(57)【要約】【課題】本発明は、酵素を用いてガラクトシルラクトースの含量が４０重量％以上であるガラクトオリゴ糖を製造する方法に関する。【解決手段】乳糖を水に溶解させる段階；前記乳糖溶液に下記の１）〜３）から選ばれた一つ以上の酵素及びβ―ガラクトシダーゼを添加することによって酵素反応を行う段階；及び１）ラクターゼ２）グルコースオキシダーゼ３）カタラーゼ；及び前記酵素反応液を精製する段階；を含む、ガラクトシルラクトースの含量が４０重量％以上であるガラクトオリゴ糖の製造方法。【選択図】図３
2016527886.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳糖を水に溶解させる段階；
前記乳糖溶液に下記の１）〜３）から選ばれた一つ以上の酵素及びβ―ガラクトシダーゼを添加することによって酵素反応を行う段階；及び
１）ラクターゼ
２）グルコースオキシダーゼ
３）カタラーゼ；及び
前記酵素反応液を精製する段階；を含む、
ガラクトシルラクトースの含量が４０重量％以上であるガラクトオリゴ糖の製造方法。
【請求項２】
前記酵素反応段階は、前記ラクターゼ及び前記β―ガラクトシダーゼを乳糖溶液に添加した後、酵母をさらに添加して行うことを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記ラクターゼ及び前記β―ガラクトシダーゼを乳糖溶液に添加した後、前記乳糖溶液内のガラクトオリゴ糖の含量が５０重量％以上になるとき、酵母をさらに添加することを特徴とする、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記酵母によってグルコース及びガラクトースがエタノール及び酢酸に変換されることを特徴とする、請求項２に記載の製造方法。
【請求項５】
前記酵素反応段階は、前記グルコースオキシダーゼ及びカタラーゼを乳糖溶液に添加して行うことを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
前記グルコースオキシダーゼ及びカタラーゼは、乳糖溶液に同時に又は連続的に添加することを特徴とする、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記グルコースオキシダーゼによってグルコースがグルコン酸に変換されることを特徴とする、請求項５に記載の製造方法。
【請求項８】
前記カタラーゼによって過酸化水素が除去されることを特徴とする、請求項５に記載の製造方法。
【請求項９】
前記ガラクトオリゴ糖は、ガラクトシルラクトースの含量が４０重量％以上であることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記酵素反応液内の糖中のグルコース及びガラクトースの含量は、２０重量％未満であることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記乳糖は、牛乳加工過程で出る副産物から得られることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記乳糖は、乳清由来のものであることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガラクトシルラクトースの含量が高いガラクトオリゴ糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガラクトオリゴ糖は、母乳に存在し、生理機能に優れた多糖類であって、これを用いた製品が多く開発されている（韓国公開特許１０―１９９７―００４３０６５号）。このうち、ガラクトシルラクトース（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｌａｃｔｏｓｅ）は、人体免疫機能に役立つものとして知られている。
【０００３】
ガラクトシルラクトースは、三糖類で構成されており、乳糖を原料として製造される生理機能性に優れたガラクトオリゴ糖成分の一種である（図１）。また、ガラクトシルラクトースは、人体の大腸に存在するビフィズス菌やラクトバチルス菌などを増殖させる効果を有するものとして知られており、排便活動の改善又は下痢予防のための食品などの乳児及び老人を対象とする食品などに使用されている。また、ガラクトシルラクトースは、大腸活動の改善を通じて肌の老化速度を抑制させる効果を有するものとして知られているが、これは、大腸内の菌叢変化（腸内の有益菌の増殖効果）を通じて円滑な排便活動を誘導することによって、肌の老化を抑制させるものと推定される。
【０００４】
ところが、従来の方法の通りに乳糖からガラクトオリゴ糖を製造する場合、前記ガラクトオリゴ糖内のガラクトシルラクトースの含量はそれほど高くない。そのため、本発明者等は、ガラクトシルラクトースの含量が高いガラクトオリゴ糖に対して研究した結果、特定酵素を用いて製造するときに、ガラクトシルラクトースの含量が高いガラクトオリゴ糖を製造できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】韓国公開特許１０―１９９７―００４３０６５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ガラクトシルラクトースの含量が高いガラクトオリゴ糖の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的のために、本発明は、
乳糖を水に溶解させる段階；
前記乳糖溶液に下記の１）〜３）から選ばれた一つ以上の酵素及びβ―ガラクトシダーゼを添加することによって酵素反応を行う段階；
１）ラクターゼ
２）グルコースオキシダーゼ
３）カタラーゼ；及び
前記酵素反応液を精製する段階；を含む、
ガラクトシルラクトースの含量が４０重量％以上である糖液の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、ガラクトシルラクトースの含量が４０重量％以上であるガラクトオリゴ糖を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ガラクトシルラクトースの各構造を示す図である。
【図２】本発明の製造方法を示す模式図である。
【図３】従来の糖液の製造方法を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、
乳糖を水に溶解させる段階；
前記乳糖溶液に下記の１）〜３）から選ばれた一つ以上の酵素及びβ―ガラクトシダーゼを添加することによって酵素反応を行う段階；
１）ラクターゼ
２）グルコースオキシダーゼ
３）カタラーゼ；及び
前記酵素反応液を精製する段階；を含む、
ガラクトシルラクトースの含量が４０重量％以上であるガラクトオリゴ糖の製造方法に関する。
【００１１】
また、本発明は、
乳糖を水に溶解させる段階；
前記乳糖溶液に下記のラクターゼ及びβ―ガラクトシダーゼを添加することによって酵素反応を行う段階；
酵母をさらに添加する段階；及び
前記酵素反応液を精製する段階；を含む、
ガラクトシルラクトースの含量が４０重量％以上であるガラクトオリゴ糖の製造方法に関する。
【００１２】
また、本発明は、
乳糖を水に溶解させる段階；
前記乳糖溶液にグルコースオキシダーゼ、カタラーゼ及びβ―ガラクトシダーゼを添加することによって酵素反応を行う段階；及び
前記酵素反応液を精製する段階；を含む、
ガラクトシルラクトースの含量が４０重量％以上であるガラクトオリゴ糖の製造方法に関する。
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
（乳糖）
本発明の乳糖は、市販の乳糖を購入して利用してもよく、牛乳などから直接分離して利用してもよい。また、本発明の乳糖は、牛乳加工過程で出る副産物から分離して利用してもよい。
【００１５】
（ガラクトオリゴ糖）
本発明のガラクトオリゴ糖は、乳糖を原料として酵素反応などによって製造される二糖類及び六糖類のガラクトース含有オリゴ糖であって、乳糖を除外する。本発明のガラクトオリゴ糖は、４―β―ガラクトビオース、６―β―ガラクトビオース、３’―ガラクトシルラクトース、４’―ガラクトシルラクトース、６’―ガラクトシルラクトース、４―β―ジ―ガラクトシルラクトース、４―β―トリ―ガラクトシルラクトース、４―β―テトラ―ガラクトシルラクトースなどを含む。
【００１６】
＜製造例１＞
乳糖を反応タンクに投入した後、熱水を加えて、撹拌機を稼動させることによって乳糖溶液の濃度を約４０％〜４５％にする。乳糖溶液の濃度が４０％〜４５％範囲内になると、酵素の反応温度が５５℃〜６０℃になるように反応タンクの温度を調整する。反応タンクの温度が調整された後、ラクターゼとβ―ガラクトシダーゼを反応タンクに投入し、酵素反応が起こるようにした。このとき、β―ガラクトシダーゼは、乳糖をガラクトオリゴ糖に合成させ、ラクターゼは特異的に乳糖成分を分解させる。
【００１７】
約２４時間〜４８時間酵素反応を行い、このとき、ＨＰＬＣを使用して反応液の糖組成を分析し、ガラクトオリゴ糖の含量が５０重量％以上になると、以後に酵母を反応タンクに投入し、既に生成された糖液内に存在するグルコースとガラクトース成分を発酵してエタノールと酢酸に変換させる。
【００１８】
このとき、グルコースとガラクトース成分が発酵しながら、ガラクトオリゴ糖内のガラクトシルラクトース成分が相対的に漸次高くなりながら、酵母発酵前に、ガラクトオリゴ糖内のガラクトシルラクトースの含量は、約２０％水準から発酵後に４０重量％以上、好ましくは４５重量％以上、より好ましくは５０重量％以上、さらに好ましくは５５重量％以上の水準に高くなり、糖液内のガラクトオリゴ糖の含量も、初期の４０％水準から約７５％以上に高くなる。このとき、発酵時間は約２４時間〜４８時間である。酵素反応と酵母反応が全て完了すると、反応タンクに粉末活性炭を投入し、７０℃〜８０℃で２０分〜５０分間撹拌しながら糖液の色素物質を吸着させる。
【００１９】
次の工程で糖液をろ過させることによって糖液の活性炭と異物を除去した後、イオン精製工程を通じて酢酸成分を除去する。このとき、除去反応メカニズムは、下記の式１に示す通りであり、生成された―ＣＨ３ＣＯＯ（−）は、イオン精製工程で除去される。
【００２０】
＜式１＞
Ｒ―ＯＨ（−）＋ＣＨ３ＣＯＯ（−）／Ｈ（＋）→Ｒ―ＣＨ３ＣＯＯ（−）＋Ｈ２Ｏ
註１）Ｒ：Ｒｅｓｉｎ本体
註２）ＯＨ（−）：Ｒｅｓｉｎ本体に結合されている官能基
【００２１】
糖液に対してイオン精製処理を行い、酢酸を除去した後、濃縮工程を通じて所望の濃度で糖液を濃縮する。糖液の濃縮濃度は、用途、需要などによって適宜定めることができるが、約７５％の濃度で濃縮させることが一般的である（図２）。
【００２２】
＜製造例２＞
製造例１と同一に乳糖溶液を製造した後、β―ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びカタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ）を反応タンクに同時に又は連続的に投入し、酵素反応を進行させる。このとき、工程の便宜性のために、β―ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びカタラーゼを同時に投入することが好ましい。
【００２３】
このとき、酵素反応で乳糖から生成されたグルコース成分は、グルコースオキシダーゼと反応してグルコン酸に変換され、反応メカニズムは、下記の式２に示す通りである。前記式３で生成されるＨ２Ｏ２は、カタラーゼによって除去され、Ｒ―Ｃ６Ｈ１２Ｏ６（−）は、後にイオン交換樹脂によって除去される。
【００２４】
＜式２＞
１）Ｃ６Ｈ１２Ｏ６＋Ｇｌｕｃｏｓｅ―ｏｘｉｄａｓｅ→Ｃ６Ｈ１２Ｏ７＋Ｈ２Ｏ２
２）Ｃ６Ｈ１２Ｏ７＋Ｈ２Ｏ２＋Ｃａｔａｌａｓｅ→Ｈ２Ｏ２＋Ｏ２＋Ｃ６Ｈ１２Ｏ７
３）Ｒ―ＯＨ（−）＋Ｃ６Ｈ１２Ｏ７→Ｒ―Ｃ６Ｈ１２Ｏ６（−）＋Ｏ３（イオン交換工程）
註１）Ｒ：Ｒｅｓｉｎ本体
註２）ＯＨ（−）：Ｒｅｓｉｎ本体に結合されている官能基
【００２５】
酵素反応が完了すると、以後の工程は製造例１と同一である。
【００２６】
（本発明の糖液）
【００２７】
本発明の方法を用いて製造した糖液内のガラクトオリゴ糖は、ガラクトシルラクトースの含量が４０重量％以上である。好ましくは、本発明の糖液内のガラクトオリゴ糖内の前記ガラクトシルラクトースの含量は４５重量％以上である。
【００２８】
また、本発明の方法を用いて製造した糖液内の糖組成を見ると、グルコース及びガラクトースの含量は２０重量％未満である。前記グルコース及びガラクトースの含量が２０重量％未満であることは、グルコース及びガラクトースが検出されない程度に微々たるものであるか、実質的に存在しない場合も含む。
【００２９】
本発明の利点及び特徴、そして、それらを達成する方法は、添付の図面と共に詳細に後述している各実施例を参照すれば明確になるだろう。しかし、本発明は、以下で開示する各実施例に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形態に具現可能である。但し、本実施例は、本発明の開示を完全にし、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものであって、本発明は、請求項の範疇によって定義されるものに過ぎない。
【００３０】
＜材料及び方法＞
原材料である乳糖及び酵素は、市販のものを購入して使用した。牛乳からチーズを製造する工程で出る副産物である乳清は、メイル乳業株式会社から購入して使用した。
【００３１】
（ＨＰＬＣ分析）
試料糖液に超純水（比電導度値：０．０５μＳ／ｃｍ以下）を添加し、試料糖液の濃度が約２．５％〜３．０％になるように希釈する（試料濃度の分析には、Ｒｅｆｒｘｔｏｍｅｔｅｒを使用する）。試料糖液の濃度を調整した後、０．２μｍ〜０．４５μｍのフィルターを使用して試料溶液に含有されている異物を除去した後、この試料をＨＰＬＣ分析試料として使用する。
【００３２】
ＨＰＬＣ分析条件は、下記の通りである。
【００３３】
―  ＨＰＬＣ分析用カラム：Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ系列のカラム（ＹＭＣ―Ｐａｃｋ  Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ―II／Ｊａｐａｎ）
【００３４】
―  カラムサイズ、粒度：２５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．ｓ―５μｍ、１２ｎｍ
【００３５】
―  検出器（Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）：ＲＩＤ（Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）
【００３６】
―  カラム温度（Ｃｏｌｕｍｎ  ｏｖｅｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）：２５℃〜３０℃
【００３７】
―  溶媒（Ｓｏｌｖｅｎｔ）：６４％のＡｃｅｔｏｎｔｒｉｌｅ
【００３８】
―  流量（Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ）：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
【００３９】
―  分析時間（Ｒｕｎ  ｔｉｍｅ）：２５分
【００４０】
―  試料注入量（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｖｏｌｕｍｅ）：２０μＬ
【００４１】
―  標準試薬：グルコース（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、ガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ）、乳糖（Ｌａｃｔｏｓｅ）
【００４２】
まず、該当の試料を分析する前に、前記ＨＰＬＣ分析方法と同一の方法で標準試薬をＨＰＬＣで分析し、各標準試薬のクロマトグラム（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ）に描かれたピークの滞留時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）を確認する。その次に、前処理した分析試料をＨＰＬＣに注入してＨＰＬＣクロマトグラムを求めた後、標準試薬のグルコース、ガラクトース、そして、乳糖の滞留時間と試料の滞留時間とを比較し、これらの滞留時間が一致すると同一の成分と見なし、下記の式３によってガラクトオリゴ糖の含量を求める。
【００４３】
＜式３＞
ガラクトオリゴ糖の含量（ＤＢ％）=１００−（グルコースの含量＋ガラクトースの含量＋乳糖の含量）
註１）ＤＢ％：Ｄｒｙ  Ｂａｓｉｓ．無水物基準という意味である。
【００４４】
＜実施例１＞
市販の乳糖を購入して準備した。前記乳糖を反応タンクに投入した後、熱水を加えて、撹拌機を稼動させることによって乳糖溶液１００重量％内の乳糖を約４０重量％〜４５重量％にした。乳糖溶液の濃度が４０重量％〜４５重量％の範囲内になると、酵素の反応温度が５５℃〜６０℃になるように反応タンクの温度を調整した。反応タンクの温度が調整された後、ラクターゼとβ―ガラクトシダーゼを反応タンクに投入し、酵素反応が起こるようにした。このとき、β―ガラクトシダーゼは乳糖をガラクトオリゴ糖に合成させ、ラクターゼは特異的に乳糖成分を分解させる反応を進行する。
【００４５】
前記酵素反応は３６時間行った。このとき、ＨＰＬＣを使用して反応糖液の糖組成を分析し、ガラクトオリゴ糖の含量が５０重量％以上になると、酵母を反応タンクに投入し、既に生成されたガラクトオリゴ糖に存在するグルコースとガラクトース成分を発酵してエタノールと酢酸に変換させた。酵素反応と酵母反応が全て完了した後、反応タンクに粉末活性炭を投入し、７５℃で約３０分間撹拌しながら糖液の色素物質を吸着させた。
【００４６】
その後、糖液をろ過させることによって糖液の活性炭と異物を除去した後、イオン精製工程を通じて酢酸成分を除去した。
【００４７】
糖液に対してイオン精製処理を行い、酢酸を除去した後、糖液内の固形分の濃度が７５％の濃度になるように糖液を濃縮させた。すなわち、濃縮された糖液内の糖固形分は７５重量％で、水が２５重量％である。
【００４８】
＜実施例２＞
市販の乳糖を購入して準備した。そして、前記実施例１と同一の方法で乳糖溶液を製造し、酵素の反応温度が５５℃〜６０℃になるように反応タンクの温度を調整した。その後、β―ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びカタラーゼを反応タンクに同時に投入し、６０時間酵素反応を進行させた。このとき、酵素反応で乳糖から生成されたグルコース成分は、グルコースオキシダーゼと反応してグルコン酸に変換される。
【００４９】
酵素反応が完了した後、前記実施例１と同一の方法で糖液内の色素物質を吸着させ、糖液をろ過した後、イオン精製工程を行った。酵素反応で生産されたグルコン酸は、イオン精製工程で除去された。
【００５０】
＜実施例３＞
乳清を購入して準備し、前記乳清から乳糖を分離した。前記分離は、乳清のｐＨをｐＨ４．４〜ｐＨ４．６に調整した後、約６０℃の温度で加熱し、約１時間ほど放置することによってタンパク質成分を凝固させた後、糖液をろ過し、タンパク質成分と乳糖成分とを分離して行った。そして、このように分離された乳糖を用いた点を除いては、前記実施例１と同一の方法で糖液を製造した。
【００５１】
＜比較例１＞
従来の方法によって糖液を製造した。具体的には、まず、乳糖を反応タンクに投入した後、熱水を加えて、撹拌機を稼動させることによって乳糖溶液内の固形分の濃度を約４０重量％〜４５重量％にした。乳糖溶液内の固形分の濃度が４０重量％〜４５重量％の範囲内になると、β―ガラクトシダーゼを反応タンクに投入し、酵素反応を進行させた。前記酵素反応は６０時間行い、酵素反応が終了した後、反応タンクに粉末活性炭を投入し、７５℃で約３０分間撹拌しながら糖液の色素物質を吸着させた。その後、糖液をろ過させることによって糖液の活性炭と異物を除去した後、イオン交換樹脂を用いてイオン精製工程を行った。そして、イオン精製された糖液を殺菌し、５０％の濃度で濃縮した後、クロマトグラフィを行った。その後、糖液をイオン交換樹脂を用いて精製した後、再び粉末活性炭を投入し、色素物質を吸着させ、殺菌した後で７５％の濃度で濃縮した（図３）。
【００５２】
＜実験例１＞製造方法による糖液内の糖組成差
前記実施例１〜実施例３の糖液内の糖組成を分析した。その結果、比較例に比べると、実施例１〜実施例３のガラクトシルラクトースの含量が著しく高いことが分かった（表１）。
【００５３】
【表１】
2016527886.tif 000003
【００５４】
単位：ＤＢ％
ＤＢ％：無水物基準（Ｄｒｙ  Ｂａｓｉｓ）
＊全体のガラクトオリゴ糖（ＴＯＳ）：ガラクトビオース＋ガラクトシルラクトース＋四糖類以上のガラクトオリゴ糖
【００５５】
＜実験例２＞製造方法による糖液の収率差
前記実施例１及び実施例２の収率を分析した。その結果、比較例１に比べると、実施例１及び実施例２の収率が有意に高いことが分かった（表２）。
【００５６】
【表２】
2016527886.tif 000004
【００５７】
＊全体のオリゴ糖：ガラクトシルラクトースを含むオリゴ糖の含量
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明は、ガラクトシルラクトースの含量が高いガラクトオリゴ糖の製造方法を提供する。
【図１】
2016527886.tif 000005
【図２】
2016527886.tif 000006
【図３】
2016527886.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成28年1月21日(2016.1.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
このとき、酵素反応で乳糖から生成されたグルコース成分は、グルコースオキシダーゼと反応してグルコン酸に変換され、反応メカニズムは、下記の式２に示す通りである。前記式２で生成されるＨ２Ｏ２は、カタラーゼによって除去され、Ｒ―Ｃ６Ｈ１２Ｏ６（−）は、後にイオン交換樹脂によって除去される。
【国際調査報告】
2016527886.tif 000008
2016527886.tif 000009
2016527886.tif 000010
2016527886.tif 000011