(57)【要約】  本発明は、許容できる知覚特性を有するクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類の脂質に富むバイオマスを工業規模で発酵生産するための方法において、発酵槽における溶存酸素アベイラビリティが、前記微細藻類の呼吸商を追跡することによって制御されることを特徴とする方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質に富む微細藻類のバイオマスの発酵生産のための方法において、
発酵槽における溶存酸素アベイラビリティが前記微細藻類の呼吸商を監視することによって制御される少なくとも１つの培養工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記発酵生産が、工業規模で実施されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微細藻類が、従属栄養条件下で培養されることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記微細藻類が、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）及びクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）よりなる群から好ましくは選択される、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属のものであることを特徴とする、請求項１ないし請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記微細藻類がクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）であることを特徴とする、請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記方法によって生産される前記バイオマスが、バイオマスの乾燥重量で３０％超の、好ましくは４０％超の脂質含有量を有することを特徴とする、請求項１ないし請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記発酵槽における前記溶存酸素アベイラビリティが前記呼吸商を監視することによって制御される前記培養工程が脂質蓄積工程であることを特徴とする、請求項１ないし請求項６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記発酵槽における前記溶存酸素アベイラビリティが、前記バイオマスがバイオマスの乾燥重量で２５％超、好ましくは３０％超の脂質含有量を有すると直ちに前記呼吸商を監視することによって確保されることを特徴とする、請求項１ないし請求項７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
監視期間の間、前記呼吸商が、１．５よりも大きい、好ましくは１．６よりも大きい、より優先的には１．７よりも大きい、さらにより優先的には１．８よりも大きい値に維持されることを特徴とする、請求項１ないし請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
累積ＹＯ２／Ｓ代謝比（発酵の開始から計算される）が、０．２８未満、優先的には０．２７未満、より優先的には０．２６未満の値に維持されることを特徴とする、請求項１ないし請求項９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
好ましくは前記バイオマスが２５％超の脂質、好ましくは３０％超の脂質（バイオマスの乾燥重量で表される％）を含有する場合に、脂質蓄積段階中に観察される前記ＹＯ２／Ｓ代謝比が、０．２８未満、優先的には０．２７未満、より優先的には０．２６未満の値に維持されることを特徴とする、請求項１ないし請求項１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
生産される前記バイオマスが、許容できる感覚品質のものであることを特徴とする、請求項１ないし請求項１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
生産される前記バイオマス中のリノール酸の含有量が、前記乾燥バイオマス中の脂肪酸の総重量に対して１８重量％未満、好ましくは前記乾燥バイオマス中の前記脂肪酸の前記総重量に対して１４重量％未満であることを特徴とする、請求項１ないし請求項１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記呼吸商が、ガス分析計を用いて監視されることを特徴とする、請求項１ないし請求項１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記酸素アベイラビリティが、攪拌速度、背圧または流入空気中の酸素濃度を調節することによって発酵培地への酸素供給を変えることにより制御されることを特徴とする、請求項１ないし請求項１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、許容できる感覚品質のクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の脂質に富む微細藻類のバイオマスを工業規模で生産するための新規方法に関する。
【０００２】
本発明は、モノ不飽和脂肪酸に、特にオレイン酸に富む微細藻類のバイオマスの経時不安定性に伴って起こる酸敗臭を抑制するために特に好適である。
【背景技術】
【０００３】
歴史的に、成長するために「水および日光のみ」を必要とすることから、藻類は、食品源であると長い間考えられてきた。
【０００４】
食品に使用することができる幾つかの種の藻類があり、昆布、アオサ（アルバ・ラクティューカ（Ｕｌｖａ  ｌａｃｔｕｃａ））およびタイプアマノリ属（Ｐｏｒｐｈｙｒａ）（日本国で栽培されている）またはダルス（パルマリア・パルマータ（Ｐａｌｍａｒｉａ
ｐａｌｍａｔａ））の紅藻類などの「大型藻類」がほとんどである。
【０００５】
しかしながら、これらの微細藻類に加えて、バイオ燃料または食品での用途向けに栽培されている、海洋起源または非海洋起源の「大型藻類」、すなわち、光合成または非光合成単細胞微細藻類で代表される他の藻類源もある。
【０００６】
例えば、スピルリナ（アルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ））が、食品栄養剤としての、または菓子製品もしくは飲料中へ少量（一般に０．５重量／重量％未満）組み込まれる使用のためにオープン潟湖で（光栄養条件下で）栽培されている。
【０００７】
クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属に属する特定の種などの、他の脂質に富む微細藻類がまた、食品栄養剤としてアジア諸国では非常に人気がある。
【０００８】
幾つかの種の微細藻類は、光独立栄養増殖（ＣＯ２を炭素ベースの鎖へ変換するためのエネルギーを供給する、光による増殖）から、炭素の代謝およびエネルギーのために使用され得るグルコースまたは他の炭素ベースの基質を使用する従属栄養増殖（光なしの）まで変わることができる。
【０００９】
微細藻類の３つの生産方法が、工業的に：
−  （完全閉鎖の）従属栄養反応器中で；
−  野外池で；
−  ガラス管で
現在用いられている。
【００１０】
可変の特性および組成のクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｅ）が、これらの培養方法から生産される。それらの組成は、それらが光の中で生産されるかどうか、およびそれらが野外で生産されるかどうかによって異なるであろう。
【００１１】
クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）型の微細藻類の粉末の製造および使用は、例えば、国際公開第２０１０／１２０９２３号および国際公開第２０１０／０４５３６８号に記載されており、従属栄養ルートによるおよび光の不在下での生産は、それらの増殖速度を促進
する。
【００１２】
モノ不飽和油から本質的になり得る、微細藻類粉末の油分画は、従来の食品に多くの場合見いだされる飽和油、水素化油およびポリ不飽和油と比較して栄養上および健康上の利点を提供することができる。
【００１３】
しかしながら、それらのバイオマスから微細藻類粉末粉を工業的に製造することが望まれる場合、技術的観点からのみならず、製造された組成物の官能的プロフィルの観点からも、大きな課題が残っている。
【００１４】
実際に、例えば野外池でまたは光バイオリアクターによって光合成的に栽培された藻類を使って製造された、藻類粉末が商業的に入手可能であるが、それらは、濃い緑色（クロロフィルに関連した）および強い不快な味覚を有する。
【００１５】
食品中において、または栄養補給剤として調合された場合でさえも、これらの藻類粉末は常に、視覚的に非魅力的な緑色を食品または栄養補給剤に与え、不快な魚に似た味覚または海洋藻類の味を有する。
【００１６】
クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｅ）に関して、この分野で共通して受け入れられている記述子は、大麦若葉の粉末または小麦若葉の粉末などの他の青野菜粉末に幾分似ている「緑茶」味覚であり、この味覚は、その高いクロロフィル含有量に起因する。
【００１７】
それらの味は、通常、それらが強い味の野菜または柑橘果実ジュースと混合される場合にのみ隠される。
【００１８】
さらに、脂質に富むクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｅ）については、不快な味（オフノート）は、脂質の酸化分解の生成物、とりわけモノ不飽和脂肪酸のそれと特に関連して生じ得る。
【００１９】
したがって、例えば、オレイン酸（Ｃ１８：１）は、酸化に敏感であり、その酸化分解は、
−  酸敗臭の過酸化物、ヒドロペルオキシドおよび揮発性有機化合物の形成と、
−  不飽和脂肪酸の栄養的価値の損失と
をもたらす。
【００２０】
不飽和脂肪酸の酸化分解（酵素的なまたは自動酸化による）の生成物は主に、非常に特有の臭いを与える５〜９個の炭素からなるカルボニル化合物およびアルコールである。
【００２１】
このように、（Ｅ，Ｚ）−２，６−ノナジエナールなどの、９個の炭素を含む化合物は、キュウリおよびメロン臭を有する。８個の炭素を含む化合物（１−オクテン−３−オール、１−オクテン−３−オン、１，５−オクタジエン−３−オール）は、個々にはキノコまたはゼラニウム臭を有するが、植物の臭いまたは金属臭に寄与する。６個の炭素を含む化合物（ヘキサノール、ヘキサナール、（Ｅ）−２−ヘキセナールおよび（Ｚ）−３−ヘキセン−１−オール）は、緑の香りおよび藻類の臭いに関与する。（Ｅ，Ｅ）−２，４−ヘプタジエナールは、また、キュウリの緑の臭いを有する。
【００２２】
実験室規模で脂肪酸の酸化分解を抑制するために、バイオマスの曝気の程度は、微細藻類の酸素ニーズを満たすため溶存酸素圧（ｐＯ２）を監視することによって制御される。
【００２３】
発酵プロトコルはその結果、
−  空気流量および／または
−  酸素流量および／または
−  攪拌力
によって実施されるｐＯ２の制御を含む。
【００２４】
しかしながら、ｐＯ２のこの制御は、それがプロトコルを実験室規模から工業規模に移す課題がある場合に大きな困難をもたらす。
【００２５】
これは、ｐＯ２が、飽和での発酵マスト中の溶存酸素濃度に従って画定されるからである。水が、十分に長い時間、周囲温度でおよび大気圧下に、空気下で曝気される場合、ｐＯ２は１００％に等しいと考えられる。
【００２６】
実際に、発酵槽におけるｐＯ２プローブの較正の間、溶存酸素含有量は、残存塩の濃度および発酵温度によって左右される。
【００２７】
さらに、実験室発酵槽については、ｐＯ２が、発酵マストの高さによって発生する圧力および混合効果によりほとんど左右されないことは慣例的に受け入れられている。
【００２８】
しかしながら、中容量（約１ｍ３）〜大容量（およそ数百ｍ３）の発酵槽について工業化中に、発酵マストの高さはむしろ、
−  溶存酸素圧に影響を及ぼし、および
−  「完璧に攪拌されていない」発酵槽において複雑な現象を引き起こす。
【００２９】
この意味で、実験室規模で確立されたｐＯ２値はそれ故、工業規模へ推定されることができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３０】
【特許文献１】国際公開第２０１０／１２０９２３号
【特許文献２】国際公開第２０１０／０４５３６８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
それ故、より多数のより多様な食品でのその使用を可能にする好適な官能品質のクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類粉末の組成物の工業規模製造を保証する方法を有するという不充足ニーズが依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
本出願人は、（ガス分析計を用いて）呼吸商を監視することによって、ｐＯ２プローブの応答を監視することによってではなく、前記酸素移動ニーズを調節することにより、生み出されるモノ不飽和脂肪酸の酸化分解をできるだけ多く同時に防ぎながら、微細藻類のニーズを満たすのに十分であるに違いない溶存酸素のアベイラビリティを制御するうえでこの課題を克服することが可能であることを見いだした。
【００３３】
この制御は、さらに、
−  菌株の代謝挙動を見えるようにすること、および
−  ｐＯ２を測定することによって従来は観察できるにすぎない過剰酸素供給の問題を克服すること
を可能にする。
【００３４】
したがって、本発明は、脂質に富む微細藻類の、好ましくは工業規模でのバイオマスの発酵生産のための方法であって、発酵槽における溶存酸素アベイラビリティが前記微細藻類の呼吸商を監視することによって制御される少なくとも１つの培養工程を含む方法に関する。
【００３５】
微細藻類は好ましくは、従属栄養条件下で培養される。
【００３６】
微細藻類は好ましくは、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属に属し、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）およびクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）よりなる群から選択することができる。非常に特に好ましくは、微細藻類はクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）である。
【００３７】
微細藻類は脂質に富む。得られたバイオマスは特に、バイオマスの乾燥重量で３０％または４０％超の脂質含有量を有することができる。
【００３８】
発酵槽における溶存酸素アベイラビリティが呼吸商を監視することによって制御される培養工程は好ましくは、脂質蓄積工程である。特に、発酵槽における溶存酸素アベイラビリティは、バイオマスがバイオマスの乾燥重量で２５％超、好ましくは３０％超の脂質含有量を有すると直ちに呼吸商を監視することによって制御することができる。
【００３９】
本発明による方法は、許容できる感覚品質のバイオマス、特にモノ不飽和脂肪酸の酸化分解の生成物、より具体的にはオレイン酸の酸化分解の生成物などの官能的に望ましくない化合物をほとんどまたは全く含まないバイオマスを得ることを可能にする。この感覚品質の評価は特に、色、コーティング、甘味、ならびに次の風味：キノコ、穀類、バター／乳製品、酸敗油および野菜の後味を含む記述子によって実施することができる。
【００４０】
官能分析は、
○  ５〜１０％、好ましくはおよそ７％の微細藻類粉末組成物と；
○  ０．５〜２％、好ましくはおよそ１％の糖類と；
○  ０．１〜０．５％、好ましくはおよそ０．２５％のバニラエッセンスと；
○  好ましくはおよそ９１．７５％の、スキムミルクである残りと
を含み、百分率が組成物の重量による微細藻類粉末組成物を使用して実施することができ、前記組成物は、均質化され、２〜１０分、好ましくはおよそ５分間、６０〜８５℃、好ましくはおよそ７５℃で加熱される。
【００４１】
官能分析はまた、官能分析の記述子と関連した揮発性有機化合物のＳＰＭＥ／ＧＣ−ＭＳによる分析を含むことができる。好ましくは、揮発性有機化合物は、飽和およびジ不飽和アルデヒド、不飽和ケトン、ならびにカルボン酸およびそれらの誘導体の系統に属する。
【００４２】
これらの望ましくない化合物の生成を防ぐまたは減少させるために、脂質含有量がバイオマスの乾燥重量で２５％超である場合に、監視期間の間、好ましくは脂質蓄積段階の間、呼吸商は、１．５よりも大きい、好ましくは１．６よりも大きい、より優先的には１．７よりも大きい、さらにより優先的には１．８よりも大きい値に維持することができる。
【００４３】
呼吸商は、ガス分析計を用いて監視することができ、特に攪拌速度、背圧または流入空気（培地へ注入される空気）中の酸素濃度を調節することによって発酵培地に酸素を供給することにより制御することができる。
【００４４】
この制御はまた、０．２８未満、優先的には０．２７未満、より優先的には０．２６未満の値に維持された累積ＹＯ２／Ｓ代謝比（発酵の開始から計算される）を得ることを可能にする。あるいは、それはまた、０．２８未満、優先的には０．２７未満、より優先的には０．２６未満の値に維持されている、好ましくはバイオマスが２５％超の脂質、好ましくは３０％超の脂質（バイオマスの乾燥重量で表される％）を含有する場合に、脂質蓄積段階の間に観察されるＹＯ２／Ｓ代謝比を得ることを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】試験１（ベースｐＯ２  ３０％）、２（ｐＯ２  ０％）および３（ｐＯ２  １２０％）について発酵時間（時間単位）の関数としての呼吸商の展開。
【図２】試験１（ベースｐＯ２  ３０％）、２（ｐＯ２  ０％）および３（ｐＯ２  １２０％）について脂肪酸含有量の関数としての呼吸商の展開。
【図３】ＰＣＡの様々なバッチのグラフ表現（点の群）。
【図４】様々なバッチの芳香プロフィルを表すＰＣＡの相関の円。
【図５】３つの製造バッチの個々の風味値。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
定義
本発明の目的のためには、微細藻類粉末組成物は、食品調合物での感覚パネルによるその評価が、これらの微細藻類粉末組成物を含有する前記食品調合物の官能品質を変性するオフノートが不在であると結論する場合に「許容できる感覚品質」を有する。
【００４７】
「オフノート」は、特有の望ましくない臭いのする分子および／または芳香分子の存在と関係がある。
【００４８】
用語「官能品質」は、味覚、匂い、外観、色および一貫性の観点から食品の特性を意味することを意図する。
【００４９】
「呼吸商」は、時間の単位当たり生成したＣＯ２の量と消費されたＯ２の量との間の比に相当する。この商は、発酵槽を出るガスを分析することによって得ることができる。
【００５０】
「ＹＯ２／Ｓ代謝比」は、消費されたＯ２の量と消費された基質、一般にグルコースの量との間の比に相当する。
【００５１】
「生産性」は、供給回分モードでの発酵の１リットル当たりおよび１時間当たり生産されたバイオマスの量に相当する。
【００５２】
「Ｙｘ／ｓ変換収率」は通常、形成されたバイオマスと消費されたグルコースとの間の比を表す。
【００５３】
「クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類」は本明細書では、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）、クロレラ・ケスレリ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ）、クロレラ・ミヌチシマ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ）、クロレラ種（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．）、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）、クロレラ・ルテオビリディス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄｉｓ）、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・レイシグリイ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｒｅｉｓｉｇｌｉｉ）、クロレラ・エリプソイデア（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）、クロレラ・サッカロフィラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓａｃｃａｒｏ
ｐｈｉｌａ）、パラクロレラ・ケスレリ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ）、パラクロレラ・ベイゼリンキイ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｋｉｉ）、プロトテカ・スタグノラ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ）およびプロトテカ・モリフォルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）よりなる群から選択され、好ましくはクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）およびクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）よりなる群から選択される微細藻類を意味することを意図する。特に好ましくは、微細藻類は、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）である。
【００５４】
本発明の主題
当業者は従来、酸素分圧（ｐＯ２）を測定することによって発酵培地における溶存酸素アベイラビリティを求めている。
【００５５】
この技法は、小さい発酵槽に関しては、ｐＯ２プローブによって与えられる値が全体発酵槽を代表すると考えることができるため、満足できる。
【００５６】
しかしながら、それは、大きい工業用発酵槽では、ｐＯ２がその中で一様に分布していないため、全体Ｏ２アベイラビリティを知ることを可能にしない。
【００５７】
それ故、本出願人は、この問題を克服するために、発酵槽に含有される微細藻類の代謝の迅速な、かつ、信頼できる指標である、発酵の呼吸商のレベルによって酸素供給を制御する方法を開発した。
【００５８】
それ故、本発明は、脂肪に富む、そして官能的に望ましくない化合物の全くない、微細藻類の、好ましくはクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属のバイオマスの新規な工業的生産方法に関する。この方法は、大きい発酵槽に好適な間接的方法（微細藻類菌株の呼吸商の監視）を用いる溶存酸素アベイラビリティの制御によって特徴付けられ、間接的方法のこの考えは、酸素分圧（ｐＯ２）を測定するプローブによって溶存酸素アベイラビリティを測定する直接的方法とは対照的である。
【００５９】
微細藻類の呼吸商を監視することによって溶存酸素アベイラビリティを制御する目的は、オフノートの出現に関与する分子（特に、オレイン酸などのモノ不飽和脂肪酸の酸化分解の生成物）の合成を減少させることである。
【００６０】
実際に、望ましくない分子をもたらす代謝経路の進行は、発酵培地におけるＯ２アベイラビリティに依存する。
【００６１】
これらの分解経路は、興味のある分子の生合成のための代謝経路、適切なケースではＣ１８：１オレイン酸型のモノ不飽和脂肪酸の生合成のための代謝経路よりも多くの酸素を要求する。
【００６２】
これは、標的とされる合成経路についてよりもこれらの分解経路についてより低い呼吸商をもたらす。
【００６３】
したがって、本発明の方法で基準微細藻類として選択されたクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）について、実施例に例示されるように、呼吸商は、オレイン酸生合成経路が細胞代謝において支配的である場合に１．８（消費されたＯ２の１モル当たり１．８モルのＣＯ２の生成を反映する）である。
【００６４】
他方では、発酵が過剰に酸素供給され、そして微細藻類が酸化分解生成物を生成する場合には、呼吸商は１．５を超えない。
【００６５】
本発明による方法は、発酵槽における溶存酸素アベイラビリティが微細藻類の呼吸商を監視することによって制御される培養工程を含む、脂質に富むバイオマスの発酵生産方法である。
【００６６】
微細藻類は優先的には、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属のものである。特に、それらは、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）およびクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）よりなる群から選択されてもよい。好ましくは、微細藻類は、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）である。
【００６７】
本方法はより小さい規模で用いることができるが、それは好ましくは、工業規模で、すなわち、（およそ１〜１００ｍ３の）中容量および（１００ｍ３超の）大容量の発酵槽で実施される。一実施形態によれば、本方法は、少なくとも１、１０、２５、５０、７５、１００、５００または１０００ｍ３の容量の発酵槽で実施される。
【００６８】
好ましい一形態によれば、微細藻類は、従属栄養条件下で、すなわち、炭素およびエネルギー源として炭素ベースの基質（好ましくはグルコース）を使用して光なしで培養される。
【００６９】
本発明による方法によって得られたバイオマスは、脂質に富むバイオマスである。本出願において用いられるような表現「脂質に富む」は、バイオマスの乾燥重量で２０重量％超の、好ましくは２５％超の脂質含有量を意味する。特定の一実施形態によれば、本発明による方法によって得られたバイオマスは、バイオマスの乾燥重量で３０％、３５％、４０％または４４％超の脂質含有量を有する。
【００７０】
好ましくは、発酵槽における溶存酸素アベイラビリティが微細藻類の呼吸商を監視することによって制御される培養工程は、バイオマスが脂質を蓄積する工程である。
【００７１】
脂質蓄積段階は、バイオマスの脂肪酸含有量が増加する培養段階である。この工程は、バイオマスの量を増加させることを専ら意図する増殖工程に続いて起こり得る。それは、バイオマスの量が所定の閾値、例えばおよそ７０ｇ／Ｌに達したときに、特に、ｐＨを調整するためにアンモニア水を水酸化カリウムで置き換えることによって起こり得る。
【００７２】
より特に好ましくは、発酵槽における溶存酸素アベイラビリティは、脂肪酸含有量がバイオマスの乾燥重量で２５％よりも大きい、好ましくはバイオマスの乾燥重量で３０％よりも大きいと直ちに、呼吸商を監視することによって制御される。あるいは、微細藻類の呼吸商の監視は、発酵の継続時間の全体にわたって実施することができる。
【００７３】
好ましい一形態によれば、本発明による方法によって得られたバイオマスは、許容できる感覚品質のものである。特に、それは、モノ不飽和脂肪酸の酸化分解の生成物などの官能的に望ましくない化合物をほとんどまたは全く含有しない。特に、このバイオマスは、オレイン酸酸化生成物をほとんどまたは全く含有しない。
【００７４】
好ましくは、官能的に望ましくない化合物の含有量は、感覚パネルの検出閾値未満にとどまる。特に、リノール酸（オレイン酸酸化分解生成物）の含有量は、乾燥バイオマス中
の脂肪酸の総重量に対して重量で１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％または７％未満である。
【００７５】
バイオマスの感覚品質は、微細藻類粉末呈味組成物を調製することによって、そして好ましくは少なくとも１０人の個人のパネルに、外観、風合い、味および風味に関する記述子を評価するよう依頼することによって画定することができる。
【００７６】
微細藻類粉末は、例えば国際公開第２０１０／１２０９３号に記載されているものなどの、当業者に公知の任意の方法によってすり潰され、乾燥させられたバイオマスから製造することができる。用語「微細藻類粉末組成物」は、乾燥重量で少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の微細藻類バイオマスを含む組成物を意味することを意図する。しかしながら、他の原料がこの組成物に任意選択的に含められてもよい。微細藻類バイオマスは、全細胞であっても破壊細胞であっても、または全細胞と破壊細胞との混合物であってもよい、微細藻類細胞に由来する。
【００７７】
本出願人は、さらに、仏国特許出願第１３５６１１３号明細書において、アイスクリームまたはブリオッシュなどのはるかにより複雑な、かつ、非常に異なるレシピで得られるものに似た官能評価を行うことを可能にする非常に簡単な呈味マトリックスを定義している。この呈味マトリックスを使った評価は、例えば、アイスクリームで微細藻類粉末組成物の官能品質を予測できないことが分かっている、簡単な水溶液を使って行われるものよりもはるかにより精密または正確である。
【００７８】
したがって、好ましくは、バイオマスの感覚品質を評価するために使用される微細藻類粉末呈味組成物は、
−  ５〜１０％、好ましくはおよそ７％の微細藻類粉末組成物と；
−  ０．５〜２％、好ましくはおよそ１％の糖類と；
−  ０．１〜０．５％、好ましくはおよそ０．２５％のバニラエッセンスと；
−  好ましくはおよそ９１．７５％の、スキムミルクである残りと
を含み、百分率は組成物の重量によって表される。
【００７９】
この組成物は、均質化と次に２〜１０分、好ましくはおよそ５分間、６０〜８５℃、好ましくはおよそ７５℃での加熱とによって得られる。
【００８０】
組成物の記述子は、基準組成物、すなわち、適合すると特定された、すなわち、許容できる官能品質（試験される全ての記述子において前記パネルによって適合すると認められた）の基準微細藻類粉末から得られた呈味組成物との比較によって評価される。
【００８１】
好ましくは、次表に示されるような基準生成物が各記述子と関連している。
【００８２】
【表１】
2016527912.tif 000002
【００８３】
各呈味セッションで、生成物は、許容できる官能品質のものであると見なされる基準バッチと比較して各記述子に関して評価される。
【００８４】
生成物は全て、以下の方法で、例えば１〜９の範囲の尺度で順次評価される：
１の値：評価される記述子が、生成物中に存在しない；
５の値：評価される記述子が、許容できる官能品質の基準生成物に関するのと全く同じように生成物中に存在する；
９の値：評価される記述子が、生成物中に大いに存在する。
【００８５】
許容できる官能品質の基準バッチが必ずしも、最適の感覚プロフィルを有する微細藻類の粉末ではないことを指摘することは重要である。それは好ましくは、試験された記述子全てに関して、５のグレードを特に有する、「満足できる」と官能パネルによって認められる微細藻類粉末組成物である。
【００８６】
本出願人は、さらに、微細藻類粉末組成物の感覚プロフィルがまた、特有の臭いのする分子の、とりわけ特定の揮発性有機化合物の性質および検出の閾値によって画定できることを確立している（仏国特許出願第１３５６１１３明細書を参照されたい）。
【００８７】
実際に、それは、微細藻類粉末組成物中のそれらの総含有量がそれらの官能品質を決定することを可能にする一連の１３種の揮発性有機化合物を特定している。
【００８８】
これらの１３種の揮発性有機化合物は、ヘプタナール、３−オクテン−２−オン、２，４−ヘプタジエナール、３，５−オクタジエン−２−オン、２，４−ノナジエナール、２，４−デカジエナール、ヘキサン酸、２−エチルヘキサン酸、ヘプタン酸、ミリステート−１、ラウレート−１、ミリステート−２およびゲラニルアセトンである。
【００８９】
好ましくは、これらの揮発性有機化合物は、固相微量抽出（ＳＰＭＥ）によってサンプリングされ、ガスクロマトグラフィーＧＣ、特にＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー−質量分析法）によって分析される。
【００９０】
１３種の揮発性有機化合物のそれぞれの含有量は、この揮発性有機化合物に相当するＳＰＭＥ−ＧＣ／ＭＳクロマトグラムの特定イオンのピークの表面積によって測定され、基準生成物のそれと比べて測定される。
【００９１】
全含有量は、１３種の化合物のそれぞれの含有量を加算することによって、好ましくは１３種の化合物に相当するクロマトグラフィーピークの全表面積を測定することによって得られる。次に、全含有量は、官能品質が許容できるまたは許容できないと画定される基準微細藻類粉末組成物のそれと比較することができる。
【００９２】
このようにして、これらの１３種の揮発性有機化合物の低い全含有量は、最適化された官能品質と関連付けられる。逆に、これらの１３種の揮発性有機化合物のより高い全含有量は、中位の、または不十分なもしくはさらに許容できない官能品質と関連付けられる。
【００９３】
特定の一実施形態によれば、本発明による方法で得られた微細藻類の粉末の組成物は、許容できない官能品質の組成物のそれよりも少なくとも２倍低い、好ましくは少なくとも５、１０または１５倍低いこれらの１３種の揮発性有機化合物の全含有量を有する。
【００９４】
別の特定の実施形態によれば、本発明による方法で得られた微細藻類の粉末の組成物は、許容できる官能品質の組成物のそれと同一であるかまたはそれよりも低いこれらの１３種の揮発性有機化合物の全含有量を有する。
【００９５】
好ましい一実施形態によれば、呼吸商が監視される培養工程の間、前記商は、１．５よりも大きい、好ましくは１．６よりも大きい、より優先的には１．７よりも大きい、さらにより優先的には１．８よりも大きい値に維持される。
【００９６】
したがって、特定の一実施形態では、微細藻類、好ましくはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の発酵のための条件は、脂質蓄積工程の間、より特に生産されたバイオマスが２５％超の脂質、好ましくは３０％超の脂質（バイオマスの乾燥重量で表される％）を含有すると直ちに、呼吸商を１．５よりも大きい、好ましくは１．６よりも大きい、より優先的には１．７よりも大きい、さらにより優先的には１．８よりも大きい値に維持するように制御される。
【００９７】
呼吸商は、発酵槽から脱出するガスを分析する、特にＣＯ２およびＯ２を定量化するガス分析計を用いて連続的にまたは半連続的に監視することができる。
【００９８】
これらの測定値に基づいて、微細藻類の呼吸商を調節し、その代謝を効率よく制御するために酸素供給を調節することが可能となる。
【００９９】
したがって、呼吸商が低すぎる場合には、酸素供給が減らされる。逆の場合には、酸素供給を増やすかまたは変化なしに保つことができる。
【０１００】
発酵培地への酸素供給は、任意の方法によって、特に攪拌速度、背圧または流入空気（培地中へ注入される空気）中の酸素濃度を調節することによって実施することができる。
【０１０１】
本出願人はまた、ＹＯ２／Ｓ代謝比（消費された酸素の量／消費されたグルコースの量を表す）を、酸素供給が正しい範囲にあるかどうかを判定するために用い得ることを観察した。
【０１０２】
したがって、好ましい一形態によれば、累積ＹＯ２／Ｓ代謝比（発酵の開始から計算される）は、特に微細藻類がクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）である場合におよび本発明による方法によって生産されたバイオマスが、バイオマスの乾燥重量で３０％超の脂質含有量を有する場合に、０．２８未満、優先的には０．２７未満、より優先的には０．２６未満の値に維持される。
【０１０３】
別の好ましい形態によれば、脂質蓄積段階の間に観察されるＹＯ２／Ｓ代謝比は、特に生産されたバイオマスが２５％超の脂質、好ましくは３０％超の脂質（バイオマスの乾燥重量で表される％）を含有する場合に、０．３２未満、優先的には０．２８未満、より優先的には０．２７未満、非常に特に好ましくは０．２６未満の値に維持される。
【０１０４】
別の態様によれば、本発明はまた、
−  微細藻類の増殖を可能にする第１培養工程と、
−  バイオマスに脂質を富ませることを可能にし、そして発酵槽における溶存酸素アベイラビリティが前記微細藻類の呼吸商を監視することによって制御される第２培養工程と
を含む、微細藻類の従属栄養培養方法に関する。
【０１０５】
好ましくは、第２工程において、溶存酸素アベイラビリティは、脂肪酸含有量がバイオマスの乾燥重量で２５％よりも大きい、好ましくはバイオマスの乾燥重量で３０％よりも大きいと直ちに呼吸商を監視することによって制御される。
【０１０６】
上に記載された実施形態はまた、本発明のこの態様にも適用される。
【０１０７】
別の態様によれば、本発明はまた、本発明の方法による微細藻類バイオマスの生産と前記バイオマスからの微細藻類粉末の取得とを含むことを特徴とする、微細藻類粉末組成物の製造方法に関する。
【０１０８】
本発明は、例示的であり、そして非限定的であることを意図される以下の実施例を用いてより明確に理解されるであろう。
【実施例】
【０１０９】
実施例１：脂質に富むクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の生産−酸素供給の制御
使用される菌株は、クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）ＵＴＥＸ  ２５０である。
前培養：
−  ２リットルのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中の５００ｍＬの培地；
−  培地の組成：
【０１１０】
【表２】
2016527912.tif 000003
【０１１１】
培養は、次の条件下で実施する：時間：７２ｈ；温度：２８℃；振盪：１１０ｒｐｍ（Ｉｎｆｏｒｓ  Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ培養器）。
【０１１２】
次に、前培養物をＳａｒｔｏｒｉｕｓ  ３０Ｌ発酵槽へ移す。
【０１１３】
バイオマス生産のための培養：
基本培地は、次の通りである。
【０１１４】
【表３】
2016527912.tif 000004
【０１１５】
発酵槽の初期容積（Ｖｉ）を植菌後に７Ｌに調整する。それを、１５〜２０Ｌの最終容積にする。
【０１１６】
様々な試験を実施するためのパラメータは、次の通りである。
【０１１７】
【表４】
2016527912.tif 000005
【０１１８】
グルコースの残存濃度が１０ｇ／Ｌ未満に低下したとき、グルコースの含有量を発酵槽中で０〜２０ｇ／Ｌに維持するために、７００ｇ／Ｌでの濃縮溶液の形態でのグルコースを連続的に提供する。
【０１１９】
１０００ｇのグルコースが消費され、そしてバイオマスが７０ｇ／Ｌの濃度に達したときに、ｐＨの調整のためのアンモニア水を、水酸化カリウムで置き換える。これは、バイオマスが脂質を蓄積することを可能にする。
【０１２０】
結果：
試験を、３つのレベルの酸素供給で実施した。発酵槽において測定される溶存酸素含有量（ｐＯ２）は、発酵槽が大気圧に維持され、そして空気を供給されるときに飽和点で得られる含有量の百分率として表される。１００％のｐＯ２は、およそ７ｍｇ／Ｌの酸素含有量に相当する。
【０１２１】
２つの代謝指標：
−  呼吸商（ＲＱ）＝生成したＣＯ２／消費されたＯ２
−  収率ＹＯ２／Ｓ＝消費されたＯ２／消費されたグルコース。
を、代謝への酸素供給のレベルの影響を定量化するために用いる。
【０１２２】
それらは、ガス分析計を用いて測定される、発酵槽を出るガスの酸素およびＣＯ２含有量から計算する。
【０１２３】
脂肪酸は、それらに関する限り、メタノール塩酸でのエステル交換およびクロロホルムでの抽出後にメチルエステルの形態でガスクロマトグラフィーによって測定した。結果は％分布として表し、分析は内部標準法によって実施した。
【０１２４】
ｔａｐｆｏｃｕｓ内張りのスプリット−スプリットなし注入器と水素炎イオン化検出器とを備えたクロマトグラフ（ＶＡＲＩＡＮ  ３８００）を用いた。
【０１２５】
メタノールの１ｍＬ当たりほぼ正確に０．５ｍｇのヘプタデカン酸メチルを含有する内部較正溶液を調製した。ヘプタデカン酸メチルは、クロマトグラフ基準点としての機能を果たした。
【０１２６】
ほぼ正確に３０ｍｇの事前乾燥させた試料を、６ｍＬのチューブへ秤量した。１ｍＬの内部較正溶液、次に２ｍＬの３Ｎメタノール塩酸を、２つの測定ライン付きピペットを用いて添加した。次に、チューブに栓をし、４時間にわたり１１０℃で温度自動調節されるドライバスに入れた。
【０１２７】
冷却後に、約０．５ｍＬの水および０．５ｍＬの飽和塩化ナトリウム水溶液を添加し、抽出を１ｍＬのクロロホルムで３回実施した。クロロホルム相を６ｍＬのチューブに回収し、それらを、硫酸ナトリウムを含有するカラムで乾燥させた。それらを窒素流下で濃縮して約１ｍＬにし、注入した。
【０１２８】
各脂肪酸（ｉ）の％分布は、ヘプタデカン酸メチルのピークを排除して、両端を含めてラウリン酸（Ｃ１２：０）からＤＨＡ（Ｃ２２：６  Δ４ｃ，７ｃ，１０ｃ，１３ｃ，１６ｃ，１９ｃ）まで、クロマトグラフ上に正確に示されるピーク全ての表面積の合計に対するこの脂肪酸のピークの表面積の比によって得た。
【０１２９】
【表５】
2016527912.tif 000006
【０１３０】
酸素供給の増加は、呼吸商の減少（ＣＯ２生成に対する酸素消費の増加）と、ＹＯ２／Ｓ代謝比の増加（グルコース消費に対する酸素消費の増加）とをもたらす。
【０１３１】
これは、飽和脂肪酸の合成よりも多くの酸素を要求する脂肪酸脱飽和経路の進行によって説明される。
【０１３２】
制限された酸素供給の条件下で、これらの脱飽和経路は、得られたバイオマス中のリノール酸の低い割合によって示されるように、全く進行せず、発酵の終わりに観察される呼吸商の値（１．８６）は、オレイン酸合成経路：
３５／６Ｃ６Ｈ１２Ｏ６＋９．５Ｏ２→Ｃ１８Ｈ３４Ｏ２＋１７ＣＯ２＋１８Ｈ２Ｏ
の理論値に近い。
【０１３３】
逆に、呼吸商が１．５未満の、すなわち、最適値よりもはるかに低い値に維持される試験２におけるような、過剰酸素供給条件下では、バイオマス中のリノール酸の蓄積（１９．６％）およびまたオフノート（感覚パネルによって検出される顕著な酸敗味）の出現が観察される。
【０１３４】
図１および２のグラフは、時間および（バイオマスの乾燥重量での）脂肪酸含有量の関数としての３つの試験の呼吸商の展開を示す。これらの２つの表現は、過剰酸素供給が１
．５未満への呼吸商値のブロッキングをもたらすことを示す。他方では、酸素供給条件が正しい場合、脂質蓄積工程の間の呼吸商は、特に脂肪酸含有量がバイオマスの乾燥重量の少なくとも２５％である場合に、１．５よりも大きい。
【０１３５】
実施例２：実施例１で生産された３つのバッチの感覚評価
この実施例では、本出願人は、実施例１で生産された３つのバッチから製造された微細藻類粉末であって、前記粉末が、国際公開第２０１０／１２０９３号に記載されている方法に従ってすり潰され、乾燥させられたバイオマスから製造された粉末の感覚品質を測定することを提案する。
【０１３６】
本出願人は、仏国特許出願第１３５６１１３号明細書において、アイスクリームまたはブリオッシュなどの、はるかにより複雑な、かつ、非常に異なるレシピで得られるものに似た官能評価を行うことを可能にする非常に簡単な呈味マトリックスを定義している。この呈味マトリックスを使った評価は、例えば、アイスクリームで微細藻類粉末組成物の官能品質を予測できないことが分かっている、簡単な水溶液を使って実施されるものよりもはるかにより精密または正確である。
【０１３７】
微細藻類粉末呈味組成物はしたがって、
−  ７％の微細藻類粉末組成物と；
−  １％の糖類と；
−  ０．２５％のバニラエッセンスと；
−  ９１．７５％のスキムミルクと
を含み、百分率は、組成物の重量で表される。
【０１３８】
この組成物は、その後均質化され、次に５分間７５℃で加熱される。
【０１３９】
一連の１５人の個人を、適合すると特定された、すなわち、許容できる官能品質の基準微細藻類粉末の試料（基準バッチ）、すなわち、試験される記述子の全てにおいて前記パネルによって適合すると認められる微細藻類粉末のバッチと比較して幾つかの微細藻類粉末組成物の記述子を評価するために集める。
【０１４０】
下表５に示されるような基準生成物が各記述子と関連している。
【０１４１】
【表６】
2016527912.tif 000007
【０１４２】
各呈味セッションで、生成物は、許容できる官能品質のものであると見なされる基準バッチと比較して各記述子に関して評価される。
【０１４３】
生成物は全て、以下の方法で１〜９の範囲の尺度で順次評価される：
１の値：評価される記述子が、生成物中に存在しない；
５の値：評価される記述子が、許容できる官能品質の基準生成物に関するのと全く同じように生成物中に存在する；
９の値：評価される記述子が、生成物中に大いに存在する。
【０１４４】
許容できる官能品質の基準バッチは、「満足できる」と感覚パネルによって認められる、すなわち試験される記述子全てに関して５のグレードを有する微細藻類粉末組成物である。
【０１４５】
データ処理ソフトウェア
分析は、Ｒソフトウェア（自由に売買される）を用いて実施した。
Ｒバージョン２．１４．１（２０１１−１２−２２）
著作権（Ｃ）２０１１  Ｔｈｅ  Ｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ
ＩＳＢＮ  ３−９０００５１−０７−０
プラットフォーム：ｉ３８６−ｐｃ−ｍｉｎｇｗ３２／ｉ３８６（３２ビット）
【０１４６】
このソフトウェアは、計算機能を含有するモジュールの装填を必要とする作業環境である。
【０１４７】
この研究に用いられるモジュールは、下記である：
−  ＰＣＡについては：Ｐａｃｋａｇｅ  ＦａｃｔｏＭｉｎｅＲバージョン１．１９、
−  ＡＮＯＶＡについては：Ｐａｃｋａｇｅ  ｃａｒバージョン２．０−１２、
−  線形回帰については：Ｐａｃｋａｇｅ  ｓｔａｔｓバージョン２．１４．１。
【０１４８】
データ処理：
分散分析（ＡＮＯＶＡ）は、記述子の識別能力を評価するために実施される（その記述子Ｆｉｓｈｅｒ試験−タイプ−１  ＡＮＯＶＡ−に関連したｐ値は、モデル記述子における組成物影響について０．２０未満である〜組成物＋判断）。
【０１４９】
「組成物」影響は、記述子の識別能力として解釈される。影響が全くない場合（臨界確率＞０．２０）、組成物は、この判定基準に従って識別されなかった。この臨界確率が小さければ小さいほど、記述子はより識別力がある。
【０１５０】
次に、組成物の官能マッピング、そしてまた記述子全てに関する組成物全ての同時表現を得るために主成分分析（ＰＣＡ）を実施する。
【０１５１】
実施例１の３つのバッチを、上に記載された方法に従って分析した。
【０１５２】
記述子「バター／乳製品」および「野菜の後味」に関する２つの例をここに示す。
【０１５３】
【表７】
2016527912.tif 000008
【０１５４】
【表８】
2016527912.tif 000009
【０１５５】
研究される２つの記述子についての組成物影響に関連した臨界確率は０．２未満である。２つの記述子はそれ故識別力があるように思われる。臨界確率は、「バター／乳製品」記述子に関してよりも「野菜の後味」記述子に関して小さく、それによってより大きい差が第２判定基準に関してよりも第１判定基準に関して組成物間で観察されることを意味する。
【０１５６】
以下に、組成物について得られた臨界確率および記述子全てについての判断結果を合計する表を示す。
【０１５７】
【表９】
2016527912.tif 000010
【０１５８】
黄色、野菜の後味、穀類およびキノコ記述子は全て識別力があり、それらは全て、ＰＣＡを確立するために取っておかれる。
【０１５９】
芳香は、組成物の本質的な判定基準であるため、ＰＣＡは、風味のみ（キノコ、穀類、野菜の後味、乳製品、酸敗した）に関連する記述子に関して実施した。このＰＣＡのグラフ表現を図３および図４に提供する。
【０１６０】
この方法は、実施例１の３つの試験から製造された様々な微細藻類粉末の官能品質の分類を確立することを可能にする。したがって、試験１および３（ベースまたは制限酸素供給）から得られた粉末は、試験２（過剰酸素供給）から得られた粉末の官能品質よりもはるかに良好である類似の官能品質を有する。
【０１６１】
これは、「過剰に」と定義される酸素供給条件がより大きいキノコおよび穀類風味を、そして野菜の後味をもたらすからである。それ故、これらの条件は、生成物の味覚の中立性を保証するために禁止されるべきである。
【０１６２】
「制限」と定義される酸素供給条件は、「ベース」と定義される酸素供給条件下に得られた生成物よりもわずかに黄色であるが、味覚の観点から大して違わず、かつ、それ自体基準生成物に非常に近い生成物を提供する。
【０１６３】
実施例３：実施例１から得られた微細藻類の粉末の３つのバッチの組成物中の許容できないオフノート官能分類と関連した揮発性有機化合物（ＶＯＣ）の分析
実施例１において生産されたバイオマスから得られた微細藻類の粉末の３つのバッチの組成物のＳＰＭＥ／ＧＣ−ＭＳ分析を実施するために、作業を次の通り実施する。
【０１６４】
３ｇの試料の試験検体を、密封ＳＰＭＥフラスコ（２０ｍＬ）に導入し、１５分間６０℃で定温放置し、次にＤＶＢ／ＣＡＲ／ＰＤＭＳ（ジビニルベンゼン／ｃａｒｂｏｘｅｎ／ポリジメチルシロキサンの省略形、ｄｆ５０／３０μｍ）ＳＰＭＥ繊維で４５分間６０℃で抽出する。
【０１６５】
抽出された揮発性有機化合物を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＴＳＱ  ＧＣ−ＭＳシステムの注入器で脱着させ、次に１．５ｍＬ／分でのヘリウムでＣＰｗａｘ５２（６０ｍ×０．２５ｍｍ、０．２５μｍ）カラム上で分離する。
【０１６６】
温度プログラムは次の通りである：３分間５０℃等温、次に２３０℃まで５℃／分でプログラミング、次に２０分間等温。
【０１６７】
検出は、電子衝撃（ＥＩ）質量分析によって実施し、化合物は、ＮＩＳＴライブラリーのＥＩスペクトルとの比較によって同定する。
【０１６８】
上述のように、本出願人は、仏国特許出願第１３５６１１３号明細書において、本発明により得られた微細藻類粉末の官能品質を画定することを可能にする１３種の化合物を特定した。
【０１６９】
これらの１３種の化合物は、ヘプタナール、３−オクテン−２−オン、２，４−ヘプタジエナール、３，５−オクタジエン−２−オン、２，４−ノナジエナール、２，４−デカジエナール、ヘキサン酸、２−エチルヘキサン酸、ヘプタン酸、ミリステート−１、ラウレート−１、ミリステート−２およびゲラニルアセトンである。ここでは、ジ不飽和アルデヒド、不飽和ケトン、カルボン酸およびカルボン酸誘導体の系統が表されている。
【０１７０】
これらの１３種の化合物に起因する、水中での嗅覚閾値を下表７に示す。
【０１７１】
【表１０】
2016527912.tif 000011
【０１７２】
図５は、実施例１の３つのバッチについて１３種の化合物のそれぞれの個々の風味値を示す。
【０１７３】
−  ４つの主な化合物は、検出される風味を全て有する：先行技術において不飽和脂肪酸酸化分解（過酸化）生成物として知られているものに従っている、２，４−ヘプタジエナール、３，５−オクタジエン−２−オン、２，４−ノナジエナールおよび２，４−デカジエナール；
−  ２，４−ヘプタジエナールおよび３，５−オクタジエン−２−オン含有量は、「過剰」バッチと比較して「ベース」および「制限」バッチについて相対的に低く、「制限」バッチが最低の含有率を有する；
−  ２，４−ノナジエナールおよび２，４−デカジエナール含有量は、「過剰」バッチと比較して「ベース」および「制限」バッチについて相対的に低く、「ベース」バッチが最低の含有率を有する
ように思われる。
【０１７４】
これらの結果は、「制限」および「ベース」バッチのより良好な官能品質を反映している。
【０１７５】
下表８は、これらの１３種の化合物の個々の風味値の合計、それ故、１３種の化合物の相対含有量およびそれらの嗅覚閾値から求められる、全風味値：
ＦＶ合計＝ΣＦＶｘ（個々のＦＶの合計）
を示し、
ここで、ＦＶｘ＝微細藻類粉末組成物のバッチのそれぞれについての化合物ｘの濃度／化合物ｘの嗅覚閾値である（１００％の値が「過剰」バッチに割り当てられる）。
【０１７６】
【表１１】
2016527912.tif 000012
【０１７７】
ここで再び、このＧＣ／ＭＳ分析はまた、実施例１の試験１および３（ベースまたは制限酸素供給）から得られた粉末が、試験２（過剰酸素供給）から得られた粉末の官能品質よりもはるかに良好である類似の官能品質を有することを実証することを可能にする。
【図１】
2016527912.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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