(57)【要約】  本発明は、マイクロキャリアに対し近接二重検出アッセイを利用して、患者サンプル中の対象とする検体成分の有無、発現レベル及び／又は活性レベルを検出することにより、患者の疾患状態を診断するための方法を提供する。本発明は、本明細書に記載の方法を実施するためのアッセイ装置も提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルに対し多重化免疫アッセイを実施する方法であって、
（ａ）細胞可溶化物を、少なくとも１種の検体成分に対し特異的であり、コード化されたマイクロキャリアに固定されている複数の捕捉抗体と接触させて、複数の捕捉された検体成分を生成することと、
（ｂ）前記複数の捕捉された検体成分を、前記対応する検体成分に特異的である少なくとも２種の検出抗体と接触させて、検出可能な、捕捉された複数の検体成分を生成すること（ここで、少なくとも１種の検出抗体は、シグナル増幅対の第１のメンバーを有する）と、
（ｃ）前記検出可能な、捕捉された複数の検体成分を、前記シグナル増幅対の第２のメンバーと接触させて、増幅されたシグナルを生成することと、
（ｄ）前記シグナル増幅対の前記第１及び第２のメンバーから生成された、前記増幅されたシグナルを検出することと
を含む、方法。
【請求項２】
前記コード化されたマイクロキャリアが、ラテックス、ポリスチレン、架橋されたデキストラン、ポリメチルスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、セルロース、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、フッ化エチレン−プロピレン、ガラス、ＳｉＯ２、シリコン、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）、金、銀、アルミニウム、スチール、及びＳＵ−８からなる群から選択される材料により作製される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記コード化されたマイクロキャリアがシリコン製である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記コード化されたマイクロキャリアが、前記コードの読み取りにより判定される機能を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記コード化されたマイクロキャリアが、球状、ウエハー状、正方形、ディスク形、矩形、円形、三角形、及び六角形からなる群から選択される形状に成形される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記コード化されたマイクロキャリアが、ウエハー状に成形される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記コード化されたマイクロキャリアが、複数のマイクロキャリアを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記複数のマイクロキャリアが少なくとも２群を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも２群のコード化されたマイクロキャリアのそれぞれが、異なる機能を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記特異的な機能が前記コードにより識別可能である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記コードが、前記マイクロキャリアを横切る孔を構成する形態である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記特異的な機能が、複数の捕捉抗体の特定である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルが、全血、血清、血漿、尿、痰、気管支洗浄液、涙、乳頭吸引液、リンパ液、唾液、微細針吸引液（ＦＮＡ）、脳脊髄液、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１種の検体成分が、少なくとも１種のシグナル伝達分子、病理学的分子、又は自己抗体を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出抗体が、
（ｉ）促進部分により標識されており、活性化状態に依存しない複数の抗体と、
（ｉｉ）シグナル増幅対の第１のメンバーにより標識されており、活性化状態に依存する複数の抗体と、を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記促進部分が、前記シグナル増幅対の前記第１のメンバーにチャネリングし、かつ反応する酸化剤を生成する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記促進部分がグルコースオキシダーゼである、請求項１５又は１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記酸化剤が過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記シグナル増幅対の前記第１のメンバーがペルオキシダーゼである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記シグナル増幅対の前記第２のメンバーがチラミド製剤である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記チラミド剤がビオチン−チラミドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記増幅されたシグナルが、ビオチン−チラミドがペルオキシダーゼにより酸化されることにより生成され、活性化チラミドが生成される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記活性化チラミドが直接検出される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記活性化チラミドが、シグナル検出剤の添加により検出される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記シグナル検出剤がストレプトアビジン標識されたフルオロフォアである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記シグナル検出剤が、ストレプトアビジン標識されたペルオキシダーゼと発色剤とを組み合わせたものである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記発色剤が３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法が、ヒト疾患の診断試験として使用される、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記疾患が、代謝疾患、脳及び認知疾患、胃腸疾患、又は癌である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記癌が、乳癌、結腸直腸癌、消化管間質腫瘍、消化管カルチノイド、結腸癌、直腸癌、肛門癌、胆管癌、小腸癌、前立腺癌、及び胃癌からなる群から選択されるものである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記代謝疾患が糖尿病である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記脳及び認知疾患がアルツハイマー病である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１種のシグナル伝達分子が、ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）、ＡＭＰＫキナーゼ（ＡＭＰＫＫ）、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼ（ＣＡＭＫＫ）、ＬＫＢ１、トランスフォーミング増殖因子−β−活性化キナーゼ１（ＴＡＫ１）、ＡＫＴ、アディポネクチン、レプチン、グルコース、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜３０及び３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１種の自己抗体が、ＧＡＤ６５自己抗体、インスリノーマ抗原２（ＩＡ−２）自己抗体、インスリン自己抗体（ＩＡＡ）、亜鉛トランスポータータンパク質８（ＺｎＴ８）自己抗体、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜３０及び３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも１種の病理学的分子が、タウ、アミロイドベータ（Ａβ）ペプチド、可溶性アミロイド前駆体タンパク質β（ｓＡＰＰβ）、ＶＩＬＩＰ−１、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜３０及び３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１種のシグナル伝達分子が受容体チロシンキナーゼである、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記受容体チロシンキナーゼが、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＦＬＴ−３、ＦＬＫ−２、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ＫＩＴ、ＩＮＳＲ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＩＧＦ−ＩＩＲ、ＩＲＲ、ＣＳＦ−１Ｒ、ｃＭＥＴ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも１種の受容体チロシンキナーゼが、非受容体型チロシンキナーゼを更に含む、請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記サンプルが、コード化されたマイクロキャリアを含むマイクロチャネル中を流通する、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記マイクロチャネルの少なくとも一面が透明である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記増幅されたシグナルが、前記コード化されたマイクロキャリアの前記アイデンティティに関連付けられる、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記増幅されたシグナルが、反応速度結合パラメーターに関連付けられる、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記増幅されたシグナルを検出することが、光学手段と連結させた光学センサーアレイを利用して実施され、前記センサーは、ＣＣＤ又はＣ−ＭＯＳ光センサーである、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記方法が、インビトロ法として実施される、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
ポイント・オブ・ケア診断システムであって、
（ａ）反応チャンバを含むアッセイ装置であって、前記反応チャンバはマイクロチャネルを含むアッセイ装置と、
（ｂ）ｉ）機能を有する個別にコード化されたマイクロキャリアの第１群と
ｉｉ）少なくとも２種の検出抗体と
を含むキットと
を含み、
前記個別にコード化されたマイクロキャリアの第１群は、それらのマイクロキャリアに結合した第１の複数の捕捉抗体を有し、
前記少なくとも２種の検出抗体は、
ａ）促進部分により標識されており、活性化状態に依存しない複数の抗体と、
ｂ）シグナル増幅対の第１のメンバーにより標識されており、活性化状態に依存する複数の抗体と
を含む、
ポイント・オブ・ケア診断システム。
【請求項４７】
前記装置が、前記マイクロチャネルの長手方向における前記マイクロキャリアの移動を制限しつつ、なおも前記マイクロチャネル内に流体を流通させる手段を含む、請求項４６に記載のポイント・オブ・ケア診断システム。
【請求項４８】
前記キットが、個別にコード化されたマイクロキャリアの第２群を更に含み、前記個別にコード化されたマイクロキャリアの第２群が、第２の複数の捕捉抗体を有する、請求項４６〜４７のいずれか一項に記載のポイント・オブ・ケア診断システム。
【請求項４９】
前記個別にコード化されたマイクロキャリアの第１群が前記機能を有し、前記個別にコード化されたマイクロキャリアの第２群が異なる機能を有する、請求項４６〜４７のいずれか一項に記載のポイント・オブ・ケア診断システム。
【請求項５０】
前記機能が前記コードにより特定可能である、請求項４９に記載のポイント・オブ・ケア診断システム。
【請求項５１】
前記機能が、前記複数の捕捉抗体の特定である、請求項４９に記載のポイント・オブ・ケア診断システム。
【請求項５２】
前記コードが、前記マイクロキャリアを横切る孔を構成する形態である、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載のポイント・オブ・ケア診断システム。
【請求項５３】
前記コード化されたマイクロキャリアが、ラテックス、ポリスチレン、架橋されたデキストラン、ポリメチルスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、セルロース、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、フッ化エチレン−プロピレン、ガラス、ＳｉＯ２、シリコン、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）、金、銀、アルミニウム、スチール、及びＳＵ−８からなる群から選択される材料により作製される、請求項４６〜５２のいずれか一項に記載のポイント・オブ・ケア診断システム。
【請求項５４】
前記コード化されたマイクロキャリアがシリコン製である、請求項５３に記載のポイント・オブ・ケア診断システム。
【請求項５５】
前記コード化されたマイクロキャリアの前記機能が、前記コードを読み取ることにより判定される、請求項４６〜５４のいずれか一項に記載のポイント・オブ・ケア診断システム。
【請求項５６】
前記コード化されたマイクロキャリアが、球状、ウエハー状、正方形、ディスク形、矩形、円形、三角形、及び六角形からなる群から選択される形状に成形される、請求項４６〜５５のいずれか一項に記載のポイント・オブ・ケア診断システム。
【請求項５７】
前記コード化されたマイクロキャリアが、ウエハー状に成形される、請求項４６〜５６のいずれか一項に記載のポイント・オブ・ケア診断システム。
【請求項５８】
疾患を有する患者、患者の治療応答性の有無、又は患者に投与するのに適切な薬剤投与量を特定する診断目的で、多重化された、マイクロ流体協調的酵素増強反応（ＣＥＥＲ）免疫アッセイを実施して、検体成分を特定するためのインビトロ用途。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
[0001]患者の大規模コホートを対象とした従来の疫学研究では、所定の集団に属する各個体の遺伝的多様性は考慮に入れていない。その結果、ある薬剤又は治療は、一部の個体には非常に有効なものになる一方、その他の個体には大して有効ではなくなる。個別化医療は、所定の薬剤を、正しい個体に正しい投与量で確実に投与することを目的としている。
【０００２】
[0002]様々なバイオマーカー、例えば、遺伝子、ＳＮＰ、酵素活性、タンパク質発現及び活性に加え、それらが代謝経路に与える影響などを利用して、治療を最適化するストラテジーを開発することができる。関連するバイオマーカーを特定すると、薬効及び副作用のリスクを把握するのに有用な診断アッセイを開発することができる。患者の応答を最適化し、かつ患者のリスクを最小限に抑えるには、適切な投与量又は投与スケジュールを選択することが非常に重要であり得る。
【０００３】
[0003]個別化医療のための診断アッセイ及びキットの開発においては、適切なバイオマーカーを特定することが最初の重要な工程である。バイオマーカーが特定されたならば、診断試験を利用してその有無を検証し、次に定量又は測定することができる。ある種の例では、ポイント・オブ・ケア・アプローチが用いられる。このアプローチでは、医療検査及び／又は治療を行うことができる、患者を治療する場所又は患者を治療する場所付近でアッセイが実施される。例えば、ポイント・オブ・ケア（ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｅ）のための場所としては、病院、患者の自宅、診療所、又は救急車の中若しくは救急対応が求められる場所などが挙げられるがこれらに限定されない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
[0004]医学的状態を迅速に診断すること、適切な治療を選択すること、又はポイント・オブ・ケアでの投与量を最適化することに伴う効果は数多くの利点を有する。薬剤、投与量及び治療計画を個別化することは、すなわち、患者が現代医療の恩恵を受ける最良の機会を得ることを意味する。当該技術分野では、ポイント・オブ・ケア装置を使用して、患者の臨床的な効果のために、バイオマーカーを特定及び測定するための、新しい方法が必要とされている。本発明は、この必要性及びその他の必要性を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
[0005]一実施形態では、本発明は、サンプルに対し、マイクロ流体協調的酵素増強反応（collaborative enzyme enhanced reactive）（ＣＥＥＲ）免疫アッセイなどといった多重化された免疫アッセイを実施するための、インビトロ法などの方法を提供する。本方法は、
（ａ）細胞可溶化物を、少なくとも１種の検体成分に対し特異的であり、コード化されたマイクロキャリアに固定されている複数の捕捉抗体と接触させて、複数の捕捉された検体成分を生成することと、
（ｂ）複数の捕捉された検体成分を、対応する検体成分に特異的である少なくとも２種の検出抗体と接触させて、検出可能な、捕捉された複数の検体成分を生成すること（ここで、少なくとも１種の検出抗体は、シグナル増幅対の第１のメンバーを有する）と、
（ｃ）検出可能な、捕捉された複数の検体成分を、シグナル増幅対の第２のメンバーと接触させて、増幅されたシグナルを生成することと、
（ｄ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された、増幅されたシグナルを検出することと、を含む。
【０００６】
[0006]いくつかの実施形態では、コード化されたマイクロキャリアは、ラテックス、ポリスチレン、架橋されたデキストラン、ポリメチルスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、セルロース、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、フッ化エチレン−プロピレン、ガラス、ＳｉＯ２、シリコン、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）、金、銀、アルミニウム、スチール、及びＳＵ−８からなる群から選択される材料から作製される。一実施形態では、コード化されたマイクロキャリアは、シリコン製である。
【０００７】
[0007]いくつかの実施形態では、コード化されたマイクロキャリアは、球状、ウエハー状、正方形、ディスク形、矩形、円形、三角形、及び六角形からなる群から選択される形状に成形される。一実施形態では、コード化されたマイクロキャリアはウエハー状に成形される。
【０００８】
[0008]いくつかの実施形態では、コード化されたマイクロキャリアは、複数のマイクロキャリアを含む。
【０００９】
[0009]いくつかの実施形態では、複数のマイクロキャリアは、少なくとも２群を有する。いくつかの例では、少なくとも２群のコード化されたマイクロキャリアのそれぞれは、異なる機能を有する。一例では、特異的な機能はコードにより識別可能である。
【００１０】
[0010]いくつかの実施形態では、コード化されたマイクロキャリアは、コードの読み取りにより判定される機能を有する。いくつかの例では、コードは、マイクロキャリアを横切る孔を構成する形態である。別の例では、特異的な機能は、複数の捕捉抗体の特定である。
【００１１】
[0011]いくつかの実施形態では、サンプルは、全血、血清、血漿、尿、痰、気管支洗浄液、涙、乳頭吸引液、リンパ液、唾液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、微細針吸引液（ＦＮＡ）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１２】
[0012]別の実施形態では、検出抗体は：
（ｉ）促進部分により標識されており、活性化状態に依存しない複数の抗体と、
（ｉｉ）シグナル増幅対の第１のメンバーにより標識されており、活性化状態に依存する複数の抗体と、を含む。
【００１３】
[0013]いくつかの態様では、促進部分は、シグナル増幅対の第１のメンバーにチャネリングし、かつ反応する酸化剤を生成する。ある種の例では、促進部分はグルコースオキシダーゼである。ある種の態様では、酸化剤は過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）である。いくつかの態様では、シグナル増幅対の第１のメンバーはペルオキシダーゼである。ある種の例では、ペルオキシダーゼは西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。
【００１４】
[0014]いくつかの態様では、シグナル増幅対の第２のメンバーはチラミド製剤である。ある種の例では、チラミド剤はビオチン−チラミドである。
【００１５】
[0015]いくつかの実施形態では、増幅されたシグナルは、ビオチン−チラミドがペルオキシダーゼにより酸化されることにより生成され、活性化チラミドが生成される。いくつかの態様では、活性化チラミドが直接検出される。他の態様では、活性化チラミドは、シグナル検出剤の添加により検出される。いくつかの例では、シグナル検出剤は、ストレプトアビジン標識されたフルオロフォアである。他の例では、シグナル検出剤は、ストレプトアビジン標識されたペルオキシダーゼと、発色剤とを組み合わせたものである。いくつかの実施形態では、発色剤は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である。
【００１６】
[0016]いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、ヒト疾患の診断試験として使用される。いくつかの態様では、疾患は、代謝疾患、脳及び認知障害、脳障害、認知障害、胃腸疾患、又は癌である。
【００１７】
[0017]いくつかの態様では、代謝疾患は、前糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、その他の形態の糖尿病、及び糖尿病に関係する疾患、を含む、糖尿病である。
【００１８】
[0018]いくつかの態様では、脳及び認知障害は、アルツハイマー病である。
【００１９】
[0019]いくつかの例では、癌は、乳癌、結腸直腸癌、消化管間質腫瘍、消化管カルチノイド、結腸癌、直腸癌、肛門癌、胆管癌、小腸癌、前立腺癌、及び胃癌からなる群から選択されるものである。
【００２０】
[0020]いくつかの実施形態では、少なくとも１種の検体成分は、少なくとも１種のシグナル伝達分子、病的なタンパク質凝集体、又は自己抗体を含む。
【００２１】
[0021]いくつかの例では、少なくとも１種のシグナル伝達分子は、ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）、ＡＭＰＫキナーゼ（ＡＭＰＫＫ）、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼ（ＣＡＭＫＫ）、ＬＫＢ１、トランスフォーミング増殖因子−β−活性化キナーゼ１（ＴＡＫ１）、ＡＫＴ、アディポネクチン、レプチン、グルコース、その他のＡＭＰＫモジュレーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２２】
[0022]他の例では、少なくとも１種の病的なタンパク質凝集体は、タウ、活性化（リン酸化）タウ、アミロイドベータ（Ａβ）ペプチド、可溶性アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰβ）、これらの断片、これらの複合体、及びこれらのオリゴマーからなる群から選択される。
【００２３】
[0023]他の例では、少なくとも１種の自己抗体は、ＧＡＤ６５自己抗体、インスリノーマ抗原２（ＩＡ−２）自己抗体、インスリン自己抗体（ＩＡＡ）、亜鉛トランスポータータンパク質８（ＺｎＴ８）自己抗体、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２４】
[0024]更に他の例では、少なくとも１種のシグナル伝達分子は、受容体チロシンキナーゼである。ある種の実施形態では、受容体チロシンキナーゼは、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＦＬＴ−３、ＦＬＫ−２、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ＫＩＴ、ＩＮＳＲ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＩＧＦ−ＩＩＲ、ＩＲＲ、ＣＳＦ−１Ｒ、ｃＭＥＴ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーである。その他の実施形態では、少なくとも１種の受容体チロシンキナーゼは、非受容体型チロシンキナーゼを更に含む。
【００２５】
[0025]いくつかの実施形態では、サンプルは、コード化されたマイクロキャリアを含むマイクロチャネル中を流通する。いくつかの態様では、マイクロチャネルは、少なくとも一面が透明である。
【００２６】
[0026]いくつかの実施形態では、増幅されたシグナルは、コード化されたマイクロキャリアのアイデンティティに関連付けられる。いくつかの例では、増幅されたシグナルは、反応速度結合パラメーターに関連付けられる。これらのパラメーターとしては、例えば、会合速度、ｋｏｎ；解離速度、ｋｏｆｆ；又は親和定数、Ｋａなどの、詳細な結合反応速度パラメーターが挙げられる。
【００２７】
[0027]本明細書に記載の方法は、好ましくはインビトロ法である。一実施形態では、本発明は、サンプルに対し、マイクロ流体協調的酵素増強反応（ＣＥＥＲ）による免疫アッセイなどの多重化された免疫アッセイを実施するための、インビトロ法を提供し、本方法は、
（ａ）細胞可溶化物を、少なくとも１種の検体成分に対し特異的であり、コード化されたマイクロキャリアに固定されている複数の捕捉抗体と接触させて、複数の捕捉された検体成分を生成することと、
（ｂ）複数の捕捉された検体成分を、対応する検体成分に特異的である少なくとも２種の検出抗体と接触させて、検出可能な、捕捉された複数の検体成分を生成すること（ここで、少なくとも１種の検出抗体は、シグナル増幅対の第１のメンバーを有する）と、
（ｃ）検出可能な、捕捉された複数の検体成分を、シグナル増幅対の第２のメンバーと接触させて、増幅されたシグナルを生成することと、
（ｄ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された、増幅されたシグナルを検出することと、を含む。
【００２８】
[0028]本方法のいくつかの実施形態では、増幅されたシグナルを検出することは、光学的手段と連結された光学センサーアレイを使用して実施され、センサーは、ＣＣＤ又はＣ−ＭＯＳ光センサーである。
【００２９】
[0029]別の実施形態では、本発明は、ポイント・オブ・ケア診断システムを提供する。本システムは：
（ａ）反応チャンバを含むアッセイ装置であって、前記反応チャンバはマイクロチャネルを含むアッセイ装置と、
（ｂ）ｉ）機能を有する個別にコード化されたマイクロキャリアの第１群とｉｉ）少なくとも２種の検出抗体とを含むキットとを含み、
この個別にコード化されたマイクロキャリアの第１群は、それらのマイクロキャリアに結合した第１の複数の捕捉抗体を有し、かつ
この少なくとも２種の検出抗体は、
ａ）促進部分により標識されており、活性化状態に依存しない複数の抗体と、
ｂ）シグナル増幅対の第１のメンバーにより標識されており、活性化状態に依存する複数の抗体とを含む。
【００３０】
[0030]本システムのいくつかの実施形態では、装置は、マイクロチャネルの長手方向におけるマイクロキャリアの移動を制限しつつ、なおも流体を流通させる手段を含む。その他の実施形態では、本キットは、個別にコード化されたマイクロキャリアの第２群を更に含み、個別にコード化されたマイクロキャリアの第２群は、第２の複数の捕捉抗体を有する。別の実施形態では、個別にコード化されたマイクロキャリアの第１群は機能を有し、個別にコード化されたマイクロキャリアの第２群は異なる機能を有する。
【００３１】
[0031]いくつかの態様では、機能は、複数の捕捉抗体の特定である。他の態様では、機能はコードにより特定可能である。いくつかの実施形態では、コードは、マイクロキャリアを横切る孔を構成する形態である。
【００３２】
[0032]いくつかの実施形態では、コード化されたマイクロキャリアは、ラテックス、ポリスチレン、架橋されたデキストラン、ポリメチルスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、セルロース、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、フッ化エチレン−プロピレン、ガラス、ＳｉＯ２、シリコン、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）、金、銀、アルミニウム、スチール、及びＳＵ−８からなる群から選択される材料から作製される。一実施形態では、コード化されたマイクロキャリアは、シリコン製である。
【００３３】
[0033]いくつかの実施形態では、コード化されたマイクロキャリアの機能は、コードの読み取りにより判定される。
【００３４】
[0034]いくつかの実施形態では、コード化されたマイクロキャリアは、球状、ウエハー状、正方形、ディスク形、矩形、円形、三角形、及び六角形からなる群から選択される形状に成形される。一実施形態では、コード化されたマイクロキャリアはウエハー状に成形される。
【００３５】
[0035]本発明のこれらの及びその他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明及び図面を参照することにより当業者にはより明白となろう。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】図１は本発明の代表的な実施形態から得られる結果を示す。図１Ａは、ビオチン−チラミド（ＢＴ−Ｔｙｒ）を高濃度（１：５００）で使用したときの、ＢＴ４７４細胞可溶化物の希釈系列の蛍光を示す。図１Ｂは、ＢＴ−Ｔｙｒを低濃度（１：１０００）で使用したときの、ＢＴ４７４細胞可溶化物の希釈系列の蛍光を示す。
【図１Ｂ】図１は本発明の代表的な実施形態から得られる結果を示す。図１Ａは、ビオチン−チラミド（ＢＴ−Ｔｙｒ）を高濃度（１：５００）で使用したときの、ＢＴ４７４細胞可溶化物の希釈系列の蛍光を示す。図１Ｂは、ＢＴ−Ｔｙｒを低濃度（１：１０００）で使用したときの、ＢＴ４７４細胞可溶化物の希釈系列の蛍光を示す。
【図２Ａ】図２は図１Ｂに示す結果の顕微鏡画像を示す。図２Ａは、低濃度（１：１０００）のビオチン−チラミドをサンプルの７５個の細胞とともにインキュベートしたマイクロキャリアの画像を示す。図２Ｂは、低濃度（１：１０００）のビオチン−チラミドをサンプルの７．５個の細胞とともにインキュベートしたマイクロキャリアの画像を示す。
【図２Ｂ】図２は図１Ｂに示す結果の顕微鏡画像を示す。図２Ａは、低濃度（１：１０００）のビオチン−チラミドをサンプルの７５個の細胞とともにインキュベートしたマイクロキャリアの画像を示す。図２Ｂは、低濃度（１：１０００）のビオチン−チラミドをサンプルの７．５個の細胞とともにインキュベートしたマイクロキャリアの画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
Ｉ．序論
[0038]本発明は、タンパク質バイオマーカーなどの検体成分を迅速に特定及び定量するための方法、装置、使用法、及びキットを提供する。本発明の多重化免疫アッセイでは、コード化されたマイクロキャリアに、例えば、細胞可溶化物由来のバイオマーカーを保持させるため、複数の捕捉抗体を結合させる。コード化されたマイクロキャリアは、特定の捕捉抗体を特定するために、ひいては、バイオマーカー、すなわち、捕捉した検体成分を特定するために使用することができる。ある種の例では、本発明は、疾患に罹患している患者を特定する、あるいは患者が治療に応答するかを特定する、あるいは患者に投与するのに適切な薬剤投与量を特定するなどの、診断目的で検体成分（例えば、バイオマーカー）を特定するために、多重化免疫アッセイのインビトロ利用を提供する。これらの目的は、特定される検体成分の発現又は活性レベルを測定することにより達成できる。
【００３８】
[0039]本発明の利用により、代謝疾患、脳及び認知疾患、胃腸疾患、又は癌などの医学的状態の迅速かつ正確な診断、適切な治療法の特定、並びに治療量の最適化が可能になり、患者及び医療従事は著しい利益を得る。
【００３９】
[0040]有利な点として、本発明の方法、装置、使用法、及びキットは、リアルタイム又はほとんどリアルタイムで診断検査を実施でき、そのため、実施できる試験は、本発明のシステムを利用していない同様の試験よりも効率的に実施され、ポイント・オブ・ケアで提供可能な診断検査を促進する。ポイント・オブ・ケア診断検査は、診療所又は病院又はどこであろうと医療ケアが提供される場所などの、患者を治療する場所又は患者を治療する場所付近での検査である。アッセイ結果を得るまでの所用時間が短いことにより、リアルタイムのエビデンスベースの判断、患者の緊急治療、不必要な検査を最小限に抑える、副作用を最小限に抑える、及び著しい費用効果などの数多くの利点が提供される。
【００４０】
[0041]ある種の例では、本発明の方法及び装置により、中央検査室の外部、患者のすぐ近くでの臨床検査が実施可能になる。ある種の態様では、方法は、サンプル、すなわち、全血、血漿、血清、微細針吸引液（ＦＮＡ）、又は脳脊髄液（ＣＳＦ）と、レディ・トゥ・ユーズ（ready-to-use）試薬と、使い捨てアッセイカートリッジとを使用する。ある種の態様では、本発明の装置は、携帯式であり、かつ各個体のサンプル含量及び量を利用する。
【００４１】
ＩＩ．定義
[0042]本明細書で使用するとき、以下の用語は、別途記載のない限りそれらの用語による意味を有する。
【００４２】
[0043]用語「検体成分」は、対象とする任意の分子を包含し、典型的には、有無、量、及び／又はアイデンティティが特定される、ポリペプチドなどの高分子を包含する。ある種の例では、検体成分は、固体腫瘍の循環細胞又は脳脊髄液、末梢血、若しくは血清の細胞成分である。好ましくは、検体成分又はバイオマーカーは、シグナル伝達分子、病理学的分子、又は自己抗体である。
【００４３】
[0044]用語「シグナル伝達分子」又は「シグナル伝達因子」は、細胞が、細胞外又は細胞内シグナルを変換する、すなわち典型的には、細胞内部の一連の生化学的反応に関与する応答を誘導することによりプロセスを実施するタンパク質及びその他の分子を包含する。シグナル伝達分子の例としては、それぞれ、受容体チロシンキナーゼ、例えば、ＥＧＦＲ（例えば、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ−１／ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ−３／ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ−４／ＥｒｂＢ４）、ＶＥＧＦＲ−１／ＦＬＴ−１、ＶＥＧＦＲ−２／ＦＬＫ−１／ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ−３／ＦＬＴ−４、ＦＬＴ−３／ＦＬＫ−２、ＰＤＧＦＲ（例えば、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ）、ｃ−ＫＩＴ／ＳＣＦＲ、ＩＮＳＲ（インスリン受容体）、ＩＧＦ−ＩＲ、ＩＧＦ−ＩＩＲ、ＩＲＲ（インスリン受容体関連受容体）、ＣＳＦ−１Ｒ、ＦＧＦＲ  １−４、ＨＧＦＲ  １−２、ＣＣＫ４、ＴＲＫ  Ａ−Ｃ、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＥＰＨＡ  １−８、ＥＰＨＢ  １−６、ＡＸＬ、ＭＥＲ、ＴＹＲＯ３、ＴＩＥ  １−２、ＴＥＫ、ＲＹＫ、ＤＤＲ  １−２、ＲＥＴ、ｃ−ＲＯＳ、Ｖ−カドヘリン、ＬＴＫ（白血球チロシンキナーゼ）、ＡＬＫ（未分化のリンパ腫キナーゼ）、ＲＯＲ  １−２、ＭＵＳＫ、ＡＡＴＹＫ  １−３、ＲＴＫ  １０６、及び切断された受容体チロシンキナーゼ、例えば、ｐ９５ＥｒｂＢ２；非受容体型チロシンキナーゼ、例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｓｒｃ、Ｆｒｋ、Ｂｔｋ、Ｃｓｋ、Ａｂｌ、Ｚａｐ７０、Ｆｅｓ／Ｆｐｓ、Ｆａｋ、Ｊａｋ、Ａｃｋ、及びＬＩＭＫ；チロシンキナーゼシグナル伝達カスケード構成要素、例えば、ＡＫＴ、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ、ＭＥＫ、ＲＡＦ、ＰＬＡ２、ＭＥＫＫ、ＪＮＫＫ、ＪＮＫ、ｐ３８、Ｓｈｃ（ｐ６６）、ＰＩ３Ｋ、Ｒａｓ（例えば、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ）、Ｒｈｏ、Ｒａｃ１、Ｃｄｃ４２、ＰＬＣ、ＰＫＣ、ｐ７０  Ｓ６キナーゼ、ｐ５３、ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＰＩＰ２、ＰＩＰ３、ＰＤＫ、ｍＴＯＲ、ＢＡＤ、ｐ２１、ｐ２７、ＲＯＣＫ、ＩＰ３、ＴＳＰ−１、ＮＯＳ、ＰＴＥＮ、ＲＳＫ  １−３、ＪＮＫ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｒｂ、ＣＲＥＢ、Ｋｉ６７、及びパキシリン；核内ホルモン受容体、例えば、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、アンドロゲン受容体、グルココルチコイド受容体、ミネラルコルチコイド受容体、ビタミンＡ受容体、ビタミンＤ受容体、レチノイド受容体、甲状腺ホルモン受容体、及びオーファン受容体；核内受容体コアクチベーター及びリプレッサー、例えば、ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ−１（ＡＩＢ１）及び核内受容体コリプレッサー１（ＮＣＯＲ）、及びこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。シグナル伝達分子の更なる例としては、ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）、ＡＭＰＫキナーゼ（ＡＭＰＫＫ）、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼ（ＣＡＭＫＫ）、ＬＫＢ１、トランスフォーミング増殖因子−β−活性化キナーゼ１（ＴＡＫ１）、ＡＫＴ、アディポネクチン、レプチン、グルコース、グリコーゲン、ＡＭＰ、及びＡＴＰが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４４】
[0045]用語「病理学的分子」は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、認知症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症、及び同様の疾患を含む神経変性疾患などの疾患又は障害の病理に関係するタンパク質及びその他の分子を包含する。
【００４５】
[0046]用語「捕捉抗体」は、細胞抽出物などのサンプル中の対象とする１種以上の検体成分に特異的な（すなわち、結合する、結合される、又は一緒に複合体を形成する）固定化抗体を包含することを意図する。好ましい実施形態では、捕捉抗体は、アレイ装置において、マイクロキャリア（例えば、固体支持体）上に固定される。固体支持体上に何らかの様々なシグナル伝達分子を固定するのに好適な捕捉抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｄａｎｖｅｒｓ，Ｍａｓｓ．）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．）、Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、及びＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能である。
【００４６】
[0047]本明細書で使用するとき、用語「検出抗体」は、サンプル中の対象とする１種以上の検体成分に特異的な（すなわち、結合する、結合される、又は一緒に複合体を形成する）検出可能な標識を含む抗体を包含する。この用語は、対象とする１種以上の検体成分に特異的な抗体も包含し、この抗体は、検出可能な標識を含む別種の抗体により結合され得る。検出可能な標識の例としては、ビオチン／ストレプトアビジン標識、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）標識、化学反応性標識、蛍光標識、酵素標識、放射性標識、及びこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。様々なシグナル伝達分子のうちのいずれかの活性化状態及び／又は総量を検出するのに好適な検出抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｄａｎｖｅｒｓ，Ｍａｓｓ．）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．）、Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、ａｎｄ  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能である。
【００４７】
[0048]用語「活性化状態に依存する抗体」は、サンプル中の対象とする１種以上の検体成分の特定の活性化状態に特異的な（すなわち、結合する、結合される、又は一緒に複合体を形成する）検出抗体を包含する。好ましい実施形態では、活性化状態に依存する抗体は、１種以上のシグナル伝達分子などの１種以上の検体成分のリン酸化、ユビキチン化、及び／又は複合体状態を検出する。いくつかの実施形態では、活性化状態に依存する抗体を使用して、受容体チロシンキナーゼのＥＧＦＲファミリーのメンバーのリン酸化、及び／又はＥＧＦＲファミリーメンバー同士のヘテロ二量体形成の検出を行う。活性化状態に依存する抗体による検出に好適な活性化状態（括弧内に掲載）の非限定例としては、ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ、リン酸化（ｐ−）ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ：Ｓｈｃ、ユビキチン化（ｕ−）ＥＧＦＲ、ｐ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ＥｒｂＢ２（ｐ９５：ｔｒｕｎｃａｔｅｄ（Ｔｒ）−ＥｒｂＢ２、ｐ−ＥｒｂＢ２、ｐ９５：Ｔｒ−ｐ−ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ−２：Ｓｈｃ、ＥｒｂＢ２：ＰＩ３Ｋ、ＥｒｂＢ２：ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ４）；ＥｒｂＢ３（ｐ−ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ３：ＰＩ３Ｋ、ｐ−ＥｒｂＢ３：ＰＩ３Ｋ、ＥｒｂＢ３：Ｓｈｃ）；ＥｒｂＢ４（ｐ−ＥｒｂＢ４、ＥｒｂＢ４：Ｓｈｃ）；ＥＲ（ｐ−ＥＲ（Ｓ１１８、Ｓ１６７）；ＩＧＦ−１Ｒ（ｐ−ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦ−１Ｒ：ＩＲＳ、ＩＲＳ：ＰＩ３Ｋ、ｐ−ＩＲＳ、ＩＧＦ−１Ｒ：ＰＩ３Ｋ）；ＩＮＳＲ（ｐ−ＩＮＳＲ）；ＫＩＴ（ｐ−ＫＩＴ）；ＦＬＴ３（ｐ−ＦＬＴ３）；ＨＧＦＲＩ（ｐ−ＨＧＦＲＩ）；ＨＧＦＲ２（ｐ−ＨＧＦＲ２）；ＲＥＴ（ｐ−ＲＥＴ）；ＰＤＧＦＲａ（ｐ−ＰＤＧＦＲａ）；ＰＤＧＦＲＰ（ｐ−ＰＤＧＦＲＰ）；ＶＥＧＦＲＩ（ｐ−ＶＥＧＦＲＩ、ＶＥＧＦＲＩ：ＰＬＣｇ、ＶＥＧＦＲ１：Ｓｒｃ）；ＶＥＧＦＲ２（ｐ−ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ２：ＰＬＣｙ、ＶＥＧＦＲ２：Ｓｒｃ、ＶＥＧＦＲ２：ヘパリン硫酸、ＶＥＧＦＲ２：ＶＥ−カドヘリン）；ＶＥＧＦＲ３（ｐ−ＶＥＧＦＲ３）；ＦＧＦＲ１（ｐ−ＦＧＦＲ１）；ＦＧＦＲ２（ｐ−ＦＧＦＲ２）；ＦＧＦＲ３（ｐ−ＦＧＦＲ３）；ＦＧＦＲ４（ｐ−ＦＧＦＲ４）；Ｔｉｅ１（ｐ−Ｔｉｅ１）；Ｔｉｅ２（ｐ−Ｔｉｅ２）；ＥｐｈＡ（ｐ−ＥｐｈＡ）；ＥｐｈＢ（ｐ−ＥｐｈＢ）；ＮＦＫＢ及び／又はＩＫＢ（ｐ−ＩＫ（Ｓ３２）、ｐ−ＮＦＫＢ（Ｓ５３６）、ｐ−Ｐ６５：ＩＫＢａ）；Ａｋｔ（ｐ−Ａｋｔ（Ｔ３０８、Ｓ４７３））；ＰＴＥＮ（ｐ−ＰＴＥＮ）；Ｂａｄ（ｐ−Ｂａｄ（Ｓ１１２、Ｓ１３６）、Ｂａｄ：１４−３−３）；ｍＴｏｒ（ｐ−ｍＴｏｒ（Ｓ２４４８））；ｐ７０Ｓ６Ｋ（ｐ−ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔ２２９、Ｔ３８９））；Ｍｅｋ（ｐ−Ｍｅｋ（Ｓ２１７、Ｓ２２１））；Ｅｒｋ（ｐ−Ｅｒｋ（Ｔ２０２、Ｙ２０４））；Ｒｓｋ−１（ｐ−Ｒｓｋ−１（Ｔ３５７、Ｓ３６３））；Ｊｎｋ（ｐ−Ｊｎｋ（Ｔ１８３、Ｙ１８５））；Ｐ３８（ｐ−Ｐ３８（Ｔ１８０、Ｙ１８２））；Ｓｔａｔ３（ｐ−Ｓｔａｔ−３（Ｙ７０５、Ｓ７２７））；Ｆａｋ（ｐ−Ｆａｋ（Ｙ５７６））；Ｒｂ（ｐ−Ｒｂ（Ｓ２４９、Ｔ２５２、Ｓ７８０））；Ｋｉ６７；ｐ５３（ｐ−ｐ５３（５３９２、Ｓ２０））；ＣＲＥＢ（ｐ−ＣＲＥＢ（Ｓ１３３））；ｃ−Ｊｕｎ（ｐ−ｃ−Ｊｕｎ（Ｓ６３））；ｃＳｒｃ（ｐ−ｃＳｒｃ（Ｙ４１６））；パキシリン（ｐ−パキシリン（Ｙ１１８））；ＡＭＰＫ（ｐ−ＡＭＰＫ（Ｔ１７２、Ｔ１８３）；及びタウ（ｐ−タウ（Ｙ１８、Ｙ２９、Ｓ４６、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｔ２０５、Ｔ２１２、Ｓ２１４、Ｔ２１７、Ｔ２３１、Ｓ２３５、Ｓ２６２、Ｓ３５６、Ｓ３９６、Ｓ４００、Ｓ４０４、Ｓ４１２、Ｓ４２２、Ｓ４７０、Ｓ４９２、Ｓ４９８、Ｓ５１５、Ｓ５１６、Ｓ５１９、Ｔ５３４、Ｔ５４８、Ｓ５５２、Ｓ６２２、Ｓ６４１、Ｓ７１３、Ｓ７２１、Ｓ７２６、Ｔ７３９など）が挙げられる。
【００４８】
[0049]用語「活性化状態に依存しない抗体」は、活性化状態を問わずサンプル中の対象とする１種以上の検体成分に特異的な（すなわち、結合する、結合される、又は一緒に複合体を形成する）検出抗体を包含する。例えば、活性化状態に依存しない抗体は、１種以上のシグナル伝達分子などの１種以上の検体成分のリン酸化及び非リン酸化形態の両方を検出することができる。
【００４９】
[0050]用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、一本鎖又は二本鎖形態のいずれかの、例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡなどのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそれらのポリマーを包含する。核酸は、合成品、天然に生じるもの、及び非天然に生じるものであり、かつ参照核酸配列と同様の結合特性を有する、既知のヌクレオチド類似体、又は修飾された骨格残基若しくは結合を含有する核酸を包含する。このような類似体の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロアミド酸、メチルホスホン酸、キラル−メチルホスホン酸、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、及びペプチド−核酸（ＰＮＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。別途記載のない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する天然のヌクレオチドの既知の類似体を含有している核酸を包含する。別途記載のない限り、特定の核酸配列には、それらの保存的に修飾された変異体、並びに相補的配列及び明確に示される配列も暗に包含される。
【００５０】
[0051]用語「オリゴヌクレオチド」は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリット、及び／又はそれらの模倣物の一本鎖オリゴマー又はポリマーを指す。ある種の例では、オリゴヌクレオチドは、天然に生じる（すなわち、未修飾の）核酸塩基、糖、及びヌクレオシド間（骨格）結合から構成される。他のある種の例では、オリゴヌクレオチドは、修飾された核酸塩基、糖、及び／又はヌクレオシド間結合を含む。
【００５１】
[0052]用語「インキュベートする」は、「接触させる」及び「曝露させる」と同意語であり、かつ別途記載のない限り何らかの具体的な時間又は温度を暗示するものではない。
【００５２】
[0053]本明細書で使用するとき、用語「希釈系列」は、濃度を漸減させた一連の特定のサンプル（例えば、細胞可溶化物）又は試薬（例えば、抗体）を包含することを意図する。希釈系列は、典型的には、初期濃度の一定量のサンプル又は試薬を希釈剤（例えば、希釈緩衝液）と混合して、低濃度のサンプル又は試薬を生成するプロセスを、所望数の段階希釈を得るのに十分な回数だけ繰り返すことにより生成される。サンプル又は試薬を少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、５００、又は１０００倍希釈することで、サンプル又は試薬の濃度が少なくとも１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、１／１０、１／１１、１／１２、１／１３、１／１４、１／１５、１／１６、１／１７、１／１８、１／１９、１／２０、１／２５、１／３０、１／３５、１／４０、１／４５、又は１／５０に低下している希釈系列を生成することができる。例えば、初期濃度１ｍｇ／ｍＬで捕捉抗体製剤の２倍段階希釈を含む希釈系列は、ある量の初期濃度の捕捉抗体を、同量の希釈緩衝液と混合して、濃度０．５ｍｇ／ｍＬの捕捉抗体を生成し、このプロセスを繰り返して０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．１２５ｍｇ／ｍＬ、０．０６２５ｍｇ／ｍＬ、０．０３２５ｍｇ／ｍＬなどの濃度の捕捉抗体を得ることにより生成できる。
【００５３】
[0054]本明細書で使用するとき、用語「優れたダイナミックレンジ」は、わずか１個の細胞又は数千個もの細胞において特異的な検体成分を検出するアッセイ性能を指す。例えば、本明細書に記載の免疫アッセイは、捕捉抗体の濃度希釈系列を使用して、１〜１０，０００個（例えば、約１、５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００、７５０、１０００、２５００、５０００、７５００、又は１０，０００個）の細胞において、対象とする特定のシグナル伝達分子を有利に検出することから、優れたダイナミックレンジを保有する。
【００５４】
[0055]本明細書で使用するとき、用語「マイクロキャリア」は、少なくとも１つの表面上が機能化されているマイクロ粒子又はマイクロスケールの固体支持体であり、このことから、サンプル中の検体成分を分析するのに使用でき、及び／又はこのような検体成分と反応させることができるものである。本明細書において、同時に用語「機能化されたマイクロキャリア」が使用される。「一組のマイクロキャリア」は、１種の特定の標的検体成分を捕捉及び／又は検出するのに使用される１種以上のマイクロキャリアを指す。この組は、１種のみのマイクロキャリアによるものであっても、又は１種以上のマイクロキャリアによるものであってもよい。１組のマイクロキャリアは、標的とする検体成分の２種以上の分子を捕捉する目的で、１種以上の捕捉分子（例えば、捕捉抗体又は捕捉リガンド）を担持してもよいが、これはなおも１つの機能として言及する。それぞれ区別することのできる異なる２組のマイクロキャリアは、表面に結合している捕捉分子が異なる。
【００５５】
[0056]本明細書で使用するとき、用語「コード」は、観察又は検出時に識別可能な、マイクロキャリアの何らかの特性又は特徴であり、マイクロキャリアの特定、又はマイクロキャリアの特定集団（例えば、所定の機能を有する一群のマイクロキャリア）への関連付けに使用される。マイクロキャリア上のコードは、位置とは無関係に測定でき、及びアッセイの結果とは無関係に測定でき、すなわち、検出される標的検体成分が存在する必要はない。典型的には、コードは、観察時の、マイクロキャリアの光学的又は磁気的応答により特徴づけられる。この応答は、マイクロキャリア全体について定義可能であり（例えば、マイクロキャリアの色）、又はマイクロキャリア中又はマイクロキャリア上において空間的に変化させることによって、パターン化されたレイアウト（例えば、マイクロキャリアの色の変化により得られるバーコード）を得てもよい。コードの例としては、色、形状、大きさ、刷り込み又は彫り込まれたパターン、孔の配置、ホログラフパターン、磁気符号、化学組成、光透過又は反射特性の変化、量子ドットの発光、特有の検出可能な外来分子（例えば、オリゴヌクレオチド又はその他のポリマー）、ＩＣチップの取り付けられた又は埋め込まれた表面が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５６】
[0057]用語「コード化マイクロキャリア」は、コードを有するマイクロキャリアを指す。マイクロキャリアはそれぞれコード化され、すなわち、各マイクロキャリアは、複数のマイクロキャリア（典型的には、１組のマイクロキャリア）が同値のコードを担持し得る（すなわち、マイクロキャリアが、このマイクロキャリアそのもののコードだけでは区別できない）場合にも、自身のコードを担持している。異なる組の、コード化されたマイクロキャリアは、マイクロキャリアのマイクロチャネルにおける位置とは独立に、及びアッセイの結果とは独立に識別及び／又は特定できる。
【００５７】
[0058]用語「反応チャンバ」は、標的検体成分及び捕捉分子（例えば、捕捉抗体又は捕捉リガンド）及び／又は検出抗体間に生じる反応を捕捉する及び／又は検出する空間を指す。
【００５８】
[0059]本明細書で使用するとき、用語「循環細胞」は、固形腫瘍から転移した又は微小転移した腫瘍外部の細胞（extratumoral cell）を含む。循環細胞の例としては、循環腫瘍細胞、癌幹細胞、及び／又は腫瘍内に移動する細胞（例えば、循環内皮前駆細胞、循環内皮細胞、血管新生する循環骨髄細胞、循環樹状細胞など）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５９】
[0060]本明細書で使用するとき、用語「サンプル」は、患者から得られる何らかの生体標本を包含する。サンプルとしては、全血、血漿、血清、赤血球細胞、白血球細胞（例えば、末梢血単核細胞）、脳脊髄液、乳管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ液（例えば、リンパ管の播種性腫瘍細胞）、骨髄穿刺液、唾液、尿、排泄物（すなわち、糞便）、痰、気管支洗浄液、涙、微細針吸引液（例えば、無作為な乳輪周囲の微細針吸引により採取）、何らかのその他の体液、腫瘍の細胞診（例えば、針生検）などの組織サンプル（例えば、腫瘍組織）、又はリンパ管（例えば、センチネルリンパ節生検）、及びこれらの細胞抽出物が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、サンプルは、全血、又は血漿、血清、又は細胞ペレットなどの分画成分である。その他の実施形態では、サンプルは、当該技術分野で既知の何らかの手法により、全血又はそれらの細胞画分由来の固形腫瘍循環細胞を単離することにより得られる。その他の実施形態では、サンプルは、例えば、胸部固形腫瘍由来のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプルである。
【００６０】
[0061]「生検」は、診断又は予後評価のために組織サンプルを切除するプロセス、及び組織標本そのものを指す。本発明の方法及び組成物には、当該技術分野で既知の任意の生検法を利用することができる。利用する生検法は、概して、数ある因子の中でも、評価する組織、並びに腫瘍の大きさ及び種類（すなわち、固体又は懸濁（すなわち、血液又は腹水））に応じ変更されるであろう。代表的な生検法としては、切除生検、切開生検、針生検（例えば、針生検、微細針吸引生検など）、外科生検、及び骨髄生検が挙げられる。生検法は、例えば、ハリソン内科学、Ｋａｓｐｅｒら編、第１６版、２０００５年、第７０章、パートＶまでに議論されている。当業者であれば、所定の組織サンプルにおいて対象とする細胞を特定することのできる生検法を認識されるであろう。
【００６１】
[0062]用語「対象」又は「患者」又は「個体」は、典型的には、ヒトを包含するものの、その他の動物、例えば、その他の霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタ、及び同様の動物も包含され得る。
【００６２】
[0063]本発明は、ポイント・オブ・ケアのなされる場所又は検査室ベースの臨床化学検査が行われる場所で有用である。本明細書で使用するとき、ポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）のなされる場所は、病院検査、ベッドサイド検査、緊急治療室、診療所、外来診療所、血液バンク、手術室、家庭、実験室又は養護施設での検査、遠隔検査、などの場所を意味する。サンプル、及び、ポイント・オブ・ケア検査と同じ場所で行われる試験若しくはアッセイの結果が収集される、分析システム又は装置において実施される場合、特に有用である。しかしながら、本発明は、臨床検査施設以外の施設でも使用できることは理解されたい。
【００６３】
[0064]本明細書において、用語「代謝疾患」、「代謝障害」、及び「代謝症候群」は互換的に使用され、正常な代謝（例えば、代謝のバランス）に障害が生じることにより引き起こされる状態を指す。代謝は、食物を細胞レベルでエネルギーに変換するプロセスである。典型的には、代謝疾患は、血圧上昇、高血糖、腹部の過剰な体脂肪、インスリン抵抗性、耐糖能障害、及び／又は異常なコレステロール値により特徴づけられる。代謝疾患／障害の非限定例としては、１型糖尿病、２型糖尿病、糖尿病前症、糖尿病の関連疾患、高インスリン血症、リソソーム蓄積症、ゴーシェ病、耐糖能障害、空腹時高血糖、インスリン抵抗性、及び脂質異常症が挙げられる。
【００６４】
[0065]用語「脳及び認知疾患」又は「脳及びに認知障害」は、主に、学習、記憶、知覚及び問題解決に影響を及ぼす、神経疾患／障害及び／又は心の健康に関係する疾患／障害を指す。この用語には、せん妄、重度及び軽度の認知神経科学的障害、認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症、及びヒトの心の働きを低下させ、日常生活に悪影響を及ぼすことを特徴とする全ての既知の神経疾患／障害が包含される。
【００６５】
[0066]用語「癌」は、異常細胞の非制御的増殖を特徴とする疾患クラスのメンバーを包含することを意図する。この用語は、悪性、良性、軟組織、又は固体であることを特徴とする全ての既知の癌及び腫瘍性疾患、並びに遊走前及び遊走後の癌を含む全てのステージ及び悪性度の癌を包含する。異なる種類の癌の例としては、乳癌；肺癌（例えば、非小細胞肺癌）；消化器及び胃腸癌、例えば、結腸直腸癌、消化管間質腫瘍、消化管カルチノイド、結腸癌、直腸癌、肛門癌、胆管癌、小腸癌、及び胃癌；食道癌；胆嚢癌；肝臓癌；膵臓癌；虫垂癌；卵巣癌；腎臓癌（例えば、腎細胞癌）；中枢神経系の癌；皮膚癌；リンパ腫；絨毛種；頭部及び頸部癌；骨肉腫；及び血液癌が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書で使用するとき、「腫瘍」は、１種以上の癌細胞を含む。
【００６６】
ＩＩＩ．発明を実施するための形態
[0067]一態様では、本発明は、アッセイ装置中のマイクロキャリアにおいて、近接二重検出（proximity dual detection）アッセイによる多重化アッセイを実施することにより、癌、代謝疾患、胃腸疾患又は脳及び認知疾患、脳疾患、又は認知疾患を診断するための方法を提供する。本方法は、ａ）患者サンプルを、アッセイ装置のマイクロチャネルに配置又は固定された、複数のコード化されたマイクロキャリアと接触させて、複数の捕捉された検体成分を生成することと；ｂ）マイクロキャリア上の複数の捕捉された検体成分を少なくとも２種の検出抗体と接触させることと［少なくとも１種の検出抗体はシグナル増幅対のメンバーを有し、検出可能な、捕捉された複数の検体成分を生成する］；ｃ）検出可能な、捕捉された複数の検体成分を、シグナル増幅対の第２のメンバーと接触させて、増幅されたシグナルを生成することと；及びｄ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された、増幅されたシグナルを検出することと、を含む。
【００６７】
[0068]患者サンプル中の標的検体成分の有無、発現（例えば、総量）レベル及び／又は活性（例えば、リン酸化）レベルを利用して、患者が代謝疾患、胃腸疾患、脳及び認知疾患、又は癌に罹患しているかを判断する。
【００６８】
[0069]いくつかの例では、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３．ＨＥＲ４、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＦＬＴ−３、ＦＬＫ−２、ＰＤＧＲ、ｃ−ＫＩＴ、ＩＮＳＲ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＩＧＦ−ＩＩＲ、ＩＲＲ、ＣＳＦ−ＩＲ、ｃＭＥＴ、及びこれらの組み合わせなどのシグナル伝達分子のうちの１種以上の有無、発現（例えば、総量）レベル及び／又は活性（例えば、リン酸化）レベルを利用して、患者の癌を診断する。
【００６９】
[0070]他の例では、ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）、ＡＭＰＫキナーゼ（ＡＭＰＫＫ）、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼ（ＣＡＭＫＫ）、ＬＫＢ１、トランスフォーミング増殖因子−β−活性化キナーゼ１（ＴＡＫ１）、ＡＫＴ、アディポネクチン、レプチン、グルコース、その他のＡＭＰ修飾因子、及びこれらの組み合わせなどのシグナル伝達分子のうちの１種以上の有無、発現（例えば、総量）レベル及び／又は活性（例えば、リン酸化）を利用して、患者の糖尿病を診断する。
【００７０】
[0071]他の例では、ＧＡＤ６５自己抗体、インスリノーマ抗原２（ＩＡ−２）自己抗体、インスリン自己抗体（ＩＡＡ）、亜鉛トランスポータータンパク質８（ＺｎＴ８）自己抗体、及びこれらの組み合わせなどの１種以上の自己抗体の有無及び／又は発現（例えば、総量）レベルを利用して、患者の糖尿病を診断する。
【００７１】
[0072]他の例では、タウ、アミロイドベータ（Ａβ）タンパク質、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、アミロイドベータ（Ａβ）ペプチド（例えば、β−アミロイドタンパク質２８、β−アミロイドタンパク質４０、β−アミロイドタンパク質４２、β−アミロイドタンパク質４３、可溶性アミロイド前駆体タンパク質ベータ（ｓＡＰＰβ）、及び同様のタンパク質等）、何らかのＡβタンパク質断片、ＶＩＬＩＰ−１、及びこれらの組み合わせなどの１種以上の病理学的分子の有無、発現（例えば、総量）レベル及び／又は活性（例えば、リン酸化）レベルを利用して、患者のアルツハイマー病を診断する。
【００７２】
[0073]更に他の例では、サンプル中の少なくとも１種のサイトカイン又は複数のサイトカイン有無又はレベルは、本発明に特に有用である。本明細書で使用するとき、用語「サイトカイン」は、免疫細胞により分泌され、免疫システムの機能範囲を制御する、様々なポリペプチド又はタンパク質を包含し、かつケモカインなどの低分子量のサイトカインも包含する。用語「サイトカイン」は、脂肪細胞により分泌され、例えば、体重の制御、血球新生、血管新生、創傷治癒、インスリン抵抗性、免疫応答、及び炎症応答において機能するサイトカイン群を含むアディポサイトカインも包含する。サイトカインは、疾患、調節不全、又は機能不全のバイオマーカーとして利用することもできる。
【００７３】
[0074]ある種の態様では、サンプル中の、ＴＮＦ−α、ＴＮＦに関連するアポトーシスの弱い誘導因子（ＴＷＥＡＫ）、破骨細胞形成抑制因子（ＯＰＧ）、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３、及びＩＬ−２７が挙げられるがこれらに限定されない、少なくとも１種のサイトカインの有無及びレベルが、評価される。ある種の他の態様では、サンプル中の、例えば、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯ１／ＧＲＯα、ＣＸＣＬ２／ＧＲＯ２、ＣＸＣＬ３／ＧＲＯ３、ＣＸＣＬ４／ＰＦ−４、ＣＸＣＬ５／ＥＮＡ−７８、ＣＸＣＬ６／ＧＣＰ−２、ＣＸＣＬ７／ＮＡＰ−２、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０、ＣＸＣＬ１１／Ｉ−ＴＡＣ、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１、ＣＸＣＬ１３／ＢＣＡ−１、ＣＸＣＬ１４／ＢＲＡＫ、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７／ＤＭＣ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ６／Ｃ１０、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３、ＣＣＬ８／ＭＣＰ−２、ＣＣＬ９／ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１／エオタキシン、ＣＣＬ１２／ＭＣＰ−５、ＣＣＬ１３／ＭＣＰ−４、ＣＣＬ１４／ＨＣＣ−１、ＣＣＬ１５／ＭＩＰ−５、ＣＣＬ１６／ＬＥＣ、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＣＣＬ１８／ＭＩＰ−４、ＣＣＬ１９／ＭＩＰ−３β、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ−３α、ＣＣＬ２１／ＳＬＣ、ＣＣＬ２２／ＭＤＣ、ＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ１、ＣＣＬ２４／エオタキシン−２、ＣＣＬ２５／ＴＥＣＫ、ＣＣＬ２６／エオタキシン−３、ＣＣＬ２７／ＣＴＡＣＫ、ＣＣＬ２８／ＭＥＣ、ＣＬ１、ＣＬ２、及びＣＸ３ＣＬ１などの少なくとも１種のケモカインの有無又はレベルが評価される。
【００７４】
[0075]ある種の更なる態様では、サンプル中の、レプチン、アディポネクチン、レジスチン、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子−１（ＰＡＩ−１）の活性又は総量、ビスファチン、及びレチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）が挙げられるがこれらに限定されない、少なくとも１種のアディポサイトカインの有無又はレベルが評価される。
【００７５】
[0076]他の例では、本発明の方法及びシステムを利用して、サンプル中の１種以上の増殖因子の有無又はレベルを評価できる。本明細書で使用するとき、用語「増殖因子」には、細胞の増殖及び／又は細胞の分化を刺激することのできる様々なペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質が包含される。
【００７６】
[0077]ある種の態様では、サンプル中の、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヘパリン結合上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ；ＳＥＲＰＩＮＦ１としても既知）、アンフィレギュリン（ＡＲＥＧ；シュワン腫由来増殖因子（ＳＤＧＦ）としても既知）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ１−ＢＭＰ１５）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、β−神経増殖因子（β−ＮＧＦ）、神経栄養因子（例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ３）、ニューロトロフィン４（ＮＴ４）など）、増殖分化因子−９（ＧＤＦ−９）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、及びトロンボポエチン（ＴＰＯ）が挙げられるがこれらに限定されない少なくとも１種の増殖因子の有無又はレベルが評価される。一態様では、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＥＤＦ、アンフィレギュリン（ＳＤＧＦ）、及び／又はＢＤＮＦの有無又はレベルが評価される。
【００７７】
[0078]様々な反応速度結合パラメーターを評価できる。そのようなパラメーターとしては、例えば、結合反応速度パラメーター（例えば、会合速度、ｋｏｎ；解離速度、ｋｏｆｆ；及び親和定数、Ｋａ）が挙げられる。これらのパラメーターを利用して、例えば、受容体−リガンド相互作用、酵素−基質相互作用、タンパク質−核酸相互作用、タンパク質−抗体相互作用、及びタンパク質−タンパク質相互作用などの、直接的な分子間相互作用を確認及び測定することができる。
【００７８】
[0079]増幅されたシグナルを検出する工程は、蛍光を読み取り、蛍光強度を、患者サンプル中の標的検体成分のレベル（例えば、量、有無、濃度）と相関させることを含む。この工程には、マイクロキャリアを特定することを包含させることもできる。いくつかの実施形態では、蛍光検出は、限定するものではないがＣＣＤ又はＣ−ＭＯＳ光センサーなどの光学センサーを利用して実施される。
【００７９】
[0080]当業者であれば、多重化アッセイ工程の（ａ）〜（ｃ）が、１種以上の特異的な標的検体成分を検出するような方法で実施されることを認識されるであろう。例えば、本発明の多重アッセイは、少なくとも２種類の異なる標的検体成分のレベルを測定する。
【００８０】
[0081]いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ダイナミック多重検体成分法（Dynamic Multi-Analyte Technology）（ＤＭＡＴ）装置（Ｂｉｏｃａｒｔｉｓ，Ｍｅｃｈｅｌｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）などのマイクロ流体装置で実施される。
【００８１】
Ａ．検体成分検出アッセイ
[0082]単検出アッセイ及び近接二重検出アッセイについての詳細は、例えば、米国特許第８，１６３，４９９号に見ることができ、当該出願は、全ての目的に関しその全容が参照により本明細書に援用される。
【００８２】
１．一重検出アッセイ
[0083]いくつかの実施形態では、本アッセイは、代謝疾患、又は脳の認知障害、神経疾患／障害及び／若しくは心の健康に関係する障害、又は癌に関係する対象とする検体成分など、細胞抽出物中の、対象とする活性化状態の特定の検体成分（例えば、シグナル伝達分子又は神経変性分子）を検出するためのものである。ある種の例では、固形腫瘍の循環細胞などの腫瘍細胞内部のものを検体成分とすることができる。非常に有利なことに、本発明は、優れたダイナミックレンジを備えた多重ハイスループット２抗体アッセイを提供する。非限定例として、アッセイに使用する２種類の抗体は、（１）検体成分に特異的な捕捉抗体；及び（２）活性化形態の検体成分に特異的な検出抗体（すなわち、活性化状態に依存する抗体）から構成され得る。活性化状態に依存する抗体は、例えば、検体成分のリン酸化、ユビキチン化、及び／又は複合体状態を検出することのできるものである。あるいは、検出抗体は、細胞抽出物中の検体成分の総量を検出する、活性化状態に依存しない抗体を含む。活性化状態に依存しない抗体は、概して、活性化及び非活性化形態の検体成分の両方を検出することができる。
【００８３】
[0084]好ましい実施形態では、２抗体アッセイは、（ｉ）細胞抽出物を、捕捉抗体の複数の希釈系列とともにインキュベートして、複数の捕捉された検体成分を生成することと、（ｉｉ）複数の捕捉された検体成分を、対応する検体成分に特異的な、活性化状態に依存する抗体とともにインキュベートして、検出可能な、捕捉された複数の検体成分を生成することと；（ｉｉｉ）検出可能な、捕捉された複数の検体成分を、シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーとともにインキュベートして、増幅されたシグナルを生成することと；（ｉｖ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された、増幅されたシグナルを検出することと、を含む。
【００８４】
[0085]本明細書に記載の２抗体アッセイは、典型的には、マイクロキャリア表面に結合させた捕捉抗体の濃度の範囲で、複数の異なる捕捉抗体を含む、抗体ベースのアレイである。
【００８５】
[0086]捕捉抗体及び検出抗体は、好ましくは、検体成分の結合において競合が最低限に抑えられるように選択される（すなわち、捕捉及び検出抗体は、それらの対応するシグナル伝達分子又は神経変性分子に同時に結合することができる）。
【００８６】
[0087]そのため、一実施形態では、本発明は、サンプルに対し多重化免疫アッセイを実施する方法を提供し、本方法は、
（ａ）コード化されたマイクロキャリアに固定されている、少なくとも１種の検体成分に対し特異的である複数の捕捉抗体に、細胞可溶化物を接触させて、複数の捕捉された検体成分を生成することと、
（ｂ）複数の捕捉された検体成分を、対応する検体成分に特異的である少なくとも１種の検出抗体と接触させて、検出可能な、捕捉された複数の検体成分を生成することと［ここで、少なくとも１種の検出抗体は、シグナル増幅対の第１のメンバーを有する］；
（ｃ）検出可能な、捕捉された複数の検体成分を、シグナル増幅対の第２のメンバーと接触させて、増幅されたシグナルを生成することと；
（ｄ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された、増幅されたシグナルを検出することと、を含む。
【００８７】
[0088]ある種の態様では、検出抗体は、少なくとも１種の検体成分に特異的なシグナル増幅対の第１のメンバーで標識した複数の検出抗体から構成される検出抗体を１種含む。促進部分は、シグナル増幅対の第１のメンバーと反応する酸化剤を生成する。ある種の態様では、促進部分はグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）である。ＧＯには、デキストランなどの基質が結合し得るが、抗体は結合しない。複数のＧＯ部分をデキストランに結合させることができる。
【００８８】
[0089]一実施形態では、検出抗体は結合対の第１メンバー（例えば、ビオチン）を含み、シグナル増幅対の第１のメンバーは、結合対の第２のメンバー（例えば、ストレプトアビジン）を含む。結合対のメンバーには、当業界で周知の方法を利用して、検出抗体又はシグナル増幅対の第１のメンバーを直接的に又は間接的に結合させることができる。ある種の例では、シグナル増幅対の第１のメンバーは、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、シトクロムｃペルオキシダーゼ、好酸球ペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、甲状腺ペルオキシダーゼ、脱ヨード酵素など）であり、及びシグナル増幅対の第２のメンバーは、チラミド製剤（例えば、ビオチン−チラミド）である。
【００８９】
[0090]あるいは、シグナル増幅対の第１のメンバーを、検出抗体に直接結合させることができる。ある種の例では、チラミド剤のペルオキシダーゼ酸化により、増幅されたシグナルが生じ、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在下で活性化チラミドが生成される。
【００９０】
[0091]一態様では、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）はインサイチュで生成される。例えば、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）などの促進部分は、抗体に結合させていない免疫アッセイに導入することができる。すなわち、ＧＯは、デキストランなどの基質に結合させることができる。複数のＧＯ部分をデキストランに結合させることができる。グルコースの存在下で、グルコースオキシダーゼは、シグナル増幅対の第１のメンバー（例えば、ＨＲＰ）と反応する過酸化水素などの酸化剤を生じる。
【００９１】
[0092]活性化チラミドは直接検出され、あるいは例えば、ストレプトアビジン標識されたフルオロフォア、又は、ストレプトアビジン標識されたペルオキシダーゼと発色剤とを組み合わせたもの、などのシグナル検出剤の添加により検出される。好適な本発明で利用するのに好適なフルオロフォアの例としては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）ｄｙｅ（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミンインイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＣｙＤｙｅ（商標）ｆｌｕｏｒ（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）などが挙げられるがこれらに限定されない。当業界で周知の方法を利用して、ストレプトアビジン標識を、フルオロフォア又はペルオキシダーゼに直接的に又は間接的に結合させることができる。本発明で利用するのに好適な発色剤の非限定例としては、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、４−クロロ−１−ナフトール（４ＣＮ）、及び／又はポルフィリノーゲンが挙げられる。
【００９２】
[0093]別の実施形態では、本発明は、上記の２抗体アッセイを実施するためのキットを提供し、キットは、（ａ）マイクロキャリアに固定された、複数の捕捉抗体の希釈系列；及び（ｂ）複数の検出抗体（例えば、活性化状態に依存しない抗体及び／又は活性化状態に依存する抗体）を含む。いくつかの例では、キットは、キットを使用して固形腫瘍の循環細胞の複数のシグナル伝達分子の活性化状態を検出する方法についての使用説明書を更に含有し得る。キットには、本発明の特異的な方法を実施する観点から、上記のものの他に追加の試薬を含有させてもよく、例えば、シグナル増幅対の第１及び第２のメンバー、チラミドシグナル増幅剤、ＧＯデキストラン、洗浄緩衝液などを含有させてもよい。
【００９３】
[0094]２抗体アプローチの別の実施形態では、本発明は、切断された受容体（truncated receptor）の有無を検出する方法を提供し、本方法は（ａ）細胞抽出物を、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズとともにインキュベートすることと［ＥＣＤ結合領域は完全長の受容体に特異的なものである］；（ｂ）細胞抽出物から複数のビーズを取り除くことにより、完全長の受容体を除去して、完全長の受容体を含まない細胞抽出物を生成することと；（ｃ）この完全長の受容体を含まない細胞抽出物を複数の捕捉抗体とともにインキュベートすることと［複数の捕捉抗体は、この切断された受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に特異的なものであり、かつこの複数の捕捉抗体は固体支持体に固定されており、複数の捕捉された切断された受容体を生じる］；（ｄ）複数の捕捉された切断型受容体を、対応する切断型受容体に特異的な検出抗体とともにインキュベートして、複数の、検出可能な、捕捉された切断された受容体を生じさせることと；（ｅ）複数の、検出可能な、捕捉された切断された受容体をシグナル増幅対の第１及び第２のメンバーとともにインキュベートして、増幅されたシグナルを生成することと；（ｆ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された増幅されたシグナルを検出することと、を含む。
【００９４】
[0095]ある種の実施形態では、切断された受容体はｐ９５  ＥｒｂＢ２であり、完全長の受容体はＥｒｂＢ２（ＨＥＲ−２）である。ある種の他の態様では、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズは、ストレプトアビジン−ビオチン対を含み、ビオチンはビーズに結合しており、かつビオチンは抗体（例えば、この抗体は完全長の受容体のＥＣＤ結合領域に特異的なものである）に結合している。
【００９５】
[0096]本発明は、２抗体アプローチの別の実施形態では、切断されたタンパク質の有無を検出する方法を提供し、方法は（ａ）細胞抽出物を、完全長のタンパク質に特異的な複数のビーズとともにインキュベートすることと；（ｂ）細胞抽出物から複数のビーズを取り除くことにより、完全長のタンパク質を除去して、完全長の受容体を含まない細胞抽出物を生成することと；（ｃ）この完全長のタンパク質を含まない細胞抽出物を複数の捕捉抗体とともにインキュベートすることと［複数の捕捉抗体は、切断されたタンパク質に特異的なものであり、かつこの複数の捕捉抗体は、マイクロキャリアに固定されており、複数の捕捉された切断されたタンパク質を生じる］；（ｄ）複数の捕捉された切断されたタンパク質を、対応する切断されたタンパク質に特異的な検出抗体とともにインキュベートして、複数の、検出可能な、捕捉された切断されたタンパク質を生じさせることと；（ｅ）複数の、検出可能な、捕捉された切断されたタンパク質をシグナル増幅対の第１及び第２のメンバーとともにインキュベートして、増幅されたシグナルを生成することと；（ｆ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された増幅されたシグナルを検出することと、を含む。
【００９６】
２．近接二重検出アッセイ
[0097]いくつかの実施形態では、循環細胞などといった細胞の細胞抽出物中の、対象とする活性化状態の特定の検体成分（例えば、シグナル伝達分子、例えば、ＡＭＰＫ修飾因子、又は病理学的分子、例えば、タウ、Ａβペプチド、など）を検出するためのアッセイは、優れたダイナミックレンジを備えた多重ハイスループット近接（すなわち、３抗体）アッセイである。非限定例として、近接アッセイに使用される３種の抗体には、（１）検体成分に特異的な捕捉抗体；（２）活性化形態の検体成分に特異的な検出抗体（すなわち、活性化状態に依存する抗体）；及び（３）検体成分の総量を検出する検出抗体（すなわち、活性化状態に依存しない抗体）を含ませることができる。活性化状態に依存する抗体は、例えば、検体成分のリン酸化、ユビキチン化、及び／又は複合体状態を検出することのできるものである。活性化状態に依存する抗体は、概して、活性化及び非活性化形態の検体成分を両方検出することができる。
【００９７】
[0098]一実施形態では、近接アッセイは、
（ｉ）例えば、脳脊髄液由来の細胞抽出物を、タウタンパク質に対する捕捉抗体の複数の希釈系列とともにインキュベートして、複数の捕捉されたタウタンパク質を生じさせることと；
（ｉｉ）複数の捕捉されたタウタンパク質を、全てのタウタンパク質に対する複数の抗体（例えば、活性化状態に依存しない抗体）と、リン酸化タウタンパク質に対する複数の抗体（例えば、活性化状態に依存する抗体）とを含む検出抗体とともにインキュベートして、複数の、検出可能な、捕捉された活性化タウ検体成分を生じさせることと［全てのタウタンパク質に対する抗体は促進部分（例えば、グルコースオキシダーゼ）により標識され、リン酸化タウタンパク質に対する抗体はシグナル増幅対の第１のメンバー（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）により標識され、かつ促進部分（例えば、グルコースオキシダーゼ）は、酸化剤を生成し、この酸化剤は、シグナル増幅対の第１のメンバーにチャネリングして、反応する］；
（ｉｉｉ）複数の、検出可能な、捕捉された活性化タウ検体成分を、シグナル増幅対の第２のメンバー（例えば、ビオチン−チラミド）とともにインキュベートして、増幅されたシグナルを生成することと；
（ｉｖ）シグナル検出剤としてストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）ｄｙｅを利用して、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びビオチン−チラミドから生じた増幅されたシグナルを検出することと、を含む。
【００９８】
[0099]好ましい実施形態では、近接アッセイは、（ｉ）細胞抽出物を、捕捉抗体の複数の希釈系列とともにインキュベートして、複数の捕捉された検体成分を生成することと；（ｉｉ）複数の捕捉された検体成分を、対応する検体成分に特異的な、活性化状態に依存しない複数の抗体と活性化状態に依存する複数の抗体とを含む検出抗体とともにインキュベートして、検出可能な、捕捉された複数の検体成分を生成することと［活性化状態に依存しない抗体は促進部分により標識され、活性化状態に依存する抗体はシグナル増幅対の第１のメンバーにより標識され、促進部分は酸化剤を生じさせ、この酸化剤は、シグナル増幅対の第１のメンバーにチャネリングして、反応する］；（ｉｉｉ）検出可能な、捕捉された複数の検体成分を、シグナル増幅対の第２のメンバーとともにインキュベートして、増幅されたシグナルを生成することと；（ｉｖ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された、増幅されたシグナルを検出することと、を含む。
【００９９】
[0100]あるいは、活性化状態に依存する抗体を促進部分により標識することができ、活性化状態に依存しない抗体をシグナル増幅対の第１のメンバーにより標識することができる。
【０１００】
[0101]捕捉抗体、活性化状態に依存しない抗体、及び活性化状態に依存する抗体は、好ましくは、検体成分への結合において競合が最低限に抑えられるように（すなわち、全ての抗体は、それらの対応するシグナル伝達分子に同時に結合することができる）選択されるのが好ましい。
【０１０１】
[0102]いくつかの実施形態では、活性化状態に依存しない抗体は、検出可能な部分を更に含む。このような例では、検出可能な部分の量は、細胞抽出物中の１以上の検体成分の量に相当する。検出可能な部分の例としては、蛍光標識、化学反応性標識、酵素標識、放射性標識などが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、検出可能な部分は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）ｄｙｅ（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）；ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミンインイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＣｙＤｙｅ（商標）ｆｌｕｏｒ（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）などのフルオロフォアである。当業界で周知の方法を利用して、検出可能な部分を、活性化状態に依存しない抗体に直接的に又は間接的に結合させることができる。
【０１０２】
[0103]ある種の例では、活性化状態に依存しない抗体は、促進部分により直接的に標識される。当業界で周知の方法を利用して、促進部分を、活性化状態に依存しない抗体に結合させることができる。本発明で利用するのに好適な促進部分としては、酸化剤を生成することのできる任意の分子が挙げられ、この酸化剤は、促進部分に近接する（すなわち、空間的に近い又は近傍にある）別の分子にチャネリングして（すなわち、指向して）、及び反応する（すなわち、結合する、結合される、又は一緒に複合体を形成する）ものである。促進部分の例としては、酵素、例えば、グルコースオキシダーゼ、又は、電子受容体として酸素分子（Ｏ２）が関与する酸化／還元反応を触媒する任意のその他の酵素、などの酵素、並びに光増感剤、例えば、メチレンブルー、ローズベンガル、ポルフィリン、スクアレート染料、フタロシアニンなどが挙げられるが、これらに限定されない。酸化剤の非限定例としては、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、一重項酸素、及び酸化／還元反応において、酸素原子を伝達する、又は、電子を得る、任意のその他の化合物が挙げられる。好ましくは、好適な基質（例えば、グルコース、光など）の存在下で、促進部分（例えば、グルコースオキシダーゼ、光増感剤など）は、酸化剤（例えば、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、一重項酸素など）を生じ、この酸化剤は、２つの部分が互いに近接したときに、シグナル増幅対の第１のメンバー（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、保護基により保護されているハプテン、酵素阻害剤にチオエーテル結合させることにより不活性化させた酵素など）にチャネリングして、反応する。
【０１０３】
[0104]他のある種の例では、活性化状態に依存しない抗体は、活性化状態に依存しない抗体に複合させたオリゴヌクレオチドリンカーと、促進部分に複合させた相補的なオリゴヌクレオチドリンカーとの間のハイブリダイゼーションを介し、間接的に促進部分により標識される。当業界で周知の方法を利用して、オリゴヌクレオチドリンカーを、促進部分又は活性化状態に依存しない抗体に結合させることができる。いくつかの実施形態では、促進部分を複合させたオリゴヌクレオチドリンカーは、活性化状態に依存しない抗体を複合させたオリゴヌクレオチドリンカーと１００％の相補性を有する。その他の実施形態では、オリゴヌクレオチドリンカー対は、例えば、厳密なハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーション時に、少なくとも１、２、３、４、５、又は６以上のミスマッチ領域を有する。当業者であれば、異なる検体成分に特異的である、活性化状態に依存しない抗体を、同じオリゴヌクレオチドリンカー又は異なるオリゴヌクレオチドリンカーのいずれかに結合させることができることを認識されるであろう。
【０１０４】
[0105]促進部分又は活性化状態に依存しない抗体に複合したオリゴヌクレオチドリンカーの長さは、変更することができる。概して、リンカー配列は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、又は１００ヌクレオチドの長さとすることができる。典型的には、カップリングのためにランダム核酸配列が生成される。非限定例として、連続する３つの異なるドメイン：スペーサードメイン；シグネチャードメイン；及び複合ドメイン、を有する、オリゴヌクレオチドリンカーのライブラリを設計することができる。好ましくは、オリゴヌクレオチドリンカーは、促進部分の機能を損なわずに、又はそれらを複合させる、活性化状態に依存しない抗体の機能を損なわずに、効率的に結合するよう設計する。
【０１０５】
[0106]オリゴヌクレオチドリンカー配列は、様々なアッセイ条件下での任意の副次的な構造体の形成を防止又は最小限に抑えるよう設計することができる。典型的には、リンカー内部の各断片が、アッセイ法全体において関与するように、それらの融解温度を注意深くモニターする。概して、リンカー配列断片の溶解温度は、１〜１０℃である。既定のイオン濃度下で、溶解温度、二次構造、及びヘアピン構造を測定するためのコンピューターアルゴリズム（例えば、ＯＬＩＧＯ  ６．０）を使用して、各リンカー内の３つの異なるドメインのそれぞれを分析することができる。結合配列を、全体的に、構造特性、並びに、その他の複合オリゴヌクレオチドリンカー配列に対する類似性、例えば、厳密な条件下で相補的なオリゴヌクレオチドリンカーにハイブリダイズするかについて分析することもできる。
【０１０６】
[0107]オリゴヌクレオチドリンカーのスペーサー領域により、オリゴヌクレオチド架橋部分と複合ドメインが十分な距離を保つ。複合ドメインは、相補的なオリゴヌクレオチドリンカー配列により標識されている分子を、核酸ハイブリダイゼーションにより複合ドメインに結合させるよう機能する。核酸により介在されるハイブリダイゼーションは、抗体−検体成分（すなわち、抗原）複合体形成の前又は後のいずれかに実施することができ、より柔軟なアッセイフォーマットを提供する。多くの直接的に抗体を複合させる方法とは異なり、抗体又はその他の分子に対し比較的小さなオリゴヌクレオチドを結合させることで、標的検体成分に対する抗体の特異的親和性に対する影響、又は、複合分子の機能に対する影響が最小限に抑えられる。
【０１０７】
[0108]いくつかの実施形態では、複雑な多重化タンパク質アッセイにおいて、オリゴヌクレオチドリンカーのシグネチャー配列ドメインを使用することができる。複数の抗体を、異なるシグネチャー配列を有するオリゴヌクレオチドリンカーと複合させることができる。多重免疫アッセイにおいて、適切なプローブで標識したレポーターオリゴヌクレオチド配列を利用して、多重アッセイフォーマットで抗体及びそれらの抗原の交差反応性を検出することができる。
【０１０８】
[0109]幾つかの異なる方法を利用して、オリゴヌクレオチドリンカーを抗体又はその他の分子に複合させることができる。例えば、５’又は３’末端のいすれかにチオール基を備えるオリゴヌクレオチドリンカーを合成できる。チオール基は還元剤（例えば、ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）により脱保護することができ、得られたリンカーは、脱塩スピンカラムを利用することで精製できる。これにより得られる脱保護されたオリゴヌクレオチドリンカーは、ＳＭＣＣなどのヘテロ二官能性の架橋リンカーを利用して、抗体又はその他の種類のタンパク質の一級アミンに複合させることができる。あるいは、オリゴヌクレオチド上の５’リン酸基を、水溶性カルボジイミドＥＤＣにより処理して、リン酸エステルを形成させることができ、続いてアミン含有分子に結合させることができる。ある種の例では、３’リボース残基上のジオールをアルデヒド基へと酸化させた後、還元的アミノ化により、抗体又はその他の種類のタンパク質のアミノ基に複合させることができる。他のある種の例では、３’又は５’末端のいずれかにビオチン修飾を施し、ストレプトアビジン標識された分子に複合させることにより、オリゴヌクレオチドリンカーを合成できる。
【０１０９】
[0110]オリゴヌクレオチドリンカーは、Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９：７８４５（１９８７）；Ｓｃａｒｉｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：５４３３（１９９０）；Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３：２６７７〜２６８４（１９９５）；及びＷｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４：５９（１９９７）に記載のものなどの当業界で既知の様々な手法のいずれかを利用して合成できる。概して、オリゴヌクレオチドの合成は、５’末端のジメトキシトリチル及び３’末端のホスホルアミダイトなどの、一般的な核酸保護基及びカップリング基を利用する。オリゴヌクレオチド合成に好適な試薬、核酸脱保護法、及び核酸精製法は、当該技術分野において既知である。
【０１１０】
[0111]ある種の例では、活性化状態に依存する抗体は、シグナル増幅対の第１のメンバーにより直接的に標識される。当業界で周知の方法を利用して、シグナル増幅対のメンバーを、活性化状態に依存する抗体に結合させることができる。他のある種の例では、活性化状態に依存する抗体は、活性化状態に依存する抗体に複合させた結合対の第１メンバーと、シグナル増幅対の第１のメンバーに複合させた結合対の第２のメンバーとの結合を介し、シグナル増幅対の第１のメンバーにより間接的に標識される。当業界で周知の方法を利用して、結合対のメンバー（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン）を、シグナル増幅対のメンバー又は活性化状態に依存する抗体に結合させることができる。シグナル増幅対のメンバーの例としては、限定するものではないが、ペルオキシダーゼ、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、シトクロムｃペルオキシダーゼ、好酸球ペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、甲状腺ペルオキシダーゼ、脱ヨード酵素などが挙げられる。シグナル増幅対のメンバーのその他の例としては、保護基により保護されたハプテン、及び、酵素阻害剤に対するチオエーテル結合により不活性化させた酵素、などが挙げられる。
【０１１１】
[0112]近接チャネリングの一例では、促進部分はグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）であり、シグナル増幅対の第１のメンバーは西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。ＧＯをグルコースなどの基質と接触させると、酸化剤（すなわち、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２））が生じる。ＨＲＰがＧＯの近接するチャネリング内に存在する場合、ＧＯにより生成されたＨ２Ｏ２はＨＲＰへチャネリングして、ＨＲＰ−Ｈ２Ｏ２複合体を形成し、この複合体は、シグナル増幅対の第２のメンバー（例えば、ルミノール若しくはイソルミノールなどの化学発光基質、又は、チラミド（例えば、ビオチン−チラミド）、ホモバニリン酸、又は４−ヒドロキシフェニル酢酸などの蛍光発生基質）の存在下で増幅されたシグナルを生成する。近接アッセイにおいてＧＯ及びＨＲＰを利用する方法は、例えば、Ｌａｎｇｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｏ．ＵＣＲＬ−ＩＤ−１３６７９７（１９９９）に記載されている。ビオチン−チラミドをシグナル増幅対の第２のメンバーとして利用するとき、ＨＲＰ−Ｈ２Ｏ２複合体が、チラミドを酸化して反応性チラミドラジカルを生成し、これが近くの求核性残基に共有結合する。活性化チラミドは、直接検出され、あるいはシグナル検出剤、例えば、ストレプトアビジン標識されたフルオロフォア、又は、ストレプトアビジン標識されたペルオキシダーゼと発色剤とを組み合わせたものなど、の添加により検出される。本発明で利用するのに好適なフルオロフォアの例としては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）ｄｙｅ（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７など）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）；ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミンインイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＣｙＤｙｅ（商標）ｆｌｕｏｒ（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）などが挙げられるがこれらに限定されない。当業界で周知の方法を利用して、ストレプトアビジン標識を、フルオロフォア又はペルオキシダーゼに直接的に又は間接的に結合させることができる。本発明で利用するのに好適な発色剤の非限定例としては、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、４−クロロ−１−ナフトール（４ＣＮ）、及び／又はポルフィリノーゲンが挙げられる。
【０１１２】
[0113]近接チャネリングの別の例では、促進部分は光増感剤であり、シグナル増幅対の第１のメンバーは複数のハプテンにより標識された大型分子であり、ここで、複数のハプテンは、特異的な結合パートナー（例えば、リガンド、抗体など）に対するハプテンの結合を防ぐ保護基により保護されている。例えば、保護されたビオチン、クマリン、及び／又はフルオレセイン分子により標識されたデキストラン分子をシグナル増幅対メンバーとすることができる。好適な保護基としては、フェノキシ−、アナリノ−、オレフィン−、チオエーテル−、及びセレノエーテル−保護基を挙げられるがこれらに限定されない。本発明の近接アッセイに好適なその他の光増感剤及び保護ハプテン分子は、米国特許第５，８０７，６７５号に記載されている。光増感剤が光により励起されると、酸化剤（すなわち、一重項酸素）が生成される。ハプテン分子が、光増感剤に近接するチャネリング内に存在する場合、光増感剤により生成された一重項酸素は、ハプテンの保護基上のチオエーテルのもとにチャネリングされ、これと反応し、カルボニル基（ケトン又はアルデヒド）及びスルフィン酸を生成し、ハプテンから保護基を遊離させる。保護の外れたハプテンは、次に、シグナル増幅対の第２のメンバー（例えば、検出可能なシグナルを生成し得る、特異的な結合パートナー）に特異的に結合できる。例えば、ハプテンがビオチンであるとき、特異的な結合パートナーは標識されたストレプトアビジンであり得る。酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＨＲＰなどが挙げられる。未結合の試薬を洗浄し除去した後、酵素により検出可能な（例えば、蛍光、化学発光、発色など）基質を添加することにより、検出可能なシグナルを生成し、好適な方法及び当該技術分野で既知の計測手段により検出することができる。あるいは、チラミドシグナルの増幅により、検出可能なシグナルを増幅させて、活性化チラミドを直接的に検出することができ、あるいは上記のシグナル検出剤の添加により検出することができる。
【０１１３】
[0114]近接チャネリングの更に別の例では、促進部分は光増感剤であり、シグナル増幅対の第１のメンバーは酵素−阻害剤複合体である。酵素及び阻害剤（例えば、ホスホン酸標識されたデキストラン）は、開裂可能なリンカー（例えば、チオエーテル）によりともに結合される。光増感剤が光により励起されると、酸化剤（すなわち、一重項酸素）が生成される。酵素−阻害剤複合体が、光増感剤に近接するチャネル内に存在する場合、光増感剤により生成された一重項酸素は、開裂可能なリンカーのもとにチャネリングされ、これと反応し、酵素を活性化させることにより酵素から阻害剤を遊離させる。酵素基質を添加して、検出可能なシグナルを生成し、あるいは、増幅試薬を添加して増幅されたシグナルを生成する。
【０１１４】
[0115]近接チャネリングの更なる例では、促進部分がＨＲＰであり、シグナル増幅対の第１のメンバーは上記の通り、保護されたハプテン又は酵素−阻害剤複合体であり、保護基はｐ−アルコキシフェノールを含む。フェニレンジアミン及びＨ２Ｏ２の添加は、反応性フェニレンジイミンを生成し、この分子は保護されたハプテン又は酵素−阻害剤複合体のもとにチャネリングされ、ｐ−アルコキシフェノール保護基と反応し、露出したハプテン又は反応性酵素を生成する。増幅されたシグナルは、上記（例えば、米国特許第５，５３２，１３８号及び米国特許第５，４４５，９４４号）の通りに生成され検出される。
【０１１５】
[0116]別の実施形態では、本発明は、上記の近接アッセイを実施するためのキットを提供し、キットは、（ａ）マイクロキャリア上に固定された複数の捕捉抗体の希釈系列と；（ｂ）複数の検出抗体（例えば、活性化状態に依存しない抗体及び活性化状態に依存する抗体）とを含む。いくつかの例では、キットには、固形腫瘍の循環細胞に関係する複数のシグナル伝達分子の活性化状態を検出するために、本キットの使用法についての使用説明書を、更に含有させることができる。キットには、本発明の特異的な方法の実施のため、例えば、シグナル増幅対の第１及び第２のメンバー、チラミドシグナル増幅剤、促進部分のための基質、洗浄緩衝液などの上記の任意の追加の試薬を含有させてもよい。
【０１１６】
Ｂ．マイクロキャリア
[0117]本発明の、上記の検体成分捕捉及び検出アッセイでは、特に捕捉抗体がマイクロキャリアに結合される。本発明に有用なマイクロキャリアについての詳細は、例えば、国際公開第ＷＯ  ２０１２／１０６８２７号及び米国特許第２０１１／０３０６５０６号及び米国特許第２０１３／００９５５７４号に記載されており、当該出願は、全ての目的に関しその全容が参照により本明細書に援用される。
【０１１７】
[0118]ある種の態様では、提供されるマイクロキャリアは、球状、ウエハー状、正方形、ディスク形、矩形、円形、三角形、六角形、又は多角形の形状の固体支持体である。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアの高さは、実施形態の幅及び高さのいずれよりも小さい。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、上部と下部のそれぞれに、本質的に平行でかつ本質的に平坦な表面を有する。
【０１１８】
[0119]いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、円形の形状の検出表面を備えるディスク様の形状（例えば、ウエハー形状）を有する。いくつかの例では、マイクロキャリアの本体は、コード化されたマイクロキャリアの検出面を平面に向かい合わせて平面上に配置するときに、平面と検出面との間に確実に隙間が存在するように、少なくとも本体から突き出ている間隔部材を有している。
【０１１９】
[0120]いくつかの実施形態では、ディスク様形状の直径は、約１〜約３００μｍ、例えば、１、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、又は３００μｍなどである。
【０１２０】
[0121]マイクロキャリアは、マイクロキャリア中を横切る孔を構成し得るデジタルコードなどのコードにより識別可能である。一組（例えば、一群）のマイクロキャリアは、同じコードを備え、かつ同一の機能を有する個々のマイクロキャリアから構成される。マイクロキャリアの２つの異なるセットは、異なる機能及び異なるコードを有してもよい。
【０１２１】
[0122]コードは、検出面を含むマイクロキャリアの全厚を貫き横切る任意のパターンの孔であってよい。いくつかの例では、コードは、三角形又はＬ形状のサインなどの非対称の方向マークも包含する。
【０１２２】
[0123]いくつかの実施形態では、コードは、読み取る（イメージングする）ことにより測定される。コードは、一般的なイメージング及びデコーディング法を利用して特定できる。コードは、マイクロキャリアの機能を特定するために好ましく利用される。
【０１２３】
[0124]いくつかの実施形態では、１組のマイクロキャリアは、特定の検体成分を捕捉及び／又は検出するなどの同じ機能を有する。例えば、１組のマイクロキャリアは、特定の対象とする検体成分と関係する、コード化された複数の個々のマイクロキャリアから構成される。ある種の態様では、マイクロキャリアの機能は、表面に結合させた捕捉抗体又は捕捉リガンドの特定に対応する。
【０１２４】
[0125]マイクロキャリアは、ハイスループットのスクリーニング法及び診断法に常用される任意の材料から作成できる。これらの材料の非限定例としては、ラテックス、ポリスチレン、架橋されたデキストラン、ポリメチルスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、セルロース、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、フッ化エチレン−プロピレン、並びにマイクロファブリケーション又はマイクロミリングで一般に利用される材料、例えば、ガラス、ＳｉＯ２、シリコン、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）、金、銀、アルミニウム、スチール、又はその他の金属など、あるいはエポキシ系感光剤、例えば、ＳＵ−８などが挙げられる。マイクロキャリアは、任意の形状及び大きさであってよい。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアはシリコン製である。
【０１２５】
[0126]マイクロキャリアは、本発明の１種以上の捕捉抗体によりバイオ機能化することができる。任意の既知の方法を利用して、捕捉抗体をマイクロキャリアに結合させることができる。
【０１２６】
Ｃ．診断システム
[0127]本明細書に提供される診断システムでは、コード化されたマイクロキャリアが、マイクロ流体機器のアッセイ装置のマイクロチャネルに配置される。いくつかの実施形態では、マイクロチャネルは、少なくとも１組以上のマイクロキャリアを含む反応チャンバとして提供される。典型的には、マイクロキャリアにより放出される蛍光を検出可能にするため、マイクロチャネルの少なくとも一面は透明にする。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チャネルは、透明な観察壁を有する。
【０１２７】
[0128]用語「マイクロ流体チャネル」又は「マイクロチャネル」は、約１〜約５００μｍ、好ましくは約１０〜約３００μｍ、例えば、１、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、又は３００μｍなどの断面を備える閉鎖チャネル（例えば、流体のための細長い経路）を指す。マイクロ流体チャネルは、必ずしも真っ直ぐではなく、かつマイクロ流体チャネル内で誘導される流体方向に一致する長手方向を有する。その方向が、流体の平均速度ベクトルに一致し、これにより層流域にあると考えられる場合が、好ましい。
【０１２８】
[0129]マイクロチャネルの全長にわたってマイクロキャリアが単層を形成し、確実にサンプルが最大数のマイクロキャリアを通過するようにマイクロキャリア周囲の容量を制限し、かつサンプルと試薬の流体が流動するあいだ、マイクロチャネルの長さに沿ったマイクロキャリアの移動が制限されるように、マイクロチャネルを設計する。
【０１２９】
[0130]マイクロチャネルは、シリコン、ＳＵ−８（エポキシ系フォトレジスト）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、シリコーン、又はその他の熱可塑性エラストマー（ＴＰＥ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、Ｔｅｆｌｏｎ（ＰＴＦＥ）、熱可塑性エラストマー（ＴＰＥ）、Ｖｉｃｔｒｅｘ  ＰＥＥＫ（商標）、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリスチレン（ＰＳ）、フッ化エチレン−プロピレン（ＦＥＰ）、環状オレフィン（コ）ポリマー（ＣＯＰ若しくはＣＯＣ）、又はその他の熱可塑性ポリマー、石英、ガラス、又はプレート化（plateable）することのできる、例えば、ニッケル、銀、若しくは金などの金属、最も好ましくは透明なポリマーが挙げられる（incluyding）がこれらに限定されない。
【０１３０】
[0131]アッセイ装置のマイクロキャリアは、マイクロチャネルの断面形状に対して、少なくとも２つの任意のマイクロキャリアが、マイクロチャネルの全長にわたって、互いに接触せずに、かつマイクロチャネルの外周に接触せずに隣りあわせて配置することのできるような形状を有している。
【０１３１】
Ｄ．検体成分
[0132]細胞抽出物における発現（例えば、総量）レベル及び／又は活性（例えば、リン酸化）レベルについて調査することのできるシグナル伝達分子などの検体成分の非限定例としては、受容体チロシンキナーゼ、非受容体型チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼシグナル伝達カスケード構成要素、核内ホルモン受容体、核内受容体コアクチベーター、核内受容体リプレッサー、リガンド、受容体、シグナル伝達カスケード構成要素、及びこれらの組み合わせが挙げられる。検体成分の更なる例としては、自己抗体、神経変性分子、及び病理学的分子が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３２】
[0133]一実施形態では、本発明の方法は、細胞抽出物中の、以下の検体成分：ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３．ＨＥＲ４、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＦＬＴ−３、ＦＬＫ−２、ＰＤＧＲ、ｃ−ＫＩＴ、ＩＮＳＲ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＩＧＦ−ＩＩＲ、ＩＲＲ、ＣＳＦ−ＩＲ、ｃＭＥＴ、及びこれらの組み合わせのうちの少なくとも１種以上の有無、発現レベル（例えば、総量）及び／又は活性レベル（例えば、リン酸化レベル又は複合体形成）を測定することを含む。
【０１３３】
[0134]別の実施形態では、本発明の方法は、細胞抽出物中の、以下の検体成分：ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）、ＡＭＰＫキナーゼ（ＡＭＰＫＫ）、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼ（ＣＡＭＫＫ）、ＬＫＢ１、トランスフォーミング増殖因子−β−活性化キナーゼ１（ＴＡＫ１）、ＡＫＴ、アディポネクチン、レプチン、グルコース、その他のＡＭＰ調節因子、及びこれらの組み合わせのうちの少なくとも１種以上の有無、発現レベル（例えば、総量）及び／又は活性レベル（例えば、リン酸化レベル又は複合体形成）を測定することを含む。
【０１３４】
[0135]更に別の実施形態では、本発明の方法は、自己抗体、例えば、ＧＡＤ６５自己抗体、インスリノーマ抗原２（ＩＡ−２）自己抗体、インスリン自己抗体（ＩＡＡ）、亜鉛トランスポータータンパク質８（ＺｎＴ８）自己抗体、及びこれらの組み合わせなどのうちの少なくとも１種以上の有無及び／又は発現レベル（例えば、総量）を測定することを含む。
【０１３５】
[0136]グルタミン酸脱炭酸酵素６５（ＧＡＤ６５）は、神経細胞の酵素であり、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の合成に関与する。これまでに、ＧＡＤ６５自己抗体は、１型糖尿病に関係する自己免疫疾患のバイオマーカーとして使用できることが示されている（Ａｔｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３３５：１３５７〜６０（１９９０））。更に、１型糖尿病の予想には、ＧＡＤ６５、ＩＡ−２、ＩＡＡ、ＺｎＴ８自己抗体が提案されている（Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｅｗｓ，３６（１０），Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１０；Ｂｉｎｇｌｅｙ，ＰＪ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，９５（１）：２５〜３３（２０１０））。
【０１３６】
[0137]別の実施形態では、本発明の方法は、細胞抽出物中の、以下の検体成分：タウ、アミロイドベータ（Ａβ）ペプチド（例えば、β−アミロイドタンパク質４２）、可溶性アミロイド前駆体タンパク質β（ｓＡＰＰβ）、ＶＩＬＩＰ−１、及びこれらの組み合わせのうち少なくとも１種以上の有無、発現レベル（例えば、総量）及び／又は活性レベル（例えば、リン酸化レベル又は複合体形成）を測定することを含む。β−アミロイドタンパク質４２（Ａβ４２）、ｓＡＰＰβ、全タウタンパク質、及びリン酸化タウなどの幾つかの検体成分の濃度は、アルツハイマー病と関連付けられている。
【０１３７】
[0138]特定の実施形態では、本発明は、多重アッセイにおいて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０以上の検体成分の有無、発現レベル（例えば、総量）及び／又は活性レベル（例えば、リン酸化レベル又は複合体形成）を測定することを含む。
【０１３８】
[0139]ある種の実施形態では、本発明は、細胞抽出物中で、１種以上（例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、又は５０以上）の更なる検体成分の発現レベル（例えば、総量）及び／又は活性レベル（例えば、リン酸化レベル又は複合体形成）を測定することを更に含む。いくつかの実施形態では、１種以上（例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、又は５０以上）の追加の検体成分は、受容体チロシンキナーゼ、非受容体型チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼシグナル伝達カスケード構成要素、核内ホルモン受容体、核内受容体コアクチベーター、核内受容体リプレッサー、リガンド、受容体、シグナル伝達カスケード構成要素；１種以上の神経変性タンパク質；１種以上の病的なタンパク質凝集体；及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１種以上のシグナル伝達分子を含む。
【実施例】
【０１３９】
ＩＶ．実施例
[0140]以下の実施例は例示のために提供するものであり、本発明の特許請求の範囲を制限するためのものではない。
【０１４０】
実施例１．患者サンプルにおけるリン酸化ＨＥＲ２レベルを測定するためのマイクロ流体ＣＥＥＲ
[0141]本例は、近接二重検出アッセイ（例えば、ＣＥＥＲアッセイ）が結合されたマイクロキャリアと、マイクロ流体装置とを利用して、細胞溶解サンプルにおける活性化ＨＥＲ２レベルを検出する方法を例示する。
【０１４１】
[0142]本試験は、細胞由来のサンプル中の活性化検体成分を測定するための最適条件を決定することを目的とした。試験パラメーターには、捕捉抗体の量（例えば、濃度）、サンプルの量、及びシグナル増幅対の第２のメンバーの量（例えば、希釈率）を含んだ。
【０１４２】
[0143]バーコード化させたマイクロキャリアに濃度０．５ｍｇ／ｍｌ及び１．０ｍｇ／ｍｌのＨＥＲ２捕捉抗体を結合させた。アッセイの陰性対照として用意したＩｇＧも別の組のマイクロキャリアに結合させた。次に、結合させた、コード化されたマイクロキャリアを５％  ＢＳＡ−ＰＢＳＴで１時間ブロッキングし、次にアッセイカートリッジ（アッセイ装置）に充填した。
【０１４３】
[0144]次に、ＨＥＲ２過剰発現細胞（すなわち、ＢＴ４７４細胞）由来の細胞可溶化サンプルをカートリッジに充填し、反応チャンバ内で、先ほどの結合させたマイクロキャリアとともに８０分間インキュベートした。試験サンプルには、細胞７５個（例えば、８０μｌ容量中１００個）、７．５個（例えば、８０μｌ容量中１０個）及び０．７５個（例えば、８０μｌ容量中１個）に相当する可溶化物を含有させた。インキュベート時間後、マイクロ流体装置により排出口からサンプルを排出させた。
【０１４４】
[0145]結合させたマイクロキャリアと、検出抗体（例えば、４Ｇ１０−ＨＲＰ及びＨＥＲ２−ＡＢ４−ＧＯ）を２０分間インキュベートした後、マイクロ流体装置により排出させた。抗体４Ｇ１０−ＨＲＰは、ホスホチロシン（phosphotryosine）に特異的に結合し、抗体ＨＥＲ２−ＡＢ４−ＧＯはＨＥＲ２ポリペプチドを認識する。
【０１４５】
[0111]次に、ビオチン−チラミド（ＢＴ−ｔｙｒ）、すなわちシグナル増幅対の第２のメンバーを反応チャンバに添加して３０分間インキュベートし、反応チャンバから除去した。ビオチン−チラミドの２種類の希釈液（１：５００及び１：１０００）を試験した。ビオチン−チラミドの濃度（例えば、レベル）を高くする程、蛍光の読み取りに干渉する蛍光分子の凝集体が生成されることが判明した。濃度０．５μｇ／ｍｌで、シグナル検出試薬ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ６４７を添加し、５分間インキュベートした。
【０１４６】
[0146]標準的な顕微鏡イメージング法及び蛍光解析ソフトウェアを利用して、マイクロキャリアの蛍光を検出し、定量した。
【０１４７】
[0112]結果は、わずか０．７５個の細胞を含有するサンプルにおいてさえ、活性化ＨＥＲ２レベルが検出され、定量されたことを示す（図１Ａ及び１Ｂ）。図１Ａには、高ＢＴ−Ｔｙｒの希釈系列の蛍光強度を示す。左から右に、それぞれ抗ＨＥＲ２（０．５ｍｇ／ｍｌ；１１４）、抗ＨＥＲ２（１．０ｍｇ／ｍｌ；１３３）、及びＩｇＧ（陰性対照）（１．０ｍｇ／ｍｌ；４１．２）である。図１Ｂには、低ＢＴ−Ｔｙｒの希釈系列の蛍光強度を示す。左から右に、それぞれ抗ＨＥＲ２（０．５ｍｇ／ｍｌ；１０４．２）、抗ＨＥＲ２（１．０ｍｇ／ｍｌ；１３１．５）、及びＩｇＧ（陰性対照）（１．０ｍｇ／ｍｌ；３８．５）である。更に、いずれの捕捉抗体及びビオチン−チラミド濃度でもＨＥＲ２レベルが検出可能であった。このデータは、マイクロキャリア−ベースのアッセイの感度が、ニトロセルロースコートし捕捉抗体を結合させたスライドを利用する従来のＣＥＥＲアッセイに匹敵していたことを示す。
【０１４８】
[0112]図２は、反応チャンバに充填した細胞が少ない方が、シグナルバックグラウンド比が低かったことを示す。特に、図２Ａは、サンプルの７５個のＢＴ４７４細胞とともにインキュベートしたアッセイ装置における蛍光マイクロキャリアを示す。図２Ｂは、サンプルの７．５個の細胞とともにインキュベートした同様の蛍光マイクロキャリアを示す。
【０１４９】
[0147]この例は、近接二重検出アッセイ（例えば、ＣＥＥＲアッセイ）が結合されたマイクロキャリアとマイクロ流体装置とを利用して、細胞溶解サンプル中の活性化ＨＥＲ２レベルを検出する方法を例証する。
【０１５０】
実施例２．患者サンプルにおけるリン酸化タウレベルを測定するためのマイクロ流体ＣＥＥＲ
[0148]本例には、本明細書に記載のマイクロ流体ＣＥＥＲアッセイを利用して患者由来のサンプルにおけるリン酸化タウレベルを測定する方法を記載する。活性化タウのレベルを利用して、患者がアルツハイマー病（ＡＤ）を有しているか、あるいはＡＤ発症のリスクが増加しているかを評価することができる。
【０１５１】
[0149]標準的な外来診療プロトコルに従い腰椎穿刺を行い、患者から脳脊髄液サンプルを採取する。標準的な可溶化緩衝液を利用してサンプルの細胞を可溶化させ、細胞抽出液を生成する。
【０１５２】
[0150]１組のコード化されたマイクロキャリアに、Ｂｉｏｃａｒｔｉｓの捕捉分子結合プロトコルなどの標準的な結合手順を利用して非リン酸化タウを認識する捕捉抗体を結合させる。結合させたマイクロキャリアを、５％  ＢＳＡ−ＰＢＳＴ溶液により１時間ブロッキングした。この結合させたマイクロキャリアを、マイクロ流体機器を利用してアッセイカートリッジの反応チャンバに充填した。
【０１５３】
[0151]細胞抽出物を反応チャンバに充填し、結合させたマイクロキャリアと約８０分間接触させた。流体の層流により細胞抽出物を除去し、検出抗体を反応チャンバに充填した。検出抗体は、非リン酸化タウに対するものでありグルコースオキシダーゼに結合された第１の抗体と、リン酸化タウに対するものであり西洋ワサビペルオキシダーゼに結合された第２の抗体とを含有する。検出抗体を、マイクロキャリアに結合された捕捉されたタウタンパク質とともに２０分間インキュベートし、その後除去する。次に、マイクロキャリアに結合された、検出される捕捉されたタウタンパク質を含有する反応チャンバに、ビオチン−チラミドを充填する。シグナル増幅反応を３０分間実施する。次に、シグナル検出試薬ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７を、検出される捕捉された検体成分とともに５分間インキュベートする。最後に、ＣＣＤカメラを利用して、マイクロキャリアからの蛍光シグナルを検出し、標準的なイメージングソフトウェアを利用して定量する。更に、マイクロキャリア上のコードを読み取って、マイクロキャリアの機能を解読する。
【０１５４】
[0152]測定された蛍光は、サンプル中に存在する標的検体成分（例えば、活性化タウ）のレベルに相当する。患者サンプル中のリン酸化タウのレベルが非ＡＤ対象のものよりも高い場合、その患者はＡＤを有しているか、あるいはＡＤを発症するリスクが増加しているものと評価される。
【０１５５】
[0153]これまでに、理解を明瞭にするため、図示及び例示目的により本発明を程度詳細に記載したものの、当業者であれば、添付の特許請求の範囲内である種の変更及び改変を実施できることを認識されるであろう。更に、本明細書に提供される各参照は、各参照が参照によりそれぞれ援用されている場合と同程度に、その全容が参照により援用される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【国際調査報告】
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