(57)【要約】本発明は、フィコシアニンを含有する少なくとも１つの原料からフィコシアニンを抽出および安定化する方法に関する。当該方法は、前記少なくとも１つの原料を、グリセロールまたは水／グリセロール混合物中において温浸するステップを含むことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィコシアニンを含有する少なくとも１つの原料からフィコシアニンを抽出および安定化する方法であって、
前記少なくとも１つの原料を、グリセロールまたは水／グリセロール混合物中において温浸するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
その水／グリセロール比が（６０／４０）以下であることを特徴とする、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、
用いられる前記原料が乾燥または新鮮粉末の形態にあることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、
温浸による抽出の前記ステップの終わりに、用いられる前記原料が、前記グリセロールおよびフィコシアニンの混合物を濾過することによって分離されて、前記フィコシアニンを含有する濾液と濾過残とをもたらすことを特徴とする、方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、
前記原料がスピルリナspirulin(Arthrospira platensisもしくはSpirulina maxima)および／またはＡＦＡ（Aphanizomenon Flos-Aquae）から選択されることを特徴とする、方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、
グリセロールが、７０℃を超えない、好ましくは４０℃よりも低い温度において加熱されることを特徴とする、方法。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法であって、
前記濾過がフロンタル的に行われることを特徴とする、方法。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法であって、
前記濾過が食品グレードのフィルタによって行われ、前記フィルタは例えばポリアミド製、特にナイロン製であり、２〜５０ミクロン、好ましくは２５ミクロン未満の細かさを有することを特徴とする、方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法であって、
加圧された二酸化炭素を、得られる濾液に添加することをさらに含むことを特徴とする、方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法によって得られる製品であって、
グリセロールまたは水／グリセロール溶液中に、フィコシアニンと前記抽出に用いられる前記原料中に存在する栄養素の１つ以上とを含有する前記抽出物を含有することを特徴とする、製品。
【請求項１１】
請求項１０に記載の製品であって、
一回または複数回量として包装されることを特徴とする、製品。
【請求項１２】
請求項１０に記載の製品であって、
診断薬として、医薬として、または食品もしくは化粧品分野における、またはフードサプリメントとしての利用のための、製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の目的は、フィコシアニンを抽出および安定化する方法と、特に診断および医療、食品、もしくは化粧品分野における、またはフードサプリメントとしてのその利用とを提供することである。
【背景技術】
【０００２】
フィコシアニンは水溶性蛋白質であり、例えばスピルリナspirulin(Arthrospira platensisもしくはSpirulina maxima)またはＡＦＡ（Aphanizomenon Flos-Aquae）のようなシアノバクテリアの主要な色素の１つである。安静時には、フィコシアニンは青色と赤色蛍光とを有する。フィコシアニンは、極大吸収を６２０ｎｍに、輻射放射(emission radiation)を６３５ｎｍにおいて有する。この性質は、フィコシアニンを、生体医学的診断法において好ましい標識である蛍光性の天然物にしている。
【０００３】
生理的なレベルにおいてはフィコシアニンは重要な抗酸化剤でもあり、特に、血漿蛋白質を酸化的な修飾から保護する。フィコシアニンの化学構造は、ビリルビン（これはヘモグロビンの分解産物である）と非常に近い構造的類似性を有し、極めて類似した特性を有する。
【０００４】
フィコシアニンは、特に、ヒトおよび動物の健康にとってのその有利な特性ゆえに、非常に重要な分子である。フィコシアニンは、特にその抗酸化特性、さらには幹細胞の産生を促進するその能力を求めて消費される。
【０００５】
しかしながら、フィコシアニンは抽出の難しい高価な分子である。さらに、抽出後には、細菌汚染の場合に非常に迅速に分解される分子である。このことがコストを上昇させる。なぜなら、液体形態において、水中においては、この分子は無菌条件下において抽出されて一回量ごとに包装されなければならないからである。
【０００６】
種々の抽出方法が提案されて来ており、それらの中にはタンジェンシャルフロー濾過、高速溶媒抽出、細胞溶解、および水性二相抽出がある。
【０００７】
特許文献１は０．２マイクロメートルのタンジェンシャルフロー濾過方法を記載しており、これは、フィコシアニンが水性媒体中において無菌的に低温抽出されることを可能にする。しかしながら、この方法は高い資本コストを要求する。なぜならタンジェンシャルフロー濾過用具は非常に高価であり、一回量ごと、例えばガラスアンプルでの包装を必要とするからである。なぜなら、開封後には媒体はもはや無菌的でなく、フィコシアニンは水中においてそれらの条件下では保存できないからである。
【０００８】
この方法は、溶媒として水の代わりにグリセロールを用いて行うには、非常に複雑である。なぜなら、グリセロールは高すぎる粘性を有し、タンジェンシャルフロー濾過が良好な条件下において行われることを可能にしないからである。
【０００９】
３０分未満継続する高速溶媒抽出方法は、高温と、溶媒をその沸点未満に維持する圧力とを特徴とする。この方法においては、いくつかの溶媒、すなわちヘキサン、石油エーテル、エタノール、および水が、６０、１１５、および１７０℃という温度において、３．９および１５分間という異なる抽出時間で試験されていた。これらの溶媒はどれも問題を生ずる。すなわち、ヘキサンおよび石油エーテルは毒性である。エタノールは、最も効率的な抽出を可能にするが、毒性、一部の宗教における禁制、およびヘキサンまたは石油エーテルよりもかなり大きい抗酸化活性の損失といった多くの問題を提起する。それらは、ヘキサンについてはわずか４．３０％、石油エーテルについてはわずか３．６０％という非常に低い抽出効率を有する。一方、水は保存の問題を提起する。なぜなら、細菌汚染の場合には、フィコシアニンは数日中に分解されるからである。
【００１０】
最も頻繁に用いられる細胞溶解技術は、交互に行われる凍結−融解の段階に基づいており、これに続いて、
・超音波処理（細胞膜を破壊し、したがって細胞質および細胞内オルガネラに存在する分子へのアクセスを容易にする）、あるいは、
・凍結−融解ステップにおいてリン酸緩衝溶液（ｐＨ６．８）を加えること、次にミキサーに通すこと、続いて塩酸抽出ステップを行うこと、
を行う。
【００１１】
次に、種々の成分の分離および濃縮が遠心ステップによって行われて、フィコシアニンが回収されるべき上清取得を可能にする。
【００１２】
この技術は、水溶形態のフィコシアニンが細菌汚染の場合には速く分解されてしまい、したがって無菌的な形態でまたは冷気（冷凍）中で保存されなければならず、高い追加コストの原因となるという点を考えると、欠点を有する。
【００１３】
水性二相抽出は、２つ以上の非混和性の水相間における分子の分離を含む。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびリン酸カリウムが、新鮮なフィコシアニン抽出液の所与の量に添加される。混合および静置の後に、系は２相に分離される。これらの相は、次に、イオン交換クロマトグラフィーおよびＵＶ分光法によって分析されて、フィコシアニンおよび総蛋白質の純度および量を算定する。ＰＥＧおよびリン酸カリウムの混合物は、フィコシアニンと他の蛋白質との間における分配係数を得るために用いられる。この系は、次に水性二相抽出に供される。純度を上げるためには、イオン交換クロマトグラフィーが行われる。この抽出法は、高いフィコシアニン濃度が得られることを可能にするとしても、多数の複雑なステップおよび高度で高価な装置の使用を要求するという欠点を有する。
【００１４】
したがって、容易に実施され且つ経済的に十分な、フィコシアニンを得る方法の必要性がある。
【００１５】
さらなる必要性は、得られるフィコシアニン溶液の安定性に関する。実際に、水性媒体中における加熱または紫外線滅菌がフィコシアニン分子を分解し、その全体的な性能が包装を開封した後に衰えるということが知られている。これは一回量の包装を意味する。化学保存料は毒性を有し、それらを食品用途にとって不適合にしている。精油を用いた試験のみが許容できる結果を示している。ラヴィンツァラ(Cinnamomum Camphora)精油は細菌の増殖を遅らせる一方、食品用途に適合している。しかしながら、この処理は、フィコシアニンの短期保存にしか適していない。なぜなら、細菌の増殖は遅らせられるが、最近は全滅させられはしないからである。媒体を強く酸性化して細菌の増殖を防ぐことも可能ではない。なぜならフィコシアニンはｐＨに対して非常に敏感であり、任意の大きな変化は分子の沈殿を引き起こすからである。フィコシアニンはｐＨ５未満およびｐＨ７．５超において不安定になり、沈殿する。
【００１６】
冷凍は実施が簡単な解決手段であるが、コールドチェーンを維持する必要ゆえに、運送を非常に複雑で非常に高価にしてしまう。
【００１７】
高濃度のアルコール（エタノール）は、フィコシアニンが安定化されることを可能にするが、フィコシアニンの特性を変化させて、フィコシアニンはその抗酸化特性の大部分を失う。さらに、アルコールは、それが対象となる多数の宗教上の禁制のため、問題がある。さらに、アルコールの使用は多数の技術的な問題に直面している。すなわち、アルコールは非常に引火性の製品であり、依存性（アルコール毒性）を有する。アルコール製品は多くの税および禁制の対象となるので、アルコールには商業上の制約もある。
【００１８】
抽出方法に用いられる他の溶媒または化学製品、すなわちヘキサン、石油エーテル、リン酸緩衝溶液、ポリエチレングリコールは高価であり、かなりの食品毒性の問題を有する。
【００１９】
室温におけるフィコシアニンの長期保存を可能にすることが産業界によって見いだされた解決手段は、次のものである。
【００２０】
・フィコシアニンは、抽出および濃縮の後に、脱水された乾燥粉末の形態で保存される。これは、その性能を劇的に低下させる。なぜなら乾燥は分子およびそれらの３次元構造を変化させ、分子の生物学的および蛍光的特性を喪失するかまたは減少させることになるからである。
【００２１】
・あるいは、フィコシアニンは、液体形態で、水性媒体中において保存される。これは、高価で複雑な抽出、清澄化、および無菌濾過方法を意味し、続いて一回量での包装（例えばガラスアンプル）が行われる。なぜなら、開封後には媒体が細菌によって汚染され、したがって消費は即座でなければならないからである。
【００２２】
液体形態が好ましいことが知られている。なぜならこの形態のフィコシアニンはその天然の形態を依然として保ち、その蛍光的特性を保存するので、乾燥形態よりもかなりバイオアベイラブルであるからである。
【００２３】
これらの方法は、劇的に価格を上昇させ、活性で高度に精製されたフィコシアニンを非常に高価なものにしてしまう。その価格は、精製されたミリグラムあたり５０米ドルに達し得る。
【００２４】
したがって、その特性を劣化させることのない手頃なコストでのフィコシアニン製造は、未だに困難である。
【００２５】
本発明者によって行われた研究は、新たな溶媒による抽出ステップを行うことによって、これらの問題が十分に克服され得るということを示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２６】
【特許文献１】仏国特許発明第２７８９３９９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
したがって、本発明の１つの目的は、フィコシアニンを抽出および安定化する新規方法を提供することである。
【００２８】
本発明は、任意選択で他の栄養素を有するフィコシアニン溶液または抽出物を、優れた安定性でもって、有利には複数回量の包装で利用可能に提供することも目指す。これは特に、診断法および医療、食品、もしくは化粧品分野における、またはフードサプリメントとしての利用のためである。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
フィコシアニンを、それを含有する少なくとも１つの原料から抽出する方法は、原料をグリセロールまたは水／グリセロール混合物中において温浸する(macerate)ステップを含むことを特徴とする。
【００３０】
水／グリセロール混合物の使用は、そのより低いコスト、より迅速な濾過、製品がより液状であることに関して重要であり、より良い効率での抽出を可能にする。水／グリセロール混合物が純粋なグリセロールの代わりに用いられるときには、濾液中のフィコシアニン含量はより高くなる。
【００３１】
水／グリセロール比は有利には最大で６０／４０に及び得る。
【００３２】
グリセロールは、多くの利点を有する分子である。グリセロールは認可済みの食品原料（Ｅ４２２）であり、非常に安全であると認識されており、結果的に「適量(quantum satis)」を許可されている。グリセロールはイスラムでもユダヤでも適法であり、ベジタリアンおよびヴィーガニストによって消費可能である。最後に、グリセロールは、好ましい甘みを有し、低カロリーであるという利点を有する。さらに、グリセロールは、生物によって天然に産生される分子である。身体が、エネルギー源として貯蔵された脂肪を使用するときには、グリセロールおよび脂肪酸が血中に放出される。
【００３３】
さらに、グリセロールは優れた天然の保存料である。なぜならグリセロールは蛋白質を安定化し、それらの凝集および細菌の増殖を防ぐからである。グリセロールは凍結保護物質でもあり、氷晶が形成されることを防ぐ。
【００３４】
好ましくは、本発明の方法に用いられるフィコシアニンを含有する原料は、乾燥または新鮮粉末形態にある。
【００３５】
抽出が十分であるとき、例えば、室温における２週間の温浸(maceration)後には、濾過ステップが行われる。これは、抽出されたフィコシアニンを含有する濾液と濾過残とを得ることになる。
【００３６】
前記原料は、有利には、スピルリナspirulin(Arthrospira platensisもしくはSpirulina maxima)および／またはＡＦＡ（Aphanizomenon Flos-Aquae）から選択される。
【００３７】
意外なことに、フィコシアニンは、グリセロール中においては経時的にひとりでに抽出され、徐々に濃縮される。
【００３８】
有利には、得られる濾液は微量栄養素も含有し、それらは用いられる原料からひとりでに抽出される。
【００３９】
本発明のさらなる構成においては、グリセロールが加熱されて、抽出速度を増大させる。好適な温度は、１００℃よりも、より具体的には７０℃よりも、好ましくは４０℃よりも低く、さらに特別には、フィコシアニンを分解することを避け、蛍光的特性を維持するために短時間用いられる。加熱されたグリセロールはフィコシアニンを大幅に迅速に抽出し、したがって温浸期間が短縮され得る。
【００４０】
本発明の方法の好ましい一実施形態においては、濾過はフロンタル(frontal)的に、有利には食品グレードのフィルタによって行われる。フィルタは、例えばポリアミド製、特にナイロン製であり、２〜５０ミクロン、好ましくは２５ミクロン未満の細かさを有する。この構成は、フィコシアニンが活性であり、全てのその生物学的および蛍光的特性とともに１年よりも長い期間保存されるような、清澄化された濾液が得られることを可能にする。フィコシアニンは、細菌および酸化からグリセロールによって保護される。抽出混合物中における水が６０％までであれば、細菌汚染またはフィコシアニンの分解のリスクは非常に限られており、生物学的特性は、数年にも及び得る期間に渡って維持される。尚、このようにして得られるフィコシアニンはその蛍光的特性を維持する。これは、分子によるその特性の維持とその非変性との間接的な証拠である。
【００４１】
１つ、複数、または全ての上記構成において明らかにされた本発明の方法の別の好ましい実施形態においては、得られる濾液は、加圧されたＣＯ２を補足される。これは、より良好な保存を可能にし、好ましい味を製品に与える。
【００４２】
通常は、本発明によって得られるフィコシアニンの製造コストは、通常の方法よりもかなり低い。なぜなら、単純で安価な技術が室温において実施されるからである。さらに、無菌条件を得ることは必要でなくなる。なぜなら、グリセロールがフィコシアニンを細菌汚染から保護するからである。その結果、得られる製品は経時的に安定であり、したがって一回量のアンプルに包装することは必要でなくなる。
【００４３】
さらに、開封後にバイアルは細菌汚染の恐れがなく、複数回量の包装、例えば５００ｍｌバイアルでの包装を可能にし、これは人間用の１日量３０個分に相当する。それらの包装は、一回量のアンプルの包装よりもかなり経済的である。
【００４４】
尚、濾過時間はフロンタル濾過の場合には長いが、これは問題にはならない。なぜなら、フィコシアニンは、細菌および酸化から方法の間中保護されているからである。
【００４５】
抽出ステップに用いられる原料は、通常は、多数の重要な栄養素を含んでいる。したがって、スピルリナ(spirulin)は、申し分なく消化吸収可能な形態において、多数の微量栄養素を含有する。最も効率的だと評されている成分の中でも、ビタミンＡ、Ｂ２、Ｂ８、Ｂ１２、ＰＰ、Ｄ、スーパーオキシドジスムターゼ、セレン、マグネシウム、亜鉛がある。
【００４６】
用いられる原料の微量栄養素の大部分は、本発明の方法によって得られる液状抽出物中に見いだされ得、それらもグリセロールの保護効果の恩恵を受ける。
【００４７】
本発明は、得られる濾液／抽出物にも関する。これらの濾液／抽出物は、グリセロールまたは水／グリセロール混合物中のフィコシアニンの溶液を、抽出に用いられる原料中に存在する栄養素の１つ以上とともに含む。
【００４８】
１つの選択肢においては、濾液は、加圧されたＣＯ２とともに加えられる。
【００４９】
これらの濾液／抽出物によって発揮される上記利点に鑑みて、食品、医療、もしくは化粧品分野（練り歯磨きを含む）における、またはさらにフードサプリメントとしてのそれらの利用は、特に興味深いことが分かる。したがって、本発明の濾液／抽出物は、特に、化粧品、例えば特に抗しわ作用を有する美容クリームの製造に、または、さらには歯茎出血を防ぐ有利な効果を有する練り歯磨きの調製において、原料として用いられ得る。
【００５０】
化粧品に通常用いられるグリセロールの代わりの、本発明の濾液／抽出物の利用も挙げられる。
【００５１】
別の態様によれば、本発明は、特に複数回量の形態の、前記抽出物の包装物に関する。それらの包装物は、それらの様々な利用にとって特に好適である。
【００５２】
本発明は、新規製品、濾過ステップの最後に得られる濾過残にも関する。それらの濾過残も、食品、医療、もしくは化粧品分野において、またはフードサプリメントとして利用可能である。
【００５３】
本発明のさらなる特徴および利点が次の実施例において示されるが、これは例示を目的とするものである。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００５４】
８００グラムのスピルリナ(spirulin)粉末、ＡＦＡ、またはこれら両方の混合物が、１０ｋｇのグリセロール中で混合される。それらは放置されて、２週間室温において温浸する。次に、低速のフロンタル濾過が、食品グレードのフィルタ（フィルタの細かさが２〜５０ミクロンでなければならないことを考えると、例えば、２５ミクロンの細かさを有するナイロンフィルタ）によって行われる。
【００５５】
濾過の終わりには、約７Ｌの濾液および３Ｌの濾過残が得られる。
【００５６】
フィコシアニンを含有する濾液は、複数回量のバイアル、例えば５００ｍｌバイアルとして包装され、これは約３０日間の人間への使用にとって十分な量に相当する。かかるバイアルは、問題なく３年間室温で保存され得る。
【００５７】
分光光度法によって行われた分析は、この方法が、９００ｍｇ／Ｌ濾液を超えるフィコシアニン濃度が通常得られることを可能にすることを示した。
【００５８】
さらに、フィルタ上の濾過残は直ちに回収可能であり、その蛋白質の豊富さに鑑みて食品としてアップグレードされ得る。濾過残は、例えば、動物の給餌用のレーションを強化するために用いられ得る。
【国際調査報告】
2016500052.tif 000002
2016500052.tif 000003
2016500052.tif 000004
2016500052.tif 000005
2016500052.tif 000006
2016500052.tif 000007