(57)【要約】  本発明は、ＴＷＥＡＫＲ（ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、ＦＮ１４）に対して特異的な組換え抗原結合領域ならびにこのような抗原結合領域を含有する抗体および機能的断片を提供する。したがって、前記抗体は、ＴＷＥＡＫＲの発現に関連する腫瘍ならびに他の障害および症状を治療するために使用され得る。本発明はまた、上記抗体をコードする核酸配列、これを含有するベクター、医薬組成物、および使用説明書を含むキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１６９に示されるＴＷＥＡＫＲの４７位のＤ（Ｄ４７）に特異的に結合する、単離された抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
抗体がアゴニスト抗体である、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
（ａ）式ＰＹＰＭＸ（配列番号：１７１）（式中、Ｘは、ＩまたはＭである）を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）式ＹＩＳＰＳＧＧＸＴＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号：１７２）（式中、Ｘは、ＳまたはＫである）を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖ＣＤＲ２；および
（ｃ）式ＧＧＤＴＹＦＤＹＦＤＹ（配列番号：１７３）を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖ＣＤＲ３
を含む可変重鎖と、
（ａ）式ＲＡＳＱＳＩＳＸＹＬＮ（配列番号：１７４）（式中、Ｘは、ＧまたはＳである）を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）式ＸＡＳＳＬＱＳ（配列番号：１７５）（式中、Ｘは、Ｑ、ＡまたはＮである）を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｃ）式ＱＱＳＹＸＸＰＸＩＴ（配列番号：１７６）（式中、５位のＸは、ＴまたはＳであり、６位のＸは、ＴまたはＳであり、８位のＸは、ＧまたはＦである）を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖ＣＤＲ３
を含む可変軽鎖とを含む、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
ａ．配列番号：６によって示される可変重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：７によって示される可変重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：８によって示される可変重鎖ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号：３によって示される可変軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：４によって示される可変軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：５によって示される可変軽鎖ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖、または
ｂ．配列番号：１６によって示される可変重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：１７によって示される可変重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：１８によって示される可変重鎖ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号：１３によって示される可変軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：１４によって示される可変軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：１５によって示される可変軽鎖ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖、または
ｃ．配列番号：２６によって示される可変重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：２７によって示される可変重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：２８によって示される可変重鎖ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号：２３によって示される可変軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：２４によって示される可変軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：２５によって示される可変軽鎖ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖、または
ｄ．配列番号：３６によって示される可変重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：３７によって示される可変重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：３８によって示される可変重鎖ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号：３３によって示される可変軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：３４によって示される可変軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：３５によって示される可変軽鎖ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖、または
ｅ．配列番号：４６によって示される可変重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：４７によって示される可変重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：４８によって示される可変重鎖ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号：４３によって示される可変軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：４４によって示される可変軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：４５によって示される可変軽鎖ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖、または
ｆ．配列番号：５６によって示される可変重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：５７によって示される可変重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：５８によって示される可変重鎖ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号：５３によって示される可変軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：５４によって示される可変軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：５５によって示される可変軽鎖ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖、または
ｇ．配列番号：６６によって示される可変重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：６７によって示される可変重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：６８によって示される可変重鎖ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号：６３によって示される可変軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：６４によって示される可変軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：６５によって示される可変軽鎖ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖、または
ｈ．配列番号：７６によって示される可変重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：７７によって示される可変重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：７８によって示される可変重鎖ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号：７３によって示される可変軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：７４によって示される可変軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：７５によって示される可変軽鎖ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖、または
ｉ．配列番号：８６によって示される可変重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：８７によって示される可変重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：８８によって示される可変重鎖ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号：８３によって示される可変軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：８４によって示される可変軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：８５によって示される可変軽鎖ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖、または
ｊ．配列番号：９６によって示される可変重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：９７によって示される可変重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：９８によって示される可変重鎖ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号：９３によって示される可変軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：９４によって示される可変軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：９５によって示される可変軽鎖ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖、または
ｋ．配列番号：１０６によって示される可変重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：１０７によって示される可変重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：１０８によって示される可変重鎖ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号：１０３によって示される可変軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：１０４によって示される可変軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：１０５によって示される可変軽鎖ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖、または
ｌ．配列番号：１１６によって示される可変重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：１１７によって示される可変重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：１１８によって示される可変重鎖ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号：１１３によって示される可変軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：１１４によって示される可変軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：１１５によって示される可変軽鎖ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖
を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
ａ．配列番号：１０によって示される可変重鎖配列、および配列番号：９によって示される可変軽鎖配列、または
ｂ．配列番号：２０によって示される可変重鎖配列、および配列番号：１９によって示される可変軽鎖配列、または
ｃ．配列番号：３０によって示される可変重鎖配列、および配列番号：２９によって示される可変軽鎖配列、または
ｄ．配列番号：４０によって示される可変重鎖配列、および配列番号：３９によって示される可変軽鎖配列、または
ｅ．配列番号：５０によって示される可変重鎖配列、および配列番号：４９によって示される可変軽鎖配列、または
ｆ．配列番号：６０によって示される可変重鎖配列、および配列番号：５９によって示される可変軽鎖配列、または
ｇ．配列番号：７０によって示される可変重鎖配列、および配列番号：６９によって示される可変軽鎖配列、または
ｈ．配列番号：８０によって示される可変重鎖配列、および配列番号：７９によって示される可変軽鎖配列、または
ｉ．配列番号：９０によって示される可変重鎖配列、および配列番号：８９によって示される可変軽鎖配列、または
ｊ．配列番号：１００によって示される可変重鎖配列、および配列番号：９９によって示される可変軽鎖配列、または
ｋ．配列番号：１１０によって示される可変重鎖配列、および配列番号：１０９によって示される可変軽鎖配列、または
ｌ．配列番号：１２０によって示される可変重鎖配列、および配列番号：１１９によって示される可変軽鎖配列
を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
ＩｇＧ抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
ａ．配列番号：２によって示される重鎖配列、および配列番号：１によって示される軽鎖配列、または
ｂ．配列番号：１２によって示される重鎖配列、および配列番号：１１によって示される軽鎖配列、または
ｃ．配列番号：２２によって示される重鎖配列、および配列番号：２１によって示される軽鎖配列、または
ｄ．配列番号：３２によって示される重鎖配列、および配列番号：３１によって示される軽鎖配列、または
ｅ．配列番号：４２によって示される重鎖配列、および配列番号：４１によって示される軽鎖配列、または
ｆ．配列番号：５２によって示される重鎖配列、および配列番号：５１によって示される軽鎖配列、または
ｇ．配列番号：６２によって示される重鎖配列、および配列番号：６１によって示される軽鎖配列、または
ｈ．配列番号：７２によって示される重鎖配列、および配列番号：７１によって示される軽鎖配列、または
ｉ．配列番号：８２によって示される重鎖配列、および配列番号：８１によって示される軽鎖配列、または
ｊ．配列番号：９２によって示される重鎖配列、および配列番号：９１によって示される軽鎖配列、または
ｋ．配列番号：１０２によって示される重鎖配列、および配列番号：１０１によって示される軽鎖配列、または
ｌ．配列番号：１１２によって示される重鎖配列、および配列番号：１１１によって示される軽鎖配列
を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’断片またはＦ（ａｂ’）２断片である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗原結合断片。
【請求項９】
モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１０】
ヒト抗体、ヒト化抗体もしくはキメラ抗体または抗原結合断片である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１１】
請求項１〜１０に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、抗体−薬物複合体。
【請求項１２】
請求項１〜１０に記載の抗体または抗原結合断片をコードする、単離された核酸配列。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸配列を含む、ベクター。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片を発現し、ならびに／または請求項１２に記載の核酸もしくは請求項１３に記載のベクターを含む、単離された細胞。
【請求項１５】
前記細胞が原核細胞または真核細胞である、請求項１４に記載の単離された細胞。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片を生産する方法であって、請求項１５に記載の細胞を培養すること、および前記抗体または抗原結合断片を精製することを含む、方法。
【請求項１７】
医薬として使用するための、請求項１〜１０に記載の抗体もしくは抗原結合断片または請求項１１に記載の抗体−薬物複合体。
【請求項１８】
診断剤として使用するための、請求項１〜１０に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１９】
癌を治療するための医薬として使用するための、請求項１〜１０に記載の抗体もしくは抗原結合断片または請求項１１に記載の抗体−薬物複合体。
【請求項２０】
請求項１〜１０に記載の抗体もしくは抗原結合断片または請求項１１に記載の抗体−薬物複合体を含む、医薬組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の医薬組成物と、１つ以上の治療的に活性な化合物との組み合わせ。
【請求項２２】
ＴＷＥＡＫＲの望ましくない存在に関連する障害または症状を治療するための方法であって、有効量の請求項２０に記載の医薬組成物または請求項２１に記載の組み合わせを、該治療を必要とする被験体に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＷＥＡＫＲ（ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、ＦＮ１４）に対して特異的な組換え抗原結合領域ならびにこのような抗原結合領域を含有する抗体および機能的断片を提供する。
【０００２】
したがって、本抗体は、ＴＷＥＡＫＲの発現に関連する腫瘍ならびに他の障害および症状を治療するために使用することができる。本発明はまた、上記抗体をコードする核酸配列、これを含有するベクター、医薬組成物、および使用説明書を含むキットを提供する。
【背景技術】
【０００３】
抗体ベースの治療法は、固形腫瘍を含む様々な癌の治療に極めて有効であることが判明しつつある。例えば、ハーセプチン（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））は乳癌の治療に使用されて成功を収めており、リツキサン（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））はＢ細胞関連癌タイプに有効である。奏効する新規な抗体ベースの治療法の開発において中核を成すのは、腫瘍細胞上に優先的に発現することが見出された細胞表面タンパク質に対する抗体の単離である。
【０００４】
Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）ｌｉｋｅ  ｗｅａｋ  ｉｎｄｕｃｅｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ（ＴＷＥＡＫ）およびＴＷＥＡＫ受容体（ＴＷＥＡＫＲ、エイリアスＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、ＦＮ１４、ＣＤ２６６；Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｑ９ＮＰ８４、ＮＰ＿０５７７２３）は、炎症、増殖、浸潤、遊走、分化、アポトーシスおよび血管新生に関与するＴＮＦスーパーファミリーリガンド−受容体のペアである（Ｗｉｎｋｌｅｓ  ＪＡ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２００８  Ｍａｙ；７（５）：４１１−２５；Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ  ＪＳ  ａｎｄ  Ｂｕｒｋｌｙ  ＬＣ，Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２００９；４９：１４５−６０）。ＴＷＥＡＫは、０．８〜２．４ｎＭの親和性でＴＷＥＡＫＲに結合し、この受容体に結合する唯一のＴＮＦファミリーメンバーである（Ｗｉｌｅｙ  ＳＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００１  Ｎｏｖ；１５（５）：８３７−４６）。ＴＷＥＡＫＲは、正常組織では比較的低レベルで発現しているが、それが組織リモデリングにおいて役割を果たす損傷組織では、局所的に著しく増加している（Ｗｉｎｋｌｅｓ  ＪＡ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２００８  Ｍａｙ；７（５）：４１１−２５；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２０１１  Ｊｕｌ；１０（７）：１２７６−８８；Ｂｕｒｋｌｙ  ＬＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２０１１  Ｎｏｖ；２４４（１）：９９−１１４）。ＴＷＥＡＫＲシグナル伝達は、創傷治癒、慢性自己免疫疾患および急性虚血性脳卒中のようなプロセスに関与する（Ｂｕｒｋｌｙ  ＬＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２０１１  Ｎｏｖ；２４４（１）：９９−１１４）。加えて、様々な種類の固形腫瘍、例えば膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、乳癌、腎臓癌、頭頸部癌、食道癌、膀胱癌、肝細胞癌、卵巣癌、黒色腫ならびに肝臓および骨転移では、ＴＷＥＡＫＲは高発現している（Ｃｕｌｐ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１０  Ｊａｎ  １５；１６（２）：４９７−５０８；Ｚｈｏｕ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１３  Ａｐｒ；１３３（４）：１０５２−６２）。脳癌（Ｔｒａｎ  ＮＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６  Ｏｃｔ  １；６６（１９）：９５３５−４２）、乳癌（Ｗｉｌｌｉｓ  ＡＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８  Ｍａｙ；６（５）：７２５−３４；Ｗａｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．２０１３  Ｊａｎ  ９［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］）、食道癌（Ｗａｔｔｓ  ＧＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００７  Ｎｏｖ  １５；１２１（１０）：２１３２−９  ２００７）、前立腺癌（Ｈｕａｎｇ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．２０１１  Ｎｏｖ；３２（１１）：１５８９−９６）、胃癌（Ｋｗｏｎ  ＯＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２０１２  Ｊａｎ  １；３１４（１）：７３−８１）、神経芽細胞腫（Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ．２０１３  Ａｐｒ；４２（４）：１２３９−４８）および膀胱癌（Ｓｈｉｍａｄａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１２  Ｏｃｔ  １；１８（１９）：５２４７−５５）では、ＴＷＥＡＫＲの発現の増加と高い腫瘍悪性度および／または予後不良との関連が示されている。
【０００５】
ＴＷＥＡＫＲの発現は、ＦＧＦ、ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦのような成長因子によって誘導される（Ｗｉｎｋｌｅｓ  ＪＡ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２００８  Ｍａｙ；７（５）：４１１−２５）。この観察と一致して、ＴＷＥＡＫＲの発現は、ＮＳＣＬＣでは、ＥＧＦＲの過剰発現または活性化と相関することが示されており（Ｗｈｉｔｓｅｔｔ  ＴＧ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２０１２  Ｊｕｌ；１８１（１）：１１１−２０）、乳癌では、ＨＥＲ２の発現と相関することが示されている（Ｗａｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．２０１３  Ｊａｎ  ９［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］；Ｃｈａｏ  ＤＴ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０１３  Ｆｅｂ；１３９（２）：３１５−２５）。
【０００６】
ＴＷＥＡＫによってＴＷＥＡＫＲが活性化されると、ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）が細胞内結合ドメインに動員され、標準的および非標準的なＮＦ−κＢ経路によりＮＦ−κＢが長期に活性化され、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１のようなサイトカイン分泌が誘導される（Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ  ＪＳ  ａｎｄ  Ｂｕｒｋｌｙ  ＬＣ，Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２００９；４９：１４５−６０に概説されている）。これは、ＴＷＥＡＫ／ＴＷＥＡＫＲ経路の説明されている炎症促進的な役割によく一致する。しかしながら、ＴＷＥＡＫＲは特徴的な「デスドメイン」を欠くので、ＴＷＥＡＫＲを介した細胞殺傷に関与するシグナル伝達経路は不明確である。いくつかの腫瘍細胞株（Ｋｙｍ−１、ＳＫＯＶ−３、ＯＶＣＡＲ）では、それは、ＴＮＦを介したアポトーシスおよびＴＲＡＦ２の動員を誘導し、続いて、その結果生じたＴＲＡＦ２−ｃＩＡＰ複合体がリソソーム分解される（Ｎａｋａｙａｍａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２  Ｊａｎ  １５；１６８（２）：７３４−４３；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９  Ｊｕｎ；２９（６）：１７８５−９２；Ｖｉｎｃｅ  ＪＥ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００８  Ｊｕｌ  １４；１８２（１）：１７１−８４）。他の細胞株（ＨＳＣ３、ＨＴ−２９、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ）では、ＴＷＥＡＫ誘導性アポトーシスは、ＴＮＦ非依存性であると報告されている（Ｎａｋａｙａｍａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３  Ｊａｎ  １；１７０（１）：３４１−８；Ｗｉｌｓｏｎ  ＣＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２００２  Ｄｅｃ；９（１２）：１３２１−３３）。最近の報告では、ＪＡＫ阻害剤による処理が、ＷｉＤｒ細胞におけるカスパーゼ３／７活性化を増加させるＴＷＥＡＫの能力を無効化したので、ＴＷＥＡＫによるアポトーシスの誘導は、Ｓｔａｔ−１リン酸化の刺激に依存することが示された（Ｃｈａｐｍａｎ  ＭＳ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ．２０１３  Ｊａｎ；６１（１）：２１０−７）。
【０００７】
いくつかの研究は、腫瘍学的標的としてＴＷＥＡＫＲが検証された。Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎらは、ＴＷＥＡＫの投与が、マウス異種移植モデルにおける腫瘍成長を軽減することを示した（Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ  ＪＳ  ｅｔ  ａｌ，ＭＡｂｓ．２０１１  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；３（４）：３６２−７５）。いくつかのグループが、アゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体を用いて、この抗腫瘍効果を模倣した。マウスの免疫化とそれに続くクローン選択およびヒト化によって、潜在的な薬物候補（すなわち、ＢＩＩＢ００３６／Ｐ４Ａ８（Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ  ＪＳ  ｅｔ  ａｌ，ＭＡｂｓ．２０１１  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；３（４）：３６２−７５）およびＰＤＬ−１９２（Ｃｕｌｐ  ＰＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１０  Ｊａｎ  １５；１６（２）：４９７−５０８））が作製されている。
【０００８】
ＰＤＬ−１９２は、５．５ｎＭの結合親和性でＴＷＥＡＫＲに結合し（Ｃｕｌｐ  ＰＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１０  Ｊａｎ  １５；１６（２）：４９７−５０８）、いくつかのＴＷＥＡＫＲ発現癌細胞株の成長を阻害する。しかし、ＥＣ／ＩＣ５０に関する増殖およびアポトーシスアッセイでは、ＴＷＥＡＫリガンドと比較して、ＰＤＬ−１９２は効力が弱いことが示されており、低いカスパーゼ３／７活性化効果（Ｖｍａｘ）を達成したに過ぎなかった（Ｃｕｌｐ  ＰＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１０  Ｊａｎ  １５；１６（２）：４９７−５０８）。より大規模な乳癌細胞株パネルのプロファイリングにより、単量体ＰＤＬ−１９２の抗増殖活性がごくわずかであることが確認され（Ｃｕｌｐ  ＰＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１０  Ｊａｎ  １５；１６（２）：４９７−５０８；Ｃｈａｏ  ＤＴ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０１３  Ｆｅｂ；１３９（２）：３１５−２５）、２０％超の増殖阻害で反応する細胞株は、２７種のうちのわずか５種であった。抗体の抗増殖活性は、抗体の架橋または固定化によってわずかに増強される。加えて、ＰＤＬ−１９２はＡＤＣＣを示すので、異種移植モデルで示された抗腫瘍活性は、ＡＤＣＣおよび腫瘍細胞成長阻害効果が合わさったものであると考えられる（Ｃｕｌｐ  ＰＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１０  Ｊａｎ  １５；１６（２）：４９７−５０８）。ＰＤＬ−１９２のさらなる限界は、種交差反応性（特に、マウスおよびラット）の欠如であり、例えば、毒性研究のような一般的な前臨床試験による評価が不可能である。
【０００９】
薬物候補として説明されている第２のアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体ＢＩＩＢ０３６／Ｐ４Ａ８は、内因性リガンドＴＷＥＡＫと同程度の１．７ｎＭの親和性でＴＷＥＡＫに結合する（Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ  ＪＳ  ｅｔ  ａｌ，ＭＡｂｓ．２０１１  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；３（４）：３６２−７５）。この抗体は、癌細胞においてＮＦ−κＢの活性化およびサイトカイン放出を誘導することが示されているが、有効性は、Ｆｃ−ＴＷＥＡＫ（これは、組換え可溶性ＴＷＥＡＫと同様の活性を有する可溶性ＴＷＥＡＫのｈＩｇＧ１  Ｆｃ融合物（ａａ１０６〜２４９）である）と比較して有意に低い（Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ  ＪＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００５  Ａｐｒ  １４；２４（１６）：２６１３−２４）。抗体で細胞を処理した後のＴＵＮＥＬ染色（ＢＩＩＢ０３６／Ｐ４Ａ８の効力も、Ｆｃ−ＴＷＥＡＫと比較して有意に減少している）で示されるように、細胞増殖アッセイおよびアポトーシス誘導についても同じことが言える。抗増殖活性は、抗体の多量化後に増加するが、多量体型は依然として、組換えＦｃ−ＴＷＥＡＫと比較して有効性が低い。対照的に、ＢＩＩＢ０３６／Ｐ４Ａ８は、ＡＤＣＣの強力な誘導因子であり、異種移植モデルにおける抗腫瘍活性は、Ｆｃエフェクター機能に大きく依存することが示された。
【００１０】
両薬物候補の他に、いくつかのマウス抗体は、ヒト治療に有用なヒト化の抗体操作が必要であると説明されている。癌細胞に対する抗増殖活性を有する第１の抗ＴＷＥＡＫＲ抗体は、Ｎａｋａｙａｍａら（Ｎａｋａｙａｍａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００３  Ｊｕｌ  １１；３０６（４）：８１９−２５）によって記載されている抗体Ｉｔｅｍ１−４であった。しかしながら、これらの抗体は、比較的弱いアゴニスト活性を有するに過ぎず、ＴＷＥＡＫ媒介性のＴＷＥＡＫＲ活性化に関して、部分的なアゴニスト／アンタゴニストとして作用することが示された。抗体１３６．１および１８．３．３（国際公開第２００９／０２０９３３号）は、ＴＷＥＡＫリガンドと比較して高い親和性結合を示すが、これが、より有効なカスパーゼ活性化につながるわけではない。抗体Ｐ３Ｇ５およびＰ２Ｄ３（国際公開第２００９／１４０１７７号）は、癌細胞におけるサイトカイン放出を誘導するが、Ｆｃ−ＴＷＥＡＫと比較して有効性が有意に低い。要約すると、当技術分野で説明されている抗ＴＷＥＡＫＲ抗体によるアポトーシスの誘導および増殖の阻害に関するＴＷＥＡＫＲアゴニスト活性は限定的であり、内因性リガンドＴＷＥＡＫの有効性に及ぶものではなく、それを上回るものでもない。これらの抗体は、内因性リガンドＴＷＥＡＫと比較して同程度の親和性でＴＷＥＡＫＲに結合し（Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ  ＪＳ  ｅｔ  ａｌ，ＭＡｂｓ．２０１１  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；３（４）：３６２−７５；Ｃｕｌｐ  ＰＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１０  Ｊａｎ  １５；１６（２）：４９７−５０８）、また、高い結合親和性を有する抗体が、より強力なシグナル伝達活性を必ずしも示すわけではないので（Ｃｕｌｐ  ＰＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１０  Ｊａｎ  １５；１６（２）：４９７−５０８）、このアゴニスト活性の欠如は、低い親和性によるものではない。以前に記載されている抗体の抗腫瘍活性は、Ｆｃエフェクター機能に依存することが示されており、ＡＤＣＣは、マウスモデルにおいてインビボ有効性に重要な役割を果たすことが示されている。しかしながら、抗体のチャレンジおよび免疫エフェクター細胞の固形腫瘍への浸潤（Ｃｕｌｐ  ＰＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１０  Ｊａｎ  １５；１６（２）：４９７−５０８）を考慮すると、臨床では、Ｆｃ−Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）相互作用を介したＡＤＣＣおよびインビボ架橋の、固形腫瘍における抗腫瘍活性への寄与は依然として不明である。加えて、ＦｃγＲＩＩＩＡの低親和性対立遺伝子を保有する患者は、Ｆｃ−ＦｃＲ相互作用能力が低いので、治療から受ける利益が少ないであろう（Ｖａｒｃｈｅｔｔａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７  Ｄｅｃ  １５；６７（２４）：１１９９１−９）。
【００１１】
したがって、ＴＷＥＡＫＲの過剰活性化による癌細胞のアポトーシスおよび成長阻害を、内因性リガンドＴＷＥＡＫと比較して同じかまたはそれ以上に誘導する強力な固有能力を有する開発可能なヒト抗体が、非常に求められている。患者における抗腫瘍反応の誘導において、アポトーシスの誘導および増殖の阻害は、長年にわたる有効な構想であるので（Ｈａｎａｈａｎ  Ｄ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ＲＡ，Ｃｅｌｌ．２０００  Ｊａｎ  ７；１００（１）：５７−７０；Ｋｉｍ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００２  Ｎｏｖ；５０（５）：３４３−５２；Ｆｅｓｉｋ  ＳＷ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．２００５  Ｎｏｖ；５（１１）：８７６−８５５）、これらの抗体は、ヒトの固形腫瘍において高い抗腫瘍活性を示すことが期待されており、したがって、癌治療の有望な薬物候補である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２００９／０２０９３３号
【特許文献２】国際公開第２００９／１４０１７７号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｗｉｎｋｌｅｓ  ＪＡ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２００８  Ｍａｙ；７（５）：４１１−２５
【非特許文献２】Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ  ＪＳ  ａｎｄ  Ｂｕｒｋｌｙ  ＬＣ，Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２００９；４９：１４５−６０
【非特許文献３】Ｗｉｌｅｙ  ＳＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００１  Ｎｏｖ；１５（５）：８３７−４６
【非特許文献４】Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２０１１  Ｊｕｌ；１０（７）：１２７６−８８
【非特許文献５】Ｂｕｒｋｌｙ  ＬＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２０１１  Ｎｏｖ；２４４（１）：９９−１１４
【非特許文献６】Ｃｕｌｐ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１０  Ｊａｎ  １５；１６（２）：４９７−５０８
【非特許文献７】Ｚｈｏｕ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１３  Ａｐｒ；１３３（４）：１０５２−６２
【非特許文献８】Ｔｒａｎ  ＮＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６  Ｏｃｔ  １；６６（１９）：９５３５−４２
【非特許文献９】Ｗｉｌｌｉｓ  ＡＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８  Ｍａｙ；６（５）：７２５−３４
【非特許文献１０】Ｗａｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．２０１３  Ｊａｎ  ９［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］
【非特許文献１１】Ｗａｔｔｓ  ＧＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００７  Ｎｏｖ  １５；１２１（１０）：２１３２−９  ２００７
【非特許文献１２】Ｈｕａｎｇ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．２０１１  Ｎｏｖ；３２（１１）：１５８９−９６
【非特許文献１３】Ｋｗｏｎ  ＯＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２０１２  Ｊａｎ  １；３１４（１）：７３−８１
【非特許文献１４】Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ．２０１３  Ａｐｒ；４２（４）：１２３９−４８
【非特許文献１５】Ｓｈｉｍａｄａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１２  Ｏｃｔ  １；１８（１９）：５２４７−５５
【非特許文献１６】Ｗｈｉｔｓｅｔｔ  ＴＧ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２０１２  Ｊｕｌ；１８１（１）：１１１−２０
【非特許文献１７】Ｃｈａｏ  ＤＴ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０１３  Ｆｅｂ；１３９（２）：３１５−２５
【非特許文献１８】Ｎａｋａｙａｍａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２  Ｊａｎ  １５；１６８（２）：７３４−４３
【非特許文献１９】Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９  Ｊｕｎ；２９（６）：１７８５−９２
【非特許文献２０】Ｖｉｎｃｅ  ＪＥ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００８  Ｊｕｌ  １４；１８２（１）：１７１−８４
【非特許文献２１】Ｎａｋａｙａｍａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３  Ｊａｎ  １；１７０（１）：３４１−８
【非特許文献２２】Ｗｉｌｓｏｎ  ＣＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２００２  Ｄｅｃ；９（１２）：１３２１−３３
【非特許文献２３】Ｃｈａｐｍａｎ  ＭＳ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ．２０１３  Ｊａｎ；６１（１）：２１０−７
【非特許文献２４】Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ  ＪＳ  ｅｔ  ａｌ，ＭＡｂｓ．２０１１  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；３（４）：３６２−７５
【非特許文献２５】Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ  ＪＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００５  Ａｐｒ  １４；２４（１６）：２６１３−２４
【非特許文献２６】Ｎａｋａｙａｍａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００３  Ｊｕｌ  １１；３０６（４）：８１９−２５
【非特許文献２７】Ｖａｒｃｈｅｔｔａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７  Ｄｅｃ  １５；６７（２４）：１１９９１−９
【非特許文献２８】Ｈａｎａｈａｎ  Ｄ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ＲＡ，Ｃｅｌｌ．２０００  Ｊａｎ  ７；１００（１）：５７−７０
【非特許文献２９】Ｋｉｍ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００２  Ｎｏｖ；５０（５）：３４３−５２
【非特許文献３０】Ｆｅｓｉｋ  ＳＷ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．２００５  Ｎｏｖ；５（１１）：８７６−８５５
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、ＴＷＥＡＫＲの強力な活性化をもたらし、それにより、ＴＷＥＡＫＲの過剰発現を示す様々な癌細胞において、アポトーシスの強力な誘導をもたらす抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体に関する。本明細書に記載される抗体による癌細胞アポトーシスの誘導は、当技術分野で説明されているすべての抗体（例えば、ＰＤＬ−１９２またはＢＩＩＢ００３６／Ｐ４Ａ８；例えば、架橋剤の追加を必要とする）と比較してより有効である。本発明の抗体のユニークな特性は、ＴＷＥＡＫＲ（配列番号：１６９；および図１を参照のこと）の４７位のアミノ酸（Ｄ４７）に対する抗体の選択的結合を特徴とする新規な結合エピトープに基づくものである。
【００１５】
したがって、本発明の抗体は、癌およびその転移、特に特定のＴＷＥＡＫＲ発現腫瘍、例えば結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部癌、食道癌、黒色腫、肝細胞癌、膀胱癌、胃癌、乳癌、膵臓癌、腎細胞癌、前立腺癌、卵巣癌および子宮頸癌の治療に適切である。
【００１６】
本発明は、ほとんどの細胞株において、内因性リガンドＴＷＥＡＫと比較して優れたレベルで、癌細胞アポトーシスの強力な活性化を誘導するという点において、既存の抗ＴＷＥＡＫＲ抗体と区別される抗体を説明する。本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ａ）ＴＷＥＡＫＲを強力に活性化し、ｂ）癌細胞におけるアポトーシスを誘導し、ｃ）癌細胞からのサイトカイン分泌を誘導し、ｄ）インビボ腫瘍実験において、共に抗体の抗腫瘍活性をもたらし、ｅ）加えて、前記抗体のみでは効果がない実験条件において、前記抗体は、サポリンコンジュゲート二次抗体と共にインキュベートすると、ＴＷＥＡＫＲのインターナリゼーションおよび癌細胞増殖の阻害をもたらし、ｆ）いくつかの種に対して交差反応性である。本発明のこれらのおよび他の目的は、本明細書により詳細に記載されている。
【００１７】
本発明の抗体は、公知の医薬と共に同時投与され得、一部の場合には、前記抗体は、それ自体が改変され得る。例えば、有効性を潜在的にさらに増加させるために、抗体を細胞毒性剤、免疫毒素、担毒体または放射性同位体にコンジュゲートし得る。
【００１８】
本発明はさらに、正常組織と比較してＴＷＥＡＫＲ発現が上昇している悪性症状または形成異常症状を診断するためのツールを構成する抗体を提供する。検出可能なマーカーにコンジュゲートされた抗ＴＷＥＡＫＲ抗体が提供される。好ましいマーカーは、放射性ラベル、酵素、発色団または発蛍光体である。
【００１９】
本発明はまた、本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド、本発明の抗体またはその抗原結合断片を発現する細胞、本発明の抗体またはその抗原結合断片を生産するための方法、本発明の抗体またはその抗原結合断片を使用して形成異常細胞の成長を阻害するための方法、および本発明の抗体またはその抗原結合断片を使用して癌を治療および検出するための方法に関する。
【００２０】
本発明はまた、単離された核酸配列であって、そのそれぞれが、ＴＷＥＡＫＲのエピトープに対して特異的な上記抗体またはその抗原結合断片をコードし得る単離された核酸配列に関する。本発明の核酸は、抗体または抗原結合抗体断片の組換え生産に適切である。したがって、本発明はまた、本発明の核酸配列を含有するベクターおよび宿主細胞に関する。
【００２１】
本発明の組成物は、治療用途または予防用途に使用することができる。したがって、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合断片と、したがって薬学的に許容され得る担体または賦形剤とを含む医薬組成物を含む。関連する態様では、本発明は、ＴＷＥＡＫＲ発現細胞の望ましくない存在に関連する障害または症状を治療するための方法を提供する。好ましい実施形態では、上記障害は、癌である。このような方法は、本明細書に記載されるまたは本明細書で想定される本発明の抗体を含有する有効量の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与する工程を含有する。
【００２２】
本発明はまた、抗体ライブラリーを使用して、このようなライブラリーのＴＷＥＡＫＲに特異的に結合する１つ以上のメンバーを単離するための指示を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】様々な種のＴＷＥＡＫＲシステインリッチドメイン（ａａ３４〜６８）のアライメント（数字は、シグナル配列を含む全長構築物のアミノ酸位置を示す；配列番号：１６９）
【図２】Ａ−ＴＷＥＡＫＲ（配列番号：１６９）の構造の模式図。図は、システインリッチドメイン（３６−６７）を含む細胞外ドメイン（ａａ２８〜８０）（配列番号：１６８）、膜貫通ドメイン−ＴＭ（８１−１０１）および細胞内ドメイン（１０２−１２９）を示す。ＴＰＰ−２２０２−ｈＩｇＧ１のＦｃドメインに融合した全長外部ドメイン（２８−８０）。ＴＰＰ−２２０３−ｈＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＮ末端およびＣ末端短縮型細胞外ドメイン（３４−６８）。ジスルフィド架橋Ｃｙｓ３６−Ｃｙｓ４９、Ｃｙｓ５２−Ｃｙｓ６７およびＣｙｓ５５−Ｃｙｓ６４は、黒色のバーによって示されている。適切なフォールディングを確実にするために、ＴＰＰ−２２０３は、純粋なシステインリッチドメインと比較して、Ｎ末端に２個のアミノ酸を多く含有し、Ｃ末端に１個のアミノ酸を多く含有する。ＴＰＰ−１９８４−ＨＩＳ６タグに融合したＣ末端短縮型細胞外ドメイン（２８−６８）。３つの構築物はすべて、本発明の抗体およびＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）に対する同程度の結合を示す。Ｐ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４）は、全長細胞外ドメイン（ＴＰＰ−２２０２）に結合するに過ぎない。Ｂ−細胞外ドメインのアミノ酸配列：ａａ４６は、ＴＷＥＡＫリガンド結合に必須であると発表され、ａａ４７は、本発明の抗体の結合に必須であると特性評価された。
【図３】ＴＷＥＡＫＲ外部ドメインと本発明の抗体および参照抗体の抗体との相互作用。ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃ融合タンパク質（ＴＰＰ−２２０２）コーティング（１μｇ／ｍｌ）、ならびに可溶性結合パートナーとして０．０８μｇ／ｍｌ（白色のバー）および０．３μｇ／ｍｌ（黒色のバー）のビオチン化ＩｇＧを用いたＥＬＩＳＡの結果を示す。ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＡｍｐｌｅｘ−Ｒｅｄ基質を用いて、検出を行った。Ｙは、「ＥＬＩＳＡシグナル強度［Ｒｆｕ］」である；Ｘは、「試験した抗体構築物」である：ａは、「ＴＰＰ−２０９０」である；ｂは、「ＴＰＰ−２０８４」である；ｃは、「ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）」である；ｄは、「Ｐ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４）」である；ｅは、「Ｐ３Ｇ５（ＴＰＰ−２１９５）」である；ｆは、「１３６．１（ＴＰＰ−２１９４）」である；ｈは、「ＩＴＥＭ１」である；ｉは、「ＩＴＥＭ４」である；ｊは、マウスアイソタイプ対照である；ｋは、ヒトアイソタイプ対照である。試験した抗体はすべて、８０ｎｇ／ｍｌの濃度で飽和的な結合を示す。
【図４】ＴＷＥＡＫＲシステインリッチドメインと本発明の抗体および参照抗体の抗体との相互作用。ＴＷＥＡＫＲ（３４−６８）−Ｆｃ融合タンパク質（ＴＰＰ−２２０３）コーティング（１μｇ／ｍｌ）、ならびに可溶性結合パートナーとして０．０８μｇ／ｍｌ（白色のバー）および０．３μｇ／ｍｌ（黒色のバー）のビオチン化ＩｇＧを用いたＥＬＩＳＡの結果を示す。ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＡｍｐｌｅｘ−Ｒｅｄ基質を用いて、検出を行った。Ｙは、「ＥＬＩＳＡシグナル強度［Ｒｆｕ］」である；Ｘは、「試験した抗体構築物」である：ａは、「ＴＰＰ−２０９０」である；ｂは、「ＴＰＰ−２０８４」である；ｃは、「ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）」である；ｄは、「Ｐ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４）」である；ｅは、「Ｐ３Ｇ５（ＴＰＰ−２１９５）」である；ｆは、「１３６．１（ＴＰＰ−２１９４）」である；ｈは、「ＩＴＥＭ１」である；ｉは、「ＩＴＥＭ４」である；ｊは、マウスアイソタイプ対照である；ｋは、ヒトアイソタイプ対照である。本発明の抗体は、システインリッチドメインに結合する。
【図５】ＴＷＥＡＫＲ（２８−６８）と本発明の抗体および参照抗体の抗体との相互作用。ＴＷＥＡＫＲ（２８−６８）−ＨＩＳ（ＴＰＰ−１９８４）コーティング（１μｇ／ｍｌ）、ならびに可溶性結合パートナーとして０．０８μｇ／ｍｌ（白色のバー）および０．３μｇ／ｍｌ（黒色のバー）のビオチン化ＩｇＧを用いたＥＬＩＳＡの結果を示す。ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＡｍｐｌｅｘ−Ｒｅｄ基質を用いて、検出を行った。Ｙは、「ＥＬＩＳＡシグナル強度［Ｒｆｕ］」である；Ｘは、「試験した抗体構築物」である：ａは、「ＴＰＰ−２０９０」である；ｂは、「ＴＰＰ−２０８４」である；ｃは、「ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）」である；ｄは、「Ｐ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４）」である；ｅは、「Ｐ３Ｇ５（ＴＰＰ−２１９５）」である；ｆは、「１３６．１（ＴＰＰ−２１９４）」である；ｈは、「ＩＴＥＭ１」である；ｉは、「ＩＴＥＭ４」である；ｊは、マウスアイソタイプ対照である；ｋは、ヒトアイソタイプ対照である。本発明の抗体は、システインリッチドメインに結合する。抗体Ｐ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４）、Ｐ３Ｇ５（ＴＰＰ−２１９５）、ＩＴＥＭ−１およびＩＴＥＭ−４は、結合障害を示す。
【図６Ａ】システインリッチドメインのアラニンスキャン。ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）（Ｘ）およびＴＰＰ−２０９０（Ｙ）結合について、ＴＷＥＡＫＲ（３４−６８）−Ｆｃの変異タンパク質を分析した。Ｓ３７Ａ、Ｒ３８Ａ、Ｓ４０Ａ、Ｗ４２Ａ、Ｓ４３Ａ、Ｄ４５Ａ、Ｄ４７Ａ、Ｋ４８Ａ、Ｄ５１Ａ、Ｓ５４Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｒ５８Ａ、Ｐ５９Ａ、Ｈ６０Ａ、Ｓ６１Ａ、Ｄ６２Ａ、Ｆ６３ＡおよびＬ６５Ａ変異タンパク質をＨＥＫ２９３細胞（黒色の菱形）で発現させた。ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）およびＴＰＰ−２０９０をコーティング（１μｇ／ｍｌ）し、ＴＷＥＡＫＲ変異タンパク質結合のために、ＨＥＫ２９３発酵ブロスの８倍希釈上清を追加した。Ｘは、「ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）相互作用のＥＬＩＳＡ強度［Ｒｆｕ］」であり、Ｙは、「ＴＰＰ−２０９０相互作用のＥＬＩＳＡ強度［Ｒｆｕ］」である。ＴＰＰ−２０９０（Ｙ）は、Ｄ４７Ａ  ＴＷＥＡＫＲ変異タンパク質（実線の囲み枠）に対する結合障害を示し、ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）（Ｘ）は、Ｒ５６Ａ（破線の囲み枠）に対する結合障害を示す。
【図６Ｂ】Ｙは、「野生型（ｗｔ）結合シグナルによって正規化した％結合［％］」であり、１は、「ＴＰＰ−２０９０」である；２は、「ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）」である；３は、「Ｐ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４）」である。抗体をコーティング（１μｇ／ｍｌ）し、ＴＷＥＡＫＲ変異体を２５０ｎｇ／ｍｌで追加し、抗ＨＩＳ  ＨＲＰによって検出した。ＴＴＰ−２０９０は、野生型（ＷＴ）構築物と比較して５％未満の結合を示す。
【図６Ｃ】Ｙは、「野生型（ｗｔ）結合シグナルによって正規化した％結合［％］」であり、１は、「ＴＰＰ−２０９０」である；２は、「ＴＰＰ−２１４９」であり、３は、「ＴＰＰ−２０９３」である；４は、「ＴＰＰ−２１４８」である；５は、「ＴＰＰ−２０８４」である；６は、「ＴＰＰ−２０７７」である；７は、「ＴＰＰ−１５３８」である；８は、「ＴＰＰ−８８３」である；９は、「ＴＰＰ−１８５４」である；１０は、「ＴＰＰ−１８５３」である；１１は、「ＴＰＰ−１８５７」である；１２は、「ＴＰＰ−１８５８」である；１３は、「ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）」である。抗体をコーティング（１μｇ／ｍｌ）し、ＴＷＥＡＫＲ変異体を２５０ｎｇ／ｍｌで追加し、抗ＨＩＳ  ＨＲＰによって検出した。ＰＤＬ−１９２を除くすべての変異体は、野生型（ＷＴ）構築物と比較して５％未満の結合を示す。
【図７】Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉら（ＦＥＢＳ  ２８０：１８１８−１８２９）が発表したＴＷＥＡＫＲ外部ドメインのＮＭＲ構造。ＴＷＥＡＫ結合は、Ｌ４６（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ）に依存し、ＴＰＰ−２０９０結合は、Ｄ４７に依存し、ＰＤＬ−１９２結合は、Ｒ５６に依存する。ＰＤＬ−１９２は、ＴＷＥＡＫリガンド結合部位の反対側に結合し、ＴＰＰ−２０９０は、ＴＷＥＡＫリガンド部位に直接結合する。
【図８】本発明の抗体および参照抗体の結合エピトープを区別するために、競合実験を実施した。第２の抗体の注入後における第２の結合事象の欠如は、各抗体ペア内の明確な競合を示す。非競合抗体ペアは、第２の抗体の注入後に、バックグラウンドを超える明確な結合シグナルを示した。加えて、内部システム対照として、自己競合（第１の抗体および第２の抗体が同一）の調査をモニタリングした。（−）第２の結合は検出されず；（＋）第２の結合。本発明の抗体は、試験したすべての抗体と競合する。
【図９】本発明の抗体および参照抗体の結合エピトープを区別するために、競合実験を実施した。一般に、分析したすべての抗ＴＷＥＡＫＲ抗体を３つの異なる「競合群」にクラスタ化することができる。１つの群は、ＴＰＰ−２０８４およびＴＰＰ−２０９０（これらは両方とも、試験したすべての他のメンバーとの競合を示す）のみを含有する。これらの他のメンバーを、互いにいかなる競合も示さない２つの別個の抗体セットに分けることができる。本発明の抗体は両方とも、ユニークな新規エピトープに結合する。
【図１０】２９個の公知のＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーすべての相同性ツリー。最も近縁の相同体ＴＮＦＲＳＦ１３ＣおよびＴＮＦＲＳＦ１７は、わずか約３０％の配列同一性を有する。
【図１１】ＴＰＰ−２０９０の選択性評価に関する、２９個のＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーすべてを用いた結合ＥＬＩＳＡ。ＥＬＩＳＡの結果を示す：Ｙは、「ＥＬＩＳＡシグナル強度［Ｒｆｕ］」である；Ｘは、「試験したＴＮＦ受容体スーパーファミリータンパク質（Ｆｃ−融合タンパク質）」である：１は、「ＴＷＥＡＫＲ」である；２は、「ＴＷＥＡＫＲ」である；３は、「Ａｐｏ−３」である；４は、「Ｔｒａｉｌ−Ｒ１」である；５は、「Ｔｒａｉｌ−Ｒ２」である；６は、「ＣＤ３８５」である；７は、「ＣＤ９５」である；８は、「Ｒａｎｋ」である；９は、「ＴＮＦ−Ｒ１」である；１０は、「ＴＮＦ−Ｒ２」である；１１は、「ＢＡＦＦ−Ｒ」である；１２は、「ＤｃＲ３」である；１３は、「ＢＣＭＡ」である；１４は、「ＴＡＣＩ」である；１５は、「ＯＸ４０」である；１６は、「ＣＤ３０」である；１７は、「ＣＤ２７」である；１８は、「ＣＤ４０」である；１９は、「オステオプロテジェリン」である；２０は、「ＥＤＡＲ」である；２１は、「ＧＩＴＲ」である；２２は、「ＨＶＥＭ」である；２３は、「ＮＧＦ  Ｒ」である；２４は、「Ｔｒａｉｌ  Ｒ３」である；２５は、「リンホトキシンβ  Ｒ」である；２６は、「Ｔｒａｉｌ  Ｒ４」である；２７は、「ＥＤＡ２Ｒ」である；２８は、「ＴＲＯＹ」である；２９は、「ＲＥＬＴ」である；３０は、「４−１ＢＢ」である。（１）では、３００ｐＭのＴＰＰ−２０９０を用い、（２）では、７５ｎＭを用いた。ＴＰＰ−２０９０は、（１）３００ｐＭの非常に低濃度および（２）７５ｎＭの高濃度において、ＴＷＥＡＫＲに飽和的に結合する。すべての他のＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー（３〜３０）に対する結合分析では、７５ｎＭのＴＰＰ−２０９０を使用した。ＴＰＰ−２０９０は、ＴＷＥＡＫＲに選択的に結合する。
【図１２】ＨＴ−２９細胞に対する抗ＴＷＥＡＫＲ抗体の結合に関するＦＡＣＳ分析。Ｙは、「ＦＡＣＳシグナルのバックグラウンド補正幾何平均［ａｕ］」である。１０μｇ／ｍｌの示されている抗体と共にインキュベートしたＨＴ−２９細胞のＦＡＣＳ分析後の蛍光から、二次抗体のみと共にインキュベートしたＨＴ−２９細胞の蛍光の幾何平均を差し引いたものを示す。この濃度では、本発明の抗体（ＴＰＰ−１５３８、ＴＰＰ−２０８４、ＴＰＰ−２０９０）は、公知の抗体［ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）およびＰ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４）］と比較して低い細胞結合を示す。
【図１３】ＨＴ−２９細胞における抗ＴＷＥＡＫＲ抗体によるカスパーゼ３／７活性化。Ｘは、「試験した抗ＴＷＥＡＫＲ抗体［μｇ／ｍｌ］」である。Ｙは、「相対光単位［ＲＬＵ］」である。ＩＦＮガンマの存在下で、ＨＴ−２９細胞を、示されている様々な濃度（０．０３〜３００μｇ／ｍｌ）の抗ＴＷＥＡＫＲ抗体と共に２４時間インキュベートした。カスパーゼ３／７Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって発光として測定したカスパーゼ３／７活性を抗体濃度に対してプロットした。３回反復で実施した１〜３回の代表的な実験の平均値を示す（標準偏差を含む）。黒色の記号は、本発明の抗体を示し、白色の記号は、公知の抗体［ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）；Ｐ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４）、１３６．１（ＴＰＰ−２１９４）］を示す。本発明の抗体（ＴＰＰ−１５３８、ＴＰＰ−１８５４、ＴＰＰ−２０８４、ＴＰＰ−２０９０）は、公知の抗体［ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）；Ｐ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４）および１３６．１（ＴＰＰ−２１９４）］と比較して強力なカスパーゼ３／７活性化誘導効果を示す。
【図１４Ａ】ＷｉＤｒ細胞における抗ＴＷＥＡＫＲ抗体の抗増殖活性。Ｘは、「試験した抗ＴＷＥＡＫＲ抗体［μｇ／ｍｌ］」である；Ｙは、「未処理対照細胞の増殖に関する細胞増殖（％）」である。細胞を、示されている様々な濃度（０．０３〜３００μｇ／ｍｌ）の抗ＴＷＥＡＫＲ抗体と共に９６時間インキュベートした（ＷｉＤｒ細胞はＩＦＮガンマの非存在下、７８６−Ｏ細胞はＩＦＮガンマの存在下）。３回反復で実施した代表的な実験の平均値を示し、標準偏差をエラーバーによって示す。黒色の記号：本発明の抗体、白色の記号、公知の抗体［ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）およびＰ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４］。本発明の抗体（ＴＰＰ−１５３８、ＴＰＰ−１８５４、ＴＰＰ−２０８４、ＴＰＰ−２０９０）は、公知の抗体［ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）およびＰ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４］と比較して強力な細胞増殖阻害効果を示す。
【図１４Ｂ】７８６−Ｏ細胞における抗ＴＷＥＡＫＲ抗体の抗増殖活性。Ｘは、「試験した抗ＴＷＥＡＫＲ抗体［μｇ／ｍｌ］」である；Ｙは、「未処理対照細胞の増殖に関する細胞増殖（％）」である。細胞を、示されている様々な濃度（０．０３〜３００μｇ／ｍｌ）の抗ＴＷＥＡＫＲ抗体と共に９６時間インキュベートした（ＷｉＤｒ細胞はＩＦＮガンマの非存在下、７８６−Ｏ細胞はＩＦＮガンマの存在下）。３回反復で実施した代表的な実験の平均値を示し、標準偏差をエラーバーによって示す。黒色の記号：本発明の抗体、白色の記号、公知の抗体［ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）およびＰ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４］。本発明の抗体（ＴＰＰ−１５３８、ＴＰＰ−１８５４、ＴＰＰ−２０８４、ＴＰＰ−２０９０）は、公知の抗体［ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）およびＰ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４］と比較して強力な細胞増殖阻害効果を示す。
【図１５】Ａ３７５細胞における抗ＴＷＥＡＫＲ抗体によって誘導されるＩＬ−８分泌。Ｘは、「試験した抗ＴＷＥＡＫＲ抗体［μｇ／ｍｌ］」である。Ｙは、「ＩＬ−８レベル［ｐｇ／ｍｌ］」である。Ａ３７５細胞を、示されている様々な濃度（０．０３〜３００μｇ／ｍｌ）の抗ＴＷＥＡＫＲ抗体と共にインキュベートした。処理２４時間後の細胞の上清において、ＩＬ−８のレベルを決定した（および、使用した抗体濃度に対してプロットした）。３回反復で実施した１〜３回の代表的な実験の平均値を示す（標準偏差を含む）。黒色の記号は、本発明の抗体を示し、白色の記号は、公知の抗体［ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）；Ｐ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４）、１３６．１（ＴＰＰ−２１９４）］を示し、アイソタイプ対照抗体による処理は、（Ｃ）に示されている。本発明の抗体（ＴＰＰ−１５３８、ＴＰＰ−１８５４、ＴＰＰ−２０８４、ＴＰＰ−２０９０）は、公知の抗体［ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）、Ｐ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４）、１３６．１（ＴＰＰ−２１９４）］と比較して強力な、Ａ３７５細胞からのＩＬ−８分泌誘導効果を示す。
【図１６Ａ】異種移植マウスにおける抗ＴＷＥＡＫＲ抗体によって誘導されるヒトＩＬ−８分泌。３ｍｇ／ｋｇのＴＰＰ−２０９０（白色の記号）またはビヒクル（Ｃ−黒色の記号）の単回投与でＷｉＤｒ異種移植腫瘍担持マウスを処理し、処理後の様々な時点において、腫瘍担持マウスの血漿中のヒトＩＬ−８（ＩＬ−８ｐｇ／ｍｌ）のレベルを決定した。Ｘは、「処理後の時間［時］」である；Ｙは、「Ｉｌ−８レベル［ｐｇ／ｍｌ］」である。動物３匹／群の結果を示し、エラーバーは標準偏差を表す。ＷｉＤｒ腫瘍担持マウスでは、ＴＰＰ−２０９０による処理後に、ヒトＩＬ−８分泌が時間依存的に明確に誘導されている。
【図１６Ｂ】異種移植マウスにおける抗ＴＷＥＡＫＲ抗体によって誘導されるヒトＩＬ−８分泌。１０ｍｇ／ｋｇのＴＰＰ−１５３８、ビヒクルまたはアイソタイプ対照抗体の単回投与でＡ３７５腫瘍担持マウス（黒色の記号）または非腫瘍担持マウス（白色の記号）を処理した。Ｃ１は、「ビヒクル対照」である；Ｃ２は、「アイソタイプ対照抗体」である；Ｙは、「ヒトＩｌ−８のレベル［ｐｇ／ｍｌ］」である。処理７時間後のマウス４匹／群の血清において決定したヒトＩＬ−８のレベルを示す。Ａ３７５腫瘍担持マウスでは、ＴＰＰ−１５３８によって、ＩＬ−８分泌が明確に誘導されているが、同様に処理した非腫瘍動物では誘導されなかった。
【図１７】内因性ＴＷＥＡＫＲ発現細胞に結合する抗体に対する、ＴＷＥＡＫＲの経時的な特異的インターナリゼーションの顕微鏡評価（ＩｎＣｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）。腎臓癌細胞株７８６−Ｏにおいて、ＴＰＰ−１５３８およびＴＰＰ−２０９０のインターナリゼーションを調査した。本発明の抗体（１／μｇ／ｍｌ）またはアイソタイプ対照Ｃ（５μｇ／ｍｌ）による処理後の顆粒数／細胞を、示されている様々なインキュベーション時間についてプロットする（Ｘは、「時間［分］」である；Ｙは、「顆粒数／細胞［量］」である）。本発明の抗体（ＴＰＰ−１５３８、ＴＰＰ−２０９０）は、ＴＷＥＡＫＲ発現細胞において迅速かつ特異的なインターナリゼーションを示す。
【図１８】サポリンコンジュゲート二次抗体（Ｈｕｍ−Ｚａｐ  Ａｓｓａｙ）と共にインキュベートした後の抗ＴＷＥＡＫＲ抗体による７８６−Ｏ細胞増殖の阻害。（ＩＦＮガンマの非存在下）抗体濃度１０ｎＭのサポリンコンジュゲート二次抗体の存在下または非存在下で、７８６−Ｏ細胞をＴＷＥＡＫＲまたはアイソタイプ対照抗体と共に４８時間インキュベートした。Ｘは、「試験した抗体変異体」であり、ａは、「ビヒクル対照」であり、ｂは、「アイソタイプ対照抗体」であり、ｃは、「ＴＰＰ−２０８４」であり、ｄは、「ＴＰＰ−２０９０」である；Ｙは、「未処理対照細胞と比較した細胞増殖［％］」である。未処理対照細胞と比較した細胞増殖を、サポリンコンジュゲート二次抗体の存在下（白色のバー）または非存在下（黒色のバー）、様々な抗体で処理した７８６−Ｏ細胞に対してプロットした。３回反復の１回の代表的な実験の結果を示し、標準偏差をエラーバーによって示す。使用した実験条件では、サポリンコンジュゲート二次抗体の存在下における本発明の抗体（ＴＰＰ−２０８４、ＴＰＰ−２０９０）のみが、７８６−Ｏ細胞の増殖をほぼ完全に阻害する。したがって、サポリンコンジュゲート二次抗体の存在下で抗ＴＷＥＡＫＲ抗体から観察された抗増殖効果は、ＴＷＥＡＫＲ発現細胞に対する抗体複合体の結合後のサポリンの特異的インターナリゼーションの結果である。
【図１９】腫瘍細胞の接種後７日目に開始した０．３、１．０および３．０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．、ｑ４ｄｘ３）による処理後のヒト腎細胞癌異種移植片７８６−Ｏにおける抗ＴＷＥＡＫＲ抗体の有効性。４０日目の最終腫瘍重量を示す。Ａは、「ＰＢＳ（ｉ．ｖ．ｑ４ｄｘ３）で処理したビヒクル群」である。Ｂは、「アイソタイプ、３ｍｇ／ｋｇ」であり、Ｃは、「ＴＰＰ−２０８４、０．３ｍｇ／ｋｇ」であり、Ｄは、「ＴＰＰ−２０８４、１ｍｇ／ｋｇ」であり、Ｅは、「ＴＰＰ−２０８４、３ｍｇ／ｋｇ」であり、Ｆは、「ＴＰＰ−２０９０、０．３ｍｇ／ｋｇ」であり、Ｇは、「ＴＰＰ−２０９０、１ｍｇ／ｋｇ」であり、Ｈは、「ＴＰＰ−２０９０、３ｍｇ／ｋｇ」である。（Ｙは、「腫瘍重量、ｎ＝８の平均である；ＳＤ［ｇ］」）。
【図２０】単独療法ならびにイリノテカン（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、４ｄ  ｏｎ、３ｄ  ｏｆｆ）およびレゴラフェニブ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．、毎日）との併用療法における、ヒト結腸癌異種移植片ＷｉＤｒにおける３ｍｇ／ｋｇのＴＰＰ−２０９０（ｉ．ｖ．、ｑ４ｄｘ７）の有効性。約４０ｍｍ２の樹立腫瘍の接種後７日目に、処理を開始した。Ａは、「ＰＢＳ（ｉ．ｖ．ｑ４ｄｘ７）で処理したビヒクル群」である。Ｂは、「ＴＰＰ−２０９０、３ｍｇ／ｋｇ」であり、Ｃは、「ＴＰＰ−２０９０、１０ｍｇ／ｋｇ」であり、Ｄは、「イリノテカン、５ｍｇ／ｋｇ」であり、Ｅは、「Ｃｏｍｂｏ  ＴＰＰ−２０９０、３ｍｇ／ｋｇ＋イリノテカン、５ｍｇ／ｋｇ」であり、Ｆは、「レゴラフェニブ、１０ｍｇ／ｋｇ」であり、Ｇは、「Ｃｏｍｂｏ  ＴＰＰ−２０９０、３ｍｇ／ｋｇ＋レゴラフェニブ１０ｍｇ／ｋｇ」である（Ｘは、「接種後の時間［日］」であり、Ｙは、「腫瘍面積、ｎ＝１０の平均である；ＳＤ［ｍｍ２］）。
【図２１】単独療法およびパクリタキセル（１６ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、ｑ７ｄｘ４）との併用療法における、ヒト肺癌異種移植片ＮＣＩ−Ｈ３２２における１０ｍｇ／ｋｇのＴＰＰ−２０９０（ｉ．ｖ．、ｑ４ｄｘ８）の有効性。約４５ｍｍ２の樹立腫瘍の接種後１４日目に、処理を開始した。Ａは、「ＰＢＳ（ｉ．ｖ．ｑ４ｄｘ８）で処理したビヒクル群」である。Ｂは、「ＴＰＰ−２０９０、５ｍｇ／ｋｇ」であり、Ｃは、「ＴＰＰ−２０９０、１０ｍｇ／ｋｇ」であり、Ｄは、「パクリタキセル、１６ｍｇ／ｋｇ」であり、Ｅは、「Ｃｏｍｂｏ  ＴＰＰ−２０９０、１０ｍｇ／ｋｇ＋パクリタキセル１６ｍｇ／ｋｇ」である（Ｘは、「接種後の時間［日］」である；Ｙは、「腫瘍面積、ｎ＝１０の平均である；ＳＤ［ｍｍ２］」）。
【図２２Ａ】本発明の抗体による処理後の異種移植片における増殖細胞の減少。ＰＢＳ（ｉ．ｖ．、ｑ４ｄｘ７）による処理後のＷｉＤｒ異種移植腫瘍の凍結切片を、免疫組織化学によって増殖マーカーＫｉ６７について染色した。腫瘍細胞の接種後７日目に処理を開始し、研究終了時（２９日目）に採取した腫瘍から凍結切片を調製した。１群当たりＮ＝３個の腫瘍を分析し、代表的な画像を示す。マウスのＷｉＤｒ異種移植腫瘍において、ＴＰＰ−２０９０による処理は、Ｋｉ６７陽性細胞（画像中、濃く染色された細胞）の強力な減少をもたらす。
【図２２Ｂ】本発明の抗体による処理後の異種移植片における増殖細胞の減少。ＴＰＰ−２０９０（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．ｑ４ｄｘ７）による処理後のＷｉＤｒ異種移植腫瘍の凍結切片を、免疫組織化学によって増殖マーカーＫｉ６７について染色した。腫瘍細胞の接種後７日目に処理を開始し、研究終了時（２９日目）に採取した腫瘍から凍結切片を調製した。１群当たりＮ＝３個の腫瘍を分析し、代表的な画像を示す。マウスのＷｉＤｒ異種移植腫瘍において、ＴＰＰ−２０９０による処理は、Ｋｉ６７陽性細胞（画像中、濃く染色された細胞）の強力な減少をもたらす。
【図２３】インビボにおける抗ＴＷＥＡＫＲ抗体によるＳｔａｔ−１およびＮＦ−κＢ２シグナル伝達経路の誘導。ＰＢＳ（ｉ．ｖ．、ｑ４ｄｘ７：レーン１および２）またはＴＰＰ−２０９０（３ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、ｑ４ｄｘ７：レーン３および４）による処理後の急速凍結ＷｉＤｒ異種移植腫瘍の溶解物をウエスタンブロット分析に供し、Ｐ−Ｓｔａｔ１（ａ）、Ｓｔａｔ−１（ｂ）、ＮＦ−κ２−ｐ５２（ｃ）およびＧＡＰＤＨ（ｄ）について、特異的抗体を用いて検出した。腫瘍細胞の接種後７日目にマウスの処理を開始し、研究終了時（２９日目）に採取した急速凍結腫瘍から溶解物を調製した。１群当たり２匹の代表的な動物のブロットを示す。ＷｉＤｒ異種移植腫瘍において、ＴＰＰ−２０９０による処理は、Ｐ−Ｓｔａｔ１および全Ｓｔａｔ１レベルならびにＮＦ−κＢ２活性化（Ｐ５２バンドの出現によって示される）の強力な誘導をもたらす。
【図２４】抗ＴＷＥＡＫＲ抗体のコンセンサス配列。ＣＤＲ−Ｈ１−５位のＸ：ＭまたはＩ；ＣＤＲ−Ｈ２−８位のＸ：ＳまたはＫ；ＣＤＲ−Ｌ１−８位のＸ：ＧまたはＳ；ＣＤＲ−Ｌ２−１位のＸ：Ｎ、ＡまたはＱ；ＣＤＲ−Ｌ３−５位のＸ：ＴまたはＳ；６位のＸ：ＳまたはＴ；８位のＸ：ＦまたはＧ。
【図２５Ａ】連続するＣＤＲ配列の命名。突然変異収集（成熟過程）のために、囲み枠内の位置を多様化した。
【図２５Ｂ】連続するＣＤＲ配列の命名。１つの組換えライブラリーにおいて、囲み枠内の１つの置換を組換えた。
【図２６】本発明の配列
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、ＴＷＥＡＫＲに対する特異的親和性を有し、被験体に治療的利益を送達することができる新規抗体の発見に基づくものである。ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る本発明の抗体は、本明細書により詳細に説明される多くの状況において使用することができる。
【００２５】
定義
別段の定義がある場合を除き、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解している意味を有する。しかしながら、本発明が関係する技術分野の当業者であれば、本発明で使用される用語の多くについて、その一般的定義を、以下の参考文献に見出すことができ、それらの定義が当技術分野で一般に理解されている意味と合致している限り、以下の参考文献を参照し、使用することができる。このような参考文献には、例えばＳｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｄ  ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）；Ｈａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）；およびＬａｃｋｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（３ｄ  ｅｄ．１９９９）；およびＣｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ａｂｂａｓ，Ｌｉｃｈｔｍａｎ  ａｎｄ  Ｐｏｂｅｒ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙが含まれるが、これらに限定されない。当業者に利用可能な任意のさらなる技術情報源であって、当技術分野で一般に理解されている意味を有する本明細書で使用される用語の定義を提供するものを参照し得る。本発明の目的のために、以下の用語をさらに定義する。さらなる用語は、本明細書の他の箇所で定義する。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」および「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないことが明白である場合を除き、複数の言及を含む。したがって、例えば「遺伝子（ａ  ｇｅｎｅ）」は１つ以上の遺伝子への言及であり、当業者に公知のその均等物などを含む。
【００２６】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。別段の指示がない限り、特定のポリペプチド配列はまた、その保存的に改変された変異体を黙示的に包含する。
【００２７】
「ヒト」抗体またはその抗原結合断片は、本明細書では、キメラ抗体ではなく（例えば、「ヒト化」抗体ではなく）、非ヒト種に（全部または一部が）由来する抗体でもないものと定義される。ヒト抗体またはその抗原結合断片は、ヒトに由来し得るか、または合成ヒト抗体であり得る。「合成ヒト抗体」は、本明細書では、公知のヒト抗体配列の分析に基づく合成配列からインシリコで全部または一部が導き出された配列を有する抗体と定義される。ヒト抗体配列またはその断片のインシリコ設計は、例えばヒト抗体配列または抗体断片配列のデータベースを分析し、そこから得られたデータを利用してポリペプチド配列を考案することなどによって、達成することができる。ヒト抗体またはその抗原結合断片の別の例は、ヒト起源の抗体配列のライブラリーから単離された核酸によってコードされるものである（すなわち、上記ライブラリーはヒト天然供給源から採取された抗体に基づく）。ヒト抗体の例には、Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０００，１８：８５３−８５６に記載されている抗体が含まれる。
【００２８】
「ヒト化抗体」またはそのヒト化抗原結合断片は、本明細書では、（ｉ）非ヒト供給源（例えば、異種免疫系を保持するトランスジェニックマウス）に由来し、ヒト生殖細胞系配列に基づく抗体、（ｉｉ）非ヒト抗体のフレームワーク領域のアミノ酸が遺伝子工学によってヒトアミノ酸配列に部分的に交換されているもの、または（ｉｉｉ）ＣＤＲ移植されたものであって、可変ドメインのＣＤＲが非ヒト起源のものであり、一方、可変ドメインの１つ以上のフレームワークはヒト起源のものであり、定常ドメイン（存在する場合）はヒト起源のものであるものと定義される。
【００２９】
「キメラ抗体」またはその抗原結合断片は、本明細書では、可変ドメインが非ヒト起源に由来し、定常ドメインの一部または全部がヒト起源に由来するものと定義される。
【００３０】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、その集団を含む個々の抗体は、微量に存在し得る可能な突然変異（例えば、天然に存在する突然変異）を除いて同一である。したがって、「モノクローナル」という用語は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示している。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含んでいるポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に向けられる。モノクローナル抗体調製物は、その特異性だけではなく、それらが典型的には他の免疫グロブリンによって汚染されていないという点でも有利である。「モノクローナル」という用語が、何らかの特定の方法による抗体の生産を要求しているとは解釈すべきでない。モノクローナル抗体という用語は、特にキメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体を含む。本明細書で使用される「アゴニスト／アゴニスト抗体」は、目的のポリペプチド（本明細書では、ＴＷＥＡＫＲリガンドであるＴＷＥＡＫ）の機能活性の少なくとも１つを模倣する抗体である。
【００３１】
本明細書で使用される場合、目的の抗原、例えば腫瘍関連ポリペプチド抗原標的（本明細書ではＴＷＥＡＫＲ）「に特異的に結合する」抗体、目的の抗原「に対して／に関して特異的な」抗体、または目的の抗原「を特異的に認識する」抗体は、抗体が、その抗原を発現する細胞または組織を標的とする際に治療剤として有用であり、他のタンパク質と有意に交差反応しないか、または上記抗原標的のオルソログおよび変異体（例えば、変異型、スプライス変異体、またはタンパク質分解によって切断された形態）以外のタンパク質と有意に交差反応しないような形で、その抗原に十分な親和性で結合するものである。特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「を特異的に認識する」または「に特異的に結合する」または「に対して／関して特異的な」という用語は、本明細書では、例えば、その抗原に関して、約１０−４Ｍ未満、あるいは約１０−５Ｍ未満、あるいは約１０−６Ｍ未満、あるいは約１０−７Ｍ未満、あるいは約１０−８Ｍ未満、あるいは約１０−９Ｍ未満、あるいは約１０−１０Ｍ未満、あるいは約１０−１１Ｍ未満、あるいは約１０−１２Ｍ未満、またはそれ未満の一価ＫＤを有する抗体またはその抗原結合断片によって表すことができる。抗体は、その抗体がある抗原と１つ以上の（１または複数の）参照抗原とを識別できるのであれば、その抗原「に特異的に結合」し、その抗原「に対して／関して特異的」であり、またはその抗原「を特異的に認識」する。その最も一般的な形態において、「特異的結合」、「に特異的に結合する」、「に対して／関して特異的である」または「を特異的に認識する」は、例えば次に挙げる方法の１つにしたがって決定される、目的の抗原と無関係な抗原とを識別する抗体の能力を指している。このような方法には、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ試験、ＲＩＡ試験、ＥＣＬ試験、ＩＲＭＡ試験およびペプチドスキャンが含まれるが、これらに限定されない。例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを行うことができる。スコア化は、標準的な発色法（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼを有する二次抗体およびテトラメチルベンジジンと過酸化水素）で行うことができる。特定のウェルにおける反応を、例えば４５０ｎｍにおける光学密度によってスコア化する。典型的なバックグラウンド（＝陰性反応）は、０．１ＯＤであり得る；典型的な陽性反応は、１ＯＤであり得る。これは陽性／陰性差が、５倍超、１０倍超、５０倍超、そして好ましくは１００倍超であることを意味する。典型的には、結合特異性の決定は、単一の参照抗原ではなく、例えば粉乳、ＢＳＡ、トランスフェリンなどの、およそ３〜５個の無関係な抗原のセットを使用して行われる。
【００３２】
「結合親和性」は、分子の単一結合部位とその結合パートナーとの間の非共有結合的相互作用の総和の強さを指す。別段の指示がない限り、本明細書で使用される「結合親和性」は、結合ペアのメンバー（例えば、抗体と抗原）の間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。解離定数「ＫＤ」は、ある分子（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の親和性を表すために、すなわち、リガンドが特定タンパク質にどのくらい強固に結合するかを表すために一般的に使用される。リガンド−タンパク質親和性は、それら２つの分子間の非共有結合的分子間相互作用による影響を受ける。親和性は、本明細書に記載される方法を含め、当技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。一実施形態では、本発明による「ＫＤ」または「ＫＤ値」が、実施例２にしたがって、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いる表面プラズモン共鳴アッセイによって測定される。他の適切なデバイスは、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ２００、ＢＩＡＣＯＲＥ（Ｒ）−２０００、ＢＩＡＣＯＲｅ  ４０００、ＢＩＡＣＯＲＥ（Ｒ）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）またはＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６機器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）である。
【００３３】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子、好ましくは４本のポリペプチド鎖、すなわち典型的にはジスルフィド結合によって相互に連結されている２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖で構成されるものを指すものとする。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記する）と重鎖定常領域とで構成される。重鎖定常領域は、例えば３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含み得る。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記する）と軽鎖定常領域とで構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）で構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、さらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される保存度の比較的高い領域がところどころに挿入された、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域に細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、例えば次の順序で配置された３つのＣＤＲと４つまでのＦＲとで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００３４】
本明細書で使用される「相補性決定領域」（ＣＤＲ；例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）という用語は、抗原結合にとってその存在が必要な、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。各可変ドメインは、典型的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と同定される３つのＣＤＲ領域を有する。各相補性決定領域は、Ｋａｂａｔが定義した「相補性決定領域」からのアミノ酸残基［例えば、軽鎖可変ドメインにおける残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインにおける３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）付近（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｌｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））］および／または「超可変ループ」からの残基［例えば、軽鎖可変ドメインにおける残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおける２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）付近（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ；Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１−９１７（１９８７））］を含み得る。いくつかの例において、相補性決定領域は、Ｋａｂａｔにしたがって定義されるＣＤＲ領域と超可変ループの両方からのアミノ酸を含み得る。
【００３５】
インタクトな抗体は、その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なる「クラス」に割り当てることができる。インタクトな抗体には５つの主要クラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２へと、さらに分割することができる。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと称される。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。本明細書で使用される抗体は、従来から公知の抗体およびその機能的断片である。
【００３６】
抗体／免疫グロブリンの「機能的断片」または「抗原結合抗体断片」は、本明細書では、抗原結合領域を保っている抗体／免疫グロブリンの断片（例えば、ＩｇＧの可変領域）と定義される。抗体の「抗原結合領域」は、典型的には、抗体の１つ以上の（１または複数の）超可変領域、例えばＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３領域に見られる；しかしながら、可変「フレームワーク」領域も、ＣＤＲに足場を提供することなどにより、抗原結合に重要な役割を果たすことができる。好ましくは、「抗原結合領域」は、少なくとも可変軽（ＶＬ）鎖のアミノ酸残基４〜１０３と、可変重（ＶＨ）鎖のアミノ酸残基５〜１０９とを含み、より好ましくはＶＬのアミノ酸残基３〜１０７とＶＨのアミノ酸残基４〜１１１とを含み、特に好ましいのは、完全なＶＬ鎖およびＶＨ鎖（ＶＬのアミノ酸位置１〜１０９とＶＨのアミノ酸位置１〜１１３；国際公開第９７／０８３２０号による番号付与）である。本発明における使用にとって好ましい免疫グロブリンクラスはＩｇＧである。
【００３７】
本発明の「機能的断片」または「抗原結合抗体断片」には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ダイアボディ；単一ドメイン抗体（ＤＡｂ）、線状抗体；単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成される多重特異性（例えば、二重特異性および三重特異性）抗体（Ｃ．Ａ．Ｋ  Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，ｅｄｉｔｏｒ（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｒ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ＆Ｓ．Ｄｕｅｂｅｌ，ｅｄｉｔｏｒｓ（２００１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）が含まれる。「多重特異性」または「多官能性」抗体以外の抗体は、その結合部位のそれぞれが同一であると理解される。Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂは、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間に生じる分子間ジスルフィド相互作用が最小限になるか完全に除去されるように、工学的に操作することができる。
【００３８】
本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列のＦｃ領域および変種Ｆｃ領域を含む。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもよいし、または存在しなくてもよい。本明細書で別段の指定がない限り、Ｆｃ領域中または定常領域中のアミノ酸残基の番号付与は、ＥＵ指標とも称されるＥＵ番号付与方式にしたがい、これは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されている。
【００３９】
本発明で想定される抗体または抗原結合抗体断片の変異体は、ＴＷＥＡＫＲに対する抗体または抗原結合抗体断片の結合活性が維持されている分子である。
【００４０】
本発明で想定される結合タンパク質は、例えば、アフィボディ、アドネクチン、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、ナノボディなどの抗体模倣体である（Ｇｅｂａｕｅｒ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００９；１３：２４５−２５５；Ｎｕｔｔａｌｌ  Ｓ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２００８；８：６０８−６１７に総説がある）。
【００４１】
本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合する能力を有する任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子またはそれらの組み合わせの化学的に活性な表面配置からなり、通常は特異的な三次元構造特徴と、特異的な電荷特徴とを有する。
【００４２】
「単離された」抗体は、同定され、それを発現する細胞の構成要素から分離された抗体である。細胞の夾雑構成要素は、抗体の診断的または治療的使用を妨害するであろう物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を含み得る。好ましい実施形態では、抗体が、（１）例えばローリー法、ＵＶ−Ｖｉｓ分光法、またはＳＤＳ−キャピラリーゲル電気泳動（例えば、Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩ、ＧＸ  ９０またはＢｉｏｒａｄ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ装置によるもの）などによる決定で、抗体の９５重量％を上回るまで、さらに好ましい実施形態では９９重量％を上回るまで精製されるか、（２）少なくとも１５残基のＮ末端アミノ酸配列または内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度にまで精製されるか、または（３）還元条件下もしくは非還元条件下に、クーマシーブルーを使用するか、好ましくは銀染色を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドになるまで精製される。抗体の天然環境の少なくとも１つの構成要素が存在しないので、単離された天然に存在する抗体には、組換え細胞内におけるインサイチューの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製されるであろう。
【００４３】
「抗体依存性細胞性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」は、特定の細胞傷害性細胞（例えば、ＮＫ細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）に結合した分泌Ｉｇによって、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が、抗原を保持する標的細胞に特異的に結合し、次いでその標的細胞を、例えば細胞毒によって殺すことが可能になる、細胞傷害性の一形態を指す。目的の抗体のＡＤＣＣ活性を評価するには、インビトロＡＤＣＣアッセイ、例えば米国特許第５，５００，３６２号または米国特許第５，８２１，３３７号または米国特許第６，７３７，０５６号（Ｐｒｅｓｔａ）に記載されているものを行うことができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が含まれる。
【００４４】
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。古典的補体経路の活性化は、それぞれのコグネイト抗原に結合している抗体（適切なサブクラスのもの）に補体系の第１構成要素（Ｃ１ｑ）が結合することによって開始される。補体活性化を評価するには、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載されているようなＣＤＣアッセイを行うことができる。変化したＦｃ領域アミノ酸配列を有し、Ｃ１ｑ結合の増加または減少を伴うポリペプチド変異体（変異Ｆｃ領域を有するポリペプチド）が、例えば米国特許第６，１９４，５５１号および国際公開第１９９９／５１６４２号に記載されている。
【００４５】
イムノコンジュゲート（免疫複合体）という用語（互換的に「抗体−薬物コンジュゲート（抗体−薬物複合体）」または「ＡＤＣ」とも称される）は、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、動物起源の酵素的に活性な毒素、またはその断片）、または放射性同位元素（すなわち、ラジオコンジュゲート）などの１つ以上の細胞毒性剤または細胞増殖抑制剤にコンジュゲートされた抗体を指す。イムノコンジュゲートは、癌の治療において、細胞毒性剤、すなわち細胞を殺すか、その成長または増殖を阻害する薬物を、局所的に送達するために使用されてきた（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９６），９３，８６１８−８６２３））。イムノコンジュゲートは、非コンジュゲート薬物の全身性投与が正常細胞および／または正常組織に許容できないレベルの毒性をもたらし得る場合に、腫瘍への薬物成分の標的送達と、そこでの細胞内蓄積を可能にする。抗体−毒素コンジュゲートに使用される毒素には、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシン（ｒｉｃｉｎ）などの植物毒素、ゲルダナマイシンなどの小分子毒素が含まれる。毒素は、その細胞傷害効果を、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、またはトポイソメラーゼ阻害を含む機序によって発揮し得る。
【００４６】
参照ポリヌクレオチド配列または参照ポリペプチド配列に関して、それぞれ「パーセント（％）配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性が得られるように配列をアラインメントし、必要であればギャップを導入した後に、それぞれ参照ポリヌクレオチド配列または参照ポリペプチド配列中のそれぞれ核酸残基またはアミノ酸残基と同一である候補配列中のそれぞれ核酸残基またはアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。保存的置換は、配列同一性の一部とはみなされない。好ましいのは、ギャップなしのアラインメントである。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野における技能の範囲に含まれる様々な方法で、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含めて、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。
【００４７】
「成熟抗体」または「成熟抗原結合断片」、例えば成熟Ｆａｂ変異体という用語は、ＴＷＥＡＫＲの細胞外ドメインなどの所定の抗原に対して、より強力な結合−すなわち、増加した親和性での結合−を示す抗体または抗体断片の誘導体を含む。成熟は、抗体または抗体断片の６個のＣＤＲ内にある少数の変異であってこの親和性増加につながるものを同定するプロセスである。成熟プロセスは、抗体中に変異を導入するための分子生物学的方法と、改善された結合体を同定するためのスクリーニングとの組み合わせである。
【００４８】
本明細書では、アミノ酸は、一般的に公知の３文字記号によって、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨する１文字記号によって参照され得る。同様に、ヌクレオチドは、一般的に認められている１文字コードによって参照され得る。
【００４９】
「アゴニスト」抗体または「アゴニスト活性」を有する抗体は、その標的に結合して各標的の活性化を誘導する（例えば、各標的によって媒介されるシグナル伝達経路または生物学的効果の活性化をもたらす）ものである。
【００５０】
本発明の抗体
本発明は、ＴＷＥＡＫＲ（配列番号：１６９（タンパク質）；配列番号：１７０（ＤＮＡ））の強力な活性化をもたらして、ＴＷＥＡＫＲの過剰発現を示す様々な癌細胞において、アポトーシスの強力な誘導をもたらす抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体に関する。
【００５１】
アポトーシスの誘導および増殖の阻害に関する、以前に記載されている抗ＴＷＥＡＫＲ抗体（例えば、ＰＤＬ−１９２）のＴＷＥＡＫＲアゴニスト活性は限定的であり、内因性リガンドＴＷＥＡＫの有効性に及ばない。これらの抗体は、内因性リガンドＴＷＥＡＫと比較して同程度の親和性でＴＷＥＡＫＲに結合し（Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ  ＪＳ  ｅｔ  ａｌ，ＭＡｂｓ．２０１１  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；３（４）：３６２−７５；Ｃｕｌｐ  ＰＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１０  Ｊａｎ  １５；１６（２）：４９７−５０８）、また、高い結合親和性を有する抗体が、より有効なシグナル伝達活性を必ずしも示すわけではないので（Ｃｕｌｐ  ＰＡ，ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１０  Ｊａｎ  １５；１６（２）：４９７−５０８）、アゴニスト活性のこの欠如は、低い親和性によるものではない。加えて、以前に記載されている抗体の抗腫瘍活性は、Ｆｃエフェクター機能に依存することが示されており、ＡＤＣＣは、マウスモデルにおいてインビボ有効性に重要な役割を果たすことが示されている。
【００５２】
本発明は、重要な役割を果たすＡＤＣＣを伴わずにインビボ抗腫瘍効果を達成することができるような、アポトーシスの誘導および増殖の阻害に関する強力なアゴニスト活性を有する抗体、その抗原結合断片またはその変異体を提供する。当業者であれば、抗原結合およびアゴニスト活性を維持しながら、ＡＤＣＣを抑制するためにＦｃガンマ受容体活性化を欠く抗体変異体を提供するための方法を認識している。このような方法には、ヒトＩｇＧ２およびヒトＩｇＧ４抗体アイソタイプの使用、アグリコシル化抗体の使用、またはＦｃガンマ受容体活性化を抑制する突然変異を有する抗体の使用が含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
本発明の一実施形態は、１つ以上のＴＷＥＡＫＲ発現細胞株において、カスパーゼ３／７の強力な誘導を有する抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体を提供することである。好ましい実施形態では、１つ以上のＴＷＥＡＫＲ発現細胞株は、ＷｉＤｒ、Ａ２５３、ＮＣＩ−Ｈ３２２、ＨＴ−２９および７８６−Ｏ細胞からなる群に含まれる。「カスパーゼ３／７の誘導」は、当技術分野で公知の一般的な方法（本明細書に記載されるものを含む）によって測定され得る。一実施形態では、本発明の「カスパーゼ３／７の誘導」は、カスパーゼ３／７溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ｇ８０９３）による活性の決定を使用し、ＶＩＣＴＯＲ  Ｖ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で発光の読むことによって測定される。インキュベーション時間の終了時に、カスパーゼ３／７活性を決定し、カスパーゼ３／７の誘導倍率を未処理細胞と比較して計算した。誘導倍率が１．２超、好ましくは１．５超、より好ましくは１．８超、より好ましくは２．１超、より好ましくは２．５超である場合に、抗体は、カスパーゼ３／７の「強力な誘導」を有すると言われる。以前に記載されているアゴニスト抗体［例えば、ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）、Ｐ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４）、１３６．１（ＴＰＰ−２１９４）］と比較して、およびまた３００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＷＥＡＫと比較して、ＨＴ−２９細胞においてカスパーゼ３／７の強力な誘導をもたらす抗ＴＷＥＡＫＲ抗体が提供される。癌細胞におけるこの強力なカスパーゼ３／７誘導効果は、ＷｉＤｒ、Ａ２５３、ＮＣＩ−Ｈ３２２および７８６−Ｏ細胞においても見られ、ほとんどの実験において、試験した本発明の抗体は、参照抗体［ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）、Ｐ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４）］および３００ｎｇ／ｍｌのＴＷＥＡＫと比較して高倍率の変化を誘導した。いくつかの本発明の抗体は、ごく普通の親和性（＞１０ｎＭ）（これは、内因性リガンドＴＷＥＡＫの親和性と比較して明確に低く、他の公知のアゴニスト抗体と比較して低い）でＴＷＥＡＫＲに結合する。この特性は、例えば、腫瘍浸潤の潜在的改善のようなさらなる潜在的な利点を提供する。
【００５４】
これらの目的のために、本発明の一実施形態は、新規エピトープにおいてＴＷＥＡＫＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合抗体断片であって、ＴＷＥＡＫＲ（配列番号：１６９；および図１を参照のこと）の４７位のアスパラギン酸（Ｄ４７）に対する選択的結合を特徴とする抗体またはその抗原結合抗体断片を提供することである。抗体相互作用に関して、特定のＴＷＥＡＫＲアミノ酸に対する同定された依存性は、これらの抗体について決定されたアゴニスト活性と相関する。ネイティブリガンドのＴＷＥＡＫは、ＴＷＥＡＫＲの効率的な活性化を示し、ＴＷＥＡＫＲのシステインリッチドメインのロイシン４６依存的に結合する（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳ  ２８０：１８１８−１８２９）。Ｐ４Ａ８は、非常に低いアゴニスト活性を示し、ＴＷＥＡＫＲのシステインリッチドメインの外側のドメインと少なくとも部分的に相互作用する。ＰＤＬ−１９２は、わずかなアゴニスト活性を示し、ＴＷＥＡＫリガンド部位とは反対側に、Ｒ５６依存的にシステインリッチドメインに結合する。本発明の抗体（例示的には、ＴＰＰ−２０９０）は、Ｄ４７依存的に結合し、ＴＷＥＡＫは、Ｌ４６依存的に結合し、類似するが区別可能な結合部位に結合する（図７）。したがって、強力なアゴニスト活性を示す本発明の抗体は、抗体の非常に強力なアゴニスト活性に関係する新規エピトープに（Ｄ４７依存的に）結合する。
【００５５】
ＴＷＥＡＫＲ（配列番号：１６９）の４７位のアミノ酸（Ｄ４７）は、本発明の抗体の結合に重要であるとみなされ、これは、実施例２および図６に記載されているように、この残基をアラニンに変化させることによって、前記抗体がそのＥＬＩＳＡシグナルの２０％超、あるいは３０％超、あるいは４０％超、あるいは５０％超、あるいは６０％超、あるいは７０％超、あるいは８０％超、あるいは９０％超、あるいは１００％を喪失すると、前記抗体は、ＴＷＥＡＫＲ（配列番号：１６９）の４７位のＤ（Ｄ４７）に特異的に結合することを意味する。あるいは、抗体が、ＴＰＰ−２２０３と比較してＴＰＰ−２６１４に対するそのＥＬＩＳＡシグナルの２０％超、あるいは３０％超、あるいは４０％超、あるいは５０％超、あるいは６０％超、あるいは７０％超、あるいは８０％超、あるいは９０％超、あるいは１００％を喪失すると、抗体は、ＴＷＥＡＫＲ（配列番号：１６９）の４７位のＤ（Ｄ４７）に特異的に結合する。好ましくは、抗体が、ＴＰＰ−２２０３と比較してＴＰＰ−２６１４に対するそのＥＬＩＳＡシグナルの８０％超を喪失すると、抗体は、ＴＷＥＡＫＲ（配列番号：１６９）の４７位のＤ（Ｄ４７）に特異的に結合する。
【００５６】
本発明の好ましい実施形態は、ＴＷＥＡＫＲ（配列番号：１６９）のアスパラギン酸４７（Ｄ４７）に特異的に結合する抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片である。
【００５７】
本発明のさらに好ましい実施形態は、ＴＷＥＡＫＲ（配列番号：１６９）のアスパラギン酸４７（Ｄ４７）に特異的に結合するアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片である。
【００５８】
本発明のさらに好ましい実施形態は、減少したＡＤＣＣ活性を有するか、またはＡＤＣＣ活性を欠くアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片であって、ＴＷＥＡＫＲ（配列番号：１６９）のアスパラギン酸４７（Ｄ４７）に特異的に結合するアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片である。本発明のさらに好ましい実施形態は、ＴＷＥＡＫＲ（配列番号：１６９）のアスパラギン酸４７（Ｄ４７）に特異的に結合するアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片であって、抗ＴＷＥＡＫＲ抗体のアゴニスト活性が、カスパーゼ３／７の誘導、ＴＷＥＡＫＲ発現細胞株の増殖の阻害、およびサイトカイン分泌の誘導からなるアゴニスト活性の群より選択されるアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片である。
【００５９】
本発明のさらに好ましい実施形態は、ＴＷＥＡＫＲ（配列番号：１６９）のアスパラギン酸４７（Ｄ４７）に特異的に結合するアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片であって、抗ＴＷＥＡＫＲ抗体のアゴニスト活性が、カスパーゼ３／７の誘導であるアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片である。
【００６０】
本発明のさらに好ましい実施形態は、ＴＷＥＡＫＲ（配列番号：１６９）のアスパラギン酸４７（Ｄ４７）に特異的に結合するアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片であって、抗ＴＷＥＡＫＲ抗体のアゴニスト活性が、ＴＷＥＡＫＲ発現癌細胞株におけるカスパーゼ３／７の誘導であるアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片である。
【００６１】
本発明のさらに好ましい実施形態は、ＴＷＥＡＫＲ（配列番号：１６９）のアスパラギン酸４７（Ｄ４７）に特異的に結合するアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片であって、抗ＴＷＥＡＫＲ抗体のアゴニスト活性が、ＷｉＤｒ、Ａ２５３、ＮＣＩ−Ｈ３２２、ＨＴ−２９および７８６−Ｏ細胞からなる群に含まれるＴＷＥＡＫＲ発現癌細胞株におけるカスパーゼ３／７の誘導であるアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片である。
【００６２】
本発明のさらにより好ましい実施形態は、ＴＷＥＡＫＲ（配列番号：１６９）のアスパラギン酸４７（Ｄ４７）に特異的に結合するアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片であって、抗ＴＷＥＡＫＲ抗体のアゴニスト活性が、ＨＴ−２９および／または７８６−Ｏ細胞株における、組換えヒトＴＷＥＡＫによる誘導と比較して高いカスパーゼ３／７の誘導であるアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片である。さらに好ましい実施形態では、使用される抗ＴＷＥＡＫＲ抗体の濃度は１００μｇ／ｍｌであり、組換えヒトＴＷＥＡＫの濃度は３００ｎｇ／ｍｌである。
【００６３】
本発明の別の実施形態は、様々な種のＴＷＥＡＫＲのシステインリッチドメイン（配列番号：１６９のａａ３４〜６８）（図１）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体を提供することである。
【００６４】
本発明の別の好ましい実施形態は、ＴＷＥＡＫＲのシステインリッチドメイン（配列番号：１６９のａａ３４〜６８）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体であって、ＴＷＥＡＫＲの４７位のＤ（Ｄ４７）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体を提供することである。
【００６５】
本発明の別の好ましい実施形態は、ヒト、マウス、イヌ、ブタ、ラットおよびカニクイザルからなるＴＷＥＡＫＲ種の群に含まれる少なくとも２つの種のＴＷＥＡＫＲのシステインリッチドメイン（配列番号：１６９のａａ３４〜６８）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体であって、ＴＷＥＡＫＲの４７位のＤ（Ｄ４７）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体を提供することである。好ましい実施形態では、２つの種は、ヒトおよびマウスである。
【００６６】
本発明の別の実施形態は、様々なＴＷＥＡＫＲ発現細胞株の増殖を阻害する抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体を提供することである。カスパーゼ３／７の強力な誘導と一致して、様々な癌細胞株の増殖の有効な阻害が観察される。本発明の抗体は、様々な癌細胞の増殖の阻害において、他の公知の抗体（ＰＤＬ−１９２、Ｐ４Ａ８）と比較して有効である。ほとんどの実験において、本発明の抗体は、ＴＷＥＡＫリガンドと比較して高いかまたは同じ有効性を示す。したがって、前記抗体は、限定されないが、７８６−Ｏ、ＬＯＶＯ、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、ＳＷ４８０、ＷｉＤｒ、ＨＴ−２９、Ａ２５３、ＳＫ−ＯＶ３を含む広範な癌細胞株パネルにおけるアポトーシスおよび増殖阻害の誘導効果の点でユニークである。
【００６７】
本発明のさらに好ましい実施形態は、ＴＷＥＡＫＲ（配列番号：１６９）のアスパラギン酸４７（Ｄ４７）に特異的に結合するアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片であって、抗ＴＷＥＡＫＲ抗体のアゴニスト活性が、ＴＷＥＡＫＲ発現細胞株の増殖の阻害であるアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片である。本発明の好ましい実施形態では、ＴＷＥＡＫＲ発現細胞株は、７８６−Ｏ、ＬＯＶＯ、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、ＳＷ４８０、ＷｉＤｒ、ＨＴ−２９、Ａ２５３およびＳＫ−ＯＶ３からなる群に含まれる。
【００６８】
本発明のさらにより好ましい実施形態は、ＴＷＥＡＫＲ（配列番号：１６９）のアスパラギン酸４７（Ｄ４７）に特異的に結合するアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片であって、抗ＴＷＥＡＫＲ抗体のアゴニスト活性が、組換えヒトＴＷＥＡＫによる阻害と比較して強力な７８６−Ｏおよび／またはＷｉＤｒ細胞株の増殖阻害であるアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片である。さらに好ましい実施形態では、使用される抗ＴＷＥＡＫＲ抗体の濃度は１００μｇ／ｍｌであり、組換えヒトＴＷＥＡＫの濃度は３００ｎｇ／ｍｌである。
【００６９】
本発明の別の実施形態は、限定されないが、Ａ３７５、ＷｉＤｒ細胞および異種移植片を含む様々な癌細胞からのサイトカイン分泌を強力に誘導する抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体を提供することである。誘導されるサイトカインには、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＰ−１０、ＩＬ−１ＲＡおよびＭＣＰ−１が含まれるが、これらに限定されない。誘導される好ましいサイトカインは、ＩＬ−８である。本発明の抗体は、他の公知の抗体（ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）、Ｐ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４）、１３６．１（ＴＰＰ−２１９４））と比較して高いＡ３７５細胞におけるＩＬ−８誘導効果を示す。
【００７０】
本発明の好ましい実施形態は、ＴＷＥＡＫＲ（配列番号：１６９）のアスパラギン酸４７（Ｄ４７）に特異的に結合するアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片であって、抗ＴＷＥＡＫＲ抗体のアゴニスト活性が、サイトカイン分泌の誘導であるアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片である。
【００７１】
本発明の好ましい実施形態は、ＴＷＥＡＫＲ（配列番号：１６９）のアスパラギン酸４７（Ｄ４７）に特異的に結合するアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片であって、抗ＴＷＥＡＫＲ抗体のアゴニスト活性が、ＴＷＥＡＫＲ発現癌細胞株におけるサイトカイン分泌の誘導であるアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片である。より好ましい実施形態では、ＴＷＥＡＫＲ発現癌細胞株は、Ａ３７５またはＷｉＤｒ細胞株である。
【００７２】
本発明のさらに好ましい実施形態は、ＴＷＥＡＫＲ（配列番号：１６９）のアスパラギン酸４７（Ｄ４７）に特異的に結合するアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片であって、抗ＴＷＥＡＫＲ抗体のアゴニスト活性が、サイトカイン分泌の誘導であり、サイトカインが、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＰ−１０、ＩＬ−１ＲＡおよびＭＣＰ−１からなるサイトカインの群に含まれるアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片である。
【００７３】
本発明のさらに好ましい実施形態は、ＴＷＥＡＫＲ（配列番号：１６９）のアスパラギン酸４７（Ｄ４７）に特異的に結合するアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片であって、抗ＴＷＥＡＫＲ抗体のアゴニスト活性が、ＴＷＥＡＫＲ発現癌細胞株分泌におけるサイトカイン分泌の誘導であり、サイトカインが、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＰ−１０、ＩＬ−１ＲＡおよびＭＣＰ−１からなるサイトカインの群に含まれるアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片である。
【００７４】
本発明のさらに好ましい実施形態は、ＴＷＥＡＫＲ（配列番号：１６９）のアスパラギン酸４７（Ｄ４７）に特異的に結合するアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片であって、抗ＴＷＥＡＫＲ抗体のアゴニスト活性が、ＴＷＥＡＫＲ発現癌細胞株分泌におけるサイトカイン分泌の誘導であり、サイトカインが、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＰ−１０、ＩＬ−１ＲＡおよびＭＣＰ−１からなるサイトカインの群に含まれ、ＴＷＥＡＫＲ発現癌細胞株がＡ３７５またはＷｉＤｒ細胞株であるアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片である。
【００７５】
さらに好ましい実施形態では、サイトカインはＩＬ−８であり、さらにより好ましい実施形態では、ＩＬ−８はヒトＩＬ−８である。
【００７６】
本発明の好ましい実施形態は、ＴＷＥＡＫＲ（配列番号：１６９）のアスパラギン酸４７（Ｄ４７）に特異的に結合するアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片であって、抗ＴＷＥＡＫＲ抗体のアゴニスト活性が、マウス腫瘍異種移植モデルにおけるサイトカイン分泌の誘導であるアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片である。さらに好ましい実施形態では、分泌されるサイトカインは、腫瘍異種移植片由来のヒトサイトカインである。
【００７７】
本発明のさらに好ましい実施形態は、ＴＷＥＡＫＲ（配列番号：１６９）のアスパラギン酸４７（Ｄ４７）に特異的に結合するアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片であって、抗ＴＷＥＡＫＲ抗体のアゴニスト活性が、マウス腫瘍異種移植モデルにおけるヒトＩＬ−８分泌の誘導であるアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片である。
【００７８】
さらに好ましい実施形態では、マウス腫瘍異種移植モデルは、Ａ３７５またはＷｉＤｒマウス異種移植モデルである。
【００７９】
さらに好ましい実施形態では、サイトカイン分泌の誘導は、３ｍｇ／ｋｇ以上または１０ｍｇ／ｋｇ以上の本発明の抗ＴＷＥＡＫＲ抗体の注射後に観察される。
【００８０】
本発明のさらに好ましい実施形態は、ＴＷＥＡＫＲ（配列番号：１６９）のアスパラギン酸４７（Ｄ４７）に特異的に結合するアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片であって、抗ＴＷＥＡＫＲ抗体のアゴニスト活性が、３ｍｇ／ｋｇの前記抗体の注射後のマウスＷｉＤｒ腫瘍異種移植モデルにおけるヒトＩＬ−８分泌の誘導であり、マウスＩＬ−８類似体ＫＣの誘導が検出されないアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片である。
【００８１】
さらに好ましい実施形態では、サイトカイン分泌の誘導は、腫瘍担持マウスの血漿中で観察される。
【００８２】
本発明の別の実施形態は、限定されないが、表２１に示されているものを含む広範囲の様々なＴＷＥＡＫＲ発現細胞株に結合する抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体を提供することである。表２１の例は、多くの腫瘍起源由来のヒトおよびマウス細胞株を含む（例えば、ＮＳＣＬＣ、ＣＲＣ、ＨＮＳＣＣ、ＲＣＣ、膵臓ＣＡ、ＯｖＣａ、乳房ＣＡ、黒色腫、胃ＣＡ、食道ＣＡ、膀胱ＣＡ、ＨＣＣ、前立腺ＣＡ、神経芽細胞腫）。
【００８３】
本発明の別の実施形態は、ヒトへの投与に安全な抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体を提供することである。
【００８４】
本発明の別の実施形態は、ヒトＴＷＥＡＫＲに結合する抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体であって、同様の親和性で、限定されないが、マウス、ラット、ブタ、イヌ、カニクイザルを含む別の種のＴＷＥＡＫＲと交差反応性である抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体を提供することである。好ましくは、前記他の種は、例えばマウスまたはラットなどの齧歯類である。最も好ましくは、前記抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体は、ヒトＴＷＥＡＫＲに結合し、マウスＴＷＥＡＫＲと交差反応性である。
【００８５】
本発明の別の実施形態は、ＴＷＥＡＫＲ発現が正常組織と比較して上昇しているか、またはＴＷＥＡＫＲが細胞表面から脱落して血清中で検出可能となっている悪性症状または形成異常症状の診断ツールを構成する抗体を提供することである。検出可能なマーカーにコンジュゲートした抗ＴＷＥＡＫＲ抗体が提供される。好ましいマーカーは、放射性標識、酵素、発色団または蛍光である。
【００８６】
本明細書を通じて、表３１に示されている以下の本発明の好ましい抗体について言及する：「ＴＰＰ−２０９０」、「ＴＰＰ−２１４９」、「ＴＰＰ−２０９３」、「ＴＰＰ−２１４８」、「ＴＰＰ−２０８４」、「ＴＰＰ−２０７７」、「ＴＰＰ−１５３８」、「ＴＰＰ−８８３」、「ＴＰＰ−１８５４」、「ＴＰＰ−１８５３」、「ＴＰＰ−１８５７」、「ＴＰＰ−１８５８」および「ＴＰＰ−２６５８」。
【００８７】
ＴＰＰ−２０９０は、配列番号：２に対応する重鎖領域、および配列番号：１に対応する軽鎖領域を含む抗体を表す。
【００８８】
ＴＰＰ−２１４９は、配列番号：１２に対応する重鎖領域、および配列番号：１１に対応する軽鎖領域を含む抗体を表す。
【００８９】
ＴＰＰ−２０９３は、配列番号：２２に対応する重鎖領域、および配列番号：２１に対応する軽鎖領域を含む抗体を表す。
【００９０】
ＴＰＰ−２１４８は、配列番号：３２に対応する重鎖領域、および配列番号：３１に対応する軽鎖領域を含む抗体を表す。
【００９１】
ＴＰＰ−２０８４は、配列番号：４２に対応する重鎖領域、および配列番号：４１に対応する軽鎖領域を含む抗体を表す。
【００９２】
ＴＰＰ−２０７７は、配列番号：５２に対応する重鎖領域、および配列番号：５１に対応する軽鎖領域を含む抗体を表す。
【００９３】
ＴＰＰ−１５３８は、配列番号：６２に対応する重鎖領域、および配列番号：６１に対応する軽鎖領域を含む抗体を表す。
【００９４】
ＴＰＰ−８８３は、配列番号：７２に対応する重鎖領域、および配列番号：７１に対応する軽鎖領域を含む抗体を表す。
【００９５】
ＴＰＰ−１８５４は、配列番号：８２に対応する重鎖領域、および配列番号：８１に対応する軽鎖領域を含む抗体を表す。
【００９６】
ＴＰＰ−１８５３は、配列番号：９２に対応する重鎖領域、および配列番号：９１に対応する軽鎖領域を含む抗体を表す。
【００９７】
ＴＰＰ−１８５７は、配列番号：１０２に対応する重鎖領域、および配列番号：１０１に対応する軽鎖領域を含む抗体を表す。
【００９８】
ＴＰＰ−１８５８は、配列番号：１１２に対応する重鎖領域、および配列番号：１１１に対応する軽鎖領域を含む抗体を表す。
【００９９】
ＴＰＰ−２６５８は、配列番号：２１３に対応する重鎖領域、および配列番号：１に対応する軽鎖領域を含む抗体を表す。
【０１００】
ＴＰＰ−２０９０は、配列番号：１０に対応する可変重鎖領域、および配列番号：９に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【０１０１】
ＴＰＰ−２１４９は、配列番号：２０に対応する可変重鎖領域、および配列番号：１９に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【０１０２】
ＴＰＰ−２０９３は、配列番号：３０に対応する可変重鎖領域、および配列番号：２９に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【０１０３】
ＴＰＰ−２１４８は、配列番号：４０に対応する可変重鎖領域、および配列番号：３９に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【０１０４】
ＴＰＰ−２０８４は、配列番号：５０に対応する可変重鎖領域、および配列番号：４９に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【０１０５】
ＴＰＰ−２０７７は、配列番号：６０に対応する可変重鎖領域、および配列番号：５９に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【０１０６】
ＴＰＰ−１５３８は、配列番号：７０に対応する可変重鎖領域、および配列番号：６９に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【０１０７】
ＴＰＰ−８８３は、配列番号：８０に対応する可変重鎖領域、および配列番号：７９に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【０１０８】
ＴＰＰ−１８５４は、配列番号：９０に対応する可変重鎖領域、および配列番号：８９に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【０１０９】
ＴＰＰ−１８５３は、配列番号：１００に対応する可変重鎖領域、および配列番号：９９に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【０１１０】
ＴＰＰ−１８５７は、配列番号：１１０に対応する可変重鎖領域、および配列番号：１０９に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【０１１１】
ＴＰＰ−１８５８は、配列番号：１２０に対応する可変重鎖領域、および配列番号：１１９に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
【０１１２】
さらに好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、抗体「ＴＰＰ−２０９０」、「ＴＰＰ−２１４９」、「ＴＰＰ−２０９３」、「ＴＰＰ−２１４８」、「ＴＰＰ−２０８４」、「ＴＰＰ−２０７７」、「ＴＰＰ−１５３８」、「ＴＰＰ−８８３」、「ＴＰＰ−１８５４」、「ＴＰＰ−１８５３」、「ＴＰＰ−１８５７」もしくは「ＴＰＰ−１８５８」の少なくとも１つの（好ましくは、対応する）ＣＤＲ配列と少なくとも５０％、５５％、６０％７０％、８０％、９０もしくは９５％同一の、またはそれぞれ「ＴＰＰ−２０９０」、「ＴＰＰ−２１４９」、「ＴＰＰ−２０９３」、「ＴＰＰ−２１４８」、「ＴＰＰ−２０８４」、「ＴＰＰ−２０７７」、「ＴＰＰ−１５３８」、「ＴＰＰ−８８３」、「ＴＰＰ−１８５４」、「ＴＰＰ−１８５３」、「ＴＰＰ−１８５７」もしくは「ＴＰＰ−１８５８」のＶＨもしくはＶＬ配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％もしくは９５％同一の重鎖または軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【０１１３】
さらに好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、表３１に示されている少なくとも１つのＣＤＲ配列または少なくとも１つの可変重鎖もしくは可変軽鎖配列を含む。
【０１１４】
より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：６（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号：７（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号：８（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号：３（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号：４（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号：５（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１１５】
より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１６（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号：１７（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号：１８（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号：１３（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号：１４（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号：１５（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１１６】
より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：２６（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号：２７（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号：２８（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号：２３（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号：２４（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号：２５（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１１７】
より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：３６（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号：３７（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号：３８（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号：３３（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号：３４（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号：３５（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１１８】
より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：４６（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号：４７（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号：４８（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号：４３（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号：４４（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号：４５（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１１９】
より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：５６（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号：５７（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号：５８（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号：５３（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号：５４（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号：５５（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１２０】
より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：６６（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号：６７（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号：６８（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号：６３（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号：６４（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号：６５（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１２１】
より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：７６（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号：７７（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号：７８（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号：７３（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号：７４（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号：７５（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１２２】
より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：８６（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号：８７（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号：８８（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号：８３（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号：８４（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号：８５（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１２３】
より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：９６（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号：９７（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号：９８（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号：９３（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号：９４（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号：９５（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１２４】
より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１０６（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号：１０７（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号：１０８（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号：１０３（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号：１０４（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号：１０５（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１２５】
より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１１６（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号：１１７（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号：１１８（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号：１１３（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号：１１４（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号：１１５（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
【０１２６】
本発明の抗体のＣＤＲの配列アラインメントは、コンセンサス配列を明らかにする（図２４を参照のこと）。より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、
式ＰＹＰＭＸ（配列番号：１７１）（式中、Ｘは、ＩまたはＭである）を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖ＣＤＲ１；
式ＹＩＳＰＳＧＧＸＴＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号：１７２）（式中、Ｘは、ＳまたはＫである）を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖ＣＤＲ２；および
式ＧＧＤＴＹＦＤＹＦＤＹ（配列番号：１７３）を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖ＣＤＲ３
を含む可変重鎖と、
式ＲＡＳＱＳＩＳＸＹＬＮ（配列番号：１７４）（式中、Ｘは、ＧまたはＳである）を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖ＣＤＲ１；
式ＸＡＳＳＬＱＳ（配列番号：１７５）（式中、Ｘは、Ｑ、ＡまたはＮである）を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖ＣＤＲ２；および
式ＱＱＳＹＸＸＰＸＩＴ（配列番号：１７６）（式中、５位のＸは、ＴまたはＳであり、６位のＸは、ＴまたはＳであり、８位のＸは、ＧまたはＦである）を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖ＣＤＲ３
を含む可変重鎖とを含む。
【０１２７】
抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）内だけではなくフレームワーク（ＦＲ）の配列も異なる。これらの配列差異は、異なるＶ遺伝子でコードされる。ヒト抗体生殖系列レパートリーは、完全に配列決定されている。ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５およびＶＨ６の配列相同性にしたがって、６つのサブファミリーに分類され得る約５０個の機能ＶＨ生殖系列遺伝子がある（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７，７７６−７９８；Ｍａｔｓｕｄａ＆Ｈｏｎｊｏ，１９９６，Ａｄｖａｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６２，１−２９）。７つのサブファミリーを含む約４０個の機能ＶＬκ遺伝子が公知である（Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４，８２７−８３６；Ｂａｒｂｉｅ＆Ｌｅｆｒａｎｃ，１９９８，Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．１５，１７１−１８３）。Ｖκ１、Ｖκ２、Ｖκ３、Ｖκ４、Ｖκ５、Ｖκ６およびＶκ７。ヒトＶＨ３サブファミリーに属する本発明の抗体の重鎖、およびヒトＶκ１サブファミリーに属する本発明の抗体の軽鎖がそれぞれ本明細書に開示される。同じサブファミリーに属する抗体のフレームワーク配列は密接に関係する（例えば、ヒトＶｈ３サブファミリーメンバーを含む抗体はすべて、同程度の安定性を共有する）ことが公知である（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００９，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．２２（３）：１２１−１３４）。対応する元の抗体の特別な特徴を維持しながら、抗体由来のＣＤＲを異なるフレームワークに移植し得ることが当技術分野で周知である。異なるサブファミリーに属する同じ種のフレームワークだけではなく、異なる種に属するフレームワークへのＣＤＲの移植も成功している。さらなる実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、表３１に示されている本発明の抗体の少なくとも１つのＣＤＲ配列と、ヒト可変鎖フレームワーク配列とを含む。
【０１２８】
好ましい実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、表３１に示されている、可変軽鎖のＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖または軽鎖抗原結合領域と、本発明の可変重鎖抗体のＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖または重鎖抗原結合領域と、ヒト可変軽鎖およびヒト可変重鎖フレームワーク配列とを含む。
【０１２９】
より好ましい実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、表３１に示されている、可変軽鎖のＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖または軽鎖抗原結合領域と、本発明の可変重鎖抗体のＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖または重鎖抗原結合領域と、可変重鎖のヒトＶＨ３サブファミリーフレームワーク配列と、可変軽鎖のヒトＶκ１サブファミリーフレームワーク配列とを含む。より好ましい実施形態では、可変重鎖のヒトＶＨ３サブファミリーフレームワーク配列は、ＶＨ３−０７、ＶＨ３−０９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０．３、ＶＨ３−３０．５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４およびＶＨ３−ｄからなるＶＨ３サブファミリーフレームワーク配列の群に含まれる。さらにより好ましい実施形態では、ヒトＶＨ３フレームワーク配列は、ヒトＶＨ３−２３フレームワーク配列と比較して１６個以下または１５個以下のアミノ酸置換を有する。より好ましい実施形態では、可変軽鎖のヒトＶκ１サブファミリーフレームワーク配列は、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ１−８、Ｖκ１Ｄ−８、Ｖκ１−９、Ｖκ１−１２、Ｖκ１Ｄ−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ１Ｄ−１３、Ｖκ１−１６、Ｖκ１Ｄ−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ１Ｄ−１７、Ｖκ１−２７、Ｖκ１−３３、Ｖκ１Ｄ−３３、Ｖκ１−３７、Ｖκ１Ｄ−３７、Ｖκ１−３９、Ｖκ１Ｄ−３９、Ｖκ１Ｄ−４２、Ｖκ１Ｄ−４３からなるＶκ１サブファミリーフレームワーク配列の群に含まれる。さらにより好ましい実施形態では、ヒトＶκ１フレームワーク配列は、ヒトＶκ１−３９フレームワーク配列と比較して１５個以下または１３個以下のアミノ酸置換を有する。
【０１３０】
より好ましい実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、表３１に示されている、可変軽鎖のＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖または軽鎖抗原結合領域と、本発明の可変重鎖抗体のＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖または重鎖抗原結合領域と、可変重鎖のヒトＶＨ３サブファミリーフレームワーク配列と、可変軽鎖のヒトＶκ１−３９フレームワーク配列とを含む。
【０１３１】
最も好ましい実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、表３１に示されている、可変軽鎖のＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖または軽鎖抗原結合領域と、本発明の可変重鎖抗体のＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖または重鎖抗原結合領域と、可変重鎖のヒトＶＨ３−３フレームワーク配列と、可変軽鎖のヒトＶκ１−３９フレームワーク配列とを含む。
【０１３２】
好ましい実施形態では、可変軽鎖フレームワーク配列は、ヒトＶκ１サブファミリーに属し、可変重鎖フレームワーク配列は、ヒトＶＨ３サブファミリーに属する。ＶＨ３サブファミリーまたはＶκ１サブファミリー可変鎖フレームワーク配列は、各ＣＤＲ配列の挿入のためのフレームワークを採用するために、各野生型（ＷＴ）フレームワーク配列と比較して配列変異を含み得る。さらなる実施形態では、ＷＴフレームワーク配列と比較して配列変異を含むＶＨ３サブファミリーまたはＶκ１サブファミリー可変鎖フレームワーク配列は、それぞれＶＨ３サブファミリーメンバーまたはＶκ１サブファミリーメンバーである。好ましくは、このような変異体フレームワーク配列は、最大１５個の配列変異、より好ましくは最大１０個の配列変異、より好ましくは最大５個の配列変異、最も好ましくは最大３個の配列変異を有する。
【０１３３】
例えば、本発明の抗体は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）であり得、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖであり得る。したがって、本発明の抗体断片は、本明細書に記載される１つ以上の挙動を示す抗原結合領域であり得るか、または前記抗原結合領域を含有し得る。
【０１３４】
好ましい実施形態では、本発明の抗体または抗原結合抗体断片は、モノクローナルである。さらに好ましい実施形態では、本発明の抗体または抗原結合抗体断片は、ヒト、ヒト化またはキメラである。
【０１３５】
別の態様では、本発明は、ＴＷＥＡＫＲに特異的に結合し、および／またはＴＷＥＡＫＲに対して高い親和性を有する抗原結合領域を有する抗体またはその抗原結合断片を提供する。親和性測定が２５０ｎＭ未満である場合（抗体または抗原結合断片の一価親和性）、抗体またはその抗原結合断片は、抗原に対して「高い親和性」を有すると言われる。本発明の抗体または抗原結合領域は、好ましくは、表６に示されているように、ヒトＴＷＥＡＫＲに対する一価親和性として決定した場合に（実施例２を参照のこと）、２５０ｎＭ未満、好ましくは１５０ｎＭ未満、より好ましくは１００ｎＭ未満、より好ましくは５０ｎＭ未満、より好ましくは３０ｎＭ未満、より好ましくは２０ｎＭ未満の親和性で、ヒトＴＷＥＡＫＲに結合し得る。
【０１３６】
別の態様では、本発明は、例えばＴＰＰ−２０９０について図１１に示されているように、ＴＷＥＡＫＲに特異的に結合するが、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの他のメンバー（表２０を参照のこと）に結合しない抗原結合領域を有する抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０１３７】
ＩｇＧ１フォーマットを、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）による細胞ベースの親和性評価に使用した。表２１は、例えばＴＰＰ−２０９０およびＴＰＰ−１５３８について、ヒトおよびマウス起源の癌細胞株における代表的な抗ＴＷＥＡＫＲ抗体の結合の概要を提供する。本発明のＦＡＣＳ分析によって検出された抗体の最大細胞結合は、記載されている他の抗体と比較してわずかであるが、それにもかかわらず、これらの抗体は非常に強力なアゴニスト活性を有しており、本発明の抗体について見出された新規エピトープの重要性を示している。
【０１３８】
本発明の別の実施形態は、ＴＷＥＡＫＲ発現細胞に対する結合後に効率的にインターナリゼーションされる抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体を提供することである。本発明の抗体は、公知の医薬と共に同時投与され得、一部の場合には、前記抗体は、それ自体が改変され得る。例えば、有効性を潜在的にさらに増加させるために、抗体を細胞毒性剤、免疫毒素、担毒体または放射性同位体にコンジュゲートし得る。
【０１３９】
ＴＷＥＡＫＲ発現腫瘍細胞内へのその半最大インターナリゼーション時間（ｔ１／２）（顆粒数／細胞によって測定）が４００分間未満、またはより好ましくは３００分間未満、さらにより好ましくは２００分間未満であれば、本発明の抗体または抗原結合断片は「効率的に」インターナリゼーションする。実施例７および図１７に記載されているプロトコールによって決定した場合に、１００分間以下の半最大インターナリゼーション時間（ｔ１／２）を有する抗体または抗原結合断片がさらに好ましい。
【０１４０】
インターナリゼーション可能な本発明の抗体またはその抗原結合断片は、抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）のターゲティング部分として適切である。抗体または抗原結合断片は、化合物、好ましくは細胞毒性剤をＴＷＥＡＫＲ発現細胞に送達するためのインビトロ方法またはインビボ方法に適切である。効率的なインターナリゼーションは、蛍光標識抗体を用いて示されている（実施例７）。抗体薬物コンジュゲートとしての効率的な使用は、サポリンコンジュゲート抗体を用いて例証されている（実施例７）。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片またはこれらをコードする核酸は、単離されている。単離された生物学的成分（例えば、核酸分子またはタンパク質、例えば抗体）は、前記成分が天然に存在する生物の細胞中の他の生物学的成分（例えば、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質および細胞小器官）から実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸およびタンパク質には、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＵＳＡ）およびＲｏｂｅｒｔ  Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９４（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ  ＬＬＣ）に記載されている標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸を包含する。
【０１４２】
本発明の抗体は、例えば、ｎ−ＣｏＤｅＲ（登録商標）技術を使用して、多数の健常志願者の抗体から単離されたアミノ酸配列をベースとする組換え抗体ライブラリーに由来し得、完全ヒトＣＤＲは、新たな抗体分子に組換えられる。あるいは、Ｈｏｅｔ  ＲＭ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００５；２３（３）：３４４−８）に記載されている完全ヒト抗体ファージディスプレイライブラリーのような抗体ライブラリーを使用して、ＴＷＥＡＫＲ特異的抗体を単離し得る。
【０１４３】
抗体の作製
完全ヒト抗体ファージディスプレイライブラリー（Ｈｏｅｔ  ＲＭ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００５；２３（３）：３４４−８）を使用して、固定化標的としてヒトおよびマウスＴＷＥＡＫＲの二量体Ｆｃ融合細胞外ドメインを用いるタンパク質パンニング（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．Ｒ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００５；２３（３）：１１０５−１６）によって、本発明のＴＷＥＡＫＲ特異的ヒトモノクローナル抗体を単離した。
【０１４４】
１１個の異なるＦａｂファージを同定し、対応する抗体を哺乳動物ＩｇＧ発現ベクター（これは、可溶性Ｆａｂに存在しないミッシングＣＨ２−ＣＨ３ドメインを提供する）に再クローニングした。好ましい抗体の同定後、これらを全長ＩｇＧとして発現させた。例えば、Ｔｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １２  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｍｉｃｈｅａｌ  Ｒ．Ｄｙｓｏｎ  ａｎｄ  Ｙｖｅｓ  Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｓｃｉｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｌｔｄ，２００７に記載されている哺乳動物細胞において、これらの構築物を一過性発現させた（実施例１を参照のこと）。実施例２に記載されているように、プロテインＡクロマトグラフィーによって抗体を精製し、ＥＬＩＳＡおよびＢＩＡｃｏｒｅ分析において、可溶性単量体ＴＷＥＡＫＲに対する結合親和性をさらに特性評価した。抗ＴＷＥＡＫＲ抗体の細胞結合特性を決定するために、細胞株（ＨＴ２９、ＨＳ６８、ＨＳ５７８）のパネルに対するフローサイトメトリーによって、結合を試験した。
【０１４５】
ＮＦ−κＢレポーター遺伝子アッセイを実施して、同定された１１個の抗体（ヒトＩｇＧ１）すべてのアゴニスト活性を評価した。さらなる効力および親和性の成熟のために、最も強力なインビトロ有効性を有する抗体（ＴＰＰ−８８３）を選択した（詳細については、実施例１を参照のこと）。改善されたアゴニスト活性を有する１個の単一置換変異体が検出された：ＣＤＲ−Ｈ３のＧ１０２Ｔ。最終的に、最良の単一置換変異体Ｇ１０２Ｔと比較して増強した親和性に基づいて、７個の変異体を選択した。これらの対応するＤＮＡを哺乳動物ＩｇＧ発現ベクターに再クローニングし、上記ＮＦｋＢレポーター細胞アッセイにおいて、機能活性について試験した。最後に、得られた配列をヒト生殖系列配列と比較し、親和性および効力に対して有意な影響を伴わない偏差を調整した。抗体ライブラリースクリーニングによって、ならびに親和性および／または効力の成熟によって、以下の抗体を得た：「ＴＰＰ−２０９０」、「ＴＰＰ−２１４９」、「ＴＰＰ−２０９３」、「ＴＰＰ−２１４８」、「ＴＰＰ−２０８４」、「ＴＰＰ−２０７７」、「ＴＰＰ−１５３８」、「ＴＰＰ−８８３」、「ＴＰＰ−１８５４」、「ＴＰＰ−１８５３」、「ＴＰＰ−１８５７」および「ＴＰＰ−１８５８」。
【０１４６】
抗体ファージディスプレイスクリーニング（例えば、Ｈｏｅｔ  ＲＭ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００５；２３（３）：３４４−８を参照のこと）、十分に確立されたハイブリドーマ技術（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ．１９７５  Ａｕｇ  ７；２５６（５５１７）：４９５−７を参照のこと）、またはマウスの免疫化（とりわけ、ｈＭＡｂマウス（例えば、ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ  ｍｏｕｓｅ（登録商標））の免疫化）のような当技術分野で公知の方法によって、本発明の抗体をさらに作製し得る。
【０１４７】
ペプチド変異体
本発明の抗体または抗原結合断片は、本明細書で提供される特定のペプチド配列に限定されない。むしろ本発明は、これらのポリペプチドの変異体も包含する。本開示ならびに従来から利用できる技術および参考文献を参照することで、当業者であれば、本明細書に開示される抗体の機能的変異体を調製し、試験し、利用することができると共に、ＴＷＥＡＫＲに結合する能力を有するこれらの変異体が本発明の範囲に包含されることを理解するであろう。
【０１４８】
変異体には、例えば、本明細書に開示されるペプチド配列と比較して変化した少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（超可変）および／またはフレームワーク（ＦＲ）（可変）ドメイン／位置を有する抗体が含まれ得る。この概念をよりよく説明するために、抗体の構造を以下に簡単に説明する。
【０１４９】
抗体は２本のペプチド鎖で構成され、それぞれが１つ（軽鎖）または３つ（重鎖）の定常ドメインと可変領域（ＶＬ、ＶＨ）とを含有し、このうち後者は、いずれも、４つのＦＲ領域と、その間に配置された３つのＣＤＲから構成されている。抗原結合部位は１つ以上のＣＤＲによって形成されるが、ＦＲ領域はＣＤＲに構造的フレームワークを提供しており、したがって、抗原結合において重要な役割を果たしている。ＣＤＲまたはＦＲ領域中の１つ以上のアミノ酸残基を改変することによって、当業者であれば、突然変異された抗体配列または多様化された抗体配列をルーチンに作製させることができ、それらを、例えば新たな性質または改善された性質について、抗原に対してスクリーニングすることができる。
【０１５０】
本発明のさらに好ましい実施形態は、ＶＨ配列およびＶＬ配列が表３１に示すように選択された抗体または抗原結合断片である。当業者であれば、表３１のデータを使用して、本発明の範囲内のペプチド変異体を設計することができる。変異体は１つ以上のＣＤＲ領域内のアミノ酸を変化させることによって構築することが好ましい；変異体はまた、１つ以上の変化したフレームワーク領域を有し得る。フレームワーク領域内に改変を加えることもできる。例えば、生殖細胞系配列と比較して残基に変動があるペプチドＦＲドメインが変化され得る。
【０１５１】
あるいは、当業者であれば、例えばＫｎａｐｐｉｋ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ  ２０００，２９６：５７−８６に記載されている手法などを使用して本明細書に開示されるアミノ酸配列を、その抗体と同じクラスの公知配列と比較することにより、同じ分析を行うこともできる。
【０１５２】
さらに、ある抗体を、抗体中の１つ以上のアミノ酸残基（好ましくは１つ以上のＣＤＲ中のアミノ酸残基）を多様化することによるさらなる最適化の出発点として使用し、その結果生じた一群の抗体変異体を、改善された性質を有する変異体についてスクリーニングすることによって、変異体を取得することもできる。特に好ましいのは、ＶＬおよび／またはＶＨのＣＤＲ３中の１つ以上のアミノ酸残基の多様化である。多様化は、例えば、トリヌクレオチド変異誘発（ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＴＲＩＭ）技術（Ｖｉｒｎｅｋａｓ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９４，２２：５６００．）を使用して一群のＤＮＡ分子を合成することによって行うことができる。抗体またはその抗原結合断片には、例えば、半減期の変化（例えば、Ｆｃ部分の改変またはＰＥＧなどのさらなる分子の取り付け）、結合親和性の変化、またはＡＤＣＣもしくはＣＤＣ活性の変化につながる改変などの、改変／変異を有する分子が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５３】
抗体の一実施形態は、変化したＡＤＣＣをもたらす改変を含むＴＰＰ−２６５８である。ＴＰＰ−２６５８は、（ＴＰＰ−２０９０と比較して）Ｆｃ部分のＮ２９７において、ＡＤＣＣを欠くアグリコシル化抗体変異体をもたらす突然変異を有する。
【０１５４】
保存的アミノ酸変異体
本明細書に記載される抗体ペプチド配列の全体的分子構造を保存しているポリペプチド変異体を作製することができる。個々のアミノ酸の性質を考慮して、当業者であれば、いくつかの合理的な置換を認識するであろう。アミノ酸置換、すなわち「保存的置換」は、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。
【０１５５】
例えば、（ａ）非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれ；（ｂ）極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ；（ｃ）陽性荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれ；（ｄ）陰性荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。置換は、典型的には、（ａ）〜（ｄ）のグループ内で行うことができる。加えて、グリシンおよびプロリンは、αヘリックスを破壊するその能力に基づいて、互いに置換することができる。同様に、アラニン、システイン、ロイシン、メチオニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンおよびリジンなどの特定のアミノ酸は、αヘリックス中に見られることの方が多く、一方、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびスレオニンは、βプリーツシート中に見られることの方が多い。グリシン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、およびプロリンはターン中によく見出される。いくつかの好ましい置換は、次に挙げるグループ内で行うことができる：（ｉ）ＳおよびＴ；（ｉｉ）ＰおよびＧ；ならびに（ｉｉｉ）Ａ、Ｖ、ＬおよびＩ。公知の遺伝暗号、組換え技術および合成ＤＮＡ技術を考慮して、当業者であれば、保存的アミノ酸変異体をコードするＤＮＡを容易に構築することができる。
【０１５６】
本明細書では、２つのポリペプチド配列間の「配列同一性」は、それらの配列の間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。「配列相同性」は、同一であるか、または保存的アミノ酸置換に相当する、アミノ酸のパーセンテージを示す。
【０１５７】
本発明のＤＮＡ分子
本発明はまた、本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードするＤＮＡ分子に関する。発現される抗体に使用されるＤＮＡ配列は、表３２に示されている。これらの配列は、哺乳動物発現に最適化される。本発明のＤＮＡ分子は本明細書に開示される配列に限定されるわけではなく、その変異体も含む。本発明に含まれるＤＮＡ変異体は、ハイブリダイゼーションにおけるその物理的性質に言及することによって表すことができる。当業者であれば、ＤＮＡを使用してその相補体を同定することができ、ＤＮＡは二本鎖であることから、核酸ハイブリダイゼーション技術を使用して、その等価物またはホモログを同定することができることを認識するであろう。ハイブリダイゼーションが１００％未満の相補性で起こり得ることも認識されよう。しかしながら、条件を適切に選択すれば、ハイブリダイゼーション技術を使用して、ＤＮＡ配列を特定のプローブに対するその構造的関連性に基づいて区別することができる。このような条件に関する指針については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  前掲およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．，＆Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．ｅｄｓ．（１９９５）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）を参照のこと。
【０１５８】
２つのポリヌクレオチド配列間の構造類似性は、それら２つの配列が互いにハイブリダイズするであろう条件の「ストリンジェンシー」の関数として表現することができる。本明細書で使用される「ストリンジェンシー」という用語は、その条件がハイブリダイゼーションを嫌う度合を指す。ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーションに好ましくないものであり、このような条件下では、構造的に最も近縁の分子だけが互いにハイブリダイズするであろう。逆に、非ストリンジェントな条件は、より低度の構造的関連性を示す分子のハイブリダイゼーションにとって有利になる。したがって、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、２つの核酸配列の構造的関係と直接的に相関する。次の関係は、ハイブリダイゼーションと関連性とを相関させるのに有用である（式中、Ｔｍは核酸二重鎖の融解温度である）：
ａ．Ｔｍ＝６９．３＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）℃
ｂ．ミスマッチ塩基対の数が１％増加するごとに、二重鎖ＤＮＡのＴｍは１℃低下する。
【０１５９】
ｃ．（Ｔｍ）μ２−（Ｔｍ）μ１＝１８．５ｌｏｇ１０μ２／μ１
式中、μ１およびμ２は２つの溶液のイオン強度である。
【０１６０】
ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、総ＤＮＡ濃度、イオン強度、温度、プローブサイズおよび水素結合を破壊する薬剤の存在などの数多くの因子の関数である。ハイブリダイゼーションを促進する因子には、高いＤＮＡ濃度、高いイオン強度、低い温度、長いプローブサイズ、および水素結合を破壊する薬剤の不在が含まれる。ハイブリダイゼーションは、典型的には、「結合」段階および「洗浄」段階の二段階で行われる。
【０１６１】
機能的に等価な変異体
本発明の範囲内のさらに別のクラスのＤＮＡ変異体は、それらがコードする産物に言及することによって表すことができる。これらの機能的に等価なポリヌクレオチドは、遺伝暗号の縮重のために同じペプチド配列をコードするという事実を特徴とする。
【０１６２】
本明細書で提供されるＤＮＡ分子の変異体をいくつかの異なる方法で構築できることが認識される。例えば、それらは、完全な合成ＤＮＡとして構築することができる。２０〜約１５０ヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドを効率的に合成する方法が広く利用可能である。Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｅｃｔｉｏｎ  ２．１１，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２１（１９９３）を参照のこと。Ｋｈｏｒａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７２：２０９  ２１７（１９７１）によって初めて報告された方法で、オーバーラップオリゴヌクレオチドを合成し、アセンブルすることができる。Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．前掲、Ｓｅｃｔｉｏｎ  ８．２も参照のこと。適切なベクターへのクローニングを容易にするために、合成ＤＮＡは、好ましくは、遺伝子の５’端および３’端で操作された便利な制限部位を有するように設計される。
【０１６３】
示されているように、変異体を作製させる方法は、本明細書に開示されるＤＮＡの１つから出発し、次に部位特異的変異誘発を行うことである。Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．前掲、ｃｈａｐｔｅｒ  ８，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３７（１９９７）を参照のこと。典型的な方法では、標的ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡバクテリオファージビヒクルにクローニングする。一本鎖ＤＮＡを単離し、所望の（１または複数の）ヌクレオチド変化を含有するオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。相補鎖を合成し、二本鎖ファージを宿主中に導入する。その結果生じる子孫の一部は所望の突然変異体を含有し、そのことは、ＤＮＡ配列決定を使用して確認することができるであろう。加えて、子孫ファージが所望の突然変異体になる確率を増加させる様々な方法を利用することができる。これらの方法は当業者には周知であり、このような突然変異体を作製させるためのキットが市販されている。
【０１６４】
組換えＤＮＡ構築物および発現
本発明はさらに、本発明のヌクレオチド配列の１つ以上を含む組換えＤＮＡ構築物を提供する（表３２を参照のこと）。本発明の組換え構築物は、本発明の抗体またはその抗原結合断片またはその変異体をコードするＤＮＡ分子が挿入されるプラスミド、ファージミド、ファージまたはウイルスベクターなどのベクターと共に使用される。
【０１６５】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、連結されている別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製する核酸構造体としてのベクター、ならびに導入された先の宿主細胞のゲノム中に組み入れられるベクターを含む。特定のベクターは、機能的に連結されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。
【０１６６】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」という用語は互換的に使用され、外来性核酸が導入された細胞（このような細胞の子孫を含む）を指す。宿主細胞には、初代形質転換細胞およびそれに由来する子孫を継代の回数に関わらず含む「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれる。子孫の核酸含量は親細胞と完全に同一ではなくてもよく、突然変異を含み得る。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたのと同じ機能または生物活性を有する突然変異体子孫は、本明細書に含まれる。
【０１６７】
本明細書で提供される抗体、その抗原結合部分または変異体は、宿主細胞における軽鎖および重鎖またはその一部をコードする核酸配列の組換え発現によって調製することができる。抗体、その抗原結合部分または変異体を組換え発現させるために、軽鎖および／もしくは重鎖またはその一部をコードするＤＮＡ断片を保有する１つ以上の組換え発現ベクターで、軽鎖および重鎖が宿主細胞中で発現するように、宿主細胞をトランスフェクトすることができる。標準的な組換えＤＮＡ法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９），Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９）およびＢｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第４，８１６，３９７号に記載されている方法などを使用して、重鎖および軽鎖をコードする核酸を調製し、および／または取得し、これらの核酸を組換え発現ベクター中に組み込み、そのベクターを宿主細胞中に導入する。
【０１６８】
加えて、重鎖および／または軽鎖の可変領域をコードする核酸配列は、例えば、全長抗体鎖もしくはＦａｂ断片をコードする核酸、またはｓｃＦｖに変換することができる。ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片は、別のＤＮＡ断片（例えば、抗体定常領域またはフレキシブルなリンカーをコードするもの）に（２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームになるように）作動的に連結することができる。ヒト重鎖および軽鎖定常領域の配列は当技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｌ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照のこと）、これらの領域を含むＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。
【０１６９】
特定のアッセイでは、マウスＩｇＧとしての本発明の抗体の発現が好ましく、例えばヒトサンプルでの免疫組織化学は、マウス抗体を使用することによって、より容易に分析することができる。
【０１７０】
ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチド配列を作製するために、ＶＬ領域とＶＨ領域とがフレキシブルなリンカーで接合されている連続した単鎖タンパク質としてＶＨ配列およびＶＬ配列が発現し得るように、ＶＨコード核酸およびＶＬコード核酸を、フレキシブルなリンカーをコードする別の断片と作動的に連結することができる（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４を参照のこと）。
【０１７１】
抗体、その抗原結合断片またはその変異体を発現させるには、標準的な組換えＤＮＡ発現法を使用することができる（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）を参照のこと）。例えば、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを発現ベクター中に挿入し、次にそれを適切な宿主細胞中にトランスフェクトすることができる。適切な宿主細胞は原核細胞および真核細胞である。原核宿主細胞の例は、例えば細菌であり、真核宿主細胞の例は、酵母、昆虫または哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、重鎖をコードするＤＮＡと軽鎖をコードするＤＮＡが、別々のベクターに挿入される。他の実施形態では、重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡが、同じベクターに挿入される。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベル、および発現が構成的または誘導性であるかなどの因子によって影響されると理解される。
【０１７２】
細菌発現
細菌での使用に有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルと共に、機能的プロモーターと作動可能な読み枠で挿入することによって構築される。ベクターは、ベクターの維持が保証されるように、また所望であれば、宿主内での増幅がもたらされるように、１つ以上の表現型選択可能マーカーと複製起点とを含むであろう。形質転換に適切な原核宿主には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ならびにシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、およびスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属の様々な種が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７３】
細菌ベクターは、例えばバクテリオファージベース、プラスミドベース、またはファージミドベースのベクターであり得る。これらのベクターは、典型的には周知のクローニングベクターｐＢ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の要素を含有する市販のプラスミドに由来する選択可能マーカーおよび細菌複製起点を含有し得る。適切な宿主株を形質転換し、その宿主株を適切な細胞密度まで成長させた後、選択したプロモーターを、適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）によって抑制解除／誘導し、細胞をさらにある期間培養する。細胞を典型的には遠心分離によって回収し、物理的または化学的手段によって破壊し、その結果得られた粗抽出物を、さらなる精製のためにとっておく。
【０１７４】
細菌系では、発現させるタンパク質の使用目的に応じて、いくつかの発現ベクターを、有利に選択することができる。例えば、抗体を作製させるために、またはペプチドライブラリーをスクリーニングするために、上記タンパク質を大量に生産しようとする場合は、例えば、精製が容易な融合タンパク質産物の高レベルな発現を指示するベクターが望ましいであろう。
【０１７５】
したがって、本発明の実施形態は、本発明の新規抗体をコードする核酸を含む発現ベクターである。例示的な説明については、実施例１を参照のこと。
【０１７６】
本発明の抗体またはその抗原結合断片またはその変異体には、天然精製産物、化学合成手法の生成物、ならびに例えば大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌などを含む原核宿主や、シュードモナス属、ストレプトミセス属およびスタフィロコッカス属の様々な種から（好ましくは大腸菌細胞から）組換え技術によって生産された産物が含まれる。
【０１７７】
哺乳動物発現および精製
哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列には、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーなどが含まれる。ウイルス調節要素のさらなる説明およびその配列については、例えばＳｔｉｎｓｋｉによる米国特許第５，１６８，０６２号、Ｂｅｌｌらによる米国特許第４，５１０，２４５号、およびＳｃｈａｆｆｎｅｒらによる米国特許第４，９６８，６１５号を参照のこと。組換え発現ベクターは複製起点および選択可能マーカーも含み得る（例えば、Ａｘｅｌらによる米国特許第４，３９９，２１６号、米国特許第４，６３４，６６５号および米国特許第５，１７９，０１７号を参照のこと）。適切な選択可能マーカーには、そのベクターが導入されている宿主細胞にＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する遺伝子が含まれる。例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子は、メトトレキサートに対する耐性を付与し、ｎｅｏ遺伝子はＧ４１８に対する耐性を付与する。
【０１７８】
宿主細胞への発現ベクターのトランスフェクションは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、およびＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどの標準的技術を使用して行うことができる。
【０１７９】
本明細書で提供される抗体、その抗原結合断片またはその変異体を発現させるのに適切な哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）［例えば、Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されているようにＤＨＦＲ選択可能マーカーと共に使用されるＵｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載されているｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む］、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、発現したタンパク質が宿主細胞を成長させる培養培地中に分泌されるように、発現ベクターが設計される。抗体、その抗原結合断片または変異体は、標準的なタンパク質精製方法を使用して、培養培地から回収することができる。
【０１８０】
本発明の抗体またはその抗原結合断片またはその変異体は、例えば限定されないが、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、プロテインＡクロマトグラフィー、プロテインＧクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーなどの周知の方法によって、組換え細胞培養物から回収し精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）も精製に使用することができる。例えば、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｏｒ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，（１９９７−２００１）の例えばＣｈａｐｔｅｒ１、４、６、８、９、１０を参照のこと（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１８１】
本発明の抗体またはその抗原結合断片またはその変異体には、天然精製産物、化学合成手法の生成物、ならびに例えば酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含む真核宿主から組換え技術によって生産された産物が含まれる。組換え生産手法に使用する宿主に応じて、本発明の抗体はグリコシル化体であり得るか、または非グリコシル化体であり得る。このような方法は、多くの標準的な実験マニュアル、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，ｓｕｐｒａ，Ｓｅｃｔｉｏｎｓ  １７．３７−１７．４２；Ａｕｓｕｂｅｌ前掲，Ｓｅｃｔｉｏｎ１７．３７〜１７．４２；Ａｕｓｕｂｅｌ前掲，Ｃｈａｐｔｅｒ１０、１２、１３、１６、１８および２０などに記載されている。
【０１８２】
したがって、本発明の実施形態はまた、ベクターまたは核酸分子を含む宿主細胞であって、哺乳動物細胞などの高等真核宿主細胞、酵母細胞などの下等真核宿主細胞であり得、細菌細胞などの原核細胞であり得る宿主細胞である。
【０１８３】
本発明の別の実施形態は、宿主細胞を使用して抗体および抗原結合断片を生産する方法であって、前記宿主細胞を適切な条件下で培養すること、および前記抗体を回収することを含む方法である。
【０１８４】
したがって、本発明の別の実施形態は、本発明の宿主細胞を用いて本発明の抗体を生産すること、およびこれらの抗体を少なくとも９５重量％の均一性まで精製することである。
【０１８５】
治療方法
治療方法は、治療有効量の本発明によって想定される抗体またはその抗原結合断片またはその変異体を、治療を必要とする被験体に投与することを含む。「治療有効」量は、本明細書では、単回投与として、または複数回投与レジメンにしたがって、単独で、または他の薬剤と組み合わせて、被験体の治療部位におけるＴＷＥＡＫＲ陽性細胞の増殖を減少させるか、またはＴＷＥＡＫＲ発現腫瘍のサイズを減少させるのに十分な抗体または抗原結合断片の量であって、有害症状の軽減をもたらすが、毒物学的には認容され得るものと定義される。被験体は、ヒトまたは非ヒト動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス、イヌ、サルまたは他の下等霊長類）であり得る。
【０１８６】
本発明の一実施形態は、細胞株由来のおよび患者由来のヒト腫瘍モデルの広範なパネルにおいて、強力な抗腫瘍効果を有する抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体を提供することである。腫瘍モデルには、７８６−Ｏ、Ａ３７５、Ａ２５３、ＳＫ−ＯＶ−３、ＷｉＤｒ、ＳＷ４８０、Ｃｏ５６８２、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、ＮＣＩ−Ｈ３２２、Ｌｕ７３４３およびＬｕ７４３３（さらなる詳細については、実施例８を参照のこと）、Ｃｏ５６７６およびＣｏ５８４１（さらなる詳細については、実施例１０を参照のこと）、ＳＣａＢＥＲ（さらなる詳細については、実施例１１を参照のこと）およびＳＣＣ４（さらなる詳細については、実施例１２を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ヒト腎細胞癌モデル７８６−Ｏについて、ＴＰＰ−２０８４およびＴＰＰ−２０９０の用量依存的な有効性が図１９に示されている。例えばＴＰＰ−２０９０の場合、ヒト結腸癌異種移植ＷｉＤｒ（図２０）およびヒト肺癌異種移植ＮＣＩ−Ｈ３２２（図２１）において、インビボ抗腫瘍効果が示されている。また、他の結腸直腸腫瘍モデル、例えばＳＷ４８０および患者由来の腫瘍モデルＣｏ５６８２において、単独療法および／または併用療法によって、ＴＷＥＡＫＲ抗体ＴＰＰ−２０９０の有効性を調査したところ、結果は同様に良好であった（表２９を参照のこと）。さらなる腫瘍モデル７８６−Ｏ、Ａ３７５、Ａ２５３、ＳＫ−ＯＶ−３、Ｂｘ−ＰＣ３を表２８に示し、ＮＣＩ−Ｈ３２２、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、Ｌｕ７３４３およびＬｕ７４３３を表３０に示す。
【０１８７】
本発明の一実施形態は、医薬として使用するための本発明の抗体またはその抗原結合断片を提供することである。
【０１８８】
本発明の一実施形態は、癌を治療するための医薬として使用するための、本発明の抗体またはその抗原結合断片を提供することである。好ましい実施形態では、癌は、固形腫瘍である。本発明の一実施形態は、癌の治療に使用するための、本発明の抗体またはその抗原結合断片を提供することである。好ましい実施形態では、癌は、固形腫瘍である。
【０１８９】
本発明の一実施形態は、癌の治療に使用するための医薬を製造するための、本発明の抗体またはその抗原結合断片の使用を提供することである。好ましい実施形態では、癌は、固形腫瘍である。
【０１９０】
本発明の別の実施形態は、癌を治療するための方法であって、治療有効量の本発明の抗体またはその抗原結合断片を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法を提供することである。好ましい実施形態では、癌は、固形腫瘍である。
【０１９１】
本発明の抗体またはその抗原結合断片またはその変異体は、公知の医薬と共に同時投与され得、一部の場合には、前記抗体は、それ自体が改変され得る。例えば、有効性を潜在的にさらに増加させるために、抗体またはその抗原結合断片またはその変異体を細胞毒性剤または放射性同位体にコンジュゲートし得る。
【０１９２】
本発明の抗体またはその抗原結合断片またはその変異体は、単独の医薬品として投与され得るか、または許容され得ない有害作用を組み合わせが引き起こさない場合には、１つ以上のさらなる治療剤と組み合わせて投与され得る。この併用療法は、本発明の抗体またはその抗原結合断片またはその変異体と、１つ以上のさらなる治療剤とを含有する単一の医薬投与製剤を投与すること、ならびにそれ自体が別個の医薬投与製剤によって、本発明の抗体および各さらなる治療剤を投与することを含む。例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片またはその変異体および治療剤を単一の液体組成物によって一緒に患者に投与してもよいし、または各薬剤を別個の投与製剤によって投与してもよい。
【０１９３】
別個の投与製剤を使用する場合、本発明の抗体またはその抗原結合断片またはその変異体および１つ以上のさらなる治療剤を本質的に同じ時点において（例えば、同時に）投与してもよいし、または別個に時間差で（例えば、逐次に）投与してもよい。
【０１９４】
本発明の別の実施形態は、抗体治療をイリノテカン、レゴラフェニブ、パクリタキセル、ＰＩ３Ｋ阻害剤１、オキサリプラチン、シスプラチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ゲムシタビンまたはセツキシマブと組み合わせた場合に、細胞株由来のおよび患者由来のヒト腫瘍モデルにおいて相乗効果または相加効果を有する抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体を提供することである。
【０１９５】
本発明の好ましい実施形態は、本発明の抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体と、イリノテカン、シスプラチン、オキサリプラチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、レゴラフェニブおよびセツキシマブからなる成分の群に含まれるさらなる有効成分との組み合わせである。抗体ＴＰＰ−２０９０と、イリノテカン、シスプラチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびレゴラフェニブからなる成分の群に含まれるさらなる有効成分との組み合わせがさらにより好ましい。
【０１９６】
本発明の好ましい実施形態は、結腸直腸癌の治療に使用するための組み合わせであって、本発明の抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体と、イリノテカン、オキサリプラチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、レゴラフェニブおよびセツキシマブからなる成分の群に含まれるさらなる有効成分との組み合わせである。結腸直腸癌の治療に使用するための組み合わせであって、抗体ＴＰＰ−２０９０と、イリノテカン、シスプラチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびレゴラフェニブからなる成分の群に含まれるさらなる有効成分との組み合わせがさらにより好ましい。
【０１９７】
好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体と、イリノテカン、オキサリプラチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、レゴラフェニブまたはセツキシマブとの組み合わせで結腸直腸癌を治療する。ＴＰＰ−２０９０とイリノテカン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）またはレゴラフェニブとの組み合わせによる結腸直腸癌の治療がさらにより好ましい。
【０１９８】
さらに好ましい実施形態は、膀胱癌の治療に使用するための組み合わせであって、本発明の抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体と、シスプラチンとの組み合わせである。膀胱癌の治療に使用するための組み合わせであって、抗体ＴＰＰ−２０９０とシスプラチンとの組み合わせがさらにより好ましい。
【０１９９】
さらに好ましい実施形態は、本発明の抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体と、シスプラチンとの組み合わせによる膀胱癌の治療である。ＴＰＰ−２０９０とシスプラチンとの組み合わせによる膀胱癌の治療がさらにより好ましい。
【０２００】
ヒト結腸癌異種移植片ＷｉＤｒでは、例えば、ＴＰＰ−２０９０をイリノテカンまたはレゴラフェニブと組み合わせた場合に、明らかなプラス効果を実証し得る。ヒト肺癌異種移植片ＮＣＩ−Ｈ３２２およびＮＣＩ−Ｈ１９７５では、例えば、ＴＰＰ−２０９０をパクリタキセルと組み合わせた場合に、プラス効果を実証し得る。
【０２０１】
特に、本発明の抗体またはその抗原結合断片またはその変異体は、他の抗腫瘍剤、例えばアルキル化剤、代謝拮抗物質、植物由来の抗腫瘍剤、ホルモン療法剤、トポイソメラーゼ阻害剤、カンプトテシン誘導体、キナーゼ阻害剤、標的薬、抗体、インターフェロンおよび／または生物学的応答調整物質、抗血管形成化合物、および他の抗腫瘍薬との一定の組み合わせまたは別個の組み合わせで、使用することができる。これに関して、以下は、本発明の抗体と組み合わせて使用することができる二次薬剤の例の非限定的なリストである。
【０２０２】
アルキル化剤には、ナイトロジェンマスタードＮ−オキシド、シクロホスファミド、イホスファミド、チオテパ、ラニムスチン、ニムスチン、テモゾロミド、アルトレタミン、アパジコン、ブロスタリシン、ベンダムスチン、カルムスチン、エストラムスチン、ホテムスチン、グルフォスファミド、マフォスファミド、ベンダムスチン、およびミトラクトールが含まれるが、これらに限定されない。また、白金配位アルキル化化合物には、シスプラチン、カルボプラチン、エプタプラチン、ロバプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、およびサトラプラチンが含まれるが、これらに限定されない。
【０２０３】
代謝拮抗物質には、メトトレキサート、６−メルカプトプリンリボシド、メルカプトプリン、５−フルオロウラシル（単独、またはロイコボリンとの組み合わせ）、テガフール、ドキシフルリジン、カルモフール、シタラビン、シタラビンオクホスファート、エノシタビン、ゲムシタビン、フルダラビン、５−アザシチジン、カペシタビン、クラドリビン、クロファラビン、デシタビン、エフロルニチン、エチニルシチジン、シトシンアラビノシド、ヒドロキシ尿素、メルファラン、ネララビン、ノラトレキシド、オクホスファイト、プレメトレキセド二ナトリウム、ペントスタチン、ペリトレキソール、ラルチトレキセド、トリアピン、トリメトレキセート、ビダラビン、ビンクリスチン、およびビノレルビンが含まれるが、これらに限定されない。
【０２０４】
ホルモン療法剤には、エクセメスタン、ルプロン、アナストロゾール、ドキセルカルシフェロール、ファドロゾール、フォルメスタン、１１−βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１阻害剤、１７−αヒドロキシラーゼ／１７，２０リアーゼ阻害剤、例えば酢酸アビラテロン、５−αレダクターゼ阻害剤、例えばフィナステリドおよびエプリステリド、抗エストロゲン薬、例えばクエン酸タモキシフェンおよびフルベストラント、トレルスター（Ｔｒｅｌｓｔａｒ）、トレミフェン、ラロキシフェン、ラソフォキシフェン、レトロゾール、抗アンドロゲン薬、例えばビカルタミド、フルタミド、ミフェプリストン、ニルタミド、カソデックス、および抗プロゲステロンならびにそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０２０５】
植物由来の抗腫瘍物質には、例えば有糸分裂阻害剤、例えばサゴピロン、イクサベピロンおよびエポチロンＢなどのエポチロン類、ビンブラスチン、ビンフルニン、ドセタキセル、およびパクリタキセルから選択されるものなどが含まれる。
【０２０６】
細胞毒性トポイソメラーゼ阻害剤には、アクラルビシン、ドキソルビシン、アモナフィド、ベロテカン、カンプトテシン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、９−アミノカンプトテシン、ジフロモテカン、イリノテカン、トポテカン、エドテカリン、エピムビシン、エトポシド、エキサテカン、ジマテカン、ラルトテカン、ミトキサントロン、ピラムビシン、ピクサントロン、ルビテカン、ソブゾキサン、タフルポシド、およびそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０２０７】
免疫薬には、インターフェロン、例えばインターフェロンα、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンβ、インターフェロンγ−１ａおよびインターフェロンγ−ｎ１、ならびに他の免疫増進剤、例えばＬ１９−ＩＬ２および他のＩＬ２誘導体、フィルグラスチム、レンチナン、シゾフィラン、セラシス（ＴｈｅｒａＣｙｓ）、ウベニメクス、アルデスロイキン、アレムツズマブ、ＢＡＭ−００２、ダカルバジン、ダクリズマブ、デニロイキン、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、イブリツモマブ、イミキモド、レノグラスチム、レンチナン、黒色腫ワクチン（Ｃｏｒｉｘａ）、モルグラモスチム、サルグラモスチム、タソネルミン、テクロイキン、チマラシン、トシツモマブ、ビムリジン、エプラツズマブ、ミツモマブ、オレゴボマブ、ペムツモマブ、およびプロベンジなどがある。
【０２０８】
生物学的応答調整物質は、生体の防御機構、または組織細胞の生存、成長もしくは分化などの生物学的応答を改変して、それらが抗腫瘍活性を有するように指示する薬剤である。このような薬剤には、例えばクレスチン、レンチナン、シゾフィラン、ピシバニール、プロミューン、およびウベニメクスなどがある。
【０２０９】
抗血管形成化合物には、アシトレチン、アフリベルセプト、アンジオスタチン、アプリジン、アセンタール、アキシチニブ、ベバシズマブ、ブリバニブアラニネート、シレングタイド、コンブレタスタチン、エンドスタチン、フェンレチニド、ハロフジノン、パゾパニブ、ラニビズマブ、レビマスタット、レセンチン、レゴラフェニブ、レモバブ、レブリミド、ソラフェニブ、スクアラミン、スニチニブ、テラチニブ、サリドマイド、ウクライン、バタラニブ、およびビタキシンが含まれるが、これらに限定されない。
【０２１０】
抗体には、トラスツズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、チシリムマブ、イピリムマブ、ルミリキシマブ、カツマキソマブ、アタシセプト、オレゴボマブ、およびアレムツズマブが含まれるが、これらに限定されない。
【０２１１】
ＶＥＧＦ阻害剤、例えばソラフェニブ、レゴラフェニブ、ベバシズマブ、スニチニブ、レセンチン、アキシチニブ、アフリベルセプト、テラチニブ、ブリバニブアラニネート、バタラニブ、パゾパニブ、およびラニビズマブなど。
【０２１２】
ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）阻害剤、例えばセツキシマブ、パニツムマブ、ベクチビックス、ゲフィチニブ、エルロチニブ、およびザクチマなど。
【０２１３】
ＨＥＲ２阻害剤、例えばラパチニブ、トラツズマブ、およびペルツズマブなど。
【０２１４】
ｍＴＯＲ阻害剤、例えばテムシロリムス、シロリムス／ラパマイシン、およびエベロリムスなど。
【０２１５】
ｃ−Ｍｅｔ阻害剤。
【０２１６】
ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えばＰＩ３Ｋ阻害剤１（２−アミノ−Ｎ−［７−メトキシ−８−（３−モルホリン−４−モルホリン−４−イルプロポキシ）−２，３−ジヒドロイミダゾ）−２，３−モルホリン−４−イルプロポキシ）−２，３−ジヒドロイミダゾ［１，２−ｃ］キナゾリン−５−イル］ピリミジン−５−カルボキサミドジヒドロクロリド（実施例１および国際公開第２０１２／１３６５５３号（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている化合物を参照のこと）
およびＡＫＴ阻害剤。
【０２１７】
ＣＤＫ阻害剤、例えばロスコビチンおよびフラボピリドール。
【０２１８】
紡錘体集合チェックポイント阻害剤および標的抗有糸分裂剤、例えばＰＬＫ阻害剤、オーロラ阻害剤（例えば、ヘスペラジン）、チェックポイントキナーゼ阻害剤、およびＫＳＰ阻害剤。
【０２１９】
ＨＤＡＣ阻害剤、例えばパノビノスタット、ボリノスタット、ＭＳ２７５、ベリノスタット、およびＬＢＨ５８９など。
【０２２０】
ＨＳＰ９０およびＨＳＰ７０阻害剤。
【０２２１】
プロテアソーム阻害剤、例えばボルテゾミブおよびカーフィルゾミブ。
【０２２２】
セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、例えばＭＥＫ阻害剤およびＲａｆ阻害剤、例えばソラフェニブ。
【０２２３】
ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、例えばティピファルニブなど。
【０２２４】
チロシンキナーゼ阻害剤、例えばダサチニブ、ニロチビブ、レゴラフェニブ、ボスチニブ、ソラフェニブ、ベバシズマブ、スニチニブ、セジラニブ、アキシチニブ、アフリベルセプト、テラチニブ、イマチニブメシラート、ブリバニブアラニネート、パゾパニブ、ラニビズマブ、バタラニブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ベクチビックス、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、トラツズマブ、ペルツズマブ、およびｃ−Ｋｉｔ阻害剤など。
【０２２５】
ビタミンＤ受容体アゴニスト。
【０２２６】
Ｂｃｌ−２タンパク質阻害剤、例えばオバトクラックス、オブリメルセンナトリウム、およびゴシポールなど。
【０２２７】
分化クラスタ２０受容体アンタゴニスト、例えばリツキシマブなど。
【０２２８】
リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤、例えばゲムシタビンなど。
【０２２９】
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド受容体１アゴニスト、例えばマパツムマブなど。
【０２３０】
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド受容体２アゴニスト、例えばレクサツムマブ、コナツムマブ、ＣＳ−１００８、ＰＲＯ９５７８０など。
【０２３１】
５−ヒドロキシトリプタミン受容体アンタゴニスト、例えばｒＥＶ５９８、キサリプローデ、パロノセトロン塩酸塩、グラニセトロン、ジンドール、およびＡＢ−１００１など。
【０２３２】
インテグリン阻害剤、例えばα５β１インテグリン阻害剤、例えばＥ７８２０、ＪＳＭ６４２５、ボロシキシマブ、およびエンドスタチンなど。
【０２３３】
アンドロゲン受容体アンタゴニスト、例えばデカン酸ナンドロロン、フルオキシメステロン、アンドロイド、プロストエイド、アンドロムスチン、ビカルタミド、フルタミド、アポ−シプロテロン、アポ−フルタミド、酢酸クロルマジノン、アンドロキュア、Ｔａｂｉ、酢酸シプロテロン、およびニルタミド。
【０２３４】
アロマターゼ阻害剤、例えばアナストロゾール、レトロゾール、テストラクトン、エクセメスタン、アミノグルテチミド、およびフォルメスタンなど。
【０２３５】
マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤。
【０２３６】
他の抗癌剤、例えばアリトレチノイン、アンプリジェン、アトラセンタンベキサロテン、ボルテゾミブ、ボセンタン、カルシトリオール、エクシスリンド、ホテムスチン、イバンドロン酸、ミルテホシン、ミトキサントロン、Ｉ−アスパラギナーゼ、プロカルバジン、ダカルバジン、ヒドロキシカルバミド、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、タザロテン、ベルケイド、硝酸ガリウム、カンホスファミド、ダリナパルシン、およびトレチノインなど。
【０２３７】
好ましい実施形態では、本発明の抗体を、化学療法（すなわち、細胞毒性剤）、抗ホルモンおよび／または標的療法、例えば他のキナーゼ阻害剤（例えば、ＥＧＦＲ阻害剤）、ｍＴＯＲ阻害剤および血管新生阻害剤と組み合わせて使用することができる。
【０２３８】
本発明の化合物を、放射線療法および／または外科的介入と共に、癌治療に使用してもよい。
【０２３９】
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、場合によっては、それ自体が改変されていてもよい。例えば抗体は、効力を潜在的にさらに高めるために、限定されないが、上記化合物いずれかまたは任意の放射性同位体にコンジュゲートすることができる。さらに、本発明の抗体は、当技術分野で周知である研究および診断に、または分析用参照標準などとして、そのまま利用するか、組成物に入れて利用することができる。
【０２４０】
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、異常なＴＷＥＡＫＲシグナリングを伴う様々な状況において、例えば癌または線維性疾患などの細胞増殖性障害において、治療ツールまたは診断ツールとして使用することができる。本発明の抗体による治療に特に適切な障害および症状は、固形腫瘍、例えば、乳房、気道、脳、生殖器、消化管、尿路、眼、肝臓、皮膚、頭頸部、甲状腺、副甲状腺の癌、およびそれらの遠隔転移などである。これらの障害には、リンパ腫、肉腫および白血病も含まれる。
【０２４１】
消化管の腫瘍には、肛門癌、大腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、膵癌、直腸癌、小腸癌、および唾液腺癌が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４２】
食道癌の例には、食道細胞癌および食道腺癌、ならびに扁平上皮細胞癌、平滑筋肉腫、悪性黒色腫、横紋筋肉腫およびリンパ腫が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４３】
胃癌の例には、腸型およびびまん型の胃腺癌が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４４】
膵癌の例には、膵管腺癌、腺扁平上皮癌および膵内分泌腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４５】
乳癌の例には、トリプルネガティブ乳癌、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、導管上皮内癌、および上皮内小葉癌が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４６】
気道の癌の例には、小細胞および非小細胞肺癌、ならびに気管支腺腫および胸膜肺芽腫が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４７】
脳癌の例には、脳幹神経膠腫、視床下部神経膠腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、膠芽腫、髄芽腫、脳室上衣腫、ならびに神経外胚葉腫瘍および松果体腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４８】
男性生殖器の腫瘍には、前立腺癌および精巣癌が含まれるが、これらに限定されない。女性生殖器の腫瘍には、子宮内膜癌、子宮頸癌、卵巣癌、膣癌および外陰癌、ならびに子宮の肉腫が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４９】
卵巣癌の例には、漿液性腫瘍、類内膜腫瘍、粘液性嚢胞腺癌、顆粒膜細胞腫、セルトリ・ライディッヒ細胞腫および男性化細胞種が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５０】
子宮頸癌の例には、扁平上皮細胞癌、腺癌、腺扁平上皮癌、小細胞癌、神経内分泌腫瘍、すりガラス細胞癌および絨毛腺管状腺癌が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５１】
尿路の腫瘍には、膀胱、陰茎、腎臓、腎盂、尿管、尿道、ならびに遺伝性および散発性乳頭状腎細胞癌が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５２】
腎癌の例には、腎細胞癌、尿路上皮細胞癌、傍糸球体細胞腫（レニノーマ）、血管腎脂肪腫、腎オンコサイトーマ、ベリーニ管癌、腎臓の明細胞肉腫、中胚葉性腎腫、ウィルムス腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５３】
膀胱癌の例には、移行上皮癌、扁平上皮細胞癌、腺癌、肉腫および小細胞癌が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５４】
眼癌には、眼内黒色腫および網膜芽細胞腫が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５５】
肝癌の例には、肝細胞癌（線維層板状変異を伴うまたは伴わない肝臓細胞癌）、胆管癌（肝内胆管癌）、および混合型肝細胞胆管癌が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５６】
皮膚癌には、扁平上皮細胞癌、カポジ肉腫、悪性黒色腫、メルケル細胞皮膚癌、および非黒色腫皮膚癌が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５７】
頭頸部癌には、頭頸部の扁平上皮細胞癌、喉頭癌、下咽頭癌、鼻咽頭癌、中咽頭癌、唾液腺癌、口唇癌および口腔癌、ならびに扁平上皮細胞癌が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５８】
リンパ腫には、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキン病、および中枢神経系のリンパ腫が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５９】
肉腫には、軟組織の肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、リンパ肉腫、および横紋筋肉腫が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６０】
白血病には、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、およびヘアリー細胞白血病が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６１】
好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、癌疾患を治療または診断するための治療方法または診断方法に適切である。好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、癌が固形癌である癌疾患を治療または診断するための治療方法または診断方法に適切である。
【０２６２】
好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、胃癌、乳癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌、子宮内膜癌、食道癌、頭頸部癌、肝細胞癌、黒色腫および膀胱癌からなる群に含まれる癌疾患を治療または診断するための治療方法または診断方法に適切である。
【０２６３】
より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、膀胱癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、腎臓癌、黒色腫、卵巣癌、頭頸部癌および膵臓癌からなる群に含まれる癌疾患を治療または診断するための治療方法または診断方法に適切である。
【０２６４】
より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、膀胱癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、腎臓癌、黒色腫、卵巣癌、頭頸部癌および膵臓癌からなる群に含まれる癌疾患を治療するための治療方法に使用するためのものである。
【０２６５】
より好ましい実施形態は、膀胱癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、腎臓癌、黒色腫、卵巣癌、頭頸部癌および膵臓癌からなる群に含まれる癌疾患の治療に使用するための医薬を製造するための、本発明の抗体またはその抗原結合断片の使用である。
【０２６６】
より好ましい実施形態は、膀胱癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、腎臓癌、黒色腫、卵巣癌、頭頸部癌および膵臓癌からなる群に含まれる癌疾患を治療するための方法であって、治療有効量の本発明の抗体または抗原結合断片を投与することを含む方法である。
【０２６７】
加えて、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＴＷＥＡＫＲが関与する他の様々な障害、例えば限定されないが、肺胞内線維症、シリカ誘発性肺線維症、実験的肺線維症、特発性肺線維症、腎線維症などの線維性疾患、ならびにリンパ管平滑筋腫症、多嚢胞性卵巣症候群、ざ瘡、乾癬、コレステリン腫、真珠腫性慢性中耳炎、歯周炎、光黒子、腸疾患、アテローム性動脈硬化または子宮内膜症などにおいて、治療ツールまたは診断ツールとして使用することもできる。
【０２６８】
上記障害はヒトにおいて詳細に特徴づけられているが、哺乳動物を含む他の動物にも、類似する病因により存在し、本発明の医薬組成物を投与することによって治療することができる。
【０２６９】
上記障害のいずれかを治療するには、本発明にしたがって使用するための医薬組成物を、１つ以上の生理学的に許容できる担体または賦形剤を使用して従来の方法で製剤化することができる。本発明の抗体またはその抗原結合断片は、治療される傷害の種類に応じて変化し得る任意の適切な手段によって、投与することができる。可能な投与経路には、非経口（例えば、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下）、肺内および鼻腔内が含まれ、局所免疫抑制治療にとって望ましい場合には、病変内投与も含まれる。加えて、本発明の抗体またはその抗原結合断片またはその変異体は、例えば抗体の用量を減らしていく、パルス注入によって投与することもできる。好ましくは、投薬は、投与が短期間または長期間であるかに部分的に応じて、注射によって、最も好ましくは静脈内注射または皮下注射によって行われる。投与すべき量は、臨床症候、個体の体重、他の薬物を投与するかなどの様々な因子に依存するであろう。当業者であれば、投与の経路が治療すべき障害または症状に応じて変化するであろうことを認識するであろう。
【０２７０】
本発明の新規抗体またはその抗原結合断片またはその変異体の治療有効量の決定は、主として、特定の患者特徴、投与経路、および治療される障害の性質に依存するであろう。一般的な指針は、例えばＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎの刊行物およびＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，ｃｈａｐｔｅｒｓ  ２７  ａｎｄ  ２８，ｐｐ．４８４−５２８（１８ｔｈ  ｅｄ．，Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，１９９０）に見られ得る。より具体的には、治療有効量の決定は、医薬の毒性および効力などの因子に依存するであろう。毒性は、上記参考文献に見られる当技術分野で周知の方法を使用して決定することができる。有効性は、同じ指針を、下記の実施例で述べる方法と合わせて利用することによって、決定することができる。
【０２７１】
診断方法
抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片は、ＴＷＥＡＫＲ発現腫瘍の存在を検出するために使用することができる。血清および組織生検標本を含む様々な生物学的サンプルにおけるＴＷＥＡＫＲ含有細胞または脱落したＴＷＥＡＫＲの存在は、抗ＴＷＥＡＫＲ抗体を使用して検出することができる。加えて、抗ＴＷＥＡＫＲ抗体は、９９Ｔｃ（または他の同位体）コンジュゲート抗体を使用した免疫シンチグラフィなどの、様々なイメージング方法に使用することができる。例えば、１１１Ｉｎコンジュゲート抗ＰＳＭＡ抗体を使用して表されたものに似たイメージングプロトコールを使用して、膵臓癌または卵巣癌を検出することができる（Ｓｏｄｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．２１：７５９−７６６，１９９７）。使用することができる別の検出方法は、本発明の抗体を適切な同位体にコンジュゲートすることによる陽電子放出断層撮影である（Ｈｅｒｚｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３４：２２２２−２２２６，１９９３を参照のこと）。
【０２７２】
医薬組成物および投与
本発明の実施形態は、単独で、または安定化化合物などの少なくとも１つの他の薬剤と組み合わせて、抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片またはその変異体を含む医薬組成物であって、限定されないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、および水を含む任意の滅菌生体適合性医薬担体で投与することができる医薬組成物である。さらなる実施形態は、ＴＷＥＡＫＲ結合抗体またはその抗原結合断片と、癌などのＴＷＥＡＫＲ関連疾患を治療するのに適切なさらに別の医薬活性化合物とを含む医薬組成物である。これらの分子はいずれも、単独で、または他の薬剤、薬物もしくはホルモンと組み合わせて、医薬組成物として患者に投与することができ、医薬組成物中で、（１または複数の）賦形剤または薬学的に許容され得る担体と混合されている。本発明の実施形態では、薬学的に許容され得る担体は医薬的に不活性である。
【０２７３】
本発明はまた、医薬組成物の投与に関する。このような投与は、経口的または非経口的に行われる。非経口送達の方法には、局所、動脈内（腫瘍に直接）、筋肉内、皮下、髄内、髄腔内、室内、静脈内、腹腔内、または鼻腔内投与が含まれる。これらの医薬組成物は、有効成分に加えて、活性化合物を医薬的に使用することができる調製物に加工することを容易にする賦形剤および助剤を含む薬学的に許容され得る適切な担体を含有し得る。製剤および投与のための技術に関するさらなる詳細は、最新版のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｅｄ．Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）に見られ得る。
【０２７４】
「医薬製剤」という用語は、その中に含まれる有効成分の生物活性が有効になることを可能にするような形態である調製物であって、製剤が投与される被験体に対して許容され得ない毒性のさらなる成分を含有しない調製物を指す。
【０２７５】
経口投与用の医薬組成物は、当技術分野で周知の薬学的に許容され得る担体を使用して、経口投与に適切な投与量で、製剤化することができる。このような担体は、医薬組成物を、患者による摂取のための錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして、製剤化することを可能にする。
【０２７６】
経口使用のための医薬調製物は、活性化合物を固形賦形剤と混和し、得られた混合物を粉砕してもよく、所望であれば適切な助剤を添加した後に、錠剤または糖衣丸の核が得られるように顆粒の混合物を加工することによって、得ることができる。適切な賦形剤は、糖質またはタンパク質充填剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖類；トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；アラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質などである。所望であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤を加えてもよい。
【０２７７】
糖衣丸の核には、濃厚糖溶液などの適切なコーティングが施され得、このコーティング溶液も、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含み得る。製品識別のために、または活性化合物の量、すなわち投与量を特徴づけるために、錠剤または糖衣丸のコーティングには、染料または顔料を加えてもよい。
【０２７８】
経口的に使用することができる医薬調製物には、ゼラチン製の押込み式カプセル剤、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどのコーティングで作られた密封軟カプセル剤が含まれる。押込み式カプセル剤は、ラクトースまたはデンプンなどの充填剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤と混合され、安定化剤と混合されていてもよい有効成分を含有し得る。軟カプセル剤では、活性化合物を適切な液体、例えば安定化剤を含む、または安定化剤を含まない、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどに溶解または懸濁することができる。
【０２７９】
非経口投与用の医薬製剤は、活性化合物の水溶液を含む。注射のために、本発明の医薬組成物を、水溶液中に、好ましくは生理学的に適合するバッファ、例えばハンクス液、リンゲル液、または生理的緩衝食塩水中に製剤化することができる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有し得る。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射用懸濁剤として製造することもできる。適切な親油性の溶剤またはビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド、またはリポソームが含まれる。懸濁液は、高濃度溶液の調製が可能になるように、適切な安定化剤、または化合物の溶解度を増加させる薬剤も含有していてもよい。
【０２８０】
局所投与または経鼻投与のためには、浸透すべき特定の障壁に適切な浸透剤を製剤化に使用する。このような浸透剤は、一般に、当技術分野で公知である。
【０２８１】
キット
本発明はさらに、上記本発明の組成物の成分の１つ以上が充填された１つ以上の容器を含む医薬パックおよびキットに関する。（１または複数の）このような容器には、医薬または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府当局によって指示された形式で、当局によるヒト投与用製品の製造、使用または販売の認可を反映した告知書を、添付することができる。
【０２８２】
別の実施形態では、キットは、本発明の抗体またはその抗原結合断片またはその変異体をコードするＤＮＡ配列を含有し得る。これらの抗体をコードするＤＮＡ配列は、好ましくは、宿主細胞へのトランスフェクションと宿主細胞による発現に適切なプラスミドに入れて提供される。プラスミドは、宿主細胞におけるＤＮＡの発現を調節するために、プロモーター（多くの場合、誘導性プロモーター）を含有し得る。プラスミドは、プラスミド中に他のＤＮＡ配列を挿入して様々な抗体を生産することが容易になるように、適切な制限部位も含有し得る。プラスミドは、コードされているタンパク質のクローニングおよび発現を容易にするために、数多くの他の要素も含有し得る。このような要素は、当業者には周知であり、例えば選択可能マーカー、開始コドン、停止コドンなどが含まれる。
【０２８３】
製造および貯蔵
本発明の医薬組成物は、当技術分野で周知である方法で、例えば従来の混合、溶解、造粒、糖衣形成、研和、乳化、カプセル化、捕捉または凍結乾燥プロセスなどによって、製造することができる。
【０２８４】
医薬組成物は塩として提供することができ、限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸を含む酸を使用して形成させることができる。塩は、水性溶媒または他のプロトン性溶媒に、対応する遊離塩基型よりも溶解しやすい傾向を示す。他の場合では、好ましい調製物は、使用前にバッファと混合されるｐＨ範囲４．５〜５．５の１ｍＭ〜５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％スクロース、２％〜７％マンニトール中の凍結乾燥粉末であり得る。
【０２８５】
許容され得る担体中に製剤化された本発明の化合物を含む医薬組成物を製造したら、それらを適切な容器に入れ、適応症の治療に関して医薬品の表示をすることができる。抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片の投与に関して、このような医薬品の表示には、投与の量、頻度および方法が含まれるであろう。
【０２８６】
治療有効量
本発明に使用するのに適切な医薬組成物には、その有効成分が、意図する目的、すなわちＴＷＥＡＫＲ発現を特徴とする特定の疾患状態の治療を達成するのに有効な量で含まれる組成物が含まれる。有効量の決定は、当業者の能力の範囲で十分に可能である。
【０２８７】
任意の化合物について、最初は細胞培養アッセイにおいて、例えば新生物細胞において、または動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌ、ブタまたはサルにおいて、治療有効量を推定することができる。動物モデルを使用して、望ましい濃度範囲および投与経路も得られる。次に、このような情報を、ヒトにおける投与にとって有用な用量および経路を決定するために使用することができる。
【０２８８】
治療有効量は、症候または症状を改善する、抗体またはその抗原結合断片の量を指す。このような化合物の治療効力および毒性は、細胞培養または実験動物において、例えばＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）などの、標準的な医薬的手法によって決定することができる。治療効果と毒性効果との間の用量比が治療係数であり、これは比ＥＤ５０／ＬＤ５０として表すことができる。大きな治療係数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトでの使用のための投与量範囲を処方する際に使用される。このような化合物の投与量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性を伴わないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用する剤形、患者の感度、および投与経路に応じて、この範囲内で変化する。
【０２８９】
厳密な投与量は、治療すべき患者を考慮して個々の医師が選択する。投与量および投与は、十分なレベルの有効成分が提供されるように、または所望の効果が維持されるように、調節される。考慮することができるさらなる因子には、疾患状態の重症度、例えば腫瘍のサイズおよび場所；患者の年齢、体重および性別；食餌、投与の時間および頻度、（１または複数の）併用薬、反応感度、および治療に対する認容性／応答が含まれる。長時間作用性医薬組成物を、その特定製剤の半減期およびクリアランス率に応じて、例えば、３〜４日ごと、１週間ごと、２週間に１回、または３週間に１回投与してもよい。
【０２９０】
通常の投与量は、投与経路に応じて、０．１〜１００，０００マイクログラム、合計用量約２ｇまでの範囲で変化し得る。特定の投与量および送達方法に関する指針は文献に記載されている。米国特許第４，６５７，７６０号；米国特許第５，２０６，３４４号；または米国特許第５，２２５，２１２号を参照のこと。当業者であれば、ポリヌクレオチド用には、タンパク質用またはそれらの阻害剤用とは異なる製剤を用いるであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、症状、場所などに特異的であろう。放射標識抗体の場合、好ましい比放射能は０．１〜１０ｍＣｉ／ｍｇタンパク質の範囲にあり得る（Ｒｉｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５：３２７５−３２８０，１９９９；Ｕｌａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２４６（３）：８９５−９０２）。
【０２９１】
本発明のさらに好ましい実施形態は、以下のものである：
１．ＴＷＥＡＫＲ（配列番号：１６９）の４７位のＤ（Ｄ４７）に特異的に結合する、単離された抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片。
【０２９２】
２．抗体が、ＴＰＰ−２２０３と比較してＴＰＰ−２６１４に対するそのＥＬＩＳＡシグナルの８０％超を喪失すると、抗体が、ＴＷＥＡＫＲ（配列番号：１６９）の４７位のＤ（Ｄ４７）に特異的に結合する、実施形態１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【０２９３】
３．抗体がアゴニスト抗体である、実施形態１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【０２９４】
４．（ａ）式ＰＹＰＭＸ（配列番号：１７１）（式中、Ｘは、ＩまたはＭである）を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）式ＹＩＳＰＳＧＧＸＴＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号：１７２）（式中、Ｘは、ＳまたはＫである）を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖ＣＤＲ２；および
（ｃ）式ＧＧＤＴＹＦＤＹＦＤＹ（配列番号：１７３）を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖ＣＤＲ３
を含む可変重鎖と、
（ａ）式ＲＡＳＱＳＩＳＸＹＬＮ（配列番号：１７４）（式中、Ｘは、ＧまたはＳである）を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）式ＸＡＳＳＬＱＳ（配列番号：１７５）（式中、Ｘは、Ｑ、ＡまたはＮである）を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｃ）式ＱＱＳＹＸＸＰＸＩＴ（配列番号：１７６）（式中、５位のＸは、ＴまたはＳであり、６位のＸは、ＴまたはＳであり、８位のＸは、ＧまたはＦである）を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖ＣＤＲ３
を含む可変軽鎖とを含む、実施形態１〜３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【０２９５】
５．ａ．配列番号：６によって示される可変重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：７によって示される可変重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：８によって示される可変重鎖ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号：３によって示される可変軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：４によって示される可変軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：５によって示される可変軽鎖ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖、または
ｂ．配列番号：１６によって示される可変重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：１７によって示される可変重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：１８によって示される可変重鎖ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号：１３によって示される可変軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：１４によって示される可変軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：１５によって示される可変軽鎖ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖、または
ｃ．配列番号：２６によって示される可変重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：２７によって示される可変重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：２８によって示される可変重鎖ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号：２３によって示される可変軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：２４によって示される可変軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：２５によって示される可変軽鎖ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖、または
ｄ．配列番号：３６によって示される可変重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：３７によって示される可変重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：３８によって示される可変重鎖ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号：３３によって示される可変軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：３４によって示される可変軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：３５によって示される可変軽鎖ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖、または
ｅ．配列番号：４６によって示される可変重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：４７によって示される可変重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：４８によって示される可変重鎖ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号：４３によって示される可変軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：４４によって示される可変軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：４５によって示される可変軽鎖ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖、または
ｆ．配列番号：５６によって示される可変重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：５７によって示される可変重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：５８によって示される可変重鎖ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号：５３によって示される可変軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：５４によって示される可変軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：５５によって示される可変軽鎖ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖、または
ｇ．配列番号：６６によって示される可変重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：６７によって示される可変重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：６８によって示される可変重鎖ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号：６３によって示される可変軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：６４によって示される可変軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：６５によって示される可変軽鎖ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖、または
ｈ．配列番号：７６によって示される可変重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：７７によって示される可変重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：７８によって示される可変重鎖ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号：７３によって示される可変軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：７４によって示される可変軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：７５によって示される可変軽鎖ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖、または
ｉ．配列番号：８６によって示される可変重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：８７によって示される可変重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：８８によって示される可変重鎖ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号：８３によって示される可変軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：８４によって示される可変軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：８５によって示される可変軽鎖ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖、または
ｊ．配列番号：９６によって示される可変重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：９７によって示される可変重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：９８によって示される可変重鎖ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号：９３によって示される可変軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：９４によって示される可変軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：９５によって示される可変軽鎖ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖、または
ｋ．配列番号：１０６によって示される可変重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：１０７によって示される可変重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：１０８によって示される可変重鎖ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号：１０３によって示される可変軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：１０４によって示される可変軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：１０５によって示される可変軽鎖ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖、または
ｌ．配列番号：１１６によって示される可変重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：１１７によって示される可変重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：１１８によって示される可変重鎖ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号：１１３によって示される可変軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：１１４によって示される可変軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号：１１５によって示される可変軽鎖ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖
を含む、実施形態１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【０２９６】
６．ａ．配列番号：１０によって示される可変重鎖配列、および配列番号：９によって示される可変軽鎖配列、または
ｂ．配列番号：２０によって示される可変重鎖配列、および配列番号：１９によって示される可変軽鎖配列、または
ｃ．配列番号：３０によって示される可変重鎖配列、および配列番号：２９によって示される可変軽鎖配列、または
ｄ．配列番号：４０によって示される可変重鎖配列、および配列番号：３９によって示される可変軽鎖配列、または
ｅ．配列番号：５０によって示される可変重鎖配列、および配列番号：４９によって示される可変軽鎖配列、または
ｆ．配列番号：６０によって示される可変重鎖配列、および配列番号：５９によって示される可変軽鎖配列、または
ｇ．配列番号：７０によって示される可変重鎖配列、および配列番号：６９によって示される可変軽鎖配列、または
ｈ．配列番号：８０によって示される可変重鎖配列、および配列番号：７９によって示される可変軽鎖配列、または
ｉ．配列番号：９０によって示される可変重鎖配列、および配列番号：８９によって示される可変軽鎖配列、または
ｊ．配列番号：１００によって示される可変重鎖配列、および配列番号：９９によって示される可変軽鎖配列、または
ｋ．配列番号：１１０によって示される可変重鎖配列、および配列番号：１０９によって示される可変軽鎖配列、または
ｌ．配列番号：１２０によって示される可変重鎖配列、および配列番号：１１９によって示される可変軽鎖配列
を含む、実施形態１〜５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【０２９７】
７．ＩｇＧ抗体である、実施形態１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
【０２９８】
８．ａ．配列番号：２によって示される重鎖配列、および配列番号：１によって示される軽鎖配列、または
ｂ．配列番号：１２によって示される重鎖配列、および配列番号：１１によって示される軽鎖配列、または
ｃ．配列番号：２２によって示される重鎖配列、および配列番号：２１によって示される軽鎖配列、または
ｄ．配列番号：３２によって示される重鎖配列、および配列番号：３１によって示される軽鎖配列、または
ｅ．配列番号：４２によって示される重鎖配列、および配列番号：４１によって示される軽鎖配列、または
ｆ．配列番号：５２によって示される重鎖配列、および配列番号：５１によって示される軽鎖配列、または
ｇ．配列番号：６２によって示される重鎖配列、および配列番号：６１によって示される軽鎖配列、または
ｈ．配列番号：７２によって示される重鎖配列、および配列番号：７１によって示される軽鎖配列、または
ｉ．配列番号：８２によって示される重鎖配列、および配列番号：８１によって示される軽鎖配列、または
ｊ．配列番号：９２によって示される重鎖配列、および配列番号：９１によって示される軽鎖配列、または
ｋ．配列番号：１０２によって示される重鎖配列、および配列番号：１０１によって示される軽鎖配列、または
ｌ．配列番号：１１２によって示される重鎖配列、および配列番号：１１１によって示される軽鎖配列、または
ｍ．配列番号：２１３によって示される重鎖配列、および配列番号：１によって示される軽鎖配列
を含む、実施形態１〜７のいずれか一項に記載の抗体。
【０２９９】
９．ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’断片またはＦ（ａｂ’）２断片である、実施形態１〜８のいずれか一項に記載の抗原結合断片。
【０３００】
１０．モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である、実施形態１〜９のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
【０３０１】
１１．ヒト、ヒト化またはキメラ抗体または抗原結合断片である、実施形態１〜１０のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
【０３０２】
１２．実施形態１〜１１に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、抗体−薬物複合体。
【０３０３】
１３．実施形態１〜１１に記載の抗体または抗原結合断片をコードする、単離された核酸配列。
【０３０４】
１４．実施形態１３に記載の核酸配列を含む、ベクター。
【０３０５】
１５．実施形態１〜１１のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片を発現し、ならびに／または実施形態１３に記載の核酸もしくは実施形態１４に記載のベクターを含む、単離された細胞
１６．前記細胞が原核細胞または真核細胞である、実施形態１５に記載の単離された細胞。
【０３０６】
１７．実施形態１〜１１のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片を生産する方法であって、実施形態１６に記載の細胞を培養すること、および前記抗体または抗原結合断片を精製することを含む、方法。
【０３０７】
１８．医薬として使用するための、実施形態１〜１１に記載の抗体もしくは抗原結合断片または実施形態１２に記載の抗体−薬物複合体。
【０３０８】
１９．診断剤として使用するための、実施形態１〜１１に記載の抗体または抗原結合断片。
【０３０９】
２０．癌の治療に使用するための、実施形態１〜１１に記載の抗体もしくは抗原結合断片または実施形態１２に記載の抗体−薬物複合体。
【０３１０】
２１．実施形態１〜１１に記載の抗体もしくは抗原結合断片または実施形態１２に記載の抗体−薬物複合体を含む、医薬組成物。
【０３１１】
２２．実施形態２１に記載の医薬組成物と、１つ以上の治療的に活性な化合物との組み合わせ。
【０３１２】
２３．ＴＷＥＡＫＲの望ましくない存在に関連する障害または症状を治療するための方法であって、有効量の実施形態２１に記載の医薬組成物または実施形態２２に記載の組み合わせを、該治療を必要とする被験体に投与することを含む、方法。
【０３１３】
以下の実施例によって、本発明をさらに説明する。実施例は、特定の実施形態を参照することによって本発明を例証するためだけに提供されるものである。これらの例示は、本発明の特定の具体的態様を例証しているが、限定を表すものではなく、開示される本発明の範囲を限定するものでもない。
【０３１４】
詳細に記載されている場合を除いて、当業者に周知のルーチンな標準技術を使用して、すべての実施例を行った。以下の実施例のルーチンな分子生物学技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９などの標準的な実験マニュアルに記載されているように行うことができる。
【０３１５】
［実施例］
［実施例１］Ｄｙａｘ抗体ライブラリーからの抗体の作製
完全ヒト抗体ファージディスプレイライブラリー（Ｈｏｅｔ  ＲＭ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００５；２３（３）：３４４−８）を使用して、固定化標的としてヒトおよびマウスＴＷＥＡＫＲの二量体Ｆｃ融合細胞外ドメインを用いるタンパク質パンニング（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．Ｒ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００５；２３（３）：１１０５−１６）によって、本発明のＴＷＥＡＫＲ特異的ヒトモノクローナル抗体を単離した。
【表１】
2016521715.tif 000002
【０３１６】
製造業者の説明書にしたがって、約２倍モル過剰のビオチン−ＬＣ−ＮＨＳ（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２１３４７）を使用して、抗原をビオチン化し、Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｃａｔ．Ｎｏ．８９８８９）を使用して脱塩した。洗浄した磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）を２００ｎＭのビオチン化ヒト抗原と共に４℃、ｏ／ｎでインキュベートし、ブロッキング緩衝液（３％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）を用いて４℃で１時間ブロッキングした。ブロッキングしたＦａｂファージライブラリーを、ブロッキングしたＴＷＥＡＫＲビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｍ２８０−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １１２−０６Ｄ）に追加し、室温で３０分間インキュベートした。ストリンジェントな洗浄（ブロッキング緩衝液で３回、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；８ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４；１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ＝７．４〜７．６に調整）で９回）の後、ビオチン化ＴＷＥＡＫＲビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｍ２８０−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １１２−０６Ｄ）に特異的に結合しているＦａｂファージをＰＢＳに再懸濁し、増幅のために大腸菌株ＴＧ１の感染に直接使用した。選択ラウンドでは、交差反応性結合体を選択するために、２つのマウスＴＷＥＡＫＲ（２００ｎＭ）を使用し、選択ラウンドでは、高親和性結合体の選択圧を増大させるために、３つの濃度のヒトＴＷＥＡＫＲを減少させた（１００ｎＭ）。
【０３１７】
１１個の異なるＦａｂファージを同定し、対応する抗体を哺乳動物ＩｇＧ発現ベクター（これは、可溶性Ｆａｂに存在しないミッシングＣＨ２−ＣＨ３ドメインを提供する）に再クローニングした。Ｔｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １２  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｍｉｃｈｅａｌ  Ｒ．Ｄｙｓｏｎ  ａｎｄ  Ｙｖｅｓ  Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｓｃｉｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｌｔｄ，２００７に記載されている哺乳動物細胞において、得られたＩｇＧを一過性発現させた。簡潔に言えば、ＣＭＶプロモーターベースの発現プラスミドをＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞にトランスフェクトし、フェルンバッハフラスコまたはウェーブバッグ中でインキュベートした。Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、発現を３７℃で５〜６日間行った。トランスフェクションの２４時間後に、１％Ｕｌｔｒａ−Ｌｏｗ  ＩｇＧ  ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および０．５ｍＭバルプロ酸（Ｓｉｇｍａ）を補充した。実施例２に記載されているように、プロテインＡクロマトグラフィーによって抗体を精製し、ＥＬＩＳＡおよびＢＩＡｃｏｒｅ分析において、可溶性単量体ＴＷＥＡＫＲに対する結合親和性をさらに特性評価した。
【表２】
2016521715.tif 000003
【０３１８】
抗ＴＷＥＡＫＲ抗体の細胞結合特性を決定するために、細胞株（ＨＴ２９、ＨＳ６８、ＨＳ５７８）のパネルに対するフローサイトメトリーによって、結合を試験した。ＦＡＣＳ緩衝液による抗体（５μｇ／ｍｌ）希釈物に細胞を懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。その後、二次抗体（ＰＥヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｄｉａｎｏｖａ  ＃１０９−１１５−０９８）を追加した。氷上で１時間インキュベートした後、ＦＡＣＳアレイ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してフローサイトメトリーによって、細胞を分析した。
【０３１９】
ＮＦ−κＢレポーター遺伝子アッセイを実施して、１１個の同定された抗体（ヒトＩｇＧ１）すべてのアゴニスト活性を評価した。製造業者の説明書にしたがって２９３フェクチンを使用して、ＮＦ−κＢレポーター構築物（ＢｉｏＣａｔ，ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＲ−００５１−ＰＡ）でＨＥＫ２９３細胞を一過性トランスフェクトした。Ｆ１７培地（無血清；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃、５％ＣＯ２で、トランスフェクトした細胞をポリリシンコーティング白色３８４ウェルプレート（ＢＤ）に播種した。翌日、様々な濃度の精製抗体で細胞を６時間刺激し、続いて、標準的な手順にしたがってルシフェラーゼアッセイを行った。
【０３２０】
インターナリゼーションの後に、抗ＴＷＥＡＫＲ抗体（ＣｙｐＨｅｒ  ５ＥモノＮＨＳエステル；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の蛍光標識を行う。処理前に、ＨＴ２９細胞（２×１０４個／ウェル）を９６−ＭＴＰプレート（ｆａｔ，ｂｌａｃｋ，ｃｌｅａｒ  ｂｏｔｔｏｍ  Ｎｏ  ４３０８７７６，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中の培地１００μｌに播種した。３７℃／５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした後、培地（表番号２１）を交換し、標識抗ＴＷＥＡＫＲ抗体を様々な濃度（１０、５、２．５、１、０．１μｇ／ｍｌ）で追加した。選択したインキュベーション時間は、０、０．２５、０．５、１、１．５、２、３、６および２４時間であった。ＩｎＣｅｌｌ  ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、蛍光測定を実施した。
【０３２１】
さらなる効力および親和性の成熟のために、最も強力なインビトロ有効性を有する抗体（ＴＰＰ−８８３）を選択した。
【０３２２】
ＴＰＰ−８８３
配列番号：７１
2016521715.tif 000004
【０３２３】
配列番号：７２
2016521715.tif 000005
【０３２４】
ＴＰＰ−８８３の軽鎖（配列番号：７１）および重鎖（配列番号：７２）のアミノ酸配列；重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲには下線が付されている。
【０３２５】
１回目の突然変異収集ラウンドを行い、続いて、親和性および効力が最も増加したアミノ酸変化の組換えによって、成熟を行った。突然変異収集では、ＮＮＫコドン多様化を含む合成オリゴヌクレオチドを使用して部位特異的変異誘発によって、以下の個々のアミノ酸位置におけるＮＮＫ（Ｎ＝ＡＧＣＴ、Ｋ＝ＧまたはＴ）ランダム化を行った（連続するアミノ酸の命名、図２５を比較）：ＣＤＲ−Ｌ１のＳ３５、Ｓ３６、Ｙ３７およびＮ３９；ＣＤＲ−Ｌ２のＡ５１、Ｓ５３、Ｓ５４、Ｑ５６およびＳ５７；ＣＤＲ−Ｌ３のＳ９２、Ｙ９３、Ｓ９４、Ｓ９５、Ｇ９７およびＩ９８；ＣＤＲ−Ｈ１のＰ３１、Ｙ３２、Ｐ３３、Ｍ３４およびＭ３５；ＣＤＲ−Ｈ２のＹ５０、Ｓ５２、Ｐ５３、Ｓ５４、Ｇ５６、Ｋ５７およびＨ５９；ＣＤＲ−Ｈ３のＧ９９、Ｇ１００、Ｄ１０１、Ｇ１０２、Ｙ１０３、Ｆ１０４、Ｄ１０５およびＹ１０６。すべての単一ＮＮＫ飽和突然変異誘発ライブラリーのＤＮＡを、それぞれ、効力成熟の場合には哺乳動物ＩｇＧ発現ベクターに再クローニングし、親和性成熟の場合にはファージミドベクターに再クローニングした。ファージパニングによって、親和性成熟を行った。洗浄した磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）を１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭおよび１０ｐＭのビオチン化ヒト抗原と共に４℃、ｏ／ｎでインキュベートし、ブロッキング緩衝液（３％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）を用いて４℃で１時間ブロッキングした。ブロッキングしたＦａｂファージライブラリーを、理論上のライブラリー複雑性と比較して１００００倍、１０００倍および１００倍過剰で、ブロッキングしたＴＷＥＡＫＲ−Ｄｙｎａｂｅａｄｓに追加し、室温で３０分間インキュベートした。したがって、全部で１２の戦略にしたがった（４つの抗原濃度×３つのＦａｂファージ力価）。ストリンジェントな洗浄（ブロッキング緩衝液で３回、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで９回）の後、ビオチン化ＴＷＥＡＫＲ−Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｍ２８０−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １１２−０６Ｄ）に特異的に結合しているＦａｂファージをＰＢＳに再懸濁し、増幅のために大腸菌株ＴＧ１の感染に直接使用した。選択ラウンドでは、２つの濃度のヒトＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃを減少させ（１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭおよび１ｐＭ）、同じＦａｂファージの力価を１２の戦略すべてに使用した（４．４×１０１１）。可溶性Ｆａｂ発現のために、制限エンドヌクレアーゼＭｌｕＩでファージミドベクターを消化して、Ｆａｂをファージ上にディスプレイするのに必要なｇｅｎｅＩＩＩ膜アンカー配列を除去し、再ライゲーションした。１２個の各選択プールの９６個の変異体を可溶性Ｆａｂとして発現させ、ＥＬＩＳＡフォーマットで試験した。したがって、２．５ｎＭのビオチン化ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃ抗原をコーティングし、抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ６２９２８）によって、可溶性Ｆａｂの結合を検出した。ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃ（配列番号：１３８）に対する結合が改善された７個の単一置換変異体（連続するアミノ酸の命名、図２５を比較）が検出された：ＣＤＲ−Ｌ１のＳ３６Ｇ、ＣＤＲ−Ｌ２のＡ５１ＱおよびＳ５７Ｋ、ＣＤＲ−Ｌ３のＳ９４ＴおよびＧ９７Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ１のＭ３５ＩならびにＣＤＲ−Ｈ３のＧ１０２Ｔ。効力成熟のために、ＮＦ−κＢレポーター（ＢｉｏＣａｔ，ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＲ−００５１−ＰＡ）でＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。Ｆ１７培地（無血清；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、トランスフェクトした細胞をポリリシンコーティング白色３８４ウェルプレート（ＢＤ）に播種し、哺乳動物細胞において、ＮＮＫ多様化位置抗体（ヒトＩｇＧ１）ライブラリーの個々の変異体を一過性発現させた。翌日、発現させた単一ＮＮＫ突然変異誘発抗体変異体でＮＦ−κＢレポーター細胞を６時間刺激し、続いて、標準的な手順にしたがってルシフェラーゼアッセイを行った。アゴニスト活性が改善された１個の単一置換変異体が検出された：ＣＤＲ−Ｈ３のＧ１０２Ｔ。この変異体は、親和性成熟からも得られ、最も大きな親和性増強を示した。突然変異収集の後、親和性および効力のスクリーニングによって、１個の組換えライブラリーにおいて、７個の有益な単一置換すべてを組換えた（ライブラリーの複雑性：１２８個の変異体）。この目的のために、オリゴヌクレオチドを合成して、選択した突然変異または対応する野生型アミノ酸を各選択位置に導入した。連続ラウンドのオーバーラップ伸長ＰＣＲを使用して、ライブラリー構築を実施した。最終ＰＣＲ産物を細菌可溶性Ｆａｂ発現ベクターにライゲーションし、前記のように、可溶性Ｆａｂを用いる平衡ＥＬＩＳＡスクリーニングのために、５２８個の変異体をランダムに選択した（約４倍のオーバーサンプリング）。最終的に、最良の単一置換変異体Ｇ１０２Ｔと比較して増強した親和性に基づいて、７個の変異体を選択した。これらの対応するＤＮＡを哺乳動物ＩｇＧ発現ベクターに再クローニングし、上記ＮＦ−κＢレポーター細胞アッセイにおいて、機能活性について試験した。最後に、得られた配列をヒト生殖系列配列と比較し、親和性および効力に対して有意な影響を伴わない偏差を調整した。抗体ライブラリースクリーニングによって、ならびに親和性および／または効力の成熟によって、以下の配列を有する抗体を得た：
ＴＰＰ−２０９０
配列番号：１
2016521715.tif 000006
【０３２６】
配列番号：２
2016521715.tif 000007
【０３２７】
ＴＰＰ−２０９０の軽鎖（配列番号：１）および重鎖（配列番号：２）のアミノ酸配列；重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲには下線が付されている。
【０３２８】
ＴＰＰ−２１４９
配列番号：１１
2016521715.tif 000008
【０３２９】
配列番号：１２
2016521715.tif 000009
【０３３０】
ＴＰＰ−２１４９の軽鎖（配列番号：１１）および重鎖（配列番号：１２）のアミノ酸配列；重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲには下線が付されている。
【０３３１】
ＴＰＰ−２０９３
配列番号：２１
2016521715.tif 000010
【０３３２】
配列番号：２２
2016521715.tif 000011
【０３３３】
ＴＰＰ−２０９３の軽鎖（配列番号：２１）および重鎖（配列番号：２２）のアミノ酸配列；重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲには下線が付されている。
【０３３４】
ＴＰＰ−２１４８
配列番号：３１
2016521715.tif 000012
【０３３５】
配列番号：３２
2016521715.tif 000013
【０３３６】
ＴＰＰ−２１４８の軽鎖（配列番号：３１）および重鎖（配列番号：３２）のアミノ酸配列；重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲには下線が付されている。
【０３３７】
ＴＰＰ−２０８４
配列番号：４１
2016521715.tif 000014
【０３３８】
配列番号：４２
2016521715.tif 000015
【０３３９】
ＴＰＰ−２０８４の軽鎖（配列番号：４１）および重鎖（配列番号：４２）のアミノ酸配列；重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲには下線が付されている。
【０３４０】
ＴＰＰ−２０７７
配列番号：５１
2016521715.tif 000016
【０３４１】
配列番号：５２
2016521715.tif 000017
【０３４２】
ＴＰＰ−２０７７の軽鎖（配列番号：５１）および重鎖（配列番号：５２）のアミノ酸配列；重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲには下線が付されている。
【０３４３】
ＴＰＰ−１５３８
配列番号：６１
2016521715.tif 000018
【０３４４】
配列番号：６２
2016521715.tif 000019
【０３４５】
ＴＰＰ−１５３８の軽鎖（配列番号：６１）および重鎖（配列番号：６２）のアミノ酸配列；重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲには下線が付されている。
【０３４６】
ＴＰＰ−１８５４
配列番号：８１
2016521715.tif 000020
【０３４７】
配列番号：８２
2016521715.tif 000021
【０３４８】
ＴＰＰ−１８５４の軽鎖（配列番号：８１）および重鎖（配列番号：８２）のアミノ酸配列；重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲには下線が付されている。
【０３４９】
ＴＰＰ−１８５３
配列番号：９１
2016521715.tif 000022
【０３５０】
配列番号：９２
2016521715.tif 000023
【０３５１】
ＴＰＰ−１８５３の軽鎖（配列番号：９１）および重鎖（配列番号：９２）のアミノ酸配列；重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲには下線が付されている。
【０３５２】
ＴＰＰ−１８５７
配列番号：１０１
2016521715.tif 000024
【０３５３】
配列番号：１０２
2016521715.tif 000025
【０３５４】
ＴＰＰ−１８５７の軽鎖（配列番号：１０１）および重鎖（配列番号：１０２）のアミノ酸配列；重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲには下線が付されている。
【０３５５】
ＴＰＰ−１８５８
配列番号：１１１
2016521715.tif 000026
【０３５６】
配列番号：１１２
2016521715.tif 000027
【０３５７】
ＴＰＰ−１８５８の軽鎖（配列番号：１１１）および重鎖（配列番号：１１２）のアミノ酸配列；重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲには下線が付されている。
【０３５８】
［実施例２］抗体の生化学的特性
Ｂｉａｃｏｒｅ分析による結合親和性の決定：
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）による表面プラズモン共鳴分析によって、抗ＴＷＥＡＫＲ抗体の結合親和性を決定した。間接カップリング試薬の抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）によって、抗体をＣＭ５センサーチップ上に固定化した。製造業者が説明しているように、「ヒト抗体捕捉キット」（ＢＲ−１００８−３９，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）の試薬を使用した。抗ＴＷＥＡＫＲ抗体を濃度１０μｇ／ｍｌ、１０μｌ／分で１０秒間注入した。
【表３】
2016521715.tif 000028
【表４】
2016521715.tif 000029
【表５】
2016521715.tif 000030
【０３５９】
様々な濃度（２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２ｎＭ、１．５６ｎＭ）の精製組換えヒトＴＷＥＡＫＲタンパク質（ＴＰＰ−２３０５、配列番号：１６８）を、ＨＥＰＥＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）によって固定化抗ＴＷＥＡＫＲ抗体に対して流速６０μｌ／分で３分間注入し、５分間解離させた。インライン参照セル補正とそれに続くバッファサンプル控除の後に、センサーグラムを作成した。一次１：１結合モデルを用いてセンサーグラムをフィッティングすることによって得られた、会合速度定数（ｋｏｎ）と解離速度定数（ｋｏｆｆ）との比に基づいて、解離平衡定数（ＫＤ）を計算した。
【表６】
2016521715.tif 000031
【０３６０】
本発明の抗体は、中程度の親和性（ＫＤ１０〜２００ｎＭ）でＴＷＥＡＫＲに結合するのに対して、比較に使用したいくつかの抗体（例えば、ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）、１３６．１（ＴＰＰ−２１９４）、１８．３．３（ＴＰＰ−２１９３）、Ｐ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４）、Ｐ３Ｇ５（ＴＰＰ−２１９５）、Ｐ２Ｄ３（ＴＰＰ−２１９６）、ＩＴＥＭ−１、ＩＴＥＭ−４）は、高い親和性結合（０．７〜３．７ｎＭ）を示すと決定された。抗体ＰＤＬ−１９２、１３６．１、１８．３．３、Ｐ４Ａ８、Ｐ３Ｇ５およびＰ２Ｄ３の可変ドメインの配列は、国際公開第２００９／０２０９３３号および国際公開第２００９／１４０１７７号から入手し、ヒトＩｇＧ１およびマウスＩｇＧ２の定常領域をコードする配列を追加して、全長ＩｇＧ  ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）、１３６．１（ＴＰＰ−２１９４）、１８．３．３（ＴＰＰ−２１９３）、Ｐ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４）、Ｐ３Ｇ５（ＴＰＰ−２１９５）、Ｐ２Ｄ３（ＴＰＰ−２１９６）を得た。以前に記載されている他の抗体について本研究で測定した親和性の範囲は、公開されているデータとよく一致している：ＰＤＬ−１９２、１８．３．３および１３６．１については、５．５、０．２および０．７ｎＭのＫＤ値が公開された（国際公開第２００９／０２０９３３号）；Ｐ４Ａ８については、２．６ｎＭ（国際公開第２００９／１４０１７７号）。比較のために、ネイティブリガンドＴＷＥＡＫは、０．８〜２．４ｎＭのＫＤ値でＴＷＥＡＫＲに結合する（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００１  Ｎｏｖ；１５（５）：８３７−４６；Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２００６  Ｊｕｌ  １５；３９７（２）：２９７−３０４；Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．２００３  Ａｐｒ  １；２３（４）：５９４−６００）。
【０３６１】
その結果、本発明の抗体（ＴＰＰ−８８３、ＴＰＰ−１５３８、ＴＰＰ−２０７７、ＴＰＰ−２０８４、ＴＰＰ−２１４８、ＴＰＰ−２０９３、ＴＰＰ−２１４９およびＴＰＰ−２０９０）は、中程度の親和性（ＫＤ１０〜２００ｎＭ）でＴＷＥＡＫＲに結合する。
【０３６２】
Ｂｉａｃｏｒｅ分析による種交差反応性の分析：
種交差反応性の分析のために、ヒト、ラット、マウス、イヌ、ブタおよびカニクイザルのＴＷＥＡＫＲを発現させ、ヒトＦｃ断片融合タンパク質として精製し、標準的なＥＤＣ／ＮＨＳ媒介化学反応（ＢＲ−１００６−３３，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）によるアミンカップリングを使用してＣＭ５センサーチップ上に固定化した。
【表７】
2016521715.tif 000032
【０３６３】
様々な濃度（２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２ｎＭ、１．５６ｎＭ）の抗ＴＷＥＡＫＲ抗体を、ＨＥＰＥＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）によって固定化抗ＴＷＥＡＫＲ種に対して流速６０μｌ／分で３分間注入し、５分間解離させた。インライン参照セル補正とそれに続くバッファサンプル控除の後に、センサーグラムを作成した。Ｂｉａｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン４．０）を使用する二価分析物モデルを用いてセンサーグラムをフィッティングすることによって得られた、会合速度定数（ｋｏｎ１）と解離速度定数（ｋｏｆｆ１）との比に基づいて、解離平衡定数（ＫＤ）を計算した。固定化二価抗原を用いて「アビディティモード」（これは、「絶対」ＫＤ値を提供するものではないが、優れた比較データが得られる）で、抗ＴＷＥＡＫＲ抗体の種交差反応性を決定した。
【表８】
2016521715.tif 000033
【０３６４】
その結果、本発明の抗体（ＴＰＰ−１５３８、ＴＰＰ−２０７７、ＴＰＰ−２０８４およびＴＰＰ−２０９０）は、試験したすべての種（ヒト、ラット、マウス、イヌ、ブタおよびカニクイザルのＴＷＥＡＫＲ）に対して親和性を示す。
【０３６５】
ＴＷＥＡＫＲ外部ドメインのＮ末端およびＣ末端短縮型変異体によるＴＰＰ−２０９０の結合エピトープの特性評価：
様々な種のＴＷＥＡＫＲシステインリッチドメイン（ａａ３４〜６８）のアライメント（図１）は、分析した６つの種すべてを通して、それがよく保存されていることを示している。ＰＤＬ−１９２は、Ｒ５６依存的に結合するので（国際公開第２００９／０２０９３３号：図２Ｂ）、ラット、ブタおよびマウスのＴＷＥＡＫＲに結合しない。ＴＰＰ−２０９０は、保存されたアミノ酸Ｄ４７依存的に結合するので、示されているすべての種に結合する。
【０３６６】
上記抗体の結合エピトープを特性評価するための第１のアプローチでは、ＴＷＥＡＫＲ外部ドメインのＮ末端およびＣ末端切断短縮型突然変異体を作製し、様々な抗ＴＷＥＡＫＲ抗体に対する結合能について試験した。Ｎ末端においてアミノ酸２８〜３３が検出され、Ｃ末端においてアミノ酸６９〜８０が検出されたことから、Ｃｙｓ３６−Ｃｙｓ４９、Ｃｙｓ５２−Ｃｙｓ６７およびＣｙｓ５５−Ｃｙｓ６４のジスルフィド架橋を有するシステインリッチドメインは依然としてインタクトであった（図２を比較）。両構築物（Ｎ末端およびＣ末端を含む全外部ドメイン２８〜８０、ならびに短縮型外部ドメイン３４〜６８）を発現させ、それぞれＦｃ融合タンパク質ＴＰＰ−２２０２およびＴＰＰ−２２０３として精製した。
【０３６７】
結合を分析するために、１μｇ／ｍｌの各二量体ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃ構築物をコーティングし、０．３μｇ／ｍｌおよび０．０８μｇ／ｍｌのビオチン化ＩｇＧを可溶性結合パートナーとして使用した。ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＡｍｐｌｅｘ−Ｒｅｄ基質を用いて、検出を行った。製造業者の説明書にしたがって、約２倍モル過剰のビオチン−ＬＣ−ＮＨＳ（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２１３４７）を使用して、ＩｇＧをビオチン化し、Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｃａｔ．Ｎｏ．８９８８９）を使用して脱塩した。可溶性リガンドの適用濃度すべてにおいて、本発明の抗体は、両構築物に対する飽和的な結合を示すのに対して、抗体Ｐ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４）、Ｐ３Ｇ５（ＴＰＰ−２１９５）およびＩＴＥＭ−４は、全長外部ドメインに対してのみ飽和的な結合を示し、Ｎ末端およびＣ末端短縮型構築物に対する結合障害を示す（図３および図４）。これは、本発明の抗体の結合エピトープが、アミノ酸３４〜６８のシステインリッチドメイン内に位置することを示している。ＴＷＥＡＫＲ外部ドメインのＮ末端またはＣ末端がＰ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４）およびＰ３Ｇ５（ＴＰＰ−２１９５）結合に必要であるかを分析するために、Ｃ末端のアミノ酸６９〜８０が欠失した単量体外部ドメインを作製した。Ｃ末端短縮型ＴＷＥＡＫＲ外部ドメインに対するＰ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４）およびＰ３Ｇ５（ＴＰＰ−２１９５）の結合も障害されているのに対して、本発明の抗体は、飽和的な結合を示す（図５）。
【表９】
2016521715.tif 000034
【表１０】
2016521715.tif 000035
【０３６８】
したがって、ＴＰＰ−２０９０、ＴＰＰ−２０８４、ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）および１３６．１（ＴＰＰ−２１９４）の結合エピトープは、システインリッチドメイン内に位置し、Ｐ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４）およびＰ３Ｇ５（ＴＰＰ−２１９５）の結合エピトープは、システインリッチドメインの外側に少なくとも部分的に位置する。
【０３６９】
抗体親和性に対するＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃ変異タンパク質の効果：
本発明の抗体の結合特性をより詳細に規定するために、公知のアゴニスト抗体の結合に適切であると提案されている特定のＴＷＥＡＫＲ変異タンパク質を試験した（国際公開第２００９／１４０１７７号）。したがって、以下の単一アミノ酸置換を有する全外部ドメイン（アミノ酸２８−８０）を発現させ、Ｆｃ融合タンパク質として精製した：Ｔ３３Ｑ；Ｓ４０Ｒ；Ｗ４２Ａ；Ｍ５０Ａ；Ｒ５６Ｐ；Ｈ６０Ｋ；Ｌ６５Ｑ。
【表１１】
2016521715.tif 000036
【０３７０】
用量応答データを収集するために、様々なＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃ変異タンパク質を低濃度（６２ｎｇ／ｍｌ）で３８４ウェルＭａｘｉｓｏｒｂ  ＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、濃度１００ｎＭから開始する系列２倍希釈のビオチン化ＩｇＧを可溶性結合パートナーとして使用した。ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄを用いて、検出を行った。試験したＩｇＧは、本発明のＴＰＰ−２０９０およびＴＰＰ−２０８４、国際公開第２００９／０２０９３３号のＰＤＬ−１９２、１３６．１および１８．３．３、国際公開第２００９／１４０１７７号のＰ４Ａ８およびＰ３Ｇ５、ならびにＮａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ［Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍ  ３０６：８１９−８２５］のＩＴＥＭ−１およびＩＴＥＭ−４であった。
【表１２】
2016521715.tif 000037
【表１３】
2016521715.tif 000038
【０３７１】
製造業者の説明書にしたがって、約２倍モル過剰のビオチン−ＬＣ−ＮＨＳ（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２１３４７）を使用して、ＩｇＧをビオチン化し、Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｃａｔ．Ｎｏ．８９８８９）を使用して脱塩した。用量応答データをフィッティングし、ＩＣ５０を決定した。結果を可視化するために、表を作成し、「−」は、ＩＣ５０が５０ｎＭ超であることを示し、「＋」は、ＩＣ５０が１〜１５０ｐＭの範囲内であることを示す。
【表１４】
2016521715.tif 000039
【０３７２】
以前に公開されているように、ＩＴＥＭ−４は、Ｈ６０Ｋ変異タンパク質に対する結合障害を示し［国際公開第２００９／１４０１７７号：図２３Ｆ］、ＰＤＬ−１９２は、Ｒ５６Ｐ変異タンパク質に対する結合障害を示す［国際公開第２００９／０２０９３３号：図２２Ｂ］。公開されているデータとは対照的に。ＩＴＥＭ−１は、Ｒ５６Ｐに対する結合障害を示し、すべての抗体は、Ｗ４２Ａに対する結合障害を示す［国際公開第２００９／１４０１７７号：図２３Ｅ、図２３Ｆ］。この差異は、選択した方法によって説明することができる；極めて低濃度のコーティングは、アビディティ効果を最小化するので、オフ速度障害の区別を容易にする。分析した抗体はいずれも、Ｗ４２Ａ変異タンパク質に対する結合が障害されていないので、この置換は、いくらかの構造変化を引き起こすが、結合エピトープの直接的な変化を引き起こさないと思われる。
【０３７３】
ＩＴＥＭ−１、ＩＴＥＭ−４、ＰＤＬ−１９２、１３６．１および１８．３．３とは対照的に、本発明の抗体は、Ｗ４２Ａ以外のすべての置換に非依存的に結合する。
【０３７４】
システインリッチドメインのアラニンスキャン：
本発明の抗体の結合部位を表すために、システインリッチドメイン（アミノ酸３４〜６８）のアラニンスキャンを実施した。図６において、ＴＷＥＡＫＲの全長外部ドメインのＮ末端およびＣ末端短縮型変異体は、本発明の抗体の結合を障害しないことを示すことができた。したがって、結合エピトープは、システインリッチドメイン内に局在する。以下の置換をＴＷＥＡＫＲ（３４−６８）−Ｆｃ構築物に導入した：Ｓ３７Ａ、Ｒ３８Ａ、Ｓ４０Ａ、Ｓ４１Ａ、Ｗ４２Ａ、Ｓ４３Ａ、Ｄ４５Ａ、Ｄ４７Ａ、Ｋ４８Ａ、Ｄ５１Ａ、Ｓ５４Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｒ５８Ａ、Ｐ５９Ａ、Ｈ６０Ａ、Ｓ６１Ａ、Ｄ６２Ａ、Ｆ６３ＡおよびＬ６５Ａ。
【表１５】
2016521715.tif 000040
2016521715.tif 000041
【０３７５】
ＨＥＫ２９３細胞において、これらのＴＷＥＡＫＲ（３４−６８）−Ｆｃ変異タンパク質を発現させた。用量応答データを収集するために、ＩｇＧを濃度１μｇ／ｍｌで３８４ウェルＭａｘｉｓｏｒｂ  ＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、ＴＷＥＡＫＲ変異タンパク質を含有する系列２倍希釈の上清を可溶性結合パートナーとして使用した。抗ＨＩＳ−ＨＲＰおよびＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄを用いて、検出を行った。試験したＩｇＧは、本発明のＴＰＰ−２０９０、国際公開第２００９／０２０９３３号のＰＤＬ−１９２および国際公開第２００９／１４０１７７号のＰ４Ａ８であった。
【表１６】
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【０３７６】
様々なＩｇＧに対する結合について、各ＴＷＥＡＫＲ変異タンパク質の適切性を評価するために、特定の変異タンパク質濃度の相関ブロットを作成した。例示的に、図６において、ＴＷＥＡＫＲ発現ブロスの８倍希釈上清の相関ブロットを示す（ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）はＸ軸、ＴＰＰ−２０９０はＸ軸）。前記ブロットは、ＴＰＰ−２０９０の結合が置換Ｄ４７Ａによって障害され、ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）の結合が置換Ｒ５６Ａによって障害されたことを示している。すべての構築物について、Ｐ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４）に対する結合を検出することができなかったが、これは、先に得られた結果と一致している（図６）。したがって、Ｐ４Ａ８エピトープは、システインリッチドメインの外側に少なくとも部分的に局在する。抗体相互作用に関して、特定のＴＷＥＡＫＲアミノ酸に対する同定された依存性は、これらの抗体について決定されたアゴニスト活性と相関する。ネイティブリガンドのＴＷＥＡＫは、ＴＷＥＡＫＲの効率的な活性化を示し、ＴＷＥＡＫＲのシステインリッチドメインのロイシン４６依存的に結合する（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳ  ２８０：１８１８−１８２９）。Ｐ４Ａ８は、非常に低いアゴニスト活性を示し、ＴＷＥＡＫＲのシステインリッチドメインの外側のドメインと少なくとも部分的に相互作用する。ＰＤＬ−１９２は、わずかなアゴニスト活性を示し、ＴＷＥＡＫリガンド部位とは反対側に、Ｒ５６依存的にシステインリッチドメインに結合する。ＴＰＰ−２０９０およびＴＷＥＡＫは、それぞれＤ４７およびＬ４６依存的に結合するので、類似する結合部位に結合する（図７）。
【０３７７】
すべての本発明の抗体に関する共通のエピトープの証拠を裏付けるために、さらなる抗体（すなわち、ＴＰＰ−２０９０、ＴＰＰ−２１４９、ＴＰＰ−２０９３、ＴＰＰ−２１４８、ＴＰＰ−２０８４、ＴＰＰ−２０７７、ＴＰＰ−１５３８、ＴＰＰ−８８３、ＴＰＰ−１８５４、ＴＰＰ−１８５３、ＴＰＰ−１８５７、ＴＰＰ−１８５８）を試験した。試験した抗体はすべて、ＴＷＥＡＫＲの４７位のＤ（Ｄ４７）に特異的に結合する（図６Ｃを参照のこと）。やはり、ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）は依然として、ＴＷＥＡＫＲのＤ４７Ａ変異タンパク質に結合することができる。
【０３７８】
結論として、本発明の抗体（例えば、ＴＰＰ−２０９０）は、Ｄ４７依存的にＴＷＥＡＫＲに結合する。
【０３７９】
抗体相互作用に関して、特定のＴＷＥＡＫＲアミノ酸に対する同定された依存性は、これらの抗体について決定されたアゴニスト活性と相関する。ネイティブリガンドのＴＷＥＡＫは、ＴＷＥＡＫＲの効率的な活性化を示し、ＴＷＥＡＫＲのシステインリッチドメインのロイシン４６依存的に結合する（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳ  ２８０：１８１８−１８２９）。Ｐ４Ａ８は、非常に低いアゴニスト活性を示し、ＴＷＥＡＫＲのシステインリッチドメインの外側のドメインと少なくとも部分的に相互作用する。ＰＤＬ−１９２は、わずかなアゴニスト活性を示し、ＴＷＥＡＫリガンド部位とは反対側に、Ｒ５６依存的にシステインリッチドメインに結合する。本発明の抗体（図６Ｃを参照のこと）は、Ｄ４７依存的に結合し、ＴＷＥＡＫは、Ｌ４６依存的に結合し、類似するが区別可能な結合部位に結合する（図７）。したがって、強力なアゴニスト活性を示す本発明の抗体は、抗体の非常に強力なアゴニスト活性に関係する抗体に関する新規エピトープに（Ｄ４７依存的に）結合する。興味深いことに、Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎら（ｐａｇｅ  ３６９，ｌｅｆｔ  ｃｏｌｕｍｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ  ＪＳ  ｅｔ  ａｌ，ＭＡｂｓ．２０１１  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；３（４）：３６２−７５を参照のこと）は、彼らが調査したすべてのアゴニスト抗体が天然リガンドＴＷＥＡＫと比較して弱いアゴニスト活性を有する理由を説明した。彼らの結論では、有効性の減少は、抗体と、ＴＷＥＡＫがおそらくは三量体で会合しているＴＷＥＡＫＲとの二量体結合相互作用に依存し得る。したがって、本発明の抗体が、ＴＷＥＡＫＲとの二量体相互作用によって、より高いアゴニスト活性を有することは、驚くべき知見である。この驚くべき効果は、本発明の抗体の特異的結合特性に連動しているので、ＴＷＥＡＫＲのＤ４７に対する特異的結合に連動している。
【０３８０】
エピトープ競合実験による本発明の抗体の特性評価：
本発明の抗体および他の公知の抗ＴＷＡＥＫＲ抗体の差異を理解するために、競合実験を実施した。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）による表面プラズモン共鳴分析によって、いくつかの抗ＴＷＥＡＫＲ抗体のオーバーラップする結合モチーフに関するこの調査を実施した。
【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【０３８１】
「アミンカップリングキット」（ＢＲ−１００６−３３，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して、すべての抗体をＣＭ５センサーチップ上に直接固定化した。製造業者が説明しているように、試薬を使用した。抗原による第２の抗体（固定化抗体）の飽和のために、２００ｎＭのＴＷＥＡＫＲ（ＴＰＰ−２３０５）のＨＥＰＥＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を３０μｌ／分で１２０秒間注入した。続いて、２００ｎＭの第２の抗体（「競合抗体」）のＨＥＰＥＳ−ＥＰ緩衝液をフローセルに３０μｌ／分で１２０秒間注入した。一般に、インライン参照セル補正とそれに続くサンプルバッファ控除の後に、センサーグラムを作成した。Ｂｉａｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン４．０）を使用して、センサーグラムを徹底的に手動で検査することによって、定性的な競合データ（図８）を作成した。第２の抗体の注入後における第２の結合事象の欠如により、各抗体ペア内の明確な競合が示された。非競合抗体ペアは、第２の抗体の注入後に、バックグラウンドを超える明確な結合シグナルを示した。加えて、内部システム対照として、自己競合（第１の抗体および第２の抗体が同一）をモニタリングした。全体として、９対９の抗体のマトリックスがこの分析に含まれていた。
【０３８２】
一般に、抗ＴＷＥＡＫＲ抗体を３つの異なる「競合群」（図９）にクラスタ化することができる。１つの群は、ＴＰＰ−２０８４およびＴＰＰ−２０９０（これらは両方とも、試験したすべての他のメンバーとの競合を示す）のみを含有する。これらの他のメンバーを、互いにいかなる競合も示さない２つの別個の抗体セットに分けることができる。したがって、試験したすべての抗ＴＷＥＡＫＲ抗体との「完全な」競合は、ＴＰＰ−２０８４およびＴＰＰ−２０９０にユニークなものである。
【０３８３】
これは、試験した本発明の抗体が両方とも、ユニークな新規エピトープに結合するという上記知見を裏付けている。
【０３８４】
本発明の抗体の選択性評価：
また、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの他のメンバーに対する結合について、本発明の抗体ＴＰＰ−２０９０を試験して、その選択性を評価した。図１０に示されているように、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーは、非常に高い配列多様性を示す。ＴＷＥＡＫＲと最も類似するのはＴＮＦＲＳＦ１３ＣおよびＴＮＦＲＳＦ１７であるが、配列同一性はわずか約３０％である。他のＴＮＦＲＳＦメンバーのいずれにおいても、エピトープ領域それ自体（システインリッチドメイン）は、マッチを有しない（最高ヒットのＢＬＡＳＴ  Ｅ値＝０．７）。２９個の公知のＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーすべての外部ドメインをＦｃ融合タンパク質として購入し（表２０）、１μｇ／ｍｌをＭａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。
【０３８５】
用量応答データを収集するために、濃度２μＭから開始する系列３倍希釈のビオチン化ＩｇＧを可溶性結合パートナーとして使用した。抗ｈＩｇＧ１−ＨＲＰおよびＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄを用いて、検出を行った。試験したＩｇＧは、本発明のＴＰＰ−２０９０であった。図１１に示されているように、ＴＰＰ−２０９０は、３００ｐＭの非常に低い濃度において、ＴＷＥＡＫＲに飽和的に既に結合しているのに対して、７５ｎＭの非常に高い濃度においても、他の２８個のＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーすべてに結合していない。
【０３８６】
したがって、ＴＰＰ−２０９０は、ＴＷＥＡＫＲに選択的に結合する。
【表２０】
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【０３８７】
［実施例３］癌細胞株の細胞表面に対する抗ＴＷＥＡＫＲ抗体の結合
マウスおよびヒト癌細胞株に対する抗ＴＷＥＡＫＲ抗体の結合特性を決定するために、細胞株パネルに対してフローサイトメトリーによって、結合を試験した。ＣａおよびＭｇを含まないＰＢＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＃Ｌ１８２５：８０００ｍｇ／ｌ  ＮａＣｌ、２００ｍｇ／ｌ  ＫＣｌ、１１５０ｍｇ／ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４および２００ｍｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４を含有する水溶液）で接着細胞を２回洗浄し、ＰＢＳベースの酵素フリー細胞解離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって剥離した。細胞を細胞約１０５個／ウェルでＦＡＣＳ緩衝液（Ｃａ／Ｍｇを含まず、３％ＦＣＳを含有するＰＢＳ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）に懸濁した。細胞を遠心分離し（２５０ｇ、５分間、４℃）し、上清を廃棄した。ＦＡＣＳ緩衝液による目的の抗体の希釈物（特に指示がない場合には８０μｌ中、１０μｇ／ｍｌ）に細胞を再懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。その後、１００μｌの冷ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を１回洗浄し、８０μｌの１：１５０希釈した二次抗体（ＰＥヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｄｉａｎｏｖａ  ＃１０９−１１５−０９８またはＰＥヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＃１１５−１１５−１６４）を追加した。氷上で１時間インキュベートした後、冷ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を再度洗浄し、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳアレイ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してフローサイトメトリーによって分析した。目的の抗体によって検出された蛍光の幾何平均から、二次抗体のみによる検出によって測定したバックグラウンド蛍光を差し引いたものとして、結果を計算する。以下のシステムにしたがって、値をスコア化する：
幾何平均−二次抗体のみの幾何平均＞１０：＋、＞１００：＋＋、＞１０００：＋＋＋、１００００：＋＋＋＋、（）内のカテゴリー境界付近。細胞株の供給源を表２１に示す。
【０３８８】
表２１に示されているように、濃度１０μｇ／ｍｌで使用した本発明の抗ＴＷＥＡＫＲ抗体はすべて、様々な腫瘍エンティティに相当するマウス（４Ｔ１，Ｌｅｗｉｓ  Ｌｕｎｇ）およびヒト（表に含まれるすべての他の細胞株）起源のＴＷＥＡＫＲを発現する広範囲の腫瘍細胞に結合する。
【表２１】
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【０３８９】
（幾何平均−二次抗体のみの幾何平均＞１０：＋、＞１００：＋＋、＞１０００：＋＋＋、１００００：＋＋＋＋、（）内のカテゴリー境界付近）
＊表２１の癌細胞株の成長培地のリスト：
１．ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２；（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ；＃  ＦＧ  ４８１５、安定グルタミンを含む）、１０％ＦＣＳ
２．ＲＰＭＩ  １６４０；（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ；＃  ＦＧ  １２１５、安定グルタミンを含む）、１０％ＦＣＳ
３．ＤＭＥＭ；（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ；＃  ＦＧ  ０４３５、安定グルタミンを含む）、１０％ＦＣＳ
４．ＭＥＭ  Ｅａｒｌｅ’ｓ；（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ；＃  ＦＧ  ０３２５、安定グルタミンを含む）、１０％ＦＣＳ
５．ＤＭＥＭ；（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ；＃  ＦＧ  ０４３５、安定グルタミンを含む）Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン；（最終４ｍＭで２ｍＭエキストラ，Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，＃  Ｋ  ０３０２）非必須アミノ酸；（最終：１×、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ；＃  Ｋ  ０２９３），１０％ＦＣＳ
６．ＤＭＥＭ；（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ；＃  ＦＧ  ０４４５、安定グルタミンを含む高グルコース），１０％ＦＣＳ
７．ＲＰＭＩ  １６４０；（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ；＃  ＦＧ  １２１５、安定グルタミンを含む）、２０％ＦＣＳ
８．ＭＥＭ  Ｅａｒｌｅ’ｓ；（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ；＃  Ｆ  ０３１５）、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン；（最終：２ｍＭ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ；＃  Ｋ  ０３０２）非必須アミノ酸；（最終：１×、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ；＃  Ｋ  ０２９３）、１０％ＦＣＳ
９．ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２；（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ；＃  ＦＧ  ４８１５、安定グルタミンを含む）、ウマ血清（最終：２．５％）；（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ；＃  Ｓ  ９１３５）１０％ＦＣＳ
１０．ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２；（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ；＃  ＦＧ  ４８１５、安定グルタミンを含む）、ヒドロコルチゾン；（最終：４０ｎｇ／ｍＬ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ；＃  Ｋ  ３５２０）、１０％ＦＣＳ
１１．ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ；（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ；＃  Ｆ  １０１５）Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン；（１．５ｍＭエキストラ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ；＃  Ｋ  ０３０２）、１０％ＦＣＳ
全体として、ＦＡＣＳ分析によって検出された本発明の抗体の最大細胞結合は、他の公知の抗体と比較してわずかであることに留意しなければならない。表２３および図１２に示されているように、ＦＡＣＳ分析によって検出された、様々な細胞に結合した抗体の量は、１０μｇ／ｍｌ（ＦＡＣＳ分析によって検出された抗体の細胞結合がプラトーに達した濃度）では、他の公知の抗体（ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）、Ｐ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４））と比較して少ない（データは示さず）。
【表２２】
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【表２３】
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【０３９０】
［実施例４］様々なＴＷＥＡＫＲ発現細胞株におけるカスパーゼ３／７活性化の誘導
アポトーシス誘導のレベルを決定するために、ＴＷＥＡＫまたはアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体による癌細胞の処理後に、カスパーゼ３／７活性化を測定した。したがって、アッセイ培地（ＤＭＥＭ／Ｈａｍ´ｓＦ１２、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＃ＦＧ４８１５＋１０％ＦＣＳ＋１００ｎｇ／ｍｌ  ＩＦＮガンマ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃２８５−ＩＦ））中、ＨＴ−２９細胞を細胞４０００個／７５μｌ／ウェルの密度で９６ウェルプレートにプレートした。２４時間後、細胞を、示されている様々な濃度の抗ＴＷＥＡＫＲ抗体（表２４を参照のこと）、組換えヒトＴＷＥＡＫ（Ｒ＆Ｄ，＃１０９０−ＴＷ−０２５／ＣＦ、大腸菌由来の組換え可溶性ヒトＴＷＥＡＫ、アクセッション＃  Ｑ４ＡＣＷ９のＡｒｇ９３−Ｈｉｓ２４９、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ８７４２、Ｎ末端Ｍｅｔおよび６−Ｈｉｓタグを含む）または対応するアイソタイプ対照ＩｇＧと共にインキュベートした。抗体と共に２４時間インキュベートした後、１００μｌ／ウェルのカスパーゼ３／７溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ｇ８０９３）を細胞に追加し、１時間インキュベートし、ＶＩＣＴＯＲ  Ｖ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で発光を読むことによって、カスパーゼ３／７活性を決定した。
【０３９１】
図１３および表２５に示されているように、本発明の抗体は、従来技術に記載されている抗体（ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）、Ｐ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４）、１３６．１（ＴＰＰ−２１９４））と比較して、およびまた３００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＷＥＡＫと比較して、カスパーゼ３／７の強力な最大誘導をもたらす（表２５）。したがって、本明細書に記載される抗体は、以前に記載されている抗体よりも、ＨＴ−２９細胞においてカスパーゼ３／７を誘導するのに優れている。
【０３９２】
本発明の抗体の強力な有効性がＨＴ−２９以外の細胞株にも当てはまるかを決定するために、組換えヒトＴＷＥＡＫと比較した抗ＴＷＥＡＫＲ抗体によるカスパーゼ３／７誘導能を細胞株パネルで評価した。この分析では、以下の条件を使用した：ＷｉＤｒ細胞を細胞３０００個／ウェルでプレートし、ＴＷＥＡＫまたは記載されている抗体の存在下で４８時間インキュベートし、Ａ２５３細胞を細胞２５００個／ウェルでプレートし、２４時間インキュベートし、ＮＣＩ−Ｈ３２２細胞を細胞５０００個／ウェルでプレートし、４８時間インキュベートし、７８６−Ｏ細胞を細胞２５００個／ウェルでプレートし、４８時間インキュベートした。Ａ２５３、ＮＣＩ−Ｈ３２２および７８６−Ｏ細胞の場合には、表２１に記載されている培地に細胞をプレートし、１００ｎｇ／ｍｌ  ＩＦＮガンマ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃２８５−ＩＦ）を追加した。プレートした２４時間後、１００μｇ／ｍの抗体または３００ｎｇ／ｍｌのＴＷＥＡＫ（ＮＣＩ−Ｈ３２２の場合には、１００ｎｇ／ｍｌのＴＷＥＡＫ）を追加し、細胞をさらに上記時間インキュベートした。インキュベーション時間の終了時に、ＨＴ−２９細胞について記載されているように、カスパーゼ３／７活性を決定した。カスパーゼ３／７の誘導倍率を未処理細胞と比較して計算した。
【０３９３】
表２５に示されているように、試験した本発明の抗体はすべて、ＨＴ−２９細胞において、他の公知の抗体と比較して増加したカスパーゼ３／７誘導を示し、３００ｎｇ／ｍｌのＴＷＥＡＫリガンドと比較して強力な活性に及んだ。癌細胞における（カスパーゼ３／７活性化によって測定した場合の）この強力なアポトーシス誘導効果は、ＷｉＤｒ、Ａ２５３、ＮＣＩ−Ｈ３２２および７８６−Ｏ細胞においても見られ、ほとんどの実験において、試験した本発明の抗体は、他の抗体および３００ｎｇ／ｍｌのＴＷＥＡＫと比較して高倍率の変化を誘導した。
【表２４】
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【表２５】
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【０３９４】
［実施例５］癌細胞株におけるアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体による増殖の阻害
本発明の抗体によるカスパーゼ３／７誘導性が、様々な癌細胞株の増殖の有効な阻害によっても反映されるかを調査するために、本発明の抗体と共にインキュベートした後に、参照抗体またはＴＷＥＡＫリガンドと比較して、抗増殖活性を測定した。
【０３９５】
したがって、７５μｌのアッセイ培地（表２１の成長培地、７８６−Ｏ細胞の場合にはそれに加えて１００ｎｇ／ｍｌ  ＩＦＮガンマ）中、細胞を以下の細胞数で９６ウェルプレートにプレートした：ＷｉＤｒ細胞、細胞３０００個／ウェル、７８６−Ｏ細胞、細胞２５００個／ウェル。２４時間後、示されている濃度（抗体は０．０３〜３００μｇ／ｍｌ、ＴＷＥＡＫは１００または３００ｎｇ／ｍｌ）の抗ＴＷＥＡＫＲ抗体（表２６を参照のこと）、組換えヒトＴＷＥＡＫまたはアイソタイプ対照ＩｇＧ（示さず）と共に細胞をインキュベートした。抗体の追加時に、シスタープレートにおいて、細胞生存率を決定した（時点ゼロ）：したがって、７５μｌ／ウェルのＣＴＧ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｃａｔａｌｏｇ  ＃Ｇ７５５Ｂ  ａｎｄ  Ｇ７５６Ｂ）を細胞に追加し、１０分間インキュベートし、Ｖｉｃｔｏｒ  Ｖ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で発光を読んだ。薬剤と共に９６時間インキュベートした後、１００μｌ／ウェルのＣＴＧ溶液を追加し、１０分間インキュベートし、発光を読むことによって、細胞生存率をアッセイプレートにおいて測定した。未処理対照ウェルにおける発光値から、時間ゼロの値を差し引くことによって、対照ウェルにおける増殖を計算した。化合物処理ウェルにおいて、未処理対照ウェルと比較した％細胞増殖を計算した。
【０３９６】
得られた用量応答曲線（これは、対照細胞と比較した、処理細胞における細胞増殖を表す）を図１４Ａ（ＷｉＤｒ細胞）および図１４Ｂ（７８６−Ｏ細胞）に示す。試験した本発明の抗体はすべて、ＷｉＤｒ細胞の増殖を５０−６０％阻害し、７８６−Ｏ細胞の増殖を７０−８０％阻害したが、これは、他の公知の抗体（例えば、ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）およびＰ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４））が達成した増殖阻害よりも有意であった。したがって、本発明の抗体は、これまでに記載されている最も有効な抗増殖性抗ＴＷＥＡＫＲ抗体である。
【０３９７】
この強力な抗増殖活性が、より広範な細胞パネルにおいても観察され得るかを評価するために、さらに、ＬＯＶＯ、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、ＳＷ−４８０（すべて、細胞３０００個／ウェル）、ＨＴ−２９（細胞４０００個／ウェル）、Ａ２５３およびＳＫ−ＯＶ３（両方とも、細胞２５００個／ウェル）細胞を１００μｇ／ｍｌの抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはＴＷＥＡＫリガンドと共に、表２７に示されている時間インキュベートした。表２１に示されている成長培地にすべての細胞を播種し、ＷｉＤｒ細胞を除くすべての細胞について、細胞を播種する際に、１００ｎｇ／ｍｌ  ＩＦＮガンマをアッセイ培地に追加した。未処理対照細胞における増殖と比較した処理細胞の成長阻害率を測定し、上記のように計算した。
【０３９８】
表２７に示されているように、本発明の抗体は、１００μｇ／ｍｌにおいて、他の公知の抗体と比較して、様々な癌細胞株の増殖を阻害するのに有効である。ほとんどの実験において、本発明の抗体はまた、１００−３００ｎｇ／ｍｌのＴＷＥＡＫリガンドと比較して同等かまたはそれよりも強力な有効性を示す。したがって、本発明に記載される抗体は、広範な癌細胞株パネルにおけるアポトーシスおよび増殖阻害の誘導活性の点でユニークである。
【表２６】
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【表２７】
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【０３９９】
［実施例６］抗ＴＷＥＡＫＲ抗体によって誘導される、癌細胞および異種移植腫瘍からのサイトカイン分泌
次に、本発明の抗体の強力なアゴニスト活性が、癌細胞からのサイトカイン分泌の誘導においても見られるかを調査することが関心対象であった。
【０４００】
したがって、成長培地ＤＭＥＭ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ；＃ＦＧ  ０４３５、安定グルタミンを含む）、１０％ＦＣＳ中、Ａ３７５細胞を細胞２５００個／ウェルで９６ウェルプレートにプレートした。２４時間後、細胞を、示されている様々な濃度の抗ＴＷＥＡＫＲ抗体、組換えヒトＴＷＥＡＫまたは対応するアイソタイプ対照ＩｇＧと共にインキュベートした。抗体と共にインキュベートを開始した２４時間後、細胞上清またはその希釈物をヒトＣＸＣＬ８／ＩＬ−８  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＹ２０８）の捕捉Ｅｌｉｓａプレートに追加し、３００ｒｐｍで振盪することによって４℃で一晩インキュベートした。翌日、製造業者の説明書にしたがって、ヒトＣＸＣＬ８／ＩＬ−８−ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＹ２０８）を使用することによって、サンプルを分析した。光学密度を４５０ｎｍで測定し（Ｔｅｃａｎ  Ｓｐｅｃｔｒａ，Ｒａｉｎｂｏｗ）、それと同時にバックグラウンド補正した。ＩＬ−８の絶対レベルを計算するために、製造業者の推奨（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）にしたがって、組換えヒトＩＬ−８タンパク質を使用した標準曲線を適用した。
【０４０１】
図１５に示されているように、本発明の抗体は、以前に公知の他の抗体と比較して増加したＩＬ−８放出誘導を示した。１００μｇ／ｍｌにおいて、本発明の抗体ＴＰＰ−１５３８／−１８５４／−２０８４／−２０９０は、３００ｎｇ／ｍｌのＴＷＥＡＫリガンドと比較してそれぞれ１３４／１２９／１１３／１０３％の活性化を達成した。対照的に、比較のために使用した抗体ＰＤＬ−１９２（ＴＰＰ−１１０４）／Ｐ４Ａ８（ＴＰＰ−１３２４）／１３６．１（ＴＰＰ−２１９４）は、それぞれ６６／２９／９３％を達成したに過ぎなかった。したがって、本発明の抗体は、以前に公知の他の抗体および３００ｎｇ／ｍｌのＴＷＥＡＫリガンドと比較して、ＩＬ−８分泌の誘導に関して最も強力な活性を示す。
【０４０２】
観察されたサイトカイン分泌が、マウス内の異種移植腫瘍においても妥当するかを調査するために、腫瘍担持マウス（Ａ３７５、ＷｉＤｒ）および無腫瘍マウス由来の血清／血漿中のヒトおよびマウスサイトカインを調査した。５×１０６個のＡ３７５細胞を含むＭａｔｒｉｇｅｌ／ＰＢＳ（１：１）または５×１０６個のＷｉＤｒ細胞を含むＭａｔｒｉｇｅｌ／培地（１：１）を免疫不全雌性ＮＭＲＩヌードマウスに皮下接種した。Ａ３７５担持マウスと平行して、非腫瘍マウスを調査した。約４０ｍｍ２の樹立腫瘍を接種した７日後に、処理を開始した。ＰＢＳで希釈したＴＰＰ−１５３８（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＴＰＰ−２０９０（３ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈に単回静脈内注射することによって、マウスを処理した。次いで、所定時点（Ａ３７５担持マウスの場合には０、６時間、２４時間、およびＷｉＤｒ担持マウスの場合には０、７時間、２４時間、７２時間、１６８時間、２４０時間）にマウスを屠殺して、血清／血漿サンプルを収集した。断頭後に血液を採取し、３０分間凝固させてから１０００×ｇで遠心分離することによって、血清を調製した。
【０４０３】
Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ビーズイムノアッセイを使用して、サイトカインを定量した。ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＣＰ−１を含むヒトサイトカイン磁気２５プレックスパネル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標），Ｃａｔ−Ｎｏ．ＬＨＣ０００９Ｍ）を用いて、ヒトサイトカインを決定した。塩基性ＦＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１２（ｐ４０／ｐ７０）、ＩＬ−１７、ＩＰ−１０、ＫＣ、ＭＣＰ−１、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１α、ＴＮＦ−αおよびＶＥＧＦを含むマウスサイトカイン磁気２０プレックスパネル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標），Ｃａｔ−Ｎｏ．ＬＨＣ０００６Ｍ）を用いて、マウスサイトカインを決定した。製造業者の説明書にしたがってアッセイを行い、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｒｅａｄｅｒ  Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  ２００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＧｍｂＨ）によって測定した。分析手順の一環として、オペレーティングソフトウェアＢｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｍａｎｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＧｍｂＨ）によって、標準曲線からサイトカイン濃度を補間した。
【０４０４】
図１６Ａに示されているように、３ｍｇ／ｋｇのＴＰＰ−２０９０による単回処理によって、ＷｉＤｒ異種移植片からヒトＩＬ−８が時間依存的に放出されている。加えて、ＴＰＰ−２０９０による処理後に、ヒトＭＣＰ−１、ＩＰ−１０およびＩＬ−１５の分泌の誘導が観察された（示さず）。
【０４０５】
本発明のアゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体による処理後の腫瘍担持マウスの血漿中で観察されたサイトカイン誘導が、実際に腫瘍特異的であったかをさらに調査するために、Ａ３７５腫瘍担持マウスおよび無腫瘍マウスにおいて同様の調査を行い、ヒトサイトカインおよびマウスサイトカインを測定した。
【０４０６】
図１６Ｂに示されているように、１０ｍｇ／ｋｇのＴＰＰ−１５３８による処理の６時間後に、腫瘍担持マウス内のＡ３７５異種移植片からヒトＩＬ−８が放出されている。加えて、ヒトＭＣＰ−１、ＩＰ−１０およびＩＬ−１ＲＡのレベルの増加が観察された（示さず）。対照的に、処理した無腫瘍マウスの血漿中では、ヒトサイトカインの分泌の増加は検出されなかった（図１６Ｂおよび示さず）。加えて、ＴＰＰ−１５３８による処理後に、腫瘍担持マウスおよび無腫瘍マウスのいずれの血漿中においても、マウスサイトカイン（マウスＩＬ−８類似体ＫＣを含む）の増加は検出されなかった（データは示さず）。要約すると、本発明の抗体は、インビボにおいて、癌細胞および異種移植片からのサイトカインの分泌を腫瘍特異的に強力に誘導する。
【０４０７】
［実施例７］抗ＴＷＥＡＫＲ抗体のインターナリゼーションおよび薬物コンジュゲートアプローチの有用性
本発明の抗ＴＷＥＡＫＲ抗体が、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の作製に潜在的に使用可能であるかを調査するために、抗体のインターナリゼーション能力を調査した。
【０４０８】
このプロセスを可視化するために、ＴＷＥＡＫＲ特異的抗体ＴＰＰ−１５３８およびＴＰＰ−２０９０ならびにアイソタイプ対照抗体を選択した。２倍モル過剰のＣｙｐＨｅｒ  ５ＥモノＮＨＳエステル（ｂａｔｃｈ  ３５７３９２，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（ｐＨ８．３）の存在下で、抗体をコンジュゲートした。コンジュゲートした後、反応混合物を４℃で一晩透析して（ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｓｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ＭＷＣＤ  １０ｋＤ，Ｆａ．Ｐｉｅｒｃｅ）、過剰な色素を除去し、ｐＨ値を調整した。その後、タンパク質溶液を濃縮した（ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ５００，Ｆａ  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃ）。ｐＨ依存性蛍光色素ＣｙｐＨｅｒ５Ｅに加えて、ｐｈ非依存性色素Ａｌｅｘａ４８８を使用した。分光光度計（Ｆａ．ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いて、抗体の色素負荷を決定した。ＴＰＰ−１５３８、ＴＰＰ−２０９０およびアイソタイプ対照抗体の色素負荷は、同様の範囲内であった。標識細胞結合アッセイにおいて標識抗体の親和性を試験して、ＴＷＥＡＫＲに対する結合を標識が変化させなかったことを確認した。以下のインターナリゼーションアッセイおいて、これらの標識抗体を使用した。処理前に、細胞（２×１０４個／ウェル）を９６−ＭＴＰ（ｆａｔ，ｂｌａｃｋ，ｃｌｅａｒ  ｂｏｔｔｏｍ  Ｎｏ  ４３０８７７６，Ｆａ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中の培地１００μｌに播種した。３７℃／５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした後、培地を交換し、標識抗ＴＷＥＡＫＲ抗体ＴＰＰ−１５３８およびＴＰＰ−２０９０を様々な濃度（１０、５、２．５、１、０．３、０．１μｇ／ｍｌ）で追加した。同位体対照抗体（陰性対照）を用いて、同一の処理を行った。インキュベーション時間は、０、０．５時間、１時間、２時間、３時間、６時間および２４時間になるように選択した。ＩｎＣｅｌｌＡｎａｌｙｚｅｒ  １０００（Ｆａ．ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、蛍光測定を実施した。細胞当たりの顆粒数および総蛍光強度を動的に測定した。
【０４０９】
内因性ＴＷＥＡＫＲを発現する癌細胞株７８６−Ｏ（腎臓癌）およびＨＴ−２９（結腸癌では、ＴＰＰ−１５３８およびＴＰＰ−２０９０の高特異的かつ有意なインターナリゼーションが観察された。
【０４１０】
抗ＴＷＥＡＫＲ抗体を使用して取り込みのみを実証することができ、アイソタイプ対照抗体ではインターナリゼーションが観察されなかったので、このインターナリゼーションは標的依存的であった。最初の６時間の間に、抗ＴＷＥＡＫＲ抗体は、アイソタイプ対照と比較して、抗体インターナリゼーションの２０〜４０倍の増加を示した。長時間（＞２４時間）の曝露後に、アイソタイプ対照抗体は、わずかなインターナリゼーションを示した。
【０４１１】
結合によるＡｌｅｘａ４８８標識抗ＴＷＥＡＫＲ抗体のインターナリゼーションは、インターナリゼーションした抗体の５０％超がエンドサイトーシス経路にしたがうと思われることを示している。
【０４１２】
図１７では、内因性ＴＷＥＡＫＲ発現細胞に対する結合に関する、ＴＰＰ−１５３８およびＴＰＰ−２０９０の経時的な特異的インターナリゼーションの評価が示されている。腎癌細胞株７８６−Ｏにおいて、抗体（１μｇ／ｍｌ）のインターナリゼーションを調査した。細胞当たりの顆粒数を動的に測定した。ＴＰＰ−１５３８およびＴＰＰ−２０９０では、迅速なインターナリゼーションを観察することができたのに対して、アイソタイプ対照ｈＩｇＧ１はインターナリゼーションしなかった。加えて、ＴＰＰ−２０９０では、有意に改善されたインターナリゼーション効果が見られた。受容体レベルが異なる様々な癌細胞を使用して実施したインターナリゼーションアッセイにおいて、ＴＰＰ−２０９０の高い有効性を検証することができた（示さず）。
【０４１３】
加えて、サポリンコンジュゲート二次抗体の存在下でインキュベートした場合の、抗ＴＷＥＡＫＲ抗体の細胞増殖阻害活性をＨｕｍＺａｐアッセイで評価した。したがって、成長培地中（ＤＭＥＭ／Ｈａｍ´ｓＦ１２，Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＃ＦＧ４８１５＋１０％ＦＣＳ）、７８６−Ｏ細胞を細胞２５００個／ウェルで９６ウェルプレートにプレートした。２４時間後、４０ｎＭサポリンコンジュゲート二次抗体（Ｈｕｍ  Ｚａｐ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｔ  ＃ＩＴ−２２，Ｌｏｔ  ５９−８３）の存在下または非存在下で、４０ｎＭ抗体（ＴＰＰ−１５３８、ＴＰＰ−２０９０またはアイソタイプ対照抗体）を室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション時間後、２５μｌの反応混合物を細胞に追加し、サンプルウェル中の抗体の最終濃度を１０ｎＭとした。抗体の追加時に、シスタープレートにおいて、細胞生存率を決定した（時点ゼロ）。したがって、７５μｌ／ウェルＣＴＧ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｃａｔａｌｏｇ  ＃Ｇ７５５Ｂ  ａｎｄ  Ｇ７５６Ｂ）を細胞に追加し、１０分間インキュベートし、Ｖｉｃｔｏｒ  Ｖ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で発光を読んだ。
【０４１４】
抗体／Ｚａｐ複合体と共にインキュベートを開始した４８時間後、１００μＬ／ウェルＣＴＧ溶液をすべての試験ウェルに追加し、１０分間インキュベートし、ＶＩＣＴＯＲ  Ｖで発光を読んだ。
【０４１５】
図１８に示されているように、サポリンコンジュゲート二次抗体の存在下で、７８６−Ｏ細胞を１０ｎＭの抗ＴＷＥＡＫＲ抗体と共にインキュベートすることにより、細胞増殖がほぼ完全に阻害されたのに対して、サポリンコンジュゲート二次抗体の非存在下では、およびアイソタイプ対照抗体の場合には、同じ実験条件下（ＩＦＮガンマの非存在下で４８時間インキュベートのみ）で、抗増殖活性は観察されなかった。
【０４１６】
要約すると、本発明の抗ＴＷＥＡＫＲ抗体は、迅速なインターナリゼーション、コンジュゲートしたペイロードのターゲティング送達を示すので、ＡＤＣの作製およびＡＤＣとしての使用に非常に適切である。
【０４１７】
［実施例８］インビボ異種移植モデルにおける抗ＴＷＥＡＫＲ抗体の抗腫瘍効果
抗ＴＷＥＡＫＲ抗体が、インビボにおいて抗腫瘍活性を示すかを調査するために、単独療法または併用療法において、アゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体による腫瘍成長阻害に対するそれらの感度について、様々な癌細胞株由来の異種移植腫瘍または患者由来の腫瘍モデルを試験した。
【０４１８】
インビボ実験の開始前に、選択した異種移植モデルにおけるＴＷＥＡＫＲの発現を免疫組織化学によって評価した。したがって、アセトンを用いて、対応する異種移植片の凍結切片（５μＭ）を４℃で５分間固定し、非特異的結合タンパク質およびペルオキシダーゼ活性に対してブロッキングした。組織切片をウサギ抗ＴＷＥＡＫＲ抗体（Ｆｎ１４，Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ，３４８８−１）と共に室温で６０分間インキュベートし、続いて、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギポリマー（ＤＡＫＯ，Ｋ４０１１）と共に３０分間インキュベートした。ジアミノベンジジンで切片を現像し、最後にヘマトキシリンで対比染色した。ＴＷＥＡＫＲの発現について陽性であったモデルのみをインビボ実験に使用した。
【０４１９】
インビボにおける抗ＴＷＥＡＫＲ抗体の抗腫瘍活性の調査のために、様々なヒト腫瘍細胞株または患者由来の腫瘍の異種移植片を担持するヌードマウスを反復静脈内注射によって処理した。
【０４２０】
上記パートに記載されているように腫瘍細胞株を培養し、細胞株特異的な数の腫瘍細胞を含有する１００μｌを雌性無胸腺ヌードマウス（ＮＭＲＩ  ｎｕ／ｎｕ，６〜８週齢、２０〜２５ｇ、Ｔａｃｏｎｉｃ）に皮下（ｓ．ｃ．）接種した。標準的な無菌条件下でマウスを飼育し、動物保護ガイドラインにしたがって処理した。
【０４２１】
腫瘍が約４０ｍｍ２のサイズに成長した後、マウスを対照群および処理群にランダムに分けた（各群のサイズｎ＝８−１０）。ＰＢＳで希釈した様々な用量の抗ＴＷＥＡＫＲ抗体を週２回のスケジュール（ｑ４ｄｘ３：週２回の適用、合計３回の適用；ｑ４ｄｘ８：週２回の適用、合計８回の適用）で尾静脈に静脈内（ｉ．ｖ．）注射することによって、マウスを処理した。レゴラフェニブ（１０ｍｇ／ｋｇ、毎日、経口）およびＰＩ３Ｋ阻害剤１（１０ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＤ、２ｄ  ｏｎ、５ｄ  ｏｆｆ（２日連続で１日２回の適用、その後は５日間処理せず）、ｉ．ｖ．）などの併用療法パートナーは、それらの各製剤で希釈したのに対して、標準治療のイリノテカン（５ｍｇ／ｋｇ、４ｄ  ｏｎ、３ｄ  ｏｆｆ（４日連続で１日１回の適用、その後は３日間処理せず）ｉ．ｖ．）およびパクリタキセル（１６ｍｇ／ｋｇ、ｑ７ｄｘ４（週１回の適用、合計４回の適用）、ｉ．ｖ．）は、０．９％ＮａＣｌで希釈した。ＰＢＳを注射した動物は、対照（ビヒクル）群としての役割を果たした。化合物の適用量は、５ｍｌ／ｋｇ体重／マウスであった。
【０４２２】
キャリパー測定（長さ×幅、ｍｍ単位）および体重（ｇ単位）によって、腫瘍成長を週２〜３回モニタリングした。研究の終了時に、腫瘍を解剖し、計量し、腫瘍対対照（Ｔ／Ｃ）の比（処理動物の平均腫瘍重量を対照／ビヒクル動物の平均腫瘍重量で割ったもの）の計算に使用した。
【０４２３】
ヒト腎細胞癌モデル（陽性ＴＷＥＡＫＲ発現）において、アイソタイプ対照抗体と対比して、抗ＴＷＥＡＫＲ抗体ＴＰＰ−２０８４およびＴＰＰ−２０９０の有効性を３つの異なる低用量で試験した。１００％マトリゲル中の２×１０６個の腫瘍細胞を雌性ヌードマウスに皮下（ｓ．ｃ．）接種した。７日後、約４０ｍｍ２のサイズの樹立腫瘍を、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇの抗体（ｉ．ｖ．、ｑ４ｄｘ３：週２回の適用、合計３回の適用）で処理した。４０日目において、解剖後の腫瘍重量の比較により、ＴＰＰ−２０８４およびＴＰＰ−２０９０の用量依存的な有効性（これは、３ｍｇ／ｋｇにおいて最高であった）が示された（図１９）。（ＰＢＳで処理した）アイソタイプ群およびビヒクル群との明確な区別を証明することができた。いかなる群においても、体重の減少は観察されなかった。表２８に記載されている腫瘍対対照比は、ｑ７ｄｘ３（週１回の適用、合計３回の適用）またはｑ４ｄｘ３（週２回の適用、合計３回の適用）スケジュールによって３〜１０ｍｇ／ｋｇの抗ＴＷＥＡＫＲ抗体ＴＰＰ−１５３８、ＴＰＰ−２０９４またはＴＰＰ−２０９０で処理した７８６−Ｏモデルおよびさらなる腫瘍モデル（Ａ３７５、Ａ２５３、ＳＫ−ＯＶ−３、Ｂｘ−ＰＣ３）における優れた有効性を実証しているが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１については、単独療法の有効性を達成するためには、より強力な投与スケジュールの抗ＴＷＥＡＫＲ抗体が必要であり得る。
【表２８】
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【０４２４】
図２０は、ヒト結腸癌異種移植片ＷｉＤｒ（これは、ＨＴ−２９腫瘍細胞株のサブクローンに相当する）における、単独療法ならびにイリノテカンおよびレゴラフェニブとの併用療法による抗ＴＷＥＡＫＲ抗体ＴＰＰ−２０９０の有効性を示す。マトリゲル／培地（１：１）中の５×１０６個のＷｉＤｒ細胞を免疫不全ＮＭＲＩヌードマウスに皮下（ｓ．ｃ．）接種した。約４０ｍｍ２の樹立腫瘍を接種した７日後に、処理を開始した。単独療法による３ｍｇ／ｋｇのＴＰＰ−２０９０（ｉ．ｖ．、ｑ４ｄｘ７：週２回の適用、合計７回の適用）でさえ、腫瘍成長を制御するのに非常に有効であった。３ｍｇ／ｋｇのＴＰＰ−２０９０とイリノテカン（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、４ｄ  ｏｎ、３ｄ  ｏｆｆ）またはレゴラフェニブ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．、毎日）のいずれかとの組み合わせは、腫瘍退縮を伴う相加効果をもたらした。治療計画はすべて、マウスに十分許容されるものであった（最大４％の回復可能な初期体重減少）。最終的なＴ／Ｃ値は、表２９に記載されている。
【０４２５】
他の結腸直腸腫瘍モデル、例えばＳＷ４８０および患者由来の腫瘍モデルＣｏ５６８２においても、ＴＰＰ−２０９０を調査したところ、同様に良好な結果であった（表２９）。用量１０ｍｇ／ｋｇのＴＰＰ−２０９０は、ＳＷ４８０における単独療法では、腫瘍成長を制御するのに有効であり（Ｔ／Ｃ０．４９）、５ｍｇ／ｋｇイリノテカン（Ｔ／Ｃ０．２２）または１０ｍｇ／ｋｇレゴラフェニブ（Ｔ／Ｃ０．３７）と組み合わせた場合には、腫瘍退縮をもたらすのに有効であった。Ｃｏ５６８２異種移植片では、３ｍｇ／ｋｇのＴＰＰ−２０９０は、イリノテカンと組み合わせた場合には、腫瘍退縮を伴う相乗効果を示し（Ｔ／Ｃ０．２３）、レゴラフェニブと組み合わせた場合には、腫瘍鬱滞を伴う相乗効果を示した（Ｔ／Ｃ０．２７）。
【表２９】
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【０４２６】
図２１は、ヒト非小細胞肺癌異種移植ＮＣＩ−Ｈ３２２における、単独療法およびパクリタキセルとの併用療法による抗ＴＷＥＡＫＲ抗体ＴＰＰ−２０９０の有効性を示す。マトリゲル中の５×１０６個のＮＣＩ−Ｈ３２２細胞を免疫不全ＮＭＲＩヌードマウスに皮下（ｓ．ｃ．）接種した。約４５ｍｍ２の樹立腫瘍を接種した１４日後に、処理を開始した。用量５ｍｇ／ｋｇにおいて、ＴＰＰ−２０９０（ｉ．ｖ．、ｑ４ｄｘ８）は単独療法で非常に有効であり、腫瘍退縮を示した。１０ｍｇ／ｋｇのＴＰＰ−２０９０とパクリタキセル（１６ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、ｑ７ｄｘ４）との組み合わせは、わずかな相加効果をもたらした。治療計画はすべて、マウスに十分許容されるものであった（最大３％の回復可能な体重減少）。最終的なＴ／Ｃ値は、表３０に記載されている。
【０４２７】
先と同様に、他の肺癌モデル、例えばＮＣＩ−Ｈ１９７５ならびに患者由来の腫瘍モデルＬｕ７３４３およびＬｕ７４３３においても、ＴＰＰ−２０９０を調査したところ、同程度の結果であった（表３０）。用量３ｍｇ／ｋｇのＴＰＰ−２０９０は、ＮＣＩ−Ｈ１９７５では、１６ｍｇ／ｋｇパクリタキセルと組み合わせた場合に相加効果を示し、腫瘍退縮をもたらした（Ｔ／Ｃ０．０８）。同様に、患者由来のＮＳＣＬＣモデルＬｕ７３４３およびＬｕ７４３３では、３ｍｇ／ｋｇのＴＰＰ−２０９０と１０ｍｇ／ｋｇのＰＩ３Ｋ阻害剤１との組み合わせは、相加効果的に、腫瘍制御または腫瘍退縮をもたらした（Ｔ／Ｃ０．１８−０．３６）。
【０４２８】
ＰＩ３Ｋ阻害剤１は、（２−アミノ−Ｎ−［７−メトキシ−８−（３−モルホリン−４−モルホリン−４−イルプロポキシ）−２，３−ジヒドロイミダゾ）［１，２−ｃ］キナゾリン−５−イル］ピリミジン−５−カルボキサミドジヒドロクロリドである。
【表３０】
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【０４２９】
記載されているインビボの実施例はすべて、細胞株由来のおよび患者由来のヒト腫瘍モデル（これらはすべて、ＴＷＥＡＫＲ発現が陽性である）の広範なパネルにおける、単独療法および併用療法による抗ＴＷＥＡＫＲ抗体ＴＰＰ−２０９０の強力な有効性を実証している。使用したすべて用量において、ＴＰＰ−２０９０は、マウスに十分許容されるものであった。
【０４３０】
［実施例９］異種移植モデルにおける抗ＴＷＥＡＫＲ抗体の作用機序
インビボにおける抗ＴＷＥＡＫＲ抗体の作用機序を調査するために、実施例８に記載されているように、ＷｉＤｒ異種移植片由来の腫瘍を研究終了時に採取し、免疫組織化学およびウエスタンブロット分析によって調査した。
【０４３１】
増殖マーカータンパク質Ｋｉ６７について、ＷｉＤｒ異種移植片（１群当たり３匹の個々の動物の腫瘍）の凍結切片（５μｍ）を免疫組織化学的に染色した（インビボ実験の詳細については、実施例８を参照のこと）。新たに調製した４％パラホルムアルデヒドを用いて、切片を４℃で２０分間固定し、非特異的結合タンパク質およびペルオキシダーゼ活性に対してブロッキングした。製造業者の説明書（ＤＡＫＯ，Ｋ３９５４）にしたがって、ビオチンでマウス抗Ｋｉ６７抗体（ＤＡＫＯ，Ｍ７２４０）を標識し、組織切片と共に室温で６０分間インキュベートし、続いて、エクストラアビジン−ペルオキシダーゼ（ＤＡＫＯ，Ｋ３４６８）と共に３０分間インキュベートした。ジアミノベンジジンで切片を現像し、最後にヘマトキシリンで対比染色した。定量のために、腫瘍切片全体をスキャンし、ＡＲＩＯＬ自動顕微鏡バージョン３．２（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して分析した。ＰＢＳ（ｉ．ｖ．、ｑ４ｄｘ７）およびＴＰＰ−２０９０（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、ｑ４ｄｘ７）で処理した異種移植片をＫｉ６７について染色した代表的な画像をそれぞれ図２２ＡおよびＢに示す。ＡＲＩＯＬ画像システムを使用した定量により、１０ｍｇ／ｋｇのＴＰＰ−２０９０（ｉ．ｖ．ｑ４ｄｘ７）で処理した群における３５５＋／−５９  Ｋｉ６７陽性細胞／ｍｍ２、およびビヒクル処理群における８６３＋／−９０  Ｋｉ６７陽性細胞／ｍｍ２が明らかになった。したがって、観察された腫瘍体積の減少と一致して、アゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体による処理は、異種移植腫瘍における増殖マーカーＫｉ６７の減少をもたらす。
【０４３２】
加えて、研究終了時に急速凍結したＷｉＤｒ異種移植片腫瘍（インビボ実験の詳細については、実施例８を参照のこと）をウエスタンブロットによって分析して、Ｓｔａｔ−１およびＮＦ−κＢシグナル伝達経路に対する抗体処理の効果を評価した。１群当たり４匹の個々の動物の腫瘍を直径約５ｍｍの薄片に切断し、各薄片を、予冷５ｍｍ  ｓｔｅｅｌ  ｂｕｌｌ（Ｑｉａｇｅｎ）および５００μｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、１００ｍＭ  ＮａＦ、１０％グリセリン、１．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、新たに追加した完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｎｏ．１８７３５８０００１）、４ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整））と一緒に２ｍｌエッペンドルフチューブにデポした。Ｔｉｓｓｕｅｌｙｚｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）によってサンプルを３００Ｈｚで３分間溶解し、続いて、氷上で３０分間インキュベートした。その後、マイクロ遠心分離機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）によってサンプルを１３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、１つの元の腫瘍由来の上清を一緒にプールした。ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｈ２Ｏで溶解物を１：５０希釈）を使用することによって、腫瘍溶解物中のタンパク質レベルを決定した。サンプルを最終濃度４ｍｇ／ｍｌに希釈し、１０μｌのサンプルを３．０８μｌの（１０＊）サンプル還元剤、１０μｌのＨ２Ｏおよび７，６８μｌの（４＊）ＮｕＰＡＧＥサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した。４０μｇのタンパク質に相当するサンプルをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＮｕＰａｇｅ  ４−１２％ＳＤＳ  ｐａｇｅゲルにアプライし、１２０Ｖで２時間４５分間ランした。製造業者の推奨にしたがって、ｉＢｌｏｔシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって、ブロッティングを行った。５％ＢＬＯＴ  ＱｕｉｃｋＢｌｏｃｋｅｒのＰＢＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）溶液によって膜を室温で２時間ブロッキングし、続いて、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。一次抗体は、以下のとおりであった：Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｔａｔ１  ＃９１６７Ｓ，Ｓｔａｔ−１  ＃９１７２、両方ともＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１：１０００希釈；ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎ１４  ＃３４８８−１  Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ、１：１００００希釈；ＮＦ−κＢ２  ｐ１００／ｐ５２  ＃４８８２Ｓ，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３％ＢＬＯＴ  ＱｕｉｃｋＢｌｏｃｋｅｒのＰＢＳＴ溶液で１：１０００希釈。翌日、ＰＢＳＴで膜を３回洗浄し、続いて、二次抗体（ペルオキシダーゼコンジュゲートロバ抗ウサギＩｇＧ  ＃ＮＡ９３４，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、３％ＢＬＯＴ  ＱｕｉｃｋＢｌｏｃｋｅｒ／ＰＢＳＴで１：１００００）と共に室温で２時間インキュベートした。続いて、ＰＢＳＴで膜を１０分間かけて４回洗浄し、ＥＣＬ試薬と共にインキュベートした後に化学発光によって、シグナルを検出したローディング対照を検出するために、室温で振盪しながら、ストリッピング溶液Ｒｅ−Ｂｌｏｔ＋濃縮液＃２５０４，Ｍｉｌｉｐｏｒｅ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ−Ｈ２Ｏで１：１０）で膜を１５分間ストリップし、続いて、ブロッキングし、抗ＧＡＰＤＨ抗体（ｃｌｏｎｅ６Ｃ５，＃  ＭＡＢ３７４，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、３％ＱｕｉｃｋＢｌｏｃｋｅｒ／ＰＢＳＴで１：１００００）および二次抗体（ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ，Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  ＃１１５−０３５−００３、３％ＢＬＯＴ  Ｑｕｉｃｋｂｌｏｃｋｅｒ／ＰＢＳＴで１：１００００）で検出した。
【０４３３】
ＴＰＰ−２０９０  ３ｍｇ／ｋｇで処理した１群当たり２匹の動物の腫瘍からの代表的なブロットを、ビヒクル処理動物由来の腫瘍と並べて図２３に示す。ｐ５２断片の出現によって示されるように、ＴＰＰ−２０９０による処理は、全Ｓｔａｔ−１およびリン酸化Ｓｔａｔ−１レベルの強力な増加、ならびにＮＦ−κＢ２の強力な活性化をもたらす。したがって、異種移植腫瘍において、ＮＦ−κＢ２およびＳｔａｔ−１経路は、アゴニスト抗ＴＷＥＡＫＲ抗体によって活性化され、この活性化は、対応する抗体の抗腫瘍活性に潜在的に関与する。
【表３１】
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【表３２】
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【０４３４】
［実施例１０］さらなるヒト結腸直腸癌インビボモデルにおける抗ＴＷＥＡＫＲ抗体ＴＰＰ−２０９０の抗腫瘍効果
さらなるヒト結腸直腸癌腫瘍細胞株Ｃｏｌｏ２０５細胞について、ならびにさらなるヒト結腸直腸癌患者由来モデルＣｏ７５５３、Ｃｏ５８９６、Ｃｏ５６７６、Ｃｏ５８４１、ＣＸＦ１１０３およびＣＸＦ５３３について、実施例８に記載されているように、動物研究を行った。標準投与スケジュールは、単独療法によって、またはレゴラフェニブもしくは標準治療（ＳｏＣ）イリノテカン（５−１５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．、４ｄ  ｏｎ、３ｄ  ｏｆｆ）、オキサリプラチン（３−８ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．、週２回）、５−フルオロウラシル（５０−１００ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．、週１回）およびセツキシマブ（１５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．、週２回）と組み合わせて、１０ｍｇ／ｋｇのＴＰＰ−２０９０を４週間にわたって週２回であった。ＴＰＰ−２０９０およびセツキシマブをＰＢＳ（対照群では、これをビヒクルとしても使用した）で製剤化し、ＳｏＣを０．９％ＮａＣｌで製剤化した。レゴラフェニブの製剤化は、実施例８に記載されている。
【０４３５】
これらのヒト結腸直腸癌患者由来のおよび細胞株ベースのモデルにおけるＴＰＰ−２０９０の単独療法の有効性は中程度であり、最終的な腫瘍対対照（Ｔ／Ｃ）比は０．４８〜１．０７の範囲内であった。ＴＰＰ−２０９０とＳｏＣ（特に、５−ＦＵおよびイリノテカン）との組み合わせは、有意な相加効果および相乗効果をもたらした（表３３〜３５を参照のこと）。これらのモデルにおけるＴＰＰ−２０９０の単独療法の有効性が限定的であった場合、結腸直腸癌に関する実施例８に示されているのと同様に、より高い単独療法の有効性を達成するためには、より強力な投与スケジュールの抗ＴＷＥＡＫＲ抗体が必要であり得る。
【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【０４３６】
［実施例１１］ヒト膀胱癌インビボモデルにおける抗ＴＷＥＡＫＲ抗体ＴＰＰ−２０９０の抗腫瘍効果
ヒト膀胱癌細胞株ＳＣａＢＥＲおよびＫＵ−１９−１９について、ならびにヒト膀胱癌患者由来モデルＢＸＦ１３５２およびＢＸＦ１２２８について、実施例８に記載されているように、動物研究を行った。標準投与スケジュールは、単独療法によって、または標準治療（ＳｏＣ）ゲムシタビン（２００ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．、週１回）およびシスプラチン（３ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．、週１回）と組み合わせて、１０ｍｇ／ｋｇのＴＰＰ−２０９０を４週間にわたって週２回であった。ＴＰＰ−２０９０をＰＢＳ（対照群では、これをビヒクルとしても使用した）で製剤化し、標準治療（ＳｏＣ）を０．９％ＮａＣｌで製剤化した。
【０４３７】
ＳＣａＢＥＲ異種移植モデルでは、ＴＰＰ−２０９０の強力な単独療法の有効性が見出された。ヒト膀胱癌患者由来の膀胱癌モデルＢＸＦ１３５２およびＢＸＦ１２２８では、ＴＰＰ−２０９０とＳｏＣ（シスプラチンおよびゲムシタビン）との組み合わせは、有意な相乗効果をもたらした（表３６を参照のこと）。これらの膀胱癌モデルにおけるＴＰＰ−２０９０の単独療法の有効性が限定的であった場合、より高い単独療法の有効性を達成するためには、より強力な投与スケジュールの抗ＴＷＥＡＫＲ抗体が必要であり得る。
【表３６】
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【０４３８】
［実施例１２］さらなるヒト癌インビボモデルにおける抗ＴＷＥＡＫＲ抗体ＴＰＰ−２０９０の抗腫瘍効果
異なる適応症のさらなるヒト癌細胞株について、実施例８に記載されているように、動物研究を行った。標準投与スケジュールは、単独療法によって、１０ｍｇ／ｋｇのＴＰＰ−２０９０を２〜３週間にわたって週２回であった。ＴＰＰ−２０９０をＰＢＳ（対照群では、これをビヒクルとしても使用した）で製剤化した。
【０４３９】
ＳＣＣ４（頭頸部癌）およびＡ３７５（黒色腫）異種移植片では、ＴＰＰ−２０９０の強力な単独療法の有効性が見出され、ＢｘＰＣ３（膵臓癌）異種移植片では、わずかな有効性が見出された（表３７を参照のこと）。特定の異種移植モデルにおけるＴＰＰ−２０９０の単独療法の有効性が限定的であった場合（ＡＣＨＮ（腎細胞癌）、ＰＡ−１（卵巣癌）、ＮＣＩ−２９２（非小細胞肺癌）およびＵ８７ＭＧ（神経膠芽腫））、より高い単独療法の有効性を達成するためには、より強力な投与スケジュールの抗ＴＷＥＡＫＲ抗体が必要であり得る。
【表３７】
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【０４４０】
［実施例１３］異種移植モデルにおける抗ＴＷＥＡＫＲ抗体のさらなる作用機序
ＴＰＰ−２０９０の抗腫瘍効果が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に依存するか、またはアゴニスト活性のみで既に十分であるかを評価するために、ＳＣＩＤベージュマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ）における異種移植研究を行い、ＮＭＲＩヌードマウスにおいて、ＴＰＰ−２０９０のアグリコシル化変異体（すなわち、ＴＰＰ−２６５８）を調査した。
【０４４１】
ＳＣＩＤベージュマウス内のＷｉＤｒ（ヒト結腸直腸癌）およびＳＣａＢＥＲ（ヒト膀胱癌）異種移植片において、実施例８に記載されているように、動物研究を行ったところ、対照群の腫瘍成長は、先の研究のＮＭＲＩヌードマウスのものと同程度であった。標準投与スケジュールは、単独療法によって、１０ｍｇ／ｋｇのＴＰＰ−２０９０（ＰＢＳで製剤化）を静脈内（ｉ．ｖ．）で２週間にわたって週２回であった。
【０４４２】
ＮＫ細胞を欠くＳＣＩＤベージュマウス異種移植モデル（ＷｉＤｒおよびＳＣａＢＥＲ）では、ＮＭＲＩヌードマウスで見られたように、ＴＰＰ−２０９０の同様に強力な単独療法の有効性が見出された。これは、インビボにおける作用機序がＡＤＣＣとは無関係であることを示している（表３８を参照のこと）。
【表３８】
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【０４４３】
インビトロ分析により、ＨＴ２９細胞に対するＴＰＰ−２０９０結合は、ＮＫ９２Ｖエフェクター細胞による標的細胞の用量依存的なＡＤＣＣをもたらしたが、アグリコシル化ＴＰＰ−２６５８は、ＡＤＣＣを誘導することができなかったことが示された（表４０）。１×１０４個のＨＴ−２９標的細胞を分注し、試験抗体を最終濃度２５μｇ／ｍｌ；５μｇ／ｍｌ；１μｇ／ｍｌ；０，２μｇ／ｍｌおよび０，０４μｇ／ｍｌで追加した。３０分間プレインキュベートした後、エフェクター細胞を追加した（５×１０４ＮＫ９２Ｖ個のＮＫ９２Ｖエフェクター細胞）。３７℃で４時間インキュベートした後、「細胞毒性検出キット−ＬＤＨ（Ｒｏｃｈｅ）」を用いて、ＨＴ２９細胞溶解を決定したところ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で可溶化した細胞から最大放出が得られ、陰性対照は抗体と共にプレインキュベートしなかった。以下の式を％ＨＴ２９溶解の計算に使用した：［Ｅｘｔ（サンプル）−Ｅｘｔ（陰性）×１００］／［Ｅｘｔ（最大放出）−Ｅｘｔ（陰性）］。ＴＰＰ−２０９０は、ＮＫ９２Ｖエフェクター細胞による標的細胞の用量依存的なＡＤＣＣをもたらしたが、これはＮ２９７グリコシル化に依存している。
【０４４４】
一方、ＷｉＤｒ異種移植モデルまたはＡ３７５異種移植モデルのいずれかにおいて、ＴＰＰ−２０９０のアグリコシル化変異体（すなわち、ＴＰＰ−２６５８）を使用した場合（表３９を参照のこと）、インビボにおいて同様の効果が見出された。両モデルにおいて、変異体ＴＰＰ−２６５８は、ＴＰＰ−２０９０と同等の強力な単独療法の有効性を示したが、これは、作用機序がＡＤＣＣ非依存性であることを示している。
【表３９】
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【表４０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２６−４】
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【図２６−５】
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【図２６−６】
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【図２６−７】
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【図２６−８】
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【図２６−９】
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【図２６−１０】
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【図２６−１１】
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【図２６−１３】
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【図２６−１４】
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【図２６−１５】
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【図２６−１６】
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【図２６−１７】
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【図２６−１８】
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【図２６−１９】
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【図２６−２０】
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【図２６−２２】
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【図２６−２３】
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【図２６−２４】
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【図２６−２５】
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【図２６−２６】
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【図２６−２７】
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【図２６−２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2016521715.tif 000132
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