(57)【要約】【課題】本開示の実施形態は、がんのための細胞療法への改善に関する。【解決手段】ある特定の実施形態では、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡張されたＴ細胞は、内因性ヘパラナーゼを発現せず、この効果の向上は、固形腫瘍のがん細胞療法を含めた、がん細胞療法のための改善を可能にする。特定の実施形態では、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡張されたＴ細胞は、組換えヘパラナーゼの発現を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパラナーゼの組換え発現を含むｅｘ  ｖｉｖｏで培養された細胞であって、該細胞内で内因性ヘパラナーゼが発現されないか、またはヘパラナーゼが組換え発現されると、ヘパラナーゼの既存の発現が過剰発現される、細胞。
【請求項２】
Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
ｅｘ  ｖｉｖｏで拡張されたＴ細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
腫瘍抗原特異的Ｔ細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）特異的Ｔ細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
細胞療法の有効性を改善する方法であって、該療法のための細胞を、ヘパラナーゼが発現されるように改変するステップを含む、方法。
【請求項７】
前記細胞が、内因性ヘパラナーゼを発現せず、前記改変するステップが、ヘパラナーゼの発現を回復させる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、内因性ヘパラナーゼを発現し、該ヘパラナーゼが、過剰発現される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、ＣＡＲ特異的Ｔ細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞療法が、がんのための細胞療法である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞療法が、固形腫瘍のための細胞療法である、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
個体におけるがんを処置する方法であって、治療用細胞の治療有効量を該個体に送達するステップを含み、該細胞が、ヘパラナーゼを組換え発現するｅｘ  ｖｉｖｏで培養された細胞である、方法。
【請求項１４】
前記細胞が、
１）内因性ヘパラナーゼを発現しないか、または
２）内因性ヘパラナーゼを発現し、組換え発現されたヘパラナーゼが、過剰発現される、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記がんが、固形腫瘍を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が、ＣＡＲ特異的Ｔ細胞である、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年３月５日出願の米国特許仮出願第６１／７７２，５９１号に基づく優先権を主張する。これらの出願はすべて、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記述
本発明は、ＮＣＩ／ＮＩＨによって与えられたＲ０１ＣＡ１４２６３６−０１、ならびに米国国防省によって与えられたＰＲ０９３８９２およびＷ８１ＸＷＨ−１０−１０４２５による政府資金提供を受けて行われた。政府は、本発明について一定の権利を有する。
【０００３】
本開示の実施形態は、少なくとも、細胞療法、免疫療法、分子生物学、細胞生物学、およびがん医学を含めた医学の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
がん患者のためのＴ細胞ベースの療法の臨床有効性は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または異所性α−ＴＣＲ鎖およびβ−ＴＣＲ鎖の発現を介して、それらの抗原特異性をリダイレクトすることを目的とする遺伝子改変によって、実質的に増大している（Ｐｕｌｅら、２００８；Ｋａｌｏｓら、２０１１；Ｍｏｒｇａｎら、２００６）。これらの腫瘍指向的Ｔ細胞は、リンパ系腫瘍では、有意な腫瘍負荷を有する患者においてさえ、高度に有効な処置であった（Ｋａｌｏｓら、２０１１；Ｒｏｏｎｅｙら、１９９５）が、それらの効果は一般に、神経芽細胞腫（ＮＢ）などの固形腫瘍ではそれほど顕著ではなく（Ｐｕｌｅら、２００８）、特に、患者が大きな腫瘍負荷を有する場合はそれほど顕著ではない。この制限は、部分的には、活動性腫瘍の免疫回避戦略に起因する可能性もあるが（Ｚｏｕ、２００５）、培養プロセス自体によって引き起こされる機能的な変化も、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養されたＴ細胞による腫瘍への浸透を低減する。
【０００５】
ＣＡＲ操作Ｔ細胞療法では、大半において、エフェクターＴ細胞およびエフェクター・メモリーＴ細胞を使用するが、これらは、それらの強力なエフェクター機能（Ｐｕｌｅら、２００８；Ｋａｌｏｓら、２０１１；Ｓａｖｏｌｄｏら、２０１１）に加えて、移動し、腫瘍部位に蓄積される能力を保持する必要がある。このような特性は、Ｔ細胞の内皮細胞への接着およびケモカイン−ケモカイン受容体間相互作用を含めた、複雑な一連の相互作用を伴い、その後、Ｔ細胞の、抗原に富む組織への溢出を調整する（Ｍｕｌｌｅｒ、２００３；Ｐａｒｉｓｈ、２００６；Ｙａｄａｃら、２００３）。このプロセスにおいて、Ｔリンパ球は、広範にわたる細胞の膜と会合する、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）を含めた、内皮下基底膜（ＢＭ）および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の主要な構成要素を、生理学的に分解する（Ｂｅｒｆｉｅｌｄら、１９９９）。ＥＣＭは、腫瘍微小環境のきわめて重要な構成要素であるので、このＴ細胞によるＨＳＰＧの分解プロセスも、固形腫瘍の有効な治療に必要とされる。
【０００６】
ＥＣＭの分解には、Ｔ細胞による分解酵素の放出が必須であり、このうちで、ヘパラナーゼ（ＨＰＳＥ）は、最も重要なものの１つであると考えられる。ＨＰＳＥは、ＨＳＰＧのヘパラン硫酸（ＨＳ）鎖を切断することができる、唯一公知の哺乳動物のβ−Ｄ−エンドグリコシダーゼである（Ｐａｒｉｓｈ、２００６；ｄｅ  Ｍｅｓｔｒｅら、２００７；Ｖｌｏｄａｖｓｋｙら、２００７；ＹｕｒｃｈｅｎｃｏおよびＳｃｈｉｔｔｎｙ、１９９０）。ＨＰＳＥは、約６５ｋＤａの不活性の前駆体タンパク質としてまず合成され、その後、二量体化して、活性のＨＰＳＥタンパク質を形成する、約８ｋＤａおよび約５０ｋＤａの２つのタンパク質サブユニットに切断される（Ｖｌｏｄａｖｓｋｙら、２００７）。ＨＰＳＥは、炎症にも大きく寄与し、活性化ＣＤ４＋Ｔリンパ球、好中球、単球、およびＢリンパ球によって大量に産生されると考えられる（Ｆｒｉｄｍａｎら、１９８７；Ｎａｐａｒｓｔｅｋら、１９８４；Ｖｌｏｄａｖｓｋｙら、１９９２）。リンパ球による組織浸潤の促進におけるこの役割と符合して、ＨＰＳＥは、実験による自己免疫性脳脊髄炎（ｄｅ  Ｍｅｓｔｒｅら、２００７）および自己免疫性関節炎（Ｐａｒｉｓｈ、２００６）においても重要な役割を果たす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＨＰＳＥは、炎症に関与しているが、腫瘍部位におけるＴ細胞浸潤の媒介へのその寄与は、依然として不明である。養子移入の前におけるＴ細胞の操作が、この酵素の産生にどのような効果を及ぼすのかも、知られていない。本開示は、当業界における、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡張された細胞など、治療用細胞の、固形腫瘍などのがんに有効である能力を強化する必要を満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、細胞療法と関連する方法および組成物を対象とする。特定の実施形態では、細胞療法は、ヒトを含めた哺乳動物など、細胞療法を必要とする個体のための細胞療法である。細胞療法は、任意の医学的状態に適しうるが、特定の実施形態では、細胞療法は、がんのための細胞療法である。がんは、任意の種類のがんでありうるが、特定の実施形態では、がんは、個体における１つまたは複数の固形腫瘍を含み、固形腫瘍は、良性であってもよく、悪性であってもよい。個体は、どのような年齢であってもよく、どちらの性別であってもよい。特定の実施形態では、個体は、がんを有するか、がんを有する危険性があるか、またはがんを有することが疑われることが知られている。がんは、原発性がんであってもよく、転移性がんであってもよく、がんは、処置に対して不応性でありうる。特定の実施形態では、がんは、例えば、乳がん、肺がん、脳腫瘍、結腸がん、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、甲状腺がん、骨がん、子宮頚がん、脾臓がん、肛門がん、食道がん、頭頸部がん、胃がん、胆嚢がん、黒色腫、非小細胞肺がん、リンパ腫、骨髄腫など、固形腫瘍の処置に関する。代わりの実施形態では、本開示は、白血病など、非固形腫瘍の処置に関する。
【０００９】
本開示の特定の実施形態は、細胞療法への改善を含めた、免疫療法への改善を提供する。特定の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞ベースの養子療法への改善を提供する。特定の態様では、本開示は、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡張されたＴ細胞など、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡張された細胞を利用する治療への改善を提供する。ある特定の態様では、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡張された細胞を、がんを有する個体のための細胞療法に利用する。特定の場合には、改善された、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡張された細胞を改変して、細胞が改変されなかった場合より有効となることを可能にする。改変細胞は、任意の様々な理由でより有効でありうるが、特定の実施形態では、改変細胞は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に浸透し、ＥＣＭ中の移動の改善も呈示することができる。ある特定の態様では、改変細胞は、ヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＥＣＭおよび細胞表面の主構成要素）を分解することができる（またはこれをより効果的に分解することができる）。ある特定の態様では、改変細胞は、内皮下基底膜に浸透することができる（またはこれによって効果的に浸透することができる）。本開示の実施形態では、改変細胞は、それらの無改変の対応物より大きな抗腫瘍効果を及ぼしうる。代わりの実施形態では、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡張された細胞は、ヘパラナーゼの発現が欠損しており、ヘパラナーゼの発現の充足は、細胞の抗腫瘍活性が改善されることを可能にするが、改善は、ＥＣＭへの浸透との関連が間接的であるか、またはこれと関連しない。
【００１０】
一態様では、無改変形態では、検出可能なヘパラナーゼを発現しないが、ヘパラナーゼを検出可能なレベルまで発現するように改変された免疫細胞を含む組成物が、本明細書において提供される。特定の態様では、免疫細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作されて内因性のヘパラナーゼ発現を喪失しているが、組換え技術を介して、ヘパラナーゼが発現されるように改変されており、例えば、このような遺伝子操作前の細胞のヘパラナーゼ発現より高度にヘパラナーゼが発現されるように改変されている。したがって、一態様では、ヘパラナーゼが発現されるように遺伝子操作された免疫細胞またはその活性断片が、本明細書において提供される。
【００１１】
本開示の実施形態は、ヘパラナーゼを発現し、大量の間質を有する固形腫瘍を含めた固形腫瘍に対して有効な改変Ｔ細胞を提供する。特定の実施形態では、改変Ｔ細胞は、腫瘍間質のＥＣＭを分解する。特定の態様では、ヘパラナーゼを発現する改変Ｔ細胞は、例えば、ヘパラナーゼを発現しないＴ細胞、または比較的低レベルのヘパラナーゼを発現するＴ細胞と比較して、Ｔ細胞溢出および腫瘍浸潤の能力が改善されている。
【００１２】
本開示の実施形態では、ヘパラナーゼの組換え発現を含むｅｘ  ｖｉｖｏで培養された細胞であって、細胞内で内因性ヘパラナーゼが発現されないか、またはヘパラナーゼが組換え発現されると、ヘパラナーゼの既存の発現が過剰発現される、細胞がある。特定の態様では、細胞は、なんらかの理由でヘパラナーゼをもたない可能性があるが、ある特定の態様では、細胞は、ヘパラナーゼ遺伝子プロモーターに因子が結合することによりヘパラナーゼを下方制御しており、ここで因子は、ある特定の実施形態において、ｐ５３である。特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞である。細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡張されたＴ細胞でありうる。細胞は、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞でありうる。ある特定の実施形態では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞は、免疫細胞を、特定の抗原、例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）を発現する標的細胞に標的化し、標的細胞を殺滅するように、免疫細胞を方向付けるポリペプチドを含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、キメラ抗原受容体または改変Ｔ細胞受容体である。別の特定の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、すなわち、ＣＡＲ−Ｔ細胞を含むＴ細胞である。
【００１３】
本開示の実施形態は、組換え技術による操作を介して、ヘパラナーゼを発現する細胞であって、そうでなく、組換え技術による操作がなければ、ヘパラナーゼを発現しない、細胞を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、ヘパラナーゼの発現の喪失を直接的または間接的にもたらす操作を経た免疫細胞を含んでいてもよく、ここで該細胞は、ヘパラナーゼが発現されるように改変されている。医薬組成物は、少なくとも水性担体を含めた、細胞のための担体組成物を含みうる。
【００１４】
本開示の実施形態では、細胞療法の有効性を改善する方法であって、該療法のための細胞を、ヘパラナーゼが発現されるように組換えにより改変するステップを含む、方法がある。特定の実施形態では、細胞は、内因性ヘパラナーゼを発現せず、改変するステップが、ヘパラナーゼの発現を回復させる。ある特定の実施形態では、細胞は、内因性ヘパラナーゼを発現し、ヘパラナーゼは、過剰発現される。細胞は、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞でありうる。細胞は、ＣＡＲ特異的Ｔ細胞でありうる。細胞は、操作されたＴ細胞受容体またはケモカイン受容体またはサイトカインなど、Ｔ細胞の移動または生存を改善することを目的とする他の改変を含みうる。
【００１５】
ＣＡＲまたは操作されたＴ細胞受容体が細胞内で発現される場合には、細胞は、それぞれのＣＡＲまたは操作されたＴ細胞受容体をコードするポリヌクレオチド（発現ベクターなど）を含みうる。細胞内のベクターは、ヘパラナーゼ、ＣＡＲ、操作されたＴ細胞受容体、またはこれらの組合せをコードする発現コンストラクトを含みうる。単一のベクターが、ヘパラナーゼ、ＣＡＲ、操作されたＴ細胞受容体、またはこれらの組合せをコードする発現コンストラクトを含んでもよく、複数のベクターが、ヘパラナーゼ、ＣＡＲ、操作されたＴ細胞受容体、またはこれらの組合せをコードする発現コンストラクトを含んでもよい。発現コンストラクトが、ヘパラナーゼ、ＣＡＲ、および操作されたＴ細胞受容体の２つ以上をコードする場合には、それらの発現の調節を、同じ調節エレメントで方向づけてもよく、異なる調節エレメントで方向づけてもよい。ある特定の実施形態では、ヘパラナーゼ、ＣＡＲ、および／または操作されたＴ細胞受容体の２つ以上は、個々のポリペプチドが切断可能なペプチド、例えば、２Ａペプチドによって分離された、単一のポリシストロニックのポリペプチドとして発現される。発現ベクターの例示の例には、プラスミドまたはウイルスベクターが含まれるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、細胞療法は、がんのための細胞療法であり、細胞療法は、固形腫瘍のための細胞療法でありうる。
【００１６】
特定の実施形態では、個体におけるがん（固形腫瘍を含めた）を処置する方法であって、前記がんを処置する、例えば、前記がんの成長を緩徐化させるか、前記がん中の腫瘍細胞の数を低減するか、腫瘍負荷を軽減するか、または前記がんを消失させるのに治療的に有効な量の治療用細胞を、個体に送達するステップを含み、細胞が、ヘパラナーゼを組換え発現するｅｘ  ｖｉｖｏで培養された細胞である、方法が提供される。特定の実施形態では、細胞は、１）内因性ヘパラナーゼを発現しないか、または２）内因性ヘパラナーゼを発現し、組換え発現されたヘパラナーゼが、過剰発現される。いくつかの場合には、内因性ヘパラナーゼは、その発現を増大させるように操作されるか、または外因性ヘパラナーゼが、細胞に添加される。ある特定の実施形態では、細胞は、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞でありうる。細胞は、ＣＡＲ特異的Ｔ細胞であってもよく、操作されたＴ細胞受容体を含んでもよい。特定の実施形態では、細胞療法は、がんのための細胞療法であり、細胞療法は、固形腫瘍のための細胞療法でありうる。
【００１７】
本明細書に記載の通り、養子移入された、腫瘍指向性Ｔ細胞によるヘパラナーゼの産生が研究され、固形腫瘍の処置のためのこれらの細胞の有効性の制限が、腫瘍ＥＣＭ内のＨＳＰＧを分解するそれらの能力の損耗から生じ、これが、腫瘍微小環境内の腫瘍細胞に到達することに成功するそれらの能力を制限するのかどうかが決定された。したがって、本開示のある特定の実施形態では、腫瘍特異的Ｔ細胞内で回復された、欠損したヘパラナーゼの発現は、それらの抗腫瘍効果、例えば、神経芽細胞腫モデルを含めた、適したモデルにおいて示されうる抗腫瘍効果など、固形腫瘍内の抗腫瘍効果を強化する。
【００１８】
ある実施形態では、ヘパラナーゼを組換え発現するｅｘ  ｖｉｖｏで培養された免疫細胞を含む組成物がある。特定の実施形態では、細胞は、内因性ヘパラナーゼを発現しない。特定の実施形態では、細胞は加えて、ヘパラナーゼを内因的に発現する。ある特定の実施形態では、内因性ヘパラナーゼの発現は、１つまたは複数の基準細胞内のレベルと比較して上方制御される。特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞である。特定の態様では、細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡張されたＴ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞である。一実施形態では、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む細胞を含め、細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。一実施形態では、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクターを含む。いくつかの場合では、発現ベクターは、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含み、ヘパラナーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。特定の実施形態では、細胞は、操作されたＴ細胞受容体を含む。いくつかの場合では、細胞は、操作されたＴ細胞受容体をコードするポリヌクレオチドを含む。特定の態様では、操作されたＴ細胞受容体をコードするポリヌクレオチドは、発現ベクターを含む。ある特定の実施形態では、発現ベクターは、操作されたＴ細胞受容体をコードし、かつ／またはヘパラナーゼをコードする。
【００１９】
一実施形態では、個体におけるがんを処置する方法であって、本開示の組成物の治療有効量を、個体に送達するステップを含む方法がある。特定の実施形態では、がんは、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）を含む細胞外マトリックスを含む。いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍を含み、腫瘍は、悪性であってもよく、悪性でなくてもよい。固形腫瘍は、肉腫、癌、またはリンパ腫でありうる。細胞は、個体に対して同種細胞であってもよく、個体に対して自己細胞であってもよい。細胞は、Ｔ細胞でありうる。いくつかの場合では、細胞は、ＣＡＲを含み、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含みうる。いくつかの実施形態では、細胞は、操作されたＴ細胞受容体を含み、細胞は、Ｔ細胞受容体をコードするポリヌクレオチドを含みうる。特定の実施形態では、がんを処置する方法は、化学療法、放射線照射、外科手術、ホルモン療法、および／または免疫療法など、１種または複数の追加のがん療法を個体に送達するステップをさらに含む。
【００２０】
一実施形態では、免疫細胞療法の有効性を改善する方法であって、ヘパラナーゼを組換え発現するように、免疫細胞を改変するステップを含む方法がある。特定の実施形態では、細胞は、内因性ヘパラナーゼを発現せず、改変するステップによって、細胞内のヘパラナーゼの発現が回復される。いくつかの実施形態では、細胞は加えて、ヘパラナーゼを内因的に発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞である。ある特定の実施形態では、免疫細胞療法の有効性を改善する方法は、細胞を、それを必要とする個体に送達するステップをさらに含む。いくつかの場合では、個体におけるがんは、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）を含む細胞外マトリックスを含む。いくつかの実施形態では、個体は、固形腫瘍を有する。特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。特定の実施形態では、細胞は、ＣＡＲを含み、細胞には、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含めることができる。いくつかの実施形態では、細胞は、操作されたＴ細胞受容体を含み、細胞は、Ｔ細胞受容体をコードするポリヌクレオチドを含みうる。特定の実施形態では、改変するステップは、ヘパラナーゼまたはヘパラナーゼ触媒性ドメインをコードするポリヌクレオチド、免疫細胞に送達することを含む。ある特定の実施形態では、改変するステップは、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを、免疫細胞に送達することをさらに含む。ある特定の実施形態では、ヘパラナーゼまたはヘパラナーゼ触媒性ドメインをコードするポリヌクレオチドは、ＣＡＲもコードする。特定の実施形態には、改変するステップが、操作されたＴ細胞受容体をコードするポリヌクレオチドを、免疫細胞に送達することをさらに含む、方法が含まれる。いくつかの実施形態では、ヘパラナーゼまたはヘパラナーゼ触媒性ドメインをコードするポリヌクレオチドは、操作されたＴ細胞受容体もコードする。
【００２１】
本開示の一実施形態には、細胞、ベクター、ヌクレオチドを含めた、本開示の任意の組成物を含むキットが含まれ、いくつかの態様では、キットは、化学療法、ホルモン療法、および／または免疫療法など、１種または複数の追加のがん治療剤をさらに含む。
【００２２】
後述の「発明を実施するための形態」をよりよく理解するために、上記で本発明の特徴および技術的な利点についてある程度広く概説した。本発明の請求の範囲の主題を形成する本発明のさらなる特徴および利点を、以下に記載する。当業者ならば、本開示の概念および具体的な実施形態は、本発明の同じ目的を実行するように他の構造を改変または設計するための基礎として容易に利用できることを理解するであろう。当業者ならば、そのような同等な構造は、添付の請求の範囲に記載される本発明の趣旨および範囲から逸脱しないことも認識するであろう。その構成および操作の方法の両方に関する、本発明の特色と考えられる新規な特徴は、さらなる目的および利点と併せて、添付の図面を参照して考慮した場合、以下の記述から、さらによく理解されるものと予想される。しかし、図面のそれぞれは、例示と説明のみを目的として提供されたものであって、本発明の限定を規定しないことが明示的に理解されるものと予想される。
【００２３】
本発明をよりいっそう理解するために、添付の図面と併せて考慮される以下の記述をここで参照する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ−１Ｅ】ｅｘ  ｖｉｖｏで拡張されたＴ細胞は、ＨＰＳＥの喪失のために、ＥＣＭへの浸潤の低減を示すことを実証する図である。パネルＡ：単球（ＣＤ１４＋細胞、黒色バー）、単離されたばかりのＴリンパ球（ＦＴ：ｆｒｅｓｈｌｙ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）（白色バー）、短時間活性化されたＴ細胞（ＢＡ−Ｔ）（グレーバー）、およびｅｘ  ｖｉｖｏで拡張されたＴ細胞（ＬＴＥ−Ｔ）（ストライプバー）のＥＣＭ浸潤アッセイ。データは、５回の独立の実験の平均±標準偏差（ＳＤ：ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）をまとめたものである。パネルＢ：異なる時点における、単球内、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋のＦＴ内、ＢＡ−Ｔ内、およびＬＴＥ−Ｔ内のＨＰＳＥの発現を示すウェスタンブロット。β−アクチン染色を使用して、試料の同等なローディングを確認した。データは、４種のドナーに由来する。培養の１４日目に、ＯＫＴ３／ＣＤ２８  Ａｂを使用して、ＬＴＥ−Ｔを再活性化し、その後、１５日目に解析した。野生型２９３Ｔ細胞またはヒトＨＰＳＥをトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を、それぞれ、陰性対照および陽性対照として使用した。パネルＣ：ＭＣＦ−７内、単球内、ＦＴ内、およびＬＴＥ−Ｔ内のＨＰＳＥについての代表的な免疫蛍光染色。核は、ＤＡＰＩで染色し、青色で示すが、ＨＰＳＥは、赤色蛍光色素（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５）で染色する。拡大率は、２０倍である。パネルＤ：ＣＤ４＋（黒色バー）およびＣＤ８＋（白色バー）のＦＴ内、ＢＡ−Ｔ内、およびＬＴＥ−Ｔ内のＨＰＳＥの定量的ＲＴ−ＰＣＲ。遺伝子発現の倍率変化は、単球に照らして計算した。データは、４回の独立の実験の平均±ＳＤをまとめたものである。培養の１４日目に、ＯＫＴ３／ＣＤ２８  Ａｂを使用して、Ｔ細胞を再活性化し、その後、１５日目に解析した。パネルＥ：ＨＰＳＥの酵素活性は、ＣＤ４＋（丸）およびＣＤ８＋（四角）のＦＴ、ＢＡ−Ｔ、およびＬＴＥ−Ｔから回収された上清中で評価した。培養の４および１４日目に、ＬＴＥ−Ｔを回収し、洗浄し、新鮮な培地中で再懸濁させた。１４日目に、ＯＫＴ３／ＣＤ２８  Ａｂを使用して、ＬＴＥ−Ｔを再活性化し、１５日目に解析した。開始時点（Ｔ＝０）の値には、培地中で４８〜７２時間にわたり休眠させた非活性化Ｔ細胞を使用した。ＨＰＳＥを放出することが知られた腫瘍細胞株ＣＨＬＡ−２５５、Ａ５４９、およびＤＵ−１４５を、陽性対照として使用して、アッセイ感度を推定した。４種の異なるドナーからプールされたＣＤ１４＋細胞の単球による溶解物も、陽性対照として使用した。
【００２５】
【図２Ａ−２Ｅ】ＨＰＳＥが発現されるように改変されたＬＴＥ−Ｔは、ＥＣＭを分解する能力を必要とすることを示す図である。ＬＴＥ−Ｔに、ＨＰＳＥおよびＧＦＰをコードするレトロウイルスベクター［ＨＰＳＥ（Ｉ）ＧＦＰ］を形質導入した。パネルＡ：培養の１２日目における、ＣＤ４＋ＬＴＥ−ＴおよびＣＤ８＋ＬＴＥ−Ｔの両方によるＧＦＰ発現。パネルＢ：対照ＬＴＥ−Ｔ内、ＨＰＳＥ（Ｉ）ＧＦＰ＋ＬＴＥ−Ｔ内、ヒトＭＳＣ内（陰性対照）、ＬＡＮ−１腫瘍細胞株内、ＣＨＬＡ−２５５腫瘍細胞株内、およびＡ５４９腫瘍細胞株内（陽性対照）のＨＰＳＥについてのｑＲＴ−ＰＣＲ。データは、３種のドナーの平均およびＳＤをまとめたものである。パネルＣ：培養の１２日目における、対照ＬＴＥ−Ｔ内および形質導入されたＬＴＥ−Ｔ内のＨＰＳＥの発現を示すＷＢ。β−アクチン染色を使用して、試料の同等なローディングを確認した。パネルＤ：ＧＦＰの発現に基づき選択を伴うかまたは伴わない、対照ＬＴＥ−ＴおよびＨＰＳＥ（Ｉ）ＧＦＰ＋ＬＴＥ−ＴのＥＣＭ浸潤アッセイ。データは、９種のドナーの平均±ＳＤをまとめたものである。パネルＥ：阻害剤ヘパリンＨ１の存在下または非存在下における、ＨＰＳＥを形質導入されたＬＴＥ−ＴのＥＣＭ浸潤アッセイ。データは、４回の実験の平均±標準偏差をまとめたものである。
【００２６】
【図３Ａ−３Ｇ】ＬＴＥ−Ｔにより共発現される、ＨＰＳＥおよびＧＤ２特異的ＣＡＲは、抗ＧＤ２特異性を保持し、ＥＣＭを分解する能力が強化されていることを示す図である。ＬＴＥ−Ｔに、ＧＤ２特異的ＣＡＲ単独をコードするレトロウイルスベクター（ＣＡＲ）、またはＧＤ２特異的ＣＡＲおよびＨＰＳＥの両方をコードするレトロウイルスベクター［ＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ］を形質導入した。パネルＡ：対照ＬＴＥ−Ｔおよび形質導入されたＬＴＥ−ＴによるＣＡＲ発現を検出するフローサイトメトリー解析。パネルＢ：対照ＬＴＥ−Ｔ内および形質導入されたＬＴＥ−Ｔ内のＨＰＳＥを検出するＷＢ。試料の同等なローディングを実証するβ−アクチン染色。パネルＣ：２０：１のエフェクター：標的比における５１Ｃｒ放出アッセイによって評価された、対照ＬＴＥ−Ｔ、ＣＡＲ＋ＬＴＥ−Ｔ、およびＣＡＲ＋ＨＰＳＥ＋ＬＴＥ−Ｔの細胞傷害活性。ＬＡＮ−１およびＣＨＬＡ−２５５（ＧＤ２＋）、ならびにＲａｊｉ（ＧＤ２−）を、標的細胞として使用した。パネルＤ：形質導入されたＬＴＥ−Ｔによる、ＧＤ２＋腫瘍細胞に応答した、ＩＬ−２およびＩＦＮγの両方の放出。パネルＥ：対照ＬＴＥ−Ｔ、ＣＡＲ＋ＬＴＥ−Ｔ、およびＣＡＲ＋ＨＰＳＥ＋ＬＴＥ−ＴによるＥＣＭへの浸潤。パネルＣ〜Ｅにおける全体的データは、４〜５種のドナーからの平均±ＳＤをまとめたものである。パネルＦ、Ｇ：対照ＬＴＥ−Ｔおよび形質導入されたＬＴＥ−Ｔは、ＥＣＭアッセイまたはインサートアッセイの上部にプレーティングしたが、ＬＡＮ−１／ＧＦＰ＋細胞は、下側チャンバーにプレーティングした。培養の３日後、下側チャンバー内の細胞を回収して、フローサイトメトリーによって、ＣＤ３＋Ｔ細胞およびＧＦＰ＋腫瘍細胞を定量化した。パネルＦは、代表的なドットプロットを示すが、パネルＧは、５種のドナーの平均±ＳＤをまとめたものである。
【００２７】
【図４Ａ−４Ｄ】ＨＰＳＥおよびＧＤ２−ＣＡＲを共発現するＴ細胞は、ＥＣＭの存在下における抗腫瘍活性が強化されていることを提示する図である。対照ＬＴＥ−ＴおよびＣＡＲまたはＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥをコードするレトロウイルスベクターを形質導入されたＬＴＥ−Ｔを、ＥＣＭアッセイの上部にプレーティングし、浸潤アッセイの下側チャンバーにプレーティングされた、ＬＡＮ１／ＧＦＰ＋細胞またはＣＨＬＡ−２２５／ＧＦＰ＋細胞を消失させるそれらの能力について評価した。Ｔ細胞および腫瘍細胞を、１５：１の比でプレーティングした。２４時間後、インサートおよびチャンバーを取り外し、培養の３日目に、浸潤細胞を回収し、抗ＣＤ３抗体で染色して、Ｔ細胞を同定し、腫瘍細胞によるＧＦＰ発現は、これらを、処置／浸潤の後におけるフローサイトメトリーによって数え上げて、抗腫瘍活性を評価することを可能にした。インサートだけを含有するアッセイ（黒色バー）を使用して、ＥＣＭの非存在下における、形質導入されたＴ細胞の抗腫瘍効果を評価した。パネルＡおよびＢは、ＬＡＮ１およびＣＨＬＡ−２２５のそれぞれの存在下における、培養物についてのフローサイトメトリー解析の代表的なドットプロットを示す。パネルＣおよびＤは、５回の独立の実験の平均±ＳＥをまとめたものである。
【００２８】
【図５Ａ−５Ｄ】ＣＡＲ−ＧＤ２＋ＨＰＳＥ＋ＬＴＥ−Ｔが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍浸潤の強化および２つの異種神経芽細胞腫マウスモデルにおける全体的生存の改善を示すことについての図である。パネルＡ：腫瘍細胞株ＣＨＬＡ−２５５を移植され、対照ＬＴＥ−Ｔ、ＣＡＲ＋ＬＴＥ−Ｔ、およびＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋ＬＴＥ−Ｔで処置されたマウスのカプラン−マイヤー解析。パネルＢ：腫瘍試料中で検出されたＣＤ３＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー解析。ドットプロットは、群１つ当たり３匹のマウスを表す。パネルＣ：腫瘍細胞株ＬＡＮ−１を移植され、対照ＬＴＥ−Ｔ、ＣＡＲ＋ＬＴＥ−Ｔ、およびＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋ＬＴＥ−Ｔで処置されたマウスのカプラン−マイヤー解析。パネルＤ：安楽死させたマウスから回収された腫瘍の重量。
【００２９】
【図６Ａ−６Ｃ】ＨＰＳＥの再発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＬＴＥ−Ｔの生体内分布に影響を及ぼさないことを示す図である。ＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋ＬＴＥ−ＴおよびＣＡＲ＋ＬＴＥ−Ｔを、ＧＦＰ．ＦＦｌｕｃをコードするベクターで標識し、その後、尾への注射を介して、ＮＯＧ−ＳＣＩＤマウスに注入した。Ｔ細胞の生体内分布は、ＬＴＥ−Ｔの注入後の表示の時点におけるｉｎ  ｖｉｖｏイメージングによって評価した（パネルＡ）。組織を、ＬＴＥ−Ｔの注入後１２または１９日目までに、注入されたマウスから回収し、ヘマトキシリンおよびエオシン（パネルＢ）および抗ＣＤ３抗体（パネルＣ）で染色した。２０倍の拡大率。ヒト扁桃腺切片を、ＣＤ３染色についての陽性対照として使用した。
【００３０】
【図７Ａ−７Ｂ】Ｔ細胞のサブセットを、ＰＢＭＣから単離し、刺激したことを示す図である。
【００３１】
【図８Ａ−８Ｂ】ヘパラナーゼの発現のための例示のコンストラクトおよび関連の対照を示す、活性化Ｔリンパ球を形質導入するのに使用されるレトロウイルスベクターの概略表示である。
【００３２】
【図９Ａ−９Ｄ】ｐ５３が、ＬＴＥ−Ｔ内で上方制御され、ＨＰＳＥプロモーターに結合することを示す図である。パネルＡ：培養後の異なる時点における、ＣＤ４＋Ｔ細胞内およびＣＤ８＋Ｔ細胞内のＨＰＳＥおよびｐ５３のｑＲＴ−ＰＣＲ。遺伝子発現の倍率変化は、Ｔ＝０に照らして計算した。データは、３回の独立の実験の平均±ＳＤをまとめたものである。パネルＢ：ＣＤ３＋ＦＩ−Ｔ内、ＣＤ３＋ＢＡ−Ｔ内、およびＣＤ３＋ＬＴＥ−Ｔ内のＨＰＳＥおよびｐ５３の発現を示すＷＢ。β−アクチン染色を使用して、試料の同等なローディングを確認した。パネルＣ、Ｄ：１４日目までの培養物中の、ＬＴＥ−Ｔ内（Ｃ）、ならびにＴＣＲ架橋の前（Ｔ＝０）および後（Ｔ＝７２時間後）におけるＣＤ４５ＲＡ＋細胞内（Ｄ）の、ｐ５３  ＣｈＩＰ。投入物は、ＤＮＡ超音波処理されているが、ＤＮＡ免疫沈降されてはいない。ＩｇＧおよびｐ５３を、それぞれ、アイソタイプＡｂおよびｐ５３特異的ＡｂでＤＮＡ免疫沈降する。ＩｇＧおよびｐ５３のＰＣＲバンドの強度を、投入物ＰＣＲバンドと比較して、相対定量化を実施した。この代表的な試料では、相対定量化は、ＬＴＥ−Ｔ（Ｃ）について、２０％のＩｇＧおよび９０％のｐ５３；ＣＤ４５ＲＡ＋細胞（Ｄ）について、Ｔ＝０では、２％のＩｇＧおよび４％のｐ５３、ならびにＴ＝７２時間後では、５３％のＩｇＧおよび１００％のｐ５３であった。
【００３３】
【図１０Ａ−１０Ｄ】腎臓内にＮＢ細胞を植え込まれたマウスにおける、ＣＡＲ−ＧＤ２＋ＨＰＳＥ＋ＬＴＥ−Ｔによる腫瘍浸潤の強化を示す図である。パネルＡ、Ｂ：ＣＡＲ＋ＬＴＥ−ＴまたはＣＡＲ−ＧＤ２＋ＨＰＳＥ＋ＬＴＥ−Ｔを注入されたマウスの腎臓内に植え込まれた腫瘍内のＣＤ３＋Ｔ細胞浸潤を示す免疫組織化学。１０倍の拡大率（Ａ）および２０倍の拡大率（Ｂ）。パネルＣ：ＣＡＲ＋ＬＴＥ−ＴまたはＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋ＬＴＥ−Ｔで処置されたマウスから回収された腫瘍内の、高倍率視野１０当たりの浸潤ＣＤ３＋Ｔ細胞の数の散布図。パネルＤ：ＣＡＲ＋ＬＴＥ−ＴまたはＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋ＬＴＥ−Ｔを注入された担がんマウスのカプラン−マイヤー解析。
【００３４】
【図１１】ＯＫＴ３／ＣＤ２８  Ａｂによる活性化後の異なる時点における、セントラル・メモリーＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ＋（ＣＭ）内およびエフェクター・メモリーＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ−（ＥＭ）内のＨＰＳＥの発現を示すウェスタンブロットである。β−アクチン染色を使用して、試料の同等なローディングを確認した。データは、不活性ＨＰＳＥ形態および活性ＨＰＳＥ形態の両方が検出可能な代表的ドナーに由来する。
【００３５】
【図１２Ａ−１２Ｂ】ＧＤ２特異的ＣＡＲで改変されたＬＴＥ−Ｔ内のＨＰＳＥの共発現が、ＥＣＭの存在下における抗腫瘍活性を強化することを示す図である。パネルＡ〜Ｂ：対照ＬＴＥ−Ｔおよび形質導入されたＬＴＥ−Ｔは、ＥＣＭアッセイまたはインサートアッセイの上部にプレーティングしたが、ＣＨＬＡ２５５／ＧＦＰ＋細胞は、下側チャンバーにプレーティングした。培養の３日後、下側チャンバー内の細胞を回収して、フローサイトメトリーによって、ＣＤ３＋Ｔ細胞およびＧＦＰ＋腫瘍細胞を定量化した。パネルＡは、ＣＨＬＡ２５５  ＧＦＰ＋腫瘍細胞によるアッセイの代表的なドットプロットを示すが、パネルＢは、５種のドナーの平均ＳＤをまとめたものである。
【００３６】
【図１３】ｐ５３の、ＨＰＳＥプロモーターへの結合を評価するＣｈＩＰ解析で使用されるプライマーのセットをまとめる表を提示する図である。プロモーターの起点に照らしたプライマーの位置も示す。５７〜２７７では、センスプライマーは、配列番号１を含み、アンチセンスプライマーは、配列番号２を含む。９７０〜１１６７では、センスプライマーは、配列番号３を含み、アンチセンスプライマーは、配列番号４を含む。１８１５〜２０３０では、センスプライマーは、配列番号５を含み、アンチセンスプライマーは、配列番号６を含む。２４０９〜２６８７では、センスプライマーは、配列番号７を含み、アンチセンスプライマーは、配列番号８を含む。２９７５〜３２７４では、センスプライマーは、配列番号９を含み、アンチセンスプライマーは、配列番号１０を含む。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
長年にわたる特許法の慣例に沿って、請求項を含め本明細書において、語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）という語と共に使用される場合、「１つまたは複数」を意味する。本開示のいくつかの実施形態は、開示の１種または複数の要素、方法ステップ、および／または方法からなるか、本質的になるものでありうる。本明細書に記載のいずれの方法または組成物も、本明細書に記載の任意の他の方法または組成物に関して実行できることが企図されている。
【００３８】
本明細書で使用される、用語「約」または「およそ」は、基準の量、レベル、値、数、頻度、百分率、大きさ、サイズ、量、重量、または長さに照らして最大で３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％変化する、数量、レベル、値、数、頻度、百分率、大きさ、サイズ、量、重量、または長さを指す。特定の実施形態では、数値に先行する場合の用語「約」または「およそ」は、±１５％、１０％、５％、または１％の範囲の値を指す。
【００３９】
本明細書を通して、文脈によりそうでないことが必要とされない限り、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、言明されたステップまたは要素またはステップもしくは要素の群の包含を含意し、任意の他のステップまたは要素またはステップもしくは要素の群の除外を含意しないことが理解されるであろう。「からなる」には、語句「からなる」に後続するいかなる内容も含まれるがこれらに限定されないことが企図されている。したがって、語句「からなる」は、列挙された要素が必要または必須であり、他のいかなる要素も存在しえないことを示す。「から本質的になる」には、語句の後に列挙され、列挙された要素について開示で指定された活動または作用に干渉しないかまたはこれに寄与する他の要素に限定される、いかなる要素も含まれることが企図されている。したがって、語句「から本質的になる」は、列挙された要素が必要または必須であり、他のいかなる要素も任意選択ではなく、存在してもよいか、存在しなくてもよいかは、列挙された要素の活動または作用に影響を及ぼすのかどうかによることを示す。
【００４０】
本明細書を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連の実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加の実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはこれらの組合せに対する言及は、実施形態との関連で記載された、特定の特徴、構造、または特色が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通した様々な箇所における以上の語句の出現は、すべてが必ずしも同じ実施形態を指すわけではない。さらに、特定の特徴、構造、または特色を、１つまたは複数の実施形態において、任意の適する形で組み合わせることができる。
【００４１】
本開示の実施形態は、特に、腫瘍に効果的に浸潤することができない細胞についての、養子細胞移入における当面の制限に取り組むものである。例えば、養子移入された腫瘍特異的Ｔリンパ球は、バルク腫瘍（本開示の方法および組成物は、いかなるサイズの腫瘍に対しても有効であるが、いくつかの実施形態では、通例、最大直径が１０ｃｍを超える）を有する患者における効果が限定的である。本明細書で記載される通り、この制限を探索するために、がん患者の処置のために製造された腫瘍特異的Ｔリンパ球の能力を、Ｔ細胞溢出を可能にする本質的なステップである、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を分解するそれらの能力について特徴づけた。末梢血から単離されたＴリンパ球とは著しく対照的に、培養されたＴリンパ球は、ヘパラナーゼ（ＨＰＳＥ）が欠損するため、ヘパラン硫酸プロテオグリカンを分解する能力が損なわれている。培養された腫瘍特異的Ｔリンパ球内のヘパラナーゼの再発現（例えば、遺伝子導入による）は、それらのエフェクター機能を損なわずに、ＥＣＭを分解するそれらの生理学的能力を回復し、腫瘍へのＴ細胞浸潤および抗腫瘍効果の強化を決定する。この戦略を利用することにより、固形腫瘍を有する患者における腫瘍指向性Ｔ細胞の活性が有意に強化される。
【００４２】
Ｉ．細胞
本開示では、ヘパラナーゼを組換え発現する（例えば、外因性ヘパラナーゼを発現することにより、または組換えにより内因性ヘパラナーゼの発現を増大させることにより）細胞が包含される。特定の態様では、細胞は、養子移入のための細胞である。細胞は、医薬組成物中に含めることができる。細胞は、本明細書で記載されるベクターで形質転換してもよく、これをトランスフェクトしてもよい。組換えヘパラナーゼを発現する細胞は、本明細書に記載のベクターのうちの少なくとも１つを導入することにより作製することができる。いくつかの実施形態では、ヘパラナーゼの発現コンストラクトは、細胞のゲノムに組み込まれるが、細胞内のベクターの存在は、ヘパラナーゼの発現コンストラクトの発現を媒介する。宿主に導入された核酸分子またはベクターは、宿主のゲノムに統合されてもよく、染色体外に維持されてもよい。
【００４３】
本明細書で使用される用語「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」は、互換的に使用することができる。これらの用語のすべてには、任意かつすべての後続の世代である、それらの子孫細胞も含まれる。すべての子孫細胞が、意図的であるかまたは予測外の突然変異のために必ずしも同一でない場合もあることが理解される。異種核酸配列の発現の文脈では、「宿主細胞」は、原核細胞または真核細胞を指し、これには、ベクターを複製し、かつ／またはベクターによりコードされる異種遺伝子を発現することができる、任意の形質転換可能な生物が含まれる。宿主細胞は、ベクターのレシピエントとして使用することができ、そのように使用されている。宿主細胞は、「トランスフェクト」してもよく、「形質転換」してもよく、これらは、外因性核酸が、宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。形質転換された細胞には、初代対象細胞およびその子孫細胞が含まれる。本明細書で使用される、用語「操作された」細胞および「組換え」細胞または宿主細胞は、例えば、ベクターなどの外因性核酸配列が導入された細胞を指すことが企図されている。したがって、組換え細胞は、組換えにより導入された核酸を含有しない、天然に存在する細胞から識別可能である。
【００４４】
ある特定の実施形態では、ＲＮＡまたはタンパク質性配列を、同じ宿主細胞内の、他の選択されたＲＮＡまたはタンパク質性配列と共に共発現しうることが企図されている。共発現は、宿主細胞に、２つ以上の異なる組換えベクターを共トランスフェクトすることによって達成することができる。代わりに、単一の組換えベクターを構築して、ＲＮＡの複数の異なるコード領域を含めることができ、その後、これを、単一のベクターをトランスフェクトされた宿主細胞内で発現することもできるであろう。いくつかの場合では、細胞は、ヘパラナーゼの発現コンストラクトおよび同じ分子または異なる分子上に存在する別の発現コンストラクトも含みうる。
【００４５】
細胞は、それらが原核細胞内および真核細胞内の両方で複製され、かつ／または発現されることを可能にする、制御配列を利用するベクターを含みうる。当業者ならば、その下で宿主細胞をインキュベートして、それらを維持し、ベクターの複製を許容するための条件をさらに理解するであろう。本開示の細胞の大規模生成を可能にする技法および条件も理解され、知られている。
【００４６】
本開示の実施形態では、開示の細胞内の、内因性ヘパラナーゼおよび外因性ヘパラナーゼの１つまたは複数の発現の調節がある。発現の調節には、ヘパラナーゼの構成的発現、ヘパラナーゼの誘導的発現、ヘパラナーゼの環境特異的発現、またはヘパラナーゼの組織特異的発現を含めることができ、このようなプロモーターの例は、当業界で公知である。哺乳動物の構成的プロモーターには、例えば、サルウイルス４０、即初期サイトメガロウイルス、ヒトユビキチンＣ、伸長因子１α−サブユニット、およびマウスホスホグリセリン酸キナーゼ１が含まれる。ヘパラナーゼの具体的な環境特異的発現には、例えば、低酸素条件のための、ある特定の調節エレメントの使用が含まれる。
【００４７】
特定の実施形態では、本明細書で企図される実施形態で使用される細胞には、例えば、哺乳動物細胞を含めた真核細胞が含まれる。ある特定の実施形態では、細胞は、ヒト細胞であるが、特定の実施形態では、細胞は、それらのそれぞれの動物における使用のための、ウマ、ウシ、マウス、ヒツジ、イヌ、ネコなどの細胞である。これらの種において、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞などの様々な種類の細胞が含まれる可能性がある。
【００４８】
細胞は、それらを受容する個体に関して、自己細胞でもよく、同系細胞でもよく、同種細胞でもよく、なおいくつかの場合では、異種細胞であってもよい。細胞は、主要組織適合複合体（「ＭＨＣ」）プロファイルを変化させることによって改変してもよく、β２−マイクログロブリンを不活化させて、機能的なクラスＩのＭＨＣ分子の形成を防止することによって改変してもよく、クラスＩＩ分子の不活化によって改変してもよく、１つまたは複数のＭＨＣ分子の発現をもたらすことによって改変してもよく、細胞傷害活性と関連する遺伝子の発現を強化または阻害することを介して、細胞傷害能を強化または不活化させることなどによって改変してもよい。
【００４９】
細胞が、特異的な抗原特異性または標的部位へのホーミング特異性を有するＴ細胞およびＢ細胞など、特定の特異性を有するいくつかの場合には、特異的クローン細胞またはオリゴクローナル細胞が対象でありうる。
【００５０】
例示のＴ細胞は、組換え以外の形でヘパラナーゼが発現されるように改変することができる。例えば、Ｔ細胞受容体の一方または両方の鎖をコードする遺伝子を導入することが要望される場合がある。例えば、ヘパラナーゼなどの治療的価値を有する遺伝子や任意選択で別の治療用遺伝子の発現をもたらすことに加えて、いくつかの実施形態では、細胞を改変して、細胞を特定の部位に方向付ける。部位には、解剖学的部位を含めることができ、特に、実施形態には、固形腫瘍が含まれる。局在化された細胞濃度の増大は、標的細胞上の天然に存在するエピトープなど、標的部位に結合することを可能にする、宿主細胞上の表面膜タンパク質を発現することによって、ＥＣＭ内を移動する（ヘパラナーゼの発現のため）それらの能力を強化した後で達成することができる。多数の状況であって、細胞を特定の部位に方向付けることが望まれる状況、治療的産物の放出が大きな価値を有する状況、または細胞のアポトーシスを直接的または間接的にもたらす細胞内経路が誘発される状況がある。
【００５１】
一実施形態では、宿主細胞は、組換えヘパラナーゼを含むが、例えば、操作されたＴＣＲ受容体、エンゲージャー分子、および／またはＣＡＲも含むＴ細胞である。天然存在のＴ細胞受容体は、２つのサブユニット、αサブユニットおよびβサブユニットを含み、両サブユニットは、それぞれが、各Ｔ細胞ゲノムで組換えイベントによって生成される特有のタンパク質である。ＴＣＲのライブラリーを、特定の標的抗原に対するそれらの選択性についてスクリーニングすることができる。「遺伝子操作されたＴＣＲ」は、選択され、クローニングされ、かつ／またはその後養子免疫療法に用いられるＴ細胞集団に導入される、標的抗原に対して高いアビディティーおよび反応性を有する天然のＴＣＲを指す。遺伝子操作されたＴＣＲとは対照的に、ＣＡＲは、ＭＨＣに依存せずに標的抗原に結合するように遺伝子操作されている。特定の実施形態では、ＣＡＲは、限定されるものではないが、抗体またはその抗原結合断片、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の細胞内共刺激性シグナル伝達ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインを含めた細胞外結合ドメインを含む。
【００５２】
特定の実施形態では、本開示の免疫細胞を、内因性ヘパラナーゼの発現の上方制御下に置く。内因性ヘパラナーゼの発現レベルを、１つまたは複数の基準細胞内のレベルと比較して上方制御することができる。基準細胞は、無改変の免疫細胞など、外因性ヘパラナーゼをもたない細胞でありうる。内因性ヘパラナーゼの発現レベルは、細胞の内因性ヘパラナーゼのゲノムの調節エレメント内に強力なプロモーターを組み込むことを含めた、１つまたは複数の手段によって増大させることができる。いくつかの場合では、内因性ヘパラナーゼの発現をオンにする、１つまたは複数の転写因子が発現されるように細胞を操作することができる。
【００５３】
様々な実施形態では、Ｔ細胞は、増大させたヘパラナーゼ、およびＴ細胞によって発現されるＣＡＲまたは操作されたＴＣＲと同じ標的抗原を認識するエンゲージャー分子をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ＣＡＲまたは遺伝子操作されたＴＣＲを発現するＴ細胞は、ＣＡＲまたは遺伝子操作されたＴＣＲによって認識される標的抗原とは異なるが、同じ標的細胞上に発現される標的抗原を認識するエンゲージャー分子をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む。本開示の実施形態は、エンゲージャー分子、例えば、エンゲージャーポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。このようなエンゲージャーポリペプチドは一般に、抗原認識ドメインおよび活性化ドメインを含む。エンゲージャー分子の抗原認識ドメインは、標的細胞上に存在する１つまたは複数の分子に結合するように設計することができるが、エンゲージャー分子の活性化ドメインは、例えば、Ｔリンパ球など、エフェクター細胞上に存在する分子に結合する。ひとたび、エンゲージャー分子の活性化ドメインがエフェクター細胞に結合したら、活性化ドメインは、エフェクター細胞を活性化させることができる。ある特定の実施形態では、エンゲージャーの活性化ドメインが免疫細胞上の活性化分子に結合し、抗原認識ドメインが標的細胞抗原に結合すると、免疫細胞によって標的細胞が殺滅される。ある特定の実施形態では、エンゲージャーは、タンパク質、例えば、遺伝子操作されたタンパク質である。特定の実施形態では、エンゲージャーの活性化ドメインが、抗体またはその抗原結合性断片もしくは部分、例えば一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）であるか、またはこれを含む。他の特定の実施形態では、抗原認識ドメインは、抗体あるいは抗体断片もしくは抗原結合性断片またはこれらの一部、例えば、モノクローナル抗体、Ｆｖ、またはｓｃＦｖであるかもしくはこれを含むか、または、リガンド、ペプチド、可溶性のＴ細胞受容体、もしくはこれらの組合せを含みうる。ある特定の実施形態では、活性化ドメインおよび抗原認識ドメインが、リンカー、例えば、ペプチドリンカーによって連結されている。エンゲージャー分子の活性化ドメインは、免疫細胞に活性化をもたらすことができる。当業者は、免疫細胞が様々な活性化受容体を有することを認識している。例えば、ＣＤ３は、Ｔ細胞上の活性化受容体であるが、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、またはＮＫｐ３０は、ＮＫ細胞上の活性化受容体であり、そして、ＣＤ３またはインバリアントＴＣＲは、ＮＫＴ細胞上の活性化受容体である。したがって、Ｔ細胞を活性化するエンゲージャー分子は、ＮＫ細胞を活性化するエンゲージャー分子とは異なる活性化ドメインを有しうる。特定の実施形態、例えば、免疫細胞がＴ細胞である実施形態では、活性化分子が、ＣＤ３、例えば、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、もしくはＣＤ３ε；またはＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ２７８のうちの１つまたは複数である。他の特定の実施形態、例えば、免疫細胞がＮＫ細胞である実施形態では、活性化分子がＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、またはＮＫｐ３０であり、免疫細胞がＮＫＴ細胞である実施形態では、活性化分子がＣＤ３またはインバリアントＴＣＲである。ある特定の他の実施形態では、エンゲージャーが、１つまたは複数の他のドメイン、例えば、１つもしくは複数のサイトカイン、共刺激性ドメイン、Ｔ細胞活性化の負の調節分子を抑制するドメイン、またはこれらの組合せをさらに含む。特定の実施形態では、サイトカインがＩＬ−１５、ＩＬ−２、および／または、ＩＬ−７である。他の特定の実施形態では、共刺激性ドメインがＣＤ２７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７である。他の特定の実施形態では、Ｔ細胞活性化の負の調節分子を抑制するドメインが、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、またはＢ７−Ｈ４である。
【００５４】
ヘパラナーゼの発現のための外因性分子を有するか、またはこれを有することを企図された本開示の細胞は、ＣＡＲ（一般に、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）結合性ドメイン（最も一般には、モノクローナル抗体の抗原結合性領域に由来するｓｃＦｖ）、細胞外スペーサー／ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む）も含みうる。ＣＡＲは、例えば、第１世代のＣＡＲでもよく、第２世代のＣＡＲでもよく、第３世代のＣＡＲ（シグナル伝達が、ＣＤ２８および４−１ＢＢまたはＯＸ４０などの腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦｒ）の１つまたは複数によってもたらされる共刺激と併せて、ＣＤ３ζによってもたらされるＣＡＲ）でもよい。ＣＡＲは、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、Ｇｌｙｐｉｃａｎ−３、５Ｔ４、８Ｈ９、αｖβ６インテグリン、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＦＡＰ、ＦＡＲ、ＦＢＰ、胎児ＡｃｈＲ、葉酸受容体α、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＩＬ１１Ｒａ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＫＤＲ、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＣ１、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、Ｓｐ１７、ＳＵＲＶＩＶＩＮ、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、ＶＥＧＲＲ２、癌胎児性抗原、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＶＥＧＦ受容体、および／またはフィブロネクチン、テネイシン、もしくは腫瘍の壊死性領域のがん胎児性バリアントなど、腫瘍の細胞外マトリックス内に存在する他の例示の抗原に特異的でありうる。ＣＡＲ（例だけを目的とする）とヘパラナーゼとは、同じベクター上にあってもよく、異なるベクター上にあってもよい。いくつかの場合では、ＣＡＲは、１つまたは複数のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、またはＩＬ−１５など）も含む。キメラ抗原構造および用語法は、当業界で公知であり、例えば、それらの各々の開示を参照によりそれらの全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第７，７４１，４６５号；同第５，９０６，９３６号；同第５，８４３，７２８号；同第６，３１９，４９４号；同第７，４４６，１９０号；同第５，６８６，２８１号；同第８，３９９，６４５号；および米国特許出願公開第２０１２／０１４８５５２号を参照されたい。
【００５５】
多くの状況において、目的が処置を終了することである場合、細胞が腫瘍性となっている場合、それらの存在の後における細胞の非存在が対象である研究において、かつ／または別の事象などでは、改変細胞を殺滅することが所望でありうる。この目的では、自殺遺伝子など、制御された条件下で、改変細胞を殺滅しうる、ある特定の遺伝子産物の発現をもたらしうる。自殺遺伝子、例えば、カスパーゼ９の改変形態が、低分子、例えば、ＡＰ１９０３と共に二量体化可能なｉＣａｓｐａｓｅ９系が、当業界で公知である。例えば、Ｓｔｒａａｔｈｏｆら、Ｂｌｏｏｄ、１０５：４２４７〜４２５４（２００５）を参照されたい。
【００５６】
ＩＩ．細胞の治療的使用
本開示のある実施形態は、腫瘍性疾患など、がん性疾患の防止、処置、または改善のための、本明細書で記載される改変細胞の使用に関する。特に、本開示の医薬組成物は、ヘパラナーゼを有することにより、医薬組成物の細胞が、細胞がヘパラナーゼをもたなかった場合より有効となるがんを防止、改善、および／または処置するのに特に、有用でありうる。特定の実施形態では、医薬組成物で処置されるがん細胞は、医薬組成物の細胞が、がん細胞のＥＣＭを分解するヘパラナーゼを発現するため、効果的に処置される。特定の実施形態では、がんは、固形腫瘍の形態である。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「処置」または「処置すること」は、疾患または病的状態の症状または病態への有益または望ましいいかなる作用も含み、処置されている疾患または状態（例えば、がん）の１種または複数の測定可能マーカーにおける最小限の低減さえ含みうる。処置は、場合によって、疾患もしくは状態の症状の軽減もしくは改善または疾患もしくは状態の進行の遅延を伴うことがある。「処置」は、必ずしも、疾患もしくは状態またはそれに伴う症状の完全な根絶または治癒を示すわけではない。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「予防する」および「予防される」、「予防すること」などの類似の語は、疾患または状態、例えば、がんの発生または再発を予防する、阻害する、またはその可能性を低減するためのアプローチを示す。この語は、疾患もしくは状態の発症もしくは再発を遅らせること、または疾患もしくは状態の症状の発症もしくは再発を遅らせることも指す。本明細書で使用される場合、「予防」および類似の語は、疾患または状態の発症または再発の前に、疾患または状態の強度、影響、症状、および／または負荷を軽減させることも含む。
【００５９】
固形腫瘍の危険性がある個体を、本開示の組成物下または方法で処理することができる。個体は、家族歴または個人歴などの１つまたは複数の公知の危険因子を有すること、喫煙者であること、１つまたは複数の遺伝子マーカーを有することなどの理由で、危険性がある可能性がある。
【００６０】
ヘパラナーゼを発現する免疫細胞の組成物の投与に関して考えられる適応症は、乳腺、前立腺、肺、および結腸がん、または乳がん、結腸がん、前立腺がん、頭頚部がん、皮膚がんなどの上皮がん／癌、尿生殖器がん、例えば、卵巣がん、子宮体がん、子宮がん、および腎がん、肺がん、胃がん、小腸のがん、肝がん、膵がん、胆嚢がん、胆管のがん、食道がん、唾液腺のがん、ならびに甲状腺のがんを含めた、腫瘍性疾患を含めたがん疾患である。特定の実施形態では、本開示の組成物の投与は、例えば、微小残存病変、初期がん、進行がん、および／または転移がんおよび／または不応性がんを含めたすべてのステージおよびタイプのがんに有用である。
【００６１】
本開示は、がんに対して有効な他の化合物を伴う共投与プロトコールをさらに包含する。本発明の細胞の共投与のための臨床レジメンは、他方の構成要素を投与するのと同時に、その前に、またはその後に行う共投与を包含しうる。特定の組合せ療法には、化学療法、放射線照射、外科手術、ホルモン療法、または他のタイプの免疫療法が含まれる。
【００６２】
例示を目的として述べると、がん患者、またはがんに対して感受性であるかもしくはがんを有することが疑われる患者は、以下の通りに処置することができる。本明細書で記載される通りに改変された細胞は、患者に投与し、長期間にわたり保持することができる。個体には、１回または複数回の細胞の投与を行うことができる。例示の細胞には、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡張されたＴ細胞が含まれる。細胞は、ヘパラナーゼの活性部分またはすべてを少なくとも発現するように改変され、それを必要とする個体に提供される。いくつかの場合では、細胞は、腫瘍に直接注射することができる。例示のヘパラナーゼのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿００６６６５の配列であり、例示のヘパラナーゼのポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＰ＿００６６５６の配列であり、これらのいずれも、参照によりそれらの全体として本明細書に組み込まれる。配列全体の活性部分またはすべてを、細胞に組み込むこともできるが、特定の態様では、組み込まれるヘパラナーゼの部分には、例えば、酵素活性に必要とされる任意のドメインが含まれる。
【００６３】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞を封入して免疫認識を阻害し、腫瘍部位に配置する。例えば、細胞は、リポソーム内、アルギン酸中、または血小板に富む血漿中に封入することができる。
【００６４】
別の実施形態には、タンパク質産物の発現を活性化させて、細胞を活性化させうる、ヘパラナーゼを伴う抗原特異的Ｔ細胞の改変が含まれる。Ｔ細胞受容体ならば、腫瘍細胞、病原体、細胞介在性自己免疫などに対して方向付けることができるであろう。細胞の活性化、例えば、ＩＬ−２などのインターロイキンをもたらすことによれば、リガンドに応答した改変Ｔ細胞の拡大をもたらすことができるであろう。改変Ｔ細胞の他の使用には、Ｔ細胞を特異的な部位に方向付けるためのホーミング受容体の発現が含まれよう。細胞傷害作用、標的細胞、例えば、内皮細胞の表面膜タンパク質の上方制御、または他の生物学的事象が所望されるであろう。
【００６５】
別の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を、エクソサイトーシスされるホルモンまたは因子を移出するように改変することができる。エクソサイトーシスの強化をもたらすことによって、大量のホルモンまたは因子が移出され、加えて、細胞質中のホルモンまたは因子の量に基づくフィードバック機構が存在する場合、ホルモンまたは因子の産生の増大がもたらされるであろう。一態様では、発現および移出が共時的に誘導されうるように、ホルモンまたは因子の発現の誘導をもたらすことができる。
【００６６】
ＩＩＩ．コンストラクトの細胞への導入
ヘパラナーゼコンストラクトは、コンストラクトを含有する宿主細胞の選択を可能にする、少なくとも１つのマーカーがありうる、１つまたは複数のＤＮＡ分子またはＤＮＡコンストラクトとして導入することができる。コンストラクトは、従来の方途により調製することができる。必要に応じて、遺伝子領域と調節領域とを隔離し、ライゲートし、適切なクローニング宿主内でクローニングし、制限もしくはシークェンシング、または他の好都合な手段によって解析した。特に、ＰＣＲを使用して、機能的な単位の全部または一部を含めた個別の断片を単離することができる。必要に応じて、「プライマー対」、ライゲーション、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける突然変異誘発などを使用して、１つまたは複数の突然変異を導入することができる。ひとたび完成され、適切な配列を有することが実証されたコンストラクトは、その後、任意の好都合な手段によって、宿主細胞に導入することができる。コンストラクトは、細胞への感染または形質導入のために、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、もしくは単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）またはレトロウイルスベクターを含めた他のウイルスなど、非複製性の欠損ウイルスゲノムに組み込み、パッケージングすることができる。所望の場合、コンストラクトには、トランスフェクションのためのウイルス配列を含めることができる。代わりに、融合、エレクトロポレーション、遺伝子銃、トランスフェクション、リポフェクションなどによって、コンストラクトを導入することもできる。コンストラクトの導入前に、宿主細胞を、培養物中で成長させ、拡張するのに続いて、コンストラクトの導入およびコンストラクトの組込みのための適切な処理を施すことができる。その後、細胞を拡張し、コンストラクト内に存在するマーカーによって、スクリーニングする。使用して成功しうる様々なマーカーには、ｈｐｒｔ、ネオマイシン耐性、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシン耐性などが含まれる。
【００６７】
特定の実施形態では、ヘパラナーゼを、一過性発現のためのＲＮＡとして、細胞に導入する。ＲＮＡは、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、および脂質媒介型トランスフェクションを含めた様々な手段によって、開示の免疫細胞に送達することができる。特定の態様では、コンストラクトの細胞への導入は、トランスポゾンを介して行うことができる。使用のための合成トランスポゾンの例は、ヘパラナーゼ遺伝子またはその活性断片を含めた発現カセットを含む、スリーピングビューティートランスポゾンである。
【００６８】
いくつかの場合では、コンストラクトを特定の遺伝子座に組み込むことが所望される相同組換えのための標的部位を有しうる。例えば、相同組換えについて当業界で公知である材料および方法を使用して、内因性遺伝子をノックアウトし、コンストラクトによってコードされた遺伝子で置き換える（同じ遺伝子座または他の場所において）ことができる。相同組換えには、Ω−ベクターまたはＯ−ベクターを使用することができる。例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、１９８７；Ｍａｎｓｏｕｒら、１９８８；ならびにＪｏｙｎｅｒら、１９８９を参照されたい。
【００６９】
コンストラクトは、少なくとも、ヘパラナーゼと、任意選択で、別の遺伝子とをコードする、単一のＤＮＡ分子として導入することもでき、１つまたは複数の遺伝子を有する、異なるＤＮＡ分子として導入することもできる。各々が同じまたは異なるマーカーを伴うコンストラクトを、同時に導入することもでき、逐次的に導入することもできる。例示の例では、１つのコンストラクトは、特定の調節配列の制御下にあるヘパラナーゼを含有する。
【００７０】
コンストラクトＤＮＡの原液を調製し、トランスフェクションを実行するのに使用されうる有用なエレメントであって、細菌または酵母による複製起点、選択および／または増幅マーカー、原核生物または真核生物における発現のためのプロモーター／エンハンサーエレメントなどのエレメントを含有するベクターは、当業界で周知であり、多くが市販されている。
【００７１】
ＩＶ．細胞の投与
ヘパラナーゼが発現されるように改変された（ＤＮＡコンストラクトを伴う細胞など）細胞は、選択条件下にある培養物中で成長させることができ、コンストラクトを有する細胞として選択された細胞は、その後、拡張し、例えば、宿主細胞内のコンストラクトの存在を決定するためのポリメラーゼ連鎖反応を使用して、さらに解析することができる。ひとたび、改変宿主細胞を同定したら、その後、計画した通りに使用することができる、例えば、培養物中で拡張することもでき、宿主生物に導入することもできる。
【００７２】
細胞の性質により、細胞を、多種様々な方途により、宿主生物、例えば、哺乳動物に導入することができる。特定の実施形態では、細胞を、腫瘍部位に導入するが、代わりの実施形態では、細胞は、がんにホーミングするか、細胞を、がんにホーミングするように改変する。利用される細胞の数は、多数の状況、導入の目的、細胞の寿命、使用されるプロトコール、例えば、投与回数、細胞の増殖能力、組換えコンストラクトの安定性などに依存するであろう。細胞は、対象の部位において、またはその近傍において一般に注射される、分散液として適用することができる。細胞は、生理学的に許容できる培地中の細胞でありうる。
【００７３】
特定の実施形態では、投与経路は、例えば、静脈内経路、動脈内経路、腹腔内経路、または皮下経路でありうる。複数回投与は、同じ経路を介してもよく、異なる経路を介してもよい。
【００７４】
当業界では、適切な用量レベルの決定が慣例的に実施されている。特定の実施形態では、形質導入されたＴ細胞に基づく、以下のレジメン：用量レベル１：１ｍ２当たり２×１０７個、用量レベル２：１ｍ２当たり１×１０８個、用量レベル３：１ｍ２当たり２×１０８個を利用することができる。
【００７５】
ＤＮＡの導入は、必ずしも全ての場合で組込みをもたらす必要はない。状況によって、導入されたＤＮＡの一過性の維持で十分な場合もある。そのような場合、細胞が宿主に導入されて、所定時間後に、例えば細胞が特定の部位にホーミングできた後に機能できるようになるといった、短期的な効果を達成することができる。
【００７６】
細胞は、所望される通りに投与することができる。所望される応答、投与の様式、細胞の寿命、存在する細胞の数により、様々なプロトコールを利用することができる。投与回数は、本明細書に記載の因子に、少なくとも部分的に依存するであろう。
【００７７】
特定の場合には、複数の開示の免疫細胞を、がんを有する個体に送達する。特定の実施形態では、単回投与が必要とされる。他の実施形態では、細胞の複数回投与が必要とされる。例えば、操作された免疫細胞の初回投与の後で、例えば、がんの存在または非存在について、個体の検査を行うこともでき、腫瘍の数および／またはサイズの低減について個体の検査を行うこともできる。万一、がんが、初回投与後における腫瘍の成長など、さらなる処置に対する必要を示す場合は、追加の１回または複数回の同じ操作された免疫細胞（または、任意選択で、別の種類の免疫療法および／もしくは化学療法、外科手術および／もしくは放射線照射を含めた、別の種類のがん療法）の送達が個体に施される。いくつかの場合では、個体における腫瘍サイズの低減は、特定の免疫療法が有効であることを示すので、同じ免疫療法のさらなる投与が個体に提供される。
【００７８】
系は、リガンドに対する細胞応答、発現の効率、および、必要に応じて、分泌レベル、発現産物の活性、時期および状況と共に変化しうる患者の特定の必要、細胞または個々の細胞の発現活性の喪失の結果としての細胞活性の喪失率などの変数下に置かれることを理解されたい。したがって、各個別の患者について、集団全体に投与されうる万能細胞があったとしても、各患者を個体に適正な投与量についてモニタリングすることが予測され、このような患者のモニタリングの実施は、当業界では慣例的である。
【００７９】
Ｖ．核酸ベースの発現系
本開示の態様では、ヘパラナーゼを発現する細胞であって、ヘパラナーゼの発現が、細胞内の組換えＤＮＡから産生される細胞が提供される。ヘパラナーゼをコードする配列は、例えば、発現ベクターを含めたベクターによりすることができる。他の遺伝子産物（ＣＡＲおよび／または操作されたＴ細胞受容体および／またはエンゲージャー分子など）は、同じ発現ベクターから発現してもよく、ヘパラナーゼとは別個のベクターにより細胞内に存在してもよい。
【００８０】
Ａ．ベクター
「ベクター」という用語は、細胞に導入するために核酸配列をその中に挿入でき、細胞内で複製可能である担体核酸分子を指すのに用いられる。核酸配列は、「外因性」であってもよく、これは、その配列が、ベクターがその中に導入される細胞にとって外来のものであること、またはその配列が細胞内の配列に相同であるが、宿主細胞核酸中において、その配列が通常は存在しない位置にあることを意味する。ベクターには、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）、および人工染色体（例えば、ＹＡＣ）が含まれる。当業者ならば、標準的な組換え技法でベクターを構築するのに十分な装備を備えている（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８８、およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９９４を参照。両文献を参照により本明細書に組み込む）。
【００８１】
「発現ベクター」という用語は、転写可能なＲＮＡをコードする核酸を含む、任意のタイプの遺伝子コンストラクトを指す。場合によっては、その後、ＲＮＡ分子がタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。その他の場合、例えば、アンチセンス分子またはリボザイムの生成においては、これらの配列は翻訳されない。発現ベクターは、様々な「制御配列」を含有することができる。「制御配列」は、特定の宿主細胞における、動作可能に連結されたコード配列の転写、場合によって翻訳に必要な核酸配列を指す。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能を果たす、下に記載される核酸配列を含有することもできる。
【００８２】
Ｂ．プロモーターおよびエンハンサー
「プロモーター」は、転写の開始および速度がそこで制御される核酸配列領域である制御配列である。「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子など、調節タンパク質および調節分子が、核酸配列の特異的な転写を開始するために結合しうる遺伝エレメントを含有しうる。「動作可能に配置された」、「動作可能に連結された」、「制御下」、および「転写制御下」という句は、プロモーターが、核酸配列との関係において、その配列の転写開始および／または発現を制御するのに正しい機能的な位置および／または方向で存在することを意味する。
【００８３】
プロモーターは、一般に、ＲＮＡ合成の開始部位の位置を決めるのに機能する配列を含む。この最もよく知られている例がＴＡＴＡボックスであるが、例えば、哺乳動物の末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターなど、プロモーターの中にはＴＡＴＡボックスをもたないものもあり、開始部位自体を覆う異なるエレメントが、開始箇所を定めるのを助ける。さらに別のプロモーターエレメントが、転写開始の頻度を調節する。典型的な場合、これらは開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置している。ただし、開始部位の下流に機能エレメントを含有していることが示されているプロモーターもいくつもある。コード配列をプロモーターの「制御下」に置くには、転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端を、選択されたプロモーターの「下流」（すなわち、３’側）に配置する。「上流」のプロモーターが、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされたＲＮＡの発現を促進する。
【００８４】
プロモーターエレメント間の間隔は、しばしば柔軟であり、そのため、エレメントが反転するか、お互いと比較して動いた場合でも、プロモーター機能が保存される。ｔｋプロモーターでは、活性を低下させずに、プロモーターエレメント間の間隔を５０ｂｐまで広げることができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントは、転写を活性化するために協力して機能することも、独立して機能することもできるようである。プロモーターは、「エンハンサー」と共に用いても、そうでなくともよい。「エンハンサー」は、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用の調節配列を指す。
【００８５】
プロモーターは、コーディングセグメントおよび／またはエキソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得ることのできる、核酸配列に天然に随伴しているものでもよい。そのようなプロモーターを「内因性」と呼ぶことができる。同様に、エンハンサーは、核酸配列に天然に随伴し、その配列の下流または上流のいずれかに位置するものでもよい。代わりに、コーディング核酸セグメントを、組換え体または異種のプロモーターの制御下に置くことによって、ある種の利点が得られるであろう。組換え体または異種のプロモーターとは、その天然の環境にある核酸配列には通常は随伴していないプロモーターを指す。組換え体または異種のエンハンサーも、その天然の環境にある核酸配列には通常は随伴していないエンハンサーを指す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、および任意の他のウイルスまたは原核もしくは真核細胞から単離されるプロモーターまたはエンハンサー、および「天然に存在」しない、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメントおよび／または発現を改変する変異を含有するプロモーターまたはエンハンサーが含まれうる。例えば、組換えＤＮＡの構築で最も一般的に用いられるプロモーターには、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース、およびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系が含まれる。プロモーターおよびエンハンサー核酸配列の合成による生成に加えて、本明細書に開示されている組成物に関して、ＰＣＲ（商標）を含めた組換えクローニングおよび／または核酸増幅技術を用いて、配列を生成することができる（それぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，６８３，２０２号および第５，９２８，９０６号を参照）。さらに、ミトコンドリア、葉緑体などの非核オルガネラ内の配列の転写および／または発現を指示する制御配列も利用できることが企図されている。
【００８６】
当然ながら、発現用に選択されたオルガネラ、細胞型、組織、器官、または生物内でＤＮＡセグメントの発現を効率的に指示するプロモーターおよび／またはエンハンサーを利用することが重要となる。分子生物学の当業者ならば、タンパク質発現用のプロモーター、エンハンサー、および細胞型の組合せの使用について一般的に知っている（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９参照）。利用するプロモーターは、導入されたＤＮＡセグメントの高レベル発現を指示するのに適切な条件下で構成的なもの、組織特異的なもの、誘導可能なもの、ならびに／または、組換えタンパク質および／もしくはペプチドの大規模生成に有利なものなど、有用なものでありうる。プロモーターは、異種のものでも、内因性のものでもよい。特定の実施形態では、ヘパラナーゼの発現は、誘導的プロモーターまたは組織特異的プロモーターの制御下にある。組織特異的プロモーターは、当業界で公知であるが、特定の実施形態では、組織特異性を、がんが位置する組織に照らして調整する。組織特異的プロモーターまたは組織特異的エレメント、およびそれらの活性を特徴付けるアッセイは、低酸素状態誘導性プロモーターなど、当業者に周知である。
【００８７】
さらに、発現を駆動させるために、あらゆるプロモーター／エンハンサーの組合せを使用することもできる。Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６の細胞質発現系の使用も、別の可能な実施形態である。真核細胞は、送達複合体の一部として、または追加の遺伝子発現コンストラクトとして適切な細菌ポリメラーゼが与えられれば、ある種の細菌プロモーターからの細胞質転写をサポートすることができる。
【００８８】
コード配列の効率的な翻訳には、特異的な開始シグナルも必要でありうる。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接の配列が含まれる。ＡＴＧ開始コドンを含めた、外因性の翻訳制御シグナルの提供が必要でありうる。当業者ならば、この決定および必要なシグナルの提供を容易に行うことができるだろう。
【００８９】
本開示のある特定の実施形態では、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを用いて、多重遺伝子または多シストロン性メッセージが生成され、これらを、本開示で用いることができる。
【００９０】
ベクターは、多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含むことができる。ＭＣＳは、複数の制限酵素部位を含有する核酸領域である。これらの制限酵素部位はいずれも、ベクターを消化する標準的な組換え技術と共に用いることができる。「制限酵素消化」は、核酸分子内の特定の位置のみで機能する酵素を用いて核酸分子を触媒により切断することを指す。これらの制限酵素の多くは市販されている。そのような酵素の使用は、当業者によって広く理解されている。しばしば、ベクターは、外因性の配列をベクターにライゲートすることが可能となるように、ＭＣＳ内で切断する制限酵素を用いて線形化または断片化される。「ライゲーション」は、相互に連続していても、いなくてもよい２つの核酸断片間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスを指す。制限酵素およびライゲーション反応を用いる技法は、組換え技術の当業者に周知である。
【００９１】
スプライシング部位、終結シグナル、複製起点、および選択マーカーも利用することができる。
【００９２】
Ｃ．プラスミドベクター
ある特定の実施形態では、プラスミドベクターが、宿主細胞を形質転換するための使用に企図されている。一般に、宿主細胞と適合性の種に由来するレプリコンおよび制御配列を含有するプラスミドベクターがこれらの宿主と共に使用される。通常、ベクターは、複製部位と、形質転換細胞における表現型選択を提供できるマーキング配列とを有する。非限定的な例では、Ｅ．ｃｏｌｉは、しばしば、Ｅ．ｃｏｌｉ種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を用いて形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有しており、したがって、形質転換細胞を同定するための簡単な手段を提供する。ｐＢＲプラスミドまたは他の微生物プラスミドもしくはファージは、例えば、微生物がそれ自体のタンパク質の発現に用いることができるプロモーターも含有しているか、含有するように改変されていなければならない。
【００９３】
加えて、宿主微生物と適合性であるレプリコンおよび制御配列を含有するファージベクターを、これらの宿主と共に形質転換ベクターとして用いることができる。例えば、組換えファージベクターを作製する際に、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２などの宿主細胞を形質転換するのに使用できるラムダファージＧＥＭ（商標）１１を利用することができる。
【００９４】
さらなる有用なプラスミドベクターには、ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅら、１９８５）およびｐＧＥＸベクターが含まれる。ｐＧＥＸベクターは、後の精製および分離または切断のために、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）可溶性融合タンパク質を生成するのに使用される。他の適した融合タンパク質は、βガラクトシダーゼやユビキチンなどとの融合タンパク質である。
【００９５】
発現ベクターを含む細菌宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、いくつかの適した培地のいずれか、例えば、ＬＢ中で培養される。当業者には理解されるように、ある種のベクターにおける組換えタンパク質の発現は、宿主細胞を、ある種のプロモーターに特異的な薬剤と接触させることによって、例えば、ＩＰＴＧを培地に添加するか、インキュベーション温度をより高温に切り換えることによって、誘導することができる。細菌をさらなる期間、通常は２〜２４時間培養した後、遠心分離によって細胞を収集し、洗浄して、残りの培地を除去する。
【００９６】
Ｄ．ウイルスベクター
ある種のウイルスは、細胞を感染させるか、受容体媒介のエンドサイトーシスを介して細胞に進入し、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、ウイルス遺伝子を安定的かつ効率的に発現する能力を有するので、そのようなウイルスは、外来の核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）内に導入する魅力的な候補となっている。本開示の構成要素は、ヘパラナーゼをコードするウイルスベクターでありうる。本開示の核酸を送達するのに使用できるウイルスベクターの非限定な例を以下に記載する。
【００９７】
１．アデノウイルスベクター
核酸の送達のための特定の方法は、アデノウイルス発現ベクターを使用するものである。アデノウイルスベクターは、ゲノムＤＮＡに組み込まれる能力が低いことが知られているが、この特徴は、これらのベクターによってもたらされる遺伝子移入の効率が高いことで相殺される。「アデノウイルス発現ベクター」には、（ａ）コンストラクトのパッケージングをサポートし、（ｂ）最終的に、その中にクローニングされた組織または細胞特異的なコンストラクトを発現するのに十分なアデノウイルス配列を含有するコンストラクトが含まれると企図されている。アデノウイルス（３６ｋｂの直鎖状二本鎖ＤＮＡウイルス）の遺伝学的構成に関する知識により、アデノウイルスＤＮＡの大きな領域を７ｋｂまでの外来配列で置換することが可能である（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２）。
【００９８】
２．ＡＡＶベクター
核酸は、アデノウイルス支援のトランスフェクションを用いて細胞内に導入できる。アデノウイルスを組み合わせた系を用いた細胞系でトランスフェクション効率の増大が報告されている（ＫｅｌｌｅｈｅｒおよびＶｏｓ、１９９４；Ｃｏｔｔｅｎら、１９９２；Ｃｕｒｉｅｌ、１９９４）。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、組み込まれる頻度が高く、かつ非分裂性の細胞を感染させることができ、それにより遺伝子を哺乳動物細胞に、例えば組織培養中（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、１９９２）またはｉｎ  ｖｉｖｏで、送達するのに有用となっているので、本開示の細胞で使用するのに魅力的なベクター系である。ＡＡＶは、感染の宿主域が広い（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、１９８４；Ｌａｕｇｈｌｉｎら、１９８６；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、１９８８；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９８８）。ｒＡＡＶベクターの生成および使用に関する詳細は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，１３９，９４１号および第４，７９７，３６８号に記載されている。
【００９９】
３．レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、それらの遺伝子を宿主ゲノムに組み込み、多量の外来遺伝物質を輸送し、広い範囲の種および細胞型を感染させ、特別な細胞株でパッケージングされる能力を有するため、送達ベクターとして有用である（Ｍｉｌｌｅｒ、１９９２。）
【０１００】
ヘパラナーゼレトロウイルスベクターを構築するために、複製欠損であるウイルスを生成する特定のウイルス配列の箇所に核酸（例えば、ヘパラナーゼの部分またはすべてをコードするもの）をウイルスゲノムに挿入する。ビリオンを生成するために、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含有するがＬＴＲおよびパッケージング構成要素が無いパッケージング細胞株を構築する（Ｍａｎｎら、１９８３）。レトロウイルスＬＴＲおよびパッケージング配列と共に、ｃＤＮＡを含有する組換えプラスミドが、特別な細胞株に導入される（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）と、パッケージング配列によって、組換えプラスミドのＲＮＡ転写産物をウイルス粒子にパッケージングすることが可能になり、その後、ウイルス粒子が培養培地中に分泌される（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８；Ｔｅｍｉｎ、１９８６；Ｍａｎｎら、１９８３）。次いで、組換え体レトロウイルスを含有する培地を収集し、場合によっては濃縮し、遺伝子移入に用いる。レトロウイルスベクターは、多様な細胞型を感染させることができる。しかし、組み込みおよび安定した発現には、宿主細胞の分裂が必要である（Ｐａｓｋｉｎｄら、１９７５）。
【０１０１】
レンチウイルスは、複雑なレトロウイルスであり、共通のレトロウイルス遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖに加えて、調節または構造的な機能を有する他の遺伝子も含有している。レンチウイルスベクターは、当業界で周知である（例えば、Ｎａｌｄｉｎｉら、１９９６；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９７；Ｂｌｏｍｅｒら、１９９７年；米国特許第６，０１３，５１６号および第５，９９４，１３６号を参照）。レンチウイルスのいくつかの例としては、ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびサル免疫不全ウイルス：ＳＩＶが挙げられる。レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ病原性遺伝子を多重弱毒化することによって生成された。例えば、遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、およびｎｅｆが欠失しており、それにより、ベクターが生物学的に安全になっている。
【０１０２】
組換え体レンチウイルスベクターは、非分裂性細胞を感染させることができ、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏの遺伝子移入ならびに核酸配列の発現の両方に用いることができる。例えば、適した宿主細胞が、パッケージング機能、すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｒｅｖ、およびｔａｔを有する２つ以上のベクターでトランスフェクトされる、非分裂性細胞を感染させることができる組換え体レンチウイルスが、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９９４，１３６号に記載されている。エンベロープタンパク質を、特定の細胞型の受容体へとターゲティングする抗体または特定のリガンドと連結することによって、組換え体ウイルスをターゲティングすることができる。対象とする配列（調節領域を含む）を、特定の標的細胞上にある受容体のリガンドをコードする別の遺伝子と共にウイルスベクターに挿入することによって、例えば、ベクターが標的特異的となる。
【０１０３】
４．他のウイルスベクター
他のウイルスベクターも、本開示におけるワクチンコンストラクトとして利用できる。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８）、シンドビスウイルス、サイトメガロウィルス、および単純ヘルペスウイルスなどのウイルス由来のベクターを利用することができる。これらは、様々な哺乳動物細胞用に魅力的な特徴をいくつかもっている（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ、１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０）。
【０１０４】
Ｅ．改変ウイルスを用いる送達
送達する核酸を、特異的な結合リガンドを発現するように遺伝子操作された感染性のウイルス中に収容することができる。したがって、ウイルス粒子は、標的細胞の同族受容体に特異的に結合し、内容物を細胞に送達することになる。ウイルスエンベロープにラクトース残基を化学的に付加することによるレトロウイルスの化学修飾に基づいて、レトロウイルスベクターの特異的なターゲティングを可能にするように設計された新規なアプローチが開発された。この修飾は、シアロ糖タンパク質受容体を介した肝細胞の特異的な感染を可能にすることができる。
【０１０５】
レトロウイルスエンベロープタンパク質および特定の細胞受容体に対するビオチン化抗体が用いられる、組換え体レトロウイルスをターゲティングする別のアプローチが設計された。抗体は、ストレプトアビジンを用いることにより、ビオチン構成要素を介して結合させた（Ｒｏｕｘら、１９８９）。Ｒｏｕｘらは、主要組織適合複合体クラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体を用いて、それらの表面抗原を有する様々なヒト細胞の、エコトロピックウイルスによる感染をｉｎ  ｖｉｔｒｏで実証した（Ｒｏｕｘら、１９８９）。
【０１０６】
Ｆ．ベクター送達と細胞形質転換
細胞をトランスフェクトまたは形質転換するための核酸送達のための適した方法は、当業者に公知である。そのような方法には、ＤＮＡのｅｘ  ｖｉｖｏでのトランスフェクションや注入などによる直接的送達が含まれるが、これらに限定されない。当業界で公知の技法の適用によって、細胞を安定的にまたは一過性に形質転換することができる。
【０１０７】
Ｇ．Ｅｘ  ｖｉｖｏ形質転換
ｅｘ  ｖｉｖｏセッティングにおいて、生物から摘出された真核細胞および組織にトランスフェクトするための方法は、当業者に公知である。したがって、細胞または組織を摘出し、ヘパラナーゼまたは本開示の他の核酸を使用して、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいてトランスフェクトしうることが企図されている。特定の態様では、移植細胞または組織が生物内に入れられる。好ましい様相では、核酸が移植細胞内で発現される。
【０１０８】
ＶＩ．キット
本明細書に記載の組成物は、いずれもキットに含めることができる。非限定的な例では、組換え発現されたヘパラナーゼを有する、細胞療法における使用のための、１つもしくは複数の細胞、および／または組換え発現されたヘパラナーゼを有する、細胞療法における使用のための、１つもしくは複数の細胞を生成する試薬を、キットに含めることができる。キットの構成要素は、適した容器手段で提供される。特定の実施形態では、キットは、ベクター、プライマー、酵素（制限酵素、リガーゼ、ポリメラーゼなど）、緩衝液、ヌクレオチドなどの組換え操作試薬を含む。
【０１０９】
キットのいくつかの構成要素は、水性媒体に入れるか、凍結乾燥形態でパッケージングすることができる。キットの容器手段には、通常、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器手段が含まれることになり、その中に、構成要素を入れる、好ましくは、適切にアリコートに分けることができる。キット内に複数の構成要素がある場合、キットは、通常、第２、第３、または他の追加の容器を含有することになり、その中に追加の構成要素を個別に入れることができる。しかし、構成要素の様々な組合せを１つのバイアルに含めることもできる。本開示のキットは、典型的には、販売用に構成要素をしっかりと封じ込めるための手段も含むことになる。そのような容器には、その中に所望のバイアルが保持される射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器が含まれることになる。
【０１１０】
キットの構成要素を１種および／または２種以上の液体溶液中で提供する場合、液体溶液は水溶液であり、無菌水溶液が特に有用である。場合によっては、容器手段が、それ自体、シリンジ、ピペット、および／または装置などの他のものであってもよく、そこから、製剤を身体の感染領域に適用すること、動物に注射すること、ならびに／またはキットの他の構成要素にさえ適用し、かつ／もしくはこれと混合することができる。
【０１１１】
しかし、キットの構成要素は、乾燥粉末として提供することができる。試薬および／または構成要素を乾燥粉末として提供する場合、この粉末を、適した溶媒の添加によって再構成することができる。溶媒を別の容器手段に入れて提供できることが企図されている。キットは、無菌の薬学的に許容できるバッファーおよび／または他の希釈剤を含有するための第２の容器手段を含むことができる。
【０１１２】
本開示の特定の実施形態では、細胞療法に用いられる細胞をキットに入れて提供し、場合によっては、細胞がキットの本質的に唯一の構成要素となる。キットは、代わりにまたは加えて、ヘパラナーゼのために細胞を組換えとする試薬および材料を含みうる。特定の実施形態では、試薬および材料には、ヘパラナーゼを増幅するためのプライマー、ヌクレオチド、適したバッファー、バッファー試薬、塩などが含まれ、場合によっては、試薬には、ヘパラナーゼをコードするベクターおよび／もしくはＤＮＡならびに／またはそのための調節エレメントが含まれる。
【０１１３】
特定の実施形態では、キット内に、個体から１つまたは複数の試料を抽出するのに適した１つまたは複数の装置がある。この装置は、シリンジ、メスなどであってもよい。
【０１１４】
本開示のいくつかの場合に、キットには、細胞療法の実施形態に加えて、例えば、化学療法、ホルモン療法、および／または免疫療法など、二次がん療法も含まれる。キットは、個体の特定のがんに照らして調整することができ、個体のためのそれぞれの二次がん療法を含みうる。
【０１１５】
本開示のいくつかの場合に、キット内の細胞は、ヘパラナーゼ以外の治療用分子が発現されるように改変することができる。他の治療用分子は、任意の種類でありうるが、特定の実施形態では、治療用分子は、例えば、キメラ抗原受容体である。
【０１１６】
場合によっては、キットが、細胞療法実施形態に加えて、例えば、化学療法、ホルモン療法、および／または免疫療法など、第２のがん療法も含む。キットは、個体用に特定のがんに適合させ、個体用のそれぞれの第２のがん療法を含むようにできる。
【０１１７】
ＶＩＩ．併用療法
本開示のある特定の実施形態では、臨床態様のための本開示の方法が、（がん療法とも称しうる）抗がん剤など、過増殖疾患の処置に有効な他の薬剤と併用される。例えば、「抗がん」剤は、がん細胞を殺滅する、がん細胞のアポトーシスを誘導する、がん細胞の成長速度を低減させる、転移の発生率または数を低減させる、腫瘍の大きさを低減させる、腫瘍成長を抑制する、腫瘍もしくはがん細胞への血液供給を低減させる、がん細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促進する、がんの進行を防止もしくは抑制する、またはがんを有する対象の寿命を延長することによって、対象体内のがんに負の影響を与えることができる。より一般的には、これらの他の組成物は、細胞を殺滅するか、その増殖を抑制するのに有効な総量で提供することになる。このプロセスは、がん細胞を、発現コンストラクトおよび薬剤または複数の因子と同時に接触させることを含みうる。これは、細胞を、両方の薬剤を含む１つの組成物または薬理学的製剤と接触させることによって、または細胞を、一方の組成物が発現コンストラクトを含み、他方が第２の薬剤を含む２つの異なる組成物もしくは製剤と同時に接触させることによって達成できる。
【０１１８】
化学療法および放射線療法薬剤に対する腫瘍細胞の耐性は、臨床腫瘍学における重大な問題となっている。現在のがん研究の１つの目標は、化学療法および放射線療法の有効性を、それを遺伝子療法と併用することによって改善する方法を見出すことである。例えば、レトロウイルスベクター系によって脳腫瘍に送達される場合の、単純ヘルペス−チミジンキナーゼ（ＨＳ−ｔＫ）遺伝子は、抗ウイルス剤ガンシクロビルに対する感受性を誘導することに成功した（Ｃｕｌｖｅｒら、１９９２）。本開示の文脈では、細胞療法は、他のアポトーシス促進剤または細胞周期調節剤に加えて、化学療法的介入、放射線療法的介入、または免疫療法的介入と共に、同様に使用しうることが企図されている。
【０１１９】
代わりに、本発明の療法は、他方の薬剤処置と数分間から何週間かの間隔を置いて、その前にまたはその後に行うことができる。他方の薬剤と本開示が個体に別々に適用される実施形態では、一般に、各送達時の間で有意な期間が期限切れにならないことを確実にして、それにより、薬剤療法および本発明の療法が細胞に対してなお有利な併用効果を及ぼすことができるようにすることになる。そのような場合、細胞を、両方の様式と、相互に約１２〜２４時間の内、より好ましくは、相互に約６〜１２時間の内に接触させることができることが企図されている。しかし、状況によっては、処置の期間をかなり延長し、それぞれの投与の間で数日（２、３、４、５、６、または７）から数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８）が経過することが望ましい可能性がある。
【０１２０】
次のような様々な組合せを利用することができる。ここで、本開示は「Ａ」であり、放射線療法または化学療法など、第２の薬剤は「Ｂ」である。
【０１２１】
Ａ／Ｂ／Ａ        Ｂ／Ａ／Ｂ        Ｂ／Ｂ／Ａ        Ａ／Ａ／Ｂ        Ａ／Ｂ／Ｂ        Ｂ／Ａ／Ａ        Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ        Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
【０１２２】
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ              Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ              Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ              Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ            Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ            Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ
【０１２３】
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ              Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ              Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ            Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ            Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ            Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
【０１２４】
必要に応じて処置サイクルを反復することが予期されている。様々な標準的療法および外科的介入を本発明の細胞療法と組み合わせて適用できることも企図されている。
【０１２５】
Ａ．化学療法
がん療法には、化学的処置および放射線照射ベースの処置の両方の様々な併用療法も含まれる。組合せ抗がん剤には、例えば、アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；アクロニン；アドゼレシン；アデルスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；アメタントロン酢酸塩；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビサントレン塩酸塩；ビスナフィドジメシレート；ビゼレシン；ブレオマイシン硫酸塩；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン；セデフィンゴール；セレコキシブ（ＣＯＸ−２阻害剤）；クロランブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；メシル酸デザグアニン；ジアジコン；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン；ドロロキシフェンクエン酸塩；プロピオン酸ドロスタノロン；ズアゾマイシン；エダトレキサート；エフロルニチン塩酸塩；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロメート；エピプロピジン；エピルビシン塩酸塩；エルブルゾール；エソルビシン塩酸塩；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸エステルナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；エトポシドリン酸塩；エトプリン；ファドロゾール塩酸塩；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；フルダラビンリン酸エステル；フルオロウラシル；フルオロシタビン；フォスキドン；フォストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；ヒドロキシ尿素；イダルビシン塩酸塩；イホスファミド；イルモフォシン；イプロプラチン；イリノテカン；イリノテカン塩酸塩；ランレオチド酢酸塩；レトロゾール；ロイプロリド酢酸塩；リアロゾール塩酸塩；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩；マソプロコール；メイタンシン；メクロレタミン塩酸塩；メゲストロール酢酸塩；メレンゲストロール酢酸エステル；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；マイトカルシン；マイトクロミン；マイトギリン；マイトマルシン；マイトマイシン；マイトスペル；ミトタン；ミトキサントロン塩酸塩；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；ペプロマイシン硫酸塩；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピロキサントロン塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン塩酸塩；ピューロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン；サフィンゴール；サフィンゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン；スパルホセートナトリウム；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン；テコガランナトリウム；タキソテール；テガフール；テロキサントロン塩酸塩；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；トレミフェンクエン酸塩；酢酸トレストロン；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；ツブロゾール塩酸塩；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン硫酸塩；ビンクリスチン硫酸塩；ビンデシン；ビンデシン硫酸塩；ビネピジン硫酸塩；硫酸ビングリシネート；硫酸ビンレウロシン；ビノレルビン酒石酸塩；硫酸ビンロシジン；ビンゾリジン硫酸塩；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；ゾルビシン塩酸塩；２０−ｅｐｉ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アデルスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス；アミホスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド；血管新生阻害剤；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；アントラレリックス；反ｄｏｒｓａｌｉｚｉｎｇ形成タンパク質１（ａｎｔｉ−ｄｏｒｓａｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）；前立腺癌用の抗アンドロゲン；抗エストロゲン；抗ネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシネート；アポトーシス遺伝子調整剤；アポトーシス調節剤；アプリン酸；ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；ベータラクタム誘導体；ベータ−アレチン；ベータクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤；ビカルタミド；ビサントレン；ビサジリジニルスペルミン；ビスナフィド；ビストラトレンＡ；ビゼレシン；ブレフレート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキサミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３；ＣＡＲＮ  ７００；軟骨由来阻害剤；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリックス；クロリン；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；ｃｉｓ−ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン；クランベシジン８１６；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；クラ��ンＡ；シクロペントアントラキノン；シクロプラタム；シペマイシン；シタラビンオクホスフェート；細胞溶解因子；サイトスタチン；ダクリキシマブ；デシタビン；デヒドロジデミンＢ；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシホスファミド；デキスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジコン：ジデミンＢ；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；９−ジヒドロタキソール；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドキソルビシン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン；エデルフォシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフル；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチン類似体；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；エトポシドリン酸塩；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；フルオロダウノルビシン塩酸塩；フォルフェニメックス；ホルメスタン；フォストリエシン；ホテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリックス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモフォシン；イロマスタット；イマチニブ（例えば、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標））、イミキモド；免疫刺激ペプチド；インスリン様成長因子１受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；イオベングアン；ヨードドキソルビシン；４−イポメアノール；イロプラクト；イルソグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリコンドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドＦ；ラメラリンＮトリアセテート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；レンチナン硫酸塩；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病阻害性因子；白血球アルファインターフェロン；ロイポロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；リュープロレリン；レバミソール；リアロゾール；直鎖状ポリアミン類似体；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リソクリナミド７；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロキソリビン；ルルトテカン；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン；溶解性ペプチド；メイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリリシン阻害剤；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害剤；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシン類似体；ミトナフィド；マイトトキシンである線維芽細胞成長因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；ヒト絨毛性ゴナドトロピンであるＥｒｂｉｔｕｘ；モノホスホリルリピドＡ＋ミオバクテリウム細胞壁ｓｋ；モ��ダモール；マスタード系抗がん剤；ミカペロキシドＢ；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ置換ベンザミド；ナファレリン；ナグレスチップ；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン：ネリドロン酸；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素調整剤；窒素酸化物による抗酸化剤；ニトルリン；オビメルセン（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））；Ｏ６−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイン誘導剤；オルマプラチン；オサステロン；オキサリプラチン；オキサウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセル類似体；パクリタキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペガスパルガーゼ；ペルデシン；ポリ硫酸ペントサンナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール；ペルフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；酢酸フェニル；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニール；ピロカルピン塩酸塩；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンＡ；プラセチンＢ；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤；白金複合体；白金化合物；白金−トリアミン複合体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビス−アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害剤；プロテインＡベースの免疫調節剤；プロテインキナーゼＣ阻害剤；小型藻類のプロテインキナーゼＣ阻害剤；プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート；ｒａｆアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルプロテイントランスフェラーゼ阻害剤；ｒａｓ阻害剤；ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤；脱メチル化レテリプチン；レニウムＲｅ１８６エチドロネート；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチナミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメックス；ルビジノンＢ１；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ１模倣体；セムスチン；老齢由来阻害剤１；センスオリゴヌ
クレオチド；シグナル伝達阻害剤；シゾフラン；ソブゾキサン；ボロカプテートナトリウム；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール；ソマトメジン結合性タンパク質；ソネルミン；スパルホス酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンギスタチン１；スクァラミン；スチピアミド；ストロメリシン阻害剤；スルフィノシン；過活動血管作動性腸管ペプチドアンタゴニスト；スラジスタ；スラミン；スワインソニン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリリウム；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；タリブラスチン；チロコラリン；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣体；チマルファシン；チモポエチン受容体アゴニスト；チモトリナン；甲状腺刺激性ホルモン；エチルエチオプルプリンすず；チラパザミン；チタノセンジクロリド；トプセンチン；トレミフェン；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；チルホスチン；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメクス；尿生殖洞由来成長阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリンＢ；ベラレソール；ベラミン；ベルジン；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン；ビタキシン；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；およびジノスタチンスチマラマー、または以上の任意の類似体バリアントもしくは誘導体バリアントが含まれる。特定の実施形態では、化学療法は、本開示と共に、例えば、開示の投与前、投与中、および／または投与後に利用する。例示の化学療法剤には、少なくとも、ダカルバジン（ＤＴＩＣとも称する）、テモゾリミド、パクリタキセル、シスプラチン、カルムスチン、ホテムスチン、ビンデシン、ビンクリスチン、またはブレオマイシンが含まれる。
【０１２６】
Ｂ．放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こし、かつ広く利用されている他の因子には、γ線、Ｘ線および／または腫瘍細胞への放射性同位元素の指向的送達として一般に知られているものが含まれる。マイクロ波およびＵＶ照射などの他の形態のＤＮＡ損傷因子も企図されている。これらの因子すべてが、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復、ならびに染色体の集合および維持に広範な損傷をもたらす可能性がきわめて高い。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３〜４週間）にわたる場合の５０〜２００レントゲンの１日線量から、２０００〜６０００レントゲンの単回線量までである。放射性同位元素の投与量範囲は、広範に様々であってもよく、同位元素の半減期、照射される放射線の強度およびタイプ、ならびに新生細胞による取り込みによって左右される。
【０１２７】
細胞に用いられる場合、「接触」および「曝露」という用語は、本明細書では、治療用コンストラクトおよび化学療法剤または放射線療法剤を標的細胞に送達するか、標的細胞の直近に置くプロセスを述べるのに使用される。細胞の殺滅または分裂停止を行うため、細胞を殺滅するか、細胞が分裂するのを妨げるのに有効な総量で両薬剤を細胞に送達する。
【０１２８】
Ｃ．免疫療法
免疫療法薬は、一般に、免疫エフェクター細胞および分子の使用に依存して、がん細胞を標的にし、破壊する。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面のなんらかのマーカーに特異的な抗体でありうる。抗体だけで、治療のエフェクターとして働いても、細胞殺滅を実際に行うのに他の細胞を動員してもよい。抗体は、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）とコンジュゲートさせてもよく、ターゲティング剤として働く。代わりに、エフェクターは、直接的または間接的に腫瘍細胞標的と相互作用する表面分子を有するリンパ球でもよい。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が含まれる。
【０１２９】
したがって、免疫療法を、本開示の細胞療法との併用療法の一部として用いることもあり得る。併用療法の一般的なアプローチについて以下に論じる。一般に、腫瘍細胞には、標的にすることができる、すなわち、大部分の他の細胞には存在しないなんらかのマーカーがあるはずである。多くの腫瘍マーカーが存在しており、これらのいずれも、本開示の関係において、ターゲティングに適したものでありうる。一般的な腫瘍マーカーには、癌胎児性抗原、前立腺特異抗原、尿中腫瘍関連抗原、胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シリアルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂ  Ｂ、およびｐ１５５などが含まれる。
【０１３０】
免疫療法には、例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２）またはインターフェロン（ＩＦＮ）が含まれうる。ある特定の実施形態では、免疫療法は、Ｎｏｔｃｈ経路のリガンドまたは受容体に対する抗体、例えば、ＤＬＬ４、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２／３、Ｆｚｄ７、またはＷｎｔに対する抗体である。ある特定の他の実施形態では、免疫療法は、ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ（ＲＳＰＯ）１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、またはＲＳＰＯ４に対する抗体である。
【０１３１】
Ｄ．遺伝子
さらに別の実施形態では、第２の処置が、治療用ポリヌクレオチドが本開示の臨床実施形態の前もしくは後、またはそれと同時に投与される遺伝子療法である。細胞増殖の誘導因子、細胞増殖の抑制因子、またはプログラム細胞死の調節因子を含めた様々な発現産物が、本開示に包含される。
【０１３２】
Ｅ．外科手術
がんを有するヒトの６０％が、予防、診断、病期分類、根治、および緩和のための手術を含めたなんらかのタイプの手術を行うことになる。根治手術は、本開示の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、および／または代替療法など、他の療法とともに施用されうるがん治療である。
【０１３３】
根治手術には、がん組織の全体または一部を物理的に摘出、切除、および／または破壊する切除術が含まれる。腫瘍切除術は、少なくとも腫瘍の一部の物理的な摘出を指す。腫瘍切除術に加えて、外科手術による処置には、レーザー外科療法、低温外科手術、電気外科手術、および顕微鏡下手術（モース手術）が含まれる。本開示は、表在がん、前がん病変、または付帯的な量の正常組織の摘出とともに使用できることがさらに企図されている。
【０１３４】
がん細胞、組織、または腫瘍の全部または一部の切除に際し、体内に空洞が形成されうる。さらなる抗がん療法の潅流、直接注射、または当該領域への局所適用によって、処置を達成させてもよい。そのような処置は、例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、もしくは７日毎に、または１週、２週、３週、４週、および５週毎に、または１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、もしくは１２カ月毎に、反復することができる。これらの処置は、投薬量が可変的なものでもよい。
【０１３５】
Ｆ．他の薬剤
処置の治療有効性を向上させるために、本開示と組み合わせて、他の薬剤を用いてもよいことが企図されている。これらの追加薬剤には、免疫調節剤、細胞表面受容体およびギャップ結合の上方制御に作用する薬剤、細胞分裂停止および分化薬剤、細胞接着の阻害剤、またはアポトーシス誘導因子に対する過増殖細胞の感受性を増強する薬剤が含まれる。免疫調節剤には、腫瘍壊死因子；インターフェロンα、β、およびγ；ＩＬ−２および他のサイトカイン；Ｆ４２Ｋおよび他のサイトカイン類似体；ＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、および他のケモカインが含まれる。Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド、ＤＲ４もしくはＤＲ５／ＴＲＡＩＬなど、細胞表面受容体またはそのリガンドの上方制御は、過増殖細胞に対するオートクリンまたはパラクリン作用を確立することによって、本開示のアポトーシス誘導能を強化するであろうことがさらに企図されている。ギャップ結合の数の増大によって、細胞間シグナル伝達が増大すれば、近傍の過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖性効果が増大するであろう。他の実施形態では、処置の抗過増殖有効性を向上させるために、本開示と組み合わせて、細胞分裂停止または分化薬剤を用いることができる。細胞接着の阻害剤は、本開示の有効性を向上させることが企図されている。細胞接着阻害剤の例は、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンである。処置の有効性を向上させるために、抗体ｃ２２５など、アポトーシスに対する過増殖細胞の感受性を増強する他の薬剤を、本開示と組み合わせて使用できるであろうことがさらに企図されている。
【実施例】
【０１３６】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証する目的で含める。当業者ならば、後続の実施例で開示される技法が、本発明者によって本発明の実施においてよく機能することが発見された技法を表し、したがって、その実施のための好ましい方式を構成すると考えられうることを理解するであろう。しかし、当業者ならば、本開示に照らして、開示される特定の実施形態において、多くの変化を施し、本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに、やはり同じ結果または同様の結果を得うることも理解するであろう。
【０１３７】
実施例１
腫瘍特異的Ｔ細胞内で回復されたヘパラナーゼの発現は、神経芽細胞腫モデルにおけるそれらの抗腫瘍効果を強化する
養子Ｔ細胞ベースの療法は、リンパ腫および他の血液悪性腫瘍を有する患者において有望な結果を示してきたが、固形腫瘍ではそれほど有効でないと考えられている。具体的に、神経芽細胞腫（ＮＢ）における近年の臨床試験が、軽度のバルク疾患を有する患者に限り、ＣＡＲ改変Ｔ細胞による抗腫瘍有効性を示したことから、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて拡張されたエフェクターＴ細胞の、固形腫瘍の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に浸透し、この中を移動する能力は、限定的であることが示唆される。
【０１３８】
活性化Ｔ細胞およびエフェクターＴ細胞のＥＣＭ内の移動を調節する機構は、それほど探索されていないが、本発明者らは、循環Ｔ細胞と異なり、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡張されたＴ細胞は、内皮下基底膜（ＢＭ）およびＥＣＭを構成する、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）の分解に関与する重要な酵素である、ヘパラナーゼ（ＨＰＳＥ）を発現しないことを見出した。この酵素活性の欠如が、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡張されたＴ細胞（８％±６％）の、休眠Ｔ細胞（２３％±８％）または活性化されて短時間のＴ細胞（３４％±８％）と比較して有意に（ｐ＝０．０１）損なわれた浸潤能力と並行したことは重要である。したがって、本発明者らは、レトロウイルス遺伝子改変による、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて培養された抗原特異的Ｔ細胞内のＨＰＳＥの回復が、それらの浸潤特性をレスキューし、抗腫瘍活性の改善をもたらすのかどうかを評価した。ＨＰＳＥおよびＧＤ２特異的ＣＡＲ（ＣＡＲ）をＴ細胞内で共発現して、ＮＢを標的化したところ、ＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋Ｔ細胞は、ＣＡＲ＋Ｔ細胞と同等な表現型特徴および抗腫瘍活性を保持したが、ＣＡＲ＋Ｔ細胞（１３％±９％；ｐ＜０．００１）と比較して、ＥＣＭに浸潤する優れた能力を獲得した（６６％±１％）。ＥＣＭの存在下において、ＮＢ腫瘍細胞を伴う共培養実験を実施した場合に、ＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抗腫瘍活性が、ＣＡＲ＋Ｔ細胞と比較して改善された（残留腫瘍細胞：対照Ｔ細胞、ＣＡＲ＋Ｔ細胞、およびＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋Ｔ細胞について、それぞれ、６８％±３％、５２％±９％および１９％±１％）（ｐ＝０．０００１：対照対ＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥおよびｐ＝０．０１７：ＣＡＲ対ＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ）ことは重要である。異種移植片神経芽細胞腫マウスモデルにおいて、抗腫瘍活性を比較したところ、ＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋Ｔ細胞で処置されたマウスは、対照Ｔ細胞（ｐ＜０．００１）またはＣＡＲ＋Ｔ細胞（ｐ＜０．００７）で処置されたマウスと比較して、４０日目までの生存が有意に改善された。加えて、ＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋Ｔ細胞を注入されたマウスの４７％は、ＣＡＲ＋Ｔ細胞を注入されたマウスの２８％と比較して、４０日目まで腫瘍はなかった。ＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋Ｔ細胞（４．６％±２．４％）で処置されたマウスは、対照Ｔ細胞（０．６％±０．５；ｐ＝０．０２９）またはＣＡＲ＋Ｔ細胞（０．１％±０．１；ｐ＝０．０４３）で処置されたマウスから回収された腫瘍と比較して、Ｔ細胞による腫瘍へのより大きな浸潤を示した。結論として、抗原特異的Ｔリンパ球内で回復されたＨＰＳＥの発現は、固形腫瘍のＴ細胞による免疫療法に有意な影響を及ぼす。
【０１３９】
実施例２
腫瘍特異的Ｔリンパ球内の、欠損したヘパラナーゼの発現の回復は、それらの抗腫瘍効果を強化する
拡張されたＴ細胞は、ＨＰＳＥの欠如により、ＥＣＭを分解する能力が損なわれている。ｅｘ  ｖｉｖｏで拡張されたＴ細胞は、ＥＣＭを分解するそれらの能力が欠損しているのかどうかをまず評価した。Ｍａｔｒｉｇｅｌベースの浸潤アッセイを使用して、拡張されたＴ細胞を、単離されたばかりの休眠Ｔ細胞（ＦＴ）（ナイーブＴ細胞、エフェクター・メモリーＴ細胞、およびセントラル・メモリーＴ細胞）、２４時間にわたりＯＫＴ３／ＣＤ２８  Ａｂに曝露された、短時間活性化されたＴ細胞（ＢＡ−Ｔ）、長期間にわたりｅｘ  ｖｉｖｏで拡張されたＴ細胞（ＬＴＥ−Ｔ）（１２〜１４日間にわたり活性化および培養された）（セントラル・メモリーＴ細胞およびエフェクター・メモリーＴ細胞）、および単離されたばかりの単球（陽性対照）と比較した。予測される通り、５種の異なる健常ドナーから単離された単球は、ＥＣＭを分解する最大の能力（６３％±２３％）を示した（図１Ａ）。ＢＡ−Ｔが、ＦＴと比較して、ＥＣＭへの浸潤の強化を示した（それぞれ、３４％±８％の対２３％±８％；ｐ＝０．０５）ことは、齧歯動物で前に報告されたデータ（ｄｅ  Ｍｅｓｔｒｅら、２００７）と符合する。しかし、ＬＴＥ−Ｔは、ＢＡ−Ｔ（ｐ＝０．０１）およびＦＴ（ｐ＝０．０２２）のいずれと比較しても、ＥＣＭを分解する能力が有意に低減された（８％±６％）。
【０１４０】
上記の観察の一因となる機構を精査するため、各細胞群内のＨＰＳＥの発現および機能を評価した。単球ならびにＣＤ４＋ＦＴおよびＣＤ８＋ＦＴならびにＣＤ４＋ＢＡ−ＴおよびＣＤ８＋ＢＡ−Ｔのいずれも、ＨＰＳＥの活性形態（５０ＫＤａ）の発現を保持したが、ＬＴＥ−Ｔは、培養の２日目までにＨＰＳＥの発現を喪失し、培養期間中において、一貫して陰性を維持した（図１Ｂ）ことは、浸潤アッセイと符合する。さらに、ＬＴＥ−Ｔが休眠していて、その後、培養の１４日目に、ＯＫＴ３／ＣＤ２８  Ａｂを使用して、再活性化された場合でさえ、ＨＰＳＥは、再発現されなかった。ＬＴＥ−ＴによるＨＰＳＥの発現の欠如は、免疫蛍光によって確認された（図１Ｃ）。セントラル・メモリー（ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋）細胞およびエフェクター・メモリー（ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ−）細胞を末梢血から分離することによって、ＯＫＴ３／ＣＤ２８  Ａｂによる刺激の１８時間後において、両方のサブセットにおけるＨＰＳＥの潜在形態（６５ｋＤａ）から活性（５０ｋＤａ）形態への移行、およびその後における酵素の恒常的な喪失（図７）も実証された。
【０１４１】
ＬＴＥ−Ｔ内のＨＰＳＥタンパク質の非存在は、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより評価される、ＨＰＳＥ  ｍＲＮＡの下方制御と関連した。図１Ｄで示される通り、ＨＰＳＥ特異的ｍＲＮＡは、ＣＤ４＋Ｔ細胞内およびＣＤ８＋Ｔ細胞内のいずれにおいても、活性化の直後に減少し、１４日間の培養期間にわたり、ＣＤ１４＋細胞と比較して（ＣＤ４＋Ｔ細胞について、ｐ＜０．００５、およびＣＤ８＋Ｔ細胞について、ｐ＜０．０３１）低量を維持した。ＯＫＴ３／ＣＤ２８  Ａｂによる、培養の１４日目までのＬＴＥ−Ｔの再活性化は、ＨＰＳＥ  ｍＲＮＡの上方制御を誘導しなかった。このＬＴＥ−Ｔ内の細胞内ＨＳＰＥの欠如は、培養物上清中の酵素活性の欠如によっても確認された。図１Ｅで示される通り、ＦＴの活性化の最初の７２時間以内に回収された上清中で、ＨＰＳＥの酵素活性が検出され、これは、培養培地中の蓄積に帰することができるが、酵素活性は、７２時間後にバックグラウンドレベルに戻っている（ＣＤ４＋ＦＴおよびＣＤ８＋ＦＴについて、それぞれ、０．３４Ｕ／ｍｌ±０．２Ｕ／ｍｌおよび０．４５Ｕ／ｍｌ±０．２７Ｕ／ｍｌから、０．２２Ｕ／ｍｌ±０．０６へ）（図１Ｅ）。
【０１４２】
腫瘍抑制因子ｐ５３は、そのプロモーターに結合することによって、ＨＰＳＥ遺伝子の発現を調節する。ｐ５３が、ＨＰＳＥを過剰発現する腫瘍内の細胞内の機能の喪失により、下方制御されるかまたは突然変異することを示す以前の研究に基づき、活性化Ｔリンパ球内の機能的ｐ５３ならば、ＨＰＳＥ  ｍＲＮＡの下方制御に関与することが考えられた。ｐ５３のｍＲＮＡ（図９Ａ）およびタンパク質サブユニット（図９Ｂ）は、活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞内およびＣＤ８＋Ｔ細胞内のいずれにおいても遷延的に上方制御され、ｅｘ  ｖｉｖｏの培養中においても上方制御されることが見出された。ｐ５３クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ：ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）により評価される通り、ｐ５３は、ＬＴＥ−Ｔ内でＨＰＳＥプロモーターに結合した（図９Ｃ）ので、ｐ５３の上方制御とＨＰＳＥの下方制御とは、実際に連関していた。この事象が、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養されたＴ細胞（ＬＴＥ−Ｔ）内で観察されるだけでなく、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋）Ｔ細胞から抗原感作を経たＴ細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋）への移行中においても生理学的に生じることをさらに実証するため、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ：Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の架橋による活性化の前および後における、単離されたばかりのＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞内で、ｐ５３  ＣｈＩＰを繰り返した。図９Ｄで示される通り、ナイーブＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞は、ＴＣＲ架橋の７２時間後に限る、ｐ５３の、ＨＰＳＥプロモーターへの結合を示し、これは、ナイーブＴ細胞から抗原感作を経たＴ細胞へのそれらの移行を指示する。したがって、活性化Ｔ細胞内のｐ５３の上方制御は、ＨＰＳＥ  ｍＲＮＡ発現の下方制御に恒常的に寄与する。
【０１４３】
ＨＰＳＥの再発現は、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡張されたＬＴＥ−Ｔの、ＥＣＭを分解する能力を回復する。ＬＴＥ−Ｔが、ＨＰＳＥの発現を下方制御し、それによって、ＥＣＭを分解するそれらの能力を喪失することを見出したところ、レトロウイルス遺伝子導入を介して、ＬＴＥ−Ｔ内のＨＰＳＥを再発現すれば、それらの浸潤能力が回復されることが考えられた。図２Ａで示される通り、ＧＦＰおよびＨＰＳＥの両方をコードするレトロウイルスベクターを形質導入されたＬＴＥ−Ｔは、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびＷＢにより評価される（図２ＢおよびＣ）通り、ＧＦＰ（５１％±１８％）およびＨＰＳＥを発現した。機能アッセイにおいて実証される通り、ＨＰＳＥ（Ｉ）ＧＦＰ＋ＬＴＥ−Ｔは、ＥＣＭ（４８％±１９％）を、対照ＬＴＥ−Ｔ（２９％±１８％；ｐ＝０．０２５）より良好に分解した（図２Ｄ）。この相違は、形質導入されたＴ細胞を、ＧＦＰ陽性細胞の選択（＞９０％）に基づき、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）細胞浸潤アッセイにより試験する前に、ＨＰＳＥの発現について濃縮した場合にさらに強められた（６９％±１９％、ｐ＜０．００１）。ＨＰＳＥ阻害剤Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｈ１（Ｎａｋａｊｉｍａら、１９８４）の添加により、ＧＦＰにより分取されたＬＴＥ−Ｔによる浸潤は、７４％±１４％から２９％±９％に有意に（ｐ＜０．０１）低減された（図２Ｅ）ので、ＨＰＳＥ（Ｉ）ＧＦＰ＋ＬＴＥ−Ｔの回復された浸潤特性は、ＨＰＳＥ特異的であることが確認された。したがって、養子Ｔ細胞移入のためにｅｘ  ｖｉｖｏで培養されたＬＴＥ−Ｔ内のＨＰＳＥの再発現は、メモリー細胞の、ＥＣＭを分解する生理学的特性を回復する。
【０１４４】
ＧＤ２特異的ＣＡＲで改変されたＴリンパ球内のＨＰＳＥの共発現は、エフェクター機能を損なわずに、ＥＣＭへの浸潤を強化する。ＬＴＥ−Ｔ内のＨＰＳＥの発現は、ＥＣＭを分解するそれらの能力を回復することを実証したので、次に、この特性を、抗腫瘍特異性とカップリングしうるのかどうかを決定した。ＮＢを、モデルとして使用し、ＧＤ２特異的ＣＡＲの発現によって、ＮＢ関連抗原ＧＤ２を標的化する、Ｔ細胞を生成した（Ｐｕｌｅら、２００５）。５種の健常ドナーに由来するＬＴＥ−Ｔに、ＣＡＲ単独またはＨＰＳＥおよびＣＡＲの両方（ＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ）をコードするレトロウイルスベクターを形質導入した。ＣＡＲベクターおよびＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥベクターを使用したところ、培養の１４日目におけるＣＡＲ発現は、それぞれ、７１％±１４％および５６％±６％であった（図３Ａ）。ＣＡＲ分子は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれによっても発現された（ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のそれぞれについて、３９％±１９％および６０％±１８％；ＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ：ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のそれぞれについて、３８％±１３％および６１％±１３％）。ＨＰＳＥは、ＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥベクターを形質導入されたＴ細胞内のウェスタンブロットによって、一貫して検出された（図３Ｂ）。ＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋ＬＴＥ−Ｔは、ＮＢ標的細胞に対するエフェクター機能を保持した。標準的な５１Ｃｒ放出アッセイでは、ＣＡＲ＋ＬＴＥ−ＴおよびＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋ＬＴＥ−Ｔのいずれも、ＧＤ２＋ＬＡＮ１細胞（２０：１のＥ：Ｔ比における、それぞれ、７１％±２２％および４１％±１６％の殺滅）およびＧＤ２＋ＣＨＬＡ−２５５細胞（それぞれ、７６％±７％および５５％±１３％）を特異的に溶解させた。ＣＡＲおよびＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥＬＴＥ−Ｔは、ＧＤ２−標的細胞系Ｒａｊｉに対して、無視できる程度の活性を示した（それぞれ、８％±３％および２％±２％）（図３Ｃ）。予測される通り、対照ＬＴＥ−Ｔは、これらの標的のいずれも溶解させなかった。ＣＡＲ改変Ｔ細胞の抗腫瘍活性は、ＩＦＮγ（ＣＡＲ＋ＬＴＥ−ＴおよびＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋ＬＴＥ−Ｔについて、それぞれ、細胞１０６個当たり９２７±３２８および５２７±３２０ｐｇ／ｍｌ）およびＩＬ−２（ＣＡＲ＋ＬＴＥ−ＴおよびＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋ＬＴＥ−Ｔについて、それぞれ、細胞１０６個当たり８３±６および６１±２７ｐｇ／ｍｌ）の放出が保持された（図３Ｄ）、Ｔｈ１サイトカインプロファイルの保存と関連した。それらの同等な細胞傷害機能とは著しく対照的に、ＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋ＬＴＥ−Ｔだけが、ＥＣＭを、ＣＡＲ＋ＬＴＥ−Ｔまたは対照ＬＴＥ−Ｔ（それぞれ、１３％±９％および１６％±１０％）と比較して、有意に（ｐ＝０．００４およびｐ＜０．００１）良好に（６６％±１％）分解した（図３Ｅ）。ＨＰＳＥおよびＣＡＲを共発現するＬＴＥ−Ｔが、ＥＣＭの存在下で抗腫瘍活性を増大させたことを、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて立証するため、ＬＴＥ−Ｔおよび腫瘍細胞を、ＬＴＥ−Ｔは、ＥＣＭを分解して、腫瘍標的に到達し、これらを消失させなければならない、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）細胞浸潤アッセイにプレーティングした。培養の３日後、ＣＡＲ＋ＬＴＥ−ＴおよびＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋ＬＴＥ−Ｔのいずれも（＜３％の残留ＧＦＰ＋腫瘍細胞）、ＥＣＭの非存在下（インサート）で、ＬＡＮ−１腫瘍細胞を、対照ＬＴＥ−Ｔ（３１％±６％の残留ＧＦＰ＋ＬＡＮ−１細胞）と比較して同等に良好に消失させた（図３Ｆ、Ｇ）。これと対照的に、ＥＣＭの存在下では、ＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋ＬＴＥ−Ｔは、ＣＡＲ＋ＬＴＥ−Ｔの存在下における３７％±１２％の残留と比較して、１６％±８％を除くすべてのＬＡＮ−１細胞を消失させた（ｐ＝０．００１）（図３Ｆ、Ｇ）。対照ＬＴＥ−Ｔは、いずれの条件（インサートまたはＥＣＭ）でも、抗腫瘍活性を示さなかった（４５％±９％の残留ＧＦＰ＋ＬＡＮ−１）。ＮＢ細胞株ＣＨＬＡ−２５５についても同一な結果が得られた。したがって、ＨＰＳＥおよびＣＡＲを共発現するＬＴＥ−Ｔだけが、ＥＣＭの存在下で頑健な抗腫瘍活性を示す。
【０１４５】
ＨＰＳＥおよびＧＤ２特異的ＣＡＲを共発現するＴ細胞は、ＥＣＭの存在下における抗腫瘍活性が強化されている。次に、ＨＰＳＥおよびＧＤ２特異的ＣＡＲの共発現が、ＥＣＭの存在下における抗ＮＢ活性を強化するのかどうかを決定した。ＬＴＥ−Ｔおよび腫瘍細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ浸潤アッセイにプレーティングし、Ｔ細胞の、ＥＣＭを分解して、その後、ＧＦＰを発現する（定量化のために）ＣＨＬＡ−２５５腫瘍細胞およびＬＡＮ１腫瘍細胞を標的化する能力を測定した。図４Ａおよび４Ｂに示される通り、培養の３日後において、ＣＡＲ＋ＬＴＥ−ＴおよびＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋ＬＴＥ−Ｔのいずれも（＜３％の残留ＧＦＰ＋細胞）、ＥＣＭの非存在下において、ＬＡＮ１腫瘍細胞およびＣＨＬＡ−２５５腫瘍細胞を、対照ＬＴＥ−Ｔ（それぞれ、３１％±６％および４２％±１０％の残留ＧＦＰ＋細胞）と比較して、同等に良好に消失させた。これと対照的に、ＥＣＭの存在下では、ＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋ＬＴＥ−Ｔは、ＣＡＲ＋ＬＴＥ−Ｔの存在下における３７％±１２％および５２％±９％の残留と比較して、１６％±８％および１９％±１％を除くすべての、それぞれ、ＬＡＮ１細胞およびＣＨＡＬ−２５５細胞を消失させた（ｐ＝０．００１）。予測される通り、対照ＬＴＥ−Ｔは、いずれの条件でも、抗腫瘍活性を示さなかった（それぞれ、４５％±９％および６８％±３％の残留ＬＡＮ１およびＣＨＡＬ−２５５）。図４Ｃおよび４Ｄは、平均±ＳＤをまとめたものである。
【０１４６】
ＨＰＳＥおよびＣＡＲ−ＧＤ２を共発現するＴ細胞は、ＮＢの異種移植片マウスモデルにおける全体的生存を改善する。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける知見を検証するため、Ｍａｔｒｉｇｅｌの存在下において、ＮＯＧ／ＳＣＩＤ／γｃ−／−マウスに、２つの異なる細胞株（ＣＨＬＡ−２５５およびＬＡＮ−１）を、ｉ．ｐ．で植え込んで、複雑で構造化された腫瘍の形成を可能にすることにより、ＮＢの異種移植片モデルを確立した。１０日後、マウスには、対照ＬＴＥ−ＴまたはＣＡＲ＋ＬＴＥ−ＴまたはＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋ＬＴＥ−Ｔをｉ．ｐ．で施した。図５Ａで示される通り、ＣＨＬＡ−２５５を植え込まれ、ＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋ＬＴＥ−Ｔで処置されたマウスは、４０日目における生存が、対照ＬＴＥ−Ｔ（ｐ＜０．００１）またはＣＡＲ＋ＬＴＥ−Ｔ（ｐ＜０．００７）で処置されたマウスと比較して有意に改善された。４０日後、各処置群からの生存マウスを安楽死させ、肉眼的腫瘍の存在について評価した。生存し、ＣＡＲ＋ＬＴＥ−Ｔを注入されたマウス７匹中、無腫瘍なのは２匹（２９％）だけであったが、生存し、ＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋ＬＴＥ−Ｔを注入されたマウス１７匹中８匹（４７％）は、腫瘍の証拠を示さなかった。別の実験セットでは、Ｔ細胞注入後の１２〜１４日目にマウスを安楽死させて、腫瘍部位におけるＴ細胞浸潤を測定した。ＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋ＬＴＥ−Ｔを注入されたマウスの腫瘍は、対照（０．６％±０．５；ｐ＝０．０２９）またはＣＡＲ＋ＬＴＥ−Ｔ（０．１％±０．１；ｐ＝０．０４３）で処置されたマウスから回収された腫瘍と比較して、Ｔ細胞浸潤が大きかった（４．６％±２．４％）（図５Ｂ）。腫瘍細胞系ＬＡＮ−１を移植されたマウスにおいても、同様の結果が得られた（図５Ｃ）。ＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋Ｔ細胞を注入されたマウスＬＴＥ−Ｔは、４０日目における生存が、対照ＬＴＥ−Ｔ（ｐ＜０．０００１）またはＣＡＲ＋ＬＴＥ−Ｔ（ｐ＜０．０３９）で処置されたマウスと比較して有意に改善された。安楽死させたマウスから回収された腫瘍も、マウスにＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋ＬＴＥ−Ｔを注入した場合、対照と比較して、体重の有意な低減を示し（０．８ｇ±０．６ｇ対３．３ｇ±２．４ｇ）（ｐ＝０．０３９）、ＣＡＲ＋ＬＴＥ−Ｔを注入されたマウスと比較してもある傾向が示された（０．８ｇ±０．６ｇ対２．５ｇ±２ｇ）（ｐ＝０．０９３）（図５Ｄ）。
【０１４７】
Ｔ細胞によるＨＰＳＥの強制発現が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるそれらの生体内分布に影響を及ぼすのかどうかを評価した。これらの研究では、ＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋ＬＴＥ−ＴおよびＣＡＲ＋ＬＴＥ−Ｔを、ｅＧＦＰ．ＦＦｌｕｃをコードするベクターで標識し、その後、尾静脈注射を介して注入した。Ｔ細胞の生体内分布は、Ｔ細胞注入後の異なる時点におけるｉｎ  ｖｉｖｏイメージングによって評価したが、マウスの２つの群間で有意差を示さなかった（図６）。
【０１４８】
ｉ．ｐ．注入する場合、ＮＢ細胞株は、複雑で構造化された腫瘍を形成するのにＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）を必要とするため、ホタルルシフェラーゼで標識されたＣＨＬＡ−２５５腫瘍細胞を腎臓内に植え込み、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）に対する必要なしに固形腫瘍を発症させる、二次ＮＯＧ／ＳＣＩＤ／γｃ−／−モデルにより、提起されたアプローチの、腫瘍へのＴ細胞浸潤の促進における関与性を検証した。ＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋ＬＴＥ−Ｔを静脈内注入されたマウスに由来する腫瘍切片は、ＣＡＲ＋ＬＴＥ−Ｔと比較して、ＣＤ３＋Ｔ細胞の浸潤の強化を示した（それぞれ、３５７±７２および１７３±３２；ｐ＝０．０２８）（図１０Ａ、Ｂ、Ｃ）。注入されたマウスの長期にわたる観察は、ＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋ＬＴＥ−Ｔを注入されたマウスの、５０日目までの生存の改善も示した（ｐ＜０．００５）（図１０Ｄ）。
【０１４９】
ＨＰＳＥの発現が回復されたＬＴＥ−Ｔによる、肺または肝臓など、正常組織への非特異的浸潤についての懸念を排除するため、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の生体内分布を評価した。したがって、これらの研究では、ＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ＋ＬＴＥ−ＴおよびＣＡＲ＋ＬＴＥ−Ｔを、ＧＦＰ．ＦＦｌｕｃをコードするベクターで標識し、その後、尾静脈注射を介して注入した。Ｔ細胞接種後の異なる時点における、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングおよび免疫組織化学によって評価されたＴ細胞の生体内分布は、マウスの２つの群間で有意差を示さなかったことから、肺または肝臓における、ＨＰＳＥの発現が回復されたＬＴＥ−Ｔの優先的蓄積は示されなかった（図６）。
【０１５０】
実施例３
ある特定の実施形態の概要
データは、がんの処置のための腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を生成するのに必要とされる、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける培養の長期化により、腫瘍ＥＣＭを構成するＨＳＰＧの分解において鍵となる役割を果たすＨＰＳＥのそれらによる産生が損なわれることを示す。ＨＰＳＥの欠如は、腫瘍指向性Ｔ細胞のＥＣＭ内の移動を限定し、腫瘍細胞への接近を妨げ、固形腫瘍を消失させるそれらの能力を低減する。遺伝子導入によるＨＰＳＥの強制発現は、ＣＡＲによりリダイレクトしたＴ細胞のＨＳＰＧを分解する能力を回復し、ＮＢモデルにおけるそれらの抗腫瘍効果を強化する。
【０１５１】
血管を介して腫瘍部位に溢出するＴリンパ球の能力は、それらの抗腫瘍機能に死活的である。ＦＴおよびＢＡＴ−Ｌは、検出可能な５０ｋＤａの活性形態のタンパク質の発現を示すが、養子免疫療法のためのＴ細胞株を製造するのに現在使用されているプロトコールに従い生成されたＬＴＥ−Ｔは、ＨＰＳＥを欠損している。実験は、ＨＰＳＥ  ｍＲＮＡは、Ｔ細胞活性化の直後に下方制御されるが、ＨＰＳＥ特異的酵素活性は、培養培地中のＴ細胞活性化後最初の７２時間以内に増大することを示す。これらの観察は、あらかじめ形成されたＨＰＳＥが細胞内区画内に保存され、活性化Ｔ細胞に応答した早期事象として放出されることを示す以前の研究と符合する（Ｂａｒｔｌｅｔｔら、１９９５）。ＨＰＳＥの不活性形態から活性形態への急速な移行およびその放出が、ＴＣＲ誘発時におけるセントラル・メモリーＴ細胞およびエフェクター・メモリーＴ細胞の生理学的特性であることは重要である。ｅｘ  ｖｉｖｏで拡張されたＴ細胞の解析も、これらの細胞のいずれも、ＨＰＳＥ  ｍＲＮＡの発現およびＨＰＳＥの酵素活性をもたず、ＬＴＥ−Ｔが休眠し、その後、ＴＣＲの刺激によって再活性化される場合、ＨＰＳＥの転写も産生も回復されないことを示す。
【０１５２】
データは、ＨＰＳＥの欠如が、ＬＴＥ−Ｔの、ＨＳＰＧを分解する能力を直接的に低減し、したがって、それらのＥＣＭの存在下における抗腫瘍活性を妨げることを示すが、ＨＳ鎖の切断により、あらかじめ形成されて保存されたケモカインが、間質に放出されることに注目することも重要である（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ、２００１；Ｉｏｚｚｏ、１９９８）。これらのケモカインは、Ｔ細胞の、腫瘍微小環境内のそれらの標的細胞への移動を導くので、ＨＰＳＥの欠如は、それらの移動を低減することによって、Ｔ細胞の抗腫瘍効果をさらに間接的に損ないうる。
【０１５３】
遺伝子導入によるＬＴＥ−Ｔ内のＨＰＳＥの再発現は、エフェクター機能を損なわずに、ＥＣＭを分解するそれらの生理学的能力を回復する。ＨＰＳＥは、単一のベクター内で、腫瘍に方向付けられたＣＡＲとたやすく組み合わせうることから、ＥＣＭ分解の回復に加えた、抗腫瘍特性の同時的な獲得が可能となる。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、腫瘍環境内でＣＡＲおよびＨＰＳＥを共発現するＴ細胞浸潤の数的増大であって、腫瘍間質のＥＣＭを分解するそれらの能力の回復を反映する増大をもたらす。本明細書に記載のアプローチは、ＨＰＳＥ＋ＣＡＲ＋ＬＴＥ−Ｔが、ＣＡＲのエンゲージメント後において、ＣＡＲ内のＣＤ２８およびＯＸ４０共刺激エンドドメインの包含を介して、共刺激を受けることを可能にする（Ｐｕｌｅら、２００５）。しかし、ＨＰＳＥをもたないＣＡＲ−Ｔ細胞は、腫瘍細胞にエンゲージしないので、ＨＰＳＥの欠如によって決定される全体的効果が、マウスにおける腫瘍成長の増大であるように、抗原媒介型刺激も共刺激も受けない。
【０１５４】
生理学的条件下において、Ｔ細胞によるＨＰＳＥの発現は、非病理学的組織へのＴ細胞溢出に由来する組織の損傷を回避するように緊密に調節される。本開示の実施形態では、ＨＰＳＥは、ＣＡＲ−Ｔ細胞だけにおいて発現され、抗原特異性は、Ｔ細胞の、抗原含量の大きな組織内の優先的な蓄積を駆動するため（Ｍａｒｅｌｌｉ−Ｂｅｒｇら、２０１０）、非特異的組織浸潤は限定的であり、当然ながら、ＨＳＰＥ＋ＣＡＲ＋ＬＴＥ−Ｔを注入されたマウスにおける、生体内分布、組織浸潤、または毒性の変化も生じない。
【０１５５】
結論として、本発明者らは、腫瘍特異的ＬＴＥ−Ｔ内のＨＰＳＥの特異的欠損であって、それらの抗腫瘍活性を限定するが、酵素の強制発現によって克服されうる欠損を同定した。この戦略を利用することにより、固形腫瘍を有する患者における腫瘍指向性Ｔ細胞の活性が有意に強化される。
【０１５６】
実施例４
例示の材料および方法
細胞株：細胞株２９３Ｔ（ヒト胎児性腎臓）、ＤＵ−１４５（ヒト前立腺がん）、Ａ５４９（ヒト肺上皮癌）、およびＣＨＬＡ−２５５（ＮＢ）を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）、および２ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を補充されたＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）中で培養した。細胞株ＭＣＦ−７（乳がん）、Ｒａｊｉ（バーキットリンパ腫）、Ｋ５６２（骨髄赤芽球性白血病）、およびＬＡＮ１（ＮＢ）を、１０％のＦＢＳおよび２ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘを補充されたＲＰＭＩ１６４０（ＨｙＣｌｏｎｅ）中で培養した。細胞を、３７℃で５％のＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で維持した。
【０１５７】
初代ヒトＴリンパ球の単離および培養：Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ）を、健常ドナー（Ｇｕｌｆ  Ｃｏａｓｔ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）の軟膜から単離した。単球は、ＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を伴う陽性磁気選択によって、ＰＢＭＣから得た。ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞は、特異的なマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用する陰性磁気選択によって、ＰＢＭＣから得た。ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞は、特異的なマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用する陰性磁気選択によって、ＰＢＭＣから得た。選択された実験では、セントラル・メモリー細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋）およびエフェクター・メモリー細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ−）も、陽性磁気選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によって、ＰＢＭＣから分離した。Ｔリンパ球を、固定化された抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）抗体（Ａｂ：ａｎｔｉｂｏｄｙ）（１μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８Ａｂ（１μｇ／ｍｌ）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）で活性化し、その後、１０％のＦＢＳおよび２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸを補充された、４５％のＲＰＭＩ１６４０および４５％のクリック培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を含有する完全培地中で拡張した。前に記載されている（Ｓａｖｏｌｄｏら、２００７）通りに、細胞には、毎週２回、組換えインターロイキン２（ＩＬ−２）（５０Ｕ／ｍＬ）（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）をフィードした。
【０１５８】
浸潤アッセイ：製造業者の指示に従い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＢｉｏＣｏａｔ（商標）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）浸潤アッセイ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、各細胞サブセットの、ＥＣＭを分解する能力を検討した。簡潔には、無血清培地中で１８時間にわたり維持された細胞を、上側チャンバー／インサート内に播種した（チャンバー１つ当たり２．５×１０５個の細胞）。１０％のＦＢＳを補充された培地を、化学誘引物質として作用するように、下側区画に添加した。２４時間後、トリパンブルー排除によって、下側チャンバー内の細胞をカウントした。すべての実験は、二連で実施した。データは、Ｍａｔｒｉｇｅｌおよび膜を介した浸潤の、対照膜（８μｍのポリエチレンテレフタレート膜の小孔）内の移動と比べた百分率として表す。浸潤の百分率は、以下：（Ｍａｔｒｉｇｅｌチャンバー膜を介する細胞浸潤の平均／対照インサート膜を介する細胞移動の平均）×１００の通りに計算した。具体的な実験では、Ｔリンパ球の浸潤と、抗腫瘍活性とを、同時に評価した。簡潔には、ＬＡＮ１／ＧＦＰ＋またはＣＨＬＡ  ２５５／ＧＦＰ＋細胞（１４×１０４個）を２４ウェルプレートのボトムにプレーティングし、Ｔ細胞（２．５×１０５個の細胞）を上側チャンバー／インサート内にプレーティングした、ＢｉｏＣｏａｔ（商標）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）浸潤アッセイを使用した。２４時間後にチャンバーおよびインサートを取り外し、さらに培養の３日後、細胞を、下側チャンバーから回収し、フローサイトメトリーによって定量化して、腫瘍細胞およびＴ細胞のそれぞれを同定した。
【０１５９】
ウェスタンブロット：ＯＫＴ３／ＣＤ２８  Ａｂによる活性化後の異なる時点において、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を回収した。プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を補充したＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、タンパク質を、５×１０６個の細胞から抽出した。５０μｇのタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、ポリビニリデンジフルオリド膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に移入し、０．１％の（Ｖ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を伴うトリス緩衝生理食塩液（ＴＢＳ）中に５％の（Ｗ／Ｖ）脱脂粉乳でブロッキングしてから、適切なＡｂでプローブした。これらの実験で使用されるＡｂおよび希釈液は、以下：ＨＰＳＥ−１の６５ｋＤａの前駆体および５０ｋＤａの活性形態の両方を認識する、マウス抗ヒトＨＰＡ１（１：１００、クローンＨＰ１３０）（ＩｎＳｉｇｈｔ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、Ｉｓｒａｅｌ）、ウサギ抗ヒトＨＰＡ１ポリクローナル（１：４０００；Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＮＣ、ＵＳＡ）、およびマウス抗ヒトβ−アクチン（１：１００００、クローンＣ４）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）の通りであった。ブロットを、０．１％の（Ｖ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳで洗浄し、その後、ブロッキング液（１：５０００、ヤギ抗マウスｓｃ−２００５およびヤギ抗ウサギｓｃ−２００４）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）中で希釈した、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート二次Ａｂで染色した。その後、ブロットを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共にインキュベートした。
【０１６０】
免疫蛍光：接着細胞（ウェル１つ当たり１×１０５個の細胞）は、カバー付きＬａｂ−Ｔｅｋ  ＩＩチャンバースライド（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｌ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）上で成長させたが、非接着細胞（３．５×１０５個の細胞）は、顕微鏡スライド上にサイトスピンした。細胞を、４％のパラホルムアルデヒド（ｖ／ｖ）で固定した。０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｖ／ｖ）による透過化の後、細胞を、５％のヤギ血清（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｎｏｌｏｇｙ（登録商標））および１％のＢＳＡと共にインキュベートして、非特異的結合をブロッキングし、その後、ヒトＨＰＳＥ１に対する一次抗体（ＨＰＡ１、クローンＨＰ１３０）（ＩｎＳｉｇｈｔ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ）で染色した（１：１００の希釈液；室温で２時間にわたり）。その後、細胞を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５ヤギ抗マウス二次抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）でプローブした（１：５００の希釈液；室温で２時間にわたり）。蛍光シグナルは、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０、Ｌｅｅｄｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ、Ｉｒｖｉｎｇ、ＴＸ、ＵＳＡ）を使用して検出した。ＤＡＰＩを、核染色として使用した。
【０１６１】
ＲＮＡの単離および定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）：ＯＫＴ３／ＣＤ２８  Ａｂによる活性化後の異なる時点において、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を回収した。ｑＲＴ−ＰＣＲでは、１００ｎｇの全ＲＮＡを使用して、ｃＤＮＡを調製した（ＴａｑＭａｎ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｋｉｔ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）。ＨＰＳＥに特異的なプライマーおよびプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）（ＨＰＳＥ：Ｈｓ００９３５０３６＿ｍ１）を使用した。ＨＰＳＥのサイクル閾値（ｃｙｃｌｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（ΔＣＴ）値の相違は、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１）のΔＣＴに照らして標準化し、発現の倍率変化はＣＤ１４＋細胞と比べて表し、これを陽性対照とみなした。
【０１６２】
酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：ＩＦＮγ特異的ＥＬＩＳＡおよびＩＬ−２特異的ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を使用して、ＧＤ２＋ＬＡＮ１細胞による刺激に応答したＴ細胞によるサイトカイン放出を解析した。ヘパラン硫酸（ＨＳ）分解酵素アッセイキット（滋賀、大津、タカラバイオ株式会社）を使用して、ＨＰＳＥ活性を測定した。簡潔には、ビオチニル化ＨＳを、酵素に対する基質として使用した。その後、アビジン−ペルオキシダーゼにより、線維芽細胞成長因子に結合した、分解されていない基質を検出し、吸光度を４５０ｎｍで測定した。前に記載されている（Ｒｏｙら、２００５；Ｚｈａｎｇら、２０１０）通りに、ＨＰＳＥ活性を、吸光度の減少の逆数として決定した。Ｔ細胞および腫瘍細胞上清は、三連で解析した。上清を、ビオチニル化ＨＳと共に、３７℃で７５分間にわたりインキュベートし、ＨＰＳＥ−１の活性を、ＥＬＩＳＡ型アッセイによって決定した：特異的な基質を使用して発色させ、マイクロプレートリーダー（ＥＬｘ８０８ｉｕ、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、プレートを４５０ｎｍで読み取った。ウェスタンブロットおよびｑＲＴ−ＰＣＲについて前に記載されている通り、ＯＫＴ３／ＣＤ２８  Ａｂによる活性化後の異なる時点において、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞からの上清を回収した。活性化の４および１４日後、細胞を回収し、カウントし、洗浄し、新鮮な培地中に再プレーティングした。
【０１６３】
レトロウイルスコンストラクト、一過性トランスフェクション、およびＴリンパ球への形質導入：ＨＰＳＥ  ｃＤＮＡ（受託番号：ＮＭ−００６６６５）を、ｅＧＦＰもコードするＳＦＧレトロウイルス骨格（ＳＦＧ．ＨＰＳＥ（Ｉ）ｅＧＦＰ）にクローニングした（図８）。ＣＤ２８、ＯＸ４０、およびζエンドドメインを含有するＧＤ２特異的ＣＡＲのためのコンストラクト（ＳＦＧ．ＣＡＲ）は、前に記載されている（Ｐｕｌｅら、２００５）。その後、本発明者らは、ＩＲＥＳ（ＳＦＧ．ＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥ）を使用して、ＨＰＳＥおよびＣＡＲ−ＧＤ２を共発現するのに、例示のバイシストロニックのベクターを生成した（図８）。Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏイメージングのための融合タンパク質ｅＧＦＰ−ホタルルシフェラーゼ（ｅＧＦＰ．ＦＦＬｕｃ）をコードするレトロウイルスベクターは、前に記載されている（Ｖｅｒａら、２００６）。レトロウイルス上清を作製するために、前に記載されている（Ｖｅｒａら、２００６）通りに、２９３Ｔ細胞を、レトロウイルスベクターである、ＭｏＭＬＶ  ｇａｇ−ｐｏｌをコードするＰｅｑ−ＰａｍプラスミドおよびＲＤ１１４エンベロープをコードするＲＤＦプラスミドと共に共トランスフェクトした。ウイルス調製時において、ＨＰＳＥの特異的阻害剤ＳＳＴ０００１（化学修飾されたヘパリン１００Ｎａ，Ｒｏ−Ｈ）（３μｇ／ｍｌ）（Ｖｌｏｄａｖｓｋｙら、２００７；Ｎａｇｇｉら、２００５）を、培地に添加して、その力価を増大させた。その後、レトロネクチンでコーティングしたプレート（タカラバイオ株式会社）を使用して、活性化Ｔリンパ球に、レトロウイルス上清を形質導入した。レトロネクチンプレートから取り出した後、Ｔ細胞系を、３７℃で５％のＣＯ２を含有する加湿雰囲気中、ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）の存在下の完全Ｔ細胞培地中で、２週間にわたり維持した。
【０１６４】
フローサイトメトリー：本発明者らは、ＦＩＴＣ蛍光色素、ＰＥ蛍光色素、ＰｅｒＣＰ蛍光色素、またはＡＰＣ蛍光色素とコンジュゲートした、以下の例示のＡｂ：ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ８、ＣＤ４、およびＣＤ３（すべてＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ製）を使用した。本発明者らは、各実験に、適切なアイソタイプマッチＡｂで標識された対照試料を含めた。Ｔリンパ球内のＧＤ２特異的ＣＡＲの発現は、特異的な抗イディオタイプ抗体（１Ａ７）（Ｒｏｓｓｉｇら、２００２）を使用して検出した。試料は、四重極蛍光シグナルのためのフィルターセットを装備したＢＤ  ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒシステムおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により解析した。本発明者らは、試料ごとに最低１０，０００の事象を解析した。
【０１６５】
クロム放出アッセイ：前に記載されている（Ｓａｖｏｌｄｏら、２００２）通りに、標準的な６時間の５１Ｃｒ放出アッセイを使用して、Ｔ細胞の細胞傷害活性を評価した。標的細胞を、培地中単独で、または１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中でインキュベートして、それぞれ、自発的５１Ｃｒ放出および最大５１Ｃｒ放出を決定した。三連ウェルの特異的溶解の平均百分率は、以下：［（被験カウント−自発的カウント）／（最大カウント−自発的カウント）］×１００の通りに計算した。被験標的細胞には、ＬＡＮ１、ＣＨＬＡ  ２５５、およびＲａｊｉが含まれた。
【０１６６】
異種ＳＣＩＤマウスモデル：本発明者らは、前に記載されているＳＣＩＤマウスモデル（Ｓａｖｏｌｄｏら、２００７；Ｑｕｉｎｔａｒｅｌｌｉら、２００７）を使用して、対照Ｔ細胞およびＳＦＧ．ＣＡＲレトロウイルスベクターまたはＳＦＧ．ＣＡＲ（Ｉ）ＨＰＳＥレトロウイルスベクターを形質導入されたＴ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果を評価した。マウスによる実験は、Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ’ｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｕｓｂａｎｄｒｙガイドラインに従い実施した。８〜１０週齢のＮＯＧ／ＳＣＩＤ／γｃ−／−マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に再懸濁させたＣＨＬＡ  ２５５細胞（２．５×１０６個）を、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。腫瘍接種の１０〜１２日間後、Ｔ細胞をｉ．ｐ．注射した（マウス１匹当たり２０×１０６個の細胞）。不快感の徴候が検出されたら、マウスを安楽死させた。Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける生体内分布については、ｅＧＦＰ．ＦＦｌｕｃベクターで標識された、マウス１匹当たり５×１０６個のＴ細胞を、尾静脈注射を介して注入した。ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングのためには、Ｘｅｎｏｇｅｎ−ＩＶＩＳ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを、前に記載されている（Ｖｅｒａら、２００６）通りに使用した。
【０１６７】
統計学：別段に注記されない限り、データは、平均±標準偏差（ＳＤ）としてまとめる。スチューデントのｔ検定を使用して、有意差を示すＰ値＜０．０５により、試料間の統計学的有意差を決定した。複数の比較解析が必要とされる場合、統計学的有意性は、反復測定ＡＮＯＶＡに続いて、複数の比較のためのニューマン−コイルス検定またはログランク（マンテル・コックス）検定によって評価した。マウスの生存データは、カプラン−マイヤー生存曲線を使用して解析した。
【０１６８】
参考文献
本明細書で引用されるすべての特許および刊行物は、参照によりそれらの全体として本明細書に組み込まれる。
Bartlett, et al., Immunol. Cell Biol. 73:113-124, 1995.
Bernfield, et al., Annu. Rev. Biochem.68:729-777, 1999.
de Mestre, et al., J. Leukoc. Biol.82:1289-1300, 2007.
Fridman, et al., J. Cell Physiol130:85-92, 1987.
Gallagher, J. Clin. Invest 108:357-361, 2001.
Iozzo, Annu. Rev. Biochem. 67:609-652, 1998.
Joyner, et al., Nature. 338:153-156, 1989.
Kalos, et al., Sci. Transl. Med.. 3:95ra73, 2011.
Mansour, et al., Nature. 336:348-352, 1988.
Marelli-Berg, et al., Immunology130:158-165, 2010.
Morgan, et al., Science 314:126-129, 2006.
Muller, Trends Immunol. 24:327-334, 2003.
Naggi, et al., J. Biol. Chem.280:12103-12113, 2005.
Naparstek, et al., Nature310:241-244, 1984.
Parish, Nat. Rev. Immunol. 6:633-643, 2006.
Pule, et al, Nat. Med. 14:1264-1270, 2008.
Pule, et al., Mol. Ther. 12:933-941, 2005.
Quintarelli, et al., Blood110:2793-2802, 2007.
Rooney, et al., Lancet 345:9-13, 1995.
Rossig, et al., Blood 99:2009-2016, 2002.
Roy, et al., Neoplasia. 7:253-262, 2005.
Savoldo, et al., Blood100:4059-4066, 2002.
Savoldo, et al., Blood110:2620-2630, 2007.
Savoldo, et al., J. Clin. Invest121:1822-1826, 2011.
Thomas & Capecchi, Cell. 51:503-512, 1987.
Vera, et al., Blood 108:3890-3897, 2006.
Vlodavsky, et al., Curr. Pharm. Des13:2057-2073, 2007.
Vlodavsky, et al., Invasion Metastasis 12:112-127, 1992.
Yadav, et al., Thromb. Haemost. 90:598-606, 2003.
Yurchenco & Schittny, FASEB J. 4:1577-1590, 1990.
Zhang, et al., Mol. Cancer Res. 8:278-290, 2010.
Zou, Nat. Rev. Cancer 5:263-274, 2005.
【０１６９】
本発明およびその利点を詳細に説明したが、添付されている本発明の請求の範囲の趣旨および範囲から逸脱せずに、様々な変更、置換、および改変をここに加えることができると理解するべきである。さらに、本出願の範囲は、本明細中に記載されたプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法、およびステップの特定の実施形態に限定されるものではない。当業者ならば、本発明の開示内容から容易に理解するように、本明細書に記載の対応する実施形態と実質的に同じ機能を果たすか、そのような実施形態と実質的に同じ結果をもたらす、現存する、または後に開発されるプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法、またはステップも、本発明に従って使用できる。したがって、添付されている請求の範囲には、そのようなプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法、またはステップも包含されるものとする。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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