(57)【要約】  本発明は、様々な型の乳癌を処置するための化合物、医薬組成物および方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの乳癌の処置において使用するための化合物であって、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（Ｘ１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択され、Ｘ５が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）（配列番号１）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３もしくはＸ１４が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）（配列番号７）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号７の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７およびＸ１１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む化合物。
【請求項２】
前記化合物が、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（式中、Ｘ１が、Ｋ、Ｒ、ＮもしくはＱのようなＮＨ２基を有するアミノ酸、またはＡ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ５が、ＥもしくはＤのような負荷電側鎖を有するアミノ酸、またはＡ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択される）（配列番号４）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１が、Ｋ、Ｒ、ＮもしくはＱのようなＮＨ２基を有するアミノ酸、またはＡ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ２が、ＥもしくはＤのような負荷電側鎖を有するアミノ酸、またはＡ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ３が、Ｋ、Ｒ、ＮもしくはＱのようなＮＨ２基を有するアミノ酸、またはＡ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ４が、Ｆ、ＷもしくはＹのような非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、またはＡ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ５が、Ｆ、ＷもしくはＹのような非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、またはＡ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ６が、Ｇまたは、Ａ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ７が、Ｋ、Ｒ、ＮもしくはＱのようなＮＨ２基を有するアミノ酸、またはＡ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ１１が、ＥもしくはＤのような負荷電側鎖を有するアミノ酸、またはＡ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ１２が、Ｇまたは、Ａ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ１３が、Ｆ、ＷもしくはＹのような非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、またはＡ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ１４が、Ｋ、Ｒ、ＮもしくはＱのようなＮＨ２基を有するアミノ酸、またはＡ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択される）（配列番号８）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号８の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７が、Ｋ、Ｒ、ＮもしくはＱのようなＮＨ２基を有するアミノ酸、またはＡ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ１１が、ＥもしくはＤのような負荷電側鎖を有するアミノ酸、またはＡ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む、請求項１に記載の使用のための化合物。
【請求項３】
前記化合物が、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（式中、Ｘ１が、Ｋ、Ｒ、ＮもしくはＱのようなＮＨ２基を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ５が、ＥもしくはＤのような負荷電側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択される）（配列番号５）含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１が、Ｋ、Ｒ、ＮまたはＱのようなＮＨ２基を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ２が、ＥまたはＤのような負荷電側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ３が、Ｋ、Ｒ、ＮまたはＱのようなＮＨ２基を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ４が、Ｆ、ＷまたはＹのような非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ５が、Ｆ、ＷまたはＹのような非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ６が、Ｇまたは、Ａ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ７が、Ｋ、Ｒ、ＮまたはＱのようなＮＨ２基を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ１１が、ＥまたはＤのような負荷電側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ１２が、Ｇまたは、Ａ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ１３が、Ｆ、ＷまたはＹのような非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ１４が、Ｋ、Ｒ、ＮまたはＱのようなＮＨ２基を有するアミノ酸を含む群から選択される）（配列番号９）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号９の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７が、Ｋ、Ｒ、ＮまたはＱのようなＮＨ２基を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ１１が、ＥまたはＤのような負荷電側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む、請求項２に記載の使用のための化合物。
【請求項４】
前記化合物が、アミノ酸配列Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ（配列番号２）、アミノ酸配列Ｋ−Ｅ−Ｑ−Ｗ−Ｆ−Ｇ−Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ−Ｇ−Ｙ−Ｒ（配列番号６）を含む、場合により、からなるペプチドまたはこのペプチド模倣物を含む、請求項１、２または３のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項５】
前記化合物が前記ペプチドまたは前記ペプチド模倣物の改変型である、請求項１、２、３または４のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項６】
前記化合物が、前記ペプチドまたはペプチド模倣物のペグ化型、ヘシル化型、パシル化型、ミリストイル化型、グリコシル化型および／または環状型である、請求項５に記載の使用のための化合物。
【請求項７】
化合物が経口投与用に、経鼻投与用にまたは皮下投与用に製剤化されている、請求項１、２、３、４または５のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項８】
前記乳癌がＣＤ４４ｖ６の発現を示す、請求項１、２、３、４、５、６または７のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項９】
前記乳癌がＣＤ４４ｖ６の発現を示す、請求項１、２、３、４、５、６、７または８のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項１０】
前記乳癌がＥｒｂＢ１および／またはＥｒｂＢ２の発現の増加を示す、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項１１】
前記乳癌が構成的なＥｒｂＢ２活性化を示さない、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項１２】
前記乳癌がＥＧＦおよび／またはＥＲの発現の増加を示す、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項１３】
前記乳癌が、ＥＧＦおよび／またはＥＲの発現の増加を示すがＴＧＦαの発現の増加を示さない、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項１４】
前記乳癌腫瘍がＥＧＦに基づくＥｒｂＢ活性化を示す、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項１５】
前記乳癌がトラスツズマブまたはペルツズマブによる処置に対する耐性を示す、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項１６】
前記乳癌がトラスツズマブまたはペルツズマブによる処置に対する耐性を示し、Ｍｅｔの発現の増加を示す、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項１７】
前記乳癌が転移性乳癌である、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項１８】
前記乳癌が、対癌米国合同委員会の癌病期分類システムのＴＮＭ解剖学的／予後群システムに従ってステージＩＩＩまたはステージＩＶと分類できる、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７のいずれかに記載の使用のための化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳癌を処置するための化合物、医薬組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々なタイプの癌が、ｃＭＥＴ、ＶＥＧＦＲならびにＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ２等のＥｒｂＢファミリー等の受容体型チロシンキナーゼに属するメンバーの過剰活性化を少なくともある程度は伴うことが分かっている。癌として、例えば結腸直腸癌、乳癌および膵癌が挙げられる。
【０００３】
ＥｒｂＢファミリーはまた、受容体型チロシンキナーゼスーパーファミリーのサブクラスＩとも称される。ＥｒｂＢファミリーには以下の４つの異なる受容体タンパク質、ＥＧＦＲまたはＥｒＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４、が含まれる。齧歯動物ではＥｒｂＢ２受容体は「Ｎｅｕ」と呼ばれている。ヒト型のＥｒｂＢはＨｅｒ１〜４と命名されている。
【０００４】
脊椎動物では、「ＥＧＦ関連リガンドファミリー」がＥｒｂＢ受容体のリガンドを構成する。この増殖因子は全て膜貫通型前駆体として産生される。その外部ドメインは、成熟した可溶性タンパク質を切断する工程であるタンパク質分解によりプロセッシングを受ける。様々な研究により、ＡＤＡＭメタロプロテイナーゼがＥｒｂＢプロリガンドの開裂に関与していることが確認されている。ＥｒｂＢリガンドには、ＥｒｂＢ受容体に結合する能力に差がある。この結合特異性に基づいて、ＥｒｂＢリガンドを３つの群に分類することができる（Olayioye他、2000で概説されており、参考文献および図１を参照）。ＥｒｂＢリガンドは通常、自己分泌因子または傍分泌因子として近距離で作用する。例えば全ての体液中に見られるＥＧＦまたはＮｒｇ−１のようないくつかのリガンドが広範囲に発現される。また、エピレグリン、ＴＧＦαおよびＨＢ−ＥＧＦは多様な細胞型で発現される。ＥＲはマクロファージ中でおよび胎盤中で発現される。ＴＧＦαは例えば脳細胞中でおよびケラチノサイト中で産生され、ＨＢ−ＥＧＦは例えばマクロファージおよびケラチノサイトにより産生される。その他のＥｒｂＢリガンドは、より制限されたパターンを示す。
【０００５】
ＥｒｂＢ受容体の活性化、特にＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ２の活性化は、多くのヒト癌で無秩序である。この無秩序は、ＥｒｂＢによりコードされたタンパク質の過剰発現もしくは変異のどちらかによりまたは自己分泌型のリガンド産生により引き起こされ、癌細胞の無制限の増殖および遊走を特徴とする。最も一般的なタイプのＥｒｂＢ１変異は、いわゆるＩＩＩ型変異である。このＩＩＩ型変異の場合、タンパク質の細胞外ドメインの欠失により受容体が構成的に活性化される。ＩＩＩ型変異を保有するＥｒｂＢ１タンパク質は、神経膠腫、卵巣癌および乳癌に関わる（Ekstrand他、1992；参考文献を参照）。
【０００６】
一方、頭頸部の扁平上皮癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、肺癌および乳癌でＥｒｂＢ１の過剰発現が発見されている。過剰発現されているが、ＥｒｂＢ１受容体は、シグナル伝達をリガンドによる誘導に依然として依存している。ＥｒｂＢ１受容体は、そのリガンドの内のいくつかと共発現される。例えば肺癌、結腸癌および乳癌でＥｒｂＢ１を無秩序に活性化させる自己分泌ループを例えばＴＧＦαが形成することが発見されることが多い（Salomon他、1995；Umekita他、2000）。
【０００７】
ＥｒｂＢ１受容体とは対照的に、これまで、ＥｒｂＢ２に関する活性化変異は発見されていない。ＥｒｂＢ２の活性化は主に、多くの場合は遺伝子増幅による過剰発現に起因する。標的細胞におけるＥｒｂＢ２分子の存在量の増加により、ＥｒｂＢ２タンパク質が自発的に二量体化する、および構成的に活性化される。この種の受容体活性化は、例えば肺癌、卵巣癌および胃癌で見られるが、受容体活性化が悪い臨床予後および治療に対する耐性と関係している乳癌で特に重要である（Ross & Fletcher、1998、参考文献を参照）。
【０００８】
ＥｒｂＢ３受容体は、ＥｒｂＢ２受容体を標的とする治療に対する耐性と関連している。例えばチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）によるＥｒｂＢ２受容体のブロックにより、ＥｒｂＢ３のリン酸化レベルが増加する。これにより、ＥｒｂＢ２シグナル伝達の非存在下で細胞寿命を延ばすＥｒｂＢ３シグナル伝達が活性化される。乳癌では、ＥｒｂＢ３受容体がＥｒｂＢ２と共に機能することが分かっており、腫瘍細胞の分裂を媒介する。多くのヒト乳癌で、この共発現が発見されている（Sithanandam & Anderson、2008、参考文献を参照）。
【０００９】
乳癌の処置は、基礎となる分子メカニズムに依存する。エストロゲン受容体依存性の乳癌を例えばタモキシフェンで処置することができる。ＥｒｂＢ受容体陽性の癌を例えばＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）で処置することができる。しかしながら、例えばＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）による処置に対する耐性が患者に生じる可能性があることが知られている。
【００１０】
そのため、乳癌の処置を可能にする薬学的活性剤に対する関心および該薬学的活性剤の必要性が絶えず存在する。特に、表現型レベルを区別することはできないが分子レベルで明確に異なる、特定の分子メカニズムを基礎とするタイプの乳癌に選択的に焦点を当てることを可能にする薬学的活性剤の必要性が絶えず存在する。更に、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）または受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の小分子阻害剤による処置に対する耐性が生じている乳癌患者の処置を可能にする薬学的活性剤の必要性が存在し、これらはＥｒｂＢ受容体を阻害する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的の一つは化合物およびそのような化合物を含む医薬組成物を提供することであり、該化合物および医薬組成物は乳癌を処置するために使用することができる。
【００１２】
本発明の更なる目的は化合物およびそのような化合物を含む医薬組成物を提供することであり、該化合物および医薬組成物は、特定の分子メカニズムを基礎とするタイプの乳癌に選択的に焦点を当てることにより特定のタイプの乳癌を処置するために使用することができる。
【００１３】
本発明の更に別の目的は化合物およびそのような化合物を含む医薬組成物を提供することであり、該化合物および医薬組成物は乳癌患者の処置を可能にし、該乳癌患者にはＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）または受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の小分子阻害剤による処置に対する耐性が生じている。
【００１４】
本発明の別の目的は、ヒトの乳癌を処置するための新規の方法を提供することであり、特に、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）または受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の小分子阻害剤による処置に対する耐性が生じている乳癌患者を処置するための新規の方法を提供することであり、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）および受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の小分子阻害剤はＥｒｂＢ受容体を阻害する。患者の乳癌を処置するための新規の方法を提供することも本発明の目的であり、該患者にＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）または受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の小分子阻害剤による処置に対する耐性が生じており、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）および受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の小分子阻害剤はＥｒｂＢ受容体を阻害する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
以下の説明から明らかになるであろうこれらの目的およびその他の目的は、独立請求項の主題によって達成される。本発明の好ましい実施形態の一部が従属請求項で述べられる。
【００１６】
本発明は、共受容体分子ＣＤ４４ｖ６の分子機能を解明することを目的の一部とする以下に記載の実験データにある程度基づいており、共受容体分子ＣＤ４４ｖ６の分子機能は、患者個人に合わせた様式での乳癌の処置の最適化に幅広い影響を有する。
【００１７】
実験では、ＣＤ４４ｖ６が、いくつかの乳癌細胞株においてＥＧＦによるＥｒｂＢ受容体の活性化を可能にすることが特に示されている。従って、造腫瘍性をＥＧＦに基づくＥｒｂＢ活性化に依存している乳癌型にＣＤ４４ｖ６が関与することができると仮定するのが妥当であると思われる。ＥｒｂＢ受容体の活性化が例えばＴＧＦαに媒介される癌型では、ＴＧＦαはＣＤ４４に非依存的であることから、ＣＤ４４ｖ６は共受容体として必要ないであろうことがデータから更に示唆される。一般的なタイプの乳癌は、乳癌細胞の増殖を刺激するために自己分泌ループにおけるＴＧＦαの発現を伴うことから、この発見は重要である（Umekita他、2000、参考文献を参照）。そのため、本発明の発見により、例えばＴＧＦαの発現が増加している患者を処置しないことを検討することによって、様々な乳癌型のより選択的で患者に最適化した処置を可能にすることができる。乳癌での一般的なタイプの無秩序なＥｒｂＢシグナル伝達である構成的なＥｒｂＢ２活性化の場合のように、ＥｒｂＢ２受容体の活性化にリガンドは必要ではなく、そのような癌を処置するために本明細書に記載の化合物を使用しないことも考えられる。更に、例えばトラスツズマブまたはペルツズマブのようなＥｒｂＢ２受容体に対する抗体で乳癌患者を処置し、異常なＥｒｂＢ２シグナル伝達をブロックする。この抗体による乳癌患者の処置は必ずしも成功するとは限らない。なぜならば、治療に対する耐性が患者に生じる可能性があるからである。この患者では、特にＭｅｔの過剰発現の場合、ＣＤ４４ｖ６をブロックするペプチドは有用なツールとなるだろう。なぜならば、ＣＤ４４ｖ６は、ＥＧＦに基づくおよびＥＲに基づくＥｒｂＢ２シグナル伝達の共受容体として作用するだけでなく、Ｍｅｔ活性化にも関与するからである。
【００１８】
以下に記載する実験では、Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ等、５個のアミノ酸のペプチド骨格に組み込まれているトリペプチド配列Ｒ−Ｗ−Ｈを最小必要条件として有するペプチドがヒト膵癌の動物モデルにおいて転移の形成をブロックすることができることが更に示されている。更に、本明細書に記載するデータは、マウスでのヒト膵癌の同所性モデルにおいて、このペプチドにより、全身にわたって既に広がって形成されている転移の効果的な退縮も可能になることを示す。この背景に先立って、このペプチドにより、膵癌に関してだけなく、乳癌等のその他の転移性癌に関しても、特に本明細に記載の乳癌型、即ち造腫瘍性がＥＧＦに基づくＥｒｂＢ活性化に依存している乳癌型に関しても、形成されて体中に広がっている転移の退縮を可能にすることができると結論付けるのが妥当であると考えられる。好ましくは、そのような転移性乳癌は、ＴＧＦαの発現または活性化の増加を示さない。別の好ましい実施形態は転移性乳癌に関し、該転移性乳癌は、トラスツズマブまたはペルツズマブによる処置に対する耐性があり、Ｍｅｔの発現を増加させた。
【００１９】
既に上述したように、トリペプチド配列Ｒ−Ｗ−Ｈが５個のアミノ酸のペプチド骨格に組み込まれる場合には、本明細書に記載のペプチドは転移の阻害だけでなく既に形成された転移の実際の除去にも効果的であることが発見されている。このことは、ペンタペプチドＮ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅのアミノ酸ＮおよびＥをそれぞれＡに変更することにより発見された。これらは非保存的アミノ酸置換であったにもかかわらず、ＭｅｔのＣＤ４４ｖ６媒介性活性化の阻害においてペプチドは依然として活性がある。そのため、ペンタペプチドＮ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅの第１位のＮをＫ、ＲまたはＱ等のアミノ酸で保存的に置換するだけでなく、任意のその他のアミノ酸またはＶ、ＬもしくはＩ等のＡに相当する非極性側鎖を有するアミノ酸により保存的に置換することができると結論付けるのが正しいと思われる。当然のことながら、同様の考察をペンタペプチドの第５位に適用し、その結果、アミノ酸ＥをＫによる等の保存的置換により置き換えるだけでなく、任意のその他のアミノ酸または特にＶ、ＬもしくはＩ等のアラニンの特性と類似するアミノ酸に置き換えることができる。
【００２０】
更に、ペンタペプチドＮ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅはまた、より長いペプチドに組み込まれる場合に、Ｍｅｔシグナル伝達のＣＤ４４ｖ６媒介性活性化を阻害するのに効果的であることも示されており、より長いペプチドの上限は１４ｍｅｒであると仮定するのが妥当である。保存的アミノ酸置換だけでなく非保存的アミノ酸置換によりペンタペプチドの最初の位置および最後の位置を置換する可能性の発見を前提として、Ｒ−Ｗ−Ｈの必須モチーフ外の任意のアミノ酸を同じ理由に従って置き換えることができたと結論付けるのが妥当であると思われる。
【００２１】
そのため、本発明は一実施形態において、ヒトの乳癌の処置において使用するための化合物であって、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（Ｘ１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択され、Ｘ５が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）（配列番号１）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３もしくはＸ１４が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）（配列番号７）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号７の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７およびＸ１１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む化合物に関する。
【００２２】
そのような乳癌として、ＴＧＦαの発現もしくは活性化の増加を示さないおよび／またはトラスツズマブもしくはペルツズマブによる処置に対する耐性を示すならびにＭｅｔの発現の増加を示す乳癌型を挙げることができ、該乳癌型は、その造腫瘍性をＥＧＦに基づくＥｒｂＢ活性化に依存している。一実施形態では、本発明は、そのような患者での転移の形成を阻害すると考えられる。別の実施形態では、この乳癌型は転移性乳癌であり、即ち転移が既に形成されている乳癌であり、該乳癌を、対癌米国合同委員会（American Joint Committee on Cancer）の癌病期分類システムのＴＮＭ解剖学的／予後群システム（TNM anatomic/prognostic group system）に従ってステージＩＶと分類することができる。そのような転移性癌の場合、本発明の化合物により、既に形成された転移を退縮させることができる。好ましくは、この乳癌型は全てＣＤ４４ｖ６の発現を示す。
【００２３】
上記に記載の知見を前提として、即ちペンタペプチドＮ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ中のアミノ酸Ｎおよびアミノ酸Ｅをアラニンに置き換えることができるという知見を前提として、これらの位置で、Ｖ、ＬまたはＩ等の物理化学特性がアラニンと同程度である保存的アミノ酸置換またはアミノ酸置換のどちらかを含むペプチドが、Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅと同じ活性を実現することもできると仮定するのが妥当であると思われる。同様の考察が、必須のトリペプチドモチーフＲ−Ｗ−Ｈに隣接する位置に関する１４ｍｅｒ由来のペプチドに当てはまる。
【００２４】
そのため、好ましい実施形態では、本発明は、ヒトの乳癌の処置において使用するための化合物であって、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ５が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）（配列番号４）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ２が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ３が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ４が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ５が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ６が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１２が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１３が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１４が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）（配列番号８）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号８の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む化合物に関する。
【００２５】
そのような乳癌として、ＴＧＦαの発現もしくは活性化の増加を示さないおよび／またはトラスツズマブもしくはペルツズマブによる処置に対する耐性を示すならびにＭｅｔの発現の増加を示す乳癌型を挙げることができ、該乳癌型は、その造腫瘍性をＥＧＦに基づくＥｒｂＢ活性化に依存している。一実施形態では、本発明は、そのような患者での転移の形成を阻害すると考えられる。別の実施形態では、この乳癌型は転移性乳癌であり、即ち転移が既に形成されている乳癌であり、該乳癌を、対癌米国合同委員会の癌病期分類システムのＴＮＭ解剖学的／予後群システムに従ってステージＩＶと分類することができる。そのような転移性癌の場合、本発明の化合物により、既に形成された転移を退縮させることができる。好ましくは、この乳癌型は全てＣＤ４４ｖ６の発現を示す。
【００２６】
ペンタペプチドまたは以下に記載する１４ｍｅｒ由来の任意のより長いペプチドは、本明細書に記載した乳癌において転移の予防だけでなく既に形成された転移の実際の除去にも効果的であるだろうが、本発明の好ましい実施形態は、以下に記載するペンタペプチド配列に関し、特に好ましい実施形態はアミノ酸配列Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ（配列番号２）に注目する。そのような化合物で処置することができる乳癌として、ＴＧＦαの発現もしくは活性化の増加を示さないおよび／またはトラスツズマブもしくはペルツズマブによる処置に対する耐性を示すならびにＭｅｔの発現の増加を示す乳癌型を挙げることができ、該乳癌型は、その造腫瘍性をＥＧＦに基づくＥｒｂＢ活性化に依存している。一実施形態では、本発明は、そのような患者での転移の形成を阻害すると考えられる。別の実施形態では、この乳癌型は転移性乳癌であり、即ち転移が既に形成されている乳癌であり、該乳癌を、対癌米国合同委員会の癌病期分類システムのＴＮＭ解剖学的／予後群システムに従ってステージＩＶと分類することができる。そのような転移性癌の場合、本発明の化合物により、既に形成された転移を退縮させることができる。好ましくは、この乳癌型は全てＣＤ４４ｖ６の発現を示す。
【００２７】
配列番号１または配列番号２のペンタペプチド等の本明細書に記載のペプチドと同じアミノ酸または該ペプチドと少なくとも同じ全体構成のペプチドを提供する任意の化合物は、本明細書に記載したように乳癌において転移の形成の予防だけでなく既に形成された転移の除去にも効果的であることができることも当業者は理解するだろう。
【００２８】
従って、本発明はいくつかの実施形態において、以下に記載のペプチドの内のいずれかのペプチド模倣物の、特に配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４もしくは５のペプチド模倣物の使用を意図する。このペプチド模倣物は、同じアミノ酸を好ましくは有することができるが骨格が変更されており、該骨格は、ペプチド自体が提供するのと同じ全体構成のペプチド模倣物を提供するが、例えばプロテアーゼ開裂に対してより耐性を示す。好ましいペプチド模倣物は例えば等配電子のペプトイドであり、該ペプトイドは、骨格のペプチド結合中にポリ−Ｎ−置換グリシンを含む。
【００２９】
本発明はまた、本明細書に記載のペプチドおよびペプチド模倣物の更なる改変型も検討する。そのような改変ペプチドまたは改変ペプチド模倣物は、例えばプロテアーゼ分解に対してペプチドをより安定させる、例えば化学的にまたは酵素的に付加された改変を含むことができ、これにより、ペプチドもしくはペプチド模倣物を薬学的に許容される塩として提供することが可能となる、または例えばペプチドもしくはペプチド模倣物の半減期等の生物学的特性を改善することが可能となる。そのようなペプチドまたはペプチド模倣物のそのような好ましい改変型は、このペプチドおよびペプチド模倣物における、特に配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５のペプチドまたはこれらの配列のペプチド模倣物におけるペグ化型、ヘシル化（hesylated）型、パシル化（pasylated）型、ミリストイル化型、グリコシル化型および／または環状型を指す。
【００３０】
そのような改変ペプチドまたは改変ペプチド模倣物は一般に、本発明に関して化合物またはペプチド化合物と称される。この化合物またはペプチド化合物を、例えば吸入による経口投与用に、経鼻投与用に、または皮下投与等の注射による投与用に製剤化することができる。
【００３１】
一実施形態では、本発明はまた、乳癌の処置において使用するための医薬組成物にも関する。そのような乳癌として、ＴＧＦαの発現もしくは活性化の増加を示さないおよび／またはトラスツズマブもしくはペルツズマブによる処置に対する耐性を示すならびにＭｅｔの発現の増加を示す乳癌型を挙げることができ、該乳癌型は、その造腫瘍性をＥＧＦに基づくＥｒｂＢ活性化に依存している。一実施形態では、本発明は、そのような患者での転移の形成を阻害すると考えられる。別の実施形態では、この乳癌型は転移性乳癌であり、即ち転移が既に形成されている乳癌であり、該乳癌を、対癌米国合同委員会の癌病期分類システムのＴＮＭ解剖学的／予後群システムに従ってステージＩＶと分類することができる。そのような転移性癌の場合、本発明の化合物により、既に形成された転移を退縮させることができる。好ましくは、この乳癌型は全てＣＤ４４ｖ６の発現を示す。この医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含むことができ、該医薬組成物を、吸入による等の経口投与用に、経鼻投与用に、または注射による投与用に製剤化することができる。
【００３２】
本発明はまた、乳癌の処置において使用するための医薬品の製造での、そのようなペプチド、このペプチド模倣物または改変ペプチドおよび改変ペプチド模倣物の使用にも関する。そのような乳癌として、ＴＧＦαの発現もしくは活性化の増加を示さないおよび／またはトラスツズマブもしくはペルツズマブによる処置に対する耐性を示すならびにＭｅｔの発現の増加を示す乳癌型を挙げることができ、該乳癌型は、その造腫瘍性をＥＧＦに基づくＥｒｂＢ活性化に依存している。一実施形態では、本発明は、そのような患者での転移の形成を阻害すると考えられる。別の実施形態では、この乳癌型は転移性乳癌であり、即ち転移が既に形成されている乳癌であり、該乳癌を、対癌米国合同委員会の癌病期分類システムのＴＮＭ解剖学的／予後群システムに従ってステージＩＶと分類することができる。そのような転移性癌の場合、本発明の化合物により、既に形成された転移を退縮させることができる。好ましくは、この乳癌型は全てＣＤ４４ｖ６の発現を示す。
【００３３】
更に、本発明は、ペプチド、このペプチド模倣物またはこの改変型を、これらを必要とするヒトに投与することにより、即ち本発明に係る化合物または本発明に係る化合物を含む医薬組成物を、これらを必要とするヒトに投与することにより、ヒトの乳癌を処置する方法に関する。そのような乳癌として、ＴＧＦαの発現もしくは活性化の増加を示さないおよび／またはトラスツズマブもしくはペルツズマブによる処置に対する耐性を示すならびにＭｅｔの発現の増加を示す乳癌型を挙げることができ、該乳癌型は、その造腫瘍性をＥＧＦに基づくＥｒｂＢ活性化に依存している。一実施形態では、本発明は、そのような患者での転移の形成を阻害すると考えられる。別の実施形態では、この乳癌型は転移性乳癌であり、即ち転移が既に形成されている乳癌であり、該乳癌を、対癌米国合同委員会の癌病期分類システムのＴＮＭ解剖学的／予後群システムに従ってステージＩＶと分類することができる。そのような転移性癌の場合、本発明の化合物により、既に形成された転移を退縮させることができる。好ましくは、この乳癌型は全てＣＤ４４ｖ６の発現を示す。
【００３４】
乳癌を処置するために、本発明に係る化合物、即ちペプチド、このペプチド模倣物またはその改変型、本発明の医薬組成物および本発明に係る方法が検討される。そのような乳癌として、ＴＧＦαの発現もしくは活性化の増加を示さないおよび／またはトラスツズマブもしくはペルツズマブによる処置に対する耐性を示すならびにＭｅｔの発現の増加を示す乳癌型を挙げることができ、該乳癌型は、その造腫瘍性をＥＧＦに基づくＥｒｂＢ活性化に依存している。好ましくは、この乳癌型は全てＣＤ４４ｖ６の発現を示す。例えば組織診、発現プロファイリング等を行なう一般的な診断方法により、この癌型を同定し、本発明に係る化合物で治療することができない、エストロゲン受容体依存性の乳癌等のその他の癌型と区別することができる。対癌米国合同委員会の癌病期分類マニュアルのＴＮＭ解剖学的段階／予後群システム（第7版、2010、Springer）により、特に有用な分類が提供される。乳癌がこの方針に従って分類され、必要に応じて例えばＥＧＦ、ＴＧＦαならびにＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ２に関する発現プロファイリングで補足されることは、本発明の目的のために好ましい。
【００３５】
転移が既に形成されており、更に全身に広がっている可能性がある乳癌を処置するために、本発明に係る化合物、即ちペプチド、このペプチド模倣物またはその改変型、本発明の医薬組成物および本発明に係る方法が検討される。この癌は転移性癌とも呼ばれ、該癌として、ＴＧＦαの発現もしくは活性化の増加を示さないおよび／またはトラスツズマブもしくはペルツズマブによる処置に対する耐性を示すならびにＭｅｔの発現の増加を示す転移型の乳癌型を挙げることができ、該乳癌型は、その造腫瘍性をＥＧＦに基づくＥｒｂＢ活性化に依存している。好ましくは、この乳癌型は全てＣＤ４４ｖ６の発現を示す。
【００３６】
そのような転移性乳癌型を、対癌米国合同委員会の癌病期分類マニュアルのＴＮＭ解剖学的段階／予後群システム（第7版、2010、Springer）に従って同定することができる。特にＭを１と設定する場合に、ＴＮＭ解剖学的段階／予後群システムに従って、本発明に係る転移性乳癌を典型的にはステージＩＶの癌と分類することができる。対癌米国合同委員会の癌病期分類マニュアル（第7版、2010、Springer）には、ＴＮＭ解剖学的段階／予後群システムと、本明細書で述べた様々な癌に関して癌を例えばステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶとみなす条件とが記載されており、そのため、該癌病期分類マニュアルは参照により援用される。
【００３７】
本発明の全ての態様および実施形態に関して、即ち以下に記載の化合物、医薬組成物および方法に関して、ヒトの乳癌を処置するために、特に上記に記載されている乳癌を処置するために、本明細書に記載のペンタペプチド、例えば配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５のペンタペプチド、特に配列番号２のペンタペプチドを使用することが常に好ましく、該乳癌は、対癌米国合同委員会の癌病期分類マニュアルのＴＮＭ解剖学的段階／予後群システム（第7版、2010、Springer）に従ってステージＩＶと分類できることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ＥｒｂＢリガンドの結合特異性を示す図である。ＥｒｂＢリガンドは、ホモ二量体およびヘテロ二量体を形成することにより１１種の異なるリガンドに結合することができる（Olayioye他、(2000)に基づく、参考文献を参照）。
【図２】ＥｒｂＢ受容体のＥＧＦ依存性誘導をＣＤ４４ｖ６特異的ペプチドでブロックすることができることを示す図である。血清飢餓させたＨＴ２９細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのＣＤ４４ｖ６特異的ペプチドまたはコントロールペプチドと共に５分にわたりプレインキュベートした。その後、細胞を２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで誘導して溶解させた。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ウェスタンブロッティングを使用して、ＥＧＦ誘導性のおよびＨＧＦ誘導性のＥｒｋキナーゼのリン酸化を検出した。
【図３】ＥＧＦおよびＥＲとは対照的に、ＴＧＦα、ＢＣ、Ｈｅｒ、ＨＢ−ＥＧＦまたはＡＲによるＥｒｂＢ受容体の誘導がＣＤ４４ｖ６に完全に非依存的であることを示す図である。血清飢餓させたＨＴ２９細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのＣＤ４４ｖ６特異的ペプチドまたはコントロールペプチドと共に５分にわたりプレインキュベートした。その後、示したように細胞を２０ｎｇ／ｍｌの様々なＥｒｂＢリガンドで誘導した。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ウェスタンブロッティングを使用して、ＥｒｂＢリガンド誘導性のＥｒｋキナーゼのリン酸化を検出した。
【図４】ｓｉＲＮＡによってＣＤ４４ｖ６の発現を抑止することにより、ＥｒｂＢ受容体のＥＧＦ依存性のおよびＥＲ依存性の誘導を消失させることができることを示す図である。示したようにＣＤ４４ｖ６特異的ｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡをＨＴ２９細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入後、細胞を２４時間にわたり血清飢餓させた。次いで、示したように細胞を５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦまたはＥＲで誘導した。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ウェスタンブロッティングを使用して、ＥＧＦ誘導性のおよびＥＲ誘導性のＥｒｂＢ１のおよびＥｒｋのリン酸化を検出した。
【図５】ＴＧＦαによるＥｒｂＢ受容体の誘導がＣＤ４４に非依存的であることを示す図である。示したようにＣＤ４４ｖ６特異的ｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡをＨＴ２９細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入後、細胞を２４時間にわたり飢餓させた。次いで、示したように細胞を５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦまたはＴＧＦαで誘導した。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ウェスタンブロッティングを使用して、ＥＧＦ誘導性のおよびＥＲ誘導性のＥｒｂＢ１のおよびＥｒｋのリン酸化を検出した。
【図６】ＨＢ−ＥＧＦによるＥｒｂＢ受容体の誘導はヘパリン硫酸塩に依存しているが、ＡＲによるＥｒｂＢ受容体の誘導はヘパリン硫酸塩に依存していないことを示す図である。血清飢餓させたＨＴ２９細胞を３時間にわたり６Ｕ／ｍｌの濃度でヘパリナーゼにより前処理し、次いで５ｎｇ／ｍｌのＨＢ−ＥＧＦまたはＡＲで誘導した（ＨＧＦをコントロールとして使用した）。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ウェスタンブロッティングを使用して、ＥｒｂＢリガンド誘導性のＥｒｋのリン酸化を検出した。
【図７】ＨＢ−ＥＧＦによるＥｒｂＢ受容体の誘導がＣＤ４４ｖ３に依存していることを示す図である。示したようにＣＤ４４ｖ３特異的ｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡをＨＴ２９細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入後、細胞を２４時間にわたり飢餓させた。次いで、示したように細胞を５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦまたはＨＢ−ＥＧＦで誘導した。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ウェスタンブロッティングを使用して、ＥＧＦ誘導性のおよびＨＢ−ＥＧＦ誘導性のＥｒｂＢ１のおよびＥｒｋのリン酸化を検出した。
【図８】ＥＧＦは、ＣＤ４４ｖ６を発現する細胞中でのみＥｒｂＢ１ホモ二量体を誘導することができるが、ＴＧＦαは、ＣＤ４４ｖ６の発現に非依存的にＥｒｂＢ１ホモ二量体を誘導することができることを示す図である。材料および方法に記載のレトロウイルスｅｃｏｐａｃｋ２−２９３システムにより、ＥｒｂＢ１発現ベクター受容体またはコントロールベクターをＡＳ細胞およびＡＳｓ６細胞に遺伝子導入した。その後、遺伝子導入細胞を飢餓させ、５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦまたはＴＧＦαで誘導した。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ウェスタンブロッティングを使用して、ＥＧＦ誘導性のおよびＴＧＦα誘導性のＥｒｂＢ１のおよびＥｒｋのリン酸化を検出した。
【図９】ＥＲは、ＣＤ４４ｖ６を発現する細胞中でのみＥｒｂＢ１ホモ二量体を誘導することができることを示す図である。材料および方法に記載のレトロウイルスｅｃｏｐａｃｋ２−２９３システムにより、ＥｒｂＢ１発現ベクター受容体またはコントロールベクターをＡＳ細胞およびＡＳｓ６細胞に遺伝子導入した。その後、遺伝子導入細胞を飢餓させ、５ｎｇ／ｍｌのＥＲまたはＴＧＦαで誘導した。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ウェスタンブロッティングを使用して、ＥＲ誘導性のおよびＴＧＦα誘導性のＥｒｂＢ１のおよびＥｒｋのリン酸化を検出した。
【図１０】ＣＤ４４ｖ３を発現する細胞中でのみＨＢ−ＥＧＦがＥｒｂＢ１ホモ二量体を誘導することができることを示す図である。材料および方法に記載のレトロウイルスｅｃｏｐａｃｋ２−２９３システムにより、ＥｒｂＢ１発現ベクター受容体またはコントロールベクターをＡＳｓ６細胞およびＡＳｖ１〜ｖ１０細胞に遺伝子導入した。その後、遺伝子導入細胞を飢餓させ、５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦまたはＨＢ−ＥＧＦで誘導した。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ウェスタンブロッティングを使用して、ＥＧＦ誘導性のおよびＨＢ−ＥＧＦ誘導性のＥｒｂＢ１のおよびＥｒｋのリン酸化を検出した。
【図１１】ＰＣＲによるＣＤ４４  ｍＲＮＡの検出に使用するプライマー対の概要を示す図である。
【図１２】ＰＣＲによるＣＤ４４の検出を示す図である。ＭＣＦ７細胞およびＭＣＦ１０Ａ細胞は１つの長いアイソフォームでＣＤ４４ｖ２〜ｖ１０を主に発現する。ＣＤ４４転写産物の発現をランオフＰＣＲ（run-off PCR）により検証した。標的細胞の全ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡに転写し、様々なバリアントエクソンに特異的なフォワードプライマーおよびＣＤ４４の定常部分の領域に特異的な１つの共通のバックワードプライマーによるＰＣＲによってＣＤ４４バリアント転写産物の発現を検出した。
【図１３】乳癌細胞中においてＣＤ４４ｖ６がＥＧＦ依存性ＥｒｂＢ誘導の共受容体として作用することを示す図である。血清飢餓させたＭＣＦ７細胞およびＭＣＦ１０細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのＣＤ４４ｖ６特異的ペプチドまたはコントロールペプチドと共に５分にわたりプレインキュベートした。その後、細胞を２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで誘導した。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ウェスタンブロッティングを使用して、ＥＧＦ誘導性のＥｒｋキナーゼのリン酸化を検出した。
【図１４】乳癌細胞中においてＣＤ４４ｖ６がＥＧＦ依存性ＥｒｂＢ誘導の共受容体として作用することを示す図である。血清飢餓させたＭＣＦ７細胞を、ＣＤ４４ｖ６特異的ｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡでそれぞれ処理した。遺伝子導入後、細胞を２４時間にわたり飢餓させた。次いで、細胞を５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで誘導した。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ウェスタンブロッティングを使用して、ＥＧＦ誘導性のＥｒｋのリン酸化を検出した。
【図１５】誘導可能な複合体中にＥｒｂＢ１およびＣＤ４４ｖ６が見出されることを示す図である。血清飢餓させたＭＣＦ１０細胞を５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで誘導した、または未処理のままにした。その後、ＥｒｂＢ１免疫沈降（またはコントロールとしてＣＤ４４ｖ６免疫沈降）を行なった。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ウェスタンブロッティングを行ない、ＥｒｂＢ１およびＣＤ４４ｖ６を検出した。
【図１６】Ｍｅｔに関するＣＤ４４ｖ６の共受容体機能が腫瘍転移に必要であることを示す図である。Ａ）示した箇所ではＢＳｐ７３ＡＳおよびその形質移入体をＨＧＦで導入し、ＭｅｔおよびＥＲＫの活性化を材料および方法に記載したように測定した。数字は、コンピュータプログラムＩｍａｇｅＪにより算出した誘導倍数（fold induction）を示す。全ての実験を少なくとも３回行ない、同様の結果を得た。Ｂ）Ａで使用した細胞を同系ラットの右後脇腹に皮下注射した（材料および方法）。４週間後、免疫組織化学的分析のためにリンパ節および肺を調製した。表したリンパ節は腋窩リンパ節である。肺について２枚の写真を表示しており、矢印は転移を示す。Ｃ）コントロール−ｓｈＲＮＡまたはＭｅｔ−ｓｈＲＮＡを発現するレトロウイルスに感染させたＡＳｓ６腫瘍のパラフィン切片の免疫組織化学的分析。切片を抗ＧＦＰ抗体で染色してｓｈＲＮＡ形質導入領域をモニタリングした、またはホスホ−Ｍｅｔ抗体で染色した。倍率２０倍。
【図１７】ＣＤ４４ｖ６特異的ペプチドが腫瘍細胞の転移性拡散をブロックすることを示す図である。Ａ）示したように、ＣＤ４４ｖ６特異的ラットペプチド、ＣＤ４４ｖ６特異的抗体またはコントロールペプチド（マウス）の存在下でＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞をＨＧＦで誘導した。ホスホ特異的抗体を使用して、ＭｅｔおよびＥｒｋの活性化を測定した。数値は誘導倍数を示す。Ｂ）ＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞をＢＤ１０ラットの右後脇腹に皮下注射した。腫瘍増殖から１週間後に、動物をＣＤ４４ｖ６ペプチド（腫瘍投与または静脈内注射）、コントロールペプチド、ＣＤ４４ｖ６抗体またはＰＢＳで処理した（材料および方法）。図１に記載したように、転移に関して腋窩リンパ節（左側）および肺（右側）を分析した。Ｃ）ＣＤ４４ｖ６ペプチドまたはコントロールペプチドのどちらかで処理した動物の肺の切片をＨ＆ＥおよびＰＡＳで染色した。Ｈ＆Ｅ−ヘマトキシリンおよびエオシン；ＰＡＳ−過ヨウ素酸シッフ反応。倍率１．５倍。Ｄ）示すように２８日にわたる処理による動物におけるＢＳｐ７３ＡＳｓ６腫瘍の増殖カーブ。ノギスを使用して、処理の開始後に毎週および２８日にわたり連続して、ＰＢＳ、ＣＤ４４ｖ６抗体、ＣＤ４４ｖ６ペプチドまたはコントロールペプチド（マウス）で処理したラットの平均腫瘍体積を測定した。
【図１８】インビボでのＣＤ４４ｖ６ペプチドの原発性腫瘍および転移への特異的結合を示す図である。Ａ）左側：ＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞を固定し、１時間にわたりＤＹ６８１標識ＣＤ４４ｖ６ラットペプチドまたはマウスペプチド（コントロール）のどちらかで染色した。２０倍の対物レンズを備えたレーザー走査型共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ２  ＳＰ２）を使用して撮像した。右側：それぞれＤＹ６８１ラットｖ６ペプチドとマウスペプチドの存在下においてＨＧＦでＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞を誘導し、Ｅｒｋの活性化を測定した。数値は誘導倍数を示す。Ｂ）ＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞（３週間にわたり増殖させた）の皮下腫瘍を有するラットに、２００μｇのＤＹ６８１ラットｖ６ペプチドまたはＤＹ６８１マウスｖ６ペプチド（コントロール）を静脈内注射し、Ｏｐｔｉｘ  ＭＸ２（ＡＲＴ、モントリオール、カナダ）を使用するＮＩＲＦ撮像により分析した。蛍光強度をＮＣ（正規化関数）で表示する。指定のペプチドの注射後の様々な時点で得た一連の蛍光データセットでは、２日の範囲内でラットｖ６ペプチドが腫瘍に結合するがマウスｖ６ペプチドは結合しないことを示す２４時間後のおよび４８時間後の蛍光シグナルが見られる。Ｃ）ＤＹ６８１ラットｖ６ペプチドを注射したラット由来の腫瘍および肺のエクスビボ走査から、腫瘍領域全体だけでなくラットペプチドの転移への結合を示す肺の特定領域において特異的蛍光シグナルが見られた。
【図１９−１】膵癌の同所性モデルにおいてＣＤ４４ｖ６ペプチドがヒト腫瘍細胞の転移を防ぐことを示す図である。Ａ：Ｌ３．６ｐｌ細胞をヒトｖ６ペプチドまたはコントロールとしてのラットｖ６ペプチドで処理した後、１０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦで誘導した。Ｅｒｋの活性化をウェスタンブロットで測定した。数字は誘導倍数を示す。Ｂ：Ｌ３．６ｐｌ細胞を雄のヌードマウス（材料および方法）の膵臓の上部に同所的に注射した。７日後、動物にヒトＣＤ４４ｖ６ペプチドまたはコントロール（ラット）ペプチド（各２０μｇ）を注射した。ペプチド注射を週当たり３回繰り返した。最初のペプチド処理から２３日後に動物を屠殺した。腫瘍を単離し、ＣＤ４４ｖ６発現（ＢＩＷＡ）またはコントロールとしての二次抗体に関して染色した。ヘマトキシリンで核を染色した。Ｃ：ホスホ−Ｍｅｔ抗体およびＭｅｔ抗体を使用する、ｖ６ペプチドまたはコントロールペプチドで処理した動物由来のＬ３．６ｐｌ腫瘍の免疫蛍光染色。ＤＡＰＩで核を染色する。Ｄの上部：式  体積＝（幅）２×長さ／２を使用して、実験の終了時に、ｖ６ペプチドまたはコントロールペプチドのどちらかで処理した動物の腫瘍体積を測定した。バーは、実験の終了時の平均腫瘍体積を表す。Ｄの下部：１５匹の動物からなる、ペプチドの内の１つで処理した各群の動物。バーは、転移を有する動物のパーセントを示す。ペプチドの内の１つで処理した各群の動物は１５匹の動物から成った。全てのグラフにおいて、スチューデントｔ検定：＊＊＊ｐ＜０．００１を使用して有意性を算出した。
【図１９−２】膵癌の同所性モデルにおいてＣＤ４４ｖ６ペプチドがヒト腫瘍細胞の転移を防ぐことを示す図である。Ｅ：コントロールペプチドまたはＣＤ３１特異的抗体を有するｖ６ペプチドで処理したＬ３．６ｐｌ腫瘍の染色。倍率は５０倍である。グラフは、５つの独立した腫瘍から算出した、平均血管数または平均血管サイズを示す。Ｆ：ｖ６ペプチド（培養培地中に２００ｎｇ／ｍｌ）の存在下でまたは非存在下でＬ３．６ｐｌ細胞により産生されたヒトＶＥＧＦ濃度。バーは、３つの独立した実験で得た３通りからの平均ＶＥＧＦ濃度を反映する。Ｇの左側：ｖ６ペプチドまたはコントロールペプチドで処理した動物の肝臓の巨視的な転移を調べた。右側：バーは転移の平均数を示す。ペプチドの内の１つで処理した各群の動物は１５匹の動物から成った。全てのグラフにおいて、スチューデントｔ検定：＊＊＊ｐ＜０．００１を使用して有意性を算出した。
【図２０−１】ヒト膵癌モデルの原発性腫瘍および転移におけるＣＤ４４ｖ６ペプチドの特異的蓄積を示す図である。Ａ：左側：ＤＹ６８１標識ＣＤ４４ｖ６ヒトペプチドまたはＤＹ６８１標識ＣＤ４４ｖ６ラットペプチドのどちらかでＬ３．６ｐｌ細胞を染色した。レーザー走査型共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ２  ＳＰ２）で撮像した。右側：ＤＹ６８１ヒトｖ６ペプチドまたはＤＹ６８１ラットｖ６ペプチドの存在下でＬ３．６ｐｌ細胞をＨＧＦで誘導し、Ｅｒｋの活性化を測定した。数字は誘導倍数を示す。Ｂ：図４に記載したように３週間にわたりＬ３．６ｐｌ腫瘍を同所的に誘導し、その後、ＤＹ６８１ヒトｖ６ペプチドまたはＤＹ６８１ラットｖ６ペプチドを１回静脈内注射した（各２０μｇ）。Ｐｅａｒｌ（登録商標）Ｉｍｐｕｌｓｅ  Ｓｍａｌｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉ−Ｃｏｒ）を使用して、麻酔したラットにおいて注射から２４時間後にペプチドの結合を分析した。ペプチド処理していない、腫瘍がない動物および腫瘍を有する動物をコントロールとして使用した。
【図２０−２】ヒト膵癌モデルの原発性腫瘍および転移におけるＣＤ４４ｖ６ペプチドの特異的蓄積を示す図である。Ｃ：Ｂに示す動物から原発性腫瘍、肝臓および脾臓を切除し、標識ペプチドの蛍光をエクスビボでモニタリングした。横のスケールは同期のシグナル強度を示す。
【図２１】ＣＤ４４ｖ６ペプチドによる、既存の転移の復帰を示す図である。Ａ：実験手順の略図。ラットまたはヌードマウスにおいてＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞またはＬ３．６ｐｌ細胞を注射した。３週間にわたり腫瘍を成長させ、転移を３週の期間後に検出した。ｖ６ペプチドまたはコントロールペプチド（ラットでは２００μｇ、ヌードマウスでは２０μｇ）で処理した群では、３週間後に処理を開始した。更に２１日後に動物を屠殺し、肺または肝臓の転移に関して分析した。Ｂ：ＢＳｐ７３ＡＳｓ６皮下腫瘍を有し、ｖ６ペプチド（ラット）またはコントロールペプチド（マウス）で処理したラットの肺を示す。下部の左側：定量化は転移の平均数を表す。各群で使用した動物の数を表３に示す。下部の右側：転移を有する動物の数のグラフ評価を表す。Ｃ：Ｌ３．６ｐｌ膵臓腫瘍を有し、ｖ６ペプチド（ヒト）またはコントロールペプチド（ラット）で処理したマウス由来の肝臓を示す。下部の右側：コントロールペプチド処理動物およびＣＤ４４ｖ６ペプチド処理動物における肝転移の数を評価するグラフを示す。下部の右側：転移を有する動物の数のグラフ評価を表す。
【図２２】既に生じた転移においてＣＤ４４ｖ６ペプチドがアポトーシスを誘導することを示す図である。腫瘍細胞の注射から３週間後に肺転移を有する動物に、ＣＤ４４ｖ６ペプチドまたはコントロールペプチドを１日おきに注射した。指定の日に、各群の内の１匹の動物を屠殺した。開裂カスパーゼ−３および開裂カスパーゼ−８（材料および方法）に対する抗体を使用して、肺転移におけるアポトーシスをパラフィン切片でモニタリングした。転移の領域に印を付けた（Ｍ）。倍率は４．５倍である。実験を２回行ない、同様の結果であった。
【図２３】表１から３を示す図である。
【図２４】ラット膵臓細胞におけるＥＲＫの活性化へのペグ化ラットＣＤ４４ｖ６ペプチドの効果を示す図である。
【図２５】ラット膵臓細胞におけるＥＲＫおよびＭｅｔの活性化へのペグ化ラットＣＤ４４ｖ６ペプチドの効果を示す図である。
【図２６】結腸癌細胞におけるＨＧＦ誘導性クラスター形成へのペグ化ラットＣＤ４４ｖ６ペプチドの効果を示す図である。
【図２７】ｖ６  １４ｍｅｒによる処理によって、肺における原発性腫瘍の増殖および巨視的な転移形成が減少することを示す図である。マウス当たり１×１０６個のマウス４Ｔ１細胞を、５０μｌ  Ｍａｔｒｉｇｅｌを加えた５０μｌ  ＲＰＭＩに希釈し、１０匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの第６乳腺脂肪体に注射した。注射から１週間後に、１００μｌ  ＰＢＳに溶解した２０μｇのマウスｖ６  １４ｍｅｒまたは１００μｌ  ＰＢＳに溶解した２０μｇのコントロールペプチド（ラットｖ６  １４ｍｅｒ）をマウスに腹腔内注射した。２週間にわたり週毎に３回、注射を行なった。２週間後にマウスを屠殺し、原発性腫瘍および肺を摘出した。Ａ：ｖ６ペプチド処理群における腫瘍体積の全般的な減少。Ｂ：原発性腫瘍の血管新生をモニタリングするための内皮マーカーＣＤ３４に関する免疫蛍光染色。全血管領域の減少をグラフで表す。Ｃ：ｖ６ペプチドにより巨視的な肺転移が減少する。黒色の矢印は転移の例に印を付ける。スケールバーは１ｃｍのサイズに相当する。肺転移の平均数の統計的評価。スチューデントｔ検定：＊ｐ＜０．０１；＊＊ｐ＜０．００５を使用して有意性を算出した。各群は５匹の動物から成った。
【図２８】Ａ：Ｌ３．６ｐｌ細胞においてＨＧＦにより誘導されるＭｅｔおよび信号伝達の活性化がＣＤ４４ｖ６に依存することを示す図である。Ｌ３．６ｐｌ細胞をヒトｖ６ペプチド（ヒトｖ６  １４ｍｅｒ）またはコントロールとしてのラットｖ６ペプチドで処理した後、１０ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦで誘導した。ＭｅｔおよびＥＲＫの活性化をウェスタンブロットで測定した。数字は誘導倍数を示す。実験を少なくとも５回繰り返した。Ｂ：ＨＧＦにより誘導されるｃ−Ｍｅｔおよび信号伝達の活性化がＣＤ４４ｖ６  ＨｅＬａ細胞に依存することを示す図である。飢餓させたＨｅＬａ細胞またはＨＴ２９細胞を３７℃で１０分にわたりｖ６ペプチド（ヒトｖ６  １４ｍｅｒ）またはコントロールペプチドと共にインキュベートし、次いで指定の時点で、２５ｎｇ／ｍｌのＨＧＦで誘導した。次いで、細胞を溶解させ、溶解物をホスホ−ＭｅｔおよびＭｅｔに関するウェスタンブロット分析にかけた。Ｃ：ＨＴ２９細胞においてＨＧＦにより誘導されるｃ−Ｍｅｔおよび信号伝達の活性化がＣＤ４４ｖ６に依存することを示す図である。ホスホ特異的抗体を使用して、上記に記載したようにＨＴ２９におけるＨＧＦ依存性のｃ−ＭｅｔおよびＥｒｋのリン酸化を測定した。示した箇所では、細胞をＣＤ４４ｖ６ペプチド（ヒトｖ６  １４ｍｅｒ）またはコントロールペプチド（実施例３の材料および方法を参照）で前処理した。ローディングコントロールをそれぞれｃ−Ｍｅｔ抗体とチューブリン抗体で染色した。
【図２９】ＥＧＦおよびＥＲとは対照的に、ＴＧＦ−α、ＢＣ、Ｈｅｒ、ＨＢ−ＥＧＦまたはＡＲによるＥｒｂＢ受容体の誘導がＣＤ４４ｖ６に完全に非依存的であることを示す図である。血清飢餓させたＨＴ２９細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＣＤ４４ｖ６特異的ペプチド（ヒトｖ６  １４ｍｅｒ）またはコントロールペプチドと共に５分にわたりプレインキュベートした。その後、示したように細胞を２０ｎｇ／ｍｌの様々なＥｒｂＢリガンドで誘導した。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ウェスタンブロッティングを使用して、ＥｒｂＢリガンド誘導性のＥｒｋキナーゼのリン酸化を検出した。
【図３０】ＨＴ２９細胞においてＥｒｂＢ受容体のＥＧＦ依存性の誘導をＣＤ４４ｖ６特異的ペプチドによりブロックすることができることを示す図である。血清飢餓させたＨＴ２９細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＣＤ４４ｖ６特異的ペプチド（ペプチド１＝１４ｍｅｒ、ペプチド２＝５ｍｅｒ）またはコントロールペプチドと共に５分にわたりプレインキュベートした。その後、細胞を２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦまたはＴＧＦαで誘導して溶解させた。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ウェスタンブロッティングを使用して、ＥＧＦ誘導性のおよびＴＧＦα誘導性のＥｒｋキナーゼのリン酸化を検出した。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
いくつかの本発明の好ましい実施形態に関して本発明をより詳細に説明する前に、一般的な定義を以下に記載する。
【００４０】
本明細書で具体的に開示していない任意の構成要素（element）または構成要素（elements）、限定事項（limitation）または限定事項（limitations）の非存在下で、以下で例示的に説明する本発明を適宜実行することができる。
【００４１】
特定に実施形態に関しておよびいくつかの図面を参照して本発明を説明するが、本発明はそれらに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【００４２】
用語「含む」を本発明の説明および特許請求の範囲で使用する場合、該用語は、その他の構成要素を除外しない。本発明の目的のために、用語「からなる」は用語「から構成される」の好ましい実施形態であるとみなす。以下において群が少なくともいくつかの実施形態を含むと定義する場合、このことは、これらの実施形態のみから好ましくはなる群も開示していると理解すべきである。
【００４３】
本発明の目的のために、用語「得られる」は、用語「得ることができる」の好ましい実施形態であるとみなす。以下において例えば抗体を特定の供給源から得ることができると定義する場合、このことは、この供給源から得られる抗体も開示していると理解すべきである。
【００４４】
単数名詞を示す際に不定冠詞または定冠詞、例えば「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」を使用する場合、その他に何らかが具体的に述べられている場合を除き、これらはその名詞の複数形を含む。用語「約（about）」または「約（approximately）」は本発明に関連して、当該特徴の技術的効果が依然として保証されると当業者が理解するであろう精度の間隔を意味する。この用語は、示した数値の±２０％の、好ましくは±１５％の、より好ましくは±１０％の、更により好ましくは±５％のずれを典型的には示す。
【００４５】
更に、本明細書および特許請求の範囲において、類似の構成要素を区別するために用語「第１の」、「第２の」、「第３の」または「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」または「（ｉ）」、「（ｉｉ）」、「（ｉｉｉ）」、「（ｉｖ）」等を使用するが、これらを逐次的なまたは経時的な順序で記載する必要はない。そのように使用する用語を適切な状況下で交換可能であること、および本明細書に記載の本発明の実施形態を本明細書に記載以外のまたは本明細書で例示以外の順序で実行可能であることを理解すべきである。
【００４６】
用語「第１の」、「第２の」、「第３の」または「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」または「（ｉ）」、「（ｉｉ）」、「（ｉｉｉ）」、「（ｉｖ）」等が方法または使用またはアッセイの工程に関する場合、別段の指示がない限り、工程間に時間コヒーレンスまたは時間間隔コヒーレンスは存在しない。即ち、本明細書で上記のまたは下記の用途において別段の指示がない限り、工程を同時に行なうことができる、または各工程間に数秒の、数分の、数時間の、数日の、数週間の、数カ月のもしくは更に数年の時間間隔が存在することができる。
【００４７】
専門用語をその一般的な意味で使用する。ある用語に特定の意味を与える場合、以下のその用語を使用する文脈において、その用語を定義するだろう。
【００４８】
上述したように、本発明は、ヒトの転移性癌の処置に使用するためのペプチドまたはペプチド化合物に関する。
【００４９】
本発明は、アミノ酸配列Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ（配列番号２）のペプチドがヒト膵癌細胞の転移を阻害することができるだけでなくヒト膵癌の同所性動物モデルにおいて既に生じた転移を除去することもできるという、以下に記載の実験的発見にある程度基づく。そのため、様々な転移性癌で同じ効果を観測することができると仮定するのが妥当であると思われ、特に、この癌がＣＤ４４ｖ６の発現を示す場合に妥当であると思われる。ＮからＡへのおよびＥからＡへの変異により、アミノ酸配列Ａ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ａ（配列番号３）のペプチドがＭｅｔ活性化を抑止することができることが更に分かった（Matzke他、Cancer Res. (2005)、65 (14)、6105〜6110を参照）。ＫからＡへのおよびＦからＡへの非保存的アミノ酸置換（Matzke他、上記参照）にもかかわらずＮ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ（配列番号２）によるＭｅｔ活性化への効果が維持されるならば、アミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（配列番号１）（式中、Ｘ１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ５が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹを含む群から選択される）のペプチドを膵癌の処置だけでなく一般的な転移性癌の処置にも使用することができると仮定するのが妥当であると思われる。ＣＤ４４ｖ６によるＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ２のリガンド依存性活性化に関して本明細書に示したデータを考慮し、これを乳癌およびその特定の型に特に適用すべきである。そのような特定の乳癌として、ＴＧＦαの発現もしくは活性化の増加を示さないおよび／またはトラスツズマブもしくはペルツズマブによる処置に対する耐性を示すならびにＭｅｔの発現の増加を示す乳癌型を挙げることができ、該乳癌型は、その造腫瘍性をＥＧＦに基づくＥｒｂＢ活性化に依存している。一実施形態では、本発明は、そのような患者での転移の形成を阻害すると考えられる。別の実施形態では、この乳癌型は転移性乳癌であり、即ち転移が既に形成されている乳癌であり、該乳癌を、対癌米国合同委員会の癌病期分類システムのＴＮＭ解剖学的／予後群システムに従ってステージＩＶと分類することができる。そのような転移性癌の場合、本発明の化合物により、既に形成された転移を退縮させることができる。好ましくは、この乳癌型は全てＣＤ４４ｖ６の発現を示す。
【００５０】
そのため、本発明は一実施形態において、ヒトの乳癌の、好ましくは本明細書で述べた特定のタイプの乳癌の処置において使用するための化合物であって、少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（式中、Ｘ１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ５が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹかを含む群から選択される）（配列番号１）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物を含む化合物に関する。
【００５１】
好ましくは、本発明は一実施形態において、ヒトの乳癌の、好ましくは本明細書で述べた特定のタイプの乳癌の処置において使用するための化合物であって、少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ５が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）（配列番号４）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物を含む化合物に関する。一例は、アミノ酸配列Ａ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ａ（配列番号３）のペプチドまたはこのペプチド模倣物である。
【００５２】
更により好ましくは、本発明は一実施形態において、ヒトの乳癌の、好ましくは本明細書で述べた特定のタイプの乳癌の処置において使用するための化合物であって、少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（式中、Ｘ１が、Ｋ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ５が、ＥまたはＤを含む群から選択される）（配列番号５）を含むペプチドを含む化合物に関する。最も好ましい実施形態の一例として、ペプチドはアミノ酸配列Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ（配列番号２）を含むことができ、好ましくは該アミノ酸配列Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ（配列番号２）からなることができる。
【００５３】
好ましい特定のタイプの乳癌として、ＴＧＦαの発現もしくは活性化の増加を示さないおよび／またはトラスツズマブもしくはペルツズマブによる処置に対する耐性を示すならびにＭｅｔの発現の増加を示す乳癌型を挙げることができ、該乳癌型は、その造腫瘍性をＥＧＦに基づくＥｒｂＢ活性化に依存している。一実施形態では、本発明は、そのような患者での転移の形成を阻害すると考えられる。別の実施形態では、この乳癌型は転移性乳癌であり、即ち転移が既に形成されている乳癌であり、該乳癌を、対癌米国合同委員会の癌病期分類システムのＴＮＭ解剖学的／予後群システムに従ってステージＩＶと分類することができる。そのような転移性癌の場合、本発明の化合物により、既に形成された転移を退縮させることができる。好ましくは、この乳癌型は全てＣＤ４４ｖ６の発現を示す。
【００５４】
用語「ペプチド」は本明細書で使用する場合、少なくとも上述の５個のアミノ酸および最大で１４個のアミノ酸を含む任意の化合物を示す。
【００５５】
本発明に係るペプチドが上述の５個のアミノ酸よりも多くを有する場合、このアミノ酸は、例えばアミノ酸配列Ｋ−Ｅ−Ｑ−Ｗ−Ｆ−Ｇ−Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ−Ｇ−Ｙ−Ｒ（配列番号６）のペプチドまたはそのバリアント中に見られるものであることができる。配列番号６のアミノ酸７位〜１１位が配列番号２に相当することが留意される。配列番号２のペプチドに関しては、Ｍｅｔ活性化への悪影響を有することなくアミノ酸１位、２位、３位、４位、５位、６位、１２位、１３位または１４位をアラニンに置換することができる、アラニン置換によるリンカースクリーン分析（linker screen analysis）で発見されている。そのため、そのようなペプチドは、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ２が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ３が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ４が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ５が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ６が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ７が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ１１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ１２が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ１３が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ１４が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹを含む群から選択される）（配列番号７）のアミノ酸６〜１２位、５〜１３位、４〜１４位等を含む任意のペプチドであることができる。好ましくは、上記に提示した原理に従って選択を行なう。そのため、Ｘ１は、Ｋに類似のアミノ酸または非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩのどちらかであることができる。同様の考察をＸ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３またはＸ１４に適用する。好ましい一実施形態では、そのようなより長いペプチドは、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ２が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ３が、Ｎ��２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ４が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ５が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ６が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１２が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１３が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１４が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）（配列番号８）のアミノ酸６〜１２位、５〜１３位、４〜１４位等を含む。更により好ましい実施形態では、そのようなより長いペプチドは、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ２が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥまたはＤを含む群から選択され、Ｘ３が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ４が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ５が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ６が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥまたはＤを含む群から選択され、Ｘ１２が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１３が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ１４が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択される）（配列番号９）のアミノ酸６〜１２位、５〜１３位、４〜１４位等を含む。
【００５６】
ペプチドは直鎖状であることができ、分枝状であることができ、および分枝しているまたは分枝していない環状であることがきる。環状の、分枝状のおよび分枝した環状のペプチドは、翻訳後の天然プロセスによって生じることができる、または合成方法によって作製され得る。
【００５７】
最も好ましい実施形態のいくつかでは、本発明に係るペプチドは、上述したように５個のまたは１４個のアミノ酸を含み、より好ましくは該アミノ酸から成り、配列番号１、２、３、４、５または６〜１０のペプチドを含む。本発明の最も好ましい実施形態は配列番号２のペプチドに関する。
【００５８】
用語「ペプチドを含む化合物」は、例えば薬学的に許容される塩の形態で、ペプチドを含む化合物を指す。この用語は、例えば化学的にまたは酵素的に改変されているペプチドも同様に指し、その結果、例えば配列番号１、２、３、４または５のペプチドは、以下に記載する更なる改変を含む。配列番号２のペプチドの改変型が特に好ましい。
【００５９】
そのため、用語「ペプチドを含む化合物」およびその文法的バリエーション、例えば「ペプチド化合物」として本明細書に記載のペプチドの塩が挙げられ、好ましくは本明細書に記載のペプチドの薬学的に許容される塩が挙げられる。用語「薬学的に許容される塩」に包含される塩は、本発明のペプチド化合物の非毒性塩を指す。代表的な塩およびエステルとして、以下のものが挙げられる：アセテート、アスコルベート、ベンゼンスルホネート、ベンゾエート、ビカルボネート、ビスルフェート、ビタータレート、ボレート、カミシレート（caamsylate）、カーボネート、シトレート、ジヒドロクロリド、メタンスルホネート、エタンスルホネート、ｐ−トルエンスルホネート、シクロヘキシルスルファメート、キネート、エデテート、エジシレート、エストレート、エシレート、フマレート、グルコネート、グルタメート、グリセロホスフェート（glycerophophates）、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエート、ラクテート、ラクトビオネート、ラウレート、マレート、マレエート、マンデレート、メシレート、ムケート、ナプシレート、ニトレート、ｎ−メチルグルカミン、オレエート、オキサレート、パルモエート、パモエート（エンボネート）、パルミテート、パントテネート、ペルクロレート、ホスフェート／ジホスフェート、ポリガラクツロネート、サリシレート、ステアレート、スクシネート、スルフェート、スルファメート、サブアセテート、スクシネート、タンエート、タートレート、トシレート、トリフルオロアセテートおよびバレレート。その他の塩として、Ｃａ塩、Ｌｉ塩、Ｍｇ塩、Ｎａ塩およびＫ塩；リシンまたはアルギニン等のアミノ酸の塩；グアニジン、ジエタノールアミンまたはコリン；アンモニウム、置換アンモニウム塩またはアルミニウム塩が挙げられる。従来の方法によりこの塩を調製する。
【００６０】
しかしながら、「ペプチドを含む化合物」のペプチド成分は、配列番号１〜９のいずれかのペプチド配列に加えて、その他のタンパク質由来のアミノ酸配列を含むことができる。従って、本発明のペプチド化合物として、異種アミノ酸配列に融合した配列番号１〜９から本質的になる異種融合ペプチドが挙げられる。異種アミノ酸配列は、１個の、２個の、３個の、４個のまたはより多くのアミノ酸を含むことができる、または該アミノ酸からなることができる。異種アミノ酸配列は、例えば少なくとも５個のまたは少なくとも１０個のまたは少なくとも２０個の異種アミノ酸を含むことができる、または該異種アミノ酸からなることができる。異種アミノ酸を、ＣＤ４４由来の配列である配列番号１〜９のＮ末端および／またはＣ末端に融合させ、細胞膜を横切る転位の改善等の、その他の機能性を付与することができる。
【００６１】
本発明のペプチド成分が単離されたペプチドであることが好ましい。用語「単離」は、自然の状態から「人の手によって」変更されたことを意味する。「単離」された組成物または物質が天然に存在する場合、該組成物または物質は、その元々の環境から変化しているもしくは該環境から取り出されているまたはその両方である。この用語を本明細書で用いる場合、例えば、生きている動物中に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されていないが、該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの天然の状態で共存する材料から分離されている、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されている。
【００６２】
本発明のペプチドが純粋な状態であることも好ましい。好ましくは、ペプチドは≧８０％の純度であり、好ましくは≧９０％の純度であり、より好ましくは≧９５％の純度であり、更により好ましくは≧９９％の純度であり、夾雑している巨大分子、特にその他のペプチドに対して９９．９％の純度を超えている薬学的に純粋な状態が特に好ましい。ペプチドが感染因子および発熱因子を含まないことが好ましい。
【００６３】
好ましくは、精製されたペプチドは、その他のペプチドを実質的に含まない。この文脈で使用する場合、用語「純粋な」は、二量体等の別の物理的形態での同じペプチドの存在を排除しない。
【００６４】
本発明のペプチドを、化学合成によりまたは宿主細胞中での組み換え発現により調製することができる。化学合成による調製が好ましい。タンパク質産物として、例えば配列番号２のまたは本発明のその他のペプチドの内のいずれかの化合物の、液相ペプチド合成または固相ペプチド合成の技法による産生が可能である。合成的なペプチド合成アプローチは一般に、自動合成器および固相としての適切な樹脂の使用を伴い、該樹脂には、所望のペプチドのＣ末端のアミノ酸が結合している。次いで、合成が完了するまで、典型的にはＦＭＯＣベースのまたはＢＯＣベースの化学プロトコルのどちらかを使用して、適切に保護された形態の次の所望のアミノ酸を連続的に連結させることにより、Ｎ末端方向へのペプチドの伸長が達成される。次いで、通常は樹脂からのペプチドの開裂と同時に、保護基をペプチドから開裂し、次いで、従来の技法を使用して、例えば、溶媒としてアセトニトリルを使用し、イオン対形成剤としてトリフルオロ酢酸を使用する逆相ＨＰＬＣにより、ペプチドを単離して精製する。そのような手順は一般に、多くの刊行物に記載されており、例えばStewartおよびYoung、「Solid Phase Peptide Synthesis」、第2版、Pierce Chemical Company、Rockford、III. (1984)を参照することができる。
【００６５】
用語「ペプチド模倣物」は、対応するペプチドを模倣するように設計されている低分子タンパク質様鎖を指す。ペプチド模倣物は、既存のペプチドの改変から、またはペプトイドおよびβ−ペプチド等のペプチドを模倣する同様のシステムを設計することにより典型的には生じることができる。アプローチに関係なく、生物活性に悪影響を及ぼすことなく代謝安定性および生物学的利用性等の分子特性を有利に調整するように、改変された化学構造が設計される。
【００６６】
典型的には、ペプチド模倣物は、ペプチド結合のアミド基の代わりにメチル化アミド基等の改変骨格を有し、プロテアーゼによる分解に対するペプチド模倣物の安定性を高めることができる。代わりにまたは加えて、ペプチド模倣物として、非天然アミノ酸またはＤ−鏡像異性体を挙げることができる。ペプチド模倣物の共通のテーマは、骨格構造中のおよび／またはアミノ酸中の分子変化が、ペプチド模倣物の生物活性に悪影響を及ぼさないように、対応するペプチドと比べてペプチド模倣物の全体構造への実質的影響を有すべきでないことである。そのため、ペプチド模倣物は、対応するペプチドの同配体である。好ましいペプチド模倣物は例えば等配電子のペプトイドであり、該ペプトイドは、骨格のペプチド結合中にポリ−Ｎ−置換グリシンを含む。従って、本発明によれば、ペプチド模倣物は、以下に記載する実験において例えば配列番号１、２、３、４または５のペプチド等の以下に記載のペプチドと同じ活性を有するだろう。最も好ましいペプチド模倣物は、配列番号２のペプチド模倣物等の５個のアミノ酸を有するもの、８個のアミノ酸を有するもの（配列番号１６、１７または１８のペプチド模倣物等）または１４個のアミノ酸を有するもの（配列番号６、７、８、９または１０を参照）である。そのようなペプチド模倣物は、好ましくは等配電子のペプトイドであり、該ペプトイドは、骨格のペプチド結合中にポリ−Ｎ−置換グリシンを含む。
【００６７】
本発明はまた、例えばヒトの乳癌を処置するための、好ましくは本明細書で述べた特定のタイプの乳癌を処置するための医薬組成物としてのペプチドまたはペプチド模倣物の改変型の使用も意図する。そのような改変型は例えば、例えばプロテアーゼによるペプチドまたはペプチド模倣物の分解を減少させるおよびペプチドまたはペプチド模倣物の安定性を高めるために、ＦＭＯＣもしくはＢＯＣ等のブロッキング基によりまたはメチル化等のアルキル化により、各Ｎ末端および／またはＣ末端で化学的に改変されているペプチドまたはペプチド模倣物に関する。その他の改変として、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、即ち環状ペプチド、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化した環状の５ｍｅｒ（配列番号２をベースとする）、６ｍｅｒ、８ｍｅｒまたは１４ｍｅｒ等のミリストイル化した環状ペプチド等のミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化等のタンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介性の付加、ユビキチン化およびｓｕｍｏ化が挙げられる。そのようなペプチド模倣物の例を表４に示す。好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、２０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧまたは２００〜２００００Ｄａの範囲の分子量を有するＰＥＧでペグ化した１４ｍｅｒ、１４ｍｅｒ、環状８ｍｅｒまたは環状５ｍｅｒである。典型的なペプチド模倣物は１つまたは複数の改変を有することができる、即ち環状であることができる、ならびに該ペプチド模倣物を更にミリストイル化することができる、ペグ化することができるおよび／またはＤ−アミノ酸の使用による等の本明細書に記載の任意のその他の方法で改変することができる。ペプチド模倣物の典型例として、配列番号１〜２３とＬ−アミノ酸および／またはＤ−アミノ酸とを有するものが挙げられる。
【００６８】
例えばZitzmann他（2005、Journal of Nuclear Medicine、46(5):782）に記載された、当業者に一般的に既知である方法により、ペプチドの環化を行なう。
【００６９】
本発明の化合物を、細胞毒性化合物および／または化学療法薬と併用投与することもできる。本発明の化合物を１種もしくは複数種の細胞毒性化合物および／もしくは化学療法薬と一緒に投与することが可能である、または、細胞毒性化合物を本発明のペプチドもしくは化合物に共有結合的に接合させることが可能である。好ましい細胞毒性化合物はマイタンシノイドであり、好ましい化学療法化合物はタキサンである。
【００７０】
加えてまたは代わりに、本発明に係るペプチドまたはペプチド模倣物の好ましい改変型として、例えば、生物学的特性が改善されている、例えば溶解性、吸収、生物学的半減期等が改善されている、本発明に係るペプチドまたはペプチド模倣物の化学的なまたは酵素的な改変型が挙げられる。改変により、分子の毒性を選択的に低減することができ、分子のあらゆる望ましくない副作用等を選択的に除去するまたは軽減することができる。例えば生物学的半減期を増加させる改変として、ペグ化、ヘシル化、パシル化、グリコシル化および／または末端でシアル酸残基を有するグリコシル構造を有する環状等が挙げられる。
【００７１】
用語「ペグ化（pegylated）」およびその文法的バリエーション、例えば「ペグ化（pegylation）」は全て、ペプチドまたはペプチド模倣物が様々な型で（例えば単離型で、薬学的に許容される塩として等）、本明細書に記載のペプチドまたはペプチド模倣物に共有結合するＰＥＧ部分、即ちポリエチレングルコール（polyethylenglycol）鎖を含むことを説明する。
【００７２】
以下に記載するように、配列番号２のヒトＣＤ４４ｖ６ペンタペプチドのカウンターパートであり、ＰＥＧ７５０またはＰＥＧ３０００で改変されている、配列ＮＥＷＱＧ（配列番号１１）のラットＣＤ４４ｖ６ペンタペプチドは、少なくともＰＥＧ３０００部分が、約６２０Ｄａである配列番号１１の配列の算出した分子量よりも著しく高い分子量、即ち３０００Ｄａを有するにもかかわらず、ＭｅｔおよびＥｒｋのＨＧＦ刺激性のおよびＣＤ４４媒介性の活性化を阻害することができる。更に、そのような分子量のＰＥＧは、長いジグザグ構造を有することが知られている。従って、驚くことに、配列番号１１のペンタペプチド等の比較的小さいペプチドの改変により活性は失われない。同じ事を配列番号２のペンタペプチド、このペプチド模倣物またはより長いペプチド、例えば配列番号６のペプチド等のヒトカウンターパートに適用すべきであると結論付けるのが正しいと思われる。更に驚くことに、非ペグ化ペプチドと比べてペグ化ペプチドによりＥＲＫシグナル伝達がより効果的に阻害される。
【００７３】
用語「ＰＥＧ部分」または「ポリエチレングリコール（Polyethylenglycol）部分」は以下で使用する場合、約２００Ｄａ〜約３５，０００，０００Ｄａの平均分子量のＰＥＧを指す。約４００Ｄａ〜約２０，０００Ｄａの、好ましくは約６００Ｄａ〜約１０，０００Ｄａの、更により好ましくは約７００Ｄａ〜約１０，０００Ｄａの平均分子量を有するＰＥＧを使用することが好ましい。最も好ましいＰＥＧは、約８００Ｄａ〜約８，０００Ｄａの、約９００Ｄａ〜約７，０００Ｄａの、約１，０００Ｄａ〜約６，０００Ｄａの、例えば約２，０００Ｄａの、約３，０００Ｄａの、約４，０００Ｄａのまたは約５，０００Ｄａの平均分子量を有する。好ましい実施形態では、ＰＥＧは、２００〜２００００Ｄａの範囲の平均分子量を有する。
【００７４】
ＰＥＧは概して、その平均分子量により命名される。そのため、９個の繰り返し単位を有するＰＥＧは４００Ｄａの平均分子量を有し、ＰＥＧ−４００と呼ばれるだろう。そのため、本発明のために検討するＰＥＧは、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ５０、ＰＥＧ８４０、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ４６００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１００００、ＰＥＧ１２０００等のＰＥＧであることができる。なぜならば、これらは例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販されているからである。
【００７５】
ＰＥＧは、直鎖状の、分枝状の、星状のまたは櫛状のＰＥＧとして生じることができる。分枝状のＰＥＧは、中心コア基から放射状に広がる３〜１０個のＰＥＧ鎖を有する。星状のＰＥＧは、中心コア基から放射状に広がる１０〜１００個のＰＥＧ鎖を有する。櫛状のＰＥＧは、通常はポリマー骨格にグラフトされた複数のＰＥＧ鎖を有する。
【００７６】
本発明の目的のために、直鎖状のＰＥＧを使用することが通常は好ましく、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ４０００もしくはＰＥＧ５０００またはより高い分子量のＰＥＧ等の約１，０００〜６，０００Ｄａの範囲の平均分子量を有する直鎖状のＰＥＧを使用することが特に好ましい。
【００７７】
ＰＥＧ部分を更に改変することができる。例えば、脂肪アルコールおよび脂肪酸でＰＥＧ部分を共有結合的に改変することができる。そのような更なる改変により、改変ペグ化ペプチドおよび改変ペグ化ペプチド模倣物を構築することまたはミセル様構造体またはリポソーム様構造体に少なくとも組み込むことが可能になる。
【００７８】
本発明はまた、そのようなミセル様構造体またはリポソーム様構造体にも関する。ペグ化ペプチドまたはこのペグ化ペプチド模倣物、およびそのようなペグ化ペプチドまたはこのペグ化ペプチド模倣物を含む医薬組成物は、例えば、薬物溶解性の改善、投薬の頻度の低減、循環半減期の延長、薬物安定性の上昇、タンパク質分解からの保護の強化等を提供することができる。脂肪アルコール鎖または脂肪酸鎖等の更なる改変により、細胞膜との相互作用の改善が可能になることから、ミセル様構造体またはリポソーム様構造体により、ペグ化ペプチドまたはペグ化ペプチド模倣物をより効率的に送達することが更に可能になる。更に、ミセル様構造体またはリポソーム様構造体は、化学療法薬等の追加の薬学的活性剤を含むことができる。膵癌の場合、この薬剤として例えばゲムシタビンを挙げることができる。乳癌の場合、この薬剤としてハーセプチンを挙げることができる。
【００７９】
本発明はまた、追加の薬学的活性剤を含むそのようなミセル様構造体またはリポソーム様構造体にも関する。そのようなミセル様構造体またはリポソーム様構造体により、ペグ化ペプチドまたはこのペグ化ペプチド模倣物によるそのような化学療法薬の例えばＣＤ４４ｖ６を発現する腫瘍へのターゲティングが可能になり、そのため、治療のターゲティングおよび改善が可能になる。
【００８０】
ペプチドまたはペプチド模倣物をＰＥＧ部分で改変する方法は当業者に既知である。ＰＥＧ部分の共有結合を化学的にまたは酵素的に行なうことができる。
【００８１】
化学的な改変における最初の工程では概して、ＰＥＧポリマーの一方の末端または両方の末端のどちらかが官能化される。官能化により、単官能性の、ホモ二官能性のまたはヘテロ二官能性のＰＥＧを区別することができる。
【００８２】
化学的なペグ化プロセスは概して、２つのタイプ、即ち溶液相バッチプロセスまたはオンカラムフェドパッチプロセス（on-column fed-batch process）に分類され得る。一般に採用されるバッチプロセスは、好ましくは４〜６℃の温度での、適切な緩衝溶液中での試薬の混合、その後の、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー等の技法を使用する所望の産物の分離および精製を含む。
【００８３】
ＰＥＧ誘導体に適した官能基の選択は、ＰＥＧに連結され得る分子上の利用可能な反応基の種類に基づく。タンパク質およびペプチドの場合、典型的な反応性アミノ酸として、リシン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、チロシンが挙げられる。アルデヒド官能性ポリマーとの接合による部位特異的な部位として、Ｎ末端のアミノ基およびＣ末端のカルボン酸を使用することもできる。例えばペプチドのＮ末端のみを除いてアミノ酸とＰＥＧとを反応させないことが好ましい場合、例えばＦＭＯＣでアミノ酸の官能基をブロックし、ペプチドをペグ化し、次いでアミノ酸を脱ブロックすることができる。
【００８４】
ペグ化ペプチド等のＰＥＧ誘導体を形成するために使用する技法は一般的に、ＰＥＧポリマーと、ヒドロキシル基と反応する基、典型的には無水物、酸塩化物、クロロギ酸塩および炭酸塩とを反応させている。第２世代のペグ化化学では、アルデヒド、エステル、アミド等のより効果的な官能基を接合に利用可能である。
【００８５】
ヘテロ二官能性ＰＥＧは、２つの構成成分を連結するのに非常に有用であり、この連結では、親水性で柔軟な生体適合性のスペーサが必要である。ヘテロ二官能性ＰＥＧに好ましい末端基は、マレイミド、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、アミン、カルボン酸およびＮＨＳエステルである。
【００８６】
本発明に係るペグ化ペプチドおよびこのペグ化ペプチド模倣物を、場合により薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物の形態で提供することができる。
【００８７】
以下では、本発明に係る化合物、即ちペプチド、このペプチド模倣物およびこれらの改変型、これらの化合物を含む医薬組成物ならびにこれらの化合物を使用する方法をどのようにしてヒトの転移性癌の処置に使用することできるかを述べる。以下において転移性癌の処置を言及する際は常に、この言及は、好ましい実施形態として、以下に記載するペンタペプチド、即ち配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５のペンタペプチド、特に配列番号２のペンタペプチド、これらのペプチド模倣物またはこれらの改変型、例えばこれらのペグ化型の使用を意図すると理解されたい。
【００８８】
以下に記載の実験から導き出すことができるように、実験で使用したペプチドは、膵癌モデルにおける転移の形成を阻害することできただけでなく、既に形成された転移の退縮を誘導することができた。述べたように、本発明は、特定の乳癌、好ましくは特定の転移性乳癌を処置するための化合物、医薬組成物の使用ならびに該処置への本明細書に記載の方法の適用に関する。
【００８９】
本発明に係る乳癌では、ＣＤ４４ｖ６の発現が癌組織で観測されている、または例えばＣＤ４４ｖ６抗体による類似の検査時に観測され得る。そのため、本明細書に記載の化合物および医薬組成物による処置に患者が適格であるかどうかを調べるために、腫瘍組織の組織診およびＣＤ４４ｖ６の発現に関する検査を行なうことができる。本明細書で述べた化合物および医薬組成物による処置が考慮される、好ましい特定の乳癌型として、ＴＧＦαの発現もしくは活性化の増加を示さないおよび／またはトラスツズマブもしくはペルツズマブによる処置に対する耐性を示すならびにＭｅｔの発現の増加を示す乳癌型を挙げることができ、該乳癌型は、その造腫瘍性をＥＧＦに基づくＥｒｂＢ活性化に依存している。一実施形態では、本発明は、そのような患者での転移の形成を阻害すると考えられる。別の実施形態では、この乳癌型は転移性乳癌であり、即ち転移が既に形成されている乳癌であり、該乳癌を、対癌米国合同委員会の癌病期分類システムのＴＮＭ解剖学的／予後群システムに分類することができる。そのような転移性癌の場合、本発明の化合物により、既に形成された転移を退縮させることができる。好ましくは、この乳癌型は全てＣＤ４４ｖ６の発現を示す。
【００９０】
一般に、例えば組織診、発現プロファイリング等を行なう一般的な診断方法により、既に転移しているか否かに非依存的なこの特定の乳癌型を同定し、本発明に係る化合物で治療することができない、エストロゲン受容体依存性の乳癌等のその他の乳癌型と区別することができる。特に有用な分類は、対癌米国合同委員会の癌病期分類マニュアルのＴＮＭ解剖学的段階／予後群システム（第7版、2010、Springer）により提供される。乳癌がこの方針に従って分類され、必要に応じて例えばＥＧＦ、ＴＧＦαならびにＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ２に関する発現プロファイリングで補足されることは、本発明の目的のために好ましい。
【００９１】
腫瘍組織の組織診およびＣＤ４４ｖ６の発現に関する検査を行なって、一般的な転移性乳癌および上述の特定の乳癌型の転移型を同定することができる。腫瘍がＣＤ４４ｖ６を発現することが明らかになり得る場合には、および転移が形成され始めているまたは既に形成されており、おそらく体中に広がっている場合には、この腫瘍を本発明に係る転移性癌とみなす。腫瘍がＥＧＦの活性の上方制御を更に示すがＴＧＦαに関しては示さない場合には、腫瘍を、ＴＮＦ−αに関する自己分泌ループが生じていないＥＧＦ依存性の乳癌型の転移型とみなすことができる。
【００９２】
対癌米国合同委員会の癌病期分類マニュアルのＴＮＭ解剖学的段階／予後群システム（第7版、2010、Springer）に従って、腫瘍を本明細書で述べた特定の乳癌型のいずれかの転移型とみなすかどうかに関して決定することができる。
【００９３】
本発明に係る転移性乳癌を、対癌米国合同委員会の癌病期分類マニュアルのＴＮＭ解剖学的段階／予後群システム（第7版、2010、Springer）に従ってステージＩＩＩまたはステージＩＶの癌と分類することができる。対癌米国合同委員会のＴＮＭ（腫瘍結節転移）病期分類システムにより、所属リンパ節（Ｎ）に転移があるかどうか、および遠隔転移が既に検出され得る（Ｍ）かどうかの問題である病期分類、ここで病期分類とは原発性腫瘍（Ｔ）のサイズおよび範囲による癌の分類である、が可能になる。次いで、この指標は、患者の治療において取るべき様々な経路に関する指標として概して受け取られ、この指標により、疾患の信頼性が高い予後も可能になる。これが、ＴＮＭシステムが腫瘍医にとって不可欠なツールとなっている理由である。遠隔転移を臨床的に検出することができないが、遠隔転移が発生し始めている可能性がある場合、パラメータＭは０の値、即ちＭ０を受け取る。ＭをＭ０に設定する場合、ＴおよびＮの値に応じて患者をステージＩＩＩと分類することができる。そのため、例えば、任意のＴ、Ｎ３およびＭ０の場合、患者をステージＩＩＩまたは例えば乳癌の場合にはステージＩＩＩｃと分類することができる（対癌米国合同委員会の癌病期分類マニュアル（第7版、2010、Springer）の３６２頁を参照）。そのようなステージＩＩＩの患者のまたはステージＩＩＩの最高のサブクラス（例えば乳癌に関するステージＩＩＩＣ）を有する患者の骨髄中において、循環腫瘍細胞および微小転移が更に示される場合、これにより予後が悪化され得る。そのため、本発明の目的のために、転移性癌を、対癌米国合同委員会の癌病期分類マニュアルのＴＮＭ解剖学的段階／予後群システム（第7版、2010、Springer）に従ってステージＩＩＩと分類することができる。
【００９４】
好ましくは、本発明に係る転移性癌の場合、ＭはＭ１である、即ち遠隔転移を臨床的に検出することができ、その結果、転移性腫瘍を、対癌米国合同委員会の癌病期分類マニュアルのＴＮＭ解剖学的段階／予後群システム（第7版、2010、Springer）に従ってステージＩＶと分類することができる。
【００９５】
そのため、特に好ましい実施形態は、乳癌を治療するための、好ましくは本明細書で述べた特定の乳癌型を治療するための、更により好ましくは転移型を治療するための、以下に記載するペンタペプチド、例えば配列番号１、２、３、４または５のペンタペプチド、最も好ましくは配列番号２のペンタペプチド、これらのペプチド模倣物またはこれらの改変型、およびこれらの化合物を含む医薬組成物の使用に関する。転移型を、対癌米国合同委員会の癌病期分類マニュアルに従ってステージＩＶと分離することができる。
【００９６】
化合物およびこの塩を、少なくとも１種のそのような化合物のみを含む、または場合により、薬学的に許容される担体、賦形剤および／もしくは希釈剤との混合物で少なくとも１種のそのような化合物を含む、医薬組成物（例えば、液体、懸濁液、エマルション、ロゼンジ剤、サシェ、アンプル、エアロゾル、粉剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射液、溶液等）として上述したように製剤化することができる。
【００９７】
化合物／この塩および医薬組成物を、例えば吸入による経口投与用に、経鼻投与用に、または皮下注射等の注射による投与用に製剤化することができる。
【００９８】
これより実験に関して本発明を説明するが、実験は限定の意味で解釈されるべきではない。
（実施例）
【実施例１】
【００９９】
ＥｒｂＢ受容体ファミリーメンバーのＣＤ４４ｖ６依存性活性化およびリガンド依存性活性化
１．材料および方法
細胞株
【０１００】
【表１】
2016501856.tif 000002
【０１０１】
抗体
【０１０２】
【表２】
2016501856.tif 000003
【０１０３】
オリゴヌクレオチド
α−ＣＤ４４ｖ６  ｓｉＲＮＡ−１：
５’−ＡＧＵ  ＡＧＵ  ＡＣＡ  ＡＣＧ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＡＴＴ−３’（配列番号１６）
α−ＣＤ４４ｖ６  ｓｉＲＮＡ−２：
５’−ＧＧＡ  ＵＡＵ  ＣＧＣ  ＣＡＡ  ＡＣＡ  ＣＣＣ  ＡＴＴ−３’（配列番号１７）
α−ＣＤ４４ｖ３  ｓｉＲＮＡ−１：
５’−ＡＧＧ  ＣＡＵ  ＵＧＡ  ＵＧＡ  ＵＧＡ  ＵＧＡ  ＡＵＵ−３’（配列番号１８）
α−ＣＤ４４ｖ３  ｓｉＲＮＡ−１：
５’−ＵＧＡ  ＡＧＡ  ＵＧＡ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＡＵＵ−３’（配列番号１９）
【０１０４】
プラスミド構築物
ヒトＥｒｂＢ１  ｐＢａｂｅプロ（pBabe puro）：ヒトＥｒｂＢ１の配列をｐＢａｂｅプロ中にクローニングした（Morgenstern & Land, 1990、参考文献を参照）、
ヒトＥｒｂＢ２  ｐＢａｂｅプロ：ヒトＥｒｂＢ２の配列をｐＢａｂｅプロ中にクローニングした（Morgenstern & Land, 1990、参考文献を参照）
【０１０５】
一般的な細胞培養
５％ＣＯ２を含む多湿（９５％）雰囲気中において３７℃で細胞を培養した。細胞の全ての取り扱いを無菌条件下で行なった。培養細胞が８０％培養密度のレベルに達し次第、培養細胞を継代した。
【０１０６】
細胞の継代
増殖培地の除去後、細胞を０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡで処理し、３７℃で５分にわたりインキュベートした。次いで、解離した細胞を増殖培地に溶解させ、３分にわたり１２００ｒｐｍで沈降させた。上清を除去し、細胞ペレットを増殖培地に再懸濁させ、所望の希釈度で新たな培養プレートに蒔いた。
【０１０７】
ＣＤ４４ｖ６特異的ペプチドによるブロッキング
６ウェルプレートのウェル当たり３×１０５個を播種し、２４時間にわたり血清飢餓させた。その後、各ウェル内の培地を１ｍｌまで減少させ、各ペプチド（ｖ６ペプチド（配列番号２のペプチドおよび配列番号６のペプチドの両方を検証した）またはコントロールペプチド）を１００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。次いで、細胞をペプチドと共に５分にわたり３７℃でインキュベートした。ペプチドブロッキング実験に関するリガンド濃度は全て２０ｎｇ／ｍｌであった。
【０１０８】
増殖因子による細胞の誘導
個々の実験において、指定の増殖因子と共に細胞をインキュベートした。ペプチドブロッキングアッセイおよび遊走アッセイを除いて、リガンド濃度は常に５ｎｇ／ｍｌであった。誘導前に、結果セクションで示したように細胞を処理した。
【０１０９】
細胞溶解物の調製
ウェスタンブロットでタンパク質発現をアッセイするために、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、その後２×Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（１６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、４％ＳＤＳ、１６％グリセロール、０．１Ｍ  ＤＴＴ、０．０１％ブロモフェノールブルー）に溶解させた。試料を２６ゲージ針に通してせん断した。続いて、９９℃で５分にわたり溶解物を煮沸して試料中のタンパク質を変性させ、次いで１分にわたり１００００ｒｐｍで沈降させた。最後に、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。
【０１１０】
ＥｒｂＢ１およびＣＤ４４ｖ６の共免疫沈殿
１５ｃｍプレートに５×１０６個の細胞を播種し、２４時間にわたり血清飢餓させ、続いて細胞をＥＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）で誘導した、または未処理のまま放置した。その後、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、３０分にわたり氷上で低塩ＲＩＰＡバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｐｓ  ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％デソキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）と共にインキュベートした。次いで、細胞をプレートから掻き落とし、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。試料を４℃および１２０００ｒｐｍで２０分にわたり沈降させ、その後、上清を新たなチューブに移した。細胞溶解物の各ｍｌに対して５μｇの抗体を添加し、振盪させつつ４℃で１．５時間にわたり溶解物と共にインキュベートした。次いで、試料にプロテインＡアガロースビーズおよびプロテインＧアガロースビーズ各２５μｌを添加し、振盪させつつ４℃で２時間超にわたりインキュベートした。次いで、１２０００ｒｐｍおよび４℃での遠心分離により免疫複合体を単離し、氷冷溶解バッファーで３回洗浄した。次いで、上清を除去し、免疫複合体を２５μｌの２×Ｌａｅｍｍｌｉバッファー＋１Ｍ  ＤＴＴに再懸濁させ、５分にわたり９９℃で煮沸した。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードするために上清を用意した。
【０１１１】
標的細胞へのｓｉＲＮＡの遺伝子導入
メーカーの説明書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を個々の細胞に一過性遺伝子導入した。６ウェルプレートのウェル当たり３×１０５個の細胞を播種し、２４時間にわたり培養し、次いで遺伝子導入した。各遺伝子導入用に混合物を別々に調製した：
１．血清フリー培地２５０μｌ中の２００ｐｍｏｌ  ｓｉＲＮＡ
２．血清フリー培地２５０μｌ中の５μｌ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００
【０１１２】
混合物を室温で５分にわたりインキュベートし、その後、１本の一般的なエッペンドルフチューブに移した。室温での２０分にわたる更なるインキュベーション期間後に、この完全混合物を標的細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入から６時間後に遺伝子導入細胞の培地を交換し、新鮮培地に置き換えた。２４〜４８時間後に細胞を血清飢餓させ、その後、次の実験に使用した。
【０１１３】
ＨＴ２９細胞のヘパリナーゼＩＩ処理
６ウェルプレートのウェル当たり３×１０５個の濃度でＨＴ２９細胞を播種し、その後２４時間にわたり血清飢餓させた。飢餓後、処理した６ウェル中の培地を１ｍｌまで減少させ、６Ｕ／ｍｌの濃度でヘパリナーゼＩＩを添加した。処理した細胞を３時間にわたり酵素と共にインキュベートし、その後、指定の増殖因子で直接処理した。次いで、細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、２×Ｌａｅｍｍｌｉバッファーに溶解させて細胞を更に調べた。
【０１１４】
ＢＳｐ７３ＡＳ細胞へのＥｒｂＢ１の遺伝子導入
遺伝子導入の２４時間前に、ウェル当たり２×１０５個の細胞の濃度でパッケージング細胞株Ｅｃｏｐａｃｋ−２−２９３を６ウェルプレートに播種した。遺伝子導入の１．５時間前に、増殖培地を、２５μＭ  クロロキンを含有する増殖培地に置き換えた。次いで、ＣａｌＰｈｏｓ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、４μｇのＥｒｂＢ１プラスミドＤＮＡまたはＥｒｂＢ３プラスミドＤＮＡを各６ウェルに遺伝子導入した。遺伝子導入をメーカーの説明書に従って行なった。４８時間後、ウイルスを含有する培地を回収し、０．４５μｍの酢酸セルロースフィルタに通してろ過した。次いで、ウイルス含有培地を通常の増殖培地に対して１：２の濃度で、２４時間前にウェル当たり０．５×１０５個の細胞の濃度で播種したＢＳｐ７３ＡＳ細胞に添加した。ポリブレンを８μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加し、細胞をウイルスと共に６〜８時間にわたりインキュベートした。次いで、ウイルス含有培地を通常の増殖培地に置き換え、細胞を更に一晩インキュベートした。その後、細胞を血清飢餓させ、指定の増殖因子で処理した。
【０１１５】
ＭＣＦ７細胞およびＭＣＦ１０Ａ細胞におけるＣＤ４４−バリアント−エクソン特異的ＲＴ−ＰＣＲ分析
上述のようにエクソン特異的ＲＴ−ＰＣＲを行なった（Orian-Rousseau他、2002、参考文献を参照、Konig他、1996、参考文献を参照）。ｖ８フォワードプライマー（５’−ＣＧＣ  ＴＴＣ  ＡＧＣ  ＣＴＡ  ＣＴＧ  ＣＡＡ  ＡＴ−３’）（配列番号２０）を除く全てのプライマーは以下で使用されたプライマーと同一であった：Konig他(1996)、参考文献を参照。
【０１１６】
インビトロでの転移アッセイ
動物実験方法に関するドイツの規則に従って全ての動物を取り扱った。Ｒｅｇｉｅｒｕｎｇｓｐｒａｓｉｄｉｕｍ  Ｋａｒｌｓｒｕｈｅから動物実験の承認を得た（３５−９１８５．８１／Ｇ−８３／０４）。全てのマウスをＨａｒｌａｎから得た。１×１０６個のマウス４Ｔ１細胞（ＰＢＳ中の２０ｍｇのコントロールペプチドまたは２０ｍｇのＣＤ４４ｖ６ペプチド（配列番号６のペプチドを検証した）のどちらかに希釈した）を、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの乳腺脂肪体に同所的に注射した。続いて、１週間に３回、ＣＤ４４ｖ６−ペプチド（マウス当たり２０μｇ）（配列番号６のペプチドを検証した）をマウスの内の５匹に腹腔内注射し、非特異的なコントロールペプチド（マウス当たり２０μｇ）をマウスの内の５匹に注射した。４週間後、マウスを屠殺し、この動物の腫瘍ならびに肺およびリンパ節を摘出した。次いで、これらの器官を４％ホルマリンに固定し、処理してパラフィンに埋め込んだ。
【０１１７】
２．結果
ＥｒｂＢ受容体のＥＧＦ誘導性活性化はＣＤ４４ｖ６に依存している
ＣＤ４４ｖ６がＥｒｂＢファミリーの受容体の活性化に関与するかどうかを検証するために、１４ｍｅｒの配列番号６を使用するペプチドブロッキング実験をＨＴ２９細胞で行なった。この細胞株は全てのＥｒｂＢ受容体（Wu他、2009、参考文献を参照）ならびにエクソンｖ３およびｖ６も含む数種のＣＤ４４バリアント（Orian-Rousseau他、2002、参考文献を参照）を発現するという事実により、この細胞株はＥｒｂＢファミリーに対するＣＤ４４タンパク質の共受容体機能を評価するのに適したツールである。評価した最初のＥｒｂＢ１リガンドはＥＧＦであった。ＥＧＦによるＥｒｂＢ受容体の活性化がＣＤ４４ｖ６に依存しているかどうかを検証するために、ＣＤ４４ｖ６の共受容体機能を特異的に阻害する配列番号６のｖ６ペプチドまたは非特異的なコントロールペプチドと共にＨＴ２９細胞をプレインキュベートした。細胞を２４時間にわたり血清飢餓させ、ＥＧＦで誘導した。ＥｒｂＢ受容体ファミリーの下流標的であるＥｒｋキナーゼのリン酸化を、ＥｒｂＢ受容体活性化のリードアウトとして使用した。ＣＤ４４ｖ６ペプチドのブロッキング効率を検証するためのコントロールとしてＨＧＦを使用した。なぜならば、ＭｅｔによるＥｒｋキナーゼの誘導はＣＤ４４ｖ６に依存しているからである（Orian-Rousseau他、2002、参考文献を参照）
【０１１８】
ＨＴ２９細胞のＥＧＦ誘導によりまたはＨＧＦ誘導により、Ｅｒｋキナーゼがリン酸化される。ＣＤ４４ｖ６ペプチドとのプレインキュベーションにより、ＥＧＦ依存性のおよびＨＧＦ依存性のＥｒｋのリン酸化を阻害することができたが、コントロールペプチドでは効果が見られなかった。このことは、ＥＧＦによるＥｒｂＢ受容体の活性化がＣＤ４４ｖ６に依存していることを示唆する（図２）。このことは、ＭｅｔおよびそのリガンドであるＨＧＦの場合に観測した状況と同様である。
【０１１９】
ＣＤ４４の必要性は受容体に非依存的である
ＥＧＦに加えて、その他の５種のリガンド、即ちＡＲ、ＢＣ、ＥＲ、ＨＢ−ＥＧＦおよびＴＧＦαもＥｒｂＢ１受容体を活性化することができる。ＥＧＦ、ＡＲおよびＴＧＦαは、ＥｒｂＢ１ホモ二量体またはＥｒｂＢ１／２ヘテロ二量体のどちらかに結合する。これらの二量体に加えて、ＢＣ、ＥＲおよびＨＢ−ＥＧＦはまた、Ｅｒｂ４／４ホモ二量体またはＥｒｂＢ２／４ヘテロ二量体にも結合することができる。指定のリガンドによるＥｒｂＢ受容体の活性化もＣＤ４４ｖ６に依存しているかどうかを調べた。ＨＴ２９細胞を２４時間にわたり血清飢餓させ、ｖ６特異的ペプチドまたはコントロールペプチドで前処理した。次いで、指定のＥｒｂＢリガンドでＨＴ２９細胞を誘導した。Ｅｒｋキナーゼのリン酸化を受容体活性化のリードアウトとして使用した。
【０１２０】
全てのリガンドがＥｒｋキナーゼを活性化することができた。ＨＴ２９細胞のＣＤ４４ｖ６ペプチドとのプレインキュベーションにより、ＥＧＦ依存性のおよびＥＲ依存性のＥｒｋのリン酸化が阻害されたが、コントロールペプチドでは効果が見られなかった（図３）。このことは、ＥＧＦに加えてＥＲも、共受容体としてのＣＤ４４ｖ６に依存している別のＥｒｂＢ１リガンドであることを示す。対照的に、ＣＤ４４ｖ６をブロックすることによりＥｒｂＢ受容体のＡＲ誘導性の、ＢＣ誘導性の、ＨＢ−ＥＧＦ誘導性のおよびＴＧＦα誘導性の活性化を阻害することはできなかった（図３）。これらのリガンドでは、それらのＥｒｂＢ受容体の誘導がＣＤ４４ｖ６に非依存的である。このことは特に印象的である。なぜならば、ＥＧＦおよびＴＧＦαは同じ受容体対（ＥｒｂＢ１／１またはＥｒｂＢ１／２）に焦点を当てるからである。これらのデータは、ＥｒｂＢ活性化の共受容体として使用される特異的なＣＤ４４アイソフォームは、ＥｒｂＢ受容体を活性化させるリガンドにより決定されるが、受容体のタンパク質自体により決定されないことを示唆する。
【０１２１】
ブロッキング試薬としてＣＤ４４ｖ６ペプチドを使用して、ＥｒｂＢファミリーのＥＧＦ依存性のおよびＥＲ依存性の活性化が阻害されることが分かった。ＥＧＦおよびＥＲが共受容体としてＣＤ４４ｖ６を必要とすることを更に確認するために、ＣＤ４４ｖ６発現の下方制御の効果を評価した。ＣＤ４４ｖ６特異的ｓｉＲＮＡまたは非特異的なコントロールｓｉＲＮＡのどちらかをＨＴ２９細胞に遺伝子導入した。発明者らの発見が細胞型に特異的であることを除外するために、更にＨｅＬａ細胞を使用して同様に処理した。次いで、これらの細胞を２４時間にわたり血清飢餓させ、続いてＥＧＦまたはＥＲのどちらかで誘導した。
【０１２２】
Ｅｒｋのリン酸化に加えて、ＥｒｂＢ１受容体のリン酸化を受容体活性化のリードアウトとして使用した。ＥｒＢｂ１のリン酸化状態を確かめることにより、ＥｒｂＢシグナル伝達のブロックがＥｒｋキナーゼのような下流標的だけでなくＥｒｂＢ１受容体自体にも影響を及ぼしたかどうかを決定することが可能であった。
【０１２３】
細胞のＥＧＦ誘導によりおよびＥＲ誘導により、ＥＲｂＢ１およびＥｒｋがリン酸化される。ＣＤ４４ｖ６特異的ｓｉＲＮＡのＨＴ２９細胞への遺伝子導入により、ＣＤ４４ｖ６特異的抗体（αＣＤ４４ｖ６）で確かめたウェスタンブロットで示されるようにＣＤ４４ｖ６の発現は低減した。これにより、ＥｒｂＢ１レベルでおよびＥｒｋレベルでＥＧＦ誘導性のおよびＥＲ誘導性のシグナル伝達が阻害される。コントロールｓｉＲＮＡでは、ＣＤ４４発現またはＥｒｂＢシグナル伝達に対する効果は見られなかった（図４）。ＨｅＬａ細胞でのＣＤ４４ｖ６の下方制御により、ＥＧＦ誘導性のおよびＥＲ誘導性のＥｒｂＢシグナル伝達も阻害され、このことは、ＣＤ４４ｖ６の必要性が細胞型に特異的ではないことを示す（図４）。
【０１２４】
ブロッキング試薬としてＣＤ４４ｖ６ペプチドを使用して、ＥｒｋキナーゼのＴＧＦα誘導性リン酸化を阻害することができなかった。ＴＧＦαがＥｒｂＢ受容体ファミリーの誘導に共受容体としてＣＤ４４ｖ６を必要としないことを確認するために、およびＴＧＦαがＣＤ４４に完全に非依存的であり得るかどうかを検証するために、ＨＴ２９細胞におけるＣＤ４４ｖ６の下方制御および全てのＣＤ４４アイソフォームの下方制御の効果を同じ実験で検証した。ＣＤ４４ｖ６特異的ｓｉＲＮＡ、全てのＣＤ４４タンパク質（ＣＤ４４ｐａｎ）に対するｓｉＲＮＡまたは非特異的なコントロールｓｉＲＮＡのいずれかを様々なＨＴ２９細胞に遺伝子導入した。次いで、細胞を血清飢餓させ、ＴＧＦαまたはＥＧＦで誘導した。ＣＤ４４の下方制御の効果を阻害するコントロールとしてＥＧＦを使用した。増殖因子による誘導後、ＥｒｂＢファミリーの活性化をＥｒｂＢ１レベルでおよびＥｒｋレベルで測定した。
【０１２５】
ＨＴ２９細胞のＥＧＦ誘導によりおよびＴＧＦα誘導により、ＥｒｂＢ１およびＥｒｋがリン酸化される。ＣＤ４４ｖ６の下方制御により、ＥｒｂＢ１レベルでおよびＥｒｋレベルでＥＧＦシグナル伝達のブロックを観測することができた（図５）。ＴＧＦα依存性シグナル伝達は、ＣＤ４４ｖ６の下方制御では阻害されなかった。全てのＣＤ４４アイソフォームの発現が阻害されたが、たとえＣＤ４４ｐａｎ  ｓｉＲＮＡの遺伝子導入であってもＴＧＦα依存性シグナル伝達はブロックされなかった。予想したように、全てのＣＤ４４アイソフォームの下方制御により、ＥＧＦ依存性シグナル伝達を消失させることができた。非特異的なｓｉＲＮＡでは、ＣＤ４４発現またはＥｒｂＢ受容体活性化のどちらに対してもあらゆる効果が見られなかった（図５）。
【０１２６】
ＴＧＦαによるＥｒｂＢ受容体の誘導はＣＤ４４ｖ６に依存していない。更に、ＴＧＦαによるＥｒｂＢ受容体の活性化はＣＤ４４に非依存性である。なぜならば、たとえ全てのＣＤ４４タンパク質を完全に下方制御してもＣＤ４４タンパク質のＥｒｂＢ活性化が消失しないからである。
【０１２７】
ＥｒｂＢ受容体のＨＢ−ＥＧＦ誘導性活性化はＣＤ４４ｖ３に依存している
ＴＧＦαが、ＥｒｂＢ受容体の誘導に関してＣＤ４４ｖ６に非依存的である唯一のＥｒｂＢ１リガンドではない。ＣＤ４４ｖ６ペプチドＩを使用して、ＥｒｋキナーゼのＢＣ依存性の、ＡＲ依存性のまたはＨＢ−ＥＧＦ依存性の活性化をブロックすることができなかった。ＨＢ−ＥＧＦおよびＡＲはヘパラン結合増殖因子である（Cook他、1991、参考文献を参照；Higashiyama他、1992、参考文献を参照）。ＨＢ−ＥＧＦおよびＡＲのヘパランへの結合は、これらのＥｒｂＢ受容体の活性化の手段となり得た。ヘパラン硫酸化がＡＲ誘導性のおよびＨＢ−ＥＧＦ誘導性のＥｒｂＢ受容体活性化のプロセスに関与するかどうかを検証するために、血清飢餓させたＨＴ２９細胞を、標的細胞の表面のヘパラン硫酸塩を切断する酵素であるヘパリナーゼで処理した。次いで、細胞をＨＢ−ＥＧＦまたはＡＲで誘導した。ＨＧＦをコントロールとして使用した。なぜならば、ＭｅｔのＨＧＦによる活性化の場合、該活性化は、ヘパリン硫酸塩ではないアイソフォームであるＣＤ４４ｖ６に依存しているからである（Orian-Rousseau他、2002）。従って、ヘパラン硫酸塩の除去は効果を有しないはずである。Ｅｒｋキナーゼを受容体活性化のリードアウトとして使用した。なぜならば、ＥｒｋキナーゼはＭｅｔ受容体によりおよびＥｒｂＢ受容体により活性化されるからである。
【０１２８】
ＨＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦまたはＡＲによるＨＴ２９細胞の誘導により、Ｅｒｋがリン酸化される。ヘパリナーゼ処理により、ＨＢ−ＥＧＦによるＥｒｂＢ受容体の活性化は抑止されたがＡＲによるＥｒｂＢ受容体の活性化は抑止されなかった（図６）。このことは、ＥｒｂＢ受容体の誘導に関して、ＨＢ−ＥＧＦはヘパラン硫酸化に依存しているがＡＲはヘパラン硫酸化に依存していないことを示す。ＣＤ４４タンパク質ファミリーでは、ＣＤ４４ｖ３が、ヘパラン硫酸塩の側鎖を保有するＣＤ４４の唯一のバリアントである。ＣＤ４４ｖ３がＥｒｂＢ受容体のＨＢ−ＥＧＦ依存性活性化を媒介するかどうかを検証するために、ＲＮＡｉ技法によりＣＤ４４ｖ３を下方制御した。
【０１２９】
ＣＤ４４ｖ３特異的ｓｉＲＮＡまたは非特異的なコントロールｓｉＲＮＡをＨＴ２９細胞に遺伝子導入した。次いで、細胞を２４時間にわたり血清飢餓させ、続いてＨＢ−ＥＧＦで誘導した。ＥＧＦをコントロールとして使用した。なぜならば、ＥＧＦはＣＤ４４ｖ６に依存しており、ＥｒｂＢ受容体のＥＧＦによる活性化はＣＤ４４ｖ３の下方制御の影響を受けないはずだからである。ＥｒｂＢ１のおよびＥｒｋのリン酸化を受容体活性化のリードアウトとして使用した。
【０１３０】
ＥＧＦまたはＨＢ−ＥＧＦによるＨＴ２９細胞の誘導により、ＥｒｂＢ１受容体およびＥｒｋキナーゼがリン酸化される。ｓｉＲＮＡによるＣＤ４４ｖ３の下方制御によって、ＨＢ−ＥＧＦによるＥｒｂＢ受容体の誘導がブロックされたが、コントロールｓｉＲＮＡでは効果はなかった（図７）。このことは、ＨＢ−ＥＧＦが、そのＥｒｂＢ１刺激活性をＣＤ４４ｖ３に依存していることを示唆する。対照的に、ＥＧＦはＣＤ４４ｖ３に非依存的である（図７）。まとめると、リガンドに依存して、特異的ＣＤ４４バリアントアイソフォームは同じＥｒｂＢ受容体の共受容体として作用することができる。
【０１３１】
ＥｒｂＢ１ホモ二量体シグナル伝達の評価
ＥｒｂＢ１受容体を活性化させるために、ＥＧＦ、ＥＲ、ＨＢ−ＥＧＦおよびＴＧＦαはＥｒｂＢ１ホモ二量体またはＥｒｂＢ１／２ヘテロ二量体に結合する。ＥＲおよびＨＢ−ＥＧＦは、ＥｒｂＢ４／４ホモ二量体またはＥｒｂＢ２／４ヘテロ二量体に更に結合することができる。実験に使用した細胞株（ＨｅＬａ細胞およびＨＴ２９細胞）は、全てのＥｒｂＢ受容体を発現する。これらの条件下で、指定のリガンドによるＥｒｂＢ１受容体の活性化をＥｒｂＢホモ二量体およびヘテロ二量体で媒介することができた。ＥｒｂＢ１ホモ二量体へのリガンド誘導の効果を確実に研究するために、ＢＳｐ７３ＡＳ膵臓細胞系を検証した。この細胞では、４種のＥｒｂＢファミリーメンバーがいずれも発現されず、ＣＤ４４の標準的なアイソフォーム（バリアントエクソンを含まない）のみが発現される。ＥｒｂＢ１受容体またはＥｒｂＢ３受容体を、特異的ＣＤ４４バリアントを発現するいくつかの遺伝子導入型ＢＳｐ７３ＡＳ細胞株に導入した（Rudy他、1993、参考文献を参照；Seiter他、1993、参考文献を参照；Sleeman他、1997、参考文献を参照；Sleeman他、1996、参考文献を参照）。ＥｒｂＢ３は、本明細書で検証したいずれのリガンドにも結合することができず、従ってＥｒｂＢ３を感染のコントロールとして使用した。
【０１３２】
ＢＳｐ７３ＡＳの非常に低い遺伝子導入効率に起因して、レトロウイルス感染系を使用した。ＥｒｂＢ１遺伝子配列およびＥｒｂＢ３遺伝子配列をレンチウイルス発現ベクターに挿入し、次いで、該レンチウイルス発現ベクターをパッケージング細胞株Ｅｃｏｐａｃｋ２−２９３に導入した。Ｅｃｐａｃｋ２−２９３細胞は、ウイルス粒子の形成および複製に必要なウイルスのｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子を安定的に発現する。レトロウイルス発現ベクターは、パッケージングシグナル、転写およびプロセシング要素ならびに標的遺伝子（ＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ３）を供給する。レトロウイルスベクターのｅｃｏｐａｃｋ２細胞への遺伝子導入後、ｅｃｏｐａｃｋ２細胞は、目的の遺伝子を含有する高力価の複製不全ウイルスを産生する。次いで、このウイルスを回収し、標的細胞に感染させて標的遺伝子を伝播させることができるが、感染細胞内で複製することはできない。なぜならば、ウイルス構造遺伝子が欠損しているからである。
【０１３３】
４８時間後に、ウイルスを含有する細胞培地を回収し、ＣＤ４４のみを発現するＢＳｐ７３ＡＳ細胞（ＡＳ細胞）またはＣＤ４４ｖ６と共に複数種のＣＤ４４を発現する細胞（ＡＳｓ６細胞）のどちらかに添加した。この細胞を血清飢餓させ、続いてＥＧＦまたはＴＧＦαのどちらかで誘導した。ＥｒｂＢ１受容体の発現をＥｒｂＢ１特異的抗体により検出した。次いで、ＥＧＦまたはＴＧＦ−αの存在下でまたは非存在下で、ＥｒｂＢ１遺伝子導入細胞中においておよびコントロール遺伝子導入細胞中において、ＥｒｂＢ１のおよびＥｒｋのリン酸化を分析した。
【０１３４】
ＡＳ細胞中でおよびＡＳｓ６細胞中でＥｒｂＢ１の発現を検出した。両方のＥｒｂＢ１発現細胞株中で、ＴＧＦαはＥｒｂＢ１受容体のおよびＥｒｋキナーゼの活性化を誘導した。一方、ＥＧＦは、ＣＤ４４ｖ６が存在するＡＳｓ６細胞中でのみＥｒｂＢ１を活性化することができた。ＥＧＦはＥｒｂＢ１ホモ二量体の誘導をＣＤ４４ｖ６に依存している。コントロール細胞では受容体の活性化を測定することができなかった（図８）。
【０１３５】
ＥＲに基づくＥｒｂＢ１ホモ二量体の活性化に対するＣＤ４４ｖ６の必要性を検証するために、上述と同様の手順を行なった。細胞を、ＣＤ４４に非依存的であるＥｒｂＢ１活性化のコントロールとしてのＴＧＦαでも誘導した。ＥＧＦと同様に、ＥＲは、ＣＤ４４ｖ６を発現する細胞中でのみＥｒｂＢ１の活性化を誘導することができたが、ＴＧＦαは、ＣＤ４４ｖ６の発現に非依存的にＥｒｂＢ１受容体を活性化することができた（図９）。ＥＲはＥｒｂＢ１ホモ二量体の誘導をＣＤ４４ｖ６に依存している。コントロール細胞では受容体の活性化が見られなかった。
【０１３６】
ＣＤ４４ｖ３の存在下でＨＢ−ＥＧＦがＥｒｂＢ１ホモ二量体を活性化することができるかどうかを検証するために、ＣＤ４４ｖ６と共に複数種のＣＤ４４を発現するＡＳｓ６細胞、およびバリアントエクソン（Ａｓｖ１〜１０）全ての配列を含むＣＤ４４の１つのアイソフォームと共に複数種のＣＤ４４を発現する細胞にＥｒｂＢ１受容体タンパク質を感染させた。次いで、細胞を血清飢餓させ、ＨＢ−ＥＧＦまたはＥＧＦ（ＣＤ４４ｖ６依存性のＥｒｂＢ１活性化のコントロール）のどちらかで誘導した。次いで、ＥｒｂＢ１のまたはＥｒｋのリン酸化を測定することにより、ＥｒｂＢ１受容体の発現を検出してその活性化を評価した。
【０１３７】
ＨＢ−ＥＧＦは、ＣＤ４４ｖ１〜１０を発現する細胞中ではＥｒｂＢ１受容体を誘導することができたが、ＣＤ４４ｖ３が存在しないＡＳｓ６細胞中ではＥｒｂＢ１受容体を誘導することができなかった。ＥＧＦは、ＡＳｓ６細胞中でおよびＡＳｖ１〜１０細胞中でＥｒｂＢ１を誘導することができた。なぜならば、両方の形質移入体中にｖ６配列が存在するからである。コントロール細胞では受容体の活性化が見られなかった（図１０）。
【０１３８】
乳癌でのＣＤ４４ｖ６の役割
ＥｒｂＢ受容体は、ＥｒｂＢ受容体の活性化、特にＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ２の活性化が無秩序であることが分かっているヒト乳癌で主要な役割を果たす（Hynes & MacDonald、2009、参考文献を参照）。発明者らの実験で使用する細胞はこれまで、結腸癌株または子宮頸癌株であった。乳癌でのＣＤ４４ｖ６の役割に焦点を当てるために、ＭＣＦ７細胞およびＭＣＦ１０Ａ細胞を使用した。ＭＣＦ７細胞は湿潤性の乳管癌由来の胸水細胞であり、ＭＣＦ１０Ａ細胞は前癌性の乳腺上皮細胞である。
【０１３９】
これらの細胞株中でのＣＤ４４の発現をランオフＰＣＲ分析により調べた。ＭＣＦ７細胞およびＭＣＦ１０Ａ細胞を溶解させ、溶解物から全ＲＮＡを単離し、逆転写によりｃＤＮＡに変換した。次いで、ＣＤ４４の各可変エクソンに特異的なフォワードプライマーおよびＣＤ４４の定常領域における１つの共通のバックワードプライマー（図１１を参照）により、ＰＣＲ反応を行なった。
【０１４０】
ランオフＰＣＲにより、細胞中でのＣＤ４４アイソフォームの構造および近似の存在量の両方の決定が可能になる。特異的バンドのサイズは、２種の各プライマー間で発現されるエクソンに対応する。その結果として、隣接するエクソンに対応するバンドがラダーを形成する場合、該エクソンがより大きなアイソフォーム中で共に発現されることを示す。例えばｖ２〜ｖ１０により形成されるラダーは、ＣＤ４４バリアントｖ２〜１０が１つの転写産物として発現されることを示唆する。
【０１４１】
ＭＣＦ７細胞およびＭＣＦ１０Ａ細胞は、主に１つの大きな転写産物で、およびいくつかのその他のより小さい転写産物でＣＤ４４ｖ２〜１０を発現する（図１２）。そのため、これらの細胞は、ＥｒｂＢ１受容体を発現するだけでなく（Gramlich他、1993、参考文献を参照；Rodriguez-Fragoso他、2009、参考文献を参照）、ＥｒｂＢ受容体の共受容体として作用することができるかもしれないＣＤ４４バリアントも発現する。
【０１４２】
ＣＤ４４ｖ６がＭＣＦ７細胞中でまたはＭＣＦ１０Ａ細胞中で共受容体として作用するかどうかを検証するために、配列番号６のペプチドを使用するペプチドブロッキング実験を行なった。細胞を２４時間にわたり血清飢餓させ、次いでｖ６ペプチドまたは非特異的なコントロールペプチドと共にプレインキュベートした。次いで、細胞をＥＧＦまたはコントロールとしてのＨＧＦで誘導した。ＥｒｂＢ活性化のリードアウトとして、Ｅｒｋキナーゼのリン酸化を使用した。
【０１４３】
ＭＣＦ７細胞中においておよびＭＣＦ１０細胞中において、ＥＧＦによるＥｒｂＢ受容体の活性化をＣＤ４４ｖ６特異的ペプチドによりブロックすることができたが、非特異的なコントロールペプチドでは効果が見られなかった。ＣＤ４４ｖ６は、これらの乳癌細胞中におけるＥＧＦ誘導性のＥｒｂＢ活性化の共受容体として必要である（図１３）。この結果を更に確認するために、ＣＤ４４ｖ６特異的ｓｉＲＮＡにより、ＭＣＦ７細胞中におけるＣＤ４４ｖ６の発現を下方制御した。Ｅｒｋシグナルの阻害により推定されるように、ＭＣＦ７細胞中におけるＣＤ４４ｖ６のｓｉＲＮＡに基づく下方制御によりＥｒｂＢ受容体の活性化が著しく低下した。このことは、ＥＧＦに基づくＥｒｂＢ活性化の共受容体としてのＣＤ４４ｖ６の活性化が乳癌細胞中で実際に必要であることを裏付ける（図１４）。
【０１４４】
ＣＤ４４ｖ６とＥｒｂＢ１受容体タンパク質との間での複合体形成
乳癌細胞中におけるＥＧＦ依存性の受容体活性化に対するＥｒｂＢ１受容体とＣＤ４４ｖ６との間の協同は、これらの２つのタンパク質が近接して位置することを示唆する。この最後の段落Ｉでは、発明者らは、ＥｒｂＢ１およびＣＤ４４ｖ６が複合体を形成するかどうかを検証した。この目的のために共免疫沈降実験を行なった。血清飢餓させたＭＣＦ１０細胞をＥＧＦで処理し（または未誘導のままにし）、その後、ＥｒｂＢ１をＥｒｂＢ１特異的ウサギ抗体で免疫沈降させた。次いで、ＣＤ４４ｖ６の存在に関して沈降物を確かめた。コントロールとして、ＣＤ４４ｖ６沈降物をゲルにロードした。非特異的なウサギＩｇＧを使用してＩＰの特異性を調節した。
【０１４５】
ＭＣＦ１０細胞では、ＣＤ４４ｖ６をＥｒｂＢ１と共に免疫沈降させることができた。興味深いことに、この複合体形成は誘導性であり、ＥＧＦで処理した細胞中でのみ見出すことができた。ＣＤ４４ｖ６がＥＧＦに基づく誘導の共受容体として作用する場合、ＣＤ４４ｖ６はＥｒｂＢ１との複合体中に存在する（図１５）。
【０１４６】
インビボでの転移アッセイ
高転移性であるマウス４Ｔ１細胞を使用した。この細胞では、ＭＣＦ１０Ａ細胞と同様にＥｒｂＢ受容体をＥＧＦで活性化することができ、この活性化はＣＤ４４ｖ６に依存している（未発表データ）。４Ｔ１細胞は元々、自然発生的なＢＡＬＢ／ｃ乳腺腫瘍に由来した（Aslakson & Miller、1992、参考文献を参照）。同所的に誘導した場合、４Ｔ１細胞は原発性部位で急速に増殖し、３〜６週の期間内に肺およびリンパ節中で転移を形成する。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける腫瘍増殖および４Ｔ１細胞の転移性拡散はヒト乳癌を非常に密に模倣しており、ステージＩＶのヒト乳癌の動物モデルである（Tao他、2008、参考文献を参照）。４Ｔ１細胞を雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの乳腺脂肪体に同所的に注射した。１週間に３回、ＣＤ４４ｖ６ペプチド（配列番号６）またはコントロールペプチドをマウスに腹腔内注射した。マウスを屠殺した後、マウスの腫瘍ならびに肺およびリンパ節を回収し、固定してパラフィンに埋め込んだ。ＣＤ４４ｖ６ペプチド処理動物とコントロールペプチド処理動物との間に４Ｔ１細胞の転移性挙動の差が存在したかどうかを検証するために、肺およびリンパ節に相当するパラフィンブロックを分析する。
【０１４７】
まとめると、このデータは、ＥｒｂＢ受容体ファミリーのリガンドがＣＤ４４の特異的なバリアントアイソフォームを使用してそれらの同族の受容体を誘導することを示す。ＴＧＦαはＣＤ４４ファミリーに非依存的であると思われるが、ＥＧＦおよびＥＲはＥｒｂＢ受容体の誘導をＣＤ４４ｖ６に依存する。ＨＢ−ＥＧＦはＣＤ４４ｖ３に依存している。
【実施例２】
【０１４８】
ＣＤ４４ｖ６ペプチドは、転移の退縮に影響を及ぼすことができる
１．材料および方法
細胞株
ラット膵癌細胞株ＢＳｐ７３ＡＳ（ＡＳとも表す）およびその形質移入体が説明されており（Orian-Rousseau他、Genes & Development(2002)、16:3074〜3086）、それらを、１０％ＦＣＳを加えたＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーエ、ドイツ）中で増殖させた。ヒト膵癌細胞Ｌ３．６ｐｌ（Bruns他、Neoplasia (1999)、1、50〜62）を、１０％ＦＣＳ（ＰＡＡ、ケルベ、ドイツ）、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミンおよびＭＥＭビタミン溶液（Ｐａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、アイデンバッハ、ドイツ）を補充したＤＭＥＭ（低グルコース；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーエ、ドイツ）中で維持した。
【０１４９】
抗体およびその他の試薬
ＣＤ４４ｖ６に対するヒトモノクローナル抗体（ＶＦＦ１８）はＢｅｎｄｅｒ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、キャンパスヴィエナバイオセンター２、Ａ−１０３０、ヴィエナ、オーストリア）からの贈与であり、抗Ｅｒｋ１（Ｋ−２３）、ｃ−Ｍｅｔ（Ｃ−２８）およびＧＦＰ抗体（ｓｃ−１０１５２５）はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ハイデルベルク、ドイツ）からであり、開裂カスパーゼ−８抗体（ＩＭＧ−５７０３）はＩｍｇｅｎｅｘ（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）からであり、ＣＤ３１抗体（ＭＥＣ１３．３）はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルク、ドイツからであり、開裂カスパーゼ−３（Ａｓｐ１７５）、ホスホ−Ｍｅｔ（Ｔｙｒ１２３４／１２３５）（Ｄ２６）、Ｍｅｔ（２５Ｈ２）およびホスホ−ＥＲＫホスホ−ｐ４４／４２抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ビバリー、英国）からであった。ラットエクソンｖ６特異的抗体１．１ＡＳＭＬが説明されている（Gunthert他、Cell(1991)、65、13〜24）。西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された二次抗体はＤａｋｏ（グロストルップ、ドイツ）からであった。Ａｌｅｘａ  ＦｌｕｏｒＲ５４６ヤギ抗ウサギ二次抗体をＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ダルムシュタット、ドイツ）から購入した。ＨＧＦをＰｅｐｒｏｔｅｃｈ（ハンブルク、ドイツ）から購入した。ＣＤ４４ｖ６ラットペプチドおよびＣＤ４４ｖ６ヒトペプチド（１４ｍｅｒおよび５ｍｅｒ）が説明されている（Matzke他、Cancer Res. (2005)、65(14)、6105〜6110）。ラット１４ｍｅｒの配列はＫＥＫＷＦＥＮＥＷＱＧＫＮＰ（配列番号１０）であり、ラット５ｍｅｒはＮＥＷＱＧ（配列番号１１）に対応する。ヒト１４ｍｅｒはＫＥＱＷＦＧＮＲＷＨＥＧＹＲ（配列番号６）に対応し、ヒト５ｍｅｒは以下の配列を有する：ＮＲＷＨＥ（配列番号２）。インビボでの撮像実験用に、ラット１１ｍｅｒ  ＷＦＥＮＥＷＱＧＫＮＰ（配列番号１２）、マウス１１ｍｅｒ  ＷＦＱＮＧＷＱＧＫＮＰ（配列番号１３）およびヒト１１ｍｅｒ  ＷＦＧＮＲＷＨＥＧＹＲ（配列番号１４）を蛍光色素ＤＹ６８１で標識した。ラット細胞またはラット同系モデルの場合におけるコントロールペプチドとして、特異的ラットｖ６ペプチドと同一の長さのヒトｖ６ペプチドを使用した。ヒト腫瘍細胞またはヒト同所性腫瘍モデルの場合、コントロールとしてラットｖ６ペプチドを使用した。全てのペプチドはＢａｃｈｅｍ（ブーベンドルフ、スイス）またはＩｎｔａｖｉｓ（ケルン、ドイツ）により産生された。凍結乾燥ペプチドを１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌのストック濃度まで再懸濁した。ＰＢＳ中に希釈することにより、最終希釈液を得た。
【０１５０】
ｓｈＲＮＡのレンチウイルス遺伝子導入
Ｍｅｔをサイレンシングするために使用するレンチウイルスシステムは既に説明されている（Corso他、Oncogene (2008)、27(5):684〜93）。他に記載されているようにレンチウイルスを産生した（Vigna他、J.Gene Med. (2000)、2(5):308〜16）。手短にいうと、４×１０６個の２９３Ｔ細胞（ｐ１２〜１５）を１０ｃｍのプレートに播種した。２４時間後にパッケージングベクターＶＳＶ−Ｇ、ＰＭＤＬおよびＲｅｖ、ＴｅｔＲならびにレンチウイルス構築物（Ｍｅｔ−ｓｈＲＮＡ構築物またはコントロール−ｓｈＲＮＡ構築物のどちらか）を混合し、４５０μｌの最終体積までＴＥを添加した。この混合物に、４５０μｌの２．５Ｍ  ＣａＣｌ２溶液を添加した。ボルテックスおよび５分間のインキュベーション後、ＤＮＡ−ＴＥ−ＣａＣｌ２混合物を全速力でボルテックスしつつ、５００μｌの２×ＨＢＳ溶液を滴加した。沈殿物を２９３Ｔ細胞に添加した。１６時間後、培地を置き換えて５ｍＭ  酪酸ナトリウムを含有する新鮮培地を添加した。２４時間後および４８時間後に培地を回収した。次いで、８μｇ／ｍＬのポリブレンの存在下で、ウイルス含有培地を標的細胞ＢＳｐ７３ＡＳｓ６（７０％培養密度）に添加した。感染から２４時間後に培地を置き換え、１μｇ／ｍｌの最終濃度までドキシサイクリン（Doxycylcline）を添加することによりｓｈＲＮＡの産生を誘導した。ＴｅｔＲおよびコントロール−ｓｈＲＮＡまたはＭｅｔ−ｓｈＲＮＡを形質導入したＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞を７２時間にわたりドキシサイクリンで処理した後、動物でのアッセイまたは注射を開始した。
【０１５１】
ウェスタンブロット分析
血清飢餓させた細胞（２４時間）を、５分にわたり３７℃において増殖因子ＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）で誘導した。示した箇所では、細胞をペプチド（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理した後に、１０分にわたり３７℃で誘導した（１００ｎｇ／ｍＬのＣＤ４４ｖ６ペプチドまたはコントロールペプチド）。ＨＧＦによる誘導後、細胞を氷冷リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。活性化されたＭｅｔおよびＥＲＫを検出するために、細胞をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、即ち１００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有するサンプルバッファーに溶解させ、煮沸し、ホスホ−Ｍｅｔおよびホスホ−ＥＲＫに対する抗体を使用するウェスタンブロット分析にかけた。Ｍｅｔ抗体またはＥｒｋ抗体で確かめることにより、ストリッピング（６２．５Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、０．８％ＤＴＴ）後の同じブロットに対してローディングコントロールを行なった。増強化学発光システム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、シュヴェーアト、ドイツ）を使用してブロットを染色した。ウェスタンブロット分析におけるバンドをプログラムＩｍａｇｅ  Ｊ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）で定量化した。
【０１５２】
細胞培養の上清におけるＨＧＦおよびＶＥＧＦの定量測定
Ｒｏｃｈｅ（マンハイム、ドイツ）およびＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ヴィースバーデン、ドイツ）のＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｈｕｍａｎ  ＨＧＦ  ＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙおよびＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙを使用して、Ｌ３．６ｐｌ細胞の細胞培養培地におけるヒトＨＧＦおよびヒトＶＥＧＦの濃度の測定を行なった。この目的のために、指定の各ペプチドの存在下で、１５ｃｍのプレート中において５日にわたり３×１０６個の細胞を培養した。遠心分離による上清（２０ｍｌ）を遠心分離し（１２００ｒｐｍ）、メーカーの説明書に従ってアッセイを行なった。
【０１５３】
動物実験
雄の胸腺欠損のヌードマウス（ＮＣＩ−ｎｕ）をＨａｒｌａｎ（ロスドルフ、ドイツ）から購入した。ＢＤ１０ラットおよびＢＤＸラットを自家で繁殖させた。Ｒｅｇｉｅｒｕｎｇｓｐｒａｓｉｄｉｕｍ  Ｋａｒｌｓｒｕｈｅにより承認された施設内に動物を収容して特定の病原体フリー条件下で維持した。動物実験に関するドイツの規則に従って全ての動物を取り扱った。Ｒｅｇｉｅｒｕｎｇｓｐｒａｓｉｄｉｕｍ  Ｋａｒｌｓｒｕｈｅから動物実験を承認された（３５−９１８５．８１７Ｇ−１９２／１０）。ゲッティンゲンで撮像実験（図１８）を行ない、これはＲｅｇｉｅｒｕｎｇｓｐｒａｓｉｄｉｕｍから認可された（３５−９１８５．８１７Ｇ−１０６／０９）。
【０１５４】
ラット同系モデルの場合、１×１０６個の膵臓細胞（ＢＳｐ７３ＡＳおよびその形質移入体）を動物の右後脇腹に皮下注射した。４週間にわたり腫瘍を発育させた。この期間中、Ｍｅｔ−ｓｈＲＮＡまたはコントロール−ｓｈＲＮＡを発現するＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞を注射した動物に、飲料水中のドキシサイクリンを与えた。実験の終了時に、原発性腫瘍を単離した。肺および腋窩リンパ節を分析した。組織を、亜鉛固定剤（１Ｌの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４中の０．５ｇ酢酸カルシウム、５．０ｇ酢酸亜鉛、５．０ｇ塩化亜鉛）中で２４時間にわたりインキュベートし、更なる分析のためにパラフィンに埋め込んだ。ペプチド処理または抗体処理の場合、最初の処理前に１週間にわたり腫瘍を発育させた。そのように表した箇所では、４週間にわたり週当たり３回の注射当たり２００μｇのペプチドまたは抗体を動物に与えた。ノギスを使用して腫瘍の増殖を毎週モニタリングした。処理の開始後２８日目にまたは３０日目に動物を屠殺した。
【０１５５】
ヒト同所性モデルの場合、Ｌ３．６ｐｌ膵癌細胞（２４〜２６継代）をトリプシン処理後にハンクス平衡塩溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーエ、ドイツ）に懸濁した。説明されたように細胞を雄のヌードマウスの膵臓に同所的に注射した（Bruns CJ他(1999) Neoplasia 1(1):50〜62）。７日後に、１５匹のマウスからなる２つの群それぞれにヒトｖ６ペプチドまたはラットコントロールペプチド（２０μｇ）のどちらかを腹腔内注射した。本明細書に記載した実験および示した実験全てに、ラット１４ｍｅｒコントロールペプチドまたはヒト１４ｍｅｒペプチドのどちらかを使用した。次いで、全ての実験をラット５ｍｅｒコントロールペプチドまたはヒト５ｍｅｒペプチド（Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ）で繰り返した。１４ｍｅｒペプチドの場合と同じ結果を観測した。注射を２１日にわたり週当たり３回繰り返した。最終処理から２日後に動物を屠殺した。
【０１５６】
調べるために、上記に記載したように、退縮した転移（ＢＳｐ７３ＡＳｓ６またはＬ３．６ｐｌのどちらか）を移植した。３週間にわたり腫瘍が増殖した。このとき、コントロール群において全ての動物で転移が発症した。週当たり３回、動物に２０μｇのペプチド（Ｌ３．６ｐｌ同所性マウスモデル：ヒトｖ６ペプチドもしくはラットコントロールペプチド）を腹腔内注射した、または２００μｇのペプチド（ラット同系モデル：ラットｖ６ペプチドもしくはマウスコントロールペプチド）を静脈内注射した。ペプチド処理の開始から２３日後に動物を屠殺した。
【０１５７】
Ｏｐｔｉｘ  ＭＸ２を使用するインビボでの撮像
既に説明されているように（Napp他、Int J Cancer(2010)、127:1958〜1974）、近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）撮像システムＯｐｔｉｘ  ＭＸ２（ＡＲＴ、モントリオール、カナダ）を使用して、ＢＤ１０ラットまたはＢＤＸラットにおいて皮下で増殖したＢＳｐ７３ＡＳｓ６腫瘍のインビボでの撮像を行なった。毛皮の自己蛍光を避けるために、撮像前に腫瘍周囲のラットの毛を剃った。その後、２％イソフルランを使用して動物に麻酔をかけ、データの取得の間中、装置の加熱プレート上に動物を静かに固定した。蛍光バックグラウンドを低減するために、ＮＩＲＦ撮像前に１週間にわたり、ラットにクロロフィル低減飼料（Ｐｒｏｖｉｍｉ  Ｋｌｉｂａ  ＡＧ、カイザーアウークシュト、スイス）を与えた。いかなる蛍光プローブも注射しない動物のネイティブ走査により、全てのインビボ分析を先行させた。インビボ分析の場合、尾静脈を介してラットにＤＹ６８１標識したラットｖ６の１１ｍｅｒペプチドまたはヒトｖ６の１１ｍｅｒペプチド２００μｇを注射した。等量のＤＹ６８１標識マウスｖ６の１１ｍｅｒペプチドをコントロールに注射した。ラット１１ｍｅｒは配列ＷＦＥＮＥＷＱＧＫＮＰ（配列番号１２）を有し、マウス１１ｍｅｒは配列ＷＦＱＮＧＷＱＧＫＮＰ（配列番号１３）を有し、ヒト１１ｍｅｒは配列ＷＦＧＮＲＷＨＥＧＹＲ（配列番号１４）を有した。全てのペプチドを蛍光色素ＤＹ６８１で標識した。ペプチドの注射から指定された時間後にデータを取得した。エクスビボでのモニタリングの場合、ペプチド注射から２４時間で動物を屠殺し、Ｏｐｔｉｘ  ＭＸ２を使用して目的の腫瘍および器官をエクスビボで走査した。
【０１５８】
７００ｎｍのロングパスエミッションフィルタと共に６７０ｎｍでの励起を使用して、ＤＹ６８１の蛍光を測定した。１．５ｍｍのラスター、走査点当たり０．５〜１秒の光子収集時間および可変レーザー出力で走査を行なった。ＯｐｔｉＶｉｅｗ（ＡＲＴ）でデータセットを解析した。蛍光強度データを、測定した蛍光強度（数値）を可変レーザー出力および積分時間に関して正規化した正規化数値（ＮＣ）で表示し、これにより様々な設定での測定の比較が可能になる。
【０１５９】
Ｐｅａｒｌ撮像装置を使用するインビボでの撮像
Ｐｅａｒｌ（商標）撮像装置（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、バートホンブルク、ドイツ）を使用して、Ｌ３．６ｐｌ腫瘍を有するマウスのインビボでの撮像を行なった。このシステムは、励起用に２つのレーザー（６８５ｎｍおよび７８５ｎｍ）を使用し、シグナル検出用に電荷結合素子検出器を使用する。レーザー励起により、深組織への浸透が可能になる。近赤外検出により、組織の自己発光の低減に起因して高感度が達成される。画像を標準化するために、発明者らはＰｅａｒｌ  Ｃａｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用した。撮像の１週間前にクロロフィル低減飼料を動物に与え、蛍光バックグラウンドを低減させた（Ｒｅｇｉｍｅ２１０、安全な飼料、オジー、フランス）。撮像前に、２．０％イソフルランでマウスに麻酔をかけた。動物を撮像装置の加熱プレート上に置き、撮像ドロワー（imaging drawer）中のノーズコーンを介してイソフルランを継続的に送った。７００ｎｍおよび８００ｎｍの白色光で撮像した。ペプチドの静脈内注射前に、およびＤＹ６８１標識ヒトｖ６ペプチドまたはコントロールとしてのＤＹ６８１標識ラットｖ６ペプチドのどちらかの注射から２４時間後に、動物を撮像した。各撮像セッション直後に動物を屠殺し、腫瘍、肝臓および脾臓を単離し、７００ｎｍおよび８００ｎｍの白色光においてエクスビボで走査した。
【０１６０】
免疫蛍光
ＡＳｓ６細胞またはＬ３．６ｐｌ細胞を、Ｌａｂ−ＴｅｋＲ  Ｃｈａｍｂｅｒ  ＳｌｉｄｅＴＭ（Ｎｕｎｃ、ネーピアビル、イリノイ州、米国）のウェル当たり５，０００個の細胞で播種した。翌日に細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、室温で３０分にわたり４％ホルマリンで固定した。室温で１時間にわたり、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡにより非特異的結合をブロックした。細胞をＤＹ６８１標識ペプチドと共に１時間にわたりインキュベートした。ＰＢＳによる３回の洗浄工程後、蛍光マウンティング培地（Ｄａｋｏ、グロストルップ、デンマーク）と共にカバーガラスを載置し、レーザー走査型共焦点顕微鏡Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ２  ＳＰ２（Ｅｘｔｏｎ、ペンシルバニア州、米国）により免疫蛍光を測定し、Ｌｅｉｃａ共焦点ソフトウェアを使用して処理した。２０倍の対物レンズを撮像に使用した。
【０１６１】
組織学的検査
組織形態学的分析のために、肺のパラフィン埋め込み切片をヘマトキシリンおよびエオシンならびに過ヨウ素酸シッフ（Ｈ＆ＥまたはＰＡＳ）で染色した。２０μｍおきに切片を分析することにより全組織ブロックの連続切片を調べ、各切片において、微小転移の存在を評価するために病理学者によって定常的に使用される手順に従って、転移性沈着物の存在および進展を評価した。
【０１６２】
免疫組織学的分析および免疫蛍光分析
７μｍ厚のパラフィン切片を脱パラフィンして再水和した。Ｐ−Ｍｅｔ染色の場合、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０中でスライドを煮沸し、続いて沸点より低い温度で１５分にわたりインキュベートすることにより抗原アンマスキングを実現し、ＣＤ３１染色の場合、切片を３７℃で１０分にわたりプロテイナーゼＫ（８μｇ／ｍｌ）で処理した。Ｐ−Ｍｅｔによる免疫蛍光染色の場合、６０分にわたり５％ヤギ血清（ＤＡＫＯ、グロストルップ、デンマーク）（１×ＰＢＳ／０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に希釈した）で非特異的結合をブロックした。免疫組織化学的検査の場合、内因性ペルオキシダーゼをＰＢＳ中の３％Ｈ２Ｏ２で最初にブロックし、続いてビオチンブロッキングシステム（Ｄａｋｏ、グロストルップ、デンマーク）と共にインキュベートし、次いでブロッキングに使用するＰＢＳ中の５％ＦＣＳと共にインキュベートすることにより非特的結合を阻害した。切片を４℃で、Ｐ−Ｍｅｔ抗体（Ｄ２６、１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中に１：５０で希釈）、Ｍｅｔ抗体（Ｃ−２８、１：５０で希釈）、ＧＦＰ抗体（ｓｃ−１０１５２５、１：５０で希釈）もしくはＣＤ３１抗体（５μｇ／ｍｌ）と共に一晩インキュベートした、またはＶＦＦ１８（５μｇ／ｍｌ）と共に一晩インキュベートした。ＰＢＳ中での洗浄後、切片を４５分にわたり、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒ  ５４６ヤギ抗ウサギ（免疫蛍光Ｐ−Ｍｅｔ染色および免疫蛍光Ｍｅｔ染色の場合、１：５００で希釈）またはビオチン化二次抗体（免疫組織化学染色の場合、ＶＦＦ１８およびＣＤ３１用にウサギ抗ラット抗体、Ｐ−Ｍｅｔ用にヤギ抗ウサギ、ＧＦＰ用に開裂カスパーゼ−３および開裂カスパーゼ−８およびウサギ抗マウス、１：５００で希釈）と共にインキュベートした。ＤＡＢ染色の場合、切片をストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ接合体（Ｄａｋｏ、グロストルップ、デンマーク）で処理し、ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）基材システム（３，３’−ジアミノベンジジン；Ｂｉｏｚｏｌ、エヒング、ドイツ）で現像した。免疫蛍光の場合、核染色にＤＡＰＩを使用した。
【０１６３】
２．結果
Ｍｅｔに対するＣＤ４４ｖ６の共受容体機能は、ラット膵臓腫瘍細胞の転移性拡散の決定的な手段である
Ｍｅｔ受容体に対するＣＤ４４ｖ６の共受容体機能が腫瘍細胞の転移性拡散の決定的な手段であるかどうかを調べるために、エクソンｖ６のみを含有するまたはＣＤ４４ｖ１〜１０アイソフォームに含まれる全てのバリアントエクソンｖ１〜１０を含有するＣＤ４４アイソフォームがラットＢＳｐ７３ＡＳ細胞に転移能を付与することができたかどうかを最初に調べた。この細胞では、ＣＤ４４ｖ６含有アイソフォームが遺伝子導入されている場合を除いて、ＨＧＦによりＭｅｔを誘導することできない（図１６Ａ）。例えばＣＤ４４ｖ１〜１０Δｖ６におけるエクソンｖ６の除去により、ＨＧＦによるＭｅｔの活性化が損なわれた（図１６Ａ）。
【０１６４】
親ＢＳｐ７３ＡＳ細胞および上述した構築物（ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ１〜１０およびＣＤ４４ｖ１〜１０Δｖ６）を安定的に遺伝子導入した細胞を同質遺伝子的ラットに皮下注射した。全ての動物において、１週間後に原発性腫瘍を既に触知することができた。ＣＤ４４ｖ６またはＣＤ４４ｖ１〜１０を遺伝子導入した細胞の場合、対応する動物の腋窩リンパ節が注射から２週間後に既に肥大しており、６週間後に動物を屠殺した。肺およびリンパ節の組織形態学的実験から、腫瘍を発現するＣＤ４４ｖ６またはＣＤ４４ｖ１〜１０を有する全てのラットが結節性の肺内転移を発症したことが明らかになった。対照的に、リンパ節または肺のどちらにおいても、親細胞またはＣＤ４４ｖ１〜１０Δｖ６を遺伝子導入した細胞から原発性腫瘍が発生したが転移は発生しなかった（図１６Ｂおよび表１）。この動物の肺では、微小転移を検出しなかった（表１）。そのため、Ｍｅｔ活性化が可能である、ＣＤ４４ｖ６等のＣＤ４４アイソフォームはまた、ＢＳｐ７３ＡＳ細胞に転移能も付与する。
【０１６５】
次に、Ｍｅｔ  ｓｈＲＮＡ配列を発現するレンチウイルスをＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞（ＣＤ４４に加えてＣＤ４４ｖ６アイソフォームを発現するＢＳｐ７３ＡＳ細胞）に安定的に遺伝子導入した。細胞がＭｅｔを発現しないことを確認した（図１６Ａ、最後の２つのレーン）。次いで、この細胞（またはコントロールｓｈ−ＲＮＡ配列を発現するレンチウイルスを感染させた細胞）を同系動物に注射した。注射から６週間後に動物を調べた。全ての動物が原発性腫瘍を発症した（表１）。しかしながら、コントロールｓｈ−ＲＮＡ発現レンチウイルスを感染させた細胞の原発性腫瘍でのみＭｅｔ活性化を観測し、Ｍｅｔ  ｓｈ−ＲＮＡを発現する原発性腫瘍では観測しなかった（図１６Ｃ）。更に、Ｍｅｔ発現が消失しなかった場合、肺または腋窩リンパ節のどちらにおいても転移または微小転移を検出せず（図１６Ｂ、表１）、このことは転移プロセスに対するＭｅｔの重要性を示す。このデータから、ＣＤ４４ｖ６およびＭｅｔの両方がＢＳｐ７３ＡＳ細胞の転移性拡散に必要であると結論付けることができる。
【０１６６】
次に、共受容体機能を妨げる配列番号２（ヒトＣＤ４４ｖ６の５ｍｅｒペプチド）または配列番号６（ヒトＣＤ４４ｖ６の１４ｍｅｒペプチド）のペプチドのラット対応物も転移形成を阻害するかどうかを調べた。ラットペプチドは、配列ＫＥＫＷＦＥＮＥＷＱＧＫＮＰ（配列番号１０）およびＮＥＷＱＧ（配列番号１１）を有した。ＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞を同系ラットに皮下注射し、配列番号１０または配列番号１１のラットＣＤ４４ｖ６ペプチド（もしくはマウスのコントロールペプチド）またはＣＤ４４ｖ６抗体（もしくはコントロールとしてのＩｇＧ）を腫瘍内にまたは静脈内に週に３回注射した。ｖ６特異的抗体による処理またはｖ６特異的ペプチドによる処理の両方とも転移を完全に阻害した（図１７Ｂ、表２）。ＣＤ４４ｖ６ペプチドで処理した動物由来の肺切片では、ＰＡＳおよびＨ＆Ｅ染色を使用する組織学的分析で転移または微小転移を検出することができなかった（図１７Ｃおよび表２）。このことは、肺で多数の転移を検出した、コントロールペプチド（またはコントロールＩｇＧ）で処理した動物から得た結果との対比において明らかである（図１７Ｂ、Ｃ）。興味深いことに、原発性腫瘍の増殖はどちらの処理の影響も受けなかった（図１７Ｄ）。このことは、ＢＳｐ７３ＡＳ細胞またはＢＳｐ７３ＡＳｖ１〜１０Δｖ６細胞もｖ６形質移入体と同様に原発性腫瘍の形成を誘導することができるという事実と両立することができる。まとめると、実験から、Ｍｅｔに対するＣＤ４４ｖ６の共受容体機能がラット膵臓細胞系における転移性拡散の決定的な手段であること、およびＭｅｔに対するＣＤ４４ｖ６の共受容体機能が原発性腫瘍の増殖の主要因ではないことが示唆される。
【０１６７】
インビボでのＣＤ４４ｖ６ペプチドの腫瘍細胞への特異的結合
ＣＤ４４ｖ６ペプチドの腫瘍部位へのおよび転移への結合の特異性を検証するために、ならびにインビボでの結合反応速度を推定するために、Ｏｐｔｉｘ  ＭＸ２による近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）撮像を行なった。この目的のために、以下の２種のＣＤ４４ｖ６ペプチドをフルオロフォアＤＹ６８１で標識した：ラット特異的ＣＤ４４ｖ６ペプチド、即ちｒｖ６ペプチドＤｙ６８１、およびコントロールとしてのマウス特異的ＣＤ４４ｖ６ペプチド、即ちｍｖ６ペプチドＤｙ６８１。図１８Ａの右側に示すように、インビトロでの試験により、実際には標識ラットペプチドのみがＭｅｔ活性化を阻害し、マウスペプチドはＭｅｔ活性化を阻害しなかったことが明らかとなった。更に、組織培養液中において、ＤＹ６８１標識ラットｖ６ペプチドはＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞に結合したが、ＤＹ６８１標識マウスｖ６ペプチドはＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞に結合しなかった（図１８Ａの左側）。
【０１６８】
インビボでの実験の場合、ＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞を同系ラットに皮下注射した。３週間後、尾静脈（tail vain）への注射により、どちらかの標識ｖ６ペプチドをラットに投与した。指定の時点で、Ｏｐｔｉｘ  ＭＸ２により、腫瘍領域における蛍光の蓄積を測定した。Ｄｙ６８１標識ペプチドの静脈内（ｉ．ｖ．）注射前に、マウスをネイティブに走査して自己蛍光バックグラウンドの濃度を測定した。次いで、Ｄｙ６８１標識ｖ６ペプチドの皮下腫瘍へのインビボ結合反応速度を測定した。ペプチド注射から１日後に、２日後に、３日後および７日後に撮影した一連の代表的なＮＩＲＦ画像に示すように、インビボで少なくとも２日にわたり腫瘍領域全体で高蛍光強度を検出し、１日目で最大であった。コントロールペプチドであるｍ６ペプチドＤｙ６８１の注射では、腫瘍領域全体で蛍光シグナルが全く生じなかった（図１８Ｄ）。
【０１６９】
腫瘍中におけるｖ６ペプチドの分布を特に調べるために、および肺中におけるｖ６ペプチドの分布も特に調べるために、ペプチドの注射から２４時間後に両方の組織を摘出し、Ｏｐｔｉｘ  ＭＸ２によりエクスビボで調べた（図１８Ｃ）。エクスビボで走査したおよびｒｖ６ペプチドＤｙ６８１を投与したマウスから摘出した腫瘍および肺の特定領域においてのみ蛍光強度を検出することができ、ｍｖ６ペプチドＤｙ６８１を事前に注射した全てのコントロールラット由来の腫瘍および肺では蛍光強度を検出することができなかった（図１８Ｃ）。この結果は、ラットペプチドが皮下のラット膵臓腫瘍に特異的に結合するというインビボでの観測を裏付けており、転移にインビボで結合することもまた更に示唆する。実際に、組織学的分析により、全ての動物の肺において転移の存在が明らかになった。
【０１７０】
配列番号２または配列番号６のヒトＣＤ４４ｖ６ペプチドによりヒト膵臓腫瘍細胞の転移形成が阻害される
ヒト膵臓腫瘍への研究を発展させるために、高転移性ヒト膵癌細胞Ｌ３．６ｐｌ（Bruns他、Neoplasia (1999)、1(1):50〜62）を調べた。この細胞は、該細胞を更に転移させる手段である、肝臓中でおよび膵臓中で数回継代しているＣＯＬＯ３７５細胞が起源である。この細胞ではＭｅｔがその活性化およびシグナル伝達をＣＤ４４ｖ６に依存していることを確認した（図１９Ａ）。配列番号２または配列番号６のヒトｖ６ペプチドの存在下でまたは非存在下で、Ｌ３．６ｐｌ細胞をＨＧＦで処理し、Ｍｅｔ活性化およびＥＲＫへの下流シグナル伝達を測定した。ヒトｖ６ペプチドによりＭｅｔおよびＥＲＫの両方のリン酸化が阻害された。対応するラットｖ６ペプチド（コントロールペプチド、配列番号１０または１１）による処理は、受容体活性化および信号伝達に影響を及ぼさなかった（図１９Ａ）。
【０１７１】
腫瘍増殖および転移形成へのペプチドの影響を検証するために、免疫不全マウス（ＮＣＩ−ｎｕ）の膵臓中にＬ３．６ｐｌ細胞を同所的に注射した。このマウスは原発性腫瘍を発症し、４週間後に肝臓中に多数の転移を示した。原発性腫瘍は多量のＣＤ４４ｖ６を発現する（図１９Ｂ）。腫瘍におけるホスホ−ＭｅｔおよびＭｅｔに関する免疫蛍光染色で示すように、３週間にわたる週当たり３回のヒト特異的ペプチドの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により、Ｍｅｔ活性化が完全に抑圧された（図１９Ｃ）。このデータは、ペプチドがインビボでＭｅｔに対するＣＤ４４ｖ６の共受容体機能を妨げるおよびＭｅｔリン酸化を抑止することを示す。Ｍｅｔの活性化は種特異的であり、ヒトＨＧＦによってのみヒトＭｅｔ受容体を活性化することができることから、この結果は、Ｌ３．６ｐｌ細胞が自らＨＧＦを産生することを示唆する。興味深いことに、ラット系とは対照的に、膵臓における原発性腫瘍の増殖はヒトｖ６ペプチドにより強力に抑圧された（図１９Ｄ上部）。膵臓における原発性腫瘍の増殖も強力に抑圧された（図１９Ｄ下部）。ラット特異的ペプチド（コントロールペプチド）では転移形成への影響または原発性腫瘍の増殖のどちらもなかった（図１９Ｄ）。この結果は、Ｌ３．６ｐｌ細胞が自らＨＧＦを産生することを示唆する。実際に、培養から５日後の上清（材料および方法を参照）中にヒトＨＧＦを３３７５ｐｇ／ｍｌの濃度で検出した（データを示さず）。
【０１７２】
マウス特異的ｖ６ペプチドによる腫瘍血管新生の阻害により原発性腫瘍の増殖が遅延したことを観測した。ここで、ｖ６ペプチド処理腫瘍における血管の数および血管のサイズの減少で例示されるように、ヒトペプチドによる処理は血管新生も縮小させたことが分かる。血管新生の縮小で腫瘍体積の減少が説明される（図１９Ｄ、Ｅ）。ｖ６ペプチドが種特異的な方法で作用することから、血管新生の阻害は、ヒト膵癌細胞によるＶＥＧＦ産生の阻害よりもマウスの内皮細胞への影響への影響に起因し得ない。実際に、ヒトＬ３．６ｐｌ細胞は、ヒトｖ６ペプチドによる処理によってブロックされ得る分泌物であるｈＶＥＧＦを産生する（図１９Ｆ）。最も目立つ観測は、ヒト特異的ペプチドが肝臓内での転移形成を完全に阻害したことをであった（図１９Ｇ）。ラット特異的ペプチド（コントロールペプチド）は転移形成または原発性腫瘍の増殖に影響を及ぼさなかった（図１９Ｃ〜Ｇ）。
【０１７３】
次いで、小動物撮像システムＰｅａｒｌ  Ｉｍｐｕｌｓｅを使用して、ヒトＣＤ４４ｖ６ペプチドのインビボでの腫瘍への結合の特異性を調べた。ヒト標識ペプチドはＬ３．６ｐｌ細胞中においてＭｅｔ活性化を阻害したがラットペプチドは阻害せず（図２０Ａの右側）、細胞培養液中で、ヒト標識ペプチドはＬ３．６ｐｌ細胞に結合したが、ラットペプチドはＬ３．６ｐｌ細胞に結合しなかった（図２０Ａの左側）。インビボで、蛍光標識（ＤＹ６８１）ヒトペプチドは、同所的に注射したＬ３．６ｐｌ細胞により誘導された腫瘍中に特異的に蓄積した（図２０Ｂ）。コントロールペプチドで処理した動物では蛍光を検出しなかった。更に、腫瘍を発症したかどうかに関わらずペプチドを投与しなかった動物ではシグナルを観測しなかった（図２０Ｂ）。標識ヒトｖ６ペプチドで処理した動物から単離した器官のエクスビボでの分析により、原発性腫瘍だけでなく転移にほぼ確実に対応する肝臓の領域への結合の検出が可能になった（図２０Ｃ）。そのため、この実験から、ＣＤ４４ｖ６ペプチドは原発性腫瘍だけでなく遠位の転移も標的とすることが明らかになる。
【０１７４】
既に生じた転移がＣＤ４４ｖ６ペプチドにより除去される
ラット系における肺のおよびヒトモデルにおける肝臓の特定の領域へのＣＤ４４ｖ６ペプチドの特異的結合から、このペプチドが既に生じた転移に影響を及ぼすことができたかどうかの疑問が惹起される。図１７および１９に記載の実験において、腫瘍細胞の注射直後にペプチドを投与し、該ペプチドは転移の発生を完全に抑圧した。既に生じた転移へのＣＤ４４ｖ６ペプチドの効果を測定するために、その他の実験的設定を使用した。ＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞を同系ラットに皮下注射し、Ｌ３．６ｐｌ細胞を雄のヌードマウスに同所的に皮下注射し、３週間にわたり増殖させた。このとき、コントロール群由来の全ての動物は、ペプチド処理に使用した群の場合と同様であることを示唆する転移（表３）を発症していた。次いで、動物を種特異的ＣＤ４４ｖ６ペプチドまたはコントロールペプチド（ラット系の場合はマウスおよびヒト系の場合はラット）のどちらかで更に３週間にわたり週当たり２回処理し（図２１Ａのスキーム）、次いで転移の存在に関して検証した。実験の終了時に、コントロールペプチドで処理した全ての動物で転移を検出することができた（ＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞の場合は表３、図２１Ｂ、Ｌ３．６ｐｌ細胞の場合は表３、図２１Ｃ）が、種特異的ＣＤ４４ｖ６ペプチドで処理した動物には転移がなかった。そのため、既に生じた転移はＣＤ４４ｖ６ペプチドでの処理により除去される。
【０１７５】
転移の消失に関する１つの仮説は、ペプチドが第２の器官におけるＣＤ４４ｖ６発現転移性細胞のアポトーシスを誘導することである。この仮説を検証するために、ＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞を使用して上記に記載の実験を繰り返した。ＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞を同系ラットで皮下注射し、３週間にわたり腫瘍を成長させた。その後、動物を、特異的ラットＣＤ４４ｖ６ペプチドまたはコントロールペプチド（マウス）のどちらかを１日おきに注射した１０匹の動物からなる２つの群に分けた。ペプチドの各注射から１日後に１匹の動物の肺を取り出し、カスパーゼ３の開裂型を検出する抗体を使用してアポトーシスを測定した。ＣＤ４４ｖ６ペプチドで処理した動物の腫瘍領域において、ペプチドの最初の注射から早くも３日後にアポトーシス性細胞を検出した。コントロールペプチドを注射した動物ではアポトーシスを全く検出しなかった（図２２）。ＣＤ４４ｖ６ペプチドの最初の注射から８日後に最大のアポトーシスを測定した。ＣＤ４４ｖ６ペプチドの注射から１２日後にはアポトーシスをほとんど観測しなかった。２２日目に、ＣＤ４４ｖ６ペプチドで処理した動物では転移をもはや検出することができなかったが、コントロール動物の肺では転移性拡散が明らかだった（図２２）。この実験から、ＣＤ４４ｖ６ペプチドが転移性細胞のアポトーシスを誘導すると結論付けられる。
【０１７６】
ミトコンドリアタンパク質の放出を特徴とする内因性経路、またはアポトーシスに関する、リガンドが結合した細胞死受容体により活性化された外因性経路のどちらがｖ６ペプチドにより誘導されたかを識別するために、ｖ６ペプチドで処理した転移における開裂カスパーゼ−８の発現を調べた。ｖ６ペプチド処理動物の肺における、カスパーゼ−３の場合に得たものと同様のカスパーゼ−８の活性化の動力学を観測した。この実験から、発明者らは、ＣＤ４４ｖ６ペプチドは外因性のアポトーシス経路を介して転移性細胞のアポトーシスを誘導すると結論付ける。
【実施例３】
【０１７７】
ペグ化ＣＤ４４ｖ６ペプチドはＨＧＦ依存性のＣＤ４４ｖ６媒介シグナル伝達を阻害する
１．材料および方法
ペグ化ペプチドの合成
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動ペプチド合成機（モデル４３３Ａ）でペプチド合成を行ない、分取ＨＰＬＣによりペプチドを精製した。配列ＮＥＷＱＧ（配列番号１１）のペプチドおよびコントロールペプチドＮＡＡＡＧ（配列番号１５）を合成した。質量分析計に接続されたＬＣ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ−Ｂｒｅｍｅｎ（ドイツ）製のμＴＯＦ  ＬＣＭＳ）により、粗製物および精製物の特徴を明らかにした。
【０１７８】
標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成プロトコル（例えばFields他、Int J Pept Protein Res. (1990)、35、161〜214、Maisch他、J Am Chem Sco. (2009)、131、15596〜15597、Strandberg他、Biophys J. (2006)、90、1676〜1686およびWadhwani他、J Org Chem. (2006)、71、55〜61を参照）を使用してペプチド合成を行なった。ＮＭＰ中の２０〜２２％ピペリジンによりＦｍｏｃ脱保護を行なった。ＤＭＦ中のＦｍｏｃ−アミノ酸：ＨＯＢｔ：ＨＢＴＵ：ＤＩＥＡ（４：４：３．９：８）の混合物を使用してカップリングを行なった。ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：ＴＩＳ（９３．５：２．５：４）の混合物を使用して、ペプチドを固体支持体から切断した。Ｎ２フロー下で切断試薬を除去し、ジエチルエーテルを使用して標識ペプチドを沈殿させた。
【０１７９】
ダイオードアレイ検出器が取り付けられたＪａｓｃｏ−ＨＰＬＣシステム（東京、日本）を使用して、３５℃において逆相Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×２４０ｍｍ）で分取ＨＰＬＣを行なった。アセトニトリル／水勾配が０．１％のＴＦＡを使用して、エピマー型ペプチドを分離した。
【０１８０】
全てのアミノ酸をＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（シュヴァルバッハ、ドイツ）から購入した。ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（分子量７５０Ｄａおよび２０００Ｄａ）ならびにカップリング試薬（ＨＢＴＵ、ＨＣＴＵ）ならびにＤＩＥＡはＩｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（マルクトレドヴィッツ、ドイツ）製であり、溶媒およびその他の試薬はＶＷＲ−Ｍｅｒｃｋ（ブルフザル、ドイツ）製であった。
【０１８１】
以下の化合物を合成した：
ＰＥＧ−コントロールペプチド：ＰＥＧ−ＮＡＡＡＧ、
ＰＥＧ−ラットＣＤ４４ｖ６ペプチド：ＰＥＧ−ＮＥＷＱＧ
パルミチン酸−ＮＨ−ＰＥＧ−ＣＯＮＨ−コントロールペプチド
パルミチン酸−ＮＨ−ＰＥＧ−ＣＯＮＨ−ラットＣＤ４４Ｖ６ペプチド
【０１８２】
Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ分子量３０００Ｄａを配列番号１１または配列番号１５のどちらかに最初にカップリングさせることにより、パルミチン酸−ＮＨ−ＰＥＧ−ＣＯＮＨ−コントロールペプチドおよびパルミチン酸−ＮＨ−ＰＥＧ−ＣＯＮＨ−ラットＣＤ４４Ｖ６ペプチドを合成した。次いで、ペグ化ペプチドをパルミチン酸と反応させた。
【０１８３】
活性化アッセイ
ＰＥＧ−コントロールペプチドおよびＰＥＧ−ラットＣＤ４４ｖ６ペプチドを、受容体型チロシンキナーゼＭｅｔおよびＥＲＫのＨＧＦ誘導性活性化をブロックする能力に関して比較した。
【０１８４】
ラット膵癌細胞ＢＳｐ７３ＡＳｓ６（Ａｓｓ６とも表す）を、コントロールペプチド（配列番号１５）、非ペグ化ｖ６ペプチド（配列番号１１）および高濃度のペグ化ペプチド、即ちＰＥＧ−ラットコントロールペプチドならびにＰＥＧ−ラットＣＤ４４ｖ６ペプチドのいずれかと共に３７℃で１０分にわたりインキュベートした後、ＨＧＦで誘導した（１０ｎｇ／ｍｌ；３７℃で５分）。
【０１８５】
ホスホ−Ｍｅｔおよびホスホ−Ｅｒｋ特異的抗体（ホスホ−ＭｅｔクローンＤ１６細胞シグナル伝達、ホスホ−Ｅｒｋ  ｐ４２／４４細胞シグナル伝達）を使用する標準的なＳＤＳおよびウェスタンブロッティング技法により、ＥＲＫおよびＭｅｔの活性化を測定した。
【０１８６】
細胞アッセイ
散乱アッセイを更に行なった。ＨＴ２９結腸癌細胞を１０％ＦＣＳ含有培地中で増殖させた。播種から１日後に細胞を飢餓させた。３日目に、細胞をＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で誘導し、ペプチドなし、コントロールペプチド（配列番号１５）、非ペグ化ｖ６ペプチド（配列番号１１）またはペグ化ペプチド、即ちＰＥＧ−ラットコントロールペプチドおよびＰＥＧ−ラットＣＤ４４ｖ６ペプチドのいずれかと共にプレインキュベートした。
【０１８７】
２．結果
図２４および２５は、ペグ化ペプチドがＭｅｔおよびＥＲＫのＨＧＦ依存性活性化の阻害で効果的であることを示す。非ペグ化ペプチドと比べてペグ化ペプチドによりＥＲＫがより効果的に阻害される。
【０１８８】
図２６は、ペグ化ペプチド、更に非ペグ化ペプチドにより細胞が細胞クラスターから離れて解離して遊走するが、コントロールペプチドにより細胞が細胞クラスターから離れて解離して遊走しないことを示す。
【実施例４】
【０１８９】
乳癌
４．１  背景
多種多様な癌において、ＲＴＫのＥｒｂＢファミリーの様々なメンバーが過剰発現される、または変異される。例えば、乳腺癌腫を含む癌腫の大部分で高ＥｒｂＢ１発現が見られ、転移性乳癌の病巣の２０〜３０％でＥｒｂＢ２遺伝子の増幅を見ることができる。この乳癌型の造腫瘍性はＥｒｂＢ受容体の構成的活性化に依存する。
【０１９０】
いくつかの乳癌細胞株ではＥＧＦによるＥｒｂＢ受容体の活性化がＣＤ４４ｖ６により可能になることが分かった。従って、ＣＤ４４ｖ６は、造腫瘍性をＥＧＦに基づくＥｒｂＢ活性化に依存している乳癌型に関与することができた。そして実際に、１００個の原発性の侵襲性乳房腫瘍および１８個のリンパ節転移の評価から、ＣＤ４４ｖ６の発現と造腫瘍性とが関連付けられた。このＣＤ４４バリアントの存在は低い生存率と相関する。２つのより近年の研究が同様の結果となった。
【０１９１】
しかしながら、乳癌におけるＣＤ４４ｖ６の役割に関して相反するデータが存在する。ステージＩＩの乳房新生物を患っている１０９例の患者を評価する研究では、例えばＣＤ４４ｖ６発現と無病生存率または全生存期間とが全く関連付けられていなかった。相反する研究では、ＣＤ４４ｖ６は全ての乳癌型の共受容体として作用しないと解釈され得た。ＥｒｂＢ受容体の活性化がＴＧＦ−αにより媒介される癌型では、ＴＧＦ−αによる活性化がＣＤ４４ｖ６に非依存的であることが示され得たことから、例えば、ＣＤ４４ｖ６は共受容体として必要ないであろう。
【０１９２】
４．２  ＣＤ４４ｖ６  １４ｍｅｒの効果
マウス乳癌細胞４Ｔ１の同所的注射により、同系マウスモデルにおいてＣＤ４４ｖ６  １４ｍｅｒの効果を検証した。４Ｔ１細胞は元々、自然発生的なＢＡＬＢ／ｃ乳腺腫瘍に由来した。同所的に誘導した場合、４Ｔ１細胞は原発性部位で急速に増殖し、３〜６週の期間内に肺およびリンパ節中で転移を形成する。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける４Ｔ１細胞の腫瘍増殖および転移性拡散は、ヒト乳癌ステージＩＶを非常に密に模倣する。
【０１９３】
４Ｔ１細胞を第６乳腺脂肪体に同所的に注射した。次いで、それぞれ移植腫瘍細胞を有する５匹の動物からなる２つの群を実験に使用した。１つの群をｖ６  １４ｍｅｒペプチドで処理し、もう１つの群をコントロール（ラット）ペプチドで処理した。ペプチドの注射を週当たり３回行ない、３〜４週間にわたり計画したが、コントロール群が大きな腫瘍を患ったことから２週間後に中止した。
【０１９４】
原発性腫瘍の分析から、ｖ６  １４ｍｅｒ処理群では腫瘍サイズの著しい減少が明らかになった（図２７Ａ）。腫瘍血管新生をモニタリングするための免疫蛍光分析（抗ＣＤ３４染色）から、ｖ６  １４ｍｅｒ処理群では血管の総数が著しく減少したことが分かった（図２７Ｂ）。
【０１９５】
ｖ６  １４ｍｅｒ処理動物とコントロールペプチド処理動物との間の差異を転移性拡散の場合でも見ることができた。肺の巨視的分析から、コントロールペプチドで処理した全てのマウスが転移を発症したことが明らかになった。転移の平均数は肺当たり６個の転移であった。ｖ６ペプチド処理群において、３匹の動物では巨視的な転移が全く見られず、２匹の動物は１つの転移のみを有した。従って、ｖ６ペプチドでの処理により、肺における転移の形成が大幅に減少する（図２７Ｃ）。
【０１９６】
結論として、乳癌に関する予備データから、ｖ６  １４ｍｅｒは、この癌型に有望なツールでもあることが明らかになった。
【実施例５】
【０１９７】
インビトロでの結果
本明細書の記載の直鎖ＣＤ４４ｖ６ペプチド
ラット：１４ｍｅｒ  ＫＥＫＷＦＥＮＥＷＱＧＫＮＰ、５ｍｅｒ  ＮＥＷＱＧ、ＤＹ６８１標識１１ｍｅｒ  ＷＦＥＮＥＷＱＧＫＮＰ
ヒト：１４ｍｅｒ  ＫＥＱＷＦＧＮＲＷＨＥＧＹＲ、５ｍｅｒ  ＮＲＷＨＥ、ＤＹ６８１標識１１ｍｅｒ  ＷＦＧＮＲＷＨＥＧＹＲ
マウス：ＤＹ６８１標識１１ｍｅｒ  ＷＦＱＮＧＷＱＧＫＮＰ
【０１９８】
１．ヒトｖ６ペプチドを使用するＲＴＫのインビトロでの阻害
直鎖ペプチド（ヒト、１４ｍｅｒ  ＫＥＱＷＦＧＮＲＷＨＥＧＹＲ、５ｍｅｒ  ＮＲＷＨＥ）
使用した細胞株
ＨＴ２９（結腸直腸癌）
ＨｅＬａ（子宮頸癌）
Ｌ３．６ｐｌ（ヒト膵癌細胞）
ＭＣＦ７（ヒト乳癌）
【０１９９】
１．１  上皮細胞
ＣＤ４４ｖ６ペプチド（ｖ６  １４ｍｅｒ；ｖ６  ５ｍｅｒも検証した、データを示さず）を使用して、ヒト上皮膵癌細胞Ｌ３．６ｐｌ（Ｃｏｌｏ３５７に由来する）、子宮頸癌細胞ＨｅＬａおよび結腸癌細胞ＨＴ２９におけるＣＤ４４ｖ６のＭｅｔシグナル伝達への寄与を分析した。ＨＧＦによる誘導前に細胞に添加した場合に、Ｍｅｔのおよびその下流標的Ｅｒｋの活性化を妨げることができた（図２８Ａ、ＢおよびＣ）。コントロールペプチドとのインキュベーションによりＭｅｔ活性化およびシグナル伝達を妨げられなかったことから、この結果から、この細胞株全てにおけるＭｅｔ活性化にＣＤ４４ｖ６が必要であることが分かる。
【０２００】
ＶＥＧＦＲおよびＭｅｔに加えて、ＥｒｂＢ１のＣＤ４４ｖ６への依存性を調べた。ＥＧＦおよびその他の５種のリガンド、即ちＡＲ、ＢＣ、ＥＲ、ＨＢ−ＥＧＦおよびＴＧＦ−αは、ＥｒｂＢ１受容体を活性化することができる。ＥＧＦ、ＡＲおよびＴＧＦ−αは、ＥｒｂＢ１ホモ二量体またはＥＲｂＢ１／２ヘテロ二量体のどちらかに結合する。これらの二量体に加えて、ＢＣ、ＥＲおよびＨＢ−ＥＧＦは、Ｅｒｂ４／４ホモ二量体またはＥｒｂＢ２／４ヘテロ二量体にも結合することができる。ここで、指定のリガンドによるＥｒｂＢ受容体の活性化もＣＤ４４ｖ６に依存しているかどうかを調べた。
【０２０１】
この目的のために、ＨＴ２９細胞を２４時間にわたり血清飢餓させ、ｖ６特異的ペプチドまたはコントロールペプチドで前処理した。次いで、ＨＴ２９細胞を、指定のＥｒｂＢリガンドで誘導した。Ｅｒｋキナーゼのリン酸化を、受容体活性化のリードアウトとして使用した。全てのリガンドはＥｒｋキナーゼを活性化することができた。ＨＴ２９細胞のＣＤ４４ｖ６ペプチド（ヒトｖ６  １４ｍｅｒ）とのプレインキュベーションにより、ＥＧＦ依存性のおよびＥＲ依存性のＥｒｋのリン酸化が阻害されたが、コントロールペプチドは効果が見られなかった（図２９）。このことは、ＥＧＦに加えて、ＥＲが、共受容体としてのＣＤ４４ｖ６に依存している別のＥｒｂＢ１リガンドであることを示す。対照的に、ＣＤ４４ｖ６をブロックすることによりＥｒｂＢ受容体のＡＲ依存性の、ＢＣ依存性の、ＨＢ−ＥＧＦ依存性のおよびＴＧＦ−α依存性の活性化を阻害することはできなかった（図２９）。これらのリガンドでは、それらのＥｒｂＢ受容体の誘導がＣＤ４４ｖ６に非依存的である。このことは特に印象的である。なぜならば、ＥＧＦおよびＴＧＦ−αは同じ受容体対（ＥｒｂＢ１／１またはＥｒｂＢ１／２）に焦点を当てるからである。これらのデータは、ＥｒｂＢ活性化の共受容体として使用される特異的なＣＤ４４アイソフォームは、ＥｒｂＢ受容体を活性化させるリガンドにより決定されるが、受容体のタンパク質自体により決定されないことを示唆する。
【０２０２】
ＭＣＦ７では、ＣＤ４４ｖ６特異的ペプチドにより、Ｅｒｋのリン酸化がＥＧＦ処理でブロックされるがＴＧＦα誘導ではブロックされない。５ｍｅｒおよび１４ｍｅｒの両方のペプチドが同様の効果を示した。コントロールペプチドはＥｒｋのリン酸化に対する効果を有しなかった（図３０）。
【０２０３】
本発明の実施形態の内のいくつかは以下に関する。
１．ヒトの乳癌の処置において使用するための化合物であって、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（Ｘ１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択され、Ｘ５が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）（配列番号１）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３もしくはＸ１４が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）（配列番号７）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号７の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７およびＸ１１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む化合物。
【０２０４】
２．前記化合物が、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ５が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）（配列番号４）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ２が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ３が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ４が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ５が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ６が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１２が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１３が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１４が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）（配列番号８）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号８の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む、実施形態１に記載の使用のための化合物。
【０２０５】
３．前記化合物が、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱを含む群から選択され、Ｘ５が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤを含む群から選択される）（配列番号５）含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ２が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥまたはＤを含む群から選択され、Ｘ３が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ４が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ５が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ６が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥまたはＤを含む群から選択され、Ｘ１２が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１３が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ１４が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択される）（配列番号９）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号９の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥまたはＤを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む、実施形態２に記載の使用のための化合物。
【０２０６】
４．前記化合物が、アミノ酸配列Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ（配列番号２）、アミノ酸配列Ｋ−Ｅ−Ｑ−Ｗ−Ｆ−Ｇ−Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ−Ｇ−Ｙ−Ｒ（配列番号６）を含む、場合により、からなるペプチドまたはこのペプチド模倣物を含む、実施形態１、２または３に記載の使用のための化合物。
【０２０７】
５．前記化合物が前記ペプチドまたは前記ペプチド模倣物の改変型である、実施形態１、２、３または４に記載の使用のための化合物。
【０２０８】
６．前記化合物が、前記ペプチドまたはペプチド模倣物のペグ化型、ヘシル化型、パシル化型、ミリストイル化型、グリコシル化型および／または環状型である、実施形態５に記載の使用のための化合物。
【０２０９】
７．化合物が経口投与用に、経鼻投与用にまたは皮下投与用に製剤化されている、実施形態１、２、３、４または５に記載の使用のための化合物。
【０２１０】
８．ヒトの乳癌の処置において使用するための医薬組成物であって、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（Ｘ１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択され、Ｘ５が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）（配列番号１）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３もしくはＸ１４が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）（配列番号７）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号７の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７およびＸ１１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む化合物を含む医薬組成物。
【０２１１】
９．前記医薬組成物が、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ５が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）（配列番号４）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ２が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ３が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ４が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ５が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ６が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１２が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１３が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１４が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）（配列番号８）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号８の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む化合物を含む、実施形態８に記載の使用のための医薬組成物。
【０２１２】
１０．前記医薬組成物が、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱを含む群から選択され、Ｘ５が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤを含む群から選択される）（配列番号５）含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ２が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥまたはＤを含む群から選択され、Ｘ３が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ４が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ５が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ６が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥまたはＤを含む群から選択され、Ｘ１２が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１３が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ１４が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択される）（配列番号９）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号９の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥまたはＤを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む化合物を含む、実施形態９に記載の使用のための医薬組成物。
【０２１３】
１１．前記化合物が、アミノ酸配列Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ（配列番号２）、アミノ酸配列Ｋ−Ｅ−Ｑ−Ｗ−Ｆ−Ｇ−Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ−Ｇ−Ｙ−Ｒ（配列番号６）を含む、場合により、からなるペプチドまたはこのペプチド模倣物を含む、実施形態８、９または１０に記載の使用のための医薬組成物。
【０２１４】
１２．前記化合物が前記ペプチドまたは前記ペプチド模倣物の改変型である、実施形態８、９、１０または１１に記載の使用のための医薬組成物。
【０２１５】
１３．前記化合物が、前記ペプチドまたはペプチド模倣物のペグ化型、ヘシル化型、パシル化型、ミリストイル化型、グリコシル化型および／または環状型である、
実施形態１２に記載の使用のための医薬組成物。
【０２１６】
１４．前記医薬組成物が薬学的に許容される賦形剤を含む、実施形態８、９、１０、１１、１２または１３に記載の使用のための医薬組成物。
【０２１７】
１５．前記医薬組成物が経口投与用に、経鼻投与用にまたは皮下投与用に製剤化されている、実施形態８、９、１０、１１、１２、１３または１４に記載の使用のための医薬組成物。
【０２１８】
１６．ヒトの乳癌の処置において使用するための医薬品の製造における化合物の使用であって、
前記化合物が、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（Ｘ１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択され、Ｘ５が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）（配列番号１）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３もしくはＸ１４が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）（配列番号７）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号７の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７およびＸ１１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む、化合物の使用。
【０２１９】
１７．前記化合物が、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ５が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）（配列番号４）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ２が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ３が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ４が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ５が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ６が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１２が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１３が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１４が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）（配列番号８）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号８の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む、実施形態１６に記載の化合物の使用。
【０２２０】
１８．前記化合物が、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱを含む群から選択され、Ｘ５が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤを含む群から選択される）（配列番号５）含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ２が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥまたはＤを含む群から選択され、Ｘ３が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ４が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ５が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ６が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥまたはＤを含む群から選択され、Ｘ１２が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１３が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ１４が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択される）（配列番号９）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号９の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥまたはＤを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む、実施形態１７に記載の化合物の使用。
【０２２１】
１９．前記化合物が、アミノ酸配列Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ（配列番号２）、アミノ酸配列Ｋ−Ｅ−Ｑ−Ｗ−Ｆ−Ｇ−Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ−Ｇ−Ｙ−Ｒ（配列番号６）を含む、場合により、からなるペプチドまたはこのペプチド模倣物を含む、実施形態１６、１７または１８に記載の化合物の使用。
【０２２２】
２０．前記化合物が前記ペプチドまたは前記ペプチド模倣物の改変型である、実施形態１６、１７、１８または１９に記載の化合物の使用。
【０２２３】
２１．前記化合物が、前記ペプチドまたはペプチド模倣物のペグ化型、ヘシル化型、パシル化型、ミリストイル化型、グリコシル化型および／または環状型である、実施形態２０に記載の化合物の使用。
【０２２４】
２２．前記医薬品が経口投与用に、経鼻投与用にまたは皮下投与用に製剤化されている、実施形態１６、１７、１８、１９、２０または２１に記載の化合物の使用。
【０２２５】
２３．化合物を、それを必要とするヒトに化合物を投与することによりヒトの乳癌を処置する方法であって、前記化合物が、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（Ｘ１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択され、Ｘ５が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）（配列番号１）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３もしくはＸ１４が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）（配列番号７）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号７の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７およびＸ１１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む、方法。
【０２２６】
２４．前記化合物が、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ５が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）（配列番号４）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ２が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ３が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ４が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ５が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ６が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１２が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１３が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１４が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）（配列番号８）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号８の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む、実施形態２３に記載の方法。
【０２２７】
２５．前記化合物が、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱを含む群から選択され、Ｘ５が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤを含む群から選択される）（配列番号５）含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ２が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥまたはＤを含む群から選択され、Ｘ３が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ４が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ５が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ６が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥまたはＤを含む群から選択され、Ｘ１２が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１３が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ１４が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択される）（配列番号９）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号９の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥまたはＤを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む、実施形態２４に記載の方法。
【０２２８】
２６．前記化合物が、アミノ酸配列Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ（配列番号２）、アミノ酸配列Ｋ−Ｅ−Ｑ−Ｗ−Ｆ−Ｇ−Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ−Ｇ−Ｙ−Ｒ（配列番号６）を含む、場合により、からなるペプチドまたはこのペプチド模倣物を含む、実施形態２３、２４または２５に記載の方法。
【０２２９】
２７．前記化合物が前記ペプチドまたは前記ペプチド模倣物の改変型である、実施形態２３、２４、２５または２６に記載の方法。
【０２３０】
２８．前記化合物が、前記ペプチドまたはペプチド模倣物のペグ化型、ヘシル化型、パシル化型、ミリストイル化型、グリコシル化型および／または環状型である、実施形態２７に記載の方法。
【０２３１】
２９．前記化合物が経口投与用に、経鼻投与用にまたは皮下投与用に製剤化されている、実施形態２３、２４、２５、２６、２７または２８に記載の方法。
【０２３２】
３０．前記乳癌がＣＤ４４ｖ６の発現を示す、実施形態１、２、３、４、５、６もしくは７のいずれかに記載の使用のための化合物、実施形態８、９、１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５のいずれかに記載の使用のための医薬組成物、実施形態１６、１７、１８、１９、２０、２１もしくは２２のいずれかに記載の使用または実施形態２３、２４、２５、２６、２７、２８もしくは２９のいずれかに記載の方法。
【０２３３】
３１．前記乳癌がＥｒｂＢ１および／またはＥｒｂＢ２の発現の増加を示す、実施形態１、２、３、４、５、６、７もしくは３０のいずれかに記載の使用のための化合物、実施形態８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくは３０のいずれかに記載の使用のための医薬組成物、実施形態１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２もしくは３０のいずれかに記載の使用または実施形態２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０のいずれかに記載の方法。
【０２３４】
３２．前記乳癌が構成的なＥｒｂＢ２活性化を示さない、実施形態１、２、３、４、５、６、７、３０もしくは３１のいずれかに記載の使用のための化合物、実施形態８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、３０もしくは３１のいずれかに記載の使用のための医薬組成物、実施形態１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、３０もしくは３１のいずれかに記載の使用または実施形態２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０もしくは３１のいずれかに記載の方法。
【０２３５】
３３．前記乳癌がＥＧＦおよび／またはＥＲの発現の増加を示す、実施形態１、２、３、４、５、６、７、３０、３１もしくは３２のいずれかに記載の使用のための化合物、実施形態８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、３０、３１もしくは３２のいずれかに記載の使用のための医薬組成物、実施形態１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、３０、３１もしくは３２のいずれかに記載の使用または実施形態２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１もしくは３２のいずれかに記載の方法。
【０２３６】
３４．前記乳癌が、ＥＧＦおよび／またはＥＲの発現の増加を示すがＴＧＦαの発現の増加を示さない、実施形態１、２、３、４、５、６、７、３０、３１、３２もしくは３３のいずれかに記載の使用のための化合物、実施形態８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、３０、３１、３２もしくは３３のいずれかに記載の使用のための医薬組成物、実施形態１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、３０、３１、３２もしくは３３のいずれかに記載の使用または実施形態２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２もしくは３３のいずれかに記載の方法。
【０２３７】
３５．前記乳癌腫瘍が、ＥＧＦに基づくＥｒｂＢ活性化を示す、実施形態１、２、３、４、５、６、７、３０、３１、３２、３３もしくは３４のいずれかに記載の使用のための化合物、実施形態８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、３０、３１、３２、３３もしくは３４のいずれかに記載の使用のための医薬組成物、実施形態１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、３０、３１、３２、３３もしくは３４のいずれかに記載の使用または実施形態２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３もしくは３４のいずれかに記載の方法。
【０２３８】
３６．前記乳癌がトラスツズマブまたはペルツズマブによる処置に対する耐性を示す、実施形態１、２、３、４、５、６、７、３０、３１、３２、３３、３４もしくは３５のいずれかに記載の使用のための化合物、実施形態８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、３０、３１、３２、３３、３４もしくは３５のいずれかに記載の使用のための医薬組成物、実施形態１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、３０、３１、３２、３３、３４もしくは３５のいずれかに記載の使用または実施形態２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４もしくは３５のいずれかに記載の方法。
【０２３９】
３７．前記乳癌がトラスツズマブまたはペルツズマブによる処置に対する耐性を示し、Ｍｅｔの発現の増加を示す、実施形態１、２、３、４、５、６、７、３０、３１、３２、３３、３４、３５もしくは３６のいずれかに記載の使用のための化合物、実施形態８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、３０、３１、３２、３３、３４、３５もしくは３６のいずれかに記載の使用のための医薬組成物、実施形態１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、３０、３１、３２、３３、３４、３５もしくは３６のいずれかに記載の使用または実施形態２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５もしくは３６のいずれかに記載の方法。
【０２４０】
３８．前記乳癌が転移性乳癌である、実施形態１、２、３、４、５、６、７、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６もしくは３７のいずれかに記載の使用のための化合物、実施形態８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６もしくは３７のいずれかに記載の使用のための医薬組成物、実施形態１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６もしくは３７のいずれかに記載の使用または実施形態２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６もしくは３７のいずれかに記載の方法。
【０２４１】
３９．前記転移性癌が、対癌米国合同委員会の癌病期分類システムのＴＮＭ解剖学的／予後群システムに従ってステージＩＩＩまたはステージＩＶと分類できる、実施形態１、２、３、４、５、６、７、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７もしくは３８のいずれかに記載の使用のための化合物、実施形態８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７もしくは３８のいずれかに記載の使用のための医薬組成物、実施形態１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７もしくは３８のいずれかに記載の使用または実施形態２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７もしくは３８のいずれかに記載の方法。
【０２４２】
４０．前記転移性癌が、対癌米国合同委員会の癌病期分類システムのＴＮＭ解剖学的／予後群システムに従ってステージＩＶと分類できる、実施形態１、２、３、４、５、６、７、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８もしくは３９のいずれかに記載の使用のための化合物、実施形態８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８もしくは３９のいずれかに記載の使用のための医薬組成物、実施形態１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８もしくは３９のいずれかに記載の使用または実施形態２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８もしくは３９のいずれかに記載の方法。
【０２４３】
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【図１】
2016501856.tif 000004
【図２】
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【図３】
2016501856.tif 000006
【図４】
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【図５】
2016501856.tif 000008
【図６】
2016501856.tif 000009
【図７】
2016501856.tif 000010
【図８】
2016501856.tif 000011
【図９】
2016501856.tif 000012
【図１０】
2016501856.tif 000013
【図１１】
2016501856.tif 000014
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2016501856.tif 000019
【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
2016501856.tif 000031
【図２７】
2016501856.tif 000032
【図２８】
2016501856.tif 000033
【図２９】
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【図３０】
2016501856.tif 000035
【配列表】
2016501856000001.app
【国際調査報告】
2016501856.tif 000036
2016501856.tif 000037
2016501856.tif 000038
2016501856.tif 000039
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2016501856.tif 000042
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