(57)【要約】   磁気粒子ベースの分離および分析方法は、容器中の液体に配置される磁気粒子の少なくとも２セットを使用し、それぞれ保持力場ｅ１とｅ２で特徴付けられ、ｅ１がｅ２よりも大きい。大きな保持力場ｅ１を有する第１の磁気粒子は、低い保持力場ｅ２を有する第２の親和性磁気粒子を操作する担体として使用される。磁気粒子の操作方法は、容器内で前記担体磁気粒子の相対運動を生じさせ、これにより親和性粒子に、液体に対する永続的な相対運動を行う粒子の均一な懸濁を形成させ時間によって変動する極性および大きさを有する外部磁場を適用するステップを含む。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁気粒子ベースの分離および分析方法であって、少なくとも２セットの磁気粒子を使用するステップを具え、その１つが保持力場ｅ１を有し、別の１つが保持力場ｅ２を有し、ｅ１がｅ２よりも大きいことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、ｅ１がｅ２より少なくとも２倍大きいことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記磁気粒子は、極性および大きさが時間によって変動する磁場を用いて操作されることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、前記磁場の変動が１秒あたり０．１から１０００サイクルの間の範囲の周波数変動を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、
ａ．周波数ｆ１の第１の磁場を適用して、前記２セットの粒子に均一な粒子懸濁を形成させるステップと；
ｂ．周波数ｆ２＜ｆ１である第２の磁場を適用して、前記２セットの粒子を共に凝集させ、粒子の凝集塊を形成させるステップ、
の一方または双方のステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、前記磁気粒子がその表面にコーティングを具え、前記磁気粒子のセットの少なくとも１が、そのコーティングに結合され標的分子と選択的に結合する親和性認識分子を具えることを特徴とする方法。
【請求項７】
容器内の磁気粒子の操作方法において、
ａ．保持力場ｅ１を有する第１の担体磁気粒子のセットを提供するステップと；
ｂ．保持力場ｅ１よりも低い保持力場ｅ２を有し、標的分子と選択的に結合するよう設計された第２の親和性磁気粒子のセットを提供するステップと；
ｃ．容器内の液体に前記担体磁気粒子のセットおよび親和性磁気粒子のセットを配置するステップと；
ｄ．時間によって変動する極性および大きさを有する外部磁場を適用して、前記容器内で前記担体磁気粒子の相対運動をもたらし、これにより親和性粒子が、前記容器内の液体に対し永続的な相対運動を行う粒子の均一な懸濁を形成させるステップと、
を具えることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、前記担体粒子のセットの粒子が強磁性体であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法において、前記親和性粒子のセットの粒子が常磁性体であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の方法において、前記磁場の前記周波数が１秒あたり１０サイクルよりも大きいことを、好ましくは１秒あたり１００サイクル以上であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項７に記載の方法において、さらに溶液から前記第１の粒子および第２の粒子のセットを分離するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、前記分離するステップが、第２の磁場を適用して、前記２セットの粒子を共に凝集させ、粒子の凝集塊を形成させるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、前記第２の磁場が静磁場であることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法において、前記第２の磁場が時間によって変動する極性および大きさを有することを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法において、前記第２の磁場の周波数が１秒あたり１０サイクル以下で、好ましくは１秒あたり２から０．１サイクルの間であることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項７に記載の方法において、前記担体磁気粒子のセットの粒子がさらに、その表面に標的分子と選択的に結合できるコーティングを有することを特徴とする方法。
【請求項１７】
少なくとも２セットの磁気粒子を含むキットであって、その１つは保持力場ｅ１を有する、別の１つは保持力場ｅ２を有する、ｅ１はｅ２よりも大きいことを特徴とする、生体分子又は化学物質を分析、操作または精製する試薬を具えることを特徴とするキット。
【請求項１８】
生命科学分析および化学分析における、請求項１７に記載されたキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に磁気粒子ベースの分離および分析方法に関し、前記粒子の懸濁液が外部磁場にさらされた場合の特定の磁気応答に特徴付けられる、磁気粒子の混合体を具える。さらに、本発明は生体分子および化学物質の分析、操作および精製のための規定された組成物を有する磁気粒子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオアッセイにおいて、多様なサンプルから標的分子、粒子または検体を抽出、濃縮および精製する（すなわち、サンプル調整）能力は、重要ステップであり、効率の良い標的の検出および解析に必須のステップとして課題となっている。これについて、磁気応答粒子は、今日、サンプル調整処理を行うための標準として考えられている。例えば、磁気粒子の表面は、相補的な標的分子と特異的に相互作用するプローブを担持するように活性化することができる。磁気粒子を使用する利点は、これらを磁場を用いて簡単に操作して、粒子の表面反応を制御し、および／または、初期の「不純物」が囲んでいる培養液から特定の標的分子を分離できることである。磁気粒子をベースとする工程とシステムは比較的迅速で、容易であって、必要な装置が単純である。
【０００３】
磁気粒子をベースとする分析において取り組むべき１つの大きな問題は、分析処理ステップの間の、粒子の分散の均一性である。このような均一性は、取り囲んでいる液体培地と接触する、利用可能な粒子表面の合計を最大にすることにおいて実に重要である。さらに、粒子ベースの分析において第２に重要な要件は、標的物質と粒子表面の間の反応レートを向上させる効果的な混合である。事実、表面ベースの様々な分析において、反応は自然の拡散プロセスにより強く制限されるため、リガンドと標的物質間の親和的な結合反応を促すために、強力な攪拌および混合が必要となる。
【０００４】
均一性の問題に対処すべく、従来の磁気粒子ベースの分析の多くは、常磁性粒子または超常磁性粒子の使用に頼っており、これらは外部磁場の存在によって帯磁状態になるが、そのような磁場がない場合は非磁化状態になるよう特徴付けられる。そうであるために、常磁性粒子または超常磁性粒子は、最初に適用された磁場を取り除いたときに残る磁化がわずかであるという特徴の磁気応答を呈する。このような要件は、操作する際に磁気粒子の凝集を最小にする目的において重要である。事実、懸濁液中で磁気粒子を操作するには、比較的「大きな」磁力をかける必要があり、これにより磁気双極が相互作用する影響下において、単分散した磁気粒子が凝集してしまう。それ故に、磁場を取り除いた後の単分散した粒子の懸濁液の回復には、粒子の双極残留磁化が少ないことが必要である。従来技術（例えばＵＳ６０２７９４５またはＵＳ５９４５５２５）に記載された超常磁性粒子は、しかしながら、外部磁場の下での磁化が低いという制限に問題があり、その結果、これらの粒子の分離、分散および混合が困難となっている。
【０００５】
超常磁性粒子の分離の遅さに関する問題を解決するため、米国特許第５１０８９３３号は、単分散されたコロイド性の磁気粒子を、分離前に凝集剤を加えることによって「凝集させる」方法を開示している。事実、大きな粒子の凝集塊を形成することによって、比較的小さい磁力を使用しても、粒子の分離はより効率が良く、早くなる。しかしながら、このような粒子の凝集塊の形成は時間がかかり、凝集している粒子を再懸濁するのも困難である。
【０００６】
超常磁性粒子の制限を克服するため、磁気粒子が与える「強磁性」作用がこの分野で提案されている。この「強磁性」粒子は、外部磁場がかけられていない場合の残留磁気に特徴付けられる磁気反応を呈する。これと共に、強磁性粒子は、超常磁性粒子と比較した場合に高い磁気モーメントを現し、これにより外部磁場を用いた操作が容易になる。
【０００７】
例えば、米国特許第７１３２２７５号は伸張した磁性体である磁気ナノワイヤーを開示しており、これは形状の不均一性により、粒子が延びている方向で優先的な磁性を生じる。この磁化の不均一性は、外部磁場を取り除いた後でさえも残っている。米国特許第８１４２８９２号では、あつらえた磁気反応を有する強磁性粒子が開示されている。このような強磁性粒子の１つの利点は、「残留磁気」を調整することによってその磁気反応を調整する可能性があることである。
【０００８】
しかしながら、超常磁気粒子に対して、強磁性粒子は大きな制限の問題がある。事実、これらの粒子は外部適用した磁場を取り除いた下でも帯磁したままなので、粒子の再懸濁が困難である。この制限を克服するため、米国特許出願２００６／０１８８８７６は、液相の存在下での磁気粒子の分散を促す官能基を含む表面を有する強磁性粒子の使用を提案している。例えば、磁気粒子の表面は、有機液体相または非極性の液体相で粒子の再懸濁を促す親水性の材料によって機能化されうる。米国特許第８１４２８９２号では、時間によって変動する極性（すなわち、磁場の方向）および大きさを有する磁場を用いて強磁性粒子が操作された場合に、このような粒子の凝集塊は効率よく制御されることができる。しかしながら、それにもかかわらず、強磁性粒子はこのような粒子が磁場なしでは均一に分散しないという制限の問題がある。
【０００９】
これらの短所を鑑み、迅速で、効率の良い超常磁気粒子の操作を可能にする新しい方法の開発が必要とされている。換言すると、磁場の下で、強磁性粒子を簡単に操作および均一に混合をすることができ、外部磁場を無くしたら、超常磁性粒子が良好に分散することを組み合わせた方法を発見することが、磁気粒子ベースの分析の実施において強く望まれている。
【発明の概要】
【００１０】
従って、本発明は磁気粒子ベースの分離および分析方法を提供する。この目的は独立請求項１で達成される。
【００１１】
従って、本発明は容器内の磁気粒子の操作方法を提供する。この目的は独立請求項７で達成される。
【００１２】
従って、本発明は、生体分子や化学物質の分析、操作または精製に使用される磁気粒子組成物を具えるキットを開示する。この目的は独立請求項１７で達成される。
【００１３】
異なる実施例は従属請求項に提示される。
【００１４】
本発明は磁気粒子を用いてサンプルから標的の分子または粒子の分離方法を開示する。前記方法は、それぞれ保持力場ｅ１およびｅ２を有する、少なくとも２セットの磁気粒子の組み合わせを使用し、ｅ１がｅ２より大きい。
【００１５】
従って、本発明は磁気粒子の分離処理における磁気粒子の操作方法を提供し、大きな保持力場ｅ１を有する第１の粒子のセットは、保持力場ｅ１よりも低い保持力場ｅ２を有する第２の粒子のセットの混合および（または）分離のための担体または媒体として使用される。好適な実施例において、低い保持力場ｅ２を有する第２の磁気粒子のセットは、選択的な標的認識能力（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ）を有する様々な生化学分子（タンパク、核酸および細胞等のような）と化学的に活性化されるか結合される。
【００１６】
本発明は、保持力場ｅ１およびｅ２を有し（ここで、ｅ１はｅ２より大きい）、容器内に配置された複雑な反応混合物（例えば全血または液体中のフラグメント細胞）が、少なくとも２セットの磁気粒子に加えられる方法を開示する。周波数の閾値ｆ１よりも高い周波数ｆによって特徴付けられる、時間によって変動する極性と大きさを有する外部磁場がかけられ、容器内で担体磁気粒子（最も高い保持力場ｅ１を具える）の相対運動をもたらし、これにより容器内の液体に対する永続的な相対運動において親和性粒子（低い保持力場ｅ２を具える）に粒子の均一な懸濁を形成させる。これにより親和性粒子と、取り囲んでいる液体培地の間での効率的な混合と相互作用が可能となる。この相互作用は、次いで、磁気粒子の表面への標的の効率の良い親和性結合をもたらす。
【００１７】
従って、磁気粒子表面に標的を捕捉したうえで、本発明は、周波数の閾値であるｆ１よりも低い（ｉｎｆｅｒｉｏｒ）周波数ｆによって特徴付けられる、時間によって変動する極性および大きさを有する磁場が、使用する２セットの粒子を共に凝集させる方法を開示する。一度凝集すると、前記粒子は容易かつ迅速に分離できるので、その結果、取り囲んでいる液体培地から標的と磁気粒子の複合体を分離できる。
【００１８】
好適な実施例において、本発明にかかる分析で使用される磁気粒子の２つのセットは、強磁性粒子と超常磁性粒子とで構成される。強磁性粒子（室温における保持力場がゼロでない定義で特徴付けられる）は、超常磁性粒子（室温における保持力場が実質的にゼロの定義で特徴付けられる）の混合および分離のための担体として使用される。この実施例によると、超常磁性粒子は、好ましくは選択的な標的認識能力を有する様々な生化学分子と化学的に活性化されるか結合される。
【００１９】
好適な実施例では、本発明にかかる分析に使用される２セットの磁気粒子は、好ましくは１００Ｏｅ以上の保持力場で特徴付けられる強磁性粒子のセットと、好ましくは５０Ｏｅ以下の保持力場によって特徴付けられる超常磁性粒子のセットとで構成される。別の好適な実施例では、本発明により使用する２セットの粒子は、２００Ｏｅ以上の保持力場によって特徴付けられる第１の磁気粒子のセットと、２５Ｏｅ以下の保持力場によって特徴付けられる第２の磁気粒子のセットとを具える。
【００２０】
好適な実施例では、２つの粒子が「分離」し粒子の均一な混合を形成する周波数の閾値ｆ１は、１秒あたり最小１０サイクルであり、好ましくは１秒あたり最小５０サイクルである。このため、および、２セットの粒子を凝集させるための、時間で変動する磁場は、好適な実施例によれば、１秒あたり１０サイクル以下の周波数を有し、好ましくは１秒あたり２サイクル以下の周波数を有する。
【００２１】
バイオアッセイの実施に関する本発明による別の好適な実施例は、保持力場ｅ１によって特徴付けられる第１の磁気応答粒子のセットと、保持力場ｅ２によって特徴付けられる第２の磁気応答粒子とのセットの使用を含み、ここで保持力場ｅ１は少なくとも保持力場ｅ２の２倍である。  
【００２２】
本発明はまた、容器内での磁気粒子の操作方法であって、
（ａ）保持力場ｅ１を有する第１の担体磁気粒子のセットを提供するステップと；
（ｂ）保持力場ｅ１よりも低い保持力場ｅ２を有する、第２の磁気粒子を提供するステップであって、第２の磁気粒子のセットは好ましくは標的分子と選択的に結合するように設計されるステップと；
（ｃ）容器内の液体に前記担体磁気粒子と親和性磁気粒子を配置するステップと；時間によって変動する極性および大きさを有する外部磁場を適用するステップと；
を含む方法を開示する。この適用された磁場は、容器内で前記担体磁気粒子の相対運動をもたらし、これにより親和性粒子が、容器内の液体に対し永続的な相対運動を行う粒子の均一な懸濁を形成するようにする。
【００２３】
好適な実施例において、この方法はさらに、第２の磁場を適用して、前記粒子の２つのセットが共に凝集して、粒子の凝集塊を形成することからなる磁気分離ステップを含む。この分離磁場は、静磁場であってもよいし、上述したステップ（ｃ）で粒子を均一化する周波数よりも低い変動周波数によって特徴付けられる、時間によって変動する磁場であってもよい。
【００２４】
本発明で使用される容器は、懸濁液中に磁気粒子と反応させるべき磁気粒子を保持する、任意の容器をいう。好適な実施例では、容器は標準の試験管である。別の実施例では、容器は流体またはマイクロ流体システムの一部の反応チャンバである。後者の場合、流体反応チャンバは、反応チャンバの内外にそれぞれサンプルおよび試薬を運ぶ少なくとも１つの入口チャネルと出口チャネルを有し、流体チャネルのネットワークと繋がっている。
【００２５】
本発明はまた、保持力場ｅ１とｅ２を有する少なくとも２つの磁気粒子セットを具え、ここで保持力場ｅ１はｅ２よりも大きいキットを開示する。第１の磁気粒子のセット（大きい保持力場を具える）は第２の磁気粒子のセット（低い保持力場を具える）を操作するドライバとして作用する。後者の粒子は、選択的な標的認識能力を有する様々な生化学分子と化学的に活性化されるか結合される。
【００２６】
好適な実施例では、大きい保持力場を有するドライバの粒子は選択的な標的認識能力を有する様々な生化学分子と化学的に活性化されるか結合される。好適な実施例ではドライバ粒子の認識能力は、「親和性」粒子（低い保持力場を有する）の認識能力とは異なる。
【００２７】
本発明の最終目的に関して、本発明は、外部磁場の適用に対し規定された磁気の保持力場で応答するように設計された機能性磁気粒子を含む懸濁液を開示している。前記粒子の懸濁液は、ｅ１がｅ２よりも大きい、保持力場ｅ１およびｅ２を有する少なくとも２つの磁気粒子のセットを具える。前記磁気粒子の表面は、選択的に標的分子と結合する親和性の認識官能基で特に機能化されている。この点に関して、大きな保持力場を有する第１の磁気粒子のセットは、低い保持力場の粒子を混合または分離するドライバとして使用される。提案された方法を用いると、外部磁場の下で強磁性体粒子（すなわち大きい保持力場の粒子）を均一に混合する操作が簡単となり、外部磁場が無い状態で超常磁性粒子（すなわち、実質的に低い保持力場の粒子）が良好に分散するといった利点が得られる。前記懸濁液は、生体分子または化学物質を分析、操作、精製および検出するための他の試薬を含むキットの一部とすることができる。これらの目的を達成するために、磁気粒子は時間によって変動する極性および大きさを有する外部磁場を用いて操作される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
本発明の目的および特徴は、特に添付された請求項において説明される。本発明は、さらなる目的および利点と共に、その構成および操作方法の両方が、添付図面と共に以下の説明を参照することにより、最も理解されるものである。
【図１】図１は、外部磁場に対する磁気材料（磁気粒子として）のヒステリシス応答を示したグラフである。保持力場を含む、反応の異なるキーパラメータが示されている。
【図２】図２は、本発明による磁気粒子の操作方法の基礎となる物理的メカニズムについての概略図であり、高い保持力場および低い保持力場の粒子は、時間によって変動する極性および大きさを有する外部磁場を用いて操作される。低い周波数では（図２（ａ））この粒子の２セットは凝集する一方で、高い周波数（図２（ｂ））では、粒子は相互に分離される（反発する）傾向がある。
【図３】図３は、本発明による磁気粒子の操作方法の概略図である。特に、本図は、容器を取り囲んでいる磁気源の連続した動作によって生み出される磁場であって、時間によって変動する極性および大きさを有する磁場にさらされた容器中における懸濁液内の磁気粒子の挙動を示す。
【図４】図４は、本発明の実施例による容器の概略図であり、反応チャンバの内外にそれぞれサンプルまたは試薬を流れによって運ぶ、少なくとも１つの入口と１つの出口チャネルを有する流体チャネルのネットワークに接続されている反応チャンバを具える。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、磁気粒子を用いたサンプルから標的分子または標的粒子を分離する方法を開示する。前記方法は、保持力場ｅ１およびｅ２を有する少なくとも２セットの磁気粒子の組み合わせの使用を含み、ここでｅ１はｅ２よりも大きい。
【００３０】
本発明は、保持力場ｅ１およびｅ２を有する（ここで、ｅ１はｅ２より大きい）少なくとも２セットの磁気粒子が、容器内に配置された複雑な反応混合物（例えば全血または液体中のフラグメント細胞）に加えられる方法を開示する。周波数閾値ｆ１よりも高い周波数ｆによって特徴付けられ、時間によって変動する極性と大きさを有する外部磁場がかけられ、容器内で担体磁気粒子（保持力場ｅ１を具える）の相対運動を生じさせ、これにより親和性粒子（低い保持力場ｅ２を具える）に粒子の均一な懸濁を形成させる。容器内の液体に対する親和性粒子のこの永続的な相対運動により、粒子と取り囲んでいる液体培地の間で効率的な相互作用（すなわち、混合）が可能となる。この相互作用は、次いで、磁気粒子の表面への標的の親和性結合をもたらす。
【００３１】
本発明の基礎となる物理的メカニズムは、時間によって変動する極性および大きさを有する磁場に対して規定された磁気応答（すなわち保持力場）を有する磁気粒子の挙動および動態の違いに基づく。
【００３２】
一般的に、磁気粒子（任意の磁気材料としての）は、外部磁場Ｈにさらされた場合の磁化（ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ）Ｂによって規定される磁気応答により特徴付けられる。この磁気応答は、図１に示されるＢ−Ｈのヒステリシス曲線によって表される。Ｂ−Ｈのヒステリシス曲線の重要な特性となる値は、保持力場または保磁力であり、これはサンプルの磁化が飽和状態に操作された後、粒子の磁化を０に減少させるために必要な外部適用される磁場の強度を規定している。このため、事実上、保持力場（ｅ）は磁気粒子が消磁されるまでの抵抗を示す。保持力場は通常、エルステッド（Ｏｅ）またはアンペア／メーター（１Ｏｅ＝１０００／４π−Ａ／ｍ）で示される。
【００３３】
これらの磁気応答に関して、一般に２種類の磁気粒子が、磁気分離処理の技術水準において説明されている。第１の磁気粒子のタイプは強磁性粒子として知られ、室温で保持力場がゼロでないことで特徴付けられる。特に、本書では、保持力場が５０Ｏｅよりも大きく、好ましくは２００Ｏｅよりも大きい保持力場を有する粒子としての強磁性粒子をいう。強磁性粒子は、また高い磁化でも知られており、高い磁化は外部の低い磁場を用いた操作を簡単にする。しかしながら、外部の磁界が取り除かれた後でも帯磁したままであるという事実から、強磁性粒子は粒子の凝集塊を形成する傾向があり、外部磁場が無い状態でこれらを再懸濁させるのが非常に困難になる。しかしながら、米国特許第８１４２８９２に開示されるように、あつらえた保持力場を有する強磁性粒子が、時間によって変動する極性および大きさを有する磁場を用いて操作された場合に引きつけ合う挙動を示す。そのような時間で変動する磁場の下では、米国特許第８５８５２７９に開示されるように、粒子が凝集する問題を解決することができ、粒子は取り囲んでいる液体培地において効率の良い均一な混合を示す。
【００３４】
第２の磁気粒子のタイプは超常磁性粒子として知られており、室温での保持力場が実質的にゼロで特徴付けられる。特に、本書では、保持力場が５０Ｏｅより低く、好ましくは２０Ｏｅより下の保持力場を有する粒子としての超常磁性粒子をいう。それらの低い保持力場のため、超常磁性粒子は外部適用された磁場を取り除くと、それらの磁化を消失する傾向がある。そのような状態下では、粒子は容易に再懸濁され均一な粒子の懸濁を形成でき、バイオアッセイの用途のための好適な状態にすることができる。しかしながら、超常磁性粒子に関する重要な制限は、外部磁場の下でこれらの磁気粒子が示す磁化が低いことである。この場合、これらの粒子を操作するのに十分な磁力を生み出すために、高い磁場が必要となる。さらに、このような粒子は、米国特許第８５８５２７９に開示されるように、時間で変動する磁場が使用される場合でさえも、超常磁性粒子が凝集塊を形成する傾向があるので、外部磁場を用いた操作と混合がより困難である。
【００３５】
従って、外部の（時間によって変動する）磁場の下での強磁性粒子の簡便な操作および均一な混合と、外部磁場が無い状態での超常磁性粒子の良好な分散を組み合わせる方法の発見が、磁気粒子ベースの分析の実施のために強く望まれていた。
【００３６】
本発明の基礎となる物理的メカニズムの磁気粒子の操作方法が図２に示されている。このメカニズムは本質的に、時間で変動する（すなわち時間が磁場を変化させる）極性および大きさを有する外部磁場の適用下で異なる保持力場を有する粒子の磁気応答の動的な挙動の違いに基づく。
【００３７】
従って、前記磁場の変動は、１秒あたり０．１から１００００サイクルの間の範囲の周波数の変動によって特徴付けられる。好適な実施例では、磁場の変動は１秒あたり１から５００サイクルの間の範囲の周波数の変動によって特徴付けられる。
【００３８】
このように時間で変動する磁場において、図２（ａ）で示されるように、高い保持力場ｅ１の磁気粒子（３）（白丸で示される）を、（比較的）低い保持力場ｅ２を有する第２の粒子（４）（黒丸で示される）と共に組合わせて、時間で変動する低い周波数の磁場を用いて操作すると、２つの粒子は共に凝集する傾向にある。時間で変動する低い周波数の磁場におけるこの凝集は、静磁場の場合と同様に、２つの粒子のタイプが外部磁場の極性の変動（または「回転」）によって同時に「回転」することによる。そのような状態下では、２つの粒子のタイプ（高い保持力場および低い保持力場）は、「遅い」磁場の極性の変動に従うことが可能であり、これによってそれぞれの磁気モーメントが整列し、したがって粒子は相互（ひいては、その凝集）間に引き付け合う相互作用を有する。
【００３９】
時間によって変動する高い周波数の磁場では、取り囲んでいる液体培地によって作用する高い粘性トルクが原因で、粒子の磁気モーメントは、外部磁場の磁場極性（または回転）の変化に対して同期しない傾向がある。高い周波数の形態は、従って、磁場の変動と粒子の磁気モーメントとの間の時間「差」によって特徴付けられる。この時間差は、粒子の保持力場が高いほど小さくなる（すなわち、高い保持力場の粒子は磁場の変動に簡単に従う傾向にある）。図２（ｂ）に示すように、（比較的）低い保持力場ｅ２を有する第２の粒子（４）（黒丸で示される）と高い保持力場ｅ１の磁気粒子（３）（白丸で示される）を組合わせて、時間で変動する高い周波数の磁場を用いて操作すると、２つの粒子は、高い周波数の磁場におけるそれぞれの磁気モーメントの間の「差」によって生じる負の（すなわち反発する）磁化の相互作用によって、相互に分離される（すなわちばらばらになる）傾向となる。外部磁場の極性変動の周波数をさらに増大させることよって、実際に、低い保持力場を有する粒子（４）が比較的低い物理的運動を行う一方で、高い保持力場を有する粒子（３）のみが未だに動的に運動して磁場に従う周波数閾値（ｆ１）に到達することができる。
【００４０】
この物理メカニズムを用い、本発明は磁気粒子の操作方法であって、それぞれ保持力場ｅ１およびｅ２を有する、少なくとも２セットの磁気粒子の組み合わせを使用し、ここでｅ１はｅ２より大きく、操作において（ａ．）周波数ｆ１に特徴付けられる第１の磁場を適用して、使用する２つの粒子に均一な粒子の懸濁を形成させるステップと；（ｂ．）周波数ｆ２＜ｆ１である第２の磁場を適用して、使用する粒子を共に凝集させ、粒子の凝集塊を形成させるステップと、を含む方法を開示する。  
【００４１】
本発明にかかる時間によって変動する磁場の周波数に関して、好適な実施例では、２つの粒子が相互に「分離」し、均一な粒子の混合を形成する際の周波数の閾値ｆ１は、最小で１秒あたり１０サイクルと等しく、好ましくは最小で１秒あたり５０サイクルと等しい。実際、第１の粒子のセットの保持力場（ｅ１）を、第２の粒子のセットの保持力場（ｅ２）と比較して高くするほど、２つの粒子を分離して均一な状態を形成するのに必要な周波数の閾値ｆ１も高くなる。周波数についての参照を考慮すると、閾値ｆ１は、２つの粒子セットを凝集させるために、時間によって変動する磁場が１秒あたり１０サイクルより低い周波数を有し、好ましくは１秒あたり２サイクルより周波数を有するべきである。
【００４２】
本発明にかかる磁気粒子の操作は、好ましくは全体が参照として組み込まれる米国特許第８５８５２７９に従って、時間によって変動する磁場を用いて行われる。従って、本発明は、反応チャンバにわたる最大の磁場勾配の位置の時間の変動を誘導するような時間によって変動する極性および大きさを有し、これにより使用する粒子に反応チャンバの容量全体に亘って粒子の霧のような相対的な並進および回転運動を生じさせる磁場シーケンスの使用を開示する。この方法を用いると、粒子の混合体は、容量単位あたりの粒子の活性化表面の有意かつ永続的な増加をもたらし、この大きな粒子表面と標的物質との間の接触が促進される。さらに、提案された磁気粒子の操作処理により、ほんの少しの時間で全体の反応量に亘る均一な混合が有利に保証され、より大きいサンプルの容積を粒子表面に効率的および迅速に接触させることが可能となる。さらに、それらの操作中、粒子は、反応チャンバ容量全体に亘って永続的に効率の良い運動をしており、これは粒子混合の促進の鍵となる。
【００４３】
本発明により使用される磁気粒子および特に、大きな保持力場を有する第１の粒子のセットは、好ましくはフェリ磁性体または強磁性体粒子からなる。好ましくは、第１の磁気粒子セットは米国特許８１４２８９２において開示され、その内容全体が参照として本願に組み込まれる。これに関して、本発明によって使用する磁気粒子は、限定しないが、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、マグネタイト（γ−Ｆｅ２Ｏ３）またはその任意の合金を含む強磁性体からなる。高い磁性および軸性の磁気結晶の強い不均一性を有する幾つかの強磁性合金は、高い保持力場をもたらすために、例えばＰｔ、ＦｅＰｔ、ＰｒＣｏ５、ＳｍおよびＣｏＰｔなどが好適に使用される。一般的に遷移金属、金属酸化物およびそれらの合金は、組成物に入る好適な材料である。
【００４４】
本発明により使用される磁気粒子および特に、低い保持力場を有する第２の粒子のセットは、好ましくは常磁性体または超常磁性体材料からなる。この分野で説明されるように、超常磁性体粒子の組成物に入る材料は、微細な（ナノメーターの大きさ以下）磁気粒子（強磁性流体懸濁液としても知られる）である。実際に、主たる磁気材料としてより微細な磁気粒子を使用した場合、微細な粒子の残留磁気の方向性が非常に小さいため取り囲まれている熱エネルギーの変動によって打ち消され、平均残留磁気の消失につながる。
【００４５】
本発明の一実施例によると、磁気粒子はその表面にコーティングを有し、前記磁気粒子のセットの少なくとも１つが、そのコーティングに結合され標的分子と選択的に結合する親和性認識分子を具えることを特徴とする。これに関して、磁気粒子表面は、例えば標的分子または標的分子のクラスと結合することができる機能的な官能基またはリガンドを含む。考えられる官能基は、限定しないが、カルボン酸、ヒドロキサム酸、非接着性の組成物、アミン、イソシアン酸塩、シアン酸塩を含む。考えられるリガンドは、限定しないが、タンパク、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、疎水性材料、親水性材料、抗体などを含む。より一般的に、本発明の使用に適したリガンドの例は、限定しないが、例えばタンパク、タンパク断片、ペプチドおよびポリペプチド、抗体、レセプタ、アプタマ、酵素、基質、基質類似体、リボザイム、構造タンパクと、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのような核酸、単糖類、脂質、様々な疎水性または親水性の基質、脂溶性物質、化学誘引物質、酵素、ホルモン、フィブロネクチン等の分子および高分子である。このような分子および高分子は天然に生み出されたものでも、合成されたものでもよい。リガンドの用語は、例えば細胞、組織、微生物全体、ウイルス等の大きな物質をも含んでもよい。
【００４６】
図３（ａ）は、容器（８）内で操作される低い保持力場の粒子（６）の挙動を示し、例えば、高い周波数で変動する磁場における超常磁性粒子である。このような状況下で、粒子は、容器（８）を取り囲み連続した磁場の挙動を引き起こす磁気源（７）に近い容器の外側との境界で凝集する傾向がある。図３（ｂ）は、時間によって変動する低い周波数の磁場（５）における、高い保持力場の粒子（白丸）と低い保持力場の粒子（黒丸）との組合わせ（９）の挙動を示す。このような状況下で、高い保持力場の粒子は、低い保持力場の粒子を、外部磁場（５）の極性の変動と共に動く粒子の凝集塊（９）の形で操作する。図３（ｃ）は、時間によって変動する高い周波数の磁場（５）における、高い保持力場の粒子（白丸）と低い保持力場（黒丸）との組合わせの挙動（１０）を示す。このような状況下で、高い保持力場の粒子は、低い保持力場を、外部磁場（５）による極性の変動と共に動く粒子の均一な懸濁（１０）の形で操作する。図３（ｄ）は図３（ｃ）と同じ粒子の挙動だが、外部磁場の大きさがより高い場合である。このような状況下では、高い磁化により、高い保持力場の粒子が容器に引き付けられるが、低い保持力場の粒子は、外部磁場（５）による極性の変動に伴って動く粒子の均一な混合（１１）を未だ形成している。
【００４７】
図４は、本発明の一実施例による容器の概略図であり、反応チャンバ（８）の内外にそれぞれサンプルまたは試薬を流れ（１４）によって運ぶ、少なくとも１つの入口（１２）と１つの出口（１３）による流体チャネルのネットワークに接続されている反応チャンバ（８）を具える。前と同様に、磁石（７）は、時間によって変動する磁場を適用すべく、チャンバ（８）の周囲に配置されている。
【００４８】
本発明で使用される容器は、前記磁気粒子と反応させるべき懸濁液の磁気粒子を保持する任意の容器をいう。好適な実施例では、容器は標準の試験管である。別の実施例では、容器は流体またはマイクロ流体システムの一部の反応チャンバである。後者の場合、流体反応チャンバは、反応チャンバの内外にそれぞれサンプルまたは試薬を流れによって運ぶ、少なくとも１つの入口と１つの出口チャネルを有する流体チャネルのネットワークに接続されている反応チャンバを具える。この容器は、前記反応チャンバを磁場に、より具体的には時間によって変動する磁場にさらす装置の中に配置される。
【００４９】
本発明の別の様態は、外部磁場に反応する規定された磁化の保持力場を有する少なくとも２つのタイプの磁気粒子を含んだ懸濁液に関する。前記磁気粒子の表面は、選択的に標的分子と結合する親和性の認識官能基で特に機能化されている。前記懸濁液は、生体分子および化学物質の分析、操作、精製に必要とされる他の試薬を含むキットの一部である。好適な実施例において、本発明によるキットは、室温での超常磁性の挙動によって特徴付けられる少なくとも１セットの磁気粒子と、強磁性の挙動によって特徴付けられる少なくとも１セットの磁気粒子とを具える。強磁性粒子は好ましくは１００から１０００Ｏｅの範囲の保持力場を有する。本発明による磁気粒子の操作において、時間によって変動する極性および大きさを有する磁場シーケンスは、反応量の全体に亘って均一な混合が生じるように操作される。
【００５０】
本発明は、特定の実施例を通して説明したが、これらの実施例に制限されるものではなく、添付の請求項によってのみ限定されるものである。従って本発明は、本発明の範囲から逸脱することなく、実施例の任意の変更、改変または組み合わせを含む。
【図１】
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【図２】
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【図３（ａ）】
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【図３（ｂ）】
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【図３（ｃ）】
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【図３（ｄ）】
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【図４】
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【国際調査報告】
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