(57)【要約】  免疫不全の動物（複数可）において個々の患者由来の腫瘍細胞を広げて、有効なワクチン生産及び利用に量的にも質的にも十分な材料を獲得し、腫瘍切除に続いて個々の患者において微小転移及び／又は再発に対する免疫応答を誘発するステップを含む、自己抗がんワクチン並びに製造及び治療の方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む、少なくとも約１０７個の生存可能な非腫瘍原性の腫瘍細胞を含有する注射可能な自己抗腫瘍ワクチンを製造する方法。
がん患者から固形腫瘍を切除して、前記患者の固形腫瘍組織の少なくとも９５％を得るステップであって、前記切除された腫瘍組織が約３．５グラム未満の重量を有する、ステップ；
前記切除された腫瘍組織を消化して、分離された腫瘍細胞を得るステップ；
前記切除された腫瘍細胞を免疫不全の動物に移植するステップ；
前記腫瘍細胞を前記動物において増殖させて、広がった腫瘍組織を得るステップ；
前記広がった腫瘍組織を前記動物から採取して、採取された腫瘍細胞を得るステップであって、前記採取された腫瘍組織が少なくとも約３．５グラムの重量を有する、ステップ；
前記採取された腫瘍細胞にある線量のガンマ線を照射して、前記細胞を非腫瘍原性にするステップ；及び
前記非腫瘍原性の腫瘍細胞を薬学的に許容される注射用担体と組み合わせて、少なくとも約１０７個の腫瘍細胞を含有する注射可能な用量を調製するステップ；
【請求項２】
広がった細胞が、患者の固形腫瘍の腫瘍細胞と少なくとも８５％の配列相同性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
注射可能な用量が、少なくとも８０％の生存能を有する腫瘍細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
切除された腫瘍組織を酵素で消化して、分離された腫瘍細胞を得るステップと、前記分離された腫瘍細胞を混合して均一な懸濁液を形成するステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
採取された腫瘍組織を消化して、分離された採取された腫瘍細胞を得るステップと、前記分離された採取された腫瘍細胞を混合して均一な懸濁液を形成するステップとをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
動物に移植された腫瘍細胞が、患者の固形腫瘍の約９５〜１００重量％を構成する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
動物から採取された腫瘍細胞が、広がった腫瘍組織の約９５〜１００重量％を構成する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
採取された腫瘍組織を第２の免疫不全の動物に移植するステップと、前記腫瘍組織を前記第２の動物において増殖させるステップと、前記増殖させた腫瘍組織を前記第２の動物から採取して、少なくとも約１０７個の腫瘍細胞を含有する注射可能な用量を調製するステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
動物が、ラットである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
動物が、ナチュラルキラー細胞活性を減少させる処置を受けている又は重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）を有する胸腺欠損ヌードマウスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
移植された組織が、約３．５〜４ｇの重量になると採取される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
採取された腫瘍を、分離前に、細胞傷害性を最小限に抑えつつ抗菌活性をもたらす濃度及び時間で殺菌性溶液を用いて処理するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
採取された細胞の抗原プロファイルを、ＲＮＡシークエンシングにより特徴付けて、患者の腫瘍の不均一性が保存されていることを確認するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
採取された細胞に、微生物及び腫瘍原性を不活性化し細胞生存能を保存するのに十分な量の線量のガンマ線を照射して、滅菌した、非腫瘍原性で、かつ免疫原性の腫瘍細胞を得るステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
以下のステップを含む、必要とするがん患者において免疫応答を誘発して転移の再発を予防するための方法。
がん患者から固形腫瘍を切除して、前記患者の固形腫瘍組織の少なくとも約９５％を得るステップであって、前記切除された腫瘍組織が約３．５グラム未満の重量を有する、ステップ；
前記切除された腫瘍組織を消化して、分離された腫瘍細胞を得るステップ；
前記腫瘍細胞を免疫不全の動物に移植するステップ；
前記腫瘍細胞を前記動物において増殖させて、広がった腫瘍組織を得るステップ；
前記動物から、前記広がった腫瘍組織を採取するステップであって、前記採取された腫瘍組織が少なくとも約３．５グラムの重量を有する、ステップ；
前記採取された腫瘍細胞にある線量のガンマ線を照射して、前記細胞を非腫瘍原性にするステップ；
前記非腫瘍原性の腫瘍細胞を薬学的に許容される注射用担体と組み合わせて、前記患者の腫瘍の細胞と少なくとも８５％の配列相同性を有する少なくとも約１０７個の腫瘍細胞を含有する注射可能な用量を調製するステップ；及び
前記患者に前記注射可能な用量を投与して、前記がんの再発に対して免疫原性応答を誘発するステップ；
【請求項１６】
採取された腫瘍細胞を薬学的に許容される注射用担体と組み合わせて、患者の切除された腫瘍と少なくとも８５％の配列相同性を有する少なくとも約１０７個の分離された腫瘍細胞をそれぞれが含有する少なくとも４つの注射可能な用量を調製するステップと、
前記がんの再発に対して免疫応答を誘発するのに十分な治療レジメンにおいて前記少なくとも４つの用量のそれぞれを投与するステップと
をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
採取された腫瘍細胞が、患者の腫瘍の細胞と少なくとも９５％の配列相同性を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
１又は２以上の用量と共にアジュバンド又は免疫刺激薬を投与するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
動物に移植された腫瘍が、切除された固形腫瘍の約９５〜１００重量％を構成し、採取された腫瘍組織が、広がった腫瘍組織の約９５〜１００重量％を構成する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
腫瘍細胞に約１５００００〜２０００００ｒａｄの線量のガンマ線を照射して、前記腫瘍細胞を滅菌し、かつ非腫瘍原性にするステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
必要とする患者がステージIII又はそれよりも早期のがんを有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
必要とする患者がステージII又はそれよりも早期のがんを有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
患者が結腸がん、腎臓がん、黒色腫がん、卵巣がん、及び乳がんからなる群から選択されるがんを有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
患者が結腸がんを有し、切除が結腸内視鏡検査中に実施される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
切除された腫瘍組織を、界面活性剤を含有する洗浄液で洗浄するステップと、
前記切除された腫瘍組織を殺菌剤で処理して、組織の微生物汚染を減少させるステップと、
前記腫瘍組織を、少なくとも１つの抗生物質及び抗真菌薬の存在下で、分離酵素で消化して少なくとも約１０７個の分離された腫瘍細胞を得るステップと
をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
約３．５ｇ未満の質量を有する固形腫瘍を切除する手術後に患者に投与するための全細胞自己抗がんワクチン組成物であって、
前記切除された腫瘍の細胞と少なくとも８５％の配列相同性を有する少なくとも約１０７個の生存可能な非腫瘍原性の腫瘍細胞、及び
薬学的に許容される注射用担体
を含み、前記患者に皮内注射を通じて投与される場合に免疫原性応答を引き起こす、前記全細胞自己抗がんワクチン組成物。
【請求項２７】
切除された腫瘍の細胞と少なくとも８５％の配列相同性を有する少なくとも１０７個の生存可能な非腫瘍原性の腫瘍細胞をそれぞれが含有する少なくとも４つの用量を含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
ワクチンが、切除された腫瘍の細胞と少なくとも８５％の配列相同性を有する少なくとも１０８個の生存可能な非腫瘍原性の腫瘍細胞を含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２９】
ワクチンの腫瘍細胞が、患者の原発腫瘍細胞と少なくとも９５％の配列相同性を有する、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３０】
ワクチンにおける生存可能な腫瘍細胞が、滅菌したものであり、非腫瘍原性であり、かつ少なくとも８０％の生存能を有する、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３１】
以下のステップを含む、少なくとも約１０７個の生存可能な非腫瘍原性の腫瘍細胞を含有する注射可能な自己抗腫瘍ワクチンを製造する方法。
がん患者から固形腫瘍を切除して、前記患者の固形腫瘍組織の少なくとも９５％を得るステップであって、前記切除された腫瘍組織が３．５グラムを超える重量を有する、ステップ；
前記切除された腫瘍組織のすべてを酵素で消化して分離された腫瘍細胞を得るステップ；
前記分離された腫瘍細胞を混合して不均一な細胞の均一な懸濁液を調製するステップであって、前記懸濁液のいずれのアリコートも前記患者の固形腫瘍由来の抗原材料の総数を含有している、ステップ；
腫瘍細胞の前記均一な懸濁液にある線量のガンマ線を照射して、前記細胞を非腫瘍原性にするステップ；及び
前記非腫瘍原性の腫瘍細胞を薬学的に許容される注射用担体と組み合わせて少なくとも約１０７個の腫瘍細胞を含有する注射可能な用量を調製するステップ；
【請求項３２】
各用量中の非腫瘍原性細胞が、患者の腫瘍細胞と少なくとも９８％の配列相同性を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
細胞の抗原プロファイルを特徴付けて、当初の腫瘍不均一性が保存されていることを確かめるステップをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
細胞に、微生物及び腫瘍原性を不活性化し細胞生存能を保存するのに十分な量の線量のガンマ線を照射して、滅菌した、非腫瘍原性で、かつ免疫原性の腫瘍細胞を得るステップをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
免疫応答を誘発して必要とするがん患者において転移の再発を予防する方法であって、請求項３１に記載の注射可能な用量を患者に投与して、前記がんの再発に対する免疫応答を誘発するステップを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個別化療法のための自己がんワクチン及び免疫原性で代謝的に活性であるが非腫瘍原性の細胞を含有する注射可能なワクチン用量を作成し利用するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Finke et al.による２００７年の評論、Vaccine 2007; 25(Suppl 2):B97-109; PMID:17916465は、別個の実体としての能動免疫療法「がんワクチン」を、免疫刺激薬又はモノクローナル抗体を用いる受動免疫療法と区別した。この分析は、所期の研究対象集団を使用して最適の標的を発現している腫瘍の割合とそれぞれの腫瘍内で前記最適の標的を発現している細胞の割合を評価することが重要であることを示していた。筆者らは、腫瘍内及び異なる腫瘍間で意味のある共通性を見つけることができる、すなわち、腫瘍間及び腫瘍内抗原相同性を特徴付け活用することができるという考えで、適切な抗原発見に焦点を合わせていた。
【０００３】
Wood et al., "The Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers," Science 2007は、「ヒト腫瘍にはどれくらいの数の遺伝子が変異しているのか」を問うた。この疑問に取り組むため、筆者らは１８１９１個のヒト遺伝子から２０８５７個の転写物の配列を分析した。典型的な乳がん又は結腸直腸がんでは、アミノ酸変化をもたらす約８０個のＤＮＡ変異が存在する。機能とは無関係に、これらの変異タンパク質はすべてが腫瘍特異的抗原の候補を表している。なぜならば、これらの変異タンパク質は、免疫系が「自己」としてすでに覚えた個人の遺伝的青写真との意味のある違いを表しているからである。乳がん及び結腸直腸がんにおける変異遺伝子の数は類似していたが、特定の遺伝子及び変異の種類は全く異なっていた。個人の腫瘍中のおよそ８０個の変異のなかでも、これらの約３個のみが所与の腫瘍集団の間で共通であるか又は意味があるように表されていた。よりいっそう重要なことに、これら３個の変異が相当数の腫瘍で同時に存在することが見出される確率は、著しく低いことである。
【０００４】
したがって、悪性疾患に対する高度に効果的な予防的又は治療的免疫応答は適応性のある系を必要とする。前操作された同種異系細胞又は少数の「既製の」共通抗原に頼っているいかなる系を用いてもこれを達成できる可能性はない。大きながん多様性に取り組むことができる組成物及び治療方法が必要とされている。
【０００５】
これらの結果を明らかにしたシークエンシング技術は比較的新しいが、現象学的データにより腫瘍不均一性が治療に対する重大な障害であったことが実証されたのはずっと以前のことであった。1977年、Fidler et al., Science, 197:4306 893-895では、移植された腫瘍中に表現型の不均一性を発見したことが報告された。悪性黒色腫細胞の親培養物からインビトロで誘導されたクローンは、同一遺伝子マウスの肺において転移コロニーを生産するその能力が大きく異なっていた。
【０００６】
その間、本発明者及び同僚らによる研究（Hanna MG Jr, et al., Cancer Res 38:204 (1978); Hanna M.G. Jr., et al., Immunotherapy of Human Cancer, Raven Press (1978), pp 11-129; Hanna M.G. Jr. et al., Immunobiology and Immunotherapy of Cancer, W.D. Terry, Y. Yamamura, eds., Elsevier/North Holland (1979), pp 331-350; and Hanna M.G. Jr., et al., Cancer Immunol Immunother, 7: 165 (1979)）では、自然免疫系には、ある種の制限はあるが、腫瘍不均一性を包含しそれと戦う適応潜在力があることが確定された。これらの研究はＬ１０モルモットで実施されたが、免疫系を、固形腫瘍の外科的切除後に全身腫瘍量を制御するように教育することができることを実証した。
【０００７】
免疫系は絶えず、一連の致命的な外来病原体、ウイルス及びタンパク質を防御している。感染性疾患に対するワクチン接種は現代医学の最も重要な進歩の１つを表していることに疑いの余地はほとんどない。しかし、この成功には、免疫系を極めて特異的なやり方で訓練した技術の進歩が必要であった。最も効果的なワクチンは、長い期間安定でありめったに抗原性変化を示さない感染病原体を標的にする。したがって、非常に大きな所与の疾患に取り組む単一の産物を設計し広く配置することができる。それとは反対に、インフルエンザ、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ及びがんは、類似する単独療法に抵抗してきた高度に適応性のある実体であるために、より困難な難問を表している。
【０００８】
自己がんワクチンは、悪性疾患と戦うための免疫学的訓練の次の進化を表している。しかし、この領域での前進に対する大きな障害は、適切な抗腫瘍応答を誘発するのに十分なワクチン接種材料の欠如である。多くのがんでは、患者の原発腫瘍は小さすぎて、効果的な免疫療法応答を起こすことができるワクチンを製造するのに十分な数の細胞を提供することができない場合が多い。
【０００９】
がんワクチンは大部分が、進行播種性疾患の治療に利用されてきた。我々は現在、進行腫瘍には、免疫抑制環境を創造することにより免疫検出を逃れる能力があることを理解している。免疫エフェクター細胞は進行腫瘍中で頻繁に見つかるが、「消耗した」表現型を示し機能的ではない。したがって、進行疾患を治療する均質なツールを利用する大多数のがんワクチンは臨床試験で失敗してきた。もっと効果的な取り組み方は、手術後に残っている最小残存疾患を標的にして、後に残った細胞を根絶することであり、この細胞は根絶しなければ増殖し続け最終的には患者を死亡させると考えられる。
【００１０】
微小転移又は腫瘍細胞播種は、疾患再発の原因になることが多いがん細胞の極端に小さな集合体である。不運にも、これらの細胞は、手術中は従来の方法による検出は可能ではない。これらの病変はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの分子技法により検出可能であり、ステージIIの結腸がん患者の５４％の局所リンパ節において発見されてきた。フォローアップ分析により、ＰＣＲ検出可能な転移のない患者は９１％の補正５年生存率であり、微小転移のある患者の５０％が同じ時期内に死亡する（ｐ＝０．０２）ことが確定された。これは取り組む必要のある重大な公衆衛生問題である。
【００１１】
外科的切除後の再発防止のために使用された最初の自己結腸がんワクチンはOncoVAX（登録商標）であった。ステージII（Ｔ３、Ｔ４Ａ＆Ｂ）の結腸がんと診断された患者のおよそ２５％〜３５％は、積極的な外科的切除にもかかわらず播種性疾患で再発することになる。化学療法薬を用いたアジュバンド治療では、これらの患者で著しい治療効果は示されていない。この患者特異的ワクチンは、ＦＤＡにより特別プロトコル査定（Special Protocol Assessment）及び優先承認審査制度（Fast Track designation）が承諾を受けた第III相試験において現在評価されているところである。OncoVAX（登録商標）は、患者の生きた代謝的に活性な腫瘍細胞を使用して手術に続く結腸がん再発の予防のために身体の免疫系を動員する自己ワクチンである。４回注射プロトコル（２回はアジュバンドTICE-BCGを用いて、２回はそれなしで）後、ステージIIの結腸がん患者の再発のリスクは３人に１人から１０人に１人に低下する。Vermorken et al., Lancet, 353(9150), 1999。
【００１２】
患者特異的ワクチンは、標準化学療法様式及び放射線様式に関して著しい改良である。現代の化学療法プロトコルで使用される細胞傷害性薬は、正常細胞とがん性細胞を積極的に区別しない。そのような方法は、ＤＮＡ架橋及び微小管停止機構に対する急速に分裂している細胞の固有の感受性に依拠している。しかし、急速に分裂している正常細胞は多細胞生物にとって極めて重要であり、これらのプロセスを停止することは免疫抑制及び他の衰弱性続発症を生じる。いわゆる標的薬（ベバシズマブ、セツキシマブなど）でさえ正常な恒常性のためにも利用されている発がん経路を阻害する。いずれの例でも、現在望まれるのは、がん専門医が患者を死亡させる前に腫瘍を死滅させるほどの毒を配達することである。これとは対照的に、自己がんワクチンは、もっぱらがん細胞上の腫瘍関連抗原に向けられる特異的免疫応答を誘発することにより標的化された効果を発揮することができる。OncoVAX（登録商標）を評価する最新の第III相試験では、ＢＣＧ治療中止を要求する重篤有害事象は極めてまれであった（８／１２８、６％）。Vermorken et al., Lancet, 353(9150), 1999。さらに、腫瘍特異的免疫が達成されると、免疫記憶が不断の監視を通じて患者を保護しており、これは化学療法薬では提供されない機構である。Weger de VA, et al., Clin Cancer Res(Feb.1,2012)によるOncoVAX（登録商標）のフォローアップ研究では、OncoVAX（登録商標）処置患者は初回治療の１５年後でも対照と比べて無再発生存が改善されていたことが実証されている。
【００１３】
大きな初期段階の容易に到達できる腫瘍は結腸直腸疾患の独特な特長である。必要なのは、自己ワクチン組成物を調製するのに量的に及び質的に十分な腫瘍材料を作成するための方法、並びに、既知の方法に従って有効なワクチンを調製するには固形腫瘍が小さすぎる患者を含む、あらゆる癌についてのがん免疫学的治療の関連する進歩である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Finke et al., Vaccine 2007; 25(Suppl 2):B97-109; PMID:17916465
【非特許文献２】Wood et al., "The Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers," Science 2007
【非特許文献３】Fidler et al., Science, 197:4306 893-895
【非特許文献４】Hanna MG Jr, et al., Cancer Res 38:204 (1978)
【非特許文献５】Hanna M.G. Jr., et al., Immunotherapy of Human Cancer, Raven Press (1978), pp 11-129
【非特許文献６】Hanna M.G. Jr. et al., Immunobiology and Immunotherapy of Cancer, W.D. Terry, Y. Yamamura, eds., Elsevier/North Holland (1979), pp 331-350
【非特許文献７】Hanna M.G. Jr., et al., Cancer Immunol Immunother, 7: 165 (1979)
【非特許文献８】Vermorken et al., Lancet, 353(9150), 1999
【非特許文献９】Weger de VA, et al., Clin Cancer Res(Feb.1,2012)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本開示は患者管理及びがん死亡における著しい進歩を提供する。OncoVAX（登録商標）を評価する初回試験中、我々は、最小残存病変に対する効果的な免疫応答のための４連続用量を作り出すためには少なくとも約３．５グラムの腫瘍が必要であったことを判定した。不運なことに、大半のがん（黒色腫、乳がんなど）は３．５グラムまで進行してしまうと、腫瘍量は多くの場合全身的で、免疫抑制性であり、したがって、以前の治療様式に感受性ではなくなる。
【００１６】
さらに、以前の研究では、がんワクチン開発のための抗原発見を妨げる内部及び間腫瘍不均一性の程度は著しく過小評価されていた。がんを均一疾患として処置することによって、がん免疫学者は、個人の独特の腫瘍の豊富な外来又は「非自己」成分を認識する患者の免疫系を適切に訓練してこなかった。本発明は、腫瘍不均一性をさらに包含し、他の種類のがん、とりわけ、他の方法では自己ワクチン又は関連する治療方法としての意味のある治療応答に十分な材料を作り出すその有用性を制限すると考えられる比較的サイズが小さい固形腫瘍にまでこの技術を拡張することにより、自己がんワクチン技術を増強する。
【００１７】
特にステージII／IIIの結腸がんにおいて、手術後の最小残存病変及び再発に対する効果的な免疫応答には典型的には、少なくとも２、３、好ましくは４又は５以上の注射可能な用量の自己非腫瘍原性細胞が必要とされることを我々は発見した。さらに、それぞれの用量は理想的には、免疫療法治療レジメン中に投与される少なくとも０．７〜１．３×１０７個の腫瘍細胞を含有するべきである。これまではこれが、有効な自己がんワクチンで治療することができるがん患者のタイプを物理的に制限してきた。本明細書で考察されている新たな技法に基づけば、比較的サイズが小さい（＜３．５グラム）の患者由来の原発腫瘍は、現在では、同時に供給源病変の不均一性を保存しつつ、効果的な免疫原性応答に十分な材料を提供するように広げられることができる。
【００１８】
一態様では、本発明は、少なくとも約１０７個の生存可能な非腫瘍原性の腫瘍細胞を含有する注射可能な自己抗腫瘍（neoplastic）ワクチンを製造する方法であって、がん患者から固形腫瘍を切除して、前記がん患者の固形腫瘍組織の少なくとも９５％を得るステップであって、前記切除された腫瘍組織が約３．５グラム未満の重量を有する、ステップと、前記切除された腫瘍組織を消化して、分離された腫瘍細胞を得るステップと、前記切除された腫瘍細胞を免疫不全の動物に移植するステップと、前記腫瘍細胞を前記動物において増殖させて、広がった（expanded）腫瘍組織を得るステップと、前記広がった腫瘍組織を前記動物から採取して、採取された腫瘍細胞を得るステップであって、前記採取された腫瘍組織（単独又は複数の移植から）が少なくとも約３．５グラムの重量を有する、ステップと、前記採取された腫瘍細胞にある線量のガンマ線を照射して、前記細胞を非腫瘍原性にするステップと、前記非腫瘍原性の細胞を薬学的に許容される注射用担体と組み合わせて、少なくとも約１０７個の腫瘍細胞を含有する注射可能な用量を調製するステップとによる、方法を提供する。一態様では、広がった細胞は、患者の固形腫瘍の腫瘍細胞と少なくとも８５％の配列相同性を有する。別の態様では、注射可能な用量は、少なくとも８０％の生存能を有する腫瘍細胞を含む。
【００１９】
別の場合の方法は、切除された腫瘍組織を酵素又は酵素の組合せで消化して、分離された腫瘍細胞を得るステップと、前記分離された腫瘍細胞を混合して均一な懸濁液を形成するステップとを含む。製造方法はさらに、採取された腫瘍組織を消化して、分離された採取された腫瘍細胞を得るステップと、前記分離された採取された腫瘍細胞を混合して均一な懸濁液を形成するステップとを含んでいてもよい。
【００２０】
一態様では、動物に移植される腫瘍細胞は、患者の固形腫瘍の９５〜１００重量％を構成する。別の態様では、動物から採取された腫瘍細胞は、広がった腫瘍組織の９５〜１００重量％を構成する。
【００２１】
自己ワクチン製造の方法は、採取された腫瘍組織を第２の免疫不全の動物に移植するステップと、前記第２の動物中で前記腫瘍組織を増殖させるステップと、前記第２の動物から前記増殖された腫瘍組織を採取して少なくとも約１０７個の腫瘍細胞を含有する注射可能な用量を調製するステップとをさらに含んでいてもよい。
【００２２】
一態様では、動物は、ラットである。別の態様では、動物は、ナチュラルキラー細胞活性を低下させる処置を受けている又は重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）を有していてもよい胸腺欠損ヌードマウスである。別の態様では、移植された組織は、約３．５〜４ｇの重量になると採取される。
【００２３】
自己ワクチン製造の方法は、採取された腫瘍を、分離前に、細胞傷害性を最小限に抑えつつ抗菌活性をもたらす濃度及び時間で殺菌性溶液を用いて処理するステップをさらに含んでもよい。別の態様では、方法は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡシークエンシング、フローサイトメトリー解析又はプロテオミクス解析により採取された細胞の抗原プロファイルを特徴付けて、患者の腫瘍の不均一性が保存されていることを確認するステップを含む。
【００２４】
さらに別の態様では、方法は、採取された細胞に、微生物を不活性化し、腫瘍原性を取り除き、細胞生存能を保存するのに十分な量の線量のガンマ線を照射して、滅菌した（sterile）、非腫瘍原性で、かつ免疫原性の腫瘍細胞を得るステップをさらに含む。
【００２５】
本発明は、必要とするがん患者において免疫応答を誘発して転移の再発を予防するための方法であって、がん患者から固形腫瘍を切除して、前記患者の固形腫瘍組織の少なくとも９５％を得るステップであって、前記切除された腫瘍組織が約３．５グラム未満の重量を有する、ステップと、前記切除された腫瘍組織を消化して、分離された腫瘍細胞を得るステップと、前記腫瘍細胞を免疫不全の動物に移植するステップと、前記腫瘍細胞を前記動物において増殖させて、広がった腫瘍組織を得るステップと、前記動物から、前記広がった腫瘍組織を採取するステップであって、前記採取された腫瘍組織が少なくとも約３．５グラムの重量を有する、ステップと、前記採取された腫瘍細胞にある線量のガンマ線を照射して、前記細胞を非腫瘍原性にするステップと、前記非腫瘍原性の腫瘍細胞を薬学的に許容される注射用担体と組み合わせて、前記患者の腫瘍の細胞と少なくとも８５％の配列相同性を有する少なくとも約１０７個の腫瘍細胞を含有する注射可能な用量を調製するステップと、前記患者に前記注射可能な用量を投与して、前記がんの再発に対して免疫原性応答を誘発するステップとを含む、方法をさらに提供する。
【００２６】
別の態様では、免疫応答を誘発するための方法は、採取された腫瘍細胞を薬学的に許容される注射用担体と組み合わせて、患者の切除された腫瘍と少なくとも８５％の配列相同性を有する少なくとも約１０７個の分離された腫瘍細胞をそれぞれが含有する少なくとも４つの注射可能な用量を調製するステップと、前記がんの再発に対して免疫応答を誘発するのに十分な治療レジメンにおいて前記少なくとも４つの用量のそれぞれを投与するステップとをさらに含む。好ましい態様では、前記採取された腫瘍細胞は前記患者の腫瘍の細胞と少なくとも９５％の配列相同性を有する。
【００２７】
別の態様では、治療方法は、１又は２以上の用量と共にアジュバンド又は免疫刺激薬を投与するステップをさらに含む。
【００２８】
免疫応答を誘発するための方法の一態様では、動物に移植された腫瘍は、切除された固形腫瘍の９５〜１００重量％を構成する、採取された腫瘍組織は、広がった腫瘍組織の９５〜１００重量％を構成する。
【００２９】
別の態様では、免疫応答を誘発するための方法は、腫瘍細胞に約１５００００〜２０００００ｒａｄの線量のガンマ線を照射して、前記腫瘍細胞を滅菌し、かつ非腫瘍原性にするステップをさらに含む。
【００３０】
一態様では、必要とする患者はステージIII又はそれよりも早期のがんを有する。別の態様では、必要とする患者はステージII又はそれよりも早期のがんを有する。本発明のある種の態様では、患者は、結腸がん、腎臓がん、黒色腫がん、頸部がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん若しくは乳がん、及びいかなる固形腫瘍亜型からなる群から選択されるがんを有する。
【００３１】
特定の態様では、患者は結腸がんを有し、組織切除は結腸内視鏡検査中に実施される。追加の態様では、方法は、切除された腫瘍組織を、界面活性剤を含有する溶液で洗浄するステップと、前記切除された腫瘍組織を殺菌剤で処理して、組織の微生物汚染を減少させるステップと、前記腫瘍組織を、少なくとも１つの抗生物質及び抗真菌薬の存在下で、分離酵素（複数可）で消化して少なくとも約１０７個の分離された腫瘍細胞を得るステップとを含む。
【００３２】
さらに、本発明は、約３．５ｇ未満の重量を有する固形腫瘍を切除する手術後に患者に投与するための全細胞自己抗がんワクチン組成物であって、切除された腫瘍の細胞と少なくとも８５％の配列相同性を有する少なくとも約１０７個の生存可能な非腫瘍原性の腫瘍細胞、及び薬学的に許容される注射用担体を含み、患者に皮内注射を通じて投与される場合に免疫原性応答を引き起こす、組成物をさらに提供する。別の態様では、組成物は、それぞれが切除された腫瘍の細胞と少なくとも８５％の配列相同性を有する少なくとも約１０７個の生存可能な非腫瘍原性の腫瘍細胞を含有する少なくとも４つの用量を含む。さらに別の態様では、ワクチンは、切除された腫瘍の細胞と少なくとも８５％の配列相同性を有する少なくとも１０８個の生存可能な非腫瘍原性の腫瘍細胞を含む。好ましい態様では、ワクチンの腫瘍細胞は、患者の原発腫瘍細胞と少なくとも９５％の配列相同性を有し、滅菌したものであり、非腫瘍原性であり、かつ少なくとも８０％の生存能を有する。
【００３３】
本発明は、少なくとも約１０７個の生存可能な非腫瘍原性の腫瘍細胞を含有する注射可能な自己抗腫瘍ワクチンを製造する方法であって、がん患者から固形腫瘍を切除して、前記患者の固形腫瘍組織の少なくとも９５％を得るステップであって、前記切除された腫瘍組織が３．５グラムよりも大きい重量を有する、ステップと、前記切除された腫瘍組織のすべてを酵素（複数可）で消化して分離された腫瘍細胞を得るステップと、前記分離された腫瘍細胞を混合して不均一な細胞の均一な懸濁液を調製するステップであって、前記懸濁液のいずれのアリコートも前記患者の固形腫瘍由来の抗原材料の総数を含有している、ステップと、腫瘍細胞の均一な懸濁液にある線量のガンマ線を照射して、前記細胞を非腫瘍原性にするステップと、前記非腫瘍原性の腫瘍細胞を薬学的に許容される注射用担体と組み合わせて、少なくとも約１０７個の腫瘍細胞を含有する注射可能な用量を調製するステップとを含む（異種移植なしで）、方法も提供する。別の態様では、それぞれの用量中の非腫瘍原性細胞は、患者の腫瘍細胞と少なくとも９８％の配列相同性を有する。別の態様では、方法は、細胞の抗原プロファイルを特徴付けて、元の腫瘍不均一性が保存されていることを確認するステップをさらに含む。
【００３４】
追加の態様に従えば、注射可能な自己抗腫瘍ワクチンを製造する方法（異種移植なしで）は、細胞に、微生物及び腫瘍原性を不活性化し細胞生存能を保存するのに十分な量の線量のガンマ線を照射して、滅菌した、非腫瘍原性で、かつ免疫原性の腫瘍細胞を得るステップを含む。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本開示に従ったそれぞれのワクチンは患者自身の原発腫瘍から構築されており、悪性固形腫瘍の遺伝的多様性又は不均一性に効果的に取り組む。したがって、効果的ながんワクチンを開発するために典型的に用いられる監視された抗原発見過程は、最終的には頑強な抗腫瘍応答を提供する患者自身の免疫系により無監視的に取り扱われる。
【００３６】
必要とする患者には、固形腫瘍の除去のための手術を受けたことがある又は受けることになっているいかなる動物又はヒトでも含まれる。本明細書で考察されている技法は、固形腫瘍が約３．０〜３．５グラム未満などのサイズが比較的小さい場合に特に有用である。外科的切除後、微小転移及び／又は再発の可能性は、本明細書に開示される自己ワクチンの投与に続いて妨げられる。本技法は、好ましくはステージIII又はそれよりも早期の疾患の、上皮由来の癌、並びに固形神経性腫瘍、及び内皮又は中皮由来のがんを含むあらゆる種類のがんに対して適用可能である。本明細書のワクチン組成物及び方法は、特にさらに進行した悪性疾患（ステージIII／IV）を治療するために、免疫チェックポイント阻害剤又は化学療法標準のケア医薬品と組み合わせてもよい。
【００３７】
自己腫瘍ワクチン及び特にOncoVAX（登録商標）療法は腫瘍関連抗原に対する患者の防御を活性化するように設計されており、自己腫瘍細胞の免疫原性をさらに増強することができる。OncoVAXは現在、外科的切除後のステージII及びIIIの結腸癌のアジュバンド治療のために患者ごとに個々に調製されている。前記産物には２つの異なる生物学的実体、すなわち（１）生存可能であるが非腫瘍原性の自己がん細胞及び（２）新鮮凍結ＢＣＧ細菌が含有されている。第１の２つのワクチン用量には、１．０×１０７個の生存可能で、代謝活性な非腫瘍原性で、かつ滅菌したがん細胞が、新鮮凍結ＢＣＧの１．０×１０７個のコロニー形成単位（ＣＦＵ）と混合されて、０．２〜０．４ｍｌの滅菌ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）の最終体積で含有されている。それに続く２つのワクチン用量は同様に調製されるが、ＢＣＧを添加しない。本発明は自己腫瘍ワクチンを、既知の自己がんワクチン療法には腫瘍が小さすぎる、結腸がん、腎臓がん、黒色腫がん、卵巣がん、前立腺がん、肺がん及び膵臓がん患者を含むがこれらに限定されないがん患者にまで拡張する。
【００３８】
本発明の一態様に従った自己ワクチンのそれぞれの用量は、少なくとも約０．７〜１．３×１０９、少なくとも０．７〜１．３×１０８、又は少なくとも０．７〜１．３×１０７個の生存可能で代謝活性な非腫瘍原性の腫瘍細胞を含有しており、それぞれの用量は、患者の原発腫瘍細胞と少なくとも約８５％、９０％、９５％又は９８〜１００％の配列相同性を有する。ある種の実施形態では、少なくとも３、４、５又は６以上の用量は治療期間にわたり投与される。本明細書で考察したように、ブースター用量は、一連の初期注射後の６か月などのそれに続く時期に、本発明のいくつかの態様において投与してもよい。現在開示されている方法により、原発腫瘍のサイズとは無関係に、それぞれのそのような用量は十分な数の腫瘍細胞を含み、以前のいかなる用量とも並びに原発腫瘍とも表現型的に、ゲノム的に、及び／若しくは抗原的に同じである又は類似している。
【００３９】
従来、自己ワクチン製造工程は典型的には、患者から切除されたおよそ最小限で１立方ｃｍの原発腫瘍、又は約３．５ｇの腫瘍細胞で開始した。腫瘍は不均一であり、腫瘍内で及び異なる患者によって抗原性、細胞充実度及び生存能が異なることがあるため、入手可能なできるだけ多くの腫瘍組織をさらなる処理のために収集して、不均一な細胞の均一な用量を調製するべきである。好ましくは、入手可能な腫瘍組織のすべてを分離し、均一な単細胞懸濁液にブレンド又は混合して、製造中はすべてのアリコートですべての腫瘍抗原及び細胞型を均等に維持する。以前の技法に従えば、約３．５ｇ以上の原発腫瘍のみがワクチン調製のために使用された。収集された腫瘍組織の重量が約３．５ｇ未満の場合には、病理医は、可能ならば、切除された原発腫瘍の追加の部分を得ることにより提供される腫瘍の量を増加させるだろう。しかし、腫瘍の重量が必要な最小限の約３．５ｇよりも著しく多い場合には、不均一性（heterogeneity）は必ずしも保存されず、得られた用量の自己細胞は、頑強な応答に免疫学的に必要な抗原の一部又はすべてを欠くことになる。
【００４０】
本発明の技法を使用すれば、３．５ｇよりも多く又は少なく、及びわずか約２．０、１．０、０．５、０．１ｇ又はそれよりも少なく含むいかなる質量の原発腫瘍及び腫瘍組織量でも現在では広げて、処理して免疫療法治療に効果的な自己ワクチンを調製することができる。
【００４１】
一態様では、したがって、本発明は、OncoVAX（登録商標）並びに他の方法では効果的なワクチン用量及び治療レジメンには小さすぎる患者の原発腫瘍由来の多数の他の自己ワクチンを作り使用するための方法を提供する。いくつかの一般的な癌は、診断時の腫瘍の制限されたサイズのために有効な自己ワクチンに処理するのは以前は受け入れられなかった。これらの癌には、比較的サイズが小さい、すなわち、３．５グラム未満（本明細書では「小腫瘍」と呼ぶ）の、腎臓癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、頸部癌、卵巣癌、初期悪性黒色腫、及び他の癌が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で考察されるように、多くのがんでは、このサイズの腫瘍は転移及び潜在的に致命的な再発には十分であるが、効果的用量及び治療レジメン用のワクチン産物を製造するための処理には一般には不十分である。
【００４２】
一態様では、本発明は、免疫不全の動物宿主において患者の腫瘍細胞を移植し拡大させることにより腫瘍細胞組成物及び自己ワクチンを提供する。典型的な宿主動物の通常の免疫選択過程なしで腫瘍細胞を拡大させると、自己腫瘍のゲノム多様性を利用して、自己ワクチン用量を単独で又はアジュバンド若しくは標準のケア化学療法と戦略的に組み合わせて使用することを通じて再発を予防しつつ、３．５グラム未満の固形腫瘍を生産する大多数の致命的癌にOncoVAX（登録商標）技術を適用することなどの自己ワクチンを拡張する手段を提供する。
【００４３】
本発明の一実施形態では、患者由来の細胞は分解され懸濁液に混合されて、組成物のいずれのアリコートもその他のアリコートを表し原発腫瘍の特定の生物学的特性（表現型、ゲノム又は抗原性）を反映するように、不均一な細胞の均一な混合物を作り出す。さらに、生着前及び生着後分離により、懸濁液のいかなるアリコートでも、ワクチン産物が増殖中にゲノム又は抗原性不均一性の変化を経験したことがないことを確証するために、いかなる数の生物学的分析過程（種特異的ＰＣＲ、マイクロアレイ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、全ゲノムディープシークエンシング、フローサイトメトリー解析等を含むが、これらに限定されない）によっても分析することが可能になる。
【００４４】
したがって、本発明に従ったワクチン産物は典型的には３．５ｇ未満の切除された固形腫瘍から調製され、こうして得られたワクチン産物は、生存可能で、非腫瘍原性で、かつ好ましくは滅菌した腫瘍細胞の総質量で利用可能であり、個々の用量、好ましくはそれぞれが少なくとも約０．７〜１．３×１０７個の生存可能で、非腫瘍原性で、かつ滅菌した腫瘍細胞を含有する少なくとも４つの注射可能な用量の調製が可能となる。それぞれの用量は、任意の形態の若しくは菌株のＢＣＧ、又は任意の適切な薬学的に許容される注射用担体などの任意の適切なアジュバンド、又は免疫刺激剤をさらに含有していてもよい。
【００４５】
特定の好ましい実施形態では、自己ワクチン産物には２つの異なる生物学的実体、すなわち（１）患者の原発腫瘍組織由来の動物宿主で増殖された生存可能な自己腫瘍細胞、及び（２）新鮮凍結ＢＣＧ細菌が含有されている。第１の、第２の又はそれに続くワクチン用量には、少なくとも約１．０×１０７個の生存可能で、代謝活性な非腫瘍原性で、滅菌した腫瘍細胞が、例えば、新鮮凍結ＢＣＧの１．０×１０７個のコロニー形成単位（ＣＦＵ）と混合されて、例えば、０．２〜０．４ｍｌの滅菌ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）の最終体積で含有されていてもよい。それに続く１、２又は３以上のワクチン用量は同様に調製されてもよいが、ＢＣＧを添加しない。前記用量は、制御された速度の冷凍方法に従って、凍結保存してもよい。いくつかの実施形態では、調製された患者用量は、適切な患者情報のラベルを貼った注射器に吸引される。次に、キャップ付き注射器は断熱容器に梱包されて、患者へのワクチンの皮内投与のための場所まで配達される。ワクチンは典型的には週３回の誘導ワクチン接種及び６か月追加免疫のレジメンを使用して、典型的には細胞を解凍して４時間以内に投与されるが、いかなる適切な投与量及び治療レジメンでも利用してよいし、本明細書の教唆を与えられた患者ケア提供者が決定してもよい。
【００４６】
腫瘍細胞は、外科的に除去され単細胞懸濁液に処理されている患者自身の固形腫瘍に最初は由来しており、前記懸濁液はその後凍結保存してもよい。滅菌メスを使用して、任意の大きさの腫瘍組織断片が典型的には１．５ｃｍ以上の断片に切断されて、輸送中の急冷及び養分可給性を促進する。腫瘍組織は製造工程中に消毒されることがあるので、腫瘍を１ｃｍよりも小さな断片に切断するのは避けるのが好ましい。
【００４７】
切除後、腫瘍組織は典型的には少なくとも１つの抗生物質及び抗真菌薬の存在下で、分離酵素（複数可）で消化して、分離された腫瘍細胞を得てもよい。腫瘍の分離は、例えば、結腸由来腫瘍に固有である内在性バイオバーデンを減少させる、例えば、レボフロキサシン、アンホテリシンＢ、プリマキシン（イミペネム及びシラスタチン）及び／又は硫酸ゲンタマイシンの存在下で実施してもよい。分離された腫瘍細胞の単細胞懸濁液は凍結させ、本明細書の教唆に従って、異種移植片としての拡大のための後の使用に向けて生存可能な形で回復させてもよい。一態様によれば、本明細書で考察されるように、異種移植前及び異種移植後生物学的分析品質管理のＲＮＡ−ｓｅｑ又は他の方法に十分なアリコート（例えば、全細胞懸濁液の約１〜５％未満などの）の細胞を除いて、原発の比較的小さな腫瘍由来のありとあらゆる細胞が異種移植のために利用される。
【００４８】
重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス動物宿主は、本発明の一態様において利用される。例えば、ヌードマウス、Ｒａｇ１及び／又はＲａｇ２マウス並びにこれらのマウスと交雑されているマウスなどの天然に生じることもある又は誘発されることもある遺伝子欠損の結果として欠損している動物を含む、他の種々の免疫不全マウス、ラット、齧歯類又は他の免疫不全の動物を使用してもよい。欠損は、例えば、組換えにおける遺伝子欠損、遺伝子欠損胸腺又は欠損Ｔ細胞受容体領域の結果としてであってもよい。誘発免疫不全は、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリンの投与、胸腺の除去、又は抗アシアロＧＭ１抗体治療を含むが、これに限定されない、ＮＫ活性を低下させる処置の結果としてであってもよい。種々のトランスジェニック免疫不全動物が現在では入手可能である又は既知の技法に従って開発することができる。理想的には、免疫不全動物はリンパ球の成熟を阻害する欠損を有する、特にＴ細胞受容体領域を再配置する能力に欠けているラット又はマウスである。一実施形態では、動物宿主はJackson Laboratory製のＮＳＧ、ＮＯＤ  ＳＣＩＤガンマ（００５５５７）マウスであるが、いかなる適切な免疫不全又は免疫不全の動物を使用してもよい。
【００４９】
適切な免疫不全動物には、Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maineから入手可能なＮＳＧ  ＮＯＤ  ＳＣＩＤガンマ、ＮＯＤ  ＳＣＩＤ、ＢＡＬＢ  ＳＣＩＤ、Ｂ６  Ｒａｇ、非近交系Ｎｕｄｅ及び近交系Ｎｕｄｅ、並びにCharles River Laboratories社, Hollister, Californiaから入手可能な胸腺欠損Ｎｕｄｅ、ＢＡＬＢ／ｃ  Ｎｕｄｅ、ＣＤ−１  Ｎｕｄｅ、Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ  ＳＣＩＤ（登録商標）Ｂｅｉｇｅ、Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ  ＳＣＩＤ（登録商標）、ＮＩＨ−ＩＩＩ  Ｎｕｄｅ、ＮＭＲＩ  Ｎｕｄｅ、ＮＯＤ  ＳＣＩＤ、ＮＵ／ＮＵ  Ｎｕｄｅ、ＯＴ  ＩＩマウス、ＲＮＵラット及びＳＨＣ（商標）マウスを含むがこれらに限定されない齧歯類、好ましくはラット及びマウスを含む。
【００５０】
消化された好ましくは均一で均質な細胞懸濁液由来の腫瘍異種移植片は、ステージII若しくはIIIのがん又は局所的に進行した若しくは転移性の疾患を有する動物及びヒト患者などの患者から外科的に除去された分離がん外植片の皮下埋め込みなどの移植により免疫不全動物において確立してもよい。腫瘍細胞の移植部位は、宿主動物の側腹部などの、血液供給が異種移植片に到達するのが可能になる任意の皮下又は他の部位中でよい。原発腫瘍由来の並びにリンパ節、肺、骨及び他の器官転移の部位由来の組織を使用して固形腫瘍異種移植片を確立してもよい。
【００５１】
確立した後は、異種移植片腫瘍は増殖し、さらなる使用のために重量及び体積が増強された原料物質を提供する。異種移植片は好ましくは、例えば、ヒトβグロビン発現により決定されるヒト表現型を保持し、ヒトがん特異的抗原を発現し、原発腫瘍を反映する増殖特徴を保持する。本発明のこの態様は、自己ワクチン製造用の数量の腫瘍細胞を作成するための方法を提供する。一実施形態では、結腸内視鏡検査患者由来の小さな結腸腫瘍を拡大するための方法は、分離懸濁液中のこれらの細胞をヌードＳＣＩＤ又は他の免疫不全動物に皮下移植するステップと、移植された材料を異種移植片として、再発又は類似の抗原プロファイルを有する追加の結腸病変から患者を保護する効果的な自己ワクチンの調製に十分な数の細胞にまで増殖させるステップとを含む。本明細書で考察されるように、次に異種移植片を採取し、さらなる処理のために細胞を消化することにより広がったヒトがん細胞が得られる。
【００５２】
皮下腫瘍は急速に増殖することができ、宿主動物は典型的には２〜６週間以内に屠殺される。１回目の異種移植では腫瘍材料を十分な重量で生産しない事象などでは、がん細胞の数をさらに増加する代替法も提供される。異種移植片は、追加の免疫不全動物における連続増殖によりさらに拡大させてもよく、十分な試料がゲノム、プロテオミクス又は抗原ドリフトの長期評価のために蓄えられる。
【００５３】
したがって、異種移植片腫瘍組織の単細胞懸濁液を使用して連続継代を通じて追加の免疫不全動物に播種してもよく、凍結させて一次ドナーにおける治療指標のためなどの後の使用のために生存可能な形で回復させてもよい。追加の動物における異種移植片腫瘍の連続継代を使用して、原発腫瘍に表現型的に、抗原的に及びさらに免疫学的に類似している又は同一であり、原発腫瘍のゲノム配列と少なくとも８５％の配列相同性を有するさらに大量の患者固形腫瘍細胞を入手してもよい。本発明は、ヌードＳＣＩＤマウス又は他の適切な免疫不全の動物宿主において複数継代を通じて安定ながん細胞表現型を保持するがん異種移植片を提供する。異種移植片腫瘍から採取された組織を使用して、ヒト又は動物患者腫瘍細胞の単細胞懸濁液を調製する。消化された異種移植片から調製された単細胞懸濁液は親腫瘍の生物学的特性も保持する。単細胞懸濁液を使用して、例えば、新たな皮下腫瘍を確立してもよい。したがって、本発明の方法は、採取された腫瘍組織を少なくとも第２の免疫不全の動物に移植するステップと、前記腫瘍組織を前記第２の動物において増殖させるステップと、前記第２の動物から、前記増殖させた腫瘍組織を採取するステップとを含む。腫瘍細胞は追加の免疫不全の動物において３〜５、〜９、若しくは〜１０までも又は１１回以上継代させてもよい。好ましい実施形態では、追加の免疫不全の動物への継代のための又はワクチン産物調製若しくは品質管理試験のためのその後に調製される単細胞懸濁液のアリコートは、患者の元の腫瘍の全抗原補体を含有するように、増殖させた腫瘍組織のすべてが採取される。
【００５４】
本発明の一態様では、宿主動物に移植される元の腫瘍細胞は、患者の固形腫瘍の約９５〜１００重量％、好ましくは約９８〜１００重量％を構成し、動物から採取された腫瘍細胞は、増殖された腫瘍組織の約９５〜１００重量％、好ましくは約９８〜１００重量％を構成する。一実施形態では、ワクチン製造のためのそれぞれの移植片（複数可）及び／又は採取された材料は、既存の腫瘍材料の約９９重量％を構成し、したがって約１％は品質管理目的で維持される。それぞれの播種又は連続継代、及び採取され拡大された腫瘍細胞のそれぞれの集合体は、好ましくは、それぞれのアリコート及びそれぞれの注射又は異種移植片が原発腫瘍の不均一な性質を表しているように、不均一な細胞の均一な単細胞懸濁液まで分離される。言い換えると、原発腫瘍の抗原不均一性は好ましくは、いかなる微小転移及び／又は再発に対しても頑強な免疫原性応答の発現のために患者が必要とする抗原の総数をワクチンが含有するように、工程のそれぞれのステップにおいて保存される。したがって、本発明は、混合され採取された腫瘍細胞のアリコートを少なくとも複数の免疫不全の動物に移植し、前記複数の動物において前記腫瘍組織を増殖させ、前記複数の動物から前記増殖された腫瘍組織を採取するための方法も提供し、それぞれの動物から採取される組織及びそこから調製されるワクチン産物は、原発腫瘍由来の細胞の総数に免疫学的に類似している又は同一である。
【００５５】
一態様では、原発腫瘍細胞は免疫不全の動物の皮膚下に移植される。腫瘍組織の移植は、動物の腎臓嚢下、動物の腹膜腔中、骨髄中、又は免疫不全動物において患者腫瘍の拡大を使用する自己全細胞腫瘍ワクチン調製に十分な腫瘍材料を作成するのに適した他のいかなる場所でもよい。
【００５６】
腫瘍細胞の量が本明細書で考察されたとおりに増加された後、異種移植片は切除され、分離され、ワクチン産物の調製及び自己全細胞ワクチン接種に使用される。採取された異種移植片（複数可）は界面活性剤を含有する生理溶液で洗浄してもよく、採取された腫瘍は、さらに消化し分離する前に、ヒト細胞に対する細胞傷害性を最小限に抑えつつ抗菌活性をもたらす濃度及び期間で殺菌性溶液を用いて洗浄してもよい。次に、広がった腫瘍組織は、典型的には少なくとも１つの抗生物質及び抗真菌薬の存在下で、分離酵素（複数可）で消化されて、さらに処理するために分離された腫瘍細胞の懸濁液を入手する。
【００５７】
次に、細胞懸濁液を、約１５００００〜２０００００ｒａｄなどの線量のガンマ線に曝露して細胞を非腫瘍原性にしてもよい。細胞を凍結している間の放射線照射が好ましいが、必ずしも適用しなくてもよい。米国特許第５４８４５９６号（「’５９６特許」）は、切除可能な固形腫瘍を有するヒト結腸がん患者を治療して再発及び転移の形成を阻害するための方法を提供している。’５９６特許は、ヒトがん患者から結腸腫瘍組織を外科的に除去し、前記腫瘍組織を処理して腫瘍細胞を入手し、前記腫瘍細胞を放射線照射して生存可能であるが非腫瘍原性にし、生存可能であるが非腫瘍原性の腫瘍細胞を含むワクチン組成物を調製し、がん患者の免疫系が手術から回復した後前記ワクチンを皮内に注射することに言及する。同じ方法を使用して、本明細書に教唆されるとおりに採取された異種移植片由来の広がった腫瘍細胞を処理してもよいが、そのような方法は結腸腫瘍に限定されていない。’５９６特許は参照によりその全体を本明細書に明示的に組み込まれる。
【００５８】
大腸内の結腸腫瘍の起源のために、’５９６特許の工程により生産されるがんワクチンは滅菌したものではない。ワクチン目的のための効果的な免疫原性細胞調製物を入手するためには、腫瘍細胞は生存可能で代謝的に活性であるべきである。したがって、細胞を滅菌するいかなる処理も、免疫化及び臨床効果に必要な無傷の生細胞という基本的生物学的特徴を過度に損ねてはならない。
【００５９】
米国特許第７６２８９９６号（「’９９６特許」）は、腫瘍細胞の免疫原性特性に実質的な変化を被ることなく、安全で滅菌した腫瘍細胞組成物を達成するための方法を提供する。これらの目標は必ずしも両立するわけではない。なぜならば、滅菌は微生物感染を不活性化することができるが、哺乳動物細胞に負の影響を及ぼすこともあり、強力な消毒薬は微生物には効果的であるが、十分な用量では、哺乳動物細胞を害することもあるからである。放射線照射は微生物を不活性にすることができるが、過剰な照射は哺乳動物細胞の免疫原性及びそれに続く生物学的特性を実質的に改変することもある。
【００６０】
’９９６特許は、腫瘍細胞からバイオバーデンを除去し不活性化して、治療及び予防産物の生産のために生存可能で免疫原性のままである滅菌した細胞組成物を入手するための化学的及び生物学的手段の組合せに言及している。この滅菌処理法は多種多様な細胞型に有用であるが、この処理法は、例として、’５９６特許の自己結腸がんワクチンを含む、がんワクチンの調製のための固形腫瘍組織を滅菌するのに特に有用であると見なされている。’９９６特許は参照によりその全体を本明細書に明示的に組み込まれる。
【００６１】
本発明は、がんを治療し、典型的には、４、５又は６用量、本明細書に示される量でＢＣＧなどの免疫アジュバンドを含む１又は２以上のこれら用量でもよいレジメンにおいて、広がった腫瘍細胞を薬学的に許容される注射用担体と組み合わせて注射可能な内皮用量を調製することにより調製され、それぞれが好ましくは、トリパンブルー排除により測定された場合少なくとも８０％の生存能を有する少なくとも約１０７個の分離腫瘍細胞を含有し、したがって、所望の特定の患者に注射した場合免疫原性応答を誘発する、固形腫瘍に由来する十分な量の生存可能で代謝的に活性であるが非腫瘍原性のがん細胞を含有する１又は２以上の用量の滅菌ワクチンを投与することにより、一次疾患の再発及び／又は転移を予防する方法をさらに提供する。
【００６２】
本発明の上記及び他の態様は、以下の非限定的な実施例により説明される。
【実施例１】
【００６３】
患者原発腫瘍細胞の獲得
前生産は自己ワクチンの製造のための原料物質（腫瘍）の獲得を含み、したがって、ワクチン生産施設以外での腫瘍の取り扱いすべてを含む。これには典型的には、外科的腫瘍切除、分離、病理学的処理及び製造施設への腫瘍の輸送が含まれる。手術室及び病理学人員は、収集及び腫瘍処理に関する特定のプロトコルに従って訓練されるべきである。腫瘍含有結腸検体の切除後、切除された結腸は滅菌袋又は深皿に置く。切除された結腸は手術室内で処理されることになる。切除された結腸は切り開き、標準手術手順に従って洗浄する。病理学者は腫瘍の切開を実施して、その後腫瘍は生産施設への輸送のために準備する。輸送では、腫瘍は、ゲンタマイシンを含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ／Ｇ）を含有する腫瘍輸送ボトルに入れてもよい。腫瘍輸送ボトルは温度検層装置及び保冷剤を含有する輸送箱に梱包して、特定の輸送温度を確実に維持してもよい。
【００６４】
生産工程中、好ましくは、処理を続けるためにいくつかの受け入れ基準を満たすべきである。最小腫瘍重量（約３．５ｇ）は異種移植なしで腫瘍処理を開始するかどうかを判定することになる。その場合、原発腫瘍の総抗原定員を含有するワクチンを入手するため、３．５ｇよりも大きな全腫瘍を収集し分離して、不均一な細胞の均一な単細胞懸濁液を調製する。生物学的物質の受け入れ基準には、腫瘍細胞の数及び生存能、並びに腫瘍細胞の同一性及び効力が含まれる。
【００６５】
腫瘍はＨＢＳＳ／Ｇを使用して洗浄し、滅菌皿に移し、そこで腫瘍由来の無関係な組織は除去して破棄する。次に、腫瘍は消毒剤を含有するボトルに移す。この処理後、消毒剤は除去し腫瘍はＨＢＳＳ／Ｇで洗浄する。
【００６６】
次に、腫瘍をトリミングして小片にし、それを撹拌した分離フラスコに移す。次に、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）及びコラゲナーゼを含有する温かい分離媒体を添加する。フラスコは３６〜３８℃の温度で３５〜４５分間インキュベートする。分離後、細胞を含有する上澄みは収集し、その後遠心管内に濾過する。細胞は遠心分離し、細胞ペレットはＨＢＳＳ／Ｇ中に再懸濁する。残っている腫瘍断片に追加の分離媒体を添加し、分離手順を繰り返し総数で３つの分離物とする。前記３つの分離物由来の細胞は１つの遠心管にプールし２〜８℃で再び遠心分離する。細胞ペレットは凍結保護媒体中に再懸濁し、体積は得られた生存可能な腫瘍細胞の数及び所望の細胞密度／バイアルに基づいている。制御された速度での凍結のために最小で９個最大で１７個までのバイアルを調製する。この凍結サイクルの間、細胞懸濁液は＋４℃から−９０℃まで凍結させ、−４０℃の温度に到達するまでは１℃／分の減少速度である。この手順により細胞生存能の凍結保存が成功する。次に、凍結した腫瘍細胞は、−１１０℃以下の温度で液体窒素の気相中制御された条件下で隔離して保存する。
【００６７】
移植のための原発腫瘍細胞の調製
凍結保存された細胞は従来の方法に従って解凍する。解凍した凍結保存された細胞及び新たに作成された腫瘍懸濁液は、特定病原体除去の動物施設への輸送中は氷上に維持される。注射に先立って、懸濁細胞の十分なアリコートを採取し、ゲノム不均一性及び／又は抗原不均一性が工程のすべてのステップを通じて保存されていたことを確かめる異種移植前分析及び異種移植後分析のために保存する。腫瘍から作成したすべてのバイアルは注射用に使用し、バイアルごとに、細胞は２０ゲージ針を通して１．０〜１０ｍｌ注射器中に吸引する。２０ゲージ針は免疫不全のマウスへの注射のために２７〜２５ゲージ針で置き換える。腫瘍細胞はMatrigel又は類似のタンパク質マトリックスと混合して、移植中又は移植後の異種移植生着率を増強してもよい。
【００６８】
免疫不全の動物への腫瘍細胞の移植
免疫不全の動物（例えば、ラット）は特定病原体除去条件下に維持し、ＩＡＣＵＣ指針に従って使用する。異種移植に先立って、動物は脊椎の両側で背外側に７０％エタノールを使用して消毒する。動物ごとに、１、２又は３以上の１００μｌの腫瘍懸濁液を、およそ１．５センチメートル互いに離して両側の側面横腹に皮下注射する。動物は毎日少なくとも１回モニターする。
【００６９】
免疫不全の動物への腫瘍細胞の腹腔内移植：皮下注射の代替案として、免疫不全の動物への腫瘍細胞の腹腔内注射も使用する。動物は７０％エタノールを使用して腹側で消毒される。動物ごとに、１ｍｌの腫瘍懸濁液を腹腔内に注射する。動物は毎日少なくとも１回モニターする。
【００７０】
腫瘍細胞の増殖及び採取
２〜８週間後、腫瘍はキャリパー測定を用いた腫瘍体積評価により評価した場合、ＩＲＢ承認及びＩＡＣＵＣ指針に従って採取するのに十分な大きさになる。異種移植された動物は屠殺し、７０％エタノールに浸す又はこれで洗浄し、腫瘍は無菌的に、腫瘍組織が動物の皮膚の外側に触れることなく除去する。次に、腫瘍は硬度について評価し、組織を切断し微細格子を通して静かに圧力をかけることにより又は上記と同じ分離プロトコルを適用することにより、ばらばらに裂いて単細胞懸濁液にする。次に、同じ原発腫瘍由来のすべての腫瘍細胞はＨＢＳＳ／Ｇに再懸濁させて、１つの適切な滅菌容器にプールし、検体採取前に静かに混合し、計数し、細胞生存能をトリパンブルー排除試験により評価する。次に、細胞はＨＢＳＳ／Ｇを使用する最終洗浄のために遠心分離し、ＨＢＳＳに再懸濁させてｍｌあたり１０％の生存細胞の最終細胞濃度に到達させる。品質管理検査のためにこの時点で異種移植後試料を採取する。次に、懸濁液は１ｍｌアリコートで滅菌凍結保存バイアルに移し、その後、さらに使用するまで凍結保存する。
【００７１】
それに続く使用時、すべての腫瘍細胞を使用して用量あたり少なくとも１０７個の細胞を含有するワクチン産物を調製する又は新たなセットの免疫不全の動物に注射して増殖させて追加の腫瘍細胞を作成して続いて上記のとおりに採取する。
【００７２】
放射線照射
増殖させ採取した腫瘍細胞のバイアルを貯蔵場所から取り出し、滅菌し、ガンマ放射線源を使用して照射し（２０００００ｒａｄ）、腫瘍細胞を滅菌して、非腫瘍原性にする。１つのバイアルは生物学的産物の品質管理試験に使用する。８個のバイアルは４患者用量を含み、すべての放出試験（外見、腫瘍細胞数及び生存能、純度、同一性、効力、滅菌、並びにエンドトキシン含有量）が成功裏に完了するまで液体窒素冷凍室の別々の隔離域で維持する。有資格者による生物学的産物の放出時、患者用量は最初の２回ワクチン接種のためのＢＣＧ及びすべての適用書類と共に、処方のため患者にとって最寄りの指定され事前承認された薬局又は研究所に輸送される。
【００７３】
生産後及び治療レジメン
ワクチン調製のため、２バイアルの滅菌した、非腫瘍原性の腫瘍細胞及び必要に応じて１バイアルの新鮮な凍結ＢＣＧを貯蔵場所から取り出してドライアイス上に梱包する。前記バイアルにはワクチン処方手順が添付されており、調合のために薬局へ送られる。細胞は３６〜３８℃で熱ブロックセット上で解凍する。最初の２つの注射はＢＣＧを細胞懸濁液に添加している。用量は１ｍＬ注射器に吸引し、冷ブロック上に梱包し、その後患者への投与のために医師又は看護師のところへ輸送される。処方された用量の満了は４時間であり細胞の解凍から開始する。
【００７４】
最初の３回のワクチン接種は、手術の２８〜３５日後に始まって、週１回の間隔で皮内経路により施される。最初の２回の注射のそれぞれは、ＢＣＧ（１．０×１０７ＣＦＵ）と混合した解凍され照射された腫瘍細胞（１．０×１０７±０．３×１０７）を含む。第３の注射は、照射された腫瘍細胞を含有するがＢＣＧは非含有ある。第４及び最終ワクチン接種も、照射された腫瘍細胞を含有するがＢＣＧは非含有であり、手術の６か月後（ステージIIの結腸がん患者）又は化学療法の完了の１か月後（ステージIIIの結腸がん患者）に行われる。
【００７５】
品質管理試験
腫瘍細胞列挙：生存可能腫瘍細胞、生存不能腫瘍細胞、及び生存可能非腫瘍細胞の列挙のための顕微鏡試験
【００７６】
同一性アッセイ：腫瘍特異的ヒトモノクローナル抗体８８ＢＶ５９を使用して腺癌細胞の存在を判定するための蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）
【００７７】
マトリックス関連効力及び同一性アッセイ：腫瘍関連抗原であるＥｐＣＡＭ及びＣＥＡに反応性である腫瘍細胞を計数するためのＦＡＣＳ
【００７８】
純度アッセイ：９０％以上の生細胞が生物学的産物中の腫瘍細胞及び／又はリンパ球であることを示すためのＦＡＣＳ
【００７９】
無菌性：生物学的物質及び生物学的産物中の微生物及びカビ汚染の存在を検出するための試験
【００８０】
エンドトキシンアッセイ：生物学的産物中のエンドトキシンレベルを判定するための試験
【実施例２】
【００８１】
ＤＴＨ応答測定
第I／II相試験（ＡＳＩ−２００２−０１）を行って、結腸のステージII／III原発腺癌を有する患者においてＢＣＧと混合した現在の（増殖させていない）滅菌した自己腫瘍細胞ワクチンの安全性及び免疫原性を評価した。さらに、この試験は滅菌ワクチン製剤に対する免疫応答が、以前の臨床試験で使用された未滅菌製剤の免疫応答に等しいことを実証することを目的とした。
【００８２】
主要エンドポイント（ＢＣＧを除いた第３のワクチン後４８時間で測定したＤＴＨ応答）を満たすため、患者は少なくとも５ｍｍの硬結を達成した場合にはワクチンに対して陽性応答を有すると見なされた。局所的、限定的、及び全身的有害事象はそれぞれのワクチン注射後にモニターされ、理学的検査、活動状態、差次的血液化学での全血球計算、ＣＥＡ、及び尿検査を含む完全安全評価は手術の３及び６か月後並びに第４回のワクチン接種の９０日後に行われた。
【００８３】
ＡＳＩ−２００２−０１において治療を受け評価された１５患者すべてが、ＤＴＨ反応＞５ｍｍの免疫応答を有していた。さらに、滅菌ワクチンで治療した１５患者のうちの１３（８７％）が少なくとも１０ｍｍのＤＴＨ反応を有していた。未滅菌製剤を利用した以前の試験（８７０１）では、ワクチンは１２８患者に投与され、そのうちの８７％が少なくとも１０ｍｍのＤＴＨ反応を経験した。しかし、非特異的紅斑の程度は滅菌製剤で劇的に減少した。紅斑は体液性応答であり、その減少はおそらく現在の滅菌製剤からのバイオバーデンの除去を反映している。
【００８４】
したがって、滅菌ワクチンに対する免疫応答は以前の未滅菌産物の免疫応答におそらく匹敵する。その結果により、この免疫化に対して達成された免疫原性応答は腫瘍関連抗原に向けられており、前記産物に固有の汚染には向けられていないことが示されている。
【００８５】
第３及び第４のワクチンは、腫瘍細胞単独からなる（ＢＣＧなし）が、ＤＴＨを測定する機会を提供する。ＤＴＨ応答は最初のワクチン接種により授けられる細胞媒介免疫の程度を示すものである。ワクチン注射の２日後、注射部位での硬結は、硬結を測定するための標準法であるペン方式により２つの垂直径で測定される。
【実施例３】
【００８６】
OncoVAX（登録商標）同一性アッセイ
本実施例は、ヌードマウスにおける増殖後の、ＣＤ６６陽性腫瘍細胞のうちフローサイトメトリーで８８ＢＶ５９陽性でもある割合を確認するための方法を記述する。
【００８７】
材料及び設備
材料：試験管１２×７５ｍｍブルー、フィルター付きの滅菌ピペットチップ１００μｌ、フィルター付きの滅菌ピペットチップ１０００μｌ、OncoVAX（登録商標）同一性５ＥＸ−ＩｇＧ抗体、OncoVAX（登録商標）同一性５ＥＸ−８８ＢＶ５９抗体、OncoVAX（登録商標）同一性ＣＤ６６−ＰＥ抗体、固定化／透過処理溶液キット、フェノールレッドなしのHB（１×）；５００ｍｌ、及び精製水
【００８８】
設備：Beckman Coulter FC500フローサイトメータ、Eppendorfモデル5415D遠心分離機、冷蔵庫GKx7080、デジタルタイマー、可変体積ピペッタ
【００８９】
手順：
試料調製
検体ごとに、一組の２（２）チューブを調製する。チューブはＩｇＧ３又は８８ＢＶ５９と標識する。分析する試料は確認される（ＳＵＢ／ＰＲＤ）。第１のチューブはヒト５−ＥＸ  ＩｇＧ３及び抗ＣＤ６６−ＰＥを含有し、第２のチューブは５−ＥＸ  ８８Ｖ５９及び抗ＣＤ６６−ＰＥを含有する。抗ＣＤ６６−ＰＥの作業希釈５０μｌをそれぞれのチューブに分取し、続いて１００μｌのよく混合した検体をそれぞれのチューブに入れる。チューブはキャップをして、静かに振盪して細胞と抗体を混合し、続いて２０〜３０分間、１５〜３０℃でインキュベートする。その後、残った試料は２〜８℃で保存する。
【００９０】
次に、Perm／洗浄バッファーの１×溶液を調製する。試料ごとに、０．３ｍｌの１０×Perm／洗浄及び２．７ｍｌの精製水を添加する。次に、混合液はキャップをして遠心管において穏やかな反転により混合させる。
【００９１】
最初の細胞洗浄及び透過処理：１ｍｌのＨＢＳＳをそれぞれのチューブに添加する。次に、チューブは穏やかに振盪して細胞と抗体を混合し、続いて１５〜３０℃、３７５〜４２５ｇで５〜１０分間遠心分離する。次に、上澄み液はペレットを掻き乱すことなく吸引し、１００μｌのCytofix／cytoperm溶液をそれぞれのチューブに添加する。次に、ペレットは再懸濁して１５〜３０℃で２０〜３０分間インキュベートする。
【００９２】
第２の細胞洗浄及び内部染色：チューブのキャップを取り、１ｍｌのPerm／洗浄バッファーをそれぞれのチューブに添加する。次に、チューブは穏やかに振盪して細胞を懸濁させ、１５〜３０℃、３７５〜４２５ｇで５〜１０分間遠心分離する。次に、上澄みはペレットを掻き乱すことなく吸引し、５０μｌのPerm／洗浄バッファーをそれぞれのチューブに添加し、穏やかに振盪してペレットは再懸濁する。次に、内部染色のための適切な抗体をそれぞれのチューブに添加する（１００μｌの５−ＥＸ  ＩｇＧ３をＩｇＧ３チューブに、１００μｌの５−ＥＸ  ８８ＢＶ５９を８８ＢＶ５９チューブに）。チューブは穏やかに振盪して細胞と抗体を混合し、その後１５〜３０℃で２０〜３０分間インキュベートする。
【００９３】
第３の細胞洗浄：チューブのキャップを取り、１ｍｌのPerm／洗浄バッファーをそれぞれのチューブに添加する。チューブはキャップをして、穏やかに振盪して細胞を懸濁させ、次に細胞を１５〜３０℃、３７５〜４２５ｇで５〜１０分間遠心分離する。チューブはキャップを取り、上澄みはペレットを掻き乱すことなく吸引する。次に、４００μｌのＨＢＳＳをそれぞれのチューブに添加する。チューブはキャップをして、穏やかに振盪して細胞を懸濁させる。その後、チューブは分析まで（１時間まで）２〜８℃で保存する。
【００９４】
チューブ分析：前方角及び直角光散乱の確立した標準ゲートパラメータを使用してＦＡＣＳにより細胞を分析する。無傷の細胞は含まれ死んだ細胞及びデブリは光散乱ゲートから排除する。８８ＢＶ５９チューブを使用してＣＤ６６＋８８ＢＶ５９＋細胞の割合を判定する。
【００９５】
アッセイ妥当性−解像度：観察可能な蛍光の変化に注目して、ＣＤ６６＋８８ＢＶ５９＋染色細胞とＣＤ６６＋ＩｇＧ３＋対照細胞を区別する。
【００９６】
パーセント同一性計算：ＣＤ６６と８８ＢＶ５９の陽性（ＣＤ６６＋８８ＢＶ５９＋）腫瘍細胞の割合をＣＤ６６陽性細胞の部分で割って１００を掛けて同一性パーセントを決定する。
【００９７】
上記の手順を使用すれば、ヌードマウスでの増殖後に採取したヒト結腸腫瘍細胞は実質的な又は完璧な同一性を示すと考えられる。
【実施例４】
【００９８】
効力アッセイ
本実施例は、ヌードマウスでの増殖後にフローサイトメトリーにより腫瘍細胞を同定し列挙するための方法を記述する。
【００９９】
設備：Beckman Coulter FC500フローサイトメータ、冷蔵庫GKx7080、２〜８℃、タイマー、可変体積ピペッタ（P200、P1000）、及び試薬と試料貯蔵庫。
【０１００】
分析にかけられる試料は２〜８℃で保存され、次に分析手順が直ちに開始される。
【０１０１】
試料調製：試料ごとに３つ（３）の同一複写物を調製する。それぞれのチューブには、抗ＥｐＣＡＭ  ＦＩＴＣ、抗ＣＤ６  ＰＥ、及び抗ＣＤ４５  ＰＣ５を含むOncoVAX（登録商標）効力抗体作業溶液が含有される。それぞれの複写物チューブに、１５０μｌのOncoVAX（登録商標）効力抗体作業溶液を添加する。それぞれのチューブに、１００μｌのよく混合させた細胞試料を添加する。細胞と抗体は穏やかに振盪して混合する。いかなる残りの試料も２〜８℃で保存する。チューブは２〜３０分間室温でインキュベートする。インキュベーション後、４００μｌのＤＰＢＳをそれぞれのチューブに添加する。次に、フローカウントフルオロスフェア（flow count fluorosphere）（ビーズ）の容器をボルテックスする。それぞれのチューブに、１００μｌのフローカウントフルオロスフェアを添加する。試料分析：生きた細胞が含まれるべきであり、死んだ細胞及びデブリは光散乱ゲートから排除されるべきである。腫瘍及び他の細胞の絶対総数を得るため、フローカウントフルオロスフェア製造元から提供される分析証明書に明記されるビーズの量が獲得される。腫瘍領域における腫瘍細胞の割合及び総数も獲得される。リンパ系領域におけるリンパ細胞の割合及び総数も獲得される。
【０１０２】
結果の計算：試料効力（腫瘍細胞／バイアル）を判定するために、平均腫瘍細胞総数／μｌ（領域Ｋ、表Ｂ）に１０００を掛ける。必要な場合には、希釈係数も使用して試料調製中の最初の濃度を説明する。リンパ細胞／バイアルを判定するために、平均リンパ細胞総数／μｌ（領域Ｌｙ、表Ｂ）に１０００を掛ける。必要な場合には、希釈係数も使用して試料調製中の最初の濃度を説明する。回収率のパーセントを計算するため、平均腫瘍細胞総数を平均リンパ細胞総数に加算して、平均光散乱ゲート総数で割る。
【０１０３】
上記の手順を使用すれば、ヌードマウスでの増殖後に採取したヒト結腸腫瘍細胞は以下の効力を示すと考えられる。
【０１０４】
【表１】
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【実施例５】
【０１０５】
広がった異種移植材料由来のヒトがん細胞の精製
異種移植した腫瘍（複数可）の採取と分離に続いて、試料から生体異物物質又は汚染物質、すなわち、供給源動物に関連する生細胞又は細胞デブリを取り除いてもよい。OncoVAX（登録商標）は自己ワクチンであり、定義によれば、ワクチン内で汚染物質として作用する可能性のある循環細胞、腫瘍関連間質、及び他のいかなる細胞デブリでも、それでも、免疫系により「自己」と見なされる。しかし、異種移植過程中、ヒトがん細胞はマウス由来間質及び脈管構造により支えられている。これらは元の患者にとって外来物質を構成するので、これらの汚染物質は自己由来組織よりも有害事象の大きなリスクを表す。したがって、異種移植片拡大に続いて、生物学的物質に対する異種間反応性を最小限に抑えて潜在的過敏症反応及び薬物誘発アレルギーのリスクを減少させてもよい。細胞が単細胞懸濁液に分離してしまうと、混合物はマウス生物学的マーカー（マウス特異的抗ＣＤ４４及び／又は抗ＣＤ５５を含むが、これらに限定されない）又は起源の内皮若しくは造血性細胞に対する一般的抗原性マーカーに特異的なモノクローナル抗体にコンジュゲートされた磁気ビーズ又は非磁気ビーズで処理する。懸濁液内のマウス細胞に結合した後、試料は遠心分離して、負の選択によりヒト腫瘍細胞を濃縮する。次に、分離物の純度はOncoVAX（登録商標）同一性アッセイにおいて定量し、得られたゲノムフィンガープリントは最初の腫瘍分離の均一な試料に対して試験される。
【実施例６】
【０１０６】
異種移植片拡大に続くヒトがん細胞の特徴付け
本開示に従ったワクチン産物OncoVAX（登録商標）の臨床的有効性は、腫瘍不均一性を包含し利用するその能力にある。個々の患者に関連する独自の抗原プロファイルに根本的な変化をもたらすその原料物質を増加させようとするいかなる企ても治療不成功のリスクを増加させる。したがって、最初の腫瘍由来の細胞の代表的懸濁液（異種移植前）とヒト細胞を濃縮した後の腫瘍移植片（異種移植後）を比較して、拡大過程の間の免疫原性連続性を確認してもよい。比較ゲノムハイブリダイゼーション、染色体核型分析、一塩基多型（ＳＮＰ）分析、短いタンデム反復プロファイリング、トランスクリプトーム（ＲＮＡ−ｓｅｑ）若しくはゲノムディープシークエンシング、ＲＮＡマイクロアレイ分析又はフローサイトメトリー分析を含むがこれらに限定されない種々のスクリーニング法を利用して、この品質管理を達成することができる。腫瘍細胞異種移植後の染色体の、変異性の、又は遺伝子発現のプロファイルの顕著な変化は、患者特異的不均一性を保存できなかったことを表す。したがって、原発腫瘍細胞の均一な試料及び異種移植片増殖腫瘍細胞の均一な試料のＲＮＡマイクロアレイ分析に続いて、異種移植片細胞は、原発腫瘍の細胞に対して顕著な相同性、好ましくは少なくとも８５％の配列相同性を示すと考えられる。
【０１０７】
このように、本発明は自己がんワクチンにより腫瘍抗原の不均一性を包含し、この技術を、他の方法では自己ワクチン産物の製造及び関連する治療方法のための原発腫瘍としての効果的使用には小さすぎると考えられるその相対的にサイズが小さい固形腫瘍を含むがんにまで拡張する。
【０１０８】
製造工程には、免疫不全の動物において患者腫瘍細胞を移植し増殖させるステップと、増殖させた細胞を動物から採取して、原発腫瘍の生物学的、表現型の、抗原性の及び免疫原性の特性を有する十分な量のワクチン組成物を調製するステップとが含まれる。本発明は、患者の原発腫瘍よりも多数の生存可能腫瘍細胞を含有し、ワクチンの腫瘍細胞が原発腫瘍細胞と少なくとも８５％の配列相同性を有する自己ワクチン産物及び組成物も提供し、不均一な細胞産物及び／又は異種移植片拡大された生存可能であり、滅菌した、非腫瘍原性であるが免疫原性である細胞からなる均一な混合物を、免疫応答を誘発して悪性疾患の微小転移及び／又は再発を予防するのに十分な用量とレジメンで投与することを通じて、免疫応答を誘発し、個々の特異的がん患者における最小残存病変を取り除くことにより転移の再発を予防するための方法を提供する。
【０１０９】
いくつかの上記実施例は結腸がんに関するが、本発明はそれに限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
新しいと主張し特許証により保護されることを望むのは、以下のとおりである。
【国際調査報告】
2016532717.tif 000003