(57)【要約】  【解決手段】  インスリン類似体は、位置Ｂ１３、B１７、Ａ１２、Ａ１３、及び／またはＡ１７における１つまたはそれより多い残基を有する特徴的なタンパク質表面における、１つまたはそれより多い改変を含有する。６つのインスリン類似体単量体あたり２．２〜１０亜鉛イオンのモル比での亜鉛イオンの存在下、または６つのインスリン類似体単量体あたり１つより少ない亜鉛イオンの存在下、少なくともｐＨ値が６．８〜８．０の範囲の、可溶性溶液中Ｕ−１００からＵ−１０００の連続的な濃度の、上記類似体の製剤。閉鎖型ループシステムとして、連続的グルコースモニター及びコンピューターベースの制御アルゴリズムと機能的に統合されている、インスリンポンプ中での上記製剤の、またはそのインスリンポンプの使用。糖尿病を有する患者を治療する方法は、生理的に有効な量のインスリン類似体、または生理的に許容可能なその塩を、静脈内、腹腔内、または皮下注射により、患者に投与する工程を有する。  【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型インスリンと比較して少なくとも１つの置換を含有するインスリン類似体であって、Ｂ１３におけるＡｌａ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、またはＬｅｕ置換、Ｂ１７におけるＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒ置換、Ａ１２におけるＡｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＴｙｒ置換、Ａ１３におけるＡｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、またはＴｒｐ置換、及びＡ１７におけるＡｌａ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒ置換からなる群から選択される位置における置換を含む、インスリン類似体。
【請求項２】
請求項１記載のインスリン類似体であって、さらに、位置Ｂ２８におけるＡｓｐまたはＬｙｓ置換を有する、インスリン類似体。
【請求項３】
請求項２記載のインスリン類似体であって、さらに、位置Ｂ２９におけるＰｒｏ置換を有する、インスリン類似体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項記載のインスリン類似体において、前記類似体は、位置Ａ１３におけるＧｌｕ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、またはＰｈｅ置換を含有する、インスリン類似体。
【請求項５】
請求項４記載のインスリン類似体であって、さらに、パラ−クロロフェニルアラニン、オルト−フルオロフェニルアラニン、及びシクロヘキシルアラニンからなる群から選択される位置Ｂ２４における置換を有する、インスリン類似体。
【請求項６】
請求項５記載のインスリン類似体であって、位置Ｂ２４におけるオルト−フルオロフェニルアラニン置換を有し、さらに、位置Ｂ１０におけるアスパラギン酸置換を有する、インスリン類似体。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項記載のオルト−フルオロ体において、前記類似体は位置Ｂ１７におけるアラニン置換を含有する、オルト−フルオロ体。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項記載のインスリン類似体において、前記類似体は位置Ａ１３におけるアラニンまたはフェニルアラニン置換を含有する、インスリン類似体。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか一項記載のインスリン類似体において、前記類似体は位置Ａ１７におけるＧｌｕ置換を含有する、インスリン類似体。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか一項記載のインスリン類似体において、Ａ鎖配列が配列ＩＤ番号：４〜８から選択される、インスリン類似体。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか一項記載のインスリン類似体において、Ｂ鎖配列が配列ＩＤ番号：９〜１１から選択される、インスリン類似体。
【請求項１２】
請求項１記載のインスリン類似体のＡ鎖をコードするＤＮＡ配列。
【請求項１３】
配列ＩＤ番号：４、５、６、７、または８に一致するインスリン類似体のＡ鎖をコードするＤＮＡ配列。
【請求項１４】
請求項１記載のインスリン類似体のＢ鎖をコードするＤＮＡ配列。
【請求項１５】
配列ＩＤ番号：９、１０、または１１に一致するインスリン類似体のＢ鎖をコードするＤＮＡ配列。
【請求項１６】
配列ＩＤ番号：９、１０、または１１に一致するインスリン類似体のＢ鎖をコードするＤＮＡ配列であって、位置Ｂ２４においてナンセンスコドンも含有する、ＤＮＡ配列。
【請求項１７】
患者の血糖を低下させるための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のインスリン類似体の使用。
【請求項１８】
請求項１７記載の使用において、前記類似体が、単鎖インスリン類似体単量体６つあたり２〜１０の亜鉛イオンのモル比で亜鉛イオンを含有する組成物に製剤化され、当該製剤のｐＨがｐＨ６．８〜ｐＨ８．０である、使用。
【請求項１９】
請求項１８記載の使用において、前記インスリン類似体が少なくともＵ−１００の濃度に製剤化される、使用。
【請求項２０】
請求項１９記載の使用において、前記インスリン類似体がＵ−５００からＵ−１０００の濃度に製剤化される、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府により後援された研究または開発に関する供述
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより助成金第ＤＫ０４０９４９号及び第ＤＫ０７４１７６号のもと授与された、共同契約下の政府支援でなされた。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有しうる。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、改変された薬物動態の及び薬力学的特性などの、増強された薬学的特性を示す、つまり対応する野生型ヒトホルモンの可溶性製剤と比較して短縮された作用持続時間を付与する、ポリペプチドホルモン類似体に関する。とりわけ、本発明は、（ｉ）その「受容体結合表面第２部位」中に１つまたはそれより多いアミノ酸置換、及びこれと共に任意で（ｉｉ）インスリン類似体の皮下デポから血流中への吸収を加速することが当技術分野において既知である１つまたはそれよりＢ鎖置換を含有する、インスリン類似体に関する。本発明のインスリン類似体は、Ａ及びＢ鎖間に連結ドメイン（Ｃドメイン）を任意で含有してもよく（そうすると単鎖類似体と表わされる）、またＡまたはＢ鎖中の他の部位において標準型または非標準型アミノ酸置換を任意で含有してもよい。本発明の基礎となる本質的な発想は、ホルモンの受容体結合表面第２部位中における置換の同時組み込みにより、速効型類似体の安全性及び有効性を向上させることである。置換のこの組合せは、糖尿病の治療法としての皮下注射後の血液グルコース濃度の食時制御における有用性の、及び糖尿病の治療のための閉鎖型ループシステムのアルゴリズムベースの作動（「スマートポンプ」）におけるさらなる有用性の、「迅速オン／迅速オフ」薬物動態特性を付与する。
【０００３】
治療薬及びワクチンを含むタンパク質の工学操作は、幅広い医学的及び社会的有益性を有しうる。ヒト、他の哺乳類、脊椎生物、無脊椎生物、または一般に真核性細胞のゲノム中にコードされる、天然起源のタンパク質は、しばしば２つまたはそれより多い機能的表面を有する。タンパク質類似体の有益性は、生物学的活性の微調整を提供することなどの、１つまたは他のこれらの機能的表面の選択的改変を達成することであろう。治療用タンパク質の例は、インスリンにより提供される。野生型インスリンの三次元構造は、亜鉛六量体、亜鉛なし二量体、及び溶液中の遊離した単量体として十分に特性解明されてきた（図１及び２）。他の哺乳類のゲノム中にコードされる野生型ヒトインスリン及びインスリン分子は、インスリン受容体（ＩＲ）に結合し、各インスリン受容体は複数のドメイン及び関連ドメイン表面を含有する。ＩＲは、α鎖及びβ鎖が単一の前駆体ポリペプチドの翻訳後生成物である、αβ半分受容体の二量体（（αβ）２と呼ぶ）である。（αβ）２二量体のホルモン結合表面は、受容体の非線形結合及び動態特性に関連して、第１部位及び第２部位として分類されてきた。結合の概略図は、図３において図式的に示される。ＩＲ外部ドメインの断片の構造的及び生化学的解析における最近の進歩は、第１部位が、（αβ）２二量体中の両サブユニットにより形成されるトランス結合エレメントで構成されることを示した。両サブユニットとは、一方のサブユニットのＮ末端Ｌ１ドメイン、及び他方のサブユニットのＣ末端α−ヘリックス（αＣＴ）である（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｊ．，  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ＬＪ，  Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＣＴ  Ｊｒ，  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＮＢ，  Ｉｓｍａｉｌ−Ｂｅｉｇｉ  Ｆ，  Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ＭＣ，  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ  ＭＡ．  α−Ｈｅｌｉｃａｌ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ａｔ  ｔｈｅ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｓ  ａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｔｏ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｉｔｓ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０９，  １１１６−７１  （２０１２））。第２部位の位置は、十分には明らかにされていないが、第一及び第二フィブロネクチン相同ドメインの一部を有すると提唱されている。
【０００４】
インスリンまたはインスリン類似体の受容体結合表面も、同様に、同じ認識ベースで分類されうる。それぞれ、結合表面第１部位（古典的受容体結合表面）、及び結合表面第２部位（非古典的受容体結合表面）である。インスリンの結合表面第１部位はインスリンＢ鎖における二量体形成境界面と重複し、一方で結合表面第２部位は、その六量体形成境界面と重複する。第１部位ホルモン−ＩＲ境界面は、最近、低解像度で可視化された（Ｍｅｎｔｉｎｇ  ＪＧ，  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｊ，  Ｍａｒｇｅｔｔｓ  ＭＢ，  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ＬＪ，  Ｋｏｎｇ  ＧＫ，  Ｓｍｉｔｈ  ＢＪ，  Ｗａｔｓｏｎ  ＣＪ，  Ｚａｋｏｖａ  Ｌ，  Ｋｌｅｔｖｉｋｏｖａ  Ｅ，  Ｊｉｒａｃｅｋ  Ｊ，  Ｃｈａｎ  ＳＪ，  Ｓｔｅｉｎｅｒ  ＤＦ，  Ｄｏｄｓｏｎ  ＧＧ，  Ｂｒｚｏｚｏｗｓｋｉ  ＡＭ，  Ｗｅｉｓｓ  ＭＡ，  Ｗａｒｄ  ＣＷ，  ａｎｄ  Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ＭＣ．  Ｈｏｗ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｅｎｇａｇｅｓ  ｉｔｓ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４９３，  ２４１−５  （２０１３））。推測に基づく第２部位関連残基は、変異の動態効果に基づき、または第１部位とは無関係の位置であるがその中の変異が結合を妨げるような位置に基づき、定義されうる。これらの基準は、非古典的残基Ａ１２、Ａ１３、Ａ１７、Ｂ１３、及びＢ１７の潜在的重要性を強調する。第１部位関連表面、及び第２部位関連表面のそれぞれが、図４において、インスリン単量体の表面との関連で示される。皮下デポからのインスリンの吸収を加速することが当技術分野において公知である置換は、ホルモンの結合表面第１部位の内部及び近隣に通常は存在するが（残基Ｂ２４、Ｂ２８、またはＢ２９など）、我々は、結合表面第２部位の改変は、標的細胞または組織の表面において一旦結合すると、ホルモン−受容体複合体によるシグナリングの、細胞での持続時間を調節しうると予想した。理論によって拘束されることを望まないが、我々は、シグナリングの細胞での持続時間のそのような短縮が、当技術分野で公知である結合表面第１部位の内部または近隣に存在する置換により皮下デポ中での解体が加速された速効型インスリン類似体（「迅速オン」）に、「迅速オフ」薬物動態特性を付与するであろうと予想した（理論的根拠については図６を参照）。従って、第１部位／第２部位関連置換のそのような新規組合せは、相まって、糖尿病の治療における新規有用性の、迅速オン／迅速オフ薬物動態特性の望ましい組合せを付与するであろう。
【０００５】
インスリンの古典的受容体結合表面内の改変または置換は、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性に対する顕著な影響なしに、そのホルモンのその受容体に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ親和性を約５倍（例えば、解離定数０．０５ｎＭから解離定数０．２５に）低下させうることが、当技術分野において公知である。ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性は、皮下または静脈内に注射された場合の変異型インスリンの、血液グルコース濃度の低下を引き起こす能力による評価としてである。そのような頑強性は、少なくとも部分的には、親和性とそのホルモンの血流からのクリアランス速度との間の補正的な関係による。ＩＲへの結合は、インスリン作用とインスリンクリアランスの大部分との両方を媒介するため、親和性の低下は、循環半減期、及びそれゆえに生物学的シグナリングをもたらす機会の比例的増加を引き起こす。そのような補正の例は、位置Ｂ２４におけるフェニルアラニンがシクロヘキサニルアラニン（Ｃｈａ）により置換されているインスリン類似体との関連で、開示されている。これは２０１２年７月１３日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／４６５７５号、及び２０１３年１月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／７５５，０２０号において開示され、これらの開示内容は本参照により本明細書に組み込まれる。位置Ｂ２４におけるＣｈａの非平面脂肪族環（図８において図解される）は、受容体結合親和性を約３倍低下させるが、糖尿病Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて試験されるＫＰ−インスリンの有効性または薬力学的特性には影響しない（図９Ａ）。位置Ｂ２４におけるフルオロ芳香族及びクロロ芳香族置換による改変により、さらなる例が提供されている。これは、図７において（野生型二量体境界面との関連で）図解され、また、２０１２年７月１８日及び２０１１年１月３１日にそれぞれ出願された米国特許出願第１３／５１５，１９２号及び第１３／０１８，０１１号、２０１２年１０月４日に出願された米国仮特許出願第６１／７０９，４４８号、並びに２０１０年１２月１３日及び２０１２年１０月２９日にそれぞれ出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／６００８５号及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／６２４２３号において開示され、これらは本参照により本明細書に組み込まれる。インスリンＬｉｓｐｒｏ（［ＬｙｓＢ２８，  ＰｒｏＢ２９］−インスリン、ＫＰ−インスリン（Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）の有効成分）とも呼ばれる、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．）中のＰｈｅＢ２４の、芳香環のオルト位における単一のクロロ置換による改変（２−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４）は、ゆえに、そのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性における変化なしに、変異型ホルモンのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける単離ＩＲに対する生化学的親和性を約３倍低下させる。そのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性は、ストレプトゾトシンにより糖尿病を罹患させられたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて評価され、または静脈内オクトレオチドにより内因性インスリン分泌が抑制された麻酔された非糖尿病性の青年期のＹｏｒｋｓｈｉｒｅブタにおいて評価された（データ表示なし）。さらにより劇的なことには、２−Ｆ−ＰｈｅＢ２４（位置Ｂ２４におけるオルト−モノフルオロ−フェニルアラニン）を含有する���ＡｓｐＢ１０，  ＬｙｓＢ２８，  ＰｒｏＢ２９］−インスリン（ＤＫＰ−インスリン）の誘導体が同様の受容体結合親和性の低下（ＫＰ−インスリンと比較して約３５（±５）％）を示す一方で、その有効性及びシグナリングの持続時間は糖尿病性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて増強される（図９Ｂ）。これは、２０１１年１月３１日に出願された米国特許出願第１３／０１８，０１１号において開示される通りである（これは本参照により本明細書に組み込まれる）。従って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価されるＩＲ結合の適度な低下を一般にもたらすインスリン中の改変または置換は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて十分に許容的であろうと予期されるであろう。また、有効性、または（自己集合に対する影響の非存在下では）他の薬学的特性に関しては、野生型インスリンとは区別不可能であろうこと、あるいは２−Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリンの場合はさらにより有効かつ持続的であろうことも予期されるであろう。従って、第２部位内の置換または改変が、変異型インスリンのＩＲに対する生化学的親和性に５倍より小さい低下を付与するにも関わらず、ｉｎ  ｖｉｖｏでのインスリン作用の持続時間を著しく短縮化しうることを発見したのは、予想外であった。位置Ｂ１３、Ｂ１７、Ａ１２、Ａ１３、及びＡ１７における側鎖はインスリン受容体の第一のホルモン結合表面において結合するとは考えられていないが、アラニンスキャン変異導入は、第２部位関連位置における単一のアラニン置換が、次のように相対的受容体結合親和性に影響することを示した。（位置Ｂ１３）１２（±３）％、（Ｂ１７）６２（±１４）％、（Ａ１２）１０８（±２８）％、（Ａ１３）３０（±７）％、及び（Ａ１７）５６（±２０）％である。
【０００６】
インスリンの投与は、糖尿病のための治療法として長く確立されてきた。糖尿病を有する患者における従来型インスリン補充療法の主な目標は、ヒト健常者特有の正常範囲より上または下への変動を防止するための、血液グルコース濃度の厳格な制御である。正常範囲より下への変動は、即座に現れるアドレナリン様または神経低糖症の症状と関連付けられ、それは重い発作では痙攣、昏睡状態、及び死に至らしめる。正常範囲より上への変動は、網膜症、失明、及び腎不全を含む微小血管障害の長期的危険性の上昇と関連付けられている。インスリンは、脊椎動物での代謝における中心的な役割を果たす小球状タンパク質である。インスリンは、２１残基を含有するＡ鎖、及び３０残基を含有するＢ鎖の２鎖を含有し、個々の残基は、アミノ酸（一般に標準型の３文字コードを用いて）、鎖、及び配列位置（一般に上付き文字として）の識別により示される。本ホルモンは、膵β細胞中にＺｎ２＋安定化六量体として貯蔵されているが、血流中ではＺｎ２＋なし単量体として機能する。インスリンは、単鎖前駆体であるプロインスリンの産物であり、プロインスリンにおいては、連結領域（３５残基）がＢ鎖のＣ末端残基（Ｂ３０残基）をＡ鎖のＮ末端残基へと連結させる。様々な証拠が、プロインスリンはインスリン様コアと無秩序な連結ペプチドとから構成されることを示す。３つの特定のジスルフィド架橋（Ａ６−Ａ１１、Ａ７−Ｂ７、及びＡ２０−Ｂ１９、図２において標識されている）の形成は、粗面小胞体（ＥＲ）におけるプロインスリンの酸化的折り畳みと共役すると考えられている。プロインスリンは、ＥＲからゴルジ体への輸出の直後、可溶性Ｚｎ２＋配位六量体を形成するように集合する。エンド型タンパク質分解性消化、及びインスリンへの変換は、未熟な分泌顆粒中で起こり、続いて形態学的濃縮が起こる。成熟貯蔵顆粒内の亜鉛インスリン六量体の結晶配列は、電子顕微鏡法（ＥＭ）により可視化されてきた。
【０００７】
（ｉ）皮下デポ中のインスリン複合体の解体加速を（ｉｉ）一旦ホルモン−受容体複合体が標的細胞または組織の表面で結合した後の細胞シグナリングの持続時間の短縮と組み合わせる、速効型二鎖インスリン類似体または単鎖インスリン類似体を工学設計する、医学的及び社会的需要が存在する。また、後期食後低血糖症を回避するために食時インスリン注射の治療を受ける一部の患者の満たされぬ需要、並びに安全性及び有効性に関する閉鎖型ループアルゴリズムベースのポンプシステム（「スマートポンプ」）の満たされぬ性能の詳細事項が、存在する。シグナリング持続時間の短縮により、超過送達事象の影響が縮小されるため、スマートポンプにおけるフィードバック制御は、より強力にされうであろう。従って、インスリン複合体の解体を加速するように設計されるＢ鎖中の改変を、シグナリング持続時間の短縮をもたらすタンパク質分子の至る箇所における改変と組み合わせる、新規の種類のインスリン類似体を提供することが望ましいであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、（ｉ）Ｂ鎖の第１部位関連表面の中または近隣の置換または改変による血流中への迅速な吸収、並びに（ｉｉ）Ａ及び／またはＢ鎖の第２部位関連表面の変異または改変による標的細胞シグナリングの持続時間の短縮を提供する、二鎖及び単鎖インスリン類似体を提供することは、本発明の一態様である。第２部位関連置換は、位置Ｂ１３、Ｂ１７、Ａ１２、Ａ１３、及びＡ１７のうち１つまたはそれより多い位置における改変である。本発明の類似体は、野生型インスリンの、皮下または静脈内注射のすぐ後に血液グルコース濃度の低下を指揮する、生物学的活性の少なくとも一部を含有する。６．８〜８．０のｐＨ範囲にある透明な可溶性溶液としての製剤が実現可能であるように、類似体の等電点が３．５〜６．０の範囲にあることは、本発明の一態様である。
【０００９】
本発明の類似体は、位置Ｂ１０においてヒスチジンを有してもよく、それゆえに亜鉛インスリン六量体としての製剤に対応しうる。任意で、本発明の類似体は、野生型インスリンのそれと比較して等しいまたはより小さいＩＲに対する親和性（ゆえにホルモン−受容体複合体の形で長い滞留時間を示す可能性は低い）、及び野生型のそれと比較して等しいまたはより小さい１型ＩＧＦ−１受容体に対する親和性（ゆえにＩＧＦ−Ｉ関連の分裂促進性を示す可能性は低い）を類似体が示すように、タンパク質中の至る箇所における置換または改変と組み合わせられる場合、位置Ｂ１０においてアスパラギン酸を含有してもよい。
【００１０】
ヒトプロインスリン特有の３６残基の野生型Ｃドメインに代わる、長さ６〜１１残基の新規短縮型Ｃドメインの発明は、本発明に関連する。単鎖インスリン類似体は、亜鉛なし単量体としての製剤に適するフィブリル化耐性インスリン類似体の設計に対する、有利な手法を提供する。そのような単鎖類似体は、速効型の薬物動態を付与するように、Ｂ鎖の結合表面第１部位の内部または付近に置換を含有するように設計されうる。Ｂ１３、Ｂ１７、Ａ１２、Ａ１３、またはＡ１７から選択される１つまたはそれより多い位置におけるさらなる改変に適する単鎖インスリン類似体は、米国特許出願第１２／９８９，３９９号（２０１０年１０月２２日出願）、及び米国特許第８，１９２，９５７号に開示される通りであり、これらの出願及び特許は本参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】代表的な医薬製剤中の、及び血流中の遊離単量体としての、インスリンの構造の図示。（Ａ）フェノール安定化Ｒ６亜鉛六量体。軸方向の亜鉛イオン（オーバーレイ）はヒスチジン側鎖により配位される重複する黒色球として示される。Ａ鎖は濃灰色で、またＢ鎖は中程度の灰色（Ｂ１−Ｂ８残基）及び薄灰色（Ｂ９−Ｂ３０残基）で示される。（Ｂ）インスリン単量体の構造。Ａ鎖は濃灰色で、またＢ鎖は中程度の灰色で示される。ジスルフィド架橋は球及び棒で描写される（標識が図２中に提供される）。
【図２】インスリン二量体及びコアベータシートの図示。逆平行ベータシートについてのＢ２４−Ｂ２８残基（中程度の灰色）は、六量体中で対称的に３回繰り返される。これ以外では、Ａ及びＢ鎖は、それぞれ薄灰色及び濃灰色で示される。Ｐｈｅ２４の位置は、濃灰色の矢印で強調される。システインは、球で示される硫黄原子により確認される。座標は、Ｔ６六量体（ＰＤＢ  ４ＩＮＳ）から得られた。
【図３】インスリン受容体のモデル。受容体の各αサブユニットは、２つの別個のインスリン結合部位を含有する。第１部位（高親和性）、及び第２部位（低親和性だがシグナル伝播に重要）である。特異的なインスリン結合は、２つのαサブユニットを架橋し、これが今後はβサブユニット間の向きを変化させ、シグナルを細胞内チロシンキナーゼ（ＴＫ）ドメインへと伝達する。
【図４】インスリンの機能的表面の図示。インスリンの古典的受容体結合表面がＩＲ第１部位に結合する（Ｂ１２、Ｂ１６、Ｂ２４−Ｂ２６）一方で、その第２部位関連表面は六量体接触点ＶａｌＢ１７及びＬｅｕＡ１３を含む。提唱される第２部位残基（Ｂ１３、Ｂ１７、Ａ１２、Ａ１３、及びＡ１７）が、隣接するB１０残基とともに示される。Ｂ１０残基は、第１及び第２の両部位に貢献しうる。これ以外では、Ａ及びＢ鎖は、それぞれ薄灰色及び濃灰色で示される。
【図５】インスリン六量体、二量体、及び単量体の表面上のＬｅｕＡ１３の位置。座標は、Ｒ６六量体（ＰＤＢ  １ＴＲＺ）から得られた。
【図６】図６。食時インスリン類似体の設計及び製剤化のための理論的根拠。亜鉛六量体の迅速な解体は、毛細血管に侵入可能な二量体及び単量体を生じる。本食時インスリン類似体は、コアベータシートの端において標準型置換を含有する。
【図７】パラ−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４改変の構造ベースの設計。（Ａ）野生型Ｒ６亜鉛インスリン六量体のリボンモデル。Ａ及びＢ鎖は薄灰色及び濃灰色で、軸方向の亜鉛イオン（オーバーレイ）は球として、またＰｈｅＢ２４側鎖は中程度の灰色で示される。（Ｂ）インスリン二量体のリボンモデル。逆平行Ｂ２４−Ｂ２８βシートは真ん中である。配色はパネルＡと同じ。（Ｃ）二量体境界面内の芳香族クラスターを示す、立体ペア。Ｂ２４及びＢ２４‘、Ｂ２５及びＢ２５’、並びにＢ２６及びＢ２６‘残基。（Ｄ）改変二量体境界面の予測モデル。Ｂ２４におけるパラ−クロロ原子（芳香環の第２位）は球として示される（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ半径の５０％）。
【図８】芳香及び非芳香環系。（Ａ）Ｐｈｅは、平面六炭素芳香環を含有する。（Ｂ）シクロヘキサニルアラニン（Ｃｈｅ）は、非平面六炭素脂肪族環を含有する。各アミノ酸の三つの見取り図が示される。各パネルにおいて、球及び棒モデルは上に、分子表面モデルは下に示される。炭素及び水素原子は、それぞれ中程度の灰色及び薄灰色、一方で酸素（窒素）原子は濃灰色、窒素原子は黒である。
【図９】クラス１関連改変を有するインスリン類似体の薬力学。ストレプトゾトシンにより糖尿病を罹患させられたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける、インスリンＬｉｓｐｒｏ（ＫＰ−インスリン）または類似体の皮下注射に対する血糖反応の実験。（Ａ）ラットあたり用量２０μｇでの、ＫＰ−インスリン（黒ひし形）とＣｈａＢ２４−ＤＫＰ−インスリン（Ｂ２４Ｃｈａ  ＫＰ、白四角形）との比較。ＣｈａＢ２４−ＤＫＰ−インスリンの相対親和性は、約３０（±５）％である。（Ｂ）ラットあたり用量５０μｇでの、ＫＰ−インスリン（黒ひし形）とオルト−モノフルオロ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリン（２Ｆ  Ｂ２４  ＤＫＰ、白四角形）との比較。２−Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリンの相対親和性は、約３５（±５）％である。
【図１０】受容体結合実験。固定された、ヒトインスリン受容体のレクチン精製アイソフォームＢを用いる、競合的結合測定。（Ａ）ＴｒｐＡ１３−ＫＰ−インスリン（三角形）とＫＰ−インスリン（四角形）との比較。（Ｂ）上パネル、ＴｙｒＡ１３−ＫＰ−インスリン（上向き三角形）と野生型ヒトインスリン（四角形）との比較。下パネル、ＴｒｐＡ１３−ＫＰ−インスリンの４−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４誘導体（逆三角形）と野生型ヒトインスリン（四角形）との比較。（ＫＰ−インスリンの親和性は、野生型ヒトインスリンのそれに類似し、ゆえにいずれも適切なコントロールを提供する。）
【図１１】薬力学解析。（Ａ）ＴｒｐＡ１３−ＫＰ−インスリン（三角形、Ａ１３Ｗ−ＫＰ）及びＫＰ−インスリン（ひし形、ＫＰ）についての経時的血液グルコースレベルの、不活性対照試料に対する比較。対照試料は、希釈剤単独（円）、及び受容体結合を約１００倍低下させる第１部位関連表面中に変異を含有する類似体（ＴｒｐＡ３−ＫＰ−インスリン、四角形、Ａ３Ｗ−ＫＰ）。（Ｂ）ＫＰ−インスリン（黒ひし形）、及びＴｙｒＡ１３−ＫＰ−インスリン（白円、ＹＡ１３−ＫＰ）についての経時的血液グルコースレベルの比較。（Ｃ）４−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＴｒｐＡ１３−ＫＰ−インスリン（四角形、ＷＡ１３  ４Ｃｌ  Ｂ２４  ＫＰ）、ＴｒｐＡ１３−ＫＰ−インスリン（円、ＷＡ１３−ＫＰ）、２−Ｃｌ−ＴｙｒＡ１４−ＫＰ−インスリン（三角形、ＹＡ１３  ２ＣＬ  Ｂ２４  ＫＰ）、及びＫＰ−インスリン（ひし形）の比較。希釈剤対照は用いられなかった。パネルＡにおいては、血液グルコース濃度の低下（平均初期値である約４００ｍｇ／ｄｌに対するパーセンテージ）が、皮下注射後の時間の関数として示される。一方、パネルＢ及びＣにおいては、平均グルコース濃度が示される。初期高血糖症の程度は、各日、ラット各組において類似していた。各事例における用量は、ラットあたり６０μｇであった。記号はまた、各パネルの右下に挿入されるように定義される。
【図１２】円二色性スペクトル。位置Ａ１３において置換を含有するインスリン類似体の遠紫外ＣＤスペクトルが、親類似体ＫＰ−インスリンのＣＤスペクトルとの比較で示される。凡例は右上に示され、以下を含む。ＫＰ−インスリン、（ＹＡ１３  Ｂ２４  Ｃｈａ  ＫＰ）ＣｈａＢ２４−ＴｙｒＡ１３−ＫＰ−インスリン、（ＷＡ１３  Ｂ２４  ４Ｃｌ  ＫＰ）４−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＴｒｐＡ１３−ＫＰ−インスリン、（ＷＡ１３  ＫＰ）ＴｒｐＡ１３−ＫＰ−インスリン、（ＹＡ１３  Ｂ２４  ４Ｃｌ  ＫＰ）４−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＴｙｒＡ１３−ＫＰ−インスリン、及び（ＹＡ１３  ＫＰ）ＴｙｒＡ１３−ＫＰ−インスリン。インスリン類似体は、温度２５℃において、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．４）中、約６０μＭに作成された。
【図１３】化学的変性実験。変性剤グアニジン塩酸塩の濃度（水平軸）の関数としての、タンパク質折り畳みのＣＤ検出実験。記号は、凡例中に定義される。（実線黒四角、ＫＰ）ＫＰ−インスリン、（円、ＹＡ１３  Ｃｈａ  ＫＰ）ＣｈａＢ２４−ＴｙｒＡ１３−ＫＰ−インスリン、（三角形）４−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＴｒｐＡ１３−ＫＰ−インスリン、（逆三角形）ＴｒｐＡ１３−ＫＰ−インスリン、（ひし形）４−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＴｙｒＡ１３−ＫＰ−インスリン、及び（回転三角形）ＴｙｒＡ１３−ＫＰ−インスリン。楕円率は、波長２２２ｎｍにて監視された。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、（ｉ）皮下デポ中からの迅速な吸収と、（ｉｉ）作用持続時間の短縮との両方を提供する、二鎖または単鎖インスリン類似体を対象とする。ＩＲ−Ａ／ＩＲ−Ｂ受容体結合親和性比は野生型インスリンのそれと類似し、５〜１００％の範囲の絶対親和性を有する（下限が選択されるとプロインスリンに相当）。迅速な吸収を付与するＢ鎖置換の例は、位置Ｂ２８におけるアスパラギン酸またはリシンで、任意で位置Ｂ２９におけるプロリンと組み合わせられる。
【００１３】
位置Ｂ２８からのプロリンの除去は、置換されるアミノ酸の特性にかかわりなく、二量体化及び六量体の集合の強度低下と関連づけられる。迅速な吸収を付与するＢ鎖置換のさらに別の一実施例は、亜鉛イオン非存在下で製剤化される場合の、位置Ｂ３におけるリシンと位置Ｂ２９におけるグルタミン酸との組合せである。シグナリング持続時間の短縮をもたらすために導入されるアミノ酸置換は、位置Ｂ１３、Ｂ１７、Ａ１２、Ａ１３、及びＡ１７のうち少なくとも１つまたはそれより多い位置においてでありうる。そのような置換の例は、トリプトファン、チロシン（Ａ１３以外）、アラニン、ヒスチジン、グルタミン酸（Ｂ１３及びＢ１７において以外）、及びグルタミン（Ｂ１３において以外）により提供される（がこれらに限定されない）。可溶性製剤中性条件（ｐＨ６．８〜８．０）が実現可能となるように、単鎖類似体の等電点が３．５と６．０との間であることは、本発明の特徴である。
【００１４】
単鎖類似体は、非限定的な例として、ブタ、ウシ、ウマ、及びイヌのインスリンなどの、動物インスリンに由来するＡ及びＢドメイン配列を用いて作製されうることも、また想像される。さらに、または代わりに、本発明のインスリン類似体は、Ｂ１−Ｂ３残基の欠失を含有しうる。あるいは、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｃｉａｅ、または他の酵母発現種もしくは株における酵母による生合成中の前駆体ポリペプチドのＬｙｓを標的とするタンパク質分解を回避するために、リシン（例えば、野生型ヒトインスリンにおけるＬｙｓＢ２９）を欠く変異型Ｂ鎖と組み合わせられうる。本発明の単鎖インスリンのＢドメインは、任意で、位置Ｂ２０及び／またはＢ２３におけるＤアミノ酸（熱力学的安定性、受容体結合親和性、及びフィブリル化に対する耐性を強化することを目的とする）などの非標準型置換、ＰｈｅＢ２４の環２位におけるハロゲン改変（つまり、オルト−Ｆ−ＰｈｅＢ２４、オルト−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４、またはオルト−Ｂｒ−ＰｈｅＢ２４、熱力学的安定性、及びフィブリル化に対する耐性を向上させることを目的とする）、ＰｈｅＢ２４の２−メチル環改変（受容体結合親和性を向上させることを目的とする）を含有しうる。ＴｈｒＢ２７、ＴｈｒＢ３０、またはＣドメイン中の１つまたはそれより多いセリン残基が、単独または組合せで、単糖付加体により改変されうることもまた、想像される。例は、Ｏ結合型Ｎアセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＧａｌＮＡｃ−Ｏβ−Ｓｅｒ、またはＧａｌＮＡｃ−Ｏβ−Ｔｈｒと呼ばれる）、Ｏ結合型α−Ｄ−マンノピラノシド（マンノース−Ｏβ−Ｓｅｒ、またはマンノース−Ｏβ−Ｔｈｒ）、及び／またはα−Ｄ−グルコピラノシド（グルコース−Ｏβ−Ｓｅｒ、またはグルコース−Ｏβ−Ｔｈｒ）により提供される。
【００１５】
さらに、ヒト及び動物インスリン間の類似性、並びに糖尿病を有するヒト患者における動物インスリンの過去の使用をふまえると、インスリン配列中の他のマイナーな改変、とくに「保存的」とみなされる置換が導入されうることもまた想定される。例えば、本発明から逸脱することなく、類似する側鎖を有するアミノ酸群内で追加のアミノ酸置換がなされうる。これらは、中性疎水性アミノ酸である、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、及びメチオニン（ＭｅｔまたはＭ）を含む。同様に、中性極性アミノ酸は、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、及びアスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）の群内でそれぞれお互いと置換されうる。塩基性アミノ酸は、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、及びヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）を含むと考えられる。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、及びグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）である。別に特筆されない限り、または文脈から明らかである箇所では、本明細書で言及されるアミノ酸はＬアミノ酸であるとみなされるべきである。標準型アミノ酸は、同じ化学的分類に属する非標準型アミノ酸により置換されてもまたよい。非制限的例として、塩基性側鎖Ｌｙｓは、より短い側鎖長の塩基性アミノ酸（オルニチン、ジアミノ酪酸、またはジアミノプロピオン酸）により置き換えられてもよい。Ｌｙｓは中性の脂肪族同配体であるノルロイシン（Ｎｌｅ）により置き換えられてもまた良く、それが今度はより短い脂肪族側鎖を含有する類似体（アミノ酪酸またはアミノプロピオン酸）により置換されてもよい。
【００１６】
ヒトプロインスリンのアミノ酸配列が、比較目的で配列ＩＤ番号：１として提供される。
配列ＩＤ番号：１（ヒトプロインスリン）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
【００１７】
ヒトインスリンのＡ鎖のアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号：２として提供される。
配列ＩＤ番号：２（ヒトＡ鎖）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
【００１８】
ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号：３として提供される。
配列ＩＤ番号：３（ヒトＢ鎖）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ
【００１９】
位置Ａ１２において改変されているヒトインスリンのＡ鎖のアミノ酸配列が、配列ＩＤ番号：４として提供される。
配列ＩＤ番号：４（変異型ヒトＡ鎖）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
配列中、Ｘａａは、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ  Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＴｙｒを表わす。
【００２０】
位置Ａ１３において改変されているヒトインスリンのＡ鎖のアミノ酸配列が、配列ＩＤ番号：５として提供される。
配列ＩＤ番号：５（変異型ヒトＡ鎖）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
配列中、Ｘａａは、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、またはＴｒｐを表わす。
【００２１】
位置Ａ１７において改変されているヒトインスリンのＡ鎖のアミノ酸配列が、配列ＩＤ番号：６として提供される。
配列ＩＤ番号：６（変異型ヒトＡ鎖）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
配列中、Ｘａａは、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを表わす。
【００２２】
位置Ａ１２、Ａ１３、及び／またはＡ１７のうち１つまたはそれより多い位置において改変されているヒトインスリンのＡ鎖のアミノ酸配列が、配列ＩＤ番号：７として提供される。
配列ＩＤ番号：７（変異型ヒトＡ鎖）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
配列中、野生型ヒトイスリンと比較して、Ｘａａ部位のうち少なくとも１つが置換を含有する。Ｘａａ１は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ  Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＴｙｒを表わし、Ｘａａ２は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＴｒｐを表わし、また、Ｘａａ３は、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを表わす。
【００２３】
Ａ８残基において置換され、かつ位置Ａ１２、Ａ１３、及び／またはＡ１７のうち１つまたはそれより多い位置においても改変されている、ヒトインスリンのＡ鎖のアミノ酸配列が、配列ＩＤ番号：８として提供される。
配列ＩＤ番号：８（変異型ヒトＡ鎖）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ１−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｘａａ４−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
配列中、野生型ヒトイスリンと比較して、第２部位関連箇所（Ａ１２、Ａ１３、及びＡ１７）のうち少なくとも１つが置換を含有し、ここで、Ｘａａ２は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ  Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＴｙｒを表わし、Ｘａａ３は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＴｒｐを表わし、また、Ｘａａ４は、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを表わす。また、Ｘａａ１は、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、またはＬｙｓを表わす。
【００２４】
位置Ｂ１３において改変されているヒトインスリンの変異型Ｂ鎖のアミノ酸配列が、配列ＩＤ番号：９として提供される。
配列ＩＤ番号：９（変異型ヒトＢ鎖）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｘａａ３−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｔｈｒ
配列中、Ｘａａ３は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、またはＬｅｕを表わし、Ｘａａ１はグリシン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、及びシステインを除く、あらゆるアミノ酸を表わし、またＸａａ２は、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、またはＬｙｓを表わす。
【００２５】
位置Ｂ１７において改変されているヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸配列が、配列ＩＤ番号：１０として提供される。
配列ＩＤ番号：１０（変異型ヒトＢ鎖）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｘａａ３−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｔｈｒ
配列中、Ｘａａ３は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを表わし、Ｘａａ１はグリシン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、及びシステインを除く、あらゆるアミノ酸を表わし、またＸａａ２は、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、またはＬｙｓを表わす。
【００２６】
Ｂ１３及びＢ１７の両位置において改変されているヒトインスリンの変異型Ｂ鎖のアミノ酸配列が、配列ＩＤ番号：１１として提供される。
配列ＩＤ番号：１１（変異型ヒトＢ鎖）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｘａａ１−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｘａａ２−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｔｈｒ
配列中、Ｘａａ１は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、またはＬｅｕを表わし、Ｘａａ２は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを表わし、Ｘａａ３はグリシン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、及びシステインを除く、あらゆるアミノ酸を表わし、またＸａａ４は、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、またはＬｙｓを表わす。
【００２７】
本発明の単鎖インスリン類似体のアミノ酸配列が、配列ＩＤ番号：１２〜１４に与えられる。
配列ＩＤ番号：１２
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｘａａ１−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｘａａ２−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ８−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ９−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｘａａ５−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
配列中、野生型ヒトイスリンと比較して、第２部位関連箇所（Ｂ１３、Ｂ１７、Ａ１２、Ａ１３、及びＡ１７）のうち少なくとも１つが置換を含有し、Ｘａａ１は、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、またはＬｅｕを表わし、Ｘａａ２は、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを表わし、Ｘａａ３は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、またはＨｉｓを表わし、Ｘａａ４は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、またはＴｒｐを表わし、Ｘａａ５は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＬｅｕを表わし、Ｘａａ１は、Ｈｉｓ、またはＡｓｐを表わし、Ｘａａ６はグリシン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、及びシステインを除く、あらゆるアミノ酸を表わし、Ｘａａ７は、Ｐｒｏ、またはＬｙｓを表わし、Ｘａａ８は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはオルニチンを表わし、Ｘａａ９は、Ｔｙｒ、またはＧｌｕを表わし、またＺは、長さ３〜８のポリペプチド断片を表わす。
配列ＩＤ番号：１３
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｘａａ１−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｘａａ２−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ８−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ９−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｘａａ５−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
配列中、野生型ヒトイスリンと比較して、第２部位関連箇所（Ｂ１３、Ｂ１７、Ａ１２、Ａ１３、及びＡ１７）のうち少なくとも１つが置換を含有し、Ｘａａ１は、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、またはＬｅｕを表わし、Ｘａａ２は、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを表わし、Ｘａａ３は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、またはＨｉｓを表わし、Ｘａａ４は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、またはＴｒｐを表わし、Ｘａａ５は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＬｅｕを表わし、Ｘａａ１は、Ｈｉｓ、またはＡｓｐを表わし、Ｘａａ６はグリシン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、及びシステインを除く、あらゆるアミノ酸を表わし、Ｘａａ７は、Ｐｒｏ、またはＬｙｓを表わし、Ｘａａ８は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはオルニチンを表わし、Ｘａａ９は、Ｔｙｒ、またはＧｌｕを表わし、またＺは、長さ２〜７のポリペプチド断片を表わす。
配列ＩＤ番号：１４
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｘａａ１−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｘａａ２−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−−Ｚ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ８−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ９−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｘａａ５−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
配列中、野生型ヒトイスリンと比較して、第２部位関連箇所（Ｂ１３、Ｂ１７、Ａ１２、Ａ１３、及びＡ１７）のうち少なくとも１つが置換を含有し、Ｘａａ１は、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、またはＬｅｕを表わし、Ｘａａ２は、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを表わし、Ｘａａ３は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、またはＨｉｓを表わし、Ｘａａ４は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、またはＴｒｐを表わし、Ｘａａ５は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＬｅｕを表わし、Ｘａａ１は、Ｈｉｓ、またはＡｓｐを表わし、Ｘａａ６はグリシン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、及びシステインを除く、あらゆるアミノ酸を表わし、Ｘａａ７は、Ｐｒｏ、またはＬｙｓを表わし、Ｘａａ８は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはオルニチンを表わし、Ｘａａ９は、Ｔｙｒ、またはＧｌｕを表わし、またＺは、長さ３〜８のポリペプチド断片を表わす。
【００２８】
一組の事例においては、相似合成遺伝子が調製され、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ中でクローニングされた。二鎖インスリン類似体の産生には、基本的には開示されるように、Ｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓにより、５３残基のミニプロインスリン前駆体が発現され、折り畳まれ、それからＮ末端シグナルペプチドを用いて分泌された（Ｋｊｅｌｄｓｅｎ  Ｔ，  Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ  ＡＦ，  Ｈａｃｈ  Ｍ．  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｌｅａｄｅｒｓ  ｉｎ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７５，  １９５−２０８  （１９９９））。位置Ａ１３をコードするコードは、部位特異的変異導入により、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、またはＧｌｕをコードするように改変された。初期の特性決定には、ＴｒｐＡ１３及びＴｙｒＡ１３類似体（配列ＩＤ番号：５）が選択された。
【００２９】
我々は、第２部位におけるＴｒｐＡ１３（配列ＩＤ番号：２０）は、ＫＰ−インスリンのＩＲへの結合を約２倍低下させ（表１及び図１０Ａ）、一方でＴｙｒＡ１３（配列ＩＤ番号：２３）の結合親和性に対する影響は無視できる程度である（表１及び図１０Ｂ上）ことを観察した。従って、ＴｒｐＡ１３−ＫＰ−インスリンの対照類似体ＴｙｒＡ１３−ＫＰ−インスリンとの比較は、第２部位改変による生化学的親和性の適度な低下が、ｉｎ  ｖｉｖｏでのインスリン作用の持続時間の短縮、つまり待望であるが未解決の目的である「迅速オフ」薬力学的特性をもたらすであろうという、指針となる仮説の試験を提供した。ゆえに我々は、以下に詳細に開示されるように、糖尿病のラットモデルにおいて、これらの及び関連インスリン類似体の薬力学的特性及び相対的有効性の研究に着手した。これらの結果が得られ、図１０及び１１に示される通りである。ＴｒｐＡ１３−ＫＰ−インスリンの薬力学的（ＰＤ）特性の短縮は、４−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４との同時改変によりさらに増強された（図１１Ｃ、配列ＩＤ番号１７）。この改変は受容体結合親和性に対しては無視できるほどの効果しか及ぼさないが（図１０Ａにおける親ＴｒｐＡ１３−ＫＰ−インスリンに対する、図１０Ｂ下）、短縮の度合いにおいては相乗的な進歩が観察される。第１部位関連表面及び第２部位関連表面における改変間のそのような相乗作用は、食時インスリン療法及び閉鎖型ループシステムの頑強かつ安全な作動の観点から、望ましい。作用持続時間が短いほど、閉鎖型ループシステムはより迅速に超過送達事象を補正しうる。
【００３０】
ＴｒｐＡ１３またはＴｙｒＡ１３を含有するＫＰ−インスリンの類似体は、トリプシン触媒性半合成により調製された。基本的な思想は、有機共溶媒中でトリプシンを「逆に」合成酵素として使用することである。本プロトコルは、（ｉ）残基（Ｎ）−ＧＸＦＹＴＫＰＴ「ＫＰ」置換（下線）に相当する合成オクタペプチド、及び（ｉｉ）短縮類似体ｄｅｓ−オクタペプチド［Ｂ２３−Ｂ３０］−インスリン（ＤＯＩ）、ＴｒｐＡ１３−ＤＯＩ、またはＴｙｒＡ１３−ＤＯＩを用いる。オクタペプチドは野生型のＢ２３−Ｂ３０配列（ＧＦＦＹＴＰＫＴ）とは異なるため、トリプシン処理中のリシンεアミノ基の保護は必要でない。このプロトコルは、Ａ１３部位の、合成オクタペプチドに含有される位置Ｂ２４における非天然型アミノ酸置換との同時改変を可能にするように、拡張された。野生型ＤＯＩはヒトまたはブタインスリンから調製され、ＤＯＩのＡ１３類似体は、酵母株Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにより発現かつ分泌される、Ａ１３コドンにおいて改変された５３残基ミニプロインスリン（ＭＰＩ）前駆体のトリプシン消化により生産された。いずれの場合においても、３つの天然型ジスルフィド架橋は工程を通して保持される。
【００３１】
簡潔には、ｄｅｓ−オクタペプチドインスリン（１５０ｍｇ）及びオクタペプチド（１５０ｍｇ）が、１０ｍＭ酢酸カルシウム及び１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有するジメチルアセトアミド／１，４−ブタンジオール／０．２Ｍ酢酸Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）の混合物（３５：３５：３０、ｖ／ｖ、４ｍＬ）に溶解された。ＤＯＩに対してオクタペプチドのモル量が５倍過剰であることは、基質の飽和によりトリプシンの逆反応（タンパク質分解）が防止されることを確実にした。最終ｐＨ値は、０．１ｍｌのＮ−メチルモルホリンを用いて７．０に調節された。その溶液は１２℃にまで冷却され、１５ｍｇのＴＰＣＫ−トリプシンが加えられ１２℃で２日間放置された。２４時間後、１５ｍｇのさらなるトリプシンが加えられた。次いで反応は、０．１％トリフルオロ酢酸で酸性化され、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｃ４）で精製された。生成物は、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）により確認された。ＰｈｅＢ２４、２−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４、４−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４、またはＣｈａＢ２４を含有するＫＰ−オクタペプチド（それぞれ約６００ｍｇの未精製物質）は、ＣＣＦ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにより提供された。
【００３２】
ＤＯＩ及びＤＯＩ類似体は、インスリン製造業者からバルク量で入手可能なヒトインスリンの、トリプシン消化により生産された。ＤＯＩまたはＤＯＩ類似体を生成するには、ＩＭ尿素を含有する０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム溶液（６０ｍｌ）にインスリン（３００ｍｇ）が加えられた。まずトリプシン（３０ｇ）が１．０ｍｌの蒸留脱イオン水に溶解させられ、それからタンパク質溶液に加えられた。切断は４８時間進行する。ＤＯＩまたはＤＯＩ類似体は、Ｃ４カラムを用いる分取逆相ＨＰＬＣにより精製され、トリプシン、未反応のインスリン、及びあらゆる他の混入物が除かれた。精製ＤＯＩ少なくとも１５０ｍｇの収量が、概して得られた。半合成の経時変化を追跡し、<１％の生成物の半定量的推定のための分析用ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（下記）によりポリペプチド試薬及び生成物の純度を評価するには、分析用逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８）が使用された。
【００３３】
ＫＰ−インスリンのＴｒｐＡ１３及びＴｙｒＡ１３誘導体についての受容体結合親和性は、図１０に例証されるように、ｉｎ  ｖｉｖｏ競合的置換測定法より測定された。受容体結合活性の測定法についてのプロトコルは以下の通りであった。マイクロタイターストリッププレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂ）は、４℃においてＡＵ５  ＩｇＧ（リン酸緩衝生理食塩水中４０ｍｇ／ｍｌが１００μｌ／ウェル）とともに一晩放置された。結合データは、二点逐次モデルにより解析された。データは、非特異的結合（ヒトインスリン１Ｍの存在下での、膜に結合したままの放射能量）について補正がなされた。すべての分析において、競合するリガンドの非存在下で結合したトレーサーの百分率は、リガンド枯渇の人為的結果を回避するべく１５%より低かった。解離定数（Ｋｄ）は、Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ（２００５．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８０，  ２０９３２−２０９３６）により開示される数学的モデルにあてはめることにより決定された。本モデルは、異種競合を想定し非線形回帰を用いた（Ｗａｎｇ，  １９９５，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３６０，  １１１−１１４）。結果は表１に要約される。ＴｙｒＡ１３はＫＰ−インスリンの受容体結合に影響しないが、一方でＴｒｐＡ１３は約二倍の結合親和性の低下もたらす。穏やかな変化はまた、以前に開示された研究に従い、ＣｈａＢ２４、２−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４、または４−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４の同時置換でも観察された。
【００３４】
【表１】
2016516728.tif 000002
【００３５】
図１２に示される円二色性（ＣＤ）スペクトルが、２５℃においてＡｖｉｖ分光偏光計を用いて得られた（Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：  １５４２９−１５４４０）。各事例におけるＣＤパターンは、アルファ−ヘリックスが優勢であることと一致する。二次構造の安定性の小さな低下を反映しうる、または追加のもしくは改変された芳香族側鎖から生じる重畳ＣＤバンドに対応しうる相違が観察される。試料は、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．４）中に約６０μＭのＫＰ−インスリンまたは類似体を含有した。試料は、２５℃におけるグアニジン誘発性の変性実験のために、５μＭまで希釈された。代表的なグアニジン用量設定は図１３に示される。変性の自由エネルギーを取り出すため、Ｓｏｓｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ３１７，  ３９３−４０９により開示されるように、変性の変遷が、非線形最小二乗法により二状態モデルにあてはめられた。簡潔には、ｘが変性剤の濃度を表わすとして、ＣＤデータΘ（ｘ）が
【化１】
2016516728.tif 000003
【００３６】
に従い非線形最小二乗法プログラムによりあてはめられた。式中、ｘはグアニジンの濃度であり、ΘＡ及びΘＢは天然型及び変性型状態におけるベースライン値である。ベースラインは、前転移線及び後転移線、ΘＡ（ｘ）＝ΘＡＨ２Ｏ＋ｍＡｘ及びΘＢ（ｘ）＝ΘＢＨ２Ｏ＋ｍＢｘに接近した。変異型変性転移をあてはめて得られたｍ値は、野生型変性曲線をあてはめて得られたｍ値よりも低い。この二状態モデルの適用から得られる変性の自由エネルギーの推定値は、表１に提供される。
【００３７】
動物モデルにおいて本類似体の生物学的活性及び有効性を評価するため、雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（平均体重〜３００グラム）が、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）での処理により糖尿病を罹患させられた。ＫＰ−インスリン（インスリンＬｉｓｐｒｏ、Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）の有効成分）、野生型ヒトインスリン、及び／または本発明の二鎖もしくは単鎖インスリンを含有するタンパク質溶液。対照は、グリセリン１６ｍｇ、メタ−クレゾール１．６ｍｇ、フェノール０．６５ｍｇ、及びｐＨ７．４リン酸ナトリウム３．８ｍgから構成される、タンパク質なしのＬｉｌｌｙ希釈剤（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．から入手）の注射により提供された。インスリン類似体の活性は、Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）（期限内の市販のバイアルから採取した濃度Ｕ−１００）のそれとの比較で評価された。これらの製剤それぞれの２０または６０マクログラムが皮下に注射され、生じる血液グルコース濃度の変化が、臨床血糖計（Ｈｙｐｏｇｕａｒｄ  Ａｄｖａｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏ−Ｄｒａｗメーター）を用いて一連の測定により監視された。ラットは、グループあたり５匹（Ｎ＝４〜６）で、時刻ｔ＝０において皮下に注射された。血液は、時刻０において、及び１０分毎に最長３６０分まで、切断された尾の先端から得られた。本発明の代表的な二鎖類似体である、本発明のＴｒｐＡ１４−ＫＰ−インスリンは、Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）の製剤条件と類似する製剤条件下において、インスリンの生物学的活性の相当な割合を保持し、かつＨｕｍａｌｏｇ（登録商標）と比較して短縮された作用の持続時間を有することが分かった。代表的な薬力学的データが、図１１に示される。特許請求の範囲に係る発明に従う様々な類似体が、表２において提供される。
【００３８】
【表２】
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2016516728.tif 000005
2016516728.tif 000006
【００３９】
特許請求の範囲に係る発明の様々な類似体による受容体結合が、以下のように解析された。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性分析は、エピトープでタグ付けされた、ヒトインスリン受容体アイソフォームＢ（ｈＩＲ−Ｂ）及び／もしくはアイソフォームＡ（ｈＩＲ−Ａ）のホロ受容体、並びに／または相同ヒト１型インスリン様成長因子受容体（ｈＩＧＦＲ）を使用した。受容体は９６ウェルプレートに固定された。相対活性は、結合した１２５Ｉ−ＴｙｒＡ１４ヒトインスリン（ＩＲの場合）または１２５Ｉ−Ｔｙｒ３１ヒトＩＧＦ−Ｉ（ＩＧＦＲの場合）による競合的置換により決定される、固有の解離定数の比として定義される。解離定数（Ｋｄ）は、Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ（２００５．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８０，  ２０９３２−２０９３６）により開示される数学的モデルにあてはめることにより決定された。本モデルは、異種競合を想定し非線形回帰を用いた（Ｗａｎｇ，  １９９５，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３６０，  １１１−１１４）。表３（分析：ｈＩＲ−Ａ、ｈＩＲ−Ｂ）に掲載される結果は、天然型のｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性と一致する。対応する、分裂促進性ＩＧＦ受容体（分析：ｈＩＧＦＲ）への交叉結合の実験は、天然型インスリンと同様の親和性を示した。
【００４０】
【表３】
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【００４１】
【表４】
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【００４２】
大型動物でのｉｎ  ｖｉｖｏ効果及び薬力学を評価するため、ＩＶ  オクトレオチド酢酸塩により膵β及びα細胞機能が抑制されている、糖尿病を有さない麻酔下のＳｉｎｃｌａｉｒブタが使用された。オクトレオチド酢酸塩注入を開始して約３０分後、１０％デキストロースの注入により、ベースラインの正常血糖が確立された。正常血糖状態となったら、０．１〜０．２Ｕ／ｋｇインスリンが血管アクセスポートを介して静脈内に投与された。末梢でのインスリン媒介性グルコース取込みを定量化するため、血液グルコースが５分毎に測定され、その間、様々な速度のグルコース注入によって約８５ｍｇ／ｄＬの血液グルコースレベルが維持された。このグルコース注入は、内因性血液グルコースがベースライン（インスリン注入前）レベルに戻るまで持続させられた。薬力学的（ＰＤ）効果は、最大効果の半分までの時間（Ｔ１／２前）、最大効果の半分までの時間（Ｔ１／２後）、及び最大効果までの時間（Ｔｍａｘ）として測定された。これらの分析それぞれに対し、２０分移動平均曲線あてはめが用いられた。本発明の代表的な類似体は、表５に示されるように、天然型インスリンと同等の、大型動物での生物学的効果を示した。
【００４３】
【表５】
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【００４４】
糖尿病を有する患者を治療するための方法は、本明細書で開示される単鎖インスリン類似体を投与する工程を有する。単鎖インスリン類似体が、酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において調製され、または天然型断片のライゲーションによる完全化学合成を受けうることは、本発明の別の一態様である。我々は、本発明の類似体が、糖尿病またはメタボリックシンドロームの治療のための方法を提供することをさらに想定する。本インスリン類似体の送達経路は、注射器またはペン型装置の使用による皮下注射による。
【００４５】
本発明の単鎖インスリン類似体は、位置Ｂ２４、Ｂ２５、またはＢ２６におけるハロゲン原子などの、他の改変もまた含有しうる。これは、同時係属中の米国特許出願第１３／０１８，０１１号においてより十分に開示される通りであり、この出願の開示内容は本参照により本明細書に組み込まれる。本発明のインスリン類似体は、同時係属中の米国仮特許出願第６１／５８９，０１２号においてより十分に開示されるように、Ｂ１−Ｂ３残基の欠失により短縮されたＢ鎖も、また含有しうる。
【００４６】
医薬組成物は、そのようなインスリン類似体を有してもよく、また任意で亜鉛を含みうる。亜鉛イオンは、インスリン類似体六量体あたり２．２亜鉛原子からインスリン類似体六量体あたり３亜鉛原子の範囲の、変動する亜鉛イオン：タンパク質比で含められうる。製剤のｐＨは、ｐＨ６．０〜８．０の範囲にある。そのような製剤においては、インスリン類似体の濃度は、一般に約０．６〜５．０ｍＭであろう。最大５ｍＭの濃度が、バイアルまたはペンにおいては使用されうる。著しいインスリン抵抗性を有する患者においては、より高濃度（Ｕ−２００またはより高濃度）の製剤は特に役立ちうる。賦形剤は、グリセロール、グリシン、アルギニン、Ｔｒｉｓ、他の緩衝液及び塩、並びにフェノール及びメタ−クレゾールなどの抗微生物保存剤を含みうる。後者の保存剤は、インスリン六量体の安定性を増強することが知られている。単鎖インスリン類似体は、亜鉛イオンの存在下または非存在下で、製剤化されうる。そのような上記開示の医薬組成物は、生理的に有効な量の組成物を患者に投与することにより、糖尿病または他の医学的状態を有する患者を治療するために使用されうる。
【００４７】
上記の開示に基づけば、今となっては、提供された二鎖または単鎖インスリン類似体が、本明細書で先に述べられた目的を成し遂げるであろうことが明らかであるはずだ。つまり、これらのインスリン類似体は、野生型インスリンの生物学的活性の少なくとも一部を維持しつつ、皮下デポから血流中への加速された吸収（「迅速オン」）と、短縮されたシグナリング持続時間（「迅速オフ」）との両方を示す。従って、特許請求の範囲に係る発明の範囲内に明らかに入るいかなる変化、またゆえに特定の成分要素の選択は、本明細書で開示及び記述された本発明の真髄から逸れることなく決定されうると理解されるべきである。
【００４８】
本明細書において開示される試験及び分析法が当業者により理解されるであろうことを示すために、以下の文献が引用される。
Ｇｌｅｎｄｏｒｆ，  Ｔ．，  Ｋｎｕｄｓｅｎ，  Ｌ．，  Ｓｔｉｄｓｅｎ，  Ｃ．Ｅ．，  Ｈａｎｓｅｎ，  Ｂ．Ｆ．，  Ｈｅｇｅｌｕｎｄ，  Ａ．Ｃ．，  Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，  Ａ．Ｒ．，  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，  Ｅ．，  &  Ｋｊｅｌｄｓｅｎ，  Ｔ．  ２０１２．  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｔｏ  ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｒａｔｉｏ  ｆｏｒ  Ｂ１０−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７（２），  ｅ２９１９８．
Ｈｏｈｓａｋａ，Ｔ．，  &  Ｓｉｓｉｄｏ，  Ｍ．  ２０１２．  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ６．  ８０９−１５．
Ｈｕａ，  Ｑ．Ｘ．，  Ｎａｋａｇａｗａ，  Ｓ．Ｈ．，  Ｊｉａ，  Ｗ．，  Ｈｕａｎｇ，  Ｋ．，  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  Ｎ．Ｂ．，  Ｈｕ，  Ｓ．  &  Ｗｅｉｓｓ，  Ｍ．Ａ．  （２００８）  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｃｔｉｖｅ  ｕｌｔｒａｓｔａｂｌｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎａｌｏｇ：  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８３，  １４７０３−１４７１６．
Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，  Ｃ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ａ．Ｓ．，  Ｈａｃｈ，  Ｍ．，  Ｗｉｂｅｒｇ，  Ｆ．Ｃ．，  Ｓｃｈａｆｆｅｒ，  Ｌ．，  &  Ｋｊｅｌｄｓｅｎ，  Ｔ．  １９９５．  Ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｉ／ｉｎｓｕｌｉｎ  ｈｙｂｒｉｄ  ｂｉｎｄｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３０５，  ９８１−６．
Ｌｅｅ，  Ｈ．Ｃ．，  Ｋｉｍ，  Ｓ．Ｊ．，  Ｋｉｍ，  Ｋ．Ｓ．，  Ｓｈｉｎ，  Ｈ．Ｃ．，  &  Ｙｏｏｎ，  Ｊ．Ｗ．  ２０００．  Ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｂｙ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎａｌｏｇｕｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４０８，  ４８３−８．  Ｒｅｔｒａｃｔｉｏｎ  ｉｎ：  Ｌｅｅ  ＨＣ，  Ｋｉｍ  ＫＳ，  Ｓｈｉｎ  ＨＣ．  ２００９．  Ｎａｔｕｒｅ  ４５８，  ６００．
Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  Ｎ．Ｂ．，  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，  Ｊ．，  Ｉｓｍａｉｌ−Ｂｅｉｇｉ，  Ｆ．，  &  Ｗｅｉｓｓ，  Ｍ．Ａ．  （２０１２）  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｓｉｇｎ：  ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａ  ｐｕｍｐ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ．  Ｊ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ６，  ２７７−２８８．
Ｓｃｉａｃｃａ，  Ｌ．，  Ｃａｓｓａｒｉｎｏ，  Ｍ．Ｆ．，  Ｇｅｎｕａ，  Ｍ．，  Ｐａｎｄｉｎｉ，  Ｇ．，  Ｌｅ  Ｍｏｌｉ，  Ｒ．，  Ｓｑｕａｔｒｉｔｏ，  Ｓ．，  &  Ｖｉｇｎｅｒｉ，  Ｒ．  ２０１０．  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  ｐｏｓｔ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ５３，  １７４３−５３．
Ｗａｎｇ，  Ｚ．Ｘ．，  １９９５．  Ａｎ  ｅｘａｃｔ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｏｒ  ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３６０：  １１１−１１４．
Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，  Ｌ．  ２００５．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８０：  ２０９３２−２０９３６．
【００４９】
配列ＩＤ番号：１（ヒトプロインスリン）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
【００５０】
配列ＩＤ番号：２（ヒトＡ鎖）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
【００５１】
配列ＩＤ番号：３（ヒトＢ鎖）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ
【００５２】
配列ＩＤ番号：４  （変異型ヒトＡ鎖）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
配列中、Ｘａａは、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ  Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＴｙｒを表わす。
【００５３】
配列ＩＤ番号：５  （変異型ヒトＡ鎖）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
配列中、Ｘａａは、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＴｒｐを表わす。
【００５４】
配列ＩＤ番号：６  （変異型ヒトＡ鎖）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
配列中、Ｘａａは、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを表わす。
【００５５】
配列ＩＤ番号：７  （変異型ヒトＡ鎖）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
配列中、野生型ヒトイスリンと比較して、Ｘａａ部位のうち少なくとも１つが置換を含有する。Ｘａａ１は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ  Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＴｙｒを表わし、Ｘａａ２は、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＴｒｐを表わし、また、Ｘａａ３は、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを表わす。
【００５６】
配列ＩＤ番号：８  （変異型ヒトＡ鎖）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ１−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｘａａ４−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
配列中、野生型ヒトイスリンと比較して、第２部位関連箇所（Ａ１２、Ａ１３、及びＡ１７）のうち少なくとも１つが置換を含有し、ここで、Ｘａａ２は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ  Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＴｙｒを表わし、Ｘａａ３は、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＴｒｐを表わし、また、Ｘａａ４は、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを表わす。また、Ｘａａ１は、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、またはＬｙｓを表わす。
【００５７】
配列ＩＤ番号：９（変異型ヒトＢ鎖）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｘａａ３−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｔｈｒ
配列中、Ｘａａ３は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、またはＬｅｕを表わし、Ｘａａ１はプロリン、グリシン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、及びシステインを除く、あらゆるアミノ酸を表わし、またＸａａ２は、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、またはＬｙｓを表わす。
【００５８】
配列ＩＤ番号：１０（変異型ヒトＢ鎖）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｘａａ３−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｔｈｒ
配列中、Ｘａａ３は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを表わし、Ｘａａ１はプロリン、グリシン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、及びシステインを除く、あらゆるアミノ酸を表わし、またＸａａ２は、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、またはＬｙｓを表わす。
【００５９】
配列ＩＤ番号：１１（変異型ヒトＢ鎖）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｘａａ１−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｘａａ２−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｔｈｒ
配列中、Ｘａａ１は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、またはＬｅｕを表わし、Ｘａａ２は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを表わし、Ｘａａ３はプロリン、グリシン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、及びシステインを除く、あらゆるアミノ酸を表わし、またＸａａ４は、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、またはＬｙｓを表わす。
【００６０】
配列ＩＤ番号：１２
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｘａａ１−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｘａａ２−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ８−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ９−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｘａａ５−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
配列中、野生型ヒトイスリンと比較して、第２部位関連箇所（Ｂ１３、Ｂ１７、Ａ１２、Ａ１３、及びＡ１７）のうち少なくとも１つが置換を含有し、Ｘａａ１は、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、またはＬｅｕを表わし、Ｘａａ２は、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを表わし、Ｘａａ３は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、またはＨｉｓを表わし、Ｘａａ４は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＴｒｐを表わし、Ｘａａ５は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、またはＬｅｕを表わし、Ｘａａ１は、Ｈｉｓ、またはＡｓｐを表わし、Ｘａａ６はプロリン、グリシン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、及びシステインを除く、あらゆるアミノ酸を表わし、Ｘａａ７は、Ｐｒｏ、またはＬｙｓを表わし、Ｘａａ８は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはオルニチンを表わし、Ｘａａ９は、Ｔｙｒ、またはＧｌｕを表わし、またＺは、長さ３〜８のポリペプチド断片を表わす。
【００６１】
配列ＩＤ番号：１３
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｘａａ１−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｘａａ２−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ８−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ９−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｘａａ５−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
配列中、野生型ヒトイスリンと比較して、第２部位関連箇所（Ｂ１３、Ｂ１７、Ａ１２、Ａ１３、及びＡ１７）のうち少なくとも１つが置換を含有し、Ｘａａ１は、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、またはＬｅｕを表わし、Ｘａａ２は、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、またはＨｉｓを表わし、Ｘａａ３は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、またはＨｉｓを表わし、Ｘａａ４は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＴｒｐを表わし、Ｘａａ５は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、またはＬｅｕを表わし、Ｘａａ１は、Ｈｉｓ、またはＡｓｐを表わし、Ｘａａ６はプロリン、グリシン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、及びシステインを除く、あらゆるアミノ酸を表わし、Ｘａａ７は、Ｐｒｏ、またはＬｙｓを表わし、Ｘａａ８は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはオルニチンを表わし、Ｘａａ９は、Ｔｙｒ、またはＧｌｕを表わし、またＺは、長さ２〜７のポリペプチド断片を表わす。
【００６２】
配列ＩＤ番号：１４
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｘａａ１−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｘａａ２−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−−Ｚ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ８−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ９−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｘａａ５−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
配列中、野生型ヒトイスリンと比較して、第２部位関連箇所（Ｂ１３、Ｂ１７、Ａ１２、Ａ１３、及びＡ１７）のうち少なくとも１つが置換を含有し、Ｘａａ１は、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、またはＬｅｕを表わし、Ｘａａ２は、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、またはＨｉｓを表わし、Ｘａａ３は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、またはＨｉｓを表わし、Ｘａａ４は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＴｒｐを表わし、Ｘａａ５は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、またはＬｅｕを表わし、Ｘａａ１は、Ｈｉｓ、またはＡｓｐを表わし、Ｘａａ６はプロリン、グリシン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、及びシステインを除く、あらゆるアミノ酸を表わし、Ｘａａ７は、Ｐｒｏ、またはＬｙｓを表わし、Ｘａａ８は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはオルニチンを表わし、Ｘａａ９は、Ｔｙｒ、またはＧｌｕを表わし、またＺは、長さ３〜８のポリペプチド断片を表わす。
【００６３】
Ｇ Ｉ Ｖ Ｅ Ｑ Ｃ Ｃ Ｔ Ｓ Ｉ Ｃ Ｓ Ｅ Ｙ Ｑ Ｌ Ｅ Ｎ Ｙ Ｃ Ｎ（配列ＩＤ番号：１５）
【００６４】
Ｆ Ｖ Ｎ Ｑ Ｈ Ｌ Ｃ Ｇ Ｓ Ｈ Ｌ Ｖ Ｅ Ａ Ｌ Ｙ Ｌ Ｖ Ｃ Ｇ Ｅ Ｒ Ｇ Ｆ Ｆ Ｙ Ｔ Ｋ Ｐ Ｔ（配列ＩＤ番号：１６）
【００６５】
Ｆ Ｖ Ｎ Ｑ Ｈ Ｌ Ｃ Ｇ Ｓ Ｈ Ｌ Ｖ Ｅ Ａ Ｌ Ｙ Ｌ Ｖ Ｃ Ｇ Ｅ Ｒ Ｇ Ｘ Ｆ Ｙ Ｔ Ｋ Ｐ Ｔ、Ｘ＝パラクロロフェニルアラニン（配列ＩＤ番号：１７）
【００６６】
Ｇ Ｉ Ｖ Ｅ Ｑ Ｃ Ｃ Ｔ Ｓ Ｉ Ｃ Ｓ Ｈ Ｙ Ｑ Ｌ Ｅ Ｎ Ｙ Ｃ Ｎ（配列ＩＤ番号：１８）
【００６７】
Ｇ Ｉ Ｖ Ｅ Ｑ Ｃ Ｃ Ｔ Ｓ Ｉ Ｃ Ｓ Ｈ Ｙ Ｑ Ｌ Ｅ Ｎ Ｙ Ｃ Ｎ（配列ＩＤ番号：１９）
【００６８】
Ｇ Ｉ Ｖ Ｅ Ｑ Ｃ Ｃ Ｔ Ｓ Ｉ Ｃ Ｓ Ｗ Ｙ Ｑ Ｌ Ｅ Ｎ Ｙ Ｃ Ｎ（配列ＩＤ番号：２０）
【００６９】
Ｆ Ｖ Ｎ Ｑ Ｈ Ｌ Ｃ Ｇ Ｓ Ｄ Ｌ Ｖ Ｅ Ａ Ｌ Ｙ Ｌ Ｖ Ｃ Ｇ Ｅ Ｒ Ｇ Ｘ Ｆ Ｙ Ｔ Ｋ Ｐ Ｔ、Ｘ＝オルトフルオロフェニルアラニン（配列ＩＤ番号：２１）
【００７０】
Ｇ Ｉ Ｖ Ｅ Ｑ Ｃ Ｃ Ｑ Ｓ Ｉ Ｃ Ｓ Ｗ Ｙ Ｑ Ｌ Ｅ Ｎ Ｙ Ｃ Ｎ（配列ＩＤ番号：２２）
【００７１】
Ｇ Ｉ Ｖ Ｅ Ｑ Ｃ Ｃ Ｔ Ｓ Ｉ Ｃ Ｓ Ｙ Ｙ Ｑ Ｌ Ｅ Ｎ Ｙ Ｃ Ｎ（配列ＩＤ番号：２３）
【００７２】
Ｆ Ｖ Ｎ Ｑ Ｈ Ｌ Ｃ Ｇ Ｓ Ｈ Ｌ Ｖ Ｅ Ａ Ｌ Ｙ Ｌ Ｖ Ｃ Ｇ Ｅ Ｒ Ｇ Ｘ Ｆ Ｙ Ｔ Ｋ Ｐ Ｔ、Ｘ＝オルトクロロフェニルアラニン（配列ＩＤ番号：２４）
【００７３】
Ｆ Ｖ Ｎ Ｑ Ｈ Ｌ Ｃ Ｇ Ｓ Ｈ Ｌ Ｖ Ｅ Ａ Ｌ Ｙ Ｌ Ｖ Ｃ Ｇ Ｅ Ｒ Ｇ Ｘ Ｆ Ｙ Ｔ Ｋ Ｐ Ｔ、Ｘ＝シクロヘキシルアラニン（配列ＩＤ番号：２５）
【００７４】
Ｇ Ｉ Ｖ Ｅ Ｑ Ｃ Ｃ Ｔ Ｓ Ｉ Ｃ Ｓ Ａ Ｙ Ｑ Ｌ Ｅ Ｎ Ｙ Ｃ Ｎ（配列ＩＤ番号：２６）
【００７５】
Ｆ Ｖ Ｎ Ｑ Ｈ Ｌ Ｃ Ｇ Ｓ Ｈ Ｌ Ｖ Ｅ Ａ Ｌ Ｙ Ｅ Ｖ Ｃ Ｇ Ｅ Ｒ Ｇ Ｆ Ｆ Ｙ Ｔ Ｋ Ｐ Ｔ（配列ＩＤ番号：２７）
【００７６】
Ｇ Ｉ Ｖ Ｅ Ｑ Ｃ Ｃ Ｔ Ｓ Ｉ Ｃ Ｓ Ｆ Ｙ Ｑ Ｌ Ｅ Ｎ Ｙ Ｃ Ｎ（配列ＩＤ番号：２８）
【００７７】
Ｇ Ｉ Ｖ Ｅ Ｑ Ｃ Ｃ Ｔ Ｓ Ｉ Ｃ Ｓ Ｌ Ｙ Ｑ Ｌ Ｅ Ｎ Ｙ Ｃ Ｎ（配列ＩＤ番号：２９）
【００７８】
Ｇ Ｉ Ｖ Ｅ Ｑ Ｃ Ｃ Ｑ Ｓ Ｉ Ｃ Ｓ Ｗ Ｙ Ｑ Ｌ Ｅ Ｎ Ｙ Ｃ Ｎ（配列ＩＤ番号：３０）
【００７９】
Ｆ Ｖ Ｎ Ｑ Ｈ Ｌ Ｃ Ｇ Ｓ Ｈ Ｌ Ｖ Ｑ Ａ Ｌ Ｙ Ｌ Ｖ Ｃ Ｇ Ｅ Ｒ Ｇ Ｘ Ｆ Ｙ Ｔ Ｋ Ｐ Ｔ、Ｘ＝パラクロロフェニルアラニン（配列ＩＤ番号：３１）
【図１】
2016516728.tif 000011
【図２】
2016516728.tif 000012
【図３】
2016516728.tif 000013
【図４】
2016516728.tif 000014
【図５】
2016516728.tif 000015
【図６】
2016516728.tif 000016
【図７】
2016516728.tif 000017
【図８】
2016516728.tif 000018
【図９Ａ】
2016516728.tif 000019
【図９Ｂ】
2016516728.tif 000020
【図１０Ａ】
2016516728.tif 000021
【図１０Ｂ】
2016516728.tif 000022
【図１１Ａ】
2016516728.tif 000023
【図１１Ｂ】
2016516728.tif 000024
【図１１Ｃ】
2016516728.tif 000025
【図１２】
2016516728.tif 000026
【図１３】
2016516728.tif 000027
【配列表】
2016516728000001.app
【国際調査報告】
2016516728.tif 000028
2016516728.tif 000029
2016516728.tif 000030