(57)【要約】本発明は、式（１０５）又は（１０６）による、任意選択でフコシル化されているグリカンを含む糖タンパク質であって、Ｓｕ（Ａ）ｘが１個又は複数の官能基Ａを含む修飾糖部分である、糖タンパク質に関する。官能基Ａは、チオール基、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホン化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から独立して選択される。本発明はまた、本発明による糖タンパク質が対象の分子にコンジュゲートされている、糖タンパク質コンジュゲートに関する。前記対象の分子は、例えば、活性物質とすることができる。本発明はさらに、修飾糖タンパク質の調製方法、及び糖タンパク質コンジュゲートの調製方法に関する。本発明は、特に、修飾抗体、抗体コンジュゲート、抗体−薬物コンジュゲート、及びそれらの調製方法に関する。    [化１]2016538877.tif 000030【選択図】図１２
2016538877.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾糖タンパク質を調製する方法であって、
β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β（１，３）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼ、変異触媒ドメインを含むβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び変異触媒ドメインを含むβ（１，３）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼからなる群から選択される触媒の存在下で、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質をＳｕ（Ａ）ｘ−Ｐに接触させるステップを含み、
Ｓｕ（Ａ）ｘが、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体Ｓｕであり、ｘが１、２、３又は４であり、Ａが、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホン化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から独立して選択され、Ｐがヌクレオチドであり、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンが、式（１０１）又は（１０２）によるグリカン：
【化１】
2016538877.tif 000025
（式中、
ｂは、０又は１であり、
ｄは、０又は１であり、
ｅは、０又は１であり、
Ｇは、モノサッカライド、又は２〜２０個の糖部分を含む直鎖状若しくは分岐状オリゴサッカライドである）
である、方法。
【請求項２】
前記触媒が、変異触媒ドメインを含むβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ及び変異触媒ドメインを含むβ（１，３）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記触媒が、ウシβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１  ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｌ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｎ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｉ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｆ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｍ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｖ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｇ及びＧａｌＴ  Ｙ２８９Ａからなる群から選択される、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼに由来する変異触媒ドメインを含む触媒である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記修飾糖タンパク質が修飾抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
非還元末端において末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質を用意するステップをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法により得ることができる、糖タンパク質。
【請求項７】
式（１０５）又は（１０６）によるグリカン：
【化２】
2016538877.tif 000026
（式中、
ｂは、０又は１であり、
ｄは、０又は１であり、
ｅは、０又は１であり、
Ｇは、モノサッカライド、又は２〜２０のサッカライド部分を含む直鎖状若しくは分岐状オリゴサッカライドであり、
Ｓｕ（Ａ）ｘは、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体Ｓｕであり、ｘは、１、２、３又は４であり、Ａは、チオール基、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホン化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から独立して選択される）
を含む、請求項６に記載の糖タンパク質。
【請求項８】
抗体である、請求項６又は７に記載の糖タンパク質。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか一項に記載の修飾糖タンパク質をリンカーコンジュゲートと反応させるステップを含む、糖タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、
前記リンカーコンジュゲートが官能基Ｂ及び１つ又は複数の対象の分子を含み、前記官能基Ｂが、前記修飾糖タンパク質のグリカン上の官能基Ａと反応する能力がある官能基であり、官能基Ａが、チオール基、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホン化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から独立して選択される、方法。
【請求項１０】
（ａ）  前記修飾糖タンパク質が、ハロゲン修飾糖タンパク質又はハロゲン化アセトアミド修飾糖タンパク質である場合、官能基Ｂは、チオール基、アルコール基又はアミン基を含む；又は
（ｂ）  前記修飾糖タンパク質が、チオール修飾糖タンパク質又はメルカプトアセトアミド修飾糖タンパク質である場合、官能基Ｂは、Ｎ−マレイミド基又はハロゲン化アセトアミド基又はアルケン基を含む；又は
（ｃ）  前記修飾糖タンパク質が、スルホニルオキシ修飾糖タンパク質又はスルホン化ヒドロキシアセトアミド修飾糖タンパク質である場合、官能基Ｂは、チオール基、アルコール基又はアミン基を含む、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記修飾糖タンパク質が、チオール修飾糖タンパク質又はメルカプトアセトアミド修飾糖タンパク質であり、官能基Ｂがアレンアミド基を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
請求項９又は請求項１０に記載の方法により得ることができる、糖タンパク質コンジュゲート。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法により得ることができる、糖タンパク質コンジュゲート。
【請求項１４】
前記糖タンパク質が、式（１２１）又は（１２２）：
【化３】
2016538877.tif 000027
（式中、
Ｐｒは、タンパク質を表し、
Ｌは、リンカーであり、
Ｄは、対象の分子であり、
ｒは、１〜２０であり、
ｘは、１、２、３又は４であり、
ｙは、１〜２０であり、
ｂは、０又は１であり、
ｄは、０又は１であり、
ｅは、０又は１であり、
ｐは、０又は１であり、
Ｑは、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−又はＣＨ２であり、
Ｓｕは、糖又は糖誘導体であり、
Ｇは、モノサッカライド、又は２〜２０個の糖部分を含む直鎖状若しくは分岐状オリゴサッカライドである）
による、請求項１２に記載の糖タンパク質コンジュゲート。
【請求項１５】
前記糖タンパク質が、式（１２３）又は（１２４）：
【化４】
2016538877.tif 000028
（式中、Ｐｒ、Ｌ、Ｄ、ｒ、ｘ、ｙ、ｂ、ｄ、ｅ、ｐ、Ｑ、Ｓｕ及びＧは、請求項１４において定義されている通りであり、
Ｒ９は、Ｌ（Ｄ）ｒ、水素、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキルアリール基及びＣ７〜Ｃ２４アリールアルキル基からなる群から選択され、前記Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、前記Ｃ６〜Ｃ２４アリール基、前記Ｃ７〜Ｃ２４アルキルアリール基及び前記Ｃ７〜Ｃ２４アリールアルキル基は、任意選択で置換されている）
による、請求項１２に記載の糖タンパク質コンジュゲート。
【請求項１６】
前記糖タンパク質が、式（１２５）又は（１２６）：
【化５】
2016538877.tif 000029
（式中、Ｐｒ、Ｌ、Ｄ、ｒ、ｘ、ｙ、ｂ、ｄ、ｅ、ｐ、Ｑ、Ｓｕ及びＧは、請求項１４において定義されている通りであり、Ｒ９は請求項１５に定義されている通りである）
による、請求項１３に記載の糖タンパク質コンジュゲート。
【請求項１７】
抗体コンジュゲートである、請求項１２、１４又は１５に記載の糖タンパク質コンジュゲート。
【請求項１８】
抗体コンジュゲートである、請求項１３又は請求項１６に記載の糖タンパク質コンジュゲート。
【請求項１９】
抗体が、リンカーＬを介して、対象の分子Ｄにコンジュゲートされており、Ｄが、薬学的に活性な物質からなる群から選択される、請求項１７に記載の抗体コンジュゲート。
【請求項２０】
抗体が、リンカーＬを介して、対象の分子Ｄにコンジュゲートされており、Ｄが、薬学的に活性な物質からなる群から選択される、請求項１８に記載の抗体コンジュゲート。
【請求項２１】
医薬として使用するための、請求項１９に記載の抗体コンジュゲート。
【請求項２２】
医薬として使用するための、請求項２０に記載の抗体コンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【発明の技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾糖タンパク質、特に、修飾糖部分を含む糖タンパク質に関する。本発明はまた、本発明による糖タンパク質が対象の分子にコンジュゲートされている、糖タンパク質コンジュゲートに関する。前記対象の分子は、例えば、活性物質とすることができる。本発明はさらに、修飾糖タンパク質の調製方法、及び糖タンパク質コンジュゲートの調製方法に関する。本発明は、特に、修飾抗体、抗体コンジュゲート、抗体−薬物コンジュゲート、及びそれらの調製方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
タンパク質コンジュゲート、すなわちリンカーを介して対象の分子にコンジュゲートされているタンパク質は、当技術分野において公知である。例えば、蛍光標識は、インビトロ及びインビボでの可視化の強力な技法であり、タンパク質の共有結合による固定化は、産業用途にとって有用な戦略であり、タンパク質のＰＥＧ化は、かなり増強された循環時間をもたらす。加えて、対象分子が薬物、例えば、細胞毒性化学物質である、抗体コンジュゲートに大きな関心がよせられている。抗体−薬物−コンジュゲートは当技術分野において公知であり、合成リンカーを介して細胞毒性化学物質に共有結合している、組換え抗体からなる。従来技術から公知のタンパク質コンジュゲートは、それぞれアシル化又はアルキル化により、官能基のアミノ酸であるリシン又はシステインの側鎖へのコンジュゲーションによって一般に調製される。
【０００３】
リシンの場合、コンジュゲーションは、立体的に最も高い接近性、最も低いｐＫａ又はそれらの組合せを有するリシン側鎖において優先的に行われる。この方法の欠点は、コンジュゲーションの部位の制御が低いことである。
【０００４】
部位特異性のよりよい制御は、通常、典型的なタンパク質において遊離システインが全く又はほとんど存在しないという事実に基づいて、システインをアルキル化することによって得られ、これにより、還元形態で既に存在しているか、又はタンパク質へと選択的に操作されているシステインしかアルキル化しないという選択肢が提供される。或いは、システインは、（一部の）還元工程により選択的に遊離され得る。例えば、還元による選択的なシステイン遊離は、還元剤（例えば、ＴＣＥＰ又はＤＴＴ）によりタンパク質を処理することによって通常、行われ、ジスルフィド結合は２つの遊離チオールに変換される。次に、遊離したチオールは、迅速に且つ高い選択性で一般に進行するマレイミド化学に通常、基づいて、求電子試薬によりアルキル化され得るか、又はシステインに対して強力な優先性をやはり示すが、リシン側鎖との副反応に直面し得る、ハロアセトアミドによりアルキル化され得る。
【０００５】
最近の報告（参照により本明細書に組み込まれている、Ｎ．Ｍ．Ｏｋｅｌｅｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０１３年、２４巻、１６５０頁）は、モノクローナル抗体のグリカンに６−チオフコースを代謝的に取り込ませ、次いで、還元−酸化−マレイミドコンジュゲーションをすることを記載している。興味深いことに、上記６−チオフコースマレイミドコンジュゲートは、システインマレイミドコンジュゲートに関して、安定性の増強を示すことが分かったということが見いだされた。しかし、６−チオフコースの取込み効率は７０％しかないことが分かった。
【０００６】
抗体−薬物コンジュゲートの生成に適用される、マレイミドコンジュゲーションの代替的な変形の１つには、モノクローナル抗体に、求核性チオールではなくマレイミドを導入するという戦略が含まれる。例えば、Ｔ−ＤＭ１は、リシンのスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）による最初の（ランダムな）コンジュゲーションにより調製され、これにより、抗体にマレイミドを効率よくチャージする。この方法の次の段階において、マレイミド官能基化抗体をチオール官能基化マイタンシノイドにより処理すると、コンジュゲートに至る。このように、これは、抗体は、ＳＭＣＣにより処理されると、求核性反応パートナー（コンジュゲーションのための求核性アミノ酸側鎖を一般に使用する代わり）に効率よく変換されるという特有の例である。しかし、この場合もやはり、この手法の性質により、抗体のランダムなコンジュゲーションしか達成されない。
【０００７】
上記の技法に多様性があるにも関わらず、マレイミドによるアルキル化によって得られるタンパク質コンジュゲートの一般的に不利な点は、一般に、得られたコンジュゲートが、アルキル化の逆、すなわちレトロマイケル反応のために、潜在的に不安定となるおそれがあることである。
【０００８】
すべてのタンパク質のサブクラスである糖タンパク質のコンジュゲートを調製するための代替的な戦略は、化学的手段（過ヨウ素酸ナトリウム）又は酵素手段（ガラクトースオキシダーゼ）のどちらかによって、タンパク質のグリカン構造に１つ又は複数のアルデヒド官能基を生成させることが含まれる。後者のアルデヒド官能基は、続いて、例えば、官能基化ヒドロキシルアミン又はヒドラジン分子との縮合による選択的なコンジュゲーション法に使用することができ、これにより、それぞれ、オキシム結合又はヒドラゾン結合されたタンパク質コンジュゲートを生成する。しかし、特に、脂肪族アルデヒドから誘導されたオキシム及びヒドラゾンもやはり、水中、又は低いｐＨにおいて、経時的な安定性に制限があることを示すことが知られている。例えば、ゲムツズマブオゾガマイシンは、オキシム結合されている抗体−薬物コンジュゲートであり、インビボにおいて、早期の脱コンジュゲーションを被ることが知られている。
【０００９】
Ｑａｓｂａらは、参照により本明細書に組み込まれているＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２年、２７７巻、２０８３３頁において、ガラクトシルトランスフェラーゼ変異体であるＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ）、ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｉ）及びＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｎ）が、ＧａｌＮＡｃを非還元ＧｌｃＮＡｃ糖（β−ベンジル−ＧｌｃＮＡｃ）に酵素的に結合させ得ることを開示している。
【００１０】
参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２００７／０９５５０６号及び国際公開第２００８／０２９２８１号（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ）変異体とＣ２−置換アジドアセトアミド部分の２−ＧａｌＮＡｚ−ＵＤＰとを組み合わせると、グリカンの末端の非還元ＧｌｃＮＡｃにおいて、ＧａｌＮＡｚが取り込まれることを開示している。次に、シュタウディンガーライゲーションによる、又は銅を触媒とするクリック化学を用いた、その後のコンジュゲーションにより、蛍光性アルキンプローブが抗体にコンジュゲートされた、個々の抗体コンジュゲートが得られる。国際公開第２００７／０９５５０６号及び国際公開第２００８／０２９２８１号は、エンドＨによりグリカンのトリミングを行うことができ、これにより、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃグリコシド結合が加水分解され、ＧａｌＮＡｚの酵素による導入のための、ＧｌｃＮＡｃが遊離することをさらに開示している。
【００１１】
Ｑａｓｂａらは、参照により本明細書に組み込まれている、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００９年、２０巻、１２２８頁において、（粗製ｍＡｂをガラクトシダーゼにより処理することによって得られる）Ｇ０グリコ型を有する、β−ガラクトシダーゼ処理されたモノクローナル抗体（例えば、リツキサン、レミケード、ハーセプチン）は、（ＧａｌＮＡｚ）を含むガラクトース部分がグリカンの末端ＧｌｃＮＡｃ残基に転移した後に、Ｇ２グリコ型へと完全に再度ガラクトシル化されて、テトラアジド置換抗体、すなわち重鎖１つあたり２つのＧａｌＮＡｚ部分をもたらすことを開示している。例えば、シュタウディンガーライゲーション又はアルキンとの環化付加による、前記テトラアジド置換抗体の対象の分子へのコンジュゲーションは開示されていない。Ｃ２置換ケト基（Ｃ２−ケト−Ｇａｌ）を含むガラクトース部分のＧ０グリコ型グリカンの末端ＧｌｃＮＡｃ残基への転移、及びＣ２−ケト−Ｇａｌのアミノオキシビオチンへの結合も開示されている。しかし、上記の通り、得られるオキシムコンジュゲートは、水による加水分解のため、限られた安定性を示し得る。
【００１２】
国際公開第２００７／０９５５０６号、国際公開第２００４／０６３３４４号及びＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００９年、２０巻、１２２８頁において開示されている方法の欠点は、アジド−アルキンクリック化学によって得られるコンジュゲートは、すべての場合において、トリアゾール結合を特徴としており、このトリアゾール結合は、ＡＤＣの免疫原性に関して、不利となり得る。さらに、銅を触媒とするクリック化学が使用される場合、例えば、Ｈｏｎｇら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２００９年、４８巻、９８７９頁（参照により組み込まれている）に開示されている通り、望ましくない酸化的過程に起因するタンパク質の損傷が起こるおそれがある。
【００１３】
上記に基づくと、ガラクトースは、野生型Ｇａｌ−Ｔ１／ＵＤＰ−Ｇａｌにより処理すると、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を特徴とするタンパク質に導入することができる（Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−タンパク質になる）一方、Ｎ−アセチルガラクトサミンは、ＧａｌＴ１の変異体であるＹ２８９Ｌにより処理すると導入することができる（ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−タンパク質が得られる）ことが明らかである。ウシβ４−Ｇａｌ−Ｔ１ではなく、様々なヒトガラクトシルトランスフェラーゼ（β４−Ｇａｌ−Ｔ１、β４−Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３−Ｇａｌ−Ｔ５）は、Ｍｎ２＋の非存在下で、ＵＤＰ−Ｇａｌにおけるガラクトースの６−ビオチン化修飾を受け入れ、モデルタンパク質であるＢＳＡ−（ＧｌｃＮＡｃ）１７及びオボアルブミンへの効率の高い転移をもたらすことができることが、Ｅｌｌｉｎｇら（参照により本明細書に組み込まれている、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２００１年、２巻、８８４頁）によりやはり示された。同様に、Ｐａｎｎｅｃｏｕｃｋｅら（参照により本明細書に組み込まれている、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２００８年、４９巻、２２９４頁）は、市販のウシβ４−Ｇａｌ−Ｔ１も、標準条件下で、ＵＤＰ−６−アジドガラクトースをモデルＧｌｃＮＡｃ−基質に転移させることができることを実証しているが、ＧｌｃＮＡｃ−タンパク質への転移は実証されなかった。
【００１４】
上記に基づくと、糖タンパク質のグリカンの化学選択的又は酵素的修飾に必要な戦略は、タンパク質コンジュゲートの部位特異的な調製に対する多様性のある戦略であると結論づけてもよい。しかし、現在の技術は、予測不能な安定性をもつ結合（マレイミド、オキシム、ヒドラゾン）、又は非天然構成物（トリアゾール）を生じさせる。さらに、調製様式は遅く、大過剰の試薬（オキシム又はヒドラゾンライゲーション）を必要とすることがあり、又はタンパク質の損傷（銅を触媒とするクリック化学）に至るおそれがある。最後に、最近開示された、代謝的なチオフコースの取込みに関する戦略は有望であるが、チオフコース取込みの効率は、天然フコースとの競合のために低い（±７０％）。
【００１５】
チオールに基づいたバイオ分子のコンジュゲーションは、当技術分野で周知である。特に、チオールとマレイミドとの反応は迅速で選択的な方法であり、この方法は、通常、迅速に所望のコンジュゲートをもたらす。それほど普及していないが、たびたび適用されるものは、遊離チオールと高い選択性でやはり反応することができるハロゲン化アセトアミドであるが、マレイミドコンジュゲーションに関すると、化学選択性が犠牲にされる。ハロゲン化アセトアミドとのコンジュゲーションの特別な利点は、チオエーテルが非可逆的に形成することであり、この非可逆的な形成は、安定性に関して、マレイミドコンジュゲートと比較すると有利である。後者の安定性は、参照により組み込まれている、ＡｂｂａｓらのＡｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１４年、５３巻、７４９１〜７４９４頁によりごく最近に報告されている通り、チオールとアレンアミドとの反応により形成されるコンジュゲートにも適用された。チオールへのコンジュゲーションのための他の代替法、例えば、ビニルスルホンコンジュゲーションも公知であるが、それほど高い頻度で適用されていない。最後に、光誘起チオール−エン反応もまた、タンパク質コンジュゲーションに好適であることが示され（例えば、ＫｕｎｚらのＡｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００７年、４６巻、５２２６〜５２３０頁を参照されたい。）、この場合、やはり非常に安定なチオエーテルへと導かれる。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、修飾糖タンパク質を調製する方法であって、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β（１，３）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼ、変異触媒ドメインを含むβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び変異触媒ドメインを含むβ（１，３）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼからなる群から選択される触媒の存在下で、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質をＳｕ（Ａ）ｘ−Ｐに接触させるステップを含み、Ｓｕ（Ａ）ｘが、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体Ｓｕであり、ｘが１、２、３又は４であり、Ａが、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホン化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から独立して選択され、Ｐがヌクレオチドであり、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンが、式（１０１）又は（１０２）によるグリカン：
【化１】
2016538877.tif 000003
（式中、
ｂは、０又は１であり、
ｄは、０又は１であり、
ｅは、０又は１であり、
Ｇは、モノサッカライド、又は２〜２０個の糖部分を含む直鎖状若しくは分岐状オリゴサッカライドである）
である、方法に関する。
【００１７】
本発明はまた、式（１０５）又は（１０６）によるグリカン：
【化２】
2016538877.tif 000004
（式中、
ｂは、０又は１であり、
ｄは、０又は１であり、
ｅは、０又は１であり、
Ｇは、モノサッカライド、又は２〜２０のサッカライド部分を含む直鎖状若しくは分岐状オリゴサッカライドであり、
Ｓｕ（Ａ）ｘは、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体Ｓｕであり、ここで、ｘは、１、２、３又は４であり、Ａは、チオール基、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホン化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から独立して選択される）
を含む、糖タンパク質に関する。
【００１８】
本発明はまた、糖タンパク質コンジュゲートの調製における、本発明による糖タンパク質の使用であって、糖タンパク質コンジュゲートが、リンカーＬを介して対象の分子にコンジュゲートされている糖タンパク質として定義される、使用；及び、糖タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、前記方法が、本発明による修飾糖タンパク質をリンカーコンジュゲートと反応させるステップを含み、前記リンカーコンジュゲートが、官能基Ｂ及び１つ又は複数の対象の分子を含み、前記官能基Ｂが、修飾糖タンパク質のグリカン上の官能基Ａと反応する能力を有する官能基であり、官能基Ａが、上で定義されている通りである、方法に関する。
【００１９】
特に、本発明は、修飾抗体、抗体コンジュゲート、及び抗体−薬物コンジュゲートに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】（Ａ）通常の発現、続いてエンド−グリコシダーゼを用いるトリミングにより得ることができるタンパク質、又は（Ｂ）スワインソニンの存在下、哺乳動物系でのｍＡｂの発現による、若しくは操作された宿主生物、例えば、Ｌｅｃ１  ＣＨＯ若しくはピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）での発現により得ることができるタンパク質、又は（Ｃ）シアリダーゼ及びガラクトシダーゼの組合せ作用の際に、グリコ型（Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆ）の通常の混合物をトリミングすることにより得ることができるタンパク質の様々なグリコ型の例を示す図である。
【図２】ガラクトシルトランスフェラーゼ変異体であるβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１（Ｙ２９８Ｌ）が作用する際の、非天然ＵＤＰ−ガラクトース誘導体１（２−ケトガラクトース）又は２（ＧａｌＮＡｚ）による、ＧｌｃＮＡｃ末端タンパク質の酵素による変換の略図を示す図である。
【図３】ガラクトシルトランスフェラーゼ（又は、その変異体）の作用下で、ＧｌｃＮＡｃ末端糖に転移させるための、修飾ガラクトース誘導体（３〜１７）の構造を示す図である。
【図４】ガラクトシルトランスフェラーゼ（又は、その変異体）の作用下で、ＧｌｃＮＡｃ末端糖に転移することができる、ある範囲の、ＵＤＰ−ガラクトース（１８〜２３）のチオール誘導体又はハロゲン誘導体を示す図である。
【図５】アセチル保護されているチオールバリアント（２８ａ）、又は脱アセチル化チオールバリアント（２８ｂ）、又は２−ＮＨＡｃ部分で置換されているＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃのハロゲンバリアント（２９＋３０）の合成的調製のためのスキームを示す図である。
【図６】ビオチン置換チオフェノール（３２）、アジド置換チオフェノール（４１）、及びプロピオン酸アミド前駆体４２に由来するアジド−アレンアミド構築物４３の合成的調製に関するスキームを示す図である。
【図７】ビオチン（３３）、ＭＭＡＦ（３４）、ピレン（４４）及びＢＣＮ（４５）のマレイミド誘導体の構造を示す図である。
【図８】トリミングしたモノクローナル抗体３５（コアＧｌｃＮＡｃしか含まない）の変換戦略を示す図である。３５におけるＧａｌ−Ｔ１（Ｙ２８９Ｌ）が作用する際に、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ誘導体２８〜３０は、ＧｌｃＮＡｃに選択的に導入され、３６（脱アセチル化後は、Ｒ＝ＳＨであるか又はハロゲンである）を与える。チオール含有３６は、マレイミド誘導体３３又は３４と反応して、それぞれ、コンジュゲート３８又は３９になることができる。或いは、ハロゲン化誘導体３６は、ＤＴＴ、ＭｅＯＰｈＳＨ若しくはＮＯ２ＰｈＳＨ、又は化合物３２などの求核試薬を用いる、ハロゲンの求核置換によってコンジュゲートされ、４０になり得る。
【図９】３７（Ｘ＝Ｃｌ）を３２により処理した後、コンジュゲート４０の粗製物のＭＳプロファイルを示す図である。
【図１０】Ｒ＝Ｃｌである塩素化抗体３６（ＧａｌＮＡｃＣｌにより置換されているコアＧｌｃＮＡｃを含む）の変換戦略を示す図である。アジド保有４１を用いて置換することにより、塩素化誘導体３６のコンジュゲーションの際、抗体のアジド誘導体が形成する（４６）。後者のアジドは、４７などのＢＣＮ毒素構築物とさらにコンジュゲートさせて、抗体−薬物コンジュゲート４８とすることができる。
【図１１】チオール化モノクローナル抗体３６（チオール化ガラクトース誘導体により置換されているコアＧｌｃＮＡｃを含む）の変換戦略を示す図である。チオール含有３６は、マレイミド誘導体４３、４４又は４５と反応し、それぞれ、コンジュゲート４９、５０又は５１とすることができる。ＢＣＮ部分を保有する、後者のコンジュゲート５１は、５２などのアジド−ビオチン構築物とさらにコンジュゲートさせて、抗体−ビオチンコンジュゲート５３とすることができる。
【図１２】アセチル保護されているＧａｌＮＡｃ誘導体であるＵＤＰ−ＧａｌＮＰｒｏＳＡｃ（５７）及びＵＤＰ−ＧａｌＮＢｕＳＡｃ（５８）、並びにチオール含有ＧａｌＮＡｃ誘導体であるＵＤＰ−ＧａｌＮＰｒｏＳＨ（５９）及びＵＤＰ−ＧａｌＮＢｕＳＨ（６０）の調製に関する合成経路を示す図である。それぞれ、ＧａｌＮＡｃＳＨ、ＧａｌＮＰｒｏＳＨ及びＧａｌＮＢｕＳＨのコンジュゲートに関するモデル化合物である、化合物６４〜６６のマレイミドコンジュゲートの調製に関する合成経路も示している。
【図１３】モノクローナル抗体の様々なグリコ型、例えば、ｍＡｂの天然のグリコシル化部位を除去し、別の位置において（ｘがプロリンを除く任意のアミノ酸である、配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔに基づいた）グリコシル化部位を操作することによって得ることができる、ＩｇＧを示す図である。
【発明の詳細な説明】
【００２１】
定義
本明細書及び特許請求の範囲において使用する動詞「含むこと（ｔｏ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、並びにその語形変化は、非限定的な意味で使用され、その単語に続く項目が含まれるが、具体的に明記されていない項目が除外されるわけではないことを意味する。
【００２２】
さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素の言及は、文脈が、要素の１つ及び１つだけであると明確に要求していない限り、２つ以上の要素が存在する可能性を除外するものではない。すなわち、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、「少なくとも１つ」を通常、意味する。
【００２３】
本明細書及び特許請求の範囲おいて開示されている化合物は、１個又は複数の不斉中心、及び様々なジアステレオマーを含むことがあり、並びに／又は該化合物の鏡像異性体が存在することがある。特に明記しない限り、本明細書及び特許請求の範囲におけるいかなる化合物の記載も、すべてのジアステレオマー、及びそれらの混合物を含むことが意図されている。また、特に明記しない限り、本明細書及び特許請求の範囲におけるいかなる化合物の記載も、個々の鏡像異性体と、鏡像異性体の任意の混合物、ラセミ体又はその他のものの両方を含むことが意図されている。化合物の構造が、特定の鏡像異性体として図示されている場合、本出願の発明は、そうした特定の鏡像異性体に限定されないものと理解されるべきである。
【００２４】
本化合物は、様々な互変異性体で生じ得る。本発明による化合物は、特に明記しない限り、すべての互変異性体を含むことが意図されている。化合物の構造が、特定の互変異性体として図示されている場合、本出願の発明は、そうした特定の互変異性体に限定されないものと理解されるべきである。
【００２５】
無置換アルキル基は、一般式ＣｎＨ２ｎ＋１を有しており、直鎖状又は分岐状であってもよい。無置換アルキル基は、環式部分を含有することもあり、したがって、一般式ＣｎＨ２ｎ−１を同時に有する。任意選択で、アルキル基は、本明細書においてさらに指定されている１つ又は複数の置換基により置換されている。アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、２−プロピル、ｔ−ブチル、１−ヘキシル、１−ドデシルなどが含まれる。
【００２６】
アリール基は、６〜１２個の炭素原子を含み、単環式及び二環式構造を含むことができる。任意選択で、アリール基は、本明細書においてさらに指定されている１つ又は複数の置換基により置換されていてもよい。アリール基の例は、フェニル及びナフチルである。
【００２７】
アリールアルキル基及びアルキルアリール基は、少なくとも７個の炭素原子を含み、単環式及び二環式構造を含むことができる。任意選択で、アリールアルキル基及びアルキルアリール基は、本明細書においてさらに指定されている１つ又は複数の置換基により置換されていてもよい。アリールアルキル基は、例えばベンジルである。アルキルアリール基は、例えば、４−ｔ−ブチルフェニルである。
【００２８】
ヘテロアリール基は、少なくとも２個の炭素原子（すなわち、少なくともＣ２）、及び１個又は複数のヘテロ原子Ｎ、Ｏ、Ｐ又はＳを含む。ヘテロアリール基は、単環式又は二環式構造を有することができる。任意選択で、ヘテロアリール基は、本明細書においてさらに指定されている１つ又は複数の置換基により置換されていてもよい。適切なヘテロアリール基の例には、ピリジニル、キノリニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、ピロリル、フラニル、トリアゾリル、ベンゾフラニル、インドリル、プリニル、ベンゾオキサゾリル、チエニル、ホスホリル及びオキサゾリルが含まれる。
【００２９】
ヘテロアリールアルキル基及びアルキルヘテロアリール基は、少なくとも３個の炭素原子（すなわち、少なくともＣ３）を含み、単環式及び二環式構造を含むことができる。任意選択で、ヘテロアリール基は、本明細書においてさらに指定されている１つ又は複数の置換基により置換されていてもよい。
【００３０】
アリール基が（ヘテロ）アリール基として意味される場合、この表記には、アリール基及びヘテロアリール基が含まれることが意図される。同様に、アルキル（ヘテロ）アリール基は、アルキルアリール基及びアルキルヘテロアリール基を含むことが意図されており、（ヘテロ）アリールアルキルは、アリールアルキル基及びヘテロアリールアルキル基を含むことが意図される。したがって、Ｃ２〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基とは、Ｃ２〜Ｃ２４ヘテロアリール基及びＣ６〜Ｃ２４アリール基を含むものとして、解釈されるべきである。同様に、Ｃ３〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基は、Ｃ７〜Ｃ２４アルキルアリール基及びＣ３〜Ｃ２４アルキルヘテロアリール基を含むことが意図されており、Ｃ３〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキルは、Ｃ７〜Ｃ２４アリールアルキル基及びＣ３〜Ｃ２４ヘテロアリールアルキル基を含むことが意図されている。
【００３１】
特に明記しない限り、アルキル基、アルケニル基、アルケン、アルキン、（ヘテロ）アリール基、（ヘテロ）アリールアルキル基及びアルキル（ヘテロ）アリール基は、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル基、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル基、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル基、Ｃ５〜Ｃ１２シクロアルケニル基、Ｃ８〜Ｃ１２シクロアルキニル基、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニルオキシ基、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニルオキシ基、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルオキシ基、ハロゲン、アミノ基、オキソ及びシリル基（シリル基は、式（Ｒ１０）３Ｓｉ−により表すことができ、Ｒ１０は、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル基、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル基、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル基、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニルオキシ基、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニルオキシ基及びＣ３〜Ｃ１２シクロアルキルオキシ基からなる群から独立して選択される。）からなる群から選択される、１つ又は複数の置換基により置換されていてもよく、ここで、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基は、任意選択で置換されており、アルキル基、アルコキシ基、シクロアルキル基及びシクロアルコキシ基は、任意選択で、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１個又は複数のヘテロ原子により分断されている。
【００３２】
アルキニル基は、炭素−炭素三重結合を含む。１つの三重結合を含む無置換アルキニル基は、一般式ＣｎＨ２ｎ−３を有する。末端アルキニルは、三重結合が炭素鎖の末端位に位置している、アルキニル基である。任意選択で、アルキニル基は、本明細書においてさらに指定されている１つ又は複数の置換基により置換されており、並びに／又は酸素、窒素及び硫黄からなる群から選択されるヘテロ原子により分断されている。アルキニル基の例には、エチニル、プロピニル、ブチニル、オクチニルなどが含まれる。
【００３３】
シクロアルキニル基は、環式アルキニル基である。１つの三重結合を含む無置換シクロアルキニル基は、一般式ＣｎＨ２ｎ−５を有する。任意選択で、シクロアルキニル基は、本明細書においてさらに指定されている１つ又は複数の置換基により置換されている。シクロアルキニル基の一例は、シクロオクチニルである。
【００３４】
ヘテロシクロアルキニル基は、酸素、窒素及び硫黄からなる群から選択される、ヘテロ原子によって分断されているシクロアルキニル基である。任意選択で、ヘテロシクロアルキニル基は、本明細書においてさらに指定されている１つ又は複数の置換基により置換されている。ヘテロシクロアルキニル基の一例は、アザシクロオクチニルである。
【００３５】
（ヘテロ）アリール基は、アリール基及びヘテロアリール基を含む。アルキル（ヘテロ）アリール基は、アルキルアリール基及びアルキルヘテロアリール基を含む。（ヘテロ）アリールアルキル基は、アリールアルキル基及びヘテロアリールアルキル基を含む。（ヘテロ）アルキニル基は、アルキニル基及びヘテロアルキニル基を含む。（ヘテロ）シクロアルキニル基は、シクロアルキニル基及びヘテロシクロアルキニル基を含む。
【００３６】
（ヘテロ）シクロアルキン化合物は、本明細書では、（ヘテロ）シクロアルキニル基を含む化合物として定義される。
【００３７】
本明細書及び特許請求の範囲において開示されている化合物のいくつかは、縮合（ヘテロ）シクロアルキン化合物、すなわち（ヘテロ）シクロアルキン化合物として記載することができ、ここで第２の環構造が（ヘテロ）シクロアルキニル基と縮合している、すなわち（ヘテロ）シクロアルキニル基と縮合環化（ａｎｎｅｌａｔｅｄ）している。例えば、縮合（ヘテロ）シクロオクチン化合物では、シクロアルキル（例えば、シクロプロピル）又はアレーン（例えば、ベンゼン）は、（ヘテロ）シクロオクチニル基と縮合環化していてもよい。縮合（ヘテロ）シクロオクチン化合物中の（ヘテロ）シクロオクチニル基の三重結合は、３つの考えられる位置、すなわちシクロオクチン部分の２、３又は４位（「有機化学のＩＵＰＡＣ命名法（ＩＵＰＡＣ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、規則Ａ３１．２に準拠した番号付け）のいずれか１つに位置することができる。本明細書及び特許請求の範囲における、いかなる縮合（ヘテロ）シクロオクチン化合物の記載も、シクロオクチン部分の３つの個々の位置異性体のすべてを含むことが意図されている。
【００３８】
アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基、（ヘテロ）アリールアルキル基、（ヘテロ）シクロアルキニル基が、任意選択で置換されている場合、前記基は、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル基、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル基、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル基、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニルオキシ基、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニルオキシ基、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルオキシ基、ハロゲン、アミノ基、オキソ基及びシリル基からなる群から独立して選択される１つ又は複数の置換基により、任意選択で独立して置換されており、ここで、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基は任意選択で置換されており、アルキル基、アルコキシ基、シクロアルキル基及びシクロアルコキシ基は、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択される、１個又は複数のヘテロ原子により任意選択で分断されており、シリル基は、式（Ｒ６）３Ｓｉ−により表され、Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル基、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル基、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル基、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニルオキシ基、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニルオキシ基及びＣ３〜Ｃ１２シクロアルキルオキシ基からなる群から独立して選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基は、任意選択で置換されており、アルキル基、アルコキシ基、シクロアルキル基及びシクロアルコキシ基は、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択される、１個又は複数のヘテロ原子により任意選択で分断されている。
【００３９】
一般用語「糖」は、本明細書では、モノサッカライド、例えば、グルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）及びフコース（Ｆｕｃ）を示すために使用される。用語「糖誘導体」は、本明細書では、モノサッカライド糖の誘導体、すなわち置換基及び／又は官能基を含む、モノサッカライド糖を示すために使用される。糖誘導体の例には、アミノ糖及び糖酸、例えば、グルコサミン（ＧｌｃＮＨ２）、ガラクトサミン（ＧａｌＮＨ２）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、シアル酸（Ｓｉａ）（シアル酸は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）とも呼ばれる。）及びＮ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）及びイズロン酸（ＩｄｏＡ）が含まれる。糖誘導体の例はまた、本明細書においてＳｕ（Ａ）ｘで示される化合物も含み、ここで、Ｓｕは、糖又は糖誘導体であり、Ｓｕはｘ個の官能基Ａを含む。
【００４０】
用語「ヌクレオチド」は、本明細書では、その通常の科学的な意味で使用される。用語「ヌクレオチド」とは、核酸塩基、五炭糖（リボース又は２−デオキシリボースのどちらか）、及び１つ、２つ又は３つのリン酸エステル基から構成される分子を指す。リン酸エステル基がない場合、核酸塩基及び糖は、ヌクレオシドを構成する。したがって、ヌクレオチドは、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸又はヌクレオシド三リン酸と呼ぶこともできる。核酸塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル又はチミンとすることができる。ヌクレオチドの例には、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）及びシチジン一リン酸（ＣＭＰ）が含まれる。
【００４１】
用語「タンパク質」は、本明細書では、その通常の科学的な意味で使用される。本明細書では、約１０個以上のアミノ酸を含むポリペプチドが、タンパク質と考えられる。タンパク質は天然のアミノ酸を含み得るが、非天然アミノ酸も含んでもよい。
【００４２】
用語「糖タンパク質」は、本明細書では、その通常の科学的な意味で使用され、タンパク質に共有結合している、１つ若しくは複数のモノサッカライド鎖又は１つ若しくは複数のオリゴサッカライド鎖（「グリカン」）を含む、タンパク質を指す。グリカンは、タンパク質のヒドロキシル基（Ｏ−結合型グリカン）、例えばセリン、トレオニン、チロシン、ヒドロキシリシン若しくはヒドロキシプロリンのヒドロキシル基に、又はタンパク質のアミド官能基（Ｎ−糖タンパク質）、例えばアスパラギン若しくはアルギニンに、又はタンパク質の炭素（Ｃ−糖タンパク質）、例えばトリプトファンに結合し得る。糖タンパク質は、１つを超えるグリカンを含むことがあり、１つ又は複数のモノサッカライド及び１つ又は複数のオリゴサッカライドグリカンを含むことがあり、Ｎ−結合型、Ｏ−結合型及びＣ−結合型グリカンの組合せを含むことがある。すべてのタンパク質の５０％超が、あるグリコシル化形態を有しており、したがって、糖タンパク質として認められることが判断される。糖タンパク質の例には、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＣＡＬ（キャンディダ・アンタルチカ（ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｔｉｃａ）リパーゼ）、ｇｐ４１、ｇｐ１２０、ＥＰＯ（エリスロポエチン）、不凍タンパク質及び抗体が含まれる。
【００４３】
用語「グリカン」は、本明細書では、その通常の科学的な意味で使用され、タンパク質に結合している、モノサッカライド鎖又はオリゴサッカライド鎖を指す。したがって、用語グリカンとは、糖タンパク質の炭水化物の部分を指す。グリカンは、１つの糖のＣ−１炭素を介してタンパク質に結合しており、この糖は、さらに置換されていなくてもよく（モノサッカライド）、又はそのヒドロキシル基の１つ又は複数においてさらに置換されていてもよい（オリゴサッカライド）。天然に存在するグリカンは、通常、１〜約１０のサッカライド部分を含む。しかし、より長鎖のサッカライド鎖がタンパク質に結合している場合、前記サッカライド鎖は、本明細書ではグリカンとも考えられる。
【００４４】
糖タンパク質のグリカンは、モノサッカライドであってもよい。通常、糖タンパク質のモノサッカライドグリカンは、タンパク質と共有結合している、単一のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、グルコース（Ｇｌｃ）、マンノース（Ｍａｎ）又はフコース（Ｆｕｃ）からなる。
【００４５】
グリカンはやはり、オリゴサッカライドであってもよい。糖タンパク質のオリゴサッカライド鎖は、直鎖状又は分岐状であってもよい。オリゴサッカライドにおいて、タンパク質に直接結合している糖は、コア糖と呼ばれる。オリゴサッカライドにおいて、タンパク質に直接結合しておらず、且つ少なくとも２つの別の糖に結合している、糖は、内部糖と呼ばれる。オリゴサッカライドでは、タンパク質に直接結合していないが、他の単一の糖に結合している、すなわち１つ又は複数のその他のヒドロキシル基においてさらなる糖の置換基を有していない糖は、末端糖と呼ばれる。誤解を回避するため、糖タンパク質のオリゴサッカライドにおいて、１つだけのコア糖を除いて、複数の末端糖が存在し得る。
【００４６】
グリカンは、Ｏ−結合型グリカン、Ｎ−結合型グリカン又はＣ−結合型グリカンとすることができる。Ｏ−結合型グリカンでは、モノサッカライド又はオリゴサッカライドグリカンは、通常、セリン（Ｓｅｒ）又はトレオニン（Ｔｈｒ）のヒドロキシル基を介して、タンパク質のアミノ酸中のＯ−原子に結合している。Ｎ−結合型グリカンでは、モノサッカライド又はオリゴサッカライドグリカンは、タンパク質のアミノ酸中のＮ原子を介して、通常、アスパラギン（Ａｓｎ）又はアルギニン（Ａｒｇ）の側鎖中のアミド窒素を介して、タンパク質に結合している。Ｃ−結合型グリカンでは、モノサッカライド又はオリゴサッカライドグリカンは、タンパク質のアミノ酸中のＣ原子、通常、トリプトファン（Ｔｒｐ）のＣ原子に結合している。
【００４７】
タンパク質に直接結合しているオリゴサッカライドの末端は、グリカンの還元末端と呼ばれる。オリゴサッカライドの別の末端は、グリカンの非還元末端と呼ばれる。
【００４８】
Ｏ−結合型グリカンの場合、幅広い多様な鎖が存在する。天然に存在するＯ−結合型グリカンは、ガラクトース、シアル酸及び／又はフコースによりさらに置換されている、セリン又はトレオニン結合α−Ｏ−ＧａｌＮＡｃ部分を、通常、特徴としている。グリカン置換を有するヒドロキシル化アミノ酸は、タンパク質中の任意のアミノ酸配列の一部とすることができる。
【００４９】
Ｎ−結合型グリカンの場合、幅広い多様な鎖が存在する。天然に存在するＮ−結合型グリカンは、アスパラギン結合β−Ｎ−ＧｌｃＮＡｃ部分であって、次に、その４−ＯＨにおいてβ−ＧｌｃＮＡｃによりさらに置換されており、次に、その４−ＯＨ位において、β−Ｍａｎによりさらに置換されており、次に、その３−ＯＨ及び６−ＯＨにおいてα−Ｍａｎによりさらに置換されている、β−Ｎ−ＧｌｃＮＡｃ部分を、通常、特徴としており、グリカン五糖Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２になる。コアＧｌｃＮＡｃ部分は、その６−ＯＨにおいて、α−Ｆｕｃによりさらに置換されていてもよい。五糖であるＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２は、Ｎ−結合糖タンパク質のほとんどすべての共通の足場オリゴサッカライドであり、以下に限定されないが、Ｍａｎ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ及びシアル酸を含めた、幅広い様々な他の置換基を有していてもよい。その側鎖のグリカンにより置換されているアスパラギンは、通常、配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒの一部であり、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸であり、Ｓｅｒ／Ｔｈｒは、セリン又はトレオニンのどちらかである。
【００５０】
用語「抗体」は、本明細書では、その通常の科学的な意味で使用される。抗体は、特定の抗原を認識して結合する能力がある免疫系により産生するタンパク質である。抗体は、糖タンパク質の一例である。用語、抗体は、本明細書では、その最も幅広い意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多特異的抗体（例えば、二特異的抗体）、抗体断片、並びに二重及び単鎖抗体を具体的に含む。用語「抗体」は、本明細書では、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、及びがん抗原に特異的に結合する抗体を含むことがやはり意図されている。用語「抗体」は、全抗体（ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を含むが、抗体の断片、例えば、抗体Ｆａｂ断片、（Ｆａｂ’）２、切断した抗体に由来するＦｖ断片若しくはＦｃ断片、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片、ミニ抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ダイアボディ又はｓｃＦｖも含むことが意図されている。さらに、この用語には、遺伝子操作された抗体及び抗体の誘導体を含む。抗体、抗体の断片、及び遺伝子操作された抗体は、当技術分野で公知の方法によって得ることができる。上市されている適切な抗体には、とりわけ、アブシキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、アダリムマブ、トシツモマブ−１３１Ｉ、セツキシマブ、イブリツキシマブチウキセタン、オマリズマブ、ベバシズマブ、ナタリズマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、エクリズマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ、カナキヌバム、カツマキソマブ、ウステキヌマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、デノスマブ、ベリムバブ、イピリムマブ及びブレンツキシマブが含まれる。
【００５１】
用語「処置」、「処置する」などは、所望の薬理学的及び／又は生理的効果を得ることを指す。この効果は、疾患若しくはその症状を完全に又は部分的に予防するという点で、予防的であってもよく、並びに／又は疾患及び／若しくは疾患に起因する悪影響を部分的に又は完全に治癒するという点で、治療的であってもよい。「処置」は、本明細書で使用する場合、哺乳動物における、特にヒトにおける疾患のいかなる処置にも及んでおり、疾患に罹りやすいおそれがあるが、疾患を有していると未だ診断されていない対象において、疾患の発生を予防すること；疾患を阻害すること、すなわちその発症を抑止すること；疾患を軽減すること、すなわち疾患の後退を引き起こすことを含む。
【００５２】
修飾糖タンパク質の調製方法
本発明は、修飾糖タンパク質を調製する方法であって、適切な触媒の存在下で、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質をＳｕ（Ａ）ｘ−Ｐに接触させるステップを含み、Ｓｕ（Ａ）ｘが、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体Ｓｕであり、ｘは１、２、３又は４であり、Ａが、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホン化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から独立して選択され、Ｐがヌクレオチドであり、適切な触媒が、ガラクトシルトランスフェラーゼ、又は変異触媒ドメインを含むガラクトシルトランスフェラーゼとして定義され、したがって、Ｓｕ（Ａ）ｘ−Ｐは基質であり、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンが、式（１０１）又は（１０２）によるグリカン：
【化３】
2016538877.tif 000005
（式中、
ｂは、０又は１であり、
ｄは、０又は１であり、
ｅは、０又は１であり、
Ｇは、モノサッカライド、又は２〜２０個の糖部分を含む直鎖状若しくは分岐状オリゴサッカライドである）
である、方法に関する。
【００５３】
触媒は、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β（１，３）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼ、変異触媒ドメインを含むβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び変異触媒ドメインを含むβ（１，３）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼからなる群から選択されるのが好ましい。触媒は、以下により詳細に記載されている。
【００５４】
本発明による方法において修飾されることになる糖タンパク質は、グリカンを含み、前記グリカンは、末端ＧｌｃＮＡｃ部分、すなわちグリカンの非還元末端に存在しているＧｌｃ−ＮＡｃ部分を含む。前記グリカンは、１つ又は複数のサッカライド部分を含み、直鎖状又は分岐状とすることができる。本明細書では、ｂが１（すなわち、グリカンがフコシル化ＧｌｃＮＡｃからなる）である、式（１０１）によるグリカンのＧｌｃＮＡｃ部分もまた、末端ＧｌｃＮＡｃ部分と考えられる。
【００５５】
グリカン（１０２）では、ｄが０である場合、ｅが１であり、ｅが０である場合、ｄが１であるのが好ましい。
【００５６】
Ｇは、モノサッカライド、又は２〜２０個、好ましくは２〜１２個、より好ましくは２〜１０個、さらにより好ましくは２〜８個、及び最も好ましくは２〜６個の糖部分を含む、直鎖状若しくは分岐状オリゴサッカライドを表す。グリカン中に存在することができる糖部分は、当業者に公知であり、例えばグルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）又はシアル酸、キシロース（Ｘｙｌ）を含む。
【００５７】
一実施形態では、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは、１つのＧｌｃＮＡｃ部分からなり、グリカンは、ｂが０である、式（１０１）によるグリカンである。別の実施形態では、前記グリカンは、フコシル化ＧｌｃＮＡｃ部分からなり、グリカンは、ｂが１である、式（１０１）によるグリカンである。さらに別の実施形態では、前記グリカンは、コア−ＧｌｃＮＡｃが存在する場合、任意選択でフコシル化（ｂは、０又は１である）されている、式（１０２）によるグリカンである。
【００５８】
コア−ＧｌｃＮＡｃ部分がフコシル化されている場合、フコースは、コア−ＧｌｃＮＡｃ置換基のＣ６にα−１，６結合されているのが最も一般的である。上記の通り、ｂが１である、式（１０１）によるグリカンのＧｌｃＮＡｃ部分もまた、本明細書では、末端ＧｌｃＮＡｃ部分と考えられる。
【００５９】
上記の通り、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含む好ましいグリカンは、式（１０１）又は（１０２）によるグリカンである。さらに好ましい実施形態では、本発明による方法で修飾されることになる糖タンパク質は、式（１０３）又は（１０４）による糖タンパク質： 
【化４】
2016538877.tif 000006
（式中、
Ｐｒは、タンパク質を表し、
ｙは、１〜２０であり、
ｂ、ｄ、ｅ及びＧは、上で定義されている通りである）
である。
【００６０】
ｄが０である場合、ｅは１であり、ｅが０である場合、ｄは１であるのが好ましい。Ｇが、直鎖状又は分岐状オリゴサッカライドである場合、Ｇは、２〜１２個、より好ましくは２〜１０個、さらにより好ましくは２〜８個、及び最も好ましくは２〜６個の糖部分を含むのが好ましい。別の好ましい実施形態では、ｙは１〜１２であり、より好ましくはｙは、１、２、３、４、５、６、７又は８であり、さらにより好ましくはｙは、１、２、３又は４である。ｙが１又は２であるのが、最も好ましい。さらに別の好ましい実施形態では、ｙは２、４、６又は８であり、好ましくは２又は４であり、最も好ましくは２である。この実施形態は、修飾される糖タンパク質が抗体である場合、すなわちＰｒがＡｂである場合、特に好ましい。
【００６１】
本発明による方法において、修飾すべき糖タンパク質が、式（１０３）又は（１０４）による糖タンパク質である場合、糖タンパク質の混合物を原料糖タンパク質として使用してもよく、前記混合物は、１つ又は複数のフコシル化（ｂが１である）グリカン（１０１）及び／若しくは（１０２）、並びに／又は１つ又は複数の非フコシル化（ｂが０である）グリカン（１０１）及び／若しくは（１０１）を含む糖タンパク質を含む。
【００６２】
末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質は、本明細書では、「末端非還元ＧｌｃＮＡｃ−タンパク質」とも呼ばれ、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは、本明細書では、「末端非還元ＧｌｃＮＡｃ−グリカン」とも呼ばれる。用語「末端非還元ＧｌｃＮＡｃ−タンパク質」には、ｂが１である式（１０３）のタンパク質が含まれること、及び用語「末端非還元ＧｌｃＮＡｃ−グリカン」には、ｂが１である式（１０１）のグリカンが含まれることに留意すべきである。
【００６３】
末端非還元ＧｌｃＮＡｃ−タンパク質は、直鎖状又は分岐状の末端非還元ＧｌｃＮＡｃ−グリカンを含んでいてもよい。前記グリカンは、コア糖部分のＣ１を介してタンパク質に結合しており、前記コア糖部分は、好ましくは、コア−ＧｌｃＮＡｃ部分である。結果として、タンパク質に結合している末端非還元ＧｌｃＮＡｃ−グリカンが、式（１０２）によるグリカンである場合、ｄは１であるのが好ましい。
【００６４】
好ましい実施形態では、末端非還元ＧｌｃＮＡｃ−グリカンのコア糖部分のＣ１は、タンパク質中のアミノ酸残基中の窒素原子へのＮ−グリコシド結合、より好ましくはアスパラギン（Ａｓｎ）又はアルギニン（Ａｒｇ）アミノ酸の側鎖のアミド窒素原子へのＮ−グリコシド結合を介して前記タンパク質に結合している。しかし、非還元ＧｌｃＮＡｃ−グリカンのコア糖部分のＣ１は、タンパク質中のアミノ酸残基中の酸素原子へのＯ−グリコシド結合、より好ましくはセリン（Ｓｅｒ）又はトレオニン（Ｔｈｒ）アミノ酸の側鎖の酸素原子へのＯ−グリコシド結合を介して前記タンパク質に結合していてもよい。この実施形態では、前記グリカンのコア糖部分は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ部分又はＯ−ＧａｌＮＡｃ部分であり、好ましくはＯ−ＧｌｃＮＡｃ部分であることが好ましい。非還元ＧｌｃＮＡｃ−グリカンのコア糖部分のＣ１はまた、タンパク質の炭素原子へのＣ−グリコシド結合、例えば、トリプトファン（Ｔｒｐ）へのＣ−グリコシド結合を介して、タンパク質に結合していてもよい。上記の通り、糖タンパク質は、２つ以上のグリカンを含んでいてもよく、Ｎ−結合型、Ｏ−結合型及びＣ−結合型糖タンパク質の組合せを含んでもよい。
【００６５】
末端非還元ＧｌｃＮＡｃ−グリカンは、タンパク質の天然のグリコシル化部位において存在していてもよいが、タンパク質の異なる部位にやはり導入されていてもよい。
【００６６】
好ましい実施形態では、末端非還元ＧｌｃＮＡｃ−タンパク質は抗体（Ａｂ）であり、抗体は、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む。こうした抗体は、本明細書では、「末端非還元ＧｌｃＮＡｃ−抗体」とも称される。好ましい末端非還元ＧｃＮＡｃ−抗体は、上記の式（１０３）又は（１０４）による抗体であり、ここで、ＰｒはＡｂである。この実施形態では、ｙは、１、２、３、４、５、６、７又は８であり、さらにより好ましくはｙは、２、４、６又は８であるのがさらに好ましい。
【００６７】
上で定義されている通り、前記抗体は全抗体であってもよく、やはり抗体断片であってもよい。抗体が全抗体である場合、前記抗体は、各重鎖に、１つ又は複数の、より好ましくは１つの末端非還元ＧｌｃＮＡｃ−グリカンを好ましくは含む。したがって、前記全抗体は、２つ以上、好ましくは２つ、４つ、６つ又は８つの前記グリカン、より好ましくは２つ又は４つ、及び最も好ましくは２つのグリカンを好ましくは含む。言い換えると、前記抗体が全抗体である場合、ｙは、好ましくは２、４、６又は８であり、より好ましくはｙは２又は４であり、最も好ましくはｙは２である。抗体が抗体断片である場合、ｙは、１、２、３又は４であり、より好ましくはｙは１又は２であるのが好ましい。
【００６８】
特定の好ましい実施形態では、前記糖タンパク質が抗体である場合、ｙは１、２又は４である。
【００６９】
好ましい実施形態では、前記抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。前記抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体からなる群から選択されるのが好ましい。前記抗体はＩｇＧ抗体であるのがより好ましく、前記抗体がＩｇＧ１抗体であるのが最も好ましい。
【００７０】
好ましい実施形態では、抗体中の糖タンパク質は、２９０〜３０５の領域のアスパラギン、通常、Ｎ２９７のアスパラギンにおけるＦｃ断片中の保存Ｎ−グリコシル化部位に結合している。別の好ましい実施形態では、抗体中の糖タンパク質は、抗体中の非天然グリコシル化部位に結合している。前記非天然グリコシル化部位が、非天然Ｎ−グリコシル化部位であることがさらに好ましい。非天然グリコシル化部位は、糖鎖工学的技法により、抗体に導入され得る。抗体におけるグリコシル化部位の位置のいくつかの例が、図１３に示されている。
【００７１】
本発明による方法で修飾され得る、末端非還元ＧｌｃＮＡｃ−タンパク質のいくつかの例が、図１に示されている。図１（ａ）は、単一の、任意選択でフコシル化されているＧｌｃＮＡｃ部分を含む糖タンパク質を示している。このＧｌｃＮＡｃ−グリカンは、例えば、Ｎ−グリコシド又はＯ−グリコシド結合を介して、タンパク質に結合していてもよい。図１（ｂ）は、分岐状のオクタサッカライドグリカンを含む糖タンパク質を示しており、分岐の１つは、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含む（このグリカンは、ＧｎＭ５とも称される）。コア−ＧｌｃＮＡｃは、任意選択でフコシル化されていてもよい。図１（ｃ）は、分岐状のヘプタサッカライドグリカンを含む抗体を示しており、コア−ＧｌｃＮＡｃ部分は、任意選択でフコシル化されており、すべての分岐が末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含む。
【００７２】
ガラクトシルトランスフェラーゼ変異体Ｙ２８９Ｌの作用での、非天然ガラクトース誘導体の末端非還元ＧｌｃＮＡｃ−タンパク質へ結合方法が、図２に示されている。
【００７３】
本発明による糖タンパク質を修飾する方法により得ることができる修飾糖タンパク質は、修飾グリカンを含む糖タンパク質として定義され、前記グリカンは、非還元末端においてＧｌｃＮＡｃ−Ｓｕ（Ａ）ｘジサッカライド部分を含んでおり、Ｓｕ（Ａ）ｘは、上で定義されている通りである。
【００７４】
修飾グリカンは、式（１０５）又は（１０６）によるものが好ましく、ｂ、ｄ及びｅ、並びにそれらの好ましい実施形態は、上で定義されている通りであり、Ｓｕ（Ａ）ｘは、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体Ｓｕであり、ｘは、１、２、３又は４であり、Ａは、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホン化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から独立して選択される。
【化５】
2016538877.tif 000007
【００７５】
こうして、本発明はまた、修飾糖タンパク質を調製する方法であって、適切な触媒の存在下で、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質をＳｕ（Ａ）ｘ−Ｐに接触させるステップを含み、Ｓｕ（Ａ）ｘが、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体Ｓｕであり、ｘは１、２、３又は４であり、Ａが、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホン化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から独立して選択され、Ｐがヌクレオチドであり、適切な触媒が、ガラクトシルトランスフェラーゼ、又は変異触媒ドメインを含むガラクトシルトランスフェラーゼとして定義され、したがって、Ｓｕ（Ａ）ｘ−Ｐが基質であり、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンが、上で定義されている式（１０１）又は（１０２）によるグリカンであり、修飾糖タンパク質が、式（１０５）又は（１０６）による修飾グリカンを含む糖タンパク質として定義され、（１０５）及び（１０６）は、上で定義されている通りである、方法に関する。
【００７６】
ここで記載されている方法により得ることができる修飾糖タンパク質は、式（１０７）又は（１０８）による糖タンパク質であり、Ｐｒ、ｂ、ｄ、ｅ、ｙ及びＳｕ（Ａ）ｘ、並びにそれらの好ましい実施形態が、上で定義されている通りであるのが、より好ましい。
【化６】
2016538877.tif 000008
【００７７】
Ｓｕ（Ａ）ｘ及びその好ましい実施形態は、以下でより詳細に記載されている。
【００７８】
本発明による修飾糖タンパク質を調製する方法は、適切な触媒の存在下で行われる。適切な触媒は、ガラクトシルトランスフェラーゼ、又は変異触媒ドメインを含むガラクトシルトランスフェラーゼとして定義され、したがって、Ｓｕ（Ａ）ｘ−Ｐが基質である。触媒がガラクトシルトランスフェラーゼである場合、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、好ましくは野生型ガラクトシルトランスフェラーゼである。触媒が変異触媒ドメインを含むガラクトシルトランスフェラーゼである場合、前記変異体ＧａｌＴドメインは、完全長ＧａｌＴ酵素内に存在していてもよいが、触媒ドメインを含む組換え分子に、やはり存在していてもよい。
【００７９】
触媒は、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β（１，３）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼ、変異触媒ドメインを含むβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び変異触媒ドメインを含むβ（１，３）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼからなる群から選択されるのが好ましい。
【００８０】
一実施形態では、触媒は、野生型ガラクトシルトランスフェラーゼであり、より好ましくは野生型β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ又は野生型β（１，３）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼであり、さらにより好ましくは野生型β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼＩである。β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼＩは、本明細書では、ＧａｌＴとさらに呼ばれる。β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼＩは、ウシβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１、ヒトβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１、ヒトβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ２、ヒトβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ３、ヒトβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ４及びヒトβ（１，３）−Ｇａｌ−Ｔ５からなる群から選択されるのが、さらにより好ましい。
【００８１】
触媒が野生型ガラクトシルトランスフェラーゼである、この実施形態は、糖誘導体Ｓｕ（Ａ）ｘにおける官能基Ａが、前記糖誘導体のＣ２又はＣ６、好ましくはＣ６に存在している場合、特に好ましい。この実施形態では、Ｓｕ（Ａ）ｘは、１つ以下の官能基Ａしか含まないのがさらに好ましい。すなわち、ｘが１であるのが好ましい。Ｓｕ（Ａ）ｘ及びＳｕ（Ａ）ｘ−Ｐは、以下でより詳細に記載されている。
【００８２】
こうして、本発明はまた、修飾糖タンパク質を調製する方法であって、適切な触媒の存在下で、修飾糖を糖タンパク質上の末端ＧｌｃＮＡｃ部分に結合させるステップを含み、修飾糖が、官能基Ａを含む糖として定義され、Ａが、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホン化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から独立して選択され、適切な触媒が、野生型ガラクトシルトランスフェラーゼ、又は変異触媒ドメインを含むガラクトシルトランスフェラーゼとして定義され、したがってＳｕ（Ａ）ｘ−Ｐが基質であるが、但し、触媒が野生型ガラクトシルトランスフェラーゼである場合、前記修飾糖は、１つ以下の官能基Ａしか含んでおらず、前記官能基Ａは、前記修飾糖のＣ６に存在していることを条件とする、方法に関する。
【００８３】
さらなる実施形態では、本発明は、修飾糖タンパク質を調製する方法であって、適切な触媒の存在下で、式（１０１）又は（１０２）によるグリカンを含む糖タンパク質をＳｕ（Ａ）ｘ−Ｐに接触させるステップを含み、Ｓｕ（Ａ）ｘが、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体Ｓｕであり、ｘが１、２、３又は４であり、Ａが、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホン化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から独立して選択され、Ｐがヌクレオチドであり、適切な触媒が、野生型ガラクトシルトランスフェラーゼ、又は変異触媒ドメインを含むガラクトシルトランスフェラーゼとして定義され、したがって、Ｓｕ（Ａ）ｘ−Ｐが基質であるが、但し、触媒が野生型ガラクトシルトランスフェラーゼである場合、Ｓｕ（Ａ）ｘ−Ｐは、１つの官能基Ａを含み（ｘは１である）、前記官能基Ａは、Ｓｕ（Ａ）ｘのＣ２又はＣ６、好ましくはＣ６に存在していることを条件とする、方法に関する。
【００８４】
野生型ガラクトシルトランスフェラーゼは、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ又はβ（１，３）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼであるのが好ましく、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼであるのがより好ましい。
【００８５】
別の実施形態では、触媒は、変異触媒ドメインを含むガラクトシルトランスフェラーゼであり、好ましくは変異触媒ドメインを含むβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ又は変異触媒ドメインを含むβ（１，３）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼであり、より好ましくは変異触媒ドメインを含むβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼである。β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼＩは、本明細書では、ＧａｌＴとさらに呼ばれる。
【００８６】
別の実施形態では、触媒は、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ又はβ（１，３）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼからなる群から、より好ましくは、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ又はβ（１，３）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼからなる群から選択され、すべてが変異触媒ドメインを含む。
【００８７】
好ましい実施形態では、触媒が、変異触媒ドメインを含むβ（１，３）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼであり、好ましくは、前記β（１，３）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼは、ヒトβ（１−３）−Ｇａｌ−Ｔ５である。
【００８８】
本触媒が、変異触媒ドメインを含むβ（１，４）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼであるのがより好ましく、変異触媒ドメインを含むβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼＩであるのがより好ましく、ウシβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１、ヒトβ４−Ｇａｌ−Ｔ１、ヒトβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ２、ヒトβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ３及びヒトβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ４からなる群から選択されるのがさらにより好ましく、すべてが変異触媒ドメインを含む。
【００８９】
触媒が変異触媒ドメインを含む、ウシβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１であるのが最も好ましい。
【００９０】
本発明による方法に適したいくつかの触媒は、当技術分野で公知である。適切な触媒は、例えば、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼＩに由来する変異触媒ドメインを含む触媒である。触媒ドメインは、本明細書では、本発明による特定の方法において、末端非還元ＧｌｃＮＡｃ−グリカンに特定の糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）ｘ−Ｐを結合させる触媒となることが可能なドメインに折りたたんでいるアミノ酸セグメントを指す。β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼＩは、本明細書では、ＧａｌＴとさらに呼ばれる。こうした変異ＧａｌＴ触媒ドメインは、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２年、２７７巻、２０８３３頁、及び国際公開第２００４／０６３３４４号（アメリカ国立衛生研究所）において開示されている。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２年、２７７巻、２０８３３頁及び国際公開第２００４／０６３３４４号は、Ｙ２８９Ｌ、Ｙ２８９Ｎ及びＹ２８９Ｉと呼ばれる、ウシβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１のＴｙｒ−２８９変異体を開示している。前記変異触媒ドメインＹ２８９Ｌ、Ｙ２８９Ｎ及びＹ２８９Ｉの調製方法は、参照により本明細書に明確に組み込まれている、国際公開第２００４／０６３３４４号の３４頁６行目〜３６頁２行目に詳細に開示されている。
【００９１】
グルコース−β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミン結合の形成を触媒する、変異ＧａｌＴドメインは、国際公開第２００４／０６３３４４号の１０頁２５行目〜１２頁４行目（参照により本明細書に明確に組み込まれている）に開示されている。Ｎ−アセチルガラクトサミン−β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミン結合の形成を触媒する、変異ＧａｌＴドメインは、国際公開第２００４／０６３３４４号の１２頁６行目〜１３頁２行目（参照により本明細書に明確に組み込まれている）に開示されている。Ｎ−アセチルグルコサミン−β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミン結合及びマンノース−β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミン結合の形成を触媒する、変異ＧａｌＴドメインは、国際公開第２００４／０６３３４４号の１２頁１９行目から１４頁６行目（参照により本明細書に明確に組み込まれている）に開示されている。
【００９２】
開示されている変異ＧａｌＴドメインには、参照により本明細書に明確に組み込まれている、国際公開第２００４／０６３３４４号の１４頁３１行目〜１６頁２８行目に開示されている通り、完全長ＧａｌＴ酵素内部又は触媒ドメインを含有する組換え分子に含まれ得る。
【００９３】
別の変異体ＧａｌＴドメインは、例えば、参照により本明細書に明確に組み込まれている、ＢｏｊａｒｏｖａらのＧｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００９年、１９巻、５０９頁により開示されているＹ２８４Ｌであり、この場合、Ｔｙｒ２８４がロイシンにより置きかえられている。
【００９４】
別の変異体ＧａｌＴドメインは、例えば、参照により本明細書に明確に組み込まれている、Ｑａｓｂａら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００２年、１２巻、６９１頁により開示されているＲ２２８Ｋであり、この場合、Ａｒｇ２２８がリシンにより置きかえられている。
【００９５】
触媒はまた、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｎ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｆ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｍ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｖ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｇ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｉ及びＧａｌＴ  Ｙ２８９Ａからなる群から選択される、好ましくは、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｆ及びＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｍからなる群から選択されるウシβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼに由来する変異触媒ドメインも含むことができる。ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｎ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｆ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｍ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｖ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｇ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｉ及びＧａｌＴ  Ｙ２８９Ａは、Ｙ２８９Ｌ、Ｙ２８９Ｎ及びＹ２８９Ｉについて、国際公開第２００４／０６３３４４号、Ｑａｓｂａら、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒ．２００３年、３０巻、２１９頁及びＱａｓｂａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２年、２７７巻、２０８３３頁（すべてが、参照により組み込まれている）において開示されているものと同様の方法で、部位特異的変異誘発法により得ることができる。ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｎでは、２８９位のチロシンアミノ酸（Ｙ）が、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸により置きかえられており、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｆでは、２８９位のチロシンアミノ酸（Ｙ）が、フェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸により置きかえられており、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｍでは、前記チロシンがメチオニン（Ｍ）アミノ酸により、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｖでは、バリン（Ｖ）アミノ酸により、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｇでは、グリシン（Ｇ）アミノ酸により、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｉでは、イソロイシン（Ｉ）アミノ酸により、及びＹ２８９Ａでは、アラニン（Ａ）アミノ酸により置きかえられている。
【００９６】
本発明により修飾糖タンパク質を調製する方法の好ましい実施形態では、前記触媒は、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼに由来する、好ましくはウシβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１に由来する、変異触媒ドメインを含む触媒である。
【００９７】
触媒は、好ましくはウシβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１  ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｌ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｎ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｉ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｆ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｍ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｖ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｇ及びＧａｌＴ  Ｙ２８９Ａからなる群から選択される、より好ましくは、ウシβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１  ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｌ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｎ及びＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｉからなる群から選択される、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼに由来する変異触媒ドメインを含む触媒であるのが好ましい。
【００９８】
さらなる好ましい実施形態では、前記触媒は、Ｙ２８９Ｌ、Ｙ２８９Ｎ、Ｙ２８９Ｉ、Ｙ２８４Ｌ、Ｒ２２８Ｋ、Ｙ２８９Ｆ、Ｙ２８９Ｍ、Ｙ２８９Ｖ、Ｙ２８９Ｇ及びＹ２８９Ａからなる群から選択される、好ましくはＹ２８９Ｌ、Ｙ２８９Ｎ、Ｙ２８９Ｉ、Ｙ２８４Ｌ及びＲ２２８Ｋからなる群から選択される、ＧａｌＴ変異触媒ドメインを含む触媒である。別の好ましい実施形態では、前記触媒は、Ｙ２８９Ｆ、Ｙ２８９Ｍ、Ｙ２８９Ｖ、Ｙ２８９Ｇ及びＹ２８９Ａからなる群から選択される、ウシβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１変異触媒ドメインを含む、触媒である。前記触媒が、Ｙ２８９Ｌ、Ｙ２８９Ｎ及びＹ２８９Ｉからなる群から選択されるＧａｌＴ変異触媒ドメインを含む触媒であるのがより好ましく、前記触媒が、Ｙ２８９Ｌからなる群から選択されるＧａｌＴ変異触媒ドメインを含む触媒であるのが、最も好ましい。
【００９９】
別のタイプの適切な触媒は、参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２００９／０２５６４６号に開示されている、α（１，３）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α３Ｇａｌ−Ｔとさらに呼ばれる）、好ましくはα（１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（α３ＧａｌＮＡｃ−Ｔとさらに呼ばれる）に基づく触媒である。α３Ｇａｌ−Ｔの変異は、酵素の供与体特異性を拡張することができ、α３ＧａｌＮＡｃ−Ｔになる。α３ＧａｌＮＡｃ−Ｔの変異は、酵素の供与体特異性を拡張することができる。α（１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼのポリペプチド断片及び触媒ドメインは、国際公開第２００９／０２５６４６号の２６頁１８行目〜４７頁１５行目、及び７７頁２１行目〜８２頁４行目（どちらも参照により本明細書に明確に組み込まれている）に開示されている。
【０１００】
本発明により修飾糖タンパク質を調製する方法は、例えばリン酸で緩衝した生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、ｔｒｉｓ−緩衝生理食塩水）、クエン酸塩、ＨＥＰＥＳ、ｔｒｉｓ及びグリシンなどの適切な緩衝溶液中で、好ましくは行われる。適切な緩衝液は、当技術分野で公知である。緩衝溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又はｔｒｉｓ緩衝液であることが好ましい。
【０１０１】
本方法は、約４〜約５０℃の範囲、より好ましくは約１０〜約４５℃の範囲、さらにより好ましくは約２０〜約４０℃の範囲、及び最も好ましくは約３０〜約３７℃の範囲の温度で、好ましくは行われる。
【０１０２】
本方法は、約５〜約９の範囲、好ましくは約５．５〜約８．５の範囲、より好ましくは約６〜約８の範囲のｐＨで、好ましくは行われる。本方法は、約７〜約８の範囲のｐＨで行うのが最も好ましい。
【０１０３】
Ｓｕ（Ａ）ｘは、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体Ｓｕとして定義され、Ａは、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホン化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から独立して選択され、ｘは１、２、３又は４である。
【０１０４】
Ｓｕ（Ａ）ｘ部分はまた、「修飾糖」と呼ぶこともできる。修飾糖は、本明細書では、糖又は糖誘導体として定義され、前記糖又は糖誘導体は、１個、２個、３個又は４個の官能基Ａを含み、Ａは、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホン化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から選択される。修飾糖又は糖誘導体が、例えば、チオール基を含む場合、前記糖又は糖誘導体は、チオール修飾糖又は糖誘導体と呼ぶことができる。修飾糖又は糖誘導体が、例えば、チオール前駆体基を含む場合、前記糖又は糖誘導体は、チオール前駆体修飾糖又は糖誘導体と呼ぶことができる。修飾糖又は糖誘導体が、例えば、ハロゲンを含む場合、前記糖又は糖誘導体は、ハロゲン修飾糖又は糖誘導体と呼ぶことができる。修飾糖又は糖誘導体が、例えば、スルホニルオキシ基を含む場合、前記糖又は糖誘導体は、スルホニルオキシ修飾糖又は糖誘導体と呼ぶことができる。
【０１０５】
チオール基は、本明細書では、−［Ｃ（Ｒ７）２］ｏＳＨ基として定義され、Ｒ７は、水素、ハロゲン及び（任意選択で置換されている）Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基からなる群から独立して選択され、ｏは、０〜２４である。Ｒ７が、水素又はＣ１、Ｃ２、Ｃ３若しくはＣ４アルキル基であるのが好ましく、Ｒ７が水素又は−ＣＨ３であるのがより好ましい。ｏが０〜１０であるのが好ましく、０、１、２、３、４、５又は６であるのがより好ましい。Ｒ７が水素、−ＣＨ３又はＣ２アルキル基であり、及び／又はｏが０、１、２、３又は４であるのがより好ましい。Ｒ７が水素であり、ｏが０、１、２又は３であるのがさらにより好ましく、ｏが１又は２であるのがより好ましく、ｏが０又は１であるのが最も好ましい。ｏが０であるのが最も好ましい。前記チオール基が、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、−ＣＨ２ＳＨ又は−ＳＨであるのが最も好ましく、−ＳＨであるのが好ましい。
【０１０６】
チオール基の前駆体は、本明細書では、−［Ｃ（Ｒ７）２］ｏＳＣ（Ｏ）ＣＨ３基として定義され、Ｒ７及びｏ、及びそれらの好ましい実施形態は、チオール基の場合に上で定義されている通りである。前記チオール−前駆体が、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＣ（Ｏ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣ（Ｏ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＳＣ（Ｏ）ＣＨ３又は−ＳＣ（Ｏ）ＣＨ３であるのが最も好ましく、−ＳＣ（Ｏ）ＣＨ３であるのが好ましい。本発明により修飾糖タンパク質を調製する方法では、Ａがチオール基の前駆体である、糖誘導体Ｓｕ（Ａ）ｘを使用することができる。前記方法の間、チオール前駆体はチオール基に変換される。
【０１０７】
ハロゲンは、本明細書では、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩとして定義される。前記ハロゲンが、Ｃｌ又はＢｒであるのが好ましく、Ｃｌであるのがより好ましい。
【０１０８】
スルホニルオキシ基は、本明細書では、−［Ｃ（Ｒ７）２］ｏＯＳ（Ｏ）２Ｒ８基として定義され、Ｒ７及びｏは、チオール基に関して上で定義されている通りであり、Ｒ８は、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキルアリール基及びＣ７〜Ｃ２４アリールアルキル基からなる群から選択される。Ｒ８は、好ましくは、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ１２アリール基、Ｃ７〜Ｃ１２アルキルアリール基又はＣ７〜Ｃ１２アリールアルキル基であり、より好ましくはＣ１〜Ｃ４アルキル基、Ｃ７〜Ｃ１２アルキルアリール基又はＣ７〜Ｃ１２アリールアルキル基であり、さらにより好ましくは−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、Ｃ３の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、フェニル基又はＣ７アルキルアリール基である。Ｒ８は、最も好ましくは、メチル基、エチル基、フェニル基又はｐ−トリル基である。Ｒ７が、水素、又はＣ１、Ｃ２、Ｃ３若しくはＣ４アルキル基であるのが好ましく、Ｒ７が、水素又は−ＣＨ３であるのがより好ましい。ｏが、０〜１０であるのが好ましく、０、１、２、３、４、５又は６であるのがより好ましい。Ｒ７が、水素、−ＣＨ３又はＣ２アルキル基であり、及び／又はｏが０、１、２、３又は４であるのがより好ましい。Ｒ７が水素であり、ｏが１又は２であるのがさらにより好ましく、ｏが０であるのが最も好ましい。Ｒ８は、好ましくは、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基、Ｃ７〜Ｃ１２アルキルアリール基又はＣ７〜Ｃ１２アリールアルキル基であり、より好ましくは−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、Ｃ３の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、又はＣ７アルキルアリール基である。スルホニルオキシ基が、メシレート基、−ＯＳ（Ｏ）２ＣＨ３、ベンゼンスルホネート基（−ＯＳ（Ｏ）２（Ｃ６Ｈ５））、又はトシレート基（−ＯＳ（Ｏ）２（Ｃ６Ｈ４ＣＨ３））であるのが、最も好ましい。
【０１０９】
ハロゲン化アセトアミド基は、本明細書では、−ＮＨＣ（Ｏ）［Ｃ（Ｒ７）２］ｏＸ基として定義され、Ｒ７は、水素、ハロゲン及び（任意選択で置換されている）Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基からなる群から独立して選択され、Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩであり、ｏは、０〜２４である。Ｒ７が、水素又はＣ１、Ｃ２、Ｃ３又はＣ４アルキル基であるのが好ましく、Ｒ７が、水素又は−ＣＨ３であるのがより好ましく、水素であるのが最も好ましい。ｏが、０〜１０であるのが好ましく、１、２、３、４、５又は６であるのがより好ましく、１、２、３又は４であるのがさらにより好ましく、ｏが１であるのが最も好ましい。Ｒ７が、水素、−ＣＨ３又はＣ２アルキル基であり、及び／又はｏが１、２、３若しくは４であるのがより好ましく、Ｒ７が水素であり、ｏが１であるのが最も好ましい。Ｘが、Ｃｌ又はＢｒであるのが好ましく、Ｘが、Ｃｌであるのがより好ましい。Ｒ７が水素であり、ＸがＣｌであり、ｏが１であるのが最も好ましい。
【０１１０】
メルカプトアセトアミド基は、本明細書では、−ＮＨＣ（Ｏ）［Ｃ（Ｒ７）２］ｏＳＨ基として定義され、Ｒ７は、水素、ハロゲン及び（任意選択で置換されている）Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基からなる群から独立して選択され、ｏは、０〜２４である。Ｒ７が、水素、又はＣ１、Ｃ２、Ｃ３若しくはＣ４アルキル基であるのが好ましく、Ｒ７が、水素又は−ＣＨ３であるのがより好ましく、水素であるのが最も好ましい。ｏが、０〜１０であるのが好ましく、１、２、３、４、５又は６であるのがより好ましく、１、２、３又は４であるのがさらにより好ましく、ｏが２、３又は４であるのが最も好ましい。Ｒ７が、水素、−ＣＨ３又はＣ２アルキル基であり、及び／又はｏが１、２、３若しくは４であるのがより好ましい。Ｒ７が水素であり、ｏが、１、２、３又は４であるのがより好ましい。Ｒ７が水素であり、ｏが、１、２又は３であるのが最も好ましく、１であるのが好ましい。好ましい例には、メルカプトエタノイルアミド基、メルカプトプロパノイルアミド基、メルカプトブタノイルアミド基及びメルカプトペンタノイルアミド基、好ましくはメルカプトプロパノイルアミド基が含まれる。
【０１１１】
スルホン化ヒドロキシアセトアミド基は、本明細書では、−ＮＨＣ（Ｏ）［Ｃ（Ｒ７）２］ｏＯＳ（Ｏ）２Ｒ８基として定義され、Ｒ７は、水素、ハロゲン及び（任意選択で置換されている）Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基からなる群から独立して選択され、Ｒ８は、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキルアリール基及びＣ７〜Ｃ２４アリールアルキル基からなる群から選択され、ｏは０〜２４である。Ｒ８は、好ましくは、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ１２アリール基、Ｃ７〜Ｃ１２アルキルアリール基又はＣ７〜Ｃ１２アリールアルキル基であり、より好ましくは−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、Ｃ３の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、Ｃ６〜Ｃ９アリール基、又はＣ７アルキルアリール基である。スルホニルオキシ基は、メシレート基−ＯＳ（Ｏ）２ＣＨ３、ベンゼンスルホネート基−ＯＳ（Ｏ）２（Ｃ６Ｈ５）、又はトシレート基−ＯＳ（Ｏ）２（Ｃ６Ｈ４ＣＨ３）であるのが最も好ましい。Ｒ７が、水素、又はＣ１、Ｃ２、Ｃ３若しくはＣ４アルキル基であるのが好ましく、Ｒ７が、水素又は−ＣＨ３であるのがより好ましく、水素であるのが最も好ましい。ｏが、０〜１０であるのが好ましく、１、２、３、４、５又は６であるのがより好ましく、１、２、３又は４であるのがさらにより好ましく、ｏが１であるのが最も好ましい。Ｒ７が、水素、−ＣＨ３若しくはＣ２アルキル基であり、及び／又はｏが１、２、３若しくは４であるのがより好ましい。Ｒ７が水素であり、ｏが、１、２又は３であるのがさらにより好ましい。Ｒ７がＨであり、ｏが１であり、Ｒ８が、メシレート基、ベンゼンスルホネート基又はトシレート基であるのが、なおさらにより好ましい。Ｒ７が水素であり、Ｒ８が−ＣＨ３であり、ｏが１であるのが最も好ましい。
【０１１２】
糖誘導体Ｓｕ（Ａ）ｘは、１個又は複数の官能基Ａを含んでもよい。Ｓｕ（Ａ）ｘが、２個以上の官能基Ａを含む場合、各官能基Ａは独立して選択され、すなわち１つのＳｕ（Ａ）ｘが、異なる官能基Ａ、例えばチオール基及びハロゲンなどを含んでもよい。好ましい実施形態では、ｘは、１又は２であり、より好ましくは、ｘは１である。別の好ましい実施形態では、官能基Ａは、チオール又はハロゲンであり、より好ましくはハロゲンである。
【０１１３】
糖誘導体Ｓｕ（Ａ）ｘは、糖又は糖誘導体Ｓｕ、例えばアミノ糖、又は他には誘導体化されている糖から誘導される。糖及び糖誘導体の例には、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、グルコース（Ｇｌｃ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸又はシアル酸（Ｓｉａｌ）及びフコース（Ｆｕｃ）が含まれる。
【０１１４】
アミノ糖は、ヒドロキシル（ＯＨ）基がアミン基により置きかえられている糖であり、例には、グルコサミン（ＧｌｃＮＨ２）及びガラクトサミン（ＧａｌＮＨ２）が含まれる。他の誘導体化されている糖の例には、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸、Ｓｉａ若しくはＮｅｕＮＡｃ）又はフコース（Ｆｕｃ）が含まれる。
【０１１５】
糖誘導体Ｓｕ（Ａ）ｘは、好ましくは、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、グルコース（Ｇｌｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、フコース（Ｆｕｃ）及びＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸Ｓｉａ又はＮｅｕＮＡｃ）から、好ましくはＧｌｃＮＡｃ、Ｇｌｃ、Ｇａｌ及びＧａｌＮＡｃからなるから誘導される。Ｓｕ（Ａ）ｘが、Ｇａｌ又はＧａｌＮＡｃから誘導されるのがより好ましく、Ｓｕ（Ａ）ｘがＧａｌＮＡｃから誘導されるのが最も好ましい。
【０１１６】
Ｓｕ（Ａ）ｘにおける１個又は複数の官能基Ａは、いくつかの方法で、糖又は糖誘導体Ｓｕに結合されていてもよい。１個又は複数の官能基Ａは、ヒドロキシル（ＯＨ）基の代わりに、糖又は糖誘導体のＣ２、Ｃ３、Ｃ４及び／又はＣ６に結合していてもよい。フコースは、Ｃ６にＯＨ基を欠いているので、ＡがＦｕｃのＣ６に結合している場合、ＡはＨ原子の場所を占めることに留意すべきである。Ｓｕ（Ａ）ｘにおける１個又は複数の官能基Ａは、糖又は糖誘導体ＳｕのＣ２及び／又はＣ６に存在し得ることが好ましい。官能基Ａが、糖又は糖誘導体のＣ２のＯＨ基の代わりに存在している場合、Ａは、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホン化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から好ましくは選択される。しかし、Ａが、２−アミノ糖誘導体、例えば、ＧａｌＮＡｃ又はＧｌｃＮＡｃのＣ２に存在している場合、Ａは、ハロゲン、チオール基及びスルホニルオキシ基からなる群から好ましくは選択される。
【０１１７】
Ａがチオール基である場合、前記チオール基は、糖誘導体の６位又は２ーアミノ糖誘導体に存在しているのが好ましい。Ａがチオール基である、Ｓｕ（Ａ）ｘの一例は、２−（メルカプトアセトアミド）−２−デオキシ−ガラクトース（２−ＧａｌＮＡｃＳＨ）である。Ａがチオール基である、Ｓｕ（Ａ）ｘの別の例は、６−メルカプト−６−デオキシ−ガラクトースである。
【０１１８】
Ａがハロゲンである場合、前記ハロゲンは、糖誘導体の６位又は２ーアミノ糖誘導体に存在しているのが好ましい。Ａがハロゲンである、Ｓｕ（Ａ）ｘの一例は、２−（クロロアセトアミド）−２−デオキシ−ガラクトース（２−ＧａｌＮＡｃＣｌ）である。Ａがハロゲンである、Ｓｕ（Ａ）ｘの別の例は、６−ヨード−６−デオキシ−ガラクトースである。Ａがハロゲンである、Ｓｕ（Ａ）ｘの別の例は、６−（クロロアセトアミド）−６−デオキシ−ガラクトースである。
【０１１９】
Ａがスルホニルオキシ基である場合、前記スルホニルオキシ基は、糖誘導体の６位又は２−アミノ糖誘導体に存在しているのが好ましい。Ａがスルホニルオキシ基である、Ｓｕ（Ａ）ｘの一例は、２−（メチルスルホニルオキシアセトアミド）−２−デオキシ−ガラクトース（２−ＧａｌＮＡｃＯＭｓ）である。Ａがスルホニルオキシ基である、Ｓｕ（Ａ）ｘの別の例は、２−（ベンゼンスルホニルオキシアセトアミド）−２−デオキシ−ガラクトース（２−ＧａｌＮＡｃＯＭｓ）である。Ａがスルホニルオキシ基である、Ｓｕ（Ａ）ｘの別の例は、６−（メチルスルホニル）−ガラクトースである。
【０１２０】
Ａが、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基又はスルホン化ヒドロキシアセトアミド基である場合、前記基は、糖誘導体の６位に存在しているのが好ましい。
【０１２１】
Ｓｕ（Ａ）ｘ−Ｐのさらなる例には、６−クロロ−６−デオキシガラクトース−ＵＤＰ（６−ＣｌＧａｌ−ＵＤＰ）、６−チオ−６−デオキシガラクトース−ＵＤＰ（６−ＨＳＧａｌ−ＵＤＰ）などの６−Ａ−６−デオキシガラクトース−ＵＤＰ（６−Ａ−Ｇａｌ−ＵＤＰ）、又は２−クロロ−２−デオキシガラクトース−ＵＤＰ（２−ＣｌＧａｌ−ＵＤＰ）、２−チオ−２−デオキシガラクトース−ＵＤＰ（２−ＨＳＧａｌ−ＵＤＰ）などの２−Ａ−２−デオキシガラクトース−ＵＤＰ（２−Ａ−Ｇａｌ−ＵＤＰ）が含まれる。或いは、Ａは、アセトアミド基の一部として糖誘導体に間接的に置換され、このアセトアミド基は、ひいては、ヒドロキシル基を置換していてもよい。例には、６−クロロアセトアミド−６−デオキシガラクトース−ＵＤＰ（Ｘ＝Ｃｌである、６−ＧａｌＮＡｃＣｌ−ＵＤＰ（２３））、６−チオアセトアミド−６−デオキシガラクトース−ＵＤＰ（１つのＣＨ２を有しており、Ｒ＝Ｈである、６−ＧａｌＮＡｃＳＨ−ＵＤＰ（２０））などの６−Ａ−アセトアミド−６−デオキシガラクトース−ＵＤＰ（６−ＧａｌＮＡｃＡ−ＵＤＰ）、又は２−クロロアセトアミド−２−デオキシガラクトース−ＵＤＰ（Ｘ＝Ｃｌである、２−ＧａｌＮＡｃＣｌ−ＵＤＰ（２１））、２−チオアセトアミド−２−デオキシガラクトース−ＵＤＰ（１つのＣＨ２を有しており、Ｒ＝Ｈである、２−ＧａｌＮＡｃＳＨ−ＵＤＰ（１８））などの２−Ａ−アセトアミド−２−デオキシガラクトース−ＵＤＰ（２−ＧａｌＮＡｃＡ−ＵＤＰ）が含まれる。或いは、Ａは、別の官能基の一部として糖誘導体に間接的に置換され、この別の官能基は、ひいては、ヒドロキシル基を置換しているか、又はヒドロキシル基に結合していてもよい。こうした他の官能基の例には、（ヘテロ）アルキル鎖又は（ヘテロ）アリール鎖が含まれる。
【０１２２】
Ｐは、本明細書では、ヌクレオチドとして定義される。Ｐは、好ましくは、ヌクレオシド一リン酸及びヌクレオシド二リン酸からなる群から、より好ましくは、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）及びシチジン一リン酸（ＣＭＰ）からなる群から、より好ましくは、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、シチジン二リン酸及び（ＣＤＰ）からなる群から選択される。ＰがＵＤＰであるのが最も好ましい。
【０１２３】
ヌクレオシド一リン酸又はヌクレオシド二リン酸Ｐが糖誘導体Ｓｕ（Ａ）ｘに結合している、式Ｓｕ（Ａ）ｘ−Ｐのいくつかの化合物は、当技術分野で公知である。例えば、参照により本明細書にすべてが組み込まれている、Ｗａｎｇら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１０年、１６巻、１３３４３〜１３３４５頁、Ｐｉｌｌｅｒら、ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２年、７巻、７５３頁、Ｐｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００５年、１５巻、５４５９〜５４６２頁、及び国際公開第２００９／１０２８２０号（Ｑａｓｂａら）は、化合物Ｓｕ（Ａ）ｘ−Ｐのいくつか、及びそれらの合成を開示している。
【０１２４】
チオール、ハロ及びメシチルオキシ置換されている糖及び糖誘導体である、Ｓｕ（Ａ）ｘ−ＵＤＰに結合している、ウリジン二リン酸のいくつかの例（１８〜２３）が、以下に示されている。同様に、Ａがチオール前駆体（Ｒ＝Ａｃである、１８〜２０）である、Ｓｕ（Ａ）ｘ−Ｐの例も示されている。上記の通り、１８〜２０では、ｏが、１、２、３、４、５又は６、好ましくは１、２、３又は４、より好ましくは１、２又は３であるのが好ましい。さらに、Ｒは、Ｈ又はＡｃである。
【化７】
2016538877.tif 000009
【０１２５】
ケト、アルキニル、ハロゲン、チオール、チオール化アセトアミド及びハロゲン化アセトアミド置換されている糖及び糖誘導体の追加の例（３〜１７）が図３に示されており、こうした糖及び糖誘導体のすべてが、それらの対応するＵＤＰ糖であるＳｕ（Ａ）ｘ−ＵＤＰに変換することができ、Ｓｕ（Ａ）ｘ−ＵＤＰの一部が図４に図示されている。それらのすべてが、共通前駆体２７から容易に調製することができる、チオール誘導体又はハロゲン化アセトアミド誘導体の一部の合成が、図５に図示されている。
【０１２６】
上記の通り、本発明により修飾糖タンパク質を調製する方法において使用することができる、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）ｘ−Ｐのいくつかは、野生型ガラクトシルトランスフェラーゼの基質である。これらの糖誘導体であるヌクレオチドＳｕ（Ａ）ｘ−Ｐの場合、本発明による方法は、触媒として、野生型ガラクトシルトランスフェラーゼ、好ましくは野生型β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、より好ましくはβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼＩの存在下で行うことができる。
【０１２７】
野生型ガラクトシルトランスフェラーゼが触媒として使用される場合、Ｓｕ（Ａ）ｘ−Ｐは、ｘが１であり、Ａが糖又は糖誘導体のＣ６に存在しており、Ａが、上で定義されている通りの、Ｓｕ（Ａ）ｘ−Ｐからなる群から選択されるのが好ましい。Ａは、ヒドロキシル基の代わりに、糖誘導体に直接、置換されていてもよい。例には、６−Ａ−６−デオキシガラクトース−ＵＤＰ（６−Ａ−Ｇａｌ−ＵＤＰ）、６−クロロ−６−デオキシガラクトース−ＵＤＰ（１つのＣＨ２を有しており、Ｘ＝Ｃｌである、６−ＣｌＧａｌ−ＵＤＰ（２２））、６−チオ−６−デオキシガラクトース−ＵＤＰ（１つのＣＨ２を有しており、Ｒ＝Ｈである、６−ＨＳＧａｌ−ＵＤＰ（１９））が含まれる。
【０１２８】
或いは、Ａは、アセトアミド基の一部として糖誘導体に間接的に置換され、このアセトアミド基は、ひいては、ヒドロキシル基を置換していてもよい。例には、６−クロロアセトアミド−６−デオキシガラクトース−ＵＤＰ（Ｘ＝Ｃｌである、６−ＧａｌＮＡｃＣｌ−ＵＤＰ（２３））、６−チオアセトアミド−６−デオキシガラクトース−ＵＤＰ（１つのＣＨ２を有しており、Ｒ＝Ｈである、６−ＧａｌＮＡｃＳＨ−ＵＤＰ（２０））などの６−Ａ−アセトアミド−６−デオキシガラクトース−ＵＤＰ（６−ＧａｌＮＡｃＡ−ＵＤＰ）が含まれる。或いは、Ａは、別の官能基の一部として糖誘導体に間接的に置換され、この別の官能基は、ひいては、ヒドロキシル基を置換しているか、又はヒドロキシル基に結合していてもよい。こうした他の官能基の例には、（ヘテロ）アルキル鎖又は（ヘテロ）アリール鎖が含まれる。
【０１２９】
修飾糖タンパク質を調製する方法の好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）ｘは、１個又は２個の官能基Ａを含み、すなわち、好ましくはｘは１又は２である。ｘが１であるのがより好ましい。好ましい実施形態では、Ｓｕは、ガラクトース（Ｇａｌ）である。さらに好ましい実施形態では、ｘは、１又は２であり、ＳｕはＧａｌであり、最も好ましくは、ｘは１であり、ＳｕはＧａｌである。
【０１３０】
好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）ｘは、６−ＧａｌＮＡｃＣｌ、６−ＧａｌＮＡｃＳＨ、２−ＧａｌＮＡｃＣｌ、２−ＧａｌＮＡｃＳＨ、６−ＣｌＧａｌ、２−ＣｌＧａｌ、２−ＨＳＧａｌ及び６−ＨＳＧａｌからなる群から、より好ましくは６−ＧａｌＮＡｃＣｌ、６−ＧａｌＮＡｃＳＨ、２−ＧａｌＮＡｃＣｌ、２−ＧａｌＮＡｃＳＨ、６−ＣｌＧａｌ及び２−ＣｌＧａｌからなる群から選択される。
【０１３１】
さらに好ましい実施形態では、ｘは１であり、Ｓｕ（Ａ）ｘは、６−ＧａｌＮＡｃＣｌ、６−ＧａｌＮＡｃＳＨ、２−ＧａｌＮＡｃＣｌ、２−ＧａｌＮＡｃＳＨ、６−ＣｌＧａｌ、２−ＣｌＧａｌ、２−ＨＳＧａｌ及び６−ＨＳＧａｌからなる群から、より好ましくは６−ＧａｌＮＡｃＣｌ、６−ＧａｌＮＡｃＳＨ、２−ＧａｌＮＡｃＣｌ、２−ＧａｌＮＡｃＳＨ、６−ＣｌＧａｌ及び２−ＣｌＧａｌからなる群から選択される。
【０１３２】
好ましい実施形態では、Ａは、チオール基又はハロゲンである。
【０１３３】
本発明による修飾糖タンパク質を修飾する方法の特に好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）ｘは、２−ＧａｌＮＡｃＳＨ、２−ＧａｌＮＡｃＸ、２−ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、６−ＧａｌＮＡｃＳＨ、６−ＧａｌＮＡｃＸ及び６−ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）２Ｒ８からなる群から選択される。さらにより好ましい実施形態では、ｘ１又は２であり、Ｓｕ（Ａ）ｘは、２−ＧａｌＮＡｃＳＨ、２−ＧａｌＮＡｃＸ、２−ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、６−ＧａｌＮＡｃＳＨ、６−ＧａｌＮＡｃＸ及び６−ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）２Ｒ８からなる群から選択される。最も好ましい実施形態では、ｘは１であり、Ｓｕ（Ａ）ｘは、２−ＧａｌＮＡｃＳＨ、２−ＧａｌＮＡｃＸ、２−ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、６−ＧａｌＮＡｃＳＨ、６−ＧａｌＮＡｃＸ及び６−ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）２Ｒ８からなる群から選択され、ＸはＣｌ又はＢｒであり、好ましくはＣｌである。
【０１３４】
本発明による修飾糖タンパク質を調製する方法の特に好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）ｘ−Ｐは、２−ＧａｌＮＡｃＳＨ−ＵＤＰ（１つのＣＨ２を有しており、Ｒ＝Ｈである、（１８））、２−ＧａｌＮＡｃＸ−ＵＤＰ（２１）、２−ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）２Ｒ８−ＵＤＰ、６−ＧａｌＮＡｃＳＨ−ＵＤＰ（１つのＣＨ２を有しており、Ｒ＝Ｈである、（２０））、６−ＧａｌＮＡｃＸ−ＵＤＰ（２３）及び６−ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）２Ｒ８−ＵＤＰからなる群から選択され、触媒は、変異触媒ドメインＧａｌＴを含むウシβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１（Ｙ２８９Ｌ）であり、Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩであり、Ｒ８は、メチル基、エチル基、フェニル基又はｐ−トリル基である。
【０１３５】
さらなる好ましい実施形態では、２−ＧａｌＮＡｃＸ−ＵＤＰは、２−ＧａｌＮＡｃＣｌ−ＵＤＰ又は２−ＧａｌＮＡｃＢｒ−ＵＤＰであり、より好ましくは２−ＧａｌＮＡｃＣｌ−ＵＤＰであり、６−ＧａｌＮＡｃＸ−ＵＤＰは、６−ＧａｌＮＡｃＣｌ−ＵＤＰ又は６−ＧａｌＮＡｃＢｒ−ＵＤＰであり、より好ましくは６−ＧａｌＮＡｃＣｌ−ＵＤＰである。別の好ましい実施形態では、２−ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）２Ｒ８−ＵＤＰにおけるＲ８は、メチル、フェニル又はｐ−トリルであり、最も好ましくはメチルであり、６−ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）２Ｒ８−ＵＤＰにおけるＲ８は、メチル、フェニル又はｐ−トリルであり、最も好ましくはＲ８はメチルである。
【０１３６】
本発明により修飾糖タンパク質を調製する方法の別の特に好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）ｘ−Ｐは、６−ＨＳＧａｌ−ＵＤＰ、６−ＸＧａｌ−ＵＤＰ、６−Ｒ８Ｓ（Ｏ）２ＯＧａｌ−ＵＤＰからなる群から選択され、触媒は、野生型ヒトＧａｌＴであり、Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩであり、Ｒ８は、メチル基、エチル基、フェニル基又はｐ−トリル基である。Ｘは、より好ましくは、Ｃｌ又はＢｒであり、最も好ましくはＣｌである。Ｒ８は、より好ましくはメチル、フェニル又はｐ−トリルであり、最も好ましくはメチルである。ヒトＧａｌＴは、好ましくは、ヒトβ４−Ｇａｌ−Ｔ１、ヒトβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ２、ヒトβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ３及びヒトβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ４である。
【０１３７】
本発明による修飾糖タンパク質を調製する方法は、非還元末端に、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質を用意することを含むステップをさらに含んでもよい。したがって、本発明はまた、
（ｉ）  非還元末端において、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質を用意するステップ、及び
（ｉｉ）  適切な触媒の存在下で、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質をＳｕ（Ａ）ｘ−Ｐに接触させるステップであって、Ｓｕ（Ａ）ｘは、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体Ｓｕであり、ｘは１、２、３又は４であり、Ａは、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホン化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から独立して選択され、Ｐはヌクレオチドであり、適切な触媒は、ガラクトシルトランスフェラーゼ、又は変異触媒ドメインを含むガラクトシルトランスフェラーゼとして定義され、したがって、Ｓｕ（Ａ）ｘ−Ｐは基質であり、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは、式（１０１）又は（１０２）によるグリカン：
【化８】
2016538877.tif 000010
（式中、ｂ、ｄ、ｅ及びＧは、上で定義されている通りである）
である、ステップ
を含む、修飾糖タンパク質を調製する方法に関する。
【０１３８】
ステップ（ｉｉ）における触媒は、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β（１，３）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼ、変異触媒ドメインを含むβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び変異触媒ドメインを含むβ（１，３）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼからなる群から選択されるのが好ましい。触媒は、上でより詳細に記載されている。
【０１３９】
非還元末端において、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質、すなわち末端非還元ＧｌｃＮＡｃタンパク質は、いくつかの方法、例えば、（ａ）ＥＭＢＯ  Ｊ．２００１年、１２巻、３０４６頁（参照により組み込まれている）に記載されている通り、Ｎ−糖タンパク質をエンド−グリコシダーゼによりトリミングすることによって、又は（ｂ）例えば、参照により組み込まれているＧｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００６年、１７巻、１０４〜１１８頁においてＳａｔｏｈらにより記載されている、スワインソニンの存在下でのハイブリッド型Ｎ−糖タンパク質の発現（続いて、シアリダーゼ／ガラクトシダーゼ処理する）によって用意され得る。
【０１４０】
特定の実施形態では、本発明はまた、
（ｉ）  エンド−グリコシダーゼの作用により、オリゴサッカライドグリカンを含む糖タンパク質をトリミングすることによって、非還元末端に末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質を用意するステップ、及び
（ｉｉ）  適切な触媒の存在下で、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質をＳｕ（Ａ）ｘ−Ｐに接触させるステップであって、Ｓｕ（Ａ）ｘが、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体Ｓｕであり、ｘが１、２、３又は４であり、Ａが、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホン化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から独立して選択され、Ｐがヌクレオチドであり、適切な触媒が、ガラクトシルトランスフェラーゼ、又は変異触媒ドメインを含むガラクトシルトランスフェラーゼとして定義され、したがって、Ｓｕ（Ａ）ｘ−Ｐが基質であり、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンが、式（１０１）又は（１０２）によるグリカン
【化９】
2016538877.tif 000011
（式中、ｂ、ｄ、ｅ及びＧは、上で定義されている通りである）
である、ステップ
を含む、修飾用タンパク質を調製する方法に関する。
【０１４１】
触媒は、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β（１，３）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼ、変異触媒ドメインを含むβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び変異触媒ドメインを含むβ（１，３）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼからなる群から選択されるのが好ましい。触媒は、上でより詳細に記載されている。
【０１４２】
グリカンは、糖タンパク質の一部である、アスパラギンアミノ酸のアミド側鎖に結合している糖タンパク質に、ＧｌｃＮＡｃ残基のＣ１を介して結合し得る。オリゴサッカライドは、Ｎ−グリコシド結合を介して、大部分の場合、アスパラギン（Ａｓｎ）又はアルギニン（Ａｒｇ）のアミノ酸側鎖に結合し得る。
【０１４３】
多くの異なるタイプのグリカンが存在する。例えば、Ｉｇ抗体のＦｃ領域は、高度に保存されているＮ−グリコシル化部位を保有する。この部位に結合しているＮ−グリカンは、主にコアがフコシル化されている、複合型の二アンテナ構造である。別のタイプのグリカンは、高マンノースグリカンのクラスである。高マンノースは、通常、２つのＮ−アセチルグルコサミン、及び様々な数のマンノース残基を含む。
【０１４４】
上記の通り、グリカンは、ＧｌｃＮＡｃ残基を介して糖タンパク質に結合することができ、このＧｌｃＮＡｃ残基はフコシル化されていてもよい。図１では、これはｂによって示されている。ｂが０の場合、前記ＧｌｃＮＡｃ残基は、フコシル化されておらず、ｂが１の場合、前記ＧｌｃＮＡｃはフコシル化されている。
【０１４５】
多くのグリカンでは、第２のＧｌｃＮＡｃ残基が、図１の（ｂ）及び（ｃ）においてやはり分かる通り、糖タンパク質に直接、結合しているＧｌｃＮＡｃ残基に結合している。第２のＧｌｃＮＡｃ残基が、糖タンパク質に直接、結合しているＧｌｃＮＡｃ残基に結合しているグリカン（例えば、図１（ｂ）及び（ｃ））は、非還元末端において、式（１０１）による末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質を得るために、トリミングされ得る。トリミングは、前記２つのＧｌｃＮＡｃ残基の間で行われる。グリカンのトリミングにより、図１（ａ）において示されている通り、式（１０１）によるグリカンが得られる。好ましくは、前記ＧｌｃＮＡｃのＣ１と抗体のアミノ酸側鎖に存在しているアミドとを介したＮ−グリコシド結合により、Ｎ−グリコシル化部位に共有結合している、こうしたＧｌｃＮＡｃ残基は、本明細書では、「末端ＧｌｃＮＡｃ部分」と呼ばれ、「コア−ＧｌｃＮＡｃ部分」とも呼ばれる。前記末端ＧｌｃＮＡｃ部分又はコア−ＧｌｃＮＡｃ部分は、任意選択でフコシル化されている。
【０１４６】
グリカンのトリミングは、適切な酵素の作用により行われ、オリゴサッカライド（グリカンとも呼ばれる）のトリミング後に、末端ＧｌｃＮＡｃ部分が得られる。トリミングによって、式（１０１）による末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンが得られる。この末端ＧｌｃＮＡｃ部分は、フコシル化されていてもよく（図１（ａ）におけるｂが１である）、又はフコシル化されていなくてもよい（ｂが０である）。
【０１４７】
「適切な酵素」は、トリミングされることになるオリゴサッカライドが基質である、酵素として定義される。本発明による方法のこの特定の実施形態のステップ（ｉ）において使用されることになる、好ましいタイプの酵素は、トリミングされる特定のグリカン（単数又は複数）に依存する。本発明による方法のこの特定の実施形態の好ましい実施形態では、本方法のこの特定の実施形態のステップ（ｉ）における酵素は、エンド−グリコシダーゼの群から選択される。
【０１４８】
エンド−グリコシダーゼは、グリカン構造における内部グリコシド結合を切断する能力があり、これにより、リモデリング及び合成上の処理（ｅｎｄｅａｖｏｒ）に利益をもたらす。例えば、エンド−グリコシダーゼは、エンド−グリコシダーゼがグリカンの保存領域内の予測可能な部位で切断を行う場合、不均一なグリカン集団を簡単に均一化するために使用することができる。この点でエンドグリコシダーゼの最も重要なクラスの１つは、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースコアにおいてβ−１，４−グリコシド結合を加水分解することにより、糖タンパク質からＮ−グリカンを取り除き、単一のコアＮ−結合型ＧｌｃＮＡｃ残基にする加水分解酵素のクラスである、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＣ３．２．１．９６、エンド及びＥＮＧアーゼとして一般に知られている）を含む（参照により本明細書に組み込まれている、ＷｏｎｇらのＣｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１１年、１１１巻、４２５９頁により概説されている）。パウチマンノースに特異的なエンドＤ；高マンノースに特異的なエンドＡ及びエンドＨ；高マンノースから二アンテナ複合型までに及ぶエンドＦサブタイプ；及びフコシル化グリカンを除く大部分のＮ−グリカン構造（高マンノース／複合型／ハイブリッド型）を切断することができるエンドＭを含む共通の化学酵素変種を含めた、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼが、自然界に幅広く分布していることが見いだされており、高マンノース型オリゴサッカライドに対する加水分解活性は、複合型及びハイブリッド型オリゴサッカライドに対する加水分解活性よりもかなり高い。これらのＥＮＧアーゼは、遠位Ｎ−グリカン構造に特異性を示し、遠位Ｎ−グリカン構造を示さないタンパク質には特異性を示さず、これにより、天然条件において、糖タンパク質から大部分のＮ−結合型グリカンを切断するのにＥＮＧアーゼを有用なものにしている。
【０１４９】
エンドグリコシダーゼＦ１、Ｆ２及びＦ３は、天然タンパク質の脱グリコシル化に最も適している。エンドＦ１、Ｆ２及びＦ３の結合特異性は、タンパク質を変性させることなく、すべてのクラスのＮ−結合型オリゴサッカライドを取り除くことができる、タンパク質の脱グリコシル化の一般的な戦略を示唆する。二アンテナ及び三アンテナ構造は、それぞれエンドグリコシダーゼＦ２及びＦ３により直ちに取り除くことができる。オリゴ−マンノース及びハイブリッド構造は、エンドＦ１により取り除かれ得る。
【０１５０】
エンドＦ３は、エンドＦ３による切断が、オリゴサッカライドのペプチド結合の状態、及びコアフコシル化の状態に敏感であるという点で、特有のものである。エンドグリコシダーゼＦ３は、アスパラギン結合されている二アンテナ及び三アンテナ複合型オリゴサッカライドを切断する。エンドグリコシダーゼＦ３は、フコシル化されていない二アンテナ及び三アンテナ構造を遅い速度で切断するが、ペプチド結合されている場合に限る。コアフコシル化されている二アンテナ構造は、エンドＦ３に対して有効な基質であり、このエンドＦ３の活性は最大４００倍である。オリゴマンノース及びハイブリッド分子に対して活性はない。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、ＴａｒｅｎｔｉｎｏらのＧｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９５年、５巻、５９９頁を参照されたい。
【０１５１】
エンドＳは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）から分泌されるエンドグリコシダーゼであり、やはり、Ｃｏｌｌｉｎら（参照により本明細書に組み込まれている、ＥＭＢＯ  Ｊ．２００１年、２０巻、３０４６頁）により開示されている通り、グリコシドヒドロラーゼファミリー１８に属する。しかし、上記のＥＮＧアーゼとは対照的に、エンドＳは、より明確な特異性を有しており、ヒトＩｇＧのＦｃドメインにおける保存Ｎ−グリカンしか切断しない特異性があり（現在のところ、別の基質は何ら特定されていない）、酵素とＩｇＧとの間のタンパク質−タンパク質相互作用によりこの特異性がもたらされることが示唆される。
【０１５２】
エンドＳ４９は、参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２０１３／０３７８２４号（Ｇｅｎｏｖｉｓ  ＡＢ）に記載されている。エンドＳ４９はストレプトコッカス・ピオゲネスＮＺ１３１から単離され、エンドＳのホモログである。エンドＳ４９は、天然のＩｇＧに特異的なエンドグリコシダーゼ活性を有しており、エンドＳよりも多くの様々なＦｃグリカンを切断する。
【０１５３】
好ましい実施形態では、この実施形態のステップ（ｉ）における酵素は、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼである。さらなる好ましい実施形態では、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、エンドＳ、エンドＳ４９、エンドＦ１、エンドＦ２、エンドＦ３、エンドＨ、エンドＭ、エンドＡ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【０１５４】
トリミングされることになるグリカンが、複合型の二アンテナ構造である場合、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、エンドＳ、エンドＳ４９、エンドＦ１、エンドＦ２、エンドＦ３、及びそれらの組合せからなる群から好ましくは選択される。
【０１５５】
トリミングされることになるオリゴサッカライドが、複合型の二アンテナ構造であり（すなわち、図１（ｃ）によるもの）、且つこのオリゴサッカライドがＮ２９７におけるＩｇＧの保存Ｎ−グリコシル化部位に存在している場合、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、好ましくはエンドＳ、エンドＳ４９、エンドＦ１、エンドＦ２、エンドＦ３、及びそれらの組合せからなる群から、より好ましくはエンドＳ、エンドＳ４９、及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【０１５６】
トリミングされることになるグリカンが、複合型の二アンテナ構造であり、且つこのグリカンがＮ２９７におけるＩｇＧの保存Ｎ−グリコシル化部位に存在していない場合、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、エンドＦ１、エンドＦ２、エンドＦ３、及びそれらの組合せからなる群から好ましくは選択される。
【０１５７】
トリミングされることになるグリカンが高マンノースである場合、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、エンドＨ、エンドＭ、エンドＡ及びエンドＦ１からなる群から好ましくは選択される。
【０１５８】
したがって、本発明はまた、
（ｉ）  式（１０１）による末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質を用意するために、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの作用により、オリゴサッカライドグリカンを含む、糖タンパク質のグリカンをトリミングするステップ、及び
（ｉｉ）  適切な触媒の存在下で、式（１０１）によるグリカンを含む前記糖タンパク質をＳｕ（Ａ）ｘ−Ｐに接触させるステップであって、Ｓｕ（Ａ）ｘが、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体Ｓｕであり、ｘが１、２、３又は４であり、Ａが、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホン化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から独立して選択され、Ｐがヌクレオチドであり、適切な触媒が、ガラクトシルトランスフェラーゼ、又は変異触媒ドメインを含むガラクトシルトランスフェラーゼとして定義され、したがって、Ｓｕ（Ａ）ｘ−Ｐが基質であり、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンが、式（１０１）又は（１０２）によるグリカン
【化１０】
2016538877.tif 000012
（式中、ｂ、ｄ、ｅ及びＧは、上で定義されている通りである）
である、ステップ
を含む、修飾糖タンパク質を調製する方法に関する。
【０１５９】
ステップ（ｉｉ）における触媒は、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β（１，３）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼ、変異触媒ドメインを含むβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び変異触媒ドメインを含むβ（１，３）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼからなる群から選択されるのが好ましい。ガラクトシルトランスフェラーゼは、上でより詳細に記載されている。
【０１６０】
さらなる好ましい実施形態では、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、エンドＳ、エンドＳ４９、エンドＦ１、エンドＦ２、エンドＦ３、エンドＨ、エンドＭ、エンドＡ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、エンドＳ、エンドＳ４９、エンドＦ１、エンドＦ２、エンドＦ３、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されるのがより好ましい。エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼが、エンドＳ又はエンドＳ４９であるのが最も好ましい。
【０１６１】
本発明による方法のトリミングするステップ（２）は、例えばリン酸で緩衝した生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、ｔｒｉｓ−緩衝生理食塩水）、クエン酸塩、ＨＥＰＥＳ、ｔｒｉｓ及びグリシンなどの適切な緩衝溶液中で、好ましくは行われる。適切な緩衝液は、当技術分野で公知である。緩衝溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又はｔｒｉｓ緩衝液が好ましい。
【０１６２】
本方法は、約４〜約５０℃の範囲、より好ましくは約１０〜約４５℃の範囲、さらにより好ましくは約２０〜約４０℃の範囲、及び最も好ましくは約３０〜約３７℃の範囲の温度で、好ましくは行われる。
【０１６３】
本方法は、約５〜約９の範囲、好ましくは約５．５〜約８．５の範囲、より好ましくは約６〜約８の範囲のｐＨで、好ましくは行われる。本方法は、約７〜約８の範囲のｐＨで行うのが最も好ましい。
【０１６４】
修飾糖タンパク質
本発明はまた、本発明による修飾糖タンパク質を調製する方法により得ることができる、糖タンパク質に関する。
【０１６５】
修飾糖タンパク質は、修飾グリカンを含む糖タンパク質として定義され、前記グリカンは、非還元末端においてＧｌｃＮＡｃ−Ｓｕ（Ａ）ｘジサッカライド部分を含んでおり、Ｓｕ（Ａ）ｘは、上で定義されている通りである。好ましい実施形態では、糖タンパク質は抗体である。
【０１６６】
好ましい実施形態では、糖タンパク質は、式（１０５）又は（１０６）によるグリカン：
【化１１】
2016538877.tif 000013
（式中、
ｂは、０又は１であり、
ｄは、０又は１であり、
ｅは、０又は１であり、
Ｇは、モノサッカライド、又は２〜２０の糖部分を含む直鎖状若しくは分岐状オリゴサッカライドであり、
Ｓｕ（Ａ）ｘは、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体Ｓｕであり、ｘは、１、２、３又は４であり、Ａは、チオール基、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホン化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から独立して選択される）
を含む。
【０１６７】
上記の通り、本発明による修飾糖タンパク質を調製する方法において、官能基Ａがチオール基の前駆体である場合、前記前駆体は、前記方法の間にチオール基に変換される。結果として、本方法が、官能基Ａとしてチオール基の前駆体を含む糖誘導体Ｓｕ（Ａ）ｘを用いて行われる場合、官能基Ａとしてチオール基を含む修飾糖タンパク質が得られる。
【０１６８】
ｄが０である場合、ｅは１であり、ｅが０である場合、ｄは１であるのが好ましい。
【０１６９】
Ｇは、モノサッカライド、又は２〜２０個、好ましくは２〜１２個、より好ましくは２〜１０個、さらにより好ましくは２〜８個、及び最も好ましくは２〜６個の糖部分を含む、直鎖状若しくは分岐状オリゴサッカライドを表す。グリカン中に存在することができる糖部分は、当業者に公知であり、例えばグルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）若しくはシアル酸、又はキシロース（Ｘｙｌ）を含む。
【０１７０】
上記の方法により得ることができる修飾糖タンパク質は、式（１０７）又は（１０８）による糖タンパク質：
【化１２】
2016538877.tif 000014
（式中、
Ｐｒは、タンパク質を表し、
ｙは、１〜２０であり、
Ｓｕ（Ａ）ｘ、ｂ、ｄ、ｅ及びＧは、上で定義されている通りである）
であるのがより好ましい。
【０１７１】
好ましい実施形態では、ｙは１〜１２であり、より好ましくは、ｙは、１、２、３、４、５、６、７又は８であり、さらにより好ましくは、ｙは、１、２、３又は４である。ｙが１又は２であるのが、最も好ましい。さらに別の好ましい実施形態では、ｙは２、４、６又は８である。この実施形態は、修飾される糖タンパク質が抗体である場合、すなわちＰｒがＡｂである場合、特に好ましい。
【０１７２】
好ましい実施形態では、非還元末端においてＧｌｃＮＡｃ−Ｓｕ（Ａ）ｘジサッカライド部分を含む、修飾グリカンのコア糖部分のＣ１は、タンパク質のアミノ酸残基中の窒素原子、より好ましくはアスパラギン（Ａｓｎ）又はアルギニン（Ａｒｇ）アミノ酸の側鎖中のアミド窒素原子へのＮ−グリコシド結合を介して、前記タンパク質に結合している。しかし、前記修飾グリカンのコア糖部分のＣ１はまた、タンパク質のアミノ酸残基中の酸素原子、より好ましくはセリン（Ｓｅｒ）又はトレオニン（Ｔｈｒ）アミノ酸の側鎖中の酸素原子へのＯ−グリコシド結合を介して、前記タンパク質に結合していてもよい。この実施形態では、前記グリカンのコア糖部分は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ部分又はＯ−ＧａｌＮＡｃ部分であり、好ましくはＯ−ＧｌｃＮＡｃ部分であるのが好ましい。前記修飾グリカンのコア糖部分のＣ１はまた、タンパク質の炭素原子、例えばトリプトファン（Ｔｒｐ）へのＣ−グリコシド結合を介して、タンパク質に結合していてもよい。上記の通り、糖タンパク質は、２つ以上のオリゴサッカライド鎖を含んでいてもよく、Ｎ−結合型、Ｏ−結合型及びＣ−結合糖タンパク質の組合せを構成してもよい。
【０１７３】
前記修飾グリカンは、タンパク質の天然のグリコシル化部位において存在していてもよいが、タンパク質の異なる部位にやはり導入されてもよい。
【０１７４】
好ましい実施形態では、修飾糖タンパク質は修飾抗体である。前記抗体（Ａｂ）は、非還元末端においてＧｌｃＮＡｃ−Ｓｕ（Ａ）ｘジサッカライド部分を含むグリカンを含む。こうした抗体は、本明細書では、修飾抗体とも称される。好ましい修飾抗体は、上で定義されている式（１０７）又は（１０８）による抗体であり、ここで、ＰｒはＡｂである。この実施形態では、ｙは、１、２、３、４、５、６、７又は８であるのがさらに好ましく、ｙは、１、２、３又は４であるのがさらにより好ましい。
【０１７５】
上で定義されている通り、前記抗体は全抗体であってもよいが、やはり抗体断片であってもよい。抗体が全抗体である場合、前記抗体は、各重鎖に、１つ又は複数の、より好ましくは１つの修飾グリカンを好ましくは含む。したがって、前記全抗体は、２つ以上、好ましくは２つ、４つ、６つ又は８つの前記グリカン、より好ましくは２つ又は４つ、及び最も好ましくは２つのグリカンを好ましくは含む。言い換えると、前記抗体が全抗体である場合、ｙは、好ましくは２、４、６又は８であり、より好ましくはｙは２又は４であり、最も好ましくはｙは２である。抗体が抗体断片である場合、ｙは、１、２、３又は４であり、より好ましくはｙは１又は２であるのが好ましい。
【０１７６】
好ましい実施形態では、前記抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。前記抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体からなる群から選択されるのが好ましい。前記抗体がＩｇＧ抗体であるのがより好ましく、前記抗体がＩｇＧ１抗体であるのが最も好ましい。
【０１７７】
好ましい実施形態では、修飾抗体における糖タンパク質は、２９０〜３０５の領域のアスパラギン、通常、Ｎ２９７のアスパラギンにおけるＦｃ断片中の保存されているＮ−グリコシル化部位に結合している。上記の通り、前記修飾グリカンは、タンパク質、この場合、抗体の天然のグリコシル化部位において存在していてもよいが、異なる部位にやはり存在していてもよい。図１３は、モノクローナル抗体、例えばＩｇＧの様々なグリコ型を示している。修飾グリカンは重鎖又は軽鎖中のいずれの位置にも存在し得る。
【０１７８】
糖誘導体Ｓｕ（Ａ）ｘ及びその好ましい実施形態は、上で詳細に記載されている。基Ａの定義及びその好ましい実施形態、並びに修飾糖タンパク質を調製する方法の好ましい実施形態はまた、前記方法により得ることができる修飾糖タンパク質にも当てはまる。したがって、好ましい実施形態では、ｘは１又は２であり、より好ましくは、ｘは１である。別の好ましい実施形態では、官能基Ａは、チオール基、ハロゲン又はハロゲン化アセトアミド基であり、より好ましくはハロゲンである。
【０１７９】
本発明による修飾糖タンパク質及び修飾抗体に存在するＳｕ（Ａ）ｘのさらなる例には、６−クロロ−６−デオキシガラクトース（６−ＣｌＧａｌ）、６−チオ−６−デオキシガラクトース（６−ＨＳＧａｌ）などの６−Ａ−６−デオキシガラクトース（６−Ａ−Ｇａｌ）、又は２−クロロ−２−デオキシガラクトース（２−ＣｌＧａｌ）、２−チオ−２−デオキシガラクトース（２−ＨＳＧａｌ）などの２−Ａ−２−デオキシガラクトース（２−Ａ−Ｇａｌ）が含まれる。或いは、Ａは、アセトアミド基の一部として糖誘導体に間接的に置換され、このアセトアミド基は、ひいては、ヒドロキシル基を置換していてもよい。例には、６−クロロアセトアミド−６−デオキシガラクトース（６−ＧａｌＮＡｃＣｌ）、６−チオアセトアミド−６−デオキシガラクトース（６−ＧａｌＮＡｃＳＨ）などの６−Ａ−アセトアミド−６−デオキシガラクトース（６−ＧａｌＮＡｃＡ）、又は２−クロロアセトアミド−２−デオキシガラクトース（２−ＧａｌＮＡｃＣｌ）、２−チオアセトアミド−２−デオキシガラクトース（２−ＧａｌＮＡｃＳＨ）などの２−Ａ−アセトアミド−２−デオキシガラクトース（２−ＧａｌＮＡｃＡ）が含まれる。或いは、Ａは、別の官能基の一部として糖誘導体に間接的に置換され、この別の官能基は、ひいては、ヒドロキシル基を置換しているか、又はヒドロキシル基に結合していてもよい。こうした他の官能基の例には、（ヘテロ）アルキル鎖又は（ヘテロ）アリール鎖が含まれる。
【０１８０】
好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）ｘは、６−ＧａｌＮＡｃＣｌ、６−ＧＡＬＮＡｃＳＨ、２−ＧａｌＮＡｃＣｌ及び２−ＧａｌＮＡｃＳＨからなる群から選択される。
【０１８１】
好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）ｘは、１個又は２個の官能基Ａを含み、すなわち、好ましくはｘは１又は２である。ｘが１であるのがより好ましい。別の好ましい実施形態では、Ｓｕは、ガラクトース（Ｇａｌ）である。さらに好ましい実施形態では、ｘは、１又は２であり、ＳｕはＧａｌであり、最も好ましくは、ｘは１であり、ＳｕはＧａｌである。
【０１８２】
好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）ｘは、６−ＧａｌＮＡｃＣｌ、６−ＧａｌＮＡｃＳＨ、２−ＧａｌＮＡｃＣｌ、２−ＧａｌＮＡｃＳＨ、６−ＣｌＧａｌ、２−ＣｌＧａｌ、２−ＨＳＧａｌ及び６−ＨＳＧａｌからなる群から、より好ましくは６−ＧａｌＮＡｃＣｌ、６−ＧａｌＮＡｃＳＨ、２−ＧａｌＮＡｃＣｌ、２−ＧａｌＮＡｃＳＨ、６−ＣｌＧａｌ及び２−ＣｌＧａｌからなる群から選択される。
【０１８３】
さらに好ましい実施形態では、ｘは１であり、Ｓｕ（Ａ）ｘは、６−ＧａｌＮＡｃＣｌ、６−ＧａｌＮＡｃＳＨ、２−ＧａｌＮＡｃＣｌ、２−ＧａｌＮＡｃＳＨ、６−ＣｌＧａｌ、２−ＣｌＧａｌ、２−ＨＳＧａｌ及び６−ＨＳＧａｌからなる群から、より好ましくは６−ＧａｌＮＡｃＣｌ、６−ＧａｌＮＡｃＳＨ、２−ＧａｌＮＡｃＣｌ、２−ＧａｌＮＡｃＳＨ、６−ＣｌＧａｌ及び２−ＣｌＧａｌからなる群から選択される。
【０１８４】
本発明による修飾糖タンパク質の好ましい実施形態では、Ａはチオール基又はハロゲンである。修飾糖タンパク質は、好ましくは、チオール修飾糖タンパク質又はハロゲン修飾糖タンパク質である。糖タンパク質がハロゲン修飾糖タンパク質である場合、糖タンパク質は、好ましくは塩素修飾糖タンパク質、臭素修飾糖タンパク質又はヨウ素修飾糖タンパク質であり、より好ましくは塩素修飾糖タンパク質又は臭素修飾糖タンパク質であり、最も好ましくは塩素修飾糖タンパク質である。ｘが１であり、修飾糖タンパク質が、好ましくは、チオール修飾糖タンパク質又はハロゲン修飾糖タンパク質（好ましくは、塩素又は臭素修飾糖タンパク質、最も好ましくは、塩素修飾糖タンパク質）であるのがより好ましい。
【０１８５】
本発明による修飾糖タンパク質の特に好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）ｘは、２−ＧａｌＮＡｃＳＨ、２−ＧａｌＮＡｃＸ、２−ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、６−ＧａｌＮＡｃＳＨ、６−ＧａｌＮＡｃＸ及び６−ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）２Ｒ８からなる群から選択される。さらにより好ましい実施形態では、ｘは１又は２であり、Ｓｕ（Ａ）ｘは、２−ＧａｌＮＡｃＳＨ、２−ＧａｌＮＡｃＸ、２−ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、６−ＧａｌＮＡｃＳＨ、６−ＧａｌＮＡｃＸ及び６−ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）２Ｒ８からなる群から選択される。最も好ましい実施形態では、ｘは１であり、Ｓｕ（Ａ）ｘは、２−ＧａｌＮＡｃＳＨ、２−ＧａｌＮＡｃＸ、２−ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、６−ＧａｌＮＡｃＳＨ、６−ＧａｌＮＡｃＸ及び６−ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）２Ｒ８からなる群から選択される。Ｒ８、及びＲ８の好ましい実施形態は、上で定義されている通りである。
【０１８６】
本発明による修飾糖タンパク質がチオール基を含む場合、前記修飾糖タンパク質は、チオール修飾糖タンパク質と呼ぶことができる。修飾糖タンパク質がハロゲンを含む場合、前記糖タンパク質は、ハロゲン修飾糖タンパク質と呼ぶことができる。修飾糖タンパク質がスルホニルオキシ基を含む場合、前記糖タンパク質は、スルホニルオキシ修飾糖タンパク質と呼ぶことができる。修飾糖タンパク質がメルカプトアセトアミド基を含む場合、前記糖タンパク質は、メルカプトアセトアミド修飾糖タンパク質と呼ぶことができる。修飾糖タンパク質がハロゲン化アセトアミド基を含む場合、前記糖タンパク質は、ハロゲン化アセトアミド修飾糖タンパク質と呼ぶことができる。修飾糖タンパク質がスルホン化ヒドロキシアセトアミド基を含む場合、前記糖タンパク質は、スルホン化ヒドロキシアセトアミド修飾糖タンパク質と呼ぶことができる。
【０１８７】
本発明はまた、糖タンパク質コンジュゲートの調製における、本発明による修飾糖タンパク質の使用であって、糖タンパク質コンジュゲートが、リンカーＬを介して対象の分子Ｄにコンジュゲートされている糖タンパク質として定義される、使用に関する。
【０１８８】
糖タンパク質コンジュゲートを調製する方法
本発明はまた、タンパク質コンジュゲートの調製における、本発明による修飾糖タンパク質の使用に関する。タンパク質コンジュゲートは、本明細書では、リンカー（Ｌ）を介して、対象の分子（Ｄ）にコンジュゲートされているタンパク質として定義される。本発明によるタンパク質コンジュゲートは、リンカー（Ｌ）を介して１つ又は１つ超の対象の分子（Ｄ）にコンジュゲートされ得る。
【０１８９】
本発明はまた、抗体コンジュゲートの調製における、本発明による修飾抗体の使用であって、抗体コンジュゲートが、リンカーＬを介して対象の分子（Ｄ）にコンジュゲートされている抗体として定義される、使用に関する。
【０１９０】
対象の分子は、例えば、リポーター分子、診断用分子、活性物質、酵素、アミノ酸（非天然アミノ酸を含む）、（非触媒的）タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、グリカン、（ポリ）エチレングリコールジアミン（例えば、１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン又はより長いエチレングリコール鎖を含む等価物）、ポリエチレングリコール鎖、ポリエチレンオキシド鎖、ポリプロピレングリコール鎖、ポリプロピレンオキシド鎖、１，ｘ−ジアミノアルカン（ｘは、アルカンの炭素原子数である）、アジド又は（ヘテロ）シクロアルキニル部分とすることができ、好ましくは二価又は二官能性（ヘテロ）シクロアルキニル部分とすることができる。好ましい実施形態では、本対象の分子は、アミノ酸（特に、リシン）、活性物質、リポーター分子、アジド及び（ヘテロ）シクロアルキニル部分からなる群から選択される。
【０１９１】
活性物質は、薬理学的及び／又は生物物質、すなわち、生物学的及び／又は薬学的に活性な物質、例えば薬物又はプロドラッグ、診断剤、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、グリカン、脂質、ビタミン、ステロイド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、ＲＮＡ又はＤＮＡである。適切なペプチドタグの例には、ヒトラクトフェン又はポリアルギニンの様な細胞透過性ペプチドが含まれる。適切なグリカンの一例は、オリゴマンノースである。
【０１９２】
好ましい実施形態では、活性物質は、薬物及びプロドラッグからなる群から選択される。活性物質は、薬学的に活性な化合物、例えば、細胞毒、抗ウイルス剤、抗菌剤、ペプチド及びオリゴヌクレオチドなどの、特に、低から中程度の分子量の化合物（例えば、約２００〜約１５００Ｄａ、好ましくは約３００〜約１０００Ｄａ）からなる群から選択されるのがより好ましい。細胞毒の例には、カンプトテシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキサン、カリケアミシン、デュオカルマイシン、マイタンシン、アウリスタチン及びピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）が含まれる。細胞毒は、コルヒチン、ビンカアルカロイド、カンプトテシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキサン、カリケアミシン、チューブリシン、イリノテカン、阻害性ペプチド、アマニチン、デボーガニン、デュオカルマイシン、マイタンシン、アウリスタチン及びピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）からなる群から選択されるのが好ましい。好ましい実施形態では、細胞毒は、カンプトテシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキサン、カリケアミシン、デュオカルマイシン、マイタンシン、アウリスタチン及びピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、細胞毒は、コルヒチン、ビンカアルカロイド、チューブリシン、イリノテカン、阻害性ペプチド、アマニチン及びデボーガニンからなる群から選択される。
【０１９３】
リポーター分子は、その存在が容易に検出される分子、例えば診断剤、色素、フルオロフォア、放射活性同位体標識、コントラスト剤、磁気共鳴造影剤又は質量標識である。フルオロフォアの例には、アレクサフルオル（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）（例えば、アレクサフルオル５５５）、シアン色素（例えば、Ｃｙ３又はＣｙ５）、クマリン誘導体、フルオレセイン、ローダミン、アロフィコシアニン及びクロモマイシンのすべての種類が含まれる。
【０１９４】
放射活性同位体標識の例には、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１８Ｆ、１４Ｃ、６４Ｃｕ、１３１Ｉ又は１２３Ｉが含まれ、これらは、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ又はＨＹＮＩＣなどのキレート部分を介して結合させてもよく、又は結合させなくてもよい。
【０１９５】
本発明によるタンパク質コンジュゲートにおいて、対象の分子（Ｄ）は、リンカー（Ｌ）を介して抗体にコンジュゲートされている。リンカー又は結合単位（ｌｉｎｋｉｎｇ  ｕｎｉｔ）は、当技術分野で周知であり、以下により詳細に記載されている。リンカーコンジュゲートは、本明細書では、対象の分子（Ｄ）にコンジュゲートされているリンカー（Ｌ）として定義される。本発明によるリンカーコンジュゲートは、１つ又は複数の対象の分子（Ｄ）を含んでもよい。リンカーコンジュゲートは、好ましくは、式Ｂ−Ｌ（Ｄ）ｒであり、Ｄは、上で定義されている通りであり、Ｂ及びＬは以下で定義されている通りであり、ｒは１〜２０である。ｒが、１〜１０であるのが好ましく、ｒが、１〜８であるのがより好ましく、ｒが１、２、３、４、５又は６であるのがさらにより好ましく、ｒが１、２、３又は４であるのがさらにより好ましく、ｒが１又は２であるのがさらにより好ましく、ｒが１であるのが最も好ましい。
【０１９６】
本発明はまた、糖タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、前記方法が、本発明による修飾糖タンパク質をリンカーコンジュゲートと反応させるステップを含み、前記リンカーコンジュゲートが、官能基Ｂ及び１つ又は複数の対象の分子を含み、前記官能基Ｂが、修飾糖タンパク質のグリカン上の官能基Ａと反応する能力を有する官能基であり、官能基Ａが、上で定義されている通りである、方法に関する。
【０１９７】
本発明は、
（ａ）  適切な触媒の存在下で、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質をＳｕ（Ａ）ｘ−Ｐに接触させて、
修飾糖タンパク質を得るステップであって、
Ｓｕ（Ａ）ｘが、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体Ｓｕであり、ｘが１、２、３又は４であり、Ａが、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホン化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から独立して選択され、Ｐがヌクレオチドであり、適切な触媒が、ガラクトシルトランスフェラーゼ、又は変異触媒ドメインを含むガラクトシルトランスフェラーゼとして定義され、したがって、Ｓｕ（Ａ）ｘ−Ｐが基質であり、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンが、式（１０１）又は（１０２）によるグリカン
【化１３】
2016538877.tif 000015
（式中、
ｂは、０又は１であり、
ｄは、０又は１であり、
ｅは、０又は１であり、
Ｇは、モノサッカライド、又は２〜２０個の糖部分を含む直鎖状若しくは分岐状オリゴサッカライドである）
である、ステップ、
及び
（ｂ）  修飾糖タンパク質をリンカーコンジュゲートに反応させるステップであって、前記リンカーコンジュゲートが官能基Ｂ及び１つ又は複数の対象の分子（Ｄ）を含み、前記官能基Ｂが、修飾糖タンパク質のグリカン上の官能基Ａと反応する能力がある官能基であり、官能基Ａが、チオール基、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホン化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から独立して選択されるステップ
を含む、糖タンパク質コンジュゲートを調製する方法に関する。
【０１９８】
糖タンパク質コンジュゲートの調製方法の好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）ｘは、１個又は２個の官能基Ａを含んでおり、すなわち、好ましくはｘは１又は２である。ｘが１であるのがより好ましい。別の好ましい実施形態では、Ｓｕは、ガラクトース（Ｇａｌ）である。さらに好ましい実施形態では、ｘは１又は２であり、ＳｕはＧａｌであり、最も好ましくは、ｘは１であり、ＳｕはＧａｌである。これらの好ましい実施形態では、リンカーコンジュゲートが、１つ又は２つ、最も好ましくは１つの対象の分子を含むのがさらに好ましい。
【０１９９】
好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）ｘは、６−ＧａｌＮＡｃＣｌ、６−ＧａｌＮＡｃＳＨ、２−ＧａｌＮＡｃＣｌ、２−ＧａｌＮＡｃＳＨ、６−ＣｌＧａｌ、２−ＣｌＧａｌ、２−ＨＳＧａｌ及び６−ＨＳＧａｌからなる群から、より好ましくは６−ＧａｌＮＡｃＣｌ、６−ＧａｌＮＡｃＳＨ、２−ＧａｌＮＡｃＣｌ、２−ＧａｌＮＡｃＳＨ、６−ＣｌＧａｌ及び２−ＣｌＧａｌからなる群から選択される。これらの好ましい実施形態では、リンカーコンジュゲートが、１つ又は２つ、最も好ましくは１つの対象の分子を含むのがさらに好ましい。
【０２００】
さらに好ましい実施形態では、ｘは１であり、Ｓｕ（Ａ）ｘは、６−ＧａｌＮＡｃＣｌ、６−ＧａｌＮＡｃＳＨ、２−ＧａｌＮＡｃＣｌ、２−ＧａｌＮＡｃＳＨ、６−ＣｌＧａｌ、２−ＣｌＧａｌ、２−ＨＳＧａｌ及び６−ＨＳＧａｌからなる群から、より好ましくは６−ＧａｌＮＡｃＣｌ、６−ＧａｌＮＡｃＳＨ、２−ＧａｌＮＡｃＣｌ、２−ＧａｌＮＡｃＳＨ、６−ＣｌＧａｌ及び２−ＣｌＧａｌからなる群から選択される。これらの好ましい実施形態では、リンカーコンジュゲートは、１つ又は２つ、最も好ましくは１つの対象の分子を含むのがさらに好ましい。
【０２０１】
本発明による修飾抗体の特に好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）ｘは、２−ＧａｌＮＡｃＳＨ、２−ＧａｌＮＡｃＸ、２−ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、６−ＧａｌＮＡｃＳＨ、６−ＧａｌＮＡｃＸ及び６−ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）２Ｒ８からなる群から選択される。さらにより好ましい実施形態では、ｘは１又は２であり、Ｓｕ（Ａ）ｘは、２−ＧａｌＮＡｃＳＨ、２−ＧａｌＮＡｃＸ、２−ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、６−ＧａｌＮＡｃＳＨ、６−ＧａｌＮＡｃＸ及び６−ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）２Ｒ８からなる群から選択される。最も好ましい実施形態では、ｘは１であり、Ｓｕ（Ａ）ｘは、２−ＧａｌＮＡｃＳＨ、２−ＧａｌＮＡｃＸ、２−ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、６−ＧａｌＮＡｃＳＨ、６−ＧａｌＮＡｃＸ及び６−ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）２Ｒ８からなる群から選択される。これらの好ましい実施形態では、リンカーコンジュゲートが、１つ又は２つ、最も好ましくは１つの対象の分子を含むのがさらに好ましい。Ｘ及びＲ８、並びにそれらの好ましい実施形態は、上で定義されている通りである。ＸがＣｌであるのが好ましい。
【０２０２】
本発明はさらに、糖タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、前記方法が、本発明による修飾糖タンパク質をリンカーコンジュゲートと反応させるステップを含み、前記リンカーコンジュゲートが官能基Ｂ及び１つ又は複数の対象の分子を含み、前記官能基Ｂが、修飾糖タンパク質のグリカン上の官能基Ａと反応する能力がある官能基であり、官能基Ａが、チオール基、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホン化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から独立して選択される、方法に関する。
【０２０３】
本発明によるタンパク質コンジュゲートの調製に適切なリンカーコンジュゲートは、官能基Ｂ及び対象の分子を含むリンカーコンジュゲートである。結合単位とも呼ばれる、リンカー（Ｌ）は、当技術分野で周知である。本明細書に記載されているリンカーコンジュゲートでは、Ｌは、上記の通り、対象の分子（Ｄ）及び官能基（Ｂ）に結合している。前記官能基（Ｂ）及び前記対象の分子（Ｄ）を結合させる様々な方法が、当技術分野で公知である。当業者に明らかな通り、リンカーの一方の末端に官能基（Ｂ）を結合させ、もう一方の末端に対象の分子（Ｄ）を結合させる適切な方法の選択肢は、官能基（Ｂ）、リンカー（Ｌ）及び対象の分子（Ｄ）の正確な性質に依存する。
【０２０４】
リンカーは、一般構造Ｆ１−Ｌ（Ｆ２）ｒを有することができ、Ｆ１は、官能基Ｂ、又は上記の官能基Ｂ上の官能基Ｆと反応することができる官能基のどちらか、例えば、（ヘテロ）シクロアルキニル基、末端アルキニル基、一級アミン、アミノオキシ基、ヒドラジル基、アジド基、Ｎ−マレイミジル基、アセトアミド基又はチオール基を表す。Ｆ２は、対象の分子上の官能基Ｆと反応することができる、官能基を表す。
【０２０５】
２つ以上の対象の分子が、リンカーに結合することができるので、２つ以上の官能基Ｆ２がＬに存在し得る。上記の通り、ｒは１〜２０であり、好ましくは、１〜１０であり、より好ましくは、１〜８であり、さらにより好ましくは１、２、３、４、５又は６であり、さらにより好ましくは、１、２、３又は４であり、最も好ましくはｒは１又は２である。
【０２０６】
Ｌは、例えば、直鎖状又は分岐状Ｃ１〜Ｃ２００アルキレン基、Ｃ２〜Ｃ２００アルケニレン基、Ｃ２〜Ｃ２００アルキニレン基、Ｃ３〜Ｃ２００シクロアルキレン基、Ｃ５〜Ｃ２００シクロアルケニレン基、Ｃ８〜Ｃ２００シクロアルキニレン基、Ｃ７〜Ｃ２００アルキルアリーレン基、Ｃ７〜Ｃ２００アリールアルキレン基、Ｃ８〜Ｃ２００アリールアルケニレン基、Ｃ９〜Ｃ２００アリールアルキニレン基からなる群から選択することができる。任意選択で、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基及びアリールアルキニレン基は、置換されていてもよく、任意選択で前記基は、１個又は複数のヘテロ原子、好ましくは１〜１００個のヘテロ原子により分断されてもよく、前記ヘテロ原子は、Ｏ、Ｓ及びＮＲ５からなる群から好ましくは選択され、Ｒ５は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択される。ヘテロ原子がＯであるのが最も好ましい。
【０２０７】
Ｆ、Ｆ１及びＦ２は、例えば、水素、ハロゲン、Ｒ５、Ｃ４〜Ｃ１０（ヘテロ）シクロアルキン基、−ＣＨ＝Ｃ（Ｒ５）２、−Ｃ≡ＣＲ５、−［Ｃ（Ｒ５）２Ｃ（Ｒ５）２Ｏ］ｑ−Ｒ５（ｑは、１〜２００の範囲である）、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＣＸ、−ＸＣＮ、−ＸＲ５、−Ｎ（Ｒ５）２、−＋Ｎ（Ｒ５）３、−Ｃ（Ｘ）Ｎ（Ｒ５）２、−Ｃ（Ｒ５）２ＸＲ５、−Ｃ（Ｘ）Ｒ５、−Ｃ（Ｘ）ＸＲ５、−Ｓ（Ｏ）Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）ＯＲ５、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ５、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）２、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ５）２、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ５、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ５、−ＯＳ（Ｏ）ＯＲ５、−ＯＳ（Ｏ）２ＯＲ５、−Ｐ（Ｏ）（Ｒ５）（ＯＲ５）、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ５）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ５）２、−Ｓｉ（Ｒ５）３、−ＸＣ（Ｘ）Ｒ５、−ＸＣ（Ｘ）ＸＲ５、−ＸＣ（Ｘ）Ｎ（Ｒ５）２、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｘ）Ｒ５、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｘ）ＸＲ５、及び−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｘ）Ｎ（Ｒ５）２からなる群から独立して選択することができ、Ｘは、酸素又は硫黄であり、Ｒ５は、上で定義されている通りである。
【０２０８】
適切な結合単位の例には、（ポリ）エチレングリコールジアミン（例えば１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン、又はより長いエチレングリコール鎖を含む等価物）、ポリエチレングリコール又はポリエチレンオキシド鎖、ポリプロピレングリコール又はポリプロピレンオキシド鎖及び１，ｘ−ジアミノアルカン（ｘは、アルカンの炭素原子数である）が含まれる。
【０２０９】
適切なリンカーの別のクラスは、切断可能なリンカーを含む。切断可能なリンカーは、当技術分野で周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｓｈａｂａｔら、Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ  ２０１２年、６巻、１０７３頁は、生物学的引き金、例えば酵素による切断又は酸化イベント時に、解放される自己犠牲的部分を含む、切断可能なリンカーを開示している。適切な切断可能なリンカーの一部の例は、プロテアーゼ、例えば、カテプシン、プラスミン若しくはメタロプロテアーゼによる特異的認識時に切断されるペプチドリンカー、又はグリコシダーゼ、例えばグルコロニダーゼによる特異的認識時に切断されるグリコシドに基づくリンカー、又は酸素が不足している低酸素領域において還元されるニトロ芳香族炭化水素である。
【０２１０】
Ａがチオール基である場合、チオール修飾糖タンパク質とリンカーコンジュゲートとの結合は、マイケル型付加反応又は求核置換反応又はチオール−エン反応により、好ましくは行われる。次に、官能基Ｂは、マイケル型付加反応の場合、Ｎ−マレイミジル基であり、求核置換反応の場合、ハロゲン化アセトアミド基であり、チオール−エン反応の場合、末端アルケンであるのが好ましい。次に、リンカーコンジュゲートは、好ましくはＸ−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＬ（Ｄ）ｒ又はＸ−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｎ［Ｌ（Ｄ）ｒ］２（Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ若しくはＩである）であり、又は以下に例示されているマレイミド−リンカーコンジュゲート（１２０）
【化１４】
2016538877.tif 000016
である。
【０２１１】
Ａが、ハロゲン修飾糖タンパク質、ハロゲン化アセトアミド修飾糖タンパク質、スルホニルオキシ修飾糖タンパク質又はスルホン化ヒドロキシアセトアミド修飾糖タンパク質である場合、修飾糖タンパク質とリンカーコンジュゲートとの結合は、チオールとの反応を介して好ましくは行われ、チオエーテルを形成する。Ａが、ハロゲン、ハロゲン化アセトアミド基、スルホニルオキシ基又はスルホン化ヒドロキシアセトアミド基である場合、修飾糖タンパク質とリンカーコンジュゲートとの結合は、チオールとの反応を介して好ましくは行われ、チオエーテルを形成する。言い換えると、修飾糖タンパク質が、ハロゲン修飾糖タンパク質、ハロゲン化アセトアミド修飾糖タンパク質、スルホニルオキシ修飾糖タンパク質又はスルホン化ヒドロキシアセトアミド修飾糖タンパク質である場合、修飾糖タンパク質とリンカーコンジュゲートとの結合は、チオールとの反応を介して好ましくは行われ、チオエーテルを形成する。
【０２１２】
次に、官能基Ｂは、チオール基を好ましくは含み、好ましいリンカーコンジュゲートはＨＳ−Ｌ（Ｄ）ｒである。しかし、官能基Ｂはまた、アルコール基又はアミン基を含んでもよい。
【０２１３】
特に、本発明は、糖タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、
（ａ）  前記修飾糖タンパク質が、ハロゲン修飾糖タンパク質又はハロゲン化アセトアミド修飾糖タンパク質である場合、官能基Ｂは、チオール基、アルコール基又はアミン基を含む；又は
（ｂ）  前記修飾糖タンパク質が、チオール修飾糖タンパク質又はメルカプトアセトアミド修飾糖タンパク質である場合、官能基Ｂは、Ｎ−マレイミド基又はハロゲン化アセトアミド基又はアルケンを含む；又は
（ｃ）  前記修飾糖タンパク質が、スルホニルオキシ修飾糖タンパク質又はスルホン化ヒドロキシアセトアミド修飾糖タンパク質である場合、官能基Ｂは、チオール基、アルコール基又はアミン基を含む、
方法に関する。
【０２１４】
前記修飾糖タンパク質が、ハロゲン修飾糖タンパク質であり、官能基Ｂがチオール基を含む場合、前記チオール基は脂肪族又は芳香族チオール基とすることができる。好ましい実施形態では、前記チオール基は、芳香族チオール基である。
【０２１５】
好ましい実施形態では、修飾糖タンパク質は、チオール修飾糖タンパク質であり、官能基Ｂは、Ｎ−マレイミド基又はハロゲン化アセトアミド基を含む。
【０２１６】
別の好ましい実施形態では、修飾糖タンパク質は、チオール修飾糖タンパク質であり、官能基Ｂは、アレンアミド基を含む。したがって、本発明はまた、糖タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、前記修飾糖タンパク質がチオール修飾糖タンパク質であり、官能基Ｂがアレンアミド基を含む、方法に関する。
【０２１７】
本発明はさらに、糖タンパク質コンジュゲートの調製における、本発明による糖タンパク質の使用であって、糖タンパク質コンジュゲートが、リンカーＬを介して対象の分子Ｄにコンジュゲートされている糖タンパク質として定義される、使用に関する。
【０２１８】
糖タンパク質コンジュゲート
本発明はまた、本発明による糖タンパク質コンジュゲートを調製する方法により得ることができる、糖タンパク質コンジュゲートに関する。
【０２１９】
好ましい実施形態では、本発明による糖タンパク質コンジュゲートは、抗体コンジュゲートである。
【０２２０】
別の好ましい実施形態では、対象の分子Ｄは、リポーター分子、活性物質、酵素、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、グリカン、（ポリ）エチレングリコールジアミン、ポリエチレングリコール鎖、ポリエチレンオキシド鎖、ポリプロピレングリコール鎖、ポリプロピレンオキシド鎖及び１，ｘ−ジアミノアルカン（ｘは、アルカンの炭素原子数であり、ｘは１〜２００である）、アジド又は（ヘテロ）シクロアルキニル部分、好ましくは二価又は二官能性（ヘテロ）シクロアルキニル部分からなる群から選択される。
【０２２１】
特に、本発明は、
（ａ）  適切な触媒の存在下で、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質をＳｕ（Ａ）ｘ−Ｐに接触させて、
修飾糖タンパク質を得るステップであって、
Ｓｕ（Ａ）ｘが、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体Ｓｕであり、ｘが１、２、３又は４であり、Ａが、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホン化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から独立して選択され、Ｐがヌクレオチドであり、適切な触媒が、ガラクトシルトランスフェラーゼ、又は変異触媒ドメインを含むガラクトシルトランスフェラーゼとして定義され、したがって、Ｓｕ（Ａ）ｘ−Ｐが基質であり、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンが、式（１０１）又は（１０２）によるグリカン：
【化１５】
2016538877.tif 000017
（式中、
ｂは、０又は１であり、
ｄは、０又は１であり、
ｅは、０又は１であり、
Ｇは、モノサッカライド、又は２〜２０個の糖部分を含む直鎖状若しくは分岐状オリゴサッカライドである）
である、ステップ
及び
（ｂ）  修飾糖タンパク質をリンカーコンジュゲートと反応させるステップであって、前記リンカーコンジュゲートが官能基Ｂ及び１つ又は複数の対象の分子（Ｄ）を含み、前記官能基Ｂが、修飾糖タンパク質のグリカン上の官能基Ａと反応する能力がある官能基であり、官能基Ａが、チオール基、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホン化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から独立して選択されるステップ
を含む方法により得ることができる、糖タンパク質コンジュゲートに関する。
【０２２２】
ステップ（ａ）及び（ｂ）の方法、並びにそれらの好ましい実施形態は、上で詳細に記載されている。
【０２２３】
チオール修飾糖タンパク質が、Ｎ−マレイミド基を含む官能基Ｂを含むリンカーコンジュゲートと反応する場合、本発明による糖タンパク質コンジュゲートは、式（１２１）又は（１２２）：
【化１６】
2016538877.tif 000018
（式中、
Ｐｒは、タンパク質を表し、
Ｌは、リンカーであり、
Ｄは、対象の分子であり、
ｒは、１〜２０であり、
ｘは、１、２、３又は４であり、
ｙは、１〜２０であり、
ｂは、０又は１であり、
ｄは、０又は１であり、
ｅは、０又は１であり、
ｐは、０又は１であり、
Ｑは、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−又はＣＨ２であり、
Ｓｕは、糖又は糖誘導体であり、
Ｇは、モノサッカライド、又は２〜２０個の糖部分を含む直鎖状若しくは分岐状オリゴサッカライドである）
によるのが好ましい。
【０２２４】
ｐの値及びＱの性質は、本発明の方法による糖タンパク質コンジュゲートの調製に使用される、修飾糖又は糖誘導体Ｓｕ（Ａ）ｘの性質に依存する。Ｓｕ（Ａ）ｘにおいて、チオール基が糖又は糖誘導体のＣ２、Ｃ３又はＣ４位（糖のＯＨ基の代わり）に存在している場合、ｐは０である。Ｓｕ（Ａ）ｘが、２−（メルカプトアセトアミド）−２−デオキシ糖誘導体（すなわち、メルカプトアセトアミド基が、前記糖又は糖誘導体のＣ２に存在する）である場合、Ｓｕ（Ａ）ｘは、例えば、ＧａｌＮＡｃＳＨ又はＧｌｃＮＡｃＳＨであり、ｐは１であり、Ｑは−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−である。Ｓｕ（Ａ）ｘにおけるチオールが、糖又は糖誘導体のＣ６位に存在する場合、ｐは１であり、Ｑは−ＣＨ２−である。
【０２２５】
チオール修飾糖タンパク質が、ハロゲン化アセトアミド基を含む官能基Ｂを含むリンカーコンジュゲートと反応する場合、本発明による糖タンパク質コンジュゲートは、式（１２３）又は（１２４）：
【化１７】
2016538877.tif 000019
（式中、Ｐｒ、Ｌ、Ｄ、ｒ、ｘ、ｙ、ｂ、ｄ、ｅ、ｐ、Ｑ、Ｓｕ及びＧは、（１２１）及び（１２２）の場合、上で定義した通りであり、Ｒ９は、Ｌ（Ｄ）ｒ、水素、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキルアリール基及びＣ７〜Ｃ２４アリールアルキル基からなる群から選択され、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキルアリール基及びＣ７〜Ｃ２４アリールアルキル基は、任意選択で置換されている）によるのが好ましい。好ましくはＲ９が、Ｌ（Ｄ）ｒ、水素、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ６〜Ｃ１２アリール基、Ｃ７〜Ｃ１２アルキルアリール基及びＣ７〜Ｃ１２アリールアルキル基からなる群から選択され、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ６〜Ｃ１２アリール基、Ｃ７〜Ｃ１２アルキルアリール基及びＣ７〜Ｃ１２アリールアルキル基は、任意選択で置換されている。より好ましくはＲ９が、Ｌ（Ｄ）ｒ、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ６〜Ｃ１２アリール基、Ｃ７〜Ｃ１２アルキルアリール基及びＣ７〜Ｃ１２アリールアルキル基からなる群から選択され、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ６〜Ｃ１２アリール基、Ｃ７〜Ｃ１２アルキルアリール基及びＣ７〜Ｃ１２アリールアルキル基は、任意選択で置換されている。さらにより好ましくはＲ９が、Ｈ、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ４若しくはＣ４アルキル又はＣ６〜Ｃ１２アリールであるの。最も好ましくはＲ９が、Ｈ又はメチルである。
【０２２６】
同様に、この実施形態では、ｐの値及びＱの性質は、本発明の方法による糖タンパク質コンジュゲートの調製に使用される、修飾糖又は糖誘導体Ｓｕ（Ａ）ｘの性質に依存する。Ｓｕ（Ａ）ｘにおいて、ハロゲンが糖又は糖誘導体のＣ２、Ｃ３又はＣ４位（糖のＯＨ基の代わり）に存在している場合、ｐは０である。Ｓｕ（Ａ）ｘが、２−（クロロアセトアミド）−２−デオキシ糖誘導体（すなわち、ハロゲン化アセトアミド基が、前記糖又は糖誘導体のＣ２に存在する）である場合、Ｓｕ（Ａ）ｘは、例えば、ＧａｌＮＡｃＣｌ又はＧｌｃＮＡｃＣｌであり、ｐは１であり、Ｑは−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−である。Ｓｕ（Ａ）ｘにおけるハロゲンが、糖又は糖誘導体のＣ６位に存在する場合、ｐは１であり、Ｑは−ＣＨ２−である。
【０２２７】
チオール修飾糖タンパク質が、アレンアミド基を含む官能基Ｂを含むリンカーコンジュゲートと反応する場合、本発明による糖タンパク質コンジュゲートは、式（１２５）又は（１２６）：
【化１８】
2016538877.tif 000020
（式中、Ｐｒ、Ｌ、Ｄ、ｒ、ｘ、ｙ、ｂ、ｄ、ｅ、ｐ、Ｑ、Ｓｕ、Ｇ及びＲ９は、上で定義されている通りである）
によるのが好ましい。
【０２２８】
同様に、（１２５）及び（１２６）において、ｐの値及びＱの性質は、本発明の方法による糖タンパク質コンジュゲートの調製に使用される、修飾糖又は糖誘導体Ｓｕ（Ａ）ｘの性質に依存する。Ｓｕ（Ａ）ｘにおいて、チオール基が糖又は糖誘導体のＣ２、Ｃ３又はＣ４位（糖ＯＨ基の代わり）に存在している場合、ｐは０である。Ｓｕ（Ａ）ｘが、２−（メルカプトアセトアミド）−２−デオキシ糖誘導体（すなわち、メルカプトアセトアミド基が、ＯＨ基の代わりに、前記糖又は糖誘導体のＣ２に存在する）である場合、Ｓｕ（Ａ）ｘは、例えば、ＧａｌＮＡｃＳＨ又はＧｌｃＮＡｃＳＨであり、ｐは１であり、Ｑは−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−である。Ｓｕ（Ａ）ｘにおけるチオールが、糖又は糖誘導体のＣ６位に存在する場合、ｐは１であり、Ｑは−ＣＨ２−である。
【０２２９】
Ｇが、直鎖状若しくは分岐状オリゴサッカライドである場合、Ｇは、２〜１２個、より好ましくは２〜１０個、さらにより好ましくは２〜８個、及び最も好ましくは２〜６個の糖部分を含むのが好ましい。別の好ましい実施形態では、ｙは１〜１２であり、ｙは、１、２、３、４、５、６、７又は８であることがより好ましく、ｙは、１、２、３又は４であることがさらにより好ましい。ｙが１又は２であるのが、最も好ましい。なお別の好ましい実施形態では、ｙは２、４、６又は８である。この実施形態は、修飾される糖タンパク質が抗体である場合、すなわちＰｒがＡｂである場合、特に好ましい。
【０２３０】
ｒは、１〜１０であるのが好ましく、１、２、３、４、５、６、７又は８であるのがより好ましく、１、２、３又は４であるのがさらにより好ましく、１又は２であるのがさらにより好ましく、ｒが１であるのが最も好ましい。
【０２３１】
好ましい実施形態では、ｙは１〜１２であり、より好ましくは、ｙは、１、２、３、４、５、６、７又は８であり、さらにより好ましくは、ｙは、１、２、３又は４である。ｙが１又は２であるのが、最も好ましい。さらに別の好ましい実施形態では、ｙは２、４、６又は８である。この実施形態は、修飾される糖タンパク質が抗体である場合、すなわちＰｒがＡｂである場合、特に好ましい。
【０２３２】
好ましい実施形態では、糖タンパク質−グリカンのコア糖部分のＣ１は、タンパク質中のアミノ酸残基中の窒素原子、より好ましくはアスパラギン（Ａｓｎ）又はアルギニン（Ａｒｇ）のアミノ酸の側鎖のアミド窒素原子へのＮ−グリコシド結合を介して、前記タンパク質に結合している。しかし、前記グリカンのコア糖部分のＣ１はまた、タンパク質のアミノ酸残基中の酸素原子、より好ましくはセリン（Ｓｅｒ）又はトレオニン（Ｔｈｒ）アミノ酸の側鎖中の酸素原子へのＯ−グリコシド結合を介して、前記タンパク質に結合していてもよい。この実施形態では、前記グリカンのコア糖部分は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ部分又はＯ−ＧａｌＮＡｃ部分であり、好ましくはＯ−ＧｌｃＮＡｃ部分であるのが好ましい。前記グリカンのコア糖部分のＣ１はまた、タンパク質の炭素原子、例えばトリプトファン（Ｔｒｐ）へのＣ−グリコシド結合を介して、タンパク質に結合していてもよい。上記の通り、糖タンパク質は、２つ以上のオリゴサッカライド鎖を含んでいてもよく、Ｎ−結合型、Ｏ−結合型及びＣ−結合糖タンパク質の組合せを構成してもよい。
【０２３３】
前記修飾グリカンは、タンパク質の天然のグリコシル化部位において存在していてもよいが、タンパク質の異なる部位にやはり導入されてもよい。
【０２３４】
好ましい実施形態では、糖タンパク質コンジュゲートは、抗体コンジュゲートであり、前記抗体は、非還元末端においてＧｌｃＮＡｃ−Ｓｕ（Ａ）ｘジサッカライド部分を含むグリカンを含む。こうした抗体は、本明細書では、修飾抗体とも称される。好ましい修飾抗体は、上で定義されている式（１０７）又は（１０８）による抗体であり、ここで、ＰｒはＡｂである。この実施形態では、ｙは、１、２、３、４、５、６、７又は８であるのがさらに好ましく、ｙは、１、２、３又は４であるのがさらにより好ましい。
【０２３５】
上で定義されている通り、前記抗体は全抗体であってもよいが、やはり抗体断片であってもよい。抗体が全抗体である場合、前記抗体は、各重鎖に、１つ又は複数の、より好ましくは１つの修飾グリカンを好ましくは含む。したがって、前記全抗体は、２つ以上、好ましくは２つ、４つ、６つ又は８つの前記グリカン、より好ましくは２つ又は４つ、及び最も好ましくは２つのグリカンを好ましくは含む。言い換えると、前記抗体が全抗体である場合、ｙは、好ましくは２、４、６又は８であり、より好ましくはｙは２又は４であり、最も好ましくはｙは２である。抗体が抗体断片である場合、ｙは、１、２、３又は４であり、より好ましくはｙは１又は２であるのが好ましい。
【０２３６】
好ましい実施形態では、前記抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。前記抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体からなる群から選択されるのが好ましい。前記抗体がＩｇＧ抗体であるのがより好ましく、前記抗体がＩｇＧ１抗体であるのが最も好ましい。
【０２３７】
好ましい実施形態では、修飾抗体における糖タンパク質は、２９０〜３０５の領域のアスパラギン、通常、Ｎ２９７のアスパラギンにおけるＦｃ断片中の保存されているＮ−グリコシル化部位に結合している。
【０２３８】
糖誘導体Ｓｕ（Ａ）ｘ及びその好ましい実施形態は、上で詳細に記載されている。修飾糖タンパク質を調製する方法の好ましい実施形態はまた、前記方法により得ることができる修飾糖タンパク質にも当てはまる。すなわち、好ましい実施形態では、ｘは１又は２であり、より好ましくは、ｘは１である。別の好ましい実施形態では、官能基Ａは、チオール基、ハロゲン又はハロゲン化アセトアミド基であり、より好ましくはハロゲンである。
【０２３９】
本発明による修飾抗体に存在するＳｕ（Ａ）ｘのさらなる例には、６−クロロ−６−デオキシガラクトース（６−ＣｌＧａｌ）、６−チオ−６−デオキシガラクトース（６−ＨＳＧａｌ）などの６−Ａ−６−デオキシガラクトース（６−Ａ−Ｇａｌ）、又は２−クロロ−２−デオキシガラクトース（２−ＣｌＧａｌ）、２−チオ−２−デオキシガラクトース（２−ＨＳＧａｌ）などの２−Ａ−２−デオキシガラクトース（２−Ａ−Ｇａｌ）が含まれる。或いは、Ａは、アセトアミド基の一部として糖誘導体に間接的に置換され、このアセトアミド基は、ひいては、ヒドロキシル基を置換していてもよい。例には、６−クロロアセトアミド−６−デオキシガラクトース（６−ＧａｌＮＡｃＣｌ）、６−チオアセトアミド−６−デオキシガラクトース（６−ＧａｌＮＡｃＳＨ）などの６−Ａ−アセトアミド−６−デオキシガラクトース（６−ＧａｌＮＡｃＡ）、又は２−クロロアセトアミド−２−デオキシガラクトース（２−ＧａｌＮＡｃＣｌ）、２−チオアセトアミド−２−デオキシガラクトース（２−ＧａｌＮＡｃＳＨ）などの２−Ａ−アセトアミド−２−デオキシガラクトース（２−ＧａｌＮＡｃＡ）が含まれる。或いは、Ａは、別の官能基の一部として糖誘導体に間接的に置換され、この別の官能基は、ひいては、ヒドロキシル基を置換しているか、又はヒドロキシル基に結合していてもよい。こうした他の官能基の例には、（ヘテロ）アルキル鎖又は（ヘテロ）アリール鎖が含まれる。
【０２４０】
本発明による糖タンパク質コンジュゲートの好ましい実施形態では、ｙは、１、２、３若しくは４（好ましくは２若しくは４）であり、及び／又はｘは、１若しくは２（好ましくは１）である。
【０２４１】
好ましい実施形態では、ｙは１〜１２であり、より好ましくは、ｙは、１、２、３、４、５、６、７又は８であり、さらにより好ましくは、ｙは、１、２、３又は４である。ｙが１又は２であるのが、最も好ましい。さらに別の好ましい実施形態では、ｙは２、４、６又は８である。この実施形態は、修飾される糖タンパク質が抗体である場合、すなわちＰｒがＡｂである場合、特に好ましい。
【０２４２】
さらに好ましい実施形態では、ｙは、１、２、３若しくは４（好ましくは２若しくは４）であり、及び／又はｘは１若しくは２（好ましくは１）であり、より好ましくはｙは１又は２であり、ｘは１又は２（好ましくは１）であり、さらにより好ましくは、ｙは１又は２であり、ｘは１である。
【０２４３】
好ましい実施形態では、非還元末端においてＧｌｃＮＡｃ−Ｓｕ（Ａ）ｘジサッカライド部分を含む、修飾グリカンのコア糖部分のＣ１は、タンパク質のアミノ酸残基中の窒素原子、より好ましくはアスパラギン（Ａｓｎ）又はアルギニン（Ａｒｇ）アミノ酸の側鎖中のアミド窒素原子へのＮ−グリコシド結合を介して、前記タンパク質に結合している。しかし、前記修飾グリカンのコア糖部分のＣ１はまた、タンパク質のアミノ酸残基中の酸素原子、より好ましくはセリン（Ｓｅｒ）又はトレオニン（Ｔｈｒ）アミノ酸の側鎖中の酸素原子へのＯ−グリコシド結合を介して、前記タンパク質に結合していてもよい。この実施形態では、前記グリカンのコア糖部分は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ部分又はＯ−ＧａｌＮＡｃ部分であり、好ましくはＯ−ＧｌｃＮＡｃ部分であるのが好ましい。前記修飾グリカンのコア糖部分のＣ１はまた、タンパク質の炭素原子、例えばトリプトファン（Ｔｒｐ）へのＣ−グリコシド結合を介して、タンパク質に結合していてもよい。上記の通り、糖タンパク質は、２つ以上のオリゴサッカライド鎖を含んでいてもよく、Ｎ−結合型、Ｏ−結合型及びＣ−結合糖タンパク質の組合せを構成してもよい。
【０２４４】
前記修飾グリカンは、タンパク質の天然のグリコシル化部位において存在していてもよいが、タンパク質の異なる部位にやはり導入されてもよい。
【０２４５】
好ましい実施形態では、修飾糖タンパク質は、修飾抗体（Ａｂ）であり、前記抗体は、非還元末端においてＧｌｃＮＡｃ−Ｓｕ（Ａ）ｘジサッカライド部分を含むグリカンを含む。こうした抗体は、本明細書では、修飾抗体とも称される。好ましい修飾抗体は、上で定義されている式（１０７）又は（１０８）による抗体であり、ここで、ＰｒはＡｂである。この実施形態では、ｙは、１、２、３、４、５、６、７又は８であるのがさらに好ましく、ｙは、１、２、３又は４であるのがさらにより好ましい。
【０２４６】
上で定義されている通り、前記抗体は全抗体であってもよいが、やはり抗体断片であってもよい。抗体が全抗体である場合、前記抗体は、各重鎖に、１つ又は複数の、より好ましくは１つの修飾グリカンを好ましくは含む。したがって、前記全抗体は、２つ以上、好ましくは２つ、４つ、６つ又は８つの前記グリカン、より好ましくは２つ又は４つ、及び最も好ましくは２つのグリカンを好ましくは含む。言い換えると、前記抗体が全抗体である場合、ｙは、好ましくは２、４、６又は８であり、より好ましくはｙは２又は４であり、最も好ましくはｙは２である。抗体が抗体断片である場合、ｙは、１、２、３又は４であり、より好ましくはｙは１又は２であるのが好ましい。
【０２４７】
ｙが、１、２、３又は４であり、ｘが１又は２であるのがさらに好ましく、ｙが２又は４であり、ｘが１であるのがさらに好ましい。
【０２４８】
好ましい実施形態では、前記抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。前記抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体からなる群から選択されるのが好ましい。前記抗体がＩｇＧ抗体であるのがより好ましく、前記抗体がＩｇＧ１抗体であるのが最も好ましい。
【０２４９】
好ましい実施形態では、修飾抗体における糖タンパク質は、２９０〜３０５の領域、通常、Ｎ２９７のアスパラギンにおけるＦｃ断片中の保存されているＮ−グリコシル化部位に結合している。
【０２５０】
糖誘導体Ｓｕ（Ａ）ｘ及びその好ましい実施形態は、上で詳細に記載されている。修飾糖タンパク質を調製する方法の好ましい実施形態はまた、前記方法により得ることができる修飾糖タンパク質にも当てはまる。したがって、好ましい実施形態では、ｘは１又は２であり、より好ましくは、ｘは１である。別の好ましい実施形態では、官能基Ａは、チオール基、ハロゲン又はハロゲン化アセトアミド基であり、より好ましくはハロゲンである。
【０２５１】
抗体−薬物コンジュゲート
本発明は、特に、糖タンパク質を調製する方法により得ることができる、糖タンパク質コンジュゲートであって、抗体コンジュゲートである、糖タンパク質コンジュゲートに関する。抗体コンジュゲートは、本明細書では、リンカー（Ｌ）を介して、対象の分子（Ｄ）にコンジュゲートされている抗体として定義される。本発明による抗体コンジュゲートは、リンカー（Ｌ）を介して１つ又は１超の対象の分子（Ｄ）にコンジュゲートされ得る。糖タンパク質コンジュゲートに関して上で開示されている好ましい実施形態が、抗体コンジュゲートにも当てはまる。
【０２５２】
さらに好ましい実施形態では、本発明による抗体コンジュゲートは、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。抗体−薬物コンジュゲートは、本明細書では、リンカー（Ｌ）を介して、対象の分子（Ｄ）にコンジュゲートされている抗体であって、Ｄが薬学的に活性な物質からなる群から選択され、より好ましくは、Ｄは薬物及びプロドラッグからなる群から選択される、抗体として定義される。
【０２５３】
活性物質は、薬学的活性化合物、例えば、細胞毒、抗ウイルス剤、抗菌剤、ペプチド及びオリゴヌクレオチドなどの、特に、低から中程度の分子量の化合物（例えば、約２００〜約１５００Ｄａ、好ましくは約３００〜約１０００Ｄａ）からなる群から選択されるのがより好ましい。細胞毒の例には、コルヒチン、ビンカアルカロイド、カンプトテシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキサン、カリケアミシン、チューブリシン、イリノテカン、阻害性ペプチド、アマニチン、デボーガニン、デュオカルマイシン、マイタンシン、アウリスタチン及びピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）が含まれる。好ましい実施形態では、細胞毒は、カンプトテシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキサン、カリケアミシン、デュオカルマイシン、マイタンシン、アウリスタチン及びピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、細胞毒は、コルヒチン、ビンカアルカロイド、チューブリシン、イリノテカン、阻害性ペプチド、アマニチン及びデボーガニンからなる群から選択される。
【０２５４】
したがって、発明はまた、本発明による抗体コンジュゲートを調製する方法により得ることができる、抗体コンジュゲートに関する。
【０２５５】
本発明はさらに、本発明による抗体コンジュゲートであって、対象の分子Ｄが、医薬として使用するための活性物質である、抗体コンジュゲートに関する。
【０２５６】
本発明はまた、本発明による抗体コンジュゲートの使用であって、対象の分子Ｄが、がんの処置に使用するための活性物質である、使用に関する。
【０２５７】
本発明はさらに、本発明による抗体コンジュゲートであって、対象の分子Ｄが、乳がんの処置に使用するため、より好ましくはＨＥＲ２陽性乳がんの処置に使用するための活性物質である、抗体コンジュゲートに関する。
【０２５８】
本発明はまた、がんを処置する方法であって、本発明による抗体−薬物コンジュゲートを、それを必要とする対象に治療有効量で投与するステップを含む、方法にも関する。
【０２５９】
本発明はまた、乳がんを処置する方法であって、本発明による抗体−薬物コンジュゲートを、それを必要とする対象に治療有効量で投与するステップを含む、方法にも関する。
【０２６０】
本発明はまた、ＨＥＲ２陽性乳がんを処置する方法であって、本発明による抗体−薬物コンジュゲートを、それを必要とする対象に治療有効量で投与するステップを含む、方法にも関する。
【０２６１】
本発明による、修飾抗体、抗体コンジュゲート及びそれらを調製する方法は、当技術分野で公知の、方法、修飾抗体及び抗体コンジュゲートよりもいくつかの利点を有する。
【０２６２】
上で記載した通り、リンカー−毒素の抗体へのコンジュゲーションについて当技術分野で公知の方法は、部位特異性と化学量論の両方を制御する点で、改善されることが依然として必要とされている。ＡＤＣはその標的に向かう能力があるにも関わらず、腫瘍細胞内部に到達すると見積もられる薬物の量は、通常、投与される用量の２％未満である。この問題は、当技術分野で公知のＡＤＣの予測不能なコンジュゲーションの結果により、拡大する。効力を低下させるコンジュゲートが不十分な抗体（ｕｎｄｅｒｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、及び循環半減期が著しく低下するおそれがある、標的タンパク質への結合を損なうおそれがある、及び毒性が向上するおそれがある、高度にコンジュゲートされた化学種を回避するのが重要である。
【０２６３】
抗体−薬物コンジュゲートの場合、対象の分子（例えば、薬物、活性物質）を抗体にローディングする尺度は、いわゆる薬物対抗体比（ＤＡＲ）であり、この薬物対抗体比は、統計的分布から算出される、抗体あたりの活性物質分子の平均数を与えるものである。ある種のタイプのＡＤＣの場合のＤＡＲの理論最大値は、アンカー部位（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｓｉｔｅ）の数に等しい。上で記載されている通り、従来技術から公知のＡＤＣの調製方法は、一般に、抗体コンジュゲートと各抗体コンジュゲート中に存在している様々な数の対象の分子との混合物を含む生成物になり、標準偏差の大きなＤＡＲとなる。
【０２６４】
本発明による、修飾抗体及び抗体コンジュゲートの利点の１つは、これらの抗体及び抗体コンジュゲートが、部位特異性と化学量論の両方において均質であることである。前記修飾抗体及び抗体コンジュゲートは、理論値に非常に近いＤＡＲ及び非常に小さい標準偏差を伴って得られる。このことはまた、本発明による抗体コンジュゲートは、前臨床試験に対する一貫性が一層高い生成物になることも意味している。本明細書に記載されている方法により調製される、抗体コンジュゲートの均質性は、例えば、図９に示されているＭＳプロファイルから明らかになる。
【０２６５】
本発明による方法及び抗体の別の利点は、製造における廃棄物の低減が含まれ、これにより、企業の売上原価が向上する。
【０２６６】
本発明によるチオール修飾抗体は、マレイミドを含むリンカーコンジュゲートに結合される場合、この方法は、当技術分野で周知あり、非常に確固たるものであり、且つ検証されている。マレイミドコンジュゲートの一部の例は、図８及び１１に提示されている。抗体−薬物コンジュゲーションのために現在、好ましい方法論は、ｍＡｂのシステイン変異体（チオｍＡｂ）と毒素のマレイミド誘導体との組合せを必要とするので、多くのマレイミド官能基化毒素が記載されている。こうしたチオール−マレイミドコンジュゲートは、非常に有益な化学量論（マレイミド成分は小過剰）の試薬を用いて調製することができることがよく知られている。得られたチオール−マレイミドコンジュゲートは、限られた安定性を有することがあるが、チオールがフコース上に存在している場合、安定性はかなり増強されることもよく知られている。本発明によるチオール修飾抗体が、毒素のハロゲン化アセトアミド誘導体を含むリンカーコンジュゲートに結合される場合、この方法の効率は、マレイミドコンジュゲーションに関して、やや損なわれることがあり、より多くの望ましくない別のコンジュゲーションが（例えば、リシン側鎖に）起こることがあるが、所望の生成物は、非可逆的に形成される（非常に安定な）チオ−エーテルコンジュゲートである。本発明によるチオール修飾抗体が、毒素のアレンアミド誘導体を含むリンカーコンジュゲートに結合される場合、この方法の効率は、マレイミドをコンジュゲートすることに関して、やや損なわれることがあり、望ましくない別のコンジュゲーションが（例えば、リシン側鎖に）起こる見込みはないが、所望の生成物は、非可逆的に形成される（非常に安定な）チオエーテルコンジュゲートである。アレンアミド構造の一例が、図６に示されている。本発明によるハロゲン−修飾抗体が、図６に表されているチオールを含む構造などの、求核性基（チオール、アルコール、アミン）を含有する毒素の誘導体を含むリンカーコンジュゲートに結合される場合、得られるコンジュゲートは、図８及び１０に表されている構造などのチオエーテル、通常のエーテル又はアミノエーテルであり、これらはすべて、可逆的に形成される。（チオｍＡｂ又はチオフコース含有ｍＡｂと同様に）遊離チオールを含有するタンパク質へのコンジュゲーションのためにハロゲン化アセトアミドを使用することとは対照的に、ハロゲン化糖基質の酵素による取込みは、他のアミノ酸（例えば、リシン）の求核性側鎖との競合的なある種の反応により損なわれない。ある特定の反応を欠くことは、その後のコンジュゲーションステップにも関連し、この場合、過剰の官能基の求核性誘導体がハロゲン化ｍＡｂに適用される。
【０２６７】
ハロゲン化抗体を使用する具体的な利点の１つは、ハロゲン化抗体は、毒性ペイロードの２段階コンジュゲーションを行う機会を提供することである。例えば、図１０に例示されている通り、ハロゲン化抗体とペンダントアジドを保有するチオフェノール誘導体との反応により、銅を使用しないクリック化学によって、毒性ペイロードを導入するための出発点として働くことができる中間体が得られる。こうした２段階法を適用することにより、（安価で非毒性の）チオフェノール誘導体の化学量論が多い一方、（高価で毒性の高い）ペイロードの化学量論は低く保つことができる。
【０２６８】
チオールを含む抗体を使用する具体的な利点の１つは、チオールを含む抗体は、毒性ペイロードの２段階コンジュゲーションを行う機会を提供することである。例えば、図１１に例示されている通り、チオールを含む抗体とペンダントアジドを保有するアレンアミド誘導体との反応により、銅を使用しないクリック化学によって、毒性ペイロードを導入するための出発点として働くことができる安定な中間体が得られる（この例では、ビオチンが毒性ペイロードの代表として使用される）。こうした２段階法を適用することにより、（安価で非毒性の）アレンアミド誘導体の化学量論が多い一方、（高価で毒性の高い）ペイロードの化学量論は低く保つことができる。
【０２６９】
したがって、追加的な利点は、本発明による抗体コンジュゲートが安定であること、並びにチオール基、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホン化ヒドロキシアセトアミド基を抗体に導入するための、直接的で一般的に適用可能な方法であることである。
【０２７０】
本明細書に記載されている方法によるチオールを含む抗体の調製に関する追加的な利点の１つは、原料のＵＤＰ−糖が、図１２に例示されている通り、容易に合成され得ることである。
【０２７１】
最後に、グリカン鎖を介して接続することによって抗体コンジュゲートを調製する利点は、天然の抗体の糖変異体の操作により、多数の異性体を調製する機会が提供されることである。天然の抗体の様々なグリコ型（Ｒ＝グリカンである）の例は、図１３に図示されている。
【実施例】
【０２７２】
合成
実施例１〜５：ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ誘導体２８〜３１の合成
実施例１〜４において行った、２４から開始するＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ誘導体２８〜３１の合成の反応スキームを、図Ｙに示している。
【０２７３】
実施例１．ＵＤＰ−ＧａｌＮＨ２の合成
化合物２４は、Ｄ−ガラクトサミンから、Ｌｉｎｈａｒｄｔら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１２年、７７巻、１４４９〜１４５６頁において、Ｄ−グルコサミンに関して記載されている手順に従って調製した。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ  ５．６９（ｄｄ，Ｊ＝６．８４，６．８４Ｈｚ，１Ｈ）、５．４３〜５．４１（ｍ，１Ｈ）、５．３５（ｄｄ，Ｊ＝１０．９，３．４Ｈｚ，１Ｈ）、４．５４（ｔ，Ｊ＝６．４８Ｈｚ，１Ｈ）、４．２３〜４．１２（ｍ，１Ｈ）、４．０４（ｄｄ，Ｊ＝１０．９，６．１Ｈｚ，１Ｈ）、３．８２（ｄｔ，Ｊ＝１１．１，２．７Ｈｚ，１Ｈ）、２．１２（ｓ，３Ｈ）、２．００（ｓ，３Ｈ）、１．９９（ｓ，３Ｈ）。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ１２Ｈ１８Ｎ３Ｏ１１（Ｍ−Ｈ＋）の計算値４１０．０６、実測値４１０．１。
【０２７４】
次に、化合物２４は、ＢａｉｓｃｈらのＢｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９７年、５巻、３８３〜３９１頁に従って、ＵＭＰに結合した。
【０２７５】
したがって、Ｄ−ウリジン−５’−一リン酸二ナトリウム塩（１．４９ｇ、４．０５ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（１５ｍＬ）溶液をＤＯＷＥＸ５０Ｗｘ８（Ｈ＋型）により３０分間、処理してろ過した。トリブチルアミン（０．９６６ｍＬ、４．０５ｍｍｏｌ）を滴下して加えながら、このろ液を室温で激しく撹拌した。３０分間のさらなる撹拌後、この反応混合物を凍結乾燥し、Ｐ２Ｏ５で真空下、５時間、さらに脱水した。
【０２７６】
アルゴン雰囲気中、得られたウリジン−５’−一リン酸トリブチルアンモニウムを乾燥ＤＭＦ（２５ｍＬ）に溶解した。カルボニルジイミダゾール（１．３８ｇ、８．５１ｍｍｏｌ）を加え、この反応混合物を室温で３０分間、撹拌した。次に、乾燥ＭｅＯＨ（１８０μＬ）を加え、１５分間、撹拌して過剰のＣＤＩを除去した。高真空下、残りのＭｅＯＨを１５分間、除去した。続いて、化合物２４（２．０ｇ、４．８６ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（２５ｍＬ）に溶解し、上記の反応混合物に滴下して加えた。この反応物を室温で２日間、撹拌した後、真空で濃縮した。イミダゾール−ＵＭＰ中間体の消費をＭＳによりモニタリングした。フラッシュクロマトグラフィー（７：２：１〜５：２：１  ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ）により、生成物２５（１．０８ｇ、１．５１ｍｍｏｌ、３７％）が得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ  ７．９６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、５．９８〜５．９４（ｍ，２Ｈ）、５．８１〜５．７９（ｍ，１Ｈ）、５．７０（ｄｄ，Ｊ＝７．１，３．３Ｈｚ，１Ｈ）、５．４９（ｄｄ，Ｊ＝１５．２，２．６Ｈｚ，１Ｈ）、５．３０（ｄｄｄ，Ｊ＝１８．５，１１．０，３．２Ｈｚ，２Ｈ）、４．５７（ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）、４．３５〜４．１６（ｍ，９Ｈ）、４．０７〜３．９５（ｍ，２Ｈ）、２．１７（ｓ，３Ｈ）、２．０８（ｓ，３Ｈ）、２．０７（ｓ，３Ｈ）。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ２１Ｈ２９Ｎ５Ｏ１９Ｐ２（Ｍ−Ｈ＋）の計算値７１６．０９、実測値７１６．３。
【０２７７】
Ｋｉｓｏら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．、２００６年、２３巻、５６５〜５７３頁に従って、化合物２５を脱アセチル化した。
【０２７８】
したがって、化合物２５（２２２ｍｇ、０．３０９ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ（２．５ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（２．５ｍＬ）及びＭｅＯＨ（６ｍＬ）を加えた。この反応混合物を３時間、撹拌して、次に真空で濃縮すると、粗製ＵＤＰ−２−アジド−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトース（２６）が得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ  ７．９９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、６．０２〜５．９８（ｍ，２Ｈ）、５．７３（ｄｄ，Ｊ＝７．４，３．４Ｈｚ，１Ｈ）、４．４２〜４．３７（ｍ，２Ｈ）、４．３０〜４．１８（ｍ，４Ｈ）、４．１４〜４．０４（ｍ，２Ｈ）、３．８０〜３．７０（ｍ，２Ｈ）、３．６５〜３．５８（ｍ，１Ｈ）。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ１５Ｈ２３Ｎ５Ｏ１６Ｐ２（Ｍ−Ｈ＋）の計算値５９０．０５、実測値５９０．２。
【０２７９】
最後に、化合物２６のＨ２Ｏ：ＭｅＯＨ  １：１（４ｍＬ）溶液に、リンドラー触媒（ｍｇ）を加えた。この反応物を水素雰囲気下、５時間、撹拌し、セライトでろ過した。ろ過器をＨ２Ｏ（１０ｍｌ）によりすすぎ、このろ液を真空で濃縮すると、ＵＤＰ−Ｄ−ガラクトサミン（ＵＤＰ−ＧａｌＮＨ２、２７）（１６９ｍｇ、０．２８６ｍｍｏｌ、９２％収率）が得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ  ７．９３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）、５．９９〜５．９０（ｍ，２Ｈ）、５．７６〜５．６９（ｍ，１Ｈ）、４．３９〜４．３４（ｍ，２Ｈ）、４．３１〜４．１７（ｍ，５Ｈ）、４．０５〜４．０１（ｍ，１Ｈ）、３．９４〜３．８６（ｍ，１Ｈ）、３．８２〜３．７０（ｍ，３Ｈ）、３．３０〜３．１６（ｍ，１Ｈ）。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ１５Ｈ２５Ｎ３Ｏ１６Ｐ２（Ｍ−Ｈ＋）の計算値５６４．０６、実測値５６４．１。
【０２８０】
実施例２．ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃＳＡｃ（２８ａ）の合成
ＵＤＰ−Ｄ−ガラクトサミン（２７）（４５ｍｇ、０．０７９６ｍｍｏｌ）をｐＨ７の緩衝液（０．５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４）（２ｍＬ）に溶解した。Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（３７ｍｇ、０．１５９ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（２ｍＬ）を加え、この反応物を室温で一晩、撹拌した。Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテートをさらに３６ｍｇ加え、３時間後、この反応物を真空で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（７：２：１〜５：２：１  ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ）により、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃＳＡｃ（２８ａ）（２８ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ、５２％）が得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ  ７．８４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）、５．９０〜５．８２（ｍ，２Ｈ）、５．４８〜５．４１（ｍ，１Ｈ）、４．２９〜４．２２（ｍ，２Ｈ）、４．２０〜４．００（ｍ，５Ｈ）、３．９８〜３．８２（ｍ，２Ｈ）、３．７９〜３．５９（ｍ，４Ｈ）、２．３０（ｓ，３Ｈ）。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ１９Ｈ２９Ｎ３Ｏ１８Ｐ２Ｓ（Ｍ−Ｈ＋）の計算値６８０．０６、実測値６８０．１。
【０２８１】
実施例３．ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃＣｌ（２９）の合成
ＵＤＰ−Ｄ−ガラクトサミン（２７）（４２ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）を０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（１ｍＬ）に溶解し、Ｎ−（クロロアセトキシ）スクシンイミド（２９ｍｇ、０．１４９ｍｍｏｌ）（Ｈｏｓｚｔａｆｉら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９６年、７９巻、１３３〜１３６頁に従って調製した）及びＤＭＦ（１ｍＬ）を加えた。この反応物を室温で一晩、撹拌し、さらに１０ｍｇのＮ−（クロロアセトキシ）スクシンイミドを加えて、撹拌を一晩、継続した。この反応物を真空で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（７：２：１〜５：２：１  ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ）により精製すると、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃＣｌ（２９）（２５ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ、５３％）が得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ  ７．８４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）、５．８９〜５．８４（ｍ，２Ｈ）、５．５３〜５．４６（ｍ，１Ｈ）、４．３３〜４．００（ｍ，９Ｈ）、３．９９〜３．８８（ｍ，２Ｈ）、３．７７〜３．５９（ｍ，２Ｈ）、１．８３（ｓ，１Ｈ）。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ１７Ｈ２６ＣｌＮ３Ｏ１７Ｐ２（Ｍ−Ｈ＋）の計算値６４０．０３（１００％）、６４２．０３（３２％）、実測値６４０．１（１００％）、６４２．２（３５％）。
【０２８２】
実施例４．ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃＢｒ（３０）の合成
ＵＤＰ−Ｄ−ガラクトサミン（２７）（４２ｍｇ、０．０８８ｍｍｏｌ）を０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（３ｍＬ）に溶解し、Ｎ−（ブロモアセトキシ）スクシンイミド（６３ｍｇ、０．２６５ｍｍｏｌ）（Ｈｏｓｚｔａｆｉら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９６年、７９巻、１３３〜１３６頁に従って調製した）及びＤＭＦ（２ｍＬ）を加えた。この反応物を室温で一晩、撹拌し、真空で濃縮した。この化合物をフラッシュクロマトグラフィー（７：２：１〜５：２：１  ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ）により精製すると、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃＢｒ（３０）（２８ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ、６５％）が得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ  ７．８６（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ）、５．９７〜５．８４（ｍ，２Ｈ）、５．５４〜５．４６（ｍ，１Ｈ）、４．３３〜４．０４（ｍ，６Ｈ）、３．９９〜３．８５（ｍ，２Ｈ）、３．７９〜３．６０（ｍ，２Ｈ）、２．７５〜２．６８（ｍ，３Ｈ）。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ１７Ｈ２６ＢｒＮ３Ｏ１７Ｐ２（Ｍ−Ｈ＋）の計算値６８３．９８（１００％）、６８５．９８（９８％）、実測値６８７．１（１００％）、６８８．０（９２％）、６８６．０（８５％）、６８９．０（７２％）。
【０２８３】
実施例６．４，４’−ジスルファンジイル二安息香酸（３１）の合成
４−メルカプト安息香酸（０．２０ｇ、１．３０ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（１０ｍＬ）溶液に、Ｉ２（０．２０ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（０．５４ｍＬ、３９５ｍｇ、３．９０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を１６時間、撹拌した。１０％Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液及び０．０１ＭのＨＣｌ水溶液（２５ｍＬ）を添加した後、この混合物をある程度、濃縮し、１ＭのＨＣｌ水溶液（１ｍＬ）を加えた。ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）、ＤＣＭ（５０ｍＬ）及び水（１０ｍＬ）を加え、この生成物をろ別し、真空で乾燥した。所望の生成物（４，４’−ジスルファンジイル二安息香酸）が、白色固体（１８０ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ、９０％）として得られ、さらに精製することなく使用した（以下を参照されたい）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ（ｐｐｍ）７．９６〜７．８８（ｍ，４Ｈ）、７．６８〜７．５９（ｍ，４Ｈ）。
【０２８４】
実施例７．メルカプト−Ｄ−ビオチンコンジュゲート（３２）の合成
（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（４５１ｍｇ、１．８２ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（５ｍＬ）溶液をアルゴン雰囲気下においた。Ｄ−ビオチン（４４５ｍｇ、１．８２ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（４１８ｍｇ、２．１８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３４３ｍｇ、２．５４ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（３１７μＬ、２３５ｍｇ、１．８２ｍｍｏｌ）及び無水ＤＭＦ（２ｍＬ）を加えた。得られた混合物を２４時間撹拌し、濃縮した。この残留物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中のＭｅＯＨ２％→１０％）により精製した。生成物含有画分の濃縮後、残留物をＥｔＯＡｃ／ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１００ｍＬ／２０ｍＬ／２０ｍＬ）の混合物に溶解し、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（２×１００ｍＬ）により洗浄した。この有機混合物を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、２０ｍＬまで濃縮した。所望の生成物（ビオチン−ＰＥＧ２−ＮＨＢｏｃ）が、無色ガラス状物（２２８ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ、２６％）として沈殿し、次の工程に使用した。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）４．４９（ｄｄ，Ｊ＝７．４，４．５Ｈｚ，１Ｈ）、４．３０（ｄｄ，Ｊ＝７．９，４．４Ｈｚ，１Ｈ）、３．６２（ｓ，４Ｈ）、３．５５（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ）、３．５２（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ）３．４０〜３．１５（ｍ，５Ｈ）、２．９３（ｄｄ，Ｊ＝１２．７，５．０Ｈｚ，１Ｈ）ｆ，２．７１（ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，１Ｈ）、２．２２（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ）、１．８１〜１．４０（ｍ，６Ｈ）、１．４４（ｓ，９Ｈ）。
【０２８５】
ビオチン−ＰＥＧ２−ＮＨＢｏｃ（２０８ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）の溶液をＭｅＯＨ（５ｍＬ）に溶解した。塩化アセチル（２５０μＬ、２７５ｍｇ、３．５ｍｍｏｌ）を添加した後、この混合物を１７時間、撹拌して濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃ（５ｍＬ）と共蒸発させ、これにより、生成物が黄色固体として、定量的に得られた。この生成物（ビオチン−ＰＥＧ２−ＮＨ２）をさらに精製することなく次の工程に使用した。
【０２８６】
４，４’−ジスルファンジイル二安息香酸（３１、２０ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に、ＨＡＴＵ（５５ｍｇ、０．１４４ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルアミン（７０μＬ、５０ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を加えた。ビオチン−ＰＥＧ２−ＮＨ２（５３ｍｇ、０．１３０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中の溶液として加えた。得られた混合物を１９時間、撹拌し、ＤＣＭ（２０ｍＬ）と飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（２０ｍＬ）の混合物中に注いだ。分離後、有機相を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）した。この残留物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中のＭｅＯＨ、５％→２０％）により精製した。所望の生成物（ビオチン−ＰＥＧ２−ＳＳ−ＰＥＧ２−ビオチン）が白色固体（２１ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ、３２％）として得られた。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）  Ｃ４６Ｈ６６Ｎ８Ｏ１０Ｓ４（Ｍ＋Ｈ＋）計算値１０１９．３９、実測値１０２０．１。
【０２８７】
ＴＨＦ（０．５ｍＬ）とＥｔＯＨ（０．５ｍＬ）との混合物中のビオチン−ＰＥＧ２−ＳＳ−ＰＥＧ２−ビオチン（３．５ｍｇ；３．４μｍｏｌ）の冷却溶液（０℃）に、ＮａＢＨ４（０．５ｍｇ、１２μｍｏｌ）を加えた。室温まで温めながら、この混合物を２時間、撹拌し、濃縮した。残留物を水（１ｍＬ）にとり、１０μＬの１ＭＨＣｌ水溶液を加えた。所望の生成物をＤＣＭ（２×２ｍＬ）により抽出した。合わせた有機層を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）して濃縮すると、表題化合物（３２）（２．７ｍｇ、７８％）が得られた。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ２３Ｈ３５Ｎ４Ｏ５Ｓ２（Ｍ＋Ｈ＋）の計算値５１１．２０、実測値５１１．２。
【０２８８】
実施例８．マレイミド−ビオチンコンジュゲート３３の合成
６−マレイミドカプロン酸Ｎ−スクシンイミジル（１０ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）の１ｍＬ  ＤＭＦ溶液に、ビオチン−ＰＥＧ２−ＮＨ２（１３ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（９μＬ、６．５ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液を加えた。この混合物を１時間、撹拌し、ＤＣＭ（１０ｍＬ）と飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１０ｍＬ）との混合物中に注いだ。分離後、この有機層を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）して濃縮し、カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中のＭｅＯＨ  ２→２０％）により、ＬＲＭＳ分析によれば、所望の生成物３３が得られた。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ２６Ｈ４２Ｎ５Ｏ７Ｓ（Ｍ＋Ｈ＋）の計算値５６８．２８、実測値５６８．２。
【０２８９】
コンジュゲーション
抗体グリコシル化変異体
トラスツズマブの特定の変異体は、文献（Ｑｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９８年、２１３巻、１３１頁、特に、Ｌ１９６Ｎ及びＧ１６４Ｓ）から誘導するか、又は特にＶ３６３Ｔは新たに設計した。３つの場合のすべてにおいて、アスパラギン２９７をグルタミン（Ｎ２９７Ｑ）に変異させて、天然のグリコシル化部位を除去した。
【０２９０】
天然のトラスツズマブと変異体抗体のどちらも、Ｅｖｉｔｒｉａ（Ｚｕｒｉｃｈ、スイス）により一過的に発現させた。
【０２９１】
ＩｇＧの質量スペクトル分析の一般プロトコル
全容積約７０μＬでの、５０μｇ（修飾されている）ＩｇＧ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び３０ｍＭ  ＤＴＴの溶液を、３７℃で２０分間、インキュベートし、ジスルフィド架橋を還元して、軽鎖と重鎖の両方を分析できるようにした。存在する場合、アジド官能基をこれらの条件下で、アミンに還元する。還元済み試料をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用するｍｉｌｌｉＱにより３回、洗浄し、１０μＭの（修飾されている）ＩｇＧまで濃縮した。ＪＥＯＬ  ＡｃｃｕＴＯＦで、還元済みＩｇＧをエレクトロスプレーイオン化飛行時間法（ＥＳＩ−ＴＯＦ）により分析した。Ｍａｇｔｒａｎソフトウェアを使用してデコンボリューション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）したスペクトルを得た。
【０２９２】
実施例９〜１２：ＩｇＧグリカンをトリミングするための一般プロトコル
ＩｇＧグリカンのトリミングは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｇｅｎｏｖｉｓ（スウェーデン）から市販）由来のエンドＳを使用して行った。このＩｇＧ（１０ｍｇ／ｍＬ）を、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）中、エンドＳ（最終濃度４０Ｕ／ｍＬ）と共に３７℃で１６時間、インキュベートした。
【０２９３】
実施例９．天然のトラスツズマブのトリミング
基準ＭＳピーク５０５９１Ｄａを有するトラスツズマブを、上のトリミングプロトコルに供した。ピークをデコンボリューションした後、質量スペクトルにより、軽鎖のピーク１つ、及び重鎖のピークが２つ示された。重鎖の２つのピークは、コアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換トラスツズマブに起因する１つの主要生成物（４９４９５Ｄａ、総重鎖の９０％）、及びコアＧｌｃＮＡｃ置換トラスツズマブに起因する少量の生成物（４９３５１Ｄａ、総重鎖の±１０％）に属した。
【０２９４】
実施例１２．トラスツズマブ−変異体Ｎ２９７Ｑ、Ｖ３６３Ｔのトリミング
１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中、Ｇ２Ｆ、Ｇ２ＦＳ１及びＧ２ＦＳ２グリコシル化アイソフォームに対応する５０９３４、５１２２７及び５１５１７Ｄａにおける主要基準ＭＳピークを有するトラスツズマブ（Ｎ２９７Ｑ、Ｖ３６３Ｔ）変異体（１０ｍｇ／ｍＬ）を、エルザベトキンギア・メニンゴセプチクム（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）（ＱＡ−Ｂｉｏから市販）に由来するエンドグリコシダーゼＦ３（エンドＦ３、２５ｍＵ／ｍｇ  ＩｇＧ）と共に１６時間、インキュベートし、これにより、完全な脱グリコシル化に至った（コアＧｌＮＡｃ（Ｆｕｃ）が結合しているＮ２９７Ｑ、Ｖ３６３Ｔ重鎖に起因する４９５１５Ｄａの主要な重鎖生成物）。
【０２９５】
修飾糖のＩｇＧへのグリコシル転移の一般プロトコル
ＩｇＧへの修飾糖の酵素による導入は、ウシβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの変異体（β１，４−Ｇａｌ−Ｔ１−Ｙ２８９Ｌ）を用いて行った。１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２及び２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で、脱グリコシル化ＩｇＧ（上記の通り調製、１０ｍｇ／ｍＬ）を修飾ＵＤＰ−糖誘導体（０．４ｍＭ）及びβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１−Ｙ２８９Ｌ（１ｍｇ／ｍＬ）と共に、３０℃で１５時間、インキュベートした。
【０２９６】
修飾ＩｇＧをプロテインＡアガロース（ＩｇＧ１ｍｇあたり４０μＬ）と共に４℃で２時間、インキュベートした。プロテインＡアガロースをＰＢＳにより３回、洗浄し、ＩｇＧを１００ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）により溶出した。溶出したＩｇＧを１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）により中和して濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＰＢＳにより洗浄し、１０ｍｇ／ｍＬの濃度にした。
【０２９７】
実施例１３．ＵＤＰ−糖２８ａ（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃＳＡｃ）の脱グリコシル化トラスツズマブへのグリコシル転移
１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２及び２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）中で、トリミングしたタラスツズマブ（２５０μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１６．５ｎｍｏｌ）をＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃＳＡｃ（２８ａ）（１８．５μＬ、１０ｍＭ）及びβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１（Ｙ２８９Ｌ）（１２．５μＬ、２ｍｇ／ｍＬ）と共に、３０℃で１６時間、インキュベートした。この粗製混合物をＰｒｏｔＡにより精製し、低いｐＨを維持するためにカラムを２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）により洗浄して、グリシン．ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．７、０．１Ｍ）による溶出後、溶出した緩衝液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２、１Ｍ）により中和した。
【０２９８】
このプロトコルにより、１．１ｍｇのＩｇＧを得て、ＩｇＧのＡｃｃｕＴＯＦ分析により、ｔｒａｓｔ−（ＧａｌＮＡｃＳＨ）２の９５％が単一の所望の生成物（恐らく、ＤＤＴによるインサイチュ脱保護による、ＧａｌＮＡｃＳＡｃマイナスアセテート基）（質量４９７２９、予期される質量４９７３０）に変換していることが示された。他の５％は、残存している出発原料（質量４９４９４）であった。
【０２９９】
実施例１４．ＵＤＰ−糖２８ａ（ＧａｌＮＡｃＳＡｃ）の脱グリコシル化トラスツズマブ（Ｎ２９７Ｑ、Ｖ３６３Ｔ）へのグリコシル転移
１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２及び２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）中で、トリミングしたトラスツズマブ（Ｎ２９７Ｑ、Ｖ３６３Ｔ）（１００μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、６．６ｎｍｏｌ）をＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃＳＡｃ（２８ａ）（１４μＬ、１０ｍＭ）及びβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１（Ｙ２８９Ｌ）（１０μＬ、２ｍｇ／ｍＬ）と共に、３０℃で１６時間、インキュベートした。この粗製混合物をＰｒｏｔＡにより精製し、低いｐＨを維持するためにカラムを２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）により洗浄して、グリシン．ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．７、０．１Ｍ）による溶出後、溶出した緩衝液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２、１Ｍ）により中和した。このプロトコルにより、０．２５ｍｇのＩｇＧを得て、ＩｇＧのＡｃｃｕＴＯＦ分析により、ｔｒａｓｔ（Ｎ２９７Ｑ、Ｖ３６３Ｔ）−（ＧａｌＮＡｃＳＨ）２が単一の所望の生成物（恐らく、ＤＤＴによるインサイチュ脱保護による、ＧａｌＮＡｃＳＡｃマイナスアセテート基）（質量４９７４４、予期される質量４９７４８）として存在していることが示された。
【０３００】
実施例１５．ＵＤＰ−糖２９（ＧａｌＮＡｃＣｌ）の脱グリコシル化トラスツズマブへのグリコシル転移
１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２及び２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）中で、トリミングしたトラスツズマブ（１００μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、６．６ｎｍｏｌ）をＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃＣｌ（２９）（５μＬ、１０ｍＭ）及びβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１（Ｙ２８９Ｌ）（５μＬ、２ｍｇ／ｍＬ）と共に、３０℃で１６時間、インキュベートした。ＧａｌＮＡｃＳＡｃの場合のプロトコルに従い、この粗製混合物をＰｒｏｔＡにより精製すると、ｔｒａｓｔ−（ＧａｌＮＡｃＣｌ）２（０．３６ｍｇ）が得られた。ＡｃｃｕＴＯＦ分析により、所望の生成物（質量４９７３１、予期される質量４９７３２）に完全に変換されていることが示された。
【０３０１】
実施例１６．ＵＤＰ−糖２９（ＧａｌＮＡｃＣｌ）の脱グリコシル化トラスツズマブ（Ｎ２９７Ｑ、Ｖ３６３Ｔ）へのグリコシル転移
１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２及び２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）中で、トリミングしたトラスツズマブＮ２９７Ｑ、Ｖ３６３Ｔ変異体（１００μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、６．６ｎｍｏｌ）をＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃＣｌ（２９）（５μＬ、１０ｍＭ）及びβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１（Ｙ２８９Ｌ）（５μＬ、２ｍｇ／ｍＬ）と共に、３０℃で１６時間、インキュベートした。ＧａｌＮＡｃＳＡｃの場合のプロトコルに従い、この粗製混合物をＰｒｏｔＡにより精製すると、ｔｒａｓｔ−（ＧａｌＮＡｃＣｌ）２（０．３５ｍｇ）が得られた。ＡｃｃｕＴＯＦ分析により、所望の生成物（質量４９７５０、予期される質量４９７５０）に完全に変換されていることが示された。
【０３０２】
実施例１７．ＵＤＰ−糖３０（ＧａｌＮＡｃＢｒ）の脱グリコシル化トラスツズマブへのグリコシル転移
１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２及び２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）中で、トリミングしたトラスツズマブ（１００μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、６．６ｎｍｏｌ）をＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃＢｒ（ＲＨＸ）（１５μＬ、１０ｍＭ）及びβ１，４−Ｇａｌ−Ｔ１−Ｙ２８９Ｌ（５μＬ、２ｍｇ／ｍＬ）と共に、３０℃で１６時間、インキュベートした。ＧａｌＮａＳＡｃの場合のプロトコルに従い、この粗製混合物をＰｒｏｔＡにより精製すると、ｔｒａｓｔ−（ＧａｌＮａｃＢｒ）２（０．３４ｍｇ）が得られた。ＡｃｃｕＴＯＦ分析により、所望の生成物（質量４９７７７、予期される質量４９７７６及び質量＋ＤＴＴ（分析試料中の反応）４９８４９．５）に５０％変換していることが示された。臭化物の分子内置換が３０％（質量４９６９６、予期される質量４９６９８）であり、２０％が残留出発原料であった。
【０３０３】
実施例１８：ｔｒａｓｔ−ＧａｌＮＡｃＣｌとＤＴＴとのコンジュゲーション
粗製ｔｒａｓｔ−（ＧａｌＮＡｃＣｌ）２（２μＬ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中、１０ｍｇ／ｍｌ）をＤＴＴ（２μＬ、０．２Ｍ）と共に３７℃で１０分間、インキュベートした。その後のＡｃｃｕＴＯＦによる分析によって、ＤＴＴの取込み（質量４９８４９、予期される質量４９８５０）が７０％及び塩素の分子内置換が３０％（質量４９６９７、予期される質量４９６９８）であることが示された。
【０３０４】
実施例１９：ｔｒａｓｔ（ＧａｌＮＡｃＣｌ）２とｐ−ＮＯ２ＰｈＳＨとのコンジュゲーション
ｔｒａｓｔ−（ＧａｌＮＡｃＣｌ）２（７．５μＬ、２６．６ｍｇ／ｍｌ、１．３ｎｍｏｌ）の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）溶液に、アルゴン雰囲気下、脱気したＴｒｉｓ−ＨＣｌ（７．５μＬ、１００ｍＭ（ｐＨ７．２））、及び脱気したｐ−ＮＯ２ＰｈＳＨ（７．５μＬ、０．１０ｍＭ、ＭｉｌｉＱ＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中の７５０ｎｍｏｌ）の溶液を加えた。４時間後のＡｃｃｕＴＯＦ分析により、所望の生成物（質量４９８４９、予期される質量４９８５１）に９５％変換されていることが示された。
【０３０５】
実施例２０：ｔｒａｓｔ（ＧａｌＮＡｃＣｌ）２とｐ−ＭｅＯＰｈＳＨとのコンジュゲーション
ｔｒａｓｔ−（ＧａｌＮＡｃＣｌ）２（７．５μＬ、２６．６ｍｇ／ｍｌ、１．３ｎｍｏｌ）の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）溶液に、アルゴン雰囲気下、脱気したＴｒｉｓ−ＨＣｌ（７．５μＬ、１００ｍＭ（ｐＨ７．２））、及び脱気したｐ−ＭｅＯＰｈＳＨ（１μＬ、０．１０ｍＭ、ＭｉｌｉＱ＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中の１００ｎｍｏｌ）の溶液を加えた。４時間後のＡｃｃｕＴＯＦ分析により、所望の生成物（質量４９８３５、予期される質量４９８３６）に９５％変換されていることが示された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、抗体のジスルフィド結合の還元は起こらなかったことが示された。
【０３０６】
実施例２１：ｔｒａｓｔ（ＧａｌＮＡｃＣｌ）２と３２とのコンジュゲーション
ｔｒａｓｔ−（ＧａｌＮＡｃＣｌ）２（７．５μＬ、２６．６ｍｇ／ｍｌ、１．３ｎｍｏｌ）の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）溶液に、アルゴン雰囲気下、脱気したＴｒｉｓ−ＨＣｌ（７．５μＬ、１００ｍＭ（ｐＨ７．２））、及び脱気した３２（１μＬ、０．１０ｍＭ、ＭｉｌｉＱ／ＤＭＦ＝１：１中の１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中１００ｎｍｏｌ）の溶液を加えた。一晩、インキュベートした後、過剰の試薬をスピンフィルター精製により除去し、この後、ＡｃｃｕＴＯＦによる分析によって、所望の生成物４０（質量５０２０８、予期される質量５０２０６）に完全に変換されていることが示された。
【０３０７】
実施例２２：ｔｒａｓｔ（ＧａｌＮＡｃＳＨ）２とｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＥ（３４）とのコンジュゲーション
ＰＢＳ中、上記の通りＵＤＰ−糖２９を使用して得た、プロテインＡで精製したｔｒａｓｔ−（ＧａｌＮＡｃＳＨ）２（５μＬ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の２０ｍｇ／ｍｌ）を、ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＥ（５μＬ、１ｍＭ、Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓから市販）と共に室温で１６時間、インキュベートした。過剰の試薬をスピンフィルター精製により除去した。その後のＡｃｃｕＴＯＦによる分析によって、所望の生成物（質量５１０５１、予期される質量＋Ｎａ＋５１０５０）の存在が示された。
【０３０８】
実施例２３：ＧａｌＴ変異体Ｙ２８９Ｎ、Ｙ２８９Ｆ、Ｙ２８９Ｍ、Ｙ２８９Ｖ、Ｙ２８９Ａ、Ｙ２８９Ｇ及びＹ２８９Ｉのクローニング及び発現
ＧａｌＴ変異体の遺伝子は、オーバーラップエクステンションＰＣＲ法により、１３０−４０２ａａ残基からなるＧａｌＴの触媒ドメインをコードする配列を含有する構築物から増幅した。野生型酵素は、配列番号１７により表される。Ｙ２８９Ｎ変異体（配列番号１８により表される）の場合、第１のＤＮＡ断片は、一対のプライマー：
【化１９】
2016538877.tif 000021
を用いて増幅した。ＮｄｅＩ制限部位には下線を引いた一方、変異部位は、太字で強調している。第２の断片は、一対のプライマー：
【化２０】
2016538877.tif 000022
により増幅した。ＢａｍＨＩ制限部位には下線を引いた一方、変異部位は、太字で強調している。ＰＣＲの最初のラウンドにおいて生じた２つの断片は、Ｏｌｉｇｏ３８＿ＧａｌＴ＿Ｅｘｔｅｒｎａｌ＿Ｆｗ及びＯｌｉｇｏ２９＿ＧａｌＴ＿Ｅｘｔｅｒｎａｌ＿Ｒｗプライマーを使用して、第２のラウンドに融合した。ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩによる消化後、この断片は、同じ制限酵素を用いて切断したｐＥＴ１６ｂベクターにライゲーションした。新しく構築した発現ベクターは、Ｙ２８９Ｎ変異体をコードする遺伝子、及びｐＥＴ１６ｂベクターに由来するＨｉｓタグをコードする配列を含有しており、このことは、ＤＮＡシークエンシング結果により確認した。Ｙ２８９Ｆ（配列番号１９により表される）、Ｙ２８９Ｍ（配列番号２０により表される）、Ｙ２８９Ｉ（配列番号２１により表される）、Ｙ２８９Ｖ（配列番号２２により表される）、Ｙ２８９Ａ（配列番号２３により表される）及びＹ２８９Ｇ（配列番号２４により表される）変異体の構築の場合、それぞれ、フェニルアラニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、アラニン又はグリシンをコードするＴＴＴ、ＡＴＧ、ＡＴＴ、ＧＴＧ、ＧＣＧ又はＧＧＣトリプレットに変化する変異部位によって、同じ手順を使用した。より詳細には、Ｙ２８９Ｆの構築の場合、第１のＤＮＡ断片は、本明細書において、配列番号１及び配列番号５として定義されている一対のプライマーを用いて増幅し、第２の断片は、本明細書において、配列番号３及び配列番号６（関連配列に関しては、表１が参照される）として定義されている一対のプライマーを用いて増幅した。さらに、Ｙ２８９Ｍの構築の場合、第１のＤＮＡ断片は、本明細書において、配列番号１及び配列番号７として定義されている一対のプライマーを用いて増幅し、第２の断片は、本明細書において、配列番号３及び配列番号８として定義されている一対のプライマーを用いて増幅した。Ｙ２８９Ｉの構築の場合、第１のＤＮＡ断片は、本明細書において、配列番号１及び配列番号９として定義されている一対のプライマーを用いて増幅し、第２の断片は、本明細書において、配列番号３及び配列番号１０として定義されている一対のプライマーを用いて増幅した。Ｙ２８９Ｖの構築の場合、第１のＤＮＡ断片は、本明細書において、配列番号１及び配列番号１１として定義されている一対のプライマーを用いて増幅し、第２の断片は、本明細書において、配列番号３及び配列番号１２として定義されている一対のプライマーを用いて増幅した。Ｙ２８９Ａの構築の場合、第１のＤＮＡ断片は、本明細書において、配列番号１及び配列番号１３として定義されている一対のプライマーを用いて増幅し、第２の断片は、本明細書において、配列番号３及び配列番号１４として定義されている一対のプライマーを用いて増幅した。Ｙ２８９Ｇの構築の場合、第１のＤＮＡ断片は、本明細書において、配列番号１及び配列番号１５として定義されている一対のプライマーを用いて増幅し、第２の断片は、本明細書において、配列番号３及び配列番号１６（関連配列に関しては、表１が参照される）として定義されている一対のプライマーを用いて増幅した。
【０３０９】
Ｑａｓｂａら（Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒ．２００３年、３０巻、２１９〜２２９頁）により報告されている手順に従って、ＧａｌＴ変異体を発現させて単離し、封入体からリフォールディングした。リフォールディング後、沈殿物を除去し、可溶なフォールディングしたタンパク質をＮｉ−ＮＴＡカラム（ＨｉｓＴｒａｐ  ｅｘｃｅｌ  １ｍＬカラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して単離した。２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ及び２００ｍＭイミダゾールにより溶出した後、タンパク質を２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して透析し、スピンフィルター（Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０  ｍｅｍｂｒａｎｅを備えたＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターユニット、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して２ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
【表１】
2016538877.tif 000023
【０３１０】
実施例２４：４，４’−ジスルファンジイル二安息香酸ビスヒドロキシスクシンイミドエステルの合成
４，４’−ジスルファンジイル二安息香酸３１（５５０ｍｇ、１．７９ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２０ｍＬ）懸濁液に、ＥＤＣ．ＨＣｌ（７７０ｍｇ、３．９５ｍｍｏｌ）及びＮＨＳ（４４７ｍｇ、３．９５ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を４時間、撹拌し、続いて水（２×２０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×２０ｍＬ）により洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水してろ過し、真空で濃縮した。４，４’−ジスルファンジイル二安息香酸ビスヒドロキシスクシンイミドエステルは、粗製物で次の反応に使用した。
【０３１１】
実施例２５：４，４’−ジスルファンジイルビス（Ｎ−（２’’−（２’−（２−アジドエトキシ）−エトキシ）エチル）ベンズアミド）の合成
２’’−（２’−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エタン−１−アミン（２１０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１０ｍＬ）溶液にＥｔ３Ｎ（２４０μＬ、１．７ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を５分間撹拌し、続いて、４，４’−ジチオ二安息香酸ビスヒドロキシスクシンイミドエステル（２４０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を加えた。一晩、撹拌した後、この反応混合物を減圧下で濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ→ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、９６：４）で生成物を精製した。生成物を含有している画分を水（３×２０ｍＬ）により洗浄し、続いてＮａ２ＳＯ４で脱水してろ過し、真空で濃縮すると４，４’−ジスルファンジイルビス（Ｎ−（２’’−（２’−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エチル）ベンズアミドが５４％収率（１６８ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）で得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）７．７４〜７．７２（ｍ，４Ｈ）、７．５４〜７．５２（ｍ，４Ｈ）、３．６８〜３．５８（ｍ，２０Ｈ）、３．３５（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ）。
【０３１２】
実施例２６：メルカプト安息香酸誘導体４１の合成
０℃の４，４’−ジスルファンジイル−ビス（Ｎ−（２’’−（２’−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エチル）−ベンズアミド（２２ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１ｍＬ）溶液に、ＮａＢＨ４（２．７ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）を加えた。このスラリーを撹拌し、３時間及び６時間後に、余分のＮａＢＨ４（２回、２．７ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）を加えた。この反応物をさらに１時間、撹拌し、続いて、０．１Ｍ  ＨＣｌ（１ｍＬ）及びＤＣＭ（２ｍＬ）を加えた。この混合物をＤＣＭ（２×５ｍＬ）により抽出し、合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で脱水してろ過し、真空で濃縮すると、４１が６９％収率（１６ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）で得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）７．６５〜７．６３（ｍ，２Ｈ）、７．２９〜７．２６（ｍ，２Ｈ）、３．６８〜３．５６（ｍ，１０Ｈ）、３．３５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）。
【０３１３】
実施例２７：Ｎ−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エチル）ブタ−３−インアミド（４２）の合成
ブタ−３−イン酸（１５ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）溶液にＭｕｋａｙａｍａ試薬（６６ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を加え、この懸濁液を１時間、撹拌し、続いて、事前に混合した２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エタン−１−アミン（１７ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（６０μＬ、０．４５ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）の溶液を滴下して加えた。３０分後、この混合物を減圧下で濃縮し、続いて水（５ｍＬ）及びＥｔＯＡｃ（５ｍＬ）を加えた。有機層を水（２×５ｍＬ）により洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水してろ過し、真空で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ペンタン１：１→６：１）により、生成物４２（９ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ、２１％）が得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ３．６４〜３．５８（ｍ，６Ｈ）、３．５５〜３．５２（ｍ，２Ｈ）、３．４５〜３．４２（ｍ，２Ｈ）、３．３３（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ）、３．１５（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ）、２．２９（ｔ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ）。
【０３１４】
実施例２８：Ｎ−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エチル）ブタ−２−アレンアミド（４３）の合成
ブチンアミド４２（９ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）をジオキサン（０．５ｍＬ）に溶解し、続いてＫ２ＣＯ３（水中、１８％、０．５ｍＬ）を加えた。この反応混合物を４０℃まで２時間、加熱し、次いで、クエン酸（２ｍＬ、水中の１０％）及びＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）を加えた。水層をＣＨ２Ｃｌ２（２×３ｍＬ）により抽出し、有機層を合わせて、Ｎａ２ＳＯ４で脱水してろ過し、真空で濃縮すると、生成物４３（８ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ、８９％）が得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ５．６３（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ）、５．２１（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ）、３．７０〜３．６０（ｍ，６Ｈ）、３．６０〜３．５８（ｍ，２Ｈ）、３．５３〜３．５０（ｍ，２Ｈ）、３．３９（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ）。
【０３１５】
実施例２９：１−ピレンカルボン酸ＯＳｕエステルの合成
１−ピレンカルボン酸（６５ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ／ＤＭＦ（各２ｍＬ）溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３４ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ．ＨＣｌ（７０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を加えた。この反応物を２時間、撹拌し、続いてＤＣＭ（１０ｍＬ）により希釈し、クエン酸水溶液（１０％、５ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３ｘ５ｍＬ）により洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水してろ過し、真空で濃縮すると、粗製１−ピレンカルボン酸ヒドロキシスクシンイミドエステルが得られた。
【０３１６】
実施例３０：４４の合成
１−ピレンカルボン酸ヒドロキシスクシンイミドエステル（４８０ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１５ｍＬ）に溶解し、（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３４８ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（２８６μＬ、２．１ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を一晩、撹拌し、水（１５ｍＬ）によりクエンチして、有機層を水（１×１５ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×１５ｍＬ）により洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水してろ過し、真空で濃縮した。グラジエントしたフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ→ＤＣＭ：ＭｅＯＨ  ９５：５）により精製すると、Ｂｏｃ保護ピレン誘導体（４６０ｍｇ、０．９７ｍｍｏｌ、７０％）が得られた。
【０３１７】
次に、Ｂｏｃ保護ピレン誘導体（４６０ｍｇ、０．９７ｍｍｏｌ）をメタノール（１０ｍＬ）に溶解した。塩化アセチル（１４０μＬ、１．９ｍｍｏｌ）を加え、１時間及び３時間後に、追加の塩化アセチル（２×１４０μＬ、１．９ｍｍｏｌ）を加えた。４時間、撹拌した後、この混合物を減圧下で濃縮した。次に、粗生成物（１００ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（３ｍＬ）に溶解し、４−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ブタン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（５０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（７３μＬ、０．５２ｍｍｏｌ）を加えた。一晩、撹拌した後、この溶液を水（３ｍＬ）によりクエンチし、水（２×３ｍＬ）により洗浄してＮａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過して濃縮した。グラジエントしたフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ→ＤＣＭ：ＭｅＯＨ  ９５：５）により精製すると、４４（６９ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、７５％）が得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）８．４８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、８．１２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）、８．０４〜７．９３（ｍ，６Ｈ）、６．５９（ｂｓ，１Ｈ）、６．３８（ｓ，２Ｈ）、５．９９（ｂｓ，１Ｈ）、３．７６〜３．７１（ｍ，４Ｈ）、３．６２〜３．６０（ｍ，２Ｈ）、３．５４〜３．５２（ｍ，２Ｈ）、３．３７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ）、３．２３〜３．１７（ｍ，４Ｈ）、１．８２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）、１．６３（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）。
【０３１８】
実施例３１：マレイミドＢＣＮコンジュゲート４５の形成
ＢＣＮ−（ＰＯＥ）３ＮＨ２（１３ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）のＤＭＡ（１ｍＬ）溶液に、４−マレイミドブタン酸ヒドロキシスクシンイミドエステル（７ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を加え、次いで、１時間、インキュベートした。この溶液をコンジュゲーション実験にそのまま使用した。
【０３１９】
実施例３２：ｔｒａｓｔ（ＧａｌＮＰｒｏＳＨ）２と３４とのコンジュゲーションにより３９が得られる
ＰＢＳ及び２０ｍＭ  ＥＤＴＡ中、トラスツズマブ−（ＧａｌＮＰｒｏＳＨ）２（１．０ｍｇ、１０ｍｇ／ｍＬ）をＴＣＥＰ（６．６μＬ、ＭｉｌｉＱ中の１０ｍＭ）と共に、室温で２時間、インキュベートした。続いて、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、この反応媒体をＰＢＳに交換した。デヒドロアスコルビン酸（５．４μＬ、ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ）を加え、次いで３時間、インキュベートした。マレイミド−ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＥ  ３４（１μＬ、ＤＭＡ中の１０ｍＭ）を加え、この混合物を３５分間、インキュベートした。続いて、ファブリケーター（Ｆａｂｒｉｃａｔｏｒ）（商標）（１０μＬのＰＢＳ中、５０Ｕ）による消化用に試料（２μＬ）を採取し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ＭｉｌｉＱにより洗浄し、質量分析すると、３９（２５７０６、予期される質量２５７０１）の形成が示された。
【０３２０】
実施例３３：トラスツズマブ−コンジュゲート４６の形成
３６（Ｒ＝Ｃｌ）（３μＬ、６３ｍｇ／ｍｌ、１．３ｎｍｏｌ）の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）溶液にＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１０μＬ、１００ｍＭ  ｐＨ７．２）及び４１（１０μＬ、１０ｍＭ、ＭｉｌｉＱ＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ＋１０％ＤＭＦ中の１００ｎｍｏｌ）の溶液を加えた。一晩、インキュベートした後、ＡｃｃｕＴＯＦ分析により、所望の生成物４６（質量５００１０、予期される質量５０００６）が９５％超で変換されていることが示された。
【０３２１】
実施例３４：４６と４７とのＳＰＡＡＣにより、抗体−薬物コンジュゲート４８になる
実施例３３の残りの試薬をスピンろ過（３×０．５ｍＬ）により除去し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５ｍＭ、ｐＨ７．５）及びＢＣＮ−ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＦ  ４７（１０μＬ、２ｍＭ、ＭｉｌｉＱ＋５％  ＤＭＦ中の２０ｎｍｏｌ）に加えた。一晩、インキュベートした後、ＡｃｃｕＴＯＦ分析により、所望の生成物４８（質量５１５６６、予期される質量５１５６４）が９５％超で変換されていることが示された。
【０３２２】
実施例３５：ｔｒａｓｔ（ＧａｌＮＰｒｏＳＨ）２のアレンアミド４３とのコンジュゲーションによりコンジュゲート４９が得られる
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）中のトラスツズマブ−（ＧａｌＮＰｒｏＳＨ）２（０．２ｍｇ、２０ｍｇ／ｍＬ）をＮ−（２’’−（２’−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エチル）ブタ−２−アレンアミド（４３）（１μＬ、ＤＭＡ中、４０ｍＭ）及び５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）（１０μＬ）と共に、室温で一晩、インキュベートした。続いて、ファブリケーター（商標）（１０μＬのＰＢＳ中、５０Ｕ）による消化用に試料（２μＬ）を採取し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ＭｉｌｉＱにより洗浄し、質量分析すると、主生成物として所望の生成物４９（２４６２７、予期される質量２４６２７）の形成が示された（約７０％）。
【０３２３】
実施例３６：ｔｒａｓｔ（ＧａｌＮＰｒｏＳＨ）２の４４とのコンジュゲーションによりコンジュゲート５０が得られる
ＰＢＳ及び２０ｍＭ  ＥＤＴＡ中、トラスツズマブ−（ＧａｌＮＰｒｏＳＨ）２（０．５ｍｇ、１０ｍｇ／ｍＬ）をＴＣＥＰ（３．３μＬ、ＭｉｌｉＱ中の１０ｍＭ）と共に、室温で２時間、インキュベートした。続いて、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、この反応媒体をＰＢＳに交換した。デヒドロアスコルビン酸（２．８μＬ、ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ）を加え、次いで３時間、インキュベートした。ピレンマレイミド４４（１μＬ、ＤＭＡ中、１０ｍＭ）を加え、この混合物を３５分間、インキュベートした。続いて、ファブリケーター（商標）（ＰＢＳ１０μＬ中、５０Ｕ）による消化用に試料（２μＬ）を採取し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ＭｉｌｉＱにより洗浄し、質量分析により、主生成物として所望の生成物５０（２４９２９、予期される質量２４９２９）の形成が示された（約８５％）。
【０３２４】
実施例３７：ｔｒａｓｔ（ＧａｌＮＰｒｏＳＨ）２と４５とのコンジュゲーション、それに続くビオチン−Ｎ３（５２）の付加
ＰＢＳ及び２０ｍＭ  ＥＤＴＡ中、トラスツズマブ−（ＧａｌＮＢｕＳＨ）２（１ｍｇ、１０ｍｇ／ｍＬ）をＴＣＥＰ（８．３μＬ、ＭｉｌｉＱ中の１０ｍＭ）と共に、室温で２時間、インキュベートした。続いて、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、この反応媒体をＰＢＳに交換した。デヒドロアスコルビン酸（６．５μＬ、ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ）を加え、次いで３時間、インキュベートした。化合物４５（３μＬプレミックス、ＤＭＡ中、４０ｍＭ）加え、この混合物を３５分間、インキュベートした。続いて、ファブリケーター（商標）（ＰＢＳ１０μＬ中、５０Ｕ）による消化用に試料（２μＬ）を採取し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ＭｉｌｉＱにより洗浄し、質量分析により、主生成物として所望の生成物５１（２４８９１、予期される質量２４８９１）の形成が示された（約８５％）。この反応混合物を２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に２回、スピンろ過し、次いで５２（３μＬ、ＤＭＦ中４０ｍＭ）を加えた。インキュベート後、試料に上で記載したＤＴＴを施し、質量分析により、主生成物として所望の生成物５３（５０６５８、予期される質量５０６５０）が形成しており（約８５％）、残りの化学種の１つは、トリミングしたトラスツズマブ（４９５０３、予期される質量４９４９５）であることが示された。
【０３２５】
実施例３８：５２の合成
２’’−（２’−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エタン−１−アミン（５０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）に溶解し、ビオチンヒドロキシスクシンイミド誘導体（６０ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（５２μＬ、０．３７ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を一晩、撹拌し、水（５ｍＬ）及びＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）によりクエンチした。有機層を水（２×５ｍＬ）により洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水してろ過し、減圧下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ→ＤＣＭ：ＭｅＯＨ→９：１）により、生成物５２（１３ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ、２０％）が得られた。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ１６Ｈ２９Ｎ６Ｏ４Ｓ（Ｍ＋Ｈ＋）計算値４０１．１９、実測値４０１．３４。
【０３２６】
実施例３９：ＵＤＰ−ＧａｌＮＰｒｏＳＨ（５９）及びＵＤＰ−ＧａｌＮＢｕＳＨ（６０）誘導体の合成
実施例ｘｘｘにおいて行った、２４から開始するＵＤＰ−ＧａｌＮＰｒｏＳＨ及びＵＤＰ−ＧａｌＮＢｕＳＨ誘導体５９＋６０の合成の反応スキームを、図１２に示す。
【０３２７】
実施例４０：３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン−１−ホスフェート（５４）
アジド２４（１０５ｍｇ、０．２５５ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（３ｍＬ）溶液にＰｄ／Ｃ（２０ｍｇ）を加えた。この反応物をＨ２雰囲気下、２時間、撹拌し、セライトでろ過した。フィルターをＭｅＯＨ（１０ｍＬ）によりすすぎ、ろ液を真空で濃縮すると、５４（９４ｍｇ、０．２４４ｍｍｏｌ、９６％）が得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ  ５．８７〜５．７６（ｍ，１Ｈ）、５．４４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、５．３０〜５．２０（ｍ，１Ｈ）、４．５５（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ）、４．２８〜４．００（ｍ，３Ｈ）、２．１１（ｓ，３Ｈ）、２．０３（ｓ，３Ｈ）、２．００（ｓ，３Ｈ）。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ１２Ｈ１９ＮＯ１１Ｐ（Ｍ−）の計算値３８４．０７、実測値３８４．１。
【０３２８】
実施例４１：５５の合成
５４（１６２ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ／ＤＭＦ（各２ｍＬ）溶液に、アセチルメルカプト−３−プロパン酸ヒドロキシスクシンイミドエステル（１７５ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（８８μＬ、０．６３ｍｍｏｌ）を加えた。一晩、撹拌後、この反応混合物を減圧下で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ→ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ  ３０：７０）により精製すると、５５（８５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、３９％）が得られた。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ１７Ｈ２５ＮＯ１３ＰＳ（Ｍ−）の計算値５１４．０９、実測値５１４．０６。
【０３２９】
実施例４２：５７の合成
次に、ＢａｉｓｃｈらのＢｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９７年、５巻、３８３〜３９１頁に従い、化合物５５をＵＭＰに結合した。
【０３３０】
したがって、Ｄ−ウリジン−５’−一リン酸二ナトリウム塩（１．４９ｇ、４．０５ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（１５ｍＬ）溶液をＤＯＷＥＸ５０Ｗｘ８（Ｈ＋型）により３０分間、処理してろ過した。トリブチルアミン（０．９６６ｍＬ、４．０５ｍｍｏｌ）を滴下して加えながら、このろ液を室温で激しく撹拌した。３０分間のさらなる撹拌後、この反応混合物を凍結乾燥した。
【０３３１】
アルゴン雰囲気中、得られたウリジン−５’−一リン酸トリブチルアンモニウム（１０３ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解した。カルボニルジイミダゾール（５７ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を加え、この反応混合物を室温で３０分間、撹拌した。次に、乾燥ＭｅＯＨ（７μＬ）を加え、１５分間、撹拌して過剰のＣＤＩを除去した。高真空下、残りのＭｅＯＨを１５分間、除去した。続いて、化合物ｘ（８７ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミジゾールＨＣｌ（１１８ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、上記の反応混合物に滴下して加えた。この反応物を一晩、撹拌した後、真空で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（９：２：１〜５：２：１  ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ）により、５７（９１ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、６５％）が得られた。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ２６Ｈ３６Ｎ３Ｏ２１Ｐ２Ｓ（Ｍ−）の計算値８２０．１１、実測値８２０．２４。
【０３３２】
実施例４３：ＵＤＰ−ＧａｌＮＰｒｏＳＨ（５９）の合成
ＵＤＰ−ガラクトサミン誘導体５７（１７８ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を水：ＭｅＯＨ：Ｅｔ３Ｎ（３：７：３、５ｍＬ）の混合物に溶解し、ＬＣＭＳにより、完全な脱保護に到達するまで撹拌した。この反応物を減圧下で濃縮し、２つの分量に分けた。分量の１つは保管した一方、もう一方の半分は、陰イオン交換カラム（Ｑ  ＨＩＴＲＡＰ、２×５ｍＬカラム）で精製した。カラムへの最初の結合は、緩衝液Ａ（１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３）のローディングにより達成し、このカラムを緩衝液Ａ１００ｍＬによりすすいだ。次に、Ｂ２５％（２５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３）までグラジエントを行い、ジＵＭＰなどの不純物を溶出させた。このグラジエントをＢ１００％まで増加させて、生成物を二量体として溶出させた。この画分を凍結乾燥し、次いで水（５ｍＬ）に溶解し、その後、ＤＴＴ（１５ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（数滴）を加えた。１時間後、還元が完了し、溶媒を減圧下で除去した。フラッシュクロマトグラフィー（６：２：１〜３：２：１  ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ）により、生成物５９（１７ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ、２６％）が得られた。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ１８Ｈ２８Ｎ３Ｏ１７Ｐ２Ｓ（Ｍ−）の計算値６５２．０７、実測値６５２．０３。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ  ７．８６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、５．８８〜５．８６（ｍ，２Ｈ）、５．４８〜５．４５（ｍ，１Ｈ）、４．２８〜４．０５（ｍ，８Ｈ）、３．９５〜３．８５（ｍ，１Ｈ）、３．６８〜３．６５（ｍ，２Ｈ）、２．６９〜２．６７（ｍ，２Ｈ）、２．６０〜２．５５（ｍ，２Ｈ）。
【０３３３】
実施例４４：アセチルメルカプト−４−ブタン酸の合成
４−ブロモブタン酸（１ｇ、６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（７ｍＬ）に溶解し、続いてチオ酢酸カリウム（１ｇ、９ｍｍｏｌ）を加えた。この反応物を１時間、撹拌し、１Ｍ  ＨＣｌ（２０ｍＬ）及びＥｔ２Ｏ（２０ｍＬ）によりクエンチした。有機層を１Ｍ  ＨＣｌ（３×２０ｍＬ）により洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水してろ過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（１：０〜７：１  ヘプタン：ＥｔＯＡｃ＋１％Ａｃ２Ｏ）により、アセチルメルカプト−４−ブタン酸（４５０ｍｇ、２．７ｍｍｏｌ、４６％）が得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ２．９４（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）、２．４５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）、２．３４（ｓ，３Ｈ）、１．９２（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）。
【０３３４】
実施例４５：アセチルメルカプト−４−ブタン酸ヒドロキシスクシンイミドエステルの合成
アセチルメルカプト−４−ブタン酸（４５０ｍｇ、２．７ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）に溶解し、次いで、ＥＤＣ．ＨＣｌ（８１３ｍｇ、４．１ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（５００ｍｇ、４．１ｍｍｏｌ）を加えた。この反応物を一晩、撹拌し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２０ｍＬ）によりクエンチした。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×２０ｍＬ）及びクエン酸水溶液（１×１０ｍＬ）により洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で脱水してろ過し、濃縮すると、表題化合物が粗生成物（６３０ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ、９０％）として得られた。
【０３３５】
実施例４６：５６の合成
ガラクトサミン誘導体５４（１６７ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）のＤＣＭ／ＤＭＦ（各２ｍＬ）溶液に、アセチルメルカプト−４−ブタン酸ヒドロキシスクシンイミド（２００ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（８８μＬ、０．６３ｍｍｏｌ）を加えた。一晩、撹拌後、この反応混合物を減圧下で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ→ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ  ３０：７０）により精製すると、５６（６８ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、３０％）が得られた。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）  Ｃ１８Ｈ２７ＮＯ１３ＰＳ（Ｍ−）計算値５２８．１０、実測値５２８．２５。
【０３３６】
実施例４７：５８の合成
次に、Ｂａｉｓｃｈら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９７年、５巻、３８３〜３９１頁に従い、ガラクトサミン誘導体５６をＵＭＰに結合した。
【０３３７】
したがって、Ｄ−ウリジン−５’−一リン酸二ナトリウム塩（１．４９ｇ、４．０５ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（１５ｍＬ）溶液をＤＯＷＥＸ５０Ｗｘ８（Ｈ＋型）により３０分間、処理してろ過した。トリブチルアミン（０．９６６ｍＬ、４．０５ｍｍｏｌ）を滴下して加えながら、このろ液を室温で激しく撹拌した。３０分間のさらなる撹拌後、この反応混合物を凍結乾燥した。
【０３３８】
アルゴン雰囲気中、得られたウリジン−５’−一リン酸トリブチルアンモニウム（７８ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解した。カルボニルジイミダゾール（４３ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を加え、この反応混合物を室温で３０分間、撹拌した。次に、乾燥ＭｅＯＨ（６μＬ）を加え、１５分間、撹拌して過剰のＣＤＩを除去した。高真空下、残りのＭｅＯＨを１５分間、除去した。続いて、化合物５６（６８ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミジゾールＨＣｌ（１１８ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、上記の反応混合物に滴下して加えた。この反応物を一晩、撹拌した後、真空で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（９：２：１〜５：２：１  ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ）により、生成物５８（５３ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ、４９％）が得られた。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ２７Ｈ３８Ｎ３Ｏ２１Ｐ２Ｓ（Ｍ−）の計算値８３４．１３、実測値８３４．２６。
【０３３９】
実施例４８：６０の合成
糖５８（５３ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を脱気した水：ＭｅＯＨ：Ｅｔ３Ｎ（３：７：３、３ｍＬ）の混合物に溶解し、ＬＣＭＳにより、完全な脱保護に到達するまで撹拌した。この反応物を減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（７：２：１〜３：２：１  ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ）で精製した。分量の１つを保管した一方、もう一方の半分は、陰イオン交換カラム（Ｑ  ＨＩＴＲＡＰ、１×５ｍＬカラム）で精製した。カラムへの最初の結合は、緩衝液Ａ（１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３）のローディングにより達成し、このカラムを緩衝液Ａ５０ｍＬによりすすいだ。次に、Ｂ２５％（２５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３）までグラジエントを行い、生成物６０（１ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ、５％）を溶出させた。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ１９Ｈ３１Ｎ３Ｏ１７Ｐ２Ｓ（Ｍ−）の計算値６６６．０８、実測値６６６．０。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ  ７．８６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、５．８８〜５．８６（ｍ，２Ｈ）、５．４８〜５．４５（ｍ，１Ｈ）、４．２７〜４．１０（ｍ，７Ｈ）、３．９４〜３．８６（ｍ，２Ｈ）、３．６８〜３．６１（ｍ，３Ｈ）、３．１２〜３．０８（ｍ，２Ｈ）、２．４６〜２．３５（ｍ，２Ｈ）、１．２０〜１．１７（ｍ，２Ｈ）。
【０３４０】
実施例４９．６４の合成
アセチルメルカプト酢酸ペンタフルオロフェノールエステル（１００ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）に溶解し、ベンジルアミン（６９μＬ、０．５ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（４４μＬ、０．４０ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を一晩、撹拌し、水（３ｍＬ）を加えてクエンチし、次いで水（３×３ｍＬ）により洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で脱水してろ過し、真空で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ヘプタン１：４→１：１）により６１が得られ、これを脱気メタノール（７ｍＬ）に溶解した。続いて、脱気したＮａＯＨ水溶液（１Ｍ、３ｍＬ）を加え、この反応物を窒素雰囲気下で撹拌した。２時間後、この反応物を１Ｍ  ＨＣｌ（１０ｍＬ）及びＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）によりクエンチした。水層をＣＨ２Ｃｌ２（２×３０ｍＬ）により抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水してろ過し、真空で濃縮した。生成物６４を粗製物で次の反応に使用した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．２８〜７．７０（ｍ，５Ｈ）、６．９４（ｂｓ，１Ｈ）、４．４０（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ）、３．２１（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ）、１．８１（ｔ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ）。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ９Ｈ１２ＮＯＳ（Ｍ＋Ｈ＋）の計算値１８２．０６、実測値１８２．６０。
【０３４１】
実施例５０．６５の合成
アセチルメルカプト−３−プロパン酸ヒドロキシスクシンイミドエステル（１００ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）に溶解し、ベンジルアミン（６９μＬ、０．５ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（４４μＬ、０．４０ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を一晩、撹拌し、水（３ｍＬ）を加えてクエンチし、次いで水（３×３ｍＬ）により洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で脱水してろ過し、真空で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ヘプタン１：４→１：１）により生成物６２が得られ、これを脱気メタノール（７ｍＬ）に溶解した。続いて、脱気したＮａＯＨ水溶液（１Ｍ、３ｍＬ）を加え、この反応物を窒素雰囲気下で撹拌した。２時間後、この反応物を１Ｍ  ＨＣｌ（１０ｍＬ）及びＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）によりクエンチした。水層をＣＨ２Ｃｌ２（２×３０ｍＬ）により抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水してろ過し、真空で濃縮した。生成物６５を粗製物で次の反応に使用した。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ１０Ｈ１４ＮＯＳ（Ｍ＋Ｈ＋）の計算値１９６．０７、実測値１９６．６０。
【０３４２】
実施例５１．６６の合成
アセチルメルカプト−４−ブタン酸ヒドロキシスクシンイミドエステル（１００ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）に溶解し、ベンジルアミン（６９μＬ、０．５ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（４４μＬ、０．４０ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を一晩、撹拌し、水（３ｍＬ）を加えてクエンチし、次いで水（３×３ｍＬ）により洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で脱水してろ過し、真空で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ヘプタン  １：４→１：１）により生成物６３が得られ、これを脱気メタノール（７ｍＬ）に溶解した。続いて、脱気したＮａＯＨ水溶液（１Ｍ、３ｍＬ）を加え、この反応物を窒素雰囲気下で撹拌した。２時間後、この反応物を１Ｍ  ＨＣｌ（１０ｍＬ）及びＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）によりクエンチした。水層をＣＨ２Ｃｌ２（２×３０ｍＬ）により抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水してろ過し、真空で濃縮した。生成物６６を粗製物で次の反応に使用した。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ１１Ｈ１６ＮＯＳ（Ｍ＋Ｈ＋）計算値２１０．０９、実測値２１０．６０。
【０３４３】
実施例５２．スクシンイミド付加物６７の合成
ピレンマレイミド誘導体４４（１０ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液に、６４（８ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（１０μＬ、０．０９ｍｍｏｌ）を加えた。１時間、撹拌した後、この反応物を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ→ＤＣＭ：ＭｅＯＨ  ９：１）により６７（４ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ、２８％）が得られた。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ４０Ｈ４３Ｎ４Ｏ７Ｓ（Ｍ＋Ｈ＋）の計算値７２３．２８、実測値７２３．３１。
【０３４４】
実施例５３．スクシンイミド付加物６８の合成
ピレンマレイミド誘導体４４（１０ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液に、６５（８ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（１０μＬ、０．０９ｍｍｏｌ）を加えた。１時間、撹拌した後、この反応物を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ→ＤＣＭ：ＭｅＯＨ  ９：１）により６８（８ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ、５４％）が得られた。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ４１Ｈ４５Ｎ４Ｏ７Ｓ（Ｍ＋Ｈ＋）の計算値７３７．２９、実測値７３６．２９。
【０３４５】
実施例５４．スクシンイミド付加物６９の合成
ピレンマレイミド誘導体４４（１０ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液に、６６（８ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（１０μＬ、０．０９ｍｍｏｌ）を加えた。１時間、撹拌した後、この反応物を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ→ＤＣＭ：ＭｅＯＨ  ９：１）により６９（６ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ、４０％）が得られた。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ４２Ｈ４７Ｎ４Ｏ７Ｓ（Ｍ＋Ｈ＋）の計算値７５１．３１、実測値７５１．３８。
【０３４６】
実施例５５．スクシンイミド６７〜６９の安定性検討
スクシンイミドコンジュゲート６７〜６９（１ｍｇ）の１種をＤＭＦ（４００μＬ）に溶解し、続いて、緩衝溶液１、２又は３（８００μＬ）を加えた。緩衝溶液１はＰＢＳであり、緩衝溶液２はＰＢＳ＋１ｍＭグルタチオン（ＧＳＨ、還元型）であり、緩衝溶液３はＰＢＳ＋１ｍＭグルタチオン（酸化型）である。グルタチオンの最終濃度（ＤＭＦによる希釈によって）は、０．７１ｍＭである。この試料を３７℃でインキュベートし、時間内に測定した。生成物の比は、ＬＣ−ＭＳにより決定した。
【表２】
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【０３４７】
実施例５６：ＵＤＰ−糖５９（ＧａｌＮＰｒｏＳＨ）の脱グリコシル化トラスツズマブへのグリコシル転移
１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２及び５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）中で、脱グリコシル化トラスツズマブ（１０ｍｇ／ｍＬ）を５９（１．３ｍＭ）及びβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１（Ｙ２８９Ｌ、Ｃ３４２Ｔ）（０．２ｍｇ／ｍＬ）と共に、３０℃で１６時間、インキュベートした。
【０３４８】
次に、官能基化トラスツズマブをプロテインＡアガロース（ＩｇＧ１ｍｇあたり４０μＬ）と共に室温で１時間、インキュベートした。プロテインＡアガロースをＴＢＳ（ｐＨ６．０）により３回、洗浄し、ＩｇＧを１００ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）により溶出した。溶出したＩｇＧを１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）により中和して濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）により洗浄し、１５〜２０ｍｇ／ｍＬの濃度にした。ファブリケーター（商標）（１０μＬのＰＢＳ（ｐＨ６．６）中、５０Ｕ）により消化した後のスペクトル分析、及びＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する、ＭｉｌｉＱによるその後の洗浄によって、２種の生成物、すなわち、脱グリコシル化トラスツズマブ＋ＧａｌＮＰｒｏＳＨ（トラスツズマブ−（ＧａｌＮＰｒｏＳＨ）２）である主要生成物（２４３８７Ｄａ、予期される質量２４３８８）、及び脱グリコシル化トラスツズマブ＋ＧａｌＮＰｒｏＳ−ＵＤＰＧａｌＮＰｒｏＳジスルフィドである少量生成物（２５０３７Ｄａ、予期される質量２５０３８）の形成が示された。これらの生成物間の比は約６０：４０である。
【０３４９】
実施例５７：ＵＤＰ−糖６０（ＧａｌＮＢｕＳＨ）の脱グリコシル化トラスツズマブへのグリコシル転移
１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２及び５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）中で、脱グリコシル化トラスツズマブ（１０ｍｇ／ｍＬ）を６０（１．３ｍＭ）及びβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１（Ｙ２８９Ｍ）（２ｍｇ／ｍＬ）と共に、３０℃で１６時間、インキュベートした。
【０３５０】
ファブリケーター（商標）（ＰＢＳ（ｐＨ６．６）１０μＬ中の５０Ｕ）により消化した後のスペクトル分析、及びＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する、ＭｉｌｉＱによるその後の洗浄によって、出発原料が６０％変換して、２種の生成物、すなわち脱グリコシル化トラスツズマブ＋ＧａｌＮＢｕＳＨ（トラスツズマブ−（ＧａｌＮＢｕＳＨ）２）である少量生成物（２４４０１Ｄａ、予期される質量２４４０２）、及び脱グリコシル化トラスツズマブ＋ＧａｌＮＢｕＳ−ＵＤＰＧａｌＮＢｕＳジスルフィドである主要生成物（２５０６６Ｄａ、予期される質量２５０６８）が示された。これらの生成物間の比は約２０：８０である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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