(57)【要約】  本発明は、トロンビン感受性凝固第X因子(FX)及び医薬品におけるその使用に関する。特に、本発明は、FX「IVGG」モチーフのN末端側の活性化ペプチド中に2〜10アミノ酸改変を含むFX分子及びそのような分子を含む組成物並びにそれらの使用に関する。このような分子は、血友病の処置及び予防における簡便で患者にやさしい処置計画に関連して有用であり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型第X因子中の「IVGG」モチーフ(配列番号1のアミノ酸195〜198)のN末端側に2〜10アミノ酸改変を含むトロンビン感受性第X因子分子であって、前記改変が、位置X10〜X1:
X10、X9、X8、X7、X6、X5、X4、X3、X2、X1、I、V、G、G
(ここで、X10〜X1は、任意の自然に存在するアミノ酸であり得る)
のいずれかにあるトロンビン感受性第X因子分子。
【請求項２】
X8が、Nであり、
X7が、Nであり、
X6が、Aであり、
X5が、Tであり、
X4が、L、I、M、F、V、P及びWからなる群から選択され、
X3が、Q、M、R、T、W、K、I及びVからなる群から選択され、
X2が、Pであり、
X1が、Rである、
請求項1に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【請求項３】
X8が、Rであり、
X7が、Gであり、
X6が、Dであり、
X5が、Nであり、
X4が、L、I、M、F、V、P及びWからなる群から選択され、
X3が、T及びSからなる群から選択され、
X2が、Pであり、
X1が、Rである、
請求項1に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【請求項４】
X9が、Aであり、
X8が、Tであり、
X7が、Nであり、
X6が、Aであり、
X5が、Tであり、
X4が、F、L、M、W、A、I、V及びPからなる群から選択され、
X3が、T、K、Q、P、S、Y、R、A、V、W、I及びHからなる群から選択され、
X2が、Pであり、
X1が、Rである。
請求項1に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【請求項５】
X3が、T、K及びQからなるリストから選択される、請求項4に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【請求項６】
X4が、F、L及びMからなるリストから選択される、請求項4に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【請求項７】
X3が、Tであり、X4が、Fである、請求項4に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【請求項８】
X3が、Tであり、X4が、Mである、請求項4に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【請求項９】
X10が、Pであり、
X9が、Eであり、
X8が、Rであり、
X7が、Gであり、
X6が、Dであり、
X5が、Nであり、
X4が、L、I、M、F、V、P及びWからなる群から選択され、
X3が、T及びSからなる群から選択され、
X2が、Pであり、
X1が、Rである、
請求項1に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【請求項１０】
X10が、Pであり、
X9が、Eであり、
X8が、Rであり、
X7が、Gであり、
X6が、Dであり、
X5が、Nであり、
X4が、Lであり、
X3が、Tであり、
X2が、Pであり、
X1が、Rである。
請求項1に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【請求項１１】
X10が、Pであり、
X9が、Eであり、
X8が、Rであり、
X7が、Nであり、
X6が、Aであり、
X5が、Tであり、
X4が、Lであり、
X3が、Tであり、
X2が、Pであり、
X1が、Rである、
請求項1に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【請求項１２】
X10が、Pであり、
X9が、Eであり、
X8が、Rであり、
X7が、Gであり、
X6が、Dであり、
X5が、Nであり、
X4が、Fであり、
X3が、Tであり、
X2が、Pであり、
X1が、Rである。
請求項1に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【請求項１３】
X10が、Pであり、
X9が、Eであり、
X8が、Rであり、
X7が、Gであり、
X6が、Dであり、
X5が、Nであり、
X4が、Mであり、
X3が、Tであり、
X2が、Pであり、
X1が、Rである。
請求項1に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【請求項１４】
X10が、Sであり、
X9が、Tであり、
X8が、Pであり、
X7が、Sであり、
X6が、Iであり、
X5が、Lであり、
X4が、Lであり、
X3が、Kであり、
X2が、Pであり、
X1が、Rである、
請求項1に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【請求項１５】
X10が、Tであり、
X9が、Rであり、
X8が、Pであり、
X7が、Sであり、
X6が、Iであり、
X5が、Lであり、
X4が、Fであり、
X3が、Tであり、
X2が、Pであり、
X1が、Rである、
請求項1に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【請求項１６】
X10が、Dであり、
X9が、Fであり、
X8が、Lであり、
X7が、Aであり、
X6が、Eであり、
X5が、Gであり、
X4が、Gであり、
X3が、Gであり、
X2が、Pであり、
X1が、Rである、
請求項1に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【請求項１７】
X10が、Nであり、
X9が、Eであり、
X8が、Sであり、
X7が、Tであり、
X6が、Tであり、
X5が、Kであり、
X4が、Iであり、
X3が、Kであり、
X2が、Pであり、
X1が、Rである、
請求項1に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【請求項１８】
請求項1〜17のいずれか一項に記載のトロンビン感受性第X因子分子と、場合によって1種又は複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬製剤。
【請求項１９】
血友病の処置において用いるための、請求項1〜17のいずれか一項に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トロンビン感受性第X因子分子並びにその治療用及び/又は予防用の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
トロンビン(凝固第IIa因子/FIIa)は、プロトロンビンの活性化により形成されるトリプシン様セリンプロテアーゼである。トロンビンは、血液凝固カスケードの中心成分であり、そのプロテアーゼ活性は、可溶性フィブリノゲンをフィブリノペプチドAの放出によりフィブリンの不溶性の鎖に変換するとともに、FV及びFVIIIの活性化を含む多くのその他の凝固関連反応を触媒する。トロンビン切断部位は、よって、凝固に関与するタンパク質中で本来見出される。
【０００３】
血友病は、凝血因子、通常、第VIII因子(FVIII)の遺伝性の欠損であり、出血の増加を引き起こす。血友病の現在の処置は、タンパク質補充療法に基づく。特に治療上難題であるのが、「インヒビター」(凝固因子に対する抗体)の発生である。
【０００４】
静脈内(IV)投与用の活性化第VII因子(NovoSeven[登録商標])が、血友病及びインヒビター保有血友病の患者のための非常に効果的な「バイパス」療法として利用可能になってきている。第VIIa因子は、約4〜5時間のインビボ循環半減期を有し、よって、インヒビター保有及び非保有血友病患者のための代替のより簡便なバイパス処置選択肢を提供することが望ましい。
【０００５】
内因性第X因子(FX)は、比較的長いインビボ循環半減期(約20時間〜40時間)を有し、よって、血友病及びインヒビター保有血友病のバイパス処置のための候補として以前に提案された。例えばWO03035861及びWO2010070137から、10アミノ酸フィブリノペプチドAペプチドと融合した組換えFXバリアントが、トロンビン感受性であることが知られている。FXへのさらなるプロテアーゼ切断部位の挿入が、US2009053185A1及びUS2006148038にさらに開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO03035861
【特許文献２】WO2010070137
【特許文献３】US2009053185A1
【特許文献４】US2006148038
【特許文献５】WO03031464
【特許文献６】US 20100036001
【特許文献７】WO2006094810
【特許文献８】WO2011101267
【特許文献９】WO07056191
【特許文献１０】WO2005014035
【特許文献１１】WO08025856
【特許文献１２】WO92/16640
【特許文献１３】US 2011/0293597
【特許文献１４】US 20090041744
【特許文献１５】WO2004005347-A1
【特許文献１６】EP2199387A1
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Nielsenら(2010) Immunome research、6(1)、9
【非特許文献２】Nielsenら、(2010) Immunome Research、6:9
【非特許文献３】Nielsenら、(2009) BMC Bioinformatics 10:296
【非特許文献４】Dewerchinら(2000) Thromb Haemost 83: 185〜190
【非特許文献５】Bioconjugation Techniques、G.T. Hermanson、Academic Press、第3版、2013 p. 309
【非特許文献６】Dufner, G. Eur. J. Org. Chem. 2000、1467〜1482
【非特許文献７】JC. Gildersleeve、Bioconjug Chem. 2008年7月; 19(7): 1485〜1490
【非特許文献８】Nadanoら(1986) J. Biol. Chem. 261: 11550〜11557
【非特許文献９】Kanamoriら(1990) J. Biol. Chem. 265: 21811〜21819
【非特許文献１０】Wuら(1998) PNAS、95: 6642〜6646
【非特許文献１１】Nieman及びSchmaier (2007) Biochemistry、46: 8603〜8610
【非特許文献１２】Carmonaら(2006) Nature Protocols 1: 1971〜1976
【非特許文献１３】Louvain-Quintardら((2005) JBC、280: 41352〜41359)
【非特許文献１４】Nano Letters (2007) 7(8)、pp. 2207〜2210
【非特許文献１５】Fujiwara, K.ら(1988) J. Immunol. Meth. 112、77〜83
【非特許文献１６】Payneら(1996) Biochemistry、35(22): 7100〜7106
【非特許文献１７】Hemkerら、「Calibrated Automated Thrombin Generation Measurement in Clotting Plasma」、Pathophysiol Haemost Thromb. 33:4〜15 (2003)
【非特許文献１８】Hemkerら、「Thrombin Generation in Plasma: Its Assessment via the Endogenous Thrombin Potential」、Thromb Haemost. 74:134〜138 (1995)
【非特許文献１９】Hemkerら、「Data management in Thrombin generation」、Thromb Res 131:3〜11 (2013)
【非特許文献２０】Durocher Y.らNucleic Acids Res. 2002年1月15日;30(2):E9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
FX分子のトロンビン感受性は、インヒビター保有及び非保有血友病患者のための、改善されたより簡便な処置選択肢をもたらす可能性がある。血友病患者のためのより簡便な処置選択肢は、予防的及び要求に応じた処置のコンプライアンスの改善にもなる可能性がある。よって、当技術分野において、FXのような凝固因子タンパク質のトロンビン感受性をさらに改善することが必要とされている。さらに、当技術分野において、インヒビターの形成に関して用いるのが安全なトロンビン感受性FX分子を提供することが必要とされている。さらに、当技術分野において、自己活性化特性を本質的に有さないトロンビン感受性FX分子が必要とされている。さらに、当技術分野において、長いインビボ循環半減期を有し、よって、より簡便な処置選択肢を可能にするトロンビン感受性FX分子が必要とされている。さらに、当技術分野において、分子の活性化型が活性化野生型FXと本質的に類似するトロンビン感受性FX分子を提供することが必要とされている。最後に、当技術分野において、主要組織適合複合体クラスII(MHC II)親和性が低く、よって中和抗薬物抗体を誘導するリスクが低いトロンビン感受性FX分子が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、FX「IVGG」モチーフのN末端側の活性化ペプチド中に2〜10アミノ酸改変を含む第X因子(FX)分子及びそのような分子を含む組成物並びにそれらの使用に関する。このような化合物は、血友病の処置及び予防における簡便で患者にやさしい処置計画に関して有用であり得る。
【００１０】
すなわち、本発明は、血友病を処置又は防止する方法であって、適切な用量の本発明のトロンビン感受性第X因子分子を、それを必要とする患者に投与する工程を含む方法に関する。
【００１１】
特に、本発明は、野生型第X因子中の「IVGG」モチーフ(配列番号1のアミノ酸195〜198)のN末端側に2〜10アミノ酸改変を含むトロンビン感受性第X因子分子であって、前記改変が、「IVGG」モチーフの上流X10位〜X1位:X10、X9、X8、X7、X6、X5、X4、X3、X2、X1、I、V、G、G(ここで、X10〜X1は、任意の自然に存在するアミノ酸であり得る)のいずれかにあるトロンビン感受性第X因子分子を提供する。
【００１２】
一実施形態では、トロンビン感受性第X因子分子は、X8〜X1配列(ここで、X8は、Nであり、X7は、Nであり、X6は、Aであり、X5は、Tであり、X4は、L、I、M、F、V、P又はWからなる群から選択され、X3は、Q、M、R、T、W、K、I又はVからなる群から選択され、X2は、Pであり、X1は、Rである)を含む。
【００１３】
別の実施形態では、トロンビン感受性第X因子分子は、X8〜X1配列(ここで、X8は、Rであり、X7は、Gであり、X6は、Dであり、X5は、Nであり、X4は、L、I、M、F、V、P又はWからなる群から選択され、X3は、T又はSからなる群から選択され、X2は、Pであり、X1は、Rである)を含む。
【００１４】
別の実施形態では、トロンビン感受性第X因子分子は、X9〜X1配列(ここで、X9は、Aであり、X8は、Tであり、X7は、Nであり、X6は、Aであり、X5は、Tであり、X4は、F、L、M、W、A、I、V及びPからなる群から選択され、X3は、T、K、Q、P、S、Y、R、A、V、W、I及びHからなる群から選択され、X2は、Pであり、X1は、Rである)を含む。
【００１５】
なお別の実施形態では、トロンビン感受性第X因子分子は、X10〜X1配列(ここで、X10は、Pであり、X9は、Eであり、X8は、Rであり、X7は、Gであり、X6は、Dであり、X5は、Nであり、X4は、L、I、M、F、V、P又はWからなる群から選択され、X3は、T又はSからなる群から選択され、X2は、Pであり、X1は、Rである)を含む。
【００１６】
なお別の実施形態では、トロンビン感受性第X因子分子は、X10〜X1配列(ここで、X10は、Pであり、X9は、Eであり、X8は、Rであり、X7は、Gであり、X6は、Dであり、X5は、Nであり、X4は、Lであり、X3は、Tであり、X2は、Pであり、X1は、Rである)を含む。
【００１７】
なお別の実施形態では、トロンビン感受性第X因子分子は、X10〜X1配列(ここで、X10は、Pであり、X9は、Eであり、X8は、Rであり、X7は、Gであり、X6は、Dであり、X5は、Nであり、X4は、Mであり、X3は、Tであり、X2は、Pであり、X1は、Rである)を含む。
【００１８】
なお別の実施形態では、トロンビン感受性第X因子分子は、X10〜X1配列(ここで、X10は、Pであり、X9は、Eであり、X8は、Rであり、X7は、Gであり、X6は、Dであり、X5は、Nであり、X4は、Mであり、X3は、Tであり、X2は、Pであり、X1は、Rである)を含む。
【００１９】
なお別の実施形態では、トロンビン感受性第X因子分子は、X10〜X1配列(ここで、X10は、Pであり、X9は、Eであり、X8は、Rであり、X7は、Nであり、X6は、Aであり、X5は、Tであり、X4は、Lであり、X3は、Tであり、X2は、Pであり、X1は、Rである)を含む。
【００２０】
なお別の実施形態では、トロンビン感受性第X因子分子は、X10〜X1配列(ここで、X10は、Gであり、X9は、Dであり、X8は、Nであり、X7は、Nであり、X6は、Aであり、X5は、Tであり、X4は、Lであり、X3は、Tであり、X2は、Pであり、X1は、Rである)を含む。
【００２１】
なお別の実施形態では、トロンビン感受性第X因子分子は、X10〜X1配列(ここで、X10は、Gであり、X9は、Gであり、X8は、Gであり、X7は、Nであり、X6は、Aであり、X5は、Tであり、X4は、Lであり、X3は、Dであり、X2は、Pであり、X1は、Rである)を含む。
【００２２】
なお別の実施形態では、トロンビン感受性第X因子分子は、X10〜X1配列(ここで、X10は、Sであり、X9は、Tであり、X8は、Pであり、X7は、Sであり、X6は、Iであり、X5は、Lであり、X4は、Lであり、X3は、Kであり、X2は、Pであり、X1は、Rである)を含む。
【００２３】
なお別の実施形態では、トロンビン感受性第X因子分子は、X10〜X1配列(ここで、X10は、Tであり、X9は、Rであり、X8は、Pであり、X7は、Sであり、X6は、Iであり、X5は、Lであり、X4は、Fであり、X3は、Tであり、X2は、Pであり、X1は、Rである)を含む。
【００２４】
なお別の実施形態では、トロンビン感受性第X因子分子は、X10〜X1配列(ここで、X10は、Dであり、X9は、Fであり、X8は、Lであり、X7は、Aであり、X6は、Eであり、X5は、Gであり、X4は、Gであり、X3は、Gであり、X2は、Pであり、X1は、Rである)を含む。
【００２５】
なお別の実施形態では、トロンビン感受性第X因子分子は、X10〜X1配列(ここで、X10は、Nであり、X9は、Eであり、X8は、Sであり、X7は、Tであり、X6は、Tであり、X5は、Kであり、X4は、Iであり、X3は、Kであり、X2は、Pであり、X1は、Rである)を含む。
【００２６】
一実施形態では、本発明のトロンビン感受性FX分子は、延長されていてよく、非延長FX分子と比較して循環半減期が増加している。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】第X因子酵素原(RKRトリペプチドを含む)の構造を示す図である。
【図２】ベンズアルデヒド基を用いるグリシルシアル酸シチジン1リン酸(GSC)の官能基化を示す図である。GSCは、4-ホルミル安息香酸でアシル化され、その後、還元的アミノ化反応によりヘパロサン(HEP)-アミンと反応させる。
【図３】ベンズアルデヒド基を用いるヘパロサン(HEP)ポリマーの官能基化と、その後の還元的アミノ化反応でのグリシルシアル酸シチジン1リン酸(GSC)との反応を示す図である。
【図４】チオ基を用いるグリシルシアル酸シチジン1リン酸(GSC)の官能基化と、その後のマレイミド官能基化ヘパロサン(HEP)ポリマーとの反応を示す図である。
【図５】タンパク質設計方策を示し、トロンビン感受性第X因子分子を作製するために用いた野生型第X因子配列に対する改変を示す図である。
【図６】タンパク質設計方策を示し、トロンビン感受性第X因子分子を作製するために用いた野生型第X因子配列に対する改変を示す図である。
【図７】タンパク質設計方策を示し、トロンビン感受性第X因子分子を作製するために用いた野生型第X因子配列に対する改変を示す図である。
【図８】タンパク質設計方策を示し、トロンビン感受性第X因子分子を作製するために用いた野生型第X因子配列に対する改変を示す図である。
【図９】FVIII-KOマウスにおける血漿第X因子濃度対時間を示すグラフである。濃度は、マウスに16.7nmol/kg(1mg FX/kg)のpdFX及び40kDa HEP-[N]-pdFXをIV投与した後に抗原ベースのアッセイにより測定した。結果は、片対数プロットでの平均±SD、n=3である。
【図１０】最終FX-AP-FpA-HPC4構築物(配列番号6)を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
配列表の簡単な説明
配列番号1は、野生型成熟ヒト凝固第X因子(酵素原)のアミノ酸配列を示す。
【００２９】
配列番号2は、野生型IVGGモチーフの一般的なアミノ酸配列と、改変され得るIVGGモチーフの上流2位〜10位とを示す。
【００３０】
配列番号3は、WO2010070137に開示されるFX-AP-FpA融合タンパク質の配列を示す。
【００３１】
配列番号4は、WO2010070137に開示されるFX-AP-FpA融合タンパク質の本発明で用いるヌクレオチド配列を示す。
【００３２】
配列番号5〜236は、トロンビン感受性成熟ヒト凝固第X因子分子(酵素原)のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。配列は、対にして列挙する。例えば、配列番号5は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、該ポリペプチドについてのアミノ酸配列は、配列番号6(FX ins[194]>[DFLAEGGGVR]-HPC4)に列挙する、などである。
【００３３】
配列番号237及び238は、消光蛍光ペプチド基質の配列を示す。
【００３４】
配列番号239は、合理的に設計したQF基質のオープン配列を示す。
【００３５】
配列番号240は、フィブリノペプチドA(FpA)基質配列を示す。
【００３６】
配列番号241は、PAR 1対照基質配列を示す。
【００３７】
配列番号242は、オープン位置X4位及びX3位を有するポジショナルスキャニング(positional scanning)ライブラリー配列を示す。
【００３８】
配列番号243〜246は、2つのPCR断片を作製するため及びFX-AP-FpAのクローニングにおいて用いる2つの断片の融合体の増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列を示す。
【００３９】
説明
本発明は、トロンビン感受性FX分子に関する。このような分子は、例えばインヒビター保有及び非保有血友病に罹患している患者の予防及び処置のために用いることができる。
【００４０】
トロンビンは、ヒトにおいてF2遺伝子によりコードされる「トリプシン様」セリンプロテアーゼである。プロトロンビン(凝固第II因子)は、凝固カスケードに関連して、タンパク質分解により切断されて、トロンビンを形成する。トロンビンは、次いで、セリンプロテアーゼとして作用し、セリンプロテアーゼは、可溶性フィブリノゲンをフィブリンの不溶性の鎖に変換するとともに、多くのその他の凝固関連反応を触媒する。
【００４１】
本発明による第X因子分子は、「トロンビン感受性」であり、これは、これらがトロンビンによりタンパク質分解により切断できることを意味する。好ましくは、本発明による第X因子分子は、少なくとも4.0E+02M-1s-1、好ましくは少なくとも4.0E+03M-1s-1又は4.0E+04M-1s-1のkcat/KMを有するトロンビン感受性を有する。本発明によるペプチド配列及び/又は凝固因子のトロンビン感受性は、FXa(ここで、FXaは、タンパク質分解により活性化された第X因子である)を測定するために一般的に用いられる例えば発色性、蛍光発生性又は消光蛍光アッセイ(実施例)で測定できる。
【００４２】
本発明による第X因子分子は、配列番号1に示すアミノ酸配列中のアミノ酸195〜198に位置するIVGGモチーフのN末端側に、それらに限定されないが変異/変更/挿入/置換及び/又は欠失(例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10、2〜10、2〜9、2〜8、2〜7、2〜6、2〜5、2〜4、2〜3又は3〜4のアミノ酸改変)を含む、2〜10のアミノ酸改変を含む。本発明に関連して、以下の番号付けスキームを、IVGG部位に関してN末端側に位置する最初の10アミノ酸(残基185〜194)に対して用いる:X10(配列番号1中のArg185に相当)、X9、X8、X7、X6、X5、X4、X3、X2、X1(配列番号1中のArg194に相当)、I、V、G、G(配列番号2)。よって、これは、配列番号2によるX10〜X1アミノ酸の2〜10個が、野生型第X因子配列中の対応する配列に関して改変されることになる。一実施形態では、アミノ酸改変は、保存アミノ酸置換又は1より多い保存アミノ酸置換を含むことができる。別の実施形態では、アミノ酸改変は、非保存アミノ酸置換又は1より多い非保存アミノ酸置換を含むことができる。明確さのために、用語「保存アミノ酸置換」は、同様の生化学的特性(例えば非極性及び脂肪族、芳香族、疎水性、酸性、塩基性並びに極性、非荷電)を有する側鎖を有するアミノ酸の置換のことをいう。逆に、「非保存アミノ酸置換」は、異なる生化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の置換のことをいう。別の実施形態では、アミノ酸改変は、アミノ酸又は1より多いアミノ酸、例えば連続アミノ酸若しくは非連続アミノ酸の挿入の形であり得る。なお別の実施形態では、アミノ酸改変は、アミノ酸の欠失、又は1より多いアミノ酸、例えば連続アミノ酸若しくは非連続アミノ酸の欠失の形であり得る。なお別の実施形態では、アミノ酸改変は、複数のアミノ酸改変、例えば置換、挿入及び/又は欠失を含むことができる。例えば、1つ又は複数のアミノ酸置換を、1つ又は複数のアミノ酸挿入及び/又は欠失と組み合わせることができ、ここで、挿入及び欠失は、連続的又は非連続的であり得る。IVGGモチーフのN末端側のX10〜X1アミノ酸は、よって、天然第X因子配列に由来するアミノ酸並びにアミノ酸置換及び/又は欠失及び/又は挿入を含む。本発明によるFX分子が野生型第X因子と比較して比較的少ないアミノ酸変更を有し、よって例えば阻害薬物抗体を発生するリスクに関して理論的により安全なプロファイルを有することが利点である。本発明による第X因子分子は、さらに、好ましくは、比較的長いインビボ循環半減期を有し、前記分子を予防及び/又は処置のために毎日、週3回、週2回、週1回、2週間ごとに1回、3週間ごとに1回、又は月1回投与することを可能にする。本発明によるFX分子は、一旦活性化されると、好ましくは、野生型第X因子の活性化型に類似する。
【００４３】
「MHC親和性」:本発明によるFX分子の主要組織適合複合体II分子に向かう親和性(MHCII親和性)は、インシリコベースの方法、インビトロアッセイ又はインビボ研究のいずれかを用いて予測できる。結合のインシリコ予測は、NetMHCIIpan-2.0ソフトウェア(Nielsenら(2010) Immunome research、6(1)、9)又はHLA-DR予測のためのNetMHCIIpan 2.1(Nielsenら、(2010) Immunome Research、6:9)及びHLA-DP/DQ予測のためのNetMHCII 2.2(Nielsenら、(2009) BMC Bioinformatics 10:296)のようなソフトウェアを用いて行うことができ、これらは、所定のペプチド配列の結合が、無作為ペプチドの大きい組のうちでどのように順位付けされるかを見積もる。結合のインビトロ評価は、組換えMHCII分子とのペプチド結合の測定、又はタンパク質/ペプチドを消化してその断片をMHCII分子上にT細胞受容体による認識(認識が陽性であることにより、T細胞株の増殖が刺激される)のために提示する抗原提示細胞にタンパク質若しくはペプチドを曝露するT細胞刺激アッセイの使用を包含できる。MHCII結合のインビボ評価は、動物をヒト野生型第X因子に対して耐性にし、次いでトロンビン感受性第X因子バリアントに曝露して、抗第X因子バリアント特異的抗体の発生を、例えば力価及び発生時間に関してモニタリングする例えば耐性破壊モデル(break of tolerance model)で研究できる。
【００４４】
第X因子(FX)は、第VII因子、プロトロンビン、第IX因子(FIX)及びプロテインCに構造的に類似するビタミンK依存性凝固因子である。これは、分泌に関するタンパク質を標的とする疎水性シグナル配列(Aa1〜31)を含有する40残基プレプロ配列で合成される。プロペプチドは、γ-カルボキシル化を第X因子の軽鎖に向けるのに重要である。循環ヒト第X因子酵素原は、N末端ガンマ-カルボキシグルタミン酸リッチ(Gla)ドメイン、2つのEGFドメイン及びC末端トリプシン様セリンプロテアーゼドメインを含む4つの異なるドメインに分割される445アミノ酸からなる。第X因子の成熟2鎖型は、ジスルフィドブリッジ(Cys172〜Cys342(未成熟アミノ酸配列))により、及び第X因子軽鎖のC末端(未成熟アミノ酸配列)にて見出される切除Arg180-Lys181-Arg182(RKR)トリペプチドによりまとめられた軽鎖(アミノ酸41〜179(番号付けは、未成熟アミノ酸配列に従う))と重鎖(アミノ酸183〜488)とからなる。軽鎖は、11のGla残基を含み、これらは、第X因子が負に荷電したリン脂質膜とCa2+-依存的に結合するために重要である。野生型ヒト凝固第X因子は、2つのN-糖鎖付加部位(Asn221及びAsn231(未成熟アミノ酸配列))及び2つのO-糖鎖付加部位(Thr199及びThr211(未成熟アミノ酸配列))を活性化ペプチド(AP)中に有する。活性化ペプチド中のN-グリカンが、内因性第X因子の比較的長い半減期の主な原因であるように見受けられることが以前に示されている。β-ヒドロキシル化は、第1-EGFドメインのAsp103(未成熟アミノ酸配列)にて生じ、β-ヒドロキシアスパラギン酸(Hya)をもたらす。図1は、FX酵素原(RKRトリペプチドを含む)の構造を描写し、番号付けは、成熟第X因子ポリペプチドに従う。
【００４５】
第X因子の活性化は、52アミノ酸の活性化ペプチド(アミノ酸183〜234)を遊離するArg234〜Ile235での制限されたトロンビンタンパク質分解により生じる。活性化の後に野生型第X因子に類似するために、本発明による第X因子分子は、好ましくは、活性化切断部位にてIVGG(Ile235、Val236、Gly237、Gly238、配列番号1によるアミノ酸195〜198に相当する)の野生型第X因子プライム部位配列を含む。本発明による第X因子分子は、配列番号2に従うX10〜X1アミノ酸残基中に2〜10の変更/改変を含み、これがトロンビン感受性の増加をもたらす。同一X4〜X1残基(及びプライム部位IVGG)を有するが、X8〜X5アミノ酸が変化した消光蛍光トロンビン基質のトロンビン切断の速度を測定するアッセイでは、同様のkcat/KM値を有する(実施例3を参照されたい)。好ましくは、Asn231(番号付けは、未成熟分子に従う)に相当するN-結合グリカンは、現在の位置(又は挿入及び/若しくは欠失が導入されるならば、場合によって異なる位置)にて保持される。
【００４６】
本発明によるトロンビン感受性第X因子分子の投与は、トロンビン産生/生成を「押し上げる」ことができると考えられ、よって、例えばFVIII及び/又はFIX欠損を「バイパス」する能力がある。本発明による分子は、よって、インヒビター保有及び非保有の血友病A又はB並びに第X因子欠損症の処置のために適切である。本発明による第X因子分子の使用は、例えば週2回、週1回、2週間に1回、3週間に1回、月1回又は2カ月に1回投与できる簡便で患者にやさしい計画を可能にすると考えられる。
【００４７】
「第X因子欠損症」は、一般的な集団における発生率が1:1,000,000である(Dewerchinら(2000) Thromb Haemost 83: 185〜190)希な常染色体劣性遺伝出血障害である。これは、様々な出血傾向を生じるが、重度の第X因子欠損症の患者は、希な凝固欠陥の患者のうちで最も深刻に影響を受ける傾向がある。ヘテロ接合性第X因子欠損症の有病率は約1:500であるが、通常、臨床的に無症状である。
【００４８】
「野生型第X因子」の一例は、配列番号1に示すような全長成熟ヒトFX分子である。
【００４９】
「第X因子」又は「FX」は、本明細書において、配列番号1の機能的断片、類似体及び誘導体を含む、プロトロンビンを活性化できる任意の機能的第X因子タンパク質分子のことをいう。「第X因子分子」又は「FX分子」は、広い意味で用いられ、野生型FX及び本発明によるトロンビン感受性FX誘導体の両方を含む。
【００５０】
本発明による第X因子分子は、好ましくは、活性化型にて野生型第X因子活性を有する。一実施形態では、本発明による第X因子分子は、野生型第X因子(その酵素原アミノ酸配列は、配列番号1に示すとおりである)と少なくとも90%同一(好ましくは、少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%同一)である。好ましくは、本発明による活性化第X因子分子は、野生型活性化第X因子と同一であり、この場合、全てのアミノ酸改変は、例えば活性化ペプチド内にある。
【００５１】
本発明による第X因子は、公知の生成及び精製方法を用いて生成される組換えタンパク質である。糖鎖付加、γ-カルボキシル化及びその他の翻訳後改変の程度及び場所は、選択された宿主細胞及びその成長条件に応じて変動することがある。
【００５２】
配列についてのさらなる記載
配列番号1は、野生型成熟ヒト凝固第X因子(酵素原)のアミノ酸配列を示す。活性化ペプチドは太字で表し、軽鎖は小文字で表し、重鎖は下線で表し、X10〜X1アミノ酸に相当する位置は太字及び下線で表し、IVGGモチーフは、拡大した大文字太字及び下線で示す。
【化１】
2016510984.tif 000002
【００５３】
配列番号2は、本発明による第X因子分子についてのアミノ酸配列フレームワークを示し、これは、野生型分子からのIVGGモチーフと、IVGGモチーフの上流領域中の2〜10のアミノ酸改変と:X10、X9、X8、X7、X6、X5、X4、X3、X2、X1、I、V、G、Gを含む。
【００５４】
配列番号3は、WO2010070137に開示されるFX-FpA融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。活性化ペプチドは太字で表し、挿入FpA配列は斜体で示し、重鎖は下線で示す。
【化２】
2016510984.tif 000003
【００５５】
配列番号5〜236は、トロンビン感受性ヒト凝固第X因子分子(酵素原)のアミノ酸配列を示す。以下に列挙する選択された典型的な成熟トロンビン感受性ヒト凝固第X因子分子について、活性化ペプチドは太字で示し、軽鎖は小文字で表し、重鎖は下線で示し、X10〜X1アミノ酸に相当する位置は太字及び下線で示し、アミノ酸改変(改変/変異/変更)は太字、下線及び斜体で示し、IVGGモチーフは拡大した大文字、太字及び下線の文字で示す。
配列番号16
【化３】
2016510984.tif 000004
配列番号20
【化４】
2016510984.tif 000005
配列番号24
【化５】
2016510984.tif 000006
配列番号28
【化６】
2016510984.tif 000007
配列番号32
【化７】
2016510984.tif 000008
配列番号36
【化８】
2016510984.tif 000009
配列番号40
【化９】
2016510984.tif 000010
配列番号48
【化１０】
2016510984.tif 000011
配列番号52
【化１１】
2016510984.tif 000012
配列番号56
【化１２】
2016510984.tif 000013
配列番号64
【化１３】
2016510984.tif 000014
配列番号72
【化１４】
2016510984.tif 000015
配列番号76
【化１５】
2016510984.tif 000016
配列番号108
【化１６】
2016510984.tif 000017
配列番号112
【化１７】
2016510984.tif 000018
配列番号116
【化１８】
2016510984.tif 000019
【００５６】
用語「血友病」/「凝固障害」/「凝血疾患」は、本明細書で用いる場合、通常の凝固カスケードの任意の凝血促進性成分の任意の質的又は量的な欠損、或いはフィブリン溶解の任意の上方制御により引き起こされ得る出血傾向の増加のことをいう。このような凝固障害は、先天性及び/又は後天性及び/又は医原性であり得る。
【００５７】
先天性凝固低下障害(hypocoagulopathies)の非限定的な例は、血友病A、血友病B、第VII因子欠損症、第X因子欠損症、第XI因子欠損症、フォン・ヴィルブランド疾患並びにグランツマン血小板無力症及びベルナール-スーリエ症候群のような血小板減少症である。前記血友病A又はBは、重度、中度又は軽度であり得る。血友病の臨床的重症度は、血液中のFIX/FVIIIの機能単位の濃度により決定され、軽度、中度又は重度に分類される。重度血友病は、正常レベルの1%未満に相当する0.01U/ml未満の凝固因子レベルにより定義されるが、中度及び軽度の患者は、それぞれ1〜5%及び5%超のレベルを有する。「インヒビター」(すなわち、第VIII因子に対するアロ抗体)保有血友病A及び「インヒビター」(すなわち、第IX因子に対するアロ抗体)保有血友病Bは、部分的に先天性で部分的に後天性である凝固障害の非限定的な例である。
【００５８】
本発明の一実施形態では、出血は、血友病A又はBと関連する。別の実施形態では、出血は、後天性インヒビター保有血友病A又はBと関連する。別の実施形態では、出血は、血小板減少症と関連する。別の実施形態では、出血は、フォン・ヴィルブランド疾患と関連する。別の実施形態では、出血は、重度の組織損傷と関連する。別の実施形態では、出血は、重度の外傷と関連する。別の実施形態では、出血は、手術と関連する。別の実施形態では、出血は、出血性胃炎及び/又は腸炎と関連する。別の実施形態では、出血は、胎盤早期剥離のような大量の子宮出血である。別の実施形態では、出血は、頭蓋内、耳内又は眼球内のような機械的止血の可能性が限られた器官で生じる。別の実施形態では、出血は、抗凝固療法と関連する。
【００５９】
用語「処置」は、本明細書で用いる場合、それを必要とする任意のヒト又はその他の脊椎動物対象の医療的治療のことをいう。前記処置は、予防的及び/又は治療的であり得る。
【００６０】
「投与の形態」:本発明による化合物は、非経口、例えば静脈内、筋内、皮下又は皮内で投与することができる。本発明による化合物は、予防的及び/又は治療的に(要求に応じて)投与することができる。
【００６１】
本発明による化合物は、1種又は複数のその他の治療剤又は製剤と共投与し得る。その他の薬剤は、本発明の化合物の効果を増進する薬剤であり得る。その他の薬剤は、患者のその他の症状又は状態を処置することを意図し得る。例えば、その他の薬剤は、鎮痛剤、その他の型の凝固因子又は止血及び/若しくはフィブリン溶解を調節する化合物であり得る。
【００６２】
本発明による化合物は、組換え核酸法により生成し得る。一般的に、本発明による分子をコードするDNA配列を発現ベクターに挿入し、これを次いで宿主細胞に形質転換又はトランスフェクト(一過的又は安定的に)する。宿主細胞(例えば酵母細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞)を、その後、分子の発現のために適切な条件下でインキュベートする。第X因子分子を、その後、単離できる。
【００６３】
本発明は、本発明の第X因子分子をコードするポリヌクレオチドにも関する。よって、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載する任意の第X因子分子をコードすることができるい。用語「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」は、本明細書において交換可能に用い、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形又はその類似体のことをいう。ポリヌクレオチドの非限定的な例は、遺伝子、遺伝子断片、メッセンジャーRNA(mRNA)、cDNA、組換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ及びプライマーを含む。本発明のポリヌクレオチドは、単離又は精製形で提供することができる。
【００６４】
選択されたポリペプチドを「コードする」核酸配列は、適当な調節配列の制御下に置かれたときにインビボでポリペプチドに転写(DNAの場合)及び翻訳(mRNAの場合)される核酸分子である。コード配列の境界は、5'(アミノ)末端の開始コドン及び3'(カルボキシ)末端の翻訳停止コドンにより決定される。本発明の目的のために、このような核酸配列は、それらに限定されないが、ウイルス、原核生物又は真核生物mRNAからのcDNA、ウイルス又は原核生物DNA又はRNAからのゲノム配列及び合成DNA配列さえ含むことができる。転写終結配列は、コード配列に対して3'にあることができる。
【００６５】
本発明のポリヌクレオチドは、なかでも配列番号3、8、108、112、120、160又はそのバリアント若しくは断片の配列を含むポリペプチドをコードすることができる。このようなポリヌクレオチドは、配列番号4、7、107、111、119又は159のいずれか1つの核酸配列からなるか又は該配列を含み得る。適切なポリヌクレオチド配列は、あるいは、これらの特定のポリヌクレオチド配列のうちの1つのバリアントであり得る。例えば、バリアントは、上記の核酸配列のいずれかの置換、欠失又は付加バリアントであり得る。
【００６６】
別の態様では、本発明は、本発明による第X因子分子を含む医薬組成物/製剤を提供する。例えば、本発明は、1種又は複数の薬学的に許容される担体(例えば保存剤、等張化剤、キレート剤、安定化剤及び界面活性剤の医薬組成物における使用は、当業者に公知である)とともに処方された医薬組成物を提供する。好ましくは、医薬製剤は、凍結乾燥製剤であり、これに対して医師又は患者が溶剤及び/又は希釈剤を使用前に添加する。さらなる態様では、医薬製剤は、水溶液及び緩衝液を含み、ここで、凝固因子は、1mg/ml以上の濃度で存在し、前記製剤は、約6.0〜約8.0、例えば約6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7,9又は8.0のpHを有する。
【００６７】
本発明による「FX誘導体」は、野生型第X因子に対して実質的に同じ又は改善された生物活性を示す本発明による第X因子分子であって、1種又は複数のアミノ酸が、例えばアルキル化、PEG化、アシル化、エステル形成又はアミド形成などにより化学改変されている第X因子分子を称することを意図する。
【００６８】
用語「延長性の基」/「半減期延長部分」は、本明細書において、-SH、-OH、-COOH、-CONH2、-NH2のような1つ若しくは複数の第X因子アミノ酸側鎖官能基又は1つ若しくは複数のN-及び/若しくはO-グリカン構造と結合した1つ又は複数の化学基のことをいうと理解される。前記半減期延長部分は、いくつかの治療的タンパク質/ペプチドのインビボ循環半減期を、これらのタンパク質/ペプチドとコンジュゲートした場合に増やすことができる。延長性の基/半減期延長部分の例は、生体適合性脂肪酸及びその誘導体、多糖類(例えばヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、例えばヒドロキシエチルデンプン(HES)、ヒアルロン酸(HA)、デキストラン、ポリシアリル酸(PSA)及びヘパロサンポリマー(HEP))、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ(Glyx-Sery)n(HAP)、ホスホリルコリンベースのポリマー(PCポリマー)、フレキシマー、ポリペプチド(例えばFcドメイン、トランスフェリン、アルブミン、エラスチン様ペプチド、XTENポリマー、アルブミン結合ペプチド及びCTPペプチド)並びにそれらの任意の組み合わせを含む。
【００６９】
本発明による「PEG化凝固因子」は、任意のアミノ酸残基又は炭水化物部分を含むタンパク質の任意の部分と結合した1つ又は複数のポリエチレングリコール(PEG)分子を有し得る。PEG(又はその他の半減期延長部分)を本発明によるタンパク質のグリカンにコンジュゲートするために、化学的及び/又は酵素的方法を採用できる。酵素的コンジュゲーション法の例は、例えばWO03031464(これは、本明細書にその全体が参照により組み込まれている)に記載されている。
【００７０】
グリカンは、自然に存在するものであってもよいし、又はこれは、例えば当技術分野において公知の組換え法を用いてN-結合グリカンの挿入により挿入してもよい。好ましい実施形態によると、本発明による第X因子分子/誘導体は、活性化ペプチド中に存在するグリカンの1つ又は複数にて半減期延長部分とコンジュゲートし、この場合、前記半減期延長部分は、分子の活性化の際に取り除かれる。
【００７１】
本発明による「HEP付加凝固因子」は、任意のアミノ酸残基又は炭水化物部分を含むタンパク質の任意の部分と結合したヘパロサン(HEP)ポリマーであり得る。
【００７２】
本発明による「システイン-コンジュゲート(例えばアシル化/peg化など)凝固因子分子/誘導体」は、タンパク質に存在するか又はタンパク質に導入されたシステインのスルフヒドリル基にコンジュゲートした1つ又は複数の半減期延長部分を有する。さらに、延長性の半減期延長部分を他のアミノ酸残基に連結することが可能である。
【００７３】
本発明による「システイン-PEG化凝固因子」は、タンパク質に存在するか又はタンパク質に導入されたシステインのスルフヒドリル基にコンジュゲートした1つ又は複数のPEG分子を有する。
【００７４】
本発明による「システイン-HEP付加凝固因子」は、タンパク質に存在するか又はタンパク質に導入されたシステインのスルフヒドリル基にコンジュゲートした1つ又は複数のHEP分子を有する。
【００７５】
「ヘパロサン」(HEP)は、(-GlcUA-1,4-GlcNAc-1,4-)反復を含む天然糖ポリマーである。これは、グリコサミノグリカン多糖ファミリーに属し、生理的pHにて負に荷電されるポリマーである。これは、ある種の細菌の莢膜で見出すことができるが、高等脊椎動物でも見出され、ここで、これは、天然ポリマーであるヘパリン及びヘパラン硫酸の前駆体として働く。HEPは、N-アセチル-a-D-グルコサミニダーゼ(NAGLU)及びβ-グルクロニダーゼ(GUSB)のようなリソソーム酵素により分解され得る。本発明で用いるためのヘパロサンポリマーは、典型的に、式(-GlcUA-ベータ1,4-GlcNAc-アルファ1,4-)nのポリマーである。HEPポリマーのサイズは、反復nの数により定義できる。前記反復nの数は、例えば2から約5,000までであり得る。反復の数は、例えば、50〜2,000単位、100〜1,000単位、5〜450又は200〜700単位であり得る。反復の数は、200〜250単位、500〜550単位又は350〜400単位であり得る。これらの範囲の任意の下限を、これらの範囲の任意の上限と組み合わせて、HEPポリマー中の単位の数の適切な範囲を形成してよい。
【００７６】
HEPポリマーのサイズは、その分子量により定義することもできる。分子量は、質量平均分子量のようなHEPポリマー分子の集団についての平均分子量であることができる。HEPポリマーのサイズに関して本明細書に記載する分子量の値は、実際上、厳密に列挙するサイズでないことがある。HEPポリマー生成中のバッチ間変動により、いくらかの変動が期待される。バッチ間変動を包含するために、よって、目標HEPポリマーサイズの周辺約+/-10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%又は1%の変動が期待できることが理解される。例えば、40kDaのHEPポリマーサイズは、40kDa+/-10%のことをいい、例えば40kDaは、例えば実際上38.8kDa又は41.5kDaを意味し得る。
【００７７】
HEPポリマーは、例えば500Da〜1,000kDaの分子量を有することができる。ポリマーの分子量は、500Da〜650kDa、5〜750kDa、10〜500kDa、15〜550kDa、25〜250kDa又は50〜175kDaであることができる。
【００７８】
本発明の目的のために、分子量は、第X因子分子の活性とコンジュゲートの半減期との間の適切なバランスを達成するために、これらの範囲内の特定のレベルで選択してよい。例えば、HEPポリマーの分子量は、5〜15kDa、15〜25kDa、25〜35kDa、35〜45kDa、45〜55kDa、55〜65kDa、65〜75kDa、75〜85kDa、85〜95kDa、95〜105kDa、105〜115kDa、115〜125kDa、125〜135kDa、135〜145kDa、145〜155kDa、155〜165kDa又は165〜175kDaから選択される範囲であり得る。他の実施形態では、分子量は、500Da〜21kDa、例えば1kDa〜15kDa、例えば5〜15kDa、例えば8〜17kDa、例えば10〜14kDa、例えば約12kDaであり得る。分子量は、20〜35kDa、例えば22〜32kDa、例えば25〜30kDa、例えば約27kDaであり得る。分子量は、35〜65kDa、例えば40〜60kDa、例えば47〜57kDa、例えば50〜55kDa、例えば約52kDaであり得る。分子量は、50〜75kDa、例えば60〜70kDa、例えば63〜67kDa、例えば約65kDaであり得る。分子量は、75〜125kDa、例えば90〜120kDa、例えば95〜115kDa、例えば100〜112kDa、例えば106〜110kDa、例えば約108kDaであり得る。分子量は、125〜175kDa、例えば140〜165kDa、例えば150〜165kDa、例えば155〜160kDa、例えば約157kDaであり得る。分子量は、5〜100kDa、例えば13〜60kDa及び例えば27〜40kDaであり得る。
【００７９】
特に興味深い実施形態では、FX分子にコンジュゲートされるHEPポリマーは、13〜65kDa、13〜55kDa、13〜50kDa、13〜49kDa、13〜48kDa、13〜47kDa、13〜46kDa、13〜45kDa、13〜44kDa、13〜43kDa、13〜42kDa、13〜41kDa、13〜40kDa、13〜39kDa、13〜38kDa、13〜37kDa、13〜36kDa、13〜35kDa、13〜34kDa、13〜33kDa、13〜33kDa、13〜32kDa、13〜31kDa、13〜30kDa、13〜29kDa、13〜28kDa、13〜27kDa、13〜26kDa、13〜25kDa、13〜21kDa、25〜55kDa、25〜50kDa、25〜45kDa、27〜40kDa、27〜41kDa、27〜42kDa、27〜43kDa、27〜44kDa、30〜45kDa及び38〜42kDaから選択される範囲のサイズを有する。
【００８０】
分子量のこれらの範囲の任意の下限を、これらの範囲からの任意の上限と組み合わせて、本発明によるHEPポリマーの分子量の適切な範囲を形成してよい。
【００８１】
本明細書に記載するFXコンジュゲートに関連して、側鎖でのHEPの使用は、インビボ循環半減期を長くするための非常に柔軟性のある方法を提供する。なぜなら、HEPサイズの範囲は、半減期の著しい改善をもたらすからである。
【００８２】
HEPポリマーは、狭いサイズ分布(すなわち単分散)又は広いサイズ分布(すなわち多分散)を有し得る。多分散性のレベルは、式Mw/Mn(式中、Mw=質量平均分子量及びMn=数平均分子量)に基づいて数値で表すことができる。理想的な多分散ポリマーについてのこの等式を用いた多分散性の値は、1である。好ましくは、本発明で用いるためのHEPポリマーは、単分散である。ポリマーは、よって、約1である多分散性を有してよく、多分散性は、1.25未満、好ましくは1.20未満、好ましくは1.15未満、好ましくは1.10未満、好ましくは1.09未満、好ましくは1.08未満、好ましくは1.07未満、好ましくは1.06未満、好ましくは1.05未満であり得る。HEPの分子量サイズ分布は、アガロースゲルで泳動できる単分散サイズ標準物質(HA Lo-Ladder、Hyalose LLC社)との比較により測定できる。
【００８３】
あるいは、HEPポリマーのサイズ分布は、高性能サイズ排除クロマトグラフィー-多角度レーザ光散乱(SEC-MALLS)により決定することができる。このような方法を用いて、HEPポリマーの分子量及び多分散性を評価できる。ポリマーサイズは、酵素的生成方法において調節できる。UDP糖に対するHEP受容鎖のモル比を制御することにより、所望の最終HEPポリマーサイズを選択できる。
【００８４】
HEPポリマーは、同調酵素重合反応(synchronised enzymatic polymerisation)(US 20100036001)により調製できる。この方法は、大腸菌(E.coli)においてマルトース結合タンパク質融合構築物として発現できるパスツレラ・マルトシダ(Pasteurella multocida)からのヘパランシンセターゼI(PmHS1)を用いる。精製MBP-PmHS1は、これを糖ヌクレオチドの等モル混合物(GlcNAc-UDP及びGlcUA-UDP)に加えた場合に、同調された化学量論的に制御された反応において単分散ポリマーを生成できる。三糖開始剤(GlcUA-GlcNAc-GlcUA)を用いて反応を開始し、ポリマーの長さは、プライマー:糖ヌクレオチドの比率により決定される。重合反応は、糖ヌクレオチドの約90%が消費されるまで行う。ポリマーは、反応混合物から、アニオン交換クロマトグラフィーにより反応混合物から単離され、その後、安定な粉末に凍結乾燥される。
【００８５】
本発明によると、本明細書に記載する第X因子分子は、本明細書に記載するHEPポリマーにコンジュゲートされる。本明細書に記載する任意の第X因子分子は、本明細書に記載する任意のHEPポリマーと組み合わせ得る。炭水化物ポリマーのような半減期延長部分を糖タンパク質に連結するための一般的な方法は、オキシム、ヒドラゾン又はヒドラジン結合形成を含む。WO2006094810は、ヒドロキシエチルデンプンポリマーをエリスロポエチンのような糖タンパク質に結合する方法(これは、活性化エステル化学を用いることに関連する問題を回避する)について記載している。これらの方法では、ヒドロキシエチルデンプン及びエリスロポエチンは炭水化物部分上の過ヨウ素酸塩を用いて個別に酸化され、反応性カルボニル基は、ビス-ヒドロキシルアミン連結剤を用いて一緒にライゲーションされる。この方法は、オキシム結合を介してエリスロポエチンに連結されたヒドロキシエチルデンプンを創出する。同様のオキシムベースの連結法は、炭水化物ポリマーをGSCに結合させることであると想像できるが(WO2011101267を参照されたい)、このようなオキシム結合は、シン-及びアンチ-の両方の異性体の形で存在することが知られているので、ポリマーとタンパク質との間の連結は、シン-及びアンチ-の両方の異性体の組み合わせを含む。このような異性体混合物は、通常、長期間の反復投与のために用いられるタンパク質様医薬品において望ましくない。なぜなら、リンカー不均質性が、抗体作製のリスクをもたらし得るからである。
【００８６】
上記の方法は、さらに不利な点を有する。糖タンパク質を活性化するために必要な酸化プロセスでは、炭水化物残基の一部が化学的に切断され、炭水化物は、よって、最終コンジュゲートにおいてインタクトな形で存在しない。酸化プロセスは、さらに、生成物の不均質性をもたらす。なぜなら、酸化剤、すなわち過ヨウ素酸塩が、ほとんどの場合、どのグリカン残基を酸化するかに関して特異的でないからである。最終薬物コンジュゲートにおける生成物不均質性及びインタクトでないグリカン残基の存在はともに、免疫原性のリスクをもたらし得る。
【００８７】
炭水化物ポリマーを糖タンパク質に連結するための代替法は、マレイミド化学の使用(WO2006094810)に関する。例えば、炭水化物ポリマーにマレイミド基を与え、マレイミド基が標的タンパク質上のスルフヒドリル基と選択的に反応できる。連結は、よって、環状スクシンイミド基を含む。
【００８８】
本発明の関係では、HEPのような炭水化物ポリマーを、マレイミド基を介してチオ改変GSC分子に連結し、シアリルトランスフェラーゼにより糖タンパク質上のインタクトなグリコシル基に反応物を移行することにより、環状スクシンイミド基を含む連結を創出することが可能であることが示される。スクシンイミドベースの連結は、しかし、コンジュゲートを水溶液中に長期間貯蔵すると、加水分解開環を受けることがあり(Bioconjugation Techniques、G.T. Hermanson、Academic Press、第3版、2013 p. 309)、連結がインタクトのままであっても、開環反応が、最終コンジュゲートに対して位置異性体及び立体異性体の形の望ましくない不均質性を付与する。
【００８９】
上記のことからして、1)糖タンパク質のグリカン残基がインタクトな形で保存され、2)インタクトなグリコシル残基と半減期延長部分との間のリンカー部分に不均質性が存在しないような方式で半減期延長部分を糖タンパク質に連結することが好ましい。
【００９０】
当技術分野において、安定で異性体を含まないコンジュゲートが得られるように化合物が連結される、HEPのような半減期延長部分を第X因子グリカンのようなタンパク質グリカンにコンジュゲートする方法が必要とされている。
【００９１】
一態様では、本発明は、HEPと第X因子とのグリシルシアル酸シチジン1リン酸(GSC)ベースのコンジュゲーションに用いるための安定で異性体を含まないリンカーを提供する。本発明で用いるGSC出発材料は、化学合成できる(Dufner, G. Eur. J. Org. Chem. 2000、1467-1482)か、又はWO07056191に記載されるような化学酵素経路により得ることができる。GSC構造を以下に示す。
【化１９】
2016510984.tif 000020
【００９２】
一実施形態では、本発明によるコンジュゲートは、以下においてサブリンカー又はサブ連結ともいう以下の構造を含むリンカー:
【化２０】
2016510984.tif 000021
を含み、これは、以下の方式の1つでHEP-アミンとGSCとを接続する。
【化２１】
2016510984.tif 000022
【００９３】
強調した4-メチルベンゾイルサブリンカーは、よって、半減期延長部分と標的タンパク質とを連結する全連結構造の一部をなす。サブリンカーは、それ自体で、スクシンイミドベースのリンカー(スルフヒドリル基を用いてマレイミド反応から調製される)のような代替物と比較して安定な構造である。なぜなら、後者の型の環状連結は、コンジュゲートを水溶液中に長期間貯蔵すると、加水分解開環を受ける傾向にあるからである(Bioconjugation Techniques、G.T. Hermanson、Academic Press、第3版、2013 p. 309)。この場合の連結(例えばHEPと糖タンパク質上のシアル酸との間)はインタクトのままであっても、開環反応が、最終コンジュゲート組成物に位置異性体及び立体異性体の形の不均質性を付与する。
【００９４】
本発明によるコンジュゲートに関連するある利点は、よって、均質な組成物が得られること、すなわちリンカー構造及び安定性による異性体形成の傾向が著しく低減されることである。別の利点は、本発明によるリンカー及びコンジュゲートが、単純なプロセス、好ましくは1工程プロセスで生成できることである。
【００９５】
異性体は、不均質な生成物を導き、ヒトにおける不要な免疫応答のリスクを増加するので、望ましくない。HEPとGSCとの間の本発明で用いる4-メチルベンゾイルサブ連結は、立体異性体又は位置異性体を形成できない。
【００９６】
機能的HEPポリマーの調製のための方法は、US 20100036001に記載され、これは、例えば、アルデヒド-、アミン-及びマレイミド官能基化HEP試薬を列挙する。US 20100036001は、本明細書に完全に示されているがごとく本明細書にその全体が参照により組み込まれている。一連のその他の官能基改変HEP誘導体は、同様の化学を用いて入手可能である。本発明のある種の実施形態で用いるHEPポリマーは、US20100036001に記載される方法に従って、還元末端にて1級アミンハンドルを有して最初に生成される。
【００９７】
US20100036001に従って調製されるアミン官能基化HEPポリマー(すなわちアミンハンドルを有するHEP)は、N-スクシンイミジル4-ホルミルベンゾエートとの反応によりHEP-ベンズアルデヒドに変換して、その後、GSCのグリシルアミノ基と還元的アミノ化反応によりカップリングできる。得られるHEP-GSC生成物を、その後、シアリルトランスフェラーゼを用いて糖タンパク質に酵素によりコンジュゲートできる。
【００９８】
例えば、HEP上の前記アミンハンドルは、以下のスキームに従って、N-スクシンイミジル4-ホルミルベンゾエートとの反応により、ベンズアルデヒド官能基に変換できる。
【００９９】
【化２２】
2016510984.tif 000023
【０１００】
上記のスキームにおけるHEPアミン(1)から4-ホルミルベンズアミド化合物(2)への変換は、アシル活性型の4-ホルミル安息香酸との反応により行うことができる。
【０１０１】
N-スクシンイミジルは、アシル活性化基として選択し得るが、いくつかのその他のアシル活性化基が当業者に知られている。非限定的な例は、ペプチド化学から知られるように、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール-、1-ヒドロキシ-ベンゾトリアゾール-、ペンタフルオロフェニル-エステルを含む。
【０１０２】
ベンズアルデヒド官能基で改変されたHEP反応物は、乾燥した形で凍結(-80℃)貯蔵される場合に、長期間安定に保つことができる。
【０１０３】
あるいは、ベンズアルデヒド部分をGSC化合物と結合させることにより、アミン官能基化HEP部分とのコンジュゲーションに適切なGSC-ベンズアルデヒド化合物を得ることができる。この合成経路は、図2に描く。
【０１０４】
例えば、GSCは、中性pH条件下でN-スクシンイミジル4-ホルミルベンゾエートと反応して、反応性アルデヒド基を含有するGSC化合物を得ることができる。アルデヒド誘導体化GSC化合物(GSC-ベンズアルデヒド)は、次いで、HEP-アミン及び還元剤と反応して、HEP-GSC反応物を形成できる。
【０１０５】
上記の反応は逆にすることができるので、HEP-アミンをまずN-スクシンイミジル4-ホルミルベンゾエートと反応させてアルデヒド誘導体化HEP-ポリマーを形成し、これをその後、還元剤の存在下でGSCと直接反応させる。実際上、このことは、GSC-CHOの冗長なクロマトグラフィーによる取り扱いを排除する。この合成経路は、図3に図示する。よって、本発明の一実施形態では、HEP-ベンズアルデヒドをGSCと還元的アミノ化によりカップリングさせる。
【０１０６】
還元的アミノ化は、以下のように進行する2工程反応である。最初に、イミン(シッフ塩基としても知られる)を、アルデヒド成分とアミン成分  (本実施形態ではGSCのグリシルアミノ基)との間で形成する。イミンを、次いで、第2工程においてアミンに還元する。還元剤は、形成されたイミンをアミン誘導体に選択的に還元するように選択する。
【０１０７】
いくつかの適切な還元反応物が当業者に利用可能である。非限定的な例は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaBH3CN)、水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)、ピリジンボラン錯体(BH3:Py)、ジメチルスルフィドボラン錯体(Me2S:BH3)及びピコリンボラン錯体を含む。
【０１０８】
炭水化物の還元端への(例えばHEPポリマーの還元末端への)還元的アミノ化は可能であるが、これは、遅く、非効率的な反応であると全般的に記載されている(JC. Gildersleeve、Bioconjug Chem. 2008年7月; 19(7): 1485〜1490)。初期に形成されたイミンがケトアミンに転位するアマドリ反応のような副反応も可能であり、本発明の関係において以前に論じたように望ましくない不均質性を導く。
【０１０９】
ベンズアルデヒド誘導体のような芳香族アルデヒドは、このような転位反応を形成できない。なぜなら、イミンはエノール化できず、炭水化物由来イミンで典型的に見出される、必要とされる隣接ヒドロキシ基も欠くからである。ベンズアルデヒド誘導体のような芳香族アルデヒドは、よって、異性体を含まないHEP-GSC反応物を作製するための還元的アミノ化反応において特に有用である。
【０１１０】
還元的アミノ化化学を早く完結させるために、余分のGSC及び還元反応物を場合によって用いる。反応が完結すると、過剰(未反応)GSC反応物及び過剰の還元反応物のようなその他の小分子成分を、その後、透析、タンジェンシャルフロー濾過又はサイズ排除クロマトグラフィーにより取り除くことができる。
【０１１１】
シアリルトランスフェラーゼのための天然基質であるSia-CMPとGSC誘導体とはともに、荷電され親水性が高い多官能性分子である。さらに、これらは、特にpHが6.0未満である場合、長期間溶液中で安定でない。このような低pHでは、基質移行のために必要なCMP活性化基が、酸触媒リン酸ジエステル加水分解により失われる。よって、GSC及びSia-CMP誘導体の選択的改変及び単離は、CMP加水分解を回避するために、pHの注意深い制御と、迅速で効率的な単離法とを必要とする。
【０１１２】
本発明の一態様では、大きい半減期延長部分が、還元的アミノ化化学を用いてGSCにコンジュゲートされる。アリールアルデヒド、例えばベンズアルデヒドで改変されたHEPポリマーは、この型の改変のために最適であることが見出されている。なぜなら、これらは、還元的アミノ化条件下でGSCと効率的に反応できるからである。
【０１１３】
GSCは酸媒体中で加水分解を受けることがあるので、HEP-ベンズアルデヒドとのカップリング中に中性に近い又はわずかに塩基性の環境を維持することが重要である。HEPポリマー及びGSCはともに水溶性が高く、水性緩衝液系は、よって、pHを中性に近いレベルに維持するために好ましい。いくつかの有機及び無機の両方の緩衝液を用いることができる。しかし、緩衝液成分は、好ましくは、還元的アミノ化条件下で反応性でない。このことにより、例えば1級及びより少ない程度で2級アミノ基を含有する有機緩衝液系は除外される。当業者は、どの緩衝液が適切でどの緩衝液が適切でないかを理解している。適切な緩衝液のあるいくつかの例は、Bicine[N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン]、HEPES(4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジンエタンスルホン酸)、TES(2-{[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ}エタンスルホン酸)、MOPS[3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸]、PIPES[ピペラジン-N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)]及びMES[2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸]を含む。
【０１１４】
この方法を用いることにより、HEPのような半減期延長部分で改変され、異性体を含まない安定な連結を有するGSC反応物が効率的に調製でき、CMP活性化基の加水分解の機会を最小限にする単純なプロセスで単離できる。上記のいずれかの化合物を互いに反応させることにより、4-メチルベンゾイルサブリンカー部分を含むHEP-GSCコンジュゲートを創出できる。
【０１１５】
GSCは、チオブチロラクトンと反応させることによりチオール改変GSC分子(GSC-SH)を創出し得る。このような反応物は、マレイミド官能基化HEPポリマーと反応させて、HEP-GSC反応物形成し得る。この合成経路を図4に図示する。得られる生成物は、スクシンイミドを含む連結構造を有する。
【化２３】
2016510984.tif 000024
【０１１６】
しかし、スクシンイミドベースの(サブ)リンカーは、なかでも改変GSC反応物を水溶液中に長期間貯蔵すると、加水分解開環を受けることがあり、連結がインタクトのままであっても、開環反応が、位置異性体及び立体異性体の形の望ましくない不均質性を付与する。
【０１１７】
グリココンジュゲーションの方法
HEP-GSCコンジュゲートとポリペプチドとのコンジュゲーションは、ポリペプチド主鎖中の残基に存在するグリカンを介して行うことができる。この形のコンジュゲーションは、グリココンジュゲーションとも呼ばれる。
【０１１８】
システインアルキル化、リジンアシル化に基づくコンジュゲーション法及びタンパク質主鎖中のアミノ酸が関与する類似のコンジュゲーションとは対照的に、グリカンを介するコンジュゲーションは、HEPポリマーのようなより大きい構造を、生物活性をあまり妨害せずに生物活性タンパク質に結合させる魅力のある方法である。これは、親水性が高いグリカンが、一般的に、タンパク質表面から離れてかつ溶液から外に配向される傾向があり、タンパク質活性のために重要な結合表面を遊離のままにするからである。グリカンは、自然に存在するものであってもよいし、又はこれは、例えば当技術分野において公知の方法を用いてN-結合グリカンの挿入により挿入してもよい。
【０１１９】
HEPポリマーのグリココンジュゲーションのための方法は、ガラクトースオキシダーゼベースのコンジュゲーション(WO2005014035)及び過ヨウ素酸塩ベースのコンジュゲーション(WO08025856)を含む。シアリルトランスフェラーゼに基づく方法は、長年にわたって、穏やかで第X因子のような血液凝固因子上のN-グリカン又はO-グリカンを改変するための選択性が高いことが証明されている。
【０１２０】
GSCは、シアリルトランスフェラーゼの使用により糖タンパク質に移行できるシアル酸誘導体である。これは、グリシルアミノ基上のPEG又はHEPのような置換基で選択的に改変でき、シアリルトランスフェラーゼの使用により糖タンパク質に酵素によりまだ移行できる。GSCは、酵素プロセスにより大規模で効率的に調製できる(WO07056191)。
【０１２１】
本発明の一態様では、第X因子グリカン上の末端シアル酸は、シアリダーゼ処理により取り除いて、アシアロFXをもたらすことができる。アシアロFX及びHEPで改変したGSCは一緒に、シアリルトランスフェラーゼの基質として働く。シアリルトランスフェラーゼ反応の生成物は、グリカン上のインタクトなグリコシル連結基により連結されたHEPを有するHEP-FXコンジュゲートである。
【０１２２】
シアリルトランスフェラーゼ
シアリルトランスフェラーゼは、自然に活性化されたシアル酸(Sia)-CMP(シチジン1リン酸)化合物から例えばタンパク質上のガラクトシル部分にシアル酸を移動させるグリコシルトランスフェラーゼのクラスである。多くのシアリルトランスフェラーゼ(ST3GalIII、ST3GalI、ST6GalNAcI)は、なかでも40kDa PEGのような大きい基でC5アセトアミド基上で改変されたシアル酸-CMP(Sia-CMP)誘導体を移動させることができる(WO03031464)。本発明で用いることができる適切なシアリルトランスフェラーゼの広範囲であるが非限定的なリストは、WO2006094810(これは、本明細書にその全体が参照により組み込まれている)に開示されている。
【０１２３】
本発明の一態様では、糖タンパク質上の末端シアル酸は、シアリダーゼ処理により取り除いて、アシアロ糖タンパク質をもたらすことができる。アシアロ糖タンパク質及び半減期延長部分で改変されたGSCは一緒に、シアリルトランスフェラーゼの基質として働く。この反応の生成物は、インタクトなグリコシル連結基、この場合はインタクトなシアル酸リンカー基により連結された半減期延長部分を有する糖タンパク質コンジュゲートである。
【０１２４】
HEP-FXコンジュゲートの特性
本発明のコンジュゲートは、様々な有利な生物学的特性を示すことがある。例えば、コンジュゲートは、適切な対照第X因子分子と比較した場合に、以下の非限定的な利点の1つ又は複数を示すことがある。インビボ循環半減期の改善、インビボ平均滞留時間の改善及びインビボ生分解性の改善。
【０１２５】
利点は、本発明のコンジュゲートを適切な対照第X因子分子と比較した場合に観察できる。対照分子は、例えば、非コンジュゲート第X因子分子であり得る。コンジュゲート対照は、水溶性ポリマーにコンジュゲートした第X因子分子又はタンパク質に化学的に連結した第X因子分子であり得る。コンジュゲート第X因子対照は、対象のコンジュゲート中のHEP分子と同様のサイズの化学部分(タンパク質又は水溶性ポリマー)にコンジュゲートした第X因子ポリペプチドであり得る。水溶性ポリマーは、例えば、PEG、分岐PEG、デキストラン、ポリ(1-ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマル)又は2-メタクリロイロキシ-2'-エチルトリメチルアンモニウムホスフェート(MPC)であり得る。
【０１２６】
対照第X因子分子中の第X因子分子は、好ましくは、対象のコンジュゲート中に存在するのと同じ第X因子分子である。例えば、対照第X因子分子は、対象のコンジュゲート中の第X因子ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有し得る。対照第X因子は、対象のコンジュゲート中の第X因子ポリペプチドと同じ糖鎖付加パターンを有し得る。
【０１２７】
ここで開示するコンジュゲートは、好ましくは、適切な対照と比較した場合に、循環半減期又は平均滞留時間の改善を示す。本発明によるコンジュゲートは、野生型タンパク質分子と比較して循環半減期が改変され、好ましくは循環半減期が増加する。循環半減期は、好ましくは、少なくとも10%、好ましくは少なくとも15%、好ましくは少なくとも20%、好ましくは少なくとも25%、好ましくは少なくとも30%、好ましくは少なくとも35%、好ましくは少なくとも40%、好ましくは少なくとも45%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも55%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、好ましくは少なくとも100%、より好ましくは少なくとも125%、より好ましくは少なくとも150%、より好ましくは少なくとも175%、より好ましくは少なくとも200%、最も好ましくは少なくとも250%又は300%増加する。さらにより好ましくは、このような分子は、少なくとも400%、500%、600%又は700%さえ増加した循環半減期を有する。
【０１２８】
比較される活性が第X因子の生物活性、例えば凝固活性又はタンパク質分解である場合、対照は、本発明のHEPコンジュゲートに匹敵するサイズの水溶性ポリマーにコンジュゲートした適切な第X因子分子であり得る。
【０１２９】
コンジュゲートは、HEPの付加により改変されていない第X因子において観察される生物活性のレベルを保持しないことがある。好ましくは、本発明のコンジュゲートは、非コンジュゲート第X因子の生物活性をできる限り多く保持する。例えば、コンジュゲートは、非コンジュゲート第X因子対照の生物活性の少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%を保持し得る。上で論じたように、対照は、コンジュゲート中の第X因子分子と同じアミノ酸配列を有するが、HEPを欠く第X因子分子であり得る。コンジュゲートは、しかし、適切な対照と比較した場合に生物活性の改善を示し得る。ここでの生物活性は、凝固活性又はタンパク質分解活性のような本明細書に記載する第X因子の任意の生物活性であり得る。
【０１３０】
本発明のコンジュゲートの利点は、HEPポリマーが酵素により生分解可能であることである。本発明のコンジュゲートは、よって、好ましくは、インビボにて酵素により分解できる。
【０１３１】
用語「シアル酸」は、9炭素カルボキシル化糖のファミリーの任意のメンバーのことをいう。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、N-アセチルノイラミン酸(2-ケト-5-アセトアミド-3,5-ジデオキシ-D-グリセロ-D-ガラクトノヌロピラノソ-1-オン酸(頻繁にNeu5Ac、NeuAc、NeuNAc又はNANAと省略される)である。ファミリーの第2のメンバーは、N-グリコリルノイラミン酸(Neu5Gc又はNeuGc)であり、ここでは、NeuNAcのN-アセチル基がヒドロキシル化されている。第3のシアル酸ファミリーメンバーは、2-ケト-3-デオキシ-ノヌロソン酸(KDN)である(Nadanoら(1986) J. Biol. Chem. 261: 11550〜11557; Kanamoriら(1990) J. Biol. Chem. 265: 21811〜21819)。9-O-C1〜C6アシル-Neu5Ac、例えば9-O-ラクチルNeu5Ac又は9-O-アセチル-Neu5Acのような9-置換シアル酸も含まれる。シアル化手順におけるシアル酸化合物の合成及び使用は、1992年10月1日に公開された国際出願WO92/16640に開示されている。
【０１３２】
用語「シアル酸誘導体」は、1つ又は複数の化学部分で改変された上で定義するシアル酸のことをいう。改変基は、例えば、メチル基のようなアルキル基、アジド及びフルオロ基、又はその他の化学部分を結合させるためのハンドルとして機能できるアミノ若しくはチオール基のような官能基であり得る。例は、9-デオキシ-9-フルオロ-Neu5Ac及び9-アジド-9-デオキシ-Neu5Acを含む。この用語は、カルボキシル基又はヒドロキシル基の1つ若しくは複数のような1つ又は複数の官能基を欠くシアル酸も包含する。カルボキシル基がカルボキサミド基又はエステル基で置き換えられた誘導体もこの用語に包含される。この用語は、1つ又は複数のヒドロキシル基がカルボニル基に酸化されたシアル酸のこともいう。さらに、この用語は、例えば過ヨウ素酸塩での酸化処理の後にC9炭素原子又はC9〜C8炭素鎖の両方を欠くシアル酸のこともいう。
【０１３３】
グリシルシアル酸は、NeuNAcのN-アセチル基がアミノアセチル基としても知られるグリシル基で置き換えられた、上記の定義に従うシアル酸誘導体である。グリシルシアル酸は、以下の構造で表すことができる。
【化２４】
2016510984.tif 000025
【０１３４】
用語「CMP-活性化」シアル酸又はシアル酸誘導体は、シアル酸部分及びシチジン1リン酸(CMP)を含む糖ヌクレオチドのことをいう。
【０１３５】
本記載では、用語「グリシルシアル酸シチジン1リン酸」は、GSCを表すために用い、同じCMP活性化グリシルシアル酸の代替名と同義である。代替名は、CMP-5'-グリシルシアル酸、シチジン-5'-モノホスホ-N-グリシルノイラミン酸、シチジン-5'-モノホスホ-N-グリシルシアル酸を含む。用語「インタクトなグリシル連結基」は、ポリペプチドとHEP部分との間にありこれらに共有結合した糖モノマーが、コンジュゲート形成中に例えばメタ過ヨウ素酸ナトリウムにより分解、例えば酸化されないグリコシル部分に由来する連結基のことをいう。「インタクトなグリコシル連結基」は、グリコシル単位の付加により自然に存在するオリゴ糖に由来してもよいし、又は親の糖構造から1つ若しくは複数のグリコシル単位を取り除くことに由来してもよい。
【０１３６】
用語「アシアロ糖タンパク質」は、1つ又は複数の末端のシアル酸残基が、例えばシアリダーゼでの処理又は化学的処理により取り除かれ、少なくとも1つのガラクトース又はN-アセチルガラクトサミン残基がガラクトース又はN-アセチルガラクトサミンの下にある「層」から露出している(「露出ガラクトース残基」)糖タンパク質を含むことを意図する。
【０１３７】
構造式中の開放端の点線は、開放原子価結合(すなわち、構造を他の化学部分に接続する結合)を表す。
【０１３８】
本発明による「融合タンパク質」は、もともと別々のタンパク質若しくはペプチド又はその断片をコードする2つ以上のDNA配列のインフレームでの接合により創出されるタンパク質である。融合タンパク質をコードするDNA配列の翻訳は、元のタンパク質又はペプチドのそれぞれに由来する機能的特性を有し得るタンパク質配列をもたらす。融合タンパク質をコードするDNA配列は、オーバーラップPCR又はDNAライゲーションのような標準的な分子生物学的方法により人工的に創出してよく、組み立ては、最初の5'端DNA配列中の停止コドンを排除し、3'端DNA配列中の停止コドンを保持して行われる。得られる融合タンパク質DNA配列を、例えば細菌、酵母、真菌、昆虫細胞又は哺乳動物細胞のような宿主生物中で異種融合タンパク質発現を支持する適当な発現ベクターに挿入し得る。
【０１３９】
融合タンパク質は、リンカー又は融合タンパク質のタンパク質若しくはペプチド部分を分けるスペーサペプチド配列を含み得る。リンカー又はスペーサペプチド配列は、個別のタンパク質又はペプチド部分の正しい折り畳みを容易にし、個別のタンパク質又はペプチド部分がそれらの個別の機能的特性を保持しやすいようにすることができる。リンカー又はスペーサペプチド配列は、完全融合タンパク質DNA配列を作り上げる個別のDNA断片のインフレームでの組み立て中、すなわちオーバーラップPCR又はDNAライゲーション中に融合タンパク質DNA配列に挿入し得る。
【０１４０】
用語「Fc融合タンパク質」は、本明細書において、任意の抗体アイソタイプに由来し得るFcドメインと融合した本発明による凝固因子を包含することを意味する。IgG Fcドメインが、IgG抗体の比較的長い循環半減期のために、頻繁に好ましい。Fcドメインは、例えば補体結合及び/又はある種のFc受容体との結合のようなある種のエフェクター機能を調節するためにさらに改変できる。FcRn受容体と結合する能力を有するFcドメインとの融合は、野生型凝固因子の半減期と比較して、融合タンパク質の循環半減期の延長を一般的にもたらす。IgG Fcドメイン中のアミノ酸234位、235位及び237位での変異は、一般的に、FcγRI受容体との結合の低減をもたらし、おそらくFcγRIIa及びFcγRIII受容体との結合の低減ももたらす。これらの変異は、FcRn受容体との結合を変更せず、これは、エンドサイトーシス再利用経路による長い循環半減期を促進する。好ましくは、本発明による融合タンパク質の改変IgG Fcドメインは、それぞれある種のFc受容体に対する親和性の減少(L234A、L235E及びG237A)及びC1q-媒介補体結合の低減(A330S及びP331S)をもたらす以下の変異の1つ又は複数を含む。あるいは、Fcドメインは、好ましくはS241P/S228P変異を含むIgG4 Fcドメインであり得る。
【０１４１】
以下は、本発明の非限定的な態様である
1.野生型第X因子中の「IVGG」モチーフ(配列番号1のアミノ酸195〜198)のN末端側に2〜10アミノ酸改変を含むトロンビン感受性第X因子分子であって、前記改変が、位置X10〜X1:
X10、X9、X8、X7、X6、X5、X4、X3、X2、X1、I、V、G、G
(ここで、X10〜X1は、任意の自然に存在するアミノ酸であり得る)
のいずれかにあるトロンビン感受性第X因子分子。
【０１４２】
2.X8が、Nであり、
X7が、Nであり、
X6が、Aであり、
X5が、Tであり、
X4が、L、I、M、F、V、P又はWからなる群から選択され、
X3が、Q、M、R、T、W、K、I又はVからなる群から選択され、
X2が、Pであり、
X1が、Rである、
態様1に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１４３】
3.X8が、Rであり、
X7が、Gであり、
X6が、Dであり、
X5が、Nであり、
X4が、L、I、M、F、V、P又はWからなる群から選択され、
X3が、T又はSからなる群から選択され、
X2が、Pであり、
X1が、Rである、
態様1に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１４４】
4.X4が、F、L、M及びWからなるリストから選択される、態様3に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１４５】
5.X3が、Tであり、X4が、Fである、態様3に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１４６】
6.X3が、Tであり、X4が、Mである、態様3に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１４７】
7.X3が、Tであり、X4が、Wである、態様3に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１４８】
8.X3が、Tであり、X4が、Lである、態様3に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１４９】
9.X9が、Aであり、
X8が、Tであり、
X7が、Nであり、
X6が、Aであり、
X5が、Tであり、
X4が、F、L、M、W、A、I、V及びPからなる群から選択され、
X3が、T、K、Q、P、S、Y、R、A、V、W、I及びHからなる群から選択され、
X2が、Pであり、
X1が、Rである。
態様1に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１５０】
10.X3が、T、K及びQからなるリストから選択される、態様9に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１５１】
11.X4が、F、L及びMからなるリストから選択される、態様9に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１５２】
12.X3が、Tであり、X4が、Fである、態様9に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１５３】
13.X3が、Tであり、X4が、Mである、態様9に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１５４】
14.X3が、Tであり、X4が、Wである、態様9に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１５５】
15.X3が、Tであり、X4が、Lである。態様9に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１５６】
16.X3が、Kであり、X4が、Lである。態様9に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１５７】
17.X3が、Kであり、X4が、Fである、態様9に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１５８】
18.X3が、Kであり、X4が、Mである、態様9に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１５９】
19.X3が、Qであり、X4が、Wである、態様9に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１６０】
20.X3が、Pであり、X4が、Wである、態様9に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１６１】
21.X10が、Pであり、
X9が、Eであり、
X8が、Rであり、
X7が、Gであり、
X6が、Dであり、
X5が、Nであり、
X4が、L、I、M、F、V、P又はWからなる群から選択され、
X3が、T又はSからなる群から選択され、
X2が、Pであり、
X1が、Rである、
態様1に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１６２】
22.X10が、Pであり、
X9が、Eであり、
X8が、Rであり、
X7が、Gであり、
X6が、Dであり、
X5が、Nであり、
X4が、Lであり、
X3が、Tであり、
X2が、Pであり、
X1が、Rである。
態様1に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１６３】
23.X10が、Pであり、
X9が、Eであり、
X8が、Rであり、
X7が、Nであり、
X6が、Aであり、
X5が、Tであり、
X4が、Lであり、
X3が、Tであり、
X2が、Pであり、
X1が、Rである、
態様1に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１６４】
24.X10が、Gであり、
X9が、Gであり、
X8が、Gであり、
X7が、Nであり、
X6が、Aであり、
X5が、Tであり、
X4が、Lであり、
X3が、Dであり、
X2が、Pであり、
X1が、Rである、
態様1に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１６５】
25.X10が、Sであり、
X9が、Tであり、
X8が、Pであり、
X7が、Sであり、
X6が、Iであり、
X5が、Lであり、
X4が、Lであり、
X3が、Kであり、
X2が、Pであり、
X1が、Rである、
態様1に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１６６】
26.X10が、Sであり、
X9が、Tであり、
X8が、Pであり、
X7が、Sであり、
X6が、Iであり、
X5が、Lであり、
X4が、Fであり、
X3が、Kであり、
X2が、Pであり、
X1が、Rである、
態様1に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１６７】
27.X10が、Tであり、
X9が、Rであり、
X8が、Pであり、
X7が、Sであり、
X6が、Iであり、
X5が、Lであり、
X4が、Fであり、
X3が、Tであり、
X2が、Pであり、
X1が、Rである、
態様1に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１６８】
28.X10が、Dであり、
X9が、Fであり、
X8が、Lであり、
X7が、Aであり、
X6が、Eであり、
X5が、Gであり、
X4が、Gであり、
X3が、Gであり、
X2が、Pであり、
X1が、Rである、
態様1に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１６９】
29.X10が、Nであり、
X9が、Eであり、
X8が、Sであり、
X7が、Tであり、
X6が、Tであり、
X5が、Kであり、
X4が、Iであり、
X3が、Kであり、
X2が、Pであり、
X1が、Rである、
態様1に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１７０】
30.第X因子分子のアミノ酸配列が、X10〜X1の外側の第X因子領域中の1つ又は複数のアミノ酸の挿入、欠失及び/又は置換により野生型第X因子の配列から異なる、態様1〜29のいずれか1つに記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１７１】
31.態様1〜30のいずれか1つに記載の第X因子分子と、場合によって1種又は複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬製剤。
【０１７２】
32.血友病の処置において用いるための、態様1〜30のいずれか1つに記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１７３】
33.IVGGモチーフ中のIle(配列番号1のアミノ酸195)が、I、L、T及びVからなるリストから選択される、態様1に記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１７４】
34.態様1〜30のいずれか1つに記載のトロンビン感受性第X因子分子を投与する工程を含む、処置を必要とする患者において血友病を処置する方法。
【０１７５】
35.態様1〜30のいずれか1つに記載のトロンビン感受性第X因子分子を調製する方法。
【０１７６】
36.活性化ペプチド中のグリカンを介して半減期延長部分に共有的にコンジュゲートしている、態様1〜30のいずれか1つに記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１７７】
37.活性化ペプチド中のシステイン残基を介して半減期延長部分に共有的にコンジュゲートしている、態様1〜30のいずれか1つに記載のトロンビン感受性第X因子分子。
【０１７８】
38.第X因子欠損症の処置において用いるための、態様1〜30のいずれか1つに記載のFX分子。
【０１７９】
39.態様1〜30のいずれか1つに記載の組換え第X因子分子をコードするDNA配列。
【０１８０】
40.態様39に記載のDNA配列を含む発現ベクター。
【０１８１】
41.態様40に記載の発現ベクター又は態様39に記載のDNA配列を含む宿主細胞。
【０１８２】
42.態様1〜30のいずれか1つに記載のトロンビン感受性第X因子分子を製造する方法であって、本発明による宿主細胞を適切な条件下でインキュベートし、その後、前記第X因子分子を単離する工程を含む方法。
【０１８３】
以下のさらなる実施形態のリストは、いずれの限定的な意味でも理解されるべきでない。全ての実施形態を組み合わせることができる。
【０１８４】
活性化ペプチド(FX「IVGG」モチーフのN末端側)中に2〜10アミノ酸改変(例えば2、3、4、5、6、7、8、9又は10アミノ酸改変)を含む第X因子分子。IVGGモチーフ位置:配列番号1のアミノ酸195〜198。
【０１８５】
以下のアミノ酸配列:X10、X9、X8、X7、X6、X5、X4、X3、X2、X1、I、V、G、G(配列番号2)(ここで、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7及びX8は、任意の自然に存在するアミノ酸であり得る)を含む、本発明による第X因子分子。自然に存在するアミノ酸のリストは、G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y及びWを含む。
【０１８６】
2〜4アミノ酸置換、例えば2、3又は4アミノ酸置換を含む、本発明による第X因子分子。
【０１８７】
改変が、X8〜X5にない、本発明による第X因子分子。したがって、X8は、Rであり、X7は、Gであり、X6は、Dであり、X5は、Nである。(X4、X3、X2及びX1は、任意の自然に存在するアミノ酸であり得る)、ここで、好ましいX1は、Rであり、好ましいX2は、Pであり、好ましいX3は、Q、M、R、T、W、K、I又はVから選択され、好ましいX4は、L、I、M、F、V、P又はWから選択される。
【０１８８】
改変が、X10〜X5及びX2〜X1にない、本発明による第X因子分子。したがって、前記FX分子は、好ましくは、2アミノ酸置換を含み、X10は、Pであり、X9は、Eであり、X8は、Rであり、X7は、Gであり、X6は、Dであり、X5は、Nであり、X2は、Tであり、X1は、Rである(X3及びX4は、X3にてL及びX4にてN以外の任意の自然に存在するアミノ酸であり得る)。
【０１８９】
X2位にてプロリンを含む、本発明による第X因子分子。
【０１９０】
X4が、疎水性又は脂肪族アミノ酸で置換され、好ましくはL、M、I、F、V、P及びWからなるリストから選択され、X3が、負荷電アミノ酸でなく、好ましくはQ、M、R、T、W、K、I及びVからなるリストから選択される、本発明による第X因子分子。
【０１９１】
X4が、L、M、I、F、V、P、Wからなるリストから選択される、本発明による第X因子分子。
【０１９２】
改変が、X10、X9、X8、X7及びX6並びにX3、X2及びX1にない、本発明による第X因子分子。したがって、前記FX分子は、好ましくは、2アミノ酸置換を含み、X5及びX4は、X5にてN及びX4にてN以外の任意の自然に存在するアミノ酸であり得る。
【０１９３】
X2及びX3が、X2位にてT及びX3位にてL以外の任意の自然に存在するアミノ酸であり得る、本発明による第X因子分子。
【０１９４】
X3及びX4が、X3位にてL及びX4位にてN以外の任意の自然に存在するアミノ酸であり得る、本発明による第X因子分子。
【０１９５】
改変が、X10、X9、X8、X7、X6、X5、X4及びX3にない、本発明による第X因子分子。したがって、前記第X因子分子は、好ましくは、2アミノ酸置換を含み、X2及びX1は、X2にてT及びX1にてR以外の任意の自然に存在するアミノ酸であり得る。好ましくは、X1は、Rである。好ましくは、X2は、Pである。
【０１９６】
IVGGモチーフ中のIle(配列番号1のアミノ酸195)が、L、T又はVで置換される、本発明による第X因子分子。
【０１９７】
X1が、好ましくはRである、本発明による第X因子分子。
【０１９８】
X2が、好ましくはPである、本発明による第X因子分子。
【０１９９】
アミノ酸挿入を含まない、本発明による第X因子分子。
【０２００】
X3が、T又はSであり、X2が、Pであり、X1が、Rである、本発明による第X因子分子。
【０２０１】
活性化ペプチド中に2アミノ酸置換を含む、本発明による第X因子分子。
【０２０２】
活性化ペプチド中に3アミノ酸置換を含む、本発明による第X因子分子。
【０２０３】
活性化ペプチド中に4アミノ酸置換を含む、本発明による第X因子分子。
【０２０４】
IVGG部位のN末端側のX1〜X10モチーフ中にN糖鎖付加配列モチーフ(N、X、T/S)を含む、本発明による第X因子分子。
【０２０５】
少なくとも1つのさらなる糖鎖付加部位を含む、本発明による第X因子分子。好ましくは、前記少なくとも1つのさらなる糖鎖付加部位は、活性化ペプチドに挿入され、好ましくは、N-糖鎖付加部位である。
【０２０６】
X8が、Nであり、X7が、Nであり、X6が、Aであり、X5が、Tであり、X4が、L、I、M、F、V、P又はWから選択され、X3が、Q、M、R、T、W、K、I又はVから選択され、X2が、Pであり、X1が、Rである、本発明による第X因子分子。
【０２０７】
X8が、Rであり、X7が、Gであり、X6が、Dであり、X5が、Nであり、X4が、L、I、F、M又はWから選択され、X3が、T又はSであり、X2が、Pであり、X1が、Rである、本発明による第X因子分子。
【０２０８】
半減期延長部分にコンジュゲートされている、本発明による第X因子分子。
【０２０９】
前記半減期延長部分が、例えばPSA又はHEPのような多糖である、本発明による第X因子分子。
【０２１０】
前記半減期延長部分が、生体適合性脂肪酸及びその誘導体、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、例えばヒドロキシエチルデンプン(HES)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ(Glyx-Sery)n(HAP)、ヒアルロン酸(HA)、ヘパロサンポリマー(HEP)、ホスホリルコリンベースのポリマー(PCポリマー)、フレキシマー、デキストラン、ポリシアル酸(PSA)、Fcドメイン、トランスフェリン、アルブミン、エラスチン様ペプチド、XTENポリマー、アルブミン結合ペプチド及びCTPペプチドからなるリストから選択される、先行する実施形態のいずれか1つによる第X因子分子。
【０２１１】
前記半減期延長部分が、活性化ペプチド中のグリカンを介してFXに共有的にコンジュゲートしている、本発明による第X因子分子。
【０２１２】
前記半減期延長部分が、シアル酸を介してFXに共有的にコンジュゲートしている、本発明による第X因子分子。
【０２１３】
前記分子の自己活性化が本質的に生じない、本発明による第X因子分子。このことは、例えば緩衝液又は血漿試料(例えば実施例に開示するように)中で測定できる。
【０２１４】
活性及び/又は活性化の速度が増加している(例えば実施例に開示するように)、本発明による第X因子分子。
【０２１５】
前記凝固因子中の変更された配列と挿入、欠失及び/又は置換の両側のフランキング15アミノ酸とのインシリコ予測MHC II親和性が、無作為ペプチドの大きい組の上位3%未満に順位付けされる、本発明による第X因子分子。好ましくは、親和性は、配列番号3中の変更された領域とフランキング15アミノ酸より低い。
【０２１６】
無細胞系におけるインビトロMHC II親和性が、野生型第X因子のMHC II親和性より低い、本発明による第X因子分子。
【０２１７】
インビボMHC II親和性が、野生型第X因子のMHC II親和性より低い、本発明による第X因子分子。
【０２１８】
細胞ベースのアッセイにおいてT細胞増殖を刺激しない、本発明による第X因子分子。
【０２１９】
前記分子の活性化が、X8〜X1の除去をもたらす、本発明による第X因子分子。
【０２２０】
前記分子の活性化が、X10〜X1の除去をもたらす、本発明による第X因子分子。
【０２２１】
X4〜X1が、少なくとも2アミノ酸置換を含む、本発明による第X因子分子。
【０２２２】
本発明による第X因子分子と、場合によって1種又は複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬製剤。
【０２２３】
本発明による第X因子分子と、1種又は複数の賦形剤とを含む液体水性製剤であって、前記賦形剤の1種又は複数が、第X因子活性に対する阻害効果を有する液体水性製剤。
【０２２４】
血友病の処置において用いるための、本発明による第X因子分子又は本発明による医薬製剤。
【０２２５】
インヒビター保有血友病の処置において用いるための、本発明による第X因子分子又は本発明による医薬製剤。
【０２２６】
手術及び/又は外傷に関連する血液喪失の処置において用いるための、本発明による第X因子分子又は本発明による医薬製剤。
【０２２７】
第X因子欠損症の処置において用いるための、本発明による第X因子分子又は本発明による医薬製剤。
【０２２８】
本発明による組換え凝固因子をコードするDNA配列。
【０２２９】
本発明によるDNA配列を含む発現ベクター。
【０２３０】
本発明による発現ベクター又は本発明によるDNA配列を含む宿主細胞。
【０２３１】
本発明による第X因子分子を製造する方法であって、本発明による宿主細胞を適切な条件下でインキュベートし、その後、前記第X因子分子を単離する工程を含む方法。
【０２３２】
IV投与のためである、本発明による医薬組成物。
【０２３３】
皮下又は皮内投与のためである、本発明による医薬組成物。
【０２３４】
本発明による医薬組成物を作製する方法であって、本発明による第X因子分子を、1種又は複数の薬学的に許容される賦形剤と混合する工程を含む方法。
【０２３５】
対象における血友病を処置する方法であって、治療量の本発明による第X因子分子又は本発明による医薬組成物を投与する工程を含む方法。
【０２３６】
対象におけるインヒビター保有血友病を処置する方法であって、治療量の本発明による第X因子分子又は本発明による医薬組成物を投与する工程を含む方法。
【実施例】
【０２３７】
本発明を、以下の非限定的な実施例においてさらに説明する。
【０２３８】
実施例で用いた略語:
AUS:アルスロバクター・ウレアファシエンス(Arthrobacter ureafaciens)シアリダーゼ
CMP:シチジン1リン酸
EDTA:エチレンジアミン4酢酸
Gla:(γ)-カルボキシグルタミン酸
GlcUA:グルクロン酸
GlcNAc:N-アセチルグルコサミン
Grx2:グルタレドキシンII
GSH:グルタチオン
GSSG:グルタチオンジスルフィド
HEP:ヘパロサン
HEP-FX:第X因子ポリペプチドにコンジュゲートしたヘパロサン(FX-HEPと交換可能に用いる)
HEP-[N]-FX:N-グリカンを介してFXにコンジュゲートしたヘパロサン。
HEP-[C]-FX:システインを介してFXシステイン変異体にコンジュゲートしたヘパロサン。
HEP-GSC:GSC官能基化ヘパロサンポリマー
HEP-NH2:アミン官能基化ヘパロサンポリマー
HEPES: 2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸
His:ヒスチジン
IV:静脈内
KO:ノックアウト
MRT:平均滞留時間
pdFX:血漿由来ヒト第X因子
PmHS1:パスツレラ・マルトシダヘパロサンシンターゼI
pNA:パラ-ニトロアニリン
SXa-11:第Xa因子発色性基質
UDP:ウリジン2リン酸
【０２３９】
(実施例1)
トロンビン感受性第X因子分子のタンパク質設計及び命名法
A.トロンビン感受性第X因子分子についてのタンパク質工学方策
第X因子の活性化ペプチドへのトロンビン感受性切断配列の導入を、以下に記載する4つのタンパク質工学方策を用いて達成した。野生型第X因子(配列番号1)のアミノ酸181及び191にある2つのN-グリカンが、第X因子及び改変第X因子分子の最適薬物動態プロファイルの維持のために重要であることが知られている(US 2011/0293597)。よって、これらの設計概念の全てにおける計画的な因子は、活性化ペプチド内に2つのN-結合糖鎖付加部位(糖鎖付加部位間の距離を同じに保つことが好ましい)を保持することとした。図5〜8は、タンパク質設計方策を示し、トロンビン感受性第X因子分子を作製するために用いた野生型第X因子配列への改変を示す。図5〜8に示すように、第X因子の配列は、野生型第X因子(配列番号1)中の成熟アミノ酸配列番号付けに従って、以下に対応する、4つの異なる領域に分割される:
1)フューリンにより切断されて2鎖448アミノ酸成熟酵素原の形の第X因子(軽鎖のC末端にてRKR配列を含む)を遊離する、-27位〜-1位の間のプロペプチド。
2)N-末端γ-カルボキシグルタミン酸リッチ(Gla)ドメインと2つの上皮増殖因子(EGF)ドメインとで構成される1位〜142位の間の軽鎖。
3)143位から194位の間にある活性化ペプチド領域。
4)195位〜448位の間の重鎖セリンプロテアーゼドメイン。Arg194〜Ile195ペプチド結合でのプロセシングにより、52アミノ酸活性化ペプチドが遊離されて酵素原第X因子の活性第Xa因子への活性化がもたらされる。
【０２４０】
図5は、フィブリノペプチドAの自然のトロンビン基質からの10アミノ酸を野生型第X因子のNLTR配列(アミノ酸191〜194;成熟アミノ酸配列(配列番号1)に従う番号付け)の直後に挿入する(US 2011/0293597も参照されたい)方策(ここで、方策1と称する)を図示する。用語「フィブリノペプチドA」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、フィブリノゲンのN末端からトロンビンにより切断される16アミノ酸の小ペプチドのことをいう。トロンビン感受性第X因子分子は、既知の基質中のトロンビン切断部位の上流の10アミノ酸配列(X10〜X1)が野生型第X因子中のNLTR配列(アミノ酸191〜194;成熟アミノ酸配列(配列番号1)に従う番号付け)の直後であって、IVGGモチーフのアミノ酸(アミノ酸195〜198;成熟アミノ酸配列に従う番号付け)の前に挿入されるように設計した。全ての自然の挿入配列は、X10X9X8X7X6X5X4X3X2R1(ここで、アミノ酸X10〜X2は、全ての自然に存在するアミノ酸:G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、Q、N、E、D、K、R、H、F、Y及びWから選択した)の形の挿入配列を与える、X1残基がアルギニン(R)に制限されるようなものである。
【０２４１】
図6は、8〜10アミノ酸配列(X10〜X1又はX8〜X1)が野生型第X因子中のNLTR配列(アミノ酸191〜194;成熟アミノ酸配列に従う番号付け)の直後であって、IVGGモチーフのアミノ酸(アミノ酸195〜198;成熟アミノ酸配列(配列番号1)に従う番号付け)の前に挿入されるようにトロンビン感受性第X因子分子を設計する方策(ここで、方策2と称する)を図示する。全ての挿入配列は、X10〜X5又はX8〜X5アミノ酸がヒトプロテアーゼ活性化受容体4(PAR4)(ここで、X10〜X1は、成熟PAR4配列(Wuら(1998) PNAS、95: 6642〜6646並びにNieman及びSchmaier (2007) Biochemistry、46: 8603〜8610)中のアミノ酸21〜30を表す)中のα-トロンビン切断部位に関してN末端側に位置する対応するアミノ酸を表すようなものである。対応する挿入配列は、よって、S10T9P8S7I6L5X4X3P2R1又はP8S7I6L5X4X3P2R1(ここで、アミノ酸X4及びX3は、全ての自然に存在するアミノ酸:G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、Q、N、E、D、K、R、H、F、Y及びWから選択した)の形のものであった。X3での好ましいアミノ酸は、以下のアミノ酸:Q、M、R、K、T、W、L、I、S及びVから選択され、好ましくは負でない。X4での好ましいアミノ酸は、脂肪族又は疎水性であり、以下のアミノ酸:L、I、M、F、V、P及びWから選択される。アミノ酸X2及びX1は、それぞれP及びRに制限される。
【０２４２】
図7は、野生型第X因子中のLTR配列(アミノ酸192〜194;成熟アミノ酸配列(配列番号1)に従う番号付け)をA6T5X4X3P2R1(ここで、アミノ酸X4及びX3は、全ての自然に存在するアミノ酸:G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、Q、N、E、D、K、R、H、F、Y及びWから選択した)の形の6アミノ酸配列(X6〜X1)で置き換えるようにトロンビン感受性第X因子分子を設計する方策(ここで、方策3と称する)を図示する。X3での好ましいアミノ酸は、以下のアミノ酸:Q、M、R、K、T、W、L、I、S及びVから選択され、好ましくは負でない。X4での好ましいアミノ酸は、脂肪族又は疎水性であり、以下のアミノ酸:L、I、M、F、V、P及びWから選択される。アミノ酸X2及びX1は、それぞれP及びRに制限され、R194(X1)は、元の配列から改変されない。NxT/SのN-糖鎖付加モチーフ及びN191(X7)の完全糖鎖付加を保つために、X6及びX5をそれぞれA及びTに固定する。このタンパク質設計アプローチは、以下の模型:A6T5X4の挿入、並びにR194をR1として保持するX3P2へのL192及びT193の変異誘発、に示すような3アミノ酸挿入及び2アミノ酸変異誘発により最終構築物が完全に具体化されるように、活性化ペプチドの自然の第X因子配列に対する変更を最小限にする。
【０２４３】
図8は、野生型第X因子中のNLTR配列(アミノ酸191〜194;成熟アミノ酸配列(配列番号1)に従う番号付け)がX4T3P2R1(ここで、アミノ酸X4は、自然に存在するアミノ酸:G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、Q、N、E、D、K、R、H、F、Y及びWから選択される)の形の4アミノ酸配列(X4〜X1)で置き換えられるようにトロンビン感受性第X因子分子を設計する方策(ここで、方策4と称する)を図示する。X4での好ましいアミノ酸は、脂肪族又は疎水性であり、以下のアミノ酸:L、I、M、F、V、P及びWから選択される。アミノ酸X3、X2及びX1は、それぞれT、P及びRに制限され、R194(X1)は元の配列から改変されない。NxT/SのN-糖鎖付加モチーフを保つために、X3をTに固定して、N-結合糖鎖付加部位をN190(X5)に導入した。このタンパク質設計アプローチは以下の模型:R194をR1として保持するX4T3P2へのN191、L192及びT193の変異誘発に示すような3アミノ酸改変により最終構築物が完全に具体化されるように、活性化ペプチドの自然の第X因子配列に対する変更を最小限にする。
【０２４４】
B.トロンビン感受性第X因子分子の命名についての命名法
本明細書に示す例示的なトロンビン感受性第X因子分子は、パートAにおいて上で論じるタンパク質設計方策に関連する以下の命名法により示す。方策1又は方策2のいずれかにより調製したトロンビン感受性第X因子分子について、全体を通して用いた命名法は、以下の一般的な術語を固守する:FX ins[194]>[X10X9X8X7X6X5X4X3X2X1](ここで、FX ins[194]は、野生型第X因子(配列番号1)中のアミノ酸194の後に挿入ペプチド配列を配置することをいい、[X10X9X8X7X6X5X4X3X2X1]又は[X8X7X6X5X4X3X2X1]は、野生型第X因子(配列番号1)のR194とI195との間の活性化ペプチド中に挿入された1文字表記アミノ酸配列のことをいう)。方策3により調製したトロンビン感受性第X因子分子について、全体を通して用いた命名法は、以下の一般的な術語を固守する:FX[191-194]>[X6X5X4X3X2X1](ここで、FX[191-194]は、野生型第X因子(配列番号1)のN191〜R194配列を含む4アミノ酸を、その1文字アミノ酸表記で言及する[X6X5X4X3X2X1]の6アミノ酸配列で置換したことをいう)。方策4により調製したトロンビン感受性第X因子分子について、全体を通して用いた命名法は、以下の一般的な術語を固守する:FX[191-194]>[X4X3X2X1](ここで、FX[191-194]は、野生型第X因子(配列番号1)のN191〜R194配列を含む4アミノ酸を、その1文字アミノ酸表記で言及する[X4X3X2X1]の4アミノ酸配列で置換したことをいう)。特定の例では、ここで示す改変トロンビン感受性第X因子分子は、C末端HPC4タグ(-HPC4)が精製の目的のために(ここで、用語「HPC4」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、親和性精製タグとして用いられるプロテインCからの11アミノ酸DQVDPRLIDGKの小ペプチドのことをいう)が付加されたか、又は野生型第X因子(配列番号1)のアミノ酸1〜47により定義されるN末端γ-カルボキシグルタミン酸リッチ(Gla)ドメインが欠失している(desGla-)さらなる改変を有する。よって、ここで示す改変トロンビン感受性分子は、定義したN末端(desGla-)又はC末端(-HPC4)改変を用いてそれらの命名法に添えることによりさらに記載できる。
【０２４５】
Table 1(表1)は、作製したトロンビン感受性第X因子分子を示し、命名法は、トロンビン感受性分子を創出するためのここで論じるような改変を示す。ここに示す配列番号は、列挙する第X因子分子のことをいう。トロンビン切断配列(X4〜X4')も列挙し、ここでは、切断がX1とX1'との間で生じる。
【表１Ａ】
2016510984.tif 000026
【表１Ｂ】
2016510984.tif 000027
【表１Ｃ】
2016510984.tif 000028
【表１Ｄ】
2016510984.tif 000029
【０２４６】
(実施例2)
消光蛍光ペプチド基質ライブラリーの作製
A.ライブラリー構築及び合成
固相樹脂Pal-ChemMatrixは、PCAS BioMatrix社から購入し、全てのFmoc-アミノ酸は、Fmoc-Lys(Dnp)-OH(IRIS Gmbh社、Germany)及びFmoc-Lys(retro Boc)Abz (Bachem社)以外は、Protein technologies社からであった。Oxyma Pureは、Merck社(Switzerland)から購入し、N-メチル-ピロリジノン(NMP)、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、トリフルオロ酢酸(TFA)は、ペプチドグレードであり、Biosolve社(Netherlands)から得た。
【０２４７】
Lys(Dnp)-ATNATX4X3PRIVGG-Lys(Abz)(配列番号237)のアミノ酸配列を有するo-アミノ安息香酸(Abz)蛍光ドナーと2,4-ジニトロフェニル(Dnp)消光剤部分とを用いる消光蛍光ペプチド基質ライブラリーを、システイン以外のX4及びX3における全ての可能な自然のアミノ酸の組み合わせを無作為化することにより構築した。消光蛍光ペプチド基質(QF基質)は、標準的なFmoc方策により、96ウェルマイクロタイターフィルタプレート(Nunc社)中のMultipep RS(Intavis社、Germany)上で合成した。各ウェルに、15mgの樹脂を分配し、各合成サイクルにおいて3回のカップリングを行った。単一のカップリング工程は、各ウェルに90μL Fmoc-アミノ酸(0.3M Oxymapure含有NMP中に0.3M)+30μL DIC及び30μLコリジンを加えることからなった。アミノ酸を樹脂に加える前に、アミノ酸を、multipep RSの製造者の使用説明に従って、ミキサーバイアル中で予備活性化した。1回目のカップリング工程は、15分間カップリングし、カップリング工程2は、1時間カップリングし、カップリング工程3は、3時間カップリングした。カップリング工程3の後に、製造者により記載されるようにマニホルドを用いて300μL NMPを各ウェルに5回用いて樹脂を洗浄した。Fmoc基の脱保護工程は、200μL 25%ピペリジンを各ウェルに2回加えることにより達成した。1回目の脱保護工程は2分間進行させ、2回目の工程は8分間進行させた。最後の脱保護工程の後に、樹脂を以前に記載したようにして洗浄した。
【０２４８】
固相合成反応の後に、300μLを各ウェルに加えることによりエタノールで樹脂を7回洗浄した。樹脂を一晩乾燥させ、その後、92% TFA中の4%トリイソプロピルシラン、1%チオアニソール及び3% H2Oを用いて脱保護した。このことは、フィルタプレートを、2mLディープウェルコレクタプレートの頂部に置くことにより行った。次いで、250μL TFAを各ウェルに加え、TFAを流した。2分後に、これを繰り返し、5分後に、別の250μLを加え、1〜2時間放置した。樹脂を、2×250μL TFAで(上記のようにして)洗浄し、回収したTFAをおよそ100〜150μLまでアルゴン流により濃縮した。ペプチドをジエチルエーテルで沈殿させ、フィルタプレート(Solvinert、Millipore社)に移し、沈殿ペプチドをジエチルエーテルで5回洗浄した。Solvinertフィルタプレートを2mlディープウェルプレート(マスタープレート)の頂部におき、ペプチドを80% DMSO(H2O中)に溶解した。フィルタプレートを穏やかに一晩振とうし、次いで、Waters真空マニホルド中で排出によりマスタープレートにペプチドを移した。4つのライブラリープレートのそれぞれからの5つの無作為に選択したペプチドをMALDIにより分析して、それが何であるかを確認した。
【０２４９】
B.消光蛍光ペプチド基質についてのストック濃度の決定
自前で(上記)又は外部供給業者(Aurigene社、Bangalore、India)が合成した消光蛍光基質(QF基質)試料は、それぞれ、典型的に80% DMSO中で貯蔵したか、又は凍結乾燥粉末から100%DMSO中に再懸濁した。QFペプチド基質のストックのモル濃度は、以下の2つの方法のうちの一方により、2,4-ジニトロフェニル(Dnp)消光剤部分の吸光度から典型的に決定した。最初の例では、ストック濃度は、Dnp消光剤部分についての吸光係数17,300M-1cm-1(Carmonaら(2006) Nature Protocols 1: 1971〜1976)を用いて、QF基質ペプチド溶液の365nmでの吸光度から直接決定した。濃度を決定するために、ストック試料(およそ5〜20mM)を、96ウェルポリプロピレンプレート中の新鮮なDMSO中で1:10及び1:100に系列希釈した。Nanodrop-1000を用いて、1:100又は1:10希釈の2μL試料の吸光度を定量して、1nm光路長でUV/Visモードにおいて0.1〜0.8AUの吸光度読み取りを達成した。読み取りは、独立して希釈した試料から1点につき2重に獲得して、平均した。QF基質の濃度(mM)を、次いで、1mm光路長について補正する以下の等式から決定した:
[QF基質]=((Abs365×希釈率×10)/吸光係数)×1000
【０２５０】
QF基質ライブラリーは、およそ4500μM(すなわち4.5mM)のストック濃度まで典型的に調製した。各基質プレート(96ウェル)を、500μMの推定濃度まで100%DMSO中で(10μLのストック+80μLのDMSO)希釈した。この希釈物を用いて、40μLを60μLのアッセイ緩衝液(50mM Hepes、150mM NaCl、10mM CaCl2、0.1% PEG8000、pH7.4)と混合することにより、定量のための希釈プレートを調製した。希釈QFペプチド基質ストックの365nmでの吸光度は、Molecular Devices吸光分光計を用いて2重の読み取りで定量し、これらを平均した。各QFペプチド基質の濃度は、50%DMSO/アッセイ緩衝液中で希釈した対照QFペプチド基質の標準曲線(0〜450nM)との比較により、その後、確認した。対照QFペプチドストック溶液の濃度は、上記のようにして365nmでの吸光度から直接決定した。
【０２５１】
(実施例3)
トロンビン切断についての運動速度定数を評価するための消光蛍光ペプチドライブラリーのスクリーニング
QFペプチド基質ライブラリーについての切断速度を決定するために、トロンビンによる基質切断の反応速度を評価するための進度曲線プロトコールを設計した。進度曲線法は、反応が単純なミカエリス・メンテン機序に従い、基質と酵素の遭遇する複合体が限定する(すなわち擬1次反応)と仮定した。[QF基質]<<KMの条件下で、この方法により、完全反応進度曲線(すなわち経時的な基質の完全加水分解)の指数関数フィットからkcat/KMを見積もることが可能になった。各QF基質(プレートあたり96まで)のストック濃度は、上の実施例2に記載するプレート法を用いて、およそ3500〜4500μMの範囲内であることを確認した。切断反応を開始するために、QFペプチド基質(96ウェルフォーマットでの)をまず、10μLのストック基質+80μL DMSOを混合し、その後、20μlの希釈物1+80μLアッセイ緩衝液(20%DMSO中におよそ100μM)及び次いで20μLの希釈物2+180μLアッセイ緩衝液(2%DMSO中におよそ10μM)をとってアッセイ緩衝液(50mM Hepes、150mM NaCl、10mM CaCl2、0.1% PEG8000、pH7.4)中で2回系列希釈することにより、100%DMSO中でおよそ500μMに希釈した。ヒト血漿精製α-トロンビンをストックから、アッセイ緩衝液中で1μMの作業濃度まで希釈した。進度曲線反応は、100μLのQF基質希釈物3(2%DMSO中におよそ10μM)を、80μLのアッセイ緩衝液及び20μLの1μMトロンビンと96ウェル黒色アッセイプレート中で合わせることにより開始した。反応は、Molecular Devices蛍光分光計で3時間、37℃にて、320nmの励起波長及び420nmの発光波長を用い、いずれのカットオフフィルタも用いずに追跡した。
【０２５２】
SoftMax Proソフトウェアを用いて回収したデータを.txtファイルとして、Excel分析テンプレートを用いる分析及びGraphPad/Prismソフトウェアスイートを用いる非線形回帰分析のためにエクスポートした。進度曲線は、以下の等式にフィットさせた:
Y=F0+Fmax*(1-exp(-E*k*x))
(式中、x=反応時間、F0=初期蛍光強度、Fmax=完全加水分解での最大蛍光強度、k=M-1s-1の単位でのkcat/KMの形の運動速度定数、E=M単位での酵素濃度)。
【０２５３】
Table 2(表2)及びTable 3(表3)は、それぞれ、消光蛍光ポジショナルスキャニングライブラリーのスクリーニングから得られたデータと、自然のトロンビン切断配列に基づく合理的に設計した消光蛍光基質の組とを示す。消光蛍光ポジショナルスキャニングライブラリー(X4/X3)は、PAR1トロンビン切断配列(Table 2[表2])に基づくが、ライブラリーがLys(Dnp)-ATNATX4X3PRIVGG-Lys(Abz)(ここで、Lys(Dnp)及びLys(Abz)(配列番号238)は、それぞれ蛍光消光剤及びドナー部分である)の形のものであるようなIVGGの固定プライム側面配列を用いた。自然のトロンビン切断配列に基づいて合理的に設計したQF基質(Table 3[表3])は、Aurigene社(Bangalore、India)により合成し、ライブラリーがLys(Dnp)-X10X9X8X7X6X5X4X3X2X1IVGG-Lys(Abz)(ここで、Lys(Dnp)及びLys(Abz)(配列番号239)は、それぞれ蛍光消光剤及びドナー部分である)の形のものであるようなIVGGの固定プライム側面配列も含んだ。データは、Tables 2及び3(表2及び3)に、順位付けしたkcat/KM速度定数、標準偏差、%CV並びにPAR1対照基質配列[Lys(Dnp)-ATNATLDPRIVGG-Lys(Abz)](配列番号241)及びフィブリノペプチドA(FpA)基質配列[Lys(Dnp)-DFLAEGGGVRIVGG-Lys(Abz)](配列番号240)に対する改善の倍数として示す。
【０２５４】
親のPAR-1配列に対して20倍超の切断速度(kcat/KM)の改善を有し、FpA基質配列に対して120倍までの切断速度の改善を有する少なくとも20配列を、QF基質ライブラリーから選択した。同様に、いくつかの自然のトロンビン配列(Table 3[表3])は、PAR-1対照のものから5〜14倍の切断速度の改善と、FpA対照基質配列に対して100倍までの切断速度の改善とを示した。最も改善された自然の基質は、FpA_P配列であったことが示され、これは、自然に存在するバリンの代わりにX2にてプロリン残基を有する。QF基質ライブラリースクリーニングの結果に基づいて、以下の好ましい配列モチーフを、X4、X3及びX2について決定し、X1アミノ酸はアルギニン(R)に固定した。X2での好ましいアミノ酸はプロリン(P)であるが、X3での好ましいアミノ酸は比較的柔軟であり、Q、M、R、T、W、K、I又はVから選択されるが、負又はプロリンでない。X4位での好ましいアミノ酸はより制限され、ほとんど脂肪族又は疎水性であり、L、I、M、F、V、P又はWから選択されるが、荷電されておらず、G、S又はTから選択されない。
【表２Ａ】
2016510984.tif 000030
【表２Ｂ】
2016510984.tif 000031
【表２Ｃ】
2016510984.tif 000032
【表２Ｄ】
2016510984.tif 000033
【表２Ｅ】
2016510984.tif 000034
【表２Ｆ】
2016510984.tif 000035
【表２Ｇ】
2016510984.tif 000036
【表２Ｈ】
2016510984.tif 000037
【表２Ｉ】
2016510984.tif 000038
【表２Ｊ】
2016510984.tif 000039
【表３Ａ】
2016510984.tif 000040
【表３Ｂ】
2016510984.tif 000041
【０２５５】
(実施例4)
第Xa因子切断についての運動速度定数を評価し、トロンビン特異的切断配列を同定するための消光蛍光ペプチドライブラリーのスクリーニング
目的は、第Xa因子による切断について最低の速度をさらに示す、上の実施例3に関してここに記載する好ましいトロンビン切断配列を同定することであった。QFペプチド基質ライブラリーについての切断速度を決定するために、トロンビンのものに対する第Xa因子による基質切断の反応速度を評価するための進度曲線プロトコールを設計した。プロトコールは、わずかな改変を加えた以外は本質的にα-トロンビンについて上記したとおりであった。進度曲線法は、反応が単純なミカエリス・メンテン機序に従い、基質と酵素の遭遇する複合体が限定する(すなわち擬1次反応)と仮定した。[QF基質]<<KMの条件下で、この方法により、完全反応進度曲線(すなわち経時的な基質の完全加水分解)の指数関数フィットからkcat/KMを見積もることが可能になった。各QF基質(プレートあたり96まで)のストック濃度は、上の実施例2に記載するプレート法を用いて、およそ3500〜4500μMの範囲内であることを確認した。切断反応を開始するために、QFペプチド基質(96ウェルフォーマットでの)をまず、10μLのストック基質+80μL DMSOを混合し、その後、20μlの希釈物1+80μLアッセイ緩衝液(20%DMSO中におよそ100μM)及び次いで20μLの希釈物2+180μLアッセイ緩衝液(2%DMSO中におよそ10μM)をとってアッセイ緩衝液(50mM Hepes、150mM NaCl、10mM CaCl2、0.1% PEG8000、pH7.4)中で2回系列希釈することにより、100%DMSO中でおよそ500μMに希釈した。ヒト血漿精製第Xa因子(Molecular Innovations, Inc社、Novi MI、USA)をストックから、アッセイ緩衝液中で4μMの作業濃度まで希釈した。進度曲線反応は、100μLのQF基質希釈物3(2%DMSO中におよそ10μM)を、80μLのアッセイ緩衝液及び20μLの4μMトロンビンと96ウェル黒色アッセイプレート中で合わせることにより開始した。反応は、Molecular Devices蛍光分光計で3時間、37℃にて、320nmの励起波長及び420nmの発光波長を用い、いずれのカットオフフィルタも用いずに追跡した。SoftMax Proソフトウェアを用いて回収したデータを.txtファイルとして、Excel分析テンプレートを用いる分析及びGraphPad/Prismソフトウェアスイートを用いる非線形回帰分析のために書き出した。進度曲線は、以下の等式にフィットした:
Y=F0+Fmax*(1-exp(-E*k*x))
(式中、x=反応時間、F0=初期蛍光強度、Fmax=完全加水分解での最大蛍光強度、k=M-1s-1の単位でのkcat/KMの形の運動速度定数、E=M単位での酵素濃度)。
【０２５６】
Table 4(表4)及びTable 5(表5)は、それぞれ、消光蛍光ポジショナルスキャニングライブラリーのスクリーニングから得られたデータと、自然のトロンビン切断配列に基づく合理的に設計した消光蛍光基質の組とを示す。消光蛍光ポジショナルスキャニングライブラリー(X4/X3)は、PAR1トロンビン切断配列(Table 4[表4])に基づくが、ライブラリーがLys(Dnp)-ATNATX4X3PRIVGG-Lys(Abz)(ここで、Lys(Dnp)及びLys(Abz)(配列番号238)は、それぞれ蛍光消光剤及びドナー部分である)の形のものであるようなIVGGの固定プライム側面配列を用いた。自然のトロンビン切断配列に基づいて合理的に設計したQF基質(Table 5[表5])は、Aurigene社(Bangalore、India)により合成し、ライブラリーがLys(Dnp)-X10X9X8X7X6X5X4X3X2X1IVGG-Lys(Abz)(ここで、Lys(Dnp)及びLys(Abz)(配列番号239)は、それぞれ蛍光消光剤及びドナー部分である)の形のものであるようなIVGGの固定プライム側面配列も含んだ。データは、Tables 4及び5(表4及び5)に、順位付けした機能的選択性の計算[ここで、機能的選択性は、特異性の比率(FXa kcat/KMで除したFIIa kcat/KM)を乗じたα-トロンビン(FIIa)切断についてのkcat/KM値として定義される]として示す。ここに記載するように、高い機能的選択性の値を有するQF基質配列は、第Xa因子と比較してα-トロンビンによる切断について最大の特異性と組み合わさったα-トロンビン切断の最高の速度を有する配列の代表である。特異性の比率と、基質ライブラリーの第Xa因子切断及びトロンビン(FIIa)切断についてのkcat/KMの値(実施例3から再現したデータ)も、FXa切断データについて示す標準偏差及び%CVとともに示す。
【０２５７】
400倍超の特異性の比率を有する5配列を、QF基質ライブラリーから選択した(Table 4[表4])。よって、ここに示すQF基質配列のうち、FTPR、FKPR、LKPR、WQPR及びWPPRの配列(X4〜X1)は、最高の特異性の比率を示した。これらの5配列に加えて、配列MTPR、WTPR及びMKPRは、およそ300倍の特異性の比率を示したが、7.0E+06〜1.0E+07の機能的選択性の値も示した。
【表４Ａ】
2016510984.tif 000042
【表４Ｂ】
2016510984.tif 000043
【表４Ｃ】
2016510984.tif 000044
【表４Ｄ】
2016510984.tif 000045
【表４Ｅ】
2016510984.tif 000046
【表４Ｆ】
2016510984.tif 000047
【表４Ｇ】
2016510984.tif 000048
【表４Ｈ】
2016510984.tif 000049
【表４Ｉ】
2016510984.tif 000050
【表４Ｊ】
2016510984.tif 000051
【表５】
2016510984.tif 000052
【０２５８】
(実施例5)
トロンビン、FXa及びFVIIaによる活性化についての運動速度定数を評価するためのトロンビン感受性FX分子のスクリーニング
工学的に操作したトロンビン感受性FX分子についての活性化速度を決定するために、トロンビン、FXa及びFVIIaによる活性化の反応速度を評価するための進度曲線プロトコールを用いる。進度曲線法は、反応が単純なミカエリス・メンテン機序に従い、基質(例えばFX分子)と酵素(例えば活性化プロテアーゼ)の遭遇する複合体が限定する(すなわち擬1次反応)と仮定した。[FX分子]<<KMの条件下で、この方法により、完全反応進度曲線(すなわち経時的なFXの完全活性化)の指数関数フィットからkcat/KMを見積もることが可能になる。方法は、わずかな改変を加えて、Louvain-Quintardら((2005) JBC、280: 41352〜41359)により本質的に記載されるとおりに行う。簡単に述べると、トロンビン感受性FX分子(およそ10〜50nM)は、アッセイ緩衝液(50mM Hepes、150mM NaCl、10mM CaCl2、0.1% PEG8000、0.1% BSA、pH 7.4)で37℃にて希釈する。活性化反応は、ヒトα-トロンビンを2〜5nMの最終濃度まで加えることにより引き起こす。指定時刻の間隔にて、試料を取り出し、トロンビン反応について過剰のヒルイジン(100〜200nM)、FVIIa反応についてEDTA、又はFXa反応についてわずかに過剰の特異的FXa阻害剤であるエコチンで消光する。FXaへのFX活性化の進度は、消光した試料のFXa活性を、特異的蛍光発生性FXa基質であるPefafluor Xa(Pentapharm社、Switzerland)を用いて測定し、既知の量のFXaの標準曲線との比較により追跡する。進度曲線は、以下の等式にフィットさせた:
Y=FXa0+FXamax*(1-exp(-E*k*x))
(式中、x=反応時間、FXa0=試料中の初期FXa量(もしあるならば)、FXamax=完全活性化での最大FXa量、k=M-1s-1の単位でのkcat/KMの形の活性化についての運動速度定数、E=M単位での酵素濃度)。
【０２５９】
(実施例6)
主要組織適合複合体クラスII(MHCII)分子との結合の予測
Table 3(表3)に列挙する配列とMHCII分子との結合のインシリコ予測を、(Nielsenら(2010) Immunome research、6(1)、9)に記載されるNetMHCIIpan-2.0ソフトウェアを用いて行った。376アミノ酸配列の組を、DFNQTQPERGDNN(X6)(X5)AT(X4)(X3)(X2)Rivggqeckdgecpwq(配列番号242)(ここで、X2は、プロリンであり、X6は、アラニンであり、X5は、トレオニンであり、X4及びX3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及びYから選択される)のフレームワークから構築した。全ての配列は、西欧個体群についてのMHCII頻度及び50のカットオフを用いて、NetMHCIIPan-2.0ソフトウェアを用いて分析した。予測された最良の結合(最低の順位)の結果だけをTable 6(表6)に示す。順位は、200,000の無作為自然ペプチドと比較したクエリコアペプチドの上位パーセンタイルを表す。例えば、3の順位は、クエリペプチドが特定のMHCII分子との結合に関して無作為ペプチドの上位3%のうちにあることを示す。3未満のカットオフは、有意な結合とみなした。比較のために、FpA挿入断片を有する第X因子(配列番号3)は、MHC II分子HLA-DQA10501-DQB10301に対してカットオフ未満の予測順位(2)を有した。
【０２６０】
Table 3(表3)に列挙した配列のいずれも、3未満の順位を有さず、このことは、X2プロリン、X6アラニン、トレオニンであるX5、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及びYから選択されるX4及びX3により最適トロンビン切断速度を導入する方策が、新規なMHCII結合ペプチドを生成すると予測されなかったことを示す。したがって、このインシリコアプローチを用いることにより、第X因子にトロンビン感受性切断配列を導入することが、Table 6(表6)に列挙する最良順位配列の1つを用いた場合に免疫原性分子を創出するとは期待できなかった。
【表６Ａ】
2016510984.tif 000053
【表６Ｂ】
2016510984.tif 000054
【表６Ｃ】
2016510984.tif 000055
【表６Ｄ】
2016510984.tif 000056
【表６Ｅ】
2016510984.tif 000057
【表６Ｆ】
2016510984.tif 000058
【表６Ｇ】
2016510984.tif 000059
【表６Ｈ】
2016510984.tif 000060
【表６Ｉ】
2016510984.tif 000061
【表６Ｊ】
2016510984.tif 000062
【表６Ｋ】
2016510984.tif 000063
【表６Ｌ】
2016510984.tif 000064
【表６Ｍ】
2016510984.tif 000065
【０２６１】
(実施例7)
主要組織適合複合体クラスII(MHCII)分子との第X因子ペプチド結合の予測
A.材料及び方法
Table 8(表8)に列挙するトロンビン感受性第X因子分子とMHCII分子(HLA-II対立遺伝子から発現される)との結合のインシリコ予測を、HLA-DR予測のためのアルゴリズムNetMHCIIpan 2.1(Nielsenら、(2010) Immunome Research、6:9)及びHLA-DP/DQ予測のためのNetMHCII 2.2(Nielsenら、(2009) BMC Bioinformatics 10:296)を用いて行った。免疫原性リスクスコア(IRS)は、MHCII/HLA-II対立遺伝子の集団内頻度(Table 7[表7]に列挙する)を乗じた重み付けペプチド順位の総計として算出した。
【０２６２】
順位は、以下のようにして割り当てた。1以下の順位のペプチド/MHCIIの組み合わせには2の重みを割り当て、1より大きいが3以下の順位の組み合わせには0.5の重みを割り当て、3より大きいが10以下の順位の組み合わせには0.2の重みを割り当てた。10以下の予測順位の新規ペプチド(野生型第X因子には存在しない)だけを含めた。総計は、HLA-DR、HLA-DP及びHLA-DQ遺伝子座について別々に報告する。
【表７Ａ】
2016510984.tif 000066
【表７Ｂ】
2016510984.tif 000067
【０２６３】
B.結果
以下のTable 8(表8)は、トロンビン感受性第X因子分子の予測免疫原性リスクスコアを示す。合計IRSスコアは0から0.98までの範囲であり、トロンビン感受性第X因子分子の潜在的な免疫原性の差が予測されることを示した。実施例1に概説した4つのタンパク質設計方策の関係で見た場合に、方策4により設計されたトロンビン感受性第X因子分子と、方策3により設計された切断配列のほとんどとは、0のIRSスコアを示し、このことは、非常に低い免疫原性リスクを示唆した。方策3により設計されたその他のトロンビン感受性第X因子分子は、0.02〜0.05の範囲のいくらか上昇したIRSスコアを示したが、方策1及び2により創出された第X因子分子は、IRSスコアの上昇(0.98まで)についての最大の傾向を示した。よって、最小主義アプローチ(方策3及び4)により作製した第X因子分子は、より大きいアミノ酸挿入断片を有する第X因子分子(方策1及び2)と比較した場合に、免疫原性がより低いと予測される。
【表８Ａ】
2016510984.tif 000068
【表８Ｂ】
2016510984.tif 000069
【表８Ｃ】
2016510984.tif 000070
【０２６４】
(実施例8)
ヘパロサンコンジュゲート-定量法
本発明のヘパロサンコンジュゲートを、HPLCにより純度について分析した。HPLCは、コンジュゲート定量のためにも用いた。定量は、280nm波長吸収プロファイルを用いる曲線下面積積分に基づいた。血漿由来ヒト第X因子(ロット:HFX 1212、Molecular Innovations, Inc社、Novi MI、USA)を参照として用いた。Zorbax 300SB-C3カラム(4.6×50mm;3.5μm Agilent社、Cat. No.:865973-909)を用いた。カラムは、蛍光検出器(Ex 280nm、Em 348nm)を備えるAgilent 1100シリーズHPLCで作動させた。カラム温度は30℃であり、5μgの試料注入及び1.5ml/分の流速を用いた。カラムを、0.1%トリフルオロ酢酸を含有する水(A)-アセトニトリル(B)溶媒系で溶出した。勾配プログラムは、以下のとおりであった:0分(25% B);4分(25% B);14分(46% B);35分(52% B);40分(90% B);40.1分(25% B)。
【０２６５】
(実施例9)
ヘパロサンコンジュゲート-SDS-PAGE分析
SDS PAGE分析は、プレキャストNuPage 7%トリス-酢酸ゲル、NuPageトリス-酢酸SDSランニング緩衝液及びNuPage LDSサンプル緩衝液(全てInvitrogen社から)を用いて行った。試料を変性(70℃にて10分)させた後に分析した。HiMark HMW(Invitrogen社)を標準として用いた。電気泳動は、動力装置付きXCell Surelock Complete(Invitrogen社)で、150V、120mAにて80分間運転した。ゲルは、Invitrogen社からのSimplyBlue SafeStainを用いて染色した。
【０２６６】
(実施例10)
ヘパロサン-ベンズアルデヒドポリマーの合成
規定されたサイズの官能基化HEPポリマーは、2つの糖ヌクレオチドUDP-GlcNAc及びUDP-GlcUAを用いて、酵素的(PmHS1)重合反応により調製する。反応を開始するためにプライミング三糖(GlcUA-GlcNAc-GlcUA)NH2を用い、糖ヌクレオチド基礎単位が枯渇するまで重合を行う。末端アミン(プライマーを起源とする)を次いで、GSCの還元的アミノ化化学のために設計されたベンズアルデヒド官能基を用いて官能基化する。HEPポリマーのサイズは、糖ヌクレオチド:プライマー化学量論における変動により予め決定できる。この技術は、US 2010/0036001に詳細に記載されている。
【０２６７】
HEP-ベンズアルデヒドは、アミン官能基化HEPポリマーを余剰のN-スクシンイミジル-4-ホルミル安息香酸と(Nano Letters (2007) 7(8)、pp. 2207〜2210)中性水溶液中で反応させることにより調製できる。ベンズアルデヒド官能基化ポリマーは、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー又はHPLCにより単離できる。
【０２６８】
末端HEPアミンは、あるいは、マレイミド反応物中に官能基化して、第X因子システイン変異体におけるシステインへのカップリングを容易にし得る。HEP-マレイミドは、アミン官能基化HEPポリマーを余剰のN-マレイミドブチリル-オキシスクシンイミドエステル(GMBS; Fujiwara, K.ら(1988) J. Immunol. Meth. 112、77〜83)と反応させることにより調製できる。
【０２６９】
ベンズアルデヒド官能基化ポリマーは、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー又はHPLCにより単離し得る。末端1級アミン官能基で官能基化したいずれのHEPポリマー(HEP-NH2)も、本実施例において用いることができる。以下に2つのオプションを示す。
【化２５】
2016510984.tif 000071
【０２７０】
さらに、多糖の非還元端中の末端糖残基は、N-アセチルグルコサミン又はグルクロン酸(グルクロン酸は上に示す)のいずれかであり得る。典型的に、重合反応において等モル量のUDP-GlcNAc及びUDP-GlcUAを用いたならば、両方の混合物が期待される。
【０２７１】
(実施例11)
40kDaヘパロサン-GSC反応物の合成
【化２６】
2016510984.tif 000072
【０２７２】
5.0ml 50mM Hepes、100mM NaCl、10mM CaCl2緩衝液、pH7.0中のグリシルシアル酸シチジン1リン酸(GSC)(20mg;32μmol)を、乾燥40kDa HEP-ベンズアルデヒド(99.7mg;2.5μmol、窒素定量)に直接加えた。全てのHEP-ベンズアルデヒドが溶解するまで混合物をゆっくりとかき混ぜた。その後2時間の間に、MilliQ水中のシアノ水素化ホウ素ナトリウムの1M溶液を少しずつ(5×50μl)加え、48mMの最終濃度に達した。反応混合物を室温に一晩放置した。過剰のGSCを、以下のようにして透析により取り除いた。全反応容量(5250μl)を透析カセット(Slide-A-Lyzer透析カセット、Thermo Scientific社  Prod# 66810、カットオフ10kDa容量:3〜12ml)に移した。溶液を2時間、2000mlの25mM Hepes緩衝液(pH7.2)に対して、そしてもう一度、17時間、2000mlの25mM Hepes緩衝液(pH7.2)に対して透析した。内部チャンバからの過剰GSCの完全な除去は、Waters X-Bridgeフェニルカラム(4.6mm×250mm、5μm)及び水アセトニトリル系(30分にわたって0.1%リン酸を含有する0〜85%アセトニトリルの直線勾配)でのHPLCにより、GSCを参照として用いて検証した。内部チャンバの物質を回収し、凍結乾燥して、83%(窒素定量)40kDa HEP-GSCを白色粉末として得た。この手順により作製したHEP-GSC反応物は、シアル酸シチジン1リン酸に4-メチルベンゾイル結合を介して結合したHEPポリマーを含有する。
【０２７３】
(実施例12)
pdFXの脱シアル化
血漿由来第X因子(14.3mg)に、50mM Hepes、100mM NaCl、pH7.0(10ml)中のシアリダーゼ(アルスロバクター・ウレアファシエンス(AUS)、750μl、0.3mg/ml、200U/ml)を加え、室温にて1時間放置した。反応混合物を、次いで、50mM Hepes、150mM NaCl、pH7.0(5ml)で希釈し、氷上で冷却した。100mM EDTA溶液(4ml)を少しずつ加えた。EDTA処理試料を、次いで、50mM Hepes、150mM NaCl、0.01% Tween 80、pH7.0で平衡化した、併せてCV=10mlの2×5ml相互接続HiTrap Q FFイオン交換カラム(Amersham Biosciences、GE Healthcare社)に供した。シアリダーゼを、50mM Hepes、150mM NaCl、0.01% Tween 80、pH7.0(4CV)で溶出した後に、アシアロ-pdFXを50mM Hepes、150mM NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween 80、pH7.0(10CV)で溶出した。アシアロ-pdFXは、このようにして、50mM Hepes、150mM NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween 80、pH7.0(19ml)中で単離した。収量(13.1mg)及び濃度(0.69mg/ml)は、HPLCにより決定した。
【０２７４】
(実施例13)
40kDaヘパロサン-[N]-pdFXの合成
50mM Hepes、150mM NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween 80、pH7.0(19ml)中のアシアロ-pdFX(13.1mg)に、20mM Hepes、120mM NaCl、50%グリセロール、pH7.0(4.9ml)中の40kDa HEP-GSC(19.4mg)及びラットST3GalIII酵素(2.44mg;1.1単位/mg)を加えた。反応混合物をゆっくりと撹拌しながら32℃にて16時間インキュベートした。50mM Hepes、150mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.0中の157mM CMP-NANの溶液(0.71ml)を次いで加え、反応物をさらに1時間、32℃にてインキュベートした。HPLC分析は、未反応のpdFX(56%)、モノHEP付加pdFX(37%)及びポリHEP付加生成物(7%)を含む生成物分布を示した。反応混合物を4つの部分に分割し、50mM Hepes、150mM NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween 80、pH7.0で平衡化したHiLoad 16/60 Superdex200プレグレードカラム(CV=124ml)に各部分を供した。カラムを同じ緩衝液で溶出し、全ての運転からの未反応及びHEP改変pdFXを含有する画分を単一の48ml画分にプールした。画分を氷上で冷却し、100mM EDTA溶液(7ml)を少しずつ加えた。EDTA処理試料を、次いで、10mM His、100mM NaCl、0.01% Tween 80、pH7.5で平衡化した、併せてCV=10mlの2×5ml HiTrap Q FFイオン交換カラム(Amersham Biosciences、GE Healthcare社)に供した。4カラム容量の10mM His、100mM NaCl、pH7.5及び10カラム容量の10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween 80、pH7.5でカラムを洗浄して、未改変pdFXを溶出した。次いで、10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween 80、pH6.0(10カラム容量)を用いてpHを6.0まで下げた。HEP付加pdFXを、次いで、カラムから、10カラム容量の10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween 80、pH6.0(40%)及び10mM His、1M NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween 80、pH6.0(60%)混合緩衝液を用いて溶出した。併せた画分を、次いで、10mM His、150mM NaCl、5mM CaCl2、0.005% Tween 80、pH6.4に対して、10kDaのカットオフのSlide-A-Lyzerカセット(Thermo Scientific社)を用いて透析した。収量(2mg)及び濃度(0.45mg/ml)は、HPLCにより決定した。
【０２７５】
(実施例14)
トロンビン感受性FX分子のN-グリカンへのヘパロサンポリマーのコンジュゲーション
本明細書に記載するように例えば活性化ペプチド中に改変を有する第X因子分子は、実施例12〜13に記載したのと同様の様式でヘパロサンにコンジュゲートできる。N-グリカンコンジュゲーションを容易にするために、FX分子を、最初に、実施例12に記載するようにしてシアリダーゼで処理する。このプロセスは、N-グリカン末端からシアル酸を取り除き、ヘパロサン改変シアル酸のHEP-GSC反応物からアシアロ-FX分子へのシアリルトランスフェラーゼにより媒介される移動を可能にする。非反応N-グリカン末端をシアル酸でキャッピングした後に、HEP-FX分子をサイズ排除クロマトグラフィー、アニオン/カチオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー又はこれらのクロマトグラフィー法の組み合わせにより単離する。
【０２７６】
(実施例15)
第X因子単一システイン変異体の選択的還元
第X因子単一システイン分子は、哺乳動物細胞で生成される場合に、混合ジスルフィドとして低分子量チオールにより遮断された非対形成システインを有して典型的に単離される。HEPコンジュゲーションを容易にするために、カップリングのためにチオールを利用可能にするために、混合ジスルフィドの遮断を最初に解除する必要がある。遮断の解除は、ホスフィンベースの還元反応物を用いる化学的還元により行うことができる。あるいは、第X因子単一システイン分子は、US 20090041744においてFVIIa407Cについて記載されるのと同様の様式で、グルタチオンベースの酸化還元緩衝液系を用いて還元できる。ある方法では、非還元第X因子単一システイン分子を室温にて24時間、GSH、GSSG及びGrx2を含有する混合物中でインキュベートする。還元された第X因子単一システイン分子を、次いで、実施例12に記載するようにしてイオン交換クロマトグラフィーにより単離する。
【０２７７】
(実施例16)
40kDa HEP-[C]-FXシステイン分子の合成
上の実施例15において調製した単一システイン還元第X因子分子の溶液を、50mM Hepes、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.0のような適当な緩衝液中で、41.5kDa HEPマレイミド反応物と反応させる。コンジュゲーションプロセスは、実施例8に記載するHPLC法に従うことができる。コンジュゲーションが完了したときに、HEP-[C]-FXシステイン分子は、実施例13に記載するように、サイズ排除クロマトグラフィー、アニオン/カチオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー又はこれらのクロマトグラフィー法の組み合わせにより単離できる。
【０２７８】
(実施例17)
ヒト第X因子のグリコHEP付加は、血友病Aマウスにおける第X因子の循環半減期を増加させる
ヒト血漿由来第X因子(pdFX)及びN-グリカン上に40kDaヘパロサン(40kDa HEP)でグリコHEP付加したヒトpdFX(以下、40kDa HEP-[N]-pdFXという)の薬物動態研究を、FVIIIノックアウト(FVIII-KO)マウスにおいて行った。研究の目的は、pdFXの薬物動態に対する延長の効果を評価することであった。調査した化合物は、Molecular Innovations, Inc社(Novi MI、USA)から購入したpdFX、カタログ番号HCX-0050ロットHFX-1212であった。この物質に基づいて、実施例12〜13に概説する方法に基づいてグリコHEP付加を行って、40kDa HEP-[N]-pdFXを生成した。Taconic社にて繁殖させた性別は混合した合計で30匹のFVIII-KOマウスを研究に含めた。動物に、1mg/kgに等しい16.7nmol/kgの単回急速投与IV注射を用いて投与した。投与容量は、5ml/kgであった。血液試料を眼窩静脈叢(orbital sinus)から、投与の18(pdFX)及び96(40kDa HEP-[N]-pdFX)時間後に、スパースサンプリング計画(時点あたり3匹のマウス、マウスあたり3つの試料)で回収した。第X因子の血漿レベルを、改変した市販の第X因子酵素イムノアッセイ(ヒトFX ELISAキット、cat no. KSP-134、Nordic BioSite社、Copenhagen、Denmark)を用いて測定したが、ここでは、第X因子が、モノクローナル抗FX被覆プレート中で、ポリクローナル抗FX-ビオチン及びストレプトアビジン-ペルオキシダーゼコンジュゲートを用いて検出される。キットにより提供される較正物質を、希釈FVIII KOマウス血漿に加えたpdFX及び40kDa HEP-[N]-pdFXに交換して、それぞれpdFX及びHEP-pdFXの血漿レベルを分析した。QC試料は、pdFX又はHEP-pdFXを希釈F8-KOマウス血漿に加えることにより調製した。
【０２７９】
薬物動態パラメータは、ノンコンパートメント解析(NCA)により算出した。血漿プロファイル及び薬物動態パラメータは、それぞれ図9及びTable 9(表9)に示す。
【０２８０】
FVIII-KOマウスにおけるpdFXの血漿半減期(T1/2)及び平均滞留時間(MRT)は、それぞれ3.8及び5.2時間であった。40kDaヘパロサンポリマーを第X因子にコンジュゲートすることにより、半減期及びMRTは、5倍に19.5及び24.7時間までそれぞれ増加した。実施例18において下に記載するように、ヒト第X因子のグリコPEG付加は、非改変ヒトFXと比較してC57BL6マウスにおける血漿半減期の4.4倍の延長を示した。HEP及びPEGにそれぞれコンジュゲートした第X因子についての血漿プロファイルは、同等であった(図9を参照されたい)。
【表９】
2016510984.tif 000073
【０２８１】
(実施例18)
正常マウスでのグリコPEG付加ヒト第X因子の循環血漿半減期の延長
ヒトFX及びPEG付加ヒトFX(FX-GP)の薬物動態研究を、ナイーブマウスで行った。研究の目的は、化合物のクリアランスに対する第X因子(この場合はグリコpeg付加)の延長の効果を調査することであった。調査した化合物は、第X因子(HCX-0050ロットAA1208)及びFX-GPであった。
【０２８２】
野生型血漿由来第X因子は、Haematologic Technologies社(HCX-0050)から購入した。この物質に基づいて、Novo Nordisk社にてFVIIa及びFIX(Neoseプロトコール)のために以前に用いた標準的な手順に従ってグリコPEG付加を行った。PEG付加及びその後のクロマトグラフィーによる分離により、非PEG付加FXを含まないがおよそ5%のジPEG付加FXを含有する、モノPEG付加された調製物が得られた。PEG付加の部位は決定しなかった。
【０２８３】
Taconic社にて繁殖させた合計で30匹のC57BL/6Jマウスに、化合物を単回急速投与IV注射を用いて投与した。FXの血漿レベルは、スパースサンプリング(時点あたり3匹のマウス、マウスあたり3つの試料、5.1.4.1項を参照されたい)により投与の168時間後に、酵素イムノアッセイ(EIA)により測定した。薬物動態パラメータは、ノンコンパートメント解析(NCA)により算出した。測定した血漿濃度は、Table 10(表10)に示し、得られたPKパラメータは、Table 11(表11)に示す。
【表１０Ａ】
2016510984.tif 000074
【表１０Ｂ】
2016510984.tif 000075
【表１０Ｃ】
2016510984.tif 000076
【表１１】
2016510984.tif 000077
【０２８４】
pdFXの活性化ペプチド中にあるN-結合グリカンへのコンジュゲーションによるヒトpdFXのグリコPEG付加は、非改変ヒトpdFXと比較して、マウスにおける血漿半減期の4.4倍の延長を示した。
【０２８５】
(実施例19)
α-トロンビン(FIIa)による活性化についての運動速度定数を評価するためのトロンビン感受性FX分子のスクリーニング
A.アッセイプロトコール
ヒトα-トロンビン(FIIa)によるトロンビン感受性FX分子の活性化について説明する反応速度論を、古典的なミカエリス・メンテンアプローチを用いて評価したが、ここでは、一連の第X因子又はトロンビン感受性FX分子を用いて、運動速度定数を算出した(ここで、基質(トロンビン感受性FX分子)は、活性化プロテアーゼ(FIIa)の少なくとも10〜20倍過剰であった)。この方法は、複数のトロンビン感受性FX分子を同時にスクリーニングできるようにプロトコールにわずかな改変を加えて、Louvain-Quintardら(2005) JBC、280: 41352〜41359により本質的に記載されたようにして行った。簡単に述べると、トロンビン感受性FX分子をアッセイ緩衝液(50mM Hepes、150mM NaCl、10mM CaCl2、0.1% PEG8000、0.1% BSA、pH7.4)中で、試験したトロンビン感受性FX分子の最高の濃度を表すおよそ2〜4μMの初期作業濃度まで希釈した。トロンビン感受性FX分子を、さらに、アッセイ緩衝液中で2倍に系列希釈して、96ウェルポリプロピレンアッセイプレート中で0nM〜4000nMの範囲の用量応答曲線を作製した。いくつかの場合では、ストック濃度だけが、0〜1000nM、0〜2000nM又は1000nMから4000nMの間の他の最終濃度間隔の範囲での用量応答曲線を可能にした。トロンビン活性化反応は、アッセイ緩衝液で希釈した11μLの10nMα-トロンビンを、100μLのトロンビン感受性FXに、111μLの反応容量中で  1nMの最終α-トロンビン濃度のために加えることにより引き起こした。反応は、37℃にて、期待される反応速度に応じて合計で30分、60分又は120分間インキュベートした。反応は、インキュベーション期間の最後に、40μLの分割量を2重に取り出し、10μLの500nMヒルジン(組換えHisタグ付加)を含む黒色96ウェルポリスチレンアッセイプレート中の2つのウェルのそれぞれに加えて最終濃度100nMのヒルジンを得ることにより消光した。このアッセイ中に生じたFXaの量は、50μLの特異的蛍光発生性FXa基質であるPefafluor FXa(CH3SO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC; Pentapharm社、Switzerland)の1mM溶液を加え、既知の量のFXa(0nM〜5nM)の標準曲線と比較することにより決定した。定量反応におけるPefafluor FXaの最終濃度は、0.5mMであった。
【０２８６】
反応進度曲線は、SpectraMax蛍光プレートリーダーにて、10分間、25℃にてモニタリングし、以下に記載するようにして分析した。FXa標準物質の触媒活性濃度は、Payneら(1996) Biochemistry、35(22): 7100〜7106により本質的に記載されるように、セリンプロテアーゼについての活性部位滴定物質として開発された蛍光発生性エステル基質である4-メチルウンベリフェリル4-グアニジノベンゾエート(MUGB)を用いる滴定により決定した。アッセイの感度のために、いくらかの場合では、100μM Glu-Gly-Arg-クロロメチルケトン(EGR-cmk)を室温にて2時間用いた後に、10mM MES、150mM NaCl、10mM CaCl2、pH6.0を含む貯蔵緩衝液に対して十分な透析を行う阻害により、試料中のバックグラウンドFXa活性の痕跡量を阻害することが必要であった。
【０２８７】
B.データ分析
Pefafluor FXa加水分解の未処理の反応進度曲線を分析して、反応速度パラメータkcat(s-1)、KM(nM又はM)及びkcat/KM(M-1s-1)を決定した。未処理の反応速度は、SpectraMax蛍光プレートリーダーと連結したSoftmax Proソフトウェアスイートにおいて蛍光単位/s(FU/s)として最初に分析し、その後、既知の量のFXa(上記を参照されたい)の反応速度(FU/s)から創出した標準曲線を用いて、nM FXaに変換した。アッセイ経過中に生じたFXaの濃度を、次いで、等式(1)を用いてnM FXa/sの形の反応速度に変形した。
【０２８８】
等式(1)
【数１】
2016510984.tif 000078
【０２８９】
反応速度(nM FXa/s)を、トロンビン感受性FX分子の濃度に対してプロットし、等式(2)で与えられる標準的な直角双曲線の関数(すなわちミカエリス・メンテン等式)にフィットさせて、kcat及びKMのフィットさせた値を得たが、ここで、Eは、活性化プロテアーゼ(FIIa)の濃度であり、Soは、用量応答曲線におけるトロンビン感受性FX分子の濃度である。
【０２９０】
等式(2)
【数２】
2016510984.tif 000079
【０２９１】
特異性定数kcat/KMは、等式(2)の評価の際のKM及びkcatのフィットさせた値から直接算出した。
【０２９２】
不定であるか、又はアッセイにおいて試験したトロンビン感受性FX分子の最高濃度よりも大きい見かけのKMをもたらす反応について、データは、アッセイの直線用量範囲において分析した。アッセイの直線範囲を用いて回収したデータについて、kcat/KM反応速度定数は、等式(3)に従うトロンビン感受性FX濃度対FXa生成速度(FXa/s)の線形回帰分析の傾きから直接算出した。
【０２９３】
等式(3):
【数３】
2016510984.tif 000080
【０２９４】
C.結果
以下のTables 12〜13(表12〜13)は、α-トロンビン(FIIa)によるHPC4-タグ付加トロンビン感受性FX分子の活性化、並びに組換えFX(FX-HPC4と称する)及び血漿精製FX(Molecular Innovations社、Novi MI、USA)について決定した反応速度パラメータ(kcat、KM及びkcat/KM)を示す。Tables 12及び13(表12及び13)は、標準偏差(S.D.)及び行ったアッセイの数(n)も示す。データは、Tables 12及び13(表12及び13)において、順位付けしたkcat/KMの値として示す。
【０２９５】
観察された特異性定数(kcat/KM)は、トロンビンによる検出可能な活性化なし(「活性なし」と称する)から、プロリンをX2に有する改変フィブリノペプチドA(FpA)配列(FX ins[194]>[DFLAEGGGPR]-HPC4)を有するバリアントについての2.8E+04 M-1s-1のkcat/KMの値の範囲までであった。この活性化速度は、未改変のFpA配列(FX ins[194]>[DFLAEGGGVR]-HPC4)を有するバリアントについて観察された活性化速度の10倍である。同じ工学的に作製された切断部位を有するにもかかわらず、FX分子に切断部位を導入する方法は、活性化速度に著しく影響した。例えば、2つのトロンビン感受性FX分子FX [191-194]>[MTPR]-HPC4及びFX [191-194]>[NATMTPR]-HPC4は、MTPR-IVGGのX4-X4'切断配列(ここで、切断は、X1とX1'(すなわちR-I結合)との間で生じる)を含む。FX [191-194]>[MTPR]-HPC4分子は、1.4E+03 M-1s-1の速度で容易に活性化され、FX [191-194]>[NATMTPR]-HPC4分子は活性化されない(Tables 12及び13[表12及び13]を参照されたい)。好ましいトロンビン感受性FX分子の多くが1.0E+03〜3.0E+03  M-1s-1の範囲での同様のkcat/KMの値を有して好ましい活性化反応速度を示すが、上記のトロンビン感受性FX分子は、個別のkcat及びKMの値の分散量により区別される(Table 12[表12]:例えば1129nMのより低いKMを有するFX [191-194]>[MTPR]-HPC4を、2239nMのKMを有するFX ins[194]>[DFLAEGGGVR]-HPC4又は2703nMのKMを有するFX [191-194]>[LTPR]-HPC4と比較されたい、これらはそれぞれ、FX [191-194]>[MTPR]-HPC4よりも5〜10倍高いkcatの値を有する)。
【０２９６】
Table 14(表14)は分子の活性化ペプチド中のN-グリカンでのモノhep付加のために21kDa、40kDa又は73kDaのヘパロサンポリマーにコンジュゲートしたトロンビン感受性FX分子FX ins[194]>[DFLAEGGGVR]-HPC4の活性化について決定された反応速度パラメータ(kcat、KM及びkcat/KM)を示す。Table 14(表14)に示すように、試験した分子について観察された反応速度パラメータに対してhep付加は著しい影響を有さない。
【表１２】
2016510984.tif 000081
【０２９７】
【表１３Ａ】
2016510984.tif 000082
【表１３Ｂ】
2016510984.tif 000083
【表１４】
2016510984.tif 000084
【０２９８】
(実施例20)
重度血友病A患者血漿におけるトロンビン産生の刺激
材料及び方法
血漿中で産生されるトロンビンの量は、較正自動トロンボグラフィー(Hemkerら、「Calibrated Automated Thrombin Generation Measurement in Clotting Plasma」、Pathophysiol Haemost Thromb. 33:4〜15 (2003); Hemkerら、「Thrombin Generation in Plasma: Its Assessment via the Endogenous Thrombin Potential」、Thromb Haemost. 74:134〜138 (1995))により測定した。96ウェルプレートにおいて、第VIII因子インヒビターを欠く重度血友病A患者からの72μLの第VIII因子欠損血漿プール(<1%残存活性、貧血小板)(George King Bio-Medical社、Overland Park、Kans.)を、8μLの組換え第X因子バリアント(又はHEPES-BSA緩衝液又は組換え第FVIII因子)と10分間、37℃にてインキュベートした。反応は、20μL Thrombinoscope PPP LOWトリガー(1pM組織因子及び4μMリン脂質)を加え、20μL蛍光発生性基質(Z-Gly-Gly-Arg-AMC)と、0.1M CaCl2含有HEPES-BSA緩衝液中で混合することにより開始した。全ての反応物は、37℃に予め温めておいた。37℃での蛍光シグナルの進展を、20秒間隔で、Fluoroskan Ascentリーダー(Thermo Labsystems OY社、Helsinki、Finland)を用いてモニタリングした。蛍光シグナルは、トロンビン較正試料(Hemkerら、「Calibrated Automated Thrombin Generation Measurement in Clotting Plasma」、Pathophysiol Haemost Thromb. 33:4〜15 (2003))からの参照シグナルにより修正し、nMでの実際のトロンビン産生は、以前に記載されたようにして算出した(Hemkerら、「Thrombin Generation in Plasma: Its Assessment via the Endogenous Thrombin Potential」、Thromb Haemost. 74:134〜138 (1995))。トロンビン産生パラメータであるピークトロンビン、速度インデックス及び内因性トロンビン産生能(ETP)は、以前に記載されたようにして算出した(Hemkerら、「Data management in thrombin generation」、Thromb Res 131:3〜11 (2013))。
【０２９９】
結果
以下のTable 15(表15)は、HPC4タグ付加トロンビン感受性FX分子の存在下で血友病A血漿中で決定されたトロンビン産生パラメータであるピークトロンビン、速度インデックス及び内因性トロンビン産生能、並びに決定した数(n)を示す。いくつかのFX分子は、緩衝液と比較して、血友病A血漿においてトロンビン産生を刺激できた。HPC4-タグ付加トロンビン感受性FX分子の存在下で血友病A血漿中で観察されたピークトロンビン濃度は、6nM〜275nMの範囲であり、緩衝液及び100%第VIII因子(1IU/mL)は、それぞれ18及び112nMのピークトロンビン濃度を生じた。
【表１５】
2016510984.tif 000085
【０３００】
(実施例21)
トロンビン感受性FX分子のクローニング及び発現
A.トロンビン感受性FX分子のクローニング
発現ベクターpNUTにクローニングしたトロンビン感受性第X因子構築物(FX-FpA)は、INSERM(WO2004005347-A1及びLouvain-Quintard VB.ら、J Biol Chem. 2005年12月16日;280(50):41352〜9)から受領した。第X因子からの活性化ペプチドは、トロンビンについてのFpA認識配列から上流に挿入して、EP2199387A1にFX-AP-FpAとして記載されるタンパク質(配列番号3)と同一のタンパク質をコードする構築物を作製した。この構築物の作製は、以下に記載するクローニング方策を用いて達成した。第X因子cDNAを鋳型として用いて、2つの部分的にオーバーラップするPCR断片を作製した。第1のPCR断片は、第X因子の軽鎖の3'端にあるApaI制限酵素についての自然に存在する認識部位と、第X因子活性化ペプチドをコードする配列と、挿入FpA配列とを含んだ。他方の断片は、FpA配列をコードする配列と、第X因子の重鎖中にあるApaI制限酵素についての自然に存在する認識部位を含む、第X因子の活性化部位(配列番号1中のArg194〜Ile195)に対して3'の第X因子DNA配列とを含んだ。2つのPCR断片を新しいPCR反応物中で混合して、FpA配列と融合し、2つのApaI制限部位に挟まれたFX活性化ペプチドについてのDNA配列を含むDNA断片を作製した。2つのPCR断片の作製及び2つの断片の融合体の増幅のために用いたプライマーは、表16に示す。PCR断片とpNUT FX-FpAとをともにApaIで消化し、ラピッドDNAライゲーションキット(Roche Applied Science社、USA)を用いて2つの断片をライゲーションすることにより、PCR断片をpNUT FX-FpAベクターにクローニングした。最終構築物の図を、図10に示す。
【表１６】
2016510984.tif 000086
【０３０１】
完全FX-AP-FpA-HPC4 cDNA及びdesGla FX-AP-FpA-HPC4 cDNAを、pTT5ベクター(Durocher Y.らNucleic Acids Res. 2002年1月15日;30(2):E9)にクローニングした。FX-AP-FpA CDSを、pQMCFベクター(Icosagen社、Tartu、Estonia)にサブクローニングした。2組の構築物(配列番号229〜236)以外は、全てのトロンビン感受性FX分子は、KOD Xtreme(商標)ホットスタートDNAポリメラーゼ(Novagen社、Germany)を用いる当技術分野において知られる標準的なPCRベースの部位特異的変異誘発と、その後のIn-Fusion HDクローニングキット(Clontech社、USA)を用いるDNA断片のライゲーション、あいは製造者の推奨する使用説明に従って(Stratagene社、USA)からのQuickChange(登録商標)部位特異的変異誘発キットを用いることによって、FX-AP-FpA cDNA又はFX-AP-FpA cDNAの誘導体に変異体を導入することにより調製した。両方の方法について、プライマーは、製造者の推奨に従って設計した。これらの方法により作製しなかった2つの断片は、Geneart(Life Technologies社、USA)に合成DNA配列を注文することにより作製した。注文したDNA断片は、第X因子のBspEI及びAgeI断片と、第X因子遺伝子中の所望の変動とを含んだ。DNA断片を、BspEI及びAgeI消化pQMCFベクターに、ラピッドDNAライゲーションキット(Roche Applied Science社、USA)を用いてクローニングした。得られたバリアントは、クローニング方策に関係なく、全ての場合において哺乳動物発現ベクターpQMCF(Icosagen社、Tartu、Estonia)を構築物主鎖として用いて発現させた。所望の変異の導入は、DNA配列決定(MWG Biotech社、Germany)により確認した。
【０３０２】
B.トロンビン感受性FX分子のトランスフェクション及び発現
合計で107のCHO EBNALT85細胞(Icosagen社、Estonia)に、Bio-Rad Genepulser XCell(商標)装置(BioRad社、USA)でのエレクトロポレーションを用いて10μgのDNAをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、125mL振とうフラスコ(Corning社、USA)中の5μg/mL K-ビタミンを含有する20mLのQMIX1培地(6mM Glutamax及び10mL/Lの50×HTサプリメント(Life Technologies社、USA)を含む、CD-CHO(Life Technologies社、USA)及び293 SFM II(Life Technologies社、USA)の1:1ミックス)にトランスフェクション後直ちに播種した。細胞を37℃、8% CO2及び125rpmにてKuhner Climo-シェーカーISF1-X(Adolf Kuhner AG社、Switzerland)において培養した。合計で10mLの新鮮な培地及び700μg/mLの最終濃度までのジェネテシン(Life technologies社、USA)を、トランスフェクションの1又は2日後に細胞に加えた。
【０３０３】
トランスフェクトされたCHO EBNALT85細胞を、5μg/mL K-ビタミン及び700μg/mLジェネテシンを含有するQMIX1培地に、3又は4日ごとに3×105c/mLの細胞密度に細胞を分けることにより継代培養した。培養容量は、100〜200mLまで徐々に増やした。トランスフェクトされた細胞の生存性が90%超に達したときに、1Lの最終容量及び3×105c/mLの最終細胞密度まで細胞に新鮮培地を加えることにより、生成を開始した。生成は、細胞を7日間、3L振とうフラスコ(Corning社、USA)中で37℃、8%CO2及び90rpmにて培養することにより行った。3又は4日目に、細胞に、6mM Glutamax(Life Technologies社、USA)を含有するフィードB(Life Technologies社、USA)を初期容量の20%供給した。7日目に、4600rpmにて20分間の遠心分離により培養培地を採集した。上清を、その後、0.22μm Corningボトルトップバキュームフィルタ(Corning社、USA)を通して滅菌濾過した。
【０３０４】
10L規模での大規模生成を行うために、FX分子DNAをトランスフェクトしたCHO EBNALT85細胞を、8.5Lの初期作業用量で20L Sartorius培養バッグ中で培養した。用いた培養培地は、6mMグルタミン、10mL/Lの50×HTサプリメント(Life Technologies社、USA))、5mg/LビタミンK1、700mg/Lジェネテシンを補った基本培地(QMIX1培地)、及び6mM L-グルタミンを含むCHO CDエフィシエントフィードBであるフィード培地からなった。フィードは、単回急速投与として供給した。バリアントの生成のために選択したプロセスの型は、1週間の流加培養であった。培養条件は、以下のとおりである。撹拌は、7°の揺れ角度で25〜30rpmであった。通気は、ヘッドスペースへの空気中5%CO2、0.5〜1L/分及び36.5℃の温度に設定した。アンチフォームC(Sigma社)の3%溶液を加えて泡の生成を制御した。発現は、以下の計画で進めた。0日目に、0.3×106c/mLの目標VCDに達するように種培養物を基本培地に接種し、4日目に、フィード溶液を加え(初期容量の20%)、7日目に、培養を停止して、清澄にした。培養物のオフライン分析(0、(2)、4、(6)、7日目)は、以下の分析アッセイを含んだ。細胞計数及び生存性(Cedex HiRes)、重要な代謝産物(Nova Bioprofile)、pH、pO2及びpCO2(Siemens RapidLab/RapidPoint)。最終生成物分析のためのサンプリング(6及び7日目)は、Micronicチューブ中の2×200μL無細胞上清(-20℃にて貯蔵)及びねじ蓋付ガラスHPLCバイアル中の1×1000μL無細胞上清(-20℃にて貯蔵)として得た。採集した培地を清澄にするために、使い捨てカプセルフィルタ;3μm Clarigard、Opticap XL10(Millipore社、USA)及び0.22μm Durapore、Opticap XL10(Millipore社、USA)からなる一連の連続するフィルタを用いて採集物を滅菌バッグ中に濾過した。清澄にした採集物は、4℃にて貯蔵し、直ちに精製するために運んだ(あるいは長期間貯蔵のために凍結貯蔵した)。
【０３０５】
(実施例22)
トロンビン感受性第X因子分子の精製
典型的に、10mM EDTA及び5mMベンズアミジンをFX分子採集物に加えた後に、+4℃にて72時間未満又は-80℃にて72時間超であって14日間未満、貯蔵した。精製は、典型的に30%緩衝液A(30mM HEPES pH8.3、10mM EDTA及び5mMベンズアミジン)で採集物の系列希釈を用いて行い、およそ7.5のpHとおよそ10mS/cmの導電性を有する開始試料を得た。
【０３０６】
最初のクロマトグラフィーカラムは、5CVの緩衝液B(20mM HEPES pH7.5、2mM CaCl2及び5mMベンズアミジン)で平衡化したPoros 50HQ AIEXカラム(GE Healthcare社)であった。希釈した採集物を供した後に、カラムを5CVの緩衝液Bで洗浄し、100%溶出緩衝液まで7CVの緩衝液C(20mM HEPES pH7.5、10mM CaCl2、300mM NaCl及び5mMベンズアミジン)を用いる段階勾配を用いて溶出した。溶出ピーク全体を回収し、さらに処理した。
【０３０７】
第2のクロマトグラフィー工程は、FX分子上のC末端HPC4タグに向かう抗HPC4親和性を利用する抗HPC4親和性カラムであった。抗HPC4抗体は、標準的な固定化技術を用いて、エポキシ活性化Sepharose 6Bマトリクス(GE Healthcare社)と共有結合させた。親和性カラムは、5CVの緩衝液D(20mM HEPES pH7.5、1mM CaCl2、100mM NaCl、0.005% Tween 80及び5mMベンズアミジン)で平衡化し、次いで、回収したプールをカラムに直接載せた。カラムを、次いで、3CVの緩衝液D、4CVの緩衝液E(20mM HEPES pH7.5、1mM CaCl2、1M NaCl、0.005% Tween 80及び5mMベンズアミジン)及び3CVの緩衝液Dで洗浄した。タンパク質は、緩衝液F(20mM HEPES pH7.5、5mM EDTA、15mM NaCl、0.005% Tween 80及び5mMベンズアミジン)を用いて溶出し、溶出ピーク全体を回収した。
【０３０８】
第3のクロマトグラフィーカラムは、以前の親和性カラムのCVの典型的に5%である小さいPoros 50HQ AIEXカラム(GE Healthcare社)であった。Poros 50HQ AIEXカラムは、緩衝液Bで平衡化し、試料を供した後に、緩衝液Bで洗浄した。第X因子分子を、次いで、緩衝液Cを用いる段階勾配により溶出した。溶出ピーク全体を回収し、さらに処理した。
【０３０９】
最終工程として、PD-10脱塩カラムを用いて緩衝液の交換を行った。タンパク質を供し、供給業者(GE Healthcare社)の使用説明に従って、緩衝液G(10mM MES pH6.5、1mM CaCl2及び100mM NaCl)を用いて緩衝液を交換した。タンパク質は、次いで、-80℃にて貯蔵した。
【０３１０】
(実施例23)
トロンビン感受性第X因子分子の作製において用いたオリゴヌクレオチドプライマー
以下のTable 17(表17)は、第X因子変異誘発のために用いたオリゴヌクレオチドプライマーを示す。プライマー名は、上の実施例1で概説した命名法により命名され、プライマーを用いる変異誘発の結果として生成される変異に対応する。プライマーは、5'から3'の方向に示し、フォワード(-For)又はリバース(-Rev)プライマーの組として示す。
【表１７Ａ】
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【表１７Ｂ】
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【表１７Ｃ】
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【表１７Ｄ】
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【表１７Ｅ】
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【表１７Ｆ】
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【０３１１】
(実施例24)
急性血友病A出血モデルにおけるヒトトロンビン感受性FX分子の有効性
12〜16週齢で雄性及び雌性のFVIII欠損FVIII-KOマウスを、12匹の動物の3群に分け、1つは試験分子、1つは陰性対照、1つは陽性対照とする。1つより多い試験化合物を試験するために、さらなる群を加えることができる。各群において、8匹の動物の尾部から出血させ、4匹の動物を並行して、ROTEM分析を用いるエキソビボ有効性試験のために用いる。
【０３１２】
マウスにイソフルランで麻酔をかけ、加熱パッド上に置く。尾部を予め加熱した生理食塩水に37℃にて5分間入れる。
【０３１３】
ヒトコンセプト分子(ここで、コンセプト分子は、配列番号3〜236に列挙する任意のトロンビン感受性第X因子分子である)又は賦形剤又は陽性対照(組換えFVIII)を、5ml/kgの投与容量でi.v.投与する。コンセプト分子の用量は、出血表現型を標準化するために十分である(コンセプト分子のインビトロ特徴決定により決定されるように)。陽性対照である5U/kg組換えFVIIIの用量も、出血表現型を標準化するために十分である。
【０３１４】
投与の後に、尾部を予め加熱した生理食塩水に5分間戻す。尾部出血を受ける動物について、尾静脈のテンプレートガイド下での横切開を、尾部の直径がちょうど2.7mmである点にて行う。横切開の後に、尾部を予め加熱した生理食塩水に再び沈める。血液を60分にわたって回収し、容器中のヘモグロビン濃度を、550nmにて分光法により決定して、全血液喪失を決定する。
【０３１５】
並行して動物を、血液サンプリング及びその後の凝固パラメータの分析(エキソビボ有効性)のために用いる。血液試料を、20μL毛細管を用い、添加剤を用いずに眼窩周囲神経叢から採取する。血液試料を、0.13Mクエン酸ナトリウムで1:10に希釈し、注意深く混合して、ROTEMによるトロンボエラストグラフィーを直ちに行うために室温にて貯蔵する。血液試料を、ミニキュベット(StarTEM)に7μL CaCl2を加えることにより再石灰化する。
【０３１６】
データを実験を通して物理的に記録し、集計し、分析して、血液喪失(尾部出血)及び凝固時間(トロンボエラストグラフィー)の低減における試験分子の有効性を証明する。
【０３１７】
(実施例25)
急性血友病A出血モデルにおけるトロンビン感受性FX分子の用量応答研究
12〜16週齢で雄性及び雌性のFVIII欠損FVIII-KOマウスを、8匹の動物の群に分ける。3〜5群を漸増用量の試験分子、1群を賦形剤(陰性対照)、1群を組換えFVIII(陽性対照)で処置する。さらなる用量の試験分子のためのさらなる群を研究に加えることができる。
【０３１８】
マウスにイソフルランで麻酔をかけ、加熱パッド上に置く。尾部を予め加熱した生理食塩水に37℃にて5分間入れる。ヒトコンセプト分子(ここで、コンセプト分子は、配列番号3〜236に列挙する任意のトロンビン感受性第X因子分子である)、賦形剤又は組換えFVIIIを、5ml/kgの投与容量でi.v.投与する。試験分子の用量は、これらの用量が用量応答ウィンドウをカバーするような様式でインビトロ特徴決定に基づいて選択する。陽性対照である5U/kg組換えFVIIIの用量は、出血表現型を標準化するために十分である。
【０３１９】
投与の後に、尾部を予め加熱した生理食塩水に戻し、5分後に尾静脈のテンプレートガイド下での横切開を、尾部の直径がちょうど2.7mmである点にて行う。尾部を予め加熱した生理食塩水に再び沈める。血液を60分にわたって回収し、容器中のヘモグロビン濃度を、550nmにて分光法により測定して、全血液喪失を決定する。
【０３２０】
データを実験を通して物理的に記録し、集計し、分析して、試験分子の用量応答プロファイルを決定する。
【０３２１】
(実施例26)
急性血友病A出血モデルにおけるトロンビン感受性FX分子の有効性
試験する各トロンビン感受性分子についてさらなるマウスの群を含めて(ここで、試験分子は、配列番号3〜236に列挙する任意のトロンビン感受性第X因子分子である)、実施例24に記載する実験を行う。組換えFVIIIを陽性対照として、賦形剤を陰性対照として、参照として実施例24及び25に記載する実験から選択された最良のコンセプト分子を含める。
【０３２２】
回収したデータを分析して、トロンビンによるトロンビン感受性FX分子の活性化を増進することが血液喪失及び凝固時間にどのように影響するかを証明する。
【０３２３】
(実施例27)
急性血友病A出血モデルにおける選択したリード分子の作用の期間
選択したリード分子(ここで、リード分子は、配列番号3〜236に列挙する任意のトロンビン感受性第X因子分子である)の単回用量を投与した8群のマウスを含めて、実施例24に記載する実験と同様の実験を行う。用量は、実施例24〜26に記載する実験に基づいて選択する。これらの群を、尾静脈横切開(尾部出血のための動物)又は血液サンプリング(ROTEMによるエキソビボ分析のための動物)の5分、又は1、3、5、12、24、48若しくは72時間前にi.v.処置する。回収したデータを分析して、血液喪失(尾部出血から)又は凝固時間(ROTEMから)を決定して、選択したリード分子の作用の期間を特徴決定する。
【０３２４】
(実施例28)
インヒビター合併血友病Aの急性出血モデルにおける有効性の検証
およそ2〜3kgの体重の雌性ニュージーランドホワイトウサギをそれぞれ8匹の動物の3群に分ける。モノクローナル抗FVIII抗体(FVIII 4F30)をi.v.投与してFVIII活性の非存在及びインヒビター患者において見出される中和抗体の存在を模倣することにより、2群を一過的に血友病にする。最後の群を参照のために正常にしておく。10分後に、ウサギに試験分子(ここで、試験分子は、配列番号3〜236に列挙する任意のトロンビン感受性第X因子分子である)、又は賦形剤を静脈内投与した後に、角質出血の誘導及び60分の観察期間を行う。血液を60分にわたって回収し、容器中のヘモグロビン濃度を、550nmにて分光法により測定して、全血液喪失を決定する。データを実験を通して物理的に記録し、集計し、分析して、インヒビター合併血友病モデルにおける血液喪失を低減する有効性を証明する。
【０３２５】
(実施例29)
血友病Aにおける出血予防の手段としてのトロンビン感受性FXコンセプトの確立
ヒト第X因子に対する耐性を、血友病A(FVIII-KO)のラットにおいて、新生児期にヒトタンパク質に曝露することにより誘導する。血友病Aラットが特発性で頻繁な再発出血を経験する青年期(およそ12週齢から)の間に、ラットを、臨床的予防を模倣する長期計画で処置する。出血の頻度及び重症度並びにそれらの臨床的発現の消散をモニタリングすることにより、効果を評価する。データを分析して、FVIIIを用いる要求に応じた処置及び/又は予防的処置を受けるFVIII-KOラットに対する過去のデータと比較した、予防的治療としての試験分子の効果を証明する。
【０３２６】
ヒト第X因子に対する耐性を誘導する代わりに、試験分子のラット特異的代替物を利用できる。
【０３２７】
(実施例30)
さらなる非げっ歯類の種での処置原理としてのトロンビン感受性FXコンセプトの確立
実施例28に記載するウサギでの研究に加えて、他の血友病処置についての効果及び投与要件を正確に予測した薬力学実験を血友病のイヌで行う。試験分子(ここで、試験分子は、配列番号3〜236に列挙する任意のトロンビン感受性第X因子分子である)を、最大で5ml/kgの投与容量を用いて少なくとも6カ月齢の血友病Aのイヌにi.v.投与する。効果を、代理マーカーを用いてエキソビボで、例えばトロンボエラストグラフィー(Knudsenら(2011) Haemophilia、17: 962〜970に以前に記載されたように)で、又はインビボで、例えば標準化した出血誘発及び全血液喪失又は出血時間のモニタリングを用いて評価する。最後に、試験分子は、自然発症的に出血するイヌを処置するために投与し得る。この背景では、確立された処置原理からの過去のデータと比較して、臨床的発現の消散を評価することにより効果をモニタリングする。
【０３２８】
本発明のあるいくつかの特徴をここに説明して記載したが、多くの改変、置換、変更及び等価物を、今では、当業者が理解している。よって、添付の特許請求の範囲は、本発明の忠実な範囲内にある全てのこのような改変及び変更をカバーすることを意図すると理解される。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図９】
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【図１】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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