(57)【要約】  クローン病（線維性又は線維狭窄性クローン病を含む）及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患を診断するためのバイオマーカー、並びに該バイオマーカーの使用方法が提供される。加えて、例えば、潰瘍性大腸炎及びクローン病（線維性又は線維狭窄性クローン病を含む）等の炎症性腸疾患のような胃腸炎症性疾患の治療方法が提供される。【選択図】図１Ａ
2016521540.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）対象から得られた生体試料において、ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）、ＩＬ−２４、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＡＭＩＧＯ２、ＳＥＲＰＩＮＢ７、ＡＢＡＴ、ＰＦ４、ＳＴＥＡＰ２、ＥＬＮ、ＣＣＬ４、ＶＥＧＦＡ、ＤＡＣＴ１、ＫＣＮＭＢ４、ＰＤＬＩＭ４、ＴＧＦＢＲ１、ＫＣＮＥ１Ｌ、ＨＩＦ１Ａ、ＳＬＣ２５Ａ４５、ＯＳＭＲ、Ｐ４ＨＡ２、ＥＬＦ３、ＴＧＩＦ１、ＴＭＥＭ１５８、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ１６Ａ１、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）及びＩＬ−１１から選択される、一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせの発現レベル、或いは一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせによってコードされた一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの発現を測定すること；
（ｂ）一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ或いは一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの（ａ）で測定された発現レベルを、基準レベルと比較すること；及び
（ｃ）一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ或いは一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの（ａ）で測定されたレベルが基準レベルを上回る場合に炎症性腸疾患の診断を提供すること
を含む方法。
【請求項２】
一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ、或いは一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせによってコードされた一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせが、ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）、ＴＭＥＭ１５８、Ｃｏｌ７Ａ１、Ｃｏｌ１６Ａ１、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、ＩＬ−１１から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ、或いは一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせによってコードされた一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせが、ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）及びアンフィレグリンから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
対象における炎症性腸疾患を診断又は診断支援する方法であって、
（ａ）対象から得られた生体試料において、ＩＬ−１β、ＣＡＳＰ１及びｐ２０から選択される、一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせの発現レベル、或いは一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせによってコードされた一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの発現を測定すること；
（ｂ）一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ或いは一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの（ａ）で測定された発現レベルを、基準レベルと比較すること；及び
（ｃ）一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ或いは一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの（ａ）で測定されたレベルが基準レベルを上回る場合に炎症性腸疾患の診断を提供すること
を含む方法。
【請求項５】
対象における線維性クローン病を診断又は診断支援する方法であって、
（ａ）対象から得られた生体試料において、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ１６Ａ１、アンフィレグリン、ＩＬ−１１、ＡＥＢＰ１及びＩＬ１Ｒ１から選択される、一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせの発現レベル、或いは一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせによってコードされた一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの発現を測定すること；
（ｂ）一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ或いは一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの（ａ）で測定された発現レベルを、基準レベルと比較すること；及び
（ｃ）一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ或いは一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの（ａ）で測定されたレベルが基準レベルを上回る場合に線維性クローン病の診断を提供すること
を含む方法。
【請求項６】
対象における線維性クローン病を診断又は診断支援する方法であって、
（ａ）対象から得られた生体試料において、ＭＭＰ３、ＩＮＨＢＡ、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＨＮ１、ＬＭＣＤ１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ１８Ａ１、ＴＭＥＭ１５８、ＦＡＭ６５Ｃ、ＩＧＦＢＰ５、ＴＨＹ１、ＴＭＥＭ１３２Ａ、ＰＸＤＮ、ＧＰＲ６８、ＴＷＩＳＴ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＡＥＢＰ１、ＮＡＢ２、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＴＭＥＭ１２１、ＶＩＭ、ＮＯＴＣＨ４及びＴＩＭＰ２から選択される、一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせの発現レベル、或いは一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせによってコードされた一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの発現を測定すること；
（ｂ）一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ或いは一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの（ａ）で測定された発現レベルを、基準レベルと比較すること；及び
（ｃ）一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ或いは一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの（ａ）で測定されたレベルが基準レベルを上回る場合に線維性クローン病の診断を提供すること
を含む方法。
【請求項７】
炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎又はクローン病である、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
線維性クローン病が線維狭窄性クローン病である、請求項５又は請求項６に記載の方法。
【請求項９】
生体試料が腸組織である、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせの発現がＰＣＲ法又はマイクロアレイチップを用いて測定される、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの発現がイムノアッセイ又は免疫組織化学アッセイを用いて測定される、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
イムノアッセイがＥＬＩＳＡアッセイである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
基準レベルが、炎症性腸疾患を有さない対象から得られた生体試料において、同じ遺伝子又は遺伝子の組み合わせ或いは同じタンパク質又はタンパク質の組み合わせの発現レベルを測定することにより得られる、請求項１から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
基準レベルが、非線維化組織において、同じ遺伝子又は遺伝子の組み合わせ或いは同じタンパク質又はタンパク質の組み合わせの発現レベルを測定することにより得られる、請求項５、６又は８に記載の方法。
【請求項１５】
対象におけるクローン病のサブタイプを診断又は診断支援する方法であって、
（ａ）対象の腸組織から得られた生体試料においてＩＬ１８の発現レベルを測定すること；
（ｂ）（ａ）で測定されたＩＬ１８の発現レベルを基準レベルと比較すること；及び
（ｃ）（ａ）で測定されたＩＬ１８のレベルが基準レベルを上回る場合に線維性クローン病の診断を提供すること
を含む方法。
【請求項１６】
基準レベルが、炎症性腸疾患を有さない対象、又は炎症性クローン病を有する対象、又は潰瘍性大腸炎を有する対象の腸組織から得られた生体試料中のＩＬ１８の発現レベルを測定することにより得られる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
線維性クローン病が線維狭窄性クローン病である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
発現レベルがイムノアッセイを用いて測定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
イムノアッセイがＥＬＩＳＡアッセイである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
対象における炎症性腸疾患を診断又は診断支援する方法であって、
（ａ）対象から得られた血清試料においてＧＣＳＦの発現レベルを測定すること；
（ｂ）（ａ）で測定されたＧＣＳＦの発現レベルを基準レベルと比較すること；及び
（ｃ）（ａ）で測定されたＧＣＳＦのレベルが基準レベルを上回る場合に炎症性腸疾患の診断を提供すること
を含む方法。
【請求項２１】
炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎又は炎症性クローン病又は線維性クローン病である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
線維性クローン病が線維狭窄性クローン病である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＧＣＳＦの発現レベルがイムノアッセイを用いて測定される、請求項２０から２２の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４】
イムノアッセイがＥＬＩＳＡアッセイである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
基準レベルが、炎症性腸疾患を有さない対象から得られた血清試料中のＧＣＳＦの発現レベルを測定することにより得られる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
患者における炎症性腸疾患を治療する方法であって、
（ａ）患者から得られた生体試料において、ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）、ＩＬ−２４、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＡＭＩＧＯ２、ＳＥＲＰＩＮＢ７、ＡＢＡＴ、ＰＦ４、ＳＴＥＡＰ２、ＥＬＮ、ＣＣＬ４、ＶＥＧＦＡ、ＤＡＣＴ１、ＫＣＮＭＢ４、ＰＤＬＩＭ４、ＴＧＦＢＲ１、ＫＣＮＥ１Ｌ、ＨＩＦ１Ａ、ＳＬＣ２５Ａ４５、ＯＳＭＲ、Ｐ４ＨＡ２、ＥＬＦ３、ＴＧＩＦ１、ＴＭＥＭ１５８、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ１６Ａ１、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）及びＩＬ−１１から選択される、一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせの発現レベル、或いは一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせによってコードされた一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの発現を測定すること；
（ｂ）一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ或いは一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの（ａ）で測定された発現レベルを、基準レベルと比較すること；及び
（ｃ）一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ或いは一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの（ａ）で測定されたレベルが基準レベルを上回る場合に、抗ＩＬ−１β抗体、抗ＩＬ−１８抗体又は多重特異性抗ＩＬ−１β／抗ＩＬ−１８抗体を患者に投与すること
を含む方法。
【請求項２７】
一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ、或いは一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせによってコードされた一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせが、ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）、ＴＭＥＭ１５８、Ｃｏｌ７Ａ１、Ｃｏｌ１６Ａ１、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、ＩＬ−１１から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ、或いは一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせによってコードされた一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせが、ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）及びアンフィレグリンから選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
患者における炎症性腸疾患を治療する方法であって、
（ａ）患者から得られた生体試料において、ＩＬ−１β、ＣＡＳＰ１及びｐ２０から選択される、一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせの発現レベル、或いは一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせによってコードされた一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの発現を測定すること；
（ｂ）一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ或いは一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの（ａ）で測定された発現レベルを、基準レベルと比較すること；及び
（ｃ）一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ或いは一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの（ａ）で測定されたレベルが基準レベルを上回る場合に、抗ＩＬ−１β抗体、抗ＩＬ−１８抗体又は多重特異性抗ＩＬ−１β／抗ＩＬ−１８抗体を患者に投与すること
を含む方法。
【請求項３０】
患者における炎症性腸疾患を治療する方法であって、
（ａ）対象から得られた生体試料において、ＭＭＰ３、ＩＮＨＢＡ、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＨＮ１、ＬＭＣＤ１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ１８Ａ１、ＴＭＥＭ１５８、ＦＡＭ６５Ｃ、ＩＧＦＢＰ５、ＴＨＹ１、ＴＭＥＭ１３２Ａ、ＰＸＤＮ、ＧＰＲ６８、ＴＷＩＳＴ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＡＥＢＰ１、ＮＡＢ２、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＴＭＥＭ１２１、ＶＩＭ、ＮＯＴＣＨ４、ＡＥＢＰ１、ＩＬ１Ｒ１及びＴＩＭＰ２から選択される、一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせの発現レベル、或いは一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせによってコードされた一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの発現を測定すること；
（ｂ）一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ或いは一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの（ａ）で測定された発現レベルを、基準レベルと比較すること；及び
（ｃ）一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ或いは一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの（ａ）で測定されたレベルが基準レベルを上回る場合に、抗ＩＬ−１β抗体、抗ＩＬ−１８抗体又は多重特異性抗ＩＬ−１β／抗ＩＬ−１８抗体を患者に投与すること
を含む方法。
【請求項３１】
患者における炎症性腸疾患を治療する方法であって、
（ａ）患者の腸組織から得られた生体試料においてＩＬ１８の発現レベルを測定すること；
（ｂ）（ａ）で測定されたＩＬ１８の発現レベルを基準レベルと比較すること；及び
（ｃ）一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ或いは一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの（ａ）で測定されたレベルが基準レベルを上回る場合に、抗ＩＬ−１β抗体、抗ＩＬ−１８抗体又は多重特異性抗ＩＬ−１β／抗ＩＬ−１８抗体を患者に投与すること
を含む方法。
【請求項３２】
患者における炎症性腸疾患を治療する方法であって、
（ａ）対象から得られた血清試料においてＧＣＳＦの発現レベルを測定すること；
（ｂ）（ａ）で測定されたＧＣＳＦの発現レベルを基準レベルと比較すること；及び
（ｃ）（ａ）で測定されたＧＣＳＦのレベルが基準レベルを上回る場合に、抗ＩＬ−１β抗体、抗ＩＬ−１８抗体又は多重特異性抗ＩＬ−１β／抗ＩＬ−１８抗体を患者に投与すること
を含む方法。
【請求項３３】
炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎又は炎症性クローン病又は線維性クローン病である、請求項２６から３２の何れか一項に記載の方法。
【請求項３４】
線維性クローン病が線維狭窄性クローン病である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
発現レベルがＰＣＲ法又はマイクロアレイチップを用いて測定される、請求項２６から３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項３６】
発現レベルがイムノアッセイを用いて測定される、請求項２６から３２の何れか一項に記載の方法。
【請求項３７】
イムノアッセイがＥＬＩＳＡアッセイである、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年５月１７日出願の米国仮出願第６１／８２４６６１号の優先権の利益を主張し、該出願はその全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
技術分野
クローン病（線維性又は線維狭窄性（ｆｉｂｒｏｓｔｅｎｏｔｉｃ）クローン病を含む）及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患を診断するためのバイオマーカー、並びに該バイオマーカーの使用方法が提供される。加えて、潰瘍性大腸炎及びクローン病（線維性又は線維狭窄性クローン病を含む）を含む炎症性腸疾患のような、胃腸炎症性疾患の治療方法も提供される。
【背景技術】
【０００３】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、胃腸（ＧＩ）管の慢性自己免疫性炎症状態であり、臨床的には潰瘍性大腸炎（ＵＣ）又はクローン病（ＣＤ）の何れかとして表れる。ＣＤは、ＧＩ管全体の如何なる部分にも影響を及ぼす可能性のある慢性貫壁性炎症性疾患であり、また、ＵＣは結腸の粘膜炎症である。何れの状態も、日常生活に支障をきたすような頻繁な便通、栄養失調及び脱水症状により臨床的に特徴付けられる。慢性炎症は、狭窄や瘻孔等の合併症とともに、ＣＤ患者の亜集団における線維症につながる可能性があり、繰り返し手術が必要な場合がある。ＵＣは、それほど頻繁ではないが、重度の血性下痢や中毒性巨大結腸症を併発することがあり、これもまた手術を要する。両方のＩＢＤ状態ともＧＩ管の悪性腫瘍のリスク  の増加と関連している。ＩＢＤの病因は複雑であり、発病の多くの側面は依然として不明である。
【０００４】
腸の筋線維芽細胞の活性化は、コラーゲン及び細胞外マトリックスタンパク質の沈着の増加を通して、腸線維症において重要な役割を果たし得る。本プロセスにおける炎症サイトカインの役割は分かっていない。
【０００５】
サイトカインのインターロイキン−１（ＩＬ−１）とＩＬ−１８ファミリーは、起源の機構、受容体構造、及び利用されるシグナル伝達経路により関連付けられる。このようなサイトカインは前駆体分子として合成され、細胞からの遊離中又は遊離前に酵素カスパーゼ−１により切断される。ＮＡＬＰ−３インフラマソームは活性カスパーゼ−１を生成するのに極めて重要である(Cassel et al., 2009; Ferrero-Miliani et al., 2007)。ＩＬ−１ファミリーは、ＩＬ−１αとＩＬ−１βの二つのアゴニスト、特異的阻害因子、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒα）、及び生物学的活性型ＩＬ−１Ｒと不活性ＩＩ型ＩＬ−１Ｒの二つの受容体を含む(Arend et al., 2008)。ＩＬ−１ＲＩとＩＬ−３３Ｒの両方は、同一の相互作用するアクセサリータンパク質（ＩＬ−１ＲＡｃＰ）を使用する。ＩＬ−１とＩＬ−１Ｒαの間のバランスは、種々の器官において疾患を予防するのに重要であり、ＩＬ−１の過剰産生は、多くのヒトの疾患と関連づけられている。ＩＬ−１８ファミリーもまた、ＩＬ−１８に液相で結合するＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）である特異的阻害因子を含む。ＩＬ−１８受容体は、ＩＬ−１受容体複合体と類似し、単一のリガンド結合鎖及び異なる相互作用をするアクセサリータンパク質を含んでいる。ＩＬ−１８は、自然免疫応答と獲得免疫応答の間の重要な連結を提供する。
【０００６】
インフラマソーム活性化及びＩＬ−１β／ＩＬ−１８プロセシング並びに分泌は、疾患の進行に関与し得る。全ゲノム相関解析は、インフラマソームの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に対する役割を示している。インフラマソーム−化合物ＮＡＬＰ−３に遺伝子多型を有する患者は、報告によればクローン病のリスクが増大している(Ferrero-Miliani et al., 2007; Villani et al., 2009)。加えて、カスパーゼ１活性化及びＩＬ−１β／ＩＬ−１８プロセシングを制御するオートファジー構成要素Ａｔｇ１６Ｉ１及びＩＲＧＭにおける遺伝子多型が、報告によればクローン病に関連している(Baldassano et al., 2007; Cadwell et al., 2008; Kuballa et al., 2008; Saitoh et al., 2008)。独立の研究により、ＩＢＤを有する患者のＩＬ−１Ββ及びＩＬ−１８の血清レベルの増加が報告されている(Ludwiczek et al., 2005; Ludwiczek et al., 2004; Monteleone et al., 1999)。ヒトにおける試験は、前臨床試験により更に裏付けられている。ＩＬ−１８又はＩＬ−１βの遮断は、報告によれば、この疾患の前臨床モデルでの臨床スコアの改善をもたらす(Ten Hove et al., 2001)。
【０００７】
中程度から重度のＩＢＤの治療は、治療医に重大な課題を提起する。なぜなら、副腎皮質ステロイド及び免疫調節療法（例えば、アザチオプリン、６メルカプトプリン及びメトトレキサート）による一般的な療法は副作用や不耐性を伴い、維持療法（ステロイド）におけるメリットが未だ証明されていないからである。腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）を標的にするモノクローナル抗体、例えば、インフリキシマブ（キメラ抗体）及びアダリブマブ（完全ヒト抗体）が、ＣＤの管理に現在使用されている。インフリキシマブは効力が示され、ＵＣへの使用が承認されている。
しかしながら、ＣＤ患者の約１０％−２０％は抗ＴＮＦ療法に対する一次非応答者であり、ＣＤ患者の更に２０％−３０％は時間と共に応答を失う(Schnitzler et al., Gut 58:492-00 (2009))。抗ＴＮＦに伴う他の有害事象（ＡＥ）は、細菌感染症（結核、また、ごく稀にリンパ腫や脱髄など）の割合の増加を含む(Chang et al., Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatology 3:220 (2006); Hoentjen et al., World J. Gastroenterol. 15(17):2067 (2009))。現在利用可能な治療は、慢性疾患を伴うＩＢＤ患者の２０％−３０％超において持続的寛解を達成していない(Hanauer et al., Lancet 359:1541-49 (2002); Sandborn et al., N Engl J Med 353:1912-25 (2005))。加えて、ほとんどの患者は、真の疾患緩和と相関する臨床転帰である持続的ステロイドフリー寛解及び粘膜治癒を達成しない。したがって、抗ＴＮＦ治療剤に全く応答しないか又は時間と共に応答を失う患者を含む患者の大部分において、持続的寛解、特にステロイドフリー寛解、及び長期合併症の防止を伴う改善された安全性プロファイルを有する慢性使用に最適なＩＢＤにおけるより標的化された療法を開発する必要性がある。
【０００８】
治療前に患者が特定の治療剤又は治療剤のクラスに対して応答するかどうかは、たいてい不明である。したがって、ＢＤ患者全般、特にＣＤ患者及びＵＣ患者が治療を求めるとき、個々の患者に有効な治療剤を探すのにかなりの試行錯誤を伴う。このような試行錯誤は、たいてい、かなりのリスクを伴い、最も有効な治療を求める患者を不安にさせる。それ故、どの患者がどの治療に応答するのかを決定し、その決定をＩＢＤ患者のためのより効果的な治療レジメンに組み入れるためのより効果的な手段が必要である。
【０００９】
よって、例えば、多重特異性抗ＩＬ−１β／抗ＩＬ１８抗体又は抗ＩＬ−１β抗体と抗ＩＬ−１８抗体の組合せなど、ＩＬ−１β及び／又はＩＬ−１８を標的にする治療を含む、種々のＩＢＤ治療剤に応答する可能性が最も高い患者を客観的に同定するために用いられる、更なる診断的バイオマーカー及び方法（予測診断バイオマーカー法を含む）を有することは非常に有利である。したがって、潰瘍性大腸炎、クローン病、及び他の炎症性腸疾患に関連し、治療応答を予測する新たなバイオマーカーを同定するための継続的な必要性が存在する。加えて、そのような関連に関する統計的及び生物学的に有意で再現可能な情報は、例えば、臨床試験において、そのような特定のＵＣ又はＣＤ患者の亜集団のどこで治療剤が治療上有益であるのか、又は有益であることが示されているのかといった、特定の治療剤を用いた治療から有意に利益を得ることが期待される特定のＵＣ又はＣＤ患者の亜集団を識別するための取り組みにおける不可欠な要素として利用され得る。
【００１０】
ここに記載される発明は上記の特定の必要性を満たし、他のメリットも提供する。
【００１１】
特許出願及び刊行物を含む本明細書中で引用されるすべての文献は、あらゆる目的のためにその全文が参照により援用される。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、少なくとも一部は、ＩＢＤの対象の腸組織内で、場合によっては血清中で、非ＩＢＤの対象と比較して差次的に発現される特定の遺伝子の同定に基づく。更に、本発明は、少なくとも一部は、例えばクローン病の対象の線維化腸組織内で、場合によっては血清中で、非ＩＢＤの対象又は非線維性／線維狭窄性ＩＢＤの対象と比較して差次的に発現される特定の遺伝子の同定に基づく。
【００１３】
したがって、一態様では、炎症性腸疾患を診断又は診断支援する方法が提供される。特定の実施態様では、該方法は、（ａ）対象から得られた生体試料中の一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせの発現レベル、或いは一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせの遺伝子によってコードされた一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの発現量を測定すること、及び（ｂ）一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ或いは一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの（ａ）で測定された発現レベルを基準レベルと比較することを含み、ここで、基準レベルを超える一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせのレベル、或いは一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせによってコードされた一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせのレベルは、対象が炎症性腸疾患を有することを示す。特定の実施態様では、該方法は、一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ或いは一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの（ａ）で測定されたレベルが基準レベルを超える場合に、炎症性腸疾患の診断を提供することを更に含む。特定の実施態様では、一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ或いは一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせによってコードされた一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせは、ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）、ＩＬ−２４、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＡＭＩＧＯ２、ＳＥＲＰＩＮＢ７、ＡＢＡＴ、ＰＦ４、ＳＴＥＡＰ２、ＥＬＮ、ＣＣＬ４、ＶＥＧＦＡ、ＤＡＣＴ１、ＫＣＮＭＢ４、ＰＤＬＩＭ４、ＴＧＦＢＲ１、ＫＣＮＥ１Ｌ、ＨＩＦ１Ａ、ＳＬＣ２５Ａ４５、ＯＳＭＲ、Ｐ４ＨＡ２、ＥＬＦ３、ＴＧＩＦ１、ＴＭＥＭ１５８、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ１６Ａ１、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）及びＩＬ−１１から選択される。特定の実施態様では、一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ或いは一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせによってコードされた一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせは、ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）、ＴＭＥＭ１５８、Ｃｏｌ７Ａ１、Ｃｏｌ１６Ａ１、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、ＩＬ−１１から選択される。特定の実施態様では、一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ或いは一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせによってコードされた一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせは、ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）及びアンフィレグリンから選択される。特定の実施態様では、炎症性腸疾患は潰瘍性大腸炎又はクローン病である。
【００１４】
炎症性腸疾患の診断又は診断支援の幾つかの実施態様では、測定された発現レベルの一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ或いは一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせによってコードされた一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせは、ＩＬ−１β、ＣＡＳＰ１及びｐ２０から選択される。特定の実施態様では、ＩＬ−１β、ＣＡＳＰ１及びｐ２０のうちの一又はそれらの組み合わせの基準レベルを超える発現レベルは、対象が炎症性腸疾患を有することを示す。特定の実施態様では、該方法は、ＩＬ−１β、ＣＡＳＰ１及びｐ２０のうちの一又はそれらの組み合わせのレベルが基準レベルを超える場合に炎症性腸疾患の診断を提供することを更に含む。特定の実施態様では、炎症性腸疾患は潰瘍性大腸炎又はクローン病である。
【００１５】
別の態様では、線維性クローン病又は線維狭窄性クローン病を診断又は診断支援する方法が提供される。特定の実施態様では、該方法は、（ａ）対象から得られた生体試料中の一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせの発現レベル、或いは一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせによってコードされた一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの発現を測定すること、及び（ｂ）一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ或いは一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの（ａ）で測定された発現レベルを基準レベルと比較することを含み、ここで、基準レベルを超える一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせのレベル、或いは一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせによってコードされた一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせのレベルは、対象が炎症性腸疾患を有することを示す。特定の実施態様では、該方法は、一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ或いは一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの（ａ）で測定されたレベルが基準レベルを超える場合に炎症性腸疾患の診断を提供することを更に含む。特定の実施態様では、一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ、或いは一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせによってコードされた一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせは、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ１６Ａ１、アンフィレグリン、ＩＬ−１１、ＡＥＢＰ１及びＩＬ１Ｒ１から選択される。特定の実施態様では、一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ、或いは一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせによってコードされた一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせは、ＭＭＰ３、ＩＮＨＢＡ、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＨＮ１、ＬＭＣＤ１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ１８Ａ１、ＴＭＥＭ１５８、ＦＡＭ６５Ｃ、ＩＧＦＢＰ５、ＴＨＹ１、ＴＭＥＭ１３２Ａ、ＰＸＤＮ、ＧＰＲ６８、ＴＷＩＳＴ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＡＥＢＰ１、ＮＡＢ２、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＴＭＥＭ１２１、ＶＩＭ、ＮＯＴＣＨ４及びＴＩＭＰ２から選択される。特定の実施態様では、基準レベルは、非線維化組織において、同じ遺伝子又は遺伝子の組み合わせ、或いは同じタンパク質又はタンパク質の組み合わせの発現レベルを測定することにより得られる。
【００１６】
特定の実施態様では、生体試料は腸組織である。特定の上記の実施態様では、一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせの発現はＰＣＲ法又はマイクロアレイチップを用いて測定される。特定の上記の実施態様では、一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせはイムノアッセイ又は免疫組織化学アッセイを用いて測定される。幾つかの実施態様では、イムノアッセイはＥＬＩＳＡアッセイである。特定の上記の実施態様では、基準レベルは、炎症性腸疾患を有さない対象から得られた生体試料において、同じ遺伝子又は遺伝子の組み合わせ、或いは同じタンパク質又はタンパク質の組み合わせの発現レベルを測定することにより得られる。
【００１７】
更に別の態様では、対象のクローン病のサブタイプを診断又は診断支援する方法が提供される。特定の実施態様では、該方法は、対象の腸組織から得られた生体試料においてＩＬ１８の発現レベルを測定すること、及び（ｂ）（ａ）で測定されたＩＬ１８の発現レベルを基準レベルと比較することを含み、ここで、基準レベルを超えるＩＬ１８のレベルは対象がクローン病のサブタイプを有することを示し、この場合サブタイプとは線維性クローン病又は線維狭窄性クローン病である。特定の実施態様では、該方法は、（ａ）で測定されたＩＬ１８のレベルが基準レベルを超える場合に線維性クローン病又は線維狭窄性クローン病の診断を提供することを更に含む。特定の実施態様では、基準レベルは、炎症性腸疾患を有さない対象の腸組織から得られた生体試料においてＩＬ１８の発現レベルを測定することにより得られる。特定の実施態様では、基準レベルは、炎症性クローン病を有する対象の腸組織から得られた生体試料においてＩＬ１８の発現レベルを測定することにより得られる。特定の実施態様では、基準レベルは、潰瘍性大腸炎を有する対象の腸組織から得られた生体試料においてＩＬ１８の発現レベルを測定することにより得られる。特定の実施態様では、発現レベルはイムノアッセイを用いて測定される。特定の実施態様では、イムノアッセイはＥＬＩＳＡアッセイである。
【００１８】
別の態様では、対象の炎症性腸疾患を診断又は診断支援する追加的方法が更に提供される。特定の実施態様では、該方法は、（ａ）対象から得られた血清試料中のＧＣＳＦの発現レベルを測定すること、及び（ｂ）（ａ）で測定されたＧＣＳＦの発現レベルを基準レベルと比較することを含み、ここで、基準レベルを超える対象の血清試料中のＧＣＳＦのレベルは、対象が炎症性腸疾患を有することを示す。特定の実施態様では、該方法は、（ａ）で測定されたＧＣＳＦのレベルが基準レベルを超える場合に炎症性腸疾患の診断を提供することを更に含む。特定の実施態様では、炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎又は炎症性クローン病、又は線維性クローン病又は線維狭窄性クローン病である。特定の実施態様では、ＧＣＳＦの発現レベルはイムノアッセイを用いて測定される。特定の実施態様では、イムノアッセイはＥＬＩＳＡアッセイである。特定の実施態様では、基準レベルは、炎症性腸疾患を有さない対象から得られた血清試料中のＧＣＳＦの発現レベルを測定することにより得られる。
【００１９】
一態様では、患者の炎症性腸疾患を治療する方法が提供される。特定の実施態様では、該方法は、（ａ）患者から得られた生体試料において、ＣＳＦ３  （ＧＣＳＦ）、ＩＬ−２４、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＡＭＩＧＯ２、ＳＥＲＰＩＮＢ７、ＡＢＡＴ、ＰＦ４、ＳＴＥＡＰ２、ＥＬＮ、ＣＣＬ４、ＶＥＧＦＡ、ＤＡＣＴ１、ＫＣＮＭＢ４、ＰＤＬＩＭ４、ＴＧＦＢＲ１、ＫＣＮＥ１Ｌ、ＨＩＦ１Ａ、ＳＬＣ２５Ａ４５、ＯＳＭＲ、Ｐ４ＨＡ２、ＥＬＦ３、ＴＧＩＦ１、ＴＭＥＭ１５８、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ１６Ａ１、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）及びＩＬ−１１から選択される、一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせの発現レベル、或いは一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせによってコードされた一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの発現を測定すること、（ｂ）一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ或いは一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの（ａ）で測定された発現レベルを基準レベルと比較すること、及び（ｃ）一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ或いは一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの（ａ）で測定されたレベルが基準レベルを超える場合に、抗ＩＬ−１β抗体、抗ＩＬ−１８抗体又は多重特異性抗ＩＬ−１β／抗ＩＬ−１８抗体を患者へ投与することを含む。特定の実施態様では、一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ、或いは一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせによってコードされた一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせは、ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）、ＴＭＥＭ１５８、Ｃｏｌ７Ａ１、Ｃｏｌ１６Ａ１、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、ＩＬ−１１から選択される。特定の実施態様では、一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ、或いは一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせによってコードされた一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせは、ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）及びアンフィレグリンから選択される。特定の実施態様では、一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ、或いは一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせによってコードされた一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせは、ＭＭＰ３、ＩＮＨＢＡ、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＨＮ１、ＬＭＣＤ１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ１８Ａ１、ＴＭＥＭ１５８、ＦＡＭ６５Ｃ、ＩＧＦＢＰ５、ＴＨＹ１、ＴＭＥＭ１３２Ａ、ＰＸＤＮ、ＧＰＲ６８、ＴＷＩＳＴ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＡＥＢＰ１、ＮＡＢ２、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＴＭＥＭ１２１、ＶＩＭ、ＮＯＴＣＨ４、ＡＥＢＰ１、ＩＬ１Ｒ１及びＴＩＭＰ２から選択される。特定の実施態様において、一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ、或いは一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせによってコードされた一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせは、ＩＬ−１β、ＣＡＳＰ１及びｐ２０から選択される。特定の実施態様では、抗ＩＬ−１β抗体、抗ＩＬ−１８抗体又は多重特異性抗ＩＬ−１β／抗ＩＬ−１８抗体  が、炎症性腸疾患を有する患者の治療における使用のために提供され、ここで、該患者は本人から得られた血清中の上記バイオマーカーの何れか一のレベルが基準レベルを超える場合に治療される。特定の実施態様では、炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎、又は炎症性クローン病、又は線維性クローン病、又は線維狭窄性クローン病である。特定の���施態様では、発現レベルはＰＣＲ法又はマイクロアレイチップを用いて測定される。特定の実施態様では、発現レベルはイムノアッセイ又はＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定される。
【００２０】
別の態様では、患者の炎症性腸疾患を治療する追加的方法が提供される。特定の実施態様において、（ａ）患者の腸組織から得られた生体試料においてＩＬ１８の発現レベルを測定すること、（ｂ）（ａ）で測定されたＩＬ１８の発現レベルを基準レベルと比較すること、及び（ｃ）一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせ或いは一のタンパク質又はタンパク質の組み合わせの（ａ）で測定されたレベルが基準レベルを超える場合に、抗ＩＬ−１β抗体、抗ＩＬ−１８抗体又は多重特異性抗ＩＬ−１β／抗ＩＬ−１８抗体を患者へ投与することを含む。特定の実施態様において、抗ＩＬ−１β抗体、抗ＩＬ−１８抗体又は多重特異性抗ＩＬ−１β／抗ＩＬ−１８抗体は、炎症性腸疾患を有する患者の治療における使用のために提供され、ここで、該患者は、本人の腸組織標本中のＩＬ１８のレベルが基準レベルを超える場合に治療される。特定の実施態様では、炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎、又は炎症性クローン病、又は線維性クローン病、又は線維狭窄性クローン病である。特定の実施態様では、発現レベルはＰＣＲ法又はマイクロアレイチップを用いて測定される。
【００２１】
また更に別の態様では、患者の炎症性腸疾患を治療する追加的方法が提供される。特定の実施態様において、（ａ）対象から得られた血清試料においてＧＣＳＦの発現レベルを測定すること、（ｂ）（ａ）で測定されたＧＣＳＦの発現レベルを基準レベルと比較すること、及び（ｃ）（ａ）で測定されたＧＣＳＦのレベルが基準レベルを超える場合に、抗ＩＬ−１β抗体、抗ＩＬ−１８抗体又は多重特異性抗ＩＬ−１β／抗ＩＬ−１８抗体を患者へ投与することを含む。特定の実施態様において、抗ＩＬ−１β抗体、抗ＩＬ−１８抗体又は多重特異性抗ＩＬ−１β／抗ＩＬ−１８抗体は、炎症性腸疾患を有する患者の治療における使用のために提供され、ここで、該患者は、本人の血清試料中のＧＣＳＦのレベルが基準レベルを超える場合に治療される。特定の実施態様では、炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎、又は炎症性クローン病、又は線維性クローン病、又は線維狭窄性クローン病である。特定の実施態様では、発現レベルはイムノアッセイ又はＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ−１Ｃ】実施例１に記載のＩＢＤ患者又は非ＩＢＤ患者から得られた切除組織中のＩＬ−１βのレベルの増加を示す。（図１Ａ）ＣＤ患者、ＵＣ患者及び非ＩＢＤ患者間のＩＬ−１β  ｍＲＮＡレベルの比較、疾病状態を横軸に、相対的ｍＲＮＡ発現レベルを縦軸に示す；（図１Ｂ）線維性又は炎症性疾患のために腸切除を受けたＣＤ患者、又は非ＩＢＤ患者（横軸に示す）間のＩＬ−１β  ｍＲＮＡレベルの比較；相対的ｍＲＮＡ発現レベルを縦軸に示す。すべてのｍＲＮＡレベルはハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨのレベルに対して正規化されている。（図１Ｃ）ＩＬ−１βタンパク質の免疫組織化学染色；上の枠は、周辺組織よりも広い面積の染色を表す、低倍率でのＣＤ患者の切除組織の切片を示す；下の枠は、高倍率による矢印で表した同一切片を示す。
【図２】実施例２に記載の非ＩＢＤ、ＵＣ又はＣＤ生検組織のイムノブロット分析を示す。
【図３Ａ−３Ｆ】実施例１に記載のようにｑＲＴ−ＰＣＲにより決定され、続いて培地、ＩＬ−１β又はＴＮＦαで刺激した三種の一次上皮下筋線維芽細胞株中のｍＲＮＡレベルを示す。各ケースにおいて、得られたデータは、ＧＡＰＤＨに対して正規化されている。細胞は、６時間刺激された図３Ｅを除いて、２４時間刺激された。（図３Ａ）ＧＣＳＦ；（図３Ｂ）ＴＭＥＭ１５８；（図３Ｃ）Ｃｏｌ７Ａ１；（図３Ｄ）Ｃｏｌ１６Ａ１；（図３Ｅ）アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）；（図３Ｆ）ＩＬ１１。
【図４Ａ−４Ｂ】実施例１に記載のように、培地、ＩＬ−１β又はＴＮＦαで２４時間処理した三種の一次上皮下筋線維芽細胞株の処理に続く、細胞上清ＥＬＩＳＡの（図４Ａ）ＧＣＳＦ及び（図４Ｂ）アンフィレグリンの結果を示す。
【図５Ａ−５Ｂ】（図５Ａ）は、炎症性ＣＤ（ｉＣＤ）、線維性／線維狭窄性ＣＤ（ｆＣＤ）、ＵＣ、結腸がん、憩室炎の患者又は健常なコントロールにおける血清ＧＣＳＦレベルを示す；ＬＬＯＤ＝検出下限値、及び（図５Ｂ）は、実施例１に記載の結腸ライセート中のＩＬ−１βレベルと血清ＧＣＳＦ中のＩＬ−１βレベルとの相関関係を示す。
【図６Ａ−６Ｆ】実施例１に記載のＲＮＡ単離、Ｈ＆Ｅ染色（炎症スコアをもたらした）及びＩＨＣによるＳＭＡ染色に対応したＣＤ組織切片における、表示のコラーゲン関連遺伝子及び線維性関連遺伝子についてのｑＲＴ−ＰＣＲにより決定されるＲＮＡ発現レベルを示す。切片はＳＭＡについて病理学者によりスコア化された；ＳＭＡ＋試料は線維症のエビデンスを有すると考えられる。（図６Ａ）コラーゲンサブタイプ  ７Ａ１；（図６Ｂ）コラーゲンサブタイプ  １６Ａ１；（図６Ｃ）アンフィレグリン；（図６Ｄ）ＩＬ−１１（図６Ｅ）ＡＥＢＰ１；（図６Ｆ）ＩＬ１Ｒ１。
【図７Ａ−７Ｆ】実施例２に記載の対応する患者試料由来の腸組織ライセート及び血清中の、ＩＬ１８及びＩＬ１８ＢＰタンパク質レベルを示す。（図７Ａ）腸組織ライセート  ＩＬ１８；（図７Ｂ）血清  ＩＬ１８；（図７Ｃ）腸組織ライセート  ＩＬ１８ＢＰ；（図７Ｄ）血清  ＩＬ１８ＢＰ；（図７Ｅ）腸組織ライセート  ＩＬ１８：ＩＬ１８ＢＰの比率；（図７Ｆ）炎症性ＣＤ（点状の円）及び線維性ＣＤ（輪郭が点線の白い円）についての、腸組織ライセート  ＩＬ１８ｖｓ血清  ＩＬ１８ＢＰの比較。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、一般的に、本発明が属する技術分野の当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), 及びMarch, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)は、本願で使用される用語の多くに対する一般的な指針を当業者に提供する。
【００２４】
特定の定義
本明細書の説明のために、以下の定義を適用し、適切な場合はいつでも、単数形で用いられる用語は複数形を含み、その逆の場合も同じである。以下に記載のいかなる定義も、参照により本明細書に援用される任意の文書と矛盾する場合には、以下に記載する定義が支配する。
【００２５】
本明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を指さない限り複数形を含む。したがって、例えば、「タンパク質」への言及は、複数のタンパク質を含み、「細胞」への言及は、細胞の混合物などを含む。
【００２６】
本明細書中及び添付の特許請求の範囲に提供される範囲は、端点と端点間のすべての点の両方を含む。したがって、例えば、２．０から３．０の範囲は２．０、３．０及び２．０と３．０の間のすべての点を含む。
【００２７】
「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」及びその文法上の変形は、治療されている個体又は細胞の自然の経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理経過中に実施され得る。治療の望ましい効果は、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。
【００２８】
「治療レジメン」とは、投与量、投与頻度、又は治療の期間、第二の薬の追加の有無の組み合わせを指す。
【００２９】
「効果的な治療レジメン」とは、治療を受ける患者に有益な応答を与える治療レジメンを指す。
【００３０】
「患者の応答」又は「患者の応答性」は、患者の利益を示す評価項目を使用して評価され得、限定されないが、以下のものを含む：（１）疾患進行の減速及び完全停止を含む、疾患進行のある程度の阻害；（２）疾患エピソード及び／又は症状の数の減少；（３）病変サイズの縮小；（４）疾患細胞の近隣の末梢器官及び／又は組織への浸潤の阻害（すなわち、低減、減速又は完全停止）；（５）疾患拡大の阻害（すなわち、低減、減速又は完全停止）；（６）自己免疫応答の低下、これにより必須ではないが病変の退縮や消失をもたらし得る；（７）疾患関連の一又は複数の症状のある程度の軽減；（８）治療後の無増悪状態の延長化；及び／又は（９）治療後の所定の時点での死亡率低下。用語「応答性」とは、完全寛解（ＣＲ）と部分寛解（ＰＲ）を含む測定可能な応答を指す。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「完全奏功」又は「ＣＲ」は、治療への反応として炎症のすべての徴候の消失又は寛解を指す。これは、必ずしも疾患が治癒されたことを意味するわけではない。
【００３２】
「部分寛解」又は「ＰＲ」は、治療への反応として炎症の重症度の少なくとも５０％低下を指す。
【００３３】
治療剤を用いた治療に対する患者の「有益な応答」及び類似の表現は、該治療剤を用いた治療により又は治療の結果、胃腸炎症性疾患のリスクがあるか又はそれに罹患している患者にもたらされる臨床的又は治療上の利益を指す。このような利益は、細胞性応答又は生物学的応答、完全奏功、部分奏功、安定した疾患（進行又は再発なし）、又は該治療剤を用いた治療により若しくは治療の結果、患者の後に再発した応答を含む。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「非応答」又は「応答の欠如」又は類似の表現は、治療剤を用いた治療に対する完全奏功、部分奏功又は有益な応答がないことを意味する。
【００３５】
治療の過程で時間と共に患者の応答性が低下しない場合、「治療は治療対する応答性を維持している」。
【００３６】
本明細書で使用される用語「試料」又は「試験試料」は、例えば、物理的、生化学的、化学的及び／又は生理学的特性に基づいて特徴付けられる及び／又は同定される細胞実体及び／又は他の分子実体を含有する、目的の対象から得られるか又は由来する組成物を指す。一実施態様では、この定義は、血液及び他の生物学的起源の液体試料、生検標本又は組織培養物等の組織標本、或いはそれに由来する細胞を包含する。組織標本の原料は、新鮮凍結及び／又は保存臓器又は組織試標本又は生検又は吸引液由来の固形組織；血液又はあらゆる血液成分；体液；対象の妊娠期又は発生期の任意の時点からの細胞又は血漿であってよい。用語「試料」又は「試験試料」は、それらの調達後に何らかの方法で、例えば、試薬での処理、可溶化、又はタンパク質若しくはポリヌクレオチド等の特定の構成成分の濃縮、又は切片作成のための半固体又は固体マトリックス中への包埋によって、操作された生体試料を含む。本明細書の目的のために、組織標本の「切片」は、組織標本の単一の部分又は片、例えば、組織標本から切り出した組織又は細胞の薄片を意味する。試料は、限定されないが、全血、血液由来の細胞、血清、血漿、リンパ液、滑液、細胞抽出物、及びこれらの組み合わせを含む。一実施態様において、試料は臨床試料である。別の実施態様では、試料は診断検査で用いられる。
【００３７】
「基準試料」は、本明細書で用いられる場合、比較目的のために用いられる、任意の試料、標準、又はレベルを指す。一実施態様では、基準試料は、同じ対象又は患者の身体の健常な及び／又は非疾患部分（例えば、組織又は細胞）から得られる。別の実施態様では、基準試料は同じ対象又は患者の身体の未処置組織及び／又は細胞から得られる。更に別の実施態様では、基準試料は、対象又は患者ではない個体の身体の健常な及び／又は非疾患部分（例えば、組織又は細胞）から得られる。更に別の実施態様では、基準試料は対象又は患者ではない個体の身体の未処置組織及び／又は細胞から得られる。
【００３８】
「胃腸炎症性疾患」とは、粘膜に炎症及び／又は潰瘍を引き起こす慢性疾患の群である。こうした疾患は、例えば、炎症性腸疾患（例：クローン病、潰瘍性大腸炎、不確定性大腸炎）、粘膜炎（例：口腔粘膜炎、胃腸粘膜炎、鼻粘膜炎及び直腸炎）、壊死性腸炎及び食道炎を含む。
【００３９】
「炎症性腸疾患」又は「ＩＢＤ」は、本明細書では互換的に使用され、炎症及び／又は潰瘍を引き起こす腸の疾患を指し、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含むがこれらに限定されない。
【００４０】
「クローン病（ＣＤ）」及び「潰瘍性大腸炎（ＵＣ）」は、原因不明の慢性炎症性腸疾患である。クローン病は、潰瘍性大腸炎と違い、腸の如何なる部分にも影響し得る。クローン病の最も顕著な特徴は、腸壁の粒状で赤紫色の浮腫性肥厚である。炎症の進行に伴い、こうした肉芽腫は、多くの場合、外接境界を失い、周囲の組織と一体化する。下痢や腸の閉塞が主な臨床的特徴である。潰瘍性大腸炎と同様に、クローン病の経過は持続性又は再発性であり得、軽度又は重度であり得るが、潰瘍性大腸炎とは異なり、クローン病は腸の患部の切除によって治癒可能ではない。クローン病患者の大半は、ある時点で手術を必要とするが、その後の再発は一般的であり、継続的な治療が通常である。
【００４１】
クローン病は、一般的には、回結腸、小腸、結腸、肛門直腸の領域に現れるが、口から肛門までの消化管の任意の部分に影響し得る。病理組織学的に、この疾患は非連続性の肉芽腫症、陰窩膿瘍、裂溝及びアフタ性潰瘍により顕在化する。炎症性浸潤物は、リンパ球（Ｔ細胞とＢ細胞の両方）、形質細胞、マクロファージ及び好中球からなる混合物である。ＩｇＭ分泌形質細胞及びＩｇＧ分泌形質細胞、マクロファージ並びに好中球における不均衡な増加がある。
【００４２】
抗炎症薬のスルファサラジン及び５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）は、穏やかに活性な結腸クローン病を治療するために使用され、一般に、疾患の寛解を維持するために処方される。メトロニダゾール及びシプロフロキサシンはスルファサラジンと有効性が類似しており、特に肛門周囲の疾患を治療するために処方される。より重症なケースでは、副腎皮質ステロイドは、激しい増悪を治療するために処方され、時には寛解を維持し得る。また、アザチオプリン及び６−メルカプトプリンも、副腎皮質ステロイドの慢性投与を必要とする患者において用いられている。これらの薬物は、長期の予防において役割を果たし得ることが示唆されている。残念ながら、一部の患者において、作用の発現までに非常に長い遅延（最大６ヶ月）が生じ得る。また、止瀉薬も一部の患者において症状緩和を提供し得る。栄養療法又は成分栄養法は、患者の栄養状態を改善し、急性疾患の症状改善を誘導するものの、持続的な臨床的寛解は誘導しない。抗生物質は、二次小腸細菌の異常増殖の治療及び化膿性合併症の治療に使用される。
【００４３】
「潰瘍性大腸炎（ＵＣ）」は大腸に影響を与える。疾患の経過は、持続性又は再発性であり得、軽度又は重度であり得る。最初期の病変は、リーベルキューンの陰窩の基部に膿瘍形成を伴う炎症性浸潤である。こうした膨張性且つ破裂性の陰窩の癒着は、覆っている粘膜をその血液供給から切り離す傾向にあり、潰瘍形成をもたらす。疾患の症状は痙攣、下腹部痛、直腸出血、並びに主として血液、膿及びわずかな糞便粒子を伴う粘液からなる、頻発する緩い排出物を含む。急性、重度又は慢性、非寛解性の潰瘍性大腸炎では結腸全摘除術が必要となる場合がある。
【００４４】
ＵＣの臨床的特徴は極めて変動的であり、発症は潜行性又は突発性であってもよく、下痢、しぶり腹及び再発性直腸出血を含み得る。全結腸に急激な発症があれば、中毒性巨大結腸、致命的な緊急事態が起こり得る。腸外の徴候は関節炎、壊疽性膿皮症、ブドウ膜炎及び結節性紅斑を含む。
【００４５】
ＵＣの治療は軽度の症例ではスルファラジン及び関連のサリシレート含有薬、また、重度の症例では副腎皮質ステロイド薬を含む。サリシレート又は副腎皮質ステロイドの局所投与は場合によっては、特に疾患が遠位の腸に限局されている場合は有効であり、全身使用と比較して低減された副作用を伴う。鉄及び抗下痢剤の投与のような補助的処置が場合により適応される。また、アザチオプリン、６−メルカプトプリン及びメトトレキサートは場合により、難治性の副腎皮質ステロイド依存症例における使用のために処方される場合がある。
【００４６】
「有効量」とは、所望の治療的又は予防的結果を達成するのに必要な用量及び期間での有効量を指す。
【００４７】
本明細書で使用される場合、用語「患者」は治療が望まれる任意の単独の対象を指す。特定の実施態様では、本明細書中の患者はヒトである。
【００４８】
本明細書中の「対象」は典型的にはヒトである。特定の実施態様では、対象は非ヒト哺乳動物である。例示的非ヒト哺乳動物は、実験動物、家畜、ペット、競技用動物及び畜産動物、例えば、マウス、ネコ、イヌ、ウマ及びウシを含む。一般的に、対象は治療、例えば、胃腸炎症性疾患の治療の対象である。
【００４９】
用語「抗体」及び「イムノグロブリン」は互換性をもって広義の意味で用いられ、モノクローナル抗体（例えば、完全長抗体又はインタクトなモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、単価抗体、多価抗体、多重特異性抗体（例えば、所望の生物活性を示す限り、二重特異性、三重特異性抗体等）を含み、また（本明細書で更に詳述される）特定の抗体断片も含み得る。抗体はヒト、ヒト化及び／又は親和性成熟したものであり得る。
【００５０】
「抗体断片」はインタクトな抗体の一部のみを含み、該一部は、特定の実施態様において、インタクトな抗体に存在する場合に、その一部に通常関連している機能の少なくとも一部、及び典型的にはその殆ど又はすべてを保持している。一実施態様では、抗体断片はインタクトな抗体の抗原結合部位を含み、よって抗原に結合する能力を保持している。別の実施態様では、抗体断片、例えばＦｃ領域を含むものは、インタクトな抗体に存在する場合に、Ｆｃ領域に通常関連している少なくとも一の生物学的機能、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合等を保持している。一実施態様では、抗体断片は、インタクトな抗体と実質的に同様のインビボ半減期を有する一価性抗体である。例えば、このような抗体断片は、インビボ安定性を断片に与えることができるＦｃ配列に結合した抗原結合アームを含み得る。
【００５１】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る自然に生じる可能性がある変異体を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原に対するものである。更に、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
【００５２】
本明細書においてモノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の種に由来するか又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一若しくは相同であるが、残りの鎖は別の種に由来するか又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一若しくは相同である、「キメラ」抗体、及び、所望の生物活性を呈する限り、該抗体の断片を特に含む（例えば、米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。
【００５３】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基によって置換された、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例においては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体はレシピエント抗体にも、又はドナー抗体にも見出されない残基を含み得る。こうした修飾は、抗体性能を更に改良するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインのすべてを実質的に含み、可変ドメイン中の超可変ループのすべて又は実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものである。また、ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。更なる詳細については、例えばJones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。またこれらの文献中で引用されている次の概説及び参考文献も参照のこと：Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)。
【００５４】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を含む抗体、及び／又は本明細書に開示のヒト抗体を作製するための任意の技術を使用して製造された抗体である。そのような技術は、ファージディスプレイ等のヒト由来のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすること（例えば、Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)及びHoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)参照）；ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株を使用すること（例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 55-93 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及び内因性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体の全レパートリーを産生可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）においてモノクローナル抗体を生成すること（例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al.,Year in Immunol., 7: 33 (1993)参照）を含む。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト動物由来の抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除く。
【００５５】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離され、及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質を含み得る。特定の実施態様において、抗体は（１）ローリー法により測定して、抗体の９５重量％を超えるまで、また通常９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用により、Ｎ末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに充分な程度にまで、或いは（３）クーマシーブルー又は銀染色を使用した還元又は非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性にまで精製される。単離された抗体は組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕの抗体を含むが、これは抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないからである。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一つの精製工程により調製される。
【００５６】
本明細書で使用される場合、用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」は、配列が超可変であり、及び／又は構造的に定義されたループを形成する、抗体可変ドメインの領域を指す。通常、抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の計６つの超可変領域を含む。多数の超可変領域の描写が使用され、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は配列可変性に基づいており、最も一般的に使用される(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに、構造ループの位置を指す(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ超可変領域は、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造的ループの折衷であり、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」超可変領域は、利用可能な複合体結晶構造の解析に基づく。これらの各ＨＶＲからの残基を以下に記す。
【００５７】
2016521540.tif 000003
【００５８】
超可変領域は、次の「拡大超変領域」を含み得る：  ＶＬの２４〜３６又は２４〜３４（Ｌ１）、４６〜５６又は４９〜５６又は５０〜５６又は５２〜５６（Ｌ２）、及び８９〜９７（Ｌ３）、並びにＶＨの２６〜３５（Ｈ１）、５０〜６５又は４９〜６５（Ｈ２）及び９３〜１０２、９４〜１０２、又は９５〜１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基には、これら各々を定義するために、上掲のＫａｂａｔらに従って番号を付した。
【００５９】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書で定義している超可変可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００６０】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選別において、最も共通して生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選別は、可変ドメイン配列のサブグループからなされる。通常、Ｋａｂａｔらによると、配列のサブグループはサブグループである。一実施態様では、ＶＬについて、Ｋａｂａｔらによると、サブグループはサブグループカッパＩである。一実施態様では、ＶＨについて、Ｋａｂａｔらによると、サブグループはサブグループＩＩＩである。
【００６１】
「親和性成熟」抗体は、その一又は複数のＣＤＲに一又は複数の改変を有する抗体であって、そのような改変を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性が向上している。特定の実施態様では、親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル又はピコモルの親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産される。Ｍａｒｋｓらは、Bio/Technology 10:779-783 (1992)において、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発が、Barbasら, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schierら, Gene 169:147-155 (1996); Yeltonら, J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jacksonら, J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995);及びHawkinsら, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)に記載されている。
【００６２】
本明細書で用いられる「実質的に類似」又は「実質的に同じ」なる句は、二つの数値の差異に、該値によって測定される生物学的性質上殆ど又は全く生物学的及び／又は統計学的有意差がないと当業者に認められるほど、二つの数値の類似性が十分に高いことを指す。
【００６３】
一般的に「結合親和性」は、分子（例えば抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合的な相互作用の総計の強度を意味する。特に明記しない限り本明細書では、「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば抗体と抗原）間の１対１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数（Ｋｄ）によって表される。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当該技術分野で周知の一般的な方法により測定され得る。低親和性抗体は一般的に抗原にゆっくり結合してすぐに解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は一般的に抗原により速く結合し、より長く結合を維持する傾向がある。結合親和性の様々な測定方法が当該技術分野で知られている。
【００６４】
抗体又は免疫グロブリンに関連した用語「可変」は、可変ドメインの特定の部分が抗体間で配列が広範囲に異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性に使用されているという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメインにわたって均一に分布しているのではない。それは、軽鎖及び重鎖可変ドメイン双方の超可変領域と称される三つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存されている部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ４つのＦＲを含み、これらは主にＢシート立体配置を採り、三つの超可変領域により連結され、これらの超可変領域はＢシート構造を連結し場合によってはその構造の一部を形作るループを形成する。各鎖の超可変領域は、ＦＲによって極めて近接した状態に保持され、他の鎖の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)参照)。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、例えば抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）への抗体の関与等、種々のエフェクター機能を呈する。
【００６５】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる二つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理は、二つの抗原結合部位を有し、なお抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）２断片を生じる。
【００６６】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした、一つの重鎖と一つの軽鎖可変ドメインとの二量体からなる。各可変ドメインの三つの超可変領域が相互作用しＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を既定するのは、この配置においてである。  集合的に、六つの超可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に対して特異的な三つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえ、全結合部位よりも親和性が低下するものの、抗原を認識して結合する能力を有している。
【００６７】
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域（ＣＨ１）を有する。Ｆａｂ＝断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一の遊離チオール基を担持しているＦａｂ’に対するここでの命名である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’の対として生産された。抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００６８】
任意の脊椎動物種由来の抗体の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる二つの明確に区別される型の一つが割り当てられ得る。
【００６９】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）には異なるクラスが割り当てられる。免疫グロブリンには五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１及びＩｇＡ２等のサブクラス（アイソタイプ）に更に分かれる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、エプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位は周知であり、その概説は、例えばAbbasら, Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W. B. Saunders, Co., 2000)に記載されている。抗体は、抗体と一又は複数の他のタンパク質若しくはペプチドとの共有的又は非共有的結合により形成される大きな融合分子の一部であってもよい。
【００７０】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、以下に定義する抗体断片ではなく、その実質的に無傷の形態の抗体を指すために本明細書では互換的に使用される。該用語は特にＦｃ領域を含む重鎖を持つ抗体を指す。
【００７１】
本明細書の目的のための「ネイキッド抗体」は、細胞傷害性部分又は放射標識にコンジュゲートされない抗体である。
【００７２】
本明細書の用語「Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域及び変異形Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６位又はＰｒｏ２３０位のアミノ酸残基から、Ｆｃ領域のカルボキシル末端まで伸長すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号付けシステムによれば残基４４７）は、例えば、抗体の産生若しくは精製の間に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え操作することによって取り除かれ得る。したがって、インタクト抗体の組成物は、すべてＫ４４７残基が除かれた抗体集団、Ｋ４４７残基が除かれていない抗体集団、及びＫ４４７残基を有する抗体と有さない抗体との混合を含む抗体集団を含み得る。
【００７３】
特に明記しない限り、本明細書中の免疫グロブリン重鎖の残基の番号付けは、出典明示により本明細書に援用されるKabat ら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)によるＥＵインデックスの番号付けである。「ＫａｂａｔのＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基番号を指す。
【００７４】
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的「エフェクター機能」は、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害、Ｆｃレセプター結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御等を含む。そのようなエフェクター機能は、通常、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と結合していることが必要であり、例えば本明細書中に開示されるような様々なアッセイを用いて評価され得る。
【００７５】
「天然配列のＦｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を包含する。天然配列のヒトＦｃ領域は、天然配列のヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域（非Ａ−及びＡ−アロタイプ）；天然配列のヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域；天然配列のヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域；及び天然配列のヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域；並びに、これらの自然に生じる変異体を含む。
【００７６】
「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも一のアミノ酸修飾のために天然配列のＦｃ領域と異なるアミノ酸配列を含む。変異体Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然配列のＦｃ領域又は親ポリペプチドのＦＣ領域に、特定の実施態様では約１から約１０個のアミノ酸置換、また、特定の実施態様では約１から約５個のアミノ酸置換を有する。特定の実施態様では、本明細書中の変異体Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と、少なくとも約８０％の相同性、又はそれらと少なくとも約９０％の相同性、又はそれらと少なくとも約９５％の相同性を有するであろう。
【００７７】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、インタクトな抗体は異なる「クラス」に割り当てられ得る。インタクトな抗体には五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ及びＩｇＡ２等の「サブクラス」（アイソタイプ）に更に分かれる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれａ、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び３次元構造はよく知られている。
【００７８】
「抗体依存性細胞媒介細胞傷害性」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）を発現する非特異性細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する第一の細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＩ、ＦｃγＩＩ及びＦｃγＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現はＲａｖｅｔｃｈ及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991)の４６４ページの表３に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、例えば米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施され得る。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。或いは又は加えて、対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynesら, PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されているような動物モデルでインビボの評価がされ得る。
【００７９】
「ヒトエフェクター細胞」は、一又は複数のＦｃＲを発現する白血球であり、エフェクター機能を果たす。特定の実施態様では、該細胞は、少なくともＦＣγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞及び好中球を含む。エフェクター細胞は、その天然の供給源、例えば本明細書に記載の血液又はＰＢＭＣから単離されてもよい。
【００８０】
「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」なる用語は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記述するために使用される。特定の実施態様では、ＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。更に、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合し（ガンマ受容体）、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これらの受容体の対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含み、それらは、主としてそれらの細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに、免疫受容体チロシン−ベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに、免疫受容体チロシン−ベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する(Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)の概説Ｍを参照されたい）。ＦｃＲはＲａｖｅｔｃｈ及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991);Capelら, Immunomethods4:25-34 (1994)；及びde Hasら, J. Lab. Cｌｉｎ． Med. 126:330-41 (1995)で概説されている。将来同定されるものも含む他のＦｃＲも、本明細書における用語「ＦｃＲ」により包含される。また、この用語は、胎児への母性ＩｇＧの移動の原因であり(Guyerら, J. Immumol. 117:587 (1976)及びKimら, J. Immunol. 24:249 (1994))、免疫グロブリンのホメオスタシスを調節する、新生児受容体であるＦｃＲｎも含む。新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合性が向上し、半減期が延長されている抗体は、国際公開第００／４２０７２号(Presta, L.)及び米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号（Hintonら）において記述されている。こうした抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合性を向上させる一又は複数の置換を有するＦｃ領域を含む。例えば、Ｆｃ領域は、一又は複数の位置２３８、２５０、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１４、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、４２８又は４３４（残基のＥｕ番号付け）において置換を有してもよい。特定の実施態様において、向上したＦｃＲｎ結合性を有するＦｃ領域含有抗体変異体は、そのＦｃ領域の位置３０７、３８０及び４３４（残基のＥｕ番号付け）のうちの一つ、二つ又は三つにおいてアミノ酸置換を含む。
【００８１】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、ＦｖポリペプチドはＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを更に含み、このリンカーはｓｃＦｖが抗原結合にとって望ましい構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、例えば、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照のこと。ＨＥＲ２抗体ｓｃＦｖ断片は、国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号に記載されている。
【００８２】
用語「ダイアボディ」は、抗原結合部位を二つ備える小さな抗体断片を指し、この抗体断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内で可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に連結した可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖の上の二つのドメインの間で対合させるにはあまりに短いリンカーを用いて、このドメインを他の鎖の相補性ドメインと強制的に対合させ、二つの抗原結合部位をつくる。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４０９７号；国際公開第９３／０１１６１号；及びHudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (11161); 及びHollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。
【００８３】
「親和性成熟」抗体は、その一又は複数の超可変領域に一又は複数の改変を有する抗体であって、そのような改変を有さない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性が向上している。特定の実施態様では、親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル又はピコモルの親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産される。Marksらは、Bio/Technology 10:779-783 (1992)で、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を記述している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発が、Barbasら,  Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schierら, Gene 169:147-155 (1995); Yeltonら, J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jacksonら, J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995);及びHawkinsら, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)に記載されている。
【００８４】
本明細書において、「アミノ酸配列変異体」抗体は、主要種の抗体と異なるアミノ酸配列を有する抗体である。特定の実施態様において、アミノ酸配列変異体は、主要種の抗体と少なくとも約７０％の相同性を有し、又は、主要種の抗体と少なくとも約８０％、若しくは少なくとも約９０％の相同性である。アミノ酸配列変異体は、主要種の抗体のアミノ酸配列内の、又は主要種の抗体のアミノ酸配列に隣接した特定の位置における置換、欠失及び／又は付加を有する。本明細書中のアミノ酸配列変異体の例は、酸性変異体（例：脱アミド化抗体変異体）、塩基性変異体、一つ又は二つの軽鎖上にアミノ末端リーダー伸長（例：ＶＨＳ−）を有する抗体、一つ又は二つの重鎖上にＣ末端リジン残基を有する抗体等を含み、また、重鎖及び／又は軽鎖のアミノ酸配列に対する変異体の組合せも含む。本明細書で特に対象となる抗体変異体はその一つ又は二つの軽鎖上にアミノ末端リーダー伸長を含み、場合により主要種抗体と比較したその他のアミノ酸配列及び／又はグリコシル化の相違を更に含む抗体である。
【００８５】
本明細書中の「グリコシル化変異体」抗体は、それに付着した一又は複数の糖質部分を有する抗体であり、その部分は、主要種抗体に付着した一又は複数の糖質部分とは異なる。本明細書において、グリコシル化変異体の例は、抗体のＦｃ領域に付着した、Ｇ０オリゴ糖構造の代わりにＧ１又はＧ２オリゴ糖構造を有する抗体、抗体の一つ又は二つの軽鎖に付着した一又は複数の糖質部分を有する抗体、抗体の一つ又は二つの重鎖に付着する糖質がない抗体及び類似のもの、並びにグリコシル化改変の組み合せを含む。抗体がＦｃ領域を有する場合、オリゴ糖構造は、抗体の一つ又は二つの重鎖、例えば、残基２９９において（２９８、残基のＥｕ番号付け）に結合してもよい。
【００８６】
本明細書で使用される場合の用語「細胞傷害性剤」は、細胞の機能を阻害又は阻止し、及び／又は細胞破壊をもたらす物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、及び小分子毒素又は細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素的に活性な毒素等の毒素、並びにそれらの断片及び／又は変異体を含むことが意図される。
【００８７】
用語「サイトカイン」は、一つの細胞集団により放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエーターとして作用するものの総称である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のような糖タンパク質ホルモン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体ホルモン（ＬＨ）；肝臓成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子‐α及び腫瘍壊死因子‐β；ミュラー管抑制因子；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦＢ等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ‐α又はＴＧＦ‐βのようなトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ；エリスロポイエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン‐α、‐β及び‐γのようなインターフェロン；マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；及び顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８等のインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−α又はＴＮＦ−βのような腫瘍壊死因子；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書で使用される場合、サイトカインなる用語は天然源由来又は組換え細胞培養物由来のタンパク質、及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
【００８８】
本明細書で補助療法として用いられる場合の「免疫抑制剤」なる用語は、本明細書中で治療される対象の免疫系を抑制又は遮断するように働く物質を表す。これは、サイトカイン産生を抑制する、自己抗原の発現を下方制御又は抑制する、或いはＭＨＣ抗原を遮断する物質を含む。そのような薬剤の例は、２−アミノ−６−アリールール−５−置換ピリミジン（米国特許第４６６５０７７号を参照）；非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）；ガンシクロビル；タクロリムス；糖質ステロイド、例えばコルチゾール又はアルドステロン；抗炎症剤、例えばシクロオキシゲナーゼ阻害剤；５−リポキシゲナーゼ阻害剤；又はロイコトリエン受容体アンタゴニスト；プリンアンタゴニスト、例えばアザチオプリン又はミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）；アルキル化剤、例えばシクロホスファミド；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソン；グルタルアルデヒド（米国特許第４１２０６４９号に記載のように、ＭＨＣ抗原を遮断する）；ＭＨＣ抗原及びＭＨＣ断片に対する抗イデオタイプ抗体；シクロスポリン；６メルカプトプリン；副腎皮質ステロイド又は糖質副腎皮質ステロイド又は糖質ステロイド類似体等のステロイド、例としてプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、例えばＳＯＬＵ−ＭＥＤＲＯＬ（登録商標）メチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウム、及びデキサメタゾン；ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、例としてメトトレキサート（経口又は皮下）；クロロキン及びヒドロキシクロロキン等の抗マラリア剤；スルファサラジン；レフルノミド；サイトカイン又はサイトカイン受容体抗体又はアンタゴニスト、例として抗インターフェロンアルファ、−ベータ、又は−ガンマ抗体、抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファ抗体（インフリキシマブ（レミケード（登録商標））又はアダリムマブ）、抗ＴＮＦアルファイムノアドヘシン（エタネルセプト）、抗ＴＮＦベータ抗体、抗インターロイキン２（ＩＬ−２）抗体及び抗ＩＬ−２受容体抗体、及び抗インターロイキン６（ＩＬ−６）受容体抗体及びアンタゴニスト；抗ＣＤ１１ａ及び抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ−１抗体；抗−Ｌ３Ｔ４抗体；異種性抗リンパ球グロブリン；全Ｔ抗体、抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ−３結合ドメインを含む可溶性ペプチド（１９９０年７月２６日公開の国際公開第９０／０８１８７号）；ストレプトキナーゼ；トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−ベータ）；ストレプトドルナーゼ（ｓｔｒｅｐｔｏｄｏｒｎａｓｅ）；宿主由来のＲＮＡ又はＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ−６１４４３；クロランブシル；デオキシスペルグアニン（ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）；ラパマイシン；Ｔ細胞受容体（Cohenら, 米国特許第５１１４７２１号）；Ｔ細胞受容体断片(Offnerら, Science 251:430-432 (1991);国際公開第90/11294号;Ianeway, Nature, 341: 482 (1989)；及び国際公開第９１／０１１３３号）；ＢＡＦＦ又はＢＲ３抗体又はイムノアドヘシン等のＢＡＦＦアンタゴニスト及びｚＴＮＦ４アンタゴニスト（概説については、Mackay and Mackay, Trends Immunol., 23:113-5 (2002)と以下の定義を参照のこと）；Ｔ細胞ヘルパー信号を阻害する生物学的薬剤、例えば、ＣＤ４０−ＣＤ４０リガンドに対する阻止抗体等の抗ＣＤ４０受容体又は抗ＣＤ４０リ���ンド（ＣＤ１５４）（例えば、Durie et al., Science, 261: 1328-30 (1993); Mohan et al., J. Immunol., 154: 1470-80 (1995))及びCTLA4-IgFinck et al., Science, 265: 1225-7 (1994))；及びＴ１０Ｂ９等のＴ細胞受容体抗体（ＥＰ３４０１０９）を含む。
【００８９】
本明細書で使用される用語「改善する」又は「改善」は、異常又は症状を含む、病態、疾患、障害又は表現型の減少、低減又は排除を指す。
【００９０】
疾患又は障害（例えば炎症性腸疾患、例えば潰瘍性大腸炎又はクローン病）の「症状」とは、対象によって経験され且つ疾患を示す、構造、機能又は感覚における任意の病的現象又は正常からの逸脱である。
【００９１】
「治療的有効量」なる表現は、疾患又は障害（例えば炎症性腸疾患、例えば潰瘍性大腸炎又はクローン病）を予防、改善、又は治療するために有効な量を指す。例えば、抗体の「治療的有効量」とは特定の疾患又は障害を予防、改善又は治療するために有効な抗体の量を指す。同様に、抗体と第二の化合物との併用剤の「治療的有効量」とは、併用して特定の疾患又は障害を予防、改善又は治療するために有効な抗体の量と第二の化合物の量を指す。
【００９２】
二種類の化合物の「併用剤」なる用語は、それらが相互に混合して投与される必要があることを意味するものではない。したがって、このような併用剤を用いた治療又はそれらの使用は、化合物の混合又は別々の投与を包含し、同日又は別の日の投与を含む。したがって、「併用」なる用語は二種類以上の化合物が別々に又は相互に混合して治療に使用されることを意味する。例えば、抗体と第二の化合物を対象に併用投与する場合には、抗体と第二の化合物が対象に別々に投与されるか又は混合して投与されるかに関係なく、抗体が対象の体内に存在するときに第二の化合物も対象の体内に存在する。特定の実施態様では、抗体以外の化合物は抗体より先に投与される。特定の実施態様では、抗体以外の化合物は抗愛より後に投与される。
【００９３】
本明細書における目的のために、「腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）」は、Pennicaら, Nature, 312:721 (1984)又はAggarwalら, JBC, 260:2345 (1985)に記載のアミノ酸配列を含むヒトＴＮＦ−アルファ分子を指す。
【００９４】
本明細書における「ＴＮＦ−アルファ阻害剤」は、一般にＴＮＦ−アルファに結合してその活性を中和することにより、ＴＮＦ−アルファの生物的機能をある程度阻害する薬剤である。本明細書で特に意図されるＴＮＦ阻害剤の例は、エタネルセプト（エンブレル（登録商標））、インフリキシマブ（レミケード（登録商標））、アダリムマブ（ヒュミラ（登録商標））、ゴリムマブ（シンポニーＴＭ）、及びセルトリズマブベゴル（シムジア（登録商標））である。
【００９５】
「副腎皮質ステロイド」は、天然に存在する副腎皮質ステロイドの効果を模倣するか又は増大させるステロイドの一般的化学構造を有する合成又は天然の幾つかの物質のいずれかを指す。合成副腎皮質ステロイドの例は、プレドニゾン、プレドニゾロン（メチルプレドニゾロンを含む）、デキサメタゾン、トリアムシノロン及びベタメサゾンを含む。
【００９６】
「アンタゴニスト」とは特定のタンパク質の活性（例えばリガンドの場合には一又は複数の受容体とのその結合、又は受容体の場合には一又は複数のリガンドとの結合）を中和、遮断、阻害、抑止、低下又は妨害することが可能な分子である。アンタゴニストは、抗体とその抗原結合断片、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖、オリゴ糖、核酸、生体有機分子、ペプチド模倣薬、薬物とその代謝産物、転写及び翻訳制御配列等を含む。アンタゴニストは、タンパク質の小分子阻害剤、及び融合タンパク質、タンパク質と特異的に結合し、それによりその標的との結合を隔離する受容体分子及び誘導体、タンパク質のアンタゴニスト変異体、タンパク質に対するアンチセンス分子、ＲＮＡアプタマー、並びにタンパク質に対するリボザイムを更に含む。
【００９７】
「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、長さが少なくとも約７ヌクレオチドであり、約２５０ヌクレオチド未満である、短い一本鎖ポリヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチは合成でもよい。用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は相互に排他的ではない。ポリヌクレオチドについての上記の説明は、等しく十分にオリゴヌクレオチドにも適用可能である。
【００９８】
用語「プライマー」は、通常、遊離３’−ＯＨ基を提供することによって核酸にハイブリダイズし、相補的な核酸の重合を可能にすることができる一本鎖ポリヌクレオチドを指す。
【００９９】
用語「増幅」は、参照核酸配列又はその補体の一又は複数のコピーを生成するプロセスを指す。増幅は、線形又は指数関数的であってよい（例えば、ＰＣＲ）。「コピー」は、鋳型配列に対して必ずしも完全な配列相補性又は同一性を意味するものではない。例えば、コピーは、デオキシイノシン等のヌクレオチド類似体、意図的な配列改変（例えば、鋳型とハイブリダイズ可能だが完全に相補的ではない配列を含むプライマーを介して導入される配列変化）及び／又は増幅の間に発生する配列の誤りを含み得る。
【０１００】
用語「検出」は、直接的及び間接的な検出を含む検出する任意の手段を含む。
【０１０１】
「発現上昇」又は「上昇レベル」は、例えば自己免疫疾患（ＩＢＤ等）に罹患していない個体又は個人のようなコントロールと比較した、或いは事前設定された閾値又はカットオフ値と比較した、或いは患者及び／又は対象の集団の中央値と比較した、患者のｍＲＮＡ又はタンパク質発現の増加を指す。
【０１０２】
「発現低下」又は「低下レベル」は、例えば自己免疫疾患（ＩＢＤ等）に罹患していない個体又は個人のようなコントロールと比較した、或いは事前設定された閾値又はカットオフ値と比較した、或いは患者及び／又は対象の集団の中央値と比較した、患者のｍＲＮＡ又はタンパク質発現の低下を指す。
【０１０３】
用語「多重ＰＣＲ」は、単一の反応内で二以上のＤＮＡ配列を増幅する目的で二以上のプライマーセットを使用して、単一の供給源（例えば、患者）から得られた核酸上で実施される単一のＰＣＲ反応を指す。
【０１０４】
本明細書で使用する用語「バイオマーカー」は、例えば病理学的状態又は治療剤に対する適切な応答性といった患者の表現型の指標を指し、患者の生体試料中で検出され得る。バイオマーカーは、限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プロテイン、炭水化物又は糖脂質ベースの分子マーカーを含む。
【０１０５】
用語「診断」は、本明細書では、分子又は病理学的状態、疾患又は病態の同定或いは分類を意味するために用いられる。例えば、「診断」は、ＵＣ又はクローン病等の特定のタイプのＩＢＤの同定を意味し得る。「診断」はまた、例えば組織病理学的な基準による、又は分子的特徴による、ＩＢＤの特定のサブタイプ（例えば、特定の遺伝子のうちの一又はそれらの組み合わせ或いは前記遺伝子によりコードされるタンパク質の発現により特徴付けられるサブタイプ）の分類も意味し得る。
【０１０６】
用語「診断を支援する」とは、症状又は病態の特定のタイプの存在又は性質に関する臨床判断を下すのに役立つ方法を指すために本明細書中で使用される。例えば、ＩＢＤの診断を支援する方法は、個体由来の生体試料中の特定の遺伝子の発現を測定することを含み得る。
【０１０７】
本明細書で用いられる「診断を提供する」なる句は、患者における潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性クローン病、線維性／線維狭窄性クローン病を含む炎症性腸疾患を診断するために、患者の試料中の、本明細書に記載のバイオマーカーの何れか一又は複数又は組み合わせのレベル又は存在に関して作成された情報又はデータを使用することを指す。情報又はデータは、書面、口頭又は電子的形態等、いかなる形態でもよい。幾つかの実施態様において、作成された情報又はデータの使用は、伝達、提示、報告、保管、送付、転送、供給、伝送、分配、又はそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施態様では、伝達、提示、報告、保管、送信、転送、供給、伝送、分配、又はそれらの組み合わせは、コンピューター、分析装置、又はそれらの組み合わせにより実施される。更に幾つかの実施態様では、伝達、提示、報告、保管、送信、転送、供給、伝送、分配、又はそれらの組み合わせは、研究又は医療の専門家により実施される。幾つかの実施態様では、情報又はデータは、本明細書に記載のバイオマーカーの何れか一又は複数又は組み合わせのレベルの基準レベルとの比較を含む。幾つかの実施態様では、情報又はデータは、本明細書に記載のバイオマーカーの何れか一又は複数又は組み合わせが試料中に存在しているか存在していないかの指標を含む。幾つかの実施態様では、情報又はデータは、患者が炎症性腸疾患と診断される指標を含む。幾つかの実施態様では、情報又はデータは、患者が潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性クローン病、又は線維性／線維狭窄性クローン病と診断される指標を含む。
【０１０８】
本明細書で用いられる「治療を推奨する」なる句は、治療に適しているか又は適していない患者を識別するために、患者の試料中の、本明細書に記載のバイオマーカーの何れか一又は複数又は組み合わせのレベル又は存在に関して作成された情報又はデータを使用することを指す。幾つかの実施態様では、治療は、抗ＩＬ−１β抗体及び／又は抗ＩＬ−１８抗体（単数又は複数）を含み得る。情報又はデータは、書面、口頭又は電子的形態等、いかなる形態でもよい。幾つかの実施態様において、作成された情報又はデータの使用は、伝達、提示、報告、保管、送付、転送、供給、伝送、分配、又はそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施態様では、伝達、提示、報告、保管、送信、転送、供給、伝送、分配、又はそれらの組み合わせは、コンピューター、分析装置、又はそれらの組み合わせにより実施される。更に幾つかの実施態様では、伝達、提示、報告、保管、送信、転送、供給、伝送、分配、又はそれらの組み合わせは、研究又は医療の専門家により実施される。幾つかの実施態様では、情報又はデータは、本明細書に記載のバイオマーカーの何れか一又は複数又は組み合わせのレベルの基準レベルとの比較を含む。幾つかの実施態様では、情報又はデータは、本明細書に記載のバイオマーカーの何れか一又は複数又は組み合わせが試料中に存在しているか存在していないかの指標を含む。幾つかの実施態様では、情報又はデータは、患者が、抗ＩＬ−１β抗体及び／又は抗ＩＬ−１８抗体（単数又は複数）を含む療法による治療に適しているか又は適していないかの指標を含む。
【０１０９】
用語「予後」は、ＩＢＤのような自己免疫疾患の自己免疫障害に起因する病徴の可能性の予測を表すために本明細書中で使用される。
【０１１０】
「予測」なる用語は、患者が、薬（治療剤）又は薬のセット又は治療レジメンに対して好ましい応答か或いは好ましくない応答を示す可能性に言及するために用いられる。一実施態様において、予測はこうした応答の程度に関する。一実施態様において、予測は、患者が、治療（例えば特定の治療剤を用いた治療）の後で、又は疾患再発なしに一定の期間、生存するか或いは改善するか否か、及び／又はその可能性に関する。本明細書に記載の予測方法は、任意の特定の患者のために最も適切な治療法を選択することによって治療決定を行うために臨床的に使用され得る。本明細書に記載の予測方法は、患者が、例えば所定の治療剤の投与又は併用、外科的介入、ステロイド治療を含む所定の治療法等の治療レジメンに対して好ましい応答をしそうかどうか、又は治療法の後に患者の長期生存又は寛解又は持続的寛解があるかどうかを予測する上で貴重なツールである。
【０１１１】
「コントロール群」は、例えばＩＢＤ等の特定の疾病を有していると診断されておらず、且つその疾病に関連する如何なる徴候や症状にも苦しんでいない健常な対象を指す。
【０１１２】
「相関」又は「相関する」とは、第一の分析又はプロトコールの成績及び／又は結果と、第二の分析又はプロトコールの成績及び／又は結果とを任意の方法で比較することを意味する。例えば、第一の分析又はプロトコールの結果を、第二のプロトコールの実施に使用してもよいし、及び／又は第二の分析又はプロトコールを実施すべきかどうかを決定するために第一の分析又はプロトコールの結果を使用してもよい。遺伝子発現分析又はプロトコールの実施態様に関して、特定の治療法を実施すべきかどうかを決定するために遺伝子発現分析又はプロトコールの結果を使用してもよい。
【０１１３】
「添付文書」は、治療薬又は医薬品の商業的パッケージに慣習的に含められる説明書を表すべく使用され、その説明書は、当該治療薬又は医薬品の使用に関する適応症、用法、用量、投与、禁忌、パッケージされている製品と併用させる他の治療薬、及び／又はその治療薬又は医薬品の用途に関する警告等についての情報を含む。
【０１１４】
「キット」は、少なくとも一の試薬、例えば、ＵＣ又はクローン病等の治療のための医薬、又はバイオマーカー遺伝子若しくはタンパク質等を特異的に検出するためのプローブを含む任意の製造品（例えば、パッケージ又は容器）である。特定の実施態様では、製造品は、本発明の方法を実施するためのユニットとして、奨励され、流通され、又は販売される。
【０１１５】
「ターゲット層」とは、とりわけ特定の使用、治療又は適応症について、マーケッティング又は広告により特定の医薬が奨励される又は奨励されることが意図される対象である人々の集団又は組織であり、例えば個々の患者、患者集団、新聞、医学文献及び雑誌の読者、テレビ又はインターネットの視聴者、ラジオ又はインターネットの聴取者、医師、製薬会社等である。
【０１１６】
用語「血清試料」は、個人から得られる任意の血清試料を指す。哺乳動物から血清を得るための方法は、当該技術分野でよく知られている。
【０１１７】
用語「全血」は、個人から得られる任意の全血試料を指す。通常、全血は、例えば細胞成分や血漿等のすべての血液成分を含有する。哺乳動物から全血を得るための方法は、当該技術分野でよく知られている。
【０１１８】
「〜に応答しない」、「非応答」なる表現及びその文法的変形は、以前投与された一又は複数の医薬（治療剤）に対する対象又は患者の反応に関する場合、医薬の投与で、治療される疾患の治療の十分な兆しを示さなかった又は全く示さなかった対象若しくは患者を記述し、或いは彼らが医薬に対して臨床的に許容できないほど高い毒性を示した、又は最初にそのような医薬を投与された後で治療の兆しを維持しなかったことを記述するものであり、治療なる単語は本明細書での定義通りに本文脈において使用される。「応答しない」なる句は、以前投与された薬物に対して耐性及び／又は不応性である対象の記述を含み、また、対象又は患者が与えられている薬物を摂取している間に増悪した状況、及び対象又は患者が、もはや応答性でなくなるまでの薬物を含むレジメンを終了してから１２か月以内（例えば６か月以内）に増悪した状況を含む。したがって、一又は複数の医薬に対する非応答性とは、医薬を用いた以前又は現在の治療後に活動性疾患を持ち続ける対象を含む。例えば、患者は、非応答である医薬を用いた治療の約１から３ヶ月後に、又は３から６ヶ月後に、又は６から１２ヶ月後に活動性疾患の活性を有することがある。そのような応答性は問題の疾患の治療に熟練した臨床医によって評価され得る。
【０１１９】
医薬に対する非応答の目的のために、一又は複数の医薬による以前又は現在の治療からの「臨床的に許容できない高レベルの毒性」を経験する対象は、経験のある臨床医により重大であると考えられる、該治療に関連する一又は複数の負の副作用又は有害事象、例えば、重篤な感染症、うっ血性心不全、脱髄（多発性硬化症につながる）、重大な過敏症、神経病理学的事象、高度の自己免疫、がん、例えば子宮内膜がん、非ホジキンリンパ腫、乳がん、前立腺がん、肺がん、卵巣がん、メラノーマ等、及び結核（ＴＢ）などを経験する。
【０１２０】
特定の疾病又は障害に罹患している患者に対する臨床的利益の増大に関連した、又は特定の治療剤又は治療レジメンに対する応答を予測するバイオマーカーの「量」又は「レベル」とは、生体試料中で検出可能なレベルである。これらは、当業者に既知で、本明細書に開示の方法により測定され得る。評価されるバイオマーカーの発現レベル又は量は、治療又は治療剤に対する反応又は予測される反応を決定するために使用され得る。
【０１２１】
「発現のレベル」又は「発現レベル」なる用語は、通常互換的に使用され、一般に、生体試料中のポリヌクレオチド又はアミノ酸産物又はタンパク質の量を指す。「発現」は、一般に、遺伝子コード情報が、細胞中に存在し作動する構造に変換されるプロセスを指す。したがって、本明細書で使用される場合、遺伝子の「発現」は、ポリヌクレオチドへの転写、タンパク質への翻訳、又はタンパク質の翻訳後修飾を意味し得る。転写されたポリヌクレオチド、翻訳されたタンパク質、又は翻訳後修飾されたタンパク質の断片もまた、選択的スプライシングにより生成された転写物、又は分解された転写物に由来するか、又は例えばタンパク質分解によるタンパク質の翻訳後プロセシングに由来しようが、発現したとみなされる。「発現した遺伝子」は、ｍＲＮＡとしてポリヌクレオチドに転写され、ついでタンパク質に翻訳されたもの、及びＲＮＡに転写はされたが、タンパク質には翻訳されていないもの（例えば、転移ＲＮＡ及びリボソームＲＮＡ）を含む。
【０１２２】
「抗ＩＬ−１β抗体及び／又は抗ＩＬ−１８抗体（単数又は複数）」なる句は、文脈により、（１）抗ＩＬ−１β抗体、又は（２）抗ＩＬ−１８抗体、又は（３）抗ＩＬ−１β抗体と抗ＩＬ−１８抗体の組み合わせ（すなわち、二つの抗体）、又は（４）ＩＬ−１βとＩＬ−１８の両方に結合する抗体を指す。
【０１２３】
用語「抗ＩＬ−１β抗体」及び「ＩＬ−１βに結合する抗体」は、抗体が、ＩＬ−１βを標的とする際に診断薬及び／又は治療剤として有用であるように、十分な親和性でＩＬ−１βを結合可能な抗体を指す。一実施態様において、抗ＩＬ−１β抗体の、無関係な非ＩＬ−１βタンパク質への結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で測定される場合、該抗体のＩＬ−１βへの結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗ＩＬ−１β抗体は、異なる種由来のＩＬ−１β間で保存されているＩＬ−１βのエピトープに結合する。
【０１２４】
用語「抗ＩＬ−１８抗体」及び「ＩＬ−１８に結合する抗体」は、抗体が、ＩＬ−１８を標的とする際に診断薬及び／又は治療剤として有用であるように、十分な親和性でＩＬ−１８を結合可能な抗体を指す。一実施態様において、抗ＩＬ−１８抗体の、無関係な非ＩＬ−１８タンパク質への結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で測定される場合、該抗体のＩＬ−１８への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗ＩＬ−１８抗体は、異なる種由来のＩＬ−１８間で保存されているＩＬ−１８のエピトープに結合する。
【０１２５】
「インフラマソーム媒介性疾患」とは、正常な非炎症組織と比べてＩＬ−１β及び／又はＩＬ−１８が上昇している任意の疾患を指す。一般的に、インフラマソーム媒介性疾患においては、非誘導コントロール細胞と比較してカスパーゼ１のプロセシング及び／又は活性化が関与／上昇している。カスパーゼ１活性は、市販のアッセイキット、例えば、カスパーゼ１蛍光定量アッセイキット((カタログ番号ａｂ３９４１２０；ＡｂＣａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ)、カスパーゼ１比色定量アッセイ（カタログ番号ＢＦ１４１００；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）等を使用して測定され得る。
【０１２６】
一般的に、疾患又は症状が体液又は組織中でのＩＬ−１βのレベルの上昇に関連し、或いは、身体から採取された細胞又は組織が培養液中に上昇したレベルのＩＬ−１βを産生するならば、疾患又は症状はＩＬ−１β関連疾患と考えられる。同様に、疾患又は症状が体液又は組織中でのＩＬ−１８のレベルの上昇に関連し、或いは、身体から採取された細胞又は組織が培養液中に上昇したレベルのＩＬ−１８を産生するならば、疾患又は症状はＩＬ−１８関連疾患と考えられる。よって、或いは身体から採取された細胞又は組織が培養液中で上昇したレベルの両サイトカインを産生するならば、ＩＬ−１β／ＩＬ−１８関連疾患又は症状は、体液又は組織中でのＩＬ−１β及びＩＬ−１８のレベルの上昇に関連する。
【０１２７】
ＩＬ−１β関連疾患の例は、急性膵炎；ＡＬＳ；ＡＩＤＳ誘導性悪液質を含む、悪液質／食欲不振；喘息及び他の肺疾患；自己免疫性脈管炎；ＣＩＡＳ１関連周期性症候群（ＣＡＰＳ）；新生児期発症多臓器性炎症性疾患（ＮＯＭＩＤ／ＣＩＮＣＡ）、全身型若年性特発性関節炎、スティルス病、マックル・ウェルズ症候群、慢性疲労症候群、クロストリジウム関連の下痢を含むクロストリジウム関連疾患；うっ血性心不全、冠状動脈再狭窄、心筋梗塞、心筋機能不全（例えば、敗血症に関連する）及び冠状動脈バイパス移植を含む冠状動脈症状及び徴候；がん、例えば、多発性骨髄腫及び骨髄性（例：ＡＭＬ及びＣＭＬ）及び他の白血病、並びに腫瘍転移；糖尿病（例：インスリン性糖尿病）；子宮内膜症；家族性感冒自己炎症性症候群（ＦＣＡＳ）；家族性地中海熱（ＦＭＦ）；発熱；線維筋痛症；糸球体腎炎；移植片対宿主病／移植片拒絶反応；出血性ショック；痛覚過敏；炎症性腸疾患；乾癬性関節炎（並びに骨関節症及び関節リウマチ）を含む関節の炎症性症状；例えば、角膜移植と関連し得る炎症性眼病；脳虚血（例えば、各々が神経変性に至り得る外傷、てんかん、出血又は脳卒中の結果としての脳損傷）を含む虚血；川崎病；学習障害；肺疾患（例：ＡＲＤＳ）；筋疾患（例：筋タンパク質代謝、特に敗血症における）；神経毒性（例えば、ＨＩＶによって誘導される）；骨粗鬆症；がん関連痛を含む疼痛；パーキンソン病；歯周病；早期分娩；乾癬；再灌流傷害；放射線療法の副作用；睡眠障害；顎関節症（ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  ｊｏｉｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）；腫瘍壊死因子受容体関連周期性発熱症候群（ＴＲＡＰＳ）；ブドウ膜炎；又は緊張、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形外科手術、感染若しくは他の疾患プロセスから生じている炎症性症状を含む。
【０１２８】
インターロイキン１８は、免疫及び炎症性の要素を伴う種々の疾患に関連する病理に重要な役割を果たしている。これらの疾患は、限定されないが、関節リウマチ、骨関節症、若年性慢性関節炎、ライム関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、狼瘡（例えば、全身性紅斑性狼瘡及びループス腎炎）、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、インシュリン依存性糖尿病、甲状腺炎、喘息、アレルギー疾患、乾癬、１型乾癬、２型乾癬、強皮症皮膚炎（ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、移植片対宿主病、臓器移植拒絶反応、臓器移植に関連する急性又は慢性免疫疾患、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、播種性血管内血液凝固、川崎病、グレーヴス病、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、ヴェゲナー肉芽腫症、ヘノッホ‐シェーンライン紫斑病、腎臓の微視的脈管炎、慢性活動性肝炎、ブドウ膜炎、敗血症性ショック、毒物ショック症候群、敗血症症候群、悪液質、感染症、寄生虫病、急性横断性脊髄炎、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、原発性胆汁性肝硬変、溶血性貧血、悪性腫瘍、心不全、心筋梗塞、アディソン病、散発性多腺性欠乏症Ｉ型及び多腺性欠乏症ＩＩ型、シュミット症候群、成人性呼吸促迫症候群、脱毛症、円形脱毛症、血清反応陰性関節症、関節症、ライター病、乾癬性関節症、潰瘍性大腸炎性関節症（ｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｃ  ａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ）、腸炎性滑膜炎、クラミジア、エルシニア及びサルモネラ菌関連関節症、脊椎関節症、アテローム性疾患１型動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｍａｔｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ１  ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、アトピー性アレルギー、自己免疫性水疱症、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、類天疱瘡、線状ＩｇＡ病、自己免疫性溶血性貧血、クームス陽性溶血性貧血（Ｃｏｏｍｂｓ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃ  ａｎｅｍｉａ）、後天性悪性貧血、若年性悪性貧血、筋痛性脳炎／ロイヤル・フリー病（ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ／Ｒｏｙａｌ  Ｆｒｅｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ）、慢性皮膚粘膜カンジダ症、巨細胞動脈炎、原発性硬化性肝炎、特発性自己免疫性肝炎、後天性免疫不全症候群、後天性免疫不全関連疾患、Ｃ型肝炎、一般の様々な免疫不全、一般の不定低ガンマグロブリン血症、拡張型心筋症、女性の不妊症、卵巣機能不全、早発卵巣不全、線維症化肺疾患、特発性線維化性肺胞炎、炎症後間質性肺疾患、間質性肺炎、結合組織病関連間質性肺疾患、混合性結合組織病関連肺疾患、全身性硬化症関連間質性肺疾患、関節リウマチ関連間質性肺疾患、全身性紅斑性狼瘡関連肺疾患、皮膚筋炎／多発性筋炎関連肺疾患、シェーグレン病関連肺疾患、強直性脊椎炎関連肺疾患、脈管性びまん性肺疾患、ヘモジデリン沈着症関連肺疾患、薬物誘発性間質性肺疾患、放射線線維症、閉塞性細気管支炎、慢性好酸球性肺炎、リンパ球浸潤性肺疾患、感染後間質性肺疾患、痛風性関節炎、自己免疫性肝炎、１型自己免疫性肝炎、古典的な自己免疫性又はルポイド肝炎、２型自己免疫性肝炎、抗ＬＫＭ抗体肝炎、自己免疫媒介低血糖症、黒色表皮腫を有するＢ型インスリン抵抗症、副甲状腺機能低下症、臓器移植関連急性免疫疾患、臓器移植関連慢性免疫疾患、骨関節���、原発性硬化性胆管炎、特発性白血球減少症、自己免疫性好中球減少症、腎疾患ＮＯＳ、糸球体腎炎、腎臓の微視的脈管炎、ライム病、円板状紅斑性狼瘡、男性の不妊症の特発性又はＮＯＳ、精子自己免疫（ｍａｌｅ  ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｏｒ  ＮＯＳ，ｓｐｅｒｍ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ）、多発性硬化症の全ての亜類型、交感性眼炎、結合組織疾患に続発する肺高血圧、グッドパスチャー症候群、結節性多発動脈炎の肺症状、急性リウマチ熱、リウマチ性脊椎炎、スティル病、全身性硬化症、シェーグレン症候群、高安病／動脈炎、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少症、自己免疫甲状腺疾患、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫性自己免疫性甲状腺機能低下症又は橋本病、萎縮性自己免疫性甲状腺機能低下症、原発性粘液水腫、水晶体原性ブドウ膜炎（ｐｈａｃｏｇｅｎｉｃ  ｕｖｅｉｔｉｓ）、原発性脈管炎、白斑、急性肝疾患、慢性肝疾患、アレルギー及び喘息、精神障害、うつ、統合失調症、Ｔｈ２型及びＴｈ１型媒介性疾患（Ｔｈ２  Ｔｙｐｅ  ａｎｄ  Ｔｈｌ  Ｔｙｐｃｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、炎症性自己免疫性骨疾患を含む。
【０１２９】
「単離された」核酸分子は、抗体核酸の天然供給源に通常付随している少なくとも一の夾雑核酸分子から同定及び分離されている核酸分子である。単離された核酸分子は、それが天然で見出される形態又は状態以外のものである。したがって、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する場合の核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子は、通常抗体を発現する細胞中に含まれる核酸分子を含み、ここで、例えば、核酸分子は天然の細胞のものとは異なる染色体の位置にある。
【０１３０】
本明細書において言及される「ノブ・イントゥー・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」又は「ＫｎＨ」という用語は、インビトロ又はインビボで二つのポリペプチドの対合を選択的に導く技術であって、それらが相互作用する界面において一方のポリペプチドに突起（ノブ）を、また他方のポリペプチドにキャビティ（ホール）を導入することによる技術を指す。例えば、ＫｎＨは、抗体のＦｃ：Ｆｃ結合界面、ＣＬ：ＣＨ１界面又はＶＨ／ＶＬ界面において導入される（例えば、米国特許出願公開第２０００７／０１７８５５２号、国際公開第９６／０２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号及びZhu et al.(1997)Protein Science 6:781-788)。これは、多重特異性抗体の製造中に二つの異なる重鎖を対合させるのに特に有用である。例えば、Ｆｃ領域にＫｎＨを有する多重特異性抗体は、各Ｆｃ領域に連結された単一可変ドメインを更に含み得、又は類似の若しくは異なる軽鎖可変ドメインと対合する異なる重鎖可変ドメインを更に含み得る。実際、ＫｎＨ技術を用いて、二つの異なる受容体細胞外ドメインを対合させること、又は異なる標的認識配列を含む任意の他のポリペプチド配列（例えばアフィボディ、ペプチボディ及び他のＦｃ融合体等）を対合させることもできる。
【０１３１】
用語「多特異性抗体」は最も広い意味で使用され、ポリエピトープ特異性を有する抗体を指す。このような多重特異性抗体は、限定されないが、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体（この場合、ＶＨＶＬユニットはポリエピトープ特異性を有する）、二以上のＶＬドメイン及びＶＨドメインを有し、各ＶＨＶＬユニットが異なるエピトープに結合する抗体、二以上の単一可変ドメインを有し、少なくとも二の単一可変ドメインが異なるエピトープに結合する抗体、完全長抗体、例えばＦａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、タンデム抗体、直鎖状抗体及びトリアボディ等の抗体断片、共有結合的に連結しているか又は非共有結合的相互作用を介して互いに結合している抗体断片を含む。多重特異性抗体を作成するために使用されている又は使用され得る抗体フォーマットの他の例は、ダイボディのＦｃ融合体、タンデム抗体、及び単鎖抗体（例えば、Ｄｂ−Ｆｃ、ｔａＤｂ−Ｆｃ、ｔａＤｂ−ＣＨ３及び（ｓｃＦＶ）４−Ｆｃ）、ノブ−Ｎ−ホール（ＫｎＨ）抗体、オクトパス抗体及びＤＡＦ抗体を含むが、これらに限定されない。
【０１３２】
本明細書で使用される「多重特異性分子」は、ポリエピトープ特異性を有する分子を指す。「ポリエピトープ特異性」とは、一つの標的分子上又は異なる標的分子上の少なくとも二つの異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す（例えば、抗ＩＬ−１β／ＩＬ−１８多重特異性抗体）。「単一特異性」は唯一つのエピトープに結合する能力を指す。一実施態様によると、多重特異性分子は、５μＭから０．００１ｐＭ、３μＭから０．００１ｐＭ、１μＭから０．００１ｐＭ、０．５μＭから０．００１ｐＭ、又は０．１μＭから０．００１ｐＭの親和性で各エピトープに結合する。本明細書で使用される「二重特異性」なる用語は、二つのエピトープに結合する能力を指す。例えば、ポリエピトープ特異性を保持する、又は保持するように操作され得る分子の例は、限定されないが、抗体、アフィボディ、イムノアドヘシン、ペプチボディ及び他のＦｃ融合体を含む。
【０１３３】
本明細書で使用される用語「オクトパス」抗体は、Ｆｃ領域とＦｃ領域のアミノ末端に二以上の抗原結合部位とを含む多価抗体を指す。（例えば、国際公開第０１／７７３４２号、Wu et al. (2007) Nature Biotechnology, 及び国際公開第2007/024715号）。一実施態様において、該抗体のポリペプチドの立体配置はＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃであり、ここで、ＶＤ１は第一の可変ドメインであり、ＶＤ２は第二の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域の一つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１とＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。一実施態様において、Ｘ１又はＸ２はＣＨ１ドメイン、ＣＨ１ドメインの一部分、ＧＳリンカー等の何らかの他のリンカー配列又はその何らかの組み合わせである（例えば、国際公開第２００７／０２４７１５号の５頁を参照）。
【０１３４】
本明細書で使用されるように、核酸が他の核酸配列と機能的な関係に配置されている場合、「作動可能に結合」されている。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、それが抗体の分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば、その抗体のＤＮＡに作動可能に結合されており；プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作動可能に結合されており；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするような位置にあるならば、コード配列と作動可能に結合されている。通常、「作動可能に結合」とは、結合するＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には、近接しており且つ読み取り相（ｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）にあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、慣行に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。
【０１３５】
「ペプチボディ」（単数及び複数）は、Ｆｃドメインを有するペプチド配列の融合体を指す。２００３年１２月９日にＦｅｉｇｅらに発行された米国特許第６６６０８４３号を参照のこと（その全文は参照により援用される）。ペプチボディは、Ｎ末端、Ｃ末端、アミノ酸側鎖、又はこれらの部位の二つ以上に結合されている一又は複数のペプチドを含む。ペプチボディ技術は、一又は複数のリガンド又は受容体を標的にするペプチド、腫瘍ホーミングペプチド、膜輸送ペプチド等を組み込む治療剤の設計を可能にする。ペプチボディ技術は、ジスルフィドによって拘束された直鎖状ペプチドである「タンデムペプチド多量体」（すなわち、Ｆｃドメインの単鎖上の二つ以上のペプチド）等、多数のこのような分子の設計において有用であることが判明している。例えば、米国特許第６６６０８４３号；２００３年１０月１６日に公開された米国特許出願公開第２００３／０１９５１５６号（２００２年１１月２１日に公開された国際公開第０２／０９２６２０号に対応する）；２００３年９月１８日に公開された米国特許出願公開第２００３／０１７６３５２号（２００３年４月１７日に公開された国際公開第０３／０３１５８９号に対応する）；１９９９年１０月２２日に出願された米国特許出願第０９／４２２８３８号（２０００年５月４日に公開された国際公開第００／２４７７０号に対応する）；２００３年１２月１１日に公開された米国特許出願公開第２００３／０２２９０２３号；２００３年７月１７日に公開された国際公開第０３／０５７１３４号；２００３年１２月２５日に公開された米国特許出願公開第２００３／０２３６１９３号（２００４年４月８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０４／０１０９８９号に対応する）；２００３年９月１８日に出願された米国特許出願第１０／６６６４８０号（２００４年４月１日に公開された国際公開第０４／０２６３２９号に対応する）を参照のこと。これらの各々は参照によりその全内容が本明細書に援用される。
【０１３６】
本明細書の目的のために、「医薬組成物」は、哺乳動物、特にヒトへの投与に適合し且つ適切なものである。したがって、該組成物は、哺乳動物において疾患又は障害を治療するために使用され得る。更に、組成物中のタンパク質は、組成物の治療的使用に支障を来たし得る夾雑物（単数又は複数）がタンパク質から分離されているように、一又は複数の精製又は単離工程に供されている。通常、医薬組成物は治療用タンパク質及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む。該組成物は通常滅菌であり、凍結乾燥されてもよい。医薬製剤の更なる詳細を以下に記載する。
【０１３７】
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体、或いはＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼにより、又は合成反応によりポリマー中に取り込み可能な任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前又は後になされ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは合成後に標識とのコンジュゲーションによるなどして更に修飾されてもよい。この他の修飾の種類は、例えば「キャップ（ｃａｐ）」、天然の一又は複数のヌクレオチドの類似体での置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電結合（例：メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等）を有するもの及び荷電結合（例：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質（例：クレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リジン等）を含有するもの、インターカレーター（例：アクリジン、プソラレン等）を有するもの、キレート剤（例：金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合（例：アルファアノマー核酸等）を有するもの、並びにポリヌクレオチド（類）の未修飾形態を含む。更に、糖類中に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えば、ホスホン酸基、リン酸基で置き換えられてもよく、標準的な保護基により保護されてもよく、又は更なるヌクレオチドへの更なる結合を作るように活性化されてもよく、又は固体若しくは半固体支持体にコンジュゲートされていてもよい。５’及び３’末端のＯＨはリン酸化され得、又はアミン若しくは１から２０の炭素原子の有機キャッピング基部分で置換され得る。また他のヒドロキシル類は標準的な保護基に誘導体化されてもよい。またポリヌクレオチドは当該分野で一般的に知られているリボース又はデオキシリボース糖類の類似形態のもの、例えば２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−又は２’−アジド−リボース、炭素環式糖の類似体、ａ−アノマー糖類、エピマー糖類（例えばアラビノース）、キシロース類又はリキソース類、ピラノース糖類、フラノース糖類、セドヘプツロース類、非環式類似体、及び脱塩基性ヌクレオシド類似体（例えばメチルリボシド）も含有し得る。一又は複数のホスホジエステル結合は代替の結合基で置換され得る。こうした代替の結合基は、限定されはないが、ホスファートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、「（Ｏ）ＮＲ２（「アミダート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ２（「ホルムアセタール」）で置換される実施態様のものを含み、ここで各Ｒ又はＲ’は独立にＨであるか、又は、場合によってエーテル（−Ｏ−）結合を含んでいてもよい置換若しくは非置換のアルキル（１−２０Ｃ）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はアラルジル（ａｒａｌｄｙｌ）である。ポリヌクレオチド中のすべての結合が同一である必要はない。先の記述は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含めた、本明細書で言及されるすべてのポリヌクレオチドに適用される。
【０１３８】
「受容体結合ドメイン」なる用語は、細胞接着分子を含む受容体に対する任意の天然リガンド、或いは対応する天然リガンドの定性的受容体結合能力を少なくとも保持している該天然リガンドの任意の領域又は誘導体を指すために使用される。本定義は、中でも、上述の受容体に対するリガンドからの結合配列を特に含む。
【０１３９】
「分泌シグナル配列」又は「シグナル配列」とは、対象となる新しく合成されたタンパク質を細胞膜、通常は原核生物の内膜又は内膜と外膜の両方を通過するように方向付けるために使用され得る、短いシグナルペプチドをコードする核酸配列を指す。このようにして、対象となっているタンパク質、例えば免疫グロブリン軽鎖又は重鎖ポリペプチドは、原核宿主細胞の周辺質に、又は培地中に分泌される。分泌シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドは、宿主細胞に対して内因性であっても又は外因性であってもよく、発現されるポリペプチドに本来あるシグナルペプチドを含む。分泌シグナル配列は、典型的には発現されるポリペプチドのアミノ末端に存在し、典型的にはポリペプチドの生合成から分泌までの間に細胞質から酵素的に取り除かれる。したがって、シグナルペプチドは、通常、成熟タンパク質産物には存在しない。
【０１４０】
「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）又は「単一可変ドメイン（ＳＶＤ）抗体」なる表現は、単一可変ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）が抗原結合を付与することができる抗体を一般に指す。言い換えると、単一可変ドメインは、標的抗原に結合するために別の可変ドメインと相互作用する必要がない。単一ドメイン抗体の例は、限定されないが、ラクダ科（ラマ及びラクダ）及び軟骨魚類（例えばコモリザメ）に由来するもの、並びにヒト及びマウス抗体に由来し、組換え法から得られるものを含む(Nature(1989)341:544-546;Dev Comp Immunol(2006)30:43-56;Trend Biochem Sci(2001)26:230-235;Trends Biotechnol(2003):21:484-490;国際公開第2005/035572号;国際公開第03/035694号;Febs Lett(1994)339:285-290;国際公開第00/29004号;国際公開第02/051870号)。
【０１４１】
本明細書で使用される「治療抗体」は、疾患若しくは障害を有する哺乳動物又は疾患若しくは障害にかかりやすい哺乳動物の疾患又は障害を治療する際に有効な抗体である。
【０１４２】
「標的分子」は、標的認識部位に結合することができる分子を指す。標的分子：標的認識部位の相互作用の例は、抗原：抗体可変ドメイン相互作用、受容体：リガンド相互作用、リガンド：受容体相互作用、アドヘシン：アドヘシン相互作用、ビオチン：ストレプトアビジン相互作用等を含む。一実施態様において、標的分子は、生体分子である。
【０１４３】
本明細書で使用される用語「ベクター」は、それに結合されている別の核酸を運搬することができる核酸分子を指すことが意図される。ベクターの一つのタイプは「プラスミド」であり、これは付加的なＤＮＡセグメントが結合され得る円形の二本鎖ＤＮＡループである。別のタイプのベクターはファージベクターである。また別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムへ結合させうる。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自律複製することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターとエピソームの哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得、それにより宿主ゲノムと共に複製される。更に、特定のベクターは、それらが作動可能に結合されている遺伝子の発現を指令することができる。このようなベクターは本明細書では「組換え発現ベクター」（又は単に「組み換えベクター」）と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形態である。プラスミドが最も一般的に使用されているベクターの形態であるので、本明細書では「プラスミド」と「ベクター」は互換的に使用され得る。
【０１４４】
標的分子でない他の分子に結合するよりも有意に優れた親和性で標的分子に「選択的に結合する」抗体。相対的結合及び／又は結合親和性は、限定されないが、酵酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）及び蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を含む当該分野で受け入れられている様々な方法で実証され得る。幾つかの実施態様において、抗体は、ＥＬＩＳＡで決定される場合、非標的分子に結合するよりも少なくともおよそ１対数高い濃度反応性で標的分子に結合する。
【０１４５】
本明細書において、更なる種々の用語が定義されており、又、そうでない場合には特性が明らかにされている。
【０１４６】
例示的な抗体
他の分子と場合によってはコンジュゲートしている可溶型ヒトＩＬ−１β又はヒトＩＬ−１８若しくはその断片は、抗体を産生するために免疫原として使用され得る。代替的にまたは追加的に、ヒトＩＬ−１β又はヒトＩＬ−１８を発現する細胞を免疫原として使用することができる。そのような細胞は天然源に由来し得、或いはヒトＩＬ−１β又はヒトＩＬ−１８を発現するように組換え技術によって形質転換された細胞であってもよい。抗体を調製するために有用なヒトＩＬ−１β又はヒトＩＬ−１８の他の形態は、当業者には明らかであろう。
【０１４７】
ａ．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、通常、関連する抗原及びアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射により動物において産生される。関連抗原を、免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又はダイズトリプシン阻害因子に、二官能性剤又は誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介したコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介した）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲとＲ１は異なるアルキル基である）を用いてコンジュゲートさせることが有益である。
【０１４８】
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ（それぞれウサギ又はマウスについて）を３容量の完全フロイントアジュバントと併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫する。およそ１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバント中の初回量の１／５から１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７から１４日後に該動物を出血させ、抗体価について血清をアッセイする。動物を、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。通常、動物は、同じ抗原のコンジュゲートで追加免疫するが、異なるタンパク質に、及び／又は異なる架橋試薬を介してコンジュゲートされる。また、コンジュゲートは、タンパク質融合体として組換え細胞培養物中で作製され得る。また、ミョウバンのような凝集剤が、免疫応答を亢進するために適切に使用される。
【０１４９】
ｂ．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohlerら, 1975, Nature, 256:495により最初に記載されたハイブリドーマ法、又は組換えＤＮＡ法（例として米国特許第４８１６５６７号を参照）によって作製され得る。
【０１５０】
ハイブリドーマ法では、マウス又は他の適切な宿主動物、例えばハムスター又はマカクザルを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生するか又は産生可能なリンパ球を誘発する。或いは、リンパ球はインビトロで免疫化されてもよい。次いで、リンパ球をポリエチレングリコールのような適切な融剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, 1986, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press))。
【０１５１】
このように調製されたハイブリドーマ細胞を、非融合の親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を通常含有する培地中に播種し、増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠くならば、ハイブリドーマの培養培地は、通常、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含むことになり、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる。
【０１５２】
特定の実施態様では、骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベルの産生を助け、ＨＡＴ培地等の培地に対して感受性な細胞である。これらの中でも、例示的な骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫細胞株、例えば、米国カリフォルニア州サンディエゴのＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒから入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍並びに米国メリーランド州ロックビルにあるＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能なＳＰ−２又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞から誘導されるものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている(Kozbor, 1984, J. Immunol., 133:3001; Brodeur et al., 1987, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York))。
【０１５３】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。特定の実施態様では、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法又はインビトロ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって決定される。
【０１５４】
ハイブリドーマ細胞が所望の特異性、親和性及び／又は活性の抗体を産生するとして同定された後、該クローンは、限定希釈手順によりサブクローニングされ得、標準的な方法により培養されてもよい（上掲のGoding）。この目的のための好適な培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖させてもよい。
【０１５５】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティクロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製手順によって、培地、腹水又は血清から適切に分離される。
【０１５６】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは容易に分離され、従来手順を用いて（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの典型的な供給源として役立つ。単離したら、ＤＮＡを発現ベクター中に配置し、次いで、そうしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞中、例えば、大腸菌細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は骨髄腫細胞にトランスフェクトし、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体の組換え産生を以下により詳細に記載する。
【０１５７】
更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCaffertyら, 1990, Nature, 348:552-554に記載の技術を使用して産生される抗体ファージライブラリーから分離され得る。Clacksonら, 1991, Nature, 352:624-628及びMarksら, J.Mol.Biol., 222:581-597は、ファージライブラリーを使用した、それぞれ、マウス抗体及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は、鎖シャッフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の生成（Marksら,1992, Bio/Technology, 10:779-783）、並びに非常に大きなファージライブラリーを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換えを記述している(Waterhouseら, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266(1993))。したがって、これらの技術はモノクローナル抗体の単離に関する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法の実行可能な別法である。
【０１５８】
また、ＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を、相同マウス配列に代えて置換することによって（米国特許第４８１６５６７号；Morrison, et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851）、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリン材料（例えばタンパク質ドメイン）のコード配列の全部又は一部を共有結合させることによって修飾され得る。
【０１５９】
典型的には、このような非免疫グロブリン材料は、抗体の定常ドメインに置換されるか、又は抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに置換され、抗原に対する特異性を有する一つの抗原結合部位と、異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【０１６０】
ｃ．ヒト化及びヒト抗体
ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からの一又は複数のアミノ酸残基を有する。非ヒトアミノ酸残基は、通常、「移入」残基と呼ばれ、典型的には「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は一般的にＷｉｎｔｅｒと共同研究者の方法（Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536）に従って、げっ歯類のＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施され得る。よって、このような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されているキメラ抗体（米国特許第４８１６５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には幾つかのＣＤＲ残基、及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が、非ヒト、例えばげっ歯類の抗体の類似部位からの残基で置換されたヒト抗体である。
【０１６１】
抗原性を低下させるには、ヒト化抗体を作製する際に使用する軽重両方のヒト可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法によれば、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次いで、げっ歯類のものと最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れる(Sims et al., 1987, J. Immunol., 151:2296; Chothia et al., 1987, J. Mol. Biol., 196:901)。別の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用してもよい(Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623）。
【０１６２】
抗体が、抗原に対する高親和性及び他の望ましい生物学的特性を保持した状態でヒト化されることが更に重要である。この目標を達成するべく、一つの方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析のプロセスによってヒト化抗体が調製される。三次元免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体配座構造を図解及び表示するコンピュータープログラムが、入手可能である。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンのその抗原へ結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、ＦＲ残基がレシピエント配列及び移入配列から選択され、組み合わされ得ることで、所望の抗体特性（例えば、標的抗原に対する親和性の向上が達成される。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接且つ最も実質的に抗原結合性に関与している。
【０１６３】
或いは、現在では、免疫化によって、内因性免疫グロブリンの産生なしに、ヒト抗体の完全なレパートリーを生成する能力があるトランスジェニック動物（例えばマウス）を作製することが可能である。例えば、キメラマウス及び生殖細胞系変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。こうした生殖細胞系変異体マウスにおけるヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの導入は、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生をもたらす。例えば、Jakobovitsら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551; Jakobovitsら, 1993, Nature, 362:255-258; Bruggermannら, 1993, Year in Immuno., 7:33; 及びDuchosalら, 1992, Nature 355:258を参照のこと。また、ヒト抗体はファージディスプレイライブラリーからも得られる（Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., J. Mol. Biol., 1991, 222:581-597; Vaughan et al., 1996, Nature Biotech 14:309）。
【０１６４】
ｉ．キメラ及びヒト化抗体
特定の実施態様では、本明細書において提供される抗体はキメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号、及びMorrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）とヒト定常領域とを含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更されている「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【０１６５】
特定の実施態様において、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したままヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）（又はその一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する、一又は複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、場合によってヒト定常領域の少なくとも一部を含む。幾つかの実施態様において、ヒト化抗体の幾つかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
【０１６６】
ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に概説されており、更に、例えば、Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号及び同第７０８７４０９号；Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) （ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記述）；Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) （「リサーフェイシング」を記述）；Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)（「ＦＲシャッフリング」を記述）；並びにOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005)及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)（ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。
【０１６７】
ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)を参照；軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；及びPresta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒトの生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照）；及びＦＲライブラリースクリーニング由来のフレームワーク領域（例えば、Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及び Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照）を含む。
【０１６８】
ヒト抗体
特定の実施態様では、本明細書において提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で既知の様々な技術を用いて生産され得る。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。
【０１６９】
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより作製され得る。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するか若しくは動物の染色体にランダムに組み込まれた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべて又は一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、通常、不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照のこと。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載している、米国特許第６０７５１８１号及び同第６１５０５８４号；ＨｕＭＡＢ（登録商標）技術を記載している米国特許第５７７０４２９号；Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７０４１８７０号、及びＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたし。このような動物により生成されるインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、更に改変され得る。
【０１７０】
ヒト抗体は、ハイブリドーマベースの方法によっても作製され得る。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が記述されている。（例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 及び Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されるヒト抗体もLi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)に記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載し）及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載）に記載のものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）もまた、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及びVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載されている。
【０１７１】
ヒト抗体は、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても生成され得る。このような可変ドメイン配列は、次いで、所望のヒト定常ドメインと組み合わされてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術は、下記に記載する。
【０１７２】
ｄ．多重特異性抗体
多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗体に対して結合特異性を有する。このような分子は二つの抗原のみに結合し得るが（例えば、二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）、本明細書で使用される場合、更なる特異性を有する抗体、例えば三重特異性抗体もこの表現に包含される。ＢｓＡｂの例は、一つの抗原結合部位がＩＬ−１βに対して方向づけられ、もう一つの抗原結合部位がＩＬ−１８に対して方向づけられるものを含む。幾つかの実施態様において、ＢｓＡｂは、ＩＬ−１β又はＩＬ−１８に対する第一の結合特異性及び細胞質ＩＴＡＭモチーフを有する活性化受容体に対する第二の結合特異性を含む。ＩＴＡＭモチーフ構造は、９−１１のアミノ酸スペーサーによって分離された二のチロシンを有する。一般的コンセンサス配列は、ＹｘｘＬ／Ｉ（ｘ）６−８ＹｘｘＬ(Isakov, N., 1997, J. Leukoc. Biol., 61:6-16)である。例示的な活性化受容体は、ＦｃεＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＣを含む。他の活性化受容体は、例えば、ＣＤ３、ＣＤ２、ＣＤ１０、ＣＤ１６１、ＤＡＰ−１２、ＫＡＲ、ＫＡＲＡＰ、ＦｃεＲＩＩ、Ｔｒｅｍ−１、Ｔｒｅｍ−２、ＣＤ２８、ｐ４４、ｐ４６、Ｂ細胞受容体、ＬＭＰ２Ａ、ＳＴＡＭ、ＳＴＡＭ−２、ＧＰＶＩ及びＣＤ４０（例えば、Azzoni, et al., 1998, J. Immunol. 161:3493; Kita, et al., 1999, J. Immunol. 162:6901; Merchant, et al., 2000, J. Biol. Chem. 74:9115; Pandey, et al., 2000, J. Biol. Chem. 275:38633; Zheng, et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:12999; Propst, et al., 2000, J. Immunol. 165:2214を参照）を含む。
【０１７３】
一実施態様において、多重特異性は、ＩＬ−１βに対する第一の結合特異性及びＩＬ−１８に対する第二の結合特異性を含む。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として作製され得る。更に、二重特異性抗体はノブ・イン・ホール又はヒンジレス抗体として作製され得る。二重特異性抗体は、Segalら, 2001, J. Immunol. Methods 248:1-6に概説されている。
【０１７４】
二重特異性抗体を作製するための方法は、当該技術分野で知られている。完全長二重特異性抗体の伝統的な製造は、二本の鎖が異なる特異性を有する、二つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づいている(Millstein et al., 1983, Nature, 305:537-539)。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖がランダムな取り合わせゆえに、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種類の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、そのうちの一つのみが正しい二重特異性構造を持つ。正しい分子の精製は通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われるが、かなり面倒であり、生成物収率は低い。類似の手順が、国際公開第９３／０８８２９号、及びTrauneckerら, EMBO J., 10:3655-3659に開示されている。
【０１７５】
異なるアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）が免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。融合は、少なくともヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合であり得る。特定の実施態様において、軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、融合体のうち少なくとも一つに存在する。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡ、及び、必要に応じて免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを、それぞれ別々の発現ベクターに挿入し、好適な宿主生物に同時形質移入する。これにより、組立に使用される三つの抗体鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす実施態様において、三つの抗体断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つの抗体鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、二つ又は三つすべての抗体鎖のコード配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０１７６】
このアプローチ法の別の実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を一方のアームに、ハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性を提供する）を他方のアームに有する、ハイブリッド免疫グロブリン重鎖から構成される。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせからの所望の二重特異性化合物の分離を容易にすることが見出された。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を生成するための方法の更なる詳細については、例えば、Sureshら, 1986, Methods in Enzymology, 121:210を参照のこと。
【０１７７】
国際公開第９６／２７０１１号に記載の別のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大にすることが可能である。一実施態様では、界面は抗体定常ドメインのうちＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第一の抗体分子の界面由来の一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置き換えられる。大きい側鎖（単数又は複数）と同じか又は類似の大きさの代償的な「キャビティー」が、大きいアミノ酸側鎖を小さいアミノ酸側鎖（例えばアラニン又はスレオニン）と置き換えることにより、第二の抗体分子の界面上に形成される。これは、ヘテロ二量体の収率をホモ二量体等の他の所望しない最終生成物を超えて高める機構を提供する。
【０１７８】
二重特異性抗体は、架橋抗体又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体のうち一方はアビジンと、他方はビオチンと、カップリングされ得る。そのような抗体は、例えば、不要な細胞に対して免疫系細胞を標的化するため（米国特許第４６７６９８０号）、及びＨＩＶ感染症の治療のために（国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／２００３７３号及びＥＰ０３０８９）提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋法を使用して作製され得る。好適な架橋剤は当該技術分野では周知であり、例えば、米国特許第４６７６９８０号において、多数の架橋法と共に開示されている。
【０１７９】
二価より多い抗体も企図されている。例えば、三重特異性抗体はTuttら, 1991, J. Immunol. 147: 60に従って調製され得る。
【０１８０】
「オクトパス抗体（Ｏｃｔｏｐｕｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」を含む三又はそれ以上の機能的抗原結合部位を有する操作抗体も本明細書に含まれる（例えば、米国特許第２００６／００２５５７６号を参照）。
【０１８１】
本明細書中の抗体又は断片は、二つの標的、例えばＩＬ−１β及びＩＬ−１８に結合する抗原結合部位を含む「二重作用性ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」も含む（例えば、米国特許第２００８／００６９８２０号参照）。
【０１８２】
ｅ．変異体ヒンジ領域を有する抗体
また、本明細書に記載の抗体は、２００３年１０月３０日出願の米国特許出願第１０／６９７９９５号に記載されているような変異体重鎖も含み得る。変異体重鎖を含む抗体は、システイン残基がジスルフィド結合を形成できないような、少なくとも一のジスルフィド形成システイン残基の改変を含む。一態様では、前記システイン（単数及び複数）は重鎖のヒンジ領域のものである（それゆえ、このようなヒンジ領域は、本明細書では「変異体ヒンジ領域」と称され、更には「ヒンジレス」と称されてもよい）。
【０１８３】
幾つかの態様において、このような免疫グロブリンは、分子間で（例えば二本の重鎖間で）又は分子内で（例えば単一ポリペプチド鎖内の二つのシステイン残基間で）、通常はジスルフィド結合を形成することができる重鎖システイン残基の完全なレパートリーを欠いている。一般に、改変されるシステイン残基（すなわち、ジスルフィド結合形成不能にされる）によって形成されるジスルフィド結合は、抗体内に存在していない場合、免疫グロブリンの通常の物理化学的及び／又は生物学的特性の実質的な損失をもたらさないものである。特定の実施態様では、ジスルフィド結合形成不能にされるシステイン残基は、重鎖のヒンジ領域のシステインである。
【０１８４】
変異体重鎖又は変異体ヒンジ領域を有する抗体は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は２からと１１の重鎖間ジスルフィド結合が取り除かれている抗体を、宿主細胞内に発現させ、宿主細胞から前記抗体を回収することによって、一般に作製される。前記抗体の発現は、ジスルフィド結合能力が低減された変異体重鎖を含む抗体をコードするポリヌクレオチドからであり得、続いて、該ポリヌクレオチドを含む宿主細胞から前記抗体を回収する。一実施態様では、重鎖は免疫グロブリン重鎖の変異体ヒンジ領域を含み、前記変異体ヒンジ領域の少なくとも一のシステインはジスルフィド結合形成不能にされている。
【０１８５】
免疫グロブリン重鎖の任意のシステインが、本明細書に記載されたヒンジシステインと同様にジスルフィド結合形成不能にされ得ることが、このような改変が免疫グロブリンの生物学的機能を実質的に減少させないという条件で、更に予想される。例えば、ＩｇＭ及びＩｇＥはヒンジ領域を欠いているが、各々が余分の重鎖ドメインを含有し、重鎖及び／又は重鎖を含む抗体の生物学的機能を実質的に減少させない限り、該重鎖システインの少なくとも一（幾つかの実施形態においてはすべて）が、ジスルフィド結合形成不能にされ得る。
【０１８６】
例えば、上掲のＫａｂａｔ、１９９１年、「Sequences of proteins of immunological interest」に記載されているように、重鎖ヒンジシステインは当該技術分野で周知である。当該技術分野で知られているように、ヒンジシステインの数は、免疫グロブリンのクラス及びサブクラスに依って変わる。例えば、Ｊaneway, 1999, Immunobiology, 4th Ed., (Garland Publishing, NY)を参照のこと。例えば、ヒトＩｇＧＩ類においては２のヒンジシステインが２のプロリンによって分離されており、これらは通常、分子間ジスルフィド結合において、隣接する重鎖上の相手側と対になっている。他の例は、４のヒンジシステインを含有するヒトＩｇＧ２、１１のヒンジシステインを含有するＩｇＧ３、及び２のヒンジシステインを含有するＩｇＧ４を含む。
【０１８７】
したがって、特定の実施態様では、方法は、変異体ヒンジ領域の少なくとも一のシステインがジスルフィド結合形成不能にされている変異体ヒンジ領域を含む免疫グロブリン重鎖を宿主細胞内に発現させること、該重鎖を軽鎖と複合体化させて、生物学的に活性な抗体を形成すること、及び宿主細胞から抗体を回収することを含む。
【０１８８】
代替的実施態様は、少なくとも２、３、又は４のシステインがジスルフィド結合形成不能にされているもの；約２から約１１のシステインが不能にされているもの；及び変異体ヒンジ領域のすべてのシステインが不能にされているものを含む。
【０１８９】
本明細書に記載の方法に従って作製された抗体を構成する軽鎖及び重鎖は、単一のポリヌクレオチドによって、又は別々のポリヌクレオチドによってコードされ得る。
【０１９０】
通常、ジスルフィド結合形成に関与するシステインは、当該技術分野で既知であるか又は本明細書に記載された基準を考慮して当業者に明らかである任意の種々の方法により、ジスルフィド結合形成不能にされ得る。例えば、ヒンジシステインは、ジスルフィド結合ができないセリン等の他のアミノ酸で置換され得る。アミノ酸置換は、修飾されるヒンジ領域をコードする核酸配列の部位特異的突然変異誘発等の標準的な分子生物学的方法によって達成され得る。好適な技術は、Sambrookら, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二版に記載されたものを含む。変異体ヒンジ領域を有する免疫グロブリンを生成するための他の技術は、ヒンジ領域をコードするオリゴヌクレオチドの合成を含み、この場合、置換されるシステインのコドンが置換アミノ酸のコドンと置き換えられる。次いで、このオリゴヌクレオチドは、適宜、可変領域及びＦｃ配列等の他の適切な抗体配列を含むベクター主鎖内に結合され得る。
【０１９１】
別の実施形態において、ヒンジシステインは欠失され得る。アミノ酸欠失は、修飾されるヒンジ領域をコードする核酸配列の部位特異的突然変異誘発等の標準的な分子生物学的方法によって達成され得る。好適な技術は、上掲のSambrookらに記載のものを含む。変異体ヒンジ領域を有する免疫グロブリンを生成するための他の技術は、修飾されるシステインのコドンが欠失しているヒンジ領域をコードする配列を含むオリゴヌクレオチドの合成を含む。次いで、このオリゴヌクレオチドは、適宜、可変領域及びＦｃ配列等の他の適切な抗体配列を含むベクター主鎖内に結合され得る。
【０１９２】
ｆ．「キャビティー内突起（Ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ−Ｉｎｔｏ−Ｃａｖｉｔｙ）」法を用いて形成される二重特異性抗体
幾つかの実施態様において、二重特異性抗体は、ヘテロオリゴマー化のために、第一のポリペプチドと第二のポリペプチドとの間の界面を操作するのに役立つ「キャビティー内突起」法（「ノブ・イントゥー・ホール」とも称される）を用いて形成される。一実施態様において、界面は、抗体定常ドメインのうちＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。Ｆｃ配列のＣＨ３ドメインにおける「ノブ・イントゥー・ホール」突然変異は、ホモ二量体の形成を大幅に減少させるという報告がある（例えば、Merchant et al., 1998, Nature Biotechnology, 16:677-681を参照）。「突起」は、第一のポリペプチド界面の小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置き換えることにより構築される。該突起と同じか又は同様のサイズの代償的な「キャビティー」が、大きなアミノ酸側鎖をより小さな側鎖と置き換えることにより第二のポリペプチドの界面に任意選択的に創出される。第一又は第二のポリペプチドのいずれかの界面に、好適に配置され、形成された突起又はキャビティーが存在する場合、隣接する界面において、それぞれ対応するキャビティー又は突起を操作するだけでよい。該突起及びキャビティーは、ポリペプチドをコードする核酸の改変等の合成的手段により、又はペプチド合成により作成され得る。ノブ・イントゥー・ホールの更なる詳細は、米国特許第５７３１１６８号；同第；５８０７７０６号；同第５８２１３３３号を参照。
【０１９３】
幾つかの実施態様において、「ノブ・イントゥー・ホール」法は、ヘテロ二量体化を促進して、完全長二重特異性抗ＦｃγＲＩＩＢ及び抗「活性化受容体」（例えばＩｇＥＲ）抗体を生成するために用いられる。一実施態様において、「ノブ」突然変異（Ｔ３６６Ｗ）をＦｃ領域に導入することにより、抗ＦｃγＲＩＩＢ成分（例えばｐ５Ａ６．１１．ノブ）のための、また、「ホール」突然変異（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）を導入することにより、抗ＩｇＥＲ成分（例えばｐ２２Ｅ７．１１．ホール）のためのコンストラクトが作成された。別の実施態様において、本明細書に開示の方法、又は上掲のMerchantら（1998)、若しくは米国特許第５７３１１６８号；同第５８０７７０６号；同第５８２１３３３号に開示の方法等により、「ホール」突然変異をそのＦｃ領域に導入することによって、抗ＦｃγＲＩＩＢ成分（例えばｐ５Ａ６．１１ホール）のための、また、「ノブ」突然変異をそのＦｃ領域に導入することによって、抗ＩｇＥＲ成分（例えばｐ２２Ｅ７．１１ノブ）のためのコンストラクトが作成される。
【０１９４】
「キャビティー内突起」法を用いてヘテロ多量体を作製する一般的な方法は、一つ又は別々の宿主細胞内で、突起をコードするように元のポリヌクレオチドから改変されている第一のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びキャビティーをコードするように元のポリヌクレオチドから改変されている第二のポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドを発現させることを含む。該ポリペプチドは、共通の宿主細胞に発現させて、宿主細胞培養物からヘテロ多量体を回収するか、別々の宿主細胞に発現させて、回収及び精製後、ヘテロ多量体を形成するかのいずれかである。幾つかの実施態様において、形成されたヘテロ多量体は、多量体抗体、例えば二重特異性抗体である。２０１１年４月２２日出願の米国特許出願第１３／０９２７０８号も参照されたし。
【０１９５】
いくつかの実施態様において、抗体は、ノブ・イントゥー・ホール法と変異体ヒンジ領域コンストラクトとを組み合わせて、ヒンジレス二重特異性抗体を作製する。
【０１９６】
ベクター、宿主細胞、及び組換え法
また本発明は、本明細書に開示の抗体をコードする単離ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞、並びに該抗体を生産するための組換え法を提供する。
【０１９７】
本発明の抗体の組換え生産の場合、該抗体をコードする核酸が単離され、更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）のため、又は発現のために複製可能なベクターに挿入される。本発明の抗体をコードするＤＮＡは、通常の方法を用いて、例えば、該抗体をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより、容易に単離され、配列決定される。多くのベクターが入手可能である。ベクターの構成要素は、次のうちの一又は複数を通常含むがそれらに限定されない：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列。
【０１９８】
（ｉ）シグナル配列成分
本明細書に記載の抗体は、直接的にのみならず、異種抗体との融合抗体として組換えでも生産され得る。一実施態様において、異種抗体は、成熟タンパク質若しくは抗体のＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列又は他の抗体である。通常、選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識されプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。天然抗体シグナル配列を認識及びプロセシングしない原核生物宿主細胞の場合、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、又は熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置き換えられる。酵母分泌の場合、天然シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（サッカロミセス及びクルイベロミセスα因子リーダー）、又は酸ホスファターゼリーダー、カンジダ・アルビカンスグルコアミラーゼリーダー、又は国際公開第９０／１３６４６号に記載のシグナルによって置き換えられる。哺乳動物の細胞発現では、哺乳動物シグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。このような前駆体領域のＤＮＡを、リーディングフレーム内で、本発明の抗体をコードするＤＮＡに結合する。
【０１９９】
別の実施態様において、抗体の産生は宿主細胞の細胞質内で生じ得、したがって、各シストロン内に分泌シグナル配列の存在を必要としない。就いては、免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖が発現され、折りたたまれ、組み立てられて、細胞質内に機能的免疫グロブリンを形成する。特定の宿主株（例えば、大腸菌ｔｒｘＢ株）はジスルフィド結合形成に有利な細胞質条件を提供し、それにより、発現されたタンパク質サブユニットの適切な折りたたみと組み立てが可能となる(Proba and Plukthun, 1995, Gene, 159:203)。
【０２００】
ｇ．（ｉｉ）複製開始点成分
発現ベクターとクローニングベクターの両方が、一又は複数の選択された宿主細胞内でベクターが複製することを可能にする核酸配列を含有する。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は、宿主の染色体ＤＮＡから独立してベクターが複製することを可能にする配列であり、複製開始点又は自律複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母及びウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製開始点は、大部分のグラム陰性細菌に適しており、２μプラスミドの開始点は酵母に適しており、種々のウイルスの開始点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製開始点の成分は哺乳動物の発現ベクターには不要である（早期プロモーターを含むという理由のみでＳＶ４０開始点が通常使用される）。
【０２０１】
ｈ．（ｉｉｉ）選択遺伝子成分
発現ベクター及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有し得る。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質又は他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート又はテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）栄養要求性欠陥を補うタンパク質、又は（ｃ）天然培地からは得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする（例えば、桿菌のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。
【０２０２】
選択方式の一例は、宿主細胞の増殖を停止させる薬物を利用する。
異種遺伝子により首尾よく形質転換されている細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生成し、それゆえ選択レジメを生き延びる。このような優性選択の例は、薬物のネオマイシン、ミコフェノール酸及びヒグロマイシンを使用する。
【０２０３】
哺乳動物細胞に好適な選択可能マーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ等、抗体核酸を取り出すことのできる細胞の同定を可能にするもの、例えば、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等である。
【０２０４】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培地ですべての形質転換体を培養することにより、先ず同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。
【０２０５】
或いは、抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）等の他の選択可能マーカーで形質転換又は同時形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、例えばカナマイシン、ネオマイシン又はＧ４１８等のアミノグリコシド抗生物質の如き選択可能マーカーに対する選択剤を含有する培地中での細胞増殖により選択され得る。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
【０２０６】
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Stinchcomb et al., Nature, 282:39(1979)）。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣ番号４４０７６又はＰＥＰ４−１に対する選択マーカーを提供する。Jones, 1977, Genetics, 85:12.次いで、酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１破壊の存在により、トリプトファンの非存在下での増殖により形質転換を検出するための効果的な環境が提供される。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株（例えば、ＡＴＣＣ寄託番号２０６２２又は３８６２６の株）が、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドにより補完される。
【０２０７】
加えて、１．６μｍの環状プラスミドｐＫＤ１由来のベクターが、クルイベロミセス酵母の形質転換に使用され得る。或いは、組換え仔牛キモシンの大規模生産用の発現系が、クルイベロミセス・ラクチスに関して報告されている。Van den Berg, 1990, Bio/Technology, 8:135を参照のこと。クルイベロミセスの産業用菌株による成熟した組換えヒト血清アルブミンの分泌に適した多コピー発現ベクターも開示されている。Fleerら, 1991, Bio/Technology, 9:968-975参照。
【０２０８】
ｉ．（ｉｖ）プロモーター成分
発現ベクター及びクローニングベクターは、宿主生物によって認識され、抗体核酸に作動可能に結合されたプロモーターを、通常は含有する。原核生物宿主との使用に適したプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、及びｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターを含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも適している。細菌系に使用されるプロモーターは、抗体をコードするＤＮＡに作動可能に結合されたシャイン・ダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含有する。
【０２０９】
真核生物に関するプロモーター配列が知られている。実質的にすべての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位からおよそ２５から３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有している。多くの遺伝子の転写の開始から７０から８０塩基上流に見出されるもう一つの配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端には、コード配列の３’末端にポリＡテイルを付加するためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列はすべて、真核生物発現ベクターに適切に挿入される。
【０２１０】
酵母宿主と共に使用するための適切なプロモーター配列の例は、３−ホスホグリセレートキナーゼ、又はエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベ−トデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼ等の他の解糖酵素のプロモーターを含む。
【０２１１】
他の酵母プロモーターは、増殖条件によって制御される転写という更なる利点を有する誘導性プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、並びにマルトース及びガラクトースの利用を担う酵素のプロモーター領域である。酵母の発現に用いられる適切なベクター及びプロモータは、ＥＰ７３６５７号に更に記載されている。酵母エンハンサーもまた、酵母プロモーターと共に有利に用いられる。
【０２１２】
哺乳動物宿主細胞中のベクターからの抗体転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから得られるプロモーター、又はアクチンプロモーター若しくは免疫グロブリンプロモーター等の異種哺乳動物プロモーターから得られるプロモーター、又は熱ショックプロモーターから得られるプロモーターにより制御される。ただし、そのようなプロモーターが宿主細胞系と適合性であることを条件とする。
【０２１３】
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製開始点をも含有するＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として簡便に得られる。ウシパピローマウイルスをベクターとして用いて哺乳動物宿主にＤＮＡを発現する系は、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の修飾は、米国特許第４６０１９７８号に記載されている。単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトＢ−インターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyesら,1982, Nature 297:598-601も参照されたい。或いは、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復がプロモーターとして使用され得る。
【０２１４】
ｊ．（ｖ）エンハンサーエレメント成分
より高等な真核生物による抗体をコードするＤＮＡの転写は、ベクター内にエンハンサー配列を挿入することによって増加することが多い。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）の多数のエンハンサー配列が、現在知られている。しかし、典型的には、真核細胞ウイルスのエンハンサーが用いられる。例は、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ  １００−２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーを含む。真核性プロモーター活性化のための強化要素については、Yaniv, 1982, Nature 297:17-18も参照されたい。エンハンサーは、抗体コード配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、典型的には、プロモーターから５’位に位置している。
【０２１５】
ｋ．（ｖｉ）転写終結成分
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞）中で用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含んでいる。このような配列は、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡｓの非翻訳領域である、通常は５’、場合によっては３’から取得できる。これら領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。一つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号及びそこに開示の発現ベクターを参照のこと。
【０２１６】
ｌ．（ｖｉｉ）翻訳強度の調整
また、本明細書に記載の免疫グロブリンは、発現された軽鎖及び重鎖の量比を、分泌されて適切に組み立てられた完全長抗体の収率を最大化するために調整することができる発現系から発現され得る。このような調整は、軽鎖と重鎖の翻訳強度を同時に調整することによって達成される。
【０２１７】
翻訳強度を調整するための一つの技術はSimmonsら米国特許第５８４０５２３号及びSimmonsら, 2002, J. Immunol. Methods, 263: 133-147に開示されている。該技術は、シストロン内の翻訳開始領域（ＴＩＲ）の変異体を利用する。所定のＴＩＲに関して、連続したアミノ酸又は核酸配列変異体は様々な翻訳強度で作成され得、これにより特定の鎖の望ましい発現レベルのためにこの因子を調節する好都合な手段が提供される。ＴＩＲ変異体は、ヌクレオチド配列のサイレント改変が代表的であるが、アミノ酸配列を変えることのできるコドン変化をもたらす通常の突然変異誘発技術により生成され得る。ＴＩＲの改変は例えば、シグナル配列の改変と共に、シャイン・ダルガノ配列の数又はスペーシングの改変を含み得る。突然変異体シグナル配列を生成するための一つの例示的な方法は、シグナル配列のアミノ酸配列を変化させない（すなわち、この変化はサイレントである）コード配列の始めに「コドンバンク（ｃｏｄｏｎ  ｂａｎｋ）」を生成することである。このことは、各コドンの第三のヌクレオチドの位置を変更することによって達成され得、加えて、ロイシン、セリン、及びアルギニン等の幾つかのアミノ酸は、コドンバンクの作製に複雑さを加え得る複数の第一及び第二の位置を有する。突然変異誘発のこの方法は、Yansuraら 1992, METHODS: A Companion to Methods in Enzymol., 4:151-158に詳細に記載されている。
【０２１８】
幾つかの実施態様において、一組のベクターが、その中の各シストロンについて様々なＴＩＲ強度で生成される。この限られた組が、様々なＴＩＲ強度組み合わせでの各鎖の発現レベル及び完全長産物の収量の比較を提供する。ＴＩＲ強度は、Ｓｉｍｍｏｎｓら、米国特許第５８４０５２３号及びSimmonsら, 2002, J. Immunol. Methods, 263: 133-147に詳細に記載されているように、レポーター遺伝子の発現レベルを定量することによって決定され得る。特定の実施態様では、ベクター内のＴＩＲの特定の対に関する翻訳強度の組み合わせは、（Ｎ−軽、Ｍ−重）によって表され、ここで、Ｎは、軽鎖の相対的ＴＩＲ強度であり、Ｍは、重鎖の相対的ＴＩＲ強度である。例えば、（３−軽、７−重）は、ベクターが、軽鎖発現に関しては約３の相対的ＴＩＲ強度、重鎖発現に関しては約７の相対的ＴＩＲ強度を提供することを意味する。翻訳強度の比較に基づき、本発明の発現ベクターコンストラクトに組み合わせるべき所望の個々のＴＩＲが選択される。
【０２１９】
ｍ．（ｖｉｉｉ）宿主細胞の選択及び形質転換
本明細書のベクターにおけるＤＮＡのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、上記の原核生物、酵母又は高等真核生物の細胞である。この目的のための適切な原核生物は、グラム陰性又はグラム陽性生物体等の古細菌及び真正細菌、例えば、大腸菌属（大腸菌等）、エンテロバクター属、エルウイニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属（ネズミチフス菌等）、セラチア属（霊菌等）及び赤痢菌属といった腸内細菌科、並びに枯草菌及びバチルス・リケニフォルミス（例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６７１０に開示されたバチルス・リケニフォルミス４１Ｐ）といったバチルス属、シュードモナス属（緑膿菌等）及びストレプトミセス属を含む。大腸菌クローニング宿主の一つは大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）及び大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）といった他の菌株も好適である。これらの例は、限定ではなく例示である。また、宿主細胞が最少量のタンパク質分解酵素を分泌することが有用であり、追加のプロテアーゼ阻害剤が細胞培養物中に組み込まれることが望ましい場合がある。また、原核宿主細胞は、チオレドキシン経路及び／又はグルタチオン経路における突然変異を含み得る。
【０２２０】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母等の有用真核微生物は、抗体をコードするベクターにとって好適なクローニング宿主又は発現宿主である。低級真核宿主微生物の中では、サッカロマイセス・セレビシエ、すなわち一般的なパン酵母が最も一般的に用いられる。しかしながら、例えば分裂酵母；例えば、クルイベロミセス・ラクチス、クルイベロミセス・フラジリス（ＡＴＣＣ１２４２４）、クルイベロミセス・ブルガリカス（ＡＴＣＣ１６０４５）、クルイベロミセス・ウィッカーラミ（ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ２４１７８）、クルイベロミセス・ワルティー（ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ５６５００）、クルイベロミセス・ドロソフィラルム（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ３６９０６）、クルイベロミセス・サーモトレランス（ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）及びクルイベロミセス・マルキシアナス（ｍａｒｘｉａｎｕｓ）等のクルイベロミセス宿主；ヤロウィア属（ＥＰ４０２２２６）；ピキア・パストリス（ＥＰ１８３０７０）；カンジダ属；トリコデルマ・リージア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ２４４２３４）；アカパンカビ；シュワンニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）等のシュワンニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属；及び、例えばアカパンカビ属、アオカビ属、トリポクラディウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）等の糸状菌、及び為巣性麹菌及びクロカビ等のアスペルギルス宿主といった他の多数の属、種、及び株が一般的に入手可能であり、本明細書において有用である。
【０２２１】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物から得られる。無脊椎動物細胞の例は、植物細胞及び昆虫細胞を含む。多数のバキュロウイルス株及び変異体と、ヨトウガ（毛虫）、ネッタイシマカ（蚊）、ヒトスジシマカ（蚊）、キイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）及びカイコガ等の宿主からの対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、キンウワバ科ＮＰＶのＬ−１変異体及びカイコガＮＰＶのＢｍ−５株が公的に入手可能であり、このようなウイルスは本明細書におけるウイルスとして、特にヨトウガ細胞のトランスフェクションのために使用され得る。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト及びタバコの植物細胞培養物も宿主として利用され得る。
【０２２２】
脊椎動物宿主細胞は広く用いられており、培養物における脊椎動物細胞の増殖（組織培養）は常套法となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胎児腎臓系（２９３細胞又は懸濁培養にて増殖用にサブクローン化した２９３細胞、Graham et al.,J.Gen.Virol.36:59(1977))；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Urlaub et al.,, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68）；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；ＮＳＯ（例えば、ＲＣＢ０２１３、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６９）及びＳＰ２／０細胞（例えば、ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８１）等のマウス骨髄腫細胞；ＹＢ２／０細胞（例えば、ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６６２）等のラット骨髄腫細胞；及びヒト肝癌系（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。ＣＨＯ細胞は、本明細書に記載の方法の実施のための代表的な細胞系であり、ＣＨＯ−Ｋ１、ＤＵＫ−Ｂ１１、ＣＨＯ−ＤＰ１２、ＣＨＯ−ＤＧ４４（SomaticCell and Molecular Genetics 12:555(1986)）及びＬｅｃ１３は代表的な宿主細胞系である。ＣＨＯ−Ｋ１、ＤＵＫ−Ｂ１１、ＤＧ４４又はＣＨＯ−ＤＰ１２宿主細胞の場合、これらは、その中で発現されたタンパク質をフコシル化する能力を欠失するように改変され得る。
【０２２３】
ハイブリドーマ細胞も使用され得る。用語「ハイブリドーマ」は、免疫源の不死細胞株と抗体産生細胞との融合によって生産されたハイブリッド細胞株を指す。この用語は、ヒト細胞と、マウス骨髄腫細胞系との融合、その後のプラズマ細胞との融合の結果である、一般にトリオーマ細胞系として知られている異種ハイブリッド骨髄腫融合体の後代を包含する。更に、該用語は、例えばクアドローマ等の抗体を産生する任意の不死化ハイブリッド細胞系を含むことが意図されている（例えば、Milstein et al., 1983, Nature, 537:3053を参照）。ハイブリッド細胞系は、ヒトやマウスを含む任意の種のものであり得る。
【０２２４】
幾つかの実施態様において、哺乳動物細胞は、対象となっている抗体をコードする外来性単離核酸で形質転換された非ハイブリドーマ哺乳動物細胞である。「外来性核酸」又は「異種核酸」は、該細胞にとって外来であるか、又は該細胞と相同ではあるが宿主細胞核酸内で該核酸が通常では見られない位置にある核酸配列を意味する。
【０２２５】
ｎ．（ｉｘ）宿主細胞の培養
宿主細胞は、抗体生産のための上述の発現ベクター又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適宜改善された通常の栄養培地中で培養される。
【０２２６】
抗体を生産するために用いられる宿主細胞は、種々の培地中で培養され得る。ＨａｍのＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ））及びＤｕｌｂｅｃｃｏの改良Ｅａｇｌｅ培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）等の市販の培地は、宿主細胞の培養に適している。加えて、Hamら,1979, Meth. Enz. 58:44、Barnesら., 1980, Anal. Biochem. 102:255、米国特許第４７６７７０４号；同第４６５７８６６号；同第４９２７７６２号；同第４５６０６５５号；又は同第５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載の何れの培地も宿主細胞用の培地として使用され得る。これらの培地の何れにも、ホルモン及び／又は他の増殖因子（例えばインスリン、トランスフェリン、又は上皮増殖因子）、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えばゲンタマイシンＴＭ薬）、微量元素（最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される）、及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物も、当業者に既知の適切な濃度で含められ得る。温度、ｐＨ等の培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で先に用いられたものであり、当業者には明らかであろう。
【０２２７】
培養培地はすべて、以下のカテゴリーの一又は複数から少なくとも一つの成分を通常提供する：
１）通常はグルコース等の糖（炭水化物）の形態のエネルギー源；
２）全必須アミノ酸、及び通常２０種類のアミノ酸の基本セット＋シスチン；
３）ビタミン類及び／又は低濃度で必要とされる他の有機化合物；
４）遊離脂肪酸；及び
５）微量元素、ここで微量元素は、通常マイクロモル範囲の極めて低濃度で典型的に必要とされる無機化合物又は天然元素として定義される。
【０２２８】
特定の実施態様では、培養培地は無血清であり（例えば、約５％未満、又は１％未満、又は０％から０．１％の血清）、また他の動物由来タンパク質も含まない。しかし、それらは所望ならば使用してもよい。一実施態様では、細胞培養培地は過剰のアミノ酸を含む。過剰に提供されるアミノ酸は、例えば、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌから選択され得る。一実施態様では、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ及びＴｒｐが過剰に提供される。例えば、欧州特許第３０７２４７号又は米国特許第６１８０４０１号に指定された範囲の１倍又は２倍で、アミノ酸、ビタミン類、微量元素及び他の培地成分が使用され得る。これら２つの文書は、参照により本明細書に援用される。
【０２２９】
所望のタンパク質を発現し、特定の位置に所望の糖（炭水化物）を付加することのできる哺乳動物細胞の培養のために、培養される宿主細胞に特に注意を払って、多数の培養条件が使用され得る。哺乳動物細胞のための好適な培養条件は、当該技術分野でよく知られている（W. Louis Cleveland et al., 1983, J. Immunol. Methods 56:221-234）か、又は当業者により容易に決定され得（例えば、Animal Cell Culture: A Practical Approach 2nd Ed., Rickwood, D. and Hames, B. D., eds. Oxford University Press, New York (1992)参照）、選択された具体的な宿主細胞によって変わる。
【０２３０】
ｏ．（ｘ）抗体精製
組換え法を用いる場合、本発明の抗体は、細胞内、細胞周辺腔内で生成されるか、又は培地中に直接分泌され得る。抗体が細胞内に生成される場合、最初の工程として、宿主細胞か又は溶解断片の何れかである微粒子状デプリは、例えば遠心分離又は限外濾過により除去される。Carterら, 1992, Bio/Technology 10: 163-167は、大腸菌の細胞周辺腔に分泌される抗体を単離する方法を記載している。手短に述べると、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下、細胞ペーストを約３０分にわたって解かす。細胞デプリは、遠心分離により除去され得る。抗体が培地中に分泌される場合、このような発現系の上澄み液は、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いて、一般的には先ず濃縮される。ＰＭＳＦ等のプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するために前述の工程の何れかに含まれ得、また、抗生物質は、偶発的夾雑物の増殖を防ぐために含まれ得る。
【０２３１】
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製され得るが、アフィニティークロマトグラフィーが代表的な精製法である。親和性リガンドとしてのタンパク質Ａの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。タンパク質Ａは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いられ得る（Lindmark et al., 1983, J. Immunol. Meth. 62:1-13）。タンパク質Ｇは、すべてのマウスアイソタイプとヒトγ３に対して推奨される（Guss et al., 1986, EMBO J. 5:15671575）。親和性リガンドが結合するマトリックスは、多くの場合アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。細孔制御ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼン等の機械的に安定なマトリックスによって、アガロースで達成され得るよりも速い流速及び短い処理時間が可能になる。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、精製には、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸＴＭ樹脂（J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.）が有用である。タンパク質精製のための他の技術、例えばイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースＴＭでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び硫酸アンモニウム沈殿も、回収する抗体に応じて利用可能である。
【０２３２】
一実施形態において、糖タンパク質は、調製物からフコース含有糖タンパク質を除去するために、レクチン基質上への吸着を用いて精製され得、それによって、フコースのない糖タンパク質を濃縮できる。
【０２３３】
ｐ．（ｘｉ）抗体活性アッセイ
本発明の免疫グロブリンは、当該技術分野で周知の種々のアッセイによって、それらの物理的／化学的特性及び生物学的機能に関して特徴付けされ得る。一態様において、免疫原に結合する抗体の選択性を他の結合標的に対するものと比較することが重要である。
【０２３４】
特定の実施態様において、本明細書で生産される免疫グロブリンを、その生物活性に関して分析する。幾つかの実施形態において、本発明の免疫グロブリンを、その抗原結合活性に関して試験する。当該技術分野で周知であり、本明細書で用いられ得る抗原結合アッセイとは、限定されないが、ウェスタンブロット、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光免疫アッセイ及びタンパク質Ａ免疫アッセイ等の方法を用いた任意の直接的又は競合結合アッセイを含む。具体的な抗原結合アッセイは、下記の実施例の項に提供されている。
【０２３５】
精製免疫グロブリンは、限定されないが、Ｎ末端配列決定、アミノ酸分析、非変性サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析法、イオン交換クロマトグラフィー及びパパイン消化を含む一連のアッセイによって更に特徴付けることができる。タンパク質定量化の方法は当該技術分野でよく知られている。例えば、発現タンパク質の試料は、それらの量的強度に関して、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥで比較され得る。或いは、対象となっている特異的バンド（例えば完全長バンド）は、例えば、ウェスタンブロットゲル分析及び／又はＡＭＥ５−ＲＰアッセイによって検出され得る。
【０２３６】
医薬製剤
本発明の抗体の治療製剤は、所望の純度を有する抗体を、任意選択的な生理学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤と混合することによって（Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980）、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で調製され得る。許容可能な担体、賦形剤又は安定剤は、用いられる投与量及び濃度にてレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）抗体；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む、単糖類、二糖類及び他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。本明細書における例示的な薬学的に許容可能な担体は、介在性（ｉｎｓｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ）薬物分散剤、例えば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）のようなヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む特定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼ等の一又は複
数の追加的グルコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０２３７】
例示的な凍結乾燥抗体製剤が米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものを含み、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０２３８】
また、本明細書中の製剤は治療される特定の適応症に必要な一を超える活性化合物も含有し得、例えば、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものである。例えば、本発明の製剤は別の抗体又は化学療法剤．を更に含んでもよい。そのような分子は、好ましくは、意図される目的に有効な量の組み合わせで存在する。
【０２３９】
また、活性成分は、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）において、又はマクロエマルジョンにおいて、例えば、コアセルベーション法により、又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル、及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに封入されてもよい。 これらの技術は、RemingtonのPharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
【０２４０】
インビボ投与に用いられる製剤は滅菌されていなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
【０２４１】
徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、該マトリックスは、例えばフィルム又はマイクロカプセル等の成形品の形態である。徐放性マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射用ミクロスフェア）のような分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸等のポリマーは１００日間以上の分子放出を可能にするが、特定のヒドロゲルはより短い時間タンパク質を放出する。カプセル化抗体が体内に長時間残留する場合、３７℃で水分に晒される結果、変性又は凝集して、生物活性を消失させ、場合によっては免疫原性を変化させ得る。関与する機構に依って、安定化のための合理的な方策が考案され得る。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが分かれば、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、含水量の制御、適切な添加剤の使用、及び特定のポリマーマトリックス組成物の開発によって安定化が達成され得る。
【０２４２】
抗体の非治療的使用
抗体はアフィニティー精製剤として使用され得る。この方法においては、当該技術分野で周知の方法を用いて、セファデックスＴＭ樹脂又は濾紙等の固相上に抗体が固定化される。固定化された抗体を、精製される抗原を含有する試料に接触させ、その後、試料中の精製される抗原以外の実質的にすべての物質を除去する好適な溶媒で支持体を洗浄し、これを固定化抗体に結合させる。最後に、抗体から抗原を遊離させるグリシン緩衝液（ｐＨ５．０）等の別の好適な溶媒で支持体を洗浄する。
【０２４３】
また、該抗体は、例えば特定の細胞、組織又は血清中の対象となっている抗原の発現を検出するための、診断的アッセイにおいても有用であり得る。診断用途では抗体は通常、検出可能部分で標識される。多数の標識が入手可能であり、一般に以下のカテゴリーに分類される：
（ａ）３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ等の放射性アイソトープ。抗体は、例えば、Current Protocols in Immunology、第１巻及び第２巻、Coligenら編、Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs. (1991)に記載の方法を用いて、放射性アイソトープで標識され得、放射性はシンチレーション測定を用いて測定され得る。
（ｂ）希土キレート類（ユーロピウムキレート類）又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリスリン及びテキサスレッド等の蛍光標識。該蛍光標識は、例えば、上掲のCurrent Protocols in Immunologyに開示の方法を用いて抗体にコンジュゲートされ得る。蛍光は蛍光光度計を用いて定量され得る。
（ｃ）種々の酵素−基質標識が入手可能であり、米国特許第４２７５１４９号はこれらの一部についての概説を提供している。酵素は一般に、種々の方法を用いて測定され得る発色性基質の化学変化を触媒する。例えば、酵素は基質における色変化を触媒でき、これは分光測定で測定され得る。或いは、酵素は基質の蛍光又は化学発光を変化させ得る。蛍光の変化を定量するための方法は、上に記載されている。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起され、次いで、測定することができる（例えば化学ルミノメーターを用いて）か、又はエネルギーを蛍光受容基に与える光を発し得る。酵素標識の例は、ルシフェラーゼ類（例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４７３７４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン類、マレートデヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等のペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、Ｂガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ類（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）複素環式オキシダーゼ（ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ等）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ等を含む。酵素を抗体にコンジュゲートするための方法は、O’Sullivanら、Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay、Methods in Enzym. (ed J. Langone and H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)に記載されている。
【０２４４】
酵素−基質の組み合わせの例は、例えば：
１）セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）は、過酸化水素を利用して色素前駆体を酸化する（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）又は塩酸３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ））；
２）アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と、発色性基質としてのパラニトロフェニルホスフェート；及び
３）β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）と発色性基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）又は蛍光発生基質の４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
を含む。
【０２４５】
多数の他の酵素−基質の組み合わせが当業者に入手可能である。これらの総説に関しては、米国特許第４２７５１４９号及び同第４３１８９８０号を参照されたい。
【０２４６】
場合によっては、標識を抗体に間接的にコンジュゲートさせる。これを達成するための種々の方法が当業者に知られている。例えば、抗体はビオチンとコンジュゲートされ得、また、上記の三つの広いカテゴリーの標識の何れかはアビジンとコンジュゲートされ得、或いはその逆も可能である。ビオチンは選択的にアビジンに結合し、したがって、標識はこの間接的な方式で抗体にコンジュゲートされ得る。或いは、標識と抗体との間接的コンジュゲーションを達成するために、抗体を小さなハプテン（例えばジゴキシン）とコンジュゲートさせ、上記の種々のタイプの標識の何れか一つを、抗ハプテン抗体（例えば抗ジゴキシン抗体）とコンジュゲートさせる。このようにして、標識と抗体との間接的コンジュゲーションが達成され得る。
【０２４７】
別の実施態様において、抗体は標識化される必要はなく、その存在は、該抗体に結合する標識抗体を用いて検出され得る。
【０２４８】
本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接的及び間接的サンドイッチアッセイ、並びに免疫沈降アッセイ等の任意の知られているアッセイ法で用いられ得る。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, 47-158頁 (CRC Press, Inc. 1987)。
【０２４９】
本発明の抗体はインビボ診断アッセイにも使用され得る。一般に、本発明の抗体を放射性核種（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐ又は３５Ｓ等）で標識し、免疫シンチオグラフィーを使用して抗原又はそれを発現する細胞が局在化できるようにする。
【０２５０】
抗体のインビボ（治療的）使用
種々な疾患の治療用に治療抗体が開発され、承認されている。特定の実施態様において、治療剤の機能を高めるために、抗ＩＬ−１β抗体及び／又は抗ＩＬ−１８抗体が治療剤とともに共投与される。
【０２５１】
疾病の予防又は治療のための抗体の適切な用量は、治療される疾患のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体が予防的目的の投与か治療的目的の投与か、治療歴、患者の病歴及び抗体に対する応答、並びに主治医の判断に依拠するであろう。抗体は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。
【０２５２】
疾患のタイプ及び重症度に応じて、例えば一回又は複数回の別個の投与によるか又は連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１−２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が患者への投与のための初期候補用量である。典型的な１日用量は、上記要因に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日間以上にわたる反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで維持される。しかしながら、他の投薬レジメンも有用であり得る。本療法の進捗は一般的な手法及びアッセイにより容易にモニターされる。
【０２５３】
本発明の抗体組成物は、医学実施基準に合致する方法で処方され、調剤され、投与されなければならない。これに関連して考慮すべき要因は、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与計画及び医療従事者が知る他の要因を含む。投与される抗体の「治療的有効量」は、このような考慮事項によって決まり、疾病若しくは疾患を予防、改善又は治療するために必要な最小量である。本発明の抗体は、必ずしも必須ではないが任意選択的に、当該問題の疾患を予防若しくは治療するのに目下使用されている一又は複数の薬剤と共に製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、疾患又は治療の種類、及び上記以外の要因によって決まる。このような他の薬剤は通常、上文で用いられたのと同じ用量及び投与経路で、又は従来用量の約１から９９％が使用される。
【０２５４】
例えば、関節リウマチ及び狼瘡のように炎症細胞（例えば、白血球）接着、遊走及び活性化を伴う自己免疫疾患を治療するため、本明細書中の抗体は、例えば、抗ＬＦＡ−１抗体（抗ＣＤ１１ａ又は抗ＣＤ１８抗体等）とともに、又は抗ＩＣＡＭ−１、−２若しくは−３等の抗ＩＣＡＭ抗体とともに共投与され得る。本明細書の抗体と併用で関節リウマチを治療するための追加の薬剤は、エンブレルＴＭ、メトトレキサート等の疾患修飾性抗リウマチ薬、及びＮＳＡＩＤ（非ステロイド性抗炎症薬）を含む。本明細書の抗体以外のこのような他の複数の活性剤も用いられてよい。加えて、インスリンが糖尿病、抗ＩｇＥが喘息、抗ＣＤ１１ａが乾癬、抗アルファ４ベータ７と成長ホルモン（ＧＨ）が炎症性腸疾患の治療に使用され得る。
【０２５５】
製造品
別の実施態様では、上述した疾患の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器、及び容器表面の若しくは容器に付随するラベル又は添付文書を含む。好適な容器は、例えばビン、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグ等を含む。該容器はガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成され得る。容器は、症状の治療、予防、及び／又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液のバッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択された病態を治療するために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）抗体を含む組成物を中に収容する第一の容器；及び（ｂ）更なる細胞傷害性剤又はその他の治療剤含む組成物を中に収容する第二の容器を含み得る。本実施態様における製造品は、組成物が特定の病態を治療するために使用され得ることを示す添付文書を更に含んでもよい。或いは、又は加えて、製造品は、薬学的に許容可能な緩衝液、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器を更に含んでもよい。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及び使用者の観点から望まれる他の材料を更に含んでもよい。
【０２５６】
治療用抗体組成物は、通常、滅菌のアクセスポートを有する容器（例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアル）内に配置される。
【０２５７】
また、例えばＣＤ又はＵＣ等の炎症性腸疾患の治療に有用な材料を含有するキット及び製造品が提供される。製造品はラベル付きの容器を含む。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル及び試験管を含む。容器は、例えば、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成され得る。容器は本明細書に記載の抗体を含む組成物を収容する。組成物中の活性剤は特定の抗体である。容器上のラベルは、組成物が特定の疾患又は障害の治療又は予防のために使用されることを示し、また上記のもののようなインビボのための用法も示す。
【０２５８】
特定の実施態様では、キットは、上記の容器及び緩衝液を含む第二の容器を含む。キットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ及び使用説明が書かれた添付文書を含む、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含んでもよい。
【０２５９】
一般的なバイオマーカー技術
特に断りのない限り、本発明の実施は、当技術分野の技術の範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の通常の技術を用いる。このような技術は、例えば「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, 第二版 (Sambrook et al., 198９）；「Oligonucleotide Synthesis」 (M. J. Gait, ed., 1984); 「Animal Cell Culture」 (R. I. Freshney, ed., 1987); 「Methods in Enzymology」 (Academic Press, Inc.); 「Current Protocols in Molecular Biology」 (F. M. Ausubel et al., eds., 1987,及び定期的更新版）；「PCR: The Polymerase Chain Reaction」, (Mullis et al., eds., 1994)等の文献に十分に説明されている。
【０２６０】
本発明で用いられるプライマー、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは当該技術分野で知られている標準的な技術を使用して生成され得る。
【０２６１】
ＵＣ又はクローン病に罹患している患者を含むＩＢＤ患者の特定の治療剤に対する応答性を予測することに関連する遺伝子発現バイオマーカーが本明細書において提供される。ｍＲＮＡ又は遺伝子によりコードされる個々のタンパク質のこうした発現レベルは、ＩＢＤ治療剤、ＵＣ治療剤及び／又はクローン病の治療剤に対する応答を予測するためのバイオマーカーを構成する。したがって本明細書に開示されている発明は、例えば炎症性腸疾患の診断及び治療に関連する方法並びに組成物等の様々な設定において有用である。
【０２６２】
遺伝子発現量の検出
核酸は、本明細書に記載の任意の方法によれば、ゲノムＤＮＡから転写されたＲＮＡ、又はＲＮＡ若しくはｍＲＮＡから生成されたｃＤＮＡであり得る。核酸は、脊椎動物、例えば哺乳動物由来であってもよい。核酸は、その供給源から直接得られる場合、又はその供給源に見出される核酸のコピーである場合に、特定の供給源に「由来」すると言われる。
【０２６３】
核酸は核酸のコピー、例えば、増幅から生じるコピーを含む。増幅は、幾つかの例において、例えば変異を検出するための材料の所望の量を得るために望ましいものであり得る。アンプリコンは、特定の遺伝子の発現を決定するための下記のような変異体検出方法に供され得る。
【０２６４】
ｍＲＮＡのレベルは、市販のキット及び試薬の使用を含む当業者に周知の様々な方法によって測定され、定量され得る。そのような方法の一つがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。定量的な使用のためのもう一つの方法は、リアルタイム定量ＰＣＲ（すなわち、ｑＰＣＲ）である。例えば、「PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications」,(M.A. Innis et al., eds., Academic Press, Inc., 1990); 「Current Protocols in Molecular Biology」 (F. M. Ausubel et al., eds., 1987及び定期的更新版）;及び「PCR: The Polymerase Chain Reaction」, (Mullis et al., eds., 1994)参照。
【０２６５】
マイクロアレイは、例えば、高ストリンジェンシー条件下でｃＤＮＡ又はｃＲＮＡ試料とハイブリダイズする数千の整列された一連の核酸プローブを通常使用するマルチプレックス技術である。プローブ−標的ハイブリダイゼーションは、通常、蛍光体標識、銀標識又は化学発光標識された標的の検出により検出及び定量され、標的における核酸配列の相対存在度を決定する。典型的なマイクロアレイでは、プローブは、（エポキシ−シラン、アミノ−シラン、リジン、ポリアクリルアミド等を介して）化学的マトリックスへの共有結合によって固体表面に付着する。固体表面とは、例えば、ガラス、シリコンチップ又は超小型ビーズである。例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．及びＩｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．製を含む種々のマイクロアレイが市販されている。
【０２６６】
生体試料は、当業者に既知の幾つかの方法を用いて得ることができる。生体試料は脊椎動物、特に哺乳類から得ることができる。幾つかの例では、生体試料は滑膜組織、血清又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。このような生体試料をスクリーニングすることによって、潰瘍性大腸炎及びクローン病等の疾患に対する簡単な早期診断が達成できる。その上、このような生体試料の標的核酸（又はコードされたポリペプチド）の発現レベルの変化を試験することによって、治療の進捗がより容易にモニターされ得る。
【０２６７】
対象又は組織若しくは細胞試料が遺伝子発現署名又は相対レベルの本明細書に開示の特定のバイオマーカーを含むことが判明した後、有効量の適切な治療剤が、対象における特定の疾患、例えばＵＣ又はクローン病を治療するために対象に投与され得ることが企図されている。本明細書に記載の様々な病的状態の哺乳動物の臨床診断は、当業者によって行われ得る。例えば、哺乳動物における炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎及びクローン病等）の診断又は検出を可能にする臨床診断技術が当該技術分野で利用される。
【０２６８】
診断アッセイキット
本明細書中に記載又は示唆された用途での使用のための、診断アッセイキット又は製造品も提供される。そのようなキットは、例えばバイアル、チューブ等の一又は複数の容器手段を厳重に封じ込めて受け取るように区画化されている担体手段を含んでよく、容器手段は各々本方法で用いられる別々の要素のうちの一つを含む。例えば、容器手段のうちの一つは、検出可能に標識されているか又は標識され得るプローブを含んでもよい。そのようなプローブは、遺伝子発現署名の一又は複数の遺伝子を含むポリヌクレオチドに対して特異的なポリヌクレオチドであり得る。標的核酸を検出するためにキットが核酸ハイブリダイゼーションを利用する場合、キットは、標的核酸配列の増幅のためのヌクレオチド（単数又は複数）を収容する容器、及び／又は酵素標識、蛍光標識若しくは放射性同位体標識等のレポーター分子に結合させたアビジン又はストレプトアビジンのようなビオチン結合タンパク質等のレポーター手段を含む容器も有し得る。
【０２６９】
診断アッセイキットは、典型的には、上記の容器並びに緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ及び使用指示書付きの添付文書を含む商業的及び使用者の観点から望ましい材料を含む一又は複数の他の容器を含む。組成物が特定の治療的又は非治療的用途に使用されることを示すラベルが容器上に存在していてもよく、また、ラベルは上記の指示等のインビボ使用又はインビトロ使用のための指示を示していてもよい。キットの他の任意選択の成分は、一又は複数の緩衝剤（例えば、ブロック緩衝剤、洗浄緩衝剤、基質緩衝剤等）、酵素標識によって化学的に改変される基質（例えば色素原）等の他の試薬、エピトープ回収溶液、コントロール試料（ポジティブ及び／又はネガティブコントロール）、コントロールスライド（単数及び複数）を含む。
【０２７０】
マーケティング方法
本明細書の発明はまた、治療剤又はその薬学的に許容可能な組成物のマーケティング方法であって、ターゲット層に対し、特定の疾患、例えばＵＣ又はクローン病を有する患者又は患者集団を治療するための薬剤又はその医薬組成物の使用を奨励、指示及び／又は明示することを含む方法をも包含し、該患者又は患者集団から採取された試料は、遺伝子発現署名、又は血清バイオマーカー若しくは末梢血バイオマーカーのレベル、又は本明細書に記載の組織バイオマーカーの検出を示す。
【０２７１】
マーケティングは、一般的に、スポンサーが特定されてメッセージが管理される、非個人的媒体を通した有料のコミュニケーションである。本明細書の目的のためのマーケティングは、宣伝、広報、プロダクト・プレイスメント、スポンサーシップ、アンダーライティング及び販売促進を含む。本用語はまた、大衆にアピールして説得し、情報を与え、奨励し、動機付け、そうでなければ本明細書の発明の購入、支持、承認の好意的な行動パターンに向けて修正するために作られた任意の紙媒体に掲載されるスポンサー付き情報公告も含む。
【０２７２】
本明細書の診断方法のマーケティングは任意の手段により達成され得る。こうしたメッセージを発信するために使用されるマーケティング媒体の例は、放送媒体に登場するメッセージであるコマーシャルを含む、テレビ、ラジオ、映画、雑誌、新聞、インターネット、看板を含む。
【０２７３】
使用されるマーケティングの種類は、多くの要因、例えば、コストの考慮並びに医薬品及び診断薬の販売に関する準拠法のみならず、病院、保険会社、病院、医師、看護師、患者等のターゲット層の性質に依拠する。マーケティングは、双方向サービス及び／又はユーザ−属性や地理的位置等の他のデータによって定義されるユーザ特性に基づいて個別化又はカスタマイズされ得る。
【０２７４】
上記の明細書及び以下の実施例は、当業者が本発明を実施するのに十分なものと考えられる。本明細書に示され記載されているものに加え、本発明の様々な変更が、上記説明及び以下の実施例から当業者には明らかであり、添付の特許請求の範囲に含まれる。
【０２７５】
特定の問題又は状況への本発明の教示の適用は、本明細書に含まれる教示に照らし、当業者の能力の範囲内である。
【０２７６】
本発明の更なる詳細は、以下の非限定的な実施例により説明される。本明細書中のすべての引用文献の開示内容は、出典明示により本明細書に援用される。
【実施例】
【０２７７】
実施例において言及されている市販の試薬は、特に示さない限りは製造者の指示に従って使用された。
【０２７８】
材料及び方法
ヒトの切除組織標本
潰瘍性大腸炎、クローン病、憩室炎又は結腸がんのために腸切除を受けた患者が、インフォームドコンセントを提出して研究に参加した。手術に先立ち血液試料が入手され、終夜便で新鮮なうちにジェネンテックに輸送されるか、又は標準的な臨床手順に従って処理されて血清又は血漿として保存された。手術後、臨床分析のために必要な分を超える組織が採取された。小さな部分は、タンパク質分析のために急速凍結され、残りの組織は終夜便でジェネンテックに輸送された。
【０２７９】
一次腸上皮下筋線維芽細胞（ＭＦ）が、患者の腸切除標本から単離された。簡潔には、表面上皮細胞が１ミリモルのＥＤＴＡを用いる３つの連続処理により粘膜試料から分離され、上皮細胞を剥離された組織標本が１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）−ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｓｂａｄ，ＵＳ）中で培養された（３７℃、５％ＣＯ２）。ＭＦが粘膜固有層の上皮下領域から遊走し、組織培養皿中でコロニーを確立した。組織標本の除去後、一次ＭＦが増殖し、数継代にわたって維持され得る単層を確立した。培養物はフローサイトメトリーによる一次ＭＦと確認された（アルファ−平滑筋アクチン陽性、ビメンチン陽性、デスミン陰性）。一次ＭＦは、１０％のＦＢＳ、１％の非必須アミノ酸及び抗生物質カクテル（１００ｕｇ／ｍｌのペニシリン／連鎖球菌、２０ｕｇ／ｍｌのゲンタマイシン、２．５ｕｇ／ｍｌのアムホテリシン（Ａｍｐｈｏｔｅｒｃｉｎ）Ｂ及び１ｕｇ／ｍｌのメトロニダゾール）で高グルコースを補充したＤＭＥＭ中で培養され、３から５継代３で実験に使用された。
【０２８０】
ＭＦ（３人の異なる患者由来）を一晩、ウェル（６ウェルプレート）当たり６５０００細胞で播種し、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）（カタログ番号２０１−ＬＢ−ＣＦ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）又はＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）（カタログ＃２１０−ＴＡ−ＣＦ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の添加有り若しくは無しで上記のように補充されたＤＭＥＭを用い、実験に応じて６時間又は２４時間３７℃で刺激し、その後、ＲＮＡ単離のために収集した。ＲＮＡは、オンカラムＤＮＡｓｅ消化工程を含む製造業者のプロトコールに従ってＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離され、マイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）用に準備された。
【０２８１】
急速凍結された切除組織標本は、液体窒素で予冷されたＢｅｓｓｍａｎ組織粉砕器（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ＣＡ；カタログ＃１８９４７５）中で処理された。組織片を、ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）−２４  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ内で４５秒間２回振盪させながら１ｍｌの溶解用緩衝液（１ｘＴＢＳ、１％トリトン−Ｘ１００、２ｘ完全プロテアーゼ阻害剤カクテル）を用いてホモジナイズした。次いで、ホモジナイズした組織を、冷やされた微量遠心管内で１４０００ｇで１０分間遠心分離した。上清をアリコートに分割し、−８０℃で保存した。
【０２８２】
マイクロアレイ解析
ＲＮＡを増幅し、Ｑｕｉｃｋ  Ａｍｐ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して標識し、合計１μｇのＲＮＡから標識されたｃＲＮＡを生成した。実験試料はＣｙ５で標識され、参照チャネル用にユニバーサルヒト参照ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）が用いられ、それからＣｙ３で標識された。Ｃｙ５及びＣｙ３で標識されたｃＲＮＡは、二色のヒトゲノム全体４×４４Ｋ遺伝子発現マイクロアレイプラットフォームに競合的にハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたマイクロアレイを製造業者のプロトコール（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）に従って洗浄し、Ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイスキャナーを使用してすべての特徴強度を収集した。スキャンされたスライドのＴＩＦＦ画像は、特徴抽出ソフトウエア（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）、プロトコールＧＥ２−ｖ５＿９５（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して解析された。すべてのデータは、色素で正規化されたＣｙ５：Ｃｙ３比のｌｏｇ２値として報告された。
【０２８３】
ＩＬ１β及びＴＮＦαに誘導された遺伝子の同定
線形モデルを、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、並びに媒体制御処理及び時間点のそれぞれに適合させた。ベースラインからの変化と、少なくとも１．５倍の治療間の差の両方を示した遺伝子を同定した（偽陽性率、すなわちＦＤＲ＝０．００１）。ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αにより独自にアップレギュレートされた遺伝子の重複を評価した。
【０２８４】
線維症に関連する遺伝子の同定
ＲＮＡは、切除組織標本から採取された全層パンチ生検から単離され、マイクロアレイ解析に供された。線維症関連遺伝子は、線維性狭窄のために切除を受けた患者対他のすべての患者からの生検間での遺伝子発現を比較することにより同定された。クローン病では線維症と炎症が同時に起こるため、線維狭窄性生検の多くは様々なレベルの免疫浸潤を示した。免疫細胞浸潤の量を推定するために、細胞型特異的遺伝子セットのパネルについて遺伝子発現値の最初の固有ベクトルを算出した（Abbas et al.,Genes Immun. 6(4):319-31(2005)参照）。この固有ベクトルは、その試料内のその細胞型の浸潤の程度の推定値として使用された。こうした推定値は、診断、線維症及び生検の場所ででも説明される線形モデルにおける共変量として使用された。遺伝子は、０．１のＦＤＲで、このモデルに基づいて選択された。
【０２８５】
ｑＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡは、組織切除標本からの生検であるインビトロＭＦ刺激実験から、また、ｑＰＣＲ試験に使用するための組織学的分析のために使用されるものに隣接したＯＣＴ切片から単離された。第一鎖ｃＤＮＡが、ｉＳｃｒｉｐｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて２００ｎｇの全ＲＮＡから生成された。１２．５ｎｇのｃＤＮＡを、製造業者の忠告に従い、希釈したＴａｑｍａｎ  ａｓｓａｙｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と共にＴａｑｍａｎ  ＰｒｅＡｍｐ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してプレ増幅させた。ｑＰＣＲは、Ｂｉｏｍａｒｋ  ＨＤシステム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  ９６．９６形式）と、幾つかのハウスキーピング遺伝子及びマイクロアレイデータから同定された遺伝子から成る４８  ＴａｑＭａｎアッセイのパネルとを用いて実施された。結果のデータは、ΔＣｔの値を得るために、ＧＡＰＤＨに対して正規化された。
【０２８６】
ＥＬＩＳＡ
刺激から上清を回収し、製造業者のプロトコール及びガイドラインに従ってＥＬＩＳＡによりＧＣＳＦ（カタログ＃ＨＳＴＣＳ０、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）及びアンフィレグリン（ａｂ９９９７５、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）ついてアッセイした。
【０２８７】
ＩＬ−１１（ａｂ１００５５１，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ＩＬ１Ｒａ（ＤＲＡ００Ｂ，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、ＩＬ１８ＢＰ（ＤＹ１１９，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、アンフィレグリン（ａｂ９９９７５，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）及びＧＣＳＦ（ＨＳＴＣＳ０，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を製造業者のプロトコール及びガイドラインに従って患者の血清試料において測定した。
【０２８８】
ＩＬ−１β（ＨＳＬＢ００Ｃ，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、ＩＬ１Ｒａ（ＤＲＡ００Ｂ，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、ＩＬ１８（７６２０，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）及びＩＬ１８ＢＰ（ＤＹ１１９，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を製造業者のプロトコール及びガイドラインに従って組織ライセートにおいて測定した。
【０２８９】
実施例１：ヒト一次腸筋線維芽細胞におけるＩＬ−１β誘導性線維症関連遺伝子の発現
腸上皮下筋線維芽細胞（ＭＦ）の活性化は、コラーゲン及び細胞外マトリックスタンパク質の沈着の増加を通して、腸線維症において重要な役割を果たし得る。本プロセスにおけるＩＬ−１βのような炎症性サイトカインの役割が十分に理解されていないため、本出願人らは腸切除術を受けた患者からの組織標本における遺伝子の発現を調査し、一次のＭＦにおけるＩＬ−１β遺伝子誘導を試験した。試験した患者の特性を表１に示す。
表１  患者特性
2016521540.tif 000004
【０２９０】
腸切除を受けた、ＩＢＤ患者と非ＩＢＤ患者からの組織においてＩＬ−１β  ｍＲＮＡレベルに差があったかどうかを最初に検討した。図１Ａに示すように、ＣＤ患者からとＵＣ患者からの組織標本中のＩＬ−１β  ｍＲＮＡのレベルは、非ＩＢＤ患者からの標本中のＩＬ−１β  ｍＲＮＡのレベルよりも有意に高かった（ＣＤ患者及びＵＣ患者における相対的発現レベルの中央値は、非ＩＢＤ患者における約０．００１に比べ、約０．０１であり、それぞれ、Ｐ＝０．０２２２及びｐ＝０．０４０９であった）。また、線維狭窄性疾患の手術を受けたＣＤ患者におけるＩＬ−１β  ｍＲＮＡのレベルは、炎症性疾患の手術を受けたＣＤ患者よりも高い傾向を見せた。本出願人らは、図１Ｂに示すように、非ＩＢＤ患者の組織と比較してＩＬ−１β  ｍＲＮＡのレベルの差が更に大きくなることを見出した（ＣＤ患者からの線維性組織における相対的発現レベルの中央値は、非ＩＢＤ  ＣＤ患者からの組織における約０．００１と比較して約０．０１５、Ｐ＝０．００１２）。加えて、本出願人らは、切除ＣＤ組織において免疫組織化学法によりＩＬ−１βタンパク質発現の増加を観察した（図１Ｃ）。
【０２９１】
また、本出願人らは、非ＩＢＤ患者、ＵＣ患者、又はＣＤ患者から得られた切除組織のイムノブロット分析を実施した。図２に示すように、この分析により、インフラマソームの活性化に関連するタンパク質であるＣＡＳＰ１及びＰ２０は、プロＩＬ１β及び成熟ＩＬ−１βとともに、特にＣＤ患者、及びＵＣ患者由来の組織において高度に発現したが、非ＩＢＤ組織においてはほとんど検出不可能であったことが明らかとなった。これらのデータは、ＣＤ患者からの非線維性若しくは炎症性の組織又は非ＩＢＤ結腸組織の何れかと比較して、ＣＤ患者における線維性組織のＩＬ−１βの発現増加のエビデンスを提供した。フローサイトメトリー及びｑＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＩＬ１Ｒ１及びＴＮＦＲ１が、切除組織から単離された一次腸上皮下のＭＦ上に存在することを実証した（データは示されていない）。
【０２９２】
次に、本出願人らは上記した方法を用いて、一次ＭＦにおいてＴＮＦαによってではなくＩＬ−１βによって制御されている遺伝子を調べた。本出願人らは、ＭＦにおいてＴＮＦαによってではなくＩＬ−１βによって特異的に誘導される、コラーゲンを含む遺伝子の群を見出した。マイクロアレイ解析によって評価した場合、ＩＬ−１β療法による誘導を最も示し、且つＴＮＦβ療法による誘導を全く示さなかった遺伝子を表２に示す。遺伝子発現は図３に示すように、刺激されたＭＦのｑＲＴ−ＰＣＲにより確認された。ＴＮＦα療法ではなくＩＬ−１β療法は、ＧＣＳＦ（図３Ａ）、ＴＭＥＭ１５８（図３Ｂ）、ＣＯｌ７Ａ１（図３Ｃ）、Ｃｏｌ１６Ａ１（図３Ｄ）、アンフィレグリン（図３Ｅ）及びＩＬ−１１（図３Ｆ）の発現を刺激し、それによりマイクロアレイの結果を実証した。
表２  ＭＦのマイクロアレイ解析
2016521540.tif 000005
【０２９３】
培地で刺激されたＭＦ培養物からの上清、ＩＬ−１β又はＴＮＦαを、ＧＣＳＦ及びアンフィレグリンについてＥＬＩＳＡにより分析した。図４Ａ−Ｂに示すように、ＧＣＳＦ及びアンフィレグリンタンパク質は、ｑＲＴ−ＰＣＲの結果と一致して、ＴＮＦα療法又は培地処理ではなくＩＬ−１β療法の後に上清中で増加した。
【０２９４】
以上の結果は、本出願人らがＥＬＩＳＡによって細胞上清中のＧＣＳＦ及びアンフィレグリンのレベルを測定及び定量できたこと、また、ＩＬ−１β刺激後のタンパク質のレベルにおいて、ＲＮＡ発現の測定により観察されたのと同様の増加を観察することができたことを実証しているため、本出願人らはヒト血清中のＧＣＳＦを測定することの実現可能性を試験した。図５Ａは、血清ＧＣＳＦレベルがＣＤ患者とＵＣ患者の両方において、健常なコントロールと比較してアップレギュレートされたことを示す。本出願人らは、如何なるがんの患者又は健常なコントロール患者においても血清ＧＣＳＦを検出することができなかったものの、多くのｆＣＤ患者とｉＣＤ患者において血清ＧＣＳＦを容易に検出することができた。２人のＤＶＴ患者のみ、血清中のＧＣＳＦが検出可能なレベルを示した。同じ試料を用いて、本出願人らは腸組織ライセートにおけるＩＬ−１βのレベルと血清ＧＣＳＦを相関させ、また、腸組織ライセートにおけるより高いＩＬ−１β発現を有する患者は、血清ＧＣＳＦのより高い検出可能なレベルを有することを見出した（図５Ｂ、スピアマン  ｒ＝０．５００、Ｐ＝０．１７７７）。これらのデータは、血清ＧＣＳＦが腸組織におけるＩＬ−１βタンパク質レベルの有用な代用バイオマーカーであることを示唆している。
【０２９５】
本出願人らは、複数の間質遺伝子及び筋肉遺伝子が、例えばＩＮＨＢＡやＬＭＣＤ１のような非線維性組織と比較して、線維性組織においてアップレギュレートされたことを見出した。加えて、細胞外マトリックスの代謝回転及び組織修復遺伝子（例えば、ＭＭＰ３、ＰＸＤＮ）、コラーゲン遺伝子（例えば、ＣＯｌ７Ａ１、ＣＯｌ５Ａ２、Ｃｏｌ１２Ａ１、Ｃｏｌ１８Ａ１）及びＷｎｔシグナル伝達標的遺伝子（例えば、ＴＭＥＭ１５８、ＣＨＮ１）は、線維性組織において、非線維性組織と比較してアップレギュレートされていた。以下の表３に、マイクロアレイ解析により決定された線維症遺伝子の同定を示す；タンパク質の位置もこの表に示す。本出願人らは更に、ＭＦ中のサイトカイン（例えば、ＩＬ２４、ＩＬ１１）、コラーゲン（例えば、ＣＯｌ７Ａ１、Ｃｏｌ１６Ａ１）及びＷＮＴシグナル伝達遺伝子（例えば、ＴＭＥＭ１５８、ＤＡＣＴ１）を含む幾つかの経路由来の、ＩＬ−１βに調節される遺伝子を見出した、ＭＦ中のＴＮＦ−αに誘導される遺伝子は、ケモカイン（例えば、ＩＬ−８、ＣＸＣＬ３）及び接着分子遺伝子（例えば、ＩＣＡＭ１）を含んだ。ＭＦ中のＩＬ−１β刺激は、腸線維形成中にアップレギュレートされる遺伝子（例えば、ＴＭＥＭ１５８、ＣＯｌ７Ａ１）と重複するコラーゲン及びＷＮＴシグナル伝達遺伝子を誘導することが観察された。これとは対照的に、腸線維症に関連する遺伝子は、ＭＦ中のＴＮＦ−αにより独自にアップレギュレートされることが見出されなかった。
表３：線維症遺伝子
2016521540.tif 000006
【０２９６】
マイクロアレイの結果を確認するために、ＩＨＣにより、ＳＭＡ染色用に使用されるものに隣接したＯＣＴ切片を分析した。切片は、ＳＭＡ用に病理学者によりスコア化された；通常、ＳＭＡ＋の試料は線維症のエビデンスを有すると考えられる。ｑＲＴ−ＰＣＲの結果を図６Ａ−Ｆに示す。本出願人らは、ＣＤ  ＳＭＡ−の切片又はコントロール切片と比較して、ＣＤ  ＳＭＡ＋切片で、アンフィレグリンとともにコラーゲンのサブタイプ７Ａ１及び１６Ａ１、ＩＬ−１１、ＡＥＢＰ１及びＩＬ１Ｒ１の発現が増加したことを見出し、これらのＩＬ−１βに誘導される遺伝子が線維性組織においてアップレギュレートされていることを実証した。
【０２９７】
実施例２：追加的バイオマーカー
表４に記載した患者コホートを用い、コンパレータとしてＵＣ及びＤＶＴを使用して、線維性／線維狭窄性（ｆＣＤ）及び炎症性ＣＤ（ｉＣＤ）を区別するために有用であり得る追加のバイオマーカーを調べた。対応する腸組織ライセートと血清試料を用いて、ＩＬ１８及びＩＬ−１８ＢＰのレベルについて各試料をＥＬＩＳＡによりアッセイした。ｆＣＤ患者は、ｉＣＤ患者と比較して、腸組織中のＩＬ１８の発現レベルがやや高かったが（図７Ａ、クラスカル・ウォリスの検定でｐ＜０．０５）、血清レベルに有意な差はないことが見出された（図７Ｂ）。何れの患者群においても組織と血清の間でＩＬ−１８ＢＰのレベルに有意差は認められなかった（図７Ｃ及び７Ｄ）。また、腸組織ライセート中のＩＬ−１８Ｂ対ＩＬ１８Ｐの比を調べた。図７Ｅに示された通り、ＩＬ１８対ＩＬ１８ＢＰ比は、ｉＣＤ患者に比べてｆＣＤ患者においてやや高かった（クラスカル・ウォリスの検定でｐ＜０．０５）。加えて、図７Ｆは、ｆＣＤ患者とｉＣＤ患者の血清ＩＬ１８ＢＰに対して腸ＩＬ１８レベルをプロットしたものを示す。
表４：患者特性
2016521540.tif 000007
【０２９８】
参照文献
Arend, W.P., G. Palmer, and C. Gabay. 2008. IL-1, IL-18, and IL-33 families of cytokines. Immunol Rev. 223:20-38.
Baldassano, R.N., J.P. Bradfield, D.S. Monos, C.E. Kim, J.T. Glessner, T. Casalunovo, E.C. Frackelton, F.G. Otieno, S. Kanterakis, J.L. Shaner, R.M. Smith, A.W. Eckert, L.J. Robinson, C.C. Onyiah, D.J. Abrams, R.M. Chiavacci, R. Skraban, M. Devoto, S.F. Grant, and H. Hakonarson. 2007. Association of the T300A non-synonymous variant of the ATG16L1 gene with susceptibility to paediatric Crohn’s disease. Gut. 56:1171-3.
Cadwell, K., J.Y. Liu, S.L. Brown, H. Miyoshi, J. Loh, J.K. Lennerz, C. Kishi, W. Kc, J.A. Carrero, S. Hunt, C.D. Stone, E.M. Brunt, R.J. Xavier, B.P. Sleckman, E. Li, N. Mizushima, T.S. Stappenbeck, and H.W.t. Virgin. 2008. A key role for autophagy and the autophagy gene Atg16l1 in mouse and human intestinal Paneth cells. Nature. 456:259-63.
Carter, K.W., J. Hung, B.L. Powell, S. Wiltshire, B.T. Foo, Y.C. Leow, B.M. McQuillan, M. Jennens, P.A. McCaskie, P.L. Thompson, J.P. Beilby, and L.J. Palmer. 2008. Association of Interleukin-1 gene polymorphisms with central obesity and metabolic syndrome in a coronary heart disease population. Hum Genet. 124:199-206.
Cassel, S.L., S. Joly, and F.S. Sutterwala. 2009. The NLRP3 inflammasome: A sensor of immune danger signals. Semin Immunol.
Ferrero-Miliani, L., O.H. Nielsen, P.S. Andersen, and S.E. Girardin. 2007. Chronic inflammation: importance of NOD2 and NALP3 in interleukin-1beta generation. Clin Exp Immunol. 147:227-35.
Kowluru, R.A., and S. Odenbach. 2004. Role of interleukin-1beta in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Br J Ophthalmol. 88:1343-7.
Kuballa, P., A. Huett, J.D. Rioux, M.J. Daly, and R.J. Xavier. 2008. Impaired autophagy of an intracellular pathogen induced by a Crohn’s disease associated ATG16L1 variant. PLoS One. 3:e3391.
Larsen, C.M., M. Faulenbach, A. Vaag, A. Volund, J.A. Ehses, B. Seifert, T. Mandrup-Poulsen, and M.Y. Donath. 2007. Interleukin-1-receptor antagonist in type 2 diabetes mellitus. N Engl J Med. 356:1517-26.
Lewis, E.C., and C.A. Dinarello. 2006. Responses of IL-18- and IL-18 receptor-deficient pancreatic islets with convergence of positive and negative signals for the IL-18 receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 103:16852-7.
Ludwiczek, O., A. Kaser, D. Novick, C.A. Dinarello, M. Rubinstein, and H. Tilg. 2005. Elevated systemic levels of free interleukin-18 (IL-18) in patients with Crohn’s disease. Eur Cytokine Netw. 16:27-33.
Ludwiczek, O., E. Vannier, I. Borggraefe, A. Kaser, B. Siegmund, C.A. Dinarello, and H. Tilg. 2004. Imbalance between interleukin-1 agonists and antagonists: relationship to severity of inflammatory bowel disease. Clin Exp Immunol. 138:323-9.
Monteleone, G., F. Trapasso, T. Parrello, L. Biancone, A. Stella, R. Iuliano, F. Luzza, A. Fusco, and F. Pallone. 1999. Bioactive IL-18 expression is up-regulated in Crohn’s disease. J Immunol. 163:143-7.
Perrier, S., F. Darakhshan, and E. Hajduch. 2006. IL-1 receptor antagonist in metabolic diseases: Dr Jekyll or Mr Hyde? FEBS Lett. 580:6289-94.
Saitoh, T., N. Fujita, M.H. Jang, S. Uematsu, B.G. Yang, T. Satoh, H. Omori, T. Noda, N. Yamamoto, M. Komatsu, K. Tanaka, T. Kawai, T. Tsujimura, O. Takeuchi, T. Yoshimori, and S. Akira. 2008. Loss of the autophagy protein Atg16L1 enhances endotoxin-induced IL-1beta production. Nature. 456:264-8.
Sandberg, J.O., A. Andersson, D.L. Eizirik, and S. Sandler. 1994. Interleukin-1 receptor antagonist prevents low dose streptozotocin induced diabetes in mice. Biochem Biophys Res Commun. 202:543-8.
Sidhu, S.S., B. Li, Y. Chen, F.A. Fellouse, C. Eigenbrot, and G. Fuh. 2004. Phage-displayed antibody libraries of synthetic heavy chain complementarity determining regions. J Mol Biol. 338:299-310.
Ten Hove, T., A. Corbaz, H. Amitai, S. Aloni, I. Belzer, P. Graber, P. Drillenburg, S.J. van Deventer, Y. Chvatchko, and A.A. Te Velde. 2001. Blockade of endogenous IL-18 ameliorates TNBS-induced colitis by decreasing local TNF-alpha production in mice. Gastroenterology. 121:1372-9.
Villani, A.C., M. Lemire, G. Fortin, E. Louis, M.S. Silverberg, C. Collette, N. Baba, C. Libioulle, J. Belaiche, A. Bitton, D. Gaudet, A. Cohen, D. Langelier, P.R. Fortin, J.E. Wither, M. Sarfati, P. Rutgeerts, J.D. Rioux, S. Vermeire, T.J. Hudson, and D. Franchimont. 2009. Common variants in the NLRP3 region contribute to Crohn’s disease susceptibility. Nat Genet. 41:71-6.
【図１Ａ】
2016521540.tif 000008
【図１Ｂ】
2016521540.tif 000009
【図１Ｃ】
2016521540.tif 000010
【図２】
2016521540.tif 000011
【図３Ａ−Ｄ】
2016521540.tif 000012
【図３Ｅ−Ｆ】
2016521540.tif 000013
【図４Ａ−Ｂ】
2016521540.tif 000014
【図５Ａ−Ｂ】
2016521540.tif 000015
【図６Ａ−Ｄ】
2016521540.tif 000016
【図６Ｅ−Ｆ】
2016521540.tif 000017
【図７Ａ−Ｂ】
2016521540.tif 000018
【図７Ｃ−Ｆ】
2016521540.tif 000019
【国際調査報告】
2016521540.tif 000020
2016521540.tif 000021
2016521540.tif 000022
2016521540.tif 000023
2016521540.tif 000024