(57)【要約】  本発明はフマル酸ジメチル(Dimethylfumarate、DMF)を有效成分として含む腎臓纎維症の予防または治療用組成物に関する。本発明によるフマル酸ジメチルは、Nrf２を活性化してTGF-β/Smad信号を阻害することで腎臓纎維症を減少する優れた治療效果があり、腎臓纎維症の予防または治療に有用に利用されることができる。
2016509020.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フマル酸ジメチル(Dimethylfumarate、DMF)を有效成分として含む腎臓纎維症の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項２】
上記フマル酸ジメチルは、Smad３リン酸化を減少させることを特徴とする、請求項１に記載の腎臓纎維症の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項３】
上記フマル酸ジメチルは、TGF-β/Smad信号を減少させることを特徴とする、請求項１に記載の腎臓纎維症の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項４】
上記フマル酸ジメチルは、Nrf２発現を促進することを特徴とする、請求項１に記載の腎臓纎維症の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項５】
フマル酸ジメチルを有效成分として含む腎臓纎維症の予防または改善用食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はフマル酸ジメチルを有效成分として含む腎臓纎維症の予防または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
纎維症(fibrosis)は、皮膚、肺、心臓、肝臓、腎臓などの臓器で、細胞外基質代謝異常が関与する結合組職タンパク質の過剰沈着を特徴とする疾病である。纎維症は任意の器官または組職内の健康な細胞を減少させることができる。また、纎維症性連結組職の塊が増加し、その結果、器官または組職の正常的構造を損傷することができる。このような損傷は影響を受ける器官または組職の生理学的及び生化学的機能を弱化させることができるし、その結果、器官が完全にいけなくなる。器官及び組職纎維症に対する病原論、診断方法、予防及び治療方法が幅広く研究されてきた。しかし、效果的治療剤の開発分野では依然と多くの課題がある。
【０００３】
纎維症の発病メカニズムは、現時点で十分に解明されたとは言えないが、一般的に、器官または組職の纎維症は複合的因子、例えば炎症、免疫学的反応、虚血、血動力学的変化など(これは軟組織細胞の炎症性変性及び怪死を引き起こす)によって引き起こされる。これによって損傷された軟組織細胞は、大食細胞を活性化させて多数のサイトカイン及び成長因子を放出するが、これらのうちTGF-β(transforminggrowth factor-beta)が重要である。TGF-βは停止細胞外基質成分(extracellular matrix: ECM)を活性化して細胞を生成し、これらを筋繊維芽細胞に変換させることができる。新しく形成された繊維芽細胞は、ECMの核心タンパク質であるコラーゲンの生成を増加させるだけでなく、ECMの破壊を減少させる。その結果、細胞外基質成分が蓄積され、これは器官または組職の纎維症を誘導する。したがって、器官または組職纎維症の開始及び進行は、炎症性反応及び炎症性サイトカイン、主にTGF-β生成の結果である。ECMの蓄積、及び器官または組職纎維症の形成に対するTGF-βの決定的役割に基づき、論理的に、抗-纎維症薬物の初期開発において前-炎症性(pro-inflammatory)サイトカイン、TGF-β(transforminggrowth factor-beta)の生成を阻害することができる化合物を調べることを重要目標とするようになった。
【０００４】
一方、フマル酸ジメチル(Dimethylfumarate、DMF)は外部からの酸化的ストレス(oxidativeStress)に対抗して細胞内抗酸化酵素(antioxidant enzymes)及びphase II解毒酵素(phase II detoxification enzymes)の生産に重要な転写調節因子であるNrf２を活性化させる物質と知られている。また、皮膚疾患である乾癬(psoriasis)治療に使われる薬物で多発性硬化症(multipleSclerosis)の治療に效果があり、これは現在臨床段階にある。そして、癌転移(metastasis)を阻害するとともに、癌細胞の増殖を抑制するという報告があるが、フマル酸ジメチルが腎臓纎維症の治療と改善に関する研究はまだ報告されていない。
【０００５】
ここで、本発明者らは新規な腎臓纎維症治療剤を開発するために努力した結果、フマル酸ジメチルがNrf２を活性化させて腎臓纎維症の減少效果があることを確認し、本発明を完成した。
【発明の詳細な説明】
【０００６】
【技術的課題】
【０００７】
本発明の目的はフマル酸ジメチル(Dimethylfumarate、DMF)を有效成分として含む腎臓纎維症の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、フマル酸ジメチルを有效成分として含む腎臓纎維症の予防または改善用食品組成物を提供することである。
【技術的解決方法】
【０００９】
上記目的を果たすために、本発明はフマル酸ジメチルを有效成分として含む腎臓纎維症の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００１０】
また、本発明はフマル酸ジメチルを有效成分として含む腎臓纎維症の予防または改善用食品組成物を提供する。
【有利な效果】
【００１１】
本発明のフマル酸ジメチルは、Nrf２を活性化させてTGF-β/Smad信号を阻害することで腎臓纎維症を減少する優秀な治療效果があるので、腎臓纎維症の予防または治療に有用に利用されることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】フマル酸ジメチルがPAI-１、α-SMA、フィブロネクチン及びコラーゲンΙ発現に及ぼす影響を示した図である。
【図２】フマル酸ジメチルがTGF-β/Smad３信号経路の減少に及ぼす影響を示した図である。
【図３】Nrf２がPAI-１、α-SMA、フィブロネクチン及びコラーゲンΙの発現抑制に及ぼす影響を示した図である。
【図４】Nrf２がTGF-β/Smad３信号経路の減少に及ぼす影響を示した図である。
【図５】抗酸化酵素であるNQO１及びHO-１とTGF-β/Smad信号経路の関連性を示した図である。
【図６】フマル酸ジメチルがUUOによって動物モデルから誘導された腎臓纎維症(renal fibrosis)に及ぼす影響を示した図である。
【発明の実施のための最善の形態】
【００１３】
本発明はフマル酸ジメチルを有效成分として含む腎臓纎維症の予防または治療用組成物を提供する。
【００１４】
上記組成物は薬学的組成物または食品組成物を含む。
【００１５】
以下、本発明についてより詳細に説明する。
【００１６】
本発明によるフマル酸ジメチルは、Nrf２発現を増加させることでTGF-β/Smad３を減少させ、細胞外基質(Extracellular matrix)の発現を抑制して腎臓纎維症を減少させる。よって、本発明によるフマル酸ジメチルは、腎臓纎維症の予防または治療に有用な医薬品または健康食品として使われることができる。
【００１７】
本発明の組成物はフマル酸ジメチルとともに腎臓纎維症の予防または治療效果を持つ公知の有效成分を１種以上含むことができる。
【００１８】
本発明の組成物は、投与するために上記の有效成分の他、さらに薬学的に許容できる担体を１種以上含んで製造することができる。薬学的に許容できる担体は、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれら成分の中で１成分以上を混合して使うことができ、必要によって抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など、他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤をさらに添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに、当該分野の適正な方法で、または、Remington's  Pharmaceutical  Science(最新版)、Mack  Publishing  Company、Easton  PAに開示されている方法で、各疾患または成分によって好ましく製剤化することができる。
【００１９】
本発明の組成物は、目的とする方法によって経口投与、または、非経口投与(例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用)することができ、投与量は患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重度などによってその範囲が多様である。上記フマル酸ジメチルの一日投与量は、約１０〜１００mg/kg、好ましくは約２５〜５０mg/kgであり、一日一回〜数回に分けて投与することが好ましい。
【００２０】
本発明の組成物は、腎臓纎維症の予防または治療のために単独で、または手術、ホルモン治療、薬物治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法と併用することができる。
【００２１】
本発明のフマル酸ジメチルは、腎臓纎維症に対する予防または改善目的で健康機能食品に添加されることができる。本発明のフマル酸ジメチルを食品添加物として使う場合、上記フマル酸ジメチルをそのまま添加したり、他の食品または食品成分とともに使うことができるし、通常の方法によって適切に使用することができる。有效成分の混合量は使用目的(予防、健康または治療的処置)によって適切に決めることができる。一般的に、食品または飲み物の製造時、本発明の組成物は原料に対して１５重量％以下、好ましくは１０重量％以下の量で添加される。しかし、健康及び衛生を目的としたり、または健康調節を目的とする長期間の攝取の場合、上記の量は上記範囲の以下であることがあり、安全性の面で何ら問題がないので、有效成分は上記範囲以上の量で使われることができる。
【００２２】
上記食品の種類に特に制限はない。上記物質を添加することができる食品は、例えば、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含んだ酪農製品、各種スープ、飲み物、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがあり、通常的意味としての健康機能食品を全て含む。
【００２３】
本発明の健康飲料の組成物は、通常の飲み物のように様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含むことができる。上述の天然炭水化物は、葡萄糖及び果糖のような単糖類、マルトース及びスクロースのような二糖類、デキストリン及びシクロデキストリンのような多糖類、及びキシリトール、ソルビトール及びエリトリトールなどの糖アルコールである。甘味剤としてはソーマチン、ステビア抽出物のような天然甘味剤や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘味剤などを使うことができる。上記天然炭水化物の割合は、本発明の組成物１００当たり一般的に約０.０１〜０.２０g、好ましくは約０.０４〜０.１０gである。
【００２４】
上記の他に本発明の組成物は様々な営養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、pH調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使われる炭酸化剤などを含むことができる。その他に本発明の組成物は天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料及び野菜飲料製造のための果肉を含有することができる。このような成分は独立的にまたは組み合わせて使うことができる。このような添加剤の割合はさほど重要ではないが、本発明の組成物１００重量部当たり０.０１〜０.２０重量部の範囲で選択されることが一般的である。
【発明の実施のための形態】
【００２５】
以下、本発明を理解するために好ましい実施例を提示する。しかし、下記実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるだけであって、実施例によって本発明の内容が限定されることではない。
【００２６】
[実施例１] フマル酸ジメチルのTGF-βによって増加されたPAI-１、α-SMA、フィブロネクチン及びコラーゲンΙの発現抑制確認。
【００２７】
１．フマル酸ジメチルの処理時、PAI-１、α-SMA、フィブロネクチン及びコラーゲンΙの発現量の確認
フマル酸ジメチルの処理時、PAI-１、α-SMA、フィブロネクチン及びコラーゲンIの発現を確認するために、下記のような実験を行った。まず、腎臓基質細胞(renal fibroblast cell、NRK-４９F)を１２時間飢えさせた後、フマル酸ジメチルを１時間処理した。その後、TGF-β(transforminggrowth factor-beta)(２ng/ml)を処理してPAI-１(plasminogen activator inhibitor１)、α-SMA(alpha-smooth muscle actin)、フィブロネクチン(Fibronectin)、コラーゲンΙ(CollagenTypeΙ)のような細胞外基質(Extracellular matrix)の発現がフマル酸ジメチル(DMF)によって減少されるか否かを半定量的(semi-quantitative)RT-PCRを通じて確認した。この結果を図１A(６時間)、B(２４時間)に示した。
【００２８】
図１A、Bに示されたように、フマル酸ジメチルが処理されない対照群に比べて、フマル酸ジメチルを処理した群の場合、PAI-１、α-SMA、フィブロネクチン、コラーゲンΙの発現量が減少することを確認した。
【００２９】
２．フマル酸ジメチルの処理時、PAI-１、α-SMAの相対的mRNAの発現量を確認
NRK-４９F細胞をフマル酸ジメチルに１時間処理した後、TGF-β(２ng/ml)で６時間刺激した。その後、PAI-１、α-SMAのmRNA発現量を実時間でRT-PCR分析し、フマル酸ジメチルの效果を確認した。データは独立的に三回測定し、平均±SEM(標準偏差)は次のとおりである。*P<０.０１vs.対照群；**P<０.０１、#P<０.００１vs.TGF-β刺激(図１Cの上端)；*P<０.００１vs.対照群；**P<０.０１、#P<０.００１vs.TGF-β刺激(図１Cの下端)。この結果を図１Cに示した。
【００３０】
図１Cに示されたように、フマル酸ジメチルが処理されない対照群に比べて、フマル酸ジメチルを処理した群の場合、PAI-１、α-SMAのmRNA発現量が著しく減少することを確認した。
【００３１】
３．フマル酸ジメチルがPAI-１の発現に及ぼす影響を確認
TGF-βによって刺激されたNRK-４９F細胞とRMC(rat mesangial cell)にフマル酸ジメチルを処理して、PAI-１の発現をウエスタンブロット(Western blot)分析法によって確認した。この結果を図１D(NRK-４９F)、E(RMC)に示した。
【００３２】
図１D、Eに示されたように、NRK-４９F及びRMC細胞の全てが、フマル酸ジメチルが処理されない対照群に比べて、フマル酸ジメチルが処理された群は、PAI-１の発現が著しく減少することを確認した。
【００３３】
[実施例２] フマル酸ジメチルのTGF-β/Smad３信号経路減少を確認。
【００３４】
１．TGF-βによって刺激されたPAI-１-Lucと(CAGA)９MLP-Lucリポーター(reporter)構造のフマル酸ジメチルによる效果の確認
AD-２９３細胞を２４時間ALK５(TGF-β構造活性タイプI受容体)があったり又はないPAI-１-Luc、または(CAGA)９MLP-Lucプラスミドに形質を感染させた。上記細胞を１２時間栄養を欠乏させた後、TGF-β(２ng/ml)で５時間刺激を与え、RLU値を測定した。データは独立的に三回測定し、平均±SEMは次のとおりである。(A)*P<０.００１vs.リポーター(reporter)単独；**P<０.００１、***P<０.０１vs.TGF-β刺激(図２Aの左側)。#P<０.０５vs.リポーター(reporter)単独；**P<０.０１、***P<０.０５vs.ALK５刺激(図２Aの右側)。(B)*P<０.０１vs.リポーター(reporter)単独；**P<０.０１vs.TGF-β刺激(図２Bの左側)。*P<０.０１vs.リポーター(reporter)単独；**P<０.０５、***P<０.０１vs.ALK５刺激(図２Bの右側)。この結果を図２A、Bに示した。
【００３５】
図２A、Bに示されたように、PAI-１-Luc及び(CAGA)９MLP-Luc形質感染された場合、全てフマル酸ジメチルを処理しない対照群に比べて、フマル酸ジメチルが処理された群はRLU値が低かった。
【００３６】
２．TGF-βによって刺激されたSmad３リン酸化に対するフマル酸ジメチルの影響を確認
TGF-βによって刺激されたSmad３リン酸化に対するフマル酸ジメチルの影響をウエスタンブロットを通じて確認してみた。欠乏されたNRK-４９F細胞とRMC(rat mesangial cell)細胞をフマル酸ジメチルに１時間予め処理しておいた後、TGF-β(２ng/ml)で１時間刺激を与えた。データは独立的に三回測定し、棒グラフは平均±SEMを意味する。(C)*P<０.０１vs.対照群、**P<０.０５vs.TGF-β刺激。(D)*P<０.００１vs.対照群、**P<０.０５、#P<０.０１、##P<０.００１vs.TGF-β刺激。この結果を図２C(NRK-２９F)、D(RMC)に示した。
【００３７】
図２C、Dに示されたように、TGF-βによって増加されたSmad３のリン酸化は、フマル酸ジメチルの濃度によって依存的に減少することを確認した。
【００３８】
[実施例３]Nrf２のPAI-１、α-SMA、フィブロネクチン、コラーゲンΙの発現抑制
【００３９】
１．フマル酸ジメチルの処理時、Nrf２発現増加の確認
血清が含まれていない培地で飢えさせたNRK-４９F細胞(Serum-starved cell)及びRMC細胞で抗酸化酵素発現の転写因子であるNrf２の発現とフマル酸ジメチル(４０μmol/l)の関係を調べるために、上記二つの細胞のNrf２発現量をサザンブロットを通じて時間帯ごとに確認した。この結果を図３A(NRK-４９F細胞)、E(RMC 細胞)に示した。
【００４０】
図３A、Eに示されたように、フマル酸ジメチルを処理した場合、Nrf２の発現量が増加することを確認した。
【００４１】
２．Nrf２の過発現時、細胞外基質成分の発現減少を確認
アデノウイルス(Ad-Nrf２)を利用してNrf２を過発現させた時、コラーゲンΙを始め、細胞外基質成分の発現に及ぼす影響をRNA水準で確認するために、２４時間欠乏されたNRK-２９F細胞をAd-Nrf２で感染させた。その後、TGF-β(２ng/ml)で６時間、１２時間または２４時間刺激を与えた。この結果を図３B(６時間)、C(１２時間)、D(２４時間)に示した。
【００４２】
図３B、C、Dに示されたように、Ad-Nrf２によって増加されたNrf２がコラーゲンΙを始め、細胞外基質成分の発現が有意に減少することをRNA水準で確認した。
【００４３】
３．Nrf２の過発現時、RNA及びタンパク質水準で細胞外基質成分の発現減少確認
アデノウイルス(Ad-Nrf２)が細胞外基質成分の発現に与える影響をタンパク質水準で確認するために、TGF-βによって刺激されたRMC細胞にAd-Nrf２を感染させ、サザンブロットでPAI-１のタンパク質発現量を確認した。また、TGF-βまたはALK５で刺激されたAD-２９３細胞を通じてNrf２の效果を調べた。ここでAD-２９３細胞は、PAI-１-LucプラスミドとNrf２-発現プラスミド、ALK５発現プラスミドとともに、またはこれらなしに２４時間相互感染(cotransfect)した後、１２時間血清が含まれていない培地で飢えさせ、TGF-βに５時間刺激を与えた。この結果を図３F、Gに示した。
【００４４】
図３Fに示されたように、Ad-Nrf２がPAI-１の発現を有意味に減少させることを確認した。
【００４５】
また、図３Gに示されたように、Nrf２がTGF-βまたはALK５によって刺激されて発現が促進されたPAI-１-Lucの発現を抑制することを確認した。
【００４６】
[実施例４]Nrf２のTGF-β/Smad３信号経路の減少。
【００４７】
１．Ad-Nrf２がSmad３リン酸化に及ぼす影響を確認
NRK-４９F細胞とRMC細胞を２４時間血清が含まれていない培地で飢えさせた後、Ad-GFPまたはAd-Nrf２に感染させてTGF-βで１時間刺激した。そして、二つの細胞で発現されたSmad３リン酸化の程度をウエスタンブロットで確認した。データは独立的に三回測定し、棒グラフは平均±SEMを意味する。(A)*P<０.０１vs.対照群、**P<０.０５vs.TGF-β刺激。(B)*P<０.００１vs.対照群、**P<０.０５、#P<０.０１vs.TGF-β刺激。この結果を図４A(NRK-４９F)、B(RMC)に示した。
【００４８】
図４A、Bに示されたように、Ad-Nrf２の量が増加するほど、Nrf２の発現量は増加し、p-Smad３(リン酸化されたSmad３)の発現量は減少することを確認した(上側)。そして、Ad-Nrf２を処理した場合、p-Smad３/Smad３の割合が縮むことを確認することができた。
【００４９】
２．Nrf２-siRNAによるNrf２発現増加の確認
フマル酸ジメチルによって増加されたNrf２が細胞外基質成分の発現に影響を与えるのか否かを確認するために、先ずNrf２ siRNA(small interfering RNA)を使用した場合、Nrf２発現の減少の可否を確認した。実験はAD-２９３細胞をNrf２-siRNAと対照群(scrambled siRNA)にそれぞれ感染させた後、２４時間培養した。そして、血清がない培地で１２時間培養した後、フマル酸ジメチル(４０μmol/l)を１時間処理し、半定量的(semi-quantitative)RT-PCRを行った。この結果を図４Cに示した。
【００５０】
図４Cに示されたように、Nrf２-siRNAを処理した場合が、対照群に比べてNrf２の発現が顕著に減少したことを確認することができた。
【００５１】
３．Nrf２-siRNAが(CAGA)９MLP-Luc発現に及ぼす影響を確認
フマル酸ジメチルによって抑制された(CAGA)９MLP-Lucの活性(TGF-β処理される)に対するNrf２-siRNAの效果を調べた。AD-２９３細胞を１２時間血清が含まれていない培地で飢えさせた後、(CAGA)９MLP-Lucに対照群-siRNAまたはNrf２-siRNAを２４時間相互感染(cotransfection)させた。その後、TGF-βに５時間刺激を与え、フマル酸ジメチル(４０μmol/l)で１時間処理した。データは独立的に三回測定し、棒グラフは平均±SEMを意味する。*P<０.０１vs.リポーター(reporter)単独、**P<０.０５vs.TGF-β刺激、***P<０.０５vs.フマル酸ジメチルを処理した対照群-siRNA。この結果を図４Dに示した。
【００５２】
図４Dに示されたように、Nrf２-siRNAを処理した場合に対照群に比べて(CAGA)９MLP-LucのRLU値が高いことを確認した。
【００５３】
４．Nrf２-siRNAのコラーゲンΙmRNA発現に対する效果を確認
フマル酸ジメチルによって抑制されたコラーゲンΙmRNA発現(TGF-β処理される)に対するNrf２-siRNAの效果を調べた。NRK-２９F細胞を２４時間対照群-siRNAとNrf２-siRNAに感染させた後、１２時間飢えさせた。細胞はフマル酸ジメチル(１０μmol/l)で１時間予め処理し、TGF-βに２４時間刺激を与えた後、半定量的(semi-quantitative)RT-PCR分析に使用した。この結果を図４Eに示した。
【００５４】
図４Eに示されたように、Nrf２-siRNAの添加によってコラーゲンΙの発現量が回復されることを確認した。
【００５５】
[実施例５] 抗酸化酵素であるNQO１及びHO-１とTGF-β/Smad信号経路の関連性
１．フマル酸ジメチルとHO-１、NQO１の関係を確認
NRK-４９F細胞でフマル酸ジメチルによる活性化酵素であるHO-１(heme-oxygenase-１)とNQO１の発現量を確認した。細胞はフマル酸ジメチル(４０μmol/l)を処理し、半定量的(semi-quantitative)RT-PCR分析を行った。結果を図５Aに示した。
【００５６】
図５Aに示されたように、フマル酸ジメチルを処理した場合、NQO１、HO-１の発現量が増加したことが判った。
【００５７】
２．NQO１と HO-１の(CAGA)９MLP-luciferase活性の下向調節(downregulation)の  效果を確認
AD-２９３細胞のNQO１とHO-１mRNAの発現に対するsiRNAの效果を半定量的(semi-quantitative)RT-PCRで確認した。
【００５８】
また、AD-２９３細胞を一時的に(CAGA)９MLP-lucリポーター(reporter)構造とNQO１またはHO-１に対するsiRNAに感染させた後、１２時間血清が含まれていない培地で飢えさせた。細胞は１時間フマル酸ジメチル(４０μmol/l)に予め処理されたし、 ５時間TGF-β(２ng/ml)で刺激した後、RLU値を測定した。データの平均±SEMは三回の独立的測定によるものであった。(C)*P<０.０５vs.リポーター(reporter)単独、**P<０.０５vs.TGF-β刺激、#P<０.０５vs.フマル酸ジメチル処理されたTGF-β刺激(図５Cの上)；*P<０.０５vs.リポーター(reporter)単独、**P<０.０５TGF-β刺激(図 ５Cの下)。この結果を図５B、Cに示した。
【００５９】
図５Bに示されたように、NQO１及びHO-１siRNAによってNQO１、HO-１の発現が減少することが確認できた。
【００６０】
また、図５Cに示されたように、フマル酸ジメチルによって減少された(CAGA)９MLP-lucプロモーターの活性がこれらsiRNAによって回復されなかった。
【００６１】
３．NQO１及びHO-１siRNAが細胞外基質に及ぼす影響を確認
TGF-βで刺激されたNRK-４９F細胞において、PAI-１、α-SMA、フィブロネクチンのmRNA発現のフマル酸ジメチル媒介性の抑制がNQO１またはHO-１によってノックダウン(knock-down)されるのか調べた。NRK-４９細胞はNQO１またはHO-１に対するsiRNAで２４時間感染させた。血清が含まれていない培地で飢えさせた細胞をフマル酸ジメチル(４０μmol/l)に１時間予め処理した後、TGF-β(２ng/ml)で６時間刺激を与え、半定量的(semi-quantitative)RT-PCRを行った。この結果を図５Dに示した。
【００６２】
図５Dに示されたように、対照群-siRNAを処理した群に比べた時、NQO１-siRNA及びHO-１-siRNAを処理した群の場合、PAI-１、α-SMA、フィブロネクチン、いずれも差がないことを確認した。これを通じて、フマル酸ジメチルによって減少された細胞外基質成分の発現にはこれら抗酸化酵素を通じる活性酸素(Reactive oxygen Species、ROS)とは無関連であることを確認した。
【００６３】
[実施例６] マウスに発生したUUO(Unilateral ureteral obstruction)
によって誘導された腎臓纎維症(renal fibrosis)に対するフマル酸ジメチルの效果を確認。
【００６４】
フマル酸ジメチルが細胞外基質成分の発現に影響を与えるのかマウスモデルの組職染色を通じて確認した。具体的には、Nrf２とNQO１の発現程度は免疫組職化学染色(immunohistochemical staining)を通じて確認したし、コラーゲンΙの発現程度はシリウスレッド(Sirius-Red)染色とトリクローム(Trichrome)染色を通じて確認した。動物実験はUUO(Unilateral ureteral obstruction)モデルを利用したし、経口投与(gavage)を通じてフマル酸ジメチルを食べさせたグループ(２５mg/kg)と食べさせなかったグループに分けて、UUO手術から一週間後に痲酔してグループ別に腎臓を得た。この結果を図６に示した。
【００６５】
図６Aに示されたように、フマル酸ジメチルを食べさせたグループでNrf２と標的タンパク質であるNQO１の発現が増加することを確認した。
【００６６】
図６Bに示されたように、フマル酸ジメチルを食べさせたグループでコラーゲンΙの発現が減少することを確認した。
【００６７】
図６Cに示されたように、フマル酸ジメチルを食べさせたグループでコラーゲンΙとα-SMAの発現が減少することを確認した。
【００６８】
図６Dに示されたように、実時間PCRを通じてα-SMA、フィブロネクチン、コラーゲンΙのRNA発現を確認した結果、フマル酸ジメチルを食べさせたグループで顕著に細胞外基質成分の発現が減少することを確認した。
【００６９】
図６Eに示されたように、リン酸化されたSmad３の発現がフマル酸ジメチルを食べさせたグループで減少することを確認した。
【００７０】
下記に本発明の組成物のための製剤例を例示する。
【００７１】
製剤例１: 薬学的製剤の製造
１．散剤の製造
フマル酸ジメチル                                  ２g
乳糖                                              １g
上記の成分を混合し、気密布に充填して散剤を製造した。
【００７２】
２．錠剤の製造
フマル酸ジメチル                              １００mg
コーンスターチ                                １００mg
乳糖                                          １００mg
ステアリン酸マグネシウム                          ２mg
上記の成分を混合した後、通常の錠剤製造方法にしたがって打錠し、錠剤を製造した。
【００７３】
３．カプセル剤の製造
フマル酸ジメチル                              １００mg
コーンスターチ                                １００mg
乳糖                                          １００mg
ステアリン酸マグネシウム                          ２mg
上記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法にしたがってゼラチンカプセルに充電してカプセル剤を製造した。
【００７４】
製剤例２: 食品の製造
本発明のフマル酸ジメチルを含む食品を次のように製造した。
【００７５】
１．調理用薬味の製造
フマル酸ジメチル２０〜９５重量％で健康増進用調理用薬味を製造した。
【００７６】
２．トマトケチャップ及びソースの製造
フマル酸ジメチル０.２〜１.０重量％をトマトケチャップまたはソースに添加して健康増進用トマトケチャップまたはソースを製造した。
【００７７】
３．小麦粉食品の製造
フマル酸ジメチル０.５〜５.０重量％を小麦粉に添加し、この混合物を利用してパン、ケーキ、クッキー、クラッカー及び麺類を製造し、健康増進用食品を製造した。
【００７８】
４．スープ及び肉汁(gravies)の製造
フマル酸ジメチル０.１〜５.０重量％をスープ及び肉汁に添加して健康増進用肉加工製品、麺類のスープ及び肉汁を製造した。
【００７９】
５．グラウンドビーフ(ground beef)の製造
フマル酸ジメチル１０重量％をグラウンドビーフに添加して健康増進用グラウンドビーフを製造した。
【００８０】
６．乳製品(dairy products)の製造
フマル酸ジメチル５〜１０重量％を牛乳に添加し、上記牛乳を利用してバター及びアイスクリームのような多様な乳製品を製造した。
【００８１】
製剤例３: 飲料の製造
１．炭酸飲料の製造
砂糖５〜１０％、クエン酸０.０５〜０.３％、カラメル０.００５〜０.０２％、ビタミンC０.１〜１％の添加物を混合し、これに７９〜９４％の精製水を入れてシロップを作り、上記シロップを８５〜９８℃で２０〜１８０秒殺菌して冷却水と１:４の割合で混合した後、炭酸ガスを０.５〜０.８２％注入して本発明のフマル酸ジメチルウル含む炭酸飲料を製造した。
【００８２】
２．健康飲料の製造
液状果糖(０.５％)、オリゴ糖(２％)、砂糖(２％)、食塩(０.５％)、水(７５％)のような副材料とフマル酸ジメチルを均質に配合して瞬間殺菌した後、これをガラス瓶、パットボトルなどの小包み容器に包装して健康飲料を製造した。
【００８３】
３．野菜ジュースの製造
フマル酸ジメチル５gをトマトまたはニンジンジュース１,０００mlに加えて健康増進用野菜ジュースを製造した。
【００８４】
４．フルーツジュースの製造
フマル酸ジメチル１gをりんごまたは葡萄ジュース１,０００mlに加えて健康増進用フルーツジュースを製造した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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