(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤に耐性のある患者の治療のためのその使用のための、ＰＩ３Ｋβ阻害剤とＲＡＦ阻害剤の組合せ、それを含むキット、それらの医薬としての使用、および患者に投与された場合の前記組合せの有効性をモニターする方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤への耐性癌細胞を有する患者の治療におけるその使用のための、ＰＩ３Ｋβ阻害剤とＲＡＦ阻害剤の組合せ。
【請求項２】
少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤への耐性は、組合せの前記ＲＡＦ阻害剤への耐性である、請求項１に記載のその使用のための組合せ。
【請求項３】
患者は黒色腫を患う、請求項１または２に記載のその使用のための組合せ。
【請求項４】
黒色腫細胞は、ＢＲＡＦ−Ｖ６００Ｅ突然変異またはＢＲＡＦ−Ｖ６００Ｋ突然変異のような、活性型ＢＲＡＦ突然変異を示す、請求項１〜３のいずれか１項に記載のその使用のための組合せ。
【請求項５】
黒色腫細胞はＰＴＥＮ欠損である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のその使用のための組合せ。
【請求項６】
ＰＩ３Ｋβ阻害剤は、次の式（Ｉ）のもの：
【化１】
2016516682.tif 000020
またはその薬学的に許容される塩の１つである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のその使用のための組合せ。
【請求項７】
ＲＡＦ阻害剤は、次の式（ＩＩ）のもの：
【化２】
2016516682.tif 000021
またはその薬学的に許容される塩の１つである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のその使用のための組合せ。
【請求項８】
前記組合せは、腫瘍細胞増殖を阻害する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のその使用のための組合せ。
【請求項９】
ＰＩ３Ｋβ阻害剤およびＲＡＦ阻害剤の投与は、同時、個別または逐次投与である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のその使用のための組合せ。
【請求項１０】
投与は個別または逐次であり、ＰＩ３Ｋβ阻害剤の投与の後、ＲＡＦ阻害剤は投与される、請求項９に記載のその使用のための組合せ。
【請求項１１】
投与は個別または逐次であり、ＲＡＦ阻害剤の投与の後、ＰＩ３Ｋβ阻害剤は投与される、請求項９に記載のその使用のための組合せ。
【請求項１２】
少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤に耐性のある癌細胞での、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組合せの有効性のバイオマーカーとしての、リン酸化リボソームタンパク質Ｓ６（ｐＳ６）の使用。
【請求項１３】
少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤に耐性のある癌細胞を有する患者の、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組合せに対する応答をモニターするｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
ｉ）最初の時点で、前記患者の、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤に耐性のある癌細胞におけるタンパク質ｐＳ６の量を求めること、
ｉｉ）後の時点で、前記患者の、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤に耐性のある癌細胞におけるタンパク質ｐＳ６の量を求めること、
ｉｉｉ）ステップｉ）のタンパク質ｐＳ６の量と、ステップｉｉ）におけるタンパク質ｐＳ６の量とを比較すること、および
ｉｖ）ステップｉ）のタンパク質ｐＳ６の量が、ステップｉｉ）におけるタンパク質ｐＳ６の量に等しいか、または超えている場合、患者は前記組合せに応答すると判定すること
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤に耐性のある患者の治療における使用のための、ＰＩ３Ｋβ阻害剤とＲＡＦ阻害剤の組合せ、その医薬としての使用、および患者に投与された場合の前記組合せの有効性をモニターする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）は、細胞周期、細胞運動およびアポトーシスのような多数の細胞機能に関与するシグナル分子である。ＰＩ３Ｋは、ＰＤＫＩおよびＡＫＴ（ＰＫＢとしても知られている）のようなセリン／トレオニンキナーゼを含むいくつかの標的タンパク質を活性化するセカンドメッセンジャー分子を生成する脂質キナーゼである。ＰＩ３Ｋは３つのクラスに分けられ、クラスＩは、ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３Ｋベータ（ＰＩ３Ｋβ）、ＰＩ３ＫデルタおよびＰＩ３Ｋガンマと名付けられた４つの異なるＰＩ３Ｋを含む。
【０００３】
２−｛２−［（２Ｓ）−２−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−１−イル］−２−オキソエチル｝−６−（モルホリン−４−イル）ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（以下では化合物（Ｉ））は、ＰＩ３Ｋβアイソフォームの選択的阻害剤である。この化合物による処置後、例えばＰＴＥＮ欠損腫瘍細胞（ホスファターゼテンシンホモログ遺伝子、多発性進行癌１突然変異ホスファターゼテンシンホモログ遺伝子）のような、活性化されたＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路を有する癌細胞は、通常、ＡＫＴとさらにはＡＫＴ下流エフェクターのリン酸化の阻害、腫瘍細胞の増殖の阻害、および腫瘍細胞死の誘導によって応答する。いくつかの研究は、ＰＩ３ＫβアイソフォームがＰＴＥＮ欠損腫瘍の腫瘍形成性に関与するＰＩ３Ｋアイソフォームであることを示す（非特許文献１、および非特許文献２；非特許文献３）。
【０００４】
ＲＡＦキナーゼは、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫシグナル伝達カスケード（また、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードとも呼ばれる）に参加する。３つのＲＡＦキナーゼファミリーメンバーは、Ａ−ＲＡＦ、Ｂ−ＲＡＦおよびＣ−ＲＡＦである。ＲＡＦキナーゼ阻害剤により処置された癌細胞は、通常、ＭＥＫおよびＥＲＫのリン酸化の阻害、サイクリンＤのダウンレギュレーション、Ｇ１休止の誘導によって応答し、最後に、アポトーシスに従う。このように、ＲＡＦは、癌治療法の開発にとって大きな関心のある標的である。
【０００５】
１−プロパンスルホンアミド，Ｎ−［３−［［５−（４−クロロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］カルボニル］−２，４−ジフルオロフェニル］（以下では化合物（ＩＩ））は、ＲＡＦキナーゼの阻害剤である。この化合物（以下では化合物（ＩＩ））は、また、ＰＬＸ−４０３２またはベムラフェニブとしても知られ、活性型ＢＲＡＦ突然変異を抱える癌の治療のために開発された、経口使用できる低分子である。より詳細には、それは、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を有する黒色腫細胞系に対して顕著な抗腫瘍効果を有するが、野生型ＢＲＡＦを有する細胞に対しては顕著な抗腫瘍効果を有さない。ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を有する黒色腫は、黒色腫の５０％超を占める。それらは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を構成的に活性化し、細胞増殖を促進し、アポトーシスを妨げる。
【０００６】
ベムラフェニブの最近の第１相試験において、ＢＲＡＦ突然変異黒色腫を有する患者の８１％に、固形腫瘍に対する治療効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ）によって、少なくとも３０％の腫瘍縮小があり、２人の患者では治療効果は完全であった（非特許文献４）。
【０００７】
しかし、このような有望な治療効果にもかかわらず、ベムラフェニブへの耐性が生じた。
【０００８】
薬剤耐性は、癌化学療法における失敗の主な理由である。耐性は、先在（内因性耐性）であるか、または薬剤によって誘発される（獲得耐性）かのいずれかであり得る。獲得耐性は、処置に対する過渡的な応答の後で現れるようであり、通常、再発を伴う。標的キナーゼ阻害剤への獲得耐性の遺伝子メカニズムは、通常、標的キナーゼに影響を及ぼす突然変異、または、標的オンコプロテインの阻害を補うかもしくは迂回し得る、標的シグナリング経路内の他の遺伝子の変異である。
【０００９】
ＲＡＦ阻害剤への癌細胞の内因性耐性は研究されている。ＰＴＥＮ発現状態は、ベムラフェニブの増殖阻害作用に対する感受性への予測ではないが、ＰＴＥＮ欠損／ＢＲＡＦ突然変異体黒色腫細胞系は、ＰＴＥＮが発現されている細胞系より著しく少ないアポトーシスを示すことが示された（非特許文献５）。突然変異ＢＲＡＦおよびＰＴＥＮ発現抑制が同時に起こることは、ヒト黒色腫では比較的一般的である（約２０〜３０％）。
【００１０】
しかし、いくつかのメカニズムが、ＲＡＦ阻害剤への耐性に関与している。実際に、いくつかのＢＲＡＦ突然変異／ＰＴＥＮ欠損黒色腫細胞系は、ＲＡＦ阻害剤に対して感受性があり、他のいくつかは、ＲＡＦ阻害剤に対して非感受性である。
【００１１】
ベムラフェニブをめぐる内因性または獲得耐性の原因となるメカニズムは、依然として研究中である。
【００１２】
現在利用できるデータは、ＢＲＡＦの高活性短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）型の出現、ＮＲＡＳ（神経芽細胞腫ＲＡＳウイルス癌遺伝子ホモログ）またはＭＥＫにおける２次突然変異によるＭＡＰＫ経路の再活性化を示唆する。例えば、処置前の対応する腫瘍には存在しなかった、下流キナーゼＭＥＫ１におけるコドン１２２１での活性型突然変異が確認された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＭＥＫ１Ｃ１２１Ｓ突然変異が、キナーゼ活性を増大させ、ＲＡＦ阻害への強健な耐性を与えることが示された（非特許文献６）。ＭＡＰＫ再活性化は、多くの再発例において起こるが、他の例ではＰＩ３Ｋシグナリングの増加が起こる。
【００１３】
さらに、ＲＡＦまたはＭＥＫ阻害剤に耐性のある黒色腫では、ＴＯＲＣ１（ＴＯＲ複合体１）活性が、ＲＡＦまたはＭＥＫ阻害剤による処置の後で、いくつかの場合にはＭＡＰＫシグナリングの強い抑制にもかかわらず、保たれるということが記載された。ＲＡＦまたはＭＥＫ阻害剤に応答したＴＯＲＣ１の阻害は、ｐＳ６（リボソームタンパク質Ｓ６、リン酸化された時ｐＳ６とも呼ばれる）の減少によって測定された時、ＢＲＡＦ突然変異体黒色腫細胞におけるＲＡＦ阻害剤による細胞死の誘導を有効に予測し得る。
【００１４】
ｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおいて、ＭＡＰＫ阻害の後のＴＯＲＣ１活性の抑制は、アポトーシスの誘導および腫瘍の応答にとって必要であった。ＲＡＦ阻害剤療法の処置前および開始後の、ＢＲＡＦ突然変異体黒色腫を有する患者から得られたペア生検において、ｐＳ６抑制は、顕著に改善された無増悪生存（ＰＦＳ）を予測した。ｐＳ６におけるこのような変化は、逐次穿刺生検（ｆｉｎｅ−ｎｅｅｄｌｅ  ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ｂｉｏｐｓｙ）によってリアルタイムでモニターされ得るので、ｐＳ６の定量は、ＢＲＡＦ突然変異体黒色腫における治療を導くための有益なバイオマーカーになり得る（非特許文献７）。
【００１５】
したがって、ＲＡＦ阻害剤への耐性を克服する癌治療法、特に黒色腫治療法が求められている。また、腫瘍細胞の増殖を阻害し、また腫瘍細胞のアポトーシスを高めるのに、より効果的である、黒色腫のような癌の治療法を提供することが求められている。また、患者に対する毒性を最小限度に抑えることも求められている。
【００１６】
通常用いられるＲＡＦ阻害剤の投薬量を、実質的に増やすことなく一層の有効性に導く、または前記投薬量を維持するもしくは減らしさえし、他の標的療法と組み合わせて用いられる、ＲＡＦ阻害剤療法が、特に求められている。
【００１７】
また、癌療法の有効性をモニターするためのバイオマーカーを提供することも求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｖ．  Ｃｅｒｔａｌら、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２０１２年、５５、４７８８〜４８０５頁
【非特許文献２】Ｖ．Ｃｅｒｔａｌら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃｓ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２２（２０１２年）６３８１〜６３８４頁
【非特許文献３】Ｖ．Ｃｅｒｔａｌら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．  ５７（２０１４年）：９０３〜２０頁
【非特許文献４】Ｆｌａｈｅｒｔｙ  ＫＴら、Ｎ．  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６３：８０９〜８１９頁、２０１０年
【非特許文献５】Ｋｉｍ  Ｈ．  Ｔ．  Ｐａｒａｉｓｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０１１年；７１：２７５０〜２７６０頁
【非特許文献６】Ｎｉｋｈｉｌ  Ｗａｇｌｅら、Ｊ  ＣｌｉｎＯｎｃｏｌ  ２９：３０８５〜３０９６頁、２０１１年
【非特許文献７】Ｒｙａｎ  Ｂ．  Ｃｏｒｃｏｒａｎら、Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．  ５：１９６ｒａ９８、２０１３年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤に耐性のある癌細胞を有する患者のための治療法を提供することである。
【００２０】
本発明の目的は、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤に耐性のある癌細胞を有する患者のための、前記少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤への耐性を克服する治療法を提供することである。
【００２１】
本発明の目的は、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤への耐性癌細胞を有する患者の治療のための使用のための組合せを提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤に耐性のある癌細胞を有する患者を治療するためのキットを提供することである。
【００２３】
本発明の目的は、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤に耐性のある癌細胞を有する患者を治療するための医薬を提供することである。
【００２４】
本発明の別の目的は、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤に耐性のある癌細胞を有する患者のための治療の方法を提供することである。
【００２５】
本発明の目的は、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤に耐性のある癌細胞を有する患者のための治療の有効性をモニターするバイオマーカーおよび方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
こうして、本発明は、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤への耐性癌細胞を有する患者の治療のためのその使用のための、ＰＩ３Ｋβ阻害剤とＲＡＦ阻害剤の組合せに関する。
【００２７】
本発明はまた、同時、個別または逐次投与のための、前記組合せを含み、前記使用のためのキットにも関する。
【００２８】
本発明はまた、発明の組合せを含み、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤への耐性癌細胞を有する患者の治療におけるその使用のための、医薬組成物にも関する。
【００２９】
本発明はまた、前記組合せを、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤への耐性癌細胞を有する患者に投与することを含む治療の方法にも関する。
【００３０】
本発明はまた、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤への耐性癌細胞を有する患者に投与された時の、前記組合せの有効性をモニターするためのバイオマーカー、および、前記バイオマーカーを用いるモニタリングの方法にも関する。
【００３１】
驚くべきことに、本発明者らは、ＰＩ３Ｋβ阻害剤とＲＡＦ阻害剤の組合せが、特に、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤に非感受性のヒト黒色腫Ａ２０５８細胞系のような、ＲＡＦ阻害剤耐性黒色腫細胞において、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤への癌細胞の耐性を克服することを見出した。
【００３２】
尚一層驚くべきことに、上で定められた組合せは、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤に耐性のある細胞系で相乗効果を示す。
【００３３】
一実施形態において、相乗効果によって、組合せの効果は、その個々の成分から予想される加えた効果より大きいことが理解される。より詳細には、相乗効果は、Ｒ．Ｓｔｒａｅｔｅｍａｎｓ、Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ、４７、２００５年、２９９〜３０８頁に記載されているレイ（Ｒａｙ）の方法デザインによって決定され得る。
【００３４】
別の実施形態において、相乗効果によって、組合せの効果は、２つの個々の成分の１つの最良の効果より大きいこともまた理解され得る。
【００３５】
別の実施形態において、相乗性は、Ｔ．  Ｈ．  ＣＯＲＢＥＴＴらに従って定義され得るが、それによれば、最高限度の用量で用いられた構成成分の１つまたはその他より、組合せが治療上優れている場合、組合せは治療上の相乗性を示す（Ｔ．  Ｈ．  ＣＯＲＢＥＴＴら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、６６、１１８７頁（１９８２年））。この定義によれば、組合せの有効性を実証するために、組合せの最大許容用量と、該研究における別々の成分の各々の最大許容用量とを比較することが必要であり得る。この有効性は、例えば、ｌｏｇ１０（死んだ細胞数）の計算、または他の知られている任意の方法によって定量化され得る。
【００３６】
一実施形態において、本発明による相乗性は、次の効果の１つに関して得ることができる：
−抗増殖活性；および／または
−プロアポトーシス活性。
【００３７】
一実施形態において、高められた効果は、Ｓ６リン酸化の阻害に関して得ることができる。「高められた効果」または「高められた阻害」は、組合せの阻害効果が、２つの個々の成分の１つの最良の阻害効果より大きいことを意味する。
【００３８】
一実施形態において、本発明による相乗性は、次の効果の１つに関して得ることができる：
−腫瘍増殖の阻害（腫瘍静止）；および／または
−腫瘍の部分的退縮；および／または
−完全な腫瘍退縮。
【００３９】
この（これらの）効果は、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤に感受性のある、または耐性のある細胞系で得ることができる。
【００４０】
本発明の利点の１つは、治療の可能性がほとんどない、ＲＡＦ阻害剤耐性を示す腫瘍を有する患者のための新しい治療法を提供することである。
【００４１】
本発明の別の利点は、前記のような組合せの相乗効果のおかげで、より少ない用量の各活性成分がＲＡＦ阻害剤への耐性を克服するために必要とされ得ること、および／または、薬剤の毒性が低減され得ることである。
【００４２】
本発明の各目的による一実施形態において、ＰＩ３Ｋβ阻害剤は、ＰＩ３Ｋβに阻害効果を示す化合物である。より詳細には、それらは、一般に、ＰＩ３Ｋβに阻害効果を示し、他のＰＩ３Ｋアイソフォーム、すなわち、ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３ＫデルタおよびＰＩ３Ｋガンマには、阻害効果を、わずかに示す、または全く示さない。
【００４３】
一実施形態において、それらは、ＰＩ３Ｋβアイソフォームに対して選択的である。「選択的ＰＩ３Ｋβ阻害剤」によって、他のアイソフォームであるＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３ＫデルタおよびＰＩ３Ｋガンマより優先して、特定のＰＩ３Ｋβアイソフォームに作用を及ぼす、ＰＩ３Ｋβ阻害剤の能力と理解することができる。ＰＩ３Ｋβ選択的阻害剤は、これらのアイソフォームの間の違いを識別し、そうして本質的にはＰＩ３Ｋβアイソフォームに作用を及ぼす能力を有し得る。一実施形態において、選択的ＰＩ３Ｋβ阻害剤は、ＰＩ３Ｋ全体の阻害剤ではない。このＰＩ３Ｋβアイソフォーム選択性は、ＰＩ３Ｋ全体の阻害剤に比べて、より良好な安全性プロフィールを示し得る。
【００４４】
より詳細には、生化学アッセイおよび細胞アッセイにおいて、選択的ＰＩ３Ｋβ阻害剤は、ＩＣ５０≦３００ｎＭで、ＰＩ３Ｋβアイソフォームを標的にし、ＩＣ５０≧２５０ｎＭである他のＰＩ３Ｋアイソフォーム、ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３ＫデルタおよびＰＩ３Ｋガンマに対して選択的であり得る。一実施形態において、それらは、他のアイソフォームに対して少なくとも２倍のＰＩ３Ｋβ阻害比を示し得る。
【００４５】
一実施形態において、前記ＰＩ３Ｋβ阻害剤は、ｍＴＯＲを阻害しない。
【００４６】
一実施形態において、ＰＩ３Ｋβ阻害剤は、下に定められる構造式（Ｉ）を有する。
【化１】
2016516682.tif 000002
【００４７】
式（Ｉ）によるＰＩ３Ｋβ阻害剤は、本明細書において、「化合物（Ｉ）」と呼ばれる。化合物（Ｉ）は、クラスＩのＰＩ３ＫのＰＩ３Ｋベータアイソフォームの選択的阻害剤である。「選択的阻害剤」によって、他のアイソフォームであるＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３ＫデルタおよびＰＩ３Ｋガンマより優先して、特定のＰＩ３Ｋβアイソフォームに作用を及ぼす、化合物（Ｉ）の能力と理解することができる。化合物（Ｉ）は、違いを識別し、そうしてＰＩ３Ｋβアイソフォームにだけ作用を及ぼす能力を有し得る。より詳細には、化合物（Ｉ）は、他のアイソフォームであるアルファ、デルタおよびガンマへのその阻害活性に対して１０倍勝る、ＰＩ３Ｋβアイソフォームへの阻害活性を有し得る。
【００４８】
化合物（Ｉ）は、生化学アッセイにおいて、６５ｎＭのＩＣ５０でＰＩ３Ｋβアイソフォームを標的にし、ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３ＫデルタおよびＰＩ３Ｋガンマで、それぞれ１１８８ｎＭ、４６５ｎＭのＩＣ５０、および１０，０００ｎＭを超えるＩＣ５０を有する他のＰＩ３Ｋアイソフォームに対して選択的であり得る。
【００４９】
化合物（Ｉ）は、ｍＴＯＲを阻害しない、より詳細には、１０μＭまでｍＴＯＲを阻害しないということがあり得る。
【００５０】
その選択性はまた、４００を超えるキナーゼを含む、脂質キナーゼおよびプロテインキナーゼの大きなパネルに対して化合物（Ｉ）をプロファイリングすることによって確認された。ＰＩ３ＫデルタおよびＰＩ３Ｋβアイソフォームを除いて、ＶＰＳ３４脂質キナーゼは、１８０ｎＭというサブマイクロモルのＩＣ５０を有する阻害を示す唯一のキナーゼである；しかし、ＶＰＳ３４へのこのレベルの生化学的活性は、ＶＰＳ３４の機能性細胞アッセイを用いる細胞活性には反映されない（１０、０００ｎＭを超えるＩＣ５０）。
【００５１】
生化学的ベースにおいて観察される、高レベルのＰＩ３Ｋβアイソフォーム選択性は、細胞アッセイにおいて確認された。
【００５２】
クラスＩのＰＩ３Ｋアイソフォームの各々に対する式（Ｉ）の化合物の細胞ベースでの選択性を個別に探究するために、すでに記載されたように（Ｃｅｒｔａｌ  Ｖ、  Ｈａｌｌｅｙ  Ｆ、Ｖｉｒｏｎｅ−Ｏｄｄｏｓ  Ａ、Ｄｅｌｏｒｍｅ  Ｃ、Ｋａｒｌｓｓｏｎ  Ａ、Ｒａｋ  Ａら、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ−ａｎｄ  Ｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ−Ｐｙｒｉｍｉｄｏｎｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＰＩ３Ｋβ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｎｄ  ＴＥＮｓｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ（ＰＴＥＮ）−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｃａｎｃｅｒｓ  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２０１２年；５５：４７８８〜４８０５頁）、セリン４７３残基（ｐＡｋｔ−Ｓ４７３）でのＡＫＴリン酸化の阻害が、適切な細胞系（ＰＩ３Ｋアルファでは、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異Ｈ４６０肺腫瘍細胞、ＰＩ３Ｋβでは、活性化ｐ１１０β過剰発現するＭＥＦ−３Ｔ３−ｍｙｒ  ｐ１１０βマウス繊維芽、ＰＩ３Ｋデルタでは、活性化ｐ１１０δ過剰発現するＭＥＦ−３Ｔ３−ｍｙｒ  ｐ１１０δマウス繊維芽、および、ＰＩ３Ｋガンマでは、ＲＡＷ  ２６４．７マウスマクロファージ（Ｃ５ａによるＡＫＴリン酸化の刺激の後））において評価された。
【００５３】
式（Ｉ）の化合物は、ＰＩ３Ｋβ依存性細胞系において、ＰＩ３Ｋデルタ（８２３ｎＭのＩＣ５０）より２６倍高い（３２ｎＭのＩＣ５０）効能で、ＰＩ３Ｋβアイソフォームを阻害し得る。
【００５４】
式（Ｉ）の化合物は、細胞アッセイおよび生化学アッセイにおいて、ＰＩ３ＫアルファおよびＰＩ３Ｋガンマアイソフォームに、同レベルの活性を示し得る（それぞれ、２，８２５および＞３，０００ｎＭのＩＣ５０）。
【００５５】
式（Ｉ）の化合物は、細胞において、ＰＩ３Ｋβ選択的阻害剤であり得る。式（Ｉ）の化合物は、ＰＩ３Ｋβに、ＰＩ３Ｋデルタ、ＰＩ３Ｋアルファ、およびＰＩ３Ｋガンマより、それぞれ、２６倍、８８倍の効能、および９４倍を超える、より大きな効能があり得る。
【００５６】
化合物（Ｉ）の製造、特性、およびＰＩ３Ｋβ阻害能は、例えば、国際公開第２０１１／００１１１４号に、特に、その中の実施例１１７およびｐ２１６の表に与えられている。ＷＯ２０１１／００１１１４の全内容は、参照によって本明細書に組み入れる。式（Ｉ）の化合物の中性および塩の形が、本明細書では全て考慮に入れられている。
【００５７】
本発明の各目的による一実施形態において、ＲＡＦ阻害剤は、ＲＡＦタンパク質に阻害効果を示す化合物である。より詳細には、それらは、通常、生化学アッセイおよび細胞において、ＲＡＦタンパク質に対して５００ｎＭ未満のＩＣ５０を示す。
【００５８】
より明確には、ＲＡＦ阻害剤はＢＲＡＦ阻害剤である。次の化合物は、ＢＲＡＦ阻害剤として挙げることができる：ソラフェニブ（ネクサバール）、ベムラフェニブ（ＰＬＸ−４０３２）、ダブラフェニブ（ＧＳＫ２１１８４３６）、ＰＬＸ−４７２０、ＧＤＣ−０８７９、レゴラフェニブ（ＢＡＹ  ７３−４５０６）、ＲＡＦ２６５（ＣＨＩＲ−２６５）、ＳＢ５９０８８５、ＡＺ６２８、ＺＭ  ３３６３７２、ＮＶＰ−ＢＨＧ７１２、Ｒａｆ２６５誘導体およびＧＳＫ２１１８４３６。
【００５９】
一実施形態において、ＲＡＦ阻害剤は、下で定められる構造式（ＩＩ）を有する。
【化２】
2016516682.tif 000003
【００６０】
式（ＩＩ）によるＲＡＦ阻害剤は、本明細書では、「化合物（ＩＩ）」と呼ばれ、ＰＬＸ−４０３２またはベムラフェニブとしてもまた知られている。
【００６１】
化合物（ＩＩ）の製造、特性、およびＲＡＦ阻害能は、例えば、国際出願第２００７／００２３２５に、特に、その中の実施例４４の化合物ｐ−０９５６、ならびに表２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅおよび２ｈに与えられている。ＷＯ２００７／００２３２５の全内容は、参照によって本明細書に組み入れる。式（ＩＩ）の化合物の中性および塩の形が、本明細書では全て考慮に入れられている。
【００６２】
いくつかの実施形態において、前記の化合物は、溶媒和していない、または溶媒和した状態であり得る。当技術分野において知られているように、溶媒和物は、水、エタノールなどのような薬学的に許容される溶媒のいずれかであり得る。一般に、溶媒和物の存在または不在は、前記ＲＡＦまたはＰＩ３Ｋβ阻害剤の有効性に実質的に影響を及ぼさない。
【００６３】
いくつかの実施形態において、これらの化合物は、薬学的に許容される塩の形で用いられる。塩は、本明細書に参照によって組み入れるＷＯ２０１１／００１１１４に詳細に記された方法および塩の形のいずれかのような、当技術分野においてよく知られている方法のいずれかによって得ることができる。
【００６４】
化合物の「薬学的に許容される塩」は、薬学的に許容され、また薬理学的活性を保持する塩を表す。薬学的に許容される塩は、無毒であると理解されている。適切な薬学的に許容される塩についてのさらなる情報は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１７版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９８５年、または、Ｓ．  Ｍ．  Ｂｅｒｇｅら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」、Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．、１９７７年；６６：１〜１９頁に見出すことができ、これらのどちらも、参照によって本明細書に組み入れる。
【００６５】
薬学的に許容される酸付加塩の例には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸のような無機酸により生成されるもの、さらには、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、グルコヘプトン酸、４，４’−メチレンビス−（３−ヒドロキシ−２−エン−ｌ−カルボンン酸）、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、ｔｅｒｔ−ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、およびサリチル酸のような有機酸により生成される塩が含まれる。
【００６６】
一実施形態において、本発明に従う使用のための組合せは、腫瘍細胞増殖を阻害するか、または部分的もしくは完全な腫瘍細胞の退縮を達成するかのいずれかであり得る。
【００６７】
一実施形態によれば、本発明は、上で定められた使用のための組合せに関し、ここで、ＰＩ３Ｋβ阻害剤およびＲＡＦ阻害剤は、上で定められたように、相乗効果を生み出す量で存在する。
【００６８】
一実施形態において、本発明に従う使用のための組合せは、患者の癌細胞で抗増殖活性およびプロアポトーシス活性を高める。
【００６９】
一実施形態によれば、本発明は、上で定められた使用のための組合せに関し、ここで、ＰＩ３Ｋβ阻害剤およびＲＡＦ阻害剤は、患者の癌細胞で、抗増殖活性とプロアポトーシス活性への相乗効果および／または刺激効果を生じさせる量で存在する。一実施形態において、患者の癌細胞でのプロアポトーシス活性への前記相乗効果および／または刺激効果は、濃度依存的に得られる。
【００７０】
特定の実施形態において、抗増殖活性への前記相乗効果は、１／１６から２６／１を含む、化合物（Ｉ）／化合物（ＩＩ）の比で達せられ得る。
【００７１】
特定の実施形態において、プロアポトーシス活性への前記刺激効果は、１０μＭの濃度の化合物（Ｉ）と組み合わせた１μＭから１０μＭの濃度の化合物（ＩＩ）で達せられ得る。
【００７２】
特定の実施形態において、プロアポトーシス活性への前記刺激効果は、１０μＭの濃度の化合物（Ｉ）と組み合わせた１０μＭまたは１μＭの濃度の化合物（ＩＩ）で達せられ得る。
【００７３】
特定の実施形態において、プロアポトーシス活性への前記刺激効果は、０．１μＭから１０μＭの濃度の化合物（Ｉ）と組み合わせた０．１μＭから１０μＭの濃度の化合物（ＩＩ）で達せられ得る。
【００７４】
特定の実施形態において、プロアポトーシス活性への前記刺激効果は、０．１μＭ、１μＭまたは１０μＭの化合物（Ｉ）と、０．１μＭ、１μＭまたは１０μＭの濃度の化合物（ＩＩ）で達せられ得る。
【００７５】
特定の実施形態において、プロアポトーシス活性への前記刺激効果は、１０μＭの化合物（Ｉ）と、１０μＭの濃度の化合物（ＩＩ）で達せられ得る。
【００７６】
特定の実施形態において、プロアポトーシス活性への前記刺激効果は、１μＭの化合物（Ｉ）と、１０μＭの濃度の化合物（ＩＩ）で達せられ得る。
【００７７】
特定の実施形態において、プロアポトーシス活性への前記刺激効果は、１０μＭの化合物（Ｉ）と、１μＭの濃度の化合物（ＩＩ）で達せられ得る。
【００７８】
特定の実施形態において、プロアポトーシス活性への前記刺激効果は、１μＭの化合物（Ｉ）と、１μＭの濃度の化合物（ＩＩ）で達せられ得る。
【００７９】
特定の実施形態において、プロアポトーシス活性への前記刺激効果は、１０μＭの化合物（Ｉ）と、０．１μＭの濃度の化合物（ＩＩ）で達せられ得る。
【００８０】
特定の実施形態において、Ｓ６リン酸化への前記阻害効果は、０．１μＭから１０μＭの濃度の化合物（Ｉ）と組み合わせた０．１μＭから１０μＭの濃度の化合物（ＩＩ）で達せられ得る。
【００８１】
特定の実施形態において、Ｓ６リン酸化への前記阻害効果は、０．１μＭ、１μＭまたは１０μＭの化合物（Ｉ）と、０．１μＭ、１μＭまたは１０μＭの濃度の化合物（ＩＩ）で達せられ得る。
【００８２】
本発明の各目的の一実施形態において、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤に耐性のある患者は、組合せの前記ＲＡＦ阻害剤に耐性がある。一実施形態において、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤への耐性は、内因性耐性である。一実施形態において、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤への耐性は、獲得耐性である。
【００８３】
一実施形態において、上で定められた耐性が獲得耐性である場合、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤に耐性のある患者は、そのＲＡＦ阻害剤によって前に治療されたことがあり、治療にもはや応答しないか、または高用量で毒性の強すぎる用量によるそのＲＡＦ阻害剤による治療に応答し得ると、理解されるべきである。
【００８４】
一実施形態において、患者の耐性癌細胞は、ＲＡＦ阻害剤に比較的耐性がある。一実施形態において、患者の耐性癌細胞は、ＲＡＦ阻害剤に対する非感受性癌細胞である。「非感受性」によって、癌細胞が、薬学的に許容される用量で、ＲＡＦ阻害剤に応答しないと理解され得る。より詳細には、ＲＡＦ阻害剤は、非感受性癌細胞で、感受性癌細胞より少なくとも１０倍を超えるＩＣ５０を示し得る。
【００８５】
例えば、ベムラフェニブＢＲＡＦ阻害剤は、Ａ２０５８非感受性癌細胞で約４，２００ｎＭのＩＣ５０を、ＷＭ−２６６−４感受性癌細胞で８４ｎＭのＩＣ５０を示し得る。
【００８６】
一実施形態において、癌細胞は、活性型ＢＲＡＦ突然変異、特に、ＢＲＡＦ−Ｖ６００Ｅ突然変異またはＢＲＡＦ−Ｖ６００Ｋ突然変異を示す。
【００８７】
ＢＲＡＦにおける様々な活性型突然変異（すなわち、体細胞点突然変異）は、タンパク質が過剰活性になる原因となる。これは、特定の悪性腫瘍において役割を果たし得るシグナリングカスケードの引き金となる。知られているＢＲＡＦ突然変異の約９０％は、Ｖ６００Ｅ突然変異である。これらは、タンパク質鎖のＶ６００の位置での、バリン（Ｖ）からグルタミン酸（Ｅ）への置換を含むので、構成的活性型ＢＲＡＦが生じる。この点突然変異の他のバリアントは、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、およびアルギニン（Ｒ）を含む。Ｖ６００点突然変異は、ＢＲＡＦが上流の刺激に無関係にシグナルを発するようにする。構成的活性型ＢＲＡＦの結果として、ＭＥＫおよびＥＲＫによる過剰活性下流シグナリングは、増殖因子に無関係に、過度の細胞増殖および生存に導く。
【００８８】
「活性型ＢＲＡＦ突然変異」は、ＢＲＡＦが上流の刺激と無関係にシグナルを発するようにする、および／または、構成的活性型ＢＲＡＦタンパク質を生成する、ＢＲＡＦ遺伝子での突然変異と理解され得る。
【００８９】
別の実施形態において、癌細胞はＰＴＥＮ欠損である。したがって、処置される癌は、ＢＲＡＦ−Ｖ６００Ｅ突然変異／ＰＴＥＮ欠損黒色腫、またはＢＲＡＦ−Ｖ６００Ｋ突然変異／ＰＴＥＮ欠損黒色腫のような、ＢＲＡＦ−突然変異癌である得る。
【００９０】
本発明に従って処置される癌は、乳癌、肺癌、結腸癌、甲状腺癌、子宮内膜および卵巣癌ならびに黒色腫からなる群から選択され、特定の実施形態において、癌は黒色腫である。
【００９１】
特定の実施形態において、処置される患者は、突然変異ＭＥＫ１キナーゼ、より詳細には突然変異ＭＥＫ１Ｃ１２１Ｓキナーゼを有する。
【００９２】
本発明の各目的による一実施形態において、ＰＩ３Ｋβ阻害剤およびＲＡＦ阻害剤は、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤への耐性癌細胞を有する患者の治療に用いられる、同時、個別または逐次投与のための組合せ製剤として存在する。
【００９３】
本発明によれば、「同時」は、ＰＩ３Ｋβ阻害剤とＲＡＦ阻害剤が、同じ経路で同時に投与される（例えば、それらは混合され得る）ことを意味し、「個別」は、それらが、異なる経路および／または異なる時間に投与されることを意味し、「逐次」は、それらが、異なる時間に別々に投与されることを意味する。
【００９４】
同時投与は、通常、両方の化合物が、正確に同じ時間に患者に入ることを意味する。しかし、同時投与はまた、ＲＡＦ阻害剤とＰＩ３Ｋβ阻害剤が異なる時間に患者に入るが、その時間差が十分に小さく、最初に投与された化合物は、２番目に投与される化合物が入る前に患者に作用を及ぼすだけの時間を与えられないという可能性も含む。このような遅延時間は、典型的には１分未満に、より典型的には３０秒未満に相当する。
【００９５】
他の実施形態において、ＲＡＦおよびＰＩ３Ｋβ阻害剤は、同時投与されない。これに関連して、最初に投与される化合物は、２番目に投与される化合物が投与される前に患者に作用を及ぼす時間を与えられる。通常、時間差は、最初に投与された化合物が、患者の中で、その作用を終える時間を超えて、または、最初に投与された化合物が、患者の中で、完全にもしくは実質的に無くなるもしくは失活する時間を越えて、広げられない。
【００９６】
特定の実施形態において、投与は、個別または逐次であり、ＰＩ３Ｋβ阻害剤の投与の後、ＲＡＦ阻害剤が投与される。
【００９７】
別の特定の実施形態において、投与は、個別または逐次であり、ＲＡＦ阻害剤の投与の後、ＰＩ３Ｋβ阻害剤が投与される。
【００９８】
別の実施形態において、前記の組合せ製剤は、使用のための教示をさらに含む、キットに含まれる。
【００９９】
本発明の各目的によれば、一実施形態において、
−化合物（Ｉ）は、１００から１６００ｍｇを含む用量で投与され、
−化合物（ＩＩ）は、６００から１１００ｍｇを含む用量で投与される。
【０１００】
より詳細には、
−化合物（Ｉ）は、次の用量：１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、６００、６２０、６４０、６６０、６８０、７００、７２０、７４０、７６０、７８０、８００、８２０、８４０、８６０、８８０、９００、９２０、９４０、９６０、９８０、１０００、１０２０、１０４０、１０６０、１０８０、１１００、１１２０、１１４０、１１６０、１１８０、１２００、１２２０、１２４０、１２６０、１２８０、１３００、１３２０、１３４０、１３６０、１３８０、１４００、１４２０、１４４０、１４６０、１４８０、１５００、１５２０、１５４０、１５６０、１５８０、および１６００ｍｇから選択され、通常は、次の用量：１００、２００、４００、６００、８００、１０００、１２００、１４００および１６００ｍｇから選択される用量で投与される、および
−化合物（ＩＩ）は、７２０ｍｇまたは９６０ｍｇ、通常は９６０ｍｇの用量で投与される。
【０１０１】
さらなる実施形態において、本発明の各目的によれば、化合物（Ｉ）および（ＩＩ）は、１日に２回投与される。一実施形態において、化合物（Ｉ）および（ＩＩ）は経口投与される。投与のサイクルは、通常、少なくとも２８日、典型的には２８日続く。投与サイクルは、２つのサイクルの間に休止期間（すなわち、化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の投与のない期間）を置いて、または置かずに、繰り返されることもある。より詳細には、化合物（Ｉ）および（ＩＩ）は、少なくとも２８日間、休止なしに投与される。
【０１０２】
「用量」は、投与用量を意味する（例えば、「ベムラフェニブは６００から１１００ｍｇの用量で投与される」という表現において）。用量は、必ずしも「単位用量（ｕｎｉｔ  ｄｏｓｅ）」（すなわち、患者に投与でき、また容易に取り扱い、パッケージ化することができ、物理的および化学的に安定な単位用量として存続する単一用量）とは限らない。例として、通常、ベムラフェニブの用量は、９６０ｍｇ（投与用量）であり、２４０ｍｇ（単位用量）の４錠が投与され得る。
【０１０３】
化合物または製品が毎日２回投与される時、１日当たりの用量は、投与用量（すなわち、本出願における用量）の２倍である。例えば、ベムラフェニブの９６０ｍｇの用量が、１日に２回投与される時、１日当たりの全用量は１，９２０ｍｇである。
【０１０４】
一実施形態において、前記のように用いられる組合せおよび／またはキットおよび／または医薬は、少なくとも１つのさらなる抗癌化合物を含む。
【０１０５】
一実施形態において、前記のように用いられる組合せおよび／またはキットおよび／または医薬組成物は、薬学的に許容される少なくとも１つの添加剤をさらに含む。
【０１０６】
一実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤に耐性のある癌細胞を有する患者を治療するための医薬の製造のための、前記組合せの使用に関する。
【０１０７】
別の態様において、本発明は、ＲＡＦ阻害剤と組み合わせて、治療に有効な量のＰＩ３Ｋβ阻害剤を患者に投与することを含む、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤に耐性のある癌細胞を有する患者を治療する方法に関する。
【０１０８】
ＲＡＦ阻害剤に耐性のある癌細胞では、ｐＳ６のレベルは低下しないことがあり、ＴＯＲＣ１活性が抑制されていないことを示す。こうして、Ｓ６のリン酸化の阻害は、上で定められた組合せの有益な活性をモニターするためのバイオマーカーとして使用され得る：Ｓ６のリン酸化が、上で定められた組合せの投与の後、阻害されれば（耐性癌細胞におけるｐＳ６のレベルが低下するということを意味する）、それは、耐性が、上で定められた組合せによって克服され得ることを示す。
【０１０９】
「ｐＳ６」は、リン酸化されたリボソームタンパク質Ｓ６を意味する。
【０１１０】
こうして、別の態様において、本発明は、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤に耐性のある癌細胞への、ＰＩ３Ｋβ阻害剤およびＲＡＦ阻害剤を含む組合せの有効性のバイオマーカーとしてのタンパク質ｐＳ６の使用に関する。特定の実施形態において、前記組合せは、本発明による組合せである。
【０１１１】
一実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤に耐性のある癌細胞を有する患者の、上で定められた組合せに対する応答をモニターするｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
ｉ）最初の時点で、前記患者の、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤に耐性のある癌細胞におけるタンパク質ｐＳ６の量を求めること、
ｉｉ）後の時点で、前記患者の、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤に耐性のある癌細胞におけるタンパク質ｐＳ６の量を求めること、
ｉｉｉ）ステップｉ）のタンパク質ｐＳ６の量と、ステップｉｉ）におけるタンパク質ｐＳ６の量とを比較すること、および
ｉｖ）ステップｉ）のタンパク質ｐＳ６の量が、ステップｉｉ）におけるタンパク質ｐＳ６の量に等しいか、または超えている場合、患者は前記組合せに応答すると判定すること
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法に関する。
【０１１２】
「患者は応答する」は、本発明の組合せが、ＴＯＲＣ１活性を低下させるまたは抑制し、Ｓ６リン酸化レベルの安定化または低下に、特に疾患の安定化または縮小に導くことを意味する。
【０１１３】
一実施形態では、ステップｉｖ）において、スッテプｉ）のタンパク質ｐＳ６の量は、ステップｉｉ）におけるタンパク質ｐＳ６の量を超えている。より詳細には、スッテプｉ）のタンパク質ｐＳ６の量は、ステップｉｉ）におけるタンパク質ｐＳ６の量の少なくとも３０％だけ、好ましくは、ステップｉｉ）におけるタンパク質ｐＳ６の量の少なくとも５０％だけ、超えている。
【０１１４】
一実施形態において、ステップｉ）は、前記組合せの投与の前に行われ、ステップｉｉ）は、患者への前記組合せの投与の後に行われる。この特定の実施形態では、ステップｉｖ）において、ステップｉ）のタンパク質ｐＳ６の量がステップｉｉ）におけるタンパク質ｐＳ６の量を超えている場合、患者が前記組合せに応答することが判定され得る。
【０１１５】
別の実施形態において、スッテプｉ）およびｉｉ）は、どちらも、前記組合せを患者に投与した後、異なる時点で、行われる。この特定の実施形態において、ステップｉｖ）において、ステップｉ）のタンパク質ｐＳ６の量がステップｉｉ）におけるタンパク質ｐＳ６の量に等しいかまたは超えている場合、患者は前記組合せに応答すると判定され得る。
【０１１６】
一実施形態において、タンパク質ｐＳ６の量は、ウェスタンブロッティングによって求められ得る。他の方法が、ｐＳ６阻害のレベルをモニターするために用いられてもよい。
【０１１７】
一実施形態において、患者の耐性癌細胞は、少なくとも１つのＲＡＦ阻害剤に対する非感受性癌細胞である。
【０１１８】
一般に、純粋な状態の、または適切な医薬組成物における、ＰＩ３ＫβおよびＲＡＦ阻害化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和形は、当技術分野において知られている受け入れられた投与方式または媒介物のいずれかにより投与され得る。前記化合物は、例えば、経口、経鼻、非経口（静脈内、筋肉内、または皮下）、局所、経皮、腟内、膀胱内、大槽内、または直腸内投与され得る。剤形は、例えば、錠剤、ピル、ソフト弾性ゼラチンカプセルもしくはハードゼラチンカプセル、粉末、溶液、懸濁液、座薬、エアロゾルなどのような、例えば、固形、半固形、凍結乾燥粉末、または液体剤形で、より詳細には、正確な投薬量の簡単な投与に適する単位剤形であり得る。投与の特定の経路は、経口であり、特に、日々の簡便な投薬計画が、治療される疾患の重篤度に応じて調節可能とされ得るものである。
【０１１９】
補助剤および佐剤には、例えば、保存剤、湿潤剤、懸濁剤、甘味料、香味料、芳香剤、乳化剤および分散剤が含まれ得る。微生物の作用の防止は、通常、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などのような、様々な抗菌および抗真菌剤によって実現される。糖、塩化ナトリウムなどのような等張剤もまた含められ得る。注入可能な医薬剤形の長期に渡る吸収は、吸収を遅らせる作用剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。補助剤には、また、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および、例えば、クエン酸、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、ブチル化ヒドロキシトルエンなどのような酸化防止剤も含まれ得る。
【０１２０】
非経口注入に適する剤形には、生理学的に許容される無菌の水溶液または非水溶液、分散体、懸濁液またはエマルジョン、および無菌の注入可能溶液または分散体に再構成される無菌の粉末が含まれ得る。適切な水性および非水性担体、希釈剤、溶媒またはビヒクルの例には、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グルセロールなど）、適切なこれらの混合物、植物油（例えばオリーブオイル）、およびオレイン酸エチルのような注入可能な有機エステルが含まれる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散体の場合には必要とされる粒径の維持によって、また、界面活性剤の使用によって、保つことができる。
【０１２１】
経口投与のための固形剤形には、カプセル、錠剤、ピル、粉末、および顆粒が含まれる。このような固形剤形において、活性化合物は、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウムのような少なくとも１つの通例の不活性添加剤（または担体）、または（ａ）フィラーもしくは増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸、（ｂ）バインダー、例えば、セルロース誘導体、デンプン、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、およびアカシアゴム、（ｃ）保湿剤、例えば、グリセロール、（ｄ）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、クロスカルメロースナトリウム、複合ケイ酸塩、および炭酸ナトリウム、（ｅ）溶解遅延剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｒｅｔａｒｄｅｒ）、例えばパラフィン、（ｆ）吸収促進剤、例えば、第四級アンモニウム化合物、（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコール、およびグリセロールモノステアレート、ステアリン酸マグネシウムなど、（ｈ）吸着剤、例えば、カオリンおよびベントナイト、ならびに（ｉ）滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、またはこれら混合物と混合される。カプセル、錠剤、およびピルの場合には、剤形は、また、緩衝剤を含み得る。
【０１２２】
前記の固形剤形は、溶腸コーティングおよび当技術分野においてよく知られている他のもののような、コーティングおよびシェルにより製造され得る。それらは、安定化剤（ｐａｃｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含んでいてもよく、１つまたはそれ以上の活性化合物を、腸管の特定の部分において、遅延方式で放出する組成物であり得る。使用され得る埋め込まれる構成物の例は、ポリマー物質およびワックスであり得る。活性化合物はまた、適切であれば、１つまたはそれ以上の前記添加剤による、マイクロカプセル化された形として存在してもよい。
【０１２３】
経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容されるエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシル剤が含まれる。このような剤形は、本明細書に記載されたＲＡＦもしくはＰＩ３Ｋβ阻害剤化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩、および任意選択の医薬佐剤を、例えば、水、生理食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール、エタノールなどのような担体；安定化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド；オイル、特に、綿実油、ピーナッツオイル、トウモロコシ胚芽油、オリーブオイル、ひまし油およびゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタン脂肪酸エステル；または、これらの物質の混合物などに、例えば、溶かす、分散させるなどして、溶液又は懸濁液を生成することによって製造される。
【０１２４】
懸濁液は、活性化合物に加えて、懸濁剤、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、マイクロクリスタリンセルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカント、またはこれらの物質の混合物などを含み得る。
【０１２５】
直腸内投与のための組成物は、例えば、本明細書に記載された化合物と、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコールまたは座薬ワックスのような適切な非刺激性添加剤または担体（これらは、常温で固体であるが、体温では液体であり、その結果、適切な体腔にある間に溶融し、そこに活性化合物を放出する）とを混合することによって製造され得る座薬である。
【０１２６】
局所投与のための剤形には、例えば、軟膏、粉末、スプレー、および吸入剤が含まれ得る。活性成分は、無菌状態で、生理学的に許容される担体、および必要とされ得る任意の保存剤、緩衝剤、または噴射剤と混合される。眼科用製剤、目軟膏、粉末、および溶液もまた用いられ得る。
【０１２７】
通常、意図される投与方式に応じて、薬学的に許容される組成物は、約１重量％から約９９重量％の本明細書に記載された化合物、または薬学的に許容されるそれらの塩、および９９重量％から１重量％の薬学的に許容される添加剤を含むであろう。一例として、本発明の組成物は、約５重量％と約７５重量％の間の本明細書に記載された化合物、または薬学的に許容されるそれらの塩を含み、残りの部分は、適切な医薬用添加剤であろう。
【０１２８】
このような剤形を製造する実際の方法は、当業者に知られているか、または明らかであろう。例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、１８版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９９０年）が参照される。
【０１２９】
本発明によれば、実施形態の各々は、個々に、または可能な全ての組合せとして、考慮され得る。
【０１３０】
実施例が、例示の目的で、本発明の特定の具体的実施形態を説明するために、下に記載されている。しかし、特許請求の範囲は、本明細書に記載されている実施例によって、決して限定されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ−２６６−４における化合物（ＩＩ）と組み合わせた化合物（Ｉ）のインビトロ抗増殖活性のイソボログラム表示である。
【図２】ヒトメラノーマ細胞株Ａ２０５８における化合物（ＩＩ）と組み合わせた化合物（Ｉ）のインビトロ抗増殖活性のイソボログラム表示である。
【発明を実施するための形態】
【０１３２】
〔実施例〕
ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ−２６６−４およびＡ２０５８（両方ともＢＲＡＦ変異体およびＰＴＥＮ欠損）における細胞増殖に対する阻害活性と、細胞死の誘導と、Ｓ６リン酸化とにおける、ＰＩ３Ｋβ阻害剤（化合物Ｉ）とＢＲＡＦ阻害剤（化合物ＩＩ）の間の相互作用を試験するために、いくつかのインビトロ実験を実施した。メラノーマ細胞株Ａ２０５８は、ＷＭ−２６６−４のような感受性細胞株と比較して、より低い抗増殖効果を有する単独剤として、化合物（ＩＩ）に対して不感受性であると示された（それぞれ、およそ１，２００ｎＭおよび６０ｎＭのＩＣ４０）。
【０１３３】
両細胞株における化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）の間の相互作用が、混合物中の化合物の異なる効果的画分ｆに対する相乗効果を調査することを可能にする、Ｒ．Ｓｔｒａｅｔｅｍａｎｓ（Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，４７，２００５）に記載のレイデザインアプローチを用いて特性化され、効果的画分は、各レイに対して一定であった。各組合せと各細胞株に対する代表的な実験を本明細書以下で示す。両方の化合物の単独または組合せによって誘導された細胞死を、ＰＡＲＰタンパク質の開裂を検出することによって、アポトーシスを調査することを可能にするウエスタンブロット法を用いて特性化した。
【０１３４】
両方の化合物の単独または組合せによるリボソームＳ６タンパク質リン酸化における阻害効果を、Ｓｅｒ２４０／２４４タンパク質（ｐＳ６）上でリン酸化されたリボソームタンパク質Ｓ６の発現を検出することによって、Ｓ６リン酸化を調査することを可能にするウエスタンブロット法を用いて特性化した。
【実施例１】
【０１３５】
ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ−２６６−４における化合物（ＩＩ）と組み合わせた化合物（Ｉ）のインビトロ抗増殖活性
ＢＲＡＦ阻害剤化合物（ＩＩ）と組み合わせたＰＩ３Ｋβ選択的阻害剤化合物（Ｉ）の抗増殖活性を評価するために、ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ−２６６−４（ＢＲＡＦ変異体およびＰＴＥＮ欠損）を用いて実験を実施した。インビトロ組合せ試験の前に、個々の薬剤の活性を、ＷＭ−２６６−４細胞株を用いて調査した。個々の試薬を試験する目的は、それらの働きの独立性を決定すること、および固定比薬物組合せアッセイの希釈デザインを決定することであった。化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）の間の相互作用の特性化を、レイデザイン法と、異なる薬物効能比にて組合せの利益を評価する、関連した統計学的解析を用いて試験した。
【０１３６】
材料と方法
ヒトメラノーマＷＭ−２６６−４細胞株をＡＴＣＣにて購入した（参照番号ＣＲＬ−１６７６  Ｂａｔｃｈ  ３２７２８２６）。ＷＭ−２６６−４細胞を、１０％ＦＢＳおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。
【０１３７】
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）を３０ｍＭの濃度にてＤＭＳＯ中に溶解した。これらを、１０ｍＭ〜０．０３μＭ溶液を得るために、３または３．３倍希釈段階に従って、ＤＭＳＯ中に連続希釈し、次いで各溶液を、１０％血清を含有する培養培地中、５０倍に希釈した後、２０倍の希釈倍率で有する細胞上に加えた。試験した最終濃度を、混合物中の種々の固定割合に対して、２つの化合物の相互作用を特性化することを可能にする、レイデザインによって定義した。本実験のために使用したレイデザインには、各単独剤あたり１レイ、および４組合せレイが含まれる。全てのレイは、１０濃度を有した（表１を参照のこと）。ＤＭＳＯ濃度は、対照中、および全ての処置したウェル中で、０．１％であった。
【０１３８】
【表１】
2016516682.tif 000004
【０１３９】
ＷＭ−２６６−４細胞を適切な培養培地中、９６ウェルプレートに２５００個／ウェルで播き、３７℃、５％ＣＯ２にて６時間インキュベートした。細胞を、該薬物比に依存して、化合物（Ｉ）の濃度を１〜３０，０００ｎＭの範囲に増加させ、化合物（ＩＩ）の濃度を０．００１〜１０，０００ｎＭの範囲に増加させてグリッド様式で処理し、９６時間インキュベートした。細胞増殖を、細胞内ＡＴＰを製造業者のプロトコールに従って、ＣｅｌｌｔｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定することによって評価した。簡単には、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）を各プレートに加え、１時間インキュベートし、次いで、蛍光シグナルを、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔプレートリーダー上で読み取った。３つの実験を細胞株上で実施した。各実験に対して、２枚の９６ウェルプレートを使用し、２連で実施を可能にした。
【０１４０】
細胞増殖の阻害を、４日間の１つの化合物または化合物の組合せでの処理の後に推定し、ビヒクル（ＤＭＳＯ）で処理した細胞に対してシグナルを比較した。
【０１４１】
増殖阻害百分率（ＧＩ％）を、以下の等式に従って計算した：ＧＩ％＝１００＊（１−（（Ｘ−ＢＧ）／（ＴＣ−ＢＧ））。
式中、数値は以下のように定義される。
Ｘ＝化合物（Ｉ）または（ＩＩ）の単独または組合せの存在下、細胞を含有するウェルの値、
ＢＧ＝培地あり、および細胞なしのウェルの値、
ＴＣ＝ビヒクル（ＤＭＳＯ）の存在下、細胞を含有するウェルの値。
【０１４２】
増殖阻害百分率から、絶対ＩＣ４０を、ＧＩ％が４０％と等しい時の化合物の濃度として定義する。
【０１４３】
この測定により、本明細書以下で記述する統計学的方法を用いて、潜在的相乗的組合せを決定することが可能になる。
【０１４４】
相対強度ρをまず
【数１】
2016516682.tif 000005
（式中、ＩＣ４０（１）は化合物（Ｉ）のＩＣ４０であり、ＩＣ４０（２）は化合物（ＩＩ）のＩＣ４０である）として推定する。
【０１４５】
次いで、レイｉに対するこの効果的画分を
【数２】
2016516682.tif 000006
（式中
【数３】
2016516682.tif 000007
は混合物中の化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の濃度の定数比である）として計算する。
【０１４６】
ソフトウェアＳＡＳ  Ｖ９．２のＮＬＭＩＸＥＤ手順を用いるグローバル非直線モデルを適用して、各レイに対する濃度応答曲線を同時に適合する。使用するモデルは、以下の等式に対応する４パラメータロジスティックモデルである。
【数４】
2016516682.tif 000008
Ｙｉｊｋは、ｉ番目のレイにおけるｊ番目の濃度のｋ番目の複製に対する阻害の割合である。
Ｃｏｎｃｉｊはｉ番目のレイ中のｊ番目の混合濃度（化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）の濃度の合計）である。Ｅｍｉｎｉはｉ番目のレイから得た最小効果である。
Ｅｍａｘｉはｉ番目のレイから得た最大効果である。
ＩＣ５０ｉは、ｉ番目のレイから得られたＩＣ５０である。
ｍｉは、ｉ番目のレイからのデータによって調整した曲線の傾きである。
εｉｊｌは、ｉ番目のレイ中のｊ番目の濃度のｋ番目の複製に対する残余であり、εｉｊｋ〜Ｎ（０，σ２）である。
Ｅｍｉｎ、Ｅｍａｘおよび／または傾きは、適合の品質を損なうことなしに、可能であるかどうかを共有した。
【０１４７】
次いで、各レイの組合せ指数Ｋｉと、その９５％信頼性区間をロエベ相加性モデルに基づいた、以下の等式を用いて推定した。
【数５】
2016516682.tif 000009
式中ＩＣ４０（１）とＩＣ４０（２）は、各化合物単独に対する４０％の阻害を得るために必要な、化合物（１）および化合物（２）の濃度であり、Ｃ（１）およびＣ（２）は、４０％阻害を得るために必要な混合物中の化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）の濃度である。
【０１４８】
次いで、相加性を組合せ指数（Ｋｉ）の信頼区間が１を含む場合に結論づけ、有意な相乗効果が、Ｋｉの信頼区間の上限が１未満である時に結論づけ、有意なアンタゴニズムが、Ｋｉの信頼区間の下限が１より大きい場合に結論づけた。
【０１４９】
イソボログラム表示は、点（０，１）を点（１，０）に結合している線によって表される、相加性状態に従った、各レイの位置を可視化することを可能にする。この線より下の全てのレイは、潜在的相乗状況に相当し、一方で、この線より上の全てのレイは、潜在的拮抗状況に相当する。
【０１５０】
インビトロ試験の結果
単独剤としての化合物（Ｉ）が、６，６８８ｎＭのＩＣ４０にてＷＭ−２６６−４細胞の増殖を阻害した。単独剤としての化合物（ＩＩ）が、３５ｎＭのＩＣ４０にてＷＭ２６６−４細胞の増殖を阻害した（以下図２を参照のこと）。
【０１５１】
【表２】
2016516682.tif 000010
【０１５２】
イソボログラム表示（図１）と表３から、有意な相乗効果が、化合物（Ｉ）が、混合物中化合物（ＩＩ）以下で存在する場合の状況に相当する、０．０５〜０．６２の、混合物中の化合物（Ｉ）の効果的画分ｆに対して、０．２８〜０．５５の範囲のＫｉにて観察される。
【０１５３】
【表３】
2016516682.tif 000011
【０１５４】
これらのデータは、３つの異なる実験からの代表的試験に相当する。これらの３つの実験に対して、相乗効果または、相乗効果に対する傾向を有する相加性が、０．０４〜０．６２の間の効果的画分ｆに対して観察された。
【実施例２】
【０１５５】
ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ−２６６−４における化合物（ＩＩ）と組み合わせた化合物（Ｉ）のインビトロアポトーシス促進活性
ＢＲＡＦ阻害剤化合物（ＩＩ）と組み合わせたＰＩ３Ｋβ選択的阻害剤化合物（Ｉ）のアポトーシス促進活性を評価するために、ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ−２６６−４（ＢＲＡＦ変異体およびＰＴＥＮ欠損）を用いて実験を実施した。化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）の間の相互作用の特性化を、ＰＡＲＰタンパク質の開裂を検出することによって、アポトーシスを調査することを可能にする、開裂ＰＡＲＰの発現を測定する、ウエスタンブロット法を用いて試験した。
【０１５６】
材料と方法
ヒトメラノーマＷＭ−２６６−４細胞株をＡＴＣＣにて購入した（参照番号ＣＲＬ−１６７６  Ｂａｔｃｈ  ３２７２８２６）。ＷＭ−２６６−４細胞を、１０％ＦＢＳおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。
【０１５７】
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）を、１０ｍＭの濃度にて、ＤＭＳＯ中に溶解した。これらを、１ｍＭ溶液を得るために、ＤＭＳＯ中１０倍段階希釈に従って希釈した。次いで１０ｍＭおよび１ｍＭでの各溶液を、１０％血清を含有する培養培地中、５０倍で希釈した後、２０倍の希釈倍率にて細胞上に加えて、１０，０００ｎＭおよび１，０００ｎＭの最終濃度に達した。最終ＤＭＳＯ濃度は、対照および全ての処理細胞において、０．１％であった。
【０１５８】
ＷＭ−２６６−４細胞を完全培養培地中、６ウェルマイクロプレートに１ウェルあたり１００００００個で播種し、３７℃、５％ＣＯ２にて一晩インキュベートした。次いで、細胞を、化合物（Ｉ）の存在、または不在下、および化合物（ＩＩ）の存在または不在下、２４時間３７℃にて、５％ＣＯ２の存在下、インキュベートした。
【０１５９】
細胞処理期間の最後に、接着細胞ならびに細胞培養上清中の細胞を、タンパク質の製造のために溶解した。細胞を、Ｈｅｐｅｓ  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、グリセリン１０％、Ｔｒｉｔｏｎ  １％、ｐＨ＝７．５を含み、１００倍希釈したプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤のカクテルを準備なしに加えた溶解緩衝液中で溶解した。各試料中のタンパク質濃度を、製造業者の説明書に従って、ｍｉｃｒｏＢＣＡ技術を用いて決定した。ウエスタンブロットを、各ゲルウェル中２０μｇのタンパク質をロードし、操作手順に従って実施した。ＰＡＲＰ開裂を、開裂ＰＡＲＰ（ａｓｐ２１４）ウサギポリクローナル抗体、続いて抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰコンジュゲート抗体を用いて明らかにした。ＧＡＰＤＨを、抗ＧＡＰＤＨウサギモノクローナル抗体１４Ｃ１０と、続いて抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰコンジュゲート抗体を用いて、対照におけて明らかにした。操作手順説明書に従ったウエスタンブロット顕色の後、蛍光を富士フイルム（Ｒａｙ  Ｔｅｓｔ）機器を用いて読み取った。
【０１６０】
本器具は、各選択したバンドに対して、富士フイルムマシン（ＡＵ）で得た蛍光の総シグナルを測定する。次いで、選択したバンドのサイズまたは面積に比例して、バックグラウンド値（ＢＧ）を差し引く。バックグラウンドを、ウエスタンブロットの特定のバックグラウンド上でとったバンドから計算し、各バンドに対して特定のシグナルまたは（ＡＵ−ＢＧ）を得る。誘導倍率の計算を、以下の式を用いて、化合物または化合物の組合せでの各処理に対して実施する。
誘導倍率＝（（ＡＵ−ＢＧ）ｔ／（ＡＵ−ＢＧ）ｓｔ）＊１００。
式中、値は下記の通り定義する。
（ＡＵ−ＢＧ）ｔ＝化合物（Ｉ）または（ＩＩ）の単独または組合せで処理した細胞を含むウェル値
（ＡＵ−ＢＧ）ｓｔ＝溶媒（ＤＭＳＯ）で処理した細胞を含むウェル値
【０１６１】
インビトロ試験の結果
未処理細胞と比較して、１０，０００ｎＭの濃度での単独剤としての化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）は、有意なＷＭ２６６−４細胞アポトーシスを誘導せず、それぞれ０．７１および１．３８のＰＡＲＰ開裂の誘導倍率であった。１０，０００ｎＭの化合物（Ｉ）および１０，０００ｎＭの化合物（ＩＩ）で細胞を処理した組合せ群において、未処理細胞と比較して、組合せ処理は、３．２６のＰＡＲＰ開裂の誘導倍率でＷＭ−２６６−４細胞アポトーシスを誘導した。１０，０００ｎＭの化合物（Ｉ）および１０，０００ｎＭの化合物（ＩＩ）で細胞を処理した組合せ群において、未処理細胞と比較して、組合せ処理は、４．３１の誘導倍率で細胞アポトーシスを誘導した。タキソテールは、２．８８のＰＡＲＰ開裂の誘導倍率で、アポトーシス誘導の陽性対照として示される（表４を参照のこと）。
【０１６２】
これらのデータは、２つの独立した実験からの代表的試験に相当する。
【０１６３】
ＧＡＰＤＨ発現を、ローディング対照として、ウエスタンブロットの下パネル中で制御した。
【０１６４】
【表４】
2016516682.tif 000012
【実施例３】
【０１６５】
ヒトメラノーマ細胞株Ａ２０５８における化合物（ＩＩ）と組み合わせた化合物（Ｉ）のインビトロ抗増殖活性
ＢＲＡＦ阻害剤化合物（ＩＩ）と組み合わせたＰＩ３Ｋβ選択的阻害剤化合物（Ｉ）の抗増殖活性を評価するために、ヒトメラノーマ細胞株Ａ２０５８（ＢＲＡＦ変異体、ＰＴＥＮ欠損および前記ＢＲＡＦ阻害剤に対して不感受性）を用いて実験を実施した。化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）の間の相互作用の特性化を、レイデザイン法と、異なる薬物効能比にて組合せの利点を評価する、関連する統計学的解析を用いて研究した。
【０１６６】
材料と方法
ヒトメラノーマＡ２０５８細胞株をＡＴＣＣにて購入した（参照番号ＣＲＬ−１１１４７  Ｂａｔｃｈ  ５０７４６５１）。Ａ２０５８細胞を、１０％ＦＢＳおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ  Ｈｉｇｈグルコース培地中で培養した。
【０１６７】
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）希釈液を、実施例１の材料と方法に従って製造した。試験した最終濃度を、以下の記述するレイデザイン法に従って定義した。ＤＭＳＯ濃度は、対照および全ての処理細胞において、０．１％であった。
【０１６８】
混合物中の種々の固定割合に対して、２つの化合物の相互作用の特性化を可能にするレイデザインを使用した。レイデザインには、各単独剤に対して１レイと、１９の組合せレイを含んだ。化合物（Ｉ）単独でのレイは、１４濃度を有し、化合物（ＩＩ）単独でのレイは、１８濃度を有し、組合せレイは、７〜１４の濃度を有した。
【０１６９】
Ａ２０５８細胞を適切な培養培地中、３８４ウェルプレートに４，０００個／ウェルで播き、３７℃、５％ＣＯ２にて６時間インキュベートした。細胞は、０．０１〜３０，０００ｎＭの範囲の増加濃度の化合物（Ｉ）、および０．０００１〜３０，０００ｎＭの範囲の増加濃度の化合物（ＩＩ）でグリッド様式で処理し、９６時間インキュベートした。製造業者のプロトコールに従って、ＣｅｌｌｔｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、細胞内ＡＴＰを測定することによって細胞増殖を評価した。簡単には、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）を各プレートに加え、１時間インキュベートし、次いで蛍光シグナルを、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔプレートリーダー上で読み取った。
【０１７０】
４つの実験を本細胞株において実施した。各実験に対して、２枚の３８４ウェルプレートを使用して、組合せレイに対して２連で、単独剤レイに対して４連で実施可能であった。
【０１７１】
単一化合物または化合物の組合せで４日間処理した後、ビヒクル（ＤＭＳＯ）で処理した細胞に対してシグナルを比較し、実施例１に記載の等式に従って、細胞増殖の阻害を推定した。
【０１７２】
これらの測定によって、実施例１に記載の統計学的方法を用いることにおける、潜在的相乗的組合せを決定することが可能である。
【０１７３】
インビトロ試験の結果
単独剤としての化合物（Ｉ）が、１１，５００ｎＭのＩＣ４０にてＡ２０５８細胞の増殖を阻害し、単独剤としての化合物（ＩＩ）が、１，８９０ｎＭのＩＣ４０にてＡ２０５８細胞の増殖を阻害した（以下表５を参照のこと）。
【０１７４】
【表５】
2016516682.tif 000013
【０１７５】
イソボログラム表示（図２）および表６から、有意な相乗効果が、０．０５〜０．９４の間の混合物中の化合物（Ｉ）の全ての効果的画分ｆに対して、０．２３〜０．５５の範囲のＫｉで観察された。
【０１７６】
【表６】
2016516682.tif 000014
【０１７７】
これらのデータは、４つの独立実験からの代表的試験に相当する。
【０１７８】
これらの４つの実験に対して、有意な相乗効果または相乗効果の傾向を有する相加性が、０．０５〜０．９４の間の混合物中の化合物（Ｉ）の効果的画分ｆの全てで観察された。
【実施例４】
【０１７９】
ヒトメラノーマ細胞株Ａ２０５８における化合物（ＩＩ）と組み合わせた化合物（Ｉ）のインビトロアポトーシス促進活性
ＢＲＡＦ阻害剤化合物（ＩＩ）と組み合わせたＰＩ３Ｋβ選択的阻害剤化合物（Ｉ）のアポトーシス促進活性を評価するために、ヒトメラノーマ細胞株Ａ２０５８（ＢＲＡＦ変異体、ＰＴＥＮ欠損および前記ＢＲＡＦ阻害剤に対して不感受性）を用いて実験を実施した。化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）の間の相互作用の特性化を、ＰＡＲＰタンパク質の開裂を検出することによって、アポトーシスを調査することを可能にする、ウエスタンブロット法を用いて試験した。
【０１８０】
材料と方法
ヒトメラノーマＡ２０５８細胞株をＡＴＣＣにて購入した（参照番号ＣＲＬ−１１１４７  Ｂａｔｃｈ  ５０７４６５１）。Ａ２０５８細胞を、１０％ＦＢＳおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ  Ｈｉｇｈグルコース培地中で培養した。
【０１８１】
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）を実施例１の材料と方法に従って製造した。
【０１８２】
細胞処理、ウエスタンブロット実験およびアポトーシス誘導倍率の計算を、実施例２に記載の材料と方法に従って実施した。
【０１８３】
インビトロ試験の結果
未処理細胞と比較して、１０，０００ｎＭの濃度での単独剤としての化合物（Ｉ）または化合物（ＩＩ）は、それぞれ１．１７および１．００のＰＡＲＰ開裂の誘導倍率で、顕著なＡ２０５８細胞アポトーシスを誘導しなかった。１０，０００ｎＭの化合物（Ｉ）および１０，０００ｎＭの化合物（ＩＩ）で細胞を処理した組合せ群において、組合せ処理は、１．４４のＰＡＲＰ開裂の誘導倍率でＡ２０５８細胞アポトーシスを誘導した。１０，０００ｎＭの化合物（Ｉ）および１，０００ｎＭの化合物（ＩＩ）で細胞を処理した組合せ群において、組合せ処理は、１．６１のアポトーシスの誘導倍率でＡ２０５８細胞アポトーシスを誘導した。タキソテールは、１．６６のＰＡＲＰ開裂の誘導倍率で、アポトーシス誘導の陽性対照として示す（表７を参照のこと）。
【０１８４】
これらのデータは、２つの独立した実験からの代表的試験に相当する。
【０１８５】
ＧＡＰＤＨ発現を、ローディング対照として、ウエスタンブロットの下パネル中で制御した。
【０１８６】
【表７】
2016516682.tif 000015
【実施例５】
【０１８７】
濃度依存的な、ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ−２６６−４における化合物（ＩＩ）と組み合わせた化合物（Ｉ）のインビトロアポトーシス促進活性
ＢＲＡＦ阻害剤化合物（ＩＩ）と組み合わせたＰＩ３Ｋβ選択的阻害剤化合物（Ｉ）のアポトーシス促進活性を評価するために、ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ−２６６−４（ＢＲＡＦ変異体、ＰＴＥＮ欠損およびＢＲＡＦ阻害剤に対して感受性）を用いて実験を実施した。化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）の間の相互作用の特性化を、ＰＡＲＰタンパク質の開裂を検出することによって、アポトーシスを調査することを可能にする、ウエスタンブロット法を用いて試験した。
【０１８８】
材料と方法
ヒトメラノーマＷＭ−２６６−４細胞株をＡＴＣＣにて購入した（参照番号ＣＲＬ−１６７６  Ｂａｔｃｈ  ３２７２８２６）。ＷＭ−２６６−４細胞を、１０％ＦＢＳおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。
【０１８９】
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）を１０ｍＭの濃度にてＤＭＳＯ中に溶解した。これらを、１ｍＭ溶液および０．１ｍＭ溶液を得るために、ＤＭＳＯ中２つの１０倍段階希釈に従って希釈した。次いで１０ｍＭ、１ｍＭおよび０．１ｍＭの各溶液を、１０％血清を含有する培養培地中、５０倍で希釈した後、２０倍希釈倍率にて細胞上に加え、１０，０００ｎＭ、１，０００ｎＭおよび１００ｎＭの最終濃度に達した。最終ＤＭＳＯ濃度は、対照および全ての処理細胞において、０．１％であった。
【０１９０】
細胞処理、ウエスタンブロット実験、およびアポトーシス誘導倍率の計算は、実施例２に記載の材料と方法に従って実施した。
【０１９１】
インビトロ試験の結果
未処理細胞と比較して、単独剤としての化合物（Ｉ）または化合物（ＩＩ）は、１０，０００ｎＭ、１，０００ｎＭおよび１００ｎＭの濃度にて、それぞれ６．８６、１．９６、０．９４（化合物Ｉ）、および３．４２、２．５９、１．６２（化合物ＩＩ）のＰＡＲＰ開裂の誘導倍率で、濃度依存的にＷＭ−２６６−４細胞アポトーシスを誘導する。
【０１９２】
増加濃度の化合物（Ｉ）および１０，０００ｎＭの化合物（ＩＩ）で細胞を処理した比較群において、組合せ処理は、１０，０００ｎＭ、１，０００ｎＭおよび１００ｎＭの化合物（Ｉ）濃度にて、それぞれ３１．０６、１１．６９および４．６９のＰＡＲＰ開裂の誘導倍率で、ＷＭ−２６６−４細胞アポトーシスを誘導した。
【０１９３】
増加濃度の化合物（Ｉ）および１，０００ｎＭの化合物（ＩＩ）で細胞を処理した比較群において、組合せ処理は、１０，０００ｎＭ、１，０００ｎＭおよび１００ｎＭの化合物（Ｉ）濃度にて、それぞれ４４．３７、１２．５６および３．７６のＰＡＲＰ開裂の誘導倍率で、ＷＭ−２６６−４細胞アポトーシスを誘導した。
【０１９４】
増加濃度の化合物（Ｉ）および１００ｎＭの化合物（ＩＩ）で細胞を処理した比較群において、組合せ処理は、１０，０００ｎＭ、１，０００ｎＭおよび１００ｎＭの化合物（Ｉ）濃度にて、それぞれ１９．６８、３．８４および１．６５のＰＡＲＰ開裂の誘導倍率で、ＷＭ−２６６−４細胞アポトーシスを誘導した。
【０１９５】
全体で、これらのデータは、化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の全ての評価された画分に対して、よりよいアポトーシス誘導が、単独剤と比較して、組合せ処理に対して観察されたことを示す。
【０１９６】
タキソテールは、１．５６のＰＡＲＰ開裂の誘導倍率で、アポトーシス誘導の陽性対照として示す（表８を参照のこと）。
【０１９７】
これらのデータは、２つの独立した実験からの代表的試験に相当する。
【０１９８】
ＧＡＰＤＨ発現を、ローディング対照としてウエスタンブロットの下パネル中で照合した。
【０１９９】
【表８】
2016516682.tif 000016
【実施例６】
【０２００】
濃度依存的な、ヒトメラノーマ細胞株Ａ２０５８における化合物（ＩＩ）と組み合わせた化合物（Ｉ）のインビトロアポトーシス促進活性
ＢＲＡＦ阻害剤化合物（ＩＩ）と組み合わせたＰＩ３Ｋβ選択的阻害剤化合物（Ｉ）のアポトーシス促進活性を評価するために、ヒトメラノーマ細胞株Ａ２０５８（ＢＲＡＦ変異体、ＰＴＥＮ欠損およびＢＲＡＦ阻害剤に対して不感受性）を用いて実験を実施した。化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）の間の相互作用の特性化を、ＰＡＲＰタンパク質の開裂を検出することによって、アポトーシスを調査することを可能にする、ウエスタンブロット法を用いて試験した。
【０２０１】
材料と方法
ヒトメラノーマＡ２０５８細胞株をＡＴＣＣにて購入した（参照番号ＣＲＬ−１１１４７  Ｂａｔｃｈ  ５０７４６５１）。Ａ２０５８細胞を、１０％ＦＢＳおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ  Ｈｉｇｈグルコース培地中で培養した。
【０２０２】
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）を、実施例５の材料と方法に従って製造した。
【０２０３】
細胞処理、ウエスタンブロット実験およびアポトーシス誘導倍率の計算を、実施例２に記載の材料と方法に従って実施した。
【０２０４】
インビトロ試験の結果
未処理細胞と比較して、単独剤としての化合物（Ｉ）または化合物（ＩＩ）は、１０，０００ｎＭ、１，０００ｎＭおよび１００ｎＭの濃度にて、それぞれ２．４３、１．２６、１．１２（化合物Ｉ）、および２．４４、２．１３、１．１４（化合物ＩＩ）のＰＡＲＰ開裂の誘導倍率で、濃度依存的にＡ２０５８細胞アポトーシスを誘導する。
【０２０５】
増加濃度の化合物（Ｉ）および１０，０００ｎＭの化合物（ＩＩ）で細胞を処理した組合せ群において、組合せ処理は、１０，０００ｎＭ、１，０００ｎＭおよび１００ｎＭの化合物（Ｉ）濃度にて、それぞれ４．４２、４．０５および２．９７のＰＡＲＰ開裂の誘導倍率で、Ａ２０５８細胞アポトーシスを誘導した。
【０２０６】
増加濃度の化合物（Ｉ）および１，０００ｎＭの化合物（ＩＩ）で細胞を処理した組合せ群において、組合せ処理は、１０，０００ｎＭ、１，０００ｎＭおよび１００ｎＭの化合物（Ｉ）濃度にて、それぞれ６．７３、４．４１および２．８６のＰＡＲＰ開裂の誘導倍率で、Ａ２０５８細胞アポトーシスを誘導した。
【０２０７】
増加濃度の化合物（Ｉ）および１００ｎＭの化合物（ＩＩ）で細胞を処理した組合せ群において、組合せ処理は、１０，０００ｎＭ、１，０００ｎＭおよび１００ｎＭの化合物（Ｉ）濃度にて、それぞれ３．８３、２．０４および１．２８のＰＡＲＰ開裂の誘導倍率で、Ａ２０５８細胞アポトーシスを誘導した。
【０２０８】
全体で、これらのデータは、化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の全ての評価された画分に対して、単独剤と比較してよりよいアポトーシス誘導が、組合せ処理に対して観察されたことを示す。
【０２０９】
タキソテールは、６．７９のＰＡＲＰ開裂の誘導倍率で、アポトーシス誘導の陽性対照として示す（表９を参照のこと）。
【０２１０】
これらのデータは、２つの独立した実験からの代表的試験に相当する。
【０２１１】
ＧＡＰＤＨ発現を、ローディング対照としてウエスタンブロットの下パネル中で照合した。
【０２１２】
【表９】
2016516682.tif 000017
【実施例７】
【０２１３】
ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ−２６６−４における化合物（ＩＩ）と組み合わせた化合物（Ｉ）のインビトロＳ６リン酸化阻害
ＢＲＡＦ阻害剤化合物（ＩＩ）と組み合わせたＰＩ３Ｋβ選択的阻害剤化合物（Ｉ）によるＳ６リン酸化の阻害を評価するために、ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ−２６６−４（ＢＲＡＦ変異体およびＰＴＥＮ欠損）を用いて実験を実施した。化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）の間の相互作用の特性化を、ｐＳ６の発現を測定するウエスタンブロット法を用いて試験した。
【０２１４】
材料と方法
ヒトメラノーマＷＭ−２６６−４細胞株をＡＴＣＣにて購入した（参照番号ＣＲＬ−１６７６  Ｂａｔｃｈ  ３２７２８２６）。ＷＭ−２６６−４細胞を、１０％ＦＢＳおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。
【０２１５】
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）を、実施例５の材料と方法に従って製造した。
【０２１６】
ＷＭ−２６６−４細胞を完全培養培地中、６ウェルマイクロプレートに１００００００個／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２にて一晩インキュベートした。次いで、細胞を、化合物（Ｉ）の存在または不在下、化合物（ＩＩ）の存在または不在下、５％ＣＯ２の存在下、２４時間、３７℃にてインキュベートした。
【０２１７】
細胞処理期間の終わりに、接着細胞ならびに細胞培養上清中の細胞を、タンパク質の製造のために溶解した。細胞を、Ｈｅｐｅｓ  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、グリセリン１０％、Ｔｒｉｔｏｎ  １％、ｐＨ＝７．５を含み、１００倍希釈したプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤のカクテルを準備なしに加えた溶解培養液中で溶解した。各試料中のタンパク質濃度を、製造業者の取扱説明書に従って、ｍｉｃｒｏＢＣＡ技術を用いて決定した。ウエスタンブロットを、各ゲルウェル中２０μｇのタンパク質をロードし、操作手順に従って実施した。ｐＳ６を、リン酸化Ｓ６リボソームタンパク質（Ｓｅｒ２４０／２４４）を検出するｐＳ６ウサギポリクローナル抗体、続いて抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰコンジュゲート抗体を用いて明らかにした。ＧＡＰＤＨを、抗ＧＡＰＤＨウサギモノクローナル抗体１４Ｃ１０と、続いて抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰコンジュゲート抗体を用いて、対照におけて明らかにした。操作手順説明書に従ったウエスタンブロット明示の後、蛍光を富士フイルム（Ｒａｙ  Ｔｅｓｔ）機器を用いて読み取った。
【０２１８】
本器具は、各選択したバンドに対して、富士フイルムマシン（ＡＵ）で得た蛍光の総シグナルを測定する。次いで、選択したバンドのサイズまたは面積に比例して、バックグラウンド値（ＢＧ）を差し引く。バックグラウンドを、ウエスタンブロットの特定のバックグラウンド上でとったバンドから計算し、各バンドに対して特定のシグナルまたは（ＡＵ−ＢＧ）を得る。阻害の割合の計算を、以下の式を用いて、化合物または化合物の組合せでの各処理に対して実施する。阻害％＝１−（（（ＡＵ−ＢＧ）ｔ／（ＡＵ−ＢＧ）ｓｔ））＊１００。
【０２１９】
式中、値は
（ＡＵ−ＢＧ）ｔ＝化合物（Ｉ）または（ＩＩ）の単独または組合せで処理した細胞を含むウェル値
（ＡＵ−ＢＧ）ｓｔ＝溶媒（ＤＭＳＯ）で処理した細胞を含むウェル値
として定義する。
【０２２０】
インビトロ試験の結果
未処理細胞と比較して、単独剤としての化合物（Ｉ）または化合物（ＩＩ）は、１０，０００ｎＭ、１，０００ｎＭおよび１００ｎＭの濃度にて、それぞれ９４、９０および６９（化合物Ｉ）または９４、９２および７６（化合物ＩＩ）の阻害百分率にて、濃度依存的にＷＭ−２６６−４においてＳ６リン酸化を有意に阻害した。
【０２２１】
増加濃度の化合物（Ｉ）および１０，０００ｎＭの化合物（ＩＩ）で細胞を処理した組合せ群において、組合せ処理は、１０，０００ｎＭ、１，０００ｎＭおよび１００ｎＭの化合物（Ｉ）濃度にて、それぞれ９７、９７および９６の阻害百分率で、ＷＭ−２６６−４においてＳ６リン酸化を有意に阻害した。
【０２２２】
増加濃度の化合物（Ｉ）および１，０００ｎＭの化合物（ＩＩ）で細胞を処理した組合せ群において、組合せ処理は、１０，０００ｎＭ、１，０００ｎＭおよび１００ｎＭの化合物（Ｉ）濃度にて、それぞれ９６、９６および９５の阻害百分率で、ＷＭ−２６６−４においてＳ６リン酸化を有意に阻害した。
【０２２３】
増加濃度の化合物（Ｉ）および１００ｎＭの化合物（ＩＩ）で細胞を処理した組合せ群において、組合せ処理は、１０，０００ｎＭ、１，０００ｎＭおよび１００ｎＭの化合物（Ｉ）濃度にて、それぞれ９７、９４および８８の阻害百分率で、ＷＭ−２６６−４においてＳ６リン酸化を有意に阻害した（表１０を参照のこと）。
【０２２４】
全体として、これらのデータは、組合せ処理が、単独剤と比較して、最も低い濃度でさえも、維持された（＞８８％阻害）ｐＳ６阻害を可能にしたことを示している。
【０２２５】
これらのデータは、２つの独立した実験からの代表的試験に相当する。
【０２２６】
ＧＡＰＤＨ発現を、ローディング対照としてウエスタンブロットの下パネル中で照合した。
【０２２７】
【表１０】
2016516682.tif 000018
【実施例８】
【０２２８】
ヒトメラノーマ細胞株Ａ２０５８における化合物（ＩＩ）と組み合わせた化合物（Ｉ）のインビトロＳ６リン酸化阻害
ＢＲＡＦ阻害剤化合物（ＩＩ）と組み合わせたＰＩ３Ｋβ選択的阻害剤化合物（Ｉ）によるＳ６リン酸化の阻害を評価するために、ヒトメラノーマ細胞株Ａ２０５８（ＢＲＡＦ変異体およびＰＴＥＮ欠損）を用いて実験を実施した。化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）の間の相互作用の特性化を、Ｓ６の発現を測定するウエスタンブロット法を用いて試験した。
【０２２９】
材料と方法
ヒトメラノーマＡ２０５８細胞株をＡＴＣＣにて購入した（参照番号ＣＲＬ−１１１４７  Ｂａｔｃｈ  ５０７４６５１）。Ａ２０５８細胞を、１０％ＦＢＳおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ  Ｈｉｇｈグルコース培地中で培養した。
【０２３０】
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）を、実施例５の材料と方法に従って製造した。
【０２３１】
細胞処理、ウエスタンブロット実験およびｐＳ６阻害百分率の計算を、実施例７に記載の材料と方法に従って実施した。
【０２３２】
インビトロ試験の結果
未処理細胞と比較して、単独剤としての化合物（Ｉ）または化合物（ＩＩ）は、１０，０００ｎＭ、１，０００ｎＭおよび１００ｎＭの濃度にて、それぞれ７３、４２および８（化合物Ｉ）、または６２、４０および２７（化合物ＩＩ）の阻害百分率にて、濃度依存的にＡ２０５８におけるＳ６リン酸化を有意に阻害した。
【０２３３】
増加濃度の化合物（Ｉ）および１０，０００ｎＭの化合物（ＩＩ）で細胞を処理した比較群において、組合せ処理は、１０，０００ｎＭ、１，０００ｎＭおよび１００ｎＭの化合物（Ｉ）濃度にて、それぞれ８７、６０および６３の阻害百分率で、Ａ２０５８におけるＳ６リン酸化を有意に阻害した。
【０２３４】
増加濃度の化合物（Ｉ）および１，０００ｎＭの化合物（ＩＩ）で細胞を処理した比較群において、組合せ処理は、１０，０００ｎＭ、１，０００ｎＭおよび１００ｎＭの化合物（Ｉ）濃度にて、それぞれ８６、６５および５９の阻害百分率で、Ａ２０５８におけるＳ６リン酸化を有意に阻害した。
【０２３５】
増加濃度の化合物（Ｉ）および１００ｎＭの化合物（ＩＩ）で細胞を処理した比較群において、組合せ処理は、１０，０００ｎＭ、１，０００ｎＭおよび１００ｎＭの化合物（Ｉ）濃度にて、それぞれ８６、６９および３４の阻害百分率で、Ａ２０５８におけるＳ６リン酸化を有意に阻害した（表１１を参照のこと）。
【０２３６】
全体として、これらのデータは、組合せ処理が、単独剤と比較して、試験した濃度に対して、増加したｐＳ６阻害を可能にしたことを示している。
【０２３７】
これらのデータは、２つの独立した実験からの代表的試験に相当する。
【０２３８】
ＧＡＰＤＨ発現を、ローディング対照としてウエスタンブロットの下パネル中で照合した。
【０２３９】
【表１１】
2016516682.tif 000019
【０２４０】
インビトロ結果の要約（実施例１〜８）
以上のデータによって、選択的ＰＩ３Ｋβ阻害剤（化合物Ｉ）が、ＢＲＡＦ阻害剤（本明細書ではベムラフェニブ）に対して感受性（本明細書ではＷＭ−２６６−４細胞株）または不感受性（本明細書では、Ａ２０５８細胞株）メラノーマ細胞における、細胞増殖における阻害活性と、細胞死の誘導と、ＰＴＥＮ欠損およびＭＡＰＫ経路活性化を通した、とりわけＢＲＡＦ活性化変異を通した、示すＰＩ３Ｋ経路活性化と、を増加させるように、ベムラフェニブのようなＢＲＡＦ阻害剤（化合物ＩＩ）と相乗効果を与えうることが実証される。
【０２４１】
図１および２：実施例１および３のイソボログラム表示
ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ−２６６．４およびＡ２０５８における化合物（ＩＩ）と組み合わせた化合物（Ｉ）のインビトロ抗増殖活性
イソボログラム表示は、点（０，１）を点（１，０）に結合している線によって表される、相加性状況に従った、各レイの位置を可視化することを可能にする。この線より下の全てのレイは、潜在的相乗状況に相当し、一方で、この線より上の全てのレイは、潜在的拮抗状況に相当する。
【０２４２】
実施例１実験に対して、イソボログラム表示に従って、０．０５〜０．６２の効果的画分ｆを有するレイは、全てのレイに対して有意な相乗効果を有して、相加性線の下である（図１を参照のこと）。実施例３実験に対して、イソボログラム表示に従って、０．０５〜０．９４の効果的画分ｆを有するレイは、全てのレイに対して、有意な相乗効果を有して相加性線の下である（図２を参照のこと）。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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