(57)【要約】様々なタイプの腫瘍に対抗しうる新規な抗ガン試薬が、多くの製薬リーディングカンパニーにおいて研究され続けている。この目的のため、本発明は、式１のヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物の新規な系列を作製するプロセスを開示する。また、ここで記載される発見によると、本発明の化合物は、抗ガン活性など増殖抑制作用を有しており、様々なタイプのガンに効き、有用であるということが表れている。ここで開示されるカチオン性両親媒性化合物の薬剤活性組成物は、ＢａｘおよびＢｃｌ−２の仲介するシグナル伝達経路を通して、細胞自然死を促進させる。ここに開示される本発明の、ヒスチジン頭部基をもつカチオン性両親媒性化合物は、将来、抗ガン治療の分野に適用できるであろう。
2016501887.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１に示す、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物。
【化１】
2016501887.tif 000017
（式１）
式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立してＨ（hydrogen）または親油性部分であって、同時にＨ（hydrogen）ではなく、Ｘは、Ｃｌ（chlorine）またはＢｒ（bromine）であ
り、ｎは、炭素数１〜２であり、前記親油性部分がＣ８−２４のアルキル基、モノ不飽和、ジ不飽和およびトリ不飽和のアルケニル基からなる群から選択される。
【請求項２】
前記化合物は、式Ａおよび式Ｂから選択される、請求項１に記載のヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物。
【化２】
2016501887.tif 000018
式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立してＨ（hydrogen）または親油性部分であって、同時にＨ（hydrogen）ではなく、Ｘは、Ｃｌ（chlorine）またはＢｒ（bromine）であ
り、前記親油性部分が、Ｃ８−２４のアルキル基、モノ不飽和、ジ不飽和、およびトリ不飽和のアルケニル基からなる群から選択される。
【請求項３】
前記化合物は、
（ｉ）：２−（（Ｓ）−２−アンモニオ−３−（（Ｒ）−１，４−ビス（ヘキサデシルオキシ）−１，４−ジオキソブタン−２−イルアミノ）−３−オキソプロピル）−１Ｈ−イミダゾール−３−イウムクロリド（ＨＤ１６）
（ii）：２−（（Ｓ）−２−アンモニオ−３−（（Ｒ）−１，４−ビス（オクタデシルオキシ）−１，４−ジオキソブタン−２−イルアミノ）−３−オキソプロピル）−１Ｈ−イミダゾール−３−イウムクロリド（ＨＤ１８）
（iii）：２−（（Ｓ）−２−アンモニオ−３−（（Ｒ）−１，５−ビス（ヘキサデシル
オキシ）−１，５−ジオキソペンタン−２−イルアミノ）−３−オキソプロピル）−１Ｈ−イミダゾール−３−イウムクロリド（ＨＥ１６）、および
（iv）：２−（（Ｓ）−２−アンモニオ−３−（（Ｒ）−１，５−ビス（オクタデシルオキシ）−１，５−ジオキソペンタン−２−イルアミノ）−３−オキソプロピル）−１Ｈ−
イミダゾール−３−イウムクロリド（ＨＥ１８）
からなる群から選択される、請求項１に記載のヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物。
【請求項４】
前記化合物は、細胞自然死を引き起こし、腫瘍血管内皮細胞および腫瘍細胞の両方での血管新生を抑制する、請求項１に記載のヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物。
【請求項５】
前記化合物は、濃度１０〜１７マイクロモルの範囲で、ガン細胞に細胞毒性効果を発現する、請求項１に記載のヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物。
【請求項６】
前記化合物は、細胞生存経路上のｂＣＬ−２およびＮＦ−ｋＢを抑制する、請求項１に記載のヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物。
【請求項７】
前記化合物は、１回あたり、３．０〜３．５ｍｇ／ｋｇの投薬で、腫瘍の成長を７０〜９０％抑制する、請求項１に記載のヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物。
【請求項８】
式１に示す、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物を作製するプロセスであって、
（ａ）極性非プロトン性溶媒中で、カップリング剤およびラセミ化抑制剤の存在下で、脂肪族アルコールにＮ  Ｂｏｃ保護誘導体を連結させた後、精製することにより、式２に示す化合物を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた式２の前記化合物を、脱保護剤としてＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を用いて脱保護させ、ろ過することにより、式３に示す化合物を得る工程、
（ｃ）極性非プロトン性溶媒中で、カップリング剤およびラセミ化抑制剤の存在下で、工程（ｂ）で得られた式３の前記化合物にＮ  Ｂｏｃ保護ヒスチジンを添加した後、精製することにより、式４に示される化合物を得る工程、
（ｄ）極性非プロトン性溶媒および脱保護剤としてのＴＦＡの存在下で、工程（ｃ）で得られた式４の前記化合物を反応させた後、イオン交換クロマトグラフィにより、式１に示す化合物を得る工程、
を有する、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物を作製するプロセス。
2016501887.tif 000019
（式２）
2016501887.tif 000020
（式３）
2016501887.tif 000021
（式４）
【請求項９】
前記脂肪族アルコールが、炭素数が８〜２４の飽和もしくは不飽和のアルコールからなる群から選択される、請求項８に記載のヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物を作製するプロセス。
【請求項１０】
前記極性非プロトン性溶媒が、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジンおよびトリエチルアミンからなる群から選択される、請求項８に記載のヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物を作製するプロセス。
【請求項１１】
前記カップリング剤が、ＥＤＣＩ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）、およびＤＣＣ（１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド）からなる群から選択される、請求項８に記載のヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物を作製するプロセス。
【請求項１２】
前記ラセミ化抑制剤が、ＨＯＢｔおよびＨＯＡｔからなる群から選択される、請求項８に記載のヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物を作製するプロセス。
【請求項１３】
前記Ｎ Ｂｏｃ保護誘導体が、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択
される、請求項８に記載のヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物を作製するプロセス。
【請求項１４】
式１に示すヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物、混合脂質およびポリアニオン性化合物、任意で、生理学的に許容できる添加剤を含む、リポソーム製剤。
【請求項１５】
前記カチオン性両親媒性化合物が、単独、もしくはヘルパー脂質との組み合わせである、請求項１４のリポソーム製剤。
【請求項１６】
前記混合脂質が、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルホスホコリン、ホスファチジルグリセロール、コレステロール、１，２−ｓｙｎ−ジオレオイルグリセロホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、および１，２−ｓｙｎ−ジオレオイルグリセロホスホコリン（ＤＯＰＣ）からなる群から選択される、請求項１４のリポソーム製剤。
【請求項１７】
前記ヘルパー脂質が、Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−ヘキサデシル−Ｎ−［２−グアニジニル］エチル−Ｎ−メチルアンモニウムクロリド（Ｑ１６ＴＧ）である、請求項１４のリポソーム製剤。
【請求項１８】
カチオン性両親媒性化合物と混合脂質とヘルパー脂質とのモル比率が、１：１：１〜３
：２：１である、請求項１４のリポソーム製剤。
【請求項１９】
前記ポリアニオン性化合物が、アニオン性の合成リン脂質である、請求項１４のリポソーム製剤。
【請求項２０】
前記生理学的に許容できる添加剤が、生理食塩水および５％グルコース溶液からなる群から選択される、請求項１４のリポソーム製剤。
【請求項２１】
前記カチオン性両親媒性化合物の使用量が濃度２〜３０マイクロモルであるときに、細胞傷害性を示す、請求項１４のリポソーム製剤。
【請求項２２】
リポソーム製剤の作製方法であって、
（ａ）メタノールおよびクロロホルムの混合物に、カチオン性両親媒性化合物、混合脂質およびヘルパー脂質をモル比率１：１：１〜３：２：１の範囲で溶解し、水分フリーな窒素ガスを少なく流しながら、前記溶媒を揮発させることにより、脂質膜を得る、
（ｂ）工程（ａ）で得られた前記脂質膜を真空乾燥させる、
（ｃ）乾燥した前記脂質膜を滅菌脱イオン水に水和させる、
（ｄ）前記工程で得られた混合物を撹拌して脂質膜の付着物を取り除き、撹拌した混合物を、超音波洗浄機を用いて室温で超音波洗浄して多重膜小胞（ＭＬＶｓ）を作製し、得られたＭＬＶｓをＴｉの超音波プローブで超音波洗浄して、純粋で半透明な単層小胞（ＳＵＶｓ）を作製する、
ことを有する、リポソーム製剤の作製方法。
【請求項２３】
前記混合脂質が、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルホスホコリン、ホスファチジルグリセロール、コレステロール、１，２−ｓｙｎ−ジオレオイルグリセロホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、および１，２−ｓｙｎ−ジオレオイルグリセロホスホコリン（ＤＯＰＣ）からなる群から選択される、請求項２２に記載のリポソーム製剤の作製方法。
【請求項２４】
前記ヘルパー脂質が、Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−ヘキサデシル−Ｎ−［２−グアニジニル］エチル−Ｎ−メチルアンモニウムクロリド（Ｑ１６ＴＧ）である、請求項２２に記載のリポソーム製剤の作製方法。
【請求項２５】
前記工程（ａ）で用いるクロロホルムおよびメタノールの比率が、１：１〜４：１の範囲内である、請求項２２に記載のリポソーム製剤の作製方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物に関する。また、本発明は、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物の新系列を作製する方法に関する。本発明によれば、抗ガン活性を有する前記カチオン性両親媒性化合物を含む新規な化合物が提供される。また、本発明は、カチオン性両親媒性化合物のリポソーム製剤に関する。リポソーム製剤は、増殖抑制作用を示し、人間や動物の体内のガン治療に有用である。カチオン性両親媒性化合物は、アポトーシスのシグナル伝達経路を通ってアポトーシス（細胞自然死）を促進させる。医療科学分野は、ガン治療において、本発明から多くの恩恵を得られやすい。
【背景技術】
【０００２】
ガンは、細胞成長を制御できないことに起因する、おそろしい病気である。ガン細胞の際立った特徴としては、外部的拡大を誘導するシグナルの助けなしに成長できる点にある。ガン細胞は、周囲の細胞や細胞外基質に緩く付着しやすく、一般に、普通の細胞よりも早く分裂する。既存の血管から新しい血管が形成される血管新生は、主に、胚発生、傷の治癒、繁殖周期、血管腫、糖尿病性網膜症、加齢による筋力低下、乾癬、歯肉炎、リウマチ性関節炎、固形腫瘍成長の間に起こる（Carmeliet, P.など、Nature 2000, 14, 6801）。腫瘍細胞は、１〜２ｍｍ３のサイズを超えて成長すると、成長する腫瘍細胞に向けて副管を形成するよう、近くの血管に対して順々に命令する酵素および成長シグナル（サイトカイン）を分泌する（Folkman, J.など Science 1987, 235, 442-447; Folkman, J.など Science 1989, 243, 1490-1493）。このように新しく形成された腫瘍血管系（ナノ血管系）は、成長する腫瘍細胞への食糧や栄養の供給を確保する。このため、抗血管形成のガン治療では、成長する腫瘍に対抗することが見込みの高いアプローチとなる。
【０００３】
イミダゾール官能性を有する両親媒性物質は、従来、特に、非ウイルス性の遺伝子導入の分野において生物工学的にうまく適用できることが確認されている。
例えば、エンドソーム内で、加水分解による消化から遺伝物質を守ることを目的として、Wolffと彼の協力者は、弱塩基性であってリソソーム属のイミダゾール頭部基を含む、
ｐＨ感応がよいカチオン性のトランスフェクション脂質を、先駆けて設計した（Nature Biotechnol, 1996, 14, 760-764）。
カチオン性ポリマを介する遺伝子導入の分野では、Midouxとその協力者が、カチオン性ポリマの分子構造中に、エンドソームを破壊する多重のヒスチジン官能性を、共有結合的にグラフト反応させることで、トランスフェクションの効率を大幅に向上させた（Adv Drug Deliv Rev 2001; 53: 75-94）。
従来から、１つのヒスチジン官能性を頭部基の付近に共有結合的にグラフト反応させると、カチオン性両親媒性化合物を、高効率で遺伝子導入できるようにすることが明らかとなっており、これは、生体膜融合が高まることに起因するものと推測される（Kumar, V.
等 Gene. Ther. 2003, 10, 1206-1215; Karmali, P.P.等 Bioconjugate Chemistry 2006,
17, 159-171）。
しかしながら、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物を抗ガン化合物として用いることについては、これまで報告されていない。本発明は、アスパラギン酸およびグルタミン酸をベースとする、ヒスチジン官能性を有する新規なカチオン性両親媒性化合物を合成する方法と、新規な抗ガン化合物としての治療可能性を明らかにする。また、本発明は、ヒスチジン官能性を有する新規なカチオン性両親媒性化合物のリポソーム製剤について、マウスモデルの腫瘍内での腫瘍成長を抑制する特性を明らかにする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の主な目的は、式１に示すヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物を提供することである。
2016501887.tif 000003
（式１） 
本発明の他の目的は、式１に示すヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物の新系列を作製する方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記カチオン性両親媒性化合物を含み、抗ガン活性を有する新規な化合物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、増殖抑制作用を示し、ガン治療に有用な、カチオン性両親媒性化合物のリポソーム製剤を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、商業的に入手可能な類似の疎水性の抗ガン剤のリポソーム製剤よりも、ガン細胞に対する細胞毒性がよい化合物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、アポトーシスのシグナル伝達経路を通って、細胞自然死を促進させるカチオン性両親媒性化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明によれば、式１に示す、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物が提供される。
2016501887.tif 000004
（式１）
式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立してＨ（hydrogen）または親油性部分であって、同時にＨ（hydrogen）ではなく、Ｘは、Ｃｌ（chlorine）またはＢｒ（bromine）であ
り、ｎは、炭素数１〜２であり、前記親油性部分が、Ｃ８−２４のアルキル基、モノ不飽和、ジ不飽和およびトリ不飽和のアルケニル基からなる群から選択される。
【０００６】
本発明の他の態様によれば、前記化合物は、式Ａおよび式Ｂの化合物からなる群から選択される。
2016501887.tif 000005
式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立してＨ（hydrogen）または親油性部分であって、同時にＨ（hydrogen）ではなく、Ｘは、Ｃｌ（chlorine）またはＢｒ（bromine）であ
り、前記親油性部分が、Ｃ８−２４のアルキル基、モノ不飽和、ジ不飽和、およびトリ不飽和のアルケニル基からなる群から選択される。
【０００７】
本発明のさらに他の態様によれば、
前記化合物が、
（ｉ）：２−（（Ｓ）−２−アンモニオ−３−（（Ｒ）−１，４−ビス（ヘキサデシルオキシ）−１，４−ジオキソブタン−２−イルアミノ）−３−オキソプロピル）−１Ｈ−イミダゾール−３−イウムクロリド（ＨＤ１６）、
（ii）：２−（（Ｓ）−２−アンモニオ−３−（（Ｒ）−１，４−ビス（オクタデシルオキシ）−１，４−ジオキソブタン−２−イルアミノ）−３−オキソプロピル）−１Ｈ−イミダゾール−３−イウムクロリド（ＨＤ１８）、
（iii）：２−（（Ｓ）−２−アンモニオ−３−（（Ｒ）−１，５−ビス（ヘキサデシル
オキシ）−１，５−ジオキソペンタン−２−イルアミノ）−３−オキソプロピル）−１Ｈ−イミダゾール−３−イウムクロリド（ＨＥ１６）、および
（iv）：２−（（Ｓ）−２−アンモニオ−３−（（Ｒ）−１，５−ビス（オクタデシルオキシ）−１，５−ジオキソペンタン−２−イルアミノ）−３−オキソプロピル）−１Ｈ−イミダゾール−３−イウムクロリド（ＨＥ１８）
からなる群から選択される。
【０００８】
本発明のさらに他の態様によれば、
前記化合物が、細胞自然死を引き起こして、腫瘍血管内皮細胞および腫瘍細胞の両方での血管新生を抑制する。
【０００９】
本発明のさらに他の態様によれば、
前記化合物が、濃度１０〜１７マイクロモルの範囲で、ガン細胞に細胞毒性効果を発現する。
【００１０】
本発明のさらに他の態様によれば、
細胞生存経路上のｂＣＬ−２およびＮＦ−ｋＢを抑制する化合物が提供される。
【００１１】
本発明のさらに他の態様によれば、１回あたり、３．０〜３．５ｍｇ／ｋｇの投薬で、腫瘍の成長を７０〜９０％抑制する化合物が提供される。
【００１２】
本発明によれば、式１に示す化合物の作製プロセスであって、
（ａ）極性非プロトン性溶媒中で、カップリング剤およびラセミ化抑制剤の存在下で、脂肪族アルコールにＮ  Ｂｏｃ保護誘導体を連結させた後、精製することにより、式２に示す化合物を得る工程、
2016501887.tif 000006
（式２） 
（ｂ）工程（ａ）で得られた前記式２の化合物を、脱保護剤としてＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を用いて脱保護させ、ろ過することにより、式３に示す化合物を得る工程、
2016501887.tif 000007
（式３） 
（ｃ）極性非プロトン性溶媒中で、カップリング剤およびラセミ化抑制剤の存在下で、式３の化合物にＮ  Ｂｏｃ保護ヒスチジンを添加した後、精製することにより、式４に示される化合物を得る工程、
2016501887.tif 000008
（式４）
（ｄ）極性非プロトン性溶媒および脱保護剤としてのＴＦＡの存在下で、工程（ｃ）で得られた前記式４の化合物を反応させた後、イオン交換クロマトグラフィにより、一般式１に示す化合物を得る工程、を有する化合物の作製プロセスが提供される。
【００１３】
本発明のさらに他の態様によれば、
前記脂肪族アルコールが、炭素数８〜２４の飽和もしくは不飽和のアルコールからなる群から選択される。
【００１４】
本発明のさらに他の態様によれば、
前記極性非プロトン性溶媒がジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジンおよびトリエチルアミンからなる群から選択される。
【００１５】
本発明のさらに他の態様によれば、
前記カップリング剤が、ＥＤＣＩ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）、およびＤＣＣ（１３−ジシクロヘキシルカルボジイミド）からなる群から選択される。
【００１６】
本発明のさらに他の態様によれば、
前記ラセミ化抑制剤が、ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）およびＨＯＡｔ（１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール）からなる群から選択される。
【００１７】
本発明のさらに他の態様によれば、
式１に示すヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物、混合脂質およびポリアニオン性化合物、任意で、生理学的に許容できる添加剤を含む、リポソーム製剤が提供される。
【００１８】
本発明のさらに他の態様によれば、
前記カチオン性両親媒性化合物が、単独、もしくはヘルパー脂質との組み合わせである。
【００１９】
本発明のさらに他の態様によれば、
前記混合脂質が、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルホスホコリン、ホスファチジルグリセロール、コレステロール、１，２−ｓｙｎ−ジオレオイルグリセロホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、および１，２−ｓｙｎ−ジオレオイルグリセロホスホコリン（ＤＯＰＣ）からなる群から選択される。
【００２０】
本発明のさらに他の態様によれば、
前記ヘルパー脂質が、Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−ヘキサデシル−Ｎ−［２−グアニジニル］エチル−Ｎ−メチルアンモニウムクロリド（Ｑ１６ＴＧ）である。
【００２１】
本発明のさらに他の態様によれば、
カチオン性両親媒性化合物と混合脂質とヘルパー脂質とのモル比率が、１：１：１〜３：２：１である。
【００２２】
本発明のさらに他の態様によれば、
前記ポリアニオン性化合物が、アニオン性の合成リン脂質である。
【００２３】
本発明のさらに他の態様によれば、
前記生理学的に許容できる添加剤が、生理食塩水および５％グルコース溶液からなる群から選択される。
【００２４】
本発明のさらに他の態様によれば、
前記製剤が、濃度が２〜３０マイクロモルであるときに細胞傷害性を示す。
【００２５】
本発明によれば、
（ａ）メタノールおよびクロロホルムの混合物に、カチオン性両親媒性化合物、混合脂質およびヘルパー脂質をモル比率１：１：１〜３：２：１の範囲で溶解し、水分フリーな窒素ガスを少なく流しながら、前記溶媒を揮発させることにより、脂質膜を得る、
（ｂ）工程（ａ）で得られた前記脂質膜を高真空で乾燥させる工程と、
（ｃ）乾燥した前記脂質膜を滅菌脱イオン水に水和させる工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）で得られた混合物を撹拌して脂質膜の付着物を取り除き、撹拌した混合物を、超音波洗浄機を用いて室温で超音波洗浄して多重膜小胞（ＭＬＶｓ）を作製し、得られたＭＬＶｓをＴｉの超音波プローブで超音波洗浄して、純粋で半透明な単層小胞（ＳＵＶｓ）を作製する工程と、を有する、リポソーム製剤の作製方法が提供される。
【００２６】
本発明のさらに他の態様によれば、
前記混合脂質が、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルホスホコリン、ホ
スファチジルグリセロール、コレステロール、１，２−ｓｙｎ−ジオレオイルグリセロホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、および１，２−ｓｙｎ−ジオレオイルグリセロホスホコリン（ＤＯＰＣ）からなる群から選択される。
【００２７】
本発明のさらに他の態様によれば、
前記ヘルパー脂質が、Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−ヘキサデシル−Ｎ−［２−グアニジニル］エチル−Ｎ−メチルアンモニウムクロリド（Ｑ１６ＴＧ）である。
【００２８】
本発明のさらに他の態様によれば、
前記工程（ａ）で用いるクロロホルムおよびメタノールの比率が、１：１〜４：１の範囲内である。
【００２９】
本発明のさらに他の態様によれば、
前記脂質膜の乾燥を６〜８時間、行う。
【００３０】
本発明のさらに他の態様によれば、
前記脂質膜の水和を、少なくとも１２時間行う。
〔図面の簡単な説明〕
〔スキーム１〕アスパラギン酸系の、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物を作製するための合成法の略図である。
〔スキーム２〕グルタミン酸系の、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物を作製するための合成法の略図である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ヘルパー脂質であるＮ，Ｎ−ジ−ｎ−ヘキサデシル−Ｎ−［２−グアニジニル］エチル−Ｎ−メチルアンモニウムクロリド（Ｑ１６ＴＧ）の構造を示す図である。
【図２】脂質ＨＤ−１６、ＨＤ−１８、ＨＥ−１６、ＨＥ−１８およびデキサメタゾン（ＤＸ）を、１，２−ｓｙｎ−ジオレオイルグリセロホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）および１，２−ｓｙｎ−ジオレオイルグリセロホスホコリン（ＤＯＰＣ）などの混合脂質や、Ｑ１６ＴＧなどのヘルパー脂質と併用したときの、Ｂ１６Ｆ１０細胞（マウスメラノーマ腫瘍細胞）に対する細胞毒性効果であって、ＭＴＴ試験にて濃度を１６〜４０μｍｏｌ／ｍＬとしたときをまとめたものである。細胞中の脂質がなくなるまでホルマザンを減少させたときの吸収量が１００であった。（Ａ）は、治療の２４時間後の試験であり、（Ｂ）は、治療の４８時間後の試験である。
【図３】脂質ＨＤ−１６、ＨＤ−１８、ＨＥ−１６、ＨＥ−１８およびＤＸｉを、ＤＯＰＣなどの混合脂質やＱ１６ＴＧなどのヘルパー脂質と併用したときの、Ａ５４９細胞（ヒト肺ガン細胞）に対する細胞毒性効果であって、ＭＴＴ試験にて濃度を１６〜４０μｍｏｌ／ｍＬとしたときをまとめたものである。細胞中の脂質がなくなるまでホルマザンを減少させたときの吸収量が１００であった。（Ａ）は、治療の２４時間後の試験であり、（Ｂ）は、治療の４８時間後の試験である。
【図４】脂質ＨＤ−１６、ＨＤ−１８、ＨＥ−１６、ＨＥ−１８およびＤＸを、混合脂質であるＤＯＰＣやヘルパー脂質であるＱ１６ＴＧと併用したときの、ＭＣＦ  ７細胞（マウス乳がん細胞）に対する細胞毒性効果であって、ＭＴＴ試験にて濃度を１６〜４０μｍｏｌ／ｍＬとしたときをまとめたものである。細胞中の脂質がなくなるまでホルマザンを減少させたときの吸収量が１００であった。（Ａ）は、治療の２４時間後の試験であり、（Ｂ）は、治療の４８時間後の試験である。
【図５】脂質ＨＤ−１６、ＨＤ−１８、ＨＥ−１６、ＨＥ−１８およびＤＸを、混合脂質であるＤＯＰＣやヘルパー脂質であるＱ１６ＴＧと併用したときの、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスターの卵巣細胞ガン）に対する細胞毒性効果であって、ＭＴＴ試験にて濃度を１６〜４０μｍｏｌ／ｍＬとしたときをまとめたものである。細胞中の脂質がなくなるまでホルマザンを減少させたときの吸収量が１００であった。（Ａ）は、治療の２４時間後の試験であり、（Ｂ）は、治療の４８時間後の試験である。
【図６】脂質ＨＤ−１６、ＨＤ−１８、ＨＥ−１６、ＨＥ−１８およびＤＸを、混合脂質であるＤＯＰＣやヘルパー脂質であるＱ１６ＴＧと併用したときの、Ｃ−２６細胞（マウス結腸ガン細胞）に対する細胞毒性効果であって、ＭＴＴ試験にて濃度を１６〜４０μｍｏｌ／ｍＬとしたときをまとめたものである。細胞中の脂質がなくなるまでホルマザンを減少させたときの吸収量が１００であった。（Ａ）は、治療の２４時間後の試験であり、（Ｂ）は、治療の４８時間後の試験である。
【図７】脂質１、２、３、４ＨＤ−１６、ＨＤ−１８、ＨＥ−１６、ＨＥ−１８およびＤＸを、混合脂質であるＤＯＰＣやヘルパー脂質であるＱ１６ＴＧと併用したときの、非ガン性で健康的なマウスマクロファージ細胞（Ｒａｗ２６４．７細胞）に対する細胞毒性効果であって、ＭＴＴ試験にて濃度を１６〜４０μｍｏｌ／ｍＬとしたときをまとめたものである。細胞中の脂質がなくなるまでホルマザンを減少させたときの吸収量が１００であった。（Ａ）は、治療の２４時間後の試験であり、（Ｂ）は、治療の４８時間後の試験である。
【図８】脂質ＨＤ−１６、ＨＤ−１８、ＨＥ−１６、ＨＥ−１８およびＤＸを、混合脂質であるＤＯＰＣやヘルパー脂質であるＱ１６ＴＧと併用したときの、健康的な非ガン性ＣＯＳ−１細胞に対する細胞毒性効果であって、ＭＴＴ試験にて濃度を１６〜４０μｍｏｌ／ｍＬとしたときをまとめたものである。細胞中の脂質がなくなるまでホルマザンを減少させたときの吸収量が１００であった。（Ａ）は、治療の２４時間後の試験であり、（Ｂ）は、治療の４８時間後の試験である。
【図９】ヒスチジン官能性を有する脂質ＨＤ−１６、ＨＤ−１８、ＨＥ−１６、ＨＥ−１８およびＤＸの、Ｂ１６Ｆ１０細胞に対するアポトーシス誘導性を示す。ヒスチジン官能性を有する脂質で治療されたＢ１６Ｆ１０細胞において、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）およびＰＥ（フィコエリトリン）の両方のシグナルが著しく増加することから、これら脂質の２４時間後のアポトーシス誘導性が確認できる。フローサイトメトリーの４分割（ＦＩＴＣｖｓＰＥ）において、左下（ＬＬ）の区画は、正常細胞を示しており、右下（ＬＲ）の区画は、早くに細胞自然死した細胞を示しており、ＦＩＴＣシグナルのみが増加している。一方、右上（ＵＲ）の区画は、遅くに細胞自然死した細胞を示しており、ＦＩＴＣおよびＰＥのシグナルが増加し、左上（ＵＬ）の区画は、壊死細胞を示しており、ＰＥシグナルのみが増加している。ヒスチジン官能性を有する脂質で治療された細胞では、未治療の細胞と比べて、ＵＲ、ＵＬおよびＬＲへのシフトが、２倍であり、顕著であることから、これら４つの脂質がアポトーシス誘導性をもつことが確認できる。
【図１０】ヒスチジン官能性を有する脂質ＨＤ−１６、ＨＤ−１８、ＨＥ−１６、ＨＥ−１８およびＤＸの、Ａ５４９ガン細胞に対するアポトーシス誘導性を示す。ヒスチジン官能性を有する脂質で治療されたＡ５４９細胞において、ＦＩＴＣおよびＰＥの両方のシグナルが著しく増加することから、これら脂質の２４時間後のアポトーシス誘導性が確認できる。フローサイトメトリーの４分割（ＦＩＴＣｖｓＰＥ）において、左下（ＬＬ）の区画は、正常細胞を示しており、右下（ＬＲ）の区画は、早くに細胞自然死した細胞を示しており、ＦＩＴＣシグナルのみが増加している。一方、右上（ＵＲ）の区画は、遅くに細胞自然死した細胞を示しており、ＦＩＴＣおよびＰＥのシグナルが増加し、左上（ＵＬ）の区画は、壊死細胞を示しており、ＰＥシグナルのみが増加している。ヒスチジン官能性を有する脂質で治療されたＡ５４９細胞では、未治療の細胞と比べて、ＵＲ、ＵＬおよびＬＲへのシフトが２倍であり、顕著であることから、これら４つの脂質がアポトーシス誘導性をもつことが確認できる。
【図１１】ヒスチジン官能性を有する脂質でＡ５４９細胞を２４時間治療した後の、（ＢＡＸ、ＢＡＫ、Ｃａｓｐａｓｅ３および９）と抗アポトーシス遺伝子（Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＮＦ−ｋＢ）の逆転写ＰＣＲ分析を示す。Ａ５４９細胞は、ヒスチジン官能性を有する脂質のリポソームを混合脂質であるＤＯＰＣおよびヘルパー脂質であるＱ１６ＴＧと併用し、濃度２５μＭ／ｍｌで治療した。４時間後、媒体を廃棄し、ウシ胎仔血清を１０％含むＤＭＥＭ媒体（シグマ）３ｍｌを、それぞれに添加して２４時間放置した。２４時間後、すべての細胞からｍＲＮＡを採取して、ｃＤＮＡは、逆転写反応により合成してポリメラーゼ連鎖反応により増幅させ、最後に２％のアガロースゲルに溶解させた。
【図１２】ヒスチジン官能性を有する脂質ＨＤ−１６（１）、ＨＤ−１８（２）、ＨＥ−１６（３）、ＨＥ−１８（４）およびデキサメタゾン（Ｄｘ）のそれぞれの腫瘍成長阻害性を示す。生後６〜８週で、悪性のメラノーマ腫瘍をもつ、メスのＣ５７ＢＬ／６マウス（０日目に、〜１×１０５のＢ１６Ｆ１０細胞を含む１００μＬのハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）を左の脇腹に皮下注射することにより作製）の複数（それぞれ体重が２０〜２２ｇ）を無作為に６つのグループに分類し、各グループ（ｎ＝５）に、カチオン性リポソームＨＤ−１６（薄緑）、ＨＥ−１６（深緑）、ＨＤ−１８（黒）、ＨＥ−１８（水色）、デキサメタゾン（赤）の、Ｑ１６ＴＧおよびＤＯＰＣのみのリポソーム製剤（対照、濃紺）を、１４日目、１６日目、１８日目、２１日目および２４日目に皮下注射した。腫瘍体積（垂直に測った腫瘍の長さの最大値をａ、最小値をｂとしたとき、Ｖ＝１／２．ａｂ２）を、ノギスにより、２３日間にわたって測定した。結果を、＋／−ＳＤ（ｎが５つの腫瘍）で表わしている（＊Ｐ＜０．０１ｖｓＨＤ１６、および、＊＊Ｐ＜０．００５ｖｓ対照）。Ｂは、２７日目に摘出したメラノーマ腫瘍のサンプルであり、Ｉは賦形剤のみで治療した腫瘍、IIはデキサメタゾンのみで治療した腫瘍、IIIはＨＥ−１８で治療した腫瘍、IVはＨＤ−１８で治療した腫瘍、ＶはＨＤ−１６で治療した腫瘍、VIはＨＥ−１６で治療した腫瘍である。
【図１３】腫瘍血管内皮細胞および腫瘍細胞の両方に細胞自然死をもたらす、ヒスチジン官能性を有する脂質の腫瘍成長阻害性を示す。メスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、皮下に、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞（１．５×１０５の細胞）が注入されており、その腫瘍は〜２０００ｍｍ３まで成長した。マウスには、カチオン性リポソームＨＤ−１６、ＨＥ−１６、そして、Ｑ１６ＴＧおよびＤＯＰＣのみのリポソーム製剤（対照）を、３日間連続して皮下注射した。マウスは注射の２４時間後には死亡した。その腫瘍を摘出し、凍結切片し、固定させた。固定させた凍結部分を、アポトーシス細胞を標識するための、ＴＵＮＥＬ（アポトーシスの生成に広く利用される、末端デオキシウリジン三リン酸のニック末端標識）試験用キットを用いて処理した（左から２番目の区画、緑）。その後、同一の腫瘍の凍結切片を、腫瘍血管内皮細胞を標識する、モノクローナル抗体ＶＥ−カドヘリンを用いて免疫染色した（左から３番目の区画、赤）。４番目の区画（左から）は、重畳イメージ（黄色）を示す。染色された腫瘍のスライドは、緑および赤のフィルターを用いて蛍光顕微鏡（１０倍率）で同じ箇所を観察された。左から１番目の区画は、明視野（Ｂａｒ＝２．０μｍ）で観察したときの組織構造を、２つのイメージ（２４時間および７２時間）で示している。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明によれば、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物の新規な系列が開示される。また、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物を作製するプロセス、より具体的には、アスパラギン酸およびグルタミン酸をベースとする、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物を作製するプロセスに関する。本発明の化合物は、抗ガン活性のような増殖抑制作用を示し、人間や動物の体内の様々なガン治療に有用である。ここで開示される、新規な、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物の薬剤活性組成物は、アポトーシスのシグナル伝達経路を通って、ガン細胞の細胞自然死（プログラム細胞死）を促す。
【００３３】
本発明の一実施態様は、式１に示す、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物である。
2016501887.tif 000009
（式１） 
式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立してＨ（hydrogen）または親油性部分であって、同時にＨ（hydrogen）ではなく、Ｘは、Ｃｌ（chlorine）またはＢｒ（bromine）であ
り、ｎは、炭素数１〜２であり、前記親油性部分が、Ｃ８−２４のアルキル基、モノ不飽和、ジ不飽和およびトリ不飽和のアルケニル基からなる群から選択される。
【００３４】
本発明の第２実施形態によれば、開示したヒスチジン頭部基をもつカチオン性脂質は、構造１で示され、Ｒ１およびＲ２がｎ−ヘキサデシルであり、Ｘ−が塩素イオンである。
2016501887.tif 000010
【００３５】
本発明の他の実施形態によれば、開示したヒスチジン官能性を有するカチオン性脂質は、構造２で示され、Ｒ１およびＲ２がｎ−オクタデシルであり、Ｘ−が塩素イオンである。
2016501887.tif 000011
【００３６】
本発明のさらに他の実施形態によれば、グルタミン酸をベースとするヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物は、構造３で示され、Ｒ１およびＲ２がｎ−ヘキサデシルであり、Ｘ−が塩素イオンである。
2016501887.tif 000012
【００３７】
本発明のさらに他の実施形態によれば、グルタミン酸をベースとする、ヒスチジン頭部基をもつカチオン性両親媒性化合物は、構造４で示され、Ｒ１およびＲ２がｎ−オクタデシルであり、Ｘ−が塩素イオンである。
2016501887.tif 000013
【００３８】
本発明のさらに他の実施形態によれば、構造ＡにおけるＲ１およびＲ２は、同時に水素でなければ、それぞれ独立して水素もしくは脂肪族炭化水素鎖である。
【００３９】
本発明のさらに他の実施形態によれば、構造ＡにおけるＲ１およびＲ２の基は、それぞれ独立してＣ８−２４のアルキル基、モノ−、ジ−またはトリ−の不飽和アルケニル基である。
【００４０】
本発明のさらに他の実施形態によれば、構造ＡにおけるＲ１およびＲ２は、同じであり、Ｃ８−２４のモノ不飽和アルケニル基である。
【００４１】
本発明のさらに他の実施形態によれば、構造ＡにおけるＸは、ハロゲン基から選択される。
【００４２】
本発明のさらに他の実施形態によれば、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物は、ヘルパー脂質と併用する。
【００４３】
本発明の他の観点によれば、混合脂質は、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルグリセロールからなる群から選択される。
【００４４】
本発明のさらに他の実施形態によれば、製剤の混合脂質は、ステロール群、中性のホスファチジルエタノールアミン、中性のホスファチジルコリンからなる群から選択される。
【００４５】
本発明のさらに他の実施形態によれば、混合脂質は、好ましくは、１，２−ｓｙｎ−ジ
オレオイルグリセロホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、および１，２−ｓｙｎ−ジオレオイルグリセロホスホコリン（ＤＯＰＣ）からなる群から選択される。
【００４６】
本発明の他の特徴によれば、用いる混合脂質がＤＯＰＣであり、ヘルパー脂質がＮ，Ｎ−ジ−ｎ−ヘキサデシル−Ｎ−［２−グアニジニル］エチル−Ｎ−メチルアンモニウムクロリド（Ｑ１６ＴＧ）である。
【００４７】
本発明の他の観点によれば、リポソーム製剤、カチオン性脂質と混合脂質とのモル比率が、１：１：１〜３：１：１である。
【００４８】
本発明のさらに他の実施形態によれば、カチオン性両親媒性化合物、混合脂質およびヘルパー脂質のモル比率が、好ましくは１：１：１である。
【００４９】
本発明のさらに他の観点によれば、化合物は、カチオン性両親媒性化合物の量が濃度２〜３０マイクロモルであるときに、細胞傷害性を示す。
【００５０】
本発明のさらに他の実施形態によれば、前記リポソーム製剤は、皮膚、皮下、皮内、鼻、静脈、筋肉内、腹腔内、もしくは肺の経路を介して投与される。
【００５１】
本発明の重要な観点によれば、前記化合物は、肺ガン、メラノーマ、乳ガン、結腸もしくは卵巣ガンなどの様々なガンの治療に有用である。
【００５２】
本発明のさらなる観点によれば、ヒスチジン官能性を有する脂質の前記リポソーム製剤は、マウスおよびヒトの両方のガン細胞株を細胞自然死に誘導する。
【００５３】
本発明のさらに他の特徴によれば、化合物は、ＢＣＬ−２（Ｂ−細胞リンパ腫２）阻害およびＢＡＸ（ＢＣＬ−２結合Ｘタンパク質）活性のシグナル伝達経路により、細胞自然死を促進させる。
【００５４】
本発明のさらに他の実施形態によれば、化合物は、システイン依存性でアスパラギン酸塩指向のプロテアーゼ３（カスパーゼ３）およびシステイン依存性でアスパラギン酸塩指向のプロテアーゼ９（カスパーゼ９）のシグナル伝達経路までを調整することにより、細胞自然死を促進させる。
【００５５】
本発明の他の特徴によれば、化合物は、生存促進性の核内因子κβ（ＮＦ−ｋＢ）のシグナル伝達を阻害することにより、細胞自然死を促進させる。
【００５６】
本発明の他の重要な観点によれば、前記脂質は、皮膚、皮下、皮内、静脈、筋肉内、腹腔内から動物の体内に投与することにより、腫瘍成長を抑制することができる。
【００５７】
本発明の他の実施形態によれば、ヒスチジン官能性を有する脂質は、腫瘍微小環境にある腫瘍細胞と同様に、腫瘍血管内皮細胞の細胞自然死を誘導する。
【００５８】
本発明の他の特徴によれば、ここに開示される化合物は、腫瘍微小環境にある腫瘍血管内皮細胞を死亡させることにより、血管新生を抑制する。
【００５９】
本発明のさらに他の実施形態によれば、前記化合物は、同じようなリポソーム製剤としたときに、商業的に入手可能な抗ガン剤であるデキサメタゾンと比べ、よりよい抗ガン活性を示す。
【００６０】
近年、ガン治療法は、手術、放射線治療、化学療法、もしくはこれらを組み合わせて行われている。これらの治療法の中でも、化学療法は、手術不可能なガンや転移性のガンには絶対に必要な方法となる。従来の化学療法薬（例えばシスプラチン、チオテパ、クロラムブシル、ドキソルビシン、パクリタキセルなど）では、薬剤耐性により効能が低下することが重要な問題となっている。従来、ガン治療のための多機能な抗ガン化学療法剤が報告されている（Willmann,J.K.等。Nat.Rev.Drug.Discov.2008,7,591）。
【００６１】
カチオン性脂質は、全身に適用できる遺伝子としてだけでなく、多くの治療薬となりうる医薬担体として、過去３０年間、多くの着目を集めている。１つのヒスチジン官能性を頭部基の付近に共有結合的にグラフト反応させると、カチオン性両親媒性化合物に遺伝子導入を高い効率で行えることが明らかとなっており、これは、生体膜融合が高まることに起因するものと推測される（Kumar, V.等 Gene. Ther. 2003, 10, 1206-1215; Karmali, P.P.等 Bioconjugate Chemistry 2006, 17, 159-171）。しかしながら、ヒスチジン官能
性を有するカチオン性両親媒性化合物を抗ガン化合物として用いることについては、これまで報告されていない。本発明は、アスパラギン酸およびグルタミン酸をベースとする、新規な、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物を合成する方法と、新規な抗ガン化合物としての治療可能性を明らかにする。また、本発明は、新規な、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物のリポソーム製剤について、マウスモデルの腫瘍内での腫瘍成長を抑制する特性を明らかにする。ここに開示されるカチオン性両親媒性化合物のリポソーム製剤は、増殖抑制作用を示し、人間や動物の体内のガン治療に有用である。ここに開示されるカチオン性両親媒性化合物は、健康的な非ガン性細胞ではなく、様々なガン細胞に、細胞自然死を促進させるように誘導する。また、本発明によれば、これらの新規なヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物のリポソーム製剤による、マウスモデルの腫瘍内での腫瘍成長阻害性が開示される。
【００６２】
本発明で開示される、ヒスチジン頭部基をもつカチオン性両親媒性化合物に共通する、新規な特有の構造的特徴は、以下を含む。（１）親水性基、ヒスチジンのイミダゾール基が、正電荷をもつ窒素の近くに位置すること、（２）ここに開示するカチオン性両親媒性化合物の分子構造が、アスパラギン酸およびグルタミン酸に基づいていること、（３）非極性の長鎖脂肪族がアスパラギン酸またはグルタミン酸にエステル結合により共有結合されていること。本発明によれば、最も恩恵を得られるのは、科学分野の中でもガン治療の分野である。本発明の実施によれば、「カチオン性」は、ヒスチジンのα−アミン基におけるプロトン化された窒素原子の一つである正電荷を示す。このようなカチオン特性によれば、カチオン性両親媒性化合物と、負電荷をもつ生物学的な細胞膜との相互作用を向上させ、その結果、ここに開示する抗ガン性分子の細胞取り込みを向上させる。
【００６３】
ここで開示する、ヒスチジン頭部基をもつカチオン性脂質は、ある共通の構造および官能基を有する。そのようなものとして、前記化合物は、式Ａおよび式Ｂの化合物からなる群から選択される。
2016501887.tif 000014
式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立してＨ（hydrogen）または親油性部分であって、同時にＨ（hydrogen）ではなく、Ｘは、Ｃｌ（chlorine）またはＢｒ（bromine）であ
り、前記親油性部分が、Ｃ８−２４のアルキル基、モノ不飽和、ジ不飽和、およびトリ不飽和のアルケニル基からなる群から選択される。
【００６４】
本発明の好ましい態様によれば、前記開示された、アスパラギン酸をベースとするカチオン性両親媒性化合物が、構造１で示され、Ｒ１およびＲ２がｎ−ヘキサデシルであり、Ｘ−が塩素イオンである。
【００６５】
本発明の他の好ましい第２の態様によれば、前記開示されたアスパラギン酸をベースとするカチオン性両親媒性化合物が、構造２で示され、Ｒ１およびＲ２がｎ−オクタデシルであり、Ｘ−が塩素イオンである。
【００６６】
本発明のさらに好ましい第３の態様によれば、前記開示されたグルタミン酸をベースとするカチオン性両親媒性化合物が、構造３で示され、Ｒ１およびＲ２がｎ−ヘキサデシルであり、Ｘ−が塩素イオンである。
【００６７】
本発明のさらに好ましい第４の態様によれば、前記開示されたグルタミン酸をベースとするカチオン性両親媒性化合物が、構造４で示され、Ｒ１およびＲ２がｎ−オクタデシルであり、Ｘ−が塩素イオンである。
【００６８】
本発明のカチオン性両親媒性化合物は、水溶液において脂質の複合体や凝集体の作製を促進させる親油性ドメインを有する。疎水性ドメインの親油性と、頭部基における極性のヒスチジンの親水性とは、カチオン性脂質が水溶液と直面したときに、第２の化合物の存在下もしくは不在下で、脂質凝集体が形成されるような状態となる。親油性のＲ１およびＲ２のグループは、例えば、（１）Ｃ８−２４の飽和アルキル基、および（２）１、２、３、４二重結合を含むＣ８−２２の不飽和アルケニル基である。ここに開示する、アスパラギン酸をベースとするヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物（Ｘ）を合成する合成方法としては、スキーム１に模式的に表される。アスパラギン酸をベースとするヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物（Ｘ、スキーム１）は、スキーム１に示す出発物アルコールに、適切に保護されたアスパラギン酸誘導体（Ｂｏｃ保護α−アミン基を含む）を結合することにより合成する。その結合物（中間物Ｉ、スキーム１）をＴＦＡにより脱保護し、得られるアミノ化合物（中間物II、スキーム１）をＮｉｍ，Ｎ□ジ−Ｂｏｃ−Ｌ−ヒスチジン誘導体にペプチド結合することにより、中間物III（スキ
ーム１）が得られる。中間物IIIを従来の方法で酸脱保護した後、アンバーリストＡ−２
６塩素イオン交換樹脂により塩素イオン交換し、目的とするカチオン性両親媒性化合物Ｘ（スキーム１）を得る。カチオン性両親媒性化合物Ｘの合成方法の詳細は、カチオン性両親媒性化合物１および２（代表的な例として）を合成する実施例１として下記に記載する。グルタミン酸をベースとするヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物（Ｙ、スキーム２）は、適切に保護されたグルタミン酸誘導体を用いて同様の方法を適用することにより合成する。カチオン性両親媒性化合物Ｙの合成方法の詳細は、下記の実施例２に記載する。スキーム１および２に示される、すべての合成した中間物や目的とするカチオン性両親媒性化合物の構造は、１Ｈ  ＮＭＲやＥＳＩ質量分析法により確認し、目的とするカチオン性両親媒性化合物の純度（＞９５％）は、移動相として、純粋なメタノール、および９５：５のメタノール：水（ｖ／ｖ）を用いた逆相分析ＨＰＬＣにより確認した。
ＨＰＬＣ条件：
システム：Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ｓｅｒｉｅｓ
カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ(Ｒ) １００，ＲＰ−１８ｅ（５μｍ）
移動相：メタノール（Ａ）；メタノール：水，９５：５，ｖ／ｖ，（Ｂ）．
流量：１．０  ｍＬ／ｍｉｎ
典型的なカラム圧力：６０−６５  Ｂａｒｓ
検出：ＵＶ  ａｔ  ２１０ｎｍ．
〔スキーム１〕
2016501887.tif 000015
〔スキーム２〕
2016501887.tif 000016
【００６９】
（製剤）
さらに、本発明によれば、開示されるカチオン性両親媒性化合物を適量と、生体高分子と、混合脂質とを含む新規な製剤が提供される。本発明の調剤薬には、製剤の貯蔵性を安定化させるため、もしくは分子の細胞内伝達を促進させるために、１またはそれ以上の、生理学的に許容できる物質が含まれていてもよい。本発明の実施によると、混合脂質は、１以上のヒスチジン官能性を有する両親媒性化合物を混合するときに有用である。ＤＯＰＣおよびＤＯＰＥは、ここで開示する両親媒性化合物と併用するのに優れた混合脂質であり、細胞内への伝達を促進させる。ＤＯＰＣおよびヘルパー脂質Ｑ１６ＴＧ（図１）は、開示する両親媒性化合物と併用する別の組み合わせであり、細胞内への伝達を促進させる。カチオン性両親媒性化合物と、混合脂質ＤＯＰＣおよびＱ１６ＴＧとのモル比率の好ましい範囲は、１：１：１である。前記範囲からかなり広い範囲に変更することも本発明の範囲内である。
【００７０】
一般的に、リポソームは、カチオン性両親媒性化合物と、混合脂質またはヘルパー脂質
（ＤＯＰＣおよびＤＯＰＥ、もしくはＤＯＰＣおよびＱ１６ＴＧ）とを、適切なモル比率で、ガラス瓶中のメタノールおよびクロロホルムに溶解させることにより作製される。溶媒を、水分フリーな窒素ガスを少量ずつ流しながら除去し、乾燥させた脂質膜を高真空下に６−８時間おいた。乾燥した脂質膜を、総体積が１ｍＬの滅菌脱イオン水に、少なくとも１２時間水和させ、カチオン性脂質の濃度を１ｍＭとした。リポソームを１−２分間攪拌して、脂質膜に付着するものを取り除き、超音波洗浄機（ULTRAsonik 28X）を用いて、室温で２−３分間、超音波洗浄し、多重膜小胞（ＭＬＶ）を作製した。ＭＬＶを、Ｔｉプローブ（Branson 450 ソニファイアーを、負荷サイクル１００％、出力２５Ｗで用いて）により、１−２分間、超音波洗浄し、純粋で半透明な溶液の構造で示されるような、小さな単層小胞（ＳＵＶｓ）を作製した。ここに開示されるヒスチジン頭部基をもつカチオン性両親媒性化合物は、１又はそれ以上の典型的なものを混合してもよく、前記生物活性のある分子を細胞／組織内への侵入を容易にさせるために、組み合わせて用いてもよい。
【００７１】
別の態様によれば、本発明で開示されるカチオン性両親媒性化合物は、ホスファチジルエタノールアミンやホスファチジルグリセロール等の他の脂質、もしくはヘルパー脂質と併用してもよい。前記治療製剤は、０−４℃で貯蔵するとよい。バクテリア成長を抑制し、その保存可能期間を延長させる物質は、例えばグリセロールを低濃度で安定的に作製できる試薬とともに含まれるとよい。特に、冷凍および解凍のサイクルは、製剤の効能を損なわせるおそれがあるので、注意されている。
【００７２】
さらに別の態様によれば、カチオン性両親媒性化合物の製剤、混合脂質（ＤＯＰＣおよびＤＯＰＥ、ＤＯＰＣおよびＱ１６ＴＧ）は、皮下、筋肉内および腹腔内などの他の経路に加え、静脈内に投与されてもよい。さらに、前記製剤は、体外の１０，０００セルに対して、ヒスチジン官能性を有する脂質の濃度が２−３０μモルの範囲で投与されるとよい。
【００７３】
（細胞毒性）
新規に発明されたヒスチジン官能性を有する脂質の抗ガン活性について理解するために、まず、ヒスチジン官能性を有する脂質について、悪性、または悪性でない様々な細胞株への細胞毒性効果を、ＭＴＴ試験により評価した。これら本発明の脂質について、脂質濃度を４−４０μモルの範囲とし、ＭＴＴに基づく細胞生存性試験を行うことにより、Ａ５４９、Ｂ１６Ｆ１０、ＭＣＦ−７、ＣＨＯ、Ｃ−２６、ＲＡＷ２６４．７、およびＣＯＳ−１細胞への細胞傷害性を評価した（図２−８）。黄色のテトラゾリウム塩（ＭＴＴ）は、ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ酵素によって、代謝的に活性な細胞から、不溶であるが、ＤＭＳＯおよびＭｅＯＨの混合物の添加により可溶化する、紫のホルマザン結晶を形成することにより、減少する。その色は分光光度法により定量化できる。それぞれの細胞タイプについて、細胞数と吸光度との間に線形関係があり、増殖の変化を正確、かつ直接的に定量化できることが確認された。脂質ＨＤ−１６（１）、ＨＥ−１６（３）およびＨＥ−１８（４）は、脂質濃度が最も高いときに（４０μモル）、治療の２４時間後における細胞生存率が１５−３０％近くであることが示されている。これらの脂質は、１５−２０μモルぐらいの範囲では、Ｂ１６Ｆ１０細胞において、２４時間後の細胞生存率が５０％であることが示されている。一方、４８時間後では、これら４つの脂質の効能が増加している（図２Ａ、Ｂ）。Ａ５４９細胞株においては、脂質ＨＤ−１６、ＨＤ−１８、ＨＥ−１６およびＨＥ−１８は、脂質濃度が最も高い４０μモルのときに、２４時間後の細胞生存率が２０−４０％であることが示されている。Ａ５４９細胞株において、全ての脂質は、脂質濃度が１０−１７μモルの範囲のときに、２４時間後の細胞生存率が５０％となることが示されている。これら４つの脂質は、４８時間後に、細胞毒性効果が向上することが示されている（図３Ａ、Ｂ）。ＭＣＦ−７細胞株においては、脂質ＨＤ−１６、ＨＥ−１６、ＨＤ−１８およびＨＥ−１８は、濃度が最も高いときに、２４時間後の細胞生存率が２０−３０％近くになることが示されている。一方、ＨＥ−１６およびＨＥ−１８
は、濃度が低くても、４８時間後と同様に、他の２つよりも強い細胞毒性効果を示す（図４Ａ、Ｂ）。本発明におけるもう一つの知見は、ヒスチジン官能性を有する脂質のすべてが、商業的に入手可能な類似の疎水性の抗ガン剤であるデキサメタゾンのリポソーム製剤よりも、３つのガン性細胞のすべてにおいて高い細胞毒性を示すことである。ＣＨＯ細胞株においては、脂質ＨＤ−１６、ＨＥ−１６およびＨＥ−１８が、４８時間後と同様に２４時間後に、最も高い細胞毒性を示す（図５Ａ−Ｂ）。Ｃ−２６細胞（マウス結腸ガン、図６Ａ、Ｂ）を、ヒスチジン官能性を有する脂質で治療したところ、同じような傾向が観察された。脂質ＨＤ−１６、ＨＥ−１６、ＨＤ−１８およびＨＥ−１８は、２４時間後および４８時間後に、正常なＲＡＷ−２６４．７細胞において細胞生存率が８０％以上であり（図７Ａ−Ｂ）、正常なＣＯＳ−１細胞において細胞生存率が〜７０％である（図８Ａ−Ｂ）ことが示されている。
【００７４】
（ヒスチジン官能性を有する脂質による体外でのアポトーシス誘導）
アポトーシス細胞死を定量化するため、ここで開示するヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物の、体外でのアポトーシス誘導の効能について、マウスメラノーマ（Ｂ１６Ｆ１０）およびヒトの肺ガンを悪性細胞のモデルとして、ＦＩＴＣ−アネキシンＶアポトーシス検出キット（シグマ）を用いたフローサイトメトリーにより検討した。この試験によれば、初期段階でアポトーシスを検出でき、簡単かつ効果的に行える（Dacharay-Prigent, J. 等、Blood 1993, 81, 2554-2565）。それは、ホスファチジルセリン（ＰＳ）が、アポトーシス誘導の直後に、細胞膜の内部の（細胞質の）リーフレットから外部の（細胞表面の）リーフレットへと転座されること、およびアネキシンＶタンパク質がＰＳと強く、かつ特別な親和性を有していることを生かしている（Zhang, G.等  BioTechniques 1997, 23, 525-531）。細胞の外部リーフレットで細胞自然死するＰＳは、単染色法で基準となる、蛍光標識されたアネキシンＶと結合することにより得られる。アネキシンＶ試験は、実行するのにちょうど１０分を要する一段階の方法である。その試験は、非酵素的であり、固化を必要とせず、また付着細胞および浮遊細胞の両方に安定である。この試験は、Ｂ１６Ｆ１０（図９）だけでなく、Ａ５４９細胞（図１０）でも行える。
【００７５】
Ｂ１６Ｆ１０細胞およびＡ５４９細胞は、４つのヒスチジン官能性を有する脂質、ＤＯＰＣおよびヘルパー脂質Ｑ１６ＴＧを含み、疎水性の抗ガン剤であるデキサメタゾンのリポソーム製剤（ヒスチジン官能性を有する脂質：ＤＯＰＣ：Ｑ１６ＴＧとのモル比率が１：１：１、２５μＭ／ｍＬ）を用いて治療された。ＤＯＰＣおよびヘルパー脂質Ｑ１６ＴＧのみの組み合わせ（モル比率１：１）を対照として用いた。治療の２４時間後、細胞は、アネキシンＶおよびＰＩ（メーカのプロトコルによる、シグマ）で染色され、フローサイトメトリー（BD FacsCanto II）により分析された。ＨＤ−１６およびＨＥ−１６は、
Ｂ１６Ｆ１０細胞およびＡ５４９細胞のいずれにおいてもアポトーシスを促進させることが示された。初期のアポトーシス細胞および後期のアポトーシス細胞の割合は、リポソームのデキサメタゾンおよび媒体物のみ（例えば、ＤＯＰＣおよびＱ１６ＴＧのみ）で治療した細胞と比べると著しく高い。両親媒性化合物の中でも、ＨＤ−１６およびＨＥ−１６は、ステアリル鎖をもつ、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物、およびデキサメタゾンのリポソーム製剤よりも、アポトーシスの誘導性において優れている。重要なことに、ヒスチジン官能性を有する脂質の４つすべて（１−４）は、２．７−３．７回であり、商業的に入手可能なデキサメタゾンのリポソーム製剤よりも、Ｂ１６Ｆ１０細胞のアポトーシス誘導性において、効率的であることが分かった。同様に、その製剤は、２．２−３．２回であり、商業的に入手可能なデキサメタゾンのリポソーム製剤よりも、Ａ５４９細胞のアポトーシス誘導性において、効率的であった。総合すれば、図９および１０によると、ここで開示されたヒスチジン官能性を有する脂質は、ガン細胞を細胞自然死に誘導できることが分かった。ヒスチジン官能性を有する脂質は、Ｂｃｌ−２およびＮＦ−κＢに基づく細胞生存経路を阻害する。
【００７６】
次に、ここで開示されるヒスチジン官能性を有する脂質による、体外におけるアポトーシス誘導性の観察から、メカニズム的に洞察するため、従来のＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）試験を行った。ヒスチジン官能性を有する脂質の、様々なアポトーシスのｍＲＮＡ発現への効果は、ＲＴ−ＰＣＲで分析された遺伝子と関連している。参考までに、ヒト肺ガン細胞（Ａ５４９）は、ＤＯＰＣおよびヘルパー脂質Ｑ１６ＴＧを含む（２５μＭ／ｍＬ）、ヒスチジン官能性を有する脂質のリポソーム製剤で治療され、治療されなかった細胞は、対照として用いた。２４時間後、全てのｍＲＮＡを、トリゾールを用いた従来の方法により分離した。ＲＴ−ＰＣＲ製造物は、２％のアガロースゲル電気泳動で分解され、臭化エチジウムで可視化された。ヒスチジン官能性を有する脂質のアポトーシス誘導性能が、抗アポトーシス性のＢｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬ遺伝子の転写を抑制することにより、また、アポトーシス促進性のＢＡＸおよびＢＡＫシグナルの伝達経路を活性化することにより、もたらされているという知見に至った。細胞がＨＤ−１６およびＨＥ−１６のリポソームで治療されたときに、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬのｍＲＮＡレベルが大きく減少する。しかし、他の２つの脂質ＨＤ−１８およびＨＥ−１８では、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬ遺伝子の大きな減少は確認されなかった。興味深いことに、脂質ＨＤ−１６、ＨＤ−１８、ＨＥ−１６およびＨＥ−１８は、アポトーシス促進性のＢＡＸにおいて発現上昇したのと同様に、カスパーゼ３およびカスパーゼ９においても発現上昇することが示された。１８Ｓ  ｍ−ＲＮＡは、全てのローディング対照として、全てのレーンで用いられた（図１１）。総合すれば、図１１によると、様々なアポトーシスのシグナル経路は、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物のリポソーム製剤により、培養しているガン細胞を活性化させることが分かる。
【００７７】
（体内での腫瘍成長抑制）
最後に、新規なヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物の治療能力について評価するため、ヒスチジン官能性を有する両親媒性化合物のリポソーム製剤を全身に適用して腫瘍成長抑制能を検討した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを体内のモデルの参考として用いた。悪性のＢ１６Ｆ１０メラノーマ腫瘍をもつ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物による腫瘍成長抑制がかなり大きいことが観察された。ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物は、変化しやすい長さのアルキル鎖をもつ（ＨＤ−１６、ＨＤ−１８、ＨＥ−１６、ＨＥ−１８）。対照のために、商業的に入手可能な疎水性の抗ガン剤であるデキサメタゾン（ヒスチジン官能性を有する脂質：ＤＯＰＣ：Ｑ１６ＴＧをモル比率１：１：１で含む）を腫瘍内に注射した。図１２（部分ＡおよびＢ）に示されるように、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物のリポソーム製剤、およびデキサメタゾンにより、対照として治療しなかったマウスと比べて、腫瘍成長を大きく抑制できることが観察された。しかし、ＨＤ−１６およびＨＥ−１６は、より高い腫瘍成長抑制能を示し、ＨＤ−１８、ＨＥ−１８およびデキサメタゾンのリポソーム製剤は、腫瘍成長の抑制が緩やかである（図１２）。ヒスチジン官能性を有する脂質、その他のリポソーム原料が、腫瘍成長抑制能で観察された媒介において重要な役割を担うことを確認するため、ＤＯＰＣおよびヘルパー脂質Ｑ１６ＴＧのみを含むリポソーム（モル比率で１：１含む）を対照として用いた。重要なことに、Ｑ１６ＴＧおよびＤＯＰＣのみを含む対照用のリポソーム製剤は、腫瘍成長抑制効果をまったく示さなかった（図１２）。ヒスチジン官能性を有する脂質は、腫瘍細胞および腫瘍血管内皮細胞の両方にアポトーシスを誘導できる。
【００７８】
腫瘍および腫瘍血管内皮細胞の両方の細胞自然死が、観察された腫瘍成長抑制よりも遅れているかどうかについてメカニズム的に洞察するため、免疫組織化学的な研究を行った。メスのＣ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞を注射し、腫瘍を１５日間、成長させて血管を新生させた。このとき、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物のリポソーム製剤と同様に、ＤＯＰＣおよびヘルパー脂質Ｑ１６ＴＧのみを含む対照用のリポソーム製剤を、悪性のＢ１６腫瘍（〜２０００ｍｍ３）をもつマウ
スに、３日間連続して注射した。マウスは３日目の注射の２４時間後には死亡した。その腫瘍を摘出し、凍結切片し、固定させ、固定した凍結部分を、プロメガのＴＵＮＥＬ試験用キットを用いて、アポトーシス細胞を標識するメーカのプロトコルに従って、着色した。続いて、腫瘍の凍結切片に、抗ＶＥ−カドヘリン単クローン抗体（内皮細胞マーカー、Satna Cruz）で免疫染色し、その後、腫瘍血管系を特定するために、テキサスレッドを付着させ、二次抗体処理した。蛍光顕微鏡により、緑（ＴＵＮＥＬ、陽性）および赤（内皮細胞、陽性）の蛍光が、かなりの量、視覚化された（図１３、部分ＡおよびＢ）。興味深いことに、図１３に示す融合区画Ｃ（部分ＡとＢとの混合）には、黄色、緑色、赤色があることが示されている。黄色（緑色と赤色との混合による）があることから、腫瘍血管内皮細胞において細胞自然死が生じていることが確認された。緑色蛍光で標識された細胞が多量にあることから、腫瘍細胞の細胞自然死が同時に生じていることが確認された。これらの知見から、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物のリポソーム製剤は、腫瘍細胞および腫瘍血管内皮細胞の両方を細胞自然死に誘導できるという考えに至った。
【００７９】
（適用）
本発明のプロセスは、頭部基の付近にヒスチジンを含む、アスパラギン酸をベースとするカチオン性両親媒性化合物を作製することに利用できる。本発明によれば、前記カチオン性両親媒性化合物と様々な混合脂質およびヘルパー脂質とを含む、新規なヒスチジン官能性を有する脂質のリポソーム組成物が提供される。カチオン性両親媒性化合物のリポソーム製剤は、悪性進行を抑制することができ、ヒトおよび動物の体内のガンを治療する方法に有用である。カチオン性両親媒性化合物は、様々なアポトーシスのシグナル伝達経路から細胞のアポトーシスを促進させることができる。ここで開示する化合物は、肺ガン、メラノーマ、乳ガン、結腸ガン、卵巣ガンなどの様々なタイプのガンの治療に有用である。また、その化合物は、他の抗ガン剤や遺伝子と組み合わせて治療に用いてもよい。新規な、ヒスチジン官能性を有する脂質は、皮下、皮内、静脈、筋肉内、腹腔内の経路から注入することにより動物体内の腫瘍成長を抑制でき、腫瘍血管内皮細胞および腫瘍細胞の両方を細胞自然死に誘導することができる。化合物は、腫瘍微小環境における腫瘍血管内皮細胞を死滅させることにより血管形成を抑制することができる。重要なことに、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物のリポソーム製剤は、商業的に入手可能な疎水性の抗ガン剤であるデキサメタゾンのリポソーム製剤よりも、体内外両方での腫瘍細胞のアポトーシス誘導性において、効果的である。本発明によれば、最も恩恵を得られるのは、医療科学分野でもガン治療においてである。
【実施例】
【００８０】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲は、これらにより限定されない。
【００８１】
（実施例１）
ＨＤ−１６〔２−（（Ｓ）−２−アンモニオ−３−（（Ｒ）−１，４−ビス（ヘキサデシルオキシ）−１，４−ジオキソブタン−２−イルアミノ）−３−オキソプロピル）−１Ｈ−イミダゾール−３−イウムクロリド〕の合成（スキーム１）：
ステップ（ａ）：固体ＨＯＢｔ（０．５８ｇ、３．７７ｍｍｏｌ）、ＤＩＭＡＰ（０．０９６ｇ、０．７ｍｍｏｌ）およびＥＤＣＩ（０．７２ｇ、３．７７ｍｍｏｌ）を、氷冷中で攪拌された、ドライＤＣＭ（１５ｍＬ）に溶解するＮαＢＯＣ−Ｌ−アスパラギン酸（０．４０ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）の溶液に順次添加した。３０分後、ドライＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解するｎ−ヘキサデシルアルコール（０．８０ｇ、３．７７ｍｍｏｌ）を、反応混合物に添加した。得られた溶液を室温で１２時間攪拌し続けた。その溶液をクロロホルム（８０ｍＬ）で希釈し、続いて、氷冷の１Ｎ  ＨＣｌ（２×８０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム（２×９０ｍＬ）および食塩水（１×６０ｍＬ）を用いて順次洗浄した。
その有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、回転式エバポレータを用いて、ろ過物から溶媒を取り除いた。その残留物に、６０−１２０メッシュのシリカゲルと、溶離剤として４％の酢酸エチル−ヘキサン（ｖ／ｖ）とを用いてカラムクロマトグラフ的な精製を行い、純粋な中間物Ｉを０．７０ｇ（収率６３％）得た（Ｒｆ＝０．８  ＴＬＣ展開溶媒として５％のクロロホルム−メタノール（ｖ／ｖ）を用いる）。
１Ｈ  ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝０．９［ｍ，６Ｈ，ＣＨ３−（ＣＨ２）１５−］；１．１−１．６［ｂｓ，５２Ｈ，−（ＣＨ２）１３−；ｍ，４Ｈ，−（ＣＨ２）１３−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ｓ，９Ｈ，ＣＯ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）３］；２．４−２．８［ｍ，２Ｈ，ＡｓｐＣβＨ２］；３．２−３．３［ｍ，４Ｈ，ｔ，４Ｈ，−（ＣＨ２）１４−ＣＨ２−Ｏ−］；４．３［ｍ，１Ｈ，ＡｓｐＣαＨ］；６．１−６．３［ｍ，１Ｈ，ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ３）３］；
ＥＳＩＭＳ：ｍ／ｚ＝６８１［Ｍ＋１］＋ｆｏｒ Ｃ４１Ｈ７９ＮＯ６
【００８２】
ステップ（ｂ）：ステップ（ａ）で作製した中間物Ｉ（０．５５ｇ、０．８８ｍｍｏｌ）をドライＤＣＭ（８ｍＬ）に溶解させ、０℃でＴＦＡ（４ｍＬ）を添加した。得られた溶液を０℃で３時間攪拌し続け、完全に脱保護させた。窒素でフラッシングすることにより過剰なＴＦＡを除去した。得られた化合物をクロロホルム（８０ｍＬ）に溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（３×９０ｍＬ）、食塩水（１×７０ｍＬ）で洗浄した。その有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、回転式エバポレータを用いて、ろ過物から溶媒を除去することにより、中間物IIIとして遊離アミンを０．４１ｇ（収率９１％）得た
（Ｒｆ＝０．２  ＴＬＣ展開溶媒として１０％のメタノール−クロロホルム（ｖ／ｖ）を用いる）。
【００８３】
ステップ（ｃ）：固体ＨＯＢｔ（０．１５ｇ、１．００ｍｍｏｌ）およびＥＤＣＩ（０．１９ｇ、１．００ｍｍｏｌ）を、氷冷中で攪拌された、ドライＤＣＭ（１５ｍＬ）に溶解するＮα，Ｎω−ジ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−ヒスチジン（０．３６ｇ、１．００ｍｍｏｌ）の溶液に順次添加した。３０分後、ステップ（ｂ）で得られた中間物II（０．４２０ｇ、０．８１０ｍｍｏｌ）をドライＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させ、反応混合物に添加した。攪拌した反応混合物に、ジ−イソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を、リトマスでアルカリ性となるまで、液滴して添加した。得られた溶液を室温で１２時間攪拌し続けた。その溶液をクロロホルム（１００ｍＬ）で希釈し、続いて、氷冷の１Ｎ
ＨＣｌ（２×８０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム（２×７０ｍＬ）および食塩水（１×８０ｍＬ）を用いて順次洗浄した。その有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、回転式エバポレータを用いて、ろ過物から溶媒を取り除いた。その残留物に、６０−１２０メッシュのシリカゲルと、溶離剤として１．５％のクロロホルム−メタノール（ｖ／ｖ）とを用いてカラムクロマトグラフ的な精製を行い、純粋な中間物IIIを０．３８ｇ
（収率５５％）得た（Ｒｆ＝０．５  ＴＬＣ展開溶媒として０．５％のクロロホルム−メタノール（ｖ／ｖ）を用いる）。
１Ｈ  ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝０．８［ｍ，６Ｈ，ＣＨ３−（ＣＨ２）１５−］；１．０−１．６［ｂｓ，５２Ｈ，−（ＣＨ２）１３−；ｓ，９Ｈ，ＣＯ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）３；ｍ，４Ｈ，−（ＣＨ２）１３−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−；ｓ，９Ｈ，ＣＯ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）３］；２．３−２．９［ｍ，２Ｈ，ＡｓｐＣβＨ２］；３．０−３．２［ｍ，４Ｈ，ｔ，４Ｈ，−（ＣＨ２）１４−ＣＨ２−Ｏ−；ｍ，２Ｈ，ＨｉｓＣβＨ］；４．２−４．６［ｍ，１Ｈ，ＡｓｐＣαＨ；ｍ，１Ｈ，ＨｉｓＣαＨ］；６．０［ｍ，１Ｈ，ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ３）３］；６．５［ｍ，１Ｈ，ＡｓｐＣαＨ−ＮＨ−ＣＯ］；７．７−８．４［ｍ，２Ｈ，Ｈｉｓ−ｒｉｎｇ］
ＥＳＩＭＳ：ｍ／ｚ＝９１９［Ｍ＋１］＋ｆｏｒ Ｃ５２Ｈ９６Ｎ４Ｏ９
【００８４】
ステップ（ｄ）：ステップ（ｃ）で作製した、氷冷した中間物III（０．２ｇ、０．０
２ｍｍｏｌ）の溶液を２ｍＬのＤＣＭに溶解させた。１ｍＬのＴＦＡを添加し、その混合
物を３−４時間、攪拌した。窒素を流してＴＦＡを除去し、その残留物を、アンバーリストＡ−２６塩素イオン交換樹脂を用いた塩素イオン交換クロマトグラフィにかけた。得られた化合物を、１：５（ｖ／ｖ）のＭｅＯＨ：アセトンから再結晶の上で塩素イオン交換することにより、白い固体として、純粋な目的とする化合物ＨＤ−１６を０．０９４ｇ（収率４７％）得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３＋ＣＤ３ＯＤ）：δ／ｐｐｍ＝０．８［ｍ，６Ｈ，ＣＨ３−（ＣＨ２）１５−］；１．０−１．６［ｂｓ，５２Ｈ，−（ＣＨ２）１３−；ｍ，４Ｈ，−（ＣＨ２）１３−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ］；２．２［ｍ，１Ｈ，ＡｓｐＣβＨ］；２．６［ｍ，１Ｈ，ＡｓｐＣβＨ］；３．０−４．６［ｍ，４Ｈ，ｔ，４Ｈ，−（ＣＨ２）１３−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−；ｍ，２Ｈ，ＨｉｓＣβＨ；ｍ，１Ｈ，ＡｓｐＣαＨ；ｍ，１Ｈ，ＨｉｓＣαＨ＋ＣＤ３ＯＨ＋ＣＨ３ＯＤ］；８．５−８．６［ｍ，２Ｈ，Ｈｉｓ−ｒｉｎｇ］
ＥＳＩＭＳ：ｍ／ｚ＝７１９［Ｍ＋１］＋ｆｏｒ Ｃ４２Ｈ８０Ｎ４Ｏ５
【００８５】
（実施例２）
ＨＤ−１８〔２−（（Ｓ）−２−アンモニオ−３−（（Ｒ）−１，４−ビス（オクタデシルオキシ）−１，４−ジオキソブタン−２−イルアミノ）−３−オキソプロピル）−１Ｈ−イミダゾール−３−イウムクロリド〕の合成（スキーム１）
ステップ（ａ）：固体ＨＯＢｔ（０．５８ｇ、３．７７ｍｍｏｌ）、ＤＩＭＡＰ（０．０９６ｇ、０．７ｍｍｏｌ）およびＥＤＣＩ（０．７２ｇ、３．７７ｍｍｏｌ）を、氷冷中で攪拌された、ドライＤＣＭ（１５ｍＬ）に溶解するＮαＢＯＣ−Ｌ−アスパラギン酸（０．４０ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）の溶液に順次添加した。３０分後、ドライＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解するｎ−オクタデシルアルコール（０．８０ｇ、３．７７ｍｍｏｌ）を、反応混合物に添加した。得られた溶液を室温で１２時間攪拌し続けた。その溶液をクロロホルム（８０ｍＬ）で希釈し、続いて、氷冷の１Ｎ  ＨＣｌ（２×８０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム（２×９０ｍＬ）および食塩水（１×６０ｍＬ）を用いて順次洗浄した。その有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、回転式エバポレータを用いて、ろ過物から溶媒を取り除いた。その残留物に、６０−１２０メッシュのシリカゲルと、溶離剤として４％の酢酸エチル−ヘキサン（ｖ／ｖ）とを用いてカラムクロマトグラフ的な精製を行い、純粋な中間物Ｉを０．７０ｇ（収率６３％）得た（Ｒｆ＝０．８  ＴＬＣ展開溶媒として５％のクロロホルム−メタノール（ｖ／ｖ）を用いる）。
１Ｈ  ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝０．９［ｍ，６Ｈ，ＣＨ３−（ＣＨ２）１７−］；１．１−１．６［ｂｓ，６０Ｈ，−（ＣＨ２）１５−；ｍ，４Ｈ，−（ＣＨ２）１５−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ｓ，９Ｈ，ＣＯ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）３］；２．４−２．８［ｍ，２Ｈ，ＡｓｐＣβＨ２］；３．２−３．３［ｍ，４Ｈ，ｔ，４Ｈ，−（ＣＨ２）１６−ＣＨ２−Ｏ−］；４．３［ｍ，１Ｈ，ＡｓｐＣαＨ］；６．１−６．３［ｍ，１Ｈ，ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ３）３］；
ＥＳＩＭＳ：ｍ／ｚ＝７３７［Ｍ＋１］＋ｆｏｒ Ｃ４５Ｈ８７ＮＯ６
【００８６】
ステップ（ｂ）：ステップ（ａ）で作製した中間物Ｉ（０．５５ｇ、０．８８ｍｍｏｌ）をドライＤＣＭ（８ｍＬ）に溶解させ、０℃でＴＦＡ（４ｍＬ）を添加した。得られた溶液を０℃で３時間攪拌し続け、完全に脱保護させた。窒素でフラッシングすることにより過剰なＴＦＡを除去した。得られた化合物をクロロホルム（８０ｍＬ）に溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（３×９０ｍＬ）、食塩水（１×７０ｍＬ）で洗浄した。その有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、回転式エバポレータを用いて、ろ過物から溶媒を除去することにより、中間物IIとして遊離アミンを０．４１ｇ（収率９１％）得た（Ｒｆ＝０．２  ＴＬＣ展開溶媒として１０％のメタノール−クロロホルム（ｖ／ｖ）を用いる）。
【００８７】
ステップ（ｃ）：固体ＨＯＢｔ（０．１５ｇ、１．００ｍｍｏｌ）およびＥＤＣＩ（０
．１９ｇ、１．００ｍｍｏｌ）を、氷冷中で攪拌された、ドライＤＣＭ（１５ｍＬ）に溶解するＮα，Ｎω−ジ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−ヒスチジン（０．３６ｇ、１．００ｍｍｏｌ）の溶液に順次添加した。３０分後、ステップ（ｂ）で得られた中間物II（０．４２０ｇ、０．８１０ｍｍｏｌ）をドライＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させ、反応混合物に添加した。攪拌した反応混合物に、ジ−イソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を、リトマスでアルカリ性となるまで、液滴して添加した。得られた溶液を室温で１２時間攪拌し続けた。その溶液をクロロホルム（１００ｍＬ）で希釈し、続いて、氷冷の１Ｎ
ＨＣｌ（２×８０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム（２×７０ｍＬ）および食塩水（１×８０ｍＬ）を用いて順次洗浄した。その有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、回転式エバポレータを用いて、ろ過物から溶媒を取り除いた。その残留物に、６０−１２０メッシュのシリカゲルと、溶離剤として１．５％のクロロホルム−メタノール（ｖ／ｖ）とを用いてカラムクロマトグラフ的な精製を行い、純粋な中間物IIIを０．３８ｇ
（収率５５％）得た（Ｒｆ＝０．５  ＴＬＣ展開溶媒として０．５％のクロロホルム−メタノール（ｖ／ｖ）を用いる）。
１Ｈ  ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝０．８［ｍ，６Ｈ，ＣＨ３−（ＣＨ２）１７−］；１．０−１．６［ｂｓ，５２Ｈ，−（ＣＨ２）１５−；ｓ，９Ｈ，ＣＯ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）３；ｍ，４Ｈ，−（ＣＨ２）１５−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−；ｓ，９Ｈ，ＣＯ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）３］；２．３−２．９［ｍ，２Ｈ，ＡｓｐＣβＨ２］；３．０−３．２［ｍ，４Ｈ，ｔ，４Ｈ，−（ＣＨ２）１６−ＣＨ２−Ｏ−；ｍ，２Ｈ，ＨｉｓＣβＨ］；４．２−４．６［ｍ，１Ｈ，ＡｓｐＣαＨ；ｍ，１Ｈ，ＨｉｓＣαＨ］；６．０［ｍ，１Ｈ，ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ３）３］；６．５［ｍ，１Ｈ，ＡｓｐＣαＨ−ＮＨ−ＣＯ］；７．７−８．４［ｍ，２Ｈ，Ｈｉｓ−ｒｉｎｇ］
ＥＳＩＭＳ：ｍ／ｚ＝９７５［Ｍ＋１］＋ｆｏｒ Ｃ５６Ｈ１０４Ｎ４Ｏ９
【００８８】
ステップ（ｄ）：ステップ（ｃ）で作製した、氷冷した中間物III（０．２ｇ、０．０
２ｍｍｏｌ）の溶液を２ｍＬのＤＣＭに溶解させた。１ｍＬのＴＦＡを添加し、その混合物を３−４時間、攪拌した。窒素を流してＴＦＡを除去し、その残留物を、アンバーリストＡ−２６塩素イオン交換樹脂を用いた塩素イオン交換クロマトグラフィにかけた。得られた化合物を、１：５（ｖ／ｖ）のＭｅＯＨ：アセトンから再結晶の上で塩素イオン交換することにより、白い固体として、純粋な目的とする化合物ＨＤ−１８を０．０９４ｇ（収率４７％）得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３＋ＣＤ３ＯＤ）：δ／ｐｐｍ＝０．８［ｍ，６Ｈ，ＣＨ３−（ＣＨ２）１７−］；１．０−１．６［ｂｓ，５２Ｈ，−（ＣＨ２）１５−；ｍ，４Ｈ，−（ＣＨ２）１５−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ］；２．２［ｍ，１Ｈ，ＡｓｐＣβＨ］；２．６［ｍ，１Ｈ，ＡｓｐＣβＨ］；３．０−４．６［ｍ，４Ｈ，ｔ，４Ｈ，−（ＣＨ２）１５−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−；ｍ，２Ｈ，ＨｉｓＣβＨ；ｍ，１Ｈ，ＡｓｐＣαＨ；ｍ，１Ｈ，ＨｉｓＣαＨ＋ＣＤ３ＯＨ＋ＣＨ３ＯＤ］；８．５−８．６［ｍ，２Ｈ，Ｈｉｓ−ｒｉｎｇ］
ＥＳＩＭＳ：ｍ／ｚ＝７７５［Ｍ＋１］＋ｆｏｒ Ｃ４２Ｈ８０Ｎ４Ｏ５
【００８９】
（実施例３）
ＨＥ−１６〔２−（（Ｓ）−２−アンモニオ−３−（（Ｒ）−１，５−ビス（ヘキサデシルオキシ）−１，５−ジオキソペンタン−２−イルアミノ）−３−オキソプロピル）−１Ｈ−イミダゾール−３−イウムクロリド〕の合成（スキーム２）
ステップ（ａ）：固体ＨＯＢｔ（０．７６ｇ、４．９６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．９４ｇ、４．９６ｍｍｏｌ）およびＤＩＭＡＰ（０．０９６ｇ、０．７ｍｍｏｌ）を、氷冷中で攪拌された、ドライＤＣＭ（１５ｍＬ）に溶解するＮαＢＯＣ−Ｌ−グルタミン酸（０．５０ｇ、１．９ｍｍｏｌ）の溶液に順次添加した。３０分後、ドライＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解するｎ−ヘキサデシルアルコール（１．１９ｇ、４．９６ｍｍｏｌ）を、反応混合物に添加した。得られた溶液を室温で１２時間攪拌し続けた。その溶液をクロロホル
ム（８０ｍＬ）で希釈し、続いて、氷冷の１Ｎ  ＨＣｌ（２×８０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム（２×９０ｍＬ）および食塩水（１×６０ｍＬ）を用いて順次洗浄した。その有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、回転式エバポレータを用いて、ろ過物から溶媒を取り除いた。その残留物に、６０−１２０メッシュのシリカゲルと、溶離剤として４％の酢酸エチル−ヘキサン（ｖ／ｖ）とを用いてカラムクロマトグラフ的な精製を行い、純粋な中間物Ｉを１．２０ｇ（収率７３％）得た（Ｒｆ＝０．８  ＴＬＣ展開溶媒として５％のクロロホルム−メタノール（ｖ／ｖ）を用いる）。
中間物Ｉ、ＨＥ−１６：
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝０．９［ｍ，６Ｈ，ＣＨ３−（ＣＨ２）１５−］；１．１−１．６［ｂｓ，４４Ｈ，−（ＣＨ２）１３−；ｍ，４Ｈ，−（ＣＨ２）１３−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ｓ，９Ｈ，ＣＯ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）３］；２．４−２．８［ｍ，４Ｈ，ＧｌｕＣβ，γＨ２］；３．２−３．３［ｍ，４Ｈ，ｔ，４Ｈ，−（ＣＨ２）１４−ＣＨ２−Ｏ−］；４．３［ｍ，１Ｈ，ＧｌｕＣαＨ，ｍ，２Ｈ，ＣＨ３−（ＣＨ２）１３−０−ＣＯ−ＣαＨ］．
ＥＳＩＭＳ：ｍ／ｚ＝６９５［Ｍ＋１］＋ｆｏｒ Ｃ４２Ｈ８１ＮＯ６
【００９０】
ステップ（ｂ）：ステップ（ａ）で作製した中間物Ｉ（０．５ｇ、０．８ｍｍｏｌ）をドライＤＣＭ（４ｍＬ）に溶解させ、０℃でＴＦＡ（２ｍＬ）を添加した。得られた溶液を０℃で３時間攪拌し続け、完全に脱保護させた。窒素でフラッシングすることにより過剰なＴＦＡを除去した。得られた化合物をクロロホルム（８０ｍＬ）に溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（３×９０ｍＬ）、食塩水（１×７０ｍＬ）で洗浄した。その有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、回転式エバポレータを用いて、ろ過物から溶媒を除去することにより、中間物IIとして遊離アミンを０．４１ｇ（収率９１％）得た。
【００９１】
ステップ（ｃ）：固体ＨＯＢｔ（０．１５ｇ、１．００ｍｍｏｌ）およびＥＤＣＩ（０．１９ｇ、１．００ｍｍｏｌ）を、氷冷中で攪拌された、ドライＤＣＭ（１５ｍＬ）に溶解するＮα，Ｎω−ジ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−ヒスチジン（０．２８ｇ、０．７９ｍｍｏｌ）の溶液に順次添加した。３０分後、ステップ（ｂ）で得られた中間物II（０．４１０ｇ、０．６６０ｍｍｏｌ）をドライＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させ、反応混合物に添加した。攪拌した反応混合物に、ジ−イソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を、リトマスでアルカリ性となるまで、液滴して添加した。得られた溶液を室温で１２時間攪拌し続けた。その溶液をクロロホルム（１００ｍＬ）で希釈し、続いて、氷冷の１Ｎ
ＨＣｌ（２×８０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム（２×７０ｍＬ）および食塩水（１×８０ｍＬ）を用いて順次洗浄した。その有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、回転式エバポレータを用いて、ろ過物から溶媒を取り除いた。その残留物に、６０−１２０メッシュのシリカゲルと、溶離剤として１．５％のクロロホルム−メタノール（ｖ／ｖ）とを用いてカラムクロマトグラフ的な精製を行い、純粋な中間物IIIを０．３８ｇ
（収率５５％）得た（Ｒｆ＝０．５  ＴＬＣ展開溶媒として０．５％のクロロホルム−メタノール（ｖ／ｖ）を用いる）。
中間物III、ＨＥ−１６：
１Ｈ  ＮＭＲ：（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝０．９［ｍ，６Ｈ，ＣＨ３−（ＣＨ２）１５−］；１．１−１．６［ｂｓ，４４Ｈ，−（ＣＨ２）１３−；ｍ，４Ｈ，−（ＣＨ２）１３−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ｓ，１８Ｈ，ＣＯ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）３］；２．４−２．８［ｍ，４Ｈ，ＧｌｕＣβ，γＨ２］；３．０−３．２［ｍ，４Ｈ，ｔ，４Ｈ，−（ＣＨ２）１２−ＣＨ２−Ｏ−；ｍ，２Ｈ，ＨｉｓＣβＨ］；３．２−３．３［ｍ，４Ｈ，ｔ，４Ｈ，−（ＣＨ２）１４−ＣＨ２−Ｏ−］；４．２−４．４［ｍ，１Ｈ，ＧｌｕＣαＨ；ｍ，１Ｈ，ＨｉｓＣαＨ；ｍ，］７．２−８．４［ｍ，２Ｈ，Ｈｉｓ−ｒｉｎｇ］
ＥＳＩＭＳ：ｍ／ｚ＝９３４［Ｍ＋１］＋ｆｏｒ Ｃ５３Ｈ９５Ｎ４Ｏ９
【００９２】
ステップ（ｄ）：ステップ（ｃ）で作製した、氷冷した中間物III（０．２ｇ、０．０
２ｍｍｏｌ）の溶液を２ｍＬのＤＣＭに溶解させた。１ｍＬのＴＦＡを添加し、その混合物を３−４時間、攪拌した。窒素を流してＴＦＡを除去し、その残留物を、アンバーリストＡ−２６塩素イオン交換樹脂を用いた塩素イオン交換クロマトグラフィにかけた。得られた化合物を、１：５（ｖ／ｖ）のＭｅＯＨ：アセトンから再結晶の上で塩素イオン交換することにより、白い固体として、純粋な目的とする化合物ＨＥ−１６を０．０９４ｇ（収率４７％）得た（Ｒｆ＝〜０．３、１０％メタノール−クロロホルム、ｖ／ｖ）。
ＨＥ−１６：
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３＋ＣＤ３ＯＤ）：δ／ｐｐｍ＝０．８［ｍ，６Ｈ，ＣＨ３−（ＣＨ２）１５−］；１．０−１．６［ｂｓ，４４Ｈ，−（ＣＨ２）１３−；ｍ，４Ｈ，−（ＣＨ２）１３−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ］；２．２［ｍ，１Ｈ，ＧｌｕＣβＨ］；２．６［ｍ，１Ｈ，ＧｌｕＣβＨ］；３．０−４．６［ｍ，４Ｈ，ｔ，４Ｈ，−（ＣＨ２）１３−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−；ｍ，２Ｈ，ＨｉｓＣβＨ；ｍ，１Ｈ，ＧｌｕＣαＨ；ｍ，１Ｈ，ＨｉｓＣαＨ＋ＣＤ３ＯＨ＋ＣＨ３ＯＤ］；７．５［ｍ，２Ｈ，Ｈｉｓ−ｒｉｎｇ］
ＥＳＩＭＳ：ｍ／ｚ＝７３２［Ｍ＋１］＋ｆｏｒ Ｃ４３Ｈ８２Ｎ４Ｏ５
【００９３】
（実施例４）
ＨＥ−１８〔２−（（Ｓ）−２−アンモニオ−３−（（Ｒ）−１，５−ビス（オクタデシルオキシ）−１，５−ジオキソペンタン−２−イルアミノ）−３−オキソプロピル）−１Ｈ−イミダゾール−３−イウムクロリド〕の合成（スキーム２）
ステップ（ａ）：固体ＨＯＢｔ（０．７６ｇ、４．９６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．９４ｇ、４．９６ｍｍｏｌ）およびＤＩＭＡＰ（０．０９６ｇ、０．７ｍｍｏｌ）を、氷冷中で攪拌された、ドライＤＣＭ（１５ｍＬ）に溶解するＮαＢＯＣ−Ｌ−グルタミン酸（０．５０ｇ、１．９ｍｍｏｌ）の溶液に順次添加した。３０分後、ドライＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解するｎ−オクタデシルアルコール（１．１９ｇ、４．９６ｍｍｏｌ）を、反応混合物に添加した。得られた溶液を室温で１２時間攪拌し続けた。その溶液をクロロホルム（８０ｍＬ）で希釈し、続いて、氷冷の１Ｎ  ＨＣｌ（２×８０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム（２×９０ｍＬ）および食塩水（１×６０ｍＬ）を用いて順次洗浄した。その有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、回転式エバポレータを用いて、ろ過物から溶媒を取り除いた。その残留物に、６０−１２０メッシュのシリカゲルと、溶離剤として４％の酢酸エチル−ヘキサン（ｖ／ｖ）とを用いてカラムクロマトグラフ的な精製を行い、純粋な中間物Ｉを１．２０ｇ（収率７３％）得た（Ｒｆ＝０．８  ＴＬＣ展開溶媒として５％のクロロホルム−メタノール（ｖ／ｖ）を用いる）。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝０．９［ｍ，６Ｈ，ＣＨ３−（ＣＨ２）１７−］；１．１−１．６［ｂｓ，４４Ｈ，−（ＣＨ２）１３−；ｍ，４Ｈ，−（ＣＨ２）１５−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ｓ，９Ｈ，ＣＯ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）３］；２．４−２．８［ｍ，４Ｈ，ＧｌｕＣβ，γＨ２］；３．２−３．３［ｍ，４Ｈ，ｔ，４Ｈ，−（ＣＨ２）１４−ＣＨ２−Ｏ−］；４．３［ｍ，１Ｈ，ＧｌｕＣαＨ，ｍ，２Ｈ，ＣＨ３−（ＣＨ２）１３−ＮＨ−ＣＯ−ＣαＨ］．
ＥＳＩＭＳ：ｍ／ｚ＝７５１［Ｍ＋１］＋ｆｏｒ Ｃ４６Ｈ８９ＮＯ６
【００９４】
ステップ（ｂ）：ステップ（ａ）で作製した中間物Ｉ（０．５ｇ、０．８ｍｍｏｌ）をドライＤＣＭ（４ｍＬ）に溶解させ、０℃でＴＦＡ（２ｍＬ）を添加した。得られた溶液を０℃で３時間攪拌し続け、完全に脱保護させた。窒素でフラッシングすることにより過剰なＴＦＡを除去した。得られた化合物をクロロホルム（８０ｍＬ）に溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（３×９０ｍＬ）、食塩水（１×７０ｍＬ）で洗浄した。その有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、回転式エバポレータを用いて、ろ過物から溶媒を除去することにより、中間物IIとして遊離アミンを０．４１ｇ（収率９１％）得た。
【００９５】
ステップ（ｃ）：固体ＨＯＢｔ（０．１５ｇ、１．００ｍｍｏｌ）およびＥＤＣＩ（０．１９ｇ、１．００ｍｍｏｌ）を、氷冷中で攪拌された、ドライＤＣＭ（１５ｍＬ）に溶解するＮα，Ｎω−ジ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−ヒスチジン（０．２８ｇ、０．７９ｍｍｏｌ）の溶液に順次添加した。３０分後、ステップ（ｂ）で得られた中間物II（０．４１０ｇ、０．６６０ｍｍｏｌ）をドライＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させ、反応混合物に添加した。攪拌した反応混合物に、ジ−イソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を、リトマスでアルカリ性となるまで、液滴して添加した。得られた溶液を室温で１２時間攪拌し続けた。その溶液をクロロホルム（１００ｍＬ）で希釈し、続いて、氷冷の１Ｎ
ＨＣｌ（２×８０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム（２×７０ｍＬ）および食塩水（１×８０ｍＬ）を用いて順次洗浄した。その有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、回転式エバポレータを用いて、ろ過物から溶媒を取り除いた。その残留物に、６０−１２０メッシュのシリカゲルと、溶離剤として１．５％のクロロホルム−メタノール（ｖ／ｖ）とを用いてカラムクロマトグラフ的な精製を行い、純粋な中間物IIIを０．３８ｇ
（収率５５％）得た（Ｒｆ＝０．５  ＴＬＣ展開溶媒として０．５％のクロロホルム−メタノール（ｖ／ｖ）を用いる）。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ＝０．９［ｍ，６Ｈ，ＣＨ３−（ＣＨ２）１７−］；１．１−１．６［ｂｓ，４４Ｈ，−（ＣＨ２）１５−；ｍ，４Ｈ，−（ＣＨ２）１５−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ｓ，１８Ｈ，ＣＯ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）３］；３−３．３［ｍ，４Ｈ，ＧｌｕＣβ，γＨ２］；３．３−３．５［ｍ，４Ｈ，ｔ，４Ｈ，−（ＣＨ２）１６−ＣＨ２−Ｏ−；ｍ，２Ｈ，ＨｉｓＣβＨ］；３．５−４［ｍ，４Ｈ，ｔ，４Ｈ，−（ＣＨ２）１４−ＣＨ２−Ｏ−］；４．２−４．４［ｍ，１Ｈ，ＧｌｕＣαＨ；ｍ，１Ｈ，ＨｉｓＣαＨ；ｍ，］７−８［ｍ，２Ｈ，Ｈｉｓ−ｒｉｎｇ］
ＥＳＩＭＳ：ｍ／ｚ＝９８９［Ｍ＋１］＋ｆｏｒ Ｃ５７Ｈ１０３Ｎ４Ｏ９
【００９６】
ステップ（ｄ）：ステップ（ｃ）で作製した、氷冷した中間物III（０．２ｇ、０．０
２ｍｍｏｌ）の溶液を２ｍＬのＤＣＭに溶解させた。１ｍＬのＴＦＡを添加し、その混合物を３−４時間、攪拌した。窒素を流してＴＦＡを除去し、その残留物を、アンバーリストＡ−２６塩素イオン交換樹脂を用いた塩素イオン交換クロマトグラフィにかけた。得られた化合物を、１：５（ｖ／ｖ）のＭｅＯＨ：アセトンから再結晶の上で塩素イオン交換することにより、白い固体として、純粋な目的とする化合物ＨＥ−１８を０．０９４ｇ（収率４７％）得た（Ｒｆ＝〜０．３、１０％メタノール−クロロホルム、ｖ／ｖ）。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３＋ＣＤ３ＯＤ）：δ／ｐｐｍ＝０．８［ｍ，６Ｈ，ＣＨ３−（ＣＨ２）１７−］；１．０−２．７［ｂｓ，４４Ｈ，−（ＣＨ２）１５−；ｍ，４Ｈ，−（ＣＨ２）１５−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ；ｍ，１Ｈ，ＧｌｕＣβＨ，ｍ，１Ｈ，ＧｌｕＣβＨ］；２．８−４．６［ｍ，４Ｈ，ｔ，４Ｈ，−（ＣＨ２）１５−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−；ｍ，２Ｈ，ＨｉｓＣβＨ；ｍ，１Ｈ，ＧｌｕＣαＨ；ｍ，１Ｈ，ＨｉｓＣαＨ＋ＣＤ３ＯＨ＋ＣＨ３ＯＤ］；８−８．３［ｍ，２Ｈ，Ｈｉｓ−ｒｉｎｇ］
ＥＳＩＭＳ：ｍ／ｚ＝７９０［Ｍ＋２］＋ｆｏｒ Ｃ４７Ｈ９０Ｎ４Ｏ５
【００９７】
（実施例５）
リポソームの作製。ヒスチジン官能性を有するカチオン性脂質（ＨＤ＝１６、ＨＤ−１８、ＨＥ−１６およびＨＥ−１８）、混合脂質（ＤＯＰＥ、ＤＯＰＣ）およびヘルパー脂質Ｑ１６ＴＧを、１：１：１〜３：２：１のモル比率の範囲でクロロホルムに溶解させた。溶媒を、窒素ガスを少量ずつ流しながら蒸発させ、８時間、真空乾燥させ、脱イオン水に夜通しで水和させることにより、濃度が１ｍＭであって、体外試験用の最終的な脂質、もしくは濃度が５ｍＭであって体内試験用の最終的な脂質を得た。水和させた脂質は、まず、３０秒間、攪拌し、それから、Branson 450ソニファイアーにより負荷サイクル１０
０％、出力２５Ｗで、透明になるまで超音波洗浄を行った。得られた純粋なリポソーム溶液を治療に用いた。
【００９８】
（実施例６）
ＭＴＴ試験：治療前の１８−２４時間に、９６−ウェルプレートのそれぞれに、細胞を、密度１００００（Ｂ１６Ｆ１０、Ａ５４９、ＭＣＦ−７およびＣＨＯ）、もしくは１５０００（Ｒａｗ２６４．７）でまいた。細胞を、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物を濃度範囲４０−１６μモル／ｍＬで含むリポソームを用いて、無血清培地にて培養した。その処理後すぐに、９６−ウェルプレートに固定された細胞をＰＢＳ（２×１００Ｌ）で洗浄した。培養の４時間後、その培地を、１０％ＦＢＳを含む新鮮で完全な培地に交換した。新たに作製したＰＢＳ（５ｍｇ／ｍＬ）の溶解するＭＴＴ溶液１０μｌを、２４時間または４８時間後のプレートの各ウェルに添加した。黄色のテトラゾリウム塩（ＭＴＴ）は、ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ酵素によって、代謝的に活性な細胞から、不溶であるが、ＤＭＳＯおよびＭｅＯＨの混合物の添加により可溶化する、紫のホルマザン結晶を形成することにより、減少する。その色の明度を分光光度法により定量化したそれぞれの細胞タイプについて、細胞数と吸光度と間に線形関係があり、増殖の変化を正確、かつ直接的に定量化できることが確認された。
【００９９】
結果：脂質ＨＤ−１６（１）、ＨＥ−１６（３）およびＨＥ−１８（４）は、脂質濃度が最も高いときに（４０μモル）、治療の２４時間後における細胞生存率が１５−３０％近くであることが示されている。２４時間後、これらの脂質は、１５−２０μモルぐらいの範囲では、Ｂ１６Ｆ１０細胞において、細胞生存率が５０％であることが示されている。一方、４８時間後では、これら４つの脂質の効能が増加している（図２Ａ、Ｂ）。Ａ５４９細胞株においては、脂質ＨＤ−１６、ＨＤ−１８、ＨＥ−１６およびＨＥ−１８は、脂質濃度が最も高い４０μモルのときに、２４時間後の細胞生存率が２０−４０％であることが示されている。Ａ５４９細胞株において、全ての脂質は、脂質濃度が１０−１７μモルの範囲のときに、２４時間後の細胞生存率が５０％となることが示されている。これら４つの脂質は、４８時間後に、細胞毒性効果が向上することが示されている（図３Ａ、Ｂ）。ＭＣＦ−７細胞株においては、脂質ＨＤ−１６、ＨＥ−１６、ＨＤ−１８およびＨＥ−１８は、濃度が最も高いときに、２４時間後の細胞生存率が２０−３０％近くになることが示されている。一方、ＨＥ−１６およびＨＥ−１８は、濃度が低くても、４８時間後と同様に、他の２つよりも強い細胞毒性効果を示す（図４Ａ、Ｂ）。本発明におけるもう一つの知見は、ヒスチジン官能性を有する脂質のすべてが、商業的に入手可能な疎水性の抗ガン剤であるデキサメタゾンのリポソーム製剤よりも、３つのガン性細胞のすべてにおいて高い細胞毒性を示すことである。ＣＨＯ細胞株においては、脂質ＨＤ−１６、ＨＥ−１６およびＨＥ−１８が、４８時間後と同様に２４時間後に、最も高い細胞毒性を示す（図５Ａ、Ｂ）。Ｃ−２６細胞（マウス結腸ガン、図６Ａ−Ｂ）を、ヒスチジン官能性を有する脂質で治療したところ、同じような傾向が観察された。脂質ＨＤ−１６、ＨＥ−１６、ＨＤ−１８およびＨＥ−１８は、２４時間後および４８時間後に、正常なＲＡＷ−２６４．７細胞において細胞生存率が８０％以上であり（図７Ａ−Ｂ）、正常なＣＯＳ−１細胞において細胞生存率が〜７０％である（図８Ａ−Ｂ）ことが示されている。
【０１００】
（実施例７）
フローサイトメトリー：Ａ５４９細胞を、Ｂ１６ｆ１０細胞と同様に、治療の１８−２４時間前に、６−ウェルプレートに１ウェルあたり細胞が１０６となる密度でまいた。ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）のリポソーム３０μＬを、プレーンなＤＭＥＭで１ｍＬまで希釈し、希釈した溶液を５分間緩やかに振った。細胞をｐＨ７．４のリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）で洗浄（１×１００μＬ）し、細胞に１ｍＬのリポソーム溶液を添加した。培養の４時間後、その培地を、１０％ＦＢＳを含む新鮮で完全な培地に交換した。それから、細胞を、３７℃、５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気化で２４時間、培養した。培養の２４時間後、細胞をトリプシン処理して遠心分離し、そして、その沈殿物を、５μＬのアネキシン−Ｖ  ＦＩＴＣおよび５μＬのＰＩを含む５００μＬの結合バッファーに再懸濁させた。その混合物を暗闇（BD、USA）で２０分
間培養し、それから、フローサイトメトリー（FACS Canto II,BD）によりすぐに分析した。
【０１０１】
結果：ＨＤ−１６およびＨＥ−１６は、Ｂ１６Ｆ１０細胞およびＡ５４９細胞のいずれにおいてもアポトーシスを促進させることが示された。初期のアポトーシス細胞および後期のアポトーシス細胞の割合は、リポソームのデキサメタゾンおよび媒体物のみ（例えば、ＤＯＰＣおよびＱ１６ＴＧのみ）で治療した細胞と比べると著しく高かった。両親媒性化合物の中でも、ＨＤ−１６およびＨＥ−１６は、ステアリル鎖をもつ、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物、およびデキサメタゾンのリポソーム製剤よりも、アポトーシスの誘導性において優れている。重要なことに、ヒスチジン官能性を有する脂質の４つすべて（１−４）は、２．７−３．７回であり、商業的に入手可能なデキサメタゾンのリポソーム製剤よりも、Ｂ１６Ｆ１０細胞のアポトーシス誘導性において、効率的であることが分かった。同様に、その製剤は、２．２−３．２回であり、商業的に入手可能なデキサメタゾンのリポソーム製剤よりも、Ａ５４９細胞のアポトーシス誘導性において、効果的であった。総合すれば、図９および１０によると、ヒスチジン官能性を有する脂質は、ガン細胞を細胞自然死に誘導できることが分かった。
【０１０２】
（実施例８）
ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）分析
治療した細胞における遺伝子発現の変化を、治療していない細胞と対比させて、測定するために、半定量的なＲＴ−ＰＤＲ分析を行った。Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ）を、トランスフェクションの１８−２４時間前に、６−ウェルプレートに１ウェルあたり細胞が１０６となる密度でまいた。ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）のリポソーム３０μＬを、プレーンなＤＭＥＭで１ｍＬまで希釈し、希釈した溶液を５分間緩やかに振った。細胞をｐＨ７．４のリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）で洗浄（１×１００μＬ）し、細胞に１ｍＬのリポソーム溶液を添加した。培養の４時間後、その培地を、１０％ＦＢＳを含む新鮮で完全な培地に交換した。それから、細胞を、３７℃、５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気化で２４時間、培養した。トランスフェクションの２４時間後、処理されたリポレックスおよび未処理の細胞を、TRIzol（登録商標）試薬（Invitrogen）を用いて６−ウェルプレートに直接溶解させた後、培地を取り除き、ＰＢＳ（１ｍＬ）で洗浄した。細胞をＴＲＩ試薬に溶解させ、細胞の溶解物を何回もピペットで移してモヤを取り除いた。細胞の溶解物を１．５ｍＬの遠心管に入れ、１０分後にクロロホルムを追加した。サンプルを密封して１５秒間力強く振って、室温で１０分間、培養し、４℃、１４０００Ｘｇで１５分間、遠心分離した。遠心分離に続いて、混合物を、下の赤いフェノール−クロロホルム相、中間相、および上の透明な水溶相に分離した。ＲＮＡは、もっぱら水相に存在する一方、ＤＮＡおよびタンパク質は、中間層および有機相にある。水相を新鮮なチューブに移し、０．８ｍＬのイソプロパノールをピペットにより添加して混合し、−２０℃で１５分間維持し、４℃、２００００ｇで２０分間遠心分離した。その浮遊物を除去し、ＲＮＡペレットを、冷たい７５％エタノールを５００μＬ用いて洗浄し、４℃、２００００ｇで１０分間遠心分離した。エタノールを吸引し、チューブを反転させ、ペレットを空気乾燥させた。最後に、ＲＮＡペレットを、水で処理したＤＥＰＣ１５μＬに溶解させ、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでのＯＤと濃度を測定し、ＲＮＡの純度を算出した。２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度の比率によると、ｍＲＮＡの純度（２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度の比率、Ａｂｓ２６０／Ａｂｓ２８０、純粋なＲＮＡは１．８−２．１）が分かり、［Ａ２６０×希釈係数×４０］によると、ＲＮＡの濃度がμｇ／ｍＬで分かる。８μｇのＲＮＡを、ランダムヘキサマーと一緒に第１ストランドのｃＤＮＡ合成キット（Super script III、Invitrogen）を用いて、最終的な量が２０μＬとなるように、第１ストランドのｃＤＮＡ合成を行った。つまり、ＰＣＲ装置において、ＰＣＲチューブに、単離されたＲＮＡを８μＬ（１μｇ／μＬ）、ポライマーを１μＬ、そしてｄＮＴＰを１μＬ、混合して６５℃で５分加熱し、４℃まで冷却した。別のＰＣ
Ｒチューブに、１０×ＲＴバッファーを２μＬ、２５ｍＭのＭｇＣｌ２を４μＬ、０．１ＭのＤＴＴを２μＬ、ＲＮＡｓｅ  ｏｕｔ（４０Ｕ／μＬ）を１μＬ、およびsuperscript IIIを１μＬ、混合した。両方のＰＣＲチューブの溶液を混合し、２５℃で１０分、５
０℃で５０分、８５℃で５分、そして４℃で３０分で、逆転写反応を行った。ｃＤＮＡ混合物の一定分量（２．５μＬ）について、Ｐｌａｔｉｎｕｍ(R)  ＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭ
ｉｘ（Ｅｐｐｅｎｄｒｏｆｆ）を用いたＰＣＲ法により、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂａｘ、ＰＩ３ｋ、カスパーゼ−９および１８Ｓ  ＲＮＡのｃＤＮＡ（ローディング対照用として）を増幅させた。増幅させる溶液には、２．５μＬのｃＤＮＡ＋２μＬのプライマー（正逆、５０ｎｇ／μＬ）＋２５．５μＬのＰＣＲ混合物が含まれている。増幅を３５サイクル行った。上記遺伝子の増幅での温度サイクルは以下のようにした。初期変性工程では９４℃（２分）、変性工程では９４℃（３０秒）、プライマーのアニーリング工程では５３℃（３０秒）、伸長工程では７２℃（３０秒）、最終的な伸長温度が７２℃（５分）とした。増幅させた配列を、２％アガロースゲル電気泳動で解析し、ＵＶ光の下で０．１％の臭化エチジウムを用いて可視化させた。
【０１０３】
用いたプライマー配列：
Ｂｃｌ２−Ｆｏｒ  ５’−ＴＧＣＣＡＧＧＡＣＧＴＣＴＣＣＴＣＴＣＡＧ−３’
Ｂｃｌ２−Ｒｅｖ  ５’−ＡＧＧＴＡＴＧＣＡＣＣＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＣＡＧ−３’
Ｂａｘ  Ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＧＴＴ  ＴＣＡ  ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＡＴＣ  ＧＡＧ  ＣＡＧ−３’
Ｂａｘ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＣＡＴ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＣＣＡ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  ＧＡ−３
Ｂｃｌ−ｘＬ−ｓｅｎｓｅ  ５′−ＴＴＴＧＡＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＣＡＧＡＧＣＡＡＣＣＧＧＧＡＧＣＴＧ−３′
Ｂｃｌ−ｘＬ−ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ５′−ＴＴＴＣＴＣＧＡＧＣＴＴＴＣＣＧＡＣＴＧＡＡＧＡＧＴＧＡＧＣＣＣＡ−３′
カスパーゼ  ３−Ｆｏｒｗａｒｄ：ＣＡＧＴＧＧＡＧＧＣＣＧＡＣＴＴＣＴＴＧ
カスパーゼ  ３−Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＴＧＧＣＡＣＡＡＡＧＣＧＡＣＴＧＧＡＴ
カスパーゼ  ９−ｓｅｎｓｅ  ５’−ＣＧＧＡＡＧＣＧＧＡＣＴＧＡＧＧＣＧＧＣ−３’カスパーゼ  ９−ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ５’−ＣＣＡＡＴＧＴＣＣＡＣＴＧＧＴＣＴＧＧ−３’
１８Ｓ−  Ｆｏｒｗａｒｄ：ＧＣＡＡＴＴＡＴＴＣＣＣＣＡＴＧＡＡＣＧ
１８Ｓ−  Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＧＧＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＣＣＡＴＣＣＡＡ
【０１０４】
結果：細胞をＨＤ−１６およびＨＥ−１６のリポソームで治療したときに、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬのｍＲＮＡレベルが著しく減少することが観察された。しかし、その他の脂質ＨＤ−１８およびＨＥ−１８では、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬ遺伝子が著しく減少することは確認されなかった。興味深いことに、脂質ＨＤ−１６、ＨＤ−１８、ＨＥ−１６およびＨＥ−１８では、アポトーシス促進性遺伝子の発現において上昇したのと同様に、カスパーゼ３およびカスパーゼ９においても上昇することが示された。これらすべてのレーンにおいて、１８Ｓ ｍ−ＲＮＡは、ローディング対照用として用いた（図１
１）。総合すると、図１１によれば、様々なアポトーシスのシグナル伝達経路は、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物でガン細胞を培養することにより、活性化することができることが分かる。
【０１０５】
（実施例９）
腫瘍成長抑制試験
複数の、生後６−８週のメスのＣ５７ＢＬ／６マウス（それぞれ体重が２０〜２２ｇ）をインドのハイデラバードのＮＩＮで購入し、動物用ガイドラインで維持する動物用の小屋で飼育した。０日目に、３０ゲージの針が取り付けられた注射器を用いて、マウスの右
脇腹に、１×１０５のＢ１６Ｆ１細胞を含む１００μＬのハンクス緩衝塩溶液を注射した。１４日目に腫瘍が見えるようになったら、マウスを無作為に６つのグループに分類し、各グループ（ｎ＝５）に、ＤＯＰＣおよびヘルパー脂質Ｑ１６ＴＧを含み、ヒスチジン官能性を有する脂質およびデキサメタゾンのリポソーム製剤（モル比率として、ヒスチジン官能性を有する脂質：ＤＯＰＣ：Ｑ１６ＴＧが１：１：１）、あるいは、ＤＯＰＣおよびヘルパー脂質Ｑ１６ＴＧのみ（対照用として、モル比率１：１で含む）を、１４日目、１６日目、１８日目、２１日目および２４日目に、マウス１匹あたり１５０μＭずつ、腫瘍箇所に注射した。腫瘍体積（垂直に測った腫瘍の長さの最大値をａ、最小値をｂとしたとき、Ｖ＝１／２．ａｂ２）をノギスにより２７日間にわたって測定した。結果を、＋／−ＳＤで表わしている（＊Ｐ＜０．０１ｖｓＨＤ１６、および、＊＊Ｐ＜０．００５ｖｓ対照）。
【０１０６】
結果：図１２（部分ＡおよびＢ）に示すように、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物およびデキサメタゾンを用いると、対照となる未治療のマウスにおける腫瘍成長の抑制と比べて、腫瘍成長をかなり抑制できることが観察された。しかし、ＨＤ−１６およびＨＥ−１６は、腫瘍成長抑制において最も高い特性を示した。ＨＤ−１８、ＨＤ−１８およびデキサメタゾンのリポソーム製剤は、腫瘍成長の抑制が緩やかであった。ヒスチジン官能性を有する脂質、その他のリポソーム原料が、腫瘍成長抑制能で観察された媒介において重要な役割を担うことを確認するため、ＤＯＰＣおよびヘルパー脂質Ｑ１６ＴＧのみを含むリポソーム（モル比率で１：１含む）を対照として用いた。重要なことに、Ｑ１６ＴＧおよびＤＯＰＣのみを含む対照用のリポソーム製剤は、腫瘍成長抑制効果をまったく示さなかった（図１２）。
【０１０７】
（実施例１０）
ＴＵＮＥＬ試験
複数の、生後６−８週のメスのＣ５７ＢＬ／６マウス（それぞれ体重が２０〜２２ｇ）をインドのハイデラバードのＮＩＮで購入し、動物用ガイドラインで維持する動物用の小屋で飼育した。０日目に、３０ゲージの針が取り付けられた注射器を用いて、マウスの右脇腹に、１×１０５のＢ１６Ｆ１細胞を含む１００μＬのハンクス緩衝塩溶液を注射した。腫瘍の平均体積が〜２０００ｍｍ３に到達したら、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物のリポソーム製剤、および、対照用として、ＤＯＰＣおよびヘルパー脂質Ｑ１６ＴＧのみを含むリポソームを、悪性のＢ１６腫瘍をもつマウスの腫瘍内に３日間連続して注射した。マウスは注射の２４時間後には死亡した。その腫瘍を摘出し、５μｍの厚さに凍結切片し、４％のホルムアルデヒドで固定させた。固定させた凍結部分をプロメガのＴＵＮＥＬ試験キットを用いて、アポトーシス細胞を標識するメーカのプロトコルに従って、着色した。続いて、腫瘍の凍結切片に、抗ＶＥ−カドヘリン単クローン抗体（内皮細胞マーカー、Satna Cruz）で免疫染色し、その後、腫瘍血管系を特定するために、テキサスレッドを付着させ、二次抗体処理した。抗ＶＥ−カドヘリン単クローン抗体（ＰＢＳにおいて１：１００、１００μｌ／区画）を、同じスライドに２時間、添加し、その後、ＰＢＳ（３×１０ｍＬ）で洗浄した。テキサスレッドが付着した二次抗体（ＰＢＳにおいて１：２００、１００μｌ／区画）をスライドに添加し、１時間培養した。最後に、これらのスライドをＰＢＳ（３×１０ｍＬ）で洗浄し、空気乾燥させた。落射蛍光顕微鏡（１００倍率）に、スライドを乗せ、ＤＮＡ断片化を緑色の領域で可視化し、内皮細胞マーカーを赤色の領域で可視化した。
【０１０８】
結果：蛍光顕微鏡により、緑色蛍光（ＴＵＮＥＬ、陽性）および赤色蛍光（内皮細胞、陽性）のかなりの量が可視化された（図１３、部分ＡおよびＢ）。興味深いことに、図１３に示すように、融合区画Ｃ（部分ＡとＢとの混合）には黄色、緑色、赤色があることが示されている。黄色（緑色と赤色との混合による）があることから、腫瘍血管内皮細胞において細胞自然死が生じていることが確認された。緑色蛍光で標識された細胞が多量にあ
ることから、腫瘍細胞の細胞自然死が同時に生じていることが確認された。これらの知見から、ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物のリポソーム製剤は、腫瘍細胞および腫瘍血管内皮細胞の両方を細胞自然死に誘導できることがわかる。
【０１０９】
以下の特許は、過去に報告された抗ガン剤化合物を進展させた例である。
１．Shaw等。乳ガン治療のための、シスプラチンおよび葉酸の投与（U.S. Pat no. 6,297,245 October 2, 2001）
２．Backel等。血管新生、内皮の増殖または腫瘍成長を抑制する方法（U.S. Pat. No. 5,843,925 December 1, 1999.）。
３．Brooks等。血管新生の抑制に有用な方法および組成物（U.S. Pat. No.5, 753,230. May 19, 1998.）。
４．Danter等。反応抑制剤およびガン治療方法（U.S. Pat. No. 8,138,191. March 20, 2012.）
【０１１０】
（本発明の利点）
（１）本発明のヒスチジン官能性を有する脂質は、商業的に入手可能な疎水性の抗ガン剤、例えばデキサメタゾン、のリポソーム製剤よりも、ガン細胞に対して高い細胞毒性を示す。
（２）本発明のヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物は、腫瘍細胞および腫瘍血管内皮細胞の両方を細胞自然死に誘導することができる。
（３）前記化合物は、肺ガン、メラノーマ、乳ガン、結腸もしくは卵巣ガンなどの様々なタイプのガンの治療に有用である。
（４）前記化合物は、他の抗ガン剤または遺伝子と組み合わせた治療に用いることができる。
（５）ヒスチジン官能性を有するカチオン性両親媒性化合物のリポソーム製剤を用いることにより、腫瘍成長を大きく抑制することができる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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