(57)【要約】本開示は、アデノウイルスの製造方法であって、アデノウイルスに感染した哺乳動物細胞を、該細胞の支持に適した培地の存在下において、該ウイルスが複製するように培養する工程であって、該細胞はウイルスの複製を支持する能力を有する工程と、培養期間終了時において、ろ過によりアデノウイルスを前記培地から単離する工程であって、ウイルスの該単離は細胞溶解工程の後ではない工程を含む製造方法と、該方法から取得し得るウイルスに関する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅ２Ｂ領域を含むゲノムを有する腫瘍崩壊性キメラアデノウイルスの製造方法であって、前記Ｅ２Ｂ領域が、第一のアデノウイルス血清型に由来する核酸配列と、第二の別個のアデノウイルス血清型に由来する核酸配列を含み、前記第一の血清型と第二の血清型は各々アデノウイルスサブグループＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦから選択され、前記方法が以下の工程：
ａ：アデノウイルスに感染した哺乳動物細胞を、該細胞の支持に適した培地の存在下において、前記ウイルスが複製するように培養する工程であって、前記細胞がウイルスの複製を支持する能力を有する工程；及び
ｂ：培養期間終了時において、工程ａ）からのウイルスをろ過により前記培地から単離する工程であって、ウイルスの該単離は細胞溶解工程の後ではない工程、
を含む、製造方法。
【請求項２】
前記ウイルスが、グループＢアデノウイルス、例えばＡｄ１１に由来するヘキソンと線維を有し、特に前記ウイルスはＣｏｌｏＡｄ１グループから選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ウイルスが複製能を有する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記培養期間が３０〜１００時間、例えば３５〜７０時間の範囲である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記培養が、灌流培養工程、流加培養、回分、特に灌流培養工程を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞を、接着培養又は懸濁培養、特に懸濁培養において増殖させる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳動物細胞が、ＨＥＫ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、Ｖｉｒｏ、ＰｅｒＣ６及びＧＭＫからなる群から選択され、特にＨＥＫ２９３である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記培養が５Ｌ以上の規模である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
培養中のウイルス濃度が、４０〜１５０ｐｐｃ、例えば５０〜１００ｐｐｃの範囲である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、開始濃度が１〜９×１０４ｖｐ／ｍｌ以上、例えば、１〜９×１０５、１〜９×１０６、１〜９×１０７、１〜９×１０８、１〜９×１０９、特に４〜５×１０６ｖｐ／ｍｌのウイルスに感染する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法により腫瘍崩壊性ウイルスの画分が提供され、前記方法は、同一又は異なる方法により作製された腫瘍崩壊性ウイルスの一又は複数の第二の画分を、前記第一の画分と結合させるような更なる工程を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法がＧＭＰ製造方法である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記フィルターがタンジェンシャルフィルターである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が、ＣｓＣｌ勾配、イオン交換クロマトグラフィー、特に陰イオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー、及びそれらの組合せから選択される精製工程を更に含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
総ウイルスの４０〜９３％を培地から回収可能である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が、保存に適したバッファー中に前記ウイルスを配合することを更に含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法から取得した若しくは取得可能なウイルス又は製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ある種のアデノウイルス、例えばキメラアデノウイルス、特に複製能を有するアデノウイルス、及びそれから取得したウイルス産物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在医薬分野では、ウイルスを治療法としてヒトに使用する可能性が認識されつつある。現在までに、ＯＮＸＹ−１５（ＯＮＹＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｓｕｎｗａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈにより買収）に由来するウイルスの頭頸部癌における使用が、限られた国で承認されている。しかし、現在多くのウイルスが臨床中であり、これらのいくつかは、ヒトへの使用に対し登録されることが望まれている。
【０００３】
多くのウイルス療法がアデノウイルスに基づいており、例えばＣｏｌｏＡｄ１は、結腸直腸癌の治療のために現在臨床試験中の腫瘍崩壊性キメラアデノウイルスである（国際公開２００５／１１８８２５号公報）。
このようなアデノウイルスに基づく治療薬は、臨床試験と、登録後と適正製造規範（ＧＭＰ）に従う条件下における要求との両方を支持するのに適する量で製造される必要がある。
【０００４】
前記製造方法の一部として、ウイルスを哺乳動物細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ、例えば細胞懸濁培養において増殖させる。該ウイルスは、細胞溶解とこれに続く精製によりこれらの細胞から回収される。図１は、ＧＭＰグレードアデノウイルスの製造に関連する方法の模式図を示す、２００４年のＫａｍｅｎ及びＨｅｎｒｙ（Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．  ６：ｐａｇｅｓ  １８４−１９２）からの抜粋である。特に、ウイルスの複製後に細胞が溶解している。
【０００５】
溶解後の細胞からのＤＮＡの混入は深刻な問題であり、治療用アデノウイルス産物から出来るだけ除去されなければならない。この点は国際公開第２０１１／０４５３８１号公報の出願に詳細に記載されており、細胞を溶解し、細胞懸濁液中のＤＮＡを細分化又は沈殿化させ、タンジェンシャルフローを使用してこれを清浄化することが記載されている。ＤＮＡｓｅを用いたＤＮＡ消化も図１の第３工程に示されている。
【０００６】
アデノウイルスのＧＭＰ製造分野における研究の殆どは、Ａｄ５について実施されてきた。先行技術には、回分法の場合には、感染後約４０時間で最大のウイルス力価が達成され、その後細胞死が起こり始めることが示されている。更に、製造されたウイルスの活性基準であるウイルス感染性の低下に関する懸念は、通常、任意のＧＭＰ方法で処理時間を最小限に維持することにより対処される。
【０００７】
要するに、組換えアデノウイルスの効果的な方法を開発するためには、基本的な宿主細胞株の生理学と代謝；組換えウイルス、及び細胞株とウイルスの間の相互作用についての詳細な理解を必要とする。基本的に、前記方法は、ウイルス又はウイルスベクターの特定種類に応じて適合させる必要がある。
【０００８】
驚くべきことに、本発明者らは、細胞培地からウイルスを単離し、細胞を溶解する必要性を回避し、その結果ウイルス産物中の混入ＤＮＡの開始レベルを著しく低減する方法により、腫瘍崩壊性キメラアデノウイルスを調製できることを確立した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
即ち、本開示は、Ｅ２Ｂ領域を含むゲノムを有する腫瘍崩壊性キメラアデノウイルスの製造方法であって、前記Ｅ２Ｂ領域が、第一のアデノウイルス血清型に由来する核酸配列と、第二の別個のアデノウイルス血清型に由来する核酸配列を含み、前記第一の血清型と第二の血清型は各々独立してアデノウイルスサブグループＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦから選択され、前記方法が以下の工程：
ａ:アデノウイルスに感染した哺乳動物細胞を、該細胞の支持に適した培地の存在下において、該ウイルスが複製するように培養する工程であって、該細胞がウイルスの複製を支持する能力を有する工程、及び
ｂ：培養期間終了時において、工程ａ）からのアデノウイルスをろ過により前記培地から単離する工程であって、ウイルスの該単離は細胞溶解工程の後ではない工程、
を含む、製造方法を提供する。
【００１０】
また、サブグループＢ（例えば、Ａｄ１１、特にＳｌｏｂｉｔｓｋｉ株としても知られるＡｄ１１ｐ）の線維（fibre）とヘキソンを有し、Ｅ４領域の一部が欠損しているアデノウイルスの製造方法であって、前記方法が、以下の工程：
ａ：アデノウイルスに感染した哺乳動物細胞を、該細胞の支持に適した培地の存在下において、該ウイルスが複製するように培養する工程であって、該細胞はウイルスの複製を支持する能力がある工程：
ｂ：培養期間終了時において、工程ａ）からのウイルスをろ過により前記培地から単離する工程であって、ウイルスの該単離は細胞溶解工程の後ではない工程、
を含む、製造方法を提供する。１つの実施態様では、前記ウイルスは複製能を有するか、又は複製欠損性である。
【００１１】
１つの実施態様では、前記アデノウイルスは、Ｅ３領域の一部または全てが欠損している。
驚くべきことに、本発明者らは、本方法を野生型Ａｄ１１ウイルス、例えばＡｄ１１ｐに拡張し、また、Ａｄ１１ｐを含むＡｄ１１に由来する線維とヘキソンを有するウイルスに拡張することに成功し得ることも見出した。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＧＭＰグレードアデノウイルスの製造に関する方法の模式図を示す、２００４年Ｋａｍｅｎ及びＨｅｎｒｙ（Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．６：Ｓ１８４−１９２）による抜粋である。
【図２】ＭＯＩ１０で感染した懸濁ＨＥＫ２９３ｓ細胞の細胞と上澄み（ＳＮ）に付随する感染性ＣｏｌｏＡｄ１粒子の割合を示す図である。
【図３】ＭＯＩ１０（感染多重度１０）で感染した接着ＨＥＫ２９３ｓ細胞の細胞と上澄み（ＳＮ）に付随ずる感染性ＣｏｌｏＡｄ１粒子の割合を示す図である。
【図４】感染条件試験における、懸濁ＨＥＫ２９３培養の総ウイルス粒子量を示す図である。
【図５】ＣｏｌｏＡｄ１に感染したＨＥＫ２９３細胞の、感染後４０時間、４６時間及び７０時間での細胞溶解物（溶解物）又は上澄み（ＳＮ）中の細胞ＤＮＡ及びウイルスＤＮＡを視覚化した図である。
【図６】Ａ−ウイルスの分配（ＣＶＬ又は上澄み）、Ｂ−総ウイルス産生量（ｖｐ／細胞）、及びＣ−ＣｏｌｏＡｄ１感染後の各時点における細胞生存率
【図７】Ａ−ウイルスの分配（ＣＶＬ又は上澄み）、Ｂ−全総ウイルス産生量（ｖｐ／細胞）、及びＣ−ＮＧ１３５感染後の各時点における細胞生存率
【図８】Ａ−ウイルスの分配（ＣＶＬ又は上澄み）、Ｂ−総ウイルス産生量（ｖｐ／細胞）、及びＣ−ＮＧ７６感染後の各時点における細胞生存率
【図９】Ａ−ウイルスの分配（ＣＶＬ又は上澄み）、Ｂ−総ウイルス産生量（ｖｐ／細胞）、及びＣ−野生型Ａｄ５感染後の各時点における細胞生存率
【図１０】Ａ−ウイルスの分配（ＣＶＬ又は上澄み）、Ｂ−総ウイルス産生量（ｖｐ／細胞）、及びＣ−野生型Ａｄ１１ｐ感染後の各時点における細胞生存率
【００１３】
本明細書中で使用するＮＧ１３５とは、導入遺伝子を挿入したＣｏｌｏＡｄ１ウイルスの誘導体を指す。該導入遺伝子は完全長抗体である。ＮＧ１３５は、付加された導入遺伝子カセットを有する配列番号１で示される。
本明細書中で使用するＮＧ７６とは、導入遺伝子を挿入したＣｏｌｏＡｄ１ウイルスの誘導体を指す。該導入遺伝子はＳｃＦｖ抗体断片である。ＮＧ７６は、付加された導入遺伝子カセットを有する配列番号１で示される。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書中で使用する腫瘍崩壊性キメラウイルスの製造方法は、該ウイルスが複製され、その結果ウイルス粒子の数が増加する方法に関することが意図される。特に、その製造により充分な数のウイルス粒子が提供され、治療用産物が配合され、例えば、１〜９×１０５〜１〜９×１０２０又はこれを超える範囲の粒子、例えば、１〜９×１０８〜１〜９×１０１５の範囲のウイルス粒子、特に１〜９×１０１０又は１〜９×１０１５ウイルス粒子を、１０Ｌバッチから製造することができる。
【００１５】
本明細書中で使用するＥ４領域の一部が欠損するとは、少なくとも一部、例えばＥ４領域の１〜９９％の範囲、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７又は９８％が欠損することを意味する。
【００１６】
本明細書中で使用する「に由来する」とは、例えばＤＮＡ断片が、アデノウイルスから取得されるか、又はアデノウイルスに本来見出される配列に対応する場合を指す。この表現は、配列を取得する方法を限定することを意図するものではなく、例えば本開示に記載されるウイルスにおいて使用される配列を合成することができる
【００１７】
１つの実施態様では、前記誘導体は、もとのＤＮＡ配列の完全長に対し１００％の配列同一性を有する。
１つの実施態様では、前記誘導体は、もとのＤＮＡ配列に対し９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性又は類似性を有する。
１つの実施態様では、前記誘導体は、ストリンジェントな条件下において、もとのＤＮＡ配列とハイブリダイズする。
【００１８】
本明細書中で使用する「ストリンジェンシー（stringency）」は、通常、約Ｔｍ（融解温度）−５０℃（プローブのＴｍより５℃低い）〜Ｔｍよりも約２０℃〜２５℃低い範囲において生じる。当業者は理解するであろうが、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを用いて、同一のポリヌクレオチド配列を同定若しくは検出するか、又は類似若しくは関連するポリヌクレオチド配列を同定若しくは検出することができる。本明細書中で使用する「ストリンジェントな条件」なる用語は、ハイブリダイゼーションが、少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％の同一性が配列間に存在する場合に通常起こることを意味する。
【００１９】
本明細書中で使用する「ハイブリダイゼーション」には、「ポリヌクレオチド鎖が塩基対形成により相補鎖と結合するあらゆる方法」が包含される（Ｃｏｏｍｂｓ、Ｊ．、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．，１９９４）。
本明細書中で使用する「ここで、該単離は細胞溶解工程の後ではない」とは、前記製造方法が特定の溶解工程を含まないという事実を指すことを意図する。即ち、培養液中の細胞の全て又は殆どを溶解するよう条件が設計された工程である。例えば、ウイルス上澄みから単離される。
【００２０】
本明細書中で使用する殆ど（Most）とは、大多数、例えば８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％を指す。
本明細書中で使用する「培養期間終了時」とは、感染した細胞中のウイルスが複製できる期間の終了時を指す。終了（End）とは、回収のために選択された時間の中の選択された点を指す。本明細書中で使用する終了とは、明確な終了点ではない。１つの実施態様では、複製されたウイルス又はそのかなりの割合を培地又は上澄みに放出するために、十分な期間の培養を継続するよう該終了点が選択される。１つの実施態様では、前記回収は複数の時点で実施するか、又は回収の開始後に継続される。
【００２１】
有利なことに、本発明の方法は、細胞から混入するＤＮＡの開始濃度が低く、細胞溶解工程が省略されるため、ウイルスの下流処理を単純化することができる。これにより下流処理で使用する試薬、装置及び時間を低減できることから、コスト削減をもたらす。これにより、混入ＤＮＡの終了濃度が低下し、且つ／又は、混入するＤＮＡの大きな断片の濃度が低下すると共に、純度が高まる結果にもなる。
【００２２】
更に、細胞酵素へのウイルス曝露は細胞溶解を回避することにより最小限化され、これにより細胞由来のヌクレアーゼ等の分解剤（degradant）となり得るものへのウイルスの曝露が最小限化される。これによりウイルス安定性、且つ／又は、例えば感染性により測定される効力がより高まる。
細胞ＤＮＡを分解するベンゾナーゼの使用も、所望により省略又は低減することができ、この点は有利である。特に、ベンゾナーゼの除去と残留ベンゾナーゼの存在を示すための試験を省略することができる。
【００２３】
興味深いことに、細胞を排出した後に、本開示のウイルスは細胞に接着しないため、上澄みから容易に除去することができる。これは、本発明の方法を促進する本明細書中に記載した腫瘍崩壊性ウイルスの特徴となる現象である。対照的に、野生型Ａｄ５は細胞に接着すると考えられる。実際に、野生型Ａｄ５ウイルス粒子は上澄み中に実質的に全く存在しないという結果が示された（図９及び表６を参照）。
【００２４】
理論による拘束を望まないが、１つの実施態様では、細胞を排出するが細胞に接着しない能力は、キメラＥ２Ｂ領域に関連し得る。
１つの実施態様では、細胞を排出する能力は、小さなウイルスゲノム、並びに／又はＥ４及び／若しくはＥ３領域における部分欠失に関連し得る。
１つの実施態様では、本開示のウイルスは導入遺伝子を更に含む。
１つの実施態様では、細胞への接着不足は、腫瘍崩壊性ウイルスのヘキソンと線維に関連し得る。
【００２５】
腫瘍崩壊性ウイルスは、癌細胞に優先的に感染し、例えばその溶解により細胞死を促進するか、又は癌細胞中で選択的に複製するウイルスである。
癌細胞に優先的に感染するウイルスは、正常で健康な細胞に比べ、癌細胞への感染率が高いウイルスである。
本開示のキメラアデノウイルスは、一群の腫瘍細胞におけるその溶解能を調べることにより、特定の腫瘍型への優先度を評価することができ、例えば結腸腫瘍細胞株としては、ＨＴ−２９、ＤＬＤ−１、ＬＳ１７４Ｔ、ＬＳ１０３４、ＳＷ４０３、ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８及びＣｏｌｏ３２０ＤＭが挙げられる。任意の入手可能な結腸腫瘍細胞株が、かかる評価に等しく有用である。
【００２６】
前立腺細胞株としてはＤＵ１４５及びＰＣ−３細胞が挙げられる。膵臓細胞株としてはＰａｎｃ−１細胞が挙げられる。乳腺腫瘍細胞株としてはＭＤＡ２３１細胞株がが挙げられ、卵巣細胞株としてはＯＶＣＡＲ−３細胞株が挙げられる。造血細胞株としては、Ｒａｊｉ及びＤａｕｄｉ  Ｂリンパ球細胞、Ｋ５６２赤芽球様細胞、Ｕ９３７骨髄性細胞、及びＨＳＢ２  Ｔリンパ球細胞が挙げられるが、これらに限定されない。他の入手可能な腫瘍細胞株も等しく有用である。
キメラでないウイルスを含む腫瘍崩壊性ウイルス、例えばＡｄ１１ｐ等のＡｄ１１も同様に上記細胞株において評価することができる。
【００２７】
癌細胞において選択的に複製するウイルスは、ｐ５３遺伝子等を複製する癌細胞において上方制御される遺伝子又はタンパク質を必要とするウイルスである。
１つの実施態様では、前記腫瘍崩壊性キメラウイルスはアポトーシス性であり、即ち、プログラム細胞死を促進する。
【００２８】
１つの実施態様では、前記腫瘍崩壊性キメラウイルスは細胞溶解性である。本開示の腫瘍崩壊性キメラアデノウイルスの細胞溶解活性は、代表的な腫瘍細胞株で測定することができ、例えば標準（即ち、効力１が付与される）として使用される、サブグループＣに属するアデノウイルス、好ましくはＡｄ５を用いることにより、そのデータが効力の測定値に変換される。細胞溶解活性の測定に適した方法はＭＴＳアッセイである（本明細書中に組み入れられる国際公開第２００５／１１８８２５号公報の実施例４、図２を参照されたい）。
【００２９】
１つの実施態様では、本開示の前記腫瘍崩壊性キメラアデノウイルスは細胞壊死を引き起こす。
１つの実施態様では、前記腫瘍崩壊性キメラウイルスは癌細胞に対する治療指数が高い。
「治療指数（therapeutic index）」又は「治療濃度域（therapeutic window）」とは、関連する癌細胞株における腫瘍崩壊性キメラアデノウイルスの効力を、正常（即ち、非癌性）細胞株における同一のアデノウイルスの効力で除することにより測定できる、特定のアデノウイルスの腫瘍崩壊性能を示す数値を指す。
【００３０】
１つの実施態様では、前記腫瘍崩壊性キメラウイルスは、大腸癌細胞、乳腺癌細胞、頭頸部癌、膵臓癌細胞、卵巣癌細胞、造血腫瘍細胞、白血病細胞、グリオーマ細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、メラノーマ細胞、肉腫細胞、肝癌細胞、腎癌細胞、膀胱癌細胞及び転移性癌細胞から成る群より選ばれる１以上の癌細胞において、高い治療指数を有する。
本明細書中で使用する腫瘍崩壊性キメラアデノウイルスは、少なくとも２つの別個のアデノウイルス血清型に由来するＤＮＡ配列を有するＥ２Ｂ領域を含み、腫瘍崩壊性であるアデノウイルスを指す。
【００３１】
現在約５６のアデノウイルス血清型が存在する。アデノウイルス血清型の区分を表１に示す：
サブグループ  アデノウイルス血清型
Ａ            １２、１８、３１
Ｂ            ３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５、５０、５５
Ｃ            １、２、５、６
Ｄ            ８−１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２−３０、
３２、３３、３６−３９、４２−５１、５３、５４、５６
Ｅ            ４
Ｆ            ４０、４１
Ｇ            ５２
【００３２】
前記Ｅ２Ｂ領域はアデノウイルス中の公知の領域であり、ウイルスゲノムの約１８％を表す。Ｅ２Ｂ領域はタンパク質ＩＶａ２、ＤＮＡポリメラーゼ及び末端タンパク質をコードすると考えられる。Ａｄ１１のＳｌｏｂｉｔｓｋｉ株（Ａｄ１１ｐと称する）では、上記タンパク質は、ゲノム配列の５５８８−３９６４、８４３５−５０６７及び１０３４２−８４３８の位置でそれぞれコードされており、Ｅ２Ｂ領域は１０３４２−３９５０から始まる。Ｅ２Ｂ領域の正確な位置は他の血清型では変わり得るが、Ｅ２Ｂ領域は全て同じ一般的構成を有しているため、その機能は現在までに試験された全てのヒトアデノウイルスゲノムにおいて保存されている。
【００３３】
１つの実施態様では、本開示のウイルス、例えば腫瘍崩壊性キメラウイルスはサブグループＢのヘキソンを有する。
１つの実施態様では、本開示のウイルス、例えば腫瘍崩壊性キメラウイルスは、Ａｄ１１ヘキソン、例えばＡ１１ｐヘキソンを有する。
１つの実施態様では、本開示のウイルス、例えば腫瘍崩壊性キメラウイルスはサブグループＢの線維を有する。
【００３４】
１つの実施態様では、本開示のウイルス、例えば腫瘍崩壊性キメラウイルスはＡｄ１１線維、例えばＡ１１ｐ線維を有する。
１つの実施態様では、本開示のウイルス、例えば腫瘍崩壊性キメラウイルスは、同じ血清型に由来する線維とヘキソンのタンパク質、例えばサブグループＢアデノウイルス、例えばＡｄ１１、特にＡｄ１１ｐを有する。
【００３５】
１つの実施態様では、本開示のウイルス、例えば腫瘍崩壊性キメラウイルスは、例えばＡｄ１１、特にＡｄ１１ｐであり、例えば、後者のゲノム配列の３０８１１−３１７８８、１８２５４−２１１００及び１３６８２−１５３６７の位置に見出される、同じ血清型に由来する線維、ヘキソン及びペントンのタンパク質を有する。
第一のウイルスとは別個の血清型のウイルスは、同一のサブグループに由来しても、異なるサブグループに由来してもよいが、常に異なる血清型に由来する。１つの実施態様では、それらの組み合わせは次の通りである（第一のＡｄ血清型：第二のＡｄ血清型）：ＡＡ、ＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＢＢ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＦ、ＢＧ、ＣＣ、ＣＤ、ＣＥ、ＣＦ、ＣＧ、ＤＤ、ＤＥ、ＤＦ、ＤＧ、ＥＥ、ＥＦ、ＥＧ、ＦＦ、ＦＧ及びＧＧ。
【００３６】
１つの実施態様では、前記キメラＥ２Ｂ領域はＡｄ３及びＡｄ１１（特にＡｄ１１ｐ）に由来する。
１つの実施態様では、前記Ｅ２Ｂ領域は本明細書中の配列番号２で示される配列である。
哺乳動物細胞は哺乳動物に由来する細胞である。１つの実施態様では、該哺乳動物細胞は、ＨＥＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ−７、ＨｅＬａ、Ｖｉｒｏ、Ａ５４９、ＰｅｒＣ６及びＧＭＫから成る群より選択され、特にＨＥＫ２９３である。
１つの実施態様では、細胞は接着培養又は懸濁培養、特に懸濁培養で増殖される。
【００３７】
本明細書中で使用する哺乳動物細胞の培養とは、細胞を制御されたｅｘ  ｖｉｖｏ条件下で増殖させる方法を指す。適切な条件は当業者に公知であり、例えば３７℃の温度が包含され得る。ＣＯ２レベルを制御する必要があり、例えば５％レベルに維持される。詳細な条件は、教科書Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｓｅｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｓｉｘ  Ｒ．  Ｉａｎ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｂａｓｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  （Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊ．Ｍ．  Ｄａｖｉｓに挙げられている。
通常、細胞はアデノウイルスに感染する前に培養されて、十分な数に生成する。これらの方法は当業者に公知であるか、又は発行されたプロトコルや文献から容易に利用可能である。
【００３８】
一般に、細胞は、商業規模、例えば５Ｌ、１０Ｌ、１５Ｌ、２０Ｌ、２５Ｌ、３０Ｌ、３５Ｌ、４０Ｌ、４５Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、２００Ｌ、３００Ｌ、４００Ｌ、５００Ｌ、６００Ｌ、７００Ｌ、８００Ｌ、９００、１０００Ｌ又はこれらと同様の規模で培養される。  哺乳動物細胞の培養に適する培地としては、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）培地、例えばＨＥＫ２９３細胞用ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）２９３無血清培地、ＣＨＯ細胞用ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）ＡＣＦ  ＣＨＯ培地  無血清培地、ＣＨＯ細胞用ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３０２無血清培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ  ＣＤ加水分解物融合培地添加物（hydrolysate fusion media supplement）、Ｌｏｎｚａ  ＲＭＰＩ（例えば、ＨＥＰＥＳ及びＬ−グルタミンを含むＲＭＰＩ１６４０、Ｌ−グルタミンを含むか、又は含まないＲＭＰＩ１６４０、及びＵｌｔｒａＧｌｕｔａｍｉｎｅを含むＲＭＰＩ１６４０）、ＭＥＭ及びＤＭＥＭ、ＳＦＭＩＩ培地等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
１つの実施態様では、前記培地は無血清である。これは、規制当局に対する製造方法の登録を容易にするため有利である。
本開示のウイルス、例えば腫瘍崩壊性キメラウイルスは、Ａｄ５のようなベクターとして使用されるアデノウイルスの特性とは異なる特性を有する。これは、細胞溶解を必要とせずとも培地からウイルスを回収可能であるという事実を包含する。従って、理論による拘束を望まないが、前記ウイルスは細胞を排出するメカニズムを有すると考えられる。
【００４０】
更に、本開示のウイルス、例えば腫瘍崩壊性キメラアデノウイルスは、細胞を排出した後にも細胞に関与又は接着するとは考えられず、そのため特に細胞培養条件が最適化される場合に、上澄みからの回収も容易にする。
加えて、前記腫瘍崩壊性キメラウイルスは、培養方法を７０時間以上まで延長する場合でも分解しないと考えられる。ウイルスの分解はウイルスの感染性をアッセイすることにより確認できる。ウイルスの感染性はウイルス粒子が分解するにつれて減少する。
【００４１】
１つの実施態様では、培養期間は３０〜１００時間の範囲、例えば３５〜７０時間、例えば４０、４５、５０、５５、６０又は６５時間である。
１つの実施態様では、培養期間は６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５時間又はそれ以上である。
１つの実施態様では、腫瘍崩壊性キメラウイルスの９０％を超える量、例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％、例えば９５％以上、特に９８％以上が、６４時間の時点で上澄み中に存在する。
【００４２】
１つの実施態様では、３８時間後に充分な量のウイルスが培地中に存在する。例えば、ウイルスの５０％を超える量、特に７０％を超える量が、３８時間後に培地中に存在する。
１つの実施態様では、感染後約４０〜６０時間、例えば感染後４９時間で、最大の総ウイルス生産量が達成される。１つの実施態様では、この最大値に続くウイルス産生量の低下は緩やかである。
１つの実施態様では、最大の総ウイルス生産量は感染後約７０〜９０時間で達成される。
【００４３】
驚くべきことに、本発明者らは、本方法を採用した場合、感染後９０時間にわたり細胞が高い生存率（例えば８０〜９０％の生存率）維持することを見出した。従って、１つの実施態様では、細胞が生存し続ける限り、前記回収と前記方法を継続することができる。
本明細書中で使用する最大の総ウイルス生産量は、細胞当たりの製造されたウイルス粒子の総数を意味し、上澄み中と細胞中のウイルス粒子を包含する。
１つの実施態様では、ＣｏｌｏＡｄ１に関し、感染後４９時間での上澄み中のウイルス製造量は、細胞当たり約２００００〜３００００ウイルス粒子（ｖｐ／細胞）である。例えば２６０００ｖｐ／細胞である。
【００４４】
１つの実施態様では、ＮＧ１３５に関し、感染後４９時間での上澄み中のウイルス製造量は、約２００００〜３００００ｖｐ／細胞、例えば２６０００ｖｐ／細胞である。
１つの実施態様では、ＮＧ７６に関し、感染後４９時間でのウイルス製造量は、約６０００〜１００００ｖｐ／細胞、例えば８０００ｖｐ／細胞である。
１つの実施態様では、６４時間の時点、即ち６４時間後には、ＣＶＬペレット中に、検出可能なウイルス量が１０％未満、例えば９、８、７、６、５、４、３、２、１％の検出可能なウイルスが存在する。実施例６には、ＣＶＬを取得する方法が記載されている。
【００４５】
本明細書中で使用するＣＶＬは、粗製のウイルス溶解物を意味する。
細胞の培養には、技術的な必要性に応じて、灌流培養、流加培養（fed batch）、回分培養、定常状態培養、連続培養又はそれらの１以上の組み合わせ、特に灌流培養を用いることができる。
１つの実施態様では、前記方法は潅流法、例えば連続潅流法である。
【００４６】
１つの実施態様では、前記培養方法は１回以上の培地変更を含む。これは細胞増殖、収率又はこれらに類似するものを最適化するのに有利となり得る。培地変更を行う場合には、変更される培地からウイルス粒子を回収する必要がある場合がある。ウイルス収率の最適化を保証するために、これらの粒子を主要なウイルスバッチと結合することができる。類似技術をウイルスの回収を最適化するための潅流法の培地を用いて行うこともできる。
【００４７】
１つの実施態様では、培養方法には培地変更工程が包含されない。この場合には、ウイルス粒子の損失がなく、それ故に収率が最適化され得るため、有利となり得る。
１つの実施態様では、前記培養方法は、１回以上の細胞の追加又は変更を含む。本明細書中で使用する細胞の追加変更は、細胞のいくらか又は全てを補充し、所望により死細胞を除去することを指す。
【００４８】
１つの実施態様では、培養中の腫瘍崩壊性キメラアデノウイルスの濃度は、細胞当たり２０〜１５０粒子（ｐｐｃ）、例えば４０〜１００ｐｐｃ、特に５０ｐｐｃである。
ウイルス濃度が、例えば１００ｐｐｃ未満、特に５０ｐｐｃという低い値である場合には、より高いウイルス濃度を用いた培養に比べて細胞生存率が高い結果となり得るため、特に細胞生存率を回収前に測定する場合には有利である。
【００４９】
細胞生存率が低いと、細胞を酵素に曝露させ得る細胞溶解が生じる結果となり、これにより時間と共にウイルスが攻撃される。しかし、細胞培養のような動的プロセスにおいては、一定の割合、例えばある少量の割合の細胞も生存することができない。これにより、通常実際には深刻な問題は生じない。
１つの実施態様では、ＣｏｌｏＡｄ１に感染した場合には、前記方法の間、例えば９６時間の時点（即ち、感染後９６時間）の細胞生存率は約８５〜９５％であり、例えば９０％の生存率である。
【００５０】
１つの実施態様では、ＮＧ７６に感染した場合には、前記方法の間、例えば９６時間の時点（即ち、感染後９６時間）の細胞生存率は約８０〜９０％であり、例えば８３％の生存率である。
１つの実施態様では、ＮＧ１３５に感染した場合には、前記方法の間、例えば９６時間の時点（即ち、感染後９６時間）の細胞生存率は約８０〜９０％であり、例えば８５％の生存率である。
１つの実施態様では、Ａｄ１１に感染した場合には、前記方法の間、例えば９６時間の時点（即ち、感染後９６時間）の細胞生存率は約８０〜９０％であり、例えば８５％の生存率である。
【００５１】
１つの実施態様では、前記培地及び／又は細胞は補充物であるか、又は定期的に補充される。
１つの実施態様では、前記方法の間、例えば不連続な時点において、又は連続的に、細胞が回収される。
前記方法の１つの実施態様では、哺乳動物細胞は、開始濃度が１〜９×１０４ｖｐ／ｍｌ以上、例えば１〜９×１０５、１〜９×１０６、１〜９×１０７、１〜９×１０８、１〜９×１０９、特に１〜５×１０６ｖｐ／ｍｌ又は２．５〜５×１０８ｖｐ／ｍｌのウイルスに感染する。
【００５２】
前記方法の１つの実施態様では、哺乳動物細胞は、約１〜２００ｐｐｃ、例えば４０〜１２０ｐｐｃ、例えば５０ｐｐｃで、開始濃度が１×１０６細胞／ｍｌにおいて感染する。
本明細書中で使用するＰｐｃは、細胞当たりのウイルス粒子数を指す。
１つの実施態様では、前記方法は、約３５〜３９℃、例えば３７℃で実施する。
１つの実施態様では、前記方法は、約４〜６％のＣＯ２、例えば５％のＣＯ２で実施する。
【００５３】
１つの実施態様では、ウイルス、例えば腫瘍崩壊性キメラウイルス粒子を含有する倍地をろ過して細胞を除去し、更なる下流処理に供する粗製上澄みを提供する。
１つの実施態様では、タンジェンシャルフローフィルター（tangential flow filter）を使用する。
１つの実施態様では、培地は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社の、セルロース系デプスフィルターを備えたＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＰＯＤシステムを用いてろ過される。Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）デプスフィルター培地は、拡張可能で、使い捨て型式のＰｏｄフィルターシステムで提供される。これは、細胞培養を含む各種の一次的及び二次的な浄化用途に理想的である。
【００５４】
Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｐｏｄフィルターは、特定用途の要求を満たすために、３種の別個の培地グレードで入手可能である。Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＤＥ、ＣＥ及びＨＣ培地は、密度勾配マトリックス（gradient density matrix）と正の表面電荷特性により最適な性能を提供する。１つの実施態様では、タンジェンシャルフロー技術を用いて、例えばＰｅｌｌｉｃｏｎ  Ｍｉｎｉカセット膜ホルダー、圧力センサー、撹拌機付１０リットルリサイクルタンク、濃縮水流量計（retentate flow meter）、計量器、フィードポンプ、移送ポンプ、配管及びバルブを含むＣｏｇｅｎｔ（商標）  Ｍ  システムを用いてろ過を実施する。該システムの制御と操作は、半自動のダイアフィルトレーション／コンセントレーションを除いて手動である。オペレーターはポンプ速度、全てのバルブ及び操作手順を手動で制御する。所望により、本工程において、ウイルスを最終的なバッファーに配合することもできる。
【００５５】
従って、１つの実施態様では、ろ過工程において、濃縮され調整されたアデノウイルス材料が、最終的な又は最終に近い製剤中に提供される。
１つの実施態様では、前記方法は２以上のろ過工程を含む。
１つの実施態様では、前記下流処理は、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋ＰＯＤシステムの３５ＣＥ及び５０ＣＥカセットと、オプティキャップＸＬ１０エクスプレス０．５／０．２ｕｍ  膜フィルターを順次含む。
【００５６】
１つの実施態様では、前記方法は、ＣｓＣｌ勾配、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、特に陰イオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー、及びそれらの組合せから選択される精製工程を更に含む。
イオン交換クロマトグラフィーはＤＮＡに非常に強固に結合し、通常ここで残留ＤＮＡが除去される。イオン交換樹脂／膜はウイルスとＤＮＡの両方に結合し、塩勾配溶出の間、ウイルスは通常最初にカラムから溶出し（低い塩勾配）、ＤＮＡと樹脂との相互作用はウイルスよりも強いため、ＤＮＡははるかに高い塩濃度で溶出する。
【００５７】
１つの実施態様では、前記クロマトグラフィー工程は、例えばＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓから入手可能なモノリス技術（monolith technology）を使用する。
１つの実施態様では、精製工程としてＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ（第４級アミン膜精製方法）が使用される。
１つの実施態様では、精製工程においてＳｏｕｒｃｅ  Ｑ  ＲＥＳＩＮが使用される。
１つの実施態様では、単離されたウイルスの下流処理おいて、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ  が使用され、続いてＳｏｕｒｃｅ  Ｑ  ＲＥＳＩＮが使用される。
【００５８】
１つの実施態様では、精製工程においてＳｏｕｒｃｅ  Ｑが使用される。
１つの実施態様では、精製後には、調製された該ウイルスは、８０ｎｇ／ｍＬ未満、例えば６０ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬの混入ＤＮＡを含有する。
１つの実施態様では、実質的に全ての混入ＤＮＡ断片は、７００塩基対以下、例えば５００ｂｐ以下、例えば２００ｂｐ以下である。
【００５９】
１つの実施態様では、精製ウイルス産物中の残留ベンゾナーゼ含量は、１ｎｇ／ｍＬ以下、例えば０．５ｎｇ／ｍＬ以下である。
１つの実施態様では、精製ウイルス産物中の残留宿主細胞タンパク質含量は、特にＥＬＩＳＡアッセイにより測定した場合には、２０ｎｇ／ｍＬ以下、例えば１５ｎｇ／ｍＬ以下である。
１つの実施態様では、精製ウイルス産物中の残留ｔｗｅｅｎは０．１ｍｇ／ｍＬ以下、例えば０．０５ｍｇ／ｍＬ以下である。
【００６０】
１つの実施態様では、該ウイルスは、グループＢアデノウイルス、例えばＡｄ１１に由来するヘキソン及び線維を有し、特に該ウイルスはＣｏｌｏＡｄ１である。
１つの実施態様では、混入ＤＮＡ含量が８０ｎｇ／ｍＬ未満の単離精製されたＣｏｌｏＡｄ１が提供される。
ＣｏｌｏＡｄ１は国際公開第２００５／１１８８２５号公報に開示されており、該ウイルスの完全配列は本明細書中に提示され、即ち配列番号１である。
【００６１】
代替となる腫瘍崩壊性キメラウイルスとしてはＯｖＡｄ１及びＯｖＡｄ２が挙げられ、それぞれ国際公開第２００８／０８０００３号公報に配列番号２及び３として開示されており、本明細書中で参照により組み入れられる。
１つの実施態様では、該ウイルスは複製能を有する。本明細書中で使用する複製能を有するウイルスとは、基本的なウイルスタンパク質をコードする相補細胞株（complementary cell line）の支持がなくても複製が可能なウイルス、例えば、Ｅ１領域によりコードされるウイルス（パッケージング細胞株とも称する）であって、ヘルパーウイルスの支持がなくても複製が可能なウイルスを指す。
【００６２】
１つの実施態様では、本開示のウイルス、例えば本開示の腫瘍崩壊性キメラウイルスは、１以上の導入遺伝子、例えば治療用ペプチド又はタンパク質配列をコードする１以上の導入遺伝子を含む。
１つの実施態様では、該腫瘍崩壊性キメラウイルスは、少なくとも１つの導入遺伝子をコードする。適切な導入遺伝子としては、いわゆる自殺遺伝子、例えばｐ５３；サイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＧＭ−ＣＳＦ又はＧ−ＣＳＦ、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−アルファ又はベータ等のインターフェロンＩ、ＩＦＮ−ガンマ等のインターフェロンＩＩ）、ＴＮＦ（例えばＴＮＦ−アルファ又はＴＮＦ−ベータ）、ＴＧＦ−ベータ、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ１２０をコードするポリヌクレオチド配列；モノクロナール抗体、例えばトラスツズマブ（trastuzamab）、セツキシマブ（cetuximab）、パニツムマブ（panitumumab）、ペルツズマブ（pertuzumab）、エピラツズマブ（epratuzumab）、抗−ＥＧＦ抗体、抗−ＶＥＧＦ抗体及び抗−ＰＤＧＦ抗体、抗−ＦＧＦ抗体をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
【００６３】
それ自体が腫瘍又は免疫応答を調節するよう作用し、治療的に作用する分子をコードし、又は、かかる分子の活性を直接的又は間接的に阻害、活性化又は促進する薬剤である、異なる種類の様々な導入遺伝子、及びそれらの組合せを想定することができる。かかる分子としては、タンパク質リガンド、又はリガンドの活性結合断片、抗体（完全長又は断片、例えばＦｖ、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２又はこれより小さい特異的結合断片）、又は、その他の標的特異的結合タンパク質若しくはペプチド（例えば、ファージディスプレイ等の技術により選択されるような）、天然又は合成結合受容体、リガンド又は断片、標的をコードする遺伝子の転写又は翻訳を制御する特定分子（例えば、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ分子、転写因子）が挙げられる。
分子は、それらの活性、安定性、特異性等を促進する他のペプチド配列を有する融合タンパク質の形態であってもよい（例えば、リガンドは、免疫グロブリンＦｃ領域と融合して二量体を形成し、安定性を高め、抗原提示細胞、例えば樹状細胞（例えば、抗‐ＤＥＣ‐２０５、抗‐マンノースレセプター、抗‐デクチン）に対する特異性を有する抗体又は抗体断片と融合してもよい。導入遺伝子は、例えば「挿入物担持（insert-bearing）アデノウイルス」に感染した細胞の検出、腫瘍の画像化、又はリンパ管及びリンパ節の排出等のために使用し得るレポーター遺伝子をコードしてもよい。
【００６４】
１つの実施態様では、腫瘍崩壊性キメラウイルスに感染した癌細胞は溶解され、導入遺伝子によりコードされるタンパク質を包含し得る細胞内容物を放出する。
１つの実施態様では、細胞内で複製された全ウイルスの４０〜９３％又はこれを超える量を培地から回収することができ、例えば、全ウイルスの４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１又は９２％を回収することができ、例えば全ウイルスの９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％を回収することができる。
【００６５】
１つの実施態様では、前記方法はＧＭＰ製造方法、例えばｃＧＭＰ製造方法である。
１つの実施態様では、前記方法は、保存に適するバッファー中にウイルスを配合する工程を更に含む。
１つの実施態様では、本開示は、本発明の方法から取得された又は取得可能なウイルス又はウイルス製剤まで拡張される。
【００６６】
細胞溶解の公知の方法としては、ＭｇＣｌ２及び洗浄剤例えば１％Ｔｗｅｅｎ‐２０を含む溶解バッファー（ｐＨ８．０）の使用が挙げられる。細胞溶解はｐＨ又はｐＯ２の制御を行わずに実施される。振とう及び加熱が用いられる。溶解は１．５〜２時間継続される。
複数回の凍結融解も細胞溶解の定法である。
【００６７】
１００Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼ（メルク）を使用して宿主細胞ＤＮＡを消化する。ベンゾナーゼ処理は＋３７℃で３０分間行われる。ベンゾナーゼ処理は、高い塩濃度を用いたインキュベーションを室温で１時間行うことにより終了させる。
細胞溶解においては、パルモザイム（Pulmozyme）を使用してもよい。
【００６８】
細胞溶解の代替法としては、細胞懸濁液を１０００×ｇ、１０分間及び４℃で遠心分離する方法が挙げられる。細胞ペレットを１ｍｌのＥｘ−Ｃｅｌｌ培地５％グリセロールに再懸濁させ、ペレットからの応答細胞を含む管を、液体窒素中で３〜５分間凍結させて凍結融解することにより、細胞からウイルスを放出させ、融解するまで＋３７℃の水浴中で融解させる。通常、凍結と融解の工程は更に２回繰り返される。このサイクルにより、細胞からウイルスを放出させる。最後の融解工程の後に、１９３６×ｇ、２０分間及び４℃で遠心分離することにより細胞片が除去される。
【００６９】
本願の内容においては、培地（単数）と培地（複数）は互換的に使用し得る。
本明細書の内容においては、「含む（comprising）」は、「包含する（including）」と解釈される。
ある要素を含む本発明の態様は、関連する要素「から成る（consisting）」又は「から本質的に成る（consisting essentially）」代替の実施態様に及ぶことも意図される。
技術的に適切であれば、本発明の実施態様を組み合わせてもよい。
【００７０】
本明細書中では、実施態様はある特徴／要素を含むことが記載される。本開示は、該特徴／要素から成る実施態様、又は該特徴／要素から本質的に成る実施態様を区別することにも及ぶ。
特許や出願等の技術的参考文献は、本明細書中で参照することにより組み入れられる。
本明細書中で具体的且つ明確に記載される実施態様は、単独で、又は１以上の更なる実施態様との組合せにより、ディスクレイマーの根拠を形成し得る。
本発明を、添付する図面を参照する以下の実施例において、例証のために記載する。
【実施例】
【００７１】
実施例１
懸濁ＨＥＫ２９３細胞（１００ｒｐｍの振とうフラスコ１２５ｍＬ中に１×１０６細胞／ｍＬ）をＭＯＩ１０で感染させ、ＣｏｌｏＡｄ１の感染の２時間後に、ＣＤ２９３培地に加えた。試料を感染後６、２４、３０、４８、５４及び７８時間に採取した。上澄みを遠心分離により細胞から分離し、細胞溶解バッファーに細胞ペレットを再懸濁させた。細胞中及び上澄み中の感染性ＣｏｌｏＡｄ１粒子の量を免疫染色感染性試験により測定し、各時点での全体に占める割合として表した。Ｎ＝１、エラーバー（ＳＤ）は３回の感染（triplicate infection）を示す。結果を図２に示す。
【００７２】
実施例２
接着ＨＥＫ２９３細胞（１ｍＬの２４ウェルプレート中に１×１０６細胞／ｍＬ）をＭＯＩ１０で感染させた（２％ＦＣＳを含有する倍地中）。ＣｏｌｏＡｄ１による感染の後６、２４、３０、４８、５４及び７８時間に、上澄みを除去し、細胞溶解バッファーに再懸濁させる前に細胞をその表面から脱離させた。細胞と上澄みに付随する感染性ＣｏｌｏＡｄ１粒子の量を免疫染色感染性試験により測定し、各時点での全体に占める割合として表した。Ｎ＝１、エラーバー（ＳＤ）は３回の感染を示す。結果を図３に示す。
【００７３】
実施例３  ＨＥＫ２９３懸濁培養で培養されたＣｏｌｏＡｄ１
腫瘍崩壊性ウイルスＣｏｌｏＡｄ１の感染条件を、小スケールの懸濁ＨＥＫ２９３細胞培養により試験した。感染に先立ち、細胞をＥｘ‐Ｃｅｌｌ‐６ｍＭ  Ｌ−グルタミン−５０ｇ／ｍｌ／５０ＩＵ／ペニシリンｍｌ／ストレプトマイシン−を用いて、３７℃及び５％ＣＯ２で９６時間培養した。
Ｂｕｒｋｅｒ細胞血球計（Burker cell hemacytometer）及びトリパンブルー染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５２５０−０６１）を用いて細胞の計数を行った。より高い希釈（希釈係数３以上）のためには、トリパンブルーを含む細胞培養培地を使用した。２種類のウイルス希釈液（細胞当たり５０粒子及び１００粒子）と６回収時点（４０、４３、３６、４９、６４及び７０時間）について試験を行った。全ての試験を二個の振とうフラスコ中で実施した。試料のウイルス粒子濃度をＡＥＸ−ＨＰＬＣで分析し、結果を表３及び４に示す。
【００７４】
【表１】
2016509836.tif 000003
【００７５】
【表２】
2016509836.tif 000004
【００７６】
１００ｐｐｃで細胞を７０時間感染させた場合に、最多量のウイルス粒子が製造された（２つのフラスコの平均値は１．０５Ｅ＋１３ｖｐ、表４）。その時点では、ウイルス粒子の９３％が培地中に存在した。図５から、ウイルスの総量は７０時間まで増加したが、６４時間後には曲線の増加が止まり始めたことが分かる。４３時間の時点で、ウイルスの半分以上が既に培養培地中に存在していたが、懸濁製造法では、精製過程において培地中のウイルス粒子を補足することもできる。７０時間では、ＭＯＩが１００ｐｐｃの場合には５０ｐｐｃの場合よりも、２．６Ｅ＋１２多いウイルス粒子が製造された（６４時間では２．８Ｅ＋１２多い）。しかし、５０ｐｐｃの場合でも、細胞の製造能力は最大値に近接しているように思われる。細胞内ウイルス量は、４０〜７０時間の間ほぼ一定に維持された。
【００７７】
実施例４  接着ＨＥＫ２９３細胞において培養されたＣｏｌｏＡｄ１の例
接着ＨＥＫ２９３細胞を、感染の７２時間前に、１８５ｃｍ２の細胞培養フラスコ（２４個）に、フラスコ当たり４．８ｘ１０６個播種した。ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ−２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを用いて、＋３７℃及び５％ＣＯ２で細胞培養を実施した。感染当日に、１個の細胞培養フラスコ内の細胞数を計数した結果、４０．６ｘ１０６細胞／フラスコであった。細胞当たりの試験粒子（ｐｐｃ）は２００、１００及び５０であった。感染後に、細胞を３５〜７０時間培養してもよい。
【００７８】
実施例５  感染後４０時間、４６時間及び７０時間における、ＣｏｌｏＡｄ１感染ＨＥＫ２９３細胞の細胞溶解物（溶解物）又は上澄み（ＳＮ）中の細胞ＤＮＡ及びウイルスＤＮＡの視覚化
細胞当たり５０粒子のＣｏｌｏＡｄ１に感染したＨＥＫ２９３細胞を、感染後４０時間、４６時間又は７０時間に回収した。培養上澄みと細胞溶解物を回収し、全てのＤＮＡを抽出した。精製した溶解物ＤＮＡ又は上澄みＤＮＡの等量を０．７％アガロースゲル上に二組加え、ＤＮＡを電気泳動で分離した。細胞溶解物から抽出したＤＮＡを含む全てのレーンにおいて、ゲル上部と塗抹として有意量の細胞ＤＮＡを検出できたが、上澄み（ＳＮ）から抽出したＤＮＡを含むレーンでは、ごく僅かな量の細胞ＤＮＡを検出出来ただけであった。対照的に、ウイルスＤＮＡは全ての試料で検出することができ、検出可能な全ウイルスＤＮＡは、上澄み中で時間と共に観察可能な程度に増加した。結を図５に示す。
【００７９】
実施例６
細胞ペレット（ＣＶＬ）に付随するウイルス粒子、又は上澄み中のウイルス粒子の相対発現量について、ＣｏｌｏＡｄ１、ＮＧ−１３５、ＮＧ−７６、Ａｄ５及びＡｄ１１ｐ（図及び表中ではＡｄ１１と称する）を比較した。
【００８０】
【表３】
2016509836.tif 000005
【００８１】
懸濁ＨＥＫ２９３細胞（２９３ｆ）を、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び５０μｇ／ｍｌ／５０ＩＵ／ペニシリンｍｌ／ストレプトマイシンを補充した、有効容量４０ｍｌのＳＦＭＩＩ倍地を含む二組の振とうフラスコ中で培養し、１０６細胞／ｍｌで、細胞当たりのウイルス粒子数（ｐｐｃ）５０でウイルスに感染させた。
１個のバイアルの細胞を融解させることにより細胞増殖を開始し、本実験に必要な全体で４．８ｘ１０８細胞が達成されるまで、３週間細胞増殖を継続した。感染前の３日間、ＨＥＫ２９３懸濁細胞を、フラスコ当たり４２８ｍｌのＳＦＭＩＩ培地中に４ｘ１０５細胞／ｍｌの１リットル振とうフラスコ（３．４ｘ１０８細胞／フラスコ）に播種し、＋３７°Ｃ、５％ＣＯ２及び１１５ｒｐｍの振とう恒温器中でインキュベートした。
【００８２】
感染の当日に、細胞の計数を実施し、細胞密度に基づいて、２．１５ｘ１０６細胞／ｍｌの細胞懸濁液２２５ｍｌを実験に使用した。残った細胞は廃棄した。
ＨＥＫ２９３懸濁細胞を、４種の異なるウイルスの１つ（表５を参照）に５０ｐｐｃで２通りに感染させた。
細胞の感染前には、ＳＦＭＩＩ増殖培地中で各ウイルスを１：１００に希釈した（ウイルス濃度は表５を参照）。
【００８３】
【表４】
2016509836.tif 000006
【００８４】
希釈したウイルスの懸濁ＨＥＫ２９３細胞への感染は以下の通り：
２．１５ｘ１０６の細胞懸濁液２２５ｍｌを遠心分離し、細胞ペレット４８０ｍｌの培地に再懸濁させて細胞濃度を１ｘ１０６細胞／ｍｌに調整した。
その後、振とうフラスコ当たり有効容量４０ｍｌの振とうフラスコ１０個を準備した。二つ組フラスコ（Dual flask）に、それぞれＣｏｌｏＡｄ１−Ａ１Ａ２、ＮＧ１３５−Ｂ１Ｂ２、ＮＧ７６−Ｃ１Ｃ２、Ａｄ５−Ｄ１Ｄ２及びＡｄ１１Ｅ１Ｅ２とラベリングした。
表６に従い、ラベリングした全てのフラスコを５０ｐｐｃでウイルスに感染させた。
全ての振とうフラスコを、＋３７℃、５％ＣＯ２及び１２０ｒｐｍの振とう恒温器中に回収されるまで置いた。
【００８５】
感染の４０、４６、４９、６４、７０、７３及び８９時間後に、各フラスコから試料２．５ｍｌを採取し、二つを併合して試料５．０ｍｌとした。感染の９６時間後に、全ての細胞を回収した。細胞生存率を０．５ｍｌを用いて評価し、次いで残りの４．５ｍｌ量を遠心分離し、各ウイルスについて、上澄みと細胞ペレットの間のウイルス分配を以下の方法で測定した：
【００８６】
細胞を１０００×ｇ、１０分間及び４℃で遠心分離した。
遠心分離の後、上澄みを無菌容器に穏やかに注ぎ、０．５ｍｌの５０％グリセロールを１ｍｌ分量の試料に添加し、分析まで−８０℃で保存した。
細胞ペレットを５％グリセロールを含むＳＦＭＩＩ培地１ｍｌに懸濁させ、以下の方法で凍結融解により細胞内ウイルスを細胞から放出させた：
遠心管を液体窒素中で３〜５分間凍結させ、次いで融解するまで＋３７℃に設定した水浴中に移動させた。
凍結と融解のプロセスを、上記工程ａに記載したように更に２回繰り返した。
最後の融解工程の後に、１９３６×ｇ、２０分間及び＋４℃で遠心分離を行い、上澄み（ＣＶＬ）を新たな容器に移すことにより、細胞片を粗ウイルス溶解物（ＣＶＬ）から除去した。
ＣＶＬを１００μｌ試料として分取し、分析まで−８０℃で保存した。
【００８７】
粗ウイルス溶解物（ＣＶＬ）と上澄み（ＳＮ）の試料からの総ウイルス粒子濃度（ｖｐ）を、ＡＥＸ−ＨＰＬＣ試験により分析した。次いで、これらの値を使用して１培養当たりのウイルス粒子の総数と、各試料の各時点について、ＳＮ中及びＣＶＬ中の割合を算出した。これらを、ＣｏｌｏＡｄ１、ＮＧ−１３５、ＮＧ−７６、Ａｄ５及びＡ１１ｐについて、ＨＥＫ２９３細胞の生存率と共に棒グラフとして図６〜１０にそれぞれ表す。ＣｏｌｏＡｄ１、ＮＧ−１３５，ＮＧ−７６及びＡｄ１１ｐについては、ウイルスの大部分は培養上澄み中に存在したが、Ａｄ５ウイルスについては、細胞溶解物（ＣＶＬ）中に全てが存在し、上澄み中には検出されなかった。全ての培養において、ＨＥＫ２９３細胞の生存率は９６時間の培養の間高く維持された。
【００８８】
ＣｏｌｏＡｄ１（図６Ａ）については、４０時間の時点で８４％が上澄み中に存在し、６４時間の時点で９８％が上澄み中に存在し、ＣＶＬ（ペレット）試料中にはウイルスは検出されなかった。
Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎ１３５（図７Ａ）とＮｅｘｔ  Ｇｅｎ７６（図８Ａ）については、ウイルス分配の傾向はＣｏｌｏＡｄ１と類似している。ＮＧ１３５については、４０時間の時点でウイルスの７７％が上澄み中に存在した。これは、６４時間の時点で、ウイルスの９７％が上澄み中に存在するように増加した。同じ時点のＮｅｘｔ  Ｇｅｎ７６については、ウイルスの５６％と９８％が上澄み中に存在した。
【００８９】
Ａｄ１１（図１０Ａ）については、４０時間の時点でウイルスの３１％が上澄み中に存在し、６４時間の時点で８８％が上澄み中に存在し、９６時間の時点でウイルスの９８％が、それぞれ上澄み中に存在した。
Ａｄ５（図９Ａ）については、ウイルスの１００％がＣＶＬ（ペレット）試料中に検出され、上澄みにはウイルスは検出されなかった。
本実験で評価された全てのウイルスについては、感染後４９時間にウイルスの最大量が観察され、その後の時点では、ウイルス量の緩やかな減少がその後観察された。
【００９０】
ＣｏｌｏＡｄ１（図６Ｂ）とＮＧ１３５（図７Ｂ）については、４９時間の時点でウイルスの最大量（２７０００ｖｐ／細胞）が観察され、ＮＧ７６（図８Ｂ）においては、同じ時点でウイルスの最大量（９２００ｖｐ／細胞）が観察された。
Ａｄ５（図９Ｂ）については、８９時間の時点でウイルスの最大量（１１０００ｖｐ／細胞）が観察され、Ａｄ１１ｐ（図１０Ｂ）においては、同じ時点でウイルスの最大量（３００００ｖｐ／細胞）が観察された。
ＡＥＸ−ＨＰＬＣで分析した全ての上澄み及びＣＶＬ試料の総ウイルス粒子濃度を表７及び８、並びに図６−１０に示す。
【００９１】
【表５−１】
2016509836.tif 000007
【００９２】
【表５−２】
2016509836.tif 000008
【００９３】
【表５−３】
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【００９４】
【表５−４】
2016509836.tif 000010
【００９５】
【表６−１】
2016509836.tif 000011
【００９６】
【表６−２】
2016509836.tif 000012
【００９７】
【表６−３】
2016509836.tif 000013
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年1月25日(2016.1.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅ２Ｂ領域を含むゲノムを有する腫瘍崩壊性キメラアデノウイルスの製造方法であって、前記Ｅ２Ｂ領域が、第一のアデノウイルス血清型に由来する核酸配列と、第二の別個のアデノウイルス血清型に由来する核酸配列を含み、前記第一の血清型と第二の血清型は各々アデノウイルスサブグループＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦから選択され、前記ウイルスはグループＢアデノウイルスに由来するヘキソンと線維を有し、前記ウイルスはＥ３領域の一部または全てが欠損し、前記ウイルスは複製能を有し、前記方法が以下の工程：
ａ：アデノウイルスに感染した哺乳動物細胞を、該細胞の支持に適した培地の存在下において、前記ウイルスが複製するように培養する工程であって、前記細胞はウイルスの複製を支持する能力を有する工程；及び
ｂ：培養期間終了時において、工程ａ）からの前記ウイルスをろ過により前記培地から単離する工程であって、ウイルスの該単離は細胞溶解工程の後ではなく、前記培養時間が３０〜１００時間の範囲である工程、
を含む、製造方法。
【請求項２】
前記ウイルスが、Ａｄ１１に由来するヘキソンと線維を有し、特に前記ウイルスはＣｏｌｏＡｄ１である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記培養期間が３５〜７０時間の範囲である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記培養が、灌流培養工程、流加培養、回分、特に灌流培養工程を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞を、接着培養又は懸濁培養、特に懸濁培養において増殖させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物細胞が、ＨＥＫ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、Ｖｉｒｏ、ＰｅｒＣ６及びＧＭＫからなる群から選択され、特にＨＥＫ２９３である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記培養が５Ｌ以上の規模である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
培養中の前記ウイルス濃度が、２０〜１５０ｐｐｃの範囲である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
培養中のウイルス濃度が、４０〜１５０ｐｐｃ、例えば５０〜１００ｐｐｃの範囲である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、開始濃度が１〜９×１０４ｖｐ／ｍｌ以上、例えば、１〜９×１０５、１〜９×１０６、１〜９×１０７、１〜９×１０８、１〜９×１０９、特に４〜５×１０６ｖｐ／ｍｌのウイルスに感染する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法により腫瘍崩壊性ウイルスの画分が提供され、前記方法は、同一又は異なる方法により作製された腫瘍崩壊性ウイルスの一又は複数の第二の画分を、前記第一の画分と結合させるような更なる工程を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法がＧＭＰ製造方法である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記フィルターがタンジェンシャルフィルターである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が、ＣｓＣｌ勾配、イオン交換クロマトグラフィー、特に陰イオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー、及びそれらの組合せから選択される精製工程を更に含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
総ウイルスの４０〜９３％を培地から回収可能である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が、保存に適したバッファー中に前記ウイルスを配合することを更に含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
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