(57)【要約】  本発明は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞において、分泌シグナルを含まない、天然では非分泌性のポリペプチドを生成し、および溶解ステップを実施することなく、ポリペプチドを回収する方法、ならびに、分泌シグナル含まない、天然では非分泌性のポリペプチドをコードする１つまたは複数の外性もしくは異種ポリヌクレオチドを含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞において、天然では非分泌性のポリペプチドを生成する方法であって、以下：
（ａ）前記天然では非分泌性のポリペプチドの発現を促進する条件下で、増殖培地において、分泌シグナルを含まない、前記天然では非分泌性のポリペプチドをコードする１つまたは複数の外性もしくは異種ポリヌクレオチドを含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を培養するステップ；および
（ｂ）細胞溶解ステップを実施することなく、前記天然では非分泌性のポリペプチドを回収するステップ
を含む方法。
【請求項２】
ポリペプチドを生成する方法であって、以下：
（ａ）前記ポリペプチドの生成を促進する条件下で、前記ポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を培養するステップであって、前記ポリペプチドが、その天然の野生型供給源により細胞内に生成され、前記１つまたは複数のポリヌクレオチドは、シグナルペプチドコード配列に作動可能にリンクされていないステップ；および
（ｂ）細胞溶解ステップを実施することなく、前記ポリペプチドを回収するステップ
を含む方法。
【請求項３】
前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞が、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなる群から選択され、好ましくは、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）または古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞に対して在来である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞に対して異種である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、好熱性生物に由来する、請求項１〜３および５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、低好熱性生物に由来する、請求項１〜３および５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記好熱性または低好熱性生物が、アエロピュルム（Ａｅｒｏｐｙｌｕｍ）、アクウィフェクス（Ａｑｕｉｆｅｘ）、アルカエオグロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｕｂｕｓ）、ディクチオグロムス（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ）、ゲオサーモバクテリウム（Ｇｅｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノピュルス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）、ピュロコックス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピュロロブス（Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ）、スルホロブス（Ｓｕｌｐｈｏｌｏｂｕｓ）、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、およびサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）からなる群から選択される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、発酵ブロス中の前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞により産生される１つまたは複数の内在性プロテアーゼによる分解に対して耐性である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、酵素であり；好ましくは、前記酵素は、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、またはトランスフェラーゼであり；より好ましくは、前記酵素は、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノトランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記酵素が、配列番号１に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むグルカノトランスフェラーゼ、または、配列番号２に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む海洋クラゲのオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来の前記緑色蛍光タンパク質の変異体、または配列番号３に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むアスパラギナーゼである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つまたは複数のポリヌクレオチドの各々が、その発現を可能にする少なくとも１つのプロモータと作動可能にリンクしており；好ましくは、前記プロモータが、内在性または外性であり；より好ましくは、前記プロモータは、タンデムプロモータである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つまたは複数のポリヌクレオチドが、前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞の少なくとも１つの染色体遺伝子座、好ましくはいくつかの遺伝子座に組み込まれる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、収集、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、または沈殿により回収される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、前記発酵ブロス中で回収される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞が、１つまたは複数のプロテアーゼ、例えば、４、５もしくは６種のプロテアーゼをコードする１つまたは複数の核酸配列の破壊、例えば、欠失を含み、これによって、より少ないプロテアーゼの生成がもたらされる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記１つまたは複数のプロテアーゼが、ＡｐｒＥ（アルカリプロテアーゼ）、Ｂｐｒ（バチロペプチダーゼＦ）、Ｅｐｒ（微小細胞外セリンプロテアーゼ）、Ｍｐｒ（メタロプロテアーゼ）、ＮｐｒＥ（細胞外中性プロテアーゼＢ）、Ｖｐｒ（微小細胞外セリンプロテアーゼ）、およびＷｐｒＡ（分泌された品質管理プロテアーゼ）からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
生成されるポリペプチドの量が、発酵ブロス１ｌ当たり少なくとも１ｇ、好ましくは少なくとも１０ｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも２０ｇ／ｌである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
分泌シグナルを含まない、天然では非分泌性のポリペプチドをコードする１つまたは複数の外性もしくは異種ポリヌクレオチドを含む、組み換えバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項２０】
ポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む組み換えバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞であって、前記ポリペプチドが、その天然の野生型供給源により細胞内に生成され、前記１つまたは複数のポリヌクレオチドが、シグナルペプチドコード配列と作動可能にリンクされていない、組み換えバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞において、分泌シグナルを含まない、天然では非分泌性のポリペプチドを生成し、および溶解ステップを実施することなく、天然では非分泌性のポリペプチドを回収する方法、ならびに、分泌シグナル含まない、目的とする天然では非分泌性のポリペプチドをコードする１つまたは複数の外性もしくは異種ポリヌクレオチドを含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、主に、いわゆるシグナルペプチドを有するポリペプチドを活発に分泌するという理由で、目的とする様々なポリペプチドの工業生産においてワークホース（ｗｏｒｋｈｏｒｓｅ）として特徴付けられている。シグナルペプチドは、典型的には約２０〜３０アミノ酸の短いポリペプチドであり、分泌されようとするポリペプチドのＮ末端との転写的および翻訳的融合物に発現される。これは、好適に装備された宿主細胞の分泌機構内に融合ポリペプチドを向かわせ、これによって、融合ポリペプチドが切断されると共に、目的とする現時点の成熟型ポリペプチドが、そのシグナルペプチドなしで周囲の培養ブロス中に分泌され、上記シグナルペプチドは、細胞内に保持されて分解される。
【０００３】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における目的の組み換え生成ポリペプチドの分泌によって、細胞溶解ステップを実施する必要なしに、培養ブロスから直接ポリペプチドの比較的容易な回収が可能になる。細胞から増殖培地に膜外輸送されることが指令されたポリペプチドだけが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）においてシグナルペプチドを天然に備えている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、細胞中のほとんどのポリペプチドは、膜外輸送を指令されておらず、むしろ細胞内、周辺細胞質、膜結合などであることが意図されている。このような天然では非分泌性のポリペプチドは、宿主細胞内から回収する必要があり、これは、通常、困難な回収工程を伴う煩雑な細胞溶解ステップを必要とするか、あるいは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のような宿主細胞からの活発な分泌を可能にすることを期待して（これが成功する保証は全くない）、異種分泌シグナルと一緒に人工融合タンパク質として発現する必要があるかのいずれかであるため、生成するのが厄介であると一般に考えられている。従って、経済的に効率的な方式で天然では非分泌性のポリペプチドを生成する方法が当技術分野において求められている。
【０００５】
本発明者らの予想とは反対に、天然では細胞内であるか、または非分泌の酵素をバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）および古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主において発現させたときの上清中に非常に高レベルの酵素活性を見出した。これは、天然では非分泌性のポリペプチドをバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）において生成し、コストのかかる細胞溶解ステップなしで、ブロスから直接回収できることを示しているため、極めて意外な結果であると同時に、経済的に重要なものでもある。
【０００６】
以下の実施例１において、シグナルペプチドを含まない、天然では非分泌性のアスパラギナーゼ（ＡＳＰ）を過剰発現する古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株、およびシグナルペプチドを含まない、天然では非分泌性のグルカノトランスフェラーゼ（ＧＴ）を過剰発現するバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、またはシグナルペプチドを含まないＧＦＰ変異体を、それぞれ、ＡＳＰ／ＧＴ／ＧＦＰ変異体コード遺伝子を含まない対照株と比較した。ＡＳＰ、ＧＴおよびＧＦＰ変異体コード遺伝子は、分泌シグナルなしで発現されたが、このシグナルは、他では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞での活発な分泌に必要と思われていた。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主の上清中に高レベルの酵素活性を認めることは、非常に意外なことであった。しかし、コストのかかる溶解ステップを実施する必要なしに、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞において、天然では細胞内であるか、または非分泌性である、シグナルペプチドのないポリペプチドを組み換えにより生成できることは、はるかにコスト効率の高い生産を可能にするため、非常に喜ぶべき驚きであった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って、第１の態様では、本発明は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞において、目的とするポリペプチドを生成する方法を提供し、前記方法は、以下：
ｉ）ポリペプチドの発現を促進する条件下で、増殖培地において、分泌シグナルを含まない、目的とする天然では非分泌性のポリペプチドをコードする１つまたは複数の外性ポリヌクレオチドを含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を培養するステップ；および
ｉｉ）溶解ステップを実施することなく、ポリペプチドを回収するステップ
を含む。
【０００８】
第２の態様では、本発明は、分泌シグナルを含まない、目的とする天然では非分泌性のポリペプチドをコードする１つまたは複数の外性または異種ポリヌクレオチドを含む組み換えバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞に関する。
【０００９】
定義
対立遺伝子変異体：「対立遺伝子変異体」という用語は、同一の染色体座を占有する遺伝子の２つ以上の代替的な形態のいずれかを意味する。対立遺伝子変異は、突然変異によって自然に生じ、また、個体群に多型性をもたらし得る。遺伝子突然変異は、サイレントである（コードされるポリペプチドに変化がない）ことが可能であり、または、改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされたポリペプチドである。
【００１０】
細胞溶解ステップ：「細胞溶解ステップ」という用語は、回収の際に導入される、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞の溶解をもたらす処理ステップを意味する。例としては、使用済み発酵培地への酵素、例えば、リゾチームの添加：音波処理；均質化、凍結および破砕、ならびにビーズを用いた溶解が挙げられる。
【００１１】
コード配列：「コード配列」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列を直接的に特定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般にオープンリーディングフレームにより判定され、これは、ＡＴＧ、ＧＴＧ、またはＴＴＧなどの開始コドンで開始し、ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡなどの終止コドンで終わる。コード配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはこれらの組み合わせであってよい。
【００１２】
制御配列：「制御配列」という用語は、本発明の成熟型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な核酸配列を意味する。各制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して在来（すなわち、同じ遺伝子由来）もしくは外来（すなわち、異なる遺伝子由来）のものであっても、または、相互に在来もしくは外来のものであってもよい。このような制御配列としては、これらに限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナルペプチド配列、および転写ターミネータが挙げられる。少なくとも、制御配列は、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコード領域に対する制御配列の連結を促進する特定の制限部位を導入する目的で、リンカーを備えていてもよい。
【００１３】
発現：「発現」という用語は、特にこれらに限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌を含むポリペプチドの生成に関与するいずれかのステップを含む。
【００１４】
発現ベクター：「発現ベクター」という用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、また、その発現をもたらす制御配列に作動可能にリンクされている直鎖または環状ＤＮＡ分子を意味する。
【００１５】
宿主細胞：「宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクターによる形質転換、形質移入、形質導入等に対する感受性を有するいずれかの細胞型を意味する。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異によって、親細胞と同一ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。
【００１６】
単離された：「単離された」という用語は、自然界に存在しない形態または環境にある物質を意味する。単離された物質の非制限的例として、これらに限定されないが、（１）任意の非天然物質、（２）自然界では結合している、天然に存在する成分の１つまたは複数または全部から少なくとも部分的に取り出された任意の物質、例えば、これらに限定されないが、任意の酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチドもしくは補因子；（３）自然界で見出される物質に関して、人為的に修飾された任意の物質；（４）天然では結合している他の成分に関して、その物質の量を増加すること（例えば、宿主細胞における組み換え生産；その物質をコードする遺伝子の多数のコピー；ならびに物質をコードする遺伝子と天然に結合したプロモータより強力なプロモータの使用）により、修飾された任意の物質。
【００１７】
成熟型ポリペプチド：「成熟型ポリペプチド」という用語は、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端切断等などの翻訳および任意の翻訳後修飾後における、その最終形態にあるポリペプチドを意味する。宿主細胞が、同じポリヌクレオチドによって発現されるさらに異なる成熟型ポリペプチド（すなわち、異なるＣ末端および／またはＮ末端アミノ酸を有する）の２つの混合物を産生し得ることは当技術分野において公知である。さらに、異なる宿主細胞は、ポリペプチドのプロセシングも異なるため、ポリペプチドを発現する１つの宿主細胞は、同じポリヌクレオチドを発現する別の細胞と比較して、異なる成熟型ポリペプチド（例えば、異なるＣ末端および／またはＮ末端アミノ酸を有する）を生成し得ることも公知である。
【００１８】
天然では非分泌性のポリペプチド：「天然では非分泌性のポリペプチド」という用語は、その天然の野生型供給源によって細胞内に生成される（すなわち、分泌されない）ポリペプチドを意味する。変異体の場合、「天然では非分泌性のポリペプチド」という用語は、変異体が由来する野生型ポリペプチドが、その天然の野生型供給源によって細胞内に生成される（すなわち、分泌されない）ことを意味する。
【００１９】
核酸構築物：「核酸構築物」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかである核酸分子を意味し、これは、天然の遺伝子から単離されるか、または、そうでなければ自然界に存在しないであろう方法で核酸のセグメントを含有するよう修飾されるか、あるいは、合成のものであり、１つまたは複数の制御配列を含む。
【００２０】
作動可能にリンクされた：「作動可能にリンクされた」という用語は、制御配列がコード配列の発現を指令するよう、ポリヌクレオチドのコード配列に対して適切な位置に、制御配列が位置する構造を意味する。
【００２１】
配列同一性：２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性が、「配列同一性」というパラメータによって記載される。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて判定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳボージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
（同等の残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
【００２２】
本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性は、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（前述のＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（前述のＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）を用いて判定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ  ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
（同等のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
【００２３】
変異体：「変異体」という用語は、親野生型または参照のアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数（例えば、いくつか）の位置で、改変（すなわち、置換、挿入、および／または欠失）を含む、酵素活性を有するポリペプチドを意味する。置換とは、ある位置を占めるアミノ酸の異なるアミノ酸による置き換えを意味し；欠失とは、ある位置を占めるアミノ酸の除去を意味し；および、挿入とは、ある位置を占めるアミノ酸に隣接して、およびその直後に、アミノ酸を付加することを意味する。
【００２４】
成熟型ポリペプチドの変異体は、１つまたは複数（例えば、いくつか）の位置に置換、欠失、および／または挿入を含み得る。成熟型ポリペプチドに導入されたアミノ酸置換、欠失および／または挿入の数は、最大１０、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０であってよい。アミノ酸変更は、軽度のもの、すなわち、タンパク質のフォールディングおよび／または活性に有意に影響しない保存的アミノ酸置換または挿入；典型的には１〜３０アミノ酸の小さな欠失；アミノ末端メチオニン残基などの小さなアミノもしくはカルボキシル末端の延伸；最大２０〜２５残基の小さなリンカーペプチド；または正味電荷もしくは別の機能を変化させることによって精製を容易にする、例えば、ポリヒスチジン配列（ｐｏｌｙ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）、抗原エピトープもしくは結合ドメインなどの小さな延伸であってよい。
【００２５】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシンおよびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）、および、小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニンおよびメチオニン）の群の範囲内である。特異活性を一般に改変しないアミノ酸置換は技術分野において公知であり、例えば、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。一般的な置換はＡｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／ＧｌｕおよびＡｓｐ／Ｇｌｙである。
【００２６】
あるいは、アミノ酸変異は、ポリペプチドの物理化学的特性が改変されるような性質のものである。例えば、アミノ酸変異は、ポリペプチドの熱安定性を向上させ、基質特異性を改変し、至適ｐＨを変化させることであり得る。
【００２７】
ポリペプチドにおける必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）などの技術分野において公知である手法に従って同定することが可能である。後者の技術においては、単一のアラニン突然変異が分子中のすべての残基に導入され、得られたミュータント分子が、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定するために酵素活性についてテストされる。また、Ｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８を参照のこと。酵素の活性部位または他の生物学的相互作用は、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異が併用される、核磁気共嗚、結晶構造解析、電子回折または光親和性標識などの技術によって判定される、構造の物理的分析によって判定されることも可能である。例えば、ｄｅ  Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０９：５９−６４を参照のこと。必須アミノ酸のアイデンティティは、関連するポリペプチドとのアラインメントから推測されることも可能である。
【００２８】
単一もしくは複数のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入は、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−５７；Ｂｏｗｉｅ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２１５２−２１５６；国際公開第９５／１７４１３号パンフレット；または、国際公開第９５／２２６２５号パンフレットにより開示されているものなどの公知の突然変異誘発方法、組換え法、および／または、シャッフリング法、これに続く関連するスクリーニング法を用いて行い、テストすることが可能である。用いられることが可能である他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）、および、領域特異的突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４６：１４５；Ｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ  ７：１２７）が挙げられる。
【００２９】
突然変異誘発／シャッフリング法は、宿主細胞によって発現されたクローン化突然変異誘発ポリペプチドの活性を検出するために、高スループット自動スクリーニング法と組み合わせることが可能である（Ｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：８９３−８９６）。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発ＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収可能であり、技術分野における標準的な方法を用いて直ぐに配列決定されることが可能である。これらの方法では、ポリペプチドにおける個別のアミノ酸残基の重要性を直ぐに判定することが可能である。
【００３０】
融合ポリペプチド：目的とするポリペプチドは、１つのポリペプチドの１領域が、別のポリペプチドの１領域のＮ末端またはＣ末端で融合されたハイブリッドポリペプチドであってもよい。
【００３１】
ポリペプチドは、他のポリペプチドが本発明のポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端で融合した融合ポリペプチドまたは切断可能な融合ポリペプチドであり得る。融合ポリペプチドは、他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドに融合させることにより生成される。融合ポリペプチドを生成する技術は、技術分野において公知であると共に、フレーム中に収まり、融合ポリペプチドの発現が同一のプロモータおよびターミネータによる制御下にあるよう、ポリペプチドをコードするコード配列を連結するステップを含む。融合ポリペプチドはまた、翻訳後に融合ポリペプチドが形成されるインテインテクノロジーを用いて構築されてもよい（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：２５７５−２５８３；Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６−７７９）。
【００３２】
融合ポリペプチドは、２つのポリペプチドの間に切断部位をさらに含んでいることが可能である。融合タンパク質が分泌される際に、この部位が切断されて２つのポリペプチドが遊離される。切断部位の例としては、これらに限定されないが、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：５６８−５７６；Ｓｖｅｔｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：２４５−２５１；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ−Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：３４８８−３４９３；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：４９８−５０３；および、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：３７８−３８１；Ｅａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：５０５−５１２；Ｃｏｌｌｉｎｓ−Ｒａｃｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：９８２−９８７；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：２４０−２４８；および、Ｓｔｅｖｅｎｓ，２００３，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｗｏｒｌｄ  ４：３５−４８に開示されている部位が挙げられる。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
生成方法
第１の態様では、本発明は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞において、目的とする天然では非分泌性のポリペプチドを生産する方法を提供し、この方法は、以下：
ｉ）ポリペプチドの発現を促進する条件下で、増殖培地において、分泌シグナルを含まない、目的とする天然では非分泌性のポリペプチドをコードする１つまたは複数の外性もしくは異種ポリヌクレオチドを含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を培養するステップ；および
ｉｉ）溶解ステップを実施することなく、ポリペプチドを回収するステップ
を含む。
【００３４】
宿主細胞は、当技術分野で周知の方法を用いて、ポリペプチドの生成に好適な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、好適な培地中ならびにポリペプチドの発現および／または単離が可能な条件下で、振盪フラスコ培養により、または、実験用もしくは産業用発酵槽における小規模もしくは大規模発酵（連続式、バッチ式、フェドバッチ式または固体状発酵を含む）により培養してよい。培養は、炭素および窒素源と、無機塩とを含む好適な栄養培地において、当技術分野では公知の手順を用いて行われる。好適な培地は、供給業者から入手可能であるか、または、（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログにおいて）公開されている組成に従って調製してもよい。温度は、典型的に３０〜４０℃の範囲であり、ｐＨは、典型的に５〜８の範囲である。本発明の方法は、目的とするポリペプチドの高い収率、すなわち、発酵ブロス１ｌ当たり少なくとも１ｇ、好ましくは少なくとも１０ｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも２０ｇ／ｌを達成する。
【００３５】
ポリペプチドは、ポリペプチドの専門分野において公知の方法を用いて検出することができる。これらの検出方法は、これらに限定されないが、特定の抗体の使用、酵素産物の形成、または、酵素基質の消失を含み得る。例えば、酵素アッセイを用いて、ポリペプチドの活性を決定してもよい。
【００３６】
ポリペプチドは、当技術分野では公知の方法を用いて回収することができる。例えば、ポリペプチドは、これらに限定されないが、収集、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、または沈殿を含む従来の手法により栄養培地から回収することができる。一態様では、ポリペプチドを含む発酵ブロスを回収する。
【００３７】
ポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチドを得るために、これらに限定されないが、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動法（例えば、分取等電点電気泳動）、較差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照のこと）など、当技術分野で公知の多様な方法によって精製することができる。
【００３８】
代替的な態様においては、ポリペプチドを回収するのではなく、ポリペプチドを発現する本発明の宿主細胞をポリペプチドの供給源として用いる。
【００３９】
天然では非分泌性のポリペプチド
本発明の目的とする、天然では非分泌性でありかつシグナルペプチドを含まないプロテアーゼは、いずれかの属の微生物から得られ得る。本発明の目的のために、「〜から得られる」という用語は、本明細書において用いられるところ、所与のソースに関連して、ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドがソースによって、または、ソースからのポリヌクレオチドが挿入された系統によって生成されることを意味することとする。
【００４０】
ポリペプチドは細菌性ポリペプチドであり得る。例えば、ポリペプチドは、酵素活性を有する、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）もしくはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ポリペプチドなどのグラム陽性細菌性ポリペプチド、または、カムピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ネイッセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）もしくはウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）ポリペプチドなどのグラム陰性細菌性ポリペプチドであり得る。
【００４１】
一態様において、ポリペプチドは、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラスフィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ポリペプチドである。
【００４２】
他の態様において、ポリペプチドは、ストレプトコッカスエクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカスウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）またはストレプトコッカスズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ  ｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）ポリペプチドである。
【００４３】
他の態様において、ポリペプチドは、ストレプトマイセスアウロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセスアベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセスコエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセスグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）またはストレプトマイセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）ポリペプチドである。
【００４４】
別の態様では、ポリペプチドは、アエロピュルム（Ａｅｒｏｐｙｌｕｍ）、アクウィフェクス（Ａｑｕｉｆｅｘ）、アルカエオグロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｕｂｕｓ）、ディクチオグロムス（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ）、ゲオサーモバクテリウム（Ｇｅｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノピュルス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）、ピュロコックス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピュロロブス（Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ）、スルホロブス（Ｓｕｌｐｈｏｌｏｂｕｓ）、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、およびサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）の属からの好熱性または低好熱性（ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｉｃ）細菌に由来する。好熱性生物は、少なくとも５０℃の最適温度を有し、最大７０〜８０℃の温度で生存することができる。低好熱性（ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｉｃ）生物は、少なくとも８０℃の最適温度を有し、増殖のために８０〜１０５℃の温度を必要とする。
【００４５】
ポリペプチドは、真菌性ポリペプチドであり得る。例えば、ポリペプチドは、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）もしくはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ポリペプチドなどのイースト菌ポリペプチド；または、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アガリクス属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ボトリオスペリア属（Ｂｏｔｒｙｏｓｐａｅｒｉａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、ケトミジウム属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｄｉｕｍ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クラビセプス属（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）、コクリオボルス属（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）、コプリノプシス属（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ）、コプトテルメス属（Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ）、コリナスクス属（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、クリホネクトリア属（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ジプロディア属（Ｄｉｐｌｏｄｉａ）、エクシディア属（Ｅｘｉｄｉａ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ギベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、ホロマスチゴトイデス属（Ｈｏｌｏｍａｓｔｉｇｏｔｏｉｄｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、イルペクス属（Ｉｒｐｅｘ）、レンチヌラ属（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ）、レプトスパエリア属（Ｌｅｐｔｏｓｐａｅｒｉａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、メラノカルプス属（Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ）、メリピルス属（Ｍｅｒｉｐｉｌｕｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロケーテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、ピロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ポイトラシア属（Ｐｏｉｔｒａｓｉａ）、シュードプレクタニア属（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｅｃｔａｎｉａ）、シュードトリコニムファ属（Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ）、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、シゾフィルム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、シタリジウム属（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、テルモアスクス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、トリコファエア属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ）、ベルチシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ボルバリエラ属（Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ）もしくはキシラリア属（Ｘｙｌａｒｉａ）ポリペプチドなどの糸状真菌性ポリペプチドであり得る。
【００４６】
他の態様において、ポリペプチドは、サッカロマイセスカルスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセスジアスタチクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセスドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセスクルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセスノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）またはサッカロマイセスオビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）ポリペプチドである。
【００４７】
他の態様において、ポリペプチドは、アクレモニウムセルロリチクス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、アスペルギルスアクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルスフォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルスフミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルスジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウムイノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウムケラチノフィルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウムルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウムメルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウムパンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウムクイーンスランジクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウムトロピクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウムゾナツム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｚｏｎａｔｕｍ）、フザリウムバクテリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムセレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウムクロークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウムクルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム  グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウムグラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウムヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム  オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムレチクランツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム  ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウムサムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウムサルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウムスポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムスルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウムトルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウムトリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラグリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコララヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、イルペクスラクテウス（Ｉｒｐ��ｘ  ｌａｃｔｅｕｓ）、ムコールミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラテルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウムフニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウムプルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロケーテクリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、チエラビアアクロマチカ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｃｈｒｏｍａｔｉｃａ）、チエラビアアルボミセス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｌｂｏｍｙｃｅｓ）、チエラビアアルボピロサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｌｂｏｐｉｌｏｓａ）、チエラビアアウストラレインシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｕｓｔｒａｌｅｉｎｓｉｓ）、チエラビアフィメティ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｆｉｍｅｔｉ）、チエラビアミクロスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）、チエラビアオビスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｏｖｉｓｐｏｒａ）、チエラビアペルビアナ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｐｅｒｕｖｉａｎａ）、チエラビアセトサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｅｔｏｓａ）、チエラビアスペデドニウム（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｐｅｄｅｄｏｎｉｕｍ）、チエラビアスブテルモフィラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｕｂｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、チエラビアテルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコデルマハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマコニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）またはトリコデルマビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）ポリペプチドである。
【００４８】
前述の種について、本発明は、知られている種の名称に関わらず、完全および不完全世代、ならびに、例えば無性世代といった他の分類学上の均等物の両方を含むことが理解されるであろう。当業者は、適切な均等物の同一性を容易に認識するであろう。
【００４９】
これらの種の系統は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ：Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）、オランダ微生物株保存センター（ＣＢＳ：Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）、および、農業研究局特許培養物コレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、北方リサーチセンター（ＮＲＲＬ：Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）などの多数の微生物保存機関において公共に容易に利用可能である。
【００５０】
ポリペプチドは、自然（例えば、汚染物、コンポスト、水等）から単離された微生物を含む他のソースまたは天然の材料（例えば、汚染物、コンポスト、水等）から直接得られたＤＮＡサンプルから同定され、また、得られ得る。微生物およびＤＮＡを自然環境から直接単離する技術は技術分野において周知である。次いで、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、他の微生物または混合ＤＮＡサンプルのゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリを同じようにスクリーニングすることにより得られ得る。一旦、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが検出されたら、ポリヌクレオチドは、当業者に知られている技術（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照のこと）を利用することにより単離またはクローン化されることが可能である。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態では、目的とするポリペプチドは、酵素である；好ましくは、酵素は、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、またはトランスフェラーゼ；より好ましくは、酵素は、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノトランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼである。
【００５２】
好ましい実施形態では、酵素は、発酵ブロス中のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞により産生される１つまたは複数の内在性プロテアーゼによる分解に対して耐性である。分解に対する耐性は、実施例１に記載の規定培地における発酵工程中の、時間経過による上清における酵素の蓄積として定義される。
【００５３】
好ましい実施形態では、酵素は、好熱性または低好熱性（ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｉｃ）生物に由来する。これらの生物由来の酵素は、一般に高温（５０〜１１０℃）で、より安定しており、また、その拘束構造のために、より低温では、プロテアーゼに対してより高い耐性を示す（Ｐａｒｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８９；Ｄａｎｉｅｌ  ｅｔ．ａｌ，１９８２  Ｐａｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：７５９０−７５９５；Ｄａｎｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２０７：６４１−６４４）。
【００５４】
本発明のより好ましい実施形態では、目的とするポリペプチドは、酵素である；より好ましくは、酵素は、配列番号１に対して、少なくとも７０％同一である、好ましくは配列番号１に対して、好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成されるグルカノトランスフェラーゼ、配列番号２に対して、少なくとも７０％同一である、好ましくは配列番号２に対して、好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成される海洋クラゲのオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）に由来する緑色蛍光タンパク質の変異体、あるいは、配列番号３に対して、少なくとも７０％同一である、好ましくは配列番号３に対して、好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成されるアスパラギナーゼである。
【００５５】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本明細書に記載する、シグナルペプチドを含まない目的とする天然では非分泌性のポリペプチドをコードする外性または異種ポリヌクレオチドにも関する。
【００５６】
ポリヌクレオチドの単離またはクローン化に用いられる技術は技術分野において公知であり、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡからの単離、またはこれらの組み合わせが含まれる。ゲノムＤＮＡからのポリヌクレオチドのクローン化は、例えば、発現ライブラリの周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または抗体スクリーニングを用いて共有される構造機構を伴うクローン化されたＤＮＡ断片を検出することにより実施されることが可能である。例えば、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，ＰＣＲ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、連結活性化転写（ＬＡＴ）およびポリヌクレオチドベース増幅（ＮＡＳＢＡ）などの他の核酸増幅法が用いられ得る。
【００５７】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾は、ポリペプチドに実質的に類似するポリペプチドの合成に必要であり得る。ポリペプチドに「実質的に同様」という用語は、ポリペプチドの非天然形態を指す。これらのポリペプチドは、天然のソースから単離されたポリペプチドとはいくらかの操作法で異なっていてもよく、例えば、特異活性、耐熱性、至適ｐＨ等が異なる変異体である。変異体は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３に示されるアミノ酸配列、そのサブ配列を含む、またはそれからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに基づいて構築され得、および／または、ポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらさないが、ポリペプチドの生成のために意図される宿主生体のコドン利用に対応するヌクレオチド置換の導入により、または、異なるアミノ酸配列をもたらし得るヌクレオチド置換の導入により構築され得る。ヌクレオチド置換の概要については、例えば、Ｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ２：９５−１０７を参照のこと。
【００５８】
核酸構築物
本発明はまた、制御配列に適合する条件下で好適な宿主細胞中にコード配列を発現させる１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクした本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。
【００５９】
ポリヌクレオチドは、多様な方法で処置されてポリペプチドの発現がもたらされ得る。ベクターへ挿入される前のポリヌクレオチドの処置が、発現ベクターに応じて、望ましいか、または、必要であり得る。組換えＤＮＡ法を利用するポリヌクレオチドを修飾するための技術は技術分野において周知である。
【００６０】
制御配列は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のための宿主細胞によって認識されるポリヌクレオチドであるプロモータであり得る。プロモータは、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモータは、ミュータント、切断およびハイブリッドプロモータを含む宿主細胞において転写活性を示すいずれかのポリヌクレオチドであり得、ならびに、宿主細胞に対して相同性または非相同性である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。好ましくは、本発明の１つまたは複数の外性もしくは異種ポリヌクレオチドの各々は、その発現を可能にするするために、少なくとも１つのプロモータと作動可能にリンクしており；好ましくは、プロモータは、内在性または外性であり；より好ましくは、プロモータは、タンデムプロモータである。タンデムプロモータの例は、国際公開第９９／４３８３５号パンフレットに開示されている。
【００６１】
細菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写を指令する上で好適なプロモータの例としては、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（Ａｇａｉｓｓｅ  ａｎｄ  Ｌｅｒｅｃｌｕｓ，１９９４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １３：９７−１０７）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃオペロン、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔｒｃプロモータ（Ｅｇｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）、ストレプトマイセスコエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、および原核β−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７２７−３７３１）、ならびに、ｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５）から得られるプロモータがある。さらなるプロモータが、「Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ」，Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２４２：７４−９４；および、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９に記載されている。
【００６２】
制御配列はまた、宿主細胞によって認識されて転写を終結させる転写ターミネータであり得る。ターミネータは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’−末端に作動可能にリンクする。本発明においては、宿主細胞において機能するいずれかのターミネータが用いられ得る。
【００６３】
細菌宿主細胞の好ましいターミネータは、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）アルカリプロテアーゼ（ａｐｒＨ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）αアミラーゼ（ａｍｙＬ）、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）リボソームＲＮＡ（ｒｒｎＢ）の遺伝子から得られる。
【００６４】
制御配列はまた、プロモータの下流で、かつ遺伝子の発現を増大する遺伝子のコード配列の上流のｍＲＮＡ安定化領域でもあってもよい。
【００６５】
好適なｍＲＮＡ安定化領域の例は、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（国際公開第９４／２５６１２号パンフレット）および古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＰ８２遺伝子（Ｈｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７７：３４６５−３４７１）から得られる。
【００６６】
制御配列はまた、例えば、ポリペプチドのＮ−末端でプロペプチド位置をコードするプロペプチドコード配列であり得る。得られたポリペプチドは、酵素原またはプロポリペプチド（または、いくつかの場合においてチモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは、一般に非活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒または自己触媒切断によって活性ポリペプチドに転換されることが可能である。プロペプチドコード配列は、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリ性タンパク分解酵素（ａｐｒＥ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中性タンパク分解酵素（ｎｐｒＴ）、ミセリオフトラテルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号パンフレット）、リゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼおよびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子の遺伝子から得られ得る。
【００６７】
また、宿主細胞の増殖に対してポリペプチドの発現を調節する調節配列を付加することが望ましい場合もある。調節配列の例としては、調節化合物の存在などの化学的または物理的刺激に応じて、遺伝子の発現をオンまたはオフにするものがある。原核系における調節配列としては、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐオペレータ系が挙げられる。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。
【００６８】
発現ベクター
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む組換え発現ベクターに関する。種々のヌクレオチドおよび制御配列が一緒になって、このような部位でポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入または置換を可能とするために１つまたは複数の好都合な制限部位を含み得る組換え発現ベクターが生成される。または、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む核酸構築物を発現に適切なベクターに挿入することにより発現され得る。発現ベクターの形成において、コード配列は、コード配列が、発現に適切な制御配列と作動可能にリンクするようベクター中に位置されている。
【００６９】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に簡便に供されることが可能であり、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことが可能であるいずれかのベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞に対するベクターの親和性に応じることとなる。ベクターは、直鎖または閉鎖された環状プラスミドであり得る。
【００７０】
ベクターは、例えば、プラスミド、染色体外要素、微小染色体、または人工染色体といった、自律複製ベクター（すなわち、染色体外のエンティティとして存在し、その複製が染色体複製から独立しているベクター）であってよい。ベクターは、自己複製を確実とするための何らかの手段を含有してもよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入された際に、ゲノムに組み込まれて、それが組み込まれている染色体と一緒に複製されるものであってもよく；好ましくは、本発明の１つまたは複数の外性ポリヌクレオチドを、宿主細胞の少なくとも１つの染色体遺伝子座、好ましくはいくつかの遺伝子座に組み込む。国際公開第２００６／０４２５４８号パンフレットに示すように、ポリヌクレオチドまたはベクターを、２つ以上のコピーで染色体に組み込んでもよい。さらに、単一のベクターもしくはプラスミド、または、宿主細胞のゲノムに導入しようとする全ＤＮＡを互いに含有する２つ以上のベクターもしくはプラスミド、または、トランスポゾンを用いてもよい。
【００７１】
ベクターは、形質転換、形質移入、形質導入等された細胞の選択を容易とする１つまたは複数の選択マーカーを含有することが好ましい。選択マーカーは、その生成物が、殺生剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性等をもたらす遺伝子である。
【００７２】
細菌性選択マーカーの例としては、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）もしくは古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｄａｌ遺伝子、または、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ネオマイシン、スペクチノマイシン、またはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーがある。
【００７３】
ベクターは、宿主細胞のゲノムへのベクターの統合、または、ゲノムとは無関係の細胞中のベクターの自律複製を許容する要素を含有することが好ましい。
【００７４】
宿主細胞ゲノムへの統合に関して、ベクターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列、または、相同的もしくは非相同的組換えによるゲノムへの統合に係るベクターのいずれかの他の要素に依存し得る。または、ベクターは、染色体における正確な位置での宿主細胞のゲノムへの相同的組換えによる統合をもたらす追加のポリヌクレオチドを含有していてもよい。正確な位置で統合される可能性を高めるために、統合要素は、相同的組換えの確率を高めるために対応する標的配列に対して高度の配列同一性を有する、１００〜１０，０００塩基対、４００〜１０，０００塩基対および８００〜１０，０００塩基対などの十分な数の核酸を含有しているべきである。統合要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同的であるいずれかの配列であり得る。さらに、統合要素は、非コーディングまたはコーディングポリヌクレオチドであり得る。他方で、ベクターは、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに統合され得る。
【００７５】
自律複製に関して、ベクターは、対象の宿主細胞におけるベクターの自律的な複製を可能とする複製起点をさらに含んでいてもよい。複製起点は、細胞において機能する自律複製を媒介するいずれかのプラスミドレプリケータであり得る。「複製起点」または「プラスミドレプリケータ」という用語は、インビボでのプラスミドまたはベクターの複製を可能とするポリヌクレオチドを意味する。
【００７６】
細菌性複製起点の例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における複製を許容するプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７およびｐＡＣＹＣ１８４の複製起点、ならびに、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における複製を許容するｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０およびｐＡＭβ１の複製起点である。
【００７７】
本発明のポリヌクレオチドの２つ以上のコピーが宿主細胞に挿入されて、ポリペプチドの生成が高められてもよい。ポリヌクレオチドのコピーの数は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノムに統合することにより、または、増幅可能な選択マーカー遺伝子をポリヌクレオチドに含めることにより増加させることが可能であり、ここで、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、従って、ポリヌクレオチドの追加のコピーを含有する細胞は、適切な選択可能な薬剤中で細胞を培養することにより選択可能である。
【００７８】
上記の要素を連結して本発明の組換え発現ベクターを構築するために用いられる手法は、当業者に周知である（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照のこと）。
【００７９】
宿主細胞
本発明はまた、分泌シグナルを含まない、目的とする天然では非分泌性のポリペプチドをコードする１つまたは複数の外性もしくは異種ポリヌクレオチドを含む組み換えバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞にも関する。本発明のポリヌクレオチドは、目的とするポリペプチドの生成を指令する１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされている。ポリヌクレオチドを含む構築物もしくはベクターは、構築物もしくはベクターが染色体性組み込み体として、または、既述の自己複製染色体外ベクターとして維持されるよう宿主細胞に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異により、親細胞と同一ではない親細胞のあらゆる子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子およびその供給源に応じて大きく変わるであろう。
【００８０】
宿主細胞は、特にこれらに限定されないが、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラスフィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞を含むいずれかのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞であり得る。
【００８１】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，１９７９，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１−１１５を参照のこと）、コンピテント細胞形質転換（例えば、Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，１９６１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：８２３−８２９、またはＤｕｂｎａｕ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ，１９７１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：２０９−２２１を参照のこと）、電気穿孔法（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ  ａｎｄ  Ｄｏｗｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：７４２−７５１を参照のこと）、または、接合により（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｅ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５２７１−５２７８を参照のこと）行われ得る。しかし、宿主細胞にＤＮＡを導入するための、当技術分野では公知の任意の方法を用いることができる。
【００８２】
発酵ブロス調合物または細胞組成物
本発明はまた、本発明の宿主細胞を含む発酵ブロス調合物または細胞組成物にも関する。発酵ブロス製品は、さらに、発酵工程に用いる別の成分、例えば、細胞（目的のポリペプチドを生成するのに用いられる本発明のポリペプチドをコードする外性もしくは異種ポリヌクレオチドを含有する宿主細胞など）、細胞残屑、バイオマス、発酵培地および／または発酵産物なども含む。一部の実施形態では、組成物は、有機酸、死滅細胞および／または細胞残屑、ならびに培地を含有する細胞死滅全ブロスである。
【００８３】
本明細書で用いる場合、「発酵ブロス」という用語は、回収および／もしくは精製に一切付されないか、または最小限にしか付されない細胞発酵により生成される調製物を指す。例えば、発酵ブロスは、微生物培養物を飽和まで増殖させ、タンパク質合成（例えば、宿主細胞による酵素の発現）および細胞培地への分泌を可能にする炭素制限条件下でインキュベートする際に生成される。発酵ブロスは、発酵の終わりに得られる発酵物質の未分画もしくは分画成分を含有していてもよい。典型的に、発酵ブロスは、未分画であり、微生物細胞（例えば、糸状真菌細胞）を、例えば遠心分離により除去した後に存在する使用済み培地および細胞残屑を含む。一部の実施形態では、発酵ブロスは、使用済み細胞培地、細胞外酵素、ならびに生育可能なおよび／または生育不能な微生物細胞を含む。
【００８４】
一実施形態では、発酵ブロス調合物および細胞組成物は、少なくとも１つの１〜５炭素有機酸および／またはその塩を含む第１有機酸成分と、少なくとも１つの６以上の炭素有機酸および／またはその塩を含む第２有機酸成分とを含む。特定の実施形態では、第１有機酸成分は、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、それらの塩、またはこれらのうちの２つ以上の混合物であり、また、第２有機酸成分は、安息香酸、シクロヘキサンカルボン酸、４−メチル吉草酸、フェニル酢酸、それらの塩、またはこれらのうちの２つ以上の混合物である。
【００８５】
一態様では、組成物は、有機酸を含み、また任意選択で、死滅細胞および／または細胞残屑も含有する。一実施形態では、死滅細胞および／または細胞残屑は、これらの成分を含まない組成物を提供するために、細胞死滅全ブロスから除去される。
【００８６】
発酵ブロス調合物または細胞組成物は、防腐剤および／または抗菌（例えば、静菌）剤を含んでもよく、このようなものとして、限定しないが、ソルビトール、塩化ナトリウム、ソルビン酸カリウム、および当技術分野では公知の他の物質などが挙げられる。
【００８７】
細胞死滅全ブロスまたは組成物は、発酵の終わりに得られる発酵物質の未分画成分を含んでもよい。典型的に、細胞死滅全ブロスまたは組成物は、微生物細胞（例えば、糸状真菌細胞）を飽和まで増殖させ、タンパク質合成を可能にする炭素制限条件下でインキュベートした後に存在する使用済み培地および細胞残屑を含有する。一部の実施形態では、細胞死滅全ブロスまたは組成物は、使用済み細胞培地、細胞外酵素、ならびに死滅糸状真菌細胞を含有する。一部の実施形態では、細胞死滅全ブロスまたは組成物中に存在する微生物細胞を、当技術分野では公知の方法を用いて、透過性にするか、および／または溶解させることができる。
【００８８】
本明細書に記載する全ブロスまたは組成物は、典型的に、液体であるが、死滅細胞、細胞残屑、培地成分、および／または不溶性酵素などの不溶性成分を含有してもよい。一部の実施形態では、清澄化した液体組成物を提供するために、不溶性成分を除去してもよい。
【００８９】
本発明の全ブロス調合物および細胞組成物は、国際公開第９０／１５８６１号パンフレットまたは国際公開第２０１０／０９６６７３号パンフレットに記載の方法によって生成してもよい。
【実施例】
【００９０】
実施例１：シグナルペプチドを含まない、グルカノトランスフェラーゼ（ＧＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびアスパラギナーゼ（ＡＳＰ）の生成
株：
ＰＰ２５７７−１：バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｃａ６３の天然の単離株の胞子形成欠損誘導体である、親バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｓｉ３株の誘導体。バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｃａ６３の分類学上の特徴は、次の通りである：名称＝バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、目＝バチルス（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、属＝バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、種＝リケニホルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）。（参照文献：Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）。宿主株の分類は、Ｐｒｉｅｓｔ  ａｎｄ  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，１９８８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １３４：３０１１−３０１８に記載されている分類学上の特徴に基づく。ＰＰ２５７７−１誘導体は、下記の遺伝子産物をコードする遺伝子への二重相同性組み換えにより達成される破壊的遺伝子欠失を有する：Ｍｐｒ（メタロプロテアーゼ）、ＡｐｒＥ（アルカリプロテアーゼ）、ＢｇｌＣ（エンド−１，４−β−グルカナーゼ）、およびＡｍｙＥ（αアミラーゼ）（名称は、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において対応する相同体を指す）。サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のグルカノトランスフェラーゼ、ＧＴの生成は、染色体上の３つの組み込み発現カセットから達成される（米国特許第６，２５５，０７６号明細書）。発現カセットは、ａｍｙＥ（αアミラーゼ）、ｇｎｔＰ（グルコン酸ペルメアーゼ）およびｘｙｌＡ（キシロースイソメラーゼ）遺伝子座中に、またはこれに隣接して挿入する（欧州特許第１８０５２９６号明細書で実施されているように）。
【００９１】
ＰＰ２９１３−１：下記の遺伝子産物をコードする遺伝子への二重相同性組み換えにより達成される破壊的遺伝子欠失を有する、胞子形成欠損バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株Ｓｉ３：Ｍｐｒ（メタロプロテアーゼ）、ＡｐｒＥ（アルカリプロテアーゼ）、Ｖｐｒ（微小細胞外セリンプロテアーゼ）、Ｂｐｒ（バチロペプチダーゼＦ）、Ｅｐｒ（微小細胞外セリンプロテアーゼ）、ＢｇｌＣ（エンド−１，４−β−グルカナーゼ）、およびＡｍｙＥ（αアミラーゼ）（名称は、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において対応する相同体を指す）。緑色蛍光タンパク質ＢｉｏＳＴの生成は、ｇｌｐＤ（グリセロ−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ）遺伝子座に隣接して挿入した染色体組み込み発現カセットから達成される。
【００９２】
ＭＯＬ２９４０：下記の遺伝子産物をコードする遺伝子への二重相同性組み換えにより達成される破壊的遺伝子欠失を有する、胞子形成欠損古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ａ１６４株ＡＴＣＣ６０５１：ＡｍｙＥ（αアミラーゼ）、ＢｇｌＣ（エンド−１，４−β−グルカナーゼ）、Ｐｅｌ（ペクチン酸リアーゼ）、ＡｐｒＥ（アルカリプロテアーゼ）、ＮｐｒＥ（細胞外中性プロテアーゼＢ）、Ｂｐｒ（バチロペプチダーゼＦ）、Ｖｐｒ（微小細胞外セリンプロテアーゼ）、Ｍｐｒ（メタロプロテアーゼ）、Ｅｐｒ（微小細胞外セリンプロテアーゼ）およびＷｐｒＡ（分泌された品質管理プロテアーゼ）（名称は、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において対応する相同体を指す）。ピュロコックス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＡＴＣＣ４３５８７由来のアスパラギナーゼＡｓｎＰｆｕの生成は、染色体上の３つの組み込み発現カセットから達成される。発現カセットは、ａｌｒ（アラニンラセマーゼ）、Ｐｅｌ（ペクチン酸リアーゼ）、およびａｍｙＥ（αアミラーゼ）遺伝子座中に、またはこれに隣接して挿入する。
【００９３】
バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）および古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を用いたいくつかのフェドバッチ発酵方法を以下に記載のように実施した。培地は全て、当技術分野では公知の方法により滅菌した。特に記載のない限り、水道水を使用した。下記レシピに示す成分濃度は、全て接種前のものである。
【００９４】
第１接種培地
ＬＢ寒天：１０ｇ／ｌのカゼイン由来ペプトン；５ｇ／ｌの酵母抽出物；１０ｇ／ｌの塩化ナトリウム；１２ｇ／ｌのＢａｃｔｏ−寒天（ｐＨ６．８〜７．２に調節）。ＭｅｒｃｋからのＰｒｅｍｉｘを使用した。
【００９５】
転写バッファー：
Ｍ−９バッファー（調製のために脱イオン水を使用する）：リン酸水素二ナトリウム、２Ｈ2Ｏ  ８．８ｇ／ｌ；リン酸二水素カリウム  ３ｇ／ｌ；塩化ナトリウム  ４ｇ／ｌ；硫酸マグネシウム  ７Ｈ2Ｏ  ０．２ｇ／ｌ。
【００９６】
接種材料振盪フラスコ培地（濃度は接種前のもの）：
ＰＲＫ−５０：１１０ｇ／ｌのひき割りダイズ；リン酸水素二ナトリウム、２Ｈ2Ｏ  ５ｇ／ｌ；滅菌前にＮａＯＨ／Ｈ3ＰＯ4でｐＨ８．８に調節。
【００９７】
構成培地（濃度は接種前のもの）：
トリプトン（Ｄｉｆｃｏからのカゼイン加水分解物）３０ｇ／ｌ；硫酸マグネシウム、７Ｈ2Ｏ  ４ｇ／ｌ；リン酸水素二カリウム  ７ｇ／ｌ；リン酸水素二ナトリウム、２Ｈ2Ｏ  ７ｇ／ｌ；硫酸二アンモニウム４ｇ／ｌ；クエン酸０．７８ｇ／ｌ；ビタミン（チアミン−二塩化物  ３４．２ｍｇ／ｌ；リボフラビン２．９ｍｇ／ｌ；ニコチン酸２３ｍｇ／ｌ；Ｄパントテン酸カルシウム２８．５ｍｇ／ｌ；ピリドキサル−ＨＣｌ５．７ｍｇ／ｌ；Ｄ−ビオチン１．１ｍｇ／ｌ；葉酸２．９ｍｇ／ｌ）；微量金属（ＭｎＳＯ4、Ｈ2Ｏ  ３９．２ｍｇ／ｌ；ＦｅＳＯ4、７Ｈ2Ｏ  １５７ｍｇ／ｌ；ＣｕＳＯ4、５Ｈ2Ｏ  １５．６ｍｇ／ｌ；ＺｎＣｌ2  １５．６ｍｇ／ｌ）；消泡剤（ＳＢ２１２１）１．２５ｍｇ／ｌ；滅菌前にＮａＯＨ／Ｈ3ＰＯ4でｐＨ６．０に調節。
【００９８】
供給培地：
スクロース７０８ｇ／ｌ
【００９９】
接種ステップの手順：
初めに、ＬＢ寒天斜面上で、株を３７℃で１日増殖させた。
【０１００】
次に、寒天をＭ−９バッファーで洗浄した後、得られた細胞懸濁液の６５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定した。
【０１０１】
接種材料振盪フラスコ（ＰＲＫ−５０）に、ＯＤ（６５０ｎｍ）×ｍｌ細胞懸濁液＝０．１の接種材料を接種した。
【０１０２】
振盪フラスコを３７℃、３００ｒｐｍで２０時間インキュベートした。
【０１０３】
振盪フラスコからの増殖培養物を主要発酵槽に接種することにより、主要発酵槽（発酵タンク）中の発酵を開始した。接種量は、構成培地の１１％（７２０ｍｌ構成培地に対し、８０ｍｌ）であった。
【０１０４】
発酵槽設備：
温度制御装置、アンモニア水およびリン酸によるｐＨ制御装置、発酵全体を通して＞２０％酸素飽和を測定するための溶存酸素電極を備える、標準的な実験室用発酵槽を使用した。
【０１０５】
発酵パラメータ：
温度：４１℃（ＧＦＰ、ＧＴ）；４３℃（ＡＳＰ）。
アンモニア水およびリン酸を用いて、ｐＨを６．８〜７．２に維持した。
制御：６．８（アンモニア水）；７．２リン酸
ばっ気：接種後８００ｍｌの開始量のために１．５リットル／分
攪拌：１５００ｒｐｍ
【０１０６】
供給計画：
０時間。接種後０．０５ｇ／分／ｋｇの初期ブロス
８時間。接種後０．１５６ｇ／分／ｋｇの初期ブロス
終了。接種後０．１５６ｇ／分／ｋｇの初期ブロス
【０１０７】
アスパラギナーゼアッセイ：
アスパラギナーゼの活性は、ＡＳＮＵで測定することができる。１アスパラギナーゼ単位（ＡＳＮＵ）は、９．２ｍｇ／ｍｌアスパラギンを含む０．１Ｍ  ＭＯＰＳバッファー中３７℃およびｐＨ７．０にて、１分で１．０マイクロモルのアンモニアを生成するのに必要な酵素の量として定義される。
【０１０８】
アスパラギナーゼは、アスパラギンをアスパラギン酸とアンモニアに加水分解する。アスパラギナーゼ活性は、生成されたアンモニアをαケトグルタル酸塩およびＮＡＤＨと反応させて、グルタミン酸とＮＡＤ+を形成する、共役アッセイにおいて決定する。後者の反応は、過剰に添加されるグルタミン酸デヒドロゲナーゼにより触媒される。１モルのアンモニアが生成されると、１モルのＮＡＤＨが消費される。ＮＡＤＨの消費は、３４０ｎｍで分光光度計により測定する。ＮＡＤＨは、３４０ｎｍで吸光度（モル拡張係数（ｍｏｌａｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ））６３００（Ｍ*ｃｍ）-1）を有するが、ＮＡＤ+は、この波長で有意な吸光度を呈示しない。このようにして減色を測定し、これをアスパラギナーゼ活性と相関させることができる。
【０１０９】
【表１】
2016521579.tif 000002
【０１１０】
アッセイ手順：
１）サンプルの希釈：約１ｇのサンプルを計量する。０．１Ｍ酢酸ナトリウムおよび０．２２５ｇ／ＬのＢｒｉｊ３５、ｐＨ５．０を含有するバッファーを含む１００ｍＬメスフラスコ中に溶解させ、目盛まで充填する。マグネチックスターラで溶液を１５〜３０分攪拌した後、約０．５７ＡＳＮＵ／ｍＬまでさらに希釈する。
【０１１１】
２）基質−試薬溶液の調製：０．１Ｍ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）中に６６．６ｍＭ  Ｌ−アスパラギン、０．６６ｍＭ  ＮＡＤＨ、１３．３ｍＭ  αケトグルタル酸塩および６７．２Ｕ／ｍＬのグルタミン酸デヒドロゲナーゼを含有する溶液を調製する。溶液は、例えば、基質試薬を含むフラスコをホイルで包むことにより、光から保護しなければならない。初期吸光度が３４０ｎｍで２．３吸光度単位を上回れば、試薬は、室温で約６時間にわたって安定している。
【０１１２】
３）２３０μＬの基質−試薬溶液をピペットでＵＶ透過性マイクロプレートに導入することにより、測定を開始し、３７℃で８分プレートを前インキュベートした後、２０μＬのサンプルを添加し、混合物を３７℃で９０秒さらに平衡させた。次に、例えば、１８秒毎に、１２０秒にわたり３４０ｎｍで吸光度を読み取る。
【０１１３】
４）時間に対する吸光度のプロットの傾きから活性を決定して、標準曲線と関連付ける。
【０１１４】
【表２】
2016521579.tif 000003
【０１１５】
サンプルの調製：
１．約１ｇのサンプルを計量する。
２．Ｂｒｉｊを含む０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）を含む１００ｍＬメスフラスコ中に溶解させ、目盛まで充填する。
３．マグネチックスターラで１５〜３０分攪拌する。
４．Ｂｒｉｊを含む０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で、約０．５７ＡＳＮＵ／ｍｌまでサンプルをさらに希釈する。
【０１１６】
計算は、ＮＡＤＨでのモル吸光度（ｍｏｌａｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、および変換されたアスパラギン酸の量と比較して、当モル量のＮＡＤ＋が生成されることに基づいて行う。
【０１１７】
次に、酵素活性を、最終サンプルに対して相関させる。
【０１１８】
サンプル中の総酵素活性を測定する場合、希釈および酵素分析の前にサンプルの分離は行わない。上清中の酵素活性を測定する場合、１０ｍｌの培養ブロスサンプルを８５００ｇで３０分遠心分離し、上澄みを沈殿物から傾瀉してから、細胞を一切含まないことを確実にするために、０．２２または０．４５μｍフィルターを通して滅菌ろ過した後、希釈し、酵素活性を決定する。酵素のほとんどが、上澄み中に存在する場合、その場合にはバイオマスが酵素活性を弱めるため、全サンプルと比較して、この画分中により高い活性が決定されるであろう。
【０１１９】
グルカノトランスフェラーゼアッセイ：
１ＧＴＮＵ（グルカノトランスフェラーゼ単位）は、６０℃以外は前述と同じ条件下で、毎分１μモルのグルコースを生成する酵素の量である。これは、３７℃で毎分１μモルのグルコースを生成する酵素の量を約７．７倍したものに相当する。
【０１２０】
グルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．２５）は、１，４−α−Ｄ−グルカンを新たな４位に転移させる酵素であり、これは、グルコースまたは別の１，４−α−Ｄ−グルカンでなければならない。このアッセイでは、マルトトリオースを基質として使用し、グルカノトランスフェラーゼの活性を下記の反応：
Ｇ−Ｇ−Ｇ＋Ｇ−Ｇ−Ｇ→Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ＋Ｇ
におけるグルコースの生成として測定する。
【０１２１】
グルカノトランスフェラーゼ反応を停止させ、水酸化ナトリウムの添加により、酵素を不活性化する。
【０１２２】
グルコースの形成は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからの市販のキットを用いて測定する。グルコースは、ヘキソキナーゼにより、グルコース−６−リン酸にリン酸化され、さらに、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼによって６−ホスホグルコン酸塩に酸化され、これにより、ＮＡＤ＋が、ＮＡＤＨに還元される。ＮＡＤＨの形成を３４０ｎｍで測定する。また、生成されたグルコースを測定する別の方法を用いてもよい。
【０１２３】
【表３】
2016521579.tif 000004
【０１２４】
アッセイ手順：
１）サンプルの希釈：約１ｇのサンプルを計量する。５０ｍＭリン酸バッファーおよび０．１％Ｗ／Ｖのトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、ｐＨ６．０を含有するバッファーを含む１００ｍＬメスフラスコ中に溶解させ、目盛まで充填する。マグネチックスターラで溶液を１５〜３０分攪拌する。
【０１２５】
２）あらゆるαグルコシダーゼを不活性化するために、希釈したサンプルを６２℃＋／−２℃で１５分インキュベートする。
【０１２６】
３）サンプルを約１．１ＧＴＮＵ／ｍＬの酵素活性までさらに希釈する。
【０１２７】
４）基質−試薬溶液の調製：５０ｍＭリン酸バッファーおよび０．１％Ｗ／ＶトリトンＸ−１００、ｐＨ６．０を含有するバッファー中に、１％Ｗ／Ｖマルトデキストリンおよび０．０６Ｗ／Ｖデキストリンを含む溶液を調製する。
【０１２８】
５）７７μＬの基質−試薬溶液をピペットでＵＶ透過性マイクロプレートに導入することにより、測定を開始し、３７℃で８分プレートを前インキュベートした後、１３μＬのサンプルを添加し、混合物を３７℃で５分インキュベートする。１３μＬの０．５Ｍ  ＮａＯＨを添加することにより、反応を停止する。生成されたグルコースの量は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの市販のキットからの１４７μＫの反応混合物を添加することにより測定する。反応を２８０秒にわたって実施した後、３４０ｎｍで吸光度を読み取る。
【０１２９】
６）標準曲線に関連させた測定吸光度から、活性を決定する。
【０１３０】
【表４】
2016521579.tif 000005
【０１３１】
サンプルの調製：
１．約１ｇのサンプルを計量する。
２．５０ｍＭリン酸バッファーと０．１％Ｗ／ＶトリトンＸ−１００、ｐＨ６．０を含有するバッファーを含む１００ｍＬメスフラスコ中に溶解させ、目盛まで充填する。
３．マグネチックスターラで１５〜３０分攪拌する。
４．あらゆるαグルコシダーゼを不活性化するために、希釈したサンプルを６２℃＋／−２℃で１５分インキュベートする。
５．５０ｍＭリン酸バッファーと０．１％Ｗ／ＶトリトンＸ−１００、ｐＨ６．０を含有するバッファーで、サンプルをさらに希釈する。
【０１３２】
初めに、サンプルをマルトトリオースと一緒に３００秒間インキュベートしてから、ＮａＯＨを添加することにより反応を停止した後、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの市販のキットにより、グルコースの量を検出する。二次反応の反応時間は、２８０秒であり、吸光度を３４０ｎｍで測定する。次に、酵素活性を、この場合、最終サンプルに対して相関させる。
【０１３３】
サンプル中の総酵素活性を測定する際、希釈および酵素分析の前に、サンプルの分離は一切行わない。上澄み中の酵素活性を測定する場合には、サンプルを８５００ｇで３０分遠心分離し、沈殿物から上澄みを傾瀉して、０．２２μｍフィルターを通して滅菌ろ過した後、希釈し、酵素活性を決定する。酵素のほとんどが、上澄み中に存在すると、その場合、細胞が酵素活性を弱めることから、全サンプルと比較して、この画分中により高い活性が決定されるであろう。
【０１３４】
結果：
発酵は３〜４日間実施し、結果を表１〜３に示す。
【０１３５】
【表５】
2016521579.tif 000006
【０１３６】
＊）：活性量（ＧＴＮＵ）は、本明細書の他所で示すように決定し、第５日のブロスにおける総活性の１００％に対して正規化した。
【０１３７】
【表６】
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【０１３８】
＊）：タンパク質の量は、ＧＦＰの決定のための蛍光分光測定を用いて決定した。ＧＦＰは、タンパク質発現を扱う多くの試験について周知であり、細胞中に存在する場合であっても、直接測定できることがわかっている。従って、全ブロスの蛍光分光測定により決定された量は、細胞および上清両方のタンパク質含量に対応する。この量を第３日のブロスにおける総活性の１００％に対して正規化した。
【０１３９】
【表７】
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【０１４０】
＊）活性量（ＡＳＮＵ）は、本明細書の他所で示すように決定し、第５日のブロスにおける総活性の１００％に対して正規化した。
【０１４１】
本発明者らの予想とは反対に、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）および古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において、天然では細胞内であるか、または非分泌の酵素を発現させたとき、上澄み中に非常に高レベルの酵素活性を認めた。これは、天然では非分泌性のポリペプチドをバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）において生成することができ、そうでなければ必要とされるコスト高の細胞溶解ステップなしで、ブロスから直接回収することができることを意味するため、極めて意外な結果であると共に、経済的に重要なものである。
【０１４２】
本発明を以下のパラグラフに詳しく定義する：
１．バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞において、天然では非分泌性のポリペプチドを生成する方法であって、以下：
（ａ）天然では非分泌性のポリペプチドの発現を促進する条件下で、増殖培地において、分泌シグナルを含まない、天然では非分泌性のポリペプチドをコードする１つまたは複数の外性もしくは異種ポリヌクレオチドを含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を培養するステップ；および
（ｂ）細胞溶解ステップを実施することなく、天然では非分泌性のポリペプチドを回収するステップ
を含む方法。
【０１４３】
２．ポリペプチドを生成する方法であって、以下：
（ａ）ポリペプチドの生成を促進する条件下で、ポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を培養するステップであって、ポリペプチドが、その天然の野生型供給源により細胞内に生成され、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、シグナルペプチドコード配列に作動可能にリンクされていないステップ；および
（ｂ）細胞溶解ステップを実施することなく、ポリペプチドを回収するステップ
を含む方法。
【０１４４】
３．バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞が、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される、パラグラフ１または２に記載の方法。
【０１４５】
４．ポリペプチドが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞に対して在来である、パラグラフ１〜３のいずれかに記載の方法。
【０１４６】
５．ポリペプチドが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞に対して異種である、パラグラフ１〜３のいずれかに記載の方法。
【０１４７】
６．ポリペプチドが、好熱性生物に由来する、パラグラフ１〜３および５のいずれかに記載の方法。
【０１４８】
７．ポリペプチドが、低好熱性（ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｉｃ）生物に由来する、パラグラフ１〜３および５のいずれかに記載の方法。
【０１４９】
８．好熱性または低好熱性（ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｉｃ）生物が、アエロピュルム（Ａｅｒｏｐｙｌｕｍ）、アクウィフェクス（Ａｑｕｉｆｅｘ）、アルカエオグロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｕｂｕｓ）、ディクチオグロムス（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ）、ゲオサーモバクテリウム（Ｇｅｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノピュルス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）、ピュロコックス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピュロロブス（Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ）、スルホロブス（Ｓｕｌｐｈｏｌｏｂｕｓ）、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、およびサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）からなる群から選択される、パラグラフ６または７に記載の方法。
【０１５０】
９．ポリペプチドが、発酵ブロス中のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞により産生される１つまたは複数の内在性プロテアーゼによる分解に対して耐性である、パラグラフ１〜８のいずれかに記載の方法。
【０１５１】
１０．目的とするポリペプチドが、酵素であり；好ましくは、酵素は、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、またはトランスフェラーゼであり；より好ましくは、酵素は、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノトランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼである、パラグラフ１〜９のいずれかに記載の方法。
【０１５２】
１１．酵素が、配列番号１に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むグルカノトランスフェラーゼ、または、配列番号２に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む海洋クラゲのオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来の緑色蛍光タンパク質の変異体、または配列番号３に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むアスパラギナーゼである、パラグラフ１０に記載の方法。
【０１５３】
１２．前記１つまたは複数のポリヌクレオチドの各々が、その発現を可能にする少なくとも１つのプロモータと作動可能にリンクしており；好ましくは、プロモータが、内在性または外性であり；より好ましくは、プロモータは、タンデムプロモータである、パラグラフ１〜１１のいずれかに記載の方法。
【０１５４】
１３．１つまたは複数のポリヌクレオチドが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞の少なくとも１つの染色体遺伝子座、好ましくはいくつかの遺伝子座に組み込まれる、パラグラフ１〜１２のいずれかに記載の方法。
【０１５５】
１４．ポリペプチドが、収集、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、または沈殿により回収される、パラグラフ１〜１３のいずれかに記載の方法。
【０１５６】
１５．ポリペプチドが、発酵ブロス中で回収される、パラグラフ１〜１３のいずれかに記載の方法。
【０１５７】
１６．バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞が、１つまたは複数のプロテアーゼ、例えば、４、５もしくは６種のプロテアーゼをコードする１つまたは複数の核酸配列の破壊、例えば、欠失を含み、これによって、より少ないプロテアーゼの生成がもたらされる、パラグラフ１〜１５のいずれかに記載の方法。
【０１５８】
１７．１つまたは複数のプロテアーゼが、ＡｐｒＥ（アルカリプロテアーゼ）、Ｂｐｒ（バチロペプチダーゼＦ）、Ｅｐｒ（微小細胞外セリンプロテアーゼ）、Ｍｐｒ（メタロプロテアーゼ）、ＮｐｒＥ（細胞外中性プロテアーゼＢ）、Ｖｐｒ（微小細胞外セリンプロテアーゼ）、およびＷｐｒＡ（分泌された品質管理プロテアーゼ）からなる群から選択される、パラグラフ１６に記載の方法。
【０１５９】
１８．生成されるポリペプチドの量が、発酵ブロス１ｌ当たり少なくとも１ｇ、好ましくは少なくとも１０ｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも２０ｇ／ｌである、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【０１６０】
１９．分泌シグナルを含まない、目的とする天然では非分泌性のポリペプチドをコードする１つまたは複数の外性もしくは異種ポリヌクレオチドを含む、組み換えバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【０１６１】
２０．ポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む組み換えバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞であって、ポリペプチドが、その天然の野生型供給源により細胞内に生成され、１つまたは複数のポリヌクレオチドが、シグナルペプチドコード配列と作動可能にリンクされていない、組み換えバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【０１６２】
２１．バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞が、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される、パラグラフ１９または２０に記載の宿主細胞。
【０１６３】
２２．ポリペプチドが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞に対して在来である、パラグラフ１９〜２１のいずれかに記載の宿主細胞。
【０１６４】
２３．ポリペプチドが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞に対して異種である、パラグラフ１９〜２１のいずれかに記載の宿主細胞。
【０１６５】
２４．ポリペプチドが、好熱性生物に由来する、パラグラフ１９〜２１および２３のいずれかに記載の宿主細胞。
【０１６６】
２５．ポリペプチドが、低好熱性（ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｉｃ）生物に由来する、パラグラフ１９〜２１および２３のいずれかに記載の宿主細胞。
【０１６７】
２６．好熱性または低好熱性（ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｉｃ）生物が、アエロピュルム（Ａｅｒｏｐｙｌｕｍ）、アクウィフェクス（Ａｑｕｉｆｅｘ）、アルカエオグロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｕｂｕｓ）、ディクチオグロムス（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ）、ゲオサーモバクテリウム（Ｇｅｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノピュルス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）、ピュロコックス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピュロロブス（Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ）、スルホロブス（Ｓｕｌｐｈｏｌｏｂｕｓ）、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、およびサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）からなる群から選択される、パラグラフ２４または２５に記載の宿主細胞。
【０１６８】
２７．ポリペプチドが、発酵ブロス中のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞により産生される１つまたは複数の内在性プロテアーゼによる分解に対して耐性である、パラグラフ１９〜２６のいずれかに記載の宿主細胞。
【０１６９】
２８．目的とするポリペプチドが、酵素であり；好ましくは、酵素が、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、またはトランスフェラーゼ；より好ましくは、酵素は、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノトランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼである、パラグラフ１９〜２７のいずれかに記載の宿主細胞。
【０１７０】
２９．酵素が、配列番号１に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むグルカノトランスフェラーゼ、または、配列番号２に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む海洋クラゲのオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来の緑色蛍光タンパク質の変異体、または配列番号３に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むアスパラギナーゼである、パラグラフ２８に記載の宿主細胞。
【０１７１】
３０．１つまたは複数のポリヌクレオチドの各々が、その発現を可能にする少なくとも１つのプロモータと作動可能にリンクしており；好ましくはプロモータが、内在性または外性であり；より好ましくは、プロモータは、タンデムプロモータである、パラグラフ１９〜２９のいずれかに記載の宿主細胞。
【０１７２】
３１．１つまたは複数のポリヌクレオチドが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞の少なくとも１つの染色体遺伝子座、好ましくはいくつかの遺伝子座に組み込まれる、パラグラフ１９〜３０のいずれかに記載の宿主細胞。
【０１７３】
３２．１つまたは複数のプロテアーゼ、例えば、４、５もしくは６種のプロテアーゼをコードする１つまたは複数の核酸配列の破壊、例えば、欠失をさらに含み、これによって、より少ないプロテアーゼの生成がもたらされる、パラグラフ１９〜３１のいずれかに記載の宿主細胞。
【０１７４】
３３．１つまたは複数のプロテアーゼが、ＡｐｒＥ（アルカリプロテアーゼ）、Ｂｐｒ（バチロペプチダーゼＦ）、Ｅｐｒ（微小細胞外セリンプロテアーゼ）、Ｍｐｒ（メタロプロテアーゼ）、ＮｐｒＥ（細胞外中性プロテアーゼＢ）、Ｖｐｒ（微小細胞外セリンプロテアーゼ）、およびＷｐｒＡ（分泌された品質管理プロテアーゼ）からなる群から選択される、パラグラフ３２に記載の宿主細胞。
【配列表】
2016521579000001.app
【国際調査報告】
2016521579.tif 000009
2016521579.tif 000010
2016521579.tif 000011
2016521579.tif 000012