(57)【要約】  本発明は、アーバスキュラ菌根菌類（ＡＭＦ）の生産のための方法およびシステムに関する。より明確には、ここに記載された本発明は、アーバスキュラ菌根菌類のインビトロでの連続的培養のための方法およびシステムに関し、好適には、回収するステップおよび／または継代するステップを含む。さらに、本発明は、その連続的培養の方法およびシステムに適切な培養条件に関する。本発明の別の態様は、ＡＭＦ胞子のような、ＡＭＦ−コロニー形成された根の材料および他の散布体を含む無菌の接種源である。本発明のまた別の態様は、液体培養メディウム中でのアーバスキュラ菌根菌類の材料の連続的生産のためのＡＭＦコロニー形成された根の材料の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アーバスキュラ菌根菌類の材料を生産する方法であって、前記方法は、
ａ．液体培養メディウム中で根の材料を連続的に培養するステップを含み、前記根の材料は、
ｉ．インビトロで分枝二次根系を構築することが可能であり、
ｉｉ．アーバスキュラ菌根菌類によりコロニー形成される、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記アーバスキュラ菌根菌類によりコロニー形成された前記根の材料の少なくとも一部を回収するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記回収されたコロニー形成された根の材料の少なくとも一部を新しい培養メディウムへ継代するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記回収されたコロニー形成された根の材料の少なくとも一部は、接種源として使用されることを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記継代するステップは、前記回収するステップに先行することが可能であることを特徴とする請求項２ないし請求項４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記液体培養メディウムは、培養するいずれかの段階中に３０μＭ以下のリン酸塩を含有することを特徴とする請求項１ないし請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記液体培養メディウムは、培養するいずれかの段階中に２０ｍＭ以下のアンモニウムを含有することを特徴とする請求項１ないし請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記アーバスキュラ菌根菌類は、グロムス門における全ての綱（現在のグロムス綱）、目（現在のパラグロムス目、アーケオスポラ目、ディバーシスポラ目、グロムス目）、科、属および種を含むグロムス門の菌類から選択されることを特徴とする請求項１ないし請求項７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記根の材料は、チコリ、クローバ、ニンジン、キュウリ、ポテト、ダイズ、インゲンマメ、ショウガ、カランコエ、ストロベリィ、ヒルガオのグループから選択される植物から誘導されることを特徴とする請求項１ないし請求項８にいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記根の材料は、Ｔ−ＤＮＡで形質転換されることを特徴とする請求項１ないし請求項９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｔ−ＤＮＡは、アグロバクテリウムから誘導されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記液体メディウムは、植物ホルモンおよび／またはビタミンが追加されることを特徴とする請求項１ないし請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記液体メディウムは、抗生物質をさらに含有することを特徴とする請求項１ないし請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１ないし請求項１３のいずれか１項に記載の方法により滅菌条件下で生産されたコンタミネーションのないアーバスキュラ菌根の接種源組成物において、３０μｍまでの範囲の粒子サイズのアーバスキュラ菌根菌類の散布体を含み、根の材料の乾燥質量１グラムあたりで１０６を超えるまでのアーバスキュラ菌根菌類散布体の散布体密度であることを特徴とする構成物。
【請求項１５】
アーバスキュラ菌根菌類のインビトロでの連続的培養のためのバイオリアクタにおいて、
ａ  請求項８に記載のアーバスキュラ菌根菌類を接種し、該菌類によりコロニー形成された分枝二次根系を構築することが可能な根の材料；と、
ｂ  請求項５ないし請求項７、請求項１２のいずれか１項に記載の液体培養メディウムと、
を含むことを特徴とするバイオリアクタ。
【請求項１６】
液体培養メディウム中でアーバスキュラ菌根菌類の材料を連続的に生産するためにインビトロで分枝二次根系を構築することが可能な根の材料の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アーバスキュラ菌根菌類（ＡＭＦ、arbuscular mycorrhizal fungi）、好適には、胞子様のＡＭＦ散布体およびコロニー形成された根の材料におけるＡＭＦ散布体のインビトロ（in vitro）での連続的培養および大量生産のための新規な方法および液体培養ベースのシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
＜アーバスキュラ菌根菌類（ＡＭＦ）＞
アーバスキュラ菌根菌類（ＡＭＦ）は、地球上の植物の約８０％の根と親密な会合体を確立する古来の単一系菌類の系統（グロムス門（Glomeromycota））を表し：アーバスキュラ菌根（ＡＭ；しばしば「ベシキュラ−アーバスキュラ菌根（vesicular arbuscular mycorrhiza）」、ＶＡＭとも称される）と称される共生体である（イジドゥら（IJdo et al.）、 ２０１１;シュスラーおよびウォーカー（ Schussler & Walker）、２０１１;コラディおよびボンファンテ（ Corradi & Bonfante）、２０１１）。
【０００３】
共生体の植物の根をコロニー形成するときに、ＡＭＦは、根の皮層に侵入し、細胞間菌糸ならびに細胞内菌糸を形成し、両共生体間の栄養分の交換の原因となる高度に分枝した構造である樹枝状体を形成する。いくつかのＡＭＦ種は、また、根の細胞内に嚢状体（vesicles、ベシクル）または根の外側に助細胞（auxiliary cells）を形成する。菌糸を有する周囲の土壌を探査することにより、ＡＭＦは、植物根系の表面積を顕著に増大させ、植物根の周囲に展開する栄養分の枯渇ゾーンを橋渡しする。それにより、共生する植物は、土壌からの水分や栄養分（例えば、リン（Ｐ）や窒素（Ｎ）の吸収向上の利益を受け、見返りに、固定炭素源（例えば糖類）を菌類にもたらす（スミスおよびリード（Smith & Read）、２００８）。さらに、コロニー形成は、生物性および非生物性のストレスに対する植物の抵抗性を向上させることも報告されている（ハリア（Harrier）、２００１）。共生植物と物理的および機能的に会合することで、ＡＭＦは、散布体（胞子および菌糸体；いくつかのＡＭＦ系統がいわゆる助細胞も形成する）の散布により土壌中に繁殖する。多くの商業的に重要な植物の生長や生存性を増進させる能力のため、ＡＭＦは、作物収量や健康の向上、ならびに、化学肥料および／または農薬の減少に対する多大な可能性のために、農業、林業、造園、復元および園芸での使用についてますます検討されている（ストラックら（Strack et al.）、２００３;イジドゥら、２０１１）。
【０００４】
その可能性にもかかわらず、ＡＭＦは、広範に商業化されているものではなく、主として、偏性生体栄養性（obligate biotrophic nature）のために、植物の広範な接種用のＡＭＦ材料のコスト効率的でラージスケールの生産の開発を複雑にしている。ＡＭＦ培養用の多くの技術が開発されているものの、全てが工業的な量での効率的なＡＭＦ接種源の生産を妨げるという問題がある。ＡＭＦは、今まで、無菌条件下（すなわち、他のいずれかの生物の不在下）でうまく培養されなかったが、現在の培養技術では、通常ＡＭＦの二者培養（他の１つの生物、すなわち、国際公開ＷＯ２００９／０９０２２０に記載されたように宿主として全植物体または根の器官が存在する）に基づいている。しかしながら、ほとんどのアプローチでは、ＡＭＦ散布体を比較にならないほど少量で得られるにすぎず、容易で効率的な大量生産に適していない。
【０００５】
＜根の器官培養（ＲＯＣ）でのＡＭＦのインビトロ生産＞
１９５０年代後期より、切り離された根の器官に会合したＡＭＦのインビトロでの生産についての種々のアプローチが明らかにされている。モッセおよびヘッペル（Mosse and Hepper）は、トマト（リコペルシカム・エスクレンタム（Lycopersicum esculentum））およびアカツメクサ（red clover）（トリフォリウム・プラテンセ（Trifolium pratense））から得られた切り離された根の器官にファネリフォルミス・モセアエ（Funneliformis mosseae）（グロムス・モセアエ（Glomus mosseae）と同義）のＡＭＦ胞子を接種することにより、インビトロでアーバスキュラ菌根の共生体を確立することを開拓した（１９７５）。しかしながら、コロニー形成および胞子形成は制限されていた。アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）の根誘導（root inducing）（Ｒｉ）Ｔ−ＤＮＡで、安定で自然に生じる根の遺伝的形質転換は、複雑な生長メディウムから独立した急速な根の生長を使用させることができる培養システムに帰着し、ＡＭＦ培養技術の洗練への道を開いた。ＡＭＦによりコロニー形成されたカリステジア・セピウム（Calistegia sepium）（コンボルブルス・セピウム（Convolvulus sepium）；セイヨウヒルガオ（bindweed）と同義）のアグロバクテリウム・リゾゲネスで形質転換された（「毛状」）根の培養は、マグニエルおよびモッセ（Mugnier and Mosse）により報告された（１９８７）。その後、ビカルドおよびフォルティン（Becard and Fortin）は、ダウクス・カロタ（Daucus carota、ニンジン）毛状根を用いたＡＭＦのインビトロでの胞子形成をはじめて報告した（１９８８）。
【０００６】
マグニエル（米国特許第４，５９９，３１２）は、Ｒｉ−Ｔ−ＤＮＡで形質転換した根を生産し培養する方法を開示する。また、その特許は、ＡＭＦコロニー形成された形質転換した根を接種し培養する方法に関する。その技術は理論的には形質転換した根の材料の発酵器（fermenter）における大量生産を許容するものの、根の感染およびＡＭＦコロニー形成された根の培養は、従来の基質培養または従来のＲＯＣで達成され、それにより、コスト効率的で実行可能なラージスケール生産の可能性を著しく制限する。同じことが仏国特許ＦＲ２８５６５５３にも当てはまり、液体培養メディウム中での（無接種の）カルス（calli）の生産を増大させるが、ＡＭＦの培養のために従来のＲＯＣを頼りにする。スイッチング培養技術の追加のステップは、複雑さおよびコンタミネーションのリスクをさらに増加させる。米国特許第４，５９９，３１２は、ＡＭＦコロニー形成された形質転換した根の発酵器における培養を推測させるものの、そうすることの手段や方法のガイダンスを提供するものではなく、むしろＡＭＦコロニー形成された根の培養のために従来のＲＯＣ技術を頼りにする。本発明者らは、コロニー形成されていない根の材料の大量生産に焦点を合わせるが、しかしながら液体培養でのＡＭＦ材料の大量生産のための方法を提供するには不十分である。ＡＭＦコロニー形成された根の材料のＲＯＣ培養ステップは、米国特許第４，５９９，３１２および仏国特許ＦＲ２８５６５５３に開示された方法の障害であり、効果的な拡大を邪魔しており、それによりＡＭＦ材料のコスト効果的な大量生産の可能性を著しく低下させる。さらに、本発明者らと違って、米国特許第４，５９９，３１２も仏国特許ＦＲ２８５６５５３も、高度な分枝二次根系を構築することが可能でありＡＭＦによりコロニー形成される根の材料がＲＯＣまたは液体メディウムでのＡＭＦ大量生産に用いられるべきこと、または、用いられ得ることを認識していない。
【０００７】
ウッドら（Wood et al.）、欧州特許ＥＰ０２０９６２７は、固化させたメディウムでの根の器官培養に関連するＡＭＦの培養がギガスポラ・マルガリタ（Gigaspora margarita）のメディウム１ｍｌあたりに１．７ＡＭＦ胞子の平均量をもたらすことを教示する。同様のアプローチは、ストルールおよびロマンド（Strullu and Romand）により採用されている（欧州特許ＥＰ０１７２０８５）。フォルティン（Fortin）（米国特許第５，５５４，５３０）は、菌根の根からＡＭＦ菌糸および胞子の生長を分離するために２分画のペトリディッシュを用いる改善されたＲＯＣシステムを開示する。切り離された根は、２分画のペトリディッシュ（スプリットプレート、図１Ａ）の１区画中で固化させたスクロース含有メディウム上で生長する。固化させたメディウムを含有するスクロースのない第２の区画中で共存するＡＭＦ生長の広がりを誘導するために、形質転換した根は、ＡＭＦ散布体で接種され得る。
【０００８】
ＲＯＣは、インビトロの滅菌条件下でＡＭＦ材料の生産を可能とする；しかしながら、コストおよび時間を浪費するものであり、膨大な数のＡＭＦ種の大多数についてまだ効率的ではないかまたは可能とされていない。広範に用いられ、比較的速く生長するモデルのＡＭＦであるリゾファガス・イレグラリス（Rhizophagus irregularis）（同義：グロムス・イレグラレ（Glomus irregulare）；以前は間違った用語のグロムス・イントララディセス（Glomus intraradices）であった）では、３ヶ月またはそれ以上の培養サイクルが通常適用される。ＡＭＦによりコロニー形成されたニンジン（ダウクス・カロタ）の宿主根での直径９．４ｃｍのスプリットプレートペトリディッシュにおける従来のＲＯＣは、１２から１８週の培養期間後に、ペトリプレートあたりにおよそ８４００から１６８００胞子の収量となる（イジドゥら、２０１１）。フォンタインら（Fontaine et al.）は、ＲＯＣにおけるＡＭＦ用の宿主として形質転換したチコリ（チコリウム・インティブス（Cichorium intybus））の根の使用を確立した（２００４）。チコリの根は、コロニー形成された根が新たな培養を開始し、早く生長し、強力に枝分かれするために容易に形質転換され得るものであり、６か月齢（half a year old）のチコリの根が新しいプレートへの移植後に新たな発芽後生育の能力を、ニンジンの根ではこの能力が早期に失われるのに対し、まだ有しているため、インビトロで培養されたＡＭＦの取扱いを容易にする。チコリベースのシステムは、６ヶ月まではメインテナンスすることなくスプリットプレートで生長され得るものであり、顕著な量の胞子が１２週後に回収される（カンパニャックら（Campagnac et al.）、２００９、参照）。
【０００９】
＜液体培養メディウム中での毛状根のインビトロ生産＞
いくつかの研究が液体培養メディウム中、例えば浸水させた培養システム、での毛状根の培養（ＡＭＦでコロニー形成されていない）を報告している（マッケルベイら（Mckelvey et al.）、１９９３；ヌウティラら（Nuutila et al.）、１９９５）。ミスト条件（液体メディウムを噴霧、マッケルベイら、１９９３）は、頻繁にリフレッシュすることを必要とする大容量の液体培養メディウムの供給を要求する。コンドウら（Kondo et al.）は、液体培養メディウム中に根の器官を含有し、スピニング攪拌または振動により酸素を供給した回転ドラムで実験を行った（１９８９）。しかしながら、これらのシステムは、ＡＭＦの生産のために用いられておらず、攪拌や振動することにより生じるストレスがＡＭＦ生長を妨げる。
【００１０】
＜液体培養メディウム中でのＡＭＦのインビトロ生産用のエアリフトバイオリアクタ＞
ジョリコユら（Jolicoeur et al.）は、液体培養メディウム中でニンジン（ダウクス・カロタ）の根の上でのＡＭＦ（リゾファガス・イレグラリス、そこでは「グロムス・イントララディセス」と称される）を培養するためのエアリフトバイオリアクタの使用を報告した（１９９９）。そのシステムの不利な点は、その複雑な構成および滅菌エアの連続的フローの要求である。そのシステムでは、ＡＭＦコロニー形成された根の材料の部分を容易に回収し、サンプリングし、継代することが可能ではなく、それにより連続的培養を実行不可能にする。また、その著者は、限界の接種濃度としてメディウム１リットルあたりに最大０．６ｇ乾燥重量（ＤＷ）の接種を報告しており、それを越えると用いた摂取量に関連するＡＭＦコロニー形成された根の生長が減少する。さらに、そのシステムは、メディウム１リットルあたりに僅か２００００胞子（５００ｍｌユニットあたりに１００００胞子）の比較できるほどに非常に低い胞子収量をもたらす。これは、並行の液体培養メディウムでのペトリディッシュ培養から得られるメディウム１リットルあたりに３００００胞子（２０ｍｌユニットあたりに６００胞子）の胞子量より少なかった。このため、いずれの方法でも、４ヶ月後に１リットルあたりにおよそ５０００００胞子の結果となる（２０ｍｌユニットあたりに１００００胞子；セントアーナウドら（St-Arnaud et al.）、１９９６）スプリットプレート（４０ｍｌ）における伝統的なＲＯＣと比べて１０倍以上少ない効率であり；スプリットプレート（４０ｍｌ）の全体のメディウムに関係するとしても、収率が低い。胞子の発芽レベルが比較的低く（５８％）、エアリフトバイオリアクタにおける菌根化率（２５−７５％）も並行の液体培養メディウムでのペトリディッシュ培養や従来のＲＯＣｓから得られる結果を越えるものではなかった。さらに、ＡＭＦコロニー形成された根の材料は、胞子数および菌糸分布において、ならびに、根のコロニー形成度合において、高度な不均質性を示した。６９および９３日（それぞれ、約１０および１３週）後に、その著者は、ＡＭＦコロニー形成された根および液体メディウムが褐色に変化したことをさらに報告し、その時点からＡＭＦおよび根の両者でそれ以上の生長が生じないことを認めている。
【００１１】
要するに、その複雑な構成のため、ジョリコユらのエアリフトバイオリアクタ（１９９９）は、コンタミネーションを起こしやすく、取扱いが難しく、連続的なまたは長期間の培養に適していない。また、従来のＲＯＣにより１２−１６週後に得られる胞子量の僅か１０−２０％の収量である。このため、エアリフトバイオリアクタは、標準的な培養技術に対する改善を示すものではなく、ＡＭＦ材料のコスト効率的で実行可能な大量生産の可能性を有するものでもない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
まとめると、現在のインビトロ生産技術は、しばしば、高価であり、時間を浪費し、コンタミネーションを起こしやすく、取扱いが難しいものであり、コスト効果的な工業的に上昇させたスケールの基礎を提供するものではない。
【００１３】
本発明の根底にある技術的問題は、従来技術に記載されたＡＭＦ材料生産の問題を解決する手段および方法の提供に見出されるものであり、より特徴的には、実行可能でコスト効率的なやり方でＡＭＦ材料の大量生産を可能とすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
その解決法は、以下に説明され、ここに記載された態様および実施形態ならびに以下に提示したクレームに反映される。実施例および図面は、発明を例証するための役割を果たし、いかなる点でもそれを制限するものではない。
【００１５】
本発明者らは、根の器官の液体培養（ＲＯＬ）におけるＡＭＦ材料の生産のための効率的な方法を開発した。驚くべきことに、ＡＭＦコロニー形成された根は、液体メディウム中、インビトロで連続的に培養され得るものであり、それにより滅菌ＡＭＦ材料のコスト効率的で複雑ではない大量生産を可能とする。本発明者らは、ＲＯＬからのＡＭＦコロニー形成された根が新たな培養を設定するために効率的に使用され得るものであり、このため新しい根をＡＭＦ胞子と再会合させること、または、新たなＲＯＬ培養を開始するための他の培養やＲＯＣからの感染した根を使用することの必要性を取り除くものである。また、ＲＯＬからのＡＭＦコロニー形成された根の材料は、スプリットプレートＲＯＣを確立するために効率的に使用され得る。さらに、本発明者らは、ＲＯＣの効率および収率を増加させるための方法を開発した。新たな手法では、菌類の生長性能を向上させ、例えばスプリットプレートＲＯＣにおける菌類の胞子の生産に必要な最小時間を短縮する。本発明者らは、根の材料の高度なコロニー形成率を維持するためのやり方をさらに見出した。ＲＯＬ培養は、さらに、室温にて、滅菌条件下でより長い期間にわたる保管のために容易に保つことが可能であり、新たなＲＯＬやＲＯＣ培養の非常に効率的な設定のために必要なときはいつでも用いられ得る。
【００１６】
従って、従来技術と違って、本発明は、培養の１２−１６週後に、メディウム１リットルあたりに１０６から１０７のＡＭＦ散布体を推定する。いくつかの実施形態において、本発明による培養技術は、積極的な通気を要求せず、これにより一層容易にスケール増大を可能とする。さらに、本発明の方法は、ジョリコユらによるエアリフトバイオリアクタ（１９９９）のように、材料にアクセスし、培養メディウムを交換するために分解しなければならない複雑なデザインを有するバイオリアクタを要求するものではない。本発明の方法は、ジョリコユらのバイオリアクタ（１９９９）より約５０から５００倍を超える胞子を産出することができ、その公報に報告されたペトリディッシュ液体培養におけるより３３から３３０倍を超える胞子を産出することができる。さらに、本発明の方法は、内部完全胞子（intraradical spores）および嚢状体の量を高度に含有する根を生産することができる。これは、非常に少ない嚢状体を含有するジョリコユら（１９９９）により得られる根の材料と著しく違っている。これは、嚢状体（胞子様構造を含む脂質貯蔵体）および内部完全胞子が生きたＡＭＦ接種源として長期にわたり保管でき得る効率的な散布体であるため、根本的な差異である。
【００１７】
本発明者らは、驚くべきことに、ＡＭＦコロニー形成された根の材料の改善された効率的な培養システムのための手段および方法を見出した。以下に開示された方法は、液体培養メディウム中での連続的培養による大量のＡＭＦコロニー形成された根の材料のコスト効率的および時間効率的な生産を可能とする。発明者らは、分枝二次根系を構築することが可能な根がインビトロでの液体培養におけるＡＭＦ大量生産のための最適な前提条件を提供することを発見しており、なぜなら、それらが、液体培養メディウム中で高い増殖率で早く（再）生長し、取扱いが容易であり、すぐに老化することなく好適には特別なメインテナンスを要求せず、そして、液体メディウム中での極めて長期の残留後でさえも新たな培養を開始することが容易にできるためである。これに対して、分枝二次根系を構築することが可能ではない根の材料は、過度に加齢することを回避するために根のチップを含有する特定長の部分の規則的な移植、菌根培養を生かし続けるためにＡＭＦ材料での新たな根の連続的な再感染等の規則的なメインテナンスを要する。このため、第１の態様において、本発明は、アーバスキュラ菌根菌類の材料を生産する方法に関し、その方法が：液体培養メディウム中で根の材料を連続的に培養し、その根の材料がインビトロで分枝二次根系を構築することが可能であり、ＡＭＦによりコロニー形成されるものである。本発明の好適な一実施形態において、その方法は、そのアーバスキュラ菌根菌類によりコロニー形成された根の材料の少なくとも一部を回収するステップをさらに含む。
【００１８】
その優れた性質のために、本発明のアーバスキュラ菌根菌類でコロニー形成された根の材料は、容易に回収され、直接的に新たな培養の設定のために継代され得る。別の好適な実施形態において、本発明は、コロニー形成された根の材料の回収された少なくとも一部を新しい培養メディウム中に継代するステップをさらに含む。
【００１９】
別の好適な実施形態において、継代するステップは、本発明の方法の回収するステップに先行することができる。
【００２０】
本発明の方法は、アーバスキュラ菌根菌類の散布体を大量に含有する根の材料を得ることができる。その材料は、植物、植物材料または根の材料を接種するために、例えば、新たなＲＯＣやＲＯＬ培養を設定するために効率的に使用され得る。従って、好適な一実施形態において、コロニー形成された根の材料の回収された少なくとも一部は、接種源として用いられる。
【００２１】
本発明者らは、ＡＭＦ生長が競合することができない根の材料の過剰生長を回避するために、根の生長とＡＭＦコロニー形成率とをバランスさせることが重要であることを見出した。別の好適な実施形態において、その液体培養メディウムは、このため、その根の材料およびＡＭＦの生長およびメインテナンスに適している。
【００２２】
発明者らは、さらに、アーバスキュラ菌根菌類の極めて高いコロニー形成率がリン酸塩濃度を低下させることにより長い間にわたって達成され得ることを発見した。このため、別の好適な実施形態において、その液体培養メディウムは、培養のいずれかの段階中でも３０μＭ以下のリン酸塩を含有する。
【００２３】
別の好適な実施形態において、その液体培養メディウムは、培養のいずれかの段階中でも２０ｍＭ以下のアンモニウムを含有する。
【００２４】
本発明の方法およびシステムは、種々のＡＭＦ種に適合し得る。それゆえ、別の好適な実施形態において、アーバスキュラ菌根菌類は、グロムス門（phylum Glomeromycota）における全ての綱（classes）（現在のグロムス綱（Glomeromycetes））、目（orders）（現在のパラグロムス目（Paraglomerales）、アーケオスポラ目（Archaeosporales）、ディバーシスポラ目（Diversisporales）、グロムス目（Glomerales））、科（families）、属（genera）、種（species）を含むグロムス門の菌類から選択される。
【００２５】
上述したように、本発明の方法およびシステムで用いられる根の材料は、本質的であるかまたは誘導可能なインビトロで分枝二次根系を構築する能力を有している。種々の植物は、本発明の方法およびシステムにおいて、インビトロで分枝二次根系を構築することが可能なほど長く使用するために適切な根の材料をもたらす。このため、本発明の好適な実施形態において、根の材料は、チコリ、クローバ、ニンジン、キュウリ、ポテト、ダイズ、インゲンマメ、カランコエ、ショウガ、ストロベリィまたはヒルガオのグループから選択される植物から誘導される。特に好適な根の材料は、ここに記載されたようにＴ−ＤＮＡで形質転換されたチコリの根の材料に類似した様式で、インビトロで分枝二次根系を構築することが可能である。「チコリの根の材料に類似」は、チコリの根の材料以外の根の材料が、（ｉ）チコリの根の材料と同じ時間枠内で、および／または、（ｉｉ）チコリの根の材料と同じ量／範囲で分枝二次根系を構築することが可能であることを意味する。特に、その用語は、好適には生きたままであり、約１−１０ｍｍ、例えば５ｍｍ等の小断片に切断した後でさえも増殖することが可能な根の材料をいう。新しい培養メディウムの中または上に小断片を位置させた後、その小フラグメントの大部分が好適には再生長するであろう。このことは、その根系における以前の位置と全く独立しており、好適には根が例えば切断面でも生長するであろう。これに対して、従来のＲＯＣ用に最も頻繁に用いられるニンジンから誘導された根の材料は、チコリ誘導の根の材料と比べて少ない二次根を構築し、根のチップを含有する約２−１０ｃｍのより大きな断片を新たな根の発芽後成長を達成するために用いなければならない。形質転換させたニンジンの根を用いる伝統的なアプローチは、新たな培養の設定後に、根のフラグメントの大部分のために、制限された数の根のチップから新たな根の生長を確保するために、１−２ｃｍの側根（side roots）を有する６−８ｃｍの断片でさえも使用する（クラネンブルックら（Cranenbrouck et al.）、２００５）。チコリの根の材料は、グロムス  インビトロ  コレクション（Glomeromycota in vitro collection）（ＧＩＮＣＯ）から得られるようなチコリＡ４ＮＨからのものが好適である。
【００２６】
根の材料は、トランスファＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）を挿入することにより遺伝的に形質転換されてもよい。このため、別の好適な実施形態において、根の材料は、好適には根の生長を誘導する、および／または、根を永続化するＴ−ＤＮＡで形質転換される。
【００２７】
Ｔ−ＤＮＡは、アグロバクテリウム属からの細菌の遺伝的材料から誘導され得るＤＮＡ部位である。それゆえ、別の好適な実施形態において、そのＴ−ＤＮＡは、アグロバクテリウム、より好適にはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネスから誘導される。
【００２８】
根の材料は、植物ホルモンやビタミンの存在下でさらに培養されてもよい。別の好適な実施形態において、液体メディウムは、このため、植物ホルモンおよび／またはビタミンが追加される。抗生物質は、例えば、インビトロ培養における新たなアーバスキュラ菌根菌類を確立するプロセスで、微生物のコンタミネーションを回避または抑制するために培養に添加され得る。従って、好適な一実施形態において、液体メディウムは、抗生物質を含有する。
【００２９】
本発明は、別の態様において、ここに記載されたいずれか一つの実施形態の方法により滅菌条件下で生産されたコンタミネーションのない（contamination-free）アーバスキュラ菌根の接種源組成物に関し、粒子サイズが３０μｍまでの範囲の散布体を含み、根の材料の乾燥質量１グラムあたりに１０６ＡＭＦ散布体を超えるまでの散布体密度である。
【００３０】
本発明は、また、別の態様において、アーバスキュラ菌根菌類のインビトロでの連続的培養のためのバイオリアクタを提供するものであり、上述した実施形態のいずれか１つのアーバスキュラ菌根菌類を接種しそれによりコロニー形成された上述の実施形態のいずれか１つの根の材料、および、上述した実施形態のいずれか１つの液体培養メディウムを含む。
【００３１】
別の態様において、本発明は、液体培養メディウム中でアーバスキュラ菌根菌類の材料を連続的に生産するために、インビトロで分枝二次根系を構築することが可能な根の材料の使用に関連する。
【００３２】
ここで用いられるように、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」が本文脈において他に明確に示されていない限り複数形の参照を含有することに留意すべきである。このため、例えば、「１つの試薬（a reagent）」の参照が１またはそれ以上の異なる試薬を含有し、「その方法（the method）」がここに記載された方法を改変または代用することができる当業者に知られた同等のステップや方法の参照を含有する。
【００３３】
他に示されていない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも（at least）」は、その一連の全ての要素をいうことが理解されるべきである。当業者は、僅かなルーチン実験で、ここに記載された発明の特有の実施形態に対する多くの同等物を確認することができ、認識するであろう。そのような同等物は、本発明に包含されるべきことを意図するものである。
【００３４】
ここで用いられるのがどこであっても用語「および／または（and/or）」は、「および」、「または」および「その用語でつなげられる要素の全てまたは他のいずれかの組み合わせ」の意味を含有する。
【００３５】
ここで用いられるように用語「約（about）」や「およそ（approximately）」は、所与の値または範囲の２０％の範囲内、好適には１０％の範囲内、より好適には５％の範囲内を意味する。しかしながら、その具体的な数も含有するものであり、例えば、約２０が２０を含有する。
【００３６】
用語「より小さい（less than）」や「より大きい（greater than）」は、その具体的な数を含有する。例えば、２０より小さい（less than 20）は、それより小さいかまたはそれと同じであることを意味する。同様に、より多くやより大きいは、それぞれ、それより多いかまたはそれと同じであること、それより大きいかまたはそれと同じであることを意味する。
【００３７】
この明細書および以下のクレームを通じて、本文脈で他のことを要求しない限り、語句「含む（comprise）」、および、「含む（comprises）」や「含んでいる（comprising）」等の変化形は、示された整数やステップまたは整数やステップのグループの包括を含むものであり、他のいずれかの整数やステップまたは整数やステップのグループの排除を含まないことを理解されるであろう。ここで用いられるときに用語「含んでいる」は、用語「包含している（containing）」や「含有している（including）」と置き換えられてもよく、ここで用いられるときにしばしば用語「有している（having）」と置き換えられてもよい。
【００３８】
ここで用いられるときに用語「からなる（consisting of）」は、クレーム要素に特定されていない要素、ステップまたは成分をいずれも排除する。ここで用いられるときに、「本質的にからなる（consisting essentially of）」は、クレームの基本的な新規な性質に実質的に影響しない材料やステップを排除するものではない。
【００３９】
ここでのそれぞれの例において、「含んでいる」、「本質的にからなる」および「からなる」のいずれかの用語は、他の２つの用語のいずれかと置き換えられてもよい。
【００４０】
本発明は、ここに記載された特定の方法論、プロトコル、材料、試薬および物質等に制限されるものではなく、それ自体変更できるものであることを理解されるべきである。ここで用いられる用語法は、特定の実施形態のみを記載する目的のものであり、本発明の範囲を制限しようとするものではなく、本発明はクレームによってのみ定められるものである。
本明細書の文脈を通じて指摘された全ての公報や特許（全ての特許、特許出願、学術論文、製造者の説明書、指示書、等を含む）は、上記のものでも下記のものでも、これによりその全体における参照によりここに組み込まれる。本発明が以前の発明のおかげによる記載に先行して権利化されないことを認めたものと解釈されるものはない。参照により組み込まれた材料が本明細書と矛盾する、または、一致しない点では、本明細書がそのような材料に優先する。
【００４１】
＜発明の詳細な説明＞
宿主植物でのそれらの有用な効果のために、ＡＭＦは、農業、林業および園芸での使用のために重要な能力を保持している。しかしながら、商業的および／または科学的使用のための滅菌条件下での十分な量の生産は、それらの偏性生体栄養性により複雑化する。ＡＭＦ培養に関連する障害を解消するために、種々のアプローチが過去１０年にわたり採用されているが、滅菌条件下でＡＭＦ材料のコスト効率的な大量生産のための方法を提供するものではない。本発明は、ＡＭＦ材料の生産のためのインビトロでの根の器官液体培養（ＲＯＬ）の連続的培養方法を提供する。その方法は、設定し回収することがより速く、より簡単であり、より強健であり、より生産性があり、このため従来のインビトロでの根の器官培養（ＲＯＣ）より安価であり、それが容易に再生産可能である。また、ＲＯＬにおいて、メディウムは、例えば、ＲＯＣでは不可能な胞子産生を開始し、活性な生長サイクルを拡大するために容易に変更され交換され得るものである。さらに、本方法は、改善されたＡＭＦ生長、およびＡＭＦ胞子生産の時間の減少を生じる。その方法は、スプリットプレートＲＯＣにおけるＡＭＦ材料の急速生産、および、例えばストック培養として、ＡＭＦコロニー形成された根の材料の液体メディウム中での長期滅菌保存を可能とし、コスト効率的なＡＭＦ大量生産のために容易にスケールアップすることができる。本発明は、さらに、菌類の生長および菌類の区画からのＡＭＦ材料の回収を促進する変更されたスプリットプレートＲＯＣを含有する。
【００４２】
ここで用いられる用語「ＡＭＦ」は、アーバスキュラ菌根菌類をいう。ＡＭＦは、世界中の土壌中に広範に分布しており、植物種の大多数（約８０％）の根と共生関係を確立する菌類の系統を表す。ＡＭＦ種は、グロムス門に全て統合されており、今のところ２５の属（エントロホスポラ（Entrophospora）を含むときは２６）に分配された約２４０とみなされる種を含む（シュスラーおよびウォーカー、２０１１；レデッカーら（Redecker et al.）、２０１３）。
【００４３】
本発明の実施形態で用いられるＡＭＦは、グロムス門から選択されるいずれの種であってもよい。当業者は、ＡＭＦ分類が長い間にわたって改訂されており、将来におけるさらなる変更を受けるかも知れないし受けないかも知れないことを認めるであろう。今のところ、全てのＡＭＦは、パラグロムス、アーケオスポラ、ディバーシスポラおよびグロムスの目を含むグロムス門にグループ化されている。一般に、本発明によるＡＭＦは、グロムス門のいずれかの綱、目、科、属および種から選択され得る。ＡＭＦは、グロムス綱から選択されてもよい。さらに、ＡＭＦは、制限されるものではないが、パラグロムス、アーケオスポラ、ディバーシスポラおよびグロムスのグループから選択される目から選択されてもよい。一実施形態において、ＡＭＦは、リゾファガス・イレグラリス（同義：グロムス・イレグラレ；以前はしばしば間違ってグロムス・イントララディセスと称された）種から選択される。特に好適な一実施形態において、ＡＭＦは、グロムス  インビトロ  コレクション（ＧＩＮＣＯ）から入手可能な、リゾファガス・イレグラリスＭＵＣＬ４３１９４（ＤＡＯＭ１８１６０２と同じ、ＤＡＯＭ１９７１９８と同じ）、他のリゾファガス・イレグラリス株（ＤＡＯＭ２２９４５７、ＤＡＯＭ２３４１７９、ＤＡＯＭ２３４１８０、ＤＡＯＭ２３４１８１）、リゾファガス・クラルス（Rhizophagus clarus）ＭＵＣＬ４６２３８（ＤＡＯＭ２３４２８１と同じ）、リゾファガス・ディアファヌス（Rhizophagus diaphanus）（同義：グロムス・ディアファヌム（Glomus diaphanum）；ＤＡＯＭ２２７０２２［この培養は、以前にはグロムス・セレブリフォルメ（Glomus cerebriforme）として誤って注釈されていた］）、リゾファガス・ディアファヌスと密接に関連する他の種（ＤＡＯＭ２２９４５６）、クラロイデオグロムス・クラロイデウム（Claroideoglomus claroideum）（同義：グロムス・クラロイデウム（Glomus claroideum）；ＤＡＯＭ２３５３７９）、または、まだ特徴づけられていない種（ＤＡＯＭ２１２３４９、ＤＡＯＭ２２９４５５）のグループから選択される。当業者は、特定のＡＭＦ種がＲＯＬ培養で生長できるかを容易に測定することができる。簡単には、ＲＯＬがここに記載されたように設定され、根のコロニー形成が、解剖顕微鏡下で、ＡＭＦ染色後の根の顕微鏡観察により視覚的に、または、ここに記載されたＲＯＣ成功率（ＲＳＲ）を測定することにより測定され得る。
【００４４】
ここで用いられる用語「菌類（fungi）」または「菌類の（fungal）」は、ＡＭＦをいう。
【００４５】
ここで用いられる「アーバスキュラ菌根菌類の材料（Arbuscular mycorrhizal fungi material）」または「ＡＭＦ材料（AMF material）」は、制限されるものではないが、ＡＭＦの菌糸、胞子、嚢状体、菌根および／または他の散布体をいう。
【００４６】
ここで用いられる用語「散布体（propagule）」や「散布体（propagules）」は、ＡＭＦ再生産の媒介物として作用する材料に関する。より好適には、用語「散布体」がＡＭＦの胞子、助細胞、菌糸、菌糸フラグメントおよび／または嚢状体をいう。
【００４７】
インビボ（in vivo）またはインビトロにおける根でのＡＭＦ生長を開始するために用いられる「ＡＭＦ接種源」は、好適にはＡＭＦ散布体を含む。ＡＭＦ接種源は、他のＡＭＦ材料、根の材料および／または残りの培養メディウムや基質をさらに含む。ＡＭＦ接種源は、スプリットプレートＲＯＣの菌類区画を回収することにより調製されてもよい。本発明は、さらに、ＲＯＬからの混合された（すなわち、根の材料およびＡＭＦ材料を含む）ＡＭＦ接種源の調製にも関する。
【００４８】
ここで用いられる「コロニー形成された（colonized）」は、根の材料上でのＡＭＦ生長の状態をいう。根のコロニー形成率は、例えば、メチルブルー染色（グレースおよびストリブレイ（Grace & Stribley）、１９９１）後の線交差法（line intersection method）（マクゴニグルら（McGonigle et al.）、１９９０）により測定することができ、完全なプロトコルについては参考文献を参照する。
【００４９】
ここで用いられる用語「ＲＯＬ」や「ＲＯＬ培養」は、ＡＭＦコロニー形成された根の材料が以下に記載された培養条件下で液体培養メディウム中に保持される根の器官の液体培養の方法をいう。従って、用語「ＲＯＬ培養システム」は、ＲＯＬ培養が確立され、および／または、維持されるシステムをいう。
【００５０】
用語「根の材料」は、分離された根の材料、および、根を有するかまたは根を構築することが可能である全植物体を含むと認識されるべきである。用語「全植物体」は、例えば、ゼニゴケ類（liverworts）やツノゴケ類（hornworts）のような全維管束植物および全非維管束植物を含有する。本発明において光合成の可能な全植物体が適用されるのであれば、本発明に適用される培養メディウムにスクロースや別の炭素源を添加する必要はない。ＲＯＣシステムで炭素源の添加を伴うことなくＡＭＦを培養するためにツノゴケ類が用いられ得ることが（本発明者の一人により）示されており（シュスラー、２０００）、ゼニゴケ類の葉状体の光合成活性を組み合わせ、糖を供給したＲＯＣシステムでＡＭＦ用の宿主としてゼニゴケが用いられ得ることが示されている（フォンセカら（Fonseca et al.）、２００６）。一般に、本発明による根の材料は、非維管束植物または維管束植物から誘導され得る。非維管束植物は、ブリオフィタ（Bryophyta、センタイ類）（モセス（mosses、セン類））、マーチャンティオフィタ（Marchantiophyta、ゼニゴケ類）、アンソセロトフィタ（Anthocerotophyta、ツノゴケ類）およびアルガエ（algae、ソウ類）（例えば、カラレス（Charales）［シャジクモ類（stoneworts）］）を含有する。維管束植物は、トラケオフィテス（tracheophytes、維管束植物類）としても知られており、クラブモセス（clubmosses、ヒカゲノカズラ類）、ホーステイルス（horsetails、トクサ類）、ファーンス（ferns、シダ類）、ジムノスパームス（gymnosperms、裸子植物類）およびアンジオスパームス（angiosperms、被子植物類）を含有する。好適には、根の材料は、双子葉植物（dicotyledones）または単子葉植物（monocotyledones）から誘導され得る。より好適には、根の材料は、制限されるものではないが、チコリ（チコリウム・インティブス）、クローバ（トリフォリウム・スピーシーズ、Trifolium species）、ニンジン（ダウクス・カロタ）、キュウリ（ククミス・サティバス、Cucumis sativus）、ポテト（ソラナム・チュベロサム、Solanum tuberosum）、ダイズ（グリシネ・マクス、Glycine max）、インゲンマメ（ファセオルス・ブルガリス、Phaseolus vulgaris）、カランコエ種（カランコエ・スピーシーズ、Kalanchoe species）、ショウガ（ジンジベル・オフィシナレ、Zingiber officinale）、ストロベリィ（フラガリア・スピーシーズ、Fragaria species）またはヒルガオ（コンボルブルス・セピウム）から選択される植物から誘導される。特定の好適な一実施形態において、根の材料は、グロムス  インビトロ  コレクション（ＧＩＮＣＯ）から入手可能なチコリＡ４ＮＨから誘導される。本発明の方法およびシステムに用いられる根の材料は、好適には、インビトロで分枝二次根系を構築することができる。分枝二次根系を構築する能力は、以下では「分枝容量（ramification capacity）」と呼ばれる。ここで用いられる用語「宿主（host）」は、通常、ＡＭＦの共生パートナをいうものであり、例えば、本発明により適用された根の材料が「宿主」としても呼ばれる。
【００５１】
本発明より前に、インビトロでのＡＭＦの連続的生産のための根の分枝容量の主要な効果は、認識されていなかった。本発明者らは、ＡＭＦの連続的培養がインビトロで高度な分枝二次根系を構築するための能力を有する根の材料で改善されることを見出した。高度な分枝容量は、根の材料の生長およびバイオマス収量を増加させるばかりではなく、ＡＭＦによるコロニー形成を容易に可能とし、小ユニットの効率的な増殖を許容するように見える。このため、本発明者らは、根の材料を高コロニー形成率で急速に生長させるための方法を開発した。インビトロで分枝二次根系を構築する能力は、ＡＭＦを含むかまたは含まないＲＯＣまたはＲＯＬにおいて永続化した根を生長させることによりテストすることができる。数週間の増殖の後、根は、分枝系を形成し、それが小断片に切断され、新たな増殖ユニットとして使用され得る。これらの断片の小さな部分のみがさらに増殖することができれば、テストした根は、適度なサイズのストック培養から始まる多数の培養の急速な同時の設定に適していない。要するに、インビトロで容易に増殖することができる分枝二次根系を構築するための根の材料の能力は、ここに記載されたようにＡＭＦの生産のための連続的培養を許容する重要な特徴として、本発明者らに認識されただけであった。
【００５２】
その能力は、用いた根の材料に本質的なものであってもよく、遺伝的な形質転換、および／または、植物ホルモンおよび／またはビタミンの存在下での培養により誘導されてもよい。
【００５３】
根の材料は、好適には、特定の宿主植物と親密関係を確立する細菌種に自然に存在し、その名称が宿主植物の核ＤＮＡゲノムに転写される事実に由来するトランスファＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）により遺伝的に形質転換される。Ｔ−ＤＮＡは、腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド（Tumor-inducing-plasmid）または根誘導（Ｒｉ−）プラスミド（Root-inducing-plasmid）に含まれてもよい。Ｔ−ＤＮＡは、アグロバクテリウム種、Ｔ−ＤＮＡの遺伝子水平転移により植物腫瘍を引き起こし得るグラム陰性土壌細菌の属、に由来してもよい。アグロバクテリウムは、アグロバクテリウム・リゾゲネスまたはアグロバクテリウム・チュメファシエンスとすることができる。Ｔ−ＤＮＡでの遺伝的形質転換は当業者に知られた標準的なプロトコルに従う。そのＴ−ＤＮＡでの遺伝的形質転換は、インビトロでの培養メディウムで急速に独立して生長することが典型的に可能な毛状根として知られる状態を引き起こす（テッフェル（Tepfer）、１９９０）。
【００５４】
根の材料は、また、その分枝容量を増加させるために植物ホルモンおよび／またはビタミンを供給したメディウム中で培養されてもよい。適切な植物ホルモンは、制限されるものではないが、オーキシンタイプ（例えば、インドール−３−酢酸、インドール−３−酪酸、フェニル酢酸およびその他）、サイトカイニンタイプ（例えば、キネチン、６−ベンジルアミノプリン、ゼアチンおよびその他）や、いずれか他の植物ホルモン（phytohormone）およびそれらの組み合わせを含む。ビタミンは、制限されるものではないが、標準のＭＳＲやＭＳメディウムに含有されたビタミンのいずれか、ナイアシン、リボフラビン、葉酸や他のビタミンおよびそれらの組み合わせを含む。
【００５５】
＜培養（Cultivation）＞
本発明者らは、頻発するサイクルに適用され得るＡＭＦコロニー形成された根の材料の根の器官液体培養（ＲＯＬ）のための方法およびシステムを開発し、それによりＡＭＦの連続的培養を可能とした。また、ＲＯＬまたは続くＲＯＣのいずれにおいても、ＡＭＦ培養のスケールアップを容易に促進する。
【００５６】
ここで用いられる用語「培養（cultivation）」および「培養する（culturing）」は、培養（culture）による菌類や根の材料の生産をいう。好適には、本発明の教示するところにより液体メディウム中で培養されるときは、ＡＭ菌類によりコロニー形成された根の材料を含む根の材料が水中に浸され、すなわち、メディウム、好適には液体メディウムにより連続的に取り囲まれ、および／または、覆われる。
【００５７】
ここで用いられる用語「連続的に培養する（continuously culturing）」や「連続的培養（continuous culture）」は、実質的な培養条件の点で途切れることなく、ＡＭＦコロニー形成された根の材料を維持する方法をいう。より特徴的には、その用語は、ＲＯＬ培養条件下における同じ反応器で、ＡＭＦコロニー形成された根の材料の少なくとも２世代、好適には３世代、より好適には４世代、さらに好適には５世代以上の後続の世代で培養する方法、および／または、それらの一部を新たな反応器に連続的に継代することで培養する方法をいう。その連続的培養は、また、培養するいずれかの段階中に、好適には、新しいＡＭＦコロニー形成された根の材料を培養に添加しないことを含む。これは、例えば、ジョリコユら（１９９９）の従来技術と明確に異なる点である。
【００５８】
例えば、用語「連続的培養」は、ここに記載されたように反応器中でＲＯＬ培養を開始し、接種した根の材料の所望の量および／または品質が達成された後に、接種した根の材料を回収し、その一部を新たなＲＯＬ培養を設定するために用いることを含む。
【００５９】
その用語は、また、ここに記載されたように反応器中でＲＯＬを開始し（「初期ＲＯＬ培養」）、接種した根の材料の所望の量および／または品質が達成された後に、接種した根の材料の大部分を回収し、残留する根の材料を再度生長させることを含む。当業者は、回収後であっても初期ＲＯＬ培養における滅菌状態を保持するためにさらなる方策が必要であることを容易に認識するであろう。培養メディウムおよびサプリメントは、培養サイクルのいずれかの段階の間に添加されてもよい。
【００６０】
好適には、一実施形態において、ＲＯＬでのＡＭＦの培養は、１２−１６週の間に、メディウム１リットルあたりに少なくとも１００００００ＡＭＦ散布体が約１０００００００ＡＭＦ散布体の増殖率を達成し、従来技術の他の方法より効率的である。増殖率は、例えば、ＡＭＦ株に依存する。
【００６１】
＜ａ．開始＞
本発明の連続的ＲＯＬ培養方法は、ＡＭＦコロニー形成された根の材料の一部をＲＯＬ培養システムに移植することにより設定され得る。そのＡＭＦコロニー形成された根の材料は、ＲＯＣやＲＯＬ培養から得られてもよく、他のいずれかの適切な方法や培養から得られてもよい。当業者は、ＡＭＦコロニー形成された根の材料のＲＯＣを如何にして確立するかを承知している（概要について、フォルティンら（Fortin et al.）、２００２を参照）。根の材料は、最新技術により利用可能なプロトコルに従いＴ−ＤＮＡで形質転換されてもよい（米国特許第４，５９９，３１２参照）。
【００６２】
これに代えて、ＲＯＬ培養を設定するために用いたＡＭＦコロニー形成された根の材料は、「ストック培養」として機能する以前のＲＯＬ培養から得られてもよい。用語「ストック培養」は、一般的に、新たな培養を設定するために用いられるＡＭＦコロニー形成された根の材料をいう。
【００６３】
初期ＲＯＬ培養を設定するために用いられるＡＭＦコロニー形成された根の材料の量は、ＡＭＦ、根の材料、培養条件および／または所望の培養期間に関して変更され得ることが認識されるであろう。例えば、ＲＯＬは、およそ｛１−５ｇ（新鮮重）のＡＭＦコロニー形成された根の材料｝／｛培養メディウムの１Ｌ｝で確立され得る。しかしながら、例えば、適用した根の材料のコロニー形成率に依存して、より多いまたはより少ないＡＭＦコロニー形成された根の材料を用いることも可能である。
【００６４】
＜ｂ．維持＞
本発明は、ＲＯＬ培養条件下で、ＡＭＦコロニー形成された根の材料を大量生産するための方法を提供する。ここで用いられるように用語「培養条件」は、特定の培養パラメータに依存する全体的な培養状況をいう。培養条件が特定の培養パラメータに依存して変更されることが認識されるであろう。当業者は、培養パラメータおよび結果として培養条件が培養する段階および／または培養期間で変化してもよく、維持されてもよいことを認識するであろう。「培養期間」は、開始から、培養の継代および／または回収までの時間である。「培養する段階」は、培養期間中の期間である。
【００６５】
ここで用いられるように用語「培養パラメータ」は、制限されるものではないが、根の材料のタイプおよび／または量、ＡＭＦのタイプおよび／または量、齢、ＡＭＦコロニー形成された根の材料のコロニー形成率および／または量、メディウム組成、リン酸塩含量、アンモニウム含量、メディウム容量、培養時間、酸素含量、温度、光照射状況をいう。培養パラメータは、いずれかの培養する段階または全体の培養期間で変化してもよく、一定に維持されてもよい。
【００６６】
＜容量＞
本発明によるＲＯＬ培養は、液体培養メディウム中で維持される。液体メディウムの容量および組成は、他の培養パラメータに依存して変更され得る。本発明の連続的ＲＯＬ培養方法は、液体培養メディウムの所望の量を保持することができる適切な培養ベッセルのいずれかで行われ得る。本発明のＲＯＬ培養システムにおける液体培養メディウムの容量は、ラボラトリースケールの生産で好適には２００−４００ｍｌであるが、数リットルやヘクト（hecto、１００）リットルまたはそれ以上に容易にスケールアップすることができる。
【００６７】
ＲＯＬ培養は、一般に、適切ないずれかの培養フラスコ内で、接種した根の材料の生長を許容する程度の長さで行われ得るものであり、好適には滅菌状態が保持され得る。例えば、ガラスやプラスチック製等であってもよく、例えばエーレンマイヤフラスコが用いられ得る。また、細胞培養フラスコも本発明に従う使用が予想される。
【００６８】
＜メディウム組成＞
当業者は、本発明の方法に用いられるメディウムの組成が他の培養パラメータに依存して変更されてもよいことを認識する。
【００６９】
インビトロでＡＭＦを培養するために、通常、２つの培養メディウム；最少メディウム（Ｍ−メディウム）および改質ストルール・ロマンド（ＭＳＲ）メディウム；が用いられ、いずれも微量栄養素（micronutrients）および多量必要栄養素（macronutrients）ならびにビタミンおよびスクロースを含有しており、別の１つがいわゆるＧ−メディウムである。メディウムは、ＲＯＣのためにゲル化剤を用いることで典型的に固化されているものの、ゲル化剤を除くことでＲＯＬのために適切なメディウムとなり得る。その上、全てのメディウムは、さらなる改質を受けてもよい。このため、好適な一実施形態において、メディウムは、Ｍ−メディウムをベースとすることができる（ビカルドおよびフォルティン、１９８８）。別の好適な実施形態において、メディウムは、デクレルクら（Declerck et al.、１９９８）により改質されたストルールおよびロマンド（ＭＳＲ）メディウム（ストルールおよびロマンド、１９８６）をベースとしてもよく、さらに別の好適な実施形態において、メディウムは、改質されたムラシゲ・スクーク（Murashige, Skoog 、ＭＳ）をベースとしてもよい。さらに、上述した混合物や他の培養メディウムが適用され得ることが予想される。通常、ＭＳのような植物生長メディウムは、ＲＯＣおよびＲＯＬのために本発明者らによりうまく適合されてもよい。
【００７０】
良好にコロニー形成された根の材料の十分な量を得るために、ＲＯＬ培養に用いられる液体メディウムが、根の材料およびＡＭＦの生長をバランスさせるために、根の材料の維持および生長、ならびに、ＡＭＦコロニー形成されたその根の材料の維持および生長の両者を可能とすることが重要である。好適な一実施形態において、その液体培養メディウムは、そのため、その根の材料およびＡＭＦ材料の維持および生長のために適切である。
【００７１】
＜アンモニウム＞
著者らは、１８０μＭのアンモニウムを含有するものとして刊行されているものの（デクレルクら、１９９８）、ＭＳＲメディウムが僅か１８８ｎＭのアンモニウムを含有することを見出した。アンモニウム（ＮＨ４＋）は、アンモニウム硫酸塩（（ＮＨ４）２ＳＯ４）や塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）または他のいずれかのアンモニウムの塩の形態でメディウムに添加されてもよい。このため、本発明は、１８８ｎＭのアンモニウムよりむしろ約３００μＭのアンモニウムを含有する改質ＭＳＲメディウムも対象とする。そのメディウムは、アンモニウムおよび硫酸塩濃度における変化を除いて、表１に示されるような濃度でＭＳＲメディウムの成分を含有する。
【００７２】
特定の理論に束縛されることを望むことなく、アンモニウムの増加が本発明の手段および方法の確立における本発明者らの興味ある発見に実質的に貢献することが推測される。好適な一実施形態において、培養メディウムは、このため、培養するいずれかの段階中に２０ｍＭより少ない、例えば、１μＭおよび２ｍＭの間のアンモニウム、等のアンモニウムを含有する。
【００７３】
＜リン酸塩＞
ＭＳＲ−およびＭ−メディウムの両方は、リン酸２水素カリウム塩（ＫＨ２ＰＯ４）、リン酸水素２カリウム塩（Ｋ２ＨＰＯ４）または他のいずれかのリン酸塩の形態でメディウムに添加されてもよいリン酸塩を含有する。ＭＳＲ−メディウムおよびＭ−メディウム中の標準的なリン酸塩濃度は、３０μＭである。しかしながら、いくつかのＲＯＬサイクルの後に、ＡＭＦコロニー形成は、根の材料の過剰生長のために低くなる。ＲＯＬ培養のいくつかの継代後にＡＭＦコロニー形成における低下を回避するために、液体培養メディウムのリン酸塩含量を減少させてもよい。このため、好適な一実施形態において、液体培養メディウムは、培養するいずれかの段階中に３０μＭより少ないリン酸塩を含有する。例えば、液体培養メディウムは、２０、１０、７．５、５、２．５、１または０．５μＭのリン酸塩を含有してもよい。好適な一実施形態において、培養メディウムのリン酸塩含量は、３μＭである。さらに好適な実施形態において、液体培養メディウムは、０μＭのリン酸塩を含有する。リン酸塩の量は、ここに記載された手段および方法において重要な役割を果たすことが、本発明者らに見出された別の特徴である。
【００７４】
本発明者らは、ＡＭＦコロニー形成された根の材料の長期間の連続的ＲＯＬ培養の適用可能性に及ぼすリン酸含量の影響を発見した最初であった。驚いたことに、ＲＯＬは、液体メディウム中にリン酸塩が不存在でも長期間保存することができ、１０ヶ月またはそれ以上の後に根の材料およびＡＭＦが生きたままであり、新たな培養のための高度に効率的な開始材料として適切である。
【００７５】
＜抗生物質＞
さらに、抗生物質は、微生物のコンタミネーションを回避し、抑制するために液体培養メディウムに添加され得る。これは、汚染された培養が通常廃棄されるべきである従来のＲＯＣに対して大きな有利性である。抗生物質は、ＲＯＬ培養に容易に添加することができ、拡散や攪拌により培養メディウム全体に一様に分散させることができる。
【００７６】
適切な抗生物質は、伝統的なベータラクタム系抗生物質（ペニシリンと同じ、例えば、アンピシリン、アモキシシリン、カルベニシリン）、セファロスポリン様（例えば、セフォタキシム）のベータラクタム系抗生物質のサブグループ、テトラサイクリン、スルフォンアミド、マクロライド、キノロン、アミノグリコシド、ニトロフラン、または、グラム陰性および／またはグラム陽性の細菌に対して作用する抗生物質の他のいずれかのグループから選択され得る。好適な一実施形態において、液体培養メディウムは、このため、抗生物質を含有する。
【００７７】
一態様において、本発明は、培養する段階のいずれかの間に３０μＭより少ないリン酸塩および／または２０ｍＭより少ないアンモニウムを含有する培養メディウムに関する。選択的に、その培養メディウムは、抗生物質および／または植物ホルモンおよび／またはビタミンをさらに含む。その培養メディウムは、ＭＳＲメディウム、Ｍ−メディウム、ＭＳ−メディウムやＧ−メディウム、または、ＡＭＦおよび根の材料の両者の生長のために適切な他のいずれかのメディウムをベースとしてもよい。
【００７８】
＜フラボノイド＞
液体培養メディウムにフラボノイドを添加することがさらに予想される。理論的に結びつけられることを望むものではないが、フラボノイドが根の材料の生長を刺激することが考えられる。ここで用いられる用語「フラボノイド」は、植物二次代謝産物の部類をいうものであり、フラボノイド、イソフラボノイドおよびネオフラボノイドを含む。本発明に従い用いられる代表的なフラボノイドは、制限されるものではないが、フラボン、フラボノール（３−ヒドロキシフラボン）、フラバノン、フラバノノール（３−ヒドロキシフラバノン、２，３−ジヒドロフラボノール）を含む。好適なフラボノイドは、欧州特許ＥＰ０４５６８０８に記載されている。
【００７９】
フラボノイドは、植物から抽出され得る。本発明の範囲において、ＲＯＬ培養の液体培養メディウムにフラボノイドを含む植物抽出物を添加することが予想される。しかしながら、その抽出物は、他の化合物、例えば付加的な二次植物代謝産物をも含んでいる。本発明に従う使用のために好適な代表的な植物抽出物の一例は、レッドクローバ（red clover、アカツメクサ）抽出物である。しかしながら、他の植物抽出物も予想される。
【００８０】
＜温度＞
本発明のＲＯＬ培養方法は、約１０℃から３０℃またはそれ以上の広範囲の温度で維持され得る。好適な一実施形態において、ＲＯＬ培養は、２５−２８℃、より好適には２７℃に維持される。
【００８１】
＜照明＞
培養は、光照射下でも暗所でも行い得る。適切な光照射条件を選ぶことは、典型的には、選択した根の材料に依存する。例えば、切り離された根の器官が宿主として選ばれるとすれば、ＲＯＬは、暗所にて好適に行われてもよい。光合成的に活性な全植物体が宿主として選ばれるとすれば、ＲＯＬは、光照射下で好適に行われてもよい。
【００８２】
＜振盪＞
本発明によるＲＯＬ培養は、栄養分の分散および／またはガス交換を促進するために、一定の、または、周期的な僅かな振盪を行ってもよい。振盪する回数は、０から６０ｒｐｍまでの範囲とすることができる。好適な実施形態において、ＲＯＬ培養は、３０ｒｐｍで一定の振盪を行う。さらに別の好適な実施形態において、ＲＯＬ培養は、振盪および／または攪拌および／または通気を行わない。好適には、振盪、攪拌や通気が行われなければ、ＲＯＬ培養は、液体の容積に対する表面の比（liquid-surface-to-volume-ratio）が高いこと、および／または、拡散により単に、例えば僅かな温度の差異／変動による多少の対流としばしば並行にガスを交換するガス浸透性の蓋（lid）；を許容する培養ベッセル中で行われる。別の好適な実施形態において、ＲＯＬは、完全に密閉されたプラスチック製培養ベッセル中に維持される。
【００８３】
＜時間＞
培養条件に依存して、ＲＯＬ培養は、変動する期間で維持され得る。ＡＭＦコロニー形成された根の材料は、ＲＯＬ培養に１０ヶ月またはそれ以上保たれてもよく、それでもコロニー形成された根およびＡＭＦ材料を生きたまま得ることができる。しかしながら、所望であれば、ＲＯＬ培養サイクルは、十分な量のＡＭＦコロニー形成された根の材料が得られ次第、回収するおよび／または継代するステップで中断されてもよい。好適な一実施形態において、回収するおよび／または継代するステップは、ＲＯＬ培養開始後の８週で行われる。別の好適な実施形態において、そのステップは、１２週後に行われ、別の一つでは１６週である。しかしながら、必要とされる時間は、培養されるＡＭＦ種に依存し、培養パラメータに依存する。
【００８４】
＜ｃ．継代＞
本発明の方法は、継代するステップをさらに含んでもよい。ここで用いられる用語「継代する（passaging）」は、ＡＭＦコロニー形成された根の材料の一部を新たなＲＯＬ培養システムに移植するプロセスをいう。
【００８５】
本発明のいくつかの好適な実施形態において、継代するステップは、以下に記載される回収するステップと並行して行われてもよい。本発明の他の好適な実施形態において、継代するステップは、以下に記載される回収するステップの前または後に行われてもよい。継代するステップは、連続的ＲＯＬ培養の次のＲＯＬサイクルの結果となる不確定の回数繰り返されてもよい。
【００８６】
継代に用いられるＡＭＦコロニー形成された根の材料の量は、培養条件および／または目的とした処理に依存して変動してもよい。好適な一実施形態において、ＲＯＬは、およそ｛１−５ｇ（新鮮重）のＡＭＦコロニー形成された根の材料｝／｛培養メディウムの１Ｌ｝で確立される。しかしながら、例えば、コロニー形成率に依存して、より多いまたはより少ないＡＭＦコロニー形成された根の材料を用いてもよい。例えば、培養は、０．１グラム（新鮮重）より少なくても効率的に確立され得るものであり、高度なコロニー形成率を確保する条件（例えば、低リン酸塩含量や十分に長い培養サイクル）下ですでに培養された材料が提供され得る。
【００８７】
ＡＭＦコロニー形成された根の材料のその後の継代のコロニー形成率は、ＲＯＣを設定するために継代しようとするＡＭＦコロニー形成された根の材料の一部を用いることでモニタされ得るものであり、接種後の所定時間で、顕著にコロニー形成された菌類の区画を有するＲＯＣプレートの割合を評価することでＲＯＣ成功率を測定する。異なるＲＯＬ条件での最適化実験は、典型的に、ＲＯＬ培養の６週後にすでに少なくとも３０−６０％のＲＯＣ成功率の結果となった。高コロニー形成効率に対する生長条件（低リン酸塩含量やより長期の培養サイクル）の調整に依存して、成功したＲＯＬサイクルから得られるＡＭＦコロニー形成された根の材料は、典型的に、５０−１００％のＲＯＣ成功率の結果となるであろう。ストック材料の培養開始材としての使用のために、０．２ｇより少ない接種源を用いたときでさえも、９ヶ月以上培養したストック培養ＲＯＬを単に用いることで、１００％成功率は、達成され得る。
【００８８】
＜ｅ．回収および接種源調製＞
好適な一実施形態において、本発明によるＲＯＬ培養は、ＡＭＦコロニー形成された根の材料を液体培養メディウム中において十分な時間的期間で培養し、ＡＭＦコロニー形成された根の材料の少なくとも一部を回収することで行われ得る。当業者は、ＡＭＦコロニー形成された根の材料を回収する前に経過させる十分な時間的期間がＡＭＦコロニー形成された根の材料の量、コロニー形成率、胞子形成率、用いたＡＭＦ種、培養パラメータおよび／または目的とした処理や他のパラメータに依存して変動しうることを承知している。ここで用いられる用語「少なくとも一部を回収する」は、ＡＭＦコロニー形成された根の材料の少なくとも一部または全てを回収することを意味する。回収は、さらなる処理に依存して、滅菌条件下または非滅菌条件下で行われてもよい。本発明のいくつかの実施形態において、ＡＭＦコロニー形成された根の材料は、８週後またはそれ以降、例えば９、１０、１１、１２週またはさらにそれ以降に、接種源調製のために回収されてもよい。
【００８９】
回収に続いて、菌根は、目的とする使用のために適切な形態に処理されてもよい。接種源として使用するために、ＡＭＦコロニー形成された根は、所望サイズの断片に単純に切断され、乾燥させ、１グラムあたりのＡＭＦ散布体の所望濃度を達成するために所望のキャリア材料と混合される。
【００９０】
従って、本発明は、一態様において、ＡＭＦ材料を生産する方法に関し、液体培養メディウム中で根の材料を連続的に培養することを含み、その根の材料がインビトロで分枝二次根系を構築することが可能であり、アーバスキュラ菌根菌類によりコロニー形成される。また、そのＡＭＦによりコロニー形成されたその根の材料の少なくとも一部を回収するステップを含む。さらに、その回収したコロニー形成された根の材料の少なくとも一部を新たな培養メディウムに継代するステップが含有されてもよい。回収したコロニー形成された根の材料の少なくとも一部は、接種源として用いられ得る。継代するステップは、回収するステップに先行してもよい。さらに、適用可能な実施形態はここに記載されている。
【００９１】
ＲＯＬのために、および、ＲＯＣのためにここに記載されたステップの全ては、滅菌条件下で行われてもよく、微生物での望まれないコンタミネーションが減少されること、好ましくは回避されることを意味している。接種源の調製のために、滅菌状態での取扱いが特に好適であり、それによりコンタミネーションのないＡＭＦ接種源が得られる。「コンタミネーションのない」は、望まれない微生物が基本的に存在しないかまたは存在しない状態をいう。
【００９２】
別の態様において、本発明は、また、ここに提示されたような方法により、滅菌条件下で生産されたコンタミネーションのないＡＭＦ接種源組成物に関し、粒子サイズが３０μｍまでの範囲の散布体を含み、根の材料の乾燥質量１グラムあたりに１０６ＡＭＦ散布体を超えるまでの散布体密度である。
【００９３】
別の態様において、本発明は、散布体を含む組成物に関し、その組成物が好適にはゲランガム、寒天培養基（agar-agar）等のような多糖類キャリアおよび／または多糖類マトリックスがフリーである。そのような組成物は、液体形態、乾燥形態または固体形態のいずれであってもよい。そのような組成物は、粒子サイズが３０μｍまでの範囲の散布体を含んでもよく、根の材料の乾燥質量１グラムあたりに１０６ＡＭＦ散布体を超えるまでの散布体密度である。そのような組成物は、フラボノイドを含んでもよい。
【００９４】
＜ｆ．ＲＯＬベースのＲＯＣ＞
ＲＯＬ培養から得られたＡＭＦコロニー形成された根の材料は、新たなＲＯＬ培養を確立するために用いられてもよいが、しかしながら、付加的にまたは排他的に、新たなＲＯＣを設定するために用いられてもよい（以下、ＲＯＬベースのＲＯＣともいう）。ＲＯＣシステムは、スプリットプレートのＲＯＣであってもよい。さらに、ＲＯＬにより得られる滅菌の材料は、開放系における固体基質での伝統的な生産用の開始接種源として用いられてもよい。
【００９５】
＜培養条件＞
ここで用いられる用語「ＲＯＣ」または「根の器官培養」は、固化させた培養メディウムでのＡＭＦコロニー形成された根の材料のインビトロ培養の方法をいう。「ＲＯＬベースのＲＯＣ」は、ここに記載されたように、先行するＲＯＬ培養から得られたＡＭＦコロニー形成された根の材料で開始されたＲＯＣである。他方、「ＲＯＣベースのＲＯＣ」は、先行するＲＯＣから得られたＡＭＦコロニー形成された根の材料で開始されたＲＯＣをいう。「スプリットプレートＲＯＣ」は、好適には、（ＡＭＦコロニー形成された）根の器官の生長に適した区画（「根の区画」）と、ＡＭＦ増殖に適した区画（「菌類の区画」）とを含む２部分または多数部分のペトリディッシュで行われる。
【００９６】
＜培養メディウム＞
ＲＯＣ培養メディウムは、ＲＯＬ培養について上述したようなＭ−メディウムやＭＳＲメディウムに基づいている。しかしながら、本発明の知見により記載された改質メディウムも好適であり、ＲＯＬベースのＲＯＣのためにさらに進化した多くの変形がある。
【００９７】
＜ゲル化剤＞
好適な実施形態において、ＲＯＣの両区画での培養メディウムは、ゲル化剤により固化される。そのゲル化剤は、ゲランガム、寒天培養基、アガロースのような多糖類または他のいずれかの適切なゲル化剤のグループから選択されてもよい。本発明者らは、菌類の区画におけるゲル化剤の濃度がその菌類の区画での好結果のコロニー形成に著しく影響することを見出しており、従来法と比べて低下させることがある。本発明の好適な実施形態において、ゲル化剤は、菌類の区画のメディウム中に０．３％（ｗ／ｖ）以下の濃度で存在し、好適には０．２５％、０．２％、０．１５％の濃度であり、最も好適には０．１％または０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度である。０．１％および０．０５％の間のゲル化剤の濃度は、より急速なＡＭＦ菌糸の生長を可能とし、それにより菌類の区画のコロニー形成時間を短縮する。より急速なコロニー形成はより同期した進展で生じ、低濃度のゲル化剤はＲＯＬベースのＲＯＣを回収するために記載されたように菌類の区画からのＡＭＦ材料の回収を容易にすることができる。
【００９８】
＜スクロース濃度＞
さらに好適な実施形態において、ＲＯＣ培養メディウムは、根の区画にスクロースが添加される。好適には、根の区画でのスクロースの濃度は、５％以下である。より好適には、根の区画でのスクロース濃度は、３％および０．５％（ｗ／ｖ）の間の範囲である。
【００９９】
＜温度および光照射＞
スプリットプレートＲＯＣは、好適には暗所にてインキュベートされるが、光照射下で培養されてもよい。スプリットプレートＲＯＣの温度は、好適には、２０℃から３０℃までの範囲であり、最も好適には２５℃から２７℃までの範囲である。
【０１００】
＜開始＞
先行するＲＯＬ培養からの新たなＲＯＣを設定するために、十分な量のＡＭＦコロニー形成された根の材料がここに記載されたようなＲＯＣシステムに移植される。好適な一実施形態において、ＲＯＬ培養から得られ、新たなＲＯＣを設定するために用いられるＡＭＦコロニー形成された根の材料の量は、０．１未満から５ｇを超えるまで（新鮮重）の範囲であり、好適には０．１から０．３ｇ（新鮮重）である。ＲＯＬ培養からのＡＭＦコロニー形成された根の材料は、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２週後またはそれ以降、好適には６−１２週後に新たなＲＯＣを設定するために用いられてもよい。しかしながら、ＡＭＦコロニー形成された根の材料は、十分な量の材料が所望する数のＲＯＣを確立するために十分であればいつでも、新たなＲＯＣを設定するために用いられてもよい。培養条件に依存して、ＡＭＦコロニー形成された根の材料は、１０ヶ月以上ＲＯＬ培養に保たれてもよく、それでも新たなＲＯＣを設定するために用いることができる。
【０１０１】
＜回収＞
本発明者らは、先に示したような低ゲル化剤濃度を用いるＲＯＣがスプリットプレートの菌類の区画からプレートの外へまたは他の培養ベッセルに単純に流し出すことにより純粋な菌類材料の急速な抽出を可能とすることを見出した。その結果のゲルは、１または２倍体積の滅菌脱イオン水と単純に混合し振盪することによりさらに液化し、それにより菌類の区画の固化したメディウムを溶解させるために、ゲル化剤の標準的な濃度の０．３％（ｗ／ｖ）で通常行われるような、１０ｍＭクエン酸バッファ（ｐＨ６）の使用を不要とする。そして、菌類材料は、即座に、容易に回収され得るものであり、また、例えば０．０５−０．１％のゲランガムを含有するゲルでのときに１０，０００ｇで５分から１０分の遠心分離により、または、２０μｍのナイロン製ふるいによる減圧濾過により、濃縮される。
【０１０２】
＜処理＞
ＲＯＬベースのＲＯＣから得られたＡＭＦコロニー形成された根の材料は、ｍＲＮＡ抽出、生化学的調査もしくは植物の接種または他の目的のために用いられてもよい。一時点で設定された全てのＲＯＣのコロニー形成された菌類の区画を有するスプリットプレートの割合が培養を設定するために用いられた根の材料のコロニー形成率に対応するため（ＲＯＣ成功率、ＲＳＲ）、ＲＯＣ菌類の区画の進展を（ＲＳＲとして）モニタすることは、破壊的なサンプリングや染色ベースの分析を要することなく、根の材料のコロニー形成率での信頼できる結論を許容する。
【０１０３】
ＲＯＬベースのＲＯＣから得られたＡＭＦコロニー形成された根の材料は、新たなＲＯＣまたはＲＯＬ培養を設定するためにさらに用いられ得る。
【０１０４】
ここに記載されたように、ＲＯＬ培養からのＡＭＦコロニー形成された根の材料がＲＯＬベースのＲＯＣの開始のために用いられたときは、新たなＲＯＣまたはＲＯＬ培養は、所望の菌類の段階（stage）に依存して、ＲＯＬベースのＲＯＣの開始後の約４−８週またはそれ以上に設定され得る。「所望の菌類の段階」は、例えば胞子形成段階または他のいずれかの段階であってもよい。６−１２週またはそれ以上の後に、ＡＭＦ材料が回収され得る。これらの時間範囲は、別個のＡＭＦ種の異なる生長速度、培養パラメータの差違および他のファクタに依存して変化してもよい。本発明のいくつかの実施形態において、（接種に用いられる少量から新たな培養の高度に効率的な確立のためにストック培養として用いられるような）長期の培養期間は、接種源の生産、例えば農業の応用のために急速な大量生産の戦略に有利である。標準的なスプリットプレートＲＯＣあたりで回収されるリゾファガス・イレグラリスのＡＭＦバイオマスは、８週後のプレートあたりでおよそ８０−１２０ｍｇ新鮮重の範囲であり、培養パラメータに依存して、スプリットプレートの菌類の区画あたりで約１０，０００胞子に対応する菌糸状の菌糸体を含有する。
【０１０５】
ＲＯＬベースのＲＯＣは、所望のＡＭＦ材料やＡＭＦコロニー形成された根の材料を得るために要求される時間を著しく短縮するため、従来のＲＯＣベースのＲＯＣと比べて大きな利点を生じる。ＲＯＣベースのＲＯＣは、ＡＭＦコロニー形成された根の材料が新たなＲＯＣ接種のために少量で効率的に用いられ得るまでに、１２週以上の培養を要し、そのためＲＯＬベースのＲＯＣがより短時間を要する。本発明の好適な一実施形態において、ＲＯＬベースのＲＯＣは、ＡＭＦコロニー形成された根の材料が新たなＲＯＣを効率的に接種するために用いられ得るまでに、僅か６−８週を要する。さらに、ＡＭＦ胞子が回収され得る前にＲＯＣベースのＲＯＣが約１２−２０週のより長期間培養されなければならないため、ＲＯＬベースのＲＯＣは、回収までの時間を短縮することができる。本発明の別の好適な実施形態において、ＲＯＬベースのＲＯＣからの菌類材料は、全体で６−１０週後に回収され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
本発明は、以下の制限されない実施例および添付した図面によりさらに例証される。
【図１】新しく接種したペトリディッシュ（ＲＯＣ）および接種後１週間のエーレンマイヤフラスコ（ＲＯＬ）の写真をそれぞれ示す。約０．１５グラムの菌根化した根の材料をスプリットプレートの接種に用い（根の区画および菌類の区画のそれぞれに２０ｍｌのメディウム）、約１．５グラムをエーレンマイヤフラスコの接種に用いた（４００ｍｌのメディウム）。
【図２】ＲＯＬベースのＲＯＣを生産するための１つの実験的設定のタイムスケールを示す。実線は低−Ｐ（３μＭ）ＲＯＬを示し、波線はＲＯＣを示す。ＲＯＬ培養した材料を新たなＲＯＬの設定（それぞれ１．５ｇ）および同時に新たなＲＯＣの設定（それぞれ０．１５ｇ）に用いた。矢印は、開始期間（ここでは：１４週、ＲＯＣが８週培養されたとき）後の、週毎のＲＯＣ回収の時点を示す。
【図３】菌根化率およびＲＯＣ成功率（ＲＳＲ）の比較を示す。異なる生長段階の３つのＲＯＣ（異なるグレーの濃淡）で、メチルブルー染色による根のコロニー形成％の直接的推定または新たなＲＯＣの接種による間接的推定のいずれか、および、８週後のＲＳＲの推定を行った。マザーカルチャ（mother culture）の菌根化％は新しく接種したＲＯＣの成功率に対応しており、このためＲＳＲがマザーカルチャの菌根化を推定するために用いられ得る。
【図４】異なるリン酸塩濃度でのＲＯＬにおける菌根のチコリの根のバイオマス生産を示す。根の１．５グラム（新鮮重）を、３０μＭリン酸塩（高−Ｐ、黒菱形）、３μＭリン酸塩（低−Ｐ、黒三角形）およびリン酸塩なし（ｎｏ−Ｐ、黒四角形）のメディウムに接種した。増加した新鮮重を２週毎に計測した。５つの根系（高−Ｐおよび低−Ｐについて）または３つの根系（ｎｏ−Ｐについて）の平均新鮮重および標準偏差（エラーバー）を示した。
【図５】高−Ｐおよび低−ＰのＲＯＬの比較を示す。高リン酸塩（３０μＭ）の９つのＲＯＬフラスコおよび低リン酸塩含量（３μＭ）の９つのフラスコ、ならびに、リン酸塩なしの３つのフラスコで約８週生長させ、それぞれのフラスコから１０の新たなＲＯＣの接種に用いた。ＲＳＲを８週後に測定した（０．１５ｇのＲＯＬ材料で開始した）。ｎｏ−ｐフラスコを高−Ｐおよび低−ＰのＲＯＬより３回長く培養したことに留意する。エラーバーは標準偏差を示す。
【図６】連続的ＲＯＬサイクルの安定性を示す（それぞれ６週間について）。低−ＰのＲＯＬを１、２、３、４または５ラウンドについてＲＯＬから直接インキュベートした。根系の半分をＲＳＲを推定するために用いた（８週後）。棒状部は、８週後の９回の繰り返し（それぞれ１０プレート）の平均ＲＳＲを示す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図７】ＲＯＣ成功率（ＲＳＲ）へのゲランガム（菌類の区画における）およびスクロース（根の区画における）の濃度の影響を示す。ＲＯＬで８週生長させた根をスプリットプレートＲＯＣでの接種源として用いた。菌類の区画が０．１％または０．０５％のいずれかのゲランガムを含有し、根の区画（０．３％ゲランガム）が０．５％または１．０％のいずれかのスクロースを含有する。３５日後、６０日後にＲＳＲを推定した。棒状部は、３５日後（濃いグレー）および６０日後（淡いグレー）で、それぞれ６０プレートの３回の繰り返しの平均を示す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図８】ｍＭＳＲメディウム中での根の器官液体培養（ＲＯＬ）における強力な菌根および菌糸体形成および大量のＡＭ菌類の胞子形成を示す。異なるリンや他の栄養素およびバッファの実質組成を有するいくつかの他のメディウム組成についても首尾よくテストした。ＡＭ菌類は、５５日後に既に大量の胞子を形成しており、ＲＯＣ法を用いたときと比べてより速くより強力であった。９３日後に、細胞壁が厚くなり黒くなることにより、胞子が成熟し暗色となった（ほとんどの生存性を損なうことなく、根を切り刻み、乾燥させ保存することにより効率的に処理され得る状態）。図８のＡ−Ｃは、培養設定後５５日でのＡＭＦコロニー形成された根の材料を示す；嚢状体を根内でより明確にするための側方の照明（脂質含有量のために白っぽい外観）。図８のＡ−Ｃは、培養設定後９３日でのＡＭＦコロニー形成された根の材料Ｄ−Ｅを示す。
【図９】ガス交換用のフィルタ付き蓋を有し、液体培養メディウム（１０％強度のＭＳ）の２００ｍｌで満たした標準的な細胞培養フラスコを示す。培養では動かすことなく（振盪なし）インキュベートした。３ヶ月後、高度な分枝根系が進展し（Ａ）、ＡＭ菌類の胞子が形成された。５ヶ月後に、ＡＭ菌類は、大量に胞子形成した（Ｂ）。
【図１０】ガス交換用のフィルタ付き蓋を有し、液体培養メディウム（１０％強度のＭＳ）の２００ｍｌで満たした標準的な細胞培養フラスコにおける５ヶ月後のＲＯＬ培養の結果を示す。培養では動かすことなく（振盪なし）インキュベートした。ミキサでの混合後に胞子をふるいにより回収した。根のフラグメントを染色し、顕微鏡で散布体数（コロニー形成された根のフラグメント）を定量した。平均で１リットルあたりに３０００００を超える胞子、７０００００を超える感染性散布体が回収された（合計：およそ１０２５４００散布体、５つのＲＯＬからの平均）。
【実施例】
【０１０７】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を説明するために記載されている。以下の実施例に開示された技術が本発明の実施において十分に機能するために本発明者らにより明らかにされた技術を表すことが当業者により認識されるべきであり、このため、その実施のための特定の形態を構成すると考えられ得る。しかしながら、当業者は、本発明の開示を考慮すれば、開示された特定の実施形態において多くの変更がなされ得るものであり、それでも本発明の意図および範囲を逸脱することなく同様の類似した結果が得られることを認識すべきである。
【０１０８】
＜実施例１：生物学的材料および根の器官培養（ＲＯＣ）＞
リゾファガス・イレグラリスＭＵＣＬ４３１９４（ＤＡＯＭ１８１６０２と同じ、ＤＡＯＭ１９７１９８と同じ）、バイオシステマティック  リサーチ  センタ、オタワ、カナダ（Biosystematic Research Center, Ottawa, Canada）（チャボットら（Chabot et al.）１９９２）を、アグロバクテリウム・リゾゲネスのＲｉ−Ｔ−ＤＮＡで形質転換したチコリ（チコリウム・インティブス）の根とともに、スプリットプレート（２区画のペトリディッシュ、図１Ａ）中の改質したストルールおよびロマンド（ＭＳＲ）のメディウム（ストルールおよびロマンド、１９８６、デクレルクらにより改質、１９９８）上で、インビトロでの根の器官培養で培養した（ＲＯＣ、図１Ａ）。コロニー形成された根を断片に切断し、それらを新たなプレート中の糖含有の根の区画に移植することで、ＲＯＣを維持した（フォルティンら、２００２）。
【０１０９】
＜実施例２：初期の根の器官液体培養（ＲＯＬ）＞
スプリットプレート培養からのチコリの根の約１．５ｇを５００ｍｌ容エーレンマイヤフラスコ中の液体培養メディウム４００ｍｌに接種することにより、初期ＲＯＬを確立した。定速（３０ｒｐｍ）でゆっくり振盪しながら暗所にて室温（約２２℃）で培養をインキュベートした（図１Ｂ）。
【０１１０】
＜実施例３：培養方法の開発＞
ＭＳＲメディウムが、１８０μＭを含有するものとして報告されているものの（デクレルクら、１９９８）、僅か１８８ｎＭのアンモニウムを含有するものなので、インビトロでの初期培養の確立後、用いた全てのＲＯＣおよびＲＯＬメディウムに３００μＭの硫酸アンモニウムを追加した（ｍＭＳＲメディウムと同じ）。スプリットプレートの根の区画において、２つの異なるスクロース濃度、０．５％（ｗ／ｖ）および１％（ｗ／ｖ）をテストした。固化のために、根の区画に０．３％（ｗ／ｖ）のゲランガム（ゲルライト（Gelrite、登録商標）、ロス、カールスルーエ）を用い、（異なる濃度をテストした後に）菌類の区画に０．１％または０．０５％（ｗ／ｖ）とした。スプリットプレートを暗所にて２７℃でインキュベートした。
【０１１１】
＜実施例４：根の器官液体培養でのバイオマス生産＞
ｍＭＳＲメディウムで行う以外は実施例２に記載されたように、ＲＯＬを確立した。
【０１１２】
ＲＯＬにおけるバイオマス生産を、０、２、４、６、８および１２週後に滅菌条件下で根を計量し、根の新鮮重を推定することにより計測した（図２）。
【０１１３】
＜実施例５：散布体増殖率の測定＞
メチルブルー染色した（グレースおよびストリブレイ、１９９１のプロトコルに従う）後に、線交差法(マクゴニグルら、１９９０)により顕微鏡的にＲＯＬからの根の菌類コロニー形成を調査した。
【０１１４】
菌類増殖能力を測定するために、一時点で根の材料を接種した全ＲＯＣのコロニー形成された菌類の区画を有するスプリットプレートの割合を測定した（ＲＯＣ成功率、ＲＳＲ）。菌糸体を有していないかまたは僅かであるスプリットプレートをネガティブとカウントする一方、緊密に生長した菌糸体ネットワークを有するスプリットプレートをポジティブとカウントした。ＲＯＬのバッチから３つの培養をランダムに選択した。それぞれのＲＯＬから、約０．２ｇの根の材料をそれぞれ１０の新たなスプリットプレートに接種するために２ｇの根の材料を用い、根長のコロニー形成（root-length colonization）を計測するために根の残りの部分の２ｇを染色した。
【０１１５】
液体培養における菌類の根のコロニー形成と、それぞれのＲＯＬの結果であるＲＯＣのＲＳＲとが互いに対応することが観察された。例えば、３つのサンプルでのコロニー形成率が２３％、１５％および４％であり、新しく確立したスプリットプレートのＲＳＲがそれぞれ８週後に７０％、３０％および２０％であった（図３）。
【０１１６】
ＲＳＲは、一方では根の長さのコロニー形成についての情報をもたらし、他方では成功したＲＯＣの異なる割合の結果となる異なる条件の可能性についての情報をもたらすことをその知見が示しており、それゆえ、根のコロニー形成のパーセンテージおよびマザーカルチャの活力の計測として用いられ得る。
【０１１７】
＜実施例６：リン酸塩濃度＞
伝統的なインビトロ培養に用いられるメディウムの通常適用される標準的なリン酸塩含量を変えることによりＲＯＬにおける根のコロニー形成を改善することができるかについて調査するために、リン酸２水素カリウムの異なる濃度をテストした：３０μＭのリン酸２水素カリウム（標準的濃度、「高−Ｐ」）、３μＭ（「低−Ｐ」）、および、いくつかのＲＯＬではリン酸塩を添加せずに設定した（「ｎｏ−Ｐ」）。菌類の増殖率について連続的ＲＯＬをテストするために、ＲＯＬを６週毎に回収し、根の材料を分割した。半分（約１．５ｇ）を新たなＲＯＬを設定するために用い、他の半分をそれぞれ約０．１５ｇの根の材料を有する１０のスプリットプレートＲＯＣを設定するために用いた。８週後、十分にコロニー形成された菌類の区画の割合（ＲＳＲ）を測定した。低−ＰのＲＯＬにおける菌類のコロニー形成が数世代後に低下しないこと（高−ＰのＲＯＬで見られたように、前述）を検証するために、ＲＯＬサイクルを５回繰り返した。
【０１１８】
初期ＲＯＬテストの５から６の連続したサイクル後に、新たなＲＯＬを開始するために用いた約１．５ｇの根の材料で、ＲＯＣ成功率の顕著な低下が生じており、ＲＯＬにおけるチコリの根のコロニー形成が培養の期間中に低下することを示している。液体ＭＳＲメディウム中でのチコリの根が非常に急速に生長するため、菌類の生長が効率的な根のコロニー形成のために遅すぎるようである。根の生長および菌類のコロニー形成率がバランスされるかについて、リン酸塩濃度を減少させることによりテストした。３０μＭ（高−Ｐ）を含有する５つのフラスコ、３μＭ（低−Ｐ）を含有する５つのフラスコ、および、０μＭ（ｎｏ−Ｐ）のリン酸２水素カリウムを含有する３つのフラスコに、１．５ｇの根の材料を接種し、暗所にて１２週間インキュベートした。根のバイオマスを２週毎に計測した。低−Ｐ濃度では、根の生長が顕著に減少し；４−６週後に新たな根の材料の１．５−２ｇを産生しており、根のバイオマスが約４週で倍加することを意味している（図４）。
【０１１９】
図４に示された結果に基づいて、本発明者らは、新たな９つの高−Ｐおよび９つの低−ＰメディウムのＲＯＬならびにｎｏ−Ｐメディウムでの３つのＲＯＬを設定するために、６週齢のＲＯＬからの根の材料を用いることを決定した。６週後、高−および低−ＰのＲＯＬを回収し、１０のスプリットプレートＲＯＣにそれぞれ接種するために用いた。３つのｎｏ−ＰのＲＯＬを６ヶ月後に回収した。接種後８週でＲＯＣ成功率を推定した。低−ＰのＲＯＬからの材料を接種したＲＯＣでは、高−ＰのＲＯＬからの材料を接種したプレートと比較して、ＲＳＲが３倍を超えて増加した（図５）。３つのｎｏ−ＰのＲＯＬからの材料では、１００％のＲＳＲが得られており、根が６ヶ月後でも生存し活性であること、および、ＡＭＦにより極めて良好にコロニー形成されることを一貫して示している。
【０１２０】
＜実施例７：連続的な根の器官液体培養＞
実施例２に記載されたようにＲＯＬを確立した。
【０１２１】
連続的ＲＯＬの初期の試みのために、培養を回収した（それぞれ８−９ｇ）。そして、約１．５ｇの部分を新たな液体培養を設定するために用い、それぞれ約０．２ｇを約４０のスプリットプレートＲＯＣを設定するために用いた。ＲＯＬの数サイクル後に、新たなＲＯＣの設定用にＲＯＬ材料を用いた後にＡＭＦコロニー形成されたスプリットプレートの少ない数により説明されるように、根のコロニー形成が低くなることがわかった。
【０１２２】
低−ＰのＲＯＬが６週の培養サイクルにおいて菌類の根のコロニー形成を損なうことなく新たなＲＯＬを連続的に接種するために用いることができるかについて調査するために、低−Ｐメディウムを有する９つのフラスコに、低−ＰのＲＯＬ根の材料を接種し、６週間生長させた。新たなＲＯＬ用の接種源として１．５ｇの根の材料（フラスコ中の根の材料の約半分）を常に用いることで、これを連続的に繰り返した。他の半分を、８週後にＲＳＲを測定するための１０のＲＯＣを開始するために用いた。図６に示されるように、６週のＲＯＬシステムが４４−６５％の安定なＲＯＣ成功率の結果となる。
【０１２３】
＜実施例８：菌類の根のコロニー形成およびＲＳＲにおけるスクロースおよびゲランガム濃度の効果＞
菌類の区画におけるゲランガム濃度が菌類の区画の十分なコロニー形成に著しく影響することを示すことができた。より低濃度では（０．０５％および０．１％ｗ／ｖ）６０日後に４０−７０％の菌類の区画でコロニー形成されたものの、通常用いられるゲランガム濃度０．３％（ｗ／ｖ）では６０日後に僅か２０％のＲＳＲの結果であった（示されていない）。０．０５％または０．１％のゲランガムと１．０％のスクロースとの組み合わせで最良の結果が得られており（図７）、これをさらなる実験および生産のために選択した。さらに、一般的には、０．３％ゲランガムのプレートから根の材料を回収することはより難しく、根にコンタミネーションを受けさせることなく菌類の区画からメディウムを単純に流れ出させることができないためである（根がしばしばスプリットプレートの境界を横切る；材料がかろうじて流れ出すことができるのであれば、根が根系に接続されたままであり、それらが区画の境界を横切っても菌類材料をコンタミネートすることはない。）。
【０１２４】
根の区画では、根の区画における０．０５％ゲランガムを有する６０のスプリットプレートでのテストがより高いＲＳＲの結果とならず、より低いゲランガム濃度が根のコンタミネーションを伴うことなく菌類の区画を回収することを許容しないため、標準的濃度の０．３％ゲランガムを用いている。しかしながら、根および菌類の区画がともに回収されるとすれば、培養を低濃度で設定することができる。
【０１２５】
＜実施例９：標準的な細胞培養用懸濁フラスコでのスケーラブルＲＯＬ培養＞
実施例２に記載されたようにＲＯＬを確立した（図８）。
【０１２６】
リゾファガス・イレグラリスＭＵＣＬ４３１９４（ＤＡＯＭ１８１６０２と同じ、ＤＡＯＭ１９７１９８と同じ）を実施例７に記載されたようにＲＯＬで培養した。これらのＲＯＬからのアグロバクテリウム・リゾゲネスのＲｉ−Ｔ−ＤＮＡで形質転換したチコリ（チコリウム・インティブス）の根を、滅菌したブレンダでおよそ０．５−１ｃｍ長の小フラグメントに切り出した。
【０１２７】
ＲＯＬ培養からブレンドしたチコリの根の約１ｇを、ガス交換用のフィルタ付き蓋を有し、液体培養メディウム（１０％強度のＭＳメディウム、イソフラボノイド含有植物抽出物を追加した）の２００ｍｌで満たした標準的な細胞培養フラスコに接種するために用いた。培養を比較的低温の約２３℃で暗所にて、動かすことなく（振盪なし）インキュベートした。３ヶ月後に、高度な分枝根系が進展し、ＡＭ菌類が形成されており、５ヶ月後に、ＡＭ菌類が大量の胞子を形成した（図１０）。
【０１２８】
ＲＯＬからの材料を小さい根のフラグメントにブレンドし、胞子をふるいにより回収した。根のフラグメントを、メチルブルーで染色した（グレースおよびストリブレイ、１９９１のプロトコルに従う）後に、線交差法（マクゴニグルら、１９９０）によるコロニー形成されたＡＭ菌類の顕微鏡的分析用に染色した。さらに、ブレンドした根の分画の散布体数（コロニー形成された根のフラグメント）についても、顕微鏡的に定量した。冷たい培養温度にもかかわらず、平均で、１リットルあたりに３０００００を超える胞子、７０００００を超える感染性散布体が回収され（図１１）、根の長さの５３％を超えてＡＭ菌類でコロニー形成された。個々の根のフラグメントは、４０を超えるまでの菌類の嚢状体を産出した。約１０％の根のフラグメントは、５を超える嚢状体を産出しており、このため、根をより小さいフラグメントにブレンドすることで、散布体数をさらに増加させるであろう。推定された活性な散布体数は、１リットルあたりに１０６散布体を超えた。
【０１２９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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