(57)【要約】  本発明は、驚いたことに、ＧＰＣＲのアミノ末端での異種のウイルス−ＧＰＣＲ（Ｇタンパク質結合受容体）由来の配列の付加が、真核細胞においてそのような受容体の細胞表面発現を改善することを示す。表面上に上述の異種のウイルス−ＧＰＣＲを発現する形質移入された細胞は、例えば、創薬、食品産業における新しい着香料の開発、または匂いＧＰＣＲに基づくセンサーの開発のための、ＧＰＣＲまたはＧＰＣＲのリガンドの活性を増加させる又は調整する試験化合物を識別する、細胞ベースのアッセイに有用である。さらに、形質移入された細胞に由来する膜抽出物は、例えば、揮発性有機化合物の識別及び／又は定量化のための、創薬における又はそのような膜抽出物を含むセンサーの開発のための化合物のアッセイに使用されてもよい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロでの真核細胞の表面において真核性受容体ＧＰＣＲの発現を改善するための、異種−ウイルスＧＰＣＲ由来の配列をコード化する核酸配列の使用。
【請求項２】
真核性受容体ＧＰＣＲは、インビトロでの真核細胞において過剰発現されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
異種−ウイルスＧＰＣＲ由来の配列をコード化する核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２によって表わされるＤＮＡ配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９を含むアミノ酸配列をコード化するＤＮＡ配列を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２によって表わされる核酸配列を含むこと、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９を含むアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含むことを特徴とする、異種−ウイルス受容体ＧＰＣＲ由来の配列をコード化する単離した核酸配列。
【請求項５】
真核性受容体ＧＰＣＲをコード化する核酸配列であって。前記コード化する核酸配列は、異種−ウイルスＧＰＣＲ由来の配列をコード化する核酸配列の少なくとも一部をさらに含むことを特徴とする、核酸配列。
【請求項６】
異種−ウイルスＧＰＣＲ由来の配列をコード化する配列の一部が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２を含むこと、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９を含むアミノ酸配列をコード化するフラグメントを含むことを特徴とする、請求項５に記載の核酸配列。
【請求項７】
表面発現を改善するためのシグナルペプチド、及び／又は異種−ウイルスＧＰＣＲ配列を積極的に発現する細胞の表面の検出及び／又は分離のための配列タグをさらに含むことを特徴とする、請求項５または６に記載の核酸配列。
【請求項８】
プロモーターをさらに含むことを特徴とする、請求項５乃至７のいずれかに記載の核酸配列。
【請求項９】
誘導性プロモーターを含むことを特徴とする、請求項８に記載の核酸配列。
【請求項１０】
エクジソン誘導性プロモーター、クマート誘導性プロモーターおよびプロゲステロン誘導性プロモーターから選択される、誘導性プロモーターを含むことを特徴とする、請求項９に記載の核酸配列。
【請求項１１】
構成的プロモーターを含むことを特徴とする、請求項８に記載の核酸配列。
【請求項１２】
配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６から選択される構成的プロモーターを含むことを特徴とする、請求項１１に記載の核酸配列。
【請求項１３】
請求項４乃至１２の核酸配列を含む、発現ベクター、好ましくはプラスミド。
【請求項１４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
請求項４乃至１２の核酸配列、または請求項１３または１４のプラスミドまたは発現ベクターによって形質移入された非ヒトの細胞。
【請求項１６】
真核細胞であることを特徴とする、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
造血細胞であることを特徴とする、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
真核性受容体ＧＰＣＲに対する候補化合物の活性または影響をスクリーニングするための、請求項１５乃至１７の細胞の使用。
【請求項１９】
異種−ウイルスＧＰＣＲ由来の配列を少なくとも含むことを特徴とする、真核性ＧＰＣＲ。
【請求項２０】
異種−ウイルスＧＰＣＲ由来の配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９によって表わされるアミノ酸配列を含むものから、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２を含む核酸配列によってコード化されたアミノ酸配列を含むものから選択されることを特徴とする、請求項１９に記載の真核性ＧＰＣＲ。
【請求項２１】
請求項４乃至１２の核酸配列によってコード化されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１９に記載の真核性ＧＰＣＲ。
【請求項２２】
真核性受容体ＧＰＣＲに対する候補化合物の活性または影響をスクリーニングするための、請求項１９乃至２１の真核性ＧＰＣＲの使用。
【請求項２３】
請求項１９乃至２１のＧＰＣＲとともに集積された細胞膜画分。
【請求項２４】
真核性受容体ＧＰＣＲに対する候補化合物の活性または影響をスクリーニングするための、請求項２３の細胞膜画分の使用。
【請求項２５】
候補化合物と真核性受容体ＧＰＣＲとの相互作用を試験するためのキットであって、該キットは、請求項１５乃至１７の細胞株、または請求項２３のＧＰＣＲで集積された前記細胞膜画分、または請求項１９乃至２１のＧＰＣＲおよび真核性受容体ＧＰＣＲ活性の決定のための基質を含むことを特徴とする、キット。
【請求項２６】
基質が、細胞内カルシウムの上昇を測定するための、蛍光基質、エクオリンの基質、または細胞によって調節するエキソサイトーシスを測定するための基質であることを特徴とする、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
候補化合物と真核性受容体ＧＰＣＲとの相互作用を試験するためのインビトロでの方法であって、該方法は、請求項１５乃至１７の細胞株、または請求項２３のＧＰＣＲで集積された細胞膜画分、または請求項１９乃至２１のＧＰＣＲおよび真核性受容体ＧＰＣＲ活性の決定とともに培養培地に候補化合物を加える工程を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２８】
真核性受容体ＧＰＣＲ活性の決定が基質によって実行されることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
基質が、細胞内カルシウムの上昇を測定するための、蛍光基質、エクオリンの基質、または細胞によって調節するエキソサイトーシスを測定するための基質であることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物工学および薬学の分野に含まれ得る。本発明は、ＧＰＣＲのアミノ末端でウイルス−ＧＰＣＲ（Ｇタンパク質結合受容体）由来の配列を付加することによって、真核細胞におけるそのような受容体の細胞表面発現が改善されることを示す。そのような異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列による細胞表面発現のこの改善は、初代細胞株または樹立細胞株のいずれか、例えば哺乳動物の造血または非造血の細胞株において、および安定して形質移入されたまたは一時的に形質移入された細胞において達成され得る。そのような異種配列は、ＧＰＣＲ陽性細胞の表面の検出及び／又は分離のための、シグナルペプチド及び／又はペプチドタグとの組み合わせであってもよい。加えて、異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列を少なくとも含むＧＰＣＲの発現のための有用なプロモーターは、発現抑制されていない（ｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｅｄ）構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターのいずれかから選択されてもよい。
【０００２】
それらの表面上で上述異種のウイルス−ＧＰＣＲを発現する形質移入された細胞は、例えば、創薬、食品産業における新しい着香料の開発、または匂い（ｏｄｏｒ）ＧＰＣＲに基づくセンサー（ｓｅｎｓｏｒｓ）の開発のための、ＧＰＣＲまたはＧＰＣＲのリガンドの活性を増加させる又は調整する試験／候補化合物を識別する、細胞ベースのアッセイに有用である。さらに、形質移入された細胞に由来する膜抽出物（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ）は、例えば、揮発性有機化合物の識別及び／又は定量化のための、創薬における又はそのような膜抽出物を含むセンサーの開発のための化合物のアッセイに使用されてもよい。
【０００３】
＜従来技術＞
リガンドのための細胞表面受容体は、細胞がその周辺環境を感知する分子実体である。リガンド−受容体の相互作用後に、細胞は、細胞過程をこの相互作用に応じるように向ける。７−膜貫通性受容体としても知られるＧＰＣＲは、まだ確認されていない細胞表面受容体の最大のファミリーを含む。現在の処方薬の６０％以上は、ＧＰＣＲを標的としており、そのため、ＧＰＣＲは、創薬調査のための最も重要な標的の１つである。現在まで、約４００の遺伝子が、ＧＰＣＲとして確認されてきた。しかしまた、ＧＰＣＲは、匂い及び味の感知のために使用される受容体である。
【０００４】
ＧＰＣＲは、類似した分子機構を介して作動する。細胞外刺激によるＧＰＣＲの活性化は、受容体の構造変化をもたらし、これは結果的に、ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）の中間結合および活性化につながる。Ｇタンパク質は、本来、ヘテロ三量体であり、異なる遺伝子によってコード化された、α、β、およびγのサブユニットからなる。
αサブユニットは、ＧＤＰとＧＴＰの結合の原因である。ＧＰＣＲに対するリガンドの結合は、結果的に、αサブユニットのＧＤＰ結合型からＧＴＰ結合型への移行をもたらし、α−ＧＴＰのβγダイマーからの分離を介するヘテロ三量体の活性化につながる。α−ＧＴＰおよびβγダイマーの両方は、二次メッセンジャー分子（例えば、カルシウム、ｃＡＭＰなど）の産生を介してシグナルを細胞内部に送信する様々な作用因子の活性を制御する。少なくとも１７のＧａ遺伝子があり、Ｇタンパク質のメンバーは、Ｇαｉ／０、Ｇαｑ、Ｇα１５およびＧα１２と称される４つの主類へとグループ化され得る。リガンド結合後に、ＧＰＣＲは、様々なＧタンパク質に結合することができ、それ故、ＧＰＣＲのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）用の読出しを複雑にし得る、多くの複合シグナル伝達経路の活性化につながる。
【０００５】
特定のＧＰＣＲに対するリガンドの結合は、シグナル伝達経路の幾つかの要素の特性の幾つかの変化を測定することによって検出されるシグナル、主として、細胞内カルシウム、環状ＡＭＰおよびイノシトールフォスフェート代謝物質のような二次メッセンジャーを開始する。ほとんどのＧＰＣＲのためのＡの共通する読出しは、両方の単純性および既知のリガンドのない受容体の非オーファン化（ｄｅｏｒｐｈａｎｉｚａｔｉｏｎ）の両方ための創薬に有用である。特定の内因性の乱雑なＧタンパク質が、多くのＧＰＣＲと結合することができるが［Ｗｉｌｋｉｅ ＴＭ， Ｓｃｈｅｒｌｅ ＰＡ， Ｓｔｒａｔｈｍａｎ ＭＰ， Ｓｌｅｐａｋ ＶＺ ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ ＭＩ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： １００４９−１００５３ （１９９１）］および［Ａｍａｔｒｕｄａ ＴＴ．， Ｓｔｅｅｌｅ ＤＡ．， Ｓｌｅｐａｋ ＶＺ． ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ ＭＩ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： ５５８７−５５９１ （１９９１）］、ヒトにおける骨髄単球性細胞およびＴ細胞、およびマウスとラットにおける骨髄単球性細胞、Ｂ細胞、および特定のＴ細胞のような特定の造血細胞においてのみ自然に発現されることは、従来技術において公知である。しかし、ほとんどのＧＰＣＲの発現は、ほとんどの造血細胞において達成するのは難しい。
【０００６】
代替策は、ＧＰＣＲおよび乱雑なＧタンパク質結合受容体の両方を非造血細胞へと同時形質移入することであるが、改善された感受性に対する高レベルでのそのような細胞株においてＧＰＣＲを発現する必要性もある。また、初代細胞をスクリーニングに使用することを望んでいる研究者もいるが、これらの細胞は、通常は低レベルのＧＰＣＲを発現するため、感受性は低い。代替策は、標的ＧＰＣＲをそのような初代細胞へと形質移入し、細胞のバックグラウンド（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）を標的疾患のそれにできるだけ接近して維持しながら、感受性を改善することであり得る。しかし、初代細胞は、形質移入するのが難しく、長時間インビトロで培養することができず、それ故、それらを安定して形質移入することができない。したがって、非造血細胞および初代細胞の両方に対して、ＧＰＣＲ発現のための改良方法が必要とされる。
【０００７】
ＧＰＣＲの薬物標的をスクリーニングするための１つの共通する技術は、高スループットの方法で、ＧＰＣＲに対するリガンドの結合後の細胞内カルシウムの変化を測定することである。しかしながら、すべてのＧＰＣＲが、カルシウム動員につながるＧαｑに結合するとは限らない。
【０００８】
造血細胞が、高レベルでＧα１５及び／又はＧα１６などの内因性の乱雑なＧタンパク質を発現することは従来技術で公知であり［Ｗｉｌｋｉｅ ＴＭ， Ｓｃｈｅｒｌｅ ＰＡ， Ｓｔｒａｔｈｍａｎ ＭＰ， Ｓｌｅｐａｋ ＶＺ ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ ＭＩ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： １００４９−１００５３ （１９９１）］および［Ａｍａｔｒｕｄａ ＴＴ．， Ｓｔｅｅｌｅ ＤＡ．， Ｓｌｅｐａｋ ＶＺ． ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ ＭＩ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： ５５８７−５５９１ （１９９１）］；これら全ての技術は、引用によって本明細書に組み込まれる。不運にも、多くのＧＰＣＲは、細胞表面において、特に造血細胞の表面において高レベルで発現されることが難しい。
【０００９】
非Ｇαｑ結合の受容体をカルシウム経路に結合するための１つの代替法は、乱雑なＧタンパク質（例えばＧα１５）またはＧαｑキメラのいずれかを同時形質移入し、ＧＰＣＲ活性化をカルシウム動員に関連づけることである。この方法では、スクリーニングのための十分なレベルで細胞表面上にＧＰＣＲを発現する必要もある。
【００１０】
また、薬物をスクリーニングために初代細胞株を使用する、特に薬物が発達されるべき標的疾患の細胞型にできるだけ接近して細胞株を使用することが時々望まれる。細胞表面上の内因性のＧＰＣＲのレベルは、初代細胞に対しては低く、それ故、高親和性結合剤（ｂｉｎｄｅｒｓ）のみが初代細胞とともに確認される。しかし、初代細胞株は、形質移入されることが難しく、長時間培養することができず、それ故、安定した形質移入は通常不可能である。
【００１１】
ＧＰＣＲはまた、匂い認識を媒介する嗅球で発現された受容体である。ヒトは、嗅球で約４００の機能的ＧＰＣＲを発現し、齧歯類は、約１０００の機能的ＧＰＣＲを発現する。しかし、異種細胞の表面上のＧＰＣＲの発現は、極端に少ない。異種細胞の表面上の嗅覚のＧＰＣＲの細胞表面発現を改善するために使用される戦略の１つは、ＲＴＰ１ＳおよびＲＥＥＰのようなシャペロンを、単独で又はロドプシン受容体に由来するＮ末端配列と併用して使用することである。細胞表面発現を改善する新しい配列が必要とされる。
【００１２】
グリコシル化が、７つの膜貫通性のＧタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）の共通の翻訳後修飾であることは従来技術において周知である。以下のグリコシル化の２つの共通の形態が、従来技術に公知である：Ｎ−結合グリコシル化およびＯ−結合グリコシル化。Ｎ−結合グリコシル化は、アスパラギンまたはアルギニンの側鎖のオリゴ糖による修飾の過程であり、幾つかの真核細胞タンパク質の折り畳みに重要である。Ｎ−結合グリコシル化は、通常、小胞体の内腔における真核細胞で生じる。Ｏ−結合グリコシル化は、Ｎ−アセチルガラクトサミンを介するセリンまたはトレオニンのヒドロキシル側鎖に対するグリカン結合を含んでいる。Ｏ−結合グリコシル化は、ゴルジ体に生じる。
【００１３】
グリコシル化は、細胞表面に対する、受容体のタンパク質の折り畳み、輸送および標的化に重要であると示されてきたが、ＧＰＣＲの表面発現に関係性のあるグリコシル化の例は、Ｎ−結合グリコシル化に限定される。実際、ＧＰＣＲにおけるＯ−結合グリコシル化に関する先行技術はない。結果として、現在、Ｏ−結合グリコシル化が、ＧＰＣＲの表面発現を改善するかどうか、またはＧＰＣＲのアミノ末端の異種配列の付加が、Ｏ−結合グリコシル化およびＧＰＣＲの表面発現のためのそのような潜在的なグリコシル化の効果をもたらすかどうかは知られていない。
【００１４】
インターロイキン２（ＩＬ−２）受容体の合成および細胞内選別が、タンパク質Ｏ−グリコシル化の可逆的な欠損を有する変異体のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の系統で研究されてきた（Ｋｏｚａｒｓｋｙ， ＫＦ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １９８８， ８（８）， ３３５７）。炭水化物欠失ＩＬ−２受容体は、誤って選別され、結果的に、表面発現はほとんどない。幾つかの他の受容体は、それらの改善された表面発現またはタンパク質分解に対するそれらの増加した安定性のために、Ｏ−グリコシル化に関連づけられることが従来技術において知られている。そのような受容体の例は、低密度リポタンパク質受容体、解離促進因子、およびエプスタイン−バーウイルスの主要な抗原外被タンパク質である。ヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン（Ｍａｔｚｕｋ ｅｔ ａｌ． １９８７）；アポタンパク質Ｅ（Ｚａｎｎｉ ｅｔ ａｌ （１９８９））；ＨＩＶのｇｐｌ２０／４１外被タンパク質などの、他の分泌タンパク質および受容体がなければ、それらの発現レベルまたは安定性におけるＯ−結合グリコシル化の効果はない。しかしまた、ＧＰＣＲおよびＧＰＣＲの表面発現レベルに対するそのような潜在的なＯ−グリコシル化の効果において、Ｏ−結合グリコシル化が存在するかどうかを上述の例は我々に教示していない。その上、ＧＰＣＲとの関係性のない天然の受容体を使用する上述の例は、異種のＧＰＣＲに対するそのような配列の付加が、それらの表面の発現を改善するとは実証または予測していない。
【００１５】
本発明では、異種のＧＰＣＲのアミノ末端に加えられたときの特定のウイルス由来のＧＰＣＲ配列が、それらの表面発現を改善することが記載されている。そのようなウイルス由来のＧＰＣＲ配列上で存在するセリンおよびトレオニンの変異が、そのようなウイルス配列を含むことによって達成される細胞表面発現の改善をすべてではないが部分的に減少させることも実証されている。さらに、我々は、ＧＰＣＲの表面発現のそのような改善が、造血および非造血の両方に由来する細胞で達成されることを実証している。この修飾された受容体を発現するそのような細胞は、例えば創薬のための細胞ベースのアッセイに使用され得るか、あるいはそのような細胞に由来する細胞膜は、ＧＰＣＲが必要とされるアッセイで使用され得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上に言及されるように、本発明は、驚いたことに、ＧＰＣＲのアミノ末端でのウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列の付加が、そのような受容体の細胞表面発現を改善することを示している。ウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列による細胞表面発現に対するこの改善は、真核細胞、例えば、造血または非造血の細胞株などの、哺乳動物の初代細胞株または樹立細胞株で達成され得る。
【００１７】
本発明の１つの特定の実施形態では、ウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １である。好ましい実施形態では、ウイルス−ＧＰＣが由来の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２として指定される、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １のより短い形態である。別の実施形態では、上述の配列は、１回または２つ以上の配列と並んで（ｉｎ ｔａｎｄｅｍ ｏｆ）存在し得る。好ましい実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８をコード化し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９をコード化する。
【００１８】
ＧＰＣＲのアミノ末端で加えられたウイルスの配列は、ＤＮＡキメラ分子として作られ、ここでウイルス配列は、例えば、ペプチドタグをコード化する配列と、成熟したＧＰＣＲをコード化する第２アミノ酸との間で加えられる。ＧＰＣＲのアミノ末端で加えられたそのようなウイルス配列は、エプスタイン−バーウイルスからのＢＩＬＦ１読取枠から好ましくは単離される。異種のＧＰＣＲのアミノ末端で加えられるときのそのような配列は、陽性細胞の割合を高めることによって、あるいは各細胞の表面上のＧＰＣＲ分子の数の平均値または中央値を高めることによって、それらの表面発現を改善する。しかしながら、本発明のウイルス−ＧＰＣＲ配列は、他のベータ−およびガンマ−ヘルペスウイルスに、例えば、ベータ−ヘルペスウイルスのすべてのファミリー、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来し得、ＧＰＣＲホモログをコード化し、およびガンマ２−ヘルペスウイルス、例えば、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）およびガンマ１−ヘルペスウイルス、例えば、エプスタイン−バーウイルスもまた、ＧＰＣＲホモログをコード化する。本発明の特定の実施形態では、ＧＰＣＲの表面発現を改善するために使用されるウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列は、ＵＬ３３、Ｍ３３、Ｒ３３、ＵＬ７８、Ｍ７８、Ｒ７８、ＵＳ２７、およびＵＳ２８を含むウイルスＧＰＣＲの群の最初の３０のアミノ酸から選択される。
【００１９】
別の好ましい実施形態では、本発明のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列を含むベクターはまた、表面発現をさらに改善する（過剰発現）ためのシグナルペプチド、または例えばフローサイトメトリーまたは磁気ビーズによって、ＧＰＣＲ陽性細胞の表面の検出及び／又は分離のための配列タグを含む。
【００２０】
本発明の別の実施形態では、ウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列は、細胞株において安定して形質移入される。好ましい実施形態では、本発明のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列は、真核性の細胞株において又は真核性の初代細胞において一時的に形質移入される。本発明のさらなる実施形態では、ＧＰＣＲによって一時的にまたは安定して形質移入された細胞株または初代細胞は、ＧＰＣＲ陽性細胞の物理的分離のために選別される。１つの実施形態では、異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列を少なくとも含むＧＰＣＲによって形質移入された細胞は、真核細胞である。１つの具体的な実施形態では、異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列を少なくとも含むＧＰＣＲによって形質移入された細胞は、哺乳動物の造血細胞または非造血細胞である。
【００２１】
本発明の１つの実施形態では、異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列を少なくとも含むＧＰＣＲは、構成的プロモーターの制御下で発現される。さらなる実施形態では、プロモーターは、形質移入され具体的な細胞株のための発現抑制されていないプロモーターから選択される。またさらなる実施形態では、発現抑制されていないプロモーターは、遍在性またはウイルス性のプロモーターから選択される。１つの実施形態では、構成的ＧＰＣＲ発現に適切なプロモーターは、ヒトまたはマウスの伸長因子１−アルファプロモーター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）、ヒト、マウスおよびラット類からのホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）、モロニーマウス白血病ウイルスプロモーター ＭｏＭＬＶ−５’ＬＴＲからの５’ＬＴＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）およびヒト、マウスおよびラット類いずれかからのユビキチンプロモーターを含む群から選択されてもよい。そのようなプロモーターは、造血細胞が本発明の方法で使用されるときには経時的に発現抑制されず、非造血細胞が本発明の方法で使用されるときに適切である。本発明の別の実施形態では、ＧＰＣＲの表面発現に適切なプロモーターは、誘導性プロモーターである。
【００２２】
本発明の１つの実施形態では、異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列を少なくとも含むＧＰＣＲは、誘導性プロモーターの制御下で発現される。特定の実施形態では、適切な誘導性プロモーターは、テトラサイクリン誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、クマート（ｃｕｍａｔｅ）誘導性プロモーターおよびプロゲステロン誘導性プロモーターを含む群から選択される。
【００２３】
上に記載されるように、アミノ末端領域で異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列を少なくとも有する１つ以上のＧＰＣＲをコード化する外因性の核酸配列は、真核細胞へと導入される。本明細書で使用されるように、外因性の核酸配列は、細胞で自然に生じない及び／又は細胞（例えば、宿主細胞、前駆（祖先）細胞）へと導入されている核酸配列を指す。アミノ末端領域でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２などの異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列を少なくとも有するＧＰＣＲをコード化することができ、および外来性に発現される、任意の核酸配列（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）は、本発明で使用され得る。
【００２４】
例えば、外因性の核酸配列の導入は、当該技術分野に周知であり、例えば、形質移入を介して実行され得る。１つの実施形態では、アミノ末端領域で異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列を少なくとも有するＧＰＣＲをコード化する外因性の核酸配列は、プラスミドまたはベクターとして細胞へと導入される。本発明の１つの実施形態では、形質移入は、一時的な又は安定した形質移入であり得る。
【００２５】
１つの実施形態では、本発明は、アミノ末端領域でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２などの異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列を少なくとも有するＧＰＣＲをコード化する核酸配列を含むプラスミドまたはベクターに言及しており、ここでＧＰＣＲは、高レベルで発現される。別の実施形態では、プラスミドは、アミノ末端領域でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２などの異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列を少なくとも有するＧタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）をコード化する核酸配列が含み、ここでＧＰＣＲをコード化する核酸配列は、ＧＰＣＲに作動可能に結合されるプロモーターをさらに含む。
【００２６】
１つの特定の実施形態では、構成的ＧＰＣＲ発現に有用なベクターは、造血細胞または非造血細胞のいずれにおいても発現制御されない強力な構成的プロモーター、細胞膜にわたる転位を助けるシグナルペプチド、表面上にＧＰＣＲを有する細胞の選択のためのタグ、細胞膜発現改善する異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列、およびメッセンジャーＲＮＡを安定させるポリアデニル化配列を含む、Ｐ−ＭｏＭＬＶ−５’ＬＴＲ−ＳＰ−ｃｍｙｃ−ｔａｇ−ＶＧＳ−ＭＣＳ−ｐｏｌｙＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７）である。配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７のベクターにおけるＰ−ＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲプロモーターの配列が、テトラサイクリン誘導性プロモーターと交換されると、誘導性のＧＰＣＲ発現に適したベクターが得られる。ＧＰＣＲのＮ末端で、異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列である、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２を加えることによって、真核細胞中の細胞表面受容体の発現が改善され、その改善が、我々によって以前に発見されたように、哺乳動物の造血細胞に限定されないことを、本発明は最初に実証する。
【００２７】
本発明のＧＰＣＲの改善された表面発現を有する細胞は、少なくとも２つの分子、リガンドまたはアゴニストとしての少なくとも１つの作用因子、および少なくとも１つのＧＰＣＲの間の相互作用を試験するのに一般に有用ある。例えば、創薬において、何千または何百万もの小分子が、そのような標的の活性を修飾する小分子を発見するために、標的に対して試験される。特定の例では、化合物は、高度に新薬の開発につながるような種類の受容体である、Ｇタンパク質結合受容体のアゴニストまたはアンタゴニストのためにスクリーニングされる。そのような相互作用は、表面ＧＰＣＲ発現が改善される、細胞ベースのアッセイまたは細胞の膜が集積した画分のいずれかを使用して、試験されてもよい。細胞ベースアッセイの例は、ラベルフリー（ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ）のアッセイ、例えば細胞内カルシウム、サイクリックＡＭＰ、およびイノシトールフォスフェート代謝物質のレベルを測定する二次メッセンジャー依存性のアッセイである。ＧＰＣＲ陽性細胞の膜画分の使用の例は、放射リガンド結合アッセイおよび表面上にＧＰＣＲを発現する細胞から膜画分をコーティングされた表面プラズモン共鳴センサーなどの、親和性ベースのスクリーニング技術である。さらに、ウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列を有するＧＰＣＲに基づいたセンサーは、診断に使用され得、特に、揮発性有機化合物の検出のために使用され得る。ウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列を有するプラスミドは、細胞ベースのアッセイで使用されるべく一時的な又は安定した細胞集団として、ＧＰＣＲの改善された発現を有する細胞株の発達のために、またはＧＰＣＲで集積された膜画分の産生のために使用されてもよい。
【００２８】
それ故、本発明はまた、化合物がＧＰＣＲと相互作用するかどうかを試験するための、及び／又はＧＰＣＲと化合物との間の相互作用を定量化するための、方法およびキットを含む。そのようなキットは、少なくとも：適切なプロモーターの制御下においてアミノ末端で異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列を少なくとも有するＧタンパク質結合受容体を含む、細胞株または細胞株の膜が集積した画分を含む。そのような細胞株はまた、内因性の又は形質移入された乱雑なＧタンパク質のいずれかを発現し得る。細胞ベースのアッセイに関して、上述のキットはまた、アッセイする、ＧＰＣＲ活性の決定のための基質（例えば、細胞内カルシウムの上昇を測定するための蛍光基質、またはエクオリンの基質、または細胞によって調節するエキソサイトーシスを測定するための基質）も含むべきである。
【００２９】
本発明で達成される細胞表面発現の改善は、例えば、放射リガンド結合アッセイのために、あるいはラベルフリーのアッセイ、細胞内カルシウム動員、ｃＡＭＰの増加、専門的な（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ）調節されたエキソサイトーシスを有する造血細胞における顆粒が貯蔵された酵素のイノシトールフォスフェートの産生または放出のような、二次メッセンジャーアッセイなどの機能的アッセイのために、ＧＰＣＲを調製する可能性を提供する。
【００３０】
以下の用語は、本発明の目的にのみ定義される：
・  表面受容体：これは、細胞の表面に生じ、細胞外の環境と相互作用し、および具体的なプロモーターの転写を最終的に調製する方法で、細胞内での環境に関する情報を送る又は形質導入し（ｔｒａｎｓｄｕｃｅ）、結果的に特定遺伝子の転写をもたらす分子を指す。表面受容体の例は、チロシンキナーゼ受容体、イオンチャネル受容体、サイトカイン受容体、走化性因子ペプチド受容体などのＧタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）、ニューロペプチド受容体、光受容体、神経伝達物質受容体、ポリペプチドホルモン受容体または匂い受容体である。
・  ７つの膜貫通性受容体、７ＴＭ受容体、七螺旋（ｈｅｐｔａｈｅｌｉｃａｌ）受容体、およびＧタンパク質連結型受容体（ＧＰＬＲ）としても知られる、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）：それらは、細胞外のＮ末端および細胞質のＣ末端を有する７つの膜貫通性のドメインによって特徴付けられた膜貫通性受容体の大きなタンパク質ファミリーである。ＧＰＣＲに対するリガンド結合は、小さなＧタンパク質結合、シグナル伝達経路の開始、および最終的に細胞反応につながる構造変化を促進する。これらの受容体を結合する且つ活性化するリガンドは、光に敏感な化合物、匂い、フェロモン、ホルモン、および神経伝達物質を含み、小分子から、ペプチド、大きなタンパク質まで、サイズは様々である。Ｇタンパク質結合受容体は、酵母、植物、および特に、動物を含む、より高度な真核生物においてのみ見られる。Ｇタンパク質結合受容体は、多くの疾患に関係するが、すべての現代の治療薬物の約半分の標的でもある。ＧＰＣＲは、類似した分子機構を介して作動する。細胞外の刺激によるＧＰＣＲの活性化は、受容体の構造変化をもたらし、これは結果的に、ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）の中間結合および活性化につながる。Ｇタンパク質は、本来、ヘテロ三量体であり、異なる遺伝子によってコード化された、α、β、およびγのサブユニットからなる。αサブユニットは、ＧＤＰとＧＴＰの結合の原因である。ＧＰＣＲに対するリガンドの結合は、結果的に、αサブユニットのＧＤＰ結合型からＧＴＰ結合型への移行をもたらし、α−ＧＴＰのβγダイマーからの分離を介するヘテロ三量体の活性化につながる。α−ＧＴＰおよびβγダイマーの両方は、二次メッセンジャー分子（例えば、カルシウム、ｃＡＭＰなど）の産生を介してシグナルを細胞内部に送信する様々な作用因子の活性を調節する。少なくとも１７のＧａ遺伝子があり、Ｇタンパク質のメンバーは、Ｇαｉ／０、Ｇαｑ、Ｇα１５およびＧα１２と称される４つの主類へとグループ化され得る。リガンド結合後に、ＧＰＣＲは、様々なＧタンパク質に結合することができ、それ故、ＧＰＣＲのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）用の読出しを複雑にし得る、多くの複合シグナル伝達経路の活性化につながる。
・  「異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列」または「ウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列」：本発明の目的のために、これは、非真核生物、主としてウイルスに由来する任意の配列を指し、前記配列は、真核細胞へと移動され、前記真核細胞は、前記真核細胞内のその発現（即ち異種発現）を達成するために、好ましくは発現ベクターによって、レシピエントとして作用する。一例として、本発明は、Ｇタンパク質受容体の発現を改善するために、真核細胞へと移動されるウイルスに由来する異種配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １および２）を含む。本明細書で使用されるように、この用語は、ウイルス−ＧＰＣＲのコード配列の第１コドンとしてのメチオニンから前記ウイルス−ＧＰＣＲの膜貫通性の１領域の前の前記ウイルス−ＧＰＣＲ配列の細胞外のアミノ末端の最後のアミノ酸までの配列を記載する。本発明の方法で使用されるように、この用語はまた、例えば、ウイルス配列または哺乳動物のベータおよびガンマのヘルペスウイルスＧＰＣＲから単離した、配列のフラグメントを好ましくは意味する。
・  造血細胞：これは、骨髄幹細胞に由来する細胞であり、脊髄（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板および幾つかの樹状細胞）およびリンパ球系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、幾つかの樹状細胞）の両方を含むすべての血液細胞型を含む。反対に、骨髄に由来しない細胞は、非造血細胞として知られている。
・  センサー：これは一種のトランスデューサーである。生物学的シグナルを形質導入するセンサーは、バイオセンサーと呼ばれる。すべての有機体は、機械的センサーの機能と類似した機能を有する生物学的センサーを含んでいる。これらのうちのほとんどは、次のものに対して感受性のある特殊化した細胞である：光、動き、温度、磁場、重力、湿度、振動、圧力、電場、音、および外部環境の他の物理的側面；伸長、有機体の動き、および付属物（固有受容性）の位置など、内部環境の物理的側面；毒素、栄養素、およびフェロモンを含む、環境分子の巨大なアレイ（ａｒｒａｙ）；グルコースレベル、酸素レベル、または浸透圧などの、内部の代謝環境の多くの側面；およびホルモン、神経伝達物質、およびサイトカインなどの、内部のシグナル分子の様々な範囲。生物学的な感受性成分の使用による生物学的センサーを模倣する人工センサーは、バイオセンサーと呼ばれる。
・  調節されたエキソサイトーシスを有する細胞株：これは、ゴニストリガンド結合後のＧＰＣＲなどの、細胞表面受容体のようなエキソサイトーシスのモジュレーターによって培地へと放出される、顆粒が貯蔵されたレポーターを発現するために一般に操作される細胞株を指す。本明細書で使用されるように、用語「調節されたエキソサイトーシスを有する細胞」、「専門的な分泌細胞株」、および「専門的な調節されたエキソサイトーシスを有する細胞株」は、交換可能に使用されてもよい。これらの用語のすべてはまた、それらの後代を含む。すべての後代が、故意の又は偶然な変異が原因で同一ではないかもしれないことが理解される。
・  創薬：薬物が発見される及び／又は設計される過程。本明細書に使用されるように、創薬は、親和性、副作用、バイオアベイラビリティのための薬物の同定および修飾を含むが、再プロファイリング（ｒｅｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）としても知られている過程である、新しい治療適用において市場に既に導入された薬物の効果を試験することも含む。
・  遺伝子：本明細書に使用されるように、遺伝子は、コード配列から構成されるだけでなく、コード配列の転写の制御に関係する隣接したＤＮＡ領域（例えば、プロモーター、エンハンサー）およびイントロンも含むことができる。
・  「安定して導入された」または「安定して形質転換された（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」または「安定して形質導入された」または「安定して形質移入された」または「安定して電気穿孔処理された（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｅｄ）」：これは、ゲノムへと組み込まれた望ましい外来性ＤＮＡを有する細胞の画分を指す。使用される発現ベクターおよび形質移入技術に依存して、細胞の画分のみが、外来性ＤＮＡをそれらのゲノムへと組み込み得る。これらの成分を同定および選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性）をコード化する遺伝子は、対象の遺伝子とともに宿主細胞へと一般に導入される。好ましい選択マーカーは、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびピューロマイシンなどの、薬物に対する耐性を与えるものを含む。選択マーカーをコード化する核酸は、検知可能な翻訳産物をコード化するものと同じベクター上の宿主細胞へと導入され得るか、または別々のベクター上で導入され得る。導入された核酸によって安定して形質移入された細胞は、薬物選択によって確認され得る（例えば、選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は残存するが、一方で他の細胞は死滅する）。
・  キメラ受容体：全体のドメインおよびその部分の両方を含む、１つの受容体の部分を、別の受容体、タンパク質フラグメント、タグ配列またはそれらの任意の組み合わせの部分と組み合わせる、人工の受容体に基づいた受容体が存在する。一般に、キメラタンパク質または「融合タンパク質」は、少なくとも別のペプチド配列または別のポリペプチドに融合した所望のタンパク質生成物の少なくとも一部を含むポリペプチドである。
・  ベクターまたはプラスミドベクターまたはプラスミド：用語「ベクター」は、核酸配列が、複製され得る細胞への導入のために挿入され得る担体核酸分子を指す。核酸配列は、「外因性」であり得、これは、それが、ベクターが導入されている細胞にとって異質であること、または細胞における配列に相同性があるが、配列が通常は見られない宿主細胞の核酸内の位置ではそうではないことを意味する。ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）、および人工染色体（例えば、ＹＡＣ）を含む。
・  発現ベクター：用語「発現ベクター」は、転写されることが可能なＲＮＡをコード化する核酸を含む任意の型の遺伝子構築物を指す。幾つかの場合では、ＲＮＡ分子は、その後、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。他の場合では、これらの配列は、例えば、アンチセンスの分子またはリボザイムの産生において、翻訳されない。発現ベクターは、様々な「制御配列」を含むことができ、これは、特定の宿主細胞における作動可能に結合されたコード配列の転写および恐らく翻訳に必要な核酸配列を指す。転写および翻訳を管理する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能も果たし、下記に記載される、ヌクレオチド配列を含み得る。
・  プロモーター：これは、調節された遺伝子転写のための制御点を提供する、遺伝子の上流に位置するＤＮＡの制御領域である。これは、核酸配列の特異的な転写を開始する、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの、調節タンパク質および分子が結合し得る遺伝要素を含み得る。句「作動可能に位置づけられた」、「作動可能に結合された」、「制御下」、および「転写制御下」は、プロモーターが、その配列の転写開始及び／又は発現を制御するために、核酸配列に対して正確な機能的な位置及び／又は配向にあることを意味する。
・  シグナルペプチドまたはシグナル配列：シグナルペプチドは、タンパク質の翻訳後輸送を指示する、短い（３−６０のアミノ酸長）ペプチド鎖である。シグナルペプチドはまた、標的シグナル、シグナル配列、輸送ペプチド、または局在化シグナルとも呼ばれ得る。シグナルペプチドのアミノ酸配列は、（サイトゾルで合成される）タンパク質を、核、ミトコンドリア基質、小胞体、クロロプラスト、アポプラストおよびペルオキシソームなどの特定のオルガネラに配向する。タンパク質が輸送された後に、シグナルペプチターゼによってタンパク質から開裂されるシグナルペプチドもある。
・  配列タグ：これは、遺伝子転写を確認するために使用され得る、およびタンパク質に対する特異抗体が利用可能でないときの又はタンパク質精製のための、例えば抗体による遺伝子の発見および遺伝子配列の決定に一般に関係する、ｃＤＮＡ配列の短い部分配列である。細胞表面の検出および分離に使用され得る既知のペプチドタグの例は、ｃ−ｍｙｃタグ、ＨＡタグおよびＦＬＡＧ ｓｕｐ．ＴＭタグである。一般に、特異的結合タンパク質に対して利用可能な任意のペプチドタグは、そのような特異的結合タンパク質が、蛍光体で、または例えば表面分離のためのビーズで直接または間接的に標識化されることが条件で、表面の検出または分離に使用され得る。
・  選択マーカーまたは選択マーカー配列または選択マーカー遺伝子：これは、人為選択に適した特性を与える細胞へと導入された遺伝子である。それらは、外来性ＤＮＡを細胞に導入するように意図された形質移入または他の手順の成功を示すために、研究室での微生物学、分子生物学、および遺伝子工学で使用される、一種のレポーター遺伝子である。選択マーカーは、しばしば、抗生物質抵抗性遺伝子であり；外来性ＤＮＡを導入するための手順にさらされた細菌は、抗生物質を含む培地上で成長させられ、成長することができる細菌コロニーは、導入された遺伝物質を取り上げることに成功し、それを発現した。
・  形質転換または形質移入：本明細書に使用されるように、これは、細胞（例えば原核細胞または真核細胞）への外来性ＤＮＡの導入を指す。形質転換は、リン酸カルシウム−ＤＮＡの共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性の形質移入、ポリブレン媒介性の形質移入、電気穿孔、微量注入、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、および微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）を含む、当該技術分野に既知の様々な手段によって達成されてもよい。特に、真核細胞への形質移入は、適切な抗生物質が、染色体へのＤＮＡの安定した組み込みを有する細胞の選択のために細胞培養培地に含まれないと、一時的なものとなり得る。安定した選択のためのプラスミドベクターは、抗生物質とともに選択される細胞へと発現される選択マーカーを有さなければならない。一時的な形質移入は、本発明の方法で使用され得るが、好ましい細胞は、抗生物質の選択によって安定した細胞である。
・  細胞の表面における受容体ＧＰＣＲの改善された発現：この用語は、本明細書との関連で、前記受容体の発現が、質的に（１個の細胞当たりのより多くの発現）または定量的に（より多くの細胞発現）のいずれかで増加されることを意味する。したがって、その概念は、その表面においてＧＰＣＲを発現しなかった細胞が、それを発現し始めるという実験的事実を意味するか又は包含している。類推によって、本発明の記載に関する用語「過剰発現」は１個の細胞当たりの質的発現に言及するときの、用語、改善された発現、と（変更すべきところは変更するが（ｍｕｔａｔｉｓ ｍｕｔａｎｄｉ））同じ意味を有する。
・  含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）：この用語は、本発明の記載にわたって、アミノ酸またはヌクレオチド配列として、特に、生物学的配列に言及するときの用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を具体的に含む。配列が、フラグメントを含み、その上に、随意に、他の配列フラグメントまたは配列部分と一緒に、生物学的活性または技術効果として得られた本発明が主として存在するか；あるいは単純に、フラグメント自体に正確に制限される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、ＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲプロモーター（Ａ）の制御下またはテトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｂ）の制御下での過剰発現に関する、マウス免疫グロブリンカッパ鎖のシグナルペプチド、抗ｃｍｙｃモノクローナル抗体による表面検出のためのｃ−ｍｙｃタグ、およびウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列を使用して、ＧＰＣＲなどの、機能的な表面受容体を発現するために使用される、ネオマイシン耐性を有するプラスミドベクターのマップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
それ故、本発明の第１実施形態は、インビトロでの真核細胞の表面において真核性受容体（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ＧＰＣＲの発現を改善するために、異種−ウイルスＧＰＣＲ由来の配列をコード化する、核酸配列の使用に言及する。好ましい実施形態では、真核性受容体ＧＰＣＲは、インビトロでの真核細胞において過剰発現される。さらに好ましい実施形態では、異種−ウイルスＧＰＣＲ由来の配列をコード化する核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２によって表わされるＤＮＡ配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９を含むアミノ酸配列をコード化するＤＮＡ配列、を含むことによって特徴づけられる。
【００３３】
本発明の第２実施形態は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２によって表わされる核酸を含むことによって、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９を含むアミノ酸配列をコード化する核酸を含むことによって特徴づけられる、異種−ウイルス受容体ＧＰＣＲ由来の配列をコード化する分離した核酸配列に言及する。
【００３４】
本発明のテトラサイクリン誘導性プロモーターの第３実施形態は、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）をコード化する核酸配列に言及し、前記コード化する核酸配列は、異種−ウイルスＧＰＣＲ由来の配列をコード化する核酸配列の少なくとも一部をさらに含むことによって特徴づけられる。好ましい実施形態では、異種−ウイルスＧＰＣＲ由来の配列をコード化する前記配列の一部は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２を含むことによって、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９を含むアミノ酸配列をコード化するフラグメントを含むことによって特徴づけられる。さらに好ましい実施形態では、前記核酸配列は、表面発現を改善するためのシグナルペプチド、及び／又は異種−ウイルスＧＰＣＲ配列を積極的に発現する細胞の表面の検出及び／又は分離のための配列タグをさらに含む。さらに好ましい実施形態では、配列は、好ましくは以下から選択される誘導性プロモーター：エクジソン誘導性プロモーター、クマート誘導性プロモーターおよびプロゲステロン誘導性プロモーター；または好ましくは以下の配列から選択される構成的プロモーター：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６、であり得るプロモーターをさらに含む。
【００３５】
本発明の第５実施形態は、上に記載される核酸配列を含む、発現ベクター、好ましくはプラスミドに言及する。好ましい実施形態では、発現ベクターはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７を含む。
【００３６】
本発明の第６実施形態は、上述の核酸配列によって、または前記プラスミドまたは発現ベクターによって形質移入された非ヒトの細胞に言及する。好ましい実施形態では、細胞は、真核細胞、好ましくは造血細胞である。
【００３７】
本発明の第７実施形態は、真核性受容体ＧＰＣＲに対する候補化合物の活性または影響をスクリーニングするための上述の細胞の使用に言及する。
【００３８】
本発明の第８実施形態は、異種−ウイルスＧＰＣＲ由来の配列を少なくとも含むことによって特徴付けられたＧＰＣＲに言及する。好ましくは、異種−ウイルスＧＰＣＲ由来の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９によって表わされるアミノ酸配列を含むものから：またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２を含む核酸配列によってコード化したアミノ酸配列を含むものから選択される。
【００３９】
本発明の第９実施形態は、上述される核酸配列によってコード化したアミノ酸配列を含むＧＰＣＲに言及する。
【００４０】
本発明の第１０実施形態は、真核性受容体ＧＰＣＲに対する候補化合物の活性または影響をスクリーニングするための前記ＧＰＣＲの使用に言及する。
【００４１】
本発明の第１１実施形態は、前記ＧＰＣＲとともに集積された細胞膜画分に言及する。
【００４２】
本発明の第１２実施形態は、真核性受容体ＧＰＣＲに対する候補化合物の活性または影響をスクリーニングするための前記細胞膜画分の使用に言及する。
【００４３】
本発明の第１３実施形態は、候補化合物と真核性受容体ＧＰＣＲとの相互作用を試験するためのキットに言及し、該キットは、上に記載される細胞による細胞株、またはＧＰＣＲで集積された前記細胞膜画分、または上述のＧＰＣＲおよび真核性受容体ＧＰＣＲ活性の決定のための基質を含む。好ましい実施形態では、基質は、細胞内カルシウムの上昇を測定するための蛍光基質、エクオリンの基質、または細胞によって調節するエキソサイトーシスを測定するための基質である。
【００４４】
本発明の第１４実施形態は、候補化合物と真核性受容体ＧＰＣＲとの相互作用を試験するためのインビトロの方法に言及し、該方法は、上述の細胞による細胞株、またはＧＰＣＲで集積された前記細胞膜画分、または上述のＧＰＣＲおよび真核性受容体ＧＰＣＲ活性の決定とともに培地に、候補化合物を加える工程を含む。好ましい実施形態では、真核性受容体ＧＰＣＲ活性の決定は、基質、好ましくは細胞内カルシウムの上昇を測定するための蛍光基質、エクオリンの基質、または細胞によって調節するエキソサイトーシスを測定するための基質によって実行される。
【実施例】
【００４５】
実施例１．造血細胞におけるＧＰＣＲの表面発現に対する、プロモーター、シグナルペプチド、および異種のウイルス−ＧＰＣＲ配列の組み合わせの影響。
ベクターを、以下のプロモーターの制御下で、専門的な調節されたエキソサイトーシスを有する造血細胞におけるＧＰＣＲの安定した発現のために発達された：モロニー白血病ウイルス５’−ＬＴＲ（ＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）、ヒトのホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）およびヒト伸長因子１アルファプロモーター（ｈＥＦ１アルファ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）。すべてのベクターは、安定した真核細胞、マウス免疫グロブリン・カッパ・シグナルペプチド、その後のｃ−ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮペプチド）、および位置１でメチオニンのない全体のＧＰＣＲの選択のためにネオマイシン抵抗性遺伝子を有していた。各ベクターを、マイクロポレーター（ｍｉｃｒｏｐｏｒａｔｏｒ）（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を使用して、ＲＢＬ−２Ｈ３へと個々に電気穿孔処理し、４８時間後、５００ｕｇ／ｍＬのネオマイシンを、選択のための培養物（ｃｕｌｔｕｒｅ）に加えた。約２週間の選択の後、細胞を、表面発現のために抗ｃｍｙｃタグ抗体（抗−ｃｍｙｃ−ＦＩＴＣ、クローン９Ｅ１０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， ＵＳＡ）とともにフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ＵＳＡ）によって分析した。表面発現に基づいて、ＧＰＣＲを以下の３つのカテゴリーに分類した：原型としてヒトのインターロイキン８受容体によって試験されたすべてのプロモーターと陽性であったＧＰＣＲ；原型としてヒトのブラジキニン型Ｂ１受容体によって試験されたプロモーターの少なくとも１つと陽性であったＧＰＣＲ（モロニー白血病ウイルス５’−ＬＴＲプロモーターのみと陽性であった）、および原型としてヒトＨＴＲ１Ｂ受容体によって試験されたすべてのプロモーターと陰性であったＧＰＣＲ。したがって、新しいベクターを、ＲＢＬ−２Ｈ３のような造血細胞へと発現されるのが難しい受容体の原型として、ヒトＨＴＲ１Ｂ受容体によって発達させた。ベクターを、以下のプロモーターの制御下で専門的な調節されたエキソサイトーシスを有するＲＢＬ−２Ｈ３細胞のヒトＨＴＲ１Ｂの安定した発現のために発達させた：モロニー白血病ウイルス５’−ＬＴＲ（ＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）、ヒトのホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）およびヒト伸長因子１アルファプロモーター（ｈＥＦ１アルファ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）。すべてのベクターは、安定した真核細胞、マウス免疫グロブリン・カッパ・シグナルペプチド、その後の、ウイルス−ＧＰＣＲ配列に由来する配列（ＶＧＳ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）である、ｃ−ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮペプチド）、および位置１でメチオニンのない全体のヒトＧＰＣＲの選択のためにネオマイシン抵抗性遺伝子を有していた。表面発現が、特定の異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列によって改善されるかどうかを試験するために、そのような異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列を含んだ。各ベクターを、マイクロポレーター（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を使用して、ＲＢＬ−２Ｈ３へと個々に電気穿孔処理し、４８時���後、５００ｕｇ／ｍＬのネオマイシンを、選択のための培養物に加えた。約２週間の選択の後、細胞を、表面発現のために抗ｃｍｙｃタグ抗体（抗−ｃｍｙｃ−ＦＩＴＣ、クローン９Ｅ１０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， ＵＳＡ）とともにフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ＵＳＡ）によって分析した。結果を、同じ抗ｃｍｙｃタグ抗体によってインキュベートした形質移入されていないＲＢＬ−２Ｈ３細胞からの値を引いた後の陽性細胞の割合として表わした。２パーセント未満の割合を、そういうものとして示し、ＭＡＣＳによるそのような陽性細胞の単離に成功しなかったため、陰性であると考えた。陽性細胞については、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、陽性細胞の表面上の表面受容体密度のマーカーとして得た。結果を以下の表１に示す：
【００４６】
【表１】
2016538823.tif 000003
【００４７】
したがって、ＨＴＲ１Ｂに関して、表面発現を増加させるためにベクターに異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列を含めること（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）で、試験されるすべてのプロモーターと陽性となった。興味深いことに、ＨＴＲ１Ｂの発現のために試験された新しいプロモーターに関して、異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列を含めることで、陽性細胞の割合は増加しないが、陽性細胞のＭＦＩは２．８倍増加された。ベクターが、ＶＧＳを含む新しいＧＰＣＲのために発達されたときに、ＶＧＳを有する、ｈＥＦ１ａｌｐｈａプロモーターまたはＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲプロモーターのいずれか及び安定して形質移入されたベクターは、常に、それらのＶＧＳ陰性の対照物と等しく又はより良く作用した。現在までに試験されたそのようなＧＰＣＲは：ＢＤＫＲＢ１、ＡＧＴＲ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＧＲＭ４、ＡＶＰＲ２、ＤＲＤ１、ＤＲＤ２、ＥＤＮＲＢ、ＴＡＣＲ３、ＡＤＯＲＡ３、ＨＴＲ１Ｂ、ＣＨＲＭ２、ＩＬ８ＲＡ、ＮＰＹ１Ｒ、ＡＤＲＡ２Ａ、ＡＤＲＡＢ２、ＣＣＫＢＲ、ＳＳＴＲ２、ＭＣ１Ｒ、ＢＢ２ＲおよびＣＨＨＲ１を含んだ。３２ＤおよびＰ８１５の細胞のような他の造血細胞においても同じ結果が得られ、ＲＢＬ−２Ｈ３でＨＴＲ１Ｂを示された結果は、幾つかの造血細胞株におけるすべての試験されたＧＰＣＲの表面発現に対する異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列の効果を表わしている。したがって、上の結果は、ＧＰＣＲに対する異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列の付加が、表面発現を改善し、それ故、本発明の方法に有用であることを示す。
【００４８】
実施例２．他の真核細胞におけるＧＰＣＲの表面発現のための異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列の影響。
ベクターを、２０を超える異なるＧＰＣＲに対して以前に試験されたＧＰＣＲの発現のための優れたプロモーターである、モロニー白血病ウイルス５’−ＬＴＲ（ＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）の制御下で、専門的な調節されたエキソサイトーシスのなしで造血細胞におけるＧＰＣＲの安定した発現のために発達させた。ベクターは、安定した真核細胞、マウス免疫グロブリン・カッパ・シグナルペプチド、その後のｃ−ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮペプチド）、および位置１でメチオニンのない全体のＨＴ１ＢＲ ＧＰＣＲの選択のためにネオマイシン抵抗性遺伝子を有していた。このＧＰＣＲは、ＲＢＬ−２Ｈ３へと発現されることが困難な受容体の原型である。以下の２つのベクターを発達させた：異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列（ＶＧＳ）を有するベクターおよびＶＧＳを有さない。各ベクターを、マイクロポレーター（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を使用して、マウスの骨髄単球性白血病細胞株（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ２６）である、ＷＥＨＩ−３Ｂへと、およびマウスリンフォーマＴ細胞株（ＨＰＡ培養物、Ｃａｔ． Ｎｏ． ８８１００５０７）である、ＢＷ５１４７．Ｇ．１．４．ｏｖａｒ．１へと個々に電気穿孔処理し、４８時間後、ネオマイシンを選択のための培養物に加えた。約２週間の選択の後、細胞を、表面発現のために抗ｃｍｙｃタグ抗体（抗−ｃｍｙｃ−ＦＩＴＣ、クローン９Ｅ１０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， ＵＳＡ）とともにフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ＵＳＡ）によって分析した。結果を以下の表２に示す。
【００４９】
【表２】
2016538823.tif 000004
【００５０】
したがって、ベクターに異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列を含めることで、ＷＥＨＩ−３Ｂ細胞およびＢＷ５１４７細胞両方においてＨＴ１ＢＲの表面発現が増加する。第１細胞株では、増加は１．６倍の比率に対して約３０％から約５０％までであるが、ＢＷ５１４７細胞における効果は、表面発現を有する細胞の約１５倍高い割合である。したがって、ＶＧＳは、ＧＰＣＲのアミノ末端に加えられるときに専門的なエキソサイトーシスなしで造血細胞株においてその表面発現を改善する配列である。
【００５１】
実施例３．非造血細胞におけるＧＰＣＲの表面発現に対する異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列の影響。
ベクターを、以下のプロモーターの制御下で哺乳動物細胞においてＧＰＣＲの安定した発現のために発達させた：モロニー白血病ウイルス５’−ＬＴＲ（ＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、ヒトのホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）およびヒト伸長因子１アルファプロモーター（ｈＥＦ１アルファ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）。すべてのベクターは、安定した真核細胞、マウス免疫グロブリン・カッパ・シグナルペプチド、その後の、ウイルス−ＧＰＣＲに由来する配列（ＶＧＳ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）である、ｃ−ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮペプチド）、および位置１でメチオニンのない全体のヒトＨＴＲ１Ｂの選択のためにネオマイシン抵抗性遺伝子を有していた。表面発現が、非造血細胞において特定の異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列によって改善されるかどうかを試験するために、そのような異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列を含んだ。各ベクターを、マイクロポレーター（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を使用して、ＨＥＫ２９３細胞（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ３０５）へと個々に電気穿孔処理し、４８時間後、１０００ｕｇ／ｍＬのネオマイシンを、選択のための培養物に加えた。約２週間の選択の後、細胞を、表面発現のために抗ｃｍｙｃタグ抗体（抗−ｃｍｙｃ−ＦＩＴＣ、クローン９Ｅ１０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， ＵＳＡ）とともにフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ＵＳＡ）によって分析した。結果を、同じ抗ｃｍｙｃタグ抗体によってインキュベートした形質移入されていないＨＥＫ２９３細胞からの値を引いた後の陽性細胞の割合として表わした。２パーセント未満の割合を、そういうものとして示し、ＭＡＣＳによるそのような陽性細胞の単離に成功しなかったため、陰性であると考えた。陽性細胞については、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、陽性細胞の表面上の表面受容体密度のマーカーとして得た。結果を以下の表３に示す。
【００５２】
【表３】
2016538823.tif 000005
【００５３】
したがって、広く用いられているヒト胎生腎の造血細胞株である、ＨＥＫ２９３（ｎｏｎ）へと安定して形質移入されたＨＴＲ１Ｂに対して、ベクターに異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列を含めることで、試験されるすべてのプロモーターのための表面発現が増加する。造血細胞系へのＧＰＣＲの発現に対する優れたプロモーターであるＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲはまた、ＨＥＫ２９３に対する優れたプロモーターでもあり、ＶＧＳを含めることで、陽性細胞の割合が２．７倍増加する。本実施例は、異種のウイルス−ＧＰＣＲ由来の配列が、異種細胞におけるＧＰＣＲの表面発現に有用であり、この改善が、造血細胞に限定されず、他の真核細胞にも当てはまることを実証している。
【００５４】
実施例４：ＧＰＣＲの表面発現に対するＶＧＳの変異の影響。
ベクターを、モロニー白血病ウイルス５’−ＬＴＲプロモーター（ＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）の制御下において、哺乳動物細胞における位置１で、メチオニンなしのヒトＨＴＲ１Ｂの安定した発現のために発達させた。すべてのベクターは、安定した真核細胞およびマウス免疫グロブリン・カッパ・シグナルペプチド、その後のｃ−ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮペプチド）の選択のためにネオマイシン抵抗性遺伝子を有していた。ベクターは、ＶＧＳ、天然のＶＧＳまたは２つのＶＧＳ変異体（ＶＧＳ変異体１およびＶＧＳ変異体２）を含まなかった。本実験を、潜在的なＮ−結合グリコシル化部位を表わすＶＧＳでのセリンおよびトレオニンが、改善された表面発現の分子の決定因子であるかどうかを試験するように設計した。ＶＧＳ変異体１では、すべての５つのセリンおよびトレオニンが、アラニンに変異し、一方でＶＧＳ変異体２では、すべてのセリンが変異し、２つのトレオニンがそのままであった。
【００５５】
本実験で使用される異なるＶＧＳの配列は以下の通りである：
・  天然の短いＶＧＳ（ＬＳＴＭＡＰＧＳＴＶＧＴ）。
・  ＶＧＳ変異体１（ＬＡＡＭＡＰＧＡＡＶＧＡ）。
・  ＶＧＳ変異体２（ＬＡＡＭＡＰＧＡＴＶＧＴ）。
【００５６】
各ベクターを、マイクロポレーター（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を使用して、ＲＢＬ−２Ｈ３へと３回繰り返して個々に電気穿孔処理し、４８時間後、５００ｕｇ／ｍＬのネオマイシンを、選択のための培養物に加えた。約２週間の選択の後、細胞を、表面発現のために抗ｃｍｙｃタグ抗体（抗−ｃｍｙｃ−ＦＩＴＣ、クローン９Ｅ１０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， ＵＳＡ）とともにフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ＵＳＡ）によって分析した。選択された細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉおよび抗ｃｍｙｃタグから磁気ビーズを使用することによって分離した。結果を、同じ抗ｃｍｙｃタグ抗体によってインキュベートした形質移入されていないＲＢＬ−２Ｈ３細胞からの値を引いた後の陽性細胞の割合として表わした。陽性細胞に関して、中央値の蛍光強度（ｘ−中央値）を、陽性細胞の表面上の表面受容体密度のマーカーとして得た。結果を以下の表４に示す。
【００５７】
【表４】
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【００５８】
上の結果は、天然のＶＧＳを含めることで、４１％から５０％まで増加した陽性細胞の両方の割合として細胞表面発現が改善しただけでなく、陽性細胞の蛍光強度の中央値が、３３．８から８９．３まで増加した、すなわち、２．６倍を増加したことを示す。さらに、上の結果は、Ｏ−グリコシル化されるコンピューター内で予測されたセリンおよびトレオニンの変異（ＶＧＳ変異体２）が、中央値の蛍光強度を、８９．３から１．４３倍の中央値の減少である６２．４まで減少させたが、そのような変異による陽性細胞の割合の変化でなく、一方で、グリコシル化されると予測されないものを含むＶＧＳのすべてのセリンおよびトレオニンの変異は、中央値の蛍光強度を８９．３から約２倍である４５．６まで減少させたが、再び陽性細胞の割合の変化がなかったことを示す。上の結果は、ＧＰＣＲの表面発現に対するウイルス由来のＧＰＣＲ配列の効果が、部分であるがセリンおよびトレオニンがすべての原因ではないことを実証している。そのようなセリンおよびトレオニンが、グリコシル化されると（現在は知られていないが、もしそうならば（ｉｓ ｎｏｔ ｋｎｏｗｎ ａｔ ｐｒｅｓｅｎｔ ｂｕｔ ｉｆ ｓｏ））、潜在的なＯ−グリコシル化以外の特性が、なぜＶＧＳがＧＰＣＲの細胞表面発現を改善するかの説明となる。
【図１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年4月7日(2014.4.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロでの真核細胞の表面の真核性受容体ＧＰＣＲの発現を改善するための、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２によって、あるいはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９によって表わされるようなアミノ酸配列を又はＶＧＳ変異体１またはＶＧＳ変異体２によって表わされるようなその変異体のアミノ酸配列をコード化するＤＮＡ配列によって、表わされるような、核酸配列の使用。
【請求項２】
真核性受容体ＧＰＣＲは、インビトロでの真核細胞において過剰発現されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２によって、あるいはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９によって表わされるようなアミノ酸配列を又はＶＧＳ変異体１またはＶＧＳ変異体２によって表わされるようなその変異体のアミノ酸配列をコード化する核酸配列によって、表わされるような、分離した核酸配列。
【請求項４】
真核性受容体ＧＰＣＲを含むキメラＧＰＣＲをコード化する核酸配列であって、ここでＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９によって表わされるようなウイルスＧＰＣＲの少なくとも一部またはＶＧＳ変異体１またはＶＧＳ変異体２によって表わされるようなその変異体が加えられ、前記核酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２によって表わされるような少なくとも１つの核酸配列あるいはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９によって表わされるようなアミノ酸配列を又はＶＧＳ変異体１またはＶＧＳ変異体２によって表わされるようなその変異体のアミノ酸配列をコード化する少なくとも１つの核酸配列を含むことを特徴とする、核酸配列。
【請求項５】
表面発現を改善するためのシグナルペプチド、及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２によって表わされるような核酸配列、あるいはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９によって表わされるようなアミノ酸配列を又はＶＧＳ変異体１またはＶＧＳ変異体２によって表わされるようなその変異体のアミノ酸配列をコード化する核酸配列を積極的に発現する細胞の表面の検出及び／又は分離のための配列タグをさらに含むことを特徴とする、請求項４に記載の核酸配列。
【請求項６】
プロモーターをさらに含むことを特徴とする、請求項４または５に記載の核酸配列。
【請求項７】
誘導性プロモーターを含むことを特徴とする、請求項６に記載の核酸配列。
【請求項８】
テトラサイクリン誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、クマート誘導性プロモーターおよびプロゲステロン誘導性プロモーターから選択される、誘導性プロモーターを含むことを特徴とする、請求項７に記載の核酸配列。
【請求項９】
構成的プロモーターを含むことを特徴とする、請求項６に記載の核酸配列。
【請求項１０】
配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６から選択される構成的プロモーターを含むことを特徴とする、請求項９に記載の核酸配列。
【請求項１１】
請求項３乃至１０の核酸配列を含む、発現ベクター、好ましくはプラスミド。
【請求項１２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７をさらに含むことを特徴とする、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
請求項３乃至１０の核酸配列、または請求項１１または１２のプラスミドまたは発現ベクターを含む、真核細胞。
【請求項１４】
造血細胞であることを特徴とする、請求項１３に記載の真核細胞。
【請求項１５】
真核性受容体ＧＰＣＲに対する候補化合物の活性または影響をスクリーニングするための、請求項１３または１４の細胞の使用。
【請求項１６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９によって表わされるような少なくとも１つのアミノ酸配列またはＶＧＳ変異体１またはＶＧＳ変異体２によって表わされるようなその変異体が加えられた、真核性ＧＰＣＲを含むこと、あるいはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２によって表わされるような核酸配列によってコード化されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、キメラＧＰＣＲ。
【請求項１７】
請求項３乃至１０の核酸配列によってコード化されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１６に記載のキメラＧＰＣＲ。
【請求項１８】
真核性受容体ＧＰＣＲに対する候補化合物の活性または影響をスクリーニングするための、請求項１６または１７のキメラＧＰＣＲの使用。
【請求項１９】
請求項１６または１７のキメラＧＰＣＲを含む、細胞膜画分。
【請求項２０】
真核性受容体ＧＰＣＲに対する候補化合物の活性または影響をスクリーニングするための、請求項１９の細胞膜画分のインビトロでの使用。
【請求項２１】
候補化合物と真核性受容体ＧＰＣＲとの相互作用を試験するためのキットであって、該キットは、請求項１３または１４の細胞株、または請求項１９の前記細胞膜画分、または請求項１６または１７のキメラＧＰＣＲ、および真核性受容体ＧＰＣＲ活性の決定のための基質を含むことを特徴とする、キット。
【請求項２２】
基質が、細胞内カルシウムの上昇を測定するための、蛍光基質、エクオリンの基質、または細胞によって調節するエキソサイトーシスを測定するための基質であることを特徴とする、請求項２１に記載キット。
【請求項２３】
候補化合物と真核性受容体との相互作用を試験するためのインビトロでの方法であって、該方法は、請求項１３または１４の細胞株、または請求項１９の細胞膜画分、または請求項１６または１７のキメラＧＰＣＲ、および真核性受容体ＧＰＣＲ活性の決定とともに培養培地に候補化合物を加える工程を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２４】
真核性受容体ＧＰＣＲ活性の決定が基質によって実行されることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
基質が、細胞内カルシウムの上昇を測定するための、蛍光基質、エクオリンの基質、または細胞によって調節するエキソサイトーシスを測定するための基質であることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成28年3月23日(2016.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロでの真核細胞の表面の真核性受容体ＧＰＣＲの過剰発現を改善するための、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２によって、あるいはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９によって表わされるペプチドをあるいはＶＧＳ変異体１によって表わされるペプチド（LAAMAPGAAVGA）またはＶＧＳ変異体２によって表わされるペプチド（LAAMAPGATVGT）をコード化するＤＮＡ配列によって表わされる核酸の使用。
【請求項２】
真核性受容体ＧＰＣＲと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９によって表わされるウイルスＧＰＣＲの少なくとも一部あるいはＶＧＳ変異体１によって表わされるペプチド（LAAMAPGAAVGA）またはＶＧＳ変異体２によって表わされるペプチド（LAAMAPGATVGT）を含むキメラＧＰＣＲをコード化する核酸であって、キメラＧＰＣＲをコード化する核酸が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２によって表わされる少なくとも１つの核酸あるいはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９、ＶＧＳ変異体１またはＶＧＳ変異体２によって表わされるペプチドをコード化する少なくとも１つの核酸を含むことを特徴とする、核酸。
【請求項３】
表面発現を改善するためのシグナルペプチドをコード化する核酸、
及び／又は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２によって表わされる核酸、あるいはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９、ＶＧＳ変異体１（LAAMAPGAAVGA）またはＶＧＳ変異体２（LAAMAPGATVGT）によって表わされるペプチドをコード化する核酸を積極的に発現する細胞の表面の検出及び／又は分離のための配列タグ、
をさらに含むことを特徴とする、請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
プロモーターをさらに含むことを特徴とする、請求項２又は３に記載の核酸。
【請求項５】
誘導性プロモーターを含むことを特徴とする、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
テトラサイクリン誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、クマート誘導性プロモーターおよびプロゲステロン誘導性プロモーターから選択される、誘導性プロモーターを含むことを特徴とする、請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
構成的プロモーターを含むことを特徴とする、請求項４に記載の核酸。
【請求項８】
配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６から選択される構成的プロモーターを含むことを特徴とする、請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
請求項２乃至８のいずれか１つに記載の核酸を含むことを特徴とする、発現ベクター。
【請求項１０】
発現ベクターがプラスミドであることを特徴とする、請求項９記載の発現ベクター。
【請求項１１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７をさらに含むことを特徴とする、請求項９又は１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
請求項２乃至８のいずれか１つに記載の核酸、または請求項９または１０の発現ベクターを含む、真核細胞。
【請求項１３】
造血細胞であることを特徴とする、請求項１２に記載の真核細胞。
【請求項１４】
真核性受容体ＧＰＣＲに対する候補化合物の活性または影響をスクリーニングするための、請求項１２又は１３に記載の細胞の使用。
【請求項１５】
真核性受容体ＧＰＣＲ、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９、ＶＧＳ変異体１（LAAMAPGAAVGA）またはＶＧＳ変異体２（LAAMAPGATVGT）によって表わされるペプチドを含むこと、あるいは真核性受容体ＧＰＣＲ、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２によって表わされる核酸によってコード化されたペプチドを含むことを特徴とする、キメラＧＰＣＲ。
【請求項１６】
請求項２乃至８のいずれか１つに記載の核酸によってコード化されたペプチドを含むことを特徴とする、請求項１５に記載のキメラＧＰＣＲ。
【請求項１７】
真核性受容体ＧＰＣＲに対する候補化合物の活性または影響をスクリーニングするための、請求項１５又は１６に記載のキメラＧＰＣＲの使用。
【請求項１８】
請求項１５または１６に記載のキメラＧＰＣＲを含む、細胞膜画分。
【請求項１９】
真核性受容体ＧＰＣＲに対する候補化合物の活性または影響をスクリーニングするための、請求項１８記載の細胞膜画分のインビトロでの使用。
【請求項２０】
候補化合物と真核性受容体ＧＰＣＲとの相互作用を試験するためのキットであって、該キットは、請求項１２又は１３に記載の細胞株、または請求項１８に記載の細胞膜画分、または請求項１５又は１６に記載のキメラＧＰＣＲ、および真核性受容体ＧＰＣＲ活性の決定のための基質を含むことを特徴とする、キット。
【請求項２１】
基質が、細胞内カルシウムの上昇を測定するための、蛍光基質、エクオリンの基質、または細胞によって調節するエキソサイトーシスを測定するための基質であることを特徴とする、請求項２０に記載キット。
【請求項２２】
候補化合物と真核性受容体との相互作用を試験するためのインビトロでの方法であって、該方法は、請求項１２または１３の細胞株、または請求項１８の細胞膜画分、または請求項１５または１６のキメラＧＰＣＲとともに培養培地に候補化合物を加え、真核性受容体ＧＰＣＲ活性を決定する工程を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２３】
真核性受容体ＧＰＣＲ活性の決定が基質によって実行されることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
基質が、細胞内カルシウムの上昇を測定するための、蛍光基質、エクオリンの基質、または細胞によって調節するエキソサイトーシスを測定するための基質であることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【国際調査報告】
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