(57)【要約】  本発明は、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの固定化のための複合担体、その調製方法、および適用が提供される。複合担体は、多孔質材料であり、以下：（１）開放気孔を含む多孔質有機発泡材料；および（２）アルデヒド基を有し、および多孔質有機発泡材料の１つ以上の孔の壁の表面に固定化される架橋化生成物を備え、ここでアルデヒド基は、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドと反応し得、ならびにアルデヒド基は、ポリアルデヒド化合物との架橋反応を介してキトサンにより形成される。開示される複合担体は、いくつかの利点および著しい技術的効果を有している。特に、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドを容易におよび安定に固定化できる。固定化生成物は大きな比表面積と高い比活性を有している。固定化は単純で低コストであり、産業用途に適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの固定化のための多孔質複合担体であって、
ａ）開放気孔を含む多孔質有機発泡材料；および
ｂ）アルデヒド基を有し、および多孔質有機発泡材料の１つ以上の孔の壁の表面に固定化される架橋化生成物を備え、ここでアルデヒド基は、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドと反応し得、そして架橋化生成物が、ポリアルデヒド化合物との架橋反応を介してキトサンにより形成される、複合担体。
【請求項２】
有機発泡材料が、メラミンフォームである、請求項１に記載の複合担体。
【請求項３】
複合担体が、顆粒、ストラップ、シート、ブロック、またはカラムの形態にある、請求項１に記載の複合担体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の複合担体の調製のための方法であって、ここで方法は、以下の工程：
ａ）開放気孔を含む多孔質有機発泡材料を提供する工程：
ｂ）多孔質有機発泡材料の１つ以上の孔の壁の表面にキトサンを沈殿する工程：および
ｃ）ポリアルデヒド化合物と、沈殿されたキトサンとを架橋して、複合担体を形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項５】
工程ｂ）において、キトサンが、アルカリと、好ましくは水酸化ナトリウムと反応することにより、表面に沈殿される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ポリアルデヒド化合物がグルタルアルデヒドまたはジアルデヒドデンプンである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の複合担体、および
複合担体に固定化されるタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドを備える、複合体。
【請求項８】
タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドが、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドのアミノ基と、複合担体のアルデヒド基との間の反応を介して複合担体に固定化される、請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドが酵素であり、および好ましくはトランスグルコシダーゼである、請求項７または８に記載の複合体。
【請求項１０】
タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドが、細菌を殺傷するのに、または細菌の増殖を阻害するのに有用であり、および好ましくはポリミキシンＢである、請求項７または８に記載の複合体。
【請求項１１】
タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドが、親和性クロマトグラフィー精製に有用であり、および好ましくはグルタチオンまたはプロテインＡである、請求項７または８に記載の複合体。
【請求項１２】
複合体が、請求項１〜３のいずれか１項に記載の複合担体と、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの溶液との間の反応によって調製される、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の複合体を調製するための方法。
【請求項１３】
生体触媒の方法であって、請求項７〜９のいずれか１項に記載の複合体が、その対応する基質の反応に触媒作用を及ぼすための生体触媒として使用される、方法。
【請求項１４】
細菌を殺傷するための、または細菌増殖を阻害するための方法であって、ここで請求項７、８、または１０に記載の複合体が、細菌を殺傷するための、または細菌増殖を阻害するための媒体として使用される、方法。
【請求項１５】
生理活性物質を精製するための方法であって、ここで請求項７、８、または１１に記載の複合体が、生理活性物質を精製するために親和性クロマトグラフィーにおける媒体として使用される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの固定化の技術分野に関する。より具体的には、本発明は、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの固定化のために使用される複合担体の調製および適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオ技術の発達とともに、酵素の適用が一般的になる。産業および他の分野において、酵素はしばしば、遊離酵素の高いコストに起因して、固定化形態において使用される。また、固定化形態は、反復使用のために、生成物から分離および回収することが容易であり、ならびに遊離酵素よりも安定である。物理的吸着、親和性結合、共有結合的架橋、凝集、およびカプセル化のような、多くの固定化方法は、酵素の固定化形態を得ることが知られる（非特許文献１）。
【０００３】
固定化酵素／細胞の単位重量の活性である比活性は、固定化酵素／細胞の効率を評価するために使用される。比活性は、固定化法および固定化酵素／細胞の比表面積の両方によって影響される。一般に、より大きな比表面積は、より高い比活性を生じる。それゆえ、多くの固定化法が、酵素粒子の比表面積を増加するために開発される。今日、比表面積を増加するための一般的な方法として、多孔質小規模担体を使用することが挙げられる。例えば、予め作られた（ｐｒｅｆａｂｒｉｃａｔｅｄ）毛管孔隙を有する小粒子担体が、酵素および細胞を吸着および担持するために使用される。しかし、硬質の無機または有機の材料から作製される従来の担体の孔隙率は、主にその表面で具現化される。担体は、余分な内部細孔がある場合、容易にクラッキングされる。その結果、当該分野における科学者らは、大きな表面積を備え、および破損の傾向がほとんどない固定化担体を探求する。
【０００４】
特許文献１は、酵素／細胞の固定化のために使用される担体、および担体を使用する固定化法を開示する。担体は大きな比表面積を有し、そして物理的および化学的に安定である。しかし、反応性の官能基をなんら有しない不活性な担体は、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドを直接的に固定化し得ない。特に、あるタンパク質またはポリペプチド（例えば、トランスグルコシダーゼまたはプロテインＡ）の固定化は有効ではない。さらに、その固定化は、オリゴペプチド（例えば、グルタチオンまたはポリミキシンＢ）を固定化し得ない。
【０００５】
親和性クロマトグラフィー技術は、一般的な分離方法であり、固定化技術を利用する。親和性クロマトグラフィーの原理は、生理活性物質とその対応するリガンドとの間の非常に特異的な可逆性相互作用に基づく。親和性クロマトグラフィーの一般的な手順としては以下が挙げられる：（１）標的生理活性物質に対応するリガンドの、担体カラムへの固定化；（２）カラムへの、精製される標的生理活性物質の投入；（３）ｐＨ、イオン強度、濃度のような移動相の組成を変化することによる、および親和性結合を弱めるための競合リガンドの添加による、カラムからの標的生理活性物質の解離。親和性クロマトグラフィーは、これが単純で迅速な、および特異的な分離を提供するので、専ら使用される。さらに、これは高分解能を提供する。親和性カラムの既存の担体は、しばしば、アガロースから作製される。しかし、その産業適用は、アガロースの高コスト、および毒物、臭化シアン（ＣＮＢｒ）（そのリガンドタンパク質と結合する場合、アガロースの活性化のために必要とされる）のために、大きく制限される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】中国特許公報第ＣＮ１９８２４４５Ａ号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｒｏｇｅｒ  Ａ．Ｓｈｅｌｄｏｎ，２００７、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＆  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ，３４９：１２８９−１３０７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
既存の固定化技術の欠点を解決するために、本発明は、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの固定化のために使用される、複合担体の調製および適用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
具体的には、本発明は以下の１５項目を提供する：
【００１０】
１．タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの固定化のための多孔質複合担体であって、以下：
ａ）開放気孔を含む多孔質有機発泡材料；および
ｂ）アルデヒド基を有し、多孔質有機発泡材料の１つ以上の孔の壁の表面に固定化される架橋化生成物を備え、ここでアルデヒド基は、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドと反応し得、そして架橋化生成物が、ポリアルデヒド化合物との架橋反応を介してキトサンにより形成される、複合担体。
【００１１】
２．有機発泡材料が、メラミンフォームである、項目１に記載の複合担体。
【００１２】
３．複合担体が、顆粒、ストラップ、シート、ブロック、またはカラムの形態にある、項目１に記載の複合担体。
【００１３】
４．項目１〜３のいずれか１項に記載の複合担体の調製のための方法であって、ここで方法は、以下の工程：
ａ）開放気孔を含む多孔質有機発泡材料を提供する工程：
ｂ）多孔質有機発泡材料の１つ以上の孔の壁の表面にキトサンを沈殿する工程：および
ｃ）ポリアルデヒド化合物と、沈殿したキトサンとを架橋して、複合担体を形成する工程、
を包含する、方法。
【００１４】
５．工程ｂ）において、キトサンがアルカリと、好ましくは水酸化ナトリウムと反応することにより、表面に沈殿される、項目４に記載の方法。
【００１５】
６．ポリアルデヒド化合物がグルタルアルデヒドまたはジアルデヒドデンプンである、項目４に記載の方法。
【００１６】
７．項目１〜３のいずれか１項に記載の複合担体、および複合担体に固定化されるタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドを備える、複合体。
【００１７】
８．タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドが、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドのアミノ基と、複合担体のアルデヒド基との間の反応を介して複合担体に固定化される、項目７に記載の複合体。
【００１８】
９．タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドが酵素であり、および好ましくはトランスグルコシダーゼである、項目７または８に記載の複合体。
【００１９】
１０．タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドが、細菌を殺傷するのに、または細菌の増殖を阻害するのに有用であり、および好ましくはポリミキシンＢである、項目７または８に記載の複合体。
【００２０】
１１．タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドが、親和性クロマトグラフィー精製に有用であり、および好ましくはグルタチオンまたはプロテインＡである、項目７または８に記載の複合体。
【００２１】
１２．項目７〜１１のいずれか１項に記載の複合体を調製するための方法であって、複合体が項目１〜３のいずれか１項に記載の複合担体と、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの溶液との間の反応によって調製される、方法。
【００２２】
１３．生体触媒法であって、ここで項目７〜９のいずれか１項に記載の複合体は、その対応する基質の反応に触媒作用を及ぼすための生体触媒として使用される、方法。
【００２３】
１４．細菌を殺傷するための、または細菌増殖を阻害するための方法であって、ここで項目７、８、または１０に記載の複合体が、細菌を殺傷するための、または細菌増殖を阻害するための媒体として使用される、方法。
【００２４】
１５．生理活性物質を精製するための方法であって、項目７、８、または１１に記載の複合体が、生理活性物質を精製するための親和性クロマトグラフィーにおける媒体として使用される、方法。
【００２５】
既存の技術に比較して、本発明は以下の利点を有する：
【００２６】
１．第１に、複合担体は、アルデヒド基と、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドのアミノ基との間の化学反応を介して、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドを安定に固定化し得る反応性アルデヒド基を保有する。例えば、複合担体は、共有結合を介して、トランスグルコシダーゼ、ポリミキシンＢ、グルタチオン、およびプロテインＡを安定に固定化する。第２に、本発明は、比表面積を非常に増加し、従って固定化タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの比活性を増加する開放気孔を含む、多孔質有機発泡材料を使用する。第３に、担体は、安価な不活性物質を使用し、それゆえ生産コストを低減する。第４に、本発明において得ることができる生成物は、比表面積を変化することなく種々の形状および大きさに合わせることが可能であり得、これは大規模産業生産に特に有用である。
【００２７】
２．本発明の複合担体は、応用酵素学、およびタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの分野に広範に使用され得る。理論的には、本発明の方法は、アルデヒド基に結合し得る任意のタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの固定化に適用可能である。さらに、複合担体は、単純な調製および低い生産コストのために、大規模産業生産に適切である。
【００２８】
本発明の複合担体は、充填層固定化カラムに適切なリール形状のシリンダーとして作製され得、これは従来の微粒子形状の固定化タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドよりも単純であり効果的である。このような利点は、特に大規模産業生産において明白である。リール形状の担体は、管状軸およびケーシングを伴わない充填層カラム中に直接的にアセンブリされ得る。この構造は、固定コストを明らかに下げ得る。リール形状担体のみからなる充填層反応カラムは、連続してまたは平行に設置され得、そしてまた、充填層反応カラムの数および長さは、産業生産の規模に従って容易に適合され得る。さらに、固定化タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの活性、特に基質の入り口近くの活性は、反応の間に徐々に減少し、そして充填層反応カラムの２つの端の間に活性の差異を生じる。高い活性の充填層反応カラムでの低い活性の充填層反応カラムの置き換えは容易に行われ得、それによってカラムの寿命および生産性がより効果的に調整され得る。この効果は、従来の粒子形状の固定化タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドにより達成され得ない。
【００２９】
３．本発明の生体触媒法および親和性クロマトグラフ法は、従来の技術よりも単純であり、およびコストが低く、従って、大規模産業生産に特に適切である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】固定化ポリミキシンＢの存在下でのＥ．ｃｏｌｉのインキュベーション後の、アガープレートの結果を示し、ここで（Ａ）は、サンプルＡのアガープレートであり；（Ｂ）は、サンプルＢのアガープレート（コントロール実験）である。
【図２】固定化グルタチオンによるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼの精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、ここでレーン１は、精製前のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼであり；レーン２は、精製後のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼである。
【図３】固定化プロテインＡカラムによるウサギ血清の親和性精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、ここでレーン１は、精製前のウサギ血清であり；レーン２は、精製後のウサギ血清である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下に示される特定の実施態様は、本発明の説明のためのみであり、および本発明の制限として見なされることを意図しない。当業者は、種々の改変および変更が、本発明の概念および精神から逸脱することなく本発明に対してなされ得、そして改変および変更は、本発明の範囲内にあることをまた理解する。
【００３２】
本発明における用語「メラミンフォーム」は、メラミン樹脂から作製されるフォーム材料をいう。フォーム材料は、軟質であり、高い親水性を有し、そしてその密度は、０．０２ｇ／ｃｍ３よりも大きくない。これはまた、開放気孔を含む三次元網の多孔質構造を保有する。材料は、種々の大きさおよび異なる形状（例えば、顆粒、ストラップ、シート、ブロック、およびカラム）において調製され得る。
【００３３】
本発明者らは、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの固定化に対して多くの研究（例えば、有機発泡材料の処理、および異なる有機発泡材料のスクリーニング）を行い、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの固定化に対するより適切なおよびより良好な担体を選択した。本発明者らは、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドが、多孔質有機発泡材料の孔壁で、孔壁がキトサンによって導入された反応性のアルデヒド基を有する場合、容易におよび安定に固定化され得ることを驚くべきことに発見した。これらの知見に基づいて、本発明の技術的解決法が開発された。
【００３４】
特に、本発明は以下の６つの節を提供する：
【００３５】
［１］．タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの固定化のための複合担体
本発明は、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの固定化のための複合担体を提供する。複合担体は多孔質であり、ならびに以下：
ａ）開放気孔を含む多孔質有機発泡材料；および
ｂ）アルデヒド基を有し、および多孔質有機発泡材料の１つ以上の孔の壁の表面に固定化された架橋化生成物を備え、ここでアルデヒド基は、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドと反応し得、そして架橋化生成物はポリアルデヒド化合物との架橋反応を介してキトサンによって形成される。
【００３６】
キトサン、キチンの脱アセチル化生成物、の化学名は、ポリ−β−（１→４）−２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコースであることは、当該分野において周知である。一般に、脱アセチル化されたキチンは、脱アセチル化の程度が５５％を超える場合；または１％の脱アセチル化キチンが、１％の酢酸もしくは１％の塩酸中に可溶性である場合、キトサンとして分類される。事実、５５％を超える脱アセチル化の程度を伴う脱アセチル化キチンは、希酸に可溶性である。キトサンの産業等級は、７０％を超える脱アセチル化の程度を有する。５５％〜７０％、７０％〜８５％、８５％〜９５％、および９５％〜１００％の範囲の脱アセチル化の程度は、それぞれ、脱低アセチル化キトサン、中間脱アセチル化キトサン、高脱アセチル化キトサン、および超高脱アセチル化キトサンとして分類される。本発明において使用されるキトサンは、脱アセチル化の具体的な程度に制限されない。キトサンの脱アセチル化の任意の程度が、これがアルカリまたは他の方法でその溶解度を減少することにより多孔質有機発泡材料の孔壁に沈殿され得る限り、使用され得る。
【００３７】
「タンパク質」は、アミノ酸の脱水縮合により形成されるポリペプチドの１つ以上の鎖からなる高分子化合物であり、およびポリペプチド鎖は、特異的な三次元形状に折り畳まれる。「ポリペプチド」は、ペプチド結合により連結される２０個以上のアミノ酸からなる物質を言う。ペプチド結合によって連結される２〜２０個のアミノ酸からなるペプチド鎖は、「オリゴペプチド」と呼ばれる。
【００３８】
好ましくは、多孔質有機発泡材料はメラミンフォームである。
【００３９】
好ましくは、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの固定化のための複合担体は、顆粒、ストラップ、ブロック、シート、またはカラムの形態にある。
【００４０】
本発明は、固体化タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの比活性を増加するために、開放気孔を含む多孔質有機発泡材料を担体として利用する。担体はまた、開放気孔を内側に有し、すなわち、孔は閉じられず、そして少なくとも内部接続された２つの孔が担体内にある。この担体の適用は、固定化生成物が開放気孔を含む三次元網の構造を保有することを可能にし、そして反応溶液は、固定化生成物の内側を介して流動され得る。これは、比表面積を有意に増加するのみでなく、従来の顆粒固定化生成物の表面と内部との間の反応速度の変量をまた最小にする。さらに、本発明の固定化生成物は、顆粒またはシート形状を有する既存の生成物とは異なり；それらは必要とされる任意の大きさで顆粒、ブロック、シート、または他の形状の形態において調製され得、そして比表面積にほとんど影響しない。
【００４１】
本発明の担体は、多孔質有機発泡材料から作製され、開放気孔および親水性特性を伴う。担体の開放気孔は、固定化の間、担体内部への、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの溶液の侵入を容易にし、反応の間、基質と、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドとの間の交互作用を促進し、そしてまた、反応後、生成物の物質移動を容易にする。担体の親水特性はさらに、担体の孔壁の表面へのタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの分布、相応の接着、および固定化を増強する。
【００４２】
多孔質有機発泡材料の開放気孔および親水特性は、以下を容易にする：（ｉ）タンパク質溶液／酵素溶液／ポリペプチド溶液／オリゴペプチド溶液の、担体内部への侵入、および固定化の間の担体の表面へのそれらのさらなる分布；（ｉｉ）酵素反応の間の基質と、固定化酵素との間の密接な接触；ならびに（ｉｉｉ）クロマトグラフ精製の間の、移動相における標的化合物と、担体におけるその対応するリガンドとの間の効果的な結合。本発明のタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの固定化のための複合担体は、種々の大きさおよび異なる形状（例えば、顆粒、ブロック、シート、または他の形状）において調製され得る。
【００４３】
［２］．タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの固定化のための複合担体の調製のための方法。
【００４４】
本発明は、［１］節において言及した複合担体の調製のための方法を提供し、ここで方法は以下の工程：
ａ）開放気孔を含む多孔質有機発泡材料を提供する工程；
ｂ）多孔質有機発泡材料の１つ以上の孔の壁の表面にキトサンを沈殿する工程；および
ｃ）ポリアルデヒド化合物と、沈殿されたキトサンとを架橋して、複合担体を形成する工程、を包含する。
【００４５】
好ましくは、工程ｂ）において、キトサンは、アルカリと反応して、多孔質有機発泡材料の１つ以上の孔の壁の表面に沈殿し、そして使用されるアルカリは、好ましくは水酸化ナトリウムである。しかし、本発明のキトサンの沈殿方法は制限されず、多孔質有機発泡材料の孔壁にキトサンをその可溶性を減少することにより沈殿する任意の方法が、本発明に包含される。
【００４６】
工程ｃ）において、架橋化反応の際、複合担体の反応性アルデヒド基が、ポリアルデヒドの未反応のアルデヒド基に起因して得られ、ここでポリアルデヒドは、グルタルアルデヒドおよびジアルデヒドデンプンからなる基から選択される。
【００４７】
複合担体の調製法の特定の実施態様は、以下として示される：
ａ）多孔質有機発泡材料が、シートまたは顆粒に切り取られる；
ｂ）適切な量のキトサン溶液（０．０１〜１０％（ｗ／ｖ））が、多孔質有機発泡材料に添加され、そして発泡材料がプレスされて発泡材料にキトサン溶液を均一に分布する；
ｃ）工程ｂ）における担体が、アルカリ溶液（０．０１Ｍ〜１０Ｍ水酸化ナトリウム）中に浸漬されて、多孔質有機発泡材料の孔壁にキトサンを沈殿する；
ｄ）適切な期間後、工程（ｃ）における担体は、それが中性ｐＨになるまで脱イオン水によって洗浄される；
ｅ）工程ｄ）における担体は、ポリアルデヒド溶液（０．０１％〜３０％（ｖ／ｖ））中に浸漬される；
ｆ）適切な期間後、工程ｅ）における担体は中性リン酸緩衝液（０．００１Ｍ〜１０Ｍ）によって洗浄され、未反応のポリアルデヒド溶液を除去する。
【００４８】
［３］．複合体
本発明はまた、［１］節において記載される複合担体、複合担体に固定化されたタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドからなる複合体を提供する。
【００４９】
好ましくは、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドは、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドのアミノ基と、［１］節において記載される複合担体におけるアルデヒド基との間の反応を介して、［１］節において記載される複合担体に固定化される。
【００５０】
反応の原理は：タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドは、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドにおけるアミノ基と、キトサンおよびポリアルデヒド化合物の架橋化生成物におけるアルデヒド基との間の反応により形成されたシッフ塩基を介して、［１］節において記載される複合担体に共有結合的に固定化される。
【００５１】
上記の原理は、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドが、開放気孔を含む多孔質有機発泡材料、キトサン、およびポリアルデヒド化合物からなる複合担体に、化学反応を介して、固定化されることを示す。固定化のプロセスは、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの溶解度を変化しない。本出願とは異なり、中国特許公報第ＣＮ１９８２４４５Ａ号は、凝集剤および架橋剤でタンパク質の溶解度を変化することにより、多孔質メラミンフォームの孔中にタンパク質が沈殿される方法を記載する。
【００５２】
好ましくは、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドは、酵素である。酵素のタイプに制限はなく、アルデヒド基と反応し得る任意の酵素が本発明において包含される。例えば、本発明における１つの好ましい酵素は、トランスグルコシダーゼであるが、本発明はこれに制限されない。
【００５３】
好ましくは、複合体は、細菌を殺傷するために、または細菌の増殖を阻害するために適用される。タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドのタイプに制限はなく、アルデヒド基と反応し得る任意のタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドが、本発明において包含される。例えば、本発明における１つの好ましいタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドは、ポリミキシンＢであるが、本発明はこれに制限されない。
【００５４】
好ましくは、複合体は、親和性精製のために適用され、ここでは複合体のタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドは、対応する生理活性物質と特異的および可逆的な結合特性を保有する。タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドのタイプに特に制限はなく、アルデヒド基と反応し得る任意のタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドが、本発明において包含される。例えば、本発明における１つの好ましいタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドは、グルタチオンまたはプロテインＡである。
【００５５】
好ましくは、固定化タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの形状は、シートまたはカラムである。より好ましくは、シート形状の固定化タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドは、ディスク形状に切り取られ、そしてクロマトグラフカラム／固定化酵素カラムとして充填されるか、または円筒状のリール構造に巻かれてクロマトグラフカラム／固定化酵素カラムを形成する。
【００５６】
本発明において調製される固定化タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの顆粒形態は、撹拌タンクリアクターまたは充填層リアクターにおいて使用され得る。シート形状の生成物は、円筒状リール構造に巻かれ、そして反応カラムとして直接的に使用され得る。このようなリール構造生成物は、モジュールとして使用され得、そしてバイオリアクターの内側で充填および処理される。リール構造生成物のそれぞれは、単独でまたは互いに組み合わせて使用され得、産業生産に順応可能な直径又は長さを備える反応カラムを形成する。
【００５７】
本発明のシート形状生成物の巻き取り間の、巻き取り操作から生じる張力および内核に対して多孔質材料に適用される連続的な圧力は、多孔質材料の適度の圧縮を生じる。それゆえ、この巻き取りプロセスは、リール構造生成物の形成のプロセスであり、およびまた、多孔質材料の圧縮のプロセスである。リール構造の気密の程度は、多孔質材料に適応される圧力を調整することによって調整され得る。リール構造の直径は、巻き取り数および担体材料の厚さを変化することによって制御され得る。リールシリンダーの高さは、担体の幅を変化することによって、またはリール構造を必要とされる高さに直接切り取ることによって制御され得る。
【００５８】
本出願における記載される円筒状リールカラムのカラム表面は、屈曲の喪失を防ぐために適切な充填材によって固定および密封され得る。生成物が管状軸およびケーシングを伴う充填層カラムに充填される場合、反応タンクを水で充填した後、カラム表面とカラムホルダーの内壁との間に存在し得るギャップを減少するために、充填材は、乾燥ＰＶＡフォームおよびパルプフォームのような親水性および膨張性の材料から、固定化タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチド自体が当該特性を有しない場合は作製されるべきである。このようなギャップはまた、顆粒材料を用いて抑えられ得る。円筒状リールカラムは、これが反応カラムとして単独で直接的に使用される場合、またはカラムホルダーを伴わずに他のカラムとともに連結される場合、エネルギー消費を減少するために、ポリウレタンフォームのような防水性および断熱性の材料で被覆されるべきである。他方、反応の間に円筒状リールカラムが収縮し、そしてその容量が減少する場合、充填材は、カラム操作の間のギャップの発生を回避するために、ゴムまたはゴムを含む材料のような、持続的収縮の特性を保有するべきである。
【００５９】
円筒状リールカラムが単独でまたは他のカラムとともに連結される場合、カラムの両端は、反応溶液の効率的な流入または流出を許容するためにカラムおよび管を連結する装置を有するべきであり、ならびに濾過の機能を有するべきである。直列で使用される場合、円筒状リールカラムのモジュールブロックの接合部は、液体漏出を防ぐためにゴムバンドで密封されるべきである。
【００６０】
［４］．複合体の調製
本発明は、［３］節において記載される複合体を調製するための方法を提供し、ここで複合体は、［１］節において記載される複合担体と、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの溶液と間の反応によって調製される。
【００６１】
反応の原理は：  タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドは、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドのアミノ基と、ポリアルデヒドを用いたキトサンの架橋反応により得られる架橋化生成物のアルデヒド基との間に形成されるスタッフ塩基を介して、複合担体に共有結合的に固定化される。
【００６２】
タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの固定化の間、担体は手または装置または機械によってプレスされ得る。一般に、使用されるタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの濃度は０．３％〜３０％（ｗ／ｖ）であり、および架橋剤の濃度は０．０１％〜３０％（ｖ／ｖ）である。架橋剤は通常、ポリアルデヒド化合物（例えば、グルタルアルデヒド、ジアルデヒドデンプン、グルカンジアルデヒド等）である。
【００６３】
［５］．複合体の適用
本発明はまた、［３］節において記載される複合体の適用を提供し、ここで適用は、生体触媒および親和性クロマトグラフィーを包含する。
【００６４】
好ましくは、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドは酵素であり、これは生体触媒として使用される。酵素のタイプに制限はなく、アルデヒド基と反応し得る任意の酵素が本発明において包含される。例えば、本発明における１つの好ましい実施態様は、トランスグルコシダーゼであるが、本発明はこれに制限されない。
【００６５】
好ましくは、複合体は、細菌を殺傷するために、または細菌の増殖を阻害するために適用される。タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドのタイプに制限はなく、アルデヒド基と反応し得る任意のタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドが、本発明において包含される。例えば、本発明における１つの好ましいタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドは、ポリミキシンＢであるが、本発明はこれに制限されない。
【００６６】
例えば、ポリミキシンＢは、細菌を殺傷し得るか、または細菌の増殖を阻害し得る（Ｍ．Ｍｏｈｏｒｃｉｃ、Ｉ．Ｊｅｒｍａｎ、Ｍ．Ｚｏｒｋｏ、Ｌ．Ｂｕｔｉｎａｒ、Ｂ．Ｏｒｅｌ、Ｒ．Ｊｅｒａｌａ、Ｊ．Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ、２０１０、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２１：２７７５−２７８２を参照のこと）。［１］節において記載される複合担体は、細菌を殺傷するために、または細菌の増殖を阻害するために、ポリミキシンＢと反応して複合体を形成するために使用され得る。
【００６７】
好ましくは、複合体は、親和性精製に適用され、ここでは複合体のタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドは、対応する生理活性物質と特異的なおよび可逆的な反応特性を保有する。タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドのタイプに制限はなく、親和性クロマトグラフィーにおいてリガンドとして使用され得、およびアルデヒド基と反応し得るアミノ基を有する、先行技術における任意のタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドが、本発明において包含される。
【００６８】
例えば、グルタチオンは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの対応するリガンドであり、親和性精製において広範に使用される（Ｈｏｎｇ  Ｊｉｎ、Ｈｅｎｇ  Ｗｕ、Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ｏｓｔｅｒｈａｕｓ、Ｊｉａｎｎｉｎｇ  Ｗｅｉ、Ｋａｔｈｌｅｅｎ  Ｄａｖｉｓ、Ｄｉ  Ｓｈａ、Ｅｒｉｃ  Ｆｌｏｏｒ、Ｃｈｅ−Ｃｈａｎｇ  Ｈｓｕ、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｄ．Ｋｏｐｋｅ、Ｊａｎｇ−Ｙｅｎ  Ｗｕ、２００３、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ、１００：４２９３−４２９８；Ｃｈｅｎｇ  Ｘｉａｎｇ  Ｈｏｕ，Ｚｈｉ  Ｑｉａｎｇ  Ｆｕ，Ｂｙｕｎｇ  Ｒａｅ  Ｊｉｎ、Ｚｈｏｎｇ  Ｚｈｅｎｇ  Ｇｕｉ、２００８、Ａｆｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７：３１１−３１６）。［１］節において記載される複合担体は、グルタチオンと反応してグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ精製のための複合体を形成するために使用され得る。
【００６９】
さらに、抗体タンパク質は、免疫系において主要な役割を果たす。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は、医学的な診断および処理において広範に使用される。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を調製するための多くの方法があり、それらの全ては予め精製されることを必要とする。プロテインＡ親和性クロマトグラフィーカラムは、抗体の精製のための主な道具の１つである（Ｋｉｓｈｏｒｅ  Ｋ．Ｒ．Ｔｅｔａｌａ、ＴｅｒｉｓＡ．Ｖａｎ  Ｂｅｅｋ、２０１０  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３：４２２−４３８を参照のこと）。例えば、プロテインＡは、抗体のＦｃ領域に特異的に結合し得る黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁タンパク質であり、そしてその結合はｐＨを変化することによって解離され得る。それゆえ、プロテインＡ親和性カラムは、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を精製するための効率的な道具である。本発明とは異なり、プロテインＡ親和性カラムの既存の担体は、アルカリ条件下で臭化シアン（ＣＮＢｒ）を使用して活性された後、プロテインＡに結合するアガロースから作製される（Ｒｏｌｆ  Ａｘｅｎ、Ｓｖｅｒｋｅｒ  Ｅｒｎｂａｃｋ、１９７１、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８：３５１−３６０を参照のこと）。臭化シアンは、操作および輸送において危険である非常に毒性の化合物であり、それゆえその産業適用が制限される。しかし、［１］節において記載される複合担体およびプロテインＡにより形成される複合体では、このような問題は何もない。
【００７０】
［６］．生体触媒、細菌の殺傷、および親和性クロマトグラフィーのための方法
本発明は、生体触媒法を提供し、ここでは、［３］節において記載される複合体が、その対応する基質の反応に触媒作用を及ぼす生体触媒として使用され、そしてタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドは酵素である。
【００７１】
酵素のタイプに制限はなく、アルデヒド基と反応し得る任意の酵素が本発明において包含される。好ましくは、酵素はトランスグルコシダーゼである。
【００７２】
本発明は、細菌を殺傷するための、または細菌の増殖を阻害するための方法を提供し、ここでは［３］節において記載される複合体が、細菌を殺傷するための、および細菌の増殖を阻害するための培地として使用される。タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドのタイプに制限はなく、アルデヒド基と反応し得る任意のタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドが、本発明において包含される。
【００７３】
好ましくは、本発明における複合体のタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドは、ポリミキシンＢである。
【００７４】
最後に、本発明は、生理活性物質を精製するための、媒体として［３］節において記載される複合体を使用することによる、親和性クロマトグラフィーについての方法を提供する。タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドのタイプに制限はなく、アルデヒド基と反応し得る任意のタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドが、本発明において包含される。
【００７５】
好ましくは、本発明における複合体のタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドは、グルタチオンまたはプロテインＡである。
【００７６】
複合担体を使用することによる親和性カラムの調製の特定の実施態様は以下のように示される：
１）基質として開放気孔を含む多孔質有機発泡材料を使用する；
２）その反応性を改善するために、開放気孔を含む多孔質有機発泡材料に反応性官能基を導入する；
３）複合担体にタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドを固定化する；
４）親和性カラムのリガンドおよび担体として、固定化タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドを含む担体を使用する。
【００７７】
本発明の１つの実施態様において、メラミンフォームが担体として使用され、メラミンフォームの反応性は反応性官能基の導入によって改善され、それによりこれは、固定化タンパク質、酵素、ポリペプチド、またはオリゴペプチドに利用され得る。方法は、以下の工程を包含する：
ａ）多孔質有機発泡材料が、シートまたは顆粒に切り取られる工程；
ｂ）適切な量のキトサン溶液（０．０１％〜１０％（ｗ／ｖ））が、多孔質有機発泡材料に添加され、そして発泡材料がプレスされて発泡材料にキトサン溶液を均一に分布する工程；
ｃ）工程ｂ）における担体がアルカリ溶液（０．０１Ｍ〜１０Ｍ  水酸化ナトリウム）中に浸漬されて、多孔質有機発泡材料の孔壁にキトサンを沈殿する工程；
ｄ）適切な期間後、工程（ｃ）における担体が、それが中性ｐＨになるまで脱イオン水で洗浄される工程；
ｅ）工程ｄ）における担体が、ポリアルデヒド溶液（０．０１％〜３０％（ｖ／ｖ））中に浸漬される工程；
ｆ）適切な期間後、工程ｅ）における担体が、中性リン酸緩衝液（０．００１Ｍ〜１０Ｍ）で洗浄され、未反応のマルチ−アルデヒド溶液を除去する工程；
ｇ）タンパク質、酵素、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの溶液（０．０１％〜３０％（ｗ／ｖ））が、脱イオン水または緩衝溶液を使用して調製される工程；
ｈ）工程ｆ）における担体が、固定化のために工程ｇ）において調製されたタンパク質、酵素、ポリペプチド、またはオリゴペプチド溶液中に浸漬される工程；
ｉ）適切な期間後、ｈ）において得られた担体が、中性リン酸緩衝液（０．００１Ｍ〜１０Ｍ）で洗浄され、未反応のタンパク質、酵素、ポリペプチド、またはオリゴペプチドを除去する工程；
ｊ）固定化タンパク質、酵素、ポリペプチド、またはオリゴペプチドが、ディスク形状に切り取られ、そしてクロマトグラフカラムとして充填されるか、またはシート形状に切り取られ、そして円筒状リール構造に巻き取られて、クロマトグラフカラムまたは固定化酵素カラムを形成する工程。
【００７８】
キトサンを多孔質有機発泡材料に添加する場合、材料は、手によって、または特別な装置もしくは機械によってプレスされ得る。架橋剤は、一般に、ポリアルデヒド化合物（例えば、グルタルアルデヒド、ジアルデヒドデンプン等）である。
【００７９】
以下に示される実施例は、本発明のさらなる説明のためのみであり、そして本発明の制限として見なされることを意図しない。
【実施例】
【００８０】
実施例１
固定化トランスグルコシダーゼ
２０ｇのメラミンフォーム（Ｚｈｕｈａｉ  Ｔｉｎ  Ｈｏｎｇ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｓｐｏｎｇｅ  Ｆａｃｔｏｒｙ）をシートに切り取り、これを担体として使用した。０．８ｇの２％（ｗ／ｖ）キトサン溶液（Ｌａｉｚｈｏｕ  Ｃｉｔｙ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ  Ｈａｉｌｉ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏ．Ｌｔｄ）を、発泡材料に添加し、続いて手によって担体を繰り返しプレスしてキトサンを担体に均一に分布した。担体を、５ｍｌの１Ｍ  水酸化ナトリウム溶液中に３０分間浸漬し、そしてこれが中性のｐＨに達するまで脱イオン水で洗浄した。次いで、担体を１％（ｖ／ｖ）酢酸を含有する６ｍｌの５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド溶液（Ｔｉａｎｊｉｎ  Ｄａｍａｏ  Ｃｈｅｍｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｆａｃｔｏｒｙ）中に１時間浸漬し、そして２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４で洗浄して、未反応のグルタルアルデヒドを除去した。濾紙による過剰な水分の除去後に５００ｍｇの湿潤担体を得た。
【００８１】
担体を５ｍｌの２ｍｇ／ｍｌ  トランスグルコシダーゼ溶液（Ａｍａｎｏ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｃ．２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４中に調製）中に、２４時間浸漬し、そして１０ｍｌの２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４で、１０回洗浄して、未反応のトランスグルコシダーゼを除去した。濾紙による過剰の水の除去の後、４６０ｍｇの固定化トランスグルコシダーゼを得た。
【００８２】
１０ｍｇの固定化トランスグルコシダーゼを正確に秤量し、そして１０ｍｌの１％（ｗ／ｖ）メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｔｄ、１０ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０中に調製、そして４５℃に予熱）を添加した。反応混合液を４５℃にて１８０ｒｐｍで６０分間浸とうし、そして反応混合液を５分間沸騰水中に浸漬することによって終結した。
【００８３】
酵素活性１単位を、上述の条件下で１時間当たりに放出される１μｇのグルコースと定義した。グルコースの量を、Ｂｉｏｓｉｎｏ  Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．のグルコースキットにより測定した。
【００８４】
実施例１における固定化トランスグルコシダーゼの比活性を、２４０，０００Ｕ／ｇと測定した。
【００８５】
実施例２
固定化ポリミキシンＢ
４０ｍｇのメラミンフォームを、シート担体に切り取った。１．６ｇの２％（ｗ／ｖ）キトサン溶液を添加し、続いて担体を手によって繰り返しプレスして、キトサンを担体に均一に分布した。担体を、１０ｍｌの１Ｍ  水酸化ナトリウム溶液中に３０分間浸漬し、これが中性のｐＨに達するまで、脱イオン水で洗浄した。次いで、担体を１２ｍｌの５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド溶液中に１時間浸漬し、そして２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４で洗浄して、未反応のグルタルアルデヒドを除去した。濾紙による過剰な水分の除去後に１ｇの湿潤担体を得た。
【００８６】
担体を２０ｍｌの１．８ｍｇ／ｍｌ  ポリミキシンＢ溶液（Ｗｏｒｌｄ（Ｊｉａｎｇｓｕ）Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ、２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４中に調製）中に２４時間浸漬し、そして１０ｍｌの２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４で１０回洗浄して、未反応のポリミキシンＢを除去した。濾紙による過剰の水分の除去後に１ｇの固定化ポリミキシンＢを得た。
【００８７】
ｐＲＥＳＴ−ｌａｃ−ｋａｎ（中国特許第ＣＮ１９１２１２７Ａ号）を含有するＥ．ｃｏｌｉを、１００μｇ／ｍｌ  カナマイシンとともに１０ｍｌのＬＢブロスに接種し、そして３７℃にて２５０ｒｐｍで一晩、ＯＤ６００が２．５〜３．０に達するまで振とうした。培養液を１０６細胞／ｍｌに希釈し、そしてカナマイシンを１００μｇ／ｍｌの最終濃度に添加した。
【００８８】
１ｇの固定化ポリミキシンＢおよび１０ｍｌの調製培養液を含有するサンプルを、サンプルＡと名付けた。コントロール実験として、固定化ポリミキシンＢを伴わず１０ｍｌの調製培養液を含有するサンプルを、サンプルＢと名付けた。サンプルＡおよびサンプルＢの両方を３７℃にて２５０ｒｐｍで１６．５時間、インキュベートした。サンプルＡおよびサンプルＢの６００ｎｍでの吸光度は、それぞれ、０および２．６７であった。１００μｌのサンプルＡおよび１μｌのサンプルＢを、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するアガープレートに塗布した。結果は、固定化ポリミキシンＢで処理したサンプルＡにおいてＥ．ｃｏｌｉは存在しなかったことを示す（図１）。
【００８９】
実施例３
グルタチオンの固定化
２０ｍｇのメラミンフォームをシート担体に切り取り、０．８ｇの２％（ｗ／ｖ）キトサン溶液を添加し、続いて手によって担体を繰り返しプレスして、キトサンを担体に均一に分布した。担体を５ｍｌの１Ｍ  水酸化ナトリウム溶液中に３０分間浸漬し、そしてこれが中性ｐＨに達するまで脱イオン水で洗浄した。次いで、担体を６ｍｌの５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド溶液中に１時間浸漬し、そして２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４で洗浄して、未反応のグルタルアルデヒドを除去した。濾紙による過剰な水分の除去後に５００ｍｇの湿潤担体を得た。
【００９０】
担体を、３０ｍｌの１％（ｗ／ｖ）グルタチオン溶液（Ｓｈａｎｇｄｏｎ  Ｊｉｎｃｈｅｎｇ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＆  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、脱イオン水中で調製（ｐＨを５．５に調製した））中に２４時間浸漬し、そして１０ｍｌの２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４で１０回洗浄して、未反応のグルタチオンを除去した。濾紙による過剰な水分の除去後に５００ｍｇの固定化グルタチオンを得た。
【００９１】
５００ｍｇの固定化グルタチオンを、２０ｍｌの２ｍｇ／ｍｌ  粗グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ溶液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に添加した。反応混合液を２５℃にて７０ｒｐｍで１時間、インキュベートした。固定化グルタチオンを、２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４を含有する１０ｍｌの結合緩衝液で５回洗浄して、未結合のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼを除去した。５０ｍＭ  グルタチオンおよび５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５を含有する５ｍｌの溶出緩衝液を添加し、そして２５℃にて７０ｒｐｍで４５分間インキュベートして、精製グルタチオンＳ−トランスフェラーゼを溶出した。精製グルタチオンの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによると９０％よりも大きかった（図２）。
【００９２】
実施例４
固定化プロテインＡ親和性カラム
６０ｍｇのメラミンフォームをシート担体に切り取り、１．２ｇの２％（ｗ／ｖ）キトサン溶液を添加し、続いて手によって担体を繰り返しプレスして、キトサンを担体に均一に分布した。担体を１５ｍｌの１Ｍ  水酸化ナトリウム溶液中に３０分間浸漬し、そしてこれが中性のｐＨに達するまで脱イオン水で洗浄した。次いで、担体を１％（ｖ／ｖ）酢酸を含有する１８ｍｌの５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド溶液中に１時間浸漬し、そして２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４で洗浄して、未反応のグルタルアルデヒドを除去した。濾紙による過剰な水の除去後に１ｇの湿潤担体を得た。
【００９３】
担体を、１５ｍｌの５ｍｇ／ｍｌ  プロテインＡ溶液（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｙａｘｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｒｄ．、２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４中に調製）中に２４時間浸漬し、そして３０ｍｌの２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４で１０回洗浄して、未反応のプロテインＡを除去した。濾紙による過剰な水の除去後に１５００ｍｇの固定化プロテインＡを得た。
【００９４】
固定化プロテインＡを、ディスク形状に切り取り、そして２．６ｍｌの親和性カラムに充填した。標準ウサギ血清（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｊｉａｎｇ  Ｌａｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）をプロテインＡ親和性カラムに投入し、続いて０．１Ｍ  リン酸カリウムおよび０．１５Ｍ  塩化ナトリウム、ｐＨ７．２を含有する１５ｍｌの結合緩衝液を投入してカラムを洗浄した。０．２５Ｍ〜０．１Ｍ  グリシン溶液および０．０２Ｍ  塩酸、ｐＨ２．９を含有する２０ｍｌの溶出緩衝液を使用して、精製ウサギ血清（ウサギＩｇＧ）を溶出した。精製ウサギＩｇＧの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによると９０％よりも大きかった（図３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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