(57)【要約】  インフルエンザヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ変異体を含む、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、方法、組成物、並びにワクチンが提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘマグルチニンポリペプチドをコードする第１ゲノムセグメントを含む組換え再集合体インフルエンザウイルスであって、前記ヘマグルチニンポリペプチドが、配列番号１、配列番号３、又は配列番号４に示すアミノ酸配列を含む、組換え再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項２】
ヘマグルチニンポリペプチドをコードする第１ゲノムセグメントを含む組換え再集合体インフルエンザウイルスであって、前記ヘマグルチニンポリペプチドが、以下：
アミノ酸残基１２４位のロイシン；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸；又は
アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２４位のロイシンとアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２４位のロイシン、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸
を含む、組換え再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項３】
ノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第２ゲノムセグメントをさらに含み、前記ノイラミニダーゼポリペプチドが、以下：
アミノ酸残基２２２位のアスパラギン；又は
アミノ酸残基２４１位のバリン；又は
アミノ酸残基３６９位のアスパラギン；又は
アミノ酸残基２２２位のアスパラギンとアミノ酸残基３６９位のアスパラギン；又は
アミノ酸残基２４１位のバリンとアミノ酸残基３６９位のアスパラギン；又は
アミノ酸残基２２２位のアスパラギン、アミノ酸残基２４１位のバリン、及びアミノ酸残基３６９位のアスパラギン
を含む、請求項１又は２に記載の組換え再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項４】
弱毒化、温度感受性、及び低温適応の１つ又は複数の表現型特徴を有するインフルエンザウイルスの６つの内部ゲノムセグメントをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項５】
前記ヘマグルチニンポリペプチドが、配列番号１に示す前記アミノ酸配列を含み、
アミノ酸残基１２５位が、アスパラギン酸であり；かつ
アミノ酸残基１２７位が、グルタミン酸であり；かつ
アミノ酸残基２０９位が、グルタミン酸である
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項６】
前記ヘマグルチニンポリペプチドが、配列番号３に示す前記アミノ酸配列を含み、
アミノ酸残基１２５位が、アスパラギン酸であり；かつ
アミノ酸残基１２７位が、グルタミン酸であり；かつ
アミノ酸残基２０９位が、グルタミン酸である、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項７】
前記ヘマグルチニンポリペプチドが、配列番号４に示す前記アミノ酸配列を含み、
アミノ酸残基１２５位が、アスパラギン酸であり；かつ
アミノ酸残基１２７位が、グルタミン酸であり；かつ
アミノ酸残基２０９位が、グルタミン酸である、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項８】
前記ノイラミニダーゼポリペプチドが、配列番号８に示すアミノ酸配列を含み、
アミノ酸残基２２２位が、アスパラギンであり；かつ
アミノ酸残基２４１位が、バリンであり；かつ
アミノ酸残基３６９位が、アスパラギンである、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換え再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項９】
前記６つの内部ゲノムセグメントが、インフルエンザウイルスＡ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０由来のものである、請求項５〜８のいずれか一項に記載の組換え再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項１０】
前記６つの内部ゲノムセグメントが、インフルエンザウイルスＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４由来のものである、請求項５〜８のいずれか一項に記載の組換え再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項１１】
前記再集合体インフルエンザウイルスが、不活性化されている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換え再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項１２】
前記再集合体インフルエンザウイルスが、生弱毒化されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換え再集合体インフルエンザウイルス。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組換えインフルエンザウイルスを含む、免疫原性組成物。
【請求項１４】
Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ株ＨＡ及びＮＡ抗原を含む組換えインフルエンザウイルス、山形（Ｙａｍａｇａｔａ）インフルエンザＢ株ＨＡ及びＮＡ抗原を含む組換えインフルエンザウイルス、並びにビクトリア（Ｖｉｃｔｏｒｉａ）インフルエンザＢ株ＨＡ及びＮＡ抗原を含む組換えインフルエンザウイルスを含む、請求項１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
組換えインフルエンザウイルスを製造する方法であって、以下：
（ａ）インフルエンザウイルスの複製を支持することができる宿主細胞の集団に複数のベクターを導入するが、これら複数のベクターは、第１インフルエンザ株の少なくとも６つの内部ゲノムセグメントと、配列番号１、配列番号３、又は配列番号４に示すアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドをコードする第１ゲノムセグメントとを含む、ステップ；
（ｂ）前記宿主細胞の集団を培養して、前記組換え再集合体インフルエンザウイルスを増幅するステップ；及び
（ｃ）前記宿主細胞の集団から前記組換え再集合体インフルエンザウイルスを回収するステップ
を含む方法。
【請求項１６】
前記配列番号１のアミノ酸配列を含む前記ヘマグルチニンポリペプチドが、以下：
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸；又は
アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸
を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記配列番号３のアミノ酸配列を含む前記ヘマグルチニンポリペプチドが、以下：
アミノ酸残基１２４位のロイシン；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸；又は
アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２４位のロイシンとアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２４位のロイシン、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸
を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
配列番号４の前記アミノ酸配列を含む前記ヘマグルチニンポリペプチドが、以下：
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸；又は
アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸
を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ａ）の前記複数のベクターが、配列番号５、又は配列番号７、又は配列番号８のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第２ゲノムセグメントを含む、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ノイラミニダーゼポリペプチドが、配列番号８の前記アミノ酸を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
配列番号８に示す前記ノイラミニダーゼポリペプチドが、以下：
アミノ酸残基２２２位のアスパラギン；又は
アミノ酸残基２４１位のバリン；又は
アミノ酸残基３６９位のアスパラギン；又は
アミノ酸残基２２２位のアスパラギンとアミノ酸残基３６９位のアスパラギン；又は
アミノ酸残基２４１位のバリンとアミノ酸残基３６９位のアスパラギン；又は
アミノ酸残基２２２位のアスパラギン、アミノ酸残基２４１位のバリン、及びアミノ酸残基３６９位のアスパラギン
を含む、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１１月１６日に提出された米国特許出願第６１／７２７，２１３号明細書に対する優先権を請求する。この仮出願の開示内容は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
【背景技術】
【０００２】
ブタ由来のＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスにより引き起こされた２００９年インフルエンザ・パンデミックは、２１５の国々に広がり、検査確認された１８，０００人の死亡の原因となった（Garten et al.,2009,Science 325:197-201,31）。こうしたパンデミックの事象には、迅速なワクチンの製造が不可欠である。しかし、インフルエンザワクチンウイルス生産用の基質である孵化鶏卵におけるヒトインフルエンザウイルスの増殖は、一般的に、トリ受容体よりヒト受容体と結合するウイルスの優先性により阻害される。従って、通常、卵におけるワクチンウイルスの増殖を改善するために卵馴化が必要である（Gambaryan et al.,1989 p.175-218.In R.Krug(ed.),The Influenza Viruses.Plenum Press,New York;Robertson 1993 Reviews in Med.Virol.3:97-106;Robertson et al.,1987 Virol.160:31-37;Rogers et al.,1983 Nature 304:76-78)。２００９年４月のＨ１Ｎ１パンデミックの発生時に、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍワクチンの開発は、卵でのこのような貧弱なウイルス増殖によって阻害された(Robertson et al.,2011 Vaccine 29:1836-1843)。
【０００３】
ブタ由来のＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスに対する生きた弱毒化インフルエンザウイルスワクチン（ＬＡＩＶ）を製造するために、ＨＡタンパク質の３つの残基（Ｋ１１９Ｅ、Ａ１８６Ｄ、Ｄ２２２Ｇ、全てＨ１番号付与）が置換された。これらの置換により、ＬＡＩＶが得られ、これは、米国で市販される最初のＨ１Ｎ１ｐｄｍワクチンであった。ＬＡＩＶは、２００３年から米国で実施許諾を取得し、韓国及びカナダなどの他の国でも承認された(Ambrose et al.,2008 Influenza Other Respi Viruses 2:193-202)。各ＬＡＩＶウイルスは、６：２再集合体であり、これは、温度感受性（ｔｓ）、低温適応（ｃａ）及び弱毒化（ａｔｔ）表現型を付与するマスターウイルス由来の６つの内部タンパク質遺伝子セグメントと、野生型ウイルス由来の抗原性ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）表面糖タンパク質セグメントとを含む（Murphy et al.,2002 Viral Immunol 15:295-323）。
【０００４】
２００９年以後、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（ＣＡ／０９）様Ｈ１Ｎ１ｐｄｍウイルスが流行し、年１回のインフルエンザワクチンに存在するＨ１Ｎ１株として季節性Ｈ１Ｎ１ウイルスに代わって用いられている。現時点で流行しているＨ１Ｎ１ウイルスは、抗原がＣＡ／０９に類似しているが、新規のＨ１Ｎ１ｐｄｍ株の間に、ＣＡ／０９遺伝的多様性及びＣＡ／０９内亜群が確認されている（ＣＤＣ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）。さらに、動物モデルから得られたデータは、配列変異又は他のインフルエンザウイルスとの再集合によって、毒性がより高いＨ１Ｎ１ｐｄｍの出現が可能であることを明らかにした(Ilyshina et al.,2010 mBio 1:e00249-10;Schrauwen et al.,2011 Emerging Infectious Diseases 17;Ye et al.,2010 PLoS Pathog.6:e1001145)。従って、卵での高収率ウイルスの迅速な産生を促進することができるＨ１Ｎ１ｐｄｍウイルスにおける遺伝子シグネチャーをみいだすことが重要である。
【０００５】
インフルエンザＨＡ表面タンパク質同様、ＮＡ表面糖タンパク質もウイルス複製に重要な役割を果たす。ＨＡは、細胞表面上のシアル酸受容体に結合して、ウイルス付着及びウイルス侵入時の膜融合を媒介する(Skehel et al.,2000 Annu Rev Biochem.69:531-569)。ＮＡは、細胞表面上の末端シアル酸の除去を触媒することにより、新たに集合したウイルスは感染細胞から放出され、拡散することができる(Colman et al.,1989 p.175-218.In R.Krug(ed.),The Influenza Viruses.Plenum Press,New York)。ＨＡ及びＮＡタンパク質はいずれもシアロシドを認識するが、相殺機能を有する。ゆえに、効率的なウイルス複製のためには、ＨＡの受容体結合と、ＮＡの受容体破壊特性との機能的均衡が重要である(Mitnaul et al.,2000 J Virol.74:6015-6020;Wagner et al.,2002 Rev.Med.Virol.12:159-166)。例えば、卵及びＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２（Ｈ３Ｎ２）の複製は、ＨＡの受容体結合能力を増大するように２つのＨＡ残基を置換するか、又はＮＡの酵素活性を低減するように２つのＮＡ残基を置換するかのいずれかによって、改善できることがわかっている（Lu et al.,2005 J.Virol.79:6763-6771）。さらに、ＨＡ−ＮＡ均衡及びＮＡ活性は、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍウイルスの感染力に影響をもたらすことも報告されている(Lakdawala et al.,2011 PLoS Pathog.7:e1002443;Yen et al.,2011 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108:14264-14269)。グリカン結合及びＮＡ活性アッセイを用いた、Ｘｕらの報告は、ＨＡ及びＮＡ活性の機能的均衡が、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍウイルスの出現にとって重要であることを明らかにしている(Xu et al.,2012 Functional Balance of the Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Accompanies the Emergence of the 2009 H1N1 Influenza Pandemic.J.Virol.86:17 9221-9232;Epub ahead of print 20 June 2012 doi:10.1128/JVI.00697-12)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Garten et al.,2009,Science 325:197-201,31
【非特許文献２】Gambaryan et al.,1989 p.175-218.In R.Krug(ed.),The Influenza Viruses.Plenum Press,New York
【非特許文献３】Robertson 1993 Reviews in Med.Virol.3:97-106
【非特許文献４】Robertson et al.,1987 Virol.160:31-37
【非特許文献５】Rogers et al.,1983 Nature 304:76-78
【非特許文献６】Robertson et al.,2011 Vaccine 29:1836-1843
【非特許文献７】Ambrose et al.,2008 Influenza Other Respi Viruses 2:193-202
【非特許文献８】Murphy et al.,2002 Viral Immunol 15:295-323
【非特許文献９】Ilyshina et al.,2010 mBio 1:e00249-10;
【非特許文献１０】Schrauwen et al.,2011 Emerging Infectious Diseases 17
【非特許文献１１】Ye et al.,2010 PLoS Pathog.6:e1001145
【非特許文献１２】Skehel et al.,2000 Annu Rev Biochem.69:531-569
【非特許文献１３】Colman et al.,1989 p.175-218.In R.Krug(ed.),The Influenza Viruses.Plenum Press,New York
【非特許文献１４】Mitnaul et al.,2000 J Virol.74:6015-6020
【非特許文献１５】Wagner et al.,2002 Rev.Med.Virol.12:159-166
【非特許文献１６】Lu et al.,2005 J.Virol.79:6763-6771
【非特許文献１７】Lakdawala et al.,2011 PLoS Pathog.7:e1002443;
【非特許文献１８】Yen et al.,2011 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108:14264-14269
【非特許文献１９】Xu et al.,2012 Functional Balance of the Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Accompanies the Emergence of the 2009 H1N1 Influenza Pandemic.J.Virol.86:17 9221-9232;
【非特許文献２０】Epub ahead of print 20 June 2012 doi:10.1128/JVI.00697-12
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本開示は、卵でのワクチンウイルスの増殖を改善する、Ｈ１Ｎ１ウイルスのＨＡ及びＮＡの両方に、別の重要な残基を提供する。具体的には、本開示は、ウイルスの複製を改善する、ＨＡ球状頭部及びＮＡ残基に複数の酸性残基を提供する。これらのアミノ酸置換は、ウイルスの抗原性に影響を与えないため、ワクチン製造に好適である。インフルエンザＨＡ及びＮＡポリペプチドにおけるこうしたアミノ酸残基の同定は、将来の変異型Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ様ウイルスに対する高収率の再集合体ワクチンウイルスの産生において、ワクチン製造者に役立つに違いない。数々の他の恩恵はこの開示を見ることによって明らかとなろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、ヘマグルチニンポリペプチドをコードする第１ゲノムセグメントを含む再集合インフルエンザウイルスを提供し、上記ヘマグルチニンポリペプチドは、配列番号１、配列番号３、又は配列番号４に示すアミノ酸配列を含む。
【０００９】
本開示はまた、アミノ酸残基１２５位、１２７位、及び２０９位（Ｈ１番号付与）に対応する１個又は複数のヘマグルチニンアミノ酸残基を、非天然アミノ酸残基に改変することにより、孵化卵におけるインフルエンザＡウイルスの複製能力を増大する方法も提供する。
【００１０】
本開示はさらに、アミノ酸残基２２２位、２４１位、及び３６９位（Ｎ１番号付与）に対応する１個又は複数のノイラミニダーゼアミノ酸残基を、非天然アミノ酸残基に改変することにより、孵化卵におけるインフルエンザＡウイルスの複製能力を増大する方法も提供する。
【００１１】
さらには、本開示は、単離ヘマグルチニンポリペプチド及び単離ノイラミニダーゼポリペプチドを提供する。単離ヘマグルチニンポリペプチドは、配列番号１、配列番号３、又は配列番号４に示すアミノ酸配列を含んでもよい。単離ノイラミニダーゼポリペプチドは、配列番号５、配列番号７、又は配列番号８に示すアミノ酸配列を含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】卵における様々なＨ１Ｎ１ｐｄｍｃａウイルスの増殖。図１Ａは、卵でのウイルス力価を示す。手短には、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２０１０（Ｂｒｉｓ／１０）、Ａ／Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ／２／２０１０（ＮＨ／１０）又はＡ／Ｇｉｌｒｏｙ／２３１／２０１１（Ｇｉｌ／１１）を卵に接種し、感染力価をＦＦＡにより決定した。卵馴化により起こったＨＡタンパク質でのアミノ酸置換を表示した。データは、３つの独立した実験の平均を表すものであり、標準偏差バーを共に示す。検出限界は、３．２Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍｌである。図１Ｂは、表示されるＨＡアミノ酸置換を含み、ＭＤＣＫ細胞中で増殖させたＢｒｉｓ／１０ｃａ及びＮＨ／１０ｃａウイルスを示す。プラークアッセイをＭＤＣＫ細胞中で実施し、インフルエンザＡウイルスに対するポリクローナル抗血清でプラークを免疫染色した。
【図２】１２５位、１２７位及び２０９位のＨＡ配列変異は、卵におけるＣＡ／０９ｃａウイルスの増殖を改善する。図２Ａは、卵でのウイルス力価を示す。手短には、ＨＡ遺伝子に、表示したアミノ酸置換を有するＣＡ／０９ｃａ再集合体を卵に接種し、感染力価をＦＦＡにより決定した。データは、３つの独立した実験の平均を表すものであり、標準偏差バーを共に示す。検出限界は、３．２Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍｌである。図２Ｂは、表示したＨＡアミノ酸置換を含み、ＭＤＣＫ細胞中で増殖させたＣＡ／０９ｃａ変異体を示す。プラークアッセイをＭＤＣＫ細胞中で実施し、インフルエンザＡウイルスに対するポリクローナル抗血清でプラークを免疫染色した。
【図３】卵におけるＧｉｌ／１１ｃａウイルス増殖に対するＮＡセグメントの作用。図３Ａは、卵でのウイルス力価を示す。手短には、表示したアミノ酸置換を有するＧｉｌ／１１ＨＡ変異体と、Ｇｉｌ／１１又はＢｒｉｓ／１０いずれか由来のＮＡセグメントを含む６：２再集合体をリバースジェネティクスによりレスキューした。ウイルスを卵に接種し、感染力価をＦＦＡにより決定した。データは、３つの独立した実験の平均を表すものであり、標準偏差バーを共に示す。検出限界は、３．２Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍｌである。図３Ｂは、ＭＤＣＫ細胞中で増殖させた際の図３Ａに表したウイルスの画像を示す。プラークアッセイをＭＤＣＫ細胞中で実施し、インフルエンザＡウイルスに対するポリクローナル抗血清でプラークを免疫染色した。
【図４】卵におけるＧｉｌ／１１ｃａウイルス増殖に対するＮＡ残基の作用。図４Ａは、卵でのウイルス力価を示す。手短には、ＨＡにＮ２５Ｄ／Ｄ１２７Ｅ変異を、またＮＡに表示のアミノ酸置換を含むＧｉｌ／１１ｃａ再集合体を卵に接種し、感染力価をＦＦＡにより決定した。データは、３つの独立した実験の平均を表すものであり、標準偏差バーを共に示す。検出限界は、３．２Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍｌである。図４Ｂは、ＭＤＣＫ細胞中で増殖させた際の前述したＧｉｌ／１１ｃａ変異体の画像を示す。プラークアッセイをＭＤＣＫ細胞中で実施し、インフルエンザＡウイルスに対するポリクローナル抗血清でプラークを免疫染色した。
【図５】図５Ａは、ＭＤＣＫ細胞における６：２ｃａ再集合体ＣＡ／０９−Ｄ１２７Ｅ及びＣＡ／０９−Ｎ１２５Ｄ／Ｄ１２７Ｅの増殖動態を示す。ＭＤＣＫ細胞をＭＯＩ：５又は０．００５で２つのウイルスに感染させ、３３℃でインキュベートした。表示した時間間隔で、培養物上清を回収し、ＭＤＣＫ細胞でのＦＦＡアッセイによりウイルス力価を決定した。図５Ｂは、細胞溶解物又はＭＤＣＫ細胞中で増殖したウイルスの上清から得たタンパク質のウエスタンブロットの画像を示す。手短には、ＭＤＣＫ細胞をＭＯＩ：５で２つのウイルスに感染させ、３３℃でインキュベートした。感染細胞上清及び細胞溶解物を感染から８時間又は１６時間後に回収し、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍＨＡに対するポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングにより分析した。図５Ｃは、ＭＯＩ：０．００５で２つのウイルスに感染させ、３３℃でインキュベートしたＭＤＣＫ細胞の免疫染色した画像を示す。感染から１５時間又は４８時間後に、感染細胞単層をＨ１Ｎ１ｐｄｍＨＡに対するポリクローナル抗体で免疫染色した。
【図６】ＭＤＣＫ細胞に増殖させたウイルスの細胞溶解物又は上清から得られたタンパク質のウエスタンブロットの画像を示す。感染細胞からのウイルスタンパク質発現及び放出。ＭＤＣＫ細胞をＭＯＩ：５で、Ｇｉｌ／１１ＮＡ又はＢｒｉｓ／１０ＮＡ含有Ｇｉｌ／１１−Ｎ１２５Ｄ／Ｄ１２７Ｅｃａウイルスに感染させ、３３℃でインキュベートした。感染から８時間又は１６時間後、感染細胞上清及び細胞溶解物を回収し、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍＨＡに対するポリクローナル抗体を用いて、ウエスタンブロッティングにより分析した。
【図７】ＨＡ及びＮＡの結晶構造。図７Ａは、ＨＡの結晶構造の画像を示す。ＨＡ３次元構造（１つのモノマーのみを示す）上のＨ１Ｎ１ｐｄｍウイルスの増殖を改善する、特定されたＨＡ残基の位置を明示する。図７Ｂは、ＮＡの結晶構造の画像を示す。１つのＮＡモノマー構造上の３つの特定されたＮＡ残基の位置を明示する。ＨＡ構造：ＰＤＢ＃３ＬＺＧ；ＮＡ構造：ＰＤＢ＃３ＮＳＳ。画像は、ＰｙＭｏＬソフトウエアを用いて表示した。ＲＢＳ：受容体結合部位；ＡＣ：ＮＡ活性キャビティ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書に明示及び記載する具体的実施内容は、例であり、本出願の範囲を何ら限定する意図はないことを理解すべきである。また、本明細書に記載の実施形態及び特徴の各々をあらゆる方法で組み合わせ得ることも理解すべきである。
【００１４】
本明細書で言及した公開特許、特許出願、ウェブサイト、会社名、及び科学文献は、各々が、参照により組み込まれていることが具体的かつ個別に示されているのと同じ範囲まで、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。本明細書に引用するいずれかの参照文献と本明細書の具体的教示内容の間に矛盾がある場合、これは、後者を優先して解決されるものとする。同様に、当分野で理解されている単語又はフレーズの定義と、本明細書に具体的に教示される単語又はフレーズの定義との間に矛盾がある場合にも、後者を優先して解決されるものとする。
【００１５】
本明細書で使用される場合、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、内容が明らかに別のことを指示していない限り、それらが指す用語の複数形も明確に包含する。
【００１６】
本明細書で使用される技術及び科学用語は、別に定義されない限り、本出願が関する分野の技術者により一般に理解される意味を有する。本明細書では、当業者には公知の様々な方法及び材料を参照にする。組換えＤＮＡ技術の一般的原理を記載する標準参照文献を以下に挙げる：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，”ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（１９９５）；及びＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｅｄ．，“Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，”ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）。尚、これらの各々の開示内容は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
【００１７】
再集合体インフルエンザウイルス
一般に、インフルエンザウイルスは、天然に存在するもの、又は人による操作で産生されるもののいずれであろうと、セグメント化された一本鎖ＲＮＡゲノムを含む内部リボ核タンパク質コア及びマトリックスタンパク質によって覆われる外側リポタンパク質エンベロープから構成される。インフルエンザウイルスのゲノムは、免疫原生表面ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質をコードする線状（−）鎖リボ核酸（ＲＮＡ）の８つのセグメントと、６つの内部コアポリペプチド：ヌクレオキャプシド核タンパク質（ＮＰ）；マトリックスタンパク質（Ｍ）；非構造タンパク質（ＮＳ）；及び３つのＲＮＡポリメラーゼ（ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２）タンパク質から構成される。複製中、ゲノムウイルスＲＮＡは、宿主細胞の核内の（＋）鎖メッセンジャーＲＮＡ及び（−）鎖ゲノムｃＲＮＡに転写される。８つのゲノムセグメントの各々は、ＲＮＡ以外にＮＰ及びポリメラーゼ複合体（ＰＢ１、ＰＢ２及びＰＡ）を含むリボ核タンパク質複合体にパッケージングされる。
【００１８】
Ａ型及びＢ型インフルエンザは、典型的には、ヒト集団におけるインフルエンザの大流行を伴う。しかし、Ａ型インフルエンザは、例えば、トリ、ブタ、及び他の動物などの他の種にも感染する。Ａ型ウイルスは、そのヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ表面糖タンパク質抗原内の相違に基づきサブタイプに分類される。Ａ型ウイルスのヘマグルチニンは、１６の既知サブタイプを有し、ノイラミニダーゼは、９つの既知サブタイプを有する。ヒトの場合、現時点で約４つの異なるヘマグルチニンと、２つの異なるノイラミニダーゼサブタイプ、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｎ１、及びＮ２がわかっている。特に、インフルエンザＡの２つの主要なサブタイプ、すなわちＨ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２は、ヒトにおいて活性である。しかし、Ｈ１Ｎ２も近年懸念されてきている。インフルエンザＢウイルスは、そのヘマグルチニン及びノイラミニダーゼタンパク質に基づくサブタイプに区分されない。
【００１９】
再集合体インフルエンザは、典型的に、２つ以上の親ウイルス株又は供給源の遺伝子及び／又はポリペプチド成分を含むウイルスである。例えば、７：１再集合体インフルエンザウイルスは、第１親ウイルス由来の７つのウイルスゲノムセグメント（又は遺伝子セグメント）と、例えば、本明細書に記載するヘマグルチニン又はノイラミニダーゼをコードする単一相補的ウイルスゲノムセグメントとを含む。６：２再集合体は、６つのゲノムセグメント、最も一般的には第１親ウイルス由来の６つのウイルスゲノムセグメントと、１つ又は複数の異なる親ウイルスに由来する２つの相補的ウイルスゲノムセグメント、例えば、ヘマグルチニン及びノイラミニダーゼゲノムセグメントとを含む。６：２再集合体が、第１の親ウイルスに由来する６つのウイルスゲノム、すなわち６つの内部ゲノムセグメントと、２つ以上の異なる親ウイルスに由来するヘマグルチニン及びノイラミニダーゼゲノムセグメントとを含む場合、これは、６：１：１再集合体ウイルスと称することもある。また、再集合体ウイルスは、本明細書に記載する状況に応じて、「キメラ」と呼ぶこともできる。
【００２０】
再集合体インフルエンザウイルスが、組換えインフルエンザウイルスである場合、これは、例えば、遺伝子クローン化操作及びリバースジェネティクス（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いて、人の介入により人工的又は合成的に（非天然に）改変されていてもよい。インフルエンザウイルスは、組換え核酸の発現により産生されるとき、組換え体であってもよい。
【００２１】
再集合体インフルエンザウイルスは、配列番号１のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドをコードするゲノムセグメントを有してもよい。ゲノムセグメントが、配列番号１のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドをコードする場合、これは、アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸残基、又はアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有し得る。
【００２２】
再集合体インフルエンザウイルスは、配列番号３のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドをコードするゲノムセグメントを有してもよい。ゲノムセグメントが、配列番号３のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドをコードする場合、これは、アミノ酸残基１２４位のロイシン、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２４位のロイシンとアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２４位のロイシン、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有し得る。
【００２３】
再集合体インフルエンザウイルスは、配列番号４のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドをコードするゲノムセグメントを有してもよい。ゲノムセグメントが、配列番号４のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドをコードする場合、これは、アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有し得る。
【００２４】
再集合体インフルエンザウイルスが、配列番号１のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドをコードするゲノムセグメントを有する場合、これは、７：１再集合体インフルエンザウイルス、６：１：１再集合体インフルエンザウイルス又は６：２再集合体インフルエンザウイルスであってよい。これが、６：２再集合体インフルエンザウイルスである場合、再集合体インフルエンザウイルスは、配列番号５のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドをコードするゲノムセグメントをさらに有し得る。
【００２５】
再集合体インフルエンザウイルスが、配列番号３のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドをコードするゲノムセグメントを有する場合、これは、７：１再集合体インフルエンザウイルス、６：１：１再集合体インフルエンザウイルス又は６：２再集合体インフルエンザウイルスであってよい。これが、６：２再集合体インフルエンザウイルスである場合、再集合体インフルエンザウイルスは、配列番号６のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドをコードするゲノムセグメントをさらに有し得る。再集合体インフルエンザウイルスが、配列番号３のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドをコードするゲノムセグメントと、配列番号６のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドをコードするゲノムセグメントとを有する場合、配列番号３のアミノ酸配列は、アミノ酸残基１２４位のロイシンとアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸とを有し得るか、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸とを有し得るか、又はアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有し得る。
【００２６】
再集合体インフルエンザウイルスが、配列番号４のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドをコードするゲノムセグメントを有する場合、これは、７：１再集合体インフルエンザウイルス、６：１：１再集合体インフルエンザウイルス又は６：２再集合体インフルエンザウイルスであってよい。これが、６：２再集合体インフルエンザウイルスである場合、再集合体インフルエンザウイルスは、配列番号８のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドをコードするゲノムセグメントをさらに有し得る。ゲノムセグメントが、配列番号８のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドをコードする場合、アミノ酸残基２２２位は、アスパラギンであるか、又はアミノ酸残基２４１位はバリンであるか、又はアミノ酸残基３６９位はアスパラギンであるか、又はアミノ酸残基２２２位がアスパラギンであり、かつアミノ酸残基３６９位がアスパラギンであるか、又はアミノ酸残基２４１位がバリンであり、かつアミノ酸残基３６９位がアスパラギンであるか、又はアミノ酸残基２２２位がアスパラギンであり、アミノ酸残基２４１位がバリンであり、かつアミノ酸残基３６９位がアスパラギンであり得る。配列番号４のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドをコードするゲノムセグメントを有する再集合体インフルエンザウイルスが、６：１：１再集合体インフルエンザウイルスである場合、これは、配列番号５又は配列番号７のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドをコードするゲノムセグメントをさらに有し得る。
【００２７】
再集合体インフルエンザウイルスが、６：２再集合体インフルエンザウイルスであり、ヘマグルチニンポリペプチドをコードするゲノムセグメントが、配列番号４のアミノ酸配列を含み、かつノイラミニダーゼポリペプチドをコードするゲノムセグメントが、配列番号８に示すアミノ酸配列を含む場合、ヘマグルチニンポリペプチドをコードするゲノムセグメントは、配列番号４を含み得るが、ここで、アミノ酸残基１２５位はアスパラギン酸であり、アミノ酸残基１２７位はグルタミン酸であり、配列番号８のノイラミニダーゼポリペプチドをコードするゲノムセグメントは、アミノ酸２２２位のアスパラギン、アミノ酸残基２４１位のバリン及びアミノ酸残基３６９位のアスパラギンを含む。あるいは、ヘマグルチニンポリペプチドをコードするゲノムセグメントは、配列番号４を含み得るが、ここで、アミノ酸残基１２５位はアスパラギン酸であり、かつアミノ酸残基１２７位はグルタミン酸であり、また、配列番号８のノイラミニダーゼポリペプチドをコードするゲノムセグメントは、アミノ酸残基３６９位のアスパラギンを含み得る。
【００２８】
例えば、７：１、６：２、６：１：１などの再集合体インフルエンザウイルスのいずれにおいても、６つの内部ゲノムセグメントは、ドナーウイルスなどのいずれか１つ又は複数のウイルスであってよい。ドナーウイルスは、当業者には一般に理解されている。ドナーウイルスの例として、Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０又はＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４、Ｂ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／１４／１７／５５、Ｂ／１４／５／１、Ｂ／ＵＳＳＲ／６０／６９、Ｂ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／１７９／８６、Ｂ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／１４／５５、又はＢ／Ｅｎｇｌａｎｄ／２６０８／７６が挙げられる。６つの内部ゲノムセグメントが、単一のドナーウイルス由来のものである場合、ドナーウイルスは、Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０又はＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４、Ｂ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／１４／１７／５５、Ｂ／１４／５／１、Ｂ／ＵＳＳＲ／６０／６９、Ｂ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／１７９／８６、Ｂ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／１４／５５、又はＢ／Ｅｎｇｌａｎｄ／２６０８／７６であってよい。
【００２９】
再集合体ウイルスのいずれも免疫原性組成物の形態にすることができる。免疫原性組成物は、抗原、すなわち配列番号１、配列番号３、若しくは配列番号４に示すアミノ酸配列の全部若しくは一部を含むヘマグルチニンポリペプチドを含むインフルエンザウイルス、又は配列番号５、配列番号７、若しくは配列番号８に示すアミノ酸配列の全部若しくは一部を含むノイラミニダーゼポリペプチドを含むインフルエンザウイルスに対する個体の免疫応答を増大することができる組成物であってよい。免疫原性は、例えば、中和分泌抗体及び／又は血清抗体のレベル若しくは量を測定することにより、モニターすることができる。免疫原性組成物は、防御免疫応答を誘発する能力を有し得る。免疫原性組成物が、防御免疫応答を誘発する場合、該組成物は、配列番号１、配列番号３、若しくは配列番号４に示すアミノ酸配列の全部若しくは一部を含むヘマグルチニンポリペプチドを含む野生型インフルエンザウイルス、又は配列番号５、配列番号７、若しくは配列番号８に示すアミノ酸配列の全部若しくは一部を含むノイラミニダーゼポリペプチドを含むインフルエンザウイルスへの感染によって引き起こされる症状を予防又は軽減し得る。
【００３０】
免疫原性組成物中の再集合体インフルエンザウイルスは、不活性化してもよい。例えば、ホルムアルデヒド及び／又はｂ−プロピオラクトンの使用により、インフルエンザウイルスを不活性化することができる。あるいは、免疫原性組成物中の再集合体インフルエンザウイルスを生弱毒化してもよい。このような生弱毒化再集合体インフルエンザウイルスは、例えば、低温適応、弱毒化、又は温度感受性などの特徴を呈示する。ウイルスに用いられる「温度感受性」、「低温適応」及び「弱毒化」という用語は、当分野において公知である。例えば、用語「温度感受性」（ｔｓ）は、例えば、インフルエンザＡ株の場合、ウイルスが、３３℃と比較して３９℃で１００倍以上の力価の減少を示すこと、又はインフルエンザＢ株の場合、ウイルスが、３３℃と比較して３７℃で１００倍以上の力価の減少を示すことを意味する。「低温適応」（ｃａ）という用語は、ウイルスが、２５℃で、３３℃での増殖の１００倍以内の増殖を示すことを意味し、また、「弱毒化」（ａｔｔ）という用語は、フェレットの上気道内でウイルスは複製するが、その肺組織内では検出限界以下であり、しかも、当該動物においてインフルエンザ様疾患を引き起こさないことを意味する。また、中間表現型を有するウイルス、すなわち、３３℃での増殖と比較し、３９℃（Ａ株ウイルスの場合）若しくは３７℃（Ｂ株ウイルスの場合）で１００倍未満の力価減少を示すか、又は２５℃で１００倍超（例えば、２００倍、５００倍、１０００倍、１０，０００倍以内）の増殖を示すウイルス、並びに／又はフェレットの上気道中での増殖と比較し、低減した肺での増殖（すなわち部分的弱毒）及び／若しくは当該動物において軽減されたインフルエンザ様疾患を示すウイルスも、本明細書に記載するＨＡ及びＮＡ配列と共に６：２又は６：１：１又は７：１再集合体インフルエンザウイルスを調製するのに好適であることが理解されよう。
【００３１】
ワクチン
インフルエンザワクチンの一例としてＦＬＵＭＩＳＴ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，ＬＬＣ）があり、これは、小児及び成人をインフルエンザ疾患から防御する弱毒化生ワクチンである（Ｂｅｌｓｈｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９８  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３８：１４０５−１２；Ｎｉｃｈｏｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９９  ＪＡＭＡ  ２８２：１３７−４４）。
【００３２】
ＦＬＵＭＩＳＴワクチン株は、例えば、共通のマスタードナーウイルス（ＭＤＶ）由来の６つの遺伝子セグメント、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ及びＮＳと一緒に、ワクチンが対象とする野生型株（又は場合によっては、関連株）に由来するＨＡ及びＮＡ遺伝子セグメントを含有する。このように、本明細書に記載のＨＡ及びＮＡ配列は、様々なＦＬＵＭＩＳＴ製剤に含有させることができる。ＦＬＵＭＩＳＴのインフルエンザＡ株用のＭＤＶ（ＭＤＶ−Ａ）は、連続的に温度を低くしながら、一次ニワトリ腎組織培養物中での野生型Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０（Ａ／ＡＡ／６／６０）株の連続継代により作出された（Ｍａａｓｓａｂ  １９６７  Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ａｔ  ２５  ｄｅｇｒｅｅｓ  Ｃ  Ｎａｔｕｒｅ  ２１３：６１２−４）。ＭＤＶ−Ａは、２５℃で効率的に複製する（ｃａ、低温適応）が、その増殖は、３８及び３９℃に限定される（ｔｓ、温度感受性）。さらに、このウイルスは、感染フェレットの肺では複製しない（ａｔｔ、弱毒化）。ｔｓ表現型は、その複製を気道の最も低温領域以外の領域に限定することにより、ヒトにおけるワクチンの弱毒化に寄与すると考えられる。
【００３３】
ワクチンの他の例として、不活性化ワクチンＦＬＵＺＯＮＥ（登録商標）（Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ）、ＦＬＵＶＩＲＩＮ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ）、ＦＬＵＡＲＩＸ（登録商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＦＬＵＬＡＶＡＬ（ＩＤ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｑｕｅｂｅｃ）、ＡＦＬＵＲＩＡ（登録商標）（ＣＬＳ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ）が挙げられる。これらのワクチンは、本明細書に開示するものなどのＨＡ及びＮＡ配列を含むインフルエンザウイルスと、第２の（例えば、ＰＲ８）インフルエンザウイルスの６つの内部ゲノムセグメントとから製造される。不活性化インフルエンザワクチンは、スプリット又は全ウイルス形態のいずれでもよい。典型的に、不活性化インフルエンザワクチンは、スプリットウイルス形態である。
【００３４】
ワクチンは、インフルエンザ抗原に対する免疫応答を増大するための１種又は複数のアジュバントを含有するように製剤化してもよい。好適なアジュバントとしては、以下：完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リソレシチンなどの界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油又は炭化水素乳剤、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、コリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、及び合成アジュバントＱＳ−２１、ＡＳ０３、及びＭＦ５９が挙げられる。
【００３５】
また、ワクチンは１種又は複数の免疫刺激分子と一緒に製剤化するか、あるいはこれらと一緒に送達してもよい。免疫刺激分子としては、免疫刺激、免疫増強、及び炎症誘発活性を有する各種サイトカイン、リンホカイン及びケモカイン、例えば、インターロイキン（例：ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３）；増殖因子（例：顆粒球（ＧＭ）−コロニー刺激因子（ＣＳＦ））；並びにその他の免疫刺激分子、例えば、マクロファージ炎症因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１；Ｂ７．２などが挙げられる。
【００３６】
本明細書に記載する組換え及び再集合体ウイルス、免疫原性組成物、及びワクチンは、免疫学的に有効な量で、かつ適切な担体若しくは賦形剤を用いて予防的に投与することにより、ＨＡ及び／又はＮＡ配列により決定される１つ又は複数のインフルエンザウイルス株に特異的な免疫応答を刺激することができる。典型的に、適切な担体若しくは賦形剤は、滅菌水、食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール水溶液、エタノール、非感染鶏卵からの尿膜液（すなわち、正常尿膜液又はＮＡＦ）、又はこれらの組み合わせなどの、薬学的に許容される担体若しくは賦形剤である。滅菌性、ｐＨ、等張性、及び安定性を確実にするこのような溶液の調製は、当分野で確立されたプロトコルに従って実施する。一般に、担体又は賦形剤は、アレルギー及びその他の不要な作用を最小限にし、かつ、例えば、皮下、筋内、鼻内などの具体的投与経路に適合するように選択する。
【００３７】
免疫学的に有効な量の組換え及び再集合体ウイルス、免疫原性組成物、又はワクチンの投与は、１つ又は複数のインフルエンザウイルス株に特異的な（すなわち、本明細書に記載のＨＡ及び／又はＮＡインフルエンザ抗原に対して）免疫応答を刺激するのに十分な量でなければならない。１つ又は複数のインフルエンザ株に対する防御的免疫応答を誘発するための投薬量及び方法は、当業者には公知である。例えば、米国特許（ＵＳＰＮ）第５，９２２，３２６号明細書；Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３７：３９７−４００；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９７３  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ５２：５６−６３；及びＷｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９７６  Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．８８：９３１−９３６を参照されたい。例えば、インフルエンザウイルスは、投与される用量当たり約１〜１０００ＨＩＤ５０（ヒト感染量）、すなわち１０５〜１０８ｐｆｕ（プラーク形成単位）の範囲で提供される。典型的に、例えば、年齢、健康状態、体重、性別、食事、投与時間、及びその他の臨床的要因に基づき、上記の範囲内で用量を調節する。ワクチン製剤は、例えば、針及び注射器、又は無針注射器を用いた皮下若しくは筋内注射により、全身投与することができる。あるいは、ワクチン製剤は、点鼻薬、大粒子エアロゾル（約１０μ超）、又は上気道への噴霧のいずれかにより、鼻内投与してもよい。鼻内投与の場合、弱毒化生ウイルスワクチンが往々にして好ましく、例えば、弱毒化、低温適応及び／又は温度感受性組換え体若しくは再集合体インフルエンザウイルスがある。前掲参照。単回用量による防御免疫応答の刺激が好ましいが、要望される予防効果を達成するために、同じ又は異なる経路により、追加用量を投与することができる。
【００３８】
単回用量による防御免疫応答の刺激が好ましいが、要望される予防効果を達成するために、同じ又は異なる経路により、追加用量を投与することができる。例えば、新生児及び乳児の場合には、十分な免疫レベルを誘発するために複数回の投与を必要とし得る。野生型インフルエンザ感染に対する十分なレベルの防御を維持するために必要に応じて、小児期を通じ、間隔を置いて投与を継続することができる。同様に、例えば、医療従事者、デイケア従事者、幼児の家族、高齢者、及び心肺機能が損傷した個体のような、繰り返すインフルエンザ感染又は重度のインフルエンザ感染に特に罹患しやすい成人も、防御免疫応答を確立及び／又は維持するために複数回の免疫が必要となり得る。誘発される免疫のレベルは、例えば、分泌及び血清抗体を中和する量、及び要望される防御レベルを誘発及び維持する上で必要に応じて調節される用量又は反復されるワクチン接種量を測定することにより、モニターすることができる。
【００３９】
ワクチンは、配列番号１、配列番号３、若しくは配列番号４のアミノ酸配列の全部若しくは一部を含むヘマグルチニンポリペプチド及び／又は配列番号５、配列番号７、若しくは配列番号８のアミノ酸配列の全部若しくは一部を含むノイラミニダーゼポリペプチドを含むインフルエンザウイルスに加えて、２種以上の組換え及び／又は再集合体インフルエンザウイルス、すなわち、インフルエンザウイルスを含み得る。ワクチンは、Ｈ３  ＨＡ抗原を有する組換えインフルエンザＡウイルスと、山形（Ｙａｍａｇａｔａ）又はビクトリア（Ｖｉｃｔｏｒｉａ）株ＨＡ抗原のいずれかを有する組換えインフルエンザＢとをさらに含む三価ワクチンであってもよい。ワクチンは、四価ワクチンであってもよい。ワクチンが四価ワクチンである場合、これは、ＨＡ３  ＨＡ抗原を有する組換えインフルエンザＡウイルス、山形（Ｙａｍａｇａｔａ）株ＨＡ抗原を有する組換えインフルエンザＢウイルス、及びビクトリア（Ｖｉｃｔｏｒｉａ）株ＨＡ抗原を有する組換えインフルエンザＢウイルスをさらに含み得る。
【００４０】
インフルエンザウイルスを作製する方法
組換え又は再集合体インフルエンザウイルスは、当分野では公知の複数の方法により容易に取得することができる。一方法では、１つ又は複数のベクターを、インフルエンザウイルスの複製を支持することができる宿主細胞の集団に導入する。１つ又は複数のベクターは、第１インフルエンザ株の少なくとも６つの内部ゲノムセグメントと、配列番号１又は配列番号３、又は配列番号４のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドを産生する第１ゲノムセグメントとに対応するヌクレオチド配列を含む。
【００４１】
第１ゲノムセグメントが、配列番号１のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドを産生する場合、これは、アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸残基、又はアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有し得る。さらに、ノイラミニダーゼポリペプチドを産生する第２ゲノムセグメントに対応するヌクレオチド配列を導入してもよい。第２ゲノムセグメントは、配列番号５のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドを産生しうる。
【００４２】
第１ゲノムセグメントが、配列番号３のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドを産生する場合、これは、アミノ酸残基１２４位のロイシン、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２４位のロイシンとアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２４位のロイシン、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有し得る。さらに、ノイラミニダーゼポリペプチドを産生する第２ゲノムセグメントに対応するヌクレオチド配列を導入してもよい。第２ゲノムセグメントは、配列番号６のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドを産生しうる。
【００４３】
第１ゲノムセグメントが、配列番号４のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドを産生する場合、これは、アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸残基、又はアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有し得る。さらに、ノイラミニダーゼポリペプチドを産生する第２ゲノムセグメントに対応するヌクレオチド配列を導入してもよい。第２ゲノムセグメントは、配列番号５、又は配列番号７、又は配列番号８のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドを産生しうる。第２ゲノムセグメントが、配列番号８のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドを産生する場合、アミノ酸残基２２２位は、アスパラギンであるか、又はアミノ酸残基２４１位はバリンであるか、又はアミノ酸残基３６９位はアスパラギンであるか、又はアミノ酸残基２２２がアスパラギンであり、かつアミノ酸残基３６９位がアスパラギンであるか、又はアミノ酸残基２４１がバリンであり、かつアミノ酸残基３６９位がアスパラギンであるか、又はアミノ酸残基２２２がアスパラギンであり、アミノ酸残基２４１位がバリンであり、かつアミノ酸残基３６９位がアスパラギンであってよい。
【００４４】
第１インフルエンザ株の少なくとも６つの内部ゲノムセグメントに対応するヌクレオチド配列は、インフルエンザワクチンへの添加、又は科学的研究、又は開発目的のために有用な特性を提供する任意のインフルエンザ株のものであってよい。第１インフルエンザ株の望ましい特徴は、弱毒化病原性又は表現型、低温適応、温度感受性であってよい。第１インフルエンザ株の例として、Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０又はＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４、Ｂ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／１４／１７／５５、Ｂ／１４／５／１、Ｂ／ＵＳＳＲ／６０／６９、Ｂ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／１７９／８６、Ｂ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／１４／５５、又はＢ／Ｅｎｇｌａｎｄ／２６０８／７６が挙げられる。
【００４５】
インフルエンザウイルス産生のためのベクターは、例えば、細菌及び真核生物細胞中で機能的な１つ又は複数の複製起点、並びに任意選択で、プラスミド配列を含む細胞をスクリーニング若しくは選択するのに好都合なマーカを賦与するプラスミドベクターであってもよい。例えば、Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，ＰＮＡＳ．ＵＳＡ  ９６：９３４５−９３５０を参照されたい。
【００４６】
ベクターは、いずれの方向でも挿入ｃＤＮＡからのウイルスゲノムセグメントの転写を開始することができる、すなわち、（＋）鎖及び（−）鎖ウイルスＲＮＡ分子の両方を生成することができる二方向性発現ベクターであってもよい。二方向転写を実施するために、ウイルスゲノムセグメントの各々を、少なくとも２つの独立したプロモータを有する発現ベクターに挿入して、一本の鎖から、第１ＲＮＡポリメラーゼプロモータ（例えば、ＲＮＡ  ｐｏｌ  Ｉプロモータ）によりウイルスゲノムＲＮＡのコピーが転写され、第２ＲＮＡポリメラーゼプロモータ（例えば、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩプロモータ）からウイルスｍＲＮＡが合成されるようにすることができる。従って、２つのプロモータは、少なくとも１つのクローン化部位（すなわち、制限酵素認識配列）、好ましくは、ウイルスゲノムＲＮＡセグメントの挿入に好適な唯一のクローン化部位とフランキングして、反対配向に配列することができる。あるいは、（＋）鎖ｍＲＮＡ及び（−）鎖ウイルスＲＮＡ（ｃＲＮＡとして）が、ベクターの同じ鎖から転写される「アンビセンス」発現ベクターを使用することもできる。
【００４７】
これ以外に、ベクターは、一方向発現ベクターであってもよく、この場合、ウイルスｃＤＮＡをｐｏｌ  Ｉプロモータと終結配列（内部転写単位）との間に挿入する。この内部転写単位は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）プロモータとポリアデニル化部位（外部転写単位）によりフランキングされている。一方向系では、ｐｏｌ  Ｉ及びｐｏｌ  ＩＩプロモータは、ｃＤＮＡの上流にあり、プラス鎖キャップなしｃＲＮＡ（ｐｏｌ  Ｉプロモータから）及びプラス鎖キャップ付きｍＲＮＡ（ｐｏｌ  ＩＩプロモータからを産生する。例えば、Ｈｏｆｆｍａｎｎ及びＷｅｂｓｔｅｒ，２０００，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１：２８４３−２８４７を参照。
【００４８】
他の系では、ｐｏｌ  Ｉ及びｐｏｌ  ＩＩプロモータにより転写されるウイルス配列を様々な発現ベクターから転写することができる。これらの実施形態では、ｐｏｌ  Ｉプロモータの制御下でウイルスゲノムセグメントの各々をコードするベクター（「ｖＲＮＡ発現ベクター）及びｐｏｌ  ＩＩプロモータの制御下で１つ又は複数のウイルスポリペプチド、例えば、インフルエンザＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、及びＮＰポリペプチドをコードするベクター（「タンパク質発現ベクター」）を用いることができる。
【００４９】
ヌクレオチド配列を含む１つ又は複数のベクターの導入は、当分野において公知の任意の方法又は技術により実施してよい。例えば、ベクターは、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、及びパーティクル・ガン送達により導入することができる。また、例えば、以下も参照されたい：Ｌｏｅｆｆｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｅｈｒ，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８；Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４；Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２（１９８５），Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９  ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７−２００１）。
【００５０】
ヌクレオチド配列を含む１つ又は複数のベクターの導入は、脂質又はリポソームを使用して実施してもよい。脂質又はリポソームは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡに結合して、疎水性被覆送達ビヒクルを提供する脂肪粒子若しくは脂質の混合物を含む。好適なリポソームは、卵などの天然の供給源、植物又は動物源由来のリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン若しくはホスファチジルイノシトールなどの従来の合成又は天然リン脂質リポソーム材料のいずれを含んでもよい。また、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジコリン、並びに対応する合成ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルグリセロールなどの合成リン脂質を用いてもよい。また、ベクターと結合させることができる脂質又はリポソームは、市販のものも当業者には入手可能である。当業者には公知の市販されている脂質又はリポソームトランスフェクション試薬の例としては、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＧＥＮＥＪＵＩＣＥ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ＧＥＮＥＪＡＭＭＥＲ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＦＵＧＥＮＥ  ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）、ＭＥＧＡＦＥＣＴＩＮ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｉａｇｅｎ）、及びＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（Ｑｉａｇｅｎ）が挙げられる。
【００５１】
さらに、ヌクレオチド配列を含む１つ又は複数のベクターの導入は、圧縮ポリヌクレオチド複合体又はナノスフィアを形成することにより実施してもよい。圧縮ポリヌクレオチド複合体は、米国特許第５，９７２，９０１号明細書、第６，００８，３３６号明細書、及び第６，０７７，８３５号明細書に記載されている。ナノスフィアについては、米国特許第５，７１８，９０５号明細書及び第６，２０７，１９５号明細書に記載されている。核酸を複合体化するこれらの圧縮ポリヌクレオチド複合体又はナノスフィアは、ポリマーカチオンを使用する。典型的なポリマーカチオンとしては、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リシン、及びキトサンが挙げられる。あるいは、ベクターのポリヌクレオチドをＤＥＡＥ−デキストランと複合体化すること、又はリン酸カルシウム共沈、又は塩化カルシウム共沈などの技術を用いてトランスフェクトすることもできる。ヌクレオチド配列を含む１つ又は複数のベクターの導入は、宿主細胞のクロモソームに組み込まれるヌクレオチド配列をもたらす場合もあれば、もたらさない場合もある。
【００５２】
１つ又は複数のベクターを導入する宿主細胞の集団は、インフルエンザウイルスの複製を支持することができる任意のものである。これらの宿主細胞の多くは、当業者には公知であり、ＭＤＣＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＰＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ベロ（Ｖｅｒｏ）アフリカミドリザル腎細胞；ＰＥＲＣ．６細胞（組換えＤＮＡ技術を用いて、不死化した単一ヒト網膜由来細胞から得られる）；ニワトリ胚由来のＥＢｘ幹細胞系統（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）が挙げられる。宿主細胞の集団は、細胞の組み合わせ又は混合物、例えば、２９３細胞（例えば、２９３Ｔ細胞）、又はＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７細胞）と、ＭＤＣＫ又はＶＥＲＯ又はＰＥＲＣ．６細胞との組み合わせを指す場合もある。
【００５３】
１つ又は複数のベクターを含む宿主細胞の集団を培養した後、インフルエンザウイルスを回収する。宿主細胞の培養は、インフルエンザウイルス産生を促進することがわかっている複数の適切な培養条件のいずれかによって実施することができる。例えば、培養は、３５℃以下の温度で実施してよく、これは、約３２℃〜３５℃、又は３２℃〜３４℃、又は約３３℃、又は約３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、若しくは３８℃であってよい。
【００５４】
典型的に、培養物は、サーモスタットなどの温度調節装置を用いて一定温度で、制御された湿度及びＣＯ２下、細胞培養インキュベータなどのシステム内に維持する。細胞の集団は、中性緩衝ｐＨ（例えば、７．０〜７．２のｐＨ）を維持するのに好適な制御湿度及びＣＯ２下、血清（例えば、１０％ウシ胎仔血清）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）などの標準的な市販の培地において、又は無血清培地で培養してよい。任意選択で、培地は、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシンなどの細菌増殖防止のための抗生物質、及び／又はＬ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸などの追加栄養素、好ましい増殖特性を促進するための追加補充物、例えば、トリプシン、βメルカプトエタノールなどを含有する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのインフルエンザウイルスの産生において特に興味深い組織培養手順に関してさらに詳細なものとして、例えば、Ｍｅｒｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｉｎ  Ｃｏｈｅｎ及びＳｈａｆｆｅｒｍａｎ（ｅｄｓ）  Ｎｏｖｅｌ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓが挙げられ、これらは、全体を本明細書に組み込むものとする。さらに、本発明に合わせた上記手順の改変は、常用の実験により容易に決定される。
【００５５】
宿主細胞の培養集団からのインフルエンザウイルスの回収は、当業者には周知であり、当業者により理解される複数の方法のいずれかによって実施することができる。例えば、粗培地を採取し、清澄化した後、濃縮してよい。インフルエンザウイルスを回収するために当業者が使用する一般的技法としては、濾過、超濾過、硫酸バリウムへの吸着及び溶離、並びに遠心分離がある。例えば、初めに、培養物からの粗培地は、例えば、１０００〜２０００×ｇの遠心分離を、細胞屑及び他の大きな粒状物質を除去するのに十分な時間、例えば、１０〜３０分にわたって実施することより清澄化することができる。あるいは、０．８μｍ酢酸セルロースフィルターにより培地を濾過して、インタクトな細胞及び他の大きな粒状物質を除去することもできる。次に、任意選択で、清澄化した培地上清を、例えば、１５，０００×ｇで約３〜５時間にわたり遠心分離して、インフルエンザウイルスをペレット化する。ＳＴＥ（０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；０．１５Ｍ  ＮａＣｌ；０．０００１Ｍ  ＥＤＴＡ）又はｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの適切なバッファー中にウイルスペレットを再懸濁させた後、ショ糖（６０％〜１２％）又は酒石酸カリウム（５０％〜１０％）での密度勾配遠心分離によりウイルスを濃縮させる。連続又はステップ勾配（例えば、４つの１２％ステップで１２％〜６０％のショ糖勾配）のいずれかが好適である。勾配は、ウイルスが、回収のための可視帯に濃縮するのに十分な速度で、かつ時十分な時間にわたり遠心分離してよい。これに代わり、及び一部のラージスケールの商業用途の場合、連続モードで運転するゾーン遠心分離ロータを用いて、密度勾配からウイルスを水ひしてもよい。組織培養物からのインフルエンザウイルスの調製を通じて当業者を指導するのに十分な追加的詳細事項は、例えば、以下の文献に提供されている：Ｆｕｒｍｉｎｇｅｒ．Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｉｎ  Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｐｐ．３２４−３３２；Ｍｅｒｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｉｎ  Ｃｏｈｅｎ  ＆  Ｓｈａｆｆｅｒｍａｎ（ｅｄｓ）Ｎｏｖｅｌ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｐｐ．１４１−１５１、及び米国特許第５，６９０，９３７号明細書。必要に応じて、回収したウイルスは、安定剤としてショ糖−リン酸−グルタミン酸（ＳＰＧ）の存在下、−８０℃で保存することができる。
【００５６】
インフルエンザＡの複製能力を増大する方法
アミノ酸残基１２５位、１２７位、及び２０９位（Ｈ１番号付与）に対応する１個又は複数のヘマグルチニンアミノ酸残基を非天然の酸性アミノ酸残基に改変することにより、孵化卵でのインフルエンザＡウイルスの複製能力を増大することができる。改変は、１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換、又は１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換、又は２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換、又は１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と１２７位のアミノ酸残基のグルタミン酸による置換、又は１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換、又は１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換、又は１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換、１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換、及び２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換を含み得る。
【００５７】
また、アミノ酸残基２２２位、２４１位、及び３６９位（Ｎ１番号付与）に対応する１個又は複数のノイラミニダーゼアミノ酸残基を非天然の酸性アミノ酸残基に改変することにより、孵化卵でのインフルエンザＡウイルスの複製能力を増大することができる。改変は、２２２位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又は２４１位アミノ酸残基のバリンによる置換、又は３６９位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又は２２２位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換と、２４１位のアミノ酸残基のバリンによる置換、又は２２２位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換と、３６９位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又は２４１位アミノ酸残基のバリンによる置換と、３６９位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又は２２２位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換と、２４１位アミノ酸残基のバリンによる置換と、３６９位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換とを含み得る。
【００５８】
さらに、孵化卵でのインフルエンザＡウイルスの複製能力は、アミノ酸残基２２２位、２４１位、及び３６９位に対応する１個又は複数のノイラミニダーゼアミノ酸残基と組み合わせて、アミノ酸残基１２５位、１２７位、及び２０９位に対応する１個又は複数のヘマグルチニンアミノ酸残基を非天然の酸性アミノ酸残基に改変することにより増大することもできる。改変は、ヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２２２位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２４１位のバリンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける３６９位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２２２位のアスパラギン及び３６９位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２２２位のアスパラギン及び２４１位のバリンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２４１位のバリン及び３６９位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２２２位のアスパラギ、２４１位のバリン、及び３６９位のアスパラギンによる置換を含み得る。
【００５９】
改変は、ヘマグルチニンポリペプチドにおける２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２２２位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２４１位のバリンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける３６９位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２２２位のアスパラギン及び３６９位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２２２位のアスパラギン及び２４１位のバリンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２４１位のバリン及び３６９位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２２２位のアスパラギン、２４１位のバリン及び３６９位のアスパラギンによる置換を含み得る。
【００６０】
改変は、ヘマグルチニンポリペプチドにおける１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２２２位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２４１位のバリンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける３６９位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２２２位のアスパラギン及び３６９位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２２２位のアスパラギン及び２４１位のバリンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２４１位のバリン及び３６９位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２２２位のアスパラギン、２４１位のバリン及び３６９位のアスパラギンによる置換を含み得る。
【００６１】
改変は、ヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２２２位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２４１位のバリンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける３６９位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２２２位のアスパラギン及び３６９位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２２２位のアスパラギン及び２４１位のバリンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２４１位のバリンによる置換及び３６９位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２２２位のアスパラギン、２４１位のバリン及び３６９位のアスパラギンによる置換を含み得る。
【００６２】
改変は、ヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換及び２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２２２位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換及び２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２４１位のバリンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換及び２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける３６９位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換及び２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２２２位のアスパラギン及び３６９位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換及び２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２２２位のアスパラギン及び２４１位のバリンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換及び２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２４１位のバリンによる置換及び３６９位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換及び２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける２２２位のアスパラギン、２４１位のバリン及び３６９位のアスパラギンによる置換を含み得る。
【００６３】
改変は、ヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける３６９位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける３６９位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける３６９位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける３６９位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける３６９位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換及び２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける３６９位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換、１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換及び２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける３６９位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換を含み得る。
【００６４】
改変は、ヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおけるアミノ酸残基２２２のアスパラギン、２４１位のバリン及び３６９位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおけるアミノ酸残基２２２のアスパラギン、２４１位のバリン及び３６９位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおけるアミノ酸残基２２２のアスパラギン、２４１位のバリン及び３６９位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおけるアミノ酸残基２２２のアスパラギン、２４１位のバリン及び３６９位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおけるアミノ酸残基２２２のアスパラギン、２４１位のバリン及び３６９位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換及び２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおけるアミノ酸残基２２２のアスパラギン、２４１位のバリン及び３６９位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換、１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換及び２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおけるアミノ酸残基２２２のアスパラギン、２４１位のバリン及び３６９位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換を含み得る。
【００６５】
ヘマグルチニン及び／又はノイラミニダーゼポリペプチドにおける１つ又は複数の改変の結果もたらされる複製能力の増大により、親インフルエンザウイルス（例えば、ヘマグルチニン及び／又はノイラミニダーゼポリペプチドにおける１つ又は複数の改変の導入前のインフルエンザウイルス）と比較して、孵化鶏卵中でより高い力価まで増殖するインフルエンザウイルスが得られる。ヘマグルチニン及び／又はノイラミニダーゼポリペプチドにおける１つ又は複数の改変は、親インフルエンザウイルスと比較して、複製能力を少なくとも約１０％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約１００％、又は少なくとも約２００％、又は少なくとも約３００％、又は少なくとも約４００％、又は少なくとも約５００％増大させ得る。
【００６６】
ヘマグルチニン及び／又はノイラミニダーゼポリペプチドにおける１つ又は複数の改変は、親インフルエンザウイルスと比較してインフルエンザウイルスの複製能力を少なくとも２倍増大させ得るか、又は親インフルエンザウイルスと比較してインフルエンザウイルスの複製能力を少なくとも４倍若しくは少なくとも８倍、少なくとも１０倍、又は親インフルエンザウイルスと比較して少なくとも１００倍増大させ得る。
【００６７】
ヘマグルチニン及び／又はノイラミニダーゼポリペプチドにおける１つ又は複数の改変は、インフルエンザウイルスの複製能力を、孵化卵中で少なくとも約７．５ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍｌ、又は孵化卵中で少なくとも約８ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍｌ、又は孵化卵中で少なくとも約８．１ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍｌ、又は孵化卵中で少なくとも約８．２ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍｌ、又は孵化卵中で少なくとも約８．３ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍｌ、又は孵化卵中で少なくとも約８．４ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍｌ、又は孵化卵中で少なくとも約８．５ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍｌ、又は孵化卵中で少なくとも約９ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍｌ増大させ得る。
【００６８】
アミノ酸残基１２５位、１２７位、及び２０９位（Ｈ１番号付与）に対応する１個又は複数のヘマグルチニンアミノ酸残基並びに／又はアミノ酸残基２２２、２４１、及び３６９（Ｎ１番号付与）に対応する１個又は複数のノイラミニダーゼアミノ酸残基の改変は、１個又は複数の天然のアミノ酸残基を本明細書に記載のような非天然アミノ酸残基で置換することにより実施することができる。１つ又は複数のアミノ酸置換は、当業者には公知の任意の操作技術又は一連の操作技術により実施してよい。このような操作に含まれ得る手順のための詳細なプロトコルは例えば、以下の文献に記載されているように、増幅、クローン化、突然変異誘発、形質転換などであってよい：Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００まで増補）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（“Ａｕｓｕｂｅｌ”）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９（“Ｓａｍｂｒｏｏｋ”）、並びにＢｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（“Ｂｅｒｇｅｒ”）。
【００６９】
例えば、ヘマグルチニン及び／又はノイラミニダーゼポリペプチドにおける選定したアミノ酸残基の置換は、例えば、部位特異的突然変異誘発により達成することができる。部位特異的突然変異誘発は、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、及びＢｅｒｇｅｒ（前掲）に記載する公知の方法により実施することができる。部位特異的突然変異誘発を実施するための多数のキットも市販されており、例えば、Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）があり、これらを製造者の指示に従い用いることにより、例えば、１つ又は複数のアミノ酸置換を、インフルエンザＡヘマグルチニン及び／又はノイラミニダーゼポリペプチドをコードするゲノムセグメントに導入することができる。
【００７０】
ヘマグルチニン及び／又はノイラミニダーゼポリペプチドにアミノ酸置換を導入するのに使用することができる他の操作技術としては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑ−レプリカーゼ増幅、及びその他のＲＮＡポリメラーゼ媒介技術（例えば、ＮＡＳＢＡ）などが挙げられ、これらは、以下の文献にみいだされる：Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号明細書；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）（“Ｉｎｎｉｓ”）；Ａｒｎｈｅｉｍ及びＬｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０）Ｃ＆ＥＮ  ３６；Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９１  ３：８１；Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．１９８９  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６，１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９０  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：１８７４；Ｌｏｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．１９８９  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ３５：１８２６；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ  １９９０  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２９１；Ｗｕ及びＷａｌｌａｃｅ  １９８９  Ｇｅｎｅ  ４：５６０；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９０  Ｇｅｎｅ  ８９：１１７、並びにＳｏｏｋｎａｎａｎ及びＭａｌｅｋ  １９９５  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５６３。核酸をクローン化するのに有用な別の方法として、Ｗａｌｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，４２６，０３９号明細書がある。ＰＣＲにより大きな核酸を増幅する改善された方法が、Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：６８４及び本明細書に記載の参照文献にまとめられている。
【００７１】
ヘマグルチニン及び／又はノイラミニダーゼポリペプチドにアミノ酸置換を導入する操作技術に用いることができるポリヌクレオチドは、例えば、モノヌクレオチド−及び／又はトリヌクレオチドベースのホスホロアミダイトカップリング化学などの様々な固相方法を用いて合成することができるオリゴヌクレオチドであってもよい。例えば、核酸配列は、延長ポリヌクレオチド鎖の活性化モノマー及び／又は三量体の連続的添加により合成することができる。例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．１９９２  Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２１１：３を参照されたい。また、オリゴヌクレオチドは、様々な商業的供給源、例えば、Ｔｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ）、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ，ＵＴ）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）、及びその他多数のいずれから注文してもよい。
【００７２】
ヘマグルチニンのアミノ酸位置は、Ｈ１番号付与に基づく。ノイラミニダーゼのアミノ酸位置は、Ｎ１番号付与に基づく。ヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ番号付与計画は、当業者には公知である。当業者は、Ｈ１アミノ酸残基の位置の知識に基づき、Ｈ１〜Ｈ１６インフルエンザＡヘマグルチニンポリペプチドのいずれかにおけるアミノ酸残基の位置を容易に決定することができるだろう。同様に、当業者は、Ｎ１アミノ酸残基の位置の知識に基づき、インフルエンザＡＮ１〜Ｎ９ノイラミニダーゼポリペプチドのいずれかにおけるアミノ酸残基の位置を容易に決定することができるだろう。１個又は複数のヘマグルチニンアミノ酸残基が改変されるインフルエンザＡウイルスは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、又はＨ９インフルエンザＡウイルスであってよい。
【００７３】
ポリペプチド
ヘマグルチニンポリペプチドは、配列番号１、３及び４に示すポリペプチドの全部又は任意の部分を含む。ヘマグルチニンポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列の全部又は一部を含む場合、これは、アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸残基、又はアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有し得る。ヘマグルチニンポリペプチドは、単離されたものでもよいし、あるいは、それが天然に存在する環境で、通常それに伴う、又はそれと相互作用する成分を実質的に含有しないものであってもよい。
【００７４】
ヘマグルチニンポリペプチドが、配列番号３に示すアミノ酸配列の全部又は一部を含む場合、これは、アミノ酸残基１２４位のロイシン、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２４位のロイシンとアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２４位のロイシン、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有し得る。ヘマグルチニンポリペプチドは、単離されたものでもよいし、あるいは、それが天然に存在する環境で、通常それに伴う、又はそれと相互作用する成分を実質的に含有しないものであってもよい。
【００７５】
ヘマグルチニンポリペプチドが、配列番号４に示すアミノ酸配列の全部又は一部を含む場合、これは、アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸残基、又はアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有し得る。ヘマグルチニンポリペプチドは、単離されたものでもよいし、あるいは、それが天然に存在する環境で、通常それに伴う、又はそれと相互作用する成分を実質的に含有しないものであってもよい。
【００７６】
ノイラミニダーゼポリペプチドは、配列番号５〜８に示すポリペプチドの全部又は任意の部分を含む。ノイラミニダーゼポリペプチドが、配列番号８のアミノ酸配列の全部又は一部を含む場合、アミノ酸残基２２２位は、アスパラギンであるか、又はアミノ酸残基２４１位はバリンであるか、又はアミノ酸残基３６９位はアスパラギンであってもよく、又はアミノ酸残基２２２がアスパラギンであり、かつアミノ酸残基３６９位がアスパラギンであってもよく、又はアミノ酸残基２４１位がバリンであり、かつアミノ酸残基３６９位がアスパラギンであってもよく、又はアミノ酸残基２２２がアスパラギンであり、アミノ酸残基２４１位がバリンであり、しかもアミノ酸残基３６９位がアスパラギンであってもよい。ノイラミニダーゼポリペプチドは、単離されたものでもよいし、あるいは、それが天然に存在する環境で、通常それに伴う、又はそれと相互作用する成分を実質的に含有しないものであってもよい。
【００７７】
ポリペプチドは、宿主細胞系統又は株の形質導入を行い、適切な細胞密度まで宿主細胞を増殖させてから、細胞を所定期間にわたりさらに培養した後、産生させることができる。次に、発現したポリペプチド、例えば、ＨＡ及び／又はＮＡポリペプチドを培地から回収することができる。あるいは、宿主細胞を遠心分離により回収し、物理若しくは化学的手段により破砕した後、得られた粗抽出物をさらなる精製のために保持することもできる。真核生物又は微生物細胞をタンパク質の発現に使用した後、任意の好都合な方法で破砕することができ、このような方法として、凍結融解サイクル、音波処理、機械的破砕、若しくは細胞溶解剤の使用、又は当業者には周知の他の方法がある。
【００７８】
発現ポリペプチドを回収し、当分野において公知の複数の方法のいずれかによって組換え細胞培養物から精製してもよく、このような方法として、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー（例えば、当業者には周知のタグ付け系のいずれかを用いて）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーが挙げられる。必要に応じて、成熟タンパク質の構成の完成にタンパク質リフォールディングステップを用いることができる。また、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製ステップで使用することができる。本明細書に記載する標準的方法以外にも、様々な精製方法が当分野では公知であり、例えば、以下の文献に記載されているものが挙げられる：Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；及びＢｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ；Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｙｄｅｎ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＮＹ；並びにＷａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ。
【００７９】
ポリペプチドは、単独で、又は他のポリペプチドと組み合わせて組成物にしてもよい。１種又は複数のポリペプチドが、投与に好適な組成物に含まれる場合、これらは、生理学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤と一緒に、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液、ローション、又は懸濁液の形態に製剤化してよい（例えば、以下を参照：Ｈａｒｄｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，及びＷｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｗｅｉｎｅｒ及びＫｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）。
【００８０】
ポリペプチドを組み合わせる場合、組み合わせは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、又はそれ以上のヘマグルチニン及び／又はノイラミニダーゼポリペプチドを含んでよい。組成物は、配列番号５のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドと一緒に配列番号１のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドとを含み得る。組み合わせは、アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸を有する配列番号１と、配列番号５のアミノ酸配列を有するノイラミニダーゼポリペプチドとを含むか、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸を有する配列番号１と、配列番号５のアミノ酸配列を有するノイラミニダーゼポリペプチドとを含むか、又はアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有する配列番号１と、配列番号５のアミノ酸配列を有するノイラミニダーゼポリペプチドとを含むか、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸及びアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸を有する配列番号１と、配列番号５のアミノ酸配列を有するノイラミニダーゼポリペプチドとを含むか、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有する配列番号１と、配列番号５のアミノ酸配列を有するノイラミニダーゼポリペプチドとを含むか、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有する配列番号１と、配列番号５のアミノ酸配列を有するノイラミニダーゼポリペプチドとを含むか、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有する配列番号１と、配列番号５のアミノ酸配列を有するノイラミニダーゼポリペプチドとを含み得る。
【００８１】
組成物は、配列番号３のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドと、配列番号６のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドとを含み得る。組み合わせは、アミノ酸残基１２４位のロイシンを有する配列番号３と、配列番号６のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドとを含むか、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸を有する配列番号３と、配列番号６のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドとを含むか、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸を有する配列番号３と、配列番号６のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドとを含むか、又はアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有する配列番号３と、配列番号６のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドとを含むか、又はアミノ酸残基１２４位のロイシン及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有する配列番号３と、配列番号６のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドとを含むか、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有する配列番号３と、配列番号６のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドとを含むか、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有する配列番号３と、配列番号６のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドとを含むか、又はアミノ酸残基１２４位のロイシン、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有する配列番号３と、配列番号６のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドとを含むか、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有する配列番号３と、配列番号６のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドとを含み得る。
【００８２】
組成物は、配列番号４のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドと、配列番号５又は配列番号６、又は配列番号８のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドとを含み得る。組み合わせは、アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸を有する配列番号４と、配列番号５を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸を有する配列番号４と、配列番号５を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有する配列番号４と、配列番号５を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸及びアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸を有する配列番号４と、配列番号５を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有する配列番号４と、配列番号５を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有する配列番号４と、配列番号５を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有する配列番号４と、配列番号５を含むノイラミニダーゼポリペプチドを含み得る。
【００８３】
組成物は、アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸を有する配列番号４と、配列番号６を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸残基を有する配列番号４と、配列番号６を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有する配列番号４と、配列番号６を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸及びアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸を有する配列番号４と、配列番号６を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有する配列番号４と、配列番号６を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有する配列番号４と、配列番号６を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有する配列番号４と、配列番号６を含むノイラミニダーゼポリペプチドを含み得る。
【００８４】
組成物は、アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸を有する配列番号４と、配列番号８を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸を有する配列番号４と、配列番号８を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有する配列番号４と、配列番号８を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸及びアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸を有する配列番号４と、配列番号８を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有する配列番号４と、配列番号８を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有する配列番号４と、配列番号８を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸を有する配列番号４と、配列番号８を含むノイラミニダーゼポリペプチドを含み得る。配列番号８のノイラミニダーゼポリペプチドは、２２２位のアスパラギン、又は２４１位のバリン、又は３６９位のアスパラギン、又は２２２位のアスパラギン及び３６９位のアスパラギン、又は２４１位のバリン及び３６９位のアスパラギン、又は２２２位のアスパラギン、２４１位のバリン及び３６９位のアスパラギンを有し得る。
【００８５】
ポリヌクレオチド
ポリヌクレオチドは、配列番号１、３、及び４に示すヘマグルチニンポリペプチドのいずれか又は配列番号５〜８に示すノイラミニダーゼポリペプチドのいずれかの全部若しくは一部をコードし得る。ポリヌクレオチドの例として、配列番号９〜１６に示す配列の全部若しくは一部を含むものが挙げられる。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子の他の合成若しくは改変形態であってよい。ポリヌクレオチドは、ベクター中に含まれてもよい。
【００８６】
ベクターは、核酸を増殖することができる、及び／又は生物、細胞、若しくは細胞成分間で輸送することができる手段であってよい。ベクターとしては、自律的に複製するか、又は宿主細胞の染色体に組み込むことができるプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポソン、人工染色体などが挙げられる。ベクターはまた、ネイキッドＲＮＡポリヌクレオチド、ネイキッドＤＮＡポリヌクレオチド、同一鎖内のＤＮＡ及びＲＮＡの両方から構成されるポリヌクレオチド、ポリ−リシン結合ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ペプチド結合ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、リポソーム結合ＤＮＡなどであってもよく、これは自律的に複合しない。ベクターが、発現ベクターである場合、これは、そこに組み込まれた核酸の発現、及び複製を促進する能力を有し得る。ベクター又は発現ベクターを宿主細胞に組み込んでもよい。
【００８７】
ベクターが、発現ベクターであり、しかも発現ベクターが細菌細胞への導入のために選択されたものであれば、発現ベクターは、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などの多機能大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローン化及び発現ベクター、又はｐＩＮベクター（Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ  １９８９  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４：５５０３−５５０９）；ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）；又は他のこうした公知の発現ベクターであってよい。同様に、酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では、α因子、アルコールオキシダーゼ及びＰＧＨなどの構成又は誘導性プロモータを含有する複数のベクターを所望の発現産物の産生のために用いることができる。詳しくは、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｉｎｆｒａ，及びＧｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３：５１６−５４４を参照されたい。
【００８８】
宿主細胞
宿主細胞は、任意の数の公知、かつ一般に実施されている技術を用いて、ベクターで形質導入、形質転換又はトランスフェクトされたものでよい。一般的に、宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、及びネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などの細菌細胞；サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、及びアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）などの真菌細胞；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）及びヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）などの昆虫細胞；又は  ＣＯＳ、Ｖｅｒｏ、ＰｅｒＣ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、２９３、２９３Ｔ、及びＣＯＳ７細胞などの哺乳動物細胞であってよい。
【００８９】
ベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞は、プロモータを活性化し、形質転換体を選定するために、又は例えば、ウイルスの産生によって、挿入ポリヌクレオチド配列を増幅するために、必要に応じて改変された従来の栄養培地中に培養することができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、典型的に、発現用に選択された特定の宿主細胞と一緒に、以前より用いられているものであり、当業者には明らかであり、本明細書に引用する以下を含む参照文献にもみいだされよう：例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ及びそこに引用される参照文献。他の有用な参照文献としては、例えば、以下のものが挙げられる：Ｐａｕｌ（１９７５）Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ；Ａｄａｍｓ（１９８０）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ｗｏｒｋ  ａｎｄ  Ｂｕｒｄｏｎ（ｅｄｓ．）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのインフルエンザウイルスの産生で特に興味深い組織培養手順に関してさらに詳細なものとしては、例えば、Ｍｅｒｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．ｉｎ  Ｃｏｈｅｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｆｆｅｒｍａｎ（ｅｄｓ．）Ｎｏｖｅｌ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓが挙げられ、これは、その全体をあらゆる目的のために本明細書に組み込むものとする。さらに、本発明に合わせたこのような手順の改変は、常用の実験により容易に決定され、当業者には周知であろう。
【００９０】
キット及び試薬
キットは、本明細書に記載の核酸、ポリペプチド、抗体、又は本明細書に記載の細胞系統（例えば、配列番号１、及び３〜８のいずれかの全部若しくは一部を含むインフルエンザＨＡ及び／又はＮＡ分子を含むか、これと一緒に）の１つ又は複数を含み得る。キットは、例えば、抗体、プローブセット、例えば、好適な容器にパッケージされたｃＤＮＡマイクロアレイのような診断用核酸又はポリヌクレオチド、あるいは、１つ又は複数の発現ベクターなどの他の核酸を含み得る。キットは、例えば、発現産物を標識するための基質、標識、プライマーなどの１種又は複数の別の試薬、チューブ及び／又は他の付属品、サンプルを採取するための試薬、バッファー、ハイブリダイゼーションチャンバ、カバースリップなどをさらに含んでもよい。キットは、任意選択で、発見のためにキット構成要素を用いた好ましい方法又は診断セットの適用を詳述する指示セット又はユーザマニュアルをさらに含んでもよい。
【００９１】
指示に従って用いる場合、例えば、病態又は病状を評価するため、細胞若しくは生物の病態又は病状の進行に対する薬剤又は他の治療介入の効果を評価するため、あるいは、ワクチンとして使用するなどのために、キットを用いることができる。
【００９２】
キットは、適切なパッケージング材料、容器、及び指示材料と共に、１つ又は複数の翻訳系（例えば、宿主細胞）を含んでもよい。さらに、キットは、配列番号１、及び３〜８のＨＡ及び／又はＮＡ配列のいずれかの全部若しくは一部を含む弱毒化生ワクチン（例えば、ＦｌｕＭｉｓｔ）などの様々なワクチンを含んでもよい。
【００９３】
実施形態
実施形態Ａ１．ヘマグルチニンポリペプチドをコードする第１ゲノムセグメントを含む組換えインフルエンザウイルスであって、ヘマグルチニンポリペプチドが、配列番号１、配列番号３、又は配列番号４に示すアミノ酸配列を含む、組換えインフルエンザウイルス。
【００９４】
実施形態Ａ２．ヘマグルチニンが、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１の組換えインフルエンザウイルス。
【００９５】
実施形態Ａ３．配列番号１に示すヘマグルチニンが、以下：
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸；又は
アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸
を含む、実施形態Ａ２の組換えインフルエンザウイルス。
【００９６】
実施形態Ａ４．ノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第２ゲノムセグメントをさらに含み、ノイラミニダーゼポリペプチドが、配列番号５に示すアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ２又はＡ３のいずれかの組換えインフルエンザウイルス。
【００９７】
実施形態Ａ５．ヘマグルチニンが、配列番号３に示すアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１の組換えインフルエンザウイルス。
【００９８】
実施形態Ａ６．配列番号３に示すヘマグルチニンポリペプチドが、以下：
アミノ酸残基１２４位のロイシン；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸；又は
アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２４位のロイシンとアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２４位のロイシン、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸
を含む、実施形態Ａ５の組換えインフルエンザウイルス。
【００９９】
実施形態Ａ７．配列番号３に示すヘマグルチニンポリペプチドが、以下：
アミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２４位のロイシンとアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸
を含む、実施形態Ａ６の組換えインフルエンザウイルス。
【０１００】
実施形態Ａ８．ノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第２ゲノムセグメントをさらに含み、ノイラミニダーゼポリペプチドが、配列番号６に示すアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ５〜Ａ７のいずれかの組換えインフルエンザウイルス。
【０１０１】
実施形態Ａ９．ヘマグルチニンが、配列番号４に示すアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１の組換えインフルエンザウイルス。
【０１０２】
実施形態Ａ１０．配列番号４に示すヘマグルチニンが、以下：
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸；又は
アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸
を含む、実施形態Ａ９の組換えインフルエンザウイルス。
【０１０３】
実施形態Ａ１１．ノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第２ゲノムセグメントをさらに含み、ノイラミニダーゼポリペプチドが、配列番号５、配列番号７、又は配列番号８に示すアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ９又はＡ１０のいずれかの組換えインフルエンザウイルス。
【０１０４】
実施形態Ａ１２．ノイラミニダーゼポリペプチドが、配列番号８に示すアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１１の組換えインフルエンザウイルス。
【０１０５】
実施形態Ａ１３．配列番号８に示すノイラミニダーゼポリペプチドが、以下：
アミノ酸残基２２２位のアスパラギン；又は
アミノ酸残基２４１位のバリン；又は
アミノ酸残基３６９位のアスパラギン；又は
アミノ酸残基２２２位のアスパラギンとアミノ酸残基３６９位のアスパラギン；又は
アミノ酸残基２４１位のバリンとアミノ酸残基３６９位のアスパラギン；又は
アミノ酸残基２２２位のアスパラギン、アミノ酸残基２４１位のバリン、及びアミノ酸残基３６９位のアスパラギン
を含む、実施形態Ａ１２の組換えインフルエンザウイルス。
【０１０６】
実施形態Ａ１４．配列番号８に示すノイラミニダーゼポリペプチドが、以下：
アミノ酸残基３６９位のアスパラギン；又は
アミノ酸残基２２２位のアスパラギン、アミノ酸残基２４１位のバリン、及びアミノ酸残基３６９位のアスパラギン
を含む、実施形態Ａ１３の組換えインフルエンザウイルス。
【０１０７】
実施形態Ａ１５．配列番号８に示すノイラミニダーゼポリペプチドが、アミノ酸残基２２２位のアスパラギン、アミノ酸残基２４１位のバリン、及びアミノ酸残基３６９位のアスパラギンを含み；かつ
配列番号４に示すヘマグルチニンポリペプチドが、アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸を含む、実施形態Ａ１４の組換えインフルエンザウイルス。
【０１０８】
実施形態Ａ１６．弱毒化、温度感受性、及び低温適応の１つ又は複数の表現型特徴を有するインフルエンザウイルスの６つの内部ゲノムセグメントをさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ１５のいずれかの組換えインフルエンザウイルス。
【０１０９】
実施形態Ａ１７．６つの内部ゲノムセグメントが、インフルエンザウイルスＡ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０由来のものである、実施形態Ａ１６の組換えインフルエンザウイルス。
【０１１０】
実施形態Ａ１８．Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４の６つの内部ゲノムセグメントをさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ１５のいずれかの組換えインフルエンザウイルス。
【０１１１】
実施形態Ａ１９．不活性化されている実施形態Ａ１〜１８のいずれかの組換えインフルエンザウイルス。
【０１１２】
実施形態Ａ２０．生弱毒化されている実施形態Ａ１〜１７のいずれかの組換えインフルエンザウイルス。
【０１１３】
実施形態Ａ２１．実施形態Ａ１９又はＡ２０の組換えインフルエンザウイルスを含む免疫原性組成物。
【０１１４】
実施形態Ａ２２．実施形態Ａ２１の免疫原性組成物を含むワクチン。
【０１１５】
実施形態Ａ２３．少なくとも１種の他の組換えインフルエンザウイルスをさらに含む、実施形態Ａ２２のワクチン。
【０１１６】
実施形態Ａ２４．Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ株ＨＡ及びＮＡ抗原を含む組換えインフルエンザウイルス、山形（Ｙａｍａｇａｔａ）インフルエンザＢ株ＨＡ及びＮＡ抗原を含む組換えインフルエンザウイルス、並びにビクトリア（Ｖｉｃｔｏｒｉａ）インフルエンザＢ株ＨＡ及びＮＡ抗原を含む組換えインフルエンザウイルスをさらに含む、実施形態Ａ２２のワクチン。
【０１１７】
実施形態Ｂ１．実施形態Ａ２の組換えインフルエンザウイルスを製造する方法であって、以下：
（ａ）インフルエンザウイルスの複製を支持することができる宿主細胞の集団に複数のベクターを導入するが、これら複数のベクターは、第１インフルエンザ株の少なくとも６つの内部ゲノムセグメントに対応するヌクレオチド配列と、配列番号１のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドを産生する第１ゲノムセグメントとを含む、ステップ；
（ｂ）宿主細胞の集団を培養するステップ；及び
（ｃ）インフルエンザウイルスを回収するステップ
を含む方法。
【０１１８】
実施形態Ｂ２．配列番号１のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドが、以下：
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸；又は
アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸
を含む、実施形態Ｂ１の方法。
【０１１９】
実施形態Ｂ３．ステップ（ａ）で、配列番号５のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドを産生する第２ゲノムセグメントに対応するヌクレオチド配列をさらに導入することを含む、実施形態Ｂ１又はＢ２の方法。
【０１２０】
実施形態Ｂ４．実施形態Ａ５の組換えインフルエンザウイルスを産生する方法であって、以下：
（ａ）インフルエンザウイルスの複製を支持することができる宿主細胞の集団に複数のベクターを導入するが、これら複数のベクターは、第１インフルエンザ株の少なくとも６つの内部ゲノムセグメントに対応するヌクレオチド配列と、配列番号３のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドを産生する第１ゲノムセグメントとを含む、ステップ；
（ｂ）宿主細胞の集団を培養するステップ；及び
（ｃ）インフルエンザウイルスを回収するステップ
を含む方法。
【０１２１】
実施形態Ｂ５．配列番号３のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドが、以下：
アミノ酸残基１２４位のロイシン；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸；又は
アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２４位のロイシンとアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２４位のロイシン、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸
を含む、実施形態Ｂ４の方法。
【０１２２】
実施形態Ｂ６．配列番号３に示すヘマグルチニンポリペプチドが、以下：
アミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２４位のロイシンとアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸
を含む、実施形態Ｂ５の方法。
【０１２３】
実施形態Ｂ７．ステップ（ａ）で、配列番号６のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドを産生する第２ゲノムセグメントに対応するヌクレオチド配列をさらに導入することを含む、実施形態Ｂ４〜Ｂ６のいずれかの方法。
【０１２４】
実施形態Ｂ８．実施形態Ａ９の組換えインフルエンザウイルスを産生する方法であって、以下：
（ａ）インフルエンザウイルスの複製を支持することができる宿主細胞の集団に複数のベクターを導入するが、これら複数のベクターは、第１インフルエンザ株の少なくとも６つの内部ゲノムセグメントに対応するヌクレオチド配列と、配列番号４のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドを産生する第１ゲノムセグメントとを含む、ステップ；
（ｂ）宿主細胞の集団を培養するステップ；及び
（ｃ）インフルエンザウイルスを回収するステップ
を含む方法。
【０１２５】
実施形態Ｂ９．配列番号４のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドが、以下：
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸；又は
アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸
を含む、実施形態Ｂ８の方法。
【０１２６】
実施形態Ｂ１０．ステップ（ａ）で、配列番号５、又は配列番号７、又は配列番号８のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドを産生する第２ゲノムセグメントに対応するヌクレオチド配列をさらに導入することを含む、実施形態Ｂ８又はＢ９の方法。
【０１２７】
実施形態Ｂ１１．ノイラミニダーゼポリペプチドが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｂ１０の方法。
【０１２８】
実施形態Ｂ１２．配列番号８に示すノイラミニダーゼポリペプチドが、以下：
アミノ酸残基２２２位のアスパラギン；又は
アミノ酸残基２４１位のバリン；又は
アミノ酸残基３６９位のアスパラギン；又は
アミノ酸残基２２２位のアスパラギンとアミノ酸残基３６９位のアスパラギン；又は
アミノ酸残基２４１位のバリンとアミノ酸残基３６９位のアスパラギン；又は
アミノ酸残基２２２位のアスパラギン、アミノ酸残基２４１位のバリン、及びアミノ酸残基３６９位のアスパラギン
を含む、実施形態Ｂ１１の方法。
【０１２９】
実施形態Ｂ１３．配列番号８に示すノイラミニダーゼポリペプチドが、以下：
アミノ酸残基３６９位のアスパラギン；又は
アミノ酸残基２２２位のアスパラギン、アミノ酸残基２４１位のバリン、及びアミノ酸残基３６９位のアスパラギン
を含む、実施形態Ｂ１２の方法。
【０１３０】
実施形態Ｂ１４．配列番号８に示すノイラミニダーゼポリペプチドが、アミノ酸残基２２２位のアスパラギン、アミノ酸残基２４１位のバリン、及びアミノ酸残基３６９位のアスパラギンを含み；かつ
配列番号４に示すヘマグルチニンポリペプチドが、アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基１２７位のグルタミン残基酸を含む、実施形態Ｂ１３の方法。
【０１３１】
実施形態Ｃ１．孵化卵においてインフルエンザＡウイルスの複製能力を増大させる方法であって、
アミノ酸残基１２５位、１２７位、及び２０９位（Ｈ１番号付与）に対応する１つ又は複数のヘマグルチニンアミノ酸残基を非天然の酸性アミノ酸残基に改変することを含み：
これにより、インフルエンザウイルスの複製能力を増大させる方法。
【０１３２】
実施形態Ｃ２．改変が、以下：
１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換；又は
１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換；又は
２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換；又は
１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と、１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換；又は
１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と、２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換；又は
１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換；又は
１２５位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換、１２７位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換、及び２０９位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換
を含む、実施形態Ｃ１の方法。
【０１３３】
実施形態Ｃ３．アミノ酸残基２２２位、２４１位、又は３６９位（Ｎ１番号付与）に対応する１つ又は複数のノイラミニダーゼアミノ酸残基を非天然の酸性アミノ酸残基に改変することをさらに含み、改変が、以下：
２２２位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換；又は
２４１位アミノ酸残基のバリンによる置換；又は
３６９位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換；又は
２２２位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換と、２４１位アミノ酸残基のバリンによる置換；又は
２２２位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換と、３６９位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換；又は
２４１位アミノ酸残基のバリンによる置換と、３６９位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換；又は
２２２位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、２４１位アミノ酸残基のバリンによる置換、及び３６９位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換
を含む、実施形態Ｃ１又はＣ２の方法。
【０１３４】
実施形態Ｃ４．インフルエンザＡウイルスが、インフルエンザＨ１Ｎ１ウイルスである、実施形態Ｃ１〜Ｃ３のいずれかの方法。
【０１３５】
実施形態Ｃ５．実施形態Ｃ１〜Ｃ４のいずれか１つの方法により産生されるインフルエンザＡウイルス。
【０１３６】
実施形態Ｃ６．不活性化されている、実施形態Ｃ５のインフルエンザＡウイルス。
【０１３７】
実施形態Ｃ７．生弱毒化されている、実施形態Ｃ５のインフルエンザＡウイルス。
【０１３８】
実施形態Ｃ９．実施形態Ｃ６又はＣ７のインフルエンザＡウイルスを含む、免疫原性組成物。
【０１３９】
実施形態Ｃ１０．実施形態Ｃ９の免疫原性組成物を含むワクチン。
【０１４０】
実施形態Ｄ１．孵化卵においてインフルエンザＡウイルスの複製能力を増大させる方法であって、
アミノ酸残基２２２位、２４１位、又は３６９位（Ｎ１番号付与）に対応する１つ又は複数のノイラミニダーゼアミノ酸残基を非天然の酸性アミノ酸残基に改変することを含み、改変が、以下：
２２２位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換；又は
２４１位アミノ酸残基のバリンによる置換；又は
３６９位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換；又は
２２２位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換と、２４１位アミノ酸残基のバリンによる置換；又は
２２２位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換と、３６９位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換；又は
２４１位アミノ酸残基のバリンによる置換と、３６９位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換；又は
２２２位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、２４１位アミノ酸残基のバリンによる置換、及び３６９位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換
を含み、
これにより、インフルエンザウイルスの複製能力を増大させる方法。
【０１４１】
実施形態Ｄ２．インフルエンザＡウイルスが、インフルエンザＨ１Ｎ１ウイルスである、実施形態Ｄ１の方法。
【０１４２】
実施形態Ｄ３．実施形態Ｄ１又はＤ２のいずれか１つの方法により産生されるインフルエンザＡウイルス。
【０１４３】
実施形態Ｄ４．不活性化されている、実施形態Ｄ３のインフルエンザＡウイルス。
【０１４４】
実施形態Ｄ５．生弱毒化されている、実施形態Ｄ４のインフルエンザＡウイルス。
【０１４５】
実施形態Ｄ６．実施形態Ｄ４又はＤ５のインフルエンザＡウイルスを含む、免疫原性組成物。
【０１４６】
実施形態Ｄ７．実施形態Ｄ６の免疫原性組成物を含むワクチン。
【０１４７】
実施形態Ｅ１．配列番号１、配列番号３、又は配列番号４に示すアミノ酸配列を含む、単離ヘマグルチニンポリペプチド。
【０１４８】
実施形態Ｅ２．配列番号１に示すアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ１の単離ヘマグルチニンポリペプチド。
【０１４９】
実施形態Ｅ３．配列番号１に示すアミノ酸配列が、以下：
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸；又は
アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸
を含む、実施形態Ｅ２の単離ヘマグルチニンポリペプチド。
【０１５０】
実施形態Ｅ４．配列番号３に示すアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ１の単離ヘマグルチニンポリペプチド。
【０１５１】
実施形態Ｅ５．配列番号３に示すアミノ酸配列が、以下：
アミノ酸残基１２４位のロイシン；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸；又は
アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２４位のロイシンとアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２４位のロイシン、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸
を含む、実施形態Ｅ４の単離ヘマグルチニンポリペプチド。
【０１５２】
実施形態Ｅ６．配列番号４のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ１の単離ヘマグルチニンポリペプチド。
【０１５３】
実施形態Ｅ７．配列番号４のアミノ酸配列が、以下：
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸；又は
アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基１２７位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸とアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸；又は
アミノ酸残基１２５位のアスパラギン酸、アミノ酸残基１２７位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基２０９位のグルタミン酸
を含む、実施形態Ｅ６の単離ヘマグルチニンポリペプチド。
【０１５４】
実施形態Ｅ８．実施形態Ｅ１〜Ｅ７のいずれかのヘマグルチニンポリペプチドをコードする、単離ヘマグルチニンポリペプチド。
【０１５５】
実施形態Ｅ９．実施形態Ｅ８のポリヌクレオチドを含むベクター。
【０１５６】
実施形態Ｅ１０．実施形態Ｅ９のベクターを含む細胞。
【０１５７】
実施形態Ｅ１１．実施形態Ｅ１〜Ｅ７のいずれかのヘマグルチニンポリペプチドを含む組成物。
【０１５８】
実施形態Ｅ１２．免疫原性である、実施形態Ｅ１１の組成物。
【０１５９】
実施形態Ｅ１３．実施形態Ｅ８の単離ポリヌクレオチド、実施形態Ｅ９のベクター、又は実施形態１０の細胞のいずれかを含む組成物。
【０１６０】
実施形態Ｅ１４．ノイラミニダーゼポリペプチドをさらに含む、実施形態Ｅ１１又はＥ１２のいずれかの組成物。
【０１６１】
実施形態Ｅ１５．ノイラミニダーゼポリペプチドが、配列番号５、配列番号７、又は配列番号８のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ１４の組成物。
【０１６２】
実施形態Ｅ１６．ノイラミニダーゼポリペプチドが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ１５の組成物。
【０１６３】
実施形態Ｅ１７．配列番号８のノイラミニダーゼポリペプチドが、以下：
アミノ酸残基２２２位のアスパラギン；又は
アミノ酸残基２４１位のバリン；又は
アミノ酸残基３６９位のアスパラギン；又は
アミノ酸残基２２２位のアスパラギンとアミノ酸残基３６９位のアスパラギン；又は
アミノ酸残基２４１位のバリンとアミノ酸残基３６９位のアスパラギン；又は
アミノ酸残基２２２位のアスパラギン、アミノ酸残基２４１位のバリン、及びアミノ酸残基３６９位のアスパラギン
を含む、実施形態Ｅ１６の組成物。
【０１６４】
実施形態Ｆ１．配列番号５、配列番号７、又は配列番号８のアミノ酸配列を含む、単離ノイラミニダーゼポリペプチド。
【０１６５】
実施形態Ｆ２．配列番号８に示すアミノ酸配列を含む、実施形態Ｆ１の単離ノイラミニダーゼポリペプチド。
【０１６６】
実施形態Ｆ３．配列番号８のノイラミニダーゼポリペプチドが、以下：
アミノ酸残基２２２位のアスパラギン；又は
アミノ酸残基２４１位のバリン；又は
アミノ酸残基３６９位のアスパラギン；又は
アミノ酸残基２２２位のアスパラギンとアミノ酸残基３６９位のアスパラギン；又は
アミノ酸残基２４１位のバリンとアミノ酸残基３６９位のアスパラギン；又は
アミノ酸残基２２２位のアスパラギン、アミノ酸残基２４１位のバリン、及びアミノ酸残基３６９位のアスパラギン
を含む、実施形態Ｆ２の単離ノイラミニダーゼポリペプチド。
【０１６７】
実施形態Ｆ４．実施形態Ｆ１〜Ｆ３のいずれかのノイラミニダーゼポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
【０１６８】
実施形態Ｆ５．実施形態Ｆ４のポリヌクレオチドを含むベクター。
【０１６９】
実施形態Ｆ６．実施形態Ｆ５のベクターを含む細胞。
【０１７０】
実施形態Ｆ７．実施形態Ｆ１〜Ｆ３のいずれかのノイラミニダーゼポリペプチド、実施形態４のポリヌクレオチド、実施形態Ｆ５のベクター又は実施形態Ｆ６の細胞を含む組成物。
【実施例】
【０１７１】
以下の実施例を参照にしながら、本発明を説明する。これらの実施例は、あくまで例示を目的として提供されるものであり、本発明がこれらの実施例に限定されると決して解釈すべきではなく、むしろ本明細書に記載する教示によって明らかになるあらゆる改変を包含すると解釈すべきである。
【０１７２】
１．材料及び方法
野生型ウイルス：卵増殖野生型Ｈ１Ｎ１ｐｄｍウイルスＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２０１０及びＡ／Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ／２／２０１０は、親切にも米国疾病管理予防センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）（米国）により提供された。畜産業従業者から感染したヒトインフルエンザに罹患したフェレットの鼻洗浄液からＡ／Ｇｉｌｒｏｙ／２３１／２０１１を単離した。Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）及び孵化鶏卵（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）の両方で、全てのウイルスを増殖させた。
【０１７３】
リバースジェネティクスによる組換えウイルスの作製：ｗｔＨ１Ｎ１ｐｄｍウイルスのＨＡ及びＮＡ遺伝子セグメントをＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、ｐＡＤ３０００ベクターにクローン化した（Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９７：６１０８−１３）。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットを用いて、部位特異的突然変異誘発を実施することにより、ＨＡ及びＮＡ遺伝子に特定の変異を導入した（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）。以前記載されているように、プラスミドレスキューにより、６：２再集合体ワクチンウイルスを作製した（Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３０６：１８−２４）。手短には、Ｈ１Ｎ１ウイルスのＨＡ及びＮＡタンパク質遺伝子セグメントと、低温適応Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０（ＡＡ  ｃａ、Ｈ２Ｎ２）ウイルスの６つの内部タンパク質遺伝子セグメントをコードする８つのｃＤＮＡプラスミドを、同時培養した２９３Ｔ及びＭＤＣＫ細胞に同時トランスフェクトすることにより、６：２再集合体候補ワクチンウイルスを作製した。細胞上清からのレスキューウイルスを１０〜１１日齢の孵化鶏卵の尿膜腔中で増殖させた。ｖＲＮＡから増幅したＲＴ−ＰＣＲｃＤＮＡを配列決定することにより、ウイルスのＨＡ及びＮＡ配列を確認した。
【０１７４】
ウイルス力価測定：ＭＤＣＫ細胞での蛍光フォーカスアッセイにより、感染ウイルス力価を測定し、ｌｏｇ１０ＦＦＵ（蛍光フォーカス単位）／ｍｌとして表した。以前記載されている（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：６７６３−６７７１）ようなプラークアッセイにより、ウイルスプラーク形態を調べた。卵における６：２再集合体ウイルスの複製を比較するために、卵に１０３ＦＦＵ／卵のウイルスを接種し、３３℃で３日間インキュベートした。ＦＦＡアッセイ及びプラークアッセイの両方のために、尿膜液を採取した。
【０１７５】
ウイルス増殖動態及びウイルスタンパク質発現：組換え６：２再集合体の増殖動態をＭＤＣＫ細胞で決定した。ＭＤＣＫ細胞に、５又は０．００５の感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスを接種した。吸着から１時間後、感染細胞をＰＢＳで洗浄し、１ｇ／ｍｌのＴＰＣＫ−トリプシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する最少必須培地（ＭＥＭ）と一緒にインキュベートし、３３℃でインキュベートした。細胞培養上清を様々な時点で回収し、ＦＦＡアッセイによりウイルス力価を決定した。
【０１７６】
感染細胞中に産生されたウイルスタンパク質及び細胞培養上清中に放出されたビリオンをウエスタンブロットにより分析した。前述のように、ＭＯＩ：５で、ＭＤＣＫ細胞を感染させた。感染から８時間及び１６時間後、細胞培養物上清を回収し、細胞屑を１４，０００ｒｐｍの微量遠心機で５分間の遠心分離により分離した。感染細胞を回収し、ＲＩＰＡバッファー（２０ｍＭ  ＴｒｉｓＣｌ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、プロテアーゼインヒビターカクテル）で溶解させた。等量の細胞溶解物及び細胞上清を、変性条件下、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）１２％Ｔｒｉｓ−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）上で電気泳動させた。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、インフルエンザ特異的抗体と一緒にブロッティングした。
【０１７７】
免疫蛍光アッセイのために、０．００５のＭＯＩで、ＭＤＣＫ細胞をウイルスに感染させた。感染から１５時間又は４８時間後、感染細胞を１０％ホルマリンで２０分固定した後、氷冷メタノールを用いた５分の処理を実施した。次に、細胞を１：４０希釈のヤギ抗インフルエンザＡウイルスポリクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）と一緒に、室温で１時間インキュベートした後、１：１００希釈のＦＩＴＣ結合ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）と一緒に３０分インキュベートした。蛍光顕微鏡により、染色した細胞を検定した。
【０１７８】
ＨＡＩアッセイによる血清抗体検出：Ｓｉｍｏｎｓｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇｉｌｒｏｙ，ＣＡ）からの８〜１０週齢雄及び雌フェレット（ｎ＝３匹／群）に０．２ｍｌ用量当たり７．０ｌｏｇ１０ＦＦＵを鼻内接種した。感染から１４日後、フェレット血清サンプルを採取した。ＨＡＩアッセイを用いて、相同性及び異種ウイルスに対する感染後フェレット血清中の抗体レベルを決定した。受容体破壊酵素（ＲＤＥ，Ｄｅｎｋａ  Ｓｅｉｋｅｎ  Ｃｏ．，日本国東京）で処理した２５μｌの連続希釈血清サンプルを９６ウェルＶ字底マイクロプレート中で４ＨＡ単位の表示ウイルス（２５μｌ）と混合した。室温で３０分インキュベートした後、５０μｌの０．５％ニワトリ赤血球（ｃＲＢＣ）を各ウェルに添加し、さらに４５分インキュベートした。ＨＡＩ力価は、ウイルス血球凝集を阻害した最も高い血清希釈度の逆数として定義した。
【０１７９】
２．Ｈ１Ｎ１ｐｄｍワクチン株は、孵化鶏卵中で増殖が異なった
３つの最近のＨ１Ｎ１ｐｄｍ株、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２０１０（Ｂｒｉｓ／１０）、Ａ／Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ／２／２０１０（ＮＨ／１０）及びＡ／Ｇｉｌｒｏｙ／２３１／２０１１（Ｇｉｌ／１１）は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（ＣＡ／０９）と比較して、ＨＡ及びＮＡ遺伝子セグメントの両方で配列がまちまちであった。卵馴化による配列変異が、１１９、１２４、１２７、１９１、２０９及び２２２などの複数のＨＡ位置で認められた（表１、以下）。これらウイルスのＬＡＩＶワクチン候補の増殖を評価するために、マスタードナーウイルスＡ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０ｃａ由来の６つの内部タンパク質遺伝子セグメントと、野生型（ｗｔ）Ｈ１Ｎ１ｐｄｍウイルス由来のＨＡ及びＮＡ遺伝子を含有する６：２低温適応（ｃａ）再集合体ウイルスを、８プラスミドリバースジェネティクス系を用いて作製した。レスキューしたウイルスを孵化鶏卵中で増幅し、感染ウイルス力価を蛍光フォーカスアッセイ（ＦＦＡ）アッセイにより決定した。ＭＤＣＫ細胞でのプラークアッセイによりプラーク形態を検定した（図１）。Ｂｒｉｓ／１０ｗｔのＨＡ遺伝子は異種であった（表１）。ＣＡ／０９とは対照的に、Ｂｒｉｓ／１０ｃａは、８．５ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍｌの力価まで効率的に増殖し、ＭＤＣＫ細胞中に大きなプラークを形成した。ＨＡに卵馴化変異を有する３つのＨＡ変異体（Ｐ１２４Ｌ／Ｌ１９１Ｉ、Ｐ１２４Ｌ／Ｋ２０９Ｅ及びＤ１２７Ｅ／Ｋ２０９Ｅ）をＮＨ／１０ｗｔウイルスからクローン化した。それぞれのＮＨ／１０ｃａ変異体は、卵において様々な力価まで増殖し、異なるプラーク形態を有した。Ｐ１２４Ｌ／Ｌ１９１Ｉ変異体は、卵において低い力価を有し、ＭＤＣＫ細胞中でごく小さいプラークを形成した。Ｐ１２４Ｌ／Ｋ２０９Ｅ及びＤ１２７Ｅ／Ｋ２０９Ｅｃａウイルスはいずれも大きなプラークを形成し、Ｄ１２７Ｅ／Ｋ２０９Ｅ変異体は、８．２ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍｌの力価に達したが、これは、Ｋ２０９Ｅ置換が、概して効率的なウイルス増殖に寄与したことを示している。元のＨＡ配列又は卵馴化変異を有するＨＡ（Ｄ２２２Ｎ）を含むＧｉｌ／１１  ６：２ｃａウイルスは、プラスミドトランスフェクト細胞から回収することができなかった。相応して、Ｄ１２７Ｅ／Ｋ２０９Ｅを含むＢｒｉｓ／１０ｗｔ及びＮＨ／１０ｗｔ単離物は効率的に増殖したのに対し、Ｇｉｌ／１１ｗｔは、ＭＤＣＫ細胞及び卵の両方で増殖が乏しかった（データは示していない）が、これは、ＨＡ及びＮＡ遺伝子がウイルス複製を制御したことを示している。これらの高及び低増殖ウイルスの配列比較により、１２５位、１２７位及び２０９位のＨＡ残基が、卵におけるウイルス増殖に重要であり得ることが判明した。
【０１８０】
【表１】
2016500007.tif 000002
【０１８１】
３．ワクチンウイルスの高い増殖を支持するＨＡ残基の特定
元のＨＡ配列を含む組換えＣＡ／０９ｃａウイルスは、プラスミドＤＮＡトランスフェクト細胞から回収されないことが事前に判明していた。受容体結合ドメインにおけるＨＡ  Ｄ２２２Ｇ置換により、ウイルスの回収が可能になったが、ウイルス力価は低かった。Ｋ１１９Ｅ及びＡ１８６Ｄ置換により、ウイルス増殖が大幅に改善し、約８．５ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍｌの力価に到達した（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４：４４−５１）。新しく特定したアミノ酸置換（Ｎ１２５Ｄ、Ｄ１２７Ｅ及びＫ２０９Ｅ）が、卵でのＨ１Ｎ１ｐｄｍワクチンウイルスの増殖を有利にしたことを確認するために、特定した突然変異の各々を元のＣＡ／０９ＨＡのｃＤＮＡに個別又は組み合わせて導入した。６：２ｃａ再集合体ウイルスをレスキューし、卵におけるその増殖について調べた（図２）。単一突然変異（Ｎ１２５Ｄ、Ｄ１２７Ｅ又はＫ２０９Ｅ）は全て、卵におけるウイルス増殖を有意に改善した。さらに、Ｎ１２５Ｄを含むウイルスは、ＭＤＣＫ細胞中に大きなプラークを形成した。二重突然変異は、ウイルス複製をさらに改善し、約８．３ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍｌの最高力価に達したが、これは、ウイルス力価及びプラークサイズにおいてＢｒｉｓ／１０と同等であった（図１）。従って、Ｋ１１９Ｅ及びＡ１８６Ｄに加えて、本発明者らが事前に特定したＨＡでの置換、すなわちＮ１２５Ｄ、Ｄ１２７Ｅ及びＫ２０９Ｅ置換も、ワクチンウイルス増殖を大幅に促進した。
【０１８２】
４．Ｇｉｌ／１１の高い増殖のためにＨＡ及びＮＡの両方が必要であった
ＨＡの１２５位、１２７位及び２０９位での置換が、卵におけるＧｉｌ／１１ｃａウイルス増殖も改善することができるかどうかを決定するために、単一又は二重ＨＡ突然変異をＧｉｌ／１１ｃａウイルスに導入した（図３Ａ、左列）。全てのＨＡ変異体をレスキューしたが、これらは全て、ごく小さいか、又は小さいプラークを形成し（図３Ｂ、上パネル）、感染力価も６．５〜７．７ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍｌと低かった。これらのデータは、ＨＡの変異が、Ｇｉｌ／１１ｃａウイルスの増殖を完全に改善することはできないことを示唆していた。
【０１８３】
ＮＡタンパク質のウイルス増殖に対する考えられる寄与を評価するために、これらＧｉｌ／１１ｃａＨＡ変異体のＮＡセグメントを、リバースジェネティクスによりＢｒｉｓ／１０ＮＡで置換し、Ｂｒｉｓ／１０からのＮＡセグメントを含む、回収したＧｉｌ／１１ｃａＨＡ変異体を卵におけるそれらの増殖について調べた。ＣＡ／０９ＮＡによるＧｉｌ／１１ＨＡの置換によって、ウイルス増殖が同様に改善した（データは示していない）。ＨＡにおけるＮ１２５Ｄ／Ｄ１２７Ｅ二重突然変異及びＢｒｉｓ／１０ＮＡを含有するＧｉｌ／１１ｃａ変異体は、卵において最高力価（８．２ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍｌ）まで増殖し、大きなプラークを形成した。これらのデータは、ＨＡ及びＮＡタンパク質の両方が、卵及びＭＤＣＫ細胞におけるウイルス増殖に寄与することを明らかにするものであり、また、Ｇｉｌ／１１ウイルスのＨＡ受容体結合及びＮＡ受容体切断機能が、宿主細胞でのウイルス複製から十分に均衡していないことを意味した。
【０１８４】
ＭＵＮ基質を用いて、Ｇｉｌ／１１及びＢｒｉｓ／１０ＮＡ酵素活性に有意な差が検出されなかったことは注目に値する（データは示していない）。
【０１８５】
５．卵におけるＧｉｌ／１１ｃａウイルスの効率的な増殖に寄与するＮＡ残基の特定
配列比較により、Ｇｉｌ／１１が、ＣＡ／０９及びＢｒｉｓ／１０のＮＡと比較して、４４位、２２２位、２４１位、３６９位及び４４３位（Ｎ１番号付与）に５つのユニークなＮＡ残基を有することがわかった（表２）。これらのＮＡアミノ酸置換のいずれかが、Ｇｉｌ／１１ｃａの低い増殖の原因であるのかどうかを確認するために、Ｓ４４Ｎ、Ｓ２２２Ｎ、Ｉ２４１Ｖ、Ｋ３６９Ｎ及びＭ４４３Ｉ置換をＧｉｌ／１１（ＨＡ中のＮ１２５Ｄ／Ｄ１２７）ｃａウイルスに導入した。図４に示すように、Ｓ２２２Ｎ、Ｉ２４１Ｖ及びＫ３６９Ｎ（それぞれ、Ｎ２番号２２１、２４１、及び３６９に対応する）は、卵におけるウイルス増殖を改善した。Ｋ３６９Ｎ置換が最も重要であり、これは、ウイルス力価を０．５ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍｌ増加し、ウイルスプラークサイズを改善した。Ｓ４４Ｎ及びＭ４４３Ｉ置換は、ウイルス増殖に影響を与えなかった（データは示していない）。二重突然変異は、単一突然変異と比較して、ウイルス増殖に追加的作用を及ぼさなかった。しかし、ＮＡ残基２２２、２４１及び３６９に変異を有する三重ＮＡ突然変異体は、最高力価が８．３ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍｌで、しかも大きなプラーク形態を有し、Ｂｒｉｓｂａｎｅ  ＮＡを有するウイルスと同等であった。従って、ＨＡタンパク質だけではなく、ＮＡも、Ｇｉｌ／１１ｃａの乏しい増殖の原因であった。
【０１８６】
【表２】
2016500007.tif 000003
【０１８７】
６．ウイルス免疫原性及び抗原性に対するＨＡ残基の作用
上記の高増殖ｃａ変異体におけるＨＡ変異が、ウイルス抗原性及び免疫原性に影響を与えるかどうかを評価するために、Ｂｒｉｓ／１０、ＨＡにＤ１２７Ｅ／Ｋ２０９Ｅを含むＮＨ／１０（ＮＨ／１０  ｖ１）並びにＨＡ中のＮ１２５Ｄ／Ｄ１２７Ｅ及びＢｒｉｓ／１０  ＮＡを含むＧｉｌ／１１（Ｇｉｌ／１１  ｖ１）ｃａウイルスをフェレットにおけるその免疫原性及び抗原性について調べた。フェレットに、前述のワクチン候補７．０ｌｏｇ１０ＦＦＵを接種し、第１４日にフェレットの血清を採取した。相同性及び異種Ｈ１Ｎ１ｐｄｍウイルスに対する抗体力価をＨＡＩアッセイにより評価した（表３）。Ｂｒｉｓ／１０、ＮＨ／１０及びＧｉｌ／１１ｃａウイルスは全て、免疫原性であり、相同性ウイルスに対して高いＨＡＩ抗体力価（９１２〜２０４８）を誘導した。既存のＣＡ／０９ＬＡＩＶと同様に、これらは全て、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ  ｗｔウイルス及び異種ウイルスと交差反応した（ＨＡＩ力価は、相同性力価と比較して４倍以内であった）。例えば、ＨＡ  Ｎ１２５／Ｄ１２７Ｅ含有ウイルス（Ｂｒｉｓ／１０及びＧｉｌ／１１）で免疫したフェレット血清は、ＨＡ  Ｄ１２７Ｅ／Ｋ２０９Ｅ（ＮＨ／１０ｖ１及びＧｉｌ／１１ｖ２）又はＨＡ  Ｐ１２４Ｌ／Ｌ１９１Ｉ（ＮＨ／１０ｖ２）を含有するウイルスと良好に交差反応した。従って、Ｇｉｌ／１１及びＮＨ／１０両方のＨＡにおけるＮ１２５Ｄ／Ｄ１２７Ｅ又はＤ１２７Ｅ／Ｋ２０９Ｅ置換は、ウイルス抗原性を改変しなかったが、これらの新しい株、Ｂｒｉｓ／１０、ＮＨ／１０及びＧｉｌ／１１は、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍワクチンとして作用することができる。
【０１８８】
【表３】
2016500007.tif 000004
【０１８９】
７．ＨＡ及びＮＡ置換は、感染細胞からのウイルス放出を促進することにより、ウイルス増殖を改善する
ワクチンウイルス増殖を改善するもので、特定されたＨＡアミノ酸は全て、酸性アミノ酸置換（Ｋ１１９Ｅ、Ａ１８６Ｄ、Ｎ１２５Ｄ、及びＫ２０９Ｅ）を含有した。ウイルス複製に対するこれら残基の影響を調べるために、酸性残基変異を含む、又は含まないウイルスのペアを、ＭＤＣＫ細胞におけるそれらの増殖動態について比較した。低増殖ウイルスＣＡ０９−Ｄ１２７Ｅ（１２５Ｎ）対高増殖ウイルスＣＡ０９−Ｎ１２５Ｄ／Ｄ１２７Ｅ（１２５Ｄ）を図５Ａに示す。１２５Ｎウイルスは、高ＭＯＩ及び低ＭＯＩの両方で、１２５Ｄウイルスより低い複製動態を呈示したが、これは、１２５Ｎウイルスの多周期複製が損なわれたことを示している。ＭＯＩ：５（１６ｈｐｉ）又はＭＯＩ：０．００５（４８ｈｐｉ）での１２５Ｄウイルスのピーク力価は、１２５Ｎウイルスより約２ｌｏｇ高かった。
【０１９０】
様々な時点での感染細胞及び培養上清中のウイルスタンパク質レベルをウエスタンブロットにより調べた（図５Ｂ）。１２５Ｎ及び１２５Ｄウイルスは、感染から８〜１６時間後、感染細胞中に同等量のウイルスタンパク質を産生した。しかし、ウイルスタンパク質レベルにより検出されるように、１２５Ｎウイルスに感染した細胞の上清中に放出されたウイルス粒子の量は、高増殖１２５Ｄウイルスよりはるかに低かった。データから、低増殖ウイルスは、細胞に侵入して、ＲＮＡ転写及びタンパク質合成を効率的に開始することができるが、感染細胞からのウイルス放出が効率的ではないため、貧弱なウイルス拡散又は多周期複製となることがわかった。これらは、ＭＤＣＫ細胞における小さなウイルスプラーク、並びに卵及びＭＤＣＫ細胞での低力価に表されている。
【０１９１】
低ＭＯＩでのウイルス拡散における２つのウイルスの差異を免疫蛍光により確認した（図５Ｃ）。ＭＯＩ：０．００５で、いずれのウイルスについても感染から１５時間後に、同等の割合の細胞が感染した。感染から４８時間後、大部分の細胞が１２５Ｄウイルスに感染した；しかし、わずかな割合の細胞しか１２５Ｎウイルスに感染しなかった。ＣＡ／０９（Ｄ２２２Ｇ）とＣＡ／０９（Ｄ２２２Ｇ）−Ｋ１１９Ｅ／Ａ１８６Ｄなどの他のウイルスペアでも同様の結果が得られ、ＨＡでの酸性残基変異が、細胞からのウイルスの放出を容易にしたことを示している。
【０１９２】
ＭＤＣＫ細胞におけるウイルス複製に対するＮＡの作用を調べるために、Ｇｉｌ／１１ＮＡ又はＢｒｉｓ／１０ＮＡを含有するＧｉｌ／１１ｃａウイルスも、感染細胞におけるウイルスタンパク質発現について比較した（図６）。同様に、２つのウイルスは、感染細胞において同様のタンパク質発現を示したが、Ｇｉｌ／１１ＮＡを含むウイルスは、Ｂｒｉｓ／１０ＮＡを含むウイルスと比較して、非効率なウイルス拡散を有した。
【０１９３】
８．ウイルス増殖を改善するＨＡ及びＮＡ置換の構造的状況
全体として、ＨＡ  Ｎ１２５Ｄ／Ｄ１２７Ｅ及びＤ１２７Ｅ／Ｋ２０９Ｅ馴化部位が、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２０１０及びＡ／Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ／２／２０１０インフルエンザ株の高増殖の原因であることが明らかになった。異種ＣＡ／０９ｃａウイルスＨＡへの上記置換の導入は、その貧弱な増殖を回復させることができた。ＨＡ残基１２５は、抗原性Ｓａドメインに位置し、受容体結合部位（ＲＢＳ）に隣接している（図７Ａ）。ＨＡ  Ｎ１２５Ｄを含有するＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２０１０様ウイルスは、卵において高い増殖を示した。Ｈ１  ＨＡ  Ｎ１２５Ｄ置換を有するＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２０１０様ウイルスは、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅからの臨床分離株において２０１０年４月下旬に初めて検出された（Ｂａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｅｕｒｏ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌ．１５：ｐｉｉ：１９６９２，２６）。Ｂｒｉｓｂａｎｅ様株は、より初期のＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０９株と抗原性は大きく変わらなかったが、これらは、ワクチンブレイクスルー感染に関連しており、複数の死亡症例で認められている（Ｂａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｅｕｒｏ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌ．１５：ｐｉｉ：１９６９２；Ｓｔｒｅｎｇｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６：ｅ２５８４８）。Ａ／Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ／２／２０１０におけるＤ１２７Ｅ又はＫ２０９Ｅ置換は、卵馴化から起こった。ＨＡ  １２７及び２０９の変異は、他の流行Ｈ１インフルエンザＡウイルスにおいて、又はマウスでの馴化後に検出されている（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４１２：４０１−４１０；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２９：１８３６−１８４３）。これらの残基は、球状頭部の表面上に位置する（図７Ａ）。Ｄ１２７Ｅを含むＨＡを有するマウス馴化Ａ／ＣＡ／０４は、マウスにおいてより毒性の高い表現型に関連していることが判明した（Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．６：ｅ１００１１４５）。２０９残基は、ＨＡ三量体において隣接するモノマー中のＲＢＳから比較的離れている。不活性化インフルエンザワクチン用のいくつかの高収率再集合体において、Ｋ２０９Ｔ置換が報告されているが、単一のＫ２０９Ｔ置換は、ワクチン収率を大きく改善しなかった（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２９：１８３６−１８４３）。
【０１９４】
卵でのワクチンウイルス増殖に寄与したＮＡにおける遺伝子シグネチャーは、Ｓ２２２Ｎ、Ｉ２４１Ｖ、Ｋ３６９Ｎを個別に、又は組み合わせて含んだ。Ａ／Ｇｉｌｒｏｙ／２３１／２０１１は、ＨＡ及びＮＡタンパク質が改変されると特に良好に増殖した。２２２、２４１及び３６９位のアミノ酸（それぞれ、Ｎ２番号２２１、２４０及び３７２に対応する）は、Ｇｉｌ／１１の貧弱な増殖の主な原因であった。これらの３つの残基は全て、ＮＡ触媒部位周辺に位置する（図７Ｂ）。３６９残基は、保存的触媒部位Ｒ３７１に近接しており、３６９及び２２２の両方が、抗原性表面上に位置する（Ｃｏｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｐ．１７５−２１８．Ｉｎ  Ｒ．Ｋｒｕｇ（ｅｄ．），Ｔｈｅ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１７：１２６６−１２６８）。Ｇｉｌ／１１ＮＡのＫ３６９及びＩ２４１は、以前のヒト季節性Ｈ１Ｎ１株に保存され、最新型２０１１／２０１２Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ株は、Ｋ３６９及びＩ２４１を含有しており、これは、新型Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ株のＮＡが、ヒトに適応している可能性があることを示唆している（Ｓｏｕｎｄａｒａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．：６）。
【０１９５】
９．論考
特定の理論に束縛されるわけではないが、受容体結合部位周辺のＨＡ残基置換は、卵又はＭＤＣＫ細胞における受容体結合に有利に働き、ＨＡでの酸性表面変異は、感染細胞からのウイルス増殖をさらに促進して、効率的な多周期複製を開始すると考えられる。以前の研究（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．８４：４４−５１）と、本発明に記載する実施例とを合わせると、ＨＡにおけるＤ２２２Ｇ、Ａ１８６Ｄ、Ｎ１２５Ｄ、Ｄ１２７Ｅ及びＫ２０９Ｅのアミノ酸置換は、卵又はＭＤＣＫ細胞におけるウイルス増殖を大幅に改善することが明らかである。これらの置換の大部分は、酸性残基置換である。これらの陰荷電残基は、ウエスタンブロット及び免疫蛍光アッセイによって立証されるように、陰荷電シアル酸受容体又は細胞膜の反発を引き起こし、ウイルスの侵入及びウイルスのタンパク質合成に影響することなく、ＭＤＣＫ細胞からのウイルス粒子放出を増加する。
【０１９６】
また、卵馴化によるＨＡの変異が、ウイルスとα２，３−連結シアル酸の結合を増大させ、卵におけるウイルス増殖を改善したこと（Ｎｉｃｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０：７４５−７５１；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２９：１８３６−１８４３；Ｓｕｐｈａｐｈｉｐｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｖｉｒｏｌ  Ｊ．７：１５７)；Ｄ２２２Ｇ変異が、ウイルスとα２，３−連結シアル酸の結合を増大させたこと（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４：４４−５１；Ｃｈｕｔｉｎｉｍｉｔｋｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４：１１８０２−１１８１３）も仮定されている。しかし、再シアル化赤血球を用いた受容体結合アッセイにより、Ｎ１２５Ｄ、Ｄ１２７Ｅ及びＫ２０９Ｅ変異を有するウイルスは、ほとんどが、他のグリカン結合受容体と一致するα２，６−連結シアル酸受容体と結合したままである（データは示していない）ことが判明した（Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，２０１１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４１３：１６９−１８２；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４１２：４０１−４１０；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．８６：９８２−９９０）。恐らく、既存のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法では、これらの変異により起こった受容体結合の差を検出することができなかったのであろう。
【０１９７】
以上、本発明を、明瞭化及び理解を目的としてある程度詳細に説明してきたが、本開示を読めば、本発明の範囲を逸脱することなく、形態及び詳細事項に様々な変更を実施できることが当業者には明らかであろう。例えば、上に記載した全ての技術及び装置は、多様に組み合わせて用いてもよい。本出願に引用する刊行物、特許、特許出願、又はその他の文献は、あたかも個々の刊行物、特許、特許出願、又はその他の文献が各々、あらゆる目的のために参照により組み込まれることが個別に示されているのと同じ程度まで、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれるものとする。
【０１９８】
配列表
配列番号１は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９由来のＨＡポリペプチドのアミノ酸配列を示す。ここで、１２５位のＸ＝Ｎ又はＤ；１２７位のＸ＝Ｄ又はＥ；２０９位のＸ＝Ｋ又はＥ。
【０１９９】
配列番号２は、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０由来のＨＡポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０２００】
配列番号３は、Ａ／Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ／２／１０由来のＨＡポリペプチドのアミノ酸配列を示す。ここで、１２４位のＸ＝Ｐ又はＬ；１２５位のＸ＝Ｎ又はＤ；２０９位のＸ＝Ｋ又はＥ。
【０２０１】
配列番号４は、Ａ／Ｇｉｌｒｏｙ／２３１／１１由来のＨＡポリペプチドのアミノ酸配列を示す。ここで、１２５位のＸ＝Ｎ又はＤ；１２７位のＸ＝Ｄ又はＥ；２０９位のＸ＝Ｋ又はＥ。
【０２０２】
配列番号５は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９由来のＮＡポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０２０３】
配列番号６は、Ａ／Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ／２／１０由来のＮＡポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０２０４】
配列番号７は、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０由来のＮＡポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０２０５】
配列番号８は、Ａ／Ｇｉｌｒｏｙ／２３１／１１由来のＮＡポリペプチドのアミノ酸配列を示す。ここで、２２２位のＸ＝Ｓ又はＮ；２４１位のＸ＝Ｉ又はＶ；３６９位のＸ＝Ｋ又はＮ。
【０２０６】
配列番号９は、Ａ／ＣＡ／０７／０９由来のＨＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
【０２０７】
配列番号１０は、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０由来のＨＡをコードする核酸配列を示す。
【０２０８】
配列番号１１は、Ａ／Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ／２／１０由来のＨＡポリペプチドをコードする核酸配列を示す。
【０２０９】
配列番号１２は、Ａ／Ｇｉｌｒｏｙ／２３１／１１由来のＨＡポリペプチドをコードする核酸配列を示す。
【０２１０】
配列番号１３は、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０由来のＮＡポリペプチドをコードする核酸配列を示す。
【０２１１】
配列番号１４は、Ａ／Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ／２／１０由来のＮＡポリペプチドをコードする核酸配列を示す。
【０２１２】
配列番号１５は、Ａ／Ｇｉｌｒｏｙ＿／２３１／１１由来のＮＡポリペプチドをコードする核酸配列を示す。
【０２１３】
配列番号１６は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９由来のＮＡポリペプチドをコードする核酸配列を示す。
【０２１４】
配列
Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９ＨＡ
（配列番号１、ここで、１２５位のＸ＝Ｎ；１２７位のＸ＝Ｄ；２０９位のＸ＝Ｋ）
【化１】
2016500007.tif 000005
Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０ＨＡ（配列番号２）
【化２】
2016500007.tif 000006
Ａ／Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ／２／１０ＨＡ
（配列番号３、ここで、１２４位のＸ＝Ｐ；１２５位のＸ＝Ｎ；２０９位のＸ＝Ｋ）
【化３】
2016500007.tif 000007
Ａ／Ｇｉｌｒｏｙ／２３１／１１ＨＡ
（配列番号４、ここで、１２５位のＸ＝Ｎ；１２７位のＸ＝Ｄ；２０９位のＸ＝Ｋ）
【化４】
2016500007.tif 000008
Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９ＮＡ（配列番号５）
【化５】
2016500007.tif 000009
Ａ／Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ／２／１０ＮＡ（配列番号６）
【化６】
2016500007.tif 000010
Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０ＮＡ（配列番号７）
【化７】
2016500007.tif 000011
Ａ／Ｇｉｌｒｏｙ／２３１／１１ＮＡ
（配列番号８、ここで、２２２位のＸ＝Ｓ；２４１位のＸ＝Ｉ；３６９位のＸ＝Ｋ）
【化８】
2016500007.tif 000012
Ａ／ＣＡ／０７／０９ＨＡ（配列番号９）
【化９】
2016500007.tif 000013
Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０ＨＡ（配列番号１０）
【化１０】
2016500007.tif 000014
Ａ／ＮｅｗＨａｍｐｓｈｉｒｅ／２／１０ＨＡ（配列番号１１）
【化１１】
2016500007.tif 000015
Ａ／Ｇｉｌｒｏｙ／２３１／１１ＨＡ（配列番号１２）
【化１２】
2016500007.tif 000016
Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０ＮＡ（配列番号１３）
【化１３】
2016500007.tif 000017
Ａ／ＮｅｗＨａｍｐｓｈｉｒｅ／２／１０＿ＮＡ（配列番号１４）
【化１４】
2016500007.tif 000018
Ａ／Ｇｉｌｒｏｙ／２３１／１１ＨＡ（配列番号１５）
【化１５】
2016500007.tif 000019
Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９＿ＮＡ（配列番号１６）
【化１６】
2016500007.tif 000020
【図１】
2016500007.tif 000021
【図２】
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【図３】
2016500007.tif 000023
【図４】
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【図５】
2016500007.tif 000025
【図６】
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【図７】
2016500007.tif 000027
【配列表】
2016500007000001.app
【国際調査報告】
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