(57)【要約】  脂肪族ジカルボン酸を生産できる操作された微生物およびこのような微生物によって発現された生成物が提供される。脂肪族ジカルボン酸を生産する生物学的方法も提供される。【選択図】  図３１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変酵母であって、以下の遺伝学的改変を含まない対応する酵母と比較して、
ベータ酸化活性を実質的にブロックする少なくとも１つの遺伝学的改変と；
モノオキシゲナーゼ活性、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、チオエステラーゼ活性、アシルトランスフェラーゼ活性、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性、アシル−ｃｏＡオキシダーゼ活性、脂肪族アルコールオキシダーゼ活性、アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ活性、アルコールデヒドロゲナーゼ活性、ペルオキシソーム生合成因子活性、脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、ＣＴＦ、ＵＴＲ、ＦＡＴ１からなる群より選択される少なくとも１種の活性を増加させる少なくとも１つの遺伝学的改変と；
ＭＩＧ１活性を減少させる少なくとも１つの遺伝学的改変と
を含む、遺伝子改変酵母。
【請求項２】
ＣＹＰ５２Ａ１２のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＹＰ５２Ａ１３のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＹＰ５２Ａ１４のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＹＰ５２Ａ１５のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＹＰ５２Ａ１６のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＹＰ５２Ａ１７のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＹＰ５２Ａ１８のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＹＰ５２Ａ１９のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＹＰ５２Ａ２０のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＹＰ５２Ｄ２のモノオキシゲナーゼ活性およびＢＭ３のモノオキシゲナーゼ活性から選択される１つまたはそれより多くのモノオキシゲナーゼ活性を増加させる少なくとも１つの遺伝学的改変を含む、請求項１に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項３】
ＣＰＲＡモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、ＣＰＲＢモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性およびＣＰＲ７５０モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性からなる群より選択される１つまたはそれより多くのモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性を増加させる少なくとも１つの遺伝学的改変を含む、請求項１または２に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項４】
ＩＤＰ２イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性を増加させる少なくとも１つの遺伝学的改変を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項５】
ＧＤＰ１グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を増加させる少なくとも１つの遺伝学的改変を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項６】
ＺＷＦ１グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性およびＺＷＦ２グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性からなる群より選択される少なくとも１種のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を増加させる少なくとも１つの遺伝学的改変を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項７】
ＦＡＯ１脂肪族アルコールオキシダーゼ活性、ＦＡＯ２Ａ脂肪族アルコールオキシダーゼ活性、ＦＡＯ２Ｂ脂肪族アルコールオキシダーゼ活性、ＦＡＯ１３脂肪族アルコールオキシダーゼ活性、ＦＡＯ１７脂肪族アルコールオキシダーゼ活性、ＦＡＯ１８脂肪族アルコールオキシダーゼ活性およびＦＡＯ２０脂肪族アルコールオキシダーゼ活性からなる群より選択される１種またはそれより多くの脂肪族アルコールオキシダーゼ活性を増加させる少なくとも１つの遺伝学的改変を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項８】
ＡＤＨ１アルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＡＤＨ２アルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＡＤＨ３アルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＡＤＨ４アルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＡＤＨ５アルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＡＤＨ７アルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＡＤＨ８アルコールデヒドロゲナーゼ活性およびＳＦＡアルコールデヒドロゲナーゼ活性からなる群より選択される１種またはそれより多くのアルコールデヒドロゲナーゼ活性を増加させる少なくとも１つの遺伝学的改変を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項９】
ＡＣＨ−Ａアシル−ＣｏＡヒドロラーゼ活性およびＡＣＨ−Ｂアシル−ＣｏＡヒドロラーゼ活性からなる群より選択される１種またはそれより多くのアシル−ＣｏＡヒドロラーゼ活性を増加させる少なくとも１つの遺伝学的改変を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項１０】
アシル−ＣｏＡステロールアシルトランスフェラーゼ活性、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性、およびリン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性からなる群より選択される１種またはそれより多くのアシルトランスフェラーゼ活性を増加させる少なくとも１つの遺伝学的改変を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項１１】
１種またはそれより多くのアシルトランスフェラーゼ活性が、ＡＲＥ１アシル−ＣｏＡステロールアシルトランスフェラーゼ活性、ＡＲＥ２アシル−ＣｏＡステロールアシルトランスフェラーゼ活性、ＤＧＡ１ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性、およびＬＲＯ１リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性からなる群より選択される、請求項１０に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項１２】
アシル−ｃｏＡチオエステラーゼ活性を増加させる少なくとも１つの遺伝学的改変を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項１３】
アシル−ｃｏＡチオエステラーゼ活性が、ＴＥＳＡアシル−ｃｏＡチオエステラーゼ活性である、請求項１２に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項１４】
ＰＥＸ１１ペルオキシソーム生合成因子活性を増加させる少なくとも１つの遺伝学的改変を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項１５】
ＨＦＤ１脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性およびＨＦＤ２脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性からなる群より選択される１種またはそれより多くの脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を増加させる少なくとも１つの遺伝学的改変を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項１６】
ＰＯＸ５アシル−ｃｏＡオキシダーゼ活性を増加させる少なくとも１つの遺伝学的改変を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項１７】
モノオキシゲナーゼ活性およびモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性を増加させる少なくとも１つの遺伝学的改変を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの遺伝学的改変が、ＣＹＰ５２Ａ１９のモノオキシゲナーゼ活性およびＣＰＲＢモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性を増加させる、請求項１７に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの遺伝学的改変が、ＣＹＰ５２Ａ１４のモノオキシゲナーゼ活性およびＣＰＲＢモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性を増加させる、請求項１７に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項２０】
モノオキシゲナーゼ活性、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、およびイソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性の増加を引き起こす１種またはそれより多くの遺伝学的改変を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項２１】
前記１種またはそれより多くの遺伝学的改変が、ＣＹＰ５２Ａ１９のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＰＲＢモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、およびＩＤＰ２イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性を増加させる、請求項２０に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項２２】
モノオキシゲナーゼ活性、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を増加させる少なくとも１つの遺伝学的改変を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項２３】
ＣＹＰ５２Ａ１９のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＰＲＢモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、およびＺＷＦ１グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を増加させる少なくとも１つの遺伝学的改変を含む、請求項２２に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項２４】
前記モノオキシゲナーゼ活性が、配列番号５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０および６１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドによる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが、配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３および２４からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされている、請求項２４に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項２６】
前記モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性が、配列番号２８、６３、６４および６５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドによる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが、配列番号２４、２５、２６および２７からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされている、請求項２６に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項２８】
チオエステラーゼ活性が、配列番号３８のアミノ酸配列を含むポリペプチドによる、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項２９】
前記ポリペプチドが、配列番号３７のポリヌクレオチドによってコードされている、請求項２８に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項３０】
アシルトランスフェラーゼ活性が、配列番号４４、４６、４８および５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドによる、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが、配列番号４３、４５、４７および４９からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされている、請求項３０に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項３２】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性が、配列番号６７、６９または１００のアミノ酸配列を含むポリペプチドによる、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項３３】
前記ポリペプチドが、配列番号６８、７０または９９のポリヌクレオチドによってコードされている、請求項３２に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項３４】
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性が、配列番号７２のアミノ酸配列を含むポリペプチドによる、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項３５】
前記ポリペプチドが、配列番号７１のポリヌクレオチドによってコードされている、請求項３４に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項３６】
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性が、配列番号７４、７６または１５７のアミノ酸配列を含むポリペプチドによる、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項３７】
前記ポリペプチドが、配列番号７３または７５のポリヌクレオチドによってコードされている、請求項３６に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項３８】
アシル−ｃｏＡオキシダーゼ活性が、配列番号３２のアミノ酸配列を含むポリペプチドによる、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項３９】
前記ポリペプチドが、配列番号３１のポリヌクレオチドによってコードされている、請求項３８に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項４０】
脂肪族アルコールオキシダーゼ活性が、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１３２および１３４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドによる、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項４１】
前記ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１３１および１３３からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされている、請求項４０に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項４２】
アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ活性が、配列番号３４および３６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドによる、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項４３】
前記ポリペプチドが、配列番号３３および３５からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされている、請求項４２に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項４４】
アルコールデヒドロゲナーゼ活性が、配列番号１２９、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１５２および１５４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドによる、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項４５】
前記ポリペプチドが、配列番号１３０、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１５３および１５５からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされている、請求項４４に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項４６】
ペルオキシソーム生合成因子活性が、配列番号９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドによる、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項４７】
前記ポリペプチドが、配列番号９５のポリヌクレオチドによってコードされている、請求項４６に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項４８】
脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が、配列番号１３９および１４１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドによる、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項４９】
前記ポリペプチドが、配列番号１４０および１４２からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされている、請求項４８に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項５０】
アシル−ｃｏＡシンセターゼ活性を減少させる少なくとも１つの遺伝学的改変を含む、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項５１】
前記少なくとも１つの遺伝学的改変が、ＡＣＳ１アシル−ｃｏＡシンセターゼ活性およびＦＡＴ１長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性からなる群より選択される１種またはそれより多くのアシル−ｃｏＡシンセターゼ活性を減少させる、請求項５０に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項５２】
少なくとも１つの遺伝学的改変が、アシル−ｃｏＡシンセターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を破壊する、請求項５０または５１に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項５３】
前記アシル−ｃｏＡシンセターゼ活性が、配列番号４０、４２、８０、８２、８４、９０、１５８および１５９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドによる、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項５４】
前記ポリペプチドが、配列番号３９、４１、７９、８１、８３および８９からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされている、請求項５３に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項５５】
カンジダ種の酵母である、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項５６】
前記カンジダ種の酵母が、Ｃ．トロピカリスおよびＣ．ビスワナチイからなる群より選択される、請求項５５に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項５７】
前記カンジダ種の酵母が、遺伝子改変ＡＴＣＣ２０３３６酵母である、請求項５６に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項５８】
ヤロウイア種の酵母、ピチア種の酵母、サッカロミセス種の酵母およびクルイベロマイセス種の酵母からなる群より選択される、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項５９】
Ｙ.リポリチカ（Y. lipolytica）、Ｐ．パストリス（P. pastoris）、Ｐ．メンブラニファシエンス（P. membranifaciens）、Ｐ．クルベリ（P. kluyveri）、Ｐ．ギリエルモンジイ（P. guilliermondii）、Ｐ．ヒーディ（P. heedii）、Ｐ．サブペリキュローサ（P. subpelliculosa）、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）、Ｓ．バヤヌス（S. bayanus）、Ｓ．パストリアヌス（S. pastorianus）、Ｓ．カールスベルゲンシス（S. carlsbergensis）、Ｋ．ラクティス（K. lactis）およびＫ．マルキシアヌス（K. marxianus）からなる群より選択される、請求項５８に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項６０】
前記酵母が、植物油から得られた少なくとも１種の成分を含む供給材料から、望ましい二酸を生産できる、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項６１】
前記望ましい二酸が、Ｃ４〜Ｃ２４の二酸である、請求項６０に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項６２】
前記望ましい二酸が、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０の二酸である、請求項６１に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項６３】
前記望ましい二酸が、Ｃ１０の二酸である、請求項６２に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項６４】
前記望ましい二酸が、Ｃ１２の二酸である、請求項６２に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項６４】
前記望ましい二酸が、Ｃ１８の二酸である、請求項６２に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項６５】
前記望ましい二酸が、実質的な不飽和を含有しない、請求項６０〜６４のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項６６】
前記望ましい二酸が、１つまたはそれより多くの不飽和を含有する、請求項６０〜６４のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項６７】
前記望ましい二酸が、二酸の混合物中の主な二酸である、請求項６０〜６６のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項６８】
前記供給材料が、実質的に純粋な油を含む、請求項６０〜６７のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項６９】
前記供給材料が、複数の脂肪酸を含む、請求項６０〜６８のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項７０】
前記供給材料が、石鹸原料を含む、請求項６９に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項７１】
前記供給材料が、脂肪酸蒸留物を含む、請求項６９に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項７２】
前記植物油が、パーム、パーム核、ヤシ、ダイズ、ベニバナ、キャノーラまたはそれらの組み合わせからなる群より選択される植物由来である、請求項６０〜７１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項７３】
活性を増加させる遺伝学的改変が、該活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの複数のコピーを前記酵母に取り込むことを含む、請求項１〜７２のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項７４】
活性を増加させる遺伝学的改変が、該活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結されたプロモーターを前記酵母に取り込むことを含む、請求項１〜７３のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項７５】
前記プロモーターが、前記酵母にとって天然である、請求項７４に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項７６】
前記プロモーターが、ＰＯＸ４プロモーター、ＰＥＸ１１プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、ＰＧＫプロモーターおよびＦＡＯ１プロモーターからなる群より選択される、請求項７４または７５に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項７７】
前記プロモーターが、配列番号１６２、１６５、１６６、１６７および１６９からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む、請求項７６に記載の遺伝子改変酵母。
【請求項７８】
望ましい二酸を生産する方法であって、
請求項１〜７７のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母を、該酵母により二酸に変換可能な供給材料と接触させることと；
該酵母を、該供給材料から望ましい二酸が生産される条件下で培養することと
を含む、上記方法。
【請求項７９】
前記供給材料が、植物油からの１種またはそれより多くの成分を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記望ましい二酸が、Ｃ４〜Ｃ２４の二酸である、請求項７８または７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記望ましい二酸が、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０の二酸である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記望ましい二酸が、Ｃ１０の二酸である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記望ましい二酸が、Ｃ１２の二酸である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記望ましい二酸が、Ｃ１８の二酸である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８５】
前記望ましい二酸が、不飽和を含有しない、請求項７８〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記望ましい二酸が、１つまたはそれより多くの不飽和を含有する、請求項７８〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記望ましい二酸が、二酸の混合物中の主な二酸である、請求項７８〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記供給材料が、実質的に純粋な油を含む、請求項７８〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記供給材料が、複数の脂肪酸を含む、請求項７８〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記供給材料が、石鹸原料を含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記供給材料が、脂肪酸蒸留物を含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記植物油が、パーム、パーム核、ヤシ、ダイズ、ベニバナ、キャノーラまたはそれらの組み合わせからなる群より選択される植物由来である、請求項７８〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記供給材料が、脂肪酸メチルエステルを含む、請求項７８〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記脂肪酸メチルエステルが、ラウリン酸メチルであり、前記二酸が、ドデカン二酸を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記供給材料が、脂肪酸エチルエステルを含み、前記二酸が、ドデカン二酸を含む、請求項７８〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記供給材料が、ラウリン酸を含み、前記二酸が、ドデカン二酸を含む、請求項７８〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記供給材料が、カプリン酸エチルを含み、前記二酸が、セバシン酸を含む、請求項７８〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
請求項７８〜９７のいずれか一項に記載の方法によって生産された二酸。
【請求項９９】
酵母に対し毒性の供給材料から酵母によって望ましい二酸を生産する方法であって、
（ａ）培養状態の遺伝子改変酵母を、該酵母に対し実質的に毒性ではない供給材料と接触させることによって、誘導を行うことと；
（ｂ）（ａ）で誘導した後の該酵母を、該酵母に対し毒性の供給材料と接触させることと
を含み、
それにより、誘導が行われない場合に該酵母に対し毒性の供給材料から生産される二酸の量より多くの量で、該酵母に対し毒性の供給材料から該酵母によって望ましい二酸が生産される、上記方法。
【請求項１００】
前記酵母に対し実質的に毒性ではない供給材料が、前記酵母に対し毒性の供給材料と同じ数の炭素を有する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記酵母に対し実質的に毒性ではない供給材料が、前記酵母に対し毒性の供給材料と比較して異なる数の炭素を有する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
前記酵母に対し実質的に毒性ではない供給材料が、脂肪酸メチルエステルを含む、請求項９９〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記酵母に対し実質的に毒性ではない供給材料が、遊離脂肪酸を含む、請求項９９〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記酵母に対し実質的に毒性ではない供給材料が、１２個より多くの炭素を含む、請求項９９〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
請求項９９〜１０４のいずれか一項に記載の方法によって製造された二酸。
【請求項１０６】
配列番号１４８または１５０のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１０７】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１４７または１４９のヌクレオチド配列を含む、請求項１０６に記載の単離された核酸。
【請求項１０８】
配列番号３７のヌクレオチド配列、または配列番号３７に対して７５％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１０９】
配列番号４４のポリペプチド；配列番号４４に対して７１％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または配列番号４４の配列中に１〜５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１１０】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４３のヌクレオチド配列、または配列番号４３に対して６９％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１０９に記載の単離された核酸。
【請求項１１１】
配列番号４６のポリペプチド；配列番号４６に対して７１％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または配列番号４６の配列中に１〜５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１１２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４５のヌクレオチド配列、または配列番号４５に対して７０％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１１１に記載の単離された核酸。
【請求項１１３】
配列番号４８のポリペプチド；配列番号４８に対して８７％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または配列番号４８の配列中に１〜５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１１４】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４７のヌクレオチド配列、または配列番号４７に対して７８％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１１３に記載の単離された核酸。
【請求項１１５】
配列番号５０のポリペプチド；配列番号５０に対して８０％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または配列番号５０の配列中に１〜５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１１６】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４９のヌクレオチド配列、または配列番号４９に対して７５％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１１５に記載の単離された核酸。
【請求項１１７】
配列番号６７のポリペプチド；配列番号６７に対して９９％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または配列番号６７の配列中に１〜５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１１８】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号６８のヌクレオチド配列、または配列番号６８に対して９７％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１１７に記載の単離された核酸。
【請求項１１９】
配列番号７４のポリペプチド；配列番号７４に対して９９％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または配列番号７４の配列中に１〜５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１２０】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号７３のヌクレオチド配列、または配列番号７３に対して９７％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１１９に記載の単離された核酸。
【請求項１２１】
配列番号７６のポリペプチド；配列番号７６に対して９９％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または配列番号７６の配列中に１〜５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１２２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号７５のヌクレオチド配列、または配列番号７５に対して９９％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１２１に記載の単離された核酸。
【請求項１２３】
配列番号３のポリペプチド；配列番号３に対して９９％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または配列番号３の配列中に１〜５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１２４】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２のヌクレオチド配列、または配列番号２に対して９９％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１２３に記載の単離された核酸。
【請求項１２５】
配列番号５のポリペプチド；配列番号５に対して９９％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または配列番号５の配列中に１〜５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１２６】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４のヌクレオチド配列、または配列番号４に対して９８％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１２５に記載の単離された核酸。
【請求項１２７】
配列番号７のポリペプチド；配列番号７に対して９９％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または配列番号７の配列中に１〜５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１２８】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号６のヌクレオチド配列、または配列番号６に対して９９％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１２７に記載の単離された核酸。
【請求項１２９】
配列番号３４のポリペプチド；配列番号３４に対して９５％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または配列番号３４の配列中に１〜５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１３０】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号３３のヌクレオチド配列、または配列番号３３に対して７３％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１２９に記載の単離された核酸。
【請求項１３１】
配列番号３６のポリペプチド；配列番号３６に対して９４％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または配列番号３６の配列中に１〜５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１３２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号３５のヌクレオチド配列、または配列番号３５に対して７３％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１３１に記載の単離された核酸。
【請求項１３３】
配列番号１２９のポリペプチド；配列番号１２９に対して８９％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または配列番号１２９の配列中に１〜５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１３４】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１３０のヌクレオチド配列、または配列番号１３０に対して８４％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１３３に記載の単離された核酸。
【請求項１３５】
配列番号１１３のポリペプチド；配列番号１１３に対して８５％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または配列番号１１３の配列中に１〜５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１３６】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１１４のヌクレオチド配列、または配列番号１１４に対して８４％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１３５に記載の単離された核酸。
【請求項１３７】
配列番号１１５のポリペプチド；配列番号１１５に対して９７％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または配列番号１１５の配列中に１〜５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１３８】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１１６のヌクレオチド配列、または配列番号１１６に対して８６％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１３７に記載の単離された核酸。
【請求項１３９】
配列番号１１７のポリペプチド；配列番号１１７に対して８０％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または配列番号１１７の配列中に１〜５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１４０】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１１８のヌクレオチド配列、または配列番号１１８に対して８０％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１３９に記載の単離された核酸。
【請求項１４１】
配列番号１１９のポリペプチド；配列番号１１９に対して８４％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または配列番号１１９の配列中に１〜５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１４２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１２０のヌクレオチド配列、または配列番号１２０に対して７６％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１４１に記載の単離された核酸。
【請求項１４３】
配列番号１２１のポリペプチド；配列番号１２１に対して８１％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または配列番号１２１の配列中に１〜５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１４４】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１２２のヌクレオチド配列、または配列番号１２２に対して７４％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１４３に記載の単離された核酸。
【請求項１４５】
配列番号１２３のポリペプチド；配列番号１２３に対して９０％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または配列番号１２３の配列中に１〜５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１４６】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１２４のヌクレオチド配列、または配列番号１２４に対して８２％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１４５に記載の単離された核酸。
【請求項１４７】
配列番号１２５のポリペプチド；配列番号１２５に対して８０％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または配列番号１２５の配列中に１〜５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１４８】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１２６のヌクレオチド配列、または配列番号１２６に対して７７％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１４７に記載の単離された核酸。
【請求項１４９】
配列番号１２７のポリペプチド；配列番号１２７に対して８１％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または配列番号１２７の配列中に１〜５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１５０】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１２８のヌクレオチド配列、または配列番号１２８に対して７８％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１４９に記載の単離された核酸。
【請求項１５１】
配列番号９６のポリペプチド；配列番号９６に対して８５％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または配列番号９６の配列中に１〜５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１５２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号９５のヌクレオチド配列、または配列番号９５に対して７２％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１５１に記載の単離された核酸。
【請求項１５３】
配列番号１３９のポリペプチド；配列番号１３９に対して７６％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または配列番号１３９の配列中に１〜５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１５４】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１４０のヌクレオチド配列、または配列番号１４０に対して７７％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１５３に記載の単離された核酸。
【請求項１５５】
配列番号１４１のポリペプチド；配列番号１４１に対して８３％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または配列番号１４１の配列中に１〜５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１５６】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１４２のヌクレオチド配列、または配列番号１４２に対して７３％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１５５に記載の単離された核酸。
【請求項１５７】
配列番号９０のポリペプチド；配列番号９０に対して９５％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または配列番号９０の配列中に１〜５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１５８】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号８９のヌクレオチド配列、または配列番号８９に対して８１％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１５７に記載の単離された核酸。
【請求項１５９】
配列番号４０のポリペプチド；配列番号４０に対して９２％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または配列番号４０の配列中に１〜５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１６０】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号３９のヌクレオチド配列、または配列番号３９に対して８４％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１５９に記載の単離された核酸。
【請求項１６１】
配列番号１６６のヌクレオチド配列、または配列番号１６６に対して８４％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１６２】
配列番号１６７のヌクレオチド配列、または配列番号１６７に対して８５％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１６３】
配列番号１６４のヌクレオチド配列、または配列番号１６９に対して９２％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【請求項１６４】
前記１〜５つのアミノ酸置換のうち少なくとも１つが、保存的である、請求項１０８〜１６０のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項１６５】
前記１〜５つのアミノ酸置換のうち少なくとも１つが、非保存的である、請求項１０８〜１６０のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項１６６】
請求項１０６〜１６５のいずれか一項に記載の単離された核酸を含む発現ベクター。
【請求項１６７】
請求項１０６〜１６５のいずれか一項に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項１６８】
前記細胞が、細菌細胞である、請求項１６７に記載の宿主細胞。
【請求項１６９】
酵母細胞である、請求項１６７に記載の宿主細胞。
【請求項１７０】
カンジダ種の酵母である、請求項１６９に記載の宿主細胞。
【請求項１７１】
前記カンジダ種の酵母が、Ｃ．トロピカリスおよびＣ．ビスワナチイからなる群より選択される、請求項１７０に記載の宿主細胞。
【請求項１７２】
前記カンジダ種の酵母が、遺伝子改変ＡＴＣＣ２０３３６酵母である、請求項１７０に記載の宿主細胞。
【請求項１７３】
ヤロウイア種の酵母、ピチア種の酵母、サッカロミセス種の酵母およびクルイベロマイセス種の酵母からなる群より選択される、請求項１６９に記載の宿主細胞。
【請求項１７４】
Ｙ.リポリチカ、Ｐ．パストリス、Ｐ．メンブラニファシエンス、Ｐ．クルベリ、Ｐ．ギリエルモンジイ、Ｐ．ヒーディ、Ｐ．サブペリキュローサ、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．バヤヌス、Ｓ．パストリアヌス、Ｓ．カールスベルゲンシス、Ｋ．ラクティスおよびＫ．マルキシアヌスからなる群より選択される、請求項１７３に記載の宿主細胞。
【請求項１７５】
請求項７８〜９７および９９〜１０４のいずれか一項に記載の方法により得られたドデカン二酸を含む、発現生成物。
【請求項１７６】
請求項１〜７７のいずれか一項からの遺伝子改変酵母を、好適な供給材料と接触させて；そして、前記酵母を、前記供給材料からドデカン二酸を含む発現生成物が生産されるような条件下で培養することにより得られたドデカン二酸を含む、発現生成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）に基づき、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる２０１２年１２月１９日付けで出願された米国仮特許出願第６１／７３９，６５６号の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
分野
本技術は、部分的に、脂肪族ジカルボン酸を生産する生物学的方法、およびこのような生産が可能な操作された微生物に関する。
【背景技術】
【０００３】
微生物は、それら自身の代謝および増殖を支持するための様々な酵素によって駆動する生物学的経路を採用している。細胞は、インビボでデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）から酵素などの天然タンパク質を合成する。ＤＮＡはまず、タンパク質をコードするリボヌクレオチド配列を含む相補的なリボ核酸（ＲＮＡ）に転写される。次いでＲＮＡは、リボソームなどの様々な細胞成分との相互作用によって、コードされたタンパク質の翻訳に方向付けられる。結果得られた酵素は、生物学的な触媒として、生物による分子生産に関与する経路に参加する。
【０００４】
これらの経路は、自然に生産された生成物を回収するのに活用できる。この経路はまた、生産を増加させたり、または商業的に有用な可能性がある異なる生成物を生産させたりするように変更させることもできる。組換え分子生物学的な方法論の進歩のため、研究者は、１種の生物からＤＮＡを単離してそれを別の生物に挿入することにより、酵素または他のタンパク質の細胞合成を変更することが可能である。また組換え分子生物学的な方法論の進歩は、微生物のゲノムＤＮＡ中に含まれる内因性遺伝子のコピー数を増加させること、したがって酵素または他のタンパク質の細胞合成を変更することも可能にする。このような遺伝子工学は、宿主生物内の生物学的経路を変化させて、宿主生物に望ましい生成物を生産させることを可能にする。微生物の工業的生産は、腐食性の化学物質の使用と毒性副産物の生産を最小化できるため、所定の化合物にとって「クリーンな」源を提供できる。適切な植物から得られた供給材料の使用は、「環境に優しい」化合物を生産しつつ、さらに石油から得られた化合物への必要性とその使用を最小化できる。
【発明の概要】
【０００５】
所定の形態において、ベータ酸化活性を実質的にブロックする１種またはそれより多くの遺伝学的改変と；モノオキシゲナーゼ活性、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、チオエステラーゼ活性、アシルトランスフェラーゼ活性、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性、アシル−ｃｏＡオキシダーゼ活性、脂肪族アルコールオキシダーゼ活性、アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ活性、アルコールデヒドロゲナーゼ活性、ペルオキシソーム生合成因子活性、および脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性から選ばれる１種またはそれより多くの活性を増加させる１種またはそれより多くの遺伝学的改変とを含む遺伝子改変酵母が提供される。
【０００６】
１種またはそれより多くの遺伝学的改変は、時には、（ａ）ＣＹＰ５２Ａ１２のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＹＰ５２Ａ１３のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＹＰ５２Ａ１４のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＹＰ５２Ａ１５のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＹＰ５２Ａ１６のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＹＰ５２Ａ１７のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＹＰ５２Ａ１８のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＹＰ５２Ａ１９のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＹＰ５２Ａ２０のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＹＰ５２Ｄ２のモノオキシゲナーゼ活性およびＢＭ３のモノオキシゲナーゼ活性から選ばれるモノオキシゲナーゼ活性から選ばれる１種またはそれより多くのモノオキシゲナーゼ活性；（ｂ）ＣＰＲＡモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、ＣＰＲＢモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性およびＣＰＲ７５０モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性から選ばれる１種またはそれより多くのモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性；（ｃ）ＩＤＰ２イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性；（ｄ）ＧＤＰ１グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性；（ｅ）ＺＷＦ１グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性およびＺＷＦ２グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性から選ばれる１種またはそれより多くのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性；（ｆ）ＦＡＯ１脂肪族アルコールオキシダーゼ活性、ＦＡＯ２Ａ脂肪族アルコールオキシダーゼ活性、ＦＡＯ２Ｂ脂肪族アルコールオキシダーゼ活性、ＦＡＯ１３脂肪族アルコールオキシダーゼ活性、ＦＡＯ１７脂肪族アルコールオキシダーゼ活性、ＦＡＯ１８脂肪族アルコールオキシダーゼ活性およびＦＡＯ２０脂肪族アルコールオキシダーゼ活性から選ばれる１種またはそれより多くの脂肪族アルコールオキシダーゼ活性；（ｇ）ＡＤＨ１アルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＡＤＨ２アルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＡＤＨ３アルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＡＤＨ４アルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＡＤＨ５アルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＡＤＨ７アルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＡＤＨ８アルコールデヒドロゲナーゼ活性およびＳＦＡアルコールデヒドロゲナーゼ活性から選ばれる１種またはそれより多くのアルコールデヒドロゲナーゼ活性；（ｈ）ＡＣＨ−Ａアシル−ＣｏＡヒドロラーゼ活性およびＡＣＨ−Ｂアシル−ＣｏＡヒドロラーゼ活性から選ばれる１種またはそれより多くのアシル−ＣｏＡヒドロラーゼ活性；（ｉ）アシル−ＣｏＡステロールアシルトランスフェラーゼ活性、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性およびリン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性から選ばれる１種またはそれより多くのアシルトランスフェラーゼ活性；（ｊ）ＡＲＥ１アシル−ＣｏＡステロールアシルトランスフェラーゼ活性、ＡＲＥ２アシル−ＣｏＡステロールアシルトランスフェラーゼ活性、ＤＧＡ１ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性、およびＬＲＯ１リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性から選ばれる１種またはそれより多くのアシルトランスフェラーゼ活性；（ｋ）アシル−ｃｏＡチオエステラーゼ活性（例えば、ＴＥＳＡアシル−ｃｏＡチオエステラーゼ活性）；（ｌ）ＰＥＸ１１ペルオキシソーム生合成因子活性；（ｍ）ＨＦＤ１脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性およびＨＦＤ２脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性から選ばれる１種またはそれより多くの脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性；ならびに（ｎ）ＰＯＸ５アシル−ｃｏＡオキシダーゼ活性の１種またはそれより多くを増加させる。
【０００７】
所定の形態において、遺伝子改変酵母は、ベータ酸化が完全にブロックされている。いくつかのケースにおいて、遺伝子改変酵母においてアシル−ｃｏＡオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの全ての対立遺伝子が破壊されている。遺伝子改変酵母がカンジダ種の酵母である所定のケースにおいて、ＰＯＸ４およびＰＯＸ５の全ての対立遺伝子が破壊されている。
【０００８】
いくつかの形態において、遺伝子改変酵母における活性を増加させる遺伝学的改変は、該活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの複数のコピーを該酵母に取り入れることを含む。遺伝子改変酵母における活性を増加させる遺伝学的改変は、時には、該活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結されたプロモーターを該酵母に取り入れることを含む。いくつかのケースにおいて、該プロモーターは、ＰＯＸ４プロモーター、ＰＥＸ１１プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、ＰＧＫプロモーターおよびＦＡＯ１プロモーターから選ばれる。
【０００９】
所定の形態において、遺伝子改変酵母は、アシル−ｃｏＡシンセターゼ活性を減少させる１種またはそれより多くの遺伝学的改変を含む。いくつかのケースにおいて、１種またはそれより多くの遺伝学的改変は、ＡＣＳ１アシル−ｃｏＡシンセターゼ活性およびＦＡＴ１長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性から選ばれる１種またはそれより多くのアシル−ｃｏＡシンセターゼ活性を減少させる。
【００１０】
いくつかの形態において、遺伝子改変酵母は、カンジダ種の酵母（例えば、Ｃ．トロピカリス（C. tropicalis）、Ｃ．ビスワナチイ（C. viswanathii）、遺伝子改変ＡＴＣＣ２０３３６酵母）、ヤロウイア（Yarrowia）種の酵母、ピチア（Pichia）種の酵母、サッカロミセス種の酵母およびクルイベロマイセス種の酵母から選ばれる。
【００１１】
目的とする二酸生成物生産のために、本明細書で説明される遺伝学的改変のあらゆる好適な組み合わせを遺伝子改変酵母に取り入れることができる。いくつかのケースにおいて、遺伝子改変酵母は、本明細書で説明されるような（ａ）活性を増加させる遺伝学的改変、（ｂ）活性を減少させる遺伝学的改変、および（ｃ）プロモーターの挿入のうち１種またはそれより多くをあらゆる好適な組み合わせで包含する。
【００１２】
いくつかの形態において、二酸を生産する方法であって、本明細書で説明される遺伝子改変酵母を、該酵母により二酸に変換可能な供給材料と接触させることと；該供給材料から二酸が生産される条件下で該酵母を培養することとを含む、上記方法が提供される。いくつかのケースにおいて、供給材料は、植物油からの１種またはそれより多くの成分を含み、時には二酸は、Ｃ４〜Ｃ２４の二酸である。
【００１３】
所定の形態において、酵母に対し毒性の供給材料から酵母によって二酸を生産する方法であって、（ａ）培養状態の遺伝子改変酵母を、該酵母に対し実質的に毒性ではない供給材料と接触させることによって、誘導を行うことと；（ｂ）（ａ）で誘導した後の該酵母を、該酵母に対し毒性の供給材料と接触させることとを含み、それにより、誘導が行われない場合に該酵母に対し毒性の供給材料から生産される二酸の量より多くの量で、該酵母に対し毒性の供給材料から該酵母によって二酸が生産される、上記方法が提供される。
いくつかの形態において、特定の単離された核酸も本明細書において提供される。
【００１４】
以下の説明、実施例、特許請求の範囲および図面において、所定の実施態様をさらに説明する。
【００１５】
図面の簡単な説明
図面は、本技術の実施態様を例示するが、これらに限定されない。例示の明確化および簡易化のために、図面は原寸比にはなっておらず、いくつかの場合において、特定の実施態様を理解しやすくするために、様々な形態を誇張または拡大して示す場合もある。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ベータ酸化がブロックされた微生物におけるデカンからセバシン酸への変換の概略図である。オメガ酸化中、中間体としてカプリン酸が形成される。
【図２】図２は、ベータ酸化がブロックされた微生物におけるドデカンからドデカン二酸への変換の概略図である。オメガ酸化中、中間体としてラウリン酸が形成される。
【図３】図３は、ベータ酸化がブロックされた微生物における、混合鎖長アルカンを含有する供給材料から、セバシン酸を包含する混合二酸生成物への変換の概略図である。オメガ酸化中、中間体として混合鎖長脂肪酸が形成される。セバシン酸は、適切な分離技術の使用によって他の二酸生成物から分離できる。
【図４】図４は、ベータ酸化がブロックされた微生物における、ドデカン二酸を包含する混合鎖長アルカンを含有する供給材料から混合二酸生成物への変換の概略図である。オメガ酸化中、中間体として混合鎖長脂肪酸が形成される。ドデカン二酸は、適切な分離技術の使用によって他の二酸生成物から分離できる。
【図５】図５は、ベータ酸化が部分的にブロックされた微生物における、長鎖アルカンからセバシン酸への変換の概略図である。長鎖アルカンはまず、オメガ酸化経路における活性によって長鎖脂肪酸に変換され、次いで長鎖二酸に変換される。長鎖二酸は、ベータ酸化経路における活性によってセバシン酸に変換でき、それと同時にアセチル−ＣｏＡが生成される。
【図６】図６は、ベータ酸化が部分的にブロックされた微生物における長鎖アルカンからドデカン二酸への変換の概略図である。長鎖アルカンはまず、オメガ酸化経路における活性によって長鎖脂肪酸に変換され、次いで長鎖二酸に変換される。長鎖二酸は、ベータ酸化経路における活性によってドデカン二酸に変換でき、それと同時にアセチル−ＣｏＡが生成される。
【図７】図７は、ベータ酸化が部分的にブロックされた微生物における、混合鎖長アルカンを含有する供給材料からセバシン酸への変換の概略図である。混合鎖長アルカンはまず、オメガ酸化経路における活性によって混合鎖長脂肪酸に変換され、次いで混合二酸に変換される。混合二酸は、ベータ酸化経路における活性によってセバシン酸に変換でき、それと同時にアセチル−ＣｏＡが生成される。
【図８】図８は、ベータ酸化が部分的にブロックされた微生物における、混合鎖長アルカンを含有する供給材料からドデカン二酸への変換の概略図である。混合鎖長アルカンはまず、オメガ酸化経路における活性によって混合鎖長脂肪酸に変換され、次いで混合二酸に変換される。混合二酸は、ベータ酸化経路における活性によってドデカン二酸に変換でき、それと同時にアセチル−ＣｏＡが生成される。
【図９】図９は、ベータ酸化が完全にブロックされたカンジダ属の酵母株における、デカンからセバシン酸への変換のグラフ表示である。培地をグラフに示された時間インキュベートした後、ガスクロマトグラフィーで処理した。結果から、デカンの９９％より多くがセバシン酸に変換され、ガスクロマトグラフィーによって検出されたカプリン酸量も最小であったことが示される。他のいずれの一酸または二酸の有意な蓄積もガスクロマトグラフィーでは検出されなかった。実施例１に、実験の詳細および結果を示す。
【図１０】図１０は、Ｃ．トロピカリス酵母株におけるカプリン酸からセバシン酸への変換のグラフ表示である。予め決められた増殖期間後、ＧＣ分析を行った。カプリン酸の開始濃度を使用したところ、添加されたカプリン酸のほぼ全てがセバシン酸に変換された。実施例２に、実験の詳細および結果を示す。
【図１１】図１１は、ベータ酸化が部分的にブロックされたカンジダ・トロピカリス株（例えば、ｓＡＡ１０６）を使用した発酵条件下での、長鎖脂肪酸から混合二酸への変換中に生産された二酸の分布のグラフ表示である。実施例５に、実験の詳細および結果を示す。
【図１２】図１２は、追加の遺伝学的改変を有するベータ酸化が完全にブロックされたＣ．トロピカリス酵母株における、デカンからセバシン酸への変換のグラフ表示である。ｓＡＡ００３株は、ベータ酸化が完全にブロックされた対照株である。＋ＣＰＲは、ベータ酸化が完全にブロックされた株がシトクロムＰ４５０レダクターゼの増加したコピー数も包含することを示す。＋ＣＰＲ＋Ａ１２は、開始のｓＡＡ００３株がシトクロムＰ４５０レダクターゼの増加したコピー数の追加の遺伝学的改変を包含し、さらに、シトクロムＰ４５０Ａ１２（例えば、ＣＹＰ５２Ａ１２）の増加したコピー数も包含することを示す。＋ＣＰＲ＋Ａ１８は、開始のｓＡＡ００３株がシトクロムＰ４５０レダクターゼの増加したコピー数の追加の遺伝学的改変を包含し、さらに、シトクロムＰ４５０Ａ１８（例えば、ＣＹＰ５２Ａ１８）の増加したコピー数も包含することを示す。＋ＣＰＲ＋Ａ１９は、開始のｓＡＡ００３株がシトクロムＰ４５０レダクターゼの増加したコピー数の追加の遺伝学的改変を包含し、さらに、シトクロムＰ４５０Ａ１９（例えば、ＣＹＰ５２Ａ１９）の増加したコピー数も包含することを示す。＋ＣＰＲ＋Ａ２０は、開始のｓＡＡ００３株がシトクロムＰ４５０レダクターゼの増加したコピー数の追加の遺伝学的改変を包含し、さらに、シトクロムＰ４５０Ａ２０（例えば、ＣＹＰ５２Ａ２０）の増加したコピー数も包含することを示す。実施例７に、実験の詳細および結果を示す。
【図１３】図１３は、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性、またはモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性およびモノオキシゲナーゼ活性に対する遺伝子変更も含有するベータ酸化が完全にブロックされたＣ．トロピカリス酵母株における、ラウリン酸メチルからドデカン二酸への変換の結果のグラフ表示である。培地を４８時間インキュベートした後、ガスクロマトグラフィーで処理した。結果から、ＣＹＰ５２Ａ１８のモノオキシゲナーゼ活性の増加したコピー数およびモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性（例えば、ＣＰＲ７５０）の増加したコピー数を含有するカンジダ株が、振盪フラスコ発酵実験においてドデカン二酸（例えば、ＤＤＤＡ）の最大収量をもたらすことが示される。実施例８に、実験の詳細および結果を示す。
【図１４】図１４は、特異的な基質特異性を有するアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を同定するためのスクリーニングおよび／または選択方法を図式的に例示する。この方法は、変更された鎖長基質特異性を有するアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を生成および／または同定することと共に利用できる。実施例９に、スクリーニング／選択方法の詳細を示す。
【図１５】図１５は、特異的な基質特異性を有するアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を同定するためのスクリーニングおよび／または選択方法を図式的に例示する。この方法は、変更された鎖長基質特異性を有するアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を生成および／または同定することと共に利用できる。実施例９に、スクリーニング／選択方法の詳細を示す。
【図１６】図１６は、本明細書で説明される供給材料として様々な量のデカンを使用した発酵条件下でデカンをセバシン酸に変換する操作された微生物の結果のグラフ表示である。実施例３に、実験の詳細および結果を示す。
【図１７】図１７は、本明細書で説明される発酵条件下で混合脂肪酸供給材料（例えば、混合鎖長脂肪酸）をセバシン酸に変換する操作された微生物の結果のグラフ表示である。実施例４に、実験の詳細および結果を示す。
【図１８】図１８は、ＰＯＸ４プロモーターおよびＰＯＸ４ターミネーターを含有するｐＡＡ０７３と名付けられたプラスミドの略図を示す。
【図１９】図１９は、ｐＡＡ２９８と名付けられたプラスミドの略図を示す。
【図２０】図２０は、ｓＡＡ１３０６株およびｓＡＡ００３株を利用した、ラウリン酸メチル（ＭＬ）からドデカン二酸への、またはミリスチン酸メチル（ＭＭ）からテトラデカン二酸へのいずれかの生産を示す。
【図２１】図２１は、ｓＡＡ１０８２株およびｓＡＡ００３株を使用した、ラウリン酸メチル（ＭＬ）からドデカン二酸への、またはミリスチン酸メチル（ＭＭ）からテトラデカン二酸へのいずれかの生産を示す。
【図２２】図２２は、４種のベータ酸化が完全にブロックされた株におけるオレイン酸からシス−９−オクタデセン二酸（Ｃ１８：１二酸）への生産を示す。データポイントは、３つの同一な発酵の平均から得られる。
【図２３】図２３は、ｓＡＡ００３株、ｓＡＡ１２３３株、ｓＡＡ１３０６株およびｓＡＡ１４８５株によってオレイン酸のオメガ酸化中に生産されたＨＦＡの濃度を示す。
【図２４】図２４は、デカン二酸（セバシン酸）の生産を示し、２種の異なる誘導条件下での２種の株の生産性を比較する。
【図２５】図２５は、異なる発酵条件下で生産されたデカン酸の量を示す。
【図２６】図２６は、ラウリン酸メチルからのＤＤＤＡおよび１２−ヒドロキシ−ドデカン酸（ＨＦＡ）の生産を示す。
【図２７】図２７は、ラウリン酸メチルからのＤＤＤＡの生産を示。
【図２８】図２８は、ＤＤＤＡの生産を示す。
【図２９】図２９は、ラウリン酸メチルからのＨＦＡの生産を示す。
【図３０】図３０は、プロモーターの置き換え方策を示す。
【図３１】図３１は、オメガ酸化経路における第一の酸化工程中のＨＦＡの生産の例を示す。
【図３２Ａ】図３２Ａは、ｓＡＡ００３株およびｓＡＡ２０４７株からのオメガヒドロキシオレイン酸およびシス−９Ｃ１８二酸の生産を示す。
【図３２Ｂ】図３２Ｂは、ｓＡＡ００３株およびｓＡＡ２０４７株からの１２−ＨＤＤＡおよびＤＤＤＡの生産を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
詳細な説明
所定の脂肪族ジカルボン酸（すなわち、二酸、例えばドデカン二酸またはセバシン酸）は、所定のポリアミド、ポリウレタンおよび可塑剤の作製に使用される製造プロセスにおける化学中間体であり、これらはいずれも、消毒剤、トップグレードのコーティング、ホットメルトコーティングおよび接着剤、塗料原料、腐食抑制剤、界面活性剤、エンジニアリングプラスチックなどの物品の製造において広範囲の用途を有し、さらに例えば芳香剤の製造における出発原料としても使用できる。例えばドデカン二酸はまた、１，１２ドデカン二酸、およびＤＤＤＡとしても知られており、これらは、脂肪族ジカルボン酸である炭素１２個の有機分子である。別の例において、セバシン酸はまた、１，１０デカン二酸、および１，８オクタンジカルボン酸としても知られており、これらは、脂肪族ジカルボン酸である炭素１０個の有機分子である。
【００１８】
本明細書において、脂肪族ジカルボン酸（本明細書では二酸とも称される）を生産する方法が提供される。あらゆる好適な二酸を生産でき、多くの場合、生産された二酸は分子の各末端に酸部分を包含する（例えば、アルファオメガ二酸）。二酸は、時には、Ｃ４〜Ｃ２４の二酸（すなわち、４個〜２４個の炭素を含有する二酸）であり、時には、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、またはＣ２０の二酸である。本明細書に記載の酵母およびプロセスは、奇数の炭素を含有する二酸を生産でき、時には、生成物は、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ９、Ｃ１１、Ｃ１３、Ｃ１５、Ｃ１７、Ｃ１９、Ｃ２１およびＣ２３の二酸から選ばれる１個またはそれより多くの二酸を含有する。二酸の炭化水素部分は、時には完全に飽和しており、二酸は、時には１つまたはそれより多くの不飽和（例えば、二重結合）を包含する。
二酸の非限定的な例としては、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）および生物系を使用した他の有機中間体が挙げられる。脂肪族ジカルボン酸の非限定的な例としては、スベリン酸（すなわち、オクタン二酸、１，８−オクタン二酸、オクタン二酸、オクタン−１，８−二酸、１，６−ヘキサンジカルボン酸、カプリル二酸）、セバシン酸（すなわち、１，１０−デカン二酸、デカン二酸、デカン−１，１０−二酸、１，８−オクタンジカルボン酸、カプリン二酸）、ドデカン二酸（すなわち、ＤＤＤＡ、１，１２−ドデカン二酸、ドデカン二酸、ドデカン−１，１２−二酸、１，１０−デカンジカルボン酸、デカメチレンジカルボン酸、１，１０−ジカルボキシデカン、ラウリン二酸）、テトラデカン二酸（すなわち、ＴＤＤＡ、１，１４−テトラデカン二酸、テトラデカン二酸、テトラデカン−１，１４−二酸、１，１２−ドデカンジカルボン酸、ミリスチン二酸）、タプシン酸（thapsic acid）（すなわち、ヘキサデカン二酸、１，１６−ヘキサデカン二酸、ヘキサデカン二酸、ヘキサデカン−１，１６−二酸、１，１４−テトラデカンジカルボン酸、パルミチン二酸）、シス−９−ヘキサデセン二酸（すなわち、パルミトレイン二酸）、オクタデカン二酸（すなわち、１，１８−オクタデカン二酸、オクタデカン二酸、オクタデカン−１，１８−二酸、１，１６−ヘキサデカンジカルボン酸、ステアリン二酸）、シス−９−オクタデセン二酸（すなわち、オレイン二酸）、シス−９，１２−オクタデセン二酸（すなわち、リノール二酸）、シス−９，１２，１５−オクタデセン二酸（すなわち、リノレン二酸）、アラキジン二酸（すなわち、エイコサン二酸、イコサン二酸）、１１−エイコセン二酸（すなわち、シス−１１−エイコセン二酸）、１３−エイコセン二酸（すなわち、シス−１３−エイコセン二酸）、アラキドン二酸（すなわち、シス−５，８，１１，１４−エイコサテトラエン二酸）が挙げられる。
【００１９】
遺伝子改変酵母は、二酸を生産するための供給材料と共に提供でき、供給材料は、時には、二酸が生産される実質的に純粋な脂肪族分子を包含する。いくつかの実施態様において、供給材料は、二酸が生産され得る脂肪族分子の混合されたセットを含有する。いくつかの実施態様において、供給材料中の脂肪族分子が、主要な脂肪族化学種であり、時にはその脂肪族分子から生産された特定の二酸が、生産された主要な二酸化学種である。主要な化学種は、一般的に、供給材料中の脂肪族分子化学種の重量に対して、５１％またはそれより高いか、または生成物中の二酸化学種の重量に対して、５１％またはそれより高い（例えば、約５５％またはそれより高い、６０％またはそれより高い、６５％またはそれより高い、７０％またはそれより高い、７５％またはそれより高い、８０％またはそれより高い、８５％またはそれより高い、９０％またはそれより高いまたは９５％またはそれより高い）。
【００２０】
このような生産システムは、環境への影響をより有意に少なくすることができ、現行の製造システムとの経済的な競合が可能である。したがって、本明細書において、部分的に、操作された微生物による、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）の製造方法が提供される。いくつかの実施態様において、微生物は、酵素をコードする少なくとも１種の異種遺伝子が含有されるように操作され、ここで酵素は、微生物に組み込まれた新規のおよび／または変更された経路の一要素である。いくつかの実施態様において、生物は、天然の酵素の高い活性によって選択されてもよい。
【００２１】
微生物
選択された微生物は、多くの場合、遺伝子操作に好適であり、多くの場合、さらに目的とする脂肪族ジカルボン酸生成物の工業的生産に有用な細胞密度で培養できる。選択された微生物は、多くの場合、発酵デバイスで維持できる。
【００２２】
用語「操作された微生物」は、本明細書で使用される場合、開始点として利用した微生物（以降、「宿主微生物」）に存在する活性とは異なる１種またはそれより多くの活性を包含する改変微生物を指す。いくつかの実施態様において、操作された微生物は異種ポリヌクレオチドを包含し、いくつかの実施態様において、操作された生物は、宿主微生物に対して活性を変更する、または活性を導入する選択的な条件で処理されたものである。したがって、操作された微生物は、ヒトによって直接的または間接的に変更されたものである。宿主微生物は、時には天然の微生物であり、所定の程度まで操作された微生物であることもある。
【００２３】
いくつかの実施態様において、操作された微生物は、多くの場合、分裂して繁殖できる単細胞生物である。微生物は、以下の特徴：好気性、嫌気性、糸状、非糸状、一倍体、二倍体、栄養要求性および／または非栄養要求性のうち１つまたはそれより多くを包含していてもよい。いくつかの実施態様において、操作された微生物は、原核性微生物（例えば、細菌）であり、いくつかの実施態様において、操作された微生物は、非原核性微生物である。いくつかの実施態様において、操作された微生物は、真核性微生物（例えば、酵母、菌類、アメーバ）である。いくつかの実施態様において、操作された微生物は、真菌である。いくつかの実施態様において、操作された生物は、酵母である。
【００２４】
宿主微生物、操作された微生物、遺伝子改変生物、または異種もしくは改変ポリヌクレオチドのための源として、あらゆる好適な酵母が選択できる。酵母としては、これらに限定されないが、ヤロウイア属の酵母（例えば、Ｙ．リポリチカ（Y. lipolytica）（以前はカンジダ・リポリチカとして分類された））、カンジダ属の酵母（例えば、Ｃ．レブカウフィ（C. revkaufi）、Ｃ．ビスワナチイ、Ｃ．プルケリマ（C. pulcherrima）、Ｃ．トロピカリス、Ｃ．ユチリス（C. utilis））、ロドトルラ属の酵母（例えば、Ｒ．グルチナス（R. glutinus）、Ｒ．グラミニス（R. graminis））、ロドスポリディウム属の酵母（例えば、Ｒ．トルロイデス（R. toruloides））、サッカロミセス属の酵母（例えば、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）、Ｓ．バヤヌス（S. bayanus）、Ｓ．パストリアヌス（S. pastorianus）、Ｓ．カールスベルゲンシス（S. carlsbergensis））、クリプトコックス属の酵母、トリコスポロン属の酵母（例えば、Ｔ．プランス（T. pullans）、Ｔ．クタネウム（T. cutaneum））、ピチア属の酵母（例えば、Ｐ．パストリス（P. pastoris））、およびリポマイセス属の酵母（例えば、Ｌ．スターキイ（L. starkeyii）、Ｌ．リポフェラス（L. lipoferus））が挙げられる。いくつかの実施態様において、好適な酵母は、以下の属：アラクニオタス属（Arachniotus）、アスペルギルス属、オーレオバシディウム属、アクサルスロン属（Auxarthron）、ブラストマイセス属、カンジダ属、クリソスポリウム属（Chrysosporuim）、クリソスポリウム・デバリオマイセス（Chrysosporuim Debaryomyces）、コクシジオイデス属（Coccidiodes）、クリプトコックス属、ギムノアスカス属（Gymnoascus）、ハンセヌラ属、ヒストプラスマ属、イッサチェンキア属（Issatchenkia）、クルイベロマイセス属（Kluyveromyces）、リポマイセス属、イッサチェンキア属（Lssatchenkia）、ミクロスポルム属、ミクソトリクム属（Myxotrichum）、ミクソザイマ属（Myxozyma）、オイディオデンドロン属（Oidiodendron）、パチソレン属（Pachysolen）、ペニシリウム属、ピチア属、ロドスポリディウム属（Rhodosporidium）、ロドトルラ属、ロドトルラ属、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、スコプラリオプシス属、セペドニウム属（Sepedonium）、トリコスポロン属、またはヤロウイア属の酵母である。いくつかの実施態様において、好適な酵母は、以下の種：アラクニオタス・フラボルテウス（Arachniotus flavoluteus）、アスペルギルス・フラーブス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスぺルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、オーレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）、アクサルスロン・タクステリ（Auxarthron thaxteri）、ブラストマイセス・デルマチチジス（Blastomyces dermatitidis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・ドゥブリニエンシス（Candida dubliniensis）、カンジダ・ファマタ（Candida famata）、カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）、カンジダ・ギリエルモンジイ（Candida guilliermondii）、カンジダ・ケフィア（Candida kefyr）、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）、カンジダ・ランビカ（Candida lambica）、カンジダ・リポリチカ（Candida lipolytica）、カンジダ・ルシタニア（Candida lustitaniae）、カンジダ・パラシローシス（Candida parapsilosis）、カンジダ・プルケリマ（Candida pulcherrima）、カンジダ・レブカウフィ（Candida revkaufi）、カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、カンジダ・ユチリス（Candida utilis）、カンジダ・ビスワナチイ（Candida viswanathii）、カンジダ・クセストビイ（Candida xestobii）、クリソスポリウム・ケラチノフィラム（Chrysosporuim keratinophilum）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidiodes immitis）、クリプトコックス・アルビダスの変種ディフルエンス（Cryptococcus albidus var. diffluens）、クリプトコックス・ラウレンテイ（Cryptococcus laurentii）、クリプトコックス・ネオフォマンス（Cryptococcus neofomans）、デバリオマイセス・ハンセニイ（Debaryomyces hansenii）、ギムノアスカス・ダグウェイエンシス（Gymnoascus dugwayensis）、ハンセヌラ・アノマーラ（Hansenula anomala）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、イッサチェンキア・オクシデンタリス（Issatchenkia occidentalis）、イッサチェンキア・オリエンタリス（Isstachenkia orientalis）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイベロマイセス・サーモトレランス（Kluyveromyces thermotolerans）、クルイベロマイセス・ワルテイ（Kluyveromyces waltii）、リポマイセス・リポフェラス（Lipomyces lipoferus）、リポマイセス・スターキイ（Lipomyces starkeyii）、ミクロスポルム・ジプセウム（Microsporum gypseum）、ミクソトリクム・デフレクサム（Myxotrichum deflexum）、オイディオデンドロン・エキヌラタム（Oidiodendron echinulatum）、パチソレン・タノフィリス（Pachysolen tannophilis）、ペニシリウム・ノタツム（Penicillium notatum）、ピチア・アノマーラ（Pichia anomala）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、ピチア・スティピティス（Pichia stipitis）、ロドスポリディウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）、ロドトルラ・グルチナス（Rhodotorula glutinus）、ロドトルラ・グラミニス（Rhodotorula graminis）、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、スコプラリオプシス・アクレモニウム（Scopulariopsis acremonium）、セペドニウム・クリソスペルマム（Sepedonium chrysospermum）、トリコスポロン・クタネウム（Trichosporon cutaneum）、トリコスポロン・プランス（Trichosporon pullans）、ヤロウイア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）、またはヤロウイア・リポリチカ（以前はカンジダ・リポリチカとして分類された）の酵母である。いくつかの実施態様において、酵母は、Ｙ．リポリチカ株であり、その例としては、これらに限定されないが、ＡＴＣＣ２０３６２、ＡＴＣＣ８８６２、ＡＴＣＣ１８９４４、ＡＴＣＣ２０２２８、ＡＴＣＣ７６９８２およびＬＧＡＭ  Ｓ（７）１株が挙げられる（Papanikolaou S.、およびAggelis G.、Bioresour. Technol. 82（1）:43〜9（2002））。いくつかの実施態様において、酵母は、カンジダ種（Candida species）（すなわち、カンジダ種（Candida spp.））の酵母である。脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）生産のために、あらゆる好適なカンジダ種を使用してもよいし、および／または遺伝子改変してもよい。いくつかの実施態様において、好適なカンジダ種としては、これらに限定されないが、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ドゥブリニエンシス、カンジダ・ファマタ、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・ケフィア、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ランビカ、カンジダ・リポリチカ、カンジダ・ルシタニア（Candida lustitaniae）、カンジダ・パラシローシス、カンジダ・プルケリマ（Candida pulcherrima）、カンジダ・レブカウフィ、カンジダ・ルゴサ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・ユチリス、カンジダ・ビスワナチイ、カンジダ・クセストビイおよび本明細書で説明される他のあらゆるカンジダ種の酵母が挙げられる。カンジダ種の株の非限定的な例としては、これらに限定されないが、ｓＡＡ００１（ＡＴＣＣ２０３３６）、ｓＡＡ００２（ＡＴＣＣ２０９１３）、ｓＡＡ００３（ＡＴＣＣ２０９６２）、ｓＡＡ４９６（ＵＳ２０１２／００７７２５２）、ｓＡＡ１０６（ＵＳ２０１２／００７７２５２）、ＳＵ−２（ｕｒａ３−／ｕｒａ３−）、Ｈ５３４３（ベータ酸化がブロックされた；米国特許第５６４８２４７号）株が挙げられる。遺伝学的改変のための親株として、カンジダ種の酵母からのあらゆる好適な株が利用できる。
【００２５】
酵母の属、種および株は、多くの場合、遺伝学的な内容に関して密接に関連しているため、それらを区別、分類および／または命名することが難しい場合がある。いくつかのケースにおいて、Ｃ．リポリチカおよびＹ．リポリチカの株は、区別、分類、および／または命名が難しい場合があり、いくつかのケースでは同じ生物とみなされる可能性がある。いくつかのケースにおいて、Ｃ．トロピカリスおよびＣ．ビスワナチイの様々な株は、区別、分類、および／または命名が難しい場合がある（例えば、Arieら、J. Gen. Appl.Microbiol.、46、257〜262（2000）を参照）。ＡＴＣＣから、加えて他の商業的または教育機関の源から得られたいくつかのＣ．トロピカリスおよびＣ．ビスワナチイの株は、本明細書で説明される実施態様にとって等価で同じように好適であるとみなされる可能性がある。いくつかの実施態様において、Ｃ．トロピカリスおよびＣ．ビスワナチイのいくつかの親株は、名称に関してのみ異なるとみなされる。
【００２６】
宿主微生物、操作された微生物または異種ポリヌクレオチドのための源として、あらゆる好適な真菌が選択できる。菌類の非限定的な例としては、これらに限定されないが、アスペルギルス属の菌（例えば、A．パラスティカス（A. parasiticus）、A．ニデュランス（A. nidulans））、トラウストチトリウム（Thraustochytrium）菌類、シゾチトリウム（Schizochytrium）菌類およびリゾープス菌類（例えば、R．アリズス（R. arrhizus）、R．オリゼー（R. oryzae）、R．ニグリカンス（R. nigricans））が挙げられる。いくつかの実施態様において、真菌は、これらに限定されないが、ＡＴＣＣ２４６９０株などのＡ．パラスティカス株であり、いくつかの実施態様において、真菌は、これらに限定されないが、ＡＴＣＣ３８１６３株などのＡ．ニデュランス株である。
【００２７】
宿主微生物、操作された微生物または異種ポリヌクレオチドのための源として、あらゆる好適な原核生物が選択できる。グラム陰性またはグラム陽性細菌が選択されてもよい。細菌の例としては、これらに限定されないが、バチルス属の細菌（例えば、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis)、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium））、アシネトバクター属の細菌、ノルカルディア属の細菌、ザントバクター属の細菌、エシェリキア属の細菌（例えば、大腸菌（E. coli）（例えば、ＤＨ１０Ｂ株、Ｓｔｂｌ２株、ＤＨ５−アルファ株、ＤＢ３株、ＤＢ３．１株）、ＤＢ４、ＤＢ５、ＪＤＰ６８２およびｃｃｄＡ−ｏｖｅｒ（例えば、米国出願第０９／５１８，１８８号））、ストレプトマイセス属の細菌、エルウィニア属の細菌、クレブシエラ属の細菌、セラチア属の細菌（例えば、Ｓ．マルセサンズ（S. marcessans））、シュードモナス属の細菌（例えば、緑膿菌（P. aeruginosa））、サルモネラ属の細菌（例えば、ネズミチフス菌（S. typhimurium）、腸チフス菌（S. typhi））、メガスファエラ属の細菌（例えば、メガスファエラ・エルスデニイ（Megasphaera elsdenii））が挙げられる。また細菌としては、これらに限定されないが、光合成細菌（例えば、緑色非硫黄細菌、クロロフレクサス属（Choroflexus）の細菌（例えば、Ｃ．オーランティアカス（C. aurantiacus））、クロロネマ属（Chloronema）の細菌（例えば、Ｃ．ギガテウム（C. gigateum）））、緑色硫黄細菌（例えば、クロロビウム属の細菌（例えば、Ｃ．リミコーラ（C. limicola）））、ペロディクチオン属の細菌（例えば、Ｐ．ルテオルム（P. luteolum））、紅色硫黄細菌（purple sulfur bacteria）（例えば、クロマチウム属の細菌（例えば、Ｃ．オケニイ（C. okenii）））、および紅色非硫黄細菌（purple non-sulfur bacteria）（例えば、ロドスピリルム属の細菌（例えば、Ｒ．ルブルム（R. rubrum））、ロドバクター属の細菌（例えば、Ｒ．スポロスフェロイデス（R. sphaeroides）、Ｒ．カプスラータス（R. capsulatus））、およびロドミクロビウム属の細菌（例えば、Ｒ．バネリイ（R. vanellii）））も挙げられる。
【００２８】
宿主微生物、操作された微生物または異種ポリヌクレオチドのための源として、微生物以外の生物からの細胞が利用できる。このような細胞の例としては、これらに限定されないが、昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエ属（例えば、キイロショウジョウバエ（D. melanogaster））、スポドプテラ属（Spodoptera）（例えば、Ｓ．フルギペルダ（S. frugiperda）Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞）およびトリコプルシア属（Trichoplusa）（例えば、ハイファイブ（High-Five）細胞）；線虫細胞（例えば、Ｃ．エレガンス（C. elegans）細胞）；鳥類細胞；両生類細胞（例えば、アフリカツメガエル細胞）；爬虫類細胞；哺乳類細胞（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、２９３、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＶＥＲＯ、Ｃ１２７、ＢＨＫ、Ｐｅｒ−Ｃ６、ボーズ（Bowes）黒色腫およびＨｅＬａ細胞）；ならびに植物細胞（例えば、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ニコタニア・タバカム（Nicotania tabacum）、クフェア・アンシニフォリア（Cuphea acinifolia）、クフェア・Cuphea aequipetala、クフェア・アングスチフォリア（Cuphea angustifolia）、クフェアア・ペンディキュラタ（Cuphea appendiculata）、クフェア・アビゲラ（Cuphea avigera）、クフェア・アビゲラの変種プルケリマ（Cuphea avigera var. pulcherrima）、クフェア・アクシリフロラ（Cuphea axilliflora）、クフェア・バヒエンシス（Cuphea bahiensis）、クフェア・バイロニス（Cuphea baillonis）、クフェア・ブラキポダ（Cuphea brachypoda）、クフェア・ブスタマンテ（Cuphea bustamanta）、クフェア・カルカラタ（Cuphea calcarata）、クフェア・カロフィラ（Cuphea calophylla）、クフェア・カロフィラの亜種メソステモン（Cuphea calophylla subsp. mesostemon）、クフェア・カルサゲネンシス（Cuphea carthagenensis）、クフェア・サーカエオイデス（Cuphea circaeoides）、クフェア・コンフェルティフロラ（Cuphea confertiflora）、クフェア・コルダタ（Cuphea cordata）、クフェア・クラシフロラ（Cuphea crassiflora）、クフェア・シアネア（Cuphea cyanea）、クフェア・デカンドラ（Cuphea decandra）、クフェア・デンティクラタ（Cuphea denticulata）、クフェア・ディスペルマ（Cuphea disperma）、クフェア・エピロビフォリア（Cuphea epilobiifolia）、クフェア・エリコイデス（Cuphea ericoides）、クフェア・フラバ（Cuphea flava）、クフェア・フラビセツラ（Cuphea flavisetula）、クフェア・フクシフォリア（Cuphea fuchsiifolia）、クフェア・ガウメリ（Cuphea gaumeri）、クフェア・グルチノサ（Cuphea glutinosa）、クフェア・ヘテロフィラ（Cuphea heterophylla）、クフェア・フーケリアナ（Cuphea hookeriana）、クフェア・ヒッソピフォリア（Cuphea hyssopifolia）（メキシカンヘザー（Mexican-heather））、クフェア・ヒッドポイデス（Cuphea hyssopoides）、クフェア・イグネア（Cuphea ignea）、クフェア・イングラタ（Cuphea ingrata）、クフェア・ジョルレンシス（Cuphea jorullensis）、クフェア・ランセオラタ（Cuphea lanceolata）、クフェア・リナリオイデス（Cuphea linarioides）、クフェア・ラベア（Cuphea llavea）、クフェア・ロフォストマ（Cuphea lophostoma）、クフェア・ルテア（Cuphea lutea）、クフェア・ルテセンス（Cuphea lutescens）、クフェア・メラニウム（Cuphea melanium）、クフェア・メルビラ（Cuphea melvilla）、クフェア・ミクランサ（Cuphea micrantha）、クフェア・ミクロペタラ（Cuphea micropetala）、クフェア・ミヌロイデス（Cuphea mimuloides）、クフェア・ニチドゥラ（Cuphea nitidula）、クフェア・パルストリス（Cuphea palustris）、クフェア・パーソンシア（Cuphea parsonsia）、クフェア・パスクオラム（Cuphea pascuorum）、クフェア・パウシペタラ（Cuphea paucipetala）、クフェア・プロクムベンス（Cuphea procumbens）、クフェア・シュードシレネ（Cuphea pseudosilene）、クフェア・シュードバシニウム（Cuphea pseudovaccinium）、クフェア・プルクラ（Cuphea pulchra）、クフェア・ラセモサ（Cuphea racemosa）、クフェア・レペンス（Cuphea repens）、クフェア・サリシフォリア（Cuphea salicifolia）、クフェア・サルバドレンシス（Cuphea salvadorensis）、クフェア・シュマニイ（Cuphea schumannii）、クフェア・セッシリフロラ（Cuphea sessiliflora）、クフェア・セッシリフォリア（Cuphea sessilifolia）、クフェア・セトサ（Cuphea setosa）、クフェア・スペクタビリス（Cuphea spectabilis）、クフェア・スペルマコセ（Cuphea spermacoce）、クフェア・スプレンディダ（Cuphea splendida）、クフェア・スプレンディダの変種ビリジフラバ（Cuphea splendida var. viridiflava）、クフェア・ストリグロサ（Cuphea strigulosa）、クフェア・スブリゲラ（Cuphea subuligera）、クフェア・テレアンドラ（Cuphea teleandra）、クフェア・チモイデス（Cuphea thymoides）、クフェア・トルカナ（Cuphea tolucana）、クフェア・ウレンス（Cuphea urens）、クフェア・ウトリクロサ（Cuphea utriculosa）、クフェア・ビソシッシマ（Cuphea viscosissima）、クフェア・ワトソニアナ（Cuphea watsoniana）、クフェア・ライチイ（Cuphea wrightii）、クフェア・ランセオラタ））が挙げられる。
【００２９】
宿主生物または異種ポリヌクレオチドのための源として使用される微生物または細胞は、市販されている。本明細書で説明される微生物および細胞、および他の好適な微生物および細胞は、例えば、インビトロジェン社（Invitrogen Corporation）（カリフォルニア州カールスバッド）、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（バージニア州マナサス）、およびアグリカルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレクション（Agricultural Research Culture Collection）（ＮＲＲＬ；イリノイ州ピオリア）から入手可能である。
【００３０】
宿主微生物および操作された微生物は、あらゆる好適な形態で提供されてもよい。例えば、このような微生物は、液体培養または固体培養（例えば、寒天ベースの培地）の状態で提供されてもよく、これらは初代培養物であってもよいし、または１回またはそれより多く継代されていてもよい（例えば、希釈して培養してもよい）。また微生物は、凍結した形態または乾燥形態（例えば、凍結乾燥した形態）で提供されてもよい。微生物は、あらゆる好適な濃度で提供されてもよい。
【００３１】
炭素のプロセシング経路および活性
図１〜８は、様々な開始炭素源または供給材料から脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）を生産するのに使用できる操作された経路の非限定的な実施態様を図式的に例示する。図１は、ベータ酸化経路が完全にブロックされた微生物中で、炭素源出発原料としてデカンを使用してセバシン酸を生産するための非限定的な操作された生物学的経路の実施態様を表す。図２は、ベータ酸化経路が完全にブロックされた微生物中で、炭素源出発原料としてドデカンを使用してドデカン二酸を生産するための非限定的な操作された生物学的経路の実施態様を表す。図３および図４は、ベータ酸化経路が完全にブロックされた微生物中で、炭素源出発原料として混合鎖長アルカンを使用して混合鎖長二酸を生産するための非限定的な操作された生物学的経路の実施態様を表す。セバシン酸（図３）およびドデカン二酸（図４）は、遠心分離、有機溶媒抽出、クロマトグラフィー、および／または他の精製／分離技術の好適な組み合わせを使用して他の二酸生成物から分離および／または精製できる。図５および図６は、ベータ酸化経路が部分的にブロックされた微生物中で、炭素源出発原料として長鎖アルカンを使用してセバシン酸（図５）およびドデカン二酸（図６）を生産するための非限定的な操作された生物学的経路の実施態様を表す。図７および図８は、ベータ酸化経路が部分的にブロックされた微生物中で、炭素源出発原料として混合鎖長アルカンを使用してセバシン酸（図７）およびドデカン二酸（図８）を生産するための非限定的な操作された生物学的経路の実施態様を表す。
【００３２】
炭素源出発原料であるアルカンを、最初のうちは天然に存在するおよび／または操作された経路における天然に存在するおよび／または操作された活性を使用して代謝して中間体アルコールを産出し、次いでこれを、図１〜８に表された他の天然に存在するおよび／または操作されたオメガ酸化経路における活性の作用によってカルボン酸（例えば、脂肪酸）に変換してもよい。
【００３３】
シトクロムＰ４５０酵素の活性によってアルカンをオメガ−ヒドロキシル化することにより、開始のアルカン炭素源材料に対応する鎖長アルコール誘導体が生成する。いくつかの実施態様において、シトクロムＰ４５０活性は、シトクロムＰ４５０遺伝子のコピー数を増加させること（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い遺伝子のコピー）、シトクロムＰ４５０遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させること、またはシトクロムＰ４５０遺伝子のコピー数を増加させて、シトクロムＰ４５０遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させることができ、それにより標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産は、１種またはそれより多くのシトクロムＰ４５０酵素活性の増加のために増加する。いくつかの実施態様において、シトクロムＰ４５０酵素は、宿主微生物にとって内因性である。いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くのシトクロムＰ４５０活性を、炭素源出発原料に応じて追加および／または増加してもよい。シトクロムＰ４５０は、時には、所定の供給材料または炭素源出発原料による刺激に応答して活性の増加を示す。いくつかの実施態様において、操作された微生物は、選ばれた炭素源出発原料または供給材料によって刺激される１種またはそれより多くのシトクロムＰ４５０の増加したコピー数を包含する。選ばれた開始炭素源または供給材料に対するシトクロムＰ４５０の反応性は、あらゆる好適なアッセイを使用して決定できる。開始の炭素源または供給材料に対するシトクロムＰ４５０の反応性の同定に好適なアッセイの非限定的な例としては、宿主微生物を様々な時間量で選ばれた炭素源または供給材料に晒した後のＲＴ−ＰＣＲまたはｑＲＴ−ＰＣＲが挙げられる。
【００３４】
シトクロムＰ４５０は、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）の活性によって還元されて、それによりシトクロムＰ４５０は再利用されてさらなる酵素活性がもたらされる。いくつかの実施態様において、ＣＰＲ酵素は、宿主微生物にとって内因性である。いくつかの実施態様において、宿主のＣＰＲ活性は、ＣＰＲ遺伝子のコピー数を増加させること（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い遺伝子のコピー）、ＣＰＲ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させること、またはＣＰＲ遺伝子のコピー数を増加させて、ＣＰＲ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させることができ、それにより標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産は、シトクロムＰ４５０の再利用増加のために増加する。いくつかの実施態様において、プロモーターは、異種プロモーター（例えば、内因性または外因性プロモーター）であってもよい。いくつかの実施態様において、ＣＰＲ遺伝子は、異種および外因性であり、あらゆる好適な生物から単離できる。ＣＰＲ遺伝子を単離できる生物の非限定的な例としては、Ｃ．トロピカリス、Ｓ．セレビシエおよびバチルス・メガテリウムが挙げられる。
【００３５】
アルコールからアルデヒドへの酸化は、脂肪族アルコールオキシダーゼファミリーにおける酵素（例えば、長鎖脂肪族アルコールオキシダーゼＥＣ１．１．３．２０）、またはアルコールデヒドロゲナーゼファミリーにおける酵素（例えば、脂肪族アルコールデヒドロゲナーゼ；ＥＣ１．１．１．１）によって行ってもよい。アルデヒドは、酵素アルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、長鎖−アルデヒドデヒドロゲナーゼまたは脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ；ＥＣ１．２．１．４８）の活性によってカルボン酸（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）に酸化されていてもよい。いくつかの実施態様において、長鎖脂肪族アルコールオキシダーゼ、脂肪族アルコールデヒドロゲナーゼおよび／または長鎖アルデヒドデヒドロゲナーゼは、宿主生物中に存在する。これらの二段階を介したフラックスは、時には、酵素のコピー数を増加させること、または遺伝子を転写するプロモーターの活性を増加させることによって増大される可能性がある。いくつかの実施態様において、炭素１０、１２または１４個の基質に特異的なアルコールおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼを別の生物から単離して、宿主生物に挿入してもよい。
【００３６】
図１は、炭素源出発原料としてデカン（例えば、Ｃ１０アルカン）を使用してセバシン酸を作製するための、操作された生物学的経路の非限定的な実施態様を表す。デカンの炭素鎖長のために、炭素１０個の二酸であるセバシン酸に到達するのに鎖を短くする必要はない。したがってベータ酸化が完全にブロックされた微生物を利用すれば、望ましい炭素１０個の二酸からそれより短い鎖長を有する二酸への変換を最小化できる。
【００３７】
図２は、炭素源出発原料としてドデカン（例えば、Ｃ１２アルカン）を使用してドデカン二酸を作製するための操作された生物学的経路の非限定的な実施態様を表す。ドデカンの炭素鎖長のために、炭素１２個の二酸であるドデカン二酸に到達するのに鎖を短くする必要はない。したがってベータ酸化が完全にブロックされた微生物を利用すれば、望ましい炭素１２個の二酸からより短い鎖長を有する二酸への変換を最小化できる。
【００３８】
図３および４は、炭素源出発原料として混合鎖長アルカンを含有する炭素源または供給材料を使用して、セバシン酸（図３）およびドデカン二酸（図４）などの二酸（脂肪族ジカルボン酸）生成物の混合された集団を生成するための、操作された生物学的経路の非限定的な実施態様を表す。あらゆる好適な混合鎖長アルカン、脂肪族アルコール、混合鎖長の脂肪族アルコール供給材料、脂肪酸、混合脂肪酸供給材料、パラフィン、脂肪または油が使用できる。いくつかの実施態様において、出発原料における炭素鎖長の分布は、混合二酸生成物における望ましい炭素鎖長分布に実質的に類似している。いくつかの実施態様において、供給材料は、望ましい鎖長が高濃度化されている。いくつかの実施態様において、高濃度化される部分は、炭素約１０個の炭素鎖長に関して高濃度化される。いくつかの実施態様において、高濃度化される部分は、炭素約１２個の炭素鎖長に関して高濃度化される。いくつかの実施態様において、生成した二酸は、炭素源出発原料中に見出される鎖長と実質的に同じ鎖長を有することから、ベータ酸化が完全にブロックされた微生物を利用すれば、望ましい鎖長の二酸からより短い鎖長の二酸への変換を最小化できる。図３および図４における経路の下の部分は、本明細書で説明される分離技術、または当業界公知の分離技術の使用による、混合二酸生成物からのセバシン酸およびドデカン二酸それぞれの分離を示す。
【００３９】
ベータ酸化経路が部分的にブロックされた遺伝子改変生物を含むいくつかの実施態様において（図５〜８を参照）、使用に好適な供給材料としては、これらに限定されないが、再生可能な油の脂肪酸蒸留物または石鹸原料（パーム油の脂肪酸蒸留物、ダイズ油の石鹸原料、ヤシ油の石鹸原料）、再生可能な油（ヤシ油、パーム油、パーム核油、ダイズ油、トウモロコシ油など）が挙げられ、脂肪酸の鎖長は、実質的に単一の形態（例えば、実質的に純粋な形態）または混合物の形態で、Ｃ１０に等しいかまたはそれより長く、アルカンの鎖長は、実質的に単一の形態（例えば、実質的に純粋な形態）または混合物の形態で、Ｃ１０に等しいかまたはそれより長い。
【００４０】
天然に存在するおよび／または操作された経路を使用して、より長い鎖長を有する炭素源（例えば、長さが１２個またはそれより長い炭素）を代謝させて、図５〜８の下の部分に示されるベータ酸化経路を使用してさらに代謝させることができる分子を産出することもできる。いくつかの実施態様において、図５〜８に示される経路におけるベータ酸化活性はまた、代謝および標的生成物の形成が強化されるように操作されてもよい（例えば、本明細書で説明されるように）。いくつかの実施態様において、ベータ酸化経路のアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性のうち１種が強化されるように操作され、いくつかの実施態様において、他のアシル−ＣｏＡオキシダーゼベータ酸化経路における活性が、活性が低減または除去されるように変更され、それによって望ましい鎖長の二酸または望ましい鎖長の分布を有する二酸の生産が最適化される。いくつかの実施態様において、アシル−ＣｏＡオキシダーゼは、酵素の基質特異性が変更されるように選択および／または操作される。いくつかの実施態様において、異種および／または操作されたアシル−ＣｏＡオキシダーゼの基質特異性は、約１２個の炭素から約１８個の炭素の炭素鎖長に対する基質特異性であり、いくつかの実施態様において、異種および／または操作されたアシル−ＣｏＡオキシダーゼは、長さが１２個未満の炭素の基質において活性を示さない。いくつかの実施態様において、望ましい鎖長への特異性を有する異種アシル−ＣｏＡオキシダーゼは、あらゆる好適な生物から単離できる。アシル−ＣｏＡオキシダーゼ酵素を包含するかまたはそのためのドナーとして使用できる生物の非限定的な例としては、酵母（例えば、カンジダ属、サッカロミセス属、デバリオマイセス属、メイエロザイマ属（Meyerozyma）、ロデロマイセス属（Lodderomyces）、シェフェルソマイセス属（Scheffersomyces）、クラビスポラ属、ヤロウイア属、ピチア属、クルイベロマイセス属、エレモテシウム属、チゴサッカロミセス属、ラチャンセア属（Lachancea）、ナカセオマイセス属（Nakaseomyces））、動物（例えば、ヒト属（Homo）、クマネズミ属（Rattus））、細菌（例えば、エシェリキア属、シュードモナス属、バチルス属）、または植物（例えば、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、ニクトタニア属（Nictotania）、クフェア属）が挙げられる。
【００４１】
いくつかの実施態様において、中間体または長い鎖長（例えば、約１０個の炭素から２２個の炭素）の炭素源出発原料（例えば、アルカン、脂肪酸、脂肪族アルコール、ジカルボン酸）は、ベータ酸化経路への侵入のためにアシル−ＣｏＡ誘導体に変換される。いくつかの実施態様において、アシル−ＣｏＡ誘導体は、アシル−ＣｏＡリガーゼ酵素の活性によって生成できる。いくつかの実施態様において、アシル−ＣｏＡ誘導体は、その後、天然または変更された基質特異性を有するアシル−ＣｏＡオキシダーゼ酵素（例えば、アシル−ＣｏＡオキシドレダクターゼおよび脂肪族アシル−補酵素Ａオキシダーゼとしても知られている）の活性によって酸化される。トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ誘導体である長鎖脂肪族アルコール、脂肪酸またはジカルボン酸はさらに、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼの活性によって３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換されてもよい。３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡは、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼの活性によって３−オキソアシル−ＣｏＡに変換できる。３−オキソアシル−ＣｏＡは、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ（例えば、また、ベータ−ケトチオラーゼおよびベータ−ケトチオラーゼとしても知られている）の活性によって、炭素２個分短くなったアシル−ＣｏＡ分子およびアセチル−ＣｏＡに変換されてもよい。いくつかの実施態様において、アシル−ＣｏＡ分子は、望ましい炭素鎖長（例えば、１０または１２個の炭素、それぞれセバシン酸またはドデカン二酸）が得られるまで、ベータ酸化により繰り返して短くされてもよい。短くされた脂肪酸をオメガ酸化を使用してさらにプロセシングして、ジカルボン酸（例えば、ドデカン二酸）を産出することもできる。
【００４２】
ベータ酸化活性
用語「ベータ酸化経路」は、本明細書で使用される場合、脂肪族アルコール、脂肪酸、またはジカルボン酸を代謝するのに利用される一連の酵素活性を指す。脂肪族アルコール、脂肪酸、またはジカルボン酸を代謝するのに利用される活性としては、これらに限定されないが、アシル−ＣｏＡリガーゼ活性、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性、アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ活性、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ活性、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性およびアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ活性が挙げられる。用語「ベータ酸化活性」は、脂肪族アルコール、脂肪酸またはジカルボン酸を代謝するのに利用されるベータ酸化経路における活性のいずれかを指す。
【００４３】
ベータ酸化−アシル−ＣｏＡリガーゼ
アシル−ＣｏＡリガーゼ酵素は、時には、宿主生物によってコードされており、操作された生物を生成するのに追加されてもよい。いくつかの実施態様において、宿主のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性は、アシル−ＣｏＡリガーゼ遺伝子のコピー数を増加させること、アシル−ＣｏＡリガーゼ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させること、または該遺伝子のコピー数を増加させて、該遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させることができ、それにより標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産が、経路を介した炭素フラックス増加のために増加する。いくつかの実施態様において、アシル−ＣｏＡリガーゼ遺伝子は、あらゆる好適な生物から単離できる。アシル−ＣｏＡリガーゼ酵素を包含するかまたはそのためのドナーとして使用できる生物の非限定的な例としては、カンジダ属、サッカロミセス属、またはヤロウイア属が挙げられる。
【００４４】
ベータ酸化−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ
エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ酵素は、脂肪族アシルＣｏＡ上の不飽和β−炭素へのヒドロキシル基およびプロトンの付加を触媒し、時には、宿主生物によってコードされており、時には、操作された生物を生成するのに追加されてもよい。いくつかの実施態様において、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性は、宿主または操作された生物中で変化しない。いくつかの実施態様において、宿主のエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性は、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子のコピー数を増加させること、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させること、または該遺伝子のコピー数を増加させて、該遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させることができ、それにより標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産は、経路を介した炭素フラックス増加のために増加する。いくつかの実施態様において、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子は、あらゆる好適な生物から単離できる。エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ酵素を包含するかまたはそのためのドナーとして使用できる生物の非限定的な例としては、カンジダ属、サッカロミセス属、またはヤロウイア属が挙げられる。
【００４５】
ベータ酸化−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ
３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素は、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼの活性によって作製された新たに形成されたヒドロキシル基から水素を除去することによって、３−ケトアシル−ＣｏＡの形成を触媒する。いくつかの実施態様において、この活性は、宿主生物によってコードされており、時には、操作された生物が生成するように追加または増加させることができる。いくつかの実施態様において、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ活性は、宿主または操作された生物中で変化しない。いくつかの実施態様において、宿主の３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性は、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を増加させること、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させること、または該遺伝子のコピー数を増加させて、該遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させることができ、それにより標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産が、経路を介した炭素フラックス増加のために増加する。いくつかの実施態様において、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子は、あらゆる好適な生物から単離できる。３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素を包含するかまたはそのためのドナーとして使用できる生物の非限定的な例としては、カンジダ属、サッカロミセス属、またはヤロウイア属が挙げられる。
【００４６】
ベータ酸化−アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ
アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ−ケトチオラーゼ）酵素は、ＣｏＡの別の分子チオール基の３−ケトアシル−ＣｏＡを切断することによって、炭素２個分短くなった脂肪族アシル−ＣｏＡの形成を触媒する。チオールがＣ−２とＣ−３との間に挿入されて、アセチルＣｏＡ分子とそれより炭素２個分短いアシルＣｏＡ分子が産出する。アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼは、時には、宿主生物によってコードされており、時には、操作された生物を生成するのに追加されてもよい。いくつかの実施態様において、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ活性は、宿主または操作された生物中で変化しない。いくつかの実施態様において、宿主のアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ活性は、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ遺伝子のコピー数を増加させること、またはアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させることができ、それにより標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産は、経路を介した炭素フラックス増加のために増加する。いくつかの実施態様において、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ遺伝子は、あらゆる好適な生物から単離できる。アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ酵素を包含するかまたはそのためのドナーとして使用できる生物の非限定的な例としては、カンジダ属、サッカロミセス属、またはヤロウイア属が挙げられる。
【００４７】
オメガ酸化活性
β酸化がブロックされた株における脂肪酸供給材料からの二酸生成物形成の生産性を向上させる標的は、多くの場合、ω酸化経路を介した炭素フラックスを向上させることができる標的である。いくつかの実施態様において、これらの標的は：１）ω酸化経路における律速段階を行う酵素（例えば、ＣＰＲおよびＣＹＰ４５０）、２）細胞への脂肪酸輸送を行う酵素（例えば、アシルＣｏＡシンセターゼ）、および３）ω酸化経路に必要な補因子を提供する酵素（例えば、Ｇ６ＰＤＨ）である。
【００４８】
用語「オメガ酸化活性」は、アルカン、脂肪族アルコール、脂肪酸、ジカルボン酸、または糖を代謝するのに利用されるオメガ酸化経路における活性のいずれかを指す。脂肪族アルコール、脂肪酸、またはジカルボン酸を代謝するのに利用される活性としては、これらに限定されないが、モノオキシゲナーゼ活性（例えば、シトクロムＰ４５０活性）、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性（例えば、シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性）、アルコールデヒドロゲナーゼ活性（例えば、脂肪のアルコールデヒドロゲナーゼ活性、または長鎖アルコールデヒドロゲナーゼ活性）、脂肪族アルコールオキシダーゼ活性、脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、およびチオエステラーゼ活性が挙げられる。
【００４９】
オメガ酸化−モノオキシゲナーゼ
シトクロムＰ４５０酵素（例えば、モノオキシゲナーゼ活性）は、多くの場合、１つの酸素原子を有機基質（ＲＨ）に挿入し、同時に他の酸素原子を水に還元することを触媒する。基質のオメガ炭素に近い酸素原子の挿入により、元の開始基質のアルコール誘導体が産出する（例えば、脂肪族アルコールが産出する）。シトクロムＰ４５０は、時には、宿主生物によってコードされており、時には、操作された生物を生成するのに追加されてもよい。
【００５０】
いくつかの実施態様において、モノオキシゲナーゼ活性は、宿主または操作された生物中で変化しない。いくつかの実施態様において、宿主のモノオキシゲナーゼ活性は、シトクロムＰ４５０遺伝子のコピー数を増加させること、またはシトクロムＰ４５０遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させることができ、それにより標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産は、経路を介した炭素フラックス増加のために増加する。いくつかの実施態様において、シトクロムＰ４５０遺伝子は、あらゆる好適な生物から単離できる。シトクロムＰ４５０酵素を包含するかまたはそのためのドナーとして使用できる生物の非限定的な例としては、酵母（例えば、カンジダ属、サッカロミセス属、デバリオマイセス属、メイエロザイマ属、ロデロマイセス属、シェフェルソマイセス属、クラビスポラ属、ヤロウイア属、ピチア属、クルイベロマイセス属、エレモテシウム属、チゴサッカロミセス属、ラチャンセア属、ナカセオマイセス属）、動物（例えば、ヒト属、クマネズミ属）、細菌（例えば、エシェリキア属、シュードモナス属、バチルス属）、または植物（例えば、シロイヌナズナ属、ニクトタニア属、クフェア属）が挙げられる。
【００５１】
ω酸化の律速工程は、脂肪酸のω炭素の水酸化であり、これは、２種の酵素、ＮＡＤＰＨシトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）およびシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（例えば、ＣＹＰ５２、ＥＣ１．１４．１４．１）で構成される酵素系によって実行される。Ｐ４５０レダクターゼは、異なる基質特異性を有するアイソザイムを生産する遺伝子ファミリーである。カンジダ属において、遺伝子ファミリーは、典型的にはＣＹＰ５２Ａ１２、ＣＹＰ５２Ａ１３、ＣＹＰ５２Ａ１４、ＣＹＰ５２Ａ１５、ＣＹＰ５２Ａ１６、ＣＹＰ５２Ａ１７、ＣＹＰ５２Ａ１８、ＣＹＰ５２Ａ１９、ＣＹＰ５２Ａ２０、およびＣＹＰ５２Ｄ２で構成される。Ｐ４５０酵素は、カンジダ種ではＡ１２〜Ａ２０、およびＤ２と名付けられたＣＹＰ遺伝子の遺伝子ファミリーによってコードされている。Ｐ４５０遺伝子ファミリーの各メンバーは、固有の基質鎖長特異性を提示する。操作されたカンジダ株を使用して、本発明者らは、異なる鎖長の脂肪酸供給材料での性能を向上させるＰ４５０アイソザイムを同定した。短鎖または中鎖脂肪酸の供給材料（Ｃ６〜Ｃ１４）の場合、ＣＹＰ５２Ａ１９の増幅は、他のアイソザイムよりも高く性能を向上させた。長鎖脂肪酸の供給材料（＞Ｃ１６）の場合、ＣＹＰ５２Ａ１４の増幅は、他のアイソザイムよりも高く性能を向上させた。いくつかの実施態様において、ω酸化経路を介する炭素フラックスを増加させるためには、ＣＰＲおよびＰ４５０酵素ファミリーの一方または両方の酵素活性が増幅される。いくつかの実施態様において、外因的に供給された脂肪酸供給材料の鎖長に適合する基質特異性を有するＰ４５０ファミリーメンバーが選択されるように留意する。いくつかの実施態様において、ω酸化経路を介する炭素フラックスを増加させるためには、ＣＹＰ５２Ａ１９の酵素活性が増幅される。いくつかの実施態様において、ω酸化経路を介する炭素フラックスを増加させるためには、ＣＹＰ５２Ａ１４の酵素活性が増幅される。
【００５２】
用語「モノオキシゲナーゼ活性」は、本明細書で使用される場合、Ｏ２のうち一方の酸素原子を有機基質（ＲＨ）に挿入して、他方の酸素原子を水に還元することを指す。いくつかの実施態様において、モノオキシゲナーゼ活性は、炭素６個の有機基質に酸素原子を取り入れることを指す。いくつかの実施態様において、モノオキシゲナーゼ活性は、ヘキサノアートから６−ヒドロキシヘキサン酸への変換を指す。モノオキシゲナーゼ活性は、あらゆる好適なポリペプチド、例えばいくつかの実施態様においてはシトクロムＰ４５０ポリペプチド（以降、「ＣＹＰ４５０」）によって提供できる。ＣＹＰ４５０活性を付与する核酸配列は、バチルス・メガテリウムなどの多数の源から得てもよいし、これらに限定されないが、カンジダ・トロピカリス、ヤロウイア・リポリチカ、アスペルギルス・ニダランス、およびアスペルギルス・パラスティカスなどの生物中で誘導されてもよい。ＣＹＰ４５０活性を有するポリペプチド（例えば、ＣＹＰ５２Ａ１２ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１３ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１４ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１５ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１６ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１７ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１８ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１９ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ２０ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ｄ２ポリヌクレオチド、および／またはＢＭ３ポリヌクレオチド）をコードするポリヌクレオチド配列を単離するのに利用されるオリゴヌクレオチド配列の例は、本明細書で示されている。いくつかの実施態様において、モノオキシゲナーゼ活性は、宿主微生物中で変更されず、いくつかの実施態様において、該活性は、宿主微生物と比べて、操作された微生物中で追加または増加される。いくつかの実施態様において、変更されたモノオキシゲナーゼ活性は、内因性の活性であり、いくつかの実施態様において、変更されたモノオキシゲナーゼ活性は、外因性の活性である。いくつかの実施態様において、外因性の活性は、モノオキシゲナーゼとモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性との両方を有する単一のポリペプチドである（例えば、Ｂ．メガテリウムのシトクロムＰ４５０：ＮＡＤＰＨＰ４５０レダクターゼ）。
【００５３】
シトクロムＰ４５０活性の存在、非存在または量は、当業界公知のあらゆる好適な方法によって検出できる。例えば、検出は、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ５２Ａファミリー）およびＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼを含有する反応をアッセイすることによって行うことができる（Appl Environ Microbiol 69：5983および5992を参照）。簡単に言えば、標準条件下で細胞を増殖させて、マイクロソーム生産のために回収し、ＣＹＰ活性を使用してＣＹＰ活性を検出する。トリス緩衝化スクロース（ｐＨ７．５の１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２５Ｍスクロース）中で細胞を溶解させることによりマイクロソームを調製する。まず２５，０００×ｇで、次いで１００，０００×ｇで分画遠心分離を行い、死細胞片、次いでマイクロソームをそれぞれペレット化する。マイクロソームのペレットを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡに再懸濁して、タンパク質をおよそ１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度にする。１ｍＬ中およそ０．３ｍｇのマイクロソーム、０．１ｍＭヘキサン酸ナトリウム、０．７ｍＭのＮＡＤＰＨ、ｐＨ７．５の５０ｍＭトリス−ＨＣｌを含有する反応混合物をＮＡＤＰＨの添加により反応開始させ、３７℃で１０分間インキュベートする。０．２５ｍＬの５ＭのＨＣｌの添加によって反応を止め、内部標準として０．２５ｍＬの２．５ｕｇ／ｍＬの１０−ヒドロキシデカン酸（３．３ｎｍｏｌ）を添加する。この混合物を、ＮａＣｌ飽和条件下で４．５ｍＬのジエチルエーテルで抽出する。有機相を新しいチューブに移し、乾燥するまで蒸発させる。１０ｍＭの３−ブロモメチル−７−メトキシ−１，４−ベンズオキサジン−２−オン（ＢｒＭＢ）を含有するアセトニトリル中で残留物を溶解させ、アセトニトリル中０．１ｍＬの１５ｍｇ／ｍＬの１８−クラウン−６をＫ２ＣＯ３で飽和させる。この溶液を４０℃で３０分間インキュベートし、その後０．０５ｍＬの２％酢酸を添加する。４３０ｎｍでの検出および３５５ｎｍでの励起を用いたＨＰＬＣにより、蛍光標識したオメガ−ヒドロキシ脂肪酸を検出する（Yamadaら、1991、AnalBiochem 199：132〜136）。場合によっては、特異的に誘導されたＣＹＰ遺伝子は、ノーザンブロッティングおよび／または定量ＲＴ−ＰＣＲによっても検出できる（Craftら、2003、AppEnvironMicro 69：5983〜5991）。
【００５４】
オメガ酸化−モノオキシゲナーゼレダクターゼ
シトクロムＰ４５０レダクターゼ（例えば、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性）は、電子をシトクロムＰ４５０に移動させることによってシトクロムＰ４５０中のヘムチオレート部分の還元を触媒する。シトクロムＰ４５０レダクターゼは、時には、宿主生物によってコードされており、時には、操作された生物を生成するのに追加されてもよい。いくつかの実施態様において、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性は、宿主または操作された生物中で変化しない。いくつかの実施態様において、宿主のモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性は、シトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子のコピー数を増加させること、またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させることができ、それにより標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産は、経路を介した炭素フラックス増加のために増加する。いくつかの実施態様において、シトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子は、あらゆる好適な生物から単離できる。シトクロムＰ４５０レダクターゼ酵素を包含するかまたはそのためのドナーとして使用できる生物の非限定的な例としては、酵母（例えば、カンジダ属、サッカロミセス属、デバリオマイセス属、メイエロザイマ属、ロデロマイセス属、シェフェルソマイセス属、クラビスポラ属、ヤロウイア属、ピチア属、クルイベロマイセス属、エレモテシウム属、チゴサッカロミセス属、ラチャンセア属、ナカセオマイセス属）、動物（例えば、ヒト属、クマネズミ属）、細菌（例えば、エシェリキア属、シュードモナス属、バチルス属）、または植物（例えば、シロイヌナズナ属、ニクトタニア属、クフェア属）が挙げられる。
【００５５】
レダクターゼ（ＣＰＲ）酵素（ＥＣ１．６．２．４）は、Ｐ４５０アイソザイムのいずれかと共に作用することができる。レダクターゼは、カンジダ種において、遺伝子ＣＰＲＡおよびＣＰＲＢによってコードされている。いくつかの実施態様において、ω酸化経路を介する炭素フラックスを増加させるために、ＣＰＲの酵素活性が増幅される。いくつかの実施態様において、ＣＰＲＡ遺伝子が増幅される。いくつかの実施態様においてＣＰＲＢ遺伝子が増幅される。
【００５６】
用語「モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性」は、本明細書で使用される場合、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、ＦＭＮ、またはＦＡＤから電子を電子移動連鎖を経由して移動させ、シトクロムＰ４５０のヘム第二鉄を第一鉄の状態に還元することを指す。また用語「モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性」は、本明細書で使用される場合、電子輸送系を介して第二の電子を移動させ、二酸素付加物を負電荷を有するペルオキソ基に還元することを指す場合もある。いくつかの実施態様において、モノオキシゲナーゼ活性は、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性を有するポリペプチドのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−結合ドメインにＮＡＤ（Ｐ）Ｈが結合できる共役二工程反応で、２電子供与体のＮＡＤ（Ｐ）ＨからシトクロムＰ４５０のヘムに電子を供与することができ（例えば、モノオキシゲナーゼ活性）、電子は、ＮＡＤ（Ｐ）ＨからＦＡＤおよびＦＭＮを介してモノオキシゲナーゼ活性のヘムに戻ることによって、活性なモノオキシゲナーゼ活性（例えば、シトクロムＰ４５０）を再生する。いくつかの実施態様において、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性は、あらゆる好適なポリペプチド、例えばシトクロムＰ４５０レダクターゼのポリペプチド（以降、「ＣＰＲ」）によって提供できる。ＣＰＲ活性を付与する核酸配列は、多数の源から得てもよいし、および／または多数の源において誘導されてもよい、このような源としては、これらに限定されないが、バチルス・メガテリウム、カンジダ・トロピカリス、ヤロウイア・リポリチカ、アスペルギルス・ニダランス、およびアスペルギルス・パラスティカスが挙げられる。ＣＰＲ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を単離するのに利用されるオリゴヌクレオチド配列の例は、本明細書で示されている。いくつかの実施態様において、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性は、宿主微生物中で変更されず、いくつかの実施態様において、該活性は、宿主微生物と比べて、操作された微生物中で追加または増加される。いくつかの実施態様において、変更されたモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性は、内因性の活性であり、いくつかの実施態様において、変更されたモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性は、外因性の活性である。いくつかの実施態様において、外因性の活性は、モノオキシゲナーゼとモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性との両方を有する単一のポリペプチドである（例えば、Ｂ．メガテリウムのシトクロムＰ４５０：ＮＡＤＰＨＰ４５０レダクターゼ）。
【００５７】
ＣＰＲ活性の存在、非存在または量は、当業界公知のあらゆる好適な方法によって検出できる。例えば、宿主微生物と比べてＣＰＲ活性をコードする遺伝子の数を増加させた操作された微生物は、定量的な核酸検出方法（例えば、サザンブロッティング、ＰＣＲ、プライマー伸長など、およびそれらの組み合わせ）を使用して検出できる。宿主微生物と比べてＣＰＲ活性をコードする遺伝子の発現を増加させた操作された微生物は、定量的な発現ベースの分析（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット分析、ノーザンブロット分析など、およびそれらの組み合わせ）を使用して検出できる。あるいは、酵素的なアッセイを使用してシトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を検出してもよく、この場合、酵素活性は、基質溶液の５５０ナノメートルにおける光学的吸光度を変更する（Masters, B.S.S.、Williams, C.H.、Kamin, H.（1967）Methods in Enzymology, X、565〜573）。
【００５８】
オメガ酸化−ヒドロキシ脂肪酸
オメガ−ヒドロキシ脂肪酸（ＨＦＡ）は、脂肪酸の末端メチル基の酸化における中間体である（図３１）。ＮＡＤＰＨから提供された分子酸素および電子を使用してシトクロムＰ４５０によって触媒されるオメガ酸化経路における第一の酸化工程中に、ＨＦＡが生産される可能性がある。ＮＡＤＰＨからの電子移動は、酵素のシトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）を使用して行うことができる。ＨＦＡがさらに酸化されて、オメガ−オキソ−脂肪酸が形成される可能性がある。このＨＦＡの酸化は、３つの異なる酵素的メカニズム：１）分子酸素、ＮＡＤＰＨ、およびＣＰＲを必要とするシトクロムＰ４５０による過酸化；２）ＡＤＨの特異性に応じてＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋のいずれかを必要とするアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）；または３）分子酸素を必要とし、反応副産物として過酸化水素を生産する脂肪族アルコールオキシダーゼ（ＦＡＯ）によって起こる可能性がある。ＦＡＯ酵素は、カンジダ属では、膜結合型であり、ペルオキシソームと結合している。オメガ−オキソ脂肪酸は、シトクロムＰ４５０による過酸化反応を介するか、または酵素アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤ）を介するかのいずれかによってジカルボン酸に酸化される可能性がある。
【００５９】
ＨＦＡは、供給材料として脂肪酸または脂肪酸メチルエステルを使用したベータ酸化がブロックされたカンジダ株でのジカルボン酸発酵において、少量だが経済的に有意な量で見出されることが多い。ＨＦＡは最終的な酸化生成物のおよそ５〜１０％しか構成しないが、ＨＦＡの存在は、最終的な脂肪族ジカルボン酸生成物の収量および純度を低減する可能性があり、望ましくない場合がある。
【００６０】
オメガ酸化−アルコールデヒドロゲナーゼ
アルコールデヒドロゲナーゼ（例えば、脂肪族アルコールデヒドロゲナーゼ、長鎖アルコールデヒドロゲナーゼ）は、細胞の小胞体中で、アルコールから水素を除去して、アルデヒドまたはケトンならびに水素原子およびＮＡＤＨを産出することを触媒する。より長い鎖のアルコール（例えば、ヘキサデカノール）のケースにおいて、水は、長鎖カルボキシレート、２つのＮＡＤＨおよびＨ２を産出するための脱水素で利用される。アルコールデヒドロゲナーゼは、時には、宿主生物によってコードされており、時には、操作された生物を生成するために追加されてもよい。いくつかの実施態様において、アルコールデヒドロゲナーゼ活性は、宿主または操作された生物中で変化しない。いくつかの実施態様において、宿主のアルコールデヒドロゲナーゼ活性は、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を増加させること、またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させることができ、それにより標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産は、経路を介した炭素フラックス増加のために増加する。いくつかの実施態様において、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、あらゆる好適な生物から単離できる。アルコールデヒドロゲナーゼ酵素を包含するかまたはそのためのドナーとして使用できる生物の非限定的な例としては、酵母（例えば、カンジダ属、サッカロミセス属、デバリオマイセス属、メイエロザイマ属、ロデロマイセス属、シェフェルソマイセス属、クラビスポラ属、ヤロウイア属、ピチア属、クルイベロマイセス属、エレモテシウム属、チゴサッカロミセス属、ラチャンセア属、ナカセオマイセス属）、動物（例えば、ヒト属、クマネズミ属）、細菌（例えば、エシェリキア属、シュードモナス属、バチルス属）、または植物（例えば、シロイヌナズナ属、ニクトタニア属、クフェア属）が挙げられる。脂肪族アルコールデヒドロゲナーゼの非限定的な例は、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２ａ、ＡＤＨ２ｂ、ＡＤＨ３、ＡＤＨ４、ＡＤＨ６、ＡＤＨ７、ＡＤＨ８、ＳＦＡ１、ＦＡＯ１、ＥＣ１．１．１．６６、ＥＣ１．１．１．１６４および／またはＥＣ１．１．１．１９２である。いくつかの実施態様において、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２ａ、ＡＤＨ２ｂ、ＡＤＨ３、ＡＤＨ４、ＡＤＨ６、ＡＤＨ７、ＡＤＨ８、ＳＦＡ１、ＦＡＯ１、ＥＣ１．１．１．６６、ＥＣ１．１．１．１６４および／またはＥＣ１．１．１．１９２の発現は、脂肪族ジカルボン酸産生生物において増加する。
【００６１】
オメガ酸化−脂肪族アルコールオキシダーゼ
脂肪族アルコールオキシダーゼ（例えば、長鎖アルコールオキシダーゼ、ＥＣ１．１．３．２０）酵素は、細胞のペルオキシソーム中で、長鎖アルコールの２つの分子に酸素を付加して、２つの長鎖アルデヒドと２分子の水とを産出することを触媒する。脂肪族アルコールオキシダーゼは、時には、宿主生物によってコードされており、時には、操作された生物を生成するのに追加されてもよい。いくつかの実施態様において、脂肪族アルコールオキシダーゼ活性は、宿主または操作された生物中で変化しない。いくつかの実施態様において、宿主の脂肪族アルコールオキシダーゼ活性は、脂肪族アルコールオキシダーゼ遺伝子のコピー数を増加させること、または脂肪族アルコールオキシダーゼ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させることができ、それにより標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産は、経路を介した炭素フラックス増加のために増加する。いくつかの実施態様において、脂肪族アルコールオキシダーゼ遺伝子は、あらゆる好適な生物から単離できる。脂肪族アルコールオキシダーゼの非限定的な例としては、ＦＡＯ１、ＦＡＯ２ａ、ＦＡＯ２ｂ、ＦＡＯ１３、ＦＡＯ１７、ＦＡＯ１８、ＦＡＯ２０およびＦＡＯ１ΔＰＴＳ１が挙げられる。脂肪族アルコールオキシダーゼ酵素を包含するかまたはそのためのドナーとして使用できる生物の非限定的な例としては、酵母（例えば、カンジダ属、サッカロミセス属、デバリオマイセス属、メイエロザイマ属、ロデロマイセス属、シェフェルソマイセス属、クラビスポラ属、ヤロウイア属、ピチア属、クルイベロマイセス属、エレモテシウム属、チゴサッカロミセス属、ラチャンセア属、ナカセオマイセス属）、動物（例えば、ヒト属、クマネズミ属）、細菌（例えば、エシェリキア属、シュードモナス属、バチルス属）、または植物（例えば、シロイヌナズナ属、ニクトタニア属、クフェア属）が挙げられる。
【００６２】
オメガ酸化−アルデヒドデヒドロゲナーゼ
脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、長鎖アルデヒドデヒドロゲナーゼ）酵素は、長鎖アルデヒドから長鎖ジカルボン酸、ＮＡＤＨおよびＨ２への酸化を触媒する。脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼは、時には、宿主生物によってコードされており、時には、操作された生物を生成するのに追加されてもよい。いくつかの実施態様において、脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、宿主または操作された生物中で変化しない。いくつかの実施態様において、宿主の脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を増加させること、または脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させることができ、それにより標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産は、経路を介した炭素フラックス増加のために増加する。いくつかの実施態様において、脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、あらゆる好適な生物から単離できる。脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素を包含するかまたはそのためのドナーとして使用できる生物の非限定的な例としては、酵母（例えば、カンジダ属、サッカロミセス属、デバリオマイセス属、メイエロザイマ属、ロデロマイセス属、シェフェルソマイセス属、クラビスポラ属、ヤロウイア属、ピチア属、クルイベロマイセス属、エレモテシウム属、チゴサッカロミセス属、ラチャンセア属、ナカセオマイセス属）、動物（例えば、ヒト属、クマネズミ属）、細菌（例えば、エシェリキア属、シュードモナス属、バチルス属）、または植物（例えば、シロイヌナズナ属、ニクトタニア属、クフェア属）が挙げられる。アルデヒドデヒドロゲナーゼの非限定的な例は、ＡＬＤ１、ＡＬＤ５、ＨＦＤ１、ＨＦＤ１ａ、ＥＣ１．２．１．３、ＥＣ１．２．１．４８および／またはＨＦＤ２である。いくつかの実施態様において、ＡＬＤ１、ＡＬＤ５、ＨＦＤ１および／またはＨＦＤ２の発現は、脂肪族ジカルボン酸産生生物において増加する。
【００６３】
オメガ酸化−チオエステラーゼ
チオエステラーゼ酵素（例えば、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ活性、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性）は、アシル−ＣｏＡまたはアシルキャリアータンパク質（例えば、エステル化脂肪酸）などの脂肪酸から補酵素Ａまたはアシルキャリアータンパク質（例えば、ＡＣＰ）を除去して、脂肪酸およびアルコールを産出することを触媒する。この反応は、水および補酵素Ａの存在下で起こるか、またはチオール基においてアシルキャリアータンパク質が特異的に除去される。チオエステラーゼは、時には、宿主生物によってコードされており、時には、操作された生物を生成するのに追加されてもよい。いくつかの実施態様において、チオエステラーゼ活性は、宿主または操作された生物中で変化しない。いくつかの実施態様において、宿主のチオエステラーゼ活性は、チオエステラーゼ遺伝子のコピー数を増加させること、またはチオエステラーゼ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させることができ、それにより標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産は、経路を介した炭素フラックス増加のために増加する。いくつかの実施態様において、チオエステラーゼ遺伝子は、あらゆる好適な生物から単離できる。チオエステラーゼ酵素を包含するかまたはそのためのドナーとして使用できる生物の非限定的な例としては、酵母（例えば、カンジダ属、サッカロミセス属、デバリオマイセス属、メイエロザイマ属、ロデロマイセス属、シェフェルソマイセス属、クラビスポラ属、ヤロウイア属、ピチア属、クルイベロマイセス属、エレモテシウム属、チゴサッカロミセス属、ラチャンセア属、ナカセオマイセス属）、動物（例えば、ヒト属、クマネズミ属）、細菌（例えば、エシェリキア属、シュードモナス属、バチルス属）、または植物（例えば、シロイヌナズナ属、ニクトタニア属、クフェア属）が挙げられる。
【００６４】
転写因子
ＭＩＧ１（「ＧＡＬ遺伝子発現の多コピー阻害剤（Multicopy Inhibitor of GAL Gene Expression）」）は、グルコースが存在する場合に発現が止まる遺伝子の転写が抑制されるように主として機能する転写因子である。このような遺伝子の例は、糖の利用に関与する酵素である。細胞においてグルコースが限定されると、ＭＩＧ１は、その標的化遺伝子の転写を抑制できなくなるようにリン酸化されて細胞核から除去されることが示されている。メカニズムに制限されることはないが、ＭＩＧ遺伝子の欠失は、二酸生産に必要なオメガ酸化および輸送に関与する遺伝子の活性を増加させる可能性があると考えられる。いくつかの場合において、二酸が生産されるように操作された微生物におけるＭＩＧ１対立遺伝子の一方または両方の欠失は、微生物によって生産されたオメガ−ヒドロキシ脂肪酸の量を減少させるのに役立つ可能性がある。
【００６５】
ＣＴＦ１は、推定のジンクフィンガー転写因子であり、アスペルギルス・ニダランスのＦａｒＡおよびＦａｒＢ転写因子に明らかに類似している。ＣＴＦ１は、オレイン酸の存在によって誘導される脂肪酸分解に必要な遺伝子を活性化すると考えられる。ＣＴＦ１の過剰発現は、オメガおよびベータ酸化に関与する遺伝子の発現を増加させ、それによって操作された微生物の生産性を増加させると予測されている。
【００６６】
ＵＴＲは、ＮＡＤおよびＮＡＤＨの両方をＮＡＤＰおよびＮＡＤＰＨにリン酸化するＮＡＤＨキナーゼである。ＵＴＲに関するＥＣの数値は、それぞれ２．７．１．２３．および．２．７．１．８６である。過量のＮＡＤまたはＮＡＤＨまたはＮＡＤＰまたはＮＡＤＰＨの欠乏がある状況で、一方を他方に変換することができる。オメガ酸化中、ＮＡＤＨは増加するが、ＮＡＤＰＨは減少する可能性がある。いくつかの実施態様において、ＮＡＳＨキナーゼの過剰発現は、二酸生産を増加させる。
【００６７】
操作された経路
図１〜８は、様々なアルカン、脂肪酸、脂肪族アルコールまたはそれらの組み合わせを使用してセバシン酸およびドデカン二酸を作製するための生物学的経路の実施態様を表す。供給材料として、あらゆる好適なアルカン、脂肪酸、脂肪族アルコール、植物ベースの油、種子ベースの油、石油以外から得られた石鹸原料または同種のもの（例えば、ドデカン、ラウリン酸メチル、ラウリン酸、１０個またはそれより多い炭素を有する炭素源（例えばセバシン酸生産の場合）または１２個またはそれより多くの炭素を有する炭素源（例えばドデカン二酸生産の場合））が、生物に使用できる。いくつかの実施態様において、天然に存在するおよび／または操作された経路を使用して、１２個より長い炭素を有する炭素源を代謝させて、図５〜８の下の部分に示されるベータ酸化経路を使用してさらに代謝させることができる分子を産出することもできる。いくつかの実施態様において、図１〜８に表された経路における活性は、本明細書で説明されるように、代謝および標的生成物の形成が強化されるように操作されてもよい。
【００６８】
いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くの代謝経路における１種またはそれより多くの活性は、操作された経路を介して炭素フラックスを増加させて、望ましい生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）が生産されるように操作されてもよい。操作された活性は、１種またはそれより多くの他の操作された経路で利用できる代謝中間体の生産を増加させて、未改変の宿主生物と比べて望ましい生成物の生産の増加が達成されるように選ぶことができる。また操作された活性は、望ましい中間体または最終産物の生産を低減させて、酵素の活性が減少されるように選ぶこともできる（例えば、逆の活性）。この「炭素フラックスの管理」は、適切な経路における適切な活性を操作することによりあらゆる選ばれた供給材料ごとに最適化できる。純粋なアルカン（例えば、単一の鎖長アルカン、ドデカンなど）、混合鎖長アルカン、長鎖アルカン、純粋な脂肪酸（例えば、単一の鎖長脂肪酸、カプリン酸など）および混合鎖長脂肪酸（図１〜８を参照）を使用した非限定的な例が本明細書で示される。いくつかの実施態様において、操作された経路を介した「炭素フラックス操作」プロセスは、あらゆる所定の供給材料に関して計算された最大理論収量に近いレベルおよび比率でジカルボン酸（例えばセバシン酸またはドデカン二酸）を生産する。用語「理論収量」または「最大理論収量」は、本明細書で使用される場合、反応が完了まで行った場合に形成される可能性がある化学的または生物学的反応の生成物の収量を指す。理論収量は、出発原料が完全に消費され、望ましくない副反応が起こらず、逆反応が起こらず、ワークアップ手法中の損失がない反応の化学量論および理想的な条件に基づく。
【００６９】
微生物は、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）経路における１種またはそれより多くの活性を包含するかまたはそれらを調節するように改変され操作されてもよい。用語「活性」は、本明細書で使用される場合、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）およびその前駆体などの様々な生成物が産出されるように微生物の天然のまたは操作された生物学的経路が機能化されることを指す。いくつかの実施態様において、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）を生産する活性は、あらゆる非哺乳動物源によって提供できる。このような源としては、これらに限定されないが、酵母および菌類などの真核生物、ならびに細菌などの原核生物が挙げられる。いくつかの実施態様において、本明細書で説明される経路における逆の活性を変更（例えば、破壊、低減）して、ベータ酸化経路、オメガ酸化経路、またはベータ酸化およびオメガ酸化経路を介した、標的生成物の生産（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）への炭素フラックスを増加させてもよい。いくつかの実施態様において、遺伝学的改変は、ベータ酸化経路における活性を破壊するか、またはベータ酸化経路における正反応を実行するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊し、それによりベータ酸化活性が検出不可能になる。用語「検出不可能」とは、本明細書で使用される場合、公知の（例えば、本明細書で説明された）検出方法またはアッセイを使用した場合、検出限界未満の分析物の量を指す。いくつかの実施態様において、遺伝学的改変は、ベータ酸化活性を部分的に低減させる。用語「ベータ酸化活性を部分的に低減させる」は、ここで使用される場合、操作された生物における活性のレベルが、宿主または開始時の生物で見出される活性のレベルよりも低くなることを指す。
【００７０】
いくつかの実施態様において、ベータ酸化活性は、選ばれた活性の触媒特異性が変更されるように改変してもよい。いくつかの実施態様において、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、炭素鎖長の選択および／または特異性に関して触媒ドメインを改変することによって変更されてもよい。いくつかの実施態様において、変更された触媒特異性は、宿主生物の天然に存在する変異体または突然変異体集団をスクリーニングすることによって見出すことができる。いくつかの実施態様において、変更された触媒性は、望ましい活性に関して選択および／またはスクリーニングすることと共に、様々な変異誘発技術によって生成できる。いくつかの実施態様において、変更された触媒活性は、混合および適合アプローチを使用してキメラアシル−ＣｏＡオキシダーゼを生成し、続いて望ましい触媒活性に関して選択および／またはスクリーニングすることによって生成できる。触媒活性が変更されたアシル−ＣｏＡオキシダーゼを生成するために行われる実験の例が、本明細書で説明される。
【００７１】
本明細書で示される操作された微生物内の活性は、以下の活性：６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性；６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性；シトクロムＰ４５０活性；シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性；脂肪族アルコールオキシダーゼ活性；アシル−ＣｏＡリガーゼ活性、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性；エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性、脂肪酸シンターゼ活性、リパーゼ活性、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ活性、アシルトランスフェラーゼ活性（ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ、リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ）およびチオエステラーゼ活性（例えば、アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ、ベータ−ケトチオラーゼおよび同種のもの）のうち１種またはそれより多く（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４種または全て）を包含していてもよい。いくつかの実施態様において、前述の活性のうち１種またはそれより多く（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種または全て）は、遺伝学的改変によって変更される。いくつかの実施態様において、前述の活性のうち１種またはそれより多く（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４種または全て）は、（ｉ）該活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを追加すること、および／または（ｉｉ）該活性を有するポリペプチドの発現を調節する調節配列を変更または追加することによって変更される。いくつかの実施態様において、前述の活性のうち１種またはそれより多くは、（ｉ）該活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドを破壊すること（例えば、挿入変異誘発）、（ｉｉ）該活性を有するポリペプチドの発現を調節する調節配列を欠失させること、および／または（ｉｉｉ）該活性を有するポリペプチドをコードするコード配列を欠失させること（例えば、ノックアウト変異誘発）によって変更される。
【００７２】
用語「オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性」は、本明細書で使用される場合、オメガヒドロキシル脂肪酸からオメガオキソ脂肪酸への変換を指す。オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性は、ポリペプチドによって提供できる。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、宿主微生物に導入された異種ヌクレオチド配列によってコードされている。いくつかの実施態様において、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有する内因性ポリペプチドが宿主微生物中で同定されたら、宿主微生物を遺伝子操作して、生産されるポリペプチドの量を増加させる（例えば、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結された異種プロモーターを導入する；そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数を増加させる（例えば、そのポリヌクレオチドを包含するプラスミドを導入することによって））。オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を付与する核酸配列は、アクチノバクター属（Actinobacter）、ノルカルディア属、シュードモナス属およびザントバクター属の細菌などの多数の源から得ることができる。オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列および該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の例は、本明細書で示されている。オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性の存在、非存在または量は、当業界公知のあらゆる好適な方法によって検出できる。いくつかの実施態様において、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性は、宿主微生物中で変更されず、いくつかの実施態様において、該活性は、宿主微生物と比べて、操作された微生物中で追加または増加される。
【００７３】
脂肪族ジカルボン酸産生酵母におけるＮＡＤＰＨ生産の増加
ω酸化経路は、第一の工程において補因子ＮＡＤＰＨならびに第二および第三の工程においてＮＡＤ＋を必要とする。ω酸化における第一の工程は律速段階であるため、細胞中でのこの工程を行う酵素活性の増幅には、反応のためにＮＡＤＰＨ補因子の十分な供給も必要であると予想される。ω酸化における第一の工程によって使用される可能性があるＮＡＤＰＨを生産する多数の細胞性反応がある。細胞においてＮＡＤＰＨ生産反応を行う酵素のうちいくつかは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、およびグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼである。これらの遺伝子のいずれかの活性レベルを増幅させることにより、ＮＡＤＰＨの細胞レベルを増加させて、増幅したω酸化活性にとって十分な補因子を提供できる。
【００７４】
ＮＡＤＰＨは、ω酸化と脂肪酸合成の両方に必要である。細胞中でＮＡＤＰＨの量を増加させる遺伝学的変化は、単一の脂肪酸および／または脂肪酸混合物のいずれかからの二酸生産において生産の押し上げをもたらす可能性がある。加えて、グルコース１つに対して得られたＮＡＤＰＨの数が増加する場合、コフィードとして必要なグルコースの量を低減させることができる。
【００７５】
ＺＷＦ１またはＺＷＦ２遺伝子の過剰発現を介してグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を増加させることによるＮＡＤＰＨ生産の増加
ＺＷＦ１およびＺＷＦ２遺伝子は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ、例えば、ＥＣ１．１．１．４９）の２種のアイソザイムをコードする。Ｓ．セレビシエにおいて、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）活性を増加させることにより、細胞質のＮＡＤＰＨが増加する。この技術は、キシリトール生産を増加させ、フルフラール耐性を増加させた株を作製するのに使用されている。いくつかの実施態様において、ＺＷＦ１のオープンリーディングフレームは、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６またはシェフェルソマイセス・スティピティスのいずれかから増幅されて、ＺＷＦ１プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、ＰＯＸ４プロモーター、または別の強い構成的または誘導性プロモーターの制御下に置かれると予想される。これらのカセットは、選択のためのＵＲＡ３栄養要求性マーカーを使用して、特異的またはランダムな統合のいずれかにとって好適な酵母株に形質転換されてもよい。Ｕｒａ＋株は、適正な統合またはコピー数に関してＰＣＲおよびｑＰＣＲで分析できる。グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性の増加は、活性アッセイによって確認できる。次いで株を望ましい脂肪族ジカルボン酸の生産に関して試験できる。いくつかの実施態様において、次いで株を、使用される株および供給材料に応じて、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸、スベリン酸またはアジピン酸の生産に関して試験できる。ＮＡＤＰＨ生産の増加に関する操作された酵母株の発酵性能は、親株と比較できる。
【００７６】
以下に、Ｇ６ＰＤＨに関するアミノ酸配列の２つの例を示す：
＞シェフェルソマイセス属＿スティピティス＿ＺＷＦ１−配列番号１５７
カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６＿ＺＷＦ１−配列番号７４。
【００７７】
ＰＧＩ１遺伝子の破壊を介して解糖を減少させてペントース経路を増加させることによるＮＡＤＰＨ生産の増加
いくつかの実施態様において、ＰＧＩ１の破壊カセットを構築する。例えばＰＧＩ１遺伝子の３００〜７００ｂｐの５’および３’非翻訳領域またはオープンリーディングフレームを増幅できる。２つの断片を一緒にライゲートしてそれらの間に固有の制限部位を残すことができ、そこにＵＲＡ３をクローニングできる。このＵＲＡ３カセットは、それぞれＵＲＡ３カセットの始点または終点のいずれかで複製されたターミネーターまたはプロモーターのいずれかを有していてもよい。直接的な反復により、ＵＲＡ３のループアウトが可能になる。次いで破壊カセットを好適な酵母株に形質転換させることにより、ウラシル欠乏プレートでの増殖により選択することができる。ＰＧＩ１の第一のコピーの破壊は、ＰＣＲで検証できる。ＵＲＡ３ループアウト事象は、５−フルオロオロチン酸（Fluorootic acid）含有プレート中での増殖により選択できる。ループアウト事象は、形質転換カセットを取り囲む領域の外側におけるプライマーを使用したＰＣＲによって検証できる。この株は、これまでに使用されたＰＧＩ１破壊カセットまたは第一の破壊に存在しない領域を標的とする新しい破壊カセットで形質転換されてもよい。Ｕｒａ＋株は、ＰＧＩ１遺伝子の完全な損失に関してスクリーニングできる。次いで株は、望ましい脂肪族ジカルボン酸の生産に関して試験できる。いくつかの実施態様において、次いで株は、使用される株および供給材料に応じて、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸、スベリン酸またはアジピン酸の生産に関して試験できる。ＮＡＤＰＨ生産の増加に関する操作された酵母株の発酵性能は、親株と比較できる。
【００７８】
ＰＧＩ１に関するアミノ酸配列の例を以下に示す：
カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６＿ＰＧＩ１−配列番号７８。
【００７９】
ＫｌＧＤＰ１の過剰発現によるＮＡＤＰＨ生産の増加
ＧＤＰ１（例えば、クルイベロマイセス・ラクティスのＧＤＰ１、すなわち、ＫＩＧＤＰ１）は、グリセルアルデヒド３−リン酸を、ＮＡＤＨの代わりにＮＡＤＰＨを生産する１，３ビスホスホグリセリン酸に変換するＮＡＤＰ＋依存性グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．９）をコードする。この活性は、グルコースからのＮＡＤＰＨの生産を増加させることができる。ＫｌＧＤＰ１のオープンリーディングを変異誘発させて、ＣＴＧコドンを別のロイシンをコードするコドンに変化させることができる。このオープンリーディングフレームは、ＴＥＦ１プロモーター、ＰＯＸ４プロモーターまたは別の強い構成的または誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。これらのカセットは、形質転換事象に関して選択するためのＵＲＡ３栄養要求性マーカーを使用した、標的化された統合またはランダムな統合によってあらゆる好適な酵母株に統合させることができる。Ｕｒａ＋株は、ＰＣＲおよびｑＰＣＲによって適正な統合またはコピー数の決定に関して分析できる。加えて、ＮＡＤＰ＋依存性グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性の増加は、活性アッセイによって確認できる。次いで株は、望ましい脂肪族ジカルボン酸の生産に関して試験できる。いくつかの実施態様において、次いで株は、使用される株および供給材料に応じて、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸、スベリン酸またはアジピン酸の生産に関して試験できる。ＮＡＤＰＨ生産の増加に関する操作された酵母株の発酵性能は、親株と比較できる。
【００８０】
ＧＤＰ１に関するアミノ酸配列の例を以下に示す：
＞ＧＤＰ１、Ｋｌ−配列番号７２。
【００８１】
ＩＤＰの過剰発現によるＮＡＤＰＨ生産の増加
ＩＤＰ１およびＩＤＰ２（例えば、カンジダ株２０３３６由来）は、イソクエン酸塩を、ＮＡＤＨの代わりにＮＡＤＰＨを生産するα−ケトグルタル酸塩に変換するイソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性（例えば、ＥＣ１．１．１．４２）を有するタンパク質をコードする。ＩＤＰ１タンパク質はミトコンドリアを標的とし、一方でＩＤＰ２タンパク質はペルオキシソームを標的としており、さらにω酸化が起こるＥＲ中に存在する可能性がある。ＩＤＰ２発現は、アルカンの存在により誘導されることが示されており、過剰発現は、ＮＡＤＰＨの利用可能性を増加させる可能性がある。
【００８２】
オープンリーディングフレームは、ＴＥＦ１プロモーター、ＰＯＸ４プロモーター、または別の強い構成的または誘導性プロモーター下に置くことができる。これらのカセットは、形質転換事象に関して選択するためのＵＲＡ３栄養要求性マーカーを使用した、標的化された統合またはランダムな統合のいずれかによってあらゆる好適な酵母株に統合させることができる。Ｕｒａ＋株は、ＰＣＲおよびｑＰＣＲによって適正な統合またはコピー数に関して検証できる。加えて、ＮＡＤＰ＋依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性の増加は、活性アッセイによって確認できる。次いで株は、望ましい脂肪族ジカルボン酸の生産に関して試験できる。いくつかの実施態様において、次いで株は、使用される株および供給材料に応じて、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸、スベリン酸またはアジピン酸の生産に関して試験できる。ＮＡＤＰＨ生産の増加に関する操作された酵母株の発酵性能は、親株と比較できる。
【００８３】
試験される別のＩＤＰは、ＩＤＰ３（例えばサッカロミセス・セレビジエ由来、すなわち、ＳｃＩｄｐ３）であってもよい。このタンパク質は、ペルオキシソームを標的とし、またＥＲ中にも存在する可能性がある。ＩＤＰ２に関して類似のアプローチをとる可能性があるが、ただし何らかのＣＴＧコドンが存在する場合、オープンリーディングフレームを変異誘発させる必要がある可能性がある。
【００８４】
ＩＤＰ２およびＩＤＰ３に関するアミノ酸配列の例を以下に示す：
カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６＿ＩＤＰ２−配列番号６７
＞サッカロミセス＿セレビジエ＿ＩＤＰ３−配列番号６９。
【００８５】
ＳｃＭＡＥ１およびＳｃＰＹＣ２の過剰発現によるＮＡＤＰＨ生産の増加
ＭＡＥは、リンゴ酸を、ＮＡＤＰＨを生産するピルビン酸塩に変換するリンゴ酸酵素（例えば、１．１．１．４０）をコードする（以下に示す通り）。
（Ｓ）−リンゴ酸塩＋ＮＡＤＰ＋→ピルビン酸塩＋ＣＯ２＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋。
【００８６】
サイトゾル中で、ピルビン酸塩をオキザロ酢酸に変換するＰＹＣ２（すなわち、ピルビン酸カルボキシラーゼ、例えば、６．４．１．１）の存在下で過剰発現させると、１つのＡＴＰとＮＡＤＨを消費して１つのＮＡＤＰＨを生産する分路が形成される。ＭＡＥのミトコンドリアへの転移を防ぐトランケーションされた型を発現させることによって、ＭＡＥ発現をサイトゾルに特定できる。
【００８７】
ＭＡＥ１（例えば、カンジダ株またはサッカロミセス・セレビジエ由来、すなわち、ＳｃＭＡＥ１）およびＰＹＣ２（例えば、サッカロミセス・セレビジエ由来、すなわち、ＳｃＰＹＣ２）のオープンリーディングフレームを増幅して変異誘発させて、いずれかのＣＴＧコドンを他のロイシンをコードするコドンに置き換えることができる。この遺伝子は、ＴＥＦ１プロモーター、ＰＯＸ４プロモーター、または別の強い構成的または誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。これらのカセットは、形質転換事象に関して選択するためのＵＲＡ３栄養要求性マーカーを使用した、標的化した統合またはランダムな統合によってあらゆる好適な酵母株に統合させることができる。Ｕｒａ＋株は、ＰＣＲおよびｑＰＣＲによって適正な統合またはコピー数に関して検証できる。次いで株は、望ましい脂肪族ジカルボン酸の生産に関して試験できる。いくつかの実施態様において、次いで株は、使用される株および供給材料に応じて、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸、スベリン酸またはアジピン酸の生産に関して試験できる。ＮＡＤＰＨ生産の増加に関する操作された酵母株の発酵性能は、親株と比較できる。
【００８８】
ＳｃＭＡＥ１およびＳｃＰＹＣ２に関するアミノ酸配列の例を以下に示す：
＞ＳｃＭＡＥ１−配列番号１９１
＞ＳｃＰＹＣ２−配列番号１０７
＞カンジダ株、トランケーションされたサイトゾルのＭＡＥ１−配列番号１４３。
【００８９】
コフィードとしてグリセロールを使用した場合のＮＡＤＰＨ生産の増加
アーケオグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）のｇｐｓＡは、補因子としてＮＡＤＰ＋を使用するグリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする。この酵素をコードする遺伝子を変異誘発させて、あらゆるＣＴＧコドンを他のロイシンをコードするコドンに変化させることができる。この遺伝子は、ＧＵＴ２に関する破壊カセットにループアウト可能なＵＲＡ３栄養要求性マーカーを有する構成的またはグリセロール誘導性プロモーターのいずれかの下に置くことができる。このカセットは、ＧＵＴ２の第一のコピーを破壊するあらゆる好適な酵母株に形質転換できる。ＵＲＡ３マーカーは再利用でき、結果得られた株は、統合カセットで再形質転換できる。破壊されたＧＵＴ２の両方のコピーを有する株が選択される可能性がある。この株は、グリセロール−３−リン酸からジヒドロキシアセトンへの変換においてＦＡＤＨの代わりにＮＡＤＰＨを生産すると予想される。次いで株は、望ましい脂肪族ジカルボン酸の生産に関して試験できる。いくつかの実施態様において、次いで株は、使用される株および供給材料に応じて、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸、スベリン酸またはアジピン酸の生産に関して試験できる。ＮＡＤＰＨ生産の増加に関する操作された酵母株の発酵性能は、親株と比較できる。
【００９０】
ＧＵＴ２およびアーケオグロブス・フルギダスのｇｐｓＡに関するアミノ酸配列の例を以下に示す：
＞カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６  ＧＵＴ２−配列番号１０９
＞ＡｆｇｐｓＡ−配列番号１１１。
【００９１】
アシル−ＣｏＡオキシダーゼ
用語「アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性」は、本明細書で使用される場合、長鎖脂肪族アシル−ＣｏＡから、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ脂肪族アルコールへの酸化を指す。いくつかの実施態様において、アシル−ＣｏＡ活性は、ペルオキシソーム由来である。いくつかの実施態様において、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、ＰＯＸポリペプチドによって実行されたペルオキシソームのアシル−ＣｏＡオキシダーゼ（ＰＯＸ）活性である。いくつかの実施態様において、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、宿主生物によってコードされており、時には、操作された生物が生成されるように変更されてもよい。アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、Ｃ．トロピカリスのＰＯＸ４およびＰＯＸ５遺伝子によってコードされている。いくつかの実施態様において、内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を、増加させることができる。いくつかの実施態様において、ＰＯＸ４ポリペプチドまたはＰＯＸ５ポリペプチドのアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、互いに独立して変更されてもよい（例えば、ＰＯＸ４単独の活性、ＰＯＸ５単独の活性を増加させる、一方を増加させて他方を破壊する、など）。いくつかの実施態様において、一方のＰＯＸ活性の活性を増加させつつ他方のＰＯＸ活性の活性を破壊することは、炭素鎖長に関するアシル−ＣｏＡオキシダーゼの特異的な活性を変更しつつ、ベータ酸化経路を介した全体的なフラックスを維持したりまたは増加させたりすることを可能にする。
【００９２】
いくつかの実施態様において、ＰＯＸ遺伝子のうち１つの宿主におけるアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、生産されるポリペプチドの量を遺伝学的に変更することによって（例えば、増加させることによって）（例えば、強く転写される、または構成的に発現される異種プロモーターを、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結して導入することによって）；該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数を増加させることによって（例えば、該ポリヌクレオチドを包含するプラスミドの導入、宿主ゲノムへの追加のコピーの統合によって））増加させることができる。いくつかの実施態様において、宿主のアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子の破壊（例えば、ノックアウト、挿入変異誘発など、およびそれらの組み合わせ）によって、またはアシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子を転写するプロモーター（例えば、プロモーターまたは５’ＵＴＲへのリプレッサー配列の追加）の活性を減少させることによって、減少させることができる。
【００９３】
上述したように、ＰＯＸ４、ＰＯＸ５、またはＰＯＸ４およびＰＯＸ５をコードするヌクレオチド配列の破壊は、時には、長さが異なる炭素鎖（例えば、長さが約１〜約６０個の炭素の脂肪族アルコール、脂肪酸、パラフィン、ジカルボン酸などの炭素鎖）の代謝に関して、経路の効率、特異性および／または特異的な活性を変更する可能性がある。いくつかの実施態様において、ＰＯＸ４、ＰＯＸ５、またはＰＯＸ４およびＰＯＸ５のヌクレオチド配列を選択マーカーをコードするＵＲＡ３ヌクレオチド配列で破壊して、宿主微生物に導入することにより、ＰＯＸ４、ＰＯＸ５またはＰＯＸ４およびＰＯＸ５活性が欠損した操作された生物が生成される。ＰＯＸ４およびＰＯＸ５をコードする核酸配列は、例えばカンジダ・トロピカリスなどの多数の源から得ることができる。ＰＯＸ４およびＰＯＸ５のアミノ酸配列およびポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の例は、本明細書で示されている。ＰＯＸ５遺伝子によってコードされた活性を増幅するために行われた実験は、実施例で説明される。
【００９４】
これも上述したように、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ（例えば、ＰＯＸ４、ＰＯＸ５）の触媒特異性は、様々な方法によって変更できる。アシル−ＣｏＡオキシダーゼの結合および／または触媒特異性を変更することは、鎖長認識が変更され、鎖長の触媒活性が変更された新規のアシル−ＣｏＡオキシダーゼの生成、および／または制限された、または特異的な鎖長特異性を有するアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性の生成に関して有利であることが証明される可能性があり、それによって異なる長さの炭素鎖の代謝または特定の選ばれた供給材料で見出される炭素鎖分布の代謝に関して経路の効率、特異性および／または特異的な活性におけるさらなる増加がもたらされる。いくつかの実施態様において、（ｉ）天然に存在する変異体集団をスクリーニングすること；（ｉｉ）内因性配列の変異誘発；（ｉｉｉ）望ましい特異性を有する異種配列を導入すること；（ｉｖ）１つのポリヌクレオチド源（例えば、遺伝子、生物）からのコード配列の部分および別の源からのコード配列の部分を有するキメラ配列を生成すること、ならびに／または（ｖ）内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼを再構築するための、望ましい特異性を有するアシル−ＣｏＡオキシダーゼからのヌクレオチド配列および３次元構造分析を使用したインテリジェントデザインによって、変更されたアシル−ＣｏＡオキシダーゼ配列が同定および／または生成され、それにより、新規の特異性酵素を生成することができる。いくつかの実施態様において、キメラアシル−ＣｏＡオキシダーゼ配列は、２種またはそれより多くの源からのポリヌクレオチド配列の寄与分を有する可能性がある。いくつかの実施態様において、キメラアシル−ＣｏＡオキシダーゼ配列は、内因性ポリヌクレオチドからのコード配列の部分と、異種ポリヌクレオチドからのコード配列の部分とを含む。新規の触媒性および結合特異性を有するアシル−ＣｏＡオキシダーゼを同定および／または生成するのに利用される方法が、実施例で説明される。
【００９５】
ＰＯＸ４および／またはＰＯＸ５活性の存在、非存在または量は、当業界公知のあらゆる好適な方法によって検出できる。例えば、Shimizuら、1979で説明されているような酵素的なアッセイを使用して、本明細書における実施例で説明されるようにしてなされる。その代わりに、天然および／または破壊されたＰＯＸ４およびＰＯＸ５配列を表す核酸配列はまた、核酸検出方法（例えば、ＰＣＲ、プライマー伸長、核酸ハイブリダイゼーションなど、およびそれらの組み合わせ）、または定量的な発現ベースの分析（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット分析、ノーザンブロット分析など、およびそれらの組み合わせ）を使用しても検出でき、この場合、操作された生物は、宿主生物と比較して、ＲＮＡおよび／またはポリペプチドレベルの減少を示す。
【００９６】
チオエステラーゼ
用語「チオエステラーゼ活性」は、本明細書で使用される場合、ヘキサノアートからの補酵素Ａの除去を指す。用語「チオエステラーゼ活性」はまた、本明細書で使用される場合、活性化された脂肪酸（例えば、脂肪族アシル−ＣｏＡ）からの補酵素Ａの除去も指す。チオエステラーゼ活性を有する酵素の非限定的な例としては、アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（例えば、ＥＣ３．１．２．２０；また、アシル補酵素Ａチオエステラーゼ、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ、アシル補酵素Ａヒドロラーゼ、チオエステラーゼＢ、チオエステラーゼＩＩ、レシチナーゼＢ、リソホスホリパーゼ（lysophopholipase）Ｌ１、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ１、およびアシル−ＣｏＡチオエステラーゼとも称される）が挙げられる。脂肪族アシル−ＣｏＡ分子から補酵素Ａを除去するチオエステラーゼは、以下の反応、
アシル−ＣｏＡ＋Ｈ２Ｏ−→ＣｏＡ＋カルボキシレート
を触媒し、式中、カルボキシレートは、多くの場合、脂肪酸である。次いで放出される補酵素Ａは、他の細胞活性に再使用できる。
【００９７】
チオエステラーゼ活性は、ポリペプチドによって提供できる。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、コピー数を増加させる内因性ヌクレオチド配列、異種および／もしくは内因性プロモーターに作動可能に連結される内因性ヌクレオチド配列、またはコピー数を増加させ、且つ異種および／または内因性プロモーターに機能するように連結される、内因性ヌクレオチド配列である。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、宿主微生物に導入された異種ヌクレオチド配列によってコードされている。チオエステラーゼ活性を付与する核酸配列は、クフェア・ランセオラタ、Ｃ．トロピカリス（例えば、配列番号３３および３５を参照）、および大腸菌（例えば、配列番号３７を参照）などの多数の源から得ることができる。チオエステラーゼポリヌクレオチド配列ドナーとして使用できる追加の生物が、本明細書で示されている。このようなポリペプチドの例としては、これらに限定されないが、クフェア・ランセオラタ由来のアシル−（ＡＣＰ）チオエステラーゼＢ型（配列番号１を参照）、Ｃ．トロピカリス由来のアシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（例えば、ＡＣＨＡおよびＡＣＨＢ、配列番号３４および３６を参照））、大腸菌由来のアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（例えば、ＴＥＳＡ、配列番号３８を参照）が挙げられる。チオエステラーゼのポリヌクレオチド配列の非限定的な例は、国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）（ＮＣＢＩ）のワールドワイドウェブのユニフォームリソースロケータ（ＵＲＬ）であるncbi.nlm.nih.govにおいて受託番号ＣＡＢ６０８３０で照会される。
【００９８】
チオエステラーゼ活性の存在、非存在または量は、当業界公知のあらゆる好適な方法によって検出できる。このような方法の例は、Chemistry and Biology 9：981〜988で説明されている。いくつかの実施態様において、チオエステラーゼ活性は、宿主微生物中で変更されず、いくつかの実施態様において、該活性は、宿主微生物と比べて、操作された微生物中で追加または増加される。いくつかの実施態様において、チオエステラーゼ活性を有するポリペプチドは、別のポリペプチド（例えば、ヘキサノアートシンターゼＡまたはヘキサノアートシンターゼＢポリペプチド）に連結される。チオエステラーゼ活性およびチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の非限定的な例は、実施例３３で示される。
【００９９】
オメガ脂肪酸の変換を低減させること−概説
用語「オメガヒドロキシル脂肪酸の変換を低減させる遺伝学的改変」は、本明細書で使用される場合、オメガヒドロキシル脂肪酸を別の生成物に変換する内因性活性を低減させる宿主微生物の遺伝子変更を指す。いくつかの実施態様において、内因性オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性が低減する。このような変更は、有利にはジカルボン酸の量を増加させることができ、さらにこのジカルボン酸を精製してプロセシングできる。
【０１００】
ベータ酸化を低減させること−概説
用語「ベータ酸化活性を低減させる遺伝学的改変」は、本明細書で使用される場合、カルボン酸含有有機分子のベータ炭素を酸化させる内因性活性を低減させる宿主微生物の遺伝子変更を指す。いくつかの実施態様において、有機分子は、炭素分子１０個または１２個であり、時には、分子の末端に配置された１個または２個のカルボン酸部分を含有する（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）。このような変更は、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）などの最終産物の収量を有利に増加させる可能性がある。
【０１０１】
用語「脂肪酸合成の増加をもたらす遺伝学的改変」はまた、本明細書で使用される場合、脂肪酸を脂肪族アシル−ＣｏＡ中間体に変換する内因性活性を低減させる宿主微生物の遺伝子変更も指す。いくつかの実施態様において、脂肪酸を脂肪族アシル−ＣｏＡ中間体に変換する内因性活性は低減される。いくつかの実施態様において、アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性は低減される。このような変更は、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）などの最終産物の収量を有利に増加させる可能性がある。
【０１０２】
アシル−ＣｏＡシンセターゼ
β酸化経路が完全にブロックされた生物は、脂肪酸または二酸をエネルギーに利用できない。これらのβ酸化がブロックされた生物において、生産された二酸の鎖長は、脂肪酸供給材料の鎖長と類似している。β酸化経路のブロックは、二酸生成物の収量損失のために一次経路を除去する。いくつかの実施態様において、他の生化学的経路で脂肪酸を利用する細胞の能力を変更する遺伝学的改変により、二酸生産の増加が起こる。いくつかの実施態様において、アシルＣｏＡシンセターゼをノックアウトまたは改変することによって脂肪酸活性化経路をブロックすることにより、二酸生産の増加が起こる。
【０１０３】
脂肪酸の脂肪族アシル−ＣｏＡチオエステルへの活性化は、アシル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）と呼ばれる酵素によって行われる。アシル−ＣｏＡシンセターゼは、酵素のリガーゼクラスのメンバーであり、以下の反応
ＡＴＰ＋脂肪酸＋ＣｏＡ⇔ＡＭＰ＋ピロリン酸塩＋脂肪族アシル−ＣｏＡ
を触媒する。
【０１０４】
多くの生物において、脂肪酸は、アシル−ＣｏＡシンセターゼ（例えば、ＡＣＳ１、ＡＣＳ２；ＥＣ６．２．１．３；また、アシル−ＣｏＡシンセターゼ、アシル−ＣｏＡリガーゼとも称される）の活性によって、脂肪族アシル−ＣｏＡ中間体に変換される可能性がある。酵母細胞は、異なる細胞位置を標的として、異なる基質鎖長特異性を有する可能性があるＡＣＳ酵素に関する複数の遺伝子を含有する。Ｓ．セレビシエは、ＦＡＡ１、ＦＡＡ２、ＦＡＡ３、ＦＡＡ４、ＦＡＴ１、およびＦＡＴ２と名付けられたＡＣＳ活性を有する６つの遺伝子を有する。これらの遺伝子によって生産された対応するタンパク質は、多くの場合、それぞれＦａａ１ｐ、Ｆａａ２ｐ、Ｆａａ３ｐ、Ｆａａ４ｐ、Ｆａｔ１ｐおよびＦａｔ２ｐと呼ばれる。Ｆａａ１ｐアイソザイムは、広範な物質の鎖長特異性を示し、細胞ＡＣＳ活性の９０％に相当し、サイトゾルおよびミクロソーム分画に局在している可能性がある。Ｆａａ２ｐアイソザイムは、ペルオキシソームを標的とし、広範な鎖長特異性を有する。Ｆａａ３ｐアイソザイムは、長鎖または超長鎖脂肪酸への基質特異性を有し、その細胞局在性は不明である。Ｆａａ４ｐは、広範な鎖長特異性を有し、タンパク質のミリストイル化において重要であることが示されている。Ｆａｔ１ｐは、脂肪酸輸送および脂肪酸活性化の両方に関する活性を有する、細胞膜に局在化した二機能性タンパク質である。Ｆａｔ２ｐは、中鎖脂肪酸輸送および活性化のためにペルオキシソーム膜を標的とする。
【０１０５】
アシル−ＣｏＡシンセターゼは、いくつかのカンジダ種においてそれぞれＡＣＳ１、ＦＡＴ１、ＡＣＳ２Ａ、ＡＣＳ２Ｂ、ＡＣＳ２Ｃ、およびＡＣＳ２Ｄによってコードされた６つのアイソフォームを有する（例えば、Ｓ．セレビシエの場合、ＦＡＡ１、ＦＡＴ１、およびＦＡＡ２に相同）。
【０１０６】
細胞膜およびサイトゾル分画を標的とした活性を用いたＡＣＳアイソザイムをコードする遺伝子の破壊は、外因的に供給された脂肪酸を、ω酸化経路への侵入のための基質である遊離脂肪酸の形態で残すことができる。これは、本質的に、正常な細胞での利用（エネルギー、トリアシルグリセリド、リン脂質）から、望ましい二酸生成物の生産へと外因的に供給された脂肪酸を再び方向付ける。いくつかの実施態様では、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６において、これらの遺伝子の標的は、ＡＣＳ１およびＦＡＴ１である。
【０１０７】
カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６＿ＡＣＳ１−配列番号４０
カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６＿ＦＡＴ１−配列番号１４８。
【０１０８】
ペルオキシソームを標的とする活性を用いたＡＣＳアイソザイムをコードする遺伝子の破壊は、ペルオキシソーム区画の内部に輸送されるあらゆる外因的に供給された脂肪酸の活性化を防ぐことができる。β酸化がブロックされた生物において、脂肪族アシル−ＣｏＡ分子は、β酸化に侵入できないが、これらはリン脂質合成のための基質になり得る。これらのＡＣＳアイソザイムをコードする遺伝子をノックアウトすることは、リン脂質合成経路の代わりにω酸化に遊離脂肪酸を再び方向付けることによって、二酸生成物の収量を増加させることができる。ペルオキシソームのＳ．セレビシエＦＡＡ２に対するカンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６相同体は、ＡＣＳ２Ａ、ＡＣＳ２Ｂ、ＡＣＳ２Ｃ、およびＡＣＳ２Ｄと名付けられ、ＡＣＳ２Ａ、ＡＣＳ２ＢおよびＡＣＳ２Ｃのタンパク質配列を以下に示す。
【０１０９】
カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６＿ＡＣＳ２Ａ−配列番号８０
カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６＿ＡＣＳ２Ｂ−配列番号１５８
カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６＿ＡＣＳ２Ｃ−配列番号１５９。
【０１１０】
脂肪酸および補酵素Ａは、多くの場合、様々な細胞プロセスへの侵入のために、脂肪酸の脂肪族アシル−ＣｏＡ中間体への活性化で利用される。理論に制限されるつもりはないが、様々な細胞プロセスに利用可能な脂肪族アシル−ＣｏＡ量の低減は、同じ宿主生物における他の操作された経路（例えば、オメガ酸化経路、ベータ酸化経路、オメガ酸化経路およびベータ酸化経路）によって、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）への変換に利用可能な脂肪酸量を増加させることができると考えられる。アシル−ＣｏＡシンセターゼは、あらゆる好適な手段によって不活性化できる。ＡＣＳ１活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を破壊するための使用に好適な遺伝子のノックアウト法が、本明細書で説明される。ＡＣＳ１のヌクレオチド配列は、実施例３３、配列番号３９で示される。ＡＣＳ１に関して欠失した突然変異体が生成するように設計された統合／破壊コンストラクトの例も実施例に示す。
【０１１１】
アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性の存在、非存在または量は、当業界公知のあらゆる好適な方法によって検出できる。好適な検出方法の非限定的な例としては、酵素的なアッセイ（例えば、Lagewegら「A Fluorimetric Assay for Acyl-CoA Synthetase Activity」、Analytical Biochemistry、197（2）：384〜388（1991））、ＰＣＲベースのアッセイ（例えば、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）、免疫学的な検出方法（例えば、アシル−ＣｏＡシンセターゼに特異的な抗体）など、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１１２】
用語「脂肪酸合成の増加をもたらす遺伝学的改変」はまた、本明細書で使用される場合、長鎖および超長鎖脂肪酸を活性化された脂肪族アシル−ＣｏＡ中間体に変換する内因性活性を低減させる宿主微生物の遺伝子変更も指す。いくつかの実施態様において、長鎖および超長鎖脂肪酸を活性化された脂肪族アシル−ＣｏＡ中間体に変換する内因性活性は低減される。いくつかの実施態様において、長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性は低減される。このような変更は、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）などの最終産物の収量を有利に増加させる可能性がある。
【０１１３】
長鎖脂肪酸（例えば、Ｃ１２〜Ｃ１８の鎖長）および超長鎖脂肪酸（例えば、Ｃ２０〜Ｃ２６）は、多くの場合、いくつかの生物において、長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼ（例えば、ＦＡＴ１；ＥＣ６．２．１．３；また、長鎖脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ、アシル−ＣｏＡシンセターゼとも称され；脂肪酸チオキナーゼ（長鎖）；アシル活性化酵素；パルミトイル−ＣｏＡシンターゼ；リグノセロイル−ＣｏＡシンターゼ；アラキドニル−ＣｏＡシンセターゼ；アシル補酵素Ａシンセターゼ；アシル−ＣｏＡリガーゼ；パルミトイル補酵素Ａシンセターゼ；チオキナーゼ；パルミトイル−ＣｏＡリガーゼ；アシル−補酵素Ａリガーゼ；脂肪酸ＣｏＡリガーゼ；長鎖脂肪族アシル補酵素Ａシンセターゼ；オレオイル−ＣｏＡシンセターゼ；ステアロイル−ＣｏＡシンセターゼ；長鎖脂肪族アシル−ＣｏＡシンセターゼ；長鎖アシルＣｏＡシンセターゼ；脂肪酸エロンガーゼ（ＥＬＯ）；ＬＣＦＡシンセターゼ；プリスタノイル−ＣｏＡシンセターゼ；ＡＣＳ３；長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼＩ；長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼＩＩ；脂肪族アシル−補酵素Ａシンセターゼ；長鎖アシル−補酵素Ａシンセターゼ；および酸：ＣｏＡリガーゼ（ＡＭＰ形成））のチオエステル化活性によって活性化および／または輸送される。また脂肪酸は、長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼの活性によって供給材料から宿主生物に輸送される可能性もある。
【０１１４】
長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼは、以下の反応、
ＡＴＰ＋長鎖カルボン酸＋ＣｏＡ＝ＡＭＰ＋二リン酸塩＋アシル−ＣｏＡ
を触媒し、式中、「アシル−ＣｏＡ」は、脂肪族アシル−ＣｏＡ分子を指す。本明細書で述べたように、脂肪酸の活性化は、多くの場合、様々な細胞プロセスへの脂肪酸の侵入に必要である（例えば、エネルギー源として、膜形成および／またはリモデリング成分として、炭素貯蔵分子として）。ＦＡＴ１の欠失突然変異体は、超長鎖脂肪酸を蓄積して、これらの脂肪酸の活性化の減少を示すことが示されている。理論に制限されるつもりはないが、長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性の低減は、脂肪族アシル−ＣｏＡ中間体に変換された長鎖脂肪酸の量を低減させることができると考えられ、それによって同じ宿主生物における他の操作された経路（例えば、オメガ酸化経路、ベータ酸化経路、オメガ酸化経路およびベータ酸化経路）によって、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）への変換に利用可能な脂肪酸量が増加する。長鎖−アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性は、あらゆる好適な手段によって低減または不活性化させることができる。ＦＡＴ１活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を破壊するのに好適な遺伝子のノックアウト法が、本明細書で説明される。ＦＡＴ１のヌクレオチド配列は、実施例３３、配列番号４１で示される。「ノックアウト」コンストラクト構築での使用に好適なＤＮＡベクターが本明細書で説明される。
【０１１５】
長鎖−アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性の存在、非存在または量は、当業界公知のあらゆる好適な方法によって検出できる。好適な検出方法の非限定的な例としては、酵素的なアッセイ、結合アッセイ（例えば、Erlandら、Analytical Biochemistry 295（1）：38〜44（2001））、ＰＣＲベースのアッセイ（例えば、ｑＰＣＲ、ＲＴＰＣＲ）、免疫学的な検出方法（例えば、長鎖−アシル−ＣｏＡシンセターゼに特異的な抗体）など、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１１６】
輸送活性を保持するためのＦａｔ１ｐの選択的な改変
細胞膜を通る遊離脂肪酸の輸送は、受動拡散またはタンパク質が介在する能動輸送によって起こる可能性がある。受動拡散のメカニズムは、脂肪酸供給材料の選択によって、または細胞外の環境を変化させることによって、ある程度操作できる（速度を増加させたり、または速度の減少させたりできる）。細胞への能動遊離脂肪酸の輸送の速度は、脂肪酸の移入に関与する輸送タンパク質を増幅することによって増加される可能性がある。このような酵素の１種は、Ｆａｔ１ｐ（例えば、Ｓ．セレビシエのＦａｔ１ｐ）であり、これは、脂肪酸輸送およびアシル−ＣｏＡシンセターゼ活性の両方を有する二機能性タンパク質である。
【０１１７】
アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性を有する酵素をノックアウトする利益は、上記で論じられている。ＡＣＳ活性をも増加させることなく細胞への脂肪酸輸送を増加させるためには、輸送能はあるがＡＣＳ能がないＦａｔ１ｐの突然変異体を構築してもよい。
【０１１８】
Ｆａｔ１ｐは、細胞膜を通じて遊離脂肪酸を輸送し、細胞膜の内側で脂肪酸をアシル−ＣｏＡチオエステルに「活性化する」ことができる。脂肪酸は、アシル−ＣｏＡチオエステルに変換されると、以下の生化学的経路：１）ペルオキシソームのベータ酸化、２）トリアシルグリセリド合成、３）コレステリルエステル合成または４）リン脂質合成に入ることができる。これらの脂肪族アシル−ＣｏＡにとって起こり得る結果の全ては、移入した脂肪酸からジカルボン酸への代謝を防いで、脂肪酸供給材料からの低い収量のジカルボン酸生産をもたらす可能性がある。それゆえに、いくつかの実施態様において、脂肪酸輸送活性（例えば、細胞膜を通って脂肪酸を輸送する能力）を保持するが、チオエステラーゼ活性（例えば、脂肪酸をアシル−ＣｏＡチオエステルに活性化する能力）を欠いた、突然変異体Ｆａｔ１ｐ酵素（すなわち、Ｆａｔ１ｐ−ｍｕｔ）を有する株が開発中である。Ｆａｔ１ｐ突然変異体は、Ｓ．セレビシエに関する文献で説明されている。このような突然変異体のうちいくつかは、文献において公知であり、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６のＦａｔ１ｐ酵素における突然変異Ｓ２４４ＡまたはＤ４９５Ａに相当する。
【０１１９】
ペルオキシソームへの輸送のノックアウト
ペルオキシソームへの脂肪酸の輸送メカニズムは、脂肪酸の鎖長に基き異なっている。Ｃ１６〜Ｃ１８の長鎖脂肪酸は、遊離酸形態ではペルオキシソーム膜を通って拡散できないが、その代わりに、Ｐｘａ１ｐ／Ｐｘａ２ｐヘテロ二量体（例えばＥＣ３．６．３．４７）によって触媒されるＡＴＰ依存性プロセスでは脂肪族アシル−ＣｏＡエステルとして輸送される。Ｃ６〜Ｃ１４の短鎖および中鎖脂肪酸は、遊離酸形態でペルオキシソーム膜を通って拡散できると考えられるが、これもまた、Ｐｅｘ１１ｐによる、またはまだ知られていない輸送体として他の方法によるペルオキシソームのマトリックスへの輸送の助けにより拡散される可能性がある。いくつかの実施態様において、これらの輸送タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることは、この場合にも、外因的に供給された脂肪酸を、ペルオキシソームにおける生化学的利用からω酸化経路に再び方向付けることによって、二酸収量を向上させると予想される。
【０１２０】
カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６由来のＰｘａ１ｐ、Ｐｘａ２ｐおよびＰｅｘ１１ｐの配列の例を以下に示す。
【０１２１】
カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６＿ＰＸＡ１−配列番号９２
カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６＿ＰＸＡ２−配列番号９４
カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６＿ＰＥＸ１１−配列番号９６。
【０１２２】
アシル−ＣｏＡステロールアシルトランスフェラーゼ
用語「脂肪酸合成の増加をもたらす遺伝学的改変」はまた、本明細書で使用される場合、脂肪酸をコレステロールエステルに変換する内因性活性を低減させる宿主微生物の遺伝子変更も指す。いくつかの実施態様において、脂肪酸をコレステロールエステルに変換する内因性活性は低減される。いくつかの実施態様において、アシル−ＣｏＡステロールアシルトランスフェラーゼ活性は低減される。このような変更は、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）などの最終産物の収量を有利に増加させる可能性がある。
【０１２３】
脂肪酸は、多くの生物において、アシル−ＣｏＡステロールアシルトランスフェラーゼ（例えば、ＡＲＥ１、ＡＲＥ２、ＥＣ２．３．１．２６；また、ステロールＯ−アシルトランスフェラーゼとも称され；コレステロールアシルトランスフェラーゼ；ステロール−エステルシンターゼ；ステロール−エステルシンセターゼ；ステロール−エステルシンターゼ；アシル補酵素Ａ−コレステロール−Ｏ−アシルトランスフェラーゼ；アシル−ＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ；ＡＣＡＴ；アシル補酵素Ａ：コレステロールＯ−アシルトランスフェラーゼ；コレステロールエステルシンターゼ；コレステロールエステルシンセターゼ；およびコレステリルエステルシンセターゼ）の活性によってコレステロール−エステルに変換される可能性がある。いかなる理論にも限定されるつもりはないが、コレステロールのエステル化は、細胞膜への取り込みから脂質の貯蔵形態に脂肪酸を方向付けることに関与する可能性がある。アシル−ＣｏＡステロールアシルトランスフェラーゼは、以下の反応
アシル−ＣｏＡ＋コレステロール＝ＣｏＡ＋コレステロールエステル
を触媒する。
【０１２４】
コレステロールのエステル化は、細胞の膜脂質中でのその溶解性を制限し、したがって細胞質内の脂肪滴（例えば、炭素貯蔵分子の形態）におけるコレステロールエステルの蓄積を促進すると考えられる。それゆえに、いかなる理論にも限定されるつもりはないが、コレステロールのエステル化は、脂質貯蔵分子の蓄積を引き起こす可能性があり、アシル−ＣｏＡステロールアシルトランスフェラーゼの活性の破壊は、同じ宿主生物における他の操作された経路（例えば、オメガ酸化経路、ベータ酸化経路、オメガ酸化経路およびベータ酸化経路）によって、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）に変換できるアシル−ＣｏＡレベルの増加を引き起こす可能性がある。アシル−ＣｏＡステロールアシルトランスフェラーゼは、あらゆる好適な手段によって不活性化できる。ＡＲＥ１活性、ＡＲＥ２活性またはＡＲＥ１活性およびＡＲＥ２活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を破壊するのに好適な遺伝子のノックアウト法が、本明細書で説明される。ＡＲＥ１およびＡＲＥ２のヌクレオチド配列は、実施例３３、配列番号４３および４５で示される。「ノックアウト」コンストラクト構築での使用に好適なＤＮＡベクターが本明細書で説明される。
【０１２５】
アシル−ＣｏＡステロールアシルトランスフェラーゼ活性の存在、非存在または量は、当業界公知のあらゆる好適な方法によって検出できる。好適な検出方法の非限定的な例としては、酵素的なアッセイ（例えば、Chenら、Plant Physiology 145：974〜984 （2007））、結合アッセイ、ＰＣＲベースのアッセイ（例えば、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）、免疫学的な検出方法（例えば、長鎖−アシル−ＣｏＡシンセターゼに特異的な抗体）など、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１２６】
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼおよびアシルトランスフェラーゼ
用語「脂肪酸合成の増加をもたらす遺伝学的改変」はまた、本明細書で使用される場合、ジアシルグリセロールのエステル化を触媒する内因性活性を低減させる宿主微生物の遺伝子変更（例えば、アシル基をジアシルグリセロールに付加して、トリアシルグリセロールを形成すること）も指す。いくつかの実施態様において、ジアシルグリセロールをトリアシルグリセロールに変換する内因性活性は低減される。いくつかの実施態様において、アシルトランスフェラーゼ活性は低減される。いくつかの実施態様においてジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性は低減される。いくつかの実施態様において、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（例えば、ＤＧＡ１、ＥＣ２．３．１．２０）活性およびアシルトランスフェラーゼ（例えば、ＬＲＯ１）活性は低減される。このような変更は、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）などの最終産物の収量を有利に増加させる可能性がある。
【０１２７】
ジアシルグリセロールは、多くの生物において、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（例えば、ＤＧＡ１；ＥＣ２．３．１．２０；また、ジグリセリドアシルトランスフェラーゼとも称され；１，２−ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ；ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ；ジグリセリドＯ−アシルトランスフェラーゼ；パルミトイル−ＣｏＡ−ｓｎ−１，２−ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ；アシル−ＣｏＡ：１，２−ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼおよびアシル−ＣｏＡ：１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ）の活性によってトリアシルグリセロールに変換される可能性がある。ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼは、以下の反応
アシル−ＣｏＡ＋１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール＝ＣｏＡ＋トリアシルグリセロール
を触媒し、一般的には、トリグリセリド合成において最後の唯一行われる工程とみなされる。
【０１２８】
酵母におけるＤＧＡ１遺伝子の生成物は通常、脂質粒子に局在化される。ＤＧＡ１に関して説明したジアシルグリセロールのエステル化活性に加えて、多くの生物はさらに、他のアシルトランスフェラーゼ活性の活性によってトリグリセリドも生成でき、この他のアシルトランスフェラーゼ活性の非限定的な例としては、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性（例えば、ＬＲＯ１；ＥＣ２．３．１．４３；また、ホスファチジルコリン−ステロールＯ−アシルトランスフェラーゼ活性とも称され；レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性；リン脂質−コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性；ＬＣＡＴ（レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ）活性；レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性；ならびにリゾレシチンアシルトランスフェラーゼ活性）およびリン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（例えば、ＥＣ２．３．１．１５８；また、ＰＤＡＴ活性およびリン脂質とも称される：１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ活性）が挙げられる。ＥＣ２．３．１．４３およびＥＣ２．３．１．５８ファミリーのアシルトランスフェラーゼは、一般的な反応
リン脂質＋１，２−ジアシルグリセロール＝リゾリン脂質＋トリアシルグリセロール
を触媒する。
【０１２９】
トリアシルグリセリドは、多くの場合、炭素（例えば、脂肪酸または脂質）貯蔵分子として利用される。いかなる理論にも限定されるつもりはないが、アシルトランスフェラーゼの活性を低減させることは、ジアシルグリセロールからトリアシルグリセロールへの変換を低減させる可能性があり、それにより、同じ宿主生物における他の操作された経路（例えば、オメガ酸化経路、ベータ酸化経路、オメガ酸化経路およびベータ酸化経路）によって脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）に変換できる追加の遺伝学的改変（例えば、グリセロール主鎖から脂肪酸をさらに除去するためのリパーゼ）と共に、脂肪酸蓄積の増加が引き起こされる可能性があると考えられる。アシルトランスフェラーゼは、あらゆる好適な手段によって不活性化できる。ＤＧＡ１活性、ＬＲＯ１活性またはＤＧＡ１活性およびＬＲＯ１活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を破壊するのに好適な遺伝子のノックアウト法が、本明細書で説明される。ＤＧＡ１のヌクレオチド配列は、実施例３３、配列番号４７で示され、ＬＲＯ１のヌクレオチド配列は、実施例３３、配列番号４９で示される。「ノックアウト」コンストラクト構築での使用に好適なＤＮＡベクターが本明細書で説明される。
【０１３０】
Ｓ．セレビシエにおける遺伝子ＡＲＥ１およびＡＲＥ２も、トリアシルグリセリド合成に関与する。これらの酵素をコードする遺伝子をノックアウトすることにより、外因的に供給された脂肪酸をω酸化に再び方向付けることができる。
【０１３１】
アシルトランスフェラーゼ活性の存在、非存在または量は、当業界公知のあらゆる好適な方法によって検出できる。好適な検出方法の非限定的な例としては、酵素的なアッセイ（例えば、Geelen、Analytical Biochemistry 322（2）：264〜268（2003）、Dahlqvistら、PNAS 97（12）：6487〜6492（2000））、結合アッセイ、ＰＣＲベースのアッセイ（例えば、ｑＰＣＲ、ＲＴＰＣＲ）、免疫学的な検出方法（例えば、ＤＧＡ１またはＬＲＯ１アシルトランスフェラーゼに特異的な抗体）など、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１３２】
カルニチンアセチルトランスフェラーゼ
カルニチンアセチルトランスフェラーゼ（すなわち、Ｃａｔ２、Ｃａｔ２ｐ）は、ペルオキシソーム区画とミトコンドリア区画の両方を標的とする酵素である。カルニチンアセチルトランスフェラーゼは、以下に示すようなＣｏＡ基からカルニチンへのアセチル基の移行（または位置に応じてその逆）を触媒する；
アセチル−ＣｏＡ＋カルニチン→アセチルカルニチン＋ＣｏＡ。
【０１３３】
アセチル−カルニチン分子は、ペルオキシソーム膜およびミトコンドリア膜を通って輸送されるが、それに対してアセチル−ＣｏＡ分子は輸送されない。それゆえに、Ｃａｔ２（例えば、２．３．１．７）の作用は、アセチル基がペルオキシソームから離れるための３つの可能性のある経路のうち１つを提供する。ベータ酸化によって生産されたアセチル−ＣｏＡは、アセチル−カルニチンに変換されて、ＴＣＡサイクルに入るためにミトコンドリアに輸送される可能性がある。いくつかの実施態様において、ペルオキシソームからのアセチル−ＣｏＡの流出を遅くするために、Ｃａｔ２の活性は低減または除去される。いくつかの実施態様において、ベータ酸化から誘導されたアジピン酸中間体の下流にボトルネックを提供することは、アジピン酸収量を向上させるための方策である。
【０１３４】
カルニチンＯ−アシルトランスフェラーゼ
カルニチンＯ−アシルトランスフェラーゼ（すなわち、ＣＲＯＴ、例えば、２．３．１．１３７）は、以下に示すようにＣｏＡ基からカルニチン基へアシル鎖を移行させることができるペルオキシソーム酵素である；
アシル−ＣｏＡ＋カルニチン→アシルカルニチン＋ＣｏＡ。
【０１３５】
次いで生産されたアシル−カルニチンは、細胞のどこか他所で使用するためにペルオキシソームから輸送される場合もある。この酵素は、様々な鎖長のアシル鎖に作用し得るが、短鎖（Ｃ６〜Ｃ８）に対して最も活性である。二酸がベータ酸化から時期尚早に引き出されて他の細胞区画に送られると、収量の損失をもたらす可能性がある。
【０１３６】
ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ
ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ酵素（すなわち、ＵＧＴＡ１、ＵｇｔＡ１ｐ、例えば、２．４．１．−）は、ソホロ脂質合成における第一の反応を行う。ソホロ脂質は、疎水性環境に晒されたときに数種の酵母によって生産されるバイオサーファクタント分子のクラスの一つである。これらは、１６または１８個の炭素のω−または（ω−１）−ヒドロキシル化脂肪酸にそのアノマー炭素を介して付着したソホロース（２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコピラノース）で構成される。最もよく知られているソホロ脂質産生酵母は、カンジダ・ボンビコラ（Candida bombicola）である。この酵母におけるソホロ脂質産生経路は、ヒドロキシ−脂肪酸への２つのグルコース分子の段階的な移行を介して進行する。第一の工程はＵｇｔＡ１ｐによって実行され、第二の工程はＵｇｔＢ１ｐによって実行される（Saerens KMJ、Roelants SLKW、VanBogaert INA、Soetaert W（2011）FEMS Yeast Res 11：123〜132；Saerens KMJ、Zhang J、Saey L、VanBogaert INA、Soetaert W（2011）Yeast 28：279〜292）。ＵＤＰ−グルコースからヒドロキシル−脂肪酸のω−末端へのグルコースの段階的な移行は、ω酸化の第一の工程で生産されたω−ヒドロキシ脂肪酸が二酸生産ではなくソホロ脂質生産に引き込まれる場合に、収量の損失をもたらす可能性がある。
【０１３７】
エロンガーゼ
「エロンガーゼ」は、（ｉ）脂肪族アシル−ＣｏＡ分子の鎖長を伸長させる、例えばＣ−１２〜Ｃ−１６脂肪族アシル−ＣｏＡ分子をＣ１６〜Ｃ１８脂肪酸に変換する；（ｉｉ）パルミトイル−ＣｏＡおよびステアロイル−ＣｏＡを最大約２２個の炭素の脂肪酸に延長させる；または（ｉｉｉ）Ｃ−１８−ＣｏＡなどのより短い鎖のＣｏＡプライマーからより長い鎖の炭素の脂肪酸を合成する能力を有する生物における酵素を意味する。いくつかの実施態様において、脂肪族ジカルボン酸産生酵母において、エロンガーゼの発現は、低減またはノックアウトされる。
【０１３８】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド
核酸（例えば、本明細書では核酸試薬、目的とする核酸、標的ヌクレオチド配列、対象の核酸配列または核酸の関心領域とも称される）は、あらゆる源または組成物由来ものもでもよく、例えばＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ＲＮＡｉ、ｔＲＮＡまたはｍＲＮＡであり、これらはあらゆる形態であってもよい（例えば、直鎖状、環状、スーパーコイル、一本鎖、二本鎖および同種のもの）。核酸はまた、ＤＮＡまたはＲＮＡ類似体（例えば、塩基類似体、糖類似体および／または非天然の主鎖ならびに同種のものを含有する）を含む場合もある。用語「核酸」は、特定の長さのポリヌクレオチド鎖を指したり、またはそのようなものと推定されることはなく、したがってポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドも定義に包含されることが理解される。デオキシリボヌクレオチドは、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンおよびデオキシチミジンを包含する。ＲＮＡの場合、ウラシル塩基は、ウリジンである。
【０１３９】
核酸は、時には、プラスミド、ファージ、自律複製配列（ＡＲＳ）、動原体、人工染色体、酵母人工染色体（例えば、ＹＡＣ）、または宿主細胞中で複製可能な、もしくは複製された他の核酸である。いくつかの実施態様において、核酸は、ライブラリー由来のものもでもよいし、または対象の生物からの酵素消化、剪断、または超音波破砕したゲノムＤＮＡ（例えば、フラグメント化した）から得ることもできる。いくつかの実施態様において、フラグメント化または切断処理した核酸は、約５〜約１０，０００塩基対、約１００〜約１，０００塩基対、約１００〜約５００塩基対、または約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００もしくは１００００塩基対の、名目上の長さ、標準的な長さ、または平均の長さを有していてもよい。フラグメントは、当業界におけるあらゆる好適な方法によって生成でき、核酸フラグメントの標準的な長さ、平均の長さまたは名目上の長さは、通常の技術を有するものによって適切なフラグメント生成手法を選択することによって制御できる。いくつかの実施態様において、フラグメント化したＤＮＡをサイズ選択して、特定のサイズ範囲の核酸フラグメントを得ることができる。
【０１４０】
核酸は、通常の技術を有するものに公知の様々な方法によってフラグメント化でき、このような方法としては、これらに限定されないが、物理的、化学的および酵素的プロセスが挙げられる。このようなプロセスの例は、米国公開特許公報第２００５０１１２５９０号（２００５年５月２６日に公開、Van Den Boomらによる、タイトル「配列バリエーションの検出および発見のためのフラグメント化ベースの方法およびシステム（Fragmentation-based methods and systems for sequence variation detection and discovery）」）で説明されている。非特異的に切断されたフラグメントまたは特異的に切断されたフラグメントを生成するために、通常の技術を有するものによって所定のプロセスを選択できる。非特異的に切断されたフラグメントのサンプル核酸を生成できるプロセスの例としては、これらに限定されないが、サンプル核酸を、核酸を剪断力に晒す器具と接触させること（例えば、核酸をシリンジの針に通過させること；フレンチプレスの使用）；サンプル核酸に放射線照射すること（例えば、ガンマ、Ｘ線、ＵＶ放射線照射；フラグメントサイズは、放射線照射の強度によって制御できる）；核酸を水中で煮沸すること（例えば、約５００塩基対のフラグメントが得られる）、ならびに核酸を酸および塩基加水分解プロセスに晒すことが挙げられる。
【０１４１】
核酸は、核酸を１種またはそれより多くの特異的な切断剤と接触させることによって特異的に切断されてもよい。用語「特異的な切断剤」は、本明細書で使用される場合、１つまたはそれより多くの特異的な部位で核酸を切断可能な物質、時には化学的な物質、または酵素を指す。特異的な切断剤は、多くの場合、特定の部位における特定のヌクレオチド配列に従って特異的に切断すると予想される。酵素的に特異的な切断剤の例としては、これらに限定されないが、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＤＮアーゼ（例えば、ＤＮアーゼＩ、ＩＩ）；ＲＮアーゼ（例えば、ＲＮアーゼＥ、Ｆ、Ｈ、Ｐ）；クリーベース（Cleavase）（商標）酵素；Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ；大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩおよび真核性構造特異的エンドヌクレアーゼ；マウスＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ；タイプＩ、ＩＩまたはＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ、例えばＡｃｃＩ、ＡｆｌＩＩＩ、ＡｌｕＩ、Ａｌｗ４４Ｉ、ＡｐａＩ、ＡｓｎＩ、ＡｖａＩ、ＡｖａＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＢａｎＩＩ、ＢｃｌＩ、ＢｇｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｌｎＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＣｆｏＩ、ＣＩａＩ、ＤｄｅＩ、ＤｐｎＩ、ＤｒａＩ、ＥｃＩＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨａｅＩＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、ＫｐｎＩ、ＫｓｐＩ、ＭｌｕＩ、ＭＩｕＮＩ、ＭｓｐＩ、ＮｃｉＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｄｅＩＩ、ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｉＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＲｓａＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＳｃａＩ、ＳｃｒＦＩ、ＳｆｉＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＳｔｙＩ、ＳｗａＩ、ＴａｑＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ）；グリコシラーゼ（例えば、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼＩＩ、ピリミジン水和物−ＤＮＡグリコシラーゼ、ＦａＰｙ−ＤＮＡグリコシラーゼ、チミンミスマッチ−ＤＮＡグリコシラーゼ、ヒポキサンチン−ＤＮＡグリコシラーゼ、５−ヒドロキシメチルウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＨｍＵＤＧ）、５−ヒドロキシメチルシトシンＤＮＡグリコシラーゼ、または１，Ｎ６−エテノ−アデニンＤＮＡグリコシラーゼ）；エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ）；リボザイム、およびＤＮＡザイムが挙げられる。サンプル核酸は、化学物質で処置されていてもよいし、または改変されたヌクレオチドを使用して合成されてもよく、改変された核酸が切断されてもよい。非限定的な例において、サンプル核酸は、（ｉ）アルキル化剤、例えば、アルキルプリンＤＮＡ−グリコシラーゼによって認識されて切断されるＮ３−メチルアデニンおよびＮ３−メチルグアニンなどの数種のアルキル化塩基を生成するメチルニトロソウレア；（ｉｉ）ＤＮＡにおいてシトシン残基の脱アミノを引き起こしてウラシルＮ−グリコシラーゼで切断可能なウラシル残基を形成する、亜硫酸水素ナトリウム；および（ｉｉｉ）グアニンを、ホルムアミドピリミジンＤＮＡのＮ−グリコシラーゼによって切断可能なその酸化された形態である８−ヒドロキシグアニンに変換する化学物��で処置されていてもよい。化学的切断プロセスの例としては、これらに限定されないが、アルキル化（例えば、ホスホロチオエートで改変された核酸のアルキル化）；Ｐ３’−Ｎ５’−ホスホロアミデート含有核酸の酸不安定性部分の切断；ならびに核酸の四酸化オスミウムおよびピペリジン処置が挙げられる。
【０１４２】
本明細書で使用される用語「相補的な切断反応」は、同じ標的または参照の核酸もしくはタンパク質の代替の切断パターンが生成されるように、異なる切断試薬を使用して、または同じ切断試薬の切断特異性を変更することによって、同じ核酸上で実行される切断反応を指す。いくつかの実施態様において、対象の核酸は、１つまたはそれより多くの反応容器中で、１種またはそれより多くの特異的な切断剤（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれより多くの特異的な切断剤）で処置されていてもよい（例えば、対象の核酸は、別々の容器でそれぞれの特異的な切断剤で処置される）。
【０１４３】
本明細書で説明される実施態様での使用に好適な核酸は、時には、当業界公知のあらゆる増幅プロセス（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよび同種のもの）によって増幅される。典型的には培養が難しい生物を使用する場合（例えば、増殖が遅いこと、特殊な培養条件を必要とすること、など）、核酸増幅は、特に有益であり得る。用語「増幅する」、「増幅」、「増幅反応」、または「増幅すること」は、本明細書で使用される場合、目的とする核酸配列のコピーを増殖させるあらゆるインビトロでのプロセスを指す。増幅は、時には、目的とする核酸の「指数関数的な」増加を指す。しかしながら、「増幅すること」はまた、本明細書で使用される場合、核酸の多数の選択された目的とする配列における直線的な増加を指す場合もあるが、１回の単一プライマーによる伸長工程とは異なる。いくつかの実施態様において、予備増幅としても知られる限定的な増幅反応を行ってもよい。予備増幅は、少数のサイクル、例えば１０サイクルを行うことにより限定的な量の増幅を起こす方法である。予備増幅は、多少の増幅を引き起こす場合もあるが、対数期に入る前に増幅を止め、典型的には望ましいヌクレオチド配列の約５００コピーを生産する。また予備増幅の使用も、標準的なＰＣＲ反応における反応物の枯渇に伴う不正確さを抑える可能性もある。
【０１４４】
いくつかの実施態様において、核酸試薬は、時には、宿主生物の染色体に安定して統合され、またはいくつかの実施態様において（例えば、宿主ゲノムの変更が、遺伝学的改変を有する望ましい生物を選択的または優先的に維持する能力を付与する遺伝子改変生物において）、核酸試薬は、宿主染色体の一部の欠失であってもよい。このような核酸試薬（例えば、変更されたゲノムが生物に選択可能な特色を付与する核酸または遺伝子改変生物）は、望ましいタンパク質または核酸分子の生産を誘導するそれらの能力に応じて選択される可能性がある。核酸試薬は、望ましい場合、コドンが、（ｉ）天然配列で特定されたｔＲＮＡとは異なるｔＲＮＡを使用して同じアミノ酸をコードするか、または（ｉｉ）通常ではないアミノ酸または非天然アミノ酸（検出可能に標識されたアミノ酸を含む）などの、正常なものとは異なるアミノ酸をコードするように変更されてもよい。用語「天然の配列」は、本明細書で説明される場合、その天然の環境で見出されるような未改変のヌクレオチド配列（例えば、生物中で見出されるようなヌクレオチド配列）を指す。
【０１４５】
核酸または核酸試薬は、多くの場合、核酸の意図した使用に従って選択された所定の要素を含んでいてもよい。以下の要素のいずれかが核酸試薬に包含されていてもよいし、核酸試薬から除かれていてもよい。核酸試薬は、例えば、以下のヌクレオチド要素：１つまたはそれより多くのプロモーター要素、１つまたはそれより多くの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、標的ヌクレオチド配列が挿入され得る１つまたはそれより多くの領域（「挿入要素」）、１つまたはそれより多くの標的ヌクレオチド配列、１つまたはそれより多くの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、および１つまたはそれより多くの選択要素のうち１種またはそれより多くまたは全てを包含していてもよい。核酸試薬は、このような要素のうち１またはそれより多くと共に提供されてもよいし、核酸が望ましい生物に導入される前に他の要素が核酸に挿入されてもよい。いくつかの実施態様において、提供された核酸試薬は、プロモーター、５’ＵＴＲ、任意選択の３’ＵＴＲ、および標的ヌクレオチド配列をヌクレオチド酸試薬に挿入（すなわち、クローニング）するための挿入要素を含む。いくつかの実施態様において、提供された核酸試薬は、プロモーター、挿入要素および任意選択の３’ＵＴＲを含み、５’ＵＴＲ／標的ヌクレオチド配列は、任意選択の３’ＵＴＲと共に挿入される。要素は、選ばれた発現系における発現（例えば、選ばれた生物における発現、または例えば細胞非含有系における発現）に好適なあらゆる順番で配置されてもよいし、いくつかの実施態様において、核酸試薬は、５’から３’の方向で、以下の要素：（１）プロモーター要素、５’ＵＴＲ、および挿入要素；（２）プロモーター要素、５’ＵＴＲ、および標的ヌクレオチド配列；（３）プロモーター要素、５’ＵＴＲ、挿入要素および３’ＵＴＲ；ならびに（４）プロモーター要素、５’ＵＴＲ、標的ヌクレオチド配列および３’ＵＴＲを含む。
【０１４６】
プロモーター
プロモーター要素は、典型的にはＤＮＡ合成および／またはＲＮＡ合成に必要である。プロモーター要素は、多くの場合、遺伝子に対応するＲＮＡを合成するための開始部位を提供することによって特定の遺伝子の転写を容易にできるＤＮＡの領域を含む。いくつかの実施態様において、プロモーターは、一般的に、それらが調節する遺伝子の近くに配置され、遺伝子上流（例えば、遺伝子の５’）に配置され、遺伝子のセンス鎖としてＤＮＡの同じ鎖上に存在する。いくつかの実施態様において、プロモーター要素は、遺伝子または生物から単離されて、発現が変更および／または調節されるように、ポリヌクレオチド配列と機能的に連結した状態で挿入されてもよい。核酸の発現に使用される非天然のプロモーター（例えば、通常は、所定の核酸配列とは結合しないプロモーター）は、多くの場合、異種プロモーターと称される。いくつかの実施態様において、異種プロモーターおよび／または５’ＵＴＲは、本明細書で説明されるような望ましい活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に連結した状態で挿入されてもよい。用語「〜と作動可能に連結した」および「〜と機能的に連結した状態で」は、本明細書でプロモーターに関して使用される場合、コード配列とプロモーター要素との関係を指す。転写を介したコード配列からの発現がプロモーター要素によって調節または制御される場合、そのプロモーターは、コード配列と作動可能に連結しているか、またはコード配列と機能的に連結した状態である。用語「〜と作動可能に連結した」および「〜と機能的に連結した状態で」は、本明細書ではプロモーター要素に関して同義的に使用される。
【０１４７】
プロモーターは、多くの場合、ＲＮＡポリメラーゼと相互作用する。ポリメラーゼは、既存の核酸試薬を使用して核酸の合成を触媒する酵素である。テンプレートがＤＮＡテンプレートである場合、ＲＮＡ分子が転写されて、その後タンパク質が合成される。本発明の方法での使用に好適なポリメラーゼ活性を有する酵素は、タンパク質を合成するために選ばれたテンプレートを含む選ばれた系中で活性なあらゆるポリメラーゼを包含する。いくつかの実施態様において、プロモーター（例えば、異種プロモーター）は、本明細書ではプロモーター要素としてとも称されるが、これは、ヌクレオチド配列またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結できる。プロモーター要素からの転写は、プロモーターに作動可能に連結したヌクレオチド配列またはＯＲＦ配列に対応するＲＮＡの合成を触媒でき、続いてそれにより、望ましいペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の合成が起こる。
【０１４８】
プロモーター要素は、時には、調節コントロールに反応性を示す。またプロモーター要素は、時には、選択剤によって調節される場合もある。すなわち、プロモーター要素からの転写は、時には、環境、栄養または内部条件もしくはシグナルの変化に応答してオン、オフ、アップレギュレートまたはダウンレギュレートされる可能性がある（例えば、熱誘導性プロモーター、光調節性プロモーター、フィードバック調節性プロモーター、ホルモンの影響を受けるプロモーター、組織特異的なプロモーター、酸素およびｐＨの影響を受けるプロモーター、選択剤（例えば、カナマイシン）に対応するプロモーターおよび同種のものなど）。環境、栄養または内部シグナルの影響を受けるプロモーターはしばしば、プロモーターの位置で結合するかまたはその近くに結合して、所定の条件下で目的とする配列の発現を増加または減少させるシグナル（直接的または間接的）の影響を受ける。
【０１４９】
本明細書で説明される実施態様で使用されるプロモーター要素からの転写に影響を与えることができる選択剤または調節剤の非限定的な例としては、これらに限定されないが、（１）別の状況では毒性の化合物（例えば、抗生物質）に対する耐性を提供する生成物をコードする核酸セグメント；（２）別の状況ではレシピエント細胞中で欠失している生成物（例えば、必須の生成物、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）をコードする核酸セグメント；（３）遺伝子産物の活性を抑制する生成物をコードする核酸セグメント；（４）容易に同定できる生成物（例えば、表現型マーカー、例えば抗生物質（例えば、β−ラクタマーゼ）、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、および細胞表面タンパク質）をコードする核酸セグメント；（５）別の状況では細胞の生存および／または機能に有害な生成物に結合する核酸セグメント；（６）別の状況では上記の１〜５番で説明された核酸セグメントのいずれかの活性を阻害する核酸セグメント（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）；（７）基質を改変する生成物に結合する核酸セグメント（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）；（８）望ましい分子を単離または同定するのに使用できる核酸セグメント（例えば、特異的なタンパク質結合部位）；（９）別の状況では非機能的な可能性がある特異的なヌクレオチド配列をコードする核酸セグメント（例えば、分子の部分集団のＰＣＲ増幅のための）；（１０）存在しない場合、特定の化合物に対する耐性または感受性を直接的または間接的に付与する核酸セグメント；（１１）レシピエント細胞において、毒性であるか、または比較的非毒性の化合物を毒性の化合物に変換するかのいずれかである生成物をコードする核酸セグメント（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）；（１２）それらを含有する核酸分子の複製、分割または遺伝を阻害する核酸セグメント；ならびに／または（１３）条件付きの複製機能、例えば、所定の宿主または宿主細胞株での、または所定の環境条件下での（例えば、温度、栄養条件および同種のもの）複製をコードする核酸セグメントが挙げられる。いくつかの実施態様において、調節剤または選択剤は、生物が晒される既存の増殖条件（例えば、液体培養での増殖、発酵槽での増殖、固体栄養素プレートでの増殖および同種のものなど）を変化させるのに添加されてもよい。
【０１５０】
いくつかの実施態様において、プロモーター要素の調節は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の活性（例えば、酵素活性）を変更する（例えば、増加させる、追加する、減少させる、または実質的に除去する）のに使用できる。いくつかの実施態様において、例えば、微生物は、新規の活性（例えば、宿主生物では通常見出されない活性）を追加できる、または対象のヌクレオチド配列（例えば、対象の同種または異種ヌクレオチド配列）に作動可能に連結した同種または異種プロモーターからの転写を増加させることによって、既存の活性の発現を増加させる核酸試薬を発現させる遺伝学的改変によって操作されてもよい。いくつかの実施態様において、微生物は、対象のヌクレオチド配列に作動可能に連結した同種または異種プロモーターからの転写を減少させるかまたは実質的に除去することによって活性の発現を減少させることができる核酸試薬を発現させる遺伝学的改変によって操作されてもよい。
【０１５１】
いくつかの実施態様において、活性は、当業者公知の組換えＤＮＡおよび遺伝学的技術を使用して変更されてもよい。微生物を操作する方法は、本明細書でさらに説明される。本明細書に記載の表は、酸素によってアップレギュレートされる酵母プロモーター、酸素によってダウンレギュレートされる酵母プロモーター、酵母の転写リプレッサーおよびそれに関連する遺伝子、ＭＥＭＥ配列分析ソフトウェアを使用して決定されるようなＤＮＡ結合モチーフの非限定的な一覧を提供する。可能性のあるレギュレーター結合モチーフは、過剰に提示される配列においてレギュレーターに制約される遺伝子間領域を検索するためのプログラムであるＭＥＭＥを使用して同定できる。レギュレーターごとに、０．００１未満のｐ値に制約される遺伝子間領域の配列を抽出し、モチーフ発見のためのインプットとして使用した。以下の設定：６〜１８塩基の範囲のモチーフ幅、「ズープス（zoops）」分布モデル、６位のマルコフバックグラウンドモデル、および２０モチーフの発見限定を使用してＭＥＭＥソフトウェアを実行した。２つの基準：ＭＥＭＥによって計算されたＥ値と特異度スコアとによって、発見された配列モチーフを重要性に関してスコア付けした。各測定基準を使用して最良のスコアを有するモチーフをレギュレーターごとに示す。ガラクトース中で増殖させたエピトープタグを有するＧａｌ４に関するこれまで公開されたデータセットを除いて、提示された全てのモチーフは、リッチな増殖条件で生成されたデータセットから得られる。
【０１５２】
いくつかの実施態様において、変更された活性は、活性における望ましい変化を選択する条件下で生物をスクリーニングすることによって見出すことができる。例えば、所定の微生物は、あまりよく代謝されない物質またはさらには毒性の物質を含有する培地上で生物を選択またはスクリーニングすることによって活性が増加または減少するように適合させることができる。通常あまりよく代謝されない物質中で増殖する生物の能力の増加は、例えば、その物質での増殖速度の増加をもたらす可能性がある。有毒物質に対する感受性の減少は、例えば、より高い有毒物質濃度での増殖によって証明される可能性がある。この方式で同定される遺伝学的改変は、時には、天然に存在する突然変異と称され、またはそれらを有する生物が、時には、天然に存在する突然変異体と称される場合もある。この方式で得られた改変は、プロモーター配列における変更に限定されない。すなわち、上述したような選択圧力によって微生物をスクリーニングすることは、非プロモーター配列中に発生する可能性がある遺伝子変更をもたらす可能性があり、時には、対象のヌクレオチド配列中ではないが、関連するヌクレオチド配列（例えば、同じ経路の異なる工程に関与する遺伝子、輸送遺伝子および同種のもの）中に発生する可能性もある。いくつかの実施態様において、天然に存在する突然変異体は、時には、天然に存在する変異体を固有の環境から単離することによって見出すことができる。
【０１５３】
相同性および同一性
本明細書で示される調節されたプロモーター配列、調節配列、およびコード化ポリヌクレオチドに加えて、核酸試薬は、前述の配列（または相補的配列）に８０％またはそれより高く同一なポリヌクレオチド配列を包含していてもよい。すなわち、本明細書で説明されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％またはそれより高く、８１％またはそれより高く、８２％またはそれより高く、８３％またはそれより高く、８４％またはそれより高く、８５％またはそれより高く、８６％またはそれより高く、８７％またはそれより高く、８８％またはそれより高く、８９％またはそれより高く、９０％またはそれより高く、９１％またはそれより高く、９２％またはそれより高く、９３％またはそれより高く、９４％またはそれより高く、９５％またはそれより高く、９６％またはそれより高く、９７％またはそれより高く、９８％またはそれより高く、または９９％またはそれより高く同一なヌクレオチド配列が利用できる。用語「同一」は、本明細書で使用される場合、互いに比較した場合、実質的に同じヌクレオチド配列を有する２つまたはそれより多くのヌクレオチド配列を指す。２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が実質的に同一であるかどうかを決定する試験の１つは、共通する同一なヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のパーセントを決定することである。
【０１５４】
配列同一性の計算は、以下のように行うことができる。比較目的で最適になるように配列を並べる（例えば、最適なアライメントのために第一および第二のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入してもよく、比較目的のために非相同配列を無視してもよい）。比較目的で並べられた参照配列の長さは、時には、参照配列の長さの、３０％またはそれより長い、４０％またはそれより長い、５０％またはそれより長い、多くの場合、６０％またはそれより長い、より多くの場合、７０％またはそれより長い、８０％またはそれより長い、９０％またはそれより長い、または１００％である。次いで、対応するヌクレオチドまたはポリペプチド位置におけるヌクレオチドまたはアミノ酸をそれぞれ２つの配列間で比較する。第一の配列の位置が、第二の配列の対応する位置と同じヌクレオチドまたはアミノ酸によって占められている場合、そのヌクレオチドまたはアミノ酸は、その位置において同一であるとみなされる。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入されたギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、それらの配列で共通の同一な位置の数の関数である。
【０１５５】
２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、数学的なアルゴリズムを使用して達成できる。２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０の重量残基表（weight residue table）、１２のギャップ伸長ペナルティーおよび４のギャップペナルティーを使用したＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたMeyersおよびMiller、CABIOS 4：11〜17（1989）のアルゴリズムを使用して決定できる。また２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２のマトリックスまたはＰＡＭ２５０のマトリックス、および１６、１４、１２、１０、８、６もしくは４のギャップウェイト、および１、２、３、４、５もしくは６のレングスウェイトのいずれかを使用したＧＣＧソフトウェアパッケージ（www.gcg.comのｈｔｔｐアドレスで利用可能）中のギャッププログラムに組み込まれたNeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol. 48：444〜453（1970）のアルゴリズムを使用しても決定できる。２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、および４０、５０、６０、７０、または８０のギャップウェイト、および１、２、３、４、５、または６のレングスウェイトを使用したＧＣＧソフトウェアパッケージ中のギャッププログラム（www.gcg.comのｈｔｔｐアドレスで利用可能）を使用して決定できる。多くの場合使用されるパラメーターのセットは、１２のＧＡＰオープンペナルティー、４のギャップ伸長ペナルティー、および５のフレームシフトギャップペナルティーを用いたＢｌｏｓｓｕｍ６２のスコアマトリックスである。
【０１５６】
また配列同一性は、ストリンジェントな条件下で行われるハイブリダイゼーションアッセイによっても決定できる。用語「ストリンジェントな条件」は、本明細書で使用される場合、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を指す。ストリンジェントな条件は当業者公知であり、Current Protocols in Molecular Biology、ジョン・ワイリー＆サンズ（John Wiley & Sons）、N.Y.、6.3.1〜6.3.6（1989）に見出すことができる。その参考文献では水性および非水性の方法が説明されており、どちらも使用できる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーション、続いて５０℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの１回またはそれより多くの洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の別の例は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーション、続いて５５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの１回またはそれより多くの洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる例は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーション、続いて６０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの１回またはそれより多くの洗浄である。多くの場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーション、続いて６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの１回またはそれより多くの洗浄である。より多くの場合、ストリンジェンシー条件は、６５℃での０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ、続いて６５℃での０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳでの１回またはそれより多くの洗浄である。
【０１５７】
ＵＴＲ
上述したように、核酸試薬はまた、１つまたはそれより多くの５’ＵＴＲ’、および１つまたはそれより多くの３’ＵＴＲ’を含んでいてもよい。５’ＵＴＲは、その起源となるヌクレオチド配列にとって内因性の１つまたはそれより多くの要素を含んでいてもよく、時には、１つまたはそれより多くの外因性要素を包含する。５’ＵＴＲは、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡなどのあらゆる好適な核酸に由来するものでもよいし、例えば、あらゆる好適な生物（例えば、ウイルス、細菌、酵母、菌類、植物、昆虫または哺乳動物）に由来するものでもよい。技術者は、選ばれた発現系（例えば、選ばれた生物における発現、または例えば細胞非含有系における発現）に基づいて５’ＵＴＲに適切な要素を選択することが可能である。５’ＵＴＲは、時には、以下の当業者公知の要素：エンハンサー配列（例えば、転写または翻訳の）、転写開始部位、転写因子結合部位、翻訳調節部位、翻訳開始部位、翻訳因子結合部位、アクセサリータンパク質結合部位、フィードバック調節剤結合部位、プリブナウボックス、ＴＡＴＡボックス、−３５エレメント、Ｅ−ボックス（へリックス−ループ−へリックス結合要素）、リボソーム結合部位、レプリコン、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、サイレンサー要素および同種のもののうち１種またはそれより多くを含む。いくつかの実施態様において、適切な条件付きの調節に必要な全ての５’ＵＴＲ要素がプロモーター要素フラグメント中に、またはプロモーター要素フラグメントの機能的な部分配列内に含有されるように、プロモーター要素が孤立していてもよい。
【０１５８】
核酸試薬中の５’ＵＴＲは、翻訳エンハンサーヌクレオチド配列を含んでいてもよい。翻訳エンハンサーヌクレオチド配列は、多くの場合、核酸試薬中でプロモーターと標的ヌクレオチド配列との間に配置される。翻訳エンハンサー配列は、多くの場合、リボソームに結合しており、時には、１８Ｓ  ｒＲＮＡ結合リボヌクレオチド配列（すなわち、４０Ｓリボソーム結合配列）であり、時には、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳは、一般的に、多数の特異的な分子間相互作用を介して４０Ｓリボゾームサブユニットと接触する正確に配置されたＲＮＡの３次構造を有するＲＮＡの足場を形態する。リボゾームエンハンサー配列の例は公知であり、技術者により同定が可能である（例えば、Mignoneら、Nucleic Acids Research 33：D141〜D146（2005）；Paulousら、Nucleic Acids Research 31：722〜733（2003）；Akbergenovら、Nucleic Acids Research 32：239〜247（2004）；Mignoneら、Genome Biology 3（3）：総論0004.1〜0001.10（2002）；Gallie、Nucleic Acids Research 30：3401〜3411（2002）；Shaloikoら、www.interscience.wiley.comのｈｔｔｐアドレス、DOI：10.1002／bit.20267；およびGallieら、Nucleic Acids Research 15：3257〜3273（1987））。
【０１５９】
翻訳エンハンサー配列は、時には、真核性配列、例えばコザックコンセンサス配列または他の配列（例えば、ヒドロポリプ配列、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ０７１２８）である。翻訳エンハンサー配列は、時には、原核性配列、例えばシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）コンセンサス配列である。いくつかの実施態様において、翻訳エンハンサー配列は、ウイルスのヌクレオチド配列である。翻訳エンハンサー配列は、時には、例えばタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）；タバコエッチ病ウイルス（ＥＴＶ）；ジャガイモウイルスＹ（ＰＶＹ）；カブモザイク（ｐｏｔｙ）ウイルスおよびエンドウ種子伝染モザイクウイルスなどの植物ウイルスの５’ＵＴＲ由来である。いくつかの実施態様において、長さが約６７塩基のＴＭＶ由来オメガ配列が、翻訳エンハンサー配列として核酸試薬に包含される（例えば、グアノシンヌクレオチドを欠失しており、長さが２５ヌクレオチドのポリ（ＣＡＡ）中央領域を包含する）。
【０１６０】
３’ＵＴＲは、その起源となるヌクレオチド配列にとって内因性の１つまたはそれより多くの要素を含んでいてもよく、時には、１つまたはそれより多くの外因性要素を包含する。３’ＵＴＲは、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡなどのあらゆる好適な核酸に由来するものでもよいし、例えば、あらゆる好適な生物（例えば、ウイルス、細菌、酵母、菌類、植物、昆虫または哺乳動物）に由来するものでもよい。技術者は、選ばれた発現系（例えば、選ばれた生物における発現）に基づいて３’ＵＴＲに適切な要素を選択することが可能である。３’ＵＴＲは、時には、以下の当業者公知の要素：転写調節部位、転写開始部位、転写終結部位、転写因子結合部位、翻訳調節部位、翻訳終結部位、翻訳開始部位、翻訳因子結合部位、リボソーム結合部位、レプリコン、エンハンサー要素、サイレンサー要素およびポリアデノシンテールのうち１種またはそれより多くを含む。３’ＵＴＲは、多くの場合、ポリアデノシンテールを包含するが、時には包含せず、ポリアデノシンテールが存在する場合、それから１つまたはそれより多くのアデノシン部分が付加または欠失されていてもよい（例えば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５または約５０個のアデノシン部分が付加されてもよいし、または差し引かれてもよい）。
【０１６１】
いくつかの実施態様において、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲの改変は、プロモーターの活性を変更する（例えば、増加させる、追加する、減少させる、または実質的に除去する）のに使用できる。プロモーター活性の変更は続いて、改変された５’または３’ＵＴＲを含む作動可能に連結したプロモーター要素からの対象のヌクレオチド配列の転写を変化させることにより、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の活性（例えば、酵素活性）を変更できる。いくつかの実施態様において、例えば、微生物は、新規の活性（例えば、宿主生物では通常見出されない活性）を追加できる、または対象のヌクレオチド配列（例えば、対象の同種または異種ヌクレオチド配列）に作動可能に連結した同種または異種プロモーターからの転写を増加させることによって、既存の活性の発現を増加させる改変された５’または３’ＵＴＲを含む核酸試薬を発現させる遺伝学的改変によって操作されてもよい。いくつかの実施態様において、微生物は、対象のヌクレオチド配列に作動可能に連結した同種または異種プロモーターからの転写を減少させるかまたは実質的に除去することによって活性の発現を減少させることができる改変された５’または３’ＵＴＲを含む核酸試薬を発現させる遺伝学的改変によって操作されてもよい。
【０１６２】
標的ヌクレオチド配列
ヌクレオチド試薬は、時には、標的ヌクレオチド配列を含んでいてもよい。「標的ヌクレオチド配列」は、本明細書で使用される場合、対象の核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードし、リボヌクレオチド配列またはデオキシリボヌクレオチド配列であってもよい。目的とする核酸は、時には、非翻訳リボ核酸であり、時には、翻訳リボ核酸である。非翻訳リボ核酸としては、これらに限定されないが、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型リボ核酸（ｓｈＲＮＡ）、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）可能な他のリボ核酸、アンチセンスリボ核酸、またはリボザイムを挙げることができる。翻訳可能な標的ヌクレオチド配列（例えば、目的とするリボヌクレオチド配列）は、時には、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードし、これらは、時には、本明細書において「標的ペプチド」、「目的とするポリペプチド」または「標的タンパク質」とも称される。
【０１６３】
あらゆるペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、または１つまたはそれより多くのペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質によって触媒される活性は、標的ヌクレオチド配列によってコードされていてもよいし、使用者によって選択されてもよい。代表的なタンパク質としては、酵素（例えば、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、チオエステラーゼ、モノオキシゲナーゼ、モノオキシゲナーゼレダクターゼ、脂肪族アルコールオキシダーゼ、アシルトランスフェラーゼおよび同種のものなど）、抗体、血清タンパク質（例えば、アルブミン）、膜結合型タンパク質、ホルモン（例えば、成長ホルモン、エリスロポイエチン、インスリンなど）、サイトカインなどが挙げられ、さらに天然に存在するポリペプチドおよび外因的に発現されたポリペプチドの両方も挙げられる。代表的な活性（例えば、酵素、または機能的に連携して活性を提供する酵素の組み合わせ）としては、例えば、チオエステラーゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、アシルトランスフェラーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、ベータ酸化活性、オメガ酸化活性および同種のものなどが挙げられる。用語「酵素」は、本明細書で使用される場合、他の化合物において化学的変化を誘導し、１種またはそれより多くの基質から１種またはそれより多くの生成物を生産する触媒として作用できるタンパク質を指す。
【０１６４】
本明細書で説明される実施態様に有用な特異的なポリペプチド（例えば、酵素）が、本明細書で列挙される。用語「タンパク質」は、本明細書で使用される場合、ペプチド結合で連結されたアミノ酸の配列を有する分子を指す。この用語は、天然かまたは組換えかどうかに関わらず、融合タンパク質、オリゴペプチド、ペプチド、環状ペプチド、ポリペプチドおよびポリペプチド誘導体を包含し、さらにそれらのフラグメント、誘導体、相同体、および変異体も包含する。タンパク質またはポリペプチドは、時には、細胞内由来であり（例えば、インビボでは宿主細胞の細胞核、サイトゾル、または間質腔に存在する）、時には、インビボにおいて細胞膜タンパク質である。いくつかの実施態様において（上記で説明された、および下記の操作および変更方法のさらなる詳細において）、遺伝学的改変は、目的とする活性の改変（例えば、増加、実質的な増加、減少または実質的な減少）をもたらす可能性がある。
【０１６５】
翻訳可能なヌクレオチド配列は、一般的に、開始コドン（リボ核酸ではＡＵＧおよびデオキシリボ核酸ではＡＴＧ）と終止コドン（例えば、リボ核酸ではＵＡＡ（オーカー）、ＵＡＧ（アンバー）またはＵＧＡ（オパール）、デオキシリボ核酸ではＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）との間に配置され、時には、本明細書では「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）とも称される。翻訳可能なヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）は、時には、ある生物において（例えば、ほとんどの生物は、ＣＴＧをロイシンとしてコードしている）、別の生物とは異なってコードされている（例えば、Ｃ．トロピカリスは、ＣＴＧをセリンとしてコードしている）。いくつかの実施態様において、翻訳可能なヌクレオチド配列は、ヌクレオチドドナー生物とヌクレオチドレシピエント生物（例えば、操作された生物）との間での代替の遺伝子コード（例えば、コドン使用頻度）の差が修正されるように変更される。いくつかの実施態様において、翻訳可能なヌクレオチド配列は、（ｉ）コドン使用頻度、（ｉｉ）転写効率、（ｉｉｉ）翻訳効率、（ｉｖ）その他同様のもの、およびそれらの組み合わせが改善するように変更される。
【０１６６】
核酸試薬およびツール
核酸試薬は、時には、１つまたはそれより多くのＯＲＦを含む。ＯＲＦは、あらゆる好適な源由来でもよく、時には、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、逆転写ＲＮＡもしくは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）または前述のものの１種またはそれより多くを含む核酸ライブラリー由来であってもよく、対象の核酸配列、対象のタンパク質、または対象の活性を含有するあらゆる生物種由来である。ＯＲＦを得ることができる生物の非限定的な例としては、例えば、細菌、酵母、菌類、ヒト、昆虫、線虫、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ラットまたはマウスが挙げられる。
【０１６７】
核酸試薬は、時には、ＯＲＦに隣接しており、ＯＲＦと共に翻訳されてアミノ酸タグをコードするヌクレオチド配列を含む。タグをコードするヌクレオチド配列は、核酸試薬においてＯＲＦの３’および／または５’に配置されることから、ＯＲＦによってコードされたタンパク質またはペプチドのＣ末端またはＮ末端にタグがコードされる。インビトロでの転写および／または翻訳を阻止しないあらゆるタグを利用でき、技術者によって適切に選択することが可能である。タグは、培養物または発酵培地からの望ましいＯＲＦ産物の単離および／または精製を容易にする可能性がある。
【０１６８】
タグは、時には、例えば固相の分子もしくは一部または検出可能な標識に特異的に結合するために、ＯＲＦによってコードされたタンパク質またはペプチドの単離、精製および／または検出に関する有用性を有する。いくつかの実施態様において、タグは、以下の要素：ＦＬＡＧ（例えば、ＤＹＫＤＤＤＤＫＧ）、Ｖ５（例えば、ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）、ｃ−ＭＹＣ（例えば、ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、ＨＳＶ（例えば、ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ）、インフルエンザヘマグルチニン、ＨＡ（例えば、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）、ＶＳＶ−Ｇ（例えば、ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ）、細菌のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、ストレプトアビジン−またはアビジン結合タグ（例えば、ｐｃＤＮＡ（商標）６バイオイース（6 BioEase）（商標）ゲートウェイ（Gateway）（登録商標）ビオチン化システム（インビトロジェン））、チオレドキシン、β−ガラクトシダーゼ、ＶＳＶ−糖タンパク質、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質またはその多くの色変異体（例えば、黄色、赤色、青色）のうちの１種）、ポリリジンまたはポリアルギニン配列、ポリヒスチジン配列（例えば、Ｈｉｓ６）または金属（例えば、コバルト、亜鉛、銅）をキレート化する他の配列、ならびに／またはヒ素含有分子に結合するシステインリッチ配列のうち１種またはそれより多くを含む。いくつかの実施態様において、システインリッチタグは、アミノ酸配列ＣＣ−Ｘｎ−ＣＣを含み、ここでＸはあらゆるアミノ酸であり、ｎは１〜３であり、システインリッチ配列は、時にはＣＣＰＧＣＣである。いくつかの実施態様において、タグは、システインリッチ要素およびポリヒスチジン要素（例えば、ＣＣＰＧＣＣおよびＨｉｓ６）を含む。
【０１６９】
タグは、多くの場合、結合パートナーに都合よく結合する。例えば、いくつかのタグは、抗体（例えば、ＦＬＡＧ）に結合し、時には、小分子に特異的に結合する。例えば、ポリヒスチジンタグは、２価金属、例えば銅、亜鉛およびコバルトを特異的にキレート化し；ポリリジンまたはポリアルギニンタグは、ジンクフィンガーに特異的に結合し；グルタチオンＳ−トランスフェラーゼタグは、グルタチオンに結合し；システインリッチタグは、ヒ素含有分子に特異的に結合する。ヒ素含有分子としては、ＬＵＭＩＯ（商標）剤（インビトロジェン、カリフォルニア州）、例えばＦｌＡｓＨ（商標）（ＥＤＴ２［４’，５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン−（１，２−エタンジチオール）２］）およびＲｅＡｓＨ試薬（例えば、Tsienらの米国特許第５，９３２，４７４号、タイトル「Target Sequences for Synthetic Molecules」；Tsienらの米国特許第６，０５４，２７１号、タイトル「Methods of Using Synthetic Molecules and Target Sequences」；全てのTsienらの、米国特許第６，４５１，５６９号および６，００８，３７８号；公開された米国特許出願第２００３／００８３３７３号、ならびに公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ９９／２１０１３、全てのタイトル「Synthetic Molecules that Specifically React with Target Sequences」）が挙げられる。このような抗体および小分子は、時には、標的タンパク質または標的ペプチドの便利な単離のための固相に連結される。
【０１７０】
タグは、時には、翻訳されたタンパク質またはペプチドを系中の成分に局在化する配列を含み、このような配列は、本明細書では「シグナル配列」または「局在化シグナル配列」と称される。シグナル配列は、多くの場合、標的タンパク質または標的ペプチドのＮ末端に取り込まれ、時には、Ｃ末端にも取り込まれる。シグナル配列の例は当業者公知であり、核酸試薬に容易に取り込まれ、多くの場合、核酸試薬の発現が行われる生物に従って選択される。いくつかの実施態様において、シグナル配列は、翻訳されたタンパク質またはペプチドを細胞膜に局在化する。シグナル配列の例としては、これらに限定されないが、細胞核標的シグナル（例えば、ＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のステロイド受容体配列およびＮ末端配列）；ミトコンドリア標的シグナル（例えば、両親媒性へリックスを形成するアミノ酸配列）；ペルオキシソーム標的シグナル（例えば、Ｓ．セレビジエ由来ＹＦＧにおけるＣ末端配列）；および分泌シグナル（例えば、インベルターゼ由来のＮ末端配列、交配因子アルファ、ＰＨＯ５およびＳ．セレビジエにおけるＳＵＣ２；Ｂ．ズブチリスタンパク質の複数のＮ末端配列（例えば、Tjalsmaら、Microbiol. Molec. Biol. Rev. 64：515〜547（2000））；アルファアミラーゼシグナル配列（例えば、米国特許第６，２８８，３０２号）；ペクチン酸リアーゼシグナル配列（例えば、米国特許第５，８４６，８１８号）；前コラーゲンシグナル配列（例えば、米国特許第５，７１２，１１４号）；ＯｍｐＡシグナル配列（例えば、米国特許第５，４７０，７１９号）；ｌａｍベータシグナル配列（例えば、米国特許第５，３８９，５２９号）；Ｂ．ブレビス（B. brevis）のシグナル配列（例えば、米国特許第５，２３２，８４１号）；ならびにＰ．パストリスのシグナル配列（例えば、米国特許第５，２６８，２７３号））が挙げられる。
【０１７１】
タグは、時には、ＯＲＦによってコードされたアミノ酸配列と直接隣接しており（すなわち、介在配列がない）、時には、タグは、ＯＲＦでコードされたアミノ酸配列と実質的に隣接している（例えば、介在配列が存在する）。介在配列は、時には、標的タンパク質またはペプチドからタグを切断するのに有用なプロテアーゼの認識部位を包含する。いくつかの実施態様において、介在配列は、例えば、Ｘａ因子（例えば、認識部位Ｉ（Ｅ／Ｄ）ＧＲ）、トロンビン（例えば、認識部位ＬＶＰＲＧＳ）、エンテロキナーゼ（例えば、認識部位ＤＤＤＤＫ）、ＴＥＶプロテアーゼ（例えば、認識部位ＥＮＬＹＦＱＧ）またはプレシジョン（PreScission）（商標）プロテアーゼ（例えば、認識部位ＬＥＶＬＦＱＧＰ）によって切断される。
【０１７２】
介在配列は、時には、本明細書では「リンカー配列」と称され、技術者によって選択されたあらゆる好適な長さを有していてもよい。リンカー配列は、時には長さが約１〜約２０アミノ酸であり、時には長さが約５〜約１０アミノ酸である。技術者であれば、リンカーの長さを選択して、標的タンパク質またはペプチドの機能を実質的に保存すること（例えば、タグは、リンカーで分離させない限り、標的タンパク質またはペプチドの機能を低減させることができる）、プロテアーゼ切断部位が存在する場合、標的タンパク質またはペプチドからのタグの解離を強化すること（例えば、リンカーが存在する場合、切断が強化される可能性がある）、およびタグ／標的タンパク質産物と固相との相互作用を強化することが可能である。リンカーは、あらゆる好適なアミノ酸含量を有していてもよく、多くの場合、比較的短い側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、セリンおよびスレオニン）をより高い比率で含む。
【０１７３】
核酸試薬は、時には、タグ要素と挿入要素またはＯＲＦとの間に終止コドンを包含し、これは、タグ有りまたはタグ無しでＯＲＦを翻訳するのに有用な可能性がある。終止コドンを認識する突然変異ｔＲＮＡ分子（上記で説明した）は、翻訳の終結を抑制することから、「サプレッサーｔＲＮＡ」と名付けられている。サプレッサーｔＲＮＡは、アミノ酸の挿入および終止コドンを過ぎた後の翻訳の継続をもたらす可能性がある（例えば、２００４年７月１４日付けで出願された米国特許出願第６０／５８７，５８３号、タイトル「Production of Fusion Proteins by Cell-Free Protein Synthesis」；Eggertssonら（1988）Microbiological Review 52（3）：354〜374、およびEngleerg-Kuklaら（1996）、Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology、60章、909〜921頁、Neidhardtら編、ASMプレス（ASM Press）、ワシントンDC）。多数のサプレッサーｔＲＮＡが公知であり、例えば、これらに限定されないが、アンバー終止コドンの翻訳の終結を抑制するｓｕｐＥ、ｓｕｐＰ、ｓｕｐＤ、ｓｕｐＦおよびｓｕｐＺサプレッサー；オーカー終止コドンの機能を抑制するｓｕｐＢ、ｇｌＴ、ｓｕｐＬ、ｓｕｐＮ、ｓｕｐＣおよびｓｕｐＭサプレッサー、ならびにオパール終止コドンの機能を抑制するｇｌｙＴ、ｔｒｐＴおよびＳｕ−９サプレッサーが挙げられる。一般的に、サプレッサーｔＲＮＡは、ｔＲＮＡのアンチコドンループ中に、通常は終止コドンとして機能するコドンとｔＲＮＡが塩基対を形成することを可能にする１つまたはそれより多くの突然変異を含有する。突然変異ｔＲＮＡは、その同族アミノ酸残基で構築されていることから、終止コドンが相対したときに、その同族アミノ酸残基が翻訳ポリペプチドに挿入される。終結サプレッサーの効率を強化する（すなわち、終止コドンのリードスルーを増加させる）突然変異は同定されている。これらの突然変異としては、これらに限定されないが、ｕａｒ遺伝子（また、ｐｒｆＡ遺伝子としても知られている）における突然変異、ｕｐｓ遺伝子における突然変異、ｓｕｅＡ、ｓｕｅＢおよびｓｕｅＣ遺伝子における突然変異、ｒｐｓＤ（ｒａｍＡ）およびｒｐｓＥ（ｓｐｃＡ）遺伝子における突然変異、およびｒｐｌＬ遺伝子における突然変異が挙げられる。
【０１７４】
したがって、ＯＲＦとタグとの間に配置された終止コドンを含む核酸試薬は、翻訳系中にサプレッサーｔＲＮＡが存在しない場合、翻訳されたＯＲＦを単独で産出することができ、翻訳系中にサプレッサーｔＲＮＡが存在する場合、翻訳されたＯＲＦ−タグ融合体を産出することができる。サプレッサーｔＲＮＡは、ｔＲＮＡをコードする核酸でトランスフェクトされた細胞中で生成できる（例えば、ヒトｔＲＮＡ−Ｓｅｒサプレッサー遺伝子を含有する複製能のないアデノウイルスを、細胞にトランスフェクションさせてもよいし、または酵母または細菌のｔＲＮＡサプレッサー遺伝子を含有するＹＡＣを、酵母細胞にトランスフェクションさせてもよい）。技術者は、サプレッサーｔＲＮＡを合成するため、およびタグ有りまたはタグ無しでＯＲＦを翻訳するためのベクターを入手できる（例えば、タグ−オン−デマンド（Tag-On-Demand）（商標）キット（インビトロジェン社、カリフォルニア州）；タグ−オン−デマンド（商標）サプレッサー上清説明マニュアル、バージョンＢ、２００３年６月６日、www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/tagondemand_supernatant_man.pdfのｈｔｔｐアドレス；タグ−オン−デマンド（商標）ゲートウェイ（登録商標）ベクター説明マニュアル、バージョンＢ、２００３年６月２０日、www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/tagondemand_vectors_man.pdfのｈｔｔｐアドレス；およびCaponeら、Amber, ochre and opal suppressor tRNA genes derived from a human serine tRNA gene. EMBO J. 4：213、1985）。
【０１７５】
核酸試薬にＯＲＦなどの要素を取り込むために、当業界公知のあらゆる便利なクローニング方策が利用可能である。挿入要素から独立してテンプレートに要素を挿入するために、公知の方法が利用でき、このような方法としては、例えば、（１）１つまたはそれより多くの既存の制限酵素部位でテンプレートを切断し、対象の要素をライゲートすること、および（２）１つまたはそれより多くの好適な制限酵素部位を包含するオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズして、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅することによって、テンプレートに制限酵素部位を付加すること（本明細書でより詳細に説明される）が挙げられる。他のクローニング方策は、例えばＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドプライマーハイブリダイゼーション部位など、核酸試薬中に存在するかまたは核酸試薬に挿入される１つまたはそれより多くの挿入部位、および本明細書で説明される他のものを利用する方策である。いくつかの実施態様において、クローニング方策は、組換え（例えば、本明細書でさらに説明されているような、改変しようとする生物のゲノムに対象の核酸配列を含ませることによる核酸試薬の組換え）などの遺伝子操作と組み合わせることができる。いくつかの実施態様において、クローニングしたＯＲＦは、対象の１つまたはそれより多くのＯＲＦで微生物を操作することによって、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）を（直接的または間接的に）生産でき、ここで上記微生物は、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性、アシルトランスフェラーゼ活性、チオエステラーゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性およびモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性からなる群より選択される１つまたはそれより多くの変更された活性を含む。
【０１７６】
いくつかの実施態様において、核酸試薬は、１つまたはそれより多くのリコンビナーゼ挿入部位を包含する。リコンビナーゼ挿入部位は、組換えタンパク質による統合／組換え反応に参加する核酸分子における認識配列である。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼのための組換え部位は、ｌｏｘＰであり、これは、８塩基対のコア配列の両端にある２つの１３塩基対の逆方向反復配列（リコンビナーゼ結合部位として機能する）で構成される３４塩基対の配列である（例えば、Sauer, B.、Curr. Opin. Biotech. 5：521〜527（1994）の図１）。組換え部位の他の例としては、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ配列、ならびにそれらの突然変異体、フラグメント、変異体および誘導体が挙げられ、これらは、組換えタンパク質λＩｎｔによって、さらに補助的なタンパク質である組込み宿主因子（ＩＨＦ）、ＦＩＳおよび除去酵素（Ｘｉｓ）によって認識される（例えば、米国特許５，８８８，７３２第；６，１４３，５５７第；６，１７１，８６１第；６，２７０，９６９第；６，２７７，６０８第；ならびに６，７２０，１４０第；２０００年３月２日付けで出願された米国特許出願第０９／５１７，４６６号、および２００３年８月１４日付けで出願された０９／７３２，９１４号、および米国特許公報第２００２−０００７０５１−Ａ１号；Landy、Curr. Opin. Biotech. 3：699〜707（1993））。
【０１７７】
リコンビナーゼクローニング核酸の例は、ゲートウェイ（登録商標）システム（インビトロジェン、カリフォルニア州）におけるものであり、これは、インビボまたはインビトロで望ましい核酸分子をクローニングするための少なくとも１つの組換え部位を包含する。いくつかの実施態様において、このシステムは、多くの場合バクテリオファージラムダ系（例えば、ａｔｔ１およびａｔｔ２）をベースとする少なくとも２種の異なる部位特異的な組換え部位を含有し、野生型（ａｔｔ０）部位から突然変異したベクターを利用する。各突然変異部位は、その同族パートナーである同じタイプのａｔｔ部位（すなわち、その結合パートナーの組換え部位）に対して固有の特異性を有し（例えばａｔｔＢ１とａｔｔＰ１、またはａｔｔＬ１とａｔｔＲ１）、他の突然変異体タイプの組換え部位または野生型ａｔｔ０部位とは交差反応しないと予想される。異なる部位特異性は、望ましい分子の指向性のクローニングまたはリンケージを可能にし、したがってクローニングした分子の望ましい方向性を提供する。組換え部位を両端に有する核酸フラグメントは、ゲートウェイ（登録商標）システムを使用して、時にはデスティネーションベクターとも称されるレシピエントプラスミド分子においてａｔｔ部位を両端に有する選択マーカー（例えば、ｃｃｄＢ）を置き換えることによってクローニングおよびサブクローニングされる。次いで、ｃｃｄＢ感受性宿主株の形質転換およびレシピエント分子上のマーカーでの陽性選択によって望ましいクローンを選択する。陰性選択に関する類似の方策（例えば、毒性遺伝子の使用）は、哺乳動物および昆虫におけるチミジンキナーゼ（ＴＫ）などの他の生物で使用できる。
【０１７８】
酵母の操作に有用な組換え系を簡単に概説する。このような系は、ＵＲＡ３遺伝子（例えば、Ｓ．セレビジエおよびＣ．アルビカンスの場合）またはＵＲＡ４およびＵＲＡ５遺伝子（例えば、Ｓ．ポンベの場合など）、ならびにヌクレオチド類似体である５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）の毒性を利用する。ＵＲＡ３またはＵＲＡ４およびＵＲＡ５遺伝子は、オロチジン−５’−一リン酸（ＯＭＰ）デカルボキシラーゼ（orotine-5’-monophosphate (OMP) dicarboxylase）をコードする。活性なＵＲＡ３またはＵＲＡ４およびＵＲＡ５遺伝子を有する酵母（表現型ではＵｒａ＋）は、５−ＦＯＡを、酵母細胞にとって毒性のフルオロデオキシウリジンに変換する。適切な遺伝子における突然変異を有する、または適切な遺伝子のノックアウトを有する酵母は、培地にウラシルも補充される場合、５−ＦＯＡの存在下でも増殖できる。
【０１７９】
同じヌクレオチド配列のどちらかの側の両端に同じ方向で配置されたＵＲＡ３遺伝子またはカセット（Ｓ．セレビジエの場合）を含んでいてもよい、核酸操作用コンストラクトを作製できる。ＵＲＡ３カセットは、プロモーター、ＵＲＡ３遺伝子および機能的な転写ターミネーターを含む。標的配列が、ＵＲＡ３カセットのどちらかの側に配置されたフランキング配列と隣接し接触するように、操作しようとする生物中でコンストラクトを特定の核酸の関心領域に向かわせる標的配列が付加される。酵母を操作用コンストラクトで形質転換させて、ウラシル非含有の最小培地で平板培養してもよい。コロニーをＰＣＲでスクリーニングして、ゲノムの適切な位置に操作用コンストラクトが挿入された形質転換株を決定してもよい。ｕｒａ３カセットの組換えに関して選択する前に挿入位置をチェックすることにより、手法の後段階に持ち越される不正確なクローンの数を減らすことができる。次いで正確に挿入された形質転換株を５−ＦＯＡを含有する最小培地で平板培養して複製し、コンストラクトからＵＲＡ３カセットの組換えに関して選択して、破壊された遺伝子および破壊された遺伝子の存在を検証するのに使用できる同定可能なフットプリント（例えば、核酸配列）を残すことができる。説明した技術は、遺伝子の機能を破壊または「ノックアウト」するのに有用であるが、標的化された配列特異的な方式で宿主生物のゲノムに遺伝子またはコンストラクトを挿入するためにも使用できる。
【０１８０】
いくつかの実施態様において、核酸試薬は、１つまたはそれより多くのトポイソメラーゼ挿入部位を包含する。トポイソメラーゼ挿入部位は、部位特異的なトポイソメラーゼで認識されて結合される定義済みのヌクレオチド配列である。例えば、ヌクレオチド配列５’−（Ｃ／Ｔ）ＣＣＴＴ−３’は、ワクシニアウイルスＤＮＡトポイソメラーゼＩなどのほとんどのポックスウイルストポイソメラーゼと特異的に結合するトポイソメラーゼ認識部位である。認識配列に結合した後、トポイソメラーゼは、認識部位の最も３’側にあるチミジンで鎖を切断して、トポイソメラーゼ中のチロシンを介して３’リン酸に共有結合したトポイソメラーゼの複合体である５’−（Ｃ／Ｔ）ＣＣＴＴ−ＰＯ４−ＴＯＰＯを含むヌクレオチド配列を生産する（例えば、Shuman、J. Biol. Chem. 266：11372〜11379、1991；SekiguchiおよびShuman、Nucl. Acids Res. 22：5360〜5365、1994；米国特許第５，７６６，８９１号；ＰＣＴ／ＵＳ９５／１６０９９；およびＰＣＴ／ＵＳ９８／１２３７２）。それに対して、ヌクレオチド配列５’−ＧＣＡＡＣＴＴ−３’は、タイプＩＡ大腸菌トポイソメラーゼＩＩＩのためのトポイソメラーゼ認識部位である。挿入しようとする要素は、多くの場合、トポイソメラーゼと反応したテンプレートと組み合わされ、それによって核酸試薬に取り込まれる（例えば、ワールドワイドウェブＵＲＬ、invitrogen.com/downloads/F-１３５１２_Topo_Flyer.pdf；ワールドワイドウェブＵＲＬ、invitrogen.com/content/sfs/brochures/710_021849%20_B_TOPOCloning_bro.pdf；ＴＯＰＯ  ＴＡクローニング（TOPO TA Cloning）（登録商標）キットおよびゼロブラント（Zero Blunt）（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）クローニングキットの製品情報）。
【０１８１】
核酸試薬は、時には、１つまたはそれより多くの複製起点（ＯＲＩ）要素を含有する。いくつかの実施態様において、テンプレートは、２またはそれより多くのＯＲＩを含み、その場合、一方はある生物（例えば、細菌）において効率的に機能し、他方は別の生物（例えば、真核生物、例えば酵母）において効率的に機能する。いくつかの実施態様において、ＯＲＩは、ある種（例えば、Ｓ．セレビジエ）において効率的に機能する可能性があり、別のＯＲＩは、異なる種（例えば、Ｓ．ポンベなど）において効率的に機能する可能性がある。また核酸試薬は、時には、１つまたはそれより多くの転写調節部位も包含する。
【０１８２】
核酸試薬は、１つまたはそれより多くの選択要素（例えば、選択的に調節可能なプロモーター要素の活性化ではなく、核酸試薬の存在を選択するための要素）を包含していてもよい。選択要素は、多くの場合、核酸試薬が細胞に包含されているかどうかを決定する公知のプロセスを使用して利用される。いくつかの実施態様において、核酸試薬は、２種またはそれより多くの選択要素を包含し、その場合、一方はある生物において効率的に機能し、他方は別の生物において効率的に機能する。選択要素の例としては、これらに限定されないが、（１）別の状況では毒性の化合物（例えば、抗生物質）に対する耐性を提供する生成物をコードする核酸セグメント；（２）別の状況ではレシピエント細胞中で欠失している生成物（例えば、必須の生成物、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）をコードする核酸セグメント；（３）遺伝子産物の活性を抑制する生成物をコードする核酸セグメント；（４）容易に同定できる生成物（例えば、表現型マーカー、例えば抗生物質（例えば、β−ラクタマーゼ）、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、および細胞表面タンパク質）をコードする核酸セグメント；（５）別の状況では細胞の生存および／または機能に有害な生成物に結合する核酸セグメント；（６）別の状況では上記の１〜５番で説明された核酸セグメントのいずれかの活性を阻害する核酸セグメント（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）；（７）基質を改変する生成物に結合する核酸セグメント（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）；（８）望ましい分子を単離または同定するのに使用できる核酸セグメント（例えば、特異的なタンパク質結合部位）；（９）別の状況では非機能的な可能性がある特異的なヌクレオチド配列をコードする核酸セグメント（例えば、分子の部分集団のＰＣＲ増幅のための）；（１０）存在しない場合、特定の化合物に対する耐性または感受性を直接的または間接的に付与する核酸セグメント；（１１）レシピエント細胞において、毒性であるか、または比較的非毒性の化合物を毒性の化合物に変換するかのいずれかである生成物をコードする核酸セグメント（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）；（１２）それらを含有する核酸分子の複製、分割または遺伝を阻害する核酸セグメント；ならびに／または（１３）条件付きの複製機能、例えば、所定の宿主または宿主細胞株での、または所定の環境条件下での（例えば、温度、栄養条件および同種のもの）複製をコードする核酸セグメントが挙げられる。
【０１８３】
核酸試薬は、インビボでの転写および／または翻訳に有用なあらゆる形態を有する。核酸は、時には、プラスミド、例えばスーパーコイルプラスミドであり、時には、酵母人工染色体（例えば、ＹＡＣ）であり、時には、直鎖状の核酸（例えば、ＰＣＲまたは制限酵素消化によって生産された直鎖状の核酸）であり、時には、一本鎖であり、時には、二本鎖である。核酸試薬は、時には、増幅プロセス、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスまたは転写介在増幅プロセス（ＴＭＡ）によって調製される。ＴＭＡでは、等温反応で２種の酵素を使用して、光の放出によって検出される増幅産物を生産する（例えば、Biochemistry、1996年6月25日；35（25）：8429〜38およびwww.devicelink.com/ivdt/archive/00/11/007.htmlのｈｔｔｐアドレスを参照）。標準的なＰＣＲプロセスは公知であり（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号；４，６８３，１９５号；４，９６５，１８８号；および５，６５６，４９３号）、一般的に数サイクルで行われる。各サイクルは、ハイブリッド核酸が解離する熱変性；プライマーであるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする冷却；およびポリメラーゼ（すなわち、Ｔａｑポリメラーゼ）によるオリゴヌクレオチド伸長を包含する。ＰＣＲの周期的プロセスの例は、サンプルを９５℃で５分間処置すること；９５℃で１分間、５９℃で１分間、１０秒間、および７２℃で１分３０秒間を４５サイクル繰り返すこと；次いでサンプルを７２℃で５分間処置することである。複数のサイクルは、市販のサーマルサイクラーを使用して行われることが多い。ＰＣＲ増幅産物は、時には、より低温で（例えば、４℃で）所定時間保存され、時には、分析前に凍結させる（例えば、−２０℃で）。
【０１８４】
いくつかの実施態様において、本明細書で説明される核酸試薬、タンパク質試薬、タンパク質フラグメント試薬または他の試薬は、単離または精製される。用語「単離された」は、本明細書で使用される場合、材料がその元の環境（例えば、それが天然に存在するものの場合は天然の環境、または外因的に発現されるものの場合は宿主細胞）から取り出されることを指し、したがって「人為的に」その元の環境から変更された材料を指す。用語「精製された」は、本明細書で分子に関して使用される場合、絶対純度を意味しない。そうではなく、「精製された」は、対象の物質以外の同じクラスに含まれる物質種（例えば、核酸またはタンパク質種）の含量が、その元となるサンプルと比較してより少なくなっている組成を有する物質を指す。「精製された」は、例えば核酸またはタンパク質の場合、対象の核酸またはタンパク質以外の核酸種またはタンパク質種の含量が、その元となるサンプルと比較してより少なくなっている組成を有する物質を指す。時には、タンパク質または核酸は「実質的に純粋」であり、これは、そのタンパク質または核酸が、組成物の質量に基づき少なくとも５０％のタンパク質または核酸で存在することを示す。多くの場合、実質的に純粋なタンパク質または核酸は、組成物の質量に基づき少なくとも７５％、時には組成物の質量に基づき少なくとも９５％である。
【０１８５】
操作および変更方法（Engineering and Alteration Methods）
本明細書で説明される方法および組成物（例えば、核酸試薬）は、操作された微生物を生成するのに使用できる。上述したように、用語「操作された微生物」は、本明細書で使用される場合、改変のための開始点として利用される微生物（例えば、宿主微生物または改変されていない生物）中に存在する活性とは異なる１種またはそれより多くの活性を包含する改変された生物を指す。典型的には、通常、容易に利用できる技術を使用して当業者により導入または選択された遺伝学的改変の結果として操作された微生物が生じる。変更された活性を生成するのに有用な方法の非限定的な例としては、異種ポリヌクレオチドを導入すること（例えば、核酸または遺伝子統合、また「ノックイン」とも称される）、内因性ポリヌクレオチドを除去すること、既存の内因性核酸配列の配列を変更すること（例えば、部位特異的変異誘発）、既存の内因性核酸配列の破壊（例えば、ノックアウトおよびトランスポゾンまたは挿入要素が介在する変異誘発）、選択により安定して遺伝する可能性がある天然に存在する活性において変化が引き起こされる、変更された活性に関する選択（例えば、生物のゲノム中、または複製されて娘細胞に継承される後成的な核酸中での核酸配列の変化を引き起こす）、ＰＣＲベースの変異誘発および同種のものが挙げられる。用語「変異誘発」は、本明細書で使用される場合、その後宿主または改変された生物において生成物を生成させるのに使用される核酸（例えば、核酸試薬、または宿主染色体）へのあらゆる改変を指す。変異誘発の非限定的な例としては、欠失、挿入、置換、再構成、点突然変異、サプレッサー変異および同種のものが挙げられる。変異誘発方法は当業界公知であり、技術者にとって容易に利用できるものである。変異誘発方法の非限定的な例が本明細書で説明されており、また、Maniatis, T.、E. F. FritschおよびJ. Sambrook（1982）Molecular Cloning：a Laboratory Manual；コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーでも見出すことができる。変異誘発の他の非限定的な例は、ストラタジーン（Stratagene）（カリフォルニア州サンディエゴ）「クイックチェンジ（QuickChange）」キットを製造元の説明書に従って使用して行うことができる。
【０１８６】
用語「遺伝学的改変」は、本明細書で使用される場合、操作された微生物における標的脂肪族ジカルボン酸生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産を容易にするあらゆる好適な核酸の付加、除去または変更を指す。遺伝学的改変としては、これらに限定されないが、１つまたはそれより多くの位置における宿主生物の天然の核酸中の１つまたはそれより多くのヌクレオチドの挿入、１つまたはそれより多くの位置における宿主生物の天然の核酸中の１つまたはそれより多くのヌクレオチドの欠失、１つまたはそれより多くの位置における宿主生物の天然の核酸中の１つまたはそれより多くのヌクレオチドの改変もしくは置換、宿主生物への非天然の核酸の挿入（例えば、自律複製ベクターの挿入）、および宿主生物における非天然の核酸の除去（例えば、ベクターの除去）が挙げられる。
【０１８７】
用語「異種ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、いくつかの実施態様において、宿主微生物中に存在しないヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、宿主微生物の場合とは異なる量（例えば、異なるコピー数）で存在し、これは、例えば、宿主微生物に特定のヌクレオチド配列のより多くのコピーを導入することによって達成できる（例えば、特定のヌクレオチド配列は、宿主染色体の自律的な核酸中に存在していてもよいし、または染色体に挿入されてもよい）。異種ポリヌクレオチドは、いくつかの実施態様において、異なる生物由来であり、いくつかの実施態様において、同じタイプの生物由来であるが、外部の源（例えば、組換え源）由来である。
【０１８８】
いくつかの実施態様において、本明細書で説明される方法および核酸試薬を使用して操作された生物は、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）を生産できる。いくつかの実施態様において、本明細書で説明される脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）を生産する操作された微生物は、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、脂肪酸シンターゼ活性、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性およびモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性からなる群より選択される１つまたはそれより多くの変更された活性を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、本明細書で説明されるような操作された微生物は、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、脂肪酸シンターゼ活性、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性およびモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性を追加するかまたは増加させる遺伝学的改変を含んでいてもよい。
【０１８９】
いくつかの実施態様において、本明細書で説明される操作された微生物は、変更されたチオエステラーゼ活性を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、操作された微生物は、チオエステラーゼ活性を追加するかまたは増加させる遺伝子変更を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、チオエステラーゼ活性を追加するかまたは増加させる遺伝子変更を含む操作された微生物は、チオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。
【０１９０】
用語「変更された活性」は、本明細書で使用される場合、操作された微生物における、宿主微生物と比べて追加または改変された活性（例えば、追加された、増加した、低減された、阻害された、または除去された活性）を指す。活性は、追加された、増加した、低減された、阻害された、または除去された活性を有する操作された微生物が産出する遺伝学的改変を宿主微生物に導入することによって変更されてもよい。
【０１９１】
追加された活性は、多くの場合、宿主微生物では検出不可能な活性である。増加した活性は、一般的に、操作された微生物において増加した、宿主微生物において検出可能な活性である。活性は、標的脂肪族ジカルボン酸生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産に関してあらゆる好適なレベルに増加させることができ、このような増加としては、これらに限定されないが、２倍未満（例えば、約１０％の増加から約９９％の増加；約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の増加）、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、もしくは１０倍の増加、または約１０倍より多くの増加が挙げられる。低減された活性または阻害された活性は、一般的に、操作された微生物において低減または阻害された、宿主微生物において検出可能な活性である。活性は、いくつかの実施態様において、検出不可能なレベルに低減される場合もあるし、またはいくつかの実施態様において、検出可能なレベルに低減される場合もある。活性は、標的脂肪族ジカルボン酸生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産に関してあらゆる好適なレベルに減少させることができ、このような減少としては、これらに限定されないが、２倍未満（例えば、約１０％の減少から約９９％の減少；約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の減少）、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、もしくは１０倍の減少、または約１０倍より多くの減少が挙げられる。
【０１９２】
変更された活性は、時には、宿主生物において検出不可能な活性であって、操作された生物に追加される活性である。変更された活性はまた、宿主生物において検出可能な活性であって、操作された生物において増加する活性であってもよい。いくつかの実施態様において、活性は、標的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数を増加させることによって追加されるかまたは増加してもよい。いくつかの実施態様において、天然ポリペプチドの活性は、改変された生物中で該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数を増加させること（例えば、ポリヌクレオチドの１〜約１００個の追加のコピーを導入すること（例えば、ポリヌクレオチドの、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０個またはそれより多くの追加のコピーを導入すること）によって増加させることができる。いくつかの実施態様において、活性は、追加された活性を有する異種ポリペプチドをコードする、または改変された内因性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主微生物に挿入することによって追加または増加させることができる。このような実施態様において、ポリヌクレオチドの１〜約１００個のコピーを導入してもよい（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０個のコピーを導入してもよい）。「改変された内因性ポリペプチド」は、多くの場合、天然ポリペプチド対応物の活性とは異なる活性（例えば、異なる触媒活性および／または異なる基質特異性）を有し、多くの場合、活性である（例えば、活性（例えば、基質の転換）は、検出可能である）。いくつかの実施態様において、活性は、（ｉ）追加された活性を有するポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドに作動可能に連結され、（ｉｉ）ポリヌクレオチド生産をアップレギュレートする異種ポリヌクレオチドを宿主微生物に挿入することによって追加または増加できる。したがって、活性は、標的活性を有するポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節性ポリヌクレオチドを挿入するか、またはそれを改変することによって追加または増加できる。いくつかの実施態様において、活性は、宿主微生物を選択的な環境に晒して、標的活性の検出可能なレベルを有する微生物に関してスクリーニングすることによって追加または増加できる。選択的な環境の例としては、これらに限定されないが、宿主生物がプロセシングできる基質を含有する培地、および宿主生物がプロセシングできる基質が欠失した培地が挙げられる。
【０１９３】
変更された活性は、時には、宿主生物において検出可能な活性であって、操作された生物において低減、阻害または除去された（すなわち、検出不可能な）活性である。いくつかの実施態様において、活性は、標的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数を減少させることによって低減または除去してもよい。いくつかの実施態様において、活性は、（ｉ）標的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド内にポリヌクレオチドを挿入すること（破壊的挿入）、および／または（ｉｉ）標的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部または全部を除去すること（それぞれ欠失またはノックアウト）によって低減または除去できる。いくつかの実施態様において、活性は、（ｉ）標的活性を有するポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドに作動可能に連結され、（ｉｉ）ポリヌクレオチド生産をダウンレギュレートする異種ポリヌクレオチドを宿主微生物に挿入することによって低減または除去できる。したがって、活性は、標的活性を有するポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節性ポリヌクレオチドを挿入するか、またはそれを改変することによって低減または除去できる。
【０１９４】
活性はまた、（ｉ）その活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを阻害すること、または（ｉｉ）その活性を有するポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを阻害することによっても低減または除去できる。ポリヌクレオチドは、当業界公知の好適な技術によって阻害でき、例えばポリヌクレオチドによってコードされたＲＮＡを、特異的な阻害性ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム）と接触させることによって阻害できる。活性はまた、その活性を有するポリペプチドを、その活性を特異的に阻害する分子（例えば、酵素阻害剤、抗体）と接触させることによっても低減または除去できる。いくつかの実施態様において、活性は、宿主微生物を選択的な環境に晒し、標的活性のレベルが低減されたかまたは標的活性が除去された微生物に関してスクリーニングすることによって低減または除去できる。
【０１９５】
いくつかの実施態様において、非翻訳リボ核酸、またはｃＤＮＡは、特定の活性または酵素の発現を低減させるのに使用できる。例えば、微生物は、対象の活性をコードする対象の核酸配列に部分的または実質的に相同なＲＮＡ分子を生産することによって活性の発現を低減させる核酸試薬を発現させる遺伝学的改変によって操作されてもよい。いくつかの実施態様において、ＲＮＡ分子は、対象の核酸配列に結合して、核酸配列がその天然の機能を発揮しないようにすることができる。いくつかの実施態様において、ＲＮＡは、対象の核酸配列がその天然の機能を発揮できなくなるような方式で（例えば、リボザイムの作用によって）対象の活性をコードする対象の核酸配列を変更する可能性がある。
【０１９６】
いくつかの実施態様において、ヌクレオチド配列が、時には、プロモーター、５’ＵＴＲ、標的配列、または３’ＵＴＲ要素などの核酸試薬要素のうち１またはそれより多くに付加される、それらから改変または除去されることにより、このような要素が核酸試薬に取り込まれる前または後に、転写および／または翻訳が強化される、強化される可能性がある、低減される、または低減される可能性がある。いくつかの実施態様において、以下の配列：安定な２次構造を形成する配列（例えば、四重構造またはステム・ループ・ステム構造（例えば、ＥＭＢＬ配列であるＸ１２９４９、ＡＦ２７４９５４、ＡＦ１３９９８０、ＡＦ１５２９６１、Ｓ９５９３６、Ｕ１９４１４４、ＡＦ１１６６４９、またはこのようなステム・ループ・ステム構造を形成する実質的に同一な配列））；標的ヌクレオチド配列の開始コドン上流の翻訳開始コドン；標的ヌクレオチド配列の翻訳開始コドン上流の終止コドン；標的ヌクレオチド配列の翻訳開始コドン上流のＯＲＦ；鉄応答要素（ＩＲＥ）または類似の配列；および５’末端オリゴピリミジン配列（ＴＯＰ、例えば、キャップに隣接する５−１５ピリミジンからなる配列）のうち１種またはそれより多くが、５’ＵＴＲ中に存在する場合、改変または除去される可能性がある。翻訳エンハンサー配列および／または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が、時には、５’ＵＴＲ（例えば、ＥＭＢＬヌクレオチド配列であるＪ０４５１３、Ｘ８７９４９、Ｍ９５８２５、Ｍ１２７８３、ＡＦ０２５８４１、ＡＦ０１３２６３、ＡＦ００６８２２、Ｍ１７１６９、Ｍ１３４４０、Ｍ２２４２７、Ｄ１４８３８およびＭ１７４４６、ならびに実質的に同一なヌクレオチド配列）に挿入される。
【０１９７】
非センスコドンの後に続くＡＵリッチ要素（ＡＲＥ、例えば、ＡＵＵＵＡ反復配列）および／またはスプライシングジャンクションは、時には、３’ＵＴＲから除去されるか、または３’ＵＴＲにおいて改変される。ポリアデノシンテールは、時には、存在しない場合、３’ＵＴＲに挿入され、時には、存在する場合、除去され、アデノシン部分は、時には、３’ＵＴＲ中に存在するポリアデノシンテールに付加されるか、またはそれから除去される。したがって、いくつかの実施態様は、翻訳効率が増加される、増加される可能性がある、低減される、または低減される可能性がある何らかのヌクレオチド配列が要素中に存在するかどうかを決定すること、およびそれらが同定された場合、このような配列のうち１またはそれより多くを付加、除去、または改変することを含むプロセスを対象とする。所定の実施態様は、翻訳効率を増加させる、または、増加させる可能性がある何らかのヌクレオチド配列が要素中に存在しないかどうかを決定すること、および核酸試薬にこのような配列を取り込むことを含むプロセスを対象とする。
【０１９８】
いくつかの実施態様において、活性は、ＯＲＦのヌクレオチド配列を改変することによって変更されてもよい。時には、（例えば、点変異、欠失突然変異、挿入突然変異、ＰＣＲベースの変異誘発および同種のものによって）ＯＲＦを突然変異または改変することにより、コードされたタンパク質またはペプチドの活性が、変更される、強化される、または増加される、低減される、実質的に低減もしくは除去される。改変されたＯＲＦによってコードされたタンパク質またはペプチドは、時には、より低い量で生産されるか、または検出可能なレベルで生産されない場合もあり、他の実施態様において、改変されたＯＲＦによってコードされた生成物またはタンパク質は、より高いレベルで生産される（例えば、時には、宿主生物または操作された生物において優先的に使用されるｔＲＮＡに適合するように、コドンが改変される）。相対的な活性を決定するために、突然変異したＯＲＦ（またはそれを含有する細胞）の生成物からの活性を、改変されていないＯＲＦ（またはそれを含有する細胞）によってコードされた生成物またはタンパク質の活性と比較してもよい。
【０１９９】
いくつかの実施態様において、時には、ＯＲＦのヌクレオチド配列を突然変異または改変することにより、アミノ酸をコードするのに使用される三つ組みのヌクレオチド配列（例えば、アミノ酸コドンの三つ組み）を変更する。コドンの三つ組みを変更するためのＯＲＦのヌクレオチド配列改変は、時には、ＯＲＦまたは核酸試薬が発現されると予想される生物の好ましいコドン使用頻度をよりよくマッチングするために元の配列に見出されるコドンを変化させるのに使用される。細菌におけるコドン使用頻度、したがって核酸配列によってコードされたコドンの三つ組みは、例えば酵母または植物のような真核生物において好ましいコドン使用頻度とは異なっている可能性がある。好ましいコドン使用頻度もまた、細菌種間でも異なっている可能性がある。いくつかの実施態様において、ＯＲＦのヌクレオチド配列は、時には、コドン対が除去される、および／またはＯＲＦのヌクレオチド配列によってコードされたｍＲＮＡの翻訳中に中断を引き起こす可能性があるｍＲＮＡの２次構造が除去されるように改変される。翻訳の中断は、時には、ｍＲＮＡ中に核酸の２次構造が存在する場合に起こり、時には、リボソームの中断を引き起こすことによって翻訳速度を遅くするコドン対の存在に起因して起こる。いくつかの実施態様において、より低い存在量のコドンの三つ組みを使用すれば、リボソーム翻訳機構にｔＲＮＡを入れるのに必要な中断時間が短縮されるため、翻訳の中断を少なくすることができる。それゆえに、細菌における転写および翻訳効率を増加させるためには（例えば、転写および翻訳が同時に起こる場合）または真核生物において翻訳効率を増加させるためには（例えば、転写および翻訳が機能的に別個になっている場合）、対象のヌクレオチド配列のヌクレオチド配列は、宿主および／または遺伝子改変微生物の転写および／または翻訳機構により適するように変更されてもよい。いくつかの実施態様において、リボソームを低速化したりまたは中断させたりするより低い存在量のコドンを使用することによる翻訳速度の遅延により、正確に折り畳まれたタンパク質の増加と封入体形成の低減によってより高い収量の望ましい生成物が得られる可能性がある。
【０２００】
ドナー生物のヌクレオチド配列のコドン分布を決定して、そのコドン分布を、レシピエントまたは宿主生物におけるコドン分布と比較することによって、所定の生物により、好ましい使用に従ってコドンを変更して最適化してもよい。次いで本明細書で説明される技術（例えば、部位特異的変異誘発および同種のもの）を使用して、それに従いコドンを変更してもよい。コドン使用頻度の比較は、手作業でなされるか、または技術者に市販されている核酸分析ソフトウェアを使用してなされる。
【０２０１】
またＯＲＦのヌクレオチド配列の改変は、異なる生物において相違するコドンの三つ組み配列を修正するのにも使用できる。例えば、所定の酵母（例えば、Ｃ．トロピカリスおよびＣ．マルトサ（C. maltosa））は、セリンをコードするためには、アミノ酸三つ組みＣＵＧ（例えば、ＤＮＡ配列ではＣＴＧ）を使用する。典型的には、ＣＵＧは、ほとんどの生物ではロイシンをコードする。得られたポリペプチドまたはタンパク質中で正しいアミノ酸を維持するために、核酸試薬が発現されると予想される生物を考慮してＣＵＧコドンを変更しなければならない。したがって、細菌ドナーからのＯＲＦを上述のカンジダ属の酵母株のいずれかで発現させようとするならば、まず異種ヌクレオチド配列を適切なロイシンコドンに変更または改変しなければならない。それゆえに、いくつかの実施態様において、ＯＲＦのヌクレオチド配列は、時には、異なる生物間のアミノ酸のコドン三つ組みの進化において生じた差が修正されるように変更または改変される。いくつかの実施態様において、コードされたアミノ酸が保存的であるか、または元々コードされていたアミノ酸と比較してアミノ酸中で中立的な変化である場合、ヌクレオチド配列を特定のアミノ酸コドンで不変のままにしてもよい。
【０２０２】
いくつかの実施態様において、活性は、例えば終止コドンのような翻訳調節シグナルを改変することによって変更されてもよい。ＯＲＦの末端における終止コドンは、時には、上記で説明したアンバー終止コドンなどの別の終止コドンに改変される。いくつかの実施態様において、終止コドンは、時には、挿入または既存のコドンの突然変異によってＯＲＦ内に導入される。改変された末端終止コドンおよび／または内部終止コドンを含むＯＲＦは、多くの場合、終止コドンを認識するサプレッサーｔＲＮＡを含む系中で翻訳される。終止コドンを含むＯＲＦは、時には、標的タンパク質または標的ペプチドの翻訳中に非天然アミノ酸を取り込むサプレッサーｔＲＮＡを含む系中で翻訳される。標的タンパク質またはペプチドに非天然アミノ酸を取り込む方法は公知であり、このような方法としては、例えば、異種ｔＲＮＡ／シンセターゼ対を利用するプロセスが挙げられ、この場合、ｔＲＮＡは、アンバー終止コドンを認識し、非天然アミノ酸と共に充填される（例えば、ワールドワイドウェブＵＲＬのiupac.org/news/prize/2003/wang.pdf）。
【０２０３】
変更（例えば、変異誘発、導入または欠失による）のために選ばれる核酸試薬の部分（例えば、プロモーター、５’または３’ＵＴＲ、ＯＲＩ、ＯＲＦおよび同種のもの）に応じて、上記で説明した改変は、（ｉ）フィードバック阻害メカニズムを増加または減少させること、（ｉｉ）プロモーターの開始を増加または減少させること、（ｉｉｉ）翻訳開始を増加または減少させること、（ｉｖ）翻訳効率を増加または減少させること、（ｖ）本明細書で説明される核酸試薬から発現されるペプチドまたは生成物の局在化を改変すること、または（ｖｉ）対象のヌクレオチド配列のコピー数を増加または減少させること、（ｖｉｉ）アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、リボザイムおよび同種のものの発現によって所定の活性を変更できる。いくつかの実施態様において、核酸試薬またはヌクレオチド配列の変更は、フィードバック阻害に関与する領域（例えば、５’ＵＴＲ、プロモーターおよび同種のもの）を変更できる。時には、フィードバックレギュレーターの結合を追加または強化できる改変がなされ、時には、フィードバックレギュレーターの結合を低減させる、阻害する、または除去することができる改変がなされる。
【０２０４】
いくつかの実施態様において、核酸試薬またはヌクレオチド配列の変更は、転写開始に関与する配列（例えば、プロモーター、５’ＵＴＲおよび同種のもの）を変更できる。時には、内因性または異種プロモーター要素からの開始を強化または増加させることができる改変がなされてもよい。時には、転写開始を増加または強化して、結果として内因性または異種プロモーター要素からの転写の減少または除去を引き起こす配列を除去または破壊する改変がなされてもよい。
【０２０５】
いくつかの実施態様において、核酸試薬またはヌクレオチド配列の変更は、翻訳開始または翻訳効率に関与する配列（例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、より高いまたはより低い存在量のコドンの三つ組み、翻訳ターミネーター配列および同種のもの）を変更できる。時には、翻訳開始を増加または減少させて、例えばリボソーム結合部位を改変できる改変がなされてもよい。時には、翻訳効率を増加または減少させることができる改変がなされてもよい。翻訳開始および翻訳効率を変更するためになされ得る遺伝学的改変の非限定的な例は、ヘアピンを形成する配列を除去または付加して、程度の差はあるが好ましいコドンにコドンの三つ組みを変化させることである。
【０２０６】
いくつかの実施態様において、核酸試薬またはヌクレオチド配列の変更は、ペプチド、タンパク質または他の望ましい生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸など）の局在化に関与する配列を変更できる。時には、細胞内の細胞器官、ペリプラスム、細胞膜、または細胞外にポリペプチド、タンパク質または生成物を標的化することに関与する配列を変更、付加、または除去できる改変がなされてもよい。異なる細胞内空間または細胞外への異種生成物の輸送は、時には、封入体（例えば、望ましい生成物の不溶性集合体）の形成を低減または除去する可能性がある。
【０２０７】
いくつかの実施態様において、核酸試薬またはヌクレオチド配列の変更は、対象のヌクレオチド配列のコピー数を増加または減少させることに関与する配列を変更できる。時には、生物のゲノムに、または後成的な核酸試薬上に安定して統合されるＯＲＦのコピー数を増加または減少させる改変がなされてもよい。対象の配列のコピー数を増加させることができる変更の非限定的な例としては、ゲノム中の領域の複製によって（例えば、組換えによって、または宿主ゲノムの遺伝子増幅を引き起こすことによって追加のコピーを付加することなど）対象の配列のコピーを追加すること、核酸試薬上に配列の追加のコピーをクローニングすること、または後成的な核酸試薬のコピー数が増加するようにＯＲＩを変更することが挙げられる。対象の配列のコピー数を減少させることができる変更の非限定的な例としては、ゲノム中の領域の欠失または破壊によって対象の配列のコピーを除去すること、後成的な核酸試薬から該配列の追加のコピーを除去すること、または後成的な核酸試薬のコピー数が減少するようにＯＲＩを変更することが挙げられる。
【０２０８】
いくつかの実施態様において、対象のヌクレオチド配列の発現を増加または減少させることは、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、リボザイムおよび同種のものの発現に関与する配列を変更、付加または除去することによっても達成できる。上記で説明した方法は、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、リボザイムおよび同種のものの発現を改変するのに使用できる。
【０２０９】
本明細書で説明される方法および核酸試薬は、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）の合成に関与する細胞プロセスにおいて変更された活性を有する遺伝子改変微生物を生成するのに使用できる。いくつかの実施態様において、本明細書で説明される操作された微生物は、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドの増加したコピー数を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、本明細書で説明される操作された微生物は、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドの増加したコピー数を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、本明細書で説明される操作された微生物は、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、本明細書で説明される操作された微生物は、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、細菌由来であってもよい。いくつかの実施態様において、細菌は、アシネトバクター属、ノカルジア属、シュードモナス属またはザントバクター属の細菌であってもよい。
【０２１０】
いくつかの実施態様において、本明細書で説明される操作された微生物は、モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、細菌由来であってもよい。いくつかの実施態様において、細菌は、バチルス属の細菌であってもよい。いくつかの実施態様において、バチルス属の細菌は、Ｂ．メガテリウムである。
【０２１１】
いくつかの実施態様において、本明細書で説明される操作された微生物は、オメガヒドロキシル脂肪酸の変換を低減させる遺伝学的改変を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、該遺伝学的改変は、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を低減させることができる。いくつかの実施態様において、本明細書で説明される操作された微生物は、ベータ酸化活性を低減させる遺伝学的改変を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、該遺伝学的改変は、本明細書で説明される標的活性を低減させることができる。
【０２１２】
いくつかの実施態様において、本明細書で説明されるような脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）を生産する操作された微生物は、変更されたモノオキシゲナーゼ活性を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、本明細書で説明される操作された微生物は、モノオキシゲナーゼ活性を変更する遺伝学的改変を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、本明細書で説明される操作された微生物は、モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドの増加したコピー数を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、本明細書で説明される操作された微生物は、モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、細菌由来であってもよい。いくつかの実施態様において、細菌は、バチルス属の細菌であってもよい。いくつかの実施態様において、バチルス属の細菌は、Ｂ．メガテリウムである。いくつかの実施態様において、該遺伝学的改変は、ポリケチドシンターゼ活性を低減させることができる。
【０２１３】
いくつかの実施態様において、本明細書で説明されるような脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）を生産する操作された微生物は、変更されたチオエステラーゼ活性を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、操作された微生物は、チオエステラーゼ活性を追加するかまたは増加させる遺伝学的改変を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、操作された微生物は、チオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含んでいてもよい。
【０２１４】
いくつかの実施態様において、変更されたチオエステラーゼ活性を有する操作された微生物は、変更されたオメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、変更されたチオエステラーゼ活性を有する操作された微生物は、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を追加するかまたは増加させる遺伝学的改変を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、操作された微生物は、変更されたオメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、細菌由来であってもよい。いくつかの実施態様において、細菌は、アシネトバクター属、ノカルジア属、シュードモナス属またはザントバクター属の細菌であってもよい。
【０２１５】
本明細書で説明されるような脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）を生産する操作された微生物は、変更されたオメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、操作された微生物は、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を追加するかまたは増加させる遺伝学的改変を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、操作された微生物は、変更されたオメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、細菌由来である。いくつかの実施態様において、細菌は、アシネトバクター属、ノカルジア属、シュードモナス属またはザントバクター属の細菌であってもよい。いくつかの実施態様において、操作された微生物は、真核生物であってもよい。いくつかの実施態様において、真核生物は、酵母であってもよい。いくつかの実施態様において、真核生物は、真菌であってもよい。いくつかの実施態様において、酵母は、カンジダ属の酵母であってもよい。いくつかの実施態様において、カンジダ属の酵母は、Ｃ．トロピカリスであってもよい。いくつかの実施態様において、真菌は、ヤロウイア属の真菌であってもよい。いくつかの実施態様において、ヤロウイア属の真菌は、Ｙ．リポリチカであってもよい。いくつかの実施態様において、真菌は、アスペルギルス属の真菌であってもよい。いくつかの実施態様において、アスペルギルス属の真菌は、Ａ．パラスティカスまたはＡ．ニデュランスであってもよい。いくつかの実施態様において、上述したような操作された微生物は、オメガヒドロキシル脂肪酸の変換を低減させる遺伝学的改変を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、該遺伝学的改変は、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を低減させることができる。いくつかの実施態様において、該遺伝学的改変は、ベータ酸化活性を低減させることができる。いくつかの実施態様において、該遺伝学的改変は、本明細書で説明される標的活性を低減させることができる。
【０２１６】
操作された微生物は、上述したように、宿主ゲノム中に、または安定して維持される後成的な核酸試薬中にヌクレオチド配列を変更、導入または除去することによって調製できる。宿主ゲノムまたは後成的な核酸中にヌクレオチド配列を変更、導入または除去するのに使用される核酸試薬は、本明細書で説明される方法または技術者に利用可能な方法を使用して調製できる。
【０２１７】
望ましい活性を有する核酸配列は、公知の参考マニュアルで説明されている溶解および核酸精製手法を使用して（例えば、Maniatis, T.、E. F. FritschおよびJ. Sambrook（1982）Molecular Cloning：a Laboratory Manual；コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）、または市販の細胞溶解およびＤＮＡ精製試薬およびキットを使用して好適な生物の細胞から単離できる。いくつかの実施態様において、微生物を操作するのに使用される核酸は、その核酸を含有する生物をプロセシングした後に本明細書で説明される方法を行うために提供できる。例えば、対象の核酸は、サンプルから（例えば、対象の生物から、または酵母もしくは細菌などの対象の生物を複数含有する培養物から）抽出、単離、精製または増幅されてもよい。用語「単離された」は、本明細書で使用される場合、その元の環境（例えば、それが天然に存在するものの場合は天然の環境、または外因的に発現されるものの場合は宿主細胞）から取り出された核酸を指し、したがって「人為的に」その元の環境から変更された核酸を指す。単離された核酸は、一般的に、源サンプル中に存在する成分の量よりも少ない量の非核酸成分（例えば、タンパク質、脂質）と共に提供される。単離されたサンプル核酸を含む組成物は、実質的に単離されていてもよい（例えば、非核酸成分の約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％超を含まない）。用語「精製された」は、本明細書で使用される場合、サンプル核酸が得られるサンプル源中よりも少ない核酸種を含有するサンプル核酸が提供されることを指す。サンプル核酸を含む組成物は、実質的に精製されていてもよい（例えば、他の核酸種の約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％超を含まない）。用語「増幅された」は、本明細書で使用される場合、サンプル中の核酸のヌクレオチド配列またはそれらの一部と同じまたは実質的に同じヌクレオチド配列を有するアンプリコン核酸を直線的または指数関数的に生成するプロセスで、細胞、生物またはサンプルの核酸を処理することを指す。上述したように、本明細書で説明されるような核酸試薬を調製するのに使用される核酸は、フラグメント化または切断されてもよい。
【０２１８】
核酸の増幅は、時には、培養が難しい生物を扱う場合に必要である。増幅が望ましい可能性がある場合、あらゆる好適な増幅技術を利用できる。ポリヌクレオチド増幅方法の非限定的な例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；ライゲーション増幅（またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ））；Ｑ−ベータレプリカーゼまたはテンプレート依存性ポリメラーゼの使用に基づく増幅方法（米国特許公報ＵＳ２００５０２８７５９２号を参照）；ヘリカーゼ依存性等温増幅（Vincentら、「Helicase-dependent isothermal DNA amplification」. EMBO report 5（8）：795〜800（2004））；鎖置換増幅（ＳＤＡ）；好熱性ＳＤＡ核酸配列ベースの増幅（３ＳＲまたはＮＡＳＢＡ）および転写関連増幅（ＴＡＡ）が挙げられる。ＰＣＲ増幅方法の非限定的な例としては、標準的なＰＣＲ、ＡＦＬＰ−ＰＣＲ、対立遺伝子特異的なＰＣＲ、Ａｌｕ−ＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、コロニーＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、逆ＰＣＲ（ＩＰＣＲ）、インサイチュＰＣＲ（ＩＳＨ）、配列間特異的ＰＣＲ（Intersequence-specific PCR）（ＩＳＳＲ−ＰＣＲ）、ロングＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量ＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、シングルセルＰＣＲ、固相ＰＣＲ、それらの組み合わせ、および同種のものが挙げられる。ＰＣＲを行うための試薬およびハードウェアは市販されている。
【０２１９】
上記で列挙した様々なタイプのＰＣＲを行うためのプロトコールは、技術者にとって容易に入手できる。ＰＣＲ条件は、プライマーの配列、標的の存在量、および増幅の望ましい量によって左右される可能性があるため、当業者は、利用可能な多数のＰＣＲプロトコールから選択することが可能である（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および４，６８３，２０２号；およびPCR Protocols：A Guide to Methods and Applications、Innisら編、1990を参照）。ＰＣＲは、多くの場合、熱安定性酵素を用いた自動プロセスとして実行される。このプロセスにおいて、反応混合物の温度は、変性領域、プライマー−アニーリング領域、および伸長反応領域を通じて自動的にサイクル化される。この目的に特化させた機械が市販されている。本明細書で説明される実施態様に適している可能性があるＰＣＲプロトコールの非限定的な例は、９５℃で５分間サンプルを処置すること；９５℃で１分間、５９℃で１分間、１０秒間、および７２℃で１分３０秒間を４５サイクル繰り返すこと；次いでサンプルを７２℃で５分間処置することである。追加のＰＣＲプロトコールは、実施例の章で説明される。複数のサイクルは、市販のサーマルサイクラーを使用して行われることが多い。いくつかの実施態様において、当業者公知の、および当業者によって選択された好適な等温増幅プロセスが適用されてもよい。いくつかの実施態様において、望ましい活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、本明細書で説明される配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドまたはプライマーを使用して望ましい活性を有する生物から望ましい配列を増幅することによって単離できる。
【０２２０】
増幅、単離および／または精製された核酸は、本明細書における図面で説明した組換えＤＮＡベクターにクローニングしてもよいし、または好適な市販の組換えＤＮＡベクターにクローニングしてもよい。組換えＤＮＡベクターへの対象の核酸配列のクローニングは、核酸試薬調製のための核酸のさらなる操作（例えば、変異誘発、相同組換え、増幅および同種のものによるヌクレオチド配列の変更）を容易にする可能性がある。標準的なクローニング手法（例えば、酵素的消化、ライゲーションおよび同種のもの）は公知である（例えば、Maniatis, T.、E. F. FritschおよびJ. Sambrook（1982）Molecular Cloning：a Laboratory Manual；コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーで説明されている）。
【０２２１】
いくつかの実施態様において、単離または増幅によって調製された核酸配列を使用して、さらなる改変をまったく使用しないで微生物に活性を追加し、それによって遺伝子改変または操作された微生物を作製できる。いくつかの実施態様において、単離または増幅によって調製された核酸配列を遺伝子改変して、望ましい活性を変更する（例えば、増加または減少させる）ことができる。いくつかの実施態様において、核酸を使用して、生物に活性を追加し、時には遺伝子改変して、望ましい活性（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）をコードする異種ポリヌクレオチド配列を最適化する。用語「最適化」は、本明細書で使用される場合、好ましいコドン使用頻度によって発現を増加させるかまたは強化するための変更を指す場合がある。最適化という用語はまた、活性がポリペプチドまたはタンパク質の「天然」型と比較してより高い触媒活性を示すようにポリペプチドまたはタンパク質の活性を増加させるためのアミノ酸配列への改変を指す場合もある。
【０２２２】
対象の核酸配列は、当業界公知の方法を使用して遺伝子改変が可能である。変異誘発技術は、スモールスケール（例えば、１、２、５、１０個またはそれより多くのヌクレオチド）またはラージスケール（例えば、５０、１００、１５０、２００、５００個、またはそれより多くのヌクレオチド）の遺伝学的改変に特に有用である。技術者は、変異誘発により、自然に（例えば、選択およびスクリーニングを使用した単離）、または実験的に化学物質、放射線もしくは不正確なＤＮＡ複製（例えば、ＰＣＲ変異誘発）の使用によってのいずれかで安定な方式で生物の遺伝情報を変更することが可能になる。いくつかの実施態様において、遺伝学的改変は、参照配列として天然のヌクレオチド配列を使用した全体規模の核酸の合成的合成、および望ましい活性の変更をもたらす可能性があるヌクレオチドの改変によって行うことができる。変異誘発方法は、時には、特異的な領域またはヌクレオチドに特異的であるか、または標的化される（例えば、部位特異的変異誘発、ＰＣＲベースの部位特異的変異誘発、およびインビトロでの変異誘発技術、例えばトランスプレイスメント（transplacement）およびインビボでのオリゴヌクレオチド部位特異的変異誘発）。変異誘発方法は、時には、遺伝学的改変の配置に関して非特異的またはランダムである（例えば、化学的突然変異誘発、挿入要素（例えば、挿入またはトランスポゾン要素）および不正確なＰＣＲベースの方法）。
【０２２３】
部位特異的変異誘発は、ＤＮＡ分子中の特異的なヌクレオチドまたは特異的なヌクレオチドが突然変異したりまたは変更されたりする手法である。部位特異的変異誘発は、典型的には、環状のプラスミドベクターにクローニングした対象の核酸配列を使用して行われる。部位特異的変異誘発は、野生型の配列が公知であり遺伝子変更のためのプラットフォームとして使用されていることを必要とする。部位特異的変異誘発は、望ましい遺伝学的改変が対象のヌクレオチド配列の相補物に取り込まれているオリゴヌクレオチドを使用して行うことができることから、この技術は、時には、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発とも称される。野生型の配列および変更されたヌクレオチドはハイブリダイズが可能であり、ハイブリダイズした核酸をＤＮＡポリメラーゼを使用して伸長して複製する。二本鎖核酸は、宿主（例えば、大腸菌）に導入され、さらなる一連の複製がインビボで実行される。次いで突然変異した核酸配列を有する形質転換細胞が選択され、および／または正確に変異誘発された配列を有する細胞に関してスクリーニングされる。部位特異的変異誘発技術のさらなる改変法は、カセット変異誘発およびＰＣＲベースの部位特異的変異誘発である。部位特異的変異誘発は、インビボで行うこともできる（例えば、トランスプレイスメント「ポップイン・ポップアウト（pop-in pop-out）」、インビボでの合成オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異誘発および同種のものなど）。
【０２２４】
ＰＣＲベースの変異誘発は、望ましい突然変異または突然変異を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲを使用して行うことができる。この技術は、微生物宿主におけるクローンの複製および選択の代わりにサーモサイクラーおよびＰＣＲ条件が使用されることを除いて、標準的な部位特異的変異誘発に類似した方式で機能する。ＰＣＲベースの変異誘発も環状のプラスミドベクターを使用するため、標準的な電気泳動的手法を使用して十分な回数のサーモサイクラー増幅が行われた後に、取り込まれた遺伝学的改変を含有する増幅フラグメント（例えば、直線状の核酸分子）を、テンプレート配列を含有するプラスミドから分離できる。この方法の改変は、プラスミド全体を増幅する線形増幅方法および突然変異誘発性プライマー対を使用する。この手法は、インビボで複製されたＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩに対して感受性にする大腸菌Ｄａｍメチラーゼ系を利用する。ＰＣＲ合成されたＤＮＡはメチル化されないため、ＤｐｎＩ耐性である。このアプローチは、テンプレートプラスミドを消化して遺伝子改変を残し、ＤＮＡ修復および複製のためにＰＣＲ合成されたプラスミドを単離して宿主細菌に形質転換することを可能にし、それによってそれに続くクローニングおよび同定工程を容易にする。部分的にディジェネレートプライマーを使用することによって、ＰＣＲベースの部位特異的変異誘発に所定量のランダム性を追加してもよい。
【０２２５】
組換えは、時には、変異誘発のツールとして使用できる。技術者は、相同組換えによって、宿主生物の天然のＤＮＡ複製および修復酵素を使用して異種ヌクレオチド配列を挿入するために、公知の配列の領域を特異的に標的化することが可能になる。相同組換え方法は、時には、「ポップイン・ポップアウト」変異誘発、トランスプレイスメント、ノックアウト変異誘発またはノックイン変異誘発と称される。宿主ゲノムへの核酸配列の統合は、核酸試薬全体を挿入する単一のクロスオーバー事象（例えば、ポップイン）である。第二のクロスオーバー事象は、核酸試薬の全部か一部を取り除き、異種配列を残すことであり、多くの場合「フットプリント」（例えば、ポップアウト）と称される。挿入による変異誘発（例えば、ノックイン）、または破壊する異種核酸を残す二重の組換えによる変異誘発（例えば、ノックアウト）はいずれも、挿入が起こる遺伝子または核酸配列の機能を破壊または「ノックアウト」するように機能する。技術者は、選択マーカーおよび／または栄養要求性マーカーを、適切な核酸標的配列が提供されるように設計された核酸試薬と組み合わせることによって、選択可能な核酸試薬を特異的な領域に標的化し、次いで挿入された（例えば、「ポップイン」）核酸試薬の一部を「ポップアウト」する組換え事象に関して選択することが可能になる。
【０２２６】
このような方法は、核酸またはゲノムの関心領域において、またはその近傍で公知の標的核酸配列を用いて特異的に設計された核酸試薬を利用する。ポップアウトすると、典型的には、組換え事象の後に残った残存配列である「フットプリント」が残る。残存配列は遺伝子を破壊することができ、それによってその遺伝子の発現を低減または除去する。いくつかの実施態様において、この方法は、遺伝子発現の強化または低減をもたらす可能性がある遺伝子の上流または下流に配列を挿入するのに使用できる。いくつかの実施態様において、類似の組換えまたは「ポップイン」方法を使用して、宿主生物のゲノムに新しい遺伝子を導入できる。ｕｒａ３遺伝子および５−ＦＯＡを使用した酵母の組換え系の例は上記で簡単に説明されており、さらなる詳細が本明細書で示される。
【０２２７】
改変のための方法が、Alaniら、「A method for gene disruption that allows repeated use of URA3 selection in the construction of multiply disrupted yeast strains」、Genetics 116（4）：541〜545、1987年8月で説明されている。オリジナルの方法は、をＵＲＡ３カセットのどちらかの側に同じ方向でクローニングされた同じヌクレオチド配列の１０００塩基対（ｂｐ）を有するＵｒａ３カセット使用する。コンストラクトの各側に約５０ｂｐの標的配列が付加される。二本鎖の標的配列は、宿主生物のゲノム中の配列に相補的である。この標的配列は、関心領域中での部位特異的な組換えを可能にする。オリジナルの技術の改変は、２つの１０００ｂｐの同方向反復配列を、２つの２００ｂｐの同方向反復配列に置き換える。改変された方法においても、５０ｂｐの標的配列が使用される。この改変は、第一の変異誘発の後に残った１０００ｂｐの反復への第二のノックアウトの組換えを低減させるかまたは除去するため、ノックアウトされた酵母を増やすことが可能になる。加えて、本明細書で使用される２００ｂｐの配列は、同定可能なフットプリントをあとに残す独特に設計された自己構築型配列である。このような配列を設計するのに使用される技術は、酵母ゲノムへの低い同一性、および相互の低い同一性などの設計特色を取り入れている。それゆえに、自己構築型配列のライブラリーを生成することにより、以前のノックアウトに統合される可能性を低減または除去しながら同じ生物に複数のノックアウトをもたらすことが可能になる。
【０２２８】
上述したように、ＵＲＡ３カセットは、機能的なＵＲＡ３遺伝子を有する酵母における５−ＦＯＡの毒性を利用する。標準的な酵母形質転換プロトコールを使用して、ウラシル合成欠損酵母を改変されたＵＲＡ３カセットで形質転換し、形質転換細胞をウラシル非含有最小培地で平板培養する。いくつかの実施態様では、ＰＣＲを使用して宿主ゲノム中の関心領域への正しい挿入を検証してもよく、所定の実施態様では、ＰＣＲ工程を省いてもよい。ＰＣＲ工程を含めることにより、ＵＲＡ３カセットが「ポップアウト」されるように対比選択する必要がある形質転換株の数を減らすことができる。次いで形質転換株（例えば、全て、または例えばＰＣＲによって正しいと決定されたもの）を、ＵＲＡ３カセットから組換えに関して選択（例えば、ポップアウト）すると予想される５−ＦＯＡ含有培地上で対比選択してもよく、そのため酵母を再びｕｒａ３欠損にして、５−ＦＯＡの毒性に耐性にすることができる。特異的な領域への組換え事象に方向付けるのに使用される標的配列は、本明細書で示されている。上記で説明した方法を改変して、染色体に遺伝子を統合させるのに使用でき、その場合、組換えの後、機能的な遺伝子は、２００ｂｐのフットプリントに隣接して残される。
【０２２９】
いくつかの実施態様において、ＵＲＡ３（例えば、栄養要求性選択マーカー）の代わりに、選択培地および選択物質に適切に変化させることにより他の栄養要求性または優性選択マーカーも使用できる。必要な生体分子（例えば、アミノ酸またはヌクレオシド）の合成が欠損した株において、栄養要求性選択マーカーが使用される。追加の栄養要求性マーカーの非限定的な例としては、ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＬＥＵ２−ｄ、およびＬＹＳ２が挙げられる。所定の栄養要求性マーカー（例えば、ＵＲＡ３およびＬＹＳ２）は、組換えコンストラクトの同方向反復配列のうちの１つを除く全てをポップアウトする第二の組換え事象に関して選択するための対比選択を可能にする。ＨＩＳ３は、ヒスチジン合成に関与する活性をコードする。ＴＲＰ１は、トリプトファン合成に関与する活性をコードする。ＬＥＵ２は、ロイシン合成に関与する活性をコードする。ＬＥＵ２−ｄは、ロイシン非含有最小培地での生存を可能にするための、増加したコピー数（例えば、遺伝子またはプラスミドのコピー数）に関して選択するＬＥＵ２の低発現型である。ＬＹＳ２は、リシン合成に関与する活性をコードし、アルファ−アミノアジピン酸塩（α−アミノアジピン酸塩）を使用したＬＹＳ２遺伝子からの組換えに関する対比選択を可能にする。
【０２３０】
優性選択マーカーは、工業用および／または原栄養菌株の遺伝子操作への使用を可能にすることから、有用である。加えて、優性選択マーカーは、平板培養および培養増殖に富栄養培地を使用できるという利点を提供することから、増殖速度が著しく増加する。優性選択マーカーの非限定的な例としては、Ｔｎ９０３ｋａｎｒ、Ｃｍｒ、Ｈｙｇｒ、ＣＵＰ１、およびＤＨＦＲが挙げられる。Ｔｎ９０３ｋａｎｒは、カナマイシン抗生物質耐性（例えば、典型的にはネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩまたはＮＰＴＩＩ）に関与する活性をコードする。Ｃｍｒは、クロラムフェニコール抗生物質耐性（例えば、典型的にはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたはＣＡＴ）に関与する活性をコードする。Ｈｙｇｒは、ハイグロマイシンＢ（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、またはＨＰＴ）のリン酸化による、ハイグロマイシン耐性に関与する活性をコードする。ＣＵＰ１は、重金属（例えば、銅）の毒性への耐性に関与する活性をコードする。ＤＨＦＲは、メトトレキセートおよびスルファニルアミド（sulfanilamde）化合物への耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼ活性をコードする。
【０２３１】
部位特異的または特異的変異誘発とは対照的に、ランダム変異誘発は、いかなる配列情報も必要とせず、数々の広く様々な方法によって達成できる。ランダム変異誘発は、多くの場合、望ましい遺伝子型または表現型に関してスクリーニングするために使用できる突然変異体ライブラリーを作製するのに使用される。ランダム変異誘発の非限定的な例としては、化学的突然変異誘発、ＵＶによって誘導された変異誘発、挿入要素またはトランスポゾンが介在する変異誘発、ＤＮＡシャフリング、エラープローンＰＣＲ変異誘発および同種のものが挙げられる。
【０２３２】
化学的突然変異誘発は、多くの場合、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、亜硝酸、マイトマイシンＣ、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＭＮＵ）、ジエポキシブタン（ＤＥＢ）、１，２，７，８−ジエポキシオクタン（ＤＥＯ）、メチルメタンスルホン酸（ＭＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、４−ニトロキノリン１−オキシド（４−ＮＱＯ）、２−メチルオキシ−６−クロロ−９（３−［エチル−２−クロロエチル］−アミノプロピルアミノ）−アクリジンジヒドロクロリド（ＩＣＲ−１７０）、２−アミノプリン（２ＡＰ）、およびヒドロキシルアミン（ＨＡ）などの化学物質を含み、これらは非限定的な例として本明細書で示される。これらの化学物質は、塩基対置換、フレームシフト突然変異、欠失、トランスバージョン突然変異、塩基転位型突然変異、不正確な複製および同種のものを引き起こす可能性がある。いくつかの実施態様において、変異誘発は、インビボで実行できる。時には、突然変異誘発プロセスは、変異誘発された塩基または塩基（複数）を取り込んで複製するために、宿主生物のＤＮＡ複製および修復メカニズムを使用することを含む。
【０２３３】
別のタイプの化学的突然変異誘発は、塩基類似体の使用を含む。塩基類似体の使用は、不正確な塩基対形成を引き起こし、これが次の一連の複製で、開始時の配列と比較してミスマッチしたヌクレオチドに修正される。塩基類似体変異誘発は、開始時の配列中の所定のヌクレオチドで取り込まれる可能性がある特異的な塩基類似体を選択できることから、ランダム変異誘発にわずかな非ランダム性が導入される。誤対合の修正は、典型的には公知の置換をもたらす。例えば、ブロモ−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）をＤＮＡに取り込むことができ、それにより配列中のＴが置き換えられる。時には、宿主ＤＮＡの修復および複製機構により欠陥が修正される可能性もあるが、時には、ＢｒｄＵとＧとが誤対合すると予想される。次いで、次の一連の複製で、天然の配列における元のＡ−ＴからのＧ−Ｃのトランスバージョンが起こる。
【０２３４】
紫外線（ＵＶ）によって誘導された変異誘発は、２つの隣接するチミン残基間の化学結合に紫外線が照射されたときにチミジン二量体が形成されることによって引き起こされる。宿主生物の除去修復メカニズムがＤＮＡ中の傷害を修正するが、場合によっては傷害は不正確に修復され、結果として典型的にはＣからＴの変異が起こる。
【０２３５】
挿入要素またはトランスポゾンが介在する変異誘発は、天然に存在するまたは改変された天然に存在する可動遺伝要素を利用する。トランスポゾンは、多くの場合、転移に必要な活性（例えば、トランスポゼース活性を使用した移動）に加えて補助的な活性をコードする。多くの例において、トランスポゾンの補助的な活性は、抗生物質耐性マーカーである（例えば、上記で説明したＴｎ９０３ｋａｎｒを参照）。挿入要素は、典型的には核酸配列の移動に必要な活性だけをコードする。挿入要素およびトランスポゾンが介在する変異誘発は、多くの場合、ランダムに起こる可能性があるが、いくつかのトランスポゾンに関して特異的な標的配列が公知である。ＩＳ要素またはトランスポゾン（Ｔｎ）のような可動遺伝要素は、多くの場合、逆方向反復配列、同方向反復配列、または転移遺伝子をコードする領域の両端における逆方向反復配列と同方向反復配列との両方を有する。トランスポゼースによって触媒される組換え事象により、要素それ自身がゲノムから除去され、新しい位置に移動し、逆方向または同方向反復配列の部分が残る。トランスポゾンの典型的な例は、トウモロコシで発見された「可動遺伝要素」である。トランスポゾン変異誘発キットが市販されており、これは、５つのコドンのインサートがあとに残るように設計されている（例えば、突然変異生成システム（Mutation Generation System）キット、フィンザイム（Finnzymes）、ワールドワイドウェブＵＲＬはfinnzymes.us）。このキットにより、技術者は、ほとんどの遺伝子の機能を完全に破壊せずに挿入部位を同定することが可能である。
【０２３６】
ＤＮＡシャフリングは、突然変異体ライブラリーのメンバーからのＤＮＡフラグメントを使用し、フラグメントをランダムにリシャッフルして、新しい突然変異配列の組み合わせを生成する方法である。フラグメントは、典型的にはＤＮアーゼＩを使用して生成され、続いてセルフプライミングＰＣＲを使用してランダムアニーリングと再結合が行われる。ＤＮＡのオーバーハングした末端は、ランダムなフラグメントのアニーリングによって生じたものであり、ＰＣＲプロセスのための「プライマー」配列を提供する。シャフリングは、上記の変異誘発方法のどれによって生成されたライブラリーにも適用できる。
【０２３７】
エラープローンＰＣＲおよびそれから派生したローリングサークル・エラープローンＰＣＲは、Ｔａｑポリメラーゼの忠実度を低減させるために１または２個のヌクレオチドの量を制限することと共に高いマグネシウムおよびマンガン濃度を使用する。得られた突然変異配列を野生型の開始時の配列と比較した場合、エラー率は、適切な条件下では２％もの高さになる可能性がある。増幅後、突然変異コード配列のライブラリーは、好適なプラスミドにクローニングしなければならない。エラープローンＰＣＲにおいては点突然変異が最も一般的なタイプの突然変異であるが、欠失およびフレームシフト突然変異も起こる可能性がある。利用可能な多数の市販のエラープローンＰＣＲキットがあり、例えばストラタジーンおよびクロンテック（Clontech）（例えば、それぞれワールドワイドウェブＵＲＬはstrategene.comであり、ワールドワイドウェブＵＲＬはclontech.comである）からのものが挙げられる。ローリングサークル・エラープローンＰＣＲは、エラープローンＰＣＲの改変型であり、それによれば、まず野生型配列がプラスミドにクローニングされ、次いでエラーを起こしやすい条件下でプラスミド全体が増幅される。
【０２３８】
上述したように、変更された活性を有する生物はまた、選択培地で刺激された生物の遺伝学的選択およびスクリーニングを使用して単離してもよいし、または固有の環境から天然に存在する変異体を同定することによって単離してもよい。例えば、２−デオキシ−Ｄ−グルコースは、毒性のグルコース類似体である。この物質上で酵母を増殖させると、グルコース調節が解除された突然変異体が産出する。２−デオキシ−Ｄ−グルコースを使用して、輸送突然変異体、およびグルコースを枯渇させると最初にグルコースを発酵させて次いでガラクトースを発酵させる代わりに、グルコースとガラクトースを同時に発酵させる突然変異体などの多数の突然変異体が単離されている。類似の技術を使用して、実験室の環境において、または固有の環境からのいずれかで、プラスチックを代謝できる突然変異微生物（例えば、埋め立て地から）、石油化学製品を代謝できる突然変異微生物（例えば、石油流出から）および同種のものが単離されている。
【０２３９】
いくつかの実施態様において、対象の生物において活性が比較的低いかまたはほぼ検出不可能なレベルで存在する場合、類似の方法を使用して、望ましい活性で天然に存在する突然変異を単離できる。この方法は、一般的に、液体培養中で特定の密度まで生物を増殖させること、細胞を濃縮すること、および代謝活性の増加が求められる物質の様々な濃度で細胞を平板培養することからなる。穏やかな増殖温度で５〜１０日間、細胞をインキュベートする。選択プロセスを強化するために、さらに５〜１０日間、低温でプレートを保存してもよい。低温は、時には、活性を獲得したかまたは増加させた株を増殖させ続けることを可能にし、一方で低温は他の株の増殖を阻害する。最初の選択と低温での二次的な増殖に続いて、望ましい活性に関してさらに選択するために、より高いまたはより低い選択物質濃度でプレートを重複して平板培養してもよい。
【０２４０】
宿主生物に導入するために、核酸試薬に天然、異種または変異誘発されたポリヌクレオチドを導入してもよく、それによって操作された微生物が生成される。技術者は、標準的な組換えＤＮＡ技術（制限酵素消化、ライゲーションおよび同種のもの）を使用することにより、（ｉ）宿主生物中での選択により安定して維持すること、または（ｉｉ）宿主生物のゲノムに統合することが可能な好適な核酸試薬に、変異誘発された対象の核酸を組み込むことができる。上述したように、時には、核酸試薬は、宿主生物（例えば、酵母または真菌）への最終的な最終産物導入の前に細菌中で同じ核酸試薬を操作可能にする２つの複製起点を含む。標準的な分子生物学および組換えＤＮＡ方法は公知である（例えば、Maniatis, T.、E. F. FritschおよびJ. Sambrook（1982）Molecular Cloning：a Laboratory Manual；コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーで説明されている）。
【０２４１】
様々な技術を使用して核酸試薬を微生物に導入できる。様々な生物に異種核酸を導入するのに使用される方法の非限定的な例としては、形質転換、トランスフェクション、形質移入、エレクトロポレーション、超音波が介在する形質転換、粒子衝撃および同種のものが挙げられる。いくつかの場合において、キャリアー分子の付加（例えば、ビス−ベンズイミダゾリル化合物、例えば、米国特許第５５９５８９９号を参照）により、典型的には従来の方法での形質転換が難しいと考えられている細胞におけるＤＮＡの取り込みを増加させることができる。従来の形質転換方法は公知である（例えば、Maniatis, T.、E. F. FritschおよびJ. Sambrook（1982）Molecular Cloning：a Laboratory Manual；コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーで説明されている）。
【０２４２】
供給材料(Feedstocks)、培地、補助物質および添加剤
操作された微生物は、多くの場合、脂肪族ジカルボン酸（例えば、炭素８〜１８個の脂肪族ジカルボン酸）の収量を最適化する条件下で培養される。脂肪族ジカルボン酸の非限定的な例としては、スベリン酸（すなわち、オクタン二酸、１，８−オクタン二酸、オクタン二酸、オクタン−１，８−二酸、１，６−ヘキサンジカルボン酸、カプリル二酸）、セバシン酸（すなわち、１，１０−デカン二酸、デカン二酸、デカン−１，１０−二酸、１，８−オクタンジカルボン酸、カプリン二酸）、ドデカン二酸（すなわち、ＤＤＤＡ、１，１２−ドデカン二酸、ドデカン二酸、ドデカン−１，１２−二酸、１，１０−デカンジカルボン酸、デカメチレンジカルボン酸、１，１０−ジカルボキシデカン、ラウリン二酸）、テトラデカン二酸（すなわち、ＴＤＤＡ、１，１４−テトラデカン二酸、テトラデカン二酸、テトラデカン−１，１４−二酸、１，１２−ドデカンジカルボン酸、ミリスチン二酸）、タプシン酸（thapsic acid）（すなわち、ヘキサデカン二酸、１，１６−ヘキサデカン二酸、ヘキサデカン二酸、ヘキサデカン−１，１６−二酸、１，１４−テトラデカンジカルボン酸、パルミチン二酸）、シス−９−ヘキサデセン二酸（すなわち、パルミトレイン二酸）、オクタン二酸（すなわち、１，１８−オクタデカン二酸、オクタデカン二酸、オクタデカン−１，１８−二酸、１，１６−ヘキサデカンジカルボン酸、ステアリン二酸）、シス−９−オクタデセン二酸（すなわち、オレイン二酸）、シス−９，１２−オクタデセン二酸（すなわち、リノール二酸）、シス−９，１２，１５−オクタデセン二酸（すなわち、リノレン二酸）、アラキジン二酸（すなわち、エイコサン二酸、イコサン二酸）、１１−エイコセン二酸（すなわち、シス−１１−エイコセン二酸）、１３−エイコセン二酸（すなわち、シス−１３−エイコセン二酸）、アラキドン二酸（すなわち、シス−５，８，１１，１４−エイコサテトラエン二酸）が挙げられる。培養条件は、多くの場合、以下の活性：オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、脂肪族アルコールオキシダーゼ、アシル−ＣｏＡリガーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、および／またはアシルトランスフェラーゼ（例えば、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ）活性のうち１種またはそれより多くの活性を最適化する。一般的に、最適化される可能性がある条件の非限定的な例としては、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素と窒素との比率、酸素レベル、増殖温度、ｐＨ、バイオマス生産期の長さ、標的生成物蓄積期の長さ、および細胞の回収時間が挙げられる。
【０２４３】
培養培地は、一般的に、好適な炭素源を含有する。微生物の培養および／または発酵プロセスに有用な炭素源は、時には、供給材料と称される。用語「供給材料」は、本明細書で使用される場合、生物に供給される炭素源を含有する組成物を指し、これは、エネルギーと増殖に有用な代謝生成物を生産するのに生物によって使用される。供給材料は、天然物質、「人工物質」、精製または単離された物質、精製された物質の混合物、未精製の物質の混合物またはそれらの組み合わせであってもよい。供給材料は、多くの場合、人によって調製されるか、および／または人によって生物に供給され、さらに供給材料は、多くの場合、生物に投与される前に製剤化される。炭素源は、これらに限定されないが、１種またはそれより多くの以下の物質：アルカン、アルケン、モノカルボン酸、ジカルボン酸、単糖（例えば、「糖類」とも称され、例えば六炭糖（例えば、グルコース、フルクトース）、五炭糖（例えば、キシロースおよび他のペントース）および同種のものが挙げられる）、二糖類（例えば、ラクトース、スクロース）、オリゴ糖（例えば、グリカン、単糖類のホモポリマー）、多糖類（例えば、デンプン、セルロース、単糖のヘテロポリマーまたはそれらの混合物）、糖アルコール（例えば、グリセロール）、および再生可能な供給材料（例えば、チーズ乳清の浸透液、コーンスティープリカー、砂糖大根の糖蜜、大麦の麦芽）などを含んでいてもよい。
【０２４４】
また炭素源は、以下の非限定的な例：パラフィン（例えば、飽和パラフィン、不飽和パラフィン、置換パラフィン、直鎖パラフィン、分岐パラフィン、またはそれらの組み合わせ）；それぞれ直鎖状、分岐状、飽和、不飽和、置換またはそれらの組み合わせであってもよいアルカン（例えば、ドデカン）、アルケンまたはアルキン（以下でより詳細に説明される）；直鎖状または分岐アルコール（例えば、ドデカノール）；脂肪酸（例えば、炭素約１個から炭素約６０個、例えば遊離脂肪酸、例えば、これらに限定されないが、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸など）、または石鹸原料など；脂肪酸のエステル（例えばメチルエステル、エチルエステル、ブチルエステルおよび同種のもの）、例えば、これらに限定されないが、エステル、例えばカプリン酸メチル、カプリン酸エチル、ラウリン酸メチル、ラウリン酸エチル、ミリスチン酸メチル、ミリスチン酸エチル、カプロン酸メチル（methyl caprolate）、カプロン酸エチル（ethyl caprolate）、カプリル酸エチル、カプリル酸メチル、パルミチン酸メチル、またはパルミチン酸エチルなど；モノグリセリド；ジグリセリド；トリグリセリド、リン脂質のうち１種またはそれより多くからも選択できる。供給材料を調製するための生成物の非限定的な商業的供給源としては、植物、植物の油または植物製品（例えば、植物油（例えば、アーモンド油、キャノーラ油、カカオバター、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、亜麻仁油、菜種油、モワ（illipe）、オリーブ油、パーム油、パームオレイン、パーム核油、ベニバナ油、落花生油、ダイズ油、ゴマ油、シアの実の油、ヒマワリ油、クルミ油など、およびそれらの組み合わせ）、および動物性脂肪（例えば、牛脂、バター脂、ラード、タラ肝油）が挙げられる。炭素源としては、石油製品および／または石油蒸留物（例えば、ディーゼル、燃料油、ガソリン、ケロシン、パラフィンワックス、パラフィン油、石油化学製品）も挙げられる。いくつかの実施態様において、供給材料は、石油蒸留物を含む。炭素源は、脂肪酸蒸留物（例えば、パーム油の蒸留物またはトウモロコシ油の蒸留物）であってもよい。脂肪酸蒸留物は、粗製植物油の精製からの副産物であってもよい。いくつかの実施態様において、供給材料は、脂肪酸蒸留物を含む。
【０２４５】
いくつかの実施態様において、供給材料は、石鹸原料（すなわち石鹸原料）を含む。広く実施されている食用のための粗製植物油の精製方法は、アルカリまたはカセイアルカリによる精製方法である。このプロセスは、存在する遊離脂肪酸と反応させるためにカセイソーダの希薄水溶液を採用しており、それにより石鹸の形成が起こる。石鹸は、典型的には、精製遠心分離機からの重質相放出物（heavy phase discharge）として、水和したホスファチド、ゴムおよび酸化促進性の金属と一緒に精製された油から分離され、これは、典型的には石鹸原料として知られている。
【０２４６】
また炭素源としては、本明細書で説明される操作された経路で代謝基質として直接使用できる代謝生成物、または操作された微生物における操作されたもしくは天然の生合成経路を使用した異なる分子への変換を介して間接的に使用できる代謝生成物も挙げることができる。いくつかの実施態様において、少なくとも１種の共通の代謝および／または合成基質を有するか、および／またはそれらを生成する１種またはそれより多くの代謝経路における１種またはそれより多くの活性のレベルを増加させることによって、望ましい生成物の生産に優先的に代謝経路が偏るようにすることができる。いくつかの実施態様において、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）に変換できる炭素源を生成するために、糖新生、ペントースリン酸経路、解糖、脂肪酸合成、ベータ酸化、およびオメガ酸化から選択される１種またはそれより多くの代謝経路で、操作された活性（例えば、オメガ酸化活性）の代謝副産物（例えば、脂肪酸）を使用できる。
【０２４７】
用語「パラフィン」は、本明細書で使用される場合、源（例えば、植物由来、石油由来、化学的に合成された、微生物によって発酵された源）または炭素鎖長とは無関係に、アルカン炭化水素の一般名称を指す。炭素源は、時には、パラフィンを含み、いくつかの実施態様において、パラフィンは、炭素源中の主成分である（例えば、約７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のパラフィン）。パラフィンは、時には、飽和しており（例えば、完全に飽和しており）、時には、１つまたはそれより多くの不飽和（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の不飽和）を包含し、時には、１つまたはそれより多くの水素以外の置換基で置換されている。水素以外の置換基の非限定的な例としては、ハロ、アセチル、＝Ｏ、＝Ｎ−ＣＮ、＝Ｎ−ＯＲ、＝ＮＲ、ＯＲ、ＮＲ２、ＳＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＮＲ２、ＮＲＳＯ２Ｒ、ＮＲＣＯＮＲ２、ＮＲＣＯＯＲ、ＮＲＣＯＲ、ＣＮ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ２、ＯＯＣＲ、ＣＯＲ、およびＮＯ２が挙げられ、式中Ｒは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ８アシル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキニル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、またはＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリールであり、各Ｒは、場合によってはハロ、＝Ｏ、＝Ｎ−ＣＮ、＝Ｎ−ＯＲ’、＝ＮＲ’、ＯＲ’、ＮＲ’２、ＳＲ’、ＳＯ２Ｒ’、ＳＯ２ＮＲ’２、ＮＲ’ＳＯ２Ｒ’、ＮＲ’ＣＯＮＲ’２、ＮＲ’ＣＯＯＲ’、ＮＲ’ＣＯＲ’、ＣＮ、ＣＯＯＲ’、ＣＯＮＲ’２、ＯＯＣＲ’、ＣＯＲ’、およびＮＯ２で置換されていてもよく、式中各Ｒ’は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ８アシル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールまたはＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリールである。
【０２４８】
いくつかの実施態様において、供給材料は、培養しようとする操作された微生物の遺伝子型および／または表現型に従って選択される。本明細書で説明されるようにＰＯＸ４活性を破壊することによってベータ酸化を部分的にブロックする変更を含む酵母株を培養するためには、例えば、炭素１２個の脂肪酸、炭素１２個のジカルボン酸もしくは炭素１２個のパラフィンが豊富な供給材料、または炭素１０、１２および１４個の化合物の混合物が有用な可能性がある。１０〜１４個の炭素を有する炭素源の非限定的な例としては、脂肪（例えば、ヤシ油、パーム核油）、１０〜１４個の炭素を有するパラフィン（例えば、アルカン、アルケン、またはアルキン）（例えば、ドデカン（また、アダカン（adakane）１２、ビヘキシル、ジヘキシルおよびデュオデカン（duodecane）とも称される）；テトラデカン）、アルケンおよびアルキン誘導体）、脂肪酸（ドデカン酸、テトラデカン酸）、脂肪族アルコール（ドデカノール、テトラデカノール）、それと類似したもの、それらの非毒性の置換誘導体または組み合わせが挙げられる。
【０２４９】
炭素源は、時には、アルキル、アルケニルまたはアルキニル化合物もしくは分子（例えば、アルキル、アルケニルまたはアルキニル部分を包含する化合物（例えば、アルカン、アルケン、アルキン））を含む。いくつかの実施態様において、アルキル、アルケニルもしくはアルキニル分子、またはそれらの組み合わせは、炭素源中の主成分である（例えば、約７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のこのような分子）。本明細書で使用されるように、用語「アルキル」、「アルケニル」および「アルキニル」は、直鎖（本明細書では「線形」とも称される）、分岐鎖（本明細書では「非線形」とも称される）、環状の１価ヒドロカルビルラジカル、およびこれらの組み合わせを包含し、これらは、非置換の場合、Ｃ原子とＨ原子しか含有しない。アルキル部分の非限定的な例としては、メチル、エチル、イソブチル、シクロヘキシル、シクロペンチルエチル、２−プロペニル、３−ブチニルおよび同種のものが挙げられる。Ｃ原子とＨ原子のみを含有し、非置換のアルキルは、時には、「飽和」と称される。一般的に、アルケニルまたはアルキニルは、それぞれ１つまたはそれより多くの二重結合または三重結合を含有するため、「不飽和」である。アルケニルは、多数の二重結合、例えば１、２、３、４または５個の二重結合を包含していてもよい。アルキニルとしては、多数の三重結合、例えば１、２、３、４または５個の三重結合を包含していてもよい。アルキル、アルケニルおよびアルキニル分子は、時には、約２〜約６０個の炭素原子（Ｃ）を含有する。例えば、アルキル、アルケニルおよびアルキニル分子は、約１個の炭素原子、約２個の炭素原子、約３個の炭素原子、約４個の炭素原子、約５個の炭素原子、約６個の炭素原子、約７個の炭素原子、約８個の炭素原子、約９個の炭素原子、約１０個の炭素原子、約１２個の炭素原子、約１４個の炭素原子、約１６個の炭素原子、約１８個の炭素原子、約２０個の炭素原子、約２２個の炭素原子、約２４個の炭素原子、約２６個の炭素原子、約２８個の炭素原子、約３０個の炭素原子、約３２個の炭素原子、約３４個の炭素原子、約３６個の炭素原子、約３８個の炭素原子、約４０個の炭素原子、約４２個の炭素原子、約４４個の炭素原子、約４６個の炭素原子、約４８個の炭素原子、約５０個の炭素原子、約５２個の炭素原子、約５４個の炭素原子、約５６個の炭素原子、約５８個の炭素原子または約６０個の炭素原子を包含していてもよい。いくつかの実施態様において、パラフィンは、炭素原子約８〜約１８個の炭素原子の平均数（例えば、約８個の炭素原子、約９個の炭素原子、約１０個の炭素原子、約１１個の炭素原子、約１２個の炭素原子、約１３個の炭素原子、約１４個の炭素原子、約１５個の炭素原子、約１６個の炭素原子、約１７個の炭素原子および約１８個の炭素原子）を有する可能性がある。単一の基が、１種より多くのタイプの複数の結合、または１個より多くの複数の結合を包含していてもよい。このような基が少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有する場合、それらは用語「アルケニル」の定義に包含され、このような基が少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含有する場合、それらは用語「アルキニル」に包含される。アルキル、アルケニルおよびアルキニル分子は、アルキル、アルケニルおよび／またはアルキニル部分を含む分子を包含し、さらに、アルキル、アルケニルまたはアルキニル部分からなる分子（すなわち、アルカン、アルケンおよびアルキン分子）も包含する。本明細書に記載の所定の実施態様を実施するのに有用な不飽和脂肪酸供給材料の非限定的な例としては、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エイコセン酸、パルミトレイン酸およびアラキドン酸が挙げられる。
【０２５０】
アルキル、アルケニルおよびアルキニル置換基は、時には、１〜２０個のＣ（アルキル）または２〜２０個のＣ（アルケニルまたはアルキニル）を含有する。いくつかの実施態様において、これらは、約８〜２０個のＣまたは約１０〜２０個のＣを含有する可能性がある。単一の基が、１種より多くのタイプの複数の結合、または１個より多くの複数の結合を包含していてもよい。このような基が少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有する場合、それらは用語「アルケニル」の定義に包含され、このような基が少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含有する場合、それらは用語「アルキニル」に包含される。
【０２５１】
アルキル、アルケニルおよびアルキニル基または化合物は、時には、このような置換が合成されて存在できるような程度に置換される。典型的な置換基としては、これらに限定されないが、ハロ、アセチル、＝Ｏ、＝Ｎ−ＣＮ、＝Ｎ−ＯＲ、＝ＮＲ、ＯＲ、ＮＲ２、ＳＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＮＲ２、ＮＲＳＯ２Ｒ、ＮＲＣＯＮＲ２、ＮＲＣＯＯＲ、ＮＲＣＯＲ、ＣＮ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ２、ＯＯＣＲ、ＣＯＲ、およびＮＯ２が挙げられ、式中Ｒは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ８アシル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキニル、Ｃ６〜Ｃ１１アリール、またはＣ５〜Ｃ１１ヘテロアリールであり、各Ｒは、場合によってはハロ、＝Ｏ、＝Ｎ−ＣＮ、＝Ｎ−ＯＲ’、＝ＮＲ’、ＯＲ’、ＮＲ’２、ＳＲ’、ＳＯ２Ｒ’、ＳＯ２ＮＲ’２、ＮＲ’ＳＯ２Ｒ’、ＮＲ’ＣＯＮＲ’２、ＮＲ’ＣＯＯＲ’、ＮＲ’ＣＯＲ’、ＣＮ、ＣＯＯＲ’、ＣＯＮＲ’２、ＯＯＣＲ’、ＣＯＲ’、およびＮＯ２で置換されていてもよく、式中各Ｒ’は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ８アシル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールまたはＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリールである。アルキル、アルケニルおよびアルキニル基はまた、Ｃ１〜Ｃ８アシル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールまたはＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリールで置換されていてもよく、これらはそれぞれ、特定の基に適した置換基で置換されていてもよい。
【０２５２】
「アセチレン」または「アセチル」置換基は、場合によっては置換されており式−Ｃ≡Ｃ−Ｒｉを有する２〜１０Ｃアルキニル基であり、式中Ｒｉは、ＨまたはＣ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキニル、Ｃ１〜Ｃ８アシル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ７〜Ｃ１２アリールアルキル、またはＣ６〜Ｃ１２ヘテロアリールアルキルであり、各Ｒｉ基は、場合によっては、ハロ、＝Ｏ、＝Ｎ−ＣＮ、＝Ｎ−ＯＲ’、＝ＮＲ’、ＯＲ’、ＮＲ’２、ＳＲ’、ＳＯ２Ｒ’、ＳＯ２ＮＲ’２、ＮＲ’ＳＯ２Ｒ’、ＮＲ’ＣＯＮＲ’２、ＮＲ’ＣＯＯＲ’、ＮＲ’ＣＯＲ’、ＣＮ、ＣＯＯＲ’、ＣＯＮＲ’２、ＯＯＣＲ’、ＣＯＲ’、およびＮＯ２から選択される１個またはそれより多くの置換基で置換されていてもよく、式中各Ｒ’は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アシル、Ｃ２〜Ｃ６ヘテロアシル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ７〜１２アリールアルキル、またはＣ６〜１２ヘテロアリールアルキルであり、これらはそれぞれ、場合によってはハロ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アシル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアシル、ヒドロキシ、アミノ、および＝Ｏから選択される１つまたはそれより多くの基で置換されていてもよく；ここで２つのＲ’が連結して、場合によってはＮ、ＯおよびＳから選択される最大３つのヘテロ原子を含有する３〜７員環の環を形成する。いくつかの実施態様において、−Ｃ≡Ｃ−ＲｉのＲｉは、ＨまたはＭｅである。
【０２５３】
炭素源は、時には、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニルおよび／またはヘテロアルキニル分子もしくは化合物を含む（例えば、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニルおよび／またはヘテロアルキニル部分を含む（例えば、ヘテロアルカン、ヘテロアルケンまたはヘテロアルキン））。「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」および「ヘテロアルキニル」および同種のものは、対応するヒドロカルビル（アルキル、アルケニルおよびアルキニル）基と同様に定義されるが、「ヘテロ」という用語は、主鎖内に１〜３つのＯ、ＳもしくはＮヘテロ原子またはそれらの組み合わせを含有する基を指し、したがって対応するアルキル、アルケニル、またはアルキニル基の少なくとも１つの炭素原子が特定されたヘテロ原子のうち１つで置き換えられて、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニル基が形成される。アルキル、アルケニルおよびアルキニル基のヘテロ型に関する典型例およびサイズは、一般的に対応するヒドロカルビル基に関するものと同じであり、ヘテロ型に存在する可能性がある置換基は、上記でヒドロカルビル基に関して説明したものと同じである。化学的安定性の理由で、このような基は、特に他の規定がない限り、２つより多くの連続したヘテロ原子を包含しないとも理解されているが、ニトロまたはスルホニル基としてＮまたはＳ上にオキソ基が存在する場合はこの限りではない。
【０２５４】
用語「アルキル」は、本明細書で使用される場合、シクロアルキルおよびシクロアルキルアルキル基および化合物を包含し、用語「シクロアルキル」は、環炭素原子を介して連結された炭素環式の非芳香族化合物または基を説明するのに本明細書で使用される場合があり、さらに「シクロアルキルアルキル」は、アルキルリンカーを介して分子に連結された炭素環式の非芳香族化合物または基を説明するのに使用される場合もある。同様に、「ヘテロシクリル」は、環員として少なくとも１つのヘテロ原子を含有し、環原子（ここで環原子は、ＣまたはＮであってもよい）を介して分子に連結された非芳香族環式基を説明するのに使用される可能性があり；さらに「ヘテロシクリルアルキル」は、リンカーを介して別の分子に連結されたこのような基を説明するのにも使用される可能性がある。シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、およびヘテロシクリルアルキル基に好適なサイズおよび置換基は、アルキル基に関して上記で説明したものと同じである。これらの用語は、本明細書で使用される場合、環が非芳香族である限り、１つの二重結合または２つの二重結合を含有する環も包含する。
【０２５５】
炭素源は、時には、アシル化合物または部分（例えば、アシル部分を含む化合物）を含む。「アシル」は、本明細書で使用される場合、カルボニル炭素原子の２つの利用可能な原子価の位置のうち一方に付着したアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアリールアルキルラジカルを含む基を包含し、ヘテロアシルは、それに対応する基であって、カルボニル炭素以外の少なくとも１つの炭素が、Ｎ、ＯおよびＳから選ばれるヘテロ原子で置き換えられている基を指す。したがってヘテロアシルは、例えば、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲおよび−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２、加えて−Ｃ（＝Ｏ）−ヘテロアリールを包含する。
【０２５６】
アシルおよびヘテロアシル基は、カルボニル炭素原子の空いた原子価を介して付着しているあらゆる基または分子に結合される。アシルおよびヘテロアシル基は、典型的にはＣ１〜Ｃ８アシル基であり、その例としては、ホルミル、アセチル、ピバロイル、およびベンゾイル、ならびにＣ２〜Ｃ８ヘテロアシル基が挙げられ、ここでＣ２〜Ｃ８ヘテロアシル基としては、メトキシアセチル、エトキシカルボニル、および４−ピリジノイルが挙げられる。アシルまたはヘテロアシル基を含むヒドロカルビル基、アリール基、およびこのような基のヘテロ型は、本明細書においてアシルまたはヘテロアシル基の対応する成分のそれぞれに関して一般的に好適な置換基として説明される置換基で置換されていてもよい。
【０２５７】
炭素源は、時には、１つまたはそれより多くの芳香族部分および／または複素環式芳香族化合物部分を含む。「芳香族」部分または「アリール」部分は、芳香族性の周知の特徴を有する単環式または縮合二環式部分を指し、その例としては、フェニルおよびナフチルが挙げられる。同様に、「複素環式芳香族化合物」および「ヘテロアリール」は、このような単環式または縮合二環式環系であって、環員として１つまたはそれより多くのＯ、ＳおよびＮから選択されるヘテロ原子を含有する単環式または縮合二環式環系を指す。ヘテロ原子を含んでいても、５員環、加えて６員環における芳香族性が認められる。典型的な複素環式芳香族化合物系としては、単環式Ｃ５〜Ｃ６芳香族基、例えばピリジル、ピリミジル、ピラジニル、チエニル、フラニル、ピロリル、ピラゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、およびイミダゾリルが挙げられ、加えて、これらの単環式基の１つとフェニル環またはヘテロ芳香族単環式基のいずれかとを縮合させて、インドリル、ベンズイミダゾリル、インタゾリル、ベンゾトリアゾリル、イソキノリル、キノリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾフラニル、ピラゾロピリジル、キナゾリニル、キノキサリニル、シンノリニル、および同種のものなどのＣ８〜Ｃ１０二環式基を形成することによって形成された縮合二環式部分が挙げられる。環系全体で電子分布に関して芳香族性の特徴を有するあらゆる単環式または縮合環二環式系がこの定義に包含される。これには、少なくとも分子の残部に直接付着している環が、芳香族性の特徴を有するような二環式基も包含される。典型的には、このような環系は、５〜１２環員の原子を含有する。単環式ヘテロアリールは、時には、５〜６環員を含有し、二環式ヘテロアリールは、時には、８〜１０環員を含有する。
【０２５８】
アリールおよびヘテロアリール部分は、様々な置換基で置換されていてもよく、ここでこのような置換基としては、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ５〜Ｃ１２アリール、Ｃ１〜Ｃ８アシル、およびこれらのヘテロ型が挙げられ、これらのそれぞれは、それ自身さらに置換されていてもよく；アリールおよびヘテロアリール部分のための他の置換基としては、ハロ、または、ＮＲ２、ＳＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＮＲ２、ＮＲＳＯ２Ｒ、ＮＲＣＯＮＲ２、ＮＲＣＯＯＲ、ＮＲＣＯＲ、ＣＮ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ２、ＯＯＣＲ、ＣＯＲ、およびＮＯ２が挙げられ、式中Ｒは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキニル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ７〜Ｃ１２アリールアルキル、またはＣ６〜Ｃ１２ヘテロアリールアルキルであり、各Ｒは、上記でアルキル基に関して説明したように場合によっては置換されていてもよい。アリールまたはヘテロアリール基上の置換基は、本明細書でこのような置換基の各タイプに関して、または置換基の各成分に関して好適であると説明された基でさらに置換されていてもよい。したがって、例えば、アリールアルキル置換基は、アリール部分においてアリール基に典型的な置換基で置換されていてもよいし、アリールアルキル置換基はさらに、アルキル部分においてアルキル基に典型的または好適な置換基で置換されていてもよい。
【０２５９】
同様に、「アリールアルキル」および「ヘテロアリールアルキル」は、芳香族および芳香族複素環系であって、独立した分子（例えば、ベンゼンまたは置換ベンゼン、ピリジンまたは置換ピリジン）であるか、またはアルキレンなどの結合基、例えば置換もしくは非置換、飽和もしくは不飽和、環式もしくは非環式のリンカーを介して付着点に結合している芳香族および芳香族複素環系を指す。リンカーは、多くの場合、Ｃ１〜Ｃ８アルキルまたはそれらのヘテロ型である。これらのリンカーはカルボニル基を包含する場合もあることから、アシルまたはヘテロアシル部分として置換基をもたらす可能性もある。アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキル基中のアリールまたはヘテロアリール環は、上記でアリール基に関して説明したのと同じ置換基で置換されていてもよい。アリールアルキル基は、時には、非置換であるか、または１もしくは２個のＣ１〜Ｃ４アルキル基もしくはヘテロアルキル基で置換された、上記でアリール基およびＣ１〜Ｃ４アルキレンに関して定義された基で場合によって置換されていてもよいフェニル環を包含し、ここでアルキルまたはヘテロアルキル基は、場合によっては環化してシクロプロパン、ジオキソラン、またはオキサシクロペンタンなどの環を形成できる。同様に、ヘテロアリールアルキル基は、多くの場合、場合によっては上記でアリール基において典型的な置換基として説明した基、および非置換のＣ１〜Ｃ４アルキレンの１またはそれより多くで置換されていてもよいＣ５〜Ｃ６単環式ヘテロアリール基を包含する。ヘテロアリールアルキル基は、時には、１または２つのＣ１〜Ｃ４アルキル基またはヘテロアルキル基で置換されるか、または場合によっては置換されていてもよいフェニル環またはＣ５〜Ｃ６単環式ヘテロアリール、および非置換であるか、または１または２つのＣ１〜Ｃ４アルキルもしくはヘテロアルキル基で置換されたＣ１〜Ｃ４ヘテロアルキレンを包含し、ここでアルキルまたはヘテロアルキル基は、場合によっては環化してシクロプロパン、ジオキソラン、またはオキサシクロペンタンなどの環を形成していてもよい。
【０２６０】
アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキル基が、場合によっては置換されていてもよいと説明される場合、置換基が、基のアルキルまたはヘテロアルキル部分上に存在するか、またはアリールまたはヘテロアリール部分に存在する可能性がある。場合によってはアルキルまたはヘテロアルキル部分に存在する置換基は、時には、アルキル基に関して上記で説明したものと同じであり、場合によってはアリールまたはヘテロアリール部分に存在する置換基は、多くの場合、アリール基に関して上記で一般的に説明したものと同じである。
【０２６１】
「アリールアルキル」基は、本明細書で使用される場合、それらが非置換である場合、ヒドロカルビル基であり、環およびアルキレンまたは類似のリンカー中の炭素原子の総数に基づき記載される。したがって、ベンジル基は、Ｃ７−アリールアルキル基であり、フェニルエチルは、Ｃ８−アリールアルキルである。
【０２６２】
上述したような「ヘテロアリールアルキル」は、結合基を介して付着したアリール基を含む部分を指し、アリール部分の少なくとも１つの環原子または結合基中の１つの原子が、Ｎ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子であるという点で「アリールアルキル」とは異なる。ヘテロアリールアルキル基は、本明細書では、環と組み合わされたリンカー中の原子の総数に基づき記載され、このような基としては、ヘテロアルキルリンカーを介して連結されたアリール基；アルキレンなどのヒドロカルビルリンカーを介して連結されたヘテロアリール基；およびヘテロアルキルリンカー介して連結されたヘテロをアリール基が挙げられる。したがって、Ｃ７−ヘテロアリールアルキルとしては、例えば、ピリジルメチル、フェノキシ、およびＮ−ピロリルメトキシが挙げられる。
【０２６３】
「アルキレン」は、本明細書で使用される場合、２価ヒドロカルビル基を指す。アルキレンは２価であるため、２つの他の基を一緒に連結させることができる。アルキレンは、多くの場合、−（ＣＨ２）ｎ−と表され、式中ｎは、１〜２０、１〜１０、１〜８、または１〜４であってもよいが、具体的に特定された場合、アルキレンは、他の基で置換されていてもよく、他の長さを有していてもよく、空の原子価が鎖の逆側の末端に存在していなくてもよい。したがって−ＣＨ（Ｍｅ）−および−Ｃ（Ｍｅ）２−もアルキレンと称される場合があり、例えば、シクロプロパン−１，１−ジイルなどの環式基であり得る。アルキレン基が置換されている場合、置換基は、典型的には本明細書で説明したようなアルキル基上に存在する置換基を包含する。
【０２６４】
いくつかの実施態様において、供給材料は、炭素源の混合物を包含し、ここで供給材料中の各炭素源は、操作された微生物の遺伝子型に基づき選択される。いくつかの実施態様において、混合された炭素源の供給材料は、糖、セルロース、アルカン、脂肪酸、トリアシルグリセリド、パラフィンなど、およびそれらの組み合わせから選択される１種またはそれより多くの炭素源を包含する。
【０２６５】
窒素は、無機源（例えば、（ＮＨ４）２ＳＯ４）または有機源（例えば、尿素またはグルタメート）から供給されてもよい。適切な炭素および窒素源に加えて、培養培地はまた、好適な無機物、塩、補因子、緩衝液、ビタミン、金属イオン（例えば、Ｍｎ＋２、Ｃｏ＋２、Ｚｎ＋２、Ｍｇ＋２）および微生物培養に好適な他の成分を含有してもよい。
【０２６６】
操作された微生物は、時には、複合培地（例えば、酵母抽出物−ペプトン−デキストロース液体培地（ＹＰＤ））中で培養される。いくつかの実施態様において、操作された微生物は、増殖に必要な成分が欠失しているために望ましい発現カセットの選択が強制的に起こる規定された最小培地（例えば、酵母窒素原礎培地（ディフコ・ラボラトリーズ（DIFCO Laboratories）、ミシガン州デトロイト））中で培養される。
【０２６７】
いくつかの実施態様において、培養培地は、酵母窒素原礎培地（ディフコ・ラボラトリーズ、ミシガン州デトロイト）などの一般的な商業的に調製された培地である。他の規定または合成の増殖培地も使用が可能であり、特定の微生物の増殖に適切な培地は公知である。操作された微生物の生産のために様々な宿主生物を選択できる。非限定的な例としては、酵母（例えば、カンジダ・トロピカリス（例えば、ＡＴＣＣ２０３３６、ＡＴＣＣ２０９１３、ＡＴＣＣ２０９６２）、ヤロウイア・リポリチカ（例えば、ＡＴＣＣ２０２２８））および糸状菌（例えば、アスペルギルス・ニダランス（例えば、ＡＴＣＣ３８１６４）およびアスペルギルス・パラスティカス（例えば、ＡＴＣＣ２４６９０））が挙げられる。具体的な実施態様において、  酵母は、ＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌバクト酵母抽出物、２０ｇ／Ｌバクトペプトン、および２０ｇ／Ｌデキストロース）中で培養される。特定の実施態様において、糸状菌は、１０ｇ／Ｌデキストロース、２ｇ／Ｌバクトペプトン、１ｇ／Ｌバクト酵母抽出物、１ｇ／Ｌカザミノ酸、５０ｍＬ／Ｌの２０×硝酸塩（１２０ｇ／ＬのＮａＮＯ３、１０．４ｇ／ＬのＫＣｌ、１０．４ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、１ｍＬ／Ｌの１０００×微量元素（２２ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１１ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、５ｇ／ＬのＭｎＣｌ２・７のＨ２Ｏ、５ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．７ｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．６ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１．５ｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、および５０ｇ／ＬのＮａ４ＥＤＴＡ）、および１ｍＬ／Ｌビタミン溶液（１００ｍＬの水中、それぞれ１００ｍｇのビオチン、ピリドキシン、チアミン、リボフラビン、ｐ−アミノ安息香酸、およびニコチン酸）を含有するＣＭ（完全培地）中で増殖する。
【０２６８】
不飽和脂肪酸またはそれらのエステルを含む供給材料が採用された実施態様において、結果得られた二酸は、同様に不飽和であり得る。最終産物として飽和二酸が望ましい場合、不飽和二酸を水素化して、１つまたは全ての炭素−炭素二重結合を除去してもよい。水素化は、当業界公知の方法を使用して達成してもよい。二重結合に対する水素化は、金属の化学触媒、非金属の化学触媒、または酵素触媒によって達成できる。水素源は、化学触媒作用のケースでは分子状の水素であってもよいし、または酵素触媒作用のケースでは酵素の補因子（すなわちＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤＨ２）であってもよい。
【０２６９】
金属触媒を用いた接触水素化は、多くの様々なタイプの触媒を利用してもよい。金属は、白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、ニッケル、または他の金属であってもよい。触媒は、均一または不均一系触媒であってもよい。反応速度を増加させるために、高められた温度および圧力が採用される可能性がある。また接触水素化は、フラストレイティド・ルイスペア化合物などの非金属触媒を用いて起こる可能性もある。
【０２７０】
酵素による水素化は、インビボまたはインビトロで、基質または生成物として不飽和の二酸または脂肪酸を使用する酸化還元反応を触媒する天然または操作された酵素を用いて起こすことができる。このような酵素の例は、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．３．１．８）、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ番号１．３．１．４４）、またはステアロイル−ＣｏＡ９−デサチュラーゼ（ＥＣ番号１．１４．１９．１）である。いくつかの場合において、飽和二酸を生産する望ましい反応は、実際にはその正常なインビボでの反応とは逆方向で作用する酵素を必要とする場合があり、このような逆転は、酵素の遺伝子操作によって達成できる。
【０２７１】
増殖条件および発酵
発酵に好適なｐＨの範囲は、多くの場合、約ｐＨ４．０〜約ｐＨ８．０であり、ここで時には、初期の培養条件として約ｐＨ５．５〜約ｐＨ７．０の範囲のｐＨが利用される。宿主生物に応じて、培養は、好気性または嫌気性条件下で行われる可能性があり、その場合、時には、微好気性条件が維持される。２段階プロセスが利用される場合もあり、その場合、１段階目は微生物の繁殖を促進し、他方の状況は標的分子の生産を促進する。２段階プロセスにおいて、第一の段階は、好気条件下（例えば、空気および／または酸素の導入）で行ってもよく、第二の段階は、嫌気性条件下（例えば、培養条件に空気または酸素が導入されない）で行ってもよい。いくつかの実施態様において、第一の段階は、嫌気性条件下で行ってもよく、第二の段階は、好気条件下で行ってもよい。いくつかの実施態様において、２段階プロセスは、さらに２種の生物を包含していてもよく、その場合、例えば、そのうち１種の生物は、一方の段階で中間生成物を生成し、別の生物は、他方の段階で中間生成物を標的脂肪族ジカルボン酸生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）にプロセシングする。
【０２７２】
様々な発酵プロセスが、標的脂肪族ジカルボン酸生成物の商業的な生物学的生産のために適用できる。いくつかの実施態様において、組換え微生物宿主からの標的脂肪族ジカルボン酸生成物の商業的生産は、例えばバッチ式、流加培養または連続発酵プロセスを使用して行われる。
【０２７３】
バッチ発酵プロセスは、多くの場合、閉鎖系であり、その場合、プロセス開始時に培地組成が固定され、プロセス中にｐＨおよび酸素レベルの維持に必要な添加のほかにさらなる添加はなされない。培養プロセスの開始時に、望ましい生物を培地に植え付けると、培地に追加の源（すなわち、炭素および窒素源）を添加しなくても増殖または代謝活性を起こすことが可能である。バッチプロセスにおいて、培養が終わる時間まで系の代謝産物およびバイオマスの組成は絶えず変化する。典型的なバッチプロセスにおいて、細胞は変化のないラグフェーズを経て高増殖対数期に進行し、最終的に固定相に至り、ここで増殖速度は減少するかまたは停止する。未処置のまま放置すれば、固定相中の細胞は、最終的に死ぬと予想される。
【０２７４】
標準的なバッチプロセスのバリエーションは、流加培養プロセスであり、その場合、発酵プロセスの間中、炭素源が発酵槽に継続的に添加される。流加培養プロセスは、異化生成物の抑制が、細胞の代謝を阻害する傾向がある場合や、または培地中の炭素源の量が常に制限されることが望ましい場合に有用である。流加培養システムにおける炭素源濃度の測定は、ｐＨ、溶存酸素および排ガス（例えば、ＣＯ２）の分圧などの測定可能な要素の変化に基づき推定が可能である。
【０２７５】
バッチおよび流加培養式の培養方法は、当業界公知である。このような方法の例は、Thomas D. Brock in Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology、第2版、（1989）Sinauer Associates Sunderland、Mass. and Deshpande、Mukund V.、Appl. Biochem. Biotechnol.、36：227（1992）に見出すことができる。
【０２７６】
連続発酵プロセスでは、多くの場合、バイオリアクターに規定された培地が連続添加され、それと同時に生成物回収のために等量の体積の培養が取り出される。連続培養は、一般的に、一定の細胞密度での対数増殖期で細胞を維持する。連続または半連続培養方法は、細胞増殖または最終産物濃度に影響を与える１種の要素または多数の要素の調節を許容する。例えば、炭素源を制限し、他の全てのパラメーターを代謝が適度になるようなものにすることができるアプローチが可能である。いくつかのシステムにおいて、増殖に影響を及ぼす多数の要素を連続的に変更して、同時に培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に維持することができる。連続的なシステムは、多くの場合、定常状態での増殖を維持し、したがって、多くの場合、細胞増殖速度は、培養物から培地が引き出されることによる細胞の損失とのバランスを保っている。連続培養プロセスのための栄養素および増殖因子の調節方法、加えて生成物形成速度を最大化する技術は公知であり、様々な方法が、上記のBrockによって詳述されている。
【０２７７】
発酵を含むいくつかの実施態様において、発酵は、２種またはそれより多くの微生物（例えば、宿主微生物、操作された微生物、単離された天然に存在する微生物など、およびそれらの組み合わせ）を使用して実行してもよく、その場合、供給材料は、発酵（例えば、混合型の発酵）において１種またはそれより多くの生物により部分的または完全に利用され、１種またはそれより多くの生物の細胞の呼吸または代謝の生成物は、望ましい標的生成物（例えば、セバシン酸、ドデカン二酸、ヘキサン酸）を生産する１種またはそれより多くの他の生物によってさらに代謝させることができる。いくつかの実施態様において、各生物を独立して発酵させて、細胞の呼吸または代謝の生成物を精製し、別の生物と接触させて望ましい標的生成物を生産してもよい。いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くの生物は、代謝経路（例えば、ベータ酸化、オメガ酸化など、またはそれらの組み合わせ）が部分的または完全にブロックされており、それによって１種またはそれより多くの他の生物のための供給材料として使用できる望ましい生成物が生産される。混合型の発酵または連続的な発酵を実行するために、微生物のあらゆる好適な組み合わせが利用できる。
【０２７８】
発酵プロセスの強化
所定の供給材料の成分が、標的生成物（例えば、Ｃ４〜Ｃ２４の二酸）を生産する目的の発酵プロセスで利用される酵母に対し毒性であるか、またはそのような酵母に対し毒性の副産物（例えば、代謝産物）を生産することが確認されている。供給材料からの毒性成分または代謝産物は、時には、標的生成物（例えば、標的分子）を生産するために酵母によって利用される。
【０２７９】
いくつかの場合において、１２個の炭素（すなわち、Ｃ１２）またはそれより少ない炭素を有する脂肪酸成分は、酵母に対し毒性である可能性がある。遊離脂肪酸ではないが、酵母によって１２個またはそれより少ない炭素を有する脂肪酸にプロセシングされた成分も毒作用を有する可能性がある。このような成分の非限定的な例は、酵母によって１２個またはそれより少ない炭素を有する脂肪酸にプロセシングされる脂肪酸のエステル（例えば、メチルエステル）である。直接的に毒性であるか、または非毒性成分が毒性代謝産物に変換されることによって間接的に毒性である分子を含有する供給材料は、集合的に、「毒性供給材料」および「毒性成分」と称される。１種またはそれより多くの毒性成分を含むかまたは送達する供給材料を酵母に供給することは、酵母の生存率を低減させたり、および／または酵母によって生産された標的生成物の量を低減させたりする可能性がある。
【０２８０】
いくつかの実施態様において、供給材料中の所定の成分の毒作用を克服するプロセスは、まず実質的に毒性成分を含有しない供給材料で酵母を誘導し、次いで毒性成分を含む供給材料を酵母に供給することを包含する。したがって、いくつかの実施態様において、酵母に対し毒性の供給材料から酵母によって二酸を生産する方法であって、（ａ）培養状態の遺伝子改変酵母を、該酵母に対し実質的に毒性ではない成分を含む第一の供給材料と接触させることによって、誘導を行うことと；（ｂ）（ａ）で誘導した後の該酵母を、該酵母に対し毒性の成分（「毒性成分」）を含むかまたは送達する第二の供給材料と接触させることとを含み、それにより、誘導が行われない場合に生産される二酸の量より多くの量で、二酸が酵母により生産される、上記方法が提供される。
【０２８１】
第二の供給材料によって供給される毒性成分は、時には、酵母によって標的生成物（例えば、二酸）にプロセシングされる。時には、第一の供給材料中の酵母に対し実質的に毒性ではない成分（例えば、誘導物質）は、酵母によって標的生成物または副産物（例えば、標的生成物とは異なる数の炭素を含有する二酸）にプロセシングされる。第一の供給材料は、時には、第二の供給材料中の成分と同じ数の炭素を有する、酵母に対し実質的に毒性ではない成分、または第二の供給材料中の成分から酵母によってプロセシングされた、すなわち酵母に対し実質的に毒性の代謝産物を含む。いくつかの実施態様において、第一の供給材料は、第二の供給材料中の成分と異なる数の炭素を有する酵母に対し実質的に毒性ではない成分、または第二の供給材料中の成分から酵母によってプロセシングされた、すなわち酵母に対し実質的に毒性の代謝産物を含む。いくつかの実施態様において、第一の供給材料は、標的生成物と同じ数の炭素を有する、酵母に対し実質的に毒性ではない成分（例えば、誘導物質）を含む。時には、第一の供給材料は、標的生成物（例えば、二酸）と異なる数の炭素を有する、酵母に対し実質的に毒性ではない成分（例えば、誘導物質）を含む。
【０２８２】
いくつかの実施態様において、第一の供給材料は、酵母に対し実質的に毒性ではない脂肪酸のエステル（例えば、メチルエステル）を含み、時には、脂肪酸は、１２個より多くの炭素を有する。第一の供給材料は、時には、酵母に対し実質的に毒性ではない脂肪酸を含み、いくつかのケースにおいて、脂肪酸は、１２個より多くの炭素を有する。第一の供給材料は、時には、トリグリセリドを含み、トリグリセリドは、多くの場合、酵母に対し実質的に毒性ではない様々な鎖長の脂肪酸を含有する。所定のケースにおいて、第一の供給材料は、脂肪鎖を含み、ここで脂肪鎖は、多くの場合、６個より多くの炭素を含有し、すなわち酵母に対し実質的に毒性ではない。いくつかの実施態様において、第一の供給材料は、６個の炭素より長い鎖長を有する１種またはそれより多くのアルカン（例えば、直鎖状アルカン、分岐状アルカン、置換アルカン）を含む。いくつかの実施態様において、標的生成物は、Ｃ１２の二酸であり、第一の供給材料は、アルカン（例えば、アルカン誘導物質）を含み、第二の供給材料は、Ｃ１２脂肪酸またはＣ１２脂肪酸のエステルを含み、ここでアルカンは、時には、Ｃ１２アルカンである。いくつかの実施態様において、標的生成物は、Ｃ１０の二酸であり、第一の供給材料は、アルカン（例えば、アルカン誘導物質）を含み、第二の供給材料は、Ｃ１０脂肪酸またはＣ１０脂肪酸のエステルを含み、ここでアルカンは、時には、Ｃ１０アルカンである。いくつかの実施態様において、標的生成物は、Ｃ１８の二酸であり、第一の供給材料は、アルカン（例えば、アルカン誘導物質）を含み、第二の供給材料は、Ｃ１８脂肪酸またはＣ１８脂肪酸のエステルを含み、ここでアルカンは、時には、Ｃ１８アルカンである。いくつかの実施態様において、（ｉ）第一の供給材料および／または第二の供給材料中の成分および（ｉｉ）生成物（例えば、標的生成物）のうち１種またはそれより多くは、飽和している。いくつかの実施態様において、（ｉ）第一の供給材料および／または第二の供給材料中の成分および（ｉｉ）生成物（例えば、標的生成物）のうち１種またはそれより多くは、１つまたはそれより多くの不飽和（例えば、１つまたはそれより多くの二重結合）を包含する。
【０２８３】
いくつかの実施態様において、酵母に第一の供給材料が供給された後、第二の供給材料が酵母に所定の時間供給される。この時間は、時には、約１時間〜約４８時間であり、時には、約１時間〜約１２時間（例えば、約２時間、３、時間、４、時間、５、時間、６時間、７時間、８、時間、９時間、１０時間または１１時間）であり、時には、約３時間〜約９時間である。いくつかの実施態様において、酵母は、カンジダ種の酵母、または本明細書で説明される別の酵母である。
【０２８４】
標的生成物の生産、単離および収量
様々な実施態様において、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）は、培養培地から単離または精製されるか、または操作された微生物から抽出される。いくつかの実施態様において、本明細書で説明される方法による供給材料の発酵は、標的脂肪族ジカルボン酸生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）を、理論収量の約１０％〜約１００％（例えば、理論収量の約１５％、約２０％、約２５％またはそれより多く（例えば、理論収量の、２５％またはそれより多く、２６％またはそれより多く、２７％またはそれより多く、２８％またはそれより多く、２９％またはそれより多く、３０％またはそれより多く、３１％またはそれより多く、３２％またはそれより多く、３３％またはそれより多く、３４％またはそれより多く、３５％またはそれより多く、３６％またはそれより多く、３７％またはそれより多く、３８％またはそれより多く、３９％またはそれより多く、４０％またはそれより多く、４１％またはそれより多く、４２％またはそれより多く、４３％またはそれより多く、４４％またはそれより多く、４５％またはそれより多く、４６％またはそれより多く、４７％またはそれより多く、４８％またはそれより多く、４９％またはそれより多く、５０％またはそれより多く、５１％またはそれより多く、５２％またはそれより多く、５３％またはそれより多く、５４％またはそれより多く、５５％またはそれより多く、５６％またはそれより多く、５７％またはそれより多く、５８％またはそれより多く、５９％またはそれより多く、６０％またはそれより多く、６１％またはそれより多く、６２％またはそれより多く、６３％またはそれより多く、６４％またはそれより多く、６５％またはそれより多く、６６％またはそれより多く、６７％またはそれより多く、６８％またはそれより多く、６９％またはそれより多く、７０％またはそれより多く、７１％またはそれより多く、７２％またはそれより多く、７３％またはそれより多く、７４％またはそれより多く、７５％またはそれより多く、７６％またはそれより多く、７７％またはそれより多く、７８％またはそれより多く、７９％またはそれより多く、８０％またはそれより多く、８１％またはそれより多く、８２％またはそれより多く、８３％またはそれより多く、８４％またはそれより多く、８５％またはそれより多く、８６％またはそれより多く、８７％またはそれより多く、８８％またはそれより多く、８９％またはそれより多く、９０％またはそれより多く、９１％またはそれより多く、９２％またはそれより多く、９３％またはそれより多く、９４％またはそれより多く、９５％またはそれより多く、９６％またはそれより多く、９７％またはそれより多く、９８％またはそれより多く、または９９％またはそれより多く）のレベルで生産できる。用語「理論収量」は、本明細書で使用される場合、反応が１００％完了した場合、出発原料から作製される可能性がある生成物の量を指す。理論収量は、出発原料が完全に消費され、望ましくない副反応が起こらず、逆反応が起こらず、ワークアップ手法中の損失がない反応の化学量論および理想的な条件に基づく。標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）濃度に関して培養培地を試験してもよいし、濃度が予め決められたレベルに達したら培養培地を引き出してもよい。検出方法は当業界公知であり、例えば、これらに限定されないが、クロマトグラフ法（例えば、ガスクロマトグラフィー）またはクロマトグラフ／マススペクトロメトリーの組み合わせ（例えば、ＧＣ−ＭＳ）方法が挙げられる。標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）は、本明細書で説明されるようなレベルの範囲で存在する可能性がある。
【０２８５】
標的脂肪族ジカルボン酸生成物は、時には、培養プロセスが完了した後に操作された微生物内に保持され、いくつかの実施態様において、標的生成物は、微生物から培養培地に分泌される。後者の実施態様の場合、（ｉ）培養培地を培養系から引き出して、新しい培地を補充してもよいし、および／または（ｉｉ）培養プロセス中または培養プロセスが完了した後に、標的生成物を培養培地から抽出してもよい。操作された微生物は、固体培地上で、半固体培地上でまたは液状培地中で培養してもよい。いくつかの実施態様において、プレートに付着している細胞から培地を抜く。いくつかの実施態様において、当業界で知られている通りに、細胞をペレット化するのに十分であるが細胞を破壊しない速度で液体と細胞の混合物を遠心分離して、培地を抜き出す。次いで細胞を新しい培地に再懸濁してもよい。当業界公知の方法に従って、標的生成物を培養培地から精製してもよい。
【０２８６】
いくつかの実施態様において、標的二酸は、他の二酸および／または副産物を含有する生成物中に存在する。標的二酸は、好適な精製手法を使用して他の二酸および／または副産物から精製できる。一部精製された、または実質的に精製された標的二酸は、精製プロセスを使用して生産してもよい。
【０２８７】
本明細書において、発酵ブロスから標的生成物を回収する、および／または混合鎖長供給材料を利用する場合、非標的生成物から標的脂肪族ジカルボン酸生成物を単離する／部分的に精製するのに有用な方法の非限定的な例を示す。発酵ブロスからの脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）の回収は、様々な方法を使用して達成できる。場合によっては、水相から細胞塊と脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）とを分離するために、まず遠心分離工程を採用してもよい。脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）は、発酵条件下における水への溶解度が限られており、水の密度に類似した密度を有する。遠心分離すると、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）の大部分が水のストリームから抜き出され、細胞塊ストリーム中で濃縮されると予想される。次いで濃縮した脂肪族ジカルボン酸のストリームは、ろ過工程を介してさらに濃縮されると予想される（例えば、固体のドデカン二酸はフィルターに保持され、水はそのまま通過するので、生成物が濃縮される）。脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）が望ましいレベルに濃縮されたら、その融点である１３０℃より高く温度を高めると予想される。脂肪族ジカルボン酸が融解した後、残存した不純物をろ過により除去し、温度を下げて、脂肪族ジカルボン酸をそのまま凝固させて、固体生成物を収集することにより最終産物を回収する。
【０２８８】
その代わりに、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）を、まず、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）が溶解できる有機溶媒（例えば、エタノール）を用いて液体培地を抽出することによって、発酵ブロスから回収してもよい。次いで有機溶媒相を様々な膜に通過させてろ過して、脂肪族ジカルボン酸をさらに精製してもよい。それに続いて同じまたは異なる有機溶媒を用いた抽出を行ってもよく、続いて、脂肪族ジカルボン酸をさらに濃縮するために各抽出ラウンドの後に膜ろ過を行ってもよい。有機溶媒を蒸発させて、残留物として脂肪族ジカルボン酸を残してもよく、この残留物を乾燥させて、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）を固体の形態で得てもよい。
【０２８９】
いくつかの実施態様において、標的生成物は、培養された操作された微生物から抽出される。微生物細胞は、細胞膜を剪断するのに十分な速度で遠心分離することにより濃縮されてもよい。いくつかの実施態様において、細胞は、物理的に破壊してもよいし（例えば、剪断力、超音波破砕）または化学的に破壊してもよい（例えば、界面活性剤または他の溶解剤との接触）。遠心分離または当業界公知の他の方法によって相分離を行ってもよいし、公知の方法に従って標的生成物を単離してもよい。
【０２９０】
市販用グレードの標的生成物は、時には、実質的に純粋な形態で（例えば、９０％またはそれより高く純粋な、９５％またはそれより高く純粋な、９９％またはそれより高く純粋な、または９９．５％またはそれより高く純粋な形態で）提供される。いくつかの実施態様において、標的生成物は、多数の下流生成物のいずれか１種に改変されてもよい。例えば、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）をヘキサメチレンジアミンと重縮合させてナイロンを生産してもよい。ナイロンはさらに、カーペット、自動車用タイヤコードおよび衣類における用途のための繊維に操作されてもよい。脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）はまた、可塑剤、潤滑剤成分およびポリウレタン系のためのポリエステルポリオールの製造にも使用される。食品グレードの脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）の様々なエステルが、芳香剤製造、ゲル化助剤、香料、酸味料、膨張剤および緩衝剤における成分として使用される。脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）は、２つのカルボン酸（−ＣＯＯＨ）基を有することから、２種の塩を産出することができる。その誘導体、ハロゲン化アシル、無水物、エステル、アミドおよびニトリルは、さらなる置換反応、触媒還元、金属水素化物による還元、ジボランによる還元、有機金属試薬とのケト形成、酸素における求電子性の結合、および縮合を介して様々な下流生成物を作製することに使用される。
【０２９１】
標的生成物は、標的生成物を含有する培養された微生物内に提供されてもよいし、培養された微生物は、液状培地中で新鮮な状態もしくは凍結した状態で、または乾燥させた状態で提供されてもよい。新鮮なまたは凍結した微生物は、必要に応じて温度制御可能な適切な耐湿性容器中に入れられてもよい。標的生成物は、時には、実質的に細胞を含まない培養培地中に提供される。いくつかの実施態様において、微生物から精製された標的生成物または改変された標的生成物が提供され、標的生成物は、時には、実質的に純粋な形態で提供される。いくつかの実施態様において、結晶化または粉末化した標的生成物が提供される。ドデカン二酸（１，１２ドデカン二酸；ＤＤＤＡ）は、２６０°Ｆ〜２６６°Ｆの融点を有する白色の粉末または結晶である。またセバシン酸（１，８オクタンジカルボン酸）も、２６８°Ｆ〜２７４°Ｆの融点を有する白色の粉末または結晶である。結晶化または粉末化した脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）は、１トンのカートン、ドラム、５０ポンドのバッグおよび同種のものなどの様々な容器中で輸送が可能である。
【０２９２】
いくつかの実施態様において、脂肪族ジカルボン酸である標的生成物（例えば、ドデカン二酸またはセバシン酸）は、添加された供給材料１グラムあたり約０．５０グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．５１グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．５２グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．５３グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．５４グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．５５グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．５６グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．５７グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．５８グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．５９グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．６０グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．６１グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．６２グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．６３グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．６４グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．６５グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．６６グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．６７グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．６８グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．６９グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．７０グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．７１グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．７２グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．７３グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．７４グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．７５グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．７６グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．７７グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．７８グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．７９グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．８０グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．８１グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．８２グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．８３グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．８４グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．８５グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．８６グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．８７グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．８８グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．８９グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．９０グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．９１グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．９２グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．９３グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．９４グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．９５グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．９６グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．９７グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．９８グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．９９グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり１．０グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり１．１グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり１．２グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり１．３グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり１．４グラムの標的生成物、またはそれより多く；または約添加された供給材料１グラムあたり１．５グラムの標的生成物、またはそれより多くの収量で生産される。
【０２９３】
いくつかの実施態様において、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）は、供給材料（例えば、ドデカン、混合鎖長アルカン、ラウリン酸、混合鎖長脂肪酸、油など、または前述のものの組み合わせ）１グラムあたり約０．１５グラムより多くの収量で生産される。いくつかの実施態様において、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）は、導入されたあらゆる供給材料の最大理論収量の約１０％〜約１００％（（例えば、理論収量の、約１５％、約２０％、約２５％またはそれより多く（例えば、最大理論収量の２５％またはそれより多く、２６％またはそれより多く、２７％またはそれより多く、２８％またはそれより多く、２９％またはそれより多く、３０％またはそれより多く、３１％またはそれより多く、３２％またはそれより多く、３３％またはそれより多く、３４％またはそれより多く、３５％またはそれより多く、３６％またはそれより多く、３７％またはそれより多く、３８％またはそれより多く、３９％またはそれより多く、４０％またはそれより多く、４１％またはそれより多く、４２％またはそれより多く、４３％またはそれより多く、４４％またはそれより多く、４５％またはそれより多く、４６％またはそれより多く、４７％またはそれより多く、４８％またはそれより多く、４９％またはそれより多く、５０％またはそれより多く、５１％またはそれより多く、５２％またはそれより多く、５３％またはそれより多く、５４％またはそれより多く、５５％またはそれより多く、５６％またはそれより多く、５７％またはそれより多く、５８％またはそれより多く、５９％またはそれより多く、６０％またはそれより多く、６１％またはそれより多く、６２％またはそれより多く、６３％またはそれより多く、６４％またはそれより多く、６５％またはそれより多く、６６％またはそれより多く、６７％またはそれより多く、６８％またはそれより多く、６９％またはそれより多く、７０％またはそれより多く、７１％またはそれより多く、７２％またはそれより多く、７３％またはそれより多く、７４％またはそれより多く、７５％またはそれより多く、７６％またはそれより多く、７７％またはそれより多く、７８％またはそれより多く、７９％またはそれより多く、８０％またはそれより多く、８１％またはそれより多く、８２％またはそれより多く、８３％またはそれより多く、８４％またはそれより多く、８５％またはそれより多く、８６％またはそれより多く、８７％またはそれより多く、８８％またはそれより多く、８９％またはそれより多く、９０％またはそれより多く、９１％またはそれより多く、９２％またはそれより多く、９３％またはそれより多く、９４％またはそれより多く、９５％またはそれより多く、９６％またはそれより多く、９７％またはそれより多く、９８％またはそれより多く、または９９％またはそれより多く）で生産される。いくつかの実施態様において、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）は、約５０ｇ／Ｌ（培養培地）〜約１０００ｇ／Ｌ（培養培地）の濃度範囲（例えば、約５０ｇ／Ｌ、約５５ｇ／Ｌ、約６０ｇ／Ｌ、約６５ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ、約７５ｇ／Ｌ、約８０ｇ／Ｌ、約８５ｇ／Ｌ、約９０ｇ／Ｌ、約９５ｇ／Ｌ、約１００ｇ／Ｌ、約１１０ｇ／Ｌ、約１２０ｇ／Ｌ、約１３０ｇ／Ｌ、約１４０ｇ／Ｌ、約１５０ｇ／Ｌ、約１６０ｇ／Ｌ、約１７０ｇ／Ｌ、約１８０ｇ／Ｌ、約１９０ｇ／Ｌ、約２００ｇ／Ｌ、約２２５ｇ／Ｌ、約２５０ｇ／Ｌ、約２７５ｇ／Ｌ、約３００ｇ／Ｌ、約３２５ｇ／Ｌ、約３５０ｇ／Ｌ、約３７５ｇ／Ｌ、約４００ｇ／Ｌ、約４２５ｇ／Ｌ、約４５０ｇ／Ｌ、約４７５ｇ／Ｌ、約５００ｇ／Ｌ、約５５０ｇ／Ｌ、約６００ｇ／Ｌ、約６５０ｇ／Ｌ、約７００ｇ／Ｌ、約７５０ｇ／Ｌ、約８００ｇ／Ｌ、約８５０ｇ／Ｌ、約９００ｇ／Ｌ、約９５０ｇ／Ｌ、または約１０００ｇ／Ｌ）で生産される。
【０２９４】
いくつかの実施態様において、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）は、約０．５ｇ／Ｌ／時間〜約５ｇ／Ｌ／時間の速度（例えば、約０．５ｇ／Ｌ／時間、約０．６ｇ／Ｌ／時間、約０．７ｇ／Ｌ／時間、約０．８ｇ／Ｌ／時間、約０．９ｇ／Ｌ／時間、約１．０ｇ／Ｌ／時間、約１．１ｇ／Ｌ／時間、約１．２ｇ／Ｌ／時間、約１．３ｇ／Ｌ／時間、約１．４ｇ／Ｌ／時間、約１．５ｇ／Ｌ／時間、約１．６ｇ／Ｌ／時間、約１．７ｇ／Ｌ／時間、約１．８ｇ／Ｌ／時間、約１．９ｇ／Ｌ／時間、約２．０ｇ／Ｌ／時間、約２．２５ｇ／Ｌ／時間、約２．５ｇ／Ｌ／時間、約２．７５ｇ／Ｌ／時間、約３．０ｇ／Ｌ／時間、約３．２５ｇ／Ｌ／時間、約３．５ｇ／Ｌ／時間、約３．７５ｇ／Ｌ／時間、約４．０ｇ／Ｌ／時間、約４．２５ｇ／Ｌ／時間、約４．５ｇ／Ｌ／時間、約４．７５ｇ／Ｌ／時間、または約５．０ｇ／Ｌ／時間）で生産される。所定の実施態様において、操作された生物は、同一の発酵条件下で野生型または同じ株の部分的に操作された生物と比較した場合、約５倍〜約５００倍増加した脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）生産を含む（例えば、約５倍の増加、約１０倍の増加、約１５倍の増加、約２０倍の増加、約２５倍の増加、約３０倍の増加、約３５倍の増加、約４０倍の増加、約４５倍の増加、約５０倍の増加、約５５倍の増加、約６０倍の増加、約６５倍の増加、約７０倍の増加、約７５倍の増加、約８０倍の増加、約８５倍の増加、約９０倍の増加、約９５倍の増加、約１００倍の増加、約１２５倍の増加、約１５０倍の増加、約１７５倍の増加、約２００倍の増加、約２５０倍の増加、約３００倍の増加、約３５０倍の増加、約４００倍の増加、約４５０倍の増加、または約５００倍の増加）。
【０２９５】
いくつかの実施態様において、ベータ酸化が完全にブロックされた操作された微生物におけるドデカン二酸の最大理論収量（Ｙｍａｘ）は、添加されたラウリン酸１グラムあたり約１．１５グラムの生産されたドデカン二酸である。いくつかの実施態様において、ベータ酸化が完全にブロックされた操作された微生物におけるドデカン二酸の最大理論収量（Ｙｍａｘ）は、添加されたラウリン酸メチル１グラムあたり約１．０７グラムの生産されたドデカン二酸である。いくつかの実施態様において、ベータ酸化が部分的にブロックされた操作された微生物におけるドデカン二酸の最大理論収量（Ｙｍａｘ）は、添加されたオレイン酸１グラムあたり約０．８２グラムの生産されたドデカン二酸である。いくつかの実施態様において、ベータ酸化が部分的にブロックされた操作された微生物におけるドデカン二酸の最大理論収量（Ｙｍａｘ）は、添加されたヤシ油１グラムあたり約０．９５グラムの生産されたドデカン二酸である。ドデカン二酸が生産される条件下での操作された微生物に関するＹｍａｘのパーセンテージは、（％Ｙｍａｘ）＝Ｙｐ／ｓ／Ｙｍａｘ×１００として計算され、式中（Ｙｐ／ｓ）＝［ドデカン二酸（ｇ／Ｌ）］×フラスコ中の培養液の最終容量（Ｌ）］／［フラスコに添加された供給材料（ｇ）］である。いくつかの実施態様において、操作された微生物は、最大理論収量の約１０％〜約１００％でドデカン二酸を生産する。
【０２９６】
いくつかの実施態様において、ベータ酸化が完全にブロックされた操作された微生物におけるセバシン酸の最大理論収量（Ｙｍａｘ）は、添加されたデカン１グラムあたり約１．４２グラムの生産されたセバシン酸である。いくつかの実施態様において、ベータ酸化が完全にブロックされた操作された微生物におけるセバシン酸の最大理論収量（Ｙｍａｘ）は、添加されたカプリン酸１グラムあたり約１．１７グラムの生産されたセバシン酸である。いくつかの実施態様において、ベータ酸化が部分的にブロックされた操作された微生物におけるセバシン酸の最大理論収量（Ｙｍａｘ）は、添加されたヤシ油１グラムあたり約０．８３グラムの生産されたセバシン酸である。いくつかの実施態様において、ベータ酸化が部分的にブロックされた操作された微生物におけるセバシン酸の最大理論収量（Ｙｍａｘ）は、添加されたオレイン酸１グラムあたり約０．７２グラムの生産されたセバシン酸である。セバシン酸が生産される条件下での操作された微生物に関するＹｍａｘのパーセンテージは、（％Ｙｍａｘ）＝Ｙｐ／ｓ／Ｙｍａｘ×１００として計算され、式中（Ｙｐ／ｓ）＝［セバシン酸（ｇ／Ｌ）］×フラスコ中の培養液の最終容量（Ｌ）］／［フラスコに添加された供給材料（ｇ）］である。いくつかの実施態様において、操作された微生物は、最大理論収量の約１０％〜約１００％でセバシン酸を生産する。
【実施例】
【０２９７】
以下に記載の実施例は所定の実施態様を例示したものであり、本技術を限定するものではない。以下に記載の所定の実施例は、標準的な組換えＤＮＡおよび他の当業界公知の生物工学プロトコールを利用する。多くのこのような技術は、Maniatis, T.、E. F. FritschおよびJ. Sambrook（1982）Molecular Cloning：a Laboratory Manual；コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーで詳細に説明されている。ＤＮＡ変異誘発は、ストラタジーン（カリフォルニア州サンディエゴ）「クイックチェンジ」キットを製造元の説明書に従って使用して達成できる。
【０２９８】
微生物の組換えＤＮＡ技術および遺伝子操作の非限定的な例を本明細書で説明する。いくつかの実施態様において、望ましい標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産のために、本明細書で説明される天然および／または操作された経路を介した炭素フラックスの管理がさらに強化されるように、本明細書で説明される操作された生物の株は、交配されて遺伝学的背景が組み合わされている。
【０２９９】
実施例１：振盪フラスコ発酵でのデカンからセバシン酸への変換
５０ｍＬのＳＰ９２培地（６．７ｇ／Ｌ酵母窒素原礎培地、３．０ｇ／Ｌ酵母抽出物、３．０ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、７５ｇ／Ｌデキストロース）に、カンジダ・トロピカリスのベータ酸化が完全にブロックされた株（ＡＴＣＣ２０９６２）のシングルコロニーを植え付け、培養物を約３００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。細胞を４℃で１０分間、１，０５０×ｇで遠心分離することによってペレット化し、上清を捨てた。細胞を２０ｍＬのＴＢ−低窒素含有（低Ｎ）培地（硫酸アンモニウム非含有の１．７ｇ／Ｌ酵母窒素原礎培地、３．０ｇ／Ｌ酵母抽出物、１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４）中に再懸濁し、新しい滅菌した２５０ｍＬガラス製バッフル付きフラスコに移し、以下の栄養供給スケジュールを利用して、約２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃でインキュベートした：０、１、２、３、４、および５時間にデキストロースを０．１％まで供給、３０時間にデキストロースを５％まで供給、０、５、３０、および４８時間にデカンを０．７％まで供給。０、４、３０、および７２時間に、ガスクロマトグラフ（ＧＣ）分析のためにサンプルを取り出した。図９で示されるように、ＧＣプロファイルから、培養によりＣ１０ジカルボン酸（セバシン酸）が蓄積し、Ｃ１０モノカルボン酸（カプリン酸）の蓄積は極めてわずかであったことが示された。７２時間インキュベートした後セバシン酸濃度は０．９４ｇ／Ｌであり、カプリン酸濃度は０．０１ｇ／Ｌであった。他のあらゆる一酸または二酸の有意な蓄積はなかった。
【０３００】
実施例２：振盪フラスコ発酵でのカプリン酸からセバシン酸への変換
５ｍＬのＳＰ９２−グリセロール培地（６．７ｇ／Ｌ酵母窒素原礎培地、３．０ｇ／Ｌ酵母抽出物、３．０ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、７５ｇ／Ｌグリセロール）に、カンジダ・トロピカリス（ＡＴＣＣ２０９６２）のシングルコロニーを植え付け、初発培養物を約２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。ＳＰ９２培地の配合の改変は公知であり、その非限定的な例としては、デキストロースおよび／またはグリセロールなど、またはそれらの組み合わせの添加が挙げられる。ＳＰ９２培地は、本明細書で述べられる場合、デキストロースおよび／またはグリセロールを包含する場合もある。次いで初発培養物を使用して、同じ培地中の２５ｍＬの培養物を初期ＯＤ６００ｎｍが０．４になるまで植え付け、約３００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。細胞を４℃で１０分間、１，０５０×ｇで遠心分離することによってペレット化し、上清を捨てた。１２．５ｍＬのＴＢ−低Ｎ培地＋グリセロール（硫酸アンモニウム非含有の１．７ｇ／Ｌ酵母窒素原礎培地、３．０ｇ／Ｌ酵母抽出物、１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、７５ｇ／Ｌグリセロール）中に細胞を再懸濁し、新しい滅菌した２５０ｍＬガラス製バッフル付きフラスコに移した。培養物に、０．０５％または０．１％カプリン酸を供給し、約３００ｒｐｍで振盪しながら３０℃でインキュベートした。２４時間インキュベートした後、培養物に、グリセロールを７５ｇ／Ｌまで供給し、インキュベートを続け、その後４８時間にＧＣ用のサンプリングを行った。ＧＣ分析から、図１０で示されるように、両方のカプリン酸の開始濃度下で、カプリン酸のほぼ全てがセバシン酸に変換されたことが示された。
【０３０１】
実施例３：デカンからセバシン酸へ変換するための発酵手法
ろ過滅菌した改変ＳＰ９２−グリセロール発酵培地（６．７ｇ／Ｌ酵母窒素原礎培地、３．０ｇ／Ｌ酵母抽出物、３．０ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２０ｇ／Ｌグリセロール）を滅菌発酵容器に移した。カンジダ・トロピカリス（ＡＴＣＣ２０９６２）の増殖物を初期ＯＤ６００ｎｍが約１．０になるまで５％の接種材料で植え付け、以下：３０℃約１０００ｒｐｍで振盪しながら、１体積／分あたり１体積の通気（ｖｖｍ）、ｐＨ５．８および０．３Ｌの初期体積の条件下で増殖を実行した。増殖をおよそ８時間進行させ、２ｇ／Ｌまでデカンを添加することによって変換期を開始させた。デカンのボーラス添加と同時にデカン（１ｇ／Ｌ−ｈ）およびグルコース（１．５ｇ／Ｌ−ｈ）の連続フィードを開始させた。発酵条件を、３０℃、１０００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、およびｐＨ５．８で４４時間に維持した。
【０３０２】
変換期を開始させた後、４４時間でＧＣ分析のためにサンプルを収集した。図１６に示したデータは、デカンが独占的にＣ１０ジカルボン酸であるセバシン酸に変換されたことを示す。デカンフィードボトルからの有意な蒸発による損失により生成物収量の正確な決定が妨げられた。
【０３０３】
実施例４：振盪フラスコ発酵での混合脂肪酸供給材料からセバシン酸を含有する混合二酸生成物への変換
５ｍＬのＳＰ９２−グリセロール培地（６．７ｇ／Ｌ酵母窒素原礎培地、３．０ｇ／Ｌ酵母抽出物、３．０ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、７５ｇ／Ｌグリセロール）にカンジダ・トロピカリス（ＡＴＣＣ２０９６２）のシングルコロニーを植え付け、実施例２で説明されているようにして増殖させた。２５ｍＬの同じ培地を、一晩の培養により初期ＯＤ６００ｎｍが０．４になるまで植え付け、約３００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。４℃で１０分間、１，０５０×ｇで遠心分離することによって細胞をペレット化し、上清を捨てた。炭素源非含有のＴＢ−低Ｎ培地（硫酸アンモニウム非含有の１．７ｇ／Ｌ酵母窒素原礎培地、３．０ｇ／Ｌ酵母抽出物、１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４）１２．５ｍＬに細胞を再懸濁し、新しい滅菌した２５０ｍＬガラス製バッフル付きフラスコに移した。培養物に０．０５％カプリン酸、０．０５％ラウリン酸メチル、および３０ｇ／Ｌグリセロールを供給し、３０℃、３００ｒｐｍでインキュベートした。２４時間インキュベート後、ＧＣ分析のために培養物をサンプリングした。
【０３０４】
図１７に示した結果から、Ｃ１２およびＣ１０脂肪酸が、同じ鎖長を有するジカルボン酸（例えば、Ｃ１２およびＣ１０ジカルボン酸）に変換されたことが示され、二酸の鎖が短くなった証拠（例えば、有意なレベルのモノカルボン酸が検出されなかったこと）は示されなかった。
【０３０５】
実施例５：長鎖脂肪酸から混合二酸への変換
ＳＰ９２発酵培地をろ過滅菌し、滅菌発酵容器に移した。ベータ酸化が部分的にブロックされたカンジダ・トロピカリスの株（ｓＡＡ１０６）の増殖を、１０％の接種材料（初期のＯＤ６００ｎｍ＝３．０）を用いて開始させ、以下：３０℃、約１２００ｒｐｍで振盪しながら、１ｖｖｍ、ｐＨ６．１および０．３Ｌの初期体積の条件下で増殖させた。グルコース濃度が２ｇ／Ｌ未満に落ちるまで増殖を続け、その時間に、６ＮのＫＯＨの添加によりｐＨを８．０に高めることによって、さらにミリスチン酸メチルを３０ｇ／Ｌまで添加することによって変換期を開始させた。ミリスチン酸メチルのボーラスの直後、グルコースの連続フィードを１．５ｇ／Ｌ−ｈの速度で開始させた。変換開始後の２４、４８、および７２時間に３０ｇ／Ｌミリスチン酸メチルのボーラスを用いることにより、発酵条件を３０℃、１２００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、およびｐＨ８．０で９０時間に維持した。２４、４８、７２、および９０時間にＧＣ用のサンプルを収集した。図１１で図表を用いて例示された二酸プロファイルは、セバシン酸を包含する６〜１４個の炭素長を有する鎖長の範囲のジカルボン酸が蓄積したことを示す。サイクリックβ酸化経路を介した２つの炭素の増加によって短縮化される前に、まずミリスチン酸メチル基質（ミリスチン酸のメチルエステル）がω酸化経路を介してＣ１４ジカルボン酸に変換された。発酵中に採用されたグルコースのコフィードは、全ての鎖長の二酸が蓄積されるようにβ酸化経路を抑制した。二酸鎖長分布の操作は、発酵培地中のグルコースのコフィード速度を変更することで様々なグルコース濃度下で増殖させることによって目下調査中である。
【０３０６】
実施例６：混合長鎖脂肪酸からそれより短い鎖長の混合二酸への変換のための発酵手法
グリセロール非含有のＳＰ９２発酵培地をろ過滅菌し、滅菌発酵容器に移した。容器にオートクレーブした未処理のヤシ油を８０ｇ／Ｌの最終濃度まで添加した。ベータ酸化が部分的にブロックされたカンジダ・トロピカリス株（ｓＡＡ４９６）を初期ＯＤ６００ｎｍが１．０になるまで５％の接種材料で植え付け、以下：３０℃約１２００ｒｐｍで振盪しながら、１ｖｖｍ、初期ｐＨ６．５および１．０Ｌの初期体積の条件下で増殖させた。脂肪酸の鎖長の分布に対するｐＨの作用を、発酵培地のｐＨを操作することによって決定した。発酵のｐＨは、１）ｐＨ７．５まで高めて実行中そのｐＨで制御するか、２）培養の増殖によって自然に低下させて、その後、残りの実行中、ｐＨ６．０で制御するか、または３）培養の増殖によって自然に低下させて、その後、残りの実行中、ｐＨ４．５で制御するかのいずれかであった。１４０時間の発酵時間の後にＧＣ分析のためにサンプルを収集した。以下の表１で示されるように、生成物である二酸組成物は、ｐＨを高めることによってより長い鎖の二酸にシフトすることが示された。
【０３０７】
【表１】
2016501040.tif 000003
【０３０８】
実施例７：オメガ酸化経路において追加の遺伝学的改変を有するベータ酸化が完全にブロックされた株を使用した、振盪フラスコ発酵でのカプリン酸からセバシン酸への変換
カンジダ・トロピカリスの様々な遺伝子改変株を、５ｍＬのＳＰ９２培地（６．７ｇ／Ｌ酵母窒素原礎培地、３．０ｇ／Ｌ酵母抽出物、３．０ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、７５ｇ／Ｌグリセロール）に植え付けた。カンジダ・トロピカリスのベータ酸化が完全にブロックされた株（ｓＡＡ００３）、加えてオメガ酸化経路の要素（例えば、様々なシトクロムＰ４５０、シトクロムＰ４５０レダクターゼまたはそれらの組み合わせ）を増幅させたｓＡＡ００３の誘導体を包含する株およびそれらの培養物を、約２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。次いでこれらの初発培養物を使用して、同じ培地中の２５ｍＬの培養物を植え付け、約２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。細胞を４℃で１０分間、１，０５０×ｇで遠心分離することによってペレット化し、上清を捨てた。１２．５ｍＬのＴＢ−低Ｎ培地＋グリセロール（硫酸アンモニウム非含有の１．７ｇ／Ｌ酵母窒素原礎培地、３．０ｇ／Ｌ酵母抽出物、１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、７５ｇ／Ｌグリセロール）中に細胞を再懸濁し、新しい滅菌した２５０ｍＬガラス製バッフル付きフラスコに移した。培養物に、エタノール中５％カプリン酸溶液から０．０５％供給したおよび約３００ｒｐｍで振盪しながら３０℃でインキュベートした。２４時間インキュベートした後、培養物に、３０ｇ／Ｌまでのグリセロールと０．０５％カプリン酸の追加のボーラスを供給した。インキュベートを続け、その後２４、４８、および７２時間にＧＣ用のサンプリングを行った。図１２に結果を示す。ＧＣ分析から、オメガ酸化経路の特定の要素が増幅されると、より大きい比率のカプリン酸がセバシン酸に変換されたことが示された。データは、最大理論収量の％として示される。ＣＹＰＡ１８およびＣＹＰＡ１９に対する遺伝学的改変を包含する株は、カプリン酸からセバシン酸への変換における最大理論収量のおよそ８０％を達成する。＋ＣＰＲ＋Ａ１８と名付けられた株は、ＣＹＰＡ１８の約３０のコピーを有するが、それに対して＋ＣＰＲ＋Ａ１９と名付けられた株は、ＣＹＰＡ１９の約７のコピーを有する。
【０３０９】
実施例８：振盪フラスコ発酵でのラウリン酸メチルからドデカン二酸への変換
５ｍＬのＳＰ９２グリセロール培地（６．７ｇ／Ｌ酵母窒素原礎培地、３．０ｇ／Ｌ酵母抽出物、３．０ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、７５ｇ／Ｌグリセロール）に、カンジダ・トロピカリスのベータ酸化が完全にブロックされた株（ＡＴＣＣ２０９６２）、加えてオメガ酸化経路の要素を増幅させたこの株の改変された誘導体のシングルコロニーを植え付け、この培養物を約２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。次いで初発培養物を使用して、同じ培地の２５ｍＬの培養物に植え付け、約２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。細胞を４℃で１０分間、１，０５０×ｇで遠心分離することによってペレット化し、上清を捨てた。細胞を１２．５ｍＬのＳＰ９２グリセロール培地に再懸濁し、滅菌した２５０ｍＬガラス製バッフル付きフラスコに移した。培養物に、２％（ｖ／ｖ）ラウリン酸メチルを供給し、約３００ｒｐｍで振盪しながら３０℃でインキュベートした。２４時間インキュベートした後、培養物に、グリセロールを６０ｇ／Ｌまで供給し、インキュベートを続け、その後４８時間にＧＣ用のサンプリングを行った。ＧＣ分析から、オメガ酸化経路における所定の要素が増幅されると、ドデカン二酸への変換が増加することが示された（図１３）。
【０３１０】
実施例９：アシルＣｏＡオキシダーゼの基質特異性の変更
ペルオキシソームのアシル−ＣｏＡオキシダーゼ酵素ＰＯＸ４およびＰＯＸ５の基質特異性は、混合鎖長脂肪酸供給材料が供給されたカンジダ・トロピカリスの発酵における二酸生成物の鎖長の制御に関与することが示されている。ＰＯＸ４活性、ＰＯＸ５活性またはＰＯＸ４活性およびＰＯＸ５活性の低減または除去は、Ｃ．トロピカリスで生産されたジカルボン酸の炭素鎖長の分布をもたらす。アシル−ＣｏＡオキシダーゼは、各サイクルで基質を２つの炭素分短くする、サイクリックベータ酸化経路における第一の酵素である。したがって、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、ベータ酸化経路に入る基質にとって経路の入り口として役立つ。望ましい炭素鎖長（例えば、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４および同種のもの）より短い炭素鎖の基質に対して活性ではなくなるようにアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性の基質特異性を変更することによって、選ばれた理論限界より短く炭素鎖を短くすることを阻害することができ、望ましい標的鎖長および生成物（例えば、Ｃ１２、ドデカン二酸）の蓄積を可能にする。
【０３１１】
Ｃ．トロピカリスにおける天然のアシル−ＣｏＡオキシダーゼアイソザイムであるＰｏｘ４ｐおよびＰｏｘ５ｐは、異なる基質特異性を有する。Ｐｏｘ４ｐアイソザイムは広範な基質特異性を有するが、Ｐｏｘ５ｐアイソザイムは、制限された基質特異性を有する。Ｐｏｘ４−、Ｐｏｘ５＋である株において、二酸生成物の鎖長は、Ｐｏｘ５ｐアイソザイムの基質特異性によって決定され、主要な生成物は、アジピン酸である。
【０３１２】
いくつかの実施態様において、発酵においてより長い鎖長（例えば、Ｃ１２）を有する望ましい二酸生成物の生産を最大にするために、望ましい二酸生成物の鎖長に適切な基質鎖長特異性を有するアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を含有する遺伝子改変生物を操作してもよい。アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性の源またはアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を操作する方法は、様々であってもよい。アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性の変更された基質特異性の操作での使用に好適なポリヌクレオチド配列を提供するのに使用できる生物の非限定的な例としては、植物（例えば、シロイヌナズナ属、ウリ科（例えば、カボチャ、スクワッシュ）、イネ科（Oryza）（例えば、コメ））；動物（例えば、ウシ属（Bos）（例えば、ウシ）、テンジクネズミ属（例えば、モルモット）、ハツカネズミ属（例えば、マウス）、クマネズミ属（例えば、ラット）、コアラ属（Phascolarctos）（例えば、コアラ）、霊長類（例えば、オランウータン））；糸状菌（例えば、タマホコリカビ属（例えば、粘菌））；昆虫（例えば、ショウジョウバエ）；酵母（例えば、ヤロウイア・リポリチカ、カンジダ・マルトサ、カンジダ・グラブラータ、アシュビア・ゴシッピイ（Ashbya gossypii）、デバリオマイセス・ハンセニイ、クルイベロマイセス・ラクティス、ピチア・パストリス、サッカロミセス・セレビジエ）；細菌（例えば、大腸菌（Eschericia coli））；シアノバクテリア；線虫（例えば、カエノルハブディティス属（Caenorhabditis））；およびヒトが挙げられる。
【０３１３】
異なる基質鎖長特異性を有するアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、以下によって同定できる：
１）異なる基質鎖長特異性を含有する異種生物からアシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子を選択すること。同定された遺伝子を、全てのアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性が欠失したカンジダ株に移行させることができる。このような遺伝子改変生物において検出可能なアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、異種遺伝子によって付与されたものだけであってもよい。
【０３１４】
２）複数のアシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子からのドメイン交換によるアシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子ライブラリーの操作は、非天然キメラアシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子ライブラリーを生産する。キメラ遺伝子のライブラリーは、全てのアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性が欠失したＣ．トロピカリスの株に移行させることができる。検出可能なアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、非天然キメラアシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子ライブラリーからの操作された遺伝子によって付与されたものだけであってもよい。
【０３１５】
３）ランダム変異誘発によってアシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子ライブラリーを操作すること。望ましいものに近い基質鎖長特異性を有する天然に存在する、または操作されたアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、望ましい基質鎖長特異性を有する変更された活性を生成し同定する目的での、ランダム変異誘発、それに続くスクリーニングおよび／または選択のための基準として使用できる。遺伝子のライブラリーは、全てのアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性が欠失したカンジダ株に移行させることができる。検出可能なアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、ランダムに変異誘発されたライブラリーからの遺伝子によって付与されたものだけであってもよい。
【０３１６】
４）置き換えようとするアミノ酸の位置および同一性を導くためにタンパク質構造情報を使用した、インテリジェントデザインおよび定方向突然変異によってアシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子を操作すること。操作された遺伝子は、全てのアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性が欠失したカンジダ株に移行させることができる。検出可能なアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、操作された遺伝子によって付与されたものだけであってもよい。
【０３１７】
望ましい基質鎖長特異性を付与する遺伝子を選択するための操作後の方法の非限定的な例は、本明細書で示される。唯一の炭素源として供給される異なる鎖長の基質上での増殖によって、選択を行う。他のものではなく所定の基質上での細胞の増殖は、多くの場合、株に存在するアシル−ＣｏＡオキシダーゼ酵素の基質鎖長特異性を反映する。カンジダ・トロピカリスは、増殖のためのその唯一の炭素源として気相中に供給されるアルカンを利用できる。異なる鎖長のアルカンは、適切なアルカン中にろ紙を浸し、炭素源非含有の固体増殖培地をろ紙上で反転させて、異なるペトリ皿に各特異的炭素源（例えば、特異的な鎖長アルカン）を供給することによって提供される。各株におけるアシル−ＣｏＡオキシダーゼ酵素の鎖長特異性に関する増殖選択のために、変更された特異性アシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子を有する連続希釈したＣ．トロピカリスを固体増殖培地上にスポッティングする。図１４および１５に、本明細書で説明されるような気相炭素源としてアルカンを供給する選択プロセスの概略図を示す。固体増殖培地は、アミノ酸または他のあらゆる炭素源を含まない酵母窒素原礎培地を含有する寒天培地である。図１４で示されるように、蒸発して気相を介して炭素源を提供する適切な鎖長のアルカンに浸したろ紙を含有する蓋の上に、平板培養した細胞を反転させる。
【０３１８】
本明細書で説明されたように生成した変更されたアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を含有するカンジダ株が、本明細書で説明される方法を使用して選択および／またはスクリーニングされる。異なる変更されたアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を有する株（例えば、株１（Ｓ１）、株２（Ｓ２）、株３（Ｓ３）、株４（Ｓ４））を栄養培地（例えば、ＹＰＤ）で一晩増殖させる。一晩培養したものをを遠心分離し、洗浄して、微量の残留した栄養培地を全て除去し、リン酸緩衝液で細胞の連続希釈液を調製する。各株の連続希釈液を、複数のＹＮＢ寒天プレート（アミノ酸または他の炭素源を含まない増殖培地）上にスポッティングし、個々のプレートを適切な鎖長アルカンに浸したろ紙上で反転させて、プレートを３０℃でインキュベートした。株の増殖は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼの鎖長特異性に依存する。増殖のために特定のアルカンを利用するために、供給された鎖長がベータ酸化経路に侵入できなければならない。所定の株が増殖できる最も短い鎖長は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼアイソザイムの基質特異性の最も短い鎖長であることを示す。図１５にその例を示す。図１５は、株Ｓ４は、デカン上で増殖できるが、オクタン上では増殖できないことを例示する。それゆえに、株Ｓ４の改変されたアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、８炭素分子の利用を阻害する基質鎖長特異性を有し、この株を用いた発酵からの二酸生成物は、典型的には、炭素８個の二酸になる。本明細書で説明される方法を使用して、あらゆる望ましい特異性を有するアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を選択および／またはスクリーニングできる。
【０３１９】
本明細書で示された実施例は、選択／スクリーニングプロセスを説明するために使用された一般化された方法であることが理解されよう。選択およびスクリーニングプロセスに使用される供給材料は、捜しているアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性に適するように変更される。例えば、より長い鎖の基質に対する特異性を有するアシル−ＣｏＡオキシダーゼの場合、より長い炭素鎖長に対する特異性を有するアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性の選択および／またはスクリーニングが可能になるように、より長い炭素鎖長を有する供給材料で代用してもよい。
【０３２０】
実施例１０：Ｃ．トロピカリスの形質転換手法
５ｍＬのＹＰＤの初発培養液に、Ｃ．トロピカリスのシングルコロニーを植え付け、約２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩インキュベートした。翌日、０．０５％アンチフォームＢを含有する新鮮なＹＰＤ培養液２５ｍＬを初期ＯＤ６００ｎｍが０．４になるまで植え付け、培養物を、１．０〜２．０のＯＤ６００ｎｍが達成されるまで、約２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃でインキュベートした。細胞を、１，０００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離によってペレット化した。１０ｍＬ滅菌水に再懸濁することによって細胞を洗浄し、ペレット化し、１ｍＬ滅菌水に再懸濁して、１．５ｍＬマイクロ遠沈管に移した。次いで細胞を１ｍＬ滅菌ＴＥ／ＬｉＯＡＣ溶液、ｐＨ７．５で洗浄し、ペレット化し、０．２５ｍＬのＴＥ／ＬｉＯＡＣ溶液に再懸濁し、３０℃で３０分間振盪することによってインキュベートした。
【０３２１】
細胞溶液を、５〜８μｇの直線状ＤＮＡおよび５μＬのキャリアーＤＮＡ（沸騰させ冷却したサケ精子ＤＮＡ、１０ｍｇ／ｍＬ）を添加した１．５ｍＬチューブ中に、５０μＬのアリコートに分けた。３００μＬの滅菌ＰＥＧ溶液（４０％ＰＥＧ３５００、１×ＴＥ、１×ＬｉＯＡＣ）を添加し、徹底的に混合し、１５分毎に穏やかに混合しながら３０℃で６０分間インキュベートした。４０μＬのＤＭＳＯを添加し、徹底的に混合し、細胞溶液を４２℃で１５分間インキュベートした。次いで細胞を、１，０００×ｇ３０秒間での遠心分離によってペレット化し、５００μＬのＹＰＤ培地に再懸濁し、約２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で２時間インキュベートした。次いで細胞を遠心分離によってペレット化し、１ｍＬの１×ＴＥに再懸濁し、細胞を再度ペレット化し、０．２ｍＬの１×ＴＥに再懸濁し、選択培地上で平板培養した。形質転換株の増殖のためにプレートを３０℃でインキュベートした。
【０３２２】
実施例１１：ＵＲＡ３マーカーを再利用するための手法
カンジダ属酵母培養物ＡＴＣＣ２０３３６のゲノムＤＮＡからＵＲＡ３遺伝子を得た。Ｃ．トロピカリスは、Ｓ．セレビシエと比較して限られた数の選択マーカーしか有さないために、ＵＲＡ３を使用した複数回の選択を可能にするにはＵＲＡ３マーカーが「再利用」される。その後のＣ．トロピカリスの操作でＵＲＡ３マーカーを再利用するために、Ｕｒａ＋表現型を有するシングルコロニーを、３ｍＬのＹＰＤに植え付け、振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。次いで一晩培養したものを遠心分離によって回収し、１ｍＬのＹＮＢ＋ＹＥ（６．７ｇ／Ｌ酵母窒素液体培地、３ｇ／Ｌ酵母抽出物）に再懸濁した。次いで再懸濁した細胞をＹＮＢ＋ＹＥで連続希釈し、１００μＬのアリコートをＹＰＤプレート上で平板培養し（３０℃で一晩インキュベート）、元の懸濁液の力価を決定した。加えて、希釈していない懸濁液の３連の１００μＬのアリコートを、ＳＣデキストロース（バクトアガー２０ｇ／Ｌ、ウラシル、０．３ｇ／Ｌ、デキストロース、２０ｇ／Ｌ、酵母窒素液体培地６．７ｇ／Ｌ、アミノ酸ドロップアウトミックス（Amino Acid Dropout Mix）２．１４ｇ／Ｌ）、および３種の異なる濃度（０．５、０．７５、１ｍｇ／ｍＬ）の５−ＦＯＡ上で平板培養した。
【０３２３】
プレートを３０℃で少なくとも５日間インキュベートした。ＳＣデキストロース＋５−ＦＯＡプレート上で発生したコロニーを５０μＬ滅菌蒸留水中に再懸濁し、５μＬを利用してＹＰＤ、ＳＣ−ＵＲＡ（ウラシル非含有ＳＣデキストロース培地）プレート上に画線した。次いで、ＹＰＤでのみ増殖してＳＣ−ＵＲＡプレートでは増殖しないコロニーを、３ｍＬのＹＰＤに植え付け、振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。一晩培養したものを遠心分離によって回収し、１．５ｍＬのＹＮＢ（６．７ｇ／Ｌ酵母窒素液体培地）に再懸濁した。再懸濁した細胞をＹＮＢで連続希釈し、１００μＬのアリコートをＹＰＤプレート上で平板培養し、３０℃で一晩インキュベートして、最初の力価を決定した。それぞれの希釈していない細胞懸濁液１ｍＬもＳＣ−ＵＲＡ上で平板培養し、３０℃で最大７日間インキュベートした。ＳＣ−ＵＲＡプレート上のコロニーは復帰突然変異体であり、最も低い逆突然変異頻度（＜１０−７）を有する単離物を、その後の株の操作に使用した。
【０３２４】
実施例１２：Ｃ．トロピカリスの脂肪族アルコールオキシダーゼ（ＦＡＯ）対立遺伝子のクローニングおよび分析
Ｃ．トロピカリスからの脂肪族アルコールオキシダーゼ遺伝子の単離
プロモーター、脂肪族アルコールオキシダーゼ遺伝子（ＦＡＯ）およびＦＡＯ１配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＦＡＯ１  ＡＹ５３８７８０）のターミネーターを包含する配列領域を増幅するために作製されたプライマーを使用したＰＣＲ増幅によって、Ｃ．トロピカリス（ＡＴＣＣ２０３３６）脂肪族アルコールオキシダーゼ遺伝子を単離した。以下の表２に、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６から脂肪族アルコールオキシダーゼヌクレオチド配列を増幅するのに使用されたプライマーを示す。
【０３２５】
【表２】
2016501040.tif 000004
【０３２６】
ＰＣＲ反応は、２５μＬの２×マスターミックス、１．５μＬのｏＡＡ０１４４およびｏＡＡ０１４５（１０ｕＭ）、３．０μＬのゲノムＤＮＡ、および１９μＬ滅菌Ｈ２０を含んでいた。使用された熱サイクルのパラメーターは、９８℃で２分間、９８℃で２０秒間、５２℃で２０秒間、７２℃で１分間を３５サイクル、続いて７２℃で５分間および４℃で保持であった。正しいサイズのＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（pCR-Blunt II-TOPO）（インビトロジェン）にライゲートし、コンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞（インビトロジェン）に形質転換した。ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定して、正しいＤＮＡ配列を確認した。配列分析から４つのＦＡＯ対立遺伝子を同定し、ＦＡＯ−１３、ＦＡＯ−１７、ＦＡＯ−１８およびＦＡＯ−２０と名付けた。ＦＡＯ−１８と名付けられたクローンの配列は、ＧｅｎＢａｎｋからのＦＡＯ１の配列と実質的に同一な配列を有していた。結果得られた４つの対立遺伝子のプラスミドをそれぞれｐＡＡ０８３、ｐＡＡ０８４、ｐＡＡ０５９およびｐＡＡ０８５と名付けた。以下の表３〜５に、本明細書で説明されたようにして単離されたＦＡＯ遺伝子の配列同一性の比較を示す。
【０３２７】
【表３】
2016501040.tif 000005
【０３２８】
【表４】
2016501040.tif 000006
【０３２９】
【表５】
2016501040.tif 000007
【０３３０】
大腸菌におけるＦＡＯ対立遺伝子の発現
様々な炭素源に関してＦＡＯ酵素活性のレベルを決定するために、４つの単離されたＦＡＯ対立遺伝子をさらにクローニングし、大腸菌中で過剰発現させた。ＤＮＡテンプレートとして上述のプラスミドを使用した、ＦＡＯ−１３およびＦＡＯ−２０にはプライマーｏＡＡ０２６８とｏＡＡ０２６９、ならびにＦＡＯ−１７およびＦＡＯ−１８にはｏＡＡ０２６８とｏＡＡ０２８２を用いたＰＣＲによって、本明細書で説明されるような条件を使用してＦＡＯを増幅した。正しいサイズのＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＥＴ１１ａベクターのＮｄｅＩとＢａｍＨＩ部位との間にライゲートし、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞に形質転換した。対応するＦＡＯを含有するコロニーをＤＮＡの配列決定によって確認した。対照として、未改変のｐＥＴ１１ａベクターもＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。結果得られた株およびプラスミドを、それぞれｓＡＡ１５３（ｐＥＴ１１ａ）、ｓＡＡ１５４（ＦＡＯ−１３を含有するｐＡＡ０７９）、ｓＡＡ１５５（ＦＡＯ−１７を含有するｐＡＡ０８０）、ｓＡＡ１５６（ＦＡＯ−１８を含有するｐＡＡ０８１）およびｓＡＡ１５７（ＦＡＯ−２０を含有するｐＡＡ０８２）と名付けた。これらの株およびプラスミドを、大腸菌におけるＦＡＯ過剰発現のために使用した。各株の１つのコロニーを、１００□ｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢ培地５ｍＬに移行し、３７℃、２００ｒｐｍで一晩増殖させた。一晩培養したものを使用して、１００□ｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ２５ｍｌ中で０．２のＯＤ６００ｎｍになるまで新しい培養液に植え付けた。０．８のＯＤ６００ｎｍで、０．３ｍＭのＩＰＴＧで３時間細胞を誘導し、４℃、１，０５０×ｇで１０分間の遠心分離によって回収した。細胞のペレットを−２０℃で保存した。
【０３３１】
Ｃ．トロピカリスにおけるＦＡＯの発現
ＦＡＯを過剰発現させた大腸菌の可溶性細胞抽出物の酵素アッセイから決定されたそれらの基質特異性プロファイルに基づき、Ｃ．トロピカリスでの増幅のために、２つの対立遺伝子、ＦＡＯ−１３およびＦＡＯ−２０を選んだ。プライマーｏＡＡ０４２１およびｏＡＡ０４２２を用いたＰＣＲによって、ＦＡＯ−１３およびＦＡＯ−２０を含有するＤＮＡフラグメントを、それぞれＤＮＡテンプレートとしてプラスミドｐＡＡ０７９およびｐＡＡ０８２を使用して増幅した。正しいサイズのＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にライゲートし、コンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞（インビトロジェン）に形質転換し、ＦＡＯインサートを含有するクローンを配列決定して、正しいＤＮＡ配列を確認した。ＦＡＯ−１３およびＦＡＯ−２０を含有するプラスミドを、ＳａｐＩで消化し、Ｃ．トロピカリスのＰＧＫプロモーターとターミネーターとを包含するベクターｐＡＡ１０５にライゲートした。結果得られたプラスミドを制限消化とＤＮＡ配列決定によって確認し、それぞれｐＡＡ１１５（ＦＡＯ−１３）およびｐＡＡ１１６（ＦＡＯ−２０）と名付けた。プラスミドｐＡＡ１１５およびｐＡＡ１１６をＳｐｅＩで直線状にし、コンピテントＣ．トロピカリスＵｒａ−株ｓＡＡ００２（ＳＵ−２、ＡＴＣＣ２０９１３）およびｓＡＡ１０３に形質転換した。ＦＡＯ−１３およびＦＡＯ−２０の統合を、プライマーｏＡＡ０４２９およびｏＡＡ０２８１を使用したコロニーＰＣＲによって確認した。結果得られた株を、ｓＡＡ２７８（株ｓＡＡ００２に統合されたｐＡＡ１１５）、ｓＡＡ２８０（ｓＡＡ００２に統合されたｐＡＡ１１６）、ｓＡＡ２８２（ｓＡＡ１０３に統合されたｐＡＡ１１５）、およびｓＡＡ２８４（ｓＡＡ１０３に統合されたｐＡＡ１１６）と名付け、これらをＣ．トロピカリスにおける脂肪族アルコールオキシダーゼの過剰発現に使用した。
【０３３２】
各株の１つのコロニーを、本明細書で説明されるようにして５ｍｌのＹＰＤに植え付け、一晩増殖させた。一晩培養したものを使用して、ＯＤ６００ｎｍがおよそ０．５になるまで新しい２５ｍＬのＹＰＤ培養液に植え付けた。培地中のグルコースによって誘導され構成的に発現されたＰＧＫプロモーター／ターミネーターによってＦＡＯの過剰発現を調節した。ＦＡＯ過剰発現の陰性対照として、株ｓＡＡ００２およびｓＡＡ１０３（例えば、形質転換されていない開始時の株）を含めた。初期の対数期（ＯＤ６００ｎｍ＝約３〜約５の範囲）で、４℃、１０分間で１，０５０×ｇの遠心分離によって細胞を回収した。細胞のペレットを−２０℃で保存した。
【０３３３】
大腸菌からの細胞抽出物の調製
２５ｍＬのＦＡＯを発現する大腸菌培養物からの細胞のペレットを、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、２０％グリセロール、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、２μＬベンゾナーゼ（Benzonase）２５Ｕ／μＬ、２０μＬの１０ｍｇ／ｍＬリゾチームを含有するリン酸−グリセロール緩衝液１０ｍＬ中に再懸濁した。次いで回転式振盪機において室温で５０分間インキュベートすることによって細胞を溶解させ、細胞懸濁液を、１５，０００×ｇを使用して、４℃で３０分間遠心分離した。上清を１．５ｍｌマイクロ遠沈管にアリコートにし、ＦＡＯ酵素活性アッセイのために−２０℃で保存した。
【０３３４】
Ｃ．トロピカリスからの細胞抽出物の調製
凍結したＣ．トロピカリス細胞のペレットを、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、２０％グリセロール、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を含有するリン酸−グリセロール緩衝液１．２ｍｌ中に再懸濁した。再懸濁した細胞を、氷上で約５００μＬのジルコニアビーズを含有する１．５ｍＬスクリューキャップ付きチューブに移した。ビーズ式破砕機（バイオスペック（Biospec））で、氷上で２分のパルスおよび１分の休止インターバルを使用して細胞を溶解させた。このプロセスを３回繰り返した。次いで全細胞抽出物を新しい１．５ｍｌチューブに移し、１６，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、ＦＡＯ酵素活性アッセイに使用した。
【０３３５】
タンパク質濃度の決定
ブラッドフォード試薬（カタログ番号２３２３８、サーモ・サイエンティフィック（Thermo Scientific））を製造元の推奨に従って使用して、細胞抽出物のタンパク質濃度を決定した。
【０３３６】
ＦＡＯ酵素活性アッセイ
Eirichら、2004の改変法を使用して、ＦＡＯ酵素活性アッセイを行った。このアッセイは、２種の酵素がカップリングされた反応（例えば、ＦＡＯとホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））を利用しており、分光光度法によるモニターが可能である。脂肪族アルコールオキシダーゼ酵素活性アッセイの標準基質として１−ドデカノールを使用した。ＦＡＯは、同時に分子酸素を過酸化水素に還元しながらドデカノールをドデカナールに酸化する。ＨＲＰは、２種の酵素がカップリングされた反応で（２，２’−アジノ−ビス３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸；ＡＢＴＳ）を還元し、ここで過酸化水素をＡＢＴＳに酸化することによって得られた電子は、４０５ｎｍでの分光分析によって測定できる。内因性カタラーゼによるＨ２Ｏ２の破壊を防ぎ、ミクロソームの断片化の必要性をなくすために、このアッセイをアミノトリアゾール（ＡＴ）を使用して改変した。ＦＡＯ酵素アッセイのための最終的な反応混合物（１．０ｍＬ）は、５００μＬの２００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．６；５０μＬの脱イオン水中１０ｍｇ／ｍＬのＡＢＴＳ溶液；１０μＬのアセトン中５ｍＭのドデカノール溶液；４０μＬの１ＭのＡＴおよび５μＬの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）中の２ｍｇ／ｍＬホースラディッシュペルオキシダーゼ溶液からなっていた。抽出物を添加した後、４０５ｎｍ、室温で１０分間吸光度を測定することによって反応活性を測定した。活性が０．２〜１．０ΔＡ４０５ｎｍ／分の範囲に収まるように、反応混合物に添加された抽出物の量を変化させた。使用された抽出物の実際の量は、大腸菌が発現したＦＡＯ−１３の場合、約１．６９Ｕ／ｍｇであり、大腸菌が発現したＦＡＯ−１７の場合、０．０１８Ｕ／ｍｇであり、大腸菌が発現したＦＡＯ−１８（例えばＦＡＯ１）の場合、０．３５Ｕ／ｍｇであり、大腸菌が発現したＦＡＯ−２０の場合、０．４７Ｕ／ｍｇであり、Ｃ．トロピカリス（株ｓＡＡ２７８）が発現したＦＡＯ−１３の場合、０．０３６Ｕ／ｍｇであり、Ｃ．トロピカリス（株ｓＡＡ２８２）が発現したＦＡＯ−１３の場合、０．０１６Ｕ／ｍｇであり、Ｃ．トロピカリス（株ｓＡＡ２８０）が発現したＦＡＯ−２０の場合、０．０３２Ｕ／ｍｇであり、およびＣ．トロピカリス（株ｓＡＡ２８４）が発現したＦＡＯ−２０の場合、０．０２９Ｕ／ｍｇであった。ＦＡＯ活性は、総タンパク質１ｍｇあたりの活性単位（１ユニット＝１□モル（酸化された基質）／分）として報告した。ＡＢＴＳには、１８．４の４０５ｎｍにおける吸光係数を使用し、これは、０．５ｍＭの酸化された基質に等しい。以下の表６〜７に活性アッセイの結果を示す。
【０３３７】
【表６】
2016501040.tif 000008
【０３３８】
【表７】
2016501040.tif 000009
【０３３９】
実施例１３：Ｃ．トロピカリスのシャトルベクターｐＡＡ０６１の構築
ベクターｐＡＡ０６１を、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６からの選択マーカーＵＲＡ３、加えてＣ．トロピカリスのプロモーターおよびターミネーターを挿入させる改変を内包するｐＵＣ１９主鎖から構築した。Ｃ．トロピカリスＡＴＣＣ２０３３６からのＵＲＡ３のプロモーター、ＯＲＦ、およびターミネーターを含有する１，５０７ｂｐのＤＮＡフラグメントを、以下の表８に示されるプライマーｏＡＡ０１２４およびｏＡＡ０１２５を使用して増幅した。ＵＲＡ３のＰＣＲ産物をＮｄｅＩ／ＭｌｕＩで消化し、ＮｄｅＩ／ＢｓｍＢＩで消化したｐＵＣ１９（ＭｌｕＩに適合するオーバーハングをＢｓｍＢＩによって作製した）の２，５０５ｂｐのフラグメントにライゲートした。ｌａｃプロモーターを短い２１ｂｐのリンカー配列で置き換えるために、結果得られたプラスミドをＳｐｈＩ／ＳａｐＩで消化し、オリゴｏＡＡ０１７３とｏＡＡ０１７４とをアニーリングすることによって作製されたリンカーを埋め込んだ。結果得られたプラスミドを、ｐＡＡ０６１と名付けた。
【０３４０】
【表８】
2016501040.tif 000010
【０３４１】
実施例１４：Ｃ．トロピカリスＰＧＫプロモーターおよびターミネーターのクローニング
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）挿入のために介在する多重クローニング部位（ＭＣＳ）と共に、Ｃ．トロピカリスＡＴＣＣ２０３３６からのホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびターミネーター領域を包含させるために、ベクターｐＡＡ１０５をベースのベクターｐＡＡ０６１から構築した。以下の表９に示されるプライマーｏＡＡ０３４７およびｏＡＡ０３４８を使用したＰＣＲによって、ＰＧＫプロモーター領域を増幅した。ＰＧＫプロモーターを含有する１，０２９ｂｐのＤＮＡフラグメントを、制限酵素ＰｓｔＩ／ＸｍａＩで消化した。同様に以下の表９に示されるプライマーｏＡＡ０３５１およびｏＡＡ０３５２を使用したＰＣＲによって、ＰＧＫターミネーター領域を増幅した。ＰＧＫターミネーターを含有する３９６ｂｐのＤＮＡフラグメントを、制限酵素ＸｍａＩ／ＥｃｏＲＩで消化した。スリーピースライゲーション反応で、ｐＡＡ１０５を生産するためのＰＧＫプロモーターおよびターミネーター領域と共にｐＡＡ０６１からの３，７２８ｂｐのＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ  ＤＮＡフラグメントを使用した。ＰＧＫプロモーターとターミネーターとの間の配列は、機能的に連結された構成的ＰＧＫプロモーターによって制御しようとするＯＲＦを取り込むための制限部位を含有する。
【０３４２】
【表９】
2016501040.tif 000011
【０３４３】
実施例１５：ＰＯＸ４遺伝子座のクローニング
プライマーｏＡＡ０１３８およびｏＡＡ０１４１（表１０）を生成させ、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６から調製したゲノムＤＮＡからＹＳＡＰＯＸ４遺伝子座に関するＮＣＢＩ受託番号Ｍ１２１６０の配列全体を増幅した。２，８４５ｂｐのＰＣＲ産物をベクター、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にクローニングし、配列決定し、ｐＡＡ０５２と名付けた。
【０３４４】
【表１０】
2016501040.tif 000012
【０３４５】
実施例１６：ＰＯＸ５遺伝子座のクローニング
プライマーｏＡＡ０１７９およびｏＡＡ０１８２（表１１）を生成させ、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６から調製したゲノムＤＮＡからＹＳＡＰＯＸ５遺伝子座に関するＮＣＢＩ受託番号Ｍ１２１６１の配列全体を増幅した。２，６２４ｂｐのＰＣＲ産物をベクター、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にクローニングし、配列決定し、ｐＡＡ０４９と名付けた。
【０３４６】
【表１１】
2016501040.tif 000013
【０３４７】
実施例１７：ＣＰＲおよびＣＹＰ５２遺伝子が増幅された株の構築
ＣＰＲおよびＣＹＰ５２の過剰発現がどのように二酸生産に影響するかを決定するために、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）および／またはシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ５２）遺伝子のコピー数が増加した株を構築した。
【０３４８】
ＣＰＲ遺伝子のクローニングおよび統合
Ｃ．トロピカリスＡＴＣＣ７５０からのＣＰＲプロモーター、ＯＲＦ、およびターミネーターをコードする３，０１９ｂｐのＤＮＡフラグメントを、固有のＳａｐＩおよびＳｐｈＩ部位を組み込んだプライマーｏＡＡ０１７１およびｏＡＡ０１７２（表１２）を使用したＰＣＲによって増幅した。増幅したＤＮＡフラグメントを指定された制限酵素で切断し、プラスミドｐＡＡ０６１にライゲートし（実施例１３で説明した）、プラスミドｐＡＡ０６７を生産した。プラスミドｐＡＡ０６７をＣｌａＩで直線状にし、Ｃ．トロピカリスＵｒａ−株ｓＡＡ１０３（ｕｒａ３／ｕｒａ３、ｐｏｘ４：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４：：ｕｒａ３、ｐｏｘ５：：ｕｒａ３／ｐｏｘ５：：ｕｒａ３）に形質転換した。形質転換は、プラスミドｐＡＡ０６７単独で、以下で説明されるＣＹＰ５２Ａ１５またはＣＹＰ５２Ａ１６遺伝子を含むプラスミドと組み合わせて行われた。
【０３４９】
ＣＹＰ５２Ａ１５遺伝子のクローニングおよび統合
Ｃ．トロピカリスＡＴＣＣ２０３３６からのＣＹＰ５２Ａ１５プロモーター、ＯＲＦ、およびターミネーターをコードする２，８４２ｂｐのＤＮＡフラグメントを、プライマーｏＡＡ０１７５およびｏＡＡ０１７８（表１２）を使用したＰＣＲによって増幅し、ＤＮＡ配列の検証のためにｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯにクローニングした。クローニングしたＣＹＰ５２Ａ１５のＤＮＡフラグメントを、ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩでの制限酵素消化によって単離し（２，７４２ｂｐ）、プラスミドｐＡＡ０６１にライゲートし（実施例１３で説明した）、プラスミドｐＡＡ０７７を生産した。プラスミドｐＡＡ０７７をＰｍｌＩで直線状にし、Ｃ．トロピカリスＵｒａ−株ｓＡＡ１０３（ｕｒａ３／ｕｒａ３、ｐｏｘ４：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４：：ｕｒａ３、ｐｏｘ５：：ｕｒａ３／ｐｏｘ５：：ｕｒａ３）に形質転換した。ｐＡＡ０７７を、ＣＰＲ遺伝子を含むプラスミドｐＡＡ０６７を用いて共に形質転換した。
【０３５０】
ＣＹＰ５２Ａ１６遺伝子のクローニングおよび統合
Ｃ．トロピカリスＡＴＣＣ２０３３６からのＣＹＰ５２Ａ１６プロモーター、ＯＲＦ、およびターミネーターをコードする２，７２８ｂｐのＤＮＡフラグメントを、プライマーｏＡＡ０１７７およびｏＡＡ０１７８（表１２）を使用したＰＣＲによって増幅し、ＤＮＡ配列の検証のためにｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯにクローニングした。クローニングしたＣＹＰ５２Ａ１６ＤＮＡフラグメントを、固有のＳａｃＩ／ＸｂａＩ制限部位を組み込んだプライマーｏＡＡ０２６０およびｏＡＡ０２６１（表１２）により増幅した。増幅したＤＮＡフラグメントを、ＳａｃＩおよびＸｂａＩ制限酵素で消化し、プラスミドｐＡＡ０６１にライゲートし、プラスミドｐＡＡ０７８を生産した。プラスミドｐＡＡ０７８をＣｌａＩで直線状にし、Ｃ．トロピカリスＵｒａ−株ｓＡＡ１０３（ｕｒａ３／ｕｒａ３、ｐｏｘ４：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４：：ｕｒａ３、ｐｏｘ５：：ｕｒａ３／ｐｏｘ５：：ｕｒａ３）に形質転換した。ｐＡＡ０７８を、ＣＰＲ遺伝子を含むプラスミドｐＡＡ０６７を用いて共に形質転換した。
【０３５１】
【表１２】
2016501040.tif 000014
【０３５２】
ゲノムＤＮＡの調製
ＰＣＲの検証のため、さらにサザンブロット分析のために、形質転換株からゲノムＤＮＡを調製した。単離されたコロニーを、３ｍＬのＹＰＤに植え付け、振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。細胞を遠心分離によってペレット化した。各ペレットに、２００μＬのブレイキング緩衝液（２％トリトンＸ−１００、１％ＳＤＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭトリス（ｐＨ８）、および１ｍＭのＥＤＴＡ）を添加し、ペレットを再懸濁し、２００μＬの０．５ｍｍジルコニア／シリカビーズを含有する新しいチューブに移した。各チューブに２００μＬのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を添加し、続いて１分間ボルテックスで混合した。各チューブに滅菌蒸留水（２００μＬ）を添加し、チューブを１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。水層をエタノール沈殿し、７０％エタノールで洗浄した。ペレットを乾燥させた後、１００〜２００□ｌの１０ｍＭトリスに再懸濁した。サザンブロット分析用のゲノムＤＮＡの調製を、試験された各コロニーにつき２５ｍＬの培養物に対して同じ手法を使用して行った。
【０３５３】
ＣＰＲおよびＣＹＰ５２遺伝子を増幅させた株の特徴付け
プライマーｏＡＡ０２５２およびｏＡＡ０２５６（ＣＰＲ）、ｏＡＡ０２３１およびｏＡＡ０２８１（ＣＹＰ５２Ａ１５）、ならびにｏＡＡ２４２およびｏＡＡ０２５７（ＣＹＰ５２Ａ１６）を使用したＰＣＲによって、遺伝子統合の検証を行った。表１３に、検証のために使用されたプライマーを示す。
【０３５４】
【表１３】
2016501040.tif 000015
【０３５５】
ＣＰＲ、ＣＹＰ５２Ａ１５およびＣＹＰ５２Ａ１６遺伝子のコピー数を決定するために、サザンブロット分析を使用した。表１４で特定した各遺伝子標的から生成したＰＣＲ産物に、ニューイングランドバイオラボ（New England BioLabs）からのＮＥブロットフォトトープ（NEBlot Phototope）キット（カタログ番号Ｎ７５５０Ｓ）を使用して、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを含むビオチン化したＤＮＡプローブを調製した。標準的な方法を使用してサザンハイブリダイゼーションを行った（例えば、Sambrook、J.およびRussell、D. W.（2001）Molecular Cloning：A Laboratory Manual（第3版）、6.33〜6.64頁. コールドスプリングハーバープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press））。ニューイングランドバイオラボからのフォトトープ−スター（Phototope-Star）検出キット（カタログ番号Ｎ７０２０Ｓ）を使用して、ハイブリダイズしたプローブの検出を行った。結果得られたバンドの濃度測定によってコピー数を決定した。
【０３５６】
【表１４】
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【０３５７】
実施例１８：モノオキシゲナーゼおよびモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性の追加および／または増幅
シトクロムＰ４５０は、多くの場合、モノオキシゲナーゼ反応を触媒し、例えば、１つの酸素原子を有機基質（ＲＨ）に挿入しつつ、他の酸素原子を水に還元する：
ＲＨ＋Ｏ２＋２Ｈ＋＋２ｅ−→ＲＯＨ＋Ｈ２Ｏ
基質は、時には、均一な炭素鎖長を有する。モノオキシゲナーゼ活性を有する酵素は、時には、特異的な炭素鎖長の基質、または同種の炭素鎖長を有する有機基質に関する炭素鎖長のサブグループを認識する。いくつかの実施態様において、新規のシトクロム活性（例えば、Ｂ．メガテリウムＢＭ３）の追加および／または所定のまたは全ての内因性もしくは異種モノオキシゲナーゼ活性（例えば、ＣＹＰ５２Ａ１２ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１３ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１４ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１５ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１６ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１７ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１８ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１９ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ２０ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ｄ２ポリヌクレオチド、ＢＭ３ポリヌクレオチド）の増幅は、天然のおよび／または操作された代謝経路を介した炭素フラックスの全体的な増加に寄与する可能性がある。いくつかの実施態様において、新規のモノオキシゲナーゼの追加、または所定のまたは全ての内因性もしくは異種モノオキシゲナーゼ活性の増加は、特異的な炭素鎖長の基質または特異的な炭素鎖長の混合物を含む基質のサブグループのフラックスを増加させることができる。いくつかの実施態様において、操作された株で増幅させるためのモノオキシゲナーゼ活性の選択は、操作された株の増殖に利用される供給材料、選ばれた供給材料の代謝経路、および望ましい最終産物（例えば、ドデカン二酸）に関連する。
【０３５８】
ドデカン二酸への変換に植物ベースの油を利用するために操作された株は、油の脂肪酸鎖長分布に適合する基質特異性を有する１種またはそれより多くのモノオキシゲナーゼ活性を有することで有利な可能性がある。例えば、ヤシ油における最も一般的な脂肪酸はラウリン酸（１２個の炭素長）であるため、ヤシ油を利用する株のために選ばれたモノオキシゲナーゼ活性は、基質としてＣ１２脂肪酸を優先的に使用する可能性がある。異なる脂肪酸鎖長分布を有する他の植物ベースの油を利用するために操作された株の場合、基質の優先性に合ったモノオキシゲナーゼ活性を増幅することがが望ましい可能性がある。いくつかの実施態様において、モノオキシゲナーゼ活性を変更する遺伝学的改変は、約１２〜約２４個の炭素の炭素鎖長を有する供給材料（例えば、混合鎖長アルカン、混合鎖長脂肪酸、石鹸原料など、およびそれらの組み合わせ）を基質として優先的に使用する１種またはそれより多くのモノオキシゲナーゼ活性の活性を増加させる。いくつかの実施態様において、遺伝学的改変は、約１０個の炭素から約１６個の炭素の範囲の炭素鎖長分布を有する脂肪酸を優先的に使用するモノオキシゲナーゼ活性の活性を増加させる。
【０３５９】
上述したように、モノオキシゲナーゼ活性を実行する酵素は、モノオキシゲナーゼレダクターゼの活性によって還元され、それによって酵素は再生される。いくつかの実施態様において、操作された株での増幅のためのＣＰＲの選択は、どのＰ４５０が増幅されるかに依存する。いくつかの実施態様において、特定のＣＰＲは、１種またはそれより多くのモノオキシゲナーゼ活性と優先的に相互作用する可能性があるが、他のモノオキシゲナーゼとはそれほど相互作用しない可能性がある。カンジダ株ＡＴＣＣ７５０からのモノオキシゲナーゼレダクターゼ、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６からの２種のモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、およびバチルス・メガテリウムからのモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性は、本明細書で説明される追加および／または増幅したモノオキシゲナーゼを用いて活性に関して評価中である。以下の表に、モノオキシゲナーゼおよびモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性を追加または増幅するのに使用されたヌクレオチド配列を示す。
【０３６０】
実施例１９：選択されたベータ酸化活性の増幅
ＰＯＸ５ベータ酸化活性を増幅する方法をここで説明する。本明細書で説明されるように基質特異性が変更された非ＰＯＸ（例えば、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ）活性および／またはアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性などの異なるベータ酸化活性を増幅するのに、実質的に類似した方法が利用できる。
【０３６１】
ＰＯＸ５増幅株の構築
プラスミドｐＡＡ１６６（ＰＰＯＸ４ＰＯＸ５ＴＰＯＸ４）
ＰＯＸ５のヌクレオチド配列を含有するＰＣＲ産物を、プライマーｏＡＡ５４０およびｏＡＡ５４１を使用して、Ｃ．トロピカリス２０３３６のゲノムＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にライゲートし、コンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞（インビトロジェン）に形質転換し、ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定して、正しいＤＮＡ配列を確認した。このようなプラスミドの１つを、ｐＡＡ１６５と名付けた。プラスミドｐＡＡ１６５をＢｓｐＱＩで消化し、２ｋｂのフラグメントを単離した。ＰＯＸ４プロモーターおよびＰＯＸ４ターミネーターを含むプラスミドｐＡＡ０７３もＢｓｐＱＩで消化し、ゲルで精製した。単離されたフラグメントを一緒にライゲートして、プラスミドｐＡＡ１６６を生成した。プラスミドｐＡＡ１６６は、ＰＰＯＸ４ＰＯＸ５ＴＰＯＸ４フラグメントを含有する。
【０３６２】
プラスミドｐＡＡ２０４（チオラーゼ欠失コンストラクト）
短鎖チオラーゼ（例えば、アセチル−ｃｏＡアセチルトランスフェラーゼ）のヌクレオチド配列を含有するＰＣＲ産物を、プライマーｏＡＡ６４０およびｏＡＡ６４１を使用してＣ．トロピカリス２０３３６のゲノムＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にライゲートし、コンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞（インビトロジェン）に形質転換し、ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定して、正しいＤＮＡ配列を確認した。このようなプラスミドの１つを、ｐＡＡ１８４と名付けた。ＵＲＡ３のＰＣＲ産物を、ｐＡＡ０６１から、プライマーｏＡＡ６６０およびｏＡＡ６６１を使用して増幅した。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にライゲートし、説明したようにして形質転換し、ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定して、正しいＤＮＡ配列を確認した。このようなプラスミドの１つを、ｐＡＡ１９２と名付けた。プラスミドｐＡＡ１８４を、ＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩで消化し、ゲルで精製した。プラスミドｐＡＡ１９２を、ＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩで消化し、１．５ｋｂのフラグメントをゲルで精製した。単離されたフラグメントを一緒にライゲートして、ｐＡＡ１９９を作製した。代替のＰＵＲＡ３のＰＣＲ産物を、プラスミドｐＡＡ０６１から、プライマーｏＡＡ６８４およびｏＡＡ６８５を使用して増幅した。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にライゲートし、説明したようにして形質転換し、ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定した。このようなプラスミドの１つを、ｐＡＡ２０１と名付けた。プラスミドｐＡＡ１９９を、ＳａｌＩで消化し、ゲルで精製した。プラスミドｐＡＡ２０１を、ＳａｌＩで消化し、０．４３ｋｂのＰＵＲＡ３をゲルで精製した。単離されたフラグメントをライゲートして、ＰＵＲＡ３の同方向反復配列を含有するプラスミドｐＡＡ２０４を作製した。
【０３６３】
プラスミドｐＡＡ２２１（チオラーゼ欠失コンストラクト中のＰＰＯＸ４ＰＯＸ５ＴＰＯＸ４）
ＰＰＯＸ４ＰＯＸ５ＴＰＯＸ４のヌクレオチド配列を含有するＰＣＲ産物を、プラスミドｐＡＡ１６６ＤＮＡから、プライマーｏＡＡ７２８およびｏＡＡ７２９を使用して増幅した。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯにライゲートし、説明したようにして形質転換し、ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定して、インサートの配列を確認した。このようなプラスミドの１つを、ｐＡＡ２２０と名付けた。プラスミドｐＡＡ２０４を、ＢｇｌＩＩで消化し、エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）で処置し、６．５ｋｂのフラグメントをゲルで精製した。プラスミドｐＡＡ２２０を、ＢｇｌＩＩで消化し、２．７ｋｂのＰＰＯＸ４ＰＯＸ５ＴＰＯＸ４を含有するフラグメントをゲルで精製した。単離されたフラグメントをライゲートして、プラスミドｐＡＡ２２１を作製した。
【０３６４】
株ｓＡＡ６１７（ｓＡＡ４５１中のＰＰＯＸ４ＰＯＸ５ＴＰＯＸ４）
株ｓＡＡ４５１は、ｕｒａ−、β酸化が部分的にブロックされたカンジダ株（ｕｒａ３／ｕｒａ３ｐｏｘ４ａ：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４ｂ：：ｕｒａ３ＰＯＸ５／ＰＯＸ５）である。プラスミドｐＡＡ２２１をＥｃｏＲＩで消化して、チオラーゼ欠失コンストラクト中にＰＰＯＸ４ＰＯＸ５ＴＰＯＸ４を含有するＤＮＡフラグメントを放出させた。ＤＮＡをカラムで精製し、株ｓＡＡ４５１に形質転換して、ＳＣＤ−ｕｒａプレート上で平板培養した。２日後、コロニーをＹＰＤプレート上に画線して植え付けた、シングルコロニーを選択し、再度ＹＰＤプレート上に画線して植え付けた。第二のＹＰＤプレートからシングルコロニーを選択して、コロニーＰＣＲによって特徴付けた。株ｓＡＡ４５１へのＰＰＯＸ４ＰＯＸ５ＴＰＯＸ４の挿入、短鎖チオラーゼ遺伝子の破壊をＰＣＲによって確認し、このような株の１つを、ｓＡＡ６１７と名付けた。
【０３６５】
株ｓＡＡ６２０
株ｓＡＡ６１７を、ＹＰＤ培地上で一晩増殖させ、ＳＣＤ＋ＵＲＡ＋５−ＦＯＡ上で平板培養して、ＵＲＡ３のループアウトに関して選択した。株ｓＡＡ６１７に関して説明したようにしてＹＰＤプレート上にコロニーを２回画線して植え付け、シングルコロニーをコロニーＰＣＲによって特徴付けた。ＰＵＲＡ３同方向反復配列によるＵＲＡ３のループアウトを、ＰＣＲによって確認した。このような株の１つを、ｓＡＡ６２０と名付けた。株ｓＡＡ６２０は、ＰＯＸ４プロモーターの制御下でＰＯＸ５の１つの追加のコピーを有する。
【０３６６】
プラスミドｐＡＡ１５６
ＣＹＰ５２Ａ１９のヌクレオチド配列を含有するＰＣＲ産物を、カンジダ株２０３３６のゲノムＤＮＡから、プライマーｏＡＡ５２５およびｏＡＡ５２６を使用して増幅した。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯにライゲートし、説明したようにして形質転換し、ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定して、正しいＤＮＡ配列を確認した。このようなプラスミドの１つを、ｐＡＡ１４４と名付けた。プラスミドｐＡＡ１４４をＢｓｐＱＩで消化し、１．７ｋｂのフラグメントを単離した。ＰＯＸ４プロモーターおよびＰＯＸ４ターミネーターを包含するプラスミドｐＡＡ０７３もＢｓｐＱＩで消化し、ゲルで精製した。単離されたフラグメントを一緒にライゲートして、プラスミドｐＡＡ１５６を生成した。プラスミドｐＡＡ１５６は、ＰＰＯＸ４ＣＹＰ５２Ａ１９ＴＰＯＸ４フラグメントおよびＵＲＡ３を包含していた。
【０３６７】
株ｓＡＡ４９６
プラスミドｐＡＡ１５６をＣｌａＩで消化し、カラムで精製した。この直線状ＤＮＡで株ｓＡＡ４５１を形質転換し、ＳＣＤ−ｕｒａプレート上で平板培養した。ＣＹＰ５２Ａ１９の統合に関してコロニーをチェックした。プラスミド統合に関して陽性のコロニーをさらにｑＰＣＲによって分析し、統合されたＣＹＰ５２Ａ１９のコピー数を決定した。このような株の１つは、名付けられ、ＣＹＰ５２Ａ１９によってコードされたモノオキシゲナーゼ活性の約１３のコピーを含んでいた。
【０３６８】
株ｓＡＡ６３２およびｓＡＡ６３５
直線状にしたｐＡＡ１５６のＤＮＡで株ｓＡＡ６２０を形質転換し、ＳＣＤ−ｕｒａプレート上で平板培養した。ＣＹＰ５２Ａ１９の統合に関して数種のコロニーをチェックした。プラスミド統合に関して陽性のコロニーをさらにｑＰＣＲによって分析し、統合されたＣＹＰ５２Ａ１９のコピー数を決定した。このような株の１つは、ｓＡＡ６３２と名付けられ、ＣＹＰ５２Ａ１９によってコードされたモノオキシゲナーゼ活性の約２７のコピーを含んでいた。別の株は、ｓＡＡ６３５と名付けられ、ＣＹＰ５２Ａ１９によってコードされたモノオキシゲナーゼ活性の約１２のコピーを含んでいた。
【０３６９】
実施例２０：Ｃ．トロピカリスのＡＣＨ遺伝子のクローニング
ＡＣＨのＰＣＲ産物を、Ｃ．トロピカリス２０３３６のゲノムＤＮＡから、表１５に示したプライマーｏＡＡ１０９５およびｏＡＡ１０９６を使用して増幅した。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にライゲートし、コンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞（インビトロジェン）に形質転換し、ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定して、正しいＤＮＡ配列を確認した。
【０３７０】
複数の形質転換株の配列分析から、ＡＣＨ遺伝子に関する対立遺伝子配列の存在が解明され、これらをＡＣＨＡおよびＡＣＨＢと名付けた。ＡＣＨＡ対立遺伝子に関するＤＮＡ配列を含有するベクターを生成し、ｐＡＡ３１０と名付けた（図５１を参照）。ＡＣＨＢ対立遺伝子に関するＤＮＡ配列を含有するベクターを生成し、ｐＡＡ３１１と名付けた。
【０３７１】
【表１５】
2016501040.tif 000017
【０３７２】
実施例２１：Ｃ．トロピカリスのＦＡＴ１遺伝子のクローニング
ＦＡＴ１のＰＣＲ産物を、Ｃ．トロピカリス２０３３６のゲノムＤＮＡから、表１６に示したプライマーｏＡＡ１０２３およびｏＡＡ１０２４を使用して増幅した。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にライゲートし、コンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞（インビトロジェン）に形質転換し、ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定して、正しいＤＮＡ配列を確認した。ＦＡＴ１遺伝子に関するＤＮＡ配列を含有するベクターを、ｐＡＡ２９６と名付けた。
【０３７３】
【表１６】
2016501040.tif 000018
【０３７４】
実施例２２：Ｃ．トロピカリスのＡＲＥ１およびＡＲＥ２遺伝子のクローニング
ＡＲＥ１およびＡＲＥ２のＰＣＲ産物を、Ｃ．トロピカリス２０３３６のゲノムＤＮＡから、それぞれ表１７に示したプライマーｏＡＡ２００６／ｏＡＡ２００７およびｏＡＡ１０１２／ｏＡＡ１０１８を使用して増幅した。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にライゲートし、コンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞（インビトロジェン）に形質転換し、ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定して、正しいＤＮＡ配列を確認した。ＡＲＥ１遺伝子に関するＤＮＡ配列を含有するベクターを、ｐＡＡ３１８と名付けた。ＡＲＥ２遺伝子に関するＤＮＡ配列を含有するベクターを、ｐＡＡ３０１と名付けた。
【０３７５】
【表１７】
2016501040.tif 000019
【０３７６】
実施例２３：Ｃ．トロピカリスにおける発現のための最適化されたＴＥＳＡ遺伝子の構築
大腸菌のＴＥＳＡ遺伝子のための遺伝子配列を、Ｃ．トロピカリスにおける発現のためにコドンの置き換えにより最適化した。天然大腸菌のＴＥＳＡ遺伝子におけるコドンのそれぞれに関して類似の使用頻度を有するＣ．トロピカリスからのコドンを使用して新しいＴＥＳＡ遺伝子配列を構築した（ＣＴＧコドンは、Ｃ．トロピカリスによって利用される代替の酵母の核遺伝子コードであるためにその使用は避けた）。最適化されたＴＥＳＡ遺伝子を端にあるＢｓｐＱＩ制限部位を用いて合成し、ベクターｐＩＤＴＳＭＡＲＴ−Ｋａｎ中に入れた（インテグレーテッドＤＮＡテクノロジーズ（Integrated DNA Technologies））。このベクターを、ｐＡＡ２８７と名付けた。プラスミドｐＡＡ２８７をＢｓｐＱＩで切断し、５５５ｂｐのＤＮＡフラグメントをゲルで精製した。プラスミドｐＡＡ０７３もＢｓｐＱＩで切断し、直鎖状ＤＮＡフラグメントをゲルで精製した。２つのＤＮＡフラグメントを一緒にライゲートして、Ｃ．トロピカリスのＰＯＸ４プロモーターの制御下に最適化されたＴＥＳＡ遺伝子を入れた。結果得られたプラスミドを、ｐＡＡ２９４と名付けた。
【０３７７】
実施例２４：Ｃ．トロピカリスのＤＧＡ１遺伝子のクローニング
ＤＧＡ１のＰＣＲ産物を、Ｃ．トロピカリス２０３３６のゲノムＤＮＡから、表１８に示したプライマーｏＡＡ９９６およびｏＡＡ９９７を使用して増幅した。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にライゲートし、コンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞（インビトロジェン）に形質転換し、ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定して、正しいＤＮＡ配列を確認した。ＤＧＡ１遺伝子のＤＮＡ配列を含有するベクターを、ｐＡＡ２９９と名付けた。
【０３７８】
【表１８】
2016501040.tif 000020
【０３７９】
実施例２５：Ｃ．トロピカリスのＬＲＯ１遺伝子のクローニング
ＬＲＯ１ＰＣＲ産物を、Ｃ．トロピカリス２０３３６のゲノムＤＮＡから、表１９に示したプライマーｏＡＡ９９８およびｏＡＡ９９９を使用して増幅した。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にライゲートし、コンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞（インビトロジェン）に形質転換し、ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定して、正しいＤＮＡ配列を確認した。ＬＲＯ１遺伝子のＤＮＡ配列を含有するベクターを、ｐＡＡ３００と名付けた。
【０３８０】
【表１９】
2016501040.tif 000021
【０３８１】
実施例２６：Ｃ．トロピカリスのＡＣＳ１遺伝子のクローニングおよび欠失カセットの構築
ＡＣＳ１のＰＣＲ産物を、Ｃ．トロピカリス２０３３６のゲノムＤＮＡから、表２０に示したプライマーｏＡＡ９５１およびｏＡＡ９５２を使用して増幅した。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にライゲートし、コンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞（インビトロジェン）に形質転換し、ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定して、ＤＮＡ配列を確認した。このようなプラスミドの１つを、ｐＡＡ２７５と名付けた。プラスミドｐＡＡ２８０をＢａｍＨＩで消化して、２．０ｋｂのＰＵＲＡ３ＵＲＡ３ＴＵＲＡ３ＰＵＲＡ３カセットを放出させた。プラスミドｐＡＡ２７５をＢｇｌＩＩで消化し、ゲルで精製した。２つの断片を一緒にライゲートして、プラスミドｐＡＡ２７６およびｐＡＡ２８２を生成した。プラスミドｐＡＡ２７６およびｐＡＡ２８２は、ＡＣＳ遺伝子に逆方向に挿入されたＰＵＲＡ３ＵＲＡ３ＴＵＲＡ３ＰＵＲＡ３カセットを有する。
【０３８２】
【表２０】
2016501040.tif 000022
【０３８３】
実施例２７：株ｓＡＡ７２２（ｐｏｘ４ａ：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４ｂ：：ｕｒａ３ＰＯＸ５／ＰＯＸ５  ＡＣＳ１／ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３ＵＲＡ３ＴＵＲＡ３ＰＵＲＡ３）の構築
プラスミドｐＡＡ２７６を、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化し、カラムで精製した。株ｓＡＡ３２９（ｕｒａ３／ｕｒａ３  ｐｏｘ４ａ：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４ｂ：：ｕｒａ３  ＰＯＸ５／ＰＯＸ５）を、直線状ＤＮＡで形質転換し、ＳＣＤ−ｕｒａプレート上で平板培養した。ＡＣＳ１破壊に関して数種のコロニーをチェックした。このような株の１つを、ｓＡＡ７２２と名付けた。
【０３８４】
実施例２８：株ｓＡＡ７４１（ｐｏｘ４ａ：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４ｂ：：ｕｒａ３  ＰＯＸ５／ＰＯＸ５  ＡＣＳ１／ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３）の構築
株ｓＡＡ７２２をＹＰＤ培地中で一晩増殖させ、５−ＦＯＡプレート上で平板培養した。５−ＦＯＡの存在下で増殖したコロニーを、ＡＣＳ１部位中にＵＲＡ３プロモーター（ＰＵＲＡ３）のみを後に残すＵＲＡ３遺伝子のループアウトに関してＰＣＲでスクリーニングした。分析した３０種のコロニーのうち、１種の株のみが正しい遺伝学的改変を示した。この株を、ｓＡＡ７４１と名付けた。
実施例２９：株ｓＡＡ７７６（ｐｏｘ４ａ：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４ｂ：：ｕｒａ３  ＰＯＸ５／ＰＯＸ５  ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３ＵＲＡ３ＴＵＲＡ３ＰＵＲＡ３／ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３）の構築
プラスミドｐＡＡ２８２を、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化し、カラムで精製した。株ｓＡＡ７４１（実施例２８を参照）を、直線状ＤＮＡで形質転換し、ＳＣＤ−ｕｒａプレート上で平板培養した。二重のＡＣＳ１ノックアウトに関して数種のコロニーを挿入不活性化によってチェックした。このような株の１つを、ｓＡＡ７７６と名付けた。
【０３８５】
実施例３０：株ｓＡＡ７７９（ｐｏｘ４ａ：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４ｂ：：ｕｒａ３  ＰＯＸ５／ＰＯＸ５  ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３／ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３）の構築
株ｓＡＡ７７６（実施例２９を参照）をＹＰＤ培地中で一晩増殖させ、５−ＦＯＡプレート上で平板培養した。５−ＦＯＡの存在下で増殖したコロニーを、両方のＡＣＳ１コピーにおいてＵＲＡ３プロモーター（ＰＵＲＡ３）のみを後に残すＵＲＡ３遺伝子のループアウトに関してＰＣＲでスクリーニングした。このような株の１つを、ｓＡＡ７７９と名付けた。
【０３８６】
実施例３１：株ｓＡＡ８１１（ｐｏｘ４ａ：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４ｂ：：ｕｒａ３  ＰＯＸ５／ＰＯＸ５  ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３／ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３  ｕｒａ３：：３ｘＰＰＯＸ４Ｐ４５０Ａ１９）の構築
Ｐ４５０Ａ１９の統合カセットを含有するプラスミドｐＡＡ１５６をＣｌａＩで消化し、カラムで精製した。株ｓＡＡ７７９（実施例３０を参照）を、直線状ＤＮＡで形質転換し、ＳＣＤ−ｕｒａプレート上で平板培養した。Ｐ４５０Ａ１９の統合に関して数種のコロニーをチェックした。これらのコロニーから、ｑＰＣＲを行って、Ｐ４５０Ａ１９の統合のコピー数をチェックした。１種の株は、ｓＡＡ８１１と名付けられ、Ｐ４５０Ａ１９の３つのコピーを含んでいた。
【０３８７】
実施例３２：株ｓＡＡ８１０（ｐｏｘ４ａ：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４ｂ：：ｕｒａ３  ＰＯＸ５／ＰＯＸ５  ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３／ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３  ｕｒａ３：：５ｘＰＰＯＸ４Ｐ４５０Ａ１９  ｕｒａ３：：８ｘＰＰＯＸ４ＴＥＳＡ）の構築
Ｐ４５０−Ａ１９の統合カセットを含有するプラスミドｐＡＡ１５６をＣｌａＩで消化し、カラムで精製した。ＴＥＳＡ統合カセットを含有するプラスミドｐＡＡ２９４もＣｌａＩで消化し、カラムで精製した。株ｓＡＡ７７９を、両方の直線状ＤＮＡを用いて共に形質転換し、ＳＣＤ−ｕｒａプレート上で平板培養した。Ｐ４５０Ａ１９の統合とＴＥＳＡ統合の両方に関して数種のコロニーをチェックした。ＴＥＳＡおよびＰ４５０Ａ１９の両方に関して陽性であったコロニーをさらにｑＰＣＲによって分析した。ｑＰＣＲを行い、Ｐ４５０Ａ１９およびＴＥＳＡ統合事象のコピー数をチェックした。１種の株が、ｓＡＡ８１０と名付けられ、Ｐ４５０Ａ１９の５つのコピーとＴＥＳＡの８つのコピーを含んでいた。
【０３８８】
実施例３３．技術および方法（実施例３４〜５５で使用された）。
【０３８９】
増殖培地、試薬および条件
ＹＰＤ、ＳｃＤ−ｕｒａ培地およびプレート、ならびに５−ＦＯＡ含有プレートを、Methods in Yeast Genetics：a Cold Spring Harbor Laboratory Manual/David C. Amberg、Daniel J. Burke、Jeffrey Strathern、-2005年度版）で説明されているようにして作製した。
【０３９０】
ＳＰ９２＋グリセロールを、最終容量１リットルまでの水に、アミノ酸非含有の６．７ｇのバクト酵母窒素原礎培地（BD、米国ニュージャージー州フランクリンレイクス）、３．０ｇのバクト酵母抽出物（BD、米国ニュージャージー州フランクリンレイクス）、３．０ｇの硫酸アンモニウム、１．０ｇのリン酸二水素カリウム、１．０ｇの二塩基性リン酸カリウム、および７５ｇのグリセロールを添加することによって作製した。次いで培地をろ過滅菌した。
【０３９１】
水１リットルあたりに、硫酸アンモニウム非含有の１．７ｇのバクト酵母窒素原礎培地、３ｇのバクト酵母抽出物、１ｇのリン酸二水素カリウムおよび１ｇの二塩基性リン酸カリウムを添加することによってＴＢ−低Ｎ培地を作製した。培地をろ過滅菌した。
【０３９２】
一晩培養したものを、典型的には３０℃、約２５０ｒｐｍの振盪機で、標準的な培養チューブにより、２〜５ｍｌのＳｃＤ−ｕｒａ培地またはＹＰＤ培地のいずれかを用いて増殖させた。
【０３９３】
分子学的方法
ＤＮＡフラグメントのゲルによる精製を、ジーンＪＥＴ（GeneJET）ゲル抽出キット（ファーメンタス社（Fermentas Inc）、米国メリーランド州グレンバーニー）またはザイモクリーン（Zymoclean）ゲルＤＮＡ回収キット（ザイモリサーチ（ZymoResearch）、米国カリフォルニア州アーバイン）のいずれかを使用して、製造元によって推奨された通りにして行った。
【０３９４】
ＰＦＵウルトラＩＩ（PFU Ultra II）ＤＮＡポリメラーゼ（アジレント・テクノロジーズ（Agilent Technologies）、米国カリフォルニア州サンタクララ）、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ（New England Biolabs）、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ）、ＤｒｅａｍＴａｑ  ＰＣＲマスターミックス（ファーメンタス社、米国メリーランド州グレンバーニー）またはクイックロード・ミダス・ミックス（Quick Load Midas Mix）（モンセラート（Monserate）、米国カリフォルニア州サンディエゴ）のいずれかを使用して、ＰＣＲを行った。各酵素を製造元の説明書に従って使用した。
【０３９５】
制限酵素消化を各製造元によって推奨された通りに行った（ニューイングランドバイオラボ、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ、またはファーメンタス社、米国メリーランド州グレンバーニー）。製造元の説明書に従って、ラピッドライゲーションキット（Rapid Ligation Kit）（ファーメンタス社、米国メリーランド州グレンバーニー）を使用するか、またはＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイオラボ、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ）を使用するかのいずれかによって、ＤＮＡのライゲーションを行った。
【０３９６】
実施例１０で説明されているようにして酵母の形質転換を行った。
【０３９７】
ゲノムＤＮＡの調製
カンジダ属の酵母培養株ＡＴＣＣ２０３３６のゲノムＤＮＡから、ＵＲＡ３遺伝子を得た。カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６からのゲノムＤＮＡを以下のようにして調製した：約１．５ｍｌの細胞の一晩培養したもをペレット化し、これを、２％トリトンＸ−１００、１％ＳＤＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ＭＭのトリス（ｐＨ８．０）、および１ｍＭのＥＤＴＡを含有する溶液約２００μｌに再懸濁した。約２００μｌの酸洗浄したガラスビーズを、約８．０のｐＨで約２００μｌのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を用いて添加した。サンプルを約２分間ボルテックスで混合し、その後、約２００μｌの水を添加した。次いでサンプルを１３０００ｒｐｍで約１０分間遠心分離した。水層を新しいマイクロ遠沈管に移し、等しい体積のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）溶液を添加した。このサンプルを１０秒間ボルテックスで混合し、次いで１３０００ｒｐｍで約２分間遠心分離した。水層を新しいマイクロ遠心管に移し、１ｍｌのエタノールを添加した。次いでチューブを−８０℃で約１５分間置き、次いで１３０００ｒｐｍで１５分間回転させてＤＮＡをペレット化し、ＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、風乾した。次いでＤＮＡを約５００μｌの水に再懸濁した。
【０３９８】
クルイベロマイセス・ラクティス（Klyveromyces lactis）（ＡＴＣＣ８５８５）のゲノムＤＮＡは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（米国バージニア州マナサス）から購入した。
【０３９９】
遺伝子のコピー数を計算するために、qＰＣＲ方法を、Jinら（Appl. Environ. Microbiol. 2003年1月、69巻、1号、495〜503）によって説明されているようにして使用した。ｑＰＣＲを、製造元の説明書に従って、ブリリアントＩＩＩウルトラ−ファストＳＹＢＲ（Brilliant III Ultra-Fast SYBR）（登録商標）グリーンＱＰＣＲマスターミックス（アジレント・テクノロジーズ、米国コロラド州イングルウッド）またはＱｕａｎｔｉＴｅｃｔマルチプレックスＰＣＲ  ＮｏＲＯＸキット（キアゲン（Qiagen））のいずれかを使用して行った。標準として、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６からのゲノムＤＮＡまたはＡＴＣＣ２０３３６からのアクチン遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡ、および対象の遺伝子を使用した。
【０４００】
これらの実施例全体で使用されたプライマーおよびプローブは、インテグレーテッドＤＮＡテクノロジーズ（米国アイオワ州コーラルビル）により、標準的なＤＮＡ合成技術によって作製された。
【０４０１】
実施例３４：クローニングプラスミドＡＡ０７３の構築
プラスミドｐＡＡ０７３を、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６（この株はまた、本明細書では株ｓＡＡ００１とも称される）からのＰＯＸ４プロモーターおよびターミネーターが含有されるように設計した。このプラスミドを、公共的に利用可能なアンピシリン耐性マーカーを含有するプラスミドｐＵＣ１９から誘導した。あらゆる対象の遺伝子が、ＰＯＸ４プロモーターとタンデム式に一方向にクローニングされるようにＰＯＸ４プロモーターとターミネーターとの間に配置される２つのＳａｐＩ制限酵素部位が含まれるように、ｐＡＡ０７３を設計した。カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６の、オープンリーディングフレームおよび内因性調節領域を含むＵＲＡ３遺伝子も、形質転換株のための選択マーカーとしてｐＡＡ０７３に入れた。プラスミドｐＡＡ０７３は、ＳｐｅＩ、ＣｌａＩまたはＢｓｔＺ１７１などの固有の制限酵素でプラスミドを消化することによってあらゆる対象の遺伝子の複数のコピーの直接の統合を可能にする。これらの多重クローニング部位は、ＵＲＡ３栄養要求性マーカー領域に含有されており、対象の遺伝子の切断を回避するのに使用できる（すなわち、対象の遺伝子のＤＮＡ配列を、特定の制限酵素切断部位で検索して、これらの酵素を回避できる）。加えて、このプラスミドは、ＵＲＡ３遺伝子の３’領域と５’領域との間に挿入された対象の遺伝子およびＰＯＸ４調節領域を含有する抗生物質非含有のＤＮＡカセットを作製するためのテンプレートとして役立つ可能性がある。このカセットは、テンプレートとして該プラスミドを使用してＰＣＲ増幅でき、単離されたＰＣＲ産物は、あらゆる微生物株に挿入が可能である。
【０４０２】
図１８にｐＡＡ０７３の略図を示し、ｐＡＡ０７３の配列は、配列番号１６０として記載される。
【０４０３】
実施例３５：酵母形質転換プラスミドおよび統合カセットを作製するための一般的な手法ならびにＺＷＦ１遺伝子形質転換プラスミドの作製
カンジダ属の酵母宿主のゲノムＤＮＡに挿入された増幅したレベルの内因性遺伝子または外因性遺伝子のいずれかを含む形質転換したカンジダ属の酵母株の作製に有用なＤＮＡコンストラクトを生成するために、２つの手法のうち１つを使用した。ゲノムのカンジダＡＴＣＣ２０３３６のゲノムＤＮＡから、以下の内因性遺伝子：脂肪族アルコールデヒドロゲナーゼ（「ＡＤＨ」）−ＡＤＨ１、２、３、４、５、７および８；ＺＷＦ１（グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）；ＦＡＴ１（脂肪族アシル輸送体１）；ＰＥＸ１１（ペルオキシソーム生合成因子１１）；ＨＦＤ１およびＨＦＤ２（ヒト脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ１および２）、ＣＰＲＢ（シトクロムｐ４５０レダクターゼＢ）、Ｐ４５０Ａ１２−Ａ２０およびＰ４５０Ｄ２（シトクロムｐ４５０オキシダーゼ１２−２０およびＤ２）；ＦＡＴ１（脂肪族アシル輸送体１）；ならびにＩＤＰ２（細胞質内のイソクエン酸デヒドロゲナーゼＮＡＤＰ＋）を、増幅した。遺伝子ＧＤＰ１（グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ）をクルイベロマイセス・ラクティスのゲノムＤＮＡから得て、これを、時には、「ＫｌＧＤＰ１」と称した。ＡＤＨ１遺伝子のケースでは、対立遺伝子を別々にクローニングした。これらの対立遺伝子を、「ＡＤＨ１−１およびＡＤＨ１−２と称した。加えて、ＡＤＨ１対立遺伝子１を、「ショート」バージョンとしてクローニングし、したがってこれを、「ＡＤＨ１−１ショート」と称した；ＡＤＨ１対立遺伝子２を、ショートおよびレギュラーバージョンの両方としてクローニングし、これらの遺伝子を、「ＡＤＨ１−２−ショート」および「ＡＤＨ１−２」と称した。ＡＤＨ２の場合、２つの別個の遺伝子が同定されており、それらのそれぞれをここでクローニングし、増幅し、これらを、「ＡＤＨ２ａ」および「ＡＤＨ２ｂ」と称した。第一の手法（「手法１」）により、酵母を直接形質転換するプラスミドが得られ、このプラスミドは、カナマイシンの抗生物質耐性遺伝子を含んでいた。
【０４０４】
第二の手法（「手法２」）は、第一の手法の全ての工程を包含するが、形質転換したカンジダ株に外因性抗生物質耐性遺伝子をまったく含有させなくするための、抗生物質耐性遺伝子を除去する追加の最終工程が追加された。
【０４０５】
手法１における第一の工程は、適切に設計されたプライマーおよび上記のような標準的なＰＣＲ技術を使用して、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６のゲノムＤＮＡから対象の遺伝子を増幅することであった。表２５、２６および２７に、各プライマーの配列を記載した。次いで増幅した対象の遺伝子を、製造元が推奨する標準的な技術を使用してプラスミドｐＣＲ−ブラントＩＩ−Ｔｏｐｏ（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）、米国カリフォルニア州カールスバッド）に挿入した。次いで対象の遺伝子の配列を、標準的な配列決定技術を使用して検証した。以下の表２１の「プラスミド１」と表示された列に、対象の遺伝子ごとの結果得られたプラスミドの名称を記載した。次に、プラスミド１を適切な制限酵素で消化して、対象の遺伝子のインサートを単離した。次いでこの対象の遺伝子をｐＡＡ０７３（実施例３５で説明した）に挿入し、各対象の遺伝子で「プラスミド３」を作製した。表２１の「プラスミド３」と表示された列に、対象の遺伝子ごとの各プラスミド３の名称を記載した。ＰＣＲフラグメントをプラスミド３に直接的にクローニングすることにより、プラスミド１の構築を回避することが可能である。得られた各プラスミド３は、ＰＯＸ４プロモーターおよびターミネーターの制御下に対象の遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子および調節領域、ならびにアンピシリン耐性マーカー遺伝子を含んでいた。いくつかのコンストラクトに関して、このプラスミド３をＵＲＡ３遺伝子中で切断し、直線状プラスミド全体をカンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６に形質転換した。このような形質転換したカンジダ株は、アンピシリン耐性遺伝子を含んでいた。
【０４０６】
第二の手法では、第一の手法の全体を繰り返した。しかしながら、プラスミド３作製後、２つのＰＣＲ反応を行った。第一の反応は、ＵＲＡ３遺伝子の３’領域のみを増幅するように設計され、次いで増幅したフラグメントをゲルで精製した。第二のＰＣＲ反応では、単一のフラグメントとして、ＰＯＸ４プロモーター、対象の遺伝子、ＰＯＸ４ターミネーターおよびＵＲＡ３遺伝子の５’領域を増幅した。このフラグメントもゲルで精製した。２つのフラグメントをＰＣＲによって一緒に融合させ、このＰＣＲ産物をプラスミドｐＣＲ−ブラントＩＩ−Ｔｏｐｏに挿入し、このプラスミドを大腸菌細胞に形質転換し、次いでコロニーを、プラスミドのインサートの配列を検証するために選択した。正しい配列を含有するプラスミドを名付け、表２１では「プラスミド４」と称した。次いでプラスミド４を使用して、ＵＲＡ３’−ＰＯＸ４プロモーター−対象の遺伝子−ＰＯＸ４ターミネーター−ＵＲＡ５’コンストラクトの全体をＰＣＲ増幅し、次いでこのコンストラクトを使用して、カンジダ細胞を形質転換した。結果得られた形質転換細胞は対象の遺伝子を含んでいたが、抗生物質耐性遺伝子は株に導入されなかった。
【０４０７】
ＺＷＦ１形質転換プラスミドの調製
直前で説明した手法１を使用して、このプラスミドを作製した。ＺＷＦ１遺伝子を、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６のゲノムＤＮＡから、プライマーｏＡＡ８３１およびｏＡＡ８３２を使用して、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲフラグメントをゲルで精製し、製造元が推奨する標準的な技術を使用してプラスミドｐＣＲ−ブラントＩＩ−Ｔｏｐｏ（ライフ・テクノロジーズ、米国カリフォルニア州カールスバッド）にクローニングし、配列を検証した。プラスミドｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯは、カナマイシン耐性遺伝子を含有する。ＺＷＦ１ポリペプチドをコードする遺伝子を含有する結果得られたプラスミドを、ｐＡＡ２４６（「プラスミド１」）と名付けた。次いでＺＷＦ１のオープンリーディングフレームを、Ｓａｐ１フラグメントとしてｐＡＡ０７３にクローニングした。結果得られたプラスミドを、ｐＡＡ２５３（「プラスミド３」）と名付けた。
【０４０８】
実施例３６：ＡＤＨ２ａ遺伝子のための抗生物質非含有酵母統合カセットの作製
前の実施例で説明した手法２を使用して、カンジダ属の酵母細胞にＡＤＨ２ａをコードする遺伝子を導入するための統合カセットを作製した。ＡＤＨ２ａ遺伝子を、標準的手法を使用して、プライマーｏＡＡ３０１８およびｏＡＡ３０１９を使用してカンジダ株のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲフラグメントをゲルで精製し、標準的なクローニング技術を使用してｐＣＲ−ブラントＩＩ−Ｔｏｐｏ（インビトロジェン、米国カリフォルニア州カールスバッド）にクローニングし、配列を検証した。正しい配列を含有するプラスミド１を、ｐＡＡ６７１と名付けた。次いでｐＡＡ６７１からのＡＤＨ２Ａフラグメントを、ＳａｐＩ制限酵素部位を使用してｐＡＡ０７３にサブクローニングし、プラスミド３を形成し、これはｐＡＡ６８３と称され、ＰＯＸ４プロモーターおよびＰＯＸ４ターミネーターの制御下にＡＤＨ２ａのオープンリーディングフレームを含んでいた。次いで抗生物質非含有カセットをアセンブリＰＣＲによって作製した。ＵＲＡ３の３’領域と、ＰＯＸ４プロモーター、ＡＤＨ２ａのオープンリーディングフレーム、ＰＯＸ４ターミネーター、およびＵＲＡ３の５’領域を含有する別個のフラグメントとをそれぞれ、それぞれプライマーｏＡＡ２２０６およびｏＡＡ２２０７、またはプライマーｏＡＡ２２０８およびｏＡＡ２２０９のいずれかによるＰＣＲを使用して増幅した。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、組み合わせて、プライマーｏＡＡ２２０６およびｏＡＡ２２０９を使用して再び増幅した。結果得られたＰＣＲフラグメントをｐＣＲ−ブラントＩＩ  Ｔｏｐｏ（ライフ・テクノロジーズ、米国カリフォルニア州カールスバッド）にクローニングし、配列を検証した。正しい配列を有するプラスミド（「プラスミド４」）を、ｐＡＡ７１１と名付けた。
【０４０９】
実施例３７：Ｋ．ラクティス（K. lactis）のＧＤＰ１遺伝子のための抗生物質非含有酵母統合カセットの作製
ＫｌＧＤＰ１を、ゲノムＤＮＡからクローニングし、同時に７７４位でグアノシンをアデノシンに置き換えることによって内部ＣＵＧコドンをロイシンをコードする別のコドンに置き換えるために変異誘発させた。ＫｌＧＤＰ１の５’領域または３’領域を、Ｋ．ラクティスのゲノムＤＮＡから、それぞれｏＡＡ２４５７およびｏＡＡ２４５９またはｏＡＡ２４５８およびｏＪＨＲ４のいずれかを使用してＰＣＲで増幅した。ＰＣＲフラグメントをゲルで精製し、組み合わせて、ｏＡＡ２４５７およびｏＪＨＲ４でのＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用した。ＰＣＲフラグメントをゲルで精製し、製造元によって推奨された通りにｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯにクローニングした。プラスミドを配列決定し、正しい配列を有するプラスミドをｐＡＡ５４１と名付けた。このプラスミドを、プラスミドｐＡＡ５７８を作製するためのプライマーｏＡＡ２８５４およびｏＡＡ２８５５を用いたＰＣＲのためのテンプレートとした。他の全てのこのカセットの製造手法は、ＡＤＨ２ａに関して説明したように、クローニングおよび遺伝子増幅のための適切なプライマーを使用して行われた。
＞ＧＤＰ１、Ｋｌ−配列番号７１。
【０４１０】
実施例３８：他の遺伝子増幅カセットのコンストラクト
ＺＷＦ１およびＡＤＨ２ａに加えて、数種の他の遺伝子を、上記の手法１（形質転換プラスミド）または手法２（増幅カセット）のいずれかを使用して形質転換プラスミドまたは増幅カセットのいずれかに入れた。表２１に、これらのプラスミドまたはカセットに包含される遺伝子を記載した。抗生物質非含有増幅カセットに挿入された遺伝子は、表２１に記載のプラスミド４を有し、形質転換プラスミドに入れられた遺伝子は、プラスミド４を有さない。表２５〜２８に、本明細書に記載の実施例で説明した遺伝子のうちいくつかをサブクローニングおよびクローニングするのに使用されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド配列の一部を列挙した。
【０４１１】
実施例３９：ＺＷＦ１を過剰発現するカンジダ株の作製
プラスミドｐＡＡ２５３を、制限酵素ＣｌａＩで消化した。標準的な形質転換手法を使用して、直線状プラスミドをカンジダ株ｓＡＡ１０３に形質転換した。標準的手法を使用して、形質転換株を、ＳｃＤ−ｕｒａプレートでの増殖によって選択した。プレートに画線してシングルコロニーを生成さ、形質転換株をＰＣＲと配列分析によって検証した。ＺＷＦ１コピー数をｑＰＣＲを使用して決定した。ＺＷＦ１のおよそ６つのコピーを有する株を、ｓＡＡ１２３３と名付けた。
【０４１２】
実施例４０：ＡＤＨ２ａを過剰発現するカンジダ株の作製
テンプレートとしてプラスミドｐＡＡ７１１を使用し、プラスミドの望ましい領域をプライマーｏＡＡ２２０６およびｏＡＡ２２０９を用いてＰＣＲで増幅することによって、３’ＵＲＡ３−ＰＰＯＸ４−ＡＤＨ２Ａ−ＴＰＯＸ４−５’ＵＲＡ３フラグメントを構築した。ＰＣＲフラグメントをゲルで精製し、カンジダ株ｓＡＡ１０３に形質転換した。形質転換株を、ＳｃＤ−ｕｒａプレート中での増殖によって選択した。単一の分離株ごとにコロニーを画線し、形質転換体の分離株をＰＣＲによって検証した。次いで遺伝子のコピー数をｑＰＣＲによって決定した。ＰＰＯＸ４−ＡＤＨ２Ａ−ＴＰＯＸ４４のおよそ７つのコピーを有する株を同定し、これを、ｓＡＡ１８０３と名付けた。
【０４１３】
実施例４１：追加のカンジダ株の作製
数種の他の形質転換プラスミドまたは増幅カセットを生成させ、上記で説明した手法１または手法２を使用してカンジダ株ｓＡＡ１０３に形質転換し、新規のプラスミドおよびカンジダ株を作製した。表２１に、遺伝子、プラスミドの名称および株の名称を記載した。
【０４１４】
【表２１】
2016501040.tif 000023
【０４１５】
注釈：「プラスミド１」、「プラスミド３」および「プラスミド４」は、実施例３５で説明した通りであり；「プラスミド２」は、部位特異的変異誘発によって６００位におけるグアノシンをアデノシンに突然変異させたアルコールデヒドロゲナーゼ３の遺伝子だけのために生成した。このプラスミドを調製するために、製造元によって推奨された通りにプライマーｏＡＡ３０７３およびｏＡＡ３０７４ならびにＰＦＵウルトラＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ（アジレント・テクノロジーズ、米国カリフォルニア州サンタクララ）を使用した５０μｌのＰＣＲ反応液中、３０〜５０ｎｇのｐＡＡ６７５をテンプレートとして使用した。ＰＣＲが完了した後、ＰＣＲ反応液に２０ユニットのＤｐｎＩ（ニューイングランドバイオラボ、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ）を添加し、３７℃で２時間インキュベートした。５μｌの反応液を使用して、製造元によって推奨された通りにＤＨ５α細胞（モンセラート・バイオテクノロジー（Monserate Biotechnology）、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を形質転換させた。結果得られたプラスミドの配列を検証し、正しい配列を有するプラスミドを、ｐＡＡ７１５と名付けた。
【０４１６】
実施例４２：２種のＦＡＴ１突然変異遺伝子の作製
酵素のアシルＣｏＡシンセターゼ活性を、その脂肪酸輸送活性を維持しながら低減させようとする試みにおいて、ＦＡＴ１遺伝子の２種の突然変異体を作製した。第一の突然変異体は、２４４位において天然のセリンがアラニンで置換され；第二の突然変異体は、４９５位において天然のアスパラギン酸がアラニンで置換された。
【０４１７】
ＦＡＴ１のＳ２４４Ａ突然変異を含有する遺伝子を調製するために、オリゴヌクレオチドｏＡＡ２８３９およびｏＡＡ２８０５を使用して、カンジダＡＴＣＣ２０３３６のゲノムＤＮＡからの天然のＦＡＴ１遺伝子の５’末端を増幅し、一方でオリゴヌクレオチドｏＡＡ２８０４およびｏＡＡ２８７５を使用して、同遺伝子の３’末端を増幅した。両方の生成物をゲルで精製し、オリゴヌクレオチドｏＡＡ２８３９およびｏＡＡ２８７５を使用した２回目のＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＢｓｐＱＩ（ニューイングランドバイオラボ）を使用してｐＡＡ０７３と共に消化し、ゲルで精製し、生成物をＴ４ＤＮＡリガーゼ（ファーメンタス）でライゲートした。ライゲートしたものを大腸菌のＤＨ５α（モントセラート（Montserrat））に形質転換し、ＬＢアンピシリン上で平板培養した。数種のコロニーにミニプレップ（Minipreps）（キアゲン）を完了させて、配列を確認した。
【０４１８】
ＦＡＴ１のＤ４９５Ａ突然変異遺伝子についても、該遺伝子の５’末端にはｏＡＡ２８３９およびｏＡＡ２８４２、ならびに３’末端にはｏＡＡ２８４１およびｏＡＡ２８７５を使用して上記のプロセスを繰り返した。ｏＡＡ２８３９およびｏＡＡ２８７５を用いて遺伝子の２つの末端を説明したようにして使用し、完全長の生成物を得て、これを消化し、クローニングし、上述したように検証した。
【０４１９】
各突然変異遺伝子を、プラスミドｐＡＡ０７３に挿入した。
【０４２０】
実施例４３：複数の増幅した遺伝子を含有するカンジダ株の調製
単一の遺伝子が増幅された新規のカンジダ株を作製することに加えて、１種より多くの遺伝子が増幅された数種の株を作製した。これらの株は、対象の遺伝子のそれぞれにおいて株ｓＡＡ１０３を個々の形質転換プラスミドまたは増幅カセットと共に形質転換することによって生成された。
以下の表２２に、このような作製されたカンジダ株それぞれの名称と株を形質転換した遺伝子を記載した。
【０４２１】
【表２２】
2016501040.tif 000024
【０４２２】
実施例４４：ＦＡＴ１ノックアウト株の作製
ＦＡＴ１遺伝子発現が減少したカンジダ株を作製するために、各ＦＡＴ１対立遺伝子ごとにノックアウトカセットを生成した。第一の対立遺伝子については、５’相同性領域（ＦＡＴ１のオープンリーディングフレームのヌクレオチド２７〜４８８）を、テンプレートとしてカンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６のゲノムＤＮＡと共にプライマーｏＡＡ２０５５およびｏＡＡ２０５６を使用して増幅した。３’相同性領域（ＦＡＴ１のオープンリーディングフレームのヌクレオチド１４８３〜１８９１からなる）を、同じゲノムＤＮＡからのプライマーｏＡＡ２０６９およびｏＡＡ２０６０を使用して増幅した。３’末端でプロモーターの反復を有するＵＲＡ３マーカーを含有するカセットをｐＡＡ２９８から増幅して、ｏＡＡ２０５７およびｏＡＡ２０６８を用いて両方の相同性領域のオーバーラップを含有させた。次いでこれらの３つのＤＮＡフラグメント断片を、それに続くオリゴｏＡＡ２０５５およびｏＡＡ２０６０を使用したＰＣＲ反応に使用し、欠失カセットを生成した。次いでＰＣＲで精製されたカセットを株ｓＡＡ１０３に形質転換し、形質転換株をＰＣＲによって検証して、ｓＡＡ９１９を得た。この株を、５ＦＯＡ上で平板培養し、ＵＲＡ３マーカーを除去し、ＰＣＲによって検証した。このＵＲＡ３を含まない株を、ｓＡＡ９８６と名付けた。
【０４２３】
第二のＦＡＴ１対立遺伝子破壊カセットを以下のようにして生成した：５’相同性領域（オープンリーディングフレームのヌクレオチド４８７〜９５１）を、プライマーｏＡＡ２０７０およびｏＡＡ２０７１を使用して増幅した。３’相同性領域（オープンリーディングフレームのヌクレオチド９８７〜１４３９）を、プライマーｏＡＡ２０７４およびｏＡＡ２０７５ならびにテンプレートとしてカンジダＡＴＣＣ２０３３６のゲノムＤＮＡを使用して増幅した。プライマーｏＡＡ２０７２およびｏＡＡ２０７３との相同性を有するオーバーラップを含有させるために、３’末端にプロモーターの反復を有するＵＲＡ３マーカーを含有するカセットを構築した。次いでそれに続くオリゴｏＡＡ２０７０およびｏＡＡ２０７５を使用したＰＣＲ反応で３つのフラグメントを使用し、欠失カセットを生成した。次いでこの精製された生成物を使用して、ｓＡＡ９８６を形質転換し、第二の対立遺伝子が破壊された形質転換株をＰＣＲによって検証した。正しい遺伝子型を有する株を、ｓＡＡ１０００と名付けた。この株を、５ＦＯＡ上で平板培養し、ＵＲＡ３マーカーの除去に関してＰＣＲを使用して検証した。この株を、ｓＡＡ１１８２と名付けた。
【０４２４】
実施例４５：ＦＡＴ１／ＡＣＳ１二重欠失株の作製
ＵＲＡ３が破壊された遺伝子座を機能的な対立遺伝子で置き換えるために、カンジダ株ｓＡＡ００３において、機能的なＰＯＸ５対立遺伝子を、ＰＯＸ５直鎖状ＤＮＡでのｓＡＡ００３の形質転換によって回復させた。ＰＯＸ５のＯＲＦ、加えてＯＲＦの４５６ｂｐ上流および１７９ｂｐ下流を含む２，５８４ｂｐのＤＮＡフラグメントを、テンプレートとしてプラスミドｐＡＡ０４９を使用して、プライマーｏＡＡ０１７９およびｏＡＡ０１８２を使用したＰＣＲによって増幅した。精製されたＰＣＲ産物を使用して、コンピテントｓＡＡ００３細胞を形質転換し、これを、炭素源として（例えば、反転させたペトリ皿の蓋にドデカンに浸したろ紙を置くことによって）ドデカンの蒸気が補充されたＹＮＢ寒天プレート上で平板培養し、３０℃で４〜５日間インキュベートした。唯一の炭素源としてのドデカン上で増殖させたコロニーを再びＹＰＤ寒天上に画線し、３０℃でインキュベートした。ＹＰＤ培養中でシングルコロニーを増殖させ、ゲノムＤＮＡの調製に使用した。形質転換株から調製したゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析を、オリゴｏＡＡ０１７９およびｏＡＡ０１８２を用いて行った。ｕｒａ３が破壊されたＰＯＸ５は、４，７８４ｂｐのＰＣＲ産物を生産すると予想され、一方で機能的なＰＯＸ５は、２，５８４ｂｐのＰＣＲ産物を生産すると予想された。結果得られた株ｓＡＡ２３５において、２，５８４ｂｐのＰＣＲ産物が増幅されたことから、これは、両方のＰＯＸ５対立遺伝子が機能的に回復したことを示す。選択方策（ドデカンを含むＹＮＢ寒天）の予期せぬ結果は、細胞がＵｒａ＋表現型に戻り始めることであった。いかなる理論にも限定されるつもりはないが、固体培地中のウラシルの非存在と機能的なＵＲＡ３のみの置き換えが、他のｕｒａ３遺伝子座のうち１つが機能的な対立遺伝子に戻るように細胞を突然変異させたと考えられる。プラスミドｐＡＡ２７６を、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化し、カラムで精製した。株ｓＡＡ３２９（ｕｒａ３／ｕｒａ３  ｐｏｘ４ａ：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４ｂ：：ｕｒａ３  ＰＯＸ５／ＰＯＸ５）を、直線状ＤＮＡで形質転換し、ＳＣＤ−ｕｒａプレート上で平板培養した。ＡＣＳ１破壊に関して数種のコロニーをチェックした。このような株の１つを、ｓＡＡ７２２と名付けた。
【０４２５】
株ｓＡＡ７２２をＹＰＤ培地中で一晩増殖させ、５−ＦＯＡプレート上で平板培養した。５−ＦＯＡの存在下で増殖したコロニーを、ＡＣＳ１部位においてＵＲＡ３プロモーター（ＰＵＲＡ３）のみを後に残すＵＲＡ３遺伝子のループアウトに関してＰＣＲでスクリーニングした。分析した３０種のコロニーのうち、１種の株のみが正しい遺伝学的改変を示した。この株を、ｓＡＡ７４１と名付けた。
【０４２６】
プラスミドｐＡＡ２８２を、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化し、カラムで精製した。株ｓＡＡ７４１を、直線状ＤＮＡで形質転換し、ＳＣＤ−ｕｒａプレート上で平板培養した。二重のＡＣＳ１ノックアウトに関して数種のコロニーを挿入不活性化によってチェックした。このような株の１つを、ｓＡＡ７７６と名付けた。
【０４２７】
株ｓＡＡ７７６をＹＰＤ培地中で一晩増殖させ、５−ＦＯＡプレート上で平板培養した。５−ＦＯＡの存在下で増殖したコロニーを、両方のＡＣＳ１遺伝子の対立遺伝子においてＵＲＡ３プロモーター（ＰＵＲＡ３）のみを後に残すＵＲＡ３遺伝子のループアウトに関してＰＣＲでスクリーニングした。このような株の１つを、ｓＡＡ７７９と名付けた。Ｆａｔ１遺伝子の全長コード配列を、プライマーｏＡＡ１０２３およびｏＡＡ１０２４を使用して、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６のゲノムＤＮＡから増幅した。２，０８６ｂｐのＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にライゲートし、コンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞（インビトロジェン）に形質転換し、ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定して、正しいＤＮＡ配列を確認した。このようなプラスミドの１つを、ｐＡＡ２９６と名付けた。
【０４２８】
オーバーラップ伸長ＰＣＲ（ＯＥ−ＰＣＲ）によって構築された直鎖状ＤＮＡカセットで細胞を形質転換することによって、各ＦＡＴ１の対立遺伝子の欠失が達成された。ｓＡＡ７７９における第一のＦＡＴ１対立遺伝子のための欠失カセットを、３つのＤＮＡフラグメントから作製した。第一のＤＮＡフラグメント（ＦＡＴ１の５’相同性）を、プラスミドｐＡＡ２９６から、プライマーｏＡＡ２０５５およびｏＡＡ２０５６を使用して増幅した。第二のＤＮＡフラグメント（ＰＵＲＡ３ＵＲＡ３ＴＵＲＡ３ＰＵＲＡ３）を、プラスミドｐＡＡ２９８から、プライマーｏＡＡ２０５７およびｏＡＡ２０６８を使用して増幅した。図１９にプラスミドｐＡＡ２９８の略図を示し、このプラスミドの配列は、配列番号１６１として記載した。
＞ＰＡＡ２９８−配列番号１６１。
【０４２９】
第三のＤＮＡフラグメント（ＦＡＴ１の３’相同性）を、プラスミドｐＡＡ２９６から、プライマーｏＡＡ２０６９およびｏＡＡ２０６０を使用して増幅した。図５９に、ＦＡＴ１ＤＮＡフラグメントを増幅するｐＡＡ２９６におけるプライマーのアニーリング部位の位置を示した。全ての３つのＤＮＡフラグメントを同じ反応液中で組み合わせ、ｏＡＡ２０５５およびｏＡＡ２０６０を使用したＯＥ−ＰＣＲプライマーによって全長欠失カセットを生成した。株ｓＡＡ７７９を、全長欠失カセットで形質転換し、ＳＣＤ−Ｕｒａプレート上で平板培養した。数種のコロニーを、第一のＦＡＴ１の対立遺伝子における欠失カセットの統合に関してＰＣＲによってスクリーニングした。このような株の１つを、ｓＡＡ８６５と名付けた。
【０４３０】
株ｓＡＡ８６５をＹＰＤ培地中で一晩増殖させ、５−ＦＯＡプレート上で平板培養した。５−ＦＯＡの存在下で増殖したコロニーを、第一のＦＡＴ１の対立遺伝子においてＵＲＡ３プロモーター（ＰＵＲＡ３）のみを後に残すＵＲＡ３遺伝子のループアウトに関してＰＣＲでスクリーニングした。このような株の１つを、ｓＡＡ８６９と名付けた。
【０４３１】
ｓＡＡ８６９における第二のＦＡＴ１の対立遺伝子の欠失を、ＯＥ−ＰＣＲによって作製された欠失カセットでの形質転換によって行った。第二のＦＡＴ１の対立遺伝子のための欠失カセットを、３つのＤＮＡフラグメントから構築した。第一のＤＮＡフラグメント（ＦＡＴ１の５’相同性）を、プラスミドｐＡＡ２９６から、プライマーｏＡＡ２０７０およびｏＡＡ２０７５を使用して増幅した。第二のＤＮＡフラグメント（ＰＵＲＡ３ＵＲＡ３ＴＵＲＡ３ＰＵＲＡ３）を、プラスミドｐＡＡ２９８から、プライマーｏＡＡ２０７２およびｏＡＡ２０７３を使用して増幅した。第三のＤＮＡフラグメント（ＦＡＴ１の３’相同性）を、プラスミドｐＡＡ２９６から、プライマーｏＡＡ２０７４およびｏＡＡ２０７５を使用して増幅した。全ての３つのＤＮＡフラグメントを同じ反応液中に組み合わせ、プライマーｏＡＡ２０７０およびｏＡＡ２０７１を使用したＯＥ−ＰＣＲによって全長欠失カセットを作製した。株ｓＡＡ８６９を、全長欠失カセットで形質転換し、ＳＣＤ−Ｕｒａプレート上で平板培養した。数種のコロニーを、第二のＦＡＴ１の対立遺伝子における欠失カセットの統合に関してＰＣＲによってスクリーニングした。このような株の１つを、ｓＡＡ８７５と名付けた。
【０４３２】
カンジダ株ｓＡＡ８７５をＹＰＤ培地中で一晩増殖させ、次いで５−フルオロオロチン酸（5-fluorotic acid）含有プレート上に画線した。シングルコロニーを、ＵＲＡ３逆突然変異の頻度に関して試験し、最小の逆突然変異の頻度を有する分離株を、ｓＡＡ８８６と名付けた。
【０４３３】
ＰＯＸ５遺伝子の第一の対立遺伝子のための破壊カセットを、オーバーラップＰＣＲによって構築した。５’ＰＯＸ５（ＯＲＦの＋３４から＋４８８）または３’ＰＯＸ５（ＯｒＦの＋１４８７から＋１９６０）フラグメントを、テンプレートとしてＡＴＣＣ２０３３６からのゲノムＤＮＡ、ならびにプライマーｏＡＡ２１７３およびｏＡＡ２１７４（５’フラグメントのため）またはｏＡＡ２１７７およびｏＡＡ２１７８（３’フラグメントのため）を使用してＰＣＲ増幅した。同方向反復配列を有するカンジダＵＲＡ３遺伝子フラグメントを、プライマーとしてｏＡＡ２１７５およびｏＡＡ２１７６を使用してＰＣＲ増幅した。次いで３つの遺伝子フラグメントをゲルで精製し、組み合わせて、ライゲートし、これをテンプレートとして使用して、プライマーとしてｏＡＡ２１７３およびｏＡＡ２１７８を使用したＰＣＲによって全長コンストラクトを作製した。このおよそ２．９Ｋｂのフラグメントをゲルで精製し、これを使用して、ｓＡＡ８８６を形質転換した。形質転換株を、ＳｃＤ−ｕｒａプレートでの増殖によって選択した。コロニーを再び画線して、個々の形質転換株を単離した。ＰＯＸ５の第一の対立遺伝子の破壊をＰＣＲによって検証した。正しい遺伝子型を有する株を、ｓＡＡ９４０と名付けた。
【０４３４】
株ｓＡＡ９４０を、ＹＰＤ中で一晩増殖させ、次いで５−フルオロオロチン酸（5-fluoroticacid）含有プレートに画線した。株を、ＰＯＸ５欠失の存在に関してＰＣＲによってスクリーニングした。正しい遺伝子型を有する株を再度ｓＡＡ９６９と名付けた。
【０４３５】
ＰＯＸ５遺伝子の第二の対立遺伝子のための破壊カセットを、オーバーラップＰＣＲによって構築した。５’ＰＯＸ５（ＯＲＦの＋４８９〜＋９６０）または３’ＰＯＸ５（ＯＲＦの＋１０１４〜＋１４７９）フラグメントを、ＡＴＣＣ２０３３６からのゲノムＤＮＡ、ならびにそれぞれプライマーｏＡＡ２１８８およびｏＡＡ２１８９またはｏＡＡ２１９２およびｏＡＡ２１９３を使用してＰＣＲ増幅した。同方向反復配列としてターミネーターを有するカンジダのＵＲＡ３遺伝子フラグメントを、プライマーとしてｏＡＡ２１９０およびｏＡＡ２１９１ならびにテンプレートとしてｐＡＡ２９８を使用してＰＣＲ増幅した。これらの３つのＤＮＡフラグメントをゲルで精製し、組み合わせて、ライゲートし、プライマーとしてｏＡＡ２１８８およびｏＡＡ２１９３を使用したＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。このおよそ２．９Ｋｂのフラグメントをゲルで精製し、これを使用して、株ｓＡＡ９６９を形質転換した。形質転換株を、ＳｃＤ−ｕｒａプレートでの増殖によって選択した。コロニーを再び画線して、個々の形質転換株を単離した。ＰＣＲによって、両方のＰＯＸ５対立遺伝子の破壊に関して株をスクリーニングした。正しい遺伝子型を有する株を、ｓＡＡ９８８と名付けた。
【０４３６】
実施例４６：ＰＯＸ４、ＰＯＸ５、ＡＣＳ１欠失株の構築
第一のＡＣＳ１遺伝子の対立遺伝子のための破壊カセットを、オーバーラップＰＣＲによって構築した。５’ＡＣＳ１（ＯＲＦの＋１０１〜＋６０１）または３’ＡＣＳ１フラグメント（ＯＲＦの＋１５４６〜＋１９６０）を、ＡＴＣＣ２０９６２からのゲノムＤＮＡ、ならびにプライマーｏＡＡ２４０６およびｏＡＡ２４０７またはｏＡＡ２４０８およびｏＡＡ２４０９を使用してＰＣＲ増幅した。カンジダのＵＲＡ３遺伝子フラグメントを、プライマーとしてｏＡＡ２４１０およびｏＡＡ２４１１ならびにテンプレートとしてｐＡＡ２４４（実施例５８で説明した）を使用してＰＣＲ増幅した。３つの遺伝子フラグメントをゲルで精製し、組み合わせて、ライゲートし、プライマーとしてｏＡＡ２４０６およびｏＡＡ２４０９を使用したＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。このＰＣＲフラグメントをゲルで精製し、これを使用して、ｓＡＡ１０３を形質転換した。形質転換株を、ＳｃＤ−ｕｒａプレートでの増殖によって選択した。コロニーを再び画線して、個々の形質転換株を単離した。ＡＣＳ１の第一の対立遺伝子の破壊をＰＣＲによって検証した。正しい遺伝子型を有する株を、ｓＡＡ１１８５と名付けた。
【０４３７】
ｓＡＡ１１８５を、ＹＰＤ中で一晩増殖させ、５−フルオロオロチン酸（5-fluoorotic acid）含有プレートに画線した。ＰＣＲによって、ＡＣＳ１欠失の存在に関して株をスクリーニングした。正しい遺伝子型を有する株を再度ｓＡＡ１３１３と名付けた。
【０４３８】
ネステッド破壊カセットを、オーバーラップＰＣＲによって構築した。５’ＡＣＳ１（ＯＲＦの＋６２６〜＋１０２１）または３’ＡＣＳ１（ＯＲＦの＋１１５１〜＋１５１８）フラグメントを、ＡＴＣＣ２０３３６からのゲノムＤＮＡ、ならびにそれぞれプライマーｏＡＡ２４１２およびｏＡＡ２４１３またはｏＡＡ２４１４およびｏＡＡ２４１５を使用してＰＣＲ増幅した。カンジダのＵＲＡ３フラグメントを、ＵＲＡ３遺伝子増幅ためのプライマーとしてｏＡＡ２４１６およびｏＡＡ２４１７を使用してＰＣＲ増幅した。３つのフラグメントをゲルで精製し、組み合わせて、このＰＣＲ反応のプライマーとしてｏＡＡ２４１２およびｏＡＡ２４１５を用いたＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。正しいＰＣＲフラグメントをゲルで精製し、これを使用して、ｓＡＡ１１８４を形質転換した。形質転換株を、ＳｃＤ−ｕｒａプレートでの増殖によって選択した。コロニーを再び画線して、個々の形質転換株を単離した。これらの形質転換株を、ＰＣＲによって、両方のＡＣＳ１対立遺伝子の破壊に関してスクリーニングした。正しい遺伝子型を有する株を、ｓＡＡ１３７１と名付けた。
【０４３９】
実施例４７：所定のＣＰＲ７５０−ＣＹＰ４５０株の構築および評価
ＣＰＲ７５０遺伝子および１つまたはそれより多くのＣＹＰ４５０遺伝子の組み合わせを含むプラスミドを、以下のように（表２３）、内因性ＣＰＲ７５０プロモーターを含有するＣＰＲ７５０遺伝子のいずれか（実施例１６のプラスミドｐＡＡ０６７を参照）を、ｐＡＡ１５１−１５８、ｐＡＡ１６０またはｐＡＡ１６１のそれぞれにライゲートすることによって作製した。
【０４４０】
プラスミドｐＡＡ１５１を、Ｓｂｆ１／ＳｐｅＩ制限酵素で消化し、ＣＰＲ７５０をコードする２５８４ｂｐのフラグメントを単離し、Ｓｂｆ１およびＳｐｅ１で消化したときにｐＡＡ０６７の６１９８ｂｐのフラグメントにライゲートした。ライゲーション混合物を大腸菌細胞（ＤＨ５ａｌｐｈａ）に形質転換した。プラスミドを、制限酵素分析と配列決定によって検証した。正しい配列を有するプラスミドを、ｐＡＡ２２３と名付けた。
【０４４１】
【表２３】
2016501040.tif 000025
【０４４２】
プラスミドｐＡＡ２２３およびｐＡＡ２３３をＳｐｅＩで直線状にし（ニューイングランドバイオラボ）、一方で残りのプラスミドをＣｌａＩで直線状にした（ニューイングランドバイオラボ）。ｓＡＡ１０３を、直線状プラスミドで形質転換した。形質転換株を、ＳｃＤ−ｕｒａプレートでの増殖によって選択した。単一の分離株ごとにコロニーを画線し、各分離株中の形質転換株を選択し、ＰＣＲによって検証した。
【０４４３】
次いで上記で調製された株を、基質（「供給材料」）としてヤシ油を使用した二酸の生産に関して試験した。
【０４４４】
株を、ＳＰ９２＋グリセロール（５ｍＬ）中で一晩増殖させ、次いで５０ｍＬのＳＰ９２＋グリセロール（５０ｍＬ）に開始時のＯＤ＝０．４で移した。各株を遠心分離し、ペレットをＴＢ低Ｎ培地（１２．５ｍＬ）に再懸濁した。各フラスコに２％ヤシ油を添加した。フラスコを、３００ＲＰＭで３０℃インキュベートした。ＧＣ分析のために３０および９６時間でサンプル（１ｍＬ）を採取した。
【０４４５】
表２４からわかるように、Ｐ４５０Ａ１９は、Ｃ１０、Ｃ１２およびＣ１４脂肪酸での二酸形成において最も大きい向上を示した。
【０４４６】
【表２４】
2016501040.tif 000026
【０４４７】
実施例４８．ラウリン酸メチルおよびミリスチン酸メチルから対応する二酸への変換−株ｓＡＡ１３０４とｓＡＡ００３との比較
発泡体の栓を有する５００ｍＬバッフル付きフラスコ中での、８０ｍＬのＳＰ９２（６．７ｇ／Ｌ酵母窒素原礎培地、３．０ｇ／Ｌ酵母抽出物、３．０ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、７５ｇ／Ｌデキストロース）の予備培養物に、株ｓＡＡ００３（ベータ酸化がブロックされた株）または株ｓＡＡ１３０４（ベータ酸化がブロックされ、ＣＰＲＢおよびＣＹＰ５２Ａ１９が増幅された株）の凍結したグリセロールストックから１．０ｍＬを植え付け、３０℃および２５０ＲＰＭで２４時間インキュベートした。発酵培地（ＭＭ１）組成物、２７ｇ／Ｌのデキストロース、７．０ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、５．１ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、１．０２４ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物、０．１５５ｇ／Ｌの硫酸カルシウム二水和物、０．０６ｇ／Ｌの無水クエン酸、０．０４ｇ／Ｌの硫酸第一鉄七水和物、０．０００２ｍｇ／Ｌのビオチン、１．０ｍＬ微量ミネラル溶液（０．９ｇ／Ｌのホウ酸、０．１１ｇ／Ｌの硫酸銅五水和物、０．１８ｇ／Ｌのヨウ化カリウム、０．８０６ｇ／Ｌの硫酸マンガン一水和物、０．３６０ｇ／Ｌのモリブデン酸ナトリウム、０．７２０ｇ／Ｌの硫酸亜鉛）、ｐＨ５．８をろ過滅菌し、滅菌発酵容器に移した。初期ＯＤ６００ｎｍが１．０になるまで、３５℃、１０００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、ｐＨ５．８の増殖条件で、予備培養の接種材料を用いて増殖を開始させた。およそ１０〜１２時間増殖を続け、そのあとに５ｇ／Ｌの供給材料（ミリスチン酸メチルのみ）のボーラスの添加によって、その直後に供給材料の連続フィードによって変換期を開始させた。高濃度でラウリン酸メチルが脱メチルされることによって変換プロセス中に形成されるラウリン酸の毒性のために、最初のボーラスは付与されなかった。供給材料フィード速度を、以下：ミリスチン酸メチル（シグマ−アルドリッチ（Sigma-Aldrich）番号Ｗ２７２２０５）の場合、最初の２４時間は１．０ｇ／Ｌ−ｈ；２４時間から終結までは１．５ｇ／Ｌ−ｈ；ラウリン酸メチル（シグマ−アルドリッチ番号Ｗ２７１５００）の場合、最初の２４時間は０．５ｇ／Ｌ−ｈ；２４時間から終結までは１．２ｇ／Ｌ−ｈのように変化させた。加えて、グルコースのコフィードを、基質としてミリスチン酸メチルを使用した場合は１．２５ｇ／Ｌ−ｈの速度で、または基質としてラウリン酸メチルを使用した場合は１．０ｇ／Ｌ−ｈの速度でフィードした。誘導時に、温度を３０℃に変化させ、６ＮのＫＯＨの添加によってｐＨを６．０に維持した。図２０に記載のデータは、ラウリン酸メチルからのドデカン二酸の生産またはミリスチン酸メチルからのテトラデカン二酸の生産のいずれかを示し、株ｓＡＡ１３０６の生産性は、両方の供給材料に対してｓＡＡ００３よりも向上したことを実証している。ミリスチン酸メチルを供給材料として使用した場合、ｓＡＡ１３０６は、ｓＡＡ００３と比べておよそ２５％の生産性の向上を示した。
【０４４８】
実施例４９．ラウリン酸メチルおよびミリスチン酸メチルから対応する二酸への変換−株ｓＡＡ１０８２とｓＡＡ００３との比較
発泡体の栓を有する５００ｍＬバッフル付きフラスコ中での８０ｍＬのＳＰ９２の予備培養に、株ｓＡＡ００３（ベータ酸化がブロックされた株）または株ｓＡＡ１０８２（ベータ酸化がブロックされ、ＣＰＲＢおよびＣＹＰ５２Ａ１９が増幅された株）の凍結したグリセロールストックから１．０ｍＬを植え付け、３０℃および２５０ＲＰＭで２４時間インキュベートした。ｐＨ５．８での発酵培地（ＭＭ１）をろ過滅菌し、滅菌発酵容器に移した。初期ＯＤ６００ｎｍが１．０になるまで、３５℃、１０００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、ｐＨ５．８の増殖条件で、予備培養の接種材料を用いて増殖を開始させた。およそ１０〜１２時間増殖を続け、そのあとに５ｇ／Ｌの供給材料（ミリスチン酸メチルのみ）のボーラスの添加によって、その直後に供給材料の連続フィードによって変換期を開始させた。高濃度でラウリン酸メチルが脱メチルされることによって変換プロセス中に形成されるラウリン酸の毒性のために、最初のボーラスは付与されなかった。供給材料フィード速度を、以下：ミリスチン酸メチルの場合、最初の２４時間は１．０ｇ／Ｌ−ｈ；２４時間から終結までは１．５ｇ／Ｌ−ｈ；ラウリン酸メチルの場合、最初の２４時間は０．７５ｇ／Ｌ−ｈ；２４時間から終結までは１．４ｇ／Ｌ−ｈのように変化させた。加えて、グルコースのコフィードを、全ての発酵にわたり１．２５ｇ／Ｌ−ｈの速度でフィードした。誘導時に、温度を３０℃に変化させ、６ＮのＫＯＨの添加によってｐＨを６．０に維持した。図２１に記載のデータは、ラウリン酸メチルからのドデカン二酸の生産またはミリスチン酸メチルからのテトラデカン二酸の生産およびのいずれかを示し、これから、両方の供給材料に対してｓＡＡ００３と比べて向上した株ｓＡＡ１０８２の生産性が実証された。ラウリン酸メチルを供給材料として使用した場合、ｓＡＡ１０８２は、ｓＡＡ００３と比べて約２３％の生産性の向上を実証した。供給材料としてミリスチン酸メチルを用いた場合、ｓＡＡ１０８２は、ｓＡＡ００３と比べておよそ３７％の向上を示した。
【０４４９】
実施例５０．オレイン酸からシス−９−オクタデセン二酸への変換−株ｓＡＡ１２３３、ｓＡＡ１３０６およびｓＡＡ１４８５とｓＡＡ００３との比較
発泡体の栓を有する５００ｍＬバッフル付きフラスコ中での８０ｍＬのＳＰ９２の予備培養に、株ｓＡＡ００３（ベータ酸化がブロックされた株）、株ｓＡＡ１２３３（ベータ酸化がブロックされ、ＺＷＦ１が増幅された株）、株ｓＡＡ１３０６（ベータ酸化がブロックされ、ＩＤＰ２が増幅された株）、または株ｓＡＡ１４８５（ベータ酸化がブロックされ、ＫｌＧＤＰ１が増幅された株）の凍結したグリセロールストックから１．０ｍＬを植え付け、３０℃および２５０ＲＰＭで２４時間インキュベートした。ｐＨ５．８での発酵培地（ＭＭ１）をろ過滅菌し、滅菌発酵容器に移した。初期ＯＤ６００ｎｍが１．０になるまで、３５℃、１０００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、ｐＨ５．８の増殖条件で、予備培養の接種材料を用いて増殖を開始させた。およそ１０〜１２時間増殖を続け、そのあとに５ｇ／Ｌのオレイン酸（シグマ−アルドリッチ番号Ｗ２８１５０６）のボーラスの添加によって、その直後に、変換期全体で２．０ｇ／Ｌ−ｈの速度の供給材料の連続フィードによって、変換期を開始させた。加えて、グルコースのコフィードを、全ての発酵にわたり１．２５ｇ／Ｌ−ｈの速度でフィードした。誘導時に、温度を３０℃に変化させ、６ＮのＫＯＨの添加によってｐＨを６．０に維持した。図２２に記載のデータは、３つの同一な発酵の平均であり、オレイン酸からのシス−９−オクタデセン二酸（Ｃ１８：１二酸）の生産を示す。
【０４５０】
全ての３種の増幅した遺伝子（ＺＷＦ１、ＩＤＰ２、およびＫｌＧＤＰ１）は、生化学反応中にＮＡＤＰＨを生産する酵素をコードし、そのために、これらの酵素の発現の増加は、ＮＡＤＰＨの細胞内レベルの増加を引き起こすと予想される。オメガ−ヒドロキシ脂肪酸（ＨＦＡ）は、脂肪酸供給材料から対応する二酸への不完全な酸化の結果として生産されることが観察されている。この不完全な酸化の理由の一つは、シトクロムＰ４５０によるＨＦＡの過酸化反応に必要なＮＡＤＰＨレベルの低減である可能性がある。したがって、ＮＡＤＰＨの細胞内プールの増加が、発酵ブロス中のＨＦＡレベルの減少を引き起こすと予想される。図２３に、ｓＡＡ００３株、ｓＡＡ１２３３株、ｓＡＡ１３０６株およびｓＡＡ１４８５株によってオレイン酸のオメガ酸化中に生産されたＨＦＡの濃度を示す。結果（３種の発酵の平均）から、全ての３種の試験株（ｓＡＡ１２３３、ｓＡＡ１３０６およびｓＡＡ１４８５）は、ベースの株であるｓＡＡ００３より低いレベルのＨＦＡを生産したことが実証される。商業的な二酸発酵プロセスにおけるＨＦＡ生産は、より低いモル収量を引き起こし、さらに二酸精製中に除去しなければならないために、望ましくない。これらの結果から、ＺＷＦ１、ＩＤＰ２またはＫｌＧＤＰ１のいずれかの増幅は、ＨＦＡをより低いレベルにした二酸発酵の向上をもたらすと予想されることが示される。
【０４５１】
実施例５１．のデカン酸メチルからセバシン酸への変換−株ｓＡＡ１０８２とｓＡＡ００３との比較
カンジダ株によってセバシン酸を生産するためのデカン酸のオメガ酸化は、この起こり得る供給材料（ｒｅｆ）の高度な毒性のために実現できない可能性がある。代替法は、毒性が極めて低いデカン酸メチルの使用である。カンジダは、オメガ酸化プロセス中に脂肪酸エステルを脱メチル化するエステラーゼを生産し、デカン酸メチルを非毒性の二酸であるセバシン酸に変換させるため、脂肪酸のメチルエステルは、ベータ酸化がブロックされたカンジダの株によって対応する二酸に変換できる。残念なことに、オメガ酸化プロセスに関与する酵素を誘導する前に、発酵ブロス中の過量のデカン酸メチルが含まれることは、デカン酸メチルの十分な脱メチルを引き起こし、毒性レベルのデカン酸が生じ、結果として急速な細胞死と発酵の失敗に至る。標準的な発酵手法は、誘導物質として供給材料（デカン酸メチル）を利用すると予想される。しかしながら、デカン酸として同じ炭素鎖長を有するデカンなどの非毒性の誘導物質を用いて誘導を行う代替法が予想されるが、これは、セバシン酸への生物変換反応中にデカン酸を生産しない。一連の４つの発酵を行い、誘導物質としてデカンとデカン酸メチルとの比較、加えてベータ酸化がブロックされたベースの株であるｓＡＡ００３と、ＣＰＲＢおよびＣＹＰ５２Ａ１９遺伝子を増幅させた株ｓＡＡ１０８２との比較を行った。前の実施例において、ｓＡＡ１０８２は、ラウリン酸メチルおよびミリスチン酸メチルの両方を用いた場合、ｓＡＡ００３と比べて生産性の増加を実証した。
【０４５２】
発泡体の栓を有する５００ｍＬバッフル付きフラスコ中での８０ｍＬのＳＰ９２の予備培養に、株ｓＡＡ００３（ベータ酸化がブロックされた株）または株ｓＡＡ１０８２（ベータ酸化がブロックされ、ＣＰＲＢおよびＣＹＰ５２Ａ１９が増幅された株）の凍結したグリセロールストックから１．０ｍＬを植え付け、３０℃および２５０ＲＰＭで２４時間インキュベートした。ｐＨ５．８での発酵培地（ＭＭ１）をろ過滅菌し、滅菌発酵容器に移した。初期ＯＤ６００ｎｍが１．０になるまで、３５℃、１０００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、ｐＨ５．８の増殖条件で、予備培養の接種材料を用いて増殖を開始させた。およそ１０〜１２時間増殖を続け、そのあとに１）６時間にわたる１０ｇ／Ｌのデカン（シグマ−アルドリッチ番号４５７１１６）のボーラス添加、その後、０．２５ｇ／Ｌ−ｈのデカン酸メチル（ＴＣＩアメリカ（TCI America）番号Ｄ００２３）の連続フィードの開始か、または２）デカンの添加なしのいずれかによって変換期を誘導した。０．２５ｇ／Ｌ−ｈでのデカン酸メチルの連続フィードを開始させることにより、誘導を行った。デカンの揮発性のために、誘導物質としてデカンを用いた６時間の誘導期中に、通気速度を０．３ｖｖｍに下げた。加えて、グルコースのコフィードを、全ての発酵にわたり１．２５ｇ／Ｌ−ｈの速度でフィードした。誘導時に、温度を３０℃に変化させ、６ＮのＫＯＨの添加によってｐＨを６．０に維持した。図２４のデータは、デカン二酸（セバシン酸）の生産を示し、２種の異なる誘導条件下での２種の株の生産性を比較する。デカン酸メチルのみで誘導した場合、発酵経過中ずっと株ｓＡＡ００３またはｓＡＡ１０８２のどちらも有意な量のセバシン酸を生産しなかった。しかしながら、デカン酸メチルの低速のフィードを開始する前にデカンで誘導した場合、両方の株はセバシン酸を生産した。しかしながら株ｓＡＡ１０８２は、８４時間の発酵時間で株ｓＡＡ００３よりも４倍より高い力価のセバシン酸を産出したことから、ｓＡＡ１０８２は、供給材料としてデカン酸メチル、加えてラウリン酸メチルおよびミリスチン酸メチルでの二酸生産のための優れた株であることが示される。デカンで誘導された株ｓＡＡ１０８２を用いた場合に生産性がより優れている理由の１つは、異なる発酵条件下で生産されたデカン酸の量を示す図２５で例示される。検出可能な量の毒性副産物であるデカン酸を生産しない唯一の発酵は、デカンで誘導された株ｓＡＡ１０８２での発酵であった。他の３つの発酵は、１〜４ｇ／Ｌのデカン酸を生産した。生存可能な細胞の数のデータから、デカン酸の毒性が実証される。生存可能な細胞の数が発酵中ずっと高いままであった唯一の発酵は、デカンで誘導された株ｓＡＡ１０８２での発酵であった。他の３つの発酵は、培養液体培地１ｍＬあたり生存可能な細胞１０３〜１０５個を失った。デカンで誘導されたｓＡＡ１０８２での発酵を除いては、この生物学的に活性な細胞の有意な低減は、全ての発酵においてデカン酸メチルおよびデキストロース両方の大きい蓄積をもたらす。この発酵は、デカン酸メチルまたはデキストロースのどちらもほとんど蓄積を示さなかった。これらのデータは、０．２５ｇ／Ｌ−ｈより速いデカン酸メチルフィ���ド速度の使用が可能になるかもしれないということを示す。これらの結果は、正しい誘導条件下で、生産が向上した株を用いることにより、毒性脂肪酸のメチルエステルから有意な量のセバシン酸を生産することが可能であることを実証する。
【０４５３】
他の非毒性の誘導物質、例えばＣ６より長い鎖長を有するアルカン、Ｃ１２より長い鎖長を有する脂肪酸、Ｃ１２より長い様々な脂肪酸のエステル、様々な鎖長の脂肪酸を含有するトリグリセリド、またはＣ６より長い脂肪鎖を含有する他の非毒性化学物質などが、非毒性の誘導物質として使用できる。しかしながら、この実施例の場合のように、オメガ酸化プロセス中にセバシン酸を生産しないと予想される誘導物質を使用して、望ましい生成物であるセバシン酸から精製する必要があると予想される酸化生成物が生じる可能性がある。
【０４５４】
この実施例で説明した、毒性脂肪酸のメチルエステルからの二酸生産を誘導するために非毒性の供給材料を採用するための方法は、供給材料としてラウリン酸メチルを利用した発酵により使用が可能である。カンジダにとって、ラウリン酸はデカン酸ほど毒性ではないが、誘導プロセスにおいて、過剰にフィードすることなく優れた誘導をもたらすのに十分な速度でラウリン酸メチルをフィードすることに注意を払わなければならなず、過剰なフィードはエステラーゼでの脱メチルに起因する毒性レベルのラウリン酸の生産および蓄積を起こす可能性がある。
【０４５５】
実施例５２．ラウリン酸メチルからＤＤＤＡへの変換−株ｓＡＡ１５６９とｓＡＡ００３との比較
発泡体の栓を有する５００ｍＬバッフル付きフラスコ中での８０ｍＬのＳＰ９２の予備培養に、株ｓＡＡ００３（ベータ酸化がブロックされた株）、または株ｓＡＡ１５６９（ベータ酸化がブロックされ、ＣＰＲＢおよびＣＹＰ５２Ａ１４が増幅された株）の凍結したグリセロールストックから１．０ｍＬを植え付け、３０℃および２５０ＲＰＭで２４時間インキュベートした。ｐＨ５．８での発酵培地（ＭＭ１）をろ過滅菌し、滅菌発酵容器に移した。初期ＯＤ６００ｎｍが１．０になるまで、３５℃、１０００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、ｐＨ５．８の増殖条件で、予備培養の接種材料を用いて増殖を開始させた。およそ１０〜１２時間増殖を続け、そのあとに最初の２４時間は０．７５ｇ／Ｌ−ｈ；２４時間から終結までは１．５ｇ／Ｌ−ｈの速度のラウリン酸メチルの連続フィードによって、変換期を開始させた。加えて、グルコースのコフィードを、全ての発酵にわたり１．２５ｇ／Ｌ−ｈの速度でフィードした。誘導のとき、温度を３０℃に変化させ、６ＮのＫＯＨの添加によってｐＨを６．０に維持した。図２６に記載のデータは、２種の同一な発酵の平均であり、ラウリン酸メチルからのＤＤＤＡおよび１２−ヒドロキシ−ドデカン酸（ＨＦＡ）の生産を示す。株ｓＡＡ１５６９は、ｓＡＡ００３と比べて生産性の増加を示さなかったが、生産されたＨＦＡの量は、ｓＡＡ００３と比べて半分未満であった。この結果は、ＣＹＰ５２Ａ１４が天然のＰ４５０よりも速い速度のオメガ−ヒドロキシドデカン酸の過酸化を示すことによる可能性がある。
【０４５６】
実施例５３．ラウリン酸メチルからＤＤＤＡへの変換−株ｓＡＡ１０８２およびｓＡＡ１６３３とｓＡＡ００３との比較
発泡体の栓を有する５００ｍＬバッフル付きフラスコ中での８０ｍＬのＳＰ９２の予備培養に、株ｓＡＡ００３（ベータ酸化がブロックされた株）、株ｓＡＡ１０８２（ベータ酸化がブロックされ、ＣＰＲＢおよびＣＹＰ５２Ａ１９が増幅された株）またはｓＡＡ１６３３（ベータ酸化がブロックされ、ＣＰＲＢ、ＣＹＰ５２Ａ１９およびＺＷＦ１が増幅された株）の凍結したグリセロールストックから１．０ｍＬを植え付け、３０℃および２５０ＲＰＭで２４時間インキュベートした。ｐＨ５．８での発酵培地（ＭＭ１）をろ過滅菌し、滅菌発酵容器に移した。初期ＯＤ６００ｎｍが１．０になるまで、３５℃、１０００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、ｐＨ５．８の増殖条件で、予備培養の接種材料を用いて増殖を開始させた。およそ１０〜１２時間増殖を続け、そのあとに最初の２４時間は０．７５ｇ／Ｌ−ｈ；２４時間から終結までは１．５ｇ／Ｌ−ｈの速度でのラウリン酸メチルの連続フィードによって変換期を開始させた。加えて、グルコースのコフィードを、全ての発酵にわたり１．２５ｇ／Ｌ−ｈの速度でフィードした。誘導のとき、温度を３０℃に変化させ、６ＮのＫＯＨの添加によってｐＨを６．０に維持した。図２７に記載のデータは、２種の同一な発酵の平均であり、ラウリン酸メチルからのＤＤＤＡの生産を示す。ここでも株ｓＡＡ１０８２は、ｓＡＡ００３と比べて約２３％の生産性の増加を実証した。株ｓＡＡ１６３３は、ｓＡＡ００３と比べて約３０％よりさらに大きい生産性の増加を示した。この追加の生産性の増加は、オメガ酸化経路に電子を提供するＮＡＤＰＨ生産の増加をもたらすＺＷＦ１の増幅に起因するものと予想される。
【０４５７】
実施例５４．ラウリン酸メチルからＤＤＤＡへの変換−株ｓＡＡ１９０１、ｓＡＡ１９０４、ｓＡＡ１８０３およびｓＡＡ１８０５とｓＡＡ００３との比較
発泡体の栓を有する５００ｍＬバッフル付きフラスコ中での８０ｍＬのＳＰ９２の予備培養に、株ｓＡＡ００３（ベータ酸化がブロックされた株）、ｓＡＡ１９０１（ベータ酸化がブロックされ、加えてＡＤＨ３が増幅された株）、ｓＡＡ１９０４（ベータ酸化がブロックされ、ＡＤＨ８が増幅された株）、株ｓＡＡ１８０３（ベータ酸化がブロックされ、ＡＤＨ２ａが増幅された株）またはｓＡＡ１８０５（ベータ酸化がブロックされ、ＡＤＨ２ｂが増幅された株）の凍結したグリセロールストックから１．０ｍＬを植え付け、３０℃および２５０ＲＰＭで２４時間インキュベートした。ｐＨ５．８での発酵培地（ＭＭ１）をろ過滅菌し、移した。
【０４５８】
【表２５】
2016501040.tif 000027
【０４５９】
【表２６】
2016501040.tif 000028
【０４６０】
【表２７】
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【０４６１】
【表２８】
2016501040.tif 000030
【０４６２】
実施例５５．より強いまたは構成的プロモーターでのＦＡＯ１プロモーターの置き換え
以下のプロモーター置き換えＤＮＡ  Ｉ分子を、図３０で例示されるように、５種の異なるＤＮＡフラグメント（断片Ａ〜Ｅ）から、オーバーラップＰＣＲ、ＤＮＡ合成または両方の組み合わせのいずれかによって構築した。
【０４６３】
断片Ａ（例えば、配列番号１６２）→カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６のＦＡＯ１遺伝子の５’非翻訳領域の約２５０ｂｐの断片（約−５００位から約−２５０）。
【０４６４】
断片Ｂ（例えば、配列番号１６３）→ＵＲＡ３マーカー。
【０４６５】
断片Ｃ（例えば、配列番号１６４）→カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６のＦＡＯ１の約５０ｂｐの非翻訳領域（−３００位から−２５０）。
【０４６６】
断片Ｄ（例えば、配列番号１６５、１６６、１６７）→それぞれカンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６から得られたＰＯＸ４のプロモーター、ＰＥＸ１１またはＴＥＦ１遺伝子の５００ｂｐ〜１ｋｂの断片。
【０４６７】
断片Ｅ（配列番号１６８）→カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６からのＦＡＯ１のコード配列の第一の２５０ｂｐ。
【０４６８】
このプロモーター置き換えＤＮＡ  Ｉは、少なくとも１つの染色体に統合されるが、２つの染色体間におけるヌクレオチド配列の相違に応じて両方の染色体に統合される場合もある。ＦＡＯ１遺伝子の−１５００〜＋５００の領域を、両方の染色体で配列決定した。−１５００〜＋５００の領域を、プライマーｏＢＳ１およびｏＢＳ２を使用して、ＡＴＣＣ２０３３６からのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲフラグメントをｐＣＲ−ブラントＩＩ  Ｔｏｐｏにクローニングした。複数のクローンを配列決定し、第二の対立遺伝子の配列を決定した。断片Ａ、ＣおよびＥを、第二の対立遺伝子の配列に適合するように変化させた。第二のプロモーター置き換えカセットを構築し、配列を検証し、プロモーター置き換えＤＮＡ  ＩＩと名付けた。
【０４６９】
ｓＡＡ１０３などのカンジダ株を、プロモーター置き換えＤＮＡカセットＩで形質転換した。ＳｃＤ−ｕｒａプレートでの増殖によって形質転換株を選択した。単一の分離株ごとにコロニーを画線した。統合された断片の正しい挿入をＰＣＲによって検証した。ＹＰＤ中で正しい株を一晩増殖させ、５−ＦＯＡ含有プレート中で平板培養し、ＵＲＡ３マーカーのループアウトを選択した。単一の分離株ごとにＵｒａ−株を画線し、ＵＲＡ３のループアウトをＰＣＲによって検証した。この時点でこの株は、ＰＯＸ４の制御下の１つのＦＡＯ１対立遺伝子、ＰＥＸ１１またはＴＥＦ１プロモーターを有していた。
【０４７０】
次いでｕｒａ−株をプロモーター置き換えＤＮＡ  ＩＩ分子で形質転換した。ＳｃＤ−ｕｒａプレートでの増殖によって形質転換株を選択した。単一の分離株ごとにコロニーを画線した。第二の姉妹染色体に統合された断片の正しい挿入をＰＣＲによって検証した。正しい株をＹＰＤ中で一晩増殖させ、５−ＦＯＡ含有プレートで平板培養し、ＵＲＡ３マーカーのループアウトに関して選択した。単一の分離株ごとにＵｒａ−株を画線し、ＵＲＡ３のループアウトをＰＣＲによって検証した。この時点でこの株は、ＰＯＸ４の制御下の両方の対立遺伝子、ＰＥＸ１１またはＴＥＦ１プロモーターを有していた。
【０４７１】
次いでこの株を、発酵中に、この遺伝学的改変を含有しない株と比較した性能向上に関して試験した。コンストラクトで使用された各フラグメントのＤＮＡ配列を以下に記載する：
配列番号１６２−断片Ａ（ＦＡＯ１の５’非翻訳領域（−５００位から−２５０）。
配列番号１６３−断片Ｂ−ＵＲＡ３マーカー。
配列番号１６４−断片Ｃ。
配列番号１６５−断片Ｄ−プロモーターＰＯＸ４。
配列番号１６６−断片Ｄ−プロモーターＰＥＸ１１。
配列番号１６７−断片Ｄ−プロモーターＴＥＦ１。
配列番号１６８−断片Ｅ−ＦＡＯ１のコード配列の第一の２５０ｂｐ。
【０４７２】
実施例５６．サイトゾルのＭＡＥ１およびＰＹＣ２の過剰発現によるＮＡＤＰＨ生産の増加
ＳｃＭＡＥ１（非ミトコンドリア由来）およびＳｃＰＹＣ２のオープンリーディングフレームを変異誘発させて、全てのＣＴＧコドンを他のロイシンをコードするコドンで置き換えた。ｐＡＡ７１２オープンリーディングフレームのカンジダＨＦＤ２を、ＳｃＭＡＥ１またはＳｃＰＹＣ２オープンリーディングフレームのいずれかで置き換えた２つのプラスミドを構築した。３’ＵＲＡ３−ＰＰＯＸ４−ＳｃＭＡＥ１＊−ＴＰＯＸ４−５’ＵＲＡ３または３’ＵＲＡ３−ＰＰＯＸ４−ＳｃＰＹＣ２−ＴＰＯＸ４−５’ＵＲＡ３フラグメントを、プライマーｏＡＡ２２０６およびｏＡＡ２２０９ならびにテンプレートとして対応するプラスミドを使用してＰＣＲで増幅した。２つのＰＣＲフラグメントをゲルで精製し、組み合わせて、ｓＡＡ１０３に形質転換した。ＳｃＤ−ｕｒａプレートでの増殖によって形質転換株を選択した。シングルコロニーごとにコロニーを画線し、形質転換株をＰＣＲによって検証し、コピー数をｑＰＣＲによって決定した。ＰＰＯＸ４−ＳｃＭＡＥ１＊−ＴＰＯＸ４のおよそ５〜１０のコピーと、ＰＰＯＸ４−ＳｃＰＹＣ２−ＴＰＯＸ４株の５〜１０のコピーとを有する株を同定した。
【０４７３】
ＳｃＭＡＥ１（非ミトコンドリア由来）をカンジダＭＡＥ１（非ミトコンドリア由来）で置き換えることによって、同時のアプローチを行った。ＰＰＯＸ４−ＭＡＥ１＊−ＴＰＯＸ４のおよそ５〜１０のコピーと、ＰＰＯＸ４−ＳｃＰＹＣ２−ＴＰＯＸ４の５〜１０のコピーとを有する株を同定した。
【０４７４】
以下の実施例のうちいくつかにおいて、以下の表２９に列挙したオリゴヌクレオチドを選択的に使用した。
【０４７５】
【表２９−１】
2016501040.tif 000031
【０４７６】
【表２９−２】
2016501040.tif 000032
【０４７７】
【表２９−３】
2016501040.tif 000033
【０４７８】
【表２９−４】
2016501040.tif 000034
【０４７９】
【表２９−５】
2016501040.tif 000035
【０４８０】
表３０に、以下の実施例で説明した選択されたカンジダ属の酵母株の遺伝学的改変を記載する。記号「Δ」は、その記号の前に記載された遺伝子の欠失を指し；「Ｐ４５０Ａ」は、ＣＹＰ４５０Ａを指し；「ｍｉｇ１Δ／ＭＩＧ１」は、ＭＩＧ１遺伝子の１つの対立遺伝子の欠失を指す。
【０４８１】
【表３０】
2016501040.tif 000036
【０４８２】
実施例５７．ＭＩＧ１対立遺伝子が破壊された株ｓＡＡ２０４７の構築
ＭＩＧ１発現が減少したカンジダ株を作製するために、各ＭＩＧ１対立遺伝子のためのノックアウトカセットを生成した。第一の対立遺伝子の場合、ＭＩＧ１の５’−相同性領域を、プライマーｏＡＡ３３２９およびｏＡＡ３３３０ならびにテンプレートとしてＡＴＣＣ２０９６２のゲノムＤＮＡを使用して増幅した。３’相同性領域を、同じゲノムＤＮＡおよびプライマーｏＡＡ３３３１およびｏＡＡ３３３２を使用して増幅した。５’末端で反復されたターミネーターを有するＵＲＡ３マーカーを含有するカセットを、オリゴｏＡＡ３３３３およびｏＡＡ３３３４を使用して、プラスミドｐＡＡ２４４（実施例５８で説明した）から増幅した。このプラスミドは、両方のＭＩＧ１相同性領域とのオーバーラップを含有する。ＰＣＲ増幅後、各ＰＣＲ反応からのＤＮＡフラグメントをゲルで精製した。次いで全ての結果得られたＤＮＡフラグメントを、それに続くオリゴｏＡＡ３３２９およびｏＡＡ３３３２を使用したＰＣＲ反応に使用した。次いでＰＣＲで精製されたカセットを、株ｓＡＡ１０３（上記で説明した）に形質転換し、形質転換株をＰＣＲによって検証した。１つの正確に形質転換した株を、ｓＡＡ１９７９と名付けた。この株を５ＦＯＡ上で平板培養し（上記で説明した手法）、ＵＲＡ３マーカーを除去し、ＰＣＲによって検証した。ＵＲＡ３を含まない株を、ｓＡＡ２０１４と名付けた。
【０４８３】
第二のＭＩＧ１対立遺伝子破壊カセットを以下のようにして生成した。５’相同性領域を、プライマーｏＡＡ３３３５およびｏＡＡ３３３６を使用して増幅した。３’相同性領域を、プライマーｏＡＡ３３３７およびｏＡＡ３３３８ならびにテンプレートとしてカンジダＡＴＣＣ２０９６２のゲノムＤＮＡを使用して増幅した。反復されたターミネーターを有するＵＲＡ３マーカーを含有するカセットを、プライマーｏＡＡ３３３９およびｏＡＡ３３４０を使用して増幅した。次いで３つのフラグメントを、それに続くオリゴｏＡＡ３３３５およびｏＡＡ３３３８を使用して欠失カセットを生成するためのＰＣＲ反応に使用した。次いで精製されたカセット生成物を株ｓＡＡ２０１４に形質転換し、第二の対立遺伝子が破壊された形質転換株をＰＣＲによって検証した。正しい遺伝子型を有する株を、ｓＡＡ２０４７と名付けた。ＭＩＧ１のＯＲＦおよびフランキング領域は、配列番号１９８で提示される。
【０４８４】
実施例５８．株ｓＡＡ２１７４およびｓＡＡ２１７８の構築
５’ＰＯＸ４−ＣＰＲＢ−ＴＵＲＡ３−ＵＲＡ３−３’ＰＯＸ４（「ＴＵＲＡ３」は、ＵＲＡ３遺伝子のターミネーター領域を意味する）カセットを以下のようにして構築した。ＰＯＸ４の５’フランキング領域を、テンプレートとしてＡＴＣＣ株２０３３６から得られたゲノムＤＮＡと共にプライマーｏＡＡ２３８８およびｏＡＡ２３８９を使用して増幅した。結果得られたフラグメントをゲルで精製し、ｐＣＲ  ＴＯＰＯブラントＩＩにクローニングし、配列を検証し、結果得られたプラスミドを、ｐＡＡ３９５と名付けた。別々に、ＰＯＸ４の３’フランキング領域を、プライマーｏＡＡ２３９０およびｏＡＡ２３９１を使用して、ＡＴＣＣ株２０３３６のゲノムＤＮＡから増幅した。この増幅したＤＮＡフラグメントを、ｐＣＲ  ＴｏｐｏブラントＩＩにクローニングし、配列を検証し、プラスミドを、ｐＡＡ３９６と名付けた。別々に、ｐＡＡ３９５からのＰＯＸ４のコード領域をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨ１で切断し、ＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ１でｐＡＡ３９６のＰＯＸ４のコード配列にライゲートした。ライゲーション産物を、ｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。結果得られたプラスミドを、ｐＡＡ４０６と名付けた。
【０４８５】
ＣＰＲＢ遺伝子を、プライマーｏＡＡ２３９８およびｏＡＡ２３９９またはｏＡＡ２３９８およびｏＡＡ２４００を使用して、ＡＴＣＣ２０３３６のゲノムＤＮＡから増幅した。２つの結果得られたＰＣＲフラグメントを別々に、ｐＣＲ  ＴｏｐｏブラントＩＩにクローニングし、結果得られたそれぞれのＣＰＲＢインサートの配列を検証し、それぞれプラスミドｐＡＡ３９８およびｐＡＡ３９９を作製した。ｐＡＡ３９８からのＣＰＲＢのコード領域を、ＢａｍＨ１およびＮｏｔ１で切断し、ｐＡＡ４０６のＢａｍＨ１およびＮｏｔ１部位にライゲートして、プラスミドｐＡＡ４１８を形成した。ｐＡＡ３９９中でのＣＰＲＢの方向のために、プラスミドをＢａｍＨ１で切断することによって、ＣＰＲＢフラグメントを放出させた。このＢａｍＨ１断片をｐＡＡ４１８のＢａｍＨ１部位にライゲートして、プラスミドｐＡＡ４１５を形成した。
【０４８６】
プラスミドｐＡＡ２４４を以下のようにして調製した：ＵＲＡ３ターミネーターを、テンプレートとしてｐＡＡ０６１を使用して、プライマーｏＡＡ０７２２およびｏＡＡ０７２３により増幅した。ＵＲＡ３遺伝子カセット（プロモーター、オープンリーディングフレームおよびターミネーター）も、プライマーｏＡＡ０７２４およびｏＡＡ０７２７を使用してｐＡＡ０６１から増幅した。両方のＰＣＲ産物を組み合わせて、プライマーｏＡＡ０７３０およびｏＡＡ０７３１を使用したＰＣＲによって融合させた。次いでＴＵＲＡ３−ＵＲＡ３のＰＣＲフラグメントを、ｐＣＲ  ＴｏｐｏブラントＩＩにクローニングし、正しい配列を有するプラスミドを、ｐＡＡ２４４と名付けた。
【０４８７】
オリゴｏＡＡ２３９４およびｏＡＡ２３９５を使用してＴＵＲＡ３−ＵＲＡ３カセットをＰＣＲで増幅するためのテンプレートとして、プラスミドｐＡＡ２４４を使用した。増幅したフラグメントを、ｐＣＲ  ＴｏｐｏブラントＩＩにクローニングし、配列を検証し、次いでプラスミドｐＡＡ４０２と名付けた。内部ＳｐｅＩ部位を除去するためのプライマーｐＡＡ２３９６およびｐＡＡ２３９７を用いた部位特異的変異誘発用のテンプレートとして、プラスミドｐＡＡ４０２を提供した。結果得られたプラスミドを、ｐＡＡ４０８と名付けた。このＵＲＡ３カセットを、Ｎｏｔ１で切断し、ｐＡＡ４１５のＮｏｔＩ部位にライゲートして、プラスミドｐＡＡ４５０を作製した。
【０４８８】
株ｓＡＡ１０３を、ゲルで精製されたｐＡＡ４５０のＰａｃＩフラグメントで形質転換し、形質転換株を、ＳｃＤ−ｕｒａプレート上での増殖によって選択した。５’ＰＯＸ４−ＣＰＲＢ−ＣＰＲＢ−ＴＵＲＡ３−ＵＲＡ３−３’ＰＯＸ４の正しい統合をＰＣＲによって検証した。正しい遺伝子型を有する株を、ｓＡＡ１３９６と名付けた。この株を５ＦＯＡ上で平板培養し、ＵＲＡ３マーカーを除去し、ＰＣＲによって検証した。ＵＲＡ３を含まない株を、ｓＡＡ１４００と名付けた。
【０４８９】
株ｓＡＡ１４００を、ＰＯＸ４フランキング領域を両端に有するＵＲＡ３を含有するＰＣＲフラグメントで形質転換した。ＵＲＡ３カセットを、ＡＴＣＣ２０３３６のゲノムＤＮＡからのＰＯＸ４の５’または３’フランキング領域を、プライマーｏＡＡ２９０２およびｏＡＡ２９０３ならびにｏＡＡ２９０６およびｏＡＡ２９０７を用いて増幅することによって作製した。ｐＡＡ４５０のＵＲＡ３を、プライマーｏＡＡ２９０４およびｏＡＡ２９０５を使用して増幅した。最終的なカセットフラグメントを、プライマーｏＡＡ２９０２およびｏＡＡ２９０７を使用したＰＣＲによって組み立てた。ＵＲＡ３遺伝子の正しい統合をＰＣＲによって検証した。正しい遺伝子型を有する株を、ｓＡＡ１４８６と名付けた。この株を５ＦＯＡ上で平板培養し、ＵＲＡ３遺伝子を除去した。これにより、ＣＰＲＢ遺伝子の挿入が起こった。正しい株を、ｓＡＡ１５４４と名付けた。
【０４９０】
別々に、５’ＰＯＸ５−２ｘＰ４５０Ａ１９−ＴＵＲＡ３−ＵＲＡ３−３’ＰＯＸ５カセットを以下のようにして構築した。ＰＯＸ５の５’フランキング領域を、プライマーｏＡＡ２６５６およびｏＡＡ２６５７を使用して増幅した。ＰＯＸ５の３’フランキング領域を、ＡＴＣＣ２０３３６のゲノムＤＮＡから、プライマーｏＡＡ２６５８およびｏＡＡ２６５９を使用して増幅した。各ＰＣＲフラグメントを別々に、ｐＣＲ  ＴｏｐｏブラントＩＩにクローニングし、結果得られたプラスミドのＰＯＸ５インサートの配列を検証した。プラスミドを、それぞれｐＡＡ４９４およびｐＡＡ４９５と名付けた。ｐＡＡ４９５からのＰＯＸ５断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨ１で切断し、ＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ１でｐＡＡ４９４のＰＯＸ５断片にライゲートし、ｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。結果得られたプラスミドを、ｐＡＡ６２０と名付けた。
【０４９１】
カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６からのＣＹＰ４５０Ａ１９をコードする遺伝子を、プラスミドｐＡＡ１５６から、プライマーｏＡＡ２８８８およびｏＡＡ２８８９またはｏＡＡ２８９０およびｏＡＡ２８９１を使用して増幅した。ＰＣＲフラグメントを別々に、ｐＣＲ  ＴｏｐｏブラントＩＩにクローニングし、配列を検証した。Ｐ４５０Ａ１９断片を、それぞれＳｐｈ１およびＸｍａ１、またはＸｍａＩおよびＮｏｔ１のいずれかで消化し、ｐＡＡ６２０のＳｐｈ１およびＮｏｔ１制限部位にライゲートして、ｐＡＡ６２５を形成した。ｐＡＡ４４８のＮｏｔ１  ＵＲＡ３断片を、ｐＡＡ６２５のＮｏｔ１制限部位にライゲートして、ｐＡＡ５０５を形成した。
【０４９２】
株ｓＡＡ１５４４を、ｐＡＡ５０５のゲルで精製されたＰＡＣ１フラグメントで形質転換し、形質転換株を、ＳｃＤ−ｕｒａプレート上での増殖によって選択した。５’ＰＯＸ５−２ｘＰ４５０Ａ１９−−ＴＵＲＡ３−ＵＲＡ３−３’ＰＯＸ４の正しい統合を確認した。正しい遺伝子型を有する株を、ｓＡＡ１８１６と名付けた。この株を５ＦＯＡ上で平板培養し、ＵＲＡ３マーカーを除去し、ＰＣＲによって検証した。ＵＲＡ３を含まない株を、ｓＡＡ１９５７と名付けた。
【０４９３】
株ｓＡＡ１９５７を、ＰＯＸ５フランキング領域を両端に有するＵＲＡ３遺伝子を含有するＰＣＲフラグメントで形質転換した。このＵＲＡ３カセットを、プライマーｏＡＡ３３７８およびｏＡＡ３３７９およびｏＡＡ３３８１およびｏＡＡ３３８２を用いて、ＡＴＣＣ２０３３６のゲノムＤＮＡからのＰＯＸ５の５’または３’フランキング領域を増幅することによって作製した。ｐＡＡ４５０からのＵＲＡ３遺伝子を、プライマーｏＡ３３８０およびｏＡＡ２９０５を使用して増幅した。完全なフラグメントを、プライマーｏＡＡ３３７８およびｏＡＡ３３８２を使用したＰＣＲによって組み立てた。正しい統合を検証した。正しい遺伝子型を有する株を、ｓＡＡ２０４２と名付けた。この株を５ＦＯＡ上で平板培養し、ＵＲＡ３マーカーを除去した。正しい株を、ｓＡＡ２１１５と名付けた（表３０）。
【０４９４】
株ｓＡＡ２１７８およびｓＡＡ２１７４を作製するために、以下のＡＴＣＣ２０９６２遺伝子：ＡＤＨ２ａ、ＡＤＨ８、ＨＦＤ２およびＣＹＰ４５０Ａ１９（表３１）のそれぞれのゲルで精製されたＰＣＲ増幅産物で、株ｓＡＡ２１１５を形質転換した。表４０に各遺伝子の配列を記載した。これらの遺伝子全てを含有する２種の株を選択し、ｓＡＡ２１７８およびｓＡＡ２１７４と名付けた（表３１を参照）。
【０４９５】
【表３１】
2016501040.tif 000037
【０４９６】
実施例５９：株ｓＡＡ２４３３の構築
５’ＰＯＸ４−ＣＰＲＡ−ＣＰＲＢ−ＴＵＲＡ３−ＵＲＡ３−３’ＰＯＸ４カセットを以下のようにして構築した：
ＣＰＲＡ遺伝子を、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６のゲノムＤＮＡから、プライマーｏＡＡ２４０１およびｏＡＡ２４０３を使用して増幅した。結果得られたＰＣＲフラグメントを、ｐＣＲ  ＴＯＰＯブラントＩＩにクローニングし、配列を検証し、結果得られたプラスミドを、ｐＡＡ４０１と名付けた。ＣＰＲＢ遺伝子フラグメントを、ＢａｍＨ１およびＮｏｔ１でプラスミドｐＡＡ３９８を切断することによって得て、このフラグメントをｐＡＡ４０１から増幅されたＣＰＲＡフラグメントにライゲートし、ライゲーション産物を、ｐＡＡ４０６のＦｓｅＩおよびＮｏｔＩ断片にクローニングし、プラスミドｐＡＡ４１７を作製した。ｐＡＡ４０８からのＮｏｔ１  ＵＲＡ３カセットを、ｐａＡ４１７のＮｏｔＩ部位にライゲートして、プラスミドｐＡＡ４５２を作製した。
【０４９７】
株ｓＡＡ１０３を、ゲルで精製されたｐＡＡ４５２のＰａｃＩフラグメントで形質転換し、形質転換株を、ＳｃＤ−ｕｒａプレート上での増殖によって選択した。ＰＯＸ４の第一の対立遺伝子への５’ＰＯＸ４−ＣＰＲＡ−ＣＰＲＢ−ＴＵＲＡ３−ＵＲＡ３−３’ＰＯＸ４カセットの正しい統合を検証した。正しい遺伝子型を有する株を、ｓＡＡ１５９６と名付けた。この株を５ＦＯＡ上で平板培養し、ＵＲＡ３遺伝子を除去した。ＵＲＡ３を含まない株を、ｓＡＡ１５９８と名付けた。
【０４９８】
株ｓＡＡ１５９８を、標準的な形質転換手法を使用して以下のように調製されたＰＣＲフラグメントで形質転換した：ＡＴＣＣ２０３３６のゲノムＤＮＡからＰＯＸ４の５’または３’フランキング領域をプライマーｏＡＡ２９０４およびｏＡＡ２９０５（５’）またはプライマーｏＡＡ２９０６およびｏＡＡ２９０７（３’）を用いて増幅することによって、ＵＲＡ３カセットを作製した。別々に、プラスミドｐＡＡ４５０からのＵＲＡ３遺伝子を、プライマーｏＡＡ２９０４およびｏＡＡ２９０５を使用して増幅した。直前に説明した全ての３つのフラグメントを含有するカセットフラグメントを、プライマーｏＡＡ２９０２およびｏＡＡ２９０７を使用したＰＣＲによって組み立てた。形質転換後、ＵＲＡ３カセットの正しい統合をＰＣＲによって検証した。正しい遺伝子型を有する株を、ｓＡＡ１６５３と名付けた。この株を５ＦＯＡ上で平板培養し、ＵＲＡ３遺伝子を除去し、最終的な株（ＵＲＡ３なし）を、ｓＡＡ１６５６と名付けた。
【０４９９】
次に、両方のＰＯＸ５遺伝子座においてＰＯＸ４またはＰＥＸ１１プロモーターのいずれかの制御下に遺伝子ＣＹＰ４５０Ａ１９を入れたカセットを生成した。これを達成するために、５’−ＰＯＸ５−２ｘＰ４５０Ａ１９−ＴＵＲＡ３−ＵＲＡ３−３’−ＰＯＸ５カセットを以下のようにして構築した。ＰＯＸ４プロモーター（「ＰＰＯＸ４」）およびＣＹＰ４５０Ａ１４遺伝子を含有するフラグメントを、プライマーｏＡＡ２８８８およびｏＡＡ２８８９またはｏＡＡ２８９０およびｏＡＡ２８９１を使用してｐＡＡ１５３の２つの領域を増幅することによって作製した。２つの結果得られたＰＣＲフラグメントを、別個のｐＣＲ  ＴｏｐｏブラントＩＩプラスミドにクローニングし、それぞれの配列を検証した。ＰＰＯＸ４およびＣＹＰ４５０Ａ１９断片を、それぞれＳｐｈ１およびＸｍａ１、またはＸｍａＩおよびＮｏｔ１のいずれかで消化し、ｐＡＡ６２０のＳｐｈ１およびＮｏｔ１制限部位にライゲートして、ｐＡＡ６３４を形成した。ｐＡＡ４４８のＮｏｔ１  ＵＲＡ３断片を、ｐＡＡ６３４のＮｏｔ１制限部位にライゲートして、ｐＡＡ５００を形成した。
【０５００】
ＰＥＸ１１のプロモーターおよびターミネーターを、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６から得られたゲノムＤＮＡから、それぞれオリゴｏＡＡ２１６４およびｏＡＡ２１３８またはｏＡＡ２１３５およびｏＡＡ２１３６を使用したＰＣＲで増幅した。２つの断片を、Ｐｓｔ１およびＳｍａＩまたはＮｄｅＩおよびＳｍａＩのいずれかで消化し、ｐＡＡ６１のＰｓｔ１およびＮｄｅＩ部位にライゲートして、ｐＡＡ３３５を形成した。
【０５０１】
Ｐ４５０Ａ１９のオープンリーディングフレームを、オリゴｏＡＡ３３５８およびｏＡＡ３３５９を使用して増幅し、ＰＣＲ産物を、ＳａｐＩ断片としてｐＡＡ３３５のＳａｐＩ制限部位にクローニングした。結果得られたプラスミドを配列決定し、ｐＡＡ７９８と名付けた。ＰＰＥＸ１１−Ｐ４５０Ａ１９−ＴＰＥＸ１１を、ＸｍａＩ−ＳｐｈＩフラグメントとして、ｐＡＡ５００のＳｍａＩ−ＳｐｈＩ１部位に移動した。結果得られたプラスミドを、ｐＡＡ８００と名付けた。ｐＡＡ５０５のＸｍａＩ−ＣｌａＩ制限フラグメント（長さ３１３７ｂｐ）を、ｐＡＡ８００のＸｍａＩ−ＣｌａＩフラグメント（６９８８ｂｐ）にライゲートして、ｐＡＡ８６６を形成した。
【０５０２】
株ｓＡＡ１６５６を、ゲルで精製されたｐＡＡ８６６のＰａｃ１フラグメントで形質転換し、形質転換株をＳｃＤ−ｕｒａプレート中で選択した。５’ＰＯＸ５−２ｘＰ４５０Ａ１９−−ＴＵＲＡ３−ＵＲＡ３−３’ＰＯＸ５カセットの正しい統合をＰＣＲによって検証した。正しい遺伝子型を有する株を、ｓＡＡ２１２３と名付けた。この株を５ＦＯＡ上で平板培養し、ＵＲＡ３マーカーを除去し、ＰＣＲによって検証した。ＵＲＡ３を含まない株を、ｓＡＡ２１８７と名付けた。株ｓＡＡ２１８７を、ゲルで精製されたｐＡＡ８６６のＰａｃ１フラグメントで形質転換し、形質転換株をＳｃＤ−ｕｒａプレート中で選択した。遺伝子型をＰＣＲによって検証し、２つの正しい株を、ｓＡＡ２３１３およびｓＡＡ２３１４と名付けた。ｓＡＡ２３１３を５ＦＯＡ上で平板培養し、ＵＲＡ３マーカーを除去し、ＰＣＲによって検証した。ＵＲＡ３を含まない株を、ｓＡＡ２３５５と名付けた。
【０５０３】
５’ＭＩＧ１−ＡＤＨ８−ＰＥＸ１１−ＺＷＦ１−３’ＭＩＧ１欠失カセットを構築した。ＭＩＧ１の５’フランキング領域または３’フランキング領域を、それぞれプライマーｏＡＡ３６９２およびｏＡＡ３６９３またはｏＡＡ３６９４およびｏＡＡ３６９５により増幅した。２つのＰＣＲフラグメントを、プライマーｏＡＡ３６９３およびｏＡＡ３６９５を使用したＰＣＲによって組み合わせた。各フラグメントを精製し、別々にｐＣＲ  ＴｏｐｏブラントＩＩにクローニングした。各プラスミドにおける挿入フラグメントを配列決定し、検証し、ＥｃｏＲ１およびＳｐｈＩ断片としてｐＵＣ１９にクローニングした。次いでこのプラスミドを部位特異的変異誘発によって改変し、オリゴｏＡＡ３７１１およびｏＡＡ３７１２を使用してＳｆａ１制限部位を生成した。フラグメントを配列決定し、配列番号１９６に記載の配列を有するクローンを選択した。このプラスミドを、ｐＡＡ９１７と名付けた。
【０５０４】
ＡＤＨ８、ＰＥＸ１１、およびＺＷＦ１遺伝子を、株ＡＴＣＣ２０３３６のゲノムＤＮＡから、それぞれプライマーｏＡＡ３５７３およびｏＡＡ３５７４、ｏＡＡ３６４０およびｏＡＡｏＡＡ３６４１、またはｏＡＡ３６４３およびｏＡＡ３６４４を使用して増幅した。各ＰＣＲフラグメントを別々に、ｐＣＲ  ＴｏｐｏブラントＩＩにクローニングし、各プラスミドのインサートを配列決定した。正しいインサートを含有するプラスミドを、それぞれｐＡＡ９０６、ｐＡＡ８８１およびｐＡＡ９１４と名付けた。それらそれぞれのプラスミドから全ての３つの遺伝子のインサートをＳｆｉＩフラグメントとして切り出し、ｐＡＡ９１７のＳｆｉＩ部位にライゲートした。結果得られたプラスミドを、ｐＡＡ９４４と名付けた。ｐＡＡ４０８のＮｏｔ１  ＵＲＡ３フラグメントを、ｐＡＡ９４４のＮｏｔＩ部位にクローニングし、ｐＡＡ９４６を形成した。
【０５０５】
株ｓＡＡ２３５５を、ゲルで精製されたｐＡＡ９４６のＰａｃ１フラグメントで形質転換し、形質転換株をＳｃＤ−ｕｒａプレート中で選択した。５’ＭＩＧ１−ＡＤＨ８−ＰＥＸ１１−ＺＷＦ１−３’ＭＩＧ１の正しい統合を検証した。正しい遺伝子型を有する株を、ｓＡＡ２３９０と名付けた。この株を５ＦＯＡ上で平板培養し、ＵＲＡ３マーカーを除去し、検証した。ＵＲＡ３を含まない株を、ｓＡＡ２４１５と名付けた。株ｓＡＡ２４１５を、ゲルで精製されたｐＡＡ９４６のＰａｃ１フラグメントで形質転換し、形質転換株を、ＳｃＤ−ｕｒａプレート上での増殖によって選択した。正しい遺伝子型を有する株を、ｓＡＡ２４３３と名付けた。
【０５０６】
実施例６０：株２５９３および２６８７の構築
５’末端においてＡＴＣＣ２０９６２のＰＯＸ４プロモーターに、３’末端においてＡＴＣＣ２０９６２のターミネーターに連結されたカンジダ・クロアカエ（Candida cloacae）のＦＡＯ１をコードする合成遺伝子を、標準的なＤＮＡ合成手法によって作製した。この合成コンストラクトを、ｐＣＲ  ＴｏｐｏブラントＩＩにクローニングした。プラスミドを配列決定し、ｐＡＡ１００９と名付けた。このｐＡＡ１００９中のプロモーター−ＦＡＯ１−ターミネーターインサートの配列を、配列番号１９７として記載した。
【０５０７】
２つのＵＲＡ３フラグメントを、ｐＡＡ００７３から、プライマーｏＡＡ３９３０およびｏＡＡ３９３１またはｏＡＡ３９３４およびｏＡＡ３９３５を使用して増幅した。これらの２つの断片を、ｐＡＡ１００９からのｏＡＡ３９３２およびｏＡＡ３９３５のＰＣＲ産物と組み合わせた。この断片を、プライマーｏＡＡ３９３０およびｏＡＡ３９３５を使用したＰＣＲによって融合させた。次いでＰＣＲ産物を、ｐＣＲ  ＴｏｐｏブラントＩＩにクローニングし、配列を検証し、ｐＡＡ１０１５と名付けた。
【０５０８】
別々に、ＰＥＸ１１発現カセットを以下のようにして調製した：２つのフラグメントを、ｐＡＡ３３６から、プライマーｏＡＡ２２０６およびｏＡＡ２２０７またはｏＡＡ２２０８およびｏＡＡ２２０９を使用して増幅した。これらのフラグメントを、プライマーｏＡＡ２２０６およびｏＡＡ２２０９を使用したＰＣＲによって融合させ、ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ  ＴｏｐｏブラントＩＩ中にクローニングし、配列を検証した。正しい配列を有するプラスミドを、ｐＡＡ９９６と名付けた。
【０５０９】
株ｓＡＡ２４３３を５ＦＯＡ上で平板培養し、ＵＲＡ３マーカーを除去し。遺伝子型を検証し、この株を、ｓＡＡ２４６６と名付けた。
【０５１０】
株ｓＡＡ２６８７およびｓＡＡ２６９３を作製するために、株ｓＡＡ２４６６を、ＡＴＣＣ２０９６２のＡＤＨ８、ＰＥＸ１１、カンジダ・クロアカエのＦＡＯ１およびＡＴＣＣ２０９６２のＣＹＰ４５０Ａ１９のための増幅カセットで形質転換した。各カセットを、各遺伝子のテンプレートと共に標準的なＰＣＲ技術を使用して調製した；テンプレートとして使用された各遺伝子の配列は、実施例７５に記載される。これらの遺伝子全てを含有する２種の株を、ｓＡＡ２６８７およびｓＡＡ２６９３と名付けた（表３２）。
【０５１１】
【表３２】
2016501040.tif 000038
【０５１２】
実施例６１：ＣＴＦ＋株の生産
ＴＥＦ１プロモーターおよびターミネーターを、ＡＴＣＣ株２０３３６のゲノムＤＮＡから、それぞれオリゴｏＡＡ２１０７およびｏＡＡ２１０８またはｏＡＡ２１０９およびｏＡＡ２１１０を使用してＰＣＲで増幅した。２つのＰＣＲ産物を、Ｐｓｔ１およびＳｍａＩまたはＰｓｔ１およびＮｄｅＩのいずれかで消化し、プラスミドｐＡＡ６１のＰｓｔ１およびＮｄｅＩ部位にライゲートして、ｐＡＡ３３２を形成した。
【０５１３】
ＳＳＡ３のプロモーターを、ＡＴＣＣ株２０３３６のゲノムＤＮＡから、プライマーｏＡＡ０６３４およびｏ０ＡＡ６３５を使用して増幅した。ＰＣＲ産物をｐＣＲ  ＴｏｐｏブラントＩＩにクローニングし、配列を検証した。プロモーター断片を、Ｐｓｔ１およびＸｂａＩフラグメントとしてプラスミドｐＡＡ７３に移し、プラスミドｐＡＡ１８１を形成した。
【０５１４】
ＣＴＦ１をＳＳＡ１プロモーター下に入れるために、ＣＴＦ１を、ＡＴＣＣ株２０９６２のゲノムＤＮＡから、プライマーｏＡＡ３８０４およびｏＡＡ３８０５を使用してＰＣＲで増幅した。ＰＣＲフラグメントを、ＡｖｒＩＩとＸｂａＩで消化し、ｐＡＡ１８１のＡｖｒＩＩおよびＸｂａＩ部位にライゲートした。このプラスミドを配列決定によって検証し、ｐＡＡ９９０と名付けた。
【０５１５】
ＣＴＦ１をＴＥＦ１プロモーター下に入れるために、ＣＴＦ１を、プライマーとしてｏＡＡ３８０６およびｏＡＡ３８０７を使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲフラグメントをＳａｐＩで消化し、２つのフラグメントを、プラスミドｐＡＡ３３２のＳａｐＩ部位にライゲートした。２つのプラスミドを選択し、それぞれにおけるインサートを配列決定によって検証した。これらの同一なプラスミドを、ｐＡＡ１０１７およびｐＡＡ１０１８と名付けた。
【０５１６】
プラスミドｐＡＡ９９０、ｐＡＡ１０１７、およびｐＡＡ１０１８を、ＵＲＡ３遺伝子内のＣｌａＩ部位で制限消化により直線状にし、直鎖状プラスミドを精製した。次いで直線状にした生成物を株ｓＡＡ２１１５およびｓＡＡ２３５６に形質転換した。得られた形質転換株をＰＣＲによって検証し、以下の株を作製した（表３３）。
【０５１７】
【表３３】
2016501040.tif 000039
【０５１８】
株ｓＡＡ２１１５を、オリゴｏＡＡ０１０８およびｏＡＡ０１０９を使用して、ｐＡＡ０６１から増幅されたＵＲＡ３のＰＣＲフラグメントで形質転換した。形質転換株をＳｃＤ−ｕｒａ中で選択した。Ｕｒａ＋株を、ｓＡＡ２２７４と名付けた。
【０５１９】
実施例６２：ＵＴＲ１過剰発現株の作製
ＵＴＲ１（配列番号２００）をコードする遺伝子を、株ＡＴＣＣ２０３３６のゲノムＤＮＡから、オリゴｏＡＡ３７８９およびｏＡＡ３７９０を使用して増幅した。ＰＣＲフラグメントを、ＳａｐＩフラグメントとしてｐＡＡ７３のＳａｐ１部位にクローニングし、ｐＡＡ９７５を形成した。遺伝子を配列決定によって検証した。このプラスミドをＳｐｅＩで消化し、株ｓＡＡ２４６６に形質転換した。形質転換株をＳｃＤ−ｕｒａ中で選択した。ＵＴＲ１が統合されたＵｒａ＋形質転換体を、ｓＡＡ２５５２と名付けた。
【０５２０】
実施例６３：ＦＡＴ１およびＦＡＴ１  Ｓ２４４Ａ突然変異過剰発現株の作製
プラスミドｐＡＡ６３５およびｐＡＡ６３７をＣｌａＩで消化し、ｓＡＡ２４６６に形質転換した。形質転換株をＳｃＤ−ｕｒａ中で選択した。統合されたＦＡＴ１の複数のコピーを有するＵｒａ＋を、ｓＡＡ２６７１と名付け、ＦＡＴ１  Ｓ２４４Ａの複数のコピーを有するＵｒａ＋株を、ｓＡＡ２６７２と名付けた
実施例６４：選択されたＣＴＦ＋およびＣＴＦ−株による二酸生産
振盪フラスコ発酵を行って、以下のようにラウリン酸メチル供給材料からの二酸の生産へのＣＴＦ１の作用を決定した：株ｓＡＡ２２７４、ｓＡＡ２４７９、ｓＡＡ２５７４、ｓＡＡ２３１４、ｓＡＡ２４８１およびｓＡＡ２５７７を、５０ｇ／Ｌグルコースを含有するＳＰ９２培地５０ｍＬを含有する別の振盪フラスコに植え付け、一晩増殖させた。それぞれの培養物を遠心分離によってペレット化し、細胞を、以下のように調製した２５ｍＬのＤＣＡ３培地に再懸濁した：最終容量５００ｍＬまでの水に、約６．７ｇの酵母窒素および５０ｇのデキストロースを溶解させた。別々に、最終容量５００ｍｌまでの水に、７．７ｇの一塩基性リン酸カリウムおよび４２．４ｇの二塩基性リン酸カリウムを添加することによってリン酸塩溶液を調製した。溶液を合わせて、ろ過滅菌した。
【０５２１】
この発酵には、底部バッフル付きフラスコを使用した。各株でフラスコを２連にするために、１２．５ｍＬの培養物を添加した。各フラスコに２５０μＬのラウリン酸メチルを添加し、３００ｒｐｍで振盪しながらフラスコを３０℃で４０時間インキュベートした。ガスクロマトグラフ分析のために、１８および４０時間で１ｍＬを取り出すことによりフラスコをサンプリングした。表３４に、結果（発酵ブロス１リットルあたりのＤＤＤＡのグラム）を示す。
【０５２２】
【表３４】
2016501040.tif 000040
【０５２３】
結果から、ＣＴＦ１ｂを発現するＳＳＡ３のプロモーターは、両方の宿主のバックグラウンドにおいてラウリン酸メチルからドデカン二酸への変換を増強し、オメガ−ヒドロキシ脂肪酸（ＨＤＤＡ）での低減はｓＡＡ２３５６宿主のバックグラウンドで観察されたことが示される。ＣＴＦ１ｂを発現するＴＥＦプロモーターを含有する株も、ｓＡＡ２１１５のバックグラウンドに関する対照株と比較してドデカン二酸（ＤＤＤＡ）生産の増加を示した。しかしながら、これは、ｓＡＡ２３５６のバックグラウンドに関しては観察されなかったが、ＣＴＦ１ｂ遺伝子のコピー数がより低いことに起因する可能性がある。
【０５２４】
実施例６５：ラウリン酸メチルからＤＤＤＡへの変換−株ｓＡＡ２０４７と株ＡＴＣＣ２０９６２との比較
発泡体の栓を有する５００ｍＬバッフル付きフラスコ中での８０ｍＬのＳＰ９２培地（６．７ｇ／Ｌ酵母窒素原礎培地、３．０ｇ／Ｌ酵母抽出物、３．０ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、７５ｇ／Ｌデキストロース）の予備培養に、株ＡＴＣＣ２０９６２または株ｓＡＡ２０４７の凍結したグリセロールストックから１．０ｍＬを植え付け、３０℃および２５０ＲＰＭで２４時間インキュベートした。発酵培地（ＭＭ１）、ｐＨ５．８をろ過滅菌し、滅菌発酵容器に移した。初期ＯＤ６００ｎｍが１．０になるまで、３５ｏＣ、１０００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、ｐＨ５．８の増殖条件で、予備培養の接種材料を用いて増殖を開始させた。およそ１０〜１２時間増殖を続け、そのあとにラウリン酸メチルの連続フィードによって変換期を開始させた。供給材料フィード速度を、以下：ラウリン酸メチル（シグマ−アルドリッチ番号Ｗ２７１５００）、最初の２４時間は０．７ｇ／Ｌ−ｈ；２４時間から終結までは１．０ｇ／Ｌ−ｈのように変化させた。加えて、デキストロースのコフィードを１．２５ｇ／Ｌ−ｈの速度でフィードした。誘導時に、温度を３０℃に変化させ、６ＮのＫＯＨの添加によってｐＨを６．０に維持した。
【０５２５】
株ｓＡＡ２０４７に関するＤＤＤＡの生産性（３連の発酵の平均）は、０．５８５ｇ／Ｌ−ｈであり（１時間あたりの発酵ブロス１リットルあたりのＤＤＤＡのグラム）、一方で株ｓＡＡ０００３は、０．５４３ｇ／Ｌ−ｈの生産性を示し、これは、約８パーセントの差である。株ｓＡＡ２０４７も、株ｓＡＡ０００３より低いレベルのラウリン酸および１２−ヒドロキシラウリン酸の両方を生産した。ラウリン酸レベルはほぼ６０％低減し、１２−ヒドロキシラウリン酸レベルは２５％低減した。
【０５２６】
実施例６６：ラウリン酸メチルからＤＤＤＡへの変換−株ｓＡＡ２１７４およびｓＡＡ２１７８とｓＡＡ１０８２の比較
発泡体の栓を有する５００ｍＬバッフル付きフラスコ中での８０ｍＬのＳＰ９２培地の予備培養に、株ｓＡＡ１０８２、ｓＡＡ２０７４、またはｓＡＡ２０７８のいずれかの凍結したグリセロールストックから１．０ｍＬを植え付け、３０℃および２５０ＲＰＭで２４時間インキュベートした。ｐＨ５．８での発酵培地（ＭＭ１）をろ過滅菌し、滅菌発酵容器に移した。初期ＯＤ６００ｎｍが１．０になるまで、３５℃、１０００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、ｐＨ５．８の増殖条件で、予備培養の接種材料を用いて増殖を開始させた。およそ１０〜１２時間増殖を続け、そのあとに供給材料の連続フィードによって変換期を開始させた。ラウリン酸メチルフィード速度は、最初の２４時間には０．７５ｇ／Ｌ−ｈおよび２４時間から終結までは１．４ｇ／Ｌ−ｈであった。加えて、デキストロースのコフィードを、１．２５ｇ／Ｌ−ｈの速度でフィードした。誘導時に、温度を３０℃に変化させ、６ＮのＫＯＨの添加によってｐＨを６．０に維持した。
【０５２７】
ＤＤＤＡの生産性（３連の発酵の平均）は、株ｓＡＡ２１７８に関しては０．８９６ｇ／Ｌ−ｈであり、株ｓＡＡ２１７４では、０．８７９ｇ／Ｌ−ｈであり、一方でｓＡＡ１０８２は、０．８２０ｇ／Ｌ−ｈの生産性を示し、これは、株ｓＡＡ１０８２と比べて、ｓＡＡ２１７８に関しては約８％の向上であり、ｓＡＡ２１７４に関しては７．２％の向上である。ｓＡＡ２１７８およびｓＡＡ２１７４の両方は、株ｓＡＡ１０８２より低いレベルのラウリン酸を生産した。ラウリン酸レベルは、ｓＡＡ１０８２と比べて、ｓＡＡ２１７４では５０％低減し、ｓＡＡ２１７８では２６％低減した。ラウリン酸の量を低くすることは、ラウリン酸メチルからのＤＤＤＡの全体的な収量を向上させる。
【０５２８】
実施例６６．１．ラウリン酸エチルからＤＤＤＡへの変換−株ｓＡＡ２４３３とｓＡＡ２６７１との比較
発泡体の栓を有する５００ｍＬバッフル付きフラスコ中での８０ｍＬのＳＰ９２（６．７ｇ／Ｌ酵母窒素原礎培地、３．０ｇ／Ｌ酵母抽出物、３．０ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、７５ｇ／Ｌデキストロース）の予備培養に、株ｓＡＡ２４３３または株ｓＡＡ２０４７の凍結したグリセロールストックから１．０ｍＬを植え付け、３０℃および２５０ＲＰＭで２４時間インキュベートした。ｐＨ５．８の発酵培地（ＭＭ１）をろ過滅菌し、滅菌発酵容器に移した。初期ＯＤ６００ｎｍが１．０になるまで、３５℃、１０００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、ｐＨ５．８の増殖条件で、予備培養の接種材料を用いて増殖を開始させた。およそ１０〜１２時間増殖を続け、そのあとにラウリン酸エチルの連続フィードによって変換期を開始させ、ここでラウリン酸エチルは、最初の２４時間は０．７５ｇ／Ｌ−ｈ；２４時間から終結までは１．２８ｇ／Ｌ−ｈの速度でフィードされた。加えて、デキストロースのコフィードを０．９ｇ／Ｌ−ｈの速度でフィードした。誘導時に、温度を３０℃に変化させ、６ＮのＫＯＨの添加によってｐＨを６．０に維持した。これらの２種の株間の主要な差は、株ｓＡＡ２６７１は、増幅された脂肪酸輸送（ＦＡＴ１）の遺伝子を有するが、ｓＡＡ２４３３ではそうではないことである。これらの株のＤＤＤＡの生産性は約０．８ｇ／Ｌ−ｈで類似していた。しかしながら、株２４３３は、４．０ｇ／Ｌのラウリン酸を生産したが、株ｓＡＡ２６７１は、０．３ｇ／Ｌしか生産しなかった。この差は、ラウリン酸がラウリン酸エチルの脱エステル化によって生産され、その後液体培地に放出される場合、ＦＡＴ１を増幅した株、すなわちｓＡＡ２６７１では、ＤＤＤＡへの生物変換反応のためにより容易に輸送されて細胞に戻されると予想されることが原因である可能性がある。液体培地中の１２−ヒドロキシラウリン酸の蓄積における２５％の低減も、株ｓＡＡ２６７１で観察された。
【０５２９】
実施例６６．２．ラウリン酸エチルからＤＤＤＡへの変換−株ｓＡＡ２５９３、ｓＡＡ２６８７およびｓＡＡ２６９３とｓＡＡ２１７８との比較
発泡体の栓を有する５００ｍＬバッフル付きフラスコ中での８０ｍＬのＳＰ９２の予備培養に、株ｓＡＡ２５９３、ｓＡＡ２６８７もしくはｓＡＡ２６９３、またはｓＡＡ２１７８のいずれかの凍結したグリセロールストックから１．０ｍＬを植え付け、３０℃および２５０ＲＰＭで２４時間インキュベートした。ｐＨ５．８での発酵培地（ＭＭ１）をろ過滅菌し、滅菌発酵容器に移した。初期ＯＤ６００ｎｍが１．０になるまで、３５℃、１０００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、ｐＨ５．８の増殖条件で、予備培養の接種材料を用いて増殖を開始させた。およそ１０〜１２時間増殖を続け、そのあとに供給材料の連続フィードによって変換期を開始させた。ラウリン酸エチルのフィード速度は、最初の２４時間には０．７５ｇ／Ｌ−ｈおよび２４時間から終結までは１．４９ｇ／Ｌ−ｈであった。加えて、デキストロースのコフィードを０．９ｇ／Ｌ−ｈの速度でフィードした。誘導時に、温度を３０℃に変化させ、６ＮのＫＯＨの添加によってｐＨを６．０に維持した。全ての株に関するＤＤＤＡの生産性（２連の発酵の平均）は約０．８３ｇ／Ｌ−ｈで類似していた。しかしながら、株ｓＡＡ２６８７および２６９３（両方ともカンジダ・クロアカエのＦＡＯ１遺伝子が増幅された）、それぞれ、どちらも増幅したＦＡＯ遺伝子を有さないｓＡＡ２１７８またはｓＡＡ２５９３のどちらより２４％および４７％低いレベルのヒドロキシル脂肪酸を蓄積した。加えて、株ｓＡＡ２６８７は、他の３種の株のどれよりも少なくとも５５％少ないラウリン酸を蓄積した。
【０５３０】
実施例６７：ラウリン酸エチルまたはラウリン酸メチル供給材料からのＤＤＤＡの生産
増殖基質としてデキストロースを含むＭＭ１培地中で増殖させた、ただし供給材料としてラウリン酸メチルまたはラウリン酸エチル（シグマ−アルドリッチ番号Ｗ２４４１１２）のいずれかを使用した株ｓＡＡ１０８２で、発酵を実行した。発泡体の栓を有する５００ｍＬバッフル付きフラスコ中での８０ｍＬのＳＰ９２の予備培養に、株ｓＡＡ１０８２（ベータ酸化がブロックされ、ＣＰＲＢおよびＣＹＰ５２Ａ１９が増幅された株）の凍結したグリセロールストックから１．０ｍＬを植え付け、３０℃および２５０ＲＰＭで２４時間インキュベートした。ｐＨ５．８での発酵培地（ＭＭ１）をろ過滅菌し、滅菌発酵容器に移した。初期ＯＤ６００ｎｍが１．０になるまで、３５℃、１０００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、ｐＨ５．８の増殖条件で、予備培養の接種材料を用いて増殖を開始させた。およそ１０〜１２時間増殖を続け、そのあとに供給材料の連続フィードによって変換期を開始させた。ラウリン酸メチルのフィード速度を、以下：最初の２４時間は０．７５ｇ／Ｌ−ｈ；２４時間から終結までは１．２ｇ／Ｌ−ｈのように変化させた。ラウリン酸エチルを、最初の２４時間は０．７５ｇ／Ｌ−ｈ；２４時間から終結までは１．２８ｇ／Ｌ−ｈの速度でフィードした。誘導時に、温度を３０℃に変化させ、６ＮのＫＯＨの添加によってｐＨを６．０に維持した。また誘導時に、デキストロースのコフィードを、１．２５ｇ／Ｌ−ｈまたは０．９ｇ／Ｌ−ｈのいずれかの速度でフィードした。表３５で、これらの２つのラウリン酸エチル発酵からのデータを、同じ条件下で行われたラウリン酸メチル発酵から得られた類似のデータと比較した。
【０５３１】
結果は、２連の発酵の平均である。これらのデータは、ラウリン酸エチルが、極めてよくラウリン酸メチルの代用になったことを示す。１．２５ｇ／Ｌ−ｈまたは０．９ｇ／Ｌ−ｈのいずれかのデキストロースのフィード速度を用いたラウリン酸エチル発酵はどちらも、優れたＤＤＤＡの生産性を示した。比較的高いデキストロースのフィードは、類似のコフィード速度を用いたラウリン酸メチル発酵と比べて、約６％の生産性の向上を示した。ラウリン酸エチル発酵はどちらも、ラウリン酸メチル発酵のいずれかと比較して、１２−ヒドロキシラウリン酸（ＨＦＡ）濃度において有意な減少を示した。ラウリン酸エチル発酵はまた最も低いラウリン酸の蓄積も示し、ラウリン酸は毒性レベルまで蓄積して、最終的に生産性を阻害するする可能性があるために、これは利点である。ラウリン酸エチルの使用に関する追加の利益は、液体培地中に蓄積される有意な量のエタノールが観察されないことである。排ガス中のエタノールは決定されなかったが、エタノールはラウリン酸エチルから徐々に放出され、排ガスに蒸発する前に迅速に消費されたと予想されることから、そのようなエタノールは、極めて低いと予想される。最終的な有益な結果は、デキストロース：ＤＤＤＡの比率が有意に低減されたことであり、これは、エタノールは極めて優れたエネルギー源であり、うまくデキストロースと置き換えられたためである。ラウリン酸エチル発酵の結果を、同じコフィード速度（１．２５ｇ／Ｌ−ｈおよび０．９ｇ／Ｌ−ｈ）を有するラウリン酸メチル発酵と比較したところ、極めて大きい差がみられた。ラウリン酸メチルのコフィードを０．９ｇ／Ｌ−ｈに減少させると（１．２５ｇ／Ｌ−ｈのコフィード速度と比べて）、生産性の減少が起こり、ラウリン酸蓄積において有意な増加が起こり、さらに結果としてＤＤＤＡ純度の有意な減少も起こる。対照的に、ラウリン酸エチル発酵の場合、より低速のデキストロースのフィードでは、生産性にわずかな減少しか起こさず、ラウリン酸濃度とＨＦＡ濃度はいずれも少しの濃度の増加を示し、結果として純度の減少も小さかった。より低いデキストロース：ＤＤＤＡの比率は、ラウリン酸メチルと比較して、ラウリン酸エチルからＤＤＤＡを生産するのにかかるコストの有意な減少をもたらす可能性がある。表３５において、「純度」は、液体培地中の全ての他の鎖長の脂肪酸および二酸に対する発酵ブロス中のＤＤＤＡの量を指す。
【０５３２】
【表３５】
2016501040.tif 000041
【０５３３】
実施例６８：コフィードとしてスクロースまたはデキストロースを使用したＤＤＤＡ生産
発泡体の栓を有する５００ｍＬバッフル付きフラスコ中での８０ｍＬのＳＰ９２の予備培養に、株ｓＡＡ２１７８（ベータ酸化がブロックされ、ＣＰＲＢ、ＣＹＰ５２Ａ１９、ＡＤＨ２ａ、ＡＤＨ８、およびＨＦＤ２が増幅された株）の凍結したグリセロールストックから１．０ｍＬを植え付け、３０℃および２５０ＲＰＭで２４時間インキュベートした。ｐＨ５．８での発酵培地（ＭＭ１）をろ過滅菌し、滅菌発酵容器に移した。対照のために、増殖およびコフィードの両方にデキストロースを使用した。実験発酵のために、増殖培地（ＭＭ１）およびコフィードの両方においてｇ／ｇの基準でデキストロースの代わりにスクロースを用いた。初期ＯＤ６００ｎｍが１．０になるまで、３５℃、１０００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、ｐＨ５．８の増殖条件で、予備培養の接種材料を用いて増殖を開始させた。およそ１０〜１２時間増殖を続け、そのあとにラウリン酸エチルの連続フィードによって変換期を開始させた。ラウリン酸エチルを、最初の２４時間は０．７５ｇ／Ｌ−ｈ；２４時間から終結までは１．２８ｇ／Ｌ−ｈの速度でフィードした。加えて、全ての発酵にわたり、デキストロースまたはスクロースのいずれかのコフィードを０．９ｇ／Ｌ−ｈの速度でフィードした。誘導時に、温度を３０℃に変化させ、６ＮのＫＯＨの添加によってｐＨを６．０に維持した。比較のために、３つの発酵からのデータを平均した。
【０５３４】
コフィードとしてデキストロースを用いた場合、ＤＤＤＡの生産は、０．８７２ｇ／Ｌ−ｈであり、スクロースを用いた場合、ＤＤＤＡの生産は、０．８４７ｇ／Ｌ−ｈでそれより約３％だけ少なかった。コフィードとしてスクロースを用いた発酵は、コフィードとしてデキストロースを用いた発酵（ラウリン酸＝０．５２ｇ／ＬおよびＨＦＡ＝１．４４ｇ／Ｌ）より少し多くのラウリン酸（１．５６ｇ／Ｌ）およびＨＦＡ（１．７８ｇ／Ｌ）を蓄積した。このために、コフィードとしてスクロースを用いた発酵は、コフィードとしてグルコースを用いた発酵（９４．３％）よりわずかに低い純度（９２．２％）を有していた。全体的に、スクロースは、うまくデキストロースの代用になった。
【０５３５】
実施例６９：代替のコフィード−ＤＤＤＡ生産におけるデキストロースのグリセロールまたはキシロースでの置換
発泡体の栓を有する５００ｍＬバッフル付きフラスコ中での８０ｍＬのＳＰ９２の予備培養に、株ｓＡＡ２１７８（ベータ酸化がブロックされ、ＣＰＲＢ、ＣＹＰ５２Ａ１９、ＡＤＨ２ａ、ＡＤＨ８、およびＨＦＤ２が増幅された株）の凍結したグリセロールストックから１．０ｍＬを植え付け、３０℃および２５０ＲＰＭで２４時間インキュベートした。ｐＨ５．８での発酵培地（ＭＭ１）をろ過滅菌し、滅菌発酵容器に移した。対照のために、増殖およびコフィードの両方にデキストロースを使用した。実験発酵のために、増殖培地（ＭＭ１）およびコフィードの両方においてｇ／ｇの基準でデキストロースの代わりにグリセロールまたはキシロースを用いた。初期ＯＤ６００ｎｍが１．０になるまで、３５℃、１０００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、ｐＨ５．８の増殖条件で、予備培養の接種材料を用いて増殖を開始させた。およそ１０〜１２時間増殖を続け、そのあとにラウリン酸エチルの連続フィードによって変換期を開始させた。ラウリン酸エチルを、最初の２４時間は０．７５ｇ／Ｌ−ｈ；２４時間から終結までは１．２８ｇ／Ｌ−ｈの速度でフィードした。加えて、デキストロース、グリセロールまたはキシロースのいずれかのコフィードを、全ての発酵にわたり１．２５ｇ／Ｌ−ｈの速度でフィードした。誘導時に、温度を３０℃に変化させ、６ＮのＫＯＨの添加によってｐＨを６．０に維持した。
【０５３６】
コフィードとしてデキストロースを用いた場合、ＤＤＤＡの生産は、０．８２５ｇ／Ｌ−ｈであった；グリセロールを用いた場合、ＤＤＤＡの生産は、０．３２７ｇ／Ｌ−ｈで約６０％少なく、キシロースを用いた場合、ＤＤＤＡの生産は、０．２１１ｇ／Ｌ−ｈで約７５％少なかった。コフィードとしてグリセロールおよびキシロースを用いた発酵は、コフィードとしてデキストロースを用いた発酵（０．３７ｇ／Ｌ）よりかなり多くのラウリン酸（それぞれ１２．２８ｇ／Ｌおよび１９．０４ｇ／Ｌ）を蓄積した。グリセロール（０．３３ｇ／Ｌ）またはキシロース（０．２０ｇ／Ｌ）を用いた発酵では、ＨＦＡレベルは、デキストロース（１．２４ｇ／Ｌ）と比べて有意に低かったが、これは、部分的にそれらが生産するＤＤＤＡはかなり少ないためである。ラウリン酸の多量の蓄積のために、コフィードとしてグリセロールまたはキシロース（それぞれ３９．６％および２８．９％の純度）を用いた発酵でのＤＤＤＡ純度は、デキストロース発酵でのＤＤＤＡ純度（９３．４％）と比べて有意に劣っていた。ｇ／ｇの基準で、コフィードとしてのデキストロースをグリセロールまたはキシロースのいずれかで置換することにより、より低い生産性、より多量のラウリン酸の蓄積、およびより低い全体的なＤＤＤＡ純度の発酵が起こる。
【０５３７】
実施例７０：ＤＤＤＡの生産：コフィードとしてのエタノールまたはデキストロースの使用
発泡体の栓を有する５００ｍＬバッフル付きフラスコ中での８０ｍＬのＳＰ９２の予備培養に、株ｓＡＡ１０８２（ベータ酸化がブロックされ、ＣＰＲＢおよびＣＹＰ５２Ａ１９が増幅された株）の凍結したグリセロールストックから１．０ｍＬを植え付け、３０℃および２５０ＲＰＭで２４時間インキュベートした。ｐＨ５．８での発酵培地（ＭＭ１）をろ過滅菌し、滅菌発酵容器に移した。対照のために、増殖およびコフィードの両方にデキストロースを使用した。実験発酵のために、増殖培地（ＭＭ１）およびコフィードの両方においてｇ／ｇの基準でデキストロースの代わりにグリセロールまたはキシロースを用いた。初期ＯＤ６００ｎｍが１．０になるまで、３５℃、１０００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、ｐＨ５．８の増殖条件で、予備培養の接種材料を用いて増殖を開始させた。およそ１０〜１２時間増殖を続け、そのあとにラウリン酸メチルの連続フィードによって変換期を開始させた。ラウリン酸メチルを、最初の２４時間は０．７ｇ／Ｌ−ｈ；２４時間から終結までは１．２ｇ／Ｌ−ｈの速度でフィードした。加えて、エタノールのコフィードを０．７ｇ／Ｌ−ｈの速度でフィードした。エタノールは論理上より高エネルギーの化合物であるため、エタノールのフィード速度を、通常グルコースで使用されると予想される速度（１．２ｇ／ｌ−ｈ）よりも低減させた。誘導のとき、温度を３０℃に変化させ、６ＮのＫＯＨの添加によってｐＨを６．０に維持した。
【０５３８】
選択されたフィード速度で、エタノールをコフィードとしてのデキストロースで置換することにより、デキストロースで観察されるものより低いＤＤＤＡの生産性（０．４４６ｇ／Ｌ）での発酵が起こり、より大きいラウリン酸（８．５ｇ／Ｌ）、ＨＦＡ（５．３ｇ／Ｌ）、およびラウリン酸メチル（３８ｇ／Ｌ）の蓄積、ならびにより低い全体的なＤＤＤＡ純度（３３％）がもたらされる。
【０５３９】
実施例７１：デカン酸メチルからセバシン酸（デカン二酸）への変換−株ｓＡＡ１０８２とｓＡＡ２１７８との比較
発泡体の栓を有する５００ｍＬバッフル付きフラスコ中での８０ｍＬのＳＰ９２の予備培養に、株ｓＡＡ２１７８または株ｓＡＡ１０８２の凍結したグリセロールストックから１．０ｍＬを植え付け、３０℃および２５０ＲＰＭで２４時間インキュベートした。ｐＨ５．８での発酵培地（ＭＭ１）をろ過滅菌し、滅菌発酵容器に移した。初期ＯＤ６００ｎｍが１．０になるまで、３５℃、１０００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、ｐＨ５．８の増殖条件で、予備培養の接種材料を用いて増殖を開始させた。およそ１０〜１２時間増殖を続け、そのあとに６時間にわたる１０ｇ／Ｌのデカン（シグマ−アルドリッチ番号４５７１１６）のボーラス、その後、０．２５または０．５０ｇ／Ｌ−ｈのデカン酸メチル（ＴＣＩアメリカ番号Ｄ００２３）の連続フィードを開始させることにより変換期を誘導した。デカンの揮発性のために、誘導物質としてデカンを用いた６時間の誘導期中に、通気速度を０．３ｖｖｍに下げた。加えて、デキストロースのコフィードを、全ての発酵にわたり１．２５ｇ／Ｌ−ｈの速度でフィードした。誘導時に、温度を３０℃に変化させ、６ＮのＫＯＨの添加によってｐＨを６．０に維持した。
【０５４０】
以下の表３６に記載の結果は、「生産性」（１時間あたりの発酵ブロス１リットルあたりの生産されたセバシン酸のグラム）として報告したデカン二酸（セバシン酸）の生産を示し、異なるフィード速度下での２種の株の生産性を比較する。「デカン酸メチル」は、各発酵の最後に存在する供給材料であるデカン酸メチルの量を指す。株ｓＡＡ１０８２およびｓＡＡ２１７８はどちらも、フィード速度が０．２５ｇ／Ｌ−ｈのときにセバシン酸を十分に生産することが可能であったが、フィード速度が０．５ｇ／Ｌ−ｈに増加すると、株ｓＡＡ１０８２は有意な量のデカン酸および１０−ヒドロキシデカン酸を生産し、デカン酸メチルを蓄積し、結果としてセバシン酸純度は大きく低減した。蓄積したデカン酸の毒性のために、生産性は有意に低減した。しかしながら、株ｓＡＡ２１７８は、デカン酸メチルのフィード速度を０．５ｇ／Ｌ−ｈに増加させたときに強い生産性の増加を示し、デカン酸、１０−ヒドロキシデカン酸またはデカン酸メチルのいずれの蓄積もほとんどみられなかった。
【０５４１】
【表３６】
2016501040.tif 000042
【０５４２】
実施例７２：様々な炭素鎖長の供給材料からの二酸生産
この実施例における生物変換反応試験を振盪フラスコプロトコールに従って行った。１日目、５ｍｌのＹＰＤに、カンジダ株ＡＴＴＣ２０９６２、ｓＡＡ１０８２、またはｓＡＡ２１７８の新鮮なコロニーを植え付けた。ＹＰＤは、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌのペプトン、および２０ｇ／Ｌデキストロースを含んでいた。次いでこれらの培養物を３０℃の振盪インキュベーター中に２５０ｒｐｍで１８〜２０時間置いた。
【０５４３】
この増殖期の後に、これらの培養物を使用して、各株で３５ｍｌのアリコートで１０〜２５０ｍｌ広口フラスコに分配した３５０ｍｌのＳＰ９２−グリセロール培地に植え付けた。ＳＰ９２−グリセロール培地は、６．７ｇ／Ｌの酵母窒素原礎培地、３ｇ／Ｌの酵母抽出物、３ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、１ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、１ｇ／Ｌの二塩基性リン酸カリウム、および７５ｇ／Ｌのグリセロールを含んでいた（Picataggio S.ら、Biotechnology（N Y）. 1992年8月；10（8）：894〜8）。次いで培養物を３０℃の振盪インキュベーター中に３００ｒｐｍで２０〜２４時間置いた。
【０５４４】
次いで細胞を５分間および３０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を捨てた。細胞を、１．０％トリトン−Ｘ１００が補充されたＤＣＡ３培地中に再懸濁した。ＤＣＡ３は、６．７ｇ／Ｌの酵母窒素原礎培地および５０ｇ／Ｌのグリセロールを含有する０．３Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５である。ＤＣＡ３培地配合のバリエーションは公知であり、その非限定的な例としては、デキストロースおよび／またはグリセロールなど、またはそれらの組み合わせの添加が挙げられる。ＤＣＡ３培地は、本明細書で述べられる場合、デキストロースおよび／またはグリセロールを包含する場合もある。再懸濁した後、各培養物のＯＤ６００ｎｍを共通のＯＤ（最小の増殖を示す株にとって利用可能なＯＤに基づく）に調整し、１０ｍｌを、予め重さを量った２５０ｍｌ底部バッフル付き振盪フラスコに移した。次いでフラスコの重さを再度量り、培養物の開始時の重量を決定した。次いで変換させようとする基質を、エチルエステルの場合は１％ｖ／ｖで、アルカンの場合は３％ｖ／ｖで添加した。添加されたアルカンの量を、それらの揮発性のために多くし、それにより生物変換反応のための溶液中に十分な基質が残るようにした。フラスコの重さをもう一度量って、各フラスコに添加された基質の正確な量を決定し、次いで３０℃の振盪インキュベーター中に３００ｒｐｍで４８時間置いた。ステアリン酸エチルおよびパルミチン酸エチルに関する生物変換反応試験は、これらの基質の融点の限界のために、３５℃で行われた。
【０５４５】
４８時間後、フラスコの重さをもう一度量って、最終的な培養物の重量を決定した。培養物を回転させることによってよく混合し、１ｍｌを、０．８ｍｌの６ＮのＨＣｌを含有する予め重さを量った１５ｍｌファルコンチューブに移した。チューブの重さを量って最終的な培養物の密度を決定し、この数値を使用して、最終的なタイムポイントで存在する培養物の体積を決定した。ＧＣによる分析のためにサンプルを分析に送った。
【０５４６】
【表３７】
2016501040.tif 000043
【０５４７】
実施例７３：デカン酸エチルからデカン二酸（セバシン酸）への変換
各０．４Ｌの実効体積を有する０．５ＬインフォースＨＴマルチフォース（Infors HT Multifors）バイオリアクター（インフォース社（Infors AG）、スイス）で、デカン酸エチルに関する生物変換反応試験を行った。発泡体の栓を有する２５０ｍＬバッフル付きフラスコ中での５０ｍＬのＳＰ９２の予備培養（６．７ｇ／Ｌ酵母窒素原礎培地、３．０ｇ／Ｌ酵母抽出物、３．０ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、７５ｇ／Ｌデキストロース）に、カンジダ株ＡＴＣＣ２０９６２、株ｓＡＡ１０８２、または株ｓＡＡ２１７８の新しいプレートからのシングルコロニーを植え付け、３０℃および２５０ＲＰＭで２４時間インキュベートした。発酵培地（ＭＭ１）、ｐＨ５．８をろ過滅菌し、滅菌発酵容器に移した。バイオリアクターに、１０００ｒｐｍで回転する２つのラシュトンインペラーを備え付けた。バイオリアクターにＯＤがおよそ０．２なるまで植え付け、およそ１２〜１４時間増殖を続け、そのあとに均一に間隔をあけたデカン酸エチルのボーラスによって変換期を開始させた。増殖期中、６ＮのＫＯＨの自動添加によって培養物のｐＨを５．８で一定に維持し、温度と空気流をそれぞれ３０℃と１ｖｖｍに制御した。
【０５４８】
誘導のとき、ｐＨを６．２に変化させ、６ＮのＫＯＨの添加によって維持した。蒸発を最小化するために０．２５ｖｖｍの空気流速での６時間にわたる最初の４．０ｍｌのデカンのボーラスを用いて、バイオリアクターを誘導した。この最初の誘導期の後、最小のデカン二酸（セバシン酸）を観察し、これは、デカンの大部分が蒸発で失われたことを示す。
【０５４９】
この最初の６時間にわたる誘導の後、空気流を１ｖｖｍに高めて、次の６時間、３０分間毎に５８μｌのデカン酸エチルを添加した。次いで次の３６時間、１時間あたり１回の頻度で、デカン酸エチルのボーラスを１１６μｌに増加させた。加えて、デキストロースのコフィードを、１．２５ｇ／Ｌ−ｈの速度でフィードした。最後のデカン酸エチルのボーラスの１２時間後、最終サンプルを採取した。デカンの揮発性に加えて最初の誘導期の後にデカン二酸の形成がなかったことから、収量計算は、全ての培養に関して、添加されたデカン酸エチルだけを考慮に入れて行われた。以下の表３８に結果を示す。それからわかるように、株ｓＡＡ１０８２およびｓＡＡ２１７８は、株ＡＴＣＣ２０９６２の場合より有意に多くのセバシン酸を生産した。
【０５５０】
【表３８】
2016501040.tif 000044
【０５５１】
実施例７４：ＭＩＧ１突然変異株の振盪フラスコの評価
振盪フラスコ発酵を行って、以下のようにラウリン酸メチルまたはオレイン酸供給材料からの二酸の生産へのＭＩＧ１欠失の作用を決定した：株ＡＴＣＣ  ＡＴＣＣ２０９６２（ｓＡＡ００３）およびｓＡＡ２０４７を、５０ｇ／Ｌのグルコースを含有するＳＰ９２培地５０ｍＬを含有する別の振盪フラスコに植え付け、一晩増殖させた。それぞれの培養物を遠心分離によってペレット化し、細胞を、以下のように調製した２５ｍＬのＤＣＡ３培地に再懸濁した：最終容量５００ｍＬまでの水に、約６．７ｇの酵母窒素および５０ｇのデキストロースを溶解させた。別々に、最終容量５００ｍｌまでの水に、７．７ｇの一塩基性リン酸カリウムおよび４２．４ｇの二塩基性リン酸カリウムを添加することによってリン酸塩溶液を調製した。溶液を合わせて、ろ過滅菌した。
【０５５２】
この発酵には、底部バッフル付きフラスコを使用した。各株でフラスコを２連にするために、１２．５ｍＬの培養物を添加した。各フラスコに２５０μＬのラウリン酸メチルまたはオレイン酸を添加し、３００ｒｐｍで振盪しながらフラスコを３０℃で４０時間インキュベートした。ガスクロマトグラフ分析のために、フラスコから２４時間で１ｍＬを取り出すことによりサンプリングした。
【０５５３】
以下の表３９Ａおよび３９Ｂに結果を示す。これらの表において、「ＨＤＤＡ」は、ヒドロキシドデカン酸を指す。明らかに、ＭＩＧ１欠失を含有する株ｓＡＡ２０４７は、株ＡＴＣＣ２０９６２の場合と比較して、オレイン酸およびラウリン酸メチル発酵の両方からより多くの二酸生産を示した。重要なことに、それに付随して、株ｓＡＡ２０４７の発酵ブロス中のヒドロキシ脂肪酸が、株ＡＴＣＣ２０９６２と比較して低減した。
【０５５４】
【表３９Ａ】
2016501040.tif 000045
【０５５５】
【表３９Ｂ】
2016501040.tif 000046
【０５５６】
実施例７５：遺伝学的改変のための所定のヌクレオチドおよびアミノ酸配列
【０５５７】
【表４０−１】
2016501040.tif 000047
【０５５８】
【表４０−２】
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【０５５９】
【表４０−３】
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【０５６０】
【表４０−４】
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【０５６１】
【表４０−５】
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【０５６２】
【表４０−６】
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【０５６３】
【表４０−７】
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【０５６４】
【表４０−８】
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【０５６５】
【表４０−９】
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【０５６６】
【表４０−１０】
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【０５６７】
【表４０−１１】
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【０５６８】
【表４０−１２】
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【０５６９】
【表４０−１３】
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【０５７０】
【表４０−１４】
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【０５７１】
【表４０−１５】
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【０５７２】
【表４０−１６】
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【０５７３】
【表４０−１７】
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【０５７４】
【表４０−１８】
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【０５７５】
【表４０−１９】
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【０５７６】
【表４０−２０】
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【０５７７】
【表４０−２１】
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【０５７８】
【表４０−２２】
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【０５７９】
【表４０−２３】
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【０５８０】
【表４０−２４】
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【０５８１】
【表４０−２５】
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【０５８２】
【表４０−２６】
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【０５８３】
【表４０−２７】
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【０５８４】
【表４０−２８】
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【０５８５】
【表４０−２９】
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【０５８６】
【表４０−３０】
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【０５８７】
【表４０−３１】
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【０５８８】
【表４０−３２】
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【０５８９】
【表４０−３３】
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【０５９０】
【表４０−３４】
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【０５９１】
【表４０−３５】
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【０５９２】
【表４０−３６】
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【０５９３】
【表４０−３７】
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【０５９４】
【表４０−３８】
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【０５９５】
【表４０−３９】
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【０５９６】
【表４０−４０】
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【０５９７】
【表４０−４１】
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【０５９８】
【表４０−４２】
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【０５９９】
【表４０−４３】
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【０６００】
【表４０−４４】
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【０６０１】
【表４０−４５】
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【０６０２】
【表４０−４６】
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【０６０３】
【表４０−４７】
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【０６０４】
【表４０−４８】
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【０６０５】
【表４０−４９】
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【０６０６】
【表４０−５０】
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【０６０７】
【表４０−５１】
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【０６０８】
【表４０−５２】
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【０６０９】
【表４０−５３】
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【０６１０】
【表４０−５４】
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【０６１１】
【表４０−５５】
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【０６１２】
【表４０−５６】
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【０６１３】
【表４０−５７】
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【０６１４】
【表４０−５８】
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【０６１５】
【表４０−５９】
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【０６１６】
【表４０−６０】
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【０６１７】
【表４０−６１】
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【０６１８】
【表４０−６２】
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【０６１９】
【表４０−６３】
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【０６２０】
【表４０−６４】
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【０６２１】
【表４０−６５】
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【０６２２】
【表４０−６６】
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【０６２３】
【表４０−６７】
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【０６２４】
【表４０−６８】
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【０６２５】
【表４０−６９】
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【０６２６】
【表４０−７０】
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【０６２７】
【表４０−７１】
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【０６２８】
【表４０−７２】
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【０６２９】
【表４０−７３】
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【０６３０】
【表４０−７４】
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【０６３１】
【表４０−７５】
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【０６３２】
【表４０−７６】
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【０６３３】
【表４０−７７】
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【０６３４】
【表４０−７８】
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【０６３５】
【表４０−７９】
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【０６３６】
【表４０−８０】
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【０６３７】
【表４０−８１】
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【０６３８】
【表４０−８２】
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【０６３９】
【表４０−８３】
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【０６４０】
【表４０−８４】
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【０６４１】
【表４０−８５】
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【０６４２】
【表４０−８６】
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【０６４３】
【表４０−８７】
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【０６４４】
【表４０−８８】
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【０６４５】
【表４０−８９】
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【０６４６】
【表４０−９０】
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【０６４７】
【表４０−９１】
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【０６４８】
【表４０−９２】
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【０６４９】
【表４０−９３】
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【０６５０】
【表４０−９４】
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【０６５１】
【表４０−９５】
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【０６５２】
【表４０−９６】
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【０６５３】
【表４０−９７】
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【０６５４】
【表４０−９８】
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【０６５５】
【表４０−９９】
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【０６５６】
【表４０−１００】
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【０６５７】
【表４０−１０１】
2016501040.tif 000147
【０６５８】
【表４０−１０２】
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【０６５９】
【表４０−１０３】
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【０６６０】
【表４０−１０４】
2016501040.tif 000150
【０６６１】
【表４０−１０５】
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【０６６２】
【表４０−１０６】
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【０６６３】
【表４０−１０７】
2016501040.tif 000153
【０６６４】
【表４０−１０８】
2016501040.tif 000154
【０６６５】
【表４０−１０９】
2016501040.tif 000155
【０６６６】
【表４０−１１０】
2016501040.tif 000156
【０６６７】
【表４０−１１１】
2016501040.tif 000157
【０６６８】
【表４０−１１２】
2016501040.tif 000158
【０６６９】
【表４０−１１３】
2016501040.tif 000159
【０６７０】
【表４０−１１４】
2016501040.tif 000160
【０６７１】
【表４０−１１５】
2016501040.tif 000161
【０６７２】
【表４０−１１６】
2016501040.tif 000162
【０６７３】
【表４０−１１７】
2016501040.tif 000163
【０６７４】
【表４０−１１８】
2016501040.tif 000164
【０６７５】
【表４０−１１９】
2016501040.tif 000165
【０６７６】
【表４０−１２０】
2016501040.tif 000166
【０６７７】
【表４０−１２１】
2016501040.tif 000167
【０６７８】
【表４０−１２２】
2016501040.tif 000168
【０６７９】
【表４０−１２３】
2016501040.tif 000169
【０６８０】
【表４０−１２４】
2016501040.tif 000170
【０６８１】
【表４０−１２５】
2016501040.tif 000171
【０６８２】
【表４０−１２６】
2016501040.tif 000172
【０６８３】
【表４０−１２７】
2016501040.tif 000173
【０６８４】
【表４０−１２８】
2016501040.tif 000174
【０６８５】
【表４０−１２９】
2016501040.tif 000175
【０６８６】
【表４０−１３０】
2016501040.tif 000176
【０６８７】
【表４０−１３１】
2016501040.tif 000177
【０６８８】
【表４０−１３２】
2016501040.tif 000178
【０６８９】
【表４０−１３３】
2016501040.tif 000179
【０６９０】
【表４０−１３４】
2016501040.tif 000180
【０６９１】
【表４０−１３５】
2016501040.tif 000181
【０６９２】
【表４０−１３６】
2016501040.tif 000182
【０６９３】
【表４０−１３７】
2016501040.tif 000183
【０６９４】
【表４０−１３８】
2016501040.tif 000184
【０６９５】
【表４０−１３９】
2016501040.tif 000185
【０６９６】
【表４０−１４０】
2016501040.tif 000186
【０６９７】
実施例７６：本明細書で参照されたいくつかの株の説明
【０６９８】
【表４１】
2016501040.tif 000187
【０６９９】
注釈：小文字で記載されているか、および／または記号Δが付いている遺伝子は、欠失した遺伝子を示す。株ｓＡＡ６１７、ｓＡＡ６２０およびｓＡＡ６３２は、「ａｃｏａｔ」の１つの対立遺伝子の欠失を含み、ａｃｏａｔ遺伝子ノックアウトに関してヘテロ接合型である（例えば、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ−／＋）。
＊＊株ＡＡ２７８０は、内因性ＰＯＸ４遺伝子の欠失（すなわちｐｏｘ４Δ）およびＰＥＸ１１プロモーターの制御下に野生型ＰＯＸ４遺伝子の再導入（すなわち、ＰＯＸ４）を含む。
【０７００】
実施例７７：所定の非限定的な実施態様の例
Ａ１．ベータ酸化活性を実質的にブロックする１種またはそれより多くの遺伝学的改変と；
モノオキシゲナーゼ活性、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、チオエステラーゼ活性、アシルトランスフェラーゼ活性、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性、アシル−ｃｏＡオキシダーゼ活性、脂肪族アルコールオキシダーゼ活性、アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ活性、アルコールデヒドロゲナーゼ活性、ペルオキシソーム生合成因子活性、脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、ＣＴＦ、ＵＴＲ、ＦＡＴ１から選ばれる１種またはそれより多くの活性を増加させる１種またはそれより多くの遺伝学的改変と；
ＭＩＧ１活性を減少させる遺伝学的改変と
を含む、遺伝子改変酵母。
【０７０１】
Ａ２．前記１種またはそれより多くの遺伝学的改変が、ＣＹＰ５２Ａ１２のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＹＰ５２Ａ１３のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＹＰ５２Ａ１４のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＹＰ５２Ａ１５のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＹＰ５２Ａ１６のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＹＰ５２Ａ１７のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＹＰ５２Ａ１８のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＹＰ５２Ａ１９のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＹＰ５２Ａ２０のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＹＰ５２Ｄ２のモノオキシゲナーゼ活性およびＢＭ３のモノオキシゲナーゼ活性から選ばれる１つまたはそれより多くのモノオキシゲナーゼ活性を増加させる、実施態様Ａ１に記載の遺伝子改変酵母。
【０７０２】
Ａ３．前記１種またはそれより多くの遺伝学的改変が、ＣＰＲＡモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、ＣＰＲＢモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性およびＣＰＲ７５０モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性から選ばれる１つまたはそれより多くのモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性を増加させる、実施態様Ａ１またはＡ２に記載の遺伝子改変酵母。
【０７０３】
Ａ４．前記１種またはそれより多くの遺伝学的改変が、ＩＤＰ２イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性を増加させる、実施態様Ａ１〜Ａ３のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７０４】
Ａ５．前記１種またはそれより多くの遺伝学的改変が、ＧＤＰ１グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を増加させる、実施態様Ａ１〜Ａ４のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７０５】
Ａ６．前記１種またはそれより多くの遺伝学的改変が、ＺＷＦ１グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性およびＺＷＦ２グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性から選ばれる１種またはそれより多くのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を増加させる、実施態様Ａ１〜Ａ５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７０６】
Ａ７．前記１種またはそれより多くの遺伝学的改変が、ＦＡＯ１脂肪族アルコールオキシダーゼ活性、ＦＡＯ２Ａ脂肪族アルコールオキシダーゼ活性、ＦＡＯ２Ｂ脂肪族アルコールオキシダーゼ活性、ＦＡＯ１３脂肪族アルコールオキシダーゼ活性、ＦＡＯ１７脂肪族アルコールオキシダーゼ活性、ＦＡＯ１８脂肪族アルコールオキシダーゼ活性およびＦＡＯ２０脂肪族アルコールオキシダーゼ活性から選ばれる１種またはそれより多くの脂肪族アルコールオキシダーゼ活性を増加させる、実施態様Ａ１〜Ａ６のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７０７】
Ａ８．前記１種またはそれより多くの遺伝学的改変が、ＡＤＨ１アルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＡＤＨ２アルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＡＤＨ３アルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＡＤＨ４アルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＡＤＨ５アルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＡＤＨ７アルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＡＤＨ８アルコールデヒドロゲナーゼ活性およびＳＦＡアルコールデヒドロゲナーゼ活性から選ばれる１種またはそれより多くのアルコールデヒドロゲナーゼ活性を増加させる、実施態様Ａ１〜Ａ７のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７０８】
Ａ９．前記１種またはそれより多くの遺伝学的改変が、ＡＣＨ−Ａアシル−ＣｏＡヒドロラーゼ活性およびＡＣＨ−Ｂアシル−ＣｏＡヒドロラーゼ活性から選ばれる１種またはそれより多くのアシル−ＣｏＡヒドロラーゼ活性を増加させる、実施態様Ａ１〜Ａ８のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７０９】
Ａ１０．前記１種またはそれより多くの遺伝学的改変が、アシル−ＣｏＡステロールアシルトランスフェラーゼ活性、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性およびリン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性から選ばれる１種またはそれより多くのアシルトランスフェラーゼ活性を増加させる、実施態様Ａ１〜Ａ９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７１０】
Ａ１１．１種またはそれより多くのアシルトランスフェラーゼ活性が、ＡＲＥ１アシル−ＣｏＡステロールアシルトランスフェラーゼ活性、ＡＲＥ２アシル−ＣｏＡステロールアシルトランスフェラーゼ活性、ＤＧＡ１ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性、およびＬＲＯ１リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性から選ばれる、実施態様Ａ１０に記載の遺伝子改変酵母。
【０７１１】
Ａ１２．前記１種またはそれより多くの遺伝学的改変が、アシル−ｃｏＡチオエステラーゼ活性を増加させる、実施態様Ａ１〜Ａ１１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７１２】
Ａ１３．アシル−ｃｏＡチオエステラーゼ活性が、ＴＥＳＡアシル−ｃｏＡチオエステラーゼ活性である、実施態様Ａ１２に記載の遺伝子改変酵母。
【０７１３】
Ａ１４．前記１種またはそれより多くの遺伝学的改変が、ＰＥＸ１１ペルオキシソーム生合成因子活性を増加させる、実施態様Ａ１〜Ａ１３のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７１４】
Ａ１５．前記１種またはそれより多くの遺伝学的改変が、ＨＦＤ１脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性およびＨＦＤ２脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性から選ばれる１種またはそれより多くの脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を増加させる、実施態様Ａ１〜Ａ１４のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７１５】
Ａ１６．前記１種またはそれより多くの遺伝学的改変が、ＰＯＸ５アシル−ｃｏＡオキシダーゼ活性を増加させる、実施態様Ａ１〜Ａ１５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７１６】
Ａ１７．前記１種またはそれより多くの遺伝学的改変が、モノオキシゲナーゼ活性およびモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性を増加させる、実施態様Ａ１〜Ａ１６のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７１７】
Ａ１８．前記１種またはそれより多くの遺伝学的改変が、ＣＹＰ５２Ａ１９のモノオキシゲナーゼ活性およびＣＰＲＢモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性を増加させる、実施態様Ａ１７に記載の遺伝子改変酵母。
【０７１８】
Ａ１９．前記１種またはそれより多くの遺伝学的改変が、ＣＹＰ５２Ａ１４のモノオキシゲナーゼ活性およびＣＰＲＢモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性を増加させる、実施態様Ａ１７に記載の遺伝子改変酵母。
【０７１９】
Ａ２０．前記１種またはそれより多くの遺伝学的改変が、モノオキシゲナーゼ活性、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、およびイソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性を増加させる、実施態様Ａ１〜Ａ１９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７２０】
Ａ２１．前記１種またはそれより多くの遺伝学的改変が、ＣＹＰ５２Ａ１９のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＰＲＢモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、およびＩＤＰ２イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性を増加させる、実施態様Ａ２０に記載の遺伝子改変酵母。
【０７２１】
Ａ２２．前記１種またはそれより多くの遺伝学的改変が、モノオキシゲナーゼ活性、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を増加させる、実施態様Ａ１〜Ａ２１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７２２】
Ａ２３．前記１種またはそれより多くの遺伝学的改変が、ＣＹＰ５２Ａ１９のモノオキシゲナーゼ活性、ＣＰＲＢモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、およびＺＷＦ１グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を増加させる、実施態様Ａ２２に記載の遺伝子改変酵母。
【０７２３】
Ａ２４．モノオキシゲナーゼ活性が、配列番号５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０および６１から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドによる、実施態様Ａ１〜Ａ２３のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７２４】
Ａ２５．前記ポリペプチドが、配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３および２４から選ばれるポリヌクレオチドによってコードされている、実施態様Ａ２４に記載の遺伝子改変酵母。
【０７２５】
Ａ２６．モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性が、配列番号２８、６３、６４および６５から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドによる、実施態様Ａ１〜Ａ２５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７２６】
Ａ２７．前記ポリペプチドが、配列番号２４、２５、２６および２７から選ばれるポリヌクレオチドによってコードされている、実施態様Ａ２６に記載の遺伝子改変酵母。
【０７２７】
Ａ２８．チオエステラーゼ活性が、配列番号３８のアミノ酸配列を含むポリペプチドによる、実施態様Ａ１〜Ａ２７のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７２８】
Ａ２９．前記ポリペプチドが、配列番号３７のポリヌクレオチドによってコードされている、実施態様Ａ２８に記載の遺伝子改変酵母。
【０７２９】
Ａ３０．アシルトランスフェラーゼ活性が、配列番号４４、４６、４８および５０から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドによる、実施態様Ａ１〜Ａ２９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７３０】
Ａ３１．前記ポリペプチドが、配列番号４３、４５、４７および４９から選ばれるポリヌクレオチドによってコードされている、実施態様Ａ３０に記載の遺伝子改変酵母。
【０７３１】
Ａ３２．イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性が、配列番号６７、６９または１００のアミノ酸配列を含むポリペプチドによる、実施態様Ａ１〜Ａ３１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７３２】
Ａ３３．前記ポリペプチドが、配列番号６８、７０または９９のポリヌクレオチドによってコードされている、実施態様Ａ３２に記載の遺伝子改変酵母。
【０７３３】
Ａ３４．グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性が、配列番号７２のアミノ酸配列を含むポリペプチドによる、実施態様Ａ１〜Ａ３３のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７３４】
Ａ３５．前記ポリペプチドが、配列番号７１のポリヌクレオチドによってコードされている、実施態様Ａ３４に記載の遺伝子改変酵母。
【０７３５】
Ａ３６．グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性が、配列番号７４、７６または１５７のアミノ酸配列を含むポリペプチドによる、実施態様Ａ１〜Ａ３５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７３６】
Ａ３７．前記ポリペプチドが、配列番号７３または７５のポリヌクレオチドによってコードされている、実施態様Ａ３６に記載の遺伝子改変酵母。
【０７３７】
Ａ３８．アシル−ｃｏＡオキシダーゼ活性が、配列番号３２のアミノ酸配列を含むポリペプチドによる、実施態様Ａ１〜Ａ３７のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７３８】
Ａ３９．前記ポリペプチドが、配列番号３１のポリヌクレオチドによってコードされている、実施態様Ａ３８に記載の遺伝子改変酵母。
【０７３９】
Ａ４０．脂肪族アルコールオキシダーゼ活性が、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１３２および１３４から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドによる、実施態様Ａ１〜Ａ３９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７４０】
Ａ４１．前記ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１３１および１３３から選ばれるポリヌクレオチドによってコードされている、実施態様Ａ４０に記載の遺伝子改変酵母。
【０７４１】
Ａ４２．アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ活性が、配列番号３４および３６から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドによる、実施態様Ａ１〜Ａ４１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７４２】
Ａ４３．前記ポリペプチドが、配列番号３３および３５から選ばれるポリヌクレオチドによってコードされている、実施態様Ａ４２に記載の遺伝子改変酵母。
【０７４３】
Ａ４４．アルコールデヒドロゲナーゼ活性が、配列番号１２９、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１５２および１５４から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドによる、実施態様Ａ１〜Ａ４３のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７４４】
Ａ４５．前記ポリペプチドが、配列番号１３０、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１５３および１５５から選ばれるポリヌクレオチドによってコードされている、実施態様Ａ４４に記載の遺伝子改変酵母。
【０７４５】
Ａ４６．ペルオキシソーム生合成因子活性が、配列番号９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドによる、実施態様Ａ１〜Ａ４５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７４６】
Ａ４７．前記ポリペプチドが、配列番号９５のポリヌクレオチドによってコードされている、実施態様Ａ４６に記載の遺伝子改変酵母。
【０７４７】
Ａ４８．脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が、配列番号１３９および１４１から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドによる、実施態様Ａ１〜Ａ４７のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７４８】
Ａ４９．前記ポリペプチドが、配列番号１４０および１４２から選ばれるポリヌクレオチドによってコードされている、実施態様Ａ４８に記載の遺伝子改変酵母。
【０７４９】
Ａ５０．アシル−ｃｏＡシンセターゼ活性を減少させる１種またはそれより多くの遺伝学的改変を含む、実施態様Ａ１〜Ａ４９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７５０】
Ａ５１．前記１種またはそれより多くの遺伝学的改変が、ＡＣＳ１アシル−ｃｏＡシンセターゼ活性およびＦＡＴ１長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性から選ばれる１種またはそれより多くのアシル−ｃｏＡシンセターゼ活性を減少させる、実施態様Ａ５０に記載の遺伝子改変酵母。
【０７５１】
Ａ５２．前記１種またはそれより多くの遺伝学的改変が、アシル−ｃｏＡシンセターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を破壊する、実施態様Ａ５０またはＡ５１に記載の遺伝子改変酵母。
【０７５２】
Ａ５３．前記アシル−ｃｏＡシンセターゼ活性が、配列番号４０、４２、８０、８２、８４、９０、１５８および１５９から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドによる、実施態様Ａ５０〜Ａ５２のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７５３】
Ａ５４．前記ポリペプチドが、配列番号３９、４１、７９、８１、８３および８９から選ばれるポリヌクレオチドによってコードされている、実施態様Ａ５３に記載の遺伝子改変酵母。
【０７５４】
Ａ５５．カンジダ種の酵母である、実施態様Ａ１〜Ａ５４のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７５５】
Ａ５６．前記カンジダ種の酵母が、Ｃ．トロピカリスおよびＣ．ビスワナチイから選ばれる、実施態様Ａ５５に記載の遺伝子改変酵母。
【０７５６】
Ａ５７．前記カンジダ種の酵母が、遺伝子改変ＡＴＣＣ２０３３６酵母である、実施態様Ａ５６に記載の遺伝子改変酵母。
【０７５７】
Ａ５８．ヤロウイア種の酵母、ピチア種の酵母、サッカロミセス種の酵母およびクルイベロマイセス種の酵母から選ばれる、実施態様Ａ１〜Ａ５７のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７５８】
Ａ５９．Ｙ.リポリチカ（Y. lipolytica）、Ｐ．パストリス（P. pastoris）、Ｐ．メンブラニファシエンス（P. membranifaciens）、Ｐ．クルベリ（P. kluyveri）、Ｐ．ギリエルモンジイ（P. guilliermondii）、Ｐ．ヒーディ（P. heedii）、Ｐ．サブペリキュローサ（P. subpelliculosa）、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）、Ｓ．バヤヌス（S. bayanus）、Ｓ．パストリアヌス（S. pastorianus）、Ｓ．カールスベルゲンシス（S. carlsbergensis）、Ｋ．ラクティス（K. lactis）およびＫ．マルキシアヌス（K. marxianus）から選ばれる、実施態様Ａ５８に記載の遺伝子改変酵母。
【０７５９】
Ａ６０．植物油からの１種またはそれより多くの成分を含む供給材料から二酸を生産することが可能な、実施態様Ａ１〜Ａ５９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７６０】
Ａ６１．前記二酸が、Ｃ４〜Ｃ２４の二酸である、実施態様Ａ６０に記載の遺伝子改変酵母。
【０７６１】
Ａ６２．前記二酸が、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０の二酸である、実施態様Ａ６１に記載の遺伝子改変酵母。
【０７６２】
Ａ６２．１．前記二酸が、Ｃ１０の二酸である、実施態様Ａ６２に記載の遺伝子改変酵母。
【０７６３】
Ａ６３．前記二酸が、Ｃ１２の二酸である、実施態様Ａ６２に記載の遺伝子改変酵母。
【０７６４】
Ａ６４．前記二酸が、Ｃ１８の二酸である、実施態様Ａ６２に記載の遺伝子改変酵母。
【０７６５】
Ａ６５．前記二酸が、不飽和を含有しない、実施態様Ａ６０〜Ａ６４のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７６６】
Ａ６６．前記二酸が、１つまたはそれより多くの不飽和を含有する、実施態様Ａ６０〜Ａ６４のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７６７】
Ａ６７．前記二酸が、二酸の混合物中の主な二酸である、実施態様Ａ６０〜Ａ６６のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７６８】
Ａ６８．前記供給材料が、実質的に純粋な油を含む、実施態様Ａ６０〜Ａ６７のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７６９】
Ａ６９．前記供給材料が、複数の脂肪酸を含む、実施態様Ａ６０〜Ａ６８のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７７０】
Ａ７０．前記供給材料が、石鹸原料を含む、実施態様Ａ６９に記載の遺伝子改変酵母。
【０７７１】
Ａ７１．前記供給材料が、脂肪酸蒸留物を含む、実施態様Ａ６９に記載の遺伝子改変酵母。
【０７７２】
Ａ７２．前記植物油が、パーム、パーム核、ヤシ、ダイズ、ベニバナ、キャノーラまたはそれらの組み合わせから選ばれる植物由来である、実施態様Ａ６０〜Ａ７１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７７３】
Ａ７３．活性を増加させる遺伝学的改変が、該活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの複数のコピーを前記酵母に取り込むことを含む、実施態様Ａ１〜Ａ７３のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７７４】
Ａ７４．活性を増加させる遺伝学的改変が、該活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結されたプロモーターを前記酵母に取り込むことを含む、実施態様Ａ１〜Ａ７３のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
【０７７５】
Ａ７５．前記プロモーターが、前記酵母にとって天然である、実施態様Ａ７４に記載の遺伝子改変酵母。
【０７７６】
Ａ７６．前記プロモーターが、ＰＯＸ４プロモーター、ＰＥＸ１１プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、ＰＧＫプロモーターおよびＦＡＯ１プロモーターから選ばれる、実施態様Ａ７４またはＡ７５に記載の遺伝子改変酵母。
【０７７７】
Ａ７７．前記プロモーターが、配列番号１６２、１６５、１６６、１６７および１６９から選ばれるポリヌクレオチドを含む、実施態様Ａ７６に記載の遺伝子改変酵母。
【０７７８】
Ｂ１．二酸を生産する方法であって、
実施態様Ａ１〜Ａ７７のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母を、該酵母により二酸に変換可能な供給材料と接触させることと；
該供給材料から二酸が生産される条件下で該酵母を培養することと
を含む、上記方法。
【０７７９】
Ｂ２．前記供給材料が、植物油からの１種またはそれより多くの成分を含む、実施態様Ｂ１に記載の方法。
【０７８０】
Ｂ３．前記二酸が、Ｃ４〜Ｃ２４の二酸である、実施態様Ｂ１またはＢ２に記載の方法。
【０７８１】
Ｂ４．前記二酸が、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０の二酸である、実施態様Ｂ３に記載の方法。
【０７８２】
Ｂ５．前記二酸が、Ｃ１０の二酸である、実施態様Ｂ４に記載の方法。
【０７８３】
Ｂ６．前記二酸が、Ｃ１２の二酸である、実施態様Ｂ４に記載の方法。
【０７８４】
Ｂ７．前記二酸が、Ｃ１８の二酸である、実施態様Ｂ４に記載の方法。
【０７８５】
Ｂ８．前記二酸が、不飽和を含有しない、実施態様Ｂ１〜Ｂ７のいずれか一項に記載の方法。
【０７８６】
Ｂ９．前記二酸が、１つまたはそれより多くの不飽和を含有する、実施態様Ｂ１〜Ｂ７のいずれか一項に記載の方法。
【０７８７】
Ｂ１０．前記二酸が、二酸の混合物中の主な二酸である、実施態様Ｂ１〜Ｂ９のいずれか一項に記載の方法。
【０７８８】
Ｂ１１．前記供給材料が、実質的に純粋な油を含む、実施態様Ｂ１〜Ｂ１０のいずれか一項に記載の方法。
【０７８９】
Ｂ１２．前記供給材料が、複数の脂肪酸を含む、実施態様Ｂ１〜Ｂ１０のいずれか一項に記載の方法。
【０７９０】
Ｂ１３．前記供給材料が、石鹸原料を含む、実施態様Ｂ１２に記載の方法。
【０７９１】
Ｂ１４．前記供給材料が、脂肪酸蒸留物を含む、実施態様Ｂ１２に記載の方法。
【０７９２】
Ｂ１５．前記植物油が、パーム、パーム核、ヤシ、ダイズ、ベニバナ、キャノーラまたはそれらの組み合わせから選ばれる植物由来である、実施態様Ｂ１〜Ｂ１４のいずれか一項に記載の方法。
【０７９３】
Ｂ１６．前記供給材料が、脂肪酸メチルエステルを含む、実施態様Ｂ１〜Ｂ８のいずれか一項に記載の方法。
【０７９４】
Ｂ１７．前記脂肪酸メチルエステルが、ラウリン酸メチルであり、前記二酸が、ドデカン二酸を含む、実施態様Ｂ１６に記載の方法。
【０７９５】
Ｂ１８．前記供給材料が、脂肪酸エチルエステルを含み、前記二酸が、ドデカン二酸を含む、実施態様Ｂ１〜Ｂ８のいずれか一項に記載の方法。
【０７９６】
Ｂ１９．前記供給材料が、ラウリン酸を含み、前記二酸が、ドデカン二酸を含む、実施態様Ｂ１〜Ｂ８のいずれか一項に記載の方法。
【０７９７】
Ｂ２０．前記供給材料が、カプリン酸エチルを含み、前記二酸が、セバシン酸を含む、実施態様Ｂ１〜Ｂ８のいずれか一項に記載の方法。
【０７９８】
Ｃ１．酵母に対し毒性の供給材料から酵母によって二酸を生産する方法であって、
（ａ）培養状態の遺伝子改変酵母を、該酵母に対し実質的に毒性ではない供給材料と接触させることによって、誘導を行うことと；
（ｂ）（ａ）で誘導した後の該酵母を、該酵母に対し毒性の供給材料と接触させることと
を含み、それにより、誘導が行われない場合に該酵母に対し毒性の供給材料から生産される二酸の量より多くの量で、該酵母に対し毒性の供給材料から該酵母によって二酸が生産される、上記方法。
【０７９９】
Ｃ２．前記酵母に対し実質的に毒性ではない供給材料が、前記酵母に対し毒性の供給材料と同じ数の炭素を有する、実施態様Ｃ１に記載の方法。
【０８００】
Ｃ３．前記酵母に対し実質的に毒性ではない供給材料が、前記酵母に対し毒性の供給材料と比較して異なる数の炭素を有する、実施態様Ｃ１に記載の方法。
【０８０１】
Ｃ４．前記酵母に対し実質的に毒性ではない供給材料が、脂肪酸メチルエステルを含む、実施態様Ｃ１〜Ｃ３のいずれか一項に記載の方法。
【０８０２】
Ｃ５．前記酵母に対し実質的に毒性ではない供給材料が、遊離脂肪酸を含む、実施態様Ｃ１〜Ｃ３のいずれか一項に記載の方法。
【０８０３】
Ｃ６．前記酵母に対し実質的に毒性ではない供給材料が、１２個より多くの炭素を含む、実施態様Ｃ１〜Ｃ５のいずれか一項に記載の方法。
【０８０４】
Ｄ１．配列番号１４８または１５０のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８０５】
Ｄ２．前記ポリヌクレオチドが、配列番号１４７または１４９のヌクレオチド配列を含む、実施態様Ｄ１に記載の単離された核酸。
【０８０６】
Ｄ３．配列番号３７のヌクレオチド配列、または配列番号３７に対して７５％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８０７】
Ｄ４．配列番号４４のポリペプチド；配列番号４４に対して７１％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または１〜５つのアミノ酸置換を有する配列番号４４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８０８】
Ｄ５．前記ポリヌクレオチドが、配列番号４３のヌクレオチド配列、または配列番号４３に対して６９％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様Ｄ４に記載の単離された核酸。
【０８０９】
Ｄ６．配列番号４６のポリペプチド；配列番号４６に対して７１％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または１〜５つのアミノ酸置換を有する配列番号４６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８１０】
Ｄ７．前記ポリヌクレオチドが、配列番号４５のヌクレオチド配列、または配列番号４５に対して７０％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様Ｄ６に記載の単離された核酸。
【０８１１】
Ｄ８．配列番号４８のポリペプチド；配列番号４８に対して８７％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または１〜５つのアミノ酸置換を有する配列番号４８のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８１２】
Ｄ９．前記ポリヌクレオチドが、配列番号４７のヌクレオチド配列、または配列番号４７に対して７８％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様Ｄ８に記載の単離された核酸。
【０８１３】
Ｄ１０．配列番号５０のポリペプチド；配列番号５０に対して８０％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または１〜５つのアミノ酸置換を有する配列番号５０のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８１４】
Ｄ１１．前記ポリヌクレオチドが、配列番号４９のヌクレオチド配列、または配列番号４９に対して７５％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様Ｄ１０に記載の単離された核酸。
【０８１５】
Ｄ１２．配列番号６７のポリペプチド；配列番号６７に対して９９％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または１〜５つのアミノ酸置換を有する配列番号６７のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８１６】
Ｄ１３．前記ポリヌクレオチドが、配列番号６８のヌクレオチド配列、または配列番号６８に対して９７％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様Ｄ１２に記載の単離された核酸。
【０８１７】
Ｄ１４．配列番号７４のポリペプチド；配列番号７４に対して９９％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または１〜５つのアミノ酸置換を有する配列番号７４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８１８】
Ｄ１５．前記ポリヌクレオチドが、配列番号７３のヌクレオチド配列、または配列番号７３に対して９７％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様Ｄ１４に記載の単離された核酸。
【０８１９】
Ｄ１６配列番号７６のポリペプチド；配列番号７６に対して９９％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または１〜５つのアミノ酸置換を有する配列番号７６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８２０】
Ｄ１７．前記ポリヌクレオチドが、配列番号７５のヌクレオチド配列、または配列番号７５に対して９９％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様Ｄ１６に記載の単離された核酸。
【０８２１】
Ｄ１８．配列番号３のポリペプチド；配列番号３に対して９９％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または１〜５つのアミノ酸置換を有する配列番号３のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８２２】
Ｄ１９．前記ポリヌクレオチドが、配列番号２のヌクレオチド配列、または配列番号２に対して９９％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様Ｄ１８に記載の単離された核酸。
【０８２３】
Ｄ２０．配列番号５のポリペプチド；配列番号５に対して９９％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または１〜５つのアミノ酸置換を有する配列番号５のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８２４】
Ｄ２１．前記ポリヌクレオチドが、配列番号４のヌクレオチド配列、または配列番号４に対して９８％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様Ｄ２０に記載の単離された核酸。
【０８２５】
Ｄ２２．配列番号７のポリペプチド；配列番号７に対して９９％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または１〜５つのアミノ酸置換を有する配列番号７のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８２６】
Ｄ２３．前記ポリヌクレオチドが、配列番号６のヌクレオチド配列、または配列番号６に対して９９％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様Ｄ２２に記載の単離された核酸。
【０８２７】
Ｄ２４．配列番号３４のポリペプチド；配列番号３４に対して９５％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または１〜５つのアミノ酸置換を有する配列番号３４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８２８】
Ｄ２５．前記ポリヌクレオチドが、配列番号３３のヌクレオチド配列、または配列番号３３に対して７３％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様Ｄ２４に記載の単離された核酸。
【０８２９】
Ｄ２６．配列番号３６のポリペプチド；配列番号３６に対して９４％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または１〜５つのアミノ酸置換を有する配列番号３６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８３０】
Ｄ２７．前記ポリヌクレオチドが、配列番号３５のヌクレオチド配列、または配列番号３５に対して７３％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様Ｄ３に記載の単離された核酸。
【０８３１】
Ｄ２８．配列番号１２９のポリペプチド；配列番号１２９に対して８９％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または１〜５つのアミノ酸置換を有する配列番号１２９のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８３２】
Ｄ２９．前記ポリヌクレオチドが、配列番号１３０のヌクレオチド配列、または配列番号１３０に対して８４％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様Ｄ２８に記載の単離された核酸。
【０８３３】
Ｄ３０．配列番号１１３のポリペプチド；配列番号１１３に対して８５％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または１〜５つのアミノ酸置換を有する配列番号１１３のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８３４】
Ｄ３１．前記ポリヌクレオチドが、配列番号１１４のヌクレオチド配列、または配列番号１１４に対して８４％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様Ｄ３０に記載の単離された核酸。
【０８３５】
Ｄ３２．配列番号１１５のポリペプチド；配列番号１１５に対して９７％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または１〜５つのアミノ酸置換を有する配列番号１１５のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８３６】
Ｄ３３．前記ポリヌクレオチドが、配列番号１１６のヌクレオチド配列、または配列番号１１６に対して８６％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様Ｄ３２に記載の単離された核酸。
【０８３７】
Ｄ３４．配列番号１１７のポリペプチド；配列番号１１７に対して８０％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または１〜５つのアミノ酸置換を有する配列番号１１７のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８３８】
Ｄ３５．前記ポリヌクレオチドが、配列番号１１８のヌクレオチド配列、または配列番号１１８に対して８０％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様Ｄ３４に記載の単離された核酸。
【０８３９】
Ｄ３６．配列番号１１９のポリペプチド；配列番号１１９に対して８４％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または１〜５つのアミノ酸置換を有する配列番号１１９のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８４０】
Ｄ３７．前記ポリヌクレオチドが、配列番号１２０のヌクレオチド配列、または配列番号１２０に対して７６％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様Ｄ３６に記載の単離された核酸。
【０８４１】
Ｄ３８．配列番号１２１のポリペプチド；配列番号１２１に対して８１％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または１〜５つのアミノ酸置換を有する配列番号１２１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８４２】
Ｄ３９．前記ポリヌクレオチドが、配列番号１２２のヌクレオチド配列、または配列番号１２２に対して７４％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様Ｄ３８に記載の単離された核酸。
【０８４３】
Ｄ４０．配列番号１２３のポリペプチド；配列番号１２３に対して９０％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または１〜５つのアミノ酸置換を有する配列番号１２３のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８４４】
Ｄ４１．前記ポリヌクレオチドが、配列番号１２４のヌクレオチド配列、または配列番号１２４に対して８２％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様Ｄ４０に記載の単離された核酸。
【０８４５】
Ｄ４２．配列番号１２５のポリペプチド；配列番号１２５に対して８０％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または１〜５つのアミノ酸置換を有する配列番号１２５のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８４６】
Ｄ４３．前記ポリヌクレオチドが、配列番号１２６のヌクレオチド配列、または配列番号１２６に対して７７％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様Ｄ４２に記載の単離された核酸。
【０８４７】
Ｄ４４．配列番号１２７のポリペプチド；配列番号１２７に対して８１％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または１〜５つのアミノ酸置換を有する配列番号１２７のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８４８】
Ｄ４５．前記ポリヌクレオチドが、配列番号１２８のヌクレオチド配列、または配列番号１２８に対して７８％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様Ｄ４４に記載の単離された核酸。
【０８４９】
Ｄ４６．配列番号９６のポリペプチド；配列番号９６に対して８５％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または１〜５つのアミノ酸置換を有する配列番号９６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８５０】
Ｄ４７．前記ポリヌクレオチドが、配列番号９５のヌクレオチド配列、または配列番号９５に対して７２％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様Ｄ４６に記載の単離された核酸。
【０８５１】
Ｄ４８．配列番号１３９のポリペプチド；配列番号１３９に対して７６％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または１〜５つのアミノ酸置換を有する配列番号１３９のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８５２】
Ｄ４９．前記ポリヌクレオチドが、配列番号１４０のヌクレオチド配列、または配列番号１４０に対して７７％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様Ｄ４８に記載の単離された核酸。
【０８５３】
Ｄ５０．配列番号１４１のポリペプチド；配列番号１４１に対して８３％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または１〜５つのアミノ酸置換を有する配列番号１４１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８５４】
Ｄ５１．前記ポリヌクレオチドが、配列番号１４２のヌクレオチド配列、または配列番号１４２に対して７３％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様Ｄ５０に記載の単離された核酸。
【０８５５】
Ｄ５２．配列番号９０のポリペプチド；配列番号９０に対して９５％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または１〜５つのアミノ酸置換を有する配列番号９０のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８５６】
Ｄ５３．前記ポリヌクレオチドが、配列番号８９のヌクレオチド配列、または配列番号８９に対して８１％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様Ｄ５２に記載の単離された核酸。
【０８５７】
Ｄ５４．配列番号４０のポリペプチド；配列番号４０に対して９２％より高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または１〜５つのアミノ酸置換を有する配列番号４０のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８５８】
Ｄ５５．前記ポリヌクレオチドが、配列番号３９のヌクレオチド配列、または配列番号３９に対して８４％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施態様Ｄ５４に記載の単離された核酸。
【０８５９】
Ｄ５６．配列番号１６６のヌクレオチド配列、または配列番号１６６に対して８４％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８６０】
Ｄ５７．配列番号１６７のヌクレオチド配列、または配列番号１６７に対して８５％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８６１】
Ｄ５８．配列番号１６４のヌクレオチド配列、または配列番号１６９に対して９２％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
【０８６２】
Ｄ５９．前記１〜５つのアミノ酸置換のうち少なくとも１つが、保存的である、実施態様Ｄ３〜Ｄ５８のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【０８６３】
Ｄ６０．前記１〜５つのアミノ酸置換のうち少なくとも１つが、非保存的である、実施態様Ｄ３〜Ｄ５８のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【０８６４】
Ｅ１．発現ベクターである、実施態様Ｄ１〜Ｄ６０のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【０８６５】
Ｅ２．実施態様Ｄ１〜Ｅ１のいずれか一項に記載の核酸を含む細胞。
【０８６６】
Ｅ３．細菌である、実施態様Ｅ２に記載の細胞。
【０８６７】
Ｅ４．酵母である、実施態様Ｅ２に記載の細胞。
【０８６８】
Ｅ５．カンジダ種の酵母である、実施態様Ｅ４に記載の細胞。
【０８６９】
Ｅ６．前記カンジダ種の酵母が、Ｃ．トロピカリスおよびＣ．ビスワナチイから選ばれる、実施態様Ｅ５に記載の細胞。
【０８７０】
Ｅ７．前記カンジダ種の酵母が、遺伝子改変ＡＴＣＣ２０３３６酵母である、実施態様Ｅ６に記載の細胞。
【０８７１】
Ｅ８．ヤロウイア種の酵母、ピチア種の酵母、サッカロミセス種の酵母およびクルイベロマイセス種の酵母から選ばれる、実施態様Ｅ４に記載の細胞。
【０８７２】
Ｅ９．Ｙ.リポリチカ、Ｐ．パストリス、Ｐ．メンブラニファシエンス、Ｐ．クルベリ、Ｐ．ギリエルモンジイ、Ｐ．ヒーディ、Ｐ．サブペリキュローサ、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．バヤヌス、Ｓ．パストリアヌス、Ｓ．カールスベルゲンシス、Ｋ．ラクティスおよびＫ．マルキシアヌスから選ばれる、実施態様Ｅ８に記載の細胞。
【０８７３】
本明細書で参照された各特許、特許出願、出版物および文書の全体は、参照により本明細書に組み入れられる。上記の特許、特許出願、出版物および文書の引用は、前述の全てのものが関連する従来技術であることを承認するものではないし、またこれらの出版物または文書の内容もしくは日付に関するいかなる承認も構成しない。
【０８７４】
本技術の基本的な形態から逸脱することなく、前述のものに改変をなすことができる。１つまたはそれより多くの具体的な実施態様を参照しながら本技術を実質的に詳細に説明したが、当業者であれば、本出願において具体的に開示された実施態様を変化させることが可能であることをを認識しているものと予想され、これらの改変および向上は、本技術の範囲および本質の範囲内である。
【０８７５】
本明細書で例証として説明した技術は、好適には、本明細書で具体的に開示されていない何らかの要素が存在しなくても実施できる。したがって、例えば、本明細書におけるいずれの場合においても、「〜を含む」、「本質的に〜からなる」、および「〜からなる」という用語のどれかが、他の２つの用語のいずれかによって置き換えられてもよい。採用された用語および表現は、限定のためではなく説明のための用語として使用され、このような用語および表現の使用は、示され説明された特色またはそれらの部分のあらゆる等価体を排除せず、特許請求された技術の範囲内で様々な改変が可能である。用語「a」または「an」は、それが修飾する要素が１つかまたは複数であることを指す可能性がある（例えば、「試薬（a reagent）」は、文脈上、明らかにその要素のうちの１つか、または１つより多くの要素のどちらかが記載されていない限り、１種またはそれより多くの試薬を意味し得る。用語「約」は、本明細書で使用される場合、基礎となるパラメーターの１０％以内（すなわち、プラスまたはマイナス１０％）の値を指し、一連の値の始めにおける用語「約」の使用は、値のそれぞれを修飾する（すなわち、「約１、２および３」は、約１、約２および約３を指す）。例えば、「約１００グラム」の重量は、９０グラムと１１０グラムとの間の重さを包含する可能性がある。さらに、値の列挙が本明細書で記載される場合（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％または８６％）、その一覧は、それらの全ての中間の値および小数値（例えば、５４％、８５．４％）を包含する。したがって、本発明の技術は、代表的な実施態様および任意選択の特色によって具体的に開示されたが、当業者により本明細書で開示された概念の改変およびバリエーションが用いられてもよく、このような改変およびバリエーションは、本技術の範囲内とみなされることが理解されるものとする。
【０８７６】
本技術の所定の実施態様は、以下に示す特許請求の範囲に記載される。
【図１】
2016501040.tif 000188
【図２】
2016501040.tif 000189
【図３】
2016501040.tif 000190
【図４】
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【図５】
2016501040.tif 000192
【図６】
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【図７】
2016501040.tif 000194
【図８】
2016501040.tif 000195
【図９】
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【図１０】
2016501040.tif 000197
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2016501040.tif 000201
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３１】
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【図１１】
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【図１９】
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【図３０】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【国際調査報告】
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