(57)【要約】  本発明は、様々なシアル酸含量を有するダルベポエチンアルファのアイソフォームの混合物からシアル酸含量が高いアイソフォームのみ選択的に分離するダルベポエチンアルファの精製方法に関する。本発明の方法は、生産適用が便利かつ簡便で新規なダルベポエチンアルファの精製方法であり、本発明により、ダルベポエチンアルファの大量生産時に、高純度のダルベポエチンアルファの収得はもとより、工程の効率改善による飛躍的な生産性の向上が可能である。
2016538261.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）様々なシアル酸含量を有するダルベポエチンアルファを含む混合物を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムにローディングしてダルベポエチンアルファをカラムに結合させるステップと、
（ｂ）アルギニン（Arginine）を含む洗浄緩衝液で前記クロマトグラフィーカラムを洗浄するステップと、
（ｃ）前記クロマトグラフィーカラムとの結合が維持されたダルベポエチンアルファをカラムから溶出するステップを含む、ダルベポエチンアルファの精製方法。
【請求項２】
前記（ｃ）ステップで溶出されたダルベポエチンアルファは、等電点がｐＨ２．０以上４．０以下である、請求項１に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
【請求項３】
前記アルギニンを含む洗浄緩衝液は、ｐＨ３．０以上５．０以下である、請求項１に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
【請求項４】
前記アルギニンを含む洗浄緩衝液は、アルギニンを含み、ＮａＣｌ及びウレア（Urea）からなる群から選択されるいずれか１つ以上をさらに含む、請求項１に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
【請求項５】
前記洗浄緩衝液は、５ｍＭ以上９０ｍＭ以下のＮａＣｌを含む、請求項４に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
【請求項６】
前記洗浄緩衝液は、３Ｍ以上８Ｍ以下のウレアを含む、請求項４に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
【請求項７】
前記（ｂ）ステップは、目的とする等電点を有するアイソフォーム（isoform）であるダルベポエチンアルファを得るために、目的とする等電点より高い等電点を有するダルベポエチンアイソフォームを洗浄することを特徴とする、請求項１に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
【請求項８】
前記（ｂ）ステップの前又は後に、アルギニンを含む又は含まない洗浄緩衝液で洗浄するステップをさらに含む、請求項１に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
【請求項９】
前記（ｂ）ステップの前に、ｐＨ６以上ｐＨ８以下の洗浄緩衝液で前記カラムを１次洗浄するステップをさらに含み、
前記（ｂ）ステップは、ｐＨ３以上ｐＨ５以下のアルギニンを含む洗浄緩衝液でカラムを２次洗浄するステップである、請求項１に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
【請求項１０】
前記１次洗浄するステップの洗浄緩衝液はリン酸ナトリウム溶液であり、
前記２次洗浄するステップの洗浄緩衝液はグリシン−ＨＣｌ溶液である、請求項９に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
【請求項１１】
前記生物学的流液は、酵母、植物細胞又は動物細胞の培養液である、請求項１に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
【請求項１２】
前記陰イオン交換クロマトグラフィーカラムを構成する樹脂の官能基が、Ｑ（Quaternary amine）、ＤＥＡＥ（DiEthylAminoEthyl）及びＱＡＥ（Quaternary Amino Ethyl）からなる群から選択されるいずれかである、請求項１に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
【請求項１３】
（ｄ）前記（ｃ）ステップで得られた陰イオン交換クロマトグラフィー溶出液をゲル濾過クロマトグラフィーにかけて分画するステップをさらに含む、請求項１に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
【請求項１４】
（ａ）ダルベポエチンアルファを含む生物学的流液を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけてダルベポエチンアルファを含む分画を溶出するステップと、
（ｂ）ステップ(ａ)で生成された溶出液を吸着クロマトグラフィーにかけてダルベポエチンアルファを含む分画を溶出するステップと、
（ｃ）ステップ(ｂ)で生成された溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムにローディングしてダルベポエチンアルファをカラムに結合させるステップと、
（ｄ）アルギニンを含む洗浄緩衝液でステップ（ｃ）における前記カラムを洗浄するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）における前記カラムとの結合が維持されたダルベポエチンアルファをカラムから溶出するステップを含む、ダルベポエチンアルファの精製方法。
【請求項１５】
前記吸着クロマトグラフィーの固定相はヒドロキシアパタイト樹脂である、請求項１４に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
【請求項１６】
（ｆ）前記（ｅ）ステップで得られた陰イオン交換クロマトグラフィー溶出液をゲル濾過クロマトグラフィーにかけて分画するステップをさらに含む、請求項１４に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
【請求項１７】
前記（ａ）ステップは、平衡化した陰イオン交換樹脂にダルベポエチンアルファを含む生物学的流液を加えて吸着させた後、０〜１００ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６〜８の洗浄緩衝液で洗浄し、次いで１００〜３００ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６〜８の溶出緩衝液でダルベポエチンアルファを含む分画を溶出するステップである、請求項１４に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
【請求項１８】
前記（ｂ）ステップは、平衡化したヒドロキシアパタイト樹脂に（ａ）ステップで回収された溶出液をローディングし、その後０〜１００ｍＭリン酸ナトリウムを含むｐＨ６〜８の洗浄緩衝液で洗浄し、次いでローディングと洗浄により樹脂に付着せずに流出した液からダルベポエチンアルファを含む分画を得るステップである、請求項１４に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、様々なシアル酸含量を有するダルベポエチンアルファのアイソフォームの混合物からシアル酸含量が高いアイソフォームのみ選択的に分離するダルベポエチンアルファの精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ダルベポエチンアルファ（Darbepoetin Alfa, NESP）とは、エリスロポエチン（ＥＰＯ）の分子内の５つのアミノ酸を置換することにより２つのＮ-糖鎖を付加したＥＰＯの類似体である（特許文献１参照）。ＥＰＯとは分子量、等電点などの生化学的特性が異なるが、ＥＰＯと同様に赤血球生成促進タンパク質である。
【０００３】
ダルベポエチンアルファは、シアル酸含量が高く、エリスロポエチンに比べてマウス、ラット、イヌ、ヒトなどにおいて血漿半減期が約３倍長いため（非特許文献１）、生体内分解が抑制されることにより、天然のＥＰＯより高い生物学的活性を有することが知られている。
【０００４】
ダルベポエチンアルファは、グリコシル化によるシアル酸含量の違いにより最大２２種のアイソフォーム（isoform）を有し、シアル酸含量が高いほど低い等電点を示し、高い治療的価値を有する。よって、シアル酸含量が高いアイソフォームのみ選択的に分離精製することは、ダルベポエチンアルファを用いるタンパク質治療分野において重要な課題である。
【０００５】
従来のＥＰＯ及びＥＰＯ類似体を精製する方法としては、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用（hydrophobic-interaction）、サイズ排除（size-exclusion）クロマトグラフィーなどが開示されている。具体的には、特許文献２に、疎水性相互作用、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを順次的に行うことによりＥＰＯを精製する方法が開示されている。特許文献３には、逆相クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを行うことにより組換えヒトＥＰＯを精製する方法が開示されている。
【０００６】
特に、ダルベポエチンアルファを精製する方法として、特許文献４には、陰イオン交換樹脂及びＣ４樹脂を用いる方法が開示されており、特許文献５には、等電点４．５以下のシアル酸含量が高いダルベポエチンアルファを精製するために、目的とするタンパク質が陽イオン交換樹脂のカラムに吸着することなくクロマトグラフィー処理溶液に流出するようにするフロースルー（flow through）工程が開示されている。しかし、前記方法においては、複数のステップで樹脂を用いるので、莫大なコスト及び時間を必要とし、大量生産に適用できないという欠点がある。
【０００７】
一方、特許文献６には、前記４ステップの工程より単純化された工程を実現するために、陰イオンクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーを順次的に行う３ステップの工程を採用し、等電点が低いアイソフォームを選択的に分離するために、２次陰イオン交換クロマトグラフィーを行う際に特定のｐＨ条件下で吸着及び洗浄を行う方法が開示されている。特に、低い等電点を有するアイソフォームを得るために、ｐＨ４．０〜５．０の条件でダルベポエチンアルファをカラムに吸着させた後、ｐＨ２．０〜２．４の緩衝液で洗浄する方法が開示されている。
【０００８】
前述したように提案された方法は、従来の工程より多少ステップが簡易化されているので大量生産工程に適用すると時間及びコスト面で有利ではあるが、前記特許文献が開示しているように、低いｐＨ（ｐＨ２．２〜２．４）条件を大量生産において実現するにはＨＣｌなどの有毒性の酸性溶液を大量に用いなければならないので、安全性の面で好ましくない。また、スケールアップ時にカラムの処理容量が増加すると、所定のｐＨ条件ではアイソフォームの反応が一定でないため、緩衝液のｐＨ条件を制御することにより所望の範囲の等電点を有するアイソフォームを得ることになるので、大量生産における再現性が低くなる。
【０００９】
すなわち、従来のダルベポエチンアルファの精製方法を用いると、複数のステップで樹脂を用いたクロマトグラフィーによる複雑な工程を経なければならないので、それによる莫大なコスト及び時間を必要とし、従来の工程ステップを少なくして精製すると、工程簡素化により減少する精製効果を補償するためにｐＨなどの精製条件を精密に制御しなければならず、生産規模が大きくなるほどその制御が困難になる。
【００１０】
よって、従来の精製方法より工程ステップが簡素でありながらも工程条件の制御が容易であり、大量生産に適用するとコスト及び時間が節約され、安定して好ましい工程条件を再現できる改善されたダルベポエチンアルファの精製方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００１／０７６６４０号
【特許文献２】国際公開第２０００／０２７８６９号
【特許文献３】国際公開第２００３／０４５９９６号
【特許文献４】国際公開第１９９５／００５４６５号
【特許文献５】国際公開第２０１０／００８８２３号
【特許文献６】韓国公開特許第１０−２０１３−００４２１０７号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Pedrazzoli P, Cinieri S, Lorusso V, Gamucci T, Secondino S, Silvestris N 2007 Nov-Dec,27(6C),4419-24;Anticancer Res.
【非特許文献２】Development and characterization of novel erythropoiesis stimulating protein (NESP), British Journal of Cancer (2001) 84 (Supplement 1), 3-10
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明者らは、従来の工程より簡素でありながらも工程制御が容易なダルベポエチンアルファの精製方法を開発すべく努力した。その結果、驚くべきことに、陰イオンとアルギニンを用いた簡易な工程でシアル酸含量が高いダルベポエチンアルファを短時間で分離できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、様々なシアル酸含量を有するダルベポエチンアルファのアイソフォームの混合物からシアル酸含量が高いダルベポエチンアルファを精製する方法を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法は、生産適用が便利かつ簡便で新規なダルベポエチンアルファの精製方法であり、本発明により、ダルベポエチンアルファの大量生産時に、高純度のダルベポエチンアルファの収得はもとより、工程の効率改善による飛躍的な生産性の向上が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】陰イオン交換クロマトグラフィー及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー精製により得られたダルベポエチンアルファの溶出液に対してＣ４ ＨＰＬＣにより純度を測定した結果である。
【図２】アルギニンを含むグリシン−ＨＣｌ緩衝液を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーのＩＥＦ結果である。
【図３】アルギニンを含む酢酸ナトリウム緩衝液を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーのＩＥＦ結果である。
【図４】アルギニンを含まないグリシン−ＨＣｌ緩衝液を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーのＩＥＦ結果である。
【図５】陰イオン交換クロマトグラフィーにより得られたダルベポエチンアルファの分画物に対してゲル濾過クロマトグラフィーを行った結果である。
【図６】図５の各分画別の等電点を示すＩＥＦ結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
前記目的を達成するために、本発明の一態様は、様々なシアル酸含量を有するダルベポエチンアルファのアイソフォームの混合物からダルベポエチンアルファを精製する方法を提供する。
【００１８】
具体的には、ダルベポエチンアルファの様々なアイソフォームの混合物からシアル酸含量が高いアイソフォームのみ選択的に分離するために、アルギニンを含む洗浄緩衝液で洗浄するステップを含む陰イオン交換クロマトグラフィーによりダルベポエチンアルファを精製する方法を提供する。
【００１９】
本発明によるダルベポエチンアルファを精製する方法は、いずれか１つ以上の陰イオン交換クロマトグラフィーを行うステップを含み、前記陰イオン交換クロマトグラフィーを行うステップは、ダルベポエチンアルファの様々なアイソフォームの混合物を陰イオン交換樹脂に結合させるステップと、アルギニンを含む緩衝液で前記樹脂を洗浄するステップと、クロマトグラフィーカラムからカラムに結合したダルベポエチンアルファを溶出するステップを含むことが好ましい。
【００２０】
本発明の好ましい一態様は、（ａ）様々なシアル酸含量を有するダルベポエチンアルファを含む混合物を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムにローディングしてダルベポエチンアルファをカラムに結合させるステップと、（ｂ）アルギニン（Arginine）を含む洗浄緩衝液で前記クロマトグラフィーカラムを洗浄するステップと、（ｃ）前記クロマトグラフィーカラムとの結合が維持されたダルベポエチンアルファをカラムから溶出するステップとを含む、ダルベポエチンアルファの精製方法であってもよい。
【００２１】
また、本発明の好ましい一態様は、（ａ）ダルベポエチンアルファを含む生物学的流液を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけてダルベポエチンアルファを含む分画を溶出するステップと、（ｂ）ステップ(ａ)で生成された溶出液をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにかけてダルベポエチンアルファを含む分画を溶出するステップと、（ｃ）ステップ(ｂ)で生成された溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムにローディングしてダルベポエチンアルファをカラムに結合させるステップと、（ｄ）アルギニンを含む洗浄緩衝液でステップ（ｃ）における前記カラムを洗浄するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）における前記カラムとの結合が維持されたダルベポエチンアルファをカラムから溶出するステップとを含む、ダルベポエチンアルファの精製方法であってもよい。
【００２２】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２３】
本発明における「ダルベポエチンアルファ（Darbepoetin alfa）」とは、糖タンパク質であるエリスロポエチン（erythropoietin, EPO）の組換え形態であり、エリスロポエチンの分子内の５つのアミノ酸を置換することにより２つのＮ糖鎖を付加した糖タンパク質である。エリスロポエチンとは分子量、等電点などの生化学的特性が異なる。ダルベポエチンアルファは、赤血球生成を誘導するので、腎不全又は癌の化学治療における貧血治療剤として用いられている。ダルベポエチンアルファは、糖鎖の付加によりエリスロポエチンに比べて血漿半減期が約３倍以上長くなっており、シアル酸含量によるアイソフォーム（isoform）が多様に存在する。ダルベポエチンアルファの糖鎖及びシアル酸含量が高いアイソフォームは低い等電点を有し、そのアイソフォームは生体内で高い生物学的活性を有する。よって、糖鎖及びシアル酸含量が高いアイソフォームのみ選択的に高純度で分離精製することは前記ダルベポエチンアルファを用いるタンパク質治療剤において重要な課題であるが、今でも従来の精製工程は複数のステップで樹脂を用いるため莫大なコスト及び時間を必要とするという問題があった。よって、本発明者らは、簡易な工程で所望の高度にグリコシル化されたダルベポエチンアルファのみ短時間で分離精製する方法を開発した。
【００２４】
ダルベポエチンアルファは、ＥＰＯに比べてグリコシル化の程度が高いので、１モル当たりのシアル酸含量が最大で１３モルにすぎないＥＰＯより１モル当たりのシアル酸含量が高く、その理論的最大値は２２モルであることが知られている（非特許文献２）。
【００２５】
特に、本発明の精製方法により分離精製されるダルベポエチンアルファは、糖鎖含量及びシアル酸含量が高いことを特徴とし、ｐＨ２．０〜４．０と低い等電点を有するアイソフォームを有するダルベポエチンアルファであることが好ましく、等電点が３．５以下であることがより好ましい。
【００２６】
本発明における「生物学的流液」とは、細胞、細胞構成要素又は細胞産物を含有するか、それらに由来する全ての培養液を意味し、これらに限定されるものではないが、細胞培養物、細胞培養上清、細胞溶解物、細胞抽出物、組織抽出物、血液、血漿、血清、乳、尿、それらの分画などが含まれる。本発明の精製方法においては、このような様々な形態の生物学的流液を用いることができる。酵母、植物細胞又は動物細胞の培養液であることが好ましく、ダルベポエチンアルファをコードするヌクレオチドが遺伝子組換え方式で形質転換された動物細胞培養液を用いることがより好ましく、前記動物細胞がＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）である動物細胞培養液であることがさらに好ましい。動物細胞培養液などを用いる場合は、当該分野で公知のように、培養液を遠心分離してその上清を用いることがさらに好ましい。
【００２７】
本発明の生物学的流液は、限外濾過法を用いたダイアフィルトレーションを行うことにより得ることが好ましい。前記限外濾過法を用いたダイアフィルトレーションにおいては、培養液中の１０，０００Ｍ．Ｗ．Ｃ．Ｏ．（Molecuar weight cut off）以下の低分子物質（例えば、界面活性剤（surfactant）、染料、低分子ペプチド(small peptide)、糖成分など）を除去するだけでなく、その後クロマトグラフィー平衡化緩衝液に緩衝液を交換することによりカラムの吸着効率を向上させることができる。
【００２８】
本発明の具体的な一実施例においては、ダルベポエチンアルファを含むベクターで形質転換されたＣＨＯ細胞を培養し、その後培養液の上清を限外濾過システム（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を用いる）によりダイアフィルトレーション（diafiltration）して生物学的流液として用いた。
【００２９】
本発明における「陰イオン交換クロマトグラフィー」とは、陽性に荷電した支持体に陰性に荷電した（又は酸性）分子を結合させることにより、分子をこれらの電荷に応じて分離する技法であり、分子の同族体（酸性、塩基性及び中性）はこの技法により容易に分離することができる。本発明の陰イオン交換クロマトグラフィーに用いる樹脂としては、強陰イオン交換樹脂と弱陰イオン交換樹脂を制限なく用いることができ、例えば、セファデックス、セファロース、ソース、モノ、ミニ（商品名，GE healthcare）などが挙げられ、これらに限定されるものではないが、前記樹脂の官能基がＱ（Quaternary amine）、ＤＥＡＥ（DiEthylAminoEthyl）、ＱＡＥ（Quaternary Amino Ethyl）などである樹脂を用いることができる。前記樹脂の官能基がＱ又はＤＥＡＥであるものが好ましく、強陰イオン交換樹脂であるＱ−セファロースを用いることが最も好ましい。
【００３０】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、カラムクロマトグラフィーで行うこともできる。商業的な製造においてはバッチモードを用いることが好ましい。また、本発明の陰イオン交換クロマトグラフィーに用いる陰イオン交換樹脂は、培養液を吸着させる前に水性緩衝液で平衡化してもよく、緩衝液としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、リン酸ナトリウム（sodium phosphate）緩衝液などを用いることができる。
【００３１】
また、本発明の陰イオン交換クロマトグラフィーに用いる陰イオン交換樹脂は、培養液を吸着させる前に水性緩衝液で平衡化してもよい。
【００３２】
本発明に用いられる吸着クロマトグラフィーの固定相には、シリカ、アルミナ、酸化マグネシウム及びヒドロキシアパタイトが含まれ、ヒドロキシアパタイトであることが最も好ましい。ヒドロキシアパタイトは、通常ＤＮＡなどの核酸の除去のために多く用いられることが知られている。
【００３３】
ダルベポエチンアルファの分画物から生物学的不純物を除去した後、様々なシアル酸含量のアイソフォームを含む前記ダルベポエチンアルファの分画物を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけることにより、シアル酸含量が高いダルベポエチンアルファを選択的に分離する。本発明の精製方法におけるアルギニンを含む洗浄緩衝液で洗浄するステップは、目的とする等電点を有するアイソフォーム（isoform）であるダルベポエチンアルファを得るために、目的とする等電点より高い等電点を有するダルベポエチンアイソフォームを洗浄することを特徴とするものであってもよい。
【００３４】
本発明の目的上、前記陰イオン交換クロマトグラフィーは、アルギニンを含む洗浄緩衝液を用いて洗浄する。
【００３５】
本発明におけるアルギニンを含む洗浄緩衝液は、ｐＨ３．０以上５．０以下のものであることが好ましく、また、アルギニンを含み、ＮａＣｌ及びウレア（Urea）からなる群から選択されるいずれか１つ以上をさらに含むものであることが好ましい。特に、前記洗浄緩衝液は、５ｍＭ以上９０ｍＭ以下のＮａＣｌを含み、かつ／又は３Ｍ以上８Ｍ以下のウレアを含むものであってもよい。
【００３６】
様々なシアル酸含量を有するダルベポエチンアルファを含む混合物を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムにローディングしてダルベポエチンアルファをカラムに結合させ、アルギニンを含む洗浄緩衝液で前記クロマトグラフィーカラムを洗浄する前又は後に、アルギニンを含む又は含まない洗浄緩衝液で洗浄するステップをさらに含むことが好ましく、アルギニンを含む洗浄緩衝液で前記クロマトグラフィーカラムを洗浄する前に、ｐＨ６以上ｐＨ８以下の洗浄緩衝液で前記カラムを１次洗浄するステップをさらに含み、アルギニンを含む洗浄緩衝液で前記クロマトグラフィーカラムを洗浄するステップは、ｐＨ３以上ｐＨ５以下のアルギニンを含む洗浄緩衝液でカラムを２次洗浄するステップであることがより好ましい。
【００３７】
前記洗浄するステップで用いる洗浄緩衝液としては、リン酸ナトリウム（sodium phosphate）緩衝液、酢酸ナトリウム（sodium acetate）緩衝液、クエン酸塩（citrate）緩衝液、グリシン−ＨＣｌ（glycin-HCl）緩衝液、クエン酸−リン酸ナトリウム（citric acid-sodium phosphate）緩衝液などを用いることができる。１次洗浄時の洗浄緩衝液はｐＨ６〜８のリン酸ナトリウム溶液であり、２次洗浄時の洗浄緩衝液はｐＨ３〜５のグリシン−ＨＣｌ溶液であり、目的とするｐＨの範囲や移動相のイオン強度を得るためにＮａＣｌ、Ｕｒｅａなどをさらに含むことがより好ましい。
【００３８】
前記アルギニンを含む洗浄緩衝液の適用は、シアル酸含量が低いダルベポエチンアルファを除去する重要な役割を果たす。図２は洗浄緩衝液としてアルギニンを含むグリシン−ＨＣｌを用いた場合のクロマトグラフィー結果を示す図であり、図３はアルギニンを含む酢酸ナトリウム緩衝液を用いた場合のクロマトグラフィー結果を示す図である。どちらの場合もシアル酸含量が高いダルベポエチンアルファが溶出することが確認された。すなわち、アルギニンを含むｐＨ緩衝液を用いた場合、２〜３の範囲の等電点を有する、シアル酸含量が高い高品質のダルベポエチンアルファが溶出し、特に等電点２前後に集中して溶出する（図２及び図３の矢印を参照）。
【００３９】
それに対して、他の条件は同一条件にして洗浄緩衝液内にアルギニンを含めない場合、ダルベポエチンアルファの分画物からシアル酸含量が低いアイソフォームが等電点３前後及び等電点３以上で多量に溶出し、ダルベポエチンアルファのアイソフォームに対する精製効果が著しく低下することが確認された（図４）。
【００４０】
アルギニンを含む洗浄緩衝液を用いて洗浄を行い、その後シアル酸含量が高いダルベポエチンアルファを溶出するステップでｐＨ６〜８の緩衝液を用いて段階塩勾配（stepwise salt gradient）により溶出させる。
【００４１】
他の実施形態として、本発明は、ゲル濾過（gel filtration）クロマトグラフィーをさらに用いてシアル酸含量が高いアイソフォームのみ選択的に分離するダルベポエチンアルファの精製方法を提供する。すなわち、前述したように得られた陰イオン交換クロマトグラフィー溶出液をゲル濾過クロマトグラフィーにかけて分画するステップをさらに含む精製方法である。
【００４２】
ゲル濾過（gel-filtration）クロマトグラフィーとは、タンパク質のサイズ（size）によりタンパク質を分離する方法であり、タンパク質重合体の分離に用いられる。本発明のゲル濾過（gel-filtration）クロマトグラフィーに用いる樹脂としては、セファデックス、セファロース、セファクリル（商品名：GE healthcare）などを用いることができ、セファクリルＳ−１００、Ｓ−２００、Ｓ−３００を用いることが最も好ましい。
【００４３】
前記アルギニンを含む洗浄緩衝液を用いた陰イオンクロマトグラフィーにより得られた溶出液をゲル濾過（gel-filtration）クロマトグラフィーにさらにかけることにより、一層高いシアル酸含量と９９％以上の純度を有するダルベポエチンアルファを溶出させることができる。
【００４４】
まず、ゲル濾過クロマトグラフィーを緩衝液で十分に平衡化した後、平衡化したゲル濾過クロマトグラフィーに、アルギニンを含む洗浄緩衝液を用いた陰イオンクロマトグラフィーから得られた溶出液をローディングして分画することにより、目的とする等電点を有する溶出液を得ることができる。分画の順に、すなわち先に溶出する分画におけるシアル酸含量が高い。
【００４５】
本発明の具体的な一実施例においては、約１．７ＬのセファクリルＳ−１００〜２００（GE Healthcare社）樹脂をＸＫ−５０／９０カラム（GE Healthcare社）に充填し、１４０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．２）を十分に流してゲル濾過カラムを平衡化した。よって、ダルベポエチンアルファを含む溶液を濃縮して約６０ｍｌを７．５ｍｌ／ｍｉｎの流速でカラムに流した後、１４０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．２）を十分に流してシアル酸含量が高いダルベポエチンアルファを含む溶出液を分画した（図５）。溶出液分画の順にダルベポエチンアルファのシアル酸含量が高いことが確認された（表１及び図６）。
【００４６】
本発明の他の態様は、（ａ）ダルベポエチンアルファを含む生物学的流液を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけてダルベポエチンアルファを含む分画を溶出するステップと、（ｂ）ステップ(ａ)で生成された溶出液をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにかけてダルベポエチンアルファを含む分画を溶出するステップと、（ｃ）ステップ(ｂ)で生成された溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムにローディングしてダルベポエチンアルファをカラムに結合させるステップと、（ｄ）アルギニンを含む洗浄緩衝液でステップ（ｃ）における前記カラムを洗浄するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）における前記カラムとの結合が維持されたダルベポエチンアルファをカラムから溶出するステップとを含む、ダルベポエチンアルファの精製方法であってもよい。
【００４７】
以下、前記各ステップを具体的に説明する。
【００４８】
（ａ）ステップは、ダルベポエチンアルファを含む生物学的流液を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけてダルベポエチンアルファを含む分画を溶出するステップであり、平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムにダルベポエチンアルファを含む生物学的流液を加えて吸着させ、その後１０〜１００ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６〜８の洗浄緩衝液で洗浄し、次いで１００〜３００ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６〜８の溶出緩衝液でダルベポエチンアルファを含む分画を溶出するステップであることが好ましい。
【００４９】
本発明の陰イオン交換クロマトグラフィー及び当該カラムを構成する樹脂は前述した通りである。
【００５０】
本発明の具体的な一実施例においては、ダルベポエチンアルファを含むベクターで形質転換されたＣＨＯ細胞からダルベポエチンアルファを発現させて得た培養液約１Ｌを１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）により限外濾過システム（分子量カットオフ１０，０００）を用いてダイアフィルトレーション（diafiltration）した生物学的流液を、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した陰イオン交換（Q fast flow, GE Healthcare社）樹脂が充填されたＸＫ−５０カラムにローディングした後、再び１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を約２ＣＶ（column volume）流してカラムを平衡化した。その後、０〜１００ｍＭ ＮａＣｌを含む洗浄緩衝液で洗浄し、次いで１００〜３００ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６〜８の溶出緩衝液で溶出した。前記陰イオン交換クロマトグラフィーを行うと、生物学的由来の不純物が除去され、多量のダルベポエチンアルファを含む溶液に精製されることがＲＰ−ＨＰＬＣにより確認された（図１のＢ）。
【００５１】
（ｂ）ステップは、平衡化した吸着クロマトグラフィーの固定相、より好ましくはヒドロキシアパタイト樹脂に（ａ）ステップで回収された溶出液をローディングし、その後０〜１００ｍＭリン酸ナトリウムを含むｐＨ６〜８の洗浄緩衝液で洗浄し、次いでローディングと洗浄により樹脂に吸着せずに流出した液からダルベポエチンアルファを含む分画を得るステップであってもよい。
【００５２】
本発明に用いられる吸着クロマトグラフィーの固定相には、シリカ、アルミナ、酸化マグネシウム及びヒドロキシアパタイトが含まれ、ヒドロキシアパタイトであることが最も好ましい。本発明における「ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー」又は「ヒドロキシアパタイト樹脂クロマトグラフィー」とは、ヒドロキシアパタイト樹脂が充填された固定相を有する吸着クロマトグラフィーを意味し、「ヒドロキシアパタイトカラム」と混用される。
【００５３】
前記各洗浄及び溶出ステップで用いる緩衝液としては、リン酸ナトリウム（sodium phosphate）緩衝液、リン酸カリウム（potassium phosphate）緩衝液又はトリス（Tris）緩衝液を用いることが好ましい。
【００５４】
本発明の具体的な一実施例においては、陰イオン交換樹脂溶出液を、７ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したヒドロキシアパタイト樹脂が充填されたＸＫ−５０カラムにローディングした後、約３カラム容量の７ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を流し、糖鎖が多く付着したダルベポエチンアルファを溶出した。前記ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの結果、生物学的由来の不純物が除去され、多量のダルベポエチンアルファを含む溶液に精製されることがＲＰ−ＨＰＬＣにより確認された（図１のＣ）。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は本発明を例示するためのものにすぎず、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５６】
陰イオン交換クロマトグラフィー及びヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィーによる様々なシアル酸含量を有するダルベポエチンアルファアイソフォームの混合物の収得
ダルベポエチンアルファを含むベクターで形質転換されたＣＨＯ細胞からダルベポエチンアルファを発現させて得た培養液約１Ｌを１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）により限外濾過システム（分子量カットオフ１０，０００）を用いてダイアフィルトレーション（diafiltration）した。これを陰イオン交換クロマトグラフィー及びヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィーを用いて、２つのカラムに順次的にローディングした。
【００５７】
まず、陰イオン交換クロマトグラフィーは、具体的に次のように行った。約１００ｍｌの陰イオン交換（Q fast flow, GE Healthcare社）樹脂をＸＫ−５０カラム（GE Healthcare社）に充填し、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を十分に流してカラムを平衡化した。準備したＱセファローズＦＦカラムに前記ダイアフィルトレーション液を約０．１〜０．２リットルを１５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した後、再び１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を約２ＣＶ（column volume）流してカラムを平衡化した。その後、１０〜１００ｍＭ ＮａＣｌを含む洗浄緩衝液で洗浄し、次いで１００〜３００ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ６〜８の溶出緩衝液で溶出した。
【００５８】
前記陰イオン交換クロマトグラフィーを行った溶出液に対するヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィーは、具体的に次のように行った。約１００ｍｌのヒドロキシアパタイト（GE Healthcare社）樹脂をＸＫ−５０カラム（GE Healthcare社）に充填し、７ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を十分に流してカラムを平衡化した。準備したヒドロキシアパタイトカラムに前記ダイアフィルトレーション液を約０．１リットルを１０ｍｌ／ｍｉｎの流速で流し、その後再び７ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を約３ＣＶ（column volume）流した。
【００５９】
ここで、ローディングと洗浄により樹脂に吸着せずに流出した溶液にはシアル酸含量が様々なダルベポエチンアルファが含まれているので、この溶液を回収して次の工程を行った。洗浄後、０．１〜０．７Ｍリン酸カリウム（potassium phosphate）ｐＨ７の緩衝液を樹脂に流して糖鎖が少ないダルベポエチンアルファ及び不純物を含有する分画を溶出させることにより、樹脂から除去した。生物学的由来の不純物が除去され、多量のダルベポエチンアルファを含む溶液に精製されることがＲＰ−ＨＰＬＣにより確認された（図１）。
【実施例２】
【００６０】
陰イオン交換クロマトグラフィーにアルギニンを用いて洗浄する方法によるシアル酸含量が高いダルベポエチンアルファの精製
約２０ｍｌのＱセファローズＦＦ（GE Healthcare社）樹脂をＸＫ−２６カラム（GE Healthcare社）に充填し、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を十分に流してカラムを平衡化した。
【００６１】
前記実施例１で得られたダルベポエチンアルファを含む溶液を約０．２リットルを５ｍｌ／ｍｉｎの流速でカラムに流した後、再び平衡化緩衝液である１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を約２ＣＶ（column volume）流してカラムを平衡化した。その後、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で１次洗浄し、次いでウレア、アルギニン、ＮａＣｌを含むｐＨ３〜５以下のグリシン−ＨＣｌ緩衝液で２次洗浄することにより、シアル酸含量が低いダルベポエチンアルファを含有する分画を洗浄した。グリコシル化の程度が大きく等電点が低いダルベポエチンアルファのみ含有するタンパク質は、１９０ｍＭ ＮａＣｌを含むリン酸ナトリウム（ｐＨ６．２）緩衝液を用いて溶出した。この洗浄過程による高品質のダルベポエチンアルファはＩＥＦにより確認された（図２）。
【実施例３】
【００６２】
アルギニンを含む洗浄液がシアル酸含量に及ぼす影響の測定
前記実施例２におけるアルギニンを用いる洗浄方法は、シアル酸含量が高いダルベポエチンアルファを精製する上で重要な要素となることが下記実施例により確認された。
【００６３】
実施例２と同様に、前記実施例１で得られたダルベポエチンアルファを含む溶液をＱセファローズＦＦに吸着させた後、再び平衡化緩衝液である１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を約２ＣＶ（column volume）流してカラムを１次洗浄した。ただし、２次洗浄の際に、実施例２とは異なり、グリシン−ＨＣｌ緩衝液の代わりにｐＨ３〜５の酢酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。溶出させた結果、等電点が２〜３のシアル酸含量が高いダルベポエチン含量が得られることが確認された（図３の矢印）。
【００６４】
さらに他の実施形態として、実施例２と同様に１次洗浄及び２次洗浄を行うものの、アルギニンを投入せずに２次洗浄を行った。溶出させた結果、等電点が２〜３以上のシアル酸含量が低いダルベポエチンまで溶出し、品質が著しく低下することが確認された（図４の矢印）。
【００６５】
この実施例により、アルギニンは低い等電点のシアル酸ダルベポエチンアルファを得る重要な要素であることが確認された。
【実施例４】
【００６６】
ゲル濾過クロマトグラフィーを用いたシアル酸含量が高いダルベポエチンの精製
約１．７ＬのセファクリルＳ−１００〜２００（GE Healthcare社）樹脂をＸＫ−５０／９０カラム（GE Healthcare社）に充填し、１４０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．２）を十分に流してカラムを平衡化した。
【００６７】
前記実施例２で得られたダルベポエチンアルファを含む溶液を濃縮して約５ｍｌを７．５ｍｌ／ｍｉｎの流速でカラムに流し、その後１４０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．２）を十分に流してシアル酸含量が高いダルベポエチンアルファを含む溶出液を分画した（図５）。溶出液分画の順にダルベポエチンアルファのシアル酸含量が高いことが確認された（表１及び図６）。各分画のシアル酸含量を示すＷａｘ−ＨＰＬＣの結果は表１の通りである。
【００６８】
【表１】
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【００６９】
前記結果をまとめると、陰イオン交換カラムを用いた場合は、アルギニンを含む緩衝液を用いて洗浄過程を行うことにより、シアル酸含量が高いダルベポエチンアルファを精製できることが確認され、また、その後ゲル濾過クロマトグラフィーをさらに行って分画した結果、高純度のシアル酸含量が高いダルベポエチンアルファを精製できたので、本発明の精製方法を用いて高純度のシアル酸含量が高いダルベポエチンアルファを精製できることが確認された。
【００７０】
以上の説明から、本発明に属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、明細書ではなく特許請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態を含むものであると解釈すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年4月21日(2016.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
前記（ｃ）ステップで溶出されたダルベポエチンアルファは、等電点がｐＩ２．０以上４．０以下である、請求項１に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
特に、本発明の精製方法により分離精製されるダルベポエチンアルファは、糖鎖含量及びシアル酸含量が高いことを特徴とし、ｐＩ２．０〜４．０と低い等電点を有するアイソフォームを有するダルベポエチンアルファであることが好ましく、等電点が３．５以下であることがより好ましい。
【国際調査報告】
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