(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つの腫瘍関連抗原遺伝子を内包するミセルである、腫瘍を治療するための医薬組成物を提供する。本発明はまた、腫瘍を治療する方法であって、少なくとも１つの腫瘍関連抗原遺伝子を内包するミセルをかかる治療を必要とする患者に投与することを含む前記方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの腫瘍関連抗原遺伝子および少なくとも１つのアジュバント遺伝子を内包するミセルである、腫瘍を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
前記腫瘍関連抗原遺伝子が、Ｔ細胞３により認識される扁平上皮癌抗原（ＳＡＲＴ３）、Ｙボックス結合タンパク質１（ＹＢ−１）、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）およびサバイビンからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記アジュバント遺伝子が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣＤ４０Ｌからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記アジュバント遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）配列番号１３のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）１〜４０個のアミノ酸が配列番号１４のアミノ酸配列において欠失、置換、挿入および／または付加されているアミノ酸配列からなり、２８ｓｃＦｖ（ＬＨ）−ＣＤ８６キメラの活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、２８ｓｃＦｖ（ＬＨ）−ＣＤ８６キメラの活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｅ）配列番号１３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、２８ｓｃＦｖ（ＬＨ）−ＣＤ８６キメラの活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチドのいずれか１つである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ポリヌクレオチドをＧＭ−ＣＳＦおよびＣＤ４０Ｌのいずれか１つまたは両方と組み合わせて含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ミセルがポリイオン複合体ミセルである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記腫瘍が、骨肉腫、軟部組織肉腫、乳房の癌腫、肺の癌腫、膀胱の癌腫、甲状腺の癌腫、前立腺の癌腫、結腸の癌腫、結腸直腸の癌腫、膵臓の癌腫、胃の癌腫、肝臓の癌腫、子宮の癌腫、子宮頸部の癌腫、卵巣の癌腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、神経芽細胞腫、メラノーマ、ミエローマ、ウィルムス腫瘍、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、グリオーマ、および網膜芽細胞腫からなる群から選択される１つである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
少なくとも１つの腫瘍関連抗原遺伝子および少なくとも１つのアジュバント遺伝子を内包するミセルの有効量を対象に投与することを含む、対象における腫瘍を予防および／または治療する方法。
【請求項９】
前記腫瘍が獲得拒絶記憶免疫により予防される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記腫瘍関連抗原遺伝子が、Ｔ細胞３により認識される扁平上皮癌抗原（ＳＡＲＴ３）、Ｙボックス結合タンパク質１（ＹＢ−１）、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）、およびサバイビンからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アジュバント遺伝子が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣＤ４０Ｌからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記アジュバント遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）配列番号１３のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）１〜４０個のアミノ酸が配列番号１４のアミノ酸配列において欠失、置換、挿入および／または付加されているアミノ酸配列からなり、２８ｓｃＦｖ（ＬＨ）−ＣＤ８６キメラの活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、２８ｓｃＦｖ（ＬＨ）−ＣＤ８６キメラの活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｅ）配列番号１３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、２８ｓｃＦｖ（ＬＨ）−ＣＤ８６キメラの活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
からなる群から選択される、ポリヌクレオチドのいずれか１つである、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドが、ＧＭ−ＣＳＦおよびＣＤ４０Ｌのいずれか１つまたは両方と組み合わせて用いられ得る、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ミセルがポリイオン複合体ミセルである、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記腫瘍が、骨肉腫、軟部組織肉腫、乳房の癌腫、肺の癌腫、膀胱の癌腫、甲状腺の癌腫、前立腺の癌腫、結腸の癌腫、結腸直腸の癌腫、膵臓の癌腫、胃の癌腫、肝臓の癌腫、子宮の癌腫、子宮頸部の癌腫、卵巣の癌腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、神経芽細胞腫、メラノーマ、ミエローマ、ウィルムス腫瘍、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、グリオーマ、および網膜芽細胞腫からなる群から選択される１つである、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子担体デバイス、少なくとも１つの腫瘍関連抗原遺伝子を内包するミセルである、腫瘍を治療するための医薬組成物に関する。本発明はまた、腫瘍を治療する方法であって、少なくとも１つの腫瘍関連抗原遺伝子を内包するミセルをかかる治療を必要とする対象（被験対象）に投与することを含む前記方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
化学療法、放射線療法、外科的療法と異なり、癌ワクチンは低侵襲性に抗腫瘍効果を発揮するので、悪性腫瘍に対する有望な治療法として注目されつつある。抗腫瘍効果は、腫瘍特異的な拒絶免疫の賦活化によりもたらされる。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、樹状細胞（ＤＣ）／抗原提示細胞（ＡＰＣ）に運ばれ［１］、ここで断片化されたＴＡＡペプチドが、細胞表面の主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラス１分子およびクラス２分子に提示される。これらは、補助刺激作用、例えば、Ｂ７／ＣＤ２８およびＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌと共同して活性化される、特異的細胞傷害性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球により、それぞれ認識される［２］。更に顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）による細胞外刺激は、ＤＣ／ＡＰＣ細胞を成熟させ、ＭＨＣクラス２分子の発現を亢進し［３］、ワクチン効果を増強する［４］。
【０００３】
三つのタイプのワクチン（ペプチド、細胞および遺伝子ワクチン）が、癌治療法として基礎研究や臨床試験において検討されてきた。ペプチドワクチンは、低い生産コスト、臨床における高い安全性および良好な服薬コンプライアンスという優れた特性を有するが、免疫原性の低い腫瘍に対して強力なワクチン効果を誘発するＴＡＡエピトープペプチドの同定は困難である［５、６］。エピトープペプチドと提示できるＭＨＣ型(ハプロタイプ)が一致することも必要であり、ペプチドワクチンの適応がある患者が限られることになる［５、６］。細胞ワクチンは、ウイルスベクターを通常用いて培養ＤＣまたは自己の腫瘍細胞にＴＡＡ遺伝子を導入して作製される。細胞ワクチンは、構築に時間がかかり、改変は容易ではなく、病原体に関する安全性の問題を有し、かつ高い生産コストがかかる問題点を有する［７］。一方、ウイルスベクターなしでＴＡＡ単独またはアジュバント遺伝子を併用してＴＡＡを導入する遺伝子ワクチンにより抗腫瘍免疫が誘発されるならば、上記の問題点を解決することになる［８］。
【０００４】
種々の合成素材、例えば、カチオン性リポソーム［９、１０］、多糖類［１１、１２］、デンドリマー［１３、１４］およびカチオン性ポリマー［１５〜１７］を用いた非ウイルス性遺伝子担体デバイスの開発が研究されてきた。しかしながら、非ウイルス性遺伝子担体デバイスの特性は未だ完成の域に遠く、正常組織損傷を引き起こすことなく、生体内での高率な遺伝子導入が達成できていない。近年、カチオン性ポリマーの改変により正常組織損傷少なく生体内に遺伝子導入できる高分子ミセル型遺伝子担体の開発が報告されている［１８〜２１］。
【０００５】
参考文献
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
遺伝子担体ミセルが、in vivoで生体適合性を維持しつつ遺伝子導入を高率に達成することが近年示された。本研究において、本発明者らは、マウス腫瘍モデルにおいて腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、ＣＤ４０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を内包するミセルの腹腔内（ｉ．ｐ．）投与実験を行い、ＤＮＡワクチンプラットフォームとしての可能性を調べた。ＴＡＡ（ＳＡＲＴ３またはＹＢ−１）、ＣＤ４０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を搭載するＤＮＡワクチンは、Mock対照群、または単一遺伝子療法群と比較して、colon-26腹膜播種マウスの生存期間を有意に延長した。同癌細胞の再移植（チャレンジ）実験により、ＤＮＡワクチンで治療した長期生存マウスにおいて拒絶記憶免疫の定着が確認された。また、ＤＮＡワクチンはcolon-26やLewis肺癌皮下腫瘍モデルにおいて腫瘍増大と肺転移を阻害した。両腫瘍モデルにおいて、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性は、ＤＮＡワクチンによってのみ高度に活性化され、一方、ＮＫ活性は、ＧＭ−ＣＳＦ内包ミセルにより活性化された。ＣＴＬの活性化が主要組織適合抗原複合体およびＳＡＲＴ３特異的に生じたことは、抗ＭＨＣ抗体およびＳＡＲＴ３ siRNAノックダウンにより確認された。さらに、ＤＮＡワクチン治療により、リンパ節および脾臓におけるＧＭ−ＣＳＦおよびＣＤ１１ｃ陽性細胞の皮下腫瘍への浸潤（７日目）、およびＣＤ４およびＣＤ８ａ陽性Ｔリンパ球の皮下腫瘍への浸潤（１４日目および２８日目）の増強が認められた。これらのデータは、ＴＡＡ／ＣＤ４０Ｌ／ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子搭載ミセルがＣＴＬを介した拒絶免疫活性化により腫瘍成長および転移を抑制できる新規のワクチンプラットフォームであることを示している。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は以下を提供する。
【０００８】
［１］少なくとも１つの腫瘍関連抗原遺伝子および少なくとも１つのアジュバント遺伝子を内包するミセルである、腫瘍を治療（処置）するための医薬組成物。
【０００９】
［２］腫瘍関連抗原遺伝子が、Ｔ細胞により認識される扁平上皮癌抗原-３（ＳＡＲＴ３）、Ｙボックス結合タンパク質１（ＹＢ−１）、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）およびサバイビンからなる群から選択される少なくとも１つである、［１］の医薬組成物
【００１０】
［３］アジュバント遺伝子が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣＤ４０Ｌからなる群から選択される少なくとも１つである、［１］または［２］の医薬組成物。
【００１１】
［４］アジュバント遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）配列番号１３のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）１〜４０個のアミノ酸が配列番号１４のアミノ酸配列において欠失、置換、挿入および／または付加されているアミノ酸配列からなり、２８ｓｃＦｖ（ＬＨ）−ＣＤ８６キメラの活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、２８ｓｃＦｖ（ＬＨ）−ＣＤ８６キメラの活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｅ）配列番号１３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、２８ｓｃＦｖ（ＬＨ）−ＣＤ８６キメラの活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチドのいずれか１つである、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【００１２】
［５］ポリヌクレオチドをＧＭ−ＣＳＦおよびＣＤ４０Ｌのいずれか１つまたは両方と組み合わせて含む、［４］の医薬組成物。
【００１３】
［６］ミセルがポリイオン複合体ミセルである、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【００１４】
［７］腫瘍が、骨肉腫、軟部組織肉腫、乳房の癌腫、肺の癌腫、膀胱の癌腫、甲状腺の癌腫、前立腺の癌腫、結腸の癌腫、結腸直腸の癌腫、膵臓の癌腫、胃の癌腫、肝臓の癌腫、子宮の癌腫、子宮頸部の癌腫、卵巣の癌腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、神経芽細胞腫、メラノーマ、ミエローマ、ウィルムス腫瘍、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、グリオーマ、および網膜芽細胞腫からなる群から選択される１つである、［１］〜［６］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【００１５】
［８］少なくとも１つの腫瘍関連抗原遺伝子および少なくとも１つのアジュバント遺伝子を内包するミセルの有効量を対象に投与することを含む、対象における腫瘍を予防および／または治療（処置）する方法。
【００１６】
［９］腫瘍が、獲得拒絶記憶免疫により予防される、［８］に記載の方法。
【００１７】
［１０］腫瘍関連抗原遺伝子が、Ｔ細胞により認識される扁平上皮癌抗原-３（ＳＡＲＴ３）、Ｙボックス結合タンパク質１（ＹＢ−１）、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）、およびサバイビンからなる群から選択される少なくとも１つである、［８］または［９］に記載の方法。
【００１８】
［１１］アジュバント遺伝子が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣＤ４０Ｌからなる群から選択される少なくとも１つである、［８］〜［１０］のいずれか１つに記載の方法。
【００１９】
［１２］アジュバント遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）配列番号１３のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）１〜４０個のアミノ酸が配列番号１４のアミノ酸配列において欠失、置換、挿入および／または付加されているアミノ酸配列からなり、２８ｓｃＦｖ（ＬＨ）−ＣＤ８６キメラの活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、２８ｓｃＦｖ（ＬＨ）−ＣＤ８６キメラの活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｅ）配列番号１３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、２８ｓｃＦｖ（ＬＨ）−ＣＤ８６キメラの活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチドのいずれか１つである、［８］〜［１０］のいずれか１つに記載される方法。
【００２０】
［１３］前記ポリヌクレオチドが、ＧＭ−ＣＳＦおよびＣＤ４０Ｌのいずれか１つまたは両方と組み合わせて用いられ得る、［１２］に記載の方法。
【００２１】
［１４］ミセルがポリイオン複合体ミセルである、［８］〜［１３］のいずれか１つに記載の方法。
【００２２】
［１５］腫瘍が、骨肉腫、軟部組織肉腫、乳房の癌腫、肺の癌腫、膀胱の癌腫、甲状腺の癌腫、前立腺の癌腫、結腸の癌腫、結腸直腸の癌腫、膵臓の癌腫、胃の癌腫、肝臓の癌腫、子宮の癌腫、子宮頸部の癌腫、卵巣の癌腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、神経芽細胞腫、メラノーマ、ミエローマ、ウィルムス腫瘍、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、グリオーマ、および網膜芽細胞腫からなる群から選択される１つである、［８］〜［１４］のいずれか１つに記載の方法。
【発明の効果】
【００２３】
本研究において、本発明者らは、マウス腫瘍モデルにおいて、ＴＡＡ（ＳＡＲＴ３またはＹＢ−１）、ＣＤ４０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を内包するミセルのＤＮＡワクチンプラットフォームとしての可能性を調べた。これらの遺伝子を有するミセルの腹腔内投与は、腹膜播種マウスの生存を延長し、皮下腫瘍の増大および転移を阻害し、ＣＴＬ／ＮＫ活性の活性化ならびにＣＤ４およびＣＤ８ａ陽性リンパ球（ＣＴＬ）の腫瘍組織浸潤の増強が認められている。これらの結果は、ＴＡＡ／ＣＤ４０Ｌ／ＧＭ−ＣＳＦ搭載ミセルが、非常に強力なＤＮＡワクチンのプラットフォームとなり得ることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】（Ａ）脾臓におけるポリプレックスミセルの局在を示す顕微鏡写真（左パネル）およびリンパ節におけるポリプレックスミセルの局在を示す顕微鏡写真（中央パネル）、ならびにリンパ節におけるポリプレックスミセルと樹状細胞の共局在を示す顕微鏡写真（右パネル）の図である。（Ｂ）ｍＧＭ−ＣＳＦ発現を示すグラフである。
【図２】（Ａ）ＣＴ２６腹膜播種モデルにおいて、治療用遺伝子を内包するポリプレックスミセルを用いたワクチン接種スケジュールを示す図である。（Ｂ）ＳＡＲＴ３、ＣＤ４０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦを搭載するＤＮＡワクチンが、マウス癌モデルの生存期間を有意に延長したことを示すカプラン・マイヤー生存曲線の図である。（Ｃ）ポリプレックスミセルを用いたワクチン接種スケジュールを示す図である。（Ｄ）１４日目のＣＴ２６癌およびＬＬＣ皮下腫瘍の腫瘍重量を示すグラフである。
【図３】（Ａ）ＬＬＣ癌の皮下移植の２８日後の、図示したＤＮＡワクチンまたはMockミセルを接種したマウスから得た肺組織の免疫組織化学画像の図である。（Ｂ）ＣＤ４およびＣＤ８ａ陽性Ｔリンパ球の肺組織への浸潤を示す免疫組織化学染色の画像である。
【図４】（Ａ）ＮＫ活性（上部のパネル）およびＣＴＬ活性（下側のパネル）を示すグラフである。（Ｂ）腫瘍を保有するマウスの写真画像の図である。（Ｃ）ＤＮＡワクチン接種長期生存マウスおよびワクチン非接種対照マウスのＣＴＬ活性を示すグラフである。（Ｄ）ＣＦＳＥ標的細胞殺傷性のＭＨＣおよびＴＡＡに対する特異性を確認する目的で実施した、ＣＴＬアッセイにおける抗ＭＨＣクラス１（Ｈ−２ＬおよびＨ−２Ｄ）抗体を用いたブロッキング実験またはｓｉＲＮＡトランスフェクションによるＳＡＲＴ３ノックダウン実験の結果を示す図である。
【図５】図示した抗体で免疫染色した脾臓、リンパ節および腫瘍の組織切片の顕微鏡画像、およびデジタル化したタンパク質シグナルレベルのグラフ（右パネルにおける赤色）（左パネル）である。
【図６】（Ａ）ＳＡＲＴ３、ＣＤ４０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦを内包するリポソーム搭載ＤＮＡワクチンがＣＴ２６腹膜播種を宿しているマウスの生存を延長することを示す図である。（Ｂ）ＤＮＡワクチンの鼠径部皮下投与は、腹膜播種を有するマウスの生存期間を延長することを示す図である。
【図７】ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内にＣＴ２６大腸癌細胞を移植した１週間後に、マウスＭＵＣ１／ＣＤ４０Ｌ／ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を内包するポリプレックスミセルを腹腔内投与して、マウスの生存期間をモニターしたことを示す図である。
【図８】ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹膜腔にＣＴ２６大腸癌細胞を移植した１週間後に、マウスサバイビン／ＣＤ４０Ｌ／ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を内包するポリプレックスミセルを腹腔内投与して、マウスの生存期間をモニターしたことを示す図である。
【図９】ＣＴ２６大腸癌細胞をマウス脇腹領域皮下に移植した翌日、腹腔内に、ＳＡＲＴ３及び図示したアジュバント遺伝子を内包するブロック／ホモ混合ポリプレックスミセル（ｐＤＮＡ６０μｇ、ＮＰ比＝１０）を投与した図である。アジュバント遺伝子は、（Ａ）ＣＤ４０Ｌ＋ＧＭ−ＣＳＦ、（Ｂ）“２８＝ｓｃＦｖ２８−ＣＤ８６キメラ”である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本明細書において以下で、本発明が詳細に記載される。後述の実施形態は、単に本発明を記載するための例示の目的で提示することを意図し、以下の実施形態のみに限定されない。本発明は、本発明の要旨から逸脱することなく、種々の方法で実施され得る。
【００２６】
本出願において引用される刊行物、公開された特許出願、特許および他の特許文書の全てが、本明細書において参照によりその全体が組み込まれる。本出願は、本明細書により、２０１３年４月５日付けで出願された日本国特許出願（第２０１３−０７９８５４号）における明細書および図面の内容を参照により組み込み、これに基づく優先権を主張する。
【００２７】
第１の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの腫瘍関連抗原遺伝子および少なくとも１つのアジュバント遺伝子を内包するミセルである、腫瘍を治療するための医薬組成物を提供する。本明細書において以下で、ミセルは、本発明の「ＤＮＡワクチン」としても表され得る。
【００２８】
本発明において、腫瘍関連抗原遺伝子は、Ｔ細胞により認識される扁平上皮癌抗原-３（ＳＡＲＴ３）、Ｙボックス結合タンパク質１（ＹＢ−１）、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）およびサバイビンからなる群から選択される少なくとも１つである。
【００２９】
上に挙げたＴＡＡ遺伝子の図解のヌクレオチド配列は、以下の表１において要約される。しかしながら、ＴＡＡ遺伝子のヌクレオチド配列は、表において示されるものに限定されず、その相同遺伝子のヌクレオチド配列も含む。
【００３０】
【表１】
2016516667.tif 000002
【００３１】
さらに、アジュバント遺伝子は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣＤ４０Ｌからなる群から選択される少なくとも１つである。
【００３２】
上に挙げたアジュバント遺伝子の図解のヌクレオチド配列は、以下の表２において要約される。しかしながら、アジュバント遺伝子のヌクレオチド配列は、表において示されるものに限定されず、その相同遺伝子のヌクレオチド配列も含む。
【００３３】
【表２】
2016516667.tif 000003
【００３４】
あるいは、アジュバント遺伝子は、２８ｓｃＦｖ（ＬＨ）−ＣＤ８６キメラ、または２８ｓｃＦｖ（ＬＨ）−ＣＤ８６キメラの活性を有する、その変異体であり得る。２８ｓｃＦｖ（ＬＨ）−ＣＤ８６キメラまたはその変異体を含むポリヌクレオチドは、以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）配列番号１３のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）１〜４０個のアミノ酸が配列番号１４のアミノ酸配列において欠失、置換、挿入および／または付加されているアミノ酸配列からなり、２８ｓｃＦｖ（ＬＨ）−ＣＤ８６キメラの活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、２８ｓｃＦｖ（ＬＨ）−ＣＤ８６キメラの活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｅ）配列番号１３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、２８ｓｃＦｖ（ＬＨ）−ＣＤ８６キメラの活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
からなる群から選択され得る。
【００３５】
２８ｓｃＦｖ（ＬＨ）−ＣＤ８６キメラまたはその変異体を含むポリヌクレオチドは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＣＤ４０Ｌのいずれか１つまたは両方と組み合わせて用いられ得る。
【００３６】
本明細書で用いられる、用語「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。
【００３７】
本明細書で用いられる、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」は、プローブとして、例えば、配列番号１３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号１４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの全体もしくは部分を用いた、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法などにより得られたポリヌクレオチドを指す。ハイブリダイゼーション法について、例えば、「Sambrook & Russell, Molecular Cloning; A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001」および「Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997」などに記載される方法が用いられる。
【００３８】
本明細書で用いられる、用語「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中程度のストリンジェントな条件または高ストリンジェントな条件のいずれかであり得る。用語「低ストリンジェントな条件」は、例えば、３２℃での５×ＳＳＣ、５×デンハート液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミドである。用語「中程度のストリンジェントな条件」は、例えば、４２℃での５×ＳＳＣ、５×デンハート液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、または４２℃での５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０％ホルムアミドである。用語「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５０℃での５×ＳＳＣ、５×デンハート液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミドまたは６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳである。これらの条件下で、より高い相同性を有するＤＮＡが、より高い温度で効率的に得られると予想されるが、温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度などを含む複数の因子が、ハイブリダイゼーション ストリンジェンシーに関与し、当業者は、これらの因子を適宜選択して、同様のストリンジェンシーを達成し得る。
【００３９】
市販のキットが、ハイブリダイゼーションのため用いられるとき、例えば、Ａｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が用いられ得る。この場合、添付のプロトコールに従い、標識プローブと一晩培養後、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含有する一次洗浄緩衝液で５５℃にて膜を洗浄し、これにより、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出する。あるいは、配列番号１３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、または配列番号１４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の全体もしくは部分に基づくプローブの生産において、プローブが、市販の試薬（例えば、ＰＣＲ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）など）を用いてジゴキシゲニン（ＤＩＧ）で標識されるとき、ハイブリダイゼーションは、ＤＩＧ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で検出され得る。
【００４０】
上述のものに加えて、ハイブリダイズし得る他のポリヌクレオチドは、デフォルトのパラメーターを用いて、相同性検索ソフトウェア、例えば、ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴにより計算される、配列番号１３のＤＮＡ、または配列番号１４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに対して７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上または９９．９％以上の同一性を有するＤＮＡを含む。
【００４１】
アミノ酸配列またはヌクレオチド配列間の同一性は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990、Proc. Nail Acad. Sci. USA, 90: 5873, 1993）によるアルゴリズムＢＬＡＳＴを用いて決定され得る。ＢＬＡＳＴアルゴリズムに基づくＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰ、ｔＢＬＡＳＴＮおよびｔＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが、開発されている（Altschul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403, 1990）。ヌクレオチド配列がＢＬＡＳＴＮを用いて配列決定されるとき、パラメーターは、例えば、スコア＝１００およびワード長＝１２である。アミノ酸配列がＢＬＡＳＴＰを用いて配列決定されるとき、パラメーターは、例えば、スコア＝５０およびワード長＝３である。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムが用いられるとき、プログラムのそれぞれについてデフォルトのパラメーターが利用される。
【００４２】
上述の本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子操作技術、公知の合成方法などにより獲得され得る。
【００４３】
腫瘍の例は、（１）肉腫、例えば、骨肉腫および軟部組織肉腫、（２）癌腫、例えば、乳房の癌腫、肺の癌腫、膀胱の癌腫、甲状腺の癌腫、前立腺の癌腫、結腸の癌腫、結腸直腸の癌腫、膵臓の癌腫、胃の癌腫、肝臓の癌腫、子宮の癌腫、子宮頸部の癌腫および卵巣の癌腫、（３）リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、（４）神経芽細胞腫、（５）メラノーマ、（６）ミエローマ、（７）ウィルムス腫瘍、（８）白血病、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、（９）グリオーマ、および（１０）網膜芽細胞腫を含む。
【００４４】
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）遺伝子およびアジュバント遺伝子は、発現ベクターの形態において適当な発現カセットに挿入され得る。適当な発現カセットは、以下の構成物（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）標的腫瘍細胞において転写可能なプロモーター、
（ｉｉ）プロモーターにインフレームでライゲーションされた遺伝子、および
（ｉｉｉ）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化シグナルをコードする配列
を少なくとも含有する。
【００４５】
標的腫瘍細胞において転写可能なプロモーターの例は、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＬＴＲ、ＥＦ−１αおよびＳＶ４０プロモーターを含むが、これらに限定されない。
【００４６】
発現カセットの例は、挿入された遺伝子を発現することができる限り、制限されないが、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＣＭＶ−ＨＡ（商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＭＳＣＶｐｕｒｏ（商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＶｉｒａＰｏｗｅｒ  ＩＩ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｇａｔｅｗａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＶＩＶＯ１−ｍｃｓ２プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む。
【００４７】
本発明の組成物がＤＮＡワクチンとして用いられる場合、遺伝子導入は、ミセルが身体に直接的に注射される直接投与、またはベクターが、遺伝子導入のため対象自身の細胞または他の細胞に感染し、次に、感染細胞が標的部位に注射される間接投与のいずれかにより達成され得る。ベクターの直接的注射のため、腹腔内注射なども用いられ得る。
【００４８】
あるいは、本発明のミセルは、ポリプレックスミセルまたはリポソームを含むポリイオン複合体ミセルであり得る。かかるミセルを用いて、そこに内包されるＴＡＡ遺伝子およびアジュバント遺伝子が、リポフェクションのように細胞に導入される。次に、得られた細胞が、例えば、静脈内経路または動脈内経路により全身性に投与される。それらは、標的組織、例えば、脳などに局所性に投与され得る。
【００４９】
ポリイオン複合体ミセルを形成するために用いられ得る脂質の例は、リン脂質、コレステロールおよび窒素含有脂質を含む。天然のリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、およびリゾレシチンを含むリン脂質、ならびに標準的方法で得られる水素添加産物が一般に好ましい。合成リン脂質、例えば、リン酸ジセチル、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、エレオステアロイルホスファチジルコリン、エレオステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ならびにホモ−ポリ｛Ｎ’−［Ｎ−（２−アミノエチル）−２−アミノエチル］アスパルトアミド｝Ｐ［Ａｓｐ（ＤＥＴ）］およびブロック−カチオマーポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）−ｂ−Ｐ［Ａｓｐ（ＤＥＴ）］を用いることも可能である。
【００５０】
ミセルの調製は、得られたミセルがＤＮＡを保持する限り、決して制限されない。ミセルは、従来の方法で、例えば、逆相蒸発、エーテル注入、界面活性剤に基づく技術などにより調製され得る。
【００５１】
これらのリン脂質を含む脂質は、単独または組合せのいずれかで用いられ得る。ＤＮＡ分子は電気的に負であるので、ＤＮＡ、すなわち、ＴＡＡおよびアジュバント遺伝子とミセルの間の結合率は、カチオン基（例えば、エタノールアミンまたはコリン）を有する原子団を含有する脂質を用いることにより、増強され得る。これらのリン脂質に加えて、他の添加物、例えば、コレステロール、ステアリルアミン、α−トコフェロールなどをミセルにおいて用いることも可能であり、これらは、ミセル形成添加物として一般的に公知である。このようにして得られたミセルは、標的組織の患部での細胞へのこれらの取り込みを増強するために、膜融合プロモーター（例えば、ポリエチレングリコール）をさらに含んでもよい。
【００５２】
本発明によるＤＮＡワクチンまたは医薬組成物は、所定の方法で製剤され、ミセルを懸濁するための薬学的に許容される担体を含み得る。かかる担体は、添加物であり得、水、緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、薬学的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶解性デキストラン、カルボキシメチルデンプンナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、および医薬添加剤などとして許容可能な界面活性剤を含む。
【００５３】
上記添加剤は、本発明のそれぞれの治療剤の投薬形態に依存して、単独または上に挙げたもののなかから組み合わせて選択され得る。例えば、注射可能な製剤として使用するため、精製されたベクターが、溶媒（例えば、生理学的食塩水、緩衝液、グルコース溶液）に溶解され、次に、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミンなどを補足した。あるいは、成分は、使用前に再構成される投薬形態としての使用のため凍結乾燥され得る。凍結乾燥のための賦形剤の例は、糖、例えば、マンニトール、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトールおよびソルビトール、デンプン、例えば、トウモロコシ、麦、米、ジャガイモおよび他の植物からもたらされるもの、セルロース、例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム、ゴム、例えば、アラビアゴムおよびトラガカントゴム、ならびにゼラチン、コラーゲンなどを含む。
【００５４】
第２の実施形態において、本発明は、腫瘍を予防および／または治療する方法であって、少なくとも１つの腫瘍関連抗原遺伝子および少なくとも１つのアジュバント遺伝子を内包するミセルをかかる治療を必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００５５】
本発明のＤＮＡワクチンを投与されるべき対象（被験対象）は、例えば、ヒトおよび他の全ての哺乳類、例えば、非ヒト霊長類（例えば、サル）、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシおよびイヌを含み、ヒトがより好ましい。対象はまた、例えば、癌、例えば、結腸癌に罹患しているもの、癌、例えば、結腸癌を有することが疑われるものであってもよい。
【００５６】
本発明のＤＮＡワクチンの投薬量は、対象の年齢、性別および症状、投与経路、投与頻度、ならびに意図される投薬形態に依存して変動するであろう。投与様式は、対象の年齢および症状に応じて選択される。ＤＮＡワクチンの有効な投薬量は、疾患の兆候または状態を低減するのに必要なワクチンの量である。かかるＤＮＡワクチンの治療効果および毒性は、細胞培養におけるまたは実験動物における標準的医薬的手法により、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）またはＬＤ５０（集団の５０％についての致死用量）アッセイにより、決定され得る。
【００５７】
投与の経路は、必要に応じて選択され得、例は、経皮経路、鼻腔内経路、経気管支経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路および皮下経路を含むが、これらに限定されない。特に好ましい経路は、腹腔内投与、皮下投与などである。接種は、単一の部位にてまたは複数の部位にてなされ得る。
【００５８】
発現ベクターの種類は、必要に応じて選択され得、例は、プラスミドベクターを含むが、これに限定されない。一般的に好ましいベクター、例えば、アデノウイルス遺伝子ベクター、アデノ随伴ウイルス遺伝子ベクター、ワクシニアウイルス遺伝子ベクター、センダイウイルス遺伝子ベクターおよびポックスウイルス遺伝子ベクターも、本発明のため用いることが可能である。治療効果と毒性作用の間の用量比は、治療指標であり、ＥＤ５０／ＬＤ５０として表され得る。ヒトにおいて、本発明のワクチンの１回投薬量は、約１μｇ〜１０００μｇ、好ましくは、約１０〜５００μｇ、より好ましくは、約５０〜２５０μｇである。投与頻度は、副作用が臨床上許容可能な範囲内にある限り、１回または複数回であり得る。
【実施例】
【００５９】
本発明は、ここで、以下の実施例を用いて詳細に記載される。しかしながら、本発明の範囲は、実施例に限定されず、添付の請求の範囲により考慮されるべきである。
【００６０】
材料および方法
プラスミドＤＮＡコンストラクト
ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、Ｔ細胞により認識される扁平上皮癌抗原-３（ＳＡＲＴ３）およびＹボックス結合タンパク質１（ＹＢ−１）遺伝子の発現プラスミドを以下の通り構築した。マウスＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＳＡＲＴ３またはヒトＹＢ−１遺伝子の部分配列（１〜１２１のアミノ酸に対応する）のオープンリーディングフレームを、ｐＶＩＶＯ１−ｍｃｓ２プラスミド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）におけるマルチクローニングサイトにて組み込んだ。プラスミドＤＮＡを、大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５Ａコンピテント細胞において増幅し、ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｇｉｇａ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ｉｎｃ．）を用いて精製した。
【００６１】
ｐＤＮＡを内包するポリプレックスミセルの調製
既に報告された［参考文献１９、２２］通り合成したホモ−ポリ｛Ｎ’−［Ｎ−（２−アミノエチル）−２−アミノエチル］アスパルトアミド｝、Ｐ［Ａｓｐ（ＤＥＴ）］（重合度（ＤＰ）：５５）およびブロック−カチオマーポリ（エチレングリコール）、（ＰＥＧ）−ｂ−Ｐ［Ａｓｐ（ＤＥＴ）］（ＰＥＧのＭｗ：１２０００、ＤＰ：６５）を、日油株式会社（川崎、日本）から親切にも提供いただいた。ｐＤＮＡ（５０μｇ）、ＰＥＧ−ｂ−Ｐ［Ａｓｐ（ＤＥＴ）］およびＰ［Ａｓｐ（ＤＥＴ）］を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）において、ブロック／ホモ比７／３およびＮ／Ｐ比１０（Ｎ＝ポリカチオンにおける総アミン、Ｐ＝ｐＤＮＡにおける総リン酸陰イオン）にて混合することにより、ポリプレックスミセルを調製した。検出角度１６０°のＨｅ−Ｎｅイオンレーザー（６３３ｎｍ）を入射ビームとして備えた、ＥＬＳＺ−ＳＶ２（大塚電子株式会社）を用いて２５℃にて、動的光散乱（ＤＬＳ）測定を行った。キュムラント法により、光相関関数における減衰の比を分析し、次に、ストークス・アインシュタインの式により、ポリプレックスの対応する流体力学的径を計算した。
【００６２】
細胞株
マウス大腸癌腫（ＣＴ２６）、リンパ腫（ＹＡＣ−１）およびルイス肺癌（３ＬＬ／ＬＬＣ）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た。これらの細胞を、１０％熱失活ウシ胎児血清（ＦＢＳ、和光純薬工業株式会社）、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ナカライテスク株式会社）において３７℃で５％ＣＯ２を含有する加湿インキュベーターにて培養した。
【００６３】
動物
ＢＡＬＢ／ｃ  ＡｎＮＣｒｌＣｒｌｊマウス（メス、６週齢）およびＣ５７ＢＬ／６Ｊ（メス、６週齢）を、日本チャールス・リバー株式会社（横浜、日本）から購入した。１２／１２時間の明／暗サイクル下、温度を制御した部屋に動物を収容し、自由に食餌および水の摂取にアクセスさせた。全ての動物の手法は、九州大学の動物の愛護および使用委員会の動物実験の施設ガイドラインに従い承認され、行われた。
【００６４】
ｉ．ｐ．投与後のポリプレックスミセル分布
［Ｋｕｍａｇａｉ  Ａ］らが既に報告した方法で、Ｆｌｕｏｌｉｄ蛍光でＰＥＧ−ｂ−Ｐ［Ａｓｐ（ＤＥＴ）］を標識した。ｐＶＩＶＯ−１−Mockを有する蛍光標識ＰＥＧ−ｂ−Ｐ［Ａｓｐ（ＤＥＴ）］／Ｐ［Ａｓｐ（ＤＥＴ）］混合ミセルを、マウスの腹膜腔に投与した。２４時間後、いくつかの器官組織（肝臓、脾臓およびリンパ節）を得て、蛍光標識ポリプレックスミセルの組織局在を、レーザー共焦点顕微鏡下で調べた。
【００６５】
ｉ．ｐ．投与後のポリプレックスミセルからの遺伝子発現の局在
ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を内包するＰＥＧ−ｂ−Ｐ［Ａｓｐ（ＤＥＴ）］／Ｐ［Ａｓｐ（ＤＥＴ）］混合ミセルを、マウスの腹腔内に投与し、１日、３日および７日（それぞれにおいてｎ＝４）にて、器官組織（肝臓、脾臓、肺、腎臓およびリンパ節）を得た。ＲＮＡ抽出キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、総ＲＮＡ試料を抽出し、その後、既に報告された［Ｏｈｇｉｔａｎｉ  Ｍ］通り、合成したｃＤＮＡ試料を、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子発現についてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析にかけた。
【００６６】
マウス腫瘍モデルおよびワクチン接種プロトコール
外科的切除後に、微小転移を有する癌の対象を模倣するためのアジュバント設定のため、治療ワクチンとしてワクチン接種プロトコールを設計した。本発明者らは、２種類の同系腫瘍モデル、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてマウス大腸癌ＣＴ２６細胞、およびＣ５７／ＢＬ６マウスにおいて高い転移の可能性を有するマウス肺癌ＬＬＣ細胞で発生させた腹膜播種および皮下腫瘍モデルを作成した。
【００６７】
腹膜播種モデルのため、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内にＣＴ２６細胞（１×１０５細胞／マウス）を接種した（０日）。その後、１週間の間隔毎に４回（１日、８日、１５日および２２日）、示した遺伝子（表３）を内包するポリプレックスミセルを腹腔内投与した。ＣＴ２６細胞の第１の接種後８０日まで、マウスの生存をモニターして、ＤＮＡワクチンを内包するポリプレックスミセルの抗腫瘍効果を評価した。ＣＴ２６特異的拒絶免疫の獲得を調べるために、ＣＴ２６細胞（１×１０６細胞／マウス）を８０日より長く生存したマウス（長期生存者）の脇腹領域の皮下に接種した（再移植実験）。ＣＴ２６細胞の再移植後６０日間、注射部位での皮下腫瘍の発生率および成長を注意深く観察した。一部の実験において、長期生存マウスから脾細胞を新たに単離し、ＣＴＬおよびＮＫ細胞傷害アッセイにかけて、これらの細胞の抗腫瘍免疫活性を調べた。
【００６８】
皮下腫瘍モデル作成のため、同系ＣＴ２６細胞またはＬＬＣ細胞（共に、１×１０６細胞／マウス）を、それぞれＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７／ＢＬ６マウスの脇腹領域の皮下に移植した（０日）。次に、１週間間隔で４回（１日、８日、１５日および２２日）、図示した遺伝子（表３）を内包するポリプレックスミセルを腹腔内に投与した。ＢＡＬＢ／ｃマウスについては１４日目に、Ｃ５７／ＢＬ６マウスについては（２８日未満に死亡したマウスを除き）２８日目にマウスを屠殺した。群間で皮下腫瘍の重量を比較して、ポリプレックスミセル搭載ＤＮＡワクチンの抗腫瘍効果を評価した。腫瘍およびいくつかの器官組織を採取し、採取した組織はＯＣＴコンパウンドに包埋し、液体窒素内でスナップ凍結させた。組織化学染色で３ＬＬ／ＬＬＣ腫瘍モデルにおける肺転移の有無を調べ、免疫組織染色で脾臓、リンパ節および腫瘍組織への免疫細胞浸潤を検討した。一部の実験において、ＣＴＬおよびＮＫ細胞傷害アッセイのため脾細胞を別途新たに単離し、標的ＣＴ２６、ＬＬＣ、またはＹＡＣ−１細胞と共培養した。
【００６９】
鼠径部領域におけるＤＮＡワクチンの皮下投与
Ｎ／Ｐ比１０にて、ＰＥＧ−ｂ−［Ｐａｓｐ（ＤＥＴ）］／Ｐａｓｐ（ＤＥＴ）でＳＡＲＴ３、ＣＤ４０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦのｐＤＮＡ（計５０μｇ）を内包した。ＣＴ２６大腸癌腹膜播種を宿しているマウスの鼠径部領域において、ポリプレックスミセル搭載ＤＮＡワクチンを皮下投与した。
【００７０】
ＣＴＬおよびＮＫアッセイ（ＣＦＳＥに基づく細胞傷害アッセイ）
細胞増殖を停止するため、ＣＴ２６またはＬＬＣ細胞を２０Ｇｙ照射で処理した。１０％ＦＢＳ、５×１０−５Ｍ  ２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（ナカライテスク株式会社）２０ｍｌを用いて、３７℃で５％ＣＯ２を含有する加湿インキュベーター内で、ＣＴ２６およびＬＬＣ皮下腫瘍マウスから単離した脾細胞（５×１０７細胞）を、放射線照射で増殖停止させたＣＴ２６またはＬＬＣ／３ＬＬ（５×１０６細胞）と共培養した。７２時間のインキュベーション後、これらの脾細胞を回収し、既に記載された通り［参考文献２３］、ＣＴＬおよびＮＫアッセイのためのエフェクター細胞として用いた。
【００７１】
ＣＴ２６または３ＬＬ／ＬＬＣ（ＣＴＬアッセイのため）、およびＹＡＣ−１標的細胞（ＮＫアッセイのため）を、密度２０×１０６細胞／ｍＬにてＲＰＭＩ−１６４０培地で再懸濁し、３７℃で１０分間、１０μＭ  ＣＦＳＥ（株式会社同仁化学研究所）で標識した。当量のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を加えることにより、標識反応を停止させた。ＲＰＭＩ培地で２回洗浄後、異なる標的細胞／エフェクター（Ｔ／Ｅ）比、１／０、１／２５、１／５０または１／１００（Ｔ：１×１０４細胞／Ｅ：それぞれ、０、２５×１０４、５０×１０４、１００×１０４細胞）となるように、ＲＰＭＩ培地２００μｌを用いてＣＦＳＥ標識標的細胞をエフェクター細胞と直ちに混合し、５％ＣＯ２および３７℃の加湿状態でさらに６時間インキュベーションした。フローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣＡＮＴ−ＩＩ）分析の直前に、Ｆｌｏｗ−Ｃｏｕｎｔ  Ｆｌｕｏｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（それぞれの試料において１０，０００、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびヨウ化プロピジウム（１μｇ／ｍＬ、死亡細胞のマーカー）を細胞混合物に加えた。標的細胞の数を揃えるため、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアでの事象カウントで２，０００個のミクロビーズを指標にした。生存の割合を以下の通り計算した：［Ｔ／Ｅ比１／２５〜１／１００についての生ＣＦＳＥ＋標的細胞数］を［Ｔ／Ｅ比１／０についての生ＣＦＳＥ＋標的細胞数］で割り、１００倍した。
【００７２】
ＣＴＬアッセイにおけるＭＨＣおよびＳＡＲＴ３ブロッキング実験
ＣＴＬアッセイにおいて標的細胞の分解（target cell lysis）が主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に拘束されるかを分析するために、中和抗体を用いて阻害（ブロッキング）実験を行った。エフェクター細胞と混合する前に、３０分間、標的細胞を飽和濃度の抗ＭＨＣクラスＩモノクローナル抗体（Ｈ−２Ｌｄ：２８−１４−８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄおよびＨ−２Ｋｄ：ＳＦ１−１．１．１、ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）とインキュベーションした。あるいは、ＣＴＬアッセイにおいて標的細胞の分解のＴＡＡ特異性を確認するために、製造元のプロトコール（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ（商標））に従い、リポフェクタミン２０００を用いてｓｉＲＮＡ（センス：５’−ＣＵＡＣＡＧＵＣＡＧＵＡＣＣＵＡＧＡＵＴＴ−３’（配列番号１５）およびアンチセンス：５’−ＡＵＣＵＡＧＧＵＡＣＵＧＡＣＵＧＵＡＧＴＴ−３’（配列番号１６））により、ＣＴ２６においてＳＡＲＴ３発現をノックダウンした。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により、ｍＲＮＡノックダウンの効率を確認した。ＭＨＣ分子をブロッキング後またはＳＡＲＴ３発現をノックダウン後、ＣＴＬアッセイのため、いくつかのＥ／Ｔ比で処理したＣＴ２６細胞をエフェクター細胞と混合した。
【００７３】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ｉｌｌｕｓｔｒａ（商標）ＲＮＡｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、総ＲＮＡを抽出し、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。既に報告された［参考文献２４］通り、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０  ＩＩ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）において、ＧＭ−ＣＳＦおよびベータ−アクチンについての公開されたプライマーセット、ならびにＳＡＲＴ３について５’−ＧＴＧＡＧＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＡＣ−３’（配列番号１７）および５’−ＣＡＴＧＣＴＧＡＴＣＴＣＡＴＣＧＴＧＧＡ−３’（配列番号１８）を用いて、マウスＧＭ−ＣＳＦ、ＳＡＲＴ３およびβ−アクチン（ハウスキーピング遺伝子）についてのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００７４】
ＳＡＲＴ３、ＣＤ４０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦを内包するリポソーム搭載ＤＮＡワクチン
製造元のプロトコールに従い、リポソーム（Ｃｏａｔｓｏｍｅ  ＥＬ−０１−Ｃ、日油株式会社）でＳＡＲＴ３、ＣＤ４０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦのｐＤＮＡ（計５０μｇ）を内包した。ポリプレックスミセル搭載ＤＮＡワクチンと同様に、ＣＴ２６腹膜播種マウスにおいて、リポソーム搭載ＤＮＡワクチンを腹腔内に投与した。
【００７５】
組織免疫化学
皮下腫瘍モデルにおける腫瘍、肺および免疫器官組織（脾臓、肝臓およびリンパ節）を、厚さ１０μｍに薄切し、１０分間氷冷アセトンで固定した。切片を３％Ｈ２Ｏ２および１％ウシ血清アルブミンで浸漬して、内在性ペルオキシダーゼ活性を失活させた。室温で１時間、標本を、ＣＤ４（１：２５０、番号１００５０５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８ａ（１：１０００、番号１００７０１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１１ｃ（１：５００、ａｂ３３４８３、Ａｂｃａｍ）、またはＧＭ−ＣＳＦ（１：１０００、ａｂ１３７８９、Ａｂｃａｍ）についての一次抗体と、次に、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮビオチン／アビジンシステム（ベクター、ＵＳＡ）を用いてインキュベーションし、続いて、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）およびヘマトキシリン対比染色で可視化した。光学顕微鏡（ＥＣＬＩＰＳＥ  ５５ｉ、株式会社ニコン）下でデジタル画像データとして免疫染色のシグナルを取得し、ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｄ  ３．２定量分析プログラム（株式会社ニコン）で発現レベルを定量化した。
【００７６】
統計的分析
結果を平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。２群間の有意差はスチューデントｔ検定を用いて、また複数群間は分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて統計学的に検討した。カプラン・マイヤー法により生存曲線を作成しログランク検定で検定した。０．０５未満のＰ値を、統計的に有意であるとみなした。
【００７７】
遺伝子ワクチンのＴＡＡとしてのＭＵＣ１およびサバイビンの検証
ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内にＣＴ２６大腸癌細胞を移植した。１週間後、マウスＭＵＣ１／ＣＤ４０Ｌ／ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子またはマウスサバイビン／ＣＤ４０Ｌ／ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を内包するポリプレックスミセルを腹腔内投与し、マウスの生存期間をモニターした。
【００７８】
ＣＤ８６分子に融合した抗ＣＤ２８抗体の可変断片の１本鎖のキメラはアジュバント効果を有する
共刺激分子（co-stimulatory molecule）としてのＣＤ２８に対する１本鎖抗体の遺伝子配列情報（ｓｃＦｖ２８：配列番号１４の２８〜１４０番目および１５６〜２７８番目のアミノ酸残基）を、Ｋｕｍａｇａｉおよび同僚らにより報告されたアンタゴニスト抗ＣＤ２８抗体の配列情報から得た。次に、本発明者らは、ＣＤ８６のシグナル配列（配列番号１４の１〜２７番目）の直後に第１のスペーサー配列（配列番号１４の１４１〜１５５番目のアミノ酸残基）を挟んでｓｃＦｖ２８配列を、更に第２のスペーサー配列（配列番号１４の２７９〜２８３番目のアミノ酸残基）の後ろにＣＤ８６の２８４〜４９９番目のアミノ酸残基を融合したキメラアジュバント遺伝子：ｓｃＦｖ２８−ＣＤ８６（配列番号１３）を生成した。ＣＴ２６大腸癌細胞（１×１０６／マウス）をマウス脇腹領域の皮下に移植し、翌日ＳＡＲＴ３およびアジュバント遺伝子搭載ＤＮＡワクチン（ｐＤＮＡ６０μｇ、ＮＰ比＝１０）を腹腔内に投与した。ワクチン接種を繰り返した（１週間間隔で４回）後、２８日目に皮下腫瘍を採取して、ＤＮＡワクチンとmockコントロール群の間で腫瘍重量を比較した。
【００７９】
参考文献
22. Itaka K, Ishii T, Hasegawa Y, Kataoka K (2010) Biodegradable polyamino acid-based polycations as safe and effective gene carrier minimizing cumulative toxicity. Biomaterials 31: 3707-3714.
23. Furugaki K, Pokorna K, Le Pogam C, Aoki M, Reboul M, et al. (2010) DNA vaccination with all-trans retinoic acid treatment induces long-term survival and elicits specific immune responses requiring CD4+ and CD8+ T-cell activation in an acute promyelocytic leukemia mouse model. Blood 115: 653-656.
24. Ohgidani M, Furugaki K, Shinkai K, Kunisawa Y, Itaka K, et al. (2013) Block/homo polyplex micelle-based GM-CSF gene therapy via intraperitoneal administration elicits antitumor immunity against peritoneal dissemination and exhibits safety potentials in mice and cynomolgus monkeys. J Control Release 167: 238-247.
【００８０】
結果
ポリプレックスミセルの特徴付け
ＰＥＧ−Ｐ［Ａｓｐ（ＤＥＴ）］、Ｐ［Ａｓｐ（ＤＥＴ）］およびｐＤＮＡ（５０μｇ）混合ポリプレックス（ブロック／ホモ＝７／３、ＮＰ＝１０）は、直径９１．３±３．１６ｎｍのミセルを形成した。ポリプレックスミセルは、中性ζ−電位値１．５５±１．１６（ｍＶ）を示した。
【００８１】
ポリプレックスミセルの組織局在および遺伝子発現
ミセル化した蛍光標識ＰＥＧ−Ｐ［Ａｓｐ（ＤＥＴ）］、Ｐ［Ａｓｐ（ＤＥＴ）］およびｐＤＮＡ（５０μｇ）混合ポリプレックス（ブロック／ホモ＝７／３、ＮＰ＝１０）は、脾臓およびリンパ節に主に局在した（図１Ａ）。本発明者らは、ＧＭ−ＣＳＦ  ｐＤＮＡ内包ポリプレックスミセルのｉ．ｐ．投与の１日、３日、７日後に、種々の正常器官組織をｑＲＴ−ＰＣＲ解析し、治療遺伝子：ＧＭ−ＣＳＦの発現レベルおよび分布を調べた。ポリプレックスミセルは、Mockコントロール群と比較して、リンパ節において２０倍高いＧＭ−ＣＳＦ発現および脾臓において２４倍高いＧＭ−ＣＳＦ発現を認めた（図１Ｂ）。一方、肺（図１Ｂ）、肝臓および腎臓において、有意な発現亢進を検出しなかった。
【００８２】
ＳＡＲＴ３、ＣＤ４０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を内包するポリプレックスミセル搭載ＤＮＡワクチンは、腹膜播種マウスの生存期間を延長する
本発明者らは、ＣＴ２６癌の腹膜播種マウスの生存期間を比較した（表３）。ＳＡＲＴ３のみを内包するポリプレックスミセル（３８．７±６．９日）、ＣＤ４０Ｌのみを内包するポリプレックスミセル（４４．０±９．９日）またはＧＭ−ＣＳＦのみを内包するポリプレックスミセル投与群（４４．３±１３．３日）は、Mock対照群（３２．５±９．８日）と比較して、生存期間を有意に延長しなかった。さらに、ＣＤ４０Ｌ＋ＧＭ−ＣＳＦ（３９．１±１０．３日）、ＳＡＲＴ３＋ＣＤ４０Ｌ（３６．０±９．１日）、Mock対照群と比較して、有意な生存期間の延長を認めなかった。ＳＡＲＴ３＋ＣＤ４０Ｌ＋ＧＭ−ＣＳＦの３遺伝子を内包するポリプレックスミセル投与群（６２．７±１９．１日）、およびＳＡＲＴ３＋ＧＭ−ＣＳＦ内包ミセル群（５０．３±９．８日）がMock対照群（３２．５±９．８日）と比較して、有意に長い生存期間を達成した（図６Ａ）。カプラン・マイヤー分析により、ＳＡＲＴ３またはＹＢ−１＋ＣＤ４０Ｌ＋ＧＭ−ＣＳＦを搭載するＤＮＡワクチン群が、Mock対照群より有意に生存率の向上を認めている（Ｐ＝０．００００３、図２Ｂ左パネル）。一方、単一遺伝子を有するポリプレックスミセル（図２Ｂ  右パネル）またはポリプレックスミセルを有さない裸プラスミド（ＳＡＲＴ３／ＣＤ４０Ｌ＋ＧＭ−ＣＳＦ）（データ非公開）のいずれによっても、生存率の改善は認められなかった。
【００８３】
【表３】
2016516667.tif 000004
【００８４】
値を、生存中央値についての平均±ＳＤとして表す（ｎ＝６〜１９）。
＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０００１  対  Mock対照群
ＳＡＲＴ３：Ｔ細胞により認識される扁平上皮癌抗原-３
【００８５】
ＳＡＲＴ３、ＣＤ４０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を内包するポリプレックスミセル搭載ＤＮＡワクチンは皮下腫瘍の増大を阻害する。
図２Ｃにおいて示す通り、本発明者らは、ＣＴ２６またはＬＬＣ／３ＬＬ皮下腫瘍モデルにおいて、ＤＮＡワクチンの腫瘍増大抑制効果も調べた。図２Ｄ（左パネル）に示す通り、腹膜播種モデルと同様に、ＳＡＲＴ３、ＣＤ４０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦの組合せを搭載するＤＮＡワクチンは、Mock対照群と比較して、ＣＴ２６皮下腫瘍の増大を有意に抑制した（０．２２±０．１７ｇ対１．３±０．４６ｇ、Ｐ＝０．０００１）。一方、ＣＤ４０Ｌ（０．９２±０．２８ｇ、Ｐ＝０．２）、ＳＡＲＴ３（０．８９±０．０９ｇ、Ｐ＝０．０６）、ＧＭ−ＣＳＦ（０．６０±０．４０ｇ、Ｐ＝０．０５）、ＣＤ４０Ｌ＋ＧＭ−ＣＳＦ（０．５８±０．４０ｇ、Ｐ＝０．０５）、ＳＡＲＴ３＋ＧＭ−ＣＳＦ（０．７３±０．１２ｇ、Ｐ＝０．０２）およびＳＡＲＴ３＋ＣＤ４０Ｌ（０．６９±０．４９ｇ、Ｐ＝０．０４５）治療群においては、腫瘍の増大抑制は認められないか、その抑制の程度は小さなものであった。
【００８６】
別のＭＨＣ型および腫瘍種に対してもＤＮＡワクチンが有効か否かを検証するために、本発明者らは、異なるハプロタイプのＭＨＣクラス１であるＨ−２Ｂを有するＣＢ５７／ＢＬ６マウスにおいて、ＬＬＣ／３ＬＬ細胞の皮下腫瘍の増大に対する抑制効果を調べた。図２Ｄ（右パネル）に示す通り、ＬＬＣ皮下腫瘍の増大は、ＳＡＲＴ３、ＣＤ４０Ｌ及びＧＭ−ＣＳＦを搭載するＤＮＡワクチン投与（２．０±１．３ｇ）により、Mock対照群（５．５±１．１ｇ、Ｐ＝０．０００４）と比較して、有意に抑制された。一方、ＳＡＲＴ３（３．７±０．５ｇ）、ＧＭ−ＣＳＦ（５．３±１．５ｇ）、ＣＤ４０Ｌ（５．７±２．７ｇ）、ＣＤ４０Ｌ＋ＧＭ−ＣＳＦ（４．３±３．５ｇ）、ＳＡＲＴ３＋ＧＭ−ＣＳＦ（６．５±３．１ｇ）、またはＳＡＲＴ３＋ＣＤ４０Ｌ（６．４±２．０ｇ）の治療群については、Mock対照群と比較して有意差を認めなかった（図２Ｄ  左パネル）。
【００８７】
ＳＡＲＴ３、ＣＤ４０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を内包するポリプレックスミセル搭載ＤＮＡワクチンはＬＬＣ皮下腫瘍の肺転移を阻害する
ＬＬＣ／３ＬＬ癌は高い転移性形質を有することが報告されており、本発明者らは、ＤＮＡワクチンまたはMock遺伝子を内包するポリプレックスミセルのｉ．ｐ．投与後４週間目に、ＬＬＣ皮下腫瘍マウスにおける肺転移を検索した。予想した通り、組織学的検査により対照群１００％（４／４例）で肺転移が認められた（図３Ａ、左パネル）。一方、ＳＡＲＴ３、ＣＤ４０およびＧＭ−ＣＳＦの組合せを搭載するＤＮＡワクチンを投与した全てのマウスは、肺転移を認めず（０／４例、図３Ａ、右パネル）、腫瘍の増大の抑制も認めている（図２Ｄ、左パネル）。ＤＮＡワクチン群の肺組織に転移結節は認められなかった代わりに免疫細胞が肺組織に多く浸潤していた。従って、本発明者らは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４およびＣＤ８ａについて免疫組織化学分析を行い、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ４およびＣＤ８ａ陽性免疫細胞の浸潤が、Mock対照群と比較して、２倍程度増加していることを見出した（それぞれ、Ｐ＝０．００６、０．０２４、および０．００１、それぞれにおいてｎ＝４、図３Ｂ）。
【００８８】
ＤＮＡワクチンの鼠径部皮下投与は腹膜播種を有するマウスの生存を延長する
左パネルは、ポリプレックスミセル搭載ＤＮＡワクチンが、Mock対照群および生理食塩水対照群と比較して、ＣＴ２６腹膜播種マウスの生存期間を延長したことを示す（ログランク検定：各々、Ｐ＝０．０２およびＰ＝０．００５）。右パネルは、Ｆｌｕｏｌｉｄ標識ポリプレックスミセルが、マウス鼠径部リンパ節に送達されていることを示す（図６Ｂ）。
【００８９】
ＳＡＲＴ３、ＣＤ４０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦを内包するリポソーム搭載ＤＮＡワクチンはＣＴ２６腹膜播種マウスの生存を延長する
リポソーム搭載ＤＮＡワクチンは、Mock対照群（３２．５±９．８日、ログランク検定: Ｐ＝０．０６と比較して、ＣＴ２６腹膜播種マウスの生存期間を延長した（４８．０±１９．５日）。
【００９０】
ＣＴＬおよびＮＫ細胞傷害性はＳＡＲＴ３、ＣＤ４０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を発現するポリプレックスミセル搭載ＤＮＡワクチンにより増強される
ＢＡＬＢ／ｃおよびＣＢ５７／ＢＬ６マウスは正常免疫系を有し、２つの機序：自然免疫および／または獲得免疫による抗腫瘍効果があり得ると仮定した。自然免疫の活性化は獲得免疫の誘導に必須とされるので、まず、本発明者らはＮＫ細胞活性を解析した。ＹＡＣ−１細胞は、マウスリンパ腫に由来し、ＮＫ細胞による殺傷作用に対する感受性が高い。Mock遺伝子、ＳＡＲＴ３遺伝子のみ、またはＣＤ４０Ｌ遺伝子のみを内包するポリプレックスミセルのいずれも、ＮＫ活性を亢進しなかった（図４Ａ、左の上部のパネル）。一方、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子導入、例えば、ＧＭ−ＣＳＦのみ、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＳＡＲＴ３およびＧＭ−ＣＳＦ＋ＳＡＲＴ３／ＣＤ４０Ｌを発現するポリプレックスミセルは、ＮＫ活性を明らかに活性化した（図４Ａ、左上部のパネル）。
【００９１】
本発明者らは、ＣＴＬ活性を高感度に評価できる、ＣＴ２６またはＬＬＣ／３ＬＬの標的細胞を用いたＣＦＳＥに基づく細胞傷害性アッセイを評価方法として用いた。ＣＴ２６皮下腫瘍モデル（図４Ａ、左の一番下のパネル）において、ＣＦＳＥ標識された標的ＣＴ２６細胞は、ＳＡＲＴ３、ＣＤ４０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦの遺伝子搭載ＤＮＡワクチン投与により低減し、その程度は脾細胞エフェクター／標的細胞の比に依存性であったが、Mock対照群、ＧＭ−ＣＳＦのみまたはＧＭ−ＣＳＦ＋ＳＡＲＴ３群では、顕著な変化を認めなかった（図４Ａ、左の一番下のパネル）。ＬＬＣ／３ＬＬ皮下腫瘍モデル（図４Ａ、右の一番下のパネル）において、ＣＦＳＥ標識された標的ＬＬＣ／３ＬＬ細胞は、ＤＮＡワクチン群ではエフェクター／標的細胞比に比例して低減したが、対照群では低減を認めなかった（図４Ａ、右の一番下のパネル）。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＭＨＣハプロタイプ「ｄ」を有し、一方、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ハプロタイプ「ｂ」を有する。これらの結果を合わせて考慮すると、本発明ＤＮＡワクチンが、腫瘍特異的抗原の全配列を使用することで有効な抗原エピトープの同定を省略できるという利点を示しており、また、種々のＭＨＣハプロタイプを持つ患者に対しても投与適応があることを示唆する。
【００９２】
ＹＢ−１遺伝子搭載ＤＮＡワクチンはＣＴＬ活性化および抗腫瘍効果を誘導するためのこのワクチンプラットフォームの有用性を表す
ＤＮＡワクチンプラットフォームが、他のＴＡＡでも機能するかどうかを調べるために、本発明者らは、ＹＢ−１、ＣＤ４０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦの組合せを搭載するＤＮＡワクチンを、ＣＴ２６腹膜播種マウスに投与した。ＳＡＲＴ３を搭載するＤＮＡワクチンと同様に、ＹＢ−１搭載ＤＮＡワクチンは、Mock対照群（３２．５±９．８日）より有意に生存期間（４７．２±１２．８日）を延長し、カプラン・マイヤー分析で有意に生存率の改善を認めている（Ｐ＝０．０２、図２Ｂ  左パネル）。さらに、ＳＡＲＴ３搭載ＤＮＡワクチンで認められたように、高いＣＴＬおよびＮＫ活性が誘発された（図４Ａ）。
【００９３】
同癌再移植(リ・チャレンジ)実験はＤＮＡワクチン治療により拒絶記憶免疫が定着したことを示唆する
ＣＴ２６腹膜播種モデルにおいて、ＳＡＲＴ３、ＣＤ４０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を有するＤＮＡワクチンを接種したマウスにのみ長期生存例が認められた。ＤＮＡワクチン接種マウスはＣＴ２６特異的な拒絶記憶免疫を獲得したかどうかを明らかにするために、長期生存マウスにＣＴ２６癌細胞の再移植（１×１０６細胞）を行い、非ワクチン接種マウス（対照群）と比較した。図４Ｂに示す通り、ＤＮＡワクチン群では、再移植したＣＴ２６癌細胞を完全に拒絶したが（全８例）、対照マウスでは皮下腫瘍が形成された。ＣＴ２６拒絶の機序に関連するデータとして、ＤＮＡワクチン接種マウスのＣＴＬ活性はＮＫ活性と同様に（データ非公開）活性化を認め、その程度はエフェクター／標的細胞比に依存して増大した（図４Ｃ）。一方、対照マウスにおいてはＣＴＬ、ＮＫ活性はいずれも変化しなかった（図４Ｃ）。
【００９４】
ＣＴＬの細胞殺傷活性のＴＡＡおよびＭＨＣ分子に対する特異性
ＣＴＬ活性がＭＨＣ拘束性に生じることを確認するために、本発明者らは、ＭＨＣ（Ｈ−２ＬおよびＨ−２Ｄ）中和抗体を用いて、ＭＨＣ阻害によりＣＴＬ活性の変化を検討した（図４Ｄ）。ＳＡＲＴ３、ＣＤ４０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦ遺伝子発現ＤＮＡワクチンを接種したマウスから単離した脾細胞のＣＴＬ活性は、ＭＨＣ阻害条件下で、対照値の３分の１まで顕著に減退した。ＣＴＬ活性のＴＡＡ特異性を調べるために、本発明者らは、ＳＡＲＴ３標的ｓｉＲＮＡを用いてＣＴ２６細胞でＳＡＲＴ３発現をノックダウンし、ｍＲＮＡ発現がｓｉＲＮＡ対照の３０％まで低下することを確認した。ＣＴＬ活性の低下は、残ったＳＡＲＴ３発現に起因したＭＨＣ阻害ほどではないものの、ＳＡＲＴ３サイレンシングＣＴ２６細胞に対するＤＮＡワクチン治療マウス由来の脾細胞のＣＴＬ活性は、無治療の対照群と比較して低減した（図４Ｄ）。これらの結果は、ＤＮＡワクチンにより誘発されるＣＴＬ活性には、ＭＨＣクラス１分子に提示されたＳＡＲＴ３ペプチドが介在することを示唆する。
【００９５】
免疫組織染色分析は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４、および／またはＣＤ８ａ陽性免疫細胞のリンパ節、脾臓および腫瘍への浸潤がＤＮＡワクチン治療によって亢進することを示す
免疫組織染色法の解析により、リンパ節、脾臓および腫瘍組織において、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４、ＣＤ８ａを発現する免疫細胞の浸潤度の変化が明らかになった（図５）。ＤＮＡワクチン接種７日後の脾臓を除き、対照と比較してＤＮＡワクチン群の７〜２１日のリンパ節および脾臓におけるＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ１１ｃ発現細胞は数倍増加した。腫瘍組織のＣＤ４、ＣＤ８ａ発現は、治療後早期（７日）ではＤＮＡワクチン群とMock対照群の間に有意差は認めなかった。その後１４日（右パネル  写真）および２１日に、ＣＤ４およびＣＤ８ａ陽性細胞数の増加をＤＮＡワクチン群のみで認めている。定量分析の結果（左パネル）は、対照群に比較してＤＮＡワクチン群で腫瘍におけるＣＤ４およびＣＤ８ａの発現レベルがワクチン接種１４日後および２１日後に３〜１０倍高かったことを示す。
【００９６】
遺伝子ワクチンのＴＡＡとしてのＭＵＣ１およびサバイビンの検証
ＭＵＣ１またはサバイビンＴＡＡ遺伝子を搭載したＤＮＡワクチンにより、生存期間は両方ともMock対照群より有意に延長した（それぞれ、３２．３±８．２対２４．９±３．１日、３２．４±６．８対２５．０±３．０日）。カプラン・マイヤー分析において、ＭＵＣ１遺伝子搭載ＤＮＡワクチンおよびサバイビン遺伝子搭載ＤＮＡワクチンは両治療とも生存率を有意に改善することを示し（ログランク検定：図７および図８においてＰ＜０．０５）、これは、ＭＵＣ１およびサバイビンが、ＤＮＡワクチンのための有用なＴＡＡであることを示唆する。
【００９７】
ＣＤ８６分子と、抗ＣＤ２８抗体の可変領域断片の一本鎖が融合したキメラ分子は、アジュバント効果を有する
ＳＡＲＴ３／ｓｃＦｖ２８−ＣＤ８６、ＳＡＲＴ３／ｓｃＦｖ２８−ＣＤ８６／ＧＭ−ＣＳＦおよびＳＡＲＴ３／ｓｃＦｖ２８−ＣＤ８６／ＧＭ−ＣＳＦ／ＣＤ４０Ｌ搭載ＤＮＡワクチン治療群の腫瘍重量は、ＳＡＲＴ３＋ＧＭ−ＣＳＦ＋ＣＤ４０Ｌ搭載ＤＮＡワクチンおよびMock対照群に比較して有意に低かった（図９においてそれぞれ、０．９２±０．１（中央値０．５５）ｇ、０．５９±０．１（中央値０．５１）ｇ、１．２±０．９（中央値０．５５）ｇ対２．４±０．３（中央値２．５）ｇ、５．２±０．２（中央値５．０）ｇ）。これらの結果は、ｓｃＦｖ２８−ＣＤ８６キメラ遺伝子が、ＤＮＡワクチンのアジュバント効果を有することを示唆する。
【００９８】
考察
本発明者らは、本研究において新規ＤＮＡワクチンを構築した。腹膜播種マウスモデルにおいて、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）：ＳＡＲＴ３またはＹＢ−１遺伝子ならびにＣＤ４０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦアジュバント遺伝子を搭載したＤＮＡワクチンは、ＣＴＬ活性化を介して生存期間を延長し、再移植腫瘍細胞を完全に拒絶したことから、腫瘍特異的な拒絶記憶免疫を誘導できることが示唆された。ＤＮＡワクチン治療は、皮下腫瘍モデルにおいてＣＴＬを活性化してＣＤ４およびＣＤ８ａ陽性Ｔリンパ球を皮下腫瘍および肺組織へ浸潤させる。中和抗体を用いてＣＤ４およびＣＤ８ａ陽性細胞を阻害すると、ＤＮＡワクチンの抗腫瘍効果は消失した。これらの結果は、ＴＡＡ、ＣＤ４０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の組合せを内包する高分子ミセルが特異的抗腫瘍免疫を活性化するＤＮＡワクチンとして機能することを示している。
【００９９】
ペプチドワクチンの場合はＴＡＡの弱い免疫原性を増感するために、フロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバントを同時に投与する［参考文献２５］。細胞ワクチンの場合、ウイルス成分および細菌成分、例えば、ｐＣｐＧモチーフが、アジュバントとして働き得るし［参考文献２６］、ＤＣ細胞自体も抗原提示能を有する［参考文献１］。遺伝子ワクチンについては、弱い抗原性の問題を解決するために、アジュバント効果、例えば、ポリユビキチン化配列［参考文献２７］およびスカベンジャー分子についての熱ショックタンパク質［参考文献２８］を発現する方法が報告されている。本研究において、本発明者らは、ミセル型遺伝子担体を用いて、ＴＡＡ、サイトカインおよび共（副）刺激因子を組み合わせていくつかの発現の組み合わせを試みた。細胞ワクチン臨床試験において、サイトカインＧＭ−ＣＳＦまたは共（副）刺激分子ＣＤ４０Ｌが、抗原提示能を亢進することが報告されている［参考文献２９、３０］。それ故、本発明者らはまずＴＡＡ、ＣＤ４０ＬまたはＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を単体で内包する高分子ミセルを検討したが、腫瘍の増大の抑制が認められず（図２Ｄ）、生存期間の延長も認められなかった（図２Ｂ  右パネル、表３）。一方、ＴＡＡ、ＣＤ４０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦの３つの遺伝子の組合せは、ＤＮＡワクチンで治療したマウスの４０％において播種の長期生存（治癒）をもたらし（図２Ｂ  左パネル）、肺転移を防止した（図３）。本発明者らは、ＴＡＡ／ＣＤ４０Ｌ／ＧＭ−ＣＳＦ添加ミセルのｉ．ｐ．投与という単純なワクチン接種法を初めて発明した。
【０１００】
本発明者らは、この研究において、様々な癌において過剰発現する２つの遺伝子をＴＡＡの候補として検討した。ＳＡＲＴ３に関しては、ワクチン効果を誘導するエピトープペプチドの配列が報告されている［参考文献３１］。ワクチン効果を誘導する可能性のあるＹＢ−１のエピトープペプチド配列は不明であるが、神経膠芽腫患者におけるＳＥＲＥＸ分析によりＹＢ−１に抗原性がある可能性が報告されている［参考文献３２］。ｉｎ  ｖｉｖｏでＴＡＡ遺伝子を導入すれば、ＴＡＡ遺伝子コードタンパク質が細胞質において発現し、エンドソームで断片化ペプチドに分解され、種々のタイプのＭＨＣ分子に提示されることになる。ＢＡＬＢ／ｃおよびＣＢ５７／ＢＬ６マウスの両腫瘍モデルにおいて、ＣＴＬ活性化を介した抗腫瘍効果が本発明者らの見出したＤＮＡワクチン組成遺伝子により誘導された。これは、遺伝子導入によりＳＡＲＴ３およびＹＢ−１抗原が発現し、複数のエピトープペプチドを生じ、異なるハプロタイプのＭＨＣに結合して表面に出て、腫瘍抗原を強く免疫細胞に提示したことに由来するものと考えられる。さらに、全ゲノムマイクロアレイおよび配列シーケンスにおける近年の技術進歩により、多くのＴＡＡとしての候補遺伝子のスクリーニングが可能になりつつある［参考文献３３］。ペプチドワクチンと違って、ＴＡＡ遺伝子のスクリーニングは、網羅的に可能であり、遺伝子ワクチンはＭＨＣハプロタイプに関わらず、全ての患者に適応することができる。
【０１０１】
ナノサイズ化された担体デバイスは、ｉ．ｐ．投与後、リンパ管に吸収されるという特性を有するという報告がある［参考文献３４］。例えば、マンノースリガンドで囲まれた超音波応答性リポソームは、網内系（例えば、脾臓）に取り込まれ、リポソームが超音波刺激により放出されるとき、導入遺伝子を放出する［参考文献３５］。既に示されたように［参考文献２４］、ブロック／ホモポリプレックスミセルは、ｉ．ｐ．投与後にリンパ節および脾臓に多くは運ばれるという特徴を有する。その後、ミセルの一部はＤＣ細胞に取り込まれ（図１）、発現したＧＭ−ＣＳＦとＣＤ４０Ｌの協調刺激により、ＤＣ細胞におけるＴＡＡに対する免疫不応答性が改善すると予想される。この可能性は、ミセル投与後早期にＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ１１ｃ陽性免疫細胞のリンパ節および脾臓での増加を認めた免疫組織染色の結果（図５）により、支持される。ＧＭ−ＣＳＦなしの治療群は、ＮＫ活性を活性化しなかったので、導入されたＧＭ−ＣＳＦは、ＤＣ細胞を成熟させるばかりでなく、ＮＫ細胞も刺激すると考えられる（図４Ａ）。自然免疫が活性化されたうえで、ＤＣ細胞におけるＴＡＡ／ＭＨＣクラス１および２ならびにＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌからの両シグナルがＣＤ８リンパ球およびＣＤ４リンパ球に活性化シグナルを伝達すると思われる。再移植した腫瘍細胞が完全な拒絶されたという結果は、本発明者らのＤＮＡワクチン組成が特異的拒絶記憶免疫を誘発したことを意味するが、腫瘍組織におけるヘルパー（ＣＤ４＋）Ｔリンパ球および細胞傷害性（ＣＤ８ａ＋）Ｔリンパ球の増加および浸潤という結果がこの可能性を裏付けている（図５）。
【０１０２】
本研究において、本発明者らは、外科的切除後補助治療としての臨床応用を想定したワクチン接種プロトコールを設計し検討した。癌の進行に伴って腫瘍微小環としては免疫抑制の方向にバランスシフトし、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）が増加すると報告されているが［参考文献３６、３７］、本発明者らの予備実験によると癌細胞の移植の１週間後まではＴｒｅｇ細胞の増加は認めていない（データ非公開）。
【０１０３】
参考文献
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【０１０４】
図面の説明
図１  ポリプレックスミセルのｉｎ  ｖｉｖｏでの分布および遺伝子発現
（Ａ）マウス腹腔内にｐＤＮＡを内包するＦｌｕｏｌｉｄ標識ポリプレックスミセル（５０μｇ、Ｎ／Ｐ比＝１０）を投与した。２４時間後、器官組織をスナップ凍結して、蛍光レーザー共焦点顕微鏡下に組織分布を調べた。また、切片を抗ＣＤ１１ｃ抗体で免疫染色して、ポリプレックスミセルと樹状細胞の共局在性を検討した。ポリプレックスミセルは、脾臓（左パネル）およびリンパ節（中央パネル）に主に局在し、マージ画像処理は、リンパ節におけるポリプレックスミセルと樹状細胞の共局在を示す（右パネル）。（Ｂ）ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を内包するポリプレックスミセルのｉ．ｐ．投与の２４時間後に採取した凍結組織から総ＲＮＡを抽出し、作成したｃＤＮＡ試料をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析にかけた。主に脾臓およびリンパ節においてＧＭ−ＣＳＦの発現は亢進し、肺および他の器官においてはほとんど検出されなかった。
【０１０５】
図２  腹膜播種および皮下腫瘍マウスにおけるポリプレックスミセル搭載ＤＮＡワクチンの抗腫瘍効果
（Ａ）図は、ＣＴ２６腹膜播種モデルにおける治療用遺伝子（表３）を発現するポリプレックスミセル搭載ワクチンの接種スケジュールを示す。（Ｂ）カプラン・マイヤー生存曲線は、ＳＡＲＴ３、ＣＤ４０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦを搭載するＤＮＡワクチンが、Mock対照群と比較して、ＣＴ２６腹膜播種マウスの生存期間を有意に延長したことを示す（左パネル）。単一遺伝子導入群は生存率の有意な改善を認めなかった（右パネル）。（Ｃ）図は、ＣＴ２６およびＬＬＣの皮下腫瘍モデルにおける治療用遺伝子を内包するポリプレックスミセル搭載ワクチンの接種スケジュールを示す。（Ｄ）１４日目のＣＴ２６癌の腫瘍重量は、Mock対照群または単一遺伝子治療群に比較してＤＮＡワクチン群で有意に少なかった（左パネル）。ＬＬＣ皮下腫瘍重量は、Mock対照群または単一遺伝子治療群に比較して、ＤＮＡワクチン治療群で有意に低下した（右パネル）。
【０１０６】
図３  ＬＬＣ腫瘍の肺転移に対するポリプレックスミセル搭載ＤＮＡワクチンの阻害効果
（Ａ）ＬＬＣ癌の皮下接種の２８日後に、図示したＤＮＡワクチンまたはMock遺伝子をを投与されたマウスから肺組織を得た。ＨＥ染色により、肺転移はMock対照群マウスにおいて高度に発生し（４／４例、左パネル）、ＤＮＡワクチン群において検出されなかったこと（０／４例、右パネル）が示されている。（Ｂ）免疫組織染色により、ＣＤ４およびＣＤ８ａ陽性Ｔリンパ球の肺組織浸潤は、Mock対照群（左パネル）と比較して、ＤＮＡワクチン群（右パネル）で増加したこと（それぞれ、Ｐ＜０．０５およびＰ＜０．０１）が示されている。
【０１０７】
図４  ポリプレックスミセル搭載ＤＮＡワクチンによる、ＮＫおよびＣＴＬ活性の活性化とＴＡＡ特異的な拒絶記憶免疫の獲得
（Ａ）ＣＴ２６およびＬＬＣ皮下腫瘍を保有するマウスから脾細胞（エフェクター細胞）を単離し、図示したエフェクター／標的細胞比にて、照射したＣＳＦＥ標識ＣＴ２６またはＹＡＣ−１（標的細胞）と共培養し、フローサイトメトリーを通じてＣＴＬまたはＮＫアッセイを行った。ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を導入しいた全ての治療群において、ＮＫ活性（上部のパネル）は増大された。一方、ＣＴＬ活性（下側のパネル）は、ＳＡＲＴ３またはＹＢ−１、ＣＤ４０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を内包するポリプレックスミセル（ＤＮＡワクチン群）においてのみエフェクター／標的細胞比に依存した活性化を認めた。（Ｂ）８０日より長く生存したマウスにおいて、ＣＴ２６細胞を脇腹の皮下に再移植し、皮下腫瘍の形成をさらに６０日間モニターした。ＤＮＡワクチン群マウスにおいて特異的拒絶が認められ、対照群では認められなかった。（Ｃ）図２Ａと同じく、ＣＴ２６の再移植後に脾細胞を単離し、ＣＦＳＥ標識標的ＣＴ２６細胞と共培養してＣＴＬ活性を評価した。ＤＮＡワクチン接種長期生存マウスのＣＴＬ活性は亢進したが、ワクチン非接種の対照群マウスでは亢進を認めなかった。（Ｄ）抗ＭＨＣクラス１（Ｈ−２ＬおよびＨ−２Ｄ）抗体を用いたブロッキングまたはｓｉＲＮＡトランスフェクションによるＳＡＲＴ３ノックダウンを行った後のＣＴＬアッセイによって、ＭＨＣ拘束性およびＴＡＡ特異的なＣＦＳＥ標的細胞殺傷性を確認した。
【０１０８】
図５  腫瘍および免疫器官組織に浸潤した免疫細胞の免疫組織化学分析
脾臓、リンパ節および腫瘍組織の切片を作成し、図示した抗体を用いて免疫染色した。ある一定の閾値を上回るタンパク質発現シグナルをデジタル化し（右パネルにおける赤色）、ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔプログラムを用いて、シグナルの強さによりタンパク質の発現レベルを定量化した（左パネル）。
【０１０９】
図６  ＳＡＲＴ３、ＣＤ４０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦを内包するリポソーム搭載ＤＮＡワクチンの腹腔内投与、ならびに鼠径部皮下投与の治療効果
（Ａ）製造元のプロトコールに従い、ＳＡＲＴ３、ＣＤ４０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦのｐＤＮＡ（計５０μｇ）をリポソーム（Ｃｏａｔｓｏｍｅ  ＥＬ−０１−Ｃ、日油株式会社）で内包した。ポリプレックスミセル搭載ＤＮＡワクチンと同様に、ＣＴ２６腹膜播種担癌マウスモデルにおいてリポソーム搭載ＤＮＡワクチンを腹腔内投与した。リポソーム搭載ＤＮＡワクチンは、Mock対照群と比較して生存期間を延長した（４８．０±１９．５日 対 ３２．５±９．８日、ログランク検定:Ｐ＝０．０６）。（Ｂ）Ｎ／Ｐ比１０にて、ＳＡＲＴ３、ＣＤ４０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦのｐＤＮＡ（計５０μｇ）をＰＥＧ−ｂ−［Ｐａｓｐ（ＤＥＴ）］／Ｐａｓｐ（ＤＥＴ）で内包した。ＣＴ２６腹膜播種マウスモデルにおいて、ポリプレックスミセル搭載ＤＮＡワクチンを鼠径部皮下投与した。左パネルは、ポリプレックスミセル搭載ＤＮＡワクチンがMock対照群および生理食塩水対照に比べて生存期間を延長したことを示す（ログランク検定で、それぞれ、Ｐ＝０．０２およびＰ＝０．００５）。右パネルは、Ｆｌｕｏｌｉｄ標識ポリプレックスミセルは、マウスの鼠径部リンパ節に送達されたことを示す。
【０１１０】
図７  カプラン・マイヤー生存曲線
ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内にＣＴ２６大腸癌細胞を移植した。１週間後マウスＭＵＣ１／ＣＤ４０Ｌ／ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子搭載ポリプレックスミセルを腹腔内投与し、マウスの生存期間をモニターした。カプラン・マイヤー分析は、ＭＵＣ１搭載ＤＮＡワクチンについて、生存率が有意に改善されたことを示し（ログランク検定：Ｐ＜０．０５）、これはＭＵＣ１がＤＮＡワクチンのための有用なＴＡＡであることを示唆する。
【０１１１】
図８  カプラン・マイヤー生存曲線
ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内にＣＴ２６大腸癌細胞を移植した。１週間後、マウスサバイビン／ＣＤ４０Ｌ／ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子搭載ポリプレックスミセルを腹腔内投与し、マウスの生存期間をモニターした。カプラン・マイヤー分析は、サバイビン搭載ＤＮＡワクチンについて、生存率が有意に改善されたことを示し（ログランク検定：Ｐ＜０．０５）、これはサバイビンが、ＤＮＡワクチンのための有用なＴＡＡであることを示唆する。
【０１１２】
図９  ＣＴ２６皮下腫瘍
ＣＴ２６大腸癌細胞をわき腹領域の皮下に移植し、１日後、マウスの腹腔内に、ＳＡＲＴ３および図示したアジュバント遺伝子を内包しているブロック／ホモ混合ポリプレックスミセル（ｐＤＮＡ６０μｇ、ＮＰ比＝１０）を投与した：（Ａ）アジュバント＝ＣＤ４０Ｌ＋ＧＭ−ＣＳＦ、および（Ｂ）アジュバント＝「２８＝ｓｃＦｖ２８−ＣＤ８６キメラ」。腫瘍重量は、ＳＡＲＴ３／ｓｃＦｖ２８−ＣＤ８６、ＳＡＲＴ３／ｓｃＦｖ２８−ＣＤ８６／ＧＭ−ＣＳＦおよびＳＡＲＴ３／ｓｃＦｖ２８−ＣＤ８６／ＧＭ−ＣＳＦ／ＣＤ４０Ｌ搭載ＤＮＡワクチン群が、ＳＡＲＴ３／ＧＭ−ＣＳＦ／ＣＤ４０ＬまたはMock対照群より有意に低かった（それぞれ、０．９２±０．１（中央値０．５５）ｇ、０．５９±０．１（中央値０．５１）ｇ、１．２±０．９（中央値０．５５）ｇ対２．４±０．３（中央値２．５）ｇ、５．２±０．２（中央値５．０）ｇ）。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本データは、マウス腫瘍モデルにおいて、ＴＡＡ（ＳＡＲＴ３またはＹＢ−１）、ＣＤ４０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の組合せを内包するミセルを用いたＤＮＡワクチン遺伝子治療の効用を明らかにした。ＤＮＡワクチンは、腹膜播種担癌マウスの生存期間を延長し、ＣＴＬ活性化およびＣＤ４およびＣＤ８ａ陽性リンパ球（ＣＴＬ）の腫瘍への浸潤を誘導し、皮下腫瘍の増大および転移を阻害した。ＴＡＡ／ＣＤ４０Ｌ／ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子内包ミセルが、難治性の癌に対して抗腫瘍免疫を活性化して治療効果を発揮するための新規ＤＮＡワクチンプラットフォームとなると結論付けられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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