(57)【要約】本発明はマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体の設計、合成及び活性に関する研究を開示する。更に具体的には、本発明は一般式（Ｉ）で表される化合物（その中、Ｒの定義は、明細書を参照）を提供し、この誘導体は、アンモニアペプチド酵素（ＡＰＮ／ＣＤ１３）阻害剤であるウベニメクスと市販の抗腫瘍薬とをエステル結合又はアミド結合によって得られるマルチターゲット化合物であって、様々な悪性腫瘍を治療するための抗腫瘍薬として適用され、特に様々な固形腫瘍の治療に適用される。2016527192.tif 000094
2016527192.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）で示されるマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体、その鏡像異性体、その非鏡像異性体、そのラセミ化合物、それらの薬理学的に許容できる塩、又はそれらの溶媒和物。
【化１】
2016527192.tif 000062
一般式（Ｉ）中、Ｒは下記の置換基の少なくとも一つであり、
【化２】
2016527192.tif 000063
前記置換基において、ｎは１〜６の整数であり、ＸはＮＨ又はＯであり、Ｒ１はＨ、ＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ３であり、Ｒ２はＬ−アミノ酸残基の側鎖であり、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）、ＣＨ３ＳＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２Ｐｈ及びＯＨ−ρ−ＰｈＣＨ２から選択される少なくとも一つであり、
Ｒ３は以下のとおりであり、
【化３】
2016527192.tif 000064
Ｒ４は以下のとおりである。
【化４】
2016527192.tif 000065
【請求項２】
前記一般式（Ｉ）中、Ｒは下記の置換基である請求項１に記載のマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体。
【化５】
2016527192.tif 000066
式中、Ｒ１はＨ、ＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ３である。
【請求項３】
前記一般式（Ｉ）中、Ｒは下記の置換基である請求項１に記載のマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体。
【化６】
2016527192.tif 000067
前記置換基において、ｎ、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は請求項１における定義と同じであって、好ましいＲは以下のとおりであり、
【化７】
2016527192.tif 000068
前記置換基において、ｎは１〜４であり、好ましくは１又は２であり、ＸはＮＨ又はＯであり、Ｒ１はＨであり、Ｒ３は請求項１における定義と同じであり、
好ましいＲ３は以下のとおりであり、
【化８】
2016527192.tif 000069
更に好ましいＲは以下のとおりであり、
【化９】
2016527192.tif 000070
前記置換基において、ｎは１であり、ＸはＮＨであり、Ｒ１はＨである。
【請求項４】
前記一般式（Ｉ）中、Ｒは下記の置換基である請求項１に記載のマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体。
【化１０】
2016527192.tif 000071
【請求項５】
前記一般式（Ｉ）中、Ｒは下記の置換基である請求項１に記載のマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体。
【化１１】
2016527192.tif 000072
【請求項６】
前記一般式（Ｉ）中、Ｒは下記の置換基である請求項１に記載のマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体。
【化１２】
2016527192.tif 000073
【請求項７】
前記一般式（Ｉ）中、Ｒは下記の置換基である請求項１に記載のマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体。
【化１３】
2016527192.tif 000074
前記置換基において、ｎは１〜６であり、
Ｒ４は以下のとおりである。
【化１４】
2016527192.tif 000075
【請求項８】
下記合成経路に基づき、
５−フルオロウラシルとアルデヒド１−１とを反応させて中間体２′を得て、前記中間体２′とＢｏｃ−Ｌ−ロイシンとを反応させて中間体３′を得て、前記中間体３′の保護基を脱保護して化合物４′を得て、前記化合物４′とＢｏｃ−ＡＨＰＡとを縮合して化合物５′を得て、前記化合物５′を脱保護して目的とする化合物６′を得る請求項２に記載のマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体の製造方法。
【化１５】
2016527192.tif 000076
式中、Ｒ１はＨ、ＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ３である。
【請求項９】
下記合成経路に基づき、
５−フルオロウラシルとアルデヒド１−１とを反応させて中間体２′を得て、化合物７における水酸基をＤＨＰで保護して中間産物８を得て、前記中間産物８からベンジルを除去して化合物９を得て、前記化合物９と前記中間体２′とを縮合して化合物１０′を得て、前記化合物１０′を酸で脱保護して目的とする化合物６′を得る請求項２に記載のマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体の別の製造方法。
【化１６】
2016527192.tif 000077
【化１７】
2016527192.tif 000078
式中、Ｒ１はＨ、ＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ３であり、ＤＨＰは３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピランである。
【請求項１０】
下記合成経路に基づき、
無水ＤＣＭ中で、ＥＤＣＩ及びＨＯＢｔを用いて、化合物１４′又はそのカチオン塩と化合物９とを縮合して化合物１５′を得て、前記化合物１５′をＨＣＬ−ＡｃＯＥｔで脱保護して目的とする化合物１６′を得る請求項３に記載のマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体の製造方法。
【化１８】
2016527192.tif 000079
式中、ＤＣＭは塩化メチレンであり、ＥＤＣＩは１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩であり、ＨＯＢｔは１−ヒドロキシベンゾトリアゾールであり、ＨＣＬ−ＡｃＯＥｔは飽和塩酸を含む酢酸エチル溶液であり、
前記化合物９は以下のとおりであり、
【化１９】
2016527192.tif 000080
前記化合物１４′は以下のとおりであるか、
【化２０】
2016527192.tif 000081
又は前記化合物１４′において、ＹはＯ又はＮＨであり、Ｍは以下のとおりであり、
【化２１】
2016527192.tif 000082
式中、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は請求項３における定義と同じである。
【請求項１１】
式中、ＹはＮＨであり、Ｍが以下で示される場合、
【化２２】
2016527192.tif 000083
下記合成経路に基づき、
Ｌ−グリシン１１を（Ｂｏｃ）２Ｏで保護して化合物１２を得て、無水ＤＣＭ中で、ＥＤＣＩ及びＨＯＢｔを用いて、前記化合物１２と化合物２′とを縮合して化合物１３′を得て、前記化合物１３′をＨＣＬ−ＡｃＯＥｔで脱保護して化合物１４′を得る請求項１０に記載の方法。
【化２３】
2016527192.tif 000084
式中、（Ｂｏｃ）２Ｏは二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルであり、ＤＣＭは塩化メチレンであり、ＥＤＣＩは１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩であり、ＨＯＢｔは１−ヒドロキシベンゾトリアゾールであり、ＨＣＬ−ＡｃＯＥｔは飽和塩酸を含む酢酸エチル溶液であり、
前記化合物２′は以下のとおりである。
【化２４】
2016527192.tif 000085
【請求項１２】
下記合成経路に基づき、
Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシン１７とペンタフルオロフェノール（ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｏｌ）とを縮合して中間体１８を得て、前記中間体１８とヒドロキシ尿素（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）とを反応させて化合物１９を得て、前記化合物１９の保護基を酸で脱保護して化合物２０を得て、前記化合物２０とＢｏｃ−ＡＨＰＡとを縮合して化合物２１を得て、前記化合物２１を脱保護して目的とする化合物２２を得る請求項４に記載のマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体の製造方法。
【化２５】
2016527192.tif 000086
【請求項１３】
下記合成経路に基づき、
エピルビシンを（Ｂｏｃ）２Ｏで脱保護して化合物２４を得て、前記化合物２４とＣｂｚ−Ｌ−ロイシンとを縮合して化合物２５を得て、前記化合物２５のアミノ基の保護基を除去して化合物２６を得て、前記化合物２６とＢｏｃ−ＡＨＰＡとを縮合して化合物２７を得て、前記化合物２７を脱保護して目的とする化合物２８を得る請求項５に記載のマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体の製造方法。
【化２６】
2016527192.tif 000087
【請求項１４】
下記合成経路に基づき、
Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシン１７と化合物Ａ−Ｅ−Ｈとを縮合して化合物２９′を得て、前記化合物２９′を酸で脱保護して化合物３０′を得て、前記化合物３０′とＢｏｃ−ＡＨＰＡとを縮合して化合物３１′を得て、前記化合物３１′を脱保護して目的とする化合物３２′を得る請求項６に記載のマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体の製造方法。
【化２７】
2016527192.tif 000088
式中、Ａ−Ｅ−Ｈは以下のとおりであるか、
【化２８】
2016527192.tif 000089
又はＡ−Ｅ−Ｈにおいて、ＥはＮＨ又はＯであり、
Ａは以下のとおりである。
【化２９】
2016527192.tif 000090
【請求項１５】
下記合成経路に基づき、
化合物９と化合物Ｑ−Ｙ−Ｈとを縮合して目的とする化合物３３′を得る請求項７に記載のマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体の製造方法。
【化３０】
2016527192.tif 000091
式中、化合物Ｑ−Ｙ−Ｈにおいて、ＹはＮＨ又はＯであり、
Ｑは以下のとおりであり、
【化３１】
2016527192.tif 000092
式中、ｎは請求項７における定義と同じである。
【請求項１６】
下記合成経路に基づき、
化合物９とｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドとを縮合して化合物３３を得て、前記化合物３３を還元してアルコール３４を得て、前記アルコール３４とトリホスゲンとを反応させて化合物３５を得て、前記化合物３５とＨ−Ｒ４とを反応させて化合物３６を得て、前記化合物３６を脱保護して目的とする化合物３７を得る請求項７に記載のマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体の製造方法。
【化３２】
2016527192.tif 000093
式中、Ｒ４は請求項７における定義と同じである。
【請求項１７】
様々な腫瘍を予防又は治療するための医薬品の製造に使用するものである請求項１〜７のいずれか一項に記載のマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体。
【請求項１８】
請求項１７に記載のマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体の、化学療法薬に耐性がある固形腫瘍への使用。
【請求項１９】
様々な腫瘍を予防又は治療するために使用するものである請求項１〜７のいずれか一項に記載のマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体。
【請求項２０】
請求項１９に記載のマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体の、化学療法薬に耐性がある固形腫瘍への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品化学分野に関し、具体的には、マルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体及びその製造方法、並びにこれら化合物の医薬用途、特に抗腫瘍薬（特に固形腫瘍）としての用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノペプチダーゼＮ（ＡＰＮ／ＣＤ１３）は亜鉛依存性のＩＩ型膜貫通メタロプロテイナーゼであり、ＭＩ族のＧｌｕｚｉｎｃｉｎｓのサブファミリーに属し、ホモ二量体の形状で細胞膜に結合している（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９９，２７（１）：３２５−３３１）。ＣＤ１３は多種の組織の細胞表面に発現し、例えば、中枢神経系のシナプス細胞、滑膜線維芽細胞、活性化内皮細胞、肝細胞、腸管上皮細胞、胎盤、骨髄前駆細胞、単球細胞、破骨細胞等が挙げられ、特に腎臓と腸刷子縁において増殖する（Ｈａｅｍａ．，２００３，４（６）：４５３−４６１）。また、正常細胞と比較して、ＣＤ１３は、黒色腫、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、すい臓癌、乳癌、肺癌等の多くの腫瘍細胞表面で発現量が多い。
【０００３】
近年の研究で、ＣＤ１３は多機能性タンパク質であるとともに、タンパク質分解酵素、ウイルスの受容体、細胞膜の表面にあるシグナル伝達分子等の役割を果たし、しかも、癌の浸潤、転移及び新生血管の生成に関与することが報告されている（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，１４，６３９−６４７）。最近の研究で、腫瘍細胞の表面のＣＤ１３は、周囲組織の微小環境を変化させて、癌の浸潤及び新生血管の生成において重要な役割を果たしていることが明らかになっている（ＰＮＡＳ  ２０１２，１０９，１６３７−１６４２）。また、Ｈａｒａｇｕｃｈｉ等の研究によれば、ＣＤ１３は、人の肝臓癌細胞とその臨床サンプルにおいて、半休止期の肝臓癌幹細胞（ＨＣＳＣｓ）の機能性バイオマーカーであり、放射線治療／化学療法によって引き起こされる細胞内活性酸素量の増加を抑え、治療に対する耐性を強化することができる（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２０１０，１２０，３３２６−３３３９）。従来から知られているように、肝臓癌幹細胞は、腫瘍化学療法耐性、再発、及び転移を引き起こす主要因である。更なる研究では、ＣＤ１３＋は肝臓癌細胞の増殖を遅延させて、自己複製、分化、及び耐治療の能力を有し、腫瘍の再発に関与していることが示されている。ＣＤ１３阻害剤とＣＤ１３中和抗体は、どちらも細胞のアポトーシスを誘発して、多剤耐性の腫瘍に作用し、細胞毒性抗腫瘍薬とＣＤ１３阻害剤は、腫瘍の抑制及び破壊を極めて向上させることができるため、ウベニメクス（Ｕｂｅｎｉｍｅｘ，Ｂｅｓｔａｔｉｎ，Ｕｂｅ）と他の細胞毒性抗腫瘍薬とを組み合わせることで治療効果を大きく向上することができ、更に重要であるのは、腫瘍の再発、転移を防止することができるということである（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２０１０，１２０，３３２６−３３３９）。
【０００４】
ウベニメクスはストレプトマイセス・オリボレチクリ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｏｌｉｖｏｒｅｔｉｃｕｌｉ）の培養液中で発見されたジペプチド構造の化合物であり、１９８７年に免疫力増強剤として日本で発売され、白血病の治療に用いられている。その後、ウベニメクスは、商品名ベスタチン（Ｂｅｓｔａｔｉｎ）で１９９８年に中国国内で発売された。ベスタチンは標的抗癌効果を持つ免疫力増強剤であり、二重機構を持つ。多くの研究により、ベスタチンのＣＤ１３に対する活性阻害が報告されており、ＣＤ１３に対する抑制作用を有するＩＣ５０は、２．５〜１６．９μＭである。インビトロ研究において、ベスタチンはマウス黒色腫高転移株Ｂ１６ＢＬ６の攻撃を抑え、ＨＵＶＥＣｓ管腔構造の形成を抑制できることが明らかになっている（Ｃａｎｃｅｒ  ｌｅｔ，２００４，２１６（１）：３５−４２）。マウスに腫瘍を移植する実験で、ベスタチンは腫瘍細胞の転移と腫瘍細胞より誘導される血管の生成を抑制できることが発見されており（Ｂｉｏ．Ｐｈａｒｍ，Ｂｕｌｌ．，１９９６，１９（１）：６−１０）、臨床においてベスタチンは、放射線治療、化学療法との組み合わせ、及び併用して白血病、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、及び他の固形腫瘍等の疾病の治療に用いてもよい。しかし、その相乗効果のメカニズムはよく分かっていない。
【０００５】
最近の研究で、マウスに腫瘍を移植する実験において、ウベニメクス又は５−フルオロウラシルの単独投与と、二者の併用投与とを比較すると、併用群は、単独群に比べ極めて高い抗腫瘍活性（図１、２に示す）を示すことが明らかになっている。また、更なる実験で、５−フルオロウラシルによって治療したマウスの肝細胞を別のマウスに移植し、ウベニメクスの投与群と非投与群とを比較した結果、ウベニメクス投与治療群では腫瘍の再発が認められないのに対し、ウベニメクス非投与群では腫瘍の再発例が認められた。この研究結果により、ウベニメクスと５−フルオロウラシル、及び他の化学治療薬との併用の重大な証拠が示された（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２０１０，１２０，３３２６−３３３９）。また、がん化学治療における癌幹細胞制御の重要性も証明された。
【０００６】
５−フルオロウラシル（５−Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ，５−ＦＵ）は、化学名は２，４−ジヒドロキシ−５−フッ素ピリミジンのフッ化ピリミジン系の代謝拮抗剤であり、抗悪性腫瘍薬である。チミンヌクレオチド合成酵素を抑え、デオキシチミンヌクレオチドのチミンヌクレオチドへの代謝を遮断し、ＤＮＡ合成を阻害することができ、ＲＮＡ合成に対してある程度の抑制作用も有している。臨床においては、結腸癌、直腸癌、胃癌、乳癌、卵巣癌、絨毛上皮腫、悪性胞状奇胎、頭頸部扁平上皮癌、皮膚癌、肝臓癌、膀胱癌等の治療に用いられ、固形腫瘍を治療する選択薬であり、しかも、この薬物は常用の抗腫瘍薬との交差耐薬現象がなく、臨床で広く使われる抗腫瘍薬である。また、臨床においては、多くの抗腫瘍薬は５−ＦＵと併用することができ、細胞毒性を増強するため、すでに５−ＦＵとの併用療法で白血病の治療に用いる研究（Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８  （２０１１）３６２-３６５））がなされている。しかし、５−ＦＵは広く臨床応用され、多くの腫瘍に治療効果がある一方で、多くのデメリットがあり、５−ＦＵの有効量と毒性のある量との差は少なく、臨床において、重篤な骨髄抑制と、胃腸障害等の有害な副作用を有している。半減期が短いこと、代謝安定性が悪いこと（ジヒドロピリミジン脱水素酵素により、直ちにＦＵＨ２に分解される）、及びチミジル酸生成酵素の発現率が高い５−ＦＵに耐性がある腫瘍に対しても不利である。経口投与は、不規則で個人差が大きく、脂溶性が低く薬物の組織透過性が悪いため、臨床において、主に経静脈又は経動脈投与され、使用に便利な経口投与製剤を製造するのが困難で、長期にわたる化学療法に適さない。
【０００７】
近年、研究者は様々な方法で５−ＦＵのデメリットを低減、又は回避している。その主な方法は、プロドラッグを開発して、体内での代謝の安定性を向上し、毒性を軽減し、治療指数を増加させるものである。現在、複数の５−ＦＵのプロドラッグ誘導体は、合成されており、且つ、その一部は臨床に用いられており、例えば、テガフール（ＦＴＯ）、カルモフール（ＨＣＦＵ）、ドキシフルリジン、カペシタビン（ゼローダ）、Ａｔｏｆｌｏｄｉｎｇ（ＡＴＦＵ）、ＢＯＦ−Ａ２等が挙げられる。ゼローダは、ＦＤＡの承認を得ており、現在最も臨床的効果のある経口フルオロウラシル類抗がん剤であり、フルオロウラシルの連続静脈投与の効果を発揮、又はそれを超える効果を発揮することができ、ＡＴＦＵが体内でＴＦＵ、５−ＦＵに段階的に分解されて、更に持続的に効果を発揮することができる。本研究は、ゼローダとＴＦＵを陽性対照薬とし、本発明者等が合成したマルチターゲットのウベニメクスと５−ＦＵが結合した併用プロドラッグ誘導体の経口薬力学試験である。
【０００８】
ヒドロキシ尿素（Ｈｙｄｒｏｘｙｃａｒｂａｍｉｄｅ）は、ヌクレオシド二リン酸還元酵素阻害剤であり、ヌクレオチドを還元してデオキシリボヌクレオチドになることを阻害し、プリン及びピリミジン塩基の生合成を阻害し、ＤＮＡ合成を選択的に阻害することができ、ＲＮＡ及びタンパク質合成に対して阻害効果を有さない。周期特異性薬であり、Ｓ期の細胞に対して良く反応する。臨床において、悪性黒色腫、胃癌、腸癌、乳癌、膀胱癌等の固形腫瘍の治療に用いられる。
【０００９】
エピルビシン（Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）は、アドリアシンの異性体の構造を有する抗生物質類抗がん剤である。エピルビシンの主な抗腫瘍のメカニズムは、ＤＮＡの核酸塩基対に直接に組み込まれ、転写過程を阻害することができ、ｍＲＮＡの形成を阻止し、ＤＮＡとＲＮＡの合成を抑制することができる。また、研究により、エピルビシンはトポイソメラーゼＩＩに対しても阻害効果を有し、細胞周期非特異性薬である。臨床においては、主に急性白血病、腎母細胞腫、軟部組織肉腫、膀胱癌、精巣腫瘍、前立腺癌、胃癌、悪性リンパ腫、乳癌、気管支肺癌、卵巣癌、肝臓癌（原発性肝細胞がんと転移性癌を含む）等の固形腫瘍の治療に用いられる。現在、エピルビシンは、併用療法として用いられる例が多く、例えば、タキソールとの併用療法、ソラフェニブとの併用療法は、進行乳癌等の治療に用いられる。
【００１０】
ダサチニブ（Ｄａｓａｔｉｎｉｂ）は、ブリストル・マイヤーズ・スクイブ社により開発され、２００６年６月に米国ＦＤＡより承認を受け、イマチニブに耐性があるか又はイマチニブで治療できないＣＭＬ患者の治療に用いられる。これは経口チロシンキナーゼ阻害剤であり、複数のチロシンキナーゼを標的とすることで、全てのＣＭＬ又はＰｈ＋患者由来の骨髄の白血病細胞の過剰な増殖を抑制し、慢性骨髄性白血病を治療することができる。ダサチニブは、Ｓｒｃキナーゼを抑制できるため、ＢＣＲ−ＡＢＬを発現しない他の人体腫瘍細胞を抑えることができ、例えば、ＰＣ−３（前立腺癌細胞、ＩＣ５０は５〜９ｎｍｏｌ／Ｌ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２１１（乳癌細胞、ＩＣ５０は１０〜１２ｎｍｏｌ／Ｌ）及びＷｉＤｒ（結腸直腸癌細胞、ＩＣ５０は３８〜５２ｎｍｏｌ／Ｌ）等が挙げられる（Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ａｓｓｏｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５，４６：１５９）。
【００１１】
レナリドミド（Ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ／レブラミド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ））は、化学名３−（７−アミノ−３−オキソ−１Ｈ−イソインドール−２−イル）ピペリジン−２，６−ジオンであり、アメリカのセルジーン社により開発されたサリドマイドの誘導体であり、臨床において、骨髄異形成症候群の治療、及びデキサメタゾンとの併用療法による多発性骨髄腫の治療に用いられる。レナリドミドは多くの細胞内の生物学的経路に影響を与える。現在、その第Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ期の臨床研究は全て終了した。第Ｉ、ＩＩ期の臨床研究において、これが多発性骨髄腫、前立腺癌、甲状腺癌、腎臓癌、黒色腫、肝臓癌及び慢性リンパ性白血病等を含む様々な腫瘍に対して抗腫瘍効果があることが示された（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２０１２，１−１４）。
【００１２】
ウベニメクス（ｕｂｅｎｉｍｅｘ）、５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ヒドロキシ尿素（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、チラパザミン（ｔｉｒａｐａｚａｍｉｎｅ）、レナリドミド（ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ）、ヒドロキシカンプトテシン（ｈｙｄｒｏｘｙｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎｅ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）とパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）の化学構造式は、以下のとおりである。
【００１３】
【化１】
2016527192.tif 000003
【００１４】
マルチターゲット薬（ｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔ  ｄｒｕｇｓ）は現在、新薬の研究の一つの重要な動向であり、マルチターゲット薬は、同時に同一の疾患の複数の異なる病理標的に作用し相乗効果を発揮する薬物である。疾患に関する多くの標的を包括的に制御することにより、より良好な治療効果、より少ない副作用を示し、特に、白血病及び他の悪性腫瘍、中枢神経系疾患、心臓血管疾患及び代謝性疾患を含む複雑な病理学的機構及び多遺伝子に関する様々な重大な疾患等の治療に有用である。そのうち、マルチターゲット薬を採用し複数の標的の治療を行うことは、白血病を含める各種の悪性腫瘍に対して最も有効な治療方法の一つになっている。
【００１５】
相互プロドラッグ（Ｍｕｔｕａｌ  Ｐｒｏｄｒｕｇ）又はマルチターゲット薬は、単一の物理的化学的性質と、均一な薬物動態特性を有し、マルチターゲット薬は、併用薬物と比べると、薬物の混合物における種々の組成物間の相互作用、及び種々の組成物の吸収・分布・代謝等の問題を回避することができ、相乗効果をより良好に発揮することができ、特に低濃度の場合、マルチターゲット薬は、対応する単一標的薬の併用薬と比較して有意な効果を示す。癌の再発・転移及び薬剤耐性の治療に用いるために、相乗原理により相乗治療効果を有する新型の抗癌薬物を設計、合成し、特にがん幹細胞の抑制効果を有するウベニメクスを他の抗腫瘍薬と結合させることが重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、従来技術の欠点を克服し、マルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体及びその製造方法、並びにこれら化合物の医薬用途を提供することである。本発明では、ファーマコフォアハイブリダイゼーション法を用いてＣＤ１３阻害剤であるウベニメクスをエステル結合又はアミド結合によって別の市販薬（例えば、５−ＦＵ、ヒドロキシ尿素、エピルビシン、ダサチニブ及びパクリタキセル等）の分子構造と一体化し、一連の新規な相互プロドラッグを設計・合成した。これらの化合物は、ＣＤ１３の抑制活性を保持し、体内に入った後、ＣＤ１３阻害剤がＣＤ１３の活性を抑制することで、がん幹細胞を抑える標的抗がんの役割を果たす。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の上記課題を解決するための技術的解決手段は、以下のとおりである。一般式（Ｉ）で示されるマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体、その鏡像異性体、その非鏡像異性体、そのラセミ化合物、それらの薬理学的に許容できる塩、又はそれらの溶媒和物を提供する。
【００１８】
【化２】
2016527192.tif 000004
一般式（Ｉ）中、Ｒは下記の置換基の少なくとも一つであり、
【００１９】
【化３】
2016527192.tif 000005
前記置換基において、ｎは１〜６の整数であり、ＸはＮＨ又はＯであり、Ｒ１はＨ、ＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ３であり、Ｒ２はＬ−アミノ酸残基の側鎖であり、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）、ＣＨ３ＳＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２Ｐｈ及びＯＨ−ρ−ＰｈＣＨ２から選択される少なくとも一つであり、
Ｒ３は以下のとおりであり、
【００２０】
【化４】
2016527192.tif 000006
Ｒ４は以下のとおりである。
【００２１】
【化５】
2016527192.tif 000007
【００２２】
本発明の前記一般式（Ｉ）中、Ｒは下記の置換基であってもよい。
【００２３】
【化６】
2016527192.tif 000008
前記置換基において、ｎは１〜６の整数であり、ＸはＮＨ又はＯであり、Ｒ２はＬ−アミノ酸残基の側鎖であり、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）、ＣＨ２０Ｈ、ＣＨ３ＣＨ（０Ｈ）、ＣＨ３ＳＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２Ｐｈ及びＯＨ−ρ−ＰｈＣＨ２から選択される少なくとも１つであり、Ｒ３は以下のとおりであり、
【００２４】
【化７】
2016527192.tif 000009
Ｒ４は以下のとおりである。
【００２５】
【化８】
2016527192.tif 000010
【００２６】
本発明の前記一般式（Ｉ）中、Ｒは下記の置換基であってもよい。
【００２７】
【化９】
2016527192.tif 000011
前記置換基において、ｎ、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２は前記における定義と同じであり、
Ｒ３は以下のとおりであり、
【００２８】
【化１０】
2016527192.tif 000012
好ましいＲの構造は以下のとおりであり、
【００２９】
【化１１】
2016527192.tif 000013
前記置換基において、ｎは１〜４、ＸはＮＨ又はＯ、Ｒ１はＨであり、
Ｒ３は以下のとおりであり、
【００３０】
【化１２】
2016527192.tif 000014
特に好ましいＲは以下のとおりであり、
【００３１】
【化１３】
2016527192.tif 000015
前記置換基において、ｎは１又は２、ＸはＮＨ又はＯ、Ｒ１はＨであり、
Ｒ３は以下のとおりである。
【００３２】
【化１４】
2016527192.tif 000016
【００３３】
最も好ましいＲは以下のとおりである。
【００３４】
【化１５】
2016527192.tif 000017
前記置換基において、ｎは１、ＸはＮＨ、Ｒ１はＨである。
【００３５】
本発明の上記一般式（Ｉ）中、Ｒは以下の置換基であってもよい。
【００３６】
【化１６】
2016527192.tif 000018
【００３７】
本発明の上記一般式（Ｉ）中、Ｒは以下の置換基であってもよい。
【００３８】
【化１７】
2016527192.tif 000019
【００３９】
本発明の上記一般式（Ｉ）中、Ｒは以下の置換基であってもよい。
【００４０】
【化１８】
2016527192.tif 000020
好ましいＲの構造は以下のとおりである。
【００４１】
【化１９】
2016527192.tif 000021
【００４２】
特に好ましいＲは以下のとおりである。
【００４３】
【化２０】
2016527192.tif 000022
【００４４】
最も好ましいＲは以下のとおりである。
【００４５】
【化２１】
2016527192.tif 000023
【００４６】
本発明の上記一般式（Ｉ）中、Ｒはつぎの置換基であってもよい。
【００４７】
【化２２】
2016527192.tif 000024
前記置換基において、ｎは１〜６であり、
Ｒ４は以下のとおりであり、
【００４８】
【化２３】
2016527192.tif 000025
好ましいＲの構造は以下のとおりであり、
【００４９】
【化２４】
2016527192.tif 000026
前記置換基においてｎは１〜６であり、
Ｒ４は以下のとおりである。
【００５０】
【化２５】
2016527192.tif 000027
【００５１】
特に好ましいＲは以下のとおりである。
【００５２】
【化２６】
2016527192.tif 000028
前記置換基において、Ｒ４は以下のとおりである。
【００５３】
【化２７】
2016527192.tif 000029
【００５４】
最も好ましいＲは以下のとおりである。
【００５５】
【化２８】
2016527192.tif 000030
前記置換基において、Ｒ４は以下のとおりである。
【００５６】
【化２９】
2016527192.tif 000031
【００５７】
本発明によって提供されるマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体において、「薬理学的に許容できる塩」とは、治療効果を有し、且つ、毒性のない塩の形態の一般式（Ｉ）で表される化合物を意味している。これは、いずれかのアルカリ性官能基（アミノ等）から陽イオンの塩を形成することができる。本分野において、多くの塩類が任意のアルカリ性官能基（アミノ等）によって形成される陽イオンの塩であることは知られている。これらのうち多くの塩は本分野ですでに公知である。また、相応の酸をアルカリ性形式の（Ｉ）と反応させることにより、陽イオンの塩を得てもよく、このような酸は無機酸又は有機酸を含み、無機酸としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸等が挙げられ、有機酸としては、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、２−ヒドロキシプロピオン酸、２−オキソプロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、２−ヒドロキシ−１，２，３−プロパントリカルボン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、安息香酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、スルフィン酸シクロヘキシル、２−ヒドロキシ安息香酸、４−アミノ−２−ヒドロキシ安息香酸等が挙げられる。これらの塩は当業者に周知であり、当業者により、いかなる塩も製造することができる。また、当業者は溶解性、安定性、製剤の容易さ等の観点に基づき、ある塩を他の種類の塩の代わりに用いてもよい。また、これらの塩の決定と最適化は当業者の経験則の範囲内である。
【００５８】
本発明においては、ＴＨＦがテトラヒドロフラン、ＤＣＣがジシクロヘキシルカルボジイミド、ＤＭＡＰが４−ジメチルアミノピリジン、ＨＣｌ−ＡｃＯＥｔが飽和塩酸を含む酢酸エチル溶液、ＤＣＭが塩化メチレン、ＥＤＣＩが１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩、ＨＯＢｔが１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ＰＰＴＳがｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム、ＤＨＰが３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン、Ｐｄ／Ｃ，Ｈ２がパラジウム炭素水素、（Ｂｏｃ）２Ｏが二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルを示す。
【００５９】
本発明におけるマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体の製造方法は以下の工程を含む。５−フルオロウラシルとアルデヒド１−１とを反応させて中間体２′を得て、前記中間体２′とＢｏｃ−Ｌ−ロイシンとの縮合反応を行って中間体３′を得て、前記中間体３′の保護基を脱保護して化合物４′を得て、前記化合物４′とＢｏｃ−ＡＨＰＡとの縮合によって化合物５′を得て、前記化合物５′を脱保護して目的とする化合物６′を得る。その合成経路は次のとおりである。
【００６０】
【化３０】
2016527192.tif 000032
式中、Ｒ１はＨ、ＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ３である。
【００６１】
具体的に、ＢＣ−０１の合成経路の例を挙げると（他の化合物６′について、当業者は下記ＢＣ−０１の合成方法を参考して製造することができる）、５−フルオロウラシルと３７％ホルムアルデヒド溶液とを反応させて中間体２を得て、前記中間体２とＢｏｃ−Ｌ−ロイシンとを縮合反応させて前記中間体３を得て、前記中間体３の保護基を脱保護して化合物４を得て、前記化合物４とＢｏｃ−ＡＨＰＡとを縮合して化合物５を得て、前記化合物５を脱保護して目的とする化合物６（ＢＣ−０１）を得る。その合成経路は次のとおりである。
【００６２】
【化３１】
2016527192.tif 000033
【００６３】
更に具体的な例を挙げると、５−フルオロウラシルを３７％ホルムアルデヒド溶液に溶解し、室温で反応させて中間体２を得て、前記中間体２を無水ＴＨＦ中に溶解し、ＤＣＣとＤＭＡＰを用いてＢｏｃ−Ｌ−ロイシンと反応させて中間体３を得て、ＨＣｌ−ＡｃＯＥｔ溶液に前記中間体３の保護基を脱保護して化合物４を得て、無水ＤＣＭ中でＥＤＣＩとＨＯＢｔを用いて前記化合物４とＢｏｃ−ＡＨＰＡとを縮合して化合物５を得て、飽和塩酸を含む酢酸エチル溶液により前記化合物５を脱保護して目的とする化合物６（ＢＣ−０１）を得る。
【００６４】
上記反応経路において、各反応の具体的な条件は、いずれも本分野の通常の反応条件であってもよい。
【００６５】
本発明におけるマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体の製造方法は以下の工程を含む。５−フルオロウラシルとアルデヒド１−１とを反応させて中間体２′を得て、化合物７の水酸基をＤＨＰで保護して中間産物８を得て、前記中間産物８からベンジルを除去して化合物９を得て、前記化合物９と前記中間体２′とを縮合して化合物１０′を得て、前記化合物１０′を酸で脱保護して目的とする化合物６′を得る。その合成経路は次のとおりである。
【００６６】
【化３２】
2016527192.tif 000034
【００６７】
【化３３】
2016527192.tif 000035
式中、Ｒ１はＨ、ＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ３であり、前記ＤＨＰは３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピランである。
【００６８】
具体的に、ＢＣ−０１の合成経路の例を挙げると（他の化合物６′について、当業者は下記ＢＣ−０１の合成方法を参照して製造することができる）、５−フルオロウラシルと３７％ホルムアルデヒド溶液を反応させて中間体２を得て、化合物７の水酸基をＤＨＰで保護して中間産物８を得て、前記中間産物８からベンジルを除去して化合物９を得て、前記化合物９と前記中間体２とを縮合して化合物１０を得て、前記化合物１０を酸で脱保護して目的とする化合物６（ＢＣ−０１）を得る。その合成経路は次のとおりである。
【００６９】
【化３４】
2016527192.tif 000036
【００７０】
【化３５】
2016527192.tif 000037
【００７１】
更に具体的な合成経路の例を挙げると、５−フルオロウラシルを３７％ホルムアルデヒド溶液に溶解し、室温で反応させて中間体２を得て、化合物７を無水ＤＣＭ中に溶解し、水酸基をＰＰＴＳとＤＨＰで保護して中間産物８を得て、前記中間産物８をＰｄ／Ｃ，Ｈ２触媒の存在下でベンジルを除去して化合物９を得て、無水ＤＣＭ中でＥＤＣＩとＨＯＢｔとを用いて前記化合物９と前記中間体２とを縮合して化合物１０を得て、前記化合物１０を、飽和塩酸を含む酢酸エチル溶液で脱保護して目的とする化合物６（ＢＣ−０１）を得る。
【００７２】
上記反応経路において、各反応の具体的な条件は、いずれも本分野の通常の反応条件であってもよい。
【００７３】
本発明におけるマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体の製造方法は以下の工程を含む。無水ＤＣＭ中でＥＤＣＩとＨＯＢｔとを用いて化合物１４′又はそのカチオン塩と化合物９とを縮合して化合物１５′を得て、前記化合物１５′を酸で脱保護して目的とする化合物１６′を得る。その具体的な合成経路は次のとおりであり、
【００７４】
【化３６】
2016527192.tif 000038
式中、前記化合物９は以下のとおりであり、
【００７５】
【化３７】
2016527192.tif 000039
前記化合物１４′は以下のとおりであるか、
【００７６】
【化３８】
2016527192.tif 000040
又は前記化合物１４′において、ＹはＯ又はＮＨであり、Ｍは以下のとおりであり、
【００７７】
【化３９】
2016527192.tif 000041
式中、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３の定義は上記と同じである。
前記カチオン塩は、塩酸塩であることが好ましい。
ＹがＮＨであり、Ｍが以下のとおりである場合、
【００７８】
【化４０】
2016527192.tif 000042
化合物１４′の製造方法は以下の工程を含み、Ｌ−グリシン１１を（Ｂｏｃ）２Ｏで保護して化合物１２を得て、前記化合物１２と化合物２′とを縮合して化合物１３′を得て、前記化合物１３′を酸で脱保護して化合物１４′を得る。
【００７９】
【化４１】
2016527192.tif 000043
前記化合物２′は、以下のとおりである。
【００８０】
【化４２】
2016527192.tif 000044
【００８１】
具体的に、ＢＣ−０２の合成を例として挙げると（他の化合物１６′について、当業者は下記ＢＣ−０２の合成方法を参照して製造することができる）、Ｌ−グリシンを（Ｂｏｃ）２Ｏで保護して化合物１２を得て、前記化合物１２と前記化合物２とを縮合して化合物１３を得て、前記化合物１３を酸で脱保護して中間体１４を得て、前記中間体１４と前記化合物９とを縮合して化合物１５を得て、前記化合物１５を酸で脱保護して目的とする化合物１６（ＢＣ−０２）を得る。その具体的な合成経路は次のとおりである。
【００８２】
【化４３】
2016527192.tif 000045
【００８３】
更に具体的には、Ｌ−グリシンを（Ｂｏｃ）２Ｏで保護して化合物１２を得て、無水ＤＣＭ中でＥＤＣＩ及びＨＯＢｔを用いて前記化合物１２と前記化合物２とを縮合して化合物１３を得て、前記化合物１３を、飽和塩酸を含む酢酸エチルで脱保護して中間体１４を得て、無水ＤＣＭ中でＥＤＣＩ及びＨＯＢｔを用いて前記中間体１４と前記化合物９とを縮合して化合物１５を得て、前記化合物１５を、飽和塩酸を含む酢酸エチルで脱保護して目的とする化合物１６（ＢＣ−０２）を得る。
【００８４】
上記反応経路において、各反応の具体的な条件はいずれも本分野の通常の反応条件であってもよい。
【００８５】
本発明におけるマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体の製造方法は以下の工程を含む。Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシン１７とペンタフルオロフェノール（ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｏｌ）とを縮合反応させて中間体１８を得て、前記中間体１８とヒドロキシ尿素（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）とを反応させて化合物１９を得て、前記化合物１９を酸により脱保護して化合物２０を得て、前記化合物２０とＢｏｃ−ＡＨＰＡとを縮合反応させて化合物２１を得て、前記化合物２１を脱保護して目的とする化合物２２を得る。その具体的な合成経路は次のとおりである。
【００８６】
【化４４】
2016527192.tif 000046
【００８７】
更に具体的には、Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシンを、無水ＴＨＦに溶解し、ＥＤＣＩを用いてペンタフルオロフェノールと縮合反応させて中間体１８を得て、前記中間体１８からＮ−メチルモルホリンの存在下で化合物１９を得て、前記化合物１９を、飽和塩酸を含む酢酸エチルで脱保護して化合物２０を得て、無水ＤＣＭ中でＥＤＣＩ及びＨＯＢｔを用いて前記化合物２０とＢｏｃ−ＡＨＰＡとを縮合反応させて化合物２１を得て、前記化合物２１を、飽和塩酸を含む酢酸エチルで脱保護して目的とする化合物２２を得る。
【００８８】
上記反応経路において、各反応の具体的な条件はいずれも本分野の通常の反応条件であってもよい。
【００８９】
本発明におけるマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体の製造方法は以下の工程を含む。エピルビシンを（Ｂｏｃ）２Ｏにより保護して化合物２４を得て、前記化合物２４とＣｂｚ−Ｌ−ロイシンとを縮合反応させて化合物２５を得て、前記化合物２５のアミノ基の保護基を除去して化合物２６を得て、前記化合物２６とＢｏｃ−ＡＨＰＡとを縮合反応させて化合物２７を得て、前記化合物２７を脱保護して目的とする化合物２８を得る。その具体的な合成経路は次のとおりである。
【００９０】
【化４５】
2016527192.tif 000047
【００９１】
更に具体的には、エピルビシンを（Ｂｏｃ）２Ｏにより保護して化合物２４を得て、無水ＤＣＭ中でＥＤＣＩ及びＨＯＢｔを用いて前記化合物２４とＣｂｚ−Ｌロイシンとの縮合反応を行うことで化合物２５を得て、前記化合物２５をパラジウム炭素水素でアミノ基を脱保護して化合物２６を得て、無水ＤＣＭ中でＥＤＣＩ及びＨＯＢｔを用いて前記化合物２６とＢｏｃ−ＡＨＰＡとを縮合反応させて化合物２７を得て、前記化合物２７を、飽和塩酸を含む酢酸エチル溶液で脱保護して目的とする化合物２８を得る。
【００９２】
上記反応経路において、各反応の具体的な条件はいずれも本分野の通常の反応条件であってもよい。
【００９３】
本発明におけるマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体の製造方法は以下の工程を含む。Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシン１７と化合物Ａ−Ｅ−Ｈとを縮合反応させて化合物２９′を得て、前記化合物２９′を酸により脱保護して化合物３０′を得て、前記化合物３０′とＢｏｃ−ＡＨＰＡとを縮合反応させて化合物３１′を得て、前記化合物３１′を脱保護して目的とする化合物３２′を得る。その具体的な合成経路は次のとおりであり、
【００９４】
【化４６】
2016527192.tif 000048
式中、Ａ−Ｅ−Ｈは以下のとおりであるか、
【００９５】
【化４７】
2016527192.tif 000049
又は、ＥはＮＨ又はＯであり、
Ａは以下のとおりである。
【００９６】
【化４８】
2016527192.tif 000050
【００９７】
具体的に、ダサチニブ誘導体３２の合成経路の例を挙げると（他の化合物３２′について、当業者は下記ダサチニブ誘導体３２の製造方法を参照して製造することができる）、Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシンとダサチニブとを縮合反応させて化合物２９を得て、前記化合物２９を酸により脱保護して化合物３０を得て、前記化合物３０とＢｏｃ−ＡＨＰＡとを縮合反応させて化合物３１を得て、前記化合物３１を脱保護して目的とする化合物３２を得る。その具体的な合成経路は次のとおりである。
【００９８】
【化４９】
2016527192.tif 000051
【００９９】
更に具体的には、無水ＤＣＭ中でＥＤＣＩ及びＨＯＢｔを用いてＢｏｃ−Ｌ−ロイシンとダサチニブとを縮合反応させて化合物２９を得て、前記化合物２９を、飽和塩酸を含む酢酸エチルで脱保護して化合物３０を得て、無水ＤＣＭ中でＥＤＣＩ及びＨＯＢｔを用いて前記化合物３０とＢｏｃ−ＡＨＰＡとを縮合反応させて化合物３１を得て、前記化合物３１を、飽和塩酸を含む酢酸エチルで脱保護して目的とする化合物３２を得る。
【０１００】
上記反応経路において、各反応の具体的な条件はいずれも本分野の通常の反応条件であってもよい。
【０１０１】
本発明におけるマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体の製造方法は以下の工程を含む。化合物９と化合物Ｑ−Ｙ−Ｈとを縮合反応させて目的とする化合物３３′を得る。
【０１０２】
【化５０】
2016527192.tif 000052
式中、化合物Ｑ−Ｙ−Ｈにおいて、ＹはＮＨ又はＯであり、
Ｑは以下のとおりである。
【０１０３】
【化５１】
2016527192.tif 000053
【０１０４】
具体的には、本発明におけるマルチターゲットのウベニメクスプロドラッグ誘導体の製造方法は以下の工程を含む。化合物９とｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドとを縮合反応させて化合物３３を得て、前記化合物３３を還元してアルコール３４を得て、前記アルコール３４とトリホスゲンとを反応させて化合物３５を得て、前記化合物３５とＨ−Ｒ４とを反応させて化合物３６を得て、前記化合物３６を脱保護して目的とする化合物３７を得る。その合成経路は次のとおりである。
【０１０５】
【化５２】
2016527192.tif 000054
【０１０６】
本発明において、ウベニメクスに結合させる別の市販薬及び結合に用いる単純誘導体は、本分野の公知の方法によって得ることができる。
【０１０７】
本発明に係るターゲットウベニメクスプロドラッグ誘導体は、様々な腫瘍を予防・治療するために使用することができ、特に化学療法薬に耐性がある固形腫瘍を治療する薬物として使用でき、特に医薬分野において抗悪性腫瘍薬（特に固形腫瘍）として使用することができる。
【０１０８】
本発明に係るターゲットウベニメクスプロドラッグ誘導体は、様々な腫瘍の予防・治療に用いられてもよい。この腫瘍は、化学療法薬に耐性がある固形腫瘍が好ましい。
【発明の効果】
【０１０９】
本発明では、プロドラッグ理論と結合原理に従い、新しい抗腫瘍薬を提供するため、亜鉛イオンキレート基が残っていることを前提として、ウベニメクスの骨組構造を改質している。本発明者等は、ファーマコフォアハイブリダイゼーション法を用いて、ＣＤ１３阻害剤であるウベニメクスを、エステル結合又はアミド結合によって別の市販薬（例えば、５−ＦＵ、ヒドロキシ尿素、エピルビシン、ダサチニブ及びパクリタキセル等）の分子構造と一体化し、一連の新規な相互プロドラッグの設計・合成をした。これらの化合物は、ＣＤ１３の抑制活性を保持し、体内に入った後、ＣＤ１３阻害剤がＣＤ１３の活性を抑制することで、がん幹細胞を抑える標的抗がんの役割を果たしている。また、これらのプロドラッグは、体内において、エステラーゼの存在下で、ウベニメクスと別の抗腫瘍薬の断片を代謝して放出することができ、ウベニメクスはＣＤ１３に作用して持続的にがん幹細胞を抑える一方で、放出した別の抗腫瘍薬の断片は、その特定の薬理学的効果を発揮して二つの薬の相乗抗癌効果を実現することができ、抗腫瘍活性を効果的に高めることができる。また、本発明者等が設計する相互プロドラッグは、いずれも塩類であり、化合物の水溶性を改善することができ、経口投与と静脈投与に適するとともに、二つの薬の生体利用率を高めることができる。また、本発明者等が選択した抗腫瘍薬（例えば、５−ＦＵ、ヒドロキシ尿素、エピルビシン、ダサチニブ、パクリタキセル、ゲムシタビン、ヒドロキシカンプトテシン（ｈｙｄｒｏｘｙｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎｅ））は、臨床で広く使用されている抗腫瘍薬であり、肝臓癌の治療において高い治療効果を発揮する。従って、広義の意味で、この相互薬により、二つの薬の体内の滞在時間の延長、薬物動態性質の改善、薬の生体利用率の向上ができることが期待される。本発明のプロドラッグは、がん幹細胞と腫瘍の微小環境内の血管生成を抑制するウベニメクスと、細胞毒性を有する５−ＦＵ等の他の抗腫瘍薬との相乗効果により抗腫瘍活性を効果的に高めることができ、特にがん幹細胞を抑制することで再発、転移防止の効果を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１は、コントロール群マウスと、ウベニメクス及び５ＦＵの併用投与群マウスとの腫瘍の大きさの比較を示す。
【図２】図２は、昆明マウスの腫瘍体積の比較を示す。
【図３】図３は、経口投与群の昆明マウスの体重変化曲線の比較を示す。
【図４】図４は、経口投与群の昆明マウスの腫瘍重量の比較を示す。
【図５】図５は、経口投与群の化合物の腫瘍阻害率の比較を示す。
【図６】図６は、経口投与群毎の腫瘍の写真を示す。
【図７】図７は、静脈投与群の昆明マウスの体重変化曲線の比較を示す。
【図８】図８は、静脈投与群の昆明マウスの腫瘍重量の比較を示す。
【図９】図９は、静脈投与群の化合物の腫瘍抑制率の比較を示す。
【図１０】図１０は、静脈投与群毎の腫瘍の写真を示す。
【図１１】図１１は、腫瘍重量及びその偏差を示す。図１１中、＊表記群の投与方法は経口胃管投与であり、未表記の投与方法は尾静脈投与である。
【図１２】図１２は、化合物の抑制率を示す。図１２中、＊表記群の投与方法は経口胃管投与であり、未表記の投与方法は尾静脈投与である。
【図１３】図１３は、動物の体重変化曲線を示す。図１３中、＊表記群の投与方法は経口胃管投与であり、未表記の投与方法は尾静脈投与である。
【図１４】図１４は、動物試験の腫瘍の写真を示す。図１４中、＊表記群の投与方法は経口胃管投与とし、未表記の投与方法は尾静脈投与とし、○は腫瘍が発見されなかったことを示し、×は動物が死亡したことを示す。
【実施例】
【０１１１】
次に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。
【０１１２】
［実施例１］
５−フルオロ−１−ヒドロキシメチルピリミジン−２，４（１Ｈ、３Ｈ）−ジオン（２）の調製
５−フルオロウラシル（０．２６ｇ、２ｍｍｏｌ）を１ｍＬの３７％ホルムアルデヒド溶液に溶解し、６０℃の油浴中で２時間反応させた。その後、溶媒を減圧下で蒸発させて、残渣を真空乾燥し、無色粘性油状物２（０．３ｇ、９４％）を得た。
【０１１３】
［実施例２］
（Ｓ）−（５−フルオロ−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ））メチル−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−メチルペンタノエート（３）の調製
無色粘性油状物２（０．３ｇ、１．９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル溶液に溶解し、氷浴中で撹拌しながらＢｏｃ−Ｌ−ロイシン（０．７ｇ、２．８ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（０．６ｇ、２．８ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．０３ｇ）を加えた。氷浴を除去して室温で１２時間反応させた。濾過して蒸発させて溶媒を除去し、酢酸エチルで抽出し、有機層を、水、１Ｍのクエン酸、飽和炭酸水素ナトリウム、飽和塩化ナトリウムの順に洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過して蒸発させて溶媒を除去し、無色油状物３（０．４２ｇ、６０％）を得た。
【０１１４】
［実施例３］
（Ｓ）−（５−フルオロ−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジニル−１（２Ｈ））メチル−２−（アミノ）−４−メチルペンタノエート塩酸塩（４）の調製
無色油状物３（０．３７ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を、飽和塩酸を含む酢酸エチル溶液に溶解し、室温で２時間反応させた。溶媒を濾過し、白色固体４（０．２６ｇ、８３％）を得た。
【０１１５】
［実施例４］
（Ｓ）−（５−フルオロ−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジニル−１（２Ｈ））メチル−２−（（２Ｓ，３Ｒ）−３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル）−４−メチルペンタノエート（５）の調製
Ｂｏｃ−ＡＨＰＡ（０．３ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタンに溶解し、氷浴でＥＤＣＩ（０．３ｇ、１．５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．２ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を加え、０．５時間後に白色固体４（０．３ｇ、１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン０．２ｍＬを加えた。氷浴を除去して室温で５時間反応させた。反応が完了した後に、有機層を、それぞれ、水、１Ｍのクエン酸、飽和炭酸水素ナトリウム、飽和塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過して蒸発させて溶媒を除去し、白色固体５（０．３３ｇ、５５％）を得た。
【０１１６】
［実施例５］
（Ｓ）−（５−フルオロ−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ））メチル−２−（（２Ｓ，３Ｒ）−３−（アミノ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル）−４−メチルペンタノエート塩酸塩（６（ＢＣ−０１）の調製
白色固体５（０．３３ｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を、飽和塩酸を含む酢酸エチル溶液に溶解し、室温で２時間反応させた。濾過して白色固体６（ＢＣ−０１）（０．２３ｇ、８５％）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：４５１．６（Ｍ＋Ｈ）＋、１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ）：δ０．８４−０．８７（ｍ、６Ｈ）、１．５０−１．５３（ｍ、１Ｈ）、１．６０−１．６８（ｍ、２Ｈ）、２．８９−２．９５（ｍ、２Ｈ）、３．９９−４．０３（ｍ、２Ｈ）、４．２２−５．２５（ｍ、１Ｈ）、５．５６−５．６１（ｍ、２Ｈ）、６．８０（ｓ、１Ｈ）、７．２６−７．３５（ｍ、５Ｈ）、８．０４（ｓ、３Ｈ）、８．１３（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ、１Ｈ）、８．４７（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、１２．０１（ｓ、１Ｈ）。ｍｐ：１２８−１３０℃。
【０１１７】
［実施例６］
（Ｓ）−ベンジル−２−（（２Ｓ，３Ｒ）−３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル）−４−メチルペンタノエート（７）の調製
Ｂｏｃ−ＡＨＰＡ（６ｇ、２０．３ｍｍｏｌ）を塩化メチレンに溶解し、氷浴でＨＯＢｔ（３ｇ、２２．３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（４．５ｇ、２２．３ｍｍｏｌ）を加えた。その後、０．５時間後にＬ−ロイシンベンジルエステルｐ−トルエンスルホン酸塩（８．５ｇ、２２．３ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン３．１ｍＬを加えた。氷浴を除去して５時間反応させた。反応液をそれぞれ１０％のクエン酸、飽和炭酸水素ナトリウム、飽和塩化ナトリウムで３回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。次いで、濾過して蒸発させて溶媒を除去し、淡黄色固体７（４．８ｇ、４７．５％）を得た。
【０１１８】
［実施例７］
（２Ｓ）−ベンジル−２−（（２Ｓ，３Ｒ）−３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−フェニル−２−（２−（２Ｈ）−テトラヒドロピラニルオキシ）ブチリル）−４−メチルペンタノエート（８）の調製
淡黄色固体７（１２ｇ、２４ｍｍｏｌ）を乾燥塩化メチレンに溶解し、ＰＰＴＳ（０．６ｇ、２．４ｍｍｏｌ）を加え、ＤＨＰ（３．６ｇ、４３．２ｍｍｏｌ）を滴下した。更に、３５℃で２４時間反応させ、ＴＬＣ検出反応が完了した後に、Ｋ２ＣＯ３  ０．５ｇを加え２０分撹拌し、飽和塩化ナトリウムで３回洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、濾過して減圧下で溶媒を蒸発させて除去し、薄黄色固体８（１２．６ｇ、９０．８％）を得た。
【０１１９】
［実施例８］
（２Ｓ）−２−（（２Ｓ，３Ｒ）−３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−フェニル−２−（２−２Ｈ−テトラヒドロピラニルオキシ）ブチリル）−４−メチルペンタノエート（９）の調製
薄黄色固体８（１２．６ｇ、２１．６ｍｍｏｌ）をメタノールに溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（１０％）１．３ｇを複数回に分けて添加した。更に、反応容器を真空にして水素バルーンを用いて水素を注入し、１２時間反応の後、二層ろ紙でろ過した。溶媒を乾燥するまで蒸発させて白色泡状固体９（１０．２ｇ、９６．０％）を得た。
【０１２０】
［実施例９］
（Ｓ）−（５−フルオロ−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ））メチル−２−（（２Ｓ，３Ｒ）−３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−フェニル−２−（２−（２Ｈ）−テトラヒドロピラニルオキシ）アシル）−４−メチルペンタノエート（１０）の調製
白色泡状固体９（６ｇ、２０．３ｍｍｏｌ）を再蒸留した塩化メチレンに溶解し、氷浴でＨＯＢｔ（３．６ｇ、２６．９２ｍｍｏｌ）とＥＤＣＩ（５．２ｇ、２６．９２ｍｍｏｌ）を加えた。０．５時間後に無色粘性油状物２（４．３ｇ、２６．９２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液とトリエチルアミン３．７ｍＬを加え、氷浴を除去して２０時間反応させた。反応液をそれぞれ１０％のクエン酸、飽和炭酸水素ナトリウム、飽和塩化ナトリウムで３回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。次いで、濾過して溶媒を蒸発させて除去し、黄色油状物１０を得て、フラッシュ・カラム・クロマトグラフィーを用いて油分を分離し、無色油状物１０（８．８ｇ、６７％）を得た。
【０１２１】
［実施例１０］
（Ｓ）−（５−フルオロ−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ））メチル−２−（（２Ｓ，３Ｒ）−３−（アミノ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル）−４−メチルペンタノエート塩酸塩（６（ＢＣ−０１））の調製
無色油状物１０（８．８ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）を、飽和塩酸を含む酢酸エチル溶液に溶解し、室温で２時間反応させた。これを濾過して白色固体６（ＢＣ−０１）（５．９４ｇ、８８％）を得た。ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：４５１．５（Ｍ＋Ｈ）＋、１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ）：δ０．８５−０．８９（ｍ、６Ｈ）、１．５１−１．５６（ｍ、１Ｈ）、１．５９−１．６６（ｍ、２Ｈ）、２．８７−２．９４（ｍ、２Ｈ）、４．０１−４．０５（ｍ、２Ｈ）、４．２４−５．２８（ｍ、１Ｈ）、５．６０−５．６３（ｍ、２Ｈ）、６．７５（ｓ、１Ｈ）、７．２３−７．３２（ｍ、５Ｈ）、８．０９（ｓ、３Ｈ）、８．１６（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ、１Ｈ）、８．４８（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、１２．０５（ｓ、１Ｈ）。ｍｐ：１２８−１２９℃。
【０１２２】
［実施例１１］
２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）酢酸（１２）の調製
Ｌ−グリシン（２．３ｇ、３０ｍｍｏｌ）を１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウムに溶解し、氷浴下で機械的に撹拌しながら、（Ｂｏｃ）２Ｏ（７．２ｇ、３３ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液を滴下した。滴下完了から０．５時間後に氷浴を除去した。２ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウムで反応液をｐＨ１０に維持して一晩反応させた。テトラヒドロフランを蒸発させた後、石油エーテルで３回抽出し、水相を３ｍｏｌ／ＬのＨＣｌでｐＨ２〜３に調整して、酢酸エチルで３回抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過した後、蒸発させて真空中で２４時間乾燥し、白色固体１２（５．１ｇ、９６％）を得た。
【０１２３】
［実施例１２］
（５−フルオロ−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ））メチル−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）酢酸エステル（１３）の調製
白色固体１２（１．１ｇ、６．３ｍｍｏｌ）を再蒸留した塩化メチレンに溶解し、氷浴でＨＯＢｔ（１．２ｇ、８．８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（１．７ｇ、８．８ｍｍｏｌ）を加えた。０．５時間後に無色粘性油状物２（１．４ｇ、８．８ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液とトリエチルアミン１．２ｍＬを加え、氷浴を除去して２０時間反応させた。反応液をそれぞれ１０％のクエン酸、飽和炭酸水素ナトリウム、飽和塩化ナトリウムで３回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過して溶媒を蒸発させて除去し、黄色油状物を得て、フラッシュ・カラム・クロマトグラフィーを用いて油分を分離して無色油状物１３（１．３ｇ、６７％）を得た。
【０１２４】
［実施例１３］
（５−フルオロ−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ））メチル−２−アミノ）酢酸エステル塩酸塩（１４）の調製
無色油状物１３（１．３ｇ、４．２ｍｍｏｌ）を、飽和塩酸を含む酢酸エチル溶液に溶解し、室温で２時間反応させた。これを濾過して白色固体１４（０．９３ｇ、８８％）を得た。
【０１２５】
［実施例１４］
（６Ｒ，７Ｓ，１０Ｓ）−（５−フルオロ−２，６−ジオキソ−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン−３−イル）メチル−６−ベンジル−１０−イソブチル−２，２−ジメチル−４，８，１１−トリオキソ−７−（２−２Ｈ−テトラヒドロピラニルオキシ）−３−オキシ−５，９，１２−トリアザテトラデカン酸エステル（１５）の調製
白色泡状固体９（１．２１ｇ、２．４５ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタンに溶解し、氷浴でＥＤＣＩ（０．６５ｇ、３．４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．４６ｇ、３．４ｍｍｏｌ）を加え、０．５時間後に白色固体１４（０．９３ｇ、３．４ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン０．４８ｍＬを加えた。氷浴を除去して室温で５時間反応させた。反応が完了した後に、溶媒を蒸発させて除去し、残渣をカラム・クロマトグラフィーにより分離して白色固体１５（０．８６ｇ、５１％）を得た。
【０１２６】
［実施例１５］
（５−フルオロ−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ））メチル−２−（（Ｓ）−２−（（２Ｓ，３Ｒ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタノイル）−４−メチルペンタンアミド）酢酸エステル塩酸塩（１６（ＢＣ−０２））の調製
白色固体１５（０．８６ｇ、１．２４ｍｍｏｌ）を、飽和塩酸を含む酢酸エチル溶液に溶解し、室温で２時間反応させた。これを濾過して白色固体１６（ＢＣ−０２）（０．５７ｇ、８５％）を得た。ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：５０８．４（Ｍ＋Ｈ）＋、１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ）：δ０．８６−０．８９（ｍ、６Ｈ）、１．４９−１．５３（ｍ、２Ｈ）、１．６２−１．６６（ｍ、１Ｈ）、２．８７−２．９７（ｍ、２Ｈ）、３．５５−３．５７（ｍ、１Ｈ）、３．８０−３．９２（ｍ、２Ｈ）、４．００−４．０６（ｍ、１Ｈ）、４．３１−４．３２（ｍ、１Ｈ）、５．５７−５．８０（ｍ、２Ｈ）、６．７３（ｓ、１Ｈ）、７．２５−７．３７（ｍ、５Ｈ）、８．０２−８．０８（ｍ、４Ｈ）、８．１４（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ、１Ｈ）、８．５９−８．６２（ｍ、１Ｈ）、１２．０１（ｓ、１Ｈ）。ｍｐ：１３６−１３７℃。
【０１２７】
［実施例１６］
ＢＣ−０２と同じ合成工程にて以下の化合物を得た。
（Ｓ）−（５−フルオロ−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ））メチル‐２−（（Ｓ）−２−（（２Ｓ，３Ｒ）−３−（アミノ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチルアミド）−４−メチルペンタンアミド）プロピオン酸塩酸塩（ＢＣ−０３）。
ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：５２１．５（Ｍ＋Ｈ）＋、１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ）：δ０．８５−０．９１（ｍ、６Ｈ）、１．２５−１．２８（ｍ、３Ｈ）、１．４３−１．５１（ｍ、２Ｈ）、１．６０−１．６４（ｍ、１Ｈ）、２．８７−２．９４（ｍ、２Ｈ）、３．５３−３．５７（ｍ、１Ｈ）、３．９９−４．０４（ｍ、１Ｈ）、４．２４−４．３１（ｍ、２Ｈ）、５．５４−５．６４（ｍ、２Ｈ）、７．２７−７．３４（ｍ、５Ｈ）、７．９８−８．００（ｍ、４Ｈ）、８．１２（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ、１Ｈ）、８．６１（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、１Ｈ）、１１．９９（ｓ、１Ｈ）。ｍｐ：１１１−１１２℃。
【０１２８】
（５−フルオロ−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジニル−１（２Ｈ））メチル−３−（（Ｓ）−２−（（２Ｓ，３Ｒ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタノイル）−４−メチルペンタンアミド）プロピオン酸塩酸塩（ＢＣ−０４）。
ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：５２２．５（Ｍ＋Ｈ）＋、１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ）：δ０．８４−０．８８（ｍ、６Ｈ）、１．４５−１．５９（ｍ、４Ｈ）、２．８６−２．９７（ｍ、２Ｈ）、３．２０−３．３１（ｍ、２Ｈ）、３．５６−３．５７（ｍ、１Ｈ）、４．００−４．０６（ｍ、１Ｈ）、４．１８−４．２３（ｍ、１Ｈ）、５．５５−５．６０（ｍ、２Ｈ）、７．２６−７．３６（ｍ、５Ｈ）、７．９９−８．０１（ｍ、４Ｈ）、８．０９−８．１１（ｍ、１Ｈ）、８．２１−８．２４（ｍ、１Ｈ）、１１．９６（ｓ、１Ｈ）。ｍｐ：１１９−１２０℃。
【０１２９】
（５−フルオロ−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジニル−１（２Ｈ））メチル−４−（（Ｓ）−２−（（２Ｓ，３Ｒ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタノイル）−４−メチルペンタンアミド）酪酸塩酸塩（ＢＣ−０５）。
ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：５３６．４（Ｍ＋Ｈ）＋，１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ）：δ０．８５−０．８９（ｍ，６Ｈ）、１．４８−１．６５（ｍ、６Ｈ）、２．３２−２．３６（ｍ、２Ｈ）、２．８９−２．９４（ｍ、２Ｈ）、３．０２−３．０７（ｍ、２Ｈ）、３．５６−３．５７（ｍ、１Ｈ）、４．０１−４．０４（ｍ、１Ｈ）、４．２０−４．２６（ｍ、１Ｈ）、５．５６−５．６２（ｍ、２Ｈ）、７．２７−７．３５（ｍ、５Ｈ）、７．９９−８．０４（ｍ、５Ｈ）、８．１２−８．１５（ｍ、１Ｈ）、１１．９６（ｓ、１Ｈ）。ｍｐ：１１７−１１８℃。
【０１３０】
（５−フルオロ−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ））メチル−６−（（Ｓ）−２−（（２Ｓ，３Ｒ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタノイル）−４−メチルペンチルアミド）カプロン酸塩酸塩（ＢＣ−０６）。
ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：５６４．５（Ｍ＋Ｈ）＋、１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ）：δ０．８６−０．８９（ｍ、６Ｈ）、１．１６−１．２４（ｍ、２Ｈ）、１．３６−１．３８（ｍ、２Ｈ）、１．４６−１．５２（ｍ、５Ｈ）、２．２８−２．３２（ｍ、２Ｈ）、２．８９−３．０２（ｍ、４Ｈ）、３．５５（ｓ、１Ｈ）、３．９９−４．０４（ｍ、１Ｈ）、４．２２−４．２６（ｍ、１Ｈ）、５．５６（ｓ、２Ｈ）、７．２７−７．３５（ｍ、５Ｈ）、７．９９−８．１５（ｍ、６Ｈ）、１１．９６（ｓ、１Ｈ）。ｍｐ：９８−９９℃。
【０１３１】
（Ｓ）−（５−フルオロ−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ））メチル‐１−（（Ｓ）−２−（（２Ｓ，３Ｒ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタノイル）−４−メチルペンチルアミド）−２−ピロリジンエステル塩酸塩（ＢＣ−０７）
ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：５４８．４（Ｍ＋Ｈ）＋、１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ）：δ０．８７−０．９２（ｍ、６Ｈ）、１．３９−１．４１（ｍ、１Ｈ）、１．４６−１．４９（ｍ、１Ｈ）、１．６５−１．７１（ｍ、１Ｈ）、１．８５−１．９９（ｍ、２Ｈ）、２．１６−２．１７（ｍ、１Ｈ）、２．８９−２．９１（ｍ、２Ｈ）、３．４８−３．５３（ｍ、４Ｈ）、３．７０−３．７２（ｍ、１Ｈ）、３．９６−４．０４（ｍ、１Ｈ）、４．３１−４．３４（ｍ、１Ｈ）、４．４６−４．５３（ｍ、１Ｈ）、５．５４（ｄ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．６７（ｄ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，１Ｈ）、６．７１（ｓ、１Ｈ）、７．２７−７．３６（ｍ、５Ｈ）、８．０２−８．０３（ｍ、３Ｈ）、８．１１−８．１４（ｍ、２Ｈ）、１２．００（ｓ、１Ｈ）。ｍｐ：１４０−１４１℃。
【０１３２】
［実施例１７］
（Ｓ）−５フルオロフェニル−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−メチル−ペンタノエート（１８）の調製
Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシン（１．１７ｇ、５ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン溶液に溶解し、ペンタフルオロフェノール（１．０１ｇ、５．５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（１．０５ｇ、５．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間反応させた。この溶媒を真空蒸留で除去し、更に真空乾燥し、無色油状物１８（１．７ｇ、８６％）を得た。
【０１３３】
［実施例１８］
（Ｓ）−１−（（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４−メチルペンタノイル）オキシ）尿素（１９）の調製
ヒドロキシ尿素（０．３５ｇ、４．３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ溶液に溶解し、Ｎ−メチルモルホリン０．５２ｍＬを加え、更に無色油状物１８（１．７ｇ、４．３ｍｍｏｌ）を反応液に滴下し、室温で１２時間反応させた。溶媒を蒸発させて除去し、残留物はカラムクロマトグラフィーで精製して、白色固体１９（０．７５ｇ、６０％）を得た。
【０１３４】
［実施例１９］
（Ｓ）−１−（（２−アミノ−４−メチルペンタノイル）オキシ）尿素塩酸塩（２０）の調製
白色固体１９（０．７５ｇ、２．５８ｍｍｏｌ）を、飽和塩酸を含む酢酸エチル溶液に溶解し、室温で２時間反応させた。得られた白色固体２０（０．４７ｇ、８１％）をろ過した。
【０１３５】
［実施例２０］
（２Ｓ，３Ｒ）−３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（（Ｓ）−４−メチルペンタノイル）オキシ）尿素）−４−フェニルブタンアミド（２１）の調製
Ｂｏｃ−ＡＨＰＡ（１ｇ、３．３８ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタンに溶解し、氷浴でＥＤＣＩ（０．７１ｇ、３．７２ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．５ｇ、３．７２ｍｍｏｌ）を加え、０．５時間後に２０（０．８４ｇ、３．７２ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン０．５４ｍＬを加えた。氷浴を除去して室温で５時間反応させた。反応が完了した後に、溶媒を蒸発させて除去し、残留物はカラムクロマトグラフィーにより精製して、白色固体２１（０．７１ｇ、４５％）を得た。
【０１３６】
［実施例２１］
（２Ｓ，３Ｒ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−Ｎ−（（Ｓ）−４−メチルペンタノイル）オキシ）尿素）−４−フェニルブタンアミド塩酸塩（２２）の調製
白色固体２１（０．７１ｇ、１．５２ｍｍｏｌ）を、飽和塩酸を含む酢酸エチル溶液に溶解し、室温で２時間反応させた。得られた白色固体２２（０．４８ｇ、７８％）をろ過した。ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：３６７．３（Ｍ＋Ｈ）＋、１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ）：δ０．８０−０．９２（ｍ、６Ｈ）、１．５６−１．７５（ｍ、３Ｈ）、２．９０−３．０５（ｍ、２Ｈ）、４．０１−４．０６（ｍ、２Ｈ）、４．５３（ｍ、１Ｈ）、６．４８−６．５５（ｍ、２Ｈ）、６．８８（ｓ、１Ｈ）、７．２６−７．３８（ｍ、５Ｈ）、８．０２−８．０９（ｍ、３Ｈ）、８．６３（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、９．７７（ｍ、１Ｈ）。ｍｐ：１１０−１１２℃。
【０１３７】
［実施例２２］
Ｂｏｃ−エピルビシン（２４）の調製
２３（１．０９ｇ、２ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン溶液に溶解し、氷浴でトリエチルアミン０．８４ｍＬを加え、（Ｂｏｃ）２Ｏ（０．５２ｇ、２．４ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液を滴下し、室温で一晩反応させ、ＴＬＣ検出反応を行った。反応が完了した後に、１０％のクエン酸、飽和塩化ナトリウムで３回洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過して溶媒を蒸発させて除去し、化合物２４（１．０９ｇ、８５％）を得た。
【０１３８】
［実施例２３］
（Ｓ）−２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−ヒドロキシ−６−メチル−２（２Ｈ）−テトラヒドロピラニルオキシ）−２，５，１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−６，１１−ジオキソ−２−（１，２，３，４，６，１１−４フェニルヘキサヒドロ））−２−エトキシ−２−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）−４−メチルペンタノエート（２５）の調製
Ｃｂｚ−Ｌ−ロイシン（０．５ｇ，１．８７ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタンに溶解し、氷浴でＥＤＣＩ（０．３６ｇ、１．８７ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．２５ｇ、１．８７ｍｍｏｌ）を加え、０．５時間後に化合物２４（１．０９ｇ、１．７ｍｍｏｌ）を加えた。氷浴を除去して室温で５時間反応させた。反応が完了した後に、溶媒を蒸発させて除去し、残留物はカラムクロマトグラフィーにより精製して、白色固体２５（０．７６ｇ、５０％）を得た。
【０１３９】
［実施例２４］
（Ｓ）−２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−ヒドロキシ−６−メチル−２（２Ｈ）−テトラヒドロピラニルオキシ）−２，５，１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−６，１１−ジオキソ−２−（１，２，３，４，６，１１−４フェニルヘキサヒドロ））−２−エトキシ−２−アミノ−４−メチルペンタノエート（２５）の調製
白色固体２５（０．７６ｇ、０．８５ｍｍｏｌ）をメタノールに溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（１０％）０．１ｇを複数回に分けて添加した。更に、反応容器の空気を抜き、バルーンを用いてＨ２を注入し、１２時間反応の後、二層ろ紙でろ過した。その溶媒を蒸発させて乾燥し、白色泡状固体２６（０．６ｇ、９３．０％）を得た。
【０１４０】
［実施例２５］
（Ｓ）−２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−ヒドロキシ−６−メチル−２（２Ｈ）−テトラヒドロピラニルオキシ）−２，５，１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−６，１１−ジオキソ−２−（１，２，３，４，６，１１−４フェニルヘキサヒドロ））−２−エトキシ−２−（（２Ｓ，３Ｒ）−３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル）−４−メチルペンタノエート（２７）の調製
Ｂｏｃ−ＡＨＰＡ（０．２７ｇ、０．８８ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタンに溶解し、氷浴でＥＤＣＩ（０．１７ｇ、０．８８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．１２ｇ、０．８８ｍｍｏｌ）を加え、０．５時間後に白色泡状固体２６（０．６ｇ、０．８ｍｍｏｌ）を加えた。氷浴を除去して室温で５時間反応させた。
反応が完了した後に、溶媒を蒸発させて除去し、残留物はカラムクロマトグラフィーにより精製して、白色固体２７（０．４７ｇ、５７％）を得た。
【０１４１】
［実施例２６］
（Ｓ）−２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−ヒドロキシ−６−メチル−２（２Ｈ）−テトラヒドロピラニルオキシ）−２，５，１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−６，１１−ジオキソ−２−（１，２，３，４，６，１１−４フェニルヘキサヒドロ））−２−エトキシ−２−（（２Ｓ，３Ｒ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル）−４−メチルペンタノエート塩酸塩（２８）の調製
白色固体２７（０．４７ｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を、飽和塩酸を含む酢酸エチル溶液に溶解し、室温で２時間反応させた。得られた白色固体２８（０．３６ｇ、８７％）をろ過したＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：８３３．７（Ｍ＋Ｈ）＋，１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ）：δ０．８１−０．９４（ｍ，６Ｈ），１．２３（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ）、１．５８−１．８３（ｍ、３Ｈ）、１．７５（ｍ、１Ｈ）、２．０７（ｍ、１Ｈ）、２．２０−２．２４（ｍ、２Ｈ）、２．９３−３．１８（ｍ、４Ｈ）、３．４４−３．４９（ｍ、２Ｈ）、３．８８（ｓ、３Ｈ）、３．９８（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．０６−４．０９（ｍ、２Ｈ）、４．５５（ｍ、１Ｈ）、４．５８−４．６９（ｍ、２Ｈ）、４．９１−４．９８（ｍ、２Ｈ）、５．０５−５．０９（ｍ、１Ｈ）、５．２８−５．３５（ｍ、１Ｈ）、５．４７（ｓ、１Ｈ）、５．７６（ｓ、１Ｈ）、６．９３（ｓ、１Ｈ）、７．２６−７．３８（ｍ、５Ｈ）、７．６９（ｍ、１Ｈ）、７．９１−７．９８（ｍ、２Ｈ）、８．１１−８．１９（ｍ、３Ｈ）、８．６３（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）。ｍｐ：１３６−１３８℃。
【０１４２】
［実施例２７］
（Ｓ）−２−（４−（６−（５−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−チアゾリルカルボニルアミノ）−２−メチル−４−ピリミジニル）−１−トリアジニル）エチル−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４−メチルペンタノエート（２９）の調製
Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシン（０．２５ｇ、１．１ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタンに溶解し、氷浴でＥＤＣＩ（０．２１ｇ、１．１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．１５ｇ、１．１ｍｍｏｌ）を加え、０．５時間後にダサチニブ（０．５１ｇ、１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン０．２ｍＬを加えた。氷浴を除去して室温で５時間反応させた。反応が完了した後に、有機層を、それぞれ水、１Ｍのクエン酸、飽和炭酸水素ナトリウム、飽和塩化ナトリウムで洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過して、溶媒を蒸発させて除去し、白色固体２９（０．２８ｇ、４０％）を得た。
【０１４３】
［実施例２８］
（Ｓ）−２−（４−（６−（５−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−チアゾリルカルボニルアミノ）−２−メチル−４−ピリミジニル）−１−ピペラジニル）エチル−２−アミノ−４−メチルペンタノエート塩酸塩（３０）の調製
２９（０．７ｇ、１ｍｍｏｌ）を、飽和塩酸を含む酢酸エチル溶液に溶解し、室温で２時間反応させた。得られた白色固体３０（０．５４ｇ、８０％）をろ過した。
【０１４４】
［実施例２９］
（Ｓ）−２−（４−（６−（５−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−チアゾリルカルボニルアミノ）−２−メチル−４−ピリミジニル）−１−ピペラジニル）エチル−２−（（２Ｓ，３Ｒ）−３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル）−４−メチルペンタノエート（３１）の調製
Ｂｏｃ−ＡＨＰＡ（０．１６ｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタンに溶解し、氷浴でＥＤＣＩ（０．１１ｇ、０．５５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．０８ｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を加え、０．５時間後に３０（０．３４ｇ、０．５ｍｍｏｌ）を加えた。氷浴を除去して室温で５時間反応させた。反応が完了した後に、溶媒を蒸発させて除去し、残留物はカラムクロマトグラフィーにより精製され、白色固体３１（０．２２ｇ、５１％）を得た。
【０１４５】
［実施例３０］
（Ｓ）−２−（４−（６−（５−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−チアゾリルカルボニルアミノ）−２−メチル−４−ピリミジニル）−１−ピペラジニル）エチル−２−（（２Ｓ，３Ｒ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル）−４−メチルペンタノエート塩酸塩（３２）の調製
白色固体３１（０．２２ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を、飽和塩酸を含む酢酸エチル溶液に溶解し、室温で２時間反応させた。得られた白色固体３２（０．１８ｇ、８４％）をろ過した。ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：７７７．５（Ｍ＋Ｈ）＋、１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ）：δ０．８３−０．９５（ｍ、６Ｈ）、１．５９−１．８５（ｍ、３Ｈ）、２．１３（ｓ、３Ｈ）、２．２６（ｓ、３Ｈ）、２．５４−２．５８（ｍ、６Ｈ）、２．９０−３．０５（ｍ、２Ｈ）、３．６０−３．７０（ｍ、６Ｈ）、４．０１−４．０６（ｍ、２Ｈ）、４．５３（ｍ、１Ｈ）、６．０９（ｓ、１Ｈ）、６．８８（ｓ、１Ｈ）、７．２６−７．３８（ｍ、７Ｈ）、７．４８（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．０２−８．０９（ｍ、３Ｈ）、８．２２（ｓ、１Ｈ）、８．６３（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、９．５７（ｍ、２Ｈ）、９．７７（ｍ、２Ｈ）。ｍｐ：１７４−１７６℃。
【０１４６】
［実施例３１］
インビトロ酵素活性阻害（アミノペプチダーゼＮ活性阻害試験）
【０１４７】
１．材料と方法
アミノペプチダーゼＮと基質であるＬ−ロイシル−ｐ−ニトロアニリンは、共にシグマ社から購入した。
【０１４８】
緩衝液の製造方法：１２．８９ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏと２．１８ｇのＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏを１０００ｍＬの容量フラスコに溶解し、沸騰させて冷却した蒸留水を加えて、５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）を得て、室温で放置した。
【０１４９】
アミノペプチダーゼＮを緩衝液に溶かして０．１ＩＵ／ｍＬの溶液を調製した。
【０１５０】
基質をＤＭＳＯに溶解させて１６ｍｍｏｌ／ｍＬの溶液とし、各溶液を冷蔵庫に入れた。
【０１５１】
２．実験手順
【０１５２】
【表１】
2016527192.tif 000055
【０１５３】
９６ウェルプレートにそれぞれ、１０μＬの前記アミノペプチダーゼＮ溶液、５μＬの基質及び４０μＬの異なる勾配濃度の化合物を添加し、５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）で２００μＬに調整した。１００％群は阻害剤を含まない。ブランク群において、５μＬの基質を使用して緩衝液で２００μＬに定容した。３７℃で０．５時間培養し、４０５ｎｍの波長で吸光度を測定した。阻害率は、次の式に従って計算した。
【０１５４】
阻害率（％）＝（１００％対照群吸光度−化合物吸光度）／（１００％対照群吸光度−ブランク対照群吸光度）×１００％
化合物の濃度と相応の阻害率により、Ｏｒｉｇｉｎ７．５ソフトウェアカーブフィッテイングを使用して、各化合物のＩＣ５０を得た。
【０１５５】
３．実験結果
本発明の一般式（Ｉ）に示す化合物と陽性対照薬ウベニメクスのアミノペプチダーゼＮに対する活性阻害の結果を下記の表に示す。
【０１５６】
【表２】
2016527192.tif 000056
【０１５７】
インビトロ酵素活性阻害の実験結果に示すように、本発明の一般式（Ｉ）に示すターゲット化合物ＢＣ−０１、ＢＣ−０２、ＢＣ−０３、ＢＣ−０４、ＢＣ−０５、ＢＣ−０６、ＢＣ−０７、２２、２８、３２は、全てＡＰＮに対する阻害効果を示しているが、そのうちＢＣ−０２、ＢＣ−０３、ＢＣ−０４、ＢＣ−０５、ＢＣ−０６、ＢＣ−０７は活性阻害が陽性対照のウベニメクスより高く、特にＢＣ−０７は０．１５μＭに達した。ＢＣ−０１、２２、２８、３２の活性はウベニメクスの活性と同等であった。この結果が示すように、ウベニメクスのカルボキシ基に相乗断片を結合することで、全体の構造を破壊せずにその酵素活性阻害を高めることができた。
【０１５８】
［実施例３２］
インビトロ薬力学試験（ＭＴＴ法）
ヒト白血病細胞株Ｋ５６２、卵巣明細胞癌細胞株ＥＳ−２、ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７、細胞株Ｈｅｌａ、ヒト肝臓癌細胞株Ｈ７４０２、ヒト卵巣癌細胞株３−ＡＯを取って細胞培養フラスコに入れ、培地を添加して３７℃、５％ＣＯ２及び飽和湿度の条件の下で培養した。対数成長期の細胞を一ボトル採取し、ピペットで吸引しかき混ぜた後、細胞懸濁液を取って、血球計算盤塗抹標本を作成し、倒立顕微鏡で細胞数を計数し、培地を加え、細胞が１×１０５個／ｍＬになるように調整した。９６ウェルプレートに細胞を播種し、薬物試験を行った。細胞培養液のみを１５０μＬ／ウェルとなるように加えたブランク対照群；細胞懸濁液を１００μＬ／ウェルとなるように播種し細胞培養液を５０μＬ／ウェルとなるように加えた陰性対照群；細胞懸濁液を１００μＬ／ウェルとなるように播種し陽性対照薬を５０μＬ／ウェルとなるように加えた陽性対照群；及び細胞懸濁液を１００μＬ／ウェルとなるように播種し測定化合物溶液を５０μＬ／ウェルとなるように加えた薬物試験群を設け、その周辺部のウェル（無菌ＰＢＳを充填する）は使わないで、陽性対照群と薬物試験群は、それぞれ５つの異なる薬物の最終濃度０．０１、０．１、１、１０、１００μｍｏｌ・Ｌ−１として、各濃度群毎に３つの並行なウェルを準備した。薬物添加の完了後に、９６ウェルプレートをＣＯ２インキュベータに入れて３７℃、５％ＣＯ２及び飽和湿度の条件で４８時間培養した。ＭＴＴ溶液（濃度５ｍｇ／ｍＬ）を２０μＬ／ウェルとなるように前記９６ウェルプレートに加え、４時間を継続的に培養し、培養板を取り出して２０００ｒｐｍで３０分間遠心操作し、各ウェル内の培養液を注意深く吸引して廃棄し、更に、ＤＭＳＯを各ウェルに１００μＬずつ添加し、板振動子で１５分間振動し、ホルマザン結晶を十分に溶解した。次いで、５７０ｎｍの波長で各ウェルのＯＤ値をＥＬＩＳＡで測定し、異なる濃度での各薬物の細胞増殖阻害率を計算した。統計解析ソフトウェアＳＰＳＳ１６．０を採用して半数阻害濃度（ＩＣ５０）を計算した。細胞増殖阻害率は、次の式に従って計算した。
【０１５９】
細胞増殖阻害率（％）＝（陰性対照ウェル平均ＯＤ値−薬物試験ウェル平均ＯＤ値）／（陰性対照ウェル平均ＯＤ値−ブランクウェル平均ＯＤ値）×１００％。
【０１６０】
本発明の一般式（Ｉ）に示す化合物６（ＢＣ−０１）、ＢＣ−０２、２２、２８、３２及び陽性対照薬ウベニメクスと５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）の卵巣明細胞癌細胞株ＥＳ−２、ヒト白血病細胞株Ｋ５６２、ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７、細胞株Ｈｅｌａ、ヒト肝臓癌細胞株Ｈ７４０２、ヒト卵巣癌細胞株３−ＡＯに対する増殖活性阻害の結果を下記の表に示す。
【０１６１】
【表３】
2016527192.tif 000057
【０１６２】
生物活性の試験結果を示すように、本発明の一般式（Ｉ）に示されるターゲット化合物ＢＣ−０１、ＢＣ−０２、２２、２８、３２は、前記の腫瘍細胞の増殖に対して阻害効果を示した。陽性対照薬ウベニメクスと５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に比べて、ＢＣ−０１は、細胞株Ｈｅｌａの増殖に対する非常に高い阻害活性を示し、また、ＢＣ−０１は、卵巣明細胞癌細胞株ＥＳ−２、ヒト白血病細胞株Ｋ５６２、ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７、ヒト肝臓癌細胞株Ｈ７４０２、ヒト卵巣癌細胞株３−ＡＯの増殖に対しても共に比較的有意な阻害活性を有し、ＢＣ−０２は、卵巣明細胞癌細胞株ＥＳ−２の増殖に対して良好な阻害活性を示した。化合物２２、２８、３２は、５−フルオロウラシルに比べて、増殖に対して更に良好な阻害活性を示した。
【０１６３】
インビトロ細胞試験の結果からわかるように、ターゲット化合物ＢＣ−０１、ＢＣ−０２、２２、２８、３２は、７種の細胞株の増殖に対して良好な阻害活性を示した。
【０１６４】
下記の動物試験に使用する材料は、次のとおりである。
動物：昆明マウス、４〜６週齢、体重２６〜３０ｇ、雄、山東大学実験動物センター提供。
肝臓癌細胞Ｈ２２：山東大学薬学院提供の実験室での細胞培養で培養するものである。
試薬：無菌ＰＢＳ溶液、ＤＭＳＯ（北京Ｓｏｌａｒｂｉｏ科学技術有限会社製、Ｌｏｔ．Ｎｏ．３０４Ａ０４５）、ＲＰＭＩ−１６４０培地（サーモフィッシャー生化学製品有限会社製、Ｌｏｔ．Ｎｏ．ＮＹＪ５９７８）、ウシ胎児血清（浙江天杭生物技術有限会社製、Ｌｏｔ．Ｎｏ．１３１２３５）。
試験化合物溶液の調製：陽性対照試薬ゼローダ及び目的化合物を量り、ＤＭＳＯで溶解した後、無菌ＰＢＳを投与濃度（ＤＭＳＯ濃度５％）まで添加し、水不溶性化合物を使用する前に超音波中で１０分間振動して均一な懸濁液にして、ゼローダを対照群とし、目的化合物を試薬供給群として、５％ＤＭＳＯを含む無菌ＰＢＳをブランク対照として用いた。
【０１６５】
［実施例３３］
ターゲット化合物の肝臓癌Ｈ２２阻害試験
１．移植腫瘍のマウスモデルの構築
Ｈ２２腹水肝癌にかかったマウスの腹水を採取し、無菌ＰＢＳで３回洗浄した後、無菌ＰＢＳで細胞を重懸濁し（細胞計数：３．７５×１０７個／ｍｌ）、昆明マウスの右脇下に１００μｌ接種した。体重が大きくなり過ぎたか又は小さくなり過ぎた昆明マウスを除き、無作為に群に分け、投薬計画に従って投与し始め、その後一日一回、５日間連続で投与して２日間休薬し、７日間を１サイクルとして計２サイクル（毎回、一匹あたりの投与量を２００μｌ／２０ｇとして、投与方法としては、経口胃管投与する）行った。各サイクルの開始と終了時に各昆明マウス群の体重を記録し、毎回、一匹あたり投与量の平均値を２００μｌ／２０ｇとして、投与方法として、１日１回に、経口胃管投与した。
【０１６６】
２．薬力学試験
２．１経口投与の肝臓癌Ｈ２２抑制試験
Ｈ２２腫瘍を接種した昆明マウスの重量を量った後、無作為に（１）陰性対照群：ＰＢＳ、（２）ゼローダ群：１００ｍｇ／ｋｇ／日、（３）ＴＦＵ群：７０ｍｇ／ｋｇ／日、（４）ＢＣ−０１群：１００ｍｇ／ｋｇ／日、の４つの群（１群１０匹）に分け、一日一回、５日間連続で投与してから２日間休薬し、７日間を１サイクルとして計２サイクル（毎回、一匹あたりの投与量を２００μｌ／２０ｇとして、投与方法としては、経口胃管投与する）行った。各サイクルの開始と終了時に腫瘍の大きさをノギスにて測定し、マウスの体重を電子秤で量って平均値を計算した。接種１３日後、マウスを屠殺して腫瘍ブロックを採取し、重量を量った。腫瘍体積と抑制率は、次の式に従って算出した。Ｌ、Ｗは腫瘍の長径および短径をそれぞれ表す。
腫瘍体積＝１／２  ＬＷ２
腫瘍重量抑制率（１００％）＝［１−（試験群平均腫瘍重量／対照群平均腫瘍重量）］×１００％
腫瘍体積抑制率（１００％）＝［１−（試験群平均腫瘍体積／対照群平均腫瘍体積）］×１００％
【０１６７】
２．２静脈注射投与の肝臓癌Ｈ２２抑制試験
Ｈ２２腫瘍を接種した昆明マウスの重量を秤量した後に、無作為に（１）陰性対照群：ＰＢＳ、（２）５−ＦＵ群：２０ｍｇ／ｋｇ／日、（３）ＢＣ−０１群：５０ｍｇ／ｋｇ／日、（４）ＢＣ−０１群：７０ｍｇ／ｋｇ／日、（５）ＢＣ−０２群：７０ｍｇ／ｋｇ／日、（６）ウベニメクスと５ＦＵとの併用群：５ＦＵ：１５ｍｇ／ｋｇ／日（静脈注射）、ウベニメクス：３０ｍｇ／ｋｇ／日（経口投与）の４つの群（１群７匹）に分け、一日一回、５日間連続で投与してから２日休薬し、７日間を１サイクルとして計２サイクル（毎回、一匹あたりの投与量を２００ｕｌ／２０ｇとして、投与方法としては、尾静脈注射にて投与する）行った。各サイクルの開始と終了時に腫瘍の大きさをノギスにて測定し、マウスの体重を電子秤にて量って平均値を算出した。接種１３日後、マウスを屠殺して腫瘍ブロックを採取して、重量を量った。腫瘍体積と抑制率は、次の式に従って算出した。（Ｌ、Ｗは腫瘍の長径および短径をそれぞれ示す。）
腫瘍体積＝１／２  ＬＷ２
腫瘍重量抑制率（１００％）＝［１−（試験群平均腫瘍重量／対照群平均腫瘍重量）］×１００％
腫瘍体積抑制率（１００％）＝［１−（試験群平均腫瘍体積／対照群平均腫瘍体積）］×１００％
【０１６８】
３．試験結果
３．１肝臓癌Ｈ２２抑制試験の経口投与群の試験結果（図３、４、５、６に示す）
【０１６９】
【表４】
2016527192.tif 000058
【０１７０】
３．２肝臓癌Ｈ２２抑制試験の静脈注射投与群の試験結果（図７、８、９、１０に示す）
【０１７１】
【表５】
2016527192.tif 000059
【０１７２】
［実施例３４］
肝臓癌細胞Ｈ２２を播種した昆明マウスモデルにおける化合物の評価試験
１．投薬量及び群分けの計画
【０１７３】
【表６】
2016527192.tif 000060
【０１７４】
２．試験の過程
肝臓癌Ｈ２２に罹患した成長良好なマウスを選び、その腹水を採取し、希釈のために無菌ＰＢＳ溶液を添加し、濃度を８．５×１０７個／ｍｌとして、更に、１ｍｌの注射器を用いて１００μｌの細胞溶液を採取し、マウスの右脇下に接種した。３日後に体重を量り、無作為に各群に分け、１群をマウス８匹程度として、所定の投薬量により、それぞれマウスに尾静脈注射投与及び経口胃管投与した。５日間連続で投与してから２日休薬し、７日間を１サイクルとして計２サイクル行った。各サイクルの開始と終了時に昆明マウス群の体重を量り、記録した。
【０１７５】
２サイクル終了後、それぞれ重さを量り記録し、マウスを頸椎脱臼して屠殺し、解剖して肺臓、肝臓及び脾臓を取り出し、それぞれ重さを量り記録した。
【０１７６】
Ｏｒｉｇｉｎ７．５ソフトウェアの一元配置分散分析法（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）によって全体の差を算出し、それぞれｔ検定にて各薬物投与群と各ブランク群とを一対比較し、且つ次の式に従って各群の薬物の抑制率を算出した。
抑制率（％）＝（対照群平均腫瘍重量−薬物投与群平均腫瘍重量）／対照群平均腫瘍重量×１００％
【０１７７】
３．試験結果（図１１、１２、１３、１４に示す）
【０１７８】
【表７】
2016527192.tif 000061
【０１７９】
図１１〜１４から分かるように、化合物ＢＣ−０１、ＢＣ−０２は、全て腫瘍の成長を抑制する有意な効果を示し、且つ０．１５ｍｍｏｌ／ｋｇ／日のＢＣ−０２を静脈内投与したときから試験終了までに、腫瘍は確認されなかった。
【０１８０】
試験終了後、マウスを解剖し、肉眼で観察した結果、臓器の顕著な変化は見つからず、これは、この化合物はこの投与量で顕著な毒性がないことを示す。
【図１】
2016527192.tif 000095
【図２】
2016527192.tif 000096
【図３】
2016527192.tif 000097
【図４】
2016527192.tif 000098
【図５】
2016527192.tif 000099
【図６】
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【図７】
2016527192.tif 000101
【図８】
2016527192.tif 000102
【図９】
2016527192.tif 000103
【図１０】
2016527192.tif 000104
【図１１】
2016527192.tif 000105
【図１２】
2016527192.tif 000106
【図１３】
2016527192.tif 000107
【図１４】
2016527192.tif 000108
【手続補正書】
【提出日】平成28年3月17日(2016.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
レナリドミド（Ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ／レブラミド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ））は、化学名３−（７−アミノ−３−オキソ−１Ｈ−イソインドール−２−イル）ピペリジン−２，６−ジオンであり、アメリカのセルジーン社により開発されたサリドマイドの誘導体であり、臨床において、骨髄異形成症候群の治療、及びデキサメタゾンとの併用療法による多発性骨髄腫の治療に用いられる。レナリドミドは多くの細胞内の生物学的経路に影響を与える。現在、その第Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ期の臨床研究は全て終了した。第Ｉ、ＩＩ期の臨床研究において、これが多発性骨髄腫、前立腺癌、甲状腺癌、腎臓癌、黒色腫、肝臓癌及び慢性リンパ性白血病等を含む様々な腫瘍に対して抗腫瘍効果があることが示された（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１２  Ｊｕｎ；６９（６）：１３９３−４０６）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
［実施例５］
（Ｓ）−（５−フルオロ−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ））メチル−２−（（２Ｓ，３Ｒ）−３−（アミノ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル）−４−メチルペンタノエート塩酸塩（６（ＢＣ−０１）の調製
白色固体５（０．３３ｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を、飽和塩酸を含む酢酸エチル溶液に溶解し、室温で２時間反応させた。濾過して白色固体６（ＢＣ−０１）（０．２３ｇ、８５％）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：４５１．６（Ｍ＋Ｈ）＋、１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ０．８４−０．８７（ｍ、６Ｈ）、１．５０−１．５３（ｍ、１Ｈ）、１．６０−１．６８（ｍ、２Ｈ）、２．８９−２．９５（ｍ、２Ｈ）、３．９９−４．０３（ｍ、２Ｈ）、４．２２−５．２５（ｍ、１Ｈ）、５．５６−５．６１（ｍ、２Ｈ）、６．８０（ｓ、１Ｈ）、７．２６−７．３５（ｍ、５Ｈ）、８．０４（ｓ、３Ｈ）、８．１３（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ、１Ｈ）、８．４７（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、１２．０１（ｓ、１Ｈ）。ｍｐ：１２８−１３０℃。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
［実施例１０］
（Ｓ）−（５−フルオロ−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ））メチル−２−（（２Ｓ，３Ｒ）−３−（アミノ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル）−４−メチルペンタノエート塩酸塩（６（ＢＣ−０１））の調製
無色油状物１０（８．８ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）を、飽和塩酸を含む酢酸エチル溶液に溶解し、室温で２時間反応させた。これを濾過して白色固体６（ＢＣ−０１）（５．９４ｇ、８８％）を得た。ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：４５１．５（Ｍ＋Ｈ）＋、１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ０．８５−０．８９（ｍ、６Ｈ）、１．５１−１．５６（ｍ、１Ｈ）、１．５９−１．６６（ｍ、２Ｈ）、２．８７−２．９４（ｍ、２Ｈ）、４．０１−４．０５（ｍ、２Ｈ）、４．２４−５．２８（ｍ、１Ｈ）、５．６０−５．６３（ｍ、２Ｈ）、６．７５（ｓ、１Ｈ）、７．２３−７．３２（ｍ、５Ｈ）、８．０９（ｓ、３Ｈ）、８．１６（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ、１Ｈ）、８．４８（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、１２．０５（ｓ、１Ｈ）。ｍｐ：１２８−１２９℃。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
［実施例１５］
（５−フルオロ−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ））メチル−２−（（Ｓ）−２−（（２Ｓ，３Ｒ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタノイル）−４−メチルペンタンアミド）酢酸エステル塩酸塩（１６（ＢＣ−０２））の調製
白色固体１５（０．８６ｇ、１．２４ｍｍｏｌ）を、飽和塩酸を含む酢酸エチル溶液に溶解し、室温で２時間反応させた。これを濾過して白色固体１６（ＢＣ−０２）（０．５７ｇ、８５％）を得た。ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：５０８．４（Ｍ＋Ｈ）＋、１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ０．８６−０．８９（ｍ、６Ｈ）、１．４９−１．５３（ｍ、２Ｈ）、１．６２−１．６６（ｍ、１Ｈ）、２．８７−２．９７（ｍ、２Ｈ）、３．５５−３．５７（ｍ、１Ｈ）、３．８０−３．９２（ｍ、２Ｈ）、４．００−４．０６（ｍ、１Ｈ）、４．３１−４．３２（ｍ、１Ｈ）、５．５７−５．８０（ｍ、２Ｈ）、６．７３（ｓ、１Ｈ）、７．２５−７．３７（ｍ、５Ｈ）、８．０２−８．０８（ｍ、４Ｈ）、８．１４（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ、１Ｈ）、８．５９−８．６２（ｍ、１Ｈ）、１２．０１（ｓ、１Ｈ）。ｍｐ：１３６−１３７℃。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
［実施例１６］
ＢＣ−０２と同じ合成工程にて以下の化合物を得た。
（Ｓ）−（５−フルオロ−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ））メチル−２−（（Ｓ）−２−（（２Ｓ，３Ｒ）−３−（アミノ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチルアミド）−４−メチルペンタンアミド）プロピオン酸塩酸塩（ＢＣ−０３）。
ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：５２１．５（Ｍ＋Ｈ）＋、１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ０．８５−０．９１（ｍ、６Ｈ）、１．２５−１．２８（ｍ、３Ｈ）、１．４３−１．５１（ｍ、２Ｈ）、１．６０−１．６４（ｍ、１Ｈ）、２．８７−２．９４（ｍ、２Ｈ）、３．５３−３．５７（ｍ、１Ｈ）、３．９９−４．０４（ｍ、１Ｈ）、４．２４−４．３１（ｍ、２Ｈ）、５．５４−５．６４（ｍ、２Ｈ）、７．２７−７．３４（ｍ、５Ｈ）、７．９８−８．００（ｍ、４Ｈ）、８．１２（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ、１Ｈ）、８．６１（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、１Ｈ）、１１．９９（ｓ、１Ｈ）。ｍｐ：１１１−１１２℃。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
［実施例２１］
（２Ｓ，３Ｒ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−Ｎ−（（Ｓ）−４−メチルペンタノイル）オキシ）尿素）−４−フェニルブタンアミド塩酸塩（２２）の調製
白色固体２１（０．７１ｇ、１．５２ｍｍｏｌ）を、飽和塩酸を含む酢酸エチル溶液に溶解し、室温で２時間反応させた。得られた白色固体２２（０．４８ｇ、７８％）をろ過した。ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：３６７．３（Ｍ＋Ｈ）＋、１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ０．８０−０．９２（ｍ、６Ｈ）、１．５６−１．７５（ｍ、３Ｈ）、２．９０−３．０５（ｍ、２Ｈ）、４．０１−４．０６（ｍ、２Ｈ）、４．５３（ｍ、１Ｈ）、６．４８−６．５５（ｍ、２Ｈ）、６．８８（ｓ、１Ｈ）、７．２６−７．３８（ｍ、５Ｈ）、８．０２−８．０９（ｍ、３Ｈ）、８．６３（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、９．７７（ｍ、１Ｈ）。ｍｐ：１１０−１１２℃。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４１】
［実施例２６］
（Ｓ）−２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−ヒドロキシ−６−メチル−２（２Ｈ）−テトラヒドロピラニルオキシ）−２，５，１２−トリヒドロキシ−７−メトキシ−６，１１−ジオキソ−２−（１，２，３，４，６，１１−４フェニルヘキサヒドロ））−２−エトキシ−２−（（２Ｓ，３Ｒ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル）−４−メチルペンタノエート塩酸塩（２８）の調製
白色固体２７（０．４７ｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を、飽和塩酸を含む酢酸エチル溶液に溶解し、室温で２時間反応させた。得られた白色固体２８（０．３６ｇ、８７％）をろ過したＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：８３３．７（Ｍ＋Ｈ）＋，１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ０．８１−０．９４（ｍ，６Ｈ），１．２３（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ）、１．５８−１．８３（ｍ、３Ｈ）、１．７５（ｍ、１Ｈ）、２．０７（ｍ、１Ｈ）、２．２０−２．２４（ｍ、２Ｈ）、２．９３−３．１８（ｍ、４Ｈ）、３．４４−３．４９（ｍ、２Ｈ）、３．８８（ｓ、３Ｈ）、３．９８（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．０６−４．０９（ｍ、２Ｈ）、４．５５（ｍ、１Ｈ）、４．５８−４．６９（ｍ、２Ｈ）、４．９１−４．９８（ｍ、２Ｈ）、５．０５−５．０９（ｍ、１Ｈ）、５．２８−５．３５（ｍ、１Ｈ）、５．４７（ｓ、１Ｈ）、５．７６（ｓ、１Ｈ）、６．９３（ｓ、１Ｈ）、７．２６−７．３８（ｍ、５Ｈ）、７．６９（ｍ、１Ｈ）、７．９１−７．９８（ｍ、２Ｈ）、８．１１−８．１９（ｍ、３Ｈ）、８．６３（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）。ｍｐ：１３６−１３８℃。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４５】
［実施例３０］
（Ｓ）−２−（４−（６−（５−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−チアゾリルカルボニルアミノ）−２−メチル−４−ピリミジニル）−１−ピペラジニル）エチル−２−（（２Ｓ，３Ｒ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル）−４−メチルペンタノエート塩酸塩（３２）の調製
白色固体３１（０．２２ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を、飽和塩酸を含む酢酸エチル溶液に溶解し、室温で２時間反応させた。得られた白色固体３２（０．１８ｇ、８４％）をろ過した。ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：７７７．５（Ｍ＋Ｈ）＋、１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ０．８３−０．９５（ｍ、６Ｈ）、１．５９−１．８５（ｍ、３Ｈ）、２．１３（ｓ、３Ｈ）、２．２６（ｓ、３Ｈ）、２．５４−２．５８（ｍ、６Ｈ）、２．９０−３．０５（ｍ、２Ｈ）、３．６０−３．７０（ｍ、６Ｈ）、４．０１−４．０６（ｍ、２Ｈ）、４．５３（ｍ、１Ｈ）、６．０９（ｓ、１Ｈ）、６．８８（ｓ、１Ｈ）、７．２６−７．３８（ｍ、７Ｈ）、７．４８（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．０２−８．０９（ｍ、３Ｈ）、８．２２（ｓ、１Ｈ）、８．６３（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、９．５７（ｍ、２Ｈ）、９．７７（ｍ、２Ｈ）。ｍｐ：１７４−１７６℃。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７３】
【表６】
2016527192.tif 000109
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７８】
【表７】
2016527192.tif 000110
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１１】
2016527192.tif 000111
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１２】
2016527192.tif 000112
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１３】
2016527192.tif 000113
【手続補正１４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１４】
2016527192.tif 000114
【国際調査報告】
2016527192.tif 000115
2016527192.tif 000116
2016527192.tif 000117
2016527192.tif 000118
2016527192.tif 000119
2016527192.tif 000120