(57)【要約】  本発明は、キメラＲＳＶ／ＳｅＶ  Ｆタンパク質を発現するゲノム複製欠損センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクターを含む、半生呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ワクチンに関する。さらに、本発明は、本発明のゲノム複製欠損ＳｅＶベクターの製造方法、並びに、ＲＳＶ感染及びＲＳＶ感染関連疾患の治療におけるその使用方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸２〜７７を欠損した変異Ｐタンパク質をコードするためのリン酸化タンパク質（Ｐ）遺伝子に改変された核酸を含む、ゲノム複製欠損センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクターであって、該核酸は、さらに、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆ細胞外ドメイン又はそのフラグメント若しくは変異体、ＲＳＶ  Ｆ膜貫通ドメイン又はその機能的フラグメント若しくは変異体、及び、ＳｅＶ  Ｆ細胞質ドメイン又はその任意のフラグメント若しくは変異体、をコードするものであって、あるいは、該核酸は、さらに、ＲＳＶ  Ｆ細胞外ドメイン又はその免疫原性フラグメント若しくは変異体、及び、ＲＳＶ  Ｆ膜貫通ドメイン又はその機能的フラグメント若しくは変異体、を含むＦタンパク質をコードする、ゲノム複製欠損センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクター。
【請求項２】
該ＲＳＶ細胞外ドメインは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のアミノ酸１〜５２４に対応し、及び／又は、該ＲＳＶ膜貫通ドメインは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のアミノ酸５２５〜５５０に対応し、及び／又は、該ＳｅＶ細胞質ドメインは、ＳｅＶ  Ｆタンパク質のアミノ酸５２４〜５６５に対応する、請求項１に記載のゲノム複製欠損ＳｅＶベクター。
【請求項３】
該キメラＦタンパク質は、本質的に、細胞外ドメインが欠損している、請求項１又は２に記載のゲノム複製欠損ＳｅＶベクター。
【請求項４】
該核酸は、さらに、可溶ＲＳＶ  Ｆタンパク質又はその免疫原性フラグメント若しくは変異体をコードする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のゲノム複製欠損ＳｅＶベクター。
【請求項５】
該可溶ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の細胞外ドメイン又はその免疫原性フラグメント若しくは変異体である、請求項４に記載のゲノム複製欠損ＳｅＶベクター。
【請求項６】
該核酸が、可溶ＲＳＶ  Ｆタンパク質又はその免疫原性フラグメント若しくは変異体をコードしない、請求項１〜３のいずれか１項に記載のゲノム複製欠損ＳｅＶベクター。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のゲノム複製欠損センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクター、請求項１〜６のいずれか１項に記載のゲノム複製欠損ＳｅＶベクターの核酸若しくはその相補体、及び／又は、請求項１〜６のいずれか１項に記載のゲノム複製欠損ＳｅＶベクターの核酸をコードするＤＮＡ分子、を含む宿主細胞。
【請求項８】
（ｉ）請求項７に記載の宿主細胞を培養すること、及び
（ｉｉ）該細胞培養物から該ゲノム複製欠損ＳｅＶベクターを回収すること、を含む
請求項１〜６のいずれか１項に記載のゲノム複製欠損センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクターを製造する方法。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のゲノム複製欠損センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクター、及び、１以上の薬学的に許容される担体を含む、ワクチン。
【請求項１０】
さらに、アジュバントを含む、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
哺乳動物において、ＲＳＶ感染又はＲＳＶ感染関連疾患の治療に使用するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載のゲノム複製欠損センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクター。
【請求項１２】
該哺乳動物が、ヒト被験体である、請求項１１に記載の使用のためのゲノム複製欠損センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクター。
【請求項１３】
該ヒト被験体が、早産のヒト幼児若しくはＲＳＶ感染に対する入院のリスクがあるヒト幼児を含むヒト幼児又は小児、高齢者、ヒト免疫無防備状態の個体、移植レシピエント、あるいは、慢性疾患を罹患している個体、である、請求項１１又は１２に記載の使用のためのゲノム複製欠損センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクター。
【請求項１４】
該ワクチンが、非経口的、局所的又は粘膜的に投与される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の使用のためのゲノム複製欠損センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクター。
【請求項１５】
該非経口投与が、皮下、静脈内、腹腔内又は筋肉注射によるものである、請求項１４に記載の使用のためのゲノム複製欠損センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キメラＲＳＶ／ＳｅＶ  Ｆタンパク質を発現するゲノム複製欠損センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクターを含む、半生呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ワクチンに関する。さらに、本発明は、本発明のゲノム複製欠損ＳｅＶベクターの製造方法、並びに、ＲＳＶ感染及びＲＳＶ感染関連疾患の治療におけるその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
＜発明の背景＞
麻疹及びいくつかのインフルエンザワクチンのものを含め、今日使用されるウイルスワクチンの多くは、弱毒化したウイルスに基づいており、良い、そして長期間持続する予防的な液性及び細胞性免疫反応を生じる（Ａｍａｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３５７：１９０３−１９１５，２００７）。このような生弱毒化ワクチンは、使用されるウイルスの病原性を減少させることによって、なおも生存状態を維持しながら（又は「生きている」）、作製される。
【０００３】
しかしながら、生ワクチンの安全性は、遺伝的不安定性及び残存する病原性にも関連してもいるため、常に議論されている（Ｅｈｒｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｅｒｔ．  Ｒｅｖ．  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ８：８９９−９０５，２００９）。セービンポリオワクチンで見られたような、弱毒変異の復帰変異の可能性（Ｓａｌｋ，  Ｄ．  ａｎｄ  Ｓａｌｋ，  Ｊ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２：５９−７４，１９８４；  Ｋｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５９：５８７−６３５，２００５）、又は、弱毒化の正しいバランスの発見が、生ワクチンの欠点を例示しており、例えば、生弱毒化呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ワクチンの開発を複雑にしている（Ｌｕｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２７：５６６７−５６７６，２００９）。
【０００４】
生ワクチン使用の存在限界があるとすれば、ウイルスベクターは、生弱毒化ワクチンと同様の免疫原性特性を備える、強力かつ明確なアプローチとして登場している（Ａｂｄｕｌｈａｑｑ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｓ．  ４２：２１９−２３２，２００８；  Ｌｉｎｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７：３２９９−３３０５，２００９；  Ｚｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２６：３４８０−３４８８，２００８；  Ｓｌｏｂｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２：３１８２−３１８６，２００４）。しかしながら、生弱毒化ウイルスベクターは、多くの場合、長期間使用された生弱毒化ワクチンのような同様の安全性の問題に直面する。
【０００５】
過去にワクチン開発から重要な注目を受けていたウイルス群は、非断片化マイナス鎖ＲＮＡウイルス群（ＮＮＳＶ）である。これらのウイルスは、挿入突然変異を引き起こす宿主ゲノムへのインテグレーションの可能性を除いて、ＲＮＡゲノムを含み、宿主細胞の細胞質中でのみ複製するため、非常に望ましい安全性プロファイルを有している。さらに、組換え事象も今のところ観察されていない（Ｂｕｋｒｅｙｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８０：１０２９３−１０３０６，２００６）。ＮＮＳＶは、ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）及び狂犬病ウイルス（ＲＶ））及びパラミクソウイルス科（例えば、センダイウイルス（ＳｅＶ）及びヒトパラインフルエンザウイルス（ｈＰＩＶ））のメンバーが、ウイルスベクターワクチンの開発候補として優先的に使用されている、４つファミリーを含む（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７５：４５９４−４６０３，２００１；  Ｂｕｋｒｅｙｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８０：１０２９３−１０３０６，２００６）。
【０００６】
ワクチンのバックボーンとして、ＮＮＳＶを使用して、様々なウイルスベクター候補が開発されている。例えば、ｈＰＩＶ２／ｈＰＩＶ３ウイルスワクチンベクターは、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（ｈＰＩＶ３）を基にしたウイルスベクター中に、ｈＰＩＶ３に対応するもので置換された、細胞質ドメインを有するヒトパラインフルエンザウイルス２型（ｈＰＩＶ２）のＨＮ及びＦタンパク質を取り込むことによって作製された（Ｈａｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４：１１６２６−３５，２０００）。さらに、公知のものは、ヒトＰＩＶ３のＦ及びＮＨタンパク、並びに、ヒトＲＳＶの全長ネイティブＦタンパク質を発現する、ウシＰＩＶ３を基にしたワクチン候補であり、それは、アフリカミドリザルにおいてＲＳＶ感染から防御を与えることが見いだされた（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９：１１１９８−１１２０７，２００４）。
【０００７】
当該技術分野にて知られる他の候補ウイルスベクターワクチンは、ゲノム複製欠損センダイウイルス（ＳｅＶ）を基にしたものである（Ｗｉｅｇａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８１  ：１３８３５−１３８４４，２００７；  ＷＯ２００６／０８４７４６Ａ１）。このベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、遺伝子を発現する能力があり、最近示されている（Ｂｏｓｓｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｐｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  Ｊ．  ６：７３−８１  ，２０１２）。Ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、複製欠損ＳｅＶベースのウイルスワクチンベクターの安全性は、しかしながら、複製欠損の性質及びゲノム安定性を考慮に入れると、まだ、証明されるべきことがある。加えて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子発現は、複製能力があるセンダイベクターと比較して、その複製欠損により減少される（Ｂｏｓｓｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｐｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  Ｊ．  ６：７３−８１，２０１２）。従って、ｉｎ  ｖｉｖｏで効率的に発現し、所望の効果のある液性及び／又は細胞性免疫反応を生じさせる方法で、免疫系に対して選択的な免疫原性ペプチド又はタンパク質を提示する複製欠損センダイベクターを組換え設計することは、挑戦的な課題である。
【０００８】
よく知られる、しかし、治療が困難である、病原性ウイルスが、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）である。ＲＳＶは、世界的に幼児や高齢者において深刻な呼吸器疾患の主要な原因である（Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｐ．Ｌ．  ａｎｄ  Ｃｒｏｗｅ  Ｊ．Ｅ．  Ｊｒ，  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ，  ｉｎ：  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｅｄｓ．  Ｋｎｉｐｅ  Ｄ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｈｏｗｌｅｙ  Ｐ．，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｗｏｌｔｅｒｓ  Ｋｌｕｗｅｒ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ，２００７：１６０１−１６４６）。ＲＳＶは、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の患者における主要な病原体でもある（Ｈａｃｋｉｎｇ，  Ｄ．  ａｎｄ  Ｈｕｌｌ，  Ｊ．，  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  ４５：１８−２４，２００２）。しかしながら、最近の、著しいＲＳＶワクチン開発の努力にもかかわらず、この病原体に対して、今日、利用可能なワクチンはまだ存在しない。
【０００９】
このように、ＲＳＶ感染及びＲＳＶ感染関連疾患を罹患している患者、特に、子供や高齢者の治療に効果的な、安全なＲＳＶワクチンに対する緊急の必要性が残っている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを含む、キメラＲＳＶ／ＳｅＶ  Ｆ（融合（ｆｕｓｉｏｎ））タンパク質、又は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質を発現する、ゲノム複製欠損センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクター（以下、「本発明のゲノム複製欠損ＳｅＶベクター」又は「本発明のｒｄＳｅＶベクター」と呼ばれる）を提供することによって上記の要求を満たす。本発明のｒｄＳｅＶベクターは、効果的に高発現することができ、ＲＳＶに対して、強力な液性及び細胞性免疫反応を誘発しうる一方、同時に安全でもある。それゆえ、「半生」ＲＳＶワクチン、つまり、非常に効果的（「生ワクチン」のように）、そして、特に安全である（「デッドワクチン」のように）ワクチンとしての使用によく適合する。
【００１１】
第一の態様において、本発明は、アミノ酸２〜７７を欠損した変異Ｐタンパク質をコードするためのリン酸化タンパク質（Ｐ）遺伝子に修飾された核酸を含む、ゲノム複製欠損センダイウイルス（ＳｅＶ）を提供するものであって、該核酸は、さらに呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆ細胞外ドメイン又はその免疫原性フラグメント若しくはその変異体、ＲＳＶ  Ｆ膜貫通ドメイン又はその機能的フラグメント若しくはその変異体、及び、ＳｅＶ  Ｆ細胞質ドメイン又はその任意のフラグメント若しくはその変異体、を含むキメラＦタンパク質をコードするものであって（以下、「キメラＦタンパク質」又は「キメラＲＳＶ／ＳｅＶタンパク質」）、又は、該核酸は、ＲＳＶ  Ｆ細胞外ドメイン又はその免疫原性フラグメント若しくはその変異体、及び、ＲＳＶ  Ｆ膜貫通ドメイン又はその機能的フラグメント若しくはその変異体、を含む、Ｆタンパク質をコードする（以下、「ＲＳＶ  Ｆタンパク質」）。
【００１２】
他の態様において、本発明は、本発明のゲノム複製欠損センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクター、本発明のゲノム複製欠損ＳｅＶベクターの核酸、若しくは、その相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）、及び／又は、本発明のゲノム複製欠損ＳｅＶベクターの核酸をコードする、若しくは、該核酸の相補体をコードするＤＮＡ分子、を含む、宿主細胞を提供する。
【００１３】
さらなる態様において、（ｉ）本発明の宿主細胞を培養すること、及び（ｉｉ）該細胞培養物よりゲノム複製欠損ＳｅＶを回収すること、を含む、本発明のゲノム複製欠損センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクターを製造する方法が提供される。
【００１４】
他の態様において、本発明は、本発明のゲノム複製欠損センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクター、及び、１以上の薬学的に許容される担体を含む、ワクチンを提供する。
【００１５】
さらに、他の態様において、本発明は、哺乳動物、とりわけヒト被験体、さらにとりわけヒト幼児若しくは子供、高齢者、ヒト免疫無防備状態の個体、移植レシピエント、又は慢性疾患を罹患した個体における、ＲＳＶ感染若しくはＲＳＶ感染関連疾患の治療の、本発明のゲノム複製欠損センダイウイルス（ＳｅＶ）の使用に関する。
【００１６】
本発明の好ましい態様は、添付された従属項に記載される。
【００１７】
前述の概要、並びに以下の詳細な説明及び例示は、添付の図面と併せて読むと、より理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、「ｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeV」ベクターとして命名された、キメラＲＳＶ／ＳｅＶ  Ｆタンパク質を発現する、本発明のゲノム複製欠損ＳｅＶベクターのゲノム構造を示す模式図である。ＳｅＶ  Ｆの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインは、それらの対応するＲＳＶ由来カウンターパートと置換されており、その結果、以下のキメラＦ（「Ｆchim2」）タンパク質を生じる：ＲＳＶ細胞外ドメイン（「ｅｃｔｏ」；ＲＳＶ  Ｆのアミノ酸１〜５２４）、ＲＳＶ膜貫通ドメイン（「ｔｍ」；ＲＳＶ  Ｆのアミノ酸５２４〜５６５）、及びＳｅＶ細胞質ドメイン（「ｃｙｔｏ」；ＳｅＶ  Ｆのアミノ酸５２４〜５６５）。「Ｐmut」ＯＲＦにおいて、最初の７６アミノ酸は、複製欠損ワクチンベクターを得るために欠損された（ＰΔ２−７７）。
【図２】図２は、「ｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeV−ΔＣＴ」と命名された、本発明のゲノム複製欠損ＳｅＶベクターの変異株（ｖａｒｉａｎｔ）のゲノム構造を示す模式図である。この変異株は、図１で示されたｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeVと同一であるが、Ｎ末端の最初の２アミノ酸（ＳｅＶ  Ｆのアミノ酸５２４〜５２５）を除いた全体の細胞質ドメインが欠けている。「Ｐmut」ＯＲＦにおいて、最初の７６アミノ酸は、複製欠損ワクチンベクターを得るために欠損された（ＰΔ２−７７）。
【図３】図３は、「ｒｄＳｅＶ−ｓＦRSV」と命名され、ＲＳＶの可溶Ｆ（ｓＦ）タンパク質を発現する、本発明の比較のゲノム複製欠損ＳｅＶベクターのゲノム構造を示す模式図である。ＲＳＶ  Ｆ細胞外ドメインのＯＲＦ（ＲＳＶ  Ｆのアミノ酸１〜５２４）は、Ｐ遺伝子下流に、追加翻訳ユニット（「ｓＦRSV」）として挿入された。「Ｐmut」ＯＲＦにおいて、最初の７６アミノ酸は、複製欠損ワクチンベクターを得るために欠損された（ＰΔ２−７７）。
【図４】図４は、本発明のゲノム複製欠損ＳｅＶベクター（ｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeV）の産生効率を示す棒グラフである。ｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeVベクターは、ＳｅＶ  ＰとＮタンパク質をコードする遺伝子を含む発現プラスミドを安定的にトランスフェクトしたＶＰＮ細胞中で産生された。異なる継代レベル（「Ｐ」）における両ベクターの異なる産生の実施が、比較において実施され（Ｐ１−１、Ｐ１−２、Ｐ２−１、Ｐ２−２、Ｐ３−１）、細胞培養上清由来のサンプルは、産生中の異なる時点、例えば、８日目〜１１日目（「ｄ８〜１１」）、１１日目〜１２日目（「ｄ１１〜１２」）など、で回収された。回収されたサンプルのベクターの力価（ｐｆｕ／ｍＬ）が決定された。
【図５】図５は、ｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeV（黒棒）及び、Ｎ末端の最初の２アミノ酸を除いた細胞質ドメイン全体を欠損したその変異株（「ｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeV−ΔＣＴ」と呼ぶ）（白棒）の産生効率を示す棒グラフである。ｐｆｕ／ｍＬにおける細胞培養上清のベクター力価は、３日目（「ｄ２−３」）、４日目（「ｄ３−４」）、５日目（「ｄ４−５」）、６日目（「ｄ５−６」）、７日目（「ｄ６−７」）で決定された。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
＜本発明の詳細な説明＞
本発明によれば、本発明のゲノム複製欠損ＳｅＶベクターは、ＲＳＶ感染及びＲＳＶ感染関連疾患に対するワクチンとしての使用に適した安全性の高いウイルスベクターを提供する。驚くべき事に、本発明のゲノム複製欠損ＳｅＶベクターは、ヒトへの使用に適した細胞を使用して、大量に高効率で産生することができることが見出された。これは、市販のワクチンのためにも最も重要である、本発明のウイルスワクチンベクターのコスト効率の高い製造を可能にする。さらに、本発明のゲノム複製欠損ＳｅＶベクターは、単純で再現可能な方法によって製造されることが可能であり、適当なその小さなゲノムサイズが、一定で、信頼性のある配列の監視を可能にする。
【００２０】
第一の態様において、本発明は、ゲノム複製欠損センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクターを提供する。このベクターは、アミノ酸２〜７７が欠損した変異体Ｐタンパク質をコードするためのリン酸化タンパク質（Ｐ）遺伝子中に修飾された核酸を含む。該核酸は、さらに、ＲＳＶ細胞外ドメイン及びＲＳＶ膜貫通ドメインを含む、特異的なキメラＲＳＶ／ＳｅＶ  Ｆタンパク質又は特異的なＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする。本明細書中で使用される、「センダイウイルスベクター」又は「ＳｅＶベクター」は、ウイルスゲノムを含む感染性ウイルスである。これは、本発明の組換えｒｄＳｅＶベクターは、細胞及び細胞株の感染のために、特に、ＲＳＶ感染に対する免疫反応を誘導するために、ヒトを含む生きた動物の感染のために使用されることが可能である。
【００２１】
本発明の文脈中において、用語「核酸」は、最も広い意味で用いられ、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、（−）−ＲＮＡ、（＋）−ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ等を包含する。しかしながら、核酸が、本発明のｒｄＳｅＶベクターの一部である及び含まれる場合、核酸は、マイナス鎖ＲＮＡ（（−）−ｓｓＲＮＡ）である。この場合、核酸は、一般的には、本発明のｒｄＳｅＶのゲノムに相当する。さらに、本明細書中で使用される用語「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」は、他の核酸の合成のため（例えば、ｍＲＮＡ、マイナス鎖ＲＮＡ（（−）−ｓｓＲＮＡ）又はプラス鎖ＲＮＡ（（＋）−ｓｓＲＮＡ））及び／又は、オリゴ−若しくはポリペプチド（「タンパク質」）を合成するための、鋳型として機能するための核酸の固有の特性を指す。これは、転写及び翻訳の結果、細胞又は他の生物学的システム中のタンパク質の産生が行われる場合、タンパク質は「コードされている」。
【００２２】
本発明のゲノム複製欠損ＳｅＶベクターのバックボーンとして機能するＳｅＶは、任意の知られているＳｅＶ株であってよい。適切な例としては、しかし限定されないが、センダイ  フシミ株（ＡＴＣＣ  ＶＲ１０５）、センダイ  ハリス株、センダイ  カンテル株又はセンダイ  Ｚ株を含む。本発明のｒｄＳｅＶは、さらに、複製欠損（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）（複製欠陥（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）であることで特徴づけられる。これは、以前述べられたように（Ｂｏｓｓｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｐｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  Ｊ．  ６：７３−８１，２０１２；  ＷＯ２００６／０８４７４６Ａ１）、Ｎ末端７６アミノ酸（Ｐタンパク質のＰΔ２−７７）を欠損するようにリン酸化タンパク質（Ｐ）中のＳｅＶバックボーンを修飾することによって達成される。得られるＳｅＶ／ＰΔ２−７７ベクターは、以前示されたように（Ｂｏｓｓｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｐｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  Ｊ．  ６：７３−８１，２０１２）、複製欠損である、つまり、非ヘルパー細胞株中にて新規ゲノム鋳型を合成することができないが、それでも転写する能力は有している、つまり、主要な転写及び遺伝子発現は可能である。
【００２３】
任意の特定の理論に拘束されるものではないが、ウイルスの転写及びウイルスの複製の両者を実行する、ウイルスＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（ｖＲｄＲｐ）の主要構成要素である、Ｐタンパク質中の欠損は、ｖＲｄＲｐの複製及び転写活性と連結しないと信じられている。これは、複製活性の完全な欠失を導く一方、ＳｅＶ／ＰΔ２−７７ベクターは未だに、初期及び後期主要転写の両方を含む主要な転写を実行することが可能である。「初期主要（ｅａｒｌｙ  ｐｒｉｍａｒｙ）」転写とは、ＳｅＶウイルス粒子中に元々含まれているｖＲｄＲｐ分子によって、ウイルスＲＮＡが転写される、感染した宿主細胞中において最初に転写するイベントをいう。「後期主要（ｌａｔｅ  ｐｒｉｍａｒｙ）転写」とは、新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）タンパク質合成が開始され、転写が、新しく合成されたｖＲｄＲｐによって増加的に実行される段階を意味する。
【００２４】
本発明によれば、本発明のｒｄＳｅＶベクターの核酸によってコードされるキメラＲＳＶ／ＳｅＶタンパク質は、（ｉ）呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質の細胞外ドメイン又はその免疫原性フラグメント若しくはその変異体、（ｉｉ）ＲＳＶ  Ｆタンパク質の膜貫通ドメイン又はその機能的フラグメント若しくはその変異体、及び、（ｉｉｉ）ＳｅＶ  Ｆタンパク質の細胞質ドメイン又はその任意のフラグメント若しくはその変異体、を含む。同様に、本発明のｒｄＳｅＶベクターの核酸によってコードされるＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆ細胞外ドメイン又はその免疫原性フラグメント若しくはその変異体、及び、ＲＳＶ  Ｆ膜貫通ドメイン又はその機能的フラグメント若しくはその変異体を含む。
【００２５】
本明細書中で使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、オープンエンド用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及びクローズドエンド用語「（から）成る（ｃｏｎｓｉｓｔ  （ｏｆ））」の両方を包含することが意図される。このように、本発明のｒｄＳｅＶベクターの核酸は、さらに、他の異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）タンパク質又はキメラタンパク質をコードしてもよく、その結果として、例えば、２価ウイルスベクターワクチンとなる（例えば、ＲＳＶ及びｈＰＩＶ指向性の）。
【００２６】
本発明の範囲内にて、上述のＲＳＶの細胞外ドメイン及び／又は膜貫通ドメインは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のアミノ酸１〜５２４及び５２５〜５５０にそれぞれ相当しうる。ＳｅＶ細胞質ドメインは、ＳｅＶ  Ｆタンパク質のアミノ酸５２４〜５６５に相当しうる。このように、キメラＲＳＶ／ＳｅＶ  Ｆタンパク質は、アミノ酸１〜５２４がＲＳＶ細胞外ドメインと定義され、アミノ酸５２５〜５５０はＲＳＶ膜貫通ドメインと定義され、及び、アミノ酸５５１〜５９２はＳｅＶ細胞質ドメインと定義される、５９２アミノ酸を含んでもよい。５９２アミノ酸キメラＲＳＶ／ＳｅＶ  Ｆタンパク質の欠損変異株（ｖａｒｉａｎｔｓ）及び変異体（ｍｕｔａｎｔｓ）もまた、本発明の範囲内であって、ここで、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインの「フラグメント」及び「変異体（ｍｕｔａｎｔｓ）」は、下記で定義されるものである。
【００２７】
好ましくは、ＲＳＶ細胞外ドメインは、配列番号：１（ＲＳＶ株ＡＴＣＣ  ＶＲ−２６（ロング株）Ｆタンパク質；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ９１１２６２、翻訳ＡＡＸ２３９９４、の細胞外ドメイン）、又はその免疫原性フラグメント若しくはその変異体で示されるアミノ酸配列を有する。好ましくは、ＲＳＶ膜貫通ドメインは、配列番号：２（ＲＳＶ株ＡＴＣＣ  ＶＲ−２６（ロング株）Ｆタンパク質；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ９１１２６２、翻訳ＡＡＸ２３９９４、の膜貫通ドメイン）で示されるアミノ酸配列を有するものである、又は、その機能的フラグメント若しくはその変異体である。好ましくは、ＳｅＶ細胞質ドメインは、配列番号：３（ＳｅＶ株フシミ  Ｆタンパク質；ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０６４３２、翻訳ＡＡＣ５４２７１、の細胞質ドメイン）で示されるアミノ酸配列を有するものである、又は、その任意のフラグメント若しくはその変異体である。
【００２８】
配列番号：１で示されるＲＳＶ細胞外ドメインのアミノ酸配列を除いて、上記で定義されるようなＲＳＶ細胞外ドメイン、ＲＳＶ膜貫通ドメイン、及びＳｅＶ細胞質ドメインは、Ｇｌｕ６６Ｇｌｙ、Ｖａｌ７６Ｇｌｕ、Ａｓｎ８０Ｌｙｓ、Ｔｈｒ１０１Ｓｅｒ及びＳｅｒ２１１Ａｓｎからなる群から選択される１以上、好ましくは、全ての点突然変異（ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）を含み、及び／又は、配列番号：３で示されるＳｅＶ細胞質ドメインのアミノ酸配列は、点突然変異Ｇｌｙ３４Ａｒｇを含む、ことも好ましい。特に好ましくは、キメラＲＳＶ／ＳｅＶ  Ｆタンパク質は、配列番号：１〜３で定義されるアミノ酸配列、又は、上記６つ全ての点変異を含む配列番号：１〜３で定義されるアミノ酸配列を有する。同様に、ＲＳＶ細胞外ドメイン及びＲＳＶ膜貫通ドメインを含む本発明のｒｄＳｅＶベクターのＲＳＶ  Ｆタンパク質は、最も好ましくは、配列番号：１及び２によって定義されるアミノ酸配列、又は、上述の５つ全ての細胞外ドメイン点変異を含む配列番号：１及び２で定義されるアミノ酸配列を有するものであって、該アミノ酸配列のフラグメント及び変異体もまた、本発明によって包含される。
【００２９】
本発明の文脈において、用語「フラグメント」は、アミノ末端及び／又はカルボキシル末端の欠損により生じたポリペプチド又はタンパク質ドメインの一部を意味する。好ましくは、アミノ末端及び／又はカルボキシル末端欠損は、１０又は５アミノ酸以下、好ましくは、１，２，又は３アミノ酸以下である。本明細書中で使用される、用語「免疫原性」は、液性及び／又は細胞性免疫反応を誘発する能力をまだ有しているＲＳＶ細胞外ドメインのフラグメント又は変異体を意味する。好ましくは、配列番号：２のアミノ酸配列を有する膜貫通ドメイン及び配列番号：３のアミノ酸配列を有する細胞質ドメインと融合するとき、免疫原性フラグメント又は変異体は、アミノ酸配列番号：１〜３のアミノ酸配列で定義される全長キメラＲＳＶ／ＳｅＶ  Ｆタンパク質によって達成されるものの１０％、２０％、４０％、６０％又は８０％と等しい程度又はそれより高い、液性及び／又は細胞性免疫反応を誘発する。本明細書中で使用される用語「機能的」は、膜貫通ドメインと機能的に同等な膜貫通ドメインフラグメント又は変異体、つまり、膜に対して、本発明のｒｄＳｅＶベクターのキメラＲＳＶ／ＳｅＶ  Ｆタンパク質及び／又はＲＳＶ  Ｆタンパク質を固定する能力をまだ有するフラグメント又は変異体、を意味する。
【００３０】
本発明の範囲内で、ＳｅＶ細胞質ドメインのフラグメント（時々、「細胞質尾部」と称される）は、１アミノ酸又は２〜５アミノ酸だけ短くすることができる。この場合、それぞれのキメラＲＳＶ  ＳｅＶ  Ｆタンパク質は、細胞質ドメインを「本質的に欠損している」として意味されても良い。以下の実施例で証明されるように、第一及び第二Ｎ末端アミノ酸を除いて（例えば、配列番号：３のアミノ酸１及び２）ＳｅＶ細胞質ドメイン全体を欠損するキメラＲＳＶ／ＳｅＶ  Ｆタンパク質の変異株は、予想外に、全長ＳｅＶ細胞質ドメインを有するＲＳＶ／ＳｅＶ  Ｆタンパク質で達成されるものよりも高い、高産生効率を可能にすることが見出された。それゆえ、細胞質ドメインは不要であると思われるので、細胞質ドメインの任意のフラグメント（一部）を含む、又は、細胞質ドメインを欠損するキメラＲＳＶ／ＳｅＶ  Ｆタンパク質は、本発明に包含される。
【００３１】
本明細書中で使用されるような用語「変異体（ｍｕｔａｎｔ）」は、変異を有するポリペプチド又はタンパク質ドメインを意味するものであって、該変異は、特定の変異の型に限定されない。特に、変異は、単一アミノ酸置換、Ｎ末端、Ｃ末端及び内部の欠損を含む１又は複数のアミノ酸の欠損、及び、Ｎ末端、Ｃ末端及び内部の挿入を含む１又は複数のアミノ酸の挿入、及びその組み合わせ、を含む。挿入された、及び／又は欠損されたアミノ酸の数は、１〜１０、特に１〜５であってよい。加えて、１〜２０、特に１〜１０、より特に１〜５アミノ酸は、他のアミノ酸へ変異（置換）されてもよい。さらに、用語「変異体（ｍｕｔａｎｔ）」は、配列番号：１（ＲＳＶ株  ＡＴＣＣ  ＶＲ−２６（ロング株）Ｆタンパク質の細胞外ドメイン）、配列番号：２（ＲＳＶ株  ＡＴＣＣ  ＶＲ−２６（ロング株）Ｆタンパク質の膜貫通ドメイン）及び配列番号：３（ＳｅＶ株フシミ  Ｆタンパク質の細胞質ドメイン）、のそれぞれで示されるアミノ酸配列と、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％、及び最も好ましくは少なくとも９７％同一である、変異した細胞外ドメイン、変異した膜貫通ドメイン及び変異した細胞質ドメインをそれぞれ包含してもよい。
【００３２】
バックボーンとして使用されるＳｅＶ、及び、細胞質ドメインの由来のＳｅＶは、同じであってもよく、又は異なってもよい。しかしながら、本発明のｒｄＳｅＶは、一般的には、ＳｅＶバックボーンのＳｅＶ細胞外ドメインと膜貫通ドメインと、対応するＲＳＶ  Ｆ細胞外ドメイン（又はその機能的フラグメント若しくはその変異体）及びＲＳＶ  Ｆ膜貫通ドメイン（又はその機能的フラグメント若しくはその変異体）、とそれぞれ置換することによって構築されるので、キメラＦタンパク質のＳｅＶ部分は、典型的には、本発明のｒｄＳｅＶベクターのバックボーンとして使用されるＳｅＶ由来である。
【００３３】
バックボーンとして使用するための、及び／又は、キメラＲＳＶ／ＳｅＶ  Ｆタンパク質の構築のための、適切なＳｅＶ株は、センダイ  フシミ株（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１０５）、センダイ  ハリス株、センダイ  カンテル株及びセンダイ  Ｚ株を含む。同様に、ＲＳＶ細胞外ドメインは、任意の組換え又は天然に存在するＲＳＶ株、好ましくは、ヒトＳｅＶ株、例えば、Ａ２株、ロング株、又はＢ株等の、ＲＳＶ  Ｆタンパク質由来であってもよい。
【００３４】
本発明の一実施態様において、本発明のゲノム複製欠損ＳｅＶベクターの核酸は、ＲＳＶ細胞外ドメイン及びＲＳＶ膜貫通ドメインを含む、キメラＲＳＶ／ＳｅＶ  Ｆタンパク質又はＲＳＶ  Ｆタンパク質に加え、可溶ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする。本発明の意味する範囲内において「可溶Ｆタンパク質」は、該Ｆタンパク質を膜へ位置するアミノ酸の任意のストレッチを欠いているＦタンパク質であり、特に、膜貫通ドメインと細胞質ドメインの両方を欠いているＦタンパク質をいう。このように、可溶ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の細胞外ドメイン又はその免疫原性フラグメント若しくはその変異体であってもよい。用語「フラグメント」、「免疫原性」及び「変異体」は、上述で定義されたものと同一の意味を有する。
【００３５】
好ましい実施態様において、可溶ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ＲＳＶタンパク質のアミノ酸１〜５２４又はその免疫原性フラグメント若しくはその変異体に相当する。特に好ましい実施態様において、可溶ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、配列番号：１で示される配列を有するＲＳＶ  ＡＴＣＣ  ＶＲ−２６株（ロング株）Ｆタンパク質の細胞外ドメイン、又はその免疫原性フラグメント若しくはその変異体である。
【００３６】
可溶ＲＳＶ  Ｆタンパク質（以下、「ｓＦ導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」と呼ばれる）をコードする異種遺伝子の高発現が所望される場合、該配列は、好ましくは、ウイルスマイナス鎖ＲＮＡゲノムの３’領域へ挿入される。その理由は、ＳｅＶのようなマイナス鎖ＲＮＡウイルスはそのマイナス鎖ＲＮＡゲノムの３’末端で転写ユニットを最も効率的に転写するからである。遺伝子のさらに下流の転写レベルは、徐々に減少し、それは、転写勾配（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）として知られる現象である。これは、ウイルスゲノム中の異なる場所において、挿入することによって、異種導入遺伝子の発現レベルの調整を許容する。本発明内において、ｓＦ導入遺伝子は、Ｐ（つまり、Ｐmut；ＰΔ２−７７）遺伝子及びＭ遺伝子の間に挿入されることが好ましい。
【００３７】
ｓＦ導入遺伝子は、転写開始配列、転写ターミネーター及び好ましくは翻訳シグナルに動作的にリンクされた、可溶ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸配列を含む転写カセットとして挿入されても良い。ｓＦ導入遺伝子は、ｍＲＮＡ安定化因子と動作的にリンクされても良い。例えば、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節因子（ＷＰＲＥ）は、そのｍＲＮＡを安定化するため、及び、その発現を延長するために、ｓＦ導入遺伝子３’ＵＴＲ及び／又は５’ＵＴＲ領域へ挿入されても良い。
【００３８】
可溶ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードするｓＦ導入遺伝子の取り込みは、２つの異なる方法、つまり、ウイルスエンベロープ中に埋め込まれている構造ベクター要素としてのＲＳＶ抗原を提示するキメラＲＳＶ／ＳｅＶ又はＲＳＶ  Ｆ表面タンパク質として、及び、可溶ＲＳＶ  Ｆタンパク質として、ＲＳＶ抗原の提示を許容する。このように、可溶ＲＳＶ  Ｆタンパク質の追加的な発現は、免疫システムの液性及び細胞性の武器（ａｒｍｓ）を含む、より効果的かつ広範な免疫反応の誘導を助けることができる。
【００３９】
本発明の他の実施形態において、本発明のｒｄＳｅＶベクターの核酸は、可溶ＲＳＶ  Ｆ、又はそのフラグメント若しくはその変異体をコードしない。さらに、本発明の文脈内において、本発明のｒｄＳｅＶベクターは、本明細書中で詳細に記載されている、キメラＲＳＶ／ＳｅＶ  Ｆタンパク質又はそのフラグメント若しくはその変異体以外の、キメラＦタンパク質又はそのフラグメント若しくはその変異体をコードしないことが好ましく、好ましくは、可溶ＲＳＶタンパク質又はその任意のフラグメント若しくは変異体もまたコードしない。さらに、本発明の文脈内において、本発明のｒｄＳｅＶベクターは、本明細書中で詳細に記載されている、ＲＳＶ  Ｆタンパク質又はそのフラグメント若しくはその変異体以外の、膜結合Ｆタンパク質又はそのフラグメント若しくはその変異体はコードしないことが好ましく、好ましくは、可溶ＲＳＶ  Ｆタンパク質又はその任意のフラグメント若しくはその変異体もコードしない。また、本明細書に詳細に記載される、キメラＲＳＶ／ＳｅＶ  Ｆタンパク質は、好ましくは、本発明のｒｄＳｅＶによって発現される唯一の異種タンパク質である。
【００４０】
上述の修飾に加えて、本発明のＳｅＶベクターは、他の修飾を含んでもよい。特に、１以上のウイルス遺伝子中に追加の変異を導入することで改変されてもよい。例えば、本発明のｒｄＳｅＶベクターは、ウイルスエンベロープタンパク質をコードする少なくとも一つの遺伝子に１以上の変異を追加的に含んでも良い。これらの変異は、当該技術分野で公知の組換え技術によって導入することができ、ウイルスの細胞特異性が変化する等の、異なる効果を導きうる。
【００４１】
Ｐ遺伝子のＮ末端ＯＲＦと、Ｃ、Ｗ及びＶのＯＲＦは重複するため、本発明のｒｄＳｅＶベクターは、ウイルスＰタンパク質中のＮ末端欠損の結果として、Ｃ、Ｗ、及び／又はＶのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中に１以上の変異を有していてもよい。さらに、本発明のｒｄＳｅＶベクターは、Ｃ’遺伝子の代替開始コドンＡＣＧの欠損を付加的に有していてもよい。Ｃ’遺伝子は、感染細胞中における抗−ＩＦＮ反応活性を示すことが知られる非構造タンパク質をコードする。Ｃ’遺伝子の開始コドンの欠損は、結果として、感染した標的細胞中の異種遺伝子産物の発現レベルの増加を引き起こすことが見出された。
【００４２】
第二の態様において、本発明は、本発明のゲノム複製欠損センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクター、本発明のゲノム複製欠損ＳｅＶベクターの核酸若しくはその相補体、及び／又は、本発明のゲノム複製欠損ＳｅＶベクターの核酸をコードする若しくはその核酸の相補体をコードするＤＮＡ分子、を含む、宿主細胞を提供する。
【００４３】
本発明の意味する範囲の、「相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）」は、核酸の配列に対して相補性があるヌクレオチド配列を意味する（つまり、「アンチセンス」核酸）。これに関して、核酸は、一般的に、本発明のｒｄＳｅＶのゲノムに対応することに留意されたい。これは、核酸の相補体は、一般的には、本発明のｒｄＳｅＶのアンチゲノムに対応する。
【００４４】
宿主細胞は、レスキュー細胞（又は、「ウイルス産生細胞」）又はヘルパー細胞（又は「増幅細胞」）のいずれかであってもよい。レスキュー細胞は、本発明のｒｄＳｅＶベクターの最初の製造のために使用される。レスキュー細胞は、典型的には、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ又は相同の細胞性ＲＮＡポリメラーゼＩＩのような、異種ＤＮＡ依存性及び／又はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを常に発現する、真核細胞、特に、哺乳類細胞である。異種ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は、レスキュー細胞のゲノムに組み込まれてもよく、又は、発現プラスミド中に存在してもよい。
【００４５】
レスキュー細胞は、本発明のｒｄＳｅＶベクターが組み立てられるように、機能的なＳｅＶ  Ｐタンパク質並びにＳｅＶ  Ｎ及びＬタンパク質をさらに発現しなければならない。これらのウイルスタンパク質の発現は、典型的には、それぞれＰ、Ｎ及びＬ遺伝子を有する発現プラスミドを１以上、レスキュー細胞にトランスフェクトすることによって達成される。本明細書中で使用するための最適なレスキュー細胞は、ゲノム中に安定的に組み込まれたＴ７ＲＮＡポリメラーゼに対する遺伝子を含み、ＳｅＶ  Ｐ、Ｎ及びＬタンパク質に対する遺伝子を保有する発現プラスミドでトランスフェクトされている、ＢＳＲ−Ｔ７細胞である（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７３：２５２−２５９，１９９９）。
【００４６】
本発明のｒｄＳｅＶベクターの最初の製造のために、本発明のｒｄＳｅＶの核酸又はそのアンチセンス核酸をコードするＤＮＡ分子は、レスキュー細胞へとトランスフェクトされる。細胞トランスフェクションは、当該技術分野で公知の手順に沿って、例えば、製造会社による記載されような、ＦｕＧＥＮＥ６又はＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ社）試薬を用いて化学的に、又はエレクトロポレーション法によって、実施されうる。トランスフェクトされたＤＮＡ分子は、一般的には、本発明のｒｄＳｅＶの核酸のｃＤＮＡを有するプラスミドである。ＤＮＡ分子は、レスキュー細胞の異種ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって常に転写されるので、ＤＮＡ分子は、好ましくは、さらに、転写シグナル、例えば、Ｔ７プロモーター、及び、ウイルスゲノム配列と操作的に結合するターミネーター配列を含む。さらに、ウイルス配列の３’末端において、転写切断を許容する、３’末端にリボザイム配列を含んでも良い。ＤＮＡ分子は、さらに、原核ヘルパー細胞（例えば、大腸菌）中、及び／又は真核ヘルパー細胞中、特に哺乳類ヘルパー細胞中で、増殖に最適であってもよい。レスキュー細胞中で組換えウイルスゲノムのパッケージの後、続いて、細胞の表面にてウイルス粒子が組み立てられ、新しく作製されたｒｄＳｅＶベクターが、細胞からの出芽によって放出され、他のラウンドのヘルパー細胞の感染に使用されてもよい。
【００４７】
ヘルパー細胞（ＨＰ）は、レスキュー細胞中で最初に組み立てられるＳｅＶベクターの増幅のために使用され、一般的には、Ｖｅｒｏ細胞又はＨＥＫ−２９３細胞等の、哺乳類細胞由来である。これらのヘルパー細胞は、Ｐタンパク質、並びに、追加的に、Ｎ及び／又はＬタンパク質を発現する。相当するＰ、Ｎ及びＬ遺伝子は、ヘルパー細胞のゲノムに組み込まれ得る、又は、１以上の発現プラスミドに存在する。代表的な最適な細胞株は、恒常的にＳｅＶ  Ｐタンパク質を発現するＨＥＫ−２９３由来の細胞株である（Ｗｉｌｌｅｎｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６８：８４１３−８４１７，１９９４）。本発明によれば、このＰ／Ｎ共発現は、驚くことに、最も高いウイルス産生の割合を生むことが見出されたので、ヘルパー細胞は、好ましくは、ウイルスＰ及びＮタンパク質、しかし、ウイルスＬタンパク質ではない、を発現するために、遺伝子的に修飾される。
【００４８】
第三の態様において、本発明は、本発明のゲノム複製欠損センダイウイルス（ＳｅＶ）を産生するための方法を提供するものであって、その工程は：
（ｉ）本発明の宿主細胞を培養する工程、及び
（ｉｉ）該細胞培養物からゲノム複製欠損ＳｅＶベクターを回収する工程、
を含む。
【００４９】
ゲノム複製欠損ＳｅＶベクターを産生するための方法は、当該技術分野において知られており、例えば、Ｗｉｅｇａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８１：１３８３５−１３８４４（２００７）、  Ｂｏｓｓｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｐｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  Ｊ．  ６：７３−８１  （２０１２）及びＷＯ２００６／０８４７４６Ａ１に記載されている。培養工程（ｉ）において、宿主細胞は、本発明のゲノム複製欠損ＳｅＶが形成されるように、ゲノム複製及び転写を許容する条件下にて、適切な培養液にて培養される。該細胞を培養するために使用される培地は、熱失活したＦＣＳ１０％を添加したＤＭＥＭ（インビトロジェン社）等の、宿主細胞の成長に適切な任意の慣習的な培地であってよい。宿主細胞は、上記で定義されたレスキュー細胞又はへルパー細胞であってよい。回収工程（ｉｉ）において、本発明の形成されたＳｅＶベクターは、当該技術分野で公知の方法によって回収されてもよい。
【００５０】
好ましい実施形態によれば、本発明のゲノム複製欠損センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクターを製造するための方法は、以下の工程：
（ａ）ＤＮＡ分子を第一宿主細胞へと導入する工程であって、該ＤＮＡ分子は、本発明のゲノム複製欠損センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクターの核酸、又はその相補体をコードするものであって、
（ｂ）該ゲノム複製欠損ＳｅＶベクターを製造するために、該第一宿主細胞を培養する工程、
（ｃ）該第一細胞培養物から、ゲノム複製欠損ＳｅＶベクターを回収する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた該ゲノム複製欠損ＳｅＶベクターを、第二宿主細胞へと感染する工程、
（ｅ）該ゲノム複製欠損ＳｅＶベクターを増幅するために、第二宿主細胞を培養する工程、
（ｆ）該第二細胞培養物から、該ゲノム複製欠損ＳｅＶベクターを回収する工程、
を含む。
【００５１】
第一宿主細胞は、好ましくは、上記のように、レスキュー細胞（ウイルス産生細胞）であって、第二宿主細胞は、好ましくは、上記の様に、ヘルパー細胞（増幅細胞）である。工程（ａ）の第一宿主細胞へのＤＮＡ分子の導入は、当該技術分野で知られるトランスフェクション方法によって実施されうる。培養及び回収工程は、上記で定義されたように実施されてもよい。
【００５２】
第四の態様において、本発明は、本発明のゲノム複製欠損センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクター及び、１以上の薬学的に許容される担体を含む、ワクチンに関する。
【００５３】
本明細書中で使用される用語「ワクチン」は、特定の病原体又は疾患に対して、被験体における治療程度の免疫を誘導するのに有効な活性化成分を含む薬剤又は組成物を指す。本発明のワクチンは、「半生」ワクチンであり、それは、複製欠損しているので、生ワクチンではないが、主要な転写及び遺伝子発現能力を有しているため、不活性化（又は殺された）ワクチンではない、ワクチンを指す。本発明の半生ワクチンは、非常に効果的であり（「生ワクチン」のように）、また特に安全である（「デッドワクチン」のように）。
【００５４】
本出願の文脈において、本発明のワクチンの投与形態は、特に限定されないが、溶液、懸濁液、凍結乾燥された材料、又は、意図される使用に適した任意の他の形態であってもよい。例えば、ワクチンは、注射又は注入用の水性若しくは非水性溶液又は分散液、あるいは、局所又は粘膜投与に適した製剤等の、非経口製剤の形態であってもよい。
【００５５】
ワクチンは、一般的に、本発明のｒｄＳｅＶの有効量を含有する。本発明内にて、用語「有効量」とは、効果的で有益な、又は、所望の治療結果に十分な化合物の量を指す。治療上有効な量は、１回以上の投与、適用、又は投薬にて投与することができ、特定の製剤又は投与経路に限定されることを意図していない。
【００５６】
さらに、ワクチンには、１以上の薬学的に許容される担体が含まれる。本明細書中で使用される用語「薬学的に許容される」は、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、及び他の問題のある合併症を引き起こすことなく、哺乳動物、特にヒトの組織と接触するのに適した化合物又は物質を意味する。本明細書中で使用される用語「担体（ｃａｒｒｉｅｒ）」は、ワクチン組成物中で必要とされる（ｎｅｅｄｅｄ）、要求される（ｒｅｑｕｉｒｅｄ）、又は所望される（ｄｅｓｉｒｅｄ）、希釈剤、アジュバント、賦形剤、媒体（ｖｅｈｉｃｌｅｓ）又は他の化合物又は物質を指す。適した担体は、レミントン：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２０００）、で説明されたように、注射や点滴のための、無菌の水性及び非水性溶液又は分散液を含む、非経口、粘膜又は局所投与に特に適したものである。
【００５７】
特に、ワクチンは、１以上のアジュバントを含んでも良い。本明細書中で使用される「アジュバント」は、抗原の免疫原性を増強させるが、免疫原性には必要ではない、薬剤（ａｇｅｎｔ）を指す。適したアジュバントは、しかし、限定する訳ではないが、１０１８  ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ（登録商標）、ＡＳ  １５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、フラゲリン若しくはフラゲリン由来ＴＬＲ５リガンド、ＦＬＴ３リガンド、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド（ＡＬＤＡＲＡ（登録商標））、レシキモド、ＩｍｕＦａｃｔ  ＩＭＰ３２１、ＩＬ−２、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、ＩＦＮ−α若しくは−β等のインターロイキン又はそのペグ化誘導体、ＩＳ  パッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＩＳＣＯＭｓ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＡＬＰ−２又はその天然若しくは合成誘導体、ＭＦ５９、モノホスホリル脂質Ａ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）、モンタニドＩＭＳ１３１２、モンタニドＩＳＡ  ２０６、モンタニドＩＳＡ  ５０Ｖ、モンタニドＩＳＡ−５１、油中水（ｗａｔｅｒ  −ｉｎ−ｏｉｌ）及び水中油エマルジョン（ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ  ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ）、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、並びにＯＳＰＡ、を含む。
【００５８】
加えて、ワクチンは、本発明のｒｄＳｅＶベクターと共に投与される、１以上の追加の活性化物質を含んでも良い。加えて、医薬組成物は、追加の薬学的に許容される物質、例えば、可溶化剤、界面活性剤、浸透張力調整剤などのような、薬学的に許容される賦形剤を含んでも良い。
【００５９】
第五の態様において、本発明は、哺乳動物におけるＲＳＶ感染又はＲＳＶ感染関連疾患の治療に使用するための、本発明のゲノム複製欠損センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクターに関する。
【００６０】
本明細書中で使用される用語「治療」は、疾患の治療及び予防的治療（又は予防）の両方を意味することが意図される。本発明によれば、「治療」は、好ましくは、予防的治療又は予防を意味する。本発明の意味の範囲内の「治療」は、一般的には、本発明のｒｄＳｅＶベクターの有効量の投与を含む。好ましくは、本発明のｒｄＳｅＶは、本明細書中に記載されるようなワクチン組成物の形態にて投与される。
【００６１】
治療されるべき哺乳動物は、好ましくはヒト被験体である。特に重要な標的群は、ヒト幼児及び子供であって、とりわけ、早産のヒト幼児又はＲＳＶ感染に対する入院のリスクがあるヒト幼児である。
他の重要な標的群は、高齢者、ヒト免疫無防備状態の個体、移植レシピエント、特に臓器移植レシピエント、及び、慢性疾患を罹患する個体が含まれる。慢性疾患は、例えば、がん、慢性肝炎、虚血性心疾患、慢性腎不全、慢性呼吸器疾患（例えば、喘息、閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺高血圧症）、慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、及び自己免疫疾患（例えば、例えば、紅斑性狼瘡、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病）であってもよい。
【００６２】
ＲＳＶ感染は、ＲＳＶに関連した気道感染症の全てのタイプを含む。ＲＳＶ感染症関連疾患は、好ましくは、中耳炎、細気管支炎、好酸球増加症、肺炎、喘息、及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＬＤ）からなる群から選択される。
【００６３】
適切な投与経路としては、限定はされないが、非経口、粘膜及び局所投与を含む。非経口投与は、皮下、静脈内、腹腔内又は筋肉内注射によるものであってもよい。粘膜投与は、鼻腔面に対する液滴投与、又は舌下投与、又は、鼻腔面若しくは他の気道通路の表面に対するエアロゾル粒子の吸入投与によるもの等の、気道表面に対する投与を含んでも良い。
【００６４】
以下の例示で示されるように、本発明のゲノム複製欠損ＳｅＶベクターは、鼻腔内に投与された時に、効果的に粘膜免疫反応を誘発する。従って、本発明のゲノム複製欠損ＳｅＶ又はワクチンは、任意の従来の経路を介して投与されてもよいが、好ましくは、粘膜、例えば、鼻腔若しくは経口（胃内）経路を介して、投与される。
【００６５】
投与計画は、特に限定されないが、例えば、毎日、各週、毎月、二ヶ月に１回、３ヶ月、６ヶ月若しくは９ヶ月に１回、年１回、又は、単一適用投与計画を含む。患者へ投与されるウイルスベクターの治療上有効な量は、適用の様式、疾患の種類、患者の体重、年齢、性別及び健康状態等に依存する。投与は、必要に応じて、単一又は複数でありうる。本発明のワクチンは、多価ワクチンのような、他の病原体からの抗原と同時に投与されてもよい。
【００６６】
本発明は、さらに、下記の、非限定的な実施例によって説明される。
【実施例】
【００６７】
以下の実施例において、本発明の複製欠損センダイウイルスベクター（以下、「ｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeV」ベクターという」の遺伝的安定性、安全性及び生産効率が評価された。その結果、ｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeVベクターは安全であり、効率的に大量に製造されることが可能である。このように、本発明のｒｄＳｅＶベクターは、ＲＳＶ感染及びＲＳＶ感染関連疾患に対して、有望なウイルスベクターワクチン候補である。
【００６８】
＜材料及び方法＞
以下の物質及び方法は、実施例１〜５において使用された。
【００６９】
細胞及びウイルス:
【００７０】
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ロックビル、メリーランド州、米国）由来のＶｅｒｏ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１）、ＨＥｐ−２（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２３）及びＰ８１５細胞（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−６４）は、５％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；インビトロジェン社）、１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン及び１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン添加のイーグル最小必須培地又はＲＰＭＩ（インビトロジェン社、ミラノ、イタリア）で維持された。ヘルパー細胞株「Ｐ−ＨＣ」（「増幅細胞」）は、ＳｅＶリン酸化タンパク質（プロテイン  Ｐ）発現Ｖｅｒｏ細胞に由来し（Ｗｉｅｇａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８１  ：１３８３５−１３８４４，２００７）、ヘルパー細胞株「ＶＰＮ」は、プラスミドにコードしたＳｅＶリン酸化タンパク質（プロテインＰ）及び核タンパク質（プロテインＮ）を発現するＶｅｒｏ細胞由来である。ＢＳＲ−Ｔ７細胞（「レスキュー細胞」）（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７３：２５１−２５９，１９９９）は、クラウス−Ｋ．コンツェルマン（Ｋｌａｕｓ−Ｋ．  Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ）（ミュンヘン）によって親切に提供された。ＲＳＶタイプＡ（ロング株、ＡＴＣＣ  ＶＲ−２６）は、ＨＥｐ−２細胞にて、３７℃で培養された。センダイウイルス株Ｄ５２（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１０５）由来の組換えＳｅＶベクターを基礎とした全てのワクチン候補（ｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeV、ｒｄＳｅＶ−ＦRSV/Sev−ΔＣＴ、ｒｄＳｅＶ−ｓＦRSV）は、３３℃にて培養された。
【００７１】
ゲノムベクター設計：
【００７２】
本発明のウイルスベクターを構築するために、ＲＳＶ又はＳｅＶ  ＦのそれぞれのｃＤＮＡを含むプラスミドが、オーバーラッピングＰＣＲ技術によって、キメラＲＳＶ／ＳｅＶ  Ｆ  ＯＲＦの構築のための鋳型として使用された（Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ７７：６１−６８，１９８９）。特異的なプライマー設計を介して、制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩに対する特異的な配列を含む３’及び５’末端の非オーバーラッピング領域が導入された。配列を検証したキメラＯＲＦは、野生型ゲノムのＰ遺伝子内のＳａｎＤＩ制限部位（ゲノムのヌクレオチド位置２７１４）からＬ遺伝内のＳａｎＤＩ制限部位（ゲノムのヌクレオチド位置９１３１）までのセンダイウイルスゲノムを含む、サブゲノムプラスミド構築物へと挿入された。このゲノムフラグメントは、ＳａｌＩ及びＸｈｏＩに対する制限酵素部位によってＦ  ＯＲＦが隣接された方法にて改変された。キメラＦ  ＯＲＦの中間クローニングベクターへの挿入後、ｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeVの全長ゲノムが、以前準備した、ｒｄＳｅＶの全長構築物に対し、クローニングベクター由来のＳａｎＤＩフラグメントの移動を介して作製された。得られた組換えＳｅＶゲノムは、「６の法則」に従い（Ｃａｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６７：４８２２−４８３０，１９９３）、「ｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeV」（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ＳｅＶ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ＲＳＶ／ＳｅＶ Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と命名され、制限分析及び配列決定によって確認された。
【００７３】
可溶ＲＳＶ  Ｆタンパク質を発現するｒｄＳｅＶ−ｓＦRSVベクターは、Ｖｏｇｅｓら（Ｖｏｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４７：８５−９４，２００７）によって記載された、Ｐ及びＭ遺伝子の間に追加の導入遺伝子として、ＲＳＶ  ＣＢＳタンパク質の可溶形態をコードする組換えセンダイベクター由来のサブゲノムＲｃｏＲＩフラグメントを、ＷＯ２００６／０８４７４６Ａ１で記載された複製欠損センダイベクターへ移植することによって製造された。得られた組換えＳｅＶゲノムは、「６の法則」に従い（Ｃａｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６７：４８２２−４８３０，１９９３）、「ｒｄＳｅＶ−ｓＦRSV」（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ＳｅＶ  ｖｅｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＲＳＶ ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と命名され、制限分析及び配列決定によって確認された。
【００７４】
ウイルスレスキュー、増殖及び力価測定：
【００７５】
組換えウイルスは、わずかな変更を加えて、Ｗｉｅｇａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８１  ：１３８３５−１３８４４，２００７に記載されるように、トランスフェクトしたＢＳＲ−Ｔ７細胞から回収された。ＦｕＧＥＮＥ６（ロッシュ社）が、２．０μｇ／ｐｇのＤＮＡにおけるトランスフェクション試薬として使用された。複製欠損ＳｅＶウイルスは上清から回収され、ＳｅＶ  Ｐタンパク質を安定的に発現するヘルパー細胞株（「Ｐ−ＨＣ」）にて増幅された。このＰ−ＨＣ株は、ウイルス産生効率に関する実験（図４参照）を除き、全ての実験で使用され、ワクチンベクターｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeVは、センダイウイルスＰ及びＮタンパク質を安定的に発現するＶＰＮヘルパー細胞株にて産生された（Ｗｉｅｇａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８１  ：１３８３５−１３８４４，  ２００７）。ウイルスは、以前記載されたように（Ｗｉｅｇａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８１：１３８３５−１３８４４，２００７）力価測定されて、力価は、ミリリットルあたりの細胞感染ユニット（ｃｉｕ／ｍＬ）（蛍光プラーク形成ユニットと同等）として与えられた。異なるＳｅＶベクターの完全性は、ＲＴ−ＰＣＲ及び配列決定によって確かめられた。
【００７６】
ウエスタンブロット解析：
【００７７】
モック感染又はＰＩＶ３、ＲＳＶ若しくはｒｄＰＩＲＶ感染させたＶｅｒｏ細胞からの抽出物が回収され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離された。ニトロセルロース膜上にブロッティングした後、タンパク質は、ＰＩＶ３  ＨＮ及びＦタンパク質に対するマウスモノクローナル抗体（ケミコン社、ミラン、イタリア）及び、抗−ＲＳＶ抗体（メリディアン  ライフサイエンス社、ソード、ＭＥ）で検出された。
【００７８】
＜実施例１＞
発明の複製欠損ＳｅＶベクターの作製
逆遺伝学的手法を用いて、「ｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeV」（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ＳｅＶ  ｖｅｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ＲＳＶ／ＳｅＶ Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と名付けられた、ヒトＲＳＶに対するＳｅＶワクチンベクターが構築された。細胞質ドメインを除いて、ＳｅＶ  Ｆ  ＯＲＦは、キメラＲＳＶ／ＳｅＶ  Ｆ表面タンパク質を与えるそのＲＳＶカウンターパートと置換された（図１）。加えて、安全なワクチンベクターを開発するために、ＳｅＶバックボーンは、Ｎ末端７６アミノ酸を欠損（Δ２−７７）したリン酸化タンパク質（Ｐ）遺伝子中にて改変された。以前示されたように、欠損ＰΔ２−７７を有するＳｅＶベクターは、非ヘルパー細胞株中では新しいゲノム鋳型を合成できないが、主要な転写及び遺伝子発現は未だ有する（Ｂｏｓｓｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｐｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  Ｊ．  ６：７３−８１，２０１２）。ｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeVは、ｃＤＮＡからうまく救出され、ヘルパー細胞株「Ｐ−ＨＣ」を使用して増幅された。
【００７９】
＜実施例２＞
複製欠損ＳｅＶベクターの遺伝的安定性
本実施例において、ゲノム複製欠損ＳｅＶベクターの遺伝的安定性は、「ｒｄＰＩＲＶ」（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ＰＩＶ３／ＲＳＶ  ＳｅＶ  ｖｅｃｔｏｒ）と呼ばれる、特異的な複製欠損ＳｅＶ構築物を使用して評価された。この構築物は、添付のクレームの範囲内ではないが、安定性に関して、この構築物のために得られた結果もまた、本発明のゲノム複製欠損ＳｅＶベクターに対して有効であると考えられる。
【００８０】
ｒｄＰＩＲＶベクターは、上述、及び／又は当該技術分野で公知の技術を使用して、可溶ＲＳＶ  Ｆタンパク質並びにキメラＲＳＶ／ＳｅＶ  Ｆ及びＨＮ表面タンパク質を発現するために、遺伝的に操作される。簡潔には、ＲＳＶ  Ｆ細胞外ドメインをコードする配列は、以前うまく使用されたように（Ｖｏｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４７：８５−９４，２００７）、可溶タンパク質（ｓＦ）として発現する追加転写ユニットとして挿入された。ＳｅＶ  Ｆ及びＨＮ  ＯＲＦは、細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインを除いて、それらのＰＩＶ３カウンターパートによって、置換された。さらに、安全なワクチンベクター開発のために、ＳｅＶバックボーンは、Ｎ末端７６アミノ酸の欠損（ＰΔ２−７７）によってリン酸化タンパク質（Ｐ）遺伝子中に改変された。
【００８１】
ｒｄＰＩＲＶは、ｃＤＮＡからうまく回収され、ヘルパー細胞株を使用して増幅された。このベクターは、非ヘルパー細胞株中で、新しいゲノム鋳型を合成できないが、ＰＩＶ３  Ｆ及びＨＮ及びＲＳＶ  ｓＦタンパク質発現のウエスタンブロット解析によって証明されたように、主要な転写及び遺伝子発現は未だ能力を有していた（データは示さず）。さらに、１０回の連続継代後の配列解析では、突然変異を示さなかった。
【００８２】
これらの結果は、複製欠損ＳｅＶ／ＰΔ２−７７ワクチンベクター、及びこのように、本発明の複製欠損ＳｅＶベクターの、構造の完全性及び配列安定性を確かめる。
【００８３】
＜実施例３＞
複製欠損ＳｅＶベクターの安全性
加えて、複製欠損ＳｅＶの安全性に関する研究、特に、ｉｎ  ｖｉｖｏの異なる組織に対する複製欠損及び生体分布は、実施例２で記載されたｒｄＰＩＲＶベクターを用いて実施された。さらに、安全性に関してｒｄＰＩＲＶベクターに対して得られた結果は、本発明のゲノム複製欠損ＳｅＶベクターに同様に適用することが考えられる。
【００８４】
ＢＡＬＢ／Ｃマウス（ｎ＝４）の２つの群は、その検出を促進するためのＥＧＦＰ（強化緑色蛍光タンパク質）を発現するｒｄＰＩＲＶ又は改変された複製欠損ＳｅＶ（ＥｅＶ−Ｅ  ｗｔ）の１×１０5ｃｉｕを用いて、鼻腔内（ｉ．ｎ．）に接種された。３日後、マウスは犠牲死され、肺及び血液サンプルが採取された。組織破砕物及び血液におけるウイルスの存在は、細胞培養中のＥＧＦＰ陽性点をカウントすることで定量された（検出限界：肺、脾臓又は５００μＬ血液あたり２０ｃｉｕ）。
【００８５】
ｒｄＰＩＲＶのウイルス粒子は、試験されたどの動物組織中にも検出されることができなかった。ＳｅＶ−Ｅ  ｗｔが使用されたときのみ、ウイルス粒子は肺に検出されることができたが（肺あたり、３．２×１０4  ｃｉｕまで）、血液中には検出されなかった（データは示さず）。加えて、ｒｄＰＩＲＶを免役したマウスから回収された肺破砕物は、任意の複製する組換えＳｅＶの不存在を確認するためにＶｅｒｏ細胞上に載せられた。ウイルスは検出されず、このワクチンベクターがｉｎ  ｖｉｖｏで複製欠損であることを確認した（データは示さず）。動物は、痛みの兆候又は体重減少を発生しなかった。
【００８６】
まとめると、これらのデータは：（ｉ）Ｐ遺伝子のアミノ酸２〜７７の欠損は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの子孫ゲノムを産生するベクターの能力を無効化する；（ｉｉ）複製能力のあるＳｅＶの広がりは、気道に限定されている、ことを証明する。これらの結果は、本発明の複製欠損ＳｅＶベクターにも適用され、従って、ヒトに対しての投与に対して特に安全であると考えられる。
【００８７】
＜実施例４＞
生産効率
商業ワクチンの生産効率は、このような製品の市場潜在能力に大きな影響を有する。それゆえ、本発明のゲノム複製欠損ＳｅＶベクター（ｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeVベクター）の生産効率が評価され、細胞質ドメインを欠損したｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeV−ΔＣＴのそれと比較された。
【００８８】
第一の研究において、ＳｅＶ  Ｐ及びＮタンパク質コードする遺伝子を安定的にトランスフェクトされたＶＰＮヘルパー細胞は、強力なｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeVベクターに感染された。ベクターの異なる継代（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）が解析された。継代Ｐ１及びＰ２の場合でも、２つの独立した製造工程が実施された（Ｐ１−１、Ｐ１−２、Ｐ２−１、Ｐ２−２）。細胞培養上清からの異なる時点（例えば、８〜１１日目（「ｄ８−１１」）、１１〜１２日目（「ｄ１１−１２」）など）で回収したサンプルは、そのベクターの力価が解析された。
【００８９】
図４から分かるように、ウイルス力価は、全ての継代レベル及び生産工程において顕著に高く、特に、継代Ｐ２の間が高い。全体として、これらの結果は、同時に２つの異なるウイルス由来の２つの表面タンパク質（Ｆ及びＨＮ）の存在のために、予想外に高い産生効率を証明する。この発見は、結合融合及び出芽の工程の間、強い干渉が期待されていたので、驚きであった。
【００９０】
第二の研究において、ｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeVの産生効率は、細胞質尾部を本質的に欠損したＦタンパク質をコードする変異株（「ｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeV−ΔＣＴ」）と比較した（図２参照）。この変異株は、ヘルパー細胞株「Ｐ−ＨＣ」にてｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeVの連続的な継代の間に自発的に生じた。産生されたベクター粒子の続く配列解析が、F遺伝子のＫ５５３（Ｌｙｓ−５５３）コドン中のナンセンス変異の結果、未成熟終始コドンとなったことを明らかにした。結果として、ＳｅＶ  Ｆ細胞質ドメインの最初の２アミノ酸のみ（つまり、アミノ酸５２４及び５２５）が変異株には残存し、それゆえ、（本質的に）その細胞質尾部が欠損している。
【００９１】
細胞培養にて、細胞質尾部を有さない自発的に生じた変異株の引き続く継代の間、非変異ウイルス（ｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeV）に対する欠損変異株の割合が増加したことが観察された。この予想外の観察に基づいて、非変異ウイルス（つまり、ｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeV）及び変異したウイルス（つまり、ｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeV−ΔＣＴ）の細胞培養における比較製造ラウンドの手段によって続いて確認され、変異ウイルスは、有意に高い力価まで増幅することができた。簡潔には、細胞は、同様に０．１のＭＯＩで感染され、５日間培養された。異なる時点において、つまり、３日目（「ｄ２−３」）、４日目（「ｄ３−４」）、５日目（「ｄ４−５」）、６日目（「ｄ５−６」）及び７日目（「ｄ６−７」）において、細胞培養上清のベクター力価が測定された。
【００９２】
図５から分かるように、早ければ３日目において、ｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeV−ΔＣＴの力価は、ｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeVのそれよりも５倍高かった。４日目及び５日目のそれぞれにおいて、ｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeV−ΔＣＴの力価は、ｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeVのそれよりも５倍から１０倍高く、６日目及び７日目における力価は、さらに１０倍以上高かった。先行技術では、ＳｅＶ  Ｆタンパク質の細胞質尾部は、ウイルスの組み立てにおいて重要な役割を果たしていることが示唆されていたため（Ｓｔｏｎｅ，  Ｒ．  ａｎｄ  Ｔａｋｉｍｏｔｏ，  Ｔ．，  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８（４）：  ｅ６１２８１．  ｄｏｉ：１０．１３７１／  ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６１２８１，２０１３、参照）、この発見は、完全に予想外であった。このように、もしあったとしても、当業者は、減少した産生を得ることを期待したであろう。しかしながら、欠損変異体ｒｄＳｅＶ−ＦＲＳＶ／ＳｅＶ−ΔＣＴは、驚くべき事に、全長キメラＲＳＶ／ＳｅＶ  Ｆタンパク質を発現するｒｄＳｅＶ−ＦRSV/SeVよりも、さらにはるかに優れた産生効率を示すことが見出された。
【００９３】
全体として、上記結果は、本発明のｒｄＳｅＶベクターは、優れた安全性プロファイルを有しており、驚くほど高い産生効率を達成することを可能にすることを示している。高い産生効率は、ワクチンとしての実用化に関して、ウイルスベクターの非常に重要かつ所望の特徴である。このように、本発明のｒｄＳｅＶベクターは、ＲＳＶの対する非常に有望なワクチン候補である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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