(57)【要約】本開示は、生理活性因子が富化された条件培地（ＣＭ）、その組成物および当該ＣＭを製造する方法に関する。条件培地中に所望される量の生理活性因子を得る方法は、骨髄由来間葉系間質／幹細胞をプールし、プールされた細胞を培養し、細胞培養を、特定の培養密度で細胞供給スケジュールに供し、特定の継代数／期間に、生理活性因子が豊富な強力な条件培地を収集することからなる。方法は、さらに、生物学的差異が少なく生物学的機能／特性を有する多数の生理活性因子を含む条件培地を生成する確率を最大化することを目的とする。本開示はまた、条件培地の組成物および製剤、ならびに美容および治療の領域におけるそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系間質細胞により分泌される生理活性因子を含む条件培地を調製する方法であって、以下の行為：
ａ．間葉系細胞を細胞培養培地中で培養し、その後、細胞を増殖させて収集すること；ならびに
ｂ．収集した細胞を、以下のプロセス：
ａ．流加回分活性化；
ｂ．流加回分活性化およびその後の完全培地交換；または
ｃ．完全培地交換；またはこれらの任意の組み合わせ、
に供して、前記条件培地を得ること
を含む、前記方法。
【請求項２】
間葉系細胞が、間葉系間質細胞または間葉系幹細胞またはそれらの組み合わせであり；ここで、前記間葉系細胞が骨髄由来間葉系細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
個々のドナーから間葉系細胞を単離し、プールして、プールされた間葉系細胞を得る、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
間葉系細胞を、第４継代培養物として、約１０００細胞／ｃｍ２〜約１０，０００細胞／ｃｍ２、好ましくは約１０００細胞／ｃｍ２の播種密度で播種して増殖させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細胞を、約５０％の培養密度まで増殖させ、培地交換に供し、さらに約８０％〜約９０％の培養密度まで培養する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
細胞をさらに、第５継代培養物として、約１０００細胞／ｃｍ２〜約１０，０００細胞／ｃｍ２、好ましくは約１０００細胞／ｃｍ２の播種密度で播種し、約４５％〜約５０％の培養密度まで増殖させる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
流加回分活性化が、以下の行為：
ａ．約４５％〜約５０％の培養密度まで増殖させた第５継代細胞に、約５００ｍｌの細胞培養培地を添加すること；ならびに
ｂ．前記細胞を約８０％〜約９０％の培養密度まで培養し、条件培地を収集すること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
流加回分活性化およびその後の完全培地交換が、以下の行為：
ａ．約４５％〜約５０％の培養密度まで増殖させた第５継代細胞に、約５００ｍｌの細胞培養培地を添加すること；
ｂ．前記細胞を約６５％〜約７０％の培養密度まで培養し、該細胞を、２Ｌの細胞培養培地を添加することによる完全培地交換に供すること；ならびに
ｃ．前記細胞を約８０％〜約９０％の培養密度まで培養し、条件培地を収集すること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
細胞培養培地の完全交換が、以下の行為：
ａ．約４５％〜約５０％の培養密度まで増殖させた第５継代細胞を、１．５Ｌの細胞培養培地を添加することによる完全培地交換に供すること；ならびに
ｂ．前記細胞を約８０％〜約９０％の培養密度まで培養し、条件培地を収集すること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
条件培地が、約１ｋＤａ以上または約３ｋＤａ以上の分子量カットオフを用いる限外濾過または接線流濾過により濃縮および富化され；ならびにここで、濃縮の後で、Ｌ−アルギニンおよびＬ−グルタミン酸またはそれらの組み合わせを含む群から選択されるアミノ酸を、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で、任意に前記条件培地に添加する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
任意に、３つのプロセスの各々から得られた条件培地をプールすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
細胞培養培地が、ダルベッコ改変イーグル培地−Knock Out、ダルベッコ改変イーグル培地−F12、ダルベッコ改変イーグル培地−低グルコース、当該分野において公知の他の基本培地もしくは無血清培地もしくは無異物培地、ウシ胎仔血清、Ｌ−アラニン−Ｌ−グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシン、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される成分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞培養培地が、生理活性因子の分泌を増強するために、塩基性線維芽細胞増殖因子を約１ｎｇ／ｍＬ〜約１０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２ｎｇ／ｍＬの濃度で含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
流加回分活性化により得られた条件培地は、Ａｎｇ−１が富化されており；流加回分活性化およびその後の完全培地交換により得られた条件培地は、ＴＧＦ−ｂが富化されており；および、完全培地交換により得られた条件培地は、ＶＥＧＦおよびＰＧＥ−２が富化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
間葉系細胞により分泌される生理活性因子を含む条件培地を調製する方法であって、以下の行為：
ａ．間葉系細胞を細胞培養培地中で培養し、その後、細胞を増殖させて収集すること；ならびに
ｂ．収集した細胞を、流加回分活性化およびその後の完全培地交換のプロセスに供して、前記条件培地を得ること
を含む、前記方法。
【請求項１６】
間葉系細胞が、間葉系間質細胞または間葉系幹細胞またはそれらの組み合わせであり；ここで、前記間葉系細胞が骨髄由来間葉系細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
個々のドナーから間葉系細胞を単離し、プールして、プールされた間葉系細胞を得る、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
流加回分活性化およびその後の完全培地交換が、以下の行為：
ａ．約４５％〜約５０％の培養密度まで増殖させた第５継代細胞に、約５００ｍｌの細胞培養培地を添加すること；
ｂ．前記細胞を約６５％〜約７０％の培養密度まで培養し、該細胞を、２Ｌの細胞培養培地を添加することによる完全培地交換に供すること；ならびに
ｃ．前記細胞を約８０％〜約９０％の培養密度まで培養し、条件培地を収集すること
を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
間葉系細胞により分泌される生理活性因子を含む、条件培地。
【請求項２０】
生理活性因子が、生物学的に活性な増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗酸化剤、低分子、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、および生物学的プロセスを機能させるかまたは生物学的プロセスを媒介することが知られている他の因子を含み、前記生物学的プロセスが、細胞増殖および細胞遊走を含む、請求項１９に記載の条件培地。
【請求項２１】
生理活性因子が、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−ｂ、ＰＧＥ−２、ＰＤＧＦ、ＧＤＮＦ、ＩＧＦＢＰ、ＦＧＦ、ＧＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、アンギオゲニン、アンギオポエチン、ＫＧＦ、ＦＧＦ７、ＢＭＰ６、ＩＧＦ１、ラミニン、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＨＧＦ、ＳＤＦ１−ＬＩＦ、ＩＬ−１０またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；ならびに、条件培地が、任意に、Ｌ−アルギニンおよびＬ−グルタミン酸またはそれらの組み合わせを含む群から選択されるアミノ酸を約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で含む、請求項２０に記載の条件培地。
【請求項２２】
ＶＥＧＦの濃度が約２〜約１０ｎｇ／ｍＬの範囲である、請求項２１に記載の条件培地。
【請求項２３】
ＴＧＦ−ｂの濃度が約１〜約５ｎｇ／ｍＬの範囲である、請求項２１に記載の条件培地。
【請求項２４】
ＰＧＥ−２の濃度が約０．８〜約２ｎｇ／ｍＬの範囲である、請求項２１に記載の条件培地。
【請求項２５】
アンギオポエチン１の濃度が約１０〜約１２ｎｇ／ｍＬの範囲である、請求項２１に記載の条件培地。
【請求項２６】
ＨＧＦの濃度が約２０〜約２００ｎｇ／ｍｌの範囲である、請求項２１に記載の条件培地。
【請求項２７】
ＳＤＦ１の濃度が約０．４〜約３ｎｇ／ｍｌの範囲である、請求項２１に記載の条件培地。
【請求項２８】
ＩＬ−１０の濃度が約１０〜約５０ｎｇ／ｍｌの範囲である、請求項２１に記載の条件培地。
【請求項２９】
請求項１９に記載の条件培地を、薬学的に許容可能な賦形剤と共に含む、組成物。
【請求項３０】
賦形剤が、添加物、キャリア、造粒剤、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、甘味剤、流動促進剤、粘着防止剤、帯電防止剤、界面活性剤、抗酸化剤、ゴム、コーティング剤、着色剤、香味剤、コーティング剤、可塑化剤、保存剤、懸濁剤、乳化剤、植物セルロース由来材料および球状化剤またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
賦形剤が、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カーボポール、ＥＤＴＡ、メチルパラベン、プロピルパラベン、脱イオン水、グリセリン、ＤＬ−パンテノール、Ｄ−パンテノール、フェノキシエタノール、アラントイン、ＰＥＧ、精製水、キサンタンガム、ＰＣＡナトリウム、グルコノラクトン、ナトリウムベンゾアート、水酸化ナトリウム、フェノキシエタノール、エチルヘキシルグリセリン、ナトリウムポリアクリラート、カプリル酸またはカプリン酸トリグリセリド、ミネラルオイル、トリ（ＰＰＧ−３ミリスチルエーテル）シトラート、ソルビタンラウラート、トリデセス−６、ＰＥＧ−７５ラノリン、ベータグルカン、ナトリウムヒアルロナート、ホスファチジルコリン、コレステロール、エッセンシャルオイル、ＤＬ−α−トコフェロールアセタートおよびシクロデキストリンまたはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
油性懸濁液、ハイドロゲル、ナノゲル、ウェットティッシュ、軟膏、貼付剤、ゲル、ローション、セラム、エマルジョン、クリーム、スプレー、滴下剤、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される投与形態に処方される、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３３】
請求項１９に記載の条件培地またはその製剤を、それを必要とする対象に投与する行為を含む、皮膚に関連する状態を管理する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本開示は、プールされた骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ  ＭＳＣ）から生理活性因子が豊富な条件培地（ＣＭ）を得る方法に関する。本発明の方法は、個々のドナーからの細胞により分泌される増殖因子およびサイトカインのレベルの固有の差異を複数のドナーからプールされた細胞を使用して正規化することにより、および、特定された培養密度（confluency）における細胞供給スケジュールを提供することにより、所望される増殖因子およびサイトカインのより高い収率を保証する。本開示はさらに、美容および治療の領域における適用のための、条件培地の製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
間葉系幹細胞は、治療／美容の分野において、皮膚の状態および創傷治癒を含む多様な適応症について、多くの関心を得てきた。ＭＳＣが組織の修復に関与する機構は、主に栄養因子の分泌を通してのものである。ＭＳＣは、広範な増殖因子、サイトカインおよびケモカインの、それらのセクレトームを通しての分泌を通して、必要とされる微小環境を提供する。ＭＳＣセクレトームは、再生医療における、およびまた美容上の適用における、処置モダリティーの新たなアプローチを提供する。増殖因子、サイトカインおよびケモカインは、細胞が連絡し合うためのツールとして役立ち、それらの分子は、条件培地（ＣＭ）、または培養細胞から収集される使用済み（spent）培地から追跡することができる（Shohara et al., 2012）。最近では、多様な細胞ベースの治療のためのCMの置換による多くの前臨床研究が行われている（Walter et al., 2010）。全てのこれらの研究は、セクレトームの分野についての多大な希望をもたらしている。
【０００３】
さらに、骨髄由来間葉系幹細胞、ヒト胚性幹細胞、羊膜由来多能性細胞などからのサイトカインおよび増殖因子が豊富な条件培地を得るためのプロセス、ならびに、創傷治癒、発毛、瘢痕軽減および他の皮膚科学的障害に関連する治療用途におけるその使用は、当該分野において公知である。しかし、特定のサイトカイン／増殖因子または特定のサイトカイン／増殖因子の組み合わせを最適な量において必要とする特定の治療用途のための、所望される型および量のサイトカイン／増殖因子を含む条件培地を製造することについての必要性が存在する。したがって、本開示は、当該分野において現在不足しているかかる必要性に取り組むことを目的とする。
【発明の概要】
【０００４】
開示の記載
したがって、本開示は、以下に関する：間葉系間質細胞により分泌される生理活性因子を含む条件培地を調製する方法であって、以下の行為：ａ．間葉系細胞を、細胞培養培地中で培養し、その後、細胞を増殖させて収集すること；ならびに、ｂ．収集した細胞を、以下のプロセス：ａ．流加回分活性化（fed batch activation）；ｂ．流加回分活性化およびその後の完全培地交換；またはｃ．完全培地交換；またはこれらの任意の組み合わせに供して、前記条件培地を得ること、を含む、前記方法；間葉系細胞により分泌される生理活性因子を含む条件培地を調製する方法であって、以下の行為：ａ．間葉系細胞を細胞培養培地中で培養し、その後、細胞を増殖させて収集すること；ならびに、ｂ．収集した細胞を流加回分活性化およびその後の完全培地交換のプロセスに供して前記条件培地を得ること、を含む、前記方法；間葉系細胞により分泌される生理活性因子を含む条件培地；薬学的に許容可能な賦形剤および添加物と共に条件培地を含む組成物；ならびに、皮膚に関連する状態を管理する方法であって、それを必要とする対象に条件培地またはその製剤を投与する行為を含む、前記方法。
【０００５】
添付の図面の簡単な説明
本開示を容易に理解し、実際の効果をもたらすことを可能にするために、ここで、例示的な態様を参照し、これは添付の図面への参照により説明される。図面は、以下の詳細な説明と共に、明細書に組み込まれ、その一部を形成し、本開示に従って、態様をさらに説明し、多様な原理および利点を説明するために役立ち、ここで：
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、３個体のドナーの間でのＶＥＧＦ分泌の差異ならびにプールおよび培養の後でのその正規化を示す。
【図２】図２は、プールされた骨髄由来間葉系間質／幹細胞からの条件培地を加えた細胞培養培地中の、多様なサイトカインおよび増殖因子の発現のレベルを示す。推定のために、ＥＬＩＳＡおよびLuminex（登録商標）ベースのアッセイを用いた多重分析を用いる。
【０００７】
【図３】図３は、３つの異なるプロセスにより培養された多能性間葉系間質／幹細胞から分泌される生理活性因子の比較を示す。（ａ）ＶＥＧＦ；（ｂ）ＰＧＥ  ２；（ｃ）ＴＧＦ−ベータ−１および（ｄ）アンギオポエチン１。
【図４】図４は、プロセス２により生成された３つの異なるバッチからの条件培地中の（ａ）ＶＥＧＦ、（ｂ）ＴＧＦベータ１および（ｃ）ＰＧＥ−２のレベルを示す。
【図５】図５（ａ）は、条件培地中の生理活性因子の保持が増強されることを、ＴＦＦ技術による濃縮後のＶＥＧＦのレベルにより示されるものとして、分子カットオフ＞３ｋＤａおよび＞１ｋＤａを用いて示す。（ｂ）は、ヒト臍帯静脈内皮細胞を用いるトランスウェル遊走アッセイにより、ＶＥＧＦの機能性を示す。
【０００８】
【図６】図６は、Ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ｔｂＯＨ）で処置されたヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）に対するＣＭの抗老化効果を示す。（ａ）は、ｔｂＯＨで損傷を受け、１０×ＣＭにより５％、１０％および５０％の投与量で処置された細胞におけるコラーゲンの回復を示す。（ｂ）は、ｔｂＯＨで損傷を受け、１０×ＣＭにより１０％および５０％の用量で処置されたＨＦＦ−１細胞におけるエラスチンレベルの、それぞれの１０×対照培地と比較した回復を示す；（ｃ）は、ｔｂＯＨで損傷を受け、１０×ＣＭにより５％および１０％の用量で処置されたＨＦＦ−１細胞におけるヒアルロン酸（ＨＡ）レベルの、それぞれの１０×対照培地と比較した回復を示す；（ｄ）は、ｔｂＯＨで損傷を受け、１０×ＣＭにより５％および１０％の用量で処置されたＨＦＦ−１細胞におけるサイクリンＢ１レベルの、それぞれの１０×対照培地と比較した増大を示す。
【０００９】
【図７】図７は、皮膚線維芽細胞における酸化的損傷により引き起こされるコラーゲン分解に対する、１０×ＣＭの前処置の保護的効果の評価を示す。
【図８】図８は、５つの希釈率の条件培地中のＨＦＦ細胞の増殖能力の、対照培地との比較分析を表すグラフに関する。
【図９ａ】図９ａは、１０×ＣＭによるＨＦＦ−１細胞の処置の際の、正の皮膚再生効果の指標である顕著な線維芽細胞遊走を示す。
【図９ｂ】図９ｂは、正の皮膚再生効果の指標であるＨＦＦ−１細胞の遊走に対する、１０×対照および１０×ＣＭの効果を示す。データポイントは、３組の値の平均値±標準誤差として示す。
【００１０】
【図１０】図１０は、ヒト皮膚線維芽細胞におけるＴｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドにより誘導される酸化ストレスに対する、１０×ＣＭの細胞保護／生存率回復効果を示す。データポイントは、３組の値の平均値±標準誤差として示す。
【図１１】図１１は、ＵＶ照射に供され、１０×ＣＭにより１０％および５０％の用量で処置されたヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ−１細胞）に対するＣＭの抗しわ効果を、それぞれの対照培地と比較して示す。（ａ）は、エラスチンレベルの回復を示す。；（ｂ）は、カスパーゼ３活性化の低下を示す；（ｃ）は、ＤＮＡ損傷に対する保護の程度を示す。
【００１１】
【図１２】図１２は、皮膚線維芽細胞における酸化ストレスにより誘導されるアポトーシスに対する、１０×ＣＭの抗アポトーシス効果の評価を示す。
【図１３】図１３は、全ての製剤を用いての、皮膚水和度レベルの平均コルネオメーター（corneometer）読み取り値のグラフ表示を示す。
【図１４】図１４は、全ての製剤を用いての、紅斑指数の平均メグザメーター（mexameter）読み取り値のグラフ表示を示す。
【００１２】
【図１５ａ】図１５ａは、照射されていない動物（対照群−Ｇ１）の第１日における画像を示し、ここで、皮膚表面は、滑らかかつ平坦である。
【図１５ｂ】図１５ｂは、未処置の動物（対照群−Ｇ１）の第４日における画像を示し、可視可能な肉眼的変化（発赤、腫脹、しわ）は観察されなかった。
【図１５ｃ】図１５ｃは、未処置の動物（対照群−Ｇ１）の第６日における画像を示し、可視可能な肉眼的変化（発赤、腫脹、しわ）は観察されなかった。
【図１５ｄ】図１５ｄは、未処置の動物（対照群−Ｇ１）の第８日における画像を示し、可視可能な肉眼的変化（発赤、腫脹、しわ）は観察されなかった。
【００１３】
【図１６ａ】図１６ａは、ＵＶＢを照射された動物（Ｇ２）の第１日における画像を示し、ここで可視可能な肉眼的変化は観察されなかった。
【図１６ｂ】図１６ｂは、ＵＶＢを照射された動物（Ｇ２）の第４日における画像を示し、ＵＶ−Ｂに暴露された群の動物において、顕著なしわおよび落屑の誘導が観察された。
【図１６ｃ】図１６ｃは、ＵＶＢを照射された動物（Ｇ２）の第６日における画像を示し、ＵＶ−Ｂに暴露された群の動物において、相当なしわ、可視可能なしわの出現、くすみ（dullness）、荒れ（roughness）および落屑が観察された。
【図１６ｄ】図１６ｄは、ＵＶＢを照射された動物（Ｇ２）の第８日における画像を示し、ＵＶ−Ｂに暴露された群の動物において、重度のしわおよび落屑が観察された。
【００１４】
【図１７ａ】図１７ａは、製剤１で処置された動物（Ｇ５）の第１日における画像を示し、ここで可視可能な肉眼的変化は観察されなかった。
【図１７ｂ】図１７ｂは、製剤１で処置された動物（Ｇ５）の第４日における画像を示す。
【図１７ｃ】図１７ｃは、製剤１で処置された動物（Ｇ５）の第６日における画像を示す。
【図１７ｄ】図１７ｄは、製剤１で処置された動物（Ｇ５）の第８日における画像を示す。
【００１５】
【図１８ａ】図１８ａは、製剤３で処置された動物（Ｇ６）の第１日における画像を示し、ここで可視可能な肉眼的変化は観察されなかった。
【図１８ｂ】図１８ｂは、製剤３で処置された動物（Ｇ６）の第４日における画像を示す。
【図１８ｃ】図１８ｃは、製剤３で処置された動物（Ｇ６）の第６日における画像を示す。
【図１８ｄ】図１８ｄは、製剤３で処置された動物（−Ｇ６）の第８日における画像を示す。
【図１９ａ−ｂ】図１９ａおよび１９ｂは、それぞれプールされた骨髄およびワルトン膠様質由来の間葉系幹細胞から生成された条件培地中のＶＥＧＦおよびＴＧＦ−βの比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
詳細な説明
本開示は、間葉系間質細胞により分泌される生理活性因子を含む条件培地を調製する方法に関し、該方法は、以下の行為を含む：
ａ．間葉系細胞を細胞培養培地中で培養し、その後、細胞を増殖させて収集すること；および
ｂ．収集した細胞を、以下のプロセス：
ａ．流加回分活性化；
ｂ．流加回分活性化およびその後の完全培地交換；または
ｃ．完全培地交換；またはこれらの任意の組み合わせ、
に供して、前記条件培地を得ること。
【００１７】
本開示の一態様において、間葉系細胞は、間葉系間質細胞または間葉系幹細胞またはそれらの組み合わせであり；およびここで、間葉系細胞は骨髄由来間葉系細胞である。
本開示の別の態様において、個々のドナーから間葉系細胞を単離し、プールして、プールされた間葉系細胞を得る。
本開示の別の態様において、間葉系細胞を、第４継代培養物として、約１０００細胞／ｃｍ２〜約１００００細胞／ｃｍ２、好ましくは約１０００細胞／ｃｍ２の播種密度で播種して増殖させる；
【００１８】
本開示の別の態様において、細胞を、約５０％の培養密度まで増殖させ、培地交換に供し、さらに約８０％〜約９０％の培養密度まで培養する。
本開示のさらに別の態様において、幹細胞を、さらに、第５継代培養物として、約１０００細胞／ｃｍ２〜約１００００細胞／ｃｍ２、好ましくは約１０００細胞／ｃｍ２の播種密度で播種し、約４５％〜約５０％の培養密度まで増殖させる。
【００１９】
本開示のさらに別の態様において、流加回分活性化は、以下の行為を含む：
ａ．約４５％〜約５０％の培養密度まで増殖させた第５継代細胞に、５００ｍｌの細胞培養培地を添加すること；および
ｂ．細胞を約８０％〜約９０％の培養密度まで培養し、条件培地を収集すること。
【００２０】
本開示のさらに別の態様において、流加回分活性化およびその後の細胞培養培地の交換は、以下の行為を含む：
ａ．約４５％〜約５０％の培養密度まで増殖させた第５継代細胞に、５００ｍｌの細胞培養培地を添加すること；
ｂ．細胞を約６５％〜約７０％の培養密度まで培養すること、および細胞を２Ｌの細胞培養培地の完全交換に供すること；ならびに
ｃ．細胞を約８０％〜約９０％の培養密度まで培養し、条件培地を収集すること。
【００２１】
本開示のなお別の態様において、細胞培養培地の完全交換は、以下の行為を含む：
ａ．約４５％〜約５０％の培養密度まで増殖させた第５継代細胞を、約１．５Ｌの細胞培養培地の完全交換に供すること；ならびに
ｂ．細胞を約８０％〜約９０％の培養密度まで培養し、条件培地を収集すること。
【００２２】
本開示のなお別の態様において、条件培地を、約１ｋＤａ以上または約３ｋＤａ以上の分子量カットオフを用いる限外濾過または接線流濾過により、濃縮（concentrate）および富化（enrich）し；およびここで濃縮の後で、任意に、Ｌ−アルギニンおよびＬ−グルタミン酸またはそれらの組み合わせを含む群から選択されるアミノ酸を、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で、条件培地に添加する。
本開示のなお別の態様において、方法は、任意に、３つのプロセスの各々から得られた条件培地をプールすることを含む。
【００２３】
本開示のなお別の態様において、細胞培養培地は、ダルベッコ改変イーグル培地−KnockOut、ダルベッコ改変イーグル培地−F12、ダルベッコ改変イーグル培地−低グルコース、ウシ胎仔血清、Ｌ−アラニン−Ｌ−グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシン、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される成分を含む。
本開示のなお別の態様において、細胞培養培地は、生理活性因子の分泌を増強するために、塩基性線維芽細胞増殖因子を、約１ｎｇ／ｍＬ〜約１０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２ｎｇ／ｍＬの濃度で含む。
【００２４】
本開示のなお別の態様において、流加回分活性化により得られた条件培地を、Ａｎｇ−１について富化し；ここで、流加回分活性化およびその後の細胞培養培地の交換により得られた条件培地を、ＴＧＦ−βについて富化し；およびここで、細胞培養培地の交換により得られた条件培地を、ＶＥＧＦおよびＰＧＥ−２について富化する。
【００２５】
本開示は、間葉系細胞により分泌される生理活性因子を含む条件培地を調製する方法に関し、該方法は、以下の行為を含む：
ａ．間葉系細胞を細胞培養培地中で培養し、その後、細胞を増殖させて収集すること；および
ｂ．収集した細胞を、流加回分活性化およびその後の完全培地交換のプロセスに供して、前記条件培地を得ること。
【００２６】
本開示の一態様において、間葉系細胞は、間葉系間質細胞または間葉系幹細胞またはそれらの組み合わせであり；およびここで、間葉系細胞は骨髄由来間葉系細胞である。
本開示の別の態様において、個々のドナーから間葉系細胞を単離し、プールして、プールされた間葉系細胞を得る。
【００２７】
本開示のさらに別の態様において、流加回分活性化およびその後の完全培地交換は、以下の行為を含む：
ａ．約４５％〜約５０％の培養密度まで増殖させた第５継代細胞に、５００ｍｌの細胞培養培地を添加すること；
ｂ．細胞を約６５％〜約７０％の培養密度まで培養すること、および細胞を２Ｌの細胞培養培地を添加することによる完全培地交換に供すること；ならびに
ｃ．細胞を約８０％〜約９０％の培養密度まで培養し、条件培地を収集すること。
【００２８】
本開示は、間葉系細胞により分泌される生理活性因子を含む条件培地に関する。生理活性因子は、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗酸化剤および生物学的プロセスを機能させるかまたはこれを媒介することが知られている他の因子を含み、ここで、生物学的プロセスは、細胞増殖および細胞遊走を含む。
【００２９】
本開示の別の態様において、生理活性因子は、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−ｂ、ＰＧＥ−２、ＰＤＧＦ、ＧＤＮＦ、ＩＧＦＢＰ、ＦＧＦ、ＧＣＳＦ  Ｍ−ＣＳＦ、アンギオゲニン、アンギオポエチン、ＫＧＦ、ＦＧＦ７、ＢＭＰ６、ＩＧＦ１、ラミニン、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＴＩＭＰ１およびＴＩＭＰ２、ＨＧＦ、ＳＤＦ１およびＬＩＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１０またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；およびここで、条件培地は、任意に、Ｌ−アルギニンおよびＬ−グルタミン酸またはそれらの組み合わせを含む群から選択されるアミノ酸を、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で含む。
【００３０】
本開示の別の態様において、ＶＥＧＦの濃度は、約２〜約１０ｎｇ／ｍＬの範囲である。
本開示のさらに別の態様において、ＴＧＦ−ｂの濃度は、約１〜約５ｎｇ／ｍＬの範囲である。
本開示のさらに別の態様において、ＰＧＥ−２の濃度は、約０．８〜約２ｎｇ／ｍＬの範囲である。
【００３１】
本開示のさらに別の態様において、アンギオポエチン１の濃度は、約１０〜約１２ｎｇ／ｍＬの範囲である。
本開示のさらに別の態様において、ＨＧＦの濃度は、約２０〜約２００ｎｇ／ｍｌの範囲である。
【００３２】
本開示のさらに別の態様において、ＳＤＦ１の濃度は、約０．４〜約３ｎｇ／ｍｌの範囲である。
本開示のさらに別の態様において、ＩＬ−１０の濃度は、約１０〜約５０ｎｇ／ｍｌの範囲である。
【００３３】
本開示は、条件培地を、薬学的に許容可能な賦形剤または美容的に許容可能なキャリアと共に含む、組成物に関する。
本開示の一態様において、賦形剤は、添加物、キャリア、造粒剤、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、甘味剤、流動促進剤、粘着防止剤、帯電防止剤、界面活性剤、抗酸化剤、ゴム、コーティング剤、着色剤、香味剤、コーティング剤、可塑化剤、保存剤、懸濁剤、乳化剤、植物セルロース由来材料および球状化剤（spheronization agent）またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される。
【００３４】
本開示の別の態様において、賦形剤は、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カーボポール（Carbopol）、ＥＤＴＡ、メチルパラベン、プロピルパラベン、脱イオン水、グリセリン、ＤＬ−パンテノール、Ｄ−パンテノール、フェノキシエタノール、アラントイン、ＰＥＧ、精製水、キサンタンガム、ナトリウムＰＣＡ、グルコノラクトン、ナトリウムベンゾアート、水酸化ナトリウム、フェノキシエタノール、エチルヘキシルグリセリン、ナトリウムポリアクリラート、カプリル酸またはカプリン酸トリグリセリド、ミネラルオイル、トリ（ＰＰＧ−３ミリスチルエーテル）シトラート、ソルビタンラウラート、トリデセス（Trideceth）−６、ＰＥＧ−７５ラノリン、ベータグルカン、ナトリウムヒアルロナート、ホスファチジルコリン、コレステロール、エッセンシャルオイル、Ｄ酢酸Ｌ−α−トコフェロールおよびシクロデキストリンまたはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される。
【００３５】
本開示のさらに別の態様において、組成物は、油性懸濁液、ハイドロゲル、ナノゲル、ウェットティッシュ、軟膏、貼付剤、ゲル、ローション、セラム、エマルジョン、クリーム、スプレー、滴下剤（drops）、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される投与形態に処方される。
本開示は、皮膚に関連する状態を管理する方法に関し、該方法は、条件培地またはその製剤をそれを必要とする対象に投与する行為を含む。
【００３６】
本開示の一態様において、間葉系間質細胞とは、多能性間葉系幹細胞を指し、前記用語は、交換可能に用いることができる。
一態様において、用語「皮膚」とは、本開示全体にわたり、完全な器官としての皮膚、またはその任意の成分もしくはバリアント、例えば外側の被覆物、外側のコーティング、真皮（cutis）、真皮（derma）、真皮（dermis）、表皮（epidermis）、外皮（integument）、皮（peel）、生皮（pelt）、鞘および表面を意味するように用いられる。さらに用語「皮膚の状態」とは、しわ（wrinkle）、しわ（frown lines）、瘢痕、ひだ、たるみ、年齢によるしみ（age spot）、不均等な色素沈着、菲薄化、弾性、瘢痕、皮膚の荒れおよび乾燥、毛穴の開きなどの皮膚の状態、および他の皮膚の状態を含む。
【００３７】
本開示の一態様において、「完全培地交換」とは、使用済みの培地の除去、および細胞に新たな細胞培養培地を供給することを指す。
本開示の一態様において、用語、多能性幹細胞は、間葉系間質細胞, 骨髄、脂肪組織、ワルトン膠様質、歯髄および他の既知のソースに由来する間葉系幹細胞を含む。
本開示の一態様において、用語、キャリアは、医薬用キャリア、美容的に許容可能なキャリアおよび皮膚科学的に許容可能なキャリアなどを含む。用語、キャリアは、本願において言及される場合、活性成分（ＣＭ）の皮膚への局所的な投与のために用いられる賦形剤またはビヒクルを意味する。
【００３８】
本開示の一態様において、条件培地（ＣＭ）または使用済み培地とは、幹細胞により分泌される多様な異なる型の生物学的に活性な因子（これらは本明細書において以下、生理活性因子として合わせて言及される）が豊富な培地を指す。用語「生理活性因子」は、生物学的に活性な増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗酸化剤、低分子、ＥＣＭ、および生物学的プロセス（例えば細胞増殖、細胞接着、分化、炎症性応答、細胞遊走および他の生物学的機能など）を機能させるかまたはこれを媒介することが知られている他の因子からなる。条件培地は、細胞が分裂期にあり、生理活性因子の産生が最大である培養密度である、培養の８０〜９０％の培養密度（１０〜１４日間）において収集された細胞培養から得られる。
【００３９】
本開示は、骨髄由来多能性間葉系幹細胞／間質細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）に由来する条件培地／使用済み培地中での生理活性因子の最終的なアベイラビリティーを増強するための、およびまた任意の生物学的差異を減少させるための、効率的な方法を提供する。方法は、生物学的差異を減少させるために、複数のドナーからの前記ＢＭ−ＭＳＣをプールすることを含む。間葉系細胞をプールすることにより、特定の生物学的機能／特性を有する多数の生理活性因子を提示する条件培地を生成する確率が最大化され、また、プールされている選択された個体のうちの１個体により分泌されない／より低いレベルで分泌される生物学的因子が代償される。プールされた生物学的差異が低い細胞を、次いで細胞培養培地中で培養し、特定の培養密度において選択的な細胞供給スケジュール／培地交換プロセスに供し、培養された間葉系間質細胞から条件培地を分離することにより、生理活性因子の細胞の分泌および収集を増強する。
【００４０】
一態様において、個々のドナーから得られたＣＭにおいて一般的に観察される生物学的差異および全体的な不均一性を減少させるために、間葉系間質細胞をプールする。プールすることにより、皮膚の健康を改善するために美容的適用のために用いることができる生理活性因子の産生がもたらされる。
本開示の別の態様において、条件培地は、無血清および無異物（xeno free）条件において生成される。細胞増殖のために用いられる細胞培養培地はまた、幹細胞を培養および維持するために用いられる無血清および無異物培地を含む。
【００４１】
別の態様において、全ての生理活性因子が豊富なＣＭの最大量を得るために、プールされたＭＳＣを、特定の培養密度において特定の供給サイクルに供する。
さらに別の態様において、生理活性因子が豊富なＣＭを、公知の技術を用いて収集し、濃縮した。濃縮プロセスは、皮膚の健康に有益な必要とされる全ての生理活性因子を保持するために、特定の分子量カットオフを用いることを含む。
さらに別の態様において、ＣＭを、当該分野において一般に公知の方法により、精製し、滅菌する。
【００４２】
さらに別の態様において、ＣＭを、多様な美容的適用のための皮膚への局所投与のために、処方する。
さらに別の態様において、ＣＭを、しわ（wrinkle）、しわ（frown lines）、瘢痕、ひだ、たるみ、年齢によるしみ、不均等な色素沈着、菲薄化、弾性、瘢痕、皮膚の荒れおよび乾燥、毛穴の開きなどの皮膚の状態、および他の皮膚の状態を改善するために用いる。
【００４３】
本開示の一態様において、複数のドナーからのＢＭ−ＭＳＣを培養およびプールする方法は、先に知られており、簡単には以下の通りである：
ａ）第１継代において凍結保存された個々のドナーからの細胞を、水槽中で３７℃で融解する
ｂ）凍結培地中の細胞を、（１：９の比）における９部の細胞培養培地を用いて復活させ、その後、試料を約１２００〜１５００ｒｐｍで１０〜２０分間室温で遠心分離する。
ｃ）上清を破棄し、ペレットを細胞培養培地で再懸濁し、細胞を計数する。
ｄ）全ドナーからの細胞を等しい割合において混合し、その後、細胞を計数し、生存率をチェックして、生細胞を、第２継代のために、限定されないが培養フラスコ、セルスタックなどを含む細胞培養容器中に、約１０００細胞／ｃｍ２の播種密度で播種する。培養容器を、約３７℃で５％のＣＯ２インキュベーターに移す。
ｅ）プールされた細胞を、さらにＰ３に継代し、将来の使用のために凍結保存する。
ｆ）第３継代（Ｐ３）において得られたプールされたＭＳＣを、融解して、以下の例において説明されるように、さらに条件培地を得るために増殖させる。
【００４４】
本開示の一態様において、本願の技術を、以下の例および図面の補助により、さらに詳述する。しかし、例は、本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
例１
この例は、個々の骨髄由来間葉系幹細胞とプールされた骨髄由来間葉系幹細胞との間の生理活性因子の分泌を比較する。
個々のドナーからの細胞の生理活性因子分泌の分析：
ヒト骨髄は、ＫＭＣマニパル病院（Manipal, India）において、健康なドナーから得た。複数のドナー、好ましくは少なくとも２人、またはより好ましくは３人の健康なドナーからから単離したヒト骨髄由来間葉系間質／幹細胞を、個別に、表１に記載される細胞培養培地組成物を用いて、５回の継代にわたり培養した。細胞培養培地は、表１において示される組成物に限定されず、当該分野において公知の無血清および無異物の培養培地またはそれらの組み合わせを含む任意の既知の細胞培養培地を含んでもよい。細胞を、２５ｃｍ２の組織培養フラスコ中で培養し、培養が８０〜９０％の培養密度に達するまで３日ごとに細胞培養培地の完全交換を行う。第５継代においてコンフルエントな（第９〜１０日の）培養から条件培地を収集し、さらなる分析のために−８０℃で保存する。
【００４５】
【表１】
2016528911.tif 000002
【００４６】
３人の個々のドナーから得られた骨髄由来間葉系幹細胞／間質細胞（ＢＭＭＳＣ）からの条件培地を、分泌された増殖因子（ＧＦ）について分析し、表２において表すとおり、３個体のドナーの間でのいくつかのＧＦのレベルの顕著な固有の差異を見出した。特定のドナーの試料において、いくつかのＧＦは表さなかった。
【表２】
2016528911.tif 000003
表２は、個々のＢＭＭＳＣ試料からの条件培地における多様な増殖因子の、培地対照に対する相対的レベルを示す。値は、任意の蛍光単位を表す。
【００４７】
プールされた細胞からの生理活性因子分泌の分析：
少なくとも２人、または好ましくは３人の健康なドナーから単離されたヒト骨髄由来間葉系幹細胞をプールして、表１に記載される細胞培養培地を用いて５回の継代で培養する。細胞培養培地は、表１に示される組成物に限定されないが、当該分野において公知の無血清および無異物の培養培地またはそれらの組み合わせを含む任意の既知の細胞培養培地を含んでもよい。細胞を、２５ｃｍ２の組織培養フラスコ中で培養し、培養が８０〜９０％の培養密度に達するまで、３日ごとに細胞培養培地の完全交換を行う。第５継代において、コンフルエントな（第９〜１０日の）培養から条件培地を収集し、さらなる分析のために−８０℃で保存する。
【００４８】
代替的に、プールした細胞をラージスケールで培養する方法は、第３継代においてプールした細胞を、第４継代培養物として、１セルスタック（ＣＳ−１）中で、１０００細胞／ｃｍ２の播種密度において増殖させ、５０％の培養密度において培地の交換に供し、および８０〜９０％の培養密度が達成されるまでさらに培養することを含む。プールした細胞を、次いで収集し、第５継代培養物として、１０００細胞／ｃｍ２の播種密度で、１０セルスタック（ＣＳ−１０）中で、４５〜５０％の培養密度が達成されるまで増殖させる。その後、５００ｍＬの細胞培養培地を、各セルスタックに添加し、培養の８０〜９０％の培養密度において条件培地を収集する。
【００４９】
表３は、３個体のドナーに由来するプールされた培養からの生理活性因子が豊富な条件培地を表し、ここで、皮膚の状態のための治療プロセスにおいて重要な著しいレベルの増殖因子が観察される。このデータは、プールすることが、ドナー間の固有の個々の差異を平均化／代償することに寄与し、それにより、条件培地中の重要なＧＦの大多数の表現の確立を増大させることを示唆する。
【表３】
2016528911.tif 000004
表３は、プールされたＢＭＭＳＣ試料からの条件培地中の多様な増殖因子の、培地対照に対する相対的レベルを示す。値は、任意の蛍光単位を表す。
【００５０】
また、個々のＢＭ−ＭＳＣ試料は、異なる量の多様な生理活性因子を産生し、いくつかの場合においては、特定の生理活性因子のレベルは、特定のドナーからの試料中で非常に低いことに注意することが重要である［例えば、ドナー１および／または２と比較した場合のドナー３におけるＩＧＦＢＰ−４］。したがって、単一のドナーを考慮する場合、生理活性因子のレベルの間には、常に差異および不均一性が存在する。一方、表３から、生理活性因子のレベルには、より高い均一性が存在すると考えられることは明らかである。複数のドナーからの多様な細胞をプールした後のものに由来する細胞の試料は、いくつかの生理活性因子においてはより少ない可能性があり得るが、また、プールすることにより増殖因子／サイトカインのレベルがより均一となることから、増殖因子／サイトカインのレベルが、個々の試料のものよりも著しく改善される場合も存在する。それはさらに、多数の生理活性因子および特定の生物学的機能／特性を有する他の分子を提示する間葉系間質／幹細胞に由来する条件培地を生成する確率を最大化し、およびまた、プールされる選択された個体のうちの１つにより分泌されない生物学的因子を代償する。したがって、前述の知見は、差異および不均一性の軽減のためのプールの重要性を確立し、プールされた細胞に由来する最終生成物が、特定の治療および／または美容用途のために得られる場合、生理活性因子の全体的なレベルが維持されることを保証する。
【００５１】
さらに、図１は、３個体のドナーの間でのＶＥＧＦ分泌の差異、およびプールおよび培養の後でのその正規化を示す。図２は、プールされた骨髄由来間葉系幹細胞からの条件培地中の多様な生理活性因子の、細胞培養培地に対する発現のレベルを示す。
図１９ａおよび１９ｂは、それぞれプールされた骨髄およびワルトン膠様質由来のＭＳＣから生成された条件培地中のＶＥＧＦおよびＴＧＦβの比較を示す。ワルトン膠様質由来条件培地は、骨髄由来条件培地と比較した場合、両方の因子をより少なく有することが観察される。
【００５２】
例２
条件培地の生成の増強のためのプロセス：
開始プロセス：凍結保存された、第３継代（Ｐ３）においてプールされたＭＳＣ［上で提供される単離およびプールのプロセスにより得られたもの］を融解し、Ｐ４培養として、１セルスタック（ＣＳ−１）中で、１０００細胞／ｃｍ２の播種密度で増殖させる。およそ５０％の培養密度（約６〜８日の培養）において細胞培養培地の完全交換を行い、細胞を８０〜９０％コンフルエントになるまで培養する。細胞を、次いで収集し、Ｐ５培養として、１０００細胞／ｃｍ２の播種密度で、１０セルスタック（ＣＳ−１０）中で増殖させ；各々のＣＳ−１０を、１．５Ｌの細胞培養培地で充填する。細胞が４５〜５０％の培養密度に達したら、以下の３つの細胞培養培地交換プロセス（または供給スケジュールプロセスとしても言及される）のうちの１つを行う（培養第７日頃）：
【００５３】
培地交換プロセス１：
プロセス１において、培地交換／細胞供給スケジュールは、流加回分活性化または培地のつぎ足し（top-up）として言及される、１回の部分的培地交換を含む。この流加回分プロセスにおいては、使用済みの培地を除去することなく、新たな培地を細胞培養に添加する。培養の０６／０７日（または細胞が約４５〜５０％の培養密度となるとき）に、１つのＣＳ−１０あたり５００ｍｌの容積で、全てのＣＳ−１０培養に対して、流加回分活性化を行う。培養が８０〜９０％の培養密度に達し次第、全てのＣＳ−１０から条件培地を収集して保存する。
【００５４】
培地交換プロセス２：
プロセス２において、培地交換／細胞供給スケジュールは、特定の培養密度における１回の部分的培地交換および１回の完全培地交換を含む。培養の０６／０７日（または細胞が約５０％の培養密度となるとき）に、全てのＣＳ−１０において、１つの１０セルスタック（ＴＣＳ）あたり５００ｍＬの容積で、部分的培地交換の間に流加回分活性化を行う。細胞が６５〜７０％の培養密度に達したら、完全培地交換を行い、ここで、使用済みの培地を培養から取り除き、１つのＣＳ−１０あたり２Ｌの新たな細胞培養培地を添加する。培養が８０〜９０％の培養密度に達したら、全てのＣＳ−１０から条件培地を収集して保存する。
【００５５】
培地交換プロセス３：
プロセス３において、培地交換／細胞供給スケジュールは、１回のみの完全培地交換スケジュールを含む。ＴＣＳ培養中の細胞が４５〜５０％の培養密度に達したら（または培養の第６〜８日において）、全てのＴＣＳから使用済みの培地を完全に除去し、１．５Ｌ／ＴＣＳの新たに調製した細胞培養培地で置き換える。培養が８０〜９０％の培養密度に達したら、全てのＣＳ−１０から条件培地を収集して保存する。
およそ、上記の３つの方法の各々についての条件培地生成プロセスは、約１０〜１５日間を必要とし、その最後において、条件培地（ＣＭ）を富化のために収集する。
【００５６】
例３
３つの異なるプロセスから生成された条件培地中の生理活性因子の比較：
３つの異なるプロセス（プロセス１、２および３）を、プールされたＢＭ−ＭＳＣから条件培地を得るために、標準化した。各々の個々のプロセスは、特定のセットの治療的生理活性因子が富化されたＣＭを生じる。図３ａ、３ｂおよび３ｃは、３つの異なるプロセスから得られた、それぞれＶＥＧＦ、ＰＧＥ−２およびＴＧＦ−ベータ−１のレベルを比較する。例えば、アンギオポエチン１が富化されたＣＭは、プロセス１に従って得ることができ、ＴＧＦ−ベータが富化されたＣＭは、プロセス２に従って得ることができ、ＶＥＧＦおよびＰＧＥ−２が富化されたＣＭは、プロセス３に従って得ることができる。したがって、特定の生成プロセスを用いて、特定の治療的適用、大量の適切なＧＦ／サイトカインもしくは他の生理活性因子を要求する適用のセットのための、テイラーメイドのＣＭを得ることができる。例えば、プロセス２は、ＣＭ中の大量のＴＧＦ−ベータのため、軟骨の再生を必要とする適用のために用いることができる。同様に、プロセス３は、ＣＭ中の大量のＰＧＥ−２のため、免疫調節のために用いることができる。プロセス１、２および３の間の、プールされたＢＭ−ＭＳＣによる、特定の生理活性因子の最適レベルにおける分泌は、分泌の速度、インビトロでの半減期および増殖因子／サイトカインの安定性と相関する。このように、細胞培養培地中で、様々な時点において、条件培地が収集されるステージに依存して、様々な生理活性因子が細胞により分泌される。
【００５７】
例えば、アンギオポエチン１の長い半減期のおかげで、特定の治療的適用のためにアンギオポエチン１の必要性が存在する場合はいつでも、プールされたＢＭ−ＭＳＣを、培養が５０％コンフルエントとなる培養の第６日または第７日に流加回分活性化を含むプロセス１に供し、その結果として、細胞密度は増大し、分泌される増殖因子は培地中に蓄積する。しかし、ＶＥＧＦは、所望される培養密度において相対的に速く分泌されるため、ＶＥＧＦの必要性が存在する場合はいつでも、プールされたＢＭ−ＭＳＣを、培養の第６〜８日における４５〜５０％の培養密度における完全培地交換の適用を含むプロセス３に供し、それにより、細胞による増殖因子のより多くの産生を誘導し、これが培地中のその最適レベルを保証する。
【００５８】
このようにして、所望される薬学的または治療的適用に依存して、プロセスに特異的でない他の増殖因子／サイトカインと共に、最適なレベルの特定の生理活性因子を含む、特定の条件培地に到達することができる。
代替的に、所与の適用のための最大量の適切なＧＦ／サイトカインを含むＣＭを得るために、異なる個々のプロセスからのＣＭを、選択的にプールすることもできる。例えば、プロセス１および３からのＣＭをプールして、Ａｎｇ−１およびＶＥＧＦなどの血管新生性の増殖因子の最大の富化を得ることができる。
【００５９】
【表４】
2016528911.tif 000005
図４（ａ、ｂ、ｃ）は、異なるバッチからの、プロセス２〜３により生成された条件培地中のＶＥＧＦ、ＴＧＦベータおよびＰＧＥ−２のレベルについてのグラフを提供する。バッチの比較は、ＴＦＦ前の元の条件培地と比較して１０倍濃縮された条件培地をもたらしたＴＦＦ濃縮の後で行った。したがって、得られた条件培地は、１０×濃縮物である。グラフは、０．４４０±０．１２５ｎｇ／ｍｌの平均濃度および統計学的に有意でない差異を有する、３つの異なるバッチからプロセス２により生成された条件培地の一貫性を示す。
【００６０】
例４
条件培地の濃縮
上の方法により収集されたＣＭを、任意に、既定の分子量カットオフを用いる限外濾過／接線流濾過（ＴＦＦ）によりさらに濃縮および富化し、濃縮された条件培地を、分析的評価および製剤のために用いた。ＣＭはまた、他の既知の確立された方法により濃縮してもよい。態様の１つにおいて、３ＫＤａ以上の分子量カットオフを用いることにより、限外濾過／接線流濾過（ＴＦＦ）による濃縮および富化を行う。一方、別の態様においては、ＣＭは、１ＫＤａ以上の分子カットオフを用いて濃縮する。図５ａおよび５ｂは、ＶＥＧＦのレベルにより示されるものとして、１ｋＤａの分子カットオフを用いるＴＦＦ濃縮技術による濃縮の後の条件培地中の増殖因子の保持が増強されたことを示し、これはさらに、以下に記載するとおりヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いるトランスウェル遊走アッセイにより、機能的であることが証明される。１ｋＤａおよび３ｋＤａの２つの異なる分子カットオフを用いて濃縮されたＣＭ中の因子に応答したＨＵＶＥＣ細胞の遊走を、単純ＫＯ（Plain KO）、ＫＯ＋１０％ＦＢＳおよびＭ１９９＋２０％ＦＢＳ中の因子に応答してのＨＵＶＥＣ細胞の遊走と比較する。
【００６１】
接線流濾過技術：
膜ベースの接線流濾過（ＴＦＦ）単位操作は、タンパク質を清澄化、濃縮および精製するために、一般的に用いられる。ＴＦＦにおいては、膜の表面に沿って液体（供給液）を接線方向にポンピングする。適用された圧力は、液体の一部が、膜を濾液側へと通過するように働く。ＴＦＦ装置において、供給流に対して圧力を生み出すために、ポンプを用いる。
【００６２】
ヒト骨髄間葉系幹細胞由来条件培地（ＣＭ）を濃縮することを目的とするＴＦＦ単位は、１ｋＤａのカットオフを有する濾過膜を利用する。なぜならば、このカットオフ値は、保持されることが所望されるタンパク質分子の分子量よりも実質的に低いからである。より大きなサイズの粒子は、液体の接線流に沿って運び流される。したがって、液体の接線流は、濾液の流路における粒子の蓄積を防止し、それにより、相対的に高い固体負荷での持続的な操作を可能にする。
【００６３】
生成物の収率または純度を増強するために、限外濾過の進行と組み合わせて、タンパク質濃縮の間に、透析濾過（ＤＦ）プロセスを行ってもよい。ＤＦ（持続的透析濾過）の間に、供給タンク中にバッファーを導入しつつ、一方で濾液を単位操作から取り除く。このことが、生成物のプールから濾液中に成分を洗い流し、それにより、バッファーを交換して、望ましくない種の濃度を減少させる。
【００６４】
ＴＦＦの進行：
膜を設置し、ＴＦＦシステムを初期化する（典型的には、水でフラッシュし、水濾液の流速および完全性について試験する）。約１〜２リットルのＣＭを供給タンクに加え、供給液入口の圧力を３０ｐｓｉ（Ｐ１）に、濃縮液（retentate）の圧力を２５ｐｓｉ（Ｐ２）に維持することにより、直交流を確立する。ＣＭが、その元の容積の１０分の１（１００〜２００ｍｌ；供給量に依存する）に減少するまで、この進行を継続する。ＴＦＦ濃縮は、したがって、ＴＦＦの前の元の条件培地と比較した場合に１０倍濃縮された条件培地をもたらす。したがって、得られる条件培地は、１０×濃縮物である。この限外濾過サイクルの間に、フラックスのあらゆる変化に注意するために、透過液の容積および供給液および濃縮液の圧力の変化を常に記録する。限外濾過サイクルが完了したら、最終的なＣＭ濃縮物の純度を増強するために、透析濾過サイクルを行う。透析濾過プロセスにおいて、ＣＭ濃縮液と等容積のダルベッコリン酸緩衝化食塩水を供給タンクに添加する。最適な純度の最終濃縮液を得るために、８サイクルの透析濾過を行う。
【００６５】
ＴＦＦにより条件培地を濃縮した後、アミノ酸であるＬ−アルギニンおよびＬ−グルタミン酸を、それらの精製形態で最小量のダルベッコリン酸緩衝化食塩水中に可溶化して、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度で、ＴＦＦ濃縮物に添加する。これらのアミノ酸は、タンパク質安定化剤として機能する。
それは、条件培地の１０×濃縮物であり、これをさらに、本開示中の実験および製剤において使用する。
【００６６】
例５
トランスウェル遊走アッセイ：
トランスウェル２チャンバー細胞培養法およびトランスウェルインサート（3422；Corning, Cambridge, MA）、および８μｍ孔のポリカーボネート膜を用いて、遊走アッセイを行う。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を２４時間にわたり血清飢餓にし、トランスウェルインサートの上部チャンバー中に１×１０５細胞／ウェルを播種する。下部チャンバー中には、細胞培養培地、単純培地（plain media）または条件培地を加える。条件の１つとして、２０μｇ／ｍＬのＶＥＧＦブロッキング抗体（R&D Systems-MAB293）を添加する。細胞を約１６〜１８時間遊走させる。５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気中での３７℃での１８時間のインキュベーションの後で、あらかじめ湿らせた綿棒を用いて遊走しなかった細胞を慎重に取り除き、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ヘマトキシリンで１０分間染色する。洗浄の後で、膜をＤＰＸでマウントし、明視野顕微鏡下において、１００×の対物レンズで、膜の上側から下側へと遊走した細胞を計数する（１００×の倍率−Nikon 90i顕微鏡）。全てのアッセイを、３回の複製において行う。データは、平均値±ＳＥＭとして表す。アッセイは、濃縮された条件培地は機能的であり、生理活性因子が処理の間に破壊されていないことを示す。
【００６７】
例６
プールされたＢＭ−ＭＳＣからの増殖因子／サイトカインが富化された条件培地の抗老化および抗しわ効果
プロセス−１により生成されたＣＭの抗老化効果についてのインビトロでの原理証明：
老化は、身体の生物時計、ならびに、皮膚の老化プロセスを加速させるフリーラジカルおよび紫外線暴露などの環境的脅威を含む、内的因子および外的因子の両方により引き起こされ得る。酸化ストレスは、エラスチンおよびヒアルロン酸を含む皮膚の重要な構成要素を分解し、さらには細胞の再生周期を改変することにより、細胞のレベルで皮膚の老化に寄与する事象を開始させ駆動することにおいて中心的役割を果たす。
【００６８】
エラスチンタンパク質繊維は、コラーゲンと組み合わされて皮膚の弾性をもたらし、一方で、ヒアルロン酸は、真皮の底部において見出され、水分子と結合する「セメント化およびゲル化」基材を形成し、栄養および酸素を組織中に受け入れ、真皮の構造層を保護する。さらに、サイクリンＢ１は有糸分裂に関与する調節タンパク質であり、そのレベルは、生細胞において老化の間に減少することが知られている。したがって、皮膚線維芽細胞における酸化ストレスに対する１０×ＣＭの後処置の、ＣＭ（１０×濃度での）のエラスチンおよびヒアルロン酸分解に対する保護効果／損傷回復効果ならびに抗老化効果を、Ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ｔｂＯＨ）に暴露された細胞の４８時間の処置後に評価する。これらの実験を目的として、プールしてプロセス１に従って培養された３個体のドナーに由来するＭＳＣの培養から、条件培地を得る。
【００６９】
ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ−１  ＡＴＣＣ（登録商標）ＳＣＲＣ−１０４１（商標）−ソース：ヒト包皮）細胞を、３００μＭのｔｂＯＨで２時間にわたり処置し、その後、様々な用量の１０×ＣＭおよび対照培地に４８時間にわたり暴露する。ＥＬＩＳＡ法により、培養上清中のエラスチンおよびヒアルロン酸レベルを推定する。サイクリンＢ１について、細胞を溶解バッファー中で溶解して細胞ライセートを得、ＥＬＩＳＡ法によりタンパク質レベルを推定する。
【００７０】
ｔｂＯＨの処置の後で、１０×ＣＭで処置された損傷ＨＦＦ−１細胞は、５％、１０％および５０％の用量において、それぞれの１０×対照培地により処置された細胞と比較して、ｔｂＯＨ損傷の後で、それぞれ７％、２３％および６％のコラーゲンレベルの回復をもたらし（図６ａ）、一方、１０％および５０％の用量においては、図６ｂにおいて観察されるように、それらのそれぞれの１０×対照培地と比較して、それぞれ３９％および３６％のエラスチンレベルの回復をもたらした。ヒアルロン酸レベルについて、５％および１０％の１０×ＣＭの用量は、それらのそれぞれの１０×対照培地と比較して、それぞれ１７％および５７％のヒアルロン酸レベルの回復をもたらした（図６ｃ）。同様に、図６ｄにおいて示されるように、１０×ＣＭの後処置は、５％および５０％の用量において、それらのそれぞれの１０×対照培地と比較した場合に、それぞれ５９％および８５％のサイクリンＢ１レベルの増大をもたらす。
【００７１】
結論：骨髄間葉系幹細胞条件培地は、損傷を受けた皮膚に対する構造フレームワークを回復し、損傷を受けた／老化した皮膚における弾性を回復し、水分を保持し、皮膚の構造の減少を予防し、酸化ストレスにより引き起こされるサイクリンＢ１レベルを増加させることにより老化を逆転させる能力を有する。
【００７２】
例７
プロセス−１により生成された条件培地のコラーゲンへの酸化的損傷に対する保護的効果：
皮膚線維芽細胞において６００μＭのＨ２Ｏ２による２ｈにわたる処置による酸化的損傷により引き起こされるコラーゲン分解に対する、プロセス−２により生成された１０×ＣＭの保護的効果を、Ｈ２Ｏ２損傷の４８ｈ後のコラーゲンのレベルを測定することにより評価する。ＨＦＦ−１細胞を、様々な用量の１０×ＣＭおよび１０×対照培地で、Ｈ２Ｏ２損傷の前に２４ｈにわたり処置する。
１０×ＣＭによるＨＦＦ−１細胞の処置は、１０×対照培地により処置された細胞と比較して、Ｈ２Ｏ２損傷の後で、５％、１０％および５０％の用量において、それぞれ３３％、２１％および２０％のコラーゲン分解に対する保護をもたらす（図７）。したがって、１０×ＣＭは、酸化ストレスにより誘導されるコラーゲン分解を保護する能力を有し、酸化ストレスにより引き起こされる皮膚構造の減少を予防する可能性を有する。
【００７３】
例８
ＨＦＦ増殖アッセイ：
９６ウェルのマイクロタイタープレート中で、１×ＤＭＥＭ＋１５％のＦＢＳ中に、ウェルあたり約２０００個のＨＦＦ細胞を播種する。翌日、１×ＤＭＥＭ＋０．１％のＦＢＳ中で２４時間にわたり細胞を血清飢餓にする。血清飢餓の後で、細胞を、様々な用量の１×／１０×の対照培地／プロセス２により生成されたＣＭで処置する。対照／条件培地の添加の６日後に、ＭＴＴアッセイを行う。アッセイは、細胞の生存率および増殖を比色測定により測定するために用いられる色素を使用する。
このアッセイは、条件培地の存在下におけるヒト線維芽細胞の増殖能を示す（図８）。ＨＦＦの増殖能は、２５％の１×ＣＭが用いられる場合に最も高いことが見出される。それは、皮膚細胞が新しい細胞を増殖させて、若々しい皮膚に寄与する能力を表す。
【００７４】
例９
遊走アッセイまたはインビトロスクラッチアッセイ：
インビトロスクラッチアッセイは、細胞遊走をインビトロで測定するための、容易かつ低コストであり、よく開発された方法である。アッセイは、細胞遊走に対する細胞マトリックスおよび細胞−細胞の相互作用の効果についての研究のために、特に好適であり、細胞遊走を模倣し、所望される場合は細胞内の事象をモニタリングするために、遊走の間の生細胞をイメージングすることを可能にする。基本的なステップは、細胞の単層中に「スクラッチ」を作り、スクラッチを閉鎖するための細胞遊走の開始において、および規則的な間隔を空けて、画像を取得し、画像を比較して、細胞の遊走率を定量化することを含む。
【００７５】
９０％より高い培養密度を達成するために、６ウェルプレートにおいて１×ＤＭＥＭ＋１５％のＦＢＳ中に、ウェルあたり約２５００００個のＨＦＦ細胞を播種する。翌日、細胞を、１×ＤＭＥＭ＋０．１％のＦＢＳ中で２４ｈにわたり血清飢餓にする。血清飢餓の後で、無菌の２００μＬピペットチップの先を用いて、細胞単層の中央にスクラッチ（直線）を作る。細胞を、１×ＤＭＥＭを用いて２回洗浄し、その後、５％、１０％および５０％の１０×の対照培地およびプロセス２により生成されたＣＭで４８ｈにわたり処置する。スクラッチの画像を、０ｈおよび２４ｈにおいて、単一のウェル中の３点において取得し、ImageJソフトウェアを用いてスクラッチ閉鎖の距離を測定する（図９ａおよび９ｂ）。
【００７６】
結果は、５％、１０％および５０％の条件培地の存在下において、対照培地による３０〜４０％と比較して、６５％の線維芽細胞の遊走を示す（図９ｂ）。したがって、このことは、条件培地による処置による、皮膚細胞の自己再生の能力を示す。
【００７７】
例１０
ＣＭの細胞保護的な生存率および回復効果：
皮膚線維芽細胞における、３００μＭのＴｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ｔｂＯＨ）での２ｈにわたる処置、および損傷を受けた線維芽細胞の１０×ＣＭによる４８ｈにわたる後処置による、プロセス２により生成された１０×ＣＭの、酸化的損傷に対する細胞保護的な生存率回復効果を、ＭＴＴアッセイにより評価した。３００μＭのｔｂＯＨによるＨＦＦ−１細胞の処置は、ＳＦＭ処置において、未処置の細胞と比較した場合に、細胞生存率の３５％の減少をもたらす。
【００７８】
ｔｂＯＨ損傷に対して、１０×ＣＭにより得られる細胞保護は、それぞれの１０×対照培地により処置された細胞と比較した場合に、５％、１０％および５０％の用量において、それぞれ１１％、１８％および１２％高い（図１０）。このアッセイにおいて、無血清培地にアスコルビン酸を加えたもの（ＳＦＭ＋ＡＡ）を、陽性対照として用いる。１００μＭのアスコルビン酸（ＡＡ）によるＨＦＦ−１細胞の処置もまた、ｔｂＯＨ損傷に対して１２％の細胞保護をもたらす。１０×ＣＭによる損傷を受けたＨＦＦ−１細胞の処置は、試験された全ての用量において、細胞保護／細胞生存率回復能力を示す。１０×ＣＭは、５％、１０％および５０％の濃度で、酸化ストレスを受けた線維芽細胞の生存率を回復させる能力における傾向を示した。最大活性は、１０％の１０×ＣＭにおいて観察される。したがって、１０×ＣＭは、酸化ストレスを受けた線維芽細胞の生存率を回復させる能力を有し、したがって、皮膚の健康を回復させる能力を有する。
【００７９】
例１１
ＣＭの抗しわ効果についてのインビトロでの原理証明
少量のＵＶ照射ですら、しわを引き起こすプロセスを誘引する。太陽光は、通常皮膚の下の組織の弾力性および強度を維持する皮膚におけるタンパク質であるエラスチンに損傷を与える。太陽により誘導されるエラスチン損傷に応答して、大量のメタロプロテイナーゼが産生され、これがコラーゲン損傷をもたらし得る。これは、日光性瘢痕（solar scar）として知られる解体されたコラーゲン繊維の形成をもたらす。皮膚がこの不完全な再建プロセスを幾度も繰り返す場合、しわが生じる。さらに、ＵＶＢ暴露は、カスパーゼ３（その活性化はミトコンドリアにより媒介されるアポトーシス経路の活性化を示す）の増大などのアポトーシス細胞死経路を活性化することにより、細胞死を誘導する。ＤＮＡ損傷もまた、ＵＶＢ暴露からもたらされ、ここで、ＤＮＡに対する著しいＵＶ誘導性の損傷は、ＣＰＤ（シクロブタンピリミジン２量体）形成をもたらす。さらに、カスパーゼ３の活性化および細胞のＤＮＡ損傷の増大は、上皮における悪性の変化、および内皮マトリックスにおける組織崩壊をもたらし、これはしわのある皮膚の出現をもたらす。
【００８０】
本研究において、皮膚線維芽細胞におけるＵＶＢ暴露に対する、１０×ＣＭの、エラスチン合成に対する回復効果、カスパーゼ３活性化に対する抗アポトーシス効果、およびＤＮＡ損傷修復効果を分析する。血清飢餓の後で、ＨＦＦ−１細胞を、１００ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢ照射で２時間にわたり処置する。その後、４８時間にわたり、様々な用量の、一緒にプールしてプロセス１に従って培養された３個体のドナーに由来するＭＳＣの培養から得られた１０×ＣＭ、および対照培地の暴露を行う。ＥＬＩＳＡ法により、培養上清中のエラスチンレベルを推定する。カスパーゼ３活性化の推定のために、細胞を細胞溶解バッファー中で溶解し、細胞ライセートを生成し、ＢＣＡ（ビシンコニン酸アッセイ）タンパク質推定法を用いて、タンパク質レベルを推定する。カスパーゼ３活性は、ＥＬＩＳＡを用いて測定する。同様に、ＣＰＤ形成のレベルを、ＥＬＩＳＡにより推定した。
【００８１】
ＵＶＢ照射されたＨＦＦ−１細胞の、１０％および５０％の用量での１０×ＣＭによる処置の後で、１０×ＣＭは、それらのそれぞれの対照培地と比較して、それぞれ２０％および５０％のエラスチンレベルの回復をもたらす（図１１ａ）。図１１ｂにおいて観察されるように、５％の用量での１０×ＣＭによる処置は、カスパーゼ３活性化の６３％の減少をもたらし、一方、試験された全てのＣＭの用量で、それらのそれぞれの対照培地と比較した場合に、ＤＮＡ損傷（ＣＰＤ形成）に対する著しい程度の保護が観察される（図１１ｃ）。ＣＰＤ損傷に対する最も高いレベルの保護は、５％の１０×ＣＭの用量で観察される。
【００８２】
結論：骨髄間葉系幹細胞由来の条件培地は、皮膚構造構築／富化効果、皮膚の引き締め、弾性の保持において役立ち、ＵＶＢにより誘導されるアポトーシスに対して保護し、ＵＶＢにより誘導されるＤＮＡ損傷に対するＤＮＡ修復効果を有する。
【００８３】
例１２
皮膚線維芽細胞における酸化ストレスにより誘導されるアポトーシスに対するＣＭの抗アポトーシス効果。
細胞周期のｓｕｂ−Ｇ０／Ｇ１期における細胞のパーセンテージは、細胞のアポトーシス性の集団を示す。皮膚線維芽細胞におけるＵＶＢにより２３０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢによる処置の後で誘導されるアポトーシスに対する、プロセス−１により得られた１０×ＣＭの抗アポトーシス効果を、照射の４８ｈ後の細胞周期のｓｕｂ−Ｇ０／Ｇ１期における細胞のパーセンテージを分析することにより評価する。３００ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢによるヒト皮膚線維芽細胞の処置は、細胞周期のｓｕｂ−Ｇ０／Ｇ１期における細胞の数の５５％の増加をもたらす。
【００８４】
５％の１０×ＣＭによるＨＦＦ−１細胞の処置は、それぞれの対照培地により処置された細胞と比較した場合に、細胞周期のｓｕｂ−Ｇ０／Ｇ１期における細胞の数をまったく減少させない。一方、１０×ＣＭの処置は、ＵＶＢ照射後に、１０％および５０％の用量において、それぞれの１０×対照培地により処置された細胞と比較した場合に、それぞれ７０％および３０％の細胞周期のｓｕｂ−Ｇ０／Ｇ１期における細胞の数の減少をもたらす（図１２）。したがって、ＣＭは、より高い用量（１０％および５０％）において、ＵＶＢにより誘導されるアポトーシスに対して、ヒト皮膚線維芽細胞を保護する。
上のプロセスから生成される条件培地は、局所投与のために処方される。ＣＭは、限定されないが、油性懸濁液、ハイドロゲル、ナノゲル、リポソーム、ウェットティッシュ、軟膏、貼付剤、ゲル、ローション、セラム、エマルジョン、クリーム、スプレー、滴下剤に処方され、当該分野において公知の他の製剤、またはこれらの任意の組み合わせを用いることができる。
【００８５】
例１３
生理活性因子が豊富な条件培地の製剤
１．ゲル製剤：
手順：
１．脱イオン水をビーカー中に取り、持続的に撹拌しながら水にＥＤＴＡを添加する。
２．メチルパラベンおよびプロピルパラベンを添加し、５ｍｉｎにわたり撹拌する。
３．正確に計量した条件培地（薬物）を溶液中に添加し、それが均一に拡散するまで撹拌する。上の溶液に、ゲル形成性ポリマーを、それが粘性ゲルを形成するまで、持続的に撹拌しながら、ゆっくりと添加する。
【００８６】
ゲル製剤の例：
【表５】
2016528911.tif 000006
【００８７】
【表６】
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【００８８】
【表７】
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【００８９】
【表８】
2016528911.tif 000009
【００９０】
製剤の物理化学的およびインビトロ評価：
抗しわ製剤を、物理化学的特性およびインビトロスクリーニング研究について評価する。実行可能性に基づいて、最初のインビトロスクリーニング研究は、フランツ型拡散セルにおいて、ラットの皮膚または透析膜を用いて行う。最終的な最適化された製剤のためには、遺体の皮膚を用いる。インビトロスクリーニング研究の間に、特定の時間間隔（０、０．１０、０．２０、０．３０、０．４５、１、２、４、６、８、１０、１２および２４時間）において、レセプター試料（receptor sample）を収集し、それをＵＶ分光法により２８０および２００ｎｍにおいて分析する。
【００９１】
レセプター試料、ｌ中に存在するタンパク質（増殖因子）は、２８０および２００ｎｍにおける最大吸光度により紫外光を吸収する。これらのパラメーターを、市販製剤およびプラセボ製剤と比較する。
【表９】
2016528911.tif 000010
【００９２】
安定性の研究：
最終的な製剤を、出荷用に好適な容器中に包装してラベルし、好適なＩＣＨガイドラインによる多様な条件下における安定性のために保管する。安定時点とみなされる特定の決定された間隔において、試料を取り出し、全ての物理化学的評価（ＰＣＥ）を行う。
【００９３】
具体例として本発明の範囲内において提供される全ての製剤および対応するデータは、±１０％の標準偏差を有する。
全ての上のゲルを、以下の物理的パラメーターについて評価する：
１．  ｐＨ
２．  展延性
３．  外観
物理的評価に基づいて、適切な粘度および展延性を有するゲル製剤を、動物研究のために選択する。さらに、ゲルを安定性チャンバー中に置き、上の物理的パラメーターについて、提案のとおりに特定の時点において、評価する。
【００９４】
【表１０】
2016528911.tif 000011
【表１１】
2016528911.tif 000012
【００９５】
２〜８℃、２５℃／６０％のＲＨおよび４０℃／７５％のＲＨでの１か月の時点における安定性についてのゲルの評価
【表１２】
2016528911.tif 000013
【表１３】
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【００９６】
【表１４】
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【００９７】
ビヒクルのみの製剤または基本の製剤
【表１５】
2016528911.tif 000016
条件培地−薬物（３０％）を用いる製剤
【表１６】
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【００９８】
条件培地−薬物（７０％）を用いる製剤
【表１７】
2016528911.tif 000018
【００９９】
表９〜１１のビヒクルのみの製剤または基本の製剤の評価
全ての上のゲルを、以下の物理的パラメーターについて評価する：
１．ｐＨ
２．展延性
３．外観
物理的評価に基づいて、適切な粘度および展延性を有するゲル製剤を、動物研究のために選択する。さらに、ゲルを安定性チャンバー中に置き、上の物理的パラメーターについて、提案のとおりに特定の時点において、評価する。
【０１００】
【表１８】
2016528911.tif 000019
【表１９】
2016528911.tif 000020
【０１０１】
２〜８℃、２５℃／６０％のＲＨおよび４０℃／７５％のＲＨでの１か月の時点における安定性についてのゲルの評価
【表２０】
2016528911.tif 000021
【表２１】
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【０１０２】
【表２２】
2016528911.tif 000023
２〜８℃、２５℃／６０％のＲＨおよび４０℃／７５％のＲＨでの３か月の時点における安定性についてのゲルの評価
【表２３】
2016528911.tif 000024
【０１０３】
【表２４】
2016528911.tif 000025
【表２５】
2016528911.tif 000026
【０１０４】
２．セラム製剤：
抗老化および皮膚の若返りを含む皮膚の健康のための条件培地
濃縮された条件培地を、美容的適用のためのセラムに処方する。美容的適用は、抗老化、抗しわ、瘢痕予防を含む一般的な皮膚の健康のため、ならびに皮膚の復活および皮膚の若返りのための、セラム製剤の使用を含む
ＢＭ−ＭＳＣ条件培地（ＣＭ）ベースの抗しわセラムを、好適な調製方法により、条件培地中に存在する多様な生理活性因子を安定化させ保護するための適合性の成分を用いて調製する。各々のバッチ製剤を、１×、３×および７×の濃度のＢＭＭＳＣ条件培地を用いて調製する。以下の表は、４つの異なる型のセラム製剤を説明する。
【０１０５】
安定性：活性成分は主にタンパク質であるため、最終生成物中に存在するタンパク質の機能を保つことは不可欠である。ヒドロキシエチルセルロース、Ｌ−アルギニンおよびＬ−グルタミン酸を含む群から選択されるアミノ酸、またはそれらの組み合わせは、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で、活性成分を保存する安定化剤として作用する。
【０１０６】
【表２６】
2016528911.tif 000027
【０１０７】
【表２７】
2016528911.tif 000028
【０１０８】
【表２８】
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【０１０９】
【表２９】
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【０１１０】
【表３０】
2016528911.tif 000031
【０１１１】
製剤の物理化学的評価：
抗しわ製剤を、物理化学的特性およびインビトロスクリーニング研究について評価する。実行可能性に基づいて、最初のインビトロスクリーニング研究は、フランツ型拡散セルにおいて、ラットの皮膚または透析膜を用いて行う。最終的な最適化された製剤のためには、遺体の皮膚を用いる。インビトロスクリーニング研究の間に、特定の時間間隔（０、０．１０、０．２０、０．３０、０．４５、１、２、４、６、８、１０、１２および２４時間）において、レセプター試料を収集し、それをＵＶ分光法により２８０および２００ｎｍにおいて分析する。
レセプター試料、ｌ中に存在するタンパク質（増殖因子）は、２８０および２００ｎｍにおける最大吸光度により紫外光を吸収する。これらのパラメーターを、市販製剤およびプラセボ製剤と比較する。
【０１１２】
【表３１】
2016528911.tif 000032
【０１１３】
安定性の研究：
最終的な製剤を、出荷用に好適な容器中に包装してラベルし、好適なＩＣＨガイドラインによる多様な条件下における安定性のために保管する。安定時点とみなされる特定の決定された間隔において、試料を取り出し、全ての物理化学的評価（ＰＣＥ）を行う。
【表３２】
2016528911.tif 000033
具体例として本発明の範囲内において提供される全ての製剤および対応するデータは、±１０％の標準偏差を有する。
【０１１４】
態様において、インビボでの効力について分析された製剤は、以下のとおりである：
【表３３】
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【０１１５】
【表３４】
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【０１１６】
【表３５】
2016528911.tif 000036
【０１１７】
選択されたパラメーターの物理化学的分析を評価する。所与の製剤外観および色を視覚的に試験した。所与の試験試料のｐＨは、ｐＨメーターを用いて行った。粘度は流体摩擦の尺度であり、これは、流体の層が別の層と関係しながら動かされた場合に生じる内部摩擦と考えることができる。それは、剪断の速度に対する剪断応力の比の尺度である。所与の製剤１および３の粘度を、ブルックフィールド粘度計を用いて試験した。ブルックフィールド粘度計は、流体中のスピンドルを回転させるために必要とされる力を測定することにより、粘度を測定する。所与の製剤の展延性は、サンプルガラスプレート上に適用した標準的な重量に対して、横切った試料の面積を測定することにより試験した。
【０１１８】
例１４
インビボ抗しわ研究：
本研究は、ヌードマウスにおけるＵＶＢ照射により誘導される病態生理学的変化に対する試験製剤の抗しわ効力を評価するために行われる。本研究において、６〜８週齢のヌードマウスを選択する。非照射群（Ｇ１）以外の全ての動物に、ＵＶＢを７日間にわたり照射する。照射の用量は、１５０ｍＪ／ｃｍ２に維持する。ＵＶＢ照射の直後に、試験製剤［下記のとおり］およびビヒクル（プラセボセラム製剤１およびプラセボセラム製剤２）を、それぞれの群中の各動物の全背側に局所投与する。ＵＶＢ暴露は、動物の皮膚において病態生理学的変化をもたらすため、全ての動物を、あらゆるしわ；皮膚の荒れ；水（水分）の減少および紅斑（発赤）の外観について接近して観察する。皮膚の水和物および紅斑指数（Ｅ．Ｉ．）は、ＵＶＢ暴露の前に毎日、それぞれコルネオメーターおよびメグザメーターを用いて測定する。
【０１１９】
第１日と第８日との間で、試験製剤の平均コルネオメーターおよびメグザメーター単位について、比較を行い、群Ｇ５（２１．８０％）およびＧ６（２３．８６％）において、第１日と比較して低い程度の皮膚水分の減少が存在することが明らかとなる。Ｇ５において１×濃度（すなわち１０×ＣＭの１０％）の用量において適用された製剤１、およびＧ６において３×（すなわち１０×ＣＭの３０％）濃度の用量において適用された製剤３は、ＵＶＢにより誘導される皮膚からの水分減少を実質的に予防することができた。
【０１２０】
第８日において、Ｅ．Ｉ．の増大の程度は、製剤１（１×濃度）処置群Ｇ５（２．２６％）および製剤３（３×濃度）処置群Ｇ６（２．７３％）において、第１日と比較して低いことが見出される。Ｇ５において１×濃度において適用された製剤１、ならびにＧ６において３×濃度の用量において適用された製剤３は、ＵＶＢにより誘導される皮膚における紅斑を実質的に予防することができる。
【０１２１】
ＵＶ−Ｂ照射による皮膚の破壊的変化を減少することにおける試験製剤の役割を、ヌードマウスにおいて研究した。保護の程度は、肉眼的および顕微鏡的パラメーターを用いて評価した。ＵＶ−Ｂの効果ならびに製剤１および３の抗しわ能力を捕えるために、画像を記録した。カメラを、動物からの固定距離においてスタンドに固定し、無菌条件下において撮影を行った。本研究においては、製剤の抗しわ効力を、ヌードマウスにおいてＵＶ−Ｂ照射により誘導される病態生理学的変化に対して評価した。６〜８週齢のヌードマウスを選択した。非照射群（対照群）を除く全ての動物に、ＵＶ−Ｂを７日間まで照射した。照射の用量は、１５０ｍＪ／ｃｍ２に維持した。ＵＶ−Ｂ照射の直後に、製剤１および３を、それぞれの群中の各動物の全背側に局所投与した。ＵＶ−Ｂ暴露は、動物の皮膚において病態生理学的変化をもたらすため、全ての動物を、皮膚のあらゆるしわ、弛緩および荒れの外観について接近して観察した。未処置のもの（対照群）は、皮膚のしわを示さなかったが、ＵＶＢ処置の後では、皮膚はしわおよび荒れを示した。製剤１および３による処置の後では、動物がＵＶＢ処置されていたにもかかわらず、皮膚の状態は、著しく改善した皮膚のしわおよび荒れの例外的な減少が存在した。したがって、製剤による処置は、皮膚の健康を回復させ、ＵＶＢにより引き起こされる皮膚の損傷を予防する。
群の割り当て
処置群
G1              未処置
G2              UVB処置
G3              製剤１のビヒクル（プラセボ）（VF1）
G4              製剤３のビヒクル（プラセボ）（VF3）
G5              製剤F1−1X
G6              製剤FN3−3X
【０１２２】
【表３６】
2016528911.tif 000037
【０１２３】
皮膚水和度レベルのコルネオメーターの読み取り値を、実験デザインに従って、７日間のＵＶＢ照射の後である第８日の最後において考慮する。グラフ図示において、ＵＶＢ処置されたものおよびプラセボ試料を含む全ての試料中の皮膚水和度レベルの漸進的減少が存在することが観察されるが、一方、皮膚水和度レベルは、第８日の終わりにおいて、７６〜７８％まで保持される。
図１３から明らかであるように、第８日の終わりにおいて、製剤処置群の水分保持は、プラセボよりも良好である。このデータから、Ｆ１−１Ｘは、より良好な皮膚水和度レベル保持を示した。
【０１２４】
【表３７】
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【０１２５】
紅斑指数のメグザメーターの読み取り値を、実験デザインに従って、７日間のＵＶＢ照射の後である第８日の最後において考慮する。グラフ図示において、ＵＶＢ処置されたものおよびプラセボ試料を含む全ての試料中の紅斑指数の漸進的増大が存在することが観察されるが、一方、製剤を用いて得られた紅斑指数は、未処置対照と同様の２７０のオーダーで一定のままである。
このデータから、いずれの製剤も、より低い紅斑指数を示すことが明らかである。 
【０１２６】
利点および適用
・本発明は、個々のドナーからの間葉系幹細胞により産生／分泌される生理活性因子のレベルをプールされたドナーのものと比較した場合の差異に取り組む。個々のドナーにより産生されないかまたは非常に少量で産生される特定の生理活性因子は、複数のドナーからの間葉系幹細胞をプールすることにより得られる条件培地において、より高いレベルで分泌される。したがって、プールされたドナーにより分泌されるサイトカインおよび増殖因子は、個々のドナーから得られる条件培地において観察される不均一性を最少化する。
【０１２７】
・プールすることにより、ＢＭＭＳＣ試料の個々の差異が減少する。３人の個々のドナーから産生された生理活性因子の量を、３人のドナーのプール試料のものと比較すると、個々のドナーから生じる差異がドナーのプールにおいては正規化されることが観察される。例えば、表２において示されるデータを参照すると、ＴＧＦ−ベータは１人のドナー（ドナー１）によってのみ産生され、ドナー２および３によっては産生されないことが明らかである。したがって、ＴＧＦ−ベータは、ドナー２または３からの条件培地においては不在である。しかし、プールされた条件培地は、ＴＦＧ−ベータを含む。したがって、プールすることにより、個々の差異が最少化または排除される。
【０１２８】
・プールすることにより、また、多数の生理活性因子および特定の生物学的機能／特性を有する他の分子を提示する間葉系間質／幹細胞に由来する条件培地を生成する確率が最大化される。例えば、必要とされる血管新生を行うための濃度において機能的ＶＥＧＦを有する条件培地。また、プールされている選択された個々のもののいずれかにより分泌されない生物学的因子を補てんするために、プールを行う。条件培地を得る本発明の方法は、生物学的／医学的適用のために必要なサイトカインおよび増殖因子の、より高いレベルの発現を示すことが見出される。
【０１２９】
・ＣＭベースの製剤は、スクリーニングによるサイトカイン／ＧＦの発現および分泌に基づいて、多様な美容的および治療的目的のために用いることができる。
・特定の型のサイトカインおよびＧＦの発現および分泌は、特定の効能のために用いられる。例えば、ＦＧＦおよびＨＧＦは、瘢痕予防特性において重要である。
・本開示の条件培地はまた、ウェットティッシュ、美容用貼付剤およびハイドロゲルの形態において使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１５ｄ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１６ｃ】
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【図１６ｄ】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１７ｄ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１８ｃ】
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【図１８ｄ】
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【図１９ａ−ｂ】
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【国際調査報告】
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