(57)【要約】【課題】高透明性、低免疫原性、良い生物活性及び生体適合性を有し、新鮮な角膜に近いコラーゲン三次元構造を維持可能であり、角膜コラーゲン線維構造の保存性及び移植後の透明性が向上し、医薬分野に広く利用できる異種角膜材料の製造方法を提供する。【解決手段】異種角膜材料製造の全過程で、濃度の異なるグリセロールを使用することにより透明でかつウイルス及び細胞のない異種角膜移植片が得られ、コラーゲンで架橋を行ることによりコラーゲンの分解耐性及び免疫原性をさらに低減し、眼球全体の保存下で１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）を架橋剤として使用することにより、角膜材料の形態を新鮮角膜にいっそう近くしてその生体力学的性能を向上させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種角膜材料の製造方法であって、
死後の動物から異種角膜材料として利用可能な眼球を採取し、眼球全体を濃度８５％〜９５％のグリセロール及び濃度５％〜１５％の緩衝液を含有する溶液に投入して密封保存しながら２℃／分〜３℃／分の降温速度で徐冷し、最終的に−７８℃の温度で少なくとも４週間の長期間保存をする細胞不活性化ステップ（１）と、
前記ステップ（１）で密封保存された眼球全体を−２０℃の保温容器に移し、２５ｋＧｙの照射量でγ線を照射するウイルス不活性化ステップ（２）と、
前記ステップ（２）で得られる眼球全体を、２０％〜８０％のグリセロールを含有する架橋剤溶液に移し、４℃で１時間〜７２時間保存する架橋ステップ（３）と、
前記ステップ（３）で得られる眼球全体を、眼球の角膜縁から後方へ２ｍｍ離れた位置に沿って切断し、得られた角膜片を表層角膜切削器に載置して切削器により２００μｍ〜５５０μｍの厚さで角膜を切削する移植片作成ステップ（４）と、を含む、
ことを特徴とする異種角膜材料の製造方法。
【請求項２】
前記架橋剤は、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドからなり、
前記１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドと前記Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドとの質量比は、１：１〜３：１であり、
前記Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドは、前記架橋剤における最終濃度が１．０％〜１０．０％である、
ことを特徴とする請求項１に記載の異種角膜材料の製造方法。
【請求項３】
前記眼球は、動物の死亡後４時間以内で採取するものであり、
前記眼球全体を密封保存する前に、濃度２％のポビドンヨード及び濃度０．９％の生理食塩水で順次前記眼球全体を洗浄した後、前記眼球周辺の筋膜及び筋肉を取り除き、続いて濃度２％のポビドンヨードで前記眼球全体を洗浄した後、濃度０．９％の生理食塩水で前記眼球全体を洗浄する、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の異種角膜材料の製造方法。
【請求項４】
前記眼球全体を密封保存する前に、前記眼球全体を４０ｍｇのトブラマイシンを含有する５０％の高濃度糖溶液に少なくとも２０分間浸漬した後、濃度０．９％の生理食塩水で前記眼球全体を洗浄する、
ことを特徴とする請求項３に記載の異種角膜材料の製造方法。
【請求項５】
前記眼球の角膜縁から後方へ２ｍｍ離れた位置に沿って切断する前に、前記眼球全体をリンゲル液で５分間の洗浄を２回行う、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の異種角膜材料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学分野に関し、より具体的に、表層角膜移植に直接利用可能な異種材料の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
角膜は、眼球壁の前方にある透明な膜であり、線維膜の前方約６分の１を占め、後方から見ると円形に示されるが、前方からみると横長楕円形に示されている。角膜は、眼球の最も前方に位置する透明な部分であり、虹彩、瞳孔、及び前眼房を覆っており、眼球に屈折力の大部分を提供し、水晶体の屈折力とともに光を網膜に正確に集めて像を結ぶようにする。
【０００３】
また、角膜の透明性の喪失による角膜失明は、白内障に次ぐ視力喪失の主要因である。眼外傷及び角膜潰瘍による失明患者は、毎年１５０万〜２００万人増えている。このような失明の唯一の効果的な治療法は、ヒト由来の角膜を移植する方法（「角膜移植術」とも呼ばれる）である。
【０００４】
現在、市場で角膜材料の需要と供給の間に大きな差がある。同種角膜が不足でかつ短期間で改善され難いという状況下で、人々が角膜不足の問題を解決するために、様々な方法を研究して新規な代替材料を求めている。
【０００５】
生物材料及び異種角膜材料（heterogeneticcorneal material）を含む新規材料が報告、検証された。従来の報告によると、生物材料は組織適合性が不十分であり、広く利用できないことに対して、異種角膜材料はより広い将来的な利用可能性を有する。従来技術では、主としてプロテアーゼ（トリプシン）又はホスホリパーゼＡ２などの化学的手段で異種角膜における細胞を取り除くことに注目している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、これらの酵素類はコラーゲン構造に影響を与え、移植後の角膜細胞の成長に対しても一定の抑制効果を有するという問題がある。従来の文献では、移植後早期の移植片混濁が異種角膜材料の主要問題であることが示されるため、上述した具体的な処理方法及び製造方法は依然として最適化の余地が大きい。
【０００７】
従来技術に存在する問題点に鑑み、本発明の目的は、極めて高い透明性、低い免疫原性、良い生物活性及び生体適合性を有する異種角膜材料を製造でき、新鮮な角膜に近いコラーゲン三次元構造を維持するとともに、コラーゲン架橋によりコラーゲンの分解耐性及び免疫原性をさらに低減できる異種角膜材料の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記した目的を達成するために、本発明は、技術的解決策として異種角膜材料の製造方法を提供する。
【０００９】
本発明に係る異種角膜材料の製造方法は、
動物の死亡後４時間以内で異種角膜材料として利用可能な眼球を採取し、濃度２％のポビドンヨード及び濃度０．９％の生理食塩水で順次眼球全体を洗浄した後、眼球周辺の筋膜及び筋肉を取り除き、続いて濃度２％のポビドンヨードで眼球全体を洗浄した後、濃度０．９％の生理食塩水で眼球全体を洗浄する処理ステップ（１）と、
処理された眼球全体を、４０ｍｇのトブラマイシンを含有する５０％の高濃度糖溶液１０ｍｌに少なくとも２０分間浸漬した後、濃度０．９％の生理食塩水で眼球全体を洗浄する滅菌ステップ（２）と、
滅菌された眼球全体を、濃度８５％〜９５％のグリセロール及び濃度５％〜１５％の緩衝液を含有する溶液に投入して密封保存しながら２℃／分〜３℃／分の降温速度で徐冷し、最終的に−７８℃の温度で少なくとも４週間の長期間保存をする細胞不活性化ステップ（３）と、
密封保存された眼球全体を−２０℃の保温容器に移し、２５ｋＧｙの照射量で眼球全体にγ線を照射するウイルス不活性化ステップ（４）と、
照射された眼球全体を、２０％〜８０％のグリセロールと質量比が１：１〜３：１の１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）からなる架橋剤とを溶液中のＥＤＣ最終濃度が１．０％〜１０．０％になるように含有する架橋剤溶液に移し、４℃で１時間〜７２時間保存する架橋ステップ（５）と、
架橋した眼球全体を取り出してリンゲル液で５分間の洗浄を２回行った後、眼球の角膜縁から後方へ２ｍｍ離れた位置に沿って切断し、得られた角膜片を表層角膜切削器（lamellarcorneal cutter）に載置して切削器により２００μｍ〜５５０μｍの厚さで角膜を切削する移植片作成ステップ（６）と、を含む。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る異種角膜材料の製造方法は、主として下記の４つの特徴を有する。
【００１１】
第１の特徴は、眼球を全体で保存することである。第１の特徴によれば、次のメリット１、２を生じさせる。メリット１は、ステップ（３）において、眼球全体で保存することで、角膜コラーゲン線維の三次元構造及び角膜の固有形態を効果的に維持でき、また、グリセロールにより角膜脱水過程がいっそう緩和、緩慢かつ均一になるので、コラーゲン線維の三次元構造を迅速かつ強烈な脱水による破壊から保護できることである。メリット２は、ステップ（５）において、特定濃度のグリセロールに保存される眼球が非脱水の状態になり、角膜本来の形、厚さ、曲率が効果的に維持可能であり、角膜コラーゲン線維の構造及び配列が新鮮角膜に最も近いので、このような状態で眼球全体で架橋を行うことにより、架橋の速度及び強度を効果的に制御しながら角膜の固有形態に最も近い条件下で緩慢かつ均一な架橋を行った後、角膜の形態及びコラーゲン線維の構造を効果的に維持できることである。以上の理由で、眼球を全体で保存することにより、新鮮角膜にいっそう近い角膜の形態、コラーゲン線維構造が得られ、さらにより透明な角膜表層材料が得られる。
【００１２】
第２の特徴は、保存、照射及び架橋にグリセロールを使用することである。ステップ（３）において高濃度グリセロール（グリセロールの濃度が８５％〜９５％であり、残りの５％〜１５％は緩衝液である）を使用することにより、次のメリットａ〜ｅを生じさせる。メリットａは、まず、グリセロールが凍結保護剤として機能することにある。グリセロールは、組織及び細胞を凍結・解凍過程中の氷結晶による細胞及び組織への損傷から保護でき、角膜コラーゲン線維を凍結・解凍による影響から効果的に保護でき、また、グリセロールが非細胞毒性であり、分子量が小さく、水に溶解しやすく、容易に溶出できる。メリットｂは、グリセロールの高吸水性により、角膜コラーゲンを効果的に脱水可能であることにある。高濃度グリセロールによる脱水は、コラーゲンの最適な保存方法として、従来の凍結乾燥法と同様の脱水効果を持ちながら、眼球全体の状態で角膜コラーゲンの形態を効果的に維持すると同時に角膜上皮細胞、角膜ストロマ細胞及び角膜内皮細胞を不活性化させ、細胞による免疫反応を減少することができるので、凍結乾燥法よりも遥かに優れた脱水効果及び優位性を持つ。メリットｃは、グリセロールが有する抗菌性及びウイルス不活性化作用にある。グリセロールのウイルス不活性化作用はグリセロール濃度、保存時間に比例することが報告されている。８５％のグリセロールで２週間保存する場合に動物のＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスを不活性化できるので、本発明において８５％以上のグリセロールで４週間以上保存するとウイルスを効果的に不活性化させ、ひいてはより安全な異種角膜材料を実現できる。メリットｄは、グリセロールによるコラーゲン線維の保護作用にある。γ線の照射は、コラーゲン線維に大きな損害を与え、角膜コラーゲン線維の構造の変化を発生させ得ることが知られており、２５ｋＧｙのγ線が細菌及びウイルスを効果的に殺滅できるが、このような強度のγ線照射による角膜コラーゲン線維への破壊が非常にひどいこともよく知られている。しかし、本発明で使用されるグリセロールのコラーゲン線維保護作用により、グリセロールで保存する場合、高強度のγ線による角膜コラーゲン線維の損傷を効果的に防止し、角膜コラーゲン線維をいっそう透明にすることができる。メリットｅは、架橋過程で使用される中濃度の吸水性グリセロールにより、角膜の架橋過程におけるコラーゲンの膨潤を効果的に防止できることにある。角膜の透明性は、コラーゲン線維の直径及びコラーゲン線維間の隙間と高い関連性を有する。そのため、コラーゲンの膨潤は、角膜コラーゲン線維の直径及びコラーゲン線維間の隙間の水腫を増加させ角膜の混濁を引き起こすことがある。さらに、コラーゲンの高度な膨潤は、コラーゲン線維間の結合を切断し、角膜の水腫の回復を困難にする。これに対して、中濃度のグリセロールは、コラーゲンの膨潤を効果的に抑制し角膜の厚さを一定に保つことができ、コラーゲン線維間の隙間を新鮮角膜に近いように維持しながら架橋を行うことで、コラーゲン線維間の分子間力を増加させ、コラーゲン三次元構造を効果的に保護することができる。その結果、移植術後の角膜コラーゲン線維の水腫時間を減少させ、水腫程度が軽減し、角膜移植片���より透明にすることができる。
【００１３】
第３の特徴は、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）を架橋剤として使用することである。このようにして、角膜コラーゲン線維内の架橋及び角膜コラーゲン線維間の架橋を緩慢に発生させることができる。これらの架橋剤の性質が非常に穏やかであるため、コラーゲン反応後に残存する水溶性イソウレア（isourea）が容易に溶出するようになる。また、眼球全体で架橋を行うことにより、架橋過程をより穏やかにし、架橋剤を角膜コラーゲン線維基質及び線維束の間までいっそう緩慢に浸透させ、組織の均一かつ完全な架橋を実現することができる。
【００１４】
第４の特徴は、従来技術と比べて、製造プロセスが簡単であり、コストが低く、操作が便利であるため、産業上の広範な用途が期待できることである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、実施例を参照しながら本発明をより具体的に説明するが、本発明の実施形態はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００１６】
＜実施例１＞
（１）処理
ブタ死亡後２時間以内でブタ眼球を採取し、濃度２％のポビドンヨード及び濃度０．９％の生理食塩水で順次眼球全体を洗浄した後、眼球周辺の筋膜及び筋肉を取り除き、続いて濃度２％のポビドンヨードで眼球全体を洗浄した後、濃度０．９％の生理食塩水で眼球全体を洗浄した。
【００１７】
（２）滅菌
処理された眼球全体を、４０ｍｇのトブラマイシンを含有する５０％の高濃度糖溶液１０ｍに少なくとも２０分間浸漬した後、濃度０．９％の生理食塩水で眼球全体を洗浄した。
【００１８】
（３）細胞の不活性化
滅菌された眼球全体を、濃度９５％の滅菌グリセロール及び濃度５％のリン酸塩緩衝液を含有する溶液に投入して密封保存しながら２℃／分〜３℃／分の降温速度で徐冷し、最終的に−７８℃の温度で８週間保存した。
【００１９】
（４）ウイルスの不活性化
グリセロールで密封保存された眼球全体を−２０℃の保温容器に移し、２５ｋＧｙの照射量で眼球全体にγ線を照射した。
【００２０】
（５）架橋
保存溶液を解凍した後、眼球を８０％のグリセロールを含有する架橋剤溶液に移し、４℃で４８時間保存した。架橋剤は１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）からなる。ＥＤＣとＮＨＳとの質量比（ＮＨＳに対するＥＤＣの質量比（ＥＤＣ：ＮＨＳ））は３：１である。ＥＤＣは溶液における最終濃度が１０．０％である（なお、本発明に係る架橋剤は、内架橋剤（inner crosslinking agent、線維内架橋剤）又は外架橋剤（outer crosslinking agent、線維間架橋剤）であってもよい。架橋剤の種類は多いが、実験によると、グリセロールを併用して眼角膜材料用の架橋剤溶液を調製するために、最適な架橋剤は１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）であることを示した）。
【００２１】
（６）移植片の作成
架橋した眼球全体を取り出して、リンゲル液で５分間の洗浄を２回行った後、眼球の角膜縁から後方へ２ｍｍ離れた位置に沿って切断し、得られた角膜片を自動表層角膜切削器に載置して切削器により２００μｍの厚さで角膜を切削した。得られた移植片をウサギ角膜移植術の実験に使用した。
【００２２】
（７）動物の準備
体重２．５ｋｇ〜３．０ｋｇのニュージーランドホワイトウサギを選択して、３％のペントバルビタールナトリウム（１ｍｌ／ｋｇ、すなわち３０ｍｇ／ｋｇ）及びスミアンキシンＩＩ（Sumianxin II、０．２５ｍｌ／ｋｇ）で麻酔を行った。
【００２３】
（８）表層角膜の移植
７．５ｍｍ角膜トレパン（cornealtrephine）を使用して、約２／３角膜厚さの深さで角膜表層片を取り外した。７．７５ｍｍ角膜トレパンを使用して、異種角膜移植片を製造した。得られた異種移植片を並置縫合（apposition suture）により角膜移植床に移植した。手術後１日目、１週目、８週目、６か月目で角膜移植片の透明性、拒絶反応の有無を観察した。
【００２４】
＜実施例２＞
（１）処理
ブタ死亡後２時間以内でブタ眼球を採取し、濃度２％のポビドンヨード及び濃度０．９％の生理食塩水で順次眼球全体を洗浄した後、眼球周辺の筋膜及び筋肉を取り除き、続いて濃度２％のポビドンヨードで眼球全体を洗浄した後、濃度０．９％の生理食塩水で眼球全体を洗浄した。
【００２５】
（２）滅菌
処理された眼球全体を、４０ｍｇのトブラマイシンを含有する５０％の高濃度糖溶液１０ｍｌに少なくとも２０分間浸漬した後、濃度０．９％の生理食塩水で眼球全体を洗浄した。
【００２６】
（３）細胞の不活性化
滅菌された眼球全体を、濃度９０％の滅菌グリセロール及び濃度１０％のリン酸塩緩衝液を含有する溶液に投入して密封保存しながら２℃／分〜３℃／分の降温速度で徐冷し、最終的に−７８℃の温度で１０週間保存した。
【００２７】
（４）ウイルスの不活性化
グリセロールで密封保存された眼球全体を−２０℃の保温容器に移し、２５ｋＧｙの照射量で眼球全体にγ線を照射した。
【００２８】
（５）架橋
保存溶液を解凍した後、眼球を５０％のグリセロールを含有する架橋剤溶液に移し、４℃で４８時間保存した。架橋剤は１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）からなる。ＥＤＣとＮＨＳとの質量比は２：１である。ＥＤＣは溶液における最終濃度が１０．０％である（なお、本発明に係る架橋剤は、内架橋剤又は外架橋剤であってもよい。架橋剤の種類は多いが、実験によると、グリセロールを併用して眼角膜材料用の架橋剤溶液を調製するために、最適な架橋剤は１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）であることを示した）。
【００２９】
（６）移植片の作成
架橋した眼球全体を取り出して、リンゲル液で５分間の洗浄を２回行った後、眼球の角膜縁から後方へ２ｍｍ離れた位置に沿って切断し、得られた角膜片を表層角膜切削器に載置して切削器により２００μｍの厚さで角膜を切削した。得られた移植片をウサギ角膜移植術の実験に使用した。
【００３０】
（７）動物の準備
体重２．５ｋｇ〜３．０ｋｇのニュージーランドホワイトウサギを選択して、３％のペントバルビタールナトリウム（１ｍｌ／ｋｇ、すなわち３０ｍｇ／ｋｇ）及びスミアンキシンＩＩ（０．２５ｍｌ／ｋｇ）で麻酔を行った。
【００３１】
（８）表層角膜の移植
７．７５ｍｍ角膜トレパンを使用して、約７／１２角膜厚さの深さで角膜表層片を取り外した。８．００ｍｍ角膜トレパンを使用して、異種角膜移植片を製造した。得られた異種移植片を並置縫合により角膜移植床に移植した。手術後１日目、１週目、８週目、６か月目で角膜移植片の透明性、拒絶反応の有無を観察した。
【００３２】
＜実施例３＞
（１）処理
ブタ死亡後２時間以内でブタ眼球を採取し、濃度２％のポビドンヨード及び濃度０．９％の生理食塩水で順次眼球全体を洗浄した後、眼球周辺の筋膜及び筋肉を取り除き、続いて濃度２％のポビドンヨードで眼球全体を洗浄した後、濃度０．９％の生理食塩水で眼球全体を洗浄した。
【００３３】
（２）滅菌
処理された眼球全体を、４０ｍｇのトブラマイシンを含有する５０％の高濃度糖溶液１０ｍｌに少なくとも２０分間浸漬した後、濃度０．９％の生理食塩水で眼球全体を洗浄した。
【００３４】
（３）細胞の不活性化
滅菌された眼球全体を、濃度８５％の滅菌グリセロール及び濃度１５％の生理食塩水を含有する溶液に投入して密封保存しながら２℃／分〜３℃／分の降温速度で徐冷し、最終的に−７８℃の温度で１２週間保存した。
【００３５】
（４）ウイルスの不活性化
密封保存された眼球全体を−２０℃の保温容器に移し、２５ｋＧｙの照射量で眼球全体にγ線を照射した。
【００３６】
（５）架橋
保存溶液を解凍した後、眼球を２０％のグリセロールを含有する架橋剤溶液に移し、４℃で４８時間保存した。架橋剤は１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）からなる。ＥＤＣとＮＨＳとの質量比は１：１である。ＥＤＣは溶液における最終濃度が１．０％である。
【００３７】
（６）移植片の作成
架橋した眼球全体を取り出して、リンゲル液で５分間の洗浄を２回行った後、眼球の角膜縁から後方へ２ｍｍ離れた位置に沿って切断し、得られた角膜片を表層角膜切削器に載置して切削器により１５０μｍの厚さで角膜を切削した。得られた移植片をウサギ角膜移植術の実験に使用した。
【００３８】
（７）動物の準備
体重２．５ｋｇ〜３．０ｋｇのニュージーランドホワイトウサギを選択して、３％のペントバルビタールナトリウム（１ｍｌ／ｋｇ、すなわち３０ｍｇ／ｋｇ）及びスミアンキシンＩＩ（０．２５ｍｌ／ｋｇ）で麻酔を行った。
【００３９】
（８）表層角膜の移植
１０．０ｍｍ角膜トレパンを使用して、１２時の方向に約１／２角膜厚さの深さで角膜層間剥離を行った。角膜層間に５．５ｍｍサイズの異種角膜移植片を挿入して移植した。手術後１日目、１週目、８週目、６か月目で角膜移植片の透明性、拒絶反応の有無を観察した。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明で製造された角膜材料は、角膜コラーゲン線維構造の保存性及び移植後の透明性が向上し、医薬分野に広く利用できる。
【国際調査報告】
2016538099.tif 000002
2016538099.tif 000003
2016538099.tif 000004
2016538099.tif 000005