(57)【要約】α７β１インテグリン調節剤、およびそれを用いて、筋ジストロフィー等の、α７β１インテグリン発現または活性の低下に関連する症状を治療する方法を開示する。一例において、筋ジストロフィーを有する被験体を治療する方法を開示する。本方法は、筋ジストロフィーを有する被験体にα７β１インテグリン調節剤の有効量を投与することを含み、α７β１インテグリン調節剤は、α７β１インテグリンの発現または活性を、治療前のα７β１インテグリン発現または活性と比較して増加させることにより、筋ジストロフィーを有する被験体を治療するものである。また、被験体において筋再生、修復、または維持を促進する方法、および、開示のα７β１インテグリン調節剤を用いてα７β１インテグリン発現を促進する方法も開示する。被験体における筋障害または損傷を予見的に防止または低減する方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋ジストロフィーを有する被験体を治療する方法であって、
α７β１インテグリン調節剤の有効量を、筋ジストロフィーを有する被験体に投与することを含み、
前記α７β１インテグリン調節剤は、
【化１】
2016516051.tif 000126
であり、
前記α７β１インテグリン調節剤は、α７β１インテグリンの発現または活性を、治療前のα７β１インテグリンの発現または活性と比較して増加させることによって、筋ジストロフィーを有する被験体を治療することを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記筋ジストロフィーは、メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー１Ａ型（ＭＤＣ１Ａ）、メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー１Ｄ型（ＭＤＣ１Ｄ）、肢体型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、福山型先天性筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）または顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＨＭＤ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記筋ジストロフィーは、ＤＭＤ、ＭＤＣ１Ａ、またはＦＣＭＤである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記筋ジストロフィーは、ＤＭＤである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記α７β１インテグリン調節剤は、付加的な治療剤とともに投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記付加的な治療剤は、コスタメリックタンパク質、成長因子、サテライト細胞、幹細胞、ミオサイト、または付加的なα７β１インテグリン調節剤である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記付加的なα７β１インテグリン調節剤は、ラミニン−１１１、ラミニン−１１１フラグメント、バルプロ酸、またはバルプロ酸アナログである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
筋ジストロフィーを有する被験体を選択することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記筋ジストロフィーを有する被験体を選択することは、前記α７β１インテグリン調節剤の有効量を被験体に投与する前に筋ジストロフィーを有する被験体を診断することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
被験体において筋再生、修復、または維持を促進する方法であって、
α７β１インテグリン調節剤の有効量を、筋再生、修復、または維持を必要とする被験体に投与することを含み、
前記α７β１インテグリン調節剤は、
【化２】
2016516051.tif 000127
であり、
前記α７β１インテグリン調節剤は、α７β１インテグリンの発現または活性を、治療前のα７β１インテグリンの発現または活性と比較して増加させることによって、被験体において筋再生、修復、または維持を促進する、方法。
【請求項１１】
前記α７β１インテグリン調節剤は、被験体が筋損傷または障害を発症する前に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法は、被験体における筋維持を促進する方法である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記α７β１インテグリン調節剤は、被験体が運動する前に被験体に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記α７β１インテグリン調節剤は、筋疾患または損傷に罹患するリスクのある被験体に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
筋再生、修復、または維持を促進する必要のある被験体を選択することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記筋再生、修復、または維持を促進する必要のある被験体を選択することは、前記α７β１インテグリン調節剤の有効量を被験体に投与する前に、筋再生障害を特徴とする症状のある被験体を診断することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記筋再生、修復、または維持を促進する必要のある被験体を選択することは、前記α７β１インテグリン調節剤の有効量を被験体に投与する前に、α７β１インテグリンの成分生成障害を特徴とする症状のある被験体を診断することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記α７β１インテグリン調節剤は、付加的な治療剤とともに投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記付加的な治療剤は、コスタメリックタンパク質、成長因子、サテライト細胞、幹細胞、ミオサイト、または付加的なα７β１インテグリン調節剤である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記付加的なα７β１インテグリン調節剤は、ラミニン−１１１、ラミニン−１１１フラグメント、バルプロ酸、またはバルプロ酸アナログである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
被験体における筋障害または損傷を予見的に防止または低減する方法であって、
α７β１インテグリン調節剤の有効量を被験体に投与することを含み、
前記α７β１インテグリン調節剤は、
【化３】
2016516051.tif 000128
であり、
前記α７β１インテグリン調節剤は、α７β１インテグリンの発現または活性を、治療前のα７β１インテグリンの発現または活性と比較して増加させることによって、被験体における筋障害または損傷を予見的に防止または低減する、方法。
【請求項２２】
前記被験体は筋障害または損傷を発症するリスクがある、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記α７β１インテグリン調節剤は、付加的な治療剤とともに投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記付加的な治療剤は、コスタメリックタンパク質、成長因子、サテライト細胞、幹細胞、ミオサイト、または付加的なα７β１インテグリン調節剤である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記付加的なα７β１インテグリン調節剤は、ラミニン−１１１、ラミニン−１１１フラグメント、バルプロ酸、またはバルプロ酸アナログである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
α７β１インテグリンの発現を促進する方法であって、
細胞をα７β１インテグリン調節剤の有効量と接触させることを含み、
前記α７β１インテグリン調節剤は、
【化４】
2016516051.tif 000129
であり、
前記α７β１インテグリン調節剤は、治療後の細胞におけるα７β１インテグリンの発現を未治療の細胞におけるα７β１インテグリンの発現と比較して増加させることにより、α７β１インテグリンの発現を促進する、方法。
【請求項２７】
前記細胞は筋細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記筋細胞は哺乳動物に存在し、前記細胞を薬剤に接触させることは、当該薬剤を当該哺乳動物に投与することを含む、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願へのクロスリファレンス】
【０００１】
本願は、２０１３年３月１５日に出願された米国特許仮出願６１／７９８，４７９号の利益を主張するものであり、当該出願の開示全体を、ここに参照のために取込む。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、筋ジストロフィーの分野に関し、特に、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、福山型先天性筋ジストロフィー、またはメロシン欠損型先天性筋ジストロフィー１Ａ型または１Ｄ型等の筋ジストロフィーを治療するための組成物および方法に関する。
【政府支援の承認】
【０００３】
本発明は、国立衛生研究所により授与された認可番号Ｒ４３  ＡＲ０６００３０、Ｒ２１  ＮＳ０５８４２９−０１、およびＲ２１  ＡＲ０６０７６９の下での政府支援で行われた。政府は、本発明における所定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
α７インテグリン遺伝子における突然変異は、ヒトの先天性ミオパシーの原因となる。α７β１インテグリンは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、福山型先天性筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）、またはメロシン欠損型先天性筋ジストロフィー１Ａ型（ＭＤＣ１Ａ）等の様々なタイプの筋ジストロフィー等をはじめとする種々の遺伝的筋疾患における筋疾患進行の主要な修飾因子でもある。しかしながら、筋ジストロフィー（例えば、ＤＭＤ、ＦＣＭＤおよび／またはＭＤＣ１Ａ）における修飾因子としての役割をはじめとするα７インテグリン遺伝子の転写調節についてはほとんど理解されていない。
【０００５】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、Ｘ染色体連鎖疾患であり、筋ジストロフィーの最も一般的な病態である。ＤＭＤは、男児出生３,５００人に１人の割合で発症し、患者は慢性の筋変性および筋衰弱を起こす。臨床症状が最初に見られるのは２歳〜５歳であり、患者が１０代になるまでに独立歩行能力は失われる。一般に、３０歳前に心肺不全で死亡する。
【０００６】
福山型先天性筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）およびＭＤＣ１Ａは、遺伝性の神経筋障害である先天性筋ジストロフィーである。ＭＤＣ１Ａは、出生時または幼年期の筋衰弱を特徴とする。罹患した幼児は、筋緊張低下がみられ、ほとんど動かなくなる。その子どもの生活の質および寿命は、進行性筋消耗、呼吸困難、脊髄性固縮により冒される。ＭＤＣ１Ａは、最も一般的かつ重症な先天性筋ジストロフィーであり、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）と診断された全ケースのうちの３０％〜４０％を占める。ＭＤＣ１Ａは、先天性筋緊張低下症、明らかな関節拘縮、および独立歩行能力の欠如を特徴とする。呼吸器系障害が生じると、経管栄養チューブ挿入および陽圧換気が必要となることが多い。ＭＤＣ１Ａに苦しむ患者は１０歳以前に死亡することが多い。ＦＣＭＤは、ヒト染色体９ｑ３１に位置するフクチン遺伝子の突然変異を原因とするものである。本疾患は、常染色体劣性遺伝する。ＦＣＭＤは肢帯筋ジストロフィーの一種である。今のところ、ＤＭＤ、ＦＣＭＡ、またはＭＤＣ１Ａに治療法はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
筋ジストロフィーは、多様な遺伝性の神経筋障害群であり、一次または二次の骨格筋の関与を特徴とする壊滅的な神経筋疾患群を代表するものである。現在、それらの疾患に対する治療法はない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書において、α７β１インテグリン発現調節剤、およびそれを用いて、筋ジストロフィー等の、α７インテグリン発現異常に関連する症状を治療する方法を開示する。一実施形態において、筋ジストロフィーを有する被験体を治療する方法を開示する。本方法は、筋ジストロフィーを有する被験体にα７β１インテグリン調節剤の有効量を投与することを含み、α７β１インテグリン調節剤は、式１〜１６のいずれか１つに包含される化合物、表１〜１６および１８のいずれか１つに提示される化合物、またはこれらの組み合わせであり、α７β１インテグリン調節剤は、α７β１インテグリンの発現または活性を、未治療のα７β１インテグリン発現または活性と比較して増加させることにより、筋ジストロフィー（例えば、ＭＤＣ１Ａ、ＭＤＣ１Ｄ、ＬＧＭＤ、ＤＭＤ、ＦＣＭＤ、またはＦＨＭＤ）を有する被験体を治療するものである。
【０００９】
また、被験体において筋再生、修復、または維持を促進する方法も開示する。いくつかの実施形態において、本方法は、α７β１インテグリン調節剤の有効量を、筋再生、修復、または維持を必要とする被験体に投与することを含み、α７β１インテグリン調節剤は、式１〜１６のいずれか１つに包含される化合物、表１〜１６および１８のいずれか１つに提示される化合物、またはこれらの組み合わせであり、α７β１インテグリン調節剤は、α７β１インテグリン発現または活性を、未治療のα７β１インテグリン発現または活性と比較して増加させることにより、被験体において筋再生、修復、または維持を促進する。特定の実施形態において、本開示は、被験体における筋再生を増加する方法を提供する。例えば、高齢被験体、筋障害のある被験体、および、運動が原因の損傷等活動誘発性筋損傷を含む筋損傷のある被験体にとって、本実施形態は有効であろう。
【００１０】
本開示の方法の他の実施形態において、α７β１インテグリン調節剤を予防的に投与して、筋損傷または障害（例えば、活動または運動誘発性障害）を防止または低減する。例えば、筋損傷、障害、または疾患を排除または改善することを目的として、高齢被験体、筋損傷を受けやすい被験体、または、例えば運動選手等の筋障害のリスクのある被験体を治療してもよい。
【００１１】
α７β１インテグリン発現を促進する方法をさらに開示する。いくつかの実施形態において、本方法は、細胞をα７β１インテグリン調節剤の有効量と接触させることを含み、α７β１インテグリン調節剤は、式１〜１６のいずれか１つに包含される化合物、表１〜１６および１８のいずれか１つに提示される化合物、またはこれらの組み合わせであり、治療後の細胞におけるα７β１インテグリン発現を未治療の細胞におけるα７β１インテグリン発現と比較して増加させることにより、α７β１インテグリン発現を促進する。  本開示の方法は、α７β１インテグリン調節剤を、１つ以上の付加的な薬理学的物質、例えば治療剤等とともに投与することを含み得る。いくつかの態様において、付加的な治療剤は、α７β１インテグリン調節剤の治療効果を促進する。さらなる態様において、治療剤は、治療中の症状に対する治療的有用性を独立して提供する。種々の例において、付加的な治療剤は、細胞外マトリックスの一成分、例えば、インテグリン、ジストロフィン、ジストログリカン、ユートロフィン、または成長因子等である。さらなる例において、治療剤は、細胞外マトリックスの形成または維持を促進する物質の発現を減少または促進する。いくつかの例では、治療剤は、付加的なα７β１インテグリン調節剤、例えばラミニン−１１１、ラミニン−１１１フラグメント、バルプロ酸、またはバルプロ酸アナログ等である。
【００１２】
いくつかの例では、α７β１インテグリン調節剤を、治療対象の被験体の特定の部位に適用する。例えば、α７β１インテグリン調節剤を、治療対象の特定部位、例えば筋肉等に注射してもよい。さらなる例において、α７β１インテグリン調節剤の投与は、被験体の複数の部位に分散するように、例えば全身投与または局所投与等を行う。
【００１３】
α７β１インテグリン調節剤は、任意の適切な方法によって投与可能であり、その方法としては、局所投与、非経口投与（静脈投与または腹腔内投与等）、または経口投与等がある。特定の例において、α７β１インテグリン調節剤を、腹部注射（stomach injection）または腹膜注射（peritoneal injection）等の非経口投与等により、全身投与する。
【００１４】
本開示の方法を、包括的に、筋再生について説明したが、本開示の方法を用いて、その他の組織および臓器の修復や維持の促進、または損傷予防をすることができる。例えば、本開示の方法を用いて、脳機能、平滑筋、心筋等の障害または異常等、骨格筋以外の細胞または組織への影響に起因する筋ジストロフィーの症状を治療することができる。
【００１５】
本開示についての上記の特徴およびその他の特徴は、添付の図面を参照して行う以下の詳細な説明によりさらに明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ＤＭＳＯコントロール、１０μＭのＭＬＳ０００６８３２３２−０１（ＩＥＤ−２３２）、１０μＭのＭＬＳ００１１６５９３７−０１（ＩＥＤ−９３７）、ヒドロキシルプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）コントロール、またはＨＰＢＣＤ中の１２μＭのＳＵ９５１６を用いて２４時間治療したＣ２Ｃ１２筋芽細胞および筋管におけるＩｔｇａ７、Ｉｔｇｂ１、およびＬａｍａ２転写物レベルの評価に用いた定量的リアルタイムＰＣＲ結果を示すデジタル画像である。＊は、相対転写レベルにおける有意差を示し、＊＊ｐ値＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図２】図２は、ＤＭＳＯコントロール、１０μＭのＭＬＳ０００６８３２３２−０１（ＩＥＤ−２３２）、ヒドロキシルプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）コントロール、またはＨＰＢＣＤ中の１２μＭのＳＵ９５１６で４８時間治療したＣ２Ｃ１２筋管におけるα７インテグリンおよびＧＡＰＤＨタンパク質レベルのウェスタンブロットおよび定量分析のデジタル画像である。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて各帯域を定量化し、その後、ＧＡＰＤＨタンパク質レベルに対するα７インテグリンタンパク質レベルとしてグラフ化した。＊は、相対タンパク質レベルにおける有意差を示し、＊＊ｐ＜０．０１である。
【図３】図３は、本開示のα７β１インテグリン調節剤の特定の実施形態を用いたスクリーニング（screen）から得た結果（薬剤の種々の濃度における対ＤＭＳＯ蛍光）の画像である。
【図４】図４は、ＦＤＧ基質からのβガラクトシダーゼの種々の濃度により生成される相対蛍光の画像である（Ａ）。α７＋／ＬａｃＺ筋芽細胞（Ｂ）および筋管（Ｃ）アッセイ上のＤＭＳＯ濃度の影響は、１％を超える濃度で、容認できないほど大きいと判断された。（Ｄ）ＦＤＧ緩衝剤におけるＦＤＧの種々のレベルを伴うα７＋／ＬａｃＺ筋管アッセイ応答。
【図５】図５は、α７＋／ＬａｃＺ筋芽細胞（Ａ）または筋管（Ｂ）におけるＳＵ９５１６の用量反応曲線を示すグラフの画像である。曲線の非従来的な外形は、濃度依存性細胞毒性のメカニズムと考えられる。
【図６】図６は、本明細書において開示する一次筋芽細胞スクリーニングからの曲線分類結果を提示する表の画像である。
【図７】図７は、検査した各化合物毎の筋管用量反応グラフおよび対応する化学構造［ＳＵ９５１６（Ａ）、ＭＬＳ０００５３２９６９（Ｂ）、ＭＬＳ００３１２６４２５（Ｃ）、ＭＬＳ００１０６０５３３（Ｄ）、ＭＬＳ０００６８３２３２（Ｅ）、およびＭＬＳ０００６８３２３４（Ｆ）］の画像であり、全ポイントで複数日にわたってｎ＝６−９である。
【図８】図８は、ウェスタンブロットによりα７インテグリンタンパク質レベルを調べた、ＤＭＳＯ（ｎ＝３）または１２μＭのＳＵ９５１６（ｎ＝３）で治療したＣ２Ｃ１２筋管で得た結果の画像であり（Ａ）、ＧａｐＤＨタンパク質レベルをローディング正規化コントロールとして用い、ＤＭＳＯおよびＳＵ９５１６治療の両方においてα７インテグリン／ＧａｐＤＨレベルを定量化しグラフ化した（Ｂ）。
【図９】図９は、本明細書において開示する種々の異なる化合物で得た結果およびヒトDMD筋管におけるα7インテグリンレベルについてのそれらの効果の画像である。
【図１０】図１０は、化学構造および名称、Ｓｔｒｙｋａ−９６９に対する類似性スコア、およびＳｔｒｙｋａ−９６９の類似構造を持つ４つの化合物のＩＴＧＡ７＋／ＬａｃＺ筋管用量反応を示す画像である。
【図１１】図１１は、定量化しグラフ化した、α７インテグリンおよびαチューブリンのウェスタンブロット分析の画像であり、有意性を独立ｔ検定で判断し、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
Ｉ．いくつかの実施形態の概要
本明細書において、α７β１インテグリン発現調節剤、およびそれを用いて、例えば筋ジストロフィー等の、α７β１インテグリン発現障害に関連する症状を治療する方法を開示する。
【００１８】
一実施形態において、筋ジストロフィーを有する被験体を治療する方法を開示する。本方法は、筋ジストロフィーを有する被験体にα７β１インテグリン調節剤の有効量を投与することを含み、α７β１インテグリン調節剤は、式１〜１６のいずれか１つに包含される化合物、表１〜１６および１８のいずれか１つに提示される化合物、またはこれらの組み合わせであり、α７β１インテグリン調節剤は、α７β１インテグリンの発現または活性を、未治療のα７β１インテグリン発現または活性と比較して増加させることにより、筋ジストロフィーを有する被験体を治療するものである。
【００１９】
いくつかの実施形態において、筋ジストロフィーを有する被験体を治療する方法は、α７β１インテグリン調節剤の有効量を、筋ジストロフィーを有する被験体に投与することを含み、前記α７β１インテグリン調節剤は、以下のいずれか１つから選択される式を有する化合物を含み、
【化１】
2016516051.tif 000002
式中、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、およびＲ３はそれぞれ独立して、表３、表４、表５、および／または表６に規定される通りである。いくつかの実施形態において、これらの化合物のいずれかの組み合わせ、または、本明細書において開示する任意の他のα７β１インテグリン調節剤を用いてもよい。α７β１インテグリン調節剤は、α７β１インテグリンの発現または活性を、未治療のα７β１インテグリン発現または活性と比較して増加させることにより、筋ジストロフィーを有する被験体を治療するものである。いくつかの実施形態において、化合物を、表１〜１６および１８のいずれか１つに提示される化合物のいずれかから選択してもよい。
【００２０】
いくつかの実施形態において、筋ジストロフィーは、メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー１Ａ型（ＭＤＣ１Ａ）、メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー１Ｄ型（ＭＤＣ１Ｄ）、肢体型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、福山型先天性筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）または顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＨＭＤ）である。
【００２１】
いくつかの特定の実施形態において、筋ジストロフィーは、ＤＭＤ、ＭＤＣ１Ａ、またはＦＣＭＤである。
【００２２】
特定の一実施形態において、筋ジストロフィーは、ＤＭＤである。
【００２３】
いくつかの実施形態において、α７β１インテグリン調節剤は、付加的な治療剤とともに投与される。
【００２４】
いくつかの実施形態において、付加的な治療剤は、コスタメリックタンパク質、成長因子、サテライト細胞、幹細胞、ミオサイト、または付加的なα７β１インテグリン調節剤である。
【００２５】
いくつかの実施形態において、付加的なα７β１インテグリン調節剤は、ラミニン−１１１、ラミニン−１１１フラグメント、バルプロ酸、またはバルプロ酸アナログである。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本方法は筋ジストロフィーを有する被験体を選択することをさらに含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、筋ジストロフィーを有する被験体を選択することは、前記α７β１インテグリン調節剤の有効量を被験体に投与する前に筋ジストロフィーを有する被験体を診断することを含む。
【００２８】
他の実施形態において、被験体において筋再生、修復、または維持を促進する方法を開示する。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本方法は、α７β１インテグリン調節剤の有効量を、筋ジストロフィーを有する被験体に投与することを含み、α７β１インテグリン調節剤は、式１〜１６のいずれか１つに包含される化合物、表１〜１６および１８のいずれか１つに提示される化合物、またはこれらの組み合わせを含み、α７β１インテグリン調節剤は、α７β１インテグリンの発現または活性を未治療のα７β１インテグリン発現または活性と比較して増加させることにより、被験体における筋再生、修復、維持を促進するものである。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本方法は、被験体が筋損傷または疾患を発症する前に、α７β１調節剤を投与することを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本方法は、被験体において筋維持を促進する方法である。
【００３２】
いくつかの実施形態において、被験体が運動する前にα７β１インテグリン調節剤を投与する。
【００３３】
いくつかの実施形態において、α７β１インテグリン調節剤を、筋疾患または損傷に罹患するリスクのある被験体、例えば高齢の被験体に投与する。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本方法は、筋再生、修復、または維持を促進する必要のある被験体を選択することも含む。
【００３５】
いくつかの実施形態において、筋再生、修復、または維持を促進する必要のある被験体を選択することは、α７β１インテグリン調節剤の有効量を被験体に投与する前に、筋再生障害を特徴とする症状のある被験体を診断することを含む。
【００３６】
いくつかの実施形態において、筋再生、修復、または維持を促進する必要のある被験体を選択することは、α７β１インテグリン調節剤の有効量を被験体に投与する前に、α７β１インテグリンの成分生成障害を特徴とする症状のある被験体を診断することを含む。
【００３７】
いくつかの実施形態において、α７β１インテグリン調節剤は、付加的な治療剤と共に投与される。
【００３８】
いくつかの実施形態において、付加的な治療剤は、コスタメリックタンパク質、成長因子、サテライト細胞、幹細胞、ミオサイト、または付加的なα７β１インテグリン調節剤である。
【００３９】
いくつかの実施形態において、付加的なα７β１インテグリン調節剤は、ラミニン−１１１、ラミニン−１１１フラグメント、バルプロ酸、またはバルプロ酸アナログである。
【００４０】
さらなる実施形態において、被験体における筋障害または損傷を予見的に防止または低減する方法を開示する。
【００４１】
いくつかの実施形態において、本方法は、α７β１インテグリン調節剤を被験体に投与することを含み、α７β１インテグリン調節剤は、式１〜１６のいずれか１つに包含される化合物、表１〜１６および１８のいずれか１つに提示される化合物、またはこれらの組み合わせを含み、α７β１インテグリン調節剤は、α７β１インテグリンの発現または活性を未治療のα７β１インテグリン発現または活性と比較して増加させることにより、被験体における筋障害または損傷を予見的に防止または低減する。
【００４２】
いくつかの実施形態において、被験体は、筋障害または損傷を発症するリスクがある。
【００４３】
いくつかの実施形態において、α７β１インテグリン調節剤は、付加的な治療剤とともに投与される。
【００４４】
いくつかの実施形態において、付加的な治療剤は、コスタメリックタンパク質、成長因子、サテライト細胞、幹細胞、ミオサイト、または付加的なα７β１インテグリン調節剤である。
【００４５】
いくつかの実施形態において、付加的なα７β１インテグリン調節剤は、ラミニン−１１１、ラミニン−１１１フラグメント、バルプロ酸、またはバルプロ酸アナログである。
【００４６】
さらに別の実施形態において、α７β１インテグリンの発現を促進する方法を提供する。
【００４７】
いくつかの実施形態において、本方法は、細胞をα７β１インテグリン調節剤の有効量と接触させることを含み、α７β１インテグリン調節剤は、式１〜１６のいずれか１つに包含される化合物、表１〜１６および１８のいずれか１つに提示される化合物、またはこれらの組み合わせを含み、治療後の細胞におけるα７β１インテグリンの発現を未治療の細胞におけるα７β１インテグリンの発現と比較して増加させることにより、α７β１インテグリンの発現を促進する。
【００４８】
いくつかの実施形態において、細胞は筋細胞である。
【００４９】
いくつかの実施形態において、筋細胞は哺乳動物に存在し、前記細胞を薬剤に接触させることは、当該薬剤を当該哺乳動物に投与することを含む。
【００５０】
ＩＩ．用語
本開示をより詳細に記載し、当業者が本開示を実施する際の手引きとなるよう、以下に用語および方法について説明する。単数形の用語、例えば、冠詞「a」、「an」、および「the」は、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、複数のものについても言及するものである。同様に、単語「or（または）」とは、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、「and（および）」を含むことも意図するものである。用語「comprises（含む）」は、「includes（含む）」を意味する。したがって、「ＡまたはＢを含む（“comprising A or B”）」は、「Ａ、Ｂ、またはＡおよびＢを含む（“including A, B, or A and B”）」ということを意味するものであり、付加的な要素を排除するものではない。
【００５１】
さらに、核酸またはポリペプチドに与えられた、塩基の大きさまたはアミノ酸の大きさサイズ、および分子量または分子質量値は全て概数値であり、説明のために提供するものであることを理解されたい。本明細書において記載したものと同様または同等の方法および物質を本開示の実施または実験において用いることができるが、好適な方法および物質を以下に記載する。
【００５２】
特に説明がない限り、本明細書において用いる技術的および科学的用語は全て、本開示が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を持つ。分子生物学における一般的な用語の定義は、以下に見出すことができる。例えば、ベンジャミン・レウィン（Benjamin Lewin）らによる「遺伝子Ｖ（Genes V）」、オックスフォード大学版、１９９４年（ISBN 0-19-854287-9）；ケンドリュー（Kendrew（eds.））らによる「分子生物学百科事典（The Encyclopedia of Molecular Biology）、ブラックウェルサイエンス社（Blackwell Science Ltd.）版、１９９４年（ISBN 0-632-02182-9）；および、ロバート・Ａ・メイヤーズ（Robert A. Meyers（ed.））による「分子生物学および生物工学：包括的便覧（Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference）、ＶＣＨ出版社版、１９９５年（ISBN 1-56081-569-8）である。
【００５３】
別段の指示がない限り、本明細書において明確に定義されていない置換基の学名は、官能基の末端部を命名し、続いて付着点（point of attachment）に向かって隣接する官能基を命名することにより得られる。
【００５４】
上記の定義は、許容外の置換パターン（例えば、５つの異なる基で置換したメチル、５価の炭素等）を含むことを意図したものでないことは、当業者には理解されるであろう。そのような許容外の置換パターンは当業者により容易に識別される。
【００５５】
本明細書において言及する全ての出版物、特許出願、特許、およびその他の文献は、その全体が援用により組み込まれる。開示されているＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号において提供される全ての配列は、２０１１年８月１１日付で利用なものが、援用により本明細書に組み込まれる。相反する場合、用語の説明を含む本明細書が優先する。さらに、物質、方法、および例は単なる例示であり、限定を意図するものではない。
【００５６】
本開示の種々の実施形態の精査を簡便なものとするため、特定の用語について以下に説明する。
【００５７】
投与：任意の効果的な経路で被験体に、１つ以上の薬剤、例えば、α７β１発現を増加および／または筋ジストロフィーに関連する１つ以上の症状を治療する薬剤等を、提供または与えること。投与経路の例としては、限定しないが、注射（皮下注射、筋肉注射、皮内注射、腹腔内投与、および静脈注射等）、経口、舌下、経直腸、経皮、経鼻腔、経膣、および吸入等が挙げられる。
【００５８】
薬剤：任意のタンパク質、核酸分子（化学修飾した核酸を含む）、化合物、抗体、小分子、有機化合物、無機化合物、またはその他の対象とする分子。薬剤の例としては、治療剤、診断薬、または医薬品が挙げられる。治療剤または医薬品は、単独で、または、付加的な化合物と一緒に使用して、所望の反応を誘導するものである（例えば、被験体に投与したときに、筋ジストロフィーを有する被験体を治療することを含め、治療的又は予防的効果を誘導する等）。
【００５９】
いくつかの例では、薬剤は、α７β１の発現および／または活性を直接または間接的に変更するように作用可能である。特定の例において、治療剤は、（筋ジストロフィー関連分子である）α７β１の発現および／または活性を有意に増加し、それによって、筋ジストロフィーに関連する１つ以上の兆候または症状を治療する。治療剤の一例として、α７β１遺伝子または遺伝子産物の発現および／または活性を増加可能なものが挙げられ、その増加とは、例えば、臨床反応によって測定されるものである（筋ジストロフィーに関連する１つ以上の兆候または症状の減少、筋肉の健康の改善、筋細胞または組織の再生、修復、または維持等）。「筋肉の健康を改善する」とは、先在する状態と比較して、または治療をしないことにより発生しうる状態と比較して、筋肉の健康を改善することをいう。例えば、筋肉の健康を改善することは、筋再生、維持、または修復を促進することを含みうる。筋肉の健康を改善することは、また、被験体を予見的に治療して筋損傷または障害を防止または低減することも含みうる。「再生」とは、障害または損傷後に、筋細胞または筋細胞を含む組織（または臓器）等の細胞または組織を修復して、当該筋肉または組織の少なくとも一部を障害または損傷が起こる前の細胞または組織と類似の状態に回復することをいう。再生とは、また、疾患を有する被験体において、疾患により影響を受けている細胞または組織の修復を容易にして、疾患の影響を排除し、または寛解させることである。より具体的な例において、細胞または組織が再生されると、その生理的状態は、疾患が存在しない場合の状態か、または障害または損傷発生前と同じ状態または改善された状態になる。細胞または組織、例えば、筋細胞または筋細胞を含む組織（または臓器）の「維持」とは、細胞または組織を、少なくとも実質的に同一の生理的状態に維持することを意味し、例えば、通常は損傷、障害、または疾病の原因となりうる刺激剤の存在下においても、そのような状態を維持することを指す。細胞または組織、例えば、筋細胞または筋細胞を含む組織（または臓器）の「修復」とは、損傷またはその他の外傷後に、当該細胞または組織への損傷を治癒する生理的プロセスを指す。
【００６０】
「医薬品」とは、単独で、または別の治療剤または医学的に許容される担体と組み合わせて被験体に投与したときに所望の治療的または予防的効果を誘導することが可能な化学物質または化学組成物である。特定の例において、医薬品は、α７β１の発現および／または活性を有意に増加することにより、α７β１の発現／活性の減少に関連する症状や疾病、例えば筋ジストロフィー等を治療する。
【００６１】
アシル：Ｈ−Ｃ（Ｏ）−、アルキル−Ｃ（Ｏ）−、置換アルキル−Ｃ（Ｏ）−、シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）−、置換シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）−、置換アリール−Ｃ（Ｏ）−、ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）−、置換ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）−、ヘテロシクリル−Ｃ（Ｏ）−、および置換ヘテロシクリル−Ｃ（Ｏ）−。
【００６２】
アシルアミノ：−ＮＲａＣ（Ｏ）アルキル、−ＮＲａＣ（Ｏ）置換アルキル、−ＮＲａＣ（Ｏ）シクロアルキル、−ＮＲａＣ（Ｏ）置換シクロアルキル、−ＮＲａＣ（Ｏ）シクロアルケニル、−ＮＲａＣ（Ｏ）置換シクロアルケニル、−ＮＲａＣ（Ｏ）アルケニル、−ＮＲａＣ（Ｏ）置換アルケニル、−ＮＲａＣ（Ｏ）アルキニル、−ＮＲａＣ（Ｏ）置換アルキニル、−ＮＲａＣ（Ｏ）アリール、−ＮＲａＣ（Ｏ）置換アリール、−ＮＲａＣ（Ｏ）ヘテロアリール、−ＮＲａＣ（Ｏ）置換ヘテロアリール、−ＮＲａＣ（Ｏ）ヘテロシクリル、および−ＮＲａＣ（Ｏ）置換ヘテロシクリルであり、Ｒａは、水素、アルキル、アリール、およびシクロアルキルから選択される。
【００６３】
アシルオキシ：アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、置換アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、アリール−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、置換アリール−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、置換シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、置換ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ヘテロシクリル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、および置換ヘテロシクリル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−。
【００６４】
アシルアルキルオキシ：アルキル−Ｃ（Ｏ）アルキルＯ−、置換アルキル−Ｃ（Ｏ）アルキルＯ−、アリール−Ｃ（Ｏ）アルキルＯ−、置換アリール−Ｃ（Ｏ）アルキルＯ−、シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）アルキルＯ−、置換シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）アルキルＯ−、ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）アルキルＯ−、置換ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）アルキルＯ−、ヘテロシクリル−Ｃ（Ｏ）アルキルＯ−、および置換ヘテロシクリル−Ｃ（Ｏ）アルキルＯ−。
【００６５】
アルキル：炭素数１〜１０の、飽和または不飽和一価炭化水素（例えば、Ｃ１−１０アルキル）であり、１水素原子を親化合物（例えば、アルカン、アルケン、アルキン）の１炭素原子から除去することにより得られる。アルキル基は分岐でも直鎖でもよい。
【００６６】
アルケニル：炭素数１〜１０の、飽和または不飽和一価炭化水素（例えば、Ｃ２−１０アルケニル）であり、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有し、親アルケンの１炭素原子から１水素原子を除去することにより得られる。アルケニル基は、分岐、直鎖、環状、シス、またはトランス（例えば、ＥまたはＺ）でもよい。
【００６７】
アルキニル：炭素数１〜１０の、不飽和一価炭化水素（例えば、Ｃ２−１０アルキニル）であり、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有し、親アルキンの１炭素原子から１水素原子を除去することにより得られる。アルキニル基は、分岐、直鎖、または環状でもよい。
【００６８】
アルコキシ：−Ｏ−アルキル（例えば、メトキシ、エポキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ）。
【００６９】
アルキルチオ：−Ｓ−アルキルであって、アルキルは本明細書で定義したもの。本用語は、硫黄の酸化体、例えば、−Ｓ（Ｏ）−アルキル、または−Ｓ（Ｏ）２−アルキルをも包含する。
【００７０】
アミノ：−ＮＨ２。
【００７１】
アミノカルボニル：−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｂ）２であって、各Ｒｂは、それぞれ独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリルから選択される。また、各Ｒｂは、任意選択で、それに結合した窒素と一体となってヘテロシクリルまたは置換ヘテロシクリル基を形成してもよいが、ただし、Ｒｂの両方が水素である場合についてはこの限りではない。
【００７２】
アミノカルボニルアルキル：−アルキルＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｂ）２であって、各Ｒｂは、それぞれ独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリルから選択される。また、各Ｒｂは、任意選択で、それに結合した窒素と一体となってヘテロシクリルまたは置換ヘテロシクリル基を形成してもよいが、ただし、Ｒｂの両方が水素である場合についてはこの限りではない。
【００７３】
アミノカルボニルアミノ：−ＮＲａＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｂ）２であって、Ｒａおよび各Ｒｂは本明細書において規定したものである。
【００７４】
アミノジカルボニルアミノ：−ＮＲａＣ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｂ）２であって、Ｒａおよび各Ｒｂは本明細書において規定したものである。
【００７５】
アミノカルボニルオキシ：−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｂ）２であって、各Ｒｂはそれぞれ独立して本明細書において規定したものである。
【００７６】
アミノスルホニル：−ＳＯ２Ｎ（Ｒｂ）２であって、各Ｒｂはそれぞれ独立して本明細書において規定したものである。
【００７７】
アナログまたは誘導体：所望の目的のために元の化合物と同様の機能活性を有するように、ある化合物に十分に一致する化合物。アナログまたは誘導体とは、コレスタン等の物質の形態を指し、親化合物と比較して、少なくとも１つの官能基が変更、追加、または除去されたもの。いくつかの例では、アナログの例を、例えば、表１〜６に示す。「官能基」とは、炭化水素ラジカル以外のラジカルを指し、物質に物理的または化学的特性を付加するものである。
【００７８】
アリール：単環（例えば、フェニル）または複合縮合環（例えば、ナフチル）を有し、炭素数６〜１５の、一価の芳香族炭化水素環基であり、この縮合環は、付着点が芳香族アリール基の原子を介するならば、芳香族であってもなくてもよい。
【００７９】
アリールオキシ：−Ｏ−アリール。
【００８０】
アリールチオ：−Ｓ−アリールであって、アリールは本明細書において規定したもの。本用語は、硫黄の酸化体、例えば、−Ｓ（Ｏ）−アリール、または−Ｓ（Ｏ）２−アリールをも包含する。
【００８１】
生物活性：薬剤が生体に与える有益または不利な効果。薬剤が複合化学混合物である場合、活性は、その物質の有効成分またはファーマコフォアにより発揮されるが、その他の成分によって修正可能である。活性は、一般に投与量によって決まるが、低投与量から高投与量まで変化させた場合に１つの物質に対して有益な効果から不利な効果までを有することも珍しくない。一例において、薬剤は、α７β１の生物活性を有意に増加させ、それによって筋ジストロフィーに関連する１つ以上の兆候または症状を低減する。
【００８２】
接触：直接的な物理的結合に置くことであり、固体状および液体状の両方を含む。薬剤と細胞との接触は、単離した細胞に薬剤を添加することにより体外（in vitro）において行うか、または被験体に薬剤を投与することにより体内（in vivo）において行うことが可能である。
【００８３】
コントロール（対照）：検査試料との比較に用いる試料または基準であり、筋ジストロフィー等特定の疾病または症状を有さない一患者（または複数の患者）から得た生体試料等のこと。いくつかの実施形態において、コントロールは、健康な一患者（または複数の患者）から得た試料であり（本明細書においては、「健常」コントロールともいう）、例えば、健常生体試料等である。いくつかの実施形態において、コントロールは、既存コントロールまたは標準値（例えば、以前に検査した対照試料または試料群であって、ベースライン値または正常値（例えば、発現値）を表すものであり、例えば、筋ジストロフィーを持たない被験体中の、例えばα７β１遺伝子等の特定の遺伝子、遺伝子産物のベースライン値または正常値等）である。いくつかの例では、コントロールは、複数の患者試料から得た平均値（または値の平均範囲）（例えば、筋ジストロフィーを有さない被験体中の、例えばα７β１等の遺伝子または遺伝子産物の平均値または値の範囲等）を示す標準値である。
【００８４】
カルボキシル：−ＣＯＯＨまたはその塩類。
【００８５】
カルボキシエステル：−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロシクリル、および−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換ヘテロシクリル。
【００８６】
（カルボキシエステル）アミノ：−ＮＲａ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、−ＮＲａ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アルキル、−ＮＲａ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール、−ＮＲａ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アリール、−ＮＲａ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−シクロアルキル、−ＮＲａ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換シクロアルキル、−ＮＲａ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール、−ＮＲａ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換ヘテロアリール、−ＮＲａ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロシクリル、および−ＮＲａ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換ヘテロシクリルであって、Ｒａは本明細書において記載したもの。
【００８７】
（カルボキシエステル）オキシ：−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アルキル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アリール、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−シクロアルキル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換シクロアルキル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換ヘテロアリール、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロシクリル、および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換ヘテロシクリル。
【００８８】
シアノ：−ＣＮ。
【００８９】
シクロアルキル：縮合、架橋、およびスピロ環系（例えば、シクロプロピル、シクロブチル等）を含む単環または多環を有する炭素数３〜１０の環式アルキル（またはアルケニル、またはアルキニル）基。
【００９０】
（シクロアルキル）オキシ：−Ｏ−シクロアルキル。
【００９１】
（シクロアルキル）チオ：−Ｓ−シクロアルキル。本用語は、硫黄の酸化体、例えば、−Ｓ（Ｏ）−シクロアルキル、または−Ｓ（Ｏ）２−シクロアルキルをも包含する。
【００９２】
減少する：あるものの品質、量、強度を減らすこと。一例において、ある治療によって、筋ジストロフィーに関連する１つ以上の症状を、例えば、治療を行わない場合の反応と比較して、減少する。
【００９３】
診断：筋ジストロフィー等の疾病をその兆候、症状、および様々な検査の結果により特定するプロセス。そのプロセスを経て下した結論も、「診断」と呼ばれる。一般的に行われる検査の形態の例としては、血液検査、画像診断、尿検査、および生検がある。
【００９４】
有効量：症状または疾病に関連する１つ以上の兆候または症状を低減または抑制する等、所望の反応を生成するのに十分な薬剤の量。被験体に投与する際は、目標とする組織／細胞濃度を達成するような投与量を用いることが一般的である。いくつかの例では、「有効量」とは、１つ以上の症状および／または任意の疾患や疾病の根本原因を治療するものである。いくつかの例では、「有効量」とは、治療的有効量であって、薬剤が単独で、付加的な治療剤（例えば、抗病原体剤）と共に、ＤＭＤ、ＦＣＭＤ、またはＭＤＣ１Ａ等の筋ジストロフィーの治療等、所望の反応をひき出すものである。
【００９５】
特定の例において、有効量とは、α７β１遺伝子の発現または活性を、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またさらには少なくとも１００％（検出できない程度にまで疾病を解消すること）増加可能な薬剤の量である。
【００９６】
いくつかの例において、有効量とは、単独で、または医学的に許容される担体または１つ以上の付加的な治療剤と共に、所望の反応を誘導する薬剤の量である。
【００９７】
一例において、所望の反応とは、疾病の進行を遅らせる、例えば、筋ジストロフィーの進行を遅らせることにより被験体の生存可能時間を増加することである。疾病が必ずしも完全に抑制されなくても、当該医薬品を有効とする。例えば、医薬品により、その医薬品を使わない場合の一般的な進行と比較して、疾病の進行を所望の程度、例えば、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またさらには少なくとも１００％減少しうる。
【００９８】
別の、または追加の例において、被験体内の筋ジストロフィーの症状を部分的または完全に緩和するのに十分な量である。治療は、疾病の進行を一時的に減速することだけでなく、疾病の進行を永久に停止または後退させることをも含みうる。
【００９９】
本明細書に記載の薬剤の有効量は、多くの様々な方法により決定することができる。そのような方法の例としては、例えば、被験体内の筋ジストロフィーに関連する１つ以上の兆候または症状の減少を分析（アッセイ）すること、または筋ジストロフィーに関連することが知られている１つ以上の分子の発現レベルを測定すること等がある。有効量は、また、本明細書に記載したアッセイをはじめとする、体外（in vitro）、体内（in vivo）、原位置（in situ）での様々なアッセイにより決定することができる。
【０１００】
本開示の治療剤は、治療の過程において、例えば毎日、単回投与または数回投与可能である。しかしながら、有効量は、適用したソース（例えば、細胞抽出液から単離した核酸分子対化学合成および精製した核酸）、治療対象の被験体、治療する症状の重篤度および種類、および投与方法によって決まる。
【０１０１】
発現：コード化した遺伝子情報を、細胞の機能部分、非機能部分、構造部分へと変換する、例えばタンパク質合成等のプロセス。遺伝子発現は、外部信号の影響を受けることがある。例えば、細胞にホルモンが作用すると、ホルモン誘起遺伝子の発現が促進される。異なる種類の細胞は、同一信号に対して異なる反応を示すことがある。遺伝子の発現は、また、ＤＮＡからＲＮＡ、タンパク質までの経路の任意の箇所でレギュレーションが可能である。レギュレーションとは、転写、翻訳、ＲＮＡ輸送および処理、ｍＲＮＡ等の中間分子の分解についての制御、または、生成後の特定のタンパク質分子の活性化、不活性化、区画化または分解を介した制御を含みうる。一例において、α７β１の発現等の発現を調節（レギュレート）して、筋ジストロフィーに関連する１つ以上の兆候または症状を治療することができる。
【０１０２】
核酸分子の発現は、正常（野生型）核酸分子に対して変更することができる。差次的発現等、遺伝子発現における変更の例としては、限定はしないが、（１）過剰発現、（２）過小発現、または（３）発現の抑制、等が挙げられる。核酸分子の発現における変更は、対応するタンパク質の発現における変化と関連付けることができ、また、実際にその原因ともなりうる。
【０１０３】
タンパク質の発現についても、若干変更されて、正常（野生型）の状況におけるタンパク質の発現とは異なるものとなる場合がある。そのようなタンパク質発現の例としては、限定はしないが、次のようなものがある。例えば、（１）１つ以上のアミノ酸残基が異なるような、タンパク質の突然変異；（２）タンパク質配列から、アミノ酸残基の１つまたはいくつか（例えば、１０〜２０以下）を短数列削除または追加すること；（３）タンパク質の全ドメインまたはサブドメインを削除または追加するような、アミノ酸残基の長配列（例えば、少なくとも２０残基）を削除または追加すること；（４）コントロールまたは標準量に対するタンパク質の発現量の増加；（５）コントロールまたは標準量に対するタンパク質の発現量の減少；（６）タンパク質の細胞内局在または標的の変更；（７）時間的にレギュレートされたタンパク質発現の変更（タンパク質が通常発現しないであろうときに発現するように、またはタンパク質が通常発現するであろうときに発現しないようにする等）；（８）タンパク質が細胞内で局在化したままになる時間的寿命を増加することによるタンパク質の安定性の変更；および（９）タンパク質の局在化（例えば、臓器または組織特異性局在、または細胞内局在等）した発現の変更（通常発現するであろうときにタンパク質が発現しないように、または通常発現しないであろうときにタンパク質が発現するようにする等）、等があり、それぞれをコントロールまたは標準と比較する。試料と比較して差次的発現を判別するためのコントロールまたは標準の例としては、臨床検査値（例えば、数値範囲）のほか、（例えば、ＤＭＤ、ＦＣＭＤ、またはＭＤＣ１Ａ等の筋ジストロフィーを有さない被験体からの試料等、所望の特徴を有するように変更されていないであろう点において）正常と思われる試料があるが、そのような臨床検査値は実験室ごとに変わりうることを踏まえ、任意の値とすることもできる。
【０１０４】
臨床標準および検査値は、既知または所定の母集団値に基づいて設定することができ、測定し実験的に決定した値の比較が可能なグラフまたは表形式で供給することができる。
【０１０５】
細胞外マトリックス：組織またはその層の細胞外構造であり、１つ以上のマトリックス成分の配列、組成、および、形態を含む。マトリックス成分の例としては、例えば、コラーゲンおよびエラスチン等の構造タンパク質を含むタンパク質、フィブロネクチンおよびラミニン等のタンパク質、およびプロテオグリカン等が挙げられる。マトリックスは、線維網を有する原線維コラーゲンを含んでもよい。いくつかの例では、細胞外マトリックスは、コスタメリックタンパク質ネットワークを介して、各細胞に結合する。
【０１０６】
ハロゲンまたはハロ：フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨード。
【０１０７】
ヘテロアリール：炭素数１〜１０、および環内の酸素、窒素、および硫黄からなる群から選択したヘテロ原子を１〜４個含む芳香族基。そのようなヘテロアリール基は、単環（例えば、ピリジニルまたはフリル）または複合縮合環（例えば、インドリジニルまたはベンゾチエニル）であって、縮合環は、付着点が芳香族ヘテロアリール基の原子を介するならば、芳香族であってもなくてもよく、および／またはヘテロ原子を含んでも含まなくてもよい。一実施形態において、ヘテロアリール基の窒素および／または硫黄環原子を任意選択で酸化してＮ−オキシド（Ｎ→Ｏ）、スルフィニル、またはスルホニル部分を提供する。
【０１０８】
ヘテロアリールオキシ：−Ｏ−ヘテロアリール。
【０１０９】
ヘテロアリールチオ：−Ｓ−ヘテロアリール。本用語は、硫黄の酸化体、例えば、−Ｓ（Ｏ）−ヘテロアリール、または−Ｓ（Ｏ）２−ヘテロアリールをも包含する。
【０１１０】
ヘテロシクリル：縮合架橋およびスピロ環系を含み、かつ、窒素、硫黄、または酸素から選択したヘテロ原子を１〜４個含む環原子を３〜１５個含む単環または複合縮合環を有する飽和、不飽和基またはその組み合わせ。これらの基は、本明細書において開示した置換基の１つ以上と置換して、置換アリールおよび／または置換アルキルとしてもよい。これらの基は、例えば、１つ以上の芳香族炭化水素またはヘテロアリール基と縮合した飽和ヘテロシクリルを包含する。
【０１１１】
ヘテロシクリルオキシ：−Ｏ−ヘテロシクリル（heterocycyl）。
【０１１２】
ヘテロシクリルチオ：−Ｓ−ヘテロシクリル（heterocycyl）。 本用語は、硫黄の酸化体、例えば、−Ｓ（Ｏ）−ヘテロシクリル、または−Ｓ（Ｏ）２−ヘテロシクリルをも包含する。
【０１１３】
ヒドロキシルまたはヒドロキシ：−ＯＨ。
【０１１４】
イミノ：−Ｎ＝Ｒｃであって、Ｒｃは、水素、アミノカルボニルアルキルオキシ、置換アミノカルボニルアルキルオキシ、アミノカルボニルアルキルアミノ、および置換アミノカルボニルアルキルアミノから選択することができる。
【０１１５】
増加する：あるものの質、量、または強度を高めること。一例において、ある薬剤は、α７β１の活性または発現を、例えば、当該薬剤がない場合に対して、増加する。特定の例において、薬剤は、α７β１の活性または発現を、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、１００％等、１０％〜９５％、２０％〜８０％、３０％〜７０％、４０％〜５０％、の間で、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、またさらには少なくとも９０％増加する。このような増加は、本明細書において開示した方法により測定することができる。
【０１１６】
特定の例において、ある治療によりα７β１の発現を増加させ、例えば、α７β１の発現を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、またさらには少なくとも９０％増加（または、アップレギュレート（上方制御））することにより、筋ジストロフィーに関連する１つ以上の兆候または症状を治療／緩和する。いくつかの例では、発現の増加とは、α７β１遺伝子産物の増加を指す。α７β１遺伝子産物とは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、および構造ＲＮＡ）またはタンパク質である。
【０１１７】
遺伝子アップレギュレーションとは、α７β１遺伝子産物の生成において任意の検出可能な増加を含む。特定の例において、α７β１遺伝子産物の生成は、コントロール（例えば、正常細胞における遺伝子発現の量）と比較して、少なくとも２倍増加し、例えば、少なくとも３倍、または少なくとも４倍増加する。一例において、コントロールは、ＤＭＤ、ＦＣＭＤ、またはＭＤＣ１Ａ等の筋ジストロフィーを有さない被験体から採取した生体試料におけるα７遺伝子発現またはタンパク質発現の相対量である。このような増加は、本明細書において開示した方法を用いて測定することができる。例えば、「α７β１遺伝子産物を検出または測定すること」とは、試料中に存在する遺伝子、遺伝子産物、またはそのモジュレーターの量を定量化することを含む。定量化は、数値化または相対化のいずれとすることもできる。遺伝子、遺伝子産物、またはそのモジュレーターの発現の検出は、当該技術分野において周知の、または本明細書に記載の任意の方法を用いて行うことができ、例えば、ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ等）により核酸を、ＥＬＩＳＡによってタンパク質を測定すること等により行うことができる。主要な実施形態において、検出された変化とは、例えば基準値または健常対照被験体等といったコントロールと比較した際の発現の増加または減少である。いくつかの例では、検出された増加または減少とは、コントロールまたは標準と比較して少なくとも２倍である。試料と比較して差次的発現を判別するためのコントロールまたは標準の例としては、臨床検査値（例えば、数誌範囲）のほか、（例えば、ＤＭＤ、ＦＣＭＤ、またはＭＤＣ１Ａ等の筋ジストロフィーを有さない被験体からの試料等、所望の特徴を有するように変更されていないであろう点において）正常であると思われる試料が挙げられるが、そのような臨床検査値は実験室ごとに変わりうることを踏まえ、任意の値とすることもできる。
【０１１８】
臨床基準および検査値は、既知または所定の母集団値に基づいて設定することができ、測定し実験的に決定した値の比較が可能なグラフまたは表形式で供給することができる。
【０１１９】
本方法のその他の実施形態において、増加または減少とは、診察上有意な量の増減であり、診断の統計的確率を提供する有意な量の変化を指す。
【０１２０】
発現のレベルにより、核酸またはタンパク質を定性的または定量的に検出可能である。検出方法の例としては、マイクロアレイ解析、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット法、ウェスタンブロット法、および質量分析法がある。
【０１２１】
疾病または症状を抑制する：例えば、罹患のリスクのある患者または特定の疾病を有する患者における疾病または症状の進行を低減することを指す語句。本開示の特定の方法は、筋ジストロフィーを抑制するための方法を提供する。
【０１２２】
インテグリン：細胞表面膜透過性グリコプロテイン受容体。インテグリンは、多数の生物学的プロセス、例えば、傷の治癒、血餅形成、遺伝子調節、および免疫反応等に関係する。インテグリンにより、組織特異的な細胞接着分子を調節できる。インテグリンは、ヘテロ二量体の非共有結合的に関連した、２つのサブユニットからなるグリコプロテインである。サブユニットは、αおよびβと呼ばれ、おのおのの分子量は、それぞれ、約１５０〜１８０キロダルトンおよび９０〜１１０キロダルトンである。
【０１２３】
α７β１インテグリンは、骨格筋において発現した主なラミニン受容体である。α７β１インテグリンは、神経筋および筋腱接合部の発達において役割を果たす。大人の場合、α７β１インテグリンは接合部に集中し、また接合部外領域に存在して筋線維の細胞外マトリックスへの接着を仲介する。α７鎖欠損マウスは、筋腱接合部を冒す筋ジストロフィーを発症する。α７インテグリンの欠損は、筋腱接合部における欠陥マトリックス沈着につながる。γ-サルコグリカンマウスにおけるαインテグリンの消失は、重症な筋病理をもたらす。ｍｄｘマウスにおけるα７インテグリンの不在も、重症な筋ジストロフィーにつながり、α７β１インテグリンが、デュシェンヌ型およびその他の筋ジストロフィーについての主な遺伝的修飾因子として作用することが確認された。
【０１２４】
α７遺伝子における突然変異は、ヒトの筋ジストロフィーの原因となる。未定義の筋疾患を有する患者からの１１７の筋生検試料のスクリーニングにより、α７インテグリン鎖のない３つの試料においてβ１Ｄインテグリン鎖のレベルが低下していたことがわかった。これらの患者には、発達の目安の遅れ、神経筋および筋腱接合部の発達と機能に対してα７β１インテグリンが果たす役割と合致する運動障害がみられた。
【０１２５】
一連のいくつかの証拠が、α７インテグリンが筋再生において重要でありうることを示唆している。例えば、胎児発育期に、α７β１インテグリンは筋芽細胞の筋線維形成領域への移動をレギュレートする。ＭｙｏＤ（筋原性決定タンパク質）は、生体外においてα７インテグリン遺伝子発現をトランス活性化し、それによって、活性化したサテライト細胞におけるα７インテグリンのレベルを増加させることになることがわかってきている。ヒト、マウス、およびネズミの、サテライト細胞から派生した筋芽細胞では、α７インテグリンが高レベルで発現した。５週齢のｍｄｘマウスの骨格筋において、α７インテグリンｍＲＮＡおよびタンパク質の増加が検出されるが、それは筋退行および再生が最大となる期間と相関する。さらに、α７β１インテグリンは、筋特異的β１インテグリン結合タンパク質（ＭＩＢＰ）と関連することにより、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞におけるラミニン堆積を調節する。ラミニンは、筋芽細胞遊走および増殖を支援する環境を提供する。最終的に、ジストロフィー性骨格筋におけるα７インテグリン発現が促進されたことにより、サテライト細胞の数が増加する。
【０１２６】
α７β１インテグリンのサブユニットについての配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて公表されており、例えば、α７インテグリンについての遺伝子アクセッション番号第ＮＭ＿００１１４４１１６（ヒト）およびＮＭ＿００８３９８．２（マウス）、およびβ１インテグリンについては遺伝子アクセッション番号第ＮＭ＿００２２１１（ＣＤ２９としても知られる）を参照されたいが、各配列は、２０１１年９月８日付で公表のものを参照により本明細書に援用する。例示的なα７β１インテグリン調節剤は、本明細書において開示の通りであり、例えば、式１〜１６のいずれか１つに包含される化合物、または表１〜１６および１８のいずれか１つに提示される化合物である。
【０１２７】
α７β１インテグリンの関連症状は、変更したα７β１インテグリンの発現または活性に関連する症状であり、例えば、ＤＭＤ、ＦＣＭＤ、ＬＧＭＤ、ＦＨＭＤ、ベッカー型および／またはＭＤＣ１Ａ等の筋ジストロフィーを含む。
【０１２８】
ラミニン：細胞外マトリックスの形成と維持に一般に関連するグリコプロテイン類のファミリーのいずれか。ラミニンは、α鎖、β鎖およびγ鎖から形成されたヘテロ三量体である。特定のラミニンの種々の鎖は、分子の特性に影響する。本開示のいくつかの態様によれば、種々のラミニンのフラグメント、誘導体、またはアナログを用いることができ、例えば、少なくとも一部がラミニンα１鎖と少なくとも実質的に一致するラミニン等を用いることができる。本明細書において、「ラミニンのフラグメント」とは、ラミニン等の物質の一部を指す。フラグメントは、いくつかの例では、タンパク質の特定の領域または鎖でありうる。例えば、本開示の特定の実施形態は、ラミニンα１鎖の少なくとも一部（または全て）に相当するラミニン−１のフラグメントを投与することを含む。フラグメントは、合成でも、より大きな親物質から生成されたものでもよい。
【０１２９】
いくつかの態様において、ラミニンは、そのフラグメント、アナログ、および誘導体を含むラミニンの混合物として投与してもよい。ラミニン領域のアナログを作成する好適な方法は、本開示と矛盾しない範囲において本明細書において参照により援用する米国特許第６，９３３，２８０号に記載される。
【０１３０】
本開示のラミニン物質または組成物は、個々の分子として、または別の物質と複合体を形成するかまたは抱合させて送達してもよい。例えば、ラミニンを担体と組み合わせて、例えば、対象部位へのラミニンの送達を支援するかまたは生理学的な摂取またはラミニンの体内への受け入れを増加する等してもよい。
【０１３１】
特定の例において、投与するラミニンは、鎖α１β１γ１を含むラミニン−１（ＬＡＭ−１１１）を含むかまたはそれからなる。さらなる例において、投与するラミニンは、鎖α２β１γ１を含むラミニン−２を含むかまたはそれからなる。さらに別の例において、投与するラミニンは、鎖α２β２γ１を含むラミニン−４を含むかまたはそれからなる。
【０１３２】
ラミニンは、任意の適切なソースから得ることができる。例えば、ラミニン−１は、胎盤組織またはＥＨＳ肉腫（Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma）から得ることができる。種々のラミニンを単離する好適な方法は、本開示と矛盾しない範囲において本明細書において参照により援用する米国特許第５，４４４，１５８に開示される。
【０１３３】
筋肉： 任意の筋芽細胞、筋細胞、筋線維、筋管、または筋細胞からなるその他の構造物を指す。筋肉または筋細胞は、骨格筋、平滑筋、または心筋とすることができる。また、本開示の特定の実施において、幹細胞およびサテライト細胞のような筋細胞を形成可能な細胞その他の物質も筋肉と呼ぶ。
【０１３４】
筋ジストロフィー：進行性筋衰弱の原因となる遺伝子疾患群を指すのに用いる用語。筋ジストロフィーは、骨格筋衰弱および骨格筋タンパク質の欠陥をもたらし、様々な生理的機能障害の原因となりうる。筋ジストロフィーの十分な治療法は存在しない。既存の治療法は、一般に、理学療法または各種整形外科的装置の提供によって疾病の影響を寛解させることおよび患者の生活の質を向上することに重点を置いたものである。
【０１３５】
筋ジストロフィーに関連する突然変異遺伝子は、コスタメリックタンパク質ネットワークに関連付けられた多数のタンパク質の符号化を行う働きをする。そのようなタンパク質の例としては、ラミニン−２、コラーゲン、ジストログリカン、インテグリン、カベオリン−３、アンキリン、ジストロフィン、α−ジストロブレビン、ビンキュリン、プレクチン、ＢＰＡＧ１ｂ、筋肉ＬＩＭタンパク質、デスミン、アクチニン関連ＬＩＭタンパク質、α−アクチン、チチン、テレソニン、サイファ（cypher）、ミオチリン（myotilin）、およびサルコグリカン／サルコスパン複合体等が挙げられる。
【０１３６】
筋ジストロフィーの最も一般的な形態はＤＭＤであり、男児出生３，５００人に１人の割合で発症する。ＤＭＤは、ジストロフィンを符号化する遺伝子の突然変異を特徴とするＸ連鎖劣性疾患である。ジストロフィンは、約４３０ｋＤａの大きさの細胞骨格タンパク質である。このタンパク質は、細胞の細胞骨格と細胞外マトリックスとを結合する働きをする。ＤＭＤ患者においてはジストロフィンが欠失しているため、収縮の際に細胞外マトリックスにおいて筋線維結合が失われ、最終的に進行性線維損傷、膜漏出、および筋機能障害の原因となる。患者の大多数が、呼吸不全または心不全のため３０歳前に死亡する。
【０１３７】
ベッカー型筋ジストロフィー（良性の偽肥大性筋ジストロフィーとしても知られる）と、ＤＭＤとは、いずれもジストロフィン遺伝子の突然変異が原因である点で関連しているが、ＤＭＤにおいては機能性ジストロフィンの生成をみない点において異なり、ＢＭＤよりもはるかに重症である。ＢＭＤは、下肢および骨盤における緩徐進行性筋衰弱を特徴とするＸ連鎖劣性遺伝性疾患である。ＢＭＤは、筋細胞においてジストロフィンが十分に生成されない一連の筋疾患を含むジストロフィン異常症の一種であり、その結果、筋細胞膜の構造が不安定になる。ＢＭＤの原因は、タンパク質ジストロフィンを符号化するジストロフィン遺伝子の突然変異である。ＢＭＤの病徴発現パターンはＤＭＤと同様であるが、発現時期は遅く、進行速度もかなり緩徐である。
【０１３８】
先天性筋ジストロフィーは、遺伝子の突然変異に起因する。先天性筋ジストロフィーの例として、ＦＣＭＤおよびＭＤＣ１Ａがある。ＭＤＣ１Ａは、ＬＡＭＡ２遺伝子における突然変異によりラミニン−α２タンパク質が不足または完全に欠失することを原因とする先天性筋ジストロフィーである。このようなラミニン−α２の欠失により、ラミニン−２１１／２２１が消失する。ラミニン−２１１／２２１は、細胞外マトリックスの主要成分であり、筋細胞発達において重要な役割を担う。筋細胞分化中に、ラミニンはα７β１インテグリンと結合する。ラミニン−α２がないと、筋線維は基底膜に付着することができず、筋管が自発的細胞死（アポトーシス）を起こす。筋再生もできず、その結果、筋修復が低下し、筋線維症および筋炎症が増加する。この慢性的な組織損傷は、ＭＤＣ１Ａにおける病的状態および死亡率の主要な原因である。
【０１３９】
先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）および肢体型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）は、異質性の高い筋ジストロフィーの最も一般的な例であり、発現時の年齢によって判別できる。ＣＭＤの発症は、出生時または６月齢以内であり、ＬＧＭＤの発症は小児期後期、青年期、または成人期である。ＬＧＭＤの遺伝は常染色体優性（ＬＧＭＤ１型）または常染色体劣性（ＬＧＭＤ２型）であり、ＣＭＤは劣性遺伝である。ＣＭＤおよびＬＧＭＤは、臨床的および遺伝子的のいずれについても重複しうる。
【０１４０】
ＭＤＣ１Ａは、進行性筋消耗性疾患であり、子どもたちは車椅子生活を強いられ、呼吸には人工呼吸器が必要であり、早期に死亡する。筋緊張の不足および低緊張乳児症候群（「フロッピー」ベビー症候群）といった症状が出生時に認められる。ＤＭＤ、ＢＭＤ、およびＬＧＭＤは、一般に、子どもの歩行および階段昇降能力等を含む発育遅延を認める３〜５歳時に診断される進行性筋変性疾患である。この疾患は進行性であり、子どもは１０代で車椅子生活となり補助換気が必要となる。
【０１４１】
福山型先天性筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）は、筋肉、脳、および眼を主に冒す遺伝的疾患である。先天性筋ジストロフィーは、幼少期から始まる筋衰弱および消耗（委縮）の原因となる遺伝子疾患群である。福山型先天性筋ジストロフィーは、体を動かすために使われる骨格筋を冒す。障害の最初の兆候は乳児期に現れ、例としては、小さい泣き声、哺乳力の弱さ、および筋緊張の低下（緊張低下）が挙げられる。顔面筋の衰弱は、眼瞼下垂（ptosis）および開口をはじめとする特徴的な顔の表情の原因となる場合が多い。小児期において、筋衰弱および関節変形（拘縮）によって動作が制限され、また、着座、起立、および歩行等の運動技能の発達が阻害される。福山型先天性筋ジストロフィーは、また、脳の発達も減退させる。この症状を有する人々は、敷石滑脳症と呼ばれる脳障害を有するが、これは脳の表面が凹凸のある不規則な外観（敷石状）を呈するものである。脳構造におけるこれらの変化は、言語および運動技能の発達の著しい遅れにつながり、また、中等度から重度の知的障害の原因となる。社会的技能の障害は、は比較的軽度である。福山型先天性筋ジストロフィーを有する子どものほとんどが全く着座および歩行できないが、一部は、支えなしに着座でき、着座姿勢で床上を滑ることができる者もある。罹患した子どもの半数以上で発作も認める。福山型先天性筋ジストロフィーのその他の兆候または症状として、視力低下その他の眼障害、および１０歳以降の緩徐進行性の心臓障害がある。病気の進行に伴い、罹患者は、誤嚥性肺炎と呼ばれる細菌性肺感染症を引き起こしうる嚥下困難を発症する場合がある。福山型先天性筋ジストロフィーに関連する重度の健康障害のため、この障害を有するほとんどの人が小児期後期または青年期までしか生きられない。
【０１４２】
福山型先天性筋ジストロフィーはほぼ日本だけに限定してみられ、（デュシェンヌ型筋ジストロフィーに次いで）２番目に多い小児筋ジストロフィーである。福山型先天性筋ジストロフィーの推定発症率は日本人の乳幼児１０万人当たり２〜４人である。
【０１４３】
福山型先天性筋ジストロフィーは、フクチンをコードするＦＫＴＮ遺伝子における突然変異を原因とする。ＦＫＴＮ遺伝子の最もよくみられる突然変異は、細胞内で生成されたフクチンの量を減少させるものである。フクチンの不足は、α−ジストログリカンの正常な修飾を阻害する恐れがあり、タンパク質の正常な機能を混乱させる。筋細胞を安定化する機能的α−ジストログリカンがないと、筋線維は、使用に伴って収縮および弛緩を繰り返すうち損傷する。損傷した線維は衰弱してやがて死ぬが、それが骨格筋の進行性衰弱および委縮につながる。
【０１４４】
欠陥性α−ジストログリカンは、脳の初期発達における神経細胞（ニューロン）移動にも悪影響を及ぼす。ニューロンが意図した移動先に到着したときに休止させるのではなく、いくつかのニューロンは脳表面を通り越してその周囲の流体で満たされた空間へと移動する。福山型先天性筋ジストロフィーはα−ジストログリカンの機能不全を伴うため、この症状はジストロカノパチーと記載される。
【０１４５】
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＨＭＤ）は、進行性筋衰弱および筋組織消失に関連する筋ジストロフィーの一種である。主に下半身が冒されるＤＭＤおよびＢＭＤとは異なり、ＦＳＨＤ は、上半身、主として顔面筋、肩甲筋、および上腕筋において発症する。しかしながら、骨盤、腰、下肢において発症する場合もある。ＦＨＭＤ の症状は、１０歳〜２６歳になってから現れることが多いが、それよりもずっと後になって発症することも稀ではない。場合によっては、全く発症しないこともある。症状は軽度であり、悪化速度も非常に遅いことが通例である。顔面筋衰弱が一般的であり、眼瞼下垂、口笛不能、顔の表情変化の減少、憂鬱または怒り顔表情、語を発音する困難、肩甲筋衰弱（肩甲骨の目立ち（翼状肩甲）および撫肩等の変形の原因となる）、下肢衰弱、聴力損失、および心臓病のおそれ等がありうる。
【０１４６】
オキソ：（＝Ｏ）。
【０１４７】
医学的に許容される担体：本開示において有用な医学的に許容される担体（ビヒクル）は従来の担体である。E. W. Martinによる「レミントン薬学（Remington’s Pharmaceutical Sciences）」、マック出版社（Mack Publishing Co.）、イーストン、ペンシルベニア州、第１９版（１９９５年）には、１つ以上の薬剤、例えば、１つ以上のα７β１調節剤の薬物送達に好適な組成物および製剤（formulation）が記載されている。
【０１４８】
一般に、担体の性質は、採用しようとする特定の投与形態によって決まることになる。例えば、非経口製剤としては、医学的および生理学的に許容される流体、例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストローズ、グリセロール等をビヒクルとして含む注射液が挙げられる。生物学的に中性の担体のほかに、投与しようとする医薬用剤は、無毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、保存料、ｐＨ緩衝剤等を少量含むことができ、例として、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレート、乳酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、およびトリエタノールアミンオレエートが挙げられる。
【０１４９】
試料（または生体試料）：被験体から得た生体試料であり、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）、タンパク質、またはその組み合わせを含有する。例としては、限定はしないが、末梢血、尿、唾液、生検組織、摘出標本、および剖検材料が挙げられる。一例において、試料は、ＤＭＤ、ＦＣＭＤ、またはＭＤＣ１Ａ等の被験体から得た筋生体組織を含む。
【０１５０】
兆候および症状：疾病または被験体の症状についての任意の主観的な証拠であり、例えば、被験体が知覚した証拠、ある身体的または精神的な状態を示す被験体の症状の顕著な変化である。「兆候」とは、疾病を示す任意の異常であり、被験体を検査または分析した際に発見できる。兆候は、通常、疾病の客観的な指標である。兆候の例として、限定はしないが、クレアチンキナーゼレベルの測定、筋電図描画法（衰弱が、神経損傷によるものではなく、筋組織の破壊によるものであることを判断する）をはじめとする筋ジストロフィーを検出するためのテスト、またはα７β１インテグリン等の筋ジストロフィー関連分子を測定する免疫組織化学／免疫ブロット法／免疫学的測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ）等の任意の測定可能なパラメータが挙げられる。一例において、筋ジストロフィーに関連する１つ以上の症状または兆候を低減または抑制することは、α７β１の活性または発現を、治療をしない場合の活性および／または発現と比較して、所望の量、例えば、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またさらには少なくとも１００％、増加させることを含む。筋ジストロフィーの症状としては、限定はしないが、筋衰弱および消失、走行困難、跳躍困難、ジャンプ困難、歩行困難、呼吸困難、疲労、骨格変形、筋変形（踵収縮；腓筋の偽性肥大）、心臓病（拡張型心筋症等）、血中クレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルの上昇、またはその組み合わせ等が挙げられる。
【０１５１】
被験体：多細胞脊椎有機体、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む分類。
【０１５２】
置換アルキル：アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アシルアルキルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノジカルボニルアミノ、アミノカルボニルアルキル、アミノスルホニル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アミノジアシルアミノ、シクロアルキルオキシ、置換シクロアルキルオキシ、シクロアルキルチオ、置換シクロアルキルチオ、ハロ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールチオ、置換ヘテロアリールチオ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルチオ、置換ヘテロシクリルチオ、イミノ、オキソ、スルホニルアミノ、ニトロ、ＳＯ３Ｈ、スルホニル、チオール、イミノ、置換イミノ、アルキルチオ、および置換アルキルチオから選択した置換基により置換された水素原子数１〜５のアルキル（またはアルケニル、またはアルキニル）基。このアルキルは、ここで規定したこれらの基のうち１〜２個、１〜３個、または１〜４個の基で置換してもよい。
【０１５３】
置換アルコキシ：−Ｏ−（置換アルキル）。
【０１５４】
置換アルキルチオ：−Ｓ−（置換アルキル）。本用語は、硫黄の酸化体、例えば、−Ｓ（Ｏ）−置換アルキル、または−Ｓ（Ｏ）２−置換アルキルをも包含する。
【０１５５】
置換アミノ：−Ｎ（Ｒｂ）２であり、各Ｒｂはそれぞれ独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリルから選択される。また、各Ｒｂは、任意選択で、それに結合した窒素と一体となってヘテロシクリルまたは置換ヘテロシクリル基を形成してもよいが、ただしＲｂの両方が水素である場合についてはこの限りではない。
【０１５６】
置換アリール：アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、置換シクロアルキルオキシ、シクロアルキルチオ、置換シクロアルキルチオ、ハロ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールチオ、置換ヘテロアリールチオ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルチオ、置換ヘテロシクリルチオ、ニトロ、ＳＯ３Ｈ、スルホニル、チオール、アルキルチオ、および置換アルキルチオから独立して選択される置換基で置換した水素原子数１〜５のアリール基。このアリール基は、ここで規定したこれらの基のうち１〜２個、１〜３個、または１〜４個の基で置換してもよい。
【０１５７】
置換アリールオキシ：−Ｏ−（置換アリール）。
【０１５８】
置換アリールチオ：−Ｓ−（置換アリール）であって、置換アリールは本明細書において規定したもの。本用語は、硫黄の酸化体、例えば、−Ｓ（Ｏ）−置換アリール、または−Ｓ（Ｏ）２−置換アリールをも包含する。
【０１５９】
置換シクロアルキル：オキソ、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、置換シクロアルキルオキシ、シクロアルキルチオ、置換シクロアルキルチオ、ハロ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールチオ、置換ヘテロアリールチオ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルチオ、置換ヘテロシクリルチオ、ニトロ、ＳＯ３Ｈ、スルホニル、チオール、アルキルチオ、および置換アルキルチオからなる群から選択した１〜５の置換基を有するシクロアルキル、シクロアルケニル、またはシクロアルキニル基。このアリール基 は、ここで規定したこれらの基のうち１〜２個、１〜３個、または１〜４個の基で置換してもよい。いくつかの実施形態において、シクロアルキル基は、付着点が非芳香族環の原子を介するならば、複合縮合環（例えば、テトラヒドロナフチルまたはテトラヒドロアントラセニル（tetrahydroanthacenyl））を有してもよい。
【０１６０】
置換（シクロアルキル）オキシ：−Ｏ−（置換シクロアルキル）。
【０１６１】
置換（シクロアルキル）チオ：−Ｓ−（置換シクロアルキル）を指す。本用語は、硫黄の酸化体、例えば、−Ｓ（Ｏ）−置換シクロアルキル、または−Ｓ（Ｏ）２−置換シクロアルキルをも包含する。
【０１６２】
置換ヘテロアリール：置換アリールについて規定した置換基と同じ群からなる群から選択した１〜５の置換基により置換されたヘテロアリール基。
【０１６３】
置換ヘテロアリールオキシ：−Ｏ−（置換ヘテロアリール）。
【０１６４】
置換ヘテロアリールチオ：−Ｓ−（置換ヘテロアリール）。本用語は、硫黄の酸化体、例えば、−Ｓ（Ｏ）−置換ヘテロアリール、または−Ｓ（Ｏ）２−置換ヘテロアリールをも包含する。
【０１６５】
置換ヘテロシクリルオキシ（Substituted Heterocycyloxy）：−Ｏ−（置換ヘテロシクリル）であって、ヘテロシクリル基は、置換アルキルについて記載した置換基の１つ以上で置換される。
【０１６６】
置換ヘテロシクリルチオ（Substituted Heterocycylthio）：−Ｓ−（置換ヘテロシクリル（substituted heterocycyl））。本用語は、硫黄の酸化体、例えば、−Ｓ（Ｏ）−置換ヘテロシクリル、または−Ｓ（Ｏ）２−置換ヘテロシクリルをも包含する。
【０１６７】
スルホニル：−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−シクロアルキル、−ＳＯ２−置換シクロアルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−置換アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリール、−ＳＯ２−置換ヘテロアリール、−ＳＯ２−ヘテロシクリル、および−ＳＯ２−置換ヘテロシクリル。
【０１６８】
スルホニルアミノ：−ＮＲａＳＯ２アルキル、−ＮＲａＳＯ２置換アルキル、−ＮＲａＳＯ２シクロアルキル、−ＮＲａＳＯ２置換シクロアルキル、−ＮＲａＳＯ２アリール、−ＮＲａＳＯ２置換アリール、−ＮＲａＳＯ２ヘテロアリール、−ＮＲａＳＯ２置換ヘテロアリール、−ＮＲａＳＯ２ヘテロシクリル、−ＮＲａＳＯ２置換ヘテロシクリルであって、Ｒａはそれぞれ独立して本明細書において規定されたものである。
【０１６９】
チオール：−ＳＨ。
【０１７０】
チオカルボニル：（＝Ｓ）。
【０１７１】
組織：一般に、特定の種類の細胞の集合体であり、細胞間物質とともに動物の構造材料を構成し、動物における例としては、結合組織、上皮、筋組織、および神経組織がある。
【０１７２】
疾病を治療する：筋ジストロフィーの兆候または症状等、疾病の兆候または症状または筋ジストロフィーに関する病的状態を寛解させる治療的介入。治療によって、症状の軽減または治癒、または進行を遅らせることができ、例えば、場合によっては、疾病の完全な発症を阻止すること、例えば、筋ジストロフィーの発症を防止することを含む。疾病を防止により、疾病がかならずしも完全になくならなくてもよい。例えば、少なくとも５０％減少すれば十分である。
【０１７３】
疾病を治療することは、当該技術分野において周知の、特定の疾病または症状に特有なその他のパラメータおよびそれら要因の組み合わせにより、疾病または容態の臨床症状の一部または全部の重症度を減少させること、疾病又は容態の再発回数を減少させること、被験体の健康全般または快適な状態を改善することでありうる。
【０１７４】
〜のための十分な条件下で：所望の作用を可能にする環境を記載するのに用いる句。一例において、開示の薬剤を被験体に十分に投与して所望の作用を可能にすることを含む。特定の例において、所望の作用とは、α７β１の発現または活性を増加させることである。
【０１７５】
ＩＩＩ．筋ジストロフィーを治療するための化合物
本明細書において開示した方法においてα１β７インテグリン 調節剤として使用可能な化合物をここに開示する。特定の開示した実施形態において、化合物は筋ジストロフィーの治療において効果を有するものである。化合物は、小分子治療剤である。開示した特定の実施形態において、小分子治療剤は、含ヘテロ原子骨格を備える環式化合物である。他の開示の実施形態において、小分子治療剤は、全炭素骨格を備える環式化合物である。開示したある実施形態において、含ヘテロ原子骨格を備える環式化合物は次式：
【化２】
2016516051.tif 000003
式１
を有し、式中、各Ｒ１はそれぞれ独立して、Ｃ１−１０アルキル、置換Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−１０アルコキシ、置換Ｃ１−１０アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アシルＣ１−１０アルキルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アミノカルボニルＣ１−１０アルキル、アミノカルボニルアミノ、アミノジカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、Ｃ６−１５アリール、置換Ｃ６−１５アリール、Ｃ６−１５アリールオキシ、置換Ｃ６−１５アリールオキシ、Ｃ６−１５アリールチオ、置換Ｃ６−１５アリールチオ、カルボキシル、カルボキシエステル、（カルボキシエステル）アミノ、（カルボキシエステル）オキシ、シアノ、Ｃ３−８シクロアルキル、置換Ｃ３−８シクロアルキル、（Ｃ３−８シクロアルキル）オキシ、置換（Ｃ３−８シクロアルキル）オキシ、（Ｃ３−８シクロアルキル）チオ、置換（Ｃ３−８シクロアルキル）チオ、ハロ、ヒドロキシル、Ｃ１−１０ヘテロアリール、置換Ｃ１−１０ヘテロアリール、Ｃ１−１０ヘテロアリールオキシ、置換Ｃ１−１０ヘテロアリールオキシ、Ｃ１−１０ヘテロアリールチオ、置換Ｃ１−１０ヘテロアリールチオ、Ｃ２−１０ヘテロシクリル、Ｃ２−１０置換ヘテロシクリル、Ｃ２−１０ヘテロシクリルオキシ、置換Ｃ２−１０ヘテロシクリルオキシ、Ｃ２−１０ヘテロシクリルチオ、置換Ｃ２−１０ヘテロシクリルチオ、イミノ、オキソ、スルホニル、スルホニルアミノ、チオール、Ｃ１−１０アルキルチオ、および置換Ｃ１−１０アルキルチオ、チオカルボニルから選択され；または
２つのＲ１置換基は、それぞれが結合する原子とともに、Ｃ６−１５アリール、置換Ｃ６−１５アリール、Ｃ３−８シクロアルキル、置換Ｃ３−８シクロアルキル、Ｃ１−１０ヘテロアリール、置換Ｃ１−１０ヘテロアリール、Ｃ２−１０置換ヘテロシクリル、およびＣ２−１０ヘテロシクリルオキシから選択される置換した環を形成してもよく；
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥはそれぞれ独立して、炭素、窒素、酸素、および硫黄から選択することができ；および
ｎは、０、１、２、３、４、または５とすることができる。
【０１７６】
他の実施形態において、含ヘテロ原子部分を備える環式化合物は次式：
【化３】
2016516051.tif 000004
式２
を有し、式中、各Ｒ２は、それぞれ独立して、Ｃ１−１０アルキル、置換Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−１０アルコキシ、置換Ｃ１−１０アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アシルＣ１−１０アルキルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アミノカルボニルＣ１−１０アルキル、アミノカルボニルアミノ、アミノジカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、Ｃ６−１５アリール、置換Ｃ６−１５アリール、Ｃ６−１５アリールオキシ、置換Ｃ６−１５アリールオキシ、Ｃ６−１５アリールチオ、置換Ｃ６−１５アリールチオ、カルボキシル、カルボキシエステル、（カルボキシエステル）アミノ、（カルボキシエステル）オキシ、シアノ、Ｃ３−８シクロアルキル、置換Ｃ３−８シクロアルキル、（Ｃ３−８シクロアルキル）オキシ、置換（Ｃ３−８シクロアルキル）オキシ、（Ｃ３−８シクロアルキル）チオ、置換（Ｃ３−８シクロアルキル）チオ、ハロ、ヒドロキシル、Ｃ１−１０ヘテロアリール、置換Ｃ１−１０ヘテロアリール、Ｃ１−１０ヘテロアリールオキシ、置換Ｃ１−１０ヘテロアリールオキシ、Ｃ１−１０ヘテロアリールチオ、置換Ｃ１−１０ヘテロアリールチオ、Ｃ２−１０ヘテロシクリル、Ｃ２−１０置換ヘテロシクリル、Ｃ２−１０ヘテロシクリルオキシ、置換Ｃ２−１０ヘテロシクリルオキシ、Ｃ２−１０ヘテロシクリルチオ、置換Ｃ２−１０ヘテロシクリルチオ、イミノ、オキソ、スルホニル、スルホニルアミノ、チオール、Ｃ１−１０アルキルチオ、および置換Ｃ１−１０アルキルチオ、チオカルボニルから選択され；または
２つのＲ２置換基は、それぞれが結合する原子とともに、Ｃ６−１５アリール、置換Ｃ６−１５アリール、Ｃ３−８シクロアルキル、置換Ｃ３−８シクロアルキル、Ｃ１−１０ヘテロアリール、置換Ｃ１−１０ヘテロアリール、Ｃ２−１０置換ヘテロシクリル、およびＣ２−１０ヘテロシクリルオキシから選択される置換した環を形成してもよく；
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦは、それぞれ独立して、炭素、窒素、酸素、および硫黄から選択することができ；および
ｎは、０、１、２、３、４、または５とすることができる。
【０１７７】
特定の開示の実施形態において、全炭素骨格を備える環式化合物は、次の一般式：
【化４】
2016516051.tif 000005
式３
を有してもよく、式中、Ｒ３およびＲ４は、独立して、ヒドロキシル、水素、Ｃ１−１０アルキル、置換Ｃ１−１０アルキル、カルボキシル、アシル、アミノアシル、アシルアミノ、アミノ、置換アミノ、Ｃ６−１５アリール、置換Ｃ６−１５アリール、およびＣ１−１０アルコキシから選択することができ；Ｒ５は、アミノ、置換アミノ、オキソ、ヒドロキシル、Ｃ１−１０アルコキシ、およびイミノから選択され；およびｎは０、１、２、３、４、または５とすることができる。当業者は、破線が、ある化合物においては存在しその他の化合物においては存在しない場合のある任意結合を示すものであることを理解されよう。
【０１７８】
特定の開示の実施形態において、環Ａおよび環Ｂは、任意結合を介して連結されて、ステロイド系骨格を形成する。環Ａおよび環Ｂが連結したいくつかの実施形態において、Ｒ５は二重結合または単結合を介して環Ａに結合してもよく、この特徴を式１３における任意選択の破線結合により示す。例えば、Ｒ５がアミノ、ヒドロキシル、置換アミノ、またはＣ１−１０アルコキシの場合には、Ｒ５は単結合を介して環Ａに付着するが、Ｒ５がオキソまたはイミノである場合には、Ｒ５は二重結合を介して環Ａに付着する。
【０１７９】
特定の開示の実施形態において、Ｃ６−１５アリールは、フェニル、ビフェニル、ナフタレン、アントラセン等から選択することができ；置換Ｃ６−１５アリールは、本明細書において規定した１つ以上の置換基と置換したフェニル、ビフェニル、ナフタレン、およびアントラセンから選択することができ；Ｃ１−１０アルキルは、Ｃ１−１０アルカン、Ｃ２−１０アルケン、およびＣ２−１０アルキンから選択することができ；より一般的には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル等；エチレン、プロピレン、ブチレン等；およびエチン、プロピン、ブチン等から選択することができ；置換Ｃ１−１０アルキルは、本明細書において提供する１つ以上の置換基より置換したＣ１−１０アルカン、Ｃ２−１０アルケン、およびＣ２−１０アルキンから選択することができる。
【０１８０】
ヘテロシクリルおよびヘテロアリール置換基に関する例示的な実施形態は、限定はしないが、エポキシ、ピロリル、イミダゾール、ピラゾール、ピリジニル、ピラジン、ピリミジン、オキサニル、チアニル、ジオキサニル、ジチアニル、クマリン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドリル、インドリニル（またはジヒドロインドール）、インダゾール、プリン、イソキノリン、キノリン、ベンゾ［ｄ］ピリダジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、ベンゾピリダジン、プテリジン、カルバゾール、イソチアゾール、フェナジン、イソオキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドリン、フタルイミド、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン、４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン、チアゾール、チアゾリジン、チオフェン、ベンゾ［ｂ］チオフェン、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペリジニル、ピロリジニル、ピペラジニル、オキサゾリジニル、オキサゾリル、チオフェニル、イソオキサゾリジニル、およびテトラヒドロフラニルを含む。
【０１８１】
少なくとも２つのＲ１基が一体となった例示的な置換基としては、次のようなものがある：
【化５】
2016516051.tif 000006
【０１８２】
特定の開示の実施形態は、以下に示す式から選択した式を有する５員環の含ヘテロ原子骨格を備える環式化合物に関する。
【化６】
2016516051.tif 000007
式４
2016516051.tif 000008
式５
2016516051.tif 000009
式６
【０１８３】
式４〜式６を参照すると、Ｒ１およびｎは本明細書に記載のものであり、および各Ｘはそれぞれ独立して炭素、酸素、窒素、および硫黄から選択される。
【０１８４】
さらに他の実施形態において、５員環の含ヘテロ原子骨格を備える環式化合物は、以下に示す式のいずれか１つを有してもよく：
【化７】
2016516051.tif 000010
式７
2016516051.tif 000011
式８
2016516051.tif 000012
式９
2016516051.tif 000013
式１０
2016516051.tif 000014
式１１
式中、Ｒ１は本明細書において記載したものである。
【０１８５】
例示的な化合物を以下に示す。
表１  例示的な化合物
【０１８６】
【表１−１】
2016516051.tif 000015
【表１−２】
2016516051.tif 000016
【０１８７】
特定の実施形態は、以下に示す式のいずれか１つを有する６員環の含ヘテロ原子骨格を備える環式化合物に関する：
【化８】
2016516051.tif 000017
式１２
2016516051.tif 000018
式１３
2016516051.tif 000019
式１４
式中、Ｒ２およびｎは本明細書に記載したものであり、Ｚは炭素および窒素から選択することができ、Ｙは窒素および酸素から選択することができ、また、各Ｘはそれぞれ独立して窒素および炭素から選択することができる。当業者には、破線が可変結合を示すものであり、当該可変結合は、各可変結合が付着する原子の結合価（valency）に応じて存在してもしなくてもよいものであることが理解されよう。例えば、式１１において示す可変結合が存在する場合、Ｘは一般的に炭素である。なぜなら、炭素原子は４結合を受け入れることができるからである。そのような化合物においては、Ｘを窒素とすることができるが、しかしながら、当業者には、窒素原子が孤立電子対を用いて第４の結合を受け入れるため、窒素原子が正に帯電するであろうことが理解されるであろう。
【０１８８】
例示的な化合物を、実例としてのみ、以下に示す。
【０１８９】
表２  例示的な化合物
【表２−１】
2016516051.tif 000020
【表２−２】
2016516051.tif 000021
【０１９０】
特定の実施形態は、以下に示す式を有する、全てが炭素でありステロイドである骨格を備える化合物に関する。
【化９】
2016516051.tif 000022
式１５
【０１９１】
例示的な化合物を以下に示す。
【化１０】
2016516051.tif 000023
【０１９２】
全炭素骨格を備える化合物の他の開示の実施形態において、環Ａは環Ｂと連結せず、以下に示す式を有するアリール化合物として存在する。
【化１１】
2016516051.tif 000024
式１６
【０１９３】
例示的な化合物を以下に示す。
【化１２】
2016516051.tif 000025
【０１９４】
本明細書において開示する方法において好適に使用される他の化合物を、以下の表３、４、５、および６に提示する。表３〜６に提示する化合物および本明細書において開示するその他の化合物は、化学合成分野で周知の合成方法により得られる。
【０１９５】
【表３−１】
2016516051.tif 000026
【表３−２】
2016516051.tif 000027
【表３−３】
2016516051.tif 000028
【表３−４】
2016516051.tif 000029
【表３−５】
2016516051.tif 000030
【０１９６】
【表４−１】
2016516051.tif 000031
【表４−２】
2016516051.tif 000032
【表４−３】
2016516051.tif 000033
【表４−４】
2016516051.tif 000034
【表４−５】
2016516051.tif 000035
【表４−６】
2016516051.tif 000036
【０１９７】
【表５−１】
2016516051.tif 000037
【表５−２】
2016516051.tif 000038
【表５−３】
2016516051.tif 000039
【０１９８】
【表６−１】
2016516051.tif 000040
【表６−２】
2016516051.tif 000041
【表６−３】
2016516051.tif 000042
【表６−４】
2016516051.tif 000043
【０１９９】
ある実施形態は、以下の化合物のうちの１つ以上を用いてもよい：
【化１３−１】
2016516051.tif 000044
【化１３−２】
2016516051.tif 000045
【化１３−３】
2016516051.tif 000046
【０２００】
ＩＩＩ．使用方法
ｉ．筋ジストロフィーを治療する方法
α７β１インテグリンは、筋ジストロフィー患者における疾病進行の主要な修飾因子であることが分かっている。筋肉におけるα７インテグリンの発現増加によって、筋ジストロフィーのマウスモデルにおける筋疾患を軽減できる。筋細胞に基づくアッセイを用いて、発明者らは、筋肉中のα７β１インテグリン発現をアップレギュレートする分子として以下のものを特定した：ラミニン−１１１；バルプロ酸；シクロピロックス・エタノールアミン；デフェロキサミン；２，２−ジピリジル；５α−コレスタン−３β−オル−６−オン；化合物ＩＤ＃１００１；化合物ＩＤ＃１００２；化合物ＩＤ＃１００３；およびコレスタンのアナログ類。これらの知見に基づき、付加的な好適な化合物でα７β１インテグリンの発現または活性を増加させることにより筋ジストロフィーを治療する方法を開示する。
【０２０１】
特に、本明細書において、例えば、ＤＭＤ、ＦＣＭＤ、ＬＧＭＤ、ＦＨＭＤ、ＢＭＤ、ＭＤＣ１Ａ、またはＭＤＣ１Ｄ等の筋ジストロフィーを治療する方法を開示する。一例において、該方法は、筋ジストロフィーを有する被験体または筋ジストロフィーを有するか発症する疑いのある被験体に対して、α７β１インテグリン調節剤の有効量を投与することを含み、当該調節剤によりα７β１インテグリンの生物活性または発現を増加して、被験体における筋ジストロフィーを治療するものである。いくつかの例では、当該治療方法により、被験体における筋ジストロフィーに関連する１つ以上の兆候または症状が阻害または低減される。
【０２０２】
いくつかの例では、α７β１インテグリン調節剤は、次に挙げる分子、すなわち、式１〜１６のいずれか１つに包含される化合物、または、表１〜１６および１８のいずれか１つに提示される化合物、のうち１つ以上を含む。いくつかの例では、アナログを、以下のスキームに示す合成経路により合成する。さらなる例において、α７β１インテグリン調節剤は、開示のα７β１インテグリン調節剤のアナログ／誘導体であり、当業者には既知の化学的原理によって設計および合成することができ、実施例１に記載の筋細胞のアッセイ等をはじめとする当業者には既知の方法によりα７β１インテグリン調節剤として識別してもよい。例えば、いくつかの例では、α７β１インテグリン調節剤は、式１〜１６のいずれか１つに提示の、または表１〜１６および１８のいずれか１つに提示の１つ以上の分子を含む。
【０２０３】
開示のα７β１インテグリン調節剤は、核酸配列（例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡｓ等）およびα７β１インテグリンのタンパク質の発現を変更することができる。発現または活性の増加が必ずしも１００％でなくても、薬剤は有効であるとする。例えば、薬剤は、コントロールにおける活性または発現と比較して、発現または生物活性を所望の量、例えば、約１５％〜約９８％、約３０％〜約９５％、約４０％〜約８０％、約５０％〜約７０％等を含み、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％または約１００％等を含む、少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはさらには少なくとも１００％増加することができる。α７β１インテグリン発現および活性を評価する方法は当業者には既知であり、以下の実施例において挙げるものを含む（例えば、市販の抗体を用いたウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡ分析等）。
【０２０４】
特定の例において、被験体はヒトである。
【０２０５】
付加的な態様において、本方法は、筋ジストロフィーを有する被験体を選択することを含む。いくつかの例において、筋ジストロフィーを有する被験体の診断の後に被験体を選択する。例えば、本方法は、被験体が、例えば、ＤＭＤ、ＭＤＣ１Ａ、ＭＤＣ１Ｄ、ＬＧＭＤ、ＤＭＤ、ＦＣＭＤ、またはＦＨＭＤ等の筋ジストロフィーに罹患していると診断することを含む。
【０２０６】
筋ジストロフィーを有する被験体を診断する方法は当業者にとって既知であり、例えば、限定はしないが、筋生検および血清クレアチンキナーゼレベルの測定等が挙げられる。さらに、筋ジストロフィーに関連することが知られるバイオマーカーの変化は、血清または尿サンプル中における前記レベルを測定することにより検出しうる。
【０２０７】
さらなる実施において、本方法は、α７インテグリンを符号化する遺伝子における突然変異を特徴とする疾病、障害、または症状に被験体が罹患していると診断することを含む。別の実施の形態において、本方法は、α７インテグリン発現レベルの減少を特徴とする疾病、障害、または症状に被験体が罹患していると診断することを含む。
【０２０８】
発現の変化は、核酸レベルにおいて（例えば、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応またはマイクロアレイ分析等）、またはタンパク質レベルにおいて（例えば、ウェスタンブロット分析またはＥＬＩＳＡ等）、測定することができる。これらの方法は当業者にとって既知である。
【０２０９】
いくつかの例では、α７インテグリン発現の発現レベルまたは血清クレアチンキナーゼレベルの測定に続いて、分析結果、知見、診断、予測、および／または治療推奨を記録して、例えば、専門技術者、医師および／または患者に伝達することができる。特定の実施形態において、コンピュータを用いて先の情報を、対象者、例えば、患者および／または主治医等に伝達する。そして、投与のための療法はこれらの結果に基づいて選択される。
【０２１０】
一実施形態において、各結果および／または関連情報は、被験体を治療している医師により被験体に伝達されてもよい。代案として、報告書の提供等による書面、ｅメール等の電子通信手段、または電話を含む任意の伝達手段により、各結果を対象被験体に直接伝達してもよい。ｅメールによる連絡の場合等、コンピュータの使用により伝達が容易になりうる。特定の実施形態において、診断検査の結果および／または検査から得た結論および／または検査に基づく治療推奨を含む通信内容は、電気通信分野の当業者にとって周知のコンピュータハードウェアとソフトウェアとの組み合わせを利用して自動的に生成し被験体に送達してもよい。健康管理用通信システムの一例は、米国特許第６，２８３，７６１号に記載されているが、本開示はこの特定の通信システムを使用する方法に限定されない。本開示の各方法の特定の実施形態において、試料を分析するステップ、疾病を診断するステップ、および分析結果または診断を伝達するステップを含む方法ステップの全てまたは一部は、それぞれ異なる管轄（例えば、領土外管轄）において実施してもよい。
【０２１１】
いくつかの方法において、ＤＭＤ、ＬＧＭＤ、ＦＨＭＤ、ＢＭＤ、ＦＣＭＤ、ＭＤＣ１Ｄ、またはＭＤＣ１Ａ等の筋ジストロフィーを有する被験体を特定することにより、結果として、医師は、筋ジストロフィーに関連する１つ以上の兆候および症状を阻止または遅延させるため開示のα７β１薬剤を１つ以上処方する等して被験体を治療することになる。付加的な実施形態において、本明細書に開示の方法を用いて得られた情報に基づき投与量または投薬計画を変更する。
【０２１２】
ｉｉ．筋再生、修復、または維持を促進する方法
また、被験体において筋再生、修復、または維持を促進する方法を開示する。いくつかの例では、本方法は、筋再生、修復、または維持を必要とする被験体に、α７β１インテグリン調節剤の有効量を投与することを含み、α７β１インテグリン調節剤は、式１〜１６のいずれか１つに包含される化合物、表１〜１６および１８のいずれか１つに提示される化合物、またはこれらの組み合わせを含み、α７β１インテグリン調節剤は、α７β１インテグリン発現または活性を、治療前のα７β１インテグリン発現または活性と比べて増加させることにより、被験体における筋再生、修復、または維持を促進する。
【０２１３】
いくつかの例では、α７β１インテグリン調節剤は、以下の分子、すなわち、式１〜１６のいずれか１つに包含される化合物または表１〜１６および１８のいずれか１つに提示される化合物、のうちの１つ以上を含む。いくつかの例では、アナログを、以下の実施例において示す合成経路により合成する。さらなる例において、α７β１インテグリン調節剤は、開示のα７β１インテグリン調節剤のいずれかのアナログ／誘導体であり、当業者には既知の化学的原理により設計および合成することができ、実施例１に記載の筋細胞に基づくアッセイ等をはじめとする当業者には既知の方法によりα７β１インテグリン調節剤として識別してもよい。例えば、いくつかの例では、α７β１インテグリン調節剤は、式１〜１６のいずれか１つに包含される化合物または表１〜１６および１８のいずれか１つに提示される化合物において提供される１以上の分子を含む。
【０２１４】
開示のα７β１インテグリン調節剤は、核酸配列（例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡｓ）およびα７β１インテグリンのタンパク質の発現を増加させることができる。発現または活性の増加が必ずしも１００％でなくても、薬剤は有効であるとする。例えば、薬剤は、発現または生物活性を所望の量、例えば、コントロールにおける活性または発現と比較して、約１５％〜約９８％、約３０％〜約９５％、約４０％〜約８０％、約５０％〜約７０％等を含み、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％または約１００％等を含む、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またさらには少なくとも１００％増加させることができる。α７β１インテグリン発現および活性を評価する方法は当業者には既知であり、以下の実施例において挙げるものを含む（例えば、市販の抗体を用いたウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡ分析等）。
【０２１５】
筋再生は、例えば、筋修復能力が減退している高齢またはその他の患者集団に利益をもたらしうるか、または、それ他の場合には、生理学的に身体障害のない患者の筋修復プロセスの加速が容易になりうる。特定の実施の形態において、α７β１インテグリン調節剤の投与により、運動選手または活動誘発性筋障害または損傷を有する他の人々における筋修復または筋損傷の減少を支援することができる。さらに別の実施の形態において、例えば事故または怪我等により筋損傷を受けた患者における筋修復は、α７β１インテグリン調節剤の投与により増強可能である。
【０２１６】
いくつかの例では、被験体が筋損傷または筋疾患を受ける前にα７β１調節剤を投与する。いくつかの例では、運動をする前の被験体にα７β１インテグリン調節剤を投与する。
【０２１７】
いくつかの例では、本方法は、筋再生、修復、または維持の促進を必要とする被験体を選択することをさらに含む。例えば、場合によっては、筋再生、修復、または維持を促進する必要のある被験体を選択することは、α７β１インテグリン調節剤の有効量を被験体に投与する前に筋再生障害を特徴とする症状を持つ被験体を診断することを含む。筋再生、修復、または維持を必要とする被験体を診断および選択する方法は当業者にとって既知であり、本明細書において記載したもの（筋ジストロフィーの治療の方法における方法を含む）が挙げられる。先に述べたように、被験体は、その日常生活様式（例えば、中等度から強度の運動または身体活動に従事している等）、年齢（例えば、筋変性または障害を受けるリスクがより高い高齢集団等）、または筋変性または障害を受けやすい体質（例えば、遺伝的特徴または筋障害の前歴）に基づいて選択することができる。
【０２１８】
ｉｉｉ．筋障害または損傷を予見的に防止または低減する方法
被験体における筋障害または損傷を予見的に防止または低減する方法も開示する。いくつかの実施形態において、本方法は、α７β１インテグリン調節剤の有効量を被験体に投与することを含み、α７β１インテグリン調節剤は、式１〜１６のいずれか１つに包含される化合物、表１〜１６および１８のいずれか１つに提示される化合物、またはこれらの組み合わせを含み、α７β１インテグリン調節剤は、α７β１インテグリンの発現または活性を未治療のα７β１インテグリン発現または活性と比較して増加させることにより、被験体における筋障害または損傷を予見的に防止または低減する。
【０２１９】
いくつかの例では、α７β１インテグリン調節剤は、以下の分子、すなわち、式１〜１６のいずれか１つに包含される化合物または表１〜１６および１８のいずれか１つに提示される化合物、のうちの１つ以上を含む。さらなる例において、α７β１インテグリン調節剤は、開示のα７β１インテグリン調節剤のアナログ／誘導体であり、当業者には既知の化学的原理によって設計および合成することができ、実施例１に記載の筋細胞に基づくアッセイ等をはじめとする当業者には既知の方法によりα７β１インテグリン調節剤として識別してもよい。例えば、いくつかの例では、α７β１インテグリン調節剤は、式１〜１６のいずれか１つに提示の、または表１〜１６および１８のいずれか１つに提示の１つ以上の分子を含む。本明細書において開示する特定のα７β１インテグリン調節剤を作成する例示の合成スキームを、以下のスキーム１および２において提示する。そのような化合物の誘導体は、好適な試薬および条件を用いてコア構造を官能化する等の当該分野で既知の方法で得られることが、当業者によって認識されるであろう。種々のアナログを生成するために変更可能な基の例を、以下のスキームに示す。いくつかの実施形態において、分子のコアを変更して、１以上の付加的なヘテロ原子を含むようにするか、および／または、既存のヘテロ原子を別の好適なヘテロ原子で置き換えてもよい。
【０２２０】
【化１４】
2016516051.tif 000047
【０２２１】
開示のα７β１インテグリン調節剤は、核酸配列（例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡｓ等）およびα７β１インテグリンのタンパク質の発現を増加することができる。発現または活性の増加が必ずしも１００％でなくても、薬剤は有効であるとする。例えば、薬剤は、コントロールにおける活性または発現と比較して、発現または生物活性を所望の量、例えば、約１５％〜約９８％、約３０％〜約９５％、約４０％〜約８０％、約５０％〜約７０％等を含み、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％または約１００％等を含む、少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはさらには少なくとも１００％増加することができる。α７β１インテグリン発現および活性を評価する方法は当業者には既知であり、以下の実施例において挙げるものを含む（例えば、市販の抗体を用いたウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡ分析等）。
【０２２２】
いくつかの例では、本方法は、筋障害または損傷を発症するリスクのある被験体を選択することをさらに含む。いくつかの例では、運動をする前の被験体にα７β１インテグリン調節剤を投与する。
【０２２３】
いくつかの例では、本方法は、筋障害または損傷を発症するリスクのある被験体を選択することをさらに含む。被験体を選択する方法は当業者にとって既知であり、本明細書に記載したものを含む。先に述べたように、被験体は、その日常生活様式（例えば、中等度から強度の運動または身体活動に従事している等）、年齢（例えば、筋変性または障害を受けるリスクがより高い高齢集団等）、または筋変性または障害を受けやすい体質（例えば、遺伝的特徴または筋障害の前歴）に基づいて選択することができる。
【０２２４】
ｉｖ．α７β１インテグリン発現を促進する方法
本明細書では、α７β１インテグリンの発現を促進する方法も開示する。いくつかの例では、これらの方法は、細胞をα７β１インテグリン調節剤の有効量と接触させることを含み、α７β１インテグリン調節剤は、式１〜１６のいずれか１つに包含される化合物、表１〜１６および１８のいずれか１つに提示される化合物、またはこれらの組み合わせを含み、既治療の細胞におけるα７β１インテグリン発現を、未治療の細胞におけるα７β１インテグリン発現と比較して増加させることにより、α７β１インテグリン発現を増加する。いくつかの例では、細胞は、例えば骨格筋細胞等の筋細胞である。いくつかの例では、筋細胞は哺乳動物に存在し、前記細胞を薬剤に接触させることは、当該薬剤を当該哺乳動物に投与することを含む。
【０２２５】
いくつかの例では、α７β１インテグリン調節剤は、以下の分子、すなわち、式１〜１６のいずれか１つに包含される化合物または表１〜１６および１８のいずれか１つに提示される化合物、のうちの１つ以上を含む。さらなる例において、α７β１インテグリン調節剤は、開示のα７β１インテグリン調節剤のアナログ／誘導体であり、当業者には既知の化学的原理によって設計および合成することができ、実施例１に記載の筋細胞に基づくアッセイ等をはじめとする当業者には既知の方法によりα７β１インテグリン調節剤として識別してもよい。いくつかの例では、α７β１インテグリン調節剤は、式１〜１６のいずれか１つに包含されるまたは表１〜１６および１８のいずれか１つに提示される１以上の分子を含む。
【０２２６】
いくつかの例では、開示のα７β１インテグリン調節剤は、核酸配列（例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡｓ等）およびα７β１インテグリンのタンパク質の発現を増加することができる。発現または活性の増加が必ずしも１００％でなくても、薬剤は有効であるとする。例えば、薬剤は、コントロールにおける活性または発現と比較して、発現または生物活性を所望の量、例えば、約１５％〜約９８％、約３０％〜約９５％、約４０％〜約８０％、約５０％〜約７０％等を含み、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％または約１００％等を含む、少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはさらには少なくとも１００％増加することができる。α７β１インテグリン発現および活性を評価する方法は当業者には既知であり、以下の実施例において挙げるものを含む（例えば、市販の抗体を用いたウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡ分析等）。
【０２２７】
α７β１インテグリン調節剤の有効量の投与
開示の方法のいずれについても、α７β１インテグリン調節剤の有効量とは、特定の経路および濃度で投与したときに所望の反応（例えば、筋ジストロフィーの治療、筋再生、修復、または維持の促進、筋障害または損傷の防止または低減、α７β１インテグリン発現の促進等）を誘発するものである。
【０２２８】
ｉ．投与経路、配合、および濃度
開示のα７β１インテグリン調節剤を投与する方法は定型化した手順であり、熟練臨床医により決定することができる。開示のα７β１インテグリン調節剤またはその他の治療物質の投与は、通常、局所的、経鼻、静脈内、経口、頭蓋内、筋肉内、非経口、またはインプラントであるが、原則的には直腸、経膣での使用も可能である。開示のα７β１インテグリン調節剤は、これらの手法の組み合わせにより被験体に投与してもよい。
【０２２９】
固体または液体の医薬製剤形態として好適なものは、例えば、エアゾール剤、（マイクロ）カプセル剤、クリーム剤、滴薬剤、アンプル形状の点滴薬剤または注射剤、乳液類、顆粒剤、粉末剤、座剤、懸架剤、シロップ剤、錠剤、コーティング錠、および活性化合物を遅延性放出する製剤があり、製剤中には、賦形剤および添加物および／または助剤、例えば、バインダー、コーティング剤、崩壊剤、香料、潤沢剤、可溶化剤、甘味剤、または、膨張剤等が慣例的に使用される。これらの医薬品は、種々のドラッグデリバリーシステムで好適に使用される。薬剤送達の種々の方法の概要については、本開示と矛盾しない範囲において参照により本明細書に援用するランガー（Langer）による「薬剤送達の新方法（“New Methods of Drug Delivery”）」科学２４９（Science 249）：１５２７頁〜１５３３頁（１９９０年）を参照されたい。
【０２３０】
本開示のα７β１インテグリン調節剤またはその他の薬剤は、被験体に対して非経口的または経口的に投与可能な治療効果のある本開示の医薬品に調合することができる。非経口投与経路としては、限定はしないが、経皮、動脈内、筋肉内（ＩＭおよびデポＩＭ）、腹腔内（ＩＰ）、静脈内（ＩＶ）、胸骨内注射または注入手法、鼻腔内（吸入）、鞘内、胃内への注射、皮下注射（皮下（ＳＱおよびデポＳＱ）、経皮、局所、および経眼等がある。
【０２３１】
開示のα７β１インテグリン調節剤またはその他の薬剤は、好適な医学的に許容される添加剤と組み合わせて、医薬品を調合することができる。医学的に許容される好適な添加剤の例としては、限定はしないが、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、緩衝剤類（リン酸塩等）、グリシン、イオン交換体類（荷電物質の注入制御を支援すること等）、レシチン、植物性飽和脂肪酸類の部分グリセリド混合物類、ソルビン酸カリウム、血清タンパク質類（ヒト血清アルブミン等）、ソルビン酸、水、セルロース系物質等の塩類または電解質類、コロイドシリカ、リン酸水素二ナトリウム、３ケイ酸マグネシウム、ポリアクリル酸塩類、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール類、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー類、ポリビニルピロリドン、リン酸水素カリウム、硫酸プロタミン、塩化ナトリウム、塩化カルボキシメチルセルロース等の第１族ハロゲン塩類、ワックス類、羊毛脂、および亜鉛塩類等が挙げられる。リポゾーム懸濁液も、医学的に許容される担体として好適に用いることができる。
【０２３２】
開示のα７β１インテグリン調節剤および／またはその他の治療剤の１つ以上を混合または添加する際、結果として得られる混合物は固体、溶液、懸濁液、乳液等であってよい。これらは、当業者には既知の方法により調合してもよい。結果として得られる混合物の形態は、多数の要因によって決まるが、要因としては、例えば、意図する投与形態および選択した担体中での薬剤の可溶性等がある。開示のα７β１インテグリン調節剤またはその他の治療剤を投与するのに好適な医薬担体としては、投与の特定の様式に適したものであることが分かっている担体等が挙げられる。さらに、開示のα７β１インテグリン調節剤またはその他の治療剤は、所望の作用を損なわないその他の不活性または活性物質と、または所望の作用を捕捉するかまたは別の作用を持つ材料と混合することができる。
【０２３３】
薬剤の担体への可溶化が不十分な場合は、可溶化する方法を用いてもよい。そのような方法は周知であり、例えば、限定はしないが、水性重炭酸ナトリウムへの溶解、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の共溶媒類の使用、およびＴＷＥＥＮ（登録商標）（ＩＣＩアメリカス社（ICI Americas、Inc.）、ウィルミントン、デラウェア州）等の界面活性剤類の使用等が挙げられる。
【０２３４】
開示のα７β１インテグリン調節剤またはその他の治療剤は、それらの急速な体外排泄を防止する担体、例えば、コーティングまたは時限放出製剤等とともに調製することができる。そのような担体としては、限定はしないが、マイクロカプセル封入デリバリーシステム等の制御放出製剤が挙げられる。医学的に許容される担体中に含まれる開示のα７β１インテグリン調節剤またはその他の治療剤の量は、治療上有効な効果を発揮するのに十分な量とし、通常、治療対象者への望ましくない副作用を回避する量とする。治療上有効な濃度は、治療した病状について既知の体外または体内モデルシステムにおいて化合物を検査することによって経験的に求められる。例えば、当該技術分野で知られているように、筋ジストロフィーのマウスモデルを用いて、後にヒト等その他の被験体用に翻訳可能な有効量または有効濃度を求める。
【０２３５】
注射溶液または懸濁液は、１，３−ブタンジオール、等張塩化ナトリウム溶液、マンニトール、リンガー溶液、食塩水、または水等の無毒性で非経口的に受け入れ可能な賦形剤類または溶剤類；または、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む無菌油、無刺激油、不揮発性油、およびオレイン酸を含む脂肪酸等の分散剤または湿潤剤および懸濁化剤；ココナッツ油、綿実油、落花生油、胡麻油等の天然植物油；グリセリン；ポリエチレングリコール；プロピレングリコール；またはその他の合成溶剤；ベンジルアルコールおよびメチルパラベン等の抗微生物剤類；アスコルビン酸および亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤類；酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩等の緩衝剤；エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤；塩化ナトリウムおよびブトウ糖等の等張化剤；およびそれらの各種組み合わせ等の分散剤または湿潤剤および懸濁化剤をそれぞれ好適に用いて調合することができる。非経口調剤は、ガラス製、プラスチック製、その他の好適な素材製のアンプル、ディスポーザブルシリンジ、または多容量バイアルに封入可能である。緩衝剤、保存料、抗酸化剤、その他は必要に応じて混合することができる。静脈内投与した場合、好適な担体としては、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、および、グルコース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびその組み合わせ等の濃化剤および可溶化剤を含む溶液が挙げられる。細胞を標的としたリポゾームをはじめとする、リポゾーム懸濁液も、医学的に許容される担体として好適に用いることができる。
【０２３６】
局所適用の場合、１つ以上の開示のα７β１インテグリン調節剤またはその他の治療剤は、好適な水性または非水性担体中のクリーム、ローション、軟膏、溶液、または懸濁液とすることができる。局所適用は、当該治療剤物質を含有する経皮吸収型貼付剤または包帯を用いて行うこともできる。添加剤としては、例えば、メタ重亜硫酸ナトリウムまたはエデト酸二ナトリウムなどの緩衝剤、酢酸フェニル水銀または硝酸フェニル水銀、塩化ベンザルコニウム、またはクロルヘキシジンをはじめとする殺菌・殺真菌剤等の保存料、およびヒプロメロース等の増粘剤を含むこともできる。
【０２３７】
開示のα７β１インテグリン調節剤またはその他の治療剤を、懸濁液として経口投与する場合、その医薬組成物は、医薬製剤の技術分野で周知の方法により調製することができ、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウム等の懸濁化剤、微結晶性セルロース等の充填剤、メチルセルロース等の増粘剤（viscosity enhancer）、甘味料／着香料等を含んでもよい。経口液剤類は、例えば、ゼラチン、グルコースシロップ、硬化食用脂肪、メチルセルロース、ソルビトール、およびシロップ等の懸濁化剤類；例えば、アカシア、レシチン、またはソルビタンモノオレエート等の乳化剤類；例えば、扁桃（アーモンド）油、分画された椰子油、グリセリン、プロピレングリコール、またはエチルアルコール等の油性エステル等の非水性担体（食用油を含む）類；メチルまたはプロピルｐ−ハイドロオキシ安息香酸またはソルビン酸等の保存料；および、必要に応じて従来の着香料または着色剤等、従来の添加剤を含有することができる。即放性錠剤として調合した場合、これらの組成物は、リン酸二カルシウム、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、微結晶性セルロース、およびデンプンおよび／またはその他の結合剤、希釈剤、崩壊剤、賦形剤、エクステンダー、および潤滑剤を含有することができる。
【０２３８】
経口投与が所望の場合、α７β１インテグリン調節剤またはその他の治療剤は、胃における酸性環境から薬剤を保護する組成物中に含ませることができる。例えば、開示したα７β１インテグリン調節剤またはその他の治療剤を、腸溶性コーティングと共に調合することができる。腸溶性コーティングは、胃ではその完全性を保ち、有効成分を腸で放出するものである。開示のα７β１インテグリン調節剤またはその他の治療剤は、制酸剤または他の類似成分と組み合わせて調合することもできる。
【０２３９】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含み、圧縮して錠剤とするか、または、ゼラチンカプセルに封入することができる。経口治療投与の目的で、１つ以上の本開示によるα７β１インテグリン調節剤またはその他の治療剤類を賦形剤とともに組み込んで、カプセル、タブレット錠剤、またはトローチ錠剤として使用することができる。医学的に適合するアジュバント材料または結合剤も、組成物の一部として含むことができる。
【０２４０】
カプセル、ピル、タブレット、トローチ等は、同様の性質を有する以下の任意の成分または化合物を含有することができる。例えば、限定はしないが、アカシア、コーンスターチ、ゼラチン、トラガントゴム、ポリビニルピロリドン、またはソルビトール等の結合剤；リン酸カルシウム、グリシン、ラクトース、微結晶性セルロース、またはデンプン等の充填剤；限定はしないが、アルギン酸およびコーンスターチ等の崩壊剤；限定はしないが、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、シリカ、タルク等の潤滑剤；限定はしないが、コロイド状二酸化ケイ素等の流動促進剤；ショ糖やサッカリンなどの甘味剤；ジャガイモデンプン等の崩壊剤；ラウリル硫酸ナトリウム等の分散剤または湿潤剤；およびペパーミント、サリチル酸メチル、フルーツ香味料などの着香料を含有することができる。
【０２４１】
投与単位剤型がカプセルの場合、カプセルには、上記のような種類の材料に加えて、脂肪油等の液体担体を含むことができる。さらに、投与単位剤形は、投与単位の物理的形状を変更するその他種々の材料を含むことができ、例えば、糖衣およびその他の溶腸剤コーティングを含むことができる。１つ以上の本開示によるα７β１インテグリン調節剤またはその他の治療剤は、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハース、茶、チューイングガム、その他の成分として投与することもできる。シロップは、活性化合物のほかに、甘味料としてのスクロースまたはグリセリン、および所定の保存料、色素、着色料、および着香量を含みうる。
【０２４２】
経口投与の場合、化合物は、経口投与用の一般的な投与剤型で投与することができる。これらの投与剤型の例としては、錠剤およびカプセル等の一般的な固体製剤、および溶液、懸濁液、およびエリキシル等の液体製剤を含む。固体製剤を使用する場合、持続放出型とすれば化合物の必要投与回数を減らすことができる。
【０２４３】
いくつかの例では、開示のα７β１インテグリン調節剤および／または治療剤を被験体の胃に注射して、多用な筋群等、被験体において全身的に組み込まれる。治療物質を投与するための方法およびタンパク質を含む組成物の例は、Bangaによる「治療的ペプチドおよびタンパク質：調合、プロセッシング、およびデリバリーシステム、第２版（Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems 2ed.）（２００５年）」；Mahatoによる「送達用生体材料およびタンパク質および核酸のターゲティング（Biomaterials for Delivery and Targeting of Proteins and Nucleic Acids （２００４年）；McNallyによる「タンパク質調合および送達、第２版（Protein Formulation and Delivery、2ed.）」（２００７年)；およびKumarらによる「タンパク質およびペプチド治療の新規なデリバリー技術（”Novel Delivery Technologies for Protein and Peptide Therapeutics,”）」Current Pharm. Biotech.、７：２６１〜２７６頁（２００６年）；において検討されており、それぞれ、本開示と矛盾しない範囲において参照により本明細書に援用する。
【０２４４】
いくつかの実施において、開示のα７β１インテグリン調節剤の１つ以上の有効量を、例えば、３〜４ヶ月毎、１月毎、１週間毎、１日毎等の時間当たりに単量投与する。または、ある時間にわたって、少なくとも２単位服用量（ユニットドース）に分けてもよい。所望の結果を達成する必要がある限り治療を続けてもよい。例えば、約３または４週間から約１２〜２４ヶ月またはそれ以上にわたり治療を続けてもよい。当該化合物は、例えば、数日毎（例えば、少なくとも約２日、３日、４日、５日、または１０日毎等）または数週間毎（例えば、少なくとも約２週、３週、４週、５週、または１０週毎等）間欠的に数回の服用量を投与することもできる。
【０２４５】
特定の被験体に、治療すべき症状、または所望の結果に対して特定の投薬計画（投薬レジメン）を適合できる。例えば、本開示の方法を用いて筋ジストロフィーまたは同様の症状を治療する場合、最初の治療計画（治療レジメン）を用いて症状を抑えることができる。そのような最初の治療計画としては、開示のα７β１インテグリン調節剤の１つ以上を高い用量で投与すること、または、より頻繁に、例えば毎日投与すること等が挙げられる。所望の治療効果、例えば筋再生の所望のレベル等が得られたら、第２の治療計画（治療レジメン）、例えば、開示のα７β１インテグリン調節剤の１つ以上の投与用量を減らすか、または、例えば、１ヶ月毎、２ヶ月毎、４半期毎、またはほぼ１年毎等の低い頻度での投与を適用することができる。そのような場合、この第２のレジメンは、筋再生の所望のレベルを回復または維持する「ブースター」として機能しうる。同様の治療レジメンは、高齢被験体等、筋再生能力の低下または障害を有するその他の被験体に用いてもよい。
【０２４６】
本開示の特定の方法を用いて、例えば、激しい運動（労作性）または負傷を原因とする筋損傷を防止または緩和する場合、治療効果を提供するため、被験体が激しい運動または怪我をするかなり前に治療を行うことが一般的である。例えば、活動または怪我をする可能性のある少なくとも約２４時間前、例えば、少なくとも、約４８時間、約７２時間、約１週間、約２週間、約３週間、または約４週間またはそれ以上前に被験体を治療してもよい。
【０２４７】
本開示の方法の実施形態を用いて筋障害を防止または治療する場合、開示のα７β１インテグリン調節剤の１つ以上またはその他の治療的物質を治療対象領域に直接またはその近隣に適用することができる。例えば、物資を領域内またはその近くに注射することができる。さらなる例において、治療対象領域に対して物質を局所的に適用することができる。治療は、一般に、怪我の前から始め、怪我の後数週間継続する。より具体的な実施の形態において、怪我後約１２時間〜約７２時間の間に、例えば怪我後約２４時間〜約４８時間の間に、治療を始める。場合によっては、所望の治療効果を提供するのに物質の単回投与が効果的である。さらなる例においては、所望の治療効果を得るために、さらに投与を行う。
【０２４８】
本開示の種々の治療処置に対する有効な量は、疾病の重度および被験体の体重および全身状態、および、治療的活性化合物または成分の吸収速度、不活化速度、および排出率、投与計画および投与量、および当業者にとって既知のその他の要因等によって決まることはもちろんである。また、正確な投与量および投与間隔は、投与中の特定のα７β１インテグリン調節剤またはその他の治療的物質、治療しようとする特定の症状、治療しようとする症状の重度、特定の被験体の年齢、体重、全身的な身体状態、および被験体が服用中のその他の薬よって決まってくるであろうことも、当業者には明白であろう。典型的には、体外で使用した投与量は、当該医薬組成物の体内投与量について有用なガイダンスとなりえるし、また動物モデルを用いて特定の疾患の治療に対する効果的な投与量を決定してもよい。例えば、当技術分野で既知であるように、筋ジストロフィーのマウスモデルを用いて、後にヒト等その他の被験体用の投与量に翻訳可能な有効薬量を求めこともできる。投与量の決定についての種々の考察は、例えば、Gilmanら編集、「治療学の薬理学的基礎（Goodman And Gilman’s: The Pharmacological Bases of Therapeutics）」、第８版、ペルガモン・プレス社（Pergamon Press）（１９９０年）；および「レミントン薬学（Remington’s Pharmaceutical Sciences）」、第１７版、マック出版社（Mack Publishing Co.）、イーストン、ペンシルベニア州（１９９０年）に記載されており、それぞれ、本開示と矛盾しない範囲において引用によりここに援用する。
【０２４９】
特定の例において、開示のα７β１インテグリン調節剤の１つ以上を被験体に投与する際の量は、薬剤の供与量が約１０ｆｍｏｌ／ｇと約５００ｎｍｏｌ／ｇとの間となるように、例えば、約２ｎｍｏｌ／ｇと約２０ｎｍｏｌ／ｇとの間、または約２ｎｍｏｌ／ｇと約１０ｎｍｏｌ／ｇとの間になるようにする。付加的な例において、α７β１インテグリン調節剤の被験体へ投与する際の量は、投与量が約０．０１μｇ／ｋｇと約１０００ｍｇ／ｋｇとの間、または約０．１ｍｇ／ｋｇと約１０００ｍｇ／ｋｇとの間となるようにし、特定の例において、この量を１日当たりまたは１週間当たりの量とする。別の例において、開示のα７β１インテグリン調節剤を被験体に投与する際の量は、投与量が約０．２ｍｇ／ｋｇと約２ｍｇ／ｋｇとの間となるようにする。さらなる例において、α７β１インテグリン調節剤を被験体に投与する際の量は、投与物質中におけるα７β１インテグリン調節剤の濃度が約５ｎＭと約５００ｎＭとの間、例えば約５０ｎＭと約２００ｎｍとの間、または約１００ｎＭとなるようにする。その他の例において、α７β１インテグリン調節剤の被験体への投与量は、約５００μｇ／ｍｌと約１μｇ／ｍｌとの間、例えば、５００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌ、３．１２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、および１．２５μｇ／ｍｌ等、約３００μｇ／ｍｌと約３μｇ／ｍｌとの間、約２００μｇ／ｍｌと約２０μｇ／ｍｌとの間とする。
【０２５０】
ｉｉ．所望の反応
開示のα７β１インテグリン調節剤の１つ以上および／または付加的な治療剤は、特定の経路および／または濃度で投与して、所望の反応を生成する。いくつかの例において、所望の反応とは、治療した疾病、障害、または症状の少なくとも１つを減少、寛解、除去、防止、または抑制するのに有効な量のことであり、経験的に決定することができる。本開示の種々の実施形態において、所望の反応とは、筋再生、筋力低下の減少または防止、筋維持の促進、筋障害または損傷の低減または防止、筋ジストロフィーに関連する１つ以上の兆候または症状の低減または防止である。
【０２５１】
特に、筋肉の健康、例えば、筋細胞再生、維持、または修復等の指標は、例えば、Ｐａｘ７、Ｐａｘ３、ＭｙｏＤ、ＭＲＦ４、およびミオゲニン等の転写因子等、筋再生のマーカーの監視等、種々の手段によりアッセイすることができる。例えば、これらのマーカーの発現の増加により、筋再生が起きているか、最近起きたばかりであることがわかる。筋再生のマーカー、例えば、胚ミオシン重鎖（ｅＭｙＨＣ）の発現等を用いて、筋再生、維持、または修復の程度を測ることができる。例えば、ｅＭｙＨＣの存在により、被験体において筋再生が起きたばかりであることが分かる。
【０２５２】
筋細胞再生、維持、修復は、筋細胞の周囲長すなわち平均断面積または筋線維密度を測定することによって監視することもできる。筋状態を示す付加的な指標としては、筋重量および筋タンパク質含有量がある。分裂指数（ＢｒｄＵ取込測定によるもの等）または筋形成を用いて筋再生の程度を評価することもできる。
【０２５３】
特定の例において、再生等の筋状態は、コントロールと比較して、少なくとも約１０％、例えば、１０％〜９０％の減少、２０％〜８０％の増加、３０％〜７０％の増加、または４０％〜６０％の増加（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、２００％又はそれ以上の増加）を含む、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％を含む、少なくとも約３０％、または少なくとも約５０％またはそれ以上、向上する。
【０２５４】
ｉｉｉ．付加的な治療または治療剤
特定の例において、筋ジストロフィーに関連する１つ以上の兆候または症状を低減または抑制する薬剤の有効量投与の前に、最中に、または後に、被験体は１つ以上のその他の治療を受けることができる。一例において、被験体は、開示のα７β１調節剤の投与の前に、１つ以上の治療を受ける。そのような治療の例としては、限定はしないが、筋鞘を安定させ筋変性を減少する働きをする、ラミニン−１１１タンパク質療法がある。いくつかの例において、筋細胞源を添加して、筋再生および修復を支援することができる。本開示のいくつかの態様において、ラミニン療法と組み合わせて、被験体にサテライト細胞を投与する。本明細書において、本開示と矛盾しない限りにおいて援用により参照する米国特許公開第２００６／００１４２８７号は、筋芽細胞における細胞の集合体を濃縮して、それらの細胞を被験体に投与する方法を提供する。さらなる態様において、脂肪組織由来幹細胞等の幹細胞を被験体に投与する。脂肪組織由来幹細胞を調合および投与する好適な方法は、本開示と矛盾しない限りにおいて援用により参照する米国特許公開第２００７／００２５９７２号において記載される。いくつかの例において、線維芽細胞等、その他の細胞物質を投与するともできる。
【０２５５】
付加的な治療剤としては開示のα７β１調節剤の効果を増強する薬剤を含み、例えば、インテグリン、ジストロフィン、ジストログリカン、ユートロフィン、または発育因子等の細胞外マトリックスの構成分子等である。いくつかの例では、付加的な治療剤は、細胞外マトリックスの形成および維持を促進する物質の発現を減少または増加させる。いくつかの例では、付加的な物質は、アグレカン、アンギオスタチン、カドヘリン、コラーゲン（コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、またはコラーゲンＩＶを含む）、デコリン、エラスチン、エナクチン、エンドスタチン、フィブリン、フィブロネクチン、オステオポンチン、テネイシン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、およびその組み合わせを含むことができる。ビグリカン、グリコサミノグリカン（ヘパリン等）、糖タンパク質（ジストログリカン等）、プロテオグリカン（ヘパラン硫酸等）、およびその組み合わせも投与することができる。
【０２５６】
いくつかの例において、サイトカイン、ポリペプチド、および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＣＮＦ（毛様体神経栄養因子）、ＥＧＦ（上皮成長因子）、ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）、グリア成長因子（ＧＧＦ）、グリア成熟因子（ＧＭＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン、インスリン様成長因子類、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３および−４、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、およびその組み合わせ等の成長因子等の成長促進剤を、本開示の方法の１つとともに投与してもよい。
【０２５７】
ＩＶ．臨床試験
筋疾患の治療における開示のα７β１調節剤の１つ以上の使用について規制当局の認可を得るため、臨床試験を行った。当該技術分野において知られているように、臨床試験はいくつかの試験段階を経て進み、それぞれの段階を第Ｉ相、第ＩＩ相、第ＩＩＩ相、および第ＩＶ相とよぶ。
【０２５８】
まず、開示のα７β１調節剤を第Ｉ相試験において評価する。一般に、第Ｉ相試験を用いて、投与の最良の形態（例えば、錠剤または注射の別）、投与の頻度、および化合物についての毒性について判断する。第Ｉ相における評価は、多くの場合、血液検査および生検等実験室での実験を含み、患者の体内における治療的有効性の効果を評価する。第Ｉ相試験について、筋障害を有する患者の小グループを、開示のα７β１調節剤を特定量投与して治療する。最大耐量（ＭＴＤ）およびその化合物に関連する用量制限毒性（ＤＬＴ）を求めるため、試験中、投与量はグループごとに増加させる。このプロセスにより、続く第ＩＩ相試験における適正投与量を求める。
【０２５９】
第ＩＩ相試験を行って、さらに、開示のα７β１調節剤の効果および安全性を評価する。第ＩＩ相試験において、筋障害を有する患者群に対して、開示のα７β１調節剤を投与するが、その際の投与量は、第Ｉ相試験において効果的であることがわかったものを使用する。
【０２６０】
第ＩＩＩ相試験では、基準、すなわち、より広く認められている治療と比較して、開示のα７β１調節剤がどうであるかを判断することに着目する。第ＩＩＩ相試験において、患者を２つ以上の「アーム」の１つに無作為に割り付ける。２つのアームを用いる試験では、例えば、１つのアームには標準的な治療を行い（コントロール群）、もう一方のアームには開示のα７β１調節剤による治療を行う（治験群）。
【０２６１】
第ＩＶ相試験を利用して、さらに、開示のα７β１調節剤の長期安全性および有効性を評価する。第ＩＶ相試験は、第Ｉ相、第ＩＩ相、および第ＩＩＩ相の各試験と比して一般的ではなく、開示のα７β１調節剤の標準的な使用について認可されてから行われる。
【０２６２】
臨床試験に対する患者の適格性
参加者の適格基準は、一般的なもの（例えば、年齢、性別、病型等）から特定的なもの（例えば、前治療の種類および回数、疾病特性、血球数、臓器機能）にまで及ぶ。一実施形態において、適正患者は筋障害を診断されている。適正基準は、試験段階によっても異なる場合がある。臨床試験の適格患者は、筋障害の客観的な測定および他の筋障害治療への非反応性に基づいて選択することもできる。例えば、第Ｉ相および第ＩＩ相試験において、実験的治療に対し、臓器機能障害またはその他の要因を原因とするリスクがありうる患者は、これらの基準から除外されることが多い。第ＩＩ相および第ＩＩＩ相試験では、疾病の種類および段階および前治療の回数および種類に関して付加的な基準が含まれることが多い。
【０２６３】
第Ｉ相試験では、通常、他の治療で効果がみられなかった１５人〜３０人の参加者を含む。第ＩＩ相試験は、一般に、既に薬物治療を受けたが治療の効果がみられなかった１００人までの参加者を含む。
【０２６４】
第ＩＩＩ相試験への参加は、以前受けた治療に基づき制限されることが多い。第ＩＩＩ相試験では、通常、数百人から数千人の参加者を擁する。これだけ多人数の患者を必要とする理由は、開示のα７β１調節剤と標準的治療との間に有効性の真の差異があるかどうかを判断するためである。第ＩＩＩ相試験では、新たに筋障害と診断された患者から、筋障害に関連する兆候および／または症状の再発があったか、前治療に対して反応を示さなかった筋障害を有する患者までを含むことができる。
【０２６５】
対象母集団が多様化しすぎて当該治療がより狭く定義された母集団について有効であるか判断できないことがない限りにおいて臨床試験はできるだけ包括的なものとすべきであることが当業者には理解されよう。試験における母集団が多様化すればするほど、特に第ＩＩＩ相試験においては、一般集団に対して結果を当てはめやすくなる。臨床試験の各段階において適切な参加者を選択することは当業者の通常の技能の範囲内であると考えられる。
【０２６６】
治療前における患者のアセスメント
試験を始める前に、本技術分野で知られているいくつかの手段を用いてまず患者を分類することができる。患者の評価は、まず、血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベル、または、筋障害のその他の指標、例えば、筋肉の炎症、アポトーシス、筋消失、筋管肥大、および／または筋線維の安定性の減少および細胞寿命等を測定することにより、行うことができる。
【０２６７】
臨床試験における開示のα７β１調節剤の投与
開示のα７β１調節剤は、試験参加者に経口投与することが一般的である。薬剤の用量の範囲を試験することができる。前臨床試験からの情報を得れば、熟練の専門家は臨床試験における薬剤の適正な投与量をすぐに判定することができる。一実施形態において、用量の範囲は、被験体の体重の約１００μｇ／ｋｇ〜約５０００ｍｇ／ｋｇ、例えば、被験体の体重の１ｍｇ／ｋｇ〜約２０００ｍｇ／ｋｇ、被験体の体重の約１００ｍｇ／ｋｇ〜約１５００ｍｇ／ｋｇ、被験体の体重の約１００μｇ／ｋｇ〜約２０００ｍｇ／ｋｇ、被験体の体重の約２００ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、被験体の体重の約２００ｍｇ／ｋｇ〜約７５０ｍｇ／ｋｇ、被験体の体重の約２５０ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｍ〜約５００ｍＭである。いくつかの実施形態において、被験体には、１日当たり体重１キロ当たり１０〜６０ｍｇの開示のα７β１調節剤を経口で与える。例えば、開示のα７β１調節剤を２週間にわたり１０〜１５ｍｇ／ｋｇ投与し、耐性がよければ、用量を５〜１０ｍｇ／ｋｇ／週に増やして最適な臨床反応を達成する。いくつかの例では、１日用量は体重の６０ｍｇ／ｋｇ以内とし、肝機能を２週間から１カ月ごとに監視しつつ最低６カ月投与する。
【０２６８】
薬物動態モニタリング
第Ｉ相基準を満たすため、開示のα７β１調節剤の分布を、例えば、定期的に採取した血液等の試料の化学的分析により監視する。例えば、治療開始後は、約７２時間まで試料を定期的に採取することができる。
【０２６９】
分析をすぐに行わない場合は、採取後の試料をドライアイス上に載置し、続いて冷凍庫に移動して、分析可能となるまで−７０℃で保存する。試料は分析のために、当該技術分野において既知の標準的な手法で準備することができ、開示のα７β１調節剤の存在量は、例えば、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により測定可能である。薬物動態データを生成して、専門の臨床薬理学者の協力を得て分析し、クリアランス、半減期、および最高血漿中濃度の測定に用いることができる。
【０２７０】
患者の転帰（治療成績）の監視
臨床試験のエンドポイントは、評価の段階で化合物の有効性を示す測定可能な成果である。試験を始める前にエンドポイントを設定し、臨床試験の種類および段階により変化することになるものである。エンドポイントの例としては、例えば、血清ＣＫレベル、炎症、アポトーシス、および筋消失の減少等が挙げられる。例えば、血清ＣＫレベルにおける１０％の減少は、治療に対する患者の感受性を示す。
【０２７１】
以下に、ある特定の特徴および／または実施形態を説明するための実施例を示す。これらの実施例によって、発明を記載の特定の特徴または実施形態に限定するものではない。
【実施例】
【０２７２】
[実施例１]
本実施例は、ＤＭＳＯコントロール、１０μＭのＭＬＳ０００６８３２３２−０１（ＩＥＤ−２３２）、１０μＭのＭＬＳ００１１６５９３７−０１（ＩＥＤ−９３７）、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）コントロール、またはＨＰＢＣＤ中の１２μＭのＳＵ９５１６を用いて２４時間治療したＣ２Ｃ１２筋芽細胞および筋管におけるＩｔｇａ７、Ｉｔｇｂ１、およびＬａｍａ２転写物レベルの評価に用いた定量的リアルタイムＰＣＲ結果を示す（図１）。図２は、ＤＭＳＯコントロール、１０μＭのＭＬＳ０００６８３２３２−０１（ＩＥＤ−２３２）、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）コントロール、またはＨＰＢＣＤ中の１２μＭのＳＵ９５１６で４８時間治療したＣ２Ｃ１２筋管におけるα７インテグリンおよびＧＡＰＤＨタンパク質レベルのウェスタンブロットおよび定量分析のデジタル画像である。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて各帯域を定量化し、その後、ＧＡＰＤＨタンパク質レベルに対するαインテグリンタンパク質レベルとしてグラフ化した。＊は、相対タンパク質レベルにおける有意差を示し、＊＊ｐ＜０．０１である。
【０２７３】
[実施例２]
以下の付加的な構造は、筋肉中のα７インテグリン発現を増加させる本明細書において開示する方法で使用され得る付加的な化合物を提供する（表７参照）。いくつかの例において、各アナログは分量５ｍｇ、塩形態（例えば、塩酸塩）、乾燥粉末として、ＨＰＬＣによる測定において少なくとも９０％の純度で作成する。いくつかの実施形態において、全ての合成分子の物理的特性（運動、溶解度、ＰＡＭＰＡ透過性、clogP)および代謝的安定性（プラズマおよびミクロソーム安定性、代謝物の同定）、および、測定薬物速度論的特性および選択した化合物の化合物レベルや分布を決定する。選択化学型を調査するための系統的置換に加えて、古典的医薬品化学パラメータ（MW、水素供与体および受容体の数、tPSA、clogP、分子の屈曲性)およびアナログ分子の組織内測定物理および代謝特性を用いて、開示の方法での使用に好適な薬物速度論的特性を有する、効力のある有効な非毒性化合物の選択を導く。
【０２７４】
【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
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【表７−７】
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【表７−８】
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【表７−９】
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【表７−１０】
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【表７−１１】
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【表７−１２】
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【表７−１３】
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【表７−１４】
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【表７−１５】
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【表７−１６】
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【表７−１７】
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【表７−１８】
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【表７−１９】
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【０２７５】
【表８−１】
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【表８−２】
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【表８−３】
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【表８−４】
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【表８−５】
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【表８−６】
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【表８−７】
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【表８−８】
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【表８−９】
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【表８−１０】
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【表８−１１】
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【表８−１２】
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【表８−１３】
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【表８−１４】
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【表８−１５】
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【表８−１６】
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【表８−１７】
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【表８−１８】
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【表８−１９】
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【表８−２０】
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【表８−２１】
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【表８−２２】
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【０２７６】
［実施例３］
本実施例では、骨格筋におけるα7インテグリンを増加させる小分子の実施形態を開示する。LacZレポーター遺伝子がマウスα7インテグリン遺伝子のエクソン１に挿入されたマウスからの筋原細胞を用いて、403,000個の化合物をスクリーニングし、βガラクトシダーゼレポーターが増加した1500を超えるヒットを特定した。さらなる評価により、筋管においてα7インテグリンを少なくとも1.5倍増やした６つの化合物を特定した。化合物を、鉄キレート化合物、細胞周期阻害剤、および未定義の機能を持つ化合物に分類した。当該スクリーニングで特定された化合物は、新規の分子プローブを表し、骨格筋におけるα７β１インテグリン発現およびシグナリングのレギュレーションをさらに解明するために用いることができ、DMD治療の有力な治療薬となり得る。
【０２７７】
ジストロフィン発現を回復する目的でいくつかの治療アプローチが開発され、ＤＭＤの動物モデルにおいて有効性を示してきた。これらには、ジストロフィンのウイルス的仲介送達および発現、筋芽細胞移入および生着、エクソンスキッピングおよび終止コドンリードスルーが含まれる。現在、これら方法はいずれも、ＤＭＤ患者の治療として承認されていない。代替アプローチは、疾患の進行を軽減しジストロフィン欠如を部分的に補償するタンパク質レベルを標的とし高めることである。これらの疾患修飾因子には、ユートロフィン、ＩＧＦ−１、α７β１インテグリン、ＧａｌＮａｃ、ｎＮｏｓ、およびアダム１２が含まれる。
【０２７８】
α７β１インテグリンは、骨格筋におけるラミニン受容体であり、基底膜におけるラミニン−２１１／２２１と筋肉のアクチン細胞骨格とを結合する働きをする。α７β１インテグリンは、筋肉の発達および生理に寄与する構造的およびシグナリング機能を有し、元々は筋分化マーカーとして同定されたものである。骨格筋および心筋におけるα７インテグリンのトランスジェニック発現の促進により、ジストロフィー病理が改善しｍｄｘ／ｕｔｒ−／−マウスの寿命が３倍超に延びることが、研究で示されている。複数のメカニズムがジストロフィン欠乏筋肉のα７インテグリン仲介レスキューに寄与すると考えられており、筋腱間および神経筋接合部の維持、筋肉肥大および再生の促進、およびアポトーシスおよび心筋症の減少が含まれる。また、α７インテグリンの促進により、筋肉が運動誘発性損傷から保護される。逆に、ｍｄｘマウスにおけるα７インテグリンの喪失は、より重い筋疾患へとつながる。これらの所見はともに、α７β１インテグリンがＤＭＤにおける主要な疾患修飾因子であることを裏付けている。  
【０２７９】
トランスジェニックマウス研究をＤＭＤの療法の可能性へと翻訳するために、骨格筋におけるα７インテグリンを増加する化学プローブを特定する創薬プログラムを開始した。内在性α７インテグリンプロモーターの下流でイントロン１内にＬａｃＺ遺伝子を挿入したマウスのα７インテグリンノックアウトラインの生成および特性化についてレポートされている。このように、βガラクトシダーゼは、これらの動物においてα７インテグリン発現のレポーターとして機能する。一次筋原細胞を、へテロ接合体マウス（α７βｇａｌ＋／−）から単離し、細胞が、α７インテグリンを発現しまたインテグリンの転写をレポートするようにする。筋原レポーター細胞は、α７βｇａｌ＋／−に指定され、予備スクリーニングにおいて２つの分子、すなわちバルプロ酸およびラミニン−１１１、を同定するのに用いられ、ＤＭＤマウスモデルでの検査が成功している。
【０２８０】
骨格筋におけるα７インテグリンを増加する小分子をさらに特定するために、筋細胞に基づくアッセイを用いて、４０３，０００個の化合物をスクリーニングした。この中には、ＦＤＡ承認薬および国立化学ゲノミクスセンター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ：ＮＣＧＣ）での大規模な化合物ライブラリーが含まれる。鉄キレート剤、微小管阻害剤、細胞周期阻害剤、およびステロイド様分子を含む既知の作用メカニズムを伴いα７インテグリンを増加するいくつかの化合物を特定した。さらに、未知の生物活性を伴ういくつかの小分子も特定した。結果は、全体として、培養筋細胞におけるα７インテグリンを増加する新規の小分子を特定し、これらは、骨格筋におけるα７β１インテグリンをレギュレートするシグナリング経路をさらに分析する分子プローブとして作用し得る。これらの小分子は、デュシェンヌ型その他の致命的筋ジストロフィーの治療における新規の治療法として開発され得る。
【０２８１】
細胞培養：先に述べたように、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞および筋管を成長させた。前記の通り、α７＋／ＬａｃＺ筋芽細胞を元々単離して維持した。一時的に、２０％のＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（ＧＩＢＣＯ）＋Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ）を含有するフェノールレッド（Ｓｉｇｍａ）なしのＤＭＥＭにおいて筋芽細胞を成長させて維持した。筋芽細胞を、アッセイにおける使用まで、７０％未満合流で維持した。筋芽細胞を、フェノールレッドなしのＤＭＥＭ、１％のウマ血清（Ａｔａｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、および１％のＰ／Ｓ＋Ｌ−グルタミンにおいて筋管内に分化させた。全細胞を、３７℃で５％ＣＯ２で培養した。パッセージ８と１４との間の筋芽細胞および筋管をアッセイした。
【０２８２】
化合物ライブラリー：当該筋細胞に基づくアッセイを用いて、４つの化合物ライブラリーをスクリーニングした。１）プレストウィック化学マイクロソーススペクトルライブラリー（Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）（ＢｉｏＦｏｃｕｓ  ＤＰＩ、ライデン、オランダ、および英国、バーゼル、ハイデルベルクに施設あり）（Ｏｖｅｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００６）。２）ＤＩＶＥＲＳｅｔライブラリー（Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ  Ｃｏｒｐ．、サンディエゴ、カリフォルニア）、およびＣｈｅｍＤｉｖライブラリーからの化合物。３）１２８０個の薬学的活性化合物からなるＬＯＰＡＣライブラリー（Ｓｉｇｍａ−ＲＰＩ）。４）ＭＬＳＭＲ−分子ライブラリー小分子リポジトリ。
【０２８３】
筋芽細胞α７＋／ＬａｃＺインテグリンＦＤＧアッセイ：全５０００個のα７βｇａｌ＋／−筋芽細胞を、黒色側ＴＣコート９６−ウェルプレート上に１２−ウェルマルチピペット（Ｒａｉｎｉｎ）を用いて１００μＬの成長培地に供給した。２４時間後、ＤＭＳＯにおける１μｌまでの化合物を、予め作られた作業薬剤プレートから、１μｌの９６−ウェルピンツールを用いてまたは８−ウェル自動多チャンネルピペットを用いて、筋芽細胞プレートに添加した。各作業薬剤プレートは、正コントロール（酪酸ナトリウム（Ｆｌｕｋａ）またはＳＵ９５１６（Ｔｏｃｒｉｓ））のカラムとＤＭＳＯのみを含む少なくとも１つのカラムとを含む。４８時間培養後、培地を吸引し、細胞を、ウェル毎に５０μＬの哺乳類タンパク質抽出試薬（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＭＰＥＲ））（Ｔｈｅｒｍｏ）で溶解し、続いて室温で１０分間培養した。５０μＬのＦＤＧアッセイ溶液  （２０％、０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ７．０（Ｓｉｇｍａ）、０．２％、１ＭのＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ）、０．２％、２０ｍＭのフルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）（Ｍａｒｋｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を添加して暗所で２０分間室温でプレートを培養することによって、各ウェルにおけるβガラクトシダーゼ（βｇａｌ）活性を定量化した。その後、停止液（２ｘＴＥ）を添加して（１００μｌ／ウェル）、４８５ｎｍの励起フィルター、５３５ｎｍの排出フィルター、および０．１ｓ／ウェルカウント時間で、ビクターＶ（Ｖｉｃｔｏｒ  Ｖ）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）上でプレートを蛍光読み出した。
【０２８４】
筋管α７インテグリンＦＤＧアッセイ：全２５，０００個のα７βｇａｌ＋／−筋芽細胞を、１００μＬの成長培地に供給した。２４時間後、培地を吸引し、ウェルを２００μＬのＰＢＳで洗浄し、１００μＬ／ウェルの分化培地を添加した。７２時間と１２０時間との間で分化培地を毎日変えて、ウェルが分化筋管を含むようになると、前記の通りＤＭＳＯ  における１μＬまでの化合物を添加した。筋芽細胞スクリーニングで述べたようにＦＤＧ蛍光アッセイを行うが、明らかな例外点として、筋管におけるβｇａｌがより高いことから、ＦＤＧ溶液添加後の培養を２０分から５分に短縮した。
【０２８５】
ＬＯＰＡＣライブラリーおよびＭＬＳＭＲのｑＨＴＳ：パッセージ１３での全２５０個のα７ＬａｃＺ＋／−筋芽細胞を、フェノールなしのＤＭＥＭ、５％のＦＢＳ、１ｘのＧｌｕＭａｘ、および１ｘのペニシリン／ストレプトマイシンを含む６μｌ培地で、マルチドロップ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて黒色低基底組織培養処理マイクロクリアオーロラプレート内に供給した。プレートを、１６〜２４時間、３７Ｃ、５％ＣＯ２、９５％湿度で、Ｋａｌｙｐｓｙｓからの低蒸発ステンレス製蓋で覆って、培養した。その後、化合物をＫａｌｙｐｓｙｓピンツールを用いて供給し、  ＤＭＳＯ  において２３ｎｌ／ウェルの化合物を与えた（６μｌに希釈した結果、化合物の１：２６０希釈）。使用した正コントロール化合物は、ｃｄｋ２阻害剤ＳＵ９５１６（Ｔｏｃｒｉｓ）である（初期ＬＯＰＡＣスクリーニングで特定）。プレートを、４８時間、３７Ｃ、５％ＣＯ２、９５％湿度で、同じステンレス製蓋を用いて培養した。化合物での培養の後、５μｌの培地をＫａｌｙｐｓｙｓウォッシャー／ディスペンサーで吸引し、３μｌの哺乳類タンパク質抽出試薬（ＭＰＥＲ）溶解培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を添加した。プレートを２０００ｒｐｍで回転して気泡を除去し、自家蛍光化合物を省略するために２５秒間４８０ｎｍの励起および５４０ｎｍの排出でＶｉｅｗｌｕｘ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上で初期捕集を得た。その後、プレートを、１０分間室温で培養した。培養後、２ｍＭのＭｇＣｌ２および０．２％のβメルカプトエタノール（ＢＭＥ）と共にＰＢＳで希釈した３μｌの１２５μＭ  ＦＤＧ（Ｍａｒｋｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加し、プレートを２０００ｒｐｍｓで遠心分離し、３０分間室温で培養した。再度、２５秒間４８０ｎｍの励起および５４０ｎｍの排出でＶｉｅｗｌｕｘ上でプレートを読み出した。
【０２８６】
ＣＭＶ−ＬａｃＺ二次スクリーニング：筋原細胞におけるβｇａｌを安定化する化合物を決定するために、二次スクリーニングでＣＭＶ−ＬａｃＺＣ２Ｃ１２細胞株を用いた。ＣＭＶ−ＬＡＣＺベクターを生成する標準的手順に従って、ベクター／ＰＣＲ生成物消化をＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）およびＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で行いＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）で結合して、ｐＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ベクターからのＥＧＦＰ遺伝子をＬＡＣＺ  ＰＣＲ生成物に置き換えた。ＬＡＣＺ遺伝子を、ｐＢＫ−ＲＳＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ベクターからプライマーＬＡＣＺＥｃｏＲＩＦ−およびＬＡＣＺＮｏｔＩＲ−を用いてＰＣＲにより生成した。その後、ＣＭＶ−ＬＡＣＺベクターをＡｆｌＩＩ（ＮＥＢ）で消化して構成を線状化し、それを製造業者の指示に従ってリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＣ２Ｃ１２筋芽細胞に導入した。１．５ｍｇ／ｍｌでＧ４１８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む成長培地において安定細胞株を選択した。クローンを選択して、筋芽細胞ＦＤＧアッセイによってβｇａｌレベルをスクリーニングした。最高βｇａｌ発現のＣ２Ｃ１２細胞株を用いて、上記の筋芽細胞および筋管スクリーニングと同じ手順に従って、チェリーピックした（ｃｈｅｒｒｙ  ｐｉｃｋｅｄ）化合物をスクリーニングした。信号が２つの個別のデータポイントで平均ＤＭＳＯ＋２ｘ標準偏差（〜３０％）を超えると、化合物はこの二次アッセイで不合格と判断した。
【０２８７】
ウェスタンブロッティング：Ｃ２Ｃ１２筋管を、４８時間各ヒット化合物で治療し、ＰＢＳで洗浄し、標準的手順に従って削ってペレット化した。細胞ペレットをＲＩＰＡ緩衝剤に再懸濁し、タンパク質濃度をＢＣＡにより決定した。約１０μｇのタンパク質をレーン毎にロードし、８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、標準的条件を用いてニトロセルロースに移動した。ブロットを、既述の通りα７Ａおよびα７Ｂインテグリン特有ウサギポリクローナル抗体を用いて検査し、αチューブリンに標準化した。
【０２８８】
統計分析および曲線適合：グラフパッドプリズムソフトウェアおよびＤＭＳＯコントロール治療グループに対する独立ｔ検定比較により、統計分析を行った。グラフパッドプリズムソフトウェアは、可変スロープを伴うログ（アゴニスト）対反応の非線形回帰分析を利用した曲線適合にも用いた。適切なＥＣ５０値を得るために、１に等しい制約を曲線の底部に置き、（必要に応じて）２または２．５を頂部に置いた。  
【０２８９】
α７＋／ＬａｃＺインテグリン筋芽細胞アッセイの生成および検証：α７インテグリン促進化合物を特定するために、α７＋／ＬａｃＺマウス由来一次筋芽細胞および筋管に基づくアッセイを開発した。へテロ接合筋芽細胞を用いて、正常筋原細胞接着およびシグナリングのためのＩｔｇａ７遺伝子コピーを維持した。第２Ｉｔｇａ７遺伝子対立遺伝子は、エクソン１  がＬａｃＺ遺伝子に置き換えられ、α７インテグリン転写のレポーターを提供し内在性プロモーター、エンハンサー、およびクロマチン環境を維持する。一次筋細胞を抽出することにより、筋原細胞が生成された。この筋原細胞は、筋管に分化可能であり、この発展過程中にβｇａｌレポーターレベルがα７インテグリンタンパク質レベルを正確に模倣するものである。線維芽細胞を除去するためにスクリーニングに用いる筋原株で前プレーティングを数回行った結果、相対的に純粋な筋原細胞集団が残った。
【０２９０】
α７インテグリン筋細胞に基づくアッセイ：９６ウェルフォーマットにおける筋原細胞の成長率を評価した。筋芽細胞アッセイでは、５０００個のα７＋／ＬａｃＺ細胞のプレーティングが蛍光定量化時の〜８０％の合流につながることが確認された。合流を８０％未満に制限することにより、ＬａｃＺ発現に影響する恐れのある本アッセイでの分化状態への移行を防止しやすくした。筋管アッセイでは、２５，０００個の筋芽細胞のプレーティングが２４時間後に約９５％の合流へとつながり、筋肉分化の進行が可能になる。次に、アッセイ用の蛍光の線形性を、ＦＤＧアッセイ溶液を用いて、さまざまな量の精製Ｅ．ｃｏｌｉβガラクトシダーゼに対して求めた（図４）。これにより、α７＋／ＬａｃＺ筋芽細胞において観測されるレベルに匹敵する線形反応が示された。最後に、ライブラリー化合物は通常ＤＭＳＯに可溶化することから、本アッセイに対するＤＭＳＯの影響を筋芽細胞、筋管共に調べた（図４）。筋芽細胞において、０．５％までのＤＭＳＯ濃度は、ＤＭＳＯ添加のない細胞に比べて、アッセイに有意な影響はなかった（図４）。１％のＤＭＳＯで、アッセイにおける全体蛍光信号が１０％低下したが、これは許容範囲内とみなされた（図４）。筋管アッセイに対するＤＭＳＯの影響はより強く、０．５％のＤＭＳＯで蛍光が〜１２％低下し、１％のＤＭＳＯで全体蛍光が〜２５％低下した（図４）。１％を超えるＤＭＳＯは蛍光低減を引き起こすため、培地におけるＤＭＳＯとして１％  が筋管の最大許容範囲であると確認した。ＦＤＧレベルを１２５μＭに最適化し、これをＭＬＳＭＲスクリーニングおよびその後の検証アッセイに用いた（図４）。
【０２９１】
予備スクリーニングでは、酪酸ナトリウムを、〜１．５ｍＭの治療でβガラクトシダーゼレベルを増加するものであると決定した。酪酸ナトリウムを用いた初期研究では、創薬の強力なアッセイとみなされる０．６のＺ’ｆａｃｔｏｒが計算されたことにより、０．２ｕｇ／ｍＬでのＰｒｅｓｔｗｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌおよび１０μＭでのＭｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓの筋管スクリーニングを開始した。これらのライブラリーは相対的に小さいため、筋管を初期スクリーニングした。これは、筋管が、α７インテグリン上昇の理想的な治療標的であるからである。最小カットオフとしてＤＭＳＯコントロールから１．２倍の増加を用いて、Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｃａｌライブラリーで２４化合物、Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｕｍライブラリーで３０化合物を特定した。これらは、ライブラリーのヒットパーセンテージ２．１％および１．５％に相当する。二次およびカウンタースクリーニングの後、α７インテグリンを増加させた化合物を、鉄キレートまたはコレステロール類似体に分類した。スクリーニングで特定された鉄キレートは、シクロピロックス・エタノールアミン、デフェロキサミン、および２，２−ジピリジルであり、これらは全て筋管で正用量反応曲線を示した。コレステロールアナログ化合物、５α−コレスタン−３β−オル−６−オンも、正用量反応曲線を示した。
【０２９２】
この初期の成功により、酪酸ナトリウムを正コントロールとし、化合物のＤＩＶＥＲＳｅｔライブラリーを用いて、より大規模な高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）を試みた。ＤＩＶＥＲＳｅｔライブラリーの化合物の数のため（〜５０，０００）、筋芽細胞スクリーニングを行った。このスクリーニングによりさらにいくつかの「ヒット」が生まれ、二次スクリーニングで３つの化合物、１００１、１００２、および１００３と呼ぶ、に絞られた。さらなる研究の結果、これらの化合物およびアナログは、研究を進めるにはより強力でないかあるいは毒性が高すぎることが分かった。
【０２９３】
ＬＯＰＡＣライブラリーおよびＭＬＳＭＲの一次スクリーニング：アッセイを、ＮＣＧＣで１５３６ウェルプレートを用いて完全自動化Ｋａｌｙｐｓｙｓロボットシステムで高スループットスクリーニングに適応した。１００１（ＤＩＶＥＲＳｅｔ）を正コントロールとするＬＯＰＡＣライブラリーの予備スクリーニングを用いて、本アッセイのための新たな条件を開発した。ここで、オフラインをオンライン結果と比較し、３８４ウェルフォーマット用に２０００細胞／ウェルにプレーティングされた筋芽細胞を削減した。このスクリーニングでいくつかの「ヒット」化合物が生まれ、その中にはニトロプルシドナトリウム二水和物、酸化窒素供与体、および２つのｃｄｋ２阻害剤ＳＵ９５１６およびＣＫ２阻害剤２が含まれる。ＳＵ９５１６は、ＤＭＳＯ  のみと比べて、約２．１倍の相対的に強い反応を与えた。ＳＵ９５１６を正コントロールとして用いても、ＤＭＳＯバックグラウンド信号にはまだ相対的に高い変動性（〜３０％）がある。しかし、ＳＵ９５１６が特定された最も再生可能に作用する薬剤であることから、これをｑＨＴＳの正コントロールとして選択した。この目的のため、筋芽細胞および筋管の用量反応曲線ＳＵ９５１６治療を生成した（図５）。 
【０２９４】
ＳＵ９５１６を正プレートコントロールとしておよびＤＭＳＯを負コントロールとして用いて、アッセイにより、濃度０．０８μＭ、０．４μＭ、２μＭ、および１０μＭ  で、ＮＩＨ化学ゲノミクスセンター（ＮＣＧＣ）の３６８，６８０個の化合物の分子ライブラリー小分子リポジトリ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（ＭＬＳＭＲ））をスクリーニングした。先に定義した曲線分類に基づいて、約１５００個の化合物を「ヒット」としてチェリーピックした（図６）。
【０２９５】
オフライン確認およびβガラクトシダーゼ安定性二次スクリーニング：１５００個のチェリーピックした「ヒット」から、さらなるオフライン筋芽細胞、筋管、および二次スクリーニングのために、２つのプールを選択した。第一のプールは  １６６個の化合物からなり、これらは、元の１５００個のチェリーピックのその後のオンライン筋芽細胞スクリーニングにおいてもまだ活性状態であった（表９〜１２）。第二のプールは上位１９７個の化合物からなり、これらは、その後のスクリーニングにおいて繰り返し活性状態ではなかった（表９〜１２）。最後に、ＳＵ９５１６が信頼性の高い正コントロールであると証明されたことから、ＳＵ９５１６プラットフォームに基づいて、４４個のアナログをＭＬＳＭＲライブラリーまたは別のストック化合物から選択してスクリーニングした。二次スクリーニングは、一貫したβガラクトシダーゼ活性を伴うＣＭＶ−ＬＡＣＺ安定導入Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞株からなる（表９〜１６、表１７）。アッセイでは、濃度０．５μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、４０μＭでの筋芽細胞（各データポイント毎にＮ＝３〜６複製）、筋管（データポイント毎にＮ＝３〜６複製）、およびＣＭＶ−ＬａｃＺ二次アッセイ（各データポイント毎にＮ＝２複製）のために、元の９６ウェルフォーマット、および、新たな用量反応曲線を用いた（表９〜１６）。ＤＭＳＯに対して２５％を超えるカットオフを用いて、化合物を除外した（表１７）。初期の１９７個の上位「ヒット」からの化合物のほぼ１／５は、筋管アッセイのみで作用し、筋芽細胞では作用しなかった。このデータは共に、一次スクリーニングの間にアッセイにおける細胞のいくつかが筋管に分化したことを示唆する。この傾向は、１６６個のＮＣＧＣ化合物では見られず、ここではほぼ１／３が筋芽細胞のみで作用した。また、オンラインからオフラインスクリーニングへの移行の間、両グループからの化合物の多く（５４％および６９％、表１７）が、筋芽細胞または筋管においてＤＭＳＯ  レベルに対する２５％増加の最小カットオフを得られなかった。加えて、βガラクトシダーゼ安定化二次スクリーニングにおいて活性を示した化合物の多くが、α７＋／ＬａｃＺに基づくアッセイのいずれかにおいて活性を示さなかった（表１７、表９〜１２における全結果）。これらの結果は、化合物のいくつかは、実際にはβガラクトシダーゼ酵素反応を安定化するまたはβガラクトシダーゼ酵素反応に触媒作用を及ぼすのではなく、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるＣＭＶプロモーターを活性化している可能性を示唆する。
【０２９６】
正コントロールとしてのＳＵ９５１６の使用から、他の「ヒット」化合物を生成するように調節可能なプラットフォームを表す可能性があるとしてＳＵ９５１６を用いた。４４個のＳＵ９５１６アナログを伴うオフラインスクリーニングを行った。筋芽細胞、筋管、および二次ＣＭＶ−ＬａｃＺアッセイを前記の通り実施し、本スクリーニングからの結果を表１７にまとめた（表１３〜１６に全結果を示す）。驚くべきことに、ＳＵ９５１６自体と共に、これらの多くが、Ｃ２Ｃ１２ＣＭＶ−ＬＡＣＺ筋芽細胞および筋管において活性を示した。化合物のほとんどは、βガラクトシダーゼ安定化スクリーニングにおいて活性を有し、また一次スクリーニングにおいて反応がなく、このことは、これらの化合物がβガラクトシダーゼ安定剤ではなく、ＣＭＶまたは本細胞株におけるＣＭＶ−ＬＡＣＺ安定統合領域の活性剤であることを示唆する。また、この結果は、ＳＵ９５１６が、別個のシグナリング経路の抑制または活性化によって、ＩＴＧＡ７プロモーターとＣＭＶプロモーターとの両方を活性化し得たことも示唆する。以下の表９〜１６を参照して、約０．９未満の値は、より望ましくない化合物に対応する。このような値の化合物は、表示の濃度値で毒性であるからである。０．９〜約１．１の値は、何らかの活性（実質的にＤＭＳＯバックグラウンドに類似）を有する化合物を示す。約１．２を超える値は、望ましい活性の化合物を示す。すなわち、これらの値は、バックグラウンドを約２０％上回る活性を有する化合物を示す。  
【０２９７】
【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【表９−４】
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【表９−５】
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【表９−６】
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【表９−７】
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【表９−８】
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【表９−９】
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【０２９８】
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１０−３】
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【表１０−４】
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【表１０−５】
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【表１０−６】
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【表１０−７】
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【表１０−８】
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【表１０−９】
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【０２９９】
【表１１−１】
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【表１１−２】
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【表１１−３】
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【表１１−４】
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【０３００】
【表１２−１】
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【表１２−２】
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【表１２−３】
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【表１２−４】
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【表１２−５】
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【表１２−６】
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【表１２−７】
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【表１２−８】
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【表１２−９】
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【０３０１】
【表１３】
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【０３０２】
【表１４】
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【０３０３】
【表１５】
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【０３０４】
【表１６】
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【０３０５】
【表１７】
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【０３０６】
スクリーニングからの上位ヒット
次に、最大反応（表１８）に基づいて、筋管におけるＩＴＧＡ７の活性のための上位６つの化合物を選択し、より正確な用量反応曲線を得るために、より多数の濃度でスクリーニングを行った（図７）。用量反応曲線から、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ非線形回帰分析を用いて筋管におけるＥＣ５０を決定した（表１８）。最大予測増加を、ＬａｃＺレポーターの単一対立遺伝子コピーのため２を乗算したα７＋／ＬａｃＺでの最大増加として計算した（図７）。
【０３０７】
【表１８】
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【０３０８】
ＳＵ９５１６によるＣ２Ｃ１２筋管におけるα７インテグリンタンパク質の増加
ＳＵ９５１６のオンターゲット活性を確認するために、Ｃ２Ｃ１２筋管を、ＤＭＳＯコントロールまたは１２μＭのＳＵ９５１６で、４８時間治療した。その後、筋管抽出タンパク質のウェスタンブロット分析をα７Ｂインテグリンに行い、ＧＡＰＤＨに正規化した（図８）。ＳＵ９５１６治療筋管は、ＤＭＳＯ治療コントロールと比べて、α７インテグリンタンパク質レベルにおいて約１．６倍（１．６−ｆｏｌｄ）の増加を示した（図８）。これらの結果から、筋原細胞に基づくアッセイは、骨格筋におけるα７インテグリン増加を目標とする、成功と特定される新規の小分子を有することが確認された。
【０３０９】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、致命的な神経筋疾患であり、今のところ治療法がなく、治療の選択肢も限られている。研究によって、α７β１インテグリンが、ＤＭＤマウスモデルにおける疾患進行の主な調節剤であることが示されている。ジストロフィン欠乏ｍｄｘマウスにおけるα７インテグリンの喪失は、より重い筋疾患へとつながる。一方、α７インテグリンのトランスジェニックまたはウイルス仲介発現により、ＤＭＤのマウスモデルを救うことができる。これらの結果は、α７β１インテグリンがＤＭＤにおける疾患進行の主な調節剤であるという仮説を支持する。骨格筋におけるα７β１インテグリンの薬剤ベースの調節がＤＭＤの治療手段となるかもしれないという考えの裏付けとして、現在ＤＭＤの最先端治療法であるプレドニゾンが、ｍｄｘマウス、ＧＲＭＤ犬、およびＤＭＤ患者細胞の筋肉においてラミニンα２およびα７β１インテグリンを増加させることが示されている。これらの前臨床研究は共に、α７インテグリンがＤＭＤの治療にとって「新薬の開発につながるような（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）」対象であることを示している。
【０３１０】
当該研究において、筋細胞に基づくアッセイを用いて、筋原細胞におけるα７インテグリンの増加を促進する小分子を特定した。ＦＤＡ承認の新規な化合物ライブラリーのスクリーニングによって、ＤＭＤの治療に有望ないくつかの化学プラットフォームを特定した。ＦＤＡ承認ライブラリーから、Ｆｅキレート化合物シクロピロックスおよびデフェロキサミンをα７β１インテグリンエンハンサーとして特定した。さらに、この同じ化合物群に含まれる２，２−ジピリジルを、筋細胞に基づくアッセイを用いて検査し、同じくα７インテグリンレベルを高めることを確認した。シクロピロックス、デフェロキサミン、および２，２−ジピリジルは崩壊（ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）防止により転写因子低酸素誘導因子−１（ＨＩＦ−１）の安定性を増加させることが示されているため、α７インテグリンプロモーターにバイオインフォマティクス分析を行った。ＭＡＴＩＮＳＰＥＣＴＯＲ（Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ社）を用いて近位α７インテグリンプロモーター配列の２．８ｋｂフラグメントを分析した結果、ＨＩＦ−１結合部位の存在およびＨＩＦ−１結合を促進するフランキング配列が明らかになった。これらの結果は、シクロピロックス、デフェロキサミン、および２，２−ジピリジルが、ＨＩＦ−１の筋細胞中におけるプロテアソーマル崩壊を阻止することによりα７インテグリン遺伝子発現を増加させるように作用しうることを示しており、その結果骨格筋におけるＨＩＦ−１タンパク質の細胞レベルが増加することを示す。興味深いことに、ＨＩＦ−１レベルの増加は血管形成の増加と関連している。よって、これらの薬剤は、α７インテグリン遺伝子発現の増加によって膜安定性を増加し得るだけでなく、筋肉の血管新生を高めて、血流量を向上し、ジストロフィー筋に関連する虚血を減少させる。
【０３１１】
骨格筋においてα７インテグリンを増加させる新規の小分子プローブを特定するために、ＮＩＨにおける国立化学ゲノミクスセンター（ＮＣＧＣ）のＭＬＳＭＲをスクリーニングした。筋細胞に基づくアッセイを用いて、ＭＬＳＭＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ａｎｄ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）における３８０，０００個の化合物を、用量反応定量的高スループットスクリーニング（ｑＨＴＳ）でスクリーニングした。一次スクリーニングから、１，５００個のヒット化合物を活性分として特定した。階層的クラスターアプローチを用いたこれらの化合物の分析の結果、３２１個のクラスターが得られた。この中で、１７個のクラスターは、１０を超える化合物および２１０を超えるシングルトンを含む。これらの研究から、さらなる検査のために５００化合物をチェリーピックした。当該検査には、一次スクリーニングアッセイおよび二次アッセイにおける活性の確認が含まれる。二次アッセイは、βガラクトシダーゼレポーター安定剤、ミオスタチンおよび細胞毒性アッセイを含む。加えて、一次ＨＴＳ活性化合物を検査して、これらが筋芽細胞および筋管におけるβガラクトシダーゼレポーターを増加させるか判断した。これらのカウンタースクリーニングから、７つの新規のヒット化合物を選択して、これらが用量依存形態でα７インテグリンを増加させるかどうかを判断するさらなる分析をした。マウスおよびＤＭＤヒト筋細胞の分析から、７つの化合物は全てα７インテグリン転写およびタンパク質レベルを増加させることが分かった。これらの化合物は、ヒトＤＭＤ筋細胞におけるα７インテグリンタンパク質を最大に増加し、これはトランスジェニックマウス研究から予測されるように治療域内である。
【０３１２】
７つの新規なα７インテグリン促進化合物の研究から、２つの分子プラットフォームは関連する一方、他の化合物は互いに関連しないことが分かった。１つの化合物であるＳＵ９１５６は、スクリーニングで正コントロールとして使用されたものであり、現在、有力な抗がん治療法として臨床試験中である。ＳＵ９５１６（３−［１−（３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−メス−（Ｚ）−イリデン］−５−メトキシ−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オン）は、３置換インドリノン化合物であり、ｃｄｋ２に結合して、選択的にその触媒キナーゼ活性を阻害する。Ｘ線結晶構造解析では、小分子化合物が、ＡＴＰの競合的阻害を通じて、ｃｄｋ２／サイクリンＡを阻害することが示された。ヒト白血病細胞において、ＳＵ９５１６は、転写抑制、プロテアソーム分解増加、ＲＮＡＰｏｌＩＩＣＴＤリン酸化反応阻害、および酸化的損傷を通じて、抗アポトーシス・タンパク質Ｍｃｌ−１の顕著なダウンレギュレーションを引き起こした。このように、ＳＵ９５１６は、抗腫瘍性治療法の開発のための実行可能な薬理的薬物としての可能性を示し、その臨床試験へと到達している。ＳＵ９５１６がインテグリンを促進する分子メカニズムについては、現在分かっていない。ＳＵ９５１６はまた、通常細胞死に関わるグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ−３β）を阻害することも報告されている。不活性ｐ−Ｓ９-ＧＳＫ３βのレベルが低減し、全ＧＳＫ３βが筋硬直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）患者の筋肉において高まる。ＤＭ１細胞培養およびマウスモデル双方でのＧＳＫ３βの阻害は、ＤＭ１マウスにおける筋衰弱およびミオトニーを軽減した。よって、ＧＳＫ３β活性を正規化する化合物は、ＤＭ１を有する患者の筋機能改善に効果的であり得る。
【０３１３】
新規の筋細胞に基づくアッセイを用いて、小分子化合物ライブラリーの徹底的なスクリーニングが行われ、骨格筋におけるα７インテグリンを増加させるいくつかの新規のFDA承認分子を特定されている。これらの小分子は、骨格筋におけるα７β１インテグリンレベルをレギュレートするシグナリング経路を分析する分子プローブとなり得る。加えて、これらの分子は、筋ジストロフィーの治療のためα７インテグリンの増加を目標とする新規の治療法を開発するプラットフォームにもなり得る。
【０３１４】
［実施例４］
本実施例では、本明細書において開示する方法およびアッセイに有用な好適なアナログ化合物を特定し分析するための方法を記載する。一実施形態において、Ｓｔｒｙｋａ−９６９を、本明細書において開示するアッセイを用いてスクリーニングした４００，０００を超える化合物から、その有効性、広範囲の効力、および細胞毒性欠如（ＲＥＦペーパー準備中（ＲＥＦ  ｐａｐｅｒ  ｉｎ  ｐｒｅｐ））のために、上位「ヒット」として特定された。ＩＴＧＡ７＋／ＬａｃＺ筋管において生成された用量反応曲線と共にＳｔｒｙｋａ−９６９の化学構造を図７に示す。Ｓｔｒｙｋａ−９６９は筋芽細胞においても同様に機能するが、α７インテグリンタンパク質促進のための治療標的は分化筋原線維であるため、本実施例は主にＩＴＧＡ７＋／ＬａｃＺ筋管におけるＳｔｒｙｋａ−９６９アナログ機能に着目する。〜２倍の最大増加は、アッセイおよび単一レポーターの異種性質のため、ＩＴＧＡ７転写において〜３倍の変化として翻訳されるべきである。この増加は十分に、ジストロフィーマウスについて以前報告されていた治療範囲内である。
【０３１５】
図１０は、Ｓｔｒｙｋａ−９６９のアナログから得た結果を示す。これらの化合物は、二者の類似性を測定するＴａｎｉｍｏｔｏ係数を用いて、Ｓｔｒｙｋａ−９６９に対するそれらの構造的類似性に基づきスコアされた。その後、これらの化合物を用いて、用量反応曲線を得るために８つの異なる濃度でＩＴＧＡ７＋／ＬａｃＺ筋管を治療した（図１０：ｎ＝３／濃度）。用量反応結果は、アミド基がα７インテグリンの増加を助ける可能性を示唆する。この基をＭＬＳ００００６１１４９に維持すると、Ｂｕｒｋｉｎアッセイにおいて親化合物Ｓｔｒｙｋａ−９６９に類似の活性を表示した（図１０）。他の化合物はＳｔｒｙｋａ−９６９にそれほど類似せず、  ほとんどまたは全く関連反応を表示しなかった（図１０）。これらの研究は共に、ＳＡＲ分析が、当該化合物プラットフォームの活性を促進するα７インテグリンを最大にすることができる官能基をさらに明らかにすることを示している。  
【０３１６】
Ｓｔｒｙｋａ−９６９のオンターゲット効果を評価するために、培養テロメラーゼ発現ヒトＤＭＤ筋管を使用した。少なくとも１０日間の分化の後、筋管をＤＭＳＯまたは種々の濃度のＳｔｒｙｋａ−９６９で治療した。４８時間後、培地を吸引し、筋管をＰＢＳ内で洗浄し、プロテアーゼ阻害剤を有する氷のように冷たいＲＩＰＡ緩衝剤に掻き出した。タンパク質濃度をＢＣＡにより判断した後、α７Ｂインテグリンおよびαチューブリンのための標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング手順を行った。２０μＭのＳｔｒｙｋａ−９６９（図１１）の治療でＤＭＳＯレベルに対して〜１．７倍の最大増加を得た。このことは、Ｓｔｒｙｋａ−９６９が、ＤＭＤ患者の治療に非常に有望なα７インテグリン促進化合物であることを示している。
【０３１７】
ＡＤＭＥＴ検査を含む治療的小分子の前臨床評価により、最も治療価値の高い小分子を優先できる。確実に小分子が患者において治療目標に的中するためのステップとして、評価用に培養ヒト患者を使用する。これにより、所与の生物学的利用率が種間で作用の保存機構を有し、治療が特定組織において所望の効果を有効に実現することを確実にする。
【０３１８】
簡潔に、各アナログ１ｍｇまたは５ｍｇを１０μＭの濃度でＤＭＳＯに懸濁する。作業プレートは、化合物毎に少なくとも８ポイント用量反応を与えるようにされている。薬物を４８時間ＩＴＧＡ７＋／ＬａｃＺ筋管に添加し、その時点で前記の通りＦＤＧアッセイを行う。Ｂｕｒｋｉｎ実験ＩＴＧＡ７＋／ＬａｃＺに基づくアッセイにおいて少なくとも１．５倍の増加を実現するようなＳｔｒｙｋａ−９６９のアナログを用いて、培養ヒトＤＭＤ筋管を有する６ｃｍプレートを、前記の用量反応に基づく濃度範囲で治療する（ｎ＝３／濃度）。４８時間後、筋管を洗浄し、ウェスタンブロット分析のために溶解する。α７Ｂおよびβ１Ａインテグリン、ラミニンα２、およびユートロフィンレベルをはじめとするいくつかのタンパク質を、標準ウェスタンブロッティング法で評価する。化合物が少なくとも１．５倍のα７インテグリン増加を実現しなければ、さらなる研究から除外してもよい。本明細書において記載する培養ヒトＤＭＤ筋管におけるＳｔｒｙｋａ−９６９の挙動は、当該化合物のアナログがヒト細胞におけるα７インテグリンの増加につながり得ることを示唆する。広範囲の濃度のウェスタンブロットを用いて小分子の最適用量を見逃すことを防止してもよい。このような見逃しは、ヒトＤＭＤ筋管に使用する初期アッセイからのＥＣ１００濃度にのみ依拠した場合に起こり得る。
【０３１９】
他のα７インテグリン化合物の活性も、筋芽細胞および筋管双方においてフルオレセインに対する非蛍光性化合物フルオレセインジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＦＤＧ）のβガラクトシダーゼ開裂を用いて決定することができる。アナログ化合物を用いる筋芽細胞アッセイでは、１ｘ１０４の細胞を９６ウェル黒色ウェル培養プレートにプレーティングし、２４時間培養する。親およびアナログ化合物を添加し、化合物添加の４８時間後ＦＤＧバイオアッセイを行う。筋管アッセイでは、９６ウェル黒色ウェル培養プレート上の２．５ｘ１０５の筋芽細胞を２４時間培養する。毎日細胞分化培地を添加し、分化の７日後に、化合物を筋管に添加して４８時間培養する。その後、ＦＤＧアッセイを用いてβガラクトシダーゼレベルを定量化する。これらのアッセイを、スクリーニングした各化合物毎に三組実施する。各アッセイで、ＤＭＳＯにおける用量範囲０．５〜２０μＭで親化合物およびアナログを細胞に添加し、各アッセイにＤＭＳＯのみのコントロールを添加する。各化合物の用量曲線クラスおよびＥＣ５０を計算し、プロットし、親ヒット分子のプロファイルと比較する。筋芽細胞および筋管において活性（正および負）を示したアナログ分子は、各分子プラットフォームシリーズ毎にＳＡＲを通知する。並行して、ミクロソームおよび筋管においてα７インテグリン増加可能な確認リード化合物のプラズマ安定性、透過性、および溶解性も評価して、さらなる薬物動態評価のための最適テンプレートの決定を容易にする。リード化合物は、リピンスキーの法則に従って、筋管（標的組織）における最も強力な活性及び最適な物理的および構造的薬物様性質に基づいて、さらなる研究用に選択される。
【０３２０】
その後、正アナログを評価して、マウスＣ２Ｃ１２およびヒトＤＭＤ筋原細胞を用いて、これらがα７インテグリン転写およびタンパク質を増加させるかどうか判定する。筋管分析では、Ｃ２Ｃ１２およびＤＭＤ筋芽細胞を、２％のウマ血清および５０Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを追加したＤＭＥＭに分化する。化合物またはＤＭＳＯを、上記のＦＤＧスクリーニングから計算したＥＣ１００用量で、Ｃ２Ｃ１２およびＤＭＤ筋芽細胞および筋管に添加する。全検査を三組実施し、ＴｒｉＺｏｌ試薬を用いてＲＮＡを抽出する。ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する。ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ法および定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて特定的にマウスまたはヒト転写を増幅するプライマー配列を使用して、反応をＡＢＩＰｒｉｓｍ７０００配列検出システムで行う。未治療細胞から得たｃＤＮＡの希釈系列からのＣＴ値および標準曲線を、対応するＡＢＩＰｒｉｓｍ７０００ＳＤＳソフトウェアで計算する。転写を１８ＳｒＲＮＡ転写に正規化し、コントロール細胞からのｆｏｌｄ変化として報告する。実験を三組実施し、ＡＮＯＶＡを用いて統計的有意性（ｐ＜０．０５）を判定する。
【０３２１】
イムノブロット解析を用いて治療およびコントロール細胞におけるタンパク質レベル発現を評価する。Ｃ２Ｃ１２およびヒトＤＭＤ筋芽細胞および筋管を、三組実験において培養し、上記の通りリード化合物またはＤＭＳＯで治療する。細胞をセルスクレーパで収穫し、タンパク質を抽出する。抽出したタンパク質を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイにより定量化する。全タンパク質の等量を４０ｍＡで１時間ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分けて、タンパク質をニトロセルロース膜に移す。ブロットをＰｏｎｃｅａｕＳで培養して、等量タンパク質ローディングを確認する。ウサギ抗α７インテグリン抗体、すなわちＡ２−３４５およびＢ２−３４７を、１：５００で用いて、それぞれマウスおよびヒトα７Ａおよびα７Ｂインテグリンを検出する。バンドを、ＯｄｙｓｓｅｙＩｎｆｒａｒｅｄイメージングシステムでスキャンする。ブロットを抗ＧＡＰＤＨで再プローブし、タンパク質ローディングのためバンド強度を正規化する。ＬｉＣｏＲＯｄｙｓｓｅｙスキャナおよびソフトウェアを用いてバンド強度を定量化し、ＡＮＯＶＡを用いて統計的有意性（ｐ＜０．０５）を判定する。
【０３２２】
所望の薬物様構造を有する化合物の薬物速度論的特性を、体内活性のために分析する。３匹の８週Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、上記の例で決定したＥＣ１００でコントロール溶質または検査対象化合物で腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｏｎｔｏｎｅａｌ）注射（ｉ．ｐ）により治療する。化合物投与から０分（投与前）および３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、および２４時間後に、５０μｌの血液を眼窩後部で採血し、血清を遠心分離で単離する。投与後、動物を観察し、体重減少、けいれん、非協調運動、活動停止、体温変化、呼吸困難（ｄｉｓｐｅｎｉａ）、および死を含む毒性の兆候を監視した。アナログの筋組織レベルを評価する別の一連の薬物動態実験では、３匹の８週Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、上記と同じ時点においてコントロール溶質または化合物で治療する。各時点で、マウスをＣＯ２吸入により安楽死させ、腓腹筋、ＴＡ、心臓、腸および横隔膜筋を切断して分析する。筋肉および腸を抽出して、組織内の各リードアナログのレベルを判定する。
【０３２３】
精製化合物をコントロールとして、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析後の小分子の痕跡を特定する。薬物動態プロファイルには、血中半減期（ｔ１／２）、分布容積（Ｖｄ）、血清中薬物濃度（ＣｏまたはＣＳＳ）、消失速度定数（ｋｅ）、クリアランス（ＣＬ）、バイオアベイラビリティ（ｆ）、最高血清濃度（Ｃｍａｘ）、および到達時間Ｃｍａｘ（ｔｍａｘ）が含まれる。それから、好適な薬物動態プロファイルのリード化合物を選択して、さらなる研究に供する。経口投与可能なリードα７インテグリン促進化合物を開発する目的で、製剤を開発する。実験的厳密さのために、分析前にサンプルを符号化し、採取データを治療グループについて盲検化する。
【０３２４】
先に特定したリード化合物の薬物動態プロファイルおよび算出した最適用量を用いて、薬物のオンターゲット体内活性がα７インテグリンをトランスジェニックマウス研究で決定した治療域に増加させるかどうかを判定する。リード化合物のオフターゲット活性も調べる。３週ｍｄｘマウスに、薬物動態試験で決定した用量で、上記例で決定した好適なリード化合物または賦形剤を経口強制飼養で１４日間毎日投与する。Ｃ５７Ｂｌ／１０マウスを野生型コントロールとして含める。検出力分析（Ｐｏｗｅｒ＝０．８、α＝０．０５、ｒ＝０．５）で決められる通り、各実験およびコントロール群毎に少なくとも２２の雄ｍｄｘマウスを用いる。マウスの体重を毎週計り、挙動変化を記録する。マウスを５週齢で安楽死させ、前脛骨筋（ＴＡ）、腓腹筋、横隔膜、および心筋を収穫する。本明細書において記載するように、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットによりα７およびβ１インテグリン発現を定量化する。オフターゲット活性については、インテグリンα３、α５、α６、および細胞外マトリックス遺伝子の転写レベルを定量化する。ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ法を用いて特定的にマウス転写を増幅するプライマーを使用して、定量ＲＴ−ＰＣＲ反応をＡＢＩＰｒｉｓｍ７０００配列検出システムで行う。それぞれのＣＴ値をＡＢＩＰｒｉｓｍ７０００ＳＤＳソフトウェアで計算し、転写を１８ＳｒＲＮＡに正規化しコントロール組織からのｆｏｌｄ変化として報告する。実験を三組実施し、ＡＮＯＶＡを用いて統計的有意性（ｐ＜０．０５）を判定する。＞２倍変化の転写を、ウェスタンブロット分析で確認する。
【０３２５】
リード化合物が治療的有用性を示すかを決定するために、予備筋肉組織研究も行う。組織を収穫する前に、マウスにＥｖａｎｓＢｌｕｅ色素（ＥＢＤ）を注入し、上記の通りＥＢＤ摂取、中央に位置する核の筋原線維パーセンテージ、炎症、筋原線維断面、および線維症について組織研究を行う。実験的厳密さのために、分析前にサンプルを符号化し、採取データを治療グループについて盲検化する。ＡＮＯＶＡおよびｐ値＜０．０５により分析したデータを、統計的に有意とみなす。
【０３２６】
これらの例を用いてリードα７インテグリン促進化合物のPK/PDを決定することができる。そして、好ましいPK/PDのリード化合物を、オンターゲット有効性およびオフターゲット活性について評価する。
【０３２７】
開示の内容
パラグラフ１．筋ジストロフィーを有する被験体を治療する方法であって、α７β１インテグリン調節剤の有効量を、筋ジストロフィーを有する被験体に投与することを含み、前記α７β１インテグリン調節剤は、式１〜１６のいずれか１つ以上および／または表１〜１６および１８に開示される化合物のいずれか１つ以上から選択され、前記α７β１インテグリン調節剤は、α７β１インテグリンの発現または活性を、治療前のα７β１インテグリンの発現または活性と比較して増加させることによって、筋ジストロフィーを有する被験体を治療することを特徴とする、方法。
【０３２８】
パラグラフ２．前記筋ジストロフィーは、メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー１Ａ型（ＭＤＣ１Ａ）、メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー１Ｄ型（ＭＤＣ１Ｄ）、肢体型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、福山型先天性筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）または顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＨＭＤ）である、先行パラグラフに開示の方法。
【０３２９】
パラグラフ３．前記筋ジストロフィーは、ＤＭＤ、ＭＤＣ１Ａ、またはＦＣＭＤである、先行パラグラフのいずれか一つに開示の方法。
【０３３０】
パラグラフ４．前記筋ジストロフィーは、ＤＭＤである、先行パラグラフのいずれか一つに開示の方法。
【０３３１】
パラグラフ５．前記α７β１インテグリン調節剤は、付加的な治療剤とともに投与される、先行パラグラフのいずれか一つに開示の方法。
【０３３２】
パラグラフ６．前記付加的な治療剤は、コスタメリックタンパク質、成長因子、サテライト細胞、幹細胞、ミオサイト、または付加的なα７β１インテグリン調節剤である、先行パラグラフに開示の方法。
【０３３３】
パラグラフ７．前記付加的なα７β１インテグリン調節剤は、ラミニン−１１１、ラミニン−１１１フラグメント、バルプロ酸、またはバルプロ酸アナログ、式１〜１６および／または表１〜１６および１８から選択される異なる化合物である、パラグラフ６に開示の方法。
【０３３４】
パラグラフ８．筋ジストロフィーを有する被験体を選択することをさらに含む、先行パラグラフのいずれか一つに開示の方法。
【０３３５】
パラグラフ９．前記筋ジストロフィーを有する被験体を選択することは、前記α７β１インテグリン調節剤の有効量を被験体に投与する前に筋ジストロフィーを有する被験体を診断することを含む、先行パラグラフに開示の方法。
【０３３６】
パラグラフ１０．被験体において筋再生、修復、または維持を促進する方法であって、α７β１インテグリン調節剤の有効量を、筋再生、修復、または維持を必要とする被験体に投与することを含み、前記α７β１インテグリン調節剤は、式１〜１６のいずれか１つ以上および／または表１〜１６および１８に開示される化合物のいずれか１つ以上から選択され、前記α７β１インテグリン調節剤は、α７β１インテグリンの発現または活性を、治療前のα７β１インテグリンの発現または活性と比較して増加させることによって、被験体において筋再生、修復、または維持を促進する、方法。
【０３３７】
パラグラフ１１．前記α７β１インテグリン調節剤は、被験体が筋損傷または障害を発症する前に投与される、先行パラグラフに開示の被験体において筋再生、修復、または維持を促進する方法。
【０３３８】
パラグラフ１２．前記方法は、被験体における筋維持を促進する方法である、先行パラグラフのいずれか一つに開示の被験体において筋再生、修復、または維持を促進する方法。
【０３３９】
パラグラフ１３．前記α７β１インテグリン調節剤は、被験体が運動する前に被験体に投与される、先行パラグラフのいずれか一つに開示の被験体において筋再生、修復、または維持を促進する方法。
【０３４０】
パラグラフ１４．前記α７β１インテグリン調節剤は、筋疾患または損傷に罹患するリスクのある被験体に投与される、先行パラグラフのいずれか一つに開示の被験体において筋再生、修復、または維持を促進する方法。
【０３４１】
パラグラフ１５．筋再生、修復、または維持を促進する必要のある被験体を選択することをさらに含む、先行パラグラフのいずれか一つに開示の被験体において筋再生、修復、または維持を促進する方法。
【０３４２】
パラグラフ１６．前記筋再生、修復、または維持を促進する必要のある被験体を選択することは、前記α７β１インテグリン調節剤の有効量を被験体に投与する前に、筋再生障害を特徴とする症状のある被験体を診断することを含む、先行パラグラフに開示の被験体において筋再生、修復、または維持を促進する方法。
【０３４３】
パラグラフ１７．前記筋再生、修復、または維持を促進する必要のある被験体を選択することは、前記α７β１インテグリン調節剤の有効量を被験体に投与する前に、α７β１インテグリンの成分生成障害を特徴とする症状のある被験体を診断することを含む、先行パラグラフのいずれか一つに開示の被験体において筋再生、修復、または維持を促進する方法。
【０３４４】
パラグラフ１８．前記α７β１インテグリン調節剤は、付加的な治療剤とともに投与される、先行パラグラフのいずれか一つに開示の被験体において筋再生、修復、または維持を促進する方法。
【０３４５】
パラグラフ１９．前記付加的な治療剤は、コスタメリックタンパク質、成長因子、サテライト細胞、幹細胞、ミオサイト、または付加的なα７β１インテグリン調節剤である、先行パラグラフに開示の被験体において筋再生、修復、または維持を促進する方法。
【０３４６】
パラグラフ２０．前記付加的なα７β１インテグリン調節剤は、ラミニン−１１１、ラミニン−１１１フラグメント、バルプロ酸、またはバルプロ酸アナログ、または式１〜１６および／または表１〜１６および１８から選択される異なる化合物である、先行パラグラフに開示の被験体において筋再生、修復、または維持を促進する方法。
【０３４７】
パラグラフ２１．被験体における筋障害または損傷を予見的に防止または低減する方法であって、α７β１インテグリン調節剤の有効量を被験体に投与することを含み、前記α７β１インテグリン調節剤は、式１〜１６のいずれか１つ以上および／または表１〜１６および１８に開示される化合物のいずれか１つ以上から選択され、前記α７β１インテグリン調節剤は、α７β１インテグリンの発現または活性を、治療前のα７β１インテグリンの発現または活性と比較して増加させることによって、被験体における筋障害または損傷を予見的に防止または低減する、方法。
【０３４８】
パラグラフ２２．前記被験体は筋障害または損傷を発症するリスクがある、先行パラグラフに開示の方法。
【０３４９】
パラグラフ２３．前記α７β１インテグリン調節剤は、付加的な治療剤とともに投与される、先行パラグラフに開示の被験体における筋障害または損傷を予見的に防止または低減する方法。
【０３５０】
パラグラフ２４．前記付加的な治療剤は、コスタメリックタンパク質、成長因子、サテライト細胞、幹細胞、ミオサイト、または付加的なα７β１インテグリン調節剤である、先行パラグラフに開示の被験体における筋障害または損傷を予見的に防止または低減する方法。
【０３５１】
パラグラフ２５．前記付加的なα７β１インテグリン調節剤は、ラミニン−１１１、ラミニン−１１１フラグメント、バルプロ酸、またはバルプロ酸アナログ、または式１〜１６および／または表１〜１６および１８から選択される異なる化合物である、先行パラグラフに開示の被験体における筋障害または損傷を予見的に防止または低減する方法。
【０３５２】
パラグラフ２６．α７β１インテグリンの発現を促進する方法であって、細胞をα７β１インテグリン調節剤の有効量と接触させることを含み、前記α７β１インテグリン調節剤は、式１〜１６のいずれか１つ以上および／または表１〜１６および１８に開示される化合物のいずれか１つ以上から選択され、前記α７β１インテグリン調節剤は、治療後の細胞におけるα７β１インテグリンの発現を未治療の細胞におけるα７β１インテグリンの発現と比較して増加させることにより、α７β１インテグリンの発現を促進する、方法。
【０３５３】
パラグラフ２７．前記細胞は筋細胞である、先行パラグラフに開示の方法。
【０３５４】
パラグラフ２８．前記筋細胞は哺乳動物に存在し、前記細胞を薬剤に接触させることは、当該薬剤を当該哺乳動物に投与することを含む、先行パラグラフのいずれかに開示のα７β１インテグリンの発現を促進する方法。
【０３５５】
本開示の発明の原理を適用することのできる幾多の可能性のある実施形態に照らして、記載した各実施形態は発明の好適な例に過ぎないことが認識されるべきであり、本発明の範囲を限定するものであるととらえられるべきではない。むしろ、本発明の範囲は添付の請求の範囲により定義される。よって、我々は、これらの請求の範囲の範疇にある全てのものを我々の発明として請求する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
2016516051.tif 000136
【図７】
2016516051.tif 000137
【図８】
2016516051.tif 000138
【図９】
2016516051.tif 000139
【図１０】
2016516051.tif 000140
【図１１】
2016516051.tif 000141
【手続補正書】
【提出日】平成27年12月25日(2015.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９６】
【表４−１】
2016516051.tif 000142
【表４−２】
2016516051.tif 000143
【表４−３】
2016516051.tif 000144
【表４−４】
2016516051.tif 000145
【表４−５】
2016516051.tif 000146
【表４−６】
2016516051.tif 000147
【表４−７】
2016516051.tif 000148
【国際調査報告】
2016516051.tif 000149