(57)【要約】  がん、神経変性疾患、慢性腎疾患及びＨＩＶ感染などの慢性疾患における治療的使用のための強力で安定なビタミンＤベースの複合体のファミリーが開示される。それらは、脱グリコシル化されたビタミンＤ結合タンパク質との相互作用により作製されて、二量体複合体を形成することが可能であり、それらは更に、不飽和脂肪酸により安定化されて、原形質膜にあるビタミンＤ受容体との細胞レベルでの相互作用の改善を提供する三量体複合体を形成することができる。有効性は、適切な溶媒中にサプリメントを溶解又は可溶化させることにより更に改善することができる。複合体に関する送達メカニズムの１つは、リポソーム中にそれらを封入することであり、経口投与を可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨格として、脱グリコシル化されたビタミンＤ結合タンパク質、ビタミンＤ３又はその類似体、及び少なくとも１つの不飽和脂肪酸の三量体複合体であるビタミンＤベースの製剤。
【請求項２】
水性アルコール系生理食塩水溶媒を更に含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記不飽和脂肪酸が、オレイン酸又はエイコサペンタエン酸である、請求項１又は２に記載の製剤。
【請求項４】
リポソーム中に封入される、請求項１から３までのいずれか一項に記載の製剤を含む経口投与可能な組成物。
【請求項５】
噴霧による投与用に製剤化されて、請求項１から３までのいずれか一項に記載の製剤を含む組成物。
【請求項６】
坐薬としての投与用に製剤化されて、請求項１から３までのいずれか一項に記載の製剤を含む組成物。
【請求項７】
浣腸剤としての投与用に製剤化されて、請求項１から３までのいずれか一項に記載の製剤を含む組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の製剤の生産方法であって、ビタミンＤ結合タンパク質を脱グリコシル化するステップと、脱グリコシル化されたタンパク質を、ビタミンＤ３又はその類似体と複合体形成させるステップと、そのようにして得られる二量体複合体を、少なくとも１つの不飽和脂肪酸と更に複合体形成させるステップとを順次含む上記方法。
【請求項９】
請求項４に記載の経口投与可能な組成物の生産方法であって、リポソーム中に請求項８に記載の方法により得られる複合体を封入するステップを含む上記方法。
【請求項１０】
請求項１から３までのいずれか一項に記載の治療有効量の製剤の投与により、がんを患う患者を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
２．専門用語：
下記説明において、読みやすさを支援するために、下記用語が使用され；それぞれ、その意味を伴う：
【０００２】
ＶＤＢＰ：ビタミンＤ結合タンパク質。
ｄｅ−ＶＤＢＰ：シアル酸及びガラクトースの逐次除去によりＴｈｒ（スレオニン）４２０位で脱グリコシル化されたビタミンＤ結合タンパク質。
Ｖｉｔ  Ｄｓ：ビタミンＤ及びその類似体。
ＶＤＲ：ビタミンＤ受容体。
ＵＦＡ：不飽和脂肪酸。
二量体／三量体／四量体複合体：特異的な認識部位間での化学的相互作用により結び付いている２個、３個又は４個の分子の安定な会合。複合体を形成する分子は、［角括弧］内に示される。
混合物：幾つかの分子種が存在するが、互いに結合しない混合物。例えば、「遊離」のｄｅ−ＶＤＢＰ＋［Ｖｉｔ  Ｄｓ／ｄｅ−ＶＤＢＰ］＋［Ｖｉｔ  Ｄｓ／ｄｅ−ＶＤＢＰ／ＵＦＡ］。
【図面の簡単な説明】
【０００３】
また、下記説明において、本発明の説明の一部を成す添付の図１から図１１に関して言及される。図１２及び図１３は、本発明が臨床治療において実施される際の治療効果を示す。
【０００４】
３．発明の分野：
本発明は、特にサプリメントとしての使用のためのビタミンＤベースの複合体に関するが、これらに限定されない。特に、本発明は、がん、神経変性疾患、慢性腎疾患及びＨＩＶ感染などの慢性疾患における補完療法的使用法のための強力で安定なビタミンＤベースのサプリメントのファミリーを提供する。
【０００５】
下記説明は、脱グリコシル化されたビタミンＤ結合タンパク質、（ｄｅ−ＶＤＢＰ）の骨格に基づく分子のファミリーの製剤を開示し、ビタミンＤ３及び他のビタミンＤ受容体アゴニストは、疎水性相互作用によってこのような骨格に結合されている。不飽和脂肪酸もまた、細胞膜との相互作用を支持するようにｄｅ−ＶＤＢＰ骨格に結合されている。これらの安定な複合体は、経口バイオアベイラビリティのためにリポソーム中に封入されてもよい。このファミリーの新規の安定化された複合体は、ビタミンＤの補給が有効であると証明されている状態全てにおいて使用され得る。
【背景技術】
【０００６】
４．発明に対する背景
４．１．ビタミンＤ及びビタミンＤ系（ａｘｉｓ）
近年、多種多様な慢性疾患において、ビタミンＤ系の役割に非常に興味が持たれている。ビタミンＤ系は、ビタミンＤ３であるビタミンＤの活性形態、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）及びビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢＰ）を包含する。ＶＤＢＰは、種々のアイソフォームで存在し、ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａタイプの直鎖状Ｏ連結三糖は、Ｇｃ１ｓ及びＧｃ１ｆと称される３つの最も一般的なアイソフォームのうちの２つにおいて４２０位にあるスレオニン残基（Ｔｈｒ  ４２０）に結合される（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２０１０  Ａｐｒ；１８０４（４）：９０９−１７）。ＶＤＢＰは、シアリダーゼ及びベータ−ガラクトシダーゼによる処置により脱グリコシル化することができ、脱グリコシル化後、ＧａｌＮＡｃ糖部分のみが、Ｔｈｒ４２０に結合されたままであり、それは、一連の相補的酸性アミノ酸を有する標的タンパク質と相互作用し得る。
【０００７】
ビタミンＤ生理学は、ビタミンＤ系の、並びに組み合わせられる水溶性及び脂溶性ビタミン群におけるその対応物の任意の他の構成成分よりも重要性を増し、且つ注目されている。この理由は、部分的には、ビタミンＤ欠乏症が工業国及び先進国の両方で依然として広く蔓延しているためであり、またビタミンＤの有益な効果がカルシウム及びリン恒常性単独の調節を超えて広がることが実証されたためである（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ，２０１０；３９：３５５−６３）。何世紀にもわたって、ミネラル恒常性に影響を及ぼすことで知られているビタミンＤ３は、がん細胞の成長に対する影響及びある特定の免疫障害に対する保護を含む幾つかの他の多様な生理学的機能を有する（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ，２０１０；３９：２４３−５３）。多数の研究により、がん、心血管リスクの中間マーカー、流行性インフルエンザ、アルブミン尿、転倒のリスク及びＨＩＶ感染に対するビタミンＤの保護効果が明らかとなった（Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  Ｌｉｅｇｅ．２０１３  Ｊａｎ；６８（１）：２５−３１）。ビタミンＤの更なる活性は、微生物感染、例えば結核の防御、骨格筋の収縮力及びうっ血性心不全の反作用に関する。横断的研究により、ヒトにおけるビタミンＤ欠乏症は、血圧の上昇及びアテローム発生の進行に関連付けられ、成体におけるビタミンＤ補給は、アテローム発生を防ぐか、又はその進行を停止させて、動脈性高血圧症に抵抗するためのほとんど潜在的な副作用を伴わない単純な手段と見なされ得ることが実証された（Ｉｎｔ  Ｕｒｏｌ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，２０１０；４２：１６５−７１）。
【０００８】
ビタミンＤのこれらの特色が、最も一般的なものを挙げると人口の高齢化、心血管疾患及びがんに関連付けられる疾患に特に関連して、多数の慢性疾患の進行にどのように関連するかが即座に明らかとなる。ビタミンＤ補給がいかに、ほとんど全ての慢性疾患にとってほぼ必須要件であるかもまた明らかとなる。実際に、新たな証拠により、慢性疾患及びそれらに関連付けられる心血管系合併症の多くの進行が、ビタミンＤ欠乏症に関連していることが示唆される。新たな証拠により、ビタミンＤに関する古典的な（ゲノム）機能並びに非古典的な（迅速な非ゲノム）機能の理解が改善されてきたため、セコステロイドホルモンとして作用するビタミンＤが、免疫系、腎臓系、神経系及び心血管系を含む幾つかの系の重要なモジュレーターであることが明白となってきた（Ｅｔｈｎ  Ｄｉｓ，２００９；１９：Ｓ５−８−１  １）。特に、腎臓で生産されるビタミンＤは、古典的な内分泌リン酸カルシウム（ｐｈｏｓｐｈｏｃａｌｃｉｃ）特性並びに細胞増殖及び分化、アポトーシス、レニン分泌、インターロイキン及び殺菌性タンパク質生産に対するオートクリン及びパラクリン作用を有すると知られている（Ｍｅｄ  Ｓｃｉ（Ｐａｒｉｓ），２０１０；２６：４１７−２１）。細胞増殖、分化及びアポトーシスに対する効果は、ビタミンＤの抗がん特性と厳密に関係があることが明らかである。更に、現代社会で増加発生している慢性腎疾患における疫学的研究により、ビタミンＤ欠乏症及びビタミンＤによる処置の欠如は、心血管死亡率の増加に関連付けられることが実証された（Ｕｇｅｓｋｒ  Ｌａｅｇｅｒ，２００９；１７１：３６８４−９）。したがって、ビタミンＤの欠乏症を伴う患者におけるビタミンＤ補給が、骨障害、心血管系の偶発的出来事（ｉｎｃｉｄｅｎｔｓ）の頻度の減少、幾つかの悪性腫瘍のより低いリスク、及び腎機能にかかわらず、免疫系応答の改善に寄与することが一貫して示されていることは驚くべきことではない（Ｐｏｌ  Ｍｅｒｋｕｒ  Ｌｅｋａｒｓｋｉ，２００９；２７：４３７−４１）。ビタミンＤが「万能薬」を表し得るという概念は、「ビタミンＤは世界を動かせるのか？」という冗談交じりの表題の論文審査のある刊行物において、近年重視された（Ｂｒｅａｓｔｆｅｅｄ．Ｍｅｄ．２００８，３（４），２３９−２５０）。
【０００９】
幾つかの可能性あるメカニズムにより、ビタミンＤがなぜ健康維持に非常に重要であるかを説明し得る。多数の研究により、ビタミンＤは、抗炎症及び免疫調節効果を発揮し、したがってそれらの病因論とは関係なく、全ての慢性状態の根底にある基礎的な病理学的変化に対抗することが示されている（Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，２００９；５：６９１−７００）。
【００１０】
「免疫調節」という概念は、ビタミンＤと、がんからＨＩＶ感染までの全ての慢性状態において頻繁に損なわれ、及び／又は混乱される系である免疫系との間の複雑な関係をもたらす。実際に、ビタミンＤは、自然免疫系を刺激して、結核及びＨＩＶなどの感染のクリアランスを容易にしている。この概念と一致して、ビタミンＤ欠乏症は、多数の近年の疫学的報告において、幾つかの自己免疫障害、各種悪性腫瘍及び心血管リスク因子に関連付けられている。これらの観察的な報告に基づいて、ビタミンＤ及びその類似体は、様々な状態の防止及び治療に関して評価されている（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ，２００８；１７：４０８−１５）。しかしながら、免疫系に対するビタミンＤの正味の効果は、免疫賦活薬として簡単に定義することはできない。実際に、場合によって、ビタミンＤは免疫抑制薬として作用し、このことは自己免疫障害において観察された有益な効果を説明し得る（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｍｅｄ．２０１２  Ｄｅｃ；６（６）：６８３−７０４）。
【００１１】
例えば、ビタミンＤはカテリシジン及びデフェンシンなどの「内因性抗生物質」の転写を誘導し、それがＴｈ１及びＴｈ２細胞媒介性疾患の両方の発生を阻止する。ビタミンＤは、喘息の有病率を低減させる。Ｔｈ１依存性自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、１型糖尿病、クローン病、関節リウマチ等）はまた、抗原提示の阻害、Ｔｈ０細胞のＴｈ１細胞への極性化の低減及び後者の細胞からのサイトカイン生産の低減に起因して、ビタミンＤにより阻害される。更に、ビタミンＤの補給は、慢性閉塞性肺疾患の防止又は補助療法に有用であることが証明されている。免疫系に対するビタミンＤの作用の複雑さのため、ビタミンＤについて言及される「免疫調節」という用語は、十分に正当化されているようである（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０１０；１０：４８２−９６）。
【００１２】
上記で引用した考察は全て、現代社会において、人々が十分に日光に当たらず、十分な内因性ビタミンＤ３を生産しない場合に、ビタミンＤ補給が、ほとんどの場合に健康の維持に必要とされるという自明の結論に至る。論理的に結果として生じる疑問：「ビタミンＤはどれくらい補給されなくてはならないのか？」に対する答えは、さほど自明ではない。腎臓研究向けの主な定期刊行物（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ，２００９；７６：９３１−３）で近年論述されているように、その疑問に対する答えは、単にビタミンＤの血清状態（ｓｅｒｏｓｔａｔｕｓ）に依存するわけではなく、古典的なＶＤＲに関する遺伝子コードの個々の多型により順に影響される受容体の機能性も考慮に入れなくてはならない。ビタミンＤ系の他の構成成分もまた、ビタミンＤ補給の妥当性を決定するのに役割を担っており、その疑問に対する答えをより一層複雑にすることが知られている。ビタミンＤの効果を媒介する際のＶＤＢＰ及びＶＤＲの役割に焦点を当てることにより、新規ファミリーのビタミンＤベースのサプリメントが開発され得ることを本発明者は見出した。
【００１３】
ＶＤＢＰに関する更なるデータは、公開された科学文献から入手可能である。上述する様々な引用に加えて、ＶＤＢＰに関する更なる参考資料に関して、下記論文が言及されるべきである：
【００１４】
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌ．１６３，Ｎｏ．１，１９８９，Ｃａｌｖｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，「ビタミンＤ結合タンパク質のビタミンＤ結合特性と脂肪酸結合特性との間の関係（Ｒｅｌａｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  ａｎｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ」，ｐａｇｅｓ  １４−１７。
【００１５】
Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ８，Ｓｅｐ  １９９２，Ｂｏｕｉｌｌｏｎ，Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，「多価不飽和脂肪酸は、ヒトビタミンＤ結合タンパク質に関するビタミンＤ代謝産物の見かけの親和性を減少する（Ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｔｈｅ  ａｐｐａｒｅｎｔ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｆ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」，ｐａｇｅｓ  ８５５−８６１。
【００１６】
Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｎｏ７，Ｎｏ７，Ｊｕｌ  ２００４，Ｇｏｍｍｅ，Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，「ビタミンＤ結合タンパク質の治療可能性（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」，ｐａｇｅｓ  ３４０−３４５。
【００１７】
Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ７，Ｊｕｌ  ２０１３，Ｔｈｙｅｒ，Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，「ビタミンＤ系の主な構成成分に関する新規役割：ビタミンＤ結合タンパク質由来マクロファージ活性化因子は、マクロファージの刺激を通じてヒト乳がん細胞のアポトーシスを誘導する（Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  ａｘｉｓ：ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）」，ｐａｇｅｓ  ２５７７−２５８９。
【００１８】
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．２１２，Ｎｏ４，Ｓｅｐｔ  １９９６，Ｒａｙ，Ｒ，「ビタミンＤ結合タンパク質における分子認識（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ」，ｐａｇｅｓ  ３０５−３１２。
【００１９】
４．２．ＶＤＢＰ及びビタミンＤ機能の調節
ビタミンＤ３は、疎水性分子であり、それ自体は、生物学的親水性液体中に可溶性ではない。したがって、ビタミンＤ３は、疎水性構造である細胞原形質膜の付近で、ビタミンＤ３を血液から標的細胞へ運搬する特異的な結合タンパク質に生理学的に結合されている。ビタミンＤ３に特異的に結合して、それを標的細胞の原形質膜へ運搬するタンパク質は、ＶＤＢＰである。ひとたび原形質膜にあると、ビタミンＤ３は、ＶＤＲと相互作用して、ＶＤＲを活性化する。活性化されたＶＤＲは、多数の細胞内シグナル伝達タンパク質と相互作用して、最終的には、先のパラグラフに記載するビタミンＤの全ての効果をもたらす（Ｓｔｅｒｏｉｄｓ．２００１  Ｍａｒ−Ｍａｙ；６６（３−５）：２１３−２１）。ビタミンＤ３の生物学的効果は全て、ＶＤＢＰ及びＶＤＲとのその相互作用により媒介されると記述することができる。
【００２０】
ＶＤＢＰは、分子量５１〜５８ｋＤａを有する単一ポリペプチド鎖で構成される血清アルファ２糖タンパク質であり、構造上血清アルブミンと関連する。ＶＤＢＰはまた、Ｇｃ−グロブリン（群特異的構成成分グロブリン）としても知られ、肝臓で合成されて、２０〜５５ｍｇ／１００ｍｌのレベルで血漿中に存在する。ＶＤＢＰは、幾つかの細胞型、即ち卵黄嚢内胚葉細胞及び幾つかのＴリンパ球の表面上で検出されている。Ｂ細胞では、ＶＤＢＰは、表面免疫グロブリンの連結に関与する。このタンパク質は長さが４５８残基であり（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９８６；２６１：３４４１−５０）、３つのドメインを形成し、そのうちの最初のドメインがビタミンＤ結合部位を含有する。３つのドメインは、互いに、及びヒト血清アルブミンにおける類似した反復と限られた配列相同性を共有する。
【００２１】
しかしながら、これらの周知の相同性の他に、本発明者らは、ビタミンＤ系の他の構成成分、即ちＶＤＲと配列相同性が存在することを観察した。図１は、ＶＤＢＰの３つのアイソフォームのアミノ酸配列、及びＶＤＲアミノ酸配列とのアラインメントを示す。アミノ酸１とアミノ酸１９７との間のトラクト（エクソン１、２、３、４、５）は、ＶＤＢＰとＶＤＲとの間で２０％同一性を示し、アミノ酸２１７とアミノ酸３３０との間のトラクト（エクソン６、７、８）は、４０％同一性を示す。これらの特徴は、ＶＤＢＰ及びＶＤＲが互いに相互作用する場合があり、したがって下記パラグラフで詳細に説明するように、ビタミンＤ３の効果を媒介するという仮説へと導いた。
【００２２】
ＶＤＢＰの疎水性プロファイルのより詳細な解析を図２に示し、ここでは、Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅの方法を使用して、アミノ酸配列の相対的疎水性を算出する。ＶＤＢＰ配列の最初の部分（アミノ末端）は、ビタミンＤ３及び／又はその類似体が疎水性相互作用を通じて結合する領域に相当する高価の疎水性を示すことが観察され得る。
【００２３】
これまでに行われてきたことと、本発明による新規ファミリーの分子の設計との間の重要な差は、古典的にアミノ末端から開始して行われるように、また図１に示すようにＶＤＢＰ及びＶＤＲのアミノ酸配列を整列させる代わりに、アラインメントを逆向きにして、ビタミンＤが結合するＶＤＢＰのアミノ末端のアミノ酸配列を、ビタミンＤがＶＤＲに結合する疎水性領域であるＶＤＲのカルボキシル末端と比較することである。換言すると、ビタミンＤが両方の分子に結合する領域であるＶＤＢＰ及びＶＤＲの２つの疎水性配列が整列される。これを実施するために、ＶＤＢＰの最初の部分をＶＤＲの最後の部分と整列させるアラインメントのセンスは、２つの配列が逆並行であるように逆向きにされなくてはならない。この新規タイプの論拠は、２つの鎖のセンスが逆並行であるＤＮＡにおけるヌクレオチド配列のアラインメントによって着想された。
【００２４】
図３は、ＶＤＢＰの最初の２３個のアミノ酸と、ＶＤＲの最後の２３個のアミノ酸とのアラインメントを示す。これらは、ビタミンＤ及び／又は類似体が結合する領域である。
【００２５】
ＶＤＢＰのアミノ末端付近に２３個の疎水性アミノ酸（−−−−−ＭＫＲＶＬＶＬＬＬＡＶＡＦＧＨＡＬＥＲＧＲＤＹ）、及びＶＤＲのカルボキシル末端付近に２３個のアミノ酸（ＳＦＱＰＥＣＳＭＫＬＴＰＬＶＬＥＶＦＧＮＥＩＳ−−−−−）が存在することが観察され得る。これらの２つの配列が図３で示されるように整列される場合、両方のタンパク質において、長い一続き（１３〜１４個）の疎水性アミノ酸（緑色で強調される）が存在することだけでなく、４個の疎水性アミノ酸が同一であり（Ｌ  Ｌ  ＦＧ；アラインメントの上下で、黄色及び緑色で示される。ＶＤＢＰの配列は上である）、１１個のアミノ酸が類似した機能的原子価を有する（定式記号［＊］、［．］及び［：］により示されるように）ことも観察することが可能である。したがって、ＶＤＢＰ及びＶＤＲのビタミンＤ結合ドメインでは、機能的同一性又は類似性を示す２３個のアミノ酸のうちの総計１１個、及び疎水性である１３〜１４個が存在する。
【００２６】
したがって、本発明による新規ファミリーの化合物は、ＶＤＢＰ及びＶＤＲが、それらの保存されたビタミンＤ結合疎水性ドメインを通じて相互作用するという発見及びビタミンＤが２つのタンパク質間に挟まれ得るという発見に基づく。
【００２７】
このタイプの疎水性相互作用の他に、ＶＤＢＰが、ＶＤＲとの分子相互作用の別の部位であるＴｈｒ４２０で選択的に脱グリコシル化されると、この際には親水性タイプのものが露出され得ることを本発明者らは見出した。
【００２８】
実際に、先のパラグラフで記述するように、Ｇｃ１ｓ及びＧｃ１ｆと称される自然に存在するＶＤＢＰアイソフォームは、Ｔｈｒ４２０に結合されるタイプＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａの直鎖状Ｏ連結三糖を保有する（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２０１０  Ａｐｒ；１８０４（４）：９０９−１７）。シアリダーゼ及びベータ−ガラクトシダーゼなどの酵素の使用は、親水性、塩基性、化学物理特性を有するアルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分の露出をもたらす。したがって、Ｔｈｒ４２０位にあるＧａｌＮＡｃは、ＶＤＲの２０７〜２１５位に位置する一続きの酸性アミノ酸と相互作用し得る。この位置では、ＧａｌＮＡｃを結合する酸性ポーチを同定する近接近している６個のアミノ酸が存在する（図４）。
【００２９】
したがって、これまで、ＶＤＢＰとＶＤＲとの間の相互作用の２つの部位が同定されている：１．ビタミンＤ３が両方の分子に結合する疎水性の一続きの２３個のアミノ酸；２．ｄｅ−ＶＤＢＰのＧａｌＮＡｃ部分が結合するＶＤＲにおける親水性の一続きの酸性アミノ酸。
【００３０】
上述の２つの結合部位の他に、本発明者らは、今回、ビタミンＤ３結合に関与しないＶＤＢＰの領域中に、ＶＤＢＰとＶＤＲとの間の相互作用の別の部位を発見した。
【００３１】
実際に、ドメインＩＩとドメインＩＩＩの間、即ち３０４位と３８７位との間に位置する領域において、ＶＤＢＰは、脂肪酸を結合する浅い間隙（ｓｈａｌｌｏｗ  ｃｌｅｆｔ）を示し（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９８８  Ｊｕｎ  ３０；１５３（３）：１０１９−２４）、この浅い間隙に位置する脂肪酸は、細胞原形質膜と相互作用することができ、したがって、膜の外側上のＶＤＢＰと、細胞内部に位置するＶＤＲとの間の相互作用を支持する。上記で引用したＶＤＲの２３個の疎水性アミノ酸（即ち、ビタミンＤ３を結合するもの）を、ＶＤＢＰの不飽和脂肪酸結合部位の相当する疎水性アミノ酸（特に、３５６〜３８６位におけるもの）と整列させる場合に、かなりの度合いの機能的相同性が観察され得る：実際に、長い一続きの疎水性アミノ酸において類似した機能的原子価を有する８個のアミノ酸が存在する。
【００３２】
ＶＤＢＰが多重結合／認識部位を有するという観察は驚くべきことではない。したがって、ＶＤＢＰが、ビタミンＤの他に、免疫グロブリン及びアクチンを結合して、更にはアクチンスカベンジャーとして作用する多機能タンパク質であることは周知である。アクチン単量体に対する親和性は高く、アクチン結合部位は、残基３５０〜４３０間のドメインＩＩＩ内に存在すると報告されている（図１を参照）。ＶＤＢＰ及びアクチンの複合体の構造（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００２；９９：８００３−８）により、ドメインＩＩＩが、アクチンのサブドメイン１と３との間にアクチン結合接触を形成することが確認される。ＶＤＢＰのこれらの特徴は、ビタミンＤ代謝に直接的に関連されないにもかかわらず、アクチンが真核細胞において最も豊富なタンパク質であり、ＶＤＢＰのアクチン除去能力を上回る場合に循環中のアクチン含有血栓の致命的な形成を引き起こし得る細胞壊死中に放出される主な細胞タンパク質であるため、がん及び心血管疾患などの細胞壊死を含む慢性状態において極めて重要である（Ｄａｎ  Ｍｅｄ  Ｂｕｌｌ，２００８；５５：１３１−４６）。したがって、近年の研究により、血清レベルのＶＤＢＰの決定が、急性肝不全、アセトアミノフェン過剰用量、多発外傷又は多臓器不全症候群又は敗血症を伴う患者における予後指標として有用であることが実証された。他の研究により、ＶＤＢＰレベルと、慢性閉塞性肺疾患、甲状腺疾患、糖尿病、多発性硬化症及びサルコイドーシスに対する耐性又は感受性との間の関連性が示唆される（Ｐｏｓｔｅｐｙ  Ｈｉｇ  Ｍｅｄ  Ｄｏｓｗ，２００８；６２：６２５−３１）。
【００３３】
更に、ＶＤＢＰが、２３個の疎水性アミノ酸結合ドメインでビタミンＤ３を一意的に結合しないことに留意すべきである。ビタミンＤ類似体と称され、且つＶＤＲを結合して、活性化することが可能な他の化合物は、ＶＤＢＰに対して親和性を示すが、ビタミンＤ３の親和性よりも一般的に低い。例えば、２つの非高カルシウム血性ビタミンＤ類似体であるカルシポトリエン及び２２−オキサカルシトリオールは、カルシウム血性作用の低減を担っている低ＶＤＢＰ親和性を示す（Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ，１９９８；３２：Ｓ２５−３９）。
【００３４】
４．３．ＶＤＢＰ及びＶＤＲシグナル伝達
最近まで、ビタミンＤ３のシグナル伝達メカニズムは下記の通りに記載されていた：非常に疎水性の分子であるビタミンＤ３は、ＶＤＢＰにより血液及び生物学的液体中で運搬される。ひとたび細胞原形質膜（高度に疎水性の構造）のレベルにあると、ビタミンＤ３は放出されて、それは原形質膜を自由に通過して、ひとたび細胞内部にあると、ＶＤＲであるそのタンパク質様受容体と相互作用する。二量体複合体ビタミンＤ３／ＶＤＲは、核へ移行して、そこで二量体複合体ビタミンＤ３／ＶＤＲは、多数のシグナル伝達タンパク質と相互作用して、最終的にビタミンＤ３の生物学的効果を担う多数の種々の遺伝子の発現を制御する。ＶＤＲは、膨大な数の正常組織及び病理組織で発現されるため、このことは、生理学及び病理学におけるビタミンＤ３の多数の効果及び多面的な効果を説明する（概説に関しては、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１（１６）：６０６２−７を参照）。この筋書きでは、ＶＤＢＰの役割は、血液中、及び生物学的液体中でビタミンＤ３を単に運搬することであり、シグナル伝達メカニズムに関与することではなかった。
【００３５】
しかしながら、より最近の研究により、この筋書きが不完全であることが実証された。実際に、ビタミンＤ３は、原形質膜を自由に通過しないが、複合体ＶＤＢＰ／ビタミンＤ３が細胞に内部移行され、ひとたび細胞内部にあると、それはＶＤＲに結合することが実証された。内部移行は、メガリン、キュビリン及びアダプタータンパク質ｄｉｓａｂｌｅｄ−２と呼ばれる原形質膜関連タンパク質により実施される（Ｊ  Ｎｕｔｒ．２００８  Ｊｕｌ；１３８（７）：１３２３−８）。この筋書きによれば、ＶＤＢＰは、ビタミンＤ３とＶＤＲとの間の相互作用に必須である。
【００３６】
しかしながら、先述のセクションに記載するように、ＶＤＢＰは、２つの形態、即ち完全にグリコシル化された形態及び脱グリコシル化された形態で存在し得る。先述のセクションで提唱されるモデルによれば、ＶＤＢＰの脱グリコシル化された形態は、Ｔｈｒ４２０にあるＧａｌＮＡｃと、上述のＶＤＲの一連の酸性アミノ酸との親水性相互作用の結果、ＶＤＲとより安定な相互作用を樹立することができる。
【００３７】
長年にわたって、ＶＤＲは細胞質及び核中に局在化されるのに対して、ＶＤＢＰは原形質膜を通過することができず、したがって表面受容体、場合によってはレクチン型受容体により認識されなくてはならないと考えられてきたため、この筋書きは、当初は異様に見えたかもしれない（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９９；２７４：１０６９７−７０５）。しかしながら、ＶＤＲに関する遺伝子コードの多型と、ヒト単球におけるｄｅ−ＶＤＢＰに対する差次的な応答との（Ｊ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．２０１２  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；２５（４）：５７７−８１）、並びに転移性乳がんとの（Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｓ．１９９８；１０（１）：４３−６）間の関連性の観察は、ｄｅ−ＶＤＢＰとＶＤＲとの間の直接的な分子相互作用の明らかに異様な事柄を支持する。この仮説を支持して、ＶＤＲが原形質膜に移行し（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００２；８６（１）：１２８−３５）、原形質膜関連ＶＤＲが、ビタミンＤの迅速な非ゲノム効果を担う（Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ（２０１３）９２：１５１−１６２）ことが観察される。
【００３８】
この新規シグナル伝達の筋書きによれば、ビタミンＤ３のシグナル伝達メカニズムは下記である：ＶＤＢＰは、上述するようにビタミンＤ３及び脂肪酸を運搬し、したがって、三量体複合体を形成する。この複合体は、ビタミンＤ３及び脂肪酸が結合されているＶＤＢＰの疎水性部分を通じて、原形質膜と相互作用する。複合体は、細胞タンパク質により内部移行される。ひとたび細胞内部にあると、複合体は、膜関連ＶＤＲと相互作用する。ＶＤＢＰが完全にグリコシル化されている場合、相互作用は、疎水性相互作用を通じてのみ媒介されるが、ＶＤＢＰが脱グリコシル化され、ＧａｌＮＡｃが露出されている場合、ＶＤＲとの相互作用は、それが親水性の塩基−酸相互作用を含むため、より安定である。この後者の場合、四量体複合体、即ち［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ／脂肪酸／ＶＤＲ］は核に移行し、そこで、それは、他のシグナル伝達タンパク質及びＤＮＡと相互作用して、したがって活性化されたＶＤＲにより修飾されることが知られている多数の遺伝子を調節する。
【００３９】
要約すると、複合体［ビタミンＤ３／ＶＤＢＰ／脂肪酸］はＶＤＲを活性化し、これまでのところビタミンＤ３に起因する効果を担う。ＶＤＢＰの脱グリコシル化された形態は、それがより安定な相互作用を樹立することができるので、ＶＤＲを活性化するのにより効率的である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００４０】
したがって、本発明の目的は、骨格として、ｄｅ−ＶＤＢＰを使用して、より効率的な方法でＶＤＲを活性化することが可能な新規分子／複合体の全体的なファミリーを提供することである。
【００４１】
上述した事項に基づいて、このファミリーの分子／複合体は、望ましくは、上記のセクション４．１に記載する様々な条件で使用されているビタミンＤから作られる現行のサプリメントと比較して、下記利点を有するべきである。
【００４２】
１．それらは、自然界に存在する実際の分子配列を模倣しているため、効力がはるかに大きいこと。
【００４３】
２．それらは、骨格としてｄｅ−ＶＤＢＰを使用するため、安定性がはるかに大きく、したがって効率がより大きいこと。
【００４４】
３．このアプローチは、ｄｅ−ＶＤＢＰ骨格上のビタミンＤ３及び脂肪酸を、特定健康状態に有益であることが知られている特性が付与された他のＶＤＲアゴニスト及び／又は脂肪酸で置換することにより、多種多様な新たな分子を設計することを可能にすべきことである。続いて、新たな分子／複合体の各タイプは、特定の疾患又は状態を標的とすることができる。
【００４５】
４．各々の対象のＶＤＲの遺伝子多型を考慮するテーラーメイドの分子／複合体を設計することができる。
【００４６】
５．これらの新規分子／複合体は、リポソームに封入することができ、これは、正規のビタミンＤ３では行うことはできない。リポソームは、経口的に消費されて、静脈内注射を使用して得ることが可能である効率に引けを取らない効率で、それらの内容物を血漿中に送達することができる。
【００４７】
５．本発明の一般的な説明
本発明は、ビタミンＤ（又はその類似体）及び脂肪酸が、疎水性相互作用によって結合されているｄｅ−ＶＤＢＰの骨格に基づく分子又は多分子複合体を提供する。この新規ファミリーの分子／複合体は、これらの新たな分子及び分子の新たな複合体が、より安定且つより活性であり、特定疾患を標的とするように特異的に設計することができ、及び／又は個々の遺伝的可変性（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｂｌｅｓ）を満たすことができ、効率的な送達のためにリポソーム中に封入することができるという利点を有するビタミンＤ３補給の全ての公知の有益な効果を提供する。
【００４８】
実際に、今まで、ビタミンＤ３は、経口又は非経口投与用のサプリメントとして供給され、現在商業目的での製剤では、ビタミンＤ３は、いかなる他の分子とも複合体形成されず、特に、製剤では、それは、ｄｅ−ＶＤＢＰとはもちろん、ＶＤＢＰであるその自然に存在する結合タンパク質と複合体形成されない。したがって、ビタミンＤ３が経口摂取される（又は投与される）と、ビタミンＤ３は、血漿ＶＤＢＰに結合し、それは細胞へ運搬されて、そこでビタミンＤ３は、上記セクション４．１に記載するようにその作用を発揮する。しかしながら、ビタミンＤ３は、ｄｅ−ＶＤＢＰと複合体形成されないため、その受容体であるＶＤＲとの相互作用は、本発明で提唱されるようにそれがｄｅ−ＶＤＢＰと複合体形成された場合で見られ得るほど安定でも効率的でもない。
【００４９】
概して、本発明によれば、下記工程を含む修飾ビタミンＤ含有複合体の生産に関するプロセスが提供される：
【００５０】
１．ＶＤＢＰは、例えば（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２０１０  Ａｐｒ；１８０４（４）：９０９−１７）に記載される方法に従って、順次脱グリコシル化される。
【００５１】
２．ビタミンＤ３又はその類似体は、疎水性相互作用を通じて、ｄｅ−ＶＤＢＰに結合される。
【００５２】
３．不飽和脂肪酸（ＵＦＡ）は、複合体［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ］に結合されている。
【００５３】
これらの三量体複合体［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ／ＵＦＡ］は、経口投与又は例えば軟膏における局所投与を可能にするようにリポソーム中に封入されてもよい。或いは、複合体は、それ自体が舌下投与用の適切な担体中で使用されてもよい。更なる代替法では、それらは、腫瘍内又は腫瘍周囲の注射に適した混合物中で使用されてもよい。
【００５４】
このプロセスを実施することにより、ビタミンＤ（又はその類似体）及び脂肪酸がｄｅ−ＶＤＢＰに結合されている新たな分子及び多分子複合体のファミリーが生産され得る。ビタミンＤ３が、様々なビタミンＤ類似体で置換することでき、幾つかのＵＦＡは、ｄｅ−ＶＤＢＰ分子において特異的な結合部位と相互作用するようにされ得るため、このアプローチを用いて生産することができる新たな分子の数は非常に多い。
【００５５】
本発明における新規性の要素は、ビタミンＤ３が生理学的なシグナル伝達で見られるため、ビタミンＤ３の自然分子配列を模倣する多分子複合体の当初の設計に存する。この設計は、ＶＤＢＰ及びＶＤＲの分子構造に関する本発明者らの観察に基づく。既存の製剤を上回るこれらの分子の利点は、先のセクションに列挙される。これらの分子の有用性は、それらが、既存のビタミンＤサプリメントよりも活性であり、より安定であり、且つより特異的であり、全てのそれらの数多くの用途において既存のビタミンＤサプリメントを置換することができるという事実に存する。
【００５６】
６．好ましい実施形態の具体的な記述
６．１．本発明による新たな分子又は分子の混合物の調製に関する一般的方法を以下のセクション６．１．１〜６．１．５に提示する：
【００５７】
６．１．１．ＶＤＢＰの脱グリコシル化。
ＶＤＢＰの脱グリコシル化は、Ｂｒａｄｓｔｒｅｅｔら（Ａｕｔｉｓｍ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ２０１２：４  ３１−３８）において修飾された場合のＲａｖｎｓｂｏｒｇら（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２０１０  Ａｐｒ；１８０４（４）：９０９−１７）の方法に従って達成された。簡潔に述べると、ＶＤＢＰは、２５−ヒドロキシビタミンＤ３−セファロース高アフィニティクロマトグラフィー又はアクチン−アガロースアフィニティクロマトグラフィーを使用して、米国赤十字社（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓ）から得られる精製ヒト血清から単離された。結合している材料を溶出させて、続いて３つの固定化酵素とのインキュベーションにより更に加工処理した。タンパク質含有量及び濃度は、標準的なＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ法を使用してアッセイした（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７６；７：２４８−２５４）。
【００５８】
６．１．２．ｄｅ−ＶＤＢＰへのビタミンＤ３の結合及び多分子複合体の新たなファミリーの第１のメンバーの調製。
ビタミンＤ３［１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（６，１９，１９−ｄ３）］は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得られた。その分子量は、原子％計算により４１９．６１Ｄａである。ｄｅ−ＶＤＢＰとのインキュベーションは、試験管中で、２５℃で３０分間穏やかに振とうして実施した。ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰの比は、ｄｅ−ＶＤＢＰの分子量を５８ｋＤａとみなして算出した。下記比を使用した：１／１０；２／１０；５／０；１／１（ここで、１番目の数は、ビタミンＤ３分子の算出数を指し、２番目の数は、ｄｅ−ＶＤＢＰ分子の算出数を指す。したがって、１／１の比は、ｄｅ−ＶＤＢＰの各１分子当たりビタミンＤ３１分子が存在したことを示す）。ビタミンＤ３とｄｅ−ＶＤＢＰとの間の疎水性相互作用を支持するために、Ｃｅｃｃｈｉらに概括される原理に従って、種々のイオン強度を有するインキュベーション緩衝液を使用した（Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ．２００７  Ｆｅｂ；３７６（１−２）：１４２−９）。本質的には、ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰの比が増加した場合に、イオン強度が増加された。このようにして、より多数の分子間での疎水性相互作用が支持及び安定化された。インキュベーション緩衝液中のＮａＣｌの濃度は、０．２〜２．０Ｍの範囲であった。他の実験では、Ｉｔａｌ  Ｊ  Ａｎａｔ  Ｅｍｂｒｙｏｌ．２００１  Ｊａｎ−Ｍａｒ；１０６（１）：３５−４６に記載される方法に従って、ＮａＣｌの代わりに塩酸グアニジンを使用した。インキュベーション後、過剰の塩を除去するために、６０ｋＤａで設定されたカットオフを有する透析膜に対して、試料を徹底的に（２４時間）透析した。２４時間の透析後、ＮａＣｌ濃度を、いわゆる生理食塩水溶液の濃度に対して調節した。最終濃度は、ｄｅ−ＶＤＢＰを考慮して調節した。例を挙げると、１００ｎｇ／ｍｌの濃度を有するバイアル中では、これは、ｄｅ−ＶＤＢＰに結合されている他の分子（ビタミンＤ３又はＵＦＡ）が存在したかどうかとは無関係に、ｄｅ−ＶＤＢＰの濃度を指す。以下を参照されたい。
【００５９】
手順の終わりに、一連の新たな分子及び新たな分子の混合物が、使用したビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰの比に依存して得られた。簡略化するために、比が１／１０で設定された場合、混合物中にはｄｅ−ＶＤＢＰ  １０分子及びビタミンＤ３  １分子のみが存在していた。したがって、ｄｅ−ＶＤＢＰ  １分子のみが、ビタミンＤ３  １分子と複合体形成された（即ち、結合された）。ｄｅ−ＶＤＢＰの残りの９分子は、インキュベーション媒質中のイオン強度のため、それら各々の疎水性ドメインを通じて互いに相互作用した。しかしながら、ｄｅ−ＶＤＢＰの数が奇数であった（即ち、それが９であった）ため、ｄｅ−ＶＤＢＰ  １分子が「遊離」のままであった。したがって、極めて単純に言うと、１／１０の比では、３つのタイプの分子：ビタミンＤ３と複合体形成されたｄｅ−ＶＤＢＰ（即ち、二量体複合体［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ］）１分子；その受容体又は他の分子と自由に相互作用できるｄｅ−ＶＤＢＰ  １分子；各対で、１個のｄｅ−ＶＤＢＰ分子が別のｄｅ−ＶＤＢＰ分子と複合体形成される４対のｄｅ−ＶＤＢＰが存在したと記述することができる。次に、これら３つのタイプの分子それぞれ１つが、細胞レベルで、及びその結果として生物全体で、別個の作用を実施することができた。二量体複合体［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ］は、細胞原形質膜に結合して、ＶＤＲを相互作用して、ＶＤＲを活性化して、「背景」セクション（４．３）に記載するシグナル伝達カスケードを誘発させる。「遊離」のｄｅ−ＶＤＢＰは、原形質膜の細胞外部分上のそのコンドロイチン硫酸プロテオグリカン受容体に結合して、そのシグナル伝達カスケードを誘発する（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９  Ａｕｇ  １５；１６３（４）：２１３５−４２）。ｄｅ−ＶＤＢＰの４つの対のそれぞれ１つが、（Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７  Ｍａｒ；４４（９）：２３７０−７）に記載されるように、細胞輸送タンパク質を通じて標的細胞へ内部移行される。
【００６０】
この方法を用いて生産される分子の活性は、水性アルコール系生理食塩水溶媒中にそれらを溶解させることにより更に調節することができる。この特定のタイプの賦形剤は、静脈内製剤において日常的に使用される。改善された結果は、等量の生理食塩水及び水性混合アルコール溶媒（２０％ｖ／ｖエタノール、３０％ｖ／ｖプロピレングリコール）、平衡水の混合物を使用すると確実であり得ることを本発明者らは見出した。この賦形剤は部分的に疎水性であるため、上述の対におけるｄｅ−ＶＤＢＰ間の相互作用を崩壊させることができる。したがって、その存在下では、１個の二量体複合体［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ］及び９個の「遊離」のｄｅ−ＶＤＢＰ分子が存在する。非常に明確に、この後者の組合せは、細胞及び生物レベルで、異なる作用を実施する。例えば、この組合せは、広範な壊死及び壊死細胞からのアクチンの放出が見られる進行がんで使用することができる。この場合、ｄｅ−ＶＤＢＰの９個の「遊離」の分子は、アクチンスカベンジャーとして作用して、毒性アクチンを除去することができるのに対して、二量体複合体［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ］は、上記「背景」セクションで言及するように、細胞応答を刺激し得る。
【００６１】
また、このような溶媒を使用して、６．１．１に記載するように調製されるｄｅ−ＶＤＢＰを可溶化することができる。実際に、ｄｅ−ＶＤＢＰ分子のみが存在する生理食塩水溶液中では、イオン強度がそれらの大部分を、それら各々の疎水性ドメインを通じて互いと相互作用させて、それらのうちのほんの少数が、その受容体又は他の分子と相互作用するのに「遊離」のままである。これらの相互作用のため、生理食塩水中のｄｅ−ＶＤＢＰの生物活性は非常に低いと記述され得る。それは水性アルコール系生理食塩水溶媒中でそれを可溶化することにより桁違いに増加することができる。
【００６２】
６．１．３．不飽和脂肪酸の、二量体複合体［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ］への結合。
不飽和脂肪酸は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得られた。不飽和脂肪酸は、下記であった：
【００６３】
ｉ．式ＣＨ３（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＯＯＨを有する１８：１シス−９の脂質数で略記される一不飽和オメガ−９脂肪酸であるオレイン酸。
【００６４】
ｉｉ．オメガ−３脂肪酸であるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、又は同様にイコサペンタエン酸）。化学的文献では、それには名称２０：５（ｎ−３）が付与される。ＥＰＡは、２０炭素鎖及び５個のシス二重結合を有するカルボン酸であり、第１の二重結合は、オメガ末端から３番目の炭素に位置する。
【００６５】
両方のＵＦＡは、４つの特徴のため選択された：高い疎水性；ｄｅ−ＶＤＢＰにおける疎水性アミノ酸の浅い間隙に結合する能力；シス立体配置における二重結合の存在に起因したそれらの分子構造に固有の可撓性；それらの文書で十分裏付けされた健康促進特性。
【００６６】
他のポリＵＦＡもまた、以下に記載するように考慮された。
【００６７】
ＵＦＡは、先述のパラグラフに記載する手順に倣って二量体［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ］複合体とともにインキュベートされた。［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ／ＵＦＡ］の比は、各［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ］複合体におけるｄｅ−ＶＤＢＰ分子の数を考慮して算出した。例えば、１／１０の比のビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰから生じる組成物中には、［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ］１分子及びｄｅ−ＶＤＢＰ（対で結合されているか、又は遊離している）９分子が存在した。ＵＦＡ（例えば、オレイン酸）が比１／１で添加されると、これは、オレイン酸と同程度多いｄｅ−ＶＤＢＰの分子が存在し、したがって、最終混合物中には、三量体複合体［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ／オレイン酸］１分子；二量体複合体［ｄｅ−ＶＤＢＰ／オレイン酸］９分子が存在したことを意味する。代わって、オレイン酸が比１／１０で添加された場合、これは、最終混合物中に、たった１個の三量体複合体［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ／オレイン酸］、及び対で結合されているか、又は遊離している９個のｄｅ−ＶＤＢＰ分子が存在したことを意味する。三量体複合体［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ／オレイン酸］のモデルレンダリングを図５に表す。ビタミンＤ３及びオレイン酸はともに、タンパク質の浅い間隙に位置するそれらの各々の疎水性結合部位に結合されるのが明確に視認でき（矢印）、ＶＤＢＰの行われた脱グリコシル化が、楕円中に示されるようなＴｈｒ４２０にあるＧａｌＮＡｃの存在により明らかとなる。
【００６８】
この手順を使用して、多数の可能性ある組合せが、４個の変数：ｉ：ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰの比、ｉｉ．［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ］／ＵＦＡの比、ｉｉｉ．ＵＦＡのタイプ；ｉｖ．水性アルコール系生理食塩水溶媒の存在を考慮して、迅速且つ単純な方法で得られ得る。
【００６９】
このようにして得られる組合せは、ビタミンＤ３の使用が有益であるとすでに実証されている特定条件を標的とし得る。例えば、分子の大部分が三量体タイプ［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ／オレイン酸］に属する組合せは、原形質膜の脂質組成が一般的である条件におけるＶＤＲシグナル伝達の最大の刺激に使用され得る。実際に、図６に示される分子レンダリングで実証されるように、どちらかというと「直鎖状」分子であるオレイン酸の存在は、ｉ．ビタミンＤ３結合ドメイン、ｉｉ．ＧａｌＮＡｃ／酸性アミノ酸認識ドメインであるｄｅ−ＶＤＢＰ／ＶＤＲ相互作用を媒介する２つの認識ドメイン間の幾らか線状の相互作用を付与する。しかしながら、図７に報告されるように、三量体複合体が［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ／ＥＰＡ］である場合、ＥＰＡはより多くの「曲線」立体配置を有するポリ不飽和脂肪酸であるため、ＥＰＡと原形質膜との相互作用が、複合体［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ／ＥＰＡ］とＶＤＲとの間の異なる空間的相互作用を決定する。図の左上角の四角内に、ｄｅ−ＶＤＢＰ及びＶＤＲの相補的な疎水性アミノ酸配列が報告される。上のラインは、ＥＰＡが結合されているｄｅ−ＶＤＢＰ配列を指し、下のラインは、ＶＤＲの疎水性の２３個のアミノ酸配列を指す。ＥＰＡが結合されているかなりの度合いの機能的相同体が存在し、実際に、長い一続きの疎水性アミノ酸（図７中では青色で強調されている）において類似した機能的原子価を有する８個のアミノ酸が存在することを言及することが可能である。図７に記載される四量体複合体［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ／ＥＰＡ／ＶＤＲ］の全体的な立体配置は、図６で表される比較的線状の四量体複合体［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ／オレイン酸／ＶＤＲ］よりも球形である。したがって、下記セクションで記載するように、四量体複合体［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ／ＥＰＡ］は、慢性炎症からがん及び神経疾患までのＥＰＡが有益であると実証されている疾患全てにおいてより効率的であり得る。実際に、ＵＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ’ｓ  ＭｅｄｌｉｎｅＰｌｕｓは、ＥＰＡ（単独で、又は他のω−３供給源と連携して）が、有効な治療であると知られているか、又は考えられている病状を列挙しており、これらの大部分が炎症を低減させるその能力を含む。上述するものなどの三量体複合体は、単一の安定なシグナル伝達効率的な分子において、ビタミンＤ３及びＥＰＡの十分に実証された有益な特性を組み合わせる。
【００７０】
６．１．４．類似体によるビタミンＤ３の置換。
上述の二量体又は三量体複合体では、ビタミンＤ３は、ＶＤＲを刺激して、上述のシグナル伝達カスケードを誘発することが可能であるが、ｄｅ−ＶＤＢＰ又はＶＤＲに対して異なる親和性を有する種々の類似体で置換することができる。ビタミンＤ類似体は、ビタミンＤ３の基本的な化学構造から開始して合成されるが、ＶＤＢＰ及び／又はＶＤＲに対して異なる親和性を有する分子である（Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１２  Ｏｃｔ  ２５；５５（２０）：８６４２−５６）。それらの大部分は、自然のビタミンＤ３の活性と類似した抗増殖活性、分化促進（ｐｒｏ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ）活性及び転写活性を有するが、あまり顕著ではない高カルシウム血性効果を有する化合物を得るために合成される。現在、それらの主な適用分野は、慢性腎疾患（Ｃｕｒｒ  Ｖａｓｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１３  Ｍａｙ  １６）、がん（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１３  Ｊａｎ１；１３（１）：１１８−２５）、糖尿病性腎症（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ．２０１３  Ａｐｒ  ２４；２０１３：９２８１９７）、乾癬（Ｊ  Ｄｒｕｇｓ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１３  Ｍａｙ  １；１２（５）：５４６−５０）及び線維症の防止（Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１２  Ｄｅｃ；９２（１２）：１６６６−９）に存する。試験されてきた類似体の幾つかは、ドキセルカルシフェロール、アルファカルシドール、パリカルシトール（１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２）、マキサカルシトール（１，２５−ジヒドロキシ−２２−オキサ−ビタミンＤ３）、カルシポトリオール（カルシポトリエン）及び２２−オキサカルシトリオール（ＯＣＴ）である。これらの化合物の大部分が、ＶＤＢＰに対してより低い親和性を有する（Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ，１９９８；３２：Ｓ２５−３９）。二量体及び三量体複合体を調製する手順は、６．１．２及び６．１．３に記載する手順と同一であった。また、これらの複合体の場合、水性アルコール系溶媒を含むことができる。ビタミンＤ３がその類似体の１つで置換され、それらそれぞれが特有の特性を有するこれらの二量体及び三量体複合体は、それらが単独で投与される場合の類似体に関して示される全ての条件に関して示され得る。同様にこの場合では、本発明の新規性は、類似体の安定化、ＵＦＡとの相互作用、最終的には活性化されたＶＤＲを介したより効率的なシグナル伝達を支持するための骨格としてのｄｅ−ＶＤＢＰの使用にある。
【００７１】
６．１．５．上述の複合体を含有するリポソームの調製。
リポソームは、脂質二重層で構成される人工的に調製される小胞である。リポソームは、栄養分及び調合薬の投与用の小胞として使用され得る。リポソームは、経口投与されて、ひとたび吸収されると、それらは、静脈内注射の効率よりもほんのわずかに低い効率で、血中にそれらの内容物を送達する。これらの特徴のため、リポソーム内の疎水性及び親水性の栄養分及び調合薬の封入は、胃系の破壊要素を迂回して、細胞及び／組織への封入された栄養分／薬の送達を助長する非常に有効な方法である。２００８年の時点で、リポソーム送達系を用いた１１個の薬物が認可されており、６個の更なるリポソーム薬が臨床試験中であった（Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００８  Ｍａｙ；８３（５）：７６１−９．Ｅｐｕｂ  ２００７  Ｏｃｔ  ２４）。これらは下記を含む：
真菌感染用のリポソームアンホテリシンＢ
真菌及び原虫感染用のリポソームアンホテリシンＢ
悪性リンパ性髄膜炎用のリポソームシタラビンＤｅｐｏｃｙｔ
ＨＩＶ関連カポジ肉腫用のリポソームダウノルビシンＤａｕｎｏＸｏｍｅ
転移性乳がんにおけるシクロホスファミドとの併用療法用のリポソームドキソルビシン
Ａ型肝炎用のリポソームＩＲＩＶワクチン
インフルエンザ用のリポソームＩＲＩＶワクチン
体内術後鎮痛用のリポソームモルヒネ
加齢性黄斑変性症、病的近視、眼ヒストプラズマ症用のリポソームベルテポルフィン
ＨＩＶ関連カポジ肉腫、転移性乳がん、転移性卵巣がん用のリポソーム−ＰＥＧドキソルビシン
ミセルエストラジオール。
【００７２】
６．１．１．、６．１．２．、６．１．３．及び６．１．４．に記載するｄｅ−ＶＤＢＰ及び多分子複合体を封入するように設計されるリポソームを調製する際、本発明者らは、ｄｅ−ＶＤＢＰのＧａｌＮＡｃ部分間の分子相互作用を考慮した。実際に、分子及び／又は複合体の他の領域全てが、特定リポソームを設計する際に考慮される必要がある表面電荷の特有の配置を提示しない。
【００７３】
下記脂質組成（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（それら全てが、負の表面電荷を生じる）が考慮された：
３０：４０：３０の比の１−パルミトイル−２−オレイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）：コレステロール：１−パルミトイル−２−オレイル−ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）。
Ｌ−α−ホスファチジルコリン，β−オレイル−γ−パルミトイル、８．７μｍｏｌ。Ｌ−α−ホスファチジル−ＤＬ−グリセロール，ジオレオイル、１．０μｍｏｌ。コレステロール、６．９μｍｏｌ。
Ｌ−α−ホスファチジルコリン，ジステアロイル、８．４μｍｏｌ。Ｌ−α−ホスファチジル−ＤＬ−グリセロール，ジステアロイル、０．９μｍｏｌ。コレステロール、６．９μｍｏｌ。
【００７４】
リポソームは、ＬｉｐｏｓｏＦａｓｔ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｆａｃｔｏｒｙ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して調製した。この方法は、一様なサイズの単層リポソームの迅速で効率的な形成を可能にする。原理は下記である：脂質エマルジョンを、多孔質ポリカーボネート膜に通して繰り返し押し出して、膜支持カプセルに取り付けた特殊修飾した機密性シリンジにより前後に力をかける。キットに備えられたシリンジを用いて、ユニットは、０．５ｍＬ容量、事実上デッドボリュームゼロを有する。２００〜４００ｎｍの孔サイズの膜を使用して、所望のサイズのリポソームを生産した。非常に明確に、より小さなサイズのリポソームは、ｄｅ−ＶＤＢＰなどの単一分子に使用され、より大きなサイズのリポソームは、上記セクション６．１．２、６．１．３及び６．１．４に記載する二量体及び三量体複合体に使用された。
【００７５】
リポソームを通じて上述の新規化合物全てを送達するという新規性及び利点は明らかである。ビタミンＤ系に関連する強力且つ安定な分子は、経口投与することができ、静脈内注射を通じて達成可能な濃度と似た血漿濃度に達し得る。リポソームは、抗がん、抗ＨＩＶ及び抗微生物医薬品を効率的に送達するのに現在使用されているため、ひとたび上述の新規多分子複合体を封入するのに使用されると、それらは、ビタミンＤ及びその類似体が有効であると証明されている条件全てで使用することができる。
【００７６】
６．２．６．１に記載する方法に従う特定疾患又は状態を対象とした特定分子及び分子の混合物の調製
６．２．１．一般的原理。
以下に記載する分子及び分子の混合物は、種々の疾患及び状態における細胞の特有の生体分子の特徴を考慮して、セクション６．１に記載する方法に従って設計される。これらの製剤の一般的な命名法は下記である：「Ｉ」は、注射用を表す。「Ｌ」は、経口で、又は経皮的に使用され得るリポソーム形態を示す。「Ｓ」は、生理食塩水を表し、化合物が生理食塩水溶液中に溶解されることを示す。「Ｘ」は、上記セクション６．１．３で指定される水性アルコール系生理食塩水溶媒を表す。ギリシャ文字を使用して、混合物の名称を示す。最終的なｄｅ−ＶＤＢＰ濃度は、１００ｎｇ／ｍｌである。他の濃度は、特定ニーズに従って容易に達成することができる。
【００７７】
６．２．２．下記は、本発明による、種々のタイプのがんを標的とするサプリメント又は注射用製剤として意図される分子及び分子の混合物の例の説明である。
【００７８】
６．２．２．１．ＩＸ−アルファ／ＩＳ−アルファ。進行がん、即ちステージ４及び転移したがん用の分子の混合物。この製剤は、壊死がん細胞から放出される高レベルの毒性アクチンを考慮する。したがって、それは、１／１０の比のビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰで開始して調製される。オレイン酸が１／１０の比で添加される。この製剤では、アクチンを除去して、ｄｅ−ＶＤＢＰ受容体と相互作用するのに利用可能な最多数の「遊離」のｄｅ−ＶＤＢＰが存在する。三量体複合体［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ／オレイン酸］は、原形質膜でＶＤＲと相互作用して、ＶＤＲシグナル伝達を誘発する。
【００７９】
６．２．２．２．ＩＳ−ベータ。白血病、リンパ腫及びアポトーシスが調節解除される他のがん用の分子の混合物。この製剤は、これらのタイプのがんにおいて最も頻繁に活性化される遺伝子の１つである遺伝子Ｂｃｌ−２の疎水性プロファイルを考慮する。ｄｅ−ＶＤＢＰ及びＢｃｌ−２の疎水性プロファイルの比較を図８に報告する。この製剤は、生理食塩水中の２／１０の比のビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰで開始して、オレイン酸が１／１の比で添加される。この製剤では、Ｂｃｌ−２との疎水性相互作用を通じて相互作用して、したがってその作用を阻害する多数の疎水性二量体複合体［ｄｅ−ＶＤＢＰ／オレイン酸］が存在する。この相互作用を支持するために、生理食塩水のイオン強度が使用される。比較的数少ない三量体複合体［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ／オレイン酸］は、原形質膜でＶＤＲと相互作用して、ＶＤＲシグナル伝達を誘発する。
【００８０】
６．２．２．３．ＩＸ−ガンマ／ＩＳ−ガンマ。結腸及び乳がん用の分子の混合物。分子のこの混合物は、ヒト癌腫の約５０％に関与する腫瘍抑制因子の遺伝子産物ｐ５３を標的とする（ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１３  Ｊｕｎ  ５；１３（１）：２７７）。図９で観察され得るように、ｐ５３は、Ｂｃｌ−２よりもはるかに低い疎水性プロファイルを示す。したがって、このタンパク質を標的とする分子の設計は、ｄｅ−ＶＤＢＰのＧａｌＮＡｃ部分を含む親水性相互作用を考慮しなくてはならない。この製剤は、１／１０の比のビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰで開始する。オレイン酸が１／１０の比で添加される。この製剤では、ひとたび内部移行されると、ｐ５３との親水性相互作用を通じて相互作用して、その作用を阻害する多数の親水性二量体複合体である「遊離」のｄｅ−ＶＤＢＰ分子が存在する。親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ）を損なうことなく、内部移行を支持するために、オレイン酸が低い比で、即ち１／１０で添加される。三量体複合体［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ／オレイン酸］は、原形質膜でＶＤＲと相互作用して、ＶＤＲシグナル伝達を誘発する。
【００８１】
６．２．２．４．ＩＸ−デルタ；ＬＳ−デルタ。黒色腫及び乾癬用の分子の混合物。分子のこの混合物は、ヒト黒色腫（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ．１９９６  Ａｕｇ；２２（４）：３４２−６）、及び乾癬が発がん性疾患ではなくても乾癬（Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９９０  Ｎｏｖ；９５（５  Ｓｕｐｐｌ）：７Ｓ−９Ｓ）に関与するがん遺伝子産物ＭＹＣを標的とする。図１０で観察され得るように、ＭＹＣは、Ｂｃｌ−２よりもはるかに低い疎水性プロファイルを示す。したがって、このタンパク質を標的とする分子の設計は、ｄｅ−ＶＤＢＰのＧａｌＮＡｃ部分を含む親水性相互作用を考慮しなくてはならない。この製剤は、１／１０の比のビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰで開始する。ＥＰＡが１／１０の比で添加される。この製剤では、ひとたび内部移行されると、ＭＹＣとの親水性相互作用を通じて相互作用して、したがってその作用を阻害する多数の親水性二量体複合体である「遊離」のｄｅ−ＶＤＢＰ分子が存在する。親水性を損なうことなく、内部移行を支持するために、ＥＰＡが低い比で、即ち１／１０で添加される。三量体複合体［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ／ＥＰＡ］は、原形質膜でＶＤＲと相互作用して、ＶＤＲシグナル伝達を誘発する。アルファ、ベータ及びガンマとは異なり、デルタでは、ＭＹＣがんタンパク質との相互作用を支持するように分子のより高い可撓性を提供するために、オレイン酸の代わりにＥＰＡが存在する。デルタは、注射用製品として、又は局所用途用のリポソーム製剤として調製され得る。
【００８２】
６．２．２．５．ＩＸ−イプシロン／ＩＳ−イプシロン。前立腺がん用の多分子複合体の混合物。ｐ５３、ＭＹＣ及びＢｃｌ−２は全て、ヒト前立腺がんの進行に関与するため（Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２００９  Ｊｕｎ  １５；４８６（２）：９５−１０２）、中間の疎水性／親水性の特徴を有する多分子複合体の混合物が設計されなくてはならない。この製剤は、５／１０の比のビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰで開始する。ＥＰＡが１／１の比で添加される。最良の結果に関して、最終的な割当５０％ｖ／ｖでのＩＳ−イプシロンとの組合せが想定される。
【００８３】
６．２．３．種々のタイプの疾患又は状態を標的とするサプリメントとして、又は注射による投与用に意図される多分子複合体及び複合体の混合物の例の説明。
【００８４】
６．２．３．１．ＬＳ−ゼータ。自閉症用の複合体の混合物。脳の炎症は、自閉症の特質の１つであるため、この現象を対象とする多分子複合体を設計した。この製剤は、１／１の比のビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰで開始する。ＥＰＡが１／１の比で添加される。これらの比により、血液脳関門を通過することが可能な最多数の疎水性分子が提供される。経口バイオアベイラビリティは、子供達への投与を支持する。ＥＰＡは、ヒトの脳の主な構造構成成分であり、多数の神経疾患において有効であると証明されているオメガ−３−脂肪酸であるドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）で置換され得る。最終的な混合物は、［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ／ＥＰＡ］＋［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ／ＤＨＡ］、５０％ｖ／ｖである。
【００８５】
６．２．３．２．ＩＸ−イータ／ＩＳ−イータ；ＬＳ−イータ。筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群、神経変性傷害、重金属関連神経状態用の複合体の混合物。この製剤は、５／１０の比のビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰで開始する。ＥＰＡが２／１０の比で添加される。この製剤は、注射用形態（ＩＸ−イータ）で、又は経口投与用のリポソーム製剤（ＬＳ−イータ）として使用され得る。また、この場合、ＥＰＡは、ヒトの脳の主な構造構成成分であり、多数の神経疾患において有効であると証明されているオメガ−３−脂肪酸であるドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）で置換され得る。最終的な混合物は、６．２．３．１．の最終的な混合物と一致するが、ＵＦＡの比は、成体における血液脳関門の異なる透過性のため異なる。
【００８６】
６．２．３．３．ＩＸ−シータ／ＩＳ−シータ、慢性腎疾患用の分子の混合物。この製剤は、１／１の比のビタミンＤ類似体／ｄｅ−ＶＤＢＰで開始する。ＥＰＡが５／１０の比で添加される。
【００８７】
６．２．３．４．ＩＸ−イオタ；ＩＳ−イオタ；Ｌ［Ｘ−イオタ／Ｓ−イオタ］。心血管疾患用の分子の混合物。ＩＸ−イオタの製剤は、１／１の比のビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰで開始する。ＥＰＡが１／１の比で添加される。続いて、ＩＳ−イオタの混合物が、１／１  ｖ／ｖの比で添加される。得られた混合物は、経口投与用のリポソーム製剤としても調製することができる。
【００８８】
６．２．３．５．カッパシリーズ。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を標的とする分子の混合物。ＨＩＶのアミノ酸配列を図１１に表す。この場合、２つの配列間に相同性が存在しないので、ｄｅ−ＶＤＢＰの配列とのアラインメントは存在しない。ＨＩＶの配列に目を向けると、６．１に記載する方法に従って調製される幾つかの分子が相互作用し得る長い一続きの疎水性アミノ酸が存在することが明確である。したがって、カッパシリーズの分子は、多分子複合体と、異なる度合いの疎水性及びビリオンの丸みを帯びた構造に適合させるための可撓性を示す各複合体との混合物を生産するという概念に従って設計された。カッパシリーズを構成する各複合体は、連続した数を用いて称される。
【００８９】
カッパ１。１／１０の比のビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ。ＥＰＡが１／１の比で添加される。
【００９０】
カッパ２。１／１の比のビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ。ＥＰＡが１／１０の比で添加される。
【００９１】
カッパ３。１／１０の比のビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ。オレイン酸が１／１の比で添加される。
【００９２】
カッパ４。１／１の比のビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ。オレイン酸が１／１０の比で添加される。
【００９３】
最終的なカッパ製剤は、２５％ｖ／ｖである等量でカッパシリーズの各複合体を含有する。カッパシリーズ製剤は、経口投与用のリポソーム製剤としても製剤化することができる。
【００９４】
６．２．３．６．個々のＶＤＲ遺伝子型に対して特異的に調整した分子及び混合物。ＶＤＲ遺伝子多型が、ビタミンＤ３に対する差次的応答に関連付けられることが十分に評価される。このため、ビタミンＤ３補給が必要とされる場合、ビタミンＤ３の投与の最も効率的な用量及び頻度を提供するために、ＶＤＲ遺伝子型の決定が推奨される（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．２００９  Ｎｏｖ；７６（９）：９３１−３）。例えば、ＢＢ及びｆｆホモ接合性遺伝子型がビタミンＤ３に対して乏しいレスポンダーであることは周知である。個々のＶＤＲ遺伝子型に対して調整された特異的な分子は、ＶＤＲの配列を考慮して、多型受容体との最良の相互作用を提供するように設計される。例えば、Ｆｏｋ−Ｉ多型は、３個アミノ酸長いＶＤＲタンパク質を含む。これは、ＶＤＲ分子を「より堅く」させて、それ自体、他のタンパク質及びＤＮＡと相互作用する能力が低い。ＶＤＲ分子のこのような特徴は、上述の分子において高い可撓性を有するポリ不飽和脂肪酸を使用することにより標的とされ得る。例えば、α−リノレン酸又はドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）は、オレイン酸又はＥＰＡに代わって使用することができる。公知のＶＤＲ遺伝子型を有する個体では、ＵＦＡのタイプは、セクション６．２．２．及び６．２．３．に記載する分子のいずれかに関して調節することができる。
【００９５】
６．２．３．７．本発明の複合体は、がんを治療するための腫瘍内／腫瘍周囲注射用に製剤化され得る。例えば、下記スキームに従う種々のエタノール（２０％ｖ／ｖ）及びプロピレングリコール（３０％ｖ／ｖ）中に溶解した１／１、１／０．５、１／０．２、１／０．１の比のｄｅ−ＶＤＢＰ／オレイン酸の多分子（五量体）混合物：
【００９６】
１．比１／１  容量２．４２ｍＬ  収量  ４００ｎｇ／ｍＬのｄｅＶＤＢＰ及び１．９７ｎｇ／ｍＬのオレイン酸  ９．１％エタノール（２０％ｖ／ｖ）及びプロピレングリコール（３０％ｖ／ｖ）。
【００９７】
２．比１／０．５  容量２．４２ｍＬ  収量  ４００ｎｇ／ｍＬのｄｅＶＤＢＰ及び１．０８ｎｇ／ｍＬのオレイン酸  ９．１％エタノール（２０％ｖ／ｖ）及びプロピレングリコール（３０％ｖ／ｖ）。
【００９８】
３．比１／０．２  容量２．４２ｍＬ  収量  ４００ｎｇ／ｍＬのｄｅＶＤＢＰ及び０．４４ｎｇ／ｍＬのオレイン酸  ６．４％エタノール（２０％ｖ／ｖ）及びプロピレングリコール（３０％ｖ／ｖ）。
【００９９】
４．比１／０．１  容量２．４２ｍＬ  収量  ４００ｎｇ／ｍＬのｄｅＶＤＢＰ及び０．１９ｎｇ／ｍＬのオレイン酸  生理食塩水中。
【０１００】
５．比１／０  容量２．４２ｍＬ  収量  ４００ｎｇ／ｍＬのｄｅＶＤＢＰ  生理食塩水中。
【０１０１】
この混合物は、超音波ガイドされた腫瘍周囲／腫瘍内注射を使用して投与され得る。これに関連して、それは、そのフォールディングが脂肪酸との結合により影響されるタンパク質に結合されたオレイン酸の周知の抗がん特性を利用する（ＦＥＢＳ  Ｊ．２０１３  Ａｐｒ；２８０（８）：１７３３−４９）。したがって、ＨＡＭＬＥＴ（腫瘍細胞に対して致死的にさせたヒトα−ラクトアルブミン）又はＶＤＢＰなどのタンパク質に結合されているオレイン酸は、がん遺伝子依存又はワールブルグ効果などのがん細胞の統一的な特色を利用することにより、がん細胞のアポトーシスを誘導する（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２０１１  Ｄｅｃ  １；３０（４８）：４７６５−７９）。
【０１０２】
この混合物は、（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１１  Ｊｕｌ  １；７１（１３）：４４８４−９３）で実証されるように、炭水化物１０％又はそれ未満、脂肪（特に、オレイン酸及び他のＵＦＡ）２５％、及びタンパク質５０〜６０％を含有する等カロリー食事に存する栄養プランを行っているがん患者において特に有効であることがわかっている。その有効性は、それが腫瘍性形質転換の基礎的な分子メカニズムを標的とするため、様々ながんに対して作動する（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２０１１  Ｄｅｃ  １；３０（４８）：４７６５−７９）。更に、その物理化学的特色、即ち同じ範囲の診断用超音波における分子複合体共鳴の形成（Ｂｒａｉｎ  Ｓｔｉｍｕｉ．２０１３  Ｍａｙ；６（３）：４０９−１５）に起因して、混合物は、集束超音波により発揮される機械力を通じて病変を標的とし得る。換言すると、混合物の注射直後に腫瘍を標的とする超音波ビームは、分子が力学的エネルギーの放出により解離される病変に対して分子に力をかけて、したがってそれらの治療的有効性を劇的に増加させる。
【０１０３】
本発明者らはまた、混合物が、一般的なネブライザーを用いてエアロゾルとして投与される場合に特に有効であることを見出した。その特有の多分子立体配置により、病原性ウイルス、細菌、微生物及びがん細胞に対する自然免疫応答の重要な要素である肺胞マクロファージを刺激する際にそれが非常に有効となる（Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ．２０１３；５９（６）：４８１−９）。実際に、オレイン酸を含有するエマルジョンが、鼻内経路を通じて迅速に吸収されるという特徴を有し、優れた薬物動態特性を示すことが実証されている（Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ．２０１１  Ｊｕｌ；４１（７）：５６７−７７）。このようなエアロゾル投与は、原発性及び転移性肺がんの他に、慢性閉塞性肺疾患並びにウイルス性又は細菌性肺炎などの様々な肺関連病的状態で有用であり得る。
【０１０４】
７．補足的観察
７．１  Ｉｎｖｉｔｒｏ活性：
先述のセクションに記載する分子及び多分子複合体の生物活性は、ビタミンＤ３及びビタミンＤ系の他の構成成分の生物活性を評価するのに日常的に使用されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ系（ＭＣＦ−７ヒト乳がん細胞培養物）中で試験した（Ｅｖｉｄ  Ｂａｓｅｄ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ａｌｔｅｒｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１２；２０１２：３１０８７２．Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ．２０１２  Ｄｅｃ；２８（６）：２１３１−７．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１２  Ｍａｒ；３２（３）：７３９−４６）。ヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７に、種々の濃度のビタミンＤ３、ｄｅ−ＶＤＢＰ及び［ビタミンＤ３／ｄｅ−ＶＤＢＰ／オレイン酸］を負荷した。表１に報告される結果により、先述のセクションに記載する新規複合体が、ビタミンＤ３又はｄｅ−ＶＤＢＰと比較してはるかに高い生物活性を有することがはっきりと示される。ＭＣＦ−７増殖の最大阻害は、非常に高い非生理学的濃度である１μＭのビタミンＤ３で達成された。しかしながら、同じレベルの阻害が、ビタミンＤ３をｄｅ−ＶＤＢＰ及びオレイン酸と複合体形成した際に、１０００倍低いビタミンＤ３で達成することができた。
【０１０５】
【表１】
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【０１０６】
細胞系。ＭＣＦ−７細胞は、ＡＴＣＣから入手した。細胞は、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したアールの平衡塩類溶液中のイーグルの最小必須培地中で、３７℃で、５％  ＣＯ２の加湿雰囲気下で日常的に維持された（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）。
【０１０７】
細胞増殖。細胞増殖の評価は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ迅速細胞増殖キットにより測定した。各条件は、四重反復試料で繰り返され、各実験は三度繰り返された。
【０１０８】
７．２  ｉｎ  ｖｉｖｏ活性：患者Ａ
６．２．２．３に記載する分子（ＩＸ−ガンマ／ＩＳ−ガンマ）を、いかなる他の従来の療法にも不適格であった不治の乳がん患者において、いわゆる「思いやりのあるアプローチ」の一部として使用した。ＩＳ−ガンマ、８８０ｎｇを、左腋窩に近接して位置する固形腫瘍に注射した。免疫系の活性化、及び続く抗がん効果を、腫瘍における血流を評価することによりモニタリングした。したがって、活性マクロファージが、血管拡張を引き起こして、且つ強力な抗がん特性を示す化合物である一酸化窒素（ＮＯ）を放出することは周知である（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９８９  Ｍａｙ  １；１６９（５）：１５４３−５５．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１  Ｆｅｂ；３（１）：６５−７０．）。腫瘍内血流を、エコーカラードップラー技法を使用して超音波系でモニタリングした。図１２は、ＩＳ−ガンマ（８８０ｎｇ）の注射前（左パネル）及び注射の２分後の固形腫瘍内部の血流を示す。中心にある壊死の円形領域により同定される腫瘍の同じ面積における血流の増加が劇的である。
【０１０９】
７．３  ｉｎ  ｖｉｖｏ活性：患者Ｂ
転移性前立腺がんを伴う患者において、ＩＳ−ガンマ、８８０ｎｇを、これまでのＭＲＩが転移性であることを示している腹腔内の大動脈周囲結節を標的とすることを目的として、鼠径部結節の領域に注射した（各側において４４０ｎｇ）。図１３は、毎日の注射の３日後に、参照とされる結節が、２５％の体積減少を示したことを示す。処置前の結節は、左パネルに示され、右パネルは、処置の３日後の結節３を示す。測定が精密であり且つ信頼できることを確実にするために、血管を参照とした。
【０１１０】
７．４  ｉｎ  ｖｉｖｏ活性：臨床結果
本発明による複合体の有効性は、Ｅｍｍａ  Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０（１）；２３−３２  ２０１４で議論される。それらの開示は、参照により本明細書に援用される。
【０１１１】
要約すると、本発明は、ビタミンＤ３及びビタミンＤ類似体（ともに、Ｖｉｔ  Ｄｓと称される）に基づく改善されたサプリメントを生産する方法を提供する。これらは、脱グリコシル化されたビタミンＤ結合タンパク質（ｄｅ−ＶＤＢＰ）との相互作用により安定化される。ＶＤＢＰは、シアリダーゼ及びベータ−ガラクトシダーゼによる処置によりＴｈｒ４２０位で脱グリコシル化され得る。ｄｅ−ＶＤＢＰは、Ｖｉｔ  Ｄｓを安定化するために骨格として使用され、細胞原形質膜との、及びビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）とのより効率的な相互作用を可能にする。安定化は、Ｖｉｔ  ＤＳとｄｅ−ＶＤＢＰの２３個の疎水性アミノ酸との間の特定疎水性相互作用により達成される。骨格としての二量体複合体［Ｖｉｔ  Ｄｓ／ｄｅ−ＶＤＢＰ］は、ｄｅ−ＶＤＢＰのドメインＩＩＩにおける一続きの疎水性アミノ酸と不飽和脂肪酸（ＵＦＡ）との間の疎水性相互作用により更に安定化され得る。生じた三量体［Ｖｉｔ  Ｄｓ／ｄｅ−ＶＤＢＰ／ＵＦＡ］は、原形質膜のレベルでＶＤＲと相互作用することが実証され得る。生じた四量体複合体［Ｖｉｔ  Ｄｓ／ｄｅ−ＶＤＢＰ／ＵＦＡ／ＶＤＲ］は、細胞輸送タンパク質により標的細胞へ自発的に内部移行されて、ひとたび細胞の内部にあると、タンパク質／タンパク質相互作用が、ｄｅ−ＶＤＢＰ骨格のＴｈｒ４２０位にあるアルファ−Ｎ−ガラクトサミンと、ＶＤＲの２０７〜２１５位における一続きの酸性アミノ酸との間の塩基−酸相互作用により更に強化される。安定化された三量体複合体［Ｖｉｔ  Ｄｓ／ｄｅ−ＶＤＢＰ／ＵＦＡ］の、正常細胞培養物及び病的細胞培養物への投与が、ビタミンＤ３単独又はｄｅ−ＶＤＢＰ単独を用いた場合に観察される応答よりも１０〜１００倍高い細胞応答を誘起する。ｄｅ−ＶＤＢＰ及び複合体の効力及びバイオアベイラビリティは、水性アルコール系生理食塩水溶媒中に複合体を溶解させることにより、更に増加させることができる。三量体複合体［Ｖｉｔ  Ｄｓ／ｄｅ−ＶＤＢＰ／ＵＦＡ］は、経口経路を通じて容易に吸収可能な、及び／又は例えば軟膏における局所使用のための化合物を生産するために、種々のリン脂質組成を有するリポソーム中に封入され得る。同様に、安定化された複合体は全て、舌下投与されてもよい。この戦略は、ビタミンＤ３が例えば非高カルシウム血性ＶＤＲアゴニスト（エルデカルシトールなどの）で置換され得るｄｅ−ＶＤＢＰの骨格に関連付けられる化合物のファミリーの生産を可能にする。Ｖｉｔ  Ｄｓ／ｄｅ−ＶＤＢＰ／ＵＦＡのこのファミリーの新規の安定化された複合体は、総死亡率の防止；免疫系の刺激；骨の健康；心血管疾患；がん；慢性腎疾患；ＨＩＶ感染；神経変性疾患（パーキンソン、アルツハイマー、自閉症、筋痛性脳脊髄炎、多発性硬化症）；重金属関連神経状態の防止を含むが、これらに限定されないビタミンＤの補給が有効であると証明されている条件全てにおいて使用され得る。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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