(57)【要約】  種々の実施形態において、改善された、遺伝的安定性、細胞機能、及び再生能を備えた、幹細胞の培養のための、細胞培養培地、またはヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）培地が提供される。実例となる培地は、幹細胞の基本の培地を含み、この培地には、１種または複数種のヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＮＴＰ及び／またはＮＰ）または、それらの１種もしくは複数種の前駆体が添加される。実例となるＮＣＴ培地は、１種または複数種のヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＮＴＰ及び／またはＮＰ）または、それらの１種または複数種の前駆体を含有する、送達担体（例えばスキンクリームまたは他の担体）を含む。このＮＣＴ培地は、とりわけ、再生、美容、及び／または治療的目的のために、ヒトの細胞組織（例えば、皮膚）へヌクレオシド混合物の直接的な送達を提供する。
2016538836.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改善された遺伝的安定性を備えた幹細胞の培養のための細胞培養培地であって、前記培養培地は、
幹細胞用の基本の培養培地を含み、前記培養培地には、１種もしくは複数種のヌクレオシド三リン酸、またはそれらの１種もしくは複数種の前駆体が添加される、培養培地。
【請求項２】
体細胞または幹細胞の遺伝的安定性を改善する、ヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）培地であって、前記培地は、
美容または医薬品の送達担体、及び
１種または複数種のヌクレオシド三リン酸またはそれらの前駆体を含む、培地。
【請求項３】
前記１種または複数種のヌクレオシド三リン酸が、独立にデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ＮＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン三リン酸、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、５−メチルウリジン三リン酸（ｍ５ＵＴＰ）、及びウリジン三リン酸（ＵＴＰ）からなる群から選択される、請求項１に記載の細胞培養培地、または請求項２に記載のヌクレオシド混合物伝達培地。
【請求項４】
前記１種または複数種のヌクレオシド三リン酸は、独立にデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ＮＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、及びデオキシウリジン三リン酸からなる群から選択される、請求項１に記載の細胞培養培地、または請求項２に記載のヌクレオシド混合物伝達培地。
【請求項５】
前記１種または複数種のヌクレオシド三リン酸は、独立にアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、５−メチルウリジン三リン酸（ｍ５ＵＴＰ）、及びウリジン三リン酸（ＵＴＰ）からなる群から選択される、請求項１に記載の細胞培養培地、または請求項２に記載のヌクレオシド混合物伝達培地。
【請求項６】
前記培養培地には、独立にデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ＮＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン三リン酸、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、５−メチルウリジン三リン酸（ｍ５ＵＴＰ）、及びウリジン三リン酸（ＵＴＰ）からなる群から選択される、ヌクレオシド三リン酸の前記１種または複数種の前駆体が添加される、または前記ＮＣＴ培地がそれらを含む、請求項１及び３〜５のいずれか１項に記載の細胞培養培地、または請求項２〜５のいずれか１項に記載のヌクレオシド混合物伝達培地。
【請求項７】
ヌクレオシド三リン酸の前記１種または複数種の前駆体が、独立にデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ＮＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、及びデオキシウリジン三リン酸からなる群から選択される、請求項６に記載の細胞培養またはＮＣＴ培地。
【請求項８】
ヌクレオシド三リン酸の前記１種または複数種の前駆体が、独立にアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、５−メチルウリジン三リン酸（ｍ５ＵＴＰ）、及びウリジン三リン酸（ＵＴＰ）からなる群から選択される、請求項６に記載の細胞培養またはＮＣＴ培地。
【請求項９】
前記培養培地には、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、またはその前駆体が添加される、または前記ＮＣＴ培地がそれを含む、請求項１及び３〜８のいずれか１項に記載の細胞培養培地、または請求項３〜８のいずれか１項に記載のＮＣＴ培地。
【請求項１０】
前記培養培地には、デオキシアデノシン三リン酸が添加される、または前記ＮＣＴ培地がそれを含む、請求項９に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項１１】
前記培養培地には、デオキシアデノシン三リン酸の前駆体が添加される、または前記ＮＣＴ培地がそれを含む、請求項９に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項１２】
デオキシアデノシン三リン酸の前記前駆体が、デオキシアデノシン二リン酸、デオキシアデノシン一リン酸、デオキシアデノシン、及びアデニンからなる群から選択される、請求項１１に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項１３】
前記培養培地には、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）またはその前駆体が添加される、または前記ＮＣＴ培地がそれを含む、請求項１及び３〜１２のいずれか１項に記載の細胞培養培地、または請求項２〜１２のいずれか１項に記載のＮＣＴ培地。
【請求項１４】
前記細胞培養培地には、デオキシグアノシン三リン酸が添加される、または前記ＮＣＴ培地がそれを含む、請求項１３に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項１５】
前記細胞培養培地には、デオキシグアノシン三リン酸の前駆体が添加される、または前記ＮＣＴ培地がそれを含む、請求項１３の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項１６】
デオキシグアノシン三リン酸の前記前駆体が、デオキシグアノシン二リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシグアノシン、及びグアニンからなる群から選択される、請求項１５に記載の細胞培養またはＮＣＴ培地。
【請求項１７】
前記培養培地には、デオキシシチジン三リン酸（ＮＣＴＰ）、またはその前駆体が添加される、または前記ＮＣＴ培地がそれを含む、請求項１または３〜１６のいずれか１項に記載の細胞培養培地、または請求項２〜１６のいずれか１項に記載のＮＣＴ培地。
【請求項１８】
前記細胞培養培地には、デオキシシチジン三リン酸が添加される、または前記ＮＣＴ培地がそれを含む、請求項１７に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項１９】
前記細胞培養培地には、デオキシシチジン三リン酸の前駆体が添加される、または前記ＮＣＴ培地がそれを含む、請求項１７に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項２０】
デオキシシチジンの前駆体が、デオキシシチジン二リン酸、デオキシシチジン一リン酸、デオキシシチジン、及びシトシンからなる群から選択される、請求項１９に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項２１】
前記培養培地には、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、またはその前駆体が添加される、または前記ＮＣＴがそれを含む、請求項１及び３〜２０のいずれか１項に記載の細胞培養培地、または請求項２〜２０のいずれか１項に記載のＮＣＴ培地。
【請求項２２】
前記培養培地には、デオキシチミジン三リン酸が添加される、または前記ＮＣＴ培地がそれを含む、請求項２０に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項２３】
前記培養培地には、デオキシチミジン三リン酸の前駆体が添加される、または前記ＮＣＴ培地がそれを含む、請求項２０に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項２４】
デオキシチミジン三リン酸の前記前駆体が、デオキシチミジン二リン酸、デオキシチミジン一リン酸、デオキシチミジン、及びチミンからなる群から選択される、請求項２３に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項２５】
前記培養またはＮＣＴ培地には、デオキシウリジン三リン酸、またはその前駆体が添加される、請求項１及び３〜２４のいずれか１項に記載の細胞培養培地、または請求項２〜２４のいずれか１項に記載のＮＣＴ培地。
【請求項２６】
前記培養培地には、デオキシウリジン三リン酸が添加される、または前記ＮＣＴ培地がそれを含む、請求項２５に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項２７】
前記培養培地には、デオキシウリジン三リン酸の前駆体が添加される、または前記ＮＣＴ培地がそれを含む、請求項２５に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項２８】
デオキシウリジン三リン酸の前記前駆体が、デオキシウリジン二リン酸、デオキシウリジン一リン酸、デオキシウリジン、及びウラシルからなる群から選択される、請求項２７に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項２９】
前記培養またはＮＣＴ培地には、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、またはその前駆体が添加される、請求項１及び３〜２８のいずれか１項に記載の細胞培養培地、または請求項２〜２８のいずれか１項に記載のＮＣＴ培地。
【請求項３０】
前記培養培地には、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）が添加される、または前記ＮＣＴ培地がそれを含む、請求項２９に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項３１】
前記培養培地には、アデノシン三リン酸の前駆体が添加される、または前記ＮＣＴ培地がそれを含む、請求項２９に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項３２】
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の前記前駆体が、アデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン、及びアデニンからなる群から選択される、請求項３１に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項３３】
前記培養培地には、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、またはその前駆体が添加される、または前記ＮＣＴ培地がそれを含む、請求項１及び３〜３２のいずれか１項に記載の細胞培養培地、または請求項２〜３２のいずれか１項に記載のＮＣＴ培地。
【請求項３４】
前記培養培地には、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）が添加される、または前記ＮＣＴ培地がそれを含む、請求項３３に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項３５】
前記培養培地には、グアノシン三リン酸の前駆体が添加される、または前記ＮＣＴ培地がそれを含む、請求項３３に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項３６】
グアノシン三リン酸の前記前駆体が、グアノシン二リン酸、グアノシン一リン酸、グアノシン、及びグアニンからなる群から選択される、請求項３５に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項３７】
前記細胞培養培地には、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）またはその前駆体が添加される、または前記ＮＣＴ培地がそれを含む、請求項１及び３〜３６のいずれか１項に記載の細胞培養培地、または請求項２〜３６のいずれか１項に記載のＮＣＴ培地。
【請求項３８】
前記培養培地には、シチジン三リン酸が添加される、または前記ＮＣＴ培地がそれを含む、請求項３７に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項３９】
前記培養培地には、シチジン三リン酸の前駆体が添加される、または前記ＮＣＴ培地がそれを含む、請求項３７に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項４０】
シチジン三リン酸の前記前駆体が、シチジン二リン酸、シチジン一リン酸、シチジン、及びシトシンからなる群から選択される、請求項３９に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項４１】
前記培養またはＮＣＴ培地には、５−メチルウリジン三リン酸（ｍ５ＵＴＰ）またはその前駆体が添加される、請求項１及び３〜４０のいずれか１項に記載の細胞培養培地、または請求項２〜４０のいずれか１項に記載のＮＣＴ培地。
【請求項４２】
前記培養培地には、５−メチルウリジン三リン酸が添加される、または前記ＮＣＴ培地がそれを含む、請求項４１に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項４３】
前記培養培地には、５−メチルウリジン三リン酸の前駆体が添加される、または前記ＮＣＴ培地がそれを含む、請求項４１に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項４４】
５−メチルウリジン三リン酸の前記前駆体が、５−メチルウリジン二リン酸、５−メチルウリジン一リン酸、５−メチルウリジン、及びチミンからなる群から選択される、請求項４３に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項４５】
前記培養培地には、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、またはその前駆体が添加される、または前記ＮＣＴ培地がそれを含む、請求項１及び３〜４４のいずれか１項に記載の細胞培養培地、または請求項２〜４４のいずれか１項に記載のＮＣＴ培地。
【請求項４６】
前記培養培地には、ウリジン三リン酸が添加される、または前記ＮＣＴ培地がそれを含む、請求項４５に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項４７】
前記培養培地には、ウリジン三リン酸の前駆体が添加される、または前記ＮＣＴ培地がそれを含む、請求項４５に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項４８】
ウリジン三リン酸の前駆体が、ウリジン二リン酸、ウリジン一リン酸、ウリジン、及びウラシルからなる群から選択される、請求項４７に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項４９】
前記ＮＣＴ培地が、皮下投与、非経口投与、局所的投与、経口投与、経鼻または吸入による投与、塗布、噴霧、または経皮的などの局所的な投与からなる群から選択される経路を経た投与のために作成された担体を含む、請求項２〜４８のいずれか１項に記載のヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）培地。
【請求項５０】
前記ＮＣＴ培地が、局所的投与、皮下投与または皮内投与のために作成された担体を含む、請求項２〜４８のいずれか１項に記載のヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）培地。
【請求項５１】
前記培地が、泥、ハーブ調合物、油脂、エマルション、ローション、クリーム、ゲル、生物製剤、溶液、スプレー、軟膏、フォーム、ムース、液体、懸濁液、分散剤、噴霧剤、石けん、シャンプー、及びコンディショナーからなる群から選択される担体中に作成される、請求項５０に記載のヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）培地。
【請求項５２】
前記培地が、クリーム（例えば美顔クリーム）として作成される、請求項５０に記載のヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）培地。
【請求項５３】
前記培地が、しわ取りクリーム、皮膚充填剤、瘢痕低減クリーム、及びにきび治療薬からなる群から選択される製剤を含む、請求項５６〜５８のいずれか１項に記載のヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）培地。
【請求項５４】
前記培養培地に添加される、または前記ＮＣＴ培地を構成する、前記ヌクレオシド三リン酸またはその前駆体が、ヌクレオシド三リン酸またはその前駆体によって添加されない同様の培地において培養された同様の細胞と比較すると、短期間及び／または長期間における幹細胞の遺伝的安定性を改善するために十分な濃度で存在している、請求項１及び３〜４８のいずれか１項に記載の細胞培養培地、または請求項２〜５３のいずれか１項に記載のヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）培地。
【請求項５５】
前記幹細胞が、体細胞からなる群から選択される幹細胞である、請求項５４に記載の細胞培養培地またはヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）培地。
【請求項５６】
前記培養培地に添加される、または前記ＮＣＴ培地を構成する、各ヌクレオシド三リン酸またはその前駆体が、約１μＭから約５０μＭまで、または約１μＭから約４０μＭまで、または約１μＭから約３５μＭまで、または約１μＭから約３０μＭまでの範囲の濃度で存在する、請求項１、３〜４８、及び５４〜５５のいずれか１項に記載の細胞培養培地、または請求項２〜５５のいずれか１項に記載のＮＣＴ培地。
【請求項５７】
前記培養培地に添加される、または前記ＮＣＴ培地を構成する、各ヌクレオシド三リン酸またはその前駆体が、約５０μＭ以下、または約４０μＭ、または約３０μＭ以下、または約２５μＭ以下、または約２０μＭ以下、または約１５μＭ以下、または約１０μＭ以下、または約５μＭ以下の、開始（ストック）または最終（外因性送達）濃度である、請求項１、３〜４８、及び５４〜５５のいずれか１項に記載の細胞培養培地、または請求項２〜５５のいずれか１項に記載のＮＣＴ培地。
【請求項５８】
前記培養培地に添加される、または前記ＮＣＴ培地を構成する、各ヌクレオシド三リン酸またはその前駆体が、約５μＭから約３０μＭの範囲の、開始（ストック）または最終（外因性送達）濃度で存在している、請求項５７に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項５９】
前記培養培地に添加される、または前記ＮＣＴ培地を構成する、各ヌクレオシド三リン酸またはその前駆体が、約３０μＭの開始（ストック）または最終（外因性送達）濃度で存在している、請求項５７に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項６０】
前記培養培地に添加される、または前記ＮＣＴ培地を構成する、各ヌクレオシド三リン酸またはその前駆体が、約５μＭの開始（ストック）または最終（外因性送達）濃度で存在している、請求項５７に記載の細胞培養培地またはＮＣＴ培地。
【請求項６１】
前記細胞培養培地または前記ＮＣＴ培地が、異種の病原体を保有しない、請求項１、３〜４８、及び５４〜６０のいずれか１項に記載の細胞培養培地、または請求項２〜６０のいずれか１項に記載のＮＣＴ培地。
【請求項６２】
前記細胞培養培地または前記ＮＣＴ培地が、動物またはヒト由来の血清アルブミンを備えない、請求項１、３〜４８、及び５４〜６１のいずれか１項に記載の細胞培養培地、または請求項２〜６１のいずれか１項に記載のＮＣＴ培地。
【請求項６３】
前記添加された培地が、ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）、ＭＥＭ（最小必須培地）、ＢＭＥ（イーグル基礎培地）、ＲＰＭＩ  １６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（ダルベッコ変法イーグル培地：栄養混合物Ｆ−１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ−１０（ダルベッコ変法イーグル培地：栄養混合物Ｆ−１０）、α−ＭＥＭ（α−最小必須培地）、Ｇ−ＧＥＭ（グラスコー最小必須培地）、ＩＭＤＭ（イスコブ変法ダルベッコ培地）、ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（Ｅ８）培地、及びＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＤＭＥＭからなる群から選択される、請求項１、３〜４８、及び５４〜６２のいずれか１項に記載の細胞培養培地。
【請求項６４】
前記基本培地がＤＭＥＭ／Ｆ１２である、請求項６３に記載の細胞培養培地。
【請求項６５】
前記ＮＣＴ培地が、前記担体及び請求項１、３〜４８、５５〜６４のいずれか１項に記載の細胞培養培地を含む、請求項２に記載のヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）培地。
【請求項６６】
体細胞培養もしくは幹細胞培養、またはヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）培養であって、前記細胞培養が、請求項１、３〜４８、及び５５〜６４のいずれか１項に記載の細胞培養培地中の細胞を含む、または請求項２〜６２、及び６５のいずれか１項に記載のＮＣＴ培地中の細胞を含む、体細胞培養もしくは幹細胞培養、またはヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）培養。
【請求項６７】
前記体細胞または前記幹細胞が、体細胞または幹細胞からなる群から選択される細胞である、請求項６６に記載の細胞培養またはＮＣＴ培養。
【請求項６８】
前記細胞が幹細胞を含む、請求項６６に記載の細胞培養またはＮＣＴ培養。
【請求項６９】
前記幹細胞が、神経幹細胞、肝幹細胞、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、表皮幹細胞、消化管幹細胞、内皮幹細胞、筋肉幹細胞、間葉幹細胞、及び膵臓幹細胞を含むがこれらに限定されない、胚性幹細胞及び成体幹細胞からなる群から選択される、請求項６８に記載の細胞培養またはＮＣＴ培養。
【請求項７０】
前記細胞が、人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）である、請求項６８に記載の細胞培養またはＮＣＴ培養。
【請求項７１】
前記ＩＰＳＣが、線維芽細胞、神経幹細胞、胃の細胞、肝細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、羊膜細胞、血液細胞、β細胞、及び脂肪細胞からなる群から選択される細胞からリプログラミングされる、請求項７０に記載の細胞培養またはＮＣＴ培養。
【請求項７２】
前記ＩＰＳＣが、ＫＬＦ４（Ｋ）、ＬＩＮ２８（Ｌ）、ｃ−ＭＹＣ（Ｍ）、ＮＡＮＯＧ（Ｎ）、ＯＣＴ４（Ｏ）、ＳＯＸ２（Ｓ）、及びバルプロ酸（ＶＰＡ）からなる群から選択される、２種またはそれ以上の因子をリプログラミングされた細胞を含む、請求項７０または７１に記載の細胞培養またはＮＣＴ培養。
【請求項７３】
前記ＩＰＳＣが、４つの基準となる山中因子であるＫＬＦ４（Ｋ）、ｃ−ＭＹＣ（Ｍ）、ＯＣＴ４（Ｏ）、及びＳＯＸ２（Ｓ）を用いてリプログラミングされた細胞を含む、請求項７２に記載の細胞培養またはＮＣＴ培養。
【請求項７４】
前記リプログラミング因子が、さらにＬＩＮ２８を含む、請求項７３に記載の細胞培養またはＮＣＴ培養。
【請求項７５】
前記ＩＰＳＣが、組み込み型ベクター、非組み込み型ベクター、除去可能ベクター及び、ＤＮＡ非含有ベクターからなる群から選択されるベクターを用いてリプログラミングされる、請求項７０〜７４のいずれか１項に記載の細胞培養またはＮＣＴ培養。
【請求項７６】
幹細胞の遺伝的不安定性を低減させる方法であって、前記方法は、請求項の請求項のいずれか１項に記載の細胞培養培地中で、請求項１、３〜４８、及び５５〜６４のいずれか１項に記載の培養培地中で前記細胞を培養することを含む、方法。
【請求項７７】
自家幹細胞移入を行う方法であって、前記方法は、対象から幹細胞を単離すること、または前記対象からＩＰＳＣを作成すること、及び実施形態１、３〜４８、及び５５〜６４のいずれか１項に記載の細胞培養培地中、または、実施形態２〜６２、及び６５のいずれか１項に記載のＮＣＴ培地中において、前記幹細胞またはＩＰＳＣを増大すること及び／または培養することを含む、方法。
【請求項７８】
組織の再生及び／または維持を促進するための方法であって、前記方法は、請求項２〜６２、及び６５のいずれか１項に記載のＮＣＴ培地を、対象に投与することを含む、方法。
【請求項７９】
前記ＮＣＴ培地が、皮下投与、非経口投与、局所的投与、経口投与、経鼻または吸入による投与、塗布、噴霧、または経皮的などの局所的な投与からなる群から選択される経路を経た投与のために作成された担体を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記ＮＣＴ培地が、局所的投与、皮下投与、または皮内投与のために作成された担体を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＮＣＴ培地が、泥、ハーブ調合物、油脂、エマルション、ローション、クリーム、ゲル、生物製剤、溶液、スプレー、軟膏、フォーム、ムース、液体、懸濁液、分散剤、噴霧剤、石けん、シャンプー、及びコンディショナーからなる群から選択される担体中に作成される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記ＮＣＴ培地が、クリーム（例えば美顔クリーム）として作成される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記ＮＣＴ培地が、しわ取りクリーム、皮膚充填剤、瘢痕低減クリーム、及びにきび治療薬からなる群から選択される製剤を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
前記ＮＣＴが、ヒトの皮膚に適用される、請求項７８〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記ＮＣＴが、瘢痕を減らすために適用される、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記ＮＣＴが、しわを減らすために適用される、請求項８４に記載の方法。
【請求項８７】
前記ＮＣＴが、細胞組織の量を増大させるために、皮内または皮下に適用される、請求項７８〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１３年１０月１６日に出願されたＵＳＳＮ６１／８９１８４６の利益及びそれに対する優先権を主張するものであり、あらゆる目的のためにその全てが参照することにより組み込まれる。
（政府支援に関する記述）
該当なし
【背景技術】
【０００２】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）と多くの類似性を共有しているが、ｉＰＳＣの誘導に用いる体細胞リプログラミング法は、新規の細胞型についての科学的興味と懸念の両方を引き起こしてきた。最適以下で添加された環境条件において、標準以下／副生理学的細胞機能（最適以下の増殖及び分化など）に関する重要な懸念に加えて、ｉＰＳＣならびにＥＳＣにおけるそれらの誘導及び長期にわたる培養の間のゲノムの完全性及び安定性に関する重要なバイオセイフティの懸念が存在する。研究、美容及び治療的／再生応用におけるヒト人工多能性幹細胞（または他の幹細胞もしくは体細胞）の有用性は、それらのゲノムの完全性、安定性、及び機能性に非常に依存する。一定のゲノムまたはエピゲノムの異常は、分化の可能性を損ない得るだけでなく、ｉＰＳＣ系療法のレシピエントに腫瘍形成を起こし得る。ゲノムの異常は、染色体の数及び構造の変化などの核型異常、わずかな核型の（ｓｕｂｋａｒｙｔｏｐｉｃ）またはわずかな染色体の（ｓｕｂｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）増幅及び欠損などのコピー数多型（ＣＮＶ）、後天的な片親性ダイソミーが原因である異型接合性の欠損（ＬＯＨ）、及びホストのゲノムへの異質なＤＮＡの無作為または部位特異的な、組み込みとして認められている。
【０００３】
現在の手法を用いて誘導した、種々の体細胞及び幹細胞、ならびに本質的に全てのＩＰＳＣのクローンは、標準以下の生理機能（細胞増殖の欠陥など）を有することに加え、リプログラミング及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養誘発性ストレスの間のゲノム不安定性を得るということが研究によって示されている（Ｍａｒｔｉｎｓ−Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｘｕ  （２０１２）  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ３０：  ２２−２７；  Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １３：  ７３２−７４４）。ゲノム不安定性と悪性である形質転換の危険の増大との間に関連が認められていることから、ｈｉＰＳＣのゲノム不安定性の問題は、個別化されたｉＰＳＣ系再生療法を臨床へ進歩させる最も重大な妨げの１つである（Ｍａｒｔｉｎｓ−Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｘｕ  （２０１２）  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ３０：  ２２−２７  ；  Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １３：  ７３２−７４４；  Ｂｙｒｎｅ  （２０１３）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ７  ：  １２３０００２）。
【０００４】
ｈｉＰＳＣのリプログラミング及び培養中の、ゲノム不安定性の原因と細胞の生理機能に欠陥がある原因、ならびに他の多能性幹細胞（ヒト胚性幹細胞など）及び体細胞の幹細胞（神経幹細胞、間葉系幹細胞、及び皮膚幹細胞など）についても実際には、不明瞭であり、そして、この極めて有害な現象の発生を減少させて、最終的に除去する方法はまだ開発されていない。
【発明の概要】
【０００５】
幹細胞及び体細胞における、ゲノムの完全性、安定性、及び機能性は、ヌクレオシド（例えばデオキシヌクレオシド）の外因性の添加によって増大され得ることを見いだした。こうしたヌクレオシド添加（ヌクレオシド混合物（ＮＣ）、または、ある特定の実施形態においてデオキシリボヌクレオシド混合物（ＤＣ）というは、細胞培養培地を増強するために用いられてもよく、もしくは、ヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）培地、またはある特定の実施形態においてはデオキシリボヌクレオシド伝達混合物（ＤＣＴ）を生成するために、送達担体と組み合わされることもできる。こうした添加は、ゲノム安定性を改善することに加えて、（例えば、細胞の増殖を加速したり、標的である治療用細胞型（肝細胞など）への分化を促進したり、及び／またはヒト細胞組織の再生をしたり（再生のために、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒトの皮膚細胞の分裂を刺激するなど）することで、細胞機能を強化することもできる。
【０００６】
さらに、ヒト皮膚線維芽細胞のヌクレオシド混合物への暴露は、顕著に増大した割合で、増殖を刺激することができ、そしてこの現象は、スキンクリームのようなヌクレオシド伝達培地と組み合わせた場合、ヒトの皮膚または他の組織を直接再生する／若返らせる場合に、非常に有用であると証明し得るということが認められた。
【０００７】
このヌクレオシド混合物は、ゲノム安定性を改善するだけでなく、標的細胞型（肝疾患の治療のための肝細胞など）へ多能性幹細胞の分化を増大させることに加えて、幅広い種類の体細胞及び幹細胞の増殖率をも顕著に増大する。
【０００８】
従って、いくつかの実施形態は、体細胞及び幹細胞の基本の培養培地を提供し、その培養培地には、１種または複数種のヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＮＴＰ、及び／またはＮＴＰ）または、それらの１種もしくは複数種の前駆体が添加される。その他の実施形態は、１種または複数種のヌクレオシド三リン酸（例えばｄＮＴＰ及び／またはＮＴＰ）または１種もしくは複数種のそれらの前駆体を、１）スキンクリーム、２）外用化粧品、及び／もしくは３）注射剤、摂取、吸入またはその他のような外的な送達機構（ＥＤＭ）を含むがこれらに限定されない外用及び／もしくは送達機構のｉｎ  ｖｉｖｏでの使用と、組み合わせる。
【０００９】
それゆえに、種々の態様において、本明細書で企図する発明は、いずれか１つ以上の下記の実施形態を含み得るが、それらに限定される必要はない。
【００１０】
種々の態様において、本明細書で企図する発明は、いずれか１つ以上の下記の実施形態を含み得るが、それらに限定される必要はない。
【００１１】
実施形態１は、改善された遺伝的安定性を備えた幹細胞の培養のための細胞培養培地であって、当該培養培地は、幹細胞の基本の培養培地を含み、当該培養培地には、１種もしくは複数種のヌクレオシド三リン酸、またはそれらの１種もしくは複数種の前駆体が添加される、当該培養培地である。
【００１２】
実施形態２は、体細胞または幹細胞の遺伝的安定性を改善する、ヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）培地であって、美容または医薬品の送達担体、及び１種または複数種のヌクレオシド三リン酸またはそれらの前駆体を含む、当該培地である。
【００１３】
実施形態３は、当該１種または複数種のヌクレオシド三リン酸が、独立にデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ＮＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン三リン酸、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、５−メチルウリジン三リン酸（ｍ５ＵＴＰ）、及びウリジン三リン酸（ＵＴＰ）からなる群から選択される、実施形態１に記載の細胞培養培地、または実施形態２に記載のヌクレオシド混合物伝達培地である。
【００１４】
実施形態４は、当該１種または複数種のヌクレオシド三リン酸が、独立にデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ＮＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、及びデオキシウリジン三リン酸からなる群から選択される、実施形態１に記載の細胞培養培地、または実施形態２に記載のヌクレオシド混合物伝達培地である。
【００１５】
実施形態５は、当該１種または複数種のヌクレオシド三リン酸が、独立にアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、５−メチルウリジン三リン酸（ｍ５ＵＴＰ）、及びウリジン三リン酸（ＵＴＰ）からなる群から選択される、実施形態１に記載の細胞培養培地、または実施形態２に記載のヌクレオシド混合物伝達培地である。
【００１６】
実施形態６は、当該培養培地には、独立にデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ＮＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン三リン酸、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、５−メチルウリジン三リン酸（ｍ５ＵＴＰ）、及びウリジン三リン酸（ＵＴＰ）からなる群から選択される、ヌクレオシド三リン酸の１種または複数種の前駆体が添加される、または当該ＮＣＴ培地がそれらを含む、実施形態１及び３〜５のいずれか１つに記載の細胞培養培地、または実施形態２〜５のいずれか１つに記載のヌクレオシド混合物伝達培地である。
【００１７】
実施形態７は、ヌクレオシド三リン酸の当該１種または複数種の前駆体が、独立にデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ＮＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、及びデオキシウリジン三リン酸からなる群から選択される、実施形態６の細胞培養、またはＮＣＴ培地である。
【００１８】
実施形態８は、ヌクレオシド三リン酸の当該１種または複数種の前駆体が、独立にアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、５−メチルウリジン三リン酸（ｍ５ＵＴＰ）、及びウリジン三リン酸（ＵＴＰ）からなる群から選択される、実施形態６の細胞培養、またはＮＣＴ培地である。
【００１９】
実施形態９は、実施形態１及び３〜８のいずれか１つに記載の細胞培養培地、または実施形態３〜８のいずれか１つに記載のＮＣＴ培地であって、当該培養培地には、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、またはその前駆体が添加される、または当該ＮＣＴ培地は、それを含む、培地である。
【００２０】
実施形態１０は、実施形態９の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、当該培養培地には、デオキシアデノシン三リン酸が添加される、または当該ＮＣＴ培地は、それを含む、培地である。
【００２１】
実施形態１１は、実施形態９の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、当該培養培地には、デオキシアデノシン三リン酸の前駆体が添加される、または当該ＮＣＴ培地は、それを含む、培地である。
【００２２】
実施形態１２は、実施形態１１の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、デオキシアデノシン三リン酸の当該前駆体は、デオキシアデノシン二リン酸、デオキシアデノシン一リン酸、デオキシアデノシン、及びアデニンからなる群から選択される、培地である。
【００２３】
実施形態１３は、実施形態１及び３〜１２のいずれか１つに記載の細胞培養培地、または実施形態２〜１２のいずれか１つに記載のＮＣＴ培地であって、当該培養培地には、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、またはその前駆体が添加される、または当該ＮＣＴ培地は、それを含む、培地である。
【００２４】
実施形態１４は、実施形態１３の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、当該細胞培養培地には、デオキシグアノシン三リン酸が添加される、または当該ＮＣＴ培地は、それを含む、培地である。
【００２５】
実施形態１５は、実施形態１３の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、当該細胞培養培地には、デオキシグアノシン三リン酸の前駆体が添加される、または当該ＮＣＴ培地は、それを含む、培地である。
【００２６】
実施形態１６は、実施形態１５の細胞培養またはＮＣＴ培地であって、デオキシグアノシン三リン酸の当該前駆体は、デオキシグアノシン二リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシグアノシン、及びグアニンからなる群から選択される、培地である。
【００２７】
実施形態１７は、実施形態１または３〜１６のいずれか１つに記載の細胞培養培地、または実施形態２〜１６のいずれか１つに記載のＮＣＴ培地であって、当該培養培地には、デオキシシチジン三リン酸（ＮＣＴＰ）、またはその前駆体が添加される、または当該ＮＣＴ培地は、それを含む、培地である。
【００２８】
実施形態１８は、実施形態１７の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、当該細胞培養培地には、デオキシシチジン三リン酸が添加される、または当該ＮＣＴ培地は、それを含む、培地である。
【００２９】
実施形態１９は、実施形態１７の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、当該細胞培養培地には、デオキシシチジン三リン酸の前駆体が添加される、または当該ＮＣＴ培地は、それを含む、培地である。
【００３０】
実施形態２０は、実施形態１９の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、デオキシシチジンの前駆体は、デオキシシチジン二リン酸、デオキシシチジン一リン酸、デオキシシチジン、及びシトシンからなる群から選択される、培地である。
【００３１】
実施形態２１は、実施形態１及び３〜２０のいずれか１つに記載の細胞培養培地、または実施形態２〜２０のいずれか１つに記載のＮＣＴ培地であって、当該培養培地には、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、またはその前駆体が添加される、または当該ＮＣＴ培地は、それを含む、培地である。
【００３２】
実施形態２２は、実施形態２０の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、当該培養培地には、デオキシチミジン三リン酸が添加される、または当該ＮＣＴ培地は、それを含む、培地である。
【００３３】
実施形態２３は、実施形態２０の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、当該培養培地には、デオキシチミジン三リン酸の前駆体が添加される、または当該ＮＣＴ培地は、それを含む、培地である。
【００３４】
実施形態２４は、実施形態２３の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、デオキシチミジン三リン酸の当該前駆体は、デオキシチミジン二リン酸、デオキシチミジン一リン酸、デオキシチミジン、及びチミンからなる群から選択される、培地である。
【００３５】
実施形態２５は、実施形態１及び３〜２４のいずれか１つに記載の細胞培養培地、または実施形態２〜２４のいずれか１つに記載のＮＣＴ培地であって、当該培養またはＮＣＴ培地には、デオキシウリジン三リン酸、またはその前駆体が添加される。
【００３６】
実施形態２６は、実施形態２５の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、当該培養培地には、デオキシウリジン三リン酸が添加される、または当該ＮＣＴ培地は、それを含む、培地である。
【００３７】
実施形態２７は、実施形態２５の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、当該培養培地には、デオキシウリジン三リン酸の前駆体が添加される、または当該ＮＣＴ培地は、それを含む、培地である。
【００３８】
実施形態２８は、実施形態２７の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、デオキシウリジン三リン酸の当該前駆体は、デオキシウリジン二リン酸、デオキシウリジン一リン酸、デオキシウリジン、及びウラシルからなる群から選択される、培地である。
【００３９】
実施形態２９は、実施形態１及び３〜２８のいずれか１つに記載の細胞培養培地、または実施形態２〜２８のいずれか１つに記載のＮＣＴ培地であって、当該培養またはＮＣＴ培地には、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、またはその前駆体が添加される、培地である。
【００４０】
実施形態３０は、実施形態２９の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、当該培養培地には、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）が添加される、またはＮＣＴ培地は、それを含む、培地である。
【００４１】
実施形態３１は、実施形態２９の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、当該培養培地には、アデノシン三リン酸の前駆体が添加される、または当該ＮＣＴ培地は、それを含む、培地である。
【００４２】
実施形態３２は、実施形態３１の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の当該前駆体は、アデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン、及びアデニンからなる群から選択される、培地である。
【００４３】
実施形態３３は、実施形態１及び３〜３２のいずれか１つに記載の細胞培養培地、または実施形態２〜３２のいずれか１つに記載のＮＣＴ培地であって、当該培養培地には、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、またはその前駆体が添加される、または当該ＮＣＴ培地は、それを含む、培地である。
【００４４】
実施形態３４は、実施形態３３の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、当該培養培地には、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）が添加される、または当該ＮＣＴ培地は、それを含む、培地である。
【００４５】
実施形態３５は、実施形態３３の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、当該培養培地には、グアノシン三リン酸の前駆体添加される、または当該ＮＣＴ培地は、それを含む、培地である。
【００４６】
実施形態３６は、実施形態３５の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、グアノシン三リン酸の当該前駆体は、グアノシン二リン酸、グアノシン一リン酸、グアノシン、及びグアニンからなる群から選択される、培地である。
【００４７】
実施形態３７は、実施形態１及び３〜３６のいずれか１つに記載の細胞培養培地、または実施形態２〜３６のいずれか１つに記載のＮＣＴ培地であって、当該細胞培養培地には、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、またはその前駆体が添加される、または当該ＮＣＴ培地は、それを含む、培地である。
【００４８】
実施形態３８は、実施形態３７の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、当該培養培地には、シチジン三リン酸が添加される、または当該ＮＣＴ培地は、それを含む、培地である。
【００４９】
実施形態３９は、実施形態３７の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、当該培養培地には、シチジン三リン酸の前駆体が添加される、または当該ＮＣＴ培地は、それを含む、培地である。
【００５０】
実施形態４０は、実施形態３９の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、シチジン三リン酸の当該前駆体は、シチジン二リン酸、シチジン一リン酸、シチジン、及びシトシンからなる群から選択される、培地である。
【００５１】
実施形態４１は、実施形態１及び３〜４０のいずれか１つに記載の細胞培養培地、または実施形態２〜４０のいずれか１つに記載のＮＣＴ培地であって、当該培地またはＮＣＴ培地には、５−メチルウリジン三リン酸（ｍ５ＵＴＰ）、またはその前駆体が添加される、培地である。
【００５２】
実施形態４２は、実施形態４１の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、当該培養培地には、５−メチルウリジン三リン酸が添加される、または当該ＮＣＴ培地は、それを含む、培地である。
【００５３】
実施形態４３は、実施形態４１の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、当該培養培地には、５−メチルウリジン三リン酸の前駆体が添加される、または当該ＮＣＴ培地は、それを含む、培地である。
【００５４】
実施形態４４は、実施形態４３の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、５−メチルウリジン三リン酸の当該前駆体は、５−メチルウリジン二リン酸、５−メチルウリジン一リン酸、５−メチルウリジン、及びチミンからなる群から選択される、培地である。
【００５５】
実施形態４５は、実施形態１及び３〜４４のいずれか１つに記載の細胞培養培地、または実施形態２〜４４のいずれか１つに記載のＮＣＴ培地であって、当該培養培地には、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、またはその前駆体が添加される、または当該ＮＣＴ培地は、それを含む、培地である。
【００５６】
実施形態４６は、実施形態４５の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、当該培養培地には、ウリジン三リン酸が添加される、または当該ＮＣＴ培地は、それを含む、培地である。
【００５７】
実施形態４７は、実施形態４５の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、当該培養培地には、ウリジン三リン酸の前駆体が添加される、または当該ＮＣＴ培地は、それを含む、培地である。
【００５８】
実施形態４８は、実施形態４７の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、ウリジン三リン酸の前駆体は、ウリジン二リン酸、ウリジン一リン酸、ウリジン、及びウラシルからなる群から選択される、培地である。
【００５９】
実施形態４９は、実施形態２〜４８のいずれか１つに記載のヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）培地であって、当該ＮＣＴ培地は、皮下投与、非経口投与、局所的投与、経口投与、経鼻または吸入による投与、塗布、噴霧、または経皮的などの局所的な投与からなる群から選択される経路を経た投与のために作成された担体を含む、培地である。
【００６０】
実施形態５０は、実施形態２〜４８のいずれか１つに記載のヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）培地であって、当該ＮＣＴ培地は、局所的投与、皮下投与または皮内投与のために作成された担体を含む、培地である。
【００６１】
実施形態５１は、実施形態５０のヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）培地であって、当該培地は、泥、ハーブ調合物、油脂、エマルション、ローション、クリーム、ゲル、生物製剤、溶液、スプレー、軟膏、フォーム、ムース、液体、懸濁液、分散剤、噴霧剤、石けん、シャンプー、及びコンディショナーからなる群から選択される担体中に作成される、培地である。
【００６２】
実施形態５２は、実施形態５０のヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）培地であって、当該培地は、クリーム（例えば美顔クリーム）として作成される、培地である。
【００６３】
実施形態５３は、実施形態５６〜５８のいずれか１つに記載のヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）培地であって、当該培地は、しわ取りクリーム、皮膚充填剤、瘢痕低減クリーム、及びにきび治療薬からなる群から選択される製剤を含む、培地である。
【００６４】
実施形態５４は、実施形態１及び３〜４８のいずれか１つに記載の細胞培養培地、または実施形態２〜５３のいずれか１つに記載のヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）培地であって、当該培養培地に添加される、または当該ＮＣＴ培地を含む、当該ヌクレオシド三リン酸またはその前駆体は、ヌクレオシド三リン酸またはその前駆体が添加されない同様の培地において培養された同様の細胞と比較すると、短期間及び／または長期間における幹細胞の遺伝的安定性を改善するために十分な濃度で存在している、培地である。
【００６５】
実施形態５５は、実施形態５４の細胞培養培地またはヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）培地であって、当該幹細胞は、体細胞（例えば、線維芽細胞）、または幹細胞（例えば、神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、脂肪幹細胞、胚性幹細胞、臍帯幹細胞、及び人工多能性幹細胞）からなる群から選択される幹細胞である、培地である。
【００６６】
実施形態５６は、実施形態１、３〜４８、及び５４〜５５のいずれか１つに記載の細胞培養培地、または実施形態２〜５５のいずれか１つに記載のＮＣＴ培地であって、当該培養培地に添加される、または当該ＮＣＴ培地を含む、各ヌクレオシド三リン酸またはその前駆体は、約１μＭから約５０μＭまで、または約１μＭから約４０μＭまで、または約１μＭから約３５μＭまで、または約１μＭから約３０μＭまでの範囲の濃度（例えば、伝達培地中、及び／または、ＮＣＴ培地としてスキンクリームを用いたヒトの皮膚へヌクレオシド混合物の外因性送達などのｉｎ  ｖｉｖｏ標的細胞上の濃度などをもたらす）で存在する、培地である。
【００６７】
実施形態５７は、実施形態１、３〜４８、及び５４〜５５のいずれか１つに記載の細胞培養培地、または実施形態２〜５５のいずれか１つに記載のＮＣＴ培地であって、当該培養培地に添加される、または当該ＮＣＴ培地に含まれる、各ヌクレオシド三リン酸またはその前駆体は、約５０μＭ以下、または約４０μＭ以下、または約３０μＭ以下、または約２５μＭ以下、または約２０μＭ以下、または約１５μＭ以下、または約１０μＭ以下、または約５μＭ以下の、開始（ストック）または最終（外因性送達）濃度である、培地である。
【００６８】
実施形態５８は、実施形態５７の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、当該培地に添加される、または当該ＮＣＴ培地に含まれる、各ヌクレオシド三リン酸またはその前駆体は、約５μＭから約３０μＭの範囲の開始（ストック）または最終（外因性送達）濃度で存在している、培地である。
【００６９】
実施形態５９は、実施形態５７の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、当該培養培地に添加される、または当該ＮＣＴ培地に含まれる、各ヌクレオシド三リン酸またはその前駆体は、約３０μＭの開始（ストック）または最終（外因性送達）濃度で存在している、培地である。
【００７０】
実施形態６０は、実施形態５７の細胞培養培地またはＮＣＴ培地であって、当該培養培地に添加される、または当該ＮＣＴ培地に含まれる、各ヌクレオシド三リン酸またはその前駆体は、約５μＭの開始（ストック）または最終（外因性送達）濃度で存在している、培地である。
【００７１】
実施形態６１は、実施形態１、３〜４８、及び５４〜６０のいずれか１つに記載の細胞培養培地、または実施形態２〜６０のいずれか１つに記載のＮＣＴ培地であって、当該細胞培養培地はまたは当該ＮＣＴ培地は、異種の病原体を保有しない。
【００７２】
実施形態６２は、実施形態１、３〜４８、及び５４〜６１のいずれか１つに記載の細胞培養培地、または実施形態２〜６１のいずれか１つに記載のＮＣＴ培地であって、当該細胞培養培地はまたは当該ＮＣＴ培地は、動物またはヒト由来の血清アルブミンを伴わない。
【００７３】
実施形態６３は、実施形態１、３〜４８、及び５４〜６２のいずれか１つに記載の細胞培養培地であって、当該添加された培地は、ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）、ＭＥＭ（最小必須培地）、ＢＭＥ（イーグル基礎培地）、ＲＰＭＩ  １６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（ダルベッコ変法イーグル培地：栄養混合物Ｆ−１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ−１０（ダルベッコ変法イーグル培地：栄養混合物Ｆ−１０）、α−ＭＥＭ（α−最小必須培地）、Ｇ−ＧＥＭ（グラスコー最小必須培地）、ＩＭＤＭ（イスコブ変法ダルベッコ培地）、ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（Ｅ８）培地、及びＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＤＭＥＭからなる群から選択される、培地である。
【００７４】
実施形態６４は、実施形態６３の細胞培養培地であって、基本培地がＤＭＥＭ／Ｆ１２である、培地である。
【００７５】
実施形態６５は、実施形態２のヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）培地であって、当該ＮＣＴ培地は、当該担体及び実施形態１、３〜４８、５５〜６４のいずれか１つに記載の細胞培養培地を含む、培地である。
【００７６】
実施形態６６は、体細胞培養もしくは幹細胞培養、またはヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）培養であって、当該細胞培養は、実施形態１、３〜４８、及び５５〜６４のいずれか１つに記載の細胞培養培地中の細胞を含む、または実施形態２〜６２、及び６５のいずれか１つに記載のＮＣＴ培地中の細胞を含む、体細胞培養もしくは幹細胞培養、またはヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）培養である。
【００７７】
実施形態６７は、実施形態６６の細胞培養またはＮＣＴ培養であって、当該体細胞または当該幹細胞は、体細胞（例えば、線維芽細胞）、または幹細胞（例えば、神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、脂肪幹細胞、胚性幹細胞、臍帯幹細胞、人工多能性幹細胞など）からなる群から選択される細胞である、培養である。
【００７８】
実施形態６８は、実施形態６６の細胞培養またはＮＣＴ培養であって、当該細胞は、幹細胞を含む、培養である。
【００７９】
実施形態６９は、実施形態６８の細胞培養またはＮＣＴ培養であって、当該幹細胞は、神経幹細胞、肝幹細胞、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、表皮幹細胞、消化管幹細胞、内皮幹細胞、筋肉幹細胞、間葉幹細胞、及び膵臓幹細胞を含むがこれらに限定されない、胚性幹細胞及び成体幹細胞からなる群から選択される、培養である。
【００８０】
実施形態７０は、実施形態６８の細胞培養またはＮＣＴ培養であって、当該細胞は、人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）（例えば、患者由来の自家ｈＩＰＳＣなど）である、培養である。
【００８１】
実施形態７１は、実施形態７０の細胞培養またはＮＣＴ培養であって、当該ＩＰＳＣは、線維芽細胞、神経幹細胞、胃の細胞、肝細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、羊膜細胞、血液細胞、β細胞、及び脂肪細胞からなる群から選択される細胞からリプログラミングされる、培養である。
【００８２】
実施形態７２は、実施形態７０または７１の細胞培養またはＮＣＴ培養であって、当該ＩＰＳＣは、ＫＬＦ４（Ｋ）、ＬＩＮ２８（Ｌ）、ｃ−ＭＹＣ（Ｍ）、ＮＡＮＯＧ（Ｎ）、ＯＣＴ４（Ｏ）、ＳＯＸ２（Ｓ）、及びバルプロ酸（ＶＰＡ）からなる群から選択される、２種またはそれ以上の因子をリプログラミングされた細胞を含む、培養である。
【００８３】
実施形態７３は、実施形態７２の細胞培養またはＮＣＴ培養であって、当該ＩＰＳＣは４つの基準となる山中因子であるＫＬＦ４（Ｋ）、ｃ−ＭＹＣ（Ｍ）、ＯＣＴ４（Ｏ）、及びＳＯＸ２（Ｓ）を用いて、リプログラミングされた細胞を含む、培養である。
【００８４】
実施形態７４は、実施形態７３の細胞培養またはＮＣＴ培養であって、当該リプログラミング因子はさらに、ＬＩＮ２８を含む、培養である。
【００８５】
実施形態７５は、実施形態７０〜７４のいずれか１つに記載の細胞培養またはＮＣＴ培養であって、当該ＩＰＳＣは組み込み型ベクター、非組み込み型ベクター、除去が可能なベクター及び、ＤＮＡ非含有ベクターからなる群から選択されるベクターを用いてリプログラミングされる、培養である。
【００８６】
実施形態７６は、幹細胞の遺伝的不安定性を低減する方法であって、実施形態の実施形態のいずれか１つに記載の細胞培養培地で、実施形態１、３〜４８、及び５５〜６４のいずれか１つに記載の培養培地で当該細胞を培養することを含む、方法である。
【００８７】
実施形態７７は、自家幹細胞移入を行う方法であって、当該方法は、対象から幹細胞を単離すること、または当該対象からＩＰＳＣを作成すること、及び実施形態１、３〜４８、及び５５〜６４のいずれか１つに記載の細胞培養培地中、または、実施形態２〜６２、及び６５のいずれか１つに記載のＮＣＴ培地中において、当該幹細胞またはＩＰＳＣを増大する、及び／または培養することを含む、方法である。
【００８８】
実施形態７８は、組織の再生及び／または維持を促進するための方法であって、当該方法は、実施形態２〜６２、及び６５のいずれか１つに記載のＮＣＴ培地を対象に投与することを含む、方法である。
【００８９】
実施形態７９は、実施形態７８の方法であって、当該ＮＣＴ培地は、皮下投与、非経口投与、局所的投与、経口投与、経鼻または吸入による投与、または、塗布、噴霧、もしくは経皮的などの局所的な投与からなる群から選択される経路を経た投与のために作成された担体を含む、方法である。
【００９０】
実施形態８０は、実施形態７８に記載の方法であって、当該ＮＣＴ培地は、局所的投与、皮下投与、または皮内投与のために作成された担体を含む、方法である。
【００９１】
実施形態８１は、実施形態８０に記載の方法であって、当該ＮＣＴ培地は、泥、ハーブ調合物、油脂、エマルション、ローション、クリーム、ゲル、生物製剤、溶液、スプレー、軟膏、フォーム、ムース、液体、懸濁液、分散剤、噴霧剤、石けん、シャンプー、及びコンディショナーからなる群から選択される担体中に作成される、方法である。
【００９２】
実施形態８２は、実施形態８０に記載の方法であって、当該ＮＣＴ培地は、クリーム（例えば美顔クリーム）として作成される、方法である。
【００９３】
実施形態８３は、実施形態８０に記載の方法であって、当該ＮＣＴ培地は、しわ取りクリーム、皮膚充填剤、瘢痕低減クリーム、及びにきび治療薬からなる群から選択される製剤を含む、方法である。
【００９４】
実施形態８４は、実施形態７８〜８３のいずれか１つに記載の方法であって、当該ＮＣＴはヒトの皮膚に適用される、方法である。
【００９５】
実施形態８５は、実施形態８４に記載の方法であって、当該ＮＣＴは、瘢痕を減らすために適用される、方法である。
【００９６】
実施形態８６は、実施形態８４に記載の方法であって、当該ＮＣＴはしわを減らすために適用される、方法である。
【００９７】
実施形態８７は、実施形態７８〜８３のいずれか１つに記載の方法であって、当該ＮＣＴは組織の量を増大させるために、皮内または皮下に適用される、方法である。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】ヒト人工多能性幹細胞（ｈＩＰＳＣ）のキャラクタリゼーション。（ａ）幹細胞マーカーの形態及び免疫組織化学的検出（挿入物は、ＤＡＰＩ）、（ｂ）導入遺伝子非含有のｈＩＰＳＣ由来のテラトーマ内に認められる、３つの胚葉のＨ＆Ｅ染色に続く、組織のキャラクタリゼーション、（ｃ）ＣＣ系ストレスの前後の、導入遺伝子非含有のｉＰＳＣの核型分析。赤い矢印は、過剰染色体１２を強調している。スケールバーは、１００ミクロンと等しい。
【図２】ｈＩＰＳＣリプログラミングに続くｄＮＴＰプールの有意な減少。*ｄＮＴＰプールの大きさは、本来の皮膚線維芽細胞中で認められたレベルと比較して、標準化した。
【図３】ＹＨ２Ａ．Ｘ陽性巣の可視化（図３Ａ）及び定量化（図３Ｂ）。緑の染色がγＨ２Ａ．Ｘ巣を強調し、青の染色がＤＡＰＩで染色された核を強調している。ＨＤＦは、ｈＩＰＳＣにリプログラミングされ、次に、デオキシリボヌクレオシド（ｄＮ）の添加が有りと無しで４日間培養した。
【図４】「臨床グレード変換」（ＣＣ）系のストレスに続く、一塩基多型（ＳＮＰ）系の異型接合性の欠損（ＬＯＨ）分析。
【図５】ｄＮを３０μＭ添加することで、顕著にｈＩＰＳＣの増殖率が増大する。第１の実験では、０μＭ、３０μＭ、１００μＭ、２００μＭのｄＮで５日間以上細胞を処理した。２００μＭでは、毒性があることが認められた（データに示さず）。第２の実験では、０μＭ、３０μＭ、５０μＭ、７５μＭ、１００μＭのｄＮで５日間以上細胞を処理した。
【図６】ｈＩＰＳＣリプログラミング及びデオキシリボヌクレオシド（ｄＮ）培養培地添加を伴うｄＮＴＰレスキューに続くｄＮＴＰプールの有意な減少を示す。ｄＮＴＰプールの大きさは、本来の皮膚細胞中で認められたレベルと比較して、標準化した。
【図７】γＨ２Ａ．Ｘの陽性巣の可視化及び定量化（二重鎖の分解を示す）を示す。
【図８】デオキシリボヌクレオシド混合物（ＤＣ）の利用が、皮膚線維芽細胞とヒト人工多能性幹細胞の両方を、より迅速に分割するために活性化することができることを示す。添加有りと無しで成長した線維芽細胞及び幹細胞の細胞数は、平板培養後０時間及び４８時間のときに記録した。ＡＤ１幹細胞に対して、培養添加物とリプログラミングしておいた１つのサブクローンは、倍加速度試験を行うために、一次的に添加物を取り除いた。平板培養後４８時間の個体数倍加時間（ＰＤＴ）を計算するために用いた方程式は、４８/（Ｌｏｇ（Ｔ４８）−Ｌｏｇ（Ｔ０））であった。２４時間における倍加速度を計算するためには、２４／ＰＤＴを用いた。
【図９】ヌクレオシド混合物（ＮＣ）はｈＩＰＳＣ中のｄＮＴＰプールを顕著に救出することができることを示している。
【図１０Ａ】ヌクレオシド混合物の存在下で減少する、γＨ２Ａ．Ｘの陽性巣（二重鎖の分解を示す）の可視化を示す。ＤＮＡ損傷（γＨ２ＡＸの発現による）の発生率は、培養添加と共に減少した。ＤＮＡ損傷レベルは、二重鎖の分解を示す、γＨ２ＡＸの発現（緑）によって測定された。損傷した核の割合を決定するために、盲検法によるカウントを実施した。添加が２つの別個の幹細胞株内の損傷の減少を引き起こす。
【図１０Ｂ】ヌクレオシド混合物の存在下で減少する、γＨ２Ａ．Ｘの陽性巣（二重鎖の分解を示す）の定量化を示す。
【図１１】治療用の標的細胞型（この場合は、肝細胞様の細胞、本願では肝細胞という）への多能性幹細胞の分化を示す。
【図１２】α−フェトプロテインが発現した肝細胞が、ＤＣ添加物を用いた場合に２週間以内に生成され得るが、ＤＣがなければ生成しない、ということを示す。
【発明を実施するための形態】
【００９９】
種々の実施形態において、本明細書に記載されている方法及び分解は、デオキシリボヌクレオシド（ｄＮ）及び／またはヌクレオシド（リボヌクレオシド）添加は、培養中の人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）を含む幹細胞の遺伝的安定性を増大させることができるという発見に関連がある。
【０１００】
本明細書に示すように、迅速に分割するｈＩＰＳＣ中のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）プールは、細胞のｄＮＴＰプール（例えば、皮膚線維芽細胞などで、ｈＩＰＳＣはこの皮膚線維芽細胞から由来している）よりも顕著に小さい（例えば、図２及び図６を参照のこと）。ｈＩＰＳＣは、本来の線維芽細胞よりもより顕著に二重鎖が分解している（ＤＳＢ）ことを示しているとも判断された（例えば、図３Ａ及び３Ｂを参照のこと）。
【０１０１】
本明細書に提示したデータは、以下のことを示す。１）ｈＩＰＳＣは、デオキシリボヌクレオシド（ｄＮ）混合物の形態で、ｈＩＰＳＣ培養またはＤＣＴ培地へ加えられた、外因性ＮＴＰ前駆体を利用することができる、そして、２）デオキシリボヌクレオシド（ｄＮ）及び／またはヌクレオシド、またはそれらの前駆体の培養培地への添加は、ｈＩＰＳＣ  ｄＮＴＰプール欠損を改善することができ、かつそれらの細胞によって経験されるゲノム不安定性を顕著に軽減することができる（例えば、図４を参照のこと）。
【０１０２】
外因性ＮＴＰ前駆体は、ヒトの皮膚細胞とヒト人工多能性幹細胞の両方について、細胞増殖を顕著に刺激することが可能である、ヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）培地を形成するために、送達担体（例えば、医薬品の送達担体、美容のための送達担体、化粧品など）に取り込むことができるということも見いだした（例えば、図８を参照のこと）。本明細書で使用される、ヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）またはヌクレオシド混合物送達（ＮＣＤ）培地という用語は、対象（例えば、ヒト、ヒト以外の哺乳動物など）へのｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために形成された、ヌクレオシド、もしくはその前駆体、またはデオキシヌクレオシドもしくはその前駆体を添加した、担体を含む製剤を示す。デオキシヌクレオシド混合物伝達（ＤＣＴ）培地またはデオキシヌクレオシド混合物送達（ＤＣＤ）培地は、対象（例えば、ヒト、ヒト以外の哺乳動物など）へのｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために形成された、デオキシヌクレオシドまたはその前駆体を添加した、担体を含む製剤を示す。
【０１０３】
ヌクレオシド混合物は、細胞増殖、及び／または組織のｉｎ  ｖｉｖｏ活性化／再生（例えば、スキンクリームの形態でのＮＣＴの直接の局所的な適用に続くことなど）を刺激することと同様に、他のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞の細胞増殖も刺激することができると考えられている。
【０１０４】
本明細書に提示したデータは、ヌクレオシドの添加が、ヒト人工多能性幹細胞中で、ｄＮＴＰプールを顕著に救出することができ（例えば、図９を参照のこと）、かつヌクレオシドの添加が、広範囲の他のヒト及びヒト以外の細胞型中で、ｄＮＴＰプールの大きさを増大させることもできると考えられることを示している。
【０１０５】
本明細書に提示したデータは、例えば、γＨ２Ａ．Ｘの免疫細胞化学（例えば、図１０を参照のこと）によって測定される通り、ヌクレオシドの添加が、ヒト人工多能性幹細胞中で、遺伝子損傷の発生を顕著に低減することができ、ヌクレオシドの添加が、広範囲の他のヒト及びヒト以外の細胞型中で、遺伝子損傷の発生を低減することもできると考えられる。
【０１０６】
本明細書に提示したデータは、ヌクレオシドの添加が、肝細胞様の細胞へのｈＩＰＳＣの分化を顕著に増大することができて（例えば、図１１及び１２を参照のこと）、そしてヌクレオシドＤＣ添加は、広範囲の他のヒト及びヒト以外の細胞型の中への分化を増大することもできると考えられる。
【０１０７】
哺乳類の細胞は、２つの経路、グルコース及びアミノ酸を用いるデノボ経路（ＤＮＰ）ならびに、細胞外環境から前もって作成されたｄＮを用いるヌクレオシドサルベージ経路（ＮＳＰ）を経てｄＮＴＰを合成する。特定の理論に束縛されるものではないが、以下のことが考えられる。それは、１）ＤＮＰを介したｄＮＴＰプールの不十分な生成は、ｈＩＰＳＣ（または培養中の他の幹細胞）の迅速な分化中の複製ストレス、ＤＮＡ損傷、及びゲノム不安定性の重大な原因である、そして、２）１種または複数種のデオキシリボヌクレオチド基質またはその前駆体を培養培地へ添加することによる、ＮＳＰのｈＩＰＳＣ細胞（または、他の幹細胞）の利用が可能になることで、ｄＮＴＰプールが増大し、培養中の幹細胞（ｉＰＳＣを含む）の複製ストレス、ＤＮＡ損傷、及びゲノム不安定性を軽減するであろう、ということである。
【０１０８】
同様に、ヌクレオシド混合物伝達培地（ＮＣＴ）の投与、例えば、本明細書に記載されているような、１種または複数種のデオキシヌクレオシドまたはそれらの前駆体を含む、医薬品や化粧品は、ｉｎ  ｖｉｖｏ幹細胞及び体細胞（例えば、線維芽細胞）の複製ストレス、ＤＮＡ損傷、及びゲノム不安定性を軽減するであろうと考えられる。
【０１０９】
ヌクレオシド非含有条件下で培養されたｈＩＰＳＣは、ｄＮＴＰ欠乏（図２及び６）、及び特に「臨床変換」（ＣＣ）系ストレス下に置かれた場合の高レベルのゲノム不安定性を示すということが見いだされた（図１）。しかし、標準的なｈＩＰＳＣ培養培地に異なる濃度のｄＮが添加された場合、３０μＭの各ｄＮは、４〜５日にわたって、ｈＩＰＳＣ増殖率及び遺伝的安定性を増大させることができた、ということがわかった（実施例１参照）。二重鎖の分解のγＨ２Ａ．Ｘ染色によるアッセイをしたところ、ゲノム損傷の発生を顕著に軽減もする一方で、低用量のｄＮ（例えば、５μＭ）は、ｈＩＰＳＣ（または他の幹細胞）の遺伝的安定性をより長期間にわたって、保証するであろうということも示した。
【０１１０】
本明細書で提示したデータは、幹細胞生物学及び再生医療分野の一員によって容易に実行され得る、簡素でかつ費用効率の高い培養培地添加法が、個別化されたｈＩＰＳＣ系細胞の治療学の臨床的可能性を増大し得ることを示している。
【０１１１】
本明細書で提示したデータは、美容、再生、及び治療の分野の一員によって容易に実行され得る、簡素でかつ費用効率の高いヌクレオシド添加法が、ヒトの組織（皮膚など）の再生を直接刺激するということを示している。具体的にいうと、ヌクレオシド混合物の直接の局所的適用（及び／または他のｉｎ  ｖｉｖｏ送達機構）は、皮膚線維芽細胞（図８）、間葉系幹細胞、及び／または皮膚に存在する他の細胞の増殖への刺激を通して、再生を誘導するであろう。
【０１１２】
ヌクレオシド（例えば、ｄＮ）を添加した細胞は、従来技術（ヌクレオシド非含有（例えば、ｄＮ非含有）培養培地）を用いて、誘導、培養し、分化した幹細胞よりも、遺伝的安定性が改善しそして個別化された幹細胞系（例えば、ｈＩＰＳＣ系）治療法に続く、腫瘍の形成の危険性の顕著な低下を引き起こすと考えられる。
【０１１３】
従って、種々の実施形態において提供される培養培地は、その培地で培養された、幹細胞（例えば、胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞など）の短期間または長期間における遺伝的安定性を向上する。この培養培地は、実質的に幹細胞（または他の細胞）の培養に利用した任意の培養培地を含み、その培地は、１種または複数種のデオキシリボヌクレオシドまたはヌクレオシド（三リン酸）及び／またはそれらの前駆体が添加される培地である。
【０１１４】
同様に、ヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）培地は、１種または複数種のデオキシヌクレオシドまたはヌクレオシド（三リン酸）及び／またはそれらの前駆体を含有する、医薬品または化粧品（例えば、本明細書に記載されている通り）を含む。
【０１１５】
培養培地。
種々の実施形態において、当該培養培地は、幹細胞の培養に利用した任意の培養培地を実質的に含み、培地には、１種または複数種のデオキシリボヌクレオシドまたはヌクレオシド（三リン酸）及び／またはそれらの前駆体が添加される。ある特定の実施形態においては、培養培地には、２つの異なるデオキシヌクレオシド及び／またはヌクレオシド（三リン酸）及び／またはそれらの前駆体が添加される。ある特定の実施形態においては、培地には、３つの異なるデオキシヌクレオシド及び／またはヌクレオシド（三リン酸）及び／またはそれらの前駆体が添加される。ある特定の実施形態においては、培地には、４つの異なるデオキシヌクレオシド及び／またはヌクレオシド（三リン酸）及び／またはそれらの前駆体が添加される。ある特定の実施形態においては、培地には、さらにいっそう異なるデオキシヌクレオシド及び／またはヌクレオシド（三リン酸）及び／またはそれらの前駆体が添加される。
【０１１６】
上述の通り、種々の実施形態において、基本の培養培地は、ＩＰＳＣを含む幹細胞を増大したり、維持したり、または分化したりすることが可能である任意の培養培地であり得る。ある特定の実施形態において、基本培地は従来の方法によって、手作業で用意されてもよい。ある特定の実施形態において、基本培地は市販の培地またはその混合物であってもよい。例えば、基本の培地は、ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地；ＧＩＢＣＯ）、ＭＥＭ（最小必須培地；ＧＩＢＣＯ）、ＢＭＥ（イーグル基礎培地；ＧＩＢＣＯ）、ＲＰＭＩ  １６４０（ＧＩＢＣＯ）、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（ダルベッコ変法イーグル培地：栄養混合物Ｆ−１２；ＧＩＢＣＯ）、ＤＭＥＭ／Ｆ−１０（ダルベッコ変法イーグル培地：栄養混合物Ｆ−１０；ＧＩＢＣＯ）、α−ＭＥＭ（α−最小必須培地；ＧＩＢＣＯ）、Ｇ−ＭＥＭ（グラスコー最小必須培地；ＧＩＢＣＯ）、ＩＭＤＭ（イスコブ変法ダルベッコ培地；ＧＩＢＣＯ）、及びＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）、ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（Ｅ８）培地、などからなる群から選択され得る。
【０１１７】
種々の実施形態において、基本培地は１種または複数種の添加物を含んでもよく、その添加物は、ＫｎｏｃｋＯｕｔ血清リプレースメント（ＧＩＢＣＯ）、ＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＳＲ  ゼノフリー（ＧＩＢＣＯ）、ＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＳＲ  ゼノフリー増殖因子混合物（ＧＩＢＣＯ）、Ｎ２サプリメント（ＧＩＢＣＯ）、Ｂ２７サプリメント（ＧＩＢＣＯ）などを含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、基本培地は、動物源由来の物質による任意の安全性の問題を避けるため、異種の病原体を保有しない培地（すなわち、ゼノフリー培地）である。概して、そのようなゼノフリー培地は、ウシの血清アルブミン及び、動物細胞から精製した遺伝子組換えタンパク質などの外来の病原菌を含まない。
【０１１８】
上述の通り、そのような培地は、研究室で日常的に用意することができ、または市販され得る。限定されない説明として、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２の組成を表１に示す。
【０１１９】
【表１Ａ】
2016538836.tif 000003
【表１Ｂ】
2016538836.tif 000004
【表１Ｃ】
2016538836.tif 000005
【表１Ｄ】
2016538836.tif 000006
【０１２０】
前述の基本の培養培地は、説明のためのものであって、限定するためのものではないことが意図される。本明細書に記載されている添加物が、事実上任意の培養培地で用いることができ、または任意の多くのＮＣＴ培地を形成するために、医薬品もしくは化粧品へ取り込まれることができる、ということは、当業者は容易に理解するだろう。
【０１２１】
ヌクレオシド混合物伝達（送達）培地。
ある特定の実施形態において、ヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）培地は、１種または複数種のデオキシヌクレオシドまたはヌクレオシド（三リン酸）及び／またはそれらの前駆体を含有する、送達担体（例えば化粧品）を含む。ＮＣＴ培地は、哺乳動物中または哺乳動物上の、所望の位置へヌクレオシドまたはヌクレオシドの前駆体を送達するために、あるいはヌクレオシドまたはヌクレオシドの前駆体の適切な局所濃度を提供するために形成される。
【０１２２】
「送達担体」は、例えば、希釈剤、補助薬、賦形剤、助剤、または担体を示し、それを用いて、本明細書に記載されている１種または複数種のヌクレオシド及び／またはヌクレオシドの前駆体が投与される。
【０１２３】
ＮＣＴは、例えば細胞増殖及び／または組織のｉｎ  ｖｉｖｏ活性化／再生を刺激するために、及び／または幹細胞もしくは他のｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞の細胞増殖を刺激するために、及び／または、導入された外来性細胞（例えば幹細胞）、内因性幹細胞、体細胞などの細胞性の維持を種々の状況において向上させるために、皮下にある、非経口の、局所的な、経口の、経鼻の（またはそれ以外の吸入の）用途に作成されることができ、または、噴霧もしくは経皮的などの局所的投与のために形成される。この組成物は、投与の方法に依って、種々の剤形／濃度で投与され得る。好適な単位剤形は、散剤、錠剤、丸薬、カプセル、ドロップ、坐剤、パッチ、鼻用スプレー、注射剤、移植可能な徐放性製剤、脂質複合体などを含むが、これらに限定されない。
【０１２４】
ある特定の実施形態において、ＮＣＴは、局所的投与、皮下投与、または皮内投与用に形成される。傷口、例えば、急性の傷の部位、術後の傷の部位、熱傷部位を含む傷口に、投与するためのある特定の製剤において、例えば回復を進めたり、瘢痕を低減したりすることが、企図される。
【０１２５】
ある特定の実施形態において、ＮＣＴは、１種または複数種の医薬品を備えて形成される。実例となる医薬品は、例えば、傷口、熱傷部位、にきび、及び他の局所的に美観を損なうもの（例えば、種々の種類の皮膚の瘢痕）の治療のために用いられる薬剤を含むが、これらに限定されない。実例となる薬剤は、例えば皮膚の瘢痕用の局所的なタモキシフェン、にきび用の過酸化ベンゾイル及び抗生物質などを含むが、これらに限定されない。
【０１２６】
実例となるＮＣＴ担体は、美容のための泥、ハーブ調合物、油脂（例えば、動物性油脂）、エマルション、ローション、クリーム、ゲル、生物製剤、ゲル、溶液、スプレー、軟膏、フォーム、ムース、液体、懸濁液、分散剤、噴霧剤、石けん、シャンプー、コンディショナー、クレンザー、及び一般的な化粧品を含む。ある特定の実施形態においては、しわ、及び／または皮膚のしみを減少させるための薬剤、及び／または皮膚充填剤を含む担体が企図される。
【０１２７】
ヌクレオシド及び／またはヌクレオシド前駆体が加えられる、好適な担体は、泥、ハーブ調合物、動物性油脂、エマルション、ローション、クリーム、ゲル、生物製剤、ゲル、溶液、スプレー、軟膏、フォーム、ムース、液体、懸濁液、分散剤、噴霧剤、石けん、シャンプー、コンディショナー、クレンザー、及び一般的な化粧品を含むが、これらに限定されない。
【０１２８】
ある特定の実施形態において、好適な担体は一般的に、局所的な投与向けの、クリーム、ローション、スプレー、フォーム、ゲル、エマルション、または化粧品の下地として用いられる、任意のキャリアまたは担体を含む。実施例は、乳化剤、炭化水素の下地を含有する不活性な担体、乳化をする下地、毒性を示さない溶媒、または水溶性下地を含む。特に好適な例は、プルロニック、ＨＰＭＣ、ＣＭＣ、及び他のセルロース系成分、ラノリン、固形パラフィン、液体パラフィン、ソフトイエローパラフィンまたはソフトホワイトパラフィン、サラシ蜜ろう、蜜ろう、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、ジメチコーン、乳化ろう、ミリスチン酸イソプロピル、ミクロワックス、オレイルアルコール、及びステアリルアルコールを含む。非イオン性のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーは、ポロクサマーともいわれることも企図される。１つの実例となるポロクサマーは、ポロクサマー４０７であり、プルロニックＦ−１２７（ＢＡＳＦ社）としても知られている。さらなる担体は、アルギン酸、ポリビニルアルコール、セルロース誘導体及び／またはポリアクリル酸を含有するヒドロゲルを含むヒドロゲル、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びそれらの混合物を含有するセルロース系担体を含むが、これらに限定されない。
【０１２９】
ある特定の実施形態において、担体はローションを含む。ローションは、懸濁化剤及び分散剤の利用を通して、分散培地中で不溶性である、細かく粉末状にした物質を含み得る。その代わりに、ローションは担体と混和しない、かつ通常乳化剤または他の好適な安定剤を用いて分散される、分散相の液状物質として有することができる。一実施形態では、ローションは、１００と１０００センチストークの間の粘度を有するエマルションの形態である。ローションの流動性は、広い表面積の上への迅速かつ均一な適用を可能にする。ローションは、概して、皮膚表面にその医薬成分の薄いコートを置いて皮膚上で乾くことを意図している。
【０１３０】
ある特定の実施形態において、担体は、外用クリームを含む。クリームは、乳化剤及び／または他の安定化剤を含み得る。一実施形態では、製剤は、１０００センチストークより大きい粘度、概して、２００００〜５００００センチストークの範囲を有するクリームの形態である。多くの場合、クリームが軟膏よりも一般に広げるには容易であり、かつ除去するにもより容易であるため、好まれる。クリームとローションの間の基本的な違いは粘度であり、この粘度は種々のオイルの量／用途、及び薬剤を調整するために用いられる水分の割合に依存する。概して、クリームはローションよりも濃厚であり、種々の用途があり得、そして皮膚上の所望の効果に依り、より多くの種類の油／バターを用いることが多い。クリーム剤において水系の割合は、約６０〜７５％であり、かつ油系は全体の約２０〜３０％、他の割合は、乳化剤、防腐剤、及び賦形剤で、合計１００％である。
【０１３１】
種々の実施形態において、担体は、軟膏を含む。好適な軟膏下地の例は、炭化水素下地（例えば、ワセリン、白色ワセリン、黄色軟膏、及びミネラルオイル）、吸収下地（親水性ワセリン、無水ラノリン、ラノリン、及びコールドクリーム）、水分除去可能な下地（例えば、親水性軟膏）、及び水溶性下地（例えば、ポリエチレングリコール軟膏）を含む。概して、ペースト剤は軟膏とは異なり、ペースト剤のほうが固体の割合が大きい。概して、ペースト剤は、同様の構成成分で調整した軟膏より、吸収力があり、かつ油っぽさが少ない。
【０１３２】
ある特定の実施形態において、担体は、ゲルを含む。いくつかのエマルションは、ゲルであってもよく、またはそれ以外のゲル構成成分を含んでもよい。しかし、いくつかのゲルはエマルションではなく、これはそれらが混合できない構成成分の均質化された混合物を含まないためである。好適なゲル化剤は、ヒドロキシプロピルセルロース及びヒドロキシエチルセルロースなどの修飾されたセルロース、Ｃａｂｏｐｏｌホモポリマー及びコポリマー、ならびにそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。好適な液体担体中の溶媒は、ジグリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコールなどのアルキレングリコール、ジメチルイソソルビド、イソプロピルアルコール及びエタノールなどのアルコールを含むが、これらに限定されない。概して溶媒は、薬剤を溶解するための能力のために選ばれる。添加剤は、皮膚の感触及び／または、製剤のエモリエント性を改善し、取り込まれてもよい。当該添加剤の例は、ミリスチン酸イソプロピル、酢酸エチル、Ｃ１２〜Ｃ１５安息香酸アルキル、ミネラルオイル、スクアラン、シクロメチコン、カプリン酸／カプリル酸トリグリセリド、及びそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。
【０１３３】
ある特定の実施形態において、担体はフォームを含む。フォームは、ガス状の噴霧剤と組み合わせたエマルションからなる。ガス状の噴霧剤は、主にヒドロフルオロアルカン（ＨＦＡ）からなる。好適な噴霧剤は、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ  １３４ａ）及び１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ  ２２７）などのＨＦＡを含むが、それらと、現在医療用の使用を承認されている、または承認され得る、他のＨＦＡの混合物及び添加物が好適である。好ましくは、噴霧剤は噴霧中に可燃性のまたは爆発性の気化物質を生成し得る、炭化水素噴霧ガスではない。さらに、好ましくは、その組成物は、使用中に可燃性または爆発性の気化物質を生成し得る、揮発性アルコールを含まない。
【０１３４】
種々の実施形態において、担体は、例えば保存期間を向上させたり、生物学的汚染を減らしたり、濡れを改善したり、最適ｐＨや粘度を維持したり、色、香り、テクスチャなどを維持したり改善したりするために、さらに付加成分を含んでもよいことは、理解されるであろう。実例となる付加成分は、賦形剤、希釈剤、皮膚軟化剤、表面活性物質、乳化剤、緩衝剤、防腐剤、浸透促進剤、芳香剤、着色剤、などを含むが、これらに限定されない。
【０１３５】
適切な賦形剤は、製剤のタイプに基づき選択される。標準的な賦形剤は、ゼラチン、カゼイン、レシチン、アラビアゴム、コレステロール、トラガントゴム、ステアリン酸、塩化ベンザルコニウム、ステアリン酸カルシウム、モノステアリン酸グリセリン、セトステアリルアルコール、セトマクロゴール乳化ワックス、ソルビタンエステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、ステアリン酸ポリオキシエチレン、コロイド状二酸化ケイ素、リン酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、非晶質セルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、トリエタノールアミン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、糖、及びデンプンを含む。
【０１３６】
「希釈剤」は、担体を溶解したり、分散したり、またはそれ以外に取り込んだりするために、製剤中に含まれ得る。希釈剤の例は、水、緩衝水溶液、１価アルコールと低分子グリコールと低分子ポリオールなどの親水性有機希釈剤（例えば、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリセロール、ブチレングリコール）を含むが、これらに限定されない。
【０１３７】
「皮膚軟化剤」は、外用として適用される、皮膚を滑らかにしたりいやしたりする薬剤であり、当技術分野で一般的に知られており、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」，  ４ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，２００３などの概説書に記載されている。これは、アーモンド油、ヒマシ油、イナゴマメエキス、セトステアロイルアルコール、セチルアルコール、セチルエステルワックス、コレステロール、綿実油、シクロメチコン、エチレングリコールパルミトステアリン酸、グリセリン、グリセリンモノステアリン酸エステル、モノオレイン酸グリセリル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ラノリン、レシチン、軽油、中鎖トリグリセリド、ミネラルオイル及びラノリンアルコール、ワセリン、ワセリン及びラノリンアルコール、大豆油、デンプン、ステアリルアルコール、ヒマワリ油、キシリトール及びそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。一実施形態において、皮膚軟化剤は、ステアリン酸エチルヘキシル及びパルミチン酸エチルヘキシルである。
【０１３８】
「表面活性物質」は、表面張力を下げる表面活性剤であり、そしてそのために生成物の乳化、泡立ち、分散、拡散及び湿潤の性状が増す。好適な表面活性物質は、乳化ろう、モノオレイン酸グリセリル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリソルベート、ソルビタンエステル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、シクロデキストリン、グリセリンモノステアリン酸エステル、ポロクサマー、ポビドン、及びそれらの混合物を含む。一実施形態において、非イオン性表面活性物質は、ステアリルアルコールである。
【０１３９】
「乳化剤」は、別の物質の中にある１つの液体の懸濁を促進する表面活性物質であり、油分と水分の安定した混合物またはエマルションの形成を促進する。一般的な乳化剤は、金属石けん、ある特定の動植物油、及び種々の極性化合物である。好適な乳化剤は、アラビアゴム、アニオン性乳化ろう、ステアリン酸カルシウム、カルボマー、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、コレステロール、ジエタノールアミン、エチレングリコールパルミトステアリン酸、モノステアリン酸グリセリン、モノオレイン酸グリセリル、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒプロメロース、ラノリン、含水、ラノリンアルコール、レシチン、中鎖トリグリセリド、メチルセルロース、ミネラルオイル及びラノリンアルコール、第１リン酸ナトリウム、モノエタノールアミン、非イオン性乳化ろう、オレイン酸、ポロクサマー、ポロクサマー類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシエチレン、アルギン酸プロピレングリコールエステル、自己乳化型モノステアリン酸グリセリル、無水クエン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ソルビタンエステル、ステアリン酸、ヒマワリ油、トラガカントゴム、トリエタノールアミン、キサンタンガム及びこれらの混合物を含む。一実施形態において、乳化剤はステアリン酸グリセロールである。
【０１４０】
「緩衝剤」は、組成物のｐＨを操作するために用いられる。好ましくは、緩衝剤は、約ｐＨ４〜約ｐＨ７．５、より好ましくは、約ｐＨ４〜約ｐＨ７、最も好ましくは、約ｐＨ５〜約ｐＨ７に組成物を緩衝する。好ましい実施形態において、緩衝剤はトリエタノールアミンである。
【０１４１】
「防腐剤」は、真菌及び微生物の増殖を妨げるために用いることができる。好適な抗真菌薬及び抗微生物薬は、安息香酸、ブチルパラベン、エチルパラベン、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、チメロサールを含むが、これらに限定されない。
【０１４２】
「浸透促進剤」は、皮膚、特に角質層を越えた薬剤の経皮的な送達を促進するためにしばしば用いられる。浸透促進剤は、活性剤が角質層の壁を越えることを可能にするために、加えられ得る。いくつかの浸透促進剤は、皮膚刺激性、皮膚毒性、及び皮膚アレルギーを起こす。しかし、より一般的に使用される物は、尿素、（カルボニルジアミド）、イミド尿素、Ｎ，Ｎ−ジエチルホルムアミド、Ｎ−メチル１−２−ピロリジン、１−ドデカル−アザシクロヘプタン−２−オン、カルシウムチオグリケート、２−ピロリジン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド、オレイン酸及び、そのメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ビニル、グリセルモノオレートなどのエステル誘導体、ソルビタンモノラウレート及びソルビタンモノオレートなどのソルビタンエステル、イソプロピルラウレート、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、アジピン酸ジイソプロピル、プロピレングリコールモノラウレート、プロピレングリコールモノオレートなどの他の脂肪酸エステル、及び、例えばＢＲＩＪ（登録商標）７６（ステアリルポリ（１０オキシエチレンエーテル）、ＢＲＩＪ（登録商標）７８（ステアリルポリ（２０）オキシエチレンエーテル）、ＢＲＩＪ（登録商標）９６（オレイルポリ（１０）オキシエチレンエーテル）、及びＢＲＩＪ（登録商標）７２１（ステアリルポリ（２１）オキシエチレンエーテル）（ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ  Ｉｎｃ．  Ｃｏｒｐ．）などの非イオン性洗剤を含む。
【０１４３】
送達担体の組成が、投与の様式、適用する部位などに伴い変化することは、理解されるであろう。医薬品及び化粧品の担体を調製する方法については、当業者によく知られている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  Ｅｄ．  Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９９０；  Ｂａｒｅｌ，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ３ｒｄ  Ｅｄ．，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎ，  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ：  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２００５））などを参照のこと）。
【０１４４】
前述の製剤及び投与の方法は、説明のためのものであって、限定するためのものではないことが意図される。本明細書に提供された教示を用いると、他の好適な製剤及び投与の方法を容易に考案することができることは理解されるであろう。
【０１４５】
ヌクレオシド添加。
種々の実施形態において、培養培地には、１種または複数種のデオキシヌクレオシドまたはヌクレオシド（三リン酸）及び／またはそれらの前駆体が添加される、あるいはＮＣＴ培地はそれらを含む。実例となるデオキシリボヌクレオシド三リン酸は、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、及びデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）を含むが、これらに限定されない。当該ｄＮＴＰの実例となる前駆体は、以下を含むが、これらに限定されない。
【０１４６】
デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）向けには、デオキシアデノシン二リン酸、デオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン、アデニン、などがある。いくつかの実施形態において、当該前駆体は、デオキシアデノシン二リン酸、デオキシアデノシン一リン酸、及び、デオキシアデノシン、または任意のそれらの混合物からなる群から選択される、１種または複数種の前駆体を含む。
【０１４７】
デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）向けには、デオキシグアノシン二リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシグアノシン、グアニン、などがある。いくつかの実施形態において、当該前駆体は、デオキシグアノシン二リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、及びデオキシグアノシン、または任意のそれらの混合物からなる群から選択される、１種または複数種の前駆体を含む。
【０１４８】
デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）向けには、デオキシシチジン二リン酸、デオキシシチジン一リン酸、デオキシシチジン、シトシン、などがある。いくつかの実施形態において、当該前駆体は、デオキシシチジン二リン酸、デオキシシチジン一リン酸、及びデオキシシチジン、または任意のそれらの混合物からなる群から選択される、１種または複数種の前駆体を含む。
【０１４９】
デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）向けには、デオキシチミジン二リン酸、デオキシチミジン一リン酸、デオキシチミジン、チミン、などがある。いくつかの実施形態において、当該前駆体は、デオキシチミジン二リン酸、デオキシチミジン一リン酸、デオキシチミジン、または任意のそれらの混合物からなる群から選択される、１種または複数種の前駆体を含む。
【０１５０】
デオキシウリジン三リン酸向けには、デオキシウリジン二リン酸、デオキシウリジン一リン酸、デオキシウリジン、ウラシル、などがある。いくつかの実施形態において、当該前駆体は、デオキシウリジン二リン酸、デオキシウリジン一リン酸、及びデオキシウリジン、または任意のそれらの混合物からなる群から選択される、１種または複数種の前駆体を含む。
【０１５１】
種々の実施形態において、基本の培養培地には、さらにまたは代わりに、１種または複数種のヌクレオシド三リン酸及び／またはそれらの前駆体が添加され、あるいはＮＣＴはそれらを含む。実例となるヌクレオシド三リン酸は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、５−メチルウリジン三リン酸（ｍ５ＵＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、などを含むが、これらに限定される必要はない。ある特定の実施形態において、ＡＴＰが存在する場合、他の少なくとも１つのヌクレオシド及び／またはデオキシヌクレオシド三リン酸またはそれらの前駆体も、添加物として存在する。実例となるＮＴＰの前駆体は、以下を含むが、これらに限定されない。
【０１５２】
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）向けには、アデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン、アデニンなど、またはそれらの任意の混合物がある。いくつかの実施形態において、当該前駆体は、アデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、及びアデノシンからなる群から選択される、１種または複数種の前駆体を含む。
【０１５３】
グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）向けには、グアノシン二リン酸、グアノシン一リン酸、グアノシン、グアニンなど、またはそれらの任意の混合物がある。いくつかの実施形態において、当該前駆体は、グアノシン二リン酸、グアノシン一リン酸、及びグアノシンからなる群から選択される、１種または複数種の前駆体を含む。
【０１５４】
シチジン三リン酸（ＣＴＰ）向けには、シチジン二リン酸、シチジン一リン酸、シチジン、シトシンなど、またはそれらの任意の混合物がある。いくつかの実施形態において、当該前駆体は、シチジン二リン酸、シチジン一リン酸、シチジンからなる群から選択される、１種または複数種の前駆体を含む。
【０１５５】
５−メチルウリジン三リン酸（ｍ５ＵＴＰ）向けには、５−メチルウリジン二リン酸、５−メチルウリジン一リン酸、５−メチルウリジン、チミンなど、またはそれらの任意の混合物がある。いくつかの実施形態において、当該前駆体は、５−メチルウリジン二リン酸、５−メチルウリジン一リン酸、及び５−メチルウリジンからなる群から選択される、１種または複数種の前駆体を含む。
【０１５６】
ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）向けには、ウリジン二リン酸、ウリジン一リン酸、ウリジン、ウラシルなど、またはそれらの任意の混合物がある。いくつかの実施形態において、当該前駆体は、ウリジン二リン酸、ウリジン一リン酸、及びウリジンからなる群から選択される、１種または複数種の前駆体を含む。
【０１５７】
ある特定の実施形態において、当該前駆体は、単独で塩基を含まない。
【０１５８】
ある特定の実施形態において、培養培地に、２つの異なるデオキシヌクレオシド、またはヌクレオシド（三リン酸）、及び／またはそれらの前駆体、あるいは、３つの異なるデオキシヌクレオシドまたはヌクレオシド（三リン酸）、及び／またはそれらの前駆体、あるいは、４つ（またはそれ以上）の異なるデオキシヌクレオシドまたはヌクレオシド（三リン酸）及び／または前駆体が添加される、またはＮＣＴ培地はそれらを含む。ある特定の実施形態において、培養培地に、少なくとも１種のプリン及び１種のピリミジン（またはそれらの前駆体）が添加される、またはＤＣＴ培地はそれらを含む。ある特定の実施形態において、培養培地には、少なくとも２種のプリン（またはそれらの前駆体）が添加される、またはＤＣＴ培地はそれらを含む。ある特定の実施形態において、培養培地には、少なくとも２種のピラミジン（またはそれらの前駆体）が添加される、またはＮＣＴ培地はそれらを含む。ある特定の実施形態において、培養培地には、少なくとも２種のプリン（またはそれらの前駆体）及び少なくとも１種のピラミジン（またはそれらの前駆体）が添加される、またはＮＣＴ培地はそれらを含む。ある特定の実施形態において、培養培地には、少なくとも２種のピラミジン（またはそれらの前駆体）及び１種のプリン（またはそれらの前駆体）が添加される、またはＮＣＴ培地はそれらを含む。ある特定の実施形態において、培養培地には、少なくとも２種のプリン（またはそれらの前駆体）及び２種のピリミジン（またはそれらの前駆体）が添加される、またはＮＣＴ培地はそれらを含む。
【０１５９】
説明として、いくつかの実施形態において、添加（例えば、培養培地を取り込むこと、またはＮＣＴ培地を含むこと）は、以下の１種または複数種を含む、または、からなる。
１）ｄＡＴＰ（またはそれらの前駆体）、
２）ｄＧＴＰ（またはそれらの前駆体）、
３）ｄＣＴＰ（またはそれらの前駆体）、
４）ｄＴＴＰ（またはそれらの前駆体）、
５）ｄＵＴＰ（またはそれらの前駆体）、
６）ｄＡＴＰ（またはそれらの前駆体）及びｄＧＴＰ（またはそれらの前駆体）、
７）ｄＡＴＰ（またはそれらの前駆体）及びｄＣＴＰ（またはそれらの前駆体）、
８）ｄＡＴＰ（またはそれらの前駆体）及びｄＴＴＰ（またはそれらの前駆体）、
９）ｄＡＴＰ（またはそれらの前駆体）及びｄＵＴＰ（またはそれらの前駆体）、
１０）ｄＧＴＰ（またはそれらの前駆体）及びｄＣＴＰ（またはそれらの前駆体）、
１１）ｄＧＴＰ（またはそれらの前駆体）及びｄＴＴＰ（またはそれらの前駆体）、
１２）ｄＧＴＰ（またはそれらの前駆体）及びｄＵＴＰ（またはそれらの前駆体）、
１３）ｄＣＴＰ（またはそれらの前駆体）及びｄＴＴＰ（またはそれらの前駆体）、
１４）ｄＣＴＰ（またはそれらの前駆体）及びｄＵＴＰ（またはそれらの前駆体）、
１５）ｄＴＴＰ（またはそれらの前駆体）及びｄＵＴＰ（またはそれらの前駆体）、
１６）ｄＡＴＰ（またはそれらの前駆体）、ｄＧＴＰ（またはそれらの前駆体）及びｄＣＴＰ（またはそれらの前駆体）、
１７）ｄＡＴＰ（またはそれらの前駆体）、ｄＧＴＰ（またはそれらの前駆体）、及びｄＴＴＰ（またはそれらの前駆体）、
１８）ｄＡＴＰ（またはそれらの前駆体）、ｄＣＴＰ（またはそれらの前駆体）、及びｄＴＴＰ（またはそれらの前駆体）、
１９）ｄＧＴＰ（またはそれらの前駆体）、ｄＣＴＰ（またはそれらの前駆体）、及びｄＴＴＰ（またはそれらの前駆体）、
２０）ｄＡＴＰ（またはそれらの前駆体）、ｄＧＴＰ（またはそれらの前駆体）、及びｄＣＴＰ（またはそれらの前駆体）、
２１）ｄＡＴＰ（またはそれらの前駆体）、ｄＧＴＰ（またはそれらの前駆体）、及びｄＵＴＰ（またはそれらの前駆体）、
２２）ｄＡＴＰ（またはそれらの前駆体）、ｄＣＴＰ（またはそれらの前駆体）、及びｄＵＴＰ（またはそれらの前駆体）、
２３）ｄＧＴＰ（またはそれらの前駆体）、ｄＣＴＰ（またはそれらの前駆体）、及びｄＵＴＰ（またはそれらの前駆体）、
２４）ｄＡＴＰ（またはそれらの前駆体）、ｄＧＴＰ（またはそれらの前駆体）、及びｄＣＴＰ（またはそれらの前駆体）、及びｄＴＴＰ（またはそれらの前駆体）、
２５）ｄＡＴＰ（またはそれらの前駆体）、ｄＧＴＰ（またはそれらの前駆体）、ｄＣＴＰ（またはそれらの前駆体）、及びｄＵＴＰ（またはそれらの前駆体）
【０１６０】
前述の任意の添加物中において、デオキシヌクレオシドは、ヌクレオシド、またはその前駆体であってもよいことは、理解されるであろう。これら添加物は、説明のためのものであって、限定するためのものではない。
【０１６１】
概して、ｄＮＴＰ及び／またはＮＴＰは、同様の培養培地で培養された、またはヌクレオシド三リン酸もしくはその前駆体を添加しないＮＣＴ培地へ曝した同様の細胞と比較して、短期間及び／または長期間の、幹細胞の遺伝的安定性を改善するために、及び／または増殖率を改善するために、及び／または生存率を改善するために、十分な量で培養中にまたはＮＣＴ培地中に存在する。
【０１６２】
ある特定の実施形態において、培養またはＤＣＴ培地に添加される、ＮＴＰ及び／またはｄＮＴＰまたはそれらの前駆体は、それぞれ独立に、約１μＭから約５０μＭまで、または約１μＭから約４０μＭまで、または約１μＭから約３５μＭまで、または約１μＭから約３０μＭまでの範囲の濃度で存在する。ある特定の実施形態において、培養またはＤＣＴ培地に添加される、ＮＴＰ及び／またはｄＮＴＰまたはそれらの前駆体は、それぞれ独立に、約５０μＭ以下、または約４０μＭ以下、または約３５μＭ以下、または約３０μＭ以下、または約２５μＭ以下、または約２０μＭ以下、または約１５μＭ以下、または約１０μＭ以下、または約５μＭ以下の濃度で存在する（少なくとも１種のヌクレオシド三リン酸またはそれらの前駆体について少なくとも０．１μＭが、「以下」は全てのヌクレオシド三リン酸またはそれらの前駆体が存在しないと解釈されるように意図されないよう、存在していると理解の上で）。
【０１６３】
ある特定の実施形態において、培養培地に添加されるまたはＮＣＴ培地を構成する、ＮＴＰ及び／またはｄＮＴＰまたはそれらの前駆体は、それぞれ独立して約５μＭから約３０μＭの範囲の濃度で存在する。
【０１６４】
ある特定の実施形態において、培養培地に添加される、またはＮＣＴ培地を構成する、ＮＴＰ及び／またはｄＮＴＰまたはそれらの前駆体は、それぞれ独立して、約１μＭ、または約２μＭ、または約３μＭ、または約４μＭ、または約５μＭ、または約６μＭ、または約７μＭ、または約８μＭ、または約９μＭ、または約１０μＭ、または約１１μＭ、または約１２μＭ、または約１３μＭ、または約１４μＭ、または約１５μＭ、または約１６μＭ、または約１７μＭ、または約１８μＭ、または約１９μＭ、または約２０μＭ、または約２１μＭ、または約２２μＭ、または約２３μＭ、または約２４μＭ、または約２５μＭ、または約２６μＭ、または約２７μＭ、または約２８μＭ、または約２９μＭ、または約３０μＭ、または約３１μＭ、または約３２μＭ、または約３３μＭ、または約３４μＭ、または約３５μＭ、または約３６μＭ、または約３７μＭ、または約３８μＭ、または約３９μＭ、または約４０μＭ、または約４１μＭ、または約４２μＭ、または約４３μＭ、または約４４μＭ、または約４５μＭ、または約４６μＭ、または約４７μＭ、または約４８μＭ、または約４９μＭ、または約５０μＭの濃度で存在する。
【０１６５】
ある特定の実施形態において、培養培地に添加されるまたはＮＣＴ培地を構成する、ＮＴＰ及び／またはｄＮＴＰまたはそれらの前駆体は、それぞれ約１μＭから、または約２μＭから、または約３μＭから、または約４μＭから、または約５μＭから、約５０μＭまで、または約４０μＭまで、または約３０μＭまで、または約２５μＭまで、または約２０μＭまで、または約１５μＭまでの範囲の濃度で存在する。
【０１６６】
ある特定の実施形態において、培養培地に添加されるまたはＮＣＴ培地を構成する、全てのＮＴＰ及び／またはｄＮＴＰまたはそれらの前駆体は、約１μＭから、または約２μＭから、または約３μＭから、または約４μＭから、または約５μＭから、または約６μＭから、または約７μＭから、または約８μＭから、または約９μＭから、または約１０μＭから、または約１１μＭから、または約１２μＭから、または約１３μＭから、または約１４μＭから、または約１５μＭから、または約１６μＭから、または約１７μＭから、または約１８μＭから、または約１９μＭから、または約２０μＭから、約２００μＭまで、または約１８０μＭまで、または約１５０μＭまで、または約１４５μＭまで、または約１４０μＭまで、または約１３５μＭまで、または約１３０μＭまで、または約１２５μＭまで、または約１２０μＭまで、または約１１５μＭまで、または約１１０μＭまで、または約１０５μＭまで、または約１００μＭまでの範囲の濃度で存在する。
【０１６７】
ある特定の実施形態において、幹細胞培養も本明細書で提供され、幹細胞培養は、本明細書に記載される１種または複数種のｄＮＴＰ及び／またはＮＴＰを添加した培養培地中の幹細胞を含む。ある特定の実施形態においては、幹細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在することができ、本明細書に記載されているようにＮＣＴに曝すこともできる。種々の実施形態において、幹細胞は、神経幹細胞、肝幹細胞、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、表皮幹細胞、消化管幹細胞、内皮幹細胞、筋肉幹細胞、間葉幹細胞、及び膵臓幹細胞などを含むがこれらに限定されない、胚性幹細胞または成体幹細胞であってもよい。ある特定の実施形態において、幹細胞は、人工多能性幹細胞、特にヒトＩＰＳＣを含む。幹細胞（ＩＰＳＣを含む）は、ヒトではない動物の幹細胞、またはヒトの幹細胞であり得る。
【０１６８】
ある特定の実施形態において、幹細胞は、人工多能性幹細胞、特にヒトＩＰＳＣである。実例となる幹細胞は、神経幹細胞、肝幹細胞、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、表皮幹細胞、消化管幹細胞、内皮幹細胞、筋肉幹細胞、間葉幹細胞、及び膵臓幹細胞を含むがこれらに限定されない、胚性幹細胞及び成体幹細胞からなる群から選択される幹細胞を含むが、これらに限定されない。
【０１６９】
ある特定の実施形態において、幹細胞はＩＰＳＣであり、このＩＰＳＣは、線維芽細胞、神経幹細胞、胃の細胞、肝細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、羊膜細胞、血液細胞、β細胞、及び脂肪細胞からなる群から選択される細胞からリプログラミングされる。ある特定の実施形態において、ＩＰＳＣは、ＫＬＦ４（Ｋ）、ＬＩＮ２８（Ｌ）、ｃ−ＭＹＣ（Ｍ）、ＮＡＮＯＧ（Ｎ）、ＯＣＴ４（Ｏ）、ＳＯＸ２（Ｓ）、及びバルプロ酸（ＶＰＡ）からなる群から選択される、２種またはそれ以上の因子をリプログラミングされた細胞を含む。ある特定の実施形態において、ＩＰＳＣは、４つの基準となる山中因子であるＫＬＦ４（Ｋ）、ｃ−ＭＹＣ（Ｍ）、ＯＣＴ４（Ｏ）、及びＳＯＸ２（Ｓ）を用いてリプログラミングされた細胞を含む。
【０１７０】
ＩＰＳＣを生成するために細胞をリプログラミングする方法は、当業者にはよく知られている。ある特定の実施形態において、リプログラミングは、例えば、組み込み型ベクター（例えばレント（ｌｅｎｔ）ウイルスベクター、誘導型レンチウイルスベクターなど）、除去可能ベクター（例えば、トランスポゾンベクター、ｌｏｘＰ隣接レンチウイルスベクターなど）、非組み込み型ベクター（例えば、アデノウイルスベクター、プラスミドベクターなど）、ＤＮＡ非含有ベクター（例えば、センダイウイルス、タンパク質ベクター、修飾ｍＲＮＡベクター、マイクロＲＮＡベクター、など）を用いて達成され得る。多数のリプログラミングキットが、市販されていることを示しておく（例えば、ライフテクノロジーズ社のＥｐｉ５（商標）エピソームｉＰＳＣリプログラミングキット、及びＣｙｔｏＴｕｎｅ（登録商標）ｉＰＳセンダイリプログラミングキットなど）。
【０１７１】
種々の実施形態において、人工幹細胞（多能性幹細胞を含む）のゲノム不安定性を軽減する方法であって、この方法は、本明細書に記載されているような、ＮＴＰ及び／またはｄＮＴＰ及び／またはそれらの前駆体を添加した細胞培養培地中の細胞を培養すること、あるいは、例えば本明細書に記載されているような、１種または複数種のＮＴＰ及び／またはｄＮＴＰ及び／またはそれらの前駆体を含むＮＣＴ培地と細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで接触させること、を含む方法を提供する。
【０１７２】
種々の実施形態において、あるいは本明細書に記載されているような、ＮＴＰ及び／またはｄＮＴＰ及び／またはそれらの前駆体が添加された細胞培養培地中に存在する、またはそれらを含むＮＣＴ培地と接触した細胞培養培地中に存在する、幹細胞（例えば、人工多能性幹細胞）が提供される。
【０１７３】
自家幹細胞移入を実現する方法も提供される。概して、この方法は、対象から単離した幹細胞または対象から作成したＩＰＳＣ、及び本明細書に記載されているような、ＮＴＰ及び／またはｄＮＴＰ及び／またはそれらの前駆体を添加した細胞培養培地またはＮＣＴ培地中で、当該幹細胞またはＩＰＳＣを増大すること、及び／または培養することを提供することを含む。
【０１７４】
本明細書に記載されているそれぞれの実施形態において、目的物（すなわち、細胞培養、ＤＣＴ培地、細胞、方法、など）は、放射標識された任意のＮＴＰ及び／またはｄＮＴＰ及び／またはそれらの前駆体を含まなくてもよい。従って、いくつかの実施形態において、そのような実施形態で用いられる、このＮＴＰ及び／またはｄＮＴＰ及び／またはそれらの前駆体は、任意の放射標識（例えば、３Ｈ、５１Ｃｒまたは３２Ｐなど）と連結されたり、結合したりしていない。従って、この実施形態では、例えば、３Ｈ−ｄＴＴＰまたは３Ｈ−ＴＴＰまたはそれらの任意の前駆体を含み得ない。
【０１７５】
本明細書に記載されている実施形態は、説明のためのものであって、限定するためのものではないことが意図される。本明細書で提供された教示を用いて、本明細書に記載されている、組成物及び方法の多数の変形が、当技術分野の当業者に利用可能であろう。
【実施例】
【０１７６】
以下の実施例は、特許請求された発明を限定するためではなく、説明するために提供される。
【０１７７】
実施例１
ゲノム安定性の促進、細胞機能の向上、再生の向上のための、ｈＩＰＳＣ培養中または、ヌクレオシド混合物伝達（ＮＣＴ）培地へのヌクレオシド添加
意義
ヒト人工多能性幹細胞（ｈＩＰＳＣ）は、有意な治療可能性を有している（Ｂｙｒｎｅ  （２００８）  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １７：Ｒ３７−４１）。しかし、我々の発見は、（図１、予備データ）及び他のデータ（Ｍａｒｔｉｎｓ−Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｘｕ  （２０１２）  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ３０：  ２２−２７；  Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ  （２０１２）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １３：  ７３２−７４４）が、実質的に現在の手法を用いて誘導された、全てのｉＰＳＣクローンが、リプログラミング及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養で誘発されたストレスの間に、ゲノム不安定性を得ていることを示している。ゲノム不安定性と悪性である形質転換の危険の増大との間に関連が認められていることから、ｈＩＰＳＣのゲノム不安定性の問題は、個別化されたｉＰＳＣ系再生療法を臨床へ進歩させる最も重大な妨げの１つである（Ｍａｒｔｉｎｓ−Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｘｕ  （２０１２）  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ３０：  ２２−２７；  Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ  （２０１２）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １３：  ７３２−７４４；  Ｂｙｒｎｅ  （２０１３）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ７：  １２３０００２）。
【０１７８】
ｈＩＰＳＣリプログラミング中及び培養中のゲノム不安定性の原因はまだ不明のままであり、そしてこの非常に有害な減少の発生を軽減して、最後には除去するための方法は、まだ開発されていない。継続中の実験において、我々は、迅速に分割するｈＩＰＳＣ中のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）プールは、ｈＩＰＳＣが由来する、皮膚線維芽細胞のｄＮＴＰプールよりも顕著に小さいということを見いだした（図２）。ｈＩＰＳＣは、本来の線維芽細胞よりもより顕著に多く二重鎖が分解している（ＤＳＢ）ことを示しているとも判断された（例えば、図３Ａ及び３Ｂ）。ｈＩＰＳＣ中のｄＮＴＰプールの減少及びＤＮＡ損傷の増大に対する我々の検証は、ｈＩＰＳＣのゲノム不安定性の原因への新たな機構の洞察を提供し得るものであり、かつ、この現象を防ぐ方法を示すかもしれない。従って、我々のデータは、以下のことを示す。１）ｈＩＰＳＣは、デオキシリボヌクレオシドの混合物（ｄＮ）の形態で、ｈＩＰＳＣ培養培地へ加えられた、外因性ｄＮＴＰ前駆体を利用することができる、そして、２）ｄＮを添加した培養培地は、ｈＩＰＳＣ  ｄＮＴＰプール欠損を改善することができ、かつそれらの細胞によって経験されるゲノム不安定性を顕著に軽減することができる（図４）。
仮説及び理論的根拠
哺乳類の細胞は、２つの経路、グルコース及びアミノ酸を用いるデノボ経路（ＤＮＰ）ならびに、細胞外環境から前もって作成されたｄＮを用いるヌクレオシドサルベージ経路（ＮＳＰ）を経てｄＮＴＰを合成する。特定の理論で束縛されるものではないが、我々は以下のことを仮定する。それは、１）ＤＮＰを介したｄＮＴＰプールの不十分な生成は、ｈＩＰＳＣを迅速に分化する、複製ストレス、ＤＮＡ損傷、及びゲノム不安定性の重大な原因である、そして、２）ＮＳＰのｄＮ基質の合成された混合物を培養培地へ添加することによって、ＮＳＰのｈＩＰＳＣ細胞の利用が可能になることで、ｄＮＴＰプールが増大し、複製ストレス、ＤＮＡ損傷、及びゲノム不安定性を軽減するであろう、ということである。
【０１７９】
特定の理論で束縛されるものではないが、我々は以下のことを仮定する。１）デノボ経路（ＤＮＰ）を介した、グルコース及びアミノ酸からのｄＮＴＰプールの不十分な生成は、ｈＩＰＳＣ中の複製ストレス、ＤＮＡ損傷、及びゲノム不安定性の重大な原因である、そして２）ｈＩＰＳＣがＤＮＰに加えて、第２のｄＮＴＰ生合成回路、ヌクレオシドサルベージ経路（ＮＳＰ）を用いることも可能にすることで、複製ストレス、ＤＮＡ損傷、及びゲノム不安定性を軽減するであろう、ということである。実例となる実施形態において、ＮＳＰの利用を可能にすることが、ＮＳＰのデオキシヌクレオシド（ｄＮ）基質の混合物をｈＩＰＳＣ培養培地に添加することで、達成された。
【０１８０】
要約すると、ゲノム不安定性の問題に対する、簡素で、効率的である、一般的に適用可能な、かつ費用効率の高い解決手段を提供し、それは現在の方法論を用いて、生成されたｈＩＰＳＣに有効である。具体的にいうと、幹細胞及びｈＩＰＳＣにおけるゲノム不安定性の発生は、それらの細胞がＮＳＰを介したｄＮＴＰの合成を可能にすることで、防ぐことができることも示している。これは、ＮＳＰのｄＮ基質の最適化された混合物を培養培地に添加することで、達成することができる。
ヒト人工多能性幹細胞の誘導及びキャラクタリゼーション
我々は、ＬｏｘＰ隣接多シストロン性のリプログラミングベクター（次いで、Ｃｒｅリコンビナーゼを用いてゲノムから取り出した）（Ｓｏｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２８：６４−７４）、または、合成ｍＲＮＡを基にした手法（Ｗａｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，７：６１８−６３０）を用いて、ヒト人工多能性幹細胞（ｈＩＰＳＣ）へ成人ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）をリプログラミングした。リプログラミング後の培養は全て、現在の標準的な手法により標準的なｈＩＰＳＣ培養培地で実施し、任意のヌクレオシドを添加しなかった（ｗｗｗ．ｓｔｅｍｇｅｎｔ．ｃｏｍ/ｐｒｏｄｕｃｔｓ/ｓｈｏｗ/６９．  ＮＵＴＲＩＳＴＥＭ（商標）  ＸＦ／ＦＦ  培養培地）。前述の通り、２つの導入遺伝子非含有のｈＩＰＳＣ株が、標準的なキャラクタリゼーションのパラメータを示した。（Ｂｙｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ４  ｅ７１１８）これらのパラメータは、胚性幹細胞（ＥＳＣ）様の形態、重要な多能性マーカー（ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１）の顕著な発現を含み、これは本来の皮膚線維芽細胞では検出されず（図１、パネルＡ）、また重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスにおいて、テラトーマ形成に続き３つの全ての胚葉について、その代表への分化を含む（図１、パネルＢ）。次いで、我々は前述の通り、研究用の条件（動物由来のエピトープを含む：培養培地を含むマトリゲル基質及びＫｎｏｃｋＯｕｔ血清リプレースメント、ＫＳＲ）から、導入遺伝子非含有のｈＩＰＳＣ株を推定上の臨床グレードの動物エピトープ非含有「ゼノフリー」合成条件（ＣｅｌｌＳｔａｒｔ（商標）基質及び、最適化されたゼノフリー培地、５０％ｍＴｅＳＲＩ（商標）、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、及び５０％  Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社）へ転換した。（Ｋａｒｕｍｂａｙａｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓ．  Ｍｅｄ．  １：  ３６−４３）前述の通り、２つのｈＩＰＳＣ株で、「臨床グレード変換」（ＣＣ）の前後両方について、核型を決定した（Ｂｙｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ  （２００９）  ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ４：ｅ７１１８）。
【０１８１】
ＣＣ誘発性ストレス及び２つの株の伸長に続き、核型的に正常な状態（４６ＸＹ）から、過剰染色体１２を所有する状態に進んだ（図１、パネルＣ）。認められたゲノム不安定性は、ｈＩＰＳＣは特に外因性のストレス条件下に置かれた場合、遺伝子的に不安定である（Ｎａｇａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，  １８３０：  ２３４５−２３５３）、そして、優先的に染色体１２を複製する（Ｄｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２２：  ５３−５４）ことを示した、複数の発表されている研究と密接な相関がある。以前より、ｈＩＰＳＣの全ての染色体は、染色体の翻訳及び複製について、同じ初期発生率を有するが、染色体１２の複製は、それが起きたときに選択の過程を通して、延長されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養に続いたｈＩＰＳＣ個体群の全体にわたった、優先的な伸長をもたらすということが示唆された（同上）。我々は、ＣＣ系ストレスがより長期間培養（６〜１２カ月超）誘発ストレスの有用なモデルとなると考察しており、これはｈＩＰＳＣ及びｈＥＳＣ中に、特に染色体１２の核型異常の蓄積を引き起こす傾向もあるものであり、我々は２カ月間にわたって下記のＣＣ系ストレスを観察した。
ｈＩＰＳＣ中  対  本来のＨＤＦｓ中のより小さいｄＮＴＰプール
【０１８２】
我々は、前述の通り、本来のＨＤＦ及び初期継代の（非ＣＣストレスの）ｈＩＰＳＣにおけるデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）プールを定量化した（Ａｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  ２０９：  ２２１５−２２２８）。我々は、ｈＩＰＳＣリプログラミングの後、４つの全てのｄＮＴＰのレベルにおいて、顕著な低下（３２〜５２％）を認めた（図２）。
ｄＮＴＰ生合成に含まれる遺伝子は、迅速に分裂するｈＩＰＳＣ及びＨＤＦと同様のレベルで、かつ細胞分裂より遅い速度で発現する
【０１８３】
ＨＤＦのアフィメトリクス社による全体的転写分析及び、誘導した初期継代ｈＩＰＳＣ（前述の通りに実施した（Ａｗｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ＆  Ｔｈｅａｐ．，４：１５））は、重要な多能性特異的マーカーの重大な増加を示し、重要な線維芽細胞特異的マーカーの発現は、ｈＩＰＳＣリプログラミングに伴い、減少した（表２）。ゲノム不安定性の誘発に以前関連づけられた遺伝子の増加も認めた（ＣＣＮＥ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ３５）。しかし、重要なｄＮＴＰ生合成遺伝子の発現に、有意な差異は認めなかった（表２）。ｈＩＰＳＣは、ＨＤＦよりも速い平均個体数倍加時間（ＰＤＴ）を有しているので（１８時間  対  ４８時間）、それらのデータは、ｈＩＰＳＣ中の小さなｄＮＴＰプールは、１）ＤＮＡ複製においてｄＮＴＰの利用を増大させるより速い速度の細胞増殖、そして２）ｄＮＴＰ生合成に関与する遺伝子の発現を増加させることは不可能であるということ、に起因し得るという、我々の仮説を支持するものである。
【０１８４】
【表２】
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【０１８５】
ｈＩＰＳＣ  対  ＨＤＦ中のＤＮＡ損傷の上昇値：ｄＮ添加は、ｈＩＰＳＣ中のＤＮＡ損傷を軽減する
我々は、前述の通りＨＤＦ中及び初期継代のｈＩＰＳＣの二重鎖の分解（ＤＳＢ）数を見積もるために、ガンマ−ヒストン２Ａ．Ｘ（γＨ２Ａ．Ｘ）染色を利用した  （Ｂｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｃｅｌｌ，  １４５：  ４３５−４４６）。γＨ２Ａ．Ｘ陽性巣が、本来のＨＤＦ中よりもｈＩＰＳＣ中でより顕著に多く検出された。我々は、４日間のｄＮ添加後に、より顕著に減少したγＨ２Ａ．Ｘ陽性巣も認めた（図３Ａ、中央と下のパネルの比較）。この発見は、ｈＩＰＳＣは、皮膚線維芽細胞より高レベルなゲノム不安定性を示し、ゲノム不安定性は、細胞培養培地のｄＮ添加により妨げられ得る、という仮説へのさらなる支持を提供するものである。我々は、ｈＩＰＳＣ個体群の中に、γＨ２Ａ．Ｘ陽性巣の数において、顕著な不均質性も認め、ゲノム不安定性の発生率は、ｈＩＰＳＣ個体群で一様でなく、ｈＩＰＳＣの亜個体群は、γＨ２Ａ．Ｘ染色でアッセイされるように、さらなるゲノムのＤＮＡ損傷を招く傾向が強く、従って、核型異常の発生に最も影響されやすい細胞を示す、という我々の仮説も認めるものである。
【０１８６】
ｄＮ添加は、ＣＣ系ストレス後のｈＩＰＳＣゲノム安定性を促進する
我々は、ｄＮ添加がＣＣ系ストレス中にゲノム不安定性が認められることを防ぐことができるかどうかを調査するために、ｄＮ有り無し両方の条件下でｈＩＰＳＣを培養した。ｈＩＰＳＣは、培養がリプログラムしたり、延長されたりする間に、ゲノム損傷を蓄積していることを示している（Ｂｅｎ−Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  （Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ，  Ｔｅｘ．）  ９：  ４６０３−４６０４）一方、我々は、ＣＣを実施した細胞にストレスを加えたときに、２つの独立したｈＩＰＳＣ株中に、最も激しいゲノム損傷（核型異常）を認めた、ということに注目するべきである。この観察は、比較的短期間（２カ月）にわたる重大なゲノム損傷を誘導するために、迅速かつ一貫した実験的試みを提供する。ヒトｉＰＳＣは、初めにｍＴｅＳＲＩ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及びＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社）を組み合わせたマトリゲルで培養された。次いで、細胞培養培地に外因的に供給されたｄＮの有無で成長させた、２つのグループに分割した（各ｄＮを３０μＭ）。１週間添加後、ゼノフリー条件への変換工程を開始した、この変換工程は、基底膜及びＮｕｔｒｉＳｔｅｍ培地のみのものとして、ＣｅｌｌＳｔａｒｔへの切り替えを伴うものである。２週間の培養後、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）は、一塩基多型（ＳＮＰ）系の異型接合性の欠損（ＬＯＨ）分析のために抽出し、これはＤＳＢ系のゲノム不安定性の正確な指標であることが、前に示されている（Ｂｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｃｅｌｌ，  １４５：  ４３５−４４６）。２つの条件（＋／−ｄＮ）間のＬＯＨのレベルを判定するために、前述の通り、アフィメトリクス社のＳＮＰ  ６．０  アレイを用いて分析を実施した（同上）。ｄＮの添加により、ゲノム不安定性の発生率が、ＬＯＨでアッセイしたところ、添加していない培地上で認められるものの２０％に低減した（図４）。４日間のｄＮ添加後のγＨ２Ａ．Ｘ陽性巣の顕著な減少に加えて（図３Ａ及び３Ｂ）、ＬＯＨの減少は、ｄＮ添加がｈＩＰＳＣリプログラミング及び培養における、複製ストレス及びそれに関連するゲノム不安定性を軽減する、という我々の仮説を支持する証拠を提供する。
【０１８７】
これまでの研究で、ゲノム不安定性をアッセイする定量化できる方法として、ＳＮＰ系ＬＯＨ測定の価値を強調する、ＤＳＢの発生とヒトがん細胞（同上）におけるＬＯＨの相関関係を証明してきたことに、留意すべきである。ｄＮ添加有りと無しでのＣＣストレスのｈＩＰＳＣにおける我々の研究において、ＣＣ誘発性ストレスに続く、ＬＯＨの軽減によってアッセイしたところ、ゲノム安定性が５倍増大したことを認めた。このことは、図４で見ることができ、１２ＬＯＨ染色体座が、ＣＣ系ストレス後に確認された。ｄＮ処理をしたｈＩＰＳＣ（赤の矢印で確認される）で認められたものより、ゲノム損傷を示す５倍のＬＯＨ遺伝子座が、未処理のｈＩＰＳＣ（緑の矢印で確認される）で認められた。このことは、ｄＮ添加がｈＩＰＳＣにおけるＣＣ誘発性のゲノム不安定性を改善することができる、という我々の仮説を支持する、強力な証拠を提供するものである。しかし、ＬＯＨ遺伝子座（青の矢印で確認される通り）の半分が、ｄＮ処理と未処理の両方のサンプル中で、依然として不安定なままであった。
【０１８８】
有効性が証明された一方で、ｄＮ添加の手順は、さらに最適化され得ると考えられる。これまでに生成されたデータは、我々及び他の研究者らが、一般的な培養及び導入ストレス後にｈＩＰＳＣ中に観察してきたゲノム不安定性において、ｄＮＴＰプールの欠乏が重要な意味を担う、という仮説を支持する。
【０１８９】
また、我々の予備的データは、臨床グレードのｈＩＰＳＣ及びその誘導体のゲノム安定性を向上するために、簡素かつ一般的に適用可能な培養培地のデオキシリボヌクレオシド添加の手順も提案する。
【０１９０】
要約すると、遺伝子的に安定な幹細胞及びｈＩＰＳＣ及び誘導体を維持することが可能な、当該最適化された培地システムを確立することが、安全性に役立ち、個別化された多能性幹細胞系治療学の有望な将来を患者のために開くであろう。
【０１９１】
実施例２
安定した幹ｄＮ濃度の入手
我々は、複数の異なるＳＴＡＢＬＥＳＴＥＭ（商標）濃度、１つは短期間培養（各ｄＮを３０μＭ）向け、１つは長期間培養（各ｄＮを５μＭ）向け、ならびにゲノム安定性を向上し、細胞機能を増大し、多細胞型を超えた分化の可能性の改善に強力であることを証明してきた好適な３０：３０：５：５混合物も、獲得してきた（例えば、表３を参照のこと）。
【０１９２】
【表３】
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【０１９３】
長期間のＳＴＡＢＬＥＳＴＥＭ（商標）培養培地添加は、ヒトｉＰＳ細胞が、少なくとも３週間分化することを可能にし、一方では、細胞が暴露されるゲノム損傷の量を劇的に軽減する（図７）。これは、γＨ２Ａ．Ｘ陽性の二重鎖の分解によって測定される。ｈＩＰＳＣリプログラミング及び培養の間のゲノム不安定性の原因は、不明瞭なままである。しかし、我々は迅速に分割するｈＩＰＳＣ中のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）プールは、ｈＩＰＳＣが由来する、皮膚細胞のｄＮＴＰプールよりも顕著に小さいということを最近見いだした。さらに、我々はデオキシリボヌクレオシド（ｄＮ）を幹細胞培養培地に添加することは、ｄＮＴＰプールを顕著に救出することが可能である、ということを見いだした（図６）。
【０１９４】
本明細書に記載されている実施例及び実施形態は、例証に過ぎず、その範囲内での種々の改良または変更は、当業者に対して示唆され、また、本出願の趣旨及び範囲内に、そして、添付された請求の範囲の範囲内に含まれるべきであることが、理解される。本明細書に引用した全ての出版物、特許、及び特許出願は、あらゆる目的のためにそれらの全てを参照することにより組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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