(57)【要約】  本発明は、非限定的に例示される微小変化群及び膜性腎症を伴うネフローゼ症候群のようなネフローゼ症候群、及び非限定的に例示される蛋白尿及び浮腫のようなネフローゼ症候群に関連する状態、並びに糖尿病性腎症、真性糖尿病、ループス腎炎または原発性糸球体疾患を治療及び／または予防するためのポリペプチド及び方法を提供する。本発明は更に、蛋白尿及び本明細書中で検討されている他の病状を抑えるための方法を提供する。その方法は、被験者に対してＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体を治療的デリバリーすることを含む。
2016516726.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造：
Ｖ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚ
（ここで、
Ｖは配列番号２３と少なくとも９５％の相同性を有する配列であり、３９−５５位はＤＥＭＮＶＬＡＨＧＬＬＱＬＧＱＧＬではなく；
Ｗは０〜５残基のオリゴペプチドであり；
Ｘは配列番号２４と少なくとも９５％の相同性を有する配列であり、６３−６６位はＲＲＫＲ、ＧＳＧＳまたはＳＧＧＧではなく；
Ｙは０〜３８残基のオリゴペプチドであり；
Ｚは配列番号２５と少なくとも９５％の相同性を有する配列である）
を含む低いＬＰＬ阻害活性及び高い開裂耐性を有するＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体。
【請求項２】
ネフローゼ症候群及び蛋白尿を特徴とする病状から選択される病状を治療または予防するための薬剤の製造における請求項１に記載のＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体の使用。
【請求項３】
医薬有効量の請求項１に記載のＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体を含む医薬組成物をその必要がある被験者に対して投与することを含むネフローゼ症候群及び蛋白尿を特徴とする病状から選択される病状を治療または予防するための方法。
【請求項４】
医薬的に許容され得る担体及び請求項１に記載のＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体を含むネフローゼ症候群及び蛋白尿を特徴とする病状から選択される病状を治療または予防するための医薬組成物。
【請求項５】
配列番号２３の３９−４０位の配列はＤＥではない請求項１〜４のいずれか１項。
【請求項６】
配列番号２３の３９位は正帯電残基または中性残基である請求項１〜５のいずれか１項。
【請求項７】
配列番号２３の４０位は負帯電残基または中性残基である請求項１〜６のいずれか１項。
【請求項８】
配列番号２３の４０位は表１に示す残基から選択される請求項１〜７のいずれか１項。
【請求項９】
配列番号２３の３９位はＤまたはＡである請求項１〜８のいずれか１項。
【請求項１０】
配列番号２３の４０位はＫ、ＡまたはＥである請求項１〜９のいずれか１項。
【請求項１１】
配列番号２３の３９位はＤまたはＡであり、配列番号２３の４０位はＫ、ＡまたはＥである請求項１〜１０のいずれか１項。
【請求項１２】
配列番号２３の３９及び４０位の配列はＤＫ、ＤＡ及びＡＥからなる群から選択される請求項１〜１１のいずれか１項。
【請求項１３】
配列番号２４の６３−６６位の１つ以上はＤ、Ｒ、Ｋ、Ａ及びＶからなる群から独立して選択される請求項１〜１２のいずれか１項。
【請求項１４】
配列番号２４の６３−６６位のすべてはＤ、Ｒ、Ｋ、Ｇ、Ａ及びＶからなる群から独立して選択される請求項１〜１３のいずれか１項。
【請求項１５】
配列番号２４の６３−６６位の１つ以上はＧ、Ａ、Ｓ及びＶからなる群から独立して選択される請求項１〜１４のいずれか１項。
【請求項１６】
配列番号２４の６３−６６位のすべてはＧ、Ａ及びＶからなる群から独立して選択される請求項１〜１５のいずれか１項。
【請求項１７】
配列番号２４の６３−６６位の配列は表２から選択される請求項１〜１６のいずれか１項。
【請求項１８】
配列番号２４の６３−６６位の配列はＧＡＡＧ、ＧＶＶＡ、ＡＡＶＶ及びＶＡＶＡから選択される請求項１〜１７のいずれか１項。
【請求項１９】
前記Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体は配列番号９と少なくとも９５％の配列相同性を有する請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体は配列番号１０と少なくとも９５％の配列相同性を有する請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
配列番号２４の６３−６６位の配列はＧＶＶＡである請求項１〜２０のいずれか１項。
【請求項２２】
配列番号２３の３９−４０位の配列はＤＡであり、配列番号２４の６３−６６位の配列はＧＶＶＡである請求項１〜２１のいずれか１項。
【請求項２３】
配列番号２３の３９−４０位の配列はＤＫであり、配列番号２４の６３−６６位の配列はＧＡＡＧである請求項１〜２０のいずれか１項。
【請求項２４】
配列番号２３の３９−４０位の配列はＤＫであり、配列番号２４の６３−６６位の配列はＡＡＶＶである請求項１〜２０のいずれか１項。
【請求項２５】
配列番号２３の３９−４０位の配列はＡＥであり、配列番号２４の６３−６６位の配列はＶＡＶＡである請求項１〜２０のいずれか１項。
【請求項２６】
前記構造は配列番号９であり、配列番号９の３９−４０位の配列はＤＡであり、配列番号９の７６位はＣであり、配列番号９の８０位はＣであり、配列番号９の１６１−１６４位の配列はＧＶＶＡである請求項１〜１９のいずれか１項。
【請求項２７】
前記構造は配列番号９であり、配列番号９の３９−４０位の配列はＤＫであり、配列番号９の７６位はＣであり、配列番号９の８０位はＣであり、配列番号９の１６１−１６４位の配列はＧＡＡＧである請求項１〜１９のいずれか１項。
【請求項２８】
前記構造は配列番号９であり、配列番号９の３９−４０位の配列はＤＫであり、配列番号９の７６位はＣであり、配列番号９の８０位はＣであり、配列番号９の１６１−１６４位の配列はＡＡＶＶである請求項１〜１９のいずれか１項。
【請求項２９】
前記構造は配列番号９であり、配列番号９の３９−４０位の配列はＡＥであり、配列番号９の７６位はＣであり、配列番号９の８０位はＣであり、配列番号９の１６１−１６４位の配列はＶＡＶＡである請求項１〜１９のいずれか１項。
【請求項３０】
前記構造は配列番号１０であり、配列番号１０の３９−４０位の配列はＤＡであり、配列番号１０の７６位はＣであり、配列番号１０の８０位はＣであり、配列番号１０の１６１−１６４位の配列はＧＶＶＡである請求項１〜１８及び２０のいずれか１項。
【請求項３１】
前記構造は配列番号１０であり、配列番号１０の３９−４０位の配列はＤＫであり、配列番号１０の７６位はＣであり、配列番号１０の８０位はＣであり、配列番号１０の１６１−１６４位の配列はＧＡＡＧである請求項１〜１８及び２０のいずれか１項。
【請求項３２】
前記構造は配列番号１０であり、配列番号１０の３９−４０位の配列はＤＫであり、配列番号１０の７６位はＣであり、配列番号１０の８０位はＣであり、配列番号１０の１６１−１６４位の配列はＡＡＶＶである請求項１〜１８及び２０のいずれか１項。
【請求項３３】
前記構造は配列番号１０であり、配列番号１０の３９−４０位の配列はＡＥであり、配列番号１０の７６位はＣであり、配列番号１０の８０位はＣであり、配列番号１０の１６１−１６４位の配列はＶＡＶＡである請求項１〜１８及び２０のいずれか１項。
【請求項３４】
Ｖ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚは、構造Ａ−Ｂ−Ｃ
（ここで、
Ａは配列番号２６と少なくとも９５％の相同性を有し、３９−５５位の配列はＤＥＭＮＶＬＡＨＧＬＬＱＬＧＱＧＬではなく、６３−６６位はＲＲＫＲ、ＧＳＧＳまたはＳＧＧＧではなく；
Ｂは０〜３８残基のオリゴペプチドであり；
Ｃは配列番号２７と少なくとも９５％の相同性を有する）
を有する請求項１〜４のいずれか１項。
【請求項３５】
前記Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体はシアル化されている請求項１〜３４のいずれか１項。
【請求項３６】
前記医薬組成物を約０．０５〜１５０，０００μｇ／ｋｇの用量で被験者に対して投与することを含む請求項２、３及び５〜３５のいずれか１項に記載の使用または方法。
【請求項３７】
前記医薬組成物を約５０〜１５０μｇ／ｋｇの用量で被験者に対して投与することを含む請求項２、３及び５〜３６のいずれか１項に記載の使用または方法。
【請求項３８】
前記医薬組成物を被験者に対して約１回／１４日投与することを含む請求項２、３及び５〜３７のいずれか１項に記載の使用または方法。
【請求項３９】
前記医薬組成物を被験者に対して約２回／月投与することを含む請求項２、３及び５〜３８のいずれか１項に記載の使用または方法。
【請求項４０】
前記医薬組成物を被験者に対して約１回／月〜約２回／月投与することを含む請求項２、３及び５〜３９のいずれか１項に記載の使用または方法。
【請求項４１】
前記Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体を被験者の血液にデリバリーするステップを含む請求項２、３及び３５〜４０のいずれか１項に記載の使用または方法。
【請求項４２】
前記Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体を被験者の腎臓にデリバリーするステップを含む請求項２、３及び５〜４１のいずれか１項に記載の使用または方法。
【請求項４３】
前記医薬組成物を被験者に対して静脈内投与することを含む請求項２、３及び５〜４２のいずれか１項に記載の使用または方法。
【請求項４４】
前記投与は浮腫を軽減させ、蛋白尿を減少させ、血漿アルブミンレベルを上昇させ、高コレステロール血症を低下させ、高トリグリセリド血症を低下させ、またはその組合せを低下させる請求項２、３及び５〜４３のいずれか１項に記載の使用または方法。
【請求項４５】
前記被験者の蛋白尿を減少させる請求項２、３及び５〜４４のいずれか１項に記載の使用または方法。
【請求項４６】
前記ネフローゼ症候群は微小変化群、巣状分節性糸球体硬化症、膜性腎症／膜性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎または糖尿病状態を伴う請求項２〜４５のいずれか１項。
【請求項４７】
前記ネフローゼ症候群は微小変化群を伴う請求項２〜４６のいずれか１項。
【請求項４８】
前記ネフローゼ症候群は糖尿病性腎症、真性糖尿病、ループス腎炎または原発性糸球体疾患を伴う請求項２〜４７のいずれか１項。
【請求項４９】
前記ネフローゼ症候群は浮腫、高脂血症、低蛋白血症、高コレステロール血症及び蛋白尿からなる群から選択される症状を呈する請求項２〜４８のいずれか１項。
【請求項５０】
請求項１及び５〜３４のいずれか１項に記載の前記Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体をコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項５１】
請求項５０に記載の前記ポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え生物。
【請求項５２】
請求項５０に記載の前記ポリヌクレオチドを含むインビトロ発現系。
【請求項５３】
約０．０３５〜１１００ｍｇの前記Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体を含む請求項４〜３４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
静脈内デリバリー用に製剤化される請求項４〜３４及び５３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
経皮デリバリー用に製剤化される請求項４〜３４及び５３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
前記Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体を血液にデリバリーするための手段を含む請求項４〜３４及び５３〜５５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
前記Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体を腎臓にデリバリーするための手段を含む請求項４〜３４及び５３〜５５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネフローゼ症候群、及び非限定的に例示される蛋白尿及び浮腫のようなネフローゼ症候群に関連する状態を治療及び予防するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ネフローゼ症候群（ＮＳ）は、尿中へのタンパク質の排泄（蛋白尿）、高脂血症（高コレステロール血症及び高トリグリセリド血症）及び浮腫を指す一般用語である。ネフローゼ症候群は有足細胞のような腎臓中の細胞の病理の変化を伴う。蛋白尿は尿中の過剰の血清タンパク質の存在として定義されている。蛋白尿の特殊タイプであるアルブミン尿はアルブミンが尿中に存在する病的状態である。
【０００３】
有足細胞（すなわち、臓側上皮細胞）は腎臓における糸球体毛細血管係蹄の外層中の細胞である。糸球体は尿を形成する際の第１ステップとして血液を濾過し、タンパク質のような大分子は引き留められ、水、塩や糖のような小分子は通過する。有足細胞の長い突起、すなわち「足突起」は毛細管の周りを取り囲み、糸球体の基底膜上に留まっている。足突起はスリット隔膜と称される多孔質構造により連結している。糸球体毛細血管係蹄の最内層は有窓内皮細胞から構成されている。ネフローゼ症候群により冒されている腎臓は血液タンパク質を漏出させる糸球体毛細血管係蹄中に異常を有しており、その結果蛋白尿が生ずる。
【０００４】
タンパク質が尿中に排泄されると、その血漿濃度が低下し、水が体の他の部位に移動し、これにより浮腫として公知の腫大が生ずる。浮腫は通常足と脚に、腹または腹部（腹水）に、目の周りで観察されるが、他の場所でも、特に重力に応答して起こり得る。加えて、体内に留まっている余分な体液のために、人々はしばしば体重増加、疲労を経験し、しばしば排尿が少ないと気づくことがあり得る。
【０００５】
微小変化群（ＭＣＤ）、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、膜性腎症（ＭＮ）（膜性糸球体腎炎，ＭＧＮとも称される）及び膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）を含めた多くの状態がネフローゼ症候群として分類されている。長らく病理学者は標本を光学顕微鏡下で検査したときＭＣＤ組織の変化を見つけられず、よって微小変化群と名付けられている。電子顕微鏡の出現で、現在疾患の特徴として公知の変化には、有足細胞足突起のびまん性喪失、有足細胞足突起の空胞化、及び臓側上皮細胞上での微絨毛の増殖が含まれる。糖尿病性腎症がネフローゼ症候群の最も一般的な原因である。
【０００６】
高トリグリセリド血症は、トリグリセリドを分解する酵素、例えばリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）の活性の変化に起因して生じ得る（２〜４）。ネフローゼ症候群及び蛋白尿の病因に関与する幾つかのタンパク質、例えばアンジオポエチン様４（Ａｎｇｐｔｌ４）はＬＰＬの活性を阻害する。
【０００７】
ネフローゼ症候群の分子学的基礎は未知である。ＭＣＤ、ＭＮ／ＭＧＮ及びＭＰＧＮのようなネフローゼ症候群では高レベルのＡｎｇｐｔｌ４が認められるが、Ａｎｇｐｔｌ４の高い循環レベルはネフローゼ症候群における蛋白尿の原因に関係していなかった。しかしながら、非限定的に例示されるＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ及びＭＰＧＮのようなネフローゼ症候群、及び限定的に例示される蛋白尿のような関連状態におけるＡｎｇｐｔｌ４の役割は未だ報告されていない。更に、ネフローゼ症候群における蛋白尿とグルココルチコイド感受性の関連、及びネフローゼ症候群の２つの重要なコンポーネントである蛋白尿と高トリグリセリド血症間のリンクは未だ確立されていない。蛋白尿を減少するように計画された治療は更に疾患のメカニズムの研究を更に複雑にする。例えば、ＭＣＤにおける蛋白尿を治療するために使用されるグルココルチコイドは独立して血漿トリグリセリドレベルを上昇させ（５）、血漿トリグリセリドレベルの正常化はある形態のネフローゼ症候群、例えばＭＣＤにおけるグルココルチコイドに対する蛋白尿の応答を遅らす（６）。
【０００８】
本発明は、Ａｎｇｐｔｌ４の高い循環レベルがネフローゼ症候群、及び非限定的に例示される蛋白尿のようなネフローゼ症候群に関連する状態の重症度を低下させることを示す。その結果、本発明は、非限定的に例示されるＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ、ＭＰＧＮ及び糖尿病性腎症のようなネフローゼ症候群を治療及び／または予防するための方法、並びに非限定的に例示される蛋白尿や浮腫のようなネフローゼ症候群に関連する状態を緩和する方法を提供する。本発明は更に蛋白尿及び浮腫を減少させるための方法を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｔｈｅ  Ｋｉｄｎｅｙ，第８版（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｂ．Ｍ．編），９８７−１０６６（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２００８）
【非特許文献２】Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，９，９４６−９５５（１９６０）
【非特許文献３】Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．，６３，１９６４−１９７６（２００３）
【非特許文献４】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９６，２５５５−２５６８(１９９５）
【非特許文献５】Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．，７０，６４７−６５３（２００６）
【非特許文献６】Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１７，１１７−１２２（２０１１）
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットの発生及び特性付けを示す。（Ａ）２００μｇ  ヒト血漿（ｎ＝４人の患者／群，トリミングした代表的ブロットを示した）の２Ｄゲル分析を示し、寛解状態の微小変化群（ＭＣＤ）を有している患者（すなわち、非蛋白尿患者）と比較して再発状態のＭＣＤを有している患者及び膜性腎症（ＭＮ）を有している患者におけるＡｎｇｐｔｌ４の高い循環レベルの存在（矢印で示す）を立証している。（Ｂ）Ａｎｇｐｔｌ４の脂肪組織特異的過剰発現についてトランスジェニック（ＴＧ）ラットモデル（ａＰ２−Ａｎｇｐｌｔ４  ＴＧ）を示す。（Ｃ）ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラット（ｎ＝３匹のラット／群）におけるＡｎｇｐｔｌ４  ｍＲＮＡの組織特異的過剰発現を示す。ＷＡＴは白色脂肪組織であり、ＢＡＴは褐色脂肪組織である。＊＊＊  Ｐ＜０．００１。（Ｄ）２００μｇ  血漿を２Ｄゲル電気泳動した後のＡｎｇｐｔｌ４についてのウェスタンブロットを示し、ヘテロ接合ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットが野生型ラット（３ヶ月齢，ｎ＝３ブロット／群）よりも高い循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルを有していたことを立証している。（Ｅ）２００μｇ  血漿を２Ｄゲル電気泳動した後の抗Ｖ５及び抗Ａｎｇｐｔｌ４抗体を用いるウェスタンブロットを示し、ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットの血漿中の脂肪組織分泌したＶ５標識Ａｎｇｐｔｌ４の存在を立証している。（Ｆ）ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラット血漿由来の抗Ｎ末端Ａｎｇｐｔｌ４免疫沈降物を２Ｄゲル電気泳動した後のレクチンＳＮＡ  Ｉ及び抗Ａｎｇｐｔｌ４抗体を用いるウェスタンブロッティングを示し、ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４中の循環シアル化Ａｎｇｐｔｌ４の存在を確認した。（Ｇ）３ヶ月齢のヘテロ接合ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラット（ｎ＝３匹のラット／群）からのＰＡＳ染色切片を示し、正常な糸球体形態（倍率４００×）を立証している。（Ｈ）３ヶ月齢のヘテロ接合ａＰ２−Ａｎｇｐｌｔ４  ＴＧ雄ラット中のトランスジェニックタンパク質を特異的に検出するための抗Ｖ５抗体を用いるイムノゴールドＥＭを示し、ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラット中の内皮表面上のゴールド粒子（矢印で示す）を選択的に立証する。
【図２】Ａｎｇｐｔｌ４の高い循環レベルと蛋白尿／アルブミン尿の関係を示す。（Ａ）ＧｅｌＣｏｄｅブルー染色したＳＤＳ  ＰＡＧＥによる異なるヒト及び実験疾患状態での尿タンパク質排泄（３μｇ／レーン，ＭＣＤ寛解を除く）の評価を示し、ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットにおける有意な蛋白尿の不在を立証した（＊を付けたレーン，矢印は約７０ｋＤａでの無傷のアルブミンを示す）。（Ｂ）ＥＬＩＳＡによるアルブミン尿の評価を示し、ヘテロ接合雌ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットが野生型同腹仔よりも低いアルブミン尿を有していた（ｎ＝６匹のラット／群）ことを明らかにした。（Ｃ）ＥＬＩＳＡによるアルブミン尿の評価を示し、ヘテロ接合雄ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットが野生型同腹仔よりも低いアルブミン尿を有していた（ｎ＝６匹のラット／群）ことを明らかにした。（Ｄ）野生型及びａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットにおけるネフローゼ症候群のモデルであるプロマイシンネフローゼ（ＰＡＮ）の誘発を示し、野生型同腹仔と比較してａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットにおける少ない蛋白尿を立証する（ｎ＝８匹のラット／群）。対応の対照と比較して、＊  Ｐ＜０．０５，＊＊  Ｐ＜０．０１。（Ｅ）組換えＡｎｇｐｔｌ４が培養した糸球体内皮細胞（ＧＥｎＣ）に対して保護効果を有していたことを示す。対応の対照と比較して、＊＊  Ｐ＜０．０１，＊＊＊  Ｐ＜０．００１。（Ｆ）ＰＡＮのような疾患モデルの野生型ラットにおける６日目のＡｎｇｐｔｌ４のアップレギュレーションは専ら糸球体であり、蛋白尿及び糸球体Ａｎｇｐｔｌ４発現が下降している場合には脂肪組織中のＡｎｇｐｔｌ４のアップレギュレーションが１０日目で認められたことを示す（ｎ＝３匹のラット／サンプル）。対応の対照と比較して、＊＊  Ｐ＜０．０１，＊＊＊  Ｐ＜０．００１。（Ｇ）ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットにおける基準時及びＰＡＮの誘発後のＡｎｇｐｔｌ４の高い循環レベルが野生型ラットと比較して血漿トリグリセリドレベルの上昇をもたらすことを示す。対応の対照と比較して、＊  Ｐ＜０．０５。（Ｈ）ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットにおける基準時及びＰＡＮの誘発後のＡｎｇｐｔｌ４の高い循環レベルが野生型ラットと比較してヘパリン後リポタンパク質リガーゼ（ＬＰＬ）活性の低下をもたらす。対応の対照と比較して、＊  Ｐ＜０．０５。
【図３】ＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲのために使用したプライマー及びプローブ（配列番号１１〜２２）を示す。
【図４】組換えＡｎｇｐｔｌ４がヒト糸球体疾患の動物モデルにおいて蛋白尿を減少させることを示す。（Ａ）糸球体間質損傷の短期間モデルであるＴｈｙ１．１腎炎における蛋白尿の減少を示す。雄Ｗｉｓｔａｒラット（ｎ＝４匹のラット／群）においてＴｈｙ１．１腎炎を誘発させた。基準蛋白尿（１日目）を評価後、Ａｎｇｐｔｌ４安定または対照細胞株由来の濃縮上清タンパク質をＢｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラット（ｎ＝４匹のラット／群）に連続２日間（１日目及び２日目，矢印）腹腔内注射した後、蛋白尿を評価した。Ａｎｇｐｔｌ４治療したラットでは蛋白尿がずっと低く、５日目で統計上有意であった。＊  Ｐ＜０．０５，＊＊  Ｐ＜０．０１。値はすべて平均＋ＳＥである。（Ｂ）糸球体間質損傷の短期間モデルであるＴｈｙ１．１腎炎における蛋白尿の減少を示す。雄Ｗｉｓｔａｒラット（ｎ＝４匹のラット／群，０日目に注射）においてＴｈｙ１．１腎炎を誘発させた。蛋白尿の誘発（１日目）を確認した後、Ａｎｇｐｔｌ４安定または対照細胞株由来の濃縮上清タンパク質を連続２日間（１日目及び２日目，矢印）静脈内注射した後、蛋白尿を評価した。Ａｎｇｐｔｌ４治療したラットでは蛋白尿がずっと低く、５日目で統計上有意であった。＊  Ｐ＜０．０５，＊＊  Ｐ＜０．０１。値はすべて平均＋ＳＥである。
【図５−１】各種種由来のＡｎｇｐｔｌ４のアミノ酸及びｃＤＮＡ配列を示す。配列番号１及び２はヒト由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す（タンパク質バリアント１イソフォームａ，長い形；４０位及び１６１−１６４のアミノ酸配列に下線を付けた）。配列番号３及び４はヒト由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す（タンパク質バリアント３イソフォームｂ，短い形；４０位及び１６１−１６４のアミノ酸配列に下線を付けた）。配列番号５及び６はラット由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す。配列番号７及び８はマウス由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す。フォワードシークエンシングプライマーに下線を付けた。太字はリバースシークエンシングプライマーである。
【図５−２】各種種由来のＡｎｇｐｔｌ４のアミノ酸及びｃＤＮＡ配列を示す。配列番号１及び２はヒト由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す（タンパク質バリアント１イソフォームａ，長い形；４０位及び１６１−１６４のアミノ酸配列に下線を付けた）。配列番号３及び４はヒト由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す（タンパク質バリアント３イソフォームｂ，短い形；４０位及び１６１−１６４のアミノ酸配列に下線を付けた）。配列番号５及び６はラット由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す。配列番号７及び８はマウス由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す。フォワードシークエンシングプライマーに下線を付けた。太字はリバースシークエンシングプライマーである。
【図５−３】各種種由来のＡｎｇｐｔｌ４のアミノ酸及びｃＤＮＡ配列を示す。配列番号１及び２はヒト由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す（タンパク質バリアント１イソフォームａ，長い形；４０位及び１６１−１６４のアミノ酸配列に下線を付けた）。配列番号３及び４はヒト由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す（タンパク質バリアント３イソフォームｂ，短い形；４０位及び１６１−１６４のアミノ酸配列に下線を付けた）。配列番号５及び６はラット由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す。配列番号７及び８はマウス由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す。フォワードシークエンシングプライマーに下線を付けた。太字はリバースシークエンシングプライマーである。
【図５−４】各種種由来のＡｎｇｐｔｌ４のアミノ酸及びｃＤＮＡ配列を示す。配列番号１及び２はヒト由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す（タンパク質バリアント１イソフォームａ，長い形；４０位及び１６１−１６４のアミノ酸配列に下線を付けた）。配列番号３及び４はヒト由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す（タンパク質バリアント３イソフォームｂ，短い形；４０位及び１６１−１６４のアミノ酸配列に下線を付けた）。配列番号５及び６はラット由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す。配列番号７及び８はマウス由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す。フォワードシークエンシングプライマーに下線を付けた。太字はリバースシークエンシングプライマーである。
【図６−１】高い循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルがネフローゼ症候群において高トリグリセリド血症を発症させるために必要であることを示す。（Ａ）原発性糸球体疾患に起因するネフローゼ症候群を有している患者における血漿Ａｎｇｐｔｌ４レベルについてのＥＬＩＳＡ。分析した患者の数を括弧内に示す。（Ｂ）すべてネフローゼ症候群のラットモデルであるパッシブヘイマン腎炎（ＰＨＮ，膜性腎症のモデル）、Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａ（Ｂ．Ｍｎａ，巣状分節性糸球体硬化症を自然に発症）、及び１回静脈内投与したプロマイシンアミノヌクレオシドネフローゼ（ＰＡＮ，微小変化群のモデル）におけるネフローゼ前及びネフローゼ段階の血漿Ａｎｇｐｔｌ４レベルについてのＥＬＩＳＡ。ＰＨＮ（Ｃ〜Ｅ）、Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラット（Ｆ〜Ｈ）及びＰＡＮラット（Ｉ〜Ｋ）における蛋白尿、高トリグリセリド血症及びＬＰＬ活性。（Ｌ、Ｍ）高い循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルを有する脂肪組織特異的Ａｎｇｐｔｌ４過剰発現ラット（ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４）及び導入遺伝子発現Ａｎｇｐｔｌ４が循環に入らない３ヶ月齢の有足細胞特異的Ａｎｇｐｔｌ４過剰発現ラット（ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４）における血漿トリグリセリドレベル及びＬＰＬ活性。（ｎ）γ２−ＮＴＳを用いてネフローゼ症候群を誘発させてから４８時間後のＡｎｇｐｔｌ４  −／−及び＋／＋マウスにおける血漿トリグリセリドレベル。＊  Ｐ＜０．０５，＊＊  Ｐ＜０．０１，＊＊＊  Ｐ＜０．００１。
【図６−２】高い循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルがネフローゼ症候群において高トリグリセリド血症を発症させるために必要であることを示す。（Ａ）原発性糸球体疾患に起因するネフローゼ症候群を有している患者における血漿Ａｎｇｐｔｌ４レベルについてのＥＬＩＳＡ。分析した患者の数を括弧内に示す。（Ｂ）すべてネフローゼ症候群のラットモデルであるパッシブヘイマン腎炎（ＰＨＮ，膜性腎症のモデル）、Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａ（Ｂ．Ｍｎａ，巣状分節性糸球体硬化症を自然に発症）、及び１回静脈内投与したプロマイシンアミノヌクレオシドネフローゼ（ＰＡＮ，微小変化群のモデル）におけるネフローゼ前及びネフローゼ段階の血漿Ａｎｇｐｔｌ４レベルについてのＥＬＩＳＡ。ＰＨＮ（Ｃ〜Ｅ）、Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラット（Ｆ〜Ｈ）及びＰＡＮラット（Ｉ〜Ｋ）における蛋白尿、高トリグリセリド血症及びＬＰＬ活性。（Ｌ、Ｍ）高い循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルを有する脂肪組織特異的Ａｎｇｐｔｌ４過剰発現ラット（ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４）及び導入遺伝子発現Ａｎｇｐｔｌ４が循環に入らない３ヶ月齢の有足細胞特異的Ａｎｇｐｔｌ４過剰発現ラット（ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４）における血漿トリグリセリドレベル及びＬＰＬ活性。（ｎ）γ２−ＮＴＳを用いてネフローゼ症候群を誘発させてから４８時間後のＡｎｇｐｔｌ４  −／−及び＋／＋マウスにおける血漿トリグリセリドレベル。＊  Ｐ＜０．０５，＊＊  Ｐ＜０．０１，＊＊＊  Ｐ＜０．００１。
【図７−１】ネフローゼ症候群における循環Ａｎｇｐｔｌ４の起源を示す。（Ａ）パッシブヘイマン腎炎（ＰＨＮ）、（Ｂ）Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラット及び（Ｃ）プロマイシンアミノヌクレオシドネフローゼ（ＰＡＮ）における対照に対する多臓器Ａｎｇｐｔｌ４  ｍＲＮＡ発現。（Ｄ）軽度ＰＡＮの誘発前及びその後の蛋白尿ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットにおける循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルを示す血漿の代表的２次元ゲル電気泳動及びウェスタンブロット。（Ｅ）    における２次元ゲルのデンシトメトリー分析。（Ｆ）循環中のＶ５標識導入遺伝子発現Ａｎｇｐｔｌ４の存在を立証するためのＰＡＮを有するＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットからの血漿の２次元ゲル電気泳動及びウェスタンブロット。（Ｇ及びＨ）野生型Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４及びＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットにおいてＰＡＮの誘発から６日後の血漿トリグリセリドレベル（Ｇ）及びリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）活性（Ｈ）。空バーは比較のためにここに含めた図６（ｌ）及び６（ｍ）からのデータに相当する。＊  Ｐ＜０．０５，＊＊  Ｐ＜０．０１，＊＊＊  Ｐ＜０．００１。パネルＧ及びＨでは、統計上有意さをトランスジェニックラットと対応する野生型対照間の差について示す。ＰＡＮを誘発前及びその後の各ラットタイプに対してＰ＜０．００１。Ａ〜Ｃのパネルでは、発現の３倍の変化（水平線）を有意とみなした。
【図７−２】ネフローゼ症候群における循環Ａｎｇｐｔｌ４の起源を示す。（Ａ）パッシブヘイマン腎炎（ＰＨＮ）、（Ｂ）Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラット及び（Ｃ）プロマイシンアミノヌクレオシドネフローゼ（ＰＡＮ）における対照に対する多臓器Ａｎｇｐｔｌ４  ｍＲＮＡ発現。（Ｄ）軽度ＰＡＮの誘発前及びその後の蛋白尿ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットにおける循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルを示す血漿の代表的２次元ゲル電気泳動及びウェスタンブロット。（Ｅ）    における２次元ゲルのデンシトメトリー分析。（Ｆ）循環中のＶ５標識導入遺伝子発現Ａｎｇｐｔｌ４の存在を立証するためのＰＡＮを有するＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットからの血漿の２次元ゲル電気泳動及びウェスタンブロット。（Ｇ及びＨ）野生型Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４及びＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットにおいてＰＡＮの誘発から６日後の血漿トリグリセリドレベル（Ｇ）及びリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）活性（Ｈ）。空バーは比較のためにここに含めた図６（ｌ）及び６（ｍ）からのデータに相当する。＊  Ｐ＜０．０５，＊＊  Ｐ＜０．０１，＊＊＊  Ｐ＜０．００１。パネルＧ及びＨでは、統計上有意さをトランスジェニックラットと対応する野生型対照間の差について示す。ＰＡＮを誘発前及びその後の各ラットタイプに対してＰ＜０．００１。Ａ〜Ｃのパネルでは、発現の３倍の変化（水平線）を有意とみなした。
【図８】ネフローゼ症候群におけるＡｎｇｐｔｌ４及びＬＰＬの尿中排泄を示す。（Ａ）正常なＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）、ＰＡＮ、ＰＨＮ及びＢｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラットからの尿の代表的な還元ウェスタンブロット。黒い矢印はＡｎｇｐｔｌ４バンドに向けられている。アルブミンブラシもＰＡＮ、ＰＨＮ及びＢｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラットにおいて６５〜７０ｋＤａに認められる。（Ｂ）ＬＰＬの尿中排泄（矢印）について評価するためのネフローゼラットからの尿のヤギ抗ＬＰＬ抗体を用いる非還元ウェスタンブロット。（Ｃ）活性ＬＰＬ（矢印）を同定するためのネフローゼラット尿の抗ＬＰＬモノクローナル抗体５Ｄ２を用いる非還元ウェスタンブロット。（Ｄ）ＰＡＮを有するＳｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットにおけるＬＰＬについての多臓器ｍＲＮＡ発現プロフィール。（Ｅ）ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットにおいてＬＰＬを発現する主要臓器のｍＲＮＡ発現プロフィール。パネルＤ及びＥでは、発現の３倍の変化（水平線）を有意とみなした。
【図９】蛋白尿に対する循環Ａｎｇｐｔｌ４の影響を示す。赤色矢印は必要に応じて抗体または組換えタンパク質を注射した時点を示す。（Ａ）野生型Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ及びａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットにおいてピューロマイシンアミノヌクレオシドネフローゼ（ＰＡＮ）を誘発させた後の蛋白尿。（Ｂ）ＰＡＮを有するＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットにおける蛋白尿に対する抗Ａｎｇｐｔｌ４  Ａｂ．を用いる欠乏する循環Ａｎｇｐｔｌ４の影響。（Ｃ）組換えラットＡｎｇｐｔｌ４を分泌する安定細胞株または対照の安定細胞株由来の濃縮上清を注射後のＢｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラットにおける蛋白尿。（Ｄ）糸球体間質損傷のモデルである重篤な抗Ｔｈｙ１．１腎炎における蛋白尿に対する上記細胞株由来の組換えラットＡｎｇｐｔｌ４または対照タンパク質の注射の影響。＊  Ｐ＜０．０５，＊＊  Ｐ＜０．０１。
【図１０】変異組換えヒトＡｎｇｐｔｌ４を用いるトリグリセリド及び蛋白尿に対する影響の分離を示す。（Ａ）ＬＰＬ結合（アミノ酸４０及び隣接アミノ酸３９）及びタンパク質開裂（アミノ酸１６１−１６４）にとって重要なエリア中の変異を示す野生型及び変異ヒトＡｎｇｐｔｌ４タンパク質の概略図。（Ｂ）無傷のタンパク質の予想されるサイズ及び変異タンパク質における少ない開裂（矢印）を立証するためのマウス抗Ｖ５抗体及び対照マウスＩｇＧを用いる組換え標識タンパク質のウェスタンブロット。（Ｃ）ヒトＡｎｇｐｔｌ４  ＥＬＩＳＡキットの試薬を用いてＯＤ  ４５０で評価した巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）のモデルであるＢｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラットに５５μｇの組換えヒトタンパク質を注射した後の野生型または変異ヒトＡｎｇｐｔｌ４の血漿レベル。（Ｄ）Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラットにおける蛋白尿に対する野生型及び変異Ａｎｇｐｔｌ４の影響。＊  Ｐ＜０．０５はすべて３つの研究群は対照とは個別に異なる場合に示す。（Ｅ）Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラットにおける血漿トリグリセリドレベルに対する野生型及び変異Ａｎｇｐｔｌ４の影響。＊  基準と比較して、野生型値についてＰ＜０．０５。＃  野生型と比較して６時間変異体値についてＰ＜０．０５。
【図１１】循環Ａｎｇｐｔｌ４が糸球体内皮αｖβ５インテグリンとの相互作用により蛋白尿を減少させることを示す。赤色矢印は抗β５インテグリン抗体または免疫前血清を注射した時点を示す。（Ａ）ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラット由来の糸球体の共焦点画像は糸球体内皮（抗フォン・ヴィレランド因子抗体，緑色）を有する脂肪組織から分泌したＡｎｇｐｔｌ４−Ｖ５（抗Ｖ５抗体，赤色）の共局在化を立証する。（Ｂ）脂肪組織分泌Ａｎｇｐｔｌ４−Ｖ５の糸球体内皮細胞結合を示すための抗Ｖ５抗体を用いるａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラット由来の糸球体のイムノゴールド電子顕微鏡写真。（Ｃ）インビトロでの精製αｖβ５インテグリンのシアル化Ａｎｇｐｔｌ４または対照との相互作用。線型回帰勾配（黒色）を重ねる。（Ｄ）Ａｎｇｐｔｌ４分泌の末梢相中の蛋白尿に対する内皮β５インテグリン−循環Ａｎｇｐｔｌ４相互作用の保護効果を立証するためのβ５インテグリン  −／−及び＋／＋マウスにおいてγ２−腎毒性血清（ＮＴＳ）を用いてネフローゼ症候群を誘発させた後の蛋白尿の発生。（Ｅ）ＰＡＮを有するＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットにおいてピーク蛋白尿からの回復（Ａｎｇｐｔｌ４分泌の末梢相に相当）時の抗β５インテグリン抗体を用いる内皮β５インテグリン−Ａｎｇｐｔｌ４相互作用の阻止効果。（Ｆ）ＰＡＮを有するａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットにおいてピーク蛋白尿からのＰＡＮでの回復時の抗β５インテグリン抗体を用いる内皮β５インテグリン−Ａｎｇｐｔｌ４相互作用の阻止効果。（Ｇ）Ａｎｇｐｔｌ４の欠乏がＡｎｇｐｔｌ４発現の末梢相中のピーク蛋白尿からの回復に影響を与えるかを調べるためのＡｎｇｐｔｌ４  −／−及び＋／＋マウスにおけるγ２−ＮＴＳを用いるネフローゼ症候群の誘発。糸球体相の所見は我々が以前公開した研究（実施例４からの参考文献６）と一致している。＊  Ｐ＜０．０５，＊＊  Ｐ＜０．０１，＊＊＊  Ｐ＜０．００１。
【図１２】ヒト血漿の二次元ゲル電気泳動を示す。（Ａ）膜性腎症（ＭＮ）、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）及び微小変化群（ＭＣＤ）における高い循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルを示すための抗Ａｎｇｐｔｌ４抗体を用いる代表的ウェスタンブロットのトリミングした画像。Ａｎｇｐｔｌ４は緑色円／楕円形で囲まれている。（Ｂ）ウェスタンブロットに対応するニトロセルロース膜のポンソーレッド染色画像。
【図１３】（Ａ）γ２−ＮＴＳ注射から４８時間後のＡｎｇｐｔｌ４  ＋／＋及びＡｎｇｐｔｌ４  −／−マウスにおけるアルブミン尿は図６（ｎ）に相当する。画像は実施例４からの参考文献６のオンライン追補から再現させる。類似の結果を図６（ｈ）に示した研究の２日目で見られる。（Ｂ）図２ｄのウェスタンブロットのために使用したニトロセルロース膜のポンソーレッド染色画像。（Ｃ）正常ヤギ血清を用いた図３ｂからのストリップト膜の露出過度なウェスタンブロット。（Ｄ）正常マウスＩｇＧを用いた図３ｃからのストリップト膜の露出過度なウェスタンブロット。（Ｅ）組換えヒト野生型Ａｎｇｐｔｌ４、ヒト変異体Ａｎｇｐｔｌ４及び対照タンパク質の注射から１２時間〜１７日後のＢｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラットにおける空腹時血漿トリグリセリドレベル。＊  Ｐ＜０．０５。
【図１４】図１１Ｅに示したγ２−ＮＴＳ注射したＩｔｇｂ  ＋／＋及び−／−マウスにおけるＡｎｇｐｔｌ４発現の末梢相（５日目及び７日目）中の高い血漿Ａｎｇｐｔｌ４レベル。（Ｂ）γ２−ＮＴＳの注射から７日後の図１１Ｅに示したＩｔｇｂ  ＋／＋マウスにおけるＡｎｇｐｔｌ４についての多臓器ｍＲＮＡ発現プロフィール。（Ｃ）図１１Ｆに示したＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ  ＰＡＮラットにおける血漿Ａｎｇｐｔｌ４レベル。（Ｄ）図１１Ｆに示したＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ  ＰＡＮラットにおける血漿トリグリセリドレベル。パネルＡ、Ｃ及びＤでの比較はすべて０日目の値で行った。＊  Ｐ＜０．０５。
【図１５】ネフローゼ症候群における循環Ａｎｇｐｔｌ４の本来の効果及び生物学的効果の概略図。中症度〜重症度の蛋白尿が確立された後、骨格筋、脂肪組織及び心臓はアップレギュレートし、Ａｎｇｐｔｌ４を循環に分泌する。このＡｎｇｐｔｌ４の幾つかは糸球体内皮表面上のαｖβ５インテグリンに結合し、蛋白尿を減少させる。一方、幾つかは活性リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）に結合し、活性ＬＰＬを不活性ＬＰＬに変換して、尿中に排泄される。低いＬＰＬ媒介トリグリセリド摂取により高トリグリセリド血症が生ずる。幾つかの循環Ａｎｇｐｔｌ４も尿中に排泄される。微小変化群（ＭＣＤ）では、有足細胞分泌した低シアル化Ａｎｇｐｔｌ４は糸球体内で局所蛋白尿誘発効果を発揮し、一方有足細胞分泌したシアル化タンパク質は糸球体内皮に結合し、循環に漏れて、高トリグリセリド血症を誘発する。膜性腎症（ＭＮ）、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）及び非ＨＩＶ虚脱型糸球体症（ＣＧ）では、有足細胞は有意な量のＡｎｇｐｔｌ４を循環に与えない。
【図１６】（Ａ）ヒトＡｎｇｐｔｌ４  ＥＬＩＳＡの標準曲線。（Ｂ）齧歯類Ａｎｇｐｔｌ４  ＥＬＩＳＡの標準曲線。（Ｃ）抗β５インテグリン抗体８４７２Ａのウェスタンブロットによる特性評価。（Ｄ）マゼンタ重複パターンを生ずる、静脈内注射から６時間後の抗β５インテグリン抗体（赤，ロバ抗家兔ＩｇＧを用いて検出）の糸球体内皮（青，マウス抗ＰＥＣＡＭ１抗体で標識）への結合を示すラット糸球体の共焦点画像。
【図１７】ヒトＡｎｇｐｔｌ４の４つの変異体形態についてのアミノ酸及び核酸置換を示す。
【図１８】無傷タンパク質の予想されるサイズ及び変異タンパク質における少ない開裂（矢印）を立証すべくマウス抗Ｖ５抗体及び対照マウスＩｇＧを用いて標識をつけた図１７に示す組換えタンパク質のウェスタンブロットを示す。
【図１９】変異体８５１１を蛋白尿Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラットに１回静脈内注射後の蛋白尿の変化についてのピークレベルを示す。
【図２０】糖尿病性腎症及び糖尿病性腎臓病のモデルであるズッカー糖尿病肥満ラットに２つの変異ヒトＡｎｇｐｔｌ４タンパク質（１５μｇ）を注射後の蛋白尿の減少を示す。
【図２１】ズッカー糖尿病肥満ラットに注射（１５μｇ）後の２つの変異ヒトＡｎｇｐｔｌ４タンパク質の蛋白尿のレベルを示す。すべての＊値は基準の０日値に対する。
【図２２】ズッカー糖尿病肥満ラットに２つの変異体形態のヒトＡｎｇｐｔｌ４タンパク質（１５μｇ）を注射後血漿トリグリセリドレベルが上昇しないことを示している。図２０〜２２の場合：＊  Ｐ＜０．０５，＊＊  Ｐ＜０．０１，＃  Ｐ＜０．０５。
【発明の概要】
【００１１】
第１の態様で、本発明はネフローゼ症候群の治療及び／または予防方法を提供する。１つの実施形態では、ネフローゼ症候群はＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ、ＭＰＧＮまたは糖尿病性腎症として特徴づけられる。別の実施形態では、ネフローゼ症候群はＭＣＤとして特徴づけられる。更なる実施形態では、ネフローゼ症候群はＭＳＧＳとして特徴づけられる。更なる実施形態では、ネフローゼ症候群は糖尿病状態により引き起こされる。１つの実施形態では、糖尿病状態は糖尿病性腎症、真性糖尿病、ループス腎炎または原発性糸球体疾患である。この方法は、被験者に対してＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体を投与するステップを含む。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドは配列番号１、３、５、７、９または１０の配列を含む。或いは、アミノ酸配列は野生型Ａｎｇｐｔｌ４またはＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体に匹敵する活性を有する上記配列のいずれかの断片である。もっと更なる実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体は本明細書中に記載されている誘導体であり、低いＬＰＬ阻害活性、開裂耐性またはその組合せを有するように修飾されている。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体はシアル化されている。前記誘導体は本明細書中に記載されているＡｎｇｐｌｔ４ポリペプチドのいずれかに基づき得る。Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体は治療有効量で単独で、医薬組成物の一部として、または第２物質と組み合わせて投与され得る。１つの実施形態では、前記投与はＡｎｇｐｔｌ４機能を付与することによりネフローゼ症候群を治療する。代替実施形態では、前記投与は、非限定的に例示される低いＬＰＬ阻害を呈するかまたは開裂に対して耐性であるＡｎｇｐｔｌ４機能のような修飾Ａｎｇｐｔｌ４機能を付与することによりネフローゼ症候群を治療する。
【００１２】
第２の態様で、本発明はＭＣＤの治療及び／または予防方法を提供する。この方法は、被験者に対してＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体を投与するステップを含む。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドは配列番号１、３、５、７、９または１０の配列を含む。或いは、アミノ酸配列は野生型Ａｎｇｐｔｌ４に匹敵する活性を有する上記配列のいずれかの断片である。もっと更なる実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体は本明細書中に記載されている誘導体であり、低いＬＰＬ阻害活性、開裂耐性またはその組合せを有するように修飾されている。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体はシアル化されている。前記誘導体は本明細書中に記載されているＡｎｇｐｌｔ４ポリペプチドのいずれかに基づき得る。Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体は治療有効量で単独で、医薬組成物の一部として、または第２物質と組み合わせて投与され得る。１つの実施形態では、前記投与はＡｎｇｐｔｌ４機能を付与することによりＭＣＤを治療する。代替実施形態では、前記投与は、非限定的に例示される低いＬＰＬ阻害を呈するかまたは開裂に対して耐性であるＡｎｇｐｔｌ４機能のような修飾Ａｎｇｐｔｌ４機能を付与することによりＭＣＤを治療する。
【００１３】
第３の態様で、本発明は、非限定的に例示される蛋白尿、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症及び浮腫のようなネフローゼ症候群の１つ以上の症状の緩和方法を提供する。１つの実施形態では、ネフローゼ症候群はＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ、ＭＰＧＮ及び糖尿病性腎症として特徴づけられる。別の実施形態では、ネフローゼ症候群はＭＣＤとして特徴づけられる。更なる実施形態では、ネフローゼ症候群はＦＳＧＳにより引き起こされる。更なる実施形態では、ネフローゼ症候群は糖尿病状態により引き起こされる。１つの実施形態では、糖尿病状態は糖尿病性腎症、真性糖尿病、ループス腎炎または原発性糸球体疾患である。この方法は、被験者に対してＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体を投与するステップを含む。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドは配列番号１、３、５、７、９または１０の配列を含む。或いは、アミノ酸配列は野生型Ａｎｇｐｔｌ４に匹敵する活性を有する上記配列のいずれかの断片である。もっと更なる実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体は本明細書中に記載されている誘導体であり、低いＬＰＬ阻害活性、開裂耐性またはその組合せを有するように修飾されている。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体はシアル化されている。前記誘導体は本明細書中に記載されているＡｎｇｐｌｔ４ポリペプチドのいずれかに基づき得る。Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体は治療有効量で単独で、医薬組成物の一部として、または第２物質と組み合わせて投与され得る。１つの実施形態では、前記投与はＡｎｇｐｔｌ４機能を付与することによりネフローゼ症候群の１つ以上の症状を緩和する。代替実施形態では、前記投与は、非限定的に例示される低いＬＰＬ阻害を呈するかまたは開裂に対して耐性であるＡｎｇｐｔｌ４機能のような修飾Ａｎｇｐｔｌ４機能を付与することによりネフローゼ症候群の１つ以上の症状を緩和する。
【００１４】
第４の態様では、本発明は被験者における蛋白尿を減少させるための方法を提供する。１つの実施形態では、被験者はネフローゼ症候群を患っている。１つの実施形態では、ネフローゼ症候群はＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ、ＭＰＧＮ及び糖尿病性腎症として特徴づけられる。別の実施形態では、ネフローゼ症候群はＭＣＤとして特徴づけられる。別の実施形態では、被験者は蛋白尿として特徴づけられる障害を患っている。別の実施形態では、被験者は糖尿病状態を患っている。更なる実施形態では、蛋白尿はＦＳＧＳにより引き起こされる。１つの実施形態では、糖尿病状態は糖尿病性腎症、真性糖尿病、ループス腎炎または原発性糸球体疾患である。この方法は、被験者に対してＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体を投与するステップを含む。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドは配列番号１、３、５、７、９または１０の配列を含む。或いは、アミノ酸配列は野生型Ａｎｇｐｔｌ４に匹敵する活性を有する上記配列のいずれかの断片である。もっと更なる実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体は本明細書中に記載されている誘導体であり、低いＬＰＬ阻害活性、開裂耐性またはその組合せを有するように修飾されている。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体はシアル化されている。前記誘導体は本明細書中に記載されているＡｎｇｐｌｔ４ポリペプチドのいずれかに基づき得る。Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体は治療有効量で単独で、医薬組成物の一部として、または第２物質と組み合わせて投与され得る。１つの実施形態では、前記投与はＡｎｇｐｔｌ４機能を付与することにより蛋白尿を減少させる。代替実施形態では、前記投与は、非限定的に例示される低いＬＰＬ阻害を呈するかまたは開裂に対して耐性であるＡｎｇｐｔｌ４機能のような修飾Ａｎｇｐｔｌ４機能を付与することにより蛋白尿を減少させる。
【００１５】
第５の態様で、本発明は被験者における浮腫の軽減方法を提供する。１つの実施形態では、被験者はネフローゼ症候群を患っている。１つの実施形態では、ネフローゼ症候群はＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ、ＭＰＧＮ及び糖尿病性腎症として特徴づけられる。別の実施形態では、ネフローゼ症候群はＭＣＤとして特徴づけられる。更なる実施形態では、ネフローゼ症候群はＦＳＧＳにより引き起こされる。特定実施形態では、浮腫はアルブミンのような血漿タンパク質の低い循環レベルにより引き起こされる。更なる実施形態では、ネフローゼ症候群は糖尿病状態により引き起こされる。１つの実施形態では、糖尿病状態は糖尿病性腎症、真性糖尿病、ループス腎炎または原発性糸球体疾患である。Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体の投与により蛋白尿を減少させると、蛋白尿が減少し、血漿タンパク質レベルが上昇し、これにより浮腫が軽減する。この方法は、被験者に対してＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体を投与するステップを含む。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドは配列番号１、３、５、７、９または１０の配列を含む。或いは、アミノ酸配列は野生型Ａｎｇｐｔｌ４に匹敵する活性を有する上記配列のいずれかの断片である。もっと更なる実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体は本明細書中に記載されている誘導体であり、低いＬＰＬ阻害活性、開裂耐性またはその組合せを有するように修飾されている。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体はシアル化されている。前記誘導体は本明細書中に記載されているＡｎｇｐｌｔ４ポリペプチドのいずれかに基づき得る。Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体は治療有効量で単独で、医薬組成物の一部として、または第２物質と組み合わせて投与され得る。１つの実施形態では、前記投与はＡｎｇｐｔｌ４機能を付与することにより浮腫を軽減させる。代替実施形態では、前記投与は、非限定的に例示される低いＬＰＬ阻害を呈するかまたは開裂に対して耐性であるＡｎｇｐｔｌ４機能のような修飾Ａｎｇｐｔｌ４機能を付与することにより浮腫を軽減させる。
【００１６】
第６の態様では、本発明は被験者における高コレステロール血症及び／または高トリグリセリド血症の低下方法を提供する。１つの実施形態では、被験者はネフローゼ症候群を患っている。１つの実施形態では、ネフローゼ症候群はＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ、ＭＰＧＮ及び糖尿病性腎症として特徴づけられる。別の実施形態では、ネフローゼ症候群はＭＣＤとして特徴づけられる。更なる実施形態では、ネフローゼ症候群は糖尿病状態により引き起こされる。１つの実施形態では、糖尿病状態は糖尿病性腎症、真性糖尿病、ループス腎炎または原発性糸球体疾患である。この方法は、被験者に対してＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体を投与するステップを含む。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドは配列番号１、３、５、７、９または１０の配列を含む。或いは、アミノ酸配列は野生型Ａｎｇｐｔｌ４に匹敵する活性を有する上記配列のいずれかの断片である。もっと更なる実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体は本明細書中に記載されている誘導体であり、低いＬＰＬ阻害活性、開裂耐性またはその組合せを有するように修飾されている。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体はシアル化されている。前記誘導体は本明細書中に記載されているＡｎｇｐｌｔ４ポリペプチドのいずれかに基づき得る。Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体は治療有効量で単独で、医薬組成物の一部として、または第２物質と組み合わせて投与され得る。１つの実施形態では、前記投与はＡｎｇｐｔｌ４機能を付与することにより高コレステロール血症及び／または高トリグリセリド血症を低下させる。代替実施形態では、前記投与は、非限定的に例示される低いＬＰＬ阻害を呈するかまたは開裂に対して耐性であるＡｎｇｐｔｌ４機能のような修飾Ａｎｇｐｔｌ４機能を付与することにより高コレステロール血症及び／または高トリグリセリド血症を低下させる。
【００１７】
第７の態様では、本発明は糖尿病状態の治療及び／または予防方法を提供する。１つの実施形態では、糖尿病状態は糖尿病性腎症、真性糖尿病、ループス腎炎または原発性糸球体疾患である。この方法は、被験者に対してＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体を投与するステップを含む。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドは配列番号１、３、５、７、９または１０の配列を含む。或いは、アミノ酸配列は野生型Ａｎｇｐｔｌ４に匹敵する活性を有する上記配列のいずれかの断片である。もっと更なる実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体は本明細書中に記載されている誘導体であり、低いＬＰＬ阻害活性、開裂耐性またはその組合せを有するように修飾されている。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体はシアル化されている。前記誘導体は本明細書中に記載されているＡｎｇｐｌｔ４ポリペプチドのいずれかに基づき得る。Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体は治療有効量で単独で、医薬組成物の一部として、または第２物質と組み合わせて投与され得る。１つの実施形態では、前記投与はＡｎｇｐｔｌ４機能を付与することにより前記状態を治療する。代替実施形態では、前記投与は、非限定的に例示される低いＬＰＬ阻害を呈するかまたは開裂に対して耐性であるＡｎｇｐｔｌ４機能のような修飾Ａｎｇｐｔｌ４機能を付与することにより前記状態を治療する。
【００１８】
第８の態様で、本発明は第１〜第６の態様の方法において使用するための医薬組成物を提供する。この組成物は、１つ以上のＡｎｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を含む。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドは配列番号１、３、５、７、９または１０の配列を含む。或いは、アミノ酸配列は野生型Ａｎｇｐｔｌ４に匹敵する活性を有する上記配列のいずれかの断片である。もっと更なる実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体は本明細書中に記載されている誘導体であり、低いＬＰＬ阻害活性、開裂耐性またはその組合せを有するように修飾されている。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体シアル化されている。前記誘導体は本明細書中に記載されているＡｎｇｐｌｔ４ポリペプチドのいずれかに基づき得る。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下の検討において、幾つかの論文及び方法が背景及び序説の目的で記載されている。ここに含まれているものはいずれも従来技術の「承認」として解釈されない。出願人は、必要に応じて本明細書中で参照されている文献及び方法は適用可能な条項の下で従来技術を構成しないことを証明する権利を明白に留保している。
【００２０】
ネフローゼ症候群を研究しながら、有足細胞から分泌されたＡｎｇｐｔｌ４が蛋白尿を誘発したことに注目した。より重要なことは、本明細書中に記載されているように、循環Ａｎｇｐｔｌ４はトランスジェニック動物モデルにおいて蛋白尿を減少させた。ＭＣＤ及びＭＮのようなネフローゼ症候群において高レベルのＡｎｇｐｔｌ４が認められたが、Ａｎｇｐｔｌ４の高い循環レベルはネフローゼ症候群の原因と関係していなかった。
【００２１】
高いＡｎｇｐｔｌ４レベルはネフローゼ症候群を治療し、関連する蛋白尿を減少させることが判明しているが、例えば非限定的に例示されるＬＰＬの阻害を介して、循環中の高Ａｎｇｐｔｌ４は高脂血症（高トリグリセリド血症）を誘発することが観察された。高脂血症のマイナスの結果をもたらすことなく高い循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルの恩恵を与えることは有利である。そのようなアプローチは本明細書中に開示されているＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体を使用することにより可能である。
【００２２】
アンジオポエチン様タンパク質は高トリグリセリド血症及び腫瘍転移の発症に関与しており、機能的にアンジオポエチンと区別される。Ａｎｇｐｔｌ４は、肝臓及び脂肪組織において高度に発現し、白色脂肪組織及び肝臓において絶食することにより強く誘発されるＰＰＡＲ（８）及びＰＰＡＲ（９）標的遺伝子であり、酸素正常条件下で血管内皮細胞に対するアポトーシス生存因子である（１０）。Ａｎｇｐｔｌ４はＬＰＬの強力な阻害剤であり（１１）、静脈内注射またはアデノウイルス媒介発現後明らかな高トリグリセリド血症が誘発される（１２，１３）。他の研究は、ノーザンブロット分析で心筋細胞及び骨格筋におけるＡｎｇｐｔｌ４の少ない発現及び全腎臓における低レベルの発現を示した（８）。最近のＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の集団ベース研究はヒトにおいてトリグリセリドレベルに影響を与えるバリアントを示している（１４，１５）。
【００２３】
本発明は、非限定的に例示されるＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ、ＭＰＧＮ及び糖尿病性腎症のようなネフローゼ症候群で観察される蛋白尿の減少における循環Ａｎｇｐｔｌ４の決定的な役割を示す。
【００２４】
定義
本明細書中で使用されている用語「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、「抑制（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、「抑制する（ｓｕｐｐｒｅｓｓ）」及び「抑制する（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ）」は、疾患または状態の症状、様相または特徴を予防または抑制すべく前記症状、様相または特徴の発症前に開始させる一連の行動（例えば、化合物または医薬組成物を投与する）を指す。前記予防及び抑制は有用であるために絶対的である必要はない。
【００２５】
本明細書中で使用されている用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔ）」及び「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患または状態の症状、様相または特徴を予防または抑制すべく前記症状、様相または特徴の発症後に開始させる一連の行動（例えば、化合物または医薬組成物を投与する）を指す。前記治療は有用であるために絶対的である必要はない。
【００２６】
本明細書中で使用されている用語「治療を要する」は、患者が治療を要するかまたは治療の恩恵を受けるであろうという介護者によりなされる判断を指す、この判断は、本発明の方法または化合物により治療可能である疾患または状態の結果として、介護者の経験の範囲内であるが、患者が病気であるかまたは病気であろうという知識を含む各種要因に基づいてなされる。
【００２７】
本明細書中で使用されている用語「予防を要する」は、患者が予防を要するかまたは予防の恩恵を受けるであろうという介護者によりなされる判断を指す。この判断は、本発明の方法または化合物により予防可能である疾患または状態の結果として。介護者の経験の範囲内であるが、患者が病気であるかまたは病気であろうという知識を含む各種要因に基づいてなされる。
【００２８】
本明細書中で使用されている用語「個人」、「被験者」または「患者」は、マウス、ラット、他の齧歯類、家兔、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマまたは霊長類、及びヒトのような哺乳動物を含めた動物を指す。この用語は雄及び／または雌を特定せず、或いは雄または雌を排除し得る。
【００２９】
本明細書中で使用されている用語「治療有効量」は、疾患または状態の症状、様相または特徴に対して検出可能なプラスの効果を有することができる単独または医薬組成物の一部としての化合物の量を指す。前記効果は有用であるために絶対的である必要はない。Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体を指す場合、用語「治療有効量」は被験者において蛋白尿を減少させるのに十分な前記ポリペプチドの量を指す。
【００３０】
用語「医薬的に許容され得る誘導体」は、被験者に対して投与すると野生型Ａｎｇｐｔｌ４の機能を（直接または間接的に）付与することができる本発明のＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体の医薬的に許容され得る塩、エステル、エステルの塩、溶媒和物または他の誘導体を意味する。ある実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体は低いＬＰＬ阻害活性または開裂耐性を示す。特に有利な誘導体は、本発明のＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を被験者に対して（例えば、経口投与した化合物を血液中により容易に吸収させることにより）前記ポリペプチドのバイオアベイラビリティーを高める、前記ポリペプチドの所与の生物学的コンパートメントへのデリバリーを高める、注射により投与できるように可溶性を向上させる、代謝を変化させる、または排泄率を変化させるものである。１つの実施形態では、誘導体はプロドラッグである。
【００３１】
用語「医薬的に許容され得る塩」には、別段の指示がない限り、本発明のＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体中に存在し得る酸性または塩基性基の塩が含まれる。
【００３２】
用語「約」及び「おおよそ」は、通常測定値の種類または精度を考えると、測定した量についての誤差または変動の許容され得る程度を意味する。典型的には、誤差または変動の例示的程度は所与の値または値の範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内である。生物学的系の場合、用語「約」は誤差の許容され得る標準偏差、好ましくは所与の値の２倍以下を指す。本明細書中で挙げられている数量は、別段の記載がない限り概算であり、用語「約」及び「おおよそ」は明確に記述されていないときには推測され得ることを意味する。
【００３３】
治療及び予防方法
本発明はネフローゼ症候群の治療及び／または予防方法を提供する。更に、本発明はＭＣＤ、ＦＳＧＳ及び／または糸球体間質損傷を伴う状態（例えば、真性糖尿病）の治療及び／または予防方法を提供する。本発明は更に、糖尿病状態の治療及び／または予防方法を提供する。１つの実施形態では、糖尿病状態は糖尿病性腎症、真性糖尿病、ループス腎炎または原発性糸球体疾患である。加えて、本発明は、非限定的に例示される蛋白尿、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症及び浮腫のようなネフローゼ症候群の１つ以上の症状の寛解方法を提供する。もっと更に、本発明は蛋白尿の減少方法を提供する。なお更に、本発明は、浮腫を軽減する方法を提供する。加えて、本発明は１つ以上のＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体を含む医薬組成物を提供する。Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体の性質は以下に更に詳細に記載する。
【００３４】
１つの実施形態では、本発明の教示は治療または予防を要する被験者におけるネフローゼ症候群の治療及び／または予防を提供する。１つの実施形態では、ネフローゼ症候群はＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ及びＭＰＧＮとして特徴づけられる。別の実施形態では、ネフローゼ症候群はＭＣＤとして特徴づけられる。更なる実施形態では、ネフローゼ症候群はＦＳＧＳにより引き起こされる。更なる実施形態では、ネフローゼ症候群は糖尿病状態により引き起こされる。１つの実施形態では、糖尿病状態は糖尿病性腎症、真性糖尿病、ループス腎炎または原発性糸球体疾患である。方法は被験者に対してＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体を投与するステップを含む。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドは配列番号１、３、５、７、９または１０の配列を含む。或いは、アミノ酸配列は野生型Ａｎｇｐｔｌ４に匹敵する活性を有する前記配列のいずれかの断片である。なお更なる実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体は本明細書中に記載されている誘導体であり、低いＬＰＬ阻害活性、開裂耐性またはその組合せを有するように修飾されている。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体はシアル化されている。前記誘導体は本明細書中に記載されているＡｎｇｐｌｔ４ポリペプチドのいずれかに基づき得る。Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体は治療有効量で単独で、医薬組成物の一部として、または第２物質と組合せて投与され得る。１つの実施形態では、前記投与はＡｎｇｐｔｌ４機能を付与することによりネフローゼ症候群を治療する。代替実施形態では、前記投与は、非限定的に例示される低いＬＰＬ阻害または開裂耐性を示すＡｎｇｐｔｌ４機能のような修飾Ａｎｇｐｔｌ４機能を付与することによりネフローゼ症候群を治療する。この方法は更に治療及び／または予防を要する被験者を同定することを含み得る。
【００３５】
代替実施形態では、本発明の教示は治療または予防を要する被験者におけるＭＣＤの治療及び／または予防を提供する。この方法は、被験者に対してＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体を投与するステップを含む。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドは配列番号１、３、５、７、９または１０の配列を含む。或いは、アミノ酸配列は野生型Ａｎｇｐｔｌ４に匹敵する活性を有する上記配列のいずれかの断片である。なお更なる実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体は本明細書中に記載されている誘導体であり、低いＬＰＬ阻害活性、開裂耐性またはその組合せを有するように修飾されている。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体はシアル化されている。前記誘導体は本明細書中に記載されているＡｎｇｐｌｔ４ポリペプチドのいずれかに基づき得る。Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体は治療有効量で単独で、医薬組成物の一部として、または第２物質と組合せて投与され得る。１つの実施形態では、前記投与はＡｎｇｐｔｌ４機能を付与することによりＭＣＤを治療する。代替実施形態では、前記投与は、非限定的に例示される低いＬＰＬ阻害または開裂耐性を示すＡｎｇｐｔｌ４機能のような修飾Ａｎｇｐｔｌ４機能を付与することによりＭＣＤを治療する。この方法は更に治療及び／または予防を要する被験者を同定することを含み得る。
【００３６】
更なる実施形態では、本発明の教示は、非限定的に例示される蛋白尿、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症及び浮腫のようなネフローゼ症候群の１つ以上の症状の緩和方法を提供する。１つの実施形態では、ネフローゼ症候群はＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ、ＭＰＧＮ及び糖尿病性腎症として特徴づけられる。別の実施形態では、ネフローゼ症候群はＭＣＤとして特徴づけられる。更なる実施形態では、ネフローゼ症候群はＦＳＧＳにより引き起こされる。更なる実施形態では、ネフローゼ症候群は糖尿病状態により引き起こされる。１つの実施形態では、糖尿病状態は糖尿病性腎症、真性糖尿病、ループス腎炎または原発性糸球体疾患である。この方法は、被験者に対してＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体を投与するステップを含む。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドは配列番号１、３、５、７、９または１０の配列を含む。或いは、アミノ酸配列は野生型Ａｎｇｐｔｌ４に匹敵する活性を有する上記配列のいずれかの断片である。なお更なる実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体は本明細書中に記載されている誘導体であり、低いＬＰＬ阻害活性、開裂耐性またはその組合せを有するように修飾されている。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体はシアル化されている。前記誘導体は本明細書中に記載されているＡｎｇｐｌｔ４ポリペプチドのいずれかに基づき得る。Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体は治療有効量で単独で、医薬組成物の一部として、または第２物質と組合せて投与され得る。１つの実施形態では、前記投与はＡｎｇｐｔｌ４機能を付与することによりネフローゼ症候群の１つ以上の症状を緩和する。代替実施形態では、前記投与は、非限定的に例示される低いＬＰＬ阻害または開裂耐性を示すＡｎｇｐｔｌ４機能のような修飾Ａｎｇｐｔｌ４機能を付与することによりネフローゼ症候群の１つ以上の症状を緩和する。この方法は更に治療及び／または予防を要する被験者を同定することを含み得る。
【００３７】
なお更なる実施形態では、本発明の教示は被験者における蛋白尿を軽減させるための方法を提供する。１つの実施形態では、被験者はネフローゼ症候群を患っている。１つの実施形態では、ネフローゼ症候群はＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ、ＭＰＧＮ及び糖尿病性腎症として特徴づけられる。別の実施形態では、ネフローゼ症候群はＭＣＤとして特徴づけられる。更なる実施形態では、ネフローゼ症候群はＦＳＧＳにより引き起こされる。更なる実施形態では、ネフローゼ症候群は糖尿病状態により引き起こされる。１つの実施形態では、糖尿病状態は糖尿病性腎症、真性糖尿病、ループス腎炎または原発性糸球体疾患である。この方法は、被験者に対してＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体を投与するステップを含む。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドは配列番号１、３、５、７、９または１０の配列を含む。或いは、アミノ酸配列は野生型Ａｎｇｐｔｌ４に匹敵する活性を有する上記配列のいずれかの断片である。なお更なる実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体は本明細書中に記載されている誘導体であり、低いＬＰＬ阻害活性、開裂耐性またはその組合せを有するように修飾されている。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体はシアル化されている。前記誘導体は本明細書中に記載されているＡｎｇｐｌｔ４ポリペプチドのいずれかに基づき得る。Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体は治療有効量で単独で、医薬組成物の一部として、または第２物質と組合せて投与され得る。１つの実施形態では、前記投与はＡｎｇｐｔｌ４機能を付与することにより蛋白尿を減少させる。代替実施形態では、前記投与は、非限定的に例示される低いＬＰＬ阻害または開裂耐性を示すＡｎｇｐｔｌ４機能のような修飾Ａｎｇｐｔｌ４機能を付与することにより蛋白尿を減少させる。この方法は更に治療及び／または予防を要する被験者を同定することを含み得る。
【００３８】
もっと更なる実施形態では、本発明の教示は被験者における浮腫を軽減させるための方法を提供する。１つの実施形態では、被験者はネフローゼ症候群を患っている。１つの実施形態では、ネフローゼ症候群はＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ、ＭＰＧＮ及び糖尿病性腎症として特徴づけられる。別の実施形態では、ネフローゼ症候群はＭＣＤとして特徴づけられる。更なる実施形態では、ネフローゼ症候群はＦＳＧＳにより引き起こされる。更なる実施形態では、ネフローゼ症候群は糖尿病状態により引き起こされる。１つの実施形態では、糖尿病状態は糖尿病性腎症、真性糖尿病、ループス腎炎または原発性糸球体疾患である。特定実施形態では、浮腫はアルブミンのような血漿タンパク質の低い循環レベルにより引き起こされる。Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体の投与により蛋白尿を減少させると、蛋白尿が減少し、血漿タンパク質レベルが上昇し、これにより浮腫が軽減する。この方法は、被験者に対してＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体を投与するステップを含む。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドは配列番号１、３、５、７、９または１０の配列を含む。或いは、アミノ酸配列は野生型Ａｎｇｐｔｌ４に匹敵する活性を有する上記配列のいずれかの断片である。なお更なる実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体は本明細書中に記載されている誘導体であり、低いＬＰＬ阻害活性、開裂耐性またはその組合せを有するように修飾されている。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体はシアル化されている。前記誘導体は本明細書中に記載されているＡｎｇｐｌｔ４ポリペプチドのいずれかに基づき得る。Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体は治療有効量で単独で、医薬組成物の一部として、または第２物質と組合せて投与され得る。１つの実施形態では、前記投与はＡｎｇｐｔｌ４機能を付与することにより浮腫を軽減させる。代替実施形態では、前記投与は、非限定的に例示される低いＬＰＬ阻害または開裂耐性を示すＡｎｇｐｔｌ４機能のような修飾Ａｎｇｐｔｌ４機能を付与することにより浮腫を軽減させる。この方法は更に治療及び／または予防を要する被験者を同定することを含み得る。
【００３９】
なお更なる実施形態では、本発明の教示は被験者における高コレステロール血症及び／または高トリグリセリド血症を低下させるための方法を提供する。１つの実施形態では、被験者はネフローゼ症候群を患っている。１つの実施形態では、ネフローゼ症候群はＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ、ＭＰＧＮ及び糖尿病性腎症として特徴づけられる。別の実施形態では、ネフローゼ症候群はＭＣＤとして特徴づけられる。更なる実施形態では、ネフローゼ症候群はＦＳＧＳにより引き起こされる。更なる実施形態では、ネフローゼ症候群は糖尿病状態により引き起こされる。１つの実施形態では、糖尿病状態は糖尿病性腎症、真性糖尿病、ループス腎炎または原発性糸球体疾患である。この方法は、被験者に対してＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体を投与するステップを含む。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドは配列番号１、３、５、７、９または１０の配列を含む。或いは、アミノ酸配列は野生型Ａｎｇｐｔｌ４に匹敵する活性を有する上記配列のいずれかの断片である。なお更なる実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体は本明細書中に記載されている誘導体であり、低いＬＰＬ阻害活性、開裂耐性またはその組合せを有するように修飾されている。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体はシアル化されている。前記誘導体は本明細書中に記載されているＡｎｇｐｌｔ４ポリペプチドのいずれかに基づき得る。Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体は治療有効量で単独で、医薬組成物の一部として、または第２物質と組合せて投与され得る。１つの実施形態では、前記投与はＡｎｇｐｔｌ４機能を付与することにより蛋白尿を減少させる。代替実施形態では、前記投与は、非限定的に例示される低いＬＰＬ阻害または開裂耐性を示すＡｎｇｐｔｌ４機能のような修飾Ａｎｇｐｔｌ４機能を付与することにより蛋白尿を減少させる。この方法は更に治療及び／または予防を要する被験者を同定することを含み得る。
【００４０】
なお更なる実施形態では、本発明の教示は糖尿病状態により引き起こされるネフローゼ症候群を治療及び／または予防するための方法を提供する。１つの実施形態では、糖尿病状態は糖尿病性腎症、真性糖尿病、ループス腎炎または原発性糸球体疾患である。この方法は、被験者に対してＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体を投与するステップを含む。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドは配列番号１、３、５、７、９または１０の配列を含む。或いは、アミノ酸配列は野生型Ａｎｇｐｔｌ４に匹敵する活性を有する上記配列のいずれかの断片である。なお更なる実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体は本明細書中に記載されている誘導体であり、低いＬＰＬ阻害活性、開裂耐性またはその組合せを有するように修飾されている。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体はシアル化されている。前記誘導体は本明細書中に記載されているＡｎｇｐｌｔ４ポリペプチドのいずれかに基づき得る。Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体は治療有効量で単独で、医薬組成物の一部として、または第２物質と組合せて投与され得る。１つの実施形態では、前記投与はＡｎｇｐｔｌ４機能を付与することにより前記状態を治療する。代替実施形態では、前記投与は、非限定的に例示される低いＬＰＬ阻害または開裂耐性を示すＡｎｇｐｔｌ４機能のような修飾Ａｎｇｐｔｌ４機能を付与することにより前記状態を治療する。
【００４１】
Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたは誘導体を投与する幾つかの実施形態は、ポリペプチドを血液にデリバリーする投与の形態を含む。１つの例では、ポリペプチドを静脈内に投与する。適切な投与形態を考慮すると、投与は経口、皮下、または当業界で公知の他の手段により実施され得る。Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたは誘導体は治療有効量で投与され得る。この量は通常化合物の質量／被験者の質量の比のある範囲内である。方法の幾つかの実施形態では、ポリペプチドを約０．００５〜１５０，０００μｇ／ｋｇ、０．５〜１５，０００μｇ／ｋｇ、５〜１５００μｇ／ｋｇ、または５０〜１５０μｇ／ｋｇの用量で投与する。よって、典型的な７０ｋｇの成人の場合、用量は０．００３５〜１１，０００ｍｇ、０．０３５〜１１００ｍｇ、０．３５〜１１０ｍｇ、または３．５〜１１ｍｇであり得る。投与は定期的に実施し得る。方法の幾つかの実施形態では、ポリペプチドを約１回／１４日投与する。他の実施形態では、ポリペプチドを約２回／月投与する。更に他の実施形態では、ポリペプチドを約１回／月〜約２回／月投与する。更なる実施形態では、ポリペプチドを１日間、２日間、３日間、１週間、１０日間、２週間、３週間、４週間及び１ヶ月からなる群から選択される所与の期間につき１回投与する。
【００４２】
スクリーニング方法
本発明は、ネフローゼ症候群、または非限定的に例示される蛋白尿、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症または浮腫のようなネフローゼ症候群に関連する状態を治療または予防するために有効である化合物を同定するための方法にも関する。１つの実施形態では、ネフローゼ症候群はＭＣＤまたはＭＮとして特徴づけられる。別の実施形態では、ネフローゼ症候群はＭＣＤとして特徴づけられる。別の実施形態では、ネフローゼ症候群はＦＳＧＳにより特徴づけられる。更なる実施形態では、ネフローゼ症候群は糖尿病状態により引き起こされる。１つの実施形態では、糖尿病状態は糖尿病性腎症、真性糖尿病、ループス腎炎または原発性糸球体疾患である。前記化合物は医薬組成物中に含まれる活性成分として、または単独で投与するために有用であり得る。１つの実施形態では、方法は、非限定的に例示されるＡｎｇｐｔｌ４のようなネフローゼ症候群の病因に関与するポリペプチドのレベルの測定を含む。
【００４３】
通常、スクリーニング方法は、非限定的に例示されるＡｎｇｐｔｌ４のようなネフローゼ症候群の病因に関与するポリペプチドを発現させる（以下により詳細に記載されている）アッセイシステムを用意するステップ、アッセイシステムに試験しようとする試験化合物を導入するステップ、及びポリペプチドのレベルに対して試験化合物が影響があるかを調べるステップを含む。この方法は、ポリペプチドのシアル化のレベルに影響を及ぼす候補物、試験化合物または物質（ポリペプチド、機能的核酸、炭水化物、抗体、小分子または他の分子）の同定を含む。その後、前記化合物は更に同定した化合物の活性を測定するために（非限定的に例示される本明細書中に記載されている動物モデル系のような）適切な系において試験され得る。
【００４４】
候補化合物は各種アッセイを用いて同定される。前記アッセイには、非限定的に例示されるＡｎｇｐｔｌ４のようなネフローゼ症候群の病因に関与するポリペプチドを発現する細胞を用いるアッセイ、または単離ペプチドを用いるアッセイが含まれるが、これらに限定されない。各種アッセイは各種の前記ポリペプチドのバリアント（例えば、完全長、生物学的に活性な断片、または所望ポリペプチドの全部または一部を含む融合タンパク質）を使用し得る。更に、前記ポリペプチドは適当な哺乳動物種（例えば、ヒト、ラットまたは齧歯類）から誘導され得る。特定実施形態では、ポリペプチドはヒトから誘導される。
【００４５】
アッセイが全細胞の使用を伴う場合、細胞は、非限定的に例示されるＡｎｇｐｔｌ４のようなネフローゼ症候群の病因に関与するポリペプチドを自然に発現し得、または該ポリペプチドを発現するように修飾され得る。後者の場合、細胞は慣用の分子生物学技術を用いて、例えば細胞に該ポリペプチドを含むウイルスを感染させることにより、所望のポリペプチドを発現するように修飾され得る。細胞は該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をトランスフェクトした原核または真核細胞でもあり得る。上記において、完全長ポリペプチド、断片、または該ポリペプチドの少なくとも一部を含む融合タンパク質を使用してもよい。例示的アッセイシステムは本明細書中に記載されている。
【００４６】
各種スクリーニングアッセイを本明細書中で検討されている病状及び状態の症状に対する試験化合物の効果の測定を伴うインビボアッセイと組み合わせてもよい。前記実施形態において、ネフローゼ症候群、または非限定的に例示される蛋白尿または浮腫のようなネフローゼ症候群に関連する状態に関連するパラメーターに影響を与えるかを調べるために化合物を評価し得る。前記パラメーターには、１）非限定的に例示されるＡｎｇｐｔｌ４のようなネフローゼ症候群及び関連状態の病因に関与するポリペプチドのレベルの測定、及び２）タンパク質排泄物の全体または特定成分のレベルの測定が含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
１つの実施形態では、前記スクリーニングアッセイは、例えば非限定的に例示されるＡｎｇｐｔｌ４のようなポリペプチドのレベルを測定し、試験化合物の非存在と比較して試験化合物の存在下でのポリペプチドのレベルの差を検出することにより実施され得る。前記スクリーニングアッセイはインビトロ、インビボまたはエクスビボであり得、（完全細胞またはライゼートを含む）細胞培養物であり得、または動物モデルに基づき得る。本発明のアッセイは上記方法において使用され得る。
【００４８】
スクリーニング方法において使用するための適当な試験化合物は適当なソース、例えば一般的な化合物ライブラリーから得ることができる。試験化合物は、生物学的ライブラリー、空間的にアドレス可能な平行固相または液相ライブラリー、デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー方法、「１ビーズ１化合物」ライブラリー方法、及びアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー方法を含めた当業界で公知のコンビナトリアルライブラリー方法における多数のアプローチを用いても得ることができる。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリーに適用可能である。分子ライブラリー合成のための方法の例は当業界で公知であり得る。化合物のライブラリーは溶液中、またはビーズ、細菌、胞子、プラスミドまたはファージ上に提示され得る。
【００４９】
本発明は本発明の方法を実施するためのキットも提供し、前記キットは本明細書中に開示されている化合物及び／または組成物、または本発明の方法を実施するために有用な他のものを含有し得る。
【００５０】
Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体の作成及び選択
アンジオポエチン関連タンパク質４はヒトにおいてＡＮＧＰＴＬ４遺伝子によりコードされるポリペプチドである。この遺伝子はアンジオポエチン／アンジオポエチン様遺伝子ファミリーのメンバーであり、Ｎ末端シグナル配列（配列番号１のアミノ酸残基１−２２）、コイルドコイルドメイン（配列番号１のアミノ酸残基２３−１７０）、リンカー領域（配列番号１のアミノ酸残基１７１−１８５）及びフィブリノーゲンＣ末端ドメイン（配列番号１のアミノ酸残基１８６−４０６）を有するグリコシル化分泌タンパク質をコードする。この遺伝子は低酸素条件下で内皮細胞中で誘発され、ペルオキシソーム増殖アクチベーターの標的である。コードされたタンパク質はグルコースホメオスタシス、脂質代謝及びインスリン感受性の調節に直接関与する血清ホルモンであり、血管内皮細胞に対するアポトーシス生存因子としても作用する。各種イソ型をコードする選択的スプライシング転写バリアントは記載されている。この遺伝子は以前ＡＮＧＰＴＬ２と称されていたが、ＡＮＧＰＴＬ４と新たに命名されている。
【００５１】
Ａｎｇｐｔｌ４はＬＰＬダイマー分子を分解することによりＬＰＬを阻害する。Ａｎｇｐｔｌ４は、血漿トリグリセリド（ＴＧ）レベルを上昇させる血液血漿ＴＧクリアランスの強力なインヒビターとして明確に確立されている。最近のエビデンスは、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドの配列中の変化がトリグリセリドに対して影響を与えることを示しており、ある変異はＬＰＬの低い阻害を暗示する低いトリグリセリドレベルを付与する（３３及び３４，その各々はＡｎｇｐｔｌ４バリアントの教示のために参照により組み入れられる）。更に、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドはオリゴマーの形態で存在し、ＬＰＬ活性を阻害するためにはオリゴマー化が必要であると報告されている。細胞から分泌されると、オリゴマー形態は開裂部位（配列番号１及び３のＲ１６１ＲＫＲ１６４）で開裂して、モノマーＣ末端形態及びオリゴマーＮ末端形態が生ずる（３４）。Ａｎｇｐｔｌ４ペプチドのＮ末端残基１−１８７はＬＰＬを阻害するのに十分であることが判明した（３３）。
【００５２】
ヒト、ラット及びマウスのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列は図５に示されており、配列番号１〜８と称されている。本発明は、非限定的に例示される治療及び予防方法のような本明細書中に開示されている方法におけるＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド及びポリペプチド誘導体の使用を考えている。本明細書中で定義されているように、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体は、配列番号１または３に示すヒトポリペプチド、または配列番号５または７に示すポリペプチドのアミノ酸配列からわかるように１つ以上の挿入、欠失及び／または置換を含むＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドを指す。
【００５３】
Ａｎｇｐｔｌ４誘導体の幾つかの実施形態は、配列番号１、３、５または７の２つ以上の間のコンセンサス配列であるコア構造及び本明細書中に記載されている１つ以上の置換を含む。Ａｎｇｐｔｌ４誘導体の１つの実施形態は配列番号１及び３（いずれも、ヒトＡｎｇｐｔｌのバージョン）間にコンセンサス配列を含む。前記コンセンサス配列は、
Ａ−Ｂ−Ｃ
（ここで、Ａは配列番号２６に対して少なくとも８０％相同であり、Ｂは０〜３８残基のオリゴペプチド（任意の連結領域）であり、Ｃは配列番号２７に対して少なくとも８０％相同である）からなる。配列番号２６に対するＡ及び配列番号２７に対するＣの相同性のレベルは勿論８０％以上であり得る。これらの相同性レベルは８０〜１００％、例えば８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％及び１００％から独立して選択され得る。オリゴペプチドＢの配列は任意の配列であり得る。オリゴペプチドＢの幾つかの実施形態は配列番号１の１８４−２２２位に対して少なくとも５０％相同である。前記実施形態では、相同性レベルは５０〜１００％の範囲の任意の点、例えば６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％及び１００％から選択され得る。
【００５４】
Ａｎｇｐｔｌ４誘導体の別の実施形態は、配列番号１、３、５及び７（ヒトバリアント、ラット及びマウス）の全ての間にコンセンサス配列を含む。前記コンセンサス配列は、
Ｖ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚ
（ここで、Ｖは配列番号２３に対して少なくとも８０％の相同性を有し、Ｗは０〜５残基のオリゴペプチドであり、Ｘは配列番号２４に対して少なくとも８０％の相同性を有し、Ｙは０〜３８残基のオリゴペプチド（任意の連結領域）であり、Ｚは配列番号２５に対して少なくとも８０％の相同性を有する）
からなる。配列番号２３に対するＶ、配列番号２２に対するＸ、配列番号２５に対するＺの相同性レベルは８０％以上であり得る。相同性レベルは８０〜１００％、例えば８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％及び１００％から独立して選択され得る。オリゴペプチドＹの配列は任意の配列であり得る。オリゴペプチドＢの幾つかの実施形態は配列番号１の１８４−２２２位に対して少なくとも５０％相同である。前記実施形態では、相同性レベルは５０〜１００％の範囲の任意の点、例えば６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％及び１００％から選択され得る。
【００５５】
これらのコンセンサス配列により、本明細書に教示されているようにＬＰＬ阻害活性を減ずるのに役立ち得る配列番号１の３９、４０、４６、５０及び５３位に相当する位置での置換が可能である。コンセンサス配列により、本明細書で教示されているように開裂に対するタンパク質の耐性を高めるのに役立ち得る配列番号１の６３−６６位に相当する位置での置換も可能である。コンセンサス配列はＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）を用いる検索により公知の天然ヒトバリアントの部位であることが明らかとなったので、配列番号１の５、６７、７２、７７、１６７、１７４、１９０、２３０、２３３、２３７、２５１、２６６、２７８、２９１、２９３、２９６、３０７、３０８、３３６、３３８、３４９、３６１、３７１及び３８４位に相当する位置での置換も可能である。Ａｎｇｐｔｌ４誘導体の特定実施形態はこれらの位置で以下の置換：Ｐ５Ｌ、Ｓ６７Ｒ、Ｒ７２Ｌ、Ｇ７７Ｒ、Ｅ１６７Ｋ、Ｐ１７４Ｓ、Ｅ１９０Ｑ、Ｅ１９６Ｋ、Ｒ２３０Ｃ、Ｇ２３３Ｒ、Ｆ２３７Ｖ、Ｐ２５１Ｔ、Ｔ２６６Ｍ、Ｒ２７８Ｑ、Ｖ２９１Ｍ、Ｌ２９３Ｍ、Ｅ２９６Ｖ、Ｐ３０７Ｓ、Ｖ３０８Ｍ、Ｒ３３６Ｃ、Ｄ３３８Ｅ、Ｗ３４９Ｃ、Ｇ３６１Ｒ、Ｇ３６１Ｓ、Ｒ３７１Ｑ及びＲ３８４Ｗの１つ以上を含む。天然に存在する置換はタンパク質の機能を保存すると予想される。
【００５６】
１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドのアミノ酸残基を除去し、異なるアミノ酸残基で置換する。バリアントは本明細書中に記載されているように、または当業界で公知のように構築され得る。こうして構築されたバリアントは活性をスクリーニングするために本明細書中に記載されている方法及びアッセイを用いて評価され得る。
【００５７】
本明細書中で使用されるとき、アミノ酸を指すために使用されている一文字表記は次の意味を有する：
【００５８】
【表１】
2016516726.tif 000003
【００５９】
１つの実施形態では、バリアントは、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドのアミノ酸配列中にＬＰＬを阻害するかまたは開裂に対して耐性であるＡｎｇｐｔｌ４の能力を低下させる変化を含む。この変化はこの領域中の１つ以上の残基の交換、欠失及び／または置換であり得る。このような変化は当業界で公知である（これらの教示のために参照により本明細書に組み入れる参考文献３３及び３４を参照されたい）。１つの実施形態では、前記変化は配列番号１の残基１−１８７、配列番号３の残基１−１８２、配列番号２６の残基１−１８２、配列番号２３中の任意の残基、及び配列番号２４中の残基１−７９で生じる。
【００６０】
Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体の幾つかの実施形態は、配列番号１の３９−５５位（ＤＥＭＮＶＬＡＨＧＬＬＱＬＧＱＧＬ）でヒト野生型配列と異なる。この領域は配列番号１、３、５、７、２２及び２４の３９−５５位に相当する。誘導体の追加の実施形態は、３９−５５位にＤＥＭＮＶＬＡＨＧＬＬＱＬＧＱＧＬ（配列番号１の３９−５５位）でも、ＤＫＭＮＶＬＡＨＧＬＬＱＬＧＱＧＬ（配列番号２８）でもない配列を含む。Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体の更なる実施形態は、Ｖの３９−４０位がＤＥではなく、Ｖの４６位がＨではなく、Ｖの５０位がＱではなく、Ｖの５３位がＱでないように３９、４０、４６、５０及び５３位に少なくとも１つの置換を有する。
【００６１】
幾つかの実施形態では、前記変化は配列番号１、３、５、７、２２または２４に対して４０位で生ずる。１つの実施形態では、４０位のアミノ酸（野生型Ａｎｇｐｔｌ４中の負帯電グルタミン酸残基）を中性のアミノ酸または正帯電アミノ酸で置換する。特定実施形態では、変化はＥ４０Ｋ置換である。別の特定実施形態では、変化はＥ４０Ａ置換である。Ｅ４０Ｋ及びＥ４０Ａ置換はＡｎｇｐｔｌ４によるＬＰＬ阻害を減ずるが、ポリペプチドの発現、分泌、プロセッシング及び他の機能を干渉しないことが判明している。更なる特定実施形態では、４０位の変化は下表１に示すものから選択される。もっと更なる実施形態では、配列番号１、３、５、７、２１または２４の３９位のアミノ酸（野生型Ａｎｇｐｔｌ４中の負帯電アスパラギン酸残基）を中性または正帯電アミノ酸で置換する。１つの実施形態では、置換はＤ３９Ａ置換のＤ３９Ｋ置換である。更なる特定実施形態では、配列番号１、３、５、７、２１または２４の３９位の変化は下表に示すものから選択される。幾つかの実施形態では、ポリペプチドバリアントは４０位に上記変化の１つ、３９位に上記変化の１つ、または上記の組合せを含み得る。特定実施形態では、ポリペプチドはＤ３９Ｋ置換とＥ４０Ｋ置換、Ｄ３９Ａ置換及びＥ４０Ｋ置換、またはＤ３９Ｋ置換とＥ４０Ａ置換を含む。ポリペプチド誘導体の更なる特定の実施形態では、３９−４０位の配列はＤＫ、ＫＥ、ＤＡ及びＡＥからなる群から選択される。ポリペプチド誘導体のなお別の実施形態では、３９−４０位の配列はＤＥではない。
【００６２】
【表２】
2016516726.tif 000004
【００６３】
別の実施形態では、誘導体はポリペプチドの開裂に関与するＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドの領域中に１つ以上の変化を含む。１つの実施形態では、この領域はＡｎｇｐｔｌ４のＲ１６１ＲＫＲ１６４領域（配列番号１、３、５、７及び２６の１６１−１６４位、及び配列番号２４の６３−６６位に相当）である。変化はこの領域中の１つ以上の残基の交換、欠失及び／または置換であり得る。Ｒ１６１ＲＫＲ１６４領域はオリゴマー形態のＡｎｇｐｔｌ４の開裂に関与して、Ｎ末端配列のオリゴマー及びＣ末端配列のモノマーを放出することが判明している。変異した開裂部位を有するＡｎｇｐｔｌ４の形態は野生型ポリペプチドよりも循環中により高いレベルで蓄積することが判明した。更に、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドの開裂を防止すると、本発明で有効であると観察されたＡｎｇｐｔｌ４のオリゴマー形態が安定化する。１つの実施形態では、配列がＲＲＫＲでないようにＲ１６１ＲＫＲ１６４領域の４つのアミノ酸残基のすべてを変化させる。代替実施形態では、Ｒ１６１ＲＫＲ１６４領域の１、２または３つのアミノ酸残基のいずれかを変化させる。更なる実施形態では、１６１、１６２または１６４位のアルギニン残基を独立してグリシン、アラニン、バリンまたはセリンで置換し、１６３位のリシン残基をグリシン、アラニン、バリンまたはセリンで置換する。特定実施形態では、Ｒ１６１ＲＫＲ１６４配列をＧＡＡＧ（配列番号２９）、ＧＳＧＳ（配列番号８０）、ＧＶＶＡ（配列番号４９）、ＳＧＧＧ（配列番号８７）及びＶＡＶＡ（配列番号９０）からなる群から選択される配列で置換する。更なる特定実施形態では、Ｒ１６１ＲＫＲ１６４配列をＡＡＶＶで置換する。配列番号１または３の全Ｒ１６１ＲＫＲ１６４領域の置換のための例示的アミノ酸配列を下表２に示す。
【００６４】
【表３】
2016516726.tif 000005
【００６５】
更なる実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４が開裂に対して耐性であるようにＡｎｇｐｌｔ４を開裂し得る酵素のコンセンサス結合部位を除去すべくＲ１６１ＲＫＲ１６４配列中の１つ以上のアミノ酸が改変されている。１つの実施形態では、酵素はプロタンパク質変換酵素であり、コンセンサス結合部位はＲＸＫＲ、ＲＸＲＲ、ＲＲまたはＫＲ（ここで、Ｘはアミノ酸である）である。前記改変を加える場合、１つ以上のアミノ酸を欠失させ、或いはグリシン、アラニン、バリンまたはセリン、または本明細書中で検討されている他の置換基で置換され得る。
【００６６】
なお更なる実施形態では、バリアントはポリペプチドのオリゴマー化に関与するＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドの領域に１つ以上の変化を含む。１つの実施形態では、この領域はＡｎｇｐｔｌ４のＣ７６及び／またはＣ８０領域である。Ｃ７６及び／またはＣ８０領域はＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドのオリゴマー化に関与することが判明している（３４，この文献はこの教示のために本明細書に組み入れる）。変化はこの領域における１つ以上の残基の交換、欠失及び／または置換であり得る。特定実施形態では、７６及び８０位のシステイン残基の１つのみが置換されている。代替実施形態では、７６及び８０位の両方のシステイン残基が置換されている。１つの実施形態では、７６及び８０位のシステイン残基の少なくとも１つが独立してアラニンまたはセリンで置換されている。別の実施形態では、両方のシステイン残基がアラニンまたはセリンで置換されている。
【００６７】
更なる実施形態では、バリアントは、Ａｎｇｐｌｔ４のＲ１６１ＲＫＲ１６４領域中にＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドオリゴマーの開裂を抑制する１つ以上の変化、及びＬＰＬ活性のＡｎｇｐｔｌ４による阻害を抑える４０位の変化を含む。本明細書において検討されている変化が含まれる。
【００６８】
１つの実施形態では、本発明は配列番号９または１０のアミノ酸配列を有するＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドバリアントを提供する。配列番号９は図４に示されており、３９、４０、７６、８０及び１６１−１６４位でのそれぞれＸ３９、Ｘ４０、Ｘ７６、Ｘ８０、Ｘ１６１、Ｘ１６２、Ｘ１６３及びＸ１６４による置換を除いて、配列番号１のＡｎｇｐｔｌ４の野生型配列を含む。配列番号１０は図４に示されており、３９、４０、７６、８０及び１６１−１６４位でのそれぞれＸ３９、Ｘ４０、Ｘ７６、Ｘ８０、Ｘ１６１、Ｘ１６２、Ｘ１６３及びＸ１６４による置換を除いて、配列番号３のＡｎｇｐｔｌ４の野生型配列を含む。
【００６９】
配列番号９及び１０では、Ｘ３９はＡ、Ｇ、Ｐ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＫであり得る。１つの実施形態では、Ｘ３９は中性または正帯電アミノ酸である。更なる実施形態では、Ｘ３９はＡまたはＫであり得る。なお更なる実施形態では、Ｘ３９はＤであり得る。
【００７０】
配列番号９及び１０では、Ｘ４０はＡ、Ｇ、Ｐ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＫであり得る。１つの実施形態では、Ｘ４０は中性または正帯電アミノ酸である。更なる実施形態では、Ｘ４０はＡまたはＫであり得る。なお更なる実施形態では、Ｘ４０はＥであり得る。もっと更なる実施形態では、Ｘ３９がＤでないならばＸ４０はＥであり得、Ｘ４０がＥでないならばＸ３９はＤであり得る。
【００７１】
配列番号９及び１０では、Ｘ７６及びＸ８０の少なくとも１つは置換され得る。１つの実施形態では、Ｘ７６及びＸ８０は独立してＡ、ＳまたはＣである。１つの実施形態では、Ｘ７６及びＸ８０の１つはＡまたはＳであり得、Ｘ７６及びＸ８０の他方はＣである。更なる実施形態では、Ｘ７６及びＸ８０の両方は独立してＡまたはＳであり得る。なお更なる実施形態では、Ｘ７６及びＸ８０の両方はＣであり得る。
【００７２】
配列番号９及び１０では、Ｘ１６１、Ｘ１６２、Ｘ１６３及びＸ１６４の少なくとも１つは置換され得る。１つの実施形態では、Ｘ１６１、Ｘ１６２、Ｘ１６３及びＸ１６４の４つすべてが置換されている。代替実施形態では、Ｘ１６１、Ｘ１６２、Ｘ１６３及びＸ１６４の１、２または３つが置換されている。更なる実施形態では、Ｘ１６１、Ｘ１６２、Ｘ１６３及びＸ１６４は独立してＤ、Ｒ、Ｋ、Ｇ、Ａ、ＶまたはＳである。なお更なる実施形態では、４つすべては表２に示されている組合せで置換されている。
【００７３】
本発明は、任意の形態の上記の組合せを考えている。更に、配列番号９及び１０中の指示されている残基は表３に示す保存的アミノ酸置換、或いは±１またはそれ未満の疎水性指標の差を有する残基、または±１またはそれ未満の親水性値の差を有する残基で置換され得る。
【００７４】
１つの実施形態では、Ｘ３９はＤであり、Ｘ４０はＡまたはＫであり、Ｘ７６及びＸ８０はＣであり、場合によりＸ１６１、Ｘ１６２、Ｘ１６３及びＸ１６４の少なくとも１つが配列番号１または３中に存在しないアミノ酸である条件でＸ１６１、Ｘ１６２、Ｘ１６３及びＸ１６４は独立してＤ、Ｒ、Ｋ、Ｇ、Ａ、ＶまたはＳで置換されている。別の実施形態では、Ｘ３９はＤであり、Ｘ４０はＡまたはＫであり、Ｘ７６及びＸ８０はＣであり、Ｘ１６１、Ｘ１６２、Ｘ１６３及びＸ１６４は表２に示す組合せから選択される。なお別の実施形態では、Ｘ３９はＤであり、Ｘ４０はＡまたはＫであり、Ｘ７６及びＸ８０はＣであり、Ｘ１６１、Ｘ１６２、Ｘ１６３及びＸ１６４はＧＳＧＳまたはＧＡＡＧである。
【００７５】
追加の実施形態では、Ｘ３９はＤであり、Ｘ４０はＡまたはＫであり、Ｘ７６及びＸ８０の１つはＡまたはＳであり、Ｘ７６及びＸ８０の他方はＣであり、場合によりＸ１６１、Ｘ１６２、Ｘ１６３及びＸ１６４の少なくとも１つが配列番号１または３中に存在しないアミノ酸である条件でＸ１６１、Ｘ１６２、Ｘ１６３及びＸ１６４は独立してＤ、Ｒ、Ｋ、Ｇ、Ａ、ＶまたはＳで置換されている。更なる実施形態では、Ｘ３９はＤであり、Ｘ４０はＡまたはＫであり、Ｘ７６及びＸ８０の１つはＡまたはＳであり、Ｘ７６及びＸ８０の他方はＣであり、Ｘ１６１、Ｘ１６２、Ｘ１６３及びＸ１６４は表２に示す組合せから選択される。なお更なる実施形態では、Ｘ３９はＤであり、Ｘ４０はＡまたはＫであり、Ｘ７６及びＸ８０の１つはＡまたはＳであり、Ｘ７６及びＸ８０の他方はＣであり、Ｘ１６１、Ｘ１６２、Ｘ１６３及びＸ１６４はＧＳＧＳまたはＧＡＡＧである。
【００７６】
１つの実施形態では、Ｘ３９はＡまたはＫであり、Ｘ４０はＥであり、Ｘ７６及びＸ８０はＣであり、場合によりＸ１６１、Ｘ１６２、Ｘ１６３及びＸ１６４の少なくとも１つが配列番号１または３中に存在しないアミノ酸である条件でＸ１６１、Ｘ１６２、Ｘ１６３及びＸ１６４は独立してＤ、Ｒ、Ｋ、Ｇ、Ａ、ＶまたはＳで置換されている。別の実施形態では、Ｘ３９はＡまたはＫであり、Ｘ４０はＥであり、Ｘ７６及びＸ８０はＣであり、Ｘ１６１、Ｘ１６２、Ｘ１６３及びＸ１６４は表２に示す組合せから選択される。なお別の実施形態では、Ｘ３９はＡまたはＫであり、Ｘ４０はＥであり、Ｘ７６及びＸ８０はＣであり、Ｘ１６１、Ｘ１６２、Ｘ１６３及びＸ１６４はＧＳＧＳまたはＧＡＡＧである。
【００７７】
１つの実施形態では、Ｘ３９はＤであり、Ｘ４０はＫであり、Ｘ７６及びＸ８０はＣであり、場合によりＸ１６１、Ｘ１６２、Ｘ１６３及びＸ１６４の少なくとも１つが配列番号１または３中に存在しないアミノ酸である条件でＸ１６１、Ｘ１６２、Ｘ１６３及びＸ１６４は独立してＤ、Ｒ、Ｋ、Ｇ、Ａ、ＶまたはＳで置換されている。別の実施形態では、Ｘ３９はＤであり、Ｘ４０はＫであり、Ｘ７６及びＸ８０はＣであり、Ｘ１６１、Ｘ１６２、Ｘ１６３及びＸ１６４は表２に示す組合せから選択される。なお別の実施形態では、Ｘ３９はＤであり、Ｘ４０はＫであり、Ｘ７６及びＸ８０はＣであり、Ｘ１６１、Ｘ１６２、Ｘ１６３及びＸ１６４はＧＳＧＳまたはＧＡＡＧである。
【００７８】
１つの実施形態では、Ｘ３９はＤであり、Ｘ４０はＫであり、Ｘ７６及びＸ８０の１つはＡまたはＳであり、Ｘ７６及びＸ８０の他方はＣであり、場合によりＸ１６１、Ｘ１６２、Ｘ１６３及びＸ１６４の少なくとも１つが配列番号１または３中に存在しないアミノ酸である条件でＸ１６１、Ｘ１６２、Ｘ１６３及びＸ１６４は独立してＤ、Ｒ、Ｋ、Ｇ、Ａ、ＶまたはＳで置換されている。別の実施形態では、Ｘ３９はＤであり、Ｘ４０はＫであり、Ｘ７６及びＸ８０の１つはＡまたはＳであり、Ｘ７６及びＸ８０の他方はＣであり、Ｘ１６１、Ｘ１６２、Ｘ１６３及びＸ１６４は表２に示す組合せから選択される。なお別の実施形態では、Ｘ３９はＤであり、Ｘ４０はＫであり、Ｘ７６及びＸ８０の１つはＡまたはＳであり、Ｘ７６及びＸ８０の他方はＣであり、Ｘ１６１、Ｘ１６２、Ｘ１６３及びＸ１６４はＧＳＧＳまたはＧＡＡＧである。
【００７９】
１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４誘導体はＡｎｇｐｌｔ４の断片に基づいている。適当な断片には、野生型Ａｎｇｐｌｔ４の活性を保持している断片または１００個以上の連続的アミノ酸の断片が含まれる。１つの実施形態では、前記断片は配列番号１のアミノ酸１−１８７または配列番号３のアミノ酸１−１８２に基づいている。前記断片は先のパラグラフに記載されているアミノ酸置換を有し得る。
【００８０】
Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体は野生型Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド活性に匹敵するかまたはそれより高い（１つの実施形態では、５０％以上）活性を有し得る。或いは、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体は野生型Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド活性と比較して低い（１つの実施形態では、５０％未満）活性を有し得る。特定実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体は低いＬＰＬの阻害能力を有し、高い開裂耐性を示す。
【００８１】
所望のＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体を生成するために当業者に公知のように欠失、付加及び置換を選択し得る。例えば、保存的置換または類似の特性を有するアミノ酸の置換は許容され得ると予想される。加えて、特定の欠失、挿入及び置換は幾つかのＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド活性にプラスまたはマイナスの影響を与え得るが、別のＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド活性には影響を与えない。
【００８２】
その組合せ（及びコーディングヌクレオチドに対する対応する修飾）を含めた配列番号１、３、５または７のアミノ酸配列に対する保存的修飾により、ＬＰＬ阻害活性のような望ましくない特性を最小限に抑えながら天然に存在するＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドに類似の機能的及び化学的特性を有するＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体が生成される。対照的に、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドの機能的及び／または化学的特性の実質的修飾は、置換エリア中の分子骨格の構造の維持に対する影響の点で大きく異なるその組合せを含めた配列番号１、３、５または７のアミノ酸配列の置換を選択することによりなし得る。
【００８３】
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置のアミノ酸残基の極性または電荷に殆どまたは全く影響がないような天然アミノ酸残基の非天然残基での置換を伴い得る。更に、ポリペプチド中の天然残基がアラニンでも置換されてもよい。
【００８４】
保存的アミノ酸置換は、典型的には生物学的系での合成ではなく化学的ペプチド合成により取り込まれる非天然アミノ酸残基も包含する。これらには、アミノ酸部分のペプチド模倣、及び他の逆転または倒置形態が含まれる。本明細書中に記載されている核酸及びポリペプチド分子が化学的に合成され、また組換え手段により産生され得ることは当業者により認められている。
【００８５】
天然に存在する残基は共通の側鎖特性：１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、及び６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅに基づいて分類され得る。
【００８６】
例えば、非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーの別のクラスからのメンバーとの交換を含み得る。こうして置換された残基は非ヒトＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドオルソログと相同性であるＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体の領域、または分子の非相同性領域に導入され得る。
【００８７】
前記変化を加える場合、アミノ酸の疎水性指標が考慮され得る。疎水性及び電荷特性に基づいて各アミノ酸には疎水性指標が割り当てられている。これらは、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、スレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタメート（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リシン（−３．９）、及びアルギニン（−４．５）である。
【００８８】
タンパク質に対して相互作用の生物学的機能を付与する際の疎水性アミノ酸指標の重要性は当業界で理解されている（Ｋｙｔｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３１，１９８２）。幾つかのアミノ酸が類似の疎水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸で置換され、なお類似の生物学的活性を保持し得ることは公知である。
【００８９】
疎水性指標に基づいて変化を加えるとき、疎水性指標が±２の範囲内であるアミノ酸の置換を使用し得る。代替実施形態では、疎水性指標は±１の範囲内である。なお別の代替実施形態では、疎水性指標は±０．５の範囲内である。
【００９０】
類似のアミノ酸の置換は親水性に基づいて効果的になし得ることも当業界で理解されている。その隣接アミノ酸の親水性により支配されるポリペプチドの最大局所平均親水性はタンパク質の生物学的特性と相関している。
【００９１】
アミノ酸残基に対して以下の親水性値が割り当てられている：アルギニン（＋３．０）、リシン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０．＋−．１）、グルタメート（＋３．０．＋−．１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５．＋−．１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）。
【００９２】
類似の親水性値に基づいて変化を加える場合、親水性値が±２の範囲内であるアミノ酸の置換が使用され得る。代替実施形態では、親水性値は±１の範囲内である。もっと別の代替実施形態では、親水性値は±０．５の範囲内である。
【００９３】
所望のアミノ酸置換（保存的または非保存的にかかわらず）は、その置換が所望される時に当業者により決定され得る。例えば、アミノ酸置換は、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドの重要な残基を同定するために、またはＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド活性を上昇または低下させるべくＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドの特定の結合標的との親和性を上昇または低下させるために使用され得る。
【００９４】
例示的アミノ酸置換を表３に示す。
【００９５】
【表４】
2016516726.tif 000006
【００９６】
当業者は、公知の技術を用いてその組合せを含めた配列番号１、３、５、７、９、１０及び２０〜２４に記載されているポリペプチドの適当なバリアントを決めることができる。活性を壊すことなく変化させ得る分子の適当なエリアを同定するために、当業者は活性にとって重要であると考えられないエリアを標的とし得る。例えば、同一種または他の種由来の類似の活性を有する類似のペプチドが公知の場合、当業者はＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドのアミノ酸配列をその類似のポリペプチドと比較し得る。この比較により、類似のポリペプチド中で保存される分子の残基及び部分を同定することができる。類似のポリペプチドに対して保存的でないＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドのエリア中の変化はＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドの生物学的活性及び／または構造にあまり悪影響を及ぼしそうにないと認識される。当業者は、比較的保存的な領域でも、活性を維持しながら天然に存在する残基を化学的に類似のアミノ酸で置換し得る（保存的アミノ酸残基置換）ことを知っている。従って、生物学的活性を壊すことなく、またポリペプチド構造に悪影響を及ぼすことなく、生物学的活性または構造にとって重要であり得るエリアに保存的アミノ酸置換を加え得る。
【００９７】
加えて、当業者は活性または構造にとって重要な類似のポリペプチド中の残基を同定する構造−機能研究を再検討し得る。この比較を考慮して、類似のポリペプチド中の活性または構造にとって重要なアミノ酸残基に相当するＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド中のアミノ酸残基の重要さを予測することができる。当業者はＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドの予測される重要なアミノ酸残基に対して化学的に類似のアミノ酸置換を選択することができる。
【００９８】
当業者は、類似のポリペプチドの三次元構造に関連して三次元構造及びアミノ酸配列も分析することができる。この情報を考慮して、当業者はＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドのアミノ酸残基のその三次元構造に対するアラインメントを予測することができる。当業者は、タンパク質の表面上にあると予測されるアミノ酸残基が他の分子との重要な相互作用に関与し得るので前記残基に対してラジカル変化を加えないように選択し得る。更に、当業者は所望アミノ酸残基の各々に１つのアミノ酸置換を含有している試験Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体を生成し得る。次いで、その誘導体を当業者に公知であり、本明細書中に開示されている活性アッセイを用いてスクリーニングし得る。前記誘導体は適当な置換に関する情報を集めるために使用され得る。例えば、特定アミノ酸残基を変化させると活性が壊れたり、望ましくなく低下したり、不適当になることを見つけたならば、そのような変化を有する誘導体は避けられる。換言すると、ルーチンの実験から集めた情報に基づいて、当業者は、更なる置換を単独でまたは他の変異と組合せて避けなければならないアミノ酸を容易に決定することができる。
【００９９】
多数の科学刊行物がアミノ酸配列の分析からの二次構造の予測に専念している（Ｃｈｏｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３（２）：２２２−２４５，１９７４；Ｃｈｏｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１３（２）：２１１−２２２，１９７４；Ｃｈｏｕら，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４７：４５−１４８，１９７８；Ｃｈｏｕら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２５１−２７６，１９７９；及びＣｈｏｕら，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７−３８４，１９７９を参照されたい）。更に、現在コンピュータープログラムがポリペプチドの二次構造の予測を助けるために利用可能である。その例には、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析に基づくプログラム（Ｊａｍｅｓｏｎら，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４（１）：１８１−１８６，１９９８；及びＷｏｌｆら，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４（１）：１８７−１９１；１９８８）、プログラムＰｅｐＰｌｏｔ．ＲＴＭ（Ｂｒｕｔｌａｇら，ＣＡＢＳ、６：２３７−２４５、１９９０；及びＷｅｉｎｂｅｒｇｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２８：７４０−７４２、１９８５）、及びタンパク質三次構造予測のための他の新しいプログラム（Ｆｅｔｒｏｗら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：４７９−４８３，１９９３）が含まれる。
【０１００】
更に、コンピユータープログラムは二次構造の予測を助けるために現在利用されている。二次構造を予測する１つの方法は相同性モデリングに基づいている。例えば、３０％以上の配列同一性または４０％以上の類似性を有している２つのポリペプチドまたはタンパク質はしばしば類似の構造トポロジーを有している。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の発展により、ポリペプチドまたはタンパク質構造内のフォールドの考えられる数を含めた二次構造の予測性が高められている（Ｈｏｌｍら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２７（１）：２４４−２４７，１９９９を参照されたい）。
【０１０１】
二次構造を予測する追加方法には、「スレッディング」（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３７７−８７，１９９７；Ｓｕｐｐｌら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４（１）：１５−９，１９９６），「プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−１７０，１９９１；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１８３：１４６−１５９，１９９０；及びＧｒｉｂｓｋｏｖら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４（１３）：４３５５−４３５８，１９８７）、及び「進化的リンケージ」（上掲のＨｏｍｅ及び上掲のＢｒｅｎｎｅｒを参照されたい）が含まれる。
【０１０２】
本明細書中で検討されているポリペプチド形態はいずれもポリペプチドの同定または精製において有用な配列をも含み得る。前記配列の例はＣ末端Ｖ５標識である。前記には、本明細書中に記載されているポリペプチド誘導体を含めた前記ポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、非限定的にｃＤＮＡ配列が例示される）も含まれる。
【０１０３】
組成物
本発明の有用な組成物は、本発明の治療及び予防方法において有用な１つ以上の本発明のポリペプチドを含み得る。有用な組成物は、本発明の治療及び予防方法において有用な１つ以上の本発明のポリペプチドをコードする１つ以上の核酸をも含む。開示されている組成物は、１つ以上の前記化合物を医薬的に許容され得る担体と一緒に含み得る。前記担体及び製剤化方法の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第２０版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，編集者Ｄａｎｉｅｌ  Ｌｉｍｍｅｒ）中に見つけることができる。投与するのに適した医薬的に許容され得る組成物を形成するために、前記組成物は治療有効量の化合物を含む。
【０１０４】
本発明の医薬組成物は本発明の治療及び予防方法において使用され得る。前記組成物は、本明細書中に開示されている治療及び予防方法において有効であるように治療有効量の化合物をデリバリーするのに十分な量で被験者に対して投与される。治療有効量は、非限定的に例示される被験者の状態、体重、性別及び年齢のような各種要因に従って変動し得る。他の要因には、投与モード及び部位が含まれる。医薬組成物は当業界で公知の方法で被験者に対して与えられ得る。投与ルートの例には、皮下、静脈内、局所、皮膚上、経口、骨内及び筋肉内が含まれるが、これらに限定されない。本発明の組成物は被験者に対して１回だけ、または被験者に対して２回以上投与し得る。更に、組成物を被験者に対して２回以上投与する場合、非限定的に例示される１日１回、１週間に１回、または１ヶ月に１回のような各種レジメンを使用し得る。組成物は被験者に対して１日２回以上投与してもよい。治療有効量及び適切な投与レジメンは、可能性ある副作用を最小限に抑えながら最適の活性を得るためにルーチンの検査により同定され得る。加えて、他の薬物の同時投与または逐次投与が望ましいことがある。
【０１０５】
治療有効量は化合物の質量と被験者の質量の比の範囲であり得る。組成物の幾つかの実施形態では、治療有効量は約０．００５〜１５０，０００μｇ／ｋｇ、０．５〜１５，０００μｇ／ｋｇ、５〜１５００μｇ／ｋｇ、または５０〜１５０μｇ／ｋｇである。典型的な７０ｋｇの成人の場合、治療有効量は０．００３５〜１１，０００ｍｇ、０．０３５〜１１００ｍｇ、０．３５〜１１０ｍｇ、または３．５〜１１ｍｇであり得る。投与は定期的に行われ得る。
【０１０６】
本発明の組成物は、全身に、例えば静脈内投与により、または局所的に、例えば皮下注射により、またはペースト剤またはクリーム剤の適用により投与し得る。Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたは誘導体を含有している組成物の幾つかの実施形態では、医薬がポリペプチドを血液にデリバリーするのに適している。医薬の適当なタイプには、静脈内製剤、筋肉内製剤、経皮ペースト剤またはクリーム剤、経皮パッチ剤、座剤、及びポリペプチドを消化から保護する経口剤形が含まれる。
【０１０７】
１つの実施形態では、本発明のＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドバリアントをコードする適当なプラスミドまたはベクターの形態であり得る核酸を提供する。前記核酸は、被験者から採取し得る細胞に当業界で公知の適当な方法（例えば、エレクトロポレーション）により導入する。１つの実施形態では、細胞は脂肪細胞である。細胞をＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体の発現についてアッセイし得る（１つの実施形態では、ポリペプチドの発現は本明細書中で検討されているようにポリペプチド上の標識の存在により調べられ得る）。次いで、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を発現する細胞を被験者に導入し得る。１つの実施形態では、細胞を被験者に対して皮下注射により投与する。本明細書中で検討されている方法を含めて他の投与方法を使用してもよい。次いで、細胞はＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドまたはＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体を発現し、これらは循環中に取り込まれる。
【０１０８】
本発明の組成物は更に、化合物の溶解度、半減期、吸収等を改善する物質を含み得る。更に、本発明の組成物は更に、望ましくない副作用を弱める及び／または化合物の毒性を低下させる物質を含み得る。前記物質の例は、非限定的に例示されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第２０版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，編集者Ｄａｎｉｅｌ  Ｌｉｍｍｅｒ）のような各種文献に記載されている。
【０１０９】
本発明の組成物は各種投与形態で投与され得る。例えば、組成物は、非限定的に例示される錠剤、カプセル剤、サッシェ剤、薬用ドロップ錠、トローチ剤、ピル剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、溶液剤、懸濁液剤、エリキシル剤、シロップ剤、軟膏剤、クリーム剤、ペースト剤、エマルジョン剤、または静脈内投与または注射用溶液剤のような形態で投与され得る。他の投与形態には、パッチメカニズムまたは軟膏を用いる経皮投与が含まれる。これらを徐放性及び／または持続放出性製剤を提供するように修飾してもよい。
【０１１０】
本発明では、医薬組成物は更、非限定的に例示されるビヒクル、補助剤、界面活性剤、懸濁化剤、乳化剤、不活性増量剤、希釈剤、賦形剤、湿潤剤、結合剤、滑沢剤、緩衝剤、崩壊剤及び担体のような医薬的に許容され得る担体、及び非限定的に例示される着色剤及び着香剤のような補助剤を含み得る（本明細書ではまとめて担体と称する）。典型的には、医薬的に許容され得る担体は活性化合物に対して化学的に不活性であり、使用条件下で有害な副作用または毒性を持たない。医薬的に許容され得る担体はポリマー及びポリマーマトリックスを含み得る。医薬的に許容され得る担体の種類は使用する具体的投与形態及び組成物の他の特性に応じて異なり得る。
【０１１１】
例えば、非限定的に例示される錠剤、カプセル剤、サッシェ剤、薬用ドロップ剤、トローチ剤、ピル剤、散剤または顆粒剤のような固体形態で経口投与する場合、化合物を、非限定的に例示される不活性増量剤、適当な結合剤、滑沢剤、崩壊剤及び補助剤のような経口非毒性の医薬的に許容され得る不活性担体と組み合わせてもよい。適当な結合剤には、非限定的に澱粉、ゼラチン、グルコースまたはβ−ラクトースのような天然糖、コーン甘味料、アカシア、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウムのような天然及び合成ガム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックス等が含まれる。これらの剤形中で使用される滑沢剤には、非限定的にオレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等が含まれる。崩壊剤には、非限定的に澱粉、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム等が含まれる。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、トウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉、アルギン酸、結晶セルロース、アカシア、ゼラチン、グアーガム、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、並びに本明細書中に記載されている他の担体の１つ以上を含み得る。薬用ドロップ剤はフレーバー、通常スクロース及びアカシア、またはトラガカント中に活性成分を含み得、トローチ剤はゼラチン及びグリセリン、またはスクロース及びアカディアのような不活性基剤中に活性成分を含む。エマルジョン剤及びゲル剤は活性成分に加えて当業界で公知の担体を含有している。
【０１１２】
非限定的に例示されるチンキ剤、溶液剤、懸濁液剤、エリキシル剤、シロップ剤のような経口液体形態の場合、本発明の核酸分子は水、食塩液またはアルコールのような希釈剤中に溶解され得る。更に、経口液体形態は、適当に着香された懸濁化剤または分散剤、例えばトラガカント、アカシア、メチルセルロース等のような合成及び天然ガムを含み得る。更に、所望または所要ならば、混合物中に適当な着色剤または他の補助剤を配合してもよい。使用され得る他の分散剤には、グリセリン等が含まれる。
【０１１３】
非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を患者の血液と等張性とする溶質を含有し得る水性及び非水性等張性滅菌注射用溶液剤、並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤及び保存剤を含み得る水性及び非水性滅菌懸濁液剤が含まれる。非限定的に例示される石鹸、油または洗剤のような医薬的に許容され得る界面活性剤、非限定的に例示されるペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースのような懸濁化剤、乳化剤及び他の薬用補助剤を添加したまたは添加していない生理学的に許容され得る希釈剤、例えば水、食塩水、水性デキストロース及び関連糖溶液、アルコール、例えばエタノール、イソプロパノールまたはヘキサデシルアルコール、グリコール、例えばプロピレングリコール、またはポリ（エチレングリコール）４００のようなポリエチレングリコール、グリセロールケタール、例えば２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール、エーテル、油、脂肪酸、脂肪酸エステルまたはグリセリド、またはアセチル化脂肪酸グリセリドを含めた滅菌液体または液体混合物中の化合物を投与し得る。
【０１１４】
非経口製剤中に使用され得る油には、石油、動物油、植物油または合成油が含まれる。油の具体例には、落花生油、大豆油、ゴマ油、綿実油、コーン油、オリーブ油、ペトロラクタム及び鉱油が含まれる。非経口製剤中に使用するための適当な脂肪酸には、ソルビタンモノオレエートのようなポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル、及びプロピリンオキシドをポリプロピレングリコール、オレイン酸、ステアリン酸及びイソステアリン酸と縮合させて形成されるエチレンオキシドと疎水性基剤の高分子量付加物が含まれる。オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルが適当な脂肪酸エステルの例である。非経口製剤中に使用するための適当な石鹸には、脂肪アルカリ金属塩、アンモニウム塩及びトリエタノールアミン塩が含まれ、適当な洗剤には、（ａ）カチオン性製剤、例えばジメチルジアルキルアンモニウムハライド及びアルキルピリジニウムハライド、（ｂ）アニオン性洗剤、例えばアルキル、オリール及びオレフィンスルホネート、アルキル、オレフィン、エーテル及びモノグリセリドスルフェート及びスルホスクシネート、（ｃ）ノニオン性製剤、例えば脂肪アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド及びポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマー、（ｄ）両性洗剤、例えばアルキルβ−アミノプロピオネート及び２−アルキルイミダゾリン第４級アンモニウム塩、及び（ｅ）その混合物が含まれる。
【０１１５】
前記製剤中に適当な保存剤及び緩衝剤を使用し得る。注射部位の刺激を最小限に抑えるかまたは無くすために、前記組成物は約１２〜約１７の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）を有する１つ以上のノニオン性界面活性剤を含有し得る。前記製剤中の界面活性剤の量は約５重量％〜約１５重量％の範囲である。
【０１１６】
非限定的に例示される軟膏剤、クリーム剤、ペースト剤、エマルジヨン剤のような本発明の核酸分子を含有している局所投与形態を当業界で公知の各種担体材料、例えばアルコール、アロエベラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡ及びＥオイル、鉱油、ＰＰＧ２ミリスチルプロピオネート等と混合して、アルコール溶液、局所クレンザー、クレンジングシリーム、スキンゲル、スキンローション、及びクリームまたはゲル製剤のシャンプーを形成し得る。皮膚剥脱剤または皮膚研磨剤の配合を使用し得る。前記局所製剤を経皮デリバリーのためにパッチ、包帯または外傷用医薬材料に適用してもよく、または創傷または皮膚損傷の部位に直接デリバリーするために包帯または外傷用医薬材料に適用してもよい。
【０１１７】
本発明の化合物はリポソームデリバリーシステム、例えば単ラメラ小胞、大ラメラ小胞及び多重ラメラ小胞の形態でも投与し得る。リポソームは各種リン脂質、例えばコレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンから形成され得る。前記リポソームは、リポソームを特定の細胞型または細胞型類にデリバリーするためにモノクローラル抗体をも含有し得る。
【０１１８】
本発明の化合物を標的可能な薬物担体としての可溶性ポリマーとカップリングさせてもよい。前記ポリマーには、ポリビニル−ピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリル−アミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルタミドフェノール、またはパルミトイル残基で置換されているポリエチレンオキシドポリリシンが含まれるが、これらに限定されない。更に、本発明の化合物を薬物を制御放出するのに有用な生分解性ポリマーの類、例えばポリ乳酸、ポリε−カプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、及びヒドロゲルの架橋または両性ブロックコポリマーにカップリングさせてもよい。
【実施例】
【０１１９】
以下の結果において、使用した方法は本明細書の方法の欄及びそこに引用されている参考文献に特定した方法であった。以下の結果の幾つかは、Ｃｌｅｍｅｎｔ  ＬＣら，“Ｐｏｄｏｃｙｔｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ４  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｕｒｉａ  ｉｎ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｎｅｐｈｒｏｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１１（この文献はＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドの使用に関するここに含まれている開示内容を参照することにより本明細書に組み入れる）に記載されている。
【０１２０】
１．  ネフローゼ症候群を有している患者は高レベルの循環Ａｎｇｐｔｌ４を有している
ネフローゼ症候群を有している患者は高い循環レベルのＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドを有している。ＭＣＤ及びＭＮと診断された患者及びＭＣＤ再発患者（ｎ＝４人の患者／群）からの２００μｇのヒト血漿を２Ｄゲル電気泳動により分析し、ウェスタンブロットを抗Ａｎｇｐｔｌ４抗体を用いて作成した（図１Ａ）。図１Ａは、ＭＣＤ再発及びＭＮの患者だけが高レベルのＡｎｇｐｔｌ４（矢印で示す）を有していたことを示す。この形態のＡｎｇｐｔｌ４は中性ｐＩ形態として存在し、モノマー及びオリゴマーとして存在している。
【０１２１】
２．  ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットは高い循環レベルのＡｎｇｐｔｌ４を有している
脂肪細胞特異的Ａｎｇｐｔｌ４過剰発現のためのトランスジェニックラットモデル（ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧ）を作成し、図１Ｂに示す。Ａｎｇｐｔｌ４を正常に発現している臓器におけるｍＲＮＡ発現の分析から、発現の特異性が確認され、Ａｎｇｐｌｔ４は褐色脂肪組織（ＢＡＴ）及び白色脂肪組織（ＷＡＴ）において検出された（図１Ｃ）。
【０１２２】
２００μｇの血漿を２Ｄゲル電気泳動にかけた後、抗Ａｎｇｐｔｌ４抗体を用いてウェスタンブロッティングすると、ヘテロ接合ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットが野生型ラットよりも高い循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルを有していたことが示された（図１Ｄ）（３ヶ月齢，ｎ＝３ブロット／群）。図１Ｅは、２００μｇの血漿を２Ｄゲル電気泳動にかけた後、抗Ａｎｇｐｔｌ４及び抗Ｖ５抗体を用いてウェスタンブロッティングすると、ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットの血漿中に脂肪組織分泌Ｖ５標識したＡｎｇｐｔｌ４が存在することを示す。ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラット血漿から（Ａｎｇｐｔｌ４のＮ末端に対して特異的な抗体を用いて）免疫沈降したＡｎｇｐｔｌ４を２Ｄゲル電気泳動にかけた後、抗Ａｎｇｐｔｌ４または抗レクチンを用いてウェスタンブロッティングした。ＳＮＡ  Ｉ抗体は循環中のシアル化Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドの存在を示した。
【０１２３】
ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットは、光学顕微鏡検査（図１Ｇ）及び電子顕微鏡検査（示さず）により形態学的に正常な糸球体を有しており、糸球体Ａｎｇｐｔｌ４発現は変化していなかった。これは、発現により１〜５ヶ月齢の足突起消失の段階的発生を含めた糸球体欠陥が生じたＡｎｇｐｔｌ４の有足細胞特異的発現（この教示について参照により本明細書に組み入れる米国仮出願Ｎｏ．６１／３５１，８６５（２０１０年６月５日出願）を参照されたい）と対照的である。
【０１２４】
３ヶ月齢のヘテロ接合ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧ雄ラットにおいて導入遺伝子発現タンパク質を特異的に検出するための抗Ｖ５抗体を用いるイムノゴールドＥＭは、内皮表面上での選択的な検出を立証し、このことから循環Ａｎｇｐｔｌ４中次及び高次オリゴマーがＧＢＭに入らず、内皮表面上に受容体を有していることが示される。蛋白尿が下降しているときＡｎｇｐｔｌ４の脂肪組織アップレギュレーションがネフローゼ症候群の後期段階で認められるので、循環Ａｎｇｐｔｌ４の影響はヒト及び実験的ネフローゼ症候群に関連している。
【０１２５】
３．  高い循環レベルのＡｎｇｐｔｌ４と蛋白尿及びアルブミン尿の関係
Ａｎｇｐｔｌ４の循環レベルとアルブミン尿を含めた蛋白尿の関係を調べるために、蛋白尿をａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットにおいて分析した。図２Ａは、尿タンパク質の分析により分かるようにａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧは蛋白尿を示さないことを示している。図２Ａでは、尿タンパク質をＧｅｌＣｏｄｅブルー染色したＳＤＳ  ＰＡＧＥ（３μｇ／レーン，ＭＣＤ寛解を除いて）により分析した（デンシトメトリー測定値を各レーンの下に示す）。無傷のアルブミンバンドは７０ｋＤａ（矢印で示す）で観察される。示され得るように、ＷＴラット、ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラット及び寛解状態のＭＣＤ患者は分析した尿サンプル中に殆どまたは全く無傷のアルブミンを示さず、ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｌｔ４  ＴＧラット（有足細胞特異的Ａｎｇｐｔｌ４発現を有し、蛋白尿を有するＭＣＤを発症することが判明しているラットトランスジェニックモデル；この教示について参照により本明細書に組み入れる米国仮出願Ｎｏ．を参照されたい）、ＭＣＤ再発、ＭＮ再発及びＰＡＮラット（ネフローゼ症候群のラットモデル）はアルブミン尿を示す強いアルブミン染色を示した。図２Ｂは、雌ヘテロ接合ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４雌ＴＧラットがＷＴ同腹仔対照に比して少ないアルブミン尿を有していたことを示している。図２Ｃは、ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４ヘテロ接合雄ＴＧラットに対して同一の結果を示している。図２Ｄは、ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットがＷＴ同腹仔に比してプロマイシンネフローゼ（ＰＡＮモデル；ネフローゼ症候群のラットモデル）において少ない蛋白尿を有していたことを示している。上で立証したように、ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットは中性またはほぼ中性の等電点で移動し、シアル化されているより高い循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルを有している。これらの結果から、蛋白尿及びネフローゼ症候群の減少における循環Ａｎｇｐｔｌ４の役割が分かる。
【０１２６】
脂肪組織の内皮結合が糸球体内皮に結合したＡｎｇｐｔｌ４を分泌したので、ラットモデルにおけるより低い基準アルブミン尿及びより少ないＰＡＮ誘発蛋白尿が糸球体内皮保護により媒介されたかどうかを研究するべく糸球体内皮細胞（ＧＥｎＣ）に対する組換えＡｎｇｐｔｌ４の影響を調べるために実験を実施した。ＧＥｎＣは過酸化水素を培地に添加することにより酸化的損傷を受け、対照の安定細胞株、Ａｎｇｐｔｌ４−ＨＥＫ２９３細胞株（高等電点（ｐＩ）・低シアル化Ａｎｇｐｔｌ４を分泌する）、またはＭａｎＮＡｃとインキュベートしたＡｎｇｐｔｌ４−ＨＥＫ２９３細胞株（中性ｐＩ，正常にシアル化されているＡｎｇｐｔｌ４）由来の濃縮上清（６００μｇ／ウェル）とインキュベートした。高ｐＩ形態のＡｎｇｐｔｌ４がＭＣＤにおいて有足細胞から大量に分泌されることに注目すべきである。ＬＤＨの放出を細胞損傷のマーカーとして評価した。過酸化水素損傷されていない対照細胞には１の相対スコアを付けた。高ｐＩ  Ａｎｇｐｔｌ４はＧＥｎＣ損傷を高め、中性ｐＩ  Ａｎｇｐｔｌ４（殆どの循環Ａｎｇｐｔｌ４を含む）は測定したすべての時点で有意に保護的であった（ｎ＝３つの測定値／条件）。
【０１２７】
ＰＡＮ  ６日目での野生型ラットにおけるＡｎｇｐｔｌ４のアップレギュレーションは専ら糸球体であり、蛋白尿及び糸球体Ａｎｇｐｔｌ４発現が下降しているときには脂肪組織でのアップレギュレーションが１０日目で認められた（ｎ＝３匹のラット／サンプル）（図２Ｆ）。従って、循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルの上昇はネフローゼ症候群における循環Ａｎｇｐｔｌ４の保護効果及び蛋白尿の減少と一致している。蛋白尿が下降しているときにはＡｎｇｐｔｌ４の脂肪組織アップレギュレーションがＰＡＮの後期段階で認められるので、循環Ａｎｇｐｔｌ４の影響はヒト及び実験的ＭＣＤを両方に関連していそうである。更に、ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットにおける基準時及びＰＡＮ誘発後の高い循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルにより、野生型ラットと比較して血漿トリグリセリドレベルは上昇し（図２Ｇ）、ヘパリン後リポタンパク質リパーゼ活性は低下した（図２Ｈ）。
【０１２８】
Ａｎｇｐｔｌ４の循環への治療的デリバリーの有効性を立証するために、ＦＳＧＳのモデルであるＢｕｆｆａｌｏ／Ｍｎａラット、または糸球体間質損傷の短期間モデルであるＴｈｙ１．１腎炎を誘発させたＷｉｓｔａｒラットに野生型Ａｎｇｐｔｌ４または対照タンパク質を投与した（図４Ａ及びＢ）。組換えタンパク質を収集することにより野生型組換えＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドを作成した。Ａｎｇｐｔｌ４−ＨＥＫ２９３安定細胞株またはｐｃＤＮＡ３．１−ＨＥＫ２９３対照の安定細胞株を１５ｃｍ皿においてコンフルエンスまで増殖し、温ＰＢＳで２回洗浄し、フェノールレッドを含有せず、場合により２５ｍＭ  ＭａｎＮＡｃを含有している無血清ＤＭＥＭと一緒に４８時間インキュベートした。細胞を収集し、上清を濃縮した。１つの１５ｃｍ皿からの濃縮上清を各注射時点で使用した。
【０１２９】
Ｂｕｆｆａｌｏ／Ｍｎａラットは、光学顕微鏡で巣状分節性病巣、電子顕微鏡で有足細胞足突起の消失、及び蛋白尿を含めたヒトＦＳＧＳを真似た病巣を生後約２ヶ月で自然に発生する。このラットは年を取るにつれて蛋白尿の段階的増加を生ずる。上記研究で使用されるラットは雄の５ヶ月齢であった。１５０μｇの抗Ｔｈｙ１．１（Ｏｘ−７ハイブリドーマ）または対照ＩｇＧ  ＩＶを雄Ｗｉｓｔａｒラットの異なる群（１００〜１２５ｇｍ，ｎ＝４匹のラット／群）に注射することにより抗Ｔｈｙ１．１腎炎を誘発させた。
【０１３０】
Ｂｕｆｆａｌｏ／Ｍｎａラットモデルでは、０日目に基準蛋白尿を評価した。Ａｎｇｐｔｌ４または対照タンパク質をＢｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラット（ｎ＝４匹のラット／群）に連続２日間（１日目及び２日目，矢印）腹腔内注射した。蛋白尿を１日おきに評価し、基準値のパーセンテージとして表示した。組換えＡｎｇｐｔｌ４治療したラットで蛋白尿の有意な減少が認められた。
【０１３１】
Ｔｈｙ１．１腎炎モデルでは、蛋白尿を１日目に確認した。ラットに組換えＡｎｇｐｔｌ４または対照タンパク質のいずれかを連続２日間（１日目及び２日目，矢印）静脈内注射した。その後、蛋白尿を評価した。図４Ｂに示すように、Ａｎｇｐｔｌ４治療したラットでは蛋白尿はずっと低く、５日目で統計上有意であった。
【０１３２】
これらの結果から、Ａｎｇｐｔｌ４の循環への治療的デリバリーが、非限定的に例示される微小変化群、巣状分節性糸球体硬化症、慢性腎症／膜性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎のようなネフローゼ症候群、または非限定的に例示される糖尿病性腎症、真性糖尿病、ループス腎炎または原発性糸球体疾患のような糖尿病状態に対する有効治療であることが分かる。更に、これらの結果から、Ａｎｇｐｔｌ４の循環への治療的デリバリーが非限定的に例示される蛋白尿、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症及び浮腫のようなネフローゼ症候群に関連する状態に対する有効治療であることが分かる。１つの実施形態では、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドは低いＬＰＬ阻害活性、開裂耐性を有する誘導体、または本明細書中に記載されている誘導体である。前記誘導体の投与は、高い血漿トリグリセリドレベルのようなＬＰＬ活性の阻害に関連するマイナスの影響なしに、Ａｎｇｐｔｌ４治療の有益な効果を維持する。
【０１３３】
実施例１〜３のための方法
完全長ラットＡｎｇｐｔｌ４のクローニング及び完全長組換えＡｎｇｐｔｌ４に対する抗体の作成
ストップコドンを除き我々の以前の実験（７）からの１２１８ｂｐの完全長ラットＡｎｇｐｔｌ４オープンリーディングフレームを真核発現のためにｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−ＨｉｓＢに、原核発現のためにｐＥＴ２８ａにクローニングした。大腸菌発現させた精製完全長タンパク質を使用して、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロットにより試験される家兔（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ  ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，米国イリノイ州シカゴ）においてポリクローナル抗体を作成した。抗体反応性バンドをＧｅｌＣｏｄｅブルー染色ゲルから切り取り、トリプシン消化し、Ａｎｇｐｔｌ４ペプチド配列の存在をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦにより確認した。抗血清の一部を抗原に対してアフィニティー精製した。別段の定めがない限り、記載されている研究はすべてこの抗体を使用した。ラットＡｎｇｐｔｌ４のＮ末端部分（シグナルペプチドを除くアミノ酸７−８６）に対する追加のポリクローナル抗体を家兔を用いて同様に作成した。
【０１３４】
ヒト糸球体疾患の動物モデルにおける蛋白尿の誘発
すべての動物研究はＩＡＣＵＣ協会により承認された。ＷＴラットにおける蛋白尿の動物モデル（ｎ＝４匹のラット／群）の誘発は括弧内の先行刊行物に記載されている：ＰＡＮ（７）、ＰＨＮ（７）、グルココルチコイドを有するＰＡＮ（２０）、非ＨＩＶ糸球体虚脱症（１８）、腎毒性血清誘発される不均一相蛋白尿（７）。抗Ｔｈｙ１．１腎炎は、２００μｇの抗Ｔｈｙ１．１（Ｏｘ−７ハイブリドーマ）または対照ＩｇＧ  ＩＶを雄Ｗｉｓｔａｒラットの各種群（１００〜１２５ｇ，ｎ＝４匹のラット／群）に注射することにより誘発させ、ラットを２４時間及び７２時間後に安楽死させた。
【０１３５】
以下の技術：ＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲ（２６）、共焦点画像解析（７）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（２７）、イムノゴールドＥＭ（２６）、ウェスタンブロットのための糸球体抽出及びプロセッシング（２６）、ＰＥＩ方法による電荷の評価（２８）は先行刊行物に記載されている。アルシアンブルー染色のために、染色液のｐＨを酢酸を用いて２．５に調節し、０．１％ヌクレアファーストレッド液を対比染色のために使用した。糸球体基底膜アシアンブルー染色のデンシトメトリー（２０個の糸球体／ラット，３匹のラット／群）をＩｍａｇｅ−Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，米国メリーランド州ベセスダ）を用いて評価した。２ＤゲルウェスタンブロットのデンシトメトリーをＧｅｌ−Ｐｒｏアナライザーソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を用いて評価した。ＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲプライノー及びブローブを図３にリストする。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのために、ラットＡｎｇｐｔｌ４に対するジゴキシゲニン標識プローブはＯＲＦの  ｂｐ  １−５４８を含んでいた。
【０１３６】
ヘパリン後ＬＰＬ活性のためのサンプルを得るために、安楽死の１５分前にラットに１０単位／１００ｇ体重のブタヘパリンを静脈内注射し、活性をＲｏａｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ（ニューヨーク州ニューヨーク）のアッセイを用いて測定した。血清トリグリセリドは空腹時状態で測定した。
【０１３７】
ＮＴＳのＡｎｇｐｔｌ４  −／−マウスへの注射
Ａｎｇｐｔｌ４  −／−マウスはＥｌｉ  Ｌｉｌｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国インディアナ州インディアナポリス）から結構なギフトとしてＳａｎｄｅｒ  Ｋｅｒｓｔｅｎに提供された。研究プロトコルはヴァーヘニンゲン大学の動物研究委員会より承認された。１１週齢の雄Ａｎｇｐｔｌ４  −／−または＋／＋マウス（ｎ＝４匹のマウス／群）に１．５ｍｇのγ２−ＮＴＳまたは正常ヒツジ血清（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，米国ミズーリ州セントルイス）を静脈内注射し、４８時間目にスポット尿サンプルを採取し、７２時間目に安楽死させ、生化学測定のために血漿を収集し、腎臓を組織学的分析のために保存した。尿アルブミンをＥＬＩＳＡ（Ｂｅｔｈｙｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，米国テキサス州モンゴメリー）によりアッセイし、尿クレアチニンを質量分析法により測定した。足突起消失を評価するために、まず足突起の平均幅を対照治療したＡｎｇｐｔｌ４  ＋／＋マウス透過型電子顕微鏡写真（１０個の均等間隔の測定値／ループ，３つのループ／糸球体，３つの糸球体／腎臓，３つの腎臓／群）において測定した。消失は平均幅の２．５倍以上の増加として記載した。全足突起及び消失した足突起をＮＴＳ治療または対照治療したＡｎｇｐｔｌ４  −／−マウスにおいてカウントした。
【０１３８】
保管されているヒトサンプルを用いる研究
保管されているヒト腎臓バイオプシー（ｎ＝５つのバイオプシー／条件）の免疫染色をメキシコシティーのＩｎｓｔｉｔｕｔｏ  Ｎａｃｉｏｎａｌ  ｄｅ  ＣａｒｄｉｏｌｏｇｉａでＩＲＢ承認プロトコルで得たサンプルに対して実施した。これらの研究のために使用した対照腎臓バイオプシーは性別及び年齢が整合しているプロトコル移植前バイオプシーであった。２Ｄゲル電気泳動及びウェスタンブロットのための保管ヒト血清（ｎ＝４個のサンプル／条件）は既に公開されている研究（２９）から得た。
【０１３９】
トランスジェニックラットの作成
ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラット（脂肪組織特異的）構築物を、ラットＡｎｇｐｔｌ４  ｃＤＮＡ（シグナル配列を含む）をｐｏｌｙＡ尾部のすぐ上流のＮｏｔＩ部位でＣ末端Ｖ５標識とクローニングすることにより、５．４Ｋｂ  マウスａＰ２プロモーター構築物（３０）（米国マサチューセッツ州ケンブリッジのＡｄｄｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．から購入）を含有しているベクターにおいて作成した。
【０１４０】
トランスジェニックラットは、消化したＤＮＡ構築物を受精したＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙの卵（ミシガン大学で実施）に微量注射し、偽妊娠宿主Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ雌に移植することにより作成し、生じた子孫を構築物特異的な対照ゲノムプロラクチンプライマー及びプロープの組合せ（図３）を用いるルーチンＰＣＲ及びＴａｑＭａｎゲノムＤＮＡリアルタイムＰＣＲ戦略により遺伝子型判定した。脂肪組織特異的発現のために３つの樹立系統を作成した。４世代にわたり安定なａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラット株３７５（３コピー）からのデータを提示する。尿中全タンパク質をＢｒａｄｆｏｒｄ方法（Ｂｉｏｒａｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて評価し、アルブミン尿をＥＬＩＳＡ（Ｂｅｔｈｙｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，米国テキサス州モンゴメリー）により評価した。
【０１４１】
ＧＥｎＣを用いるインビトロ研究
ＧＥｎＣ研究のために、培養したラットＧＥｎＣ（３２）を６個のウェルプレート（ｎ＝３個のウェル／条件）において７５％コンフルエンスまで増殖し、温ＰＢＳで２回洗浄し、２００μＭ  Ｈ２Ｏを６００μｇ／ウェルの対照の安定細胞株上清、Ａｎｇｐｔｌ４−ＨＥＫ２９３安定細胞株上清、またはＭａｎＮＡｃ治療したＡｎｇｐｔｌ４−ＨＥＫ２９３細胞株からの上清と一緒に含有している無血清ＲＰＭＩ。ウェルを２４、３６及び４８時間目にサンプリングした。ＬＤＨ放出を細胞毒性検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，独国マンハイム）を用いて測定した。ＯＤ４９２値をＨ２Ｏ２または安定細胞株上清を添加していないウェルからの測定値の比として表示した。
【０１４２】
統計分析
３つ以上の群を含む蛋白尿または遺伝子発現の差の分析をＧｒａｐｈＰａｄ  ＩｎＳｔａｔソフトウェア，バージョン３．０５を用いて事後分析検査とＡＮＯＶＡにより実施した。２つの群の比較のために、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００３で独立スチューデントｔ検定を使用した。
【０１４３】
４．  循環アンジオポエチ様−４はネフローゼ症候群において蛋白尿を高トリグリセリド血症とリンクさせる
ネフローゼ症候群における蛋白尿と高脂血症（高トリグリセリド血症及び高コレステロール血症）間の関係に対する分子的基礎は知られていない。この研究では、膜性腎症（ＭＮ）、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）及び微小変化群（ＭＣＤ）のために糖タンパク質Ａｎｇｐｔｌ４の高い血漿レベルがネフローゼ症候群において蛋白尿を高トリグリセリド血症とリンクさせることが判明している。循環Ａｎｇｐｔｌ４はほぼ中性の等電点（ｐＩ）を有しており、中症度〜重症度の蛋白尿が定着した後に殆ど骨格筋、脂肪組織及び心臓から分泌された。ＭＣＤでは、蛋白尿を誘発させる高ｐＩ  Ａｎｇｐｔｌ４及び中性のｐＩ  Ａｎｇｐｔｌ４の追加の早期有足細胞発現が既に判明した。脂肪組織過剰発現Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラット（ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４）及び組換えＡｎｇｐｔｌ４を用いて、循環Ａｎｇｐｔｌ４は糸球体内皮αｖβ５インテグリンに結合することにより蛋白尿を減少させる一方、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）媒介トリグリセリド摂取を阻止することにより高トリグリセリド血症を誘発させることが判明した。高トリグリセリド血症はネフローゼＡｎｇｐｔｌ４  −／−マウスでは存在していなかった。ネフローゼＡｎｇｐｔｌ４  −／−及びＩｔｇｂ５  −／−マウス、及び抗β５インテグリン抗体を注射したネフローゼラットはピークの蛋白尿からの回復を遅らせた。更に、ＬＰＬ結合部位に変異を有する組換えヒトＡｎｇｐｔｌ４は血漿トリグリセリドレベルに影響を与えることなく蛋白尿を減少させることができる。要約すると、循環Ａｎｇｐｔｌ４は蛋白尿を減少させる一方、高トリグリセリド血症を誘発させ、ネフローゼ範囲蛋白尿に対する全身性応答として殆ど末梢臓器から産生する。
【０１４４】
背景
ネフローゼ症候群の２つの主要な特徴である蛋白尿と高脂血症をリンクする分子経路は知られていない。高脂血症は高コレステロール血症及び高トリグリセリド血症１の２つのコンポーネントを有している。従来から、高コレステロール血症は蛋白尿及び低アルブミン血症に応答したリポタンパク質の高い肝臓合成に寄与していた（２）。しかしながら、蛋白尿と高い肝臓リポタンパク質合成間の正確な分子リンクは未知のままである。高トリグリセリド血症の発症は余り注目を受けていない。血漿トリグリセリドレベルの主要な決定因子は、循環からのトリグリセリドの組織摂取を調節する内皮結合したリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）の活性である（３）。ＬＰＬを欠くマウスは非常に高いトリグリセリドレベルを示し、誕生後すぐに死亡する（４）。以前の研究は、ｍＲＮＡではなく、ＬＰＬタンパク質の活性及び発現がネフローゼ症候群において低下していることを示している（５）。こうしたＬＰＬタンパク質活性及び発現の低下の分子的基礎、またはネフローゼ症候群における蛋白尿に対するその関係は分かっていない。
【０１４５】
我々の実験室の最近の研究は、微小変化群（ＭＣＤ）における有足細胞及び循環中でのＡｎｇｐｔｌ４の高い発現を示した（６，７）。有足細胞分泌Ａｎｇｐｔｌ４の生物学的役割を研究するために、２つのタイプのトランスジェニックラットモデルを作成した。有足細胞からの糸球体内でＡｎｇｐｔｌ４を選択的に過剰発現するＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットは、循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルを上昇させることなく大量のアルブミン尿を生ずる。対照的に、脂肪組織から選択的にＡｎｇｐｔｌ４を過剰産生し、分泌するａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットは高い循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルを生ずるが、蛋白尿性ではない。更なる研究から、有足細胞が低シアル化されている高いｐＩ形態及びシアル化されている中性ｐＩ形態の２つの異なる形態のＡｎｇｐｔｌ４を分泌することが判明した。シアル酸前駆体のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）を用いる治療により、インビボで高ｐＩ  Ａｎｇｐｔｌ４が中性のｐＩ  Ａｎｇｐｔｌ４に変換し、アルブミン尿／蛋白尿が大きく減少する。対照的に、正常及びネフローゼラット、及びヒト中の循環Ａｎｇｐｔｌ４は殆ど完全にシアル化中性ｐＩ  Ａｎｇｐｔｌ４から構成されている。
【０１４６】
Ａｎｇｐｔｌ４はＬＰＬを不活化することによりＬＰＬ活性を阻止し（８）、これによりトリグリセリド摂取を減じ、高トリグリセリド血症が生ずる（９）と考えられている。ヒトＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の集団ベースの配列決定研究は、Ｅ４０Ｋバリアントを有している欧州−米国の集団の約３％で低い血漿トリグリセリドレベルを示した（１０）。その後の研究で、Ｅ４０Ｋバリアントを有する組換えＡｎｇｐｔｌ４はインビトロでＬＰＬ活性を阻害できないことが分かった（１１）。循環中のＡｎｇｐｔｌ４はＮ末端断片（ＬＰＬ阻害領域及びコイルドコイルドメインを含み、オリゴマーを形成する）及びＣ末端断片（フィブリノーゲン様ドメインを含み、モノマーを維持している）に開裂する傾向にあり、アミノ酸１６１−１６４間のＡｎｇｐｔｌ４開裂領域を変異すると完全長タンパク質の安定性が向上する（１１）。我々は、可能性のある治療上の重要性を有する変異体を生成するためにＡｎｇｐｔｌ４のこれらの特性を利用した。
【０１４７】
本研究では、ネフローゼ症候群における循環Ａｎｇｐｔｌ４の生物学的役割を研究した。我々は、ＭＮ、ＦＳＧＳ及びＭＣＤにおけるＡｎｇｐｔｌ４及びトリグリセリドの高いレベル及び低いＬＰＬ活性に注目した。加えて、ネフローゼ症候群を有しているＡｎｇｐｔｌ４  −／−マウスは高トリグリセリド血症を発症しなかった。ネフローゼ症候群のラットモデルでは、高い循環Ａｎｇｐｔｌ４は重症の蛋白尿が発症した後主に骨格筋、脂肪組織及び心臓から派生した。実験的ＭＣＤでは、幾つかの循環Ａｎｇｐｔｌ４も有足細胞から派生した。トランスジェニック発現または組換えタンパク質の注射によるかにかかわらず、高い循環Ａｎｇｐｔｌ４はトリグリセリドレベルを上昇させ、ＬＰＬ活性を低下させるだけでなく、ネフローゼ齧歯類では糸球体内皮αｖβ５インテグリンへの結合により蛋白尿が減少した。β５インテグリンの不在、特異的抗体を用いるそのインビボでの阻止、または循環Ａｎｇｐｔｌ４の不在はすべてピーク蛋白尿からの回復を遅らせた。従って、Ａｎｇｐｔｌ４は蛋白尿と高トリグリセリド血症間の第１の直接分子リンクである。末梢Ａｎｇｐｔｌ４分泌は主にネフローゼ症候群における進行中の蛋白尿を減少させるために刺激されるだけでなく、最後にＬＰＬへ結合し、高トリグリセリド血症を誘発させる。
【０１４８】
結果
高い循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルはネフローゼ症候群において高トリグリセリド血症の発症を決定する：
正常な健康志願者と比較すると、ＭＣＤ、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、非ＨＩＶ糸球体虚脱症（ＣＧ）及び膜性腎症（ＭＮ）に起因するネフローゼ症候群を有する未治療の患者では有意に高い空腹時血漿Ａｎｇｐｔｌ４レベルがＥＬＩＳＡにより認められた（図６（ａ），図１２）。ネフローゼ症候群において高い血漿Ａｎｇｐｔｌ４レベルが高トリグリセリド血症及びＬＰＬ活性に相関し得るかどうかを調べるために、我々はパッシブヘイマン腎炎（ＰＨＮ，ＭＮのモデル）（１２，１３）、自然にＦＳＧＳを発症するＢｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラット（１４，１５）及びプロマイシンアミノヌクレオシド腎炎（ＰＡＮ，ＭＣＤのモデル）（１２）において血漿Ａｎｇｐｔｌ４、トリグリセリド及びヘパリン後ＬＰＬ活性を研究した（図６（ｂ））。これらのモデルにおいて、中症度〜重症度蛋白尿の発症前ではなく、その後には空腹時血漿Ａｎｇｐｔｌ４が高かった。ＰＨＮ及びＢｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラットでは、血漿Ａｎｇｐｔｌ４レベルが上昇し、血漿ＬＰＬ活性が低下したときには有意な高トリグリセリド血症が認められた（図６（ｃ）〜（ｈ））。ＰＡＮでは、蛋白尿の間ずっと高トリグリセリド血症が存在しており、蛋白尿が正常化した後も持続し、ＬＰＬ活性の低下とうまく相関していた（図６（ｉ）〜（ｋ））。高い循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルを発症するが、蛋白尿を発症しないａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットでは脂肪組織からのＡｎｇｐｔｌ４の過剰発現が高トリグリセリド血症も誘発し、ＬＰＬ活性を低下させた（図６（ｌ）及び（ｍ））。対照的に、有足細胞から過剰発現したＡｎｇｐｔｌ４が蛋白尿を引き起こすが、循環への漏洩を引き起こさない３ヶ月齢のＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットは高いトリグリセリドレベルまたは低いＬＰＬ活性を生じなかった。これらの過剰発現研究から、高トリグリセリド血症を発症させるためにはＡｎｇｐｔｌ４の循環への進入が必要であることが示唆される。ネフローゼ症候群における高トリグリセリド血症の発症でのＡｎｇｐｔｌ４の相対的重要性を研究するために、Ａｎｇｐｔｌ４  −／−及び＋／＋マウスにおいてγ２−ネフローゼ血清（ＮＴＳ）を用いて重症の異質相相補体−及び白血球−非依存性蛋白尿を誘発させた（図６（ｎ））。Ａｎｇｐｔｌ４  ＋／＋マウスと比較したとき、マウスが有意な蛋白尿を有しているにもかかわらず、ＮＴＳを注射したＡｎｇｐｔｌ４  −／−マウスでは高トリグリセリド血症が存在していなかった（図１３（ａ））。これらの研究から、循環Ａｎｇｐｔｌ４がネフローゼ症候群において高トリグリセリド血症の重要なメディエーターであることが分かる。
【０１４９】
ネフローゼ症候群における高い循環Ａｎｇｐｔｌ４の起源
高い循環Ａｎｇｐｔｌの起源を調べるために、我々はネフローゼ症候群のラットモデルにおいて多臓器Ａｎｇｐｔｌ４  ｍＲＮＡ発現プロフィールを実施した。高い循環Ａｎｇｐｔｌ４レベル（図６（ｂ））及び重症蛋白尿（図６（ｃ））に相当するＰＨＮ  ９日目で（図７（ａ））、顕著なアップレギュレーションが骨格筋、白色脂肪組織（ＷＡＴ）、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）及び心臓で認められた。５日目の前に糸球体及び肝臓で認められた一過性の軽度のアップレギュレーションは弱まった。高いＡｎｇｐｔｌ４レベル（図６（ｂ））及び中症度〜重症度蛋白尿（図６（ｆ））を有する４．５ヶ月齢のＢｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラット（図７（ｂ））では、顕著なアップレギュレーションが心臓で認められた。このモデルでは、Ａｎｇｐｔｌ４の糸球体アップレギュレーションは見られなかった。ネフローゼ症候群の自己制限的急性モデルであるＰＡＮでは、高い循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルが疾患の間ずっと生じている（図６（ｂ））。蛋白尿のクレッシェンド相（６日目及び１０日目）（図７（ｃ））の間の糸球体／有足細胞Ａｎｇｐｔｌ４の顕著なアップレギュレーションも既に記載されている（６）。Ａｎｇｐｔｌ４アップレギュレーションのこの「糸球体」相（６日目及び１０日目）の後に「末梢」相（１４日目及び２１日目）であり、この間には糸球体アップレギュレーションは存在せず、骨格筋、ＷＡＴ及びＢＡＴで顕著なアップレギュレーションが認められた。ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットでは有足細胞からのＡｎｇｐｔｌ４の一遺伝子過剰発現は循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルを上昇させないので、ラット血漿の２次元ゲルウェスタンブロット研究をその後軽度のＰＡＮがこれらのラットで誘発された「糸球体」相の間に実施した（図７（ｄ），７（ｅ），１３（ｂ））。ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックＰＡＮラットでは野生型ＰＡＮラットよりもＡｎｇｐｔｌ４の有意に高い循環レベルが認められた。この循環タンパク質は抗Ｖ５抗体と反応性であり（図７（ｆ））、これにより導入遺伝子発現タンパク質はそのＣ末端でＶ５標識されているのでその有足細胞起源が確認される。高い循環導入遺伝子過剰発現Ａｎｇｐｔｌ４を維持する場合、ＰＡＮを有するａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４及びＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットは野生型ＰＡＮラットよりも高い血漿トリグリセリド及び低いＬＰＬ活性を有していた（図７（ｇ）及び（ｈ））。
【０１５０】
ネフローゼ症候群におけるＬＰＬ及びＡｎｇｐｔｌ４の尿中排泄
正常なＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットとは異なり、ネフローゼラットはＡｎｇｐｔｌ４を尿中に排泄し（図８（ａ））、これによりネフローゼ状態では循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルは全Ａｎｇｐｔｌ４産生を過小評価することが示唆される。正常ラットは循環からの肝臓摂取によりＡｎｇｐｔｌ４放出ＬＰＬを分解するので（１６）、追加の排泄はネフローゼ症候群の尿中で認められた（図８（ｂ），図１３（ｃ）における対照血清ブロット）。活性ＬＰＬを選択的に結合するモノクローナル抗体である５Ｄ２（図８（ｃ），補足図７（ｄ）中の対照血清ブロット）との反応性から、活性ＬＰＬも重症蛋白尿では尿中に排泄することが示唆される。また、ネフローゼＰＡＮラットは蛋白尿が大きく低下するまでＬＰＬ  ｍＲＮＡ発現を増加させ得なかった（図８（ｄ））。対照的に、非蛋白尿ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットは高いＡｎｇｐｔｌ４レベルに応答して骨格筋及び心臓におけるＬＰＬ発現をアップレギュレートし得る（図８（ｅ））。これらの要因はネフローゼ症候群におけるＡｎｇｐｔｌ４媒介高トリグリセリド血症の維持に寄与し得る。
【０１５１】
高い循環Ａｎｇｐｔｌ４は蛋白尿を減少させる
ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニック及び野生型Ｓｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットにおけるＰＡＮの誘発はトランスジェニックラットにおいて蛋白尿を有意に減少させることを示し（図９（ａ））、これから循環Ａｎｇｐｔｌ４が抗蛋白尿効果を有していることが示唆される。この抗蛋白尿効果が循環Ａｎｇｐｔｌ４により特異的に誘発されたかどうかを調べるために、循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルを部分的に枯渇させるために蛋白尿の発症後に既に特徴づけられている家兔抗ラットＡｎｇｐｔｌ４抗体（６）を野生型ＰＡＮラットに注射し、高い蛋白尿（図９（ｂ））が認められた。次に、組換えシアル化ラットＡｎｇｐｔｌ４をＢｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラット（図９（ｃ））及び糸球体間質損傷のモデルである抗Ｔｈｙ１．１腎炎を有しているラット（図９（ｄ））に静脈内注射した。いずれの場合も、蛋白尿の有意な減少が認められた。
【０１５２】
低いＬＰＬ不活化を有するヒトＡｎｇｐｔｌ４変異体は蛋白尿を減少させる
トリグリセリド摂取に対するＡｎｇｐｔｌ４のＬＰＬ媒介効果を蛋白尿に対するその効果から分離するために、２つの部位に変異を有するヒトＡｎｇｐｔｌ４のｐｃＤＮＡ３．１  Ｖ５  Ｈｉｓ  Ｂ構築物を作成した（図１０（ａ））。１組の変異はＬＰＬに対する結合のために重要であることが公知の部位またはその近く（アミノ酸４０または３９）でなされていた。別の組の変異は完全長Ａｎｇｐｔｌ４の開裂に関与することが公知の領域（アミノ酸１６１−１６４）でなされた。
【０１５３】
次に、ＨＥＫ  ２９３ベースの安定細胞株はこれらの変異体及び野生型プラスミドのために作成し、上清を含有する組換えタンパク質を無血清条件で収集した。Ａｎｇｐｔｌ４を十分にシアル化するために、ＭａｎＮＡｃ（Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン）を培地に添加した。次いで、野生型及び組換えＡｎｇｐｔｌ４を抗Ｖ５抗体を用いるウェスタンブロットにより評価し、適切なサイズ及び少ない開裂での変異タンパク質の移動が認められた（図１０（ｂ））。等量のヒト組換えＡｎｇｐｔｌ４を蛋白尿Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラットに１回静脈内注射した後、変異タンパク質についてより高いピークレベルが認められた（図１０（ｃ））。蛋白尿の有意な減少は野生型及び変異タンパク質において１回注射してから２週間後に認められた（基準のパーセンテージとして最下点の平均±ＳＥ：野生型８５２５，５３．８±６．３；変異体８５０１，３５．９±１２．１；変異体８５１５，４１．２±７．２）（図１０（ｄ））。血漿トリグリセリドレベルは、注射後３時間及び６時間で野生型では基準と比較して有意に高かったが、変異Ａｎｇｐｔｌ４注射したラットではそうではなかった（図１０（ｅ））。変異タンパク質を注射したラットではトリグリセリドレベルが６時間目で野生型タンパク質を注射したラットよりも有意に低かった。１２時間〜１７日目の間の空腹時トリグリセリドレベルは野生型及び変異Ａｎｇｐｔｌ４注射したラットで区別できず、対照に類似していた（図１３（ｅ））。
【０１５４】
循環Ａｎｇｐｔｌ４は糸球体内皮αｖβ５インテグリンに結合することにより蛋白尿を減少させる
ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラット腎臓の抗Ｖ５抗体を用いる共焦点画像解析から、脂肪組織が糸球体内皮と共存するＡｎｇｐｔｌ４−Ｖ５を分泌したことが分かった（図１１（ａ））。イムノゴールドＥＭを用いて、このＡｎｇｐｔｌ４−Ｖ５は糸球体内皮表面上に、主に内皮−糸球体基膜界面の領域で認められた（図１１（ｂ））。安定細胞株から分泌された組換えラットＡｎｇｐｔｌ４を用いて、我々は、ネフローゼ状態の循環Ａｎｇｐｔｌ４に真似たシアル化Ａｎｇｐｔｌ４タンパク質が培養ラット糸球体内皮細胞（ＧＥｎＣ）を酸化損傷から保護し、ＰＡＮ及びＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットにおいて有足細胞分泌Ａｎｇｐｔｌ４の約半分を含む蛋白乳誘発形態の低シアル化Ａｎｇｐｔｌ４が酸化損傷の影響を増加させることを示した（図１１（ｃ））。
【０１５５】
Ａｎｇｐｔｌ４は最近β５インテグリンを結合することがわかったので（１７）、蛋白尿に対する循環Ａｎｇｐｔｌ４の保護効果が糸球体内皮中に存在するαｖβ５インテグリンへの結合を介して媒介されたかどうかを調べた。このタンパク質：タンパク質相互作用は組換えラットＡｎｇｐｔｌ４及び精製ヒトαｖβ５インテグリンを被覆したプレートを用いて確認され、強い用量依存性結合（Ｒ２  ０．９９６）が認められた（図１１（ｄ））。β５インテグリンノックアウト（Ｉｔｇｂ５  −／−）及び野生型（Ｉｔｇｂ５  ＋／＋）マウスにおいて２−ＮＴＳを用いてネフローゼ症候群を誘発させると、ノックアウトマウスでは回復相（５日目及び７日目）中に非常に高いレベルの蛋白尿を示し（図１１（ｅ））、この相はこのモデルにおける骨格筋及び脂肪組織からの循環Ａｎｇｐｔｌ４産生の末梢相に相当する（補足図１４（ａ）及び（ｂ））。このことから、ピーク蛋白尿からの低下（３日目を超える）はαｖβ５インテグリンに結合することにより抗蛋白尿効果を発揮する循環タンパク質様Ａｎｇｐｔｌ４の存在により影響されたことが示唆される。αｖβ５インテグリン−Ａｎｇｐｔｌ４相互作用を阻止するために、ＰＡＮにおいてピーク蛋白尿からの回復（１０日目を超える，循環Ａｎｇｐｔｌ４産生の末梢相に相当する）中にβ５インテグリンの細胞外部分に対する抗体（抗β５インテグリン抗体）または免疫前血清を野生型（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）ラット（図１１（ｆ），補足図１４（ｃ）及び（ｄ））及びａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラット（図１１（ｇ））に注射した。両モデルで回復の有意な遅れが認められた。最後に、ネフローゼ症候群はＡｎｇｐｔｌ４  ＋／＋及びＡｎｇｐｔｌ４  −／−マウスにおいて誘発され、Ａｎｇｐｔｌ４  −／−マウス中には存在しない循環Ａｎｇｐｔｌ４産生の末梢相中のピーク蛋白尿（７日目）からの回復の有意な遅れが認められた（図１１（ｈ））。糸球体相中のＡｎｇｐｔｌ４  −／−マウスにおける蛋白尿の低いレベルは、このモデルにおける蛋白尿の幾つかの原因の１つとしての有足細胞分泌した低シアル化Ａｎｇｐｔｌ４の我々が公開した記載（６）と一致している。
【０１５６】
追加の変異体
４つの追加の変異タンパク質：８４９６、８５０６、８５１１及び８５２０を研究した。各々は図１７に示すように３９、４０、または１６１−１６４位に少なくとも１つのアミノ酸置換を有している。ＨＥＫ  ２９３ベースの安定細胞株を作成し、変異タンパク質を発現させるために上記したように培養した。４つすべての変異タンパク質にＶ５、抗Ｖ５抗体で標識した後、抗Ｖ５抗体を用いるウェスタンブロットにより評価し、適切なサイズ及び少ない開裂で変異タンパク質の移動が認められた。結果は、ウェスタンブロットによると変異体では開裂したタンパク質の量が野生型に比して有意に少ないことを示している（図１８）。等量の変異８５１１タンパク質を蛋白尿Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラットに１回静脈内注射した後、変異体８５１１の場合より高いピークレベルが認められた（図１９）。赤い矢印は組換えタンパク質を注射した１回の時点を示す。２つの変異ヒトＡｎｇｐｔｌ４タンパク質（１５μｇ）をズッカー糖尿病肥満ラット（糖尿病性腎症及び糖尿病性腎臓病のモデル，ｎ＝４匹のラット／群）に注射し、その後血漿トリグリセリドレベルを有意に上昇させることなく（図２２）、変異タンパク質の高い循環レベル（図２０）と蛋白尿の減少が認められた（図２１）。＊  Ｐ＜０．０５，＊＊  Ｐ＜０．０１，＃  Ｐ＜０．０５。すべての＊値は基準日の０日目の値に対する。
【０１５７】
検討
所与の仮説モデルに束縛されるつもりはないが、この研究から循環Ａｎｇｐｔｌ４がネフローゼ症候群における重要な分子メディエーターであることが分かる（図１５）。最初、どのようにこの症候群の２つの重要なコンポーネントである蛋白尿及び高トリグリセリド血症が分子レベルでリンクしているかが記載されている。糸球体は、各種疾患の中で異なるメカニズムにより蛋白尿の発症のために重要である。通常蛋白尿及び浮腫の亜急性発症に関係している２つの状態であるＭＮ及びＦＳＧＳの動物モデルを用いて、Ａｎｇｐｔｌ４発現をアップレギュレートすることにより末梢臓器、特に骨格筋、脂肪組織及び心臓が高い蛋白尿に応答することを立証した。専らこれらの末梢臓器からこの段階で誘導される循環Ａｎｇｐｔｌ４は２つの強力な効果を有している。第１に、循環Ａｎｇｐｔｌ４は糸球体内皮中のαｖβ５インテグリンに結合し、蛋白尿を減少させ、これにより高い循環Ａｎｇｐｔｌ４の主目的は蛋白尿を減少させるための試みであることが示唆される。第２に、多分、高い循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルの意図しない結果はそのＬＰＬへの結合（その生理学的機能）、少ないトリグリセリド摂取及び高トリグリセリド血症である。ここで検討されている蛋白尿と高トリグリセリド血症の間のリンクは蛋白尿の主な病因に関係しないが、その循環Ａｎｇｐｔｌ４による減少／修飾に関係していることを明白にすることは重要である。応答を発生させるためには中症度〜重症度蛋白尿（ヒトでは、少なくとも３．５ｇ／２４時間）を必要とするので、ヒトネフローゼ症候群における蛋白尿の発症と高トリグリセリド血症の発生の間の遅れはＡｎｇｐｔｌ４の末梢産生によっても説明される。始めの頃、これらの２つの動物モデルにおける軽度の蛋白尿は末梢臓器Ａｎｇｐｔｌ４応答、高い血漿Ａｎｇｐｔｌ４、または高いトリグリセリドレベルと関係していなかった。末梢組織からの高いＡｎｇｐｔｌ４分泌も空腹に対する生理学的応答であるので（１８）、Ａｎｇｐｔｌ４の高い末梢産生はネフローゼ症候群における過剰の尿中タンパク質排泄を抑えるために身体により使用される空腹時様応答の一部であり得る。
【０１５８】
別の興味深い教えは、浮腫及び蛋白尿の発症が急性であるＭＣＤのモデルであるＰＡＮラットから学べる。従来の研究（６）から、ＭＣＤ中の有足細胞はＡｎｇｐｔｌ４の２つの異なる形態、すなわち蛋白尿を誘発させる高ｐＩ・低シアル化形態及び循環Ａｎｇｐｔｌ４と同一の中性ｐＩ・シアル化形態を産生することが分かる。他の要因の中で、不十分なシアル酸基質はＭＣＤにおいて有足細胞による高ｐＩ  Ａｎｇｐｔｌ４の産生において重要な役割を果たし、インビボでシアル酸前駆体のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを用いた高ｐＩ  Ａｎｇｐｔｌ４から中性ｐＩ  Ａｎｇｐｔｌ４への変換により蛋白尿が減少する。ＦＳＧＳ及びＭＮとは異なり、低シアル化Ａｎｇｐｔｌ４の糸球体アップレギュレーションはこの疾患での蛋白尿の発症において重要な役割を発揮する。循環シアル化Ａｎｇｐｔｌ４はＰＡＮモデルの期間中ずっと高いままであり、起源は初期部分では糸球体（すなわち、糸球体相）であり、後期段階では骨格筋及び脂肪組織（すなわち、末梢相）である。この論文のインビトロ研究から、酸化ストレスの環境で高ｐＩ  Ａｎｇｐｔｌ４は内皮損傷を増加し、中性ｐＩ  Ａｎｇｐｔｌ４は内皮損傷を低下させることが分かる。高ｐＩ  Ａｎｇｐｔｌ４に対する更なる研究はこの論文の範囲を超えている。この論文においてインビボ研究のために使用されたすべての組換えＡｎｇｐｔｌ４は中性ｐＩ・シアル化形態であった。ＭＮ及びＦＳＧＳを有するラットモデルのように、ＰＡＮラットは１０日目後の蛋白尿の低下に有意に寄与するＡｎｇｐｔｌ４アップレギュレーションの末梢相をも発生する。
【０１５９】
すべてのモデルにおける蛋白尿の減少に対する有意なメディエーターは糸球体内皮におけるＡｎｇｐｔｌ４−αｖβ５インテグリン相互作用である。なぜならば、ノックアウトマウス中にβ５インテグリンまたはＡｎｇｐｔｌ４が存在しないかまたはβ５インテグリンの細胞外部分に対する抗体を用いてこの相互作用を阻止すると蛋白尿の低下率が抑えられるからである。ＰＡＮにおけるＡｎｇｐｔｌ４産生の末梢相の別の影響は蛋白尿が和らいだ後でも軽度の高トリグリセリド血症の持続（２１日目）である。類似の残留高トリグリセリド血症は寛解状態に入った後のＭＣＤを有する小児で既に立証されている（１９）。循環Ａｎｇｐｔｌ４がその保護効果を発揮するために他の糸球体細胞表面分子とも相互作用し得ることが可能である。Ａｎｇｐｔｌ４の糸球体内皮αｖβ５インテグリンへの結合を追跡するためには２つの理由があった。第１は、共焦点画像解析及びイムノゴールド電子顕微鏡検査は、ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットにおいて脂肪組織から分泌されたＡｎｇｐｔｌ４−Ｖ５が糸球体中の内皮細胞に特異的に結合することを示した。第２に、αｖβ５はインビボでＡｎｇｐｔｌ４と相互作用することが判明している糸球体内皮細胞上で発現した唯一のインテグリンである。他の主要な糸球体内皮インテグリンのαｖβ３はＡｎｇｐｔｌ４と相互作用しない（１７）（我々も確認した，データ示さず）。内皮αｖβ５インテグリンへのＡｎｇｐｔｌ４結合が蛋白尿を減少させる正確なメカニズムは将来解明されるであろう。推定の内皮−有足動物フィードバックループが影響されることが可能である。
【０１６０】
別の興味深い所見は、一遺伝子過剰発現後のＡｎｇｐｔｌの循環への進入は臓器依存性であることである。以前発生させた心臓特異的Ａｎｇｐｔｌ４過剰発現トランスジェニックマウスと同様に（２０）、ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４ラットにおける有足細胞中でのＡｎｇｐｔｌ４の一遺伝子過剰発現は循環に自動的に進入し得ない。対照的に、脂肪組織での過剰発現（ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラット（６），ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックマウス（１８））は循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルを確実に上昇させる。Ｓｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットＰＡＮ糸球体相及びＰＡＮを有するＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットで認められたような有足細胞分泌Ａｎｇｐｔｌ４の循環への進入は、多分糸球体中で産生される他のまだ同定されていないタンパク質の活性を必要とする。これは、複数の遺伝子及びタンパク質の発現が同時に影響を受けるヒト糸球体疾患とうまく一致する。従って、循環Ａｎｇｐｔｌ４の全身利用可能性及び効果は多分疾患過程の一部として多臓器で変化した他の遺伝子／タンパク質により、ネフローゼ状態でのＡｎｇｐｔｌ４及びＬＰＬの尿排泄によっても影響されるであろう。
【０１６１】
循環Ａｎｇｐｔｌ４の抗蛋白尿効果は既に多くの各種形態の糸球体疾患を治療するために使用されるグルココルチコイドの有効性において部分的役割を果たし得る。Ａｎｇｐｔｌ４発現に対するグルココルチコイドの効果は臓器依存性である。グルココルチコイドはＭＣＤにおいて有足細胞中でのＡｎｇｐｔｌ４発現を低下させるが（６）、マウスにおいてＡｎｇｐｔｌ４の脂肪組織発現を増加させることが分かっている（２１）。更なる研究は、グルココルチコイドが十分量のＡｎｇｐｔｌ４の脂肪組織から循環への分泌を誘導するかどうか、この効果がインビボで用量依存性であるかどうか、これがネフローゼ症候群でも起こるかどうかを研究し得る。
【０１６２】
他の可溶性タンパク質はヒト糸球体疾患の病因に関係している。有足細胞から分泌され、循環中にも存在する血管内皮増殖因子がヒト血栓性微小血管症の発症に関与することが分かっており、内皮及び有足細胞表面上で発現した特定受容体を介してその生物学的効果を発揮する（２２）。子癇前症の胎盤から過剰量で分泌される可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１（２３）及び可溶性エンドグリン（２４）は糸球体内皮症の病因に関与している。しかしながら、これらのタンパク質は疾患病因に関係しており、疾患に対する全身応答ではない。最近、可溶性ウロキナーゼ受容体ｓｕＰＡＲは、主に有足細胞αｖβ３インテグリンに結合することにより発揮される蛋白尿誘発効果を有することが判明した（２５）。抗蛋白尿Ａｎｇｐｔｌ４及び蛋白尿誘発性ｓｕＰＡＲ間の共通性は循環タンパク質と糸球体インテグリンの相互作用である。同一群による追跡研究から、ｓｕＰＡＲレベルがＮＰＨＳ２遺伝子に変異を有するＦＳＧＳ患者でも上昇していることが分かる（２６）。このことから、これらのＮＰＨＳ２変異を有する患者では、ｓｕＰＡＲの上昇が糸球体疾患に対する全身応答であることが示唆される。このような場合、ＳｕＰＡＲは、糸球体損傷または蛋白尿に応答して上昇し、根本的な糸球体疾患の経過に影響を及ぼす強力な効果を有するＡｎｇｐｔｌ４のような循環タンパク質の類に結合する。非ＨＩＶ糸球体虚脱症（２７，２８）の病因に影響を及ぼす推定循環タンパク質が同定されたら、このリストは近い将来増えるであろう。
【０１６３】
最後に、ヒトＡｎｇｐｔｌ４の変異形態は、血漿トリグリセリドレベルに有意に悪影響を及ぼすことなく蛋白尿を非常に有意に減少させることができ（平均ピーク減少はおおよそ６０％）、１回静脈内注射してから少なくとも２週間の間有効である。これらの組換えタンパク質のヒト糸球体疾患に対する治療剤としての更なる発展が期待できる。要するに、循環Ａｎｇｐｔｌ４はネフローゼ症候群の重要な生物学的メディエーターであり、蛋白尿と高トリグリセリド血症間の重要なリンクに相当する。
【０１６４】
実施例４のための方法
ヒト及び齧歯類Ａｎｇｐｔｌ４に対するＥＬＩＳＡ
患者及び対照血漿サンプル由来のヒトＡｎｇｐｔｌ４を調べるためのサンドイッチＥＬＩＳＡはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（米国ミネソタ州ミネアポリス）から購入した。標準曲線は１．２５ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌの間で校正し、０．９８のＲ２値を有していた（補足図１６（ａ））。
【０１６５】
血漿中のラット及びマウスＡｎｇｐｔｌ４を調べるために、新しいＥＬＩＳＡアッセイを開発した。ヒツジ抗ラットＡｎｇｐｔｌ４抗体（５００６Ｂ）をアミノ酸２２−１０１に対して作成し、ポジティブ対照として既に公開されている家兔抗ラットＡｎｇｐｔｌ４抗体（６）を用いるウェスタンブロットにより特異性を特性づけた。活性を組換えＡｎｇｐｔｌ４を用いて吸収させ、ウェスタンブロット及び免疫蛍光による反応性の低下も記録した。アッセイは、組換えラットＡｎｇｐｔｌ４を分泌する既に公開されているＨＥＫ２９３ベースの安定細胞株由来の濃縮上清を用いて標準化した。ウェルを０．１〜０．５ｍｇの濃縮上清で被覆した。阻止及び洗浄後、１０μｇのヒツジ抗ラットＡｎｇｐｔｌ４抗体を添加し、次いで洗浄、１６ｎｇ／ウェルのロバ抗ヒツジＩｇ  ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、洗浄及びＴＭＢシステム試薬、及びＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いてＯＤ  ４５０ｎｍでの測定を行った。０．９９８のＲ２との線形関係を有する標準曲線を得た（図１６（ｂ））。齧歯類血漿を分析するために、ウェルを５０μｌの血漿で２回被覆した後、上記したステップを行った。研究サンプルを除くすべての試薬を含有しているブランク対照ウェルの測定値を得、研究サンプルの測定値から減じた。各時点について最低４個のサンプルを測定した。
【０１６６】
ＥＬＩＳＡアッセイのために使用したヒト血漿サンプルは、ＵＡＢ（ＰＩ  Ｃｈｕｇｈ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  Ｎａｃｉｏｎａｌ  Ｄｅ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｉａ、Ｍｅｘｉｃｏ  Ｃｉｔｙ（ＰＩ  Ａｖｉｌａ−Ｃａｓａｄｏ）で行ったＩＲＢ承認済み研究、及び既に公開されている研究（６）から得た。
【０１６７】
動物研究
ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４及びａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットの作成及び特性付けは既に公開されていた（６）。Ｂｕｆｆａｌｏ  ＭｎａラットはＭＴＡを介して日本国京都の京都大学のＭａｓａｏ  Ｍｉｔｓｕｙａｍａ博士から入手した。別段の記述がない限り、Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラットに対する比較はすべて年齢及び性別を整合させたＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ及びＷｉｓｔａｒラットと行った。結果は類似していたので、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットとの比較から得たデータのみを提示する。Ｉｔｇｂ５  −／−及び対照１２９Ｓ１／ＳｖＩｍＪマウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国メイン州バー・ハーバー）から購入した。Ａｎｇｐｔｌ４  −／−マウスはＥｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎよりＳａｎｄｅｒ  Ｋｅｒｓｔｅｎに供給された。Ａｎｇｐｔｌ４  −／−マウスを用いる研究はすべてヴァーヘンニゲン大学のアニマル・エシックス委員会より承認された。他のすべての動物研究はバーミンガムのアラバマ大学の動物実験委員会より承認された。
【０１６８】
１回静脈投与のＰＡＮ（ｎ＝４匹のラット／群）、ＰＨＮ（ｎ＝４匹のラット／群）及び抗Ｔｈｙ１．１腎炎（ｎ＝４匹のラット／群）の誘発は既に記載されていた（１２，１３）。十分量ＰＡＮのために、１５ｍｇ／１００ｇのプロマイシンアミノヌクレオシド（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，米国ミズーリ州セントルイト）を使用した。軽度ＰＡＮのためには、用量を７．５ｍｇ／１００ｇに減じた。ヒツジ抗ラットネフローゼ血清（ＮＴＳ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｅｎｔｅｒのＤａｖｉｄ  Ｓａｌａｎｔからのギフト）のγ２フラクションを用いる補体−及び白血球−非依存性ネフローゼ症候群（ｎ＝４匹のマウス／群）の誘発は既に記載されていた（２９）。家兔抗ラットＡｎｇｐｔｌ４抗体（６）をＰＡＮラット（ｎ＝３匹のラット／群）に注射する動物研究の場合、５００μｌの抗体または免疫前血清を各用量で注射した。抗体による循環Ａｎｇｐｔｌ４の枯渇はウェスタンブロットにより確認した。ラットＰＡＮ研究で１回投与あたりに注射した抗β５インテグリン抗体または免疫前血清の容量は次の通りであった：Ｓｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットＰＡＮ（２５０μｌ），ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットＰＡＮ（５００μｌ）。
【０１６９】
多臓器遺伝子発現研究のために、臓器サンプルを安楽死直後に液体窒素を用いて急速凍結した（３匹のラットまたはマウス／臓器サンプル，プールされている）。白色脂肪組織は腹部から、褐色脂肪組織は肩甲骨間領域から、骨格筋は大腿から、肝臓の凍結した無傷またはサンプルは左葉及び右葉の両方から得、心臓を無傷で凍結させ、ラット腎臓を凍結させ、その後糸球体単離のために使用した。マウスの実験では、安楽死させた直後にダイナビーズを用いて心臓を介して腎臓を潅流させた後、糸球体単離のために使用した。１２個のｃＤＮＡテンプレートをプールされている各臓器から作成し、遺伝子発現をＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲにより評価した。
【０１７０】
組換えラット及びヒトＡｎｇｐｔｌ４の注射
ＨＥＫ２９３細胞ベースの安定細胞株からのシアル化ラットＡｎｇｐｔｌ４の収集は既に記載されている（６）。１回投与につき、濃縮ＨＥＫ２９３  Ａｎｇｐｔｌ４、またはラットＡｎｇｐｔｌ４を含有している空ｐｃＤＮＡ  ３．１  Ｖ５  Ｈｉｓベクター安定細胞株上清（１．８ｍｇ，約２００ｍｌの培地から誘導）をＢｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラット（ｎ＝４匹のラット／群）及びＴｈｙ１．１ラット（ｎ＝４匹のラット／群）に注射した。組換えヒト野生型Ａｎｇｐｔｌ４、変異Ａｎｇｐｔｌ４及び対照タンパク質をＢｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラット（ｎ＝３匹のラット／群）に注射した研究の場合、１回投与につき、濃縮上清中の５５μｇの組換えタンパク質（ＥＬＩＳＡにより定量）または等量の対照安定細胞株上清（タンパク質アッセイにより同等化した）を使用した。
【０１７１】
ヘパリン後ＬＰＬ活性
安楽死の１５分前にラットに１０単位／１００ｇ体重のブタヘパリンを静脈内注射し、活性をＲｏａｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．（米国ニューヨーク州ニューヨーク）のアッセイを用いて測定した（３０）。オートアナライザー（幾つかの研究）またはＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（米国ミシガン州アナーバー）のキットを用いて血清トリグリセリドを測定した。
次の技術は既に記載されている：代謝ゲージでの１８時間尿収集、蛋白尿、マウス尿アルブミン及びクレアチニンの測定、２Ｄゲル電気泳動及びウェスタンブロット、共焦点画像解析、イムノゴールド電子顕微鏡検査、全ＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡテンプレートの作成（２μｇの全ＲＮＡ／テンプレート）、リアルタイムＰＣＲ（６，１２，１３，３１）。リアルタイムＰＣＲ研究では、ｍＲＮＡ発現の３倍の変化を有意と見なし、先行刊行物において我々により確認された（１３，３１）。ＬＰＬに対するウェスタンブロットは、ヤギ抗ＬＰＬ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国カリフォルニア州サンタソルーズＡ）及び活性ダイマーＬＰＬを特異的に同定する５Ｄ２モノクローナル抗体（ワシントン大学のＪｏｈｎ  Ｂｒｕｎｚｅｌｌからのギフト）を用いて実施した（３２）。２ＤゲルウェスタンブロットのデンシトメトリーはＩｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ＴＬ  ７．０ソフトウェァ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，米国ウィスコンシン州ウォキショー）を用いて実施した。マウス抗ＰＥＣＡＭ１抗体はＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（米国カリフォルニア州サンディエゴＡ）から購入した。使用したすべての二次抗体はＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国ペンシルベニア州ウェストグローブ）から購入し、非標的種に対して最小のバックグラウンド反応性を有していた。
【０１７２】
ヒトＡｎｇｐｔｌ４変異構築物及び安定細胞株の生成
ヒトＡｎｇｐｔｌ４クローンをＰＣＲベースの変異により変異させた。既に記載されているように（６）、ＨＥＫ  ２９３ベースの安定細胞株を作成するためにｐｃＤＮＡ  ３．１  Ｖ５  Ｈｉｓベクター中で野生型及び変異ヒトＡｎｇｐｔｌ４クローンを使用した。タンパク質を収集するために使用する場合、無血清ＤＭＥＭは培地に分泌される組換えタンパク質が十分シアル化されるようにシアル酸の前駆体である２５ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）を含んでいた。既に記載されているように（６）、タンパク質を収集し、上清を濃縮した。組換えヒトＡｎｇｐｔｌ４をＥＬＩＳＡを用いて定量した。
【０１７３】
内皮細胞研究
無血清条件で２４時間増殖させた培養ラットＧＥｎＣにＨ２Ｏ２（２００μＭ）誘発ストレスをかけ、等量のＡｎｇｐｔｌ４−ＨＥＫ２９３または対照−ＨＥＫ２９３安定細胞株からの濃縮上清と共インキュベートした。細胞損傷の目安として上清中のＬＤＨレベルを細胞毒性キット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，米国インディァナ州インディアナポリス）を用いて２４、４８及び７２時間目に測定した。
【０１７４】
αｖβ５インテグリンプレートアッセイ
９６ウェルプレートを５ｎｇのヒト精製αｖβ５インテグリン／ウェルで被覆し、１％  ＢＳＡを含むＴＢＳＴでブロックした後、漸増量のラットＡｎｇｐｔｌ４−Ｖ５を分泌する安定細胞株由来の濃縮上清とインキュベートした。Ｖ５標識を抗Ｖ５  ＨＲＰ抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，米国ニューヨーク州グランドアイランド，１：２５００）を用いて検出し、反応をＴＭＢペルオキシダーゼ基質及び溶液（ＫＰＬ、Ｉｎｃ．，米国メリーランド州ゲイザースバーグ）を用いて生じさせ、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  ＭＣＣ３４０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて４５０ｎｍで測定した。
【０１７５】
抗β５インテグリン抗体の作成及び特性付け
家兔において２つのポリクローナル抗体（抗体８４７２Ａ，アミノ酸３５−４６０，インテグリンβドメインを含む；抗体８４７２Ｂ，アミノ酸４６１−７１９，インテグリンβ尾部を含む）を作成するために、融合タンパク質をヒトβ５インテグリンの細胞外セグメントの一部に対して生成した。組換えヒトβ５インテグリンに対する反応性を吸収する前及びその後に両抗体の特異性をウェスタンブロットにより試験した。Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（ｎ＝３匹のラット／群）においてＰＡＮを誘発させ、β５インテグリンのインビトロ阻止を評価するために２つの用量の各抗体を回復相（すなわち、蛋白尿のゆっくりした回復）中に静脈内注射することによりパイロット研究を実施した。８４７２Ａの有効性は８４７２Ｂより数倍高かったので、更なる研究のために８４７２Ａ（図１６（ｃ））（ｎ＝４匹のラット／群）を使用した。この抗体を静脈内注射した後、糸球体を共焦点画像解析すると、糸球体における内皮への局在化が分かった（図１６（ｄ））。
【０１７６】
統計分析
２群間の差の分析はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１０で独立スチューデントｔ検定を用いて実施した。３つ以上の群に対して、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＩｎＳｔａｔソフトウェアバージョン３．１０を用いる事後分析検定とＡＮＯＶＡを用いた。
【０１７７】
参考文献(実施例４を除く)
【０１７８】
【表５】
2016516726.tif 000007
2016516726.tif 000008
2016516726.tif 000009
2016516726.tif 000010
【０１７９】
参考文献(実施例４)
【表６】
2016516726.tif 000011
2016516726.tif 000012
2016516726.tif 000013
【０１８０】
【表７】
2016516726.tif 000014
【図１】
2016516726.tif 000015
【図２】
2016516726.tif 000016
【図３】
2016516726.tif 000017
【図４】
2016516726.tif 000018
【図５−１】
2016516726.tif 000019
【図５−２】
2016516726.tif 000020
【図５−３】
2016516726.tif 000021
【図５−４】
2016516726.tif 000022
【図６−１】
2016516726.tif 000023
【図６−２】
2016516726.tif 000024
【図７−１】
2016516726.tif 000025
【図７−２】
2016516726.tif 000026
【図８】
2016516726.tif 000027
【図９】
2016516726.tif 000028
【図１０】
2016516726.tif 000029
【図１１】
2016516726.tif 000030
【図１２】
2016516726.tif 000031
【図１３】
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【図１４】
2016516726.tif 000033
【図１５】
2016516726.tif 000034
【図１６】
2016516726.tif 000035
【図１７】
2016516726.tif 000036
【図１８】
2016516726.tif 000037
【図１９】
2016516726.tif 000038
【図２０】
2016516726.tif 000039
【図２１】
2016516726.tif 000040
【図２２】
2016516726.tif 000041
【配列表】
2016516726000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年11月17日(2015.11.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
【図１】ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットの発生及び特性付けを示す。（Ａ）２００μｇ  ヒト血漿（ｎ＝４人の患者／群，トリミングした代表的ブロットを示した）の２Ｄゲル分析を示し、寛解状態の微小変化群（ＭＣＤ）を有している患者（すなわち、非蛋白尿患者）と比較して再発状態のＭＣＤを有している患者及び膜性腎症（ＭＮ）を有している患者におけるＡｎｇｐｔｌ４の高い循環レベルの存在（矢印で示す）を立証している。（Ｂ）Ａｎｇｐｔｌ４の脂肪組織特異的過剰発現についてトランスジェニック（ＴＧ）ラットモデル（ａＰ２−Ａｎｇｐｌｔ４  ＴＧ）を示す。（Ｃ）ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラット（ｎ＝３匹のラット／群）におけるＡｎｇｐｔｌ４  ｍＲＮＡの組織特異的過剰発現を示す。ＷＡＴは白色脂肪組織であり、ＢＡＴは褐色脂肪組織である。＊＊＊  Ｐ＜０．００１。（Ｄ）２００μｇ  血漿を２Ｄゲル電気泳動した後のＡｎｇｐｔｌ４についてのウェスタンブロットを示し、ヘテロ接合ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットが野生型ラット（３ヶ月齢，ｎ＝３ブロット／群）よりも高い循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルを有していたことを立証している。（Ｅ）２００μｇ  血漿を２Ｄゲル電気泳動した後の抗Ｖ５及び抗Ａｎｇｐｔｌ４抗体を用いるウェスタンブロットを示し、ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットの血漿中の脂肪組織分泌したＶ５標識Ａｎｇｐｔｌ４の存在を立証している。（Ｆ）ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラット血漿由来の抗Ｎ末端Ａｎｇｐｔｌ４免疫沈降物を２Ｄゲル電気泳動した後のレクチンＳＮＡ  Ｉ及び抗Ａｎｇｐｔｌ４抗体を用いるウェスタンブロッティングを示し、ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４中の循環シアル化Ａｎｇｐｔｌ４の存在を確認した。（Ｇ）３ヶ月齢のヘテロ接合ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラット（ｎ＝３匹のラット／群）からのＰＡＳ染色切片を示し、正常な糸球体形態（倍率４００×）を立証している。（Ｈ）３ヶ月齢のヘテロ接合ａＰ２−Ａｎｇｐｌｔ４  ＴＧ雄ラット中のトランスジェニックタンパク質を特異的に検出するための抗Ｖ５抗体を用いるイムノゴールドＥＭを示し、ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラット中の内皮表面上のゴールド粒子（矢印で示す）を選択的に立証する。
【図２】Ａｎｇｐｔｌ４の高い循環レベルと蛋白尿／アルブミン尿の関係を示す。（Ａ）ＧｅｌＣｏｄｅブルー染色したＳＤＳ  ＰＡＧＥによる異なるヒト及び実験疾患状態での尿タンパク質排泄（３μｇ／レーン，ＭＣＤ寛解を除く）の評価を示し、ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットにおける有意な蛋白尿の不在を立証した（＊を付けたレーン，矢印は約７０ｋＤａでの無傷のアルブミンを示す）。（Ｂ）ＥＬＩＳＡによるアルブミン尿の評価を示し、ヘテロ接合雌ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットが野生型同腹仔よりも低いアルブミン尿を有していた（ｎ＝６匹のラット／群）ことを明らかにした。（Ｃ）ＥＬＩＳＡによるアルブミン尿の評価を示し、ヘテロ接合雄ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットが野生型同腹仔よりも低いアルブミン尿を有していた（ｎ＝６匹のラット／群）ことを明らかにした。（Ｄ）野生型及びａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットにおけるネフローゼ症候群のモデルであるプロマイシンネフローゼ（ＰＡＮ）の誘発を示し、野生型同腹仔と比較してａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットにおける少ない蛋白尿を立証する（ｎ＝８匹のラット／群）。対応の対照と比較して、＊  Ｐ＜０．０５，＊＊  Ｐ＜０．０１。（Ｅ）組換えＡｎｇｐｔｌ４が培養した糸球体内皮細胞（ＧＥｎＣ）に対して保護効果を有していたことを示す。対応の対照と比較して、＊＊  Ｐ＜０．０１，＊＊＊  Ｐ＜０．００１。（Ｆ）ＰＡＮのような疾患モデルの野生型ラットにおける６日目のＡｎｇｐｔｌ４のアップレギュレーションは専ら糸球体であり、蛋白尿及び糸球体Ａｎｇｐｔｌ４発現が下降している場合には脂肪組織中のＡｎｇｐｔｌ４のアップレギュレーションが１０日目で認められたことを示す（ｎ＝３匹のラット／サンプル）。対応の対照と比較して、＊＊  Ｐ＜０．０１，＊＊＊  Ｐ＜０．００１。（Ｇ）ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットにおける基準時及びＰＡＮの誘発後のＡｎｇｐｔｌ４の高い循環レベルが野生型ラットと比較して血漿トリグリセリドレベルの上昇をもたらすことを示す。対応の対照と比較して、＊  Ｐ＜０．０５。（Ｈ）ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットにおける基準時及びＰＡＮの誘発後のＡｎｇｐｔｌ４の高い循環レベルが野生型ラットと比較してヘパリン後リポタンパク質リガーゼ（ＬＰＬ）活性の低下をもたらす。対応の対照と比較して、＊  Ｐ＜０．０５。
【図３】ＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲのために使用したプライマー及びプローブ（配列番号１１〜２２）を示す。
【図４】組換えＡｎｇｐｔｌ４がヒト糸球体疾患の動物モデルにおいて蛋白尿を減少させることを示す。（Ａ）糸球体間質損傷の短期間モデルであるＴｈｙ１．１腎炎における蛋白尿の減少を示す。雄Ｗｉｓｔａｒラット（ｎ＝４匹のラット／群）においてＴｈｙ１．１腎炎を誘発させた。基準蛋白尿（１日目）を評価後、Ａｎｇｐｔｌ４安定または対照細胞株由来の濃縮上清タンパク質をＢｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラット（ｎ＝４匹のラット／群）に連続２日間（１日目及び２日目，矢印）腹腔内注射した後、蛋白尿を評価した。Ａｎｇｐｔｌ４治療したラットでは蛋白尿がずっと低く、５日目で統計上有意であった。＊  Ｐ＜０．０５，＊＊  Ｐ＜０．０１。値はすべて平均＋ＳＥである。（Ｂ）糸球体間質損傷の短期間モデルであるＴｈｙ１．１腎炎における蛋白尿の減少を示す。雄Ｗｉｓｔａｒラット（ｎ＝４匹のラット／群，０日目に注射）においてＴｈｙ１．１腎炎を誘発させた。蛋白尿の誘発（１日目）を確認した後、Ａｎｇｐｔｌ４安定または対照細胞株由来の濃縮上清タンパク質を連続２日間（１日目及び２日目，矢印）静脈内注射した後、蛋白尿を評価した。Ａｎｇｐｔｌ４治療したラットでは蛋白尿がずっと低く、５日目で統計上有意であった。＊  Ｐ＜０．０５，＊＊  Ｐ＜０．０１。値はすべて平均＋ＳＥである。
【図５−１】各種種由来のＡｎｇｐｔｌ４のアミノ酸及びｃＤＮＡ配列を示す。配列番号１及び２はヒト由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す（タンパク質バリアント１イソフォームａ，長い形；４０位及び１６１−１６４のアミノ酸配列に下線を付けた）。配列番号３及び４はヒト由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す（タンパク質バリアント３イソフォームｂ，短い形；４０位及び１６１−１６４のアミノ酸配列に下線を付けた）。配列番号５及び６はラット由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す。配列番号７及び８はマウス由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す。フォワードシークエンシングプライマーに下線を付けた。太字はリバースシークエンシングプライマーである。配列番号９はヒトタンパク質変異バリアントと一般式におけるその配列を示す。配列番号１０はヒトタンパク質変異バリアント３と一般式におけるその配列を示す。
【図５−２】各種種由来のＡｎｇｐｔｌ４のアミノ酸及びｃＤＮＡ配列を示す。配列番号１及び２はヒト由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す（タンパク質バリアント１イソフォームａ，長い形；４０位及び１６１−１６４のアミノ酸配列に下線を付けた）。配列番号３及び４はヒト由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す（タンパク質バリアント３イソフォームｂ，短い形；４０位及び１６１−１６４のアミノ酸配列に下線を付けた）。配列番号５及び６はラット由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す。配列番号７及び８はマウス由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す。フォワードシークエンシングプライマーに下線を付けた。太字はリバースシークエンシングプライマーである。配列番号９はヒトタンパク質変異バリアントと一般式におけるその配列を示す。配列番号１０はヒトタンパク質変異バリアント３と一般式におけるその配列を示す。
【図５−３】各種種由来のＡｎｇｐｔｌ４のアミノ酸及びｃＤＮＡ配列を示す。配列番号１及び２はヒト由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す（タンパク質バリアント１イソフォームａ，長い形；４０位及び１６１−１６４のアミノ酸配列に下線を付けた）。配列番号３及び４はヒト由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す（タンパク質バリアント３イソフォームｂ，短い形；４０位及び１６１−１６４のアミノ酸配列に下線を付けた）。配列番号５及び６はラット由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す。配列番号７及び８はマウス由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す。フォワードシークエンシングプライマーに下線を付けた。太字はリバースシークエンシングプライマーである。配列番号９はヒトタンパク質変異バリアントと一般式におけるその配列を示す。配列番号１０はヒトタンパク質変異バリアント３と一般式におけるその配列を示す。
【図５−４】各種種由来のＡｎｇｐｔｌ４のアミノ酸及びｃＤＮＡ配列を示す。配列番号１及び２はヒト由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す（タンパク質バリアント１イソフォームａ，長い形；４０位及び１６１−１６４のアミノ酸配列に下線を付けた）。配列番号３及び４はヒト由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す（タンパク質バリアント３イソフォームｂ，短い形；４０位及び１６１−１６４のアミノ酸配列に下線を付けた）。配列番号５及び６はラット由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す。配列番号７及び８はマウス由来のアミノ酸及びｃＤＮＡを示す。フォワードシークエンシングプライマーに下線を付けた。太字はリバースシークエンシングプライマーである。配列番号９はヒトタンパク質変異バリアントと一般式におけるその配列を示す。配列番号１０はヒトタンパク質変異バリアント３と一般式におけるその配列を示す。
【図６−１】高い循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルがネフローゼ症候群において高トリグリセリド血症を発症させるために必要であることを示す。（Ａ）原発性糸球体疾患に起因するネフローゼ症候群を有している患者における血漿Ａｎｇｐｔｌ４レベルについてのＥＬＩＳＡ。分析した患者の数を括弧内に示す。（Ｂ）すべてネフローゼ症候群のラットモデルであるパッシブヘイマン腎炎（ＰＨＮ，膜性腎症のモデル）、Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａ（Ｂ．Ｍｎａ，巣状分節性糸球体硬化症を自然に発症）、及び１回静脈内投与したプロマイシンアミノヌクレオシドネフローゼ（ＰＡＮ，微小変化群のモデル）におけるネフローゼ前及びネフローゼ段階の血漿Ａｎｇｐｔｌ４レベルについてのＥＬＩＳＡ。ＰＨＮ（Ｃ〜Ｅ）、Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラット（Ｆ〜Ｈ）及びＰＡＮラット（Ｉ〜Ｋ）における蛋白尿、高トリグリセリド血症及びＬＰＬ活性。（Ｌ、Ｍ）高い循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルを有する脂肪組織特異的Ａｎｇｐｔｌ４過剰発現ラット（ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４）及び導入遺伝子発現Ａｎｇｐｔｌ４が循環に入らない３ヶ月齢の有足細胞特異的Ａｎｇｐｔｌ４過剰発現ラット（ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４）における血漿トリグリセリドレベル及びＬＰＬ活性。（ｎ）γ２−ＮＴＳを用いてネフローゼ症候群を誘発させてから４８時間後のＡｎｇｐｔｌ４  −／−及び＋／＋マウスにおける血漿トリグリセリドレベル。＊  Ｐ＜０．０５，＊＊  Ｐ＜０．０１，＊＊＊  Ｐ＜０．００１。
【図６−２】高い循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルがネフローゼ症候群において高トリグリセリド血症を発症させるために必要であることを示す。（Ａ）原発性糸球体疾患に起因するネフローゼ症候群を有している患者における血漿Ａｎｇｐｔｌ４レベルについてのＥＬＩＳＡ。分析した患者の数を括弧内に示す。（Ｂ）すべてネフローゼ症候群のラットモデルであるパッシブヘイマン腎炎（ＰＨＮ，膜性腎症のモデル）、Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａ（Ｂ．Ｍｎａ，巣状分節性糸球体硬化症を自然に発症）、及び１回静脈内投与したプロマイシンアミノヌクレオシドネフローゼ（ＰＡＮ，微小変化群のモデル）におけるネフローゼ前及びネフローゼ段階の血漿Ａｎｇｐｔｌ４レベルについてのＥＬＩＳＡ。ＰＨＮ（Ｃ〜Ｅ）、Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラット（Ｆ〜Ｈ）及びＰＡＮラット（Ｉ〜Ｋ）における蛋白尿、高トリグリセリド血症及びＬＰＬ活性。（Ｌ、Ｍ）高い循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルを有する脂肪組織特異的Ａｎｇｐｔｌ４過剰発現ラット（ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４）及び導入遺伝子発現Ａｎｇｐｔｌ４が循環に入らない３ヶ月齢の有足細胞特異的Ａｎｇｐｔｌ４過剰発現ラット（ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４）における血漿トリグリセリドレベル及びＬＰＬ活性。（ｎ）γ２−ＮＴＳを用いてネフローゼ症候群を誘発させてから４８時間後のＡｎｇｐｔｌ４  −／−及び＋／＋マウスにおける血漿トリグリセリドレベル。＊  Ｐ＜０．０５，＊＊  Ｐ＜０．０１，＊＊＊  Ｐ＜０．００１。
【図７−１】ネフローゼ症候群における循環Ａｎｇｐｔｌ４の起源を示す。（Ａ）パッシブヘイマン腎炎（ＰＨＮ）、（Ｂ）Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラット及び（Ｃ）プロマイシンアミノヌクレオシドネフローゼ（ＰＡＮ）における対照に対する多臓器Ａｎｇｐｔｌ４  ｍＲＮＡ発現。（Ｄ）軽度ＰＡＮの誘発前及びその後の蛋白尿ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットにおける循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルを示す血漿の代表的２次元ゲル電気泳動及びウェスタンブロット。（Ｅ）    における２次元ゲルのデンシトメトリー分析。（Ｆ）循環中のＶ５標識導入遺伝子発現Ａｎｇｐｔｌ４の存在を立証するためのＰＡＮを有するＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットからの血漿の２次元ゲル電気泳動及びウェスタンブロット。（Ｇ及びＨ）野生型Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４及びＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットにおいてＰＡＮの誘発から６日後の血漿トリグリセリドレベル（Ｇ）及びリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）活性（Ｈ）。空バーは比較のためにここに含めた図６（ｌ）及び６（ｍ）からのデータに相当する。＊  Ｐ＜０．０５，＊＊  Ｐ＜０．０１，＊＊＊  Ｐ＜０．００１。パネルＧ及びＨでは、統計上有意さをトランスジェニックラットと対応する野生型対照間の差について示す。ＰＡＮを誘発前及びその後の各ラットタイプに対してＰ＜０．００１。Ａ〜Ｃのパネルでは、発現の３倍の変化（水平線）を有意とみなした。
【図７−２】ネフローゼ症候群における循環Ａｎｇｐｔｌ４の起源を示す。（Ａ）パッシブヘイマン腎炎（ＰＨＮ）、（Ｂ）Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラット及び（Ｃ）プロマイシンアミノヌクレオシドネフローゼ（ＰＡＮ）における対照に対する多臓器Ａｎｇｐｔｌ４  ｍＲＮＡ発現。（Ｄ）軽度ＰＡＮの誘発前及びその後の蛋白尿ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットにおける循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルを示す血漿の代表的２次元ゲル電気泳動及びウェスタンブロット。（Ｅ）    における２次元ゲルのデンシトメトリー分析。（Ｆ）循環中のＶ５標識導入遺伝子発現Ａｎｇｐｔｌ４の存在を立証するためのＰＡＮを有するＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットからの血漿の２次元ゲル電気泳動及びウェスタンブロット。（Ｇ及びＨ）野生型Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４及びＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットにおいてＰＡＮの誘発から６日後の血漿トリグリセリドレベル（Ｇ）及びリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）活性（Ｈ）。空バーは比較のためにここに含めた図６（ｌ）及び６（ｍ）からのデータに相当する。＊  Ｐ＜０．０５，＊＊  Ｐ＜０．０１，＊＊＊  Ｐ＜０．００１。パネルＧ及びＨでは、統計上有意さをトランスジェニックラットと対応する野生型対照間の差について示す。ＰＡＮを誘発前及びその後の各ラットタイプに対してＰ＜０．００１。Ａ〜Ｃのパネルでは、発現の３倍の変化（水平線）を有意とみなした。
【図８】ネフローゼ症候群におけるＡｎｇｐｔｌ４及びＬＰＬの尿中排泄を示す。（Ａ）正常なＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）、ＰＡＮ、ＰＨＮ及びＢｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラットからの尿の代表的な還元ウェスタンブロット。黒い矢印はＡｎｇｐｔｌ４バンドに向けられている。アルブミンブラシもＰＡＮ、ＰＨＮ及びＢｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラットにおいて６５〜７０ｋＤａに認められる。（Ｂ）ＬＰＬの尿中排泄（矢印）について評価するためのネフローゼラットからの尿のヤギ抗ＬＰＬ抗体を用いる非還元ウェスタンブロット。（Ｃ）活性ＬＰＬ（矢印）を同定するためのネフローゼラット尿の抗ＬＰＬモノクローナル抗体５Ｄ２を用いる非還元ウェスタンブロット。（Ｄ）ＰＡＮを有するＳｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットにおけるＬＰＬについての多臓器ｍＲＮＡ発現プロフィール。（Ｅ）ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットにおいてＬＰＬを発現する主要臓器のｍＲＮＡ発現プロフィール。パネルＤ及びＥでは、発現の３倍の変化（水平線）を有意とみなした。
【図９】蛋白尿に対する循環Ａｎｇｐｔｌ４の影響を示す。赤色矢印は必要に応じて抗体または組換えタンパク質を注射した時点を示す。（Ａ）野生型Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ及びａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットにおいてピューロマイシンアミノヌクレオシドネフローゼ（ＰＡＮ）を誘発させた後の蛋白尿。（Ｂ）ＰＡＮを有するＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットにおける蛋白尿に対する抗Ａｎｇｐｔｌ４  Ａｂ．を用いる欠乏する循環Ａｎｇｐｔｌ４の影響。（Ｃ）組換えラットＡｎｇｐｔｌ４を分泌する安定細胞株または対照の安定細胞株由来の濃縮上清を注射後のＢｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラットにおける蛋白尿。（Ｄ）糸球体間質損傷のモデルである重篤な抗Ｔｈｙ１．１腎炎における蛋白尿に対する上記細胞株由来の組換えラットＡｎｇｐｔｌ４または対照タンパク質の注射の影響。＊  Ｐ＜０．０５，＊＊  Ｐ＜０．０１。
【図１０】変異組換えヒトＡｎｇｐｔｌ４を用いるトリグリセリド及び蛋白尿に対する影響の分離を示す。（Ａ）ＬＰＬ結合（アミノ酸４０及び隣接アミノ酸３９）及びタンパク質開裂（アミノ酸１６１−１６４）にとって重要なエリア中の変異を示す野生型及び変異ヒトＡｎｇｐｔｌ４タンパク質の概略図。（Ｂ）無傷のタンパク質の予想されるサイズ及び変異タンパク質における少ない開裂（矢印）を立証するためのマウス抗Ｖ５抗体及び対照マウスＩｇＧを用いる組換え標識タンパク質のウェスタンブロット。（Ｃ）ヒトＡｎｇｐｔｌ４  ＥＬＩＳＡキットの試薬を用いてＯＤ  ４５０で評価した巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）のモデルであるＢｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラットに５５μｇの組換えヒトタンパク質を注射した後の野生型または変異ヒトＡｎｇｐｔｌ４の血漿レベル。（Ｄ）Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラットにおける蛋白尿に対する野生型及び変異Ａｎｇｐｔｌ４の影響。＊  Ｐ＜０．０５はすべて３つの研究群は対照とは個別に異なる場合に示す。（Ｅ）Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラットにおける血漿トリグリセリドレベルに対する野生型及び変異Ａｎｇｐｔｌ４の影響。＊  基準と比較して、野生型値についてＰ＜０．０５。＃  野生型と比較して６時間変異体値についてＰ＜０．０５。
【図１１】循環Ａｎｇｐｔｌ４が糸球体内皮αｖβ５インテグリンとの相互作用により蛋白尿を減少させることを示す。赤色矢印は抗β５インテグリン抗体または免疫前血清を注射した時点を示す。（Ａ）ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラット由来の糸球体の共焦点画像は糸球体内皮（抗フォン・ヴィレランド因子抗体，緑色）を有する脂肪組織から分泌したＡｎｇｐｔｌ４−Ｖ５（抗Ｖ５抗体，赤色）の共局在化を立証する。（Ｂ）脂肪組織分泌Ａｎｇｐｔｌ４−Ｖ５の糸球体内皮細胞結合を示すための抗Ｖ５抗体を用いるａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラット由来の糸球体のイムノゴールド電子顕微鏡写真。（Ｃ）シアル化Ａｎｇｐｔｌ１４タンパク質が培養ラット糸球体内皮細胞（ＧＥｎＣ）を酸化損傷から保護する一方、低シアル化Ａｎｇｐｔｌ４が酸化損傷の影響を増加させた。（Ｄ）インビトロでの精製αｖβ５インテグリンのシアル化Ａｎｇｐｔｌ４または対照との相互作用。線型回帰勾配（黒色）を重ねる。（Ｅ）Ａｎｇｐｔｌ４分泌の末梢相中の蛋白尿に対する内皮β５インテグリン−循環Ａｎｇｐｔｌ４相互作用の保護効果を立証するためのβ５インテグリン  −／−及び＋／＋マウスにおいてγ２−腎毒性血清（ＮＴＳ）を用いてネフローゼ症候群を誘発させた後の蛋白尿の発生。（Ｆ）ＰＡＮを有するＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットにおいてピーク蛋白尿からの回復（Ａｎｇｐｔｌ４分泌の末梢相に相当）時の抗β５インテグリン抗体を用いる内皮β５インテグリン−Ａｎｇｐｔｌ４相互作用の阻止効果。（Ｇ）ＰＡＮを有するａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットにおいてピーク蛋白尿からのＰＡＮでの回復時の抗β５インテグリン抗体を用いる内皮β５インテグリン−Ａｎｇｐｔｌ４相互作用の阻止効果。（Ｈ）Ａｎｇｐｔｌ４の欠乏がＡｎｇｐｔｌ４発現の末梢相中のピーク蛋白尿からの回復に影響を与えるかを調べるためのＡｎｇｐｔｌ４  −／−及び＋／＋マウスにおけるγ２−ＮＴＳを用いるネフローゼ症候群の誘発。糸球体相の所見は我々が以前公開した研究（実施例４からの参考文献６）と一致している。＊  Ｐ＜０．０５，＊＊  Ｐ＜０．０１，＊＊＊  Ｐ＜０．００１。
【図１２】ヒト血漿の二次元ゲル電気泳動を示す。（Ａ）膜性腎症（ＭＮ）、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）及び微小変化群（ＭＣＤ）における高い循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルを示すための抗Ａｎｇｐｔｌ４抗体を用いる代表的ウェスタンブロットのトリミングした画像。Ａｎｇｐｔｌ４は緑色円／楕円形で囲まれている。（Ｂ）ウェスタンブロットに対応するニトロセルロース膜のポンソーレッド染色画像。
【図１３】（Ａ）γ２−ＮＴＳ注射から４８時間後のＡｎｇｐｔｌ４  ＋／＋及びＡｎｇｐｔｌ４  −／−マウスにおけるアルブミン尿は図６（ｎ）に相当する。画像は実施例４からの参考文献６のオンライン追補から再現させる。類似の結果を図６（ｈ）に示した研究の２日目で見られる。（Ｂ）図２ｄのウェスタンブロットのために使用したニトロセルロース膜のポンソーレッド染色画像。（Ｃ）正常ヤギ血清を用いた図３ｂからのストリップト膜の露出過度なウェスタンブロット。（Ｄ）正常マウスＩｇＧを用いた図３ｃからのストリップト膜の露出過度なウェスタンブロット。（Ｅ）組換えヒト野生型Ａｎｇｐｔｌ４、ヒト変異体Ａｎｇｐｔｌ４及び対照タンパク質の注射から１２時間〜１７日後のＢｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラットにおける空腹時血漿トリグリセリドレベル。＊  Ｐ＜０．０５。
【図１４】図１１Ｅに示したγ２−ＮＴＳ注射したＩｔｇｂ  ＋／＋及び−／−マウスにおけるＡｎｇｐｔｌ４発現の末梢相（５日目及び７日目）中の高い血漿Ａｎｇｐｔｌ４レベル。（Ｂ）γ２−ＮＴＳの注射から７日後の図１１Ｅに示したＩｔｇｂ  ＋／＋マウスにおけるＡｎｇｐｔｌ４についての多臓器ｍＲＮＡ発現プロフィール。（Ｃ）図１１Ｆに示したＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ  ＰＡＮラットにおける血漿Ａｎｇｐｔｌ４レベル。（Ｄ）図１１Ｆに示したＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ  ＰＡＮラットにおける血漿トリグリセリドレベル。パネルＡ、Ｃ及びＤでの比較はすべて０日目の値で行った。＊  Ｐ＜０．０５。
【図１５】ネフローゼ症候群における循環Ａｎｇｐｔｌ４の本来の効果及び生物学的効果の概略図。中症度〜重症度の蛋白尿が確立された後、骨格筋、脂肪組織及び心臓はアップレギュレートし、Ａｎｇｐｔｌ４を循環に分泌する。このＡｎｇｐｔｌ４の幾つかは糸球体内皮表面上のαｖβ５インテグリンに結合し、蛋白尿を減少させる。一方、幾つかは活性リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）に結合し、活性ＬＰＬを不活性ＬＰＬに変換して、尿中に排泄される。低いＬＰＬ媒介トリグリセリド摂取により高トリグリセリド血症が生ずる。幾つかの循環Ａｎｇｐｔｌ４も尿中に排泄される。微小変化群（ＭＣＤ）では、有足細胞分泌した低シアル化Ａｎｇｐｔｌ４は糸球体内で局所蛋白尿誘発効果を発揮し、一方有足細胞分泌したシアル化タンパク質は糸球体内皮に結合し、循環に漏れて、高トリグリセリド血症を誘発する。膜性腎症（ＭＮ）、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）及び非ＨＩＶ虚脱型糸球体症（ＣＧ）では、有足細胞は有意な量のＡｎｇｐｔｌ４を循環に与えない。
【図１６】（Ａ）ヒトＡｎｇｐｔｌ４  ＥＬＩＳＡの標準曲線。（Ｂ）齧歯類Ａｎｇｐｔｌ４  ＥＬＩＳＡの標準曲線。（Ｃ）抗β５インテグリン抗体８４７２Ａのウェスタンブロットによる特性評価。（Ｄ）マゼンタ重複パターンを生ずる、静脈内注射から６時間後の抗β５インテグリン抗体（赤，ロバ抗家兔ＩｇＧを用いて検出）の糸球体内皮（青，マウス抗ＰＥＣＡＭ１抗体で標識）への結合を示すラット糸球体の共焦点画像。
【図１７】ヒトＡｎｇｐｔｌ４の４つの変異体形態についてのアミノ酸及び核酸置換を示す。
【図１８】無傷タンパク質の予想されるサイズ及び変異タンパク質における少ない開裂（矢印）を立証すべくマウス抗Ｖ５抗体及び対照マウスＩｇＧを用いて標識をつけた図１７に示す組換えタンパク質のウェスタンブロットを示す。
【図１９】変異体８５１１を蛋白尿Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｍｎａラットに１回静脈内注射後の蛋白尿の変化についてのピークレベルを示す。
【図２０】糖尿病性腎症及び糖尿病性腎臓病のモデルであるズッカー糖尿病肥満ラットに２つの変異ヒトＡｎｇｐｔｌ４タンパク質（１５μｇ）を注射後の蛋白尿の減少を示す。
【図２１】ズッカー糖尿病肥満ラットに注射（１５μｇ）後の２つの変異ヒトＡｎｇｐｔｌ４タンパク質の蛋白尿のレベルを示す。すべての＊値は基準の０日値に対する。
【図２２】ズッカー糖尿病肥満ラットに２つの変異体形態のヒトＡｎｇｐｔｌ４タンパク質（１５μｇ）を注射後血漿トリグリセリドレベルが上昇しないことを示している。図２０〜２２の場合：＊  Ｐ＜０．０５，＊＊  Ｐ＜０．０１，＃  Ｐ＜０．０５。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
Ａｎｇｐｔｌ４誘導体の別の実施形態は、配列番号１、３、５及び７（ヒトバリアント、ラット及びマウス）の全ての間にコンセンサス配列を含む。前記コンセンサス配列は、
Ｖ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚ
（ここで、Ｖは配列番号２３に対して少なくとも８０％の相同性を有し、Ｗは０〜５残基のオリゴペプチドであり、Ｘは配列番号２４に対して少なくとも８０％の相同性を有し、Ｙは０〜３８残基のオリゴペプチド（任意の連結領域）であり、Ｚは配列番号２５に対して少なくとも８０％の相同性を有する）
からなる。配列番号２３に対するＶ、配列番号２４に対するＸ、配列番号２５に対するＺの相同性レベルは８０％以上であり得る。相同性レベルは８０〜１００％、例えば８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％及び１００％から独立して選択され得る。オリゴペプチドＹの配列は任意の配列であり得る。オリゴペプチドＢの幾つかの実施形態は配列番号１の１８４−２２２位に対して少なくとも５０％相同である。前記実施形態では、相同性レベルは５０〜１００％の範囲の任意の点、例えば６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％及び１００％から選択され得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体の幾つかの実施形態は、配列番号１の３９−５５位（ＤＥＭＮＶＬＡＨＧＬＬＱＬＧＱＧＬ）でヒト野生型配列と異なる。この領域は配列番号１、３、５、７、２３及び２６の３９−５５位に相当する。誘導体の追加の実施形態は、３９−５５位にＤＥＭＮＶＬＡＨＧＬＬＱＬＧＱＧＬ（配列番号１の３９−５５位）でも、ＤＫＭＮＶＬＡＨＧＬＬＱＬＧＱＧＬ（配列番号２８）でもない配列を含む。Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド誘導体の更なる実施形態は、Ｖの３９−４０位がＤＥではなく、Ｖの４６位がＨではなく、Ｖの５０位がＱではなく、Ｖの５３位がＱでないように３９、４０、４６、５０及び５３位に少なくとも１つの置換を有する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
幾つかの実施形態では、前記変化は配列番号１、３、５、７、２３または２６に対して４０位で生ずる。１つの実施形態では、４０位のアミノ酸（野生型Ａｎｇｐｔｌ４中の負帯電グルタミン酸残基）を中性のアミノ酸または正帯電アミノ酸で置換する。特定実施形態では、変化はＥ４０Ｋ置換である。別の特定実施形態では、変化はＥ４０Ａ置換である。Ｅ４０Ｋ及びＥ４０Ａ置換はＡｎｇｐｔｌ４によるＬＰＬ阻害を減ずるが、ポリペプチドの発現、分泌、プロセッシング及び他の機能を干渉しないことが判明している。更なる特定実施形態では、４０位の変化は下表１に示すものから選択される。もっと更なる実施形態では、配列番号１、３、５、７、２３または２６の３９位のアミノ酸（野生型Ａｎｇｐｔｌ４中の負帯電アスパラギン酸残基）を中性または正帯電アミノ酸で置換する。１つの実施形態では、置換はＤ３９Ａ置換のＤ３９Ｋ置換である。更なる特定実施形態では、配列番号１、３、５、７、２３または２６の３９位の変化は下表に示すものから選択される。幾つかの実施形態では、ポリペプチドバリアントは４０位に上記変化の１つ、３９位に上記変化の１つ、または上記の組合せを含み得る。特定実施形態では、ポリペプチドはＤ３９Ｋ置換とＥ４０Ｋ置換、Ｄ３９Ａ置換及びＥ４０Ｋ置換、またはＤ３９Ｋ置換とＥ４０Ａ置換を含む。ポリペプチド誘導体の更なる特定の実施形態では、３９−４０位の配列はＤＫ、ＫＥ、ＤＡ及びＡＥからなる群から選択される。ポリペプチド誘導体のなお別の実施形態では、３９−４０位の配列はＤＥではない。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
当業者は、公知の技術を用いてその組合せを含めた配列番号１、３、５、７、９、１０及び２３〜２７に記載されているポリペプチドの適当なバリアントを決めることができる。活性を壊すことなく変化させ得る分子の適当なエリアを同定するために、当業者は活性にとって重要であると考えられないエリアを標的とし得る。例えば、同一種または他の種由来の類似の活性を有する類似のペプチドが公知の場合、当業者はＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドのアミノ酸配列をその類似のポリペプチドと比較し得る。この比較により、類似のポリペプチド中で保存される分子の残基及び部分を同定することができる。類似のポリペプチドに対して保存的でないＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドのエリア中の変化はＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドの生物学的活性及び／または構造にあまり悪影響を及ぼしそうにないと認識される。当業者は、比較的保存的な領域でも、活性を維持しながら天然に存在する残基を化学的に類似のアミノ酸で置換し得る（保存的アミノ酸残基置換）ことを知っている。従って、生物学的活性を壊すことなく、またポリペプチド構造に悪影響を及ぼすことなく、生物学的活性または構造にとって重要であり得るエリアに保存的アミノ酸置換を加え得る。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
３．  高い循環レベルのＡｎｇｐｔｌ４と蛋白尿及びアルブミン尿の関係
Ａｎｇｐｔｌ４の循環レベルとアルブミン尿を含めた蛋白尿の関係を調べるために、蛋白尿をａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットにおいて分析した。図２Ａは、尿タンパク質の分析により分かるようにａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧは蛋白尿を示さないことを示している。図２Ａでは、尿タンパク質をＧｅｌＣｏｄｅブルー染色したＳＤＳ  ＰＡＧＥ（３μｇ／レーン，ＭＣＤ寛解を除いて）により分析した（デンシトメトリー測定値を各レーンの下に示す）。無傷のアルブミンバンドは７０ｋＤａ（矢印で示す）で観察される。示され得るように、ＷＴラット、ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラット及び寛解状態のＭＣＤ患者は分析した尿サンプル中に殆どまたは全く無傷のアルブミンを示さず、ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｌｔ４  ＴＧラット（有足細胞特異的Ａｎｇｐｔｌ４発現を有し、蛋白尿を有するＭＣＤを発症することが判明しているラットトランスジェニックモデル；この教示について参照により本明細書に組み入れる米国仮出願Ｎｏ．６１／３５１，８６５（２０１０年６月５日出願）を参照されたい）、ＭＣＤ再発、ＭＮ再発及びＰＡＮラット（ネフローゼ症候群のラットモデル）はアルブミン尿を示す強いアルブミン染色を示した。図２Ｂは、雌ヘテロ接合ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４雌ＴＧラットがＷＴ同腹仔対照に比して少ないアルブミン尿を有していたことを示している。図２Ｃは、ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４ヘテロ接合雄ＴＧラットに対して同一の結果を示している。図２Ｄは、ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットがＷＴ同腹仔に比してプロマイシンネフローゼ（ＰＡＮモデル；ネフローゼ症候群のラットモデル）において少ない蛋白尿を有していたことを示している。上で立証したように、ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットは中性またはほぼ中性の等電点で移動し、シアル化されているより高い循環Ａｎｇｐｔｌ４レベルを有している。これらの結果から、蛋白尿及びネフローゼ症候群の減少における循環Ａｎｇｐｔｌ４の役割が分かる。
【国際調査報告】
2016516726.tif 000042
2016516726.tif 000043