(57)【要約】  本発明は、ＨＬＡ遺伝子座を用いて母体血液又は母体血漿中の胎児ＤＮＡ分率を決定する方法であって、母方ＨＬＡアレルと胎児ＨＬＡアレルがクローン法又はデジタル法によって検出及び定量される前記方法を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液試料又は血漿試料の中の胎児核酸分率を決定する方法であって、
（ａ）前記試料において、少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルを定量的に検出すること、
（ｂ）前記試料において、同じ遺伝子座にある少なくとも１つの母方ＨＬＡアレルを定量的に検出すること、
（ｃ）ステップ（ａ）及びステップ（ｂ）で検出された量を用いて前記試料中の胎児核酸分率を決定すること
を含む前記方法。
【請求項２】
前記決定ステップが、ステップ（ａ）及びステップ（ｂ）で決定されたＨＬＡアレルの量の総和に対するステップ（ａ）で検出された前記非母方ＨＬＡアレルの量の比率の２倍を計算することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルと母方ＨＬＡアレルがＨＬＡ−Ａのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｂのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｃのエクソン２とエクソン３、ＤＱＡ１のエクソン２、ＤＱＢ１のエクソン２とエクソン３、ＤＰＡ１のエクソン２、ＤＰＢ１のエクソン２、ＤＲＢ１のエクソン２、ＤＲＢ３のエクソン２、ＤＲＢ４のエクソン２、及びＤＲＢ５のエクソン２、又は前記ＨＬＡ遺伝子のイントロン配列、又は前記遺伝子のエクソン配列とイントロン配列の組合せから選択される配列を含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＨＬＡアレルがシーケンシング、特にクローンシーケンシングを含む方法によって定量的に検出される、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
シーケンシングの前に標的濃縮ステップをさらに含み、且つ、前記標的濃縮ステップが少なくとも１回のゲノムＤＮＡ増幅又はターゲットキャプチャーを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＨＬＡアレルが
（ａ）フォワードプライマーとリバースプライマーを使用する増幅によりＨＬＡアンプリコンを得ること、
（ｂ）クローンシーケンシングを実施してステップ（ａ）で得られた前記ＨＬＡアンプリコンの配列を決定すること、
（ｃ）同じ遺伝子座にある少なくとも１つの母方ＨＬＡアレルと少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルを特定すること、
（ｄ）ステップ（ｃ）で特定された母方ＨＬＡ配列クローンと非母方ＨＬＡ配列クローンの数を比較することにより前記試料中の胎児核酸分率を決定すること
を含む方法によって定量的に検出される、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｃ）における特定が、
（ａ）前記ＨＬＡ遺伝子座にある配列をＨＬＡ配列データベースに対して比較し、
（ｂ）前記配列を公知のＨＬＡアレルに対応する複数のビンに区分し、
（ｃ）１つ又は２つの多数配列を母方アレルとして特定し、
（ｄ）１つ又は２つの最も代表的な少数配列を非母方アレルとして特定する
コンピューターステップを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＨＬＡアレルがデジタルＰＣＲを含む方法によって定量的に検出される、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＨＬＡアレルが
（ａ）それぞれ０コピーと約５コピーの間の前記標的ＨＬＡアレルを含む複数の反応体積に前記試料を分割すること、
（ｂ）前記標的ＨＬＡアレルの存在について各反応体積をアッセイすること、
（ｃ）同じ遺伝子座にある前記母方ＨＬＡアレルを含む反応体積の数と前記非母方ＨＬＡアレルを含む反応体積の数を比較することにより前記試料中の前記胎児核酸の分率を決定すること
を含む方法によって定量的に検出される、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
一方又は両方の親について前記少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子座における遺伝子型情報を独立して得ることをさらに含む、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
胎児の染色体異常を検出する方法であって、
（ａ）前記胎児を宿している母親に由来する血液試料を提供すること、
（ｂ）少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルを前記試料中に定量的に検出すること、同じ遺伝子座にある少なくとも１つの母方ＨＬＡアレルを前記試料中に定量的に検出すること、前記母方ＨＬＡアレルと前記非母方ＨＬＡアレルの量を比較することにより前記試料中の胎児核酸の濃度を決定することを含む方法によって前記試料中の胎児核酸分率を決定すること、
（ｃ）異常が疑われる少なくとも１つの染色体の遺伝子座を前記試料中に定量的に検出すること、
（ｄ）ステップ（ｃ）で検出された前記染色体遺伝子座がステップ（ｂ）で決定された胎児ＤＮＡの濃度と比べて異常な量で存在するか判定し、それによって前記染色体異常を検出すること
を含む前記方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルがＨＬＡ−Ａのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｂのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｃのエクソン２とエクソン３、ＤＱＡ１のエクソン２、ＤＱＢ１のエクソン２とエクソン３、ＤＰＡ１のエクソン２、ＤＰＢ１のエクソン２、ＤＲＢ１のエクソン２、ＤＲＢ３のエクソン２、ＤＲＢ４のエクソン２、及びＤＲＢ５のエクソン２、又は前記遺伝子のエクソン配列とイントロン配列の組合せから選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ）において同じ遺伝子座にある前記非母方ＨＬＡアレルと前記母方ＨＬＡアレルが２つ、３つ、又はそれより多くの遺伝子座において検出される、請求項１１又は請求項１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
妊娠している患者の血液の中の胎児分率が閾値レベルを超えているか決定することにより前記患者が子癇前症を有しているか、又は子癇前症を発症する可能性があるか判定する方法であって、前記患者に由来する血液試料を提供すること、少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルを前記試料中に定量的に検出すること、同じ遺伝子座にある少なくとも１つの母方ＨＬＡアレルを前記試料中に定量的に検出すること、前記母方ＨＬＡアレルと前記非母方ＨＬＡアレルの量を比較することにより前記試料中の胎児分率を決定することを含む方法によって前記胎児分率を決定する前記方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルがＨＬＡ−Ａのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｂのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｃのエクソン２とエクソン３、ＤＱＡ１のエクソン２、ＤＱＢ１のエクソン２とエクソン３、ＤＰＡ１のエクソン２、ＤＰＢ１のエクソン２、ＤＲＢ１のエクソン２、ＤＲＢ３のエクソン２、ＤＲＢ４のエクソン２、及びＤＲＢ５のエクソン２、又は前記遺伝子のエクソン配列とイントロン配列の組合せから選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ａ）において同じ遺伝子座にある前記非母方ＨＬＡアレルと前記母方ＨＬＡアレルが２つ、３つ、又はそれより多くの遺伝子座において検出される、請求項１４又は請求項１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
子癇前症の発症について妊娠している患者をモニターする方法であって、前記患者の血液の中の胎児分率を請求項１４に記載の方法により定期的に決定し、胎児分率の増加が検出される場合に前記患者は子癇前症を有する、又は子癇前症を発症する可能性があると診断することによる前記方法。
【請求項１８】
母体血液中の胎児核酸の濃度が閾値レベルを超えているか決定することにより妊娠している患者が子癇前症を有しているか、又は子癇前症を発症する可能性があるか判定する方法であって、前記患者に由来する多量の血液試料を提供すること、前試料の体積の中に少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルを定量的に検出することにより胎児核酸の濃度を決定することを含む方法によって胎児核酸の濃度が決定される前記方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルがＨＬＡ−Ａのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｂのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｃのエクソン２とエクソン３、ＤＱＡ１のエクソン２、ＤＱＢ１のエクソン２とエクソン３、ＤＰＡ１のエクソン２、ＤＰＢ１のエクソン２、ＤＲＢ１のエクソン２、ＤＲＢ３のエクソン２、ＤＲＢ４のエクソン２、及びＤＲＢ５のエクソン２、又は前記遺伝子のエクソン配列とイントロン配列の組合せから選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ａ）において同じ遺伝子座にある前記非母方ＨＬＡアレルと前記母方ＨＬＡアレルが２つ、３つ、又はそれより多くの遺伝子座において検出される、請求項１８又は請求項１９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
疾患状態に関連するアレルの胎児中の存在又はホモ接合状態を検出する方法であって、
（ａ）前記胎児を宿している母親に由来する血液試料を提供すること、
（ｂ）少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルを前記試料中に定量的に検出すること、同じ遺伝子座にある少なくとも１つの母方ＨＬＡアレルを前記試料中に定量的に検出すること、前記母方ＨＬＡアレルと前記非母方ＨＬＡアレルの量を比較することにより前記試料中の前記非母方ＨＬＡアレル分率を決定することを含む方法によって前記試料中の非母方ＨＬＡアレル分率を決定すること、
（ｃ）前記疾患状態に関連する前記アレルを前記試料中に定量的に検出すること、
（ｄ）前記疾患状態に関連する前記アレルの量を前記非母方ＨＬＡアレル分率と比較することにより疾患状態に関連する前記アレルが前記胎児に１コピーで存在するのか、２コピーで存在するのか、又は存在しないのか決定すること
を含む前記方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルがＨＬＡ−Ａのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｂのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｃのエクソン２とエクソン３、ＤＱＡ１のエクソン２、ＤＱＢ１のエクソン２とエクソン３、ＤＰＡ１のエクソン２、ＤＰＢ１のエクソン２、ＤＲＢ１のエクソン２、ＤＲＢ３のエクソン２、ＤＲＢ４のエクソン２、及びＤＲＢ５のエクソン２、又は前記遺伝子のエクソン配列とイントロン配列の組合せから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ａ）において同じ遺伝子座にある前記非母方ＨＬＡアレルと前記母方ＨＬＡアレルが２つ、３つ、又はそれより多くの遺伝子座において検出される、請求項２１から２２の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１９９７年の母体血液中の無細胞性胎児ＤＮＡの発見により新しい非侵襲性出生前診断及びスクリーニングの分野が始まった。循環胎児ＤＮＡを使用することはＲｈグループ遺伝子型の決定、並びに異数性と単一遺伝子疾患のスクリーニングを含み、Ｊｉａｎｇ，  Ｐ．ら（２０１２年）ＦｅｔａｌＱｕａｎｔ：  ｄｅｄｕｃｉｎｇ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｆｅｔａｌ  ＤＮＡ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｐｌａｓｍａ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ誌、第２８巻：２８８３頁において概説されている。そのような診断用途は、母体循環中に存在する全ＤＮＡにおける胎児ＤＮＡ分率（「胎児分率」としても知られる）を知っていることを必要とする。幾つかの用途ではそのことは単に品質管理の問題である。例えば、ＣＬＩＡ検査室によって提供される現在では商業ベースになっている非侵襲性出生前診断（ＮＩＰＤ）検査の中には母体血漿中のＤＮＡの４％未満が胎児性である場合に検査結果が確定的ではなく、それ故に検査を行わないと述べているものもある。異数性の検出及び劣性アレルのコピー数の検出などの他の用途については胎児分率の精密な決定が必須である。
【背景技術】
【０００２】
母体血漿中の胎児ＤＮＡの定量に対する現行のアプローチはＹ染色体遺伝子座（例えばＳＲＹ又はＤＹＳ１４、米国特許第６２５８５４０号明細書）の検出、胎児エピジェネティックマーカー（例えばマスピン遺伝子、ＲＡＳＳＦ１Ａ遺伝子及びＳＥＲＰＩＮＢ２遺伝子のメチル化パターン、Ｈａｈｎ，  Ｓ．ら（２０１１年）Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ、Ｐｌａｃｅｎｔａ誌、第３２巻：ｓ１７頁に概説）の検出、又は母体ＤＮＡを胎児ＤＮＡと区別することができる情報価値のある単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を発見しようとする多数の染色体遺伝子座のターゲティング（米国特許出願番号第１２／６４４３８８号明細書）を含む。Ｙ染色体ベースのアプローチの明らかな欠点は女性の胎児にそのアプローチを適用することができないことである。エピジェネティックアプローチは再現性が無いことで悪名高い。複数のＳＮＰを使用する方法（例えばＪｉａｎｇら、上掲）はゲノム全体にわたって情報価値のあるＳＮＰを検索するのに複雑な数理解析を必要とする。よりありきたりで、且つ、精密な胎児分率の決定方法が望ましい。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は試料中の胎児核酸分率を決定する方法であって、少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルを前記試料中に定量的に検出すること、同じ遺伝子座にある少なくとも１つの母方ＨＬＡアレルを前記試料中に定量的に検出すること、上で検出された量を用いて前記試料中の胎児核酸分率を決定することを含む前記方法である。幾つかの実施形態では前記決定ステップは複数のステップで決定された全てのＨＬＡアレルの量の総和に対する前記非母方ＨＬＡアレルの量の比率の２倍を計算することを含む。幾つかの実施形態では前記少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルと母方ＨＬＡアレルはＨＬＡ−Ａアレル、ＨＬＡ−Ｂアレル、ＨＬＡ−Ｃアレル、ＤＲＢ１アレル、ＤＲＢ３アレル、ＤＲＢ４アレル、ＤＲＢ５アレル、ＤＱＡ１アレル、ＤＱＢ１アレル、ＤＰＡ１アレル、及びＤＰＢ１アレル、又はＨＬＡ−Ａのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｂのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｃのエクソン２とエクソン３、ＤＱＡ１のエクソン２、ＤＱＢ１のエクソン２とエクソン３、ＤＰＡ１のエクソン２、ＤＰＢ１のエクソン２、ＤＲＢ１のエクソン２、ＤＲＢ３のエクソン２、ＤＲＢ４のエクソン２、及びＤＲＢ５のエクソン２、又は前記ＨＬＡ遺伝子のイントロン配列、又は前記遺伝子のエクソン配列とイントロン配列の組合せから選択される。幾つかの実施形態ではシーケンシング、特にクローンシーケンシングを含み、且つ、所望によりクローン増幅ステップを含んでもよい方法によって前記ＨＬＡアレルが定量的に検出される。幾つかの実施形態では前記クローン増幅ステップは、それぞれアダプター配列とＨＬＡハイブリダイズ配列を含むフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて実施される。幾つかの実施形態では前記方法は例えば少なくとも１回のゲノムＤＮＡ増幅又はターゲットキャプチャーによる標的濃縮ステップをシーケンシングの前に含む。幾つかの実施形態では前記ＨＬＡアレルは、フォワードプライマーとリバースプライマーを使用する増幅によりＨＬＡアンプリコンを得ること、クローンシーケンシングを実施して前記ＨＬＡアンプリコンの配列を決定すること、同じ遺伝子座にある少なくとも１つの母方ＨＬＡアレルと少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルを特定すること、母方ＨＬＡ配列クローンと非母方ＨＬＡ配列クローンの数を比較することにより前記試料中の胎児核酸分率を決定することを含む方法によって定量的に検出される。幾つかの実施形態では前記特定ステップは前記ＨＬＡ遺伝子座にある配列をＨＬＡ配列データベースに対して比較し、前記配列を公知のＨＬＡアレルに対応する複数のビンに区分し、１つ又は２つの多数配列を母方アレルとして特定し、１つ又は２つの最も代表的な少数配列を非母方アレルとして特定するコンピューターステップを含む。幾つかの実施形態では前記比較ステップは、前記特定ステップで特定された同じ遺伝子座にあるＨＬＡアレルの総数に対する前記非母方ＨＬＡアレルの比率の２倍を計算することを含む。幾つかの実施形態では前記ＨＬＡアンプリコンの配列決定はシーケンシング・バイ・シンセシスを含む。幾つかの実施形態では同じ遺伝子座にある前記非母方ＨＬＡアレルと前記母方ＨＬＡアレルは２つ、３つ、又はそれより多くの遺伝子座、例えば、ＤＰＢ１、ＤＱＢ１及びＤＲＢ１において検出される。幾つかの実施形態では２つ、３つ、又はそれより多くの遺伝子座にある前記非母方ＨＬＡアレルと前記母方ＨＬＡアレルは多重ＰＣＲによって同じ反応体積中で同時に増幅される。幾つかの実施形態では前記ＨＬＡアレルはデジタルＰＣＲを含む方法によって定量的に検出される。幾つかの実施形態では前記ＨＬＡアレルは、それぞれ０コピーと約５コピーの間の前記標的ＨＬＡアレルを含む複数の反応体積に前記試料を分割すること、前記標的ＨＬＡアレルの存在について各反応体積をアッセイすること、同じ遺伝子座にある前記母方ＨＬＡアレルを含む反応体積の数と前記非母方ＨＬＡアレルを含む反応体積の数を比較することにより前記試料中の前記胎児核酸の分率を決定することを含む方法によって定量的に検出される。この実施形態の変形例では前記アッセイはデジタルＰＣＲによる増幅を含む。幾つかの実施形態では前記方法は一方又は両方の親について前記少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子座における遺伝子型情報を独立して得ることをさらに含む。
【０００４】
さらに別の実施形態では本発明は胎児の染色体異常を検出する方法であって、前記胎児を宿している母親に由来する血液試料を提供すること、少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルを前記試料中に定量的に検出すること、同じ遺伝子座にある少なくとも１つの母方ＨＬＡアレルを前記試料中に定量的に検出すること、前記母方ＨＬＡアレルと前記非母方ＨＬＡアレルの量を比較することにより前記試料中の胎児核酸の濃度を決定することを含む方法によって前記試料中の胎児核酸分率を決定すること、異常が疑われる少なくとも１つの染色体の遺伝子座を前記試料中に定量的に検出すること、前のステップで検出された前記染色体遺伝子座が二番目のステップで決定された胎児ＤＮＡの濃度と比べて異常な量で存在するか判定し、それによって前記染色体異常を検出することを含む前記方法である。この実施形態の変形例では前記少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルはＨＬＡ−Ａのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｂのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｃのエクソン２とエクソン３、ＤＱＡ１のエクソン２、ＤＱＢ１のエクソン２とエクソン３、ＤＰＡ１のエクソン２、ＤＰＢ１のエクソン２、ＤＲＢ１のエクソン２、ＤＲＢ３のエクソン２、ＤＲＢ４のエクソン２、及びＤＲＢ５のエクソン２、又は前記遺伝子のエクソン配列とイントロン配列の組合せをはじめとするＨＬＡ−Ａアレル、ＨＬＡ−Ｂアレル、ＨＬＡ−Ｃアレル、ＤＲＢ１アレル、ＤＲＢ３アレル、ＤＲＢ４アレル、ＤＲＢ５アレル、ＤＱＡ１アレル、ＤＱＢ１アレル、ＤＰＡ１アレル、及びＤＰＢ１アレルから選択される。この実施形態の変形例では同じ遺伝子座にある前記非母方ＨＬＡアレルと前記母方ＨＬＡアレルは２つ、３つ、又はそれより多くの遺伝子座において、例えば、ＤＰＢ１遺伝子、ＤＱＢ１遺伝子及びＤＲＢ１遺伝子から検出される。幾つかの実施形態ではシーケンシング、特にクローンシーケンシングを含み、且つ、所望によりクローン増幅ステップを含んでもよい方法によって前記ＨＬＡアレルが定量的に検出される。幾つかの実施形態では前記クローン増幅ステップは、それぞれアダプター配列とＨＬＡハイブリダイズ配列を含むフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて実施される。幾つかの実施形態では前記方法は例えば少なくとも１回のゲノムＤＮＡ増幅又はターゲットキャプチャーによる標的濃縮ステップをシーケンシングの前に含む。幾つかの実施形態では前記ＨＬＡアレルは、フォワードプライマーとリバースプライマーを使用する増幅によりＨＬＡアンプリコンを得ること、クローンシーケンシングを実施して前記ＨＬＡアンプリコンの配列を決定すること、同じ遺伝子座にある少なくとも１つの母方ＨＬＡアレルと少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルを特定すること、母方ＨＬＡ配列クローンと非母方ＨＬＡ配列クローンの数を比較することにより前記試料中の胎児核酸分率を決定することを含む方法によって定量的に検出される。幾つかの実施形態では前記特定ステップは前記ＨＬＡ遺伝子座にある配列をＨＬＡ配列データベースに対して比較し、前記配列を公知のＨＬＡアレルに対応する複数のビンに区分し、１つ又は２つの多数配列を母方アレルとして特定し、１つ又は２つの最も代表的な少数配列を非母方アレルとして特定するコンピューターステップを含む。幾つかの実施形態では前記比較ステップは、前記特定ステップで特定された同じ遺伝子座にあるＨＬＡアレルの総数に対する前記非母方ＨＬＡアレルの比率の２倍を計算することを含む。幾つかの実施形態では前記ＨＬＡアンプリコンの配列決定はシーケンシング・バイ・シンセシスを含む。幾つかの実施形態では同じ遺伝子座にある前記非母方ＨＬＡアレルと前記母方ＨＬＡアレルは２つ、３つ、又はそれより多くの遺伝子座、例えば、ＤＰＢ１、ＤＱＢ１及びＤＲＢ１において検出される。幾つかの実施形態では２つ、３つ、又はそれより多くの遺伝子座にある前記非母方ＨＬＡアレルと前記母方ＨＬＡアレルは多重ＰＣＲによって同じ反応体積中で同時に増幅される。幾つかの実施形態では前記ＨＬＡアレルはデジタルＰＣＲを含む方法によって定量的に検出される。幾つかの実施形態では前記ＨＬＡアレルは、それぞれ０コピーと約５コピーの間の前記標的ＨＬＡアレルを含む複数の反応体積に前記試料を分割すること、前記標的ＨＬＡアレルの存在について各反応体積をアッセイすること、同じ遺伝子座にある前記母方ＨＬＡアレルを含む反応体積の数と前記非母方ＨＬＡアレルを含む反応体積の数を比較することにより前記試料中の前記胎児核酸の分率を決定することを含む方法によって定量的に検出される。この実施形態の変形例では前記アッセイはデジタルＰＣＲによる増幅を含む。幾つかの実施形態では前記方法は一方又は両方の親について前記少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子座における遺伝子型情報を独立して得ることをさらに含む。
【０００５】
さらに別の実施形態では本発明は妊娠している患者の血液の中の胎児分率が閾値レベルを超えているか決定することにより前記患者が子癇前症を有しているか、又は子癇前症を発症する可能性があるか判定する方法であって、前記患者に由来する血液試料を提供すること、少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルを前記試料中に定量的に検出すること、同じ遺伝子座にある少なくとも１つの母方ＨＬＡアレルを前記試料中に定量的に検出すること、前記母方ＨＬＡアレルと前記非母方ＨＬＡアレルの量を比較することにより前記試料中の胎児分率を決定することを含む方法によって前記胎児分率を決定する前記方法である。この実施形態の変形例では前記少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルはＨＬＡ−Ａアレル、ＨＬＡ−Ｂアレル、ＨＬＡ−Ｃアレル、ＤＲＢ１アレル、ＤＲＢ３アレル、ＤＲＢ４アレル、ＤＲＢ５アレル、ＤＱＡ１アレル、ＤＱＢ１アレル、ＤＰＡ１アレル、及びＤＰＢ１アレル、例えば、ＨＬＡ−Ａのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｂのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｃのエクソン２とエクソン３、ＤＱＡ１のエクソン２、ＤＱＢ１のエクソン２とエクソン３、ＤＰＡ１のエクソン２、ＤＰＢ１のエクソン２、ＤＲＢ１のエクソン２、ＤＲＢ３のエクソン２、ＤＲＢ４のエクソン２、及びＤＲＢ５のエクソン２、又は前記遺伝子のエクソン配列とイントロン配列の組合せから選択される。幾つかの実施形態ではシーケンシング、特にクローンシーケンシングを含み、且つ、所望によりクローン増幅ステップを含んでもよい方法によって前記ＨＬＡアレルが定量的に検出される。幾つかの実施形態では前記クローン増幅ステップは、それぞれアダプター配列とＨＬＡハイブリダイズ配列を含むフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて実施される。幾つかの実施形態では前記方法は例えば少なくとも１回のゲノムＤＮＡ増幅又はターゲットキャプチャーによる標的濃縮ステップをシーケンシングの前に含む。幾つかの実施形態では前記ＨＬＡアレルは、フォワードプライマーとリバースプライマーを使用する増幅によりＨＬＡアンプリコンを得ること、クローンシーケンシングを実施して前記ＨＬＡアンプリコンの配列を決定すること、同じ遺伝子座にある少なくとも１つの母方ＨＬＡアレルと少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルを特定すること、母方ＨＬＡ配列クローンと非母方ＨＬＡ配列クローンの数を比較することにより前記試料中の胎児核酸分率を決定することを含む方法によって定量的に検出される。幾つかの実施形態では前記特定ステップは前記ＨＬＡ遺伝子座にある配列をＨＬＡ配列データベースに対して比較し、前記配列を公知のＨＬＡアレルに対応する複数のビンに区分し、１つ又は２つの多数配列を母方アレルとして特定し、１つ又は２つの最も代表的な少数配列を非母方アレルとして特定するコンピューターステップを含む。幾つかの実施形態では前記比較ステップは、前記特定ステップで特定された同じ遺伝子座にあるＨＬＡアレルの総数に対する前記非母方ＨＬＡアレルの比率の２倍を計算することを含む。幾つかの実施形態では前記ＨＬＡアンプリコンの配列決定はシーケンシング・バイ・シンセシスを含む。幾つかの実施形態では同じ遺伝子座にある前記非母方ＨＬＡアレルと前記母方ＨＬＡアレルは２つ、３つ、又はそれより多くの遺伝子座、例えば、ＤＰＢ１、ＤＱＢ１及びＤＲＢ１において検出される。幾つかの実施形態では２つ、３つ、又はそれより多くの遺伝子座にある前記非母方ＨＬＡアレルと前記母方ＨＬＡアレルは多重ＰＣＲによって同じ反応体積中で同時に増幅される。幾つかの実施形態では前記ＨＬＡアレルはデジタルＰＣＲを含む方法によって定量的に検出される。幾つかの実施形態では前記ＨＬＡアレルは、それぞれ０コピーと約５コピーの間の前記標的ＨＬＡアレルを含む複数の反応体積に前記試料を分割すること、前記標的ＨＬＡアレルの存在について各反応体積をアッセイすること、同じ遺伝子座にある前記母方ＨＬＡアレルを含む反応体積の数と前記非母方ＨＬＡアレルを含む反応体積の数を比較することにより前記試料中の前記胎児核酸の分率を決定することを含む方法によって定量的に検出される。この実施形態の変形例では前記アッセイはデジタルＰＣＲによる増幅を含む。幾つかの実施形態では前記方法は一方又は両方の親について前記少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子座における遺伝子型情報を独立して得ることをさらに含む。
【０００６】
この実施形態のさらに別の変形例では本発明は子癇前症の発症について妊娠している患者をモニターする方法であって、前記患者の血液の中の胎児分率を上に記載される方法により定期的に決定し、胎児分率の増加が検出される場合に前記患者は子癇前症を有する、又は子癇前症を発症する可能性があると診断することによる前記方法である。この実施形態の変形例では前記少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルはＨＬＡ−Ａアレル、ＨＬＡ−Ｂアレル、ＨＬＡ−Ｃアレル、ＤＲＢ１アレル、ＤＲＢ３アレル、ＤＲＢ４アレル、ＤＲＢ５アレル、ＤＱＡ１アレル、ＤＱＢ１アレル、ＤＰＡ１アレル、及びＤＰＢ１アレル、例えば、ＨＬＡ−Ａのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｂのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｃのエクソン２とエクソン３、ＤＱＡ１のエクソン２、ＤＱＢ１のエクソン２とエクソン３、ＤＰＡ１のエクソン２、ＤＰＢ１のエクソン２、ＤＲＢ１のエクソン２、ＤＲＢ３のエクソン２、ＤＲＢ４のエクソン２、及びＤＲＢ５のエクソン２、又は前記遺伝子のエクソン配列とイントロン配列の組合せから選択される。この実施形態のその他の変形例では同じ遺伝子座にある前記非母方ＨＬＡアレルと前記母方ＨＬＡアレルは２つ、３つ、又はそれより多くの遺伝子座、例えば、ＤＰＢ１、ＤＱＢ１及びＤＲＢ１において検出される。
【０００７】
さらに別の実施形態では本発明は母体血液中の胎児核酸の濃度が閾値レベルを超えているか決定することにより妊娠している患者が子癇前症を有しているか、又は子癇前症を発症する可能性があるか判定する方法であって、前記患者に由来する多量の血液試料を提供すること、前試料の体積の中に少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルを定量的に検出することにより胎児核酸の濃度を決定することを含む方法によって胎児核酸の濃度が決定される前記方法である。この実施形態の変形例では前記少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルはＨＬＡ−Ａアレル、ＨＬＡ−Ｂアレル、ＨＬＡ−Ｃアレル、ＤＲＢ１アレル、ＤＲＢ３アレル、ＤＲＢ４アレル、ＤＲＢ５アレル、ＤＱＡ１アレル、ＤＱＢ１アレル、ＤＰＡ１アレル、及びＤＰＢ１アレル、例えば、ＨＬＡ−Ａのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｂのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｃのエクソン２とエクソン３、ＤＱＡ１のエクソン２、ＤＱＢ１のエクソン２とエクソン３、ＤＰＡ１のエクソン２、ＤＰＢ１のエクソン２、ＤＲＢ１のエクソン２、ＤＲＢ３のエクソン２、ＤＲＢ４のエクソン２、及びＤＲＢ５のエクソン２、又は前記遺伝子のエクソン配列とイントロン配列の組合せから選択される。幾つかの実施形態ではシーケンシング、特にクローンシーケンシングを含み、且つ、所望によりクローン増幅ステップを含んでもよい方法によって前記ＨＬＡアレルが定量的に検出される。幾つかの実施形態では前記クローン増幅ステップは、それぞれアダプター配列とＨＬＡハイブリダイズ配列を含むフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて実施される。幾つかの実施形態では前記方法は例えば少なくとも１回のゲノムＤＮＡ増幅又はターゲットキャプチャーによる標的濃縮ステップをシーケンシングの前に含む。幾つかの実施形態では前記ＨＬＡアレルは、フォワードプライマーとリバースプライマーを使用する増幅によりＨＬＡアンプリコンを得ること、クローンシーケンシングを実施して前記ＨＬＡアンプリコンの配列を決定すること、同じ遺伝子座にある少なくとも１つの母方ＨＬＡアレルと少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルを特定すること、母方ＨＬＡ配列クローンと非母方ＨＬＡ配列クローンの数を比較することにより前記試料中の胎児核酸分率を決定することを含む方法によって定量的に検出される。幾つかの実施形態では前記特定ステップは前記ＨＬＡ遺伝子座にある配列をＨＬＡ配列データベースに対して比較し、前記配列を公知のＨＬＡアレルに対応する複数のビンに区分し、１つ又は２つの多数配列を母方アレルとして特定し、１つ又は２つの最も代表的な少数配列を非母方アレルとして特定するコンピューターステップを含む。幾つかの実施形態では前記比較ステップは、前記特定ステップで特定された同じ遺伝子座にあるＨＬＡアレルの総数に対する前記非母方ＨＬＡアレルの比率の２倍を計算することを含む。幾つかの実施形態では前記ＨＬＡアンプリコンの配列決定はシーケンシング・バイ・シンセシスを含む。幾つかの実施形態では同じ遺伝子座にある前記非母方ＨＬＡアレルと前記母方ＨＬＡアレルは２つ、３つ、又はそれより多くの遺伝子座、例えば、ＤＰＢ１、ＤＱＢ１及びＤＲＢ１において検出される。幾つかの実施形態では２つ、３つ、又はそれより多くの遺伝子座にある前記非母方ＨＬＡアレルと前記母方ＨＬＡアレルは多重ＰＣＲによって同じ反応体積中で同時に増幅される。幾つかの実施形態では前記ＨＬＡアレルはデジタルＰＣＲを含む方法によって定量的に検出される。幾つかの実施形態では前記ＨＬＡアレルは、それぞれ０コピーと約５コピーの間の前記標的ＨＬＡアレルを含む複数の反応体積に前記試料を分割すること、前記標的ＨＬＡアレルの存在について各反応体積をアッセイすること、同じ遺伝子座にある前記母方ＨＬＡアレルを含む反応体積の数と前記非母方ＨＬＡアレルを含む反応体積の数を比較することにより前記試料中の前記胎児核酸の分率を決定することを含む方法によって定量的に検出される。この実施形態の変形例では前記アッセイはデジタルＰＣＲによる増幅を含む。幾つかの実施形態では前記方法は一方又は両方の親について前記少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子座における遺伝子型情報を独立して得ることをさらに含む。
【０００８】
さらに別の実施形態では本発明は疾患状態に関連するアレルの胎児中の存在又はホモ接合状態を検出する方法であって、前記胎児を宿している母親に由来する血液試料を提供すること、少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルを前記試料中に定量的に検出すること、同じ遺伝子座にある少なくとも１つの母方ＨＬＡアレルを前記試料中に定量的に検出すること、前記母方ＨＬＡアレルと前記非母方ＨＬＡアレルの量を比較することにより前記試料中の前記非母方ＨＬＡアレル分率を決定することを含む方法によって前記試料中の非母方ＨＬＡアレル分率を決定すること、前記疾患状態に関連する前記アレルを前記試料中に定量的に検出すること、前記疾患状態に関連する前記アレルの量を前記非母方ＨＬＡアレル分率と比較することにより疾患状態に関連する前記アレルが前記胎児に１コピーで存在するのか、２コピーで存在するのか、又は存在しないのか決定することを含む前記方法である。この実施形態の変形例では前記少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルはＨＬＡ−Ａアレル、ＨＬＡ−Ｂアレル、ＨＬＡ−Ｃアレル、ＤＲＢ１アレル、ＤＲＢ３アレル、ＤＲＢ４アレル、ＤＲＢ５アレル、ＤＱＡ１アレル、ＤＱＢ１アレル、ＤＰＡ１アレル、及びＤＰＢ１アレル、例えば、ＨＬＡ−Ａのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｂのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｃのエクソン２とエクソン３、ＤＱＡ１のエクソン２、ＤＱＢ１のエクソン２とエクソン３、ＤＰＡ１のエクソン２、ＤＰＢ１のエクソン２、ＤＲＢ１のエクソン２、ＤＲＢ３のエクソン２、ＤＲＢ４のエクソン２、及びＤＲＢ５のエクソン２、又は前記遺伝子のエクソン配列とイントロン配列の組合せから選択される。幾つかの実施形態ではシーケンシング、特にクローンシーケンシングを含み、且つ、所望によりクローン増幅ステップを含んでもよい方法によって前記ＨＬＡアレルが定量的に検出される。幾つかの実施形態では前記クローン増幅ステップは、それぞれアダプター配列とＨＬＡハイブリダイズ配列を含むフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて実施される。幾つかの実施形態では前記方法は例えば少なくとも１回のゲノムＤＮＡ増幅又はターゲットキャプチャーによる標的濃縮ステップをシーケンシングの前に含む。幾つかの実施形態では前記ＨＬＡアレルは、フォワードプライマーとリバースプライマーを使用する増幅によりＨＬＡアンプリコンを得ること、クローンシーケンシングを実施して前記ＨＬＡアンプリコンの配列を決定すること、同じ遺伝子座にある少なくとも１つの母方ＨＬＡアレルと少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルを特定すること、母方ＨＬＡ配列クローンと非母方ＨＬＡ配列クローンの数を比較することにより前記試料中の胎児核酸分率を決定することを含む方法によって定量的に検出される。幾つかの実施形態では前記特定ステップは前記ＨＬＡ遺伝子座にある配列をＨＬＡ配列データベースに対して比較し、前記配列を公知のＨＬＡアレルに対応する複数のビンに区分し、１つ又は２つの多数配列を母方アレルとして特定し、１つ又は２つの最も代表的な少数配列を非母方アレルとして特定するコンピューターステップを含む。幾つかの実施形態では前記比較ステップは、前記特定ステップで特定された同じ遺伝子座にあるＨＬＡアレルの総数に対する前記非母方ＨＬＡアレルの比率の２倍を計算することを含む。幾つかの実施形態では前記ＨＬＡアンプリコンの配列決定はシーケンシング・バイ・シンセシスを含む。幾つかの実施形態では同じ遺伝子座にある前記非母方ＨＬＡアレルと前記母方ＨＬＡアレルは２つ、３つ、又はそれより多くの遺伝子座、例えば、ＤＰＢ１、ＤＱＢ１及びＤＲＢ１において検出される。幾つかの実施形態では２つ、３つ、又はそれより多くの遺伝子座にある前記非母方ＨＬＡアレルと前記母方ＨＬＡアレルは多重ＰＣＲによって同じ反応体積中で同時に増幅される。幾つかの実施形態では前記ＨＬＡアレルはデジタルＰＣＲを含む方法によって定量的に検出される。幾つかの実施形態では前記ＨＬＡアレルは、それぞれ０コピーと約５コピーの間の前記標的ＨＬＡアレルを含む複数の反応体積に前記試料を分割すること、前記標的ＨＬＡアレルの存在について各反応体積をアッセイすること、同じ遺伝子座にある前記母方ＨＬＡアレルを含む反応体積の数と前記非母方ＨＬＡアレルを含む反応体積の数を比較することにより前記試料中の前記胎児核酸の分率を決定することを含む方法によって定量的に検出される。この実施形態の変形例では前記アッセイはデジタルＰＣＲによる増幅を含む。幾つかの実施形態では前記方法は一方又は両方の親について前記少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子座における遺伝子型情報を独立して得ることをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例６に記載されるＨＬＡ遺伝子座のｄｄＰＣＲ分析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
定義
「アレル」という用語は遺伝子の配列変異体を指す。１つ以上の遺伝的差異がアレルを構成する。ＨＬＡアレルについて、通常は複数の遺伝的差異がアレルを構成する（すなわち、大半のアレルは１つより多くの塩基によって相互に異なる）。本明細書において使用される場合、母方アレルは母親に存在する２つのアレルのうちの一方である。非母方アレルは胎児に存在するが、母親には存在しないアレルである。非母方アレルは胎児に存在する父方アレルであり得る。非母方アレルはどちらかの親における減数分裂時の相同組換え若しくは遺伝子変換、又は生殖細胞系突然変異により生じ、胎児に伝えられた新規のアレルでもあり得る。非母方アレルは胎児への遺伝物質に寄与しているドナー、例えば、卵ドナーに由来することもあり得る。
【００１１】
「クローン分析」という文脈での「クローン」という用語は全て単一の分子に由来する分子集合又は分子集団を別々に分析することを指す。例えば、「クローンシーケンシング」は同じ分子（標的アンプリコン）から得られた各アンプリコンを個別に配列解析することを指す。
【００１２】
「ディープシーケンシング」という用語は一回の検査で標的配列が複数回読まれるシーケンシング方法を指す。一回のディープシーケンシングの実行は、同じ標的配列に対して実行され、それぞれが独立した配列読み出し情報を生成する多数のシーケンシングから構成される。
【００１３】
「デジタル分析」又は「デジタル希釈」という文脈での「デジタル」という用語は試料に存在する複数の個々の分子の各々を分析することを指す。デジタル希釈は前記試料を各反応体積に平均で１個以下の分子が存在する複数の反応体積に分配することを指す。幾つかの例ではデジタル希釈によりデジタル式の情報読み出しが可能になり、例えば、それぞれ個々の分子からイエス／ノーの結果を得ること、及びクローン配列の数を数えることにより分子集団から得られたデジタル式の結果を表にすることが可能になる。
【００１４】
「デジタルドロップレットＰＣＲ」又は「ｄｄＰＣＲ」という用語は試料のデジタル希釈により生じる複数の反応体積（「ドロップレット」）において実施されるＰＣＲを指す。
【００１５】
「胎児分率」という用語は全核酸の中の胎児核酸の割合を指す。例えば、胎児分率は母体血漿に存在する（又は母体血漿から単離された）全ＤＮＡの中の胎児ＤＮＡの割合を表し得る。ヘテロ接合性の胎児について、胎児アレルのうちの一方の分率は胎児分率の半分であることが理解される。
【００１６】
「母体」及び「母親」という用語は胎児を宿している女性を指す。本発明の方法は胎児の遺伝上の母親、並びに遺伝的には関係ない胎児、例えば、ドナー卵に由来する胎児又は他の場合ではドナーの遺伝物質を担持する胎児を宿している女性の両者に適用可能である。
【００１７】
「多型」という用語はゲノム配列又はコードされているアミノ酸配列の２つ以上の変異体を集団の中に見出すことができる状態を指す。「単一ヌクレオチド多型」（ＳＮＰ）は配列中の変異がゲノム配列中の単一多型ヌクレオチド部位からなる多型である。
【００１８】
「遺伝子型」という用語は個体又はその個体から得られた試料に含まれる１つ以上の遺伝子の１つ以上のアレルの組合せを指す。
【００１９】
「ハプロタイプ」という用語は個体の同じ染色体上に存在する１つ以上の遺伝子の１つ以上のアレルの組合せを指す。
【００２０】
「ＨＬＡ遺伝子の遺伝子型を決定すること」という用語は対象中のＨＬＡアレルの選択された組合せを決定することを指す。例えば、本発明では「ＨＬＡ−Ａ遺伝子の遺伝子型を決定すること」は、エクソン、例えば、ＨＬＡ−Ａ遺伝子のエクソン２、エクソン３及びエクソン４のうちの１つ以上に存在する多型性残基（アレル決定要素）のうちの少なくとも１つを特定することを指す。同様にＨＬＡ−Ｂ遺伝子、ＨＬＡ−Ｃ遺伝子、ＤＲＢ１遺伝子、ＤＲＢ３遺伝子、ＤＲＢ４遺伝子、ＤＲＢ５遺伝子、ＤＰＢ１遺伝子、ＤＰＡ１遺伝子、ＤＱＡ１遺伝子及びＤＱＢ１遺伝子の遺伝子型を決定することができる。
【００２１】
「標的領域」という用語は分析される核酸配列領域を指す。
【００２２】
「核酸」という用語は天然型と非天然型の両方のヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド）の重合体を指す。その用語はその重合体の長さ（例えば、単量体の数）によって制限されることがない。核酸は一本鎖でも二本鎖でもよく、幾つかの事例ではヌクレオチド類似体が他の結合を有する場合があり得るが、一般に５’−３’ホスフォジエステル結合を含む。核酸は天然型塩基（アデノシン、グアニジン、シトシン、ウラシル及びチミジン）並びに非天然型塩基を含み得る。「非天然型ヌクレオチド」又は「修飾型ヌクレオチド」という用語は修飾型窒素塩基、修飾型糖又は修飾型ホスフェート基を含むヌクレオチド、又はヌクレオチドの構造に非天然型部分を組み込んでいるヌクレオチドを指す。非天然型ヌクレオチドの例にはジデオキシヌクレオチド、ビオチン化ヌクレオチド、アミノ化ヌクレオチド、脱アミノ化ヌクレオチド、アルキル化ヌクレオチド、ベンジル化ヌクレオチド及びフルオロフォア標識ヌクレオチドが挙げられる。
【００２３】
「プライマー」という用語は、通常は適切な緩衝液、核酸前駆体と１つ以上の所望による補因子の存在、及び適切な温度を含む適切な条件の下での核酸ポリメラーゼによるＤＮＡ合成の開始点として作用する短い核酸（オリゴヌクレオチド）を指す。プライマーは通常は標的配列に対して少なくとも実質的に相補的である少なくとも１つの標的ハイブリダイズ領域を含む。この領域は通常は約１５〜約４０ヌクレオチドの長さである。
【００２４】
プライマーの「アダプター領域」又は「アダプター」という用語は通常は標的ハイブリダイズ領域の５’に位置するプライマーの領域を指す。アダプターはその後の分析ステップにおいて機能を果たすのが典型的である。例えば、アダプターは増幅に、例えば、エマルジョンＰＣＲに使用される微粒子又は他の固形面に結合したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしてよい。アダプターはその後のステップにおいて使用されるプライマー、例えば、シーケンシングプライマーの結合部位として機能することもできる。アダプター領域は通常は１５〜３０ヌクレオチドまでの長さである。
【００２５】
「個体識別タグ」、「識別タグ」、「多重識別タグ」又は「ＭＩＤ」という用語は特定の試料から得られたＤＮＡのマーカーとして機能するプライマー領域を指すために本明細書において互換的に使用される。
【００２６】
「増幅条件」という用語はハイブリダイゼーションと鋳型依存的プライマー伸長を可能にする核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ増幅）における条件を指す。「アンプリコン」という用語は、標的核酸配列の全て又は断片を含み、且つ、あらゆる適切な増幅方法によるインビトロ増幅の産物として形成される核酸分子を指す。様々なＰＣＲ条件がＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ｍ．Ａ．  Ｉｎｎｉｓ、Ｄ．Ｈ．  Ｇｅｌｆａｎｄ、及びＪ．Ｊ．  Ｓｎｉｎｓｋｙ編、１９９５年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、カリフォルニア州）の第１４章、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｍ．Ａ．  Ｉｎｎｉｓ、Ｄ．Ｈ．  Ｇｅｌｆａｎｄ、Ｊ．Ｊ．  Ｓｎｉｎｓｋｙ、及びＴ．Ｊ．  Ｗｈｉｔｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９０年）に記載されている。
【００２７】
「試料」という用語は個体に由来する核酸を含む、又は含むと考えられるあらゆる組成物を指す。本発明の背景では胎児分率が決定される試料は母体血液及び母体血液から得られる画分、例えば、血漿である。しかしながら、本発明のある特定の態様について、例えば、親の遺伝子型の決定について、限定されないが、皮膚、血漿、血清、全血、及び血液成分、唾液、尿、涙液、精液、膣液及び他の液体、及びパラフィン包埋組織をはじめとする組織を含む他のあらゆる種類の生体試料を使用することができる。試料は個体から得られた細胞のインビトロ培養物の構成物及び成分も含み得る。
【００２８】
核酸シーケンシングに関して「有効リード」という用語は特定のゲノム配列への割り当てに成功した（エラー補正を含む、又は含まない）配列リードを指す。ＨＬＡアレルを参照すると、有効リードは試料に存在することが予期されるＨＬＡアレルのうちの１つへの割り当てに成功した（エラー補正を含む、又は含まない）配列リードである。試料に存在することが予期されるいずれのアレルにも、又はＩＭＧＴ  ＨＬＡ配列データベース内の配列のいずれにも割り当てることができないリードは無効リードである。
【００２９】
本発明はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座の独特な性質を用いて胎児分率を推定する方法を提供する。ＨＬＡ領域の遺伝子（ＨＬＡ遺伝子）はヒトゲノムの中で最も多型性である。ＨＬＡ領域は６番染色体の短腕上のおよそ３５０万塩基対に及ぶ。主要な領域はクラスＩ領域とクラスＩＩ領域である。クラスＩ遺伝子はＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃであり、主要なクラスＩＩ遺伝子はＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ及びＨＬＡ−ＤＲである。タンパク質レベルで発現される多型はＨＬＡ抗原のアミノ酸配列に反映され、したがって、移植の組織タイピングにとって非常に興味深い。これらの多型は主にクラスＩＩ遺伝子のエクソン２及びクラスＩ遺伝子のエクソン２とエクソン３に局在する。しかしながら、胎児分率の決定という目的にはサイレント変化（アミノ酸変化を生じないヌクレオチド変化）並びにＨＬＡ遺伝子のイントロンと他の非コード領域の変化を含む全ての多型が有用である。
【００３０】
検出する標的非母方配列としてＨＬＡ遺伝子座を選択することは、既存の標的を選択することよりもかなり優れている。したがって、本発明は胎児分率を決定する既存の方法に対するかなりの改善である。例えば、Ｙ染色体配列を検出する方法は女性の胎児を除外してしまう。対照的に、ＨＬＡ遺伝子は常染色体（６番染色体）上に局在し、したがって、両性において検出され得る。加えて、Ｙ染色体マーカーと違って父親と母親の両方がＨＬＡ遺伝子を有しているので、胎児分率の計算において分子の中の配列リードは分母の中の配列リードと同じアンプリコンに由来する。広く使用されているＳＮＰベースの方法（例えば、米国特許出願番号第１２／６４４３８８号明細書）は母方配列と胎児配列の間の単一のヌクレオチドの差（ＳＮＰ）を検出することを目指している。さらに、大半の増幅技術及びシーケンシング技術は誤りがちであり、認められた多数の単一ヌクレオチド変化は人為的結果であり、本当のＳＮＰではない。対照的に、ＨＬＡアレルは複数のヌクレオチドによって相互に異なる。したがって、ＨＬＡ遺伝子座内のアレルの検出を含む方法は非ＨＬＡ遺伝子座内のアレルの検出を含む方法と比べて誤りにくい。現在利用可能なＨＬＡ遺伝子型決定方法、例えば、クローンシーケンシングを使用する方法はエクソン内の多重連鎖多型相を設定することができ、各ＨＬＡアレルの配列の明確な決定を可能にする。この特徴は母体ＤＮＡからの胎児ＤＮＡの識別と胎児分率の正確な定量に対してさらに高い程度の正確性を加える。
【００３１】
本発明は母体血液又は母体血漿に存在する無細胞性ＤＮＡの中の変異型（非母方）ＨＬＡ配列の分率又は量を定量する方法である。
【００３２】
前記方法は母方ＨＬＡ配列又はＨＬＡ配列の総量と比較した非母方ＨＬＡ配列の割合を決定することにより胎児ＤＮＡの割合（胎児分率）の推定値を得ることをさらに含む。１つの実施形態では前記方法は胎児異数性を決定するための基準として前記推定胎児分率を使用することをさらに含む。他の実施形態では前記推定胎児分率は不充分な量の胎児ＤＮＡを有する試料を拒絶する（すなわち、診断法から排除する）ための閾値として使用される。さらに別の実施形態では前記方法は子癇前症になる可能性を診断するために胎児ＤＮＡの推定胎児分率又は量又は濃度を使用することを含む。この実施形態の変形例では前記方法は胎児ＤＮＡの胎児分率又は量又は濃度をモニターすることをさらに含み、且つ、増加が検出された場合は子癇前症を有する、又は子癇前症を発症する可能性があるものとその患者を特定する。さらに別の実施形態では前記方法は胎児におけるあるアレルの存在又はホモ接合状態を決定するために前記推定胎児分率を使用することを含む。この実施形態の変形例では前記方法は胎児におけるある劣性アレルのホモ接合状態（例えば、死亡率と罹患率に関連する状態）の検出を含む。この実施形態の他の変形例では前記方法は胎児内に１コピーのあるアレル（例えば、劣性アレルの保有者状態、又は常染色体優性アレル若しくはハプロ不全アレルについては死亡率と罹患率に関連する状態）を検出することを含む。ＨＬＡマーカーを用いて決定される胎児分率の正確で精密な推定値は突然変異性疾患関連アレルについて得られた結果の解釈のうえで重要である。あらゆる多型性ＨＬＡ遺伝子又はＨＬＡ遺伝子座を本発明の方法について使用してよい。幾つかの実施形態ではそのＨＬＡ遺伝子はＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＤＲＢ１、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４、ＤＲＢ５、ＤＱＡ１、ＤＱＢ１、ＤＰＡ１、及びＤＰＢ１から選択される。幾つかの実施形態ではＨＬＡ遺伝子の特定のエクソン又はエクソンの一部、例えば、ＨＬＡ−Ａのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｂのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｃのエクソン２とエクソン３、ＤＱＡ１のエクソン２、ＤＱＢ１のエクソン２とエクソン３、ＤＰＡ１のエクソン２、ＤＰＢ１のエクソン２、ＤＲＢ１のエクソン２、ＤＲＢ３のエクソン２、ＤＲＢ４のエクソン２、及びＤＲＢ５のエクソン２が標的とされる。他の実施形態では多型性ＨＬＡ遺伝子配列はイントロン配列、又はエクソン配列とイントロン配列の組合せを含む。
【００３３】
幾つかの実施形態では複数のＨＬＡ遺伝子又はＨＬＡ遺伝子座を遺伝子パネルの形で同じ反応において分析する。１つの実施形態ではそのパネルは、密接に連鎖しておらず、且つ、連鎖不平衡状態にない遺伝子配列から形成される。このアプローチは親のＨＬＡ遺伝子型が不明であるときに特に有利である。すなわち、幾つかの非連鎖遺伝子座を使用することで少なくとも幾つかの遺伝子座に情報価値がある（すなわち、母親と胎児の間で多型性であり、あるアレルが胎児に存在するが、母親には存在しない）ことが確実になる。例えば、この実施形態の変形例ではＤＰＢ１遺伝子とＤＱＢ１遺伝子の配列、又はＤＰＢ１遺伝子とＤＲＢ１遺伝子の配列を同時に分析する。別の実施形態では前記パネルは強度の連鎖不平衡状態にある密接に連鎖した遺伝子配列から形成される。このアプローチにより、母方アレルとは異なる公知のＨＬＡアレルに対応する配列を作り出す母方配列のシーケンシングエラーなどの実験エラーが認識され、「シグナル」ではなく「ノイズ」として廃棄されることが確実になる。例えば、ＤＱＡ１遺伝子座に由来する配列リードが１塩基だけ母方アレルと異なる場合にこれらの配列リードは原則として胎児ＤＮＡに存在する不明の父方アレルを反映するか、又は対照的に母方アレルのシーケンシングエラーを反映する場合があり得る。これらのＤＱＡ１非母方配列が実際に胎児ＤＮＡに由来する場合、公知の連鎖不平衡パターンに基づいて胎児がある特定のＤＱＢ１アレル又はＤＲＢ１アレルを有すると予期されることになる。非母方ＤＱＡ１配列が実際にシーケンシングエラーである場合、母方のＤＱＢ１配列又はＤＲＢ１配列における独立したシーケンシングエラーがその予期されたＤＱＢ１アレル又はＤＲＢ１アレルを生成する可能性は非常に低い。このことにより、父方アレルが不明である場合に胎児アレルを区別することが可能になり、且つ、公知のＨＬＡアレルに対応する配列を生じる母方アレルのシーケンシングエラーからこの胎児アレルを区別することが可能になる。例えば、この実施形態の変形例ではＤＱＢ１遺伝子とＤＲＢ１遺伝子の配列を同時に分析する。さらに別の実施形態では本発明は、相互に連鎖不平衡状態である２つ以上の遺伝子及び残りの遺伝子と連鎖不平衡状態ではない少なくとも１つの遺伝子を含むＨＬＡ遺伝子の組合せを検出することを含む。例えば、この実施形態の変形例ではＤＰＢ１遺伝子、ＤＱＢ１遺伝子及びＤＲＢ１遺伝子の配列を同時に分析する。ＤＱＢ１とＤＲＢ１は相互に連鎖不平衡状態であるが、ＤＰＢ１はＤＱＢ１又はＤＲＢ１と強度の連鎖不平衡状態にはない。
【００３４】
並行反応で同時分析を実施することができ、又は１つの多重反応、例えば、幾つかの増幅プライマーが同じ反応体積に存在するゲノムＰＣＲに別々の反応をまとめることにより同時分析を実施することができる。幾つかの実施形態では本発明の方法は試料中の母方ＨＬＡアレルと非母方ＨＬＡアレルの定量的検出を可能にするシーケンシングステップを含む。この実施形態では、母体血漿又は母体血液中の全ＤＮＡのわずかな割合（数パーセント）しか胎児に由来しないことが予期されるので、前記方法は「ディープシーケンシング」を必要とする。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）法（大量並行シーケンシング（ＭＰＳ）法としても知られる）は数百万の個々のＤＮＡ分子を並行してクローン的に増やす。次に各クローン集団を個別に配列解析する。時折、ＮＧＳ（ＭＰＳ）法はクローンシーケンシングと呼ばれる。その技術の進歩により、最大で２５０ヌクレオチド、さらに近年は最大で７００ヌクレオチドものこれまでよりも長い配列リードが可能になった。しかしながら、無細胞性胎児ＤＮＡは短い断片で存在し、大部分が約１６０塩基対長である（米国特許出願番号第１２／９４０９９２号明細書を参照のこと）。そのような短い標的配列のため、現在存在するシーケンシング技術の確かな成績が確実になる。
【００３５】
本発明の方法のディープシーケンシングステップは標的濃縮ステップを必要とする。幾つかの実施形態ではその標的濃縮ステップは増幅ステップを含む。他の実施形態では他の標的濃縮方法、例えば、ライブラリーベース又はプローブベースの標的濃縮方法であって例えば米国特許第７８６７７０３号明細書又は第８３８３３３８号明細書に記載される方法を使用する。少なくとも１回の増幅、例えば、１回目の増幅を当技術分野において知られているあらゆる方法によって実施することができる。幾つかの実施形態では１回より多くの増幅、例えば、２回の増幅を実施する。この実施形態の変形例では同じプライマーを使用して後続の回の増幅、例えば、ＰＣＲによる増幅を実施する。この実施形態の他の変形例ではそれらのプライマーはＨＬＡ配列に向かって３’方向にさらに延びている（ネステッドプライマー）か、５’末端に追加配列、例えば、非ＨＬＡ配列を有するかのどちらかにより異なっている。
【００３６】
幾つかの実施形態では濃縮された標的を当技術分野において知られているあらゆる適切な方法によるクローン増幅の対象とする。幾つかの実施形態ではそのクローン増幅は米国特許出願番号第１２／２４５６６６号明細書に詳細に記載されるエマルジョンＰＣＲを含む。簡単に説明すると、エマルジョンＰＣＲ時に前回の増幅に由来するアンプリコンは、例えば、前回の増幅において使用されたプライマーのアダプター領域へのハイブリダイゼーションを介してそのアンプリコンにハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドと結合した固相（例えば、ビーズ）と接触する。結果としてそのビーズはそのビーズ上に存在する前記アダプター領域にハイブリダイズしてアニールしたアンプリコンを担持する。次にそれらのビーズを水性溶液に懸濁し、油を添加して乳液を生成する。各ビーズは、クローン増幅ラウンドの実施に必要な全ての試薬を含む油封化微小液滴の中に懸濁される。各微小液滴は増幅反応のための反応室を封入する。この実施形態の変形例では２種類のビーズを使用する。１種類はアンプリコンの２本のストランドのうちの一方にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドに結合しており、２つ目の種類はそのアンプリコンの他方のストランドにハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドに結合している。他の実施形態では前記クローン増幅は例えば、米国特許第７８３５８７１号明細書、第８２４４４７９号明細書、第８３１５８１７号明細書及び第８４１２４６７号明細書に記載される二次元平面ベースの（例えば、スライドベースの）増幅を含む。一般に、利用可能な、又は利用可能になるクローン増幅のあらゆる方法が本発明の範囲内である。
【００３７】
本発明の方法はＨＬＡ遺伝子であるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＤＲＢ１、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４、ＤＲＢ５、ＤＱＡ１、ＤＱＢ１、ＤＰＡ１、及びＤＰＢ１の配列の一部を標的とする（すなわち、特異的にハイブリダイズし、増幅することができる）プライマーの使用を含む。幾つかの実施形態ではそれらのプライマーはＨＬＡ遺伝子のある特定のエクソン又はイントロン、例えば、ＨＬＡ−Ａのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｂのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｃのエクソン２とエクソン３、ＤＱＡ１のエクソン２、ＤＱＢ１のエクソン２とエクソン３、ＤＰＡ１のエクソン２、ＤＰＢ１のエクソン２、ＤＲＢ１のエクソン２、ＤＲＢ３のエクソン２、ＤＲＢ４のエクソン２、及びＤＲＢ５のエクソン２を標的とする。他の実施形態ではそれらのプライマーは対になってエクソン配列とイントロン配列の組合せを標的とする。幾つかの実施形態では表１に記載される１つ以上のプライマーが使用される。表１において示されているように、幾つかのプライマーは遺伝子特異的である、すなわち、ただ１つの遺伝子から配列を増幅することができる。他のプライマーは汎用品である、すなわち、１つより多くの遺伝子から配列を増幅することができる。
【００３８】
幾つかの実施形態では試料中の胎児分率を決定するために同じ遺伝子座にある母方ＨＬＡアレルと非母方ＨＬＡアレルの量をデジタルドロップレットＰＣＲにより定量的に決定する。デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）により非常に低い濃度であっても試料中の標的核酸の絶対的測定が可能になる。ｄｄＰＣＲ法はデジタル希釈ステップ又はドロップレット生成ステップ、ＰＣＲ増幅ステップ、検出ステップ、及び（所望により）分析ステップを含む。ドロップレット生成ステップは、それぞれ核酸増幅の実施に必要な試薬を含む複数の個々の反応体積（ドロップレット）の生成を含む。ＰＣＲ増幅ステップはそれらのドロップレット（又はドロップレットが入っているより大きな反応体積）を核酸標的の増幅に適切な熱サイクリング条件の対象としてアンプリコンを生成することを含む。検出ステップはアンプリコンを含むドロップレット（又はドロップレットが入っているより大きな反応体積）と含まないドロップレット（又はドロップレットが入っているより大きな反応体積）の特定を含む。分析ステップは例えば試料中の標的核酸の濃度、絶対量又は（別の標的に対して比較した）相対量をもたらす定量を含む。
【００３９】
手作業で（すなわち、汎用機器を使用して）ｄｄＰＣＲステップを実施することができ、又は例えばバイオラッド・ラボラトリーズ社（ハーキュリーズ、カリフォルニア州）又はＲａｉｎＤａｎｃｅ  Ｔｅｃｈ．社（ビレリカ、マサチューセッツ州）から入手可能なｄｄＰＣＲ装置、又は利用可能な、若しくは利用可能になる類似の装置などの特殊な装置を用いてｄｄＰＣＲステップを実施することができる。幾つかの実施形態では特殊な装置を用いて全ｄｄＰＣＲステップを実施する。他の実施形態では例えば手動又は自動の汎用ピペッティング装置、サーマルサイクラー、電気泳動装置等から選択される汎用機器を用いて１つ以上のステップ、例えば、デジタル希釈、熱サイクリング、検出及び分析を実施する。
【００４０】
核酸を検出するあらゆる汎用手段又は配列特異的手段によりｄｄＰＣＲ産物の検出を実施することができる。その検出は反応体積内で行われてもよいし、電気泳動又はクロマトグラフィーなどの追加のステップの後に行われてもよい。その検出は増幅時に行われてもよいし（リアルタイムＰＣＲ）、増幅の完了の後に行われてもよい（エンドポイントＰＣＲ）。プライマー又はプローブなどのＰＣＲ試薬に検出可能標識を結合させることができる。その標識は分光的技術、光化学的技術、生化学的技術、免疫化学的技術、化学的技術により検出可能であり得、又は他の技術を使用することができる。例示のため、有用な標識には放射性同位体、蛍光色素、高電子密度試薬、（ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されている）酵素、ハプテン、及び抗血清又はモノクローナル抗体が利用可能であるタンパク質が含まれる。標識ＰＣＲ試薬の代替として別の標識試薬、例えば、配列特異的標識プローブを使用してＰＣＲ後に検出を実施してもよい。あるいは、電気泳動とその後の染色などの核酸を検出する非特異的方法を用いることができる。
【００４１】
シーケンシングと異なり、本明細書において開示されるｄｄＰＣＲベースのアプローチはどのＨＬＡ遺伝子座が両親の間で情報価値のあるものであるか（すなわち、多型性であるか）知ることから利益を得る。幾つかの実施形態では前記方法は、情報価値のあるＨＬＡ遺伝子座を特定するために両親の遺伝子型を最初に決定するステップを含む。そのような情報が利用可能である場合、１セットのＰＣＲ試薬を使用して母体血漿試料内のその情報価値のある遺伝子座を標的とすることができる。あるいは、父方の情報が無い場合、少なくとも１つの遺伝子座が母親と胎児の間で多型性であることを期待して、母体試料がＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＤＲＢ１、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４、ＤＲＢ５、ＤＱＡ１、ＤＱＢ１、ＤＰＡ１、及びＤＰＢ１から選択される遺伝子座のうちの１つ以上を使用するｄｄＰＣＲ分析の対象とされ得る。幾つかの実施形態ではＨＬＡ遺伝子の特定のエクソン又はエクソンの一部、例えば、ＨＬＡ−Ａのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｂのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｃのエクソン２とエクソン３、ＤＱＡ１のエクソン２、ＤＱＢ１のエクソン２とエクソン３、ＤＰＡ１のエクソン２、ＤＰＢ１のエクソン２、ＤＲＢ１のエクソン２、ＤＲＢ３のエクソン２、ＤＲＢ４のエクソン２、及びＤＲＢ５のエクソン２が標的とされる。他の実施形態では多型性ＨＬＡ遺伝子配列はイントロン配列、又はエクソン配列とイントロン配列の組合せを含む。
【００４２】
現在使用されているＨＬＡプライマーはＨＬＡエクソン全体の配列を増幅及び検出することを目指している。ペプチド結合溝をコードするＨＬＡクラスＩＩエクソン（エクソン２）の平均サイズは約２７０塩基対である。したがって、典型的なＨＬＡタイピングアッセイは約３００塩基対のアンプリコンを含む（Ｂｅｎｔｌｅｙ，  Ｇ．ら（２００９年）Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ＨＬＡ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｂｙ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ誌、第７４巻：３９３頁）。対照的に、母体血液又は母体血漿に見出される胎児ＤＮＡの分断性のため、本発明のプライマーは長さが１６０塩基対よりも短い断片の配列を増幅及び検出することを目指している。本発明において使用されるプライマーは独特なことに短い無細胞性ＤＮＡを増幅する能力とＨＬＡ遺伝子の情報価値のある（すなわち、最も多型性の）領域を標的とする能力を兼ね備えている。幾つかの実施形態では表１に記載されるＨＬＡハイブリダイズ領域を有する少なくとも１つのプライマーをはじめとするプライマーを用いて本発明の方法を実施する。
【００４３】
幾つかの実施形態では塩基取込み法、例えば、パイロシークエンシング法（米国特許第６２７４３２０号明細書、第６２５８５６８号明細書及び第６２１０８９１号明細書）、水素イオン検出法（ＩＳＦＥＴ）（例えば、米国特許第８２６２９００号明細書）、又はダイターミネーター検出法（米国特許第７８３５８７１号明細書、第８２４４４７９号明細書、第８３１５８１７号明細書及び第８４１２４６７号明細書）によってアンプリコンを配列解析する。
【００４４】
本発明の方法により生成されたＨＬＡ配列データは個々のＤＮＡ分子のＨＬＡ配列を含む。本発明の方法において使用される典型的なＮＧＳ機器（例えば、ＧＳファミリー、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ブランフォード、コネチカット州、ＩＯＮ  ＰＲＯＴＯＮ（登録商標）及びＰＧＭ（商標）、ライフテクノロジーズ社、グランド・アイランド、ニューヨーク州、ＨＩＳＥＱ（登録商標）及びＭＩＳＥＱ（登録商標）、イルミナ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）は、試料に存在する各配列、例えば、試料に存在する同じ遺伝子座にある各ＨＬＡアレル配列を定量的に検出することが可能であるデータ分析モジュールを含む。次に胎児アレル配列及び母方アレル配列に対応するリード数を数えて試料内の胎児アレルと胎児ＤＮＡの分率を決定する。
【００４５】
前記コンピューターステップは通常はソフトウェアプログラムの機能を実行することが可能であるコンピューターにより実施される。クローンシーケンシングにより作成された個々の核酸配列リードの分析に利用可能である、又は利用可能になるあらゆる適切なソフトウェアを使用して本発明を実施することができる。そのソフトウェアは、独特なことにＨＬＡ配列の分析とＨＬＡ遺伝子型の割り当てに適切な特別の特徴を有することができる。例えば、ソフトウェアは公知のＨＬＡアレルのデータベースに対して試料から得られた配列リードを比較することができる。そのようなデータベースの一例は欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）において維持されているＩＭＧＴ／ＨＬＡ配列データベースである。Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（２００３年）ＩＭＧＴ／ＨＬＡ  ａｎｄ  ＩＭＧＴ／ＭＨＣ：ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ誌、第３１巻：３１１頁を参照されたい。ＨＬＡ配列リードの分析用のその典型的なソフトウェアにより、試料に存在するそれらのリードの中の多数グループが特定される。典型的なヒト試料では検査された各ＨＬＡ配列についてわずかに４グループの配列リードが、すなわち、同じ遺伝子座にある２つのＨＬＡアレルの各々のフォワードリードとリバースリードが存在する。（ホモ接合性個体に由来する試料には２つの配列だけが存在する。）本発明の背景では前記ソフトウェアは（予めプログラムされると、又はユーザーインターフェースを介した使用者の入力により）第３のアレル、すなわち、試料に存在する同じ遺伝子座にある２つの母方ＨＬＡアレルに加えた非母方（胎児）ＨＬＡアレルを特定する追加機能を実施する。前記ソフトウェアは（予めプログラムされると、又はユーザーインターフェースを介した使用者の入力により）低い濃度（通常は１％と１５％の間）で存在する少数非母方アレルを例えばＰＣＲ誤取込、シーケンシングエラー、関連偽遺伝子、試料中の少量のＤＮＡ混入汚染物質等に起因する、その非母方（胎児）アレルよりも低い濃度で存在する、例えば、０．５％よりかなり低い濃度で存在する人為的産物と識別しなくてはならない。
【００４６】
幾つかの実施形態では前記ソフトウェアはＨＬＡ配列データベースに対して配列リードを比較し、ある特定のＨＬＡ遺伝子座にある母方アレルとして２つの（又は、ホモ接合性の母親の場合は１つの）最も頻度が高い配列を特定する。本発明の範囲を限定するのではなく単に例として、Ｃｏｎｅｘｉｏ  ＨＬＡ遺伝子型決定ソフトウェア（Ｃｏｎｅｘｉｏ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社、パース、オーストラリア）は、統合整理された配列リードであって所与のアンプリコン（例えばＤＱＢ１エクソン２）の基準配列と整列させられた配列リードを比較し、且つ、観察された配列リードをＩＭＧＴ／ＨＬＡ配列データベースと比較する。そのアンプリコンに対応する全てのリードはＤＱＢ１エクソン２の「ビン」に区分され、どの１つの試料についても２つのアレル配列（２つのフォワードリードと２つのリバースリード）だけが存在することが前記ソフトウェアによって確実になる。これらの配列は「マスター・レイヤー」に区分され、遺伝子型の割り当てに使用される。人為的産物又は混入汚染物質に対応する他の全ての配列リードは通常は本当のアレルよりもかなり少なく、「フェイルド・レイヤー」に区分され、遺伝子型の割り当てには使用されない。
【００４７】
本発明の方法は１つより多くの遺伝子型、すなわち、試料に存在する２つより多くのアレルの検出を必要とする。幾つかの実施形態では前記ソフトウェアは（予めプログラムされると、又はユーザーインターフェースを介した使用者の入力により）少数成分を特定し、あるアンプリコン、例えば、ＤＱＢ１遺伝子座に対応する様々なアレルグループを表す複数の「ビン」にそれらの成分を区分する。例えば、前記方法はＤＱＢ１エクソン２について１つだけの「ビン」を有する代わりにＤＱＢ１遺伝子座にある複数のアレル（例えば、ＤＱＢ１*０１：０１、*０２：０１、*０３：０１等）について複数の「ビン」を作成することを含む。幾つかの実施形態では２よりも多い、例えば、３、４、５、６及び１５又は２０もの多くのそのようなビンが作成される。少数成分のＨＬＡタイプに対応する配列が適切なビンに区分される。概して、ノイズ（すなわち、ＰＣＲエラーとシーケンシングエラー、偽遺伝子等）は各ビンのフェイルド・レイヤーにさらに区分される。このステップは多数成分のアレル（母方アレル）の迅速な特定、並びに少数成分に対応するリードの特定を可能にする。特筆すべきことに、このアプローチは親の遺伝子型が不明であっても胎児アレルの特定に適切である。幾つかの実施形態では親の遺伝子型が知られている。そのような実施形態では特定の母方アレルと父方アレルを特定及び計数し、且つ、それらのアレルと異なる全てのリードを「フェイルド」リードとして廃棄するように前記ソフトウェアを改変することができる。
【００４８】
幾つかの実施形態では前記方法は、例えば、ＰＣＲ誤取込、シーケンシングエラー、関連偽遺伝子、試料中の少量のＤＮＡ混入汚染物質等に起因する人為的産物より生じるエラーを最少にするステップを含む。ＰＣＲエラー又はシーケンシングエラーによって母方アレルが別の公知のＨＬＡアレルに「変換」され得る可能性がある。この事象は珍しいこと、すなわち、非母方アレルの頻度よりもかなり低い頻度であることが予期されるが、幾つかの実施形態では本発明の方法はそのようなエラーを最少にするステップを含む。例えば、前記方法は強度の連鎖不平衡状態にある遺伝子、例えば、ＤＱＡ１及びＤＱＢ１の２つのアンプリコンの分析を含み得る。エラーによって多数アレルがＤＱＢ１の公知の第３の非母方アレルに対応する配列に変換された場合、母方ＤＱＡ１アレルも無作為なエラーによって人為産物であるＤＱＢ１アレルと連鎖不平衡状態にあるＤＱＡ１アレルに対応する配列に変換される可能性は非常に低い。
【００４９】
本発明は試料中の胎児核酸の分率又は濃度を決定する方法であって、少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルを前記試料中に定量的に検出すること、同じ遺伝子座にある少なくとも１つの母方ＨＬＡアレルを定量的に検出すること、及び前記母方アレル及び前記非母方アレルの量を使用して前記試料中の前記胎児分率を決定することを含む前記方法である。幾つかの実施形態では少なくとも１つのＨＬＡアレルはＨＬＡ−Ａアレル、ＨＬＡ−Ｂアレル、ＨＬＡ−Ｃアレル、ＤＲＢ１アレル、ＤＲＢ３アレル、ＤＲＢ４アレル、ＤＲＢ５アレル、ＤＱＡ１アレル、ＤＱＢ１アレル、ＤＰＡ１アレル、及びＤＰＢ１アレルから選択され、具体的には幾つかの実施形態ではそのアレルはＨＬＡ−Ａのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｂのエクソン２とエクソン３、ＨＬＡ−Ｃのエクソン２とエクソン３、ＤＱＡ１のエクソン２、ＤＱＢ１のエクソン２とエクソン３、ＤＰＡ１のエクソン２、ＤＰＢ１のエクソン２、ＤＲＢ１のエクソン２、ＤＲＢ３のエクソン２、ＤＲＢ４のエクソン２、及びＤＲＢ５のエクソン２、又はこれらの遺伝子のイントロン配列、又はこれらの遺伝子のエクソン配列とイントロン配列の組合せから選択される配列を含む。幾つかの実施形態では前記定量的検出はクローンシーケンシングを含む。幾つかの実施形態では前記方法はシーケンシングの前に標的濃縮ステップを含む。この実施形態の変形例では前記濃縮はＤＮＡ増幅によって実施される。この実施形態の他の変形例では前記濃縮はターゲットキャプチャーによって実施される。
【００５０】
前記方法は母方配列リードと非母方配列リードの量を使用して試料中の胎児分率を決定することをさらに含む。その決定ステップは母方リードに対する非母方（胎児）リードの比率、又はバックグラウンドノイズを差し引いたリードの総数に対する非母方（胎児）リードの比率を計算することを含む。その比率は２つの胎児アレルのうちの一方だけの割合を反映しているので胎児ＤＮＡ分率を得るためにその比率は２倍される。
【００５１】
本発明を一つの技術又は機器に限定するのではなく単に例として、前記方法の実施形態は下に記載されるようにＧＳ  ＦＬＸ（登録商標）、ＧＳ  ＦＬＸ＋（登録商標）、ＧＳ  ＦＬＸ  ＴＩＴＡＮＩＵＭ（登録商標）又はＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ（登録商標）（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ブランフォード、コネチカット州）をはじめとするＧＳファミリーのシーケンシング装置を使用して実施され得る。
【００５２】
この実施形態では前記標的濃縮ステップと前記シーケンシングステップは、（ａ）最初の増幅反応において５’から３’の方向で記載される次の配列、すなわち、アダプター配列、分子特定配列、及びＨＬＡハイブリダイズ配列を含む増幅プライマーを使用して多型部位を含む１つ以上のＨＬＡ−Ａ遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子、ＨＬＡ−Ｃ遺伝子、ＤＲＢ１遺伝子、ＤＲＢ３遺伝子、ＤＲＢ４遺伝子、ＤＲＢ５遺伝子、ＤＱＡ１遺伝子、ＤＱＢ１遺伝子、ＤＰＡ１遺伝子、及びＤＰＢ１遺伝子のエクソン又はイントロンを増幅すること、（ｂ）２回目の増幅反応においてエマルジョンＰＣＲを実施すること、（ｃ）パイロシークエンシングを用いてステップ（ｂ）で得られたアンプリコンの配列を決定すること、（ｄ）ステップ（ｃ）で決定されたＨＬＡアンプリコンの配列を公知のＨＬＡ配列と比較することによりそれらのＨＬＡアレルを母親又は胎児に割り当ててどのＨＬＡアレルが母体血液又は母体血漿に存在するか決定すること、（ｅ）１つ以上のＨＬＡアレルについてステップ（ｃ）で得られた各アレルに対応する胎児シーケンシングリード及び母方シーケンシングリードの数を定量すること、及び（ｆ）ステップ（ｅ）で得られた量を使用して母方リードに対する非母方（胎児）リードの比率、又はバックグラウンドを差し引いたリードの総数に対する非母方（胎児）リードの比率、又はリードの総数に対する非母方（胎児）リードの比率を計算することにより母体血液又は母体血漿に存在する胎児ＤＮＡの分率を決定することを含む。
【００５３】
この実施形態の変形例では前記方法はステップ（ａ）の後に複数の個体に由来するアンプリコンをプールし、複数の個体に由来するアンプリコンのプールに対して後続のステップ（ｂ）〜（ｃ）を実施することを含む。この変形例では前記増幅プライマーは多重識別（ＭＩＤ）タグとしても知られる個体識別タグをさらに含む。
【００５４】
他の実施形態ではあらゆる利用可能なディープシーケンシング技術及び機器（すなわち、デジタル配列読み出しが可能な技術及び機器）を使用してステップ（ｂ）〜（ｅ）又はそれらのステップの同等の事を実施することができる。限定されないが、機器の例にはＧＳファミリーの機器（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ブランフォード、コネチカット州）、ＩＯＮ  ＰＲＯＴＯＮ（登録商標）及びＰＧＭ（商標）（ライフテクノロジーズ社、グランド・アイランド、ニューヨーク州）、ＨＩＳＥＱ（登録商標）及びＭＩＳＥＱ（登録商標）（イルミナ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）又はそれらの機器のあらゆる改良型及び改変型が挙げられる。
【００５５】
幾つかの実施形態では胎児分率の決定は同じ遺伝子座にある全てのリードの総和に対する、又は試料から得られた同じ遺伝子座にある母方アレルに対応するリードに対する、又は母方アレルと胎児アレルの総和に対する非母方（胎児）アレルに対応するリードの比較を含む。幾つかの実施形態ではその比較ステップは、試料から得られた同じ遺伝子座にある全てのリードの総和に対する、又は試料から得られた同じ遺伝子座にある母方アレルに対応するリードに対する、又は母方アレルと胎児アレルの総和に対する非母方（胎児）アレルに対応するリードの比率の２倍を計算することを含む。例えば、１つの実施形態では母方アレルのリードの数がＭ１とＭ２であり、非母体胎児アレルのリードの数がＦである場合に胎児分率（ＦＦ）は式１：
ＦＦ＝２×Ｆ／（Ｍ１＋Ｍ２＋Ｆ）            式１
に従って決定され得る。
【００５６】
別の実施形態では前記リードを各アレルについてフォワード（Ｆ）シーケンシングリードとリバース（Ｒ）シーケンシングリードに分割することができる。次に胎児分率（ＦＦ）は式２：
ＦＦR＝２×ＦR／（Ｍ１R＋Ｍ２R＋ＦR）
ＦＦF＝２×ＦF／（Ｍ１F＋Ｍ２F＋ＦF）
ＦＦ＝（ＦＦR＋ＦＦF）／２              式２
に従って決定されるリバース分率（ＦＦR）とフォワード分率（ＦＦF）の平均として決定され得る。
【００５７】
非母体胎児アレルＦ及び母方アレルＭ１とＭ２のうちの一方又は両方、又はホモ接合性の母親の場合には単独の母方アレルＭを使用して胎児分率を決定するあらゆる数の類似の式を考案することができ、そのような式は本発明の範囲内である。
【００５８】
さらに別の実施形態では幾つかのＨＬＡ遺伝子座を配列解析することができる。各遺伝子座に由来するそれらのリードを使用して式１又は式２に従って胎児分率を計算することができ、その結果の各遺伝子座の胎児分率値を平均して胎児分率の推定値を得ることができる。
【００５９】
母体血液又は母体血漿の中の胎児ＤＮＡの胎児分率又は量の決定を必要とする様々な診断方法及びモニタリング方法も本発明の範囲内である。１つの実施形態では本発明は妊娠している患者が子癇前症を有しているか、又は子癇前症を発症する可能性があるか判定する方法である。前記方法は胎児分率（患者の血液中の胎児核酸の濃度）が閾値レベルを超えているか決定することを含む。この実施形態では胎児核酸の濃度は、前記患者に由来する血液試料を提供すること、前記試料内の少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルを前記試料内に定量的に検出すること、所望により同じ遺伝子座にある少なくとも１つの母方ＨＬＡアレルを前記試料中に定量的に検出すること、及び所望により前記母方ＨＬＡアレルと前記非母方ＨＬＡアレルの量を比較することによって前記試料中の胎児核酸の分率又は濃度を決定することを含む方法により決定される。その胎児分率がある特定の所定のレベルを超えていることが分かった場合、前記患者は子癇前症を有する、又は子癇前症を発症する可能性があると診断される。その所定のレベルは、例えば、同じ妊娠期間にある子癇前症を有しない患者の母体血液又は母体血漿の中の胎児ＤＮＡの胎児分率又は量であり得る。
【００６０】
この実施形態の変形例では本発明は、子癇前症の発症について妊娠している患者をモニターする方法であって、前記患者に由来する血液試料を提供すること、前記試料内の少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルを前記試料内に定量的に検出すること、所望により同じ遺伝子座にある少なくとも１つの母方ＨＬＡアレルを前記試料中に定量的に検出すること、所望により前記母方ＨＬＡアレルと前記非母方ＨＬＡアレルの量を比較することによって前記試料中の胎児核酸の胎児分率又は濃度を決定することを含む方法により決定される前記患者の血液又は血漿中の胎児核酸の胎児分率又は濃度を定期的に決定することによる前記方法を含む。定期的測定により増加が検出されると、その患者は子癇前症を有する、又は子癇前症を発症する可能性があると診断される。
【００６１】
他の実施形態では本発明は胎児染色体異常を検出する方法である。前記方法は、母親の血液試料を提供すること、少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルを前記試料中に定量的に検出すること、同じ遺伝子座にある少なくとも１つの母方ＨＬＡアレルを前記試料中に定量的に検出すること、前記母方ＨＬＡアレルと前記非母方ＨＬＡアレルの量を比較することにより前記試料中の胎児核酸分率を決定することによって胎児分率（母体血液中の胎児ＤＮＡの濃度）を決定することを含む。前記方法は、異常が疑われる少なくとも１つの染色体の遺伝子座を前記試料中に定量的に検出すること、その検出された染色体遺伝子座が歩調をそろえて決定された胎児ＤＮＡ分率と比べて異常な量で存在するか判定することにより胎児染色体異常を検出することをさらに含む。その異常な量は、同じ妊娠期間にある正倍数体の胎児の母体血液に見出される同じ遺伝子座の量と実質的に異なる量として定義される。
【００６２】
別の実施形態では本発明は疾患状態に関連するアレルの胎児中の存在又はホモ接合状態を検出する方法である。前記疾患状態は既存の疾患又はその疾患を発症する体質を含む。前記方法は、前記胎児を宿している母親に由来する血液試料を提供すること、少なくとも１つの非母方ＨＬＡアレルを前記試料中に定量的に検出すること、同じ遺伝子座にある少なくとも１つの母方ＨＬＡアレルを前記試料中に定量的に検出すること、前記母方ＨＬＡアレルと前記非母方ＨＬＡアレルの量を比較することにより前記試料中の前記非母方ＨＬＡアレル分率を決定することを含む方法によって前記試料中の非母方ＨＬＡアレル分率を決定すること、前記疾患状態に関連する前記アレルを前記試料中に定量的に検出すること、前記疾患状態に関連する前記アレルの量を前記非母方ＨＬＡアレル分率と比較することにより疾患状態に関連する前記アレルが前記胎児に１コピーで存在するのか、２コピーで存在するのか、又は存在しないのか決定することを含む。この実施形態の１つの変形例では前記方法は１つの劣性アレルを担持する胎児の保有者状態を表す一つのアレルの存在を検出することを含む。この実施形態の別の変形例では前記方法は常染色体優性アレル又はハプロ不全アレルを担持する胎児の疾患状態を表す一つのアレルの存在を検出することを含む。この実施形態の別の変形例では前記方法は胎児の疾患状態に関連する劣性アレルのホモ接合状態を前記胎児の中に検出することを含む。
実施例
【実施例１】
【００６３】
試料の収集とＤＮＡの精製
試料をヒト対象、すなわち、妊娠第三期の女性と胎児の父親から収集した。次のようにＤＮＡを調製した。全血を採取し、２週間以内に処理した。外界温度で１６００×ｇ、１０分の遠心分離により「バフィーコート」を調製した。あらゆる細胞を回避するように血漿（上清）を慎重に取り除き、１６，０００×ｇで１０分間再度遠心分離した。細胞沈殿物を乱さずに無細胞性血漿を慎重に取出し、−８０℃で保存した。製造業者の指示に従ってＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡＭＰ（登録商標）ＤＮＡ血液ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、カリフォルニア州）を使用して「バフィーコート」からＤＮＡを調製し、ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＥＧＦＲ突然変異検査キット：ＥＤＴＡ血漿プロトコル（ロッシュ・アプライド・サイエンス社、インディアナポリス、インディアナ州）により無細胞性血漿からＤＮＡを調製した。Ｏｒａｇｅｎｅ−Ｄｘキット（ＤＮＡ  Ｇｅｎｏｔｅｋ社、カナタ、オンタリオ州）を使用して唾液を収集し、製造業者の指示に従ってＤＮＡを単離した。ＧｅｎｔｒａＰＵＲＥＧＥＮＥ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、カリフォルニア州）を使用して細胞株からＤＮＡを精製した。
【実施例２】
【００６４】
両親の遺伝子型決定
Ｍｏｏｎｓａｍｙ，  Ｐ．ら（２０１３年）Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ誌、第８１巻：１４１頁によって公開された方法、又はＧＳ  ＧＴｙｐｅ  ＨＬＡプライマーＨＲキットについて記載される方法のどちらかにより、実施例１において単離されたバフィーコート由来又は唾液由来のＤＮＡを使用して両親の遺伝子型決定を実施した。ＤＱＢ１遺伝子座に情報価値があること、すなわち、父親が母親に存在しないＤＱＢ１アレルを有することが分かった。親の遺伝子型は次の通りであった。
【００６５】
【表１】
2016516449.tif 000003
【実施例３】
【００６６】
血漿由来無細胞性ＤＮＡのディープシーケンシング
１〜１０ｎｇのＤＮＡ鋳型と１０ｐｍｏｌずつのフォワードプライマーとリバースプライマー、１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ、１５０μΜずつのｄＡ、ｄＣ、ｄＧ及びｄＵＴＰ、グリセロール１０（重量／体積）％、及びＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを含む個々の２５μｌ反応においてＰＣＲ増幅を実施した。熱サイクリング条件：ＡＢＩ  ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００において９５℃で１０分；９５℃で１５秒、６０℃で４５秒、７２℃で１５秒を３１サイクル；７２℃で５分。
【００６７】
ＧＳ  ＦＬＸ（登録商標）装置と共に使用するためのプライマーは５’−３’方向に次の配置を有した：アダプター‐キータグ‐ＭＩＤ‐ＨＬＡハイブリダイズ配列。ＭＩ−ＳＥＱ（登録商標）装置と共に使用するためのプライマーは５’−３’方向に次の配置を有した：アダプター‐ＭＩＤ‐ＨＬＡハイブリダイズ配列。製造業者の推奨に従ってアダプター配列、キータグ配列、及びＭＩＤ配列を設計した。ＨＬＡハイブリダイズ配列は表１に記載されている。
【００６８】
【表２】
2016516449.tif 000004
【００６９】
次のようにアンプリコン・クリーンアップ、定量、希釈、及びプーリングを実施した。４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＧＳ  ＧＴｙｐｅ  ＨＬＡ  ＭＲキット及びＨＲキット（ロッシュ・アプライド・サイエンス社、インディアナポリス、インディアナ州）に記載されるクリーンアップ用のプロトコルに従ってＡＭＰＵＲＥ（登録商標）システム（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、ビバリー、マサチューセッツ州）を使用して短い非特異的人為的産物とプライマーダイマー人為的産物をアンプリコンから除去した。精製したアンプリコンのアリコットを９６ウェルＥ−ＧＥＬ（登録商標）（ライフテクノロジーズ社、カールスバッド、カリフォルニア州）上での電気泳動によりさらに評価した。プライマーダイマーが観察された場合にはＡＭＰｕｒｅステップを繰り返し、産物をＥ−ＧＥＬ（登録商標）により再評価した。その後、精製したアンプリコンをマイクロプレート分光蛍光光度計上でのＱＵＡＮＴ−ＩＴ（商標）ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（登録商標）アッセイ（ライフテクノロジーズ社、カールスバッド、カリフォルニア州）により定量した。８種類の標準物質は０ｎｇ／μｌから１２．５ｎｇ／μｌまでのＤＮＡ濃度にわたった。ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって検出できなかったあらゆるアンプリコンに（希釈の計算を可能にするために）０．１ｎｇ／μｌの濃度を割り当て、それらのアンプリコンを後続のステップに運んだ。アンプリコンを１×１０6分子／μｌに希釈した。４５４ピコタイタープレート（ＰＴＰ）の一領域上でのシーケンシング用に定められた全てのアンプリコンがまとめられるようにアンプリコンのプールを作製した。概して５ｕｌの各アンプリコンをプールに添加した。
【００７０】
次のようにエマルジョンＰＣＲ、ビーズ回収、及びパイロシークエンシングを実施した。次のこと、すなわち、１）エマルジョンＰＣＲ（ｅｍＰＣＲ）時にアンプリコンプールをビーズ当たり０．４〜０．５コピーの割合で使用したこと、２）明示されている濃度の０．２５倍の濃度でｅｍＰＣＲプライマーを使用したこと、３）ＭｕｌｔｉＰｒｏｂｅ  ＨＴリキッド・ハンドラー（パーキン・エルマー社、ウォルサム、マサチューセッツ州）上でＲＥＭｅモジュール（ロッシュ・アプライド・サイエンス社、インディアナポリス、インディアナ州）を使用することによりビーズ濃縮を自動化したこと、及び４）推奨される濃縮ＤＮＡビーズの負荷量の６０％をシーケンシングのためにＰＴＰプレートに分注したことを例外としてＧＳ  ＦＬＸ  ＴＩＴＡＮＩＵＭ（登録商標）シリーズマニュアル、すなわち、ｅｍＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｍａｎｕａｌ−ＬｉｂＡ  ＭＶ（２０１０年１月）、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｍａｎｕａｌ（２０１０年５月）に従って、４領域に分かれたＰＴＰの上でエマルジョンＰＣＲ（ｅｍＰＣＲ）、ＤＮＡ含有ビーズの濃縮、及びＧＳ  ＦＬＸ（登録商標）装置（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ブランフォード、コネチカット州）上でのパイロシークエンシングを実施した。使用した方法マニュアルがＧＳ  ＪＵＮＩＯＲ（登録商標）ｅｍＰＣＲ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｍａｎｕａｌ  Ｌｉｂ−Ａ＿Ｍａｒｃｈ  ２０１２とＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ_Ｊａｎ２０１３であったことを例外として同じ方法でＧＳ  ＪＵＮＩＯＲ（登録商標）装置上でのシーケンシングを実施した。
【００７１】
４５４  ＡＶＡ（登録商標）ソフトウェアのコンセンサス機能を使用して配列を統合整理した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ベースのコンピューターにインストールされたＡＳＳＩＧＮ  ＡＴＦ（登録商標）４５４ソフトウェア（バージョン３４）（Ｃｏｎｅｘｉｏ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社、パース、オーストラリア）を配列分析に使用した。そのソフトウェアは配列リードの各々にアレルを割り当て、且つ、各アレルに対応する配列リードの数を計算した。表２に結果が示されている。「有効リード」という列は、配列の読み込みに成功し、且つ、ＨＬＡ  ＤＱＢ１遺伝子の親のアレルのうちの１つとして特定されたリードの数を示している。
【００７２】
【表３】
2016516449.tif 000005
【００７３】
表３に示されるように、試料から得られた全てのリードの総和に対する非母方（胎児）アレルに対応するリードの比率の２倍として胎児分率を計算した。
【００７４】
【表４】
2016516449.tif 000006
【００７５】
その計算により、得られたＨＬＡ  ＤＱＢ１配列の５．８％が父方アレルに由来し、ハプロイドゲノムの同等物を表していることが決定された。二倍体胎児ゲノムを考慮すると血漿ＤＮＡの５．８×２＝１１．６％が胎児性であった。
【実施例４】
【００７６】
アレルの存在又はホモ接合状態の検出
この仮想例では患者は両親が嚢胞性線維症膜貫通制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子の同じ突然変異型アレルの保有者（遺伝子型Ｄｄ）である胎児を宿している。本発明の方法によりその胎児に突然変異が無いか、その胎児がその突然変異の保有者であるか、又は、その胎児がその突然変異についてホモ接合性であり、将来に嚢胞性線維症（ＣＦ）に冒されるか決定することが可能になる。最初のステップは実施例１及び３に記載される方法による母体血液試料中の胎児分率の決定を含み、母方ＨＬＡアレルはＨ１とＨ２であり、同じ遺伝子座にある非母方ＨＬＡアレルはＨ３である。表４の日付に基づくと、その試料中の胎児分率は２×２＝４％である。
【００７７】
【表５】
2016516449.tif 000007
【００７８】
２番目のステップはあらゆるシーケンシング方法、例えば、実施例３に記載される方法によって同じ試料における突然変異型ＣＦＴＲアレル（ｄ）の分率と非突然変異型ＣＦＴＲアレル（Ｄ）の分率を決定することを含む。次のものは試料（表４の仮想的データ）において４％であると判断される胎児分率に基づくＣＦ状態の仮想的決定である。表５に提示される仮想的データに従うと、突然変異型（ｄ）アレルが５２％で存在する場合に非突然変異型（Ｄ）アレルは４８％で存在する。その試料における突然変異型アレルの超過分は４％であり、それは同じ試料で決定された胎児分率に対応する。したがって、その胎児は突然変異型アレルだけを担持する（遺伝子型ｄｄ）可能性があり、嚢胞性線維症に冒されている。
【００７９】
【表６】
2016516449.tif 000008
【実施例５】
【００８０】
細胞株対照試料
ｄｄＰＣＲについての真の臨床的対照が存在しない場合、ＨＬＡ−ＤＱＢ１のプローブ結合領域で４種類の既知の親アレルの各々と合致することが特定されている細胞株のＤＮＡを使用した（表６）。
【００８１】
【表７】
2016516449.tif 000009
【００８２】
その細胞株ＤＮＡを希釈及び／又は混合して人為的な理論上の母方又は父方のＤＮＡ対照を作製した。同様に、母方アレル（Ｍ１及びＭ２）に合致する細胞株由来のＤＮＡ試料に父方アレルに合致する細胞株由来のＤＮＡ試料を添加して１０％が父方ＤＮＡである混合物と２．５％が父方ＤＮＡである混合物を作製した。一方の母方アレルと単一の父方アレル（ホモ接合性の父親）に特異的な二重ＴａｑＭａｎ副溝結合体（ＭＧＢ）プローブアッセイを用いてそれら全ての試料の特徴を解析した。ＦＡＭ標識プローブはＭ２アレルとＰアレルに対して２〜３か所のミスマッチを有するＭ１アレルに完璧に合致する。Ｖｉｃ標識プローブは母方アレルの各々に対して１〜２か所のミスマッチを有する父方アレルに完璧に合致する。全てのアレルとよく合致する保存領域に１３９塩基対の短いアンプリコン用のプライマーを設計した（表７）。
【００８３】
【表８】
2016516449.tif 000010
【実施例６】
【００８４】
デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）
ＱＸ１００（商標）ドロップレット・ジェネレーター（バイオラド・ラボラトリーズ社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）向けの製造業者の指示に従ってｄｄＰＣＲの設定を行った。各試料の反応を二組で行った。９ｕＬの試料をバイオラド・ドロップレットＰＣＲスーパーミックス、２５０ｎＭの各プローブ、及び９００ｎＭの各プライマーと混合し、最終的な２０μＬのＰＣＲ体積の中で４単位のウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）と混合した。その最終反応混合物をドロップレット・ジェネレーターチップ上の個々のウェルに移すと共に平行に並んだウェル内に７０ｕＬのドロップレット・ジェネレーターオイルを移した。ドロップレット生成が完了したところで油と懸濁された出来上がったドロップレットの４０ｕＬを９６ウェルプレートに移した。その後、次の熱サイクリングプロファイルを用いてドロップレットを熱サイクルにかけた：５０℃で５分間（ＵＮＧステップ）に続いて９５℃で１０分の熱活性化ステップ、及び９４℃（３０秒）から５７℃（１分）への４０サイクル、及び９８℃で１０分の保温。バイオラドＱＸ１００（商標）ドロップレットリーダーを使用してＦＡＭとＶＩＣの両方のチャンネルで各ドロップレットのエンドポイント蛍光を読んだ。偽陽性を回避するために無標的対照複製物及び／又は理論上の母方細胞株対照（ＶＩＣチャンネル）と理論上の父方細胞株対照（ＦＡＭチャンネル）で観察されるあらゆるノイズの上に陽性ドロップレット・コールの閾値を引いた。試料当たり２つの複製物の併せたウェルに由来する濃度出力値に２０を乗算することにより反応当たりのドロップレットに変換した。
【００８５】
全シグナル（ＶＩＣ陽性＋２×ＦＡＭ  Ｍ１陽性）により（父方アレルを検出する）ＶＩＣ陽性を除算することによって胎児ＤＮＡのパーセンテージ（胎児分率）を決定した。母体に由来する試料におけるあらゆる父方アレルの検出は母体血流中の循環胎児ＤＮＡを表している。一方の父方アレルだけが胎児に伝えられるので、正確な胎児分率を得るためにはＶＩＣシグナルを２倍しなくてはならない。図１に結果が示されている。上のパネル（ＦＡＭチャンネル）は試料１〜６における母方アレルの検出を表しており、下のパネル（ＶＩＣチャンネル）は父方アレル検出を表している（表８）。
【００８６】
表８のデータは母体ＤＮＡのバックグラウンドで２．５％及び１０％の父方アレルを検出するこのｄｄＰＣＲアッセイの能力を示しており、並びに、妊娠第三期の母親に由来する臨床血漿試料における胎児分率の決定は父方アレルの分率の２倍として計算された。
【００８７】
【表９】
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【００８８】
具体的な実施例を参照して本発明を詳細に説明してきたが、本発明の範囲内で様々な改変を行うことができることは当業者に明らかである。したがって、本発明の範囲は本明細書に記載される実施例では限定されず、下に提示される特許請求の範囲によって限定されるべきである。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2016516449.tif 000014
2016516449.tif 000015
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