(57)【要約】【課題】非侵襲的な胎児診断法が提供される。【解決手段】特に、母体サンプルから胎児細胞濃縮サンプルを得る方法および胎児ヌクレオチド配列または胎児遺伝子の発現について母体サンプルを評価する方法が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
母体サンプルを準備するステップと；
該母体サンプルを１つまたは複数の糖類に対して親和性を有する第１の固定相と接触させるステップと；
該第１の固定相に結合している、該母体サンプルの成分を該第１の固定相に結合していない該母体サンプルの成分から分離するステップと；
該第１の固定相に結合している、該母体サンプルの該成分を保持するステップと；
該母体サンプルをマトリックスメタロプロテアーゼ１４に対して親和性を有する単離可能に標識された親和性分子と接触させるステップと；
該単離可能に標識された親和性分子に結合している、該母体サンプルの成分を該単離可能に標識された親和性分子に結合していない該母体サンプルの成分から分離するステップと；
該単離可能に標識された親和性分子に結合している、該母体サンプルの該成分を保持し、それによって胎児細胞濃縮サンプルを得るステップとを含む、母体サンプルから胎児細胞濃縮サンプルを得る方法。
【請求項２】
前記母体サンプルを前記第１の固定相および前記第１の固定相と接触させるステップの前に：
サイズおよび／または密度によって該母体サンプルの成分を分離するステップと；
有核胎児赤血球の該サイズおよび／または密度を有する、該母体サンプルの分離された該成分を採取するステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サイズおよび／または密度によって前記母体サンプルの成分を前記分離するステップが、勾配遠心分離を使用して実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記１つまたは複数の糖類が、ガラクトースである、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記第１の固定相が、レクチン結合固定相である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記第１の固定相が、磁気ビーズを含む、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記単離可能に標識された親和性分子が、磁気ビーズに結合している、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記第１の固定相に結合している、前記母体サンプルの前記成分を保持した後に、該第１の固定相に結合している、該母体サンプルの該保持された成分を、マトリックスメタロプロテアーゼ１４に対して親和性を有する前記単離可能に標識された親和性分子と接触させる、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記母体サンプルをマトリックスメタロプロテアーゼ１４以外の胎児細胞表面マーカーに対して親和性を有する第２の固定相と接触させるステップと；
該第２の固定相に結合している該母体サンプルの成分を該第２の固定相に結合していない該母体サンプルの成分から分離するステップと；
該第２の固定相に結合している該母体サンプルの該成分を保持するステップとをさらに含む、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記胎児細胞表面マーカーが、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）、ＨＬＡ−Ｇ、ＥＧＦＲ、トロンボスポンジン受容体（ＣＤ３６）、ＣＤ３４、ＨｂＦ、ＨＡＥ  ９、ＦＢ３−２、Ｈ３−３、エリスロポエチン受容体、ＨＢＥ、ＡＦＰ、ＡＰＯＣ３、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＡＭＢＰ、ＣＰＢ２、ＩＴＩＨ１、ＡＰＯＨ、ＨＰＸ、β−ｈＣＧ、ＡＨＳＧ、ＡＰＯＢ、Ｊ４２−４−ｄ、２，３−ビスホスホグリセリン酸（ＢＰＧ）、炭酸脱水酵素（ＣＡ）およびチミジンキナーゼ（ＴＫ）からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記胎児細胞表面マーカーが、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記母体サンプルが、母体血サンプルである、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記胎児細胞濃縮サンプル中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、胎児細胞である、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記胎児細胞濃縮サンプルを準備するステップと；
該胎児細胞濃縮サンプル由来の１つまたは複数の細胞における核酸分子のヌクレオチド配列または遺伝子の発現を分析するステップとをさらに含む、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
核酸分子のヌクレオチド配列を前記分析するステップが、前記胎児細胞濃縮サンプル由来の１つまたは複数の細胞のゲノムＤＮＡをシークエンシングするステップを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ゲノムＤＮＡをシークエンシングするステップが、単一細胞の前記ＤＮＡをシークエンシングするステップを含み、単一細胞の該ＤＮＡをシークエンシングするステップが、前記胎児細胞濃縮サンプル由来の１つまたは複数の細胞に対して実施される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
単一細胞の前記ＤＮＡをシークエンシングするステップが、前記胎児細胞濃縮サンプル由来の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の細胞に対して実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
遺伝子の前記発現が、前記胎児細胞濃縮サンプル由来の１つまたは複数の細胞の表面に検出可能な抗体をハイブリダイズさせるステップを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
核酸分子のヌクレオチド配列を前記分析するステップが、前記胎児細胞濃縮サンプル由来の１つまたは複数の細胞の前記ゲノムＤＮＡに、検出可能なプローブをハイブリダイズさせるステップを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
１つまたは複数の個々の細胞が、分析される各細胞の前記ゲノムＤＮＡへの検出可能なプローブのハイブリダイゼーションについて分析される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の個々の細胞が、分析される各細胞の前記ゲノムＤＮＡへの検出可能なプローブのハイブリダイゼーションについて分析される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
母体サンプルを準備するステップと；
該母体サンプルを１つまたは複数の糖類に対して親和性を有する第１の固定相と接触させるステップと；
該第１の固定相に結合している、該母体サンプルの成分を該第１の固定相に結合していない該母体サンプルの成分から分離するステップと；
該第１の固定相に結合している、該母体サンプルの該成分を保持するステップと；
該母体サンプルを胎児細胞表面マーカーに対して親和性を有する単離可能に標識された親和性分子と接触させるステップと；
該単離可能に標識された親和性分子に結合している、該母体サンプルの成分を該単離可能に標識された親和性分子に結合していない該母体サンプルの成分から分離するステップと；
該単離可能に標識された親和性分子に結合している、該母体サンプルの該成分を保持して、分析用の胎児細胞濃縮サンプルを得るステップと；
該胎児細胞濃縮サンプルの２つ以上の細胞のそれぞれ個々の細胞における核酸分子のヌクレオチド配列または遺伝子の発現を決定するステップと；
該胎児細胞濃縮サンプルの２つ以上の細胞のそれぞれ個々の細胞について決定した核酸分子の該ヌクレオチド配列または遺伝子の発現を評価して、胎児ヌクレオチド配列または遺伝子発現を同定するステップとを含む、胎児ヌクレオチド配列または胎児遺伝子発現について母体サンプルを評価する方法。
【請求項２３】
前記胎児細胞濃縮サンプルの２つ以上の細胞のそれぞれ個々の細胞について決定した前記核酸分子のヌクレオチド配列または遺伝子の発現を評価するステップが、
該決定したヌクレオチド配列または遺伝子発現に基づいて各細胞を細胞の第１の集団もしくは細胞の第２の集団に属するように分類するステップと；
該細胞の第１および第２の集団が、胎児または母体起源のものである確率を同定するステップとを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１および第２の集団のそれぞれについて前記核酸分子のヌクレオチド配列もしくは遺伝子の発現を公知の母体細胞の公知の核酸分子のヌクレオチド配列もしくは遺伝子の発現と比較することによって、該細胞の第１および第２の集団が、胎児または母体起源のものである前記確率を同定し、該公知の母体細胞に対する類似性がより高いヌクレオチド配列もしくは遺伝子発現を有する細胞の該集団が母体起源のものとして同定される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞の第１および第２の集団が胎児または母体起源のものである前記確率が、該細胞の第１および第２の集団のサイズを評価することによって同定され、より大きな細胞集団が胎児起源のものと同定される、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
胎児細胞濃縮サンプルの２つ以上の細胞のそれぞれ個々の細胞における核酸分子のヌクレオチド配列もしくは遺伝子の発現を提供するステップを含む胎児ヌクレオチド配列または胎児遺伝子発現について母体サンプルを評価する方法であって、該胎児細胞濃縮サンプルが、
母体サンプルを準備するステップと；
該母体サンプルを１つまたは複数の糖類に対して親和性を有する第１の固定相と接触させるステップと；
該第１の固定相に結合している、該母体サンプルの成分を該第１の固定相に結合していない該母体サンプルの成分から分離するステップと；
該第１の固定相に結合している、該母体サンプルの該成分を保持するステップと；
該母体サンプルを胎児細胞表面マーカーに対して親和性を有する単離可能に標識された親和性分子と接触させるステップと；
該単離可能に標識された親和性分子に結合している、該母体サンプルの成分を該単離可能に標識された親和性分子に結合していない該母体サンプルの成分から分離するステップと；
該単離可能に標識された親和性分子に結合している、該母体サンプルの該成分を保持して、分析用の胎児細胞濃縮サンプルを得るステップと；
該胎児細胞濃縮サンプルの２つ以上の細胞のそれぞれ個々の細胞について決定した該核酸分子のヌクレオチド配列もしくは遺伝子の発現を評価して、胎児ヌクレオチド配列または遺伝子発現を同定するステップとを含む方法によって調製される方法。
【請求項２７】
前記第１および第２の集団のそれぞれについて前記核酸分子のヌクレオチド配列もしくは遺伝子の発現を公知の母体細胞の公知の核酸分子のヌクレオチド配列もしくは遺伝子の発現と比較することによって、前記細胞の第１および第２の集団が、胎児または母体起源のものである前記確率を同定し、該公知の母体細胞に対する類似性がより高いヌクレオチド配列もしくは遺伝子発現を有する細胞の該集団が母体起源のものとして同定される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞の第１および第２の集団が胎児または母体起源のものである前記確率が、該細胞の第１および第２の集団のサイズを評価することによって同定され、より大きな細胞集団が胎児起源のものと同定される、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記胎児細胞濃縮サンプルの調製方法が、前記母体サンプルを前記第１の固定相および前記第１の固定相と接触させるステップの前に：
サイズおよび／または密度によって該母体サンプルの成分を分離するステップと；
有核胎児赤血球の該サイズおよび／または密度を有する、該母体サンプルの分離された該成分を採取するステップとをさらに含む、請求項２２から２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
サイズおよび／または密度によって前記母体サンプルの成分を前記分離するステップが、勾配遠心分離を使用して実施される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記１つまたは複数の糖類が、ガラクトースである、請求項２２から３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の固定相が、レクチン結合固定相である、請求項２２から３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の固定相が、磁気ビーズを含む、請求項２２から３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記単離可能に標識された親和性分子が、磁気ビーズに結合している、請求項２２から３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記第１の固定相に結合している、前記母体サンプルの前記成分を保持した後に、該第１の固定相に結合している、該母体サンプルの該保持された成分を、前記単離可能に標識された親和性分子と接触させる、請求項２２から３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記胎児細胞濃縮サンプルの調製方法が、
前記母体サンプルを胎児細胞表面マーカーに対して親和性を有する第２の固定相と接触させるステップと；
該第２の固定相に結合している該母体サンプルの成分を該第２の固定相に結合していない該母体サンプルの成分から分離するステップと；
該第２の固定相に結合している該母体サンプルの該成分を保持するステップとをさらに含む、請求項２２から３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記胎児細胞表面マーカーが、ＭＭＰ１４（マトリックスメタロプロテアーゼ１４）、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）、ＨＬＡ−Ｇ、ＥＧＦＲ、トロンボスポンジン受容体（ＣＤ３６）、ＣＤ３４、ＨｂＦ、ＨＡＥ  ９、ＦＢ３−２、Ｈ３−３、エリスロポエチン受容体、ＨＢＥ、ＡＦＰ、ＡＰＯＣ３、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＡＭＢＰ、ＣＰＢ２、ＩＴＩＨ１、ＡＰＯＨ、ＨＰＸ、β−ｈＣＧ、ＡＨＳＧ、ＡＰＯＢ、Ｊ４２−４−ｄ、２，３−ビスホスホグリセリン酸（ＢＰＧ）、炭酸脱水酵素（ＣＡ）およびチミジンキナーゼ（ＴＫ）からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記胎児細胞表面マーカーが、ＭＭＰ１４（マトリックスメタロプロテアーゼ１４）またはトランスフェリン受容体（ＣＤ７１）である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記母体サンプルが、母体血サンプルである、請求項２２から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記胎児細胞濃縮サンプル中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、胎児細胞である、請求項２２から３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記胎児細胞濃縮サンプルの調製方法が、
該胎児細胞濃縮サンプルを準備するステップと；
該胎児細胞濃縮サンプル由来の２つ以上の細胞における核酸分子のヌクレオチド配列または遺伝子の発現を分析するステップとをさらに含む、請求項２２から４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
核酸分子のヌクレオチド配列を前記分析するステップが、前記胎児細胞濃縮サンプル由来の２つ以上の細胞のゲノムＤＮＡをシークエンシングするステップを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ゲノムＤＮＡを前記シークエンシングするステップが、単一細胞の前記ＤＮＡをシークエンシングするステップを含み、単一細胞の該ＤＮＡをシークエンシングするステップが、前記胎児細胞濃縮サンプル由来の２つ以上の細胞に対して実施される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
単一細胞の前記ＤＮＡをシークエンシングするステップが、前記胎児細胞濃縮サンプル由来の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の細胞に対して実施される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
遺伝子の前記発現が、前記胎児細胞濃縮サンプル由来の２つ以上の細胞の表面に検出可能な抗体をハイブリダイズさせるステップを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
核酸分子のヌクレオチド配列を前記分析するステップが、前記胎児細胞濃縮サンプル由来の２つ以上の細胞の前記ゲノムＤＮＡに検出可能なプローブをハイブリダイズさせるステップを含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
１つまたは複数の個々の細胞が、分析される各細胞の前記ゲノムＤＮＡへの検出可能なプローブのハイブリダイゼーションについて分析される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の個々の細胞が、分析される各細胞の前記ゲノムＤＮＡへの検出可能なプローブのハイブリダイゼーションについて分析される、請求項４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先出願の参照による援用
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で２０１３年５月１６日に出願の米国仮特許出願第６１／８２４，１２８号の優先権を主張し、その全体を参照により本明細書に明示的に組み込む。
【背景技術】
【０００２】
出生前診断は、胎児の状態に関する役に立つ情報を提供し得る。一般に、出生前診断は、胎児に危険性がある侵襲的技術を使用して実施される。
【０００３】
さらに最近では、胎性遺伝物質が、母体の循環血液内に見出されている。この胎性遺伝物質は胎児を起源とし、胎盤を横断して母体の循環系に入る。
【０００４】
胎児ＤＮＡの非侵襲的な供給源の主要な２つは、母体血漿および循環胎児細胞である。胎性遺伝物質は、妊娠初期に母体血中に検出することができる。無細胞胎児ＤＮＡを利用することによる非侵襲的な診断戦略がいくつか開発されてきた。しかしながら、定量化アッセイよると、胎児ＤＮＡは、妊娠初期および後期のそれぞれで全血漿ＤＮＡの約３．４％および約６．２％しか占めない。胎児の遺伝情報の半分は父親に由来し、その遺伝情報は母体ＤＮＡに凌駕されることになるので、正確なアッセイには技術的な課題がある。加えて、胎児無細胞ＤＮＡは、細胞膜に保護されていないので、ＤＮＡフラグメントは、完全なゲノムと比較して短く不完全である。母体血由来の胎児細胞はというと、１０６〜１０７個の母体細胞中に胎児細胞１個程度と少ない可能性がある、その存在量の乏しさゆえに単離することも困難である。分析のため十分な胎児細胞を得るために濃縮技術が使用される。その少ない数のため、母体血サンプルから胎児細胞を濃縮し、精製することは技術的に困難である。これらの課題により、胎児の診断法が最終的に複雑になる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、改善された非侵襲的な胎児の診断法を開発した。特に、母体サンプルから胎児細胞濃縮サンプルを得る方法および胎児ヌクレオチド配列または胎児遺伝子の発現について母体サンプルを評価する方法が提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一部の実施形態において、母体サンプルを準備するステップと；母体サンプルを１つまたは複数の糖類に対して親和性を有する第１の固定相と接触させるステップと；第１の固定相に結合している母体サンプルの成分を第１の固定相に結合していない母体サンプルの成分から分離するステップと；第１の固定相に結合している母体サンプルの成分を保持するステップと；母体サンプルをマトリックスメタロプロテアーゼ１４に対して親和性を有する単離可能に標識された親和性分子と接触させるステップと；単離可能に標識された親和性分子に結合している母体サンプルの成分を単離可能に標識された親和性分子に結合していない母体サンプルの成分から分離するステップと；単離可能に標識された親和性分子に結合している母体サンプルの成分を保持し、それによって胎児細胞濃縮サンプルを得るステップとを含む、母体サンプルから胎児細胞濃縮サンプルを得る方法が本明細書に提供される。そのような実施形態の一部は、母体サンプルを前記第１の固定相および前記第１の固定相と接触させるステップの前に：サイズおよび／または密度によって母体サンプルの成分を分離するステップと；有核胎児赤血球のサイズおよび／または密度を有する、母体サンプルの分離された成分を採取するステップとをさらに含む。一部の実施形態において、サイズおよび／または密度によって母体サンプルの成分を分離するステップは、勾配遠心分離を使用して実施される。一部の実施形態において、１つまたは複数の糖類は、ガラクトースである。一部の実施形態において、第１の固定相は、レクチン結合固定相である。一部の実施形態において、第１の固定相は、磁気ビーズを含む。一部の実施形態において、単離可能に標識された親和性分子は、磁気ビーズに結合している。一部の実施形態において、第１の固定相に結合している母体サンプルの成分を保持した後に、第１の固定相に結合している母体サンプルの保持された成分を、マトリックスメタロプロテアーゼ１４に対して親和性を有する単離可能に標識された親和性分子と接触させる。一部の実施形態は、母体サンプルをマトリックスメタロプロテアーゼ１４以外の胎児細胞表面マーカーに対して親和性を有する第２の固定相と接触させるステップと；第２の固定相に結合している母体サンプルの成分を第２の固定相に結合していない母体サンプルの成分から分離するステップと；第２の固定相に結合している母体サンプルの成分を保持するステップとをさらに含む。一部の実施形態において、胎児細胞表面マーカーは、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）、ＨＬＡ−Ｇ、ＥＧＦＲ、トロンボスポンジン受容体（ＣＤ３６）、ＣＤ３４、ＨｂＦ、ＨＡＥ  ９、ＦＢ３−２、Ｈ３−３、エリスロポエチン受容体、ＨＢＥ、ＡＦＰ、ＡＰＯＣ３、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＡＭＢＰ、ＣＰＢ２、ＩＴＩＨ１、ＡＰＯＨ、ＨＰＸ、β−ｈＣＧ、ＡＨＳＧ、ＡＰＯＢ、Ｊ４２−４−ｄ、２，３−ビスホスホグリセリン酸（ＢＰＧ）、炭酸脱水酵素（ＣＡ）およびチミジンキナーゼ（ＴＫ）からなる群から選択される。一部の実施形態において、胎児細胞表面マーカーは、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）である。一部の実施形態において、母体サンプルは、母��血サンプルである。一部の実施形態において、胎児細胞濃縮サンプル中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、胎児細胞である。一部の実施形態は、胎児細胞濃縮サンプルを準備するステップと；胎児細胞濃縮サンプル由来の１つまたは複数の細胞における核酸分子のヌクレオチド配列または遺伝子の発現を分析するステップとをさらに含む。一部の実施形態において、核酸分子のヌクレオチド配列を分析するステップは、胎児細胞濃縮サンプル由来の１つまたは複数の細胞のゲノムＤＮＡをシークエンシングするステップを含む。一部の実施形態において、ゲノムＤＮＡをシークエンシングするステップは、単一細胞のＤＮＡをシークエンシングするステップを含み、単一細胞のＤＮＡをシークエンシングするステップは、胎児細胞濃縮サンプル由来の１つまたは複数の細胞に対して実施される。一部の実施形態において、単一細胞のＤＮＡをシークエンシングするステップは、胎児細胞濃縮サンプル由来の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の細胞に対して実施される。一部の実施形態において、遺伝子の発現は、胎児細胞濃縮サンプル由来の１つまたは複数の細胞の表面に、検出可能な抗体をハイブリダイズさせるステップを含む。一部の実施形態において、核酸分子のヌクレオチド配列を分析するステップは、胎児細胞濃縮サンプル由来の１つまたは複数の細胞のゲノムＤＮＡに、検出可能なプローブをハイブリダイズさせるステップを含む。一部の実施形態において、１つまたは複数の個々の細胞が、分析される各細胞のゲノムＤＮＡへの検出可能なプローブのハイブリダイゼーションについて分析される。一部の実施形態において、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の個々の細胞が、分析される各細胞のゲノムＤＮＡへの検出可能なプローブのハイブリダイゼーションについて分析される。
【０００７】
母体サンプルを準備するステップと；母体サンプルを１つまたは複数の糖類に対して親和性を有する第１の固定相と接触させるステップと；第１の固定相に結合している母体サンプルの成分を第１の固定相に結合していない母体サンプルの成分から分離するステップと；第１の固定相に結合している母体サンプルの成分を保持するステップと；母体サンプルを胎児細胞表面マーカーに対して親和性を有する単離可能に標識された親和性分子と接触させるステップと；単離可能に標識された親和性分子に結合している母体サンプルの成分を単離可能に標識された親和性分子に結合していない母体サンプルの成分から分離するステップと；単離可能に標識された親和性分子に結合している母体サンプルの成分を保持して、分析用の胎児細胞濃縮サンプルを提供するステップと、胎児細胞濃縮サンプルの２つ以上の細胞のそれぞれ個々の細胞における核酸分子のヌクレオチド配列または遺伝子の発現を決定するステップと；胎児細胞濃縮サンプルの２つ以上の細胞のそれぞれ個々の細胞について決定した核酸分子のヌクレオチド配列または遺伝子の発現を評価して、胎児ヌクレオチド配列または遺伝子発現を同定するステップとを含む胎児ヌクレオチド配列または胎児遺伝子発現について母体サンプルを評価する方法も本明細書に提供される。一部の実施形態において、胎児細胞濃縮サンプルの２つ以上の細胞のそれぞれ個々の細胞について決定した核酸分子のヌクレオチド配列または遺伝子の発現を評価するステップは、決定したヌクレオチド配列または遺伝子発現に基づいて各細胞を細胞の第１の集団もしくは細胞の第２の集団に属するように分類するステップと；細胞の第１および第２の集団が胎児または母体起源のものである確率を同定するステップとを含む。一部の実施形態において、第１および第２の集団のそれぞれについて核酸分子のヌクレオチド配列もしくは遺伝子の発現を公知の母体細胞の公知の核酸分子のヌクレオチド配列もしくは遺伝子の発現と比較することによって、細胞の第１および第２の集団が、胎児または母体起源のものである確率を同定し、公知の母体細胞に対する類似性がより高いヌクレオチド配列または遺伝子発現を有する細胞の集団が母体起源のものと同定される。一部の実施形態において、細胞の第１および第２の集団が胎児または母体起源のものである確率は、細胞の第１および第２の集団のサイズを評価することによって同定され、より大きな細胞集団が胎児起源のものと同定される。
【０００８】
胎児細胞濃縮サンプルの２つ以上の細胞のそれぞれ個々の細胞における核酸分子のヌクレオチド配列または遺伝子の発現を提供するステップを含む、胎児ヌクレオチド配列または胎児遺伝子発現について母体サンプルを評価する方法も提供され、胎児細胞濃縮サンプルは、母体サンプルを準備するステップと；母体サンプルを１つまたは複数の糖類に対して親和性を有する第１の固定相と接触させるステップと；第１の固定相に結合している母体サンプルの成分を第１の固定相に結合していない母体サンプルの成分から分離するステップと；第１の固定相に結合している母体サンプルの成分を保持するステップと；母体サンプルを胎児細胞表面マーカーに対して親和性を有する単離可能に標識された親和性分子と接触させるステップと；単離可能に標識された親和性分子に結合している母体サンプルの成分を単離可能に標識された親和性分子に結合していない母体サンプルの成分から分離するステップと；単離可能に標識された親和性分子に結合している母体サンプルの成分を保持して、分析用の胎児細胞濃縮サンプルを得るステップと；胎児細胞濃縮サンプルの２つ以上の細胞のそれぞれ個々の細胞について決定した核酸分子のヌクレオチド配列または遺伝子の発現を評価して、胎児ヌクレオチド配列または遺伝子発現を同定するステップとを含む方法によって調製された。一部の実施形態において、第１および第２の集団のそれぞれについて核酸分子のヌクレオチド配列もしくは遺伝子の発現を公知の母体細胞の公知の核酸分子のヌクレオチド配列もしくは遺伝子の発現と比較することによって、細胞の第１ならびに第２の集団が、胎児または母体起源のものである確率を同定し、公知の母体細胞に対する類似性がより高いヌクレオチド配列または遺伝子発現を有する細胞の集団が母体起源のものとして同定される。一部の実施形態において、細胞の第１および第２の集団が胎児または母体起源のものである確率は、細胞の第１および第２の集団のサイズを評価することによって同定され、より大きな細胞集団が胎児起源のものと同定される。一部の実施形態において、胎児細胞濃縮サンプルの調製方法は、母体サンプルを前記第１の固定相および前記第１の固定相と接触させるステップの前に：サイズおよび／または密度によって母体サンプルの成分を分離するステップと；有核胎児赤血球のサイズおよび／または密度を有する、母体サンプルの分離された成分を採取するステップとをさらに含む。
【０００９】
本明細書に提供される方法の一部の実施形態において、サイズおよび／または密度によって母体サンプルの成分を分離するステップは、勾配遠心分離を使用して実施される。一部の実施形態において、１つまたは複数の糖類は、ガラクトースである。一部の実施形態において、第１の固定相は、レクチン結合固定相である。一部の実施形態において、第１の固定相は、磁気ビーズを含む。一部の実施形態において、単離可能に標識された親和性分子は、磁気ビーズに結合している。一部の実施形態において、第１の固定相に結合している母体サンプルの成分を保持した後に、第１の固定相に結合している母体サンプルの保持された成分を、単離可能に標識された親和性分子と接触させる。一部の実施形態において、胎児細胞濃縮サンプルの調製方法は、母体サンプルを胎児細胞表面マーカーに対して親和性を有する第２の固定相と接触させるステップと；第２の固定相に結合している母体サンプルの成分を第２の固定相に結合していない母体サンプルの成分から分離するステップと；第２の固定相に結合している母体サンプルの成分を保持するステップとをさらに含む。一部の実施形態において、胎児細胞表面マーカーは、ＭＭＰ１４（マトリックスメタロプロテアーゼ１４）、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）、ＨＬＡ−Ｇ、ＥＧＦＲ、トロンボスポンジン受容体（ＣＤ３６）、ＣＤ３４、ＨｂＦ、ＨＡＥ  ９、ＦＢ３−２、Ｈ３−３、エリスロポエチン受容体、ＨＢＥ、ＡＦＰ、ＡＰＯＣ３、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＡＭＢＰ、ＣＰＢ２、ＩＴＩＨ１、ＡＰＯＨ、ＨＰＸ、β−ｈＣＧ、ＡＨＳＧ、ＡＰＯＢ、Ｊ４２−４−ｄ、２，３−ビスホスホグリセリン酸（ＢＰＧ）、炭酸脱水酵素（ＣＡ）およびチミジンキナーゼ（ＴＫ）からなる群から選択される。一部の実施形態において、胎児細胞表面マーカーは、ＭＭＰ１４（マトリックスメタロプロテアーゼ１４）またはトランスフェリン受容体（ＣＤ７１）である。一部の実施形態において、母体サンプルは、母体血サンプルである。一部の実施形態において、胎児細胞濃縮サンプル中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％は、胎児細胞である。一部の実施形態において、胎児細胞濃縮サンプルの調製方法は、胎児細胞濃縮サンプルを準備するステップと；胎児細胞濃縮サンプル由来の２つ以上の細胞における核酸分子のヌクレオチド配列または遺伝子の発現を分析するステップとをさらに含む。一部の実施形態において、核酸分子のヌクレオチド配列を分析するステップは、胎児細胞濃縮サンプル由来の２つ以上の細胞のゲノムＤＮＡをシークエンシングするステップを含む。一部の実施形態において、ゲノムＤＮＡをシークエンシングするステップは、単一細胞のＤＮＡをシークエンシングするステップを含み、単一細胞のＤＮＡをシークエンシングするステップは、胎児細胞濃縮サンプル由来の２つ以上の細胞に対して実施される。一部の実施形態において、単一細胞のＤＮＡをシークエンシングするステップは、胎児細胞濃縮サンプル由来の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の細胞に対して実施される。一部の実施形態において、遺伝子の発現は、胎児細胞濃縮サンプル由来の２つ以上��細胞の表面に、検出可能な抗体をハイブリダイズさせるステップを含む。一部の実施形態において、核酸分子のヌクレオチド配列を分析するステップは、胎児細胞濃縮サンプル由来の２つ以上の細胞のゲノムＤＮＡに、検出可能なプローブをハイブリダイズさせるステップを含む。一部の実施形態において、１つまたは複数の個々の細胞が、分析される各細胞のゲノムＤＮＡへの検出可能なプローブのハイブリダイゼーションについて分析される。一部の実施形態において、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の個々の細胞が、分析される各細胞のゲノムＤＮＡへの検出可能なプローブのハイブリダイゼーションについて分析される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】母体血サンプルから濃縮された有核胎児赤血球を得る手順の例を表す図である。
【００１１】
【図２】有核胎児赤血球濃縮サンプルの２つ以上の細胞のそれぞれ個々の細胞について決定した核酸分子のヌクレオチド配列または遺伝子の発現を評価する手順の例を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明者らは、改善された非侵襲的な胎児の診断法を開発した。特に、母体サンプルから胎児細胞濃縮サンプルを得る方法および胎児ヌクレオチド配列または胎児遺伝子の発現について母体サンプルを評価する方法が提供される。
【００１３】
この胎児物質は、発達している胎児の性別および遺伝的性質についての情報源である。胎性遺伝物質は、妊娠初期に母体血中に検出することができる。本明細書に提供される方法は、高純度で母体血から胎児細胞を単離するのに効果的な手順を含む。一部の実施形態は、例えば、密度勾配遠心分離によって多くの母体無核細胞の除去を容易にする最初の濃縮ステップを含む。その後の胎児細胞の精製または濃縮は、親和性に基づく分離を含むことができる。例として、有核胎児赤血球前駆細胞は、細胞表面に多数のガラクトース分子を発現し、その分子をレクチンによって捕捉することができる。したがって、ダイズ凝集素（ＳＢＡ）などのレクチンを使用して、Ｋｉｔａｇａｗａら、２００２、Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ  ２２：１７〜２１頁に提供される方法など公知の方法を使用して有核胎児細胞を濃縮することができる。別の例として、有核胎児細胞は、さらなる濃縮に使用できる様々な細胞表面マーカーを有する。そのような実施形態の１つにおいて、マトリックスメタロプロテアーゼ１４（ＭＭＰ１４またはＭＭＰ−Ｘ１）前駆体および／またはトランスフェリン受容体（ＣＤ７１）を使用して、高い特異性と高い回収率の両方で胎児細胞を濃縮することができる。使用し得るさらなるマーカーには、それだけには限らないが、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）、トロンボスポンジン受容体（ＣＤ３６）、ＣＤ３４、ＨｂＦ、ＨＡＥ  ９、ＦＢ３−２、Ｈ３−３およびエリスロポエチン受容体がある。さらなる、任意選択のステップとして、例えば、ＣＤ４７、ＣＤ４５、ＣＤ３５、ＣＤ１２、ＣＤ１４、ＣＤ３２を使用する負の選択を含むことができ、それを使用して、母体赤血球を特異的に結合し、それにより除去することができる。
【００１４】
母体血サンプルから濃縮された有核胎児赤血球を得る手順の例が、図１に提供され、その手順は、（１）密度勾配遠心分離を使用するサイズ／密度選択、（２）ダイズ凝集素を使用するレクチン選択、および（３）例えば、抗ＭＭＰ１４抗体を使用する細胞表面マーカーに基づく磁気ビーズ部分を含む。
【００１５】
有核胎児赤血球濃縮サンプルの２つ以上の細胞のそれぞれ個々の細胞について決定した核酸分子のヌクレオチド配列または遺伝子の発現を評価する手順の例が図２に提供され、その手順は、（１）有核胎児赤血球濃縮サンプルから約１０〜１００個の細胞を得るステップと、（２）各ウェルが１または０個の細胞を含有するように９６ウェルプレートに細胞を分離する（図において細胞を含有するウェルは、緑色のウェルとして示される）ステップと、（３）分離した細胞を、各個別のウェルについて核酸分子のヌクレオチド配列または遺伝子の発現を決定するアッセイに供するステップとを含む。
【００１６】
母体サンプル
１つまたは複数の有核胎児細胞を含有する母体サンプルは、診断もしくは予後診断が実施されるべき任意の動物からまたは診断もしくは予後診断が実施されるべき胎児を妊娠した動物から得ることができる。一実施形態において、サンプルは、妊娠が疑われる、妊娠している、または妊娠していた雌の動物から得ることができる。動物がヒトである場合、サンプルは、第１のトリメスター（妊娠の最初の約３カ月）、第２のトリメスター（妊娠の約４〜６カ月）または第３のトリメスター（妊娠の約７〜９カ月）中に採取することができる。本発明の動物は、ヒトまたはウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジもしくはヤギなどの家畜であることができる。一般に、得られるサンプルは、血液サンプルである。他のサンプルには、膣分泌物、子宮頚部スワブおよび尿があり得る。したがって、例えば、母体血サンプルなどの母体サンプルは、妊娠中の雌性のヒトもしくはヒト以外の哺乳動物から得ることができ、それを使用して妊娠中の雌性のヒトまたはヒト以外の哺乳動物内の胎児の状態を調査することができる。
【００１７】
動物から母体サンプル（例えば、血液サンプル）を得る場合、サンプルの量は、動物のサイズ、在胎期間およびスクリーニングされる条件に応じて変化し得る。一実施形態において、最高２００、１７５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０または５ｍＬのサンプルが得られる。一実施形態において、５〜２００、１０〜１００または３０〜５０ｍＬのサンプルが得られる。一実施形態において、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１５０ｍＬ超のサンプルが得られる。一実施形態において、妊娠した雌から約１０〜１００または３０〜５０ｍＬの間の末梢血サンプルが得られる。一部の実施形態において、血液サンプルは、受胎の３６、２４、２２、２０、１８、１６、１４、１２、１０、８、６もしくは４週目以内または妊娠が終了した後にも、妊娠したヒトもしくはヒト以外の動物から得られる。
【００１８】
サンプル濃縮／精製
サンプルは、サンプルの全成分と比較して有核胎児細胞を濃縮するおよび／またはサンプル中の全細胞と比較して有核胎児細胞を濃縮する１つまたは複数のステップに供される。
【００１９】
母体血サンプルから濃縮された有核胎児赤血球を得る手順の例が、図１に提供され、その手順は、（１）密度勾配遠心分離を使用するサイズ／密度選択、（２）ダイズ凝集素を使用するレクチン選択、および（３）例えば、抗ＭＭＰ１４抗体を使用する細胞表面マーカーに基づく磁気ビーズ部分を含む。この例の方法の変形が、本明細書に提供される教示にしたがって実施され得る。
【００２０】
密度勾配遠心分離
密度勾配遠心分離は、混合物中にある細胞型の異なる密度に基づいて細胞を分離する方法である。本方法を使用して、使用される勾配物質の特定の密度より軽いかまたは重いかいずれかの細胞を含有する区画に細胞を分離することができる。密度勾配遠心分離は、一連の異なる密度勾配に基づく反復ステップによってまたは親和性分離、細胞パニング、細胞ソートなどのような他の分離法と組み合わせて実行することができる。一部の実施形態において、密度勾配遠心分離は、異なる勾配密度の複数の層を使用して実施することができる。この方法により、遠心分離後に、異なる密度の細胞は、それに対応する密度でゾーンまたはバンドを形成することができる。１つまたは複数の異なるゾーンにある細胞は、適当な位置にピペットを配置することによって採集することができる。密度勾配遠心分離によって特定の細胞型を濃縮する方法は、米国特許第５，８４０，５０２号に記述されており、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【００２１】
密度勾配遠心分離を使用して試料中の胎児細胞を同定する方法には、密度勾配媒体を利用する。密度勾配媒体は、コロイド状のポリビニルピロリドン被覆した二酸化ケイ素（例えばＰｅｒｃｏｌＤ、Ｎｙｃｏｄｅｎｚ）、単独の（Ｆｉｃｏｌｌ）もしくはジアトリゾエートナトリウムを含む（例えばＦｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅまたはＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ）非イオン性ポリスクロース、またはそれらの混合物であることができる。用いる試薬の密度は、非細胞性成分および無核赤血球など他の血液成分から対象の有核胎児細胞を分離するように選択される。
【００２２】
サイズに基づく濃縮
一部の実施形態において、希少な細胞の濃縮は、１つまたは複数のサイズに基づく分離法を使用して生ずる。サイズに基づく分離モジュールの例には、濾過膜、分子ふるいおよびマトリックスがある。本発明によって考えられる、サイズに基づく分離モジュールの例としては、国際公開番号ＷＯ  ２００４／１１３８７７に開示されるものがあり、その全体を参照により本明細書に組み込む。他のサイズに基づく分離法が、国際公開番号ＷＯ  ２００４／０１４４６５１ならびに米国特許出願公開第２００８０１３８８０９（Ａ１）号および同第２００８０２２０４２２（Ａ１）号に開示され、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【００２３】
親和性に基づく濃縮
一部の実施形態において、有核胎児細胞は、結合部分または親和性分子に対してそれらの親和性に基づいて濃縮することができる。そのような実施形態において、結合部分は単離可能に標識されて、母体サンプルの望ましくない成分からの有核胎児細胞の分離を容易にする。例えば、有核胎児細胞に対して親和性を持つ結合部分は、有核胎児細胞を結合することができ、その結合部分を磁気ビーズもしくはクロマトグラフィー物質の固相などの固体支持体に結合させることによりそれを使用して有核胎児細胞を分離することができ、または有核胎児細胞の検出支援濃縮によって有核胎児細胞を他のサンプル成分から区別できるように、結合部分を検出可能に標識することができる。
【００２４】
一部の実施形態において、親和法は、胎児細胞表面マーカーに対して親和性を有する単離可能に標識された結合部分または親和性分子を使用するステップを含む。例えば、結合部分または親和性分子は、固定相、発蛍光団、放射性核種もしくは他の検出可能な部分に結合させることができ、胎児有核細胞は結合部分もしくは親和性分子に特異的に結合できるがサンプルの他の成分は結合部分もしくは親和性分子に特異的に結合しない条件下で、サンプルを単離可能に標識された結合部分または親和性分子と接触させることができる。接触させた、単離可能に標識された結合部分または親和性分子を次いで例えば光学ピンセット、磁気スタンド、密度遠心分離、フローサイトメトリーおよびサイズに基づく液体クロマトグラフィーを使用して処理して、単離可能に標識された結合部分もしくは親和性分子に結合している母体サンプルの成分を単離可能に標識された結合部分もしくは親和性分子に結合していない母体サンプルの成分から分離することができる。結合している母体サンプルの成分を任意選択で洗浄して、非特異的に結合した成分を除去することができる。次いで、胎児有核細胞を含む単離可能に標識された結合部分もしくは親和性分子に結合しているサンプルの成分を保持または採取して、さらに濃縮もしくは分析することができる。
【００２５】
結合部分には、例えば、有核胎児細胞に特異的に結合するタンパク質、核酸および炭水化物があり得る。一実施形態において、結合部分は、ガラクトースなど１つまたは複数の炭水化物に対して親和性を有する。例えば、結合部分は、レクチンであり得る。他の実施形態において、結合部分は、抗体である。そのような結合部分抗体の例には、抗マトリックスメタロプロテアーゼ１４（抗ＭＭＰ１４）、抗トランスフェリン受容体（抗ＣＤ７１）、抗グリコホリンＡ（抗ＧＰＡ）、抗トロンボスポンジン受容体（抗ＣＤ３６）、抗ＣＤ３４、抗ＨｂＦ、抗ＨＡＥ９、抗ＦＢ３−２、抗Ｈ３−３、抗エリスロポエチン受容体、抗ＣＤ２３５ａ、抗炭水化物、抗セレクチン、抗ＣＤ４５、抗ＧＰＡ、抗抗原−ｉ、抗ＥｐＣＡＭ、抗Ｅカドヘリン、抗Ｍｕｃ−１、抗ｈＰＬ、抗ＣＨＳ２、抗ＫＩＳＳ１、抗ＧＤＦ１５、抗ＣＲＨ、抗ＴＦＰ１２、抗ＣＧＢ、抗ＬＯＣ９０６２５、抗ＦＮ１、抗ＣＯＬ１Ａ２、抗ＰＳＧ９、抗ＰＳＧ１、抗ＨＢＥ、抗ＡＦＰ、抗ＡＰＯＣ３、抗ＳＥＲＰＩＮＣ１、抗ＡＭＢＰ、抗ＣＰＢ２、抗ＩＴＩＨ１、抗ＡＰＯＨ、抗ＨＰＸ、抗β−ｈＣＧ、抗ＡＨＳＧ、抗ＡＰＯＢ、抗Ｊ４２−４−ｄ、抗２，３−ビスホスホグリセリン酸（抗ＢＰＧ）、抗炭酸脱水酵素（抗ＣＡ）または抗チミジンキナーゼ（抗ＴＫ）がある。
【００２６】
一実施形態において、有核胎児細胞は、抗ＭＭＰ１４、抗ＣＤ７１および／または抗ＧＰＡ選択を使用して濃縮される。別の実施形態において、トロホブラストは、抗ＨＬＡ−Ｇまたは抗ＥＧＦＲ選択を使用して濃縮される。別の実施形態において、有核胎児細胞は、ＭＭＰ１４、ＣＤ７１、ＧＰＡ、ＨＬＡ−Ｇ、ＥＧＦＲ、ＣＤ３６、ＣＤ３４、ＨｂＦ、ＨＡＥ  ９、ＦＢ３−２、Ｈ３−３、エリスロポエチン受容体、ＨＢＥ、ＡＦＰ、ＡＰＯＣ３、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＡＭＢＰ、ＣＰＢ２、ＩＴＩＨ１、ＡＰＯＨ、ＨＰＸ、β−ｈＣＧ、ＡＨＳＧ、ＡＰＯＢ、Ｊ４２−４−ｄ、ＢＰＧ、ＣＡまたはＴＫ遺伝子から発現されるタンパク質を結合できる１つまたは複数の抗体または抗体フラグメントを使用して濃縮される。
【００２７】
固定相に基づく濃縮
一部の実施形態において、親和性クロマトグラフィー法を使用することができる。例えば、結合部分または親和性分子を、ビーズ、カラムもしくは粒子などの固定相に結合させることができ、胎児有核細胞は結合部分もしくは親和性分子に特異的に結合できるがサンプルの他の成分は結合部分もしくは親和性分子に特異的に結合しない条件下で、サンプルを親和性分子に結合した固定相と接触させることができる。接触させた固定相は、次いで例えば移動相を使用して処理して、親和性分子を結合した固定相に結合している母体サンプルの成分を親和性分子が結合した固定相に結合していない母体サンプルの成分から分離することができる。次いで、胎児有核細胞を含む親和性分子を結合した固定相に結合しているサンプルの成分を保持または採取して、さらに濃縮もしくは分析することができる。
【００２８】
一実施形態において、磁気粒子を使用して有核胎児細胞を濃縮する。一実施形態において、抗体などの結合部分は、磁気粒子（例えば、磁気ビーズ）と結合させることができる。一実施形態において、ビーズは、抗体もしくは抗体のフラグメントに結合され、それらは抗ＭＭＰ１４、抗ＣＤ７１、抗ＧＰＡ、抗ＣＤ３６、抗ＣＤ３４、抗ＨｂＦ、抗ＨＡＥ９、抗ＦＢ３−２、抗Ｈ３−３、抗エリスロポエチン受容体、抗ＣＤ２３５ａ、抗炭水化物、抗セレクチン、抗ＣＤ４５、抗ＧＰＡ、抗抗原−ｉ、抗ＥｐＣＡＭ、抗Ｅ−カドヘリン、抗Ｍｕｃ−１、抗ｈＰＬ、抗ＣＨＳ２、抗ＫＩＳＳ１、抗ＧＤＦ１５、抗ＣＲＨ、抗ＴＦＰ１２、抗ＣＧＢ、抗ＬＯＣ９０６２５、抗ＦＮ１、抗ＣＯＬ１Ａ２、抗ＰＳＧ９、抗ＰＳＧ１、抗ＨＢＥ、抗ＡＦＰ、抗ＡＰＯＣ３、抗ＳＥＲＰＩＮＣ１、抗ＡＭＢＰ、抗ＣＰＢ２、抗ＩＴＩＨ１、抗ＡＰＯＨ、抗ＨＰＸ、抗β−ｈＣＧ、抗ＡＨＳＧ、抗ＡＰＯＢ、抗−Ｊ４２−４−ｄ、抗ＢＰＧ、抗ＣＡまたは抗ＴＫ抗体もしくは抗体のフラグメントである。
【００２９】
濃縮の効率
一部の実施形態において、濃縮された産物でさえ、対象ではない細胞（例えば、母体有核赤血球（nucleated maternal red blood cell））が優勢である場合がある（＞５０％）。一部の場合に、濃縮サンプルの有核胎児細胞は、濃縮サンプル中の全ての細胞の少なくとも２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または９５％を占める。例えば、本明細書に記述される方法およびシステムを使用して、濃縮されたサンプルが合計約５００個の細胞を有し、その２％が有核胎児細胞であり、残りの細胞が母体細胞であるように、妊娠したヒト由来の母体血サンプル２０ｍＬを有核赤血球など１つまたは複数の有核胎児細胞について濃縮できる。一部の実施形態において、実施した濃縮ステップは、サンプル由来の全ての不要な分析物（例えば、母体細胞、母体赤血球、母体有核赤血球、無核細胞）の少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８または９９．９％を除去した。
【００３０】
胎児バイオマーカー
一部の実施形態において、胎児バイオマーカーを使用して、１つまたは複数の胎児細胞を検出および／または単離することができる。例えば、これは、胎児の発達の間に差動的（differentially）に発現する遺伝子（例えば、ＤＹＳ１、ＤＹＺ、ＣＤ−７１、ＭＭＰ１４）の相対的な発現に基づいて胎児と母体有核細胞とを区別することによって実施することができる。提供される本発明の一実施形態において、ＭＭＰ１４、ＣＤ７１、ＧＰＡ、ＨＬＡ−Ｇ、ＥＧＦＲ、ＣＤ３６、ＣＤ３４、ＨｂＦ、ＨＡＥ  ９、ＦＢ３−２、Ｈ３−３、エリスロポエチン受容体、ＨＢＥ、ＡＦＰ、ＡＰＯＣ３、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＡＭＢＰ、ＣＰＢ２、ＩＴＩＨ１、ＡＰＯＨ、ＨＰＸ、β−ｈＣＧ、ＡＨＳＧ、ＡＰＯＢ、Ｊ４２−４−ｄ、２，３−ビスホスホグリセリン酸（ＢＰＧ）、炭酸脱水酵素（ＣＡ）もしくはチミジンキナーゼ（ＴＫ）を含めた１つまたは複数の遺伝子の転写産物もしくはタンパク質発現の検出を使用して、胎児細胞を濃縮、精製、列挙、同定、検出または区別する。発現は、これらの遺伝子から発現される転写産物またはタンパク質を含むことができる。提供される本発明の一実施形態において、ＭＭＰ１４、ＣＤ７１、ＧＰＡ、ＨＬＡ−Ｇ、ＥＧＦＲ、ＣＤ３６、ＣＤ３４、ＨｂＦ、ＨＡＥ  ９、ＦＢ３−２、Ｈ３−３、エリスロポエチン受容体、ＨＢＥ、ＡＦＰ、ＡＨＳＧ、Ｊ４２−４−ｄ、ＢＰＧ、ＣＡまたはＴＫを含めた１つまたは複数の遺伝子の発現を使用して、有核胎児赤血球など有核胎児細胞を同定、精製、濃縮または列挙する。
【００３１】
β−ｈＣＧ（別名ｂ−ｈＣＧ、ＨＣＧ、ＣＧＢ、ＣＧＢ３およびｈＣＧＢ）は、糖タンパク質ホルモンβ鎖ファミリーのメンバーであり、絨毛ゴナドトロピン（ＣＧ）のβ３サブユニットをコードする。糖タンパク質ホルモンは、共通のαサブユニットおよび生物学的特異性を与える固有のβサブユニットからなるヘテロ二量体である。ＣＧは、胎盤の栄養膜細胞によって生成され、卵巣を刺激して妊娠の維持に不可欠なステロイドを合成する。ＣＧのβサブユニットは、染色体１９ｑ１３．３において直列に逆位の対で配置される６つの遺伝子によってコードされ、黄体形成ホルモンβサブユニット遺伝子と隣接する。
【００３２】
ＡＰＯＢ（別名、アポリポタンパク質Ｂ（Ａｇ（ｘ）抗原を含む）およびＦＬＤＢ）は、キロミクロンおよび低密度リポタンパク質の主要なアポリポタンパク質である。それは、２つの主要なアイソフォーム、ａｐｏＢ−４８およびａｐｏＢ−１００として血漿中に存在し：前者は腸において、後者は肝臓において独占的に合成される。ａｐｏＢの腸および肝臓形態は、単一遺伝子にコードされ、単一の非常に長いｍＲＮＡに由来する。２つのアイソフォームは、共通のＮ末端配列を共有する。より短いａｐｏＢ−４８タンパク質は、ａｐｏＢ−１００転写産物の残基２１８０におけるＲＮＡ編集（ＣＡＡ−＞ＵＡＡ）後に生成され、その結果終止コドンが作られ、早期に翻訳終結する。この遺伝子またはその調節領域における突然変異は、血漿コレステロールおよびａｐｏＢレベルに影響を及ぼす疾患である低βリポタンパク質症、正常トリグリセリド性低βリポタンパク質症ならびにリガンド欠損ａｐｏＢに起因する高コレステロール血症の原因になる。
【００３３】
ＡＨＳＧ（別名α−２−ＨＳ糖タンパク質；ＡＨＳ；Ａ２ＨＳ；ＨＳＧＡ；およびＦＥＴＵＡ）は、血清中に存在する糖タンパク質であり、肝細胞によって合成され得る。ＡＨＳＧ分子は、２本のポリペプチド鎖からなり、そのポリペプチド鎖は両方とも単一のｍＲＮＡにコードされるプロタンパク質から切断される。それは、エンドサイトーシス、脳の発達および骨組織の形成などいくつかの機能に関係する。タンパク質は、未発達の大脳皮質の皮質板および骨髄造血マトリックスに一般に存在し、したがって組織の発達に関与すると仮定されてきた。
【００３４】
ＨＰＸ（別名ヘモペキシン）は、ヘムを結合することができる。ヘモグロビンなどのヘムタンパク質の代謝回転によって遊離または消失するヘムを取り除くことにより、ＨＰＸは遊離ヘムに起因し得る酸化的障害から身体を保護することができる。身体の鉄を貯蔵するために、ヘモペキシンは、肝細胞の表面に位置する特異的な受容体と相互作用すると即座に、結合しているリガンドを放出して内部移行することができる。
【００３５】
ＣＰＢ２（別名カルボキシペプチダーゼＢ２（血漿）；ＣＰＵ；ＰＣＰＢ；およびＴＡＦＩ）は、Ｃ末端ペプチド結合を加水分解することができる酵素である。カルボキシペプチダーゼファミリーには、メタロ−、セリン、およびシステインカルボキシペプチダーゼがある。基質特異性によって、これらの酵素は、カルボキシペプチダーゼＡ（脂肪族残基を切断する）またはカルボキシペプチダーゼＢ（塩基性アミノ残基を切断する）と呼ばれる。この遺伝子にコードされるタンパク質は、トリプシンによって活性化され、カルボキシペプチダーゼＢ基質に作用する。トロンビンの活性化後に、成熟タンパク質はフィブリン溶解を下方制御する。この遺伝子およびそのプロモーター領域について多形性が記述されている。利用可能な配列データ分析は、異なるアイソフォームをコードするスプライスバリアントを示す。
【００３６】
ＩＴＩＨ１［別名インターα（グロブリン）インヒビターＨ１；Ｈ１Ｐ；ＩＴＩＨ；ＬＡＴＩＨ；およびＭＧＣ１２６４１５］は、セリンプロテアーゼインヒビターファミリーメンバーである。それは、２つの前駆体タンパク質：軽鎖および１つまたは２つのいずれの重鎖から組立てられる。ＩＴＩＨ１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞接着を増強することができる。
【００３７】
ＡＰＯＨ（別名アポリポタンパク質Ｈ（β−２糖タンパク質Ｉ）；ＢＧ；およびＢ２Ｇ１）は、リポタンパク質代謝、凝固および抗リン脂質自己抗体の産生を含めた様々な生理的経路に関係している。ＡＰＯＨは、ループスおよび原発性抗リン脂質症候群の患者の多くの血清中に見られる抗リン脂質自己抗体によるアニオン性リン脂質結合に必要な補因子である可能性がある。
【００３８】
ＡＭＢＰ（別名α−１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体；ＨＣＰ；ＩＴＩ；ＵＴＩ；ＥＤＣ１；ＨＩ３０；ＩＴＩＬ；ＩＡＴＩＬ；およびＩＴＩＬＣ）は、血漿に分泌される複合体糖タンパク質をコードする。前駆体は、リポカリン輸送タンパク質のスーパーファミリーに属し、炎症過程の調節に役割を果たし得るα−１−ミクログロブリン、ならびにクニッツ型プロテアーゼインヒビターのスーパーファミリーに属する尿トリプシンインヒビターであり、多くの生理的および病理学的過程において重要な役割を果たすビクニンといった固有の機能タンパク質へとタンパク質分解的にプロセッシングされる。この遺伝子は、９番染色体のリポカリン遺伝子のクラスター中に位置する。
【００３９】
Ｊ４２−４−ｄは、ｔ複合体１１（マウス）様２；ＭＧＣ４０３６８およびＴＣＰ１１Ｌ２としても公知である。
【００４０】
濃縮細胞を評価する
胎児細胞濃縮サンプル由来の細胞を、次いで核酸分子のヌクレオチド配列または遺伝子の発現について評価することができる。
【００４１】
有核胎児赤血球濃縮サンプルの２つ以上の細胞のそれぞれ個々の細胞について決定した核酸分子のヌクレオチド配列または遺伝子の発現を評価する手順の例が図２に提供され、その手順は、（１）有核胎児赤血球濃縮サンプルから約１０〜１００個の細胞を得るステップと、（２）各ウェルが１または０個の細胞を含有するように９６ウェルプレートに細胞を分離する（図において細胞を含有するウェルは、緑色のウェルとして示される）ステップと、（３）分離した細胞を、各個別のウェルについて核酸分子のヌクレオチド配列または遺伝子の発現を決定するアッセイに供するステップとを含む。この例の方法の変形が、本明細書に提供される教示にしたがってなされ得る。
【００４２】
細胞アッセイ
濃縮された有核胎児細胞は、有核胎児細胞の１つまたは複数のヌクレオチド配列または有核胎児細胞の１つまたは複数の遺伝子の発現を同定する１つまたは複数の細胞アッセイによって分析することができる。
【００４３】
一部の実施形態において、有核胎児細胞の１つまたは複数の遺伝子の発現が、胎児細胞濃縮サンプル由来の２つ以上の細胞について評価される。一部の実施形態において、有核胎児細胞の１つまたは複数の遺伝子の発現は、単一細胞についての遺伝子発現を含む。一部の実施形態において、単一細胞の１つまたは複数の遺伝子の発現が、胎児細胞濃縮サンプル由来の２つ以上の細胞について評価される。一部の実施形態において、単一細胞の１つまたは複数の遺伝子の発現が、胎児細胞濃縮サンプル由来の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の細胞について評価される。
【００４４】
一部の実施形態において、核酸分子のヌクレオチド配列を評価するステップは、胎児細胞濃縮サンプルの細胞のゲノムＤＮＡをシークエンシングするステップを含む。一部の実施形態において、核酸分子のヌクレオチド配列を分析するステップは、対象の配列にハイブリダイズする検出可能なプローブをハイブリダイズさせるステップを含む。一部の実施形態において、有核胎児細胞のヌクレオチド配列が、胎児細胞濃縮サンプル由来の２つ以上の細胞について評価される。一部の実施形態において、ゲノムＤＮＡをシークエンシングするステップは、単一細胞のＤＮＡをシークエンシングするステップを含む。一部の実施形態において、単一細胞のＤＮＡをシークエンシングするステップは、胎児細胞濃縮サンプルの２つ以上の細胞に対して実施される。一部の実施形態において、単一細胞のＤＮＡをシークエンシングするステップは、胎児細胞濃縮サンプル由来の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の細胞に対して実施される。一部の実施形態において、核酸分子のヌクレオチド配列を分析するステップは、胎児細胞濃縮サンプル由来の２つ以上の細胞のゲノムＤＮＡに検出可能なプローブをハイブリダイズさせるステップを含む。一部の実施形態において、１つまたは複数の個々の細胞が、分析される各細胞のゲノムＤＮＡへの検出可能なプローブのハイブリダイゼーションについて分析される。一部の実施形態において、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の個々の細胞が、分析される各細胞のゲノムＤＮＡへの検出可能なプローブのハイブリダイゼーションについて分析される。
【００４５】
一部の実施形態において、遺伝子発現は、胎児細胞濃縮サンプル由来細胞の遺伝子のＲＮＡ発現を検出することによって評価される。一部の実施形態において、遺伝子発現は、胎児細胞濃縮サンプル由来細胞の遺伝子のタンパク質発現を検出することによって評価される。一部の実施形態において、遺伝子の発現は、胎児細胞濃縮サンプル由来の細胞の表面に検出可能な抗体をハイブリダイズさせるステップを含む。
【００４６】
ヌクレオチドシークエンシング法には、標的ヌクレオチドシークエンシング法およびゲノムヌクレオチドシークエンシング法がある。標的シークエンシング法は、例えば、プライマーに基づくＰＣＲを使用して標的した核酸領域を増幅し、その後当技術分野において公知の通常のヌクレオチドシークエンシングを行って、１つまたは複数の特定の遺伝子または他の標的をシークエンシングするステップを含む。ゲノムヌクレオチドシークエンシング法は、ゲノムＤＮＡの増幅およびヌクレオチドシークエンシングの方法を含む。ゲノムヌクレオチドのシークエンシング法は、それだけには限らないが、Ｚｈａｎｇら（２００６）「Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｌｏｎｉｎｇシークエンシング」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４（６）：６８０〜６頁；およびＳｐｉｔｓら（２００６）「Ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ」Ｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １（４）：１９６５〜７０頁に教示されるように単一細胞における多置換増幅を含む。さらなるゲノムヌクレオチドシークエンシング法は、それだけには限らないが、マルチアニーリングアンドループベースド増幅サイクル（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｎｎｅａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｏｏｐｉｎｇ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃｙｃｌｅｓ）（ＭＡＬＢＡＣ）に教示されるように、Ｚｏｎｇら（２０１２）「Ｇｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｎｕｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｃｏｐｙ−Ｎｕｍｂｅｒ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｏ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３８：１６２２〜６頁に教示されるように単一細胞における多置換増幅を含む。一部の実施形態において、全ゲノムを増幅した後に、使用者が設計したオリゴを用いるハイブリダイゼーションに基づく選択の後に対象の部分的なゲノム配列を配列決定することができる（全エキソームシークエンシングなど）。
【００４７】
遺伝子の発現は、例えば、遺伝子から発現される転写産物またはタンパク質を検出することにより決定できる。遺伝子からの転写産物の発現は、例えば、ＲＮＡ発色ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）、ＲＮＡ  ＦＩＳＨ、分子ビーコンプローブを使用するＲＮＡ−ＦＩＳＨ、Ｑ−ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、Ｔａｑｍａｎ  ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ、マイクロアレイを使用するＲＮＡ発現プロファイリングまたは全トランスクリプトームシークエンシングによって検出することができる。
【００４８】
タンパク質発現は、例えば、免疫組織化学、免疫細胞化学、ウェスタンブロッティング、質量分析、ＥＬＩＳＡ、ゲル電気泳動後のクーマシー染色または銀染色、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳまたは微小流体蛍光細胞ソーティングによって検出することができる。発現するタンパク質は、細胞表面または内部発現タンパク質であることができる。細胞表面タンパク質は、結合部分、例えば、抗体に基づく部分によって認識することができる。検出に使用される結合部分は、抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆｃフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、ペプチド模倣体またはペプトイドであることができる。
【００４９】
一実施形態において、発現レベルは、初期のまたはプロセッシングされていない転写産物を含めた核ＲＮＡ転写産物を測定することによって決定される。別の実施形態において、発現レベルは、リボソームＲＮＡを含めたｍＲＮＡを測定することによって決定される。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、  Ｉｎｃ．製の発現アレイまたはＩｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．およびＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、  Ｉｎｃ．製のシークエンシングを使用することを含むがこれに限定されない、核酸もしくはＲＮＡを画像化する（例えば、測定する）ための当技術分野において公知の方法が多くある。
【００５０】
ＲＴ−ＰＣＲプライマーは、遺伝子特異的な領域を標的にし、アンプリコンサイズを選択し、等しいＰＣＲ増幅効率を実現するようにプライマーアニーリング温度を調整することによって設計できる。したがって、アンプリコンのそれぞれについて、十分に分離した蛍光色素であるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−３５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４８８およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−５５５を持つＴａｑＭａｎプローブを設計することができる。選択されるプライマーは、標的ｃＤＮＡ鋳型を使用してその特異性、検出限界および増幅効率を検証するために二本鎖形式で最初に確認することができる。プライマーの最善の組合せを、その増幅効率、検出ダイナミックレンジおよび検出限界について三本鎖形式でさらに試験することができる。
【００５１】
ＱｉａｇｅｎのＯｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキットおよびＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＴａｑＭａｎ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ試薬キットを含めたＯｎｅ−ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ試薬など様々な市販の試薬を、ＲＴ−ＰＣＲに利用可能である。フォワードプライマーは、標的のそれぞれに対して標識することができる。サイトスピンすることにより濃縮した細胞をガラススライドに沈着させることができる。加えて、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲの後に、濃縮した細胞のサイトスピンを実施することができる。その後、蛍光標識アンプリコンの存在は、蛍光顕微鏡によって可視化することができる。逆転写時間およびＰＣＲサイクルを最適化して、アンプリコンシグナル：バックグラウンド比を最大にし、それによって母体サインに対する胎児の分離を最大にすることができる。一部の実施形態において、シグナル：バックグラウンド比は、５、１０、５０または１００より大きく、過程を通じての全体の細胞消失は５０、１０もしくは５％未満である。
【００５２】
本明細書に提供される核酸、抗体または抗体に基づくフラグメントプローブで使用できる様々な蛍光分子もしくは色素のいずれかは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、ＡＭＣＡ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ、ＣＦＳＥ、ＣＦＤＡ−ＳＥ、ＤｙＬｉｇｈｔ  ２８８、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、ローダミン、ローダミン６Ｇ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ｃｙ３色素、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、リサミンローダミンＢ色素、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ色素、ＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ｃｙ５色素、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ｃｙ５．５色素、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、フィコエリトリン（ＰＥ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）、ＰＥ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、ＰＥ−Ｃｙ５（ＴＲＩ−ＣＯＬＯＲ）、ＰＥ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ＰＥ−Ｃｙ７、ＡＰＣ、ＡＰＣ−Ｃｙ７、Ｄｒａｑ−５、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ、Ａｍｉｎｅ  Ａｑｕａ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−６３３、ＤｙＬｉｇｈｔ  ４０５、ＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ  ５４９、ＤｙＬｉｇｈｔ  ５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６３３、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ  ７５０またはＤｙＬｉｇｈｔ  ８００を含むがこれに限定されない。
【００５３】
一実施形態において、胎児細胞における１つまたは複数の遺伝子の存在またはその転写産物発現は、１つまたは複数のプライマー／プローブの組を使用して検出できる。例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６つ以上のプライマー／プローブの組を使用して、胎児細胞（例えば、有核胎児赤血球）における１つまたは複数の遺伝子の発現を検出することができる。一実施形態において、プライマー／プローブの組は、２つのプライマーおよび１つプローブならびに任意選択で消光物質を含む。一実施形態において、多重プライマー／プローブの組合せは、１つまたは複数のプライマー／プローブの組を含む。一実施形態において、プライマー／プローブの組または多重プライマー／プローブの組合せは、ｑ−ＰＣＲ用のサンプルと組み合わされる。一実施形態において、プライマー／プローブの組または多重プライマー／プローブの組合せは、リアルタイムＰＣＲ用のサンプルと組み合わされる。一実施形態において、各組のプライマーとプローブの量のバランスをとるように多重プライマー／プローブの組合せを設計し、それにより標的配列がサンプル中に存在する場合に各プライマー／プローブの組について検出可能なシグナルを生成することができる。一実施形態において、多重プライマー／プローブの組合せが同じ反応槽内で機能して、サンプル中の標的配列の存在を検出できるように、最適のアニーリング温度および熱サイクルプロファイルを設計することができる。一実施形態において、プローブは異なる蛍光色素で標識される。多重反応中の特定のプライマー／プローブの組の各プローブが、他の色素標識プローブと十分に異なるピーク波長の蛍光を発する異なる色素で標識されて、各組のプローブからの蛍光の同定が可能になるように色素標識プローブを最適化できる。一実施形態において、多重プライマー／プローブの組合せは、ＭＭＰ１４、ＣＤ７１、ＧＰＡ、ＨＬＡ−Ｇ、ＥＧＦＲ、ＣＤ３６、ＣＤ３４、ＨｂＦ、ＨＡＥ  ９、ＦＢ３−２、Ｈ３−３、エリスロポエチン受容体、ＨＢＥ、ＡＦＰ、ＡＰＯＣ３、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＡＭＢＰ、ＣＰＢ２、ＩＴＩＨ１、ＡＰＯＨ、ＨＰＸ、β−ｈＣＧ、ＡＨＳＧ、ＡＰＯＢ、Ｊ４２−４−ｄ、ＢＰＧ、ＣＡまたはＴＫ遺伝子のゲノムＤＮＡにアニールするプライマー／プローブの組を１つまたは複数含む。別の実施形態において、多重プライマー／プローブの組合せは、ＭＭＰ１４、ＣＤ７１、ＧＰＡ、ＨＬＡ−Ｇ、ＥＧＦＲ、ＣＤ３６、ＣＤ３４、ＨｂＦ、ＨＡＥ  ９、ＦＢ３−２、Ｈ３−３、エリスロポエチン受容体、ＨＢＥ、ＡＦＰ、ＡＰＯＣ３、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＡＭＢＰ、ＣＰＢ２、ＩＴＩＨ１、ＡＰＯＨ、ＨＰＸ、β−ｈＣＧ、ＡＨＳＧ、ＡＰＯＢ、Ｊ４２−４−ｄ、ＢＰＧ、ＣＡもしくはＴＫ遺伝子によって発現されるＲＮＡ、またはそれらによって発現されるＲＮＡのｃＤＮＡにアニールするプライマー／プローブの組を１つまたは複数含む。一実施形態において、有核胎児細胞は、ＭＭＰ１４、ＣＤ７１、ＧＰＡ、ＨＬＡ−Ｇ、ＥＧＦＲ、ＣＤ３６、ＣＤ３４、ＨｂＦ、ＨＡＥ  ９、ＦＢ３−２、Ｈ３−３、エリスロポエチン受容体、ＨＢＥ、ＡＦＰ、ＡＰＯＣ３、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＡＭＢＰ、ＣＰＢ２、ＩＴＩＨ１、ＡＰＯＨ、ＨＰＸ��β−ｈＣＧ、ＡＨＳＧ、ＡＰＯＢ、Ｊ４２−４−ｄ、ＢＰＧ、ＣＡもしくはＴＫ遺伝子のゲノムＤＮＡ、それらによって発現されるＲＮＡ、もしくはそれらによって発現されるＲＮＡのｃＤＮＡにアニールするプライマー／プローブの組を１つまたは複数含む多重プライマー／プローブの組合せを使用して、濃縮、列挙、精製、検出または同定される。別の実施形態において、多重プライマー／プローブの組合せは、ＦＮ１、β−ｈＣＧまたはＡＨＳＧ遺伝子のゲノムＤＮＡ、それらによって発現されるＲＮＡ、もしくはそれらによって発現されるＲＮＡのｃＤＮＡにアニールするプライマー／プローブの組を少なくとも３つ含む。
【００５４】
別の実施形態において、少なくとも１、２、３、４、５、６組以上のプライマーを使用して、有核胎児細胞中の１つまたは複数の遺伝子の存在またはその転写産物発現を検出することができる。一実施形態において、プライマーの組は、２つのプライマーを含む。一実施形態において、２つ以上のプライマーの組が、標的配列を含むサンプルを用いる多重反応に含まれる。一実施形態において、各組のプライマーの量のバランスをとるように多重プライマーの組合せを設計し、それにより標的配列がサンプル中に存在する場合に各プライマーの組について検出可能な増幅産物を生成することができる。一実施形態において、多重プライマーの組を組み合わせて同じ反応槽内で機能させ、それによってサンプル中の標的配列の存在を増幅できるように、最適のアニーリング温度および熱サイクルプロファイルを設計することができる。一実施形態において、プライマーの組は、ＭＭＰ１４、ＣＤ７１、ＧＰＡ、ＨＬＡ−Ｇ、ＥＧＦＲ、ＣＤ３６、ＣＤ３４、ＨｂＦ、ＨＡＥ  ９、ＦＢ３−２、Ｈ３−３、エリスロポエチン受容体、ＨＢＥ、ＡＦＰ、ＡＰＯＣ３、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＡＭＢＰ、ＣＰＢ２、ＩＴＩＨ１、ＡＰＯＨ、ＨＰＸ、β−ｈＣＧ、ＡＨＳＧ、ＡＰＯＢ、Ｊ４２−４−ｄ、ＢＰＧ、ＣＡまたはＴＫ遺伝子のゲノムＤＮＡにアニールする。別の実施形態において、プライマー組は、ＭＭＰ１４、ＣＤ７１、ＧＰＡ、ＨＬＡ−Ｇ、ＥＧＦＲ、ＣＤ３６、ＣＤ３４、ＨｂＦ、ＨＡＥ  ９、ＦＢ３−２、Ｈ３−３、エリスロポエチン受容体、ＨＢＥ、ＡＦＰ、ＡＰＯＣ３、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＡＭＢＰ、ＣＰＢ２、ＩＴＩＨ１、ＡＰＯＨ、ＨＰＸ、β−ｈＣＧ、ＡＨＳＧ、ＡＰＯＢ、Ｊ４２−４−ｄ、ＢＰＧ、ＣＡまたはＴＫ遺伝子によって発現されるＲＮＡ、もしくはそれらによって発現されるＲＮＡのｃＤＮＡにアニールする。一実施形態において、有核胎児細胞は、ＭＭＰ１４、ＣＤ７１、ＧＰＡ、ＨＬＡ−Ｇ、ＥＧＦＲ、ＣＤ３６、ＣＤ３４、ＨｂＦ、ＨＡＥ  ９、ＦＢ３−２、Ｈ３−３、エリスロポエチン受容体、ＨＢＥ、ＡＦＰ、ＡＰＯＣ３、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＡＭＢＰ、ＣＰＢ２、ＩＴＩＨ１、ＡＰＯＨ、ＨＰＸ、β−ｈＣＧ、ＡＨＳＧ、ＡＰＯＢ、Ｊ４２−４−ｄ、ＢＰＧ、ＣＡまたはＴＫ遺伝子のゲノムＤＮＡ、それらによって発現されるＲＮＡ、もしくはそれらによって発現されるＲＮＡのｃＤＮＡにアニールするプライマーの組を使用して、濃縮、列挙、精製、検出または同定される。
【００５５】
別の実施形態において、少なくとも１、２、３、４、５、６つ以上のプローブを使用して、有核胎児細胞による１つまたは複数の遺伝子の転写産物発現を検出することができる。一実施形態において、２つ以上のプローブが検出可能に標識され、ＲＮＡ配列に結合することができる。一実施形態において、２つ以上のプローブを使用して、胎児細胞によって発現されるＲＮＡ配列を複数検出する。一実施形態において、２つ以上のプローブが、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの方法に使用される。一実施形態において、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの方法は、ＲＮＡ  ＦＩＳＨである。一実施形態において、プローブは核酸プローブである。別の実施形態において、プローブはペプチド核酸（ＰＮＡ）である。別の実施形態において、プローブは、アミド修飾核酸、ホスホルアミダート修飾核酸、ボラノリン酸修飾核酸、メチルホスホン酸修飾核酸、デオキシリボ核酸グアニジン（ＤＮＧ）修飾核酸、またはモルホリノ修飾核酸など１つまたは複数の修飾核酸を含む。
【００５６】
一実施形態において、２つ以上のプローブは、標識されたコンジュゲートに結合することができるビオチンまたはストレプトアビジンなど検出可能なタグで標識される。別の実施形態において、プローブは、基質（Ｆａｓｔ  Ｒｅｄなど）を検出可能な標識に変換することができる酵素（アルカリホスファターゼなど）で標識される。一実施形態において、酵素はアルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはグルコースオキシダーゼである。
【００５７】
一実施形態において、コンジュゲートは、蛍光色素で標識される。別の実施形態において、２つ以上のプローブは、蛍光標識によって検出可能に標識される。一実施形態において、２つ以上のプローブが、同じ蛍光標識で標識される。一実施形態において、２つ以上のプローブが、異なる蛍光標識で標識される。各プローブを、他の蛍光標識プローブと十分に異なるピーク波長の蛍光を発する異なる標識で標識して、各プローブからの蛍光の同定が可能になるように蛍光標識プローブを最適化することができる。
【００５８】
一実施形態において、１つまたは複数の検出可能に標識されたプローブは、ＭＭＰ１４、ＣＤ７１、ＧＰＡ、ＨＬＡ−Ｇ、ＥＧＦＲ、ＣＤ３６、ＣＤ３４、ＨｂＦ、ＨＡＥ  ９、ＦＢ３−２、Ｈ３−３、エリスロポエチン受容体、ＨＢＥ、ＡＦＰ、ＡＰＯＣ３、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＡＭＢＰ、ＣＰＢ２、ＩＴＩＨ１、ＡＰＯＨ、ＨＰＸ、β−ｈＣＧ、ＡＨＳＧ、ＡＰＯＢ、Ｊ４２−４−ｄ、ＢＰＧ、ＣＡもしくはＴＫ遺伝子によって発現されるＲＮＡ配列にアニールするまたはそのポリペプチドに特異的に結合する。一実施形態において、有核胎児細胞は、ＭＭＰ１４、ＣＤ７１、ＧＰＡ、ＨＬＡ−Ｇ、ＥＧＦＲ、ＣＤ３６、ＣＤ３４、ＨｂＦ、ＨＡＥ  ９、ＦＢ３−２、Ｈ３−３、エリスロポエチン受容体、ＨＢＥ、ＡＦＰ、ＡＰＯＣ３、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＡＭＢＰ、ＣＰＢ２、ＩＴＩＨ１、ＡＰＯＨ、ＨＰＸ、β−ｈＣＧ、ＡＨＳＧ、ＡＰＯＢ、Ｊ４２−４−ｄ、ＢＰＧ、ＣＡもしくはＴＫ遺伝子のうち１つまたは複数によって発現されるＲＮＡ配列にアニールするもしくはそのポリペプチドに特異的に結合する１つまたは複数の検出可能に標識されたプローブを使用して、濃縮、列挙、精製、検出または同定される。
【００５９】
別の実施形態において、少なくとも１、２、３、４、５、６個以上の抗体または抗体に基づくフラグメントを使用して、胎児細胞（例えば、ｆｎＲＢＣまたはトロホブラスト）中の１つまたは複数のタンパク質の発現を検出することができる。
【００６０】
一実施形態において、抗体または抗体に基づくフラグメントは、標識されたコンジュゲートに結合することができるビオチンまたはストレプトアビジンなど検出可能なタグで標識される。別の実施形態において、抗体または抗体に基づくフラグメントは、基質（Ｆａｓｔ  Ｒｅｄなど）を検出可能な標識に変換することができる酵素（アルカリホスファターゼなど）で標識される。一実施形態において、酵素はアルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはグルコースオキシダーゼである。
【００６１】
一実施形態において、抗体または抗体フラグメントは、胎児細胞マーカータンパク質に結合する。一実施形態において、抗体または抗体フラグメントは、蛍光色素で標識される。別の実施形態において、抗体または抗体フラグメントは、蛍光色素で標識された抗体もしくは抗体フラグメントに結合する。一実施形態において、複数の抗体または抗体フラグメントが、同じ蛍光色素で標識される。一実施形態において、各抗体または抗体フラグメントが、異なる蛍光色素で標識される。各抗体または抗体に基づくフラグメントが、もう一方の色素標識抗体もしくは抗体に基づくフラグメントと十分に異なるピーク波長の蛍光を発する異なる色素で標識されて、各抗体もしくは抗体に基づくフラグメントからの蛍光の同定が可能になるように色素標識抗体もしくは抗体に基づくフラグメントを最適化できる。
【００６２】
一実施形態において、抗ＭＭＰ１４、抗ＣＤ７１、抗ＧＰＡ、抗ＣＤ３６、抗ＣＤ３４、抗ＨｂＦ、抗ＨＡＥ９、抗ＦＢ３−２、抗Ｈ３−３、抗エリスロポエチン受容体、抗ＣＤ２３５ａ、抗炭水化物、抗セレクチン、抗ＣＤ４５、抗ＧＰＡ、抗抗原−Ｉ、抗ＥｐＣＡＭ、抗Ｅ−カドヘリン、抗Ｍｕｃ−１、抗ｈＰＬ、抗ＣＨＳ２、抗ＫＩＳＳ１、抗ＧＤＦ１５、抗ＣＲＨ、抗ＴＦＰ１２、抗ＣＧＢ、抗ＬＯＣ９０６２５、抗ＦＮ１、抗ＣＯＬ１Ａ２、抗ＰＳＧ９、抗ＰＳＧ１、抗ＨＢＥ、抗ＡＦＰ、抗ＡＰＯＣ３、抗ＳＥＲＰＩＮＣ１、抗ＡＭＢＰ、抗ＣＰＢ２、抗ＩＴＩＨ１、抗ＡＰＯＨ、抗ＨＰＸ、抗β−ｈＣＧ、抗ＡＨＳＧ、抗ＡＰＯＢ、抗Ｊ４２−４−ｄ、抗ＢＰＧ、抗ＣＡまたは抗ＴＫ抗体もしくは抗体に基づくフラグメントを少なくとも１、２、３、４、５、６個以上多く使用して、胎児細胞による１つまたは複数のタンパク質の発現が検出される。一実施形態において、抗体または抗体に基づくフラグメントは、胎児細胞内のタンパク質に結合する。別の実施形態において、抗体または抗体に基づくフラグメントは、胎児細胞の表面に発現されるタンパク質に結合する。
【００６３】
特定の遺伝子によるタンパク質もしくは転写産物発現の検出を使用して、胎児細胞を参照細胞、例えば母体細胞と区別する、胎児細胞型の間を区別する、胎児細胞を同定する、１つまたは複数の胎児細胞を精製もしくは濃縮する、または１つまたは複数の胎児細胞を列挙することができる。
【００６４】
一実施形態において、細胞型に特異的な胎児細胞マーカーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲアプローチによって胎児細胞型を同定することができる。
【００６５】
一実施形態において、胎児細胞は、ＲＮＡ  ＦＩＳＨによって標識することができる。一実施形態において、胎児細胞は、分子ビーコンで標識することができる。一実施形態において、分子ビーコンで標識された胎児細胞は、ＦＡＣＳまたは微小流体蛍光細胞ソーティングによって同定、精製、濃縮または列挙することができる。
【００６６】
一実施形態において、ＲＴ−ＰＣＲとデジタルＰＣＲを組み合わせることにより、胎児細胞型を同定し、胎児細胞数を計数することができる。
【００６７】
一実施形態において、胎児細胞は、胎児細胞マーカー遺伝子によって発現されるタンパク質に結合する抗体または抗体に基づくフラグメントによって標識できる。一実施形態において、抗体または抗体に基づくフラグメントで標識された胎児細胞は、ＦＡＣＳもしくは微小流体蛍光細胞ソーティングによって同定、精製、濃縮または列挙することができる。
【００６８】
染色体分析は、Ｇバンド染色体、他の細胞遺伝学的な分染技術、ならびに蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）などの分子細胞遺伝学の通常の分析方法を含むがこれに限定されない、当技術分野において公知の１つまたは複数の細胞遺伝学的方法または本明細書に提供される別の方法を使用して実施することもできる。
【００６９】
一実施形態において、サンプル分析は、胎児細胞濃縮サンプル由来核酸に対する１つまたは複数の遺伝分析または検出ステップを実施することを含む。本明細書の方法によって分析できる濃縮細胞または濃縮された核由来の核酸には：二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡヘアピン、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）およびＲＮＡヘアピンがある。濃縮細胞または核酸で実施することができる遺伝分析の例には、例えば、ＳＮＰ検出、ＳＴＲ検出およびＲＮＡ発現分析がある。
【００７０】
一実施形態において、分析は、胎児細胞濃縮サンプルの１つまたは複数の細胞由来のＤＮＡまたはＲＮＡ転写産物における１つまたは複数の突然変異もしくはＳＮＰを検出するステップを含む。そのような検出は、例えば、ＤＮＡマイクロアレイまたはＲＮＡ転写産物発現アレイを使用して実施することができる。ＤＮＡマイクロアレイの例には、Ｋｅｎｎｅｄｙ、Ｇ．Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１、１２３３〜１２３７頁、２００３；Ｌｉｕ、Ｗ．Ｍ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １９、２３９７〜２４０３頁、２００３；Ｍａｔｓｕｚａｋｉ、Ｈ．、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３、４１４〜２５頁、２００４；およびＭａｔｓｕｚａｋｉ、Ｈ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１、１０９〜１１１頁、２００４、ならびに米国特許第５，４４５，９３４号；第５，７４４，３０５号；第６，２６１，７７６号；第６，２９１，１８３号；第５，７９９，６３７号；第５，９４５，３３４号；第６，３４６，４１３号；第６，３９９，３６５号；および第６，６１０，４８２号ならびに欧州特許第６１９３２１号；第３７３２０３号によって実証された当技術分野において公知の方法によるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆ．）製の市販のものがあり、その全体を参照により本明細書に組み込む。一実施形態において、マイクロアレイを使用して、サンプル中にある少なくとも５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００  １０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００または５００，０００個の異なる核酸標的を検出する。
【００７１】
コンピュータ実行可能なロジックを有するコンピュータ読み込み可能な媒体を含むコンピュータプログラムを使用して、遺伝子型判定クラスタリングおよび呼び出しを自動化することができる。
【００７２】
本明細書の実施形態のいずれかにおいて、濃縮した希少な細胞もしくは濃縮した希少な細胞核の遺伝的内容からの遺伝子型判定（例えば、ＳＮＰ検出）および／または発現分析（例えば、ＲＮＡ転写産物定量化）は、シークエンシングによって達成できる。シークエンシングは、当技術分野で周知の古典的なサンガーシークエンシング方法によって達成できる。シークエンシングは、高スループットシステムを使用して達成することもでき、そのいくつかは、増殖鎖への配列決定されるヌクレオチドの組み込みの直後または同時の検出、すなわち、リアルタイムまたは実質的にリアルタイムでの配列検出を可能にする。一実施形態において、高スループットシークエンシングは、１時間当たり少なくとも１０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも２００，０００、少なくとも３００，０００、少なくとも４００，０００、少なくとも５００，０００、少なくとも１，０００，０００または少なくとも５，０００，０００個の配列リードを生成し；各リードは、１リード当たり少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２０または、少なくとも１５０塩基である。シークエンシングは、鋳型としてゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ転写産物から得られるｃＤＮＡを使用して実施することができる。一実施形態において、胎児細胞濃縮サンプル由来の単一細胞の高スループットシークエンシングを含めて、高スループットシークエンシングを使用することができる。一実施形態において、胎児または母体細胞から得られるｍＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡが分析される。ｃＤＮＡの型および存在量を使用して、細胞が胎児細胞であるかどうか（Ｙ染色体特異的転写産物の存在によってなど）、または胎児細胞が遺伝的な異常（異数性、選択的な転写産物の存在量もしくは型またはＤＮＡメチル化もしくはインプリンティングによる問題など）を有するかどうか決定することができる。
【００７３】
１つまたは複数の細胞を分析して、状態もしくは疾患の存在を決定するステップは、濃縮した希少な細胞サンプル中のミトコンドリアＤＮＡ、テロメラーゼもしくは核マトリックスタンパク質を検出するステップ；濃縮サンプルの細胞における核周辺区画（ｐｅｒｉｎｕｃｌｅａｒ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ）の有無を検出するステップ；または濃縮サンプルの核酸コピー数を決定する遺伝子発現分析、インセルＰＣＲもしくは蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施するステップを含むこともできる。
【００７４】
本明細書の実施形態のいずれかにおいて、標的核酸は、単一細胞から得ることができる。
【００７５】
胎児細胞濃縮サンプルは、１つまたは複数の濃縮細胞の分析の前に「ビン化する」ことができる。ビニングは、濃縮細胞の出力の複雑さおよび／または総細胞数を減少させる任意の過程である。ビニングは、当技術分野において公知のまたは本明細書に記述される任意の方法によって実施することができる。濃縮細胞をビニングする１つの方法は、段階希釈による。そのような希釈は、任意の適当なプラットフォーム（例えば、ＰＣＲウェル、マイクロタイタープレート）を使用して実行することができる。他の方法には、サンプルを液滴に分離するナノ流体システム（例えば、ＢｉｏＴｒｏｖｅ、Ｒａｉｎｄａｎｃｅ、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）がある。そのようなビニングにより、ウェルまたはナノ液滴中に存在する単一細胞の存在を得ることができる。胎児細胞について濃縮したサンプルをビニングする場合、好ましくは、各部位は０または１個の細胞を含む。
【００７６】
ビニングに先行して、親和性結合（例えばレクチン、抗ＭＭＰ１４および／または抗ＣＤ７１抗体を使用する）を含むがそれには限らない、胎児細胞を濃縮する方法を行うことができる。例えば、濃縮した母体血は、勾配遠心分離、レクチンに基づく親和性分離およびＭＭＰ−１４に基づく親和性分離に供することができる。各ビンがおよそ１個の細胞を含有すると期待されるように、およそ１００個の細胞を含有するこのサンプルのアリコートを、次いで１００個のビン（ＰＣＲウェルまたは他の受け入れられるビニングプラットフォーム）に分離することができる。当業者は、実験設計および／またはビニングに使用するプラットフォームに応じてビンの数を増やせることを認識することができる。ビン化した細胞集団の複雑さを減少させることにより、標的細胞のさらなる遺伝的および細胞的分析を容易にできる。
【００７７】
一部の実施形態において、個々のビンに対して分析を実施して、個々のビン中の有核胎児細胞の有無を確認する。そのような分析は、ＦＩＳＨ、ＰＣＲ、ＳＴＲ検出、ＳＮＰ分析、バイオマーカー検出および配列分析を含むがそれだけには限らない本明細書における教示による当技術分野において公知の任意の方法を使用して実施することができる。
【００７８】
本明細書の方法およびシステムに基づいて決定することができる胎児の状態には、胎児の存在ならびに／または胎児異数性などの胎児の状態、例えば、１３トリソミー、１８トリソミー、２１トリソミー（ダウン症候群）、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ）および１つまたは複数の染色体のモノソミー（Ｘ染色体モノソミー、別名ターナー症候群）、１つまたは複数の染色体のトリソミー（１３、１８、２１およびＸ）、１つまたは複数の染色体のテトラソミーおよびペンタソミー（ヒトにおいては、性染色体で最も一般的に観察される、例えば、ＸＸＸＸ、ＸＸＹＹ、ＸＸＸＹ、ＸＹＹＹ、ＸＸＸＸＸ、ＸＸＸＸＹ、ＸＸＸＹＹ、ＸＹＹＹＹおよびＸＸＹＹＹ）、一倍性、三倍性（全ての染色体が３つ、例えば、ヒトにおいて６９個の染色体）、四倍性（全ての染色体が４つ、例えば、ヒトにおいて９２個の染色体）、五倍性および多倍性を含めた他の不規則な数の性もしくは常染色体がある。本明細書の方法を使用して検出することができる他の胎児状態には、１ｐ３６重複、重複（１７）（ｐ１１．２ｐ１１．２）症候群、ダウン症候群、子かん前症（pre-eclampsia）、早期陣痛、子宮内膜症、ペリツェウスメルツバッハー病、重複（２２）（ｑ１１．２ｑ１１．２）症候群、ネコ眼症候群などの部分異数性がある。一実施形態において、検出される胎児異常は、ネコ鳴き症候群、ウォルフ−ハーシュホーン症候群、ウィリアムズビューレン症候群、シャルコーマリーツース病、圧迫性麻痺易罹病性遺伝性ニューロパシー、スミスマグニス症候群、神経線維腫症、アラジール症候群、口蓋心臓顔面症候群、ディジョージ症候群、ステロイドスルファターゼ欠損症、カルマン症候群、線状皮膚欠損を伴う小眼球症、副腎低形成、グリセロールキナーゼ欠損症、ペリツェウスメルツバッハー病、Ｙ上の精巣決定因子、高窒素血症（因子ａ）、高窒素血症（因子ｂ）、高窒素血症（因子ｃ）および１ｐ３６欠失を含めた性または常染色体における１つまたは複数の欠失による。一実施形態において、胎児異常は、ＸＯ症候群など、染色体数の異常減少である。上記のリストは、本明細書に提供される方法を使用して評価することができる考え得る遺伝的疾患の単なる例として用いられる。しかしながら、これらの方法は、ＯＭＩＭなどの公開データベースにある疾患を含むがこれに限定されない公知の遺伝的な原因による任意の疾患にまで拡張することができる。
【００７９】
胎児細胞配列または発現の同定
一部の実施形態において、本明細書に提供される方法は、個々の細胞について決定した核酸分子のヌクレオチド配列データもしくは遺伝子発現データを分析するステップと、データが母体配列もしくは遺伝子発現または胎児配列もしくは遺伝子発現の指標となるか否かを決定するステップとをさらに含む。一部のそのような実施形態において、母体または胎児情報の指標となるデータの確率が、決定される。濃縮方法が実施された後でさえ、母体細胞は、胎児細胞濃縮サンプル中にまだ存在している可能性が高いと考えられる。したがって、方法を実行して、細胞が胎児もしくは母体起源であると同定する、または細胞が胎児もしくは母体起源である確率を同定することができる。胎児細胞濃縮サンプルの細胞の分析は、単一細胞ずつの原則で実施されるので、本明細書に提供される方法は、細胞が胎児起源であると同定するまたは細胞が胎児起源である見込みを同定する能力を向上させることができる。したがって、本明細書に提供される実施形態による配列もしくは遺伝子発現の決定は、細胞の集合体または多数の細胞の平均シグナルには基づかず、その代わりに複数の単一細胞の配列もしくは遺伝子発現の測定値に基づく。
【００８０】
一部の実施形態において、本方法は、胎児細胞濃縮サンプルが含む２つ以上の細胞のそれぞれ個々の細胞について決定した核酸分子のヌクレオチド配列データまたは遺伝子発現データを分析するステップを含む。そのような方法は、決定したヌクレオチド配列または遺伝子発現に基づいて各細胞を細胞の第１の集団の細胞もしくは細胞の第２の集団に属するように分類するステップと；細胞の第１および第２の集団が胎児または母体起源のものである確率を同定するステップとを含むことができる。一部のそのような実施形態において、第１および第２の集団のそれぞれについて核酸分子のヌクレオチド配列もしくは遺伝子の発現を公知の母体細胞の公知の核酸分子のヌクレオチド配列もしくは遺伝子の発現と比較することによって、細胞の第１ならびに第２の集団が、胎児または母体起源のものである確率を同定し、公知の母体細胞に対する類似性がより高いヌクレオチド配列もしくは遺伝子発現を有する細胞の集団が母体起源のものとして同定される。
【００８１】
一部の実施形態において、細胞の第１および第２の集団が胎児または母体起源のものである確率は、細胞の第１および第２の集団のサイズを評価することによって同定され、より大きな細胞集団が胎児起源のものと同定される。本明細書に提供される方法の一部の実施形態は、母体細胞より多くの胎児細胞を含有する胎児細胞濃縮サンプルを産すると本明細書において考えられる。したがって、これらの実施形態において、母体細胞が胎児細胞濃縮サンプル中に存在する可能性が高いとはいえ、胎児細胞濃縮サンプルの細胞の全体集団にわたってより一般的な配列または遺伝子発現が、胎児細胞のものであり母体細胞のものでない可能性がより高い。したがって、本明細書に提供される方法は、単一細胞の測定に適用できるが、複数の細胞の測定に適用される場合、確率の精度が高まる。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の個々の細胞をヌクレオチド配列情報もしくは遺伝子発現情報について分析することができ、この分析の結果から、胎児ヌクレオチド配列もしくは遺伝子発現の同定および／または特定のヌクレオチド配列もしくは遺伝子発現が胎児起源のものである確率を得ることができる。
【００８２】
一部の実施形態において、診断は、そのような遺伝分析の結果を参照サンプル（例えば、母体細胞）の類似の分析の結果と比較することによって行われる。例えば、胎児細胞濃縮サンプル由来の細胞における配列もしくは遺伝子発現を公知の母体細胞（例えば、母体皮膚または上皮細胞）における配列もしくは遺伝子発現と比較することによって胎児細胞濃縮サンプルを分析して、１つまたは複数の胎児細胞の存在および／またはそのような細胞における配列もしくは遺伝子発現を決定することができる。
【００８３】
一実施形態において、胎児細胞において遺伝子の発現が、参照サンプル、例えば母体細胞におけるより高いもしくは低い場合、胎児細胞中の遺伝子の転写産物もしくはタンパク質発現をマーカーとして使用して、胎児細胞を濃縮、列挙、精製、検出または同定することができる。一実施形態において、遺伝子の発現レベル（転写産物またはタンパク質の形態である）が、参照サンプル（例えば、母体細胞）における遺伝子の発現レベル（転写産物またはタンパク質の形態である）より少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、７５０％、１０００％、２０００％、３０００％、４０００％、５０００％または１０，０００％高いもしくは低い場合、その遺伝子は胎児細胞マーカーになり得る。一実施形態において、遺伝子は、参照サンプル（例えば、母体細胞）と比較して高レベルのタンパク質または転写産物の発現を有する。別の実施形態において、胎児細胞における遺伝子のタンパク質または転写産物の発現の比が、参照サンプル（例えば、母体細胞）における遺伝子の発現と比較して少なくとも約１１：１０、６：５、１３：１０、７：５、３：２、８：５、１７：１０、９：５、２：１、３：１、４：１、５：１もしくは１０：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、１００：１、１５０：１、２００：１、２５０：１、３００：１、３５０：１、４００：１、４５０：１、５００：１、５５０：１、６００：１、６５０：１、７００：１、７５０：１、８００：１、８５０：１、９００：１、９５０：１もしくは１０００：１である場合、遺伝子は、胎児細胞のマーカーになり得る。別の実施形態において、胎児細胞における遺伝子のタンパク質または転写産物の発現が、参照サンプル（例えば、母体細胞）における転写産物の発現より少なくとも約１．１〜、１．２〜、１．３〜、１．４〜、１．５〜、１．６〜、１．７〜、１．８〜、１．９〜、２〜、３〜、４〜、５〜、１０〜、１５〜、２０〜、２５〜、３０〜、３５〜、４０〜、４５〜、５０〜、５５〜、６０〜、６５〜、７０〜、７５〜、８０〜、８５〜、９０〜、９５もしくは１００〜倍高いもしくは低い場合、遺伝子は、胎児細胞のマーカーになり得る。転写産物またはタンパク質の発現レベルは、他の転写産物もしくはタンパク質の発現レベルに対してそれぞれ標準化することができる。
【実施例】
【００８４】
サンプルを、１００人の妊婦の第１、第２および／または第３妊娠三期から得た。血液サンプルを、採集後３時間以内に処理した。各血液サンプルを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で適当な容積に１：１に希釈した。希釈した血液サンプルを、約１．０９ｇ／ｍＬの密度に調節した密度媒体の上に積層した。密度遠心分離を、１５００ｒｐｍで、室温で３０分間実施した。冷ＰＢＳで３回洗浄した後に、室温で１０分間の再遠心分離により単核細胞を採集した。沈殿物をＰＢＳで再懸濁し、Ｋｉｔａｇａｗａら、２００２  Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ  ２２：１７〜２１頁に記載の通り、ダイズ凝集素（ＳＢＡ）を使用するレクチン選択に供した。
【００８５】
プロテインＡ／Ｇ磁気ビーズ混合物（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）１０ｍｇを再懸濁し、ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ−２０で２回洗浄した。候補抗体（ＣＤ７１およびＭＭＰ１４；ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）５０μｇをＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ−２０に希釈したビーズ混合物４００μＬに添加し、室温で３０分間、回転させながらインキュベートした。抗体と結合したビーズを磁気スタンドで分離し、ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ−２０中で３回洗浄した。レクチン選択後に単離した粗単核細胞を、ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ−２０  ４００μＬで希釈した抗体結合したプロテインＡ／Ｇビーズに添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、濃縮した細胞を、下流の分析用として２０μＬに希釈した。
【００８６】
濃縮後の細胞の品質および純度を推定するために、濃縮した細胞サンプルの半分を、細胞遺伝学的分析に供し、前に示した胎児細胞表面マーカーで免疫染色した。サンプルの他の半分については、細胞を９６ウェルプレートの個々のウェルに分離して、１ウェル当たり１個以下の細胞であることを確実にする。
【００８７】
３〜５個の単一細胞のＤＮＡ／ＲＮＡ構成の細胞遺伝学的分析、トランスクリプトーム／ゲノムおよび他の分析を実施することになる。対照として、母体細胞を唾液サンプルから採取することになる。単一細胞のＤＮＡ配列データを母体細胞のそれと比較して、胎児単一細胞と母体単一細胞および胎児細胞特異的な遺伝的変形とを区別することになる。異なるＲＮＡおよびタンパク質発現が、個々の単一細胞間で計算されることになり、それを利用して新規のマークを同定することになる。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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