(57)【要約】  本発明は、対象物の病因を検出するための新規病因モデル、方法またはキットに関する。特に本発明は、宿主定量基準量に対するデュアル病原体標的量の比率に由来する、病原体インデックスを提供する。病原体インデックスは、カンキツグリーニング病（ＨＬＢ）を含む、いかなる疾患の診断、予測及び／または治療戦略にも用いられる。また、カンキツグリーニング病を治療または予防するための薬剤の研究手段及びスクリーニング法、ならびに、カンキツグリーニング病の治療または予防法も提供する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む生体試料の病因検出方法：
ａ）病原体の定量的測定値を決定するために、第一の生物体に特異的な核酸の、試料中における量を定量すること（前記第一の生物体は病原体であり、第二の生物体と関連しており、前記第一の生物体と前記第二の生物体は協働して宿主生物体に影響を及ぼす）、
ｂ）病原体に対する宿主生物応答に特異的な核酸の、試料中における量を、疾患の前記病原体と関連した標的のための複合評価法を決定するために定量すること、及び、
ｃ）前記宿主定量測定量に対する前記デュアル病原体標的量の比率を計算すること（前記比率は、病因を検出するための病原体インデックスを提供する）。
【請求項２】
前記病原体インデックスは、前記病因の予後予測を示すかまたは薬物療法有効性及び薬スクリーニングのために用いることができる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一の微生物に特異的な核酸の試料中における量の前記定量が、核酸増幅反応において、前記試料から得た核酸を第一組のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることにより実行され、前記第一組のオリゴヌクレオチドは、第一の微生物の核酸と少なくとも部分的に相補的であり、前記第二の微生物に特異的な核酸の試料中における量の前記定量が、核酸増幅反応において、前記試料から得た核酸を 第二組のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることにより実行され、前記第二組のオリゴヌクレオチドは、前記第二の微生物の核酸と少なくとも部分的に相補的であり、前記第三の宿主生物に特異的な核酸の試料中における量の定量が、核酸増幅反応において、試料から得た核酸を第三組のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることにより実行され、前記第三組のオリゴヌクレオチドは、前記第三の微生物の核酸と少なくとも部分的に相補的であり、さらに核酸増幅反応からアンプリコンを検出すること（前記増幅反応は同じ容器内で起こる）、及びアンプリコンの相対数に基づいた宿主負荷の量に対する病原体比率量の比率を算出して、前記病原体インデックスまたは四分位値を誘導することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記病原体有機体が、ウイルスまたは細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記宿主生物が、細菌、植物、または動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記病因が、カンキツグリーニング病、または、Ｈｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎ（ＨＬＢ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記宿主生物が、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ（ＬＡＳ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記病原体微生物が、ファージ、ウイルス、及び、ＬＡＳと病因的に関連する、任意の誘導物質または因子遺伝子からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第二の微生物が、バクテリオファージである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記バクテリオファージが、ＳＣ１、ＳＣ２、及び、ＳＣ３溶菌ファージからなる群から選択される溶菌ファージである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸が、ＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸増幅反応が、リアルタイムＰＣＲ、リコンビナーゼ・ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ヘリカーゼ依存増幅（ＨＡＤ）、ループ仲介等温線増幅（ＬＡＭＰ）、及び、切断酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
臨床有用性を治療戦略もしくは薬剤スクリーニングとして提供する、病原体インデックスまたは四分位値と相関するレポートアルゴリズムもしくはインデックスをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記病原体微生物の誘導物質に特異的な核酸の試料中における量を定量して、誘導物質負荷を決定するステップをさらに含み、前記病原体インデックスと前記誘導物質負荷が、予後予測を決定し、治療戦略もしくは薬剤スクリーニングとしての臨床有用性を提供するために前記レポートインデックスと相関する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記病原体微生物に特異的な複数の固有な核酸、前記宿主生物、もしくは前記誘導物質が、前記レポートインデックスにおいて定量され、相関される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
以下を含む、試料中の病因を検出するためのキット：
ａ）病原体定量測定値を決定するための、少なくとも第一組のオリゴヌクレオチド（前記オリゴヌクレオチドは、試料中の第一の病原体微生物の核酸と少なくとも部分的に相補的であり、前記第一の病原体微生物は、第２の微生物と病原的に関係し、これら２つの病原体は協働して宿主生物に影響を及ぼす）、
ｂ）少なくとも第二組のオリゴヌクレオチド（前記オリゴヌクレオチドは、疾患の病原体に対する前記宿主生物反応の核酸と、少なくとも部分的に相補的である）、
ｃ）前記第一組のオリゴヌクレオチドと前記第二組のオリゴヌクレオチドとの核酸増幅反応のための試薬、
ｄ）前記核酸増幅反応を実施し、その一つ以上のアンプリコンを検出するための指示書、及び、
ｅ）前記宿主定量測定値に対する、前記アンプリコンもしくはデュアル病原体標的の量の比率を算出するための指示書（前記比率は、前記病因の検出、予後予測、薬剤スクリーニング、及び治療戦略もしくは効能のための、病原体インデックスを提供する）。
【請求項１７】
前記病因が、カンキツグリーニング病またはＨＬＢである、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
抑制されたファージ溶菌サイクルにあるバクテリオファージを有する、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ培養菌を提供すること、前記培養菌を治療薬候補の候補と混合すること、及び、前記治療薬候補が前記カンキツグリーニング病（ＨＬＢ）を阻害または予防することを示す、前記Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ培養菌の成長抑制を検出することを含む、カンキツグリーニング病（ＨＬＢ）を阻害または予防するための治療薬候補のスクリーニング法。
【請求項１９】
前記バクテリオファージが、ＳＣ１、ＳＣ２、及び、ＳＣ３溶菌ファージから成る群から選択される溶菌ファージである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ファージ溶菌サイクルが、抑制されるかまたは遺伝的に削除されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
細菌、植物または動物個体のバクテリオファージ感染の治療方法であって、ウイルス複製を選択的に阻害するヌクレオシド、非ヌクレオシド、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、リボヌクレオシド及びリボヌクレオシドの類似体からなる群から選択される薬剤の有効量を含む組成物を、それを必要としている前記個体に投与することを含む、方法。
【請求項２２】
植物のウイルス感染の治療方法であって、ウイルス複製を選択的に阻害するヌクレオシド、非ヌクレオシド、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、リボヌクレオシド及びリボヌクレオシドの類似体からなる群から選択される薬剤の有効量を含む組成物を、それを必要としている前記植物に投与することを含む、方法。
【請求項２３】
ウイルス複製を選択的に阻害するヌクレオシド、非ヌクレオシド、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、リボヌクレオシド及びリボヌクレオシドの類似体からなる群から選択される薬剤の有効量を含む組成物を、それを必要としているカンキツ類の木に投与することを含む、カンキツグリーニング病の治療方法。
【請求項２４】
前記組成物が、ヒドロキシ尿素、または他のヌクレオチドプール還元剤の有効量をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物が、対象の目標とされた位置への前記組成物の送達を促進するための界面活性剤または浸透剤をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ウイルス複製を選択的に阻害するヌクレオシド、非ヌクレオシド、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、リボヌクレオシド及びリボヌクレオシドの類似体からなる群から選択される薬剤の有効量から成っている組成物を、それを必要としているカンキツ類の木に投与することから成る、カンキツグリーニング病の予防方法。
【請求項２７】
前記組成物が、ヒドロキシ尿素、もしくは他のヌクレオチドプール還元剤の有効量をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物が、対象の標的とされる位置への前記組成物の送達を促進するための界面活性剤または浸透剤をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１０月３０日出願され、“Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｉｔｒｕｓ  Ｇｒｅｅｎｉｎｇ  Ｂｌｉｇｈｔ”（カンキツグリーニング病のための原因定量化システム及び治療方法）と題する、米国特許仮出願第６１／８９７，６２６号に対する優先権を主張し、当該仮出願の内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は特に、寄主植物及び哺乳類に病原性である、ファージ及び細菌の検出及び制御に関する。
【０００３】
本発明は、カンキツグリーニング病、別名Ｈｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎｇ（ＨＬＢ）、の関連において例証され、さらにより一般的には、デュアル病原体：病因の多重宿主定量化比率由来の病原性インデックス、または、特に四分位値の診断及び治療のため、第二に薬剤開発、及び薬剤候補の認定のための研究ツールとして設計された病因の四分位値を決定することに基づいた、試験及び治療方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
カンキツグリーニング病、別名Ｈｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎｇ（ＨＬＢ）は、世界中の柑橘類の植物の致死疾患であり、感染した木の重大な果物損失及び枯死を引き起こす。ＨＬＢ感染は、木の葉、小枝及び実に影響を及ぼし、最終的に木全体を衰えさせる。ＨＬＢの症状は、シミだらけでまだら、そして葉脈が黄色い葉、不均衡で緑で小さく、塩味と苦味のある果物、小枝の枝枯れ、及び全体的な発育阻害及び衰弱を含む。幾つかのＨＬＢの症状が、栄養欠乏を含む他の木の病気の症状と類似しているため、ＨＬＢの診断は複雑である。ＨＬＢ管理はしばしば、感染後数年間ＨＬＢの症状を示すことさえしない感染木を処分することを必要とする。
【０００５】
ポリメラーゼ連鎖反応法診断試験は、ＨＬＢの症状に関連する主要な病原体を、Ｃａ．Ｌ．ａｓｉａｔｉｃｕｓ（ＬＡＳ）、Ｃａ．Ｌ．ａｆｒｉｃａｎｕｓ、及びＣａ．Ｌ．ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ種を含む細菌、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ種として特定した。これらの細菌は、柑橘類の木の師部及び葉軸の養分移行を損なうと考えられており、植物病状は、栄養不足によって生じると思われる。推定される病因細菌の抗生管理は、受動的な解決案であるあるが、有望な解決案では決してありえない高価な木立管理の手段である。 Ｃａ．Ｌ．の柑橘類における複製レベルは低いため、それらの存在を検出するためには、高感度な方法を用いる必要がある。Ｃａ．Ｌ．ａｓｉａｔｉｃｕｓ細菌の検出のために使用されているＰＣＲベースの方法には、定性ＰＣＲ分析（Ｓａｐｏｎａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９３（２）：４７８-８６）、及び組織-ブロット診断（Ｎａｇｅｓｗａｒａ-Ｒａｏ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、２０１３、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅ．２７（５-６）：１７６-８３）がある。これらはそれぞれ参照によって、本明細書に組み込まれる。
【０００６】
バクテリオファージまたはファージは、細菌に感染するウイルスである。大多数は、ＤＮＡウイルスである。各ファージは特定の種のみ、または多くの場合その種内のある特定の株のみを侵す。構造的には、バクテリオファージまたはファージは、薄いタンパク質膜で囲まれたＤＮＡからなる多角形の頭部、及びタンパク質からなる短いまっすぐな尾部から成る。しかし、球面及び線状のファージもまた報告されている。バクテリオファージのライフサイクルは、 植物性サイクル及び溶原化サイクルの二つのサイクルを含む。植物性サイクルにおいて、ファージは毒性ファージと呼ばれ、このサイクルは装着（吸着）、浸透、衰退期、複製、組立及び解放のステップを含む。溶原化サイクルにおいて、ファージは溶原ファージと呼ばれており、サイクルは装着（吸着）、浸透、衰退期を含み、植物性サイクルの毒性ファージとは異なり、衰退期の後の溶原ファージは複製せず、代わりに細菌の染色体に組み込まれて、しばらくの間潜伏したままでいる。組み込まれたファージはプロファージと呼ばれ、プロファージを担持している細菌は、溶原菌と呼ばれる。溶原菌は、溶菌せず、染色体の一部としてプロファージを有して成長し、増殖する。溶原菌は新規な特性を得る場合があり、プロファージは毒性ファージに戻る場合があり、感染した細菌は溶菌する場合がある。バクテリオファージの実用的な応用例は、それらに限定されるものではなく、バクテリオファージ分類、細菌のファージグループへの分類、ファージ溶原変換、ファージ治療、そして、クローニングベクターとしての応用を含む。
【０００７】
ブドウ球菌及び腸共生バクテリアＥ．ｆａｅｃａｌｉｓと関連しているようなバクテリオファージは、宿主の病原性に影響を及ぼし得る宿主菌のライフサイクルにおける重要な要因とみなされる（Ｄｅｇｈｏｒａｉｎ  ＆  Ｍｅｌｄｅｒｅｎ、２０１２、Ｖｉｒｕｓｅｓ  ４：３３１６-３５、Ｄｕｅｒｋｏｐ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＮＡＳ  １０９（４３）：１７６２１-６２６）。ＨＬＢの症状を示す柑橘類から誘導されるＣａ．Ｌ．ａｓｉａｔｉｃｕｓゲノムの分析は、二つの円形ファージゲノム、ＳＣ１及びＳＣ２の存在を明らかにした（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ-Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ２４（４）：４５８-６８）。カンキツグリーニング病と関連した非培養の、細菌様の微生物（ＢＬＯ）の三つのＤＮＡフラグメント（Ｉｎ-２．６、Ｉｎ-１．０、Ｉｎ-０．６）がクローニングされ、ヌクレオチド配列決定は、カンキツグリーニング病を伴う非培養ＢＬＯのゲノムが、ｎｕｓ-ＧｒｐｌＫＡＪＬ-ｒｐｏＢＣ遺伝子集団及びバクテリオファージ型ＤＮＡポリメラーゼのための遺伝子を含むことを示した （Ｖｉｌｌｅｃｈａｎｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３、Ｃｕｒｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２６（３）：１６１-６）。これら全ての内容は、参照により本明細書に組み込まれる。Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｓ  ＢＴ-１の完全なゲノムが配列決定され、チアミン及び必須アミノ酸生合成のより多くの遺伝子、ならびに２つのプロファージ領域を含む（Ｌｅｏｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２、Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ７：２７１-８３）。この全ての内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００８】
以上を考慮すると、ＨＬＢ診断方法及び根絶方法ならびに当該疾患のための組成物、ならびにより一般的には病原体病原性宿主が媒介する疾患系のための、診断及び治療方法ならびに組成物に対する必要性が本技術分野に依然として残っている。
【発明の概要】
【０００９】
本明細書において記載される様々な実施形態は、診断、予後予測、薬剤スクリーニング及び治療の方法のための新規病因モデル、及び生体試料の病因を検出するために有用な、関連したアルゴリズムを提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、以下を含む、生体試料の病因を検出するための方法を提供する：ａ）病原体の定量的測定値を決定するために、第一の生物体に特異的な核酸の、試料中における量を定量すること（第一の生物体は病原体であり、第二の生物体と関連しており、これら二つの生物体は協働して宿主生物体に影響を及ぼす）、ｂ）疾患の病因と関連した標的のための複合評価法を決定するために、病原体に対する宿主生物応答に特異的な核酸の、試料中における量を定量すること、及び、ｃ）宿主定量測定量に対するデュアル病原体標的量の比率を計算すること（当該比率は、病因を検出するための病原体インデックスを提供する）。ある特定の実施形態では、より大きな病原体インデックスは、より不良の予後を示し、薬物療法効能及び薬剤スクリーニングのために用いることができる。
【００１０】
ある特定の実施形態では、第一の微生物に特異的な核酸の試料中における定量は、核酸増幅反応において、試料から得た核酸を第一組のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることにより実行され、第一組のオリゴヌクレオチドは、第一の微生物の核酸と少なくとも部分的に相補的である。そして、第二の微生物に特異的な核酸の試料中における量の定量は、核酸増幅反応において、試料から得た核酸を 第二組のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることにより実行され、第二組のオリゴヌクレオチドは、第二の微生物の核酸と少なくとも部分的に相補的であり、さらに核酸増幅反応からアンプリコンを検出することを含む。第三の宿主生物に特異的な核酸の試料中における量の定量は、核酸増幅反応において、試料から得た核酸を第三組のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることにより実行され、第三組のオリゴヌクレオチドは、第三の微生物の核酸と少なくとも部分的に相補的であり、さらに核酸増幅反応からアンプリコンを検出し（増幅反応は同じ容器内で起こる）、アンプリコンの相対数に基づいて宿主負荷の量に対する病原体比率量の比率を算出して、病原体インデックスまたは四分位値を誘導することを含む。本明細書において、病原体微生物はウイルス及び細菌であり、宿主生物は植物または動物である。宿主生物が細菌である場合は、 宿主はまた、植物または動物などの他の宿主（例えば、ヒト）の中に、あるいは他の宿主と共同状態にあり得る。ある特定の実施形態では、病因はカンキツグリーニング病またはＨｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎ（ＨＬＢ）であり、病原体または第一の微生物はバクテリオファージまたはウイルスでよく、第２の微生物はＣａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ（ＬＡＳ）細菌であり、宿主は広範囲の実がなる、及び実がならない植物である。また病原体インデックスは、デュアル病原体対宿主関係と共に病原的に関連するいかなる誘導物質または因子遺伝子との更なる相関からも誘導できる。
【００１１】
ある特定の実施形態では、本発明の方法はさらに、治療戦略としての臨床有用性を提供する、病原体インデックスまたは四分位値と相関する報告アルゴリズムを含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法はさらに、病原体微生物の誘導物質に特異的な核酸の試料中における量を定量して、誘導物質負荷を決定するステップを含み、病原体インデックスと誘導物質負荷が、予後を決定し治療戦略としての臨床有用性を提供するために、レポートインデックスと相関される。本発明の方法はさらに、病原体微生物、宿主生物または誘導物質に特異的な固有の核酸が定量され、報告インデックスで相関されることを提供する。
【００１２】
本発明で定量される核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡを含むが、これに限定されるものではない。ある特定の実施形態では、ファージＲＮＡ及び細菌ＤＮＡが定量化され、細菌ＤＮＡに対するファージＲＮＡの比が計算され、病原体インデックスが導き出される。核酸は、標準ポリメラーゼ連鎖反応法（ＳＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、リコンビナーゼ・ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ヘリカーゼ依存増幅（ＨＡＤ）、ループ仲介等温線増幅（ＬＡＭＰ）及び切断酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）等、 現在公知であるかまたは後で開発される、しかしこれらに限定されるものではない、任意の従来の核酸検出反応により、相対的な定量のために増幅されることができる。
【００１３】
ある特定の実施形態では、本発明は、試料の病因、例えばカンキツグリーニング病（ＨＬＢ）を検出するためのキットを提供する。キットは以下を含む：ａ）少なくとも第一組のオリゴヌクレオチド（このオリゴヌクレオチドは、試料中の第一の病原体微生物の核酸と少なくとも部分的に相補的であり、第一の病原体微生物は、第２の微生物と病原的に関係し、これら２つの病原体が相前後して宿主生物に影響を及ぼし、病原体定量測定値を決定する）、ｂ）少なくとも第二組のオリゴヌクレオチド（このオリゴヌクレオチドは、疾患の病原体に対する宿主生物反応の核酸と、少なくとも部分的に相補的である）、ｃ）第一組と第二組のオリゴヌクレオチドと核酸増幅反応する試薬、ｄ）核酸増幅反応を実施し、その一つ以上のアンプリコンを検出するための指示書、及び、ｅ）宿主定量測定値に対する、アンプリコン及び／またはデュアル病原体標的の量の比率を算出するための指示書（当該比率は、例えば、カンキツグリーニング病（ＨＬＢ）の病因の検出、予後予測、薬剤スクリーニング、及び治療戦略もしくは有効性のための、病原体インデックスを提供する）。
【００１４】
本発明はさらに、 カンキツグリーニング病の抑制または予防のための治療薬候補をスクリーニングする方法を提供する。本発明の方法は、抑制されたファージ溶菌サイクルにあるバクテリオファージを有する、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ培養菌を提供するステップ、培養菌を治療薬候補の候補と混合するステップ、及び、治療薬候補がカンキツグリーニング病を阻害または予防することを示す、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ培養菌の成長抑制を検出するステップを含む。ある特定の実施形態では、バクテリオファージは、ＳＣ１、ＳＣ２及びＳＣ３溶菌ファージを含むが、これに限定されるものではない溶菌ファージであり、そこにおいて、ファージ溶菌サイクルは抑制されるかまたは遺伝的に削除される。
【００１５】
また本発明は、細菌、植物または動物個体のバクテリオファージまたはウイルス感染を治療及び／または予防する方法を提供し、当該方法は、それを必要としている個体に、ウイルス複製を選択的に阻害するヌクレオシド、非ヌクレオシド、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、リボヌクレオシド及びリボヌクレオシドの類似体からなる群から選択される薬剤の有効量を含む組成物を投与することを含む。ある特定の実施形態では、バクテリオファージ感染は、柑橘類の木のＣａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒにあり、それはカンキツグリーニング病（例えばＨＬＢまたはＬＡＳ）を引き起こす。ある特定の実施形態では、抗ウイルス剤が、ＨＬＢまたはＬＡＳを治療及び／または予防するために用いられる。本発明は、現在公知であるかまたは後に開発される、異なる種類の抗ウイルス剤を企図する。当該抗ウイルス剤は、以下に例示されるが、これらに限定されるものではない：最大抗ウイルス活性を有するインターフェロン-α（ＩＦＮ-α）及び中程度の活性を有するインターフェロン-β（ＩＦＮ-β）のような天然抗ウイルス化合物、ならびにウイルス複製サイクルにおける作用点に基づき、以下の群に分類される合成抗ウイルス剤：１）アシクロビル（ＡＣＶ）及びそのプロドラッグ、バラシクロビル、リバビリン、ジドブジン及びアジドチミジン（ＡＺＴ）のような、ウイルス核酸合成を阻害するヌクレオシド類縁体、２）例えばシドホビル（ＣＤＶ）、ガンシクロビル（ＧＣＶ）（またはバルガンシクロビル）のような、リン酸基が付加している点においてヌクレオシド類縁体とは異なる、ヌクレオチド類似体（ヌクレオチド類似体は細胞内に長時間留まることができる）、３）例えばネビラピンのような、逆転写酵素と結合する非核酸系逆転写酵素阻害剤、４）例えばサキナビルのような、ウイルス性プロテアーゼを阻害するプロテアーゼ阻害剤、及び、５）その他のタイプ、例えば、ウイルス性脱外被を阻害することによって、インフルエンザウイルスを阻害するａｍａｎｔｉｄｉｎｅ及びｒｉｍａｎｔｉｄｉｎｅ、及び／または、ＨＩＶの逆転写酵素及びヘルペスウイルスのウイルスポリメラーゼを阻害するピロリン酸の類似体ホスホノギ酸塩（ＰＦＡ、フォスカーネット）（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｇｏｔｔｅ、２０１３、Ｖｉｒｕｓｅｓ  ５：５４-８６を参照のこと、この考察は、ファージ代用物の長所、限界及び機会について、特にその反疱疹性薬の発見及び開発における有用性に重点を置いて考察する事を目的とする）。この文献の全ての内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１６】
ある特定の実施形態では、抗ウイルス剤はＡＴＰ類似体、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ合成を阻害する２´-デオキシ-２´-アジドアデノシン５´-三リン酸（ＡｚＴＰ）、及び／または２´-デオキシ-２´-フルオロアデノシン５´-三リン酸（ＡｆＴＰ）である（Ｉｓｈｉｈａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８７：８２５-３０）。この文献の 全ての内容は、参照により本明細書に組み込まれる。他の実施形態において、抗ウイルス剤はアジドチミジン（ＡＺＴ）、エンテロバクター族の多に対して強力な細菌活動を有するチミジン類似体３´-アジド-３´-デオキシチミジン（別名ＢＷ  Ａ５０９Ｕ）、及び、複製的ＤＮＡ合成の最も強力な阻害剤であり、及び／または生体外ＤＮＡ重合反応における特定のＤＮＡ連鎖停止剤である、その事が感受性のある微生物に対するこの化合物の致死特性を説明できるＡＺＴ-三リン酸である（Ｅｌｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、１９８７、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、３１（２）：２７４-８０）。この文献の全ての内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１７】
ある特定の実施形態では、治療方法はさらに、例えば有効量のヒドロキシ尿素のようなヌクレオチドプール還元剤をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、治療組成物はさらに、罹患した植物の目標部位（例えば葉）への組成物の送達を促進するため界面活性剤または浸透剤を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】新規病因モデルを例示する。
【図２】被子植物師管要素及び伴細胞の正常の篩孔を例示する。
【図３】被子植物師管要素及び伴細胞における鞭毛状ＨＬＢを例示する。
【図４】溶菌ファージバースト（ＬＰＢ）において、ファージ粒子、細菌細胞壁、澱粉、ペプチドグリカン残遺物、及び細胞含有物が同時に放出される、ブロックされた篩孔を例示する。
【図５】下流の師部が「川床」コルク様外観に乾燥する、「緑化効果」を例示する。木のこの部分における蒸散は、他の全体的栄養素経路から独立して停止する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、その適用において、以下の説明に記載される構成要素の詳細及び構成に限定されないことが理解される。また本発明は、特定のオリゴヌクレオチドプローブ、方法、組成物、反応混合物、キット、システム、コンピュータまたはコンピュータで読取り可能なメディア（それはもちろん多様であり得る）に限定されないと理解することができる。さらに、本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態を記載する目的だけのためのものであり、限定することを目的とするものではないことが理解される。さらに、別に定められない限り、本明細書において用いられるすべての専門用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において引用される各文献は、参照により全体が本明細書に組み入れられる。本発明を記載して請求することにおいて、以下の用語及び文法上の変化形が、以下に述べる定義に従って用いられる。
【００２０】
定義
「増幅反応」とは、一つ以上の目標核酸配列またはそれに対する相補体の、プライマーによって開始される複製を指す。
【００２１】
「アンプリコン」は、他の分子を複写もしくは転写すること、例えば、 転写、クローニング、及び／またはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）（例えば、鎖置換ＰＣＲ増幅（ＳＤＡ）、二重ＰＣＲ増幅、リアルタイムＰＣＲ、リコンビナーゼ-ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＡＤ）、ループ仲介等温増幅（ＬＡＭＰ）、及び切断酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、または他の核酸増幅技術）のような技術により作成される分子を指す。概してアンプリコンは、選択された核酸（例えば、ひな型または標的核酸酸）のコピーであるかまたは、それに相補的である。
【００２２】
「増幅信号」は、増幅反応の非存在下で、または、それと連動して生成され得る、増幅された検出可能な信号を指す。例となる信号増幅技術は例えば、Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）“Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡ  ｓｉｇｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ＨＩＶ  ｔｙｐｅ  １  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ”、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １１（３）：３５３-３６１、ＳｅｇｅｖのＵ．Ｓ．５,４３７,９７７ 、Ｄｅｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．のＵ．Ｓ．６,０３３,８５３、及びＨｏｒｎのＵ．Ｓ．６,１８０,７７７に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【００２３】
「付着（した）」もしくは「結合（した）」は、物質または化合物が接続されるかまたは相互につながれる相互作用及び／または状態を意味する。これらの相互作用及び／または状態は、一般的に例えば、共有結合、イオン結合、化学吸着、物理吸着及びそれらの組み合わせによって形成される。ある特定の実施形態では、例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、固体支持体に付着される。これらのうち幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブはビオチンと結合され（すなわち、ビオチン化される）、そして、固体支持体は、プローブが例えばビオチン及びアビジンの結合相互作用を介して固体支持体に付着するように、アビジンと結合する。
【００２４】
分子種は、それらが共有結合性及び／または非共有の相互作用を経て互いと結びつくときに、「結合する」。例えば、二つの相補的な一本鎖の核酸は互いにハイブリッド形成し、少なくとも一つの二本鎖領域を有する核酸を形成する事ができる。さらに実例を示すと、抗体及び対応する抗原はまた、互いと非共有結合的に会合することができる。
【００２５】
「開裂」とは、物質または化合物を他の物資または化合物に付着した状態から解放する過程を意味する。ある特定の実施形態では、例えば、オリゴヌクレオチドは、例えば固体支持体から開裂され、溶液-相方法によるオリゴヌクレオチド分析を可能にする。Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）“Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  ｆｒｏｍ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｒｅｓｉｎ  Ｂｅａｄｓ”、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３：６４３０を参照 。これは参照により本明細書に組み込まれる。
【００２６】
文字列の文字を参照する際に使われる場合、「文字」は、文字列のサブユニットを指す。実施形態において、文字列の文字は、コードされた生体分子の一つのサブユニットをコード化する。このように、例えば、コードされた生体分子がポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである場合、文字列の文字は、単一のヌクレオチドをコードする。
【００２７】
「文字列」は、配列情報（例えば、生体分子（例えば核酸などのヌクレオチド配列）のサブユニット構造）を格納できるいかなる物でもある。実施形態において、文字列は、文字（文字、数または他の記号）の単純なシーケンスであるか、あるいは、有形または無形情報（例えば、電子情報、磁気情報など）の数値化または符号化表現である場合がある。文字列は、「線形である」必要がなく、例えば、リンクリスト項目または他の非線形配列（例えば、文字の線形配列を生成するコードとして使われる）等、多くの他の様態で存在する場合もある。文字列は概して、ポリヌクレオチド等の単量体または多量体の配列を表している文字列に、（自然の単量体でできているか、人工単量体でできているかに関わらず）明白に変換されることができる、いかなる暗号化された文字列、もしくは画像、もしくは物体の配列を含む、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド文字列を、直接または間接的にコードするものである。
【００２８】
「その相補体」は、ある与えられた核酸と同じ長さであり、かつ正確に相補的である核酸を指す。
【００２９】
「組成物」とは、二つ以上の異なる成分の組合せを意味する。例えばある特定の実施形態では、組成物は例えば、支持面に共有結合でまたは非共有結合で付着される一つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを含む固体支持体を含む。他の実施形態では、組成物は、溶液中に一つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを含む。
【００３０】
核酸配列の文脈中における「欠失」という用語は、少なくとも一つのヌクレオチドが核酸配列、例えば、５´-末端、３´-末端及び／または核酸配列の内部位置から取り除かれる、変更を指す。
【００３１】
「誘導体」という用語は、他の物質に構造的に関連している化学物質 、もしくは、他の物質から、例えば化学的もしくは酵素的変質によって作成することができる（すなわち、それが他の物質に由来した）化学物質のことを指す。例示すると、オリゴヌクレオチドプローブは、ビオチンまたはビオチン誘導体と、任意に結合される。さらに実例を示すと、一つの核酸は、例えば、他の核酸の配列についての知識に基づく化学合成、他の核酸の増幅などの方法により、他の核酸から「誘導される」ことができる。
【００３２】
核酸検出試薬の文脈中における「選択的に結合する」あるいは「選択的な結合」という用語は、核酸検出試薬が、同じハイブリッド化条件の下で対象外の核酸に結合するより大きな程度で、一つ以上の標的核酸または実質的に同一の変異型またはその相補体に結合することを指す。「検出可能的に結合する」という用語は、一つ以上の検出方法を用いることにより、バックグラウンド信号（例えば、ノイズ）より上で検出可能である、少なくとも二つの分子種間（例えば、プローブ核酸と標的核酸、配列特異抗体と標的核酸など）の結合を指す。「選択的に検出する」という用語は、一つ以上の標的核酸または実質的に同一の異型またはその相補体を、微生物からの対象外の核酸より大きな程度で検出する能力を指す。
【００３３】
核酸は、追加のヌクレオチド（または他の類似した分子）が核酸に組み込まれるときに、「延長される」かまたは「伸長される」。例えば、核酸は、ヌクレオチド組み込み生体触媒によって、任意に延長される。例えば、ポリメラーゼは一般的に、ヌクレオチドを核酸の３´末端に付加する。
【００３４】
「延長されたプライマー核酸」は、一つ以上の追加のヌクレオチドが、（例えば共有結合で）加えられたかまたは組み込まれたプライマー核酸を意味する。
【００３５】
核酸は、それらが互いと一般的に溶液中で結合するときに、「ハイブリッド形成する」かまたは「結合する」。核酸は、様々なよく特徴づけられた生理化学的な力、例えば水素結合、溶媒除外、塩基スタッキングなど、によってハイブリッド形成する。核酸ハイブリッド化の詳細にわたるガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  -  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅ  Ｐａｒｔ  Ｉ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２、“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ”（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ならびに、Ａｕｓｕｂｅｌ（Ｅｄ．）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ，ＩＩ  ａｎｄ  ＩＩＩ，１９９７ に見られる。後者は参照により本明細書に組み込まれる。Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅ  １  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  １）、及び、Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅ  ２  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ２）は、オリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ及びＲＮＡの合成、標識化、検出及び定量に関する詳細を提供する。 Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  １及び２は両方とも、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３６】
核酸増幅反応、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーションのような、核酸ハイブリッド化アッセイまたは実験の文脈中で、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存で、異なる環境因子の下では異なる。核酸のハイブリダイゼーションの詳細なガイドは、 上記Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）、及び、Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  １及び２に見られる。本発明の目的では、「非常にストリンジェントな」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、定義済みイオン強度及びｐＨにおいて、特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）より少なくとも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（定義済みイオン強度及びｐＨの下で）試験配列の５０％が完全に適合したプローブにハイブリッド形成する温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブに対してＴｍに等しくなるように選択される。
【００３７】
サザンあるいはノーザンブロットのフィルタ上における相補的核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の実施例は、 １ｍｇのヘパリンを有する５０％のホルマリンで、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施することである。ストリンジェントな洗浄条件の実施例は、０．２ｘＳＳＣ洗浄を６５℃で１５分行うことである（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）を参照、これは、ＳＳＣ緩衝液の説明のために、参照により組み込まれる）。しばしば、高いストリンジェンシーの洗浄は、バックグラウンドのプローブ信号を取り除くために、低いストリンジェンシーの洗浄が先行する。低いストリンジェンシーの洗浄の実施例は、２ｘＳＳＣ洗浄を４０℃で１５分行うことである。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイの無関係なプローブで観察されるものより５倍（またはより高い）のＳＮ比は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。
【００３８】
比較ハイブリダイゼーションを、本発明の増幅のための、核酸あるいは相補的核酸セットのための好ましいプライマーを特定するために用いることができる。特に、本発明の状況におけるストリンジェントなハイブリダイゼーションの検出は、例えば、 望ましい細菌、ファージ、ウイルスなどの核酸に対する高い構造類似性を示す。 例えば、 本明細書においてストリンジェントな条件の下で、典型的な核酸にハイブリッド形成する試験的な核酸を特定することが望ましい。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの１つの基準は、ストリンジェントな条件下で望ましい核酸（例えば、ＨＬＢあるいは他のカンキツグリーニング病に関連した細菌及び／またはファージの核酸及びその相補的核酸）のうちの一つに、検出可能的にハイブリッドする能力である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、任意の試験核酸について、容易に経験的に決定することができる。
【００３９】
例えば、非常にストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件を決定する際、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストインジェンシーは、選択された一組の条件が満たされるまで、段階的に増大される（例えば、ハイブリダイゼーション及び洗浄の際、温度を上昇させ、塩濃度を減少させ、洗剤濃度を上昇させ、及び／または有機溶剤、例えばホルマリンの濃度を増加させることによって）。例えば、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーは、一つ以上の望ましい核酸配列及びその相補的なポリヌクレオチド配列からなる、またはそれを含むプローブが、完全にマッチした相補的標的（例えば、ＨＬＢまたは他のカンキツグリーニング病に関連した細菌及び／またはファージの一つ以上の核酸配列を含む核酸、及びその相補的ポリヌクレオチド配列）に、プローブが標的外の核酸にハイブリッドする際に観測されるそれより少なくとも５倍のＳＮ比で結合するまで、段階的に増大される。この場合、標的外の核酸は、望ましい細菌、ファージ、ウイルスなど以外の微生物由来のものである。この種の標的外の核酸配列は、 例えばＧｅｎＢａｎｋにおいて、当業者によって特定することができる。試験核酸は、プローブが完全にマッチした相補的標的にハイブリッドする場合の少なくとも半分程度ハイブリッドするとき、すなわち、完全にマッチしたプローブが、完全にマッチした相補性標的に結合する条件下で、標的外の核酸にハイブリッドする場合と比べて少なくとも５倍から１０倍のＳＮ比で、プローブが標的にハイブリッドする場合と比べて少なくとも半分のＳＮ比でハイブリッドするときに、特にプローブ核酸にハイブリッドすると言われる。
【００４０】
超高ストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーが、プローブが完全にマッチした相補的標的核酸に結合する際のＳＮ比が標的外の核酸にハイブリッドする際に観察されるそれの少なくとも１０倍であるまで、増加される。このような条件下、完全にマッチした相補的標的核酸のそれより少なくとも１／２のＳＮ比でプローブにハイブリッドする標的核酸は、超高ストリンジェントな条件の下でプローブに結合すると言われる。
【００４１】
同様に、さらに高いレベルのストリンジェンシーさえも、適切なハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーション及び／または洗浄条件のストリンジェンシーを段階的に増加させることにより決定することができる。例えば、そこにおいて、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーが、プローブが完全にマッチした相補的標的核酸に結合する際のＳＮ比が標的外の核酸にハイブリッドする際に観察されるそれの少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、５００倍あるいはそれ以上であるまで、増大される条件を決定することができる。このような条件下、完全にマッチした相補的標的核酸のそれより少なくとも１／２のＳＮ比でプローブにハイブリッドする標的核酸は、超超高ストリンジェントな条件の下でプローブに結合すると言われる。
【００４２】
「選択的にハイブリッド形成する」もしくは「選択的なハイブリダイゼーション」は、核酸配列が、特定の核酸標的配列に、非標的核酸配列に対するハイブリダイゼーションより検出可能なほど大きな程度にハイブリッド形成するときに発生する。選択的にハイブリッド形成した配列は、互いに少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくはそれ以上の配列同一性、一般的には９５〜１００％の配列同一性（すなわち相補性）を有する。
【００４３】
核酸の「配列」は、核酸中のヌクレオチドの、順序及び素性を示す。配列は一般に、５´から３´の方向に読み込まれる。二つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における、「同一の」または「同一性」パーセントという用語は、同一である二つ以上の配列もしくは部分配列 、もしくは、比較され、例えば技術を有する人物が入手可能な配列比較アルゴリズムの一つを使用した測定により、あるいは目視検査により、一致が最大となるよう位置合わせをしたとき、特定の比率の同一アミノ酸残基もしくはヌクレオチドを持つ、二つ以上の配列もしくは部分配列を表す。配列同一性及び配列類似性パーセントの決定に適している例示的なアルゴリズムは、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）“Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ” Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３-４１０、Ｇｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔａｉｎ  ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｂｙ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｓｅａｒｃｈ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６-２７２、Ｍａｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ＢＬＡＳＴ  ｓｅｒｖｅｒ” Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１-１４１、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）“Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ-ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔａｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９-３４０２、及び、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）“ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ：Ａ  ｎｅｗ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ＢＬＡＳＴ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｏｒ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９-６５６に記載されている、ＢＬＡＳＴプログラムである。これらの文献はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。多くの他の最適配列アルゴリズムもまた公知技術で、配列同一性パーセントを決定するために、任意に利用される。
【００４４】
「溶液中」という表現は、分析または反応の成分が固体支持体に付着しておらず、液体媒体中に存在する、分析または反応条件を意味する。例示的な液体媒体には、水性及び有機液体が含まれる。例えば、本発明の特定の分析は、オリゴヌクレオチドプローブを、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ（ＬＡＳまたはＨＬＢ）細菌核酸及びＬＡＳ核酸アンプリコンと共に、溶液中で培養し、ハイブリダイゼーションの発生を可能にすることを含む。
【００４５】
核酸配列の文脈における「挿入」という用語は、少なくとも一つのヌクレオチドが核酸配列に、例えば、５´-終点、３´-終点、及び／または核酸配列の内部位置において加えられる変更のことを指す。
【００４６】
「標識」は、分子に（共有結合または非共有結合で）付加された、あるいは、付加されることができる部分を指し、その部分は、その分子に関する情報（例えば描写的な、あるいは識別情報など）、あるいは、その標識化された分子と相互作用（例えばハイブリッドなど）をする他の分子に関する情報を提供する、もしくは提供することができる。例示的な標識は、蛍光性標識（例えば、消光剤または吸収剤を含む）、弱蛍光性標識、非蛍光性標識、比色標識、化学発光標識、生物発光標識、放射能標識、質量修飾グループ、抗体、抗原、ビオチン、ハプテン、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、フォスファターゼなどを含む）などを含む。
【００４７】
「リンカー」は、化合物または置換基を他の部分、例えば、核酸、オリゴヌクレオチドプローブ、プライマー核酸、アンプリコン、固体支持体等に、共有結合的に、または非共有結合的に付加する化学成分を指す。例えば、リンカーは、オリゴヌクレオチドプローブを固体支持体に（例えば、線形に、あるいは他の論理プローブアレイにおける）取り付けるために、任意に用いられる。さらに例示すると、リンカーは、標識（例えば、蛍光染料、放射性同位体など）を、オリゴヌクレオチドプローブ、プライマー核酸等に任意に付加する。リンカーは一般的に、少なくとも二つの機能を持つ化学成分であり、特定の実施形態では、それらは、例えば熱、酵素、化合物、電磁放射線などにより開裂され、物質または化合物を、例えば固体支持体から分離することができる、開裂可能付加物を含む。リンカーの慎重な選択により、化合物の安定性及び分析方法に適合する適切な条件で裂開を実行することを可能にする。一般にリンカーは、例えば、化学種を一緒に結合する、あるいはそのような化学種間のある最小距離あるいは他の空間関係を維持する以外の、特定の生物学的活性を有しない。しかし、リンカーの構成要素は、連結された化学種のいくつかの特性（例えば３次元立体配座、実効電荷、疎水性など）に影響するように選択される場合がある。 例示的なリンカーには、例えば、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴポリアミド、オリゴエチレングリセロール、オリゴアクリルアミド、アルキル鎖などが含まれる。リンカー分子のさらなる記述は、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６）、Ｌｙｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（１４）：２７９３、Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ２０：３６９、Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１） Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ２０：１００７、Ｔｒａｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１２：９００、Ｏｌｅｊｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２９１：１３５、及びＰｌｊｅｖａｌｊｃｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５（１２）：３４８６ に提供される。これらすべての文献は、参照において本明細書に組み込まれる。
【００４８】
「混合物」は、二つ以上の異なる成分の組合せを指す。「反応混合物」は、所与の反応に関与する、及び／またはそれを促進することができる分子を含む混合物を指す。「増幅反応混合物」は、増幅反応を実施するため必要な試薬を含む溶液を指し、一般に、プライマー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及び好適な緩衝液中の二価金属カチオンを含有する。反応混合物は、それが反応を実施するのに必要なすべての試薬を含む場合、完全であると呼ばれ、そして、それが必要な試薬のサブセットだけを含む場合、不完全であると呼ばれる。反応成分は通常、利便性、貯蔵安定性の理由により、あるいは応用に依存する成分濃度の調整を可能にするために、別々の溶液として貯蔵され、それぞれが全成分のサブセットを含むこと、及び、その反応成分は反応の前に混合されて、完全な反応混合物をつくることは、当業者によって理解される。さらにまた、反応成分は商品化のために別々に包装されること、及び有用な市販キットは、本発明の改変プライマーを含む反応成分のいかなるサブセットも含むことができることが当業者によって理解される。
【００４９】
「改変プライマー核酸」は、プライマー核酸に望ましい特性を提供するヌクレオチドの部分または配列を含むプライマー核酸を指す。例えばある特定の実施形態では、改変プライマー核酸は、例えば、非特異的核酸増幅を低減する（例えば、プライマー二量体あるいは類似物の形成を最小限にする）、標的アンプリコンあるいは類似物の収率を増加する「核酸増幅特異性変更改変」を含む。核酸増幅特異性変更改変の例は、例えば Ｕ．Ｓ．６,００１,６１１に記載されており、それは参照により組み込まれる。他の例示的なプライマー核酸の修飾は、選択された制限部位を含むヌクレオチド配列が、例えばプライマー核酸の５´-末端に付加された、「制限部位リンカー改変」を含む。制限部位リンカーは、一般的にはプライマー核酸に付加され、その後のアンプリコンクローニング等を促進する。
【００５０】
「部位」または「基」は、何か（例えば分子）が分割された部分（例えば、官能基、置換基等）の一つを意味する。例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、任意に消光剤部位、標識化部位等を含む。
【００５１】
「Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ」 、「Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ」または「ｌｉｂｅｒｏｂａｃｔｅｒ」という用語は、リゾビアセエ系統のグラム陰性菌属を示す。Ｌｉｂｅｒｏｂａｃｔｅｒの検出は、それらの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の、従来技術において公知であるかまたはこのために設計された特定のプライマーを伴うＰＣＲ増幅を元にすることができる。属のメンバーは植物病原菌であり、主にキジラミにより伝染される。Ｃａ．Ｌ．ａｓｉａｔｉｃｕｓバクテリアの検出のために使用されたことのあるＰＣＲに基づいた方法は、多重定量的リアルタイムＰＣＲ分析（Ｓａｐｏｎａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．）、及び組織-ブロット診断（Ｎａｇｅｓｗａｒａ-Ｒａｏ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．）を含む。これらの文献は、それぞれ上で完全に引用され、本明細書に参照により組み込まれる。
【００５２】
「ファージ」または「バクテリオファージ」または「細菌性ウイルス」とは、細菌を感染させ、細菌内で自己複製するウイスル群の任意のものを示す。バクテリオファージはＤＮＡまたはＲＮＡゲノムを内部に封入するタンパク質から成る。それらのゲノムは、わずか４つの遺伝子、及び何百もの遺伝子をコードし得る。ファージは、それらを細胞質へ注入しのち、細菌内で自己複製する。ファージは、細菌宿主により占有される場所に広く分布される。ファージは、多くの細菌に対する使用可能な治療とみなされる。「ウイルス」は、生細胞内あるいは他の微生物中のみで自己複製する、小さい感染因子を指す。ウイルスは、動物及び植物から細菌及び古細菌に至るまで 、全ての種類の生物形態に感染し得る。
【００５３】
感染期間中、ファージはバクテリアに付着し、その遺伝物質を細胞に挿入する。その後、ファージは二つのライフサイクル、溶菌（毒性あるいはウイルス再生）、あるいは溶原（節制）のうちの一つをたどる。溶菌ファージは細胞機構を乗っ取り、ファージ成分を作る。それらは次いで細胞を破壊もしくは溶菌し、 新しいファージ粒子を開放する。溶原ファージは、それらの核酸を宿主細胞の染色体に組み込み、細胞を破壊することなく、宿主細胞と共に、単一体として自己複製する。ある特定の条件下で、溶原ファージが誘導され、溶菌サイクルをたどるようになる場合がある。溶菌ファージと溶原ファージサイクルの重要な違いは、溶菌ファージでは、ウイルスＤＮＡは菌体の中で別の分子として存在して、宿主細菌ＤＮＡとは別に自己複製するということである。溶原ファージサイクルのウイルスＤＮＡの存在位置は、宿主ＤＮＡ内であり、従って、いずれの場合においても、ウイルス及びファージは宿主ＤＮＡの機構を用いて自己複製するが、溶菌ファージサイクルでは、ファージは宿主ＤＮＡに対して自由に動く、別々の分子である。
【００５４】
「Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ核酸」、あるいは「Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ核酸」、あるいは「細菌、ファージ、あるいはウイルス核酸」という用語は、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ、あるいはＣａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ、あるいは標的細菌、ファージ、あるいはウイルス等から誘導されるかまたは分離される核酸（及び／またはそのアンプリコン）を指す。
【００５５】
「核酸」という用語は、共有結合により、線形あるいは分岐形体で結合したヌクレオチドを含む、ヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチドなど）及びポリマーを指す。例示的な核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、遺伝子、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、アプタマ、アンチセンス核酸、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、分子ビーコン、核酸プローブ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、係止された核酸（ＬＮＡ(商標)）、ＰＮＡ-ＤＮＡ結合体、ＰＮＡ-ＲＮＡ結合体、ＬＮＡ(商標)-ＤＮＡ結合体、ＬＮＡ(商標)-ＲＮＡ結合体などを含む。
【００５６】
核酸は一般的に一本鎖か二本鎖で、広くホスホジエステル結合を含む。但し場合によっては、本明細書において概説されるように、核酸類似体は、以下に例示されるがそれらに限定されるものではない代替の骨格鎖を有することができる：ホスホルアミド（Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９（１０）：１９２５及びその中の参照、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ（１９７０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００、Ｓｐｒｉｎｚｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３４８７、Ｓａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０、及び、Ｐａｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ  ２６：１４１９、それぞれは参照により組み込まれる）；ホスホロチオエート（Ｍａｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：１４３７、及び、Ｕ．Ｓ．５,６４４,０４８、両方とも参照により組み込まれる）；ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１、これは参照により組み込まれる）；Ｏ-メチルホスホルアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９２、これは参照により組み込まれる）；及び、ペプチド核酸骨格鎖及び結合（Ｅｇｈｏｌｍ（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５、Ｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８、Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：５６６、及び、Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：２０７、それぞれは参照により組み込まれる）。他の類似核酸は、正に荷電する骨格鎖（Ｄｅｎｐｃｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６０９７、これは参照により組み込まれる）、非イオン性骨格鎖（Ｕ．Ｓ．５，３８６，０２３、第５，６３７，６８４、第５，６０２，２４０、第５，２１６，１４１、及び第４，４６９，８６３、Ａｎｇｅｗ（１９９１）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３０：４２３、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  １３：１５９７、Ｃｈａｐｔｅｒ  ２  ａｎｄ  ３，ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｖｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ：Ｌｅｔｔ．４：３９５、Ｊｅｆｆｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌ���ｒ  ＮＭＲ  ３４：１７，及びＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７：７４３（１９９６）、それぞれは参照により組み込まれる）、及び、Ｕ．Ｓ．５,２３５,０３３及び第５，０３４，５０６、Ｃｈａｐｔｅｒ  ６  ａｎｄ  ７，ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｖｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ（これらの参考文献は参照により組み込まれる）に記載されている非リボース骨格鎖、を有するものを含む。また、一つ以上の炭素環式の糖を含んでいる核酸も、核酸の定義の中に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．ｐｐ  １６９-１７６、これは参照により組み込まれる）。また、いくつかの核酸類似体も、例えば、Ｒａｗｌｓ，Ｃ＆Ｅ  Ｎｅｗｓ, １９９７年６月２日，３５ページ（これは参照により組み込まれる）に記載されている。これらのリボース-リン酸エステル骨格の修飾は、標識のような追加部位の付加を促進するために行なってもよく、もしくは、生理学的環境下でそれらの分子の安定性及び半減期を変えるために行なってもよい。
【００５７】
核酸類似体は、核酸中に一般的に見られる天然複素環塩基（例えば、アデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシル）に加え、非天然複素環塩基もしくは修飾塩基を有するものを含み、その多くは、本明細書において記載されるか、または参照される。特に多くの非天然塩基は、例えば、Ｓｅｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ７４：１７９０、Ｇｒｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：９７１-９７６、及び、Ｓｅｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ８２：１６４０にさらに記載されている。これらの文献は参照により組み込まれる。さらに例を示すと、融解温度（ＴＯ）調節剤として作用する特定の塩基が、任意に含まれる。例えば、これらのいくつかは、７-デアザプリン類（例えば、７-デアザグアニン、７-デアザアデニンなど）、ピラゾロ［３，４-ｄ］ピリミジン類、プロピニル-ｄＮ（例えば、プロピニル-ｄＵ、プロピニル-ｄＣなど）などを含む。例えば、“ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＯＦ  ７-ＤＥＡＺＡ-２´-ＤＥＯＸＹＧＵＡＮＯＳＩＮＥ  ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ”と題する、１９９９年１１月２３日、Ｓｅｅｌａに交付されたＵ．Ｓ．５,９９０,３０３を参照 。これは、参照により組み込まれる。他の代表的な複素環塩基としては、例えば、ヒポキサンチン、イノシン、キサンチン；２-アミノプリン、２，６-ジアミノプリン、２-アミノ-６-クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン、及びキサンチンの８-アザ誘導体；アデニン、グアニン、２-アミノプリン、２，６-ジアミノプリン、２-アミノ-６-クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン、及びキサンチンの７-デアザ-８-アザ誘導体；６-アザシトシン；５-フルオロシトシン；５-クロロシトシン；５-ヨードシトシン；５-ブロモシトシン；５-メチルシトシン；５-プロピニルシトシン；５-ブロモビニルウラシル、５-フルオロウラシル；５-クロロウラシル；５-ヨードウラシル；５-ブロモウラシル；トリフルオロメチルウラシル；５-メトキシメチルウラシル；５-エチニルウラシル；５-プロピニルウラシルなどが挙げられる。
【００５８】
修飾塩基及びヌクレオチドの実施例はまた、例えば、１９９６年１月１６日、Ｆｒｏｅｈｌｅｒらに交付された“ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ  ５-ＰＲＯＰＹＮＹＬ  ＰＹＲＩＭＩＤＩＮＥＳ”と題するＵ．Ｓ．５,４８４,９０８、１９９７年７月８日、Ｆｒｏｅｈｌｅｒらに交付された“ＥＮＨＡＮＣＥＤ  ＴＲＩＰＬＥ-ＨＥＬＩＸ  ＡＮＤ  ＤＯＵＢＬＥ-ＨＥＬＩＸ  ＦＯＲＭＡＴＩＯＮ  ＷＩＴＨ  ＯＬＩＧＯＭＥＲＳ  ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＰＹＲＩＭＩＤＩＮＥＳ”と題するＵ．Ｓ．５,６４５,９８５、１９９８年１１月３日、Ｆｒｏｅｈｌｅｒらに交付された“ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＵＳＩＮＧ  ＯＬＩＧＯＭＥＲＳ  ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＰＹＲＩＭＩＤＩＮＥＳ”と題するＵ．Ｓ．５,８３０,６５３、２００３年１０月２８日、Ｋｏｃｈｋｉｎｅらに交付された“ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＯＦ［２．２．１］ＢＩＣＹＣＬＯ  ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥＳ”と題するＵ．Ｓ．６,６３９,０５９、２００１年１０月１６日、Ｓｋｏｕｖに交付された“ＯＮＥ  ＳＴＥＰ  ＳＡＭＰＬＥ  ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＩＮ  ＣＯＭＰＬＥＸ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＳＡＭＰＬＥＳ”と題するＵ．Ｓ．６,３０３,３１５、及び、２００３年５月１５日公開の“ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＯＦ［2.2.1］ＢＩＣＹＣＬＯ  ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥＳ”と題する、米国特許出願公報２００３／００９２９０５に記載されている。これらは参照により組み込まれる。
【００５９】
「核酸検出試薬」という用語は、カンキツグリーニング病またはＨＬＢに関連した望ましい細菌、ファージ、ウイルスの核酸、前記核酸または変異型の一つに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％の配列同一性を有する、実質的に同一なそれら核酸の変異型に、検出可能的に結合する（例えば、核酸ハイブリダイゼーション、抗体抗原認識などにおける水素結合、あるいはその他の結合相互作用 ）試薬を指す。「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドのエステル、例えば、ヌクレオシドのリン酸エステルを指す。例えば、ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖残基の５´位置に共有結合した、一つ、二つ、三つもしくはそれ以上のリン酸基を含むことができる。
【００６０】
「ヌクレオチド組み込み生体触媒」とは、 核酸へのヌクレオチドの取り込みに触媒作用を及ぼす触媒を意味する。一般的に、ヌクレオチド組み込み生体触媒は酵素である。「酵素」は、タンパク質及び／または核酸系触媒で、他の化合物、または「基質」が関与する化学反応の活性化エネルギーを減少するように働く 。「ヌクレオチド組み込み酵素」は、核酸へのヌクレオチドの取り込み（例えば、核酸増幅等の間）に触媒作用を及ぼす酵素を指す。例示的なヌクレオチド組み込み酵素には、例えば、重合酵素、末端転移酵素、逆転写酵素、テロメラーゼ、ポリヌクレオチド加リン酸分解酵素などが挙げられる。
【００６１】
「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも二つの核酸モノマー単位（例えば、ヌクレオチド）、一般的には三つより多いモノマー単位、またより一般的には１０を超えるモノマー単位を含む核酸を意味する。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、オリゴヌクレオチドの最終的な機能または使用法を含む各種の要因に一般に依存する。オリゴヌクレオチドは、既存もしくは天然配列の分離、ＤＮＡ複製または増幅、適切な配列の逆転写、クローニング、及び制限分解、もしくは、例えば、リン酸トリエステル法（Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０-９９）、リン酸ジエステル法（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９-１５１）、ジエチルホスホルアミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９-１８６２）、トリエステル法（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５-３１９１）、自動合成法、もしくは、Ｕ．Ｓ．４,４５８,０６６記載の、または他の公知技術による固体支持体法などの直接的な化学合成を含むが、これらに限定されない、任意の好適な方法により、任意に調製される。これらすべての参照は、本明細書に組み込まれる。
【００６２】
オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドと標的配列との間に現れるミスマッチの数が、オリゴヌクレオチドと試料中に存在するかもしれない非標的配列との間に現れるミスマッチ数より少ない場合に、「特異的」である。ハイブリダイゼーション条件は、存在するミスマッチの数が、オリゴヌクレオチドと標的配列の間に存在するミスマッチの数以下である場合のみ安定な二重鎖が形成される条件下で、選択されることができる。そのような条件下で、標的特異性オリゴヌクレオチドは、標的配列とのみ、安定な二重鎖を形成できる。従って、適切にストリンジェントな増幅条件の下で標的特異性プライマーを使用することは、標的プライマー結合部位を含む配列の特異的な増幅を可能にする 。同様に、適切にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で 標的特異性プローブを使用することは、特定の標的配列の検出を可能にする。
【００６３】
「オリゴヌクレオチドプローブ」、「プローブ核酸」、もしくは「プローブ」という用語は、適当な条件下で標的核酸酸に選択的にハイブリッド形成できる、標識化もしくは非標識化オリゴヌクレオチドを意味する。一般に、プローブは、核酸試料に含まれる特定の標的配列（例えば、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ核酸または変異型）と、選択されたハイブリダイゼーション条件（例えば、しかし限定される物ものではない、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）の下で、その特定の標的配列と安定なハイブリッド化二重鎖を形成するのに十分相補的である。十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下でプローブを用いて実施されるハイブリダイゼーション検定法は、特定の標的配列の選択的な検出ができるようにする。「ハイブリダイゼーション領域」とは、それが標的配列に対して正確に、または実質的に相補的で、従ってハイブリッド形成する、核酸中の領域を意味する。一つのヌクレオチドの相違を区別するためのハイブリダイゼーション検定法用には、ハイブリダイゼーション領域は、一般的に約８から約１００ヌクレオチド長である。一般にハイブリダイゼーション領域はオリゴヌクレオチド全体を指すが、プローブは、例えば固体支持体などにプローブ配列を付加するための部位を提供するリンカー結合部位として機能する、追加のヌクレオチド配列を含む場合がある。ある特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、一つ以上の標識（例えば、レポーター色素、失活部分など）、例えば試料中のプローブと標的核酸の間のハイブリダイゼーションを検出するために用いることができる、例えばＦＲＥＴプローブ、分子ビーコン等）を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション領域は、標的配列と完全に相補的である。しかしながら、一般に、完全な相補性は必要でなく、安定な二重鎖は、ミスマッチ塩基または複数のミスマッチの塩基を含むことができる。塩基対のミスマッチまたは複数のミスマッチの塩基を含む安定な二重鎖を許容するために、ストリンジェントな条件の変更が必要になる場合がある。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（２００１）（これは参照により組み込まれる）は、適切な変更のためのガイダンスを提供する。標的／プローブ二重鎖の安定性は、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成及び配列、温度及びイオン条件を含む、多くの変量に依存する。当業者は一般に、所与のプローブの正確な相補体は、プローブとして同じように有用であると認識する。当業者はまた、ある特定の実施形態において、プローブ核酸がプライマー核酸として用いられる場合があると認識する。
【００６４】
「プライマー核酸」もしくは「プライマー」は、テンプレート核酸（例えば、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ核酸、変異型が当該核酸もしくは異型のひとつに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％の配列同一性を有する、前記核酸と実質的に同一の変異異型など）にハイブリッド形成することができ、及び、適切な反応条件下で、例えば重合酵素のようなヌクレオチド組み込み生体触媒を用いて連鎖延長または伸長を可能にすることができる核酸を指す。プライマー核酸は、一般には天然もしくは合成オリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖のオリゴデオキシリボヌクレオチドなど）である。他の長さのプライマー核酸も任意に利用されるが、それらは一般的に、長さの範囲が約８から約１００ヌクレオチドであるハイブリダイゼーション領域を含む。短いプライマー核酸は一般により低い温度を利用して、テンプレート核酸と、十分に安定なハイブリッド複合体を形成する。テンプレートと延長が発生するようハイブリッドするためには、一般に、テンプレート核酸の部分配列と少なくとも部分的に相補的であるプライマー核酸で十分である。
【００６５】
プライマー核酸は、必要に応じて、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、あるいは他の技術によって検出可能な標識を組み込むことによって、標識化することができる。例示すると、有用な標識は、それに対して抗血清またはモノクローナル抗体が利用できる、放射性同位体、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素（ＥＬＩＳＡ法で一般的に用いられる）、ビオチン、もしくはハプテン及びタンパク質を含む。これらの多く、及び他の標識は、さらに本明細書において記載され、及び／または、さもなければ公知技術である。当業者は、ある特定の実施形態において、プライマー核酸はプローブ核酸として用いられる場合もあることを認知する。
【００６６】
「部分配列」もしくは「部分」とは、核酸配列全体のいかなる部分をも指す。核酸またはポリペプチドの文脈中における「実質的に同一の変異型」は、配列比較アルゴリズム使用した測定により、あるいは目視検査により、一致が最大となるよう比較され、位置合わせをしたとき、互いに少なくとも８５％、一般的には少なくとも９０％、より一般的には少なくとも９５％のヌクレオチドまたは配列の同一性を有する、二つ以上の配列を指す。実質的な同一性は一般に、少なくとも約１５のヌクレオチドまたはアミノ酸長、より一般的には少なくとも約２０のヌクレオチドまたはアミノ酸長の配列の領域に渡って存在し、さらにより一般的には、配列は、少なくとも約２５のヌクレオチドまたはアミノ酸長の領域に渡って実質的に同一である。いくつかの実施形態では例えば、配列は、比較された核酸またはポリペプチドの全体の長さに渡って、実質的に同一である。核酸配列の文脈における「置換」は、核酸配列の少なくとも一つのヌクレオチドが異なるヌクレオチドと置き換えられる変更を指す。「標的配列」、「標的領域」及び「標的核酸」は、増幅、検出、あるいは分析される、核酸中のある領域を指す。
【００６７】
「ターミネータヌクレオチド」は、例えば、少なくとも一つのヌクレオチド組み込み生体触媒による核酸への取り込みにより、核酸の更なる延長を防止するヌクレオチドを指す。
【００６８】
「耐熱性酵素」は、熱に対して安定で、耐熱性で、 選択された期間に渡り高温の影響下に置かれたときに充分な触媒活性を保持する酵素を指す 。例えば、耐熱性重合酵素は、二本鎖の核酸の変性を遂行するのに必要な時間に渡り高温の影響下に置かれたとき、充分な活性を保持してその後のプライマー伸長反応を遂行する。核酸変性のために必要な加熱条件は当該技術で公知であり、Ｕ．Ｓ．４,６８３,２０２及び第４，６８３，１９５において例証される。そして、これら両方は参照により組み込まれる。本明細書において、耐熱性重合酵素は、一般的に温度循環反応、例えば重合酵素連鎖反応法「ＰＣＲ」における使用に適している。耐熱性重合酵素について、酵素活性は、テンプレート核酸（例えば、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ（ＬＡＳ）ゲノムの選択された部分配列）と相補的なプライマー伸長生成物を形成する、適切な方法におけるヌクレオチドの組合せの触媒作用を指す。
【００６９】
「消光部位」または「消光剤」とは、検出可能な放射線、例えば、蛍光もしくは発光放射線の、さもなければこの放射線を放出するであろう放出源からの放出を減少させる、もしくは減少させる能力がある部位を意味する。消光剤は、放出源から放出された検出可能な放射線を、一般的に少なくとも５０％、一般的に少なくとも８０％、そしてさらに一般的には９０％減少させる。例示的な消光剤は、例えば、２００２年１０月１５日、Ｈｏｒｎらに交付された“ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＰＲＯＢＥＳ  ＢＥＡＲＩＮＧ  ＱＵＥＮＣＨＡＢＬＥ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＬＡＢＥＬＳ、ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＵＳＥ  ＴＨＥＲＥＯＦ”と題するＵ．Ｓ．６,４６５,１７５（Ｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．）に提供されている。これは、参照により組み入れられる。
【００７０】
「試料」は、一つ以上の宿主及び／または病原体核酸を含むもしくは含むと見なされる、一人以上の対象または個人、生体外細胞培養構成要素、ならびに臨床試料から単離された組織もしくは流体を含む、しかしこれらに限定されるものではない、いかなる物質をも指す。一般的な試料としては、血液、血漿、血清、尿、滑液、精液、精漿、前立腺液、膣液、頸部流体、子宮流体、子宮頸管掻爬、羊水、肛門の切屑、粘液、痰、組織、などを含む、細菌、ウイルス、植物、動物もしくは哺乳類試料が挙げられる。
【００７１】
「対象から得られた試料」とは、その試料が分析の前に一つ以上の処理ステップ（例えば、溶菌、破片除去、安定化など）を受けるか否かを問わず、対象から得られた試料を指す。例示すると、試料は対象から、公知の擦過、静脈穿刺、拭き取り、生検または他の技術によって得ることができる。
【００７２】
「配列決定反応」とは、例えば、ターミネータヌクレオチドの使用を含み、所与の核酸中のヌクレオチドの配列を解明するように設計される反応を指す。「セット」とは、少なくとも２つの物の集まりを意味する。例えば、セットは、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、１,０００、または他の数の分子または配列型を含む場合がある。例えば、特定の本発明の態様は、アンプリコンのセットを有する反応混合物を含む。「サブセット」とは、セットの任意の一部を意味する。
【００７３】
「固体支持体」とは、化学成分（例えばオリゴヌクレオチドプローブ等）により、誘導体化されるか、またはそれに付着されることができる固体物質を指す。典型的な固体支持体は、プレート、ビーズ、マイクロビーズ、チューブ、繊維、ウィスカー、櫛、ハイブリダイゼーションチップ（例えば、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）プローブ配列（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）で使用されるようなマイクロアレイ基質などを含む）、膜、単結晶、セラミック層、自己集合単層などを含む。
【００７４】
「対象」とは、有機体を意味する。一般的に、有機体は細菌有機体、ウイルス有機体、植物有機体、動物またはヒトを含む哺乳類有機体であり得る。例えばある特定の実施形態では、対象は、ＬＡＳもしくは柑橘類の緑化感染または疾患（例えばＨＬＢ）を有することが疑われる、植物または木である。
【００７５】
本発明は、ＨＬＢの原始的なファージ感染を説明する新規病因モデルを提供する。より詳しくは、本発明は、ストレス及び／または植物または細菌起源の誘導因子もしくは修飾因子の存在下で、ファージ遺伝子が細菌の標的遺伝子に付着／吸着し、「バースト」に備えたペプチドグリカンの滅失、並びにファージタンパク質の生産及びファージ会合体（“Ｂｕｒｓｔ  Ｍａｒｋｅｒ”）、次いで、細菌成分（例えばファージ粒子、細菌細胞壁、澱粉、ペプチドグリカン及び細胞成分残遺物）が同時に放出される溶菌ファージバースト（ＬＰＢ）における、溶菌ステージにあるファージの解放をもたらし、下流の師部及び／または葉が塞がれて、「河床」コルク様外観に乾燥する「緑化効果」に至り、そして他の全体的栄養素経路から独立して、木のこの部分における蒸散が停止することを提供する（図１、３、４及び５を参照）。
【００７６】
図１は、新規病因モデルを例示する。このモデルは、ストレス（１０３）、例えば、植物または細菌起源の誘導物質または修飾物質（１０４）の存在下で、ファージ遺伝子（１０１）が細菌の標的遺伝子（１０２）に付着／吸着し、「バースト」に備えたファージタンパク質の生産及びファージ会合体（“Ｂｕｒｓｔ  Ｍａｒｋｅｒ”）（１０６）及びペプチドグリカン（１０５）の滅失、次いで、細菌成分放出される、溶菌ステージにあるファージの解放（１０７）に至る様子を示す。ある特定の実施形態では、放出された細菌澱粉ブドウ糖分子（１０８）が茎及び葉（１０９）の師部を詰まらせ、ヒトの心疾患と類似の方法で、通常の蒸散を遮断する。
【００７７】
図２は、被子植物師管要素及び伴細胞の通常の篩孔を例示する。伴細胞（２００）の細胞壁（２０１）、色素体（２０２）及び液胞（２０３）、ならびに篩要素（３００）のミトコンドリア（３０１）、退化したＳＥＲ（３０２）、色素体（３０３）、細胞壁（３０４）、Ｐ-タンパク質（３０５）、変性液胞膜（３０６）、並びに大きな原形質連絡（３０７）、篩域（３０８）、及び篩要素（３００）の内腔（３０９）が、図中に示されている。図はまた、これらの通常の篩孔を通じた、矢印方向への通常の蒸散フローを例示している。
【００７８】
図３は、細菌がストレス（誘導物質）（４０３）の下にあるときに生体膜（４０１）が形成される、被子植物師管要素及び伴細胞中で鞭毛状にされたＨＬＢを示し、結果としてＨＬＢ（４０２）、篩板（４０４）の形成、そして図４及び５に示すように、通常の蒸散を遮断することに至る。
【００７９】
図４は、ファージ粒子、細菌細胞壁、澱粉、ペプチドグリカン及び細胞成分残遺物が溶菌ファージバースト（ＬＰＢ）において同時に放出される、篩板の目詰まりした篩孔を例示する。
【００８０】
図５は、下流の師部（５００）が「河床」コルク様外観に乾燥する「緑化効果」を示す。他の全体的栄養素経路から独立して、木のこの部分における蒸散が停止する
【００８１】
本発明のある特定の実施形態は、ＨＬＢにおけるファージ生産を提供する。ＳＣ１＿ｇｐ１１０遺伝子の機能性Ｈｏｌｉｎ活性は、注釈を確証する。ある特定の実施形態において、本発明は、遺伝子発現解析が、ニチニチソウにおいて、柑橘類と比較して非常により高いレベルのファージ後期遺伝子（特にＨｏｌｉｎ）発現を示したことを提供し、ニチニチソウに特有のファージ応答を示す。他の実施形態において、温度に関係なく、切り離してから１２〜２４時間後の柑橘類におけるＨｏｌｉｎ  ｍＲＮＡレベルの大幅な増加は、柑橘類における潜在的な溶菌誘発信号を示す。さらに他の実施形態では、Ｈｏｌｉｎプロモータ領域が、柑橘類において潜在的誘導物質によって溶菌始動を監視するために有用なリポーター遺伝子構造物へ発達し、感染した柑橘類の熱治療（Ｌａｓの熱硬化）の作用様式がファージ誘発と関係していないようであることが証明された。
【００８２】
本発明はさらに、分子生物学的技術及び試薬に基づいた、対象中の一つ以上の病原体の選択的な検出を提供する。特に、ウイルスもしくはファージが植物及び／または動物またはヒトを含む哺乳類において、宿主（例えば細菌または植物）に対する比率で関わるあらゆる疾患の診断、予後及び／または治療に用いられる病原性比率または負荷またはインデックスを誘導するための、病原的に結びつけられる少なくとも二つの異なる微生物からの少なくとも二つまたは三つの標的を有する定量的負荷試験を利用する新規な検出方策に基づいて。より詳しくは、本明細書において記載される方法及び試薬に基づき、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ（ＬＡＳ）または柑橘類の緑化感染症が、その宿主（すなわち、ＬＡＳ細菌ゲノム）に関する病因の病原性比率としてファージＤＮＡまたはＲＮＡ定量化を利用することによって、臨床的有用性を有する原因及び治療戦略を報告するために、診断することができる。本発明はまた、検査法及び反応混合物に加えて、これらの病原体試薬検出するためのキット及びシステム、並びに、システムの使用または、ＨＬＢ及び柑橘類の緑化を治療及び予防するための薬剤スクリーニングのためのファージ溶菌サイクル抑制因子を含む生体外細胞培養モデルを提供する。本発明はさらに、ヌクレオチドプール還元剤（例えばヒドロキシ尿素）を有して、または有さずに、ヌクレオシド、ヌクレオチド、リボヌクレオシド、もしくはその類似体を含むがこれに限らない、任意の抗ウイルス剤を使用する、ＨＬＢ及び柑橘類緑化の治療及び予防の方法及び組成物を提供する。本発明はさらにまた、治療もしくは予防組成物がさらに、よりよい目標治療のために、対象の目標位置への薬剤輸送を促進するための界面活性剤または浸透剤を含むことができることを提示する。
【００８３】
病因及び／またはカンキツグリーニング病（ＨＬＢまたはＬＡＳ）の診断及び予後予測のための病原体負荷または病原体インデックス
本発明は、生体試料における診断、予後予測、及び治療方法の新規病因モデルを提供する。
【００８４】
ある特定の実施形態において、本発明は、以下を含む、生体試料の病因を検出するための方法を提供する： ａ）病原体の定量的測定値を決定するために、第一の生物体に特異的な核酸の、試料中における量を定量すること（第一の生物体は病原体であり、第二の生物体と関連しており、これら二つの生物体は協同して宿主生物体に影響を及ぼす）、ｂ）疾患の病因と関連した標的のための複合評価法を決定するために、病原体に対する宿主生物応答に特異的な核酸の、試料中における量を定量すること、及び、ｃ）宿主定量測定量に対するデュアル病原体標的量の比率を計算すること（当該比率は、病因を検出するための病原体インデックスを提供する）。ある特定の実施形態では、より大きな病原体インデックスは、より不良の予後を示し、薬物療法効能及び薬剤スクリーニングのために用いることができる。
【００８５】
ある特定の実施形態では、 第一の微生物に特異的な核酸の試料中における量の定量は、核酸増幅反応において、試料から得た核酸を第一組のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることにより実行される、第一組のオリゴヌクレオチドは、第一の微生物の核酸と少なくとも部分的に相補的である。そして、第二の微生物に特異的な核酸の試料中における量の定量は、核酸増幅反応において、試料から得た核酸を 第二組のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることにより実行され、第二組のオリゴヌクレオチドは、第二の微生物の核酸と少なくとも部分的に相補的であり、さらに核酸増幅反応からアンプリコンを検出することを含む。第三の宿主生物に特異的な核酸の試料中における量の定量は、核酸増幅反応において、試料から得た核酸を第三組のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることにより実行され、第三組のオリゴヌクレオチドは、第三の微生物の核酸と少なくとも部分的に相補的であり、さらに核酸増幅反応からアンプリコンを検出し（増幅反応は同じ容器内で起こる）、アンプリコンの相対数に基づいて宿主負荷の量に対する病原体比率量の比率を算出して、病原体インデックスまたは四分位値を誘導することを含む。本明細書において、病原体微生物はウイルス及び細菌であり、宿主生物は植物または動物である。宿主生物が細菌である場合は、 宿主はまた、植物または動物などの他の宿主（例えば、ヒト）の中に、あるいは他の宿主と共同状態にあり得る。ある特定の実施形態では、病因はカンキツグリーニング病またはＨｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎ（ＨＬＢ）であり、病原体または第一の微生物はバクテリオファージまたはウイルスでよく、第２の微生物はＣａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ（ＬＡＳ）細菌であり、宿主は広範囲の実がなる、及び実がならない植物である。また病原体インデックスは、デュアル病原体対宿主関係と共に病原的に関連するいかなる誘導物質または因子遺伝子との更なる相関からも誘導できる。ある特定の実施形態では、第二の有機体はＳＣ１、ＳＣ２及びＳＣ３溶菌ファージを含むが、これに限定されるものではない溶菌バクテリオファージである。
【００８６】
本発明方法で定量される核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡを含むが、これに限定されるものではない。ある特定の実施形態では、病原体インデックスまたは四分位値を誘導するために、ファージＲＮＡ及び細菌ＤＮＡが定量され、細菌ＤＮＡに対するファージＲＮＡの比が算出される。核酸は、標準ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（例えば、Ｒｏｃｈｅ，ＨＩＶ-１  Ｃｏｂａｓ  Ｔａｑｍａｎ  ｓｙｓｔｅｍ；Ａｂｂｏｔ  ＨＩＶ-１  Ｍ２０００  Ｓｙｓｔｅｍ）、リコンビナーゼ・ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ヘリカーゼ依存増幅（ＨＡＤ）、ループ仲介等温線増幅（ＬＡＭＰ）及び切断酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）を含むが、しかしこれらに限定されるものではない、任意の従来の核酸増幅反応により、定量（例えば、ｑＰＣＲ）のために増幅されることができる。ｑＰＣＲ及び／またはリアルタイムＰＣＲについての詳細は、Ｕ．Ｓ．５,９７２,７１６、第６，８００，４５２、第６，７４６，８６４、第７，４２７，３８０、第７，２３８，３２１、及び第８，０５８，０５４、及び、Ｔａｔｉｎｅｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８，Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ９８（５）：５９２-９９）に見ることができる。それぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。さらに、ＲＰＡ増幅の詳細な説明は、例えば、Ｕ．Ｓ．７,４８５,４２８、第７，６６６，５９８、第７，７６３，４２７、及び、第７，７５９，０６１に提供されている。それぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。ＨＡＤ増幅の詳細な説明は、例えば、米国特許７,８２９,２８４、第７，２８２，３２８、及び、第７，６６２，５９４に提供されている。それぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。そして、ＬＡＭＰ増幅の詳細な説明は、例えば、米国特許第７,８５１,１８６、第７，７４５，１３５、及び、第６，９７４，６７０に提供されている。それぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【００８７】
ある特定の実施形態では、本発明は、以下を含む試料中のカンキツグリーニング病を検出するためのキットを提供する：ａ）カンキツグリーニング病と病原的に関係している、試料中の第一の病原体微生物の核酸と少なくとも部分的に相補的である第一組のオリゴヌクレオチド、ｂ）試料中の病原体微生物の宿主である第二の有機体の核酸と、少なくとも部分的に相補的である第二組のオリゴヌクレオチド、ｃ） 第一組と第二組のオリゴヌクレオチドと核酸増幅反応する試薬、ｄ）核酸増幅反応を実施し、その一つ以上のアンプリコンを検出するための指示書、及び、ｅ）カンキツグリーニング病の検出、予後予測、及び治療のための病原体インデックスを提供する、アンプリコンの比率を算出するための指示書。
【００８８】
一般に、核酸検出試薬の少なくとも一つは、少なくとも一つの標識及び／または少なくとも一つの消光剤部分を含む。例示すると、標識は任意に、蛍光染料、弱蛍光性標識、非蛍光性標識、比色標識、化学発光標識、生物発光標識、抗体、抗原、ビオチン、ハプテン、質量修飾グループ、放射性同位体、酵素などを含む。
【００８９】
本発明の核酸検出試薬は、各種の形式で提供される。例えばいくつかの実施形態では、核酸検出試薬の少なくとも一つは溶液形態である。他の実施形態では、固形支持体が、核酸検出試薬の少なくとも一つを包含する。これらの実施形態では、核酸検出試薬は、非共有結合または共有結合で固体支持体に結合している。これらの実施形態において利用される典型的な担体は、例えば、プレート、マイクロウエルプレート、ビーズ、マイクロビーズ（例えば、磁性マイクロビーズなど）、チューブ（例えば、マイクロチューブなど）、繊維、ウィスカー、櫛、ハイブリダイゼーションチップ、膜、単結晶、セラミック層、自己集合単層などから、任意に選択される。
【００９０】
さらに実例を示すと、核酸検出試薬は、ビオチンもしくはビオチン誘導体と任意に結合しており、固体支持体は、アビジンもしくはアビジン誘導体、もしくは、ストレプトアビジンもしくはストレプトアビジン誘導体と任意に結合している。いくつかの実施形態では、リンカーが、核酸検出試薬を固体支持体に付着させる。一般的にリンカーは、例えば、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴポリアミド、オリゴエチレングリセロール、オリゴアクリルアミド、アルキル鎖などから選択される。選択肢として、開裂性アタッチメントが、核酸検出試薬を固体支持体に付着させる。開裂可能アタッチメントは一般に、例えば、熱、酵素、化合物、電磁放射線などによって開裂することができる。
【００９１】
キットはまた、核酸検出試薬を試料から得た核酸もしくはそのアンプリコンと接触させることと、もしあるとしたら、核酸検出試薬と標的核酸酸の間の結合を検出することについての指示書セット、あるいは、核酸検出試薬及び指示書セットを包装するための少なくとも一つの容器のうちの一つ以上を含む。本発明のキットに含む典型的な固体支持体は、例えば、プレート、マイクロウエルプレート、ビーズ、マイクロビーズ、チューブ（例えば、マイクロチューブなど）、繊維、ウィスカー、櫛、ハイブリダイゼーションチップ、膜、単結晶、セラミック層、自己集合単層などから、任意に選択される。
【００９２】
診断、予後予測及び治療報告
本発明はさらに、治療方策として臨床有用性を提供する病原性インデックスと相関しているレポートアルゴリズムを含むレポートを提供する。ＴＲＵＧＥＮＥ（登録商標）  ＨＩＶ-１  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｖｉｓｉｂｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｉｅｍｅｎｓ）が、治療方策として使用される臨床有用性を有するレポートアルゴリズムの例である。特に、ＴＲＵＧＥＮＥ  ＨＩＶ-１  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ａｓｓａｙは、遺伝子配列がソフトウェアシステムにより分析されて、患者のＨＩＶ治療管理のために有用なＴＲＵＧＥＮＥ  ＨＩＶ-１  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅレポートを提供するデータ分析ステップで完結する、いくつかのプロセスに基づいている。Ｕ．Ｓ．６,８３０,８８７、第６，６５３，１０７、第６，２６５，１５２、第６，００７，９８３、第５，７９５，７２２、第５，８３４，１８９、及び、第５，５４５，５２７を参照。それぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本発明方法は、宿主菌、ファージ病原体、及び病原体微生物の誘導物質に特異的な、試料中における核酸量を定量して、宿主負荷、病原体負荷、及び誘導物質負荷を決定するステップを含み、病原性インデックス、宿主または病原体負荷、及び／または誘導物質負荷は、予後予測のための報告インデックスと相関され、治療方策としての臨床有用性を提供する。本発明の方法はさらに、病原体微生物、宿主有機体、または誘導物質に特異的な複数の固有の核酸が、レポートインデックスにおいて定量され、相関されることを提示する。
【００９４】
処置治療剤をスクリーニングするため、または研究のためのカンキツグリーニング病の培養
本発明はさらに、カンキツグリーニング病の抑制もしくは予防のための治療薬候補をスクリーニングするための方法を提供する。カンキツグリーニング病に関連した「Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ」、「Ｃａ．Ｌ．ａｆｒｉｃａｎｕｓ」、及び「Ｃａ．Ｌ．ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ」の培養は、Ｓｅｃｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００９、Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ９９（５）：４８０-８６）に報告されている。そのすべての内容は、参照により本明細書に組み入れられる。本発明方法は、抑制されたファージ溶菌サイクルを有するバクテリオファージを有するＣａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒの培養菌を提供するステップ、培養菌を治療薬候補の候補と混合するステップ、及び、治療薬候補がカンキツグリーニング病を抑制もしくは予防することを示す、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ培養菌の成長抑制を検出するステップを含む。ある特定の実施形態では、バクテリオファージは、ＳＣ１、ＳＣ２及びＳＣ３溶菌ファージを含むが、これに限定されるものではない溶菌ファージであり、ファージ溶菌サイクルは抑制されるかまたは遺伝的に削除される。いくつかの実施形態では、カンキツグリーニング病菌、例えばＨＬＢ菌Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒは、バクテリオファージのファージ溶菌サイクルに対する抑制因子を含む培地で培養される。本発明は、任意の細菌培養組織を生成するのに適している、任意の細胞培養培地及び系を含む。本発明はまた、現在公知であるかまたは後に開発される、ＳＣ１抑制因子ＳＣ１＿ｇｐ１１０（ｈｏｌｉｎ）、ＳＣ１＿ｇｐ０２５、ＳＣ１＿ｇｐ-９５、ＳＣ２＿ｇｐ１００、Ｃ１、もしくは、λラムダファージ抑制因子（例えば、ファージ４３４、Ｐ２２）を含むがこれらに限定されない任意のファージ溶菌サイクル抑制因子または阻害剤を含む。２０１３年８月７日に、Ｃｉｔｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎにより提出された、“Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌａｓ  ａｎｄ  Ｌａｍ  ｐｈａｇｅ  ｆｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ＨＬＢ”Ｃｉｔｒｕｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒａｍ，ｆｉｎａｌ  ｒｅｐｏｒｔを参照。レポートの全内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００９５】
バクテリオファージまたはウイルス感染の予防及び治療
本発明はまた、細菌、植物または動物個体中のバクテリオファージまたはウイルス感染を治療及び／または予防する方法を提供し、当該方法は、それを必要としている個体に、ウイルス複製を選択的に阻害するヌクレオシド、非ヌクレオシド、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、リボヌクレオシド及びリボヌクレオシドの類似体からなる群から選択される薬剤の有効量を含む組成物を投与することを含む。ヌクレオシドは、細胞内の特定のリン酸化酵素により、糖の一級アルコール基（-ＣＨ２-ＯＨ）をリン酸化されることにより、ＤＮＡ及びＲＮＡの分子基礎単位であるヌクレオチドを生成することができる。ヌクレオシドは、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成経路により、特に肝臓において生成可能であるが、それらは食餌中の核酸の摂取及び消化を通してより豊富に供給され、それにより、ヌクレオチダーゼは、ヌクレオチド（例えばチミジン一リン酸）をヌクレオシド（例えばチミジン）及びリン酸塩に分解する。その後今度はヌクレオシドが、消化系内腔においてヌクレオシダーゼによって、核酸塩基及び、リボースもしくはデオキシリボースに分解される。加えて、ヌクレオチドは、細胞内部で、窒素性塩基及び、リボース-１-リン酸もしくはデオキシリボース-１-リン酸に分解される。
【００９６】
いくつかのヌクレオシド類縁体がまた、抗ウイルス性または抗癌剤として使われる。ヌクレオシド類縁体は、ＤＮＡ合成においてヌクレオシドのような働きをする分子である。それらは感染細胞のウイルス複製を防止するために用いられる、さまざまな抗ウイルス性製品を含む。最も一般的に用いられるものは、アシクロビル（ＡＣＶ）である。ヌクレオシド、非ヌクレオシド、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、リボヌクレオシド、リボヌクレオシド類似体、及びヌクレオチドプール還元剤の使用は、例えば、ヒト免疫不全ウイルスの治療のような、ウイルス感染の治療のための従来技術において周知である。ウイルス重合酵素は、これらの化合物を非正規塩基と組み合わせる。これらの化合物は、ヌクレオチドに転換されることによって、細胞内で活性化される。帯電ヌクレオチドは細胞膜を容易に通過することができないので、それらはヌクレオシドとして投与される。
【００９７】
一般的なヌクレオシド類縁体薬としては、デオキシアデノシン類似体（例えば、ＤＩＤＡＮＯＳＩＮＥ（ｄｄＩ）（ＨＩＶ）、及び、ＶＩＤＡＲＡＢＩＮＥ（化学療法））、デオキシシチジン類似体（例えば、ＣＹＴＡＲＡＢＩＮＥ（化学療法）、ＥＭＴＲＩＣＩＴＡＢＩＮＥ（ＦＴＣ）（ＨＩＶ）、ＬＡＭＩＶＵＤＩＮＥ（３ＴＣ）（ＨＩＶ、Ｂ型肝炎）、及び、ＺＡＬＣＩＴＡＢＩＮＥ（ｄｄＣ）（ＨＩＶ））、デオキシグアノシン類似体（例えば、ＡＢＡＣＡＶＩＲ（ＨＩＶ）、及び、Ｅｎｔｅｃａｖｉｒ（Ｂ型肝炎））、（デオキシ）-チミジン類似体（例えば、ＳＴＡＶＵＤＩＮＥ（ｄ４Ｔ）、ＴＥＬＢＩＶＵＤＩＮＥ（Ｂ型肝炎）、ＺＩＤＯＶＵＤＩＮＥ（アジドチミジンまたはＡＺＴ）（ＨＩＶ））、及び、オキシウリジン類似体（例えば、Ｉｄｏｘｕｒｉｄｉｎｅ、及び、Ｔｒｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９８】
本発明は、現在公知であるかまたは後に開発される技術においてウイルス感染を治療できる、いかなるヌクレオシドまたはヌクレオシド類縁体を含む。例示的なヌクレオシド抗レトロウイルス薬剤としては、ジドブジン（登録商標）（ＺＤＶ、アＡＺＴ）、エピビル（登録商標）（３ＴＣ、ラミブジン）、エムトリバ（登録商標）（ＦＴＣ、エムトリシタビン）、ビリアード（登録商標）（テノホビルジソプロキシルフマル酸塩、ＴＤＦ）、ジアゲン（登録商標）（硫酸アバカビル、ＡＢＣ）、カルボビル（登録商標）（ＣＢＶ）、ラシビル（ＲＣＶ、（±）-β-２´，３´-ジデオキシ-５-フルオロ-３´-チアシチジン）、ＤＥＸＥＬＶＵＣＩＴＡＢＩＮＥ（登録商標）（β-Ｄ-２´，３´-ジデヒドロ-２´，３´-ジデオキシ-５-フルオロシチジン、ｒｅｖｅｒｓｅｔ、ＲＶＴ、ｄ-Ｄ４ＦＣ、ＤＦＣ）、アムドキソビル（登録商標）（ＡＭＤＸ、（-）-β-Ｄ-２，６-ジアミノプリン  ジオキソラン、ＤＡＰＤ）、９-（β-Ｄ-１，３-ジオキソラン-４-イル）グアニン（ＤＸＧ）、ＡＶＸ７５４（ＳＰＤ-７５４、（-）ｄＯＴＣ、（-）-２´-デオキシ-３´-オキサ-４´-チオシチジン）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。非核酸系逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）は、本発明において使用され得る他の種類の薬を代表し、ＨＩＶ感染症治療のために使用されるようなＮＮＲＴＩ、例えば、エファビレンツ（ススチバ（登録商標））、リルピビリン（エジュラント（登録商標））、エトラビリン（インテレンス（登録商標））、デラビルジン（レスクリプター（登録商標））、ネビラピン（ビラミューン（登録商標））、及び、レルシビリンから選択されることができる。Ｕ．Ｓ．８,４１５,３２１、第８，１６８，５８３、第７，６３５，６９０、第７，４０２，５８８、第７，１１５，５８４、第６，９４９，５２１、及び、第５，９９０，０９３を参照。それぞれの全内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００９９】
単一の剤形を生成するために、薬理学的に許容される担体と共に、単独でもしくは組み合わせで使用され得る、ヌクレオシドまたはその類似体の量は、治療される宿主及び特定の投与様式によって変化する。必要な有効量は単一用量のいくつかの投与により得られるので、各剤形の個々の用量に含まれるヌクレオシドまたはその類似体の単位含有量は、それ自体有効量を構成する必要がないことは、当業者によって認められる。投与量の選択は、利用される剤形、治療されている状態、及び当業者の決定に従って達成される特定の目的に依存する。
【０１００】
本発明のヌクレオシドまたはその類似体による細菌、植物または動物の個体のバクテリオファージまたはウイルス感染を治療もしくは予防するための投与計画は、対象の種類、年齢、体重、性別、食習慣、及び病態、投薬経路、薬理学的考慮点（使用される特定の化合物の活性、有効性、薬物動態学的及び毒性学的性質、ヌクレオシド送達システムが利用されるかどうか、ならびに、ヌクレオシドがプロドラッグまたは複合製剤の一部として投与されるかどうか）を含む様々な要因に従って選択される。従って、実際に使用される投与計画は、対象によって大きく異なる。
【０１０１】
本発明において使用されるヌクレオシドまたはその類似体を含むいかなる抗ウイルス薬も、化学的に合成されるか、当業者に公知のあらゆる適切な方法及び／または技術により製造されることができ、治療を受けるもしくは投与される対象に応じて、全身あるいは局所投与を含むが限定されない幾つかの適切な経路により対象に投与するために、周知の方法で調製されることができる。また、個々の抗ウイルス剤は、一つ以上の他の抗ウイルス剤と組み合わせて、及び／または、他の生物学的に活性であるか不活性である薬剤と共に投与されることができる。そのような生物学的に活性であるか不活性である薬剤は、抗ウイルス剤と流体連通もしくは機械連通しているか、抗ウイルス剤に、イオン性、共有性、ファン・デル・ワールス性、疎水性、親水性、あるいは他の物理力により付着し得る。
【０１０２】
ヌクレオシドまたはその類似体のような本発明の抗ウイルス剤は、一つ以上の薬理学的に許容される担体及び／または賦形剤を用いたあらゆる従来方式によって調製されることができる。本発明の抗ウイルス剤は、帯電した、中性の、及び／または、他の薬理学的に許容される塩の形態をとることができる。薬理学的に許容される担体の例は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．），２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＰＡ，ＵＳＡ（２０００）に記載されるそれらを含むが、これに限定されるものではない。
【０１０３】
ヌクレオシドあるいはその類似体はまた、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、散剤、徐放性もしくは持効性製剤などの形をとることができる。この種の製剤は、有効量のヌクレオシドあるいはその類似体を、好ましい量の担体と共に、その様態を患者への適切な投与に提供するように、好ましくは精製された様態で含む。製剤は投与の様式に適合すべきである。
【０１０４】
抗ウイルス剤（例えば、ヌクレオシドまたはその類似体）の有効量は、予防的であるか治療的な目的を達成するために必要とされる量、投与速度、及び、対象からの抗ウイルス剤の減損または代謝速度に、概して関連する。有効量の一般的な範囲、並びに投与頻度は、前述した要因に応じて変化し得る。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、治療及び／または予防方法はまた、ヌクレオチドプール還元剤を含むことができる。一つの態様では、ヌクレオチドプール還元剤は、ヒドロキシ尿素またはヒドロキシカルバミドである。理論に束縛されることを目的としていないが、ヒドロキシ尿素は、Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｔｈｅｗｓ，１９９８（これは参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているように、デオキシリボヌクレオチドのｄｅ  ｎｏｖｏ合成を阻害し、デオキシリボヌクレオシド三リン酸プールを減損し、宿主細胞及び前駆体分子のウイルス複製を飢餓状態にすることを示している。
【０１０６】
別の態様においては、カンキツグリーニング病を治療する方法は、組成物の送達を促進するための界面活性剤または浸透剤を含む組成物を投与することを含む。界面活性剤または浸透剤という用語は、組成物の送達を改善及び／または加速する、一つ以上の化合物を意味する。ある特定の実施形態では、本発明組成物は、ＮａｎｏＣａｎｏｐｙによりＡｔｏｍｉｃ  Ｇｒｏｗの商品名で製造される浸透剤を含む。本発明は、現在公知であるか、または従来技術において後に開発される他の任意の界面活性剤または浸透剤を、同じ目的のために含む。植物への送達に関する各種の投与戦略は、公知技術である。
【０１０７】
本明細書において参照される各刊行物は、すべての目的ために、その全体が、ここで参照により組み入れられる。
【０１０８】
本発明は、その好ましい実施形態を参照することによって説明された。本発明の変形及び変更は、前述の発明の詳細な説明から、当業者にとって明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年7月5日(2016.7.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料の病因検出方法であって：
ａ）病原体の定量的測定値を決定するために、第一の生物体に特異的な核酸の、生体試料中における量を定量すること（前記第一の生物体は病原体であり、第二の生物体と関連しており、前記第一の生物体と前記第二の生物体は協働して宿主生物体の病因に影響を及ぼす）、
ｂ）前記第二の生物体の定量的測定値を決定するために、前記第二の生物体に特異的な核酸の、前記生体試料中における量を定量すること、
ｃ）病原体に対する宿主生物応答に特異的な核酸の、試料中における量を、疾患の前記病原体と関連した標的のための複合評価法を決定するために定量すること、及び、
ｄ）宿主定量測定量に対するデュアル病原体標的量の比率を計算すること（前記比率は、病因を検出するための病原体インデックスを提供する）、
を含む、方法。
【請求項２】
前記病原体インデックスは、前記病因の予後予測を示すかまたは薬物療法有効性及び薬スクリーニングのために用いることができる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一の微生物に特異的な核酸の試料中における量の前記定量が、核酸増幅反応において、前記試料から得た核酸を第一組のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることにより実行され、前記第一組のオリゴヌクレオチドは、第一の微生物の核酸と少なくとも部分的に相補的であり、前記第二の微生物に特異的な核酸の試料中における量の前記定量が、核酸増幅反応において、前記試料から得た核酸を 第二組のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることにより実行され、前記第二組のオリゴヌクレオチドは、前記第二の微生物の核酸と少なくとも部分的に相補的であり、前記第三の宿主生物に特異的な核酸の試料中における量の定量が、核酸増幅反応において、試料から得た核酸を第三組のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることにより実行され、前記第三組のオリゴヌクレオチドは、前記第三の微生物の核酸と少なくとも部分的に相補的であり、さらに核酸増幅反応からアンプリコンを検出すること（前記増幅反応は同じ容器内で起こる）、及びアンプリコンの相対数に基づいた宿主負荷の量に対する病原体比率量の比率を算出して、前記病原体インデックスまたは四分位値を誘導することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記病原体の第一の生物体が、ウイルスまたは細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記宿主生物が、細菌、植物、または動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記宿主が柑橘類の植物であり、前記病因が、カンキツグリーニング病、または、Ｈｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎ（ＨＬＢ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第二の生物体が、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ（ＬＡＳ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
臨床有用性を治療戦略として、もしくは薬剤スクリーニングのために提供する、病原体インデックスまたは四分位値と、レポートアルゴリズムもしくはレポートインデックスとを相関させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記病原体微生物の誘導物質に特異的な核酸の試料中における量を定量して、誘導物質負荷を決定するステップをさらに含み、前記病原体インデックスと前記誘導物質負荷が、予後予測を決定し、且つ治療戦略もしくは薬剤スクリーニングとしての臨床有用性を提供するための前記レポートインデックスと相関する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記病原体微生物に特異的な複数の固有な核酸、前記宿主生物、もしくは前記誘導物質が定量され、且つ前記レポートインデックスにおいて相関される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
試料中の病因を検出するためのキットであって：
ａ）病原体定量測定値を決定するための、少なくとも第一組のオリゴヌクレオチド（前記オリゴヌクレオチドは、試料中の第一の病原体微生物の核酸と少なくとも部分的に相補的であり、前記第一の病原体微生物は、第２の微生物と病原的に関係し、これら２つの病原体は協働して宿主生物に影響を及ぼす）、
ｂ）少なくとも第二組のオリゴヌクレオチド（前記オリゴヌクレオチドは、疾患の病原体に対する前記宿主生物反応の核酸と、少なくとも部分的に相補的である）、
ｃ）前記第一組のオリゴヌクレオチドと前記第二組のオリゴヌクレオチドとの核酸増幅反応のための試薬、
ｄ）前記核酸増幅反応を実施し、その一つ以上のアンプリコンを検出するための指示書、及び、
ｅ）前記宿主定量測定値に対する、前記アンプリコンもしくはデュアル病原体標的の量の比率を算出するための指示書（前記比率は、前記病因の検出、予後予測、薬剤スクリーニング、及び治療戦略もしくは効能のための、病原体インデックスを提供する）、
を含むキット。
【請求項１２】
前記病因が、カンキツグリーニング病またはＨＬＢである、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
細菌、植物または動物個体のバクテリオファージ感染の治療方法であって、ウイルス複製を選択的に阻害するヌクレオシド、非ヌクレオシド、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、リボヌクレオシド及びリボヌクレオシドの類似体からなる群から選択される薬剤の有効量を含む組成物を、それを必要としている前記個体に投与することを含む、方法。
【請求項１４】
植物のウイルス感染の治療方法であって、ウイルス複製を選択的に阻害するヌクレオシド、非ヌクレオシド、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、リボヌクレオシド及びリボヌクレオシドの類似体からなる群から選択される薬剤の有効量を含む組成物を、それを必要としている前記植物に投与することを含む、方法。
【請求項１５】
前記宿主が柑橘類の植物であり、前記ウイルス感染がカンキツグリーニング病を引き起こす、請求項１４に記載の方法。
【国際調査報告】
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