒｋｅｒｓ：ｔｈｅ  Ｒ２  ａｌｌｅｌｅ  ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ  ｍａｐｐｅｄ  ｏｎ  ｐｏｔａｔｏ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ４．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９６：１１２１〜１１２８、を参照されたい。
【０１６６】
２．以下の例のような除草剤に対する耐性を与える遺伝子
Ａ．イミダゾリノン又はスルホニルウレアなどの、成長点又は分裂組織を抑制する除草剤。変異体ＡＬＳ酵素及び変異体ＡＨＡＳ酵素に対する、この分類コードにおける例示的な遺伝子、例えば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．７：１２４１（１９８８）、及びＭｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８０：４４９（１９９０）、によりそれぞれ説明される通り。
Ｂ．グリホセート（変異体５−エノールピルビルシキメート（ｅｎｏｌｐｙｒｕｖｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ）−３−リン酸塩シンターゼ（ＥＰＳＰ）及びａｒｏＡ遺伝子のそれぞれにより耐性が無効にされたもの）、及び、グルホシネート（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）及びストレプトミセス吸湿性ＰＡＴバー遺伝子）などの他のホスホノ化合物、及び、ピリジノキシプロピオン酸（ｐｙｒｉｄｉｎｏｘｙ  ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）又はフェノキシプロピオン酸（ｐｈｅｎｏｘｙ  ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、及びシクロヘキソン（ｃｙｃｌｏｈｅｘｏｎｅｓ）（ＡＣＣａｓｅ抑制剤コード化遺伝子）。例えば、グリホセート耐性を与え得るＥＰＳＰの形態のヌクレオチド配列を開示する、Ｓｈａｈ，ｅｔ  ａｌ．への米国特許第４，９４０，８３５号、を参照されたい。変異体ａｒｏＡ遺伝子をコード化するＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受入番号３９２５６にて入手され得、変異体遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｃｏｍａｉへの米国特許第４，７６９，０６１号に開示されている。Ｋｕｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．へのヨーロッパ特許出願第０  ３３３  ０３３号、及びＧｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第４，９７５，３７４号は、Ｌ−ホスフィノトリシンなどの除草剤に対する耐性を与えるグルタミンシンテターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を開示する。ＰＡＴ遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｌｅｅｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．へのヨーロッパ特許出願第０  ２４２  ２４６号にて提供されているＤｅＧｒｅｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：６１（１９８９）は、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼアクティビティに対してコード化するキメラバー遺伝子を発現するトランスジェニック植物の生成を説明する。セトキシジム及びハロキシホップなどのフェノキシプロピオン酸及びシクロヘキソン（ｃｙｃｌｏｈｅｘｏｎｅｓ）に対する耐性を与える例示的な遺伝子は、Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８３：４３５（１９９２）、により説明されるＡｃｃ１−Ｓ１遺伝子、Ａｃｃ１−Ｓ２遺伝子、及びＡｃｃ２−Ｓ３遺伝子である。
Ｃ．トリアジン（ｐｓｂＡ遺伝子及びｇｓ＋遺伝子）又はベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）などの、光合成を抑制する除草剤。Ｐｒｚｉｂｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：１６９（１９９１）は、クラミドモナスの、変異体ｐｓｂＡ遺伝子をコード化するプラスミドとの形質転換を説明する。ニトリラーゼ遺伝子に対するヌクレオチド配列は、Ｓｔａｌｋｅｒへの米国特許第４，８１０，６４８号に開示されており、それらの遺伝子を内含するＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受入番号５３４３５、６７４４１及び６７４４２にて利用可能である。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼに対してコード化するＤＮＡのクローニング及び発現は、Ｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８５：１７３（１９９２）、により説明されている。
Ｄ．アセトヒドロキシ酸シンターゼは、複数の種類の除草剤に対して耐性のあるこの酵素を発現する植物より見つかり、様々な植物に導入されている。Ｈａｔｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４６：４１９，１９９５、を参照されたい。除草剤に対する許容度を与える他の遺伝子は、ラットシトクロムＰ４５０７Ａ１及び酵母ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼ（Ｓｈｉｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０６：１７，１９９４）のキメラタンパク質をコード化する遺伝子、グルタチオンレダクターゼ及びスーペルオキシドディスムターゼ（Ａｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３６：１６８７，１９９５）に対する遺伝子、及び様々なホスホトランスフェラーゼ（Ｄａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：６１９，１９９２）に対する遺伝子、を含む。
Ｅ．プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス（ｐｒｏｔｏｘ））は、すべての植物の生存に必要なクロロフィルの生成に必要である。プロトックス酵素は、除草性化合物の変種に対する対象としてサーブする。それらの除草剤はまた、現在の植物のすべての異なる種の成長を抑制し、完全に枯れさせる。それらの除草剤に耐性のある、変更されたプロトックスの作用を内含する植物の開発は、米国特許第６，２８８，３０６号、６，２８２，８３７号、５，７６７，３７３号、及び国際公開第ＷＯ  ０１／１２８２５号、に説明されている。
【０１６７】
３．以下に示すものなどの付加価値的形質を与える遺伝子、又はこれらに寄与する遺伝子
Ａ．例えば、植物を、ステアリル−ＡＣＰデサチュラーゼのアンチセンス遺伝子と転換し、植物のステアリン酸含有量を増加させることによる、修飾された脂肪酸代謝。Ｋｎｕｌｔｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２６２５（１９９２）、を参照されたい。
Ｂ．フィチン酸塩含有量の低減−１）フィターゼコード化遺伝子の導入は、フィチン酸塩の機能停止を向上し、形質転換された植物に遊離リン酸塩を更に加える。例えば、アスペルギルスニゲルフィターゼ遺伝子のヌクレオチド配列の開示について、Ｖａｎ  Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １２７：８７（１９９３）、を参照されたい。２）遺伝子は、フィチン酸塩含有量を低減して導入され得る。トウモロコシでは、例えば、低レベルのフィチン酸により特徴付けられたトウモロコシの突然変異体の要因である、単一の対立遺伝子に関連するＤＮＡのクローニングと、それに続く再導入により、これは達成され得る。Ｒａｂｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｙｄｉｃａ  ３５：３８３（１９９０）、を参照されたい。
Ｃ．例えば、植物を、澱粉の分岐パターンを変更する酵素に対してコード化する遺伝子と転換することにより影響された、修飾された炭水化物組成物。Ｓｈｉｒｏｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：８１０（１９８８）（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｆｒｕｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅ），Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０：２２０（１９８５）（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ  ｇｅｎｅ），Ｐｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２９２（１９９２）（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ  ｔｈａｔ  ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｎｎｉｓ  α−ａｍｙｌａｓｅ），Ｅｌｌｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：５１５（１９９３）（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｏｍａｔｏ  ｉｎｖｅｒｔａｓｅ  ｇｅｎｅｓ），Ｓｏｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２４８０（１９９３）（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂａｒｌｅｙ  α−ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ），ａｎｄ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：１０４５（１９９３）（ｍａｉｚｅ  ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ  ｓｔａｒｃｈ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ＩＩ）、を参照されたい。
Ｄ．ＦＡＤ−２遺伝子の修飾を介して高められたオレイン酸、及び／又はＦＡＤ−３遺伝子の修飾を介して低減されたリノレン酸。米国特許第６，０６３，９４７号、６，３２３，３９２号、及び国際公開第ＷＯ  ９３／１１２４５号、を参照されたい。
【０１６８】
４．雄性不稔性を制御する遺伝子
Ａ．タペータムに特有のプロモーターの制御下での、薬品Ｎ−Ａｃ−ＰＰＴの適用を伴う、デアセチラーゼ遺伝子の導入。国際公開第ＷＯ  ０１／２９２３７号、を参照されたい。
Ｂ．様々な雄ずいに特有のプロモーターの導入。国際公開第ＷＯ  ９２／１３９５６号及び第ＷＯ  ９２／１３９５７号、を参照されたい。
Ｃ．バルナーゼ遺伝子及びバルスター遺伝子の導入。Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：６１１〜６２２，１９９２）、を参照されたい。
【０１６９】
ジャガイモ形質転換の方法
生物学的植物形質転換プロトコル及び物理的植物形質転換プロトコルを含む、植物形質転換の数々の方法が開発されている。例えば、Ｍｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ」ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．Ｅｄｓ．（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３）ｐａｇｅｓ  ６７〜８８、を参照されたい。加えて、植物細胞又は植物組織の形質転換及び植物の再生用の発現ベクター及び生体外培養方法が利用可能である。例えば、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ」ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．Ｅｄｓ．（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３）ｐａｇｅｓ  ８９〜１１９、を参照されたい。
【０１７０】
Ａ．アグロバクテリウム媒介形質転換−発現ベクターを植物内に導入するための１つの方法は、アグロバクテリウムの自然形質転換システムに基づいている。例えば、Ｈｏｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：１２２９（１９８５）、を参照されたい。アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）及びアグロバクテリウムリゾゲネス（Ａ．  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）は、植物病原性の土壌細菌であり、植物細胞を遺伝学的に変換する。アグロバクテリウムツメファシエンス及びアグロバクテリウムリゾゲネスのそれぞれのＴｉプラスミド及びＲｉプラスミドは、植物の遺伝形質転換の要因である遺伝子を保持する。例えば、Ｋａｄｏ，Ｃ．Ｉ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１０：１（１９９１）、を参照されたい。アグロバクテリウムベクターシステムの説明及びアグロバクテリウム媒介遺伝子導入の方法は、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ，Ｍｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ  ａｎｄ  Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ８：２３８（１９８９）、により提供されている。１９９６年１０月８日発行の米国特許第５，５６３，０５５号（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ及びＴｈｏｍａｓ）、も参照されたい。
【０１７１】
Ｂ．直接遺伝子導入−直接遺伝子導入と総称される植物形質転換の様々な方法が、アグロバクテリウム媒介形質転換の代替として開発されている。一般的に適用可能な方法での、植物の表面へのマイクロ発射物の寸法は、１〜４μｍである。発現ベクターは、マイクロ発射物を、植物細胞壁及び植物細胞膜の貫通に十分な３００〜６００ｍ／ｓの速度に加速する遺伝子銃機器を使用して、植物組織内に導入される。Ｓａｎｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｒｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．５：２７（１９８７）；Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｊ．Ｃ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．６：２９９（１９８８）；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．６：５５９〜５６３（１９８８）；Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｊ．Ｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  ７：２０６（１９９０）；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２６８（１９９２）。１９９１年５月１４日発行の、米国特許第５，０１５，５８０号（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ、ｅｔ  ａｌ．）、及び、１９９４年６月２１日発行の、米国特許第５，３２２，７８３号（Ｔｏｍｅｓ，ｅｔ  ａｌ．）、も参照されたい。
【０１７２】
ＤＮＡの、植物への物理的分配の別の方法は、対象細胞の超音波処理である。Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９９６（１９９１）。あるいは、リポソーム及びスフェロプラスト融合が、発現ベクターの植物内への導入に使用されている。Ｄｅｓｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：２７３１（１９８５）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３９６２（１９８７）。ＣａＣｌ２沈殿、ポリビニールアルコール、又はポリ−Ｌ−オルニチンを使用しての、プロトプラスト内へのＤＮＡの直接摂取もまた報告されている。Ｈａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１６１（１９８５）ａｎｄ  Ｄｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３：４５１（１９８２）。プロトプラスト及び、細胞並びに組織全体のエレクトロポレーションもまた説明されている。Ｄｏｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ＶＩＩｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＩＡＰＴＣ，Ａ２−３８，ｐ  ５３（１９９０）；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：１４９５〜１５０５（１９９２）ａｎｄ  Ｓｐｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：５１〜６１（１９９４）。
【０１７３】
ジャガイモの対象組織の形質転換にしたがうことで、上述の選択可能マーカー遺伝子の発現は、当該技術分野において周知の再生方法及び選択方法を使用しての、形質転換された細胞、組織、及び／又は植物の好適な選択を可能とする。
【０１７４】
形質転換用の前述の方法は一般的に、トランスジェニック変種の生成に使用される。トランスジェニック変種は続いて、新たなトランスジェニック変種を生成する目的で、別の（未形質転換の、又は形質転換された）変種と交配され得る。あるいは、前述の形質転換技術を使用して、特定のジャガイモラインへの遺伝子操作を受けた遺伝的形質は、植物ブリーディングの当業者に既知の、従来の戻し交配技術を使用して、別のラインに移され得る。例えば、戻し交配アプローチを使用して、公知の、一般階層の変種から、上流階層の変種内へ、又は、そのゲノム内に異質遺伝子を内含する変種から、ある変種、又はその遺伝子を含まない変種内へ、遺伝子操作を受けた形質が移され得る。本明細書で使用される場合、「交配」は、文脈によって、単にＸとＹの交配、又は、戻し交配のプロセスと呼ぶことができる。
【０１７５】
ジャガイモ植物という用語はまた、本発明の文脈で使用される場合、その変種の遺伝子組み換え植物、又は、そこに組み入れられた（除草剤又は害虫耐性などの）１つ以上の付加価値的遺伝子を有するトランスジェニック誘導体などの、Ｆ１０の重要な識別性質を保有する誘導体変種を含むことを当業者は認識するであろう。戻し交配方法は、ある性質を変種内で改良、又はこの性質を導入するために、本発明にて使用され得る。用語「戻し交配」は、本明細書で使用される場合、雑種子孫を親へ戻す反復性の、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、又はそれ以上の回数の繰り返し交配と呼ぶ。１つ以上の望ましい性質に対して、遺伝子（単一又は複数）に寄与する親のジャガイモ植物は、非反復性の親又はドナーとしての親と名付けられる。この専門用語は、非反復性の親が戻し交配プロトコルに１度使用され、したがって再発しないという事実を言う。非反復性の親からの単一の遺伝子又は複数の遺伝子が導入された親のジャガイモ植物は、戻し交配プロトコルに複数回使用されるため、反復親として知られる。一般的な戻し交配プロトコルでは、元の所望の変種（反復親）は、導入される所望の遺伝子（単一又は複数）を保有する第２の変種（非反復親）に交配される。この交配からの結果としての子孫は続いて、反復親に再度交配され、反復親の本質的にすべての望ましい形態的性質及び生理的性質が、非反復親から導入された１つ以上の遺伝子に加えて、変換された植物に再生されたジャガイモ植物が得られるまで、プロセスが繰り返される。
【０１７６】
好適な反復親の選択は、戻し交配手順の成功にとって重要なステップである。戻し交配プロトコルのゴールは、元の変種における１つ以上の形質又は性質を変更又は置換することである。これを達成するため、反復変種の１つ以上の遺伝子が、非反復親からの望ましい遺伝子（単一又は複数）とともに、修飾、置換、又は補充され、一方で、本質的にすべての残りの望ましい遺伝子、したがって、元の変種の、望ましい生理的構造及び形態的構造、が保持される。特定の非反復親の選択は、戻し交配の目的によって異なるであろう。主な目的の１つは、いくらかの商業的に望ましい、農学的に重要な形質を植物に加えることである。正確な戻し交配プロトコルは、変更又は追加される性質又は形質によって異なり、適切な試験プロトコルが決定される。導入される性質が優性対立遺伝子の場合、戻し交配方法は簡略化されるが、劣性対立遺伝子もまた導入されてよい。この場合、望ましい性質が正常に導入されたかを判定するために、子孫の試験が導入される必要性があってよい。
【０１７７】
同様に、導入遺伝子は、次のような当業者に既知のいずれの創設された組み換え方法を使用して、植物内に導入され得る。Ｇｒｅｓｓｅｌ，１９８５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ  Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｃｒｏｐｓ：Ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｔ  Ｒｅａｌｉｔｉｅｓ，Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｆｏｒｍ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ，Ｌ．ｖａｎ  Ｖｌｏｔｅｎ−Ｄｏｔｉｎｇ，（ｅｄ．），Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈｕｔｔｎｅｒ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｒｅｖｉｓｉｎｇ  Ｏｖｅｒｓｉｇｈｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｋｌｅｅ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ：Ｐｌａｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ，Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ；Ｋｏｎｃｚ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｏｆ  ＴＬ−ＤＮＡ  Ｇｅｎｅ  ５  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｈｅ  Ｔｉｓｓｕｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｇｅｎｅｓ  Ｃａｒｒｉｅｄ  ｂｙ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｙｐｅ  ｏｆ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｂｉｎａｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ；Ｌａｗｓｏｎ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｍｉｘｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｃｕｌｔｉｖａｒ：Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｖｉｒｕｓ  Ｘ  ａｎｄ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｖｉｒｕｓ  Ｙ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｍｉｔｓｋｙ，Ｔ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｌａｎｔｓ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ＰＬＲＶ．米国特許第５，５１０，２５３号；Ｎｅｗｅｌｌ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  Ｌ．Ｃｖ．Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ；Ｐｅｒｌａｋ，Ｆ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｐｏｔａｔｏｅｓ：Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｄａｍａｇｅ  ｂｙ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｂｅｅｔｌｅｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；この目的のため、それらのすべてを参考として引用し、本明細書に組み込む。
【０１７８】
新たな変種の開発に通常選択されないが、戻し交配及び遺伝子工学技術によって改良され得る多くの形質が同定されている。それらの形質は、トランスジェニックであってもなくても良い。それらの形質の例は、限定するものではないが、除草剤耐性、細菌病、菌類病、又はウィルス病に対する耐性、害虫耐性、澱粉及び他の炭水化物の濃度の均一性又は向上、高い栄養価、塊茎にあざができる傾向の低減、及び澱粉の糖類への変換率の低減、を含む。それらの遺伝子は一般的に、核により受け継がれたものである。それらの形質のいくらかは、米国特許第５，５００，３６５号、米国特許第５，３８７，７５６号、米国特許第５，７８９，６５７号、米国特許第５，５０３，９９９号、米国特許第５，５８９，６１２号、米国特許第５，５１０，２５３号、米国特許第５，３０４，７３０号、米国特許第５，３８２，４２９号、米国特許第５，５０３，９９９号、米国特許第５，６４８，２４９号、米国特許第５，３１２，９１２号、米国特許第５，４９８，５３３号、米国特許第５，２７６，２６８号、米国特許第４，９００，６７６号、米国特許第５，６３３，４３４号及び米国特許第４，９７０，１６８号、に説明されている。
【０１７９】
デポジット情報
上記に開示されており、添付の特許請求の範囲に引用される、Ｊ．Ｒ．Ｓｉｍｐｌｏｔ  Ｃｏｍｐａｎｙが専有するジャガイモ品種Ｆ１０の塊茎のデポジットは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０にて行われた。デポジット日は、２０１３年５月２３日である。微小塊茎の２５バイアルのデポジットが、本出願申請日の前に、Ｊ．Ｒ．Ｓｉｍｐｌｏｔ  Ｃｏｍｐａｎｙが保有する同じデポジットより持ち込まれた。すべての制限は、特許権の付与とともに、変更不可に取り除かれる。デポジットは、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§  １．８０１〜１．８０９の要件のすべてを満たすよう意図されている。ＡＴＣＣ受入番号は、ＰＴＡ−１２０３７３である。デポジットは、デポジトリに３０年間、又は、最後の要求から５年間、若しくは、特許の有効期間のいずれかのより長い方の期間に保管され、その期間中は必要に応じて交換される。
【０１８０】
多くの例示的な態様及び実施形態が上述されているが、特定の変更、置換、付加、及びこれらのサブコンビネーションを当業者は認識するであろう。したがって、以下の添付の特許請求の範囲及び以降に導入される特許請求の範囲は、すべてのそのような変更、置換、付加、及びサブコンビネーションが、その真の趣旨及び範囲内にあるものとして、これらを含むと解釈されることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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