(57)【要約】  本発明は、腫瘍を治療および／もしくは予防し、並びに／または新生細胞のアポトーシスを促進するための方法であって、ＡＴＦ５の機能および／または活性を阻害することができる細胞透過性ドミナントネガティブＡＴＦ５（「ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５」）と新生細胞を接触させることを含む方法に関する。
2016516669.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍を治療および／もしくは予防し、並びに／または新生細胞のアポトーシスを促進するための方法であって、ＡＴＦ５の機能および／または活性を阻害することができる細胞透過性ドミナントネガティブＡＴＦ５と前記新生細胞を接触させることを含む方法。
【請求項２】
前記新生細胞が、乳房、卵巣、子宮内膜、胃、結腸、肝臓、膵臓、腎臓、膀胱、前立腺、精巣、皮膚、食道、舌、口、耳下腺、喉頭、咽頭、リンパ節、肺、末梢神経系、および脳からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
新生物脳細胞が、神経膠芽腫、星状細胞腫、神経膠腫、髄芽腫  中皮腫、および神経芽細胞腫からなる群から選択され、かつ前記新生物脳細胞が原発性または再発性の脳腫瘍に関連している、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞透過性ドミナントネガティブＡＴＦ５が、経口的、非経口的、および／または経皮的に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細胞透過性ドミナントネガティブＡＴＦ５を含む組成物であって、前記細胞透過性ドミナントネガティブＡＴＦ５が、ＬＥＱＥＮＡＥＬＥＧＥＣＱＧＬＥＡＲＮＲＥＬＫＥＲＡＥＳ、ＬＥＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥＬＥＧＥＣＱＧＬＥＡＲＮＲＥ  ＬＫＥＲＡＥＳ、ＬＡＲＥＮＥＥＬＬＥＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥＬＥＧＥＣＱＧＬＥＡＲＮＲＥＬＫＥＲＡＥＳ、ＬＥＱＲＡＥＥ  ＬＡＲＥＮＥＥＬＬＥＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥＬＥＧＥＣＱＧＬＥＡＲＮＲＥＬＫＥＲＡＥＳ、ＬＥＱＲＡＥＥＬＡＲＥＮＥＥＬＬＥＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥＬＥＧＥＣＱＧＬＥＡＲＮＲＥＬＫＥＲＡＥＳＶからなる群から選択される配列からなり、前記「ＬＥＱＥＮＡＥ」、「ＬＥＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥ」、「ＬＡＲＥＮＥＥＬＬＥＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥ」、「ＬＥＱＲＡＥＥ  ＬＡＲＥＮＥＥＬＬＥＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥ」、「ＬＥＱＲＡＥＥＬＡＲＥＮＥＥＬＬＥＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥ」がドミナントネガティブ配列であり、前記配列の残りの部分がＡＴＦ５ロイシンジッパーであり、かつ前記配列が、細胞透過性配列に作動可能に連結されている、組成物。
【請求項６】
細胞透過性ドミナントネガティブＡＴＦ５を含む組成物であって、前記細胞透過性ドミナントネガティブＡＴＦ５が、ＬＥＱＥＮＡＥＬＥＧＥＣＱＧＬＥＡＲＮＲＥＬＲＥＲＡＥＳ、ＬＥＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥＬＥＧＥＣＱＧＬＥＡＲＮＲＥ  ＬＲＥＲＡＥＳ、ＬＡＲＥＮＥＥＬＬＥＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥＬＥＧＥＣＱＧＬＥＡＲＮＲＥＬＲＥＲＡＥＳ、ＬＥＱＲＡＥＥＬ  ＡＲＥＮＥＥＬＬＥＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥＬＥＧＥＣＱＧＬＥＡＲＮＲＥＬＲＥＲＡＥＳ、ＬＥＱＲＡＥＥＬＡＲＥＮＥＥＬＬＥ  ＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥＬＥＧＥＣＱＧＬＥＡＲＮＲＥＬＲＥＲＡＥＳＶからなる群から選択される配列からなり、前記「ＬＥＱＥＮＡＥ」、「ＬＥＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥ」、「ＬＡＲＥＮＥＥＬＬＥＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥ」、「ＬＥＱＲＡＥＥＬ  ＡＲＥＮＥＥＬＬＥＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥ」、「ＬＥＱＲＡＥＥＬＡＲＥＮＥＥＬＬＥ  ＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥ」がドミナントネガティブ配列であり、前記配列の残りの部分がＡＴＦ５ロイシンジッパーであり、かつ前記配列が、細胞透過性配列に作動可能に連結されている、組成物。
【請求項７】
前記細胞透過性ドミナントネガティブＡＴＦ５が
（１）ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＳ  ＭＴＧＧＱＱＭＧＲＤＰＤＬＥＱＲＡＥＥＬＡＲＥＮＥＥＬＬＥＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥＬＥＧＥＣＱＧＬＥＡＲＮＲＥＬＲＥＲＡＥＳ  Ｖ（ここで、「ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭ」は６ＸＨｉｓタグリーダー配列であり、「ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ」はペネトラチン配列であり、「ＤＹＫＤＤＤＤＫ」はＦＬＡＧタグであり、「ＭＡＳ  ＭＴＧＧＱＱＭＧＲＤＰＤ」はスペーサーアミノ酸であり、「ＬＥＱＲＡＥＥＬＡＲＥＮＥＥＬＬＥＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥ」はｄ／ｎ配列であり、かつ「ＬＥＧＥＣＱＧＬＥＡＲＮＲＥＬＲＥＲＡＥＳ  Ｖ」はその最初のバリンの後で短縮されたＡＴＦ５ロイシンジッパーである）；
（２）ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭＬＥＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＹＰＹＤＶＰＤＹＡＭＡＳＭＴＧＧ  ＱＱＭＧＲＤＰＤＬＥＱＲＡＥＥＬＡＲＥＮＥＥＬＬＥＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥＬＥＧＥＣＱＧＬＥＡＲＮＲＥＬＲＥＲＡＥＳＶ（ここで、「ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭＬＥ」は６ＸＨｉｓタグリーダー配列であり、「ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ」はＴＡＴ配列であり、「ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ」はＨＡタグであり、「ＭＡＳＭＴＧＧ  ＱＱＭＧＲＤＰＤ」はスペーサーアミノ酸であり、「ＬＥＱＲＡＥＥＬＡＲＥＮＥＥＬＬＥＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥ」はｄ／ｎ配列であり、かつ「ＬＥＧＥＣＱＧＬＥＡＲＮＲＥＬＲＥＲＡＥＳＶ」はその最初のバリンの後で短縮されたＡＴＦ５ロイシンジッパーである）；
（３）ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＬＥＱＲＡＥＥＬＡＲＥＮＥ  ＥＬＬＥＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥＬＥＧＥＣＱＧＬＥＡＲＮＲＥＬＫＥＲＡＥＳＶ（ここで、「ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭ」は６ＸＨｉｓタグリーダー配列であり、「ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ」はペネトラチン配列であり、「ＬＥＱＲＡＥＥＬＡＲＥＮＥ  ＥＬＬＥＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥ」はｄ／ｎ配列であり、かつ「ＬＥＧＥＣＱＧＬＥＡＲＮＲＥＬＫＥＲＡＥＳＶ」はその最初のバリンの後で短縮されたＡＴＦ５ロイシンジッパーである）；および
（４）ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＬＥＱＲＡＥＥＬＡＲＥＮＥＥＬＬＥＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥＬＥＧＥＣＱ  ＧＬＥＡＲＮＲＥＬＫＥＲＡＥＳＶ（ここで、「ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ」はペネトラチン配列であり、「ＬＥＱＲＡＥＥＬＡＲＥＮＥＥＬＬＥＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥ」はｄ／ｎ配列であり、かつ「ＬＥＧＥＣＱ  ＧＬＥＡＲＮＲＥＬＫＥＲＡＥＳＶ」はその最初のバリンの後で短縮されたＡＴＦ５ロイシンジッパーである）
からなる群から選択される配列を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか一項に記載の細胞透過性ドミナントネガティブＡＴＦ５を含む組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２０１３年２月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／７６８，３９０号明細書の利益を主張するものであり、この米国仮出願は、その内容全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
特許に係る政府の権利に関する記載
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）からの助成金第ＲＣＡ１２６９２４Ａ号の下で、政府の支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
１．背景技術
毎年、約１００万人が癌と診断されており、あらゆる年齢の何百万もの米国人が現在、何らかの形の癌に罹患しながら生活している。一生の間に、米国人男性の２人に１人、また米国人女性の３人に１人が何らかの形の癌と診断される。毎年癌と診断される１００万の米国人のうち、１７，０００人は脳腫瘍と診断される。脳腫瘍は正常組織に浸潤し、それを破壊して、感覚運動および認知機能の損傷、頭蓋内圧亢進、脳水腫、ならびに脳組織、脳神経、および大脳脈管の圧迫などの影響をもたらす。傾眠、嗜眠、鈍重、人格変化、異常行動、および心的能力の障害が、悪性脳腫瘍を有する患者の２５％における初期症状である。脳腫瘍の治療は多くの場合多様的であり、腫瘍の病態および部位に依存する。悪性神経膠腫の場合、化学療法、放射線療法、および外科手術を含む集学的治療が、腫瘍容積の縮小を目的として用いられる。しかしながら、このようなアプローチにもかかわらず、これらの腫瘍に罹患した患者の予後は注意深く見守られる。化学療法、放射線療法、および外科手術の後の生存期間の中央値は、わずか約１年であり、２年間生存率はこれらの患者の２５％のみである。
【０００４】
癌、特に既存の治療に抵抗性の脳腫瘍が蔓延することにより、ＡＴＦ５を含む、神経細胞の細胞周期制御に影響を与える転写因子の同定が可能になった（非特許文献１）。ＡＴＦ５は、塩基性ロイシンジッパー転写因子のうちの活性化転写因子／ＣＲＥＢファミリーに属している（非特許文献１；非特許文献２）。ＡＴＦ５は、神経細胞および膠細胞系列の神経幹細胞および前駆細胞よって高度に発現され、これらが分化するとその発現は急減する（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。神経前駆細胞の構成的ＡＴＦ５発現により、神経前駆細胞が細胞周期に留まり、その分化が遮断されるので（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）、ＧＢＭが神経幹細胞および前駆細胞に由来すると考えられる以上、ＧＢＭのＡＴＦ５発現がアッセイされた（非特許文献６）。２９個の切除したＧＢＭの検査により、検査した９種のげっ歯類およびヒトのＧＢＭ系列すべてによる高度なＡＴＦ５発現が明らかになった（非特許文献７）。これらの所見は確証されており、追加のデータにより、ＡＴＦ５レベルとＧＢＭ予後との間に相関があることが示された（非特許文献８；非特許文献９）。
【０００５】
ＧＢＭにおけるＡＴＦ５の役割を調べる目的で、ＡＴＦ５機能を干渉するためにこのタンパク質のドミナントネガティブな阻害物質が作製され（非特許文献１、非特許文献７）、またその発現を停止させるためにｓｉ／ｓｈＲＮＡが開発された。ヒトおよびラットのＧＢＭ系列に関する培養実験では、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５およびＡＴＦ５  ｓｉ／ｓｈＲＮＡが両方とも、大量のアポトーシス死をもたらすことがわかった（非特許文献７）。これに対して、ＡＴＦ５＋増殖性神経前駆細胞および星状細胞は、このアポトーシス反応を示さなかった。初期のインビボ試験において、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、レトロウイルスにより送達された場合、移植されたＣ６ラットＧＢＭ細胞から生成した腫瘍細胞を選択的かつ極めて高効率に死滅させるが、正常の増殖性脳細胞は死滅させないことが見出された（非特許文献７）。その後の試験では、ＰＤＧＦ−Ｂおよびｐ５３  ｓｈＲＮＡを発現するレトロウイルスよる感染により神経膠腫（低悪性度の神経膠腫からＧＢＭまでの範囲の悪性度）が効率的に生成する成体マウスモデルが用いられた（非特許文献１０）。ヒトＧＦＡＰプロモーターからｄ／ｎ−ＡＴＦ５を条件的に発現するように操作されたマウスを用いて（神経幹／前駆細胞、星状細胞、およびＧＢＭで発現される）、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５を誘導すると、腫瘍の完全退縮／根絶および２４匹の処置マウスすべての生存がもたらされた。同様に、ＰＤＧＦ−Ｂ／ｓｈＲＮＡ−ｐ５３レトロウイルスの注射前におけるｄ／ｎ−ＡＴＦ５の発現により、マウスの８５．７％で腫瘍発生が防止された。これに対して、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５が誘導されなかったマウスについては、１５／１６が腫瘍を有し、４０％が試験期間内に死亡した。正常細胞に対しては明白な影響はなかった（非特許文献１０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ａｃｈａｒａｙら、Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  １５５：１３０〜１３９（２００６）
【非特許文献２】Ｇｒｅｅｎｅら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  １０８：１１〜２２（２００９）
【非特許文献３】Ａｎｇｅｌａｓｔｒｏら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２３：４５９０〜４６００（２００３）
【非特許文献４】Ａｎｇｅｌａｓｔｒｏら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２５：３８８９〜３８９９（２００５）
【非特許文献５】Ｍａｓｏｎら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２９：３７２〜３８０（２００５））
【非特許文献６】Ｔａｎａｋａら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １０：１４〜２６（２０１２）
【非特許文献７】Ａｎｇｅｌａｓｔｒｏら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５：９０７〜９１６（２００６）
【非特許文献８】Ｄｏｎｇら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ６４：９４８〜９５５（２００５）
【非特許文献９】Ｓｈｅｎｇら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １６：６７１〜６７７（２０１０）
【非特許文献１０】Ａｒｉａｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３１：７３９〜７５１（２０１２）
【発明の概要】
【０００７】
２．発明の概要
ある実施形態では、本発明は、腫瘍を治療および／もしくは予防し、並びに／または新生細胞のアポトーシスを促進するための方法であって、ＡＴＦ５の機能および／または活性を阻害することができる細胞透過性ドミナントネガティブＡＴＦ５（「ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５」）と新生細胞を接触させることを含む方法に関する。
【０００８】
ある実施形態では、新生細胞は、乳房、卵巣、子宮内膜、胃、結腸、肝臓、膵臓、腎臓、膀胱、前立腺、精巣、皮膚（例えば、メラノサイト／メラノーマ細胞）、食道、舌、口、耳下腺、喉頭、咽頭、リンパ節、肺、血液（例えば、血液癌）、末梢神経系、および脳からなる群から選択される。ある実施形態では、新生細胞は、神経膠芽腫、星状細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫、中皮腫、および神経芽細胞腫からなる群から選択される。ある実施形態では、新生細胞は、原発性または再発性の脳腫瘍に関連する。
【０００９】
ある実施形態では、ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、経口的、非経口的（例えば、皮下）、鼻腔内、および／または経皮的に投与される。
【００１０】
ある実施形態では、ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、ヒト、ラット、またはマウスのＡＴＦ５ペプチド配列の一部またはそれらの組合せを含む。ある実施形態では、細胞透過性ドミナントネガティブＡＴＦ５は、ロイシンジッパーを形成するペプチドおよび細胞透過性配列に連結された、下記の群
2016516669.tif 000003
または
2016516669.tif 000004
から選択される配列を含む。ある実施形態では、ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、下記の群
2016516669.tif 000005
から選択される配列を含み、ここで、下線付きの配列はドミナントネガティブ配列であり、配列の残りの部分はＡＴＦ５ロイシンジッパーであり、かつこの配列は、細胞透過性配列に（インフレームで）作動可能に連結される。ある実施形態では、細胞透過性ドミナントネガティブＡＴＦ５は、下記の群
2016516669.tif 000006
から選択される配列を含み、ここで、下線付きの配列はドミナントネガティブ配列であり、配列の残りの部分はＡＴＦ５ロイシンジッパーであり、かつこの配列は、細胞透過性配列に作動可能に並列される。
【００１１】
ある実施形態では、細胞透過性ドミナントネガティブＡＴＦ５は、下記の（１）〜（４）群
2016516669.tif 000007
（ここで、下線付きの残基（ＭＧ〜ＨＭ）は６ＸＨｉｓタグリーダー配列であり、太字の残基（ＲＱ〜ＫＫ）はペネトラチン配列であり、イタリック体の残基（ＤＹ〜ＤＫ）はＦＬＡＧタグであり、フォント修飾のない残基（ＭＡ〜ＰＤ）はスペーサーアミノ酸であり、太字でイタリック体の残基（ＬＥ〜ＡＥ）はｄ／ｎ配列であり、かつ太字で下線付きの残基（ＬＥ〜ＳＶ）はその最初のバリンの後で短縮されたＡＴＦ５ロイシンジッパーである）；
2016516669.tif 000008
（ここで、下線付きの残基（ＭＧ〜ＬＥ）は６ＸＨｉｓタグリーダー配列であり、太字の残基（ＹＧ〜ＲＲ）はＴＡＴ配列であり、イタリック体の残基（ＹＰ〜ＹＡ）はＨＡタグであり、フォント修飾のない残基（ＭＡ〜ＰＤ）はスペーサーアミノ酸であり、太字でイタリック体の残基（ＬＥ〜ＡＥ）はｄ／ｎ配列であり、かつ太字で下線付きの残基（ＬＥ〜ＳＶ）はその最初のバリンの後で短縮されたＡＴＦ５ロイシンジッパーである）；
2016516669.tif 000009
（ここで、下線付きの残基（ＭＧ〜ＨＭ）は６ＸＨｉｓタグリーダー配列であり、太字の残基（ＲＱ〜ＫＫ）はペネトラチン配列であり、イタリック体の残基（ＬＥ〜ＡＥ）はｄ／ｎ配列であり、かつ太字で下線付きの残基（ＬＥ〜ＳＶ）はその最初のバリンの後で短縮されたＡＴＦ５ロイシンジッパーである）；および
2016516669.tif 000010
（ここで、太字の残基（ＲＱ〜ＫＫ）はペネトラチン配列であり、イタリック体の残基（ＬＥ〜ＡＥ）はｄ／ｎ配列であり、かつ太字で下線付きの残基（ＬＥ〜ＳＶ）はその最初のバリンの後で短縮されたＡＴＦ５ロイシンジッパーである）
から選択される配列を含む。ある実施形態では、細胞透過性ドミナントネガティブＡＴＦ５は化学合成される。
【００１２】
ある実施形態では、本発明はまた、腫瘍の治療および／もしくは予防に、並びに／または新生細胞のアポトーシスの促進に使用するためのキットに関する。本発明のさらなる態様は、以下の説明に照らして明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
３．図面の簡単な説明
【図１】ＧＦＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５  Ｃ末端短縮融合タンパク質（ＧＦＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−Ｔｒ）が、Ｃ６神経膠腫細胞において、完全長ＧＦＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５タンパク質と同レベルのアポトーシスを促進することを示す図である。Ｃ６細胞に、ｐＱＣ−Ｘ−Ｉ−ｅＧＦＰおよびｐＱＣ−ｄ／ｎ−ＧＦＰＡＴＦ５、またはｐＱＣ−ＧＦＰＡＴＦ５−ｔｒをトランスフェクトした。ＧＦＰ＋トランスフェクト細胞の凝縮アポトーシス核のパーセント（平均±標準誤差、ｎ＝４；条件当たり合計約２００個の細胞をスコア化した）を２日後に決定した。スチューデントｔ検定；ＧＦＰ＋細胞対ＧＦＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５＋細胞またはＧＦＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ｔｒ細胞、（＊ｐ＜０．０５）；ＧＦＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５＋細胞対ＧＦＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ｔｒ細胞（有意でない）。
【図２】細菌で発現させ精製した６ｘヒスチジン−Ｆｌａｇ−タグ付きペネトラチン−Ｆｒａｇ−Ｄ／Ｎ−ＡＴＦ５−ｔｒ（Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰ）および６ｘヒスチジン−Ｆｒａｇ−タグ付きペネトラチン−Ｆｒａｇ−対照（Ｐｅｎ−対照−ＲＰ）ペプチドの純度および分子特性を示す図である。（Ａ）精製したＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰおよびＰｅｎ−対照−ＲＰ（１レーン当たり５μｇ）のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。分子量マーカーを左側に示し、各ペプチドの直鎖模式図を各レーンの上部に示す。精製は方法に記載のとおりであった。（Ｂ）精製したＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰのＬＣ−高分解能質量分析からのデコンボリューションした質量スペクトル。最も多い化学種は、ホルミルメチオニンのない１２，９４８．８８Ｄａの単量体であり、次にホルミルメチオニンのある１３，１２７Ｄａの単量体（アイソフォーム）である。このスペクトルはまた、少量の２５，８９７．５Ｄａの二量体を示す。（Ｃ）ヒト血清におけるＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰの安定性。Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰ（３６μＭ）をヒト血清（ＰＢＳ中２５％ｖ／ｖ）と共に、３７℃で０〜４８時間インキュベートした。種々の時点でアリコートを取り出し、Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗Ｆｌａｇ抗体で探索した。抗Ｆｌａｇシグナルを、ＬｉＣｏｒソフトを用いて近赤外線により検出し、Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰの予想サイズのバンドを濃度測定し、ＩｍａｇｅＪを用いて定量した。値は、平均±標準誤差、ｎ＝３である。
【図３】培養した神経膠芽腫細胞によるＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰの取り込みおよび保持を示す図である。（Ａ）２００ｎＭのＰｅｎ−対照−ＲＰ（左）またはＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰ（右）のいずれかと共に４時間インキュベートしたＣ６ラット神経膠芽腫細胞の共焦点画像。細胞を洗浄し固定して、抗Ｆｌａｇ（赤色）およびＤＡＰＩ（青色）で染色した。スケールバー＝２μｍ。（Ｂ）ラットＣ６およびヒトＵ８７神経膠芽腫細胞を３μＭのＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰと共に表示時間インキュベートし、洗浄し固定して、抗Ｆｌａｇ（緑色）およびＤＡＰＩ（青色）で免疫染色した。スケールバー＝５μｍ。
【図４】Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰが、Ｃ６神経膠芽腫細胞のアポトーシスを促進することを示す図である。Ｃ６細胞を３μＭのＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰまたは３μＭのＰｅｎ−対照−ＲＰで処理したか、または無処理とした。細胞における凝縮アポトーシス核のパーセント（２つの独立した実験における平均±標準誤差；ｎ＝４；約２００個の細胞をスコア化した）を５日後に決定した。スチューデントｔ検定；Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰ対Ｐｅｎ−対照−ＲＰ細胞または無処理、（＊ｐ＜０．０５）；Ｐｅｎ−対照−ＲＰ細胞対無処理細胞（ｐ＝０．２９）。
【図５】Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰが、マウス脳に侵入し、神経膠腫細胞の標的化アポトーシスを引き起こすことを示す図である。（Ａ〜Ｆ）Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰの存在を示すためのＦｌａｇ抗体または腫瘍を誘発するレトロウイルスの存在を同定するためのＨＡ（赤色）；アポトーシスを同定するためのＴＵＮＥＬ（緑色）および核を同定するＤＡＰＩ（青色）で染色した代表的な脳切片。（Ａ）Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰによる処置後２４時間（最後の注射後１６時間）のマウス脳腫瘍（レトロウイルス注射後５２日目）。（Ｂ）（Ａ）と同じマウスの正常な対側の大脳半球。（Ｃ）生理食塩水の注射後２４時間のマウス脳腫瘍（レトロウイルス注射後５９日目）。細胞内のＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５の存在は、処置マウス（Ａ、Ｂ）対生理食塩水対照（Ｃ）における、Ｆｌａｇ抗体染色の増大によって確認される。（Ｂ）および（Ｃ）に比較した場合、（Ａ）におけるＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰによる神経膠腫細胞特異的なアポトーシス誘導がＴＵＮＥＬ染色（緑色）により示される。（Ｄ）レトロウイルス注射後１６０日目およびＰｅｎ−対照−ＲＰ注射後３日目の腫瘍含有脳切片のＴＵＮＥＬおよびＤＡＰＩ染色。腫瘍細胞を同定するＨＡ＋細胞およびＴＵＮＥＬ染色の欠如に注目されたい。（Ｅ）（レトロウイルス注射後１４３日目）およびＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰ処置後３日目の腫瘍含有切片の（Ｄ）と同じ染色。ＨＡ＋腫瘍細胞におけるＴＵＮＥＬ染色の存在ならびに（Ａ）および（Ｄ）に比較して染色の断片化した外観に注目されたい。（Ｆ）レトロウイルス注射後１５０日目およびＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ｔｒ−ＲＰの皮下注射による２回処置後２日目の腫瘍含有切片の（Ｄ）と同じ染色。断片化したＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡおよびＴＵＮＥＬ染色に関して、（Ｅ）との染色パターンの定性的な類似性に注目されたい。スケールバーは２０μｍに等しい。
【図６】投与後の種々の時点でのマウス脳におけるＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰの保持を示す図である。マウスに、本文に記載するように、生理食塩水（Ａ）またはＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰ（Ｂ、Ｃ）のいずれかを４回腹腔内注射した。最後の注射後４０時間（Ａ、Ｂ）または６４時間（Ｃ）のいずれかで動物を屠殺し、その固定した脳の切片を抗Ｆｌａｇ（赤色；Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰの視覚化）またはＤＡＰＩ（青色；核の視覚化）のいずれかで染色した。（Ｄ）抗Ｆｌａｇ免疫染色の濃度測定。ランダムな１５ヶ所の０．１７６インチ平方面積の光学濃度（赤色チャンネル）を、画像のそれぞれで測定し、Ｉｍａｇｅ  Ｊを用いて、平均±ＳＤを求めた。スチューデントｔ検定；Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰ（６４時間）または（４０時間）対生理食塩水（＊ｐ＜０．０５）。スケールバーは１０μｍである。
【図７】ＳＶＺおよび海馬歯状回のヘマトキシリン‐エオジン染色によると、Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰ処置マウスと無処置マウスにおいて、これらの構造間に検出可能な差がないことを示す図である。（Ａ、Ａ’）第２セットのＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰによる皮下処置後１８３日目の担癌マウスの側脳室／ＳＶＺ（Ａ）および海馬歯状回（Ａ’）（同じマウスに関するさらに詳細なデータについては図Ｓ８も参照のこと）。（Ｂ、Ｂ’）Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰで処置されず、かつレトロウイルスも注射されなかった同年齢の対照マウスの側脳室／ＳＶＺ（Ｂ）および海馬歯状回（Ｂ’）。（Ｃ、Ｃ’）第２セット（第１セット後５日目に投与）のＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰによる皮下処置後１日目の非担癌マウスの側脳室／ＳＶＺ（Ｃ）および海馬歯状回（Ｃ’）。（Ｄ、Ｄ’）同年齢の無処置非担癌対照マウスの側脳室／ＳＶＺ（Ｄ）および海馬歯状回（Ｄ’）。Ａ〜Ｃのスケールは２０μｍ、Ｄ〜Ｆについては５０μｍである。
【図８】Ｐｅｎ−対照−ＲＰペプチドで処置されたマウス神経膠腫のＭＲＩおよび組織病理学の例を示す図である。（Ａ）ＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡ／ｓｈ−ｐ５３レトロウイルスを注射されなかった対照マウスの大脳の造影後３Ｄ  ＦＬＡＳＨ  ＭＲＩ冠状断像。（Ｂ）ＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡ／ｓｈｐ５３レトロウイルス注射後２４６日目およびＰｅｎ−対照−ＲＰペプチドの処置前の両側性腫瘍（白い造影）を示すマウス大脳の造影後３Ｄ  ＦＬＡＳＨ  ＭＲＩ冠状断像。（Ｃ）（本文に記載のように）Ｐｅｎ−対照−ＲＰペプチドによる皮下処置後４０日目の同じマウス脳の造影後３Ｄ  ＦＬＡＳＨ  ＭＲＩ冠状断像は腫瘍（矢印）の残存を示す。（Ｄ）パネル（Ｃ）の矢印で示す腫瘍含有領域における、同じマウス脳のヘマトキシリン‐エオジン染色切片。瀕死の状態のため、Ｐｅｎ−対照−ＲＰペプチドによる第２の処置後１１６日目にマウスを屠殺した。腫瘍の存在は、高色素性核および高細胞充実性によって、両方の切片で示される。（Ｅ）パネル（Ｃ）で示す領域１および２の切片におけるＨＡタグの免疫染色により、誘導された腫瘍細胞においてウイルス送達ＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡの存在が示される。（Ｆ）パネル（Ｃ）で示す領域１および２の切片の免疫染色により、腫瘍を示唆する高いＫｉ６７＋／分裂細胞指数が示される。ｄ〜ｆのスケールバーは２０μｍである。
【図９】ＭＲＩおよび組織診断により示されるように、Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰがマウス神経膠腫の迅速かつ長期の退縮／根絶を促進することを示す図である。（Ａ）Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰによる処置（本文に記載するような）前および処置後種々の時点におけるマウス脳の造影後３Ｄ  ＦＬＡＳＨ  ＭＲＩスキャン。処置前は、ＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡ／ｓｈｐ５３レトロウイルス注射後２４３日目の皮質画像を示す。黄色の矢印は、両側性腫瘍の位置を示す。マウス皮質の同じ位置の処置後画像は、Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰの第２の投与後の表示時間のものである。処置後画像の黄色の矢印は、最初の腫瘍の位置を示す。（Ｂ）第２のＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰ処置後１９２日目に摘出された同じマウス脳のヘマトキシリン‐エオジン染色画像。領域１は、（Ａ）の最終時点で示される切片の位置であって、腫瘍が処置前に存在していた位置を示す。神経膠腫を特徴づける高色素性核および高細胞充実性がないことに注目されたい。（Ｃ）領域２（パネルＡから／処置後１７６日目）のＫｉ６７染色。神経膠腫で観察されるＫｉ６７＋／増殖細胞がないことに注目されたい。（Ｄ）領域１の切片のＨＡ／ＤＡＰＩ染色。外来性ＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡを発現する細胞がないことに注目されたい。（Ｅ）領域１の切片のＧＦＡＰ／ＤＡＰＩ染色。腫瘍が前に存在した神経膠瘢痕の存在と一致するＧＦＡＰ＋細胞のクラスターに注目されたい。近接切片がＨＡ染色されないことにより、腫瘍細胞が存在しないことが確認された。対角線の緑の縞は組織ひだによるものである。スケールバーは２０μｍである。
【図１０】両側性腫瘍を有する無処置マウスのＭＲＩおよび組織病理学画像を示す図である。中央のパネルは、ＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡ／ｓｈｐ５３レトロウイルス注射後１１２日目の担癌マウス脳の造影後３Ｄ  ＦＬＡＳＨ  ＭＲＩ画像を示す。パネル（Ａ）および（Ｂ）は、腫瘍細胞示すＨＡ染色および核を示すＤＡＰＩ染色の切片画像を示す。文字を伴った、ＭＲＩ上の黄色の矢印は、（Ａ）および（Ｂ）で示すＨＡ＋切片の相対位置を示す。レトロウイルス注射はＢ側であった。スケールバーは２０μｍである。ＤＡＰＩ（４０，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）。
【図１１】ＭＲＩおよび組織診断により示されるように、Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰがマウス神経膠腫の迅速かつ長期の退縮／根絶を促進することを示す第２の例を示す図である。（Ａ）Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰによる処置前および処置後種々の時点における、担癌マウス脳の造影後３Ｄ  ＦＬＡＳＨ  ＭＲＩ画像。処置前冠状断像および横断像（ＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡ／ｓｈｐ５３レトロウイルス注射後７４日目）は、皮質内の多病巣性腫瘍（矢印）を示す。本文に記載するように、Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰによる２セットの皮下処置後８、２１、および１８１日目の同じマウス脳の画像を示す。処置後８日目のシグナルの減少ならびに２１および１８１日目の検出可能なシグナルの欠如に注目されたい。（Ａ’、Ａ”）腫瘍容積の評価により、Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰ処置後８日目までにはシグナルが減少していることが確証される。処置前および処置後８日目の（Ａ）と同じ画像であり、矢印が腫瘍増殖巣（黄色の円）を指しており、目的領域楕円柱ツール（黄色の円）を用いて腫瘍増殖巣の容積測定値を得た。処置前の場合、（Ａ’）の計算容積は、増殖巣１、２、および３についてそれぞれ、０．５９７ｍｍ３、０．１６４ｍｍ３、および０．７６０ｍｍ３である。処置後８日目（Ａ”）の場合、同じ腫瘍の容積は、増殖巣１、２、および３についてそれぞれ、０．１０６ｍｍ３、０．０３０２ｍｍ３、および０．０８９５ｍｍ３に減少した。処置後２１日目では、腫瘍を視覚化して測定することができなかった。（Ｂ）同じ屠殺マウス脳のヘマトキシリン‐エオジン染色（処置後１８３日目；最初の腫瘍検出後１９０日目）により、検出可能な腫瘍のないことが確証された。矢印は、Ａ’に示す腫瘍増殖巣１に対応する残存する瘢痕を指す。（Ｃ）同じ脳のＨＡ免疫染色（ＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡに対する）により、（Ａ’）および（Ｂ）と同じ増殖巣１領域に検出可能な腫瘍細胞のないことが示される。（Ｄ）同じ脳の増殖巣１のＧＦＡＰ免疫染色により、残存するＧＦＡＰ＋神経膠瘢痕が示される。（Ｅ）同じ脳の増殖巣１領域のＫｉ６７免疫染色により、分裂細胞のないことが示される。スケールバーはＢ〜Ｅについて２０μｍである。
【図１２】Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰで処置された、神経膠腫を有するマウスについて、長期生存および腫瘍存在のアウトカムを示す図である。（Ａ）Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰ処置（本文に記載するように皮下送達）または無処置の神経膠腫を有するマウス（ＭＲＩにより確認）の生存期間。９匹の対照マウスのうち４匹の対照マウスをＰｅｎ−対照−ＲＰペプチドで処置し、５匹は無処置とした。実験終了点は、ＭＲＩによる最初の腫瘍検出後２００日目とした。ログランク検定により行った生存率分析は、ｐ値＝０．０００７を示した（http://in-silico.net/tools/statistics/survivor）。（Ｂ）本文に記載する、Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰによる皮下処置前後の担癌マウスのＭＲＩアウトカム。後者の期間は、腫瘍処置後１７６〜２２５日間に及ぶ（腫瘍検出後１８３〜２３０日間）。（Ｃ）対照マウスおよびＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰ処置マウスの腫瘍についての脳組織病理学的アウトカム。すべての場合に、ＭＲＩにより、処置前における腫瘍の存在が確認された。対照動物は（Ａ）に記載するとおりであり、死後（６匹の対照）、６ヶ月の実験終了点後（４匹の処置動物）、または腫瘍に無関係の健康問題のための屠殺後（２匹の処置動物）のいずれかで脳を摘出した。処置動物の場合、組織学的分析は、腫瘍惹起後２６０〜４３８日目（Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰ投与後１８３〜２５９日目および最初の腫瘍検出後１９０〜３０５日目）に実施した。脳の切片を方法に記載のように調製し、ヘマトキシリン‐エオジンで染色し、Ｋｉ６７およびＨＡについて免疫染色した（ＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡ＋腫瘍細胞を同定するため）。腫瘍の存在／不在については、高色素性核、高細胞充実性、上昇したＫｉ６７染色およびＨＡ免疫染色に基づいていた。
【図１３】ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５（ＴＡＴ−ＺＩＰ）が培養メラノーマＭＥＬ５０１細胞のアポトーシス死を促進することを示す図である。ＴＡＴ連結ドミナントネガティブＡＴＦ５ペプチドを表示濃度（μＭ単位）でＭＥＬ５０１メラノーマ細胞の培地に加えた。４日後に細胞をＨｏｅｓｃｈｔ色素で染色すると、細胞はアポトーシス核に比例して染色された。
【図１４】ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５（ＴＡＴ−ＺＩＰ）が、培養Ｕ３７３神経膠芽腫細胞において、内因性ＡＴＦ５の発現を低下させることを示す図である。ＴＡＴ連結ドミナントネガティブＡＴＦ５ペプチドを表示濃度（μＭ単位）でＵ３７３神経膠芽腫細胞の培地に１日１７時間加え、次いで、細胞を回収して、ウエスタン免疫ブロッティングにより、内因性ＡＴＦ５レベルを分析した。ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５が内因性ＡＴＦ５の発現を大幅に低下させることに注目されたい。腫瘍細胞が生存のために内因性ＡＴＦ５を必要とすることが以前の試験で示されているので、細胞透過性ＴＡＴ−ＺＩＰペプチドの殺作用の機序は、内因性ＡＴＦ５タンパク質の減少を原因とするものである可能性がある。ＴＡＴ−ＺＩＰペプチドが存在する場合、内因性ＡＴＦ５上のスメアにも注目されたい。これは、ＴＡＴ−ＺＩＰが、内因性ＡＴＦ５のユビキチン化およびプロテアソーム分解を引き起こすことによって内因性ＡＴＦ５を減少させることを示唆する。
【図１５】ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５（ＴＡＴ−ＺＩＰ）ペプチドが、種々の腫瘍細胞株において、細胞死促進遺伝子ＤＤＩＴ３（ＣＨＯＰ）の発現を誘導することを示す図である。細胞をＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５で表示用量（μＭ単位）にて表示時間処理し、次いで、細胞を回収して、ＣＨＯＰおよび他の非応答性タンパク質の発現についてウエスタン免疫ブロッティングにより分析した。すべての場合におけるＣＨＯＰの上昇に注目されたい。ＣＨＯＰは細胞死を促進し得るので、これらのデータから、ＣＨＯＰタンパク質の誘導が、ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５が腫瘍細胞を死滅させる１つの機序である可能性が示される。
【図１６】ｓｉＲＮＡによるＣＨＯＰタンパク質のサイレンシング（上部のウエスタン免疫ブロット）により、ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５ペプチドを原因とする死からＵ８７細胞が部分的に保護されることを示す図である。ＣＨＯＰ発現をサイレンシングさせるｓｉＣＨＯＰ（上部のウエスタン免疫ブロット）または対照ｓｉＲＮＡで細胞を処置した。次いで、それらの細胞をＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５に２日間曝露し、アポトーシス核を有する細胞の割合を評価した。これらのデータは、ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５の腫瘍細胞を死滅させる機序の一部が、その後の死を媒介するＣＨＯＰの発現増大によるという考えを支持する。
【図１７】ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５がＢＣＬ２細胞生存タンパク質を下方制御することを示す図である。培養Ｕ８７ヒト神経膠芽腫細胞を表示濃度（μＭ単位）のＴＡＴＺＩＰ（ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５ペプチド）で３０時間処理した。次いで、細胞を回収して、ウエスタン免疫ブロッティングにより細胞生存タンパク質ＢＣＬ２の発現を評価した。これらの所見から、細胞死促進ＣＨＯＰの上昇に加えて、ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、ＢＣＬ２細胞生存タンパク質のレベルを低下させることによって腫瘍細胞を死滅させる可能性も示される。
【図１８】ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５がテモゾロミド（ＴＭＺ）と相乗的に作用して、培養Ｕ８７神経膠芽腫細胞を死滅させることを示す図である。致死量以下のＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５（ＴＺＩＰ  １μＭ）およびＴＭＺ（５０μＭ）を個々にまたは併用して細胞に加え１日間培養し、次いで、アポトーシス核を有する細胞の割合を評価した。ＴＭＺは現在、ヒトＧＢＭに対する第一選択治療である。このデータから、ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５がＴＭＺの存在下で機能するだけでなく、この２つの薬物が相乗的に作用してＧＢＭ細胞を死滅させることも明らかになる。これにより、ＴＭＺを服用している患者にＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５を投与できることが示唆される。
【図１９】３〜５日間の組換えＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５（３μＭ）処置により、ＭＴＡアッセイにより証明されるように、２種のヒトＧＭＢ細胞株および１種のマウスＧＭＢ細胞株の生存率が低下することを示す図である。
【図２０】合成ＰＥＮ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５処置により、ＭＴＡアッセイにより証明されるように、培養Ｕ８７ヒト神経膠芽腫細胞の細胞生存率が低下することを示す図である。表示濃度（μＭ）での５日間処理。
【図２１】組換えＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５処置により、アネキシンＶ／ＰＩ染色およびフローサイトメトリーにより示されるように、培養Ｕ８７ヒト神経膠芽腫細胞の死が促進されることを示す図である。生細胞の割合は、下方左四分区間で示される（対照８８％対処理５８％）。瀕死細胞の割合は、下方右四分区間および上方右四分区間である（対照９％対処理３６％）。
【図２２】合成ＰＥＮ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５が、培養物中でスフェアとして増殖する初代ＧＳ９−６ヒト神経膠芽腫幹細胞のアポトーシス死を促進することを示す図である。６日間の処置およびアネキシンＶ／ＰＩ染色およびフローサイトメトリーにより測定したデータ。
【図２３】組換えＰＥＮ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５が、培養物中でスフェアとして増殖する初代ＧＳ９−６ヒト神経膠芽腫幹細胞のアポトーシス死を促進することを示す図である。５日間の処置およびアネキシンＶ／ＰＩ染色およびフローサイトメトリーにより測定したデータ。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
４．発明の詳細な説明
４．１  ＡＴＦ５およびｄ／ｎ−ＡＴＦ５組成物
ＡＴＦ５は、種々の腫瘍タイプにより広範に発現されている。具体的には、ＡＴＦ５は、高度に増殖性の神経性腫瘍、例えば神経膠芽腫で発現されるだけでなく、必ずしも以下に限定されるものではないが、乳房、卵巣、子宮内膜、胃、結腸、肝臓、膵臓、腎臓、膀胱、前立腺、精巣、皮膚、食道、舌、口、耳下腺、喉頭、咽頭、リンパ節、肺、血液癌、末梢神経系、および脳の腫瘍を含む、複数の異常増殖でも発現される。
【００１５】
本明細書で使用する場合、「ＡＴＦ５」は、「ＡＴＦ５タンパク質」と「ＡＴＦ５アナログ」の両方を含む。別段の指示がない限り、「タンパク質」は、タンパク質、タンパク質ドメイン、ポリペプチド、またはペプチド、およびそれらの任意のフラグメントを含むものとする。ＡＴＦ５タンパク質は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１１８０５７５（ヒトＡＴＦ５）またはＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿１０９６１８（マウスＡＴＦ５）に示すアミノ酸配列を、その保存的置換を含めて有する。本明細書で使用する場合、「保存的置換」とは、同様の極性または立体配置を有するため、または置換された残基と同じクラス（例えば、疎水性、酸性、または塩基性）に属するため、置換されたアミノ酸残基に機能的に等価であるアミノ酸の置換である。以下に記載するように、ウエスタン免疫ブロッティングにより、主要な細胞形態のＡＴＦ５タンパク質の同定が可能になっている。ＡＴＦ５  ｃＤＮＡ配列からは、約３０および２０ｋＤａのタンパク質をもたらすことになる２つの可能なインフレームメチオニン開始部位が予測される。細胞内のＡＴＦ５の主要形態が２０〜２２ｋＤａの見かけの分子量を有するという観察は、第２の部位の利用が好まれることを示す。標準的なＫｏｚａｋ開始コンセンサス配列が最初のメチオニンの上流に含まれていた場合には、より大きなタンパク質が発現されたので、２２ｋＤａ形態が３０ｋＤａ前駆体の切断により形成されたものではないことが示される。したがって、本発明のＡＴＦ５タンパク質は、その２２ｋＤａ異性体と３０ｋＤａ異性体の両方をさらに含む。
【００１６】
「ＡＴＦ５アナログ」とは、本明細書で使用する場合、ＡＴＦ５生物活性を有し、ＡＴＦ５タンパク質と６０％以上（ある実施形態では、７０％以上または８０％以上または９０％以上または９５％以上）のアミノ酸配列相同性を有する、ＡＴＦ５タンパク質の機能的変異体である。さらに本明細書で使用する場合、「ＡＴＦ５生物活性」という用語は、親和性は天然ＡＴＦ５と異なっていることもあるが、本明細書に記載するアッセイ条件下で、ＣＲＥと物理的に会合するかまたはそれと結合する（すなわち、陰性対照のバックグラウンド結合を超えて、約２倍、またはより好ましくは約５倍の結合）、ＡＴＦ５タンパク質またはＡＴＦ５アナログの活性を指す。
【００１７】
当業者は、ＡＴＦ５のアミノ酸残基の番号付けが本明細書に示すものと異なり得ること、または本明細書に記載するものと同じＡＴＦ５−ＣＲＥ会合活性をもたらす特定の保存的アミノ酸置換を含有し得ることを理解している。他のアイソフォームまたはアナログ中の対応するアミノ酸および保存的置換は、関連するアミノ酸配列の目視検査により、または市販の相同性ソフトウエアプログラムの使用により、容易に同定される。
【００１８】
実施例の部で概説するように、ＡＴＦ５の機能および／または活性が干渉されると、インビトロおよびインビボにおける多形性神経膠芽腫腫瘍（ＧＢＭ）のアポトーシスが促進される。さらに、他の癌腫タイプにおいてＡＴＦ５機能および／または活性が選択的に干渉されると、細胞死が誘発されることが示される。また培養試験および動物試験から、転写因子ＡＴＦ５がＧＢＭ細胞の生存に必要とされること、およびＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５による限定的な皮下処置により、明白な毒性または副作用を示すことなく、内因性神経膠腫のマウスモデルにおいて明白な腫瘍根絶がもたらされることが示される。添付する例において強調するように、ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５の投与による、そのようなＡＴＦ５干渉の効果は、ＡＴＦ５の機能および／または活性が干渉されると、新生細胞に細胞死の増大がもたらされるが、正常細胞ではそうではないという点で、実際特異的である。
【００１９】
本明細書で使用する場合、「ドミナントネガティブＡＴＦ５」または「ｄ／ｎ−ＡＴＦ５」とは、ヒトＡＴＦ５アミノ酸配列の一部を含むペプチドである。ある実施形態では、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５ペプチドは、下記の配列
2016516669.tif 000011
を含み、ここで、下線付きの配列はドミナントネガティブ配列であり、配列の残りの部分はＡＴＦ５ロイシンジッパーである。ある実施形態では、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、配列ＣＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＡＡＡＣＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＧＧＣＧＡＡＴＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧ  ＡＡＧＣＧＣＧＣＡＡＣＣＧＣＧＡＡＣＴＧＡＡＡＧＡＡＣＧＣＧＣＧＧＡＡＡＧＣＴＡＡを含む核酸によりコードされる。ある実施形態では、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５ペプチドは、
2016516669.tif 000012
を含む。ある実施形態では、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、配列ＣＴＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＡＡＡＣＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＧＧＣＧＡＡＴＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＣＧＣＧＣＡＡＣＣＧＣＧＡＡＣＴＧＡＡＡＧＡＡＣＧＣＧＣＧＧＡＡＡＧＣＴＡＡを含む核酸によりコードされる。ある実施形態では、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５ペプチドは、下記の配列
2016516669.tif 000013
を含み、ここで、下線付きの配列はドミナントネガティブ配列であり、配列の残りの部分はＡＴＦ５ロイシンジッパーである。ある実施形態では、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、配列ＣＴＧＧＣＧＣＧＣＧＡＡＡＡＣＧＡＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＡＡＡＣＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＧＧＣＧＡＡＴＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＣＧＣＧＣＡＡＣＣＧＣＧＡＡＣＴＧＡＡＡＧＡＡＣＧＣＧＣＧＧＡＡＡＧＣＴＡＡを含む核酸によりコードされる。ある実施形態では、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５ペプチドは、下記の配列
2016516669.tif 000014
を含み、ここで、下線付きの配列はドミナントネガティブ配列であり、配列の残りの部分はＡＴＦ５ロイシンジッパーである。ある実施形態では、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、配列ＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＧＣＧＣＧＧＡ  ＡＧＡＡＣＴＧＧＣＧＣＧＣＧＡＡＡＡＣＧＡＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＡＡＡＣＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＧＧＣＧＡＡＴＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＣＧＣＧＣＡＡＣＣＧＣＧＡＡＣＴＧＡＡＡＧＡＡＣＧＣＧＣＧＧＡＡＡＧＣＴＡＡを含む核酸によりコードされる。ある実施形態では、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５ペプチドは、下記の配列
2016516669.tif 000015
を含み、ここで、下線付きの配列はドミナントネガティブ配列であり、配列の残りの部分はＡＴＦ５ロイシンジッパーである。ある実施形態では、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、配列ＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＧＣＧＣＧＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＣＧＣＧ  ＣＧＡＡＡＡＣＧＡＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＡＡＡＣＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＧＧＣＧＡＡＴＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＣＧＣＧＣＡＡＣＣＧＣＧＡＡＣＴＧＡＡＡＧＡＡＣＧＣＧＣＧＧＡＡＡＧＣＧＴＧＴＡＡを含む核酸によりコードされる。ある実施形態では、ＡＴＦ５ロイシンジッパー配列ＬＥＧＥＣＱＧＬＥＡＲＮＲＥＬＫＥＲＡＥＳＶを含むｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４個の追加のＣ末端ＡＴＦ５ロイシンジッパー残基をさらに含む。ある実施形態では、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５ペプチドは、前述のペプチド配列の１つからなる。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「ドミナントネガティブＡＴＦ５」または「ｄ／ｎ−ＡＴＦ５」とは、ラットまたはマウスのＡＴＦ５アミノ酸配列の一部を含むペプチドである。ある実施形態では、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５ペプチドは、下記の配列
2016516669.tif 000016
を含み、ここで、下線付きの配列はドミナントネガティブ配列であり、配列の残りの部分はＡＴＦ５ロイシンジッパーである。ある実施形態では、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、配列ＣＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＡＡＡＣＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＧＧＣＧＡＡＴＧＣＣＡＧＧＧ  ＣＣＴＧＧＡＡＧＣＧＣＧＣＡＡＣＣＧＣＧＡＡＣＴＧＣＧＣＧＡＡＣＧＣＧＣＧＧＡＡＡＧＣＴＡＡを含む核酸によりコードされる。ある実施形態では、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５ペプチドは、下記の配列
2016516669.tif 000017
を含み、ここで、下線付きの配列はドミナントネガティブ配列であり、配列の残りの部分はＡＴＦ５ロイシンジッパーである。ある実施形態では、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、配列ＣＴＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＣＧ  ＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＡＡＡＣＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＧＧＣＧＡＡＴＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＣＧＣＧＣＡＡＣＣＧＣＧＡＡＣＴＧＣＧＣＧＡＡＣＧＣＧＣＧＧＡＡＡＧＣＴＡＡを含む核酸によりコードされる。ある実施形態では、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５ペプチドは、下記の配列
2016516669.tif 000018
を含み、ここで、下線付きの配列はドミナントネガティブ配列であり、配列の残りの部分はＡＴＦ５ロイシンジッパーである。ある実施形態では、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、配列ＣＴＧＧＣＧＣＧＣＧＡＡＡＡＣＧＡＡＧＡＡＣ  ＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＡＡＡＣＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＧＧＣＧＡＡＴＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＣＧＣＧＣＡＡＣＣＧＣＧＡＡＣＴＧＣＧＣＧＡＡＣＧＣＧＣＧＧＡＡＡＧＣＴＡＡを含む核酸によりコードされる。ある実施形態では、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５ペプチドは、下記の配列
2016516669.tif 000019
を含み、ここで、下線付きの配列はドミナントネガティブ配列であり、配列の残りの部分はＡＴＦ５ロイシンジッパーである。ある実施形態では、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、配列ＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＧＣＧＣＧＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＣＧＣＧＣＧＡＡＡＡＣＧＡＡ  ＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＡＡＡＣＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＧＧＣＧＡＡＴＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＣＧＣＧＣＡＡＣＣＧＣＧＡＡＣＴＧＣＧＣＧＡＡＣＧＣＧＣＧＧＡＡＡＧＣＴＡＡを含む核酸によりコードされる。ある実施形態では、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５ペプチドは、下記の配列
2016516669.tif 000020
を含み、ここで、下線付きの配列はドミナントネガティブ配列であり、配列の残りの部分はＡＴＦ５ロイシンジッパーである。ある実施形態では、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、配列ＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＧＣＧＣＧＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＣＧＣＧＣＧＡＡＡＡＣＧＡＡＧＡ  ＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＡＡＡＣＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＧＧＣＧＡＡＴＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＣＧＣＧＣＡＡＣＣＧＣＧＡＡＣＴＧＣＧＣＧＡＡＣＧＣＧＣＧＧＡＡＡＧＣＧＴＧＴＡＡを含む核酸によりコードされる。ある実施形態では、ＡＴＦ５ロイシンジッパー配列ＬＥＧＥＣＱＧＬＥＡＲＮＲＥＬＲＥＲＡＥＳＶを含むｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、配列ＥＲＥＩＱＹＶＫＤＬＬＩＥＶＹＫＡＲＳＱＲＴＲＳのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４個の追加のＣ末端ＡＴＦ５ロイシンジッパー残基をさらに含む。ある実施形態では、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５ペプチドは、前述のペプチド配列の１つからなる。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「細胞透過性ペプチド」または「ＣＰ」とは、細胞の形質膜および／または核膜を横断する膜透過性複合体の輸送に関連したエネルギー非依存性（すなわち、非エンドサイトーシス）移行特性を付与する短いアミノ酸配列（例えば、ある実施形態では、約１２〜３０残基）または機能モチーフを含むペプチドである。そのような特性を付与する代表的なアミノ酸モチーフは、米国特許第６，３４８，１８５号明細書に記載されており、その内容は、参照により明示的に本明細書に援用される。本発明の細胞透過性ペプチドとしては、好ましくは、以下に限定されるものではないが、ペネトラチン１、トランスポータン、ｐＩｓｌ、ＴＡＴ（４８〜６０）、ｐＶＥＣ、ＭＴＳ、およびＭＡＰが挙げられる。
【００２２】
本発明の細胞透過性ペプチドには、同定された細胞透過性ペプチドの特定の構造的および機能的特徴を保持するが、１つまたは複数の位置で同定されたペプチドのアミノ酸配列とは異なる配列が含まれる。そのようなポリペプチド変異体は、当技術分野で公知の方法によって、最初の配列からアミノ酸残基を置換、欠失、付加することにより作製することができる。
【００２３】
ある実施形態では、そのような実質的に同様の配列には、ポリペプチドアポトーシス標的阻害物質に関して上記に記載する保存的なアミノ酸置換を組み込んだ配列が含まれる。ある実施形態では、本発明の細胞透過性ペプチドは、同定されたペプチドのアミノ酸配列に対して、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性があり、かつ細胞透過を媒介することができる。細胞透過を媒介する合成ペプチドの能力に対するアミノ酸置換の影響は、以下の実施例の部に開示する方法を用いて試験することができる。
【００２４】
本発明のある実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ペプチド配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫを含むペネトラチン１またはその保存的変異体である。本明細書で使用する場合、「保存的変異体」とは、細胞透過性ペプチドの形状−−または、したがって生物活性（すなわち、輸送活性）もしくは膜毒性−−に悪影響を及ぼさない、１つまたは複数のアミノ酸置換を有するペプチドである。
【００２５】
ペネトラチン１は、ドロソフィラ・アンテナペディア（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）のホメオドメインの第３のαヘリックスに由来する１６アミノ酸ポリペプチドである。その構造および機能は、十分に研究され特徴づけられている：Ｄｅｒｏｓｓｉら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、８（２）：８４〜８７、１９９８；Ｄｕｎｉｃａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、６０（１）：４５〜６０、２００１；Ｈａｌｌｂｒｉｎｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１５１５（２）：１０１〜０９、２００１；Ｂｏｌｔｏｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１２（８）：２８４７〜５５、２０００；Ｋｉｌｋら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、１２（６）：９１１〜１６、２００１；Ｂｅｌｌｅｔ−Ａｍａｌｒｉｃら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１４６７（１）：１３１〜４３、２０００；Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．、５５（２）：１６３〜７２、２０００；Ｔｈｏｒｅｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、４８２（３）：２６５〜６８、２０００。
【００２６】
ペネトラチン１は、６３ｋＤａタンパク質であるアビジンをヒトＢｏｗｅｓメラノーマ細胞の中に効率的に輸送することが示されている（Ｋｉｌｋら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、１２（６）：９１１〜１６、２００１）。加えて、ペネトラチン１およびその積荷の輸送は、非エンドサイトーシスでかつエネルギー非依存的であり、受容体分子またはトランスポーター分子に依存しないことが示されている。さらに、ペネトラチン１が純粋な脂質二重層を横断できることが知られている（Ｔｈｏｒｅｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、４８２（３）：２６５〜６８、２０００）。この特徴により、ペネトラチン１はその積荷を、細胞−表面−受容体／−トランスポーターアベイラビリティに制限されることなく、輸送することができる。送達ベクターは、あらゆる細胞タイプに侵入すること（Ｄｅｒｏｓｓｉら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、８（２）：８４〜８７、１９９８）、およびペプチド（Ｔｒｏｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：５６３５〜４０、１９９６）またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｔｒｏｙら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１６：２５３〜６１、１９９６；Ｔｒｏｙら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１７：１９１１〜１８、１９９７）を効率的に送達することが示されている。
【００２７】
ある実施形態では、ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、ラットｄ／ｎ−ＡＴＦ５配列に作動可能に連結されたペネトラチン配列を含むペプチドである。ある実施形態では、ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５ペプチド配列は、
2016516669.tif 000021
であり、ここで、下線付きの残基は６ＸＨｉｓタグリーダー配列であり、太字の残基はペネトラチン配列であり、イタリック体の残基はＦＬＡＧタグであり、フォント修飾のない残基はスペーサーアミノ酸であり、太字でイタリック体の残基はｄ／ｎ配列であり、かつ太字で下線付きの残基はその最初のバリンの後で短縮されたＡＴＦ５ロイシンジッパーである。ある実施形態では、ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、配列ＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＴＡＴＧＣＧＴＣＡＡＡＴＴＡＡＡＡＴＴＴＧＧＴＴＴＣＡＡＡＡＴＣＧＴＣＧＴＡＴＧＡＡＡＴＧＧＡＡＡＡＡＡＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＴＧＡＣＡＡＡＡＴＧＧＣＡＴＣＴＡＴＧＡＣＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＣＡＡＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＣＧＡＡＣＡＡＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＡＧＣＡＡＧＡＧＡＡＡＡＣＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＴＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＡＧＡＡＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＣＡＧＡＧＣＴＡＧＡＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣＣＡＡＧＧＧＣＴＡＧＡＧＧＣＧＣＧＧＡＡＴＣＧＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＧＴＧＴＡＧを含む核酸によりコードされる。
【００２８】
本発明の他の非限定的な実施形態は、以下の例示的な細胞浸透性分子：わずかに異なる物理的性質を有する、ペネトラチン１に由来した配列であるＲＬ１６（Ｈ−ＲＲＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＲＲ−ＯＨ）（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２００８  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；１７８０（７−８）：９４８〜５９）；およびニューロンを標的にする狂犬病ウイルス配列であるＲＶＧＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（Ｐ．Ｋｕｍａｒ、Ｈ．Ｗｕ、Ｊ．Ｌ．ＭｃＢｒｉｄｅ、Ｋ．Ｅ．Ｊｕｎｇ、Ｍ．Ｈ．Ｋｉｍ、Ｂ．Ｌ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ、Ｓ．Ｋ．Ｌｅｅ、Ｐ．Ｓｈａｎｋａｒ、およびＮ．Ｍａｎｊｕｎａｔｈ、Ｔｒａｎｓｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｎａｔｕｒｅ  ４４８（２００７）、ｐｐ．３９〜４３を参照のこと）の使用を含む。
【００２９】
本発明の特定の代替的非限定的実施形態では、細胞透過性ペプチドは、トランスポータン、ｐＩＳｌ、Ｔａｔ（４８〜６０）、ｐＶＥＣ、ＭＡＰ、およびＭＴＳからなる群から選択される細胞透過性ペプチドである。トランスポータンは、神経ペプチドであるガラニンのアミノ末端に由来する１２個の機能的なアミノ酸と、リジンにより連結された、カルボキシル末端にあるマストパランの１４残基配列とを含有する２７アミノ酸長のペプチドである（Ｐｏｏｇａら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、１２（１）：６７〜７７、１９９８）。それは、アミノ酸配列ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ、またはその保存的変異体を含む。
【００３０】
ｐＩｓｌは、ラットインスリン１遺伝子エンハンサータンパク質のホメオドメインの第３ヘリックスに由来する（Ｍａｇｚｏｕｂら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１５１２（１）：７７〜８９、２００１；Ｋｉｌｋら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、１２（６）：９１１〜１６、２００１）。ｐＩｓｌは、アミノ酸配列ＰＶＩＲＶＷ  ＦＱＮＫＲＣＫＤＫＫ、またはその保存的変異体を含む。
【００３１】
Ｔａｔは、８６〜１０２アミノ酸の転写活性化ファクターであり、ＨＩＶ感染細胞の形質膜を横断して移行し、ウイルスゲノムをトランス活性化することが可能である（Ｈａｌｌｂｒｉｎｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１５１５（２）：１０１〜０９、２００１；Ｓｕｚｕｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７（４）：２４３７〜４３、２００２；Ｆｕｔａｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６（８）：５８３６〜４０、２００１）。残基４８〜６０にわたる小さなＴａｔフラグメントが、核内移行の原因であるとわかり（Ｖｉｖｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２（２５）：１６０１０〜０１７、１９９７）、それは、アミノ酸配列：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ；またはその保存的変異体を含む。
【００３２】
ある実施形態では、ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、ラットｄ／ｎ−ＡＴＦ５配列に作動可能に連結されたＴＡＴ配列を含むペプチドである。ある実施形態では、ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５ペプチド配列は、
2016516669.tif 000022
であり、ここで、下線付きの残基は６ＸＨｉｓタグリーダー配列であり、太字の残基はＴＡＴ配列であり、イタリック体の残基はＨＡタグであり、フォント修飾のない残基はスペーサーアミノ酸であり、太字でイタリック体の残基はｄ／ｎ配列であり、かつ太字で下線付きの残基はその最初のバリンの後で短縮されたＡＴＦ５ロイシンジッパーである。ある実施形態では、ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、配列ＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＴＡＴＧＣＴＣＧＡＧＴＡＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＡＡＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＡＴＣＣＡＴＡＴＧＡＣＧＴＣＣＣＡＧＡＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＧＣＡＴＣＴＡＴＧＡＣＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＣＡＡＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＣＧＡＡＣＡＡＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＡＧＣＡＡＧＡＧＡＡＡＡＣＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＴＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＡＧＡＡＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＣＡＧＡＧＣＴＡＧＡＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣＣＡＡＧＧＧＣＴＡＧＡＧＧＣＧＣＧＧＡＡＴＣＧＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＧＴＧＴＡＧを含む核酸によりコードされる。
【００３３】
ｐＶＥＣは、アミノ酸６１５〜６３２にわたる、細胞接着分子である血管内皮カドヘリンのマウス配列に由来する１８アミノ酸長のペプチドである（Ｅｌｍｑｕｉｓｔら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、２６９（２）：２３７〜４４、２００１）。ｐＶＥＣは、アミノ酸配列ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨ、またはその保存的変異体を含む。
【００３４】
ＭＴＳ、すなわち膜移行配列は、さらなるプロセシングのために適切な細胞小器官に新生翻訳産物を向ける役割を担うアクセプタータンパク質によって認識される、特定のペプチドの一部分である（Ｌｉｎｄｇｒｅｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２１（３）：９９〜１０３、２０００；Ｂｒｏｄｓｋｙ、Ｊ．Ｌ．、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔ．、１７８：２７７〜３２８、１９９８；Ｚｈａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２５４（１〜２）：１３７〜４５、２００１）。特に関連するＭＴＳは、ウイルスｇｐ４１タンパク質の疎水性末端ドメインとシミアンウイルス４０大型抗原由来の核移行シグナルとのキメラであるＭＰＳペプチドであり、それは、温度に依存せずに内部移行され、オリゴヌクレオチドの担体として機能する、核移行シグナルと膜移行配列との１つの組合せを表す（Ｌｉｎｄｇｒｅｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２１（３）：９９〜１０３、２０００；Ｍｏｒｒｉｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：２７３０〜３６、１９９７）。ＭＰＳは、アミノ酸配列ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、またはその保存的変異体を含む。
【００３５】
モデル両親媒性ペプチド、すなわちＭＡＰは、その基本的な特徴として、ヘリックス型両親媒性および少なくとも４つの完全なヘリックスターンの長さを有する一群のペプチドを形成する（Ｓｃｈｅｌｌｅｒら、Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、５（４）：１８５〜９４、１９９９；Ｈａｌｌｂｒｉｎｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１５１５（２）：１０１〜０９、２００１）。例示的なＭＡＰは、アミノ酸配列ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡアミド、またはその保存的変異体を含む。
【００３６】
ある実施形態では、上記の細胞透過性ペプチドは、例えばペプチド結合を介して、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５に共有結合される。ある実施形態では、細胞透過性ペプチドは、組換えＤＮＡ技術によってｄ／ｎ−ＡＴＦ５に作動可能に連結される。例えば、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、目的の細胞透過性ペプチドをコードする核酸配列の上流（細胞透過性ペプチドのアミノ末端への連結）もしくは下流（細胞透過性ペプチドのカルボキシ末端への連結）のいずれかに、またはその両方に導入することができる。ｄ／ｎ−ＡＴＦ５をコードする核酸配列と細胞透過性ペプチドをコードする核酸配列との両方を含むそのような融合配列は、当技術分野で周知の技術を用いて発現させることができる。
【００３７】
ある実施形態では、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、非共有結合を介して細胞透過性ペプチドに作動可能に連結することができる。ある実施形態では、そのような非共有結合は、イオン相互作用、疎水的相互作用、水素結合、またはファンデルワールス力によって媒介される。
【００３８】
ある実施形態では、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、化学的リンカーを介して細胞透過性ペプチドに作動可能に連結される。そのような連結の例では、典型的には、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＰからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子が組み込まれる。例示的なリンカーとしては、以下に限定されるものではないが、置換アルキルまたは置換シクロアルキルが挙げられる。あるいは、異種構造部分は、細胞透過性ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に直接結合させることができる（リンカーが単結合である場合）。リンカーが共有単結合でない場合、リンカーは、場合によっては単、二重、三重、または芳香族炭素−炭素結合、ならびに炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合、イオウ−イオウ結合、炭素−イオウ結合、リン−酸素結合、リン−窒素結合、および窒素−白金結合を含む、安定な化学結合の任意の組合せであってよい。ある実施形態では、リンカーは、２０個未満の非水素原子を組み込んでおり、エーテル、チオエーテル、尿素、チオ尿素、アミン、エステル、カルボキシアミド、スルホンアミド、ヒドラジドの結合、および芳香族またはヘテロ芳香族の結合の任意の組合せで構成される。ある実施形態では、リンカーは、炭素−炭素単結合とカルボキシアミド、スルホンアミド、またはチオエーテルの結合との組合せである。
【００３９】
連結のための一般的な戦略には、細胞透過性ペプチド成分とｄ／ｎ−ＡＴＦ５成分とを別々に調製することが含まれ、それぞれは、その２つの間の連結を可能にする適切な反応性基で修飾または誘導体化される。次いで、細胞透過性ペプチドとｄ／ｎ−ＡＴＦ５との間に共有結合が生成するように、修飾されたｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、連結用に調製された細胞透過性ペプチドと一緒に、十分な時間（および温度、ｐＨ、モル比等の適切な条件下で）インキュベートされる。
【００４０】
本発明は、例えば化学的手段またはｍＲＮＡのインビトロ翻訳による、インビトロでのポリペプチドの合成によって作製されたタンパク質およびタンパク質アナログの使用を企図する。例えば、ＡＴＦ５およびその阻害物質は、当業者に一般に知られる方法により合成することができる（ペプチド及びアミノ酸分析の現代技術（Ｍｏｄｅｒｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９８１）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｍ．、ペプチド合成の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｉｎｃ．、１９８４）。アミノ酸配列およびアミノ酸配列のアナログの合成に用いることができる方法の例としては、以下に限定されるものではないが、固相ペプチド合成、液相ペプチド合成、および市販の任意のペプチド合成機を用いる合成が挙げられる。本発明のアミノ酸配列は、タンパク質配列の合成に用いられ、かつ当業者に周知であるカップリング剤および保護基を含有してもよい。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「アミノ酸残基」、「アミノ酸」、または「残基」には、遺伝コード化アミノ酸残基および非遺伝コード化アミノ酸残基が含まれ、例えば、非遺伝コード化アミノ酸残基または非天然アミノ酸としては、以下に限定されるものではないが、天然キラルアミノ酸のＤ−エナンチオマー、β−アラニン（β−Ａｌａ）；２、３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；ニペコ酸（Ｎｉｐ）；ピペコリン酸（Ｐｉｐ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡ）；２−ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧ）；Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（ＰｈＧ）；シクロヘキシルアラニン（ＣｈＡ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ナフチルアラニン（Ｎａｌ）；４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｃｌ））；２−フロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（２−Ｆ））；３−フロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３−Ｆ））；４−フロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；β−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ−アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）；２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，３−ジアミノ酪酸（ｄａｂ）；ｐ−アミノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（ｐＮＨ２））；Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）、ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）；ホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）；ホモプロリン（ｈＰｒｏ）；ならびに前述のそれぞれの対応するＤ−エナンチオマー、例えば、Ｄ−β−Ａｌａ、Ｄ−Ｄｐｒ、Ｄ−Ｎｉｐ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−ｔ−ＢｕＡ、Ｄ−ｔ−ＢｕＧ、Ｄ−ＭｅＩｌｅ、Ｄ−ＰｈＧ、Ｄ−ＣｈＡ、Ｄ−Ｎｌｅ、Ｄ−ＮａＩ、Ｄ−Ｐｈｅ（４−Ｃｌ）、Ｄ−Ｐｈｅ（２−Ｆ）、Ｄ−Ｐｈｅ（３−Ｆ）、Ｄ−Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｄ−Ｐｅｎ、Ｄ−Ｔｉｃ、Ｄ−Ｔｈｉ、Ｄ−ＭＳＯ、Ｄ−ｈＡｒｇ、Ｄ−ＡｃＬｙｓ、Ｄ−Ｄｂｕ、Ｄ−Ｄａｂ、Ｄ−Ｐｈｅ（ｐＮＨ２）、Ｄ−ＭｅＶａｌ、Ｄ−ｈＣｙｓ、Ｄ−ｈＰｈｅ、Ｄ−ｈＳｅｒ、Ｄ−Ｈｙｐ、およびＤ−ｈＰｒｏが挙げられる。さらなる非遺伝コード化アミノ酸残基としては、３−アミノプロピオン酸；４−アミノ酪酸；イソニペコチン酸（Ｉｎｐ）；アザ−ピペコリン酸（ａｚＰｉｐ）；アザ−プロリン（ａｚＰｒｏ）；α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ−アミノバレリン酸（Ａｖａ）；Ｎ−メチルグリシン（ＭｅＧｌｙ）が挙げられる。
【００４２】
ある実施形態では、細胞透過性ドミナントネガティブＡＴＦ５は、下記の群
2016516669.tif 000023
（ここで、下線付きの残基（ＭＧ〜ＨＭ）は６ＸＨｉｓタグリーダー配列であり、太字の残基（ＲＱ〜ＫＫ）はペネトラチン配列であり、イタリック体の残基（ＤＹ〜ＤＫ）はＦＬＡＧタグであり、フォント修飾のない残基（ＭＡ〜ＰＤ）はスペーサーアミノ酸であり、太字でイタリック体の残基（ＬＥ〜ＡＥ）はｄ／ｎ配列であり、かつ太字で下線付きの残基（ＬＥ〜ＳＶ）はその最初のバリンの後で短縮されたＡＴＦ５ロイシンジッパーである）；
2016516669.tif 000024
（ここで、下線付きの残基（ＭＧ〜ＬＥ）は６ＸＨｉｓタグリーダー配列であり、太字の残基（ＹＧ〜ＲＲ）はＴＡＴ配列であり、イタリック体の残基（ＹＰ〜ＹＡ）はＨＡタグであり、フォント修飾のない残基（ＭＡ〜ＰＤ）はスペーサーアミノ酸であり、太字でイタリック体の残基（ＬＥ〜ＡＥ）はｄ／ｎ配列であり、かつ太字で下線付きの残基（ＬＥ〜ＳＶ）はその最初のバリンの後で短縮されたＡＴＦ５ロイシンジッパーである）；
2016516669.tif 000025
（ここで、下線付きの残基（ＭＧ〜ＨＭ）は６ＸＨｉｓタグリーダー配列であり、太字の残基（ＲＱ〜ＫＫ）はペネトラチン配列であり、イタリック体の残基（ＬＥ〜ＡＥ）はｄ／ｎ配列であり、かつ太字で下線付きの残基（ＬＥ〜ＳＶ）はその最初のバリンの後で短縮されたＡＴＦ５ロイシンジッパーである）；および
2016516669.tif 000026
（ここで、太字の残基（ＲＱ〜ＫＫ）はペネトラチン配列であり、イタリック体の残基（ＬＥ〜ＡＥ）はｄ／ｎ配列であり、かつ太字で下線付きの残基（ＬＥ〜ＳＶ）はその最初のバリンの後で短縮されたＡＴＦ５ロイシンジッパーである）
から選択される配列を含む。ある実施形態では、細胞透過性ドミナントネガティブＡＴＦ５は化学合成される。
【００４３】
４．２  ｄ／ｎ−ＡＴＦ５組成物の使用
本明細書に記載する方法に従うと、細胞のＡＴＦ５の機能または活性を無効、破壊、または不活性化することによって、細胞においてＡＴＦ５を阻害することができる。例えば、細胞のＡＴＦ５の機能または活性は、細胞の天然ＡＴＦ５の機能または活性を阻害することができるドミナントネガティブＡＴＦ５分子を与えることにより阻害することができる。ある実施形態では、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５はＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５である。
【００４４】
ある実施形態では、細胞のＡＴＦ５の機能または活性は、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、またはそれ以上（明示的に列挙された値の間の中間の範囲、例えば、５〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％、４０〜５０％、または５０％〜１００％を含む５０％超を包含する）阻害される。ある実施形態では、ＡＴＦ５の機能または活性は、ＡＴＦ５の発現の阻害により低下する。そのような発現は、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、またはそれ以上（明示的に列挙された値の間の中間の範囲、例えば、５〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％、４０〜５０％、または５０％〜１００％を含む５０％超を包含する）阻害することができる。ある実施形態では、図１１に概略を示すように、発現は６０％、８０％、または９０％低下する。
【００４５】
ある実施形態では、本発明は、治療を必要とする被験体の腫瘍を治療または予防するための方法であって、ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５を含み、場合によっては薬学的に許容される担体も含む医薬組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、組成物が投与される被験体の腫瘍を治療するために有効な量で提供される。本明細書で使用する場合、「有効な」という語句は、腫瘍の臨床的な障害または症状を寛解するかまたは最小限に抑えるために有効であることを示す。例えば、腫瘍の臨床的障害または症状は、被験体が受けるいかなる疼痛または不快感も低減することによって；そのような治療が受けない場合に予想される生存期間を超えて、被験体の生存期間を延長することによって；腫瘍の発生または拡散を阻害または予防することによって；または腫瘍中の細胞の成熟および増殖を制限、停止、終結、もしくは制御することによって、寛解するかまたは最小限に抑えることができる。治療を必要とする被験体の腫瘍を治療するために有効なＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５の量は、腫瘍のタイプ、腫瘍のステージ、被験体の体重、被験体の病態の重症度、および投与の方法を含む、各症例の特定の要因に応じて異なることになる。この量は、当業者により容易に決定することができる。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「腫瘍」という用語は、病的な細胞増殖を指し、異常増殖を含む。「異常増殖」という用語および本明細書でさらに使用するその関連用語は、正常細胞の増殖を誘発しないかまたはその休止を引き出すであろう条件下における、腫瘍細胞の無制御かつ進行性の増殖を指す。異常増殖は「新生物」の形成をもたらすが、新生物は、細胞の増殖が無制御で進行性である、新たで異常な任意の増殖物、特に組織の新たな増殖物を意味するように本明細書で定義される。本明細書で使用する場合、新生物は、限定されるものではないが、同じタイプの組織の正常な増殖と比較した場合の、被験体の組織細胞の形態学的な不規則性および被験体の組織細胞の病的な増殖を含む。加えて、新生物には、良性腫瘍および悪性腫瘍が含まれる。悪性新生物は、良性新生物とは、前者がより高度の退形成、または細胞の分化および配向性の消失を示す点で識別され、浸潤および転移の特性を有する。したがって、異常増殖は、血液癌を含む「癌」を含むが、本明細書では、無秩序な増殖、分化の欠如、局所的組織浸潤、および転移をもたらす、正常な制御の消失という特有の形質を有する腫瘍細胞の増殖を指す。
【００４７】
加えて、本明細書で使用する場合、「神経性腫瘍」という用語は、神経細胞の腫瘍形成形態（すなわち、形質転換した神経細胞）を指し、星状細胞腫細胞（すなわち、限定されるものではないが、悪性度Ｉ〜ＩＶの星状細胞腫、未分化星細胞腫、星膠芽細胞腫、原線維性星状細胞腫、原形質性星状細胞腫、大円形細胞性星状膠腫、および多形性神経膠芽腫を含む、あらゆる星状細胞腫の細胞）、神経膠腫、髄芽腫、神経芽細胞腫、および他の脳腫瘍を含む。脳腫瘍は正常組織に浸潤し、それを破壊し、感覚運動および認知機能の損傷、頭蓋内圧亢進、脳水腫、ならびに脳組織、脳神経、および大脳脈管の圧迫などの影響をもたらす。転移は、頭蓋骨またはいかなる頭蓋内構造も関与する。サイズ、位置、増殖速度、および組織学的悪性度により、脳腫瘍の重篤度が決定される。非悪性腫瘍は、ゆっくり増殖し、有糸分裂がほとんどなく、また壊死も血管増殖もない。悪性腫瘍は、より迅速に増殖し、他の組織に浸潤する。しかしながら、悪性腫瘍は、局所的な増殖により死に至らせるため、ＣＮＳを超えて拡散することはめったにない。
【００４８】
脳腫瘍は、部位（例えば、脳幹、小脳、大脳、脳神経、上衣、髄膜、神経膠細胞、松果体領域、脳下垂体、および頭蓋骨）によって、または組織学的タイプ（例えば、髄膜腫、一次ＣＮＳリンパ腫、または星状細胞腫）によって分類することができる。一般的な原発性小児腫瘍は、小脳星細胞腫および髄芽腫、上衣腫、脳幹の神経膠腫、神経芽細胞腫、ならびに先天性腫瘍である。成人では、原発性腫瘍としては、髄膜腫、シュワン細胞腫、および大脳半球の神経膠腫（特に、悪性の多形性神経膠芽腫および未分化星細胞腫、ならびに良性の星状細胞腫および乏突起膠腫）が挙げられる。頭蓋内新生物の全体的な発生率は、男性および女性において基本的に等しいが、小脳髄芽腫および多形性神経膠芽腫は男性でより一般的である。
【００４９】
神経膠腫は、その発生段階のいずれか１段階にて神経膠細胞で代表される組織で構成される腫瘍である。神経膠腫は、頭蓋内腫瘍の４５％を占める。神経膠腫は、星状細胞腫、上衣腫、および神経細胞腫を含む、脳および脊髄の原発性内因性新生物をすべて包含することができる。星状細胞腫は、形質転換した星状細胞または星状腫瘍細胞で構成される腫瘍である。そのような腫瘍は、以下の悪性度が増大する順序で分類されている：悪性度Ｉは、原線維性または原形質性の星状膠細胞からなり；悪性度ＩＩは、豊富な細胞質および２または３個の核を有する細胞からなる星膠芽細胞腫であり；悪性度ＩＩＩおよびＩＶは、大脳半球に通常限定され、星状細胞、神経海綿芽細胞、神経膠星状芽細胞、および他の星状腫瘍細胞の混合物で構成される迅速に増殖する腫瘍である、多形性神経膠芽腫の形態である。原発性ＣＮＳ腫瘍である星状細胞腫は、脳幹、小脳、および大脳で見つかることが多い。未分化星状細胞腫および多形性神経膠芽腫は、一般に大脳に存在する。本発明は、新生細胞のアポトーシスを促進するための方法であって、新生細胞をＡＴＦ５阻害物質と接触させることを含む方法をさらに提供する。新生細胞は、乳房、卵巣、子宮内膜、胃、結腸、肝臓、膵臓、腎臓、膀胱、前立腺、精巣、皮膚、食道、舌、口、耳下腺、喉頭、咽頭、リンパ節、肺、ならびに脳からなる群から選択することができる。一実施形態では、新生細胞は、神経膠芽腫、星状細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、および神経芽細胞腫からなる群から選択される。
【００５０】
例えば、限定されるものではないが、ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５（１〜３μＭの範囲）に感受性があると試験によって示された細胞株としては、Ｕ８７（ヒト神経膠芽腫）；Ｕ３７３（ヒト神経膠芽腫）；ＬＮ２２９（ヒト神経膠芽腫）；Ｃ６（ラット神経膠芽腫）；Ｍｅｌ５０１（ヒトメラノーマ）；Ｈ２４５２（ヒト中皮腫）；ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ヒト乳癌）が挙げられる。さらに、ＰＥＮ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５（３μＭ）に感受性があると試験によって示された細胞株の非限定的リストとしては、Ｐａｎｃ−１（ヒト膵臓癌）；ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ヒト神経芽細胞腫細胞）；およびＨＣＴ−１１６（結腸癌）が挙げられる。本発明の方法は、インビトロおよび被験体においてインビボで実施することができる。本明細書で使用する場合、「アポトーシス」とは、全面的にまたは部分的に遺伝的に制御される細胞死を指す。
【００５１】
以下の実施例で概略を示すように、特定のＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５組成物は、種を越えて有効な抗新生物剤であり、例えば、ラット／マウスのＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、ヒト癌に対して有効である。したがって、ある実施形態では、ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、ラットまたはマウスのｄ／ｎ−ＡＴＦ５ペプチド配列を含むことができ、被験体は、これに限定されるものではないが、哺乳動物（例えば、ヒト、家畜、または商業動物）を含む任意の動物であってよい。ある実施形態では、ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、ラットまたはマウスのｄ／ｎ−ＡＴＦ５ペプチド配列を含むことができ、かつ被験体はヒトである。
【００５２】
本発明の方法によると、ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、限定されるものではないが、経口投与、非経口投与、鼻腔内投与、および経皮投与を含む、公知の手順によりヒトまたは動物の被験体に投与することができる。好ましくは、阻害物質または因子は、頭蓋内、脊髄内、髄腔内、または皮下への注射によって非経口的に投与される。
【００５３】
４．３  ｄ／ｎ−ＡＴＦ５医薬組成物
経口投与のために、ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、カプセル剤、錠剤、粉剤、顆粒剤として、または懸濁剤として製剤化することができる。ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５製剤は、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ、またはジャガイモデンプンなどの従来の添加剤を含むことができる。ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５製剤にはまた、結晶セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、コーンスターチ、またはゼラチンなどの結合剤を添加することができる。加えて、ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５製剤に、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤を添加することができる。ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５製剤にはまた、無水リン酸水素カルシウムまたはデンプングリコール酸ナトリウムを添加することができる。最終的に、ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５製剤に、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど滑沢剤を添加することができる。
【００５４】
非経口投与（すなわち、消化管以外の経路を介した注射による投与）のために、ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、被験体の血液と好ましくは等張である無菌水溶液と混合することができる。そのようなＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５製剤は、塩化ナトリウム、グリシン等の生理学的に適合する物質を含有し、生理学的条件に適合するｐＨに緩衝化された水に、固体の有効成分を溶解して水溶液を作製し、次いで前記溶液を滅菌することにより調製することができる。ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５製剤は、密封したアンプルまたはバイアルなどの単回用量または複数回用量の容器に入れることができる。ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５製剤は、限定されるものではないが、筋膜上、嚢内、頭蓋内、皮内、髄腔内、筋肉内、眼窩内、腹腔内、脊髄内、胸骨内、血管内、静脈内、柔組織内、皮下、舌下を含む、任意の注射方式により送達することができる。
【００５５】
ある実施形態では、ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５製剤は、鼻腔内送達のために調製される。鼻投与のために、ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５製剤を含む溶液または懸濁液は、例えば点滴器、ピペット、またはスプレーによる従来の手段により鼻腔に直接適用するように調製することができる。定量噴霧式吸入器（ＭＤＩ）による吸入など、点鼻用組成物を送達するための他の手段もまた、本発明に従って用いることができる。いくつかのタイプのＭＤＩが、吸入による投与のために常用される。これらのタイプの装置としては、呼吸始動型ＭＤＩ、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、ＭＤＩと組み合わせたスペーサー／保持チャンバー、およびネブライザーを挙げることができる。本明細書で使用する「ＭＤＩ」という用語は、例えば、場合によっては１つまたは複数の賦形剤を含む噴霧剤に溶解または懸濁した活性薬剤を含有するキャニスター、定量バルブ、アクチュエータ、およびマウスピースを含む吸入送達システムを指す。キャニスターには通常、点鼻用組成物などの活性薬剤および１種または複数のヒドロフルオロアルカンなどの噴霧剤の溶液または懸濁液が充填されている。アクチュエータが弱められると、溶液の一定量が、吸入のためにエアロゾル化される。活性薬剤を含む粒子は、マウスピースの方へ推進された後、そこで被験体により吸入され得る。この製剤は、単回用量形態または複数回用量形態で提供することができる。例えば、点滴器またはピペットの場合には、これは、患者が溶液または懸濁液の適切な所定容量を投与することによりなされてもよい。スプレーの場合には、これは、例えば一定量を霧化する噴霧器によってなされてもよい。鼻への送達および保持を改善するために、本発明による成分は、シクロデキストリンでカプセル化するか、または鼻粘膜への送達および保持を増強すると期待される薬剤と共に製剤化することができる。
【００５６】
本発明の組成物の鼻投与に用いられるかまたはそれに適し得る市販の投与装置としては、ＡＥＲＯＮＥＢ（商標）（Ａｅｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＡＥＲＯＮＥＢ  ＧＯ（商標）（Ａｅｒｏｇｅｎ）；ＰＡＲＩ  ＬＣ  ＰＬＵＳ（商標）、ＰＡＲＩ  ＢＯＹ（商標）Ｎ、ＰＡＲＩ（商標）ｅｆｌｏｗ（米国特許第６，９６２，１５１号明細書に開示されたネブライザー）、ＰＡＲＩ  ＬＣ  ＳＩＮＵＳ（商標）、ＰＡＲＩ  ＳＩＮＵＳＴＡＲ（商標）．、ＰＡＲＩ  ＳＩＮＵＮＥＢ（商標）、ＶｉｂｒＥＮＴ（商標）、およびＰＡＲＩ  ＤＵＲＡＮＥＢ（商標）（ＰＡＲＩ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、Ｉｎｃ．、Ｍｏｎｔｅｒｅｙ、Ｃａｌｉｆ．またはＭｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；ＭＩＣＲＯＡＩＲ（商標）（Ｏｍｒｏｎ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｉｎｃ、Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ、Ｉｌｌ．）、ＨＡＬＯＬＩＴＥ（商標）（Ｐｒｏｆｉｌｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）、ＲＥＳＰＩＭＡＴ（商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＡＥＲＯＤＯＳＥ（商標）（Ａｅｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）、ＯＭＲＯＮ  ＥＬＩＴＥ（商標）（Ｏｍｒｏｎ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｉｎｃ、Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ、Ｉｌｌ．）、ＯＭＲＯＮ  ＭＩＣＲＯＡＩＲ（商標）（Ｏｍｒｏｎ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｉｎｃ、Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ、Ｉｌｌ．）、ＭＡＢＩＳＭＩＳＴ（商標）ＩＩ（Ｍａｂｉｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｉｎｃ、Ｌａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ、Ｉｌｌ．）、ＬＵＭＩＳＣＯＰＥ（商標）６６１０、（Ｔｈｅ  Ｌｕｍｉｓｃｏｐｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｃ、Ｅａｓｔ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、Ｎ．Ｊ．）、ＡＩＲＳＥＰ  ＭＹＳＴＩＱＵＥ（商標）、（ＡｉｒＳｅｐ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｕｆｆａｌｏ、Ｎ．Ｙ．）、ＡＣＯＲＮ−１（商標）およびＡＣＯＲＮ−ＩＩ（商標）（Ｖｉｔａｌ  Ｓｉｇｎｓ、Ｉｎｃ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．）、ＡＱＵＡＴＯＷＥＲ（商標）（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ａｄｅｌ、Ｉｏｗａ）、ＡＶＡ−ＮＥＢ（商標）（Ｈｕｄｓｏｎ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｃａｒｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、ＡＥＲＯＣＥＬＬ（商標）使い捨てカートリッジを利用するＡＥＲＯＣＵＲＲＥＮＴ（商標）（ＡｅｒｏｖｅｃｔＲｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｔｌａｎｔａ、Ｇａ．）、ＣＩＲＲＵＳ（商標）（Ｉｎｔｅｒｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ、Ｎ．Ｙ．）、ＤＡＲＴ（商標）（Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ、Ｓ．Ｃ．）、ＤＥＶＩＬＢＩＳＳ（商標）ＰＵＬＭＯ  ＡＩＤＥ（ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ  Ｃｏｒｐ；Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、Ｐａ．）、ＤＯＷＮＤＲＡＦＴ（商標）（Ｍａｒｑｕｅｓｔ、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ、Ｃｏｌｏ．）、ＦＡＮ  ＪＥＴ（商標）（Ｍａｒｑｕｅｓｔ、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ、Ｃｏｌｏ．）、ＭＢ−５（商標）（Ｍｅｆａｒ、Ｂｏｖｅｚｚｏ、Ｉｔａｌｙ）、ＭＩＳＴＹ  ＮＥＢ（商標）（Ｂａｘｔｅｒ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．）、ＳＡＬＴＥＲ  ８９００（商標）（Ｓａｌｔｅｒ  Ｌａｂｓ、Ａｒｖｉｎ、Ｃａｌｉｆ．）、ＳＩＤＥＳＴＲＥＡＭ（商標）（Ｍｅｄｉｃ−Ａｉｄ、Ｓｕｓｓｅｘ、ＵＫ）、ＵＰＤＲＡＦＴ−ＩＩ（商標）（Ｈｕｄｓｏｎ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｃａｒｅ；Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、ＷＨＩＳＰＥＲ  ＪＥＴ（商標）（Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ、Ｃｏｌｏ．）、ＡＩＯＬＯＳ（商標）（Ａｉｏｌｏｓ  Ｍｅｄｉｃｎｎｓｋ  Ｔｅｋｎｉｋ、Ｋａｒｌｓｔａｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）、ＩＮＳＰＩＲＯＮ（商標）（Ｉｎｔｅｒｔｅｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｂａｎｎｏｃｋｂｕｒｎ、Ｉｌｌ．）、ＯＰＴＩＭＩＳＴ（商標）（Ｕｎｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．、ＭｃＡｌｌｅｎ、Ｔｅｘ．）、ＰＲＯＤＯＭＯ（商標）およびＳＰＩＲＡ（商標）（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｃａｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｈａｍｅｅｎｌｉｎｎａ、Ｆｉｎｌａｎｄ）、ＡＥＲｘ（商標）Ｅｓｓｅｎｃｅ（商標）およびＵｌｔｒａ（商標）、（Ａｒａｄｉｇｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈａｙｗａｒｄ、Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＮＩＫ（商標）ＬＤＩネブライザー（Ｅｖｉｔ  Ｌａｂｓ、Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＡＣＣＵＳＰＲＡＹ（商標）（ＢＤ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅ、Ｎ．Ｊ．）、ＶｉａＮａｓｅ  ＩＤ（商標）（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ａｔｏｍｉｚｅｒ；Ｋｕｒｖｅ、Ｂｏｔｈｅｌｌ、Ｗａｓｈ．）、ＯｐｔｉＭｉｓｔ（商標）装置またはＯＰＴＩＮＯＳＥ（商標）（Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）、ＭＡＤ  Ｎａｓａｌ（商標）（Ｗｏｌｆｅ  Ｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｉｎｃ．、Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ、Ｕｔａｈ）、Ｆｒｅｅｐｏｄ（商標）（Ｖａｌｏｉｓ、Ｍａｒｌｙ  ｌｅ  Ｒｏｉ、Ｆｒａｎｃｅ）、Ｄｏｌｐｈｉｎ（商標）（Ｖａｌｏｉｓ）、Ｍｏｎｏｐｏｗｄｅｒ（商標）（Ｖａｌｏｉｓ）、Ｅｑｕａｄｅｌ（商標）（Ｖａｌｏｉｓ）、ＶＰ３（商標）およびＶＰ７（商標）（Ｖａｌｏｉｓ）、ＶＰ６  Ｐｕｍｐ（商標）（Ｖａｌｏｉｓ）、Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｕｍｐｓ（商標）（Ｉｎｇ．Ｅｒｉｃｈ  Ｐｆｅｉｆｆｅｒ、Ｒａｄｏｌｆｚｅｌｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＡｍＰｕｍｐ（商標）（Ｉｎｇ．Ｅｒｉｃｈ  Ｐｆｅｉｆｆｅｒ）、Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｐｕｍｐ（商標）（Ｉｎｇ．Ｅｒｉｃｈ  Ｐｆｅｉｆｆｅｒ）、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ  Ｆｒｅｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｉｎｇ．Ｅｒｉｃｈ  Ｐｆｅｉｆｆｅｒ）、Ｕｎｉｔ  Ｄｏｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｉｎｇ．Ｅｒｉｃｈ  Ｐｆｅｉｆｆｅｒ）、Ｂｉｄｏｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｉｎｇ．Ｅｒｉｃｈ  Ｐｆｅｉｆｆｅｒ）、Ｂｉｄｏｓｅ  Ｐｏｗｄｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｉｎｇ．Ｅｒｉｃｈ  Ｐｆｅｉｆｆｅｒ）、Ｓｉｎｕｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（商標）（Ａｅｒｏｓｏｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＣｈｉＳｙｓ（商標）（Ａｒｃｈｉｍｅｄｅｓ、Ｒｅａｄｉｎｇ、ＵＫ）、Ｆｉｔ−Ｌｉｚｅｒ（商標）（Ｂｉｏａｃｔｉｓ、Ｌｔｄ、ａ  ＳＮＢＬ  ｓｕｂｓｉｄｉａｒｙ（Ｔｏｋｙｏ、ＪＰ）、Ｓｗｏｒｄｆｉｓｈ  Ｖ（商標）（Ｍｙｓｔｉｃ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）、ＤｉｒｅｃｔＨａｌｅｒ（商標）Ｎａｓａｌ（ＤｉｒｅｃｔＨａｌｅｒ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ならびにＳＷＩＲＬＥＲ（商標）Ｒａｄｉｏａｅｒｏｓｏｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＭＩＣＩ、Ｉｎｃ．、Ｓｐｒｉｎｇ  Ｃｉｔｙ、Ｐａ．）が挙げられる。
【００５７】
経皮投与のために、ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、イソプロパノール、エタノール、オレイン酸、Ｎメチルピロリドン等の皮膚浸透促進剤と組み合わせることができ、皮膚浸透促進剤は、ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５に対する皮膚の透過性を増大させ、ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５が皮膚を通して浸透し、血流に入ることを可能にする。ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５組成物はまた、例えばエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチレン／ビニルアセテート、ポリビニルピロリドン等高分子物質と組み合わせてゲル形態の組成物を提供することができ、ゲル形態の組成物は、塩化メチレンなどの溶媒に溶解し、所望の粘度まで蒸発させ、次いで基材に塗布してパッチを提供することができる。
【００５８】
本発明はまた、ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５を含み、場合によっては薬学的に許容される担体も含む治療用組成物を提供する。薬学的に許容される担体は、組成物の他の成分と適合し、そのレシピエントに有害でないという意味で「許容され」なければならない。本明細書に用いられる薬学的に許容される担体は、医薬製剤に材料として用いられ、かつ鎮痛剤、緩衝剤、結合剤、崩壊剤、希釈剤、乳化剤、賦形剤、増量剤、流動促進剤、可溶化剤、安定剤、懸濁剤、等張化剤、ビヒクル、および粘度増強剤として組み込むことができる種々の有機または無機材料から選択される。必要に応じて、抗酸化剤、芳香剤、着色剤、風味改良剤、防腐剤、および甘味料などの医薬品添加剤も加えることができる。許容される医薬担体の例としては、とりわけ、カルボキシメチルセルロース、結晶セルロース、グリセリン、アラビアゴム、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、粉剤、生理食塩水、アルギン酸ナトリウム、スクロース、デンプン、タルク、および水が挙げられる。
【００５９】
本発明のＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５製剤は、医薬技術分野で周知の方法により調製することができる。例えば、ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、懸濁液または溶液として、担体または希釈剤と合わせることができる。場合によっては、１つまたは複数の副成分（例えば、緩衝剤、香味料、界面活性剤等）も加えることができる。担体の選択は投与経路に依存する。医薬組成物は、本明細書で論じるように、ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５を被験体に投与して、腫瘍および／または新生細胞を治療するために有用になるであろう。ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、医薬組成物が投与される被験体の腫瘍および／または新生細胞を治療するために有効な量で提供される。その量は、上記のように、当業者により容易に決定することができる。
【００６０】
本開示の組成物はさらに他の治療剤を含むことができる。例えば、組成物は１つまたは複数の任意の抗癌剤も含むことができる。ある実施形態では、１つまたは複数の抗癌剤は、アルキル化剤；代謝拮抗剤；微小管阻害剤；トポイソメラーゼ阻害物質、抗生物質、および抗体／抗体−薬物コンジュゲートからなる群から選択される。本開示の組成物中の抗癌剤の量は、ある実施形態では、同様な方法で投与されるそのような薬剤の通常用量に比較して減少させることができる。
【００６１】
本発明はまた、腫瘍および／または新生細胞の治療および／または予防に使用するためのキットを提供する。ある実施形態では、キットはＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５分子および薬学的に許容される担体を含む。ある実施形態では、キットは、投与手段、例えば、以下に限定されるものではないが、ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５の非経口投与用の充填済み注射器、ペン、ポンプ、または他の充填済み装置を含む。ある実施形態では、キットは、鼻腔内送達のために製剤化されたＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５と、以下に限定されるものではないが、定量噴霧式吸入器または本明細書に記載する組成物の鼻投与に用いることができるかまたはそれに適合し得る他の市販投与装置など鼻腔内投与用の手段とを含む。
【００６２】
本発明を以下の実施例で説明するが、これらの実施例は、本発明の理解を助けるために示すものであり、その後に続く特許請求の範囲に定義する、本発明の範囲を少しでも限定するものと解釈されるべきではない。
【００６３】
５．実施例
５．１  ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５の実施例
５．１．１  材料および方法
ｄ／ｎ  ＡＴＦ−５の短縮。ｐＱＣ  ｅＧＦＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５プラスミド（Ａｎｇｅｌａｓｔｒｏら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２００３；２３（１１）：４５９０〜６００を参照のこと）を鋳型として用い、上流プライマー５’−ＴＣＣ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＡ  ＣＣＧ  ＧＴＣ  ＧＣＣ−３’および下流プライマー５’−ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＴＣＡ  ＧＴＴ  ＡＴＣ  ＴＡＣ  ＡＣＴ  ＧＡＣ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＣＴＣ  ＡＧ−３’を用いるＰＣＲは、３’プラスミドから７５塩基対を短縮した。電気泳動的に精製したｅＧＦＰ−ｄ／ｎ  ＡＴＦ５−ｔｒ（ｔｒ＝短縮）ｃＤＮＡを、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結し、ＤＨ５α細胞に形質転換し、ＬＢ寒天−アンピシリンプレート上に播種して青白選択をした。選択したコロニーを、ＬＢ＋アンピシリン中で一晩増幅した。培養物から単離したプラスミド（ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＡｇｅＩおよびＥｃｏＲＶで消化した後、アガロースゲル電気泳動を行ってｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ｔｒの挿入を確認し、挿入断片をＤＮＡシークエンシングに供して確認した。Ａｇｅｌ／ＥｃｏＲＶで消化したｅＧＦＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ｔｒ  ｃＤＮＡを、ＡｇｅＩ／ＥｃｏＲＶ消化の精製ｐＱＣＸＩＸ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）発現ベクターに連結した。この連結混合物を用いてＤＨ５α細菌を形質転換し、その産物を、細菌培養物のミニプレップのＡｇｅＩ／ＥｃｏＲＶ消化およびゲル電気泳動、ならびに未切断プラスミドのＤＮＡシークエンシングにより確認した。ｐＱＣ−ｅＧＦＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ｔｒプラスミドは、Ｍａｘｉｐｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増殖させた。
【００６４】
ＣＰ−６ｘＨｉｓ−Ｐｅｎ−Ｆｌａｇ−タグ付き−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５タンパク質の生成およびバイオアッセイ。細胞透過性−６ｘＨｉｓ−ペネトラチン−Ｆｌａｇ−タグ付き−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ｔｒ（ＣＰ−６ｘＨｉｓ−Ｐｅｎ−Ｆｌａｇ−タグ付き−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ｔｒ）ｃＤＮＡを作製するために、上流プライマー５’−ＴＴＡ  ＡＴＴ  ＡＡＧ  ＣＣＧ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＴＧ  ＣＧＴ  ＣＡＡ  ＡＴＴ  ＡＡＡ  ＡＴＴ  ＴＧＧ  ＴＴＴ  ＣＡＡ  ＡＡＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＴＧＧ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＴＡＣ  ＡＡＧ  ＧＡＣ  ＧＡＴ  ＧＡＴ−３’および下流プライマー５’−  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＧＴＴ  ＡＴＣ  ＴＡＣ  ＡＣＴ  ＧＡＣ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＣＴＣ  ＡＧ−３’ならびに鋳型としてｐＱＣ−Ｆｌａｇ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ｔｒを用いて、最初にＰＣＲを使用した。その産物をゲル電気泳動後に精製し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙクローニングベクターに連結した。これをＤＨ５α細胞に形質転換して白色コロニーを選択した。ミニプレップクローンをＥｃｏＲＶで消化した後、ゲル電気泳動および未切断プラスミドのシークエンシングに供して挿入断片を確認した。Ｎ末端に６ｘＨｉｓタグを挿入するために、Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰ−ｔｒをｐＥＴ−１５ｂ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。ｐＥＴ−１５ｂベクターとｐＧＥＭＴ−Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰ−ｔｒベクターの両方を、Ｎｄｅ−１およびＢａｍＨ１で消化し、切断されたＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰ−ｔｒをゲル電気泳動によりｐＧＥＭＴから分離した。同様に、切断されたｐＥＴ−１５ｂをゲル電気泳動により挿入断片から分離した。ｐＥＴ−１５ｂとＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰ−ｔｒの両方をゲルから切り取り、精製した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結した物質を用いてＤＨ５α細胞を形質転換し、コロニーを選択した。ミニプレップコンストラクトをＸｂａ−１およびＥｃｏＲＶで消化し、ゲル電気泳動を用いて、ベクターおよびＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰ挿入断片の存在を確認した。ｐＥＴ−１５ｂ−Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰについて、正しい配向および配列を、ＤＮＡシークエンシングにより確認した。
【００６５】
ＣＰ−６ｘＨｉｓ−Ｐｅｎ−Ｆｌａｇ−タグ付き−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５タンパク質を生成させるために、発現コンストラクトをＢＬ２１  ＤＥ３  ｐＬｙｓＳ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。コロニーを選択してＬＢで増幅した。ペプチド産生を１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。一旦タンパク質誘導を確認したならば、界面活性剤ベースのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ）で抽出を行った。Ｐｅｎ−Ｆｌａｇ−タグ付き−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５ペプチドの単離および精製は、そのＮ末端の６ｘＨＩＳタグおよびコバルトスピンカラムシステム（ＨｉｓＰｕｒ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて行った。精製したペプチドは、Ｚｅｂａ脱塩スピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）またはＧ−２５セファデックス（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ）を用いて、脱塩しＰＢＳに緩衝液交換した。脱塩したタンパク質は、０．２０μｍのポリエーテルスルホン膜シリンジフィルター（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）を用いて、滅菌濾過した。最後に、このペプチドを、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４遠心濾過装置（分子量３０００カットオフ）を用いて、１〜２ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【００６６】
対照ペプチド（Ｐｅｎ−Ｆｌａｇ−タグ付き−対照）は、上流プライマー５’−ＣＣＣＧＧＧＣＡＴＡＴＧＣＧＴＣＡＡＡＴＴＡＡＡＡＴＴＴＧＧＴＴＴ−３’および下流プライマー５’−ＣＴＣＧＡＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＴＡＴＣＴＡＧＴＣＴＧＧＧＴＣＴＣＴＴＣＣ−３’のＰＣＲを用いて、コンストラクトのｄ／ｎ−ＡＴＦ５部分を除去することにより、同じ方法論を用いて作製し生成させた。
【００６７】
質量分析法。名目分子量測定のためのリニア型ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析：マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）測定値は、２００ＨｚのＮＤ−ＹＡＧレーザー源（３５５ｎｍ）を装備したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計（４７００  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）で得た。等量のＭＡＬＤＩマトリックス（５０％ＡＣＮ／０．１％ＦＡ、Ｆｌｕｋａ）を載せたＭＡＬＤＩプレート上に試料をスポットし、風乾した。機器は２０ｋＶの加速電圧で操作した。４，０００レーザーショットのシグナルを平均化してスペクトルを得た。正イオンリニアモードで質量範囲１０，０００〜６０，０００ｍ／ｚとして質量スペクトル分析を行った。データは、Ｄａｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ４．５（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）によりさらに詳細に分析した。
【００６８】
ＬＣ−ＭＳ分析：Ａｅｒｉｓ  Ｗｉｄｅｐｏｒｅ  ＸＢ−Ｃ８カラム（３．６μ、２．１０×５０ｍｍ）に試料を注入した。標準逆相勾配を２５０μｌ／分の流速で８分を超えて流し、プロファイルモードのＬＴＱ−ＯｒｂｉｔｒａｐＸＬ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）により溶出液をモニターした。Ｉｏｎ  Ｍａｘ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）をエレクトロスプレーイオン源として用い、イオン源パラメーターを、５ｋＶのスプレー電圧、２７５℃のキャピラリー温度、および２０のシースガス設定とした。スペクトルデータを、ロックマス機能を用い、１５，０００ＦＷＨＭの分解能設定で得た。
【００６９】
ｐＱＣ−ｅＧＦＰ−ｄ／ｎ  ＡＴＦ−５−ｔｒ生成物（Ｃ−末端短縮ｄ／ｎ−ＡＴＦ５）の生物活性。精製ｐＱＣ−ｅＧＦＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ｔｒ、完全長ｐＱＣ−ｅＧＦＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５陽性対照、またはｐＱＣ−ｅＧＦＰ陰性対照のプラスミドを、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、２４ウェルプレート中のラットＣ６グリア細胞にトランスフェクトした。４８時間後、ＤＡＰＩで細胞を染色し、１０ヶ所のランダムな領域を蛍光顕微鏡下にて４０倍で観察した。断片化した凝縮染色質を示す細胞をアポトーシスとしてスコア化し、全細胞数に対して数量化した（ｎ＝３回の独立した実験）。
【００７０】
細胞透過性（ＣＰ）−６ｘＨｉｓ−Ｐｅｎ−Ｆｌａｇ−タグ付き−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５のバイオアッセイ。ペプチドのバイオアッセイのために、ラットＣ６神経膠芽腫細胞を無血清ＤＭＥＭ中で２時間、次いで、３μＭペネトラチン（Ｐｅｎ）−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰペプチドまたは（ペネトラチン）Ｐｅｎ−対照−ＲＰを含むまたは含まないＤＭＥＭ／０．５％ＦＢＳ中で維持した。５日後、細胞をＤＡＰＩで染色し、アポトーシス細胞のパーセントを上記のように決定した。
【００７１】
内部移行したＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰ（組換えタンパク質）のイメージング。ラットＣ６細胞（Ｊｅｆｆ  Ｂｒｕｃｅ；Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ由来；ラット脳への移植によって２００４年に認証された、Ａｎｇｅｌａｓｔｒｏら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００６；２５（６）：９０７−１６）およびＵ８７細胞（ＡＴＣＣから購入および認証）を、フィブロネクチンコーティングの共焦点顕微鏡カバーグラス上に播種し、一晩維持した。Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰまたはＰｅｎ−対照−ＲＰのそれぞれ３μＭをウェルに加え、１、２、４、または２４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄して細胞外ペプチドを除去し、一次マウス抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で一晩染色した後、二次抗マウスＡｌｅｘａ−５６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に２時間インキュベートした。顕微鏡としては、Ａｘｉｏｃａｍビデオキャプチャーを装着したＣａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００、またはＨｕｙｇｅｎｓ  Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅにより増強された０．１μｍ光学切片のＤｅｌｔａ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ顕微鏡を用いた。ｘｙおよびｙｚ平面の画像から、Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰ染色とＤＡＰＩ染色との共局在が確認された。
【００７２】
レトロウイルス誘発マウス神経膠芽腫モデルおよびＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰによる処置。以前に記載されるように（Ａｒｉａｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０１２；３１（６）：７３９〜５１）、成体マウスに麻酔をかけ、ＰＤＧＦ−Ｂおよびｐ５３−ｓｈＲＮＡを発現するレトロウイルスの定位固定注射を行って、悪性神経膠腫を発生させた。鎮痛剤を外科手術直後に投与した。外科手術後および５２〜４３８日間に及ぶ試験期間を通して注射したマウスをモニターした。Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰまたはＰｅｎ−対照−ＲＰを、１〜２時間の間隔を置いた４回の皮下注射または腹腔内注射の処置で担癌動物に投与した。用量は、各注射につき１ｍｇ／ｋｇ（２００μｌ、０．９％生理食塩水）とした。示される一部の実験では、５日後に投薬を繰り返した。同じ投薬スケジュールおよび容量で０．９％生理食塩水を注射した動物を、対照として用いた。
【００７３】
脳の薄切および染色。以前に記載されるように（Ａｒｉａｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０１２；３１（６）：７３９−５１）、マウスに深いイソフルラン麻酔をかけて安楽死させた後、１０％ホルマリンによる経心腔的灌流を行った。脳を４％パラホルムアルデヒドで固定し、３０％スクロース中で一晩インキュベートし、ＯＣＴ培地中にマウントし、凍結して１４μｍ冠状断面に切断した。示される他の場合には、潅流したマウスの脳を１０％ホルマリン／ＰＢＳ中で４〜７日間インキュベートした後、パラフィン包埋した。パラフィン切片を記載のように（Ｓｃｈｒｏｔら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ  ２００７；８５（２）：１４９〜５７）抗原検索に供した。切片をＤＡＰＩおよび以下のもので染色した：抗Ｆｌａｇ  Ｍ２（１：２００；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ウサギ抗Ｆｌａｇ（１：１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギ抗ＨＡ（４μｇ／ｍｌ；ｓｃ〜８０５  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、またはＴＵＮＥＬ（Ｒｏｃｈｅ）および抗Ｆｌａｇ  Ｍ２。切片を、ＤＡＰＩフィルターおよび免疫蛍光法（Ａｌｅｘａ  ４８８／５６８；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で視覚化するか、またはジアミノベンジジンもしくはファーストレッド（Ｍａｃｈ２；Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）で比色定量的に視覚化し、Ａｘｉｏｃａｍビデオ装着Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００で撮影した。
【００７４】
ＭＲＩ分析。麻酔（イソフルランおよび酸素）したマウスに、３０ゲージカテーテルを静脈内に差し込み、最初に頭部の位置を決めて、スキャナベッドに腹臥させた。ＭＲＩの取得は、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｅｃ  ７テスラマグネットを作動させるＰａｒａｖｉｓｉｏｎ  ｖ５．１上で行い、統合シム制御による１１６ｍｍ直径の勾配を供給した。最大勾配強度は４５０ｍＴ／ｍとした。脳をイメージングするために交差コイル配置を用い、ＲＦ送信のために７２ｍｍＩＤの直線状コイルを、またＲＦ受信のために４チャネルフェーズドアレイコイルを用いた。造影前の像および造影後１分の像をＦＬＡＳＨ＿３Ｄｓｌａｂで得た。ガドリニウムを、１μｌ／ｇ体重の用量で静脈内注射した。
【００７５】
５．１．２  結果
細胞透過性形態のｄ／ｎ−ＡＴＦ５の作製。
全身に送達できる可能性のある改変された細胞透過性形態のｄ／ｎ−ＡＴＦ５を、本明細書に概説するように調製した。これには、迅速な生体内分布、低下した免疫応答、血液脳関門の通過、細胞への侵入、および広範に分散した腫瘍に到達する能力という潜在的な利点がある。最初のｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、ＤＮＡ結合ドメインに置き換わる、７番目の残基ごとのロイシン反復を含む両親媒性α−ヘリックス配列を有する野性型ロイシンジッパードメインを含む、Ｎ−末端短縮形態のＡＴＦ５である［Ａｎｇｅｌａｓｔｒｏら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２００３；２３（１１）：４５９０〜６００］。得られたタンパク質は、増強されたロイシンジッパー領域を介してＡＴＦ５およびその結合相手と相互作用することができるが、ＤＮＡとは相互作用できず、その結果、ＡＴＦ作用の有効なｄ／ｎサプレッサーとして作用する［Ａｎｇｅｌａｓｔｒｏら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２００３；２３（１１）：４５９０〜６００；Ｖｉｎｓｏｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １９９３；７（６）：１０４７〜５８］。Ｎ末端ドメインが欠失すると、分解に対してｄ／ｎ−ＡＴＦ５が実質的に安定化する［Ｌｅｅら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１２；７２（６）：７８９〜８０４；Ｕｅｋｕｓａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２００９；３８０（３）：６７３〜８］。送達可能形態のｄ／ｎ−ＡＴＦ５を設計するために、Ｃ末端の２つのバリン／バリン７アミノ酸反復を含む、タンパク質の最後の２５アミノ酸を最初に短縮した。この欠失コンストラクトをＣ６神経膠芽腫細胞にトランスフェクトすると、アポトーシスの促進において、完全長ｄ／ｎ−ＡＴＦ５と同等の有効性が示された（図１）。
【００７６】
細胞透過性形態のＣ末端短縮ｄ／ｎ−ＡＴＦ５（ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ｔｒ）を作製するために、６ｘヒスチジン反復およびそれに続くペネトラチン配列にＮ末端で融合した、Ｎ末端Ｆｌａｇ−タグ付きｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ｔｒコンストラクトを設計した（図２Ａ）。ペネトラチン配列は、生体膜を通した、融合した積荷の細胞内への通過を可能にするアンテナペディアホメオドメインタンパク質由来の１６アミノ酸モチーフである［Ｄｕｐｏｎｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１１；６８３：２１−９．］。ミリグラム量のタンパク質（Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５組換えタンパク質（ＲＰ）と称する）を、細菌中での発現、それに続く６ｘＨｉｓ配列を用いるコバルト樹脂親和性クロマトグラフィーによる精製により得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥから、精製した調製物が９５％超の均一性を有し、凝集したタンパク質多量体のように見えるものを含む微量な化学種を伴うことが示された。Ｎ‐ホルミルメチオニンの細菌による通常の除去によりＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰの推定分子量は１２，９４９．１８Ｄａであるが、主要な精製産物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより２５〜２８ＫＤａの間の見かけの分子量を示す（図２Ａ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したとき、野生型ＡＴＦ５およびＡＴＦ５ロイシンジッパーは泳動が異常であることがあり、そのため、高分解能ＬＣ−ＨＲＭＳを用いて、Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰの正確な分子量およびその溶液状態を確認した。デコンボリューションしたスペクトルから、最も多い形態は予測される１２，９４８．７Ｄａの単量体であり、２５，８９７．５Ｄａの二量体は少量であることが明らかになった（図２Ｂ）。以前の試験では、組換え野生型の完全長ＡＴＦ５またはＡＴＦ５のｂｚｉｐドメインがインビトロで二量体を形成できることが示された。最後に、Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰに対する対照として、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ｔｒ配列を欠くペプチド（Ｐｅｎ−対照−ＲＰ）を同様の方法で作製した（図２Ａ）。精製した組換え対照（７，０９９．９８Ｄａの推定分子量を有する）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより７，１００Ｄａの見かけの分子量で泳動した（図２Ａ）。
【００７７】
Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰは、全身投与のために設計されているので、ヒト血清の存在下３７℃での安定性では、８時間で顕著な分解がなく、４８時間までに完全長タンパク質の平均２８％の消失が示された（図２Ｃ）。
【００７８】
Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰは培養神経膠芽腫細胞に迅速に侵入し、そのアポトーシスを引き起こす。
動物実験を実施する前に、Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰが、培養において神経膠芽腫細胞に侵入し、死滅させる能力について確認した。ラットＣ６およびヒトＵ８７神経膠芽腫細胞の血清含有培養物に加えると、Ｐｅｎ−対照−ＲＰとＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰは両方とも、２〜４時間以内に細胞中に容易に検出可能になり、少なくとも２４時間検出可能のままであった（図３Ａ、Ｂ）。共焦点顕微鏡検査から、ペプチドが細胞質および核の両方のコンパートメントに存在することが明らかになった（図３Ａ）。
【００７９】
Ｐｅｎ−対照−ＲＰおよびＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰに曝露したＣ６培養物について、アポトーシス細胞死も評価した。Ｐｅｎ−対照−ＲＰ処理培養物では、無処理培養物と同様なアポトーシス死のバックグラウンドレベルが示されたが、Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰで処理した培養物では、瀕死の細胞が大幅に増加していることが示された（図４）。これらの作用は、ｄ／ｎ−ＡＴＦ５コンストラクトでトランスフェクトしたかまたはＡＴＦ５  ｓｉＲＮＡに曝露した複数のげっ歯類およびヒト神経膠芽腫細胞について以前に報告されたものに類似している［Ａｎｇｅｌａｓｔｒｏら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００６；２５（６）：９０７〜１６；Ａｒｉａｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０１２；３１（６）：７３９〜５１；Ｓｈｅｎｇら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２０１０；１６（６）：６７１〜７；Ｄｌｕｚｅｎら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１１；２８６（９）：７７０５〜１３］。
【００８０】
全身送達されたＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰは、血液脳関門を横断し、細胞に侵入し、神経膠腫細胞の迅速で選択的なアポトーシス死を選択的に誘発する。
原発性脳腫瘍に到達し治療するＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰの能力を試験するために、成体マウス脳へのＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡ／ｓｈＲＮＡ−ｐ５３レトロウイルスの定位固定注射により神経膠腫を発生させるモデルを用いた。腫瘍は、内因性の分裂前駆細胞におそらく由来したものであり、ステージＩＩ〜ＩＶの範囲にある浸潤性ヒト神経膠腫に極めて類似している。腫瘍は、早くも注射後５２日目にＭＲＩにより検出可能であり（以下を参照のこと）、ＨＡタグの存在によって、また高細胞充実性、高色素性核、および上昇したＫｉ６７染色によって組織学的に同定可能であった。
【００８１】
初期セットの実験では、Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰ、生理食塩水、またはＰｅｎ−対照−ＲＰを、１〜２時間の間隔でそれぞれ１ｍｇ／ｋｇの１セット４回の注射で担癌マウスに腹腔内送達した。最後の注射後１６〜６４時間にマウスを屠殺し、固定した脳を抗Ｆｌａｇ抗体で染色してＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰを検出するか、または抗ＨＡで染色してＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡ発現細胞をマークし、またＴＵＮＥＬ法によって瀕死の細胞を同定した。１６時間において、腫瘍細胞と正常な脳細胞（腫瘍とは対側の半球にある）は両方とも、Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰの広範囲な取り込みを示すＦｌａｇ染色を示し、生理食塩水注射についてはシグナルはなかった（図５Ａ〜Ｃ）。Ｆｌａｇ染色は、処置後４０時間でも明白であり、検出可能であったが、６４時間ではレベルが低下した（図６）。正常な脳組織ではＴＵＮＥＬ染色が示されなかったが（図５Ｂ）Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰによる処置後１日目の腫瘍内には広範なＴＵＮＥＬ染色が認められた（図５Ａ）。生理食塩水で処置した動物の腫瘍には、ＴＵＮＥＬシグナルはほとんどまたはまったく観察されなかった（図５Ｃ）。ＴＵＮＥＬおよびＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡ＋腫瘍マーカー染色の共局在は、Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰ処置後６４時間において、依然として明白であったが、これらのシグナルは、このペプチドで１６時間処置した細胞（図５Ａ）またはＰｅｎ−対照−ＲＰペプチド（図５Ｄ）で処置した細胞と比較すると、細胞の変性および断片化（図５Ｅ）を示した。
【００８２】
Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰ投与の潜在的な長期の治療効力を高めるために、担癌動物に２セットの皮下注射をそれぞれ上記のように、５日空けて施す処置プロトコールを考案した。第２の処置（最初の処置後７日目）後２日目に評価したマウスの腫瘍は、１セットの処置後６４時間のように、細胞の変性および断片化を示す、ＨＡおよびＴＵＮＥＬ染色のパターンを示した（図５Ｆ）。
【００８３】
上記２回処置レジメンの完了後１日目（ｎ＝２）または２日目（ｎ＝２）における非担癌動物の全身剖検から、内部臓器に対する明白な病理学的病変および大脳または小脳の明白な異常は示されなかった（図７および表１）。加えて、第２セットのＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰ注射後１日目に実施した肝臓腎臓血清化学パネルからは、いずれの器官にも損傷は示されなかった（表１；ｎ＝２）。
【００８４】
表１  −  Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰで処置したマウスに関する器官の肉眼的剖検、組織切片のヘマトキシリン‐エオジン染色、および肝臓腎臓機能血液パネルの結果
【表１−１】
2016516669.tif 000027
表示した器官を、本文に記載するように、Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰによる２セットの皮下処置のうちの第２の処置後１日目、２日目、および６ヶ月超（図３およびＳ９における、腫瘍が根絶されたマウスに対応して、それぞれ１９０日目および１８３日目）において屠殺したマウスから摘出した。６ヶ月超の動物には、処置前にＭＲＩで検出された腫瘍があったが、屠殺時には組織学的に検出可能な腫瘍はなかった。他のすべての動物は、担癌ではなかった。対照マウスは無処置であった。これらの器官について、肉眼的な病理変化を評価し、次いで固定しパラフィン包埋して、スライドにマウントする５μｍ切片の調製に用いた。スライドをヘマトキシリン‐エオジン染色し、可能な病理変化について顕微鏡で検査した。切片の肉眼的な病理分析および評価は、ｔｈｅ  ＵＣ  Ｄａｖｉｓ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ＭｅｄｉｃｉｎｅにおけるＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにより実施された。＊注射の間の不注意による注射針貫通による、肝臓の局所的凝固壊死および肺の限局的線状肺炎が観察された。
表１続き−肝臓腎臓機能パネル
【表１−２】
2016516669.tif 000028
肝臓腎臓機能パネルについて、血液試料は、本文に記載するように、Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰによる２セットの皮下処置のうちの第２の処置後１日目に得た。動物は非担癌であった。分析は、ｔｈｅ  ＵＣ  Ｄａｖｉｓ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ＭｅｄｉｃｉｎｅにおけるＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにより実施された。系統（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）範囲についてのデータは、ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＭｏｕｓｅ  Ｐｈｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（http://phenome.jax.org/db/q?rtn=meas/catlister&req=Dblood--clinical%20chemistryqqq44&reqstrainid=7）から得た。
【００８５】
全身送達されたＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰは、ＭＲＩおよび組織診断により示されるように、再発を起こすことなく、マウス神経膠腫の迅速な退縮を促進する。Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰの全身投与がマウスモデルにおいて神経膠腫の長期の退縮を促進したか否かについて評価した。これを達成するために、ＭＲＩ（造影後増強３Ｄ  ＦＬＡＳＨ  Ｔ１重み付き）を用いて、Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰ、Ｐｅｎ−対照−ＲＰによる処置前および処置後の種々の時点で、または無処置において、腫瘍を評価した。多くの症例において、腫瘍は、処置前に多病巣性であるかまたは両半球に存在していた（図８、９、１０、および１１）。ペプチドは、上記の２つの処置プロトコールを用いて皮下注射した。腫瘍の存在をＭＲＩにより確認して、無作為に割り当てて初めて、処置を開始した。
【００８６】
予想されるように、無処置動物（ｎ＝５）またはＰｅｎ−対照−ＲＰ（ｎ＝４）で処置した動物では、ＭＲＩにより評価すると、腫瘍退縮はいずれの症例でも観察されなかった。対照ペプチドで処置した動物についての典型例を図８に示す。腫瘍の存在は、瀕死の挙動を示した後に死亡したかもしくは屠殺した動物または試験終了点（ＭＲＩ腫瘍検出後６ヶ月）以降も生存した動物の脳に対する組織診断により確認した。腫瘍はＨＡ＋であり（図８Ｅおよび１０）、これにより、タグ付きＰＤＧＦ−Ｂの存在が示され、また高色素性核（図８Ｄ）および神経膠腫に典型的な上昇したＫｉ６７染色（図８Ｆ）を示した。浸潤性腫瘍の境界はＭＲＩ画像と一致した（図８）。
【００８７】
Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰで処置したマウスについて、ＭＲＩは、処置後８日目（モニターした最初の時点）に腫瘍シグナルの顕著な減少（２／５；図９および図１１）または検出不可能（３／５）を示し、また３週間以内に検出可能な腫瘍シグナルの完全な消失（ｎ＝７／７）を示した。ペプチド処置後１７６〜２２５日目にＭＲＩにより評価すると、評価した７／７のマウスで腫瘍がなかった（例えば、図８、図１１、および図１２Ｂを参照のこと）。したがって、Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰ処置は、少なくとも６〜７ヶ月間、ＭＲＩで検出可能な再発もなく、神経膠腫を迅速に排除するように見えた。
【００８８】
死後の組織診断（ｎ＝６；処置後１８３〜２５９日目；腫瘍検出後１９０〜３０５日目）は、腫瘍退縮／根絶のＭＲＩ所見に確証を与えた（図８、１１、および１２Ｃ）。脳の残りの部分のように、ＭＲＩにより最初腫瘍陽性であった領域には、高色素性核または高細胞充実性または上昇したＫｉ６７染色がないことが示された（図８および図１１）。ＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡ＋に対する染色もなかった（まれな散在した単一細胞以外）（図８および図１１）。しかしながら、ＧＦＡＰ＋細胞の増殖巣があり、これによって、腫瘍が存在した領域における神経膠の活性化および瘢痕が示唆される（図８および図１１）。
【００８９】
全身送達されたＰｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰは、正常な脳および組織の完全性を維持しながら、長期生存を促進する。Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰで処置した８匹の担癌マウスはすべて、腫瘍の検出後、試験の名目上の１８０日終了点まで生存した（図１２Ａ）。これに対して、対照マウスは６／９がこの期間内に死亡した。過去の試験では、マウスの４０％（ｎ＝１６）が腫瘍惹起の１８０日以内に死亡した［Ａｒｉａｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０１２；３１（６）：７３９〜５１］。
【００９０】
Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰ処置後６〜８ヶ月に組織診断のために屠殺した６匹のマウスに加えて、２匹の動物を処置後１２ヶ月間維持した。
【００９１】
腫瘍の非存在および前に腫瘍が局在した領域における神経膠の瘢痕の存在以外に、Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰ処置後６〜８ヶ月に屠殺した動物の脳のヘマトキシリン‐エオジン染色は、明白な異常を示さず、また脳室下帯と海馬顆粒細胞下帯は両方とも正常に見えた（図７）。加えて、屠殺前の処置マウスの体重は、ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＭｏｕｓｅ  Ｐｈｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（http://phenome.jax.org/db/q?rtn=strains/details&strainid=7）に示されている同年齢の対照の平均体重の１標準偏差以内か（４／６）またはそれを超えていた（２／６）。２匹のマウスはまた、処置の６ヶ月超（図８および図１１における腫瘍が根絶されたマウスに対応して、それぞれ１９０日目および１８３日目）において全身剖検に供した。病理変化は、検査した器官のいずれにも観察されなかった（表１）。
【００９２】
５．１．３  考察
本明細書に提示した所見から、Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰは、培養ＧＢＭ細胞に侵入し、アポトーシス活性を促進すること、ならびに動物に全身投与すると、血液脳関門を横断し、脳そして腫瘍細胞に侵入し、正常組織に外見上障害を与えることなく、大量の腫瘍細胞死および長期の腫瘍退縮／根絶を引き起こすことが示される。
【００９３】
本明細書に提示した試験の別の特徴として、処置した担癌動物が少なくとも６〜１２ヶ月間生存することがあった。対照的に、対照動物の２／３は、腫瘍検出の１８９日以内に死亡するかまたは病的状態を示し、全匹が死亡時または６ヶ月時点で腫瘍陽性であった。まとめると、本明細書に提示した結果は、細胞透過性形態のｄ／ｎ−ＡＴＦ５を用いて悪性神経膠腫を治療することができる証拠を提供する。
【００９４】
レトロウイルスにより発現されたＰＤＧＦ−Ｂおよびｐ５３  ｓｈＲＮＡによって、おそらくＰＤＧＦ−α−受容体＋神経前駆細胞および乏突起膠細胞前駆体の形質転換によって、悪性神経膠腫が成体マウスに誘導されたモデルが、本試験で用いられた。このような腫瘍は、高悪性度のヒト神経膠腫に類似しており［Ａｒｉａｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０１２；３１（６）：７３９−５１］、後者のように、高度に散在性で比較的大きく、かつ両半球に浸潤することができる。ヒトＧＢＭおよび悪性度の低い神経膠腫におけるＡＴＦ５の広範な発現ならびに生存のためにＡＴＦ５を発現しかつ要求するヒトおよびげっ歯類由来のＧＢＭ細胞株の変種（損傷したｐ５３およびＰＴＥＮを含むものおよび含まないもの）［Ａｒｉａｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０１２；３１（６）：７３９−５１］を考慮すると、本明細書に提示するデータに基づいて、一連の悪性神経膠腫細胞タイプは、細胞透過性ｄ／ｎ−ＡＴＦ５による処置に感受性があると期待される。さらに、悪性神経膠腫はこの試験の焦点であるが、ＡＴＦ５が多種多様な癌腫により発現されること［Ｓｈｅｎｇら、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ２０１０；１（６）：４５７〜６０；Ｃｈｅｎ  Ａら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２０１２；３１（６）：５３２〜７；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００４；２３（２９）：５０８４〜９１．；Ｋｏｎｇら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１１；２（５）：８２７〜８３１；Ｍｏｎａｃｏら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００７；１２０（９）：１８８３〜９０；およびＨｕら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１２；３２（１０）：４３８５〜９４］、および培養試験では、多様な範囲の組織に由来する腫瘍細胞に対してｄ／ｎ−ＡＴＦ５またはＡＴＦ５  ｓｉＲＮＡのアポトーシス作用が示されたこと［Ｓｈｅｎｇら、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ２０１０；１（６）：４５７〜６０；Ｃｈｅｎ  Ａら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２０１２；３１（６）：５３２〜７；Ｍｏｎａｃｏら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００７；１２０（９）：１８８３〜９０；およびＨｕら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１２；３２（１０）：４３８５〜９４］に注目することが重要である。したがって、本明細書に提示するデータに基づくと、多様な範囲の癌が、細胞透過性ｄ／ｎ−ＡＴＦ５による処置に感受性があるであろう。
【００９５】
本試験の重要な側面として、Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰは、腫瘍の退縮／根絶を促進するが、正常組織に対しては明白な有害作用を示さないことがあった。処置動物が明白な作用も受けずに少なくとも６〜１２ヶ月間生存したこと、および明白な急性または長期組織損傷が観察されなかったことは重要である。加えて、Ｐｅｎ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５−ＲＰのいかなる潜在的な負の効果も、処置期間を限定することによって軽減することができる。
【００９６】
５．２  さらなる細胞株およびＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５組成物
５．２．１  ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、培養メラノーマＭＥＬ５０１細胞のアポトーシス死を促進する
ＴＡＴ連結ドミナントネガティブＡＴＦ５ペプチドを、図１３に表示する濃度（μＭ単位）でＭＥＬ５０１メラノーマ細胞の培地に加えた。４日後、細胞をＨｏｅｓｃｈｔ色素で染色すると、細胞はアポトーシス核に比例して染色された。図１０に示すように、ＴＡＴ−ｄ／ｎ／ＡＴＦ５は用量依存的にアポトーシスを促進した。
【００９７】
５．２．２  ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、培養Ｕ３７３神経膠芽腫細胞の内因性ＡＴＦ５の発現を低下させる
ＴＡＴ連結ドミナントネガティブＡＴＦ５ペプチドを、図１４に表示する濃度（μＭ単位）で１日１７時間、Ｕ３７３神経膠芽腫細胞の培地に加え、次いで、細胞を回収して、ウエスタン免疫ブロッティングにより、内因性ＡＴＦ５レベルを分析した。ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５が内因性ＡＴＦ５の発現を大幅に低下させることに注目されたい。腫瘍細胞が生存のために内因性ＡＴＦ５を必要とすることが以前の試験で示されているので、理論に拘束されるものではないが、細胞透過性ＴＡＴ−ＺＩＰペプチドの殺作用の機序は、内因性ＡＴＦ５タンパク質の減少を原因とするものである可能性がある。ＴＡＴ−ＺＩＰペプチドが存在する場合、内因性ＡＴＦ５上のスメアにも注目されたい。これは、ＴＡＴ−ＺＩＰが、内因性ＡＴＦ５のユビキチン化およびプロテアソーム分解を引き起こすことによって内因性ＡＴＦ５を減少させることを示唆する。
【００９８】
５．２．３  ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、細胞死促進遺伝子ＤＤＩＴ３の発現を誘導する
ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５（ＴＡＴ−ＺＩＰ）ペプチドは、種々の腫瘍細胞株において、細胞死促進遺伝子ＤＤＩＴ３（ＣＨＯＰ）の発現を誘導する。図１５に表示する時間および用量（μＭ単位）でＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５により細胞を処理し、次いで、細胞を回収して、ＣＨＯＰおよび他の非応答性タンパク質の発現についてウエスタン免疫ブロッティングにより分析した。すべての場合におけるＣＨＯＰの上昇に注目されたい。ＣＨＯＰは細胞死を誘導することができるので、これらのデータから、ＣＨＯＰタンパク質の誘導が、ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５が腫瘍細胞を死滅させる１つの機序である可能性が示される。
【００９９】
５．２．４  ｓｉＲＮＡによるＣＨＯＰタンパク質のサイレンシングは、ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５からＵ８７細胞を部分的に保護する
ｓｉＲＮＡによるＣＨＯＰタンパク質のサイレンシング（図１６の上部ウエスタン免疫ブロット）により、ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５ペプチドを原因とする死からＵ８７細胞が部分的に保護される。ＣＨＯＰ発現をサイレンシングさせるｓｉＣＨＯＰ（図１６の上部ウエスタン免疫ブロット）または対照ｓｉＲＮＡで細胞を処置した。次いで、それらの細胞をＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５に２日間曝露し、アポトーシス核を有する細胞の割合を評価した。これらのデータから、ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５が腫瘍細胞を死滅させる機序の一部が、その後の死を媒介するＣＨＯＰの発現増大によることが示される。
【０１００】
５．２．ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５はＢＣＬ２細胞生存タンパク質を下方制御する
ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５はＢＣＬ２細胞生存タンパク質を下方制御する。図１７に概略を示すように、培養Ｕ８７ヒト神経膠芽腫細胞を表示濃度（μＭ単位）のＴＡＴＺＩＰ（ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５ペプチド）で３０時間処理した。次いで、細胞を回収して、ウエスタン免疫ブロッティングにより細胞生存タンパク質ＢＣＬ２の発現を評価した。これらの所見から、細胞死促進ＣＨＯＰの上昇に加えて、ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、ＢＣＬ２細胞生存タンパク質のレベルを低下させることによって腫瘍細胞を死滅させる可能性が示される。
【０１０１】
５．９  ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５はテモゾロミドと相乗的に作用して、培養Ｕ８７神経膠芽腫細胞を死滅させる
ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５はテモゾロミド（ＴＭＺ）と相乗的に作用して、培養Ｕ８７神経膠芽腫細胞を死滅させる。図１８に概略を示すように、致死量以下のＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５（ＴＺＩＰ  １μＭ）およびＴＭＺ（５０μＭ）を個々にまたは併用して細胞に加え１日間培養し、次いで、アポトーシス核を有する細胞の割合を評価した。ＴＭＺは現在、ヒトＧＢＭに対する第一選択治療である。このデータから、ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５がＴＭＺの存在下で機能するだけでなく、この２つの薬物が相乗的に作用してＧＢＭ細胞を死滅させることも明らかになる。これにより、ＴＭＺを服用している患者にＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５を投与できることが示唆される。
【０１０２】
５．１０  ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、Ｕ８７、Ｕ３７３、およびＭＳＧ細胞の生存率を低下させる
図１９に概略を示すように、３〜５日間の組換えＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５（３μＭ）処置により、ＭＴＡアッセイを用いて検出されるように、２種のヒトＧＭＢ細胞株および１種のマウスＧＭＢ細胞株の生存率が低下する。
【０１０３】
５．１１  合成ＰＥＮ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、Ｕ８７細胞の生存率を低下させる
図２０に概略を示すように、合成ＰＥＮ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、培養Ｕ８７ヒト神経膠芽腫細胞の生存率を低下させる。ＭＴＡアッセイを用いて検出する場合、表示濃度（μＭ）で５日間の処置。
【０１０４】
５．１２  ＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、Ｕ８７細胞の細胞死を促進する
図２１に概略を示すように、組換えＴＡＴ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、アネキシンＶ／ＰＩ染色およびフローサイトメトリーにより示されるように、培養Ｕ８７ヒト神経膠芽腫細胞の死を促進する。生細胞の割合は、下方左四分区間で示される（対照８８％対処理５８％）。瀕死細胞の割合は、下方右四分区間および上方右四分区間である（対照９％対処理３６％）。
【０１０５】
５．１３  合成ＰＥＮ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、ＧＳ９−６細胞のアポトーシスを促進する
図２２に概略を示すように、合成ＰＥＮ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、培養物中でスフェアとして増殖する初代ＧＳ９−６ヒト神経膠芽腫幹細胞のアポトーシス死を促進する。データは６日間処理の反映である。アネキシンＶ／ＰＩ染色およびフローサイトメトリーにより測定したデータ。
【０１０６】
５．１３  組換えＰＥＮ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、ＧＳ９−６細胞のアポトーシスを促進する
図２３に概略を示すように、組換えＰＥＮ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５は、培養物中でスフェアとして増殖する初代ＧＳ９−６ヒト神経膠芽腫幹細胞のアポトーシス死を促進する。５日間処理。アネキシンＶ／ＰＩ染色およびフローサイトメトリーにより測定したデータ。
【０１０７】
本明細書には種々の刊行物が引用されているが、それらの内容全体は、参照により本明細書に援用される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９Ａ】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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