(57)【要約】  本出願により提供されるのは、ヒト活性化プロテインＣ（ａＰＣ）を対象とし、酵素前駆体プロテインＣ（ＰＣ）への最小限の結合性を有する抗体、抗原結合性抗体フラグメント（Ｆａｂ）、および他のタンパク質スキャフォールドである。さらにこれらのａＰＣ結合性タンパク質は、凝固を誘導するためにａＰＣの抗凝固活性を強力にブロックし得た。これらの結合剤の治療的使用は、本明細書において特定の抗体をパンニングおよびスクリーニングする方法として記載される。【選択図】図１
2016501230.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離モノクローナル抗体であって、ここで前記抗体が活性化プロテインＣに結合しかつ抗凝固活性を阻害するが、しかし非活性化プロテインＣへの最小限の結合性しか有さず、ここで前記抗体が配列番号：１４、１５、１７、１８、１９、２１、２２、２３、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７および１１９から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む前記の抗体。
【請求項２】
単離モノクローナル抗体であって、ここで前記抗体が活性化プロテインＣに結合しかつ抗凝固活性を阻害するが、しかし非活性化プロテインＣへの最小限の結合性しか有さず、ここで該抗体が配列番号：４、５、７、８、９、１１、１２、１３、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６および１１８から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む前記の抗体。
【請求項３】
配列番号：４、５、７、８、９、１１、１２、１３、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６および１１８から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、請求項１の単離モノクローナル抗体。
【請求項４】
該抗体が：
ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
ｅ）配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
ｆ）配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
ｇ）配列番号２２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
ｈ）配列番号２３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
ｉ）配列番号１０９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１０８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
ｊ）配列番号１１１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
ｋ）配列番号１１３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
ｌ）配列番号１１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１１４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
ｍ）配列番号１１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
ｎ）配列番号１１９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
を含む重鎖および軽鎖可変領域を含む、請求項３の単離モノクローナル抗体。
【請求項５】
単離モノクローナル抗体であって、ここで前記抗体が活性化プロテインＣに結合しかつ抗凝固活性を阻害するが、しかし非活性化プロテインＣへの最小限の結合性しか有さず、ここで前記抗体が配列番号９４、９５、９７、９８、９９、１０１、１０２および１０３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む前記の抗体。
【請求項６】
該抗体が（ａ）配列番号７４、７５、７７、７８、７９、８１、８２および８３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号８４、８５、８７、８８、８９、９１、９２および９３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または（ｃ）配列番号７４、７５、７７、７８、７９、８１、８２および８３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および配列番号８４、８５、８７、８８、８９、９１、９２および９３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２の双方をさらに含む、請求項５の単離モノクローナル抗体。
【請求項７】
単離モノクローナル抗体であって、ここで前記抗体が活性化プロテインＣに結合しかつ抗凝固活性を阻害するが、しかし非活性化プロテインＣへの最小限の結合性しか有さず、ここで該抗体が配列番号６４、６５、６７、６８、６９、７１、７２および７３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む前記の抗体。
【請求項８】
請求項７の単離モノクローナル抗体であって、ここで該抗体が（ａ）配列番号４４、４５、４７、４８、４９、５１、５２および５３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号５４、５５、５７、５８、５９、６１、６２および６３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または（ｃ）配列番号４４、４５、４７、４８、４９、５１、５２および５３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および配列番号５４、５５、５７、５８、５９、６１、６２および６３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２の双方をさらに含む前記の抗体。
【請求項９】
該抗体が配列番号６４、６５、６７、６８、６９、７１、７２および７３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３をさらに含む、請求項５の単離モノクローナル抗体。
【請求項１０】
請求項９の単離モノクローナル抗体であって、ここで該抗体が（ａ）配列番号７４、７５、７７、７８、７９、８１、８２および８３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号８４、８５、８７、８８、８９、９１、９２および９３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、（ｃ）配列番号４４、４５、４７、４８、４９、５１、５２および５３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、および（ｄ）配列番号５４、５５、５７、５８、５９、６１、６２および６３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２をさらに含む前記の抗体。
【請求項１１】
該抗体が：
ａ）配列番号４４、５４および６４を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号７４、８４および９４を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
ｂ）配列番号４５、５５および６５を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号７５、８５および９５を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
ｃ）配列番号４７、５７および６７を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号７７、８７および９７を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
ｄ）配列番号４８、５８および６８を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号７８、８８および９８を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
ｅ）配列番号４９、５９および６９を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号７９、８９および９９を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
ｆ）配列番号５１、６１および７１を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号８１、９１および１０１を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
ｇ）配列番号５２、６２および７２を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号８２、９２および１０２を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
ｈ）配列番号５３、６３および７３を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号８３、９３および１０３を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
を含む重鎖および軽鎖可変領域を含む、請求項４の抗体。
【請求項１２】
一または複数のアミノ酸修飾をさらに含む、請求項４の単離モノクローナル抗体。
【請求項１３】
一または複数のアミノ酸修飾をさらに含む、請求項１１の単離モノクローナル抗体。
【請求項１４】
単離モノクローナル抗体であって、ここで前記抗体が活性化プロテインＣに結合しかつ抗凝固活性を阻害するが、しかし非活性化プロテインＣへの最小限の結合性しか有さず、ここで前記抗体が配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここで前記アミノ酸配列が一または複数のアミノ酸修飾を含む前記の抗体。
【請求項１５】
該修飾が置換である、請求項１３の単離モノクローナル抗体。
【請求項１６】
請求項１４の単離モノクローナル抗体であって、ここで該置換がＡ１０、Ｔ１３、Ｇ５２、Ｎ５３、Ｎ５４、Ｒ５６、Ｐ５７、Ｓ５８、Ｓ７８、Ｒ８１、Ｓ８２、Ｑ９１、Ｙ９３、Ｓ９５、Ｓ９６、Ｌ９７、Ｓ９８、Ｇ９９、Ｓ１００およびＶ１０１から成る群より選択される位置にある前記の抗体。
【請求項１７】
請求項１５の単離モノクローナル抗体であって、ここで該置換がＡ１０Ｖ、Ｔ１３Ａ、Ｇ５２Ｓ、Ｇ５２Ｙ、Ｇ５２Ｈ、Ｇ５２Ｆ、Ｎ５３Ｇ、Ｎ５４Ｋ、Ｎ５４Ｒ、Ｒ５６Ｋ、Ｐ５７Ｇ、Ｐ５７Ｗ、Ｐ５７Ｎ、Ｓ５８Ｖ、Ｓ５８Ｆ、Ｓ５８Ｒ、Ｓ７８Ｔ、Ｒ８１Ｑ、Ｓ８２Ａ、Ｑ９１Ｒ、Ｑ９１Ｇ、Ｙ９３Ｗ、Ｓ９５Ｆ、Ｓ９５Ｙ、Ｓ９５Ｇ、Ｓ９５Ｗ、Ｓ９５Ｅ、Ｓ９６Ｇ、Ｓ９６Ａ、Ｓ９６Ｙ、Ｓ９６Ｗ、Ｓ９６Ｒ、Ｌ９７Ｍ、Ｌ９７Ｇ、Ｌ９７Ｒ、Ｌ９７Ｖ、Ｓ９８Ｌ、Ｓ９８Ｗ、Ｓ９８Ｖ、Ｓ９８Ｒ、Ｇ９９Ａ、Ｇ９９Ｅ、Ｓ１００Ａ、Ｓ１００Ｖ、Ｖ１０１Ｙ、Ｖ１０１ＬおよびＶ１０１Ｅから成る群より選択される前記の抗体。
【請求項１８】
単離モノクローナル抗体であって、ここで前記抗体が活性化プロテインＣに結合しかつ抗凝固活性を阻害するが、しかし非活性化プロテインＣへの最小限の結合性しか有さず、ここで前記抗体が配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、ここで前記アミノ酸配列が一または複数のアミノ酸修飾を含む前記の抗体。
【請求項１９】
該修飾が置換である、請求項１８の単離モノクローナル抗体。
【請求項２０】
該置換がＮ５４およびＳ５６から成る群より選択される位置にある、請求項１９の単離モノクローナル抗体。
【請求項２１】
該置換がＮ５４Ｇ、Ｎ５４Ｑ、Ｎ５４Ａ、Ｓ５６ＡおよびＳ５６Ｇから成る群より選択される、請求項２０の単離モノクローナル抗体。
【請求項２２】
単離モノクローナル抗体であって、ここで前記抗体が活性化プロテインＣに結合しかつ抗凝固活性を阻害するが、しかし非活性化プロテインＣへの最小限の結合性しか有さず、ここで前記抗体が配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここで前記アミノ酸配列が一または複数のアミノ酸修飾を含む前記の抗体。
【請求項２３】
該修飾が置換である、請求項２２の単離モノクローナル抗体。
【請求項２４】
請求項２３の単離モノクローナル抗体であって、ここで該置換がＴ２５、Ｄ５２、Ｎ５３、Ｎ５４、Ｎ５５、Ｄ９５、Ｎ９８およびＧ９９から成る群より選択される位置にある前記の抗体。
【請求項２５】
請求項２４の単離モノクローナル抗体であって、ここで該置換がＴ２５Ｓ、Ｄ５２Ｙ、Ｄ５２Ｆ、Ｄ５２Ｌ、Ｄ５２Ｇ、Ｎ５３Ｃ、Ｎ５３Ｋ、Ｎ５３Ｇ、Ｎ５４Ｓ、Ｎ５５Ｋ、Ｄ９５Ｇ、Ｎ９８Ｓ、Ｇ９９Ｈ、Ｇ９９ＬおよびＧ９９Ｆから成る群より選択される前記の抗体。
【請求項２６】
ヒト活性化プロテインＣ（ヒトａＰＣ、配列番号３）のエピトープに結合する単離モノクローナル抗体であって、ここで前記エピトープがヒトａＰＣの重鎖由来の残基を含む前記の抗体。
【請求項２７】
ヒト活性化プロテインＣ（ヒトａＰＣ、配列番号３）のエピトープに結合する単離モノクローナル抗体であって、ここで前記エピトープが配列番号３のＳ１９５を含む前記の抗体。
【請求項２８】
ヒト活性化プロテインＣのエピトープに結合する単離モノクローナル抗体であって、ここで前記エピトープが配列番号３のＤ６０、Ｋ９６、Ｓ９７、Ｔ９８、Ｔ９９、Ｅ１７０、Ｖ１７１、Ｍ１７２、Ｓ１７３、Ｍ１７５、Ａ１９０、Ｓ１９５、Ｗ２１５、Ｇ２１６、Ｅ２１７、Ｇ２１８およびＧ２１８から成る群より選択される一または複数の残基を含む前記の抗体。
【請求項２９】
活性化プロテインＣの活性部位に結合する単離モノクローナル抗体。
【請求項３０】
単離モノクローナル抗体であって、ここで前記該抗体が活性化プロテインＣに結合しかつ抗凝固活性を阻害するが、しかし非活性化プロテインＣへは最小限の結合性しか有さず、ここで前記抗体が完全ヒト抗体である前記の抗体。
【請求項３１】
請求項１〜３０の単離モノクローナル抗体であって、ここで該抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ抗体、および抗体フラグメントから成る群より選択される前記の抗体。
【請求項３２】
該抗体がヒト活性化プロテインＣに結合する、請求項１〜３０の単離モノクローナル抗体。
【請求項３３】
該抗体が非ヒトの種の活性化プロテインＣにさらに結合する、請求項３２の単離モノクローナル抗体。
【請求項３４】
該抗体の存在下において血液凝固時間が短縮される、請求項１〜３０の抗体。
【請求項３５】
請求項１〜３０の抗体と競合する抗体。
【請求項３６】
請求項１〜３０のいずれかのモノクローナル抗体の治療的有効量および薬剤的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項３７】
請求項３６の医薬組成物の治療的有効量を患者に投与することを含む、凝固における遺伝性または後天性の欠乏症または欠損症を治療するための方法。
【請求項３８】
請求項３６の医薬組成物の治療的有効量を患者に投与することを含む、凝固障害を治療するための方法。
【請求項３９】
該凝固障害が血友病Ａ、ＢまたはＣである、請求項３８の方法。
【請求項４０】
凝固障害が外傷性凝固障害または大量出血患者から成る群より選択される、請求項３８の方法。
【請求項４１】
凝固因子を投与することをさらに含む、請求項３８の方法。
【請求項４２】
該凝固因子が第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子から成る群より選択される、請求項４１の方法。
【請求項４３】
治療的有効量の請求項３６の医薬組成物を患者に投与することを含む出血時間を短縮するための方法。
【請求項４４】
活性化プロテインＣに結合しかつ抗凝固活性を阻害するが、しかし非活性化プロテインＣへの最小限の結合性しか有さない抗体をコードする単離核酸分子であって、ここで該抗体が配列番号１４、１５、１７、１８、１９、２１、２２および２３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む前記の核酸分子。
【請求項４５】
活性化プロテインＣに結合しかつ抗凝固活性を阻害するが、しかし非活性化プロテインＣへの最小限の結合性しか有さない抗体をコードする単離核酸分子であって、ここで該抗体が配列番号４、５、７、８、９、１１、１２および１３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む前記の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０１２年１１月２９日出願の米国仮特許出願第６１／７３１，２９４号および２０１３年３月１５日出願の米国仮特許出願第６１／７８６，４７２号の優先権を主張し、その開示内容はその全体が本明細書で参照されることにより本明細書において援用される。
配列表の提出
本出願に関連する配列表は、電子的形態によりＥＦＳ‐Ｗｅｂにより提出され、これによりその全体が明細書で参照されることにより本明細書において援用される。
【技術分野】
【０００２】
提供されるのは、ヒトプロテインＣの活性型（ａＰＣ）に優先的に結合する、単離モノクローナル抗体およびそのフラグメントである。
【背景技術】
【０００３】
ヒトプロテインＣ（ＰＣ）酵素前駆体は、４６１個のアミノ酸残基の前駆体として肝臓中で合成され、血液中に分泌される（配列番号１に示す通りである）。分泌に先立って一本鎖のポリペプチド前駆体は、ジペプチド（Ｌｙｓ１５６‐Ａｒｇ１５７）および４２個のａａ‐残基からなるプレプロリーダーの除去によってヘテロ二量体に変換される。ヘテロ二量体型（４１７残基）は、ジスルフィド架橋によって連結した軽鎖（１５５ａａ、２１ｋＤａ）および重鎖（２６２ａａ、４１ｋＤａ）から構成される（配列番号２に示す通りである）。ＰＣ酵素前駆体は、「活性化ペプチド」の除去および配列番号３に示す活性化ＰＣ（ａＰＣ）（４０５残基）へのＰＣの活性化をもたらす、トロンビン切断部位を含む。図１は、ヒトＰＣおよびその活性型であるａＰＣの模式図を提供する。ヒトＰＣは、９個のＧｌａ‐残基およびＮ‐結合型グリコシル化のための４個の候補サイトを含む。軽鎖は、Ｇｌａドメインおよび２個のＥＧＦ様ドメインを含む。重鎖は活性型セリンプロテアーゼドメインを内部に持つ。
【０００４】
ＰＣは、通常３〜５μｇ／ｍｌ（〜６５ｎＭ）で健康人の血液中を循環し、その半減期は６〜８時間である。循環するＰＣ酵素前駆体の主要な形態は、ヘテロ二量体型である。ＰＣの軽鎖は、一個のγ‐カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）に富むドメイン（４５ａａ）、二個のＥＦＧ様ドメイン（４６ａａ）およびリンカー配列を含む。ＰＣの重鎖は、１２個のａａで高い極性の「活性化ペプチド」および典型的なセリンプロテアーゼの触媒三残基を有する触媒ドメインを内部に持つ。
【０００５】
ヒトＰＣは、グリコシル化、ビタミンＫ依存γ‐カルボキシル化およびγ‐ヒドロキシル化（１‐２）を含む、広範囲にわたる翻訳後修飾を受ける。ヒトＰＣは、炭水化物２３％（重量）および４個の潜在的なＮ‐結合型グリコシル化サイト（一個は軽鎖のＡｓｎ９７および３個は重鎖のＡｓｎ２４８／３１３／３２９）を含む。そのＧｌａドメインは、９個のＧｌａ残基を含み、負に帯電したリン脂質膜へのカルシウム依存性のＰＣの結合を担う。Ｇｌａドメインはまた、ＰＣ活性化の間にトロンビンおよびトロンボモジュリンを内皮膜上に整列させる、内皮プロテインＣレセプター（ＥＰＣＲ）にも結合し得る。
【０００６】
プロテインＣ酵素前駆体は、生物学的能力を有するために、典型的にはその活性化酵素---活性化プロテインＣ（ａＰＣ）に変換される。ＰＣ経路の活性化は、ＰＣの活性化およびａＰＣの不活性化の速度によって制御される。ＰＣの活性化は、内皮細胞上で二段階のプロセスにおいて生じる。それには、内皮細胞上のＥＰＣＲへの（Ｇｌａドメインによる）ＰＣの結合、それに続くトロンビン／トロンボモジュリン複合体によるＰＣのタンパク質分解的な活性化を必要とする。内皮細胞表面上でトロンビン／トロンボモジュリンによって触媒される、ヒトＰＣ重鎖のＡｒｇ１２での単一の開裂は、１２‐ａａのＡＰを遊離させ、酵素前駆体ＰＣをａＰＣ、活性化セリンプロテアーゼに変換する。従って、ＰＣとａＰＣのアミノ酸配列の間の主な相違点は、ＡＰＣには存在しないＰＣ中の１２‐ａａの活性ペプチドの存在である。ＰＣのａＰＣへの活性化はまた、立体構造の変化も誘導する；その結果として、ＰＣではなくａＰＣのみが、その酵素活性部位において、ベンズアミジンによってまたはクロロメチルケトン（ＣＭＫ）ペプチド阻害剤により標識され得る。ＣＭＫ阻害剤との複合体におけるＧｌａドメインレスのａＰＣの結晶構造が最近解明された。ヒト血漿における重要なａＰＣ不活性化剤は、セルピン・スーパーファミリーのメンバーであり、ヒト血漿中に１００ｎＭで存在するプロテインＣ阻害剤（ＰＣＩ）である。生理学的条件下でａＰＣは、２０〜３０分の半減期を有して、ヒト血漿中を非常に低濃度（１〜２ｎｇ／ｍｌまたは４０ｐＭ）で循環する。
【０００７】
プロテインＣ経路は、血栓症に対する自然防御機構として貢献する。該経路は、凝固応答が増加するときに、抗凝固応答を増幅し得る即時回答システムであることにおいて他の抗凝固剤と異なる。傷を負った際、凝固のためにトロンビンが産生される。同時にトロンビンはまた、血管の表面上に一列に並んだトロンボモジュリンに結合することによって抗凝固応答も引き起こし、しかもこれがプロテインＣの活性化を促進する。従ってａＰＣの産生は、トロンビン濃度およびＰＣレベルにおおよそ比例している。
【０００８】
凝固プロセスの重要な制御因子としてのプロテインＣ経路の生理学的重要性は、次の３つの臨床所見によって明らかにされる：（ａ）プロテインＣ欠乏に伴う重篤な血栓性合併症およびプロテインＣの補充による欠陥修正能、（ｂ）プロテインＣ補足因子（プロテインＳ）欠乏関連の遺伝性血友病；および（ｃ）ａＰＣによる開裂に対しそれを抵抗性とするその物質（第Ｖ因子ライデンＲ５０６Ｑ）における遺伝子突然変異と関連する血栓性リスク（Ｂｅｒｎａｒｄ，ＧＲ  ｅｔ．ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００１，３４４：６９９‐７０９  総説）。
【０００９】
他のビタミンＫ依存性凝固因子と対照的にａＰＣは、二つの凝固因子、第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子のタンパク質分解性の不活性化によって抗凝固剤として機能し、それによってトロンビンの生成を抑制する。低下トロンビンレベルの結果として、トロンビンによって誘導される炎症、凝血原および抗線維素溶解性応答は減少する。ａＰＣはまた、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ）との複合体形成によって、促進された線維素溶解性応答に直接的に寄与する。
【００１０】
その抗凝固機能に加えてａＰＣは、抗炎症および抗アポトーシス活性および内皮バリアー機能を含む、細胞保護効果を誘導する。細胞上でのａＰＣのこの直接的細胞保護効果は、ＥＰＣＲおよびＧタンパク質共役受容体、プロテアーゼ活性化型受容体‐１（ＰＡＲ‐１）を必要とする。従ってａＰＣは、線維素溶解を促進し、血栓病および炎症を抑制する。ａＰＣの抗凝固および細胞保護機能は、分離可能と思われる。細胞保護効果の大部分は、ａＰＣの抗凝固活性から本来独立しており、最小の抗凝固活性および正常な細胞保護活性を有するａＰＣ変異体が作成された。同様に、過剰な抗凝固性であるが非細胞保護的なａＰＣ変異体も報告された。
【００１１】
ａＰＣ軽鎖のＣ末端はまた、プロテアーゼドメインにおける活性部位の反対側上の残基Ｇｌｙ１４２‐Ｌｅｕ１５５を含む高帯電領域でもある。Ｅ１４９Ａ‐ａＰＣは、野生型ａＰＣと区別不能なアミド分解活性を示したが、しかしプロテインＳ補助因子活性に対する増加した感受性のために、活性化部分トロンボンプラスチン時間（ａＰＴＴ）凝固試験における抗凝固活性おいて３倍を超える上昇を示した。Ｅ１４９Ａ‐ａＰＣは、インビボでの機能亢進性の抗血栓能と同様に、血漿凝固試験において機能亢進性の抗凝固活性を示した。この変異体は、ＬＰＳ誘導性致死性内毒血病マウスモデルにおいて、細胞保護活性および死亡率低下活性を減少させた。これは、ａＰＣの細胞保護活性は、マウスモデルにおける死亡率を減少させる必要があることを暗示する。対照的にａＰＣの抗凝固活性は、死亡率の低下にとって必要でも十分でもない。ａＰＣは、凝固亢進および生成された炎症反応と関連した、生命を脅かす病態である敗血症を治療するために使用されてきた。ａＰＣ治療の重篤な副作用は、患者の２％において生じる大出血である。この重篤な副作用は、該治療の臨床用途を制限する。
【発明の概要】
【００１２】
ヒト活性化プロテインＣ（ａＰＣ）に対するモノクローナル抗体が提供される。少なくとも一の実施形態において、抗‐ａＰＣモノクローナル抗体は、ａＰＣの酵素前駆体であるプロテインＣに対し最小限の結合性を示す。
【００１３】
いくつかの実施形態において、提供されるａＰＣに対するモノクローナル抗体は、例えば、親和性を増加させるために、機能活性を増加させるためにまたは生殖系列配列からの分岐を減少させるために最適化された。
【００１４】
同様に提供されるのは、単離モノクローナル抗体によって結合されるヒトａＰＣ上の特異的エピトープである。さらに提供されるのは、該エピトープをコードする単離核酸分子である。
【００１５】
抗‐ａＰＣモノクローナル抗体を含む医薬組成物、および血友病ＡおよびＢ等の凝固における遺伝性および後天性の欠乏症または欠損症の治療法もまた提供される。また提供されるのは、必要とする患者に抗‐ａＰＣモノクローナル抗体を投与することによって出血時間を短縮するための方法である。ヒトａＰＣに結合するモノクローナル抗体を製造するための方法もまた提供される。
当業者であれば、以下に記載される図面がただ単に説明目的のためだけであることを理解するであろう。図面は本教示内容の範囲を決して制限する意図ではない。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、成熟したヘテロ二量体型におけるヒト活性化プロテインＣの模式図を示す。
【図２】図２は、重鎖および軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列アラインメントがヒトＦａｂ抗体ライブラリーから同定された１０個の抗‐ａＰＣＦａｂの間で示されるのを描く。
【図３】図３は、直接ＥＬＩＳＡによって抗‐ＡＰＣ  Ｆａｂの特性を明らかにするグラフを示す。ＥＬＩＳＡプレートを、ウェル当たり１００ｎｇでヒトＰＣ（ｈＰＣ）、ヒトａＰＣ（ｈＡＰＣ）、イヌａＰＣ（ｄＡＰＣ）、マウスａＰＣ（ｍＡＰＣ）により被覆した。Ｘ軸に示す精製Ｆａｂを、２０ｎＭ（１ｕｇ／ｍｌ）でプレートに添加した。結合したＦａｂを、二次抗体（抗‐ヒトＦａｂ‐ＨＲＰ）その後のＨＲＰ基質ＡｍｐｌｅｘＲｅｄによって検出した。精製Ｆａｂは、優先的にヒトａＰＣに結合し、Ｆａｂ  Ｒ４１Ｃ１７を除いてヒトＰＣには殆どないし全く結合性を示さない。一つのＦａｂ  Ｔ４６Ｊ２３はまた、マウスａＰＣへのある程度の結合性も示した。
【図４】図４は、ＥＬＩＳＡによる抗‐ａＰＣ  Ｆａｂの結合選択性を示す。
【図５】図５は、ヒトａＰＣにおけるスパイキングでのａＰＴＴによる、用量依存的な正常ヒト血漿における血餅形成の阻害を示すグラフを描く。プールしたヒト正常血漿の５０％が、５２秒内に血餅を形成した。血漿と１００、２００、４００、８００または１６００ｎｇ／ｍｌのヒトａＰＣとのプリインキュベーションは、用量依存的に凝固時間を延長した。組換えヒトａＰＣ（ｒｈ‐ＡＰＣ）および血漿由来のヒトａＰＣ（ｐｄｈ‐ＡＰＣ）に対する、ほとんど同じ効能が見出だされた。
【図６】図６は、抗‐ａＰＣ  ＦａｂがヒトａＰＣを阻害しかつヒト正常血漿において血餅形成を誘導することを示すグラフを描く。４００ｎｇ／ｍｌでヒトａＰＣは、血漿凝固時間を５２秒から１８０秒に延長した。ａＰＣと０、０．５、１、２、５、１０または２０ｕｇ／ｍｌの対照抗体（対照）またはそのＦａｂ（対照‐Ｆａｂ）または選抜Ｆａｂとのインキュベーションは、用量依存的に凝固時間を短縮した（上のパネル）。三つのＦａｂ（Ｒ４１Ｅ３、Ｃ２２Ｊ１３、対照Ｆａｂ）を、より大きな効果を求めて４０ｕｇ／ｍｌでも試験した（下のパネル）。
【図７】図７は、抗‐ａＰＣ  ＦａｂがイヌａＰＣを阻害し、ａＰＴＴにおける血餅形成を誘導することを示す。
【図８】図８は、ａＰＣのアミド分解活性に関する抗‐ａＰＣ  Ｆａｂの効果を示す。発色基質ＳＰＥＣＴＲＯＺＹＭＥ  ＰＣａを反応液に１ｍＭまで添加する前に、最初に等量の抗‐ａＰＣ  Ｆａｂ（１〜３０００ｎＭ）とヒトａＰＣプロテイン（２０ｎＭ）を、室温で２０分間プリインキュベートした。終濃度１０ｎＭでのヒトａＰＣのアミド分解活性を、Ｆａｂの存在下で測定した。加水分解速度はＦａｂの存在下で阻害され、最大８０％の減少に達した。
【図９】図９は、ａＰＣの第Ｖａ因子（ＦＶａ）不活性化の活性に関する、抗‐ａＰＣ  Ｆａｂの効果を示す。
【図１０】図１０は、ＥＬＩＳＡによる抗‐ａＰＣヒトＩｇＧ１の結合特異性および抗‐ａＰＣヒトＩｇＧ１の種間交差反応性を示す。ＥＬＩＳＡプレートを、１ｕｇ／ｍｌのヒトＰＣ（ｈＰＣ）、ヒトａＰＣ（ｈＡＰＣ）、イヌａＰＣ、マウスａＰＣ、ウサギａＰＣにより被覆した。精製ＩｇＧ（２０ｎＭ）をプレートに添加した。結合したＩｇＧを、二次抗体（抗‐ヒトＩｇＧ‐ＨＲＰ）その後のＨＲＰ基質ＡｍｐｌｅｘＲｅｄによって検出した。五個の抗‐ａＰＣヒトＩｇＧ１がイヌおよびウサギａＰＣと交差反応し、一個のＩｇＧはマウスａＰＣにも結合する。
【図１１】図１１は、種のａＰＣ−（ａ）ヒト、（ｂ）ウサギ、（ｃ）イヌおよび（ｄ）マウスのアミド分解活性に関する抗‐ａＰＣ  ＩｇＧの効果を示す。発色基質ＳＰＥＣＴＲＯＺＹＭＥ  ＰＣａを反応液に１ｍＭまで添加する前に、最初に等量の抗‐ａＰＣ‐ｈＩｇＧ１（１〜１０００ｎＭ）とａＰＣタンパク質（２０ｎＭ）とを、室温で２０分間プリインキュベートした。終濃度１０ｎＭでのａＰＣのアミド分解活性をＦａｂの存在下で測定した。加水分解速度は、ＩｇＧの存在下で阻害された。負の対照抗体（抗‐ＣＴＸ‐ｈＩｇＧ１）を使用した。
【図１２】図１２は、抗‐ａＰＣ‐ｈＩｇＧ１が凝固時間を短縮し、ヒト血漿凝固試験（ａＰＴＴ）において凝固を誘導することを示す。
【図１３】図１３は、重篤な血友病患者血漿に関する抗‐ａＰＣ‐ＩｇＧ１の効果を示す。内皮細胞およびトロンボモジュリンの存在下で、ＰＣはａＰＣへ活性化され、トロンビンの生成を低下させる。対照のＡｂとは違って、抗‐ａＰＣ‐抗体はこの新たに生成されたａＰＣを急速に阻害し、トロンビン生成を５〜１０倍増加させる。亢進されたトロンビン生成は、凝固障害の患者における凝血の改善をもたらすであろう。
【図１４】図１４は、抗‐ａＰＣ‐抗体変異体の活性プロファイルを示す。親抗体Ｃ２５Ｋ２３と同様に、当該変異体は、（ａ）高親和性でａＰＣに結合し、（ｂ）精製系においてａＰＣ活性を強力に阻害し、および（ｃ）ヒト血漿凝固試験において凝血へと導く凝固時間を短縮する。
【図１５】図１５は、最終Ｒｗｏｒｋ＝０．２０１、Ｒｆｒｅｅ＝０．２４１まで精製された複合体構造を描く模式図を示す。左右のパネルは、９０°の回転変化での同一の複合体の構造を示す。Ｆａｂ  Ｃ２５Ｋ２３由来のＨＣＤＲ３ループは、ａＰＣの重鎖と強い相互作用を有する。
【図１６】図１６は、左のパネルにおいてＦａｂ  Ｃ２５Ｋ２３重鎖のＣＤＲ３ループ中の残基Ｔｒｐ１０４の周囲の相互作用の拡大表示を示す、ことを示す。それはａＰＣの活性部位（触媒的に重要な残基Ｈｉｓ５７、Ａｓｐ１０２およびＳｅｒ１９５）の到達性を遮断する。右のパネルは、Ｔｒｐ１０４およびＰＰＡＣＫが活性部位の同じ領域を占めると言う理由から、Ｆａｂ  Ｃ２５Ｋ２３がＰＰＡＣＫ阻害剤と同様の方法でａＰＣの活性を阻害することを示す。
【図１７】図１７は、ＥＬＩＳＡによる、ＦａｂおよびＩｇＧの双方の形態における、抗‐ａＰＣ抗体の活性部位遮断ａＰＣへの結合性または非結合性を描くグラフを示す。発明の詳細な説明
【００１７】
上記の通り本開示は、ヒトプロテインＣの活性型（ａＰＣ）に特異的に結合するが、しかしヒトプロテインＣの酵素前駆体型（ＰＣ）に対して比較的に少ししかまたは全く反応性を示さない、モノクローナル抗体および他の結合性タンパク質を含む、抗体を提供する。
【００１８】
本特許明細書の目的のために、以下に提示する定義により以下の用語を使用する。
定義
【００１９】
適当と認められる場合は、単数形で使用される用語はまた、複数形も含み逆もまた同様である。以下に示される任意の定義が、本明細書で参照されることにより援用される任意の資料を含む、任意の他の資料におけるその言葉の使用法と一致しない場合には、（例えば、用語が最初に使用されている資料において）反対の意味が明確に意図されなければ、以下に示される定義が、本明細書および付随する請求項を解釈する目的のために常に制御することになる。別段の定めがない限り「または（ｏｒ）」は、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。別段の定めがない限りまたは「一または複数」の使用が明らかに不適当である場合、本明細書での「ａ」の使用は、「一または複数（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」を意味する。「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」の使用は、交換可能であり、限定的でない。例えば、用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「含んでいるが、限定するものではない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」を意味するものとする。
【００２０】
本明細書で用いる場合、用語「プロテインＣ」または「ＰＣ」とは、細胞により自然に発現され、血漿中に存在し、かつプロテインＣの活性型とは異なる、その酵素前駆体型のプロテインＣの任意の変異体、アイソフォームおよび／または種ホモログを表す。
【００２１】
本明細書で用いる場合、用語「活性化プロテインＣ」または「ａＰＣ」とは、プロテインＣに存在する１２個のアミノ酸の活性化ペプチドが存在しないことによって特徴づけられる、プロテインＣの活性型を表す。
【００２２】
本明細書で用いる場合、「抗体」とは、抗体全体およびその任意の抗原結合性フラグメント（すなわち「抗原‐結合性部分」）または一本鎖を表す。該用語には、自然に生じるまたは通常の免疫グロブリン遺伝子フラグメント再組み合せプロセスによって形成される、完全長免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）、または特異的な結合活性を保持する抗体フラグメント等の、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分が含まれる。構造にかかわらず、抗体フラグメントは、完全長抗体によって認識されるのと同じ抗原と結合する。例えば、抗‐ａＰＣモノクローナル抗体フラグメントは、ａＰＣのエピトープに結合する。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントによって遂行され得る。用語、抗体の「抗原結合部分」内に包含される結合性フラグメントの例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから成る一価フラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結されている二個のＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ‘）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体のシングルアームのＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインから成るｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４‐５４６）；（ｖｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）；（ｖｉｉ）ミニ抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体およびカッパ抗体（例えば、Ｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １９９７；１０：９４９‐５７を参照されたい）；（ｖｉｉｉ）ラクダＩｇＧ；および（ｉｘ）ＩｇＮＡＲが含まれる。さらに、Ｆｖフラグメントの二個のドメイン、ＶＬとＶＨは分離した遺伝子によってコードされているが、それらは、組換え法を使用して、その中でＶＬおよびＶＨ領域が一価の分子を形成するために対合する一本鎖タンパク質として作成されることを可能とする、合成リンカーによって結合し得る（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３‐４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９‐５８８３を参照されたい）。当該一本鎖抗体もまた、用語、抗体の「抗原‐結合部分」内に包含されるように意図されている。これらの抗体フラグメントは、当業者に既知の従来技術を使用して得られ、フラグメントは有用性に関して完全な抗体と同じ方法により解析される。
【００２３】
さらに、抗原結合フラグメントは、抗体模倣物に包含され得るとも考えられる。本明細書で用いる場合、用語「抗体模倣物」または「模倣物」とは、抗体と同様に結合性を示すがより小さな別の抗体または非抗体タンパク質であるタンパク質を意味する。当該抗体模倣物は、スキャフォールドに含まれ得る。用語「スキャフォールド」とは、目的に合わせた機能および特性を有する新規産物を工学するためのポリペプチドプラットフォームを表す。
【００２４】
本明細書で用いる場合、用語「抗‐ａＰＣ抗体」とは、ａＰＣのエピトープに特異的に結合する抗体を表す。インビボでａＰＣのエピトープに結合すると、本明細書に開示する抗‐ａＰＣ抗体は、一または複数の血液凝固カスケードの側面を増強する。
【００２５】
本明細書で用いる場合、用語「結合を阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」および「結合をブロックする（ｂｌｏｃｋｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」（例えば、ａＰＣへのａＰＣ基質の結合の阻害／ブロッキングを表す）は、同じ意味で使用され、例えば、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％だけの阻害またはブロッキング等の、タンパク質とその基質との部分的阻害および完全な阻害またはブロッキングの双方を包含する。本明細書で用いる場合、「約」は示された数値の＋／−１０％を意味する。
【００２６】
ａＰＣへのａＰＣ基質の結合の阻害および／ブロッキングに関して、用語・阻害およびブロッキングはまた、抗‐ａＰＣ抗体と接触していないａＰＣと比較して抗‐ａＰＣ抗体と接触したときの、生理学的物質へのａＰＣの結合親和性における任意の測定し得る低下、例えば、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％だけの第Ｖａ因子または第ＶＩＩＩａ因子を含むその基質とのａＰＣの相互作用のブロッキング、も含む。
【００２７】
本明細書で用いる場合、用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、単一分子組成物の抗体分子の製剤を表す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一結合特異性および親和性を示す。同様に、用語「ヒトモノクローナル抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有する、単一結合特異性を示す抗体を表す。ヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含み得る（インビトロでのランダムまたは部位特異的突然変異誘導またはインビボでの体細胞突然変異によって誘導される変異体）。
【００２８】
本明細書で用いる場合、「単離抗体」とは、異なる抗原特異性を有する抗体を含む、他の生物学的分子を実質的に含まない抗体を表すことを意図する（例えば、ａＰＣに結合する単離抗体は、ａＰＣ以外の抗原に結合する抗体を実質的に含まない）。いくつかの実施形態において、単離抗体は、乾燥重量で少なくとも約７５％、約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９９％、約９９．９％または約１００％純粋である。いくつかの実施形態において、純度は、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析等の方法によって測定され得る。ヒトａＰＣのエピトープ、アイソフォームまたは変異体に結合する単離抗体は、しかしながら例えば、他の種由来の他の関連する抗原（例えば、ａＰＣ種ホモログ）との交差反応性を有する。さらに単離抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まないことが可能である。本明細書で用いる場合「特異的結合」とは、所定の抗原への抗体結合を表す。典型的には「特異的結合」を示す抗体は、少なくとも約１０５Ｍ−１の親和性により抗原に結合し、無関係な抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に対するその結合親和性よりも高い、例えば少なくとも二倍以上大きい親和性により該抗原に結合する。「抗原を認識する抗体」および「抗原に対し特異的な抗体」との表現は、用語「抗原に特異的に結合する抗体」と共に本明細書において同じ意味で用いられる。
【００２９】
本明細書で用いる場合、用語「最小の結合性」とは、特定の抗原に対し結合しないおよび／または低い親和性しか示さない抗体を表す。典型的には、抗原に対し最小の結合性を有する抗体は、約１０２Ｍ−１よりも低い親和性を有する抗原に結合し、当該抗体が無関係な抗原に結合するよりも高い親和性を有する所定の抗原には結合しない。
【００３０】
本明細書で用いる場合、例えば、ＩｇＧ抗体等の抗体に対する用語「高親和性」とは、少なくとも約１０７Ｍ−１、少なくとも一の実施形態において、少なくとも約１０８Ｍ−１、いくつかの実施形態において、少なくとも約１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１またはそれ以上、例えば１０１３Ｍ−１までまたはそれ以上の結合親和性を表す。しかしながら、「高親和性」の結合性は、他の抗体アイソタイプに対して変動し得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高親和性」の結合性は、少なくとも１０７Ｍ−１の結合親和性を表す。本明細書で用いる場合、「アイソタイプ」とは重鎖定常領域の遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を表す。
【００３１】
「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とは、抗体分子の重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域内の、結合した抗原の三次元構造に相補的であるＮ末端抗原結合表面を形成する、三つの高度可変領域の一つを表す。重鎖または軽鎖のＮ末端から進み、これらの相補性決定領域はそれぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」および「ＣＤＲ３」と表示される［Ｗｕ  ＴＴ，Ｋａｂａｔ  ＥＡ，Ｂｉｌｏｆｓｋｙ  Ｈ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９７５  Ｄｅｃ；７２（１２）：５１０７およびＷｕ  ＴＴ，Ｋａｂａｔ  ＥＡ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９７０  Ａｕｇ  １；１３２（２）：２１１］。ＣＤＲは、抗原‐抗体結合に関わり、ＣＤＲ３は、抗原‐抗体結合に特異的なユニークな領域を含む。それ故に抗原結合部位は、各々の重鎖および軽鎖Ｖ領域由来のＣＤＲ領域を含む六個のＣＤＲを含み得る。
【００３２】
用語「エピトープ」とは、抗体が特異的に結合または相互作用する抗原の区域または領域を表し、いくつかの実施形態において、それは、抗原が抗体と物理的に接触している所を示す。逆に、用語「パラトープ」とは、抗原が特異的に結合する抗体の区域または領域を表す。競合結合によって特徴づけられるエピトープは、もし対応する抗体の結合が互いに排他的、すなわち一つの抗体の結合がもう一つの抗体の同時の結合を排除するのであるならば、オーバーラップしていると言われる。もし抗原が対応する抗体の双方の同時の結合に適応できるならば、エピトープは別々である（ユニーク）と言われる。
【００３３】
本明細書で用いる場合、用語「競合する抗体」とは、本明細書記載のａＰＣに対する抗体として、実質的にまたは本質的に同じまたは同一のエピトープに関して結合する抗体を表す。「競合する抗体」には、オーバーラップエピトープの特異性を有する抗体が含まれる。従って競合する抗体は、ａＰＣへの結合に関して本明細書に記載の抗体と効率的に競合することができる。いくつかの実施形態において、競合する抗体は、本明細書に記載の抗体と同一のエピトープに結合し得る。あるいは競合する抗体は、本明細書に記載の抗体と同じエピトープ特異性を有するともみなされる。
【００３４】
本明細書で用いる場合、「保守的置換」とは、ポリペプチドの生物学的または生化学的機能の損失をもたらさない、類似する生化学的特性を有するアミノ酸への一または複数のアミノ酸の置換を含むポリペプチドの修飾を表す。「保守的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において明確にされている。ファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、極性無電化側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β‐分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。本開示の抗体は、抗原結合活性を保持しつつ一または複数の保守的アミノ酸置換を有し得る。
【００３５】
核酸およびポリペプチドに対して用語「実質的相同」とは、二つの核酸または二つのポリペプチド、またはその指定された配列が、適切な核酸またはアミノ酸の挿入または欠失により最適に位置合わせされ、比較されたときに、ヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約８０％、通常は少なくとも約８５％、いくつかの実施形態において、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％、少なくとも一の実施形態において、核酸またはアミノ酸の少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％または９９．５％において同一であることを示す。あるいは、セグメントが鎖の補完のための選択的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするときに、核酸の実質的相同が存在する。同様に含まれるまた、本明細書で列挙される特定の核酸配列およびアミノ酸配列に対し実質的な相同性を有する核酸配列およびポリペプチド配列である。
【００３６】
二つの配列の間のパーセント同一性は、二つの配列の最適な位置合わせに導入される必要のある、ギャップの数、および各々のギャップの長さを考慮したうえで、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％相同性＝同一位置の数／位置の総数×１００）。配列の比較および二つの配列の間のパーセント同一性の決定は、限定するものではないがＶｅｃｔｏｒＮＴＩ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＡｌｉｇｎＸ（登録商標）モジュール等の数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。ＡｌｉｇｎＸ（登録商標）にとって、多重整列化のデフォルトパラメータは：ギャップ開始ペナルティ：１０；ギャップ伸張ペナルティ：０．０５；ギャップ分離ペナルティ範囲：８；アライメント遅延に対する同一性％：４０である。（http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/LINNEA-Online-Guides/LINNEA-Communities/Vector-NTI-Community/Sequence-analysis-and-data-management-software-for-PCs/AlignX-Module-for-Vector-NTI-Advance.reg.us.htmlにおいてさらなる詳細を見出されたい）。
【００３７】
クエリー配列（本開示の配列）と対象配列の間の全体にわたる最良のマッチを決定する、グローバルシーケンスアラインメントとも呼ばれる別の方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓら（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡＢＩＯＳ），１９９２，８（２）：１８９‐１９１）のアルゴリズムに基づく、ＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，２（２２）：４６７３‐４６８０）を使用して決定し得る。シーケンスアラインメントにおいてクエリーおよび対象配列は双方ともＤＮＡ配列である。前記のグローバルシーケンスアラインメントの結果はパーセント同一性である。ペアワイズアラインメントによりパーセント同一性を計算するためのＤＮＡ配列のＣＬＬＵＳＴＡＬＷアラインメントにおいて使用されるパラメータは：Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ、ｋ‐タプル＝１、Ｔｏｐ  Ｄｉａｇｏｎａｌ数＝５、ギャップペナルティ＝３、ギャップ開始ペナルティ＝１０、ギャップ伸張ペナルティ＝０．１。多重アラインメントのためには、以下のＣＬＵＳＴＡＬＷパラメータが使用し得る；ギャップ開始ペナルティ＝１０、ギャップ伸張パラメータ＝０．０５；ギャップ分離ペナルティ範囲＝８；アラインメント遅延のための％同一性＝４０。
【００３８】
核酸は、細胞全体中に、細胞溶解物中にまたは部分精製された、または実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、自然の環境においては通常それが随伴している、他の細胞成分から精製されたときに「単離され」または「実質的に純粋に与えられる」。核酸を単離するために、例えば以下の：アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当該技術分野において公知の方法等の標準的な技法が使用され得る。
活性化プロテインＣに対するモノクローナル抗体
【００３９】
ａＰＣはその抗凝固特性で知られる。傷が一時的なホメオスタシスの喪失をもたらす血友病または外傷患者において、ホメオスタシスが調節解除される出血性障害は、ａＰＣ阻害剤によって治療され得る。抗体、その抗原結合性フラグメント、および他のａＰＣ‐特異的タンパク質スキャフォールドは、残りを保全する一方で、ａＰＣのタンパク質機能の部分集合を阻害するための標的特異性を提供するために使用され得る。ａＰＣ（＜４ｎｇ／ｍｌ）対ＰＣ（４ｕｇ／ｍｌ）の血漿濃度における少なくとも１０００倍の差異を仮定すれば、任意の潜在的なａＰＣ阻害剤治療法の向上した特異性は、高速循環する過剰なＰＣの存在下でのａＰＣの機能をブロックするために役立つ。
【００４０】
ａＰＣの抗凝固機能をブロックするａＰＣ特異的抗体は、例えば、血友病、阻害剤を有する血友病患者、外傷誘導性凝固障害、ａＰＣによる敗血病治療の間の重篤な出血患者、移植、心臓手術、整形外科手術等の待機手術からもたらされる出血または月経過多による過剰出血を含む、出血性障害を有する患者のための治療法として使用し得る。
【００４１】
長い循環半減期を有する抗‐ａＰＣ抗体は、血友病のような慢性疾患を治療するうえで有用であり得る。短い半減期を有する、ａＰＣ抗体フラグメントまたはａＰＣ‐結合性タンパク質スキャフォールドは、急性の使用にとってより効果的であり得る（例えば、外傷の治療用）。ａＰＣは多機能タンパク質であるので、増強された親和性および標的特異性を有する抗体、抗原結合性抗体フラグメント、ａＰＣ‐特異的タンパク質スキャフォールドを含む、選択的ａＰＣ機能ブロッカー（ＳＡＦＢ）は、他のａＰＣ機能に悪影響を及ぼすことなくただ一つのａＰＣ機能を選択的にブロックし得る。
【００４２】
ａＰＣ‐結合性抗体は、ヒトａＰＣに対するヒト抗体ライブラリーをパンニングおよびスクリーニングすることによって同定された。同定された抗体は、ヒトＰＣへ結合しないかまたは最小の結合性を示した。単離された各々のモノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を配列決定し、そのＣＤＲ領域を同定した。ａＰＣ‐特異的モノクローナル抗体の各々の重鎖および軽鎖領域に応答する配列識別番号（「配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）」）を、表１に要約する。
【表１】
2016501230.tif 000003
2016501230.tif 000004
2016501230.tif 000005
2016501230.tif 000006
【００４３】
一実施形態において提供されるのは、ヒト活性化プロテインＣ（ａＰＣ）に結合し抗凝固活性を阻害するが、しかし非活性化プロテインＣに対する最小の結合性しか有さない単離モノクローナル抗体であり、ここで該抗体は、配列番号１４〜２３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００４４】
他の実施形態において提供されるのは、ヒト活性化プロテインＣ（ａＰＣ）に結合し抗凝固活性を阻害するが、しかし非活性化プロテインＣに対する最小の結合性しか有さない単離モノクローナル抗体であり、ここで該抗体は、配列番号４〜１３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００４５】
他の実施形態において提供されるのは、ヒト活性化プロテインＣ（ａＰＣ）に結合し抗凝固活性を阻害するが、しかし非活性化プロテインＣに対する最小の結合性しか有さない単離モノクローナル抗体であり、ここで該抗体は、配列番号１４〜２３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号４〜１３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００４６】
他の実施例において抗体は、以下を含む重鎖および軽鎖可変領域を含む：
【００４７】
配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
【００４８】
配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
【００４９】
配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
【００５０】
配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
【００５１】
配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
【００５２】
配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
【００５３】
配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
【００５４】
配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
【００５５】
配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；および
【００５６】
配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【００５７】
表２に示すのは、ヒトａＰＣに結合するモノクローナル抗体の各々の重鎖および軽鎖のＣＤＲ領域（「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」および「ＣＤＲ３」）に対する配列識別番頭の要約である。
【表２】
2016501230.tif 000007
【００５８】
一実施形態において提供されるのは、ヒト活性化プロテインＣ（ａＰＣ）に結合する単離モノクローナル抗体であり、ここで該抗体は配列番号９４〜１０３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。これらのＣＤＲ３は、パンニングおよびスクリーニングの間に同定される抗体の重鎖から同定される。さらなる実施形態において、この抗体は、（ａ）配列番号７４〜８３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号８４〜９３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または（ｃ）配列番号７４〜８３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および配列番号８４〜９３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２の双方、をさらに含む。
【００５９】
他の実施形態において提供されるのは、パンニングおよびスクリーニングの間に同定される抗体の軽鎖の一つ由来のＣＤＲ３を共有する抗体である。従って、同様に提供されるのは単離モノクローナル抗体であり、ここで前記の抗体は活性化プロテインＣに結合しかつ抗凝固活性を阻害するが、しかし非活性化プロテインＣに対する最小の結合性しか有さず、ここで前記の抗体は、配列番号６４〜７３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。さらなる実施形態において、該抗体は、（ａ）配列番号４４〜５３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号５４〜６３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または（ｃ）配列番号４４〜５３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および配列番号５４〜６３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２の双方、をさらに含む。
【００６０】
他の実施形態において、抗体は、スクリーニングおよびパンニングから同定される抗体の重鎖および軽鎖由来のＣＤＲ３を含む。提供されるのは、単離モノクローナル抗体であり、ここで前記の抗体は活性化プロテインＣに結合しかつ抗凝固活性を阻害するが、しかし非活性型プロテインＣに対し最小の結合性しか有さず、ここで前記の抗体は、配列番号９４〜１０３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３および配列番号６４〜７３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。さらなる実施形態において、抗体は、（ａ）配列番号７４〜８３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号８４〜９３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、（ｃ）配列番号４４〜５３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、および／または（ｄ）配列番号５４〜６３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２をさらに含む。
【００６１】
いくつかの実施形態において、抗体は、以下を含む重鎖および軽鎖可変領域を含む：
【００６２】
配列番号４４、５４および６４を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号７４、８４および９４を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
【００６３】
配列番号４５、５５および６５を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号７５、８５および９５を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
【００６４】
配列番号４６、５６および６６を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号７６、８６および９６を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
【００６５】
配列番号４７、５７および６７を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号７７、８７および９７を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
【００６６】
配列番号４８、５８および６８を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号７８、８８および９８を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
【００６７】
配列番号４９、５９および６９を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号７９、８９および９９を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
【００６８】
配列番号５０、６０および７０を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号８０、９０および１００を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
【００６９】
配列番号５１、６１および７１を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号８１、９１および１０１を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
【００７０】
配列番号５２、６２および７２を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号８２、９２および１０２を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
【００７１】
配列番号５３、６３および７３を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号８３、９３および１０３を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
【００７２】
同様に提供されるのは、活性化プロテインＣに結合しかつ抗凝固活性を阻害するが、しかし非活性化プロテインＣに対する最小の結合性しか有さない単離モノクローナル抗体であり、ここで前記の抗体は、配列番号４〜１３に記載のアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列に対し、少なくとも８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７３】
同様に提供されるのは、活性化プロテインＣに結合しかつ抗凝固活性を阻害するが、しかし非活性化プロテインＣに対する最小の結合性しか有さない単離モノクローナル抗体であり、ここで前記の抗体は、配列番号１４〜２３に記載のアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列に対し、少なくとも８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７４】
抗体は、種特異的であり得るか、または複数の種と交差反応し得る。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ブタ、イヌ、ネコまたは他の哺乳類のａＰＣと特異的に反応し得るかまたは交差反応し得る。
【００７５】
抗体は、種々の抗体のクラス、例えば、限定するものではないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体等であり得る。
【００７６】
一実施形態において提供されるのは、ヒト活性化プロテインＣに対する単離完全ヒトモノクローナル抗体である。
抗‐ａＰＣ抗体の最適化変異体
【００７７】
いくつかの実施形態において、パンニングおよびスクリーニングされた抗体は、例えば、ａＰＣに対する親和性を増加するように、ＰＣに対する任意の親和性をさらに低下させるように、異なる種に対する交差反応性を改善するようにまたはａＰＣのブロッキング活性を改善するように、最適化され得る。当該最適化は、抗体のＣＤＲまたはＣＤＲに極めて接近したアミノ酸、すなわちＣＤＲに３または４残基隣接するアミノ酸の部位飽和突然変異誘導を利用することによって実施され得る。
【００７８】
同様に提供されるのは、ａＰＣに対する増強されたまたは高い親和性を有するモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、抗‐ａＰＣ抗体は、少なくとも約１０７Ｍ‐１、いくつかの実施形態において、少なくとも約１０８Ｍ‐１、いくつかの実施形態において、少なくとも約１０９Ｍ‐１、１０１０Ｍ‐１、１０１１Ｍ‐１またはそれ以上、例えば、１０１３Ｍ‐１までまたはそれ以上の結合親和性を有する。
【００７９】
いくつかの実施形態において、さらなるアミノ酸修飾が、生殖系配列からの分岐を低下させるために導入され得る。他の実施形態において、アミノ酸修飾は、大規模生産プロセスのための抗体生産を促進するために導入され得る。
【００８０】
いくつかの実施形態において提供されるのは、特異的にヒト活性化タンパク質Ｃに結合する抗‐ａＰＣモノクローナル抗体であり、該抗体は一または複数のアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０またはそれ以上の修飾を含む。
【００８１】
同様にいくつかの実施形態において提供されるのは、ヒト活性化プロテインＣに結合する単離モノクローナル抗体であり、ここで該抗体は配列番号８に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、ここで該アミノ酸配列は一または複数のアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖の修飾は、置換、挿入または欠失である。いくつかの実施形態において、修飾は、軽鎖のＣＤＲ内に位置する。いくつかの実施形態において、修飾は、軽鎖のＣＤＲの外側に位置する。
【００８２】
いくつかの実施形態において、配列番号８の軽鎖の修飾は、Ｇ５２、Ｎ５３、Ｎ５４、Ｒ５６、Ｐ５７、Ｓ５８、Ｑ９１、Ｙ９３、Ｓ９５、Ｓ９６、Ｌ９７、Ｓ９８、Ｇ９９、Ｓ１００およびＶ１０１から選択される位置にある。修飾は、例えば、以下の置換：Ｇ５２Ｓ、Ｇ５２Ｙ、Ｇ５２Ｈ、Ｇ５２Ｆ、Ｎ５３Ｇ、Ｎ５４Ｋ、Ｎ５４Ｒ、Ｒ５６Ｋ、Ｐ５７Ｇ、Ｐ５７Ｗ、Ｐ５７Ｎ、Ｓ５８Ｖ、Ｓ５８Ｆ、Ｓ５８Ｒ、Ｑ９１Ｒ、Ｑ９１Ｇ、Ｙ９３Ｗ、Ｓ９５Ｆ、Ｓ９５Ｙ、Ｓ９５Ｇ、Ｓ９５Ｗ、Ｓ９５Ｅ、Ｓ９６Ｇ、Ｓ９６Ａ、Ｓ９６Ｙ、Ｓ９６Ｗ、Ｓ９６Ｒ、Ｌ９７Ｍ、Ｌ９７Ｇ、Ｌ９７Ｒ、Ｌ９７Ｖ、Ｓ９８Ｌ、Ｓ９８Ｗ、Ｓ９８Ｖ、Ｓ９８Ｒ、Ｇ９９Ａ、Ｇ９９Ｅ、Ｓ１００Ａ、Ｓ１００Ｖ、Ｖ１０１Ｙ、Ｖ１０１ＬまたはＶ１０１Ｅの一つであり得る。さらに、いくつかの実施形態において、抗体は、Ｇ５２Ｓ、Ｇ５２Ｙ、 Ｇ５２Ｈ、Ｇ５２Ｆ、Ｎ５３Ｇ、Ｎ５４Ｋ、Ｎ５４Ｒ、Ｒ５６Ｋ、Ｐ５７Ｇ、Ｐ５７Ｗ、Ｐ５７Ｎ、Ｓ５８Ｖ、Ｓ５８Ｆ、Ｓ５８Ｒ、Ｑ９１Ｒ、Ｑ９１Ｇ、Ｙ９３Ｗ、Ｓ９５Ｆ、Ｓ９５Ｙ、Ｓ９５Ｇ、Ｓ９５Ｗ、Ｓ９５Ｅ、Ｓ９６Ｇ、Ｓ９６Ａ、Ｓ９６Ｙ、Ｓ９６Ｗ、Ｓ９６Ｒ、Ｌ９７Ｍ、Ｌ９７Ｇ、Ｌ９７Ｒ、Ｌ９７Ｖ、Ｓ９８Ｌ、Ｓ９８Ｗ、Ｓ９８Ｖ、Ｓ９８Ｒ、Ｇ９９Ａ、Ｇ９９Ｅ、Ｓ１００Ａ、Ｓ１００Ｖ、Ｖ１０１Ｙ、Ｖ１０１ＬまたはＶ１０１Ｅからの二以上の置換を含み得る。
【００８３】
いくつかの実施形態において、配列番号８の軽鎖は、Ａ１０、Ｔ１３、Ｓ７８、Ｒ８１およびＳ８２から選択される位置の一または複数に修飾をさらに含む。いくつかの実施形態において、軽鎖の位置Ａ１０における修飾はＡ１０Ｖである。いくつかの実施形態において、軽鎖の位置Ｔ１３における修飾はＴ１３Ａである。いくつかの実施形態において、軽鎖の位置Ｓ７８における修飾はＳ７８Ｔである。いくつかの実施形態において、軽鎖の位置Ｒ８１における修飾はＲ８１Ｑである。いくつかの実施形態において、軽鎖の位置Ｓ８２における修飾はＳ８２Ａである。いくつかの実施形態において、配列番号８の軽鎖は、修飾Ａ１０Ｖ、Ｔ１３Ａ、Ｓ７８Ｔ、Ｒ８１ＱおよびＳ８２Ａの二以上を含む。いくつかの実施形態において、配列番号８の軽鎖は、すべての修飾Ａ１０Ｖ、Ｔ１３Ａ、Ｓ７８Ｔ、Ｒ８１ＱおよびＳ８２Ａを含む。
【００８４】
他の実施形態において提供されるのは、ヒトプロテインＣの活性化型に特異的に結合する単離モノクローナル抗体であり、ここで該抗体は配列番号１８に示すアミノ酸配列を有する重鎖を含み、ここで該アミノ酸配列は一または複数のアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖の修飾は、置換、挿入または欠失である。
【００８５】
いくつかの実施形態において、配列番号１８の重鎖は、位置Ｎ５４またはＳ５６に修飾をさらに含む。いくつかの実施形態において、重鎖の位置Ｎ５４における修飾はＮ５４Ｇ、Ｎ５４ＱまたはＮ５４Ａである。いくつかの実施形態において、重鎖の位置Ｓ５６における修飾はＳ５６ＡまたはＳ５６Ｇである。
【００８６】
いくつかの実施形態において、アミノ酸修飾は、大規模生産プロセスのための抗体生産を促進するために成され得る。例えば、いくつかの実施形態において、修飾は、改善された生物物理学的性質（例えば、最小限の凝集性／粘着性）を目的として、抗体の疎水性表面領域を減少させるために成され得る。いくつかの実施形態において、さらなる修飾が、配列番号８の軽鎖において成される。いくつかの実施形態において、配列番号８の軽鎖の修飾は、位置Ｙ３３においてである。いくつかの実施形態において、軽鎖のＹ３３における修飾は、Ｙ３３Ａ、Ｙ３３ＫまたはＹ３３Ｄである。いくつかの実施形態において、さらなる修飾が配列番号１８の重鎖において成される。いくつかの実施形態において、配列番号１８の重鎖における修飾は、位置Ｙ３２、Ｗ３３、Ｗ５３またはＷ１１０の一または複数である。いくつかの実施形態において、配列番号１８の重鎖における修飾は、Ｙ３２Ａ、Ｙ３２Ｋ、Ｙ３２Ｄ、Ｗ３３Ａ、Ｗ３３Ｋ、Ｗ３３Ｄ、Ｗ５３Ａ、Ｗ５３Ｋ、Ｗ５３Ｄ、Ｗ１１０Ａ、Ｗ１１０ＫまたはＷ１１０Ｄから選択される。
【００８７】
いくつかの実施形態において提供されるのは、ヒト活性化プロテインＣに結合する単離モノクローナル抗体であり、ここで該抗体は配列番号１０８に示すアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。いくつかの実施形態において提供されるのは、ヒト活性化プロテインＣに結合する単離モノクローナル抗体であり、ここで該抗体は配列番号１１０に示すアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。いくつかの実施形態において提供されるのは、ヒト活性化プロテインＣに結合する単離モノクローナル抗体であり、ここで該抗体は配列番号１１２に示すアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。いくつかの実施形態において提供されるのは、ヒト活性化プロテインＣに結合する単離モノクローナル抗体であり、ここで該抗体は配列番号１１４に示すアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。いくつかの実施形態において提供されるのは、ヒト活性化プロテインＣに結合する単離モノクローナル抗体であり、ここで該抗体は配列番号１１６に示すアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。いくつかの実施形態において提供されるのは、ヒト活性化プロテインＣに結合する単離モノクローナル抗体であり、ここで該抗体は配列番号１１８に示すアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【００８８】
いくつかの実施形態において提供されるのは、ヒト活性化プロテインＣに結合する単離モノクローナル抗体であり、ここで該抗体は配列番号１０９に示すアミノ酸配列を有する重鎖を含む。いくつかの実施形態において提供されるのは、ヒト活性化プロテインＣに結合する単離モノクローナル抗体であり、ここで該抗体は配列番号１１１に示すアミノ酸配列を有する重鎖を含む。いくつかの実施形態において提供されるのは、ヒト活性化プロテインＣに結合する単離モノクローナル抗体であり、ここで該抗体は配列番号１１３に示すアミノ酸配列を有する重鎖を含む。いくつかの実施形態において提供されるのは、ヒト活性化プロテインＣに結合する単離モノクローナル抗体であり、ここで該抗体は配列番号１１５に示すアミノ酸配列を有する重鎖を含む。いくつかの実施形態において提供されるのは、ヒト活性化プロテインＣに結合する単離モノクローナル抗体であり、ここで該抗体は配列番号１１７に示すアミノ酸配列を有する重鎖を含む。いくつかの実施形態において提供されるのは、ヒト活性化プロテインＣに結合する単離モノクローナル抗体であり、ここで該抗体は配列番号１１９に示すアミノ酸配列を有する重鎖を含む。
【００８９】
いくつかの実施形態において提供されるのは、ヒト活性化プロテインＣに結合する単離モノクローナル抗体であり、ここで該抗体は配列番号１２に示すアミノ酸配列を有する軽鎖を含み、ここで該アミノ酸配列は一または複数の修飾を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖の修飾は、置換、挿入または欠失である。いくつかの実施形態において、修飾は、軽鎖のＣＤＲに位置する。他の実施形態において、修飾は、軽鎖のＣＤＲの外側に位置する。
【００９０】
いくつかの実施形態において、配列番号１２の軽鎖の修飾は、Ｔ２５、Ｄ５２、Ｎ５３、Ｎ５４、Ｎ５５、Ｄ９５、Ｎ９８またはＧ９９から選択される位置にある。修飾は、例えば、以下の置換：Ｔ２５Ｓ、Ｄ５２Ｙ、Ｄ５２Ｆ、Ｄ５２Ｌ、Ｄ５２Ｇ、Ｎ５３Ｃ、Ｎ５３Ｋ、Ｎ５３Ｇ、Ｎ５４Ｓ、Ｎ５５Ｋ、Ｄ９５Ｇ、Ｎ９８Ｓ、Ｇ９９Ｈ、Ｇ９９ＬまたはＧ９９Ｆの一つであり得る。さらにいくつかの実施形態において、抗体は、Ｔ２５Ｓ、Ｄ５２Ｙ、Ｄ５２Ｆ、Ｄ５２Ｌ、Ｄ５２Ｇ、Ｎ５３Ｃ、Ｎ５３Ｋ、Ｎ５３Ｇ、Ｎ５４Ｓ、Ｎ５５Ｋ、Ｄ９５Ｇ、Ｎ９８Ｓ、Ｇ９９Ｈ、Ｇ９９ＬまたはＧ９９Ｆからの二以上の置換を含み得る。
【００９１】
いくつかの実施形態において提供されるのは、ヒトプロテインＣの活性型に結合する単離モノクローナル抗体であり、ここで該抗体は配列番号２２に示すアミノ酸配列を有する重鎖を含み、ここで該アミノ酸配列は一または複数の修飾を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖の修飾は、置換、挿入または欠失である。
エピトープ
【００９２】
同様に提供されるのは、ヒト活性化プロテインＣのエピトープに結合する単離モノクローナル抗体であり、ここで該エピトープは配列番号３に示すヒトａＰＣの重鎖由来の一または複数の残基を含む。
【００９３】
いくつかの実施形態において、エピトープは、ヒトａＰＣの活性部位を含み得る。いくつかの実施形態において、活性部位は、ヒトａＰＣのアミノ酸残基Ｓ１９５を含み得る。
【００９４】
いくつかの実施形態において、エピトープは、配列番号３に示すヒト活性化プロテインＣのＤ６０、Ｋ９６、Ｓ９７、Ｔ９８、Ｔ９９、Ｅ１７０、Ｖ１７１、Ｍ１７２、Ｓ１７３、Ｍ１７５、Ａ１９０、Ｓ１９５、Ｗ２１５、Ｇ２１６、Ｅ２１７、Ｇ２１８およびＧ２１８から選択される一または複数の残基を含み得る。
【００９５】
同様に提供されるのは、ヒト活性化プロテインＣに対し結合するために、本明細書に記載の抗体のいずれかと競合しうる抗体である。例えば、当該競合する抗体は、上記の一または複数のエピトープに結合し得る。
核酸、ベクターおよび宿主細胞
【００９６】
同様に提供されるのは、上記のモノクローナル抗体のいずれかをコードする単離核酸分子である。
【００９７】
従って提供されるのは、ヒト活性化プロテインＣに結合する抗体をコードする単離核酸分子である。
【００９８】
いくつかの実施形態において提供されるのは、活性化プロテインＣに結合しかつ抗凝固活性を阻害するが、しかし非活性化プロテインＣに対する最小の結合性しか有さない抗体をコードする単離核酸分子であり、ここで該抗体は配列番号３４〜４３から成る群より選択される核酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００９９】
いくつかの実施形態において提供されるのは、活性化プロテインＣに結合しかつ抗凝固活性を阻害するが、しかし非活性化プロテインＣに対する最小の結合性しか有さない抗体をコードする単離核酸分子であり、ここで該抗体は配列番号２４〜３３から成る群より選択される核酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１００】
いくつかの実施形態において提供されるのは、活性化プロテインＣに結合しかつ抗凝固活性を阻害するが、しかし非活性化プロテインＣに対する最小の結合性しか有さない抗体をコードする単離核酸分子であり、ここで該抗体は配列番号１４〜２３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態において提供されるのは、活性化プロテインＣに結合しかつ抗凝固活性を阻害するが、しかし非活性化プロテインＣに対する最小の結合性しか有さない抗体をコードする単離核酸分子であり、ここで該抗体は配列番号４〜１３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態において提供されるのは、活性化プロテインＣに結合しかつ抗凝固活性を阻害するが、しかし非活性化プロテインＣに対する最小の結合性しか有さない抗体をコードする単離核酸分子であり、ここで該抗体は、配列番号１４〜２３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域または配列番号４〜１３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および重鎖可変領域または軽鎖可変領域に一または複数のアミノ酸修飾を含む。
【０１０３】
さらに同様に提供されるのは、上記のモノクローナル抗体のいずれかをコードする単離核酸分子を含むベクター、および当該ベクターを含む宿主細胞である。
ａＰＣに対する抗体の作成方法
【０１０４】
モノクローナル抗体は、宿主細胞において本実施形態の一に従い、モノクローナル抗体の可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現することによって組換えで作成され得る。発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を含む核酸は、トランスフェクトされ得て、産生に適した宿主細胞中で発現され得る。同様に提供されるのは、ヒトａＰＣに結合するモノクローナル抗体を産生するための、以下を含む方法である：
【０１０５】
（ａ）モノクローナル抗体をコードする核酸分子を宿主細胞にトランスフェクトすること、
【０１０６】
（ｂ）宿主細胞中でモノクローナル抗体を発現するように宿主細胞を培養すること、および任意選択的に産生されたモノクローナル抗体を単離し精製すること（ここで核酸分子はモノクローナル抗体をコードするヌクレオチド配列を含む）。
【０１０７】
一実施例において、抗体またはその抗体フラグメントを発現するために、標準的な分子生物学の技術によって得られた部分長または完全長の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写可能および翻訳可能な調節配列に作動可能に連結されるように発現ベクターに挿入される。これに関連して、用語「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」とは、ベクター内の転写可能および翻訳可能な制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというその所期の機能を果たすように、抗体遺伝子がベクターに結合されるということを意図する。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主と適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入されうるが、より典型的には両遺伝子は同一の発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子フラグメント上の相補的制限部位とベクターのライゲーション、または制限部位が無い場合は平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入される。本明細書に記載の抗体の軽鎖および重鎖可変領域は、ベクター内でＶＨセグメントが作動可能にＣＨセグメントに結合されおよびベクター内でＶＬセグメントが作動可能にＣＬセグメントに結合されるように、所望のイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクターに当該領域を挿入することによって、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を作成するために使用し得る。さらにまたは任意選択的に、組み換え発現ベクターは、宿主細胞由来の抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで結合するように、ベクター内にクローン化され得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種性シグナルペプチド（すなわち非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。
【０１０８】
遺伝子をコードする抗体鎖に加えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞において抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保有する。用語「調節配列」は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。当該調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ著「Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｃｈｎｏｌｏｇｙ（遺伝子発現技術）．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）」に記載されている。調節配列の選択を含めて、発現ベクターの設計が形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等のファクターに依存し得ることは、当業者により理解されるであろう。哺乳動物の宿主細胞の発現のための調節配列の例には、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指図するウイルス要素、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサー等が含まれる。代わりに、ユビキチンプロモーターまたはβ‐グロビンプロモーター等の非ウイルス調節配列が使用され得る。
【０１０９】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて組換え発現ベクターは、追加の配列、例えば、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択マーカー遺伝子等を保有し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選抜を容易にする（例えば、Ａｘｅｌらによる米国特許第４，３９９，２１６、４，６３４，６６５および５，１７９，０１７を参照されたい）。例えば、典型的に選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に薬剤、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサート等に対する耐性を与える。選択マーカー遺伝子の例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ‐宿主細胞におけるメトトレキサートによる選択／増幅用）およびネオマイシン耐性遺伝子（Ｇ４１８選択用）が含まれる。
【０１１０】
軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターが、標準的技術によって宿主細胞にトランスフェクトされる。用語「トランスフェクション」の種々の表現形式は、原核または真核宿主細胞への外来性ＤＮＡの導入のために通常使用される多種多様な技術、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥ‐デキストラントランスフェクション法等を包含することを意図する。理論的に抗体を原核または真核宿主細胞において発現することは可能であるが、当該真核細胞、特に哺乳類細胞は、適切に折り畳まれかつ免疫学的に活性な抗体を、原核細胞よりも構築および分泌する可能性が高いとの理由で、哺乳類の宿主細胞を含む真核細胞における抗体の発現が典型的である。
【０１１１】
組換え抗体を発現するための哺乳類宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６‐４２２０に記載のｄｈｆｒ‐ＣＨＯ細胞を含み、例えば、Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１‐６２１に記載の通りＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用される）、ＮＳＯ骨髄種細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＫＢ１１細胞およびＳＰ２細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞における抗体発現または宿主細胞が増殖される培養液中への抗体分泌を可能とするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製法、例えば、限外濾過法、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび遠心分離法等を使用して培養液から回収され得る。
完全抗体を発現するための抗体部分配列の使用
【０１１２】
抗体は、主に六個の重鎖および軽鎖ＣＤＲに位置するアミノ酸残基により標的抗原と相互に作用する。この理由のためにＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側配列よりも個々の抗体の間でより多様である。ＣＤＲ配列は、ほとんどの抗体‐抗原相互作用の原因であるので、異なる性質を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列に融合された、特異的な自然起源の抗体由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特異的な自然起源の抗体を模倣する組換え抗体を発現することが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３‐３２７；Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２‐５２５；ａｎｄ  Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９‐１００３３を参照されたい）。当該フレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公的なＤＮＡデータベースから得られる。これらの生殖系列配列は、それらがＢ細胞成熟の間のＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子再構成によって形成される完全に会合した可変遺伝子を含まないであろうと言う理由から、成熟抗体遺伝子配列と異なるであろう。元の抗体の結合性と同様の結合性を有する完全な組換え抗体再構築するために、特定の抗体のＤＮＡ配列全体を獲得する必要はない（ＷＯ  ９９／４５９６２を参照されたい）。ＣＤＲ領域にまたがる重鎖および軽鎖の部分配列は、一般的にこの目的に十分である。部分配列は、どの生殖系列可変遺伝子セグメントおよびジョイニング遺伝子セグメントが組換え抗体可変遺伝子に寄与したのかを決定するために使用される。生殖系列配列は、さらに可変領域の欠失部分を埋めるために使用される。重鎖および軽鎖リーダー配列は、タンパク質の成熟の間に切断され、最終抗体の性質に寄与しない。この理由のために、発現構築物に対応する生殖系列リーダー配列を使用することが必要である。欠落している配列を付加するためにクローン化されたｃＤＮＡ配列が、ライゲーションまたはＰＣＲ増幅によって合成オリゴヌクレオチドと結合され得る。その代りに全可変領域位が、一組の短くオーバーラップするオリゴヌクレオチドとして合成され得て、合成完全可変領域クローンを作成するためにＰＣＲ増幅によって結合される。このプロセスには、特定コドンの除去または包含または特定の制限部位、または最適化等の一定の有利さがある。
【０１１３】
重鎖及び軽鎖転写物のヌクレオチド配列が、天然配列と同一のアミノ酸コード能を有する合成Ｖ配列を作成するために、オーバーラップする一組の合成オリゴヌクレオチドを設計するために使用される。合成重鎖および軽鎖配列は、天然配列と異なり得る。例えば：反復ヌクレオチド塩基の紐は、オリゴヌクレオチド合成およびＰＣＲ増幅を促進するために中断される；至適翻訳開始部位がコザック規則（Ｋｏｚａｋ，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７‐１９８７０）に従って組み込まれる；ならびに制限部位が翻訳開始部位の上流または下流に遺伝子操作される。
【０１１４】
重鎖および軽鎖可変領域の双方に対して、最適化コード鎖配列および対応する非コード鎖配列は、対応する非コードオリゴヌクレオチドのほぼ中間点において３０〜５０のヌクレオチド断片に分解される。それ故に各々の鎖に対してオリゴヌクレオチドが、１５０〜４００ヌクレオチドのセグメントにおよぶオーバーラップする二重鎖の組に組み立てられ得る。プールは、次に１５０〜４００ヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物を産生するために鋳型として使用される。典型的には単一の可変領域オリゴヌクレオチドの組は、オーバーラップする二つのＰＣＲ産物を産生するために分離して増幅される二つのプールに分解されるであろう。これらのオーバーラップする産物は、次に完全な可変領域を形成するためにＰＣＲ増幅によって結合される。発現ベクター構築物に容易にクローン化され得るフラグメントを作成するために、ＰＣＲ増幅において重鎖または軽鎖定常領域のオーバーラップするフラグメントを含むことも同様に望ましい。
【０１１５】
再構成された重鎖および軽鎖可変領域は、次に発現ベクター構築物を形成するために、クローン化されたプロモーター、翻訳開始、定常領域、３‘非翻訳領域、ポリアデニル化および転写終結配列と結合される。重鎖および軽鎖発現構築物は、単一ベクターに結合され、宿主細胞にコトランスフェクト、連続的にトランスフェクトまたは分離してトランスフェクトされ得て、該宿主細胞は両鎖を発現する宿主細胞を形成するために次に融合される。
【０１１６】
従って他の態様において、ヒト抗‐ａＰＣ抗体の構造的特徴が、ａＰＣに対する結合機能を保持する、構造的に関連するヒト抗‐ａＰＣ抗体を作成するために使用される。より具体的には、特に同定されたモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖領域の一または複数のＣＤＲが、さらに遺伝子組換え操作されたヒト抗‐ａＰＣ抗体を作成するために、既知のヒトフレームワーク領域およびＣＤＲと組換えで結合され得る。
医薬組成物
【０１１７】
同様に提供されるのは、治療的有効量の抗ａＰＣモノクローナル抗体および薬剤的に許容可能な担体を含む医薬組成物である。「薬剤的に許容可能な担体」とは、製剤を処方または安定化するために役立ち、患者に対し顕著で有害な毒性学的影響を惹起しないように活性成分に添加し得る物質である。当該担体の例は、当業者にとって周知であり、水、マルトースまたはショ糖等の糖類、アルブミン、塩化ナトリウム等の塩、等である。他の担体は、例えばＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ著のＲｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（レミントンの薬学の科学）に記載されている。当該組成物は、治療的有効量の少なくとも一つの抗‐ＴＦＰＩモノクローナル抗体を含むであろう。
【０１１８】
薬剤的に許容可能な担体には、注射用滅菌溶液または分散剤の即時調製のための滅菌水溶液または分散液および滅菌パウダーが含まれる。医薬活性物質に対する当該媒質および薬剤の使用は、当該技術分野において既知である。組成物は、いくつかの実施形態において、非経口用に製剤化される。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは高い薬剤濃度に適した他の規則構造物として製剤化され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコール等）およびその適当な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。いくつかの場合、担体は、組成中に等張化剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトール等のポリアルコールまたは塩化ナトリウムを含み得る。
【０１１９】
注射用滅菌溶液は、上に列記した必要とされる成分の一つまたは組み合せを含む適切な溶媒中に必要とされる量で活性化合物を包含すること、その後にマイクロフィルター滅菌が続くことによって調製され得る。一般的に分散剤は、基本の分散媒体および上に列記した成分からの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルに、活性化合物を包含することによって調製される。注射用滅菌溶液の調製のための滅菌パウダーの場合、いくつかの調製方法は、活性成分およびその予備濾過滅菌溶液由来の任意の追加の所望成分からなるパウダーをもたらす、減圧乾燥および凍結乾燥である。
医薬用途
【０１２０】
モノクローナル抗体は、凝固における遺伝性および後天性の欠乏症または欠損症を治療するための治療目的用に使用され得る。例えば、上記の実施形態におけるモノクローナル抗体は、ａＰＣとその基質（第Ｖａ因子または第ＶＩＩＩａ因子を含み得る）との相互作用をブロックするために使用し得る。
【０１２１】
モノクローナル抗体は、血小板減少症、血小板異常症および出血性障害（血友病Ａ、血友病Ｂおよび血友病Ｃ）等の止血障害の治療における治療的使用を有する。当該障害は、必要とする患者に治療的有効量の抗‐ａＰＣモノクローナル抗体を投与することによって治療され得る。モノクローナル抗体はまた、外傷および出血性卒中等の適応症における制御不能な出血の治療における治療的使用も有する。従って同様に提供されるのは、治療的有効量の抗‐ａＰＣｍノクローナル抗体を投与することを含む、出血時間を短縮するための方法である。
【０１２２】
他の実施形態において、抗‐ａＰＣ抗体は、例えば、敗血症または出血性障害の治療のために使用される場合を含み、ａＰＣ治療を受けた患者用の解毒剤として有用であり得る。
【０１２３】
抗体は、止血障害に対処するために、単剤治療としてまたは他の治療と併用して使用され得る。例えば第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子等の凝固因子との一または複数の抗体の同時投与は、血友病を治療するために有用であると考えられている。一実施形態において提供されるのは、（ａ）ヒト組織因子経路阻害剤に結合する第一の量のモノクローナル抗体および（ｂ）第二の量の第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子を投与することを含み、ここで前記の第一および第二の量は合わせて前記の欠乏症または欠損症を治療するために有効である、凝固における遺伝性および後天性の欠乏症または欠損症を治療するための方法である。他の実施形態において提供されるのは、（ａ）ヒト組織因子経路阻害剤に結合する第一の量のモノクローナル抗体および（ｂ）第二の量の第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子を投与することを含み、ここで前記の第一および第二の量は合わせて前記の欠乏症または欠損症を治療するために有効であり、およびさらにここで第ＶＩＩ因子が同時投与されない、凝固における遺伝性および後天性の欠乏症または欠損症を治療するための方法である。同様に含まれるのは、モノクローナル抗体と第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子からなる、治療的有効量の組み合せを含み、ここで組成物が第ＶＩＩ因子を含まない医薬組成物である。「第ＶＩＩ因子」には第ＶＩＩ因子および第ＶＩＩａ因子が含まれる。これらの併用療法は、必要とされる凝固因子の注入頻度を低減するかもしれない。同時投与または併用療法とは、各々が別々に製剤化されたまたは一つの組成物中に一緒に製剤化された二つの治療薬の投与を意味し、別々に製剤化された場合、ほぼ同時にまたは異なる時間であるが同じ治療期間にわたり投与される。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の一または複数の抗体は、止血障害に対処するために併用して使用され得る。例えば本明細書に記載の二以上の抗体の同時投与は、血友病または他の止血障害を治療するために有用であると考えられている。
【０１２５】
医薬組成物は、血友病ＡまたはＢを患う患者に対し、出血症の重症度により変動し得る、予防治療の場合には患者の凝固欠乏症の重症度により変動し得る、投与量および投与頻度で非経口的に投与され得る。
【０１２６】
組成物は、大量瞬時投与としてまたは連続注入によって患者に投与され得る。例えば、Ｆａｂフラグメントとしての本発明の抗体の大量瞬時投与は、０．００２５から１００ｍｇ／ｋｇ体重、０．０２５から０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０１０から０．１０ｍｇ／ｋｇまたは０．１０〜０．５０ｍｇ／ｋｇの量であり得る。連続注入のためのＦａｂフラグメントとしての本発明の抗体は、０．００１ないし１００ｍｇ／ｋｇ体重／分、０．０１２５ないし１．２５ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０ないし０．７５ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０ないし１．０ｍｇ／ｋｇ／分または０．１０〜０．５０ｍｇ／ｋｇ／分で、１〜２４時間、１〜１２時間、２〜１２時間、６〜１２時間、２〜８時間または１〜２時間の期間、投与され得る。完全長抗体（完全定常領域を有する）としての本発明の抗体の投与のための投与量は、約１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、２〜８ｍｇ／ｋｇまたは５〜６ｍｇ／ｋｇであり得る。当該完全長抗体は、典型的には三十分ないし三時間の期間におよぶ注入によって投与されるであろう。投与頻度は、症状の重症度に依存するであろう。頻度は週当たり３回から二週ないし六月ごとに一回に変動し得る。
【０１２７】
さらに組成物は、皮下注射により患者に投与され得る。例えば、１０ないし１００ｍｇの抗‐ａＰＣ抗体の薬量が、皮下注射により週ごと、隔週ごとまたは月ごとに患者に投与され得る。
【０１２８】
本明細書で用いる場合、「治療的有効量」とは、インビボでの凝固時間を効率的に増加させるために、ないしは必要とする患者にインビボで測定可能な有利さを引き起こすために必要とされる、抗‐ａＰＣモノクローナル抗体の量または当該抗体と第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の組み合せの量を意味する。精確な量は、限定されるものではないが、治療用組成物の成分および物理的特性、対象の患者集団、個別の患者について考慮すべき事柄等を含む多数のファクターに依存するであろうが、当御者によって容易に決定され得る。
実施例
【０１２９】
本開示の態様は、以下の実施例を考慮しさらに理解し得るが、該実施例を決して本教示の範囲を限定するものと解釈してはならない。
実施例１  材料および方法
ヒトａＰＣ‐特異的バインダーのスクリーニング
【０１３０】
マスタープレートの調製：パンニングストラテジー当たり１８８０個のクローンを、コロニーピッカーＱｐｉｘ２（Ｇｅｎｅｔｉｘ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ  ＵＳＡ）を使用して、増殖培地（２ＸＹＴ／グルコース１％／カルベニシリン１００μｇ／ｍｌ）を含む３８４ウェルプレートに収集することによってマスタープレートを作成した。プレートを３７℃で一晩振盪しながら増殖した。
【０１３１】
発現プレートの作成：リキッドハンドラＥｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐ３（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、マスタープレートからの培地５μｌを、発現培地（２ＸＹＴ／グルコース０．１％／カルベニシリン１００μｇ／ｍｌ）を含む３８４ウェルプレートに移行し、３０℃でインキュベートした。培養液がＯＤ６００で０．５に達するときに、終濃度０．５ｍＭでＩＰＴＧを添加する。次にプレートを３０℃に戻し一晩増殖する。
【０１３２】
一次ＥＬＩＳＡ：Ｍａｘｉｓｏｒｐ３８４ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ  ＵＳＡ）を、Ｃａ／Ｍｇ添加ＤＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの組換えヒトａＰＣまたはヒトＰＣ（Ｍｏｌ．Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）により被覆し、４℃で一晩インキュベートした。被覆したＥＬＩＳＡプレートを、ＤＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋ツイーン０．０５％）により３回洗浄し、ＭＤＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋ツイーン０．０５％＋乳５％）により室温で１時間ブロックした。ブロックされたプレートを吸引し、発現培地１５μｌおよびＭＤＰＢＳＴ３０μｌを各ウェルに移行した。ＥＬＩＳＡプレートを室温で１時間インキュベートし、その後ＤＰＢＳＴにより５回洗浄した。抗‐ｈＦａｂ‐ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＤＰＢＳＴ中１：１０，０００希釈）を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。次にプレートをＤＰＢＳＴにより５回洗浄した。基質Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、プレートを４８５ｎｍの励起波長および５９５ｎｍの放出波長で読み取った。
【０１３３】
確認ＥＬＩＳＡ：コロニーピッカーＱｐｉｘ２を使用して、推定陽性クローンをマスタープレートから増殖培地１ｍｌを含む９６ディープウェルプレート（Ｑｉａｇｅｎ）に再配列し、３７℃で一晩増殖した。発現プレートをマスタープレートから接種し、培養液がＯＤ６００で０．５に達したときに、終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧにより誘導した。次にＥＬＩＳＡを上で概説した発現培地で実施した。
ビオチン標識ａＰＣによるライブラリーセレクション（溶液中パンニング）
【０１３４】
二つの方法を実施した：ＰＣ結合剤欠乏および合計ＰＣおよびａＰＣ結合剤非欠乏。ストレプトアビジン結合Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ２８０をビオチン‐ＴＦ（組織因子、非欠乏用）１００ｎＭまたはビオチン‐ＰＣ（欠乏）１００ｎＭに共役し、磁気装置によって捕捉した。ＤＰＢＳ／ＢＳＡ  ３％／ツイーン２０  ０．０５％により予めブロックした、１〜７．５ｘ１０１２ｃｆｕのＦａｂライブラリーファージを、ビオチン‐ＴＦまたはストレプトアビジンビーズと共役化したビオチン‐ＰＣと回転板上室温で２時間インキュベートした。ビオチン‐ＴＦ（非欠乏）またはビオチン‐ＰＣ（欠乏）／ストレプトアビジンビーズ捕捉し廃棄した。生じたファージ上清を、ＤＰＢＳ／ＢＳＡ  ３％／ツイーン２０  ０．０５％／ＣａＣｌ２  １ｍＭの１ｍｌ中の１００ｎＭ（一回目）、５０ｎＭ（二回目）または１０ｎＭ（三回目）のビオチン‐ａＰＣとインキュベートした。ストレプトアビジン共役磁気ビーズをファージ‐ａＰＣ溶液に添加し、室温で３０分間インキュベートした。ファージ‐ａＰＣ複合体ビーズを磁気装置で捕獲し、パンニングの回に依存してＢＳＡ３％またはツイーン２０  ０．０５％添加のＤＰＢＳで異なる回数洗浄した。結合したファージをトリプシン１ｍｇ／ｍｌで溶出しアプロチニンにより中和した。溶出されたファージを、次に１０ｍｌの対数増殖期の大腸菌ＨＢ１０１Ｆ‘を感染するために使用し、次回のセレクションのために増幅した。ファージストックを、同様にＣＦＵ滴定でも分析した（パンニング出力）。
固定化ａＰＣによるライブラリーセレクション（固相パンニング）
【０１３５】
Ｍａｘｉ‐ｓｏｒｐ  ９６ウェルプレートの五つのウェルを、ＤＰＢＳ中の組換えａＰＣ４００ｎｇ／ウェルにより一晩被覆した。インソルーションパンニングと同様にファージライブラリーを、非欠乏用にビオチン‐ＴＦによりまたは欠乏用にビオチン‐ＰＣにより予備処理した。生じたファージを次にａＰＣを被覆したウェルに添加し、振盪機上室温で１〜２時間インキュベートした。非結合のファージを、パンニング回数に依存してＢＳＡ３％またはツイーン２０  ０．０５％添加ＤＰＢＳで種々の回数洗浄することによって洗い流した。結合したファージをトリプシン１ｍｇ／ｍｌで溶出しアプロチニンにより中和した。溶出されたファージを、次に１０ｍｌの対数増殖期の大腸菌ＨＢ１０１Ｆ‘を感染するために使用し、次回のセレクションのために増幅した。ファージストックを、同様にＣＦＵ滴定で分析した（パンニング出力）。
選択ファージプールの増幅：溶出ファージストックを、セレクション２、３および４回について、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を使用してＨＢ１０１Ｆ‘中で増幅した。
【０１３６】
１０ｍｌ容量の対数増殖期のＨＢ１０１Ｆ‘を、各回のセレクション由来の溶出ファージにより感染し、３７℃、５０ｒｐｍで４５分間インキュベートした。次に細菌を２ｘＹＴ培地に再懸濁し、カルボシニン１００μｇ／ｍｌ、テトラサイクリン１５μｇ／ｍｌおよびグルコース１％を含有する二枚の１５ｃｍの寒天プレートに塗布し、その後３０℃で一晩インキュベートした。プレートから細菌の菌叢を、合計８ｍｌの２ｘＹＴ／ｃａｒｂ／ｔｅｔにより収集した。
【０１３７】
約１０μｌの細胞を、１０ｍｌの２ｘＹＴ／ｃａｒｂ／ｔｅｔ（ＯＤ６００は約０．１〜０．２である）に再懸濁し、ＯＤ６００が０．５〜０．７に到達するまで３７℃でインキュベートした。５ｘ１０１０ｃｆｕのＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを細胞に添加し、３７℃で４５分間インキュベートした。感染した細胞を、次に１５ｍｌの新鮮な２ｘＹＴ／ｃａｒｂ／カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）／ｔｅｔに再懸濁し、ファージを産生するために３０℃で一晩振盪した。ファージ上清を遠心分離および０．４５μｍのフィルターを通す濾過によって収集した。上清の９００μｌを次回のセレクションに使用した。
ａＰＣ抗体のＤＮＡ配列解析
【０１３８】
プラスミドを、標準的な分子生物学的技術を使用して調製した。以下のプリマ―を、選択された抗体クローンのＤＮＡ塩基配列決定のために使用した。
ａ）プライマーＡ：５‘ＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＡＡＴＡＣＣＴＡＴＴＧＣ３’
ｂ）プライマーＢ：５‘ＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴＣＣ３’
ｃ）プライマーＣ：５‘ＴＡＧＧＴＡＴＴＴＣＡＴＴＡＴＧＡＣＴＧＴＣＴＣ３’
ｄ）プライマーＤ：５‘ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧ３’
血漿プロテインＣの精製
【０１３９】
一リットルのイヌまたはウサギ血漿を、抗凝固剤としてヘパリンを含有する２０個の５０ｍｌ凍結ストックとして購入した（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）。精製方法は、変更を加えたＥｓｍｏｎ‘ｓ  ｌａｂ（１２）による記載の通りだった。血漿を４℃で解凍し、プロテインＣおよび他のビタミンＫ依存性タンパク質を捕捉するためにＱセファロースに負荷する前に、０．０２Ｍトリス‐ＨＣｌ、ｐＨ７．５、ヘパリン終濃度１Ｕ／ｍｌ、ベンズアミジンＨＣｌ終濃度１０ｍＭにより室温で１：１に希釈した。カラムを０．１５Ｍ緩衝食塩水により洗浄し、プロテインＣを０．５Ｍ緩衝食塩水により溶出した。溶出物をＣａ＋＋  １０ｍＭおよびヘパリン１００Ｕ／ｍｌにより再石灰化し、次にＨＣＰ４‐アフィゲル‐１０アフィニティーカラムに負荷した。カラムをＣａ含有緩衝液により洗浄し、ＥＤＴＡ含有緩衝液により溶出した。精製されたＰＣをＰＢＳ緩衝液に一晩透析し、瞬間凍結し、０．５ｍｌ分量として−８０℃で保存した。精製収量は、一リットルのイヌ血漿から１．７５ｍｇであった。精製ＰＣは、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥおよび分析用ＳＥＣによって定量されたとき、９８％の純度を有した。
Ｆａｂの発現および精製
【０１４０】
Ｆａｂ発現のために５・ｌのｓＦａｂ大腸菌グリセリンストックを、１ｍｌの増殖培地（ＬＢ培地、グルコース１％、アンピシリン１００・ｇ／ｍｌ）に接種し、培養液を３７℃、２５０ｒｐｍで振盪しながら一晩増殖した。一晩培養した培養液５００・ｌを、次に１０ｍｌの予備加熱した（３７℃）誘導培地（ＬＢ培地、グルコース０．１％、アンピシリン１００・ｇ／ｍｌ）に接種し、３７℃、２５０ｒｐｍ、ＯＤ５００で０．６〜０．７まで増殖した。Ｆａｂ発現のために、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭで培地に添加し、培養液を２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩増殖した。翌日、一晩培養液を、培養液を細胞から分離するために４℃、３、０００ｇで１５分間遠心分離した。上清およびペレットの双方をＦａｂ精製のために保存した。上清およびペレットの双方におけるＦａｂ発現は、抗‐Ｈｉｓ抗体を使用するウェスタンブロット解析によって確認し得る。
【０１４１】
Ｆａｂ精製のために、プロテインＡカラム（ＭａｂＳｕｒｅ）を、ＢｉｏＩｎｖｅｎｔプロトコルの推奨通りに使用した。残差を除去するために、上清を０．４５μｍのフィルターにより濾過し、緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに負荷する前に、コンプリートプロテアーゼインヒビタータブレット（Ｒｏｃｈｅ  １１８７３５８０００１）と混合した。ＦａｂをｐＨ２〜３の緩衝液により溶出し、次にｐＨ７．０のＰＢＳに緩衝液交換した。細胞ペレットからＦａｂを遊離させるために、１ｍｌの溶解緩衝液をペレットに添加した。混合液を溶解のためにロッキングプラットホーム上４℃で１時間インキュベートし、次に４℃、３、０００ｇで３０分間遠心分離した。透明な上清を新たな試験管に移し、プロテインＡカラムに負荷した。溶解緩衝液は、ショ糖冷溶液（ショ糖２０％（ｗ／ｖ）、トリス‐ＨＣｌ  ３０ｍＭ、ＥＤＴＡ  １ｍＭ、ｐＨ８．０）中で新たに調製されたリゾチーム（Ｓｉｇｍａ  Ｌ‐６８７６）１ｍｇ／ｍｌ、ベンゾナーゼ２．５Ｕ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ  Ｅ１０１４）（２５  ＫＵ／ｍｌ、ストック溶液の１／１０、０００）およびコンプリートプロテアーゼインヒビター１錠（Ｒｏｃｈｅ  １１８７３５８０００１）を含む。精製Ｆａｂの純度を、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥおよび分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により確認した。エンドトキシンレベルも同様にモニターした。
ＰＣおよびａＰＣのウェスタンブロット解析
【０１４２】
精製タンパク質（１００ｎｇ／レーン）を、ＤＴＴ添加（還元）またはＤＴＴ無添加（非還元）の４ｘＳＤＳ‐ＰＡＧＥローディング染料と混合し、９５℃で５分間加熱し、次に４〜１２％のＮｕＧＡＧＥゲルに負荷した。タンパク質を、ｉ‐Ｂｌｏｔ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によってニトロセルロース膜に転写した。探索ステップを、ＳＮＡＰ‐ｉｄ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により実施した。５％乳／ＰＢＳにより１０分間ブロッキングした後、膜を種々の薬剤とインキュベートした（例えば、ビオチン化ａＰＣ検出用ストレプトアビジン‐ＨＲＰ、マウス抗‐ヒトＰＣモノクローナル抗体ＨＣＰ‐４およびイヌａＰＣ検出用抗‐ＰＣヤギポリクローナル抗体）。探索は、その後に室温で１０分間のＨＲＰ二次抗体とのインキュベーションが引き続いた。ツイーン２０を０．１％含むＰＢＳによりブロットを洗浄した後、ＨＲＰからのシグナルを、化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して検出し、ｘ線フィルムに露光した。
Ｆａｂ  ＥＬＩＳＡ
【０１４３】
抗原タンパク質（ヒトＰＣ、ヒトＰＣ、マウスＡＰＣ、イヌＡＰＣ）を、ＰＢＳ／Ｃａ緩衝液中（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００ｎｇ／１００μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに４℃で一晩被覆した。翌日、プレートを３回洗浄し、５％ＰＢＳ／Ｃａ／ＢＳＡ／ツイーン２０により室温で１時間ブロックした。可溶性Ｆａｂを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。抗ヒトラムダ抗体‐ＨＲＰを検出抗体として添加した後、プレートを室温で１時間インキュベートし、激しく洗浄し、次にキット製造者の記載の通りに基質Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄを使用して展開した。信号を、蛍光プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ３４０ｐｃ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して、ＲＦＵとして測定した。標準曲線を四パラメータモデルに適合させ、未知の値を曲線から外挿した。
実施例２  ライブラリーからのａＰＣ抗体のパンニング
【０１４４】
ヒト活性化プロテインＣに対する完全ヒト化Ｆａｂ抗体ライブラリーのパンニングおよびスクリーニングを、実施例１記載の方法を使用して実施した。ＤＮＡ塩基配列決定を、１０個の特有の抗体配列をもたらした正の抗体クローンに関して実施した。抗体の重鎖および軽鎖の配列比較を図２に示す。同一の重鎖ＣＤＲ３配列が５個のＦａｂ（Ｃ７１７、Ｃ７Ａ２３、Ｔ４６Ｊ２３、Ｃ２２Ｊ１３、Ｃ２５Ｋ２３）に見出される。
【０１４５】
精製Ｆａｂを：ａ）その結合特異性（ａＰＣ対ＰＣ）；結合親和性（ＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅによる）；および種間交差反応性（すなわちヒト、イヌおよびマウスを含む異なる種起源のａＰＣに対する結合性。ウサギａＰＣもまた後にＩｇＧ形態のために使用した）；ｂ）他のビタミンＫ依存性凝固因子（例えば、ＦＩＩａ、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ）に対するその結合選択性；ｃ）血漿凝固試験ａＰＴＴにおけるａＰＣの抗凝固活性を阻害するその能力；およびｄ）アミド分解活性試験（小ペプチド基質に関する）および第Ｖａ因子不活性化試験（タンパク質基質ＦＶａに関する）を使用する、緩衝液中でのａＰＣのプロテアーゼ酵素活性に関するその効力、を評価するために機能試験パネルによって特性化した。
実施例３  ａＰＣ特異的抗体の結合親和性および異種間の反応性
【０１４６】
これらの精製抗‐ａＰＣ  Ｆａｂの抗原結合活性を、図３に示す直接ＥＬＩＳＡによって測定した。抗原をＥＬＩＳＡプレート上に直接被覆した。被覆抗原は、ＰＢＳ／Ｃａ緩衝液中、１００ｎｇ／ウェルのヒトＰＣ（血漿由来）、ヒトａＰＣ（組換え体）、イヌａＰＣ（血漿由来）およびマウスａＰＣ（組換え体）を含んだ。乳５％／ＰＢＳによりプレートをブロックし、プレートをＰＢＳ‐ツイーン２０により洗浄した後に、可溶性Ｆａｂ（１ｕｇ／ｍｌ、２０ｎＭ）をプレートに添加し、振盪しながら室温で１時間インキュベートした。Ｆａｂ結合を、抗‐ヒトＦａｂ（ラムダ）抗体‐ＨＲＰおよび基質としてのＡｍｐｌｅｘ  ｒｅｄにより検出した。ＥＬＩＳＡのデータは、すべてのＦａｂが特異的にヒトａＰＣに結合するが、ヒトＰＣには結合しないことを明らかにした。一つのＦａｂ、Ｒ４１Ｃ１７はヒトＰＣに最小限の結合性を示した。対照的にＲ４１Ｃ１７は、ヒトＡＰＣおよびヒトＰＣの双方に結合する。同様に図３に示されるのは、ＥＬＩＳＡによるＦａｂの異種間の反応性である。８個のａＰＣ‐特異的結合剤の中でその４個（Ｃ７１７、Ｃ７Ａ２３、Ｃ２５Ｋ２３、Ｔ４６Ｊ２３）はまた、イヌａＰＣとの交差反応性も示した。さらに、一つのＦａｂ、Ｔ４６Ｊ２３はマウスａＰＣへのある程度の結合性を示した。
【０１４７】
図３に示されるのは、ヒトａＰＣおよびイヌａＰＣに対する抗‐ａＰＣ抗体のＥＬＩＳＡによって測定したＥＣ５０である。
【表３】
2016501230.tif 000008
【表４】
2016501230.tif 000009
実施例４  抗‐ａＰＣ  Ｆａｂの結合選択性
【０１４８】
これらのｆａｂの結合選択性を決定するために、酵素前駆体ヒトＰｃに対する、トロンビン（ＦＩＩａ）に対する、ならびに活性化第ＩＩ因子（ＦＩＩａ、トロンビン）、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）および第Ｘ因子（ＦＸａ）に対するｆａｂの結合活性もＥＩＳＡによって同様に評価した。つまりＥＬＩＳＡプレートを、１μｇ／ｍｌのヒトａＰＣ、１０μｇ／ｍｌのマウスＰＣ、１０ｕｇ［μｇ］／ｍｌのイヌＰＣ、５〜１０μｇ／ｍｌ他の凝固因子（ＦＩＩａ、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ）によりプレートを被覆した。抗‐ａＰＣＦａｂをウェルに２０ｎＭ（１μｇ／ｍｌ）で添加した。結合したＦａｂを二次抗体（抗‐ヒトＦａｂ‐ＨＲＰ）によって、その後にＨＲＰの基質ＡｍｐｌｅｘＲｅｄによって検出した。正の対照として、被覆抗原が存在することを証明するために、各抗原に対し特異的な対照抗体を使用した。
【０１４９】
図４に示す通り２０ｎＭの濃度まで、どのＦａｂも第ＩＩａ、第ＶＩＩａ、第ＩＸａまたは第Ｘａ因子に対する結合性を示さなかった。酵素前駆体マウスＰＣまたはイヌＰＣに対する結合性もまた検出されなかった。
実施例５  抗‐ａＰＣ  ＦａｂはａＰＣを阻害し、正常ヒト血漿において血餅形成を誘導する
【０１５０】
ヒトａＰＣは強力な抗凝固剤であり、この機能は図５に示す通り血漿凝固試験（ａＰＴＴ）によって容易に証明され得る。ａＰＴＴ試験においてプールされた正常なヒト血漿の５０％は、血漿とリン脂質の混合液にＣａＣｌ２（イニシエーター）を添加すると５２秒内に血餅を形成した。血漿と１００、２００、４００、８００または１６００ｎｇ／ｍｌのヒトａＰＣとの予備インキュベーションは、用量依存的に凝固時間を延長した。図５に示す通り、血漿由来のａＰＣおよび組換えａＰＣに対してほぼ同じ効力が得られた。Ｓｔａｇｏ装置の凝固時間の最大設定は２４０秒であったので、この機能的試験におけるヒトａＰＣの抗凝固活性は、最大ａＰＣの８００ｎｇ／ｍｌにおいて達した。
【０１５１】
ａＰＣの抗凝固活性に関する抗‐ａＰＣ  Ｆａｂの潜在的な阻害効果を評価するために、ａＰＴＴ試験において良好な試験範囲のために４００ｎｇ／ｍｌのａＰＣを使用した（図６）。投与されたａＰＣの抗凝固活性のために、血漿凝固時間が５２秒から１８０秒に延長した。ａＰＣと０、０．５、１、２、５、１０または２０μｇ／ｍｌのツールマウス抗‐ヒトＡＰＣ抗体（対照）またはそのＦａｂ（対照Ｆａｂ）またはＦａｂ  Ｃ７Ａ２３のインキュベーションは（すなわち、ａＰＣに対しＦａｂが１．５ないし６０倍過剰である）、用量依存的に凝固時間を減少させた。Ｆａｂ  Ｃ７Ａ２３は、ヒトａＰＣの抗凝固活性を逆転させるうえで対照Ｆａｂよりも４〜５倍強力であった。対照的に、負の対照Ｆａｂ（ヒトＦａｂラムダ）は凝固時間に効果を有さなかった。図６において、完全長の対照抗体（二価）は、ａＰＴＴ試験において対照Ｆａｂ（一価）よりも１０倍強力であった。この結果は、ａＰＣ結合の直接ＥＬＩＳＡにおけるそれらのＥＣ５０値[対照（０．５６ｎＭ）に対し対照Ｆａｂ（６．５６ｎＭ）]と一致する（データ未記載）。従って抗‐ａＰＣ  ＦａｂがＩｇＧ型に変換されるならば、より強力な分子を示唆する。ａＰＴＴの結果は、抗‐ａＰＣ  Ｆａｂ がａＰＣの抗凝固活性を顕著に阻害し、凝固時間を短縮することを示唆する。すべての試験Ｆａｂを、対照Ｆａｂと比較して血漿凝固試験ａＰＴＴにおいて評価した（図６）。図６の上のグラフにおいて、非特異的なヒトＦａｂを負の対照として使用したが、予想どおりにそれは凝固時間に効果を有さなかった。正の対照（対照および対照Ｆａｂ）は、用量依存的に凝固時間を短縮した。
【０１５２】
５μｇ／ｍｌ（添加ａＰＣと比較して１５倍モル過剰）のＦａｂ  Ｃ７Ａ２３、Ｃ７１７、Ｃ２５Ｋ２３、Ｔ４６Ｊ２３およびＴ４６Ｐ１９は、ヒトａＰＣ活性の８０〜９３％阻害を引き起こし、血餅形成を促進した。それらは対照Ｆａｂよりも明らかに強力であった。対照的に、Ｆａｂ  Ｒ４１Ｅ３は、同一条件下においてａＰＣ活性のわずか３０〜４０％阻害を生じただけであった。ａＰＴＴにおけるＲ４１Ｅ３の活性の弱さは、おそらくＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅによって定量された通りａＰＣ結合の親和性の低さに起因した。Ｒ４１Ｅ３  Ｆａｂ濃度での４０μｇ／ｍｌ（ａＰＣと比較して１００倍モル過剰）までの増加は、図６の下のグラフに示す通りヒトａＰＣの実に８０％の阻害を引き起こした。同様に、Ｃ２２Ｊ１３  Ｆａｂの高用量（４０μｇ／ｍｌ）はヒトａＰＣの８０％阻害を生じた。Ｆａｂ  Ｃ２６Ｂ９は、本試験において対照Ｆａｂよりも強力であった。下のグラフにおいてＦａｂ  Ｒ４１Ｃ１７がａＰＣ活性に効果を有さなかったのは、それがＰＣおよびａＰＣの双方に結合し、ヒト血漿中にはａＰＣよりも１０００倍以上豊富なＰＣが存在するからである。このデータはまた、Ｆａｂ  Ｒ４１Ｃ１７が他のＦａｂとは異なる結合エピトープを有することを示す。
【０１５３】
種ａＰＣ  ＥＬＩＳＡのデータによって示される通り、４個のＦａｂ（Ｃ７Ａ２３、Ｃ７１７、Ｃ２５Ｋ２３、Ｔ４６Ｊ２３）は、ナノモルの親和性でイヌａＰＣに同様に結合するので、これらのＦａｂを、図７に示す通り５０％プールヒト正常血漿に添加されたイヌａＰＣを使用してａＰＴＴによって評価した。イヌａＰＣは、ａＰＴＴによってヒトａＰＣと同じ抗凝固活性を示した（データ未記載）。３００ｎｇ／ｍｌのイヌａＰＣは、凝固時間を４７秒から１１７秒に増加させた。イヌａＰＣと０、０．５、１、２、５、１０または２０μｇ／ｍｌの対照抗体または対照Ｆａｂとのインキュベーションが、凝固時間に効果を有さなかったのは、それらがＥＬＩＳＡによりイヌａＰＣと交差しないからである。しかしながらＦａｂ  Ｃ７Ａ２３は、用量依存的に凝固時間を顕著に短縮し、イヌａＰＣ活性を５μｇ／ｍｌで８０％または２０μｇ／ｍｌで８５％まで阻害した。さらにＣ７Ａ２３は、ａＰＴＴ試験においてヒトａＰＣおよびイヌａＰＣをブロックする同等の効力を示した。Ｆａｂ  Ｃ７Ａ２３、Ｃ７１７、Ｃ２５Ｋ２３は、イヌａＰＣ活性を用量依存的に明確に阻害した。Ｆａｂ濃度２０μｇ／ｍｌにおいてこれら３つのＦａｂは、ａＰＣの８０〜９０％阻害を引き起こし、凝固時間を短縮した。Ｆａｂ  Ｔ４６Ｊ２３は、ＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅによるＣ７Ａ２３、Ｃ７１７、Ｃ２５Ｋ２３（ＫＤ＝１〜５ｎＭ）よりも弱いイヌａＰＣへの結合性（ＫＤ＝２２ｎＭ）と一致して、高用量でもわずか４０％阻害だけを与えた。対照的に、Ｆａｂ  Ｔ４６Ｐ１９およびＲ４１Ｅ３は、予想通りＡＰＴＴにおいてイヌａＰＣに効果を有さなかったのは、それらはＥＬＩＳＡによりイヌａＰＣに結合し得なかったからである。
実施例６  ａＰＣの酵素活性に及ぼす抗‐ａＰＣ  Ｆａｂの効果
【０１５４】
活性化プロテインＣはセリンプロテアーゼである。その触媒活性は、二つの方法：ａ）低分子量ペプチドを使用するアミド分解活性試験、およびｂ）生理学的タンパク質である物質ＦＶａを使用するＦＶａ分解試験、によって測定され得る。
【０１５５】
ヒトａＰＣのアミド分解活性を、緩衝液中でａＰＣの発色性ペプチド基質を使用することによって検討した。１０ｎＭの精製ａＰＣタンパク質を、１ｍＭの発色性基質ＳＰＥＣＴＲＯＺＹＭＥ  Ｐｃａ（Ｌｙｓ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐ｐＮＡ、ＭＷ  ７７３．９  Ｄａ）と３０分間インキュベートした。基質の発色性産物への変換（すなわちａＰＣの酵素活性）を、５分ごとの動力学的なＯＤ４５０の読み取りによってモニターした。標準曲線を、ヒト組換えａＰＣにより作成した。ａＰＣのアミド分解活性に関する抗‐ａＰＣ  Ｆａｂの効果を試験するために（図８）、発色性基質ＳＰＥＣＴＲＯＺＹＭＥ  Ｐｃａを１ｍＭまで反応液に添加する前に、最初に等量の抗‐ａＰＣ  Ｆａｂ （１〜１０００ｎＭ）とａＰＣタンパク質（２０ｎＭ）とを室温で２０分間予めインキュベートした。終濃度１０ｎＭでのヒトａＰＣのアミド分解活性を、Ｆａｂの存在下で測定した。最終基質濃度１ｍＭでの加水分解速度は、Ｆａｂの存在下において部分的に阻害され、最大８０％の減少に達した。Ｒ４１ｃ１７を除くすべてのＦａｂは、用量依存的にａＰＣを阻害した。ＥＬＩＳＡ結合試験においてＩＣ５０がＥＣ５０と相関したのは、高親和性結合剤（Ｃ７１７、Ｃ７Ａ２３、Ｔ４６Ｐ１９、Ｔ４６Ｊ２３、Ｃ２５Ｋ２３）が残りの低親和性結合剤（Ｒ４１Ｅ３、Ｃ２２Ｊ１３、Ｃ２６Ｂ９）よりも本試験において速い阻害を示したからである。しかしながら弱い結合剤のＦａｂ濃度を増加させると、同様に最大限の阻害を生じた。例えば、３、０００ｎＭのＲ４１Ｅ３は、ａＰＣ活性の約８０％阻害を生じ、同程度の阻害は１００ｎＭの高親和性結合剤によって達成された。従ってほとんどの結合剤は、そのアミド分解活性の阻害を引き起こしながら、ａＰＣの活性部位と相互作用した。興味深いことに対照抗体は、ａＰＣの部分阻害（４０％）を引き起こし、１００ｎＭを超える濃度で頭打ち状態に達した。濃度を増加させてＲ４１Ｃ１７  Ｆａｂを使用した時には、阻害効果は認められなかった。ヒトａＰＣに対するＲ４１Ｃ１７の結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅによる４．８ｎＭのＫＤ値を有する高親和性結合剤に匹敵するので、これらのデータは、Ｒ４１Ｃ１７がａＰＣの酵素活性部位から遠く離れた結合エピトープを有することを示す。
【０１５６】
ヒトａＰＣのＦＶａ不活化活性は、ヒトａＰＣ（１８０ｐＭ）をその生理学的タンパク質異質ＦＶａ（１．２５ｎＭ）とインキュベートすること、次にプロトロンビナーゼ複合体を形成するために該反応混合液にＦＸａおよびプロトロンビンを添加することによって測定され得る。トロンビンの発色性ペプチド基質を、トロンビンの産生を検出するために添加した（図９）。読み出し情報はトロンビン産生である（ＦＩＩａ／秒）。精製第Ｖａ因子（１．２５ｎＭ）を、Ｆａｂの濃度範囲（１〜５００ｎＭ）の存在下でａＰＣ（１８０ｐＭ）とインキュベートし、ＦＶａ活性をプロトロンビナーゼ／テナーゼ試験において評価した。
【０１５７】
生体基質ＦＶａに対してのａＰＣ活性へのＦａｂの影響を、精製ＦＶａを使用してＦＸａ生成およびトロンビン生成試験によって測定した。本試験において、０．１６Ｕ／ｍｌ（１．２５ｎＭ）のＦＶａを、抗体の存在下または非存在下において試験緩衝液（トリスＨＣｌ  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １３７ｎＭ、リン脂質１０μｇ／ｍｌ、ＣａＣｌ２  ５ｍＭ、ＢＳＡ  １ｍｇ／ｍｌ）中でａＰＣ１８０ｐＭとインキュベートした。３０分間のインキュベーション後、混合液２５ｕｌをウェルに移した。その後、試験緩衝液５０μｌ中のヒトＦＸａおよびプロトロンビンを該ウェルに添加し、トロンビン媒介性基質加水分解の動力学を、プレートリーダーを使用して３０℃でモニターした。添加Ｆａｂの非存在下のａＰＣ活性をベースラインとして、ａＰＣのインキュベーションは、読み出し情報を０．００２２ｎＭ  ＦＩＩａ／秒から０．００１５ｎＭ  ＦＩＩａ／秒まで変化させた。
【０１５８】
反応混合液へのＦａｂの添加は、ａＰＣ媒介性ＦＶａのタンパク質分解のほぼ完全な阻害およびトロンビン生成の用量依存的な急速な増加をもたらした。図９に示す通りａＰＣによるＦＶａのタンパク質分解の阻害に対するＩＣ５０値は、
ノルモルの範囲であり、試験したすべてのＦａｂに匹敵した。ほとんどのＦａｂは、正の対照Ｆａｂよりも強力であった。Ｒ４１Ｅ３は、ヒトａＰＣに対するその弱い結合性のためにより遅い増加を示した。驚いたことにＲ４１Ｃ１７は、本試験においていくらかの活性を示した。このＦａｂは、低分子量ペプチド基質を使用したとき、ａＰＴＴによるａＰＣの抗凝固活性またはａＰＣのアミド分解活性への効果を有さなかった。これらのデータは、Ｒ４１１７結合エピトープが他のＦａｂのエピトープと顕著に異なることを示す。
実施例７  抗‐ａＰＣ  ＩｇＧの発現および精製
【０１５９】
すべての１０個の抗‐ａＰＣ  Ｆａｂ を、Ｆｖ配列をヒトＩｇＧ１発現ベクターにクローン化することによって、ヒトＩｇＧ１に変換した。プラスミドを、一過性発現のためにＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。抗体は培養培地中に分泌され、タンパク質Ａカラムによって精製された。高収量の一抗体Ｔ４６Ｊ２３‐ｈＩｇＧ１は、培養液２００ｍｌ当たり１０．３ｍｇを産生した。いくつかの抗体は、２００ｍｌ当たり１ｍｇ産生しただけであった。同様に内毒素レベルをモニターした（０．０１ＥＵ／ｍｇ未満）。
【０１６０】
精製Ｆａｂと同様にすべての精製ＩｇＧは、ａ）それらの結合特異性および結合親和性；ｂ）それらの種間交差反応性（ウサギａＰＣを含む異なる種起源のａＰＣに対する結合性）；ｃ）アミド分解活性試験を使用する種のａＰＣの酵素活性への効果；およびｄ）ヒト血漿およびマウス血漿を使用する血漿凝固試験ａＰＴＴにおけるａＰＣの抗凝固活性を阻害する効力、を評価するために機能試験パネルによって特性化した。
実施例８  抗‐ａＰＣ  ＩｇＧの結合特異性および結合親和性
【０１６１】
図１０に示す通りＥＬＩＳＡは、ほとんどのＩｇＧ抗体がヒトＰＣと比較して優先的にヒトａＰＣに結合するので、それらがＦａｂと同じ様にその結合特異性を保持することを明らかにした。これに反してＲ４１Ｃ１７およびＯ３Ｅ７は、ヒトａＰＣおよびヒトＰＣの双方に結合する。驚いたことにＴ４６Ｊ２３は、そのＦａｂのＩｇＧへの変換後にヒトＰＣへの結合性を獲得した。ＥＬＩＳＡによる滴定実験はまた、一般的にこれらの二価ＩｇＧ１の結合親和性が、表５に示す通り相当する一価のＦａｂと比較して２〜５０倍増加することを明らかにした。特に低親和性Ｆａｂ  Ｒ４１Ｅ３は、Ｆａｂの１０４ｎＭに対しＩｇＧの１．７６ｎＭというＥＣ５０値を有するＦａｂ‐ＩｇＧ変換後に、ほとんど５０倍結合親和性を増加させた。すべてのＩｇＧは、ｎＭ以下ないし低ナノモルの範囲のＥＣ５０値を有する、ヒトＡＰＣに対する高親和性の結合性を示した。Ｏ３Ｅ７‐ＩｇＧは、ＥＣ５０  １６．９ｎＭを有する最も弱いＩｇＧである。
【表５】
2016501230.tif 000010
【０１６２】
同様に図１０に示す通り、これらのＩｇＧの種間交差反応性を、（ａ）ヒト、（ｂ）ウサギ、（ｃ）イヌ、（ｄ）マウスａＰＣおよびＰＣを使用して、検討した。１０個の抗‐ヒトａＰＣ  ＩｇＧの中で、５個のＩｇＧが、ウサギＰＣへの検出可能な結合性を有することなく、高親和性（ＥＣ５０＝０．６〜７ｎＭ）でウサギａＰＣに結合する。これら５個はまた、高親和性（ＥＣ５０＝１．７〜１０ｎＭ）でイヌＡＰＣにも結合し、しかもそれらはイヌＰＣに結合しなかった。５個のＩｇＧの中の一つの抗体Ｔ４６Ｊ２３はまた、６ｎＭのＥＣ５０値でマウスａＰＣに結合する。Ｔ４６Ｊ２３はマウスＰＣに結合しなかった。
実施例９  アミド分解活性試験を使用する緩衝液中の種ＡＰＣの酵素活性に関する抗‐ＡＰＣ  ＩｇＧの効果
【０１６３】
次に種間交差反応性の５個のＩｇＧを、種のＡＰＣのアミド分解活性に関するそれらの効果について評価した（図１１）。ヒトａＰＣアミド分解活性試験において、負の対照ＩｇＧ（抗‐ＣＴＸ抗体）は阻害効果を有さなかった。５個のＩｇＧすべてが、用量依存的にヒトａＰＣを阻害した。それらのＩＣ５０値は、Ｔ４６Ｊ２３‐ＩｇＧに対し１８ｎＭ；Ｃ２２Ｊ１３に対し２７ｎＭ；Ｃ７１７に対し６４ｎＭ；Ｃ７Ａ２３に対し７８ｎＭおよびＣ２５Ｋ２３に対し１３１ｎＭである。
【０１６４】
ウサギａＰＣアミド分解活性試験において、負の対照ＩｇＧ（抗‐ＣＴＸ抗体）は阻害効果を有さなかった。５個のＩｇＧすべてが、用量依存的にウサギａＰＣを阻害した。それらのＩＣ５０値は、Ｔ４６Ｊ２３‐ＩｇＧに対し１７ｎＭ；Ｃ２２Ｊ１３に対し２４ｎＭ；Ｃ７１７に対し２９ｎＭ；Ｃ７Ａ２３に対し２５ｎＭおよびＣ２５Ｋ２３に対し７４ｎＭである。
【０１６５】
イヌａＰＣアミド分解活性試験において、負の対照ＩｇＧ（抗‐ＣＴＸ抗体）は阻害効果を有さなかった。５個のＩｇＧは、用量依存的にイヌａＰＣを弱く阻害した。それらのＩＣ５０値は、Ｔ４６Ｊ２３‐ＩｇＧに対し６２５ｎＭ；Ｃ２２Ｊ１３に対し１３００ｎＭ；Ｃ７１７に対し１４７ｎＭ；Ｃ７Ａ２３に対し４９ｎＭおよびＣ２５Ｋ２３に対し６９２ｎＭである。
【０１６６】
マウスａＰＣアミド分解活性試験において、Ｔ４６Ｊ２３のみが、高用量（１０００ｎＭ）を要するがマウスａＰＣを阻害し得た。Ｃ７１７および他のＩｇＧは、マウスａＰＣに効果を有さなかった。種のＡＰＣ活性に関するこれらの抗体の阻害効果を表６に要約する。
【表６】
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【０１６７】
図１４（ｂ）に示す通りヒトａＰＣアミド分解活性試験において、２３１０‐ＩｇＧ２および２３１２‐ＩｇＧ２と称されるＣ２５Ｋ２３  ＩｇＧ１の二個の変異体は、精製系において強力なａＰＣ阻害を示す。Ｃ２５Ｋ２３  ＩｇＧ１は、配列番号１０８に示す軽鎖および配列番号１０９に示す重鎖を有する。ＴＰＰ‐２０３１は、修飾Ｎ５４Ｇを含む重鎖を有する改変されたＣ２５Ｋ２３  ＩｇＧである。変異体２３１０は、配列番号１１２に示す修飾Ａ１０Ｖ、Ｔ１３Ａ、Ｓ７８Ｔ、Ｒ８１ＱおよびＳ８２Ａを含む軽鎖および配列番号１１３に示す修飾Ｎ５４Ｑを含む重鎖を有する改変されたＣ２５Ｋ２３  ＩｇＧである。変異体２３１２は、配列番号１１６に示す修飾Ａ１０Ｖ、Ｔ１３Ａ、Ｓ７８Ｔ、Ｒ８１ＱおよびＳ８２Ａを含む軽鎖および配列番号１１７に示す修飾Ｓ５６Ａを含む重鎖を有する改変されたＣ２５Ｋ２３  ＩｇＧである。当該変異体はまた、図１４（ａ）に示す通りａＰＣに対する高親和性も示す。ＴＰＰ‐２３０９は、配列番号１１０に示す修飾Ａ１０Ｖ、Ｔ１３Ａ、Ｓ７８Ｔ、Ｒ８１ＱおよびＳ８２Ａを含む軽鎖および配列番号１１１に示す修飾Ｎ５４Ｇを含む重鎖を有する改変されたＣ２５Ｋ２３  ＩｇＧ１である。
実施例１０  抗‐ａＰＣ  ＩｇＧは正常ヒト血漿においてａＰＣを阻害し血餅形成を誘導する
【０１６８】
ａＰＣの抗凝固活性に関する抗‐ａＰＣ  ＩｇＧの効果を、最初にヒト血漿凝固試験（ａＰＴＴ）において検討したが、図１２に示す。五十パーセント（５０％）のヒト血漿が、ａＰＣの非存在下において５０〜５２秒というベースラインの凝固時間を有した。血漿へのヒトａＰＣの添加が、予想通り凝固時間を１９０秒に増加させたのは、ａＰＣが周知の抗凝固剤だからである。負の対照ＩｇＧ１（抗‐ＣＴＸ抗体）とのａＰＣの予備インキュベーションは、凝固時間を変化させなかった。対照的に、抗‐ａＰＣ特異的ＩｇＧとのａＰＣの予備インキュベーションは、用量依存的に凝固時間を顕著に短縮した。１：１のモル比において、Ｔ４６Ｊ２３‐ＩｇＧおよびＣ７１７‐ＩｇＧの双方は、１μｇ／ｍｌでａＰＣ（４００ｎｇ／ｍｌ）活性の〜５０％を阻害し、凝固時間を１９０から１１４秒に短縮した。２０μｇ／ｍｌにおいて、３個の全ての抗体（Ｔ４６Ｊ２３、Ｃ７１７、Ｃ２６Ｂ９）は、ａＰＣの抗凝固活性を完全に逆転させ、凝固を正常に回復した。Ｒ４１Ｅ３‐ＩｇＧは、ａＰＣの阻害においてこれら３個のＩｇＧよりも強力でなかった。Ｒ４１Ｅ３は凝固時間を７５秒に部分的に回復し、１６３倍のモル過剰においてａＰＣ活性の〜８０％を阻害した。
【０１６９】
抗‐ａＰＣ  ＩｇＧの改変変異体の効果をまた、図１４（ｃ）に示す通りａＰＴＴ試験において検討した。図１２の結果と同様に再び、改変抗‐ａＰＣ特異的ＩｇＧとのａＰＣの予備インキュベーションは、用量依存的に凝固時間を顕著に短縮した。
【０１７０】
実施例１１。抗‐ａＰＣ  ＩｇＧは、重度の血友病患者血漿においてａＰＣを阻害し血餅形成を誘導する。ａＰＣの抗凝固活性に関する抗‐ａＰＣ  ＩｇＧの効果を、図１３に示す通りトロンビン生成試験（ＴＧＡ）において血友病患者の血漿を使用してさらに研究した。血管を裏打ちする細胞（内皮細胞）への損傷は、外因性凝固経路として知られるトロンビンの限られた生成量をもたらす、組織因子の暴露という結果を生じる。上皮細胞上のトロンボモジュリンは、ａＰＣの生成およびその抗凝固活性に寄与する。重度の血友病血漿は、わずか〜５０ｎＭしか総トロンビンを生成しなかった。血友病血漿への抗‐ａＰＣ抗体の添加は、用量依存的にトロンビン生成を増加させた。
実施例１２  共結晶研究
抗体調製およびＱＣ
【０１７１】
組換え抗‐ａＰＣヒトＦａｂ（Ｃ２５Ｋ２３およびＴ４６Ｊ２３）を、大腸菌において発現し、プロテインＡクロマトグラフィーによって均一にまで精製した。精製Ｆａｂは、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥおよび分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって、＞９０％の純度を有し凝集がないことが明らかにされた。それらの機能を、ａＰＣ結合試験（ＥＬＩＳＡ）によって特性化した。Ｃ２５Ｋ２３ＦａｂおよびＴ４６Ｊ２３Ｆａｂの双方は、ＥＬＩＳＡによって測定される２〜４ｎＭの同等のＥＣ５０で、完全長ヒトａＰＣおよびＧｌａ‐ドメインレスａＰＣに結合する。これらのＦａｂの十ミリグラムを作成した。
抗原調製およびＱＣ
【０１７２】
血漿由来のヒトａＰＣ‐Ｇｌａ‐ドメインレス（ａＰＣ‐ＧＤ）をＥｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂから購入し、それがＣ２５Ｋ２３ＦａｂおよびＴ４６Ｊ２３Ｆａｂの双方により認識され得ることを確認するためにＥＬＩＳＡによって特性化した。
複合体形成
【０１７３】
複合体形成のために、０．９ｍｇのａＰＣ‐ＧＤを１．０５ｍｇのＣ２５Ｋ２３Ｆａｂと混合し、反応混合液を４℃で５時間インキュベートした。混合液を、遊離Ｆａｂまたは遊離ａＰＣ‐ＧＤ形態を、ａＰＣ‐ＧＤ‐Ｆａｂ複合体から分離するために、ゲル濾過カラムに負荷した。各画分を収集し、非還元条件下においてＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分析した。この工程を三回繰り返し、ａＰＣ‐ＧＤ‐Ｆａｂ複合体を含む画分をプールし、１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【０１７４】
種々の結晶成長条件下におけるａＰＣ‐Ｆａｂ複合体の結晶化を、構造決定に適した結晶を作成するために実施した（最大解像度＜３Å）。高処理結晶スクリーニングキットを利用し、２件を同定した：
ａ）ｎ‐オクチル‐β‐Ｄ‐グルコシド０．１％、クエン酸三ナトリウム二水和物０．１Ｍ  ＰＨ５．５、ＰＥＧ  ３３５０  ２２％
ｂ）２‐プロパノール１８％、クエン酸三ナトリウム二水和物０．１Ｍ  ＰＨ５．５、ＰＥＧ  ４０００  ２０％
データ収集
【０１７５】
２．２オングストロームの解像度での構造決定は、モデルとして報告されたａＰＣおよびＦａｂのＸ線結晶構造に関する分子置換によるａＰＣ‐ＧＤ‐Ｃ２５Ｋ２３Ｆａｂの結晶回折像、その後のモデル構築および精密化から成功した。図１５に示すのは、ａＰＣおよびＣ２５Ｋ２３  Ｆａｂ構造の模式図の模式図である。図１５に示す通りＣ２５Ｋ２３は、ａＰＣ触媒ドメインと接触するためにその重鎖のＣＤＲ３ループを利用する。非常に意義深いことに、図１６に示す通りＣ２５Ｋ２３からの側鎖Ｗ１０４は、以前に報告されたａＰＣ阻害剤（トリペプチド阻害剤ＰＰＡＣＫ）との立体的な重複を有する、ａＰＣの触媒ポケットの中に挿入する。
【０１７６】
この構造から、抗体によって結合されるａＰＣのエピトープは、ａＰＣの重鎖内にあることが決定された。ａＰＣ重鎖およびＦａｂの間の接触残基には、ａＰＣ残基のＤ６０、Ｋ９６、Ｓ９７、Ｔ９８、Ｔ９９、Ｅ１７０、Ｖ１７１、Ｍ１７２、Ｓ１７３、Ｍ１７５、Ａ１９０、Ｓ１９５、Ｗ２１５、Ｇ２１６、Ｅ２１７、Ｇ２１８およびＧ２１８が含まれる。
【０１７７】
特にＦａｂ  Ｃ２５Ｋ２３について、パラトープは、配列番号１８に示す重鎖の残基Ｓ３１、Ｙ３２、Ｗ５３、Ｒ５７、Ｒ１０１、Ｗ１０４、Ｒ１０６、Ｆ１０７、Ｗ１１０および配列番号８に示す軽鎖のＫ５５を含むことが特定された。
実施例１３  活性部位結合
【０１７８】
不可逆性活性部位阻害剤、ビオチン‐ＰＰＡＣＫを、ヒトａＰＣの活性部位を占有するために使用した（図１６を参照されたい）。ビオチン‐ＰＰＡＣＫ‐ｈＡＰＣまたはヒトａＰＣをｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレート上に被覆した。抗ａＰＣ抗体（ＦａｂおよびＩｇＧ）を、２０ｎＭから０．００７ｎＭまで１：３で段階的に希釈し、被覆ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。結合した抗‐ａＰＣ‐Ｆａｂまたは抗‐ａＰＣ  ＩｇＧを、ＨＲＰ‐結合抗ヒトまたは抗マウスＦａｂ抗体、その後に続く蛍光シグナル（ＲＦＵ）を産生するための蛍光発生基質（ａｍｐｌｅｘ  ｒｅｄおよびＨ２Ｏ２）とのインキュベーションによって検出した。プレートを、Ｇｅｍｉｎｉ  ＥＭ蛍光マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）によって読み取った。２０ｎＭの抗体濃度でのＲＦＵを、ウェル三連の平均として（＋／−ＳＤ）棒グラフにおいて表した。
【０１７９】
図１７に示す通り、少なくとも二つのタイプの抗体をライブラリーから同定した。第一は、Ｔ４６Ｊ２３（ＦａｂおよびｈＩｇＧ）およびＣ２５Ｋ２３（ＦａｂおよびｈＩｇＧ）を含む、もはやビオチン‐ＰＰＡＣＫ‐ｈＡＰＣ（活性部位遮断ｈＡＰＣ）に結合されない、活性部位を指揮される抗体である。第二は、Ｒ４１Ｃ１７を含む、抗‐Ｇｌａドメイン抗体であると考えられている、活性部位を指揮されない抗体である。これらのデータは、ヒトａＰＣに関するＴ４６Ｊ２３およびＣ２５Ｋ２３の活性部位結合に対する確証を提供し、これらの抗体の機能的特性、すなわちｈＡＰＣ活性の完全遮断を説明する。
【０１８０】
本実施形態が具体的な実施形態および実施例にも関して記載しているとはいえ、本明細書添付の請求項の精神と範囲から逸脱することなく種々の改変および変更が成され得て、同等物が代替し得ることを理解されたい。明細および実施例は、従って限定する意図より説明的な意図と見なされるべきである。さらに本明細書において参照されたすべての論文、書籍、特許出願および特許は、その全体が参照されることにより本明細書において援用される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１（ａ）】
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【図１１（ｂ）】
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【図１１（ｃ）】
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【図１１（ｄ）】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１３（ｂ）】
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【図１４（ａ）】
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【図１４（ｂ）】
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【図１４（ｃ）】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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