(57)【要約】  本発明は、がんの処置におけるワクチンの有効性を向上させるための方法を提供する。本発明の方法は、サバイビンワクチンによるワクチン接種の前に、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を少なくとも２回投与するステップを含む。本発明の方法に使用するための組成物も提供する。
2016516083.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象のがんの処置におけるワクチンの有効性を向上させるための方法であって、
（ｉ）前記対象に、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を、免疫調節効果をもたらすのに十分な量で少なくとも２回投与するステップと、
（ｉｉ）続いて前記対象に、少なくとも１つのサバイビン抗原を含む治療有効量のワクチンを投与するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記ワクチンを投与する少なくとも２日前に、好ましくは、前記ワクチンを投与する少なくとも４日前に、初回用量の前記薬剤を前記対象に投与するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ワクチンを投与する約１週間前に、初回用量の前記薬剤を前記対象に投与するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記薬剤を少なくとも連続２日間の期間、投与するステップを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記対象に初回用量の前記薬剤を投与し、それに続いて、維持用量の前記薬剤を１回または複数回投与するステップを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ワクチンを投与する前に、前記薬剤を前記対象に毎日少なくとも１回、２回、３回または４回、投与するステップを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ワクチンを投与する前に、前記薬剤を約１週間の期間、毎日２回、投与するステップを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ワクチンを投与する前に、前記対象に前記薬剤を投与する前記ステップを停止する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ワクチンを投与する間、前記対象に前記薬剤を投与する前記ステップを継続する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ワクチンを前記対象に３週毎に約１回、投与するステップを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ワクチンを前記対象に２回、３回、４回またはそれ以上、投与するステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡ複製を妨げる前記薬剤を前記対象に規則正しいレジメンで投与するステップを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記規則正しいレジメンが、前記薬剤を前記対象に１週おきに約１週間の期間、毎日投与するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
初回用量の前記ワクチンを投与する約１週間前から、前記薬剤を前記対象に投与するステップを含み、かつ前記ワクチンを前記対象に３週毎に約１回、投与するステップを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記サバイビン抗原がペプチド抗原であるか、または抗原をコードする核酸である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記サバイビン抗原が、前記対象に細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘発することのできるサバイビンタンパク質（配列番号１１）由来のアミノ酸配列を含むペプチド抗原であるか、または前記ペプチド抗原をコードする核酸分子である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記サバイビン抗原が、アミノ酸配列FEELTLGEF（配列番号１）；FTELTLGEF（配列番号２）；LTLGEFLKL（配列番号３）；LMLGEFLKL（配列番号４）；RISTFKNWPF（配列番号５）；RISTFKNWPK（配列番号６）；STFKNWPFL（配列番号７）；およびLPPAWQPFL（配列番号８）、もしくはそれらの任意の組合せを含むペプチド抗原であるか；または前記ペプチド抗原をコードする核酸分子である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのサバイビン抗原が、アミノ酸配列FTELTLGEF（配列番号２）；LMLGEFLKL（配列番号４）；RISTFKNWPK（配列番号６）；STFKNWPFL（配列番号７）またはLPPAWQPFL（配列番号８）を含む５つのペプチド抗原の混合物を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＤＮＡ複製を妨げる前記薬剤が、急速に分裂している免疫系細胞を選択的に標的とし、プログラム細胞死を引き起こすことができる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＤＮＡ複製を妨げる前記薬剤がアルキル化剤である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記アルキル化剤がナイトロジェンマスタードアルキル化剤である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ナイトロジェンマスタードアルキル化剤がシクロホスファミドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
免疫調節効果をもたらすのに十分な量が約２５〜３００ｍｇ／日、好ましくは約５０〜１００ｍｇ／日、より好ましくは約１００ｍｇ／日のシクロホスファミドである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
免疫調節効果をもたらすのに十分な量が、１用量あたり約５０ｍｇのシクロホスファミドである、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記シクロホスファミドを前記対象に経口投与するステップを含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ワクチンを前記対象に皮下注射などの注射により投与するステップを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ワクチンが、前記少なくとも１つのサバイビン抗原と、リポソームと、疎水性物質の連続相を含む担体とを含む組成物である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物がＴヘルパーエピトープをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｔヘルパーエピトープが、アミノ酸配列AQYIKANSKFIGITEL（配列番号９）を含むペプチドである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記組成物がアジュバントをさらに含む、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記アジュバントがポリＩ：Ｃポリヌクレオチドである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記担体が、植物油、ナッツオイルまたは鉱物油などの疎水性物質である、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記担体が鉱物油であるか、または鉱物油溶液中のオレイン酸マンニド、例えばＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ５１である、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記薬剤が、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性または数を増加させるなど、抗原に対する免疫応答を直接増強することによって、前記ワクチンの有効性を向上させる、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性または数を増加させるステップが、総ＣＤ８＋Ｔ細胞数の相対的減少による、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の濃縮を伴う、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記薬剤が、例えばＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、骨髄由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）および／またはＣＤ１９＋ＣＤ１ｄ＋ＣＤ５＋Ｂ細胞（Ｂｒｅｇ）などの抑制性免疫細胞の数または活性を低減することによって、前記ワクチンの有効性を向上させる、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記がんが皮下固形腫瘍である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記がんが卵巣がん、卵管がんまたは腹膜がんである、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記対象がヒトである、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
がんの処置におけるワクチンの有効性を向上させるための、少なくとも１つのサバイビン抗原を含むワクチンと組み合わせた、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の使用であって、前記薬剤は、前記ワクチンの前に少なくとも２回投与される、使用。
【請求項４１】
請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法に使用するための、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤と、少なくとも１つのサバイビン抗原を含むワクチンとの組合せ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般には、がんを処置するための方法に関し、詳細には、がんの処置におけるサバイビンワクチンの有効性を、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤で前もって処置することによって向上させるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチン接種によって誘導される免疫応答は大まかに、液性または細胞性の諸タイプに分類できる。液性応答は通常、ウイルスまたは細菌の侵入者に対する防御に望ましく、一方、ウイルス感染細胞およびがん細胞に対する免疫は通常、細胞により媒介される応答を伴う。液性免疫は、Ｂ細胞による高レベルの抗体産生を特徴とし、一方、細胞性免疫は、細胞障害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球の活性化の増加によって特徴付けられる。
【０００３】
前臨床開発で有望に見えた多くのワクチンが最終的には、ヒトで試験すると、臨床的有用性を示すことができなかった。がんワクチンに関しては、治療介入は複雑な問題であり、疾患の多くの側面、例えば、ケアの標準に比べた、治療の相対的タイミング、がんのステージおよび型などが全て、処置の転帰に影響する。しかし、厳密に組み合わせたなら、より良い転帰をもたらす可能性のある３つの特色が免疫療法にはある：（１）ワクチン免疫原性（すなわち、アジュバント）；（２）腫瘍関連抗原の適切な選択；および（３）腫瘍により誘導される免疫抑制を克服する能力（Weir et al., Cancer 3: 3114-3142, 2011；Berzofsky et al., Semin Oncol 39(3): 348-357, 2012）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
出願人らは、がんワクチン（すなわち、サバイビンワクチン）の有効性は、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を前もって少なくとも２回投与することによって向上できることを、ついに発見した。
【０００５】
したがって、一態様では、本発明は、対象のがんの処置におけるワクチンの有効性を向上させるための方法であって、（ｉ）対象に、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を、免疫調節効果をもたらすのに十分な量で少なくとも２回投与するステップと、（ｉｉ）続いて対象に、少なくとも１つのサバイビン抗原を含む治療有効量のワクチンを投与するステップとを含む方法に関する。
【０００６】
本発明の方法の一実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を対象に１４日毎に連続７日間毎日、投与する（すなわち、毎週交互の処置（alternating weekly treatment））。一実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤によるこの毎週交互の処置は、サバイビンワクチンの初回投与の約１週間前に開始する。
【０００７】
本発明の方法の一実施形態では、サバイビンワクチンを対象に３週毎に１回、投与する。
【０００８】
本発明の方法の一実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤はアルキル化剤、例えばシクロホスファミドなどである。
【０００９】
本発明の方法の一実施形態では、サバイビンワクチンは、アミノ酸配列：FEELTLGEF（配列番号１）；FTELTLGEF（配列番号２）；LTLGEFLKL（配列番号３）；LMLGEFLKL（配列番号４）；RISTFKNWPF（配列番号５）；RISTFKNWPK（配列番号６）；STFKNWPFＬ（配列番号７）；およびLPPAWQPFL（配列番号８）を有する１つまたは複数のサバイビンペプチド抗原を含むワクチンである。
【００１０】
本発明の方法の一実施形態では、サバイビンワクチンは、Ｉｍｍｕｎｏｖａｃｃｉｎｅ，Ｉｎｃの抗がん免疫療法ワクチン候補のＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃである。ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃは、アミノ酸配列：FTELTLGEF（配列番号２）、LMLGEFLKL（配列番号４）、RISTFKNWPK（配列番号６）、STFKNWPFL（配列番号７）、およびLPPAWQPFL（配列番号８）を有する５つの合成サバイビンペプチド抗原；破傷風トキソイド由来のユニバーサルＴヘルパーエピトープ（universal T-helper epitope）（AQYIKANSKFIGITEL；配列番号９）；ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドアジュバント；ＤＯＰＣおよびコレステロールからなるリポソーム；ならびに疎水性担体Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ５１ＶＧを含む。
【００１１】
別の態様では、本発明は、がんの処置におけるワクチンの有効性を向上させるための、少なくとも１つのサバイビン抗原を含むワクチンと組み合わせた、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の使用であって、薬剤は、ワクチンの前に少なくとも２回投与される、使用に関する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載する方法に使用するための組成物に関する。
【００１３】
本発明の他の態様および特色は、当業者であれば、付随する図と共に、本発明の具体的な実施形態に関する以下の記述を概観すれば明らかとなるはずである。
【００１４】
図面において、本発明の実施形態を単なる例として説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃの安全性および免疫原性を評価するための第Ｉ相臨床試験設計を説明する図である。試験−７日目と＋４９日目との間、低用量シクロホスファミド（５０ｍｇを１日２回、Ｂａｘｔｅｒ）の経口投与有り無しで、ワクチンを３週間毎に（約２１日の間隔をあけて３回ワクチン接種）投与した。低用量シクロホスファミドを１４日間毎に連続７日間毎日与えた。シクロホスファミドは初回ワクチン接種１週間前に開始した。患者は、（１）ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ０．５ｍＬの３回投与（コホートＡ）、（２）示してあるように、低用量経口シクロホスファミドとの組合せでＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ０．１ｍＬの３回投与（コホートＢ）または（３）示してあるように、低用量シクロホスファミドとの組合せでＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ０．５ｍＬの３回投与（コホートＣ）のいずれかを受けた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離して凍結保存するため、血液試料を、初回ワクチン接種の前（ベースライン）に、および各ワクチン接種の約３〜４週間後に採取した。血液試料は、可能な時はもっと後の時点でも採取した。ＰＢＭＣは、ＥＬＩＳＰＯＴを含め免疫アッセイならびに四量体染色および細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）などのフローサイトメトリーをベースとしたアッセイに使用した。
【図２】ＥＬＩＳＰＯＴ検出結果を提供し、ワクチン接種卵巣がん患者に由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃに誘導された、インターフェロンガンマ産生の増加を示す図である。対象ＰＢＭＣを、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてサバイビンペプチドで一晩刺激した。提示されているデータは、個々の対象に由来するＰＢＭＣ１００万あたりのスポット形成ユニット（ＳＦＵ）数を表し、ラインは、ベースラインでの、ならびに１、２投与および３回投与のワクチン投与後の平均値を表す。
【図３】患者のベースライン免疫応答と比較した、これら患者のＩＦＮ−ガンマ分泌細胞の増加倍率を示す刺激因数の概要を提供する図である。刺激因数は、有効なＥＬＩＳＰＯＴ結果を使用して算出した。ペプチド刺激の不在下で、ＥＬＩＳＰＯＴにおいて、不明な高バックグラウンドを伴う試料は分析から除外した。所与の時点において患者を免疫レスポンダーとみなすには、２ｘの最小刺激因数が必要であった。
【図４】ＥＬＩＳＰＯＴ検出結果を提供し、ワクチン接種卵巣がん患者に由来するＰＢＭＣにおける、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃに誘導された、ＩＦＮ−ガンマ産生の増加を示す図である。対象ＰＢＭＣを、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてサバイビンペプチドで一晩刺激した。提示されているデータは、個々の対象に由来するＰＢＭＣ１００万あたりのスポット形成ユニット（ＳＦＵ）の数を表している。
【図５】代表的対象０２−０４に由来するＭＨＣ多量体染色結果を説明する図である。末梢血単核細胞を、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃペプチドを使用して設計されたＭＨＣ多量体試薬（四量体）および対応するＭＨＣ分子を結合する、ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の能力により、ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在について試験した。アッセイを、非刺激ＰＢＭＣ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で、またはＨＬＡ適合サバイビンペプチド（複数可）の存在下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで１０日刺激したＰＢＭＣのいずれかで実施した。ＨＩＶペプチドに基づいた非当該ＭＨＣ−多量体を陰性対照とした。示されている図は、ワクチン接種後のＰＢＭＣ試料で、ＭＨＣ−多量体試薬に特異的に結合している、ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを表す。特異的Ｔ細胞は、ＣＤ８＋および四量体結合に二重陽性である細胞を示すために、ＰＢＭＣをＣＤ３＋生細胞に関してゲートする、フローサイトメトリーを使用して検出した。
【図６】ワクチン接種卵巣がん患者に由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃに誘導された、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加の検出。対象ＰＢＭＣを、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃペプチドを使用して設計されたＭＨＣ多量体試薬（四量体）および対応するＭＨＣ分子を結合する、ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の能力により、ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在について試験した。アッセイを、非刺激ＰＢＭＣ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で、またはＨＬＡ適合サバイビンペプチド（複数可）の存在下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで１０日刺激したＰＢＭＣのいずれかで実施した。提示されているデータは、ベースラインでの（円）、１回投与（三角）、２回投与（ひし形）および３回投与（四角）後の、個々の対象の末梢血におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を表す。
【図７】単一アミノ酸改変または非改変天然サバイビンペプチド配列に対する免疫応答および反応性のＥＬＩＳＰＯＴならびに四量体をベースとした分析を説明し、改変および非改変サバイビンペプチド双方を認識する、ワクチンが誘導した免疫応答の能力を実証する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
進行がんは、免疫により媒介される検出および破壊を逃れ、それによってがん治療法の有効性を複数のレベルで低減する、いくつかの機構を利用する。
【００１７】
腫瘍により誘導される免疫抑制は、がんの特徴の１つであり、ペプチドワクチンを含めた、がんに対するどの免疫療法にとっても、かなりの障害となる（Hanahan and Weinberg, Cell, 144(5): 646-674, 2011）。発達するにつれ腫瘍は、いくつかの機構によって、免疫検出を回避し逃れるように適応する。例えば腫瘍微小環境は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）（Curiel et al., Nat Med 10(9): 942-949, 2004）および骨髄由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）（Nagaraj and Gabrilovich, Cancer Res 68(8): 2561-3, 2008）などの、抑制性免疫細胞の発生を促進する多くの因子を上方制御する。腫瘍微小環境は、ＴＮＦ−βなどの免疫抑制性サイトカインを放出することによって、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞の直接の抑制にも寄与する（Yang et al., Trends Immunol 31(6): 220-227, 2010）。免疫圧に応答する、他の腫瘍の逃避機構には、免疫編集、ＭＨＣクラスＩの下方制御、ならびに抗原プロセシングおよび提示の変更がある。したがって、ワクチンにより誘導されるＣＤ８＋Ｔ細胞に、腫瘍細胞が適応するチャンスを得る前に速やかにそれらを認識および破壊する機会があることが、絶対に必要である。腫瘍により誘導される免疫抑制に対抗するための免疫調節剤の使用は、がんワクチンの有効性を向上させる可能性がある（Yong et al., J Biomed Biotechnol 2012: 605045）。
【００１８】
本発明の方法は、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤と、サバイビンワクチンとを組み合わせた投与による、対象のがんの処置に関する。
【００１９】
アポトーシスの負の制御に関与するタンパク質であるサバイビンは、多くの腫瘍型で高発現し、その予後的重要性が報告されている。本明細書で使用される「サバイビンワクチン」とは、本明細書に記載するサバイビン抗原の１つまたは複数を、対象に投与するためのあらゆるワクチンまたは抗原送達手段を包含することを意図する。このような「サバイビンワクチン」の例示的な実施形態が本明細書に記載されているが、当業者ならば、対象に抗原を送達するためのあらゆるワクチンまたは手段が包含されることを、了解するはずである。
【００２０】
本発明の方法の実施形態は、がんの処置におけるワクチン（すなわち、サバイビンワクチン）の有効性を、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を前もって少なくとも２回投与することによって向上させることに関する。
【００２１】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、対象のがんの処置におけるワクチンの有効性を向上させるための方法であって、（ｉ）対象に、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を、免疫調節効果をもたらすのに十分な量で少なくとも２回投与するステップと、（ｉｉ）続いて対象に、少なくとも１つのサバイビン抗原を含む治療有効量のワクチンを投与するステップとを含む方法に関する。
【００２２】
本明細書で使用される「ワクチン有効性を向上させる」または「ワクチンの有効性を向上させる」などは、対象の免疫応答の任意の変化または変更であって、がんの処置において、本発明のサバイビンワクチンをより効果的にすることができる変化または変更を指す。一部の実施形態では、これは、免疫応答の出現を促進すること、および／またはサバイビンワクチンに対する免疫応答の持続性または強さを向上させることを伴い得る。免疫応答は、細胞により媒介される免疫応答、または液性免疫応答のいずれでもよい。
【００２３】
本発明の方法では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤は、ワクチン中のサバイビン抗原に対する免疫応答を、直接または間接のいずれかで増強することによって、「ワクチンの有効性を向上させる」ことができる。これは例えば、抑制性免疫細胞の数および／または活性を低減することによって達成できる。例えば、腫瘍微小環境は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）（Curiel et al., Nat Med 10(9): 942-949, 2004）、骨髄由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）（Nagaraj and Gabrilovich, Cancer Res 68(8): 2561-3, 2008）およびＣＤ１９＋ＣＤ５＋ＣＤ１ｄｈｉＩＬ−１０＋Ｂ細胞（Ｂｒｅｇ）（Balkwill et al., Trends Immunol, 03 December 2012, 10.1016/j.it.2012.10.007 (Epub ahead of print)）などの、抑制性免疫細胞の発生を促進する多くの因子を上方制御することが報告されている。したがって、これらの抑制性免疫細胞の数または活性を低減する能力は、ワクチン有効性を向上させるための実施形態を体現する。
【００２４】
「ワクチンの有効性を向上させる」ことは、例えば、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数および／または活性を増加することによっても達成できる。これに関しては、例えば、腫瘍微小環境は、ＴＮＦ−βなどの免疫抑制性サイトカインを放出することによって、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞の直接の抑制にも寄与することが報告されている（Yang et al., Trends Immunol 31(6): 220-227, 2010）。したがって、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を増加させる能力は、ワクチン有効性を向上させる潜在的機構を表す。抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加は、このような細胞の数が増加すること、このような細胞の活性が増加すること、および／または例えば総ＣＤ８＋Ｔ細胞数の相対的減少などにより、総ＣＤ８＋Ｔ細胞数に対し、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の濃縮された集団が生じることの結果である可能性がある。
【００２５】
より一般には、「ワクチンの有効性を向上させる」ことは、ワクチンにより誘導され、細胞により媒介される免疫応答もしくは液性免疫応答のいずれかを増強することによって、ワクチンの免疫原性を増強する；ワクチン接種した部位または腫瘍部位の免疫細胞の数を増加させる；または例えばがんの予防的および／もしくは治療的処置を増強すること、ならびに／もしくは疾患症状の進行を軽減、遅延もしくは阻害することなどによって、本発明のワクチンによりもたらされる治療効果を向上させる、本発明の方法の能力を指す。ワクチンの有効性を向上させることは、単独治療処置と比べて、生活の質の向上または罹患率の減少に関連することもまたある。
【００２６】
「ワクチンの有効性を向上させる」とは、所望の結果を得るために必要とされる、本発明の組合せの有効成分の用量が低くなることを意味することもある。これは、投与量自体がより少ない実施形態、ならびにワクチン、および／またはＤＮＡ複製を妨げる薬剤をより低頻度に利用する実施形態のいずれをも包含する。
【００２７】
数種類の化学療法薬が、細胞毒性のない低用量で使用した場合に免疫調節活性を示した（Zitvogel et al., Nat Rev Immunol 8(1): 59-73, 2008；Liu and Dalgleish, Semin Oncol 39(3): 340-347, 2012）。シクロホスファミドは、記載された最初の免疫調節剤の１つで、その細胞毒性効果のために通常使用される用量の何分の１かで使用した場合、免疫系に対し複数の効果がある（Sistigu et al., Semin Immunopathol 33(4): 369-383, 2011）。低用量シクロホスファミドは、Ｔｒｅｇの機能性を選択的に低減し、かつ妨げ（Lutsiak et al., Blood 105(7):2862-2868, 2005）、腫瘍血管新生を阻害し（Browder et al., Cancer Res 60(7):1878-1886, 2000）、樹状細胞の活性化を増加させ（Radojcic et al., Cancer Immunol Immunother 59(1): 137-148, 2009）、かつ免疫応答をＴｈ１に向けて歪ませる（Schiavoni et al., Blood 95(6):2024-2030, 2000）ことが報告されている。マウスでは、シクロホスファミドの低用量での単回ボーラス投与の効果は一過的で、通常は投与後４日以内に最下点に達し、７〜１０日までには正常に戻る（Lutsiak et al., Blood 105(7):2862-2868, 2005）。
【００２８】
がんワクチンと組み合わせて使用する場合、低用量シクロホスファミドは通常、ヒトでは、ワクチン接種の１日から３日前に、約１００〜３００ｍｇ／ｍ２（１〜５ｇ／ｍ２の、化学療法での用量とは対照的なことに）の単回ボーラスＩＶ注射として投与する（Audia et al., Clin Exp Immunol 150(3):523-530, 2007；Vermeij et al., Int J Cancer 131(5): E670-680, 2012）。このレジメンはその有望性を前臨床モデルで示されたものの、臨床試験への応用では、同じ不確かな結果は得られなかった（Audia et al., Clin Exp Immunol 150(3):523-530, 2007；Vermeij et al., Int J Cancer 131(5): E670-680, 2012）。ただしＷａｌｔｅｒらは近年、腎細胞癌（ＲＣＣ）患者での第ＩＩ相研究では、ペプチドワクチン前のシクロホスファミドの単回投与が、患者の生存期間延長と関連したことを示すデータを公表している（Walter et al., Nat Med 18: 1254-1261, 2012）。しかしｓｂＣＰＡ処置には、ワクチンの免疫原性に対し測定可能な効果はなかった。
【００２９】
シクロホスファミドの単回ボーラス投与に代わるアプローチは、毎日、極低用量のシクロホスファミドを投与することによって、規則正しいスケジュールでシクロホスファミドを送達することである。規則正しいシクロホスファミド投与は、低用量シクロホスファミドの単回投与と似た免疫調節効果を有すると報告されている（Ghiringhelli et al., Cancer Immunol Immunother 56(5): 641-648, 2007；Le and Jaffee, Cancer Res 72(14): 3439-3444, 2012）。
【００３０】
驚くべきことに、そして予期しなかったことには、サバイビンワクチン（例えば、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ）の投与前に、シクロホスファミドを対象に少なくとも２回投与することにより、ワクチンの有効性を向上できることが今や見出された。これは、前臨床的な動物研究に比べ、本明細書に開示する結果はヒトでの臨床相研究に関するため、実に重要な知見である。
【００３１】
本発明によるサバイビンワクチンであるＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃは、がんの処置のための抗がん免疫療法ワクチン候補である。ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃワクチンはサバイビンを標的とするように設計されている。本明細書に記載するように、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃは、異なるＨＬＡ拘束性（ＨＬＡ−Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ２４およびＢ７）を有する、サバイビンのタンパク質配列に由来する１つのデカペプチド（配列番号６）および４つのノナペプチド（配列番号２、４、７および８）を含有する。
【００３２】
本明細書に記載する、コホートＡ、コホートＢおよびコホートＣ（図１を参照されたい）におけるＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃによる対象の処置は、まず強い抗原特異的免疫応答を生じ、また時間を経ても持続的に腫瘍に対する免疫応答を維持する、最適な処置スケジュールを検討することを目的とした。この抗原特異的Ｔ細胞応答は、発達している、または新しい腫瘍に継続的に圧力をかけ、患者の緩解を長期化してくれると予期される。
【００３３】
本発明の方法に従ってＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃで処置した対象で、広範な免疫分析を行った結果、臨床研究の第Ｉ相部分においていくつかの重要な知見が得られた。ワクチンの投与前に低用量シクロホスファミド処置期間を含むＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ組合せ治療（combination therapy）を施していた全対象（コホートＢおよびＣ、ｎ＝１２）は、本研究の３つの免疫モニタリングアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ、テトラマー解析およびマルチパラメトリック細胞内染色（intracellular cell staining）；表１）のうちの少なくとも１つによって測定される抗原特異的免疫応答を示した。
【００３４】
【表１】
2016516083.tif 000003
【００３５】
表１には、処置後の時点で調べたＥＬＩＳＰＯＴの結果（ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣ）を、ＳＦＵが＜１２８の場合に低（Ｌ）、ＳＦＵが１２８〜５１２の範囲内の場合に中（Ｍ）、ＳＦＵが＞５１２の場合に高（Ｈ）と表してある。ＰＢＭＣのテトラマー解析は、ｅｘ  ｖｉｖｏ（刺激なし）またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ（ペプチド刺激あり）のいずれかで行った。抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ワクチン接種前のレベルから２倍に増加した場合を、陽性応答者として示した；Ｎ／Ａ、適用不可（適切な試験試薬がない）。多機能性の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γと、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２のうち少なくとも片方または両方とを、同時に分泌する細胞として規定される。
【００３６】
本研究での高応答者の全員は、本発明の方法に従って組合せ治療を施していたコホートＢおよびＣ内に見られた。コホートＢおよびＣの対象１２人のうち１１人で、２つのアッセイ（５人の対象）または３つのアッセイ（６人の対象）によって免疫応答が確認された。免疫応答は一般に１回または２回のワクチン接種によって確立され、ブースターによって増加し、または維持された。コホートＣ患者で用量応答（dose response）が観察され、有意により大きな応答が生じた（コホートＣ対コホートＢ、Ｐ＝０．０１３）。ワクチン投与前に開始した低用量シクロホスファミドは、０．５ｍｌ用量のワクチンを有意に増強した（コホートＣ対コホートＡ、Ｐ＝０．０１５）。特筆すべきことには、最も高頻度な抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、コホートＣの患者で、テトラマーを使用してｅｘ  ｖｉｖｏでＰＢＬ中に（in PBL's）に検出され、またこれらの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は多機能性であることが、マルチパラメトリックＩＣＳによってさらに特徴付けられ、このことから、低用量シクロホスファミドのサバイビンワクチンとの組合せにより、最も強力な抗サバイビン免疫応答が生じたことが示された。
【００３７】
図２のコホートＡおよびＣに関するＥＬＩＳＰＯＴデータを表２にまとめる。
【００３８】
【表２】
2016516083.tif 000004
【００３９】
上の表（表２）から、コホートＡで単回のワクチン接種（ワクチンのみ；ｎ＝６）後に達成された最も高い、ＥＬＩＳＰＯＴによる免疫応答は、１３０ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣ（PBMC's）（５５〜１３０の範囲）であったことが見て取れよう。対照的に、コホートＣで単回のワクチン接種（前もってシクロホスファミド、加えてワクチン；ｎ＝６）後に達成された最も高い、ＥＬＩＳＰＯＴによる応答は、２３０９ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣ（２〜２３０９の範囲）であった。これは、達成された最も高い免疫応答が１７．７倍向上したことに相当し、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を前もって投与するステップを含む本発明の方法が、サバイビンワクチンの顕著な有効性の向上をもたらすことを示している。
【００４０】
同様に、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃワクチンの有効性も、ワクチンを２回または３回投与した場合、本発明の方法によって増強されることが見出された。表２に示すように、コホートＡで２回のワクチン接種（ワクチン単独；ｎ＝５）後に達成された最も高い、ＥＬＩＳＰＯＴによる免疫応答は、１３７ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣ（２２〜１３７の範囲）であり、一方、コホートＣで２回のワクチン接種（前もってシクロホスファミド、加えてワクチン；ｎ＝６）後に達成された最も高い、ＥＬＩＳＰＯＴによる応答は、１９１１ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣ（２５〜１９１１の範囲）である。これは、達成された最も高い免疫応答が１３．９倍向上したことに相当する。
【００４１】
３回のワクチン接種後、コホートＡ（ワクチン単独；ｎ＝６）で達成された最も高い、ＥＬＩＳＰＯＴによる免疫応答は、２８４ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣ（１２〜２８４の範囲）であった。対照的に、コホートＣ（前もってシクロホスファミド、加えてワクチン；ｎ＝６）で達成された最も高い、ＥＬＩＳＰＯＴによる免疫応答は、２５１７ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣ（３８〜２５１７の範囲）であった。これは、達成された最も高い免疫応答が８．９倍向上したことに相当する。
【００４２】
さらには図４に示すように、３回のワクチン接種後、コホートＣ（前もってシクロホスファミド、加えてワクチン）の患者のうち４／６が、５１２スポット／１０６ＰＢＭＣを超えるＥＬＩＳＰＯＴ応答を有していたことが見出されたが、これは、コホートＡ（サバイビンワクチン単独）では患者のうち０／６であったことと対照される（図４を参照されたい）。これらの結果から、低用量シクロホスファミドは、０．５ｍｌ用量のサバイビンワクチンによってもたらされる免疫応答を顕著に増強したことが示される。コホートＡでは３回のワクチン接種後にさえ、コホートＡの患者は誰も、本研究において高い免疫応答とみなす応答（すなわち、ＳＦＵ＞５１２）を達成することはできなかった。
【００４３】
ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃワクチンの有効性を向上させる、本発明の方法の能力は、コホートＡ、ＢおよびＣでワクチンを１回、２回および３回投与した場合の刺激指数を示す、図３に提示したデータからさらに明らかである。刺激指数は、患者のＩＦＮ−ガンマ分泌細胞数が、これら患者のベースライン免疫応答に対し何倍増加したかを表す。図３に示すように、コホートＡ（ワクチン単独；ｎ＝６）では、３回のワクチン接種後に達成された刺激指数は０．４〜８．９ｘであったが、一方、コホートＣ（前もってシクロホスファミド、加えてワクチン；ｎ＝６）では、３回のワクチン接種後に達成された刺激指数は１．２〜７９ｘであった。これは、この時点で達成された最も高い免疫応答が８．９倍向上したことに相当し、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を前もって投与するステップを含む本発明の方法が、サバイビンワクチンの顕著な有効性の向上をもたらすことを示している。
【００４４】
さらに、コホートＡ（ワクチン単独；ｎ＝４）では、２回投与後に少なくとも１人の患者で達成された最も高い刺激指数は３．５ｘであったが、一方、コホートＣ（前もってシクロホスファミド、加えてワクチン；ｎ＝６）では、２回投与後に少なくとも１人の患者で達成された最も高い刺激指数は５９．７ｘであった。これは、サバイビンワクチンによるワクチン接種の前に、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を投与するステップを含む本発明の方法によって、その時点で達成された最も高い免疫応答が１７．１倍向上したことに相当する。
【００４５】
本発明の方法によって生じ、ＥＬＩＳＰＯＬＴにより検出された、より大きな免疫応答（例えば、コホートＢおよびＣ）は、循環している抗原特異的Ｔ細胞応答の検出（テトラマー染色による）および血中の多機能性Ｔ細胞応答プロファイル（ＩＣＳ染色による）によっても特徴付けられた。
【００４６】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏテトラマー：コホートＢおよびＣの対象１２人のうち１０人が、テトラマー染色によって評価可能だった（表１）。１０人全員で、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃによる１回または２回のワクチン接種後に、サバイビン特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が誘導されたことの強い証拠が認められた。これらの特異的免疫細胞が活性化され、かつ維持されたことは、重要である。これは、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、がん細胞を特定し、腫瘍に侵入し、がん標的を死滅させることに関与すると示唆されているからである。コホートＣの評価可能な患者は全員、総ＣＤ８＋Ｔ細胞数の１％超が陽性であり（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激で）、総ＣＤ８＋Ｔ細胞数の３４％にまでも達していることが見出された。対照的に、コホートＡで記録された最も強い、ＳＤ７０によるテトラマー陽性は、総ＣＤ８＋Ｔ細胞数の１％未満（０．７％）であった。
【００４７】
Ｅｘ  ｖｉｖｏテトラマー：上の表１に示したように、コホートＡの患者のうち１／６が、休止させた（rested）／刺激していないＰＢＭＣ中に、ワクチン接種後の少なくとも一時点で、検出可能なテトラマー陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞を有していた。しかし重要なことにこの患者では、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＣＳ染色で決定したところでは多機能性ではなかった。対照的に、コホートＣの患者のうち４／６が、休止させた／刺激していないＰＢＭＣ中に、ワクチン接種後の少なくとも一時点で、テトラマー陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞を有していた。これらの患者では、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が多機能性であることが、ＩＣＳによって確認された。
【００４８】
ＩＣＳによる多機能性：さらに、コホートＣの患者のうち５／６が、検出可能な抗原特異的多機能性ＣＤ８＋Ｔ細胞を有していたが、これは、コホートＡでは患者のうち２／６のみであったことと対照される（表１）。これらの結果から、コホートＣの患者は、コホートＡの患者よりも顕著に大規模かつ高頻度に、抗原特異的多機能性ＣＤ８＋Ｔ細胞を生じたことが示される。
【００４９】
テトラマーおよびＩＣＳ染色によって得られた結果は、ＥＬＩＳＰＯＴによる強い免疫応答と相関することが見出された。休止させた／刺激していないＰＢＭＣ中にテトラマー陽性細胞を有していたか、またはＩＣＳによる多機能性の抗原特異的ＣＤ８＋細胞を有していた（すなわち、少なくとも、両方ともではないが片方のアッセイによって陽性）コホートＡ患者は、低い／中程度の、ＥＬＩＳＰＯＴによる応答を有することが見出された（すなわち、３回のワクチン接種後に１２〜２８４ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣの間）。対照的に、テトラマー陽性であり、確証された多機能性の抗原特異的ＣＤ８＋細胞を有していたコホートＣ患者は、中程度の／高い、ＥＬＩＳＰＯＴによる免疫応答を有していた（すなわち、３回のワクチン接種後に７７３〜２５１７ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣの間）。
【００５０】
本明細書に開示する結果から、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を前もって投与するステップを含む本発明の方法は、サバイビンワクチンの有効性を向上させる能力を有することが示される。本発明の方法はしたがって、がん、特に細胞表面にサバイビン抗原を発現するがんの処置に適している可能性がある。さらに、本発明のワクチンによって生じる免疫応答は、ワクチンに含有される特定のサバイビン抗原を発現する腫瘍細胞だけでないものを標的とする潜在的可能性を有し得る。図７に示すように、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ中の改変サバイビンペプチドによって生ずる免疫応答は、天然ペプチドにも交差反応性を呈した。
【００５１】
シクロホスファミドを前もって投与し、それに続いてサバイビンワクチンを投与するステップを含む本発明の方法によって観察された免疫誘導のレベルは、大いに際立っていた。これは、自己抗原を標的とするワクチンの他のアプローチではめったに見られないレベルである。これらの強力な免疫応答は、がん患者において達成するのは非常に困難であることが一般に了解されており、臨床的に意味のある抗腫瘍免疫応答の基礎をなすことになる可能性が高い。コホートＣでの応答の強さからは、免疫調節薬として低用量シクロホスファミドを前もって与えることが、ワクチンの有効性を向上させ、かつ記録された強い免疫応答を生ずるのに重要な因子であることが実証される。
【００５２】
本明細書に開示する臨床結果は、いずれも本明細書に記載のとおり、ＤＮＡ複製を妨げる任意の薬剤および任意のサバイビンワクチンについてのより広範な応用を有する本発明の方法の例示的な実施形態を提供する。
【００５３】
ＤＮＡ複製を妨げる薬剤
本発明の方法は、本明細書に記載するワクチンを投与する前に、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を投与するステップを伴う。
【００５４】
本明細書で使用される「ＤＮＡ複製を妨げる」という表現は、細胞のＤＮＡをコピーする（すなわち、複製する）生物学的過程を妨害し、阻害し、または遅延させるあらゆる作用を包含することを意図する。当業者ならば、ＤＮＡ複製を妨害し、阻害し、または遅延させる種々の機構、例えば、ＤＮＡ架橋、ＤＮＡのメチル化、塩基置換などが存在することを理解するはずである。本発明による方法は、当技術分野で知られるいかなる手段によるものであれ、ＤＮＡ複製を妨げるあらゆる薬剤の使用を包含する。例示的な実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤は、それだけに限らないが、薬物である。
【００５５】
一実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤は、非化学療法的な用量で使用する場合、ワクチン応答を増強するために免疫系を調節する意図で、免疫系細胞のＤＮＡ複製に選択的に影響を与えることのできる薬剤である。「非化学療法的」とは、薬剤の用量が、悪性または癌性の細胞および組織を直接かつ選択的に破壊するために使用されたはずの用量よりも低い用量であることを意味する。
【００５６】
ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の他の実施形態には、急速に分裂している免疫系細胞を選択的に標的とする能力によって、ＤＮＡ複製を妨げてプログラム細胞死を引き起こす薬剤が含まれる。このような薬剤の目的は、免疫系細胞を調節してワクチン応答を増強することである。このような薬剤は通常、化学療法的であるとは予期されず、かつヒトでの使用に許容されると考えられる用量で使用される。免疫細胞を選択的に標的とする目的は、免疫抑制性細胞の数を低減すること、および／またはＤＮＡ複製を標的とする薬物を除去すると、急速な増殖が誘導されるようにする目的で、免疫応答の媒介に関与する有用な免疫細胞を欠乏させることであり得る。
【００５７】
細胞死に至るかたちでＤＮＡ複製を妨げる原因には、それだけに限らないが、ＤＮＡ架橋の形成（例えば、アルキル化剤、白金化合物などによって）、ＤＮＡのメチル化（すなわち、メチル化剤によって）、塩基置換（すなわち、ヌクレオシド類似体によって）を含めた数多くの機構がなり得る。例示的な薬剤およびその機構は、Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principles and Practice (Cabner B.A., 5th edition, Lippincott Williams & Wilkins, PA, USA, 2011)に記載されている。
【００５８】
一実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤はアルキル化剤である。アルキル化剤には、それらだけに限らないが、シクロホスファミド、テモゾロミド、イホスファミド、マホスファミド、メルファラン、ブスルファン、ベンダムスチン、ウラムスチン、カルムスチンまたはビス−クロロエチルニトロソウレア（ＢＣＮＵ）、クロラムブシル、マイトマイシンＣ、およびそれらの誘導体、活性代謝物または代謝物中間体（metabolite intermediate）が含まれる。適切な誘導体は、それだけに限らないが例えば、パリホスファミド（例えば、イホスファミドの誘導体）であってよい。
【００５９】
別の実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤は白金化合物である。白金化合物には、それだけに限らないが、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチンおよびその誘導体が含まれる。
【００６０】
別の実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤はメチル化剤である。メチル化剤には、それだけに限らないが、テムゾロミド（temzolomide）、プロカルバジンおよびダカルバジンならびにそれらの誘導体が含まれる。
【００６１】
別の実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤はヌクレオシド類似体である。ヌクレオシド類似体の非限定的な例としては、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）およびそれらの誘導体が挙げられる。
【００６２】
別の実施形態では、トポイソメラーゼＩ、トポイソメラーゼＩＩまたはＤＮＡポリメラーゼなどの、ＤＮＡ複製に不可欠な酵素を阻害することによって間接的にＤＮＡ複製を阻害する、いかなる薬物を使用してもよい。このような薬物には、それだけに限らないが例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ミトキサントロン、エトポシド、テニポシド、トポテカン、カンプトテシン、イリノテカン、アシクロビルおよびガンシクロビルが含まれる。
【００６３】
ＤＮＡ複製を妨げる例示的な薬剤であって、本発明の方法で使用できる薬剤としては、それだけに限らないが、下の表３に記載する薬剤が挙げられる。当業者ならば了解するはずであるが、これらは、使用できる薬剤の例である。その他の薬剤には例えば、類似した機構によってＤＮＡ複製を妨げ、かつ／または類似した官能基を有する、あらゆる薬物または化合物が含まれる。
【００６４】
【表３】
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2016516083.tif 000006
【００６５】
特定の実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤はナイトロジェンマスタードアルキル化剤、またはその任意の中間代謝物もしくは活性代謝物である。ナイトロジェンマスタードは非特異的ＤＮＡアルキル化剤である。ナイトロジェンマスタードは、クロリドのアミン窒素による分子内置換によって、環状アミニウムイオン（アジリジニウム環）を形成する。そしてこのアジジリウム（azidirium）基は、グアニン塩基のＮ−７求核中心を攻撃することによって、ＤＮＡをアルキル化できる。第２の塩素が置換されると第２のアルキル化ステップが起き、その結果、鎖間架橋（ＩＣＬ）が形成される。これらの損傷は、ＤＮＡ複製および転写などの基本的代謝過程を阻止するために、極めて細胞障害性である。
【００６６】
本発明の方法は、任意のこのような非特異的ナイトロジェンマスタードＤＮＡアルキル化剤の使用を包含する。特に適切なナイトロジェンマスタードアルキル化剤には、それだけに限らないが例えば、シクロホスファミド、パリホスファミド、ベンダムスチンおよびイホスファミドが含まれ得る。
【００６７】
イホスファミドはナイトロジェンマスタードアルキル化剤である。イホスファミドのＩＵＰＡＣ名称はＮ−３−ビス（２−クロロエチル）−１，３，２−オキサザホスフィナン−２−アミド−２−酸化物である。イホスファミドは一般にはＩｆｅｘ（登録商標）として知られる。イホスファミドの化学構造は以下のとおりである：
【００６８】
【化１】
2016516083.tif 000007
【００６９】
パリホスファミドは、安定性のためにアミノ酸のリシンに共有結合しているイホスファミドの活性代謝物である。パリホスファミドはＤＮＡを不可逆的にアルキル化し、ＧＣ塩基対を介して架橋する。これにより、７原子による修復不能な鎖間架橋が生じ、ＤＮＡ複製の阻害および／または細胞死をもたらす。パリホスファミドはＺｙｍａｆｏｓ（登録商標）としても知られる。
【００７０】
ベンダムスチンは別のナイトロジェンマスタードアルキル化剤である。ベンダムスチンのＩＵＰＡＣ名称は４−［５−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］−１−メチルベンゾイミダゾール−２−イル］ブタン酸であり、一般にＴｒｅａｋｉｓｙｍ（登録商標）、Ｒｉｂｏｍｕｓｔｉｎ（登録商標）、Ｌｅｖａｃｔ（登録商標）およびＴｒｅａｎｄａ（登録商標）と称する。ベンダムスチンの化学構造は以下のとおりである：
【００７１】
【化２】
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【００７２】
本発明の方法には、ＤＮＡアルキル化剤の中間代謝物および／または活性代謝物、特に、本明細書に記載するナイトロジェンマスタードＤＮＡアルキル化剤の中間代謝物および／または活性代謝物の使用も包含される。このような代謝物には、それだけに限らないが、アルドホスファミド、４−ヒドロキシシクロホスファミド、４−ヒドロキシイホスファミド、クロルアセトアルデヒドおよびホスファミドマスタードが含まれる。
【００７３】
さらなる実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤は、本明細書に記載するアルキル化剤、白金化合物、メチル化剤またはヌクレオシド類似体の薬学的に許容される適切ないかなる塩、エステル、互変異性体、立体異性体、ラセミ混合物、溶媒和物、水和物またはプロドラッグであってもよい。
【００７４】
特定の実施形態では、本発明の方法に使用するための、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤はシクロホスファミドである。
【００７５】
シクロホスファミド（ＣＰＡ）
シトホスファン（cytophosphane）としても知られるシクロホスファミド（Ｎ，Ｎ−ビス（２−クロロエチル）−１，３，２−オキサザホスフィナン−２−アミン２−酸化物）は、ナイトロジェンマスタードアルキル化剤である。シクロホスファミドの化学構造は以下のとおりである：
【００７６】
【化３】
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【００７７】
シクロホスファミドは、Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）およびＲｅｖｉｍｍｕｎｅ（登録商標）の商標のもとでも知られ、またそう称する。シクロホスファミドと同じクラスの他のナイトロジェンマスタードアルキル化剤には、それだけに限らないが、パリホスファミド、ベンダムスチンおよびイホスファミドが含まれる。
【００７８】
シクロホスファミド（ＣＰＡ）は、通常は静脈注入で投与するが、バイオアベイラビリティをほとんど変化させずに（Juma, Rogers et al. 1979）非経口投与および経口投与することもできる（de Jonge, Huitema et al. 2005）プロドラッグである。ＣＰＡは、その活性代謝物である４−ヒドロキシ−ＣＰＡおよびアルドホスファミドへと、肝臓のＰ４５０酵素による酸化によって変換される（Emmenegger, Shaked et al. 2007; 2011）。ＣＰＡの活性代謝物は脂溶性であり、受動拡散によって細胞内に入る。細胞内の４−ＯＨ−ＣＰＡは自発的に分解して、最終活性代謝物であるホスホラミドマスタードとなる。ホスホラミドマスタードは、鎖内および鎖間ＤＮＡ架橋ならびにＤＮＡ−タンパク質架橋を触媒し、これらはＤＮＡ複製を阻害して細胞死をもたらす（de Jonge, Huitema et al. 2005）。ホスホラミドマスタードは、細胞質アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）によるカルボキシホスファミド（carboxyphoshphamide）への酵素的変換によって消失する（Emmenegger, Shaked et al. 2007; 2011）。ＡＬＤＨが低レベルの細胞は、ＣＰＡ代謝物を蓄積する傾向にあり、その効果に対しより感受性である。実際、腫瘍によるＡＬＤＨの上方制御は、ＣＰＡ抵抗性の機構の１つである（Zhang, Tian et al. 2005）。ＡＬＤＨ以外では、細胞内ＡＴＰレベルの低さも、特定の細胞型へのＣＰＡの選択性に関連付けられている（Zhao, Cao et al. 2010）。高用量、典型的には１〜５ｇ／ｍ２の範囲では、ＣＰＡの効果は、細胞型の区別なしに、急速に分裂している細胞に対し最も細胞障害性である。ほとんどの造血細胞（hematogenic cell）は急速に分裂しているので、ＣＰＡは骨髄抑制性である（Bruce, Meeker et al. 1966；Smith and Sladek 1985）。
【００７９】
ＣＰＡおよびその代謝物の全身クリアランスは、５〜９時間の間で変動し、親のピーク血漿レベルもまた患者ごとにかなり変動する（３〜１１時間）。これは、人によって代謝が遺伝的に異なることを反映している（Cohen, Jao et al. 1971；Mouridsen, Faber et al. 1974）。ＣＰＡの反復投与は、代謝に関与する酵素の活性を上昇させることによって消失半減期を短縮すると報告されているが（D'Incalci, Bolis et al. 1979）、これが活性代謝物の代謝の上昇につながるか否かは、特に低用量では（Emmenegger, Shaked et al. 2007）知られていない（de Jonge, Huitema et al. 2005）。
【００８０】
ヒトからマウス試験への用量換算は、以下の式を使用して計算する：
【００８１】
【数１】
2016516083.tif 000010
【００８２】
式中、定数であるマウスでのＫｍ値は３、ヒトでのＫｍ値は３７である（Reagan-Shaw, Nihal et al. 2008）。この計算を使用すると、５０ｍｇを１日２回経口投与することからなる、ヒトにおける毎日の規則正しい処置は、マウスにおける２０．５６ｍｇ／ｋｇと同等である。２０ｍｇ／ｋｇの経口用量が前臨床モデルで評価され、ヒトでの前記用量と生物学的に同等であると判定されている（Voelcker, Wagner et al. 1984；Man, Bocci et al. 2002）。
【００８３】
この２０年、低用量ＣＰＡは、その免疫調節および抗血管新生効果が認められてきた。高用量ＣＰＡと対照的に、低用量ＣＰＡ、典型的には１００〜３００ｍｇ／ｍ２、は広範な細胞障害活性は欠くが、免疫系細胞を選択的に調節することによって、かつさらに腫瘍微小環境内での血管新生を低減することによって、免疫により媒介される腫瘍消失を促進するようである。低用量ＣＰＡ治療はそれ単独の場合、動物モデルにおいて腫瘍成長を遅延させるが、完全に腫瘍を根絶する上では無効であることが示されている。ＣＰＡにより誘導される腫瘍の遅延機構は、がんワクチンなど、他の形態の免疫療法との組合せに対し補完的である。低用量ＣＰＡ、典型的には＜３００ｍｇ／ｍ２、は単回ボーラス注射（ｓｂＣＰＡ）として、または経口的に数日に渡って、規則正しい治療（ｍＣＰＡ）として送達することができる。腫瘍に対する活性な免疫応答が抑えられる原因となっていた免疫抑制細胞を、ＣＰＡが選択的に欠乏させることを最初に示したのが、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｎｏｒｔｈによる１９８０年代の先駆的研究（North 1982；Awwad and North 1988）であった。それ以来、ＣＰＡは選択的にＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の機能性を低減し、かつ損ない（Lutsiak, Semnani et al. 2005）、腫瘍血管新生を阻害し（Browder, Butterfield et al. 2000）、樹状細胞の活性化を増加させ（Radojcic, Bezak et al. 2009）、免疫応答をＴｈ１に向けて歪ませ（Schiavoni, Mattei et al. 2000）、かつＴおよびＮＫエフェクター機能を回復する（Ghiringhelli, Menard et al. 2007）と報告されてもきた。マウスでは、ＣＰＡの低用量での単回ボーラス投与の効果は一過的で、通常は投与後４日以内に最下点に達し、７〜１０日までには正常に戻る（Lutsiak, Semnani et al. 2005；Salem, Al-Khami et al. 2012）。
【００８４】
低用量ＣＰＡは、前臨床モデルおよび臨床試験で、がんワクチンと組み合わされてきた。Ｈｅｒｍａｎｓらは、ＤＮＡ／ＭＶＡプライム／ブースト戦略で予防的に免疫しておいた、腫瘍を持つマウスにおいて、低用量ＣＰＡ処置の有効性を調べた。手短に言えば、腫瘍抗原ｍｅｌ３をコードするプラスミドＤＮＡを用いてマウスを免疫し、次いで１４日後に、同じ抗原をコードするＭＶＡを用いてブーストした。ＭＶＡブーストの７日後、マウスをＢ１６−Ｆ１０腫瘍に曝露し、次いで６日毎に低用量ＣＰＡ（１７５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で処置した（Hermans, Chong et al. 2003）。彼らは、予め免疫し、次に低用量ＣＰＡで処置したマウスでは、腫瘍成長が顕著に遅延したが、いずれかの処置単独では効果がなかったことを見出した。彼らは、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加は検出しなかった。腫瘍を持たないマウスにおけるＢａｒｂｏｎらの研究から、ＣＹＰ１Ｂ１抗原をコードするＤＮＡワクチンの前に毎日３回、低用量ＣＰＡ（２０ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内）を注射すると、ワクチンの２日前に低用量または高用量（２０または２００ｍｇ／ｋｇ）ＣＰＡを単回投与するよりも良い免疫応答がもたらされることが示された（Barbon, Yang et al. 2010）。ＣＰＡは毎日投与し、最後の投与はワクチン接種の２日前だった。この研究では、毎日のＣＰＡ処置は、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞を残しつつ、Ｔｒｅｇの総数を低減する上でより効果的であった。Ｗａｄａらは、自己ＴＲＡＭＰ−Ｃ２／ＨＡ前立腺腫瘍モデルにおいて、ＧＶＡＸワクチンを伴う低用量ＣＰＡ（５０ｍｇ／ｋｇ、静脈内）の種々のレジメンについて研究した（Wada, Yoshimura et al. 2009）。これらの腫瘍はマウスにおいて自然に発達し、ＨＡ抗原を発現する。最良のレジメンを確立するために、ＣＰＡを、ワクチン接種前に１回、または接種後に１回与えた。低用量の単回ボーラス前投与が、ＣＤ８＋Ｔ細胞を生じさせる上で最も効果的だった。ワクチンの免疫原性は、マウスに７日間隔で（第０日および第７日）２回ワクチン接種し、これを、各ワクチンの前に（ＣＰＡを第−１日および第６日に投与した）低用量シクロホスファミドを単回投与することと組み合わせることによって、さらに増強された。彼らは、循環している総ＣＤ４およびＣＤ８数の増加、詳細には抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を報告した。Ｓａｌｅｍらによる研究では、ワクチン接種の３日前に低用量で単回ボーラス投与するかたちで、ＣＰＡの様々な用量を評価した（Salem, Kadima et al. 2007）。この研究は、ＯＴ−１トランスジェニックＴ細胞を養子移入する２日前、かつオボアルブミンペプチド（１００ｕｇ；SIINFEKL、２５７〜２６４）をＰＢＳ中にて皮下に送達することでマウスをワクチン接種する３日前に、ＣＰＡを単回腹腔内注射することによって野生型マウスを処置したトランスジェニックモデルを使用した。循環している抗原特異的Ｔ細胞の数を増加させるワクチンの能力を、ＰＢＳ、１ｍｇのＣＰＡまたは４ｍｇのＣＰＡによる前処置の後に測定した。彼らは、１ｍｇのＣＰＡ（５０ｍｇ／ｋｇの用量に対応する）はＰＢＳ偽処置よりも、抗原特異的ＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞を増加させることはなかったが、４ｍｇのＣＰＡ（２００ｍｇ／ｋｇの用量に対応する）は、これらの細胞��増加させたことを見出した。いずれの用量も「低用量」と考えられるが、単回投与は、ワクチンにより誘導される免疫応答の一貫した増強には至らなかった。極最近ではＰｅｎｇらが、ＴＣ−１  ＨＰＶ１６腫瘍モデルにおいて、ＨＰＶ１６  Ｅ７タンパク質をコードするＤＮＡワクチンと組み合わせた、毎日のＣＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ／日）をｓｂＣＰＡ（５０ｍｇ／ｋｇ）と比較した（Peng, Lyford-Pike et al. 2012）。このモデルではマウスを、移植の９日後から治療的にワクチン接種し、続く２週間これを週１回繰り返した。ｍＣＰＡは４週間継続的に投与するか、または各ワクチン接種の前に単回で、低用量にて投与した。ＣＰＡ処置は全て、初回のワクチン接種の１日前である、第８日に開始した。彼らは、ワクチンと組み合わせたｓｂＣＰＡおよびｍＣＰＡのいずれも、腫瘍防御の増加をもたらすこと、ならびに各ワクチンの前にＣＰＡを単回投与すると、最も強いＣＤ８応答および最良の抗腫瘍活性がもたらされることを見出した。最後になるがＴａｉｅｂらは、Ｍａｒｔ−１エキソソームワクチンと共に低用量ＣＰＡを、黒色腫モデルにおいて試験した（Taieb, Chaput et al. 2006）。手短に言えば、第０日にＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにＢ１６．Ａ２腫瘍を移植し、次いで第６日に、低用量ＣＰＡ（１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で処置し、第１２日にワクチン接種した。前記組合せで処置したマウスは、いずれかの処置単独よりも顕著によい腫瘍制御、ならびに抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＩＦＮ−γ放出の顕著な増加を示した。
【００８５】
低用量ＣＰＡは、臨床試験でも試験されている。Ｇｈｉｒｉｎｇｈｅｌｌｉらは、ｍＣＰＡ（ワクチン接種を伴わない）を１日２回５０ｍｇにて１ヶ月間、ステージＩＶがん患者に送達した結果、循環しているＴｒｅｇは顕著に減少したが、循環しているＣＤ４、ＣＤ８およびＮＫ細胞の総レベルは影響されなかったことを最初に報告した（Ghiringhelli, Menard et al. 2007）。加えて彼らは、処置した患者のＴ細胞およびＮＫ細胞が増殖能を増していたことを報告したが、これは、ｍＣＰＡ処置をワクチンとうまく組み合わせ得ることを示唆する。第Ｉ／ＩＩ相研究（ｎ＝１４）は、１４人の卵巣がん患者で、樹状細胞ワクチン（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴおよびＰＡＤＲＥペプチドを負荷した、単球由来の樹状細胞）の有効性を、ＣＰＡの低用量での単回ボーラス有り無しで（ｓｂＣＰＡ、ワクチンの２日前に静脈内に３００ｍｇ／ｍ２で送達した）比較した（Chu, Boyer et al. 2012）。組合せ処置を施していた患者では、無進行生存期間および全生存期間が改善する可能性が報告されたが、結果は、患者集団が小さかったためにこの研究では統計的に有意ではなかった。彼らは、ＣＰＡで処置した患者で、循環しているＴｒｅｇの減少を検出しなかった。またＣＰＡ群と非ＣＰＡ群との間で、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴによって測定したＴ細胞応答の増強は示されなかった。黒色腫患者（ｎ＝２８）での別の単一群第ＩＩ相研究では、樹状細胞ワクチン（ＫＬＨ、サバイビン、ｈＴＥＲＴ、ｐ５３およびＰＡＤＲＥ由来のペプチドを負荷した自己樹状細胞、皮内にワクチン接種した）の、経口送達だがワクチン接種後に開始したｍＣＰＡ（１日２回５０ｍｇ、１週間使用−１週間休止）との組合せを試験した（Engell-Noerregaard et al. 2012）。この単一群試験（この試験では、ＤＣに基づくワクチンを、ＩＬ−２およびＣｏｘ−２阻害剤ならびにＣＰＡと組み合わせた）においてワクチンにより誘導された免疫応答の評価では、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴは、ベースラインからワクチン接種の４回目までに中程度の免疫応答があり、応答は経時的にゆっくりと減衰するかたちで起きることを示した。重要なことには、ペプチドワクチン療法単独の場合に通常見られるように、これらの応答は低頻度であるか、またはｅｘ  ｖｉｖｏで直接検出することはできないかであった。これらの患者の応答を直接、ＣＰＡによる処置なしでワクチンを施していた患者と比較したわけではないので、単独の、またはＩＬ−２およびＣｏｘ−２阻害剤と組み合わせたＣＰＡが、少しでもワクチン有効性に寄与したのかは不明である。
【００８６】
卵巣がん患者（ｎ＝１０）での単一群第ＩＩ相試験では、ｐ５３−ＳＬＰ（長い合成ペプチド）を含有するワクチンであって、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ中にて乳化した、重なり合う１０個の合成ペプチドからなり、患者に対し皮下に送達した（３週間の間隔で）ワクチンを、ＣＰＡの低用量での単回ボーラス（ｓｂＣＰＡ、３００ｍｇ／ｍ２、ワクチンの２日前）と組み合わせた。この研究は、単独のワクチンを試験した依然の試験に比べた場合、組合せ治療を施していた患者のＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ応答が上昇したことを報告した（Vermeij, Leffers et al. 2011）。異なる試験を横断した、処置転帰の比較はしかし、結果を歪める可能性のある選択バイアスを受けやすい。より系統的に行われた黒色腫についての試験は、半分は皮下に、かつ半分は皮内にＴヘルパーペプチドと共に油中水型乳剤として送達した２つの特別なマルチペプチドワクチン（チロシナーゼ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ−Ａ１０および／またはＮＹ−ＥＳＯ１に対応するペプチド（peptides to）を含有する）の使用を、ｓｂＣＰＡ（３００ｍｇ／ｍ２、ワクチン接種前）有り無しで比較した。この研究は、ワクチン接種後のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答をＥＬＩＳＰＯＴによって注意深く調べ、ワクチン接種と組み合わせた場合もｓｂＣＰＡは、検出可能な改善をもたらさなかったことを見出した。最後になるが、Ｗａｌｔｅｒらによる腎細胞癌についての第Ｉ／ＩＩ相研究は、ペプチドワクチン（ＩＭＡ９０１）のｓｂＣＰＡ（３００ｍｇ／ｍ２、ワクチンの３日前）との組合せを試験した（Walter, Weinschenk et al. 2012）。２群第ＩＩ相研究（ｎ＝６８）は、ワクチンをｓｂＣＰＡ処置有り無しで比較した。彼らは、ｓｂＣＰＡ／ワクチンの組合せで処置した群内の免疫応答者が、同じ群の非応答者よりも、さらにまたワクチン単独で処置した群よりも生存期間が改善したことを報告した。それでもｓｂＣＰＡ処置には、ワクチンの免疫原性に対する、測定可能な効果はなかった。
【００８７】
要約すると、ＣＰＡは、ワクチン接種前の低用量での単回静脈注入として、およびワクチン接種後に開始した低用量での規則正しい経口療法としてのいずれでも、ワクチンと組み合わせて臨床試験で試験されてきた。これらの試験からは矛盾した諸結果が得られ、ワクチン活性を増強する目的で低用量ＣＰＡを使用することの、決定的かつ広く適用可能な利点は示されなかった。
【００８８】
現在までのところ出願人らの知る限り、ワクチン接種前に低用量のＣＰＡを単回投与するか、または低用量のＣＰＡを複数回投与するかについて、それぞれの利点が臨床試験において直接比較されたことはない。本発明者らは、本発明者らのマルチペプチドに基づくサバイビンワクチン（同一の試験で、ＣＰＡ非含有ワクチンに対して試験した）をがん患者にワクチン接種する前に、ＣＰＡを反復投与するステップを含む本発明の方法により得られた結果を、複数ペプチドに基づく異なる２つのワクチン、ＭＥＬＩＴＡＣ１２．１およびＭＥＬＩＴＡＣ１２．６（いずれも同一の試験で、ＣＰＡ非含有ワクチンに対して試験した）によるワクチン接種の前に、低用量のＣＰＡを単回投与することによって、Slingluff et al. (2011)によりがん患者において達成された結果と比較した。
【００８９】
ＥＬＩＳＰＯＴの結果に基づくと、ＣＰＡ前処置なしの場合、サバイビンペプチドワクチンならびに黒色腫ワクチンのＭＥＬＩＴＡＣ１２．１およびＭＥＬＩＴＡＣ１２．６は全てほぼ同等な免疫原性の強さを有していた。ＭＥＬＩＴＡＣ１２．１単独およびＭＥＬＩＴＡＣ１２．６単独による３回までのワクチン接種によって生じた免疫応答は、１００，０００個のＣＤ８＋Ｔ細胞あたり、ＭＥＬＩＴＡＣ１２．１では０〜１０９５スポット、ＭＥＬＩＴＡＣ１２．６では０〜７００スポットの範囲だった。これに比べて、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ単独のワクチン接種を３回まで施していた患者のＥＬＩＳＰＯＴ値は、１，０００，０００個のＰＢＭＣあたりのスポット数から１００，０００個のＣＤ８＋Ｔ細胞あたりのスポット数に値を変換すると、１００，０００個のＣＤ８＋Ｔ細胞あたり０〜２９１スポットの範囲内であった。患者のＰＢＭＣ中のＴ細胞計測数は、フローサイトメトリーによって決定し、本明細書に示すデータは、ＭＥＬＩＴＡＣワクチンによって得られた結果と直接比較するために、１００，０００個のＣＤ８＋Ｔ細胞あたりのスポット数に変換した。
【００９０】
これと比較して、ＭＥＬＩＴＡＣ１２．１およびＭＥＬＩＴＡＣ１２．６を、ワクチンの前に低用量のＣＰＡを単回投与することと組み合わせると、ＭＥＬＩＴＡＣ１２．１およびＭＥＬＩＴＡＣ１２．６でそれぞれ、０〜１０９５および０〜７００の範囲の免疫応答が生じた。このように、ＭＥＬＩＴＡＣ１２．１およびＭＥＬＩＴＡＣ１２．６の前に低用量のＣＰＡを単回投与することによって生じた免疫応答は、ワクチン単独に比べ本質的に変わらなかった。
【００９１】
対照的に、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃによるワクチン接種の前にＣＰＡを複数回投与した患者では、１００，０００個のＣＤ８＋Ｔ細胞あたり０〜８４６７スポットの範囲のＥＬＩＳＰＯＴ応答が生じた。ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃによるワクチン接種の前にＣＰＡを反復投与した後に、免疫応答がこのように顕著に増加した（０〜８４６７対０〜２９１）ことから、ワクチン接種前に低用量のシクロホスファミドを反復投与して前処置すると、ワクチン接種前に低用量のシクロホスファミドを単回投与するよりも、ワクチンによる免疫応答を増強するのに有利であることが示される。
【００９２】
ワクチン組成物
本明細書で使用される「ワクチン」、「ワクチン組成物」または「組成物」という用語は、互換的に使用されることがある。
【００９３】
ＤＮＡ複製を妨げる薬剤と共に使用するための、本発明のワクチン組成物は、サバイビン抗原を対象に送達するのに適したいかなる形態でもよい。本発明によるワクチン組成物は、１つまたは複数のサバイビン抗原を、１つまたは複数の薬学的に許容される添加剤または担体、好ましくはヒトへの投与で許容される添加剤または担体と混合するなどの、既知の方法によって製剤化できる。このような添加剤、担体および製剤方法の例は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co, Easton, PA)中に見出すことができる。効果的に投与するのに適した、薬学的に許容されるワクチン組成物を製剤化するために、このような組成物は通常、本明細書に記載するサバイビンポリペプチド、サバイビンペプチドもしくはサバイビンペプチド変異体などのサバイビン抗原、またはこのようなサバイビン抗原をコードする核酸分子またはベクターを治療有効量、含有するはずである。
【００９４】
本発明によるワクチン組成物は治療有効量（a therapeutically effect amount）で対象に投与することができる。本明細書で使用される「治療有効量」とは、がんもしくはがんの症状を処置、防止、軽減もしくは寛解する；処置している対象の生存期間を延長する；かつ／または細胞障害性Ｔ細胞応答などの、対象の免疫応答を刺激、誘導もしくは増強するのに効果的な、ワクチンまたは有効成分（例えば、１つまたは複数のサバイビン抗原）の量を意味する。一部の実施形態では、ワクチンの治療有効量とは、がんの処置において対象の臨床応答を誘導できる量のことである。ワクチンの治療有効量の決定は、当分野の技術者の能力であれば、特に本明細書に提供する開示内容を考慮しつつ、十分に実現することができる。治療有効量は、対象の状態、体重、性別および年齢などの因子に応じて変更してもよい。
【００９５】
１つまたは複数の適切なサバイビン抗原を、本発明によるワクチン組成物に含めるために選択したなら、前記抗原は、当技術分野で知られる適切な様々な手段によって送達することができる。本明細書に記載する方法で使用するためのワクチン組成物には、それだけに限らないが例えば、リポペプチド（例えば、Vitiello, A. et al., J. Clin. Invest. 95:341, 1995）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）微小球内に封入したペプチド組成物（例えば、Eldridge, et al.,Molec. Immunol. 28:287-294, 1991：Alonso et al., Vaccine 12:299-306, 1994；Jones et al., Vaccine 13:675-681, 1995を参照されたい）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）に含有されるペプチド組成物（例えば、Takahashi et al., Nature 344:873-875, 1990；Hu et al.,Clin Exp Immunol. 113:235-243, 1998を参照されたい）、多重抗原ペプチドシステム（ＭＡＰｓ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ）（例えば、Tam, J. P., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5409-5413, 1988；Tam, J. P., J. Immunol. Methods 196:17-32, 1996を参照されたい）、多価ペプチドとして製剤化したペプチド；弾道送達システム（ballistic delivery system）で使用するためのペプチド、典型的には結晶化ペプチド、ウイルス送達ベクター（Perkus, M. E. et al., In: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E., ed., p. 379, 1996；Chakrabarti, S. et al., Nature 320:535, 1986；Hu, S. L. et al., Nature 320:537, 1986；Kieny, M.-P. et al., AIDS Bio/Technology 4:790, 1986；Top, F. H. et al., J. Infect. Dis. 124:148, 1971；Chanda, P. K. et al., Virology 175:535, 1990）、ウイルスもしくは合成起源の粒子（例えば、Kofler, N. et al., J. Immunol. Methods. 192:25, 1996；Eldridge, J. H. et al., Sem. Hematol. 30:16, 1993；Falo, L. D., Jr. et al., Nature Med. 7:649, 1995）、アジュバント（Warren, H. S., Vogel, F. R., and Chedid, L. A. Annu. Rev. Immunol. 4:369,1986；Gupta, R. K. et al., Vaccine 11:293, 1993）、リポソーム（Reddy, R. et al, J. Immunol. 148:1585, 1992；Rock, K. L., Immunol. Today 17:131, 1996）、または裸のもしくは粒子に吸着させたｃＤＮＡ（Ulmer, J. B. et al., Science 259:1745, 1993；Robinson, H. L., Hunt, L. A., and Webster, R. G., Vaccine 11:957, 1993；Shiver, J. W. et al., In: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E., ed., p. 423, 1996；Cease, K. B., and Berzofsky, J. A., Annu. Rev. Immunol. 12:923, 1994およびEldridge, J. H. et al., Sem. Hematol. 30:16, 1993）が含まれる。
【００９６】
本発明のワクチン組成物は、核酸により媒介される療法も包含する。例えば、本明細書に記載する１つまたは複数のサバイビン抗原をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを、対象に投与してもよい。このようなアプローチは例えば、Wolff et al., Science 247:1465 (1990)ならびに米国特許第５，５８０，８５９号；第５，５８９，４６６号；第５，８０４，５６６号；第５，７３９，１１８号；第５，７３６，５２４号；第５，６７９，６４７号；およびＷＯ９８／０４７２０に記載されている。ＤＮＡに基づく送達技術の例としては、「裸のＤＮＡ」、促進された（ブピビカイン（bupivicaine）、ポリマー、ペプチドにより媒介される）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子により媒介される（「遺伝子銃」）または圧力により媒介される送達（例えば、米国特許第５，９２２，６８７号を参照されたい）が挙げられる。
【００９７】
ワクチン組成物のさらなる実施形態では、サバイビン抗原（例えば、サバイビンペプチド）を、ウイルスベクターまたは細菌ベクターによって発現させることもできる。発現ベクターの例としては、ワクシニアまたは鶏痘などの弱毒化ウイルス宿主が挙げられる。このアプローチは、例えば本明細書に記載するサバイビンペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するベクターとしての、ワクシニアウイルスの使用を伴う。急性もしくは慢性感染宿主または非感染宿主に導入すると、組換えワクシニアウイルスは抗原性ペプチドを発現し、これにより宿主免疫応答を誘発する。免疫プロトコールに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌（Bacille Calmette Guerin））である。ＢＣＧベクターはStover et al., Nature 351:456-460 (1991)に記載されている。本発明のペプチドによる治療的投与または免疫化のために有用な、他の多種多様なベクター、例えばアデノウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、サルモネラ・チフス（Salmonella typhi）ベクターおよび無毒化炭疽毒素ベクターなどは、当分野の技術者にとっては明白なはずであり、本明細書に記載するワクチン組成物に包含される。
【００９８】
本発明によるワクチンは、１つまたは複数のサバイビン抗原を含有する組成物も包含し、ここで前記抗原は、個別に提示しても、または同じもしくは異なるサバイビン抗原を複数コピー含有する構築物として提示してよい。例えばサバイビン抗原を、同じまたは異なる数個のサバイビン抗原をコードする単一の核酸分子（例えば、ベクター）として提示することができる。または他の実施形態では、同じサバイビン抗原を複数コピー含むホモポリマー、もしくは異なる様々なサバイビン抗原のヘテロポリマーを使用してもよい。このようなポリマーは、免疫学的反応の増加をもたらすという利点を有する可能性がある。これは、生じる効果が、サバイビンの抗原決定基の１つまたは複数に対する免疫応答を誘導する能力の増強となり得るように、前記ポリマーがサバイビン抗原を複数コピー含むからである。前記組成物は、１つもしくは複数のサバイビン抗原の天然に存する領域を含むことも、または例えば組換えもしくは化学合成によって、調製した抗原を含むこともある。
【００９９】
本発明のワクチンは、樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、１つまたは複数のサバイビン抗原（例えば、サバイビンペプチド）を提示するためのビヒクルとして含むこともできる。このようなワクチン組成物は、樹状細胞の動員および回収の後に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製することができ、樹状細胞への負荷はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う。例えば、樹状細胞に、１つまたは複数のサバイビン抗原をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡをトランスフェクションするか、またはサバイビンペプチド抗原をパルス状に添加する。次いで樹状細胞を対象に投与して、ｉｎ  ｖｉｖｏで免疫応答を誘発することができる。
【０１００】
本発明のワクチンは、任意の適切な手段、例えば注射（例えば、筋肉内、皮内、皮下、静脈内または腹腔内に）、エアロゾル、経口、経鼻、局所、腟内、経皮、経粘膜、または他の任意の適切な経路などによって投与することができる。ワクチンを、対象の身体内で全身に、または局所に分布させるために製剤化することができる。全身性製剤には、注射による投与のために設計された全身性製剤、および経皮、経粘膜または経口投与のために設計された全身性製剤が含まれる。
【０１０１】
注射用にはワクチンを、油中水型乳剤またはオイルに基づく担体など、本明細書に記載する疎水性物質の連続相を含む担体中に製剤化してもよい。一部の実施形態では、リポソームを担体と共に使用してもよい。ワクチンはまた、ハンクス液、リンゲル液または生理食塩緩衝液などの水溶液として製剤化してもよい。
【０１０２】
上記から明らかであろうように、本発明のワクチン組成物は、投与すると、特異的な細胞障害性Ｔ細胞応答などの対象の免疫応答を刺激することができる組成物を含めた、がんの処置に有用なあらゆる組成物または抗原送達手段（例えば、ウイルスベクター）を包含することを意図するものである。
【０１０３】
本発明のワクチン組成物を得るためには、アジュバント、添加剤、界面活性剤、免疫刺激成分（immunostimulatory component）および／または担体など種々の物質とサバイビン抗原、これは比較的小さなサバイビンペプチドであってもよい、を組み合わせるのが適切なことがある。アジュバントをワクチン組成物に含めて、特異的な免疫応答を増強してもよい。所望の投与経路、または対象における所望の分布、例えば全身かまたは局所か、に応じて異なる担体を使用することがある。
【０１０４】
特定の実施形態では、本発明の方法に使用するためのワクチンは、少なくとも１つのサバイビン抗原と、リポソームと、疎水性物質の連続相を含む担体とを含む組成物である。さらなる実施形態では、組成物は追加としてアジュバントを含むことがある。さらなる実施形態では、組成物は追加としてＴヘルパーエピトープまたは抗原を含むことがある。
【０１０５】
したがって一実施形態では、ワクチン組成物は、１つまたは複数のサバイビン抗原；Ｔヘルパーエピトープ；アジュバント；リポソーム；および疎水性物質の連続相を含む担体を含む。Ｔヘルパーエピトープは例えば、アミノ酸配列AQYIKANSKFIGITEL（配列番号９）を含むペプチドであってよい。アジュバントは例えばポリＩ：Ｃポリヌクレオチドであってよい。
【０１０６】
さらなる実施形態では、本発明の方法に使用するためのワクチンは、少なくとも１つのサバイビン抗原を、リポソームに基づく、および／または両親媒性化合物に基づくＩｍｍｕｎｏｖａｃｃｉｎｅ，Ｉｎｃのワクチンアジュバント適用プラットフォーム（vaccine adjuvanting platform）、これにはＶａｃｃｉＭａｘ（登録商標）およびＤｅｐｏＶａｘ（商標）プラットフォーム技術が含まれるがそれらだけに限らない、と共に含む組成物である（例えば、米国特許第６，７９３，９２３号および第７，８２４，６８６号；ＷＯ２００２／０３８１７５；ＷＯ２００７／０４１８３２；ＷＯ２００９／０３９６２８；ＷＯ２００９／０４３１６５およびＷＯ２００９／１４６５２３を参照されたい）。ＤｅｐｏＶａｘ（商標）プラットフォームは、抗原およびアジュバントを、制御し、かつ長期に渡って免疫系に曝露することをもたらすワクチン送達製剤である。このプラットフォームは、強く、特異的で持続性のある免疫応答を可能にし、単回投与有効性を可能にする。
【０１０７】
さらなる実施形態では、本発明のワクチンは、アミノ酸配列：FEELTLGEF（配列番号１）；FTELTLGEF（配列番号２）；LTLGEFLKL（配列番号３）；LMLGEFLKL（配列番号４）；RISTFKNWPF（配列番号５）；RISTFKNWPK（配列番号６）；STFKNWPFL（配列番号７）；およびLPPAWQPFL（配列番号８）を有する１つまたは複数のサバイビンペプチド抗原を含む、上述した任意の適切な組成物である。
【０１０８】
さらなる実施形態では、ワクチン組成物は、アミノ酸配列：FTELTLGEF（配列番号２）、LMLGEFLKL（配列番号４）、RISTFKNWPK（配列番号６）、STFKNWPFL（配列番号７）、およびLPPAWQPFL（配列番号８）を含む５つのペプチド抗原；Ｔヘルパーエピトープ；アジュバント；リポソーム；ならびに疎水性物質の連続相を含む担体を含む。Ｔヘルパーエピトープは例えば、アミノ酸配列AQYIKANSKFIGITEL（配列番号９）を含むペプチドであってよい。アジュバントは例えば、ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドであってよい。リポソームは例えば、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ；合成リン脂質）およびコレステロールで構成されていてよい。疎水性担体は例えば、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ５１ＶＧであってよい。
【０１０９】
特定の実施形態では、本発明のワクチンは、Ｉｍｍｕｎｏｖａｃｃｉｎｅ，Ｉｎｃの抗がん免疫療法ワクチン候補のＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃであってよい。ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃは、アミノ酸配列：FTELTLGEF（配列番号２）、LMLGEFLKL（配列番号４）、RISTFKNWPK（配列番号６）、STFKNWPFL（配列番号７）、およびLPPAWQPFL（配列番号８）を有する５つの合成サバイビンペプチド抗原；破傷風トキソイド由来のユニバーサルＴヘルパーエピトープ（AQYIKANSKFIGITEL；配列番号９）；ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドアジュバント；ＤＯＰＣおよびコレステロールからなるリポソーム；ならびに疎水性担体Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ５１ＶＧを含む。各成分の例示的な量（ワクチン１ｍｌあたり）としては、それだけに限らないが、各サバイビン抗原を１．０ｍｇ；Ｔヘルパーエピトープ（例えば、配列番号９）を０．５ｍｇ；アジュバント（例えば、ポリＩ：Ｃポリヌクレオチド）を０．４ｍｇ；合成ＤＯＰＣリン脂質を１２０．０ｍｇ；コレステロールを１２．０ｍｇ；および疎水性担体（例えば、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ５１ＶＧ）を０．７ｍｌが挙げられる。
【０１１０】
ワクチンは、任意選択で追加の成分、例えば乳化剤などをさらに含むことがある。ワクチンおよびその諸成分の例示的な実施形態のより詳細な開示を、以下に記載する。
【０１１１】
（ｉ）サバイビン抗原
本発明のワクチン組成物は、少なくとも１つのサバイビン抗原を含む。「少なくとも１つ」という表現は、本明細書では「１つまたは複数」という表現と互換的に使用される。これらの表現は、本明細書に明示的に別段の指定がない限り、ワクチン中の異なるサバイビン抗原の数を指すのであって、いずれか特定のサバイビン抗原の量を指すのではない。「少なくとも１つ」または「１つまたは複数」の通常の意味のとおり、本発明のワクチン組成物は、最低１つのサバイビン抗原を含有する。
【０１１２】
反復を含むバキュロウイルスのアポトーシス阻害因子５（ＢＩＲＣ５：ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｒｅｐｅａｔ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ５）とも称するサバイビンは、アポトーシスの負の制御に関与するタンパク質である。サバイビンは、アポトーシス阻害タンパク質（ＩＡＰ）ファミリーの一員に分類されている。サバイビンは、単一のＢＩＲモチーフを含み、かつリングフィンガーの代わりに、強く電荷を帯びたカルボキシ末端のコイル領域を含む、１６．５ｋＤａの細胞質タンパク質である。サバイビンをコードする遺伝子は、エフェクター細胞プロテアーゼ受容体−１（ＥＰＲ−１）の配列とほぼ同一だが、配向が逆向きである。サバイビン（ホモ・サピエンス（homo sapiens））のコード配列は、終止コドンを含めて４２９ヌクレオチドの長さである（配列番号１０）。コードされるタンパク質のサバイビン（ホモ・サピエンス（homo sapiens））は１４２アミノ酸の長さである（配列番号１１）。
【０１１３】
サバイビンタンパク質は、カスパーゼの活性化を阻害することで機能し、これによってアポトーシスの負の制御またはプログラム細胞死をもたらすと仮定される。この機能と整合することには、サバイビンは、多くの型のがんで例外なく上方制御されており、しかし正常組織では上方制御されていない上位の遺伝子の１つとして特定されている（例えば、Altieri et al., Lab Invest, 79: 1327-1333, 1999；および米国特許第６，２４５，５２３号を参照されたい）。したがってこの事実から、がん細胞は標的とされ、一方、正常細胞は標的にならないため、サバイビンはがん治療の理想的な標的となる。実際、サバイビンは、ヒトがんの大部分を含めた多くの腫瘍型で高発現し、その予後的重要性が報告されている。
【０１１４】
本発明のワクチンは、１つまたは複数のサバイビン抗原を含む。本明細書で使用されるとおり、「サバイビン抗原」という用語は、サバイビンタンパク質またはその断片に由来するあらゆるペプチド、ポリペプチドまたはその変異体（例えば、サバイビンペプチド変異体）を包含する。「サバイビン抗原」という用語は、本明細書に記載するサバイビンペプチド、サバイビンペプチド変異体またはサバイビンペプチドの機能的等価物をコードするポリヌクレオチドも包含する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）もしくはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはそれらの組合せであってよい。ポリヌクレオチドは天然に存することも、または合成（例えば、化学合成）されたものであることもある。ポリヌクレオチドに、ヌクレオチド鎖中の１つまたは複数の窒素塩基、ペントース糖またはリン酸基の修飾を含める可能性も検討される。このような修飾は当技術分野ではよく知られており、例えばポリヌクレオチドの安定性を向上させることなどを目的とすることがある。
【０１１５】
一実施形態では、サバイビン抗原は、全長サバイビンポリペプチド、または全長サバイビンポリペプチドをコードする核酸を含むことがある。代わりにサバイビン抗原は、サバイビンタンパク質の任意の長さの断片を含むサバイビンペプチドであることもある。例示的な実施形態としては、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸残基を含むサバイビンペプチドが挙げられる。特定の実施形態では、サバイビンペプチドは、サバイビンタンパク質（例えば、配列番号１１）の連続した７、８、９、１０、１１アミノ酸残基からそれぞれなるヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチドまたはウンデカペプチドからなる。サバイビン抗原の特定の実施形態には、約９または１０アミノ酸のサバイビンペプチドが含まれる。
【０１１６】
本発明のサバイビン抗原は、サバイビンペプチドの変異体および機能的等価物も包含する。サバイビンペプチドの変異体または機能的等価物は、サバイビンタンパク質特有の配列に比べ、１つもしくは複数のアミノ酸置換、欠失もしくは付加（addition）またはそれらの任意の組合せなどの差異があるアミノ酸配列を呈するペプチドを包含する。その差異は、サバイビンタンパク質配列と、サバイビンペプチド変異体またはサバイビンペプチドの機能的等価物との間での、同一性の低下として測定することができる。
【０１１７】
アミノ酸配列間の同一性は、当技術分野でよく知られたアルゴリズムを使用して計算できる。サバイビンペプチド変異体または機能的等価物は、好ましくは、その全長に渡って、サバイビンタンパク質のペプチド配列と少なくとも７０％同一、例えば、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一、これにはサバイビンタンパク質のペプチド配列と９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合が含まれる、であるならば、本発明の「サバイビン抗原」の意味の範囲内と考えるべきである。特定の実施形態では、サバイビンペプチド変異体は、配列番号１１の連続したアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な配列を有する。
【０１１８】
サバイビン抗原の由来源になり得るサバイビンタンパク質は、そのタンパク質が発現している、任意の動物種由来のサバイビンタンパク質である。ある特定の実施形態は、ヒト（配列番号１１）由来のサバイビンタンパク質である。サバイビン抗原は、選択されたサバイビンタンパク質の配列に基づき、サバイビンタンパク質またはコードする核酸に、任意の適切な化学処理または酵素処理を施すことによって派生させることができる。代わりにサバイビン抗原は、当業者の熟知している、慣用のいかなるペプチドまたは核酸合成法によって合成してもよい。
【０１１９】
本発明のサバイビン抗原（ペプチドまたは核酸）は、サバイビンの天然配列である配列を有する。代わりにサバイビン抗原は、１つまたは複数の置換、欠失または追加によって改変されたペプチドまたは核酸配列、例えば、本明細書に記載するサバイビンペプチド変異体または機能的等価物であってもよい。ペプチドの免疫原性を増加させる、サバイビンペプチドの例示的な手法および改変としては例えば、ＨＬＡクラスＩ分子へのペプチドの結合を増加させる、アンカー部位に導入されたアミノ酸置換を伴った、ＷＯ２００４／０６７０２３に記載されている手法および改変が挙げられる。
【０１２０】
一実施形態では、サバイビン抗原は、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ分子に結合できる、サバイビンタンパク質に由来する任意のペプチドまたはその任意のサバイビンペプチド変異体である。これらの方針では、サバイビン抗原は、対象の免疫応答を誘導または賦活できる任意のサバイビンペプチドまたはそのサバイビンペプチド変異体であってよい。
【０１２１】
一実施形態では、サバイビン抗原は、対象に細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘発することのできるサバイビンタンパク質（配列番号１１）由来のアミノ酸配列を含むペプチド抗原であるか、または前記ペプチドをコードする核酸分子である。
【０１２２】
一実施形態では、ワクチンは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列などのサバイビンタンパク質のアミノ酸配列に基づいた、１つまたは複数の合成サバイビンペプチドまたはその変異体を含む。
【０１２３】
サバイビンペプチド、サバイビンペプチド変異体およびサバイビンの機能的等価物、ならびに診断および治療目的でのその使用、詳細にはがんにおけるその使用は、例えばＷＯ２００４／０６７０２３およびＷＯ２００６／０８１８２６などに記載されている。これらの刊行物に開示されている新規ペプチドは、がん患者に細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘発することができることが見出された。特に、ＷＯ２００４／０６７０２３では、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ分子に結合でき、これにより、広範ながん疾患を患う患者に、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｓｉｔｕの両方のＣＴＬ免疫応答を誘発するＭＨＣクラスＩ限定ペプチドを、サバイビンタンパク質から派生させることができることが見出された。
【０１２４】
一実施形態では、本発明のワクチンは、ＷＯ２００４／０６７０２３およびＷＯ２００６／０８１８２６に開示されている任意の１つまたは複数のサバイビンペプチド、サバイビンペプチド変異体またはサバイビンペプチドの機能的等価物を含み得る。
【０１２５】
別の実施形態では、本発明のワクチンは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−Ｃ分子から選択される任意のＭＨＣクラスＩ分子に結合する能力を有する、１つまたは複数のサバイビンペプチド、サバイビンペプチド変異体またはサバイビンペプチドの機能的等価物を含み得る。
【０１２６】
サバイビンペプチド、サバイビンペプチド変異体またはサバイビンペプチドの機能的等価物が結合し得る、例示的なＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ分子としては、それだけに限らないが、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ９、ＨＬＡ−Ａ１０、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ１９、ＨＬＡ−Ａ２３、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ２５、ＨＬＡ−Ａ２６、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ２９、ＨＬＡ−Ａ３０、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３２、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ａ３４、ＨＬＡ−Ａ３６、ＨＬＡ−Ａ４３、ＨＬＡ−Ａ６６、ＨＬＡ−Ａ６８、およびＨＬＡ−Ａ６９が挙げられる。
【０１２７】
サバイビンペプチド、サバイビンペプチド変異体またはサバイビンペプチドの機能的等価物が結合し得る、例示的なＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ｂ分子としては、それだけに限らないが、ＨＬＡ−Ｂ５、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ１２、ＨＬＡ−Ｂ１３、ＨＬＡ−Ｂ１４、ＨＬＡ−Ｂ１５、ＨＬＡ−Ｂ１６、ＨＬＡ−Ｂ１７、ＨＬＡ−Ｂ１８、ＨＬＡ−Ｂ２１、ＨＬＡ−Ｂ２２、ＨＬＡ−Ｂ２７、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ３７、ＨＬＡ−Ｂ３８、ＨＬＡ−Ｂ３９、ＨＬＡ−Ｂ４０、ＨＬＡ−Ｂ４１、ＨＬＡ−Ｂ４２、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ４５、ＨＬＡ−Ｂ４６およびＨＬＡ−Ｂ４７が挙げられる。
【０１２８】
サバイビンペプチド、サバイビンペプチド変異体またはサバイビンペプチドの機能的等価物が結合し得る、例示的なＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ｃ分子としては、それだけに限らないが、ＨＬＡ−Ｃ１、ＨＬＡ−Ｃ２、ＨＬＡ−Ｃ３、ＨＬＡ−Ｃ４、ＨＬＡ−Ｃ５、ＨＬＡ−Ｃ６、ＨＬＡ−Ｃ７およびＨＬＡ−Ｃ１６が挙げられる。
【０１２９】
特定の実施形態では、本発明のワクチンは、以下から選択される１つまたは複数のサバイビンペプチド抗原を含み得る：
ｉ）  FEELTLGEF（配列番号１）          ［ＨＬＡ−Ａ１］
ｉｉ）  FTELTLGEF（配列番号２）        ［ＨＬＡ−Ａ１］
ｉｉｉ）  LTLGEFLKL（配列番号３）      ［ＨＬＡ−Ａ２］
ｉｖ）  LMLGEFLKL（配列番号４）        ［ＨＬＡ−Ａ２］
ｖ）  RISTFKNWPF（配列番号５）          ［ＨＬＡ−Ａ３］
ｖｉ）  RISTFKNWPK（配列番号６）        ［ＨＬＡ−Ａ３］
ｖｉｉ）  STFKNWPFL（配列番号７）      ［ＨＬＡ−Ａ２４］
ｖｉｉｉ）  LPPAWQPFL（配列番号８）    ［ＨＬＡ−Ｂ７］
【０１３０】
これらだけには限定されないものの、上に列挙したサバイビンペプチドは、本発明に包含される例示的なＭＨＣクラスＩ限定ペプチドとなる。各サバイビンペプチドが結合すると考えられている、特定のＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ分子を、右の角括弧内に示す。本発明のワクチンは、これらのサバイビンペプチドのうち１つまたは複数を、任意の適切な組合せで含み得る。
【０１３１】
さらなる実施形態では、本発明のワクチンは、以下に列挙する５つのサバイビンペプチドのうち任意の１つまたは複数を、任意の適切な組合せで含む：
ｉ）  FTELTLGEF（配列番号２）          ［ＨＬＡ−Ａ１］
ｉｉ）  LMLGEFLKL（配列番号４）        ［ＨＬＡ−Ａ２］
ｉｉｉ）  RISTFKNWPK（配列番号６）      ［ＨＬＡ−Ａ３］
ｉｖ）  STFKNWPFL（配列番号７）        ［ＨＬＡ−Ａ２４］
ｖ）  LPPAWQPFL（配列番号８）          ［ＨＬＡ−Ｂ７］
【０１３２】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、Ｉｍｍｕｎｏｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｎｃの組成物に見られるように、上に列挙した５つ全てのサバイビンペプチド抗原を含むか、またはペプチド抗原の任意の組合せ、もしくは１つもしくは複数を含む。好ましい実施形態では、組成物は、抗がん免疫療法ワクチン候補のＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃである５つ全てのサバイビンペプチド抗原を含む。
【０１３３】
少なくとも１つのサバイビン抗原に加えて、本発明のワクチンのさらなる実施形態は、がんの処置に有用な、またはがんに対する免疫応答を誘導もしくは賦活するのに有用な１つまたは複数の追加の抗原を含み得る。このような追加の抗原の例示的な実施形態を、以下に記載する。
【０１３４】
（ｉｉ）さらなる抗原
本発明の組成物において有用であり得る他の抗原には、限定されないが、がんの処置において有益である、対象において免疫応答を、例えば細胞媒介性免疫応答を誘導しまたは強化する能力がある抗原が含まれる。
【０１３５】
細胞媒介性免疫とは、抗体とは関係せず、それよりもマクロファージおよびナチュラルキラー細胞の活性化、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の産生ならびに抗原に応答した様々なサイトカインの放出と関係している免疫応答である。細胞傷害性Ｔリンパ球は、感染体細胞または腫瘍細胞の死を誘導することのできるＴリンパ球のサブグループ（白血球の一種）であり、すなわち、細胞傷害性Ｔリンパ球は、ウイルス（または他の病原体）に感染した細胞を、またはそうでなければ、障害を受けたか、もしくは機能障害にある細胞を死滅させる。
【０１３６】
ほとんどの細胞傷害性Ｔ細胞は、クラスＩＭＨＣ分子に結合する特異的ペプチド抗原を認識することができるＴ細胞受容体を発現する。このようなＣＴＬはＣＤ８（ＣＤ８＋Ｔ細胞）も発現し、このＣＤ８はクラスＩＭＨＣ分子の一部分に誘引される。この親和性により、抗原特異的活性化の間、ＣＴＬと標的細胞との互いの密接な結合が保たれる。
【０１３７】
細胞性免疫は、例えば、ウイルス感染細胞、細胞内細菌を有する細胞、および腫瘍抗原を提示するがん細胞などの、外来抗原のエピトープをその表面に提示する体細胞を溶解する能力のある抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化すること；マクロファージおよびナチュラルキラー細胞を活性化して、それらが細胞内病原体を破壊できるようにすること；および細胞を刺激して、適応免疫応答および自然免疫応答に関与するその他の細胞の機能に影響を及ぼす多様なサイトカインを分泌することにより、身体を保護している。
【０１３８】
したがって、さらなる実施形態では、本発明のワクチン組成物は、１つまたは複数のサバイビン抗原に加えてさらなる抗原を含むことができる。例えば、さらなる抗原は、限定されないが、ペプチド、適切な天然の、非天然の、組換えのもしくは変性タンパク質またはポリペプチド、またはそれらの断片、あるいは、対象においてＣＴＬ免疫応答を誘導しまたは強化する能力があるエピトープであってもよい。
【０１３９】
さらなる抗原はまた、抗原として機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい。核酸に基づくワクチン接種戦略は公知であり、ポリヌクレオチドを含有するワクチン組成物が対象に投与される。ポリヌクレオチドによってコードされる抗原性ポリペプチドは、抗原性ポリペプチドが最終的に対象に存在するように、ワクチン組成物自体がポリペプチドを含有していたかのように、対象で発現する。本発明の目的において、さらなる抗原は、文脈から示されている場合、抗原として機能するポリペプチドをコードするそのようなポリヌクレオチドを包含する。
【０１４０】
用語「ポリペプチド」は、長さ（例えば、少なくとも６、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０アミノ酸）または翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に関係なくアミノ酸の任意の鎖を包含し、例えば、天然のタンパク質、合成または組換えポリペプチドおよびペプチド、エピトープ、ハイブリッド分子、変異体、同族体、類似体、ペプトイド、ペプチド様物質などを含む。したがって、変異体または誘導体には、切断物および断片を含む欠失；挿入および付加、例えば保存的置換、部位特異的突然変異体および対立遺伝子の変異体；ならびに、ペプチドに共有結合する１つまたは複数の非アミノアシル基（例えば、糖、脂質など）を有するペプトイドおよび翻訳後修飾を含めて、改変が含まれる。本明細書で使用するように、用語「保存されたアミノ酸置換」または「保存的置換」とは、ペプチドの所与の位置での１つのアミノ酸の別のものへの置換を指し、この置換は関連する機能を実質的に消失せずに行なわれ得る。そのような変更を行うことにおいて、類似のアミノ酸残基の置換は、側鎖置換基の相対的類似性、例えばそれらのサイズ、電荷、疎水性、親水性などに基づいて行うことができ、そのような置換は、ペプチドの機能に及ぼすそれらの影響について通常の試験によってアッセイすることができる。保存的置換の具体的な非限定例には、以下の例が含まれる。
元の残基    保存的置換
Ａｌａ      Ｓｅｒ
Ａｒｇ      Ｌｙｓ
Ａｓｎ      Ｇｌｎ、Ｈｉｓ
Ａｓｐ      Ｇｌｕ
Ｃｙｓ      Ｓｅｒ
Ｇｌｎ      Ａｓｎ
Ｇｌｕ      Ａｓｐ
Ｈｉｓ      Ａｓｎ；Ｇｌｎ
Ｉｌｅ      Ｌｅｕ、Ｖａｌ
Ｌｅｕ      Ｉｌｅ；Ｖａｌ
Ｌｙｓ      Ａｒｇ；Ｇｌｎ；Ｇｌｕ
Ｍｅｔ      Ｌｅｕ；Ｉｌｅ
Ｐｈｅ      Ｍｅｔ；Ｌｅｕ；Ｔｙｒ
Ｓｅｒ      Ｔｈｒ
Ｔｈｒ      Ｓｅｒ
Ｔｒｐ      Ｔｙｒ
Ｔｙｒ      Ｔｒｐ；Ｐｈｅ
Ｖａｌ      Ｉｌｅ；Ｌｅｕ
【０１４１】
好ましい抗原配列と実質的な同一性を有するポリペプチドまたはペプチドを使用することができる。最適に整列させる（ギャップを許容する）ときに、それらが少なくとも約５０％の配列同一性を共有するか、それらの配列が規定の機能的モチーフを共有するならば、２つの配列は実質的な同一性を有するとみなされる。代替の実施形態では、最適に整列させた配列は、それらが特定の領域において少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有するならば、実質的に同一である（すなわち、実質的な同一性を有する）とみなすことができる。用語「同一性」とは、２つのポリペプチド分子の間の配列類似性を指す。同一性は、整列させた配列中の各位置を比較することによって決定することができる。アミノ酸配列間の同一性の程度は、例えば特定領域における、配列によって共有される位置での同一であるか一致するアミノ酸の数の関数である。同一性の比較のための配列の最適アラインメントは、http://clustalw.genome.ad.jpで入手できるＣｌｕｓｔａｌＷプログラム、Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math 2: 482のローカルホモロジーアルゴリズム、Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443のホモロジーアラインメントアルゴリズム、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性検索法を含めて、当分野で公知である様々なアルゴリズム、およびこれらのアルゴリズムのコンピュータでの実施（例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用して実行することができる。配列同一性は、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-10（公表されたデフォルト設定を使用する）に記載される、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して決定することもできる。例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して（インターネットサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST/bl2seq/wblast2.cgiを通して）入手できる「ＢＬＡＳＴ２配列」ツールを、以下のデフォルト設定で「ｂｌａｓｔｐ」プログラムを選択して使用することができる：予想閾値１０；ワードサイズ３；マトリックスＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト存在１１、エクステンション１。別の実施形態では、当業者は、所与の任意の配列を容易におよび適切に整列させ、単なる目視検査によって配列同一性および／または相同性を推測することができる。
【０１４２】
本発明のワクチンにおいてさらなる抗原として使用されるポリペプチドおよびペプチドは、天然源から単離されたものであってもよいし、合成されたものであってもよいし、または組換えによって作製されたポリペプチドであってもよい。ペプチドおよびタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで組換えによって発現させることができる。本発明を実行するために使用されるペプチドおよびポリペプチドは、当分野で公知の任意の方法を使用して作製および単離されてもよい。本発明を実行するために使用されるポリペプチドおよびペプチドはまた、当分野で周知の化学的方法を使用して全部または一部を合成してもよい。例えば、Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223；Hom (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232；Banga, A. K,Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, Paを参照されたい。例えば、ペプチド合成は様々な固相技術を使用して行うことができ（例えば、Roberge (1995) Science 269:202；Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3-13を参照）、自動合成は、例えば、ＡＢＩ  ４３１Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を製造業者により提供される説明書に従って使用して実現することができる。
【０１４３】
一部の実施形態では、さらなる抗原は、例えば、約２５％から５０％純粋な、約５０％から約７５％純粋な、約７５％から約８５％純粋な、約８５％から約９０％純粋な、約９０％から約９５％純粋な、約９５％から約９８％純粋な、約９８％から約９９％純粋な、または９９％を上回って純粋な、精製された抗原であってもよい。
【０１４４】
上記のように、さらなる抗原には、抗原として機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。本明細書において使用されるように、用語「ポリヌクレオチド」は、任意の長さ（例えば９、１２、１８、２４、３０、６０、１５０、３００、６００、１５００またはそれ以上のヌクレオチド）または鎖数（例えば一本鎖または二本鎖）のヌクレオチドの鎖を包含する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）もしくはＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）またはそれらの組合せであってもよい。それらは天然に存在していてもよいし、合成されていてもよい（例えば化学的に合成されてもよい）。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド鎖中に１つまたは複数の窒素塩基、ペントース糖またはリン酸基の修飾を含有し得ると考えられている。そのような修飾は当分野で周知であり、例えばポリヌクレオチドの安定性の向上のためのものであり得る。
【０１４５】
ポリヌクレオチドは、様々な形態で送達されてもよい。一部の実施形態では、線状の形態であるか、または発現プラスミドなどのプラスミドに挿入された、裸のポリヌクレオチドが使用され得る。他の実施形態では、ウイルスまたは細菌ベクターなどの生ベクターが使用され得る。
【０１４６】
ＤＮＡのＲＮＡへの転写および／またはＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を助ける１つまたは複数の調節配列が存在してもよい。場合によっては、ポリヌクレオチドがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子である場合など、転写プロセスに関連する調節配列（例えばプロモーター）は必要でなく、タンパク質発現はプロモーターの不在下で達成され得る。当業者であれば、状況に応じた適した調節配列を含めることができる。
【０１４７】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは発現カセット中に存在し、発現カセットにおいてポリヌクレオチドは、本発明の組成物を投与する対象においてポリヌクレオチドを発現させる調節配列と作動可能に連結されている。発現カセットの選択は、組成物を投与する対象ならびに発現するポリペプチドに望まれる特徴によって変わる。
【０１４８】
一般に、発現カセットには、対象において機能的であり、構成的または誘導性であり得るプロモーター；リボソーム結合部位；必要であれば、開始コドン（ＡＴＧ）；目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；停止コドン；および任意選択で３’末端領域（翻訳および／または転写ターミネーター）が含まれる。シグナルペプチドをコードする領域などのさらなる配列を含めてもよい。目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現カセット中の他の調節配列のいずれかと相同であっても非相同であってもよい。シグナルペプチドコード領域などの、目的のポリペプチドとともに発現する配列は、一般に、発現させるタンパク質をコードするポリヌクレオチドに隣接して位置し、適当なリーディングフレームに配置される。発現させるタンパク質をコードするポリヌクレオチドによって単独で、または発現させる任意の他の配列（例えばシグナルペプチド）とともに構成されるオープンリーディングフレームは、組成物を投与する対象において転写および翻訳が起こるように、プロモーターの制御下に配置される。
【０１４９】
本明細書に記載されるワクチン組成物による単回処置で使用されるさらなる抗原の量は、抗原の種類および対象のサイズに依存して異なってよい。当業者は、過度な実験なしで、特定用途で使用するさらなる抗原の有効量を決定することができるであろう。本明細書で使用される用語「有効量」とは、所望の結果を達成するのに、必要な投薬量でおよび時間の期間の間、有効な量を意味する。
【０１５０】
一部の実施形態では、さらなる抗原は、ＣＴＬ応答を誘導することができる少なくとも１つのＣＴＬエピトープであってもよい。例えば、さらなる抗原は、がん細胞で上方制御されていると同定されたタンパク質に由来するＣＴＬエピトープであってもよい。
【０１５１】
ある実施形態では、ＣＴＬエピトープは、例えば、黒色腫関連タンパク質などの、腫瘍関連タンパク質のエピトープであってもよい。一部の実施形態では、黒色腫関連タンパク質は、チロシン関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）またはｐ５３であって、このタンパク質は組換え技術または化学合成を含め様々な方法で入手できる。
【０１５２】
次の遺伝子は、限定されないが、さらなる抗原として本発明のワクチンに組み込むことができるペプチド配列を有する腫瘍関連タンパク質をコードする：ｐ５３、ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７、ＡＲＴ−４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｃｙｐ−Ｂ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵＩ、ＲＵ２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、ＷＴ１、ＰＳＡ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ  Ａ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ−６、ＤＡＭ−１０、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７Ｂ、ＧＡＧＥ−８、ＮＡ８８−Ａ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１ａ（ＣＡＧ−３）、ＡＦＰ、β−カテニン／ｍ、カスパーゼ−８／ｍ、ＣＤＫ−４／ｍ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇ２５０、Ｒａｓ、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ミオシン／ｍ、ＲＡＧＥ、ＳＡＲＴ−２、サバイビン、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、ならびに７０７−ＡＰ。
【０１５３】
ある実施形態では、ワクチンは、ＣＴＬ応答を誘導する抗原として、がんと関連したＣＴＬエピトープの混合物を含んでいてもよい。例えば、抗原は、腫瘍関連タンパク質の少なくとも１つのさらなる抗原とともに、例えば、限定されないが、次のアミノ酸配列：FEELTLGEF（配列番号１）；FTELTLGEF（配列番号２）；LTLGEFLKL（配列番号３）；LMLGEFLKL（配列番号４）；RISTFKNWPF（配列番号５）；RISTFKNWPK（配列番号６）；STFKNWPFL（配列番号７）；およびLPPAWQPFL（配列番号８）を有するサバイビンペプチド抗原などの、本明細書に記載されるサバイビン抗原の少なくとも１つまたは複数を含んでいてもよい。
【０１５４】
（ｉｉｉ）Ｔヘルパーエピトープ
一部の実施形態では、本発明のワクチンは少なくとも１つのＴヘルパーエピトープまたはＴヘルパー抗原を含む。
【０１５５】
Ｔヘルパーエピトープは、Ｔヘルパー活性を有するアミノ酸（天然または非天然のアミノ酸）の配列である。Ｔヘルパーエピトープは、免疫系の能力を確立し、最大にする重要な役割を果たすＴヘルパーリンパ球によって認識され、例えば細胞傷害性Ｔリンパ球などの、他の免疫細胞を活性化し、指示することに関与する。
【０１５６】
Ｔヘルパーエピトープは、連続的または不連続なエピトープからなることができる。したがって、Ｔヘルパーのあらゆるアミノ酸が必ずしもエピトープの一部とは限らない。したがって、Ｔヘルパーエピトープの類似体およびセグメントを含めて、Ｔヘルパーエピトープは、免疫応答を増強するか刺激することが可能である。免疫優勢Ｔヘルパーエピトープは、広く多岐にわたるＭＨＣ型を有する動物およびヒト集団で広く反応的である（Celis et al. (1988) J. Immunol. 140:1808-1815；Demotz et al. (1989) J. Immunol. 142:394-402；Chong et al. (1992) Infect. Immun. 60:4640-4647）。対象ペプチドのＴヘルパードメインは、約１０から約５０のアミノ酸、好ましくは約１０から約３０のアミノ酸を有する。複数のＴヘルパーエピトープが存在するとき、各Ｔヘルパーエピトープは独立して作用する。
【０１５７】
一部の実施形態では、Ｔヘルパーエピトープは、本明細書に記載される抗原の一部を形成することができる。詳細には、抗原が十分なサイズであるならば、それはＴヘルパーエピトープとして機能するエピトープを含有することができる。他の実施形態では、Ｔヘルパーエピトープは、抗原とは別々の分子である。
【０１５８】
別の実施形態では、Ｔヘルパーエピトープ類似体は、Ｔヘルパーエピトープ中に１から約１０のアミノ酸残基の置換、欠失および挿入を含んでもよい。Ｔヘルパーセグメントは、免疫応答を増強または刺激するのに十分であるＴヘルパーエピトープの連続した部分である。Ｔヘルパーセグメントの例は、単一のより長いペプチドに由来する一連の重複するペプチドである。
【０１５９】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、Ｔヘルパーエピトープまたは抗原として、安定性を増強するためにそのアミノ末端にアラニン残基が添加されている改変破傷風毒素ペプチドＡ１６Ｌ（８３０〜８４４、AQYIKANSKFIGITEL（配列番号９））を含むことができる（Slingluff et al., Clin Cancer Res., 7: 3012-3024, 2001）。
【０１６０】
本組成物で使用することのできるＴヘルパーエピトープの他の供給源には、例えば、Ｂ型肝炎表面抗原ヘルパーＴ細胞エピトープ、百日咳毒素ヘルパーＴ細胞エピトープ、はしかウイルスＦタンパク質ヘルパーＴ細胞エピトープ、クラミジア・トラコミティス（Chlamydia trachomitis）主外膜タンパク質ヘルパーＴ細胞エピトープ、ジフテリア毒素ヘルパーＴ細胞エピトープ、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）スポロゾイト周囲ヘルパーＴ細胞エピトープ、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）トリオースリン酸イソメラーゼヘルパーＴ細胞エピトープ、大腸菌（Escherichia coli）ＴｒａＴヘルパーＴ細胞エピトープ、ならびにこれらのＴヘルパーエピトープのいずれかの免疫増強類似体およびセグメントが含まれる。
【０１６１】
一部の実施形態では、Ｔヘルパーエピトープは、汎用性Ｔヘルパーエピトープである。本明細書で使用される汎用性Ｔヘルパーエピトープは、クラスＩＩ（ＣＤ４＋Ｔ細胞）制限様式でＴ細胞機能を活性化させる様式で多数のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する、ペプチドまたは他の免疫原性分子、またはその断片を指す。汎用性Ｔヘルパーエピトープの例は、ペプチド配列AKXVAAWTLKAAA（配列番号１２）を含むＰＡＤＲＥ（パン−ＤＲエピトープ）であって、配列中Ｘはシクロヘキシルアラニルであり得る。ＰＡＤＲＥはＣＤ４＋Ｔヘルパーエピトープを特異的に有し、すなわち、それはＰＡＤＲＥ特異的ＣＤ４＋Ｔヘルパー応答の誘導を刺激する。
【０１６２】
前記の改変破傷風毒素ペプチドＡ１６Ｌに加えて、破傷風トキソイドは、ＰＡＤＲＥに類似した様式で働く他のＴヘルパーエピトープを有する。破傷風およびジフテリア毒素は、ヒトＣＤ４＋細胞に対する汎用性エピトープを有する（Diethelm-Okita, B.M. et al., J. Infect. Diseases, 181:1001-1009, 2000）。別の実施形態では、Ｔヘルパーエピトープは、ペプチド配列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE（アミノ酸９４７〜９６７、配列番号１３）を含むＦ２１Ｅなどの破傷風トキソイドペプチドであってもよい。
【０１６３】
ある特定の実施形態では、Ｔヘルパーエピトープは、本発明のワクチン中の１つまたは複数のサバイビン抗原の少なくとも１つに、またはワクチンに含めることが可能なさらなる抗原に融合される（例えば融合ペプチド）。
【０１６４】
（ｉｖ）アジュバント
一部の実施形態では、本発明のワクチンは１つまたは複数の薬学的に許容されるアジュバントを含む。多数のアジュバントが記載されてあり、当業者に公知である。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985）および１９９９年に発行された米国薬局方：国民医薬品集（The United States Pharmacopoeia: The National Formulary （USP 24 NF19））を参照のこと。
【０１６５】
例示的なアジュバントとしては、限定されないが、ミョウバン、アルミニウムのその他の化合物、カルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、ＴｉｔｅｒＭａｘ（商標）、Ｒｉｂｉ（商標）、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）、リポペプチドおよびポリＩ：Ｃポリヌクレオチドが挙げられる。例示的なＣｐＧ  ＯＤＮは、5 '-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3 '（配列番号１４）である。当業者は、標的種および有効性に基づいて他の適切なＣｐＧ  ＯＤＮを容易に選択することができる。例示的なリポペプチドとしては、限定されないが、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫ（ＥＭＣ  Ｍｉｃｒｏｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）または変異体、同族体、およびそれらの類似体が含まれる。リポペプチドのＰａｍ２ファミリーは、リポペプチドのＰａｍ３ファミリーの効果的な代替であることが示されている。
【０１６６】
特定の実施形態では、ワクチンは、アジュバントとして、例えば、限定されないが、２６ｍｅｒ  デオキシイノシン／シトシン合成ポリヌクレオチドなどの、ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドを含む。
【０１６７】
本明細書において使用されるように、「ポリＩ：Ｃ」または「ポリＩ：Ｃポリヌクレオチド」とは、二本鎖ポリヌクレオチド分子（ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＤＮＡとＲＮＡとの組合せ）であり、その各々のストランドは、少なくとも６つの隣接するイノシン酸もしくはシチジル酸残基、あるいは任意の順序でイノシン酸およびシチジル酸から選択される６つの隣接する残基（例えばＩＩＣＩＩＣ、ＩＣＩＣＩＣまたはＩＩＩＣＣＣ）を含有し、哺乳動物対象において、インターフェロンなどの少なくとも１種類の炎症性サイトカインの産生を誘導または増強する能力がある。ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドは、約８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２５、２８、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、５００、１０００またはそれ以上の残基の長さを一般に有する。上限は重要であるとは考えられてない。好ましいポリＩ：Ｃポリヌクレオチドの最小長は、約６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、または３０ヌクレオチドであってもよく、最大長は約１０００、５００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５または４０ヌクレオチドであってもよい。
【０１６８】
ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドの各々のストランドは、イノシン酸またはシチジル酸残基のホモポリマーであってもよいか、または、各々のストランドは、イノシン酸およびシチジル酸残基双方を含有するヘテロポリマーであってもよい。いずれの場合も、ポリマーは、上記のように、６個のＩ、６個のＣまたは６個のＩ／Ｃ残基の少なくとも１つの隣接する領域があるならば、１つまたは複数の非イノシン酸または非シチジル酸残基（例えばウリジン）によって中断されてもよい。一般に、ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドの各々のストランドは、６個のＩ／Ｃ残基につき１個以下の非Ｉ／Ｃ残基、より好ましくは、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８または３０個のＩ／Ｃ残基毎に１個以下の非Ｉ／Ｃ残基を含有する。
【０１６９】
ポリＩ：Ｃポリヌクレオチド中のイノシン酸またはシチジル酸（またはその他の）残基は、ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドの、インターフェロンなどの炎症性サイトカインの産生を促進する能力が保持されるならば、当分野で公知のように誘導体化または修飾されてもよい。誘導体または修飾の限定されない例としては、例えばアジド修飾、フルオロ修飾、またはｉｎ  ｖｉｖｏで安定性を増強させるため天然のホスホジエステル結合の代わりにチオエステル（または同様の）結合を使用することが挙げられる。ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドはまた、例えばそのｉｎ  ｖｉｖｏでの分解に対する抵抗性を増強するために、例えば、正に帯電したポリ−リシンおよびカルボキシメチルセルロースで、または正に帯電した合成ペプチドでその分子を複合体化することにより、修飾されてもよい。
【０１７０】
ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドは、本発明の組成物中に組成物の単位用量あたり約０．００１ｍｇから１ｍｇの量で一般に含まれる。ある特定の実施形態では、ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドの量は、約０．０４ｍｇ／ワクチン組成物１ｍＬとなるであろう。
【０１７１】
ワクチンの他の適切なアジュバントは、ＴＬＲ２の活性を活性化するまたは増加させるアジュバントである。本明細書で使用されるように、ＴＬＲを「活性化する」か「その活性を増加させる」アジュバントにはいかなるアジュバントも含まれ、一部の実施形態では、ＴＬＲアゴニストとして作用する脂質をベースとしたアジュバントが含まれる。さらに、ＴＬＲ２の活性を活性化するか、または増加させることは、いかなるモノマー、ホモダイマーまたはヘテロダイマー形でのその活性化を包含し、ＴＬＲ１またはＴＬＲ６とのヘテロダイマー（すなわちＴＬＲ１／２またはＴＬＲ２／６）としてのＴＬＲ２の活性化を特に含む。
【０１７２】
ＴＬＲ２の活性を活性化するかまたは増加させるアジュバントの例示的な実施形態は、少なくとも１つの脂質部分または脂質構成成分を含む、脂質をベースとしたアジュバントである。
【０１７３】
本明細書で使用されるように、表現「脂質部分」または「脂質構成成分」とは、あらゆる脂肪酸（例えば脂肪アシル）またはその誘導体を指し、例えばトリグリセリド、ジグリセリドおよびモノグリセリドを含む。例示的脂肪酸には、限定されないが、パルミトイル、ミリストイル、ステアロイルおよびデカノイル基、または任意のＣ２〜Ｃ３０の飽和もしくは不飽和脂肪アシル基、好ましくは任意のＣ１４〜Ｃ２２の飽和もしくは不飽和脂肪アシル基、より好ましくはＣ１６の飽和もしくは不飽和脂肪アシル基が含まれる。したがって、本明細書で言及されるように、表現「脂質をベースとしたアジュバント」は、脂肪アシル基またはその誘導体を含むあらゆるアジュバントを包含する。
【０１７４】
脂質をベースとしたアジュバントは、最低でも少なくとも１つの脂質部分、または合成／半合成の脂質部分類似体を含有し、それはアミノ酸、オリゴペプチドまたは他の分子（例えば炭水化物、グリカン、多糖、ビオチン、ローダミンなど）に結合されてもよい。したがって、限定されないが、脂質をベースとしたアジュバントは、例えば、リポアミノ酸、リポペプチド、リポグリカン、リポ多糖またはリポタイコ酸であってもよい。さらに、ビルトインアジュバントの特性を有する抗原性化合物を創製するために、脂質部分または脂質部分を含有する構造は、抗原に共有結合または非共有結合で結合させることができる。例えば、限定されずに、脂質をベースとした部分は、非共有結合のための陽電荷を提供するために、カチオン（例えばニッケル）を含んでもよい。
【０１７５】
一部の実施形態では、脂質部分または脂質構成成分は、例えばグラム陽性菌もしくはグラム陰性菌、ロドシュードモナス・ビリディス（Rhodopseudomonas viridis）またはマイコプラズマからの細胞壁構成成分（例えばリポタンパク）などの、天然に存在するものでよい。他の実施形態では、脂質部分または脂質構成成分は、合成または半合成であってもよい。
【０１７６】
脂質をベースとしたアジュバントは、アジュバントの脂質部分または構成成分の少なくとも１つとして、パルミチン酸（ＰＡＭ）を含んでもよい。そのような脂質をベースとしたアジュバントは、本明細書において「パルミチン酸アジュバント」と呼ばれる。パルミチン酸は、大腸菌（Escherichia coli）の免疫学的反応性のブラウンのリポタンパクで見出される低分子量の脂質である。パルミチン酸の他の一般的な化学名には、例えば、ＩＵＰＡＣ命名法でのヘキサデカン酸、および１−ペンタデカンカルボン酸が含まれる。パルミチン酸の分子式は、ＣＨ３（ＣＨ２）１４ＣＯ２Ｈである。当業者に理解されるように、パルミチン酸の脂質鎖は変更されてもよい。パルミチン酸アジュバントとして本明細書で使用されることができる例示的な化合物、およびそれらの合成方法は、例えば、米国特許公報のＵＳ２００８／０２３３１４３；ＵＳ２０１０／０１２９３８５；およびＵＳ２０１１／０２００６３２に記載されている。
【０１７７】
脂質部分について上で記載されるように一般的に、パルミチン酸アジュバントは、最低でも少なくとも１つのパルミチン酸部分を含有し、それはアミノ酸、オリゴペプチドまたは他の分子に結合されてもよい。ビルトインアジュバントの特性を有する抗原性化合物を創製するために、パルミチン酸部分またはパルミチン酸を含有する構造は、抗原に共有結合または非共有結合で結合させることができる。パルミチン酸部分またはパルミチン酸を含有する化学構造は、直鎖状および分枝状構造を含めて、アジュバントの様々な構造的構成を可能にするために、システインペプチド（Ｃｙｓ）にコンジュゲートさせることができる。向上した溶解性を有するアジュバント化合物を創製するために、システイン残基は、Ｃ末端でセリン（Ｓｅｒ）および／またはリシン（Ｌｙｓ）などの極性残基によって一般的に拡張されている。増強された免疫応答を起こさせるために、パルミチン酸含有アジュバント化合物は、抗原と混合するか、非共有結合性相互作用を通して抗原と会合させるか、あるいは、直接に、またはリンカー／スペーサーを使用して抗原に共有結合させることができる。最も一般的には、上記のように複数の構成で使用することもできる、ジパルミトイル−Ｓ−グリセリル−システイン（ＰＡＭ２Ｃｙｓ）またはトリパルミトイル−Ｓ−グリセリル−システイン（ＰＡＭ３Ｃｙｓ）を創製するために、２つのパルミチン酸部分がグリセリル骨格およびシステイン残基に結合される。
【０１７８】
したがって、ある実施形態では、組成物のアジュバントは、パルミチン酸部分または構成成分を含んでいてもよい。パルミチン酸部分は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのその安定性を向上させるか、受容体（例えば下記のｔｏｌｌ様受容体など）へのその結合を増強するか、その生物学的活性を増強するために、改変または操作することができる。
【０１７９】
特定の実施形態では、パルミチン酸アジュバントは、ＰＡＭ２ＣｙｓまたはＰＡＭ３Ｃｙｓを含んでもよい。別の特定の実施形態では、パルミチン酸アジュバントは、Ｐａｍ−２−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４またはＰａｍ−３−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４であってもよい。そのようなパルミチン酸アジュバントは、例えば研究試薬としてＥＭＣ  Ｍｉｃｒｏｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）から入手できる。また、標識類似体を含めて、Ｐａｍ−２−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４およびＰａｍ−３−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４の様々な類似体も、ＥＭＣ  Ｍｉｃｒｏｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓから入手できる。
【０１８０】
本発明の組成物は、少なくとも１つの他の適切なアジュバントと組み合わせた上記のアジュバントを含んでもよい。少なくとも１つの他のアジュバントの例示的な実施形態は、決してそれらに限定されないが、合成、非生物、または（それらに限定されないが、ビロゾーム、ウイルス様粒子、ウイルスおよびそれらの構成成分の細菌を含む）生物供給源に由来する有機および無機の化合物、ポリマー、タンパク質、ペプチド、糖を包含する。
【０１８１】
適合するアジュバントのさらなる例には、限定されないが、ケモカイン、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、コロニー刺激因子、サイトカイン、１０１８  ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ０４、ＡＳ１５、ＡＢＭ２、Ａｄｊｕｍｅｒ、アルガミュリン、ＡＳ０１Ｂ、ＡＳ０２（ＳＢＡＳＡ）、ＡＳＯ２Ａ、ＢＣＧ、カルシトリオール、キトサン、コレラ毒素、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ、ポリＩＣ、ＣｙａＡ、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、フタル酸ジブチル（ＤＢＰ）、ｄＳＬＩＭ、ガンマイヌリン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭＤＰ、グリセロール、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔ  ＩＭＰ３２１、ＩＳ  Ｐａｔｃｈ、ＩＳＣＯＭ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＬＰＳ、脂質コアタンパク質、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＭＳ１３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）をベースとしたアジュバント、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰｅｐＴｅｌベクター系、他のパルミトイルをベースとした分子、ＰＬＧ微粒子、レシキモド、スクアレン、ＳＬＲ１７２、ＹＦ−１７ＤＢＣＧ、ＱＳ２１、ＱｕｉｌＡ、Ｐ１００５、ポロキサマー、サポニン、合成ポリヌクレオチド、ザイモサン、百日咳毒素を含めることができる。
【０１８２】
したがって、組成物は１つまたは複数の薬学的に許容されるアジュバントを含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数のサバイビン抗原の少なくとも１つまたはさらなる抗原は、アジュバントの少なくとも１つに結合していてもよい。
【０１８３】
使用されるアジュバントの量は、抗原の量およびアジュバントの種類に依存する。当業者は、経験的な試験によって特定用途で必要なアジュバントの量を容易に決定することができる。
【０１８４】
（ｖ）リポソーム
一部の実施形態では、本発明のワクチンはリポソームを含む。特定の実施形態では、ワクチン組成物が本明細書に記載される疎水性物質の連続相を含む担体を含むとき、リポソームが含まれる。
【０１８５】
リポソームは、本発明に包含されるアジュバント系の特定の実施形態である。しかし、本発明のワクチンは、リポソームを含まなくてもよい。むしろ、ワクチンの他の実施形態では、１つまたは複数のサバイビン抗原を、サバイビン抗原の対象への送達のために任意の適切なアジュバントと組み合わせてもよい。
【０１８６】
リポソームは、封入された水性容積を含有する完全に閉じられた脂質二重層膜である。リポソームは、単層小胞（単一の二重層膜を有する）であってもよいし、多重膜二重層を特徴とする多層小胞であってもよく、各々の二重層は、隣の二重層と水層で分離されていてもいなくてもよい。リポソームの一般的な考察は、Gregoriadis G. Immunol. Today, 11 :89-97, 1990；およびFrezard, F., Braz. J. Med. Bio. Res., 32:181-189, 1999に見出すことができる。本明細書および特許請求の範囲において使用されるように、用語「リポソーム」は、上記のように全てのそのような小胞構造を包含することが意図され、限定されないが、当分野で「ニオソーム」、「トランスファーソーム」および「ビロソーム」として記載されるものが含まれる。
【０１８７】
本発明では、古細菌脂質から作られるリポソームを含めて、いずれのリポソームを使用してもよいが、特に有用なリポソームはリポソーム製剤中にリン脂質および非エステル化コレステロールを使用している。コレステロールは、リポソームを安定化するために使用され、リポソームを安定化する他の任意の化合物がコレステロールに置き換わることができる。その他のリポソーム安定化化合物は当業者に公知である。例えば、飽和リン脂質により、安定性の増加を示す高い転移温度を有するリポソームが生じる。
【０１８８】
リポソームの調製で好ましくは使用されるリン脂質は、ホスホグリセロール、ホスホエタノールアミン、ホスホセリン、ホスホコリン（例えばＤＯＰＣ、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）およびホスホイノシトールからなる群から選択される少なくとも１つの頭部基を有するリン脂質である。９４〜１００％ホスファチジルコリンである脂質を含むリポソームが、より好ましい。そのような脂質は、レシチンＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｎ（登録商標）９０Ｇで市販されている。非エステル化コレステロールもリポソーム製剤で使用する場合は、コレステロールはリン脂質の重量の約１０％に等しい量で使用される。リポソームを安定させるためにコレステロール以外の化合物が使用される場合は、当業者は組成物で必要な量を容易に決定することができる。
【０１８９】
リポソーム組成物は、例えば、天然脂質、合成脂質、スフィンゴ脂質、エーテル脂質、ステロール、カルジオリピン、カチオン性脂質、ならびにポリ（エチレングリコール）および他のポリマーで修飾した脂質を使用して得ることができる。合成脂質は、以下の脂肪酸構成要素を含んでもよい；ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、アラキドイル、オレオイル、リノレオイル、エルコイル、またはこれらの脂肪酸の組合せ。
【０１９０】
（ｖｉ）担体
一部の実施形態では、本発明のワクチンは、薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む。本明細書で使用されるように、薬学的に許容される担体とは、本発明のワクチン組成物の送達に適した任意の物質を指し、かつ本発明の方法において有用である。
【０１９１】
本発明のワクチンで使用可能な担体は、当分野で周知であり、決してそれらに限定されないが、例えば、水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、血清含有溶液、ハンクス溶液、他の水性生理的平衡液、水中油型乳濁液、油、油中水型乳濁液、エステル、ポリ（エチレンビニルアセテート）、乳酸およびグリコール酸のコポリマー、ポリ（乳酸）、ゼラチン、コラーゲンマトリックス、多糖、ポリ（Ｄ、Ｌラクチド）、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（カプロラクトン）、セルロース、アルブミン、デンプン、カゼイン、デキストラン、ポリエステル、エタノール、メタクリレート、ポリウレタン、ポリエチレン、ビニルポリマー、グリコール、チログロブリン、ヒト血清アルブミンなどのアルブミン、破傷風トキソイド、ポリＬ−リシン、ポリＬ−グルタミン酸などのポリアミノ酸、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質、およびそれらの組合せなどを含む。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 2000, Gennaro, A R ed., Eaton, Pa.: Mack Publishing Co.を参照のこと。
【０１９２】
特定の実施形態では、ワクチン組成物の担体は、疎水性物質、好ましくは液体疎水性物質の連続相を含む担体である。連続相は、本質的に純粋な疎水性物質、または疎水性物質の混合物であってもよい。さらに、疎水性物質が連続相を構成するならば、担体は疎水性物質中の水の乳濁液、または疎水性物質の混合物中の水の乳濁液であってもよい。さらに、別の実施形態では、担体はアジュバントとして機能することができる。
【０１９３】
本明細書に記載される組成物中で有用な疎水性物質は、薬学的および／または免疫学的に許容される疎水性物質である。担体は液体であることが好ましいが、大気温度で液体でないある特定の疎水性物質を例えば加温により液化してもよく、それも本発明において有用である。一実施形態では、疎水性担体は、リン酸緩衝生理食塩水／フロイント不完全アジュバント（ＰＢＳ／ＦＩＡ）乳濁液であってもよい。
【０１９４】
油または油中水型の乳濁液は、本発明のワクチン組成物で使用するのに特に適した担体である。油は、薬学的および／または免疫学的に許容されるべきである。適切な油には、例えば、鉱物油（特に、Ｄｒａｋｅｏｌ（登録商標）６ＶＲなどの軽質または低粘度の鉱物油）、植物油（例えば、ダイズ油）、ナッツオイル（例えば、落花生油）またはそれらの混合物が含まれる。したがって、特定の実施形態では、担体は植物油、ナッツオイル、または鉱物油などの疎水性物質である。動物脂肪および人工疎水性ポリマー材料、特に大気温度で液体であるもの、または比較的容易に液化することができるものも使用できる。
【０１９５】
がんワクチンの免疫原性を増強するために、Ｉｍｍｕｎｏｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｎｃ．は、ペプチド抗原に対して強力で頑丈な免疫応答を促進するように設計されたアジュバントワクチンプラットフォームを開発してきた。ＤｅｐｏＶａｘ（商標）（ＤＰＸ）は、ＴＬＲ−アジュバントおよび汎用Ｔヘルパーペプチドを含む油中リポソーム製剤であり、これは、細胞傷害性Ｔリンパ球により媒介される免疫応答（Karkada et al., J Immunother 33(3):250-261, 2010）および／または液性免疫応答を誘導するように、任意のエピトープまたはエピトープの混合物と製剤化され得る。ＤＰＸは免疫部位での強力なデポーを形成し、このデポーにより免疫系への抗原曝露が長くなる。
【０１９６】
ＤＰＸのペプチドによる単回ワクチン接種により、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ５１  ＶＧ乳濁液などの他の従来製剤のペプチドでの複数回ワクチン接種に等しいかまたはそれより良好な免疫応答が、第１世代の乳濁液をベースとしたワクチンプラットフォームであったＶａｃｃｉＭａｘと同様の免疫応答がもたらされることが示された（Daftarian et al., J Transl Med 5: 26, 2007；Mansour et al., J Transl Med 5: 20, 2007）。ＤＰＸ−０９０７と称するＤｅｐｏＶａｘ（商標）をベースとしたペプチドワクチンによる、乳がん、卵巣がんおよび前立腺がん患者の第Ｉ相臨床試験を最近終了し、これらの進行した患者において安全性および免疫原性が実証された（Berinstein et al., J Transl Med 10(1): 156, 2012）。
【０１９７】
したがって、特定の実施形態では、本発明のワクチンの担体は、Ｉｍｍｕｎｏｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｎｃ．の、リポソームをベースとしたアジュバント系であってもよい。抗原とアジュバントとを含有する水滴を封入している油に依拠する、油中水型乳濁液をベースとしたワクチンと違い、ＤｅｐｏＶａｘ（商標）をベースとした製剤は、乳化する必要が無く、抗原とアジュバントが油中に直接取り込まれることを助長するリポソームに依拠している。このアプローチの利点には、（１）本来なら水性をベースとした希釈剤中で最大の溶解性を通常には有する親水性抗原／アジュバントの、油性希釈剤中での溶解性を高めること、および（２）ワクチン投与前の乳化手順の面倒が無いことが含まれる。
【０１９８】
好ましい実施形態では、担体は、鉱物油であるかまたはＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ５１（ＳＥＰＰＩＣ、Ｆｒａｎｃｅ）として市販されているオレイン酸マンニドなどの、鉱物油溶液中のオレイン酸マンニドである。
【０１９９】
ある特定の実施形態では、組成物は実質的に水を含まなくてもよい（例えば、「無水」）。水が担体の非連続相に存在するならば、これらの「無水」組成物の疎水性担体は少量の水をなお含有していてもよいことがあり得る。例えば、組成物の個々の構成成分は、真空凍結乾燥または蒸発などの工程によって完全に除去することができない結合水を有することができ、ある特定の疎水性担体は、その中に溶解した少量の水を含有することができる。一般に、「無水」である本発明の組成物は、例えば、組成物の担体構成成分の総重量の重量／重量ベースで、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％未満の水を含有する。
【０２００】
例示的ワクチン組成物の調製方法
特定の実施形態では、本発明のワクチン組成物は、少なくとも１つのサバイビン抗原と、リポソームと疎水性物質の連続相を含む担体とを含む組成物である。
【０２０１】
リポソームの作製方法は、当分野で周知である。例えば、両方とも前に引用されているGregoriadis（1990）およびFrezard（1999）を参照のこと。リポソームを作製するためのいかなる適切な方法も、本発明の実施で使用することができ、またはリポソームは商業的供給元から入手できる。リポソームは、脂質二重層を形成するリポソーム構成成分（例えばリン脂質およびコレステロール）を、水溶液で水和させることによって一般的に調製され、この水溶液は、純水、または水に溶解させた１つまたは複数の構成成分の溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、無リン酸生理食塩水もしくは生理的に適合する他の任意の水溶液であってもよい。
【０２０２】
ある実施形態では、リン脂質（例えばＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｎ（登録商標）９０Ｇ）またはＤＯＰＣおよびコレステロールなどの、リポソーム構成成分またはリポソーム構成成分の混合物は、クロロホルムおよびメタノールの混合物などの、有機溶媒に可溶化させ、続いて濾過し（例えばＰＴＦＥ０．２μｍフィルター）かつ、溶媒を除去するために例えば回転蒸発によって乾燥させることができる。
【０２０３】
生じた脂質混合物の水和は、例えば水溶液に混合脂質を注入するか、混合脂質および水溶液を超音波処理することによって実行することができる。リポソームの形成の間に、リポソーム構成成分は、リポソーム構成成分を水和する水溶液の一定容量を囲む単一の二重層（単層）または複数の二重層（多層）を形成する。
【０２０４】
一部の実施形態では、リポソームは、凍結乾燥または真空凍結乾燥によるなど、次に脱水される。
【０２０５】
リポソームは、連続疎水相を含む担体などの、適切な担体と合わされる。これは、様々な方法で実行することができる。
【０２０６】
担体が疎水性物質または疎水性物質の混合物だけで構成される（例えば、１００％の鉱物油担体を使用する）場合、リポソームを単に疎水性物質と混合することができるか、複数の疎水性物質がある場合は、それらのいずれか１つまたは組合せと混合することができる。
【０２０７】
代わりに疎水性物質の連続相を含む担体が不連続な水相を含有する場合は、担体は、油中水型乳濁液などの、疎水相中の水相の乳濁液の形態を一般的にとる。乳濁液を安定させ、リポソームの均一な分布を促進するために、そのような組成物は乳化剤を含有することができる。この点に関しては、担体でリポソームの均一な分布を促進するために、無水担体が使用される場合でも、乳化剤は有用であり得る。一般的な乳化剤には、オレイン酸マンニド（Ａｒｌａｃｅｌ（商標）Ａ）、レシチン（例えばＳ１００レシチン）、リン脂質、Ｔｗｅｅｎ（商標）８０およびＳｐａｎｓ（商標）２０、８０、８３および８５が含まれる。一般的に、疎水性物質と乳化剤との容量比（ｖ／ｖ）は約５：１〜約１５：１の範囲内であり、約１０：１の比が好ましい。
【０２０８】
リポソームは完成した乳濁液に添加することができ、またはリポソームは乳化の前に水相または疎水相に存在してもよい。
【０２０９】
サバイビン抗原または本明細書に記載のさらなる抗原は、製剤工程の様々な異なる段階で導入することができる。組成物に複数種の抗原を組み込むことができる。本セクションで使用されるように、用語「抗原」は、一般に使用され、本明細書に記載のサバイビン抗原、１つまたは複数のサバイビン抗原、本明細書に記載のさらなる抗原、または１つまたは複数のさらなる抗原、またはそれらの任意の組合せを指すことができる。本用語を一般に使用することで、任意の抗原が本発明のワクチン組成物中でどのように製剤化され得るか説明している。用語「抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）」は、単数形である「抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）」および複数形である「抗原（ａｎｔｉｇｅｎｓ）」の双方を包含する。同じように全ての抗原がワクチン組成物に導入されている必要はない。
【０２１０】
一部の実施形態では、抗原は、リポソームの脂質二重層を形成するために使用される構成成分（例えばリン脂質（複数可）およびコレステロール）を水和させるために使用される水溶液に存在する。この場合には、抗原は、その水性の内部に存在するリポソームに封入される。疎水性物質の連続相を含む担体と最終的に混合される残留水溶液が存在するように、生じるリポソームが洗浄も、乾燥もされない場合には、最終生成物のリポソームの外部にさらなる抗原が存在し得ることが可能である。関連技術では、抗原は、水溶液による水和の前に、リポソームの脂質二重層を形成するために使用される構成成分と混合されてもよい。抗原は予め形成されたリポソームに添加してもよく、その場合には、抗原をリポソーム中に能動的に担持させても、リポソームの表面に結合させてもよく、または抗原をリポソームの外部に留まらせてもよい。そのような実施形態では、抗原の添加の前に、予め形成されたリポソームは空のリポソーム（例えば封入された抗原も、脂質をベースとしたアジュバントも含有しない）であってもよく、または予め形成されたリポソームはリポソームに組み込まれるかまたはリポソームと関連づけられる脂質をベースとしたアジュバントを含有することができる。好ましくは、これらのステップは、疎水性物質の連続相を含む担体と混合する前に行ってもよい。
【０２１１】
代替のアプローチでは、担体がリポソームと組み合わされる前、その間またはその後に、抗原は疎水性物質の連続相を含む担体と代わりに混合されてもよい。担体が乳濁液である場合は、抗原は乳化の前に水相または疎水相の一方または両方と混合されてもよい。あるいは、抗原は乳化の後に担体と混合されてもよい。
【０２１２】
リポソームの中に、および疎水性物質の連続相を含む担体中の両方に抗原が存在するように、抗原を担体と組み合わせる技術は、上記のようにリポソームへの抗原の封入と一緒に使用することができる。
【０２１３】
抗原を組成物に導入するための上記の手順が組み込まれる実施形態では、上記の手順は、Ｔ−ヘルパーエピトープおよび／または本明細書に記載の組成物のアジュバントにも適用される。すなわち、Ｔ−ヘルパーエピトープおよび／またはアジュバントは、例えば以下の１つまたは複数に、担体がリポソームと組み合わされる前、その間またはその後に導入することができる：（１）リポソームの脂質二重層を形成するために使用される構成成分を水和させるために使用される水溶液、（２）リポソームの脂質二重層の形成の後の水溶液、（３）リポソームの脂質二重層を形成するために使用される構成成分、または（４）疎水性物質の連続相を含む担体。担体が乳濁液である場合は、Ｔ−ヘルパーエピトープおよび／またはアジュバントは、乳化の前、その間またはその後に、水相または疎水相の一方または両方と混合されてもよい。
【０２１４】
リポソームの内部および／または外部に、ならびに疎水性物質の連続相を含む担体にＴ−ヘルパーエピトープおよび／またはアジュバントが存在するように、Ｔ−ヘルパーエピトープおよび／またはアジュバントを担体と組み合わせる技術は、リポソームへのこれら構成成分の封入と、またはリポソームへのこれら構成成分の添加と一緒に使用することができる。
【０２１５】
Ｔ−ヘルパーエピトープおよび／またはアジュバントは、同じ処理ステップで抗原と一緒に、または異なる処理ステップで別々に、組成物に組み込むことができる。例えば、抗原、Ｔ−ヘルパーエピトープおよびアジュバントの３つの構成成分全てがリポソームに封入されるように、脂質二重層形成リポソーム構成成分を水和させるために使用される水溶液に抗原、Ｔ−ヘルパーエピトープおよびアジュバントの全てが存在してよい。あるいは、抗原およびＴ−ヘルパーエピトープはリポソームに封入されてもよく、およびアジュバントは疎水性物質の連続相を含む担体と混合されてもよい。さらなる実施形態では、リポソーム−抗原調製物を手動ミニエクストルーダに通し、得られたリポソーム−抗原調製物を、例えばリン酸緩衝液中の脂質をベースとしたアジュバントと次に混合することによって、抗原封入ステップの後にＴ−ヘルパーエピトープおよび／またはアジュバントを組成物に組み込むことができる。Ｔ−ヘルパーエピトープおよびアジュバントがリポソームと会合するか、またはその外部に留まることができるように、リポソームを形成した後に、Ｔ−ヘルパーエピトープおよび／またはアジュバントを単独で、または抗原と一緒に組成物に組み込むこともできる。Ｔ−ヘルパーエピトープおよび／またはアジュバントは、抗原の添加の前にリポソームに組み込むかそれと会合することもでき、抗原は予め形成されたリポソームの外部に留まるか、さらなる処理によってリポソームに加えられる／と会合する。そのような実施形態では、生じる調製物を真空凍結乾燥させ、疎水性物質の連続相を含む担体で次に再構成することができる。そのような多くの組合せが可能であることが理解される。
【０２１６】
特定の実施形態では、本発明のワクチンはＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃである。ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃを調製する例示的方法は以下のとおりである。しかし、抗原、アジュバントおよびＴ−ヘルパーエピトープがワクチンの製剤の任意の段階で、任意の順序で、導入可能であり、リポソームの内側に、外側にまたは内外両側に最終的に見出すことが可能である、上記の実施形態など、代替の実施形態も本明細書に包含されることが理解される。
【０２１７】
例示的方法では、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃを調製するために、サバイビン抗原およびアジュバントの存在下で脂質構成成分を混合および水和する処理によって、水性緩衝剤中で、５つのサバイビン抗原（配列番号２、４、６、７および８）、アジュバント（ポリＩ：Ｃポリヌクレオチド）およびリポソーム（ＤＯＰＣおよびコレステロール）で複合体を形成し、この複合体を滅菌濾過が可能な粒子サイズが得られるようにエクストルード処理し、次いでバイアルに充填し、乾燥ケーキへと真空凍結乾燥する。注射する前に、この乾燥ケーキは、疎水性担体Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ５１  ＶＧに次いで再懸濁する。この例示的調製方法は、サバイビン抗原、適切な任意のアジュバントおよび適切な任意のＴヘルパーエピトープの任意の組合せで使用することができる。
【０２１８】
組成物が１つまたは複数のさらなるアジュバントを含有する場合は、そのようなさらなるアジュバントは、アジュバントについて上に記載したのと同様な方法で、またはさらなるアジュバント（複数可）に適し得る方法のいくつかを組み合わせることによって組成物に組み込むことができる。
【０２１９】
抗原の有効期間を長くするために生物学的活性を維持するか化学的安定性を向上させる糖、抗酸化剤または保存料などの安定剤、アジュバント、リポソームまたは連続疎水性担体をそのような組成物に添加することができる。
【０２２０】
一部の実施形態では、抗原／アジュバント混合物を使用することができ、その場合には、抗原およびアジュバントは同時に組成物に組み込まれる。「抗原／アジュバント混合物」とは、抗原およびアジュバントが、少なくとも組成物へ組み込まれる前に、同じ希釈剤中にある実施形態を指す。抗原／アジュバント混合物中の抗原およびアジュバントは、必ずしもその必要性はないが、共有結合によるなど化学的に連結されてもよい。
【０２２１】
一部の実施形態では、疎水性物質の連続相を含む担体は、それ自体がアジュバント活性を有することができる。不完全フロイントアジュバントおよびＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ５１  ＶＧは、アジュバント効果を有する疎水性担体の例である。本明細書および特許請求の範囲で使用されるように、用語「アジュバント」が使用される場合、これは、疎水性物質の連続相を含む担体によって提供される任意のアジュバント活性に加えて、アジュバントの存在を示すものとする。
【０２２２】
投与様式
本発明の方法は、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤と少なくとも１つのサバイビン抗原を含むワクチンとの組合せ投与を含む。
【０２２３】
ワクチンの有効性を向上させるため、本発明の方法の実施形態は、ワクチンの初回投与の前に、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の少なくとも２回用量の投与を含む。このような実施形態と併せて、ワクチンの初回投与の前に少なくとも２回用量が投与される限り、ワクチンによる処置過程の前、その最中またはその後のその他いつであれ、薬剤を対象に追加的に投与することが可能である。
【０２２４】
本明細書で使用されるように、用語「組合せ」、「同時投与」、または「組合せ投与」などは、単一の患者へのＤＮＡ複製を妨げる薬剤とワクチンとの投与を包含することを意味し、かつ薬剤とワクチンとは、必ずしも同じ投与経路によってまたは同時に投与されてはいない場合を含むことを意図する。例えば、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤とワクチンとを別々に、逐次的にまたは交互に投与してもよい。
【０２２５】
本明細書で使用されるように、表現「少なくとも２回用量」は、単回用量より大きい任意の数の用量を包含することを意図する。ある実施形態では、少なくとも２回用量は、２〜５０回用量の間を、より詳細には２〜２８回用量の間を、より詳細には２〜１４回用量の間を含む。ある実施形態では、少なくとも２回用量は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４回用量である。少なくとも２回用量は、適切な任意量の時間で離れていてもよい。特定の実施形態では、少なくとも２回用量は、１週間の期間毎日２回用量、合計して１４回用量を含む。
【０２２６】
ＤＮＡ複製を妨げる薬剤は、免疫調節効果をもたらすのに十分な量で一般に投与される。本明細書で使用されるように、表現「免疫調節効果」とは、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤が、免疫系の１つもしくは複数の局面および／または免疫系の細胞を改変（調節）する能力を指す。ある実施形態では、「免疫調節効果をもたらすのに十分な量」とは、免疫系細胞中でＤＮＡ複製に選択的に影響することが可能な薬剤の量である。例えば、薬剤の量は、免疫系の急速に分裂している細胞を選択的に標的として、プログラム細胞死を引き起こすのに十分な量であり得る。このような量は、本明細書で定義されるように、「化学療法ではない（non-chemotherapeutic）」用量として説明することもできる。
【０２２７】
「免疫調節効果をもたらすのに十分な量」とは、本明細書では互換的に「低用量」の量と呼ぶことができる。したがって、本発明の方法は、ワクチンとの組合せでＤＮＡ複製を妨げる薬剤を低用量で使用することを含むことが好ましい。ＤＮＡ複製を妨げる薬剤がアルキル化剤のシクロホスファミドである、本発明の特定の実施形態に関係して、表現「低用量」とは、例えば１００〜３００ｍｇ／ｍ２などの、３００ｍｇ／ｍ２未満のシクロホスファミド用量を一般に指す。毎日投与に関して、シクロホスファミドの「低用量」は、一般に約２５〜３００ｍｇ／日、好ましくは５０〜１５０ｍｇ／日の間である。シクロホスファミドについて１００ｍｇの１日用量の量が特に適切である。また、１用量あたり約５０ｍｇのシクロホスファミドを投与するのが特に適切である。ＤＮＡ複製を妨げる他の薬剤に関して「低用量」の量は、本明細書に包含されるように、当業者に公知であり、または常法で決定することができるであろう。
【０２２８】
本発明の方法は、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の少なくとも２回用量を投与するステップと、続いて本発明のワクチンを投与するステップとを含む。「続いて投与する」とは、ワクチンの初回投与の前にＤＮＡ複製を妨げる薬剤の投与を開始することを意味する（例えばワクチン前に、対象に薬剤の少なくとも２回用量を与える）。しかし、本明細書で記載のように、ワクチン投与の開始の後、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を対象に投与し続けることができる。代替の実施形態では、ワクチンの初回投与の前に、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の投与を停止する。
【０２２９】
本発明の方法では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の初回投与は、ワクチンによる対象のいかなる処置にも先んじる。ある実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の初回投与と、ワクチンの初回投与とを隔てる最短の時間量は、免疫調節効果をもたらすのに十分な任意の時間量であり得る。当業者が理解するように、免疫調節効果をもたらすのに十分な時間量は、多くの変数に左右されてもよく個々の患者にとって同じでなくてもよい。
【０２３０】
一部の実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の初回用量は、ワクチンの初回投与の少なくとも１２時間前に、好ましくは初回ワクチン接種の少なくとも２、４または６日前に投与される。さらなる実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の初回用量は、ワクチンの初回投与の、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４日前、またはそれ以上前に提供されてもよい。特定の実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の初回投与は、ワクチンの初回投与の１〜４日前に行う。ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の初回投与は、ワクチンの初回投与の約１週間前が特に適切である。
【０２３１】
ＤＮＡ複製を妨げる薬剤による初回用量の後、ワクチンの初回投与前に少なくとも２回用量の薬剤が投与される限り、その後の用量は、投与間の所望の任意の時間間隔で投与することができる。ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の投薬は、ワクチンによる処置過程の前に、その最中にまたはその後に停止することができる。
【０２３２】
ある実施形態では、初回用量に１つまたは複数の維持用量が続く。本明細書で使用されるように、用語「維持用量」とは、対象の身体で薬剤および／またはその活性代謝物の十分量を維持するように（例えば薬剤および／またはその活性代謝物について、対象身体の全身クリアランスを回避する）、そのような間隔および／または量で与えられている、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の用量を包含することを意味する。維持用量を提供することで、ワクチンの投与過程前の、その最中のおよび／またはその後のＤＮＡ複製を妨げる薬剤の免疫調節効果を、長期間延長しかつ／または維持することが可能であり得る。
【０２３３】
ある実施形態では、低用量の投与が維持される限り、免疫調節効果を維持するために、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を毎日１、２、３、４もしくは５回またはそれ以上投与することができる（例えば合計して１日の所望の低用量ということになる多回のより小用量）。例えば飲み込むピルなど、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の単回用量（すなわち投与）を、単一時点で与えてもよい。あるいは、例えば点滴静注によるなどの、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の単回用量を、短い継続した期間にわたって与えてもよい。
【０２３４】
ＤＮＡ複製を妨げる薬剤がシクロホスファミドである本発明の実施形態について、例えば６〜１８時間毎に維持用量を提供することが適切であり得る。当業者は、常法により、シクロホスファミドの、ならびに本明細書に包含されるＤＮＡ複製を妨げる他の薬剤について、維持用量のための適切な間隔を知ることになり、または決定することができるであろう。
【０２３５】
特定の実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤は、ワクチンの初回投与前、少なくとも連続２日の期間の間投与される。これらの日数の間は、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を、薬剤の１日の低用量の量を提供するように毎日少なくとも１、２、３もしくは４回、または所望の任意の回数対象に投与することができる。
【０２３６】
別の実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤は、ワクチンの初回投与前、約１週間の期間投与される。この１週間の期間、多回投与が施されてもよい。例示的実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤は、毎日、２日毎に、または記載の維持用量を提供するのに適した任意の間隔で投与することができる。例えば、本発明の方法の特定の実施形態は、ワクチンの投与前、約１週間の期間毎日２回、薬剤を投与するステップを含む。
【０２３７】
本発明の方法では、ワクチンの初回投与前、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤による処置に中断があってもよい。そのような実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の投与は、ワクチンの初回投与前、永久にまたは一時的に停止されてもよい。ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の最終回用量とワクチンの初回用量との間の期間は、対象が薬剤から免疫調節の恩恵をなお得ている限り、適切な任意の期間であることができる。例えば、限定されないが、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の投与は、ワクチンの初回用量が投与されると同時か、ワクチンの初回用量の約１週間前までの任意の時間に停止することができる。例えば、限定されないが、ワクチンの初回用量の約６、１２、１８、２４、３６、４８、６０または７２時間前にまたはそれ以上前に、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の投与を停止してもよい。特定の実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の投与は、ワクチンの初回用量の約２、４または７日前に停止される。
【０２３８】
代替の実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤による対象の処置は、薬剤の投与中の間欠的中断とともにまたはそれ無しで、ワクチンによる処置過程をとおして継続される。さらなる実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤による処置は、ワクチン接種中止後継続することができる。
【０２３９】
したがって、ある実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤は、ワクチンの各投与前の期間中、投与することができる。あるいは、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤は、ワクチンの初回投与前の期間中に投与することしかできない。
【０２４０】
本明細書で記載のように、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤による処置は、ワクチンの初回投与の後継続してもよい。ある実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の投与は、間欠的中断とともにまたはそれ無しで、ワクチンによる処置過程をとおして、毎日ベースで継続される。したがって、一部の実施形態では、薬剤は、ワクチンによる処置前におよびその最中に投与されることになる。そのような場合、ワクチン投与が開始されると、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を、ワクチンと同時に、即座に逐次的に、またはその日の異なる時間に投与することが可能である。ＤＮＡ複製を妨げる薬剤をワクチンと同時に投与するとき、その薬剤は、単一組成物として本発明のワクチン組成物に含めることができ、または別々の組成物で投与することができる。
【０２４１】
あるいは、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の投与は、ワクチンを投与する日の間一時中止してもよい。したがって、本発明のレジメンには、ワクチンの投与過程中、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の投与を中断するステップが含まれてもよい。
【０２４２】
ワクチンの初回投与前にＤＮＡ複製を妨げる薬剤を投与するステップに関する本明細書に記載の実施形態は、ワクチンの初回投与の後の薬剤投与にも適用される（例えばワクチンのそれぞれの引き続き投与前）。
【０２４３】
特に適切な実施形態として、本発明の方法は、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤による対象の規則正しい処置を含む。本発明の目的において、「規則正しい処置」、「規則正しいレジメン」または「規則正しい投薬」などは、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の正常用量の量より低い頻回投与を指すことを意味する。本明細書で使用されるように、用語「正常用量の量」とは、例えば、限定されないが、（ｉ）確立された最大耐量（ＭＴＤ）または従来の投薬スケジュールを介する標準用量、または（ｉｉ）低用量の単回ボーラス量が、その低用量の量よりもＤＮＡ複製を妨げる特定の薬剤に対して確立されている場合のいずれかを指すことができる。
【０２４４】
規則正しい投薬では、ある特定の期間にわたり、従来の投薬スケジュールを介して投与されるのと同じ、それより低い、またはそれより高い累積用量が結果として投与されてもよい。特に適切な実施形態では、このことは、投薬が実施される間の時間枠を伸ばすこと、および／または投与の頻度を増やすが、正常用量の量と比べて投与量を減少させることによって達成される。例えば、３００ｍｇ／ｍ２の低用量の量のＤＮＡ複製を妨げる薬剤を一般に投与する場合（例えば単回ボーラス注射により）、規則正しいレジメンでは、頻回低用量を投与することで、数日の期間にわたりその同じ量を投与するステップを含むことが可能である。このアプローチにより、規則正しい投薬を使用して、例えば、本明細書に記載の維持用量を提供することが可能となる。
【０２４５】
本発明の方法のある実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤での規則正しい処置は、例えば２、３、４、５、６もしくは７またはそれ以上の連続日数の期間などの、ある特定の期間にわたる、薬剤の毎日の低用量投与を包含すること意図する。規則正しい投薬のこのような日々の間、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤は、頻回で規則的な間隔でまたは様々な間隔で提供してもよい。例えば、ある実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の用量は、１、２、３、４、６、８、１２または２４時間毎に投与されてもよい。別の実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の用量は、２、３、または４日毎に投与されてもよい。
【０２４６】
本発明の方法の一部の実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤による規則正しい処置の期間中に中断またはギャップがあってもよい。このような方法では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤による規則正しい処置を投与の期間と投与無しの期間とを交互に、周期的に行うことができる。ＤＮＡ複製を妨げる薬剤は、交互の週間隔で毎日対象に投与するのが特に適切な間隔である。例えば、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を１週間投与して、次に１週間処置を一時停止して、このサイクルを繰り返す。
【０２４７】
したがってある実施形態では、本発明の方法は、１週おきに１週間の期間毎日対象にＤＮＡ複製を妨げる薬剤を投与するステップを含む。このような実施形態の特定の態様では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の投与はワクチンの初回投与の約１週間前に開始される。
【０２４８】
本発明のワクチンに関係して、一部の実施形態では、ワクチンを対象に、１週間毎に１回、２週間毎に１回または３週間毎に１回投与するのが特に適切であり得、３週間毎に１回が好ましい。しかし、ワクチン投与の頻度および期間は、所与の任意の対象に所望されるように調整することができ、かつ１週間毎に１回、２週間毎に１回または３週間毎に１回より多いまたは少ない頻度でもよい。投与の間の間隔はまた、ワクチンによる処置過程の間は一定でなくてもよい。本発明の方法では、ワクチンは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の回数で対象に投与することができる。ワクチンによる処置は、対象のがんの処置がどのくらい進行しているかに応じて、不特定の期間継続することができる。
【０２４９】
本発明の方法のある実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤は、ワクチンのそれぞれの投与前の間欠期間の間に、プライミング剤として投与してもよい。
【０２５０】
特定の実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤とサバイビンワクチンとの組合せを含む本発明の方法は、ワクチンが３週間毎に１回（例えば、０、２１、４２、６３、８４日目など）の間隔で対象に投与されることを含むことになり、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の初回投与は、初回ワクチン投与の約１週間前（例えば−７日目）に開始されかつ交互の１週間隔で継続して毎日（例えば規則正しい）である。このような処置レジメが図１に示してある。
【０２５１】
当業者に理解されるように、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤とワクチンとの投与頻度および期間は、所与の任意の対象に所望されるように調整することができる。考慮し得る要因は、例えば、ワクチン中の１つまたは複数のサバイビン抗原の性質、がんの種類、対象の年齢、身体状態、体重、性別および食事、ならびに他の臨床的要因を含む。
【０２５２】
ＤＮＡ複製を妨げる薬剤は、適切な任意の送達手段および適切な任意の投与経路により投与することができる。ある実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤は、ピル、錠剤またはカプセルの形態などで、経口投与される。代替の実施形態では、薬剤は注射（例えば静脈内）で投与される。本発明の方法の特定の実施形態では、薬剤はシクロホスファミドであり、これは経口投与される。
【０２５３】
本明細書に記載される本発明のワクチンは、経口、鼻腔、直腸または非経口投与に適した形態で製剤化することができる。非経口投与には、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内、経上皮、肺内、くも膜下腔内、および局所の投与様式が含まれる。ワクチンが、１つまたは複数のサバイビン抗原と、リポソームと、疎水性物質の連続相を含む担体とを含む組成物として製剤化される実施形態では、特に適切な投与経路は、注射の部位でデポー効果を達成するように、注射（例えば、皮内、筋肉内または皮下）であってもよい。ワクチンおよびＤＮＡ複製を妨げる薬剤は、必ずしも同じ投与経路でまたは同時に投与されるわけではない。
【０２５４】
本発明の方法の特定の実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤は、例えばシクロホスファミドなどの、アルキル化剤である。
【０２５５】
処置適応症
本明細書に記載のように、本発明の方法は、がんの処置に関する。本発明の方法で処置および／または予防可能であり得るがんには、例えば、サバイビンを発現しているか、正常細胞と比べてサバイビンを過剰発現しているあらゆるがんが含まれ得る。
【０２５６】
ある実施形態では、本発明の方法によって処置可能であり得るがんには、限定されないが、癌腫、腺癌、リンパ腫、白血病、肉腫、芽細胞腫、骨髄腫および胚細胞腫瘍が含まれる。ある実施形態では、がんは固形腫瘍の形態である。限定されないが、特に適切な実施形態には、神経膠芽腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、卵管がん、または腹膜がんが含まれる。
【０２５７】
一部の実施形態では、対象は腫瘍の大きなバルクを除去する外科手術を受けていてもよく、本発明の方法を腫瘍バルク切除前および／またはその後に適用することができる。他の実施形態では、対象は、がん性または悪性細胞を制御するか死滅させる放射線療法、化学療法、または他の何らかの非外科的処置を施されていてもよく、本発明の方法は、このような療法に先立ちまたはそれに続いて適用することができる。ある特定の実施形態では、がんは、進行ステージにある。
【０２５８】
本明細書で使用するように、用語「腫瘍」、「腫瘍細胞」、「がん」および「がん細胞」（互換的に使用される）とは、細胞増殖の制御のかなりの喪失または不死化された細胞によって特徴付けられる異常増殖を示す細胞を指す。用語「がん」または「腫瘍」には、転移性だけでなく非転移性のがんまたは腫瘍が含まれる。がんは、悪性腫瘍の存在を含めて、当分野で一般に容認されている基準を使用して診断することができる。
【０２５９】
本明細書で言及される「処置すること」もしくは「の処置」、または「予防すること」もしくは「の予防」とは、臨床結果を含めて、有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。有益なまたは所望の臨床結果には、それらに限定されないが、１つもしくは複数の症状または状態の軽減または改善、疾患の程度の低下、疾患の状態の安定化、疾患の発達の予防、疾患の拡散の予防、疾患進行の遅延または減速、疾患発症の遅延または減速、病原因子に対して防御免疫を付与すること、および疾患状態の改善または緩和が含まれ得る。「処置すること」または「予防すること」はまた、処置の不在下で予想されるものを越えて患者の生存期間を長くすることを意味することもでき、疾患の進行を一時的に阻止することも意味することもできるが、より好ましくは、それは、対象の感染を予防することによるなどの、疾患の発生を予防することを含む。「処置すること」または「予防すること」とはまた、腫瘍塊のサイズにおける縮小も指すことができる。
【０２６０】
がんの処置および／または予防では、本発明の方法を使用して、この表現が本明細書で記載されているように、「ワクチンの有効性を向上させる」ことができる。これには、細胞媒介性免疫応答もしくは液性免疫応答のいずれかまたは双方の誘導における、ワクチンの有効性を向上させることが含まれ得る。これには、腫瘍誘導の免疫抑制を低下させることも含まれ得る。
【０２６１】
本明細書で使用されるように、免疫応答を「誘導すること」または「誘導する」とは、免疫応答を誘発し、向上させ、および／または強化することである。免疫応答を誘導することとは、前の免疫応答状態、例えば本発明の方法の適用前と比較して、免疫応答が対象の利益にとって増強されるか、上昇するか、向上されるかまたは強化される場合を包含する。
【０２６２】
本明細書で使用されるように、用語「細胞媒介性免疫応答」とは、対象の身体への抗原の導入に応答して対象の身体で、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞またはサイトカインの量が増加することを指す。
【０２６３】
細胞媒介性免疫とは、抗体とは関係せずむしろ、マクロファージおよびナチュラルキラー細胞の活性化、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の産生および抗原に応答した様々なサイトカインの放出と関係している免疫応答である。細胞傷害性Ｔリンパ球とは、感染体細胞または腫瘍細胞の死を誘導することのできるＴリンパ球のサブグループ（白血球の一種）であって、細胞傷害性Ｔリンパ球は、ウイルス（または他の病原体）に感染した細胞を、またはそうでなければ、障害を受けたか、もしくは機能障害にある細胞を死滅させる。
【０２６４】
ほとんどの細胞傷害性Ｔ細胞は、クラスＩＭＨＣ分子に結合する特異的ペプチド抗原を認識できるＴ細胞受容体を発現する。このようなＣＴＬはＣＤ８（ＣＤ８＋Ｔ細胞）も発現し、このＣＤ８はクラスＩＭＨＣ分子の一部分に誘引される。このような親和性により、抗原特異的活性化の間、ＣＴＬと標的細胞との互いの密接な結合が保たれる。
【０２６５】
細胞性免疫は、例えば、ウイルス感染細胞、細胞内細菌を有する細胞、および腫瘍抗原を提示するがん細胞などの外来抗原のエピトープをその表面に提示する体細胞を溶解する能力のある抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（例えば、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞）を活性化することにより；マクロファージおよびナチュラルキラー細胞を活性化して、それらが細胞内病原体を破壊できるようにすることにより；および細胞を刺激して、適応免疫応答および自然免疫応答に関与するその他の細胞の機能に影響を及ぼす多様なサイトカインを分泌することにより、身体を保護している。
【０２６６】
細胞性免疫は、適応免疫応答の重要な構成要素であり、樹状細胞、Ｂリンパ球および、程度は低いがマクロファージなどの抗原提示細胞との相互作用を通じての細胞による抗原認識を受けて、
１．ウイルス感染細胞、細胞内細菌を有する細胞、および腫瘍抗原を提示するがん細胞などの外来抗原のエピトープをその表面に提示する体細胞において、アポトーシスを誘導する能力のある抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化すること；
２．マクロファージおよびナチュラルキラー細胞を活性化して、それらが細胞内病原体を破壊できるようにすること；および
３．細胞を刺激して、適応免疫応答および自然免疫応答に関与するその他の細胞の機能に影響を及ぼす多様なサイトカインを分泌すること、
などの様々な機構によって身体を保護している。
【０２６７】
細胞媒介性免疫は、ウイルス感染細胞を除去するのに最も効果的であるが、真菌、原生動物、がん、および細胞内細菌に対する防御にも関与する。また、それは移植拒絶においても重要な役割を果たす。
【０２６８】
細胞媒介性免疫は、様々な細胞種の関与を伴い、異なる機構によって媒介されるので、いくつかの方法を使用して、本発明の方法の適用後の免疫性の誘導および有効性の向上を実証することができる。これらは、ｉ）特異的抗原提示細胞、ｉｉ）特異的エフェクター細胞およびそれらの機能、およびｉｉｉ）サイトカインなどの可溶性メディエーターの放出の検出に、広く分類することができる。
【０２６９】
ｉ）抗原提示細胞：樹状細胞およびＢ細胞（および程度は低いがマクロファージ）にはＴ細胞の活性化の増強を可能にする特別な免疫賦活性受容体が備わっており、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）と名付けられる。これらの免疫賦活性分子（共刺激分子とも呼ばれる）は、感染またはワクチン接種後、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞などのエフェクター細胞への抗原提示のプロセスの間に、これらの細胞で上方制御される。かかる共刺激分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩなど）は、ＡＰＣを特異的に同定する抗体（樹状細胞に対するＣＤ１１ｃなど）とともに、これらの分子に対する蛍光色素コンジュゲート抗体によるフローサイトメトリーを使用することにより検出することができる。
【０２７０】
ｉｉ）細胞傷害性Ｔ細胞：（Ｔｃ、キラーＴ細胞、または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）としても公知）は、Ｔ細胞のサブグループであり、ウイルス（および他の病原体）に感染したか、または腫瘍抗原を発現している細胞の死を誘導する。このようなＣＴＬは、その表面にある特定の外来分子または異常分子を有する他の細胞を直接攻撃する。かかる細胞傷害性の能力は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞溶解アッセイ（クロム放出アッセイ）を使用して検出することができる。したがって、適応的細胞性免疫の誘導は、かかる細胞傷害性Ｔ細胞の存在により実証することができ、この際、抗原を負荷した場合に、標的細胞はワクチン接種または感染後にｉｎ  ｖｉｖｏで産生される特異的ＣＴＬにより溶解される。
【０２７１】
ナイーブ細胞傷害性Ｔ細胞は、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）がペプチドに結合したＭＨＣクラスＩ分子と強く相互作用する時に活性化する。この親和性は、抗原／ＭＨＣ複合体の種類および配向に依存し、ＣＴＬと感染細胞を一緒に結びつけておくものである。ひとたび活性化するとＣＴＬは、クローン増殖と呼ばれるプロセスを経て、そこでＣＴＬは機能性を得、急速に分裂して、「武装した」エフェクター細胞の軍隊を産生する。活性化したＣＴＬは、次に、その特有のＭＨＣクラスＩ＋ペプチドを有する細胞を探して全身を移動する。このことを使用して、フローサイトメトリーアッセイにおいてペプチド−ＭＨＣクラスＩ四量体を使用することにより、かかるＣＴＬをｉｎ  ｖｉｔｒｏで同定することができる。
【０２７２】
そのような感染もしくは機能障害性体細胞に曝露されると、エフェクターＣＴＬは、パーフォリンおよびグラニュライシン、すなわち、標的細胞の細胞膜に孔を形成し、イオンおよび水を感染細胞に流入させ、その細胞をバーストさせるかまたは溶解する細胞毒素を放出する。ＣＴＬは、グランザイム、孔を経由して細胞に侵入してアポトーシス（細胞死）を誘導するセリンプロテアーゼを放出する。ＣＴＬからのこれらの分子の放出を、ワクチン接種後の細胞性免疫応答の誘導の成功の尺度として使用することができる。これは、ＣＴＬを定量的に測定することのできる酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または酵素免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）により行うことができる。ＣＴＬはＩＦＮ−γなどの重要なサイトカインを産生する能力もあるので、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８細胞の定量的測定は、ＥＬＩＳＰＯＴにより、および、そのような細胞での細胞内ＩＦＮ−γのフローサイトメトリー測定により達成することができる。
【０２７３】
ＣＤ４＋「ヘルパー」Ｔ細胞：ＣＤ４＋リンパ球、またはヘルパーＴ細胞は、免疫応答メディエーターであり、適応免疫応答の能力を確立しかつ最大化する際に重要な役割を果たす。これらの細胞は細胞傷害活性も食作用活性も持たず、さらに、感染細胞を死滅させることも病原体を取り除くこともできないが、他の細胞にこれらの任務を行うよう命令することによって本質的に免疫応答を「管理する」。Ｔｈ１およびＴｈ２と名付けられた、２種類のエフェクターＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞応答をプロフェッショナルＡＰＣにより誘導することができ、各々は異なる種類の病原体を排除するよう設計されている。
【０２７４】
ヘルパーＴ細胞は、クラスＩＩＭＨＣ分子に結合した抗原を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。ナイーブヘルパーＴ細胞の活性化は、ナイーブヘルパーＴ細胞にサイトカインを放出させ、このことは、ナイーブヘルパーＴ細胞を活性化させたＡＰＣを含めて、多くの細胞種の活性に影響を及ぼす。ヘルパーＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞よりもはるかに穏やかな活性化刺激を必要とする。ヘルパーＴ細胞は、細胞傷害性細胞を活性化する「助けとなる」特別なシグナルをもたらすことができる。Ｔｈ１およびＴｈ２と名付けられた、２種類のエフェクターＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞応答をプロフェッショナルＡＰＣにより誘導することができ、各々は異なる種類の病原体を排除するよう設計されている。これら２つのＴｈ細胞集団は、産生するエフェクタータンパク質（サイトカイン）のパターンの点で異なる。一般に、Ｔｈ１細胞は、マクロファージおよび細胞傷害性Ｔ細胞の活性化により細胞性免疫応答を補助し、一方、Ｔｈ２細胞は、形質細胞への変換のためのＢ細胞の刺激により、および抗体の形成により液性免疫応答を促進する。例えば、Ｔｈ１細胞により調節される応答は、マウスにおいてＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ（ヒトにおいてＩｇＧ１およびＩｇＧ３）を誘導し、抗原に対する細胞媒介性免疫応答に有利にはたらくことができる。抗原に対するＩｇＧ応答がＴｈ２型細胞により調節される場合、それは主にマウスにおけるＩｇＧ１（ヒトにおけるＩｇＧ２）の産生を増強することができる。Ｔｈ１またはＴｈ２応答に関連するサイトカインの測定により、ワクチン接種の成功の尺度が得られるであろう。これは、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αなどのＴｈ１サイトカイン、または数ある中でもＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ１０などのＴｈ２サイトカインのために設計された特異的ＥＬＩＳＡにより達成することができる。
【０２７５】
ｉｉｉ）所属リンパ節から放出されたサイトカインの測定は免疫の成功の良い指標となる。抗原提示ならびにＡＰＣ、およびＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞の成熟の結果として、数種類のサイトカインがリンパ節細胞により放出される。これらのＬＮＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗原の存在下で培養することにより、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦなどの、特定の重要なサイトカインであれば、放出を測定することにより抗原特異的免疫応答を検出することができる。これは、培養上清および標準品として組換えサイトカインを使用するＥＬＩＳＡにより行うことができる。
【０２７６】
免疫の成功は、当業者に公知のいくつかの方法で決定することができ、それには限定されないが、機能的抗体を検出するための赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）および血清中和阻害アッセイ；ワクチン接種した対象を関連する病原体によるチャレンジに付して、ワクチン接種の有効性を決定するチャレンジ試験；および、例えば活性化リンパ球またはメモリーリンパ球の同定において、特異的細胞表面マーカーを発現する細胞の集団を決定する、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）の使用が挙げられる。当業者はまた、本発明の方法により細胞媒介性免疫応答の有効性が向上されたかどうかを、他の公知の方法を使用して決定することができる。例えば、Current Protocols in Immunology Coligan et al., ed. (Wiley Interscience, 2007)を参照されたい。
【０２７７】
一部の実施形態では、本発明の方法を使用して、液性免疫応答を誘導することで、または液性免疫応答の誘導におけるワクチンの有効性を向上させることで、がんを処置することも可能である。そのような実施形態は、本発明のワクチンがサバイビン抗原以外の、本明細書に記載のようなさらなる抗原を含む場合、特別な用途を有することがある。このような方法には、細胞媒介性免疫応答および液性免疫応答の双方を誘導することでがんを処置することが含まれてもよい。
【０２７８】
液性免疫応答とは、細胞媒介性免疫とは対照的に、Ｂリンパ球系列（Ｂ細胞）の細胞中で産生される分泌抗体によって媒介される。このような分泌抗体は、例えば外来物質および／または病原体（例えばウイルス、細菌など）の表面の抗原などの、抗原に結合し、破壊するためそれら物質および病原体をフラグする。
【０２７９】
「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片により実質的にまたは部分的にコードされる１つまたは複数のポリペプチドを含むタンパク質である。認められている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、κまたはλとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、これらによって、それぞれ免疫グロブリンのクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥが定義される。一般的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、４つのポリペプチドを含有するタンパク質を含む。各々の抗体構造単位は、２本の同一ポリペプチド鎖対で構成され、各々が１本の「軽」鎖および１本の「重」鎖を有する。各々の鎖のＮ末端によって、抗原認識を主に担う可変領域が定義される。抗体構造単位（例えばＩｇＡおよびＩｇＭクラスのもの）はまた、例えばＪ鎖ポリペプチドと会合しているＩｇＭ五量体のように、相互におよびさらなるポリペプチド鎖と集まってオリゴマー形態を構築することができる。
【０２８０】
抗体は、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）と呼ばれる白血球のサブセットの抗原特異的糖タンパク質産物である。抗原とＢ細胞の表面に発現した抗体との結合により、Ｂ細胞の刺激を含む抗体応答が誘導され、活性化され、有糸分裂を経て形質細胞に最終分化することができ、この形質細胞が抗原特異的抗体の合成および分泌に特化している。
【０２８１】
Ｂ細胞は、免疫応答の間の抗体の唯一の生産者であり、したがって効果的な液性免疫の鍵となるエレメントである。抗体の大量産生に加えて、Ｂ細胞は、抗原提示細胞の役割もし、ＴヘルパーＣＤ４または細胞傷害性ＣＤ８などのＴ細胞に抗原を提示することができ、このように免疫応答を広める。Ｂ細胞、ならびにＴ細胞は、ワクチンの有効性を促進し得る適応免疫応答の一部である。ワクチン接種または自然感染のいずれかによって誘導される能動免疫応答の間、抗原特異的Ｂ細胞は活性化され、クローン的に増殖する。増殖の間、Ｂ細胞はエピトープに対してより高い親和性を有するように進化する。Ｂ細胞の増殖は、活性化Ｔヘルパー細胞によって間接に誘導することができ、またｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）などの受容体の刺激を通して直接に誘導することもできる。
【０２８２】
樹状細胞およびＢ細胞などの抗原提示細胞は、ワクチン接種部位に引き寄せられ、ワクチンに含有される抗原およびアジュバントと相互作用することができる。アジュバントは細胞を刺激して活性化させ、抗原は標的の青写真を提供する。異なる種類のアジュバントは、異なる刺激シグナルを細胞に送る。例えば、ポリＩ：Ｃポリヌクレオチド（ＴＬＲ３アゴニスト）は、樹状細胞を活性化することができるが、Ｂ細胞を活性化することはできない。Ｐａｍ３Ｃｙｓ、Ｐａｍ２ＣｙｓおよびＦＳＬ−１などのアジュバントは、Ｂ細胞を活性化してその増殖を開始させるのが特に得意であり、このことが抗体応答の生成を促進すると予想される（Moyle et al., Curr Med Chem, 2008; So ., J Immunol, 2012）。
【０２８３】
本明細書で使用されるように、用語「抗体応答」とは、対象の体内への抗原の導入に応答した、対象の身体における抗原特異的抗体の量の増加を指す。
【０２８４】
抗体応答を評価する１つの方法は、特定の抗原と反応性である抗体の力価を測定することである。これは、動物から得られる抗体含有物質の酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの、当分野で公知の様々な方法を使用して実施することができる。例えば、特定の抗原に結合する血清抗体の力価は、抗原への曝露の前と後の両方において対象で決定することができる。抗原への曝露の後の抗原特異的抗体の力価における統計的に有意な増加によって、対象が抗原への抗体応答を開始したことが示されるであろう。
【０２８５】
抗原特異的抗体の存在を検出するために使用できる他のアッセイには、限定されないが、免疫学的アッセイ（例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））、免疫沈降アッセイおよびタンパク質ブロット（例えばウェスタンブロット）アッセイ、ならびに中和アッセイ（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏかｉｎ  ｖｉｖｏアッセイでのウイルス伝染力の中和）が含まれる。
【０２８６】
本発明の方法は、液性免疫応答の誘導におけるワクチンの有効性を向上させることによって、がんを処置および／または予防することができる。
【０２８７】
液性免疫応答は、有効な感染性疾患ワクチンの主な機構である。しかし、液性免疫応答は、がんと闘うためにも有用であり得る。がん細胞を認識して破壊することができる細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を起こすように設計されるがんワクチンを補完しながら、Ｂ細胞により媒介される応答は、一部の場合では最大恩恵のために細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞と協力することができる他の機構を通して、がん細胞を標的にすることができる。Ｂ細胞により媒介される（例えば液性免疫応答により媒介される）抗腫瘍応答の機構の例には、限定されずに、以下のものが含まれる：１）腫瘍細胞または腫瘍形成に影響する他の細胞の上で見出される表面抗原に結合するＢ細胞によって産生される抗体。例えば、そのような抗体は、免疫系が認識することができるさらなる抗原の放出を潜在的にもたらす、抗体依存性の細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または補体結合を通して、標的細胞の死滅を誘導することができる、２）腫瘍細胞の上の受容体に結合してそれらの刺激をブロックし、事実上それらの作用を中和する抗体、３）腫瘍または腫瘍関連細胞によって放出されるかそれに関連する因子に結合して、がんを支えるシグナル伝達または細胞経路を調節する抗体、および４）細胞内標的に結合し、かつ現在未知の機構を通して抗腫瘍活性を媒介する抗体。
【０２８８】
本発明の方法により処置される対象は、任意の脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトであることができる。
【０２８９】
キットおよび試薬
本発明の方法を実施するため、本明細書に記載の組成物は、任意選択でキットとして使用者に提供することができる。例えば、本発明のキットは、本発明の組成物の１つまたは複数の構成成分を含有する。キットは、１つまたは複数のさらなる試薬、パッケージ材料、キットの構成成分を保持するための容器、およびキット構成成分を使用する好ましい方法を詳述するインストラクションセットまたは使用者マニュアルをさらに含むことができる。
【０２９０】
特定の実施形態では、本発明のワクチン（例えばＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ）は２つの容器を含有するキットとして供給される。容器１は、例えば、真空凍結乾燥アジュバント系（例えばリポソーム）、サバイビン抗原およびアジュバントを含んでいてもよい。容器２は、例えば、油構成成分（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ５１  ＶＧ）のみを含有していてもよい。再構成ワクチンの適切な容積（０．１または０．５ｍＬ）を皮下注射することができる。
【０２９１】
ある実施形態では、キットはＤＮＡ複製を妨げる薬剤をさらに含有していてもよい。ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を第３の容器でキットに含めることができ、または、この薬剤を上記の容器１もしくは容器２に含めることができる。特定の実施形態では、キットに含まれているＤＮＡ複製を妨げる薬剤とは、例えばシクロホスファミドなどの、アルキル化剤である。
【０２９２】
本発明の実施形態
本発明の特定の実施形態には、限定されないが以下のものが含まれる：
【０２９３】
（１）対象のがんの処置におけるワクチンの有効性を向上させるための方法であって、
（ｉ）対象に、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を、免疫調節効果をもたらすのに十分な量で少なくとも２回投与するステップと、
（ｉｉ）続いて対象に、少なくとも１つのサバイビン抗原を含む治療有効量のワクチンを投与するステップと
を含むか、それらからなるか、または本質的になる、方法。
【０２９４】
（２）ワクチンを投与する少なくとも２日前、好ましくは、ワクチンを投与する少なくとも４日前に、対象に初回用量の薬剤を投与するステップを含む、段落（１）に記載の方法。
【０２９５】
（３）ワクチンを投与する約１週間前に、対象に初回用量の薬剤を投与するステップを含む、段落（１）に記載の方法。
【０２９６】
（４）少なくとも連続２日間の期間、薬剤を投与するステップを含む、段落（１）から（３）のいずれか一段落に記載の方法。
【０２９７】
（５）対象に初回用量の薬剤を投与し、それに続いて、維持用量の薬剤を１回または複数回投与するステップを含む、段落（１）から（４）のいずれか一段落に記載の方法。
【０２９８】
（６）ワクチンを投与する前に毎日少なくとも１回、２回、３回または４回、薬剤を対象に投与するステップを含む、段落（１）から（５）のいずれか一段落に記載の方法。
【０２９９】
（７）ワクチンを投与する前に、約１週間の期間、毎日２回、薬剤を投与するステップを含む、段落（１）から（６）のいずれか一段落に記載の方法。
【０３００】
（８）ワクチンを投与する前に、対象に薬剤を投与するステップを停止する、段落（１）から（７）のいずれか一段落に記載の方法。
【０３０１】
（９）ワクチンを投与する間、対象に薬剤を投与するステップを継続する、段落（１）から（７）のいずれか一段落に記載の方法。
【０３０２】
（１０）３週毎に約１回、ワクチンを対象に投与するステップを含む、段落（１）から（９）のいずれか一段落に記載の方法。
【０３０３】
（１１）２回、３回、４回またはそれ以上の回数、ワクチンを対象に投与するステップを含む、段落（１）から（１０）のいずれか一段落に記載の方法。
【０３０４】
（１２）ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を、規則正しいレジメンで対象に投与するステップを含む、段落（１）から（１１）のいずれか一段落に記載の方法。
【０３０５】
（１３）規則正しいレジメンが、１週おきに約１週間の期間、薬剤を対象に毎日投与するステップを含む、段落（１２）に記載の方法。
【０３０６】
（１４）初回用量のワクチンを投与する約１週間前から、薬剤を対象に投与するステップを含み、かつ３週毎に約１回、ワクチンを対象に投与するステップを含む、段落（１３）に記載の方法。
【０３０７】
（１５）サバイビン抗原がペプチド抗原であるか、または抗原をコードする核酸である、段落（１）から（１４）のいずれか一段落に記載の方法。
【０３０８】
（１６）サバイビン抗原が、対象に細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘発することのできるサバイビンタンパク質（配列番号１１）由来のアミノ酸配列を含むか、それからなるか、もしくは本質的になるペプチド抗原であるか、または前記ペプチド抗原をコードする核酸分子である、段落（１）から（１５）のいずれか一段落に記載の方法。
【０３０９】
（１７）サバイビン抗原が、アミノ酸配列、FEELTLGEF（配列番号１）；FTELTLGEF（配列番号２）；LTLGEFLKL（配列番号３）；LMLGEFLKL（配列番号４）；RISTFKNWPF（配列番号５）；RISTFKNWPK（配列番号６）；STFKNWPFL（配列番号７）；およびLPPAWQPFL（配列番号８）もしくはそれらの任意の組合せを含むか、それからなるか、もしくは本質的になるペプチド抗原であるか、または前記ペプチド抗原をコードする核酸分子である、段落（１）から（１６）のいずれか一段落に記載の方法。
【０３１０】
（１８）少なくとも１つのサバイビン抗原が、アミノ酸配列、FTELTLGEF（配列番号２）；LMLGEFLKL（配列番号４）；RISTFKNWPK（配列番号６）；STFKNWPFL（配列番号７）またはLPPAWQPFL（配列番号８）を含む５つのペプチド抗原の混合物を含むか、それからなるか、または本質的になる、段落（１）から（１４）のいずれか一段落に記載の方法。
【０３１１】
（１９）ＤＮＡ複製を妨げる薬剤が、急速に分裂している免疫系細胞を選択的に標的とし、プログラム細胞死を引き起こすことができる、段落（１）から（１８）のいずれか一段落に記載の方法。
【０３１２】
（２０）ＤＮＡ複製を妨げる薬剤がアルキル化剤である、段落（１）から（１９）のいずれか一段落に記載の方法。
【０３１３】
（２１）アルキル化剤がナイトロジェンマスタードアルキル化剤である、段落（２０）に記載の方法。
【０３１４】
（２２）ナイトロジェンマスタードアルキル化剤がシクロホスファミドである、段落（２１）に記載の方法。
【０３１５】
（２３）免疫調節効果をもたらすのに十分な量が約２５〜３００ｍｇ／日、好ましくは約５０〜１００ｍｇ／日、より好ましくは約１００ｍｇ／日のシクロホスファミドである、段落（２２）に記載の方法。
【０３１６】
（２４）免疫調節効果をもたらすのに十分な量が、１用量あたり約５０ｍｇのシクロホスファミドである、段落（２２）または（２３）に記載の方法。
【０３１７】
（２５）シクロホスファミドを対象に経口投与するステップを含む、段落（２２）から（２４）のいずれか一段落に記載の方法。
【０３１８】
（２６）ワクチンを対象に皮下注射などの注射により投与するステップを含む、段落（１）から（２５）のいずれか一段落に記載の方法。
【０３１９】
（２７）ワクチンが、少なくとも１つのサバイビン抗原と、リポソームと、疎水性物質の連続相を含む担体とを含むか、それらからなるか、または本質的になる組成物である、段落（１）から（２６）のいずれか一段落に記載の方法。
【０３２０】
（２８）組成物がＴヘルパーエピトープをさらに含む、段落（２７）に記載の方法。
【０３２１】
（２９）Ｔヘルパーエピトープが、アミノ酸配列AQYIKANSKFIGITEL（配列番号９）を含むか、それからなるか、または本質的になるペプチドである、段落（２８）に記載の方法。
【０３２２】
（３０）組成物がアジュバントをさらに含む、段落（２７）から（２９）のいずれか一段落に記載の方法。
【０３２３】
（３１）アジュバントがポリＩ：Ｃポリヌクレオチドである、段落（３０）に記載の方法。
【０３２４】
（３２）担体が、植物油、ナッツオイルまたは鉱物油などの疎水性物質である、段落（２７）から（３１）のいずれか一段落に記載の方法。
【０３２５】
（３３）担体が鉱物油であるか、または鉱物油溶液中のオレイン酸マンニド、例えばＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ５１である、段落（２７）から（３１）のいずれか一段落に記載の方法。
【０３２６】
（３４）薬剤が、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性または数を増加させるなど、抗原に対する免疫応答を直接増強することによって、ワクチンの有効性を向上させる、段落（１）から（３３）のいずれか一段落に記載の方法。
【０３２７】
（３５）抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性または数を増加させるステップが、総ＣＤ８＋Ｔ細胞数の相対的減少による、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の濃縮を伴う、段落（３４）に記載の方法。
【０３２８】
（３６）薬剤が、例えばＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、骨髄由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）および／またはＣＤ１９＋ＣＤ１ｄ＋ＣＤ５＋Ｂ細胞（Ｂｒｅｇ）などの抑制性免疫細胞の数または活性を低減することによって、ワクチンの有効性を向上させる、段落（１）から（３３）のいずれか一段落に記載の方法。
【０３２９】
（３７）がんが皮下固形腫瘍である、段落（１）から（３６）のいずれか一段落に記載の方法。
【０３３０】
（３８）がんが卵巣がん、卵管がんまたは腹膜がんである、段落（１）から（３６）のいずれか一段落に記載の方法。
【０３３１】
（３９）対象がヒトである、段落（１）から（３８）のいずれか一段落に記載の方法。
【０３３２】
（４０）がんの処置におけるワクチンの有効性を向上させるための、少なくとも１つのサバイビン抗原を含むか、それからなるか、または本質的になるワクチンと組み合わせた、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の使用であって、薬剤は、ワクチンの前に少なくとも２回投与するためものである、使用。
【０３３３】
（４１）段落（１）から（３９）のいずれか一段落に記載の方法に使用するための、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤と、少なくとも１つのサバイビン抗原を含むか、それからなるか、または本質的になるワクチンとの組合せ。
【０３３４】
（４２）段落（１）から（３９）のいずれか一段落に記載の方法において使用するための、本明細書に記載の組成物。
【０３３５】
本発明は、以下の非限定例でさらに例示される。
【実施例】
【０３３６】
[実施例１]
米国（ＩＮＤ＃１４７３１）およびカナダ（ＣＴＡ−Ａ＃１５５３０１）にて実施された第Ｉ相試験により、卵巣がん患者においてシクロホスファミドと組み合わせたＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃの安全性および免疫効能性を調べた。
【０３３７】
ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃは、様々なＨＬＡ拘束性（ＨＬＡ−Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ２４およびＢ７）を備える、サバイビンタンパク質配列に由来する１つのデカペプチドおよび４つのノナペプチドを含有する、抗がん免疫療法の候補ワクチンである。詳細には、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃは、アミノ酸配列、FTELTLGEF（配列番号２）、LMLGEFLKL（配列番号４）、RISTFKNWPK（配列番号６）、STFKNWPFL（配列番号７）、およびLPPAWQPFL（配列番号８）を有する５つの合成サバイビンペプチド抗原と、破傷風トキソイドからの汎用Ｔヘルパーエピトープ（AQYIKANSKFIGITEL、配列番号９）と、ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドアジュバントと、ＤＯＰＣおよびコレステロールからなるリポソームと、疎水性担体Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ５１  ＶＧとを含む。ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃワクチンはサバイビンを標的とするように設計されている。
【０３３８】
臨床試験では、白金化学療法で処置し、疾患の進行を示さない、進行卵巣がんの患者１９人のうち１８人がワクチン療法を終了した。コホートＡ（６患者）は、３週間の間隔をあけて、３回の０．５ｍＬワクチン注射を受け、コホートＢおよびコホートＣ（それぞれ６患者）は、規則正しい低用量経口シクロホスファミドと組合せで、３回の０．１ｍＬまたは０．５ｍＬワクチン注射をそれぞれ受けた。臨床試験は、図１に示すスケジュールにそって実施した。
【０３３９】
ＣＴＣＡＥｖ４．０を使用して有害事象を評価した。血液を採取して、免疫機能およびワクチン誘導性のＴ細胞免疫性を調べた（分析は（ｉ）ＥＬＩＳＰＯＴ、（ｉｉ）四量体分析および（ｉｉｉ）マルチパラメトリック細胞内サイトカイン染色によって実施した）。ベースラインでのおよび１、２および３回注射後の、ＥＬＩＳＰＯＴによる免疫性の繰り返し測定値を、一般リニアモデルを使用して統計学的に解析した。
【０３４０】
（ｉ）機能的抗原特異的ＰＢＭＣを検出するためのＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
臨床試験対象から採取した凍結ＰＢＭＣ試料を、特定の試験抗原に対するリコール応答についてＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで試験した。解凍ＰＢＭＣをプールした５種のサバイビンペプチドでおよび対象のＨＬＡ型に応じて対応するペプチド（複数可）で刺激した。抗原への応答、陰性対照（培地中細胞のみ）および陽性対照（ＰＨＡ）を重複のウェル中で試験した。抗原を５０および５μｇ／ｍｌの濃度で試験することで、抗原特異性に加えて用量依存性も試験した。ＰＢＭＣ臨床試料を、健常対照対象に由来する性別が適合したＰＢＭＣとともに、９６ウェルＥＬＳＰＯＴプレートに３００，０００細胞／ウェルの濃度で播種した。
【０３４１】
１日目、プレートは、ＰＢＳで希釈した一次抗体８０μｌ／ウェルでコートし、このプレートを湿潤ボックス中で一晩冷却する。２日目、プレートをＰＢＳ２００μｌ／ウェルで３回洗浄し、プレートをフリックして過剰なＰＢＳを除去した。Ｔ細胞の活性化に所望の１００μｌ／ウェルの抗原（複数可）を添加し、続いて試験または対照ＰＢＭＣを１００μｌ／ウェル添加した。ＩＦＮ−γ分泌のため、細胞を湿潤インキュベーター中３７℃で２４時間インキュベートした。このステップまで、全てのステップは無菌条件下で実施した。３日目、プレートをＰＢＳで３回、ＰＢＳ−ＴＷＥＥＮで３回洗浄し、続いてＰＢＳ−ＴＷＥＥＮ−ＢＳＡのビオチン化二次抗体を８０μｌ／ウェル添加し、一晩冷蔵庫中、湿潤ボックス中でインキュベートした。４日目、プレートをＰＢＳ−ＴＷＥＥＮ２００μｌ／ウェルで３回洗浄し、続いてＰＢＳ−ＢＳＡの３次検出試薬を１００μｌ／ウェル添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−ＴＷＥＥＮで３回、ＰＢＳで３回洗浄し、調製したばかりの展開溶液２００μｌ／ウェルが添加されることになる。スポットの展開を室温で一般には１０〜６０分間モニターし、対照ウェルの培地中で発色がないことおよび抗原含有ウェル中でのスポットの出現を注意深くチェックした。プレートをフリックしながら、水道水でプレートをすすぐことで反応を停止させた。プレートを一晩空気乾燥させ、暗所にて室温で貯蔵した。次いで、自動プレートアナライザーを使用して、ＥＬＩＳＰＯＴプレートをスキャンした。ＳＦＵの生カウント数を処理しまとめて、ＰＢＭＣによる抗原誘導性ＩＦＮ−γ分泌に関するデータを得た。
【０３４２】
ＥＬＩＳＰＯＴ材料：
溶液：
１．ＰＢＳ：無菌組織培養試験済み
２．０．０５％ＰＢＳ−ＴＷＥＥＮ：例えば１ＬのＰＢＳ中５００μｌＴｗｅｅｎ−２０
３．１％ＰＢＳ−ＢＳＡ：例えば１ＬのＰＢＳ中１０ｇのＢＳＡ−フラクションＶ（１％）
４．１％ＰＢＳ−ＴＷＥＥＮ−ＢＳＡ：例えば１ＬＰＢＳ−ＴＷＥＥＮに１０ｇのＢＳＡ−フラクションＶを加えたもの
培地：
１％Ｌ−グルタミンを補った無血清試験培地。
試験細胞：
ヒトＰＢＭＣ（液体窒素で凍結および解凍）
試験試料の１ウェルあたり３ｘ１０５細胞
インキュベーター：３７℃、加湿、７％ＣＯ２
ＡＥＣ溶液：
ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ，ジメチルホルムアミド）１０ｍｌ中ＡＥＣ（３−アミノ−９−エチルカルバゾール）１００ｍｇ
ヒュームフードにて、ガラス管中で調製
ＡＥＣ緩衝剤（０．１Ｍ酢酸塩）
０．２Ｍ酢酸（Ｈ２Ｏ１Ｌあたり氷酢酸１１．５５ｍｌ）１４８ｍｌに０．２Ｍ酢酸ナトリウム（Ｈ２Ｏ１Ｌあたり２７．２ｇ）３５２ｍｌを加える。
Ｈ２Ｏで１Ｌとする。ｐＨ５．０に調整
展開溶液（即時使用）：
ＡＥＣ溶液８００μｌにＡＥＣ緩衝剤２４ｍｌを加える。０．４５μｍで濾過。Ｈ２Ｏ２（３０％）１２μｌを添加
【０３４３】
（ｉｉ）ＭＨＣ多量体（四量体）を使用する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞
ＭＨＣ多量体試薬は、ワクチン接種対象に生じる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を同定する助けとなる。このような特異的Ｔ細胞はＴＣＲを発現し、このＴＣＲは、（ＭＨＣ分子とコンジュゲートすると）ワクチンで使用されているペプチド（複数可）を認識しかつそれに結合することができる。ワクチンペプチドへの免疫応答が、抗原特異的Ｔ細胞の増殖により反映される。そのようなＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＰＢＭＣ解凍後すぐにｅｘ  ｖｉｖｏで、ならびにＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃに含まれるサバイビンペプチド抗原の存在下でｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激およびサイトカイン誘導増殖後に、直接測定した。
【０３４４】
四量体（ＨＬＡ−Ａ１、Ａ２およびＡ３についてはＢｅｃｋｍａｎ  ＣｏｕｌｔｅｒまたはＴＣ  Ｍｅｔｒｉｘ、ＨＬＡ−Ａ２４およびＢ７についてはＴＣ  Ｍｅｔｒｉｘ）などの、ＭＨＣ多量体試薬を、ワクチン誘導のＣＤ８＋Ｔ細胞の特異的検出に使用した。アッセイでは、ｅｘ  ｖｉｖｏでのＰＢＭＣおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化したＰＢＭＣ双方に、対照ＰＢＭＣおよび対照ＭＨＣ多量体試薬を使用した。ＣＭＶ特異的ＭＨＣ多量体とともにＣＭＶ＋公知の健常ドナーのＰＢＭＣを、陽性対照として使用した。ＨＩＶ−特異的試薬を、アッセイ内およびアッセイ間妥当性ならびに品質保証の陰性対照として使用する。
【０３４５】
Ａ．抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ検出
血中の特異的Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ染色を、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）表現型と共に１０色フローサイトメトリーで実施した。染色カクテルには、生／死、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２７、ＣＤ２５、Ｋｉ６７、Ｆｏｘｐ３および対象のＨＬＡ型に適合する四量体試薬が含まれていた。Ｔｒｅｇ細胞を染色する細胞内Ｆｏｘｐ３の細胞透過性が、細胞表面染色を妨げないことを検証するアッセイ認定試験は、成功のうちに終了した。ｅｘ  ｖｉｖｏ四量体分析は、フローサイトメトリー用の（上に示した）抗体カクテルおよび四量体試薬を使用して、解凍し一晩寝かせたＰＢＭＣを染色することからなっていた。手短に言えば、解凍ＰＢＭＣを４℃にて３０分間四量体試薬でまず染色し、ＩＭＦ緩衝剤（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０１％アジ化ナトリウム）中で洗浄した。次いで細胞を、表現型マーカーとして様々な蛍光色素コンジュゲート抗体を含有する抗体混合物で、４℃にて３０分間染色した。次いで細胞を洗浄し、１％パラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリーに使用した。Ｆｏｘｐ３への細胞透過性はＣＤ１９抗体結合に悪影響を及ぼすので、Ｂ細胞のレベルを検出するため、別々のチューブを使用して、細胞をＣＤ１９抗体で染色した。
【０３４６】
Ｂ．特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出するためのＰＢＭＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化
抗原特異的Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化および増殖のため、解凍してｅｘ  ｖｉｖｏ解析に使用した同じ細胞に由来するＰＢＭＣを、サバイビンペプチド抗原およびサイトカイン（ＩＬ−２およびＩＬ−１５）の存在下で１０日間培養した。手短に言えば、解凍し一晩寝かせた細胞の生存性を実施し、ＰＢＭＣを、１０％熱不活性化ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌグルタミン、５０μＭβ−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０ＩＵ／ｍｌヒト組換えＩＬ−２および１０ｎｇ／ｍｌヒト組換えＩＬ−１５を補ったＲＰＭＩ−１６４０完全培地中、１ｘ１０６細胞／ｍｌで懸濁させた。２４ウェルプレートで、１ｘ１０６細胞／ウェルを１．０ｍｌの培地に入れ、無処理かまたはＨＬＡ適合の適切なサバイビンペプチド５μｇ／ｍｌの最終濃度で刺激するか、いずれかで細胞を放置した。５％ＣＯ２を供給した湿潤インキュベーターで３７℃にて、細胞をインキュベートした。３、６および８日目に、細胞をかき乱すことなく培地を慎重に吸引し、細胞が乾燥してしまわないように、注意して培地の一部を残した。サイトカイン（１０ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２および１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１５）を有する予熱したＲＰＭＩ完全培地を適切な容量（１．０ｍｌ）で添加した。１０日目、全ての細胞を採取し、プレーンＲＰＭＩ培地で１回、ＩＭＦ緩衝剤で１回洗浄し、プロトコール：生／死、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡおよび対象のＨＬＡ型に応じて、１つまたは２つのＭＨＣ多量体試薬、に準じて四量体染色（５色）に使用した。ＨＬＡ−Ａ２四量体とＡ１またはＡ３対象のいずれかに由来するＰＢＭＣとの交差反応性があり得るので、後の２つのＨＬＡ型を有する対象からの細胞もＨＬＡ−Ａ２用に設計された試薬で試験した。患者ＰＢＭＣと並行して、ＣＭＶ＋公知の健常対照のＰＢＭＣもＣＥＦペプチドプールで活性化し、アッセイ内およびアッセイ間比較に使用できる陽性対照試料を作製した。染色に続いて、細胞をフローサイトメトリー用に１％パラホルムアルデヒドで固定した。
【０３４７】
（ｉｉｉ）マルチパラメトリックフローサイトメトリー（ＩＣＳ）
マルチパラメトリックフローサイトメトリーアッセイにより、複数のサイトカイン／ケモカイン（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１７など）および表現型および／または機能的マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ１０７ａ、Ｇｒａｎｚｙｍｅ−Ｂ、ＣＣＲ７、など）の同時検出が可能となるので、マルチパラメトリックフローサイトメトリーアッセイは非常に情報価値があると考えられている。また、多機能Ｔ細胞（複数のサイトカインを分泌する）は、防御１型免疫応答と関連していること、および参加対象でそのような細胞を検出することは、投与ワクチンの免疫有効性を反映する可能性があることが示された。
【０３４８】
ＩＣＳアッセイを、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１７、Ｇｒａｎｚｙｍｅ−ＢおよびＣＤ１０７ａ（サイトカインおよび他の機能的マーカー用）とともに、生／死マーカー、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２７（サブセットおよびメモリー分化マーカーとして）を含む１２色フローサイトメトリーとして実施した。アッセイに使用した表現型マーカーを選択することにより、アッセイのワクチン抗原に応答する可能性がある、特異的エフェクター／セントラルメモリーＴ細胞の同定が可能となる。細胞刺激の条件には、無刺激、ＰＭＡ／ロノマイシン陽性対照、ワクチンに含まれているプールされたサバイビンペプチド、所与の対象へのＨＬＡ適合のペプチド、および対照ＰＢＭＣのＣＥＦ（ＣＭＶ／ＥＢＶ／ＦＬＵ）ペプチドプール刺激が含まれていた。患者のＰＢＭＣに加えて、公知のＨＬＡ−Ａ２健常ドナーのＰＢＭＣを品質保証の内部対照として使用した。手短に言えば、１０６ＰＢＭＣを、一晩寝かせた後、抗ＣＤ１０７ａ抗体の存在下で、個々のペプチドおよびペプチドプールで１時間刺激した。刺激に使用した最終ペプチドプールまたは個々のペプチド濃度は、１μｇ／ｍＬであった。タンパク質分泌阻害剤（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（商標）／ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（商標）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、刺激の１時間後に添加し、細胞を３７℃および５％ＣＯ２で５時間別途インキュベートした。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激に続いて、細胞を洗浄し、４℃で３０分間表面を染色し（ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ４５ＲＡならびに生存率マーカー）、続いて４℃で３０分間、固定化／透過処理細胞の細胞内染色（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７、ＩＬ−２）を行った。標識細胞は、ＦＡＣＳ  ＤｉＶａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用するＬＳＲＩＩフローサイトメーターで得られ、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して解析される。多機能サイトカイン解析は、各サイトカイン陽性集団を厳密にゲートした後、実施される。さらに、ＳＰＩＣＥ、データマイニングソフトウェアアプリケーションを使用して、多色フローサイトメトリーからの大きなＦｌｏｗＪｏデータセットを分析し、正規化データを図表にまとめた。
【０３４９】
結果
ＥＬＩＳＰＯＴ分析でＩＦＮ−γの産生により評価された抗原特異的免疫応答は、１または２ワクチン接種で通常確立され、ブースターで上昇するかまたは維持された（図２〜４）。用量反応が観察され、コホートＣ患者では程度が有意に高い応答がもたらされた（コホートＣ対コホートＢ、Ｐ＝．０１３）。低用量シクロホスファミドは０．５ｍｌ用量を有意に増強した（コホートＣ対コホートＡ、Ｐ＝．０１５）。これらの結果は、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃとの組合せにある低用量シクロホスファミドによる免疫調節の組合せにより、最も強力な免疫応答が生じたことを実証している。コホートＣの患者は、低用量シクロホスファミドの１週間事前投与だけで、これに続いてワクチンの１回用量だけで免疫応答を開始することができた。１回、２回または３回用量後にコホートＣで達成された応答（１０６ＰＢＭＣあたり２３０９、１９１１および２５１７スポット程）は、サバイビンワクチンと低用量シクロホスファミドとの組合せだけで達成することができた。
【０３５０】
コホートＢおよびＣにおいてサバイビンワクチンによって生じた、程度がより高い免疫応答は、循環抗原特異的Ｔ細胞応答の検出および血中の多機能Ｔ細胞応答のプロファイルによって特徴付けられた（図５および６）。一部の対象では、このような循環抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、四量体染色によりｅｘ  ｖｉｖｏで検出することができ、かかる特異的Ｔ細胞は、ＨＬＡ適合のペプチド抗原（複数可）によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの刺激によりさらに増殖することもできる。ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ組合せ療法を受けている対象１２人のうち１０人が、四量体染色により評価可能であり、１０人全てが、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃをともなう１または２ワクチン接種に続いてサバイビン特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞誘導の強力な証拠を示した。重要なことに、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答がブースターワクチン接種で維持された。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、がん細胞を特定し、腫瘍に浸透し、がん標的を死滅させることに関係しているので、このような特異的免疫細胞の活性化および維持は特に免疫療法において興味深い。最も強力な応答が、四量体解析によりコホートＣに観察され、ＥＬＩＳＰＯＴにより得られた結果を確認した。コホートＣの患者の大部分は、（ｉｎ  ｖｉｔｏｒｏ刺激を伴う）総ＣＤ８＋Ｔ細胞の１％を超え、総ＣＤ８＋Ｔ細胞の２２％程に達する四量体陽性を有していた。これに対して、コホートＡにおいて記録された最も高い四量体陽性は総ＣＤ８＋Ｔ細胞の１％未満（０．７％）であった。このことは、低用量シクロホスファミドとワクチンとの組合せにより、有意に高い抗原特異的免疫応答が生じたことを実証している。
【０３５１】
ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃで処置したいくつかの対象は、防御免疫応答を示す、多機能ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導も示した。コホートＡおよびＢそれぞれにおいて、６対象のうち２対象それぞれが、ならびに、コホートＣの６対象のうち５対象が、複数サイトカイン分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞に対して陽性であった。このようなＣＤ８細胞のほとんどが、処置対象における、以前の抗原曝露およびサバイビンに対する持続免疫応答の誘導を示すセントラルメモリー表現型であった。表４に、処置後のマルチサイトカイン陽性に対して陽性であった代表的対象からの結果が示してある。
【０３５２】
【表４】
2016516083.tif 000011
【０３５３】
上の表（表４）は、代表的レスポンダー、対象０９−０８、１０−０９、１１−１０および０２−１６からのＩＣＳ染色結果を提供し、マルチサイトカイン分泌セントラルメモリーＣＤ８Ｔ細胞を示している。末梢血単核細胞を、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によって多機能ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在について試験した。サバイビンペプチドによる短期間（５時間）刺激の後、細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＡなどの表現型マーカーについて表面染色に付し、固定し、透過処理し、ＩＮＦ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２などの細胞内サイトカインの存在についてさらに染色した。Ｆｌｏｗ−Ｊｏソフトウェアを使用するフローサイトメトリー分析を使用して、ベースラインおよびワクチン接種後時点で、単一／複数サイトカイン分泌セントラルメモリー（ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ−）ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出し、遅発性分化ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２７−）を有する対象０９−０８は除いた。（＋）は、分析されたメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットについて＞０．０５％〜＞３．０％の頻度範囲で、処置後血中試料に多機能性Ｔ細胞が検出されたことを示す。（−）は、検出可能な多機能ＣＤ８Ｔ細胞が不在であることを示す。（＊）はＰＢＭＣの品質が悪かったので判定しなかった。
【０３５４】
[実施例２]
患者０２−０４、１１−１０、０２−１６、０３−０７、０９−０８、１０−０９、および０１−１２からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、試験７０日目に、記載のように規則正しいシクロホスファミドと組合せで与えた、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃによる第３回のワクチン接種から４週間後に採取した。患者０９−０８は例外で、分析した試料は試験１２６日目、第３回のワクチン接種から１２週間後からであった。全患者のＨＬＡハプロタイプを決定し、それを患者のＩＤ番号と共に括弧中に示してある（図７を参照）。プールしたサバイビンペプチドによる刺激に続いて、これらの患者の免疫応答を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してｅｘ  ｖｉｖｏで（図７、左パネル）またはフローサイトメトリーによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ四量体分析で（図７、右パネル）分析した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、患者ＰＢＭＣをプールしたペプチドで刺激し、これらペプチドは、ワクチンＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃに含まれている改変ペプチド（黒色棒、ＳｕｒＡ１．Ｔ（配列番号２）、ＳｕｒＡ２．Ｍ（配列番号４）、ＳｕｒＡ３．Ｋ（配列番号６）、ならびに非改変ＳｕｒＡ２４（配列番号７）およびＳｕｒＢ７（配列番号８）ペプチド）、または改変ペプチドをサバイビンタンパク質からの天然ペプチド（白色棒、ＳｕｒＡ１（配列番号１）、ＳｕｒＡ２（配列番号３）、ＳｕｒＡ３（配列番号５））と代替するペプチドプールのいずれかであった。
【０３５５】
表５に、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃに含有される改変ペプチドが示されている。
【０３５６】
【表５】
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【０３５７】
四量体分析に関し、単一ペプチド（天然または改変）を使用して、ＰＢＭＣをＩＬ−２／ＩＬ−１５サイトカインの存在下で１０日間刺激し、抗原特異的Ｔ細胞の頻度を、改変ペプチドに基づいて設計した四量体試薬および対応するＨＬＡ分子を使用して検出した。患者は、彼らの当該ＨＬＡ型（すなわち、ＨＬＡ−Ａ１に対するＳｕｒＡ１、ＨＬＡ−Ａ２に対するＳｕｒＡ２およびＨＬＡ−Ａ３に対するＳｕｒＡ３）に対応するペプチドへの免疫応答が生じると予想される。図７に示されているように、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃに含有される改変サバイビンペプチドへ生じた免疫応答は、ワクチン接種後の血液試料のＥＬＩＳＰＯＴおよび四量体分析の両方に見られるように、天然ペプチドに対して有意な交差反応性を示す。したがって、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃワクチン誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞表面上の対応するＨＬＡ分子と組み合わさって天然ペプチドを発現する腫瘍細胞を標的とすることが予想される。天然サバイビンペプチド配列への免疫交差反応性が観察されるので、ワクチンに天然ペプチドを包含することで、天然配列がワクチンにより標的される細胞上に存在する場合、天然配列を認識することが可能な免疫応答が生じることになることが予想される。
【０３５８】
本明細書中で引用する全ての刊行物および特許出願は、各々個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが明確かつ個別に指示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。いかなる刊行物の引用も、出願日以前のその開示に関してであり、本発明が先行発明によってそのような刊行物に先行する権利を有さないことの承認と解釈されるべきではない。
【０３５９】
前述の発明は、理解を明確にするために説明および実例を目的として多少詳細に記載されたが、添付される特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、ある種の変更および修正を本発明に加えてもよいことは、本発明の教示に照らして当業者に容易に明らかである。
【０３６０】
本明細書および添付される特許請求の範囲において使用される、単数形態「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈によって明らかに異なる指示が与えられない限り、複数の言及を包含することに留意しなければならない。特に異なる定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【０３６１】
ここで、明細書および特許請求の範囲で使用される語句「および／または」は、そのように結び付けられる要素、すなわち、一部の場合には一緒に存在し、他の場合には離れて存在する要素の「一方または両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または」で掲載される複数の要素は、同じように、すなわち、そのように結び付けられる要素の「１つまたは複数」と解釈されるべきである。「および／または」の文節によって具体的に特定される要素以外に、具体的に特定されるそれらの要素に関係するか無関係であるにせよ、他の要素が任意選択で存在することができる。したがって、非限定例として、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの非限定言語と一緒に使用される場合、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、一実施形態ではＡだけ（任意選択でＢ以外の要素を含む）；別の実施形態ではＢだけ（任意選択でＡ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態ではＡとＢの両方（任意選択で他の要素を含む）；などを指すことができる。
【０３６２】
ここで明細書および特許請求の範囲で使用されるように、「または」は、上で定義される「および／または」と同じ意味を包含すると理解するべきである。例えば、リスト中の項目を抽出する場合、「または」または「および／または」は包括的であると、すなわちいくつかの要素または要素のリストの内の少なくとも１つを含むが、２つ以上も含み、任意選択でさらなるリストに載ってない項目を含むと解釈されるものとする。
【０３６３】
明細書であれ添付の特許請求の範囲であれ、ここで使用されるように、移行用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「運ぶ（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」などは、包括的または非限定的である（すなわち、それらを含むがそれらに限定されないことを意味する）と理解されるべきであり、それらは引用されていない要素、材料または方法ステップを排除しない。移行句「からなる」および「から本質的になる」だけが、特許請求の範囲および本明細書の例示的実施形態の段落に関してそれぞれ排他的または半排他的移行句である。移行句「からなる」は、具体的に挙げられていないいかなる要素、ステップまたは成分も排除する。移行句「から本質的になる」は、その範囲を、指定要素、材料またはステップに、および、本明細書に開示および／または請求される本発明の基本的特性（複数可）に実質的に影響を及ぼさないものに制限する。
【図１】
2016516083.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年3月22日(2016.3.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのサバイビン抗原を含むワクチン組成物であって、
対象のがんの処置におけるワクチンの有効性を向上させるための方法であって、
（ｉ）前記対象に、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を、免疫調節効果をもたらすのに十分な量で少なくとも２回投与するステップと、
（ｉｉ）続いて前記対象に、治療有効量のワクチン組成物を投与するステップと
を含む方法に用いる、ワクチン組成物。
【請求項２】
前記方法が、前記対象に前記薬剤を
−  初回用量投与し、それに続いて１回または複数回の維持用量投与するステップ、および／または
−  前記ワクチン組成物を投与する少なくとも２日前、少なくとも４日前、もしくは少なくとも１週間前に初回用量投与するステップ、および／または
−  前記ワクチン組成物を投与する前に、少なくとも連続２日間の期間投与するステップ、および／または
−  前記ワクチン組成物を投与する前に、毎日少なくとも１回、２回、３回もしくは４回投与するステップ、および／または
−  前記ワクチン組成物を投与する前に、約１週間の期間、毎日２回投与するステップ、
を含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記ワクチン組成物を投与する前に、前記対象に前記薬剤を投与する前記ステップを停止する、請求項１または２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記ワクチン組成物を投与する間、前記対象に前記薬剤を投与する前記ステップを継続する、請求項１または２に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記方法が、前記ワクチン組成物を前記対象に、
−  ３週毎に約１回、および／または
−  ２回、３回、４回もしくはそれ以上、
投与するステップを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記方法が、ＤＮＡ複製を妨げる前記薬剤を前記対象に規則正しいレジメンで投与するステップを含み、
前記規則正しいレジメンが、前記薬剤を前記対象に１週おきに約１週間の期間、毎日投与するステップを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記方法が、初回用量の前記ワクチン組成物を投与する約１週間前から、前記薬剤を前記対象に投与するステップを含み、かつ前記ワクチン組成物を前記対象に３週毎に約１回、投与するステップを含む、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記サバイビン抗原が、
−  ペプチド抗原であるか、または抗原をコードする核酸であるか；
−  前記対象に細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘発することのできるサバイビンタンパク質（配列番号１１）由来のアミノ酸配列を含むペプチド抗原であるか、もしくは前記ペプチド抗原をコードする核酸分子であるか；
−  アミノ酸配列FEELTLGEF（配列番号１）；FTELTLGEF（配列番号２）；LTLGEFLKL（配列番号３）；LMLGEFLKL（配列番号４）；RISTFKNWPF（配列番号５）；RISTFKNWPK（配列番号６）；STFKNWPFL（配列番号７）；およびLPPAWQPFL（配列番号８）、から選択される１つ以上のペプチド抗原か、もしくはそれらの任意の組合せであるか；または前記１つ以上のペプチド抗原をコードする核酸分子であるか；または
−  アミノ酸配列FTELTLGEF（配列番号２）；LMLGEFLKL（配列番号４）；RISTFKNWPK（配列番号６）；STFKNWPFL（配列番号７）もしくはLPPAWQPFL（配列番号８）の一つを別々に含む５つのペプチド抗原の混合物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
ＤＮＡ複製を妨げる前記薬剤が、急速に分裂している免疫系細胞を選択的に標的とし、プログラム細胞死を引き起こすことができる、請求項１〜８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
ＤＮＡ複製を妨げる前記薬剤がアルキル化剤である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
前記アルキル化剤がナイトロジェンマスタードアルキル化剤である、請求項１０に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
前記ナイトロジェンマスタードアルキル化剤がシクロホスファミドである、請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
免疫調節効果をもたらすのに十分な量が約２５〜３００ｍｇ／日、約５０〜１００ｍｇ／日、または約１００ｍｇ／日のシクロホスファミドである、請求項１２に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
免疫調節効果をもたらすのに十分な量が、１用量あたり約５０ｍｇのシクロホスファミドである、請求項１２または１３に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
前記方法が前記薬剤を前記対象に経口投与するステップ、および前記ワクチン組成物を前記対象に注射により投与するステップを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
前記ワクチン組成物が、前記少なくとも１つのサバイビン抗原と、リポソームと、疎水性物質の連続相を含む担体とを含む組成物である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
前記組成物がＴヘルパーエピトープ、および／またはアジュバントをさらに含む、請求項１６に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
前記Ｔヘルパーエピトープが、アミノ酸配列AQYIKANSKFIGITEL（配列番号９）を含むペプチドであり、前記アジュバントがポリＩ：Ｃポリヌクレオチドである、請求項１７に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
前記担体が、
−  植物油、ナッツオイルもしくは鉱物油；または
−  鉱物油溶液中のオレイン酸マンニド
である、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
−  抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性もしくは数を増加させること；ならびに／または
−  例えばＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、骨髄由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）および／もしくはＣＤ１９＋ＣＤ１ｄ＋ＣＤ５＋Ｂ細胞（Ｂｒｅｇ）などの抑制性免疫細胞の数もしくは活性を低減すること
によって抗原に対する免疫応答を直接増強することで、前記薬剤が、前記ワクチンの有効性を向上させる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２１】
抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性または数を増加させるステップが、総ＣＤ８＋Ｔ細胞数の相対的減少による、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の濃縮を伴う、請求項２０に記載のワクチン組成物。
【請求項２２】
前記がんが、
−  皮下固形腫瘍；および／または
−  卵巣がん、卵管がんもしくは腹膜がん
である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２３】
前記対象がヒトである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２４】
がんの処置におけるワクチンの有効性を向上させるためのワクチン組成物の製造のためのサバイビン抗原の使用であって、ワクチン組成物とＤＮＡ複製を妨げる薬剤とを組み合わせ、前記薬剤が、前記ワクチン組成物の前に少なくとも２回投与される、使用。
【請求項２５】
ＤＮＡ複製を妨げる薬剤と、少なくとも１つのサバイビン抗原を含むワクチン組成物との組合せキットであって、
対象のがんの処置におけるワクチンの有効性を向上させるための方法であって、
（ｉ）前記対象に、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を、免疫調節効果をもたらすのに十分な量で少なくとも２回投与するステップと、
（ｉｉ）続いて前記対象に、治療有効量のワクチン組成物を投与するステップと
を含む方法に用いる、組合せキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６３】
明細書であれ添付の特許請求の範囲であれ、ここで使用されるように、移行用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「運ぶ（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」などは、包括的または非限定的である（すなわち、それらを含むがそれらに限定されないことを意味する）と理解されるべきであり、それらは引用されていない要素、材料または方法ステップを排除しない。移行句「からなる」および「から本質的になる」だけが、特許請求の範囲および本明細書の例示的実施形態の段落に関してそれぞれ排他的または半排他的移行句である。移行句「からなる」は、具体的に挙げられていないいかなる要素、ステップまたは成分も排除する。移行句「から本質的になる」は、その範囲を、指定要素、材料またはステップに、および、本明細書に開示および／または請求される本発明の基本的特性（複数可）に実質的に影響を及ぼさないものに制限する。
本発明は、以下の態様を含む。
［１］
対象のがんの処置におけるワクチンの有効性を向上させるための方法であって、
（ｉ）前記対象に、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を、免疫調節効果をもたらすのに十分な量で少なくとも２回投与するステップと、
（ｉｉ）続いて前記対象に、少なくとも１つのサバイビン抗原を含む治療有効量のワクチンを投与するステップと
を含む方法。
［２］
前記ワクチンを投与する少なくとも２日前に、好ましくは、前記ワクチンを投与する少なくとも４日前に、初回用量の前記薬剤を前記対象に投与するステップを含む、［１］に記載の方法。
［３］
前記ワクチンを投与する約１週間前に、初回用量の前記薬剤を前記対象に投与するステップを含む、［１］に記載の方法。
［４］
前記薬剤を少なくとも連続２日間の期間、投与するステップを含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
前記対象に初回用量の前記薬剤を投与し、それに続いて、維持用量の前記薬剤を１回または複数回投与するステップを含む、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
前記ワクチンを投与する前に、前記薬剤を前記対象に毎日少なくとも１回、２回、３回または４回、投与するステップを含む、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
前記ワクチンを投与する前に、前記薬剤を約１週間の期間、毎日２回、投与するステップを含む、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］
前記ワクチンを投与する前に、前記対象に前記薬剤を投与する前記ステップを停止する、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］
前記ワクチンを投与する間、前記対象に前記薬剤を投与する前記ステップを継続する、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［１０］
前記ワクチンを前記対象に３週毎に約１回、投与するステップを含む、［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］
前記ワクチンを前記対象に２回、３回、４回またはそれ以上、投与するステップを含む、［１０］に記載の方法。
［１２］
ＤＮＡ複製を妨げる前記薬剤を前記対象に規則正しいレジメンで投与するステップを含む、［１］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］
前記規則正しいレジメンが、前記薬剤を前記対象に１週おきに約１週間の期間、毎日投与するステップを含む、［１２］に記載の方法。
［１４］
初回用量の前記ワクチンを投与する約１週間前から、前記薬剤を前記対象に投与するステップを含み、かつ前記ワクチンを前記対象に３週毎に約１回、投与するステップを含む、［１３］に記載の方法。
［１５］
前記サバイビン抗原がペプチド抗原であるか、または抗原をコードする核酸である、［１］〜［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］
前記サバイビン抗原が、前記対象に細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘発することのできるサバイビンタンパク質（配列番号１１）由来のアミノ酸配列を含むペプチド抗原であるか、または前記ペプチド抗原をコードする核酸分子である、［１］〜［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］
前記サバイビン抗原が、アミノ酸配列FEELTLGEF（配列番号１）；FTELTLGEF（配列番号２）；LTLGEFLKL（配列番号３）；LMLGEFLKL（配列番号４）；RISTFKNWPF（配列番号５）；RISTFKNWPK（配列番号６）；STFKNWPFL（配列番号７）；およびLPPAWQPFL（配列番号８）、もしくはそれらの任意の組合せを含むペプチド抗原であるか；または前記ペプチド抗原をコードする核酸分子である、［１］〜［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］
前記少なくとも１つのサバイビン抗原が、アミノ酸配列FTELTLGEF（配列番号２）；LMLGEFLKL（配列番号４）；RISTFKNWPK（配列番号６）；STFKNWPFL（配列番号７）またはLPPAWQPFL（配列番号８）を含む５つのペプチド抗原の混合物を含む、［１］〜［１４］のいずれかに記載の方法。
［１９］
ＤＮＡ複製を妨げる前記薬剤が、急速に分裂している免疫系細胞を選択的に標的とし、プログラム細胞死を引き起こすことができる、［１］〜［１８］のいずれかに記載の方法。
［２０］
ＤＮＡ複製を妨げる前記薬剤がアルキル化剤である、［１］〜［１９］のいずれかに記載の方法。
［２１］
前記アルキル化剤がナイトロジェンマスタードアルキル化剤である、［２０］に記載の方法。
［２２］
前記ナイトロジェンマスタードアルキル化剤がシクロホスファミドである、［２１］に記載の方法。
［２３］
免疫調節効果をもたらすのに十分な量が約２５〜３００ｍｇ／日、好ましくは約５０〜１００ｍｇ／日、より好ましくは約１００ｍｇ／日のシクロホスファミドである、［２２］に記載の方法。
［２４］
免疫調節効果をもたらすのに十分な量が、１用量あたり約５０ｍｇのシクロホスファミドである、［２２］または［２３］に記載の方法。
［２５］
前記シクロホスファミドを前記対象に経口投与するステップを含む、［２２］〜［２４］のいずれかに記載の方法。
［２６］
前記ワクチンを前記対象に皮下注射などの注射により投与するステップを含む、［１］〜［２５］のいずれかに記載の方法。
［２７］
前記ワクチンが、前記少なくとも１つのサバイビン抗原と、リポソームと、疎水性物質の連続相を含む担体とを含む組成物である、［１］〜［２６］のいずれかに記載の方法。
［２８］
前記組成物がＴヘルパーエピトープをさらに含む、［２７］に記載の方法。
［２９］
前記Ｔヘルパーエピトープが、アミノ酸配列AQYIKANSKFIGITEL（配列番号９）を含むペプチドである、［２８］に記載の方法。
［３０］
前記組成物がアジュバントをさらに含む、［２７］〜［２９］のいずれかに記載の方法。
［３１］
前記アジュバントがポリＩ：Ｃポリヌクレオチドである、［３０］に記載の方法。
［３２］
前記担体が、植物油、ナッツオイルまたは鉱物油などの疎水性物質である、［２７］〜［３１］のいずれかに記載の方法。
［３３］
前記担体が鉱物油であるか、または鉱物油溶液中のオレイン酸マンニド、例えばＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ５１である、［２７］〜［３１］のいずれかに記載の方法。
［３４］
前記薬剤が、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性または数を増加させるなど、抗原に対する免疫応答を直接増強することによって、前記ワクチンの有効性を向上させる、［１］〜［３３］のいずれかに記載の方法。
［３５］
抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性または数を増加させるステップが、総ＣＤ８＋Ｔ細胞数の相対的減少による、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の濃縮を伴う、［３４］に記載の方法。
［３６］
前記薬剤が、例えばＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、骨髄由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）および／またはＣＤ１９＋ＣＤ１ｄ＋ＣＤ５＋Ｂ細胞（Ｂｒｅｇ）などの抑制性免疫細胞の数または活性を低減することによって、前記ワクチンの有効性を向上させる、［１］〜［３３］のいずれかに記載の方法。
［３７］
前記がんが皮下固形腫瘍である、［１］〜［３６］のいずれかに記載の方法。
［３８］
前記がんが卵巣がん、卵管がんまたは腹膜がんである、［１］〜［３６］のいずれかに記載の方法。
［３９］
前記対象がヒトである、［１］〜［３８］のいずれかに記載の方法。
［４０］
がんの処置におけるワクチンの有効性を向上させるための、少なくとも１つのサバイビン抗原を含むワクチンと組み合わせた、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の使用であって、前記薬剤は、前記ワクチンの前に少なくとも２回投与される、使用。
［４１］
［１］〜［３９］のいずれかに記載の方法に使用するための、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤と、少なくとも１つのサバイビン抗原を含むワクチンとの組合せ。
【国際調査報告】
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