(57)【要約】  本発明は、前立腺がん、前立腺上皮内腫瘍(PIN)又は異型小腺房増殖(ASAP)の診断用バイオマーカーとしてのVPS28及び/又はVPS13Aの使用、並びに前立腺がんの予後を予測するためのバイオマーカーとしてのVPS13A、VPS28及び/又はNAALADL2の使用に関する。本発明は、前立腺がんのグレード又は病理学的ステージを決定するため、及び前立腺がんの進行をモニタリングするためのバイオマーカーとしてのVPS13A、VPS28及び/又はNAALADL2の使用にも関する。さらに本発明は、結腸、膵臓又は乳がんを診断するためのバイオマーカーとしてのNAALADL2の使用に関する。これらのバイオマーカーの使用に基づくアッセイ、システム及び記憶媒体も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における前立腺がん、前立腺上皮内腫瘍(PIN)又は異型小腺房増殖(ASAP)を診断するための方法であって、対象から得られる試験試料が、
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子及び/若しくはVPS28タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質及び/若しくはVPS28タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含み、正常参照試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現及び/又は活性が対象における前立腺がん、PIN又はASAPの存在を示す方法。
【請求項２】
対象から得られる試験試料が、
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子及びVPS28タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質及びVPS28タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子又はタンパク質の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含み、正常参照試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性が対象における前立腺がん、PIN又はASAPの存在を示す、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
対象から得られる試験試料が、
(i)VPS28タンパク質をコードする遺伝子及びNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS28タンパク質及びNAALADL2タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子又はタンパク質の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含み、正常参照試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性が対象における前立腺がん、PIN又はASAPの存在を示す、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
対象における前立腺がんのグレードを決定するための方法であって、対象から得られる試験試料が、
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/若しくはNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質、及び/若しくはNAALADL2タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現より高いレベルで発現するかどうか検出することを含み、正常参照試料と比較した試験試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現及び/又は活性のレベルが対象における前立腺がんのグレードを示し、その結果、各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の高い発現及び/又は活性が高グレードの前立腺がんを示す方法。
【請求項５】
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/若しくはNALAADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質及び/若しくはNAALADL2タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現より高いレベルで発現する対象から得られる試験試料が、対象が少なくとも3+3のグリーソングレードの前立腺がんを有する可能性があることを示す、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/若しくはNALAADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質及び/若しくはNAALADL2タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現より高いレベルで発現する対象から得られる試験試料が、対象が3+4又は4+3のグリーソングレードの前立腺がんを有する可能性があることを示す、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
対象から得られる試験試料が、
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子及びVPS28タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質及びVPS28タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子又はタンパク質の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含み、正常参照試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性が対象における前立腺がんのグレードを示す、請求項4から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
対象から得られる試験試料が、
(i)VPS28タンパク質をコードする遺伝子及びNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS28タンパク質及びNAALADL2タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子又はタンパク質の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含み、正常参照試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性が対象における前立腺がんのグレードを示す、請求項4から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
対象における前立腺がんの病理学的ステージを決定するための方法であって、対象から得られる試験試料が、
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/若しくはNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質、及び/若しくはNAALADL2タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現より高いレベルで発現するかどうか検出することを含み、正常参照試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子又はタンパク質の発現又は活性が対象における前立腺がんの病理学的ステージを示し、その結果、各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の高い発現及び/又は活性が高い病理学的ステージの前立腺がんを示す方法。
【請求項１０】
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/若しくはNALAADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質及び/若しくはNAALADL2タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現より高いレベルで発現する対象から得られる試験試料が、対象がpT2又はpT3の病理学的ステージの前立腺がんを有する可能性があることを示す、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
対象から得られる試験試料が、
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子及びVPS28タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質及びVPS28タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子又はタンパク質の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含み、正常参照試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性が対象における前立腺がんの病理学的ステージを示す、請求項9又は10に記載の方法。
【請求項１２】
対象から得られる試験試料が、
(i)VPS28タンパク質をコードする遺伝子及びNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS28タンパク質及びNAALADL2タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子又はタンパク質の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含み、正常参照試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性が対象における前立腺がんの病理学的ステージを示す、請求項9から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
対象における前立腺がんの進行をモニタリングするための方法であって、対象から得られる試験試料が、
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/若しくはNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質、及び/若しくはNAALADL2タンパク質
を、前記対象から得られた以前の試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含み、以前の試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現及び/又は活性がより侵襲型への前立腺がんの進行を示す方法。
【請求項１４】
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/若しくはNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質及び/若しくはNAALADL2タンパク質
を、前記対象から得られた以前の試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現より高いレベルで発現する対象から得られる試験試料が、少なくとも3+3のグリーソングレードへの前立腺がんの進行を示す、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/若しくはNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質及び/若しくはNAALADL2タンパク質
を、前記対象から得られた以前の試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現より高いレベルで発現する患者から得られる試験試料が、3+4又は4+3のグリーソングレードへの前立腺がんの進行を示す、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
対象から得られる試験試料が、
(i)VPS28タンパク質をコードする遺伝子及びVPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS28タンパク質及びVPS13Aタンパク質
を、前記対象から得られた以前の試料における各遺伝子又はタンパク質の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含み、以前の試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性がより侵襲型への前立腺がんの進行を示す、請求項13から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
対象から得られる試験試料が、
(i)VPS28タンパク質をコードする遺伝子及びNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS28タンパク質及びNAALADL2タンパク質
を、前記対象から得られた以前の試料における各遺伝子又はタンパク質の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含み、以前の試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性がより侵襲型への前立腺がんの進行を示す、請求項13から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前立腺がんを有する対象の予後を予測するための方法であって、対象から得られる試験試料が、
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/若しくはNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質、及び/若しくはNAALADL2タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現より高いレベルで発現するかどうか検出することを含み、試験試料と比較して高いレベルの正常参照試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現及び/又は活性が悪い予後を示す方法。
【請求項１９】
対象から得られる試験試料が、
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子及びVPS28タンパク質をコードする遺伝子、若しくはVPS28タンパク質とNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質及びVPS28タンパク質、若しくはVPS28タンパク質及びNAALADL2タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子又はタンパク質の発現より高いレベルで発現するかどうか検出することを含み、試験試料と比較して高いレベルの正常参照試料における各遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性が悪い予後を示す、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
BPHを診断するための方法であって、対象から得られる試験試料がVPS13A、VPS28及び/又はNAALADL2ではなくPSAを正常参照試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含み、正常参照試料と比較して高いレベルの試験試料におけるVPS13A、VPS28及び/又はNAALADL2ではなくPSAの発現が対象におけるBPHの存在を示す方法。
【請求項２１】
試験試料が全血、血漿、血清、尿、射精液、大便、膵生検からの組織又は細胞、根治的前立腺全摘除術又は胆管膵臓スポンジからの組織又は細胞である、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
対象における結腸、膵臓又は乳がんを診断するための方法であって、対象から得られる試験試料が、
(i)NAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)NAALADL2タンパク質
を、正常参照試料におけるNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子又はNAALADL2タンパク質の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含み、正常参照試料と比較して高いレベルの試験試料におけるNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子又はNAALADL2タンパク質の発現及び/又は活性が対象における結腸、膵臓又は乳がんの存在を示す方法。
【請求項２３】
試験試料が全血、血漿、尿、大便、膵生検又は胆管膵臓スポンジからの組織若しくは細胞、乳房生検からの組織若しくは細胞、又は結腸生検からの組織若しくは細胞である、請求項22に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺がん、前立腺上皮内腫瘍(PIN)又は異型小腺房増殖(ASAP)の診断用バイオマーカーとしてのVPS28及び/又はVPS13Aの使用、並びに前立腺がんの予後を予測するためのバイオマーカーとしてのVPS13A、VPS28及び/又はNAALADL2の使用に関する。本発明は、前立腺がんのグレード又は病理学的ステージを決定するため、及び前立腺がんの進行をモニタリングするためのバイオマーカーとしてのVPS13A、VPS28及び/又はNAALADL2の使用にも関する。さらに本発明は、結腸、膵臓又は乳がんを診断するためのバイオマーカーとしてのNAALADL2の使用に関する。これらのバイオマーカーの使用に基づくアッセイ、システム及び記憶媒体も提供する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺がんは、男性100,000人当たり135症例の発生率の、英国内の男性における最も一般的ながんであり(情報源:CR-UKウエブサイト)、皮膚がんを除くと北アメリカの男性において最も一般的に診断されるがんである。2012年には、約241,740の新たな症例及び28,170の前立腺がん関連の死が米国内で生じると推定される(情報源:National Cancer Insituteウエブサイト)。前立腺特異的抗原(PSA)試験の導入は、前立腺がんの発生率の上昇をもたらした(情報源:National Cancer Insituteウエブサイト)。しかしながら、死亡率はごくわずかに低下した状態を保った。年齢、疾患のステージ、グリーソングレード及び血清中PSAがリスク階層化に使用されるが(情報源:CR-UKウエブサイト)、診断及び予後予測に関してPSAは依然として前立腺がんにおける最も有用なバイオマーカーである。
【０００３】
しかしながら、PSAは前立腺がんに関する理想的なバイオマーカーではない。PSAは良性前立腺過形成(BPH)及び前立腺炎を含めたいくつかの良性状態によって増大し得るからである(Farley,2010)。4ng/mLのカットオフが使用される場合、感度は21%であり特異性は91%である(Wolf,et al.,2012)。したがって、前立腺がんの検出のため不必要に前立腺生検を受ける相当数の患者が存在し得る。
【０００４】
バイオマーカー前立腺がん遺伝子3(PCA3)が、前立腺がんを診断するためますます使用されている(Salagierski and Schalken,2012)。その感度は約65%でありその特異性は約60%である。しかしながら、現在のアッセイは前立腺マッサージ後の尿中PCA3mRNAの定量化を利用し、このためそれはより侵襲的なプロセスとなる。
【０００５】
バイオマーカーとしての循環核酸の使用には、高感度及び特異性で増幅され検出されるそれらの能力など、タンパク質に優る利点がある(Schwarzenbach et al.,2011)。発現アレイ及びリアルタイムPCRによって、一実験中での多くの遺伝子の定量化が可能である。Leon et alは、循環DNAレベルが健常対照と比較してがん患者中で増大したことを30年以上前に示した(Leon et al.,1977参照)。現代技術の進展は、バイオマーカーの発見及び開発において使用される循環RNAをもたらした。末梢血試料におけるRNAの発現は、潜在的バイオマーカーの新たな供給源であり(Papadopoulou et al.,2006)、血中RNAはがんの発症における初期事象を反映する可能性がある。PAXgeneシステムは、2.5mL末梢血からのRNAの保存と精製に使用される(Rainen et al.,2002)。それは-20℃で50カ月間血液試料を保存する。それを使用することによって、がんがある患者とがんがない患者の試料間のRNA発現レベルの差を調べることができる。PAXgeneシステムは、血液及びリウマチ性疾患における末梢RNAレベルを調べる試験において使用されている(Batliwalla et al.,2005;Lewis et al.,2011)。腫瘍学的観点から、乳がん及び甲状腺がんにおいてPAXgeneシステムを使用して末梢RNAレベルが試験されている(Li et al.,2004;Yang et al.,2011)。
【０００６】
PINは既存の前立腺管と細胞学上異型の細胞の内部を覆う腺房からなる。PINの分布は前立腺癌に関する帯状傾向の発症頻度を反映する。針生検シリーズにおける高グレードPINの発症頻度は5〜16%の範囲である。根治的前立腺全摘除術標本における高グレードPINの優勢度は高く、それは標本の85〜100%で存在し、病変と前立腺がんの間の強い関係を反映する(Ayala and Ro,2007)。PINがいくつかの前立腺癌の前駆体病変である、疫学的、形態学的及び分子学的証拠が存在する(Montironi et al.,2011)。PINを認識する臨床的重要性はPCaとのその関係に基づく。3つの重要な特徴(i)管構造の黒い内張り、(ii)周辺の正常管及び腺房より厚い内張り、及び(iii)複雑な管腔内増殖パターンによって、低倍率でPINを同定することができる(Montironi et al.,2011)。しかしながら、PINの診断は難題であり得る。中心帯の腺は前立腺の末梢及び移動帯の腺より構造上複雑であり、PINとして解釈され得る一定の核階層化を示すからである(Montironi et al.,2011)。さらに、中心血管切片、及び病巣管又は有孔パターンを伴う乳頭架橋形成が正常前立腺に存在し得る(Montironi et al.,2011)。中心帯は前立腺基部からの切片生検に頻繁に見られ、PINの診断を困難にし得る(Montironi et al.,2011)。前立腺浸潤性腺管癌の最も一般的な型が微乳頭及び有孔高グレードPINと似ていることも報告されており、診断は難題となる(Montironi et al.,2011)。
【０００７】
異型小腺房増殖(ASAP)は、良性で組織学上異型の似たがんからわずかに試料採取したがんまでの一連範囲を取り込んだ診断結果である(Bostwick and Meiers,2006;Montironi et al.,2006)。病理学者はASAPを、がんを示唆する可能性が高いがそれと診断されない特徴がある、通常小さい腺房の増殖と呼ぶこともある(Bostwick and Meiers,2006;Montironi et al.,2006)。ASAPの病巣を示す前立腺切片生検は、がんの疑いがあるがそれと診断されない可能性がある(Bostwick and Meiers,2006;Montironi et al.,2006)。ASAPの病巣は前立腺針生検標本の約2〜5%において見られ、前立腺の周辺帯に位置することが最も多く、移動帯に位置することは稀である。前立腺切片生検後に発見される悪性の疑いがあるASAPは、反復生検で二次的前立腺癌が予測されることが多く、17〜60%の範囲の症例が報告される(Bostwick and Meiers,2006;Montironi et al.,2006)。Schlesinger et al.(2005)は、PIN単独の事前診断後23%の症例及びASAP単独の診断後37%の症例で二次生検中の前立腺癌を発見した。
【０００８】
BPHは、泌尿器及び他の症状を引き起こし得る前立腺肥大症である。前立腺肥大症の未治療は膀胱からの尿の流れを遮断する可能性があり、膀胱、尿路又は腎臓の問題を引き起こす可能性がある。前立腺肥大症が40歳より若い男性において兆候及び症状を引き起こすのは稀である。55歳までに4人の男性中約1人が何らかの兆候及び症状を有し、75歳までには男性のほぼ半数が何らかの症状を報告する(情報源:Mayo Clinicウエブサイト)。前立腺に問題がある父親又は兄弟などの血縁者を有するとBPH発症のリスクが増大し、前立腺肥大症はアメリカ及びオーストラリアの男性においてより一般的である(情報源:Mayo Clinicウエブサイト)。BPHは直腸指診法(DRE)及び前立腺特異抗原(PSA)の測定を使用して診断されることが最も多い(情報源:National Kidney and Urologic Diseases Information Clearinghouse(NKUDIC)ウエブサイト)。PSAは前立腺細胞によって産生されるタンパク質であり、精液中に液化し、前立腺がん及びBPHを有する男性の血液中にしばしば高レベルで存在する(情報源:National Kidney and Urologic Diseases Information Clearinghouse(NKUDIC)ウエブサイト)。アメリカ食品医薬品局(FDA)はPSA試験を直腸指診法と共に使用して、50歳以上の男性における前立腺がんの検出を手助けすること、及び治療後に前立腺がんがある男性をモニタリングすることを承認している。しかしながら、がんとBPHを区別するPSA試験の能力、及び多量のPSA発見後の最良作業工程は限られている(情報源:National Cancer Instituteウエブサイト)。
【０００９】
VPS13Aは近年において胃がん及び結腸直腸がん、並びに慢性閉塞性肺疾患と関係している(Alexandre et al.,2012;An et al.,2012)。VPS13Aの突然変異は、学習、障害、筋肉弱体化及び筋単収縮により特徴付けられる、コレアアカントサイトーシス、神経発生障害と関係している。病理学的に、コレアアカントサイトーシスは釘状の赤血球細胞によって特徴付けられ、アクチン重合はVPS13Aの突然変異がある個体において変化する可能性があり、これは神経細胞における発見と一致する(Foller et al.,2012;Hayashi et al.,2012)。
【００１０】
VPS28は巨大マルチタンパク質ESCRT複合体、高度に保存されたエンドソーム輸送選別複合体の一部を形成する(Pineda-Molina et al.,2006;Rusten et al.,2012)。エンドソームは、トランスゴルジネットワーク、原形質膜及びリソソームの間の小胞輸送の調整を担う。膜受容体のエンドサイトーシスによって初期エンドソームが生じ、これらは再循環エンドソームに層化され、この場合受容体が細胞表面又は後期エンドソームとリソソームに戻りタンパク質は下方制御される(例えばEGFR)。ESCRT複合体は数種のタンパク質(VPS28、VPS23及びVPS37)からなり、これらはTSG101、既知のアンドロゲン受容体モディファイヤー及びコレギュレーターと結合することも知られている(Burgdorf et al.,2004;Sun et al.,1999)。WO2009/118205は、いずれもc-myc活性の指標から誘導した潜在的がんバイオマーカーの一覧中にVPS28を含む。しかしながら、この参照文献の焦点は肺がんであり、前立腺がんではない。
【００１１】
N-アセチル化α結合酸性ジペプチダーゼ様2(NAALADL2)は、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ活性をいずれも有するN-アセチル化α結合酸性ジペプチダーゼ(NAALADase)タンパク質ファミリーの新規なタンパク質メンバーである(Stauch et al.,1989)。NAALADファミリーは前立腺特異的膜抗原(PSMA)、前立腺がんにおけるイメージング及び薬物標的化の調査用の既知の前立腺バイオマーカーとも類似している(Liu et al.,2012;Osbourne et al.,2012)。NAALADL2におけるrs17531088リスクアレルは、血管に影響を与え死につながる可能性がある川崎病と以前から関係がある(Burgner et al.,2009)。NAALADL2遺伝子は、コルネリアデランゲ症候群、精神障害、発育遅滞、独特な顔の特徴及び四肢の収縮欠損によって特徴付けられる稀な発達奇形症候群につながる切断地点の部位でも確認された(Tonkin et al.,2004)。WO2009/028521は、前立腺がんの診断、特にホルモン療法耐性疾患、及び治療のためのNAALADL2の使用を言及する。しかしながら、前立腺がんの予後予測、疾患のステージ分類、又は疾患進行のモニタリングにおけるNAALADL2の有用性はWO2009/028521中には例示、特許請求、又は記載されていないが、本出願のいくつかの態様において実証する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らは、発現アレイ分析を介した循環RNA、qPCRによる検証、及びTaylor-Sawyersのデータセットからの前立腺組織における発現アレイ分析との相関関係を使用する前立腺がん及びPIN用の診断及び予後予測標的遺伝子セットを同定することを目的とする(Osbourne et al.,2012)。本発明者らは、循環RNAレベル及び前立腺組織内での遺伝子発現と前立腺組織内での対応するタンパク質発現に相関関係があるかどうかも調べた。これは切片生検標本の免疫組織化学及び組織マイクロアレイ(TMA)を使用して評価した。
【００１３】
これらの分析の結果として、本発明者らは、PSAではない、これらの状態と良性前立腺過形成(BPH)を区別することができる、前立腺がん、PIN及びASAP用の診断及び予後予測バイオマーカーを同定した。これによって、これらのバイオマーカーを使用して実施するアッセイの特異性が増大する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
第1の態様において、本発明は、対象における前立腺がん、PIN又はASAPを診断するための方法であって、対象から得られる試験試料が、
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子及び/若しくはVPS28タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質及び/若しくはVPS28タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含み、正常参照試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現及び/又は活性が対象における前立腺がん、PIN又はASAPの存在を示す方法を提供する。
【００１５】
本方法は、対象から得られる試験試料が、
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子及びVPS28タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質及びVPS28タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子又はタンパク質の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含むことができ、正常参照試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性は対象における前立腺がん、PIN又はASAPの存在を示す。
【００１６】
本方法は、対象から得られる試験試料が、
(i)VPS28タンパク質をコードする遺伝子及びNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS28タンパク質及びNAALADL2タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子又はタンパク質の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含むことができ、正常参照試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性は対象における前立腺がん、PIN又はASAPの存在を示す。
【００１７】
本方法は、対象から得られる試験試料が、
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子及びNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質及びNAALADL2タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子又はタンパク質の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含むことができ、正常参照試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性は対象における前立腺がん、PIN又はASAPの存在を示す。
【００１８】
本方法は、対象から得られる試験試料が、
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及びNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質及びNAALADL2タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子又はタンパク質の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含むことができ、正常参照試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性は対象における前立腺がん、PIN又はASAPの存在を示す。
【００１９】
第2の態様において、本発明は、対象における前立腺がんのグレードを決定するための方法であって、対象から得られる試験試料が、
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/若しくはNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質、及び/若しくはNAALADL2タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現より高いレベルで発現するかどうか検出することを含み、正常参照試料と比較した試験試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現及び/又は活性のレベルが対象における前立腺がんのグレードを示す方法を提供する。各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の高い発現及び/又は活性は、対象における高グレードの前立腺がんを示す。
【００２０】
本方法は、対象から得られる試験試料が、
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子及びVPS28タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質及びVPS28タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子又はタンパク質の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含むことができ、正常参照試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性は対象における前立腺がんのグレードを示す。
【００２１】
本方法は、対象から得られる試験試料が、
(i)VPS28タンパク質をコードする遺伝子及びNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS28タンパク質及びNAALADL2タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子又はタンパク質の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含むことができ、正常参照試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性は対象における前立腺がんのグレードを示す。
【００２２】
本方法は、対象から得られる試験試料が、
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子及びNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質及びNAALADL2タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子又はタンパク質の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含むことができ、正常参照試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性は対象における前立腺がんのグレードを示す。
【００２３】
本方法は、対象から得られる試験試料が、
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及びNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質及びNAALADL2タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子又はタンパク質の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含むことができ、正常参照試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性は対象における前立腺がんのグレードを示す。
【００２４】
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/若しくはNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質及び/若しくはNAALADL2タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現より高いレベルで発現する対象から得られる試験試料は、対象が少なくとも3+3のグリーソングレードの前立腺がんを有する可能性があることを示す。例えば対象は、3+4又は4+3のグリーソングレードの前立腺がんを有する可能性がある。対象は4+3のグリーソングレードの前立腺がんを有する可能性が最も高い。
【００２５】
第3の態様において、本発明は、対象における前立腺がんの病理学的ステージを決定するための方法であって、対象から得られる試験試料が、
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/若しくはNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質、及び/若しくはNAALADL2タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現より高いレベルで発現するかどうか検出することを含み、正常参照試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性が対象における前立腺がんの病理学的ステージを示す方法を提供する。各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の高い発現及び/又は活性は対象における高い病理学的ステージの前立腺がんを示す。
【００２６】
本方法は、対象から得られる試験試料が、
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子及びVPS28タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質及びVPS28タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子又はタンパク質の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含むことができ、正常参照試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性は対象における前立腺がんの病理学的ステージを示す。
【００２７】
本方法は、対象から得られる試験試料が、
(i)VPS28タンパク質をコードする遺伝子及びNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS28タンパク質及びNAALADL2タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子又はタンパク質の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含むことができ、正常参照試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性は対象における前立腺がんの病理学的ステージを示す。
【００２８】
本方法は、対象から得られる試験試料が、
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子及びNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質及びNAALADL2タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子又はタンパク質の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含むことができ、正常参照試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性は対象における前立腺がんの病理学的ステージを示す。
【００２９】
本方法は、対象から得られる試験試料が、
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及びNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質及びNAALADL2タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子又はタンパク質の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含むことができ、正常参照試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性は対象における前立腺がんの病理学的ステージを示す。
【００３０】
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/若しくはNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質及び/若しくはNAALADL2タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現より高いレベルで発現する対象から得られる試験試料は、対象がpT2又はpT3の病理学的ステージで前立腺がんを有する可能性があることを示す。
【００３１】
第4の態様において、本発明は、対象における前立腺がんの進行をモニタリングするための方法であって、対象から得られる試験試料が、
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/若しくはNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質、及び/若しくはNAALADL2タンパク質
を、前記対象から得られた以前の細胞又は組織試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含み、以前の試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現及び/又は活性がより侵襲型への前立腺がんの進行を示す方法を提供する。
【００３２】
本方法は、対象から得られる試験試料が、
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子及びVPS28タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質及びVPS28タンパク質
を、前記対象から得られた以前の試料における各遺伝子又はタンパク質の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含むことができ、以前の試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性は、より侵襲型への前立腺がんの進行を示す。
【００３３】
本方法は、対象から得られる試験試料が、
(i)VPS28タンパク質をコードする遺伝子及びNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS28タンパク質及びNAALADL2タンパク質
を、前記対象から得られた以前の試料における各遺伝子又はタンパク質の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含むことができ、以前の試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性は、より侵襲型への前立腺がんの進行を示す。
【００３４】
本方法は、対象から得られる試験試料が、
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子及びNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質及びNAALADL2タンパク質
を、前記対象から得られた以前の試料における各遺伝子又はタンパク質の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含むことができ、以前の試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性は、より侵襲型への前立腺がんの進行を示す。
【００３５】
本方法は、対象から得られる試験試料が、
(i)VPS28タンパク質をコードする遺伝子、VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子及びNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS28タンパク質、VPS13Aタンパク質及びNAALADL2タンパク質
を、前記対象から得られた以前の細胞又は組織試料における各遺伝子又はタンパク質の発現より高いレベルで発現する細胞又は組織を含むかどうか決定することを含むことができ、以前の試料と比較して高いレベルの試験試料における各遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性は、より侵襲型への前立腺がんの進行を示す。
【００３６】
(i)VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/若しくはVPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子とNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子とNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又はVPS28タンパク質をコードする遺伝子、VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、及びNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS28タンパク質及び/若しくはVPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質とNAALADL2タンパク質、VPS13Aタンパク質とNAALADL2タンパク質、又はVPS28タンパク質、VPS13Aタンパク質、及びNAALADL2タンパク質
を、前記対象から得られた以前の細胞又は組織試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現より高いレベルで発現する細胞又は組織を含む試験試料は、前立腺がんが少なくとも3+3のグリーソングレードまで進行したことを示し得る。例えば前立腺がんは、3+4又は4+3のグリーソングレードまで進行した可能性がある。前立腺がんは、4+3のグリーソングレードまで進行した可能性が最も高い。
【００３７】
第5の態様において、本発明は、前立腺がんを有する対象の予後を予測するための方法であって、対象から得られる試験試料が、
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/若しくはNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質、及び/若しくはNAALADL2タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現より高いレベルで発現するかどうか検出することを含み、試験試料と比較して高いレベルの正常参照試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現及び/又は活性が悪い予後を示す方法を提供する。
【００３８】
本方法は、対象から得られる試験試料が、
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子とVPS28タンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子とNAALADL2タンパク質、VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子とNAALADL2タンパク質、若しくはVPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及びNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質とVPS28タンパク質、VPS28タンパク質とNAALADL2タンパク質、VPS13Aタンパク質とNAALADL2タンパク質、若しくはVPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質及びNAALADL2タンパク質
を、正常参照試料における各遺伝子又はタンパク質の発現より高いレベルで発現するかどうか検出することを含むことができ、前記細胞又は組織の検出は悪い予後を示す。
【００３９】
第6の態様において、本発明は、
(i)対象から得られる試験試料中のVPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/又はNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子の発現、又はVPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質及び/又はNAALADL2タンパク質の発現及び/又は活性を測定又は定量化するステップ、並びに
(ii)正常参照試料中又は対象から得られる以前の試料中でのそれらの発現と各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の測定又は定量化した発現及び/又は活性を比較するステップであって、各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現が正常参照試料又は以前の試料中でのそれらの各発現及び/又は活性と比較して増大する場合、対象が前立腺がん、PIN若しくはASAP、又はより侵襲型の前立腺がんを有する可能性が高いことを確認するステップを含むアッセイを提供する。
【００４０】
第7の態様において、本発明は、前立腺がんを有する疑いがある対象に関する治療又はさらなる試験レジメンを選択するためのアッセイを提供し、このアッセイは、対象から得られる試験試料中のVPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/又はNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子の発現、又はVPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質及び/又はNAALADL2タンパク質の発現及び/又は活性を測定又は定量化するステップ、及び各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現を正常参照試料中又は対象から得られる以前の試料中でのそれらの発現及び/又は活性と比較して、対象がさらなる試験(例えば生検)、手術(例えば、根治的前立腺全摘除術)、放射線療法及び/又は化学療法を必要とするかどうか決定するステップを含む。
【００４１】
第8の態様において、本発明は、少なくとも一つの対象から得られた少なくとも一つの試験試料からデータを得るためのシステムであって、
(i)対象から得られた試験試料におけるVPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/又はNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子の発現、又はVPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質及び/又はNAALADL2タンパク質の発現及び/又は活性を定量化するための測定モジュール、
(ii)測定モジュールからのアウトプットデータを記憶するよう形成された記憶モジュール、
(iii)正常参照試料又は前記対象から得られる以前の試料から得られた参照及び/又は対照データと記憶モジュールに記憶されたデータを比較して、比較コンテンツを与えるように適合させた比較モジュール、及び
(iv)ユーザーに関する比較コンテンツを示すためのアウトプットモジュールであって、各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現及び/又は活性が正常参照試料又は以前の試料から得られた参照及び/又は対照データより高い場合、対象が前立腺がん、PIN若しくはASAPを有する、又はより侵襲型の前立腺がんを有する可能性があることを確認するアウトプットモジュール
を含むシステムを提供する。
【００４２】
第9の態様において、本発明は、対象における前立腺がん、PIN若しくはASAPの診断を容易にする及び/又は前立腺がんの進行をモニタリングするためのコンピューター実行システムであって、
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/又はNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子の発現、又はVPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質及び/又はNAALADL2タンパク質の発現及び/又は活性をレシーブ及びアウトプットするよう形成された決定モジュール、
(ii)決定モジュールからのアウトプットデータを記憶するよう形成された記憶モジュール、
(iii)正常参照試料又は前記対象から得られる以前の試料から得られた参照及び/又は対照データと記憶モジュールに記憶されたアウトプットデータを比較して、比較コンテンツを与えるように適合させた比較モジュール、及び
(iv)ユーザーに関する比較コンテンツを示すためのアウトプットモジュールであって、各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現及び/又は活性が正常参照試料又は以前の試料から得られた参照及び/又は対照データより高い場合、対象が前立腺がん、PIN若しくはASAPを有する、又はより侵襲型の前立腺がんを有する可能性があるアウトプットモジュール
を含むシステムを提供する。
【００４３】
第10の態様において、本発明は、
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/又はNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子の発現、又はVPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質及び/又はNAALADL2タンパク質の発現及び/又は活性を表す対象からのデータを含有するデータ記憶モジュール、
(ii)正常参照試料又は前記対象から得られる以前の試料から得られた参照データ及び/又は対照データとデータ記憶モジュールに記憶されたデータを比較して比較コンテンツを与える比較モジュール、及び
(iii)ユーザーに関する比較コンテンツを示すためのアウトプットモジュールであって、各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現及び/又は活性が正常参照試料から得られた参照及び/又は対照データより高い場合、対象が前立腺がん、PIN若しくはASAPを有する、又はより侵襲型の前立腺がんを有する可能性があるアウトプットモジュール
を含むコンピューター可読記憶媒体を提供する。
【００４４】
第11の態様において、本発明は、対象における結腸、膵臓又は乳がんを診断するための方法であって、対象から得られる試験試料が、
(i)NAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)NAALADL2タンパク質
を、正常参照試料におけるNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子又はNAALADL2タンパク質の発現より高いレベルで発現するかどうか決定することを含み、正常参照試料と比較して高いレベルの試験試料におけるNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子又はNAALADL2タンパク質の発現及び/又は活性が対象における結腸、膵臓又は乳がんの存在を示す方法を提供する。
【００４５】
以下の陳述は、本発明の任意の前述の態様又は実施形態に当てはまる。
【００４６】
本明細書に開示する本発明の任意の方法、アッセイ、システム又は記憶媒体において、対象はヒトであることが好ましい。
【００４７】
試験試料は、全血、血漿、尿、射精液、大便、膵生検、前立腺生検(例えば前立腺微小針生検)、根治的前立腺全摘除術、嚢胞液又は胆管膵臓スポンジからの組織であることが好ましい。
【００４８】
正常参照試料は、対象由来の良性若しくは正常細胞又は組織を含み得る。いくつかの実施形態では、正常参照試料を試験試料と同じ組織から得ることができる。例えば、正常参照試料は試験試料内に存在する内部参照であってよい。いくつかの実施形態では、正常参照試料は、健常対象、即ち前立腺がん、PIN又はASAPがない対象由来の対応する試料型であってよい。例えば正常参照試料は、健常対象、即ち前立腺がん、PIN又はASAPがない対象から得られた全血、血漿、尿又は射精液であってよい。対象における前立腺がんの進行をモニタリングするための方法中では、以前の試料は試験試料と同じ型であることが好ましい。
【００４９】
VPS28タンパク質、VPS13Aタンパク質及び/又はNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子の発現を決定するステップは、例えばVPS28、VPS13A又はNAALADL2のmRNAの発現を決定することにより実施することができる。例えば、VPS28、VPS13A又はNAALADL2のmRNAの発現は、定量RT-PCR、デジタルPCR、次世代シークエンシング(NGS)又はノーザンブロッティングにより決定することができる。
【００５０】
VPS28、VPS13A及び/又はNAALADL2タンパク質の発現を決定するステップは、例えば関連タンパク質と結合する抗体を用いたVPS28、VPS13A及び/又はNAALADL2タンパク質の検出により実施することができる。例えば、VPS28、VPS13A及び/又はNAALADL2タンパク質の発現は免疫組織化学、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー、多重化、例えば多重化ELISA、又はモノクローナル抗体イメージングモダリティ及び関連細胞表面標的化技術(例えばナノスポッティング)により決定することができる。
【００５１】
VPS28、VPS13A及び/又はNAALADL2タンパク質の発現は、VPS28、VPS13A及び/又はNAALADL2タンパク質の活性の決定により決定することができる。例えば、NAALADL2タンパク質の酵素活性を決定することができる。
【００５２】
本発明のそれぞれの方法、アッセイ又はシステムは、対象から試験試料を得るステップを含むことができる。それぞれの方法、アッセイ又はシステムは、試験試料を処理してDNA、cDNA、mRNA及び/又はタンパク質を得るステップも含むことができる。
【００５３】
本発明のそれぞれの方法、アッセイ又はシステムは、(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/又はNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子の発現、又は(ii)VPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質及び/又はNAALADL2タンパク質の発現及び/又は活性を測定するステップを含むことができる。
【００５４】
本発明のそれぞれの方法、アッセイ又はシステムは、治療するための前立腺がん、PIN若しくはASAPを有することを確認した対象を選択する、又は前立腺がん、PIN若しくはASAPを有することを確認した対象を治療するための追加的ステップを含むことができる。例えば対象を選択し、又は手術(例えば、根治的前立腺全摘除術)、化学療法及び/又は放射線療法を施すことができる。
【００５５】
低リスク疾患(PSA<10、臓器限定疾患)に関して、手術、慎重な待機、積極的監視、放射線療法、ブラッチーセラピー(brachytherapy)、化学療法はいずれも選択肢である。中リスク疾患(PSA>10、臓器限定疾患)では慎重な待機、積極的監視又はブラッチーセラピーを患者に施す可能性は低い。再発の可能性がより高いからである。本明細書に記載するマーカーが、誰が健康/不健康状態になりやすいか予測することができる場合、この決定は十分良く伝えられる可能性がある。高リスク疾患がある患者(PSA>10、局所進行)は手術、放射線療法又は化学療法を施され得るが、この場合も決定は、バイオマーカーによって推測される再発の高リスクによって影響され得る。再発患者は、通常初回に放射線療法を施される。再発の高リスクが予測された場合、放射線療法又は化学療法を術後に施すことが可能である。
【００５６】
本発明のそれぞれの方法、アッセイ又はシステムは、前立腺がん、PIN又はASAPを有する可能性があると確認した対象をさらに試験するための、又は前立腺がん、PIN又はASAPを有する可能性があると確認した対象をさらなる試験用に選択するための追加的ステップを含むこともできる。例えば、生検試料は対象から得ることができ、又は生検用に対象を選択することができる。患者から入手した試験試料が膵生検からの組織又は細胞であった場合、この試験試料から前立腺がん、PIN又はASAPを有する可能性があると確認した対象は再生検され得る、又は再生検用に選択され得る。
【００５７】
本発明のこれらの態様及び他の態様は、以下でさらに詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】VPS13Aに関して染色した前立腺組織マイクロアレイ(TMA)切片を示す図である。腺腫瘍はVPS13Aに関して強く染色され、一方で良性腺は全く染色されない(黒い矢じり)。核をヘマトキシリンで対比染色する。染色は斑点状であり大部分は先端が分かれている。高倍率では、一定割合の組織が環様構造をさらに示した(白い矢じり)。
【図２】免疫組織化学により決定しグリーソングレードにより階層化した(G3〜G5)ケンブリッジTMAにおけるVPS13Aの発現を示す図である。それぞれの患者は、2領域由来の少なくとも3個の良性及び6個の腫瘍切片、並びに(しばしば良性であった)最大3個のPIN含有切片を有していた。明らかな良性腫瘍と腫瘍を一切片内で検出した場合、両方の領域は別々に記録した。
【図３】6以下、7、又は8以上のグリーソングレードを有する患者においてIHCにより決定したTrans-Atlantic Prostate Group(TAPG)TMAにおけるVPS13Aの発現を示す図である。それぞれの切片によって1つのスコアを得た。
【図４】IHCにより決定したKarolinksa TMAにおけるVPS13Aの発現を示す図である。それぞれの患者は評価対象の3個の良性及び3個の腫瘍切片を有していた。染色の強度と分布を測定して免疫反応積(IRP)を得た。P値はマンホイットニー両側t検定を使用して計算した。
【図５】分類したVPS13A染色の免疫反応積(IRP)によるカプランマイヤーの無再発生存率推定値を示す図である。破線は5年の生存を示す。
【図６】ホルモン療法抵抗性(HR)TMAのVPS13A染色を示す図である。ホルモン療法適合性非投薬(HN)組織とHR組織の間に統計的有意差はなかったが(p=0.49)、VPS13Aは良性と区別することができた(p<0.0001)。
【図７】様々なグレードの前立腺がんにおけるVPS13AmRNAの相対的発現を示す図である。PAXgeneチューブ中に回収した全血由来のmRNAを循環VPS13AmRNAの発現に関してアッセイした。進行性疾患に悪化する前に侵襲性疾患においてレベルが著しく上昇した。分類したデータは、一元配置ANOVA及びクラスカルワリスの補正を使用して分析した。グリーソン3+4及び4+3の疾患のペアワイズ比較を、マンホイットニー対応t検定を使用して実施した。全ての結果は平均的な良性の結果と比較して表す。
【図８】転移性患者におけるVPS13Aの相対的発現を示す図である。転移性患者の全血由来の循環mRNAを循環VPS13AmRNAの発現に関してアッセイした。ペアワイズ比較を、マンホイットニー対応t検定を使用して実施した。全ての結果は平均的なホルモン剤非投薬の結果と比較して表す。
【図９】VPS13A小胞とリソソームの間の会合を示す図である。VPS13A小胞を染色しリソソームはLAMP2で染色した。同時局在事象は白い矢じりで示す。
【図１０】リソソーム膜へのVPS13A小胞の組み込みに対するバフィロマイシン処置の影響を示す図である。バフィロマイシン処置後、VPS13A小胞がLAMP2で染色したリソソーム膜に組み込む。リソソーム膜全体にVPS13Aの分散の痕跡はない。
【図１１】PSAの分泌に対するVPS13Aノックダウンの影響を示す図である。VPS13Aが内在レベルの60〜70%までノックダウンすると、PSAの分泌は有意に減少する。
【図１２】VPS13Aタンパク質発現に対する1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸(BAPTA)又はカルシマイシンを用いた処置の影響を示す図である。非標的対照LNCaP細胞又はsiVPS13A細胞を10μMのBAPTA(B)、カルシマイシン(Cal)又は対照(C)で8時間処置した。タンパク質溶解物をSDS-PAGEによって分離し、VPS13A及びチューブリンでプローブ処置した。
【図１３】VPS13A小胞とリソソームの間の融合に対するBAPTA及びカルシマイシンを用いた処置の影響を示す図である。LNCaP細胞は100mMのカルシマイシン、カルシウムイオノフォース(calcium ionophose)、又は10nMのBAPTA、カルシウムキレート剤のいずれかを用いて4時間処置した。次いで細胞を固定しLAMP2及びVPS13Aに関して染色した。100倍レンズを使用して、10視野内のリソソームの数を数えた。次いでVPS13A融合事象の数を同じ視野内で数えた。融合事象は、VPS13A小胞接触又はLAMP2陽性リソソームへの組み込みとして分類した。データはそれぞれの視野内のリソソームの数に標準化して示す。P値はマンホイットニー両側t検定を使用して計算した。
【図１４】VPS28に関して染色した前立腺組織を示す図である。腺腫瘍はVPS28に関して強く染色され(黒い矢じり)、一方で良性腺は全く染色されない(白い矢じり)。染色は斑点状であり大部分は核周辺である。
【図１５】IHCにより決定しグリーソングレードにより階層化した(G3〜G5)ケンブリッジTMAにおけるVPS28の発現を示す図である。それぞれの患者は、2領域由来の少なくとも3個の良性及び6個の腫瘍切片を有していた。明らかな良性腫瘍と腫瘍を一切片内で検出した場合、両方の領域は別々に記録した。
【図１６】IHCにより決定したKarolinska TMAにおけるVPS28の発現を示す図である。それぞれの患者は評価対象の3個の良性及び3個の腫瘍切片を有していた。染色の強度と分布を測定して免疫反応積(IRP)を得た。P値はマンホイットニー両側t検定を使用して計算する。
【図１７】分類したVPS28染色の免疫反応積(IRP)によるカプランマイヤーの無再発生存率推定値を示す図である。破線は5年の生存を示す。
【図１８】様々なグレードの前立腺がんにおけるVPS28mRNAの相対的発現を示す図である。全血由来のmRNAをPAXgeneチューブ中に回収し、循環VPS28mRNAの発現に関してアッセイした。進行性疾患に悪化する前に侵襲性疾患においてレベルが著しく上昇した。分類したデータは、一元配置ANOVA及びクラスカルワリスの補正を使用して分析した。グリーソン3+4及び4+3の疾患のペアワイズ比較を、マンホイットニー対応t検定を使用して実施した。全ての結果は平均的な良性の結果と比較して表す。
【図１９】転移性前立腺がん患者におけるVPS28mRNAの相対的発現を示す図である。転移性患者の全血由来の循環mRNAを循環VPS28mRNAの発現に関してアッセイした。ペアワイズ比較を、マンホイットニー対応t検定を使用して実施した。全ての結果は平均的なホルモン剤非投薬の結果と比較して表す。
【図２０】NAALADL2及びPSMAに関して染色した前立腺組織を示す図である。腺腫瘍は基底膜に沿ってNAALADL2に関して強く染色され(茶色)(黒い矢じり)、一方で良性腺は全く染色されない(白い矢じり)。PSMAは先端/内腔膜を染色する(グレーの矢じり)。
【図２１】IHVにより決定しグリーソングレードにより階層化した(G3〜G5)ケンブリッジTMAにおけるNAALADL2の発現を示す図である。それぞれの患者は、2領域由来の少なくとも3個の良性及び6個の腫瘍切片を有していた。明らかな良性腫瘍と腫瘍を一切片内で検出した場合、両方の領域は別々に記録した。
【図２２】IHCにより決定し病理学的ステージにより階層化したケンブリッジTMAにおけるNAALADL2の発現を示す図である。それぞれの患者は、2領域由来の少なくとも3個の良性及び6個の腫瘍切片を有していた。明らかな良性腫瘍と腫瘍を一切片内で検出した場合、両方の領域は別々に記録した。
【図２３】IHCにより決定したKarolinska TMAにおけるNAALADL2の発現を示す図である。それぞれの患者は評価対象の3個の良性及び3個の腫瘍切片を有しており、染色の強度と分布を測定して免疫反応積(IRP)を得た。P値はマンホイットニー両側t検定を使用して計算する。
【図２４】分類したNAALADL2染色の免疫反応積(IRP)によるカプランマイヤーの無再発生存率推定値を示す図である。破線は5年の生存を示す。
【図２５】ホルモン療法抵抗性(HR)TMAのNAALADL2染色を示す図である。ホルモン療法適合性非投薬(HN)組織とHR組織の間に統計的有意差はなかったが(p=0.59)、NAALADL2は全ての腫瘍と良性腫瘍を区別することができた(p<0.0001)。
【図２６】異なるグリーソンスコアを有する前立腺がん患者におけるNAALADL2の相対的発現を示す図である。全血由来のmRNAをPAXgeneチューブ中に回収し、循環NAALADL2mRNAの発現に関してアッセイした。進行性疾患に悪化する前に侵襲性疾患においてレベルが著しく上昇した。分類したデータは、一元配置ANOVA及びクラスカルワリスの補正を使用して分析し、グリーソン3+4及び4+3の疾患のペアワイズ比較を、マンホイットニー対応t検定を使用して実施した。全ての結果は平均的な良性の結果と比較して表す。
【図２７】転移性患者におけるNAALADL2の相対的発現を示す図である。転移性患者の全血由来の循環mRNAを循環NAALADL2mRNAの発現に関してアッセイした。ペアワイズ比較を、マンホイットニー対応t検定を使用して実施した。全ての結果は平均的なホルモン剤非投薬の結果と比較して表す。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
本発明は、VPS13A、VPS28及びNAALADL2は前立腺がん組織中で増加した発現を示し、前立腺がん、PIN及びASAPの診断及び予後予測バイオマーカーとして使用することができるという発見に基づく。本発明者らは、これらのバイオマーカーが前立腺がんの病理学的ステージと異なるグレードを区別することができ、これらを使用してより侵襲型への疾患の進行をモニタリングすることができることを発見している。本明細書中に開示するように、これらのバイオマーカーを使用して前立腺がんを有する患者の予後を予測することもできる。本発明者らは、結腸、膵臓又は乳がん用の診断バイオマーカーとしてNAALADL2をさらに使用することができることも発見している。
【００６０】
ヒトVPS13A、ヒトVPS28及びヒトNAALADL2のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を以下に示す。VPS13AはCHAC及びKIAA0986としても知られている。VPS28は液胞タンパク質選別関連タンパク質28ホモログ、H-Vps28、ESCRT-1複合体サブユニットVPS28及び酵母クラスEタンパク質Vps28pホモログとしても知られている。NAALADL2は、不活性N-アセチル化α結合酸性ジペプチダーゼ様タンパク質2、NAALADaseL2、N-アセチル化α結合酸性ジペプチダーゼ2及びグルタミン酸カルボキシペプチダーゼII型非ペプチダーゼホモログとしても知られている。
【００６１】
前に記載したように、本発明は、対象における前立腺がん、PIN又はASAPを診断するための方法、対象における前立腺がんのグレード又は病理学的ステージを決定するための方法、対象における前立腺がんの進行をモニタリングするための方法、又は前立腺がんを有する対象の予後を予測するための方法に関する。アッセイ、システム及び記憶媒体も提供する。
【００６２】
対象における前立腺がん、PIN又はASAPを診断するための方法において、正常参照試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現と比較して増加した、対象から得られる試験試料における
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子及び/若しくはVPS28タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質及び/若しくはVPS28タンパク質
の発現及び/又は活性は、対象が前立腺がん、PIN又はASAPを有する可能性があることを示す。
【００６３】
本明細書で示すように、VPS13A及びVPS28の発現はBPHを有する対象中では増加せず、したがって、この方法は前立腺がん/PIN/ASAP及びBPHの存在を区別することができる。
【００６４】
したがって本発明は、BPHを診断するための方法であって、対象から得られる試験試料が、正常参照試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現より高いレベルで、VPS13A、VPS28及び/又はNAALADL2ではなくPSAを発現するかどうか決定することを含み、正常参照試料と比較して高いレベルの試験試料におけるVPS13A、VPS28及び/又はNAALADL2ではなくPSAの発現が対象におけるBPHの存在を示す方法をさらに提供する。このようにBPHを診断することが可能であることは、前立腺がんを有する疑いのある対象が、過剰治療される可能性が低いことを意味する。
【００６５】
対象における前立腺がんのグレードを決定するための方法において、正常参照試料と比較して増加した、対象から得られる試験試料における
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/若しくはNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質、及び/若しくはNAALADL2タンパク質
の発現及び/又は活性は、対象における前立腺がんのグレードを示す。
【００６６】
1つ以上の各遺伝子若しくはタンパク質の発現及び/又は活性は前立腺がんのグレードを示し、その結果、1つ以上の各遺伝子若しくはタンパク質の高レベルの発現及び/又は活性は高グレードの前立腺がんを示す。
【００６７】
例えば、正常参照試料と比較して増加した、対象から得られる試験試料における
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/若しくはNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質、及び/若しくはNAALADL2タンパク質
の発現及び/又は活性は、少なくとも3+3のグリーソングレードの前立腺がんを対象が有する可能性があることを示し得る。例えば対象は、3+4又は4+3のグリーソングレードの前立腺がんを有する可能性がある。対象は、4+3のグリーソングレードの前立腺がんを有する可能性が最も高い。
【００６８】
腫瘍のグリーソングレードは典型的に、組織生検の顕微鏡検査により病理学者によって決定される。病理学者は、最も一般的な腫瘍パターンにグレードを、次に最も一般的な腫瘍パターンに第2のグレードを割り当てる。2つのグレードを一緒に加えてグリーソンスコアを得る(Epstein et al.,2005参照)。これらのパターンは以下に記載する。
【００６９】
パターン1:密集しているが別個で、均一な、ほぼ卵形の中程度の大きさの腺房の限局性結節(パターン3より大きな腺)。
【００７０】
パターン2:パターン1と同様に、明らかに限局性であるが、腫瘍結節の端部に最小の浸潤があり得る。腺はより散漫に位置し、グリーソンパターン1ほど十分均一ではない。
【００７１】
パターン3:離散した腺単位、典型的にはグリーソンパターン1又は2において見られるものより小さな腺。非腫瘍形成前立腺房中及びその間の浸潤。大きさと形状の顕著な変化。平面に限局的な小さな腫瘍の有孔結節。
【００７２】
パターン4:融合状態の微小腺房腺、腺腔があまり形成されない不明確な腺、大きな有孔腺、不規則な境界がある有孔腺、副腎腫。
【００７３】
パターン5:腺の分化ほぼなし、固形シート、コード、又は単細胞で構成される。乳頭篩又は固形塊に囲まれた中心壊死があるコメド癌。
【００７４】
対象における前立腺がんの病理学的ステージを決定するための方法において、正常参照試料と比較して増加した、対象から得られる試験試料における
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/若しくはNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質、及び/若しくはNAALADL2タンパク質
の発現及び/又は活性は、対象における前立腺がんの病理学的ステージを示す。
【００７５】
1つ以上の各遺伝子の発現若しくは1つ以上の各タンパク質の発現及び/又は活性は前立腺がんの病理学的ステージを示し、その結果、1つ以上の各遺伝子若しくはタンパク質の高レベルの発現及び/又は活性は高い病理学的ステージの前立腺がんを示す。
【００７６】
例えば、正常参照試料と比較して増加した、対象から得られる試験試料における
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/若しくはNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質、及び/若しくはNAALADL2タンパク質
の発現及び/又は活性は、少なくともpT2又はpT3の病理学的ステージの前立腺がんを対象が有する可能性があることを示し得る。
【００７７】
(the 6th Edition of the AJCC Cancer Staging Manual,2002及びthe 6th Edition of the UICC Classification of Malignant Tumoursから得られた)TNM病理学的ステージ分類システムの詳細を以下に与える。
【００７８】
(原発性)腫瘍の評価(「T」)
・TX:原発性腫瘍を評価することができない
・T0:腫瘍の痕跡なし
・T1:腫瘍は存在するが、臨床上又はイメージングで検出できない
○T1a:摘出した前立腺組織の5%未満において(他の理由で)腫瘍が偶然発見された
○T1b:摘出した前立腺組織の5%より多くにおいて腫瘍が偶然発見された
○T1c:多量の血清中PSAのため実施した針生検において腫瘍が発見された
・T2:検査時に腫瘍を触る(触診する)ことはできるが、前立腺の外には蔓延していない
○T2a:腫瘍が前立腺の2つの葉の1つの半分以下で存在する
○T2b:腫瘍が、両方ではなく1つの葉の半分より大きい状態で存在する
○T2c:腫瘍が両方の葉中に存在する
・T3:腫瘍が前立腺被膜を通じて蔓延する(それがごく一部分中に蔓延する場合、それはまだT2である)
○T3a:腫瘍が片側又は両側で被膜を通じて蔓延する
○T3b:腫瘍が一方又は両方の精嚢に侵襲している
・T4:腫瘍が他の近隣組織に侵襲している
【００７９】
局所リンパ節の評価(「N」)
・NX:局所リンパ節を評価することができない
・N0:局所リンパ節への蔓延なし
・N1:局所リンパ節への蔓延あり
【００８０】
遠隔転移の評価(「M」)
・MX:遠隔転移を評価することができない
・M0:遠隔転移なし
・M1:遠隔転移あり
○M1a:がんが局所リンパ節を越えてリンパ節に蔓延している
○M1b:がんが骨に蔓延している
○M1c:がんが(関連骨と無関係に)他の部位に蔓延している
【００８１】
対象における前立腺がんの進行をモニタリングするための方法において、前記対象から得られた以前の試料と比較して増加した、対象から得られる試験試料における
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/若しくはNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質、及び/若しくはNAALADL2タンパク質
の発現及び/又は活性は、より侵襲型への前立腺がんの進行を示す。
【００８２】
前記対象から得られた以前の細胞又は組織試料と比較して増加した、対象から得られる試験試料における
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/若しくはNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質、及び/若しくはNAALADL2タンパク質
の発現及び/又は活性は、前立腺がんが少なくとも3+3のグリーソングレードまで進行したことを示し得る。例えば前立腺がんは、3+4のグリーソングレード又は4+3のグリーソングレードまで進行した可能性がある。前立腺がんは、4+3のグリーソングレードまで進行した可能性が最も高い。このように、本発明の方法は、正常〜3+3のグリーソングレードを有する、3+3のグリーソングレード〜3+4のグリーソングレードを有する、又は3+4のグリーソングレード〜4+3のグリーソングレードを有する前立腺組織の進行を示すことができる。
【００８３】
前立腺がんを有する対象の予後を予測するための方法において、正常参照試料における各遺伝子(複数可)及び/又はタンパク質(複数可)の発現及び/又は活性と比較して増加した、対象から得られる試験試料における
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/若しくはNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13A、VPS28タンパク質、及び/若しくはNAALADL2タンパク質
の発現及び/又は活性は悪い予後を示す。
【００８４】
例えば、1つ以上の各遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性の増加は、無増悪生存期間の減少を予測し得る。
【００８５】
1つ以上の各遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性の増加は、根治的前立腺全摘除術後の臨床的又は生化学的再発の可能性が増大することを示し得る。これはホルモンの状態とは無関係である。
【００８６】
本発明の方法、アッセイ又はシステムにおいて、対象は哺乳動物であることが好ましい。対象はヒトであることがより好ましい。対象はヒト男性であることが最も好ましい。例えば、対象は少なくとも40歳であるヒト男性であってよい。対象は、前立腺がんの事前治療を受けていない、例えば事前放射線療法を受けていないことが好ましい。
【００８７】
本発明の方法、アッセイ又はシステムは、対象から得られた試験試料におけるVPS13A、VPS28、及び/又はNAALADL2の発現及び/又は活性を決定するステップを含む。試験試料は、全血、血漿、尿、射精液、大便、膵生検からの組織又は細胞、根治的前立腺全摘除術又は胆管膵臓スポンジからの組織又は細胞であることが好ましい。
【００８８】
血液は全血、血清、血漿-EDTA、血漿-クエン酸塩又は血漿中ヘパリンとして回収することができる。循環RNAはPAXgeneチューブを使用して回収することができる。組織は生検(TRUSP、鋳型、飽和又は針を介して組織を回収する別の方法)又は根治手術、公開手術若しくはロボットによる手術のいずれかによって回収することができる。尿は回収するか「完全な状態」に保つことができ、又は尿沈渣と上澄みに分離するか試験することができる。
【００８９】
本発明の各方法、アッセイ又はシステムは、試験試料を処理してDNA、cDNA、mRNA及び/又はタンパク質を得るステップも含むことができる。例えば、DNA、cDNA、mRNA及び/又はタンパク質は市販のキット(例えばQiagen(商標)キット)を使用して得ることが可能であり、又は化学溶液を作製して体液由来のDNA、RNA又はタンパク質を沈殿させることが可能である。
【００９０】
本発明の方法、アッセイ又はシステムにおいて、試験試料におけるVPS13A、VPS28、及び/又はNAALADL2の発現を、mRNAレベル又はタンパク質レベルで決定することができる。例えば、VPS13A、VPS28、及び/又はNAALADL2遺伝子の発現は、それぞれVPS13A、VPS28、及び/又はNAALADL2のmRNAのレベルの検出によって決定することができる。例えば、VPS13A、VPS28、及び/又はNAALADL2のmRNAは対象から得られた全血から得ることができる。タンパク質レベルでのVPS13A、VPS28、及び/又はNAALADL2の発現は、それぞれVPS13A、VPS28、及び/又はNAALADL2タンパク質の発現及び/又は活性の検出によって決定することができる。
【００９１】
VPS13A、VPS28、及び/又はNAALADL2のmRNAの発現は、当業者に知られる任意の方法によって決定することができる。例えば、VPS13A、VPS28、及び/又はNAALADL2のmRNAのレベルは、定量RT-PCR、デジタルPCR、次世代シークエンシング又はノーザンブロッティングによって決定することができる。これらの方法の各々が当業者によく知られている。例えば、VPS13A、VPS28、及び/又はNAALADL2のmRNAの発現は、VPS13A、VPS28、及び/又はNAALADL2と特異的にハイブリダイズすることができる1つ以上のポリヌクレオチドを含むアレイ、遺伝子チップ又は遺伝子セットを使用して決定することができる。次世代シークエンシング及び/又はVPS13A、VPS28、及び/又はNAALADL2と特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを使用して、VPS13A、VPS28、及び/又はNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子における欠失又は突然変異を検出することができる。以下の既製品Applied Biosystems(登録商標)プライマー/プローブセット、Hs00362891m1(VPS13A)、Hs00211938m1(VPS28)及びHs00822484m1(NAALADL2)を使用して、VPS13A、VPS28、及び/又はNAALADL2のmRNAの発現を検出することができる。
【００９２】
rp12などの1つ以上のハウスキーピング遺伝子、又はリボソーム18Sの発現を決定して、試験試料中に存在するmRNAの量を制御することもできる。
【００９３】
VPS13A、VPS28及び/又はNAALADL2タンパク質の発現は、当業者に知られる任意の方法によって決定することができる。例えば、VPS13A、VPS28、及びNAALADL2タンパク質のレベルは、免疫組織化学、ELISA検出、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー、多重化(例えば多重化ELISA)、又はモノクローナル抗体イメージングモダリティ及び関連細胞表面標的化技術(例えばナノスポッティング)によって決定することができる。VPS13A、VPS28、及び/又はNAALADL2タンパク質の発現は、イメージングによって決定することもできる。例えば、NAALADL2は膜貫通タンパク質であり、したがって、その発現はイメージング法によって、例えばNAALADL2の細胞外ドメインに対する抗体を使用したNAALADL2タンパク質の検出によって決定することができる。VPS13A、VPS28及び/又はNAALADL2タンパク質の発現は、VPS13A、VPS28及びNAALADL2タンパク質の活性の決定によって決定することもできる。例えば、NAALADL2の酵素活性を決定することができる。VPS13A、VPS28及び/又はNAALADL2の発現は以下の抗体を使用して決定することができる。ヒトタンパク質Atlas012413とR and D SystemsAF4655は共にNAALADL2を認識し、ヒトタンパク質Atlas021662はVPS13Aを認識し、ヒトタンパク質Atlas024745とSanta Cruz sc-30179は共にVPS28を検出する。
【００９４】
VPS13A、VPS28及び/又はNAALADL2タンパク質の活性は、当業者に知られる任意の方法によって決定することができる。例えば、その酵素活性をアッセイすることによりNAALADL2の活性を決定することができる。
【００９５】
本発明の方法は、試験試料が、(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/又はNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は(ii)VPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質及び/又はNAALADL2タンパク質を、正常参照試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現より高いレベルで発現するかどうか決定するステップを含む。本発明の方法は、正常参照試料中の各タンパク質(複数可)の活性と比較して、試験試料中のVPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質及び/又はNAALADL2タンパク質の活性を決定するステップを含むこともできる。
【００９６】
本発明の方法、アッセイ又はシステムにおいて使用するのに適した正常参照試料の例には、対象由来の良性若しくは正常細胞又は組織が含まれる。いくつかの実施形態では、正常参照試料を試験試料と同じ組織から得ることができる。例えば、正常参照試料は、試験試料内に存在する正常、良性細胞などの、試験試料内に存在する内部参照であってよい。いくつかの実施形態では、正常参照試料は、健常対象、即ち前立腺がん、PIN又はASAPがない対象由来の対応する試料型であってよい。例えば正常参照試料は、健常対象、即ち前立腺がん、PIN又はASAPがない対象から得られた全血、血漿、尿又は射精液であってよい。対象における前立腺がんの進行をモニタリングするための方法中では、以前の試料は試験試料と同じ型であることが好ましい。
【００９７】
対象における前立腺がん又はPINの進行をモニタリングするための方法において、試験試料中のVPS13A、VPS28及び/又はNAALADL2の発現及び/又は活性を、前記対象から得られた以前の試料における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現及び/又は活性と比較する。本発明の方法、アッセイ及びシステムにおいて使用するための以前の試料は、試験試料と同じ型であることが好ましい。以前の試料は、試験試料より少なくとも1カ月、少なくとも2カ月、少なくとも3カ月、少なくとも6カ月、少なくとも1年、少なくとも2年又は少なくとも3年早く得られた可能性がある。以前の細胞又は組織試料と同じ方法を使用して、試験試料中のVPS13A、VPS28及び/又はNAALADL2の発現及び/又は活性を決定することが好ましい。
【００９８】
正常参照試料中又は以前の試料中における各遺伝子(複数可)又はタンパク質(複数可)の発現より「高い」レベルで発現されるために、試験試料中の
(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/若しくはNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又は
(ii)VPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質、及び/若しくはNAALADL2タンパク質
の発現及び/又は活性は、正常参照試料中又は以前の試料中より少なくとも1.1倍、少なくとも1.2倍、少なくとも1.3倍、少なくとも1.4倍、少なくとも1.5倍、少なくとも1.6倍、少なくとも1.7倍、少なくとも1.8倍、少なくとも1.9倍、少なくとも2倍、少なくとも2.5倍、少なくとも3倍、少なくとも3.5倍、少なくとも4倍、少なくとも4.5倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍又は少なくとも10倍高いことが好ましい。
【００９９】
本発明の方法、アッセイ又はシステムは、試験試料中の前立腺特異抗原(PSA)をコードする遺伝子の発現又はPSAタンパク質の発現を決定するステップ、及びVPS13A、VPS28及び/又はNAALADL2の発現:PSAの発現の比を計算するステップを含むことができる。PSAの発現は腫瘍負荷の代用測定値を表し、前立腺がんを診断するためクリニックで現在使用されている。VPS13A、VPS28又はNAALADL2の発現:PSAの発現の比が大きくなるほど、対象が前立腺がんを有する可能性は増大する。
【０１００】
本発明の方法、アッセイ及びシステムにおいて検出される遺伝子又はタンパク質は、VPS13A、VPS28、若しくはNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子の断片、又はVPS13A、VPS28、NAALADL2タンパク質の断片であってよい。
【０１０１】
本発明の方法、アッセイ又はシステムにおいて検出される遺伝子又はタンパク質は、VPS28、VPS13A若しくはNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子、又はVPS28、VPS13A若しくはNAALADL2タンパク質と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は少なくとも100%の相同性を有する可能性がある。
【０１０２】
本発明の方法、アッセイ又はシステムにおいて、VPS13A、VPS28又はNAALADL2のいずれか一つの発現及び/又は活性は単独で決定することができる。或いは、これらの遺伝子又はタンパク質のいずれか2つ又は3つの発現及び/又は活性を組合せで決定することができる。例えば、VPS13AとVPS28、VPS28とNAALAD2、又はVPS13AとNAALADL2の発現及び/又は活性を決定することができ、又はVPS13A、VPS28又はNAALADL2の発現及び/又は活性を決定することができる。好ましい組合せは、VPS13AとVPS28、及びVPS28とNAALAD2を含む。
【０１０３】
本発明の方法、アッセイ又はシステムにおいて、1つ以上の追加の遺伝子又はタンパク質の発現及び/又は活性を決定することもできる。例えば、PSA、PCA-3及びMSMBの発現及び/又は活性を決定することもできる。PSA及びPCA-3の発現は前立腺がん中で増大することが以前に示されており、一方MSMBの発現は低下することが示されている(Salagierski et al.2012及びWhitaker et al.,2010)。
【０１０４】
対象のTMPRSS2-ERG状態を対象において決定し、本発明の方法、アッセイ及びシステムから得られたデータを階層化することもできる(Salagierski et al.2012)。
【０１０５】
本発明の各方法、アッセイ又はシステムは、対象から試験試料を得るステップを含むことができる。例えば試験試料は、全血、血漿、血清、尿、射精液、大便、膵生検からの組織又は細胞、根治的前立腺全摘除術又は胆管膵臓スポンジからの組織又は細胞であってよい。本発明の各方法、アッセイ又はシステムは、試験試料を処理してDNA、cDNA、mRNA及び/又はタンパク質を得るステップも含むことができる。例えば、DNA、cDNA、mRNA及び/又はタンパク質は市販のキット(例えばQiagen(商標)キット)を使用して得ることが可能であり、又は化学溶液を作製して体液由来のDNA、RNA又はタンパク質を沈殿させることが可能である。
【０１０６】
本発明の各方法、アッセイ又はシステムは、(i)VPS13Aタンパク質をコードする遺伝子、VPS28タンパク質をコードする遺伝子及び/又はNAALADL2タンパク質をコードする遺伝子の発現、又は(ii)VPS13Aタンパク質、VPS28タンパク質、及び/又はNAALADL2タンパク質の発現及び/又は活性を測定するステップを含むことができる。
【０１０７】
本発明のそれぞれの方法、アッセイ又はシステムは、前立腺がん、PIN又はASAPを有すると確認した対象を治療するための、又は前立腺がん、PIN又はASAPを有すると確認した対象を治療用に選択するための追加的ステップを含むことができる。例えば、対象に手術(例えば、根治的前立腺全摘除術)及び/又は放射線療法を施すことができ、又はそれらは選択することができる。4+3のグリーソングレードの前立腺がんを有すると確認した対象は、手術及び/又は治療介入を必要とする可能性がある。例えば、4+3のグリーソングレードの前立腺がんを有すると確認した患者には、手術(例えば、根治的前立腺全摘除術)、化学療法及び/又は放射線療法を施すことができ、又はそれらは選択することができる。4+3のグリーソングレードの前立腺がんを有すると確認した患者には化学療法を施すことができ、又はそれは選択することができる。pT2の病理学的ステージの前立腺がんを有すると確認した対象には手術(例えば、根治的前立腺全摘除術)が施される、又はそれが選択される可能性がある。pT3の病理学的ステージの前立腺がんを有すると確認した患者には、手術(例えば、根治的前立腺全摘除術)及びアジュバント化学療法が施される、又はそれらが選択される可能性がある。pT3の病理学的ステージの前立腺がんを有すると確認したこのような患者には、放射線療法を施すことができ、又はそれを選択することもできる。
【０１０８】
本発明のそれぞれの方法、システム又はアッセイは、前立腺がん、PIN又はASAPを有する可能性があると確認した対象をさらに試験するための、又は前立腺がん、PIN又はASAPを有する可能性があると確認した対象をさらなる試験用に選択するための追加的ステップを含むこともできる。例えば、生検試料は対象から得ることができ、又は生検用に対象を選択することができる。患者から入手した試験試料が膵生検からの組織又は細胞であった場合、この試験試料から前立腺がん、PIN又はASAPを有する可能性があると確認した対象は再生検され得る、又は再生検用に選択され得る。
【０１０９】
本発明のそれぞれの方法、アッセイ又はシステムは、本発明の方法から得られたVPS13A、VPS28、及び/又はNAALAD2の発現レベル及び/又は活性をコンピューターのデータベースにインプットするステップ、及び試験試料中のVPS13A、VPS28、及び/又はNAALAD2の発現レベル及び/又は活性に従い対象を分類するステップを含むことができる。
【０１１０】
本発明のそれぞれの方法、アッセイ又はシステムを、細胞又は組織染色、例えばヘマトキシリン及びエオシン染色と組合せて使用し、前立腺がんのグレード若しくは病理学的ステージを診断若しくは予後予測する、又はそれらに関する他の情報を与えることができる。
【０１１１】
本発明のさらなる態様及び実施形態は、以下の実験例を含めた本開示を考慮して当業者には明らかであろう。
【実施例】
【０１１２】
実験の詳細
VPS13A
材料及び方法
組織マイクロアレイ(TMA)及び患者コホート
Cambridge TMA  -  2001年から2005年の間にAddenbrookes Hospital、Cambridge、UKにおいて実施された根治的前立腺全摘除術で得られた前立腺組織を使用して、パラフィン包埋組織から採取した2連の0.6mmコア及びBeecher Manual TMA Arrayer (Whitaker et al., 2010)を使用した組織マイクロアレイ(TMA)を作製した。全部で32人の様々な患者の組織を使用してTMAを作製した。良性、又は正常な前立腺(n=4)、前立腺上皮内腫瘍(PIN)(n=4)及び悪性腫瘍(n=2〜6)の部位は、それぞれの患者について専門の泌尿器病理学者(Anne Warren (AW))が同定した。悪性組織は、各患者から少なくとも1つ、可能ならば最高3つの異なる腫瘍巣から得た。病理学的ステージ及びグリーソングレードは、IHC染色をスコア付けする前に専門の泌尿器病理学者(AW)が確認した。
【０１１３】
Karolinska TMA  -  1998年から2002年の間にKarolinska Hospital、Stockholm、Swedenにおいて実施された根治的前立腺全摘除術で得られた前立腺組織を使用して、パラフィン包埋組織から採取した31mmコア及びBeecher Manual Arrayerを使用した組織マイクロアレイ(TMA)を作製した。全部で257人の様々な患者の腫瘍組織を使用してTMAを形成した。悪性組織は、各患者から少なくとも1つ、可能ならば最高3つの異なる腫瘍巣から同定して得た。病理学的ステージ及びグリーソングレードは、IHC染色をスコア付けする前に専門の泌尿器病理学者(Lars Egevad)が確認した。各患者の良性組織はこのTMAには含めなかった。追跡調査期間中央値は61カ月で、前立腺がん関連死を基にした。診断的有用性を検証するために一致した良性及び腫瘍試料を使用した。
【０１１４】
Trans-Atlantic Prostate群(TAPG)TMA  -  合衆国及び英国の臨床医及び科学者は、初期血清PSAレベル及び一元的な(centralised)グリーソンスコア付けの両方を用いた伝統的手段によって、治療された前立腺がんの最大コホートを構築した。コホート構築の詳細な方法は、以前の文献に記載されたことがある(Cuzick et al., 2006)。簡単に説明すると、診断時年齢が76歳未満で1990年1月から1996年12月の間に臨床的に局在型の前立腺がんと診断された場合、この研究に含めた。診断6カ月以内に根治的前立腺全摘除術又は放射線療法を受けたか、あるいは診断時若しくは診断6カ月以内に転移性疾患の明らかな証拠(骨スキャン、X線、CTスキャン、MRI、骨生検、リンパ節生検又は骨盤リンパ節切除によって)を有するか、又は転移性疾患の臨床徴候(病的骨折、軟部組織転移、脊椎圧迫骨折又は骨痛を含む)を有する患者は除外した。登録データ収集員及び医療専門従事者が患者の記録を検討することによって適格性を確認した。臨床ステージ分類は一元的に検討した。患者は全て、泌尿生殖器病理学者団が一元化されたグリーソングレードを付与し、初期診断血清PSAが使用可能であった。経尿道切除標本群を使用できるならば識別して、対応するヘマトキシリン及びエオジン切片のがん領域を明示した。
【０１１５】
0.6mmの円筒形組織を使用して、24個の標本群においてこれらのマイクロアレイを行った。4個のコアを腫瘍の様々な領域から採取し、各症例における腫瘍の不均一性を明らかにし、隣接する正常組織の領域も採取した。
【０１１６】
多数の腫瘍/正常TMA  -  前立腺、食道、肝臓、甲状腺、舌、軟部組織リンパ腫、胸部、結腸、胃、舌、皮膚、肺、腎臓、卵巣、子宮、精巣、膵臓、胸腺の腫瘍コア2種及び正常コア1種を含有するTMAは、Stretton Scientificから購入した。
【０１１７】
ホルモン不応性TMA(HR TMA)  -  75人のHR患者の前立腺組織(PSA上昇の2回連続として確認された)をTMAに使用した。組織は、2001年から2005年の間にAddenbrookes Hospital、Cambridge、UKで実施した前立腺の経尿道切除から入手した。経過観察中央値は86カ月であった。TMA用に、0.6mmコアをパラフィン包埋組織から採取し、Beecher Manual TMA Arrayerを使用してアレイにした。可能ならば、腫瘍単独(n=2)、腫瘍と良性の混合物(n=2)を各患者から入手し、一致しない良性単独も含めた。
【０１１８】
免疫組織化学
免疫組織化学(IHC)は全てBondmax Autostainerを使用して実施し、抗原回収のために1.5MトリスEDTA、pH8.0を使用した。抗VPS13A抗体(ヒトタンパク質アトラス)を1:50で使用し、核を視覚化するためにDAPIで対比染色した。
【０１１９】
スコア付け及びIHCデータ解析
Cambridge TMAを使用した初期適格性試験では、各コアの全部位をスコア付けしたところ、不均一なコア内の隣接した部位においてしばしば多数のスコアが生じた。TAPG TMAを使用した検証では、主病変に基づいて各コアに1個のスコアを与えた(HW及びAWがスコア付けを実施した)。Cambridge及びTAPG TMAは、無し(染色が存在しなかった場合)、弱(染色は見られるが、一貫していない、及び/又は弱い)、中程度(認識可能な染色)又は強(これ以上強い染色は得られない)としてスコア付けした。Karolinska TMAは、Lars Egevad及びAmanda Seipelがスコア付けし、各コアは染色されたがん細胞の強度及び割合によって互いに独立したスケール0から3にスコア付けされた。3つの強度及び割合のスコア付けの平均値を算出して、平均強度及び割合値を得た。次にこれらの値を乗じて、免疫反応積(immunoreactivity product)(IRP)を得た。
【０１２０】
感度、特異性、陽性的中率(PPV)及び陰性的中率(NPV)を算出し、可能ならば結果を示した。全群のp値(n≧3)は、クラスカルワリス検定と共に一元配置ANOVAを使用して算出した。ペアワイズ比較は全て、マンホイットニー両側t検定を使用して遂行した。
【０１２１】
カプラン-マイヤー曲線を作成するために、成果として生化学的回復を使用した時間-事象解析を行った。免疫反応積係数と生化学的回復の関係は、関係について測定したように対応する95%信頼区間と共にハザード比(HR)を概算するコックス回帰分析で評価した。調査した各タンパク質について、免疫反応積係数を3つの群(0-3、3-5及び>5)に分類し、最低の部類を参照群とした。粗分析並びに年齢、グリーソンスコア、前立腺外進展、ポジティブなサージカルマージン、小胞浸潤、臨床ステージ及び術前PSAで調整した分析の両方を行った。
【０１２２】
PAXgene
患者から血液2.5mlをPAXgene採血管に収集し、製造者の指示に従って保存した。RNAは、PAXgene RNA血液キット(Qiagen)を使用してTepnelによって抽出し、その後Nanodrop ND100を使用して定量した。mRNA発現は、以前のようにqPCRによって分析した(Thirkettle et al., 2009)。qPCRで使用したプライマーを表1に示す。各群(良性、グリーソン3+3、3+4、4+3、4+4/4+5)において12個の試料を、転移群から11個の試料を収集した。良性の男性全てにおいてPSAは上昇していたが生検は陰性で、一部(約30%)では今までのところがんは検出されていないことが示唆された。
【０１２３】
初期転移試料は、異なるホルモン状態の様々な男性から得られた。その後のより詳細な分析は、12人のホルモン療法未治療、12人のホルモン再発性及び11人のホルモン感受性患者の明確に定義されたコホートで遂行した。
【０１２４】
共焦点顕微鏡
細胞を固定し、以前のように抗VPS13A抗体(1:50、ヒトタンパク質アトラス)及びLAMP2抗体(1:500、BD Biosciences)を使用して染色した(8)。細胞は2次抗体Alexafluor 594及び488(Molecular Probes)を使用して画像化し、DAPIで封入した。画像は全てNikon Eclipse共焦点顕微鏡で100倍の対物レンズを使用して撮影した。カルシウム修飾実験のために、LNCaP細胞を以前のように約50%コンフルエンスまで増殖させてから、カルシウムイオノフォア、カルシマイシン(Invitrogen)10μM又はカルシウムキレート剤1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-4酢酸(BAPTA)(Invitrogen)10μMで8時間処理した(Whitaker et al., 2007)。
【０１２５】
PSA測定
siVPS13A又はスクランブル対照のいずれかで安定にトランスフェクトした6.67x105個のLNCaP細胞を、10% FBSを補給したRPMI培地中で72時間増殖させた。培地を収集し、5500rpmで5分間遠心分離して細胞残渣を除去した。超高感度PSA試験はClinical Biochemistry Assay Laboratory、Addenbrookes Hospitalによって実施された。結果は全て、72時間増殖後の細胞数に対して正規化した。
【０１２６】
細胞溶解物の生成及びウエスタンブロッティング
タンパク質溶解物は記載された通りに生成し(8)、SDS-PAGEで分離してからVPS13A(1:1000、ヒトタンパク質アトラス)、FAK(1:1000、Cell Signaling Technology)、pTyr397-FAK(1:1000、Cell Signaling Technology)又はチューブリン(1:2000、Abcam)でブロッティングした。
【０１２７】
結果
診断マーカーとしてのVPS13Aの定量
VPS13A発現は、前立腺組織の免疫組織化学(IHC)を使用して評価した。染色は斑点状で、内腔上皮細胞の頂端膜に分布しており、エンドサイトーシスにおいて役割を担っている可能性が示唆された。組織の一部はまた比較的大きな環状の細胞質内構造(図1)を示しており、食作用又は自己貪食において機能する可能性が示唆された。
【０１２８】
VPS13Aが前立腺組織にどのように特異的であるかを評価するために、16種類の異なる器官の多種組織コアから構成される多種腫瘍/正常組織マイクロアレイ(TMA)を使用した。VPS13Aは正常な腎臓でいくらか発現するが、その他の組織では全て、発現は低いか又は検出できなかった。
【０１２９】
次に、VPS13Aの発現を、患者104人の各個体から採取した多数の良性、前立腺上皮内腫瘍(PIN)及び腫瘍部位を含むCambridge TMAにおいて判定した。VPS13Aは、良性と比較した場合、PIN及び腫瘍において非常に顕著に上方制御されていた(図2)(p<0.0001)。陽性的中率(PPV)は76%で、陰性的中率(NPV)は98%であった。
【０１３０】
診断マーカーとしてのVPS13Aの検証
独立したTAPG TMAを使用して、前立腺がんの診断マーカーとしてのVPS13Aの有用性を検証したところ、PPV73%及びNPV87%を有するCambridge TMAと同様の結果が示された(図3)。データを腫瘍状態又はグリーソングレードによって階級化すると、VPS13A発現は非常に有意な診断マーカーであった(表2及び3)(p<0.0001)。VPS13A染色及びグリーソングレードを709個のがんコアに使用した(単変量解析及び多変量解析のために、がんコアにおける最大マニュアル強度(Manual Intensity)値を使用した)。表2及び3は、VPS13Aマニュアル強度(MI)は良性、腫瘍及びPIN(表2、p<0.0001)並びに3つの分類に分けたグリーソンスコア(<7、7及び>7、表3、p<0.0001)の間で非常に顕著に異なっていることを示している。これによってVPS13Aは有用な診断マーカーであることが裏付けられる。
【０１３１】
Karolinska TMAでは、TMAで表された良性並びに腫瘍コアを有する患者の数は限られている。これらの患者のみをさらに検証コホートとして分析し、VPS13Aタンパク質発現が良性群と腫瘍群の間で有意に異なるという発見が支持された(p<0.0001)(図4)。
【０１３２】
予測マーカーとしてのVPS13Aの適格性及び検証
Karolinska TMAは、経過観察中央値61カ月の根治的前立腺全摘除術標本から構成されており、根治的前立腺全摘除術後の再発及びその後の死亡を予測するマーカーとしてVPS13Aを分析することが可能である。免疫反応積(IRP)の弱(<3)、中程度(>3<5)及び強(>5)VPS13A IHCによって、カプラン-マイヤー曲線を作成した(図5)。VPS13A発現が弱い患者の前立腺がんによる5年以内の死亡率は20%で、一方中程度及び高発現の患者の5年以内の再発死亡率は40%で、すなわち死亡する確率は2倍であった。ハザード比によって、VPS13Aが上昇した男性(IRP>5)は、根治的前立腺全摘除術後の再発死亡率は2倍を上回ることが示された(p=0.01)(表4)。ハザード比を年齢、グリーソンスコア、前立腺外進展、ポジティブなサージカルマージン、小胞浸潤、臨床ステージ及び術前PSAで調整すると、ハザード比は1.9に下降し、有意性が低くなった(p=0.06)。
【０１３３】
TURP試料から作製されたTAPG TMAはまた、評価項目として死亡を含めた経過観察を>10年行った。データをMIによって2群(0及び1対2及び3又は1対2、3のMI)に分割すると、単変量解析においてVPS13Aはほぼ有意であった(表5)。これは、Karolinska試料と比較して試料収集法を反映している可能性が最も高い(根治的前立腺全摘除術(Karolinska)対TURP(TAPG))。
【０１３４】
VPS13ではホルモン状態を予測できない
LNCaP細胞系では、VPS13Aがアンドロゲンを調節する証拠はなかった。ヒト組織においても変わらないかどうかを決定するために、ホルモン不応性TMAにおけるVPS13A発現を評価した(図6)。VPS13Aは良性と任意の腫瘍試料の間では有意差はあるが(p<0.001)、ホルモン療法未治療(HN)とホルモン不応性(HR)腫瘍の間で差を認めることはできなかった(p=0.49)。
【０１３５】
代替評価項目としての循環VPS13A mRNA
循環mRNAを全血から抽出し、循環VPS13A mRNAを検出するためにqPCRを実施した(図7)。全群にわたって循環VPS13A mRNAの量の間に高い有意差があった(p<0.0001)。レベルは、良性と比較して低いグレードの腫瘍で上昇していたが、グリーソン4+4/4+5及び転移群では劇的に下降した。転移群においてVPS13Aが検出可能であることは、この群の不均一なホルモン状態を反映している可能性がある。最も重大なことは、グリーソン4疾患の出現に対する循環VPS13A mRNAの顕著な上昇である。グリーソン3+3とグリーソン3+4及び4+3を比較すると、高い有意差が示された(p<0.0001)。さらに、グリーソン3+4及び4+3疾患ではVPS13A mRNAの間に有意差があり(p=0.016)、循環VPS13Aで侵襲性疾患を診断することができ得る。
【０１３６】
第1の実験では、転移性コホートは、ホルモン療法未治療、ホルモン療法中(ホルモン感受性)及びホルモン不応性、すなわち、ホルモン療法にもはや応答しない患者の混合であった。この転移性群をより詳細に調べるために、第2の実験ではホルモン療法未治療患者12人、ホルモン再発性患者12人及びホルモン感受性患者11人における循環RNAの発現を調べた(図8)。ホルモン療法未治療患者とホルモン感受性患者の間に差はあったが、どの結果も有意な差ではなかった。
【０１３７】
VPS13Aはリソソーム及びPSA分泌に関連する
共焦点顕微鏡を使用して、VPS13A小胞が早期/後期エンドソーム又はファゴソームなどのよく特徴付けられた小胞画分のいずれとも共存しないことを立証した。しかし、リソソームマーカーLAMP2を使用してリソソームとの関連を確認した。対照細胞ではVPS13A小胞とリソソーム画分との間に明らかな関係が示され、小胞融合の「キッスアンドラン」仮説と一致した(図9)。さらに、細胞をバフィロマイシン(オートファゴソームとのリソソーム融合をブロックすることが知られている)で処理すると、VPS13A小胞はリソソーム膜に組み込まれることが観察された(図10)。リソソーム膜全体にわたってVPS13A分散の証拠は認められなかった。
【０１３８】
PSAはリソソームを通って処理されて分泌活性型を生じることが知られているので、siVPS13Aで安定的にトランスフェクトしたLNCaP細胞又はスクランブル対照の培地の分泌PSAをアッセイした。VPS13Aを内在レベルの30〜40%にノックダウンすると、培地中で検出可能なPSAのレベルは有意に減少した(p=0.003)(図11)。これによって、VPS13A小胞内に含有されるVPS13A又はカーゴは、PSAのプロセシング又は分泌を変化させることが示唆される。これらの結果は、良性組織と比較して腫瘍においてPSA及びVPS13Aが上昇することと一致している。
【０１３９】
VPS13A及びカルシウム
カルシウムシグナル伝達はいくつかの小胞融合事象を制御することが知られているので、カルシウムキレート剤、BAPTA及びカルシウムイオノフォア、カルシマイシンで細胞を処理することによってこのことを試験した。細胞をカルシマイシンで処理すると、VPS13Aの細胞内レベルが増加した(図12)。BAPTAで処理した後、VPS13A発現の有意な変化はなかった。これらがVPS13Aの局在化に何らかの影響を及ぼすかどうかを判定するために、細胞をLAMP2及びVPS13Aで対比染色し、膜組み込み事象数を数えた。カルシマイシンで処理した細胞では、リソソームに関連したVPS13A小胞の数は非常に顕著に減少した(p=0.0004、図13)。カルシウムシグナル伝達とVPS13Aの関係によって、おそらく不完全なカルシウムシグナル伝達の結果として、痙攣に罹患した有棘赤血球舞踏病患者の表現型を説明することができる。
【０１４０】
VPS28
材料及び方法
全TMAは、VPS13Aで使用したものと同じで、同一の方法でスコア付けした。
【０１４１】
結果
診断マーカーとしてのVPS28の適格性
前立腺組織に対する免疫組織化学(IHC)を使用してVPS28発現を評価した。染色は小胞状で、ゴルジ体と一致する管腔上皮細胞の核周辺部位に位置した(図14)。VPS28が前立腺組織にどのように特異的であるかを評価するために、16種類の異なる器官の多種組織コアから構成される多種腫瘍/正常組織マイクロアレイ(TMA)を使用した。VPS28は正常な結腸でいくらか発現するが、その他の組織では全て、発現は低いか又は検出できなかった。VPS28の発現はCambridge TMAにおいて判定した。良性と比較した場合、VPS28は腫瘍において非常に顕著に上方制御されていた(図15)(p<0001)。陽性的中率(PPV)は74%で、陰性的中率(NPV)は98%であった。
【０１４２】
診断マーカーとしてのVPS28の検証
Karolinska TMAでは、TMAで表された良性並びに腫瘍コアを有する患者の数は限られている。これらの患者のみをさらに検証コホートとして分析し、VPS28タンパク質発現が良性群と腫瘍群の間で有意に異なるという発見が支持された(p<0.0001)(図16)。
【０１４３】
予測マーカーとしてのVPS28の適格性
Karolinska TMAによって、根治的前立腺全摘除術後の再発及びその後の死亡を予測するためのマーカーとしてVPS28を分析することが可能である。免疫反応積(IRP)の弱(<3)、中程度(>3<5)及び強(>5)VPS28 IHCによって、カプラン-マイヤー曲線を作成した(図17)。VPS28発現が弱いか又は中程度の患者の前立腺がんによる5年以内の死亡率は25%で、一方高発現の患者の5年以内の再発死亡率は38%であった。ハザード比を年齢、グリーソンスコア、前立腺外進展、ポジティブなサージカルマージン、小胞浸潤、臨床ステージ及び術前PSAで調整すると、VPS28が上昇した男性(IRP>5)は根治的前立腺全摘除術後の再発死亡率は1.9倍であることがハザード比によって示された。しかしp値は有意ではない。
【０１４４】
代替評価項目としての循環VPS13A mRNA
循環mRNAを全血から抽出し、循環VPS28 mRNAを検出するためにqPCRを実施した(図18)。全群にわたって循環VPS28 mRNAの量の間に高い有意差があった(p<0.0001)。レベルは、良性と比較して低いグレードの腫瘍で上昇していたが、グリーソン4+4/4+5及び転移群では劇的に下降した。転移群においてVPS28が検出可能であることは、この群の不均一なホルモン状態を反映している可能性がある。最も重大なことは、グリーソン4疾患の出現に対する循環VPS28 mRNAの顕著な上昇である。グリーソン3+3とグリーソン3+4及び4+3を比較すると、高い有意差が示され(p<0.0001)、循環VPS28はグリーソン6の患者の進行をモニタリングするために有用であり得ることが示唆された。しかし、グリーソン3+4及び4+3疾患におけるVPS28 mRNAの間には有意差はなかった(p=0.21)。定義された転移群(ホルモン療法未治療患者12人、ホルモン再発性患者12人及びホルモン感受性患者11人)をアッセイすると、群の間に有意差はなかった(図19)。
【０１４５】
NAALADL2
材料及び方法
全TMAは、VPS13Aで使用したものと同じで、同一の方法でスコア付けした。
【０１４６】
コロニー形成アッセイ
CytoSelect(商標)96ウェル細胞形質転換アッセイ(軟寒天コロニー形成)(Cell Biolabs)を使用した。簡単に説明すると、それぞれの安定細胞系について全部で1250個の細胞をウェル毎に生物学的に4連で接種する。37℃でCO25%中において7日間インキュベートした後、足場非依存性増殖の定量は製造者の指示通りに行う。
【０１４７】
結果
診断マーカーとしてのNAALADL2の適格性及び検証
前立腺組織に対する免疫組織化学(IHC)を使用してNAALADL2発現を評価した。染色は膜状で、細胞基底膜に限られており、PSMAによって認められる端頂の染色とは明確に異なっている(図20)。NAALADL2が前立腺組織にどのように特異的であるかを評価するために、16種類の異なる器官の多種組織コアから構成される多種腫瘍/正常組織マイクロアレイ(TMA)を使用した。NAALADL2は胸部、膵臓及び結腸の腫瘍においていくらか発現するが、その他の組織では全て、発現は低いか又は検出できなかった。NAALADL2の発現はCambridge TMAにおいて判定したところ、グリーソングレードによって階級化し良性と比較した場合、腫瘍において非常に顕著に上方制御されていた(図21)(p<0.0001)。陽性的中率(PPV)は78%で、陰性的中率(NPV)は87%であった。結果を病理学的ステージによって階級化するとまた有意差があった(p=0.004)。腫瘍が前立腺被膜を逸脱すると(pT3)、NAALADL2は特に顕著に増加した(図22)。
【０１４８】
診断マーカーとしてのNAALADL2の検証
Karolinska TMAでは、TMAで表された良性並びに腫瘍コアを有する患者の数は限られている。これらの患者のみをさらなる検証コホートとして分析したところ、NAALADL2タンパク質発現が良性群と腫瘍群との間で有意に異なるという発見が支持された(p<0.0001)(図23)。
【０１４９】
予測マーカーとしてのNAALADL2の適格性及び検証
Karolinska TMAによって、根治的前立腺全摘除術後の再発及びその後の死亡を予測するためのマーカーとしてNAALADL2を分析することができる。免疫反応積(IRP)の弱(<3)、中程度(>3<5)及び強(>5)NAALADL2 IHCによって、カプラン-マイヤー曲線を作成した(図24)。NAALADL2発現が弱い又は無い患者の前立腺がんによる5年以内の死亡率は20%で、一方中程度及び高発現の患者の5年以内の再発死亡率は27%及び34%であった。ハザード比を年齢、グリーソンスコア、前立腺外進展、ポジティブなサージカルマージン、小胞浸潤、臨床ステージ及び術前PSAで調整しても、NAALADL2が上昇した男性(IRP>5)は根治的前立腺全摘除術後の再発死亡率は1.7倍であることがハザード比によって示された(表7)(p=0.036)。HR TMAでのホルモン療法未治療とホルモン不応性組織との間にはNAALADL2染色に有意差はなかった(図25)。
【０１５０】
代替評価項目としての循環NAALADL2 mRNA
循環mRNAを全血から抽出し、循環NAALADL2 mRNAを検出するためにqPCRを実施した(図26)。全群にわたって循環NAALADL2 mRNAの量の間に高い有意差があった(p<0.0001)。レベルは、良性と比較して低いグレードの腫瘍で上昇していたが、グリーソン4+4/4+5及び転移群では劇的に下降した。転移群においてNAALADL2が検出可能であることは、この群の不均一なホルモン状態を反映している可能性がある。最も重大なことは、グリーソン4+3疾患の出現に対する循環NAALADL2 mRNAの顕著な上昇である。グリーソン3+3とグリーソン3+4及び4+3を比較すると、高い有意差が示された(p=0.001)。さらに、グリーソン3+4及び4+3疾患ではVPS13A mRNAの間に有意差があり(p=0.014)、循環VPS13Aでグリーソン3疾患よりも緊急の治療を必要とするグリーソン4疾患を区別することができ得ることが示唆された。
【０１５１】
第1の実験では、転移性コホートは、ホルモン療法未治療、ホルモン療法中(ホルモン感受性)及びホルモン不応性、すなわち、ホルモン療法にもはや応答しない患者の混合であった。この転移群をより詳細に調べるために、第2の実験でホルモン療法未治療患者12人、ホルモン再発性患者12人及びホルモン感受性患者11人における循環RNAの発現を調べた(図27)。いずれの群の間にも有意差はなかった。
【０１５２】
VPS13A、VPS28及びNAALADL2の組合せ分析
これら3つのマーカーによるデータを分析して、1つ以上のマーカーの組合せがこれらのマーカーの予測能力を改善するかどうかを判定した(表8)。ハザード比はいくつかのマーカーを付加すると改善し、VPS13A及びNAALADL2については信頼区間も増加したが、その他のマーカーを付加しても予測能は増加しなかった。しかし、VPS28はVPS13A及びNAALADL2を付加することによって改善した。
【０１５３】
試験設計
全PAXgene試料は、ProMPT治験に組み入れられた患者から採取した。この試験は、機関の倫理委員会によって承認されており、全患者からインフォームドコンセントが得られた。PAXgene試料は23人の患者-PSAは上昇しているが生検は陰性だった対照患者12人(対照コホート)及び転移性前立腺がんの患者11人から入手した。これらの患者から免疫組織化学に使用可能なコア生検組織病理標本及びTURPチップを入手した。最初の23個のPAXgene試料において同定した発現プロファイルを調査するために、後でさらに84個のPAXgene試料を得た。84個の試料は、様々なグレードの限局性前立腺がんの患者48人(グリーソン3+3、3+4、4+3及び4+4/5それぞれ12試料)及び様々なホルモン感受性分類の患者36人(ホルモン療法未治療、ホルモン療法及びホルモン不応性転移性前立腺がん患者12試料)からなった。104人の患者のTMAは、Addenbrookes's Hospitalで手術を受け、Cambridgeで限局性前立腺がんにおける組織発現を分析された104人の患者の根治的前立腺全摘除術標本から構成された。
【０１５４】
RNA発現アレイ
遺伝子発現分析は、Illumina Human HT12バージョン4アレイで実施した。データ分析は全てRにてBioconductorパッケージを使用して実施した。アレイスキャナーからの生強度データは、ビーズアレイパッケージに実装されているようなBASH及びHULKアルゴリズムを使用して処理した。データのLog2変換及びquantile正規化は、全試料群について実施した。発現差異分析は、limmaパッケージを使用して実施した。多数の対比を補正するために全体的に適用した多重検定用のFDR補正を適用した後、特異に発現した遺伝子は、p<0.05のp値カットオフを使用して選択した。
【０１５５】
RNA抽出及びcDNA形成
RNAはPAXgene試験管Tepnelに保存した全血2.5mLからPAXgene RNA血液キット(Qiagenカタログ番号762714)を使用して抽出した。RNAは溶出緩衝液80μLで溶出した。RNA定量は、Nanodrop ND1000装置(Thermo Scientific)で吸光度(OD A260nm)によって実施した。十分なRNAを含む試料は、最終体積25μLで40ng/μLに正規化した。各試料についてHigh Capacity RNA-tocDNAマスターミックス(Applied Biosystems)を使用してRNA500ngをcDNAに逆転写した。
【０１５６】
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)
qPCRは、Applied Biosystems 7900HTリアルタイムPCRシステムを使用して実施した。qPCRは、Sigmaプライマー及びSYBR Greenを使用して実施した。プライマーを設計し、PAXgene試料で使用する前に実用性を確認するために細胞系のcDNAについてRT-PCRを実施することによって最初に試験した。それぞれのPCR反応のために、cDNA1μL(5ng)並びにFast SYBRTM Green5μL、水3.96μL及びフォワード、リバースプライマー0.02μLを含有するマスターミックス9μLを各ウェルに添加した。アッセイは3連で実施した。相対的発現は、Ct値をハウスキーパー遺伝子(RPLP2)に対して正規化した後、デルタ-デルタCt法を使用して算出した。プライマー配列は、付録の表に挙げる。群間の発現の差が有意であるかどうかを判定するために、各遺伝子についてマン-ホイットニー及び一元配置ANOVA試験を実施した。
【０１５７】
免疫組織化学
免疫組織化学は全てBondmax Autostainerを使用して、抗原回収用にEDTA1.5M、pH8.0を使用し、関係のある抗体は300mMトリス緩衝生理食塩水、1%ロバ血清(Sigma Aldrich)及び0.05%Tweenを含有する緩衝液で希釈した。核は、ヘマトキシリンで対比染色し、スライドガラスはDPXを使用してカバーした。Cambridge TMA-組織状態(グリーソングレード及びBPH)の確認は、泌尿器病理学者が行い、ブロックを適切に評価し印付けして行った。2連の0.6mm組織コアを切断し、予め決定した組織マイクロアレイ(TMA)配置に従って構築した。免疫組織化学用に多数の5-Am切片をTMAから切断した。スコア付けは、いずれもTMA計画を伏せた2人の観察者(1人は独立した専門の泌尿器腫瘍学病理学者)が独立して行った。染色は強度に基づいて以下の分類:無し、弱、中程度及び高に分類した。各コアの強度及び局在化に関して意見の一致が得られた。免疫組織化学データに関する統計学的分析は、クラスカルワリス検定と共に一元配置ANOVAを実施するために、GraphPad Prismを使用してコンセンサススコアについて実施した。
【０１５８】
【表１】
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【０１５９】
【表２】
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【０１６０】
【表３】
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【０１６１】
【表４】
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【０１６２】
【表５】
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【０１６３】
【表６】
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【０１６４】
【表７】
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【０１６５】
【表８】
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【０１６６】
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【０１６７】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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