(57)【要約】  本発明は新規のガングリオシド及び新規のガングリオシドの混合物、並びにこれを含有する製剤を提供する。本発明はまた一以上のガングリオシドの過剰発現を誘導された細胞を提供する。本発明はさらにGM1等のガングリオシドを培養中の細胞、例えば骨髄細胞及び神経芽細胞腫細胞から生成する方法を提供する。方法には、ヒト骨髄細胞等に対しては、神経誘導培地及びクロロキン、又はクロロキン単独で、ノイラミニダーゼ又はグルコサミンで細胞を処理することで細胞内でのGM1等のガングリオシドの生成を誘導することが含まれる。また継代せずに長期間、高密度で細胞を培養することでGM1等のガングリオシドを生成する方法を提供する。また細胞培養物中のGM等のガングリオシドを定量する方法を提供する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒツジGM1標準の遅延係数（「Rf」）よりも大きい遅延係数（「Rf」）値を有する薄層クロマトグラフィー（「TLC」）の単一のバンドで特定されるガングリオシドであって、
TLCにおいて、前記ガングリオシドを超高純度のシリカゲルの250μｍの層で被覆されたガラスプレート上のTLCに供するとともに、クロロホルム、メタノール及び0.2%のカルシウムを50：42：11の比率で含有する溶液に接触させ、その後、前記被覆されたガラスプレートを80mLの濃塩酸、0.25mLの0.1M硫酸銅、10mLの2%レゾルシノール及び10mLの水を含有する第二溶液中に入れることで染色するともに、かかるガラスプレートを前記第二溶液中で20分間100℃に加熱するところ、
前記ガングリオシド中に一以上のガングリオシドを含む、
ガングリオシド。
【請求項２】
前記ガングリオシドは未精製のガングリオシド混合物から精製される、
請求項１に記載のガングリオシド。
【請求項３】
前記未精製のガングリオシド混合物は低酸素で培養された成人骨髄間質細胞から分離される、
請求項２に記載のガングリオシド。
【請求項４】
前記低酸素は５％の酸素である、
請求項３に記載のガングリオシド。
【請求項５】
前記ガングリオシドのＲｆ値は０．６５である、
請求項１に記載のガングリオシド。
【請求項６】
前記ガングリオシドはGM1ガングリオシドである、
請求項１に記載のガングリオシド。
【請求項７】
前記ガングリオシドは前記ヒツジGM1標準よりも極性が高い、
請求項１に記載のガングリオシド。
【請求項８】
前記ガングリオシドはコレラ毒素Ｂ（CTB）と結合している、
請求項１に記載のガングリオシド。
【請求項９】
前記ガングリオシドの前記Rf値及び前記ヒツジGM1標準の前記Rf値の比は３：１から１．１：１の間にある、
請求項１に記載のガングリオシド。
【請求項１０】
前記比は１．２３：１又は約１．２３：１である、
請求項９に記載のガングリオシド。
【請求項１１】
以下の工程により製造されたガングリオシド、
（ａ）細胞をクロロキンで処理する（「CLQ」）ことでかかる前記ガングリオシドを蓄積させ；
（ｃ）前記ガングリオシドを分離する、
ここで前記ガングリオシドはヒツジGM1標準の遅延係数（「Rf」）よりも大きい遅延係数（「Rf」）値を有する薄層クロマトグラフィー（「TLC」）の単一のバンドで特定され、
TLCにおいて、前記ガングリオシドを超高純度のシリカゲルの250μｍの層で被覆されたガラスプレート上のTLCに供するとともに、クロロホルム、メタノール及び0.2%のカルシウムを50：42：11の比率で含有する溶液に接触させ、その後、前記被覆されたガラスプレートを80mLの濃塩酸、0.25mLの0.1M硫酸銅、10mLの2%レゾルシノール及び10mLの水を含有する溶液中に入れることで染色するともに、かかるガラスプレートを前記溶液中で20分間100℃に加熱する、
ガングリオシド。
【請求項１２】
前記細胞はヒト骨髄細胞である、
請求項１１に記載のガングリオシド。
【請求項１３】
前記ヒト骨髄細胞は成人骨髄細胞である、
請求項１２に記載のガングリオシド。
【請求項１４】
前記細胞は低酸素で培養される、
請求項１１に記載のガングリオシド。
【請求項１５】
前記低酸素は５％の酸素である、
請求項１４に記載のガングリオシド。
【請求項１６】
前記細胞はニューロン誘導培地で処理される、
請求項１１に記載のガングリオシド。
【請求項１７】
前記処理は５０μＭのＣＬＱに前記細胞を接触させることを含む、
請求項１１に記載のガングリオシド。
【請求項１８】
前記ガングリオシドのRf値は0.65である、
請求項１１に記載のガングリオシド。
【請求項１９】
前記ガングリオシドは前記ヒツジGM1標準よりも極性が高い、
請求項１１に記載のガングリオシド。
【請求項２０】
前記ガングリオシドはCTBと結合している、
請求項１１に記載のガングリオシド。
【請求項２１】
前記ガングリオシドの前記Rf値及び前記ヒツジGM1標準の前記Rf値の比は３：１から１．１：１の間にある、
請求項１１に記載のガングリオシド。
【請求項２２】
前記比は１．２３：１又は約１．２３：１である、
請求項２１に記載のガングリオシド。
【請求項２３】
液体クロマトグラフィーシステム中でガングリオシドが液体クロマトグラフィーに供された時に、保持時間が7.4であることを特徴とするガングリオシドであって、
前記液体クロマトグラフィーシステムでは：
ａ．アジレント1200バイナリーUPLCシステムポンプと、
ｂ．移動相Ａ及び移動相Ｂを含む移動相、ここで移動相Ａは10mMの酢酸アンモニウムからなり、移動相Ｂはメタノールからなる、と、
ｃ．ウォーターズのAcquity C18 (2.1 x 50 mm)逆相カラムと、を用い、
前記カラムは40℃で保持され、前記移動相は毎分0.4 mLの速度で流動し、ここで０分から４分において前記移動相は65%の移動相Ａと35%の移動相Ｂとからなり、４分から７．５分において前記移動相は15%の移動相Ａと85%の移動相Ｂとからなり、７．６分から１５分において前記移動相は65%の移動相Ａと35%の移動相Ｂとからなり、前記ガングリオシドは、注入体積20μｌの混合物となっている試料の状態で前記液体クロマトグラフィーシステムに注入されるところ、
前記ガングリオシドは一以上のガングリオシドを含んでなる、
ガングリオシド。
【請求項２４】
液体クロマトグラフィーシステム中でガングリオシドが液体クロマトグラフィーに供された時に、保持時間が7.8であることを特徴とするガングリオシドであって、
前記液体クロマトグラフィーシステムでは：
ｄ．アジレント1200バイナリーUPLCシステムポンプと；
ｅ．移動相Ａ及び移動相Ｂを含む移動相、ここで移動相Ａは10mMの酢酸アンモニウムからなり、移動相Ｂはメタノールからなる、と；
ｆ．ウォーターズのAcquity C18 (2.1 x 50 mm)逆相カラムと、を用い、
前記カラムは40℃で保持され、前記移動相は毎分0.4 mLの速度で流動し、ここで０分から４分において前記移動相は65%の移動相Ａと35%の移動相Ｂとからなり、４分から７．５分において前記移動相は15%の移動相Ａと85%の移動相Ｂとからなり、７．６分から１５分において前記移動相は65%の移動相Ａと35%の移動相Ｂとからなり、前記ガングリオシドは、注入体積20μｌの混合物となっている試料の状態で前記液体クロマトグラフィーシステムに注入されるところ、
前記ガングリオシドは一以上のガングリオシドを含んでなる、
ガングリオシド。
【請求項２５】
一以上のガングリオシドを過剰発現するように誘導された細胞であって、神経芽細胞腫又は成人骨髄細胞である、
細胞。
【請求項２６】
前記細胞は神経芽細胞腫である、
請求項２５に記載の細胞。
【請求項２７】
前記神経芽細胞腫はGM1、GM2及びGM3を含有するガングリオシド混合物を発現するように誘導され、
GM1は前記混合物の12.9%を占め；GM2は前記混合物の68.1%を占め；GM3は前記混合物の18.9%を占める、
請求項２６に記載の神経芽細胞腫。
【請求項２８】
前記神経芽細胞腫はSHSY細胞である、
請求項２５に記載の神経芽細胞腫。
【請求項２９】
請求項２３に記載のガングリオシドを発現するように誘導されたSHSY細胞。
【請求項３０】
請求項２４に記載のガングリオシドを発現するように誘導されたSHSY細胞。
【請求項３１】
前記細胞は成人骨髄細胞である、
請求項２５に記載の神経芽細胞腫。
【請求項３２】
請求項１に記載のガングリオシドを発現するように誘導された成人骨髄細胞。
【請求項３３】
請求項２３に記載のガングリオシドを発現するように誘導された成人骨髄細胞。
【請求項３４】
請求項２４に記載のガングリオシドを発現するように誘導された成人骨髄細胞。
【請求項３５】
GM1、GM2及びGM3を含有するガングリオシド混合物を含有する製剤であって、
GM1は前記混合物の12.9%を占め；GM2は前記混合物の68.1%を占め；GM3は前記混合物の18.9%を占める、
製剤。
【請求項３６】
請求項１、２３及び２４のいずれかに記載のガングリオシド、またはこれらの混合物を含有する製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なガングリオシドの発見及びこれらのガングリオシドを含有する組成物に関する。本発明はまたガングリオシドの発現の誘導がなされている細胞、及び医療品を含む組成物であって、これらの細胞から抽出されたガングリオシドを含有するものに関する。本発明はさらにGM1等のガングリオシドを、培養された細胞から製造する方法に関する。特に、細胞は化学的に処理され及び／又は生化学的に操作されることでGM1等のガングリオシドの産生が誘導されており、かつ／又は細胞は長期間、高密度で、継代せずに培養されることでGM1等のガングリオシドが蓄積されている。
【背景技術】
【０００２】
［GM1ガングリオシドの構造及び機能］
GM1は以下の構造を有するモノシアロガングリオシドである。
【化１】
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【０００３】
GM1は神経細胞膜の構成要素であり、細胞表面及び受容体の活性の多くを調整していることが知られている。またニューロンの分化及び発生、タンパク質リン酸化及びシナプスの機能に対して重要な働きをする。したがってGM1はニューロンの可塑性及び修復機構並びに脳内のニューロトロフィンの放出に大きく影響する。これらの神経系での働きに加えて、GM1は病原体の内部移行、細胞シグナル伝達、増殖、生存及び分化に関与する。GM1は脂質ラフトの構成要素である。脂質ラフトとはコレステロール及びスフィンゴ脂質内に富んだ、原形質膜内の微小領域である。さらに、GM1は、核膜の内膜内のナトリウム−カルシウム交換輸送体の活性化に関与する。GM1とカルシウム交換輸送体との相互作用により、核内と細胞内のカルシウムを調整する。GM1には、細胞生理学的な機能に加えて、コレラ毒素の結合部位としても働く。
【０００４】
GM1は実験動物において各種の中枢神経系の損傷の治療に効果的であることが示されており、生化学及び行動学的観点から顕著な回復が見られる。またGM1を予め投与することで、様々な神経毒素への曝露により起こる損傷を抑制することができる。
【０００５】
GM1はまたパーキンソン病患者に対する短期間の治療に効果のあることが示されており、顕著な疾患の緩和が見られる。Schneider et al., Neurology 50:1630-1636 (1998)を参照。より新しい５年間の研究により、パーキンソン病患者による長期間のGM1の使用が安全であり、これらの患者に対して一定の臨床的有用性が得られたことが示されている。ここにSchneider et al., J. Neurol. Sci. 292:45-51 (2010)を引用し、そのすべてを取り込む。ドーパミン系において、どのようにしてGM1は潜在的な神経保護作用、神経回復作用又は神経救援作用を発揮するのかは不明である。Id. at 50.  しかしながら、ニューロンの原形質膜に取り込まれたGM1が脂質ラフトの安定性を変化させることで、種々の、有用な細胞内プロセスを促進するものと予想されている。Id.  
【０００６】
［ガングリオシド］
ガングリオシドは哺乳類にとって主要なスフィンゴ糖脂質である。ガングリオシドは相異なる数のシアル酸残基を伴う糖鎖を含んでいる。ガングリオシドの糖は多くの相異なる変種がある。ガングリオシドは多くの疾病及び疾患に関連する。特にテイザックス病、パーキンソン病、アルツハイマー病及び癌が含まれる。
【０００７】
ガングリオシドの生合成は生合成に係る共通の酵素及び基質を利用することで相互に密接に接続される。例えばGM1の合成は酵素、ガラクトシルトランスフェラーゼIIに依拠しており、かかる酵素はGA1、GD1b及びGT1cといった他のガラクトシドを合成するのにも共通して用いられる。ここにXu et al., J. Lipid Res. 51:1643-1675 (2010)を引用し、そのすべてを取り込む。これらは構造的特徴及び構成要素が共通することから、分解されたガングリオシドの構成要素、とくにセラミド及びスフィンゴシンを再利用して新規のガングリオシドが合成される。Id.  例えばセラミド、ガラクトース、GalNAc、シアル酸のような中心となる分子がガングリオシドの合成に必要である。Id.  結果として、ガングリオシドファミリーを構成するものの一つの合成及び分解に影響を与える因子が他のガングリオシドの合成と分解を変化させることが頻繁にある。例えばGM1はGD1aの前駆体であることから、GM1の増加がGD1aの合成に好都合である。このためガングリオシドの比率を通常の状態に又はバランスのとれた状態に維持することができる。ここにMason et al., Biochem. J. 388:537-544 (2005)；Miller-Podraza et al., Biochem. 21:3260-3265 (1982)；Nishio et al., J. Biol. Chem. 279:33368-33378 (2004)を引用し、そのすべてを取り込む。
【０００８】
［GM1の生成］
従来、ウシの脳より採取したGM1が医療用に用いられていた。例えばSchneider et al., J. Neurol. Sci. 292:45-51, 46 (2010)の("Patients self-administered . . . bovine brain-derived [GM1] sodium salt . . .")を参照のこと。ここにかかる文献を引用し、そのすべてを取り込む。しかしながら、ウシの脳あたりのGM1の収量は限られており、GM1をこの方法で製造したときの費用から、商業的な意味で医療に用いることができるGM1の量は限定されていた。さらにウシ海綿状脳症、いわゆる狂牛病といった疾病が、かかるGM1の供給源の安全性に対する問題として浮上した。GM1ガングリオシド蓄積症を有するヒツジの脳からGM1を抽出することが記述されている（例としてU.S. Patent No. 5,532,141を参照）。ここにかかる文献を引用し、そのすべてを取り込む。しかしながら、かかる方法も同様に収量、費用及び安全性の面で問題が浮上している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、費用面で効率的であり、高い収量を誇り、かつ安全な代替品であって、商業的な意味で医療に用いることの出来るGM1の作出に資するものが明確に必要とされていたが未解決であった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は細胞内でガングリオシドを作出する方法を提供する。かかる方法はかかる細胞をクロロキンで処理する（「CLQ」）ことでかかるガングリオシドを蓄積させ；かかるガングリオシドを分離し；かかるCLQ処理済み細胞から得たかかるガングリオシド又は双方を定量する。ここでかかる細胞は不死化細胞、間質細胞及び線維芽細胞からなる群から選ばれる。ここでかかる細胞はPC12、HT22、ガングリオシド蓄積症のヒツジから採取した脳細胞及びガングリオシド蓄積症のヒツジから採取した繊維芽細胞ではない。
【００１１】
本発明はまたGM1ガングリオシドを製造する方法を提供する。かかる方法では、骨髄細胞をヒツジから単離し；ニューロン誘導培地でヒツジ骨髄細胞を培養する（「NIM」）ことでニューロン状のヒツジ骨髄細胞を形成し；ニューロン状のヒツジ骨髄細胞をCLQで処理することでGM1を蓄積させ；CLQ処理したニューロン状のヒツジ骨髄細胞から得たGM1を定量し、GM1を単離し、又は双方を行う。
【００１２】
本発明はさらにGM1ガングリオシドを製造する方法を提供する。かかる方法ではヒト骨髄細胞をCLQで処理することでGM1を蓄積させ；CLQ処理したヒト骨髄細胞から得たGM1を定量し、GM1を単離し、又は双方を行う。
【００１３】
本発明はまた、骨髄細胞等の細胞をノイラミニダーゼで処理することでGM1等のガングリオシドを細胞内に蓄積させ、ノイラミニダーゼで処理した細胞から得たガングリオシドを単離し、ガングリオシドを定量し、又は双方を行うことに関する。
【００１４】
本発明はまた、骨髄細胞等の細胞をグルコサミンで処理することでGM1等のガングリオシドを細胞内に蓄積させ、グルコサミンで処理した細胞から得たガングリオシドを単離し、ガングリオシドを定量し、又は双方を行うことに関する。
【００１５】
本発明はまた、生化学的に初代細胞又は細胞株を操作することでGM1等のガングリオシドを細胞内に蓄積させ、生化学的に修飾された細胞から得たガングリオシドを単離し、ガングリオシドを定量し、又は双方を行うことに関する。
【００１６】
また本発明によって提供されるのはGM1等のガングリオシドを製造する方法であって、継代することなく細胞を培養することで高密度にかかるガングリオシドを蓄積させることによる方法である。
【００１７】
本発明はまた、接着細胞の集団中のGM1等のガングリオシドの量を測定する方法に関する。かかる方法では、接着細胞を色素又は酵素と結合されたコレラ毒素Ｂに接触させる、ここで酵素は基質と接触することで有色最終産物を生成する；色素又は有色最終産物から放射される光又はこれらによって吸収される光を測定する、ここで放射又は吸収される光は接着細胞の集団中のGM1等のガングリオシドの量を測定するために用いられる。
【００１８】
本発明はさらに、本発明の方法により製造されるGM1等のガングリオシドを提供する。
【００１９】
本発明はまた、疾病又は疾患を治療する方法に関する。かかる方法では本発明の方法により製造されるGM1等のガングリオシドをこれらを必要とする患者に投与する。
【００２０】
本発明はさらに、ヒツジGM1標準の遅延係数（「Rf」）よりも大きい遅延係数（「Rf」）値を有する薄層クロマトグラフィー（「TLC」）の単一のバンドで特定されるガングリオシドに関する。TLCは以下の通り行う。かかるガングリオシドを超高純度のシリカゲルの250μｍの層で被覆されたガラスプレート上のTLCに供するとともに、クロロホルム、メタノール及び0.2%のカルシウムを50：42：11の比率で含有する溶液に接触させる。その後、かかる被覆されたガラスプレートを80mLの濃塩酸、0.25mLの0.1M硫酸銅、10mLの2%レゾルシノール及び10mLの水を含有する第二溶液中に入れることで染色するともに、かかるガラスプレートをかかる第二溶液中に浸漬し20分間100℃に加熱する。ここでガングリオシドは一以上のガングリオシドを含む。
【００２１】
本発明はさらに、液体クロマトグラフィーシステム中でガングリオシドが液体クロマトグラフィーに供された時に、保持時間が7.4であることを特徴とするガングリオシドを提供する。液体クロマトグラフィーシステムではアジレント1200バイナリーUPLCシステムポンプと、移動相Ａ及び移動相Ｂを含む移動相とを用いる。移動相Ａは10mMの酢酸アンモニウムからなり、移動相Ｂはメタノールからなる。液体クロマトグラフィーではまた、ウォーターズのAcquity C18 (2.1 x 50 mm)逆相カラムを用いる。カラムは40℃で保持され、移動相は毎分0.4 mLの速度で流動する。０分から４分において移動相は65%の移動相Ａと35%の移動相Ｂからなる。４分から7.5分において移動相は15%の移動相Ａと85%の移動相Ｂからなる。7.6分から15分において移動相は65%の移動相Ａと35%の移動相Ｂからなる。ガングリオシドを含有する試料は、注入体積20μｌの混合物となっている試料の状態で液体クロマトグラフィーシステムに注入される。所定の態様において、保持時間が7.4であるガングリオシドは、ガングリオシドの混合物である。
【００２２】
本発明はさらに、液体クロマトグラフィーシステム中でガングリオシドが液体クロマトグラフィーに供された時に、保持時間が7.8であることを特徴とするガングリオシドを提供する。液体クロマトグラフィーシステムではアジレント1200バイナリーUPLCシステムポンプと、移動相Ａ及び移動相Ｂを含む移動相とを用いる。移動相Ａは10mMの酢酸アンモニウムからなり、移動相Ｂはメタノールからなる。液体クロマトグラフィーではまた、ウォーターズのAcquity C18 (2.1 x 50 mm)逆相カラムを用いる。カラムは40℃で保持され、移動相は毎分0.4 mLの速度で流動する。０分から４分において移動相は65%の移動相Ａと35%の移動相Ｂからなる。４分から7.5分において移動相は15%の移動相Ａと85%の移動相Ｂからなる。7.6分から15分において移動相は65%の移動相Ａと35%の移動相Ｂからなる。ガングリオシドを含有する試料は、注入体積20μｌの混合物となっている試料の状態で液体クロマトグラフィーシステムに注入される。所定の態様において、保持時間が7.8であるガングリオシドは、ガングリオシドの混合物である。
【００２３】
本発明はさらに、一以上のガングリオシドを過剰発現する細胞に関連する。ここで細胞は神経芽細胞腫又は成人骨髄細胞である。
【００２４】
本発明はまた、GM1、GM2及びGM3を含有するガングリオシド混合物を含有する医薬品に関する。ここでGM1はかかる混合物の12.9%を占め；GM2はかかる混合物の68.1%を占め；GM3はかかる混合物の18.9%を占める。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】GM1ガングリオシド蓄積症のヒツジの骨髄から得られた細胞（「罹患ヒツジ骨髄細胞」）を培養して増殖させた。対照となる細胞は標準培地で維持した（上段のパネル）。誘導された細胞を「48h CLQ in NIM」と表記した（下段のパネル）。NIMで培養した後48時間CLQで処理した。細胞をAlexa488と結合したコレラ毒素（「CTB-Alexa488」）で染色した。図に示す写真より、誘導の度合いが表されていることが分かる。染色部分はGM1の存在を示す。処理済み細胞に係る下段のパネルはGM1の誘導を示しており；染色部分はより強く広がっている。なお多くの細胞で核の周囲も染色されている。
【００２６】
【図１Ｂ】図１Ｂは通常のヒツジの骨髄から得られた細胞を培養により増殖させた。対照となる細胞を標準培養培地（上段のパネル）。対照となる細胞は標準培地で維持した（上段のパネル）。誘導された細胞を「48h CLQ in NIM」と表記した（下段のパネル）。NIMで培養した後48時間CLQで処理した。細胞をCTB-Alexa488で染色した。培養物の異なる領域の写真より、又は異なるウェルの写真より、誘導の度合いが表されていることが分かる。染色部分はGM1の存在を示す。処理済み細胞に係る下段のパネルはGM1の誘導を示しており；染色部分はより強く広がっている。なお多くの細胞で核の周囲も染色されている。
【００２７】
【図２】通常の成人の骨髄に由来する間質細胞を通常の組織培養フラスコに播種した。対照となる細胞は標準培地で維持した（上段のパネル）。誘導された細胞を「CLQ」と表記した（下段のパネル）。48時間、アルファMEM中にてCLQで処理した。図に示す写真より、誘導の度合いが表されていることが分かる。細胞をCTB-Alexa488で染色した。染色部分はGM1の存在を示す。処理済み細胞におけるGM1シグナル（下段のパネル）は対照条件に比べて大量に見られ、また強度が強い。
【００２８】
【図３】ヒト神経芽細胞腫の細胞株、SHSY-5Y、ヒツジ骨髄細胞（「SBM」）及びヒト骨髄細胞のそれぞれに対して、異なる三種の処方：（ａ）無血清培地（「SFM」）、（ｂ）NIM、又は（ｃ）CLQで処理した。各培養物中のGM1の量はホースラディッシュペルオキシターゼ（「HRP」）−結合コレラ毒素Ｂ（「CTB-HRP」）を用いて決定した。恒温維持及び洗浄の後に残存して結合しているCTB-HRPによって生成される産物の量を測定した。各培養物をアラマーブルーで染色しそのシグナルを測定した。GM1シグナル（CTB-HRPで測定されたもの）はウェル中の細胞数（アラマーブルーで測定されたもの）で標準化した。棒グラフのｙ軸はCTB-HRPを用いた染色の度合いを細胞数で標準化したもの表す。それぞれ、各処方により各細胞株において生成したGM1の量を表す。対照となる細胞には処理を行わず、標準培養培地で維持した。GM1の誘導が最も強かったのはNIM及びCLQによる処理であった。
【００２９】
【図４】ノイラミニダーゼ処理したマウスneuro 2A神経芽細胞腫におけるGM1の誘導である。neuro 2A細胞は標準培養培地（Ctrl）で維持し、またノイラミニダーゼによる３時間の処理も行った。処理済み細胞は強く染色され（パネルＤ参照）、処理済み細胞においてGM1がより多く集積することが示された。
【００３０】
【図５】ノイラミニダーゼによる成人骨髄間質細胞（hABM-SC）におけるGM1の誘導である。hABM-SCは標準培養培地（control）で維持し、またノイラミニダーゼによる３時間の処理も行った（treated）。処理済み細胞は強く染色され、処理済み細胞においてGM1がより多く産生されることが示された。
【００３１】
【図６】高密度、長期間の条件で培養したマウスneuro 2A神経芽細胞腫におけるGM1の誘導である。マウスneuro 2A細胞は高密度で播種した。培養３日後にウェルの一部において固定を行い、GM1を染色した。その他は固定及びGM1の染色の前に９日間維持した。９日間維持した細胞で強く染色されたことからGM1が多く産生されることが示された。
【００３２】
【図７】高密度−長期間培養条件での、ヒツジ脳由来細胞におけるGM1の誘導。ヒツジ脳由来の細胞を高密度で播種した。培養３日後にウェルの一部において固定を、行いGM1を染色した。その他は固定及びGM1の染色の前に９日間維持した。９日間維持した細胞で明るく染色されたことからGM1が多く産生されることが示された。
【００３３】
【図８】プレートによるCTB-HRPを用いたヒツジGM1の定量の標準曲線である。ELISAに基づくプレートは様々な量のヒツジGM1で被覆されている。プレートを洗浄し、ブロッキングし、HRP結合コレラ毒素Ｂとともに恒温を保った。基質を添加することで、プレートリーダーを用いて測定するための有色産物を生成する。シグナル強度はウェルごとに添加されたGM1の量に関連する。本グラフは本方法により生成された標準曲線を示す。GM1の水準は本グラフを用いて定量できる。
【００３４】
【図９】プレートによるCTB-Alexa488を用いたヒツジGM1の定量の標準曲線である。ELISAに基づくプレートは様々な量のヒツジGM1で被覆されている。プレートを洗浄し、ブロッキングし、CTB-Alexa488とともに恒温を保った。基質を添加することで、プレートリーダーを用いて測定するための有色産物を生成する。シグナル強度はウェルごとに添加されたGM1の量に関連する。本グラフは本方法により生成された標準曲線を示す。GM1の水準は本グラフを用いて定量できる。
【００３５】
【図１０】不死化細胞株におけるCLQによるGM1の誘導である。SHSY-5Y細胞、SHSY-S細胞、SK-N-AS細胞、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（CHO-K1）、及びヒト胚腎臓細胞（HEK293）を24ウェル培養プレートに播種した。対照となる細胞は、これらの各標準培養培地中で維持した（図１０、パネルＡ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ）。処理済み細胞は「CLQ」と標記し、標準培養培地に添加したCLQで48-120時間処理した（図１０、パネルＢ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ）。各写真の示すところにより、誘導の度合いが表されている。細胞はCTB-Alexa488で染色した。染色によりGM1の存在が示される。シグナルの大きさ及び分布は多様であったが、全ての細胞種において、処理済み細胞中のGM1のシグナルは対照の条件と比べて、より多く、かつ、より強かった。
【００３６】
【図１１】初代細胞株におけるCLQによるGM1の誘導。ガーネットバイオセラピューティクスの成体骨髄由来間質細胞（GBT-ABMSC）、骨髄由来間質細胞（Lonza BMSC）、脂肪由来間質細胞（Lonza ADSC）、皮膚繊維芽細胞（fb）、及びガングリオシド蓄積症罹患個体由来繊維芽細胞（GM1 fb）を24ウェル培養プレートに播種した。対照となる細胞は、これらの各標準培養培地中で維持した（図１１、パネルＡ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ）。処理済み細胞は「CLQ」と標記し、標準培養培地に添加したCLQで48-120時間処理した（図１１、パネルＢ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ）。各写真の示すところにより、誘導の度合いが表されている。細胞はCTB-Alexa488で染色した。染色によりGM1の存在が示される。シグナルの大きさ及び分布は多様であったが、全ての細胞種において、処理済み細胞中のGM1のシグナルは対照の条件と比べて、より多く、かつ、より強かった。
【００３７】
【図１２】ガングリオシド及び他の脂質成分の誘導。ガーネットバイオセラピューティクスの成人骨髄由来間質細胞（すなわち、本明細書に表わされるように低酸素、低密度で培養された成人骨髄由来間質細胞）に対して、クロロキンでガングリオシドを産生するように誘導し、これを回収し、溶解した。得られた抽出物を一回カラム精製することで濃縮されたガングリオシドの試料を得た。試料は樹脂基板を用いた薄層クロマトグラフィーで分析した。カラム精製により得られた抽出物（「Exract」）はヒツジGM1標準試料（「GM1」）、すなわち陽性対照の隣に展開した。各図において複数のGM1よりも溶解性の高い複数のバンドが見られた。染色によりガングリオシド及び他の脂質成分の存在が示される。本発明の方法により生成されたGM1及びガングリオシドのRf値はそれぞれ0.45及び0.58であったことから、Rf比は1.26であった。Rf値は開始点からバンドすなわちスポットの中心までの距離を測ることで決定した。
【００３８】
【図１３】ガングリオシドの誘導。ガラス基板上におけるTLCを用いて抽出物及びヒツジGM1標準を分析した。各写真は抽出物中のガングリオシドであってGM1より極性の高いものの存在を示す。GM1及びガングリオシドのRf値はそれぞれ0.53及び0.65であったことから、Rf比は1.23であった。Rf値は開始点からバンドすなわちスポットの中心までの距離を測ることで決定した。
【００３９】
【図１４】GM1のタンデム質量分析。GM1をタンデム質量分析（「MS/MS」）に供した。各グラフはGM1のMS/MSのプロフィールを示す。
【００４０】
【図１５】未誘導細胞のタンデム質量分析。被誘導細胞、すなわち陰性対照を回収し、溶解した。抽出物を一回カラム精製した。抽出物をMS/MSで分析した。各グラフは未被誘導細胞におけるMS/MSのプロフィールを示す。
【００４１】
【図１６】誘導済み細胞のタンデム質量分析。誘導細胞、すなわちCLQ処理済み細胞を回収し、溶解した。抽出物を一回カラム精製した。抽出物をMS/MSで分析した。各グラフは誘導済み細胞におけるMS/MSのプロフィールを示す。
【００４２】
【図１７】ヒトABMSC（GBT009）の細胞画分中のガングリオシドGM1（m/z 1544.8）の典型的な較正曲線。
【００４３】
【図１８】ヒトABMSC（GBT009）の細胞画分中のガングリオシドGM1b（m/z 1572.9）の典型的な較正曲線。
【００４４】
【図１９】水を標準として比較した場合の、ヒトABMSC（GBT009）の細胞画分中のガングリオシドGM1（m/z 1544.8）の較正曲線。
【００４５】
【図２０】水を標準として比較した場合の、ヒトABMSC（GBT009）の細胞画分中のガングリオシドGM1b（m/z 1572.9）の較正曲線。
【００４６】
【図２１】ヒトABMSC（GBT009）の細胞のブランク（x100希釈）のGM1s（16個の遷移イオン）のイオンクロマトグラム。
【００４７】
【図２２】ヒトABMSC（GBT009）の細胞のブランク（x100希釈）のGM1（m/z 1544.8）のイオンクロマトグラム。
【００４８】
【図２３】10 ng/mLのヒトABMSC（GBT009）の細胞画分のGM1（m/z 1544.8）が鋭く表れたイオンクロマトグラム。
【００４９】
【図２４】ヒトABMSC（GBT009）の細胞のブランク（x100希釈）のGM1b（m/z 1572.9）のイオンクロマトグラム。
【００５０】
【図２５】5 ng/mLのヒトABMSC（GBT009）の細胞画分のGM1b（m/z 1572.9）が鋭く表れたイオンクロマトグラム。
【００５１】
【図２６】2500 ng/mLのヒトABMSC（GBT009）の細胞画分のGM1（m/z 1544.8）が鋭く表れたイオンクロマトグラム。
【００５２】
【図２７】1250 ng/mLのヒトABMSC（GBT009）の細胞画分のGM1b（m/z 1572.9）が鋭く表れたイオンクロマトグラム。
【００５３】
【図２８】対照（red）及び誘導済み（blue）のABMSCに対するMS総イオンクロマトグラムプロフィール及びUVプロフィールの重ね合わせ。
【００５４】
【図２９】対照（red）及び誘導済み（blue）のABMSCに対するダイオードアレイ検出器の分光データにおける抽出された波長のクロマトグラム。
【００５５】
【図３０】GM1試料BRW675-175、対照SHSYに対する、MRMを行うLC-MS及びUV検出。
【００５６】
【図３１】GM2試料BRW675-175、対照SHSYに対する、MRMを行うLC-MS及びUV検出。
【００５７】
【図３２】GM3試料BRW675-175、対照SHSYに対する、MRMを行うLC-MS及びUV検出。
【００５８】
【図３３】GM1試料BRW675-191、対照SHSYに対する、MRMを行うLC-MS及びUV検出。
【００５９】
【図３４】GM2試料BRW675-191、対照SHSYに対する、MRMを行うLC-MS及びUV検出。
【００６０】
【図３５】GM3試料BRW675-191、対照SHSYに対する、MRMを行うLC-MS及びUV検出。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
［本発明の詳細な説明］
［導入］
本発明は培養細胞からGM1等のガングリオシドを製造する方法を提供する。このため、本発明の方法は細胞培養中のGM1等のガングリオシドの産生を、様々な操作によって、増強し、又は誘導する工程を提供する。本発明に係る方法を以下に示し、さらに詳細に述べる。（ａ）ニューロン誘導培地（「NIM」）で細胞を培養した後、クロロキン（「CLQ」）で処理する；（ｂ）培養細胞をクロロキン単独で、すなわち初めにNIMでの処理を行わずに処理する；（ｃ）培養細胞をノイラミニダーゼで処理する；（ｄ）培養細胞をグルコサミンで処理する；（ｅ）細胞を生化学的に処理する；（ｆ）継代せずに高密度で長期間、細胞を培養することでGM1等のガングリオシドを細胞中に蓄積させる。各方法に適した細胞の種類を以下に述べる。NIM/CLQ又はCLQで処理する前の細胞を単離する方法についても述べる。本実施形態に限定されるものではないが、方法（ａ）及び／又は（ｃ）及び／又は（ｄ）及び／又は（ｅ）及び／又は（ｆ）並びに方法（ｂ）及び／又は（ｃ）及び／又は（ｄ）及び／又は（ｅ）及び／又は（ｆ）を組み合わせることで、培養細胞内でのガングリオシドの産生がさらに促進される。例えば始めにNIM/CLQで培養された細胞を次にノイラミニダーゼありで培養する、又はCLQで処理したがNIMではしていない細胞を次にノイラミニダーゼありで培養する。あるいはNIM及び／又はCLQ及び／又はノイラミニダーゼ等の化学処理の後に、継代せずに高密度で長期間、培養することでGM1等のガングリオシドを化学処理した細胞中に蓄積させる。その他、本願において開示される処理をどのように組み合わせてもよい。
【００６２】
本発明はまた細胞培養物中のGM1等のガングリオシドを定量する方法を提供するものであり、また以下に詳細を述べる。
【００６３】
本発明の一態様において、「ガングリオシド」の用語はあらゆるガングリオシドを包含する。本発明の他の一態様にガングリオシドはGM1である。本発明の他の一態様にガングリオシドはGM2である。本発明の他の一態様にガングリオシドはGM3である。本発明の他の一態様にガングリオシドはGM1aである。本発明の他の一態様にガングリオシドはGM1bである。本発明の他の一態様にガングリオシドはGD3である。本発明の他の一態様にガングリオシドはGT1である。
【００６４】
本発明はさらに本発明の方法により製造されるガングリオシドを提供する。例えば成人骨髄間質由来細胞より産生されるガングリオシドである。かかるガングリオシドは本項で述べられる低密度法により、低酸素で培養され、CLQを用いてガングリオシドの産生を誘導される。
【００６５】
［ニューロン誘導培地で培養後、CLQで処理することで産生されるガングリオシド］
実施形態において細胞をニューロン誘導培地で培養後、クロロキンで処理することでGM1等のガングリオシドを蓄積するように誘導する。この処理の組み合わせを「NIM/CLQ」と略称する。実施形態において、かかる方法に用いるのに適した細胞はそのソース、例えば動物種及びかかる動物の細胞組織のソースによって特定することができる。本発明のNIM/CLQ法で用いられる動物のソースとしてヒト、ヒツジ、ウサギ、マウス、モルモット、ウマ、ブタ、ネコ及びイヌが含まれるが、これらに限定されない。本発明の態様において、本発明のNIM/CLQ法に用いることができるのは、間質細胞、例えば骨髄及び脂肪由来の細胞であり；また繊維芽細胞、例えばGM1ガングリオシド蓄積症のヒトの繊維芽細胞（「GM1繊維芽細胞」）及び真皮線維芽細胞であって、動物ソースから得たものであり、上述の動物ソースを含むがこれに限定されない。本願において骨髄細胞及び骨髄由来細胞の用語は同義として用いられる。実施形態において本発明のNIM/CLQ法では以下に詳述する通り骨髄細胞を動物ソースから単離するための低密度／低酸素培養法によって生成された骨髄由来細胞を用いることができる。
【００６６】
本発明のNIM/CLQ法で用いられる細胞種にはさらに不死化細胞が含まれる。他の細胞種としてはヒトを含む動物ソースから単離された神経芽細胞腫細胞及び神経芽細胞腫細胞株（SHSY-5Y、SHSY-S、及びSK-N-AS）が含まれる。動物ソースには上述の動物ソースが含まれるがこれに限定されない。神経芽細胞腫は、少なくともこれらの細胞の成長速度が高いこと点で有利である。
【００６７】
実施形態において、本発明のNIM/CLQ法で用いられる各細胞は、処理前及び／又は処理中及び／又は処理後において、以下に詳述する低密度／低O2培養法で培養される。
【００６８】
実施形態において、本発明の動物細胞ソースは、GM1ガングリオシド蓄積症、GM2ガングリオシド蓄積症、又はこれら両方に罹っているものとする。これらは全体的なガングリオシドの蓄積に特徴のあるリソソーム蓄積症である。実施形態においてガングリオシド蓄積症に罹っているヒト、ネコ又はイヌ由来の骨髄細胞及び繊維芽細胞を本発明のNIM/CLQ法に用いる。実施形態において線維芽細胞はGM1繊維芽細胞である。また実施形態において不死化細胞を本発明のNIM/CLQ法に用いる。不死化細胞は例えばCHO-K1細胞及びHEK293細胞などのCHO細胞及びヒト胚腎臓細胞である。他の実施形態においてマウス、ヒツジ又はヒト由来の神経芽細胞腫細胞及び神経芽細胞腫細胞株（SHSY-5Y、SHSY-S、及びSK-N-ASが含まれるがこれらに限定されない）を本発明のNIM/CLQ法に用いる。
【００６９】
実施形態において、PC12細胞、HT22細胞、ガングリオシド蓄積症に罹っているヒツジ由来の脳細胞及びガングリオシド蓄積症に罹っているヒツジの繊維芽細胞は本発明のNIM/CLQ法に用いない。
【００７０】
「ニューロン誘導培地」の用語は、細胞を成育するための溶液であって、適切な条件で、ニューロンの表現型の特徴を一以上呈する細胞を産生するものを表す。NIMによって誘導されるニューロンの表現型の程度はいくつかの要因に依存する。要因には開始時の細胞の種類、培地の成分、NIM成分の濃度、及び細胞がNIMと接している時間の長さが含まれるが、これらに限定されない。本発明の実施形態において、培養細胞中のGM1等のガングリオシドの発現は好適なニューロン誘導培地により誘導される。かかる発現の水準は標準培地中の細胞によって発現される水準を超える。
【００７１】
実施形態においてNIMはレチノイン酸、上皮成長因子及び繊維芽細胞成長因子を補ったNeurobasal（商標）の培地、B27で構成される。これらのNIMの成分は例示であり、公知のNIMの成分を追加してもよい。
【００７２】
実施形態において、動物ソースから単離した後、本発明のNIM/CLQ法に用いる細胞は最初に標準培地で培養する。標準培地には、例えば、アルファ-MEM増殖培地に10%ウシ胎児血清（「FBS」）を補ったもの；MEM/F-12に10% FBSを補ったもの；EMEM/F-12に1%非必須アミノ酸（「NEAA」）、2mM L-グルタミン及び15% FBSを補ったもの； DMEMに0.1mM NEAA及び10% FBSを補ったもの；F-12Kに10% FBSを補ったもの；EMEMに10% FBSを補ったもの；Lonza MSC基本培地に増殖補助剤を補ったもの；Lonza ADSC基本培地に増殖補助剤を補ったもの；補助剤入りのLonza繊維芽細胞基本培地；又はEMEMに15% FBSを補ったものがある。培養は2から24時間、好ましくは4から14時間、好ましくは12時間行う。実施形態において、細胞は例えば2,000から20,000細胞/cm2の、好ましくは8,000細胞/cm2の標準的な細胞播種密度、37℃にて、標準的な（5% CO2）大気の条件の下、加湿した恒温器内で増殖させる。標準培地で培養した後、培地をNIMに交換する。細胞をNIMで2時間から24時間、好ましくは6時間から18時間、好ましくは8時間から14時間培養する。次の処理として、NIMによる処理の次に、CLQをフラスコに加えることで、NIM培養された細胞を誘導し、さらにGM1を産生させる。CLQはPC12（ラット副腎皮質腫瘍）細胞内で蓄積を誘導するために用いられる。Yuyama et al., FEBS Lett. 580:6972-6976 (2006)。しかしながら、CLQでは、HT22（マウス海馬）細胞中のGM1の水準は適度に上昇するだけである。Hirata et al., J. Neurochem. 119:839-847 (2011)。実施形態において、細胞はNIM中で培養されるが、５μＭ以上１００μＭ以下のCLQ、２０μＭ以上６０μＭ以下のCLQ、又は４０μＭ以上５０μＭ以下のCLQを培養フラスコに加える。実施形態において５０μＭのCLQを培養フラスコに加える。他の実施形態において、３０μＭのCLQを培養フラスコに加える。他の実施形態において２５μＭのCLQを培養フラスコに加える。CLQを培養細胞に接触させる時間は、4時間から72時間、好ましくは20時間から60時間、好ましくは48時間から60時間である。実施形態においてCLQを細胞に接触させる時間は48時間である。
【００７３】
ヒツジ骨髄細胞など特定の細胞腫においてはNIM/CLQ処理後、結果として細胞死が顕著に起こる。かかる実施形態において、フラスコ中の死細胞を除去し、残った生存細胞を新鮮な増殖培地に再度懸濁する。増殖培地には、例えば、アルファ-MEM増殖培地に10% FBSを補ったもの；MEM/F-12に10% FBSを補ったもの；EMEM/F-12に1%非必須アミノ酸（「NEAA」）、2mM L-グルタミン及び15% FBSを補ったもの； DMEMに0.1mM NEAA及び10% FBSを補ったもの；F-12Kに10% FBSを補ったもの；EMEMに10% FBSを補ったもの；Lonza MSC基本培地に増殖補助剤を補ったもの；Lonza ADSC基本培地に増殖補助剤を補ったもの；補助剤入りのLonza繊維芽細胞基本培地；又はEMEMに15% FBSを補ったものがある。培養は約37℃にて、標準の細胞密度及び5% CO2大気の下、加湿した恒温器内で行う。本発明の実施形態において新鮮な増殖培地に再度懸濁する。かかる増殖培地は例えばアルファ-MEMに10% FBSを補ったもの；MEM/F-12に10% FBSを補ったもの；EMEM/F-12に1%非必須アミノ酸（「NEAA」）、2mM L-グルタミン及び15% FBSを補ったもの； DMEMに0.1mM NEAA及び10% FBSを補ったもの；F-12Kに10% FBSを補ったもの；EMEMに10% FBSを補ったもの；Lonza MSC基本培地に増殖補助剤を補ったもの；Lonza ADSC基本培地に増殖補助剤を補ったもの；補助剤入りのLonza繊維芽細胞基本培地；又はEMEMに15% FBSを補ったものがある。残った生存細胞を再度CLQで処理し、上記の条件下で、さらにガングリオシドの産生を誘導する。必要に応じて浮かんでいる死細胞をフラスコから除去し、残った生存細胞を収集してもよい。他の実施形態において、二番目の処理は行わずに細胞を回収する。本発明の方法ではNIM単独による処理後又はNIM及びCLQ（処理の前後に）の処理後のいずれにおいても細胞培養物中のGM1等のガングリオシドの量を本発明の方法を用いて定量する。実施形態においては本明細書で開示されるような、当該分野で知られる方法でGM1等のガングリオシドを単離する
【００７４】
本発明の実施形態ではさらに、NIM/CLQ処理により全てのガングリオシドの蓄積が増加する。本発明の実施形態において、NIM/CLQ処理によりGM1の蓄積が増加する。本発明の他の実施形態において、NIM/CLQ処理によりGM2の蓄積が増加する。本発明の他の実施形態において、NIM/CLQ処理によりGM3の蓄積が増加する。本発明の他の実施形態において、NIM/CLQ処理によりGD1aの蓄積が増加する。本発明の他の実施形態において、NIM/CLQ処理によりGD1bの蓄積が増加する。本発明の他の実施形態において、NIM/CLQ処理によりGD3の蓄積が増加する。本発明の他の実施形態において、NIM/CLQ処理によりGT1の蓄積が増加する。
【００７５】
他の実施形態において、NIM?CLQ処理により、２以上のガングリオシドの蓄積が増加する。一実施形態ではさらに、NIM/CLQ処理により３以上のガングリオシドの蓄積が増加する。一実施形態ではさらに、NIM/CLQ処理により４以上のガングリオシドの蓄積が増加する。一実施形態ではさらに、NIM/CLQ処理により５以上のガングリオシドの蓄積が増加する。
【００７６】
本発明の一実施形態ではさらに、NIM/CLQ処理により、NIM/CLQにて処理されていない細胞に比べて約10％から約200％、又は約10％から約200％、ガングリオシドの蓄積が増加する。他の実施形態において、NIM/CLQ処理により、NIM/CLQにて処理されていない細胞に比べて15％から125％、又は約15％から約125％、ガングリオシドの蓄積が増加する。他の実施形態において、NIM/CLQ処理により、NIM/CLQにて処理されていない細胞に比べて30％から100％、又は約30％から約100％、ガングリオシドの蓄積が増加する。他の実施形態において、NIM/CLQ処理により、NIM/CLQにて処理されていない細胞に比べて60％から80％、又は約60％から約80％、ガングリオシドの蓄積が増加する。他の実施形態において、NIM/CLQ処理により、NIM/CLQにて処理されていない細胞に比べて15、19、28、63、65、83、104及び119パーセント以上、又は約15、19、28、63、65、83、104及び119パーセント以上、ガングリオシドの蓄積が増加する。他の実施形態において、NIM/CLQ処理により、NIM/CLQにて処理されていない細胞に比べて65％、ガングリオシドの蓄積が増加する。
【００７７】
本発明はさらに本発明の方法で製造されたガングリオシドを提供するものである。
【００７８】
本発明はさらに、本発明のNIM/CLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで治療を必要とする対象に、治療する方法を提供するものである。実施形態では、本発明のNIM/CLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、ニューロンの障害を治療する。実施形態では、本発明のNIM/CLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、パーキンソン病を治療する。実施形態では、本発明のNIM/CLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、アルツハイマー病を治療する。実施形態では、本発明のNIM/CLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、脳卒中に罹ったことのある、又は罹っている対象を治療する。実施形態では、本発明のNIM/CLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、ギランバレー症候群を治療する。実施形態では、本発明のNIM/CLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、癌を治療する。
【００７９】
典型的な実施形態において、GM1等のガングリオシドは正常ヒツジ骨髄由来細胞及びガングリオシド蓄積症罹患ヒツジ骨髄由来細胞中に蓄積される。典型的な実施形態においてヒツジ骨髄由来細胞は以下に述べる低酸素、低密度法で得られる。これらの細胞はまず10%FBSを含有するアルファ-MEM増殖培地にて、8,000細胞/cm2で培養される。約12時間後、培地を３０ｍｌのNIMに交換する。NIMはレチノイン酸、EGF（25マイクログラム／ml）及びFGF（10ナノグラム／ml）を補ったneurobasalの培地、B27で構成される。約10時間後、50マイクロモル濃度となるようにCLQをフラスコに添加する。３日目において約70%の細胞が死滅していることが観察される。PBSですすぐことで、浮遊している細胞を除去する。トリプシン処理で生存している細胞を収集し、新たな増殖培地に再懸濁するとともに、新しいフラスコに8,000細胞／cm2にて播種する。標本をとり、24ウェルプレート上にまいて、CTB-Alexa488等の適切な染色手段で染色することによりGM1等のガングリオシドの誘導を確認する。生存している細胞は2日でフラスコ内に広がるので細胞を回収する。実施形態において、2回目の処理として、回収前に、生存している細胞を50マイクロモル濃度のCLQで24時間処理してもよい。細胞回収後、GM1等のガングリオシドを以下の方法を用いて分離するとともに精製することができる。
［クロロキン処理によるガングリオシド生成］
【００８０】
実施形態ではさらに、ニューロン誘導培地での１回目の培養を行わずともクロロキン処理を用いて細胞内でのGM1等のガングリオシドの蓄積を誘導することができる。かかる方法についても「CLQ処理法」又は「CLQ処理」と呼ぶものもとする。CLQ処理の方法において用いられる細胞に係る動物のソースとしてヒト、ウサギ、マウス、モルモット、ウマ、ブタ、ネコ及びイヌが含まれるが、これらに限定されない。本発明の実施形態において繊維芽細胞及び間質細胞、例えば骨髄及び脂肪由来の細胞；また繊維芽細胞、例えばGM1繊維芽細胞及び真皮線維芽細胞であって動物ソースから得られたもの、上述の動物ソースを含むがこれに限定されない、を本発明のCLQ法に用いることができる。動物ソースから骨髄細胞を分離する場合には下記に述べる方法が典型的である。実施形態において、以下に述べる低密度／低酸素培養方法によって生成された細胞をCLQで処理することでGM1等のガングリオシドを生成する。実施形態においてヒト骨髄細胞は以下に述べる低密度／低酸素培養法により産生され、CLQで処理することでGM1等のガングリオシドの生成を誘導される。
【００８１】
本発明のCLQ処理法の実施形態ではさらに、不死化細胞、例えばCHO-K1細胞及びHEK293細胞などのCHO細胞及びヒト胚腎臓細胞を本発明のCLQ法に用いる。実施形態ではさらに、動物ソースから単離された神経芽細胞腫細胞を本発明のCLQ法に用いる。動物ソースには上述した動物ソースを含み、ヒトを含むがこれらに限定されない。また神経芽細胞腫細胞株（SHSY-5Y、SHSY-S、及びSK-N-ASを含むがこれらに限定されない）を本発明のCLQ法に用いる。実施形態ではさらに、本発明のCLQ法で用いる細胞がガングリオシド蓄積症に罹っている動物に由来する。例えばGM1ガングリオシド蓄積症、GM2ガングリオシド蓄積症又はこれらの両方に罹っているヒト、ネコ又はイヌに由来する。実施形態ではさらに、ガングリオシド蓄積症に罹っているヒト、ネコ又はイヌ由来の骨髄細胞及び繊維芽細胞を本発明のCLQ法に用いる。実施形態において繊維芽細胞はGM1繊維芽細胞でもよい。
【００８２】
実施形態において、本発明のCLQ法で用いられる各細胞種は処理前に及び／又は処理中に及び／又は処理後に、以下に詳細を述べる低密度／低O2培養法で培養される。
【００８３】
実施形態において、PC12細胞、HT22細胞、ガングリオシド蓄積症に罹っているヒツジ由来の脳細胞及びガングリオシド蓄積症に罹っているヒツジの繊維芽細胞は本発明のCLQ法に用いない。
【００８４】
実施形態において好ましいソース由来の細胞を標準増殖培地で培養する。標準増殖培地には、例えば、アルファ-MEMに10%FBSを補ったもの；MEM/F-12に10% FBSを補ったもの；EMEM/F-12に1%非必須アミノ酸（「NEAA」）、2mM L-グルタミン及び15% FBSを補ったもの； DMEMに0.1mM NEAA及び10% FBSを補ったもの；F-12Kに10% FBSを補ったもの；EMEMに10% FBSを補ったもの；Lonza MSC基本培地に増殖補助剤を補ったもの；Lonza ADSC基本培地に増殖補助剤を補ったもの；補助剤入りのLonza繊維芽細胞基本培地；又はEMEMに15% FBSを補ったものがある。細胞は例えば2,000から20,000細胞/cm2の、好ましくは8,000細胞/cm2の標準的な細胞播種密度、37℃、5% CO2大気の条件の下、培養する。実施形態において、細胞は2から48時間、好ましくは8から36時間、好ましくは24時間行う。培養後、培養培地を、血清を補った標準培地に交換することも選択できる。実施形態においてかかる標準培地中の血清量はその前の培養培地中の血清量よりも少ない。CLQを培養培地に加える。実施形態において5から100マイクロモル濃度のCLQ、25から75マイクロモル濃度のCLQ、又は40から50マイクロモル濃度のCLQを培養フラスコに添加する。実施形態において、50マイクロモル濃度のCLQを培養フラスコに添加する。他の実施形態において、30マイクロモル濃度のCLQを培養フラスコに添加する。25マイクロモル濃度のCLQを培養フラスコに添加する。
CLQは2から72時間、好ましくは20から60時間、好ましくは30から50時間、培養細胞と接触させる。実施形態において、細胞は48時間、CLQとともに温度を保ち、回収する。また実施形態では、細胞培養中のGM1等のガングリオシドの量を本発明の方法により定量してもよい。GM1等のガングリオシドを細胞培養物から分離するとともに精製するには以下に述べるような通常の方法を用いてもよい。
【００８５】
典型的な実施形態において、アルファ-MEM増殖培地（10%FBS添加）で培養されたヒト骨髄由来細胞を8,000細胞/cm2の密度で播種する。約24時間後、培地を血清を減らしたアルファ-MEM（1%FBS添加）に置換するとともに50マイクロモル濃度のCLQを添加する。細胞を48時間恒温を保ってから回収する。
【００８６】
また実施形態では、CLQ処理により全てのガングリオシドの蓄積が増加する。本発明の一実施形態において、CLQ処理によりGM1の蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明のCLQ処理によりGM2の蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明のCLQ処理によりGM3の蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明のCLQ処理によりGD1aの蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明のCLQ処理によりGD1bの蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明のCLQ処理によりGD3の蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明のCLQ処理によりGT1の蓄積が増加する。
【００８７】
他の実施形態において、CLQ処理により２以上のガングリオシドの蓄積が増加する。一実施形態ではさらに、CLQ処理により３以上のガングリオシドの蓄積が増加する。一実施形態ではさらに、CLQ処理により４以上のガングリオシドの蓄積が増加する。一実施形態ではさらに、CLQ処理により５以上のガングリオシドの蓄積が増加する。
【００８８】
本発明の他の実施形態において、クロロキン処理されていない細胞に比べ、CLQ処理された細胞ではガングリオシドの蓄積が10から200パーセント又は約10から約200パーセント増加する。本発明の他の実施形態において、クロロキン処理されていない細胞に比べ、CLQ処理された細胞ではガングリオシドの蓄積が15から125パーセント又は約15から約125パーセント増加する。本発明の他の実施形態において、クロロキン処理されていない細胞に比べ、CLQ処理された細胞ではガングリオシドの蓄積が30から100パーセント又は約30から約100パーセント増加する。本発明の他の実施形態において、クロロキン処理されていない細胞に比べ、CLQ処理された細胞ではガングリオシドの蓄積が60から80パーセント又は約60から約80パーセント増加する。本発明の他の実施形態において、CLQ処理された細胞では、クロロキン処理されていない細胞に比べて、ガングリオシドの蓄積が15、19、28、63、65、83、104及び119パーセント、又は約15、19、28、63、65、83、104及び119パーセント増加する。本発明の他の実施形態において、CLQ処理された細胞では、クロロキン処理されていない細胞に比べて、ガングリオシドの蓄積が65パーセント増加する。
【００８９】
本発明はさらに本発明のCLQ処理法によって製造されるガングリオシドを提供する。
【００９０】
本発明はさらに疾病又は疾患を治療する方法を提供するものであり、治療を必要とする場合には本発明のCLQ処理法により製造されたGM1等のガングリオシドを投与する。実施形態において、本発明のCLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、ニューロンの障害を治療する。実施形態では、本発明のCLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、パーキンソン病を治療する。実施形態では、本発明のCLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、アルツハイマー病を治療する。実施形態では、本発明のCLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、脳卒中に罹ったことのある、又は罹っている対象を治療する。実施形態では、本発明のCLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、ギランバレー症候群を治療する。実施形態では、本発明のCLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、癌を治療する。
【００９１】
［ノイラミニダーゼ処理によるガングリオシドの生成］
他の実施形態において、ノイラミニダーゼを単独で、又はCLQとともに用いることで、細胞に対してGM1等のガングリオシドを過剰に産生させる。ここで、ノイラミニダーゼ及びクロロキンによる処理の組み合わせをノイラミニダーゼ／CLQと呼ぶものとする。ノイラミニダーゼはシアリダーゼ酵素であり、未処理の細胞中においてGD1a、GD1b及びGT1b等の、主要な脳の複合ガングリオシドをGM1に変換する。実施形態において、ノイラミニダーゼ処理法で用いられる細胞のソースにはヒト、ヒツジ、ウサギ、マウス、モルモット、ウマ、ブタ、ネコ及びイヌが含まれるが、これらに限定されない。本発明の実施形態において、細胞が分離される動物ソースには、上記動物ソースが含まれるがこれに限定されない。動物細胞から分離される細胞として、間質細胞、例えば骨髄及び脂肪由来の細胞；また繊維芽細胞、例えばGM1繊維芽細胞及び真皮線維芽細胞を、本発明のノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法に用いることができる。本発明の他の実施形態において、これらの各動物ソースから分離された骨髄細胞を本発明のノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法に用いることができる。動物ソースから骨髄細胞を分離する場合には下記に述べる方法が典型的である。実施形態において、後述する低密度／低酸素培養法で生成された細胞をノイラミニダーゼ及びノイラミニダーゼ／CLQで処理することで、GM1等のガングリオシドの産生を誘導する。実施形態において、後述する低密度／低酸素培養法で生成されたヒト骨髄細胞をノイラミニダーゼ及びノイラミニダーゼ／CLQで処理することで、GM1等のガングリオシドの産生を誘導する。
【００９２】
他の実施形態において、不死化細胞、例えば不死化細胞は例えばCHO-K1細胞及びHEK293細胞などのCHO細胞及びヒト胚腎臓細胞を本発明のノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法に用いる。さらに他の実施形態において、動物ソースから分離された神経芽細胞腫細胞を本発明のノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法に用いる。動物ソースにはヒトを含む上記動物ソースが含まれるが、これに限定されない。また神経芽細胞腫細胞株（SHSY-5Y、SHSY-S、及びSK-N-ASが含まれるがこれらに限定されない）をこれらの方法に用いる。さらに他の実施形態において、本発明のノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法で用いる細胞はガングリオシド蓄積症に罹っている動物に由来する。例えばGM1ガングリオシド蓄積症、GM2ガングリオシド蓄積症又はこれらの両方に罹っているヒト、ネコ又はイヌに由来する。さらに他の実施形態において、ガングリオシド蓄積症に罹っているヒト、ネコ又はイヌ由来の骨髄細胞及び繊維芽細胞を本発明のノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法で用いる。実施形態において繊維芽細胞はGM1繊維芽細胞でもよい。
【００９３】
実施形態において、本発明のノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法で用いられる各細胞種は処理前に及び／又は処理中に及び／又は処理後に、後に詳細を述べる低密度／低O2培養法で培養される。
【００９４】
実施形態において、PC12細胞、HT22細胞、ガングリオシド蓄積症に罹っているヒツジ由来の脳細胞及びガングリオシド蓄積症に罹っているヒツジ由来の繊維芽細胞は本発明のノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法に用いない。
【００９５】
実施形態において好ましいソース由来の細胞を標準増殖培地で培養する。標準増殖培地には、例えば、標準播種密度の下でアルファ-MEMに10%FBS等の血清を補い、さらに1から4 mMのグルタミンを補ったもの；MEM/F-12に10% FBSを補ったもの；EMEM/F-12に1%非必須アミノ酸（「NEAA」）、2mM L-グルタミン及び15% FBSを補ったもの； DMEMに0.1mM NEAA及び10% FBSを補ったもの；F-12Kに10% FBSを補ったもの；EMEMに10% FBSを補ったもの；Lonza MSC基本培地に増殖補助剤を補ったもの；Lonza ADSC基本培地に増殖補助剤を補ったもの；補助剤入りのLonza繊維芽細胞基本培地；又はEMEMに15% FBSを補ったものがある。細胞は例えば2,000から20,000細胞/cm2の、好ましくは8,000細胞/cm2で、37℃にて、加湿した恒温器中で、標準（5% CO2）大気の条件の下、培養する。ノイラミニダーゼを培養培地に添加し、細胞を１から５時間、好ましくは２から４時間、好ましくは３時間ノイラミニダーゼで処理する。実施形態において、１units/mlから５units/mlの間でノイラミニダーゼを培養培地に加える。好ましくは１units/mlである。他の実施形態において、細胞培養物中のGM1等のガングリオシドの量は本発明の方法を用いて定量する。GM1等のガングリオシドを細胞培養物から分離するとともに精製するには後述する通常の方法を用いてもよい。
【００９６】
本発明の他の実施形態において、ノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法により全てのガングリオシドの蓄積が増加する。本発明の一実施形態において、ノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法によりGM1の蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明のノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法によりGM2の蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明のノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法によりGM3の蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明のノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法によりGD1aの蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明のノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法によりGD1bの蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明のノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法によりGD3の蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明のノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法によりGT1の蓄積が増加する。
【００９７】
他の実施形態において、ノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法により２以上のガングリオシドの蓄積が増加する。一実施形態ではさらに、ノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法により３以上のガングリオシドの蓄積が増加する。一実施形態ではさらに、ノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法により４以上のガングリオシドの蓄積が増加する。一実施形態ではさらに、ノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法により５以上のガングリオシドの蓄積が増加する。
【００９８】
本発明の他の実施形態において、ノイラミニダーゼ及びノイラミニダーゼ／CLQで処理されていない細胞に比べ、ノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法で処理された細胞では、ガングリオシドの蓄積が10から200パーセント又は約10から約200パーセント増加する。本発明の他の実施形態において、ノイラミニダーゼ及びノイラミニダーゼ／CLQで処理されていない細胞に比べ、ノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法で処理された細胞ではガングリオシドの蓄積が15から125パーセント又は約15から約125パーセント増加する。本発明の他の実施形態において、ノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法で処理された細胞では、ノイラミニダーゼ及びノイラミニダーゼ／CLQで処理されていない細胞に比べて、ガングリオシドの蓄積が15、19、28、63、65、83、104及び119パーセント、又は約15、19、28、63、65、83、104及び119パーセント増加する。本発明の他の実施形態において、ノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法で処理された細胞では、ノイラミニダーゼ及びノイラミニダーゼ／CLQで処理されていない細胞に比べて、ガングリオシドの蓄積が65パーセント増加する。
【００９９】
本発明はさらに本発明のノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法によって製造されるガングリオシドを提供する。
【０１００】
本発明はさらに疾病又は疾患を治療する方法を提供するものであり、治療を必要とする場合には本発明のノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法により製造されたGM1等のガングリオシドを投与する。実施形態において、本発明のノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、ニューロンの障害を治療する。実施形態では、本発明のノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、パーキンソン病を治療する。実施形態では、本発明のノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、アルツハイマー病を治療する。実施形態では、本発明のノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、脳卒中に罹ったことのある、又は罹っている対象を治療する。実施形態では、本発明のノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、ギランバレー症候群を治療する。実施形態では、本発明のノイラミニダーゼ法及びノイラミニダーゼ／CLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、癌を治療する。
【０１０１】
［グルコサミン処理によるガングリオシドの生成］
他の実施形態において、グルコサミンを単独で、又はCLQとともに用いることで、細胞に対してGM1等のガングリオシドを過剰に産生させる。ここで、グルコサミン処理にクロロキンを組み合わせた処理を「グルコサミン／CLQ」と呼ぶものとする。Masson et al. Biochem. J. 388:537-544 (2005)に開示される通り、所定の条件下で、グルコサミン処理により例えばGM1及びGM2などのガングリオシドの水準が高まる。ここにMasson et al. Biochem. J. 388:537-544 (2005)を引用し、そのすべてを取り込む。実施形態において、グルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法で用いられる細胞のソースにはヒト、ヒツジ、ウサギ、マウス、モルモット、ウマ、ブタ、ネコ及びイヌが含まれるが、これらに限定されない。本発明の実施形態において、動物ソース由来の繊維芽細胞及び間質細胞を本発明のグルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法に用いることができる。動物ソースには、上記動物ソースが含まれるがこれに限定されない。繊維芽細胞及び間質細胞は、例えば骨髄及び脂肪由来の細胞；また繊維芽細胞、例えばGM1繊維芽細胞及び真皮線維芽細胞である。動物ソースから骨髄細胞を分離する場合には下記に述べる方法が典型的である。実施形態において、後述する低密度／低酸素培養法で生成された細胞をグルコサミン及びグルコサミン／CLQで処理することで、GM1等のガングリオシドの産生を誘導する。実施形態において、後述する低密度／低酸素培養法で生成されたヒト骨髄細胞をグルコサミン及びグルコサミン／CLQで処理することで、GM1等のガングリオシドの産生を誘導する。
【０１０２】
他の実施形態において、不死化細胞、例えば不死化細胞は例えばCHO-K1細胞及びHEK293細胞などのCHO細胞及びヒト胚腎臓細胞を本発明のグルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法に用いる。さらに他の実施形態において、動物ソースから分離された神経芽細胞腫細胞を本発明のグルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法に用いる。動物ソースにはヒトを含む上記動物ソースが含まれるが、これに限定されない。また神経芽細胞腫細胞株（SHSY-5Y、SHSY-S、及びSK-N-ASが含まれるがこれらに限定されない）をこれらの方法に用いる。さらに他の実施形態において、本発明のグルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法で用いる細胞はガングリオシド蓄積症に罹っている動物に由来する。例えばGM1ガングリオシド蓄積症、GM2ガングリオシド蓄積症又はこれらの両方に罹っているヒト、ネコ又はイヌに由来する。さらに他の実施形態において、ガングリオシド蓄積症に罹っているヒト、ネコ又はイヌ由来の骨髄細胞及び繊維芽細胞を本発明のグルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法で用いる。実施形態において繊維芽細胞はGM1繊維芽細胞でもよい。
【０１０３】
実施形態において、本発明のグルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法で用いられる各細胞種は処理前に及び／又は処理中に及び／又は処理後に、後に詳細を述べる低密度／低O2培養法で培養される。
【０１０４】
実施形態において、PC12細胞、HT22細胞、ガングリオシド蓄積症に罹っているヒツジ由来の脳細胞及びガングリオシド蓄積症に罹っているヒツジ由来の繊維芽細胞は本発明のグルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法に用いない。
【０１０５】
実施形態において好ましいソース由来の細胞を標準増殖培地で培養する。標準増殖培地には、例えば、標準播種密度の下でアルファ-MEMに10%FBS等の血清を補い、さらに1から4 mMのグルタミンを補ったもの；MEM/F-12に10% FBSを補ったもの；EMEM/F-12に1%非必須アミノ酸（「NEAA」）、2mM L-グルタミン及び15% FBSを補ったもの； DMEMに0.1mM NEAA及び10% FBSを補ったもの；F-12Kに10% FBSを補ったもの；EMEMに10% FBSを補ったもの；Lonza MSC基本培地に増殖補助剤を補ったもの；Lonza ADSC基本培地に増殖補助剤を補ったもの；補助剤入りのLonza繊維芽細胞基本培地；又はEMEMに15% FBSを補ったものがある。細胞は例えば2,000から20,000細胞/cm2の、好ましくは8,000細胞/cm2で、37℃にて、加湿した恒温器中で、標準（5% CO2）大気の条件の下、培養する。グルコサミンを培養培地に添加し、Masson et al. Biochem. J. 388:537-544 (2005)に開示される通り培養する。他の実施形態において、細胞培養物中のGM1等のガングリオシドの量は本発明の方法を用いて定量する。GM1等のガングリオシドを細胞培養物から分離するとともに精製するには後述する通常の方法を用いてもよい。
【０１０６】
本発明の他の実施形態において、グルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法により全てのガングリオシドの蓄積が増加する。本発明の一実施形態において、グルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法によりGM1の蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明のグルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法によりGM2の蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明のグルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法によりGM3の蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明のグルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法によりGD1aの蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明のグルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法によりGD1bの蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明のグルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法によりGD3の蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明のグルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法によりGT1の蓄積が増加する。
【０１０７】
他の実施形態において、グルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法により２以上のガングリオシドの蓄積が増加する。一実施形態ではさらに、グルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法により３以上のガングリオシドの蓄積が増加する。一実施形態ではさらに、グルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法により４以上のガングリオシドの蓄積が増加する。一実施形態ではさらに、グルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法により５以上のガングリオシドの蓄積が増加する。
【０１０８】
本発明の他の実施形態において、グルコサミン及びグルコサミン／CLQで処理されていない細胞に比べ、グルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法で処理された細胞では、ガングリオシドの蓄積が10から200パーセント又は約10から約200パーセント増加する。本発明の他の実施形態において、グルコサミン及びグルコサミン／CLQで処理されていない細胞に比べ、グルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法で処理された細胞ではガングリオシドの蓄積が15から125パーセント又は約15から約125パーセント増加する。本発明の他の実施形態において、グルコサミン及びグルコサミン／CLQで処理されていない細胞に比べ、グルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法で処理された細胞ではガングリオシドの蓄積が30から100パーセント又は約30から約100パーセント増加する。本発明の他の実施形態において、グルコサミン及びグルコサミン／CLQで処理されていない細胞に比べ、グルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法で処理された細胞ではガングリオシドの蓄積が60から80パーセント又は約60から約80パーセント増加する。本発明の他の実施形態において、グルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法で処理された細胞では、グルコサミン及びグルコサミン／CLQで処理されていない細胞に比べて、ガングリオシドの蓄積が15、19、28、63、65、83、104及び119パーセント、又は約15、19、28、63、65、83、104及び119パーセント増加する。本発明の他の実施形態において、グルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法で処理された細胞では、グルコサミン及びグルコサミン／CLQで処理されていない細胞に比べて、ガングリオシドの蓄積が65パーセント増加する。
【０１０９】
本発明はさらに本発明のグルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法によって製造されるガングリオシドを提供する。
【０１１０】
本発明はさらに疾病又は疾患を治療する方法を提供するものであり、治療を必要とする場合には本発明のグルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法により製造されたGM1等のガングリオシドを投与する。実施形態において、本発明のグルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、ニューロンの障害を治療する。実施形態では、本発明のグルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、パーキンソン病を治療する。実施形態では、本発明のグルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、アルツハイマー病を治療する。実施形態では、本発明のグルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、脳卒中に罹ったことのある、又は罹っている対象を治療する。実施形態では、本発明のグルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、ギランバレー症候群を治療する。実施形態では、本発明のグルコサミン法及びグルコサミン／CLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、癌を治療する。
【０１１１】
［生化学的操作によるガングリオシドの生成］
他の実施形態において、生化学的操作単独で、又はCLQと組み合わせることで、細胞に対してGM1等のガングリオシドを過剰に産生させる。ここで、生化学的操作にクロロキンを組み合わせた処理を「生化学的操作／CLQ」と呼ぶものとする。所定の条件下で、所定の酵素の水準の変化によりガングリオシドの水準が高まり、疾病を生ずる。GM1ガングリオシド蓄積症はリソソームβガラクトシダーゼ酵素の欠陥により生じるGM1の水準の上昇に起因する。リソソームβガラクトシダーゼ酵素はGM1ガングリオシド、糖タンパク質及びグリコサミノグリカンの末端のβガラクトシル残基を加水分解する。Christie, "Ganglioside," The AOCS Lipid Library, last updated July 23, 2012参照。さらにGM2ガングリオシド蓄積症は特定の酵素の活性が不十分なことで起きる。特定の酵素とはＮアセチルヘキソサミニダーゼであり、ガングリオシドの分解を触媒する。Id。さらに、ガングリオシドを他のガングリオシドに変換する酵素が多く知られている。このため、これらの酵素の発現及び／又は活性を変えることで特定のガングリオシドの生成を増やすことができる。本発明の方法にはノックダウン等のノックダウン法、一時的なもの又は安定的なもの等のトランスフェクション法、低分子又は生物製剤等の化学阻害、及び抗体を用いることができる。生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法で用いられる細胞のソースにはヒト、ヒツジ、ウサギ、マウス、モルモット、ウマ、ブタ、ネコ及びイヌが含まれるが、これらに限定されない。本発明の実施形態において、動物ソース由来の繊維芽細胞及び間質細胞を本発明の生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法に用いることができる。動物ソースには、上記動物ソースが含まれるがこれに限定されない。繊維芽細胞及び間質細胞は、例えば骨髄及び脂肪由来の細胞；また繊維芽細胞、例えばGM1繊維芽細胞及び真皮線維芽細胞である。動物ソースから骨髄細胞を分離する場合には下記に述べる方法が典型的である。実施形態において、後述する低密度／低酸素培養法で生成された細胞を生化学的操作及び生化学的操作／CLQで処理することで、GM1等のガングリオシドの産生を誘導する。実施形態において、後述する低密度／低酸素培養法で生成されたヒト骨髄細胞を生化学的操作及び生化学的操作／CLQで処理することで、GM1等のガングリオシドの産生を誘導する。
【０１１２】
他の実施形態において、不死化細胞、例えば不死化細胞は例えばCHO-K1細胞及びHEK293細胞などのCHO細胞及びヒト胚腎臓細胞を本発明の生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法に用いる。さらに他の実施形態において、動物ソースから分離された神経芽細胞腫細胞を本発明の生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法に用いる。動物ソースにはヒトを含む上記動物ソースが含まれるが、これに限定されない。また神経芽細胞腫細胞株（SHSY-5Y、SHSY-S、及びSK-N-ASが含まれるがこれらに限定されない）をこれらの方法に用いる。さらに他の実施形態において、本発明の生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法で用いる細胞はガングリオシド蓄積症に罹っている動物に由来する。例えばGM1ガングリオシド蓄積症、GM2ガングリオシド蓄積症又はこれらの両方に罹っているヒト、ネコ又はイヌに由来する。さらに他の実施形態において、ガングリオシド蓄積症に罹っているヒト、ネコ又はイヌ由来の骨髄細胞及び繊維芽細胞を本発明の生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法で用いる。実施形態において繊維芽細胞はGM1繊維芽細胞でもよい。
【０１１３】
実施形態において、本発明の生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法で用いられる各細胞種は処理前に及び／又は処理中に及び／又は処理後に、後に詳細を述べる低密度／低O2培養法で培養される。
【０１１４】
実施形態において、PC12細胞、HT22細胞、ガングリオシド蓄積症に罹っているヒツジ由来の脳細胞及びガングリオシド蓄積症に罹っているヒツジ由来の繊維芽細胞は本発明の生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法に用いない。
【０１１５】
実施形態において好ましいソース由来の細胞を標準増殖培地で培養する。標準増殖培地には、例えば、標準播種密度の下でアルファ-MEMに10%FBS等の血清を補い、さらに1から4 mMのグルタミンを補ったもの；MEM/F-12に10% FBSを補ったもの；EMEM/F-12に1%非必須アミノ酸（「NEAA」）、2mM L-グルタミン及び15% FBSを補ったもの； DMEMに0.1mM NEAA及び10% FBSを補ったもの；F-12Kに10% FBSを補ったもの；EMEMに10% FBSを補ったもの；Lonza MSC基本培地に増殖補助剤を補ったもの；Lonza ADSC基本培地に増殖補助剤を補ったもの；補助剤入りのLonza繊維芽細胞基本培地；又はEMEMに15% FBSを補ったものがある。細胞は例えば2,000から20,000細胞/cm2の、好ましくは8,000細胞/cm2で、37℃にて、加湿した恒温器中で、標準（5% CO2）大気の条件の下、培養する。他の実施形態において、細胞培養物中のGM1等のガングリオシドの量は本発明の方法を用いて定量する。GM1等のガングリオシドを細胞培養物から分離するとともに精製するには後述する通常の方法を用いてもよい。
【０１１６】
本発明の他の実施形態において、生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法により全てのガングリオシドの蓄積が増加する。本発明の一実施形態において、生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法によりGM1の蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明の生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法によりGM2の蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明の生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法によりGM3の蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明の生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法によりGD1aの蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明の生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法によりGD1bの蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明の生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法によりGD3の蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明の生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法によりGT1の蓄積が増加する。
【０１１７】
他の実施形態において、生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法により２以上のガングリオシドの蓄積が増加する。一実施形態ではさらに、生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法により３以上のガングリオシドの蓄積が増加する。一実施形態ではさらに、生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法により４以上のガングリオシドの蓄積が増加する。一実施形態ではさらに、生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法により５以上のガングリオシドの蓄積が増加する。
【０１１８】
本発明の他の実施形態において、生化学的操作及び生化学的操作／CLQで処理されていない細胞に比べ、生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法で処理された細胞では、ガングリオシドの蓄積が10から200パーセント又は約10から約200パーセント増加する。本発明の他の実施形態において、生化学的操作及び生化学的操作／CLQで処理されていない細胞に比べ、生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法で処理された細胞ではガングリオシドの蓄積が15から125パーセント又は約15から約125パーセント増加する。本発明の他の実施形態において、生化学的操作及び生化学的操作／CLQで処理されていない細胞に比べ、生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法で処理された細胞ではガングリオシドの蓄積が30から100パーセント又は約30から約100パーセント増加する。本発明の他の実施形態において、生化学的操作及び生化学的操作／CLQで処理されていない細胞に比べ、生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法で処理された細胞ではガングリオシドの蓄積が60から80パーセント又は約60から約80パーセント増加する。本発明の他の実施形態において、生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法で処理された細胞では、生化学的操作及び生化学的操作／CLQで処理されていない細胞に比べて、ガングリオシドの蓄積が15、19、28、63、65、83、104及び119パーセント、又は約15、19、28、63、65、83、104及び119パーセント増加する。本発明の他の実施形態において、生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法で処理された細胞では、生化学的操作及び生化学的操作／CLQで処理されていない細胞に比べて、ガングリオシドの蓄積が65パーセント増加する。
【０１１９】
本発明はさらに本発明の生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法によって製造されるガングリオシドを提供する。
【０１２０】
本発明はさらに疾病又は疾患を治療する方法を提供するものであり、治療を必要とする場合には本発明の生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法により製造されたGM1等のガングリオシドを投与する。実施形態において、本発明の生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、ニューロンの障害を治療する。実施形態では、本発明の生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、パーキンソン病を治療する。実施形態では、本発明の生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、アルツハイマー病を治療する。実施形態では、本発明の生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、脳卒中に罹ったことのある、又は罹っている対象を治療する。実施形態では、本発明の生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、ギランバレー症候群を治療する。実施形態では、本発明の生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、癌を治療する。
【０１２１】
［化学的処理を伴わず、かつ継代を伴わない長期細胞培養］
本発明はさらにGM1等のガングリオシドを生成する方法を提供するものであり、継代せずに、かつニューロン誘導培地、クロロキン、又はノイラミニダーゼの処理をせずに細胞を培養することで行う。細胞を高密度で培養することで、意外なことに細胞が長期間にわたって生存するとともに、有意な量のGM1等のガングリオシドが蓄積した。高密度とは、例えば播種時にコンフルエントな状態の60-90%とする、又は好ましくは播種時にコンフルエントな状態の70-80%とすることである。他の実施形態において本発明の高密度、長期間の培養法を上述の化学的処理法又は生化学的物質と組み合わせる。例えば、NIM/CLQで培養された細胞を、高密度−長期間培養に供し、継代しないようにする。またはCLQ及び／又はノイラミニダーゼ及び／又はグルコサミンで処理した細胞を高密度−長期間培養に供し、継代しないようにした上でNIM/CLQ、CLQ、ノイラミニダーゼ及び／又はグルコサミンで処理する。
【０１２２】
本発明の高密度、長期間培養法に用いる細胞のソースにはヒト、ヒツジ、ウサギ、マウス、モルモット、ウマ、ブタ、ネコ及びイヌが含まれるが、これらに限定されない。本発明の実施形態において、動物ソース由来の繊維芽細胞及び間質細胞を本発明の高密度、長期間培養法に用いることができる。動物ソースには、上記動物ソースが含まれるがこれに限定されない。繊維芽細胞及び間質細胞は、例えば骨髄及び脂肪由来の細胞；また繊維芽細胞、例えばGM1繊維芽細胞及び真皮線維芽細胞である。動物ソースから骨髄細胞を分離する場合には下記に述べる方法が典型的である。実施形態において、後述する低密度／低酸素培養法で生成された細胞を高密度、長期間培養法に用いることで、GM1等のガングリオシドの産生を誘導する。
【０１２３】
他の実施形態において、動物ソースから分離された神経芽細胞腫細胞を本発明の高密度、長期間培養法に用いる。動物ソースにはヒトを含む上記動物ソースが含まれるが、これに限定されない。また神経芽細胞腫細胞株（SHSY-5Y、SHSY-S、及びSK-N-ASが含まれるがこれらに限定されない）をかかる方法に用いる。
【０１２４】
他の実施形態において、不死化細胞、例えば不死化細胞は例えばCHO-K1細胞及びHEK293細胞などのCHO細胞及びヒト胚腎臓細胞を本発明の生化学的操作法及び生化学的操作／CLQ法に用いる。さらに他の実施形態において、動物ソースから分離された神経芽細胞腫細胞を本発明の高密度、長期間培養法に用いる。動物ソースにはヒトを含む上記動物ソースが含まれるが、これに限定されない。また神経芽細胞腫細胞株（SHSY-5Y、SHSY-S、及びSK-N-ASが含まれるがこれらに限定されない）をかかる方法に用いる。さらに他の実施形態において、本発明の高密度、長期間培養法で用いる細胞はガングリオシド蓄積症に罹っている動物に由来する。例えばGM1ガングリオシド蓄積症、GM2ガングリオシド蓄積症又はこれらの両方に罹っているヒト、ネコ又はイヌに由来する。さらに他の実施形態において、ガングリオシド蓄積症に罹っているヒト、ネコ又はイヌ由来の骨髄細胞及び繊維芽細胞を本発明の高密度、長期間培養法で用いる。実施形態において繊維芽細胞はGM1繊維芽細胞でもよい。
【０１２５】
実施形態において、本発明の高密度、長期間培養法で用いられる各細胞種は高密度、長期間培養法における培養前に及び／又は培養中に及び／又は培養後に、後に詳細を述べる低密度／低O2培養法で培養される。
【０１２６】
実施形態において、PC12細胞、HT22細胞、ガングリオシド蓄積症に罹っているヒツジ由来の脳細胞及びガングリオシド蓄積症に罹っているヒツジ由来の繊維芽細胞は本発明の高密度、長期間培養法に用いない。
【０１２７】
かかる方法において、細胞を維持することでGM1等のガングリオシドを蓄積する。また細胞の生存性を維持する必要に応じて培養培地を交換する、又は培養培地を追加する。実施形態において細胞を標準増殖培地で培養する。標準増殖培地には、例えば、アルファ-MEMに10%FBSを補ったもの、MEM/F-12に10% FBSを補ったもの；EMEM/F-12に1%非必須アミノ酸（「NEAA」）、2mM L-グルタミン及び15% FBSを補ったもの；DMEMに0.1mM NEAA及び10% FBSを補ったもの；F-12Kに10% FBSを補ったもの；EMEMに10% FBSを補ったもの；Lonza MSC基本培地に増殖補助剤を補ったもの；Lonza ADSC基本培地に増殖補助剤を補ったもの；補助剤入りのLonza繊維芽細胞基本培地；又はEMEMに15% FBSを補ったものがある。細胞は４日から４週間、６日から２週間、又は９日から１２日間、約３７℃にて、加湿した恒温器中で、5% CO2大気の下培養する。典型的な実施形態において、培地は３日おきに交換することで細胞の生存性を維持する。
【０１２８】
本発明の本実施形態において好ましい細胞には骨髄及び脳由来の細胞が含まれる。好ましい骨髄及び脳由来の細胞にはヒツジ及びヒトから、後述する低密度／低酸素条件を用いて単離した細胞が含まれる。細胞はガングリオシド蓄積症に罹患したヒツジ及びヒトに由来することが好ましい。本実施形態で用いる他の細胞種には不死化細胞、間質細胞及び繊維芽細胞が含まれる。さらに細胞種には神経芽細胞腫が含まれ、例えば初代細胞でも細胞株でもよい。細胞株にはSHSY-5Y、SHSY-S、及びSK-N-ASが含まれるがこれらに限定されない。実施形態において高密度、長期間培養法の後に細胞を回収し、GM1等のガングリオシドを細胞から分離するとともに精製する。実施形態において、細胞中のGM1等のガングリオシドの量は本発明の方法を用いて定量する。
【０１２９】
本発明の他の実施形態において、高密度、長期間培養法により全てのガングリオシドの蓄積が増加する。本発明の一実施形態において、高密度、長期間培養法によりGM1の蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明の高密度、長期間培養法によりGM2の蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明の高密度、長期間培養法によりGM3の蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明の高密度、長期間培養法によりGD1aの蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明の高密度、長期間培養法によりGD1bの蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明の高密度、長期間培養法によりGD3の蓄積が増加する。また本発明の他の実施形態において、本発明の高密度、長期間培養法によりGT1の蓄積が増加する。
【０１３０】
他の実施形態において、本発明の高密度、長期間培養法により２以上のガングリオシドの蓄積が増加する。一実施形態ではさらに、本発明の高密度、長期間培養法により３以上のガングリオシドの蓄積が増加する。一実施形態ではさらに、本発明の高密度、長期間培養法により４以上のガングリオシドの蓄積が増加する。一実施形態ではさらに、本発明の高密度、長期間培養法により５以上のガングリオシドの蓄積が増加する。
【０１３１】
本発明の他の実施形態において、高密度、長期間培養条件下で培養されていない細胞に比べ、高密度、長期間培養法で処理された細胞では、ガングリオシドの蓄積が10から200パーセント又は約10から約200パーセント増加する。本発明の他の実施形態において、高密度、長期間培養条件下で培養されていない細胞に比べ、高密度、長期間培養法で処理された細胞ではガングリオシドの蓄積が15から125パーセント又は約15から約125パーセント増加する。本発明の他の実施形態において、高密度、長期間培養条件下で培養されていない細胞に比べ、高密度、長期間培養法で処理された細胞ではガングリオシドの蓄積が30から100パーセント又は約30から約100パーセント増加する。本発明の他の実施形態において、高密度、長期間培養条件下で培養されていない細胞に比べ、高密度、長期間培養法で処理された細胞ではガングリオシドの蓄積が60から80パーセント又は約60から約80パーセント増加する。本発明の他の実施形態において、高密度、長期間培養法で処理された細胞では、高密度、長期間培養条件下で培養されていない細胞に比べて、ガングリオシドの蓄積が15、19、28、63、65、83、104及び119パーセント、又は約15、19、28、63、65、83、104及び119パーセント増加する。本発明の他の実施形態において、高密度、長期間培養法で処理された細胞では、高密度、長期間培養条件下で培養されていない細胞に比べて、ガングリオシドの蓄積が65パーセント増加する。
【０１３２】
本発明はさらに本発明の高密度、長期間培養法によって製造されるガングリオシドを提供する。
【０１３３】
本発明はさらに疾病又は疾患を治療する方法を提供するものであり、治療を必要とする場合には本発明の高密度、長期間培養法により製造されたGM1等のガングリオシドを投与する。実施形態において、本発明の高密度、長期間培養法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、ニューロンの障害を治療する。実施形態では、本発明の高密度、長期間培養法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、パーキンソン病を治療する。実施形態では、本発明の高密度、長期間培養法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、アルツハイマー病を治療する。実施形態では、本発明の高密度、長期間培養法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、脳卒中に罹ったことのある、又は罹っている対象を治療する。実施形態では、本発明の高密度、長期間培養法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、ギランバレー症候群を治療する。実施形態では、本発明の高密度、長期間培養法により生成されたGM1等のガングリオシドを投与することで、癌を治療する。
【０１３４】
［本発明の方法により生成されるガングリオシド及び細胞］
本発明は、本発明の方法により生成されるガングリオシドを提供するものである。かかるガングリオシドにはGM1、GM2、GM3、GD1a、GD1b、GD3、及びGT1が含まれるがこれらに限定されない。本発明によって生成されるガングリオシドは先行技術によって生成されるガングリオシドと異なる。
【０１３５】
ガングリオシドは非常に複雑な混合物であり、その分子種は親水性部分と疎水性部分との両方において異なる部分がある。ここにSonnino and Chigorno, Biochim Biophys Acta 1469:63-77 (2000)を引用し、そのすべてを取り込む。ガングリオシドは脂質部分を有しており、脂質部分はオリゴ糖構造に係る非常に大きなファミリーに関連しており、オリゴ糖構造はグリコシド結合部位、糖構造、中性糖及びシアル酸含量において異なる部分がある。例えば市販のGM1ガングリオシドには長鎖のベースにおいて多様性がある。表５の実施例１３参照。このため、例えばGM1等の同じガングリオシドとして分類されているガングリオシドであっても、その中には構造上の多様性がある。さらにガングリオシド組成は生物種間で異なり、また加齢とともに変化する。ここにeda, et al., J. Lipid Res. 49:2678-2689 (2008); Masserini and Freire, Biochem. 25:1043-1049 (1986); Taketomi et al., Acta Biochim. Pol. 45:987-999を引用し、そのすべてを取り込む。例えば天然のGM1は主としてC18:1及びC20:1の長鎖ベースを含有する不均一な混合物である。Id。ヒトにおいてGM1の組成は時間とともに変化する。ここにTaketomi et al., Acta Biochim. Pol. 45:987-999を引用し、そのすべてを取り込む。より具体的には、全スフィンゴシンベースに対するd20:1（icosaスフィンゴシン）及びd20（icosa-スフィンガニン）の割合は青年期又は成年期までに急速に増加した後、約50%で一定に維持される。かかる数値は様々な成体の哺乳類の脳の中のGM1におけるd20:1及びd20の割合よりも高い。Id。
【０１３６】
実施形態において。発明者は新規なガングリオシドを生み出した。実施形態においてかかる新規なガングリオシドは１以上のガングリオシドの混合物中に存在する。これらの内のいくつかはまた新しいガングリオシドである。
【０１３７】
実施形態において、本発明は本発明の方法により生成されるガングリオシドを提供するものである（「本発明のガングリオシド」という）。実施形態において本発明はヒツジGM1標準の遅延係数（「Rf」）よりも大きい遅延係数（「Rf」）値を有する薄層クロマトグラフィー（「TLC」）の単一のバンドで特定されるガングリオシドを提供するものである。ここで、かかるガングリオシドを超高純度のシリカゲルの250μｍの層で被覆されたガラスプレート上のTLCに供するとともに、クロロホルム、メタノール及び0.2%のカルシウムを50：42：11の比率で含有する溶液に接触させる。その後、展開したTLCを80mLの濃塩酸、0.25mLの0.1M硫酸銅、10mLの2%レゾルシノール及び10mLの水を含有する溶液中に入れることで染色するともに、かかるガラスプレートをかかる溶液中で20分間100℃に加熱する。実施形態においてガングリオシドは未精製のガングリオシド混合物から精製されたものである。実施形態において上述のTLCバンドによって特定されるガングリオシドは二以上のガングリオシドの混合物である。
【０１３８】
実施形態において新規のガングリオシド（一又は複数）は未精製のガングリオシド混合物から精製される。未精製のガングリオシド混合物は低酸素下で培養されたヒト骨髄間質細胞から分離される。実施形態において低酸素は５％の酸素である。
【０１３９】
実施形態において、本発明のガングリオシドはさらに上記段落において述べられたTLC条件の下でＲｆ値が０．６５であることを特徴とする。実施形態において、本発明のガングリオシドのRf値及びヒツジGM1標準のRf値の比は上記段落で述べられたTLC条件の下で３：１から１．１：１の間にある。実施形態において、上記段落で述べられたTLC条件の下で、本発明のガングリオシドのRf値及びヒツジGM1標準のRf値の比は１．２３：１又は約１．２３：１である。実施形態において、本発明のガングリオシドはヒツジGM1標準よりも極性が高い。実施形態において、本発明のガングリオシドはさらにコレラ毒素Ｂ（CTB）と結合していることを特徴とする。実施形態において、新規なガングリオシドはGM1ガングリオシドである。
【０１４０】
実施形態において、本発明はクロロキンで細胞を処理すること（「CLQ」）でガングリオシドを蓄積させ、ガングリオシドを分離する工程によって作られるガングリオシドを提供するものである。ここでガングリオシドはヒツジGM1標準の遅延係数（「Rf」）よりも大きい遅延係数（「Rf」）値を有するTLCの単一のバンドで特定される。ここで、かかるガングリオシドを超高純度のシリカゲルの250μｍの層で被覆されたガラスプレート上のTLCに供するとともに、クロロホルム、メタノール及び0.2%のカルシウムを50：42：11の比率で含有する溶液に接触させる。その後、展開したTLCを80mLの濃塩酸、0.25mLの0.1M硫酸銅、10mLの2%レゾルシノール及び10mLの水を含有する溶液中に入れることで染色するともに、かかるガラスプレートをかかる溶液中で20分間100℃に加熱する。実施形態において細胞を50μMのCLQにて処理する。実施形態において細胞はCLQに加えてニューロン誘導培地で処理される。実施形態において、細胞は骨髄細胞である。実施形態において細胞は低酸素、低密度下で生成された成人骨髄間質細胞である。実施形態において、成人骨髄間質細胞は低酸素下、好ましくは５％酸素下で培養される。
【０１４１】
実施形態において、本発明のガングリオシドはさらに上記段落において述べられたTLC条件の下でＲｆ値が０．６５であることを特徴とする。実施形態において、本発明のガングリオシドのRf値及びヒツジGM1標準のRf値の比は上記段落で述べられたTLC条件の下で３：１から１．１：１の間にある。実施形態において、上記段落で述べられたTLC条件の下で、本発明のガングリオシドのRf値及びヒツジGM1標準のRf値の比は１．２３：１又は約１．２３：１である。実施形態において、本発明のガングリオシドはヒツジGM1標準よりも極性が高い。実施形態において、本発明のガングリオシドはさらにCTBと結合していることを特徴とする。
【０１４２】
本発明はさらに、液体クロマトグラフィーシステム中でガングリオシドが液体クロマトグラフィーに供された時に、保持時間が7.4であることを特徴とするガングリオシドを提供するものである。液体クロマトグラフィーシステムはアジレント1200バイナリーUPLCシステムポンプと、移動相Ａ及び移動相Ｂを含む移動相とで構成される。移動相は10mMの酢酸アンモニウムからなる移動相Ａと、メタノールからなる移動相Ｂとからなる。液体クロマトグラフィーシステムはまた、ウォーターズのAcquity C18 (2.1 x 50 mm)逆相カラムを含んで構成される。カラムは40℃で保持され、移動相は毎分0.4 mLの速度で流動する。０分から４分において移動相は65%の移動相Ａと35%の移動相Ｂとからなり、４分から７．５分において移動相は15%の移動相Ａと85%の移動相Ｂとからなり、７．６分から１５分において移動相は65%の移動相Ａと35%の移動相Ｂとからなる。ガングリオシドは、注入体積20μｌの混合物となっている試料の状態で液体クロマトグラフィーシステムに注入される。実施形態において、保持時間が7.4であるガングリオシドはガングリオシド（複数）の混合物である。
【０１４３】
本発明はさらに、液体クロマトグラフィーシステム中でガングリオシドが液体クロマトグラフィーに供された時に、保持時間が7.8であることを特徴とするガングリオシドを提供するものである。液体クロマトグラフィーシステムはアジレント1200バイナリーUPLCシステムポンプと、移動相Ａ及び移動相Ｂを含む移動相とで構成される。移動相は10mMの酢酸アンモニウムからなる移動相Ａと、メタノールからなる移動相Ｂとからなる。液体クロマトグラフィーシステムはまた、ウォーターズのAcquity C18 (2.1 x 50 mm)逆相カラムを含んで構成される。カラムは40℃で保持され、移動相は毎分0.4 mLの速度で流動する。０分から４分において移動相は65%の移動相Ａと35%の移動相Ｂとからなり、４分から７．５分において移動相は15%の移動相Ａと85%の移動相Ｂとからなり、７．６分から１５分において移動相は65%の移動相Ａと35%の移動相Ｂとからなる。ガングリオシドは、注入体積20μｌの混合物となっている試料の状態で液体クロマトグラフィーシステムに注入される。実施形態において、保持時間が7.8であるガングリオシドはガングリオシド（複数）の混合物である。
【０１４４】
実施形態において、本発明はさらにガングリオシドを過剰発現するよう誘導された細胞を提供するものである。実施形態において、細胞は公知のガングリオシドを及び／又は本発明の新規なガングリオシドを過剰発現する。「過剰発現」の用語は細胞によって生成される一以上のガングリオシドの量がここで述べる方法のいずれか一つによって操作されなかった細胞によって生成される量を超えることを意味する。例えば細胞が一以上のガングリオシドを過剰発現すると言えるには、クロロキン、ノイラミニダーゼ、グルコサミン、生化学的操作、化学処理をせずかつ継代をしない長期間培養、又はこれらの組み合わせによる処理の後に発現する一以上のガングリオシドが、これらの方法の一つに供されなかった細胞から生成されるものより多ければよい。
【０１４５】
実施形態において、PC12細胞、HT22細胞、ガングリオシド蓄積症に罹っているヒツジ由来の脳細胞及びガングリオシド蓄積症に罹っているヒツジ由来の繊維芽細胞はガングリオシドを過剰発現する本発明の細胞に含まれない。
【０１４６】
実施形態において、本発明は一以上のガングリオシドを過剰発現する神経芽細胞腫及び成人骨髄間質細胞を提供するものである。実施形態において、神経芽細胞腫及び成人骨髄間質細胞は後述する低密度／低酸素培養法で生成される。
【０１４７】
実施形態において、ガングリオシドを過剰発現する細胞は神経芽細胞腫である。実施形態において、神経芽細胞腫は動物ソースから分離される。動物ソースにはヒトが含まれるがこれに限定されない。実施形態において、神経芽細胞腫を過剰発現する神経芽細胞腫細胞株にはSHSY-5Y、SHSY-S、及びSK-N-ASが含まれるがこれに限定されない。さらに実施形態において、一以上のガングリオシドを過剰発現するように誘導された細胞はガングリオシド蓄積症に罹っている動物に由来する。例えばGM1ガングリオシド蓄積症、GM2ガングリオシド蓄積症又はこれらの両方に罹っているヒト、ネコ又はイヌに由来する。実施形態ではさらに、ガングリオシド蓄積症に罹っているヒト、ネコ又はイヌ由来の骨髄細胞及び繊維芽細胞を本発明のCLQ法に用いる。実施形態において繊維芽細胞はGM1繊維芽細胞でもよい。
【０１４８】
神経芽細胞腫はGM1、GM2及びGM3を含有するガングリオシド混合物を発現するように誘導される。ここでガングリオシドの発現を誘導された神経芽細胞腫におけるGM1、GM2及びGM3のそれぞれの百分率は誘導されていない神経芽細胞腫に比べて異なる。実施形態において、誘導された神経芽細胞腫中に存在するガングリオシド混合物中の各ガングリオシドの百分率は：（ａ）GM1−5-20%、好ましくは10-14%及び好ましくは12.9%又は約13%、（ｂ）GM2−55-75%、好ましくは60-70%、及び好ましくは68.1%又は約68%、並びに（ｃ）GM3−10-30%、好ましくは15-25%、及び好ましくは18.9%又は約19%である。好ましくは誘導された細胞のGM1は細胞内のガングリオシド混合物の12.9%を占め；GM2は混合物の68.1%を占め；GM3は混合物の18.9%を占める。実施形態において、神経芽細胞種はSHSY細胞である。
【０１４９】
本発明は成人骨髄細胞又はSHSY細胞を提供するものであり、これらはいずれもガングリオシドの発現が誘導されており、液体クロマトグラフィーシステム中でガングリオシドが液体クロマトグラフィーに供された時に、保持時間が7.4であることを特徴とする。液体クロマトグラフィーシステムはアジレント1200バイナリーUPLCシステムポンプと、移動相Ａ及び移動相Ｂを含む移動相とで構成される。移動相は10mMの酢酸アンモニウムからなる移動相Ａと、メタノールからなる移動相Ｂとからなる。液体クロマトグラフィーシステムはまた、ウォーターズのAcquity C18 (2.1 x 50 mm)逆相カラムを含んで構成される。カラムは40℃で保持され、移動相は毎分0.4 mLの速度で流動する。０分から４分において移動相は65%の移動相Ａと35%の移動相Ｂとからなり、４分から７．５分において移動相は15%の移動相Ａと85%の移動相Ｂとからなり、７．６分から１５分において移動相は65%の移動相Ａと35%の移動相Ｂとからなる。ガングリオシドは、注入体積20μｌの混合物となっている試料の状態で液体クロマトグラフィーシステムに注入される。実施形態において、保持時間が7.4であるガングリオシドはガングリオシド（複数）の混合物である。
【０１５０】
本発明は成人骨髄細胞又はSHSY細胞を提供するものであり、これらはいずれもガングリオシドの発現が誘導されており、液体クロマトグラフィーシステム中でガングリオシドが液体クロマトグラフィーに供された時に、保持時間が7.8であることを特徴とする。液体クロマトグラフィーシステムはアジレント1200バイナリーUPLCシステムポンプと、移動相Ａ及び移動相Ｂを含む移動相とで構成される。移動相は10mMの酢酸アンモニウムからなる移動相Ａと、メタノールからなる移動相Ｂとからなる。液体クロマトグラフィーシステムはまた、ウォーターズのAcquity C18 (2.1 x 50 mm)逆相カラムを含んで構成される。カラムは40℃で保持され、移動相は毎分0.4 mLの速度で流動する。０分から４分において移動相は65%の移動相Ａと35%の移動相Ｂとからなり、４分から７．５分において移動相は15%の移動相Ａと85%の移動相Ｂとからなり、７．６分から１５分において移動相は65%の移動相Ａと35%の移動相Ｂとからなる。ガングリオシドは、注入体積20μｌの混合物となっている試料の状態で液体クロマトグラフィーシステムに注入される。実施形態において、保持時間が7.8であるガングリオシドはガングリオシド（複数）の混合物である。
【０１５１】
本発明はガングリオシドの発現が誘導された成人骨髄細胞を提供するものであり、ガングリオシドはヒツジGM1標準よりも大きいRf値を有するTLCの単一のバンドで特定される。ここで、かかるガングリオシドを超高純度のシリカゲルの250μｍの層で被覆されたガラスプレート上のTLCに供するとともに、クロロホルム、メタノール及び0.2%のカルシウムを50：42：11の比率で含有する溶液に接触させる。その後、展開したTLCを80mLの濃塩酸、0.25mLの0.1M硫酸銅、10mLの2%レゾルシノール及び10mLの水を含有する溶液中に入れることで染色するともに、かかるガラスプレートをかかる溶液中で20分間100℃に加熱する。
【０１５２】
本発明は一以上のガングリオシドを過剰発現する細胞を提供するものであり、ここで細胞は不死化細胞であり、例えばCHO-K1細胞及びHEK293細胞等のCHO細胞及びヒト胚腎臓細胞である。
【０１５３】
［本発明の方法によって生成されたガングリオシドの使用方法］
【０１５４】
さらに実施形態において、本発明は本発明の方法により生成されたガングリオシドを投与することで疾病又は疾患を有しており治療を必要とする対象を治療する方法を提供するものである。典型的な疾病又は疾患にはニューロンの障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、ギランバレー症候群及び癌が含まれるがこれらに限定されない。
【０１５５】
これらの組成物は非経口的に投与してもよい（静脈内、皮下、腹腔内、又は筋肉内注射等）。「非経口的投与」及び「非経口的に投与され」の句は経腸投与及び局所投与以外の投与の態様を表す。通常、注射であり、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内への注射及び点滴を含むがこれらに限定されない。
【０１５６】
「処置する」又は「処置」の用語は、本発明により生成されるガングリオシドの使用において、治療処置及び予防（prophylactic）又は予防（preventative）の手段を含むがこれに限定されない。パーキンソン病の進行といった、望ましくない生理学的な変化や障害を防止すること又は緩徐する（減らす）ことを含むが限定されない。有益で望ましい臨床結果には症状の緩和、疾病の度合いの減弱、疾病状態の安定（すなわち悪化しないこと）、疾病の進行を遅らせること又は緩徐すること、疾病状態の改善又は緩和、及び寛解（一部であっても全部であっても）を含み、検出できるか否かを問わない。ここで「処置」は、処置を受けなかった場合の期待生存期間に比べた場合の生存期間の延長を意味するものでもよい。処置を必要とするものには、すでに状態又は障害にあるものを含み、同様に状態又は障害を起こしやすいもの又は状態又は障害の顕在化が防止されるべきものが含まれる。
【０１５７】
さらに「処置」の用語が、細胞培養において用いられる場合、培養細胞への投与又は特定の薬剤、化学物質、技術、治療及び／又は方法に対する培養細胞の利用が含まれるがこれに限定されない。
【０１５８】
「対象」又は「個人・個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳動物」によって表されるのは、あらゆる対象であり、特に哺乳類の対象であり、人間の患者等であり、診断、予後、予防又は治療が要求されるものである。
【０１５９】
［本発明の方法を使用するための細胞を生成する方法］
上述の通り、実施形態では、本発明の方法において細胞を用いる。かかる実施形態において、細胞は低酸素、低密度条件下で培養することで得られる。かかる方法は公知の方法であり、ここに米国特許出願公開2003/0059414号、2007/0224177号及び2009/0053183号 （米国特許8,354,370 B2として登録済み）を引用し、そのすべてを取り込む。一実施形態において、骨髄由来細胞を本発明の方法に利用する。かかる実施形態において
骨髄由来細胞は、低酸素、低密度条件下で培養して得たものでもよい。
【０１６０】
典型的な実施形態において、ヒツジ又はヒトから骨髄の吸引物を得る。さらにこれを固相と接触させながら培養する。例えばヒト骨髄細胞は健康なヒトのドナーから腸骨稜での吸引によって得る。さらに確立した技法を用いて骨髄間質細胞の集団を得る。必要であれば、全骨髄の吸引を行って単核細胞画分を得てもよい。これを固相と接触させながら培養する。固相は例えばプラスチック（組織培養用の処理済みプラスチック）でもよい。
【０１６１】
単核細胞画分は確立した手法により、全骨髄の吸引物から密度勾配上で得られる。また、単核細胞画分は骨髄吸引物に含まれる赤血球を溶解することで得られる。溶解は塩化アンモニウムを骨髄吸引物と混合することで行う。
【０１６２】
骨髄吸引物、又は骨髄吸引物の細胞画分を固相と接触させながら培養する。固相への接着の傾向に基づき、中間的な細胞集団を細胞培養の結果物から分離する。骨髄吸引物又は吸引物の細胞画分を約２０％以下の濃度の溶存酸素中で培養する。好ましくは約１％から約１０％である。最も好ましくは約２％の酸素から約７％の酸素である。好ましい態様において、溶存酸素濃度は約５％酸素である。得られた接着細胞集団を増やして実質的に均一な細胞集団を得る。かかる集団はcD49c及びCD90を共発現する。
【０１６３】
骨髄細胞の増殖は約2500細胞／ｃｍ２未満の播種密度で行う。好ましくは約2500細胞／ｃｍ２未満であり、最も好ましくは約100細胞／ｃｍ２未満である。特定の実施形態において、増殖工程初期の細胞密度は約30細胞／ｃｍ２から約50細胞／ｃｍ２の間である。播種密度は１ｃｍ２あたりの単核骨髄細胞から得られる接着細胞の数である。
【０１６４】
調製された標準培地を骨髄細胞の培養に用いてもよい。例えば、培地はアルファ-MEMに4mMのL-グルタミンと0から10%のFBSであってロットを選択したものとを補ったものでもよい。FBSは約10%であることが好ましい。培養工程は合理的な期間行うことができる。例えば、約3から約25日間、最も好ましくは約3から約15日間である。
【０１６５】
固相への接着の傾向に基づき上述の細胞培養物から中間的な細胞集団を分離する。中間的な細胞集団は実質的に自己再生を行う細胞のみの増殖を促す濃度で生育する。かかる細胞をコロニー形成単位繊維芽細胞様細胞（CFU-F）と称する。CFU-F由来の細胞を所定の条件下で継代培養することで実質的に均一な細胞集団を形成する。本発明によれば、増殖により実質的に均一な細胞集団を得る。細胞集団はCD49及びCD90を共発現している。
【０１６６】
［本発明の方法で用いるヒツジ脳由来細胞を分離する方法］
上述の通り、実施形態において、ヒツジ脳由来細胞は本発明の方法に用いられる。例えば、所定の実施形態において、ヒツジ脳由来細胞は本発明の長期間、高密度培養法に用いられる。上述の通り、所定の実施形態において、ヒツジ脳由来細胞はガングリオシド蓄積症のヒツジから分離される。ガングリオシド蓄積症のヒツジは開示されている。例えばここに米国特許5,532,141号を引用し、そのすべてを取り込む。ヒツジ脳由来細胞の分離と培養の方法は以下の文献に開示されている。例えばここに国際出願番号PCT/US2010/047522号の国際公開公報WO 2011/028795を引用し、そのすべてを取り込む。
【０１６７】
典型的な実施形態において、細胞は以下のヒツジ脳組織をソースとして分離する：半卵円中心、小脳皮質、海馬、尾状核、大脳皮質（前頭葉、頭頂等）、及び心室壁。各種組織をPIPES緩衝液ですすぎ、抗生物質及び抗真菌剤とともにパパイン／DNase I／ディスパーゼ（中性プロテアーゼ）中で消化する。酵素を中和し、解離した細胞を、細胞濾過器を通した。細胞を遠心し、5%FBS及び抗生物質／抗真菌剤を補ったDMEM/F12/N2に再懸濁する。細胞を数えるとともに、フィブロネクチンで被覆したフラスコ中の5%FBS及び抗生物質／抗真菌剤に加えさらに10ng/mlのbFGF及び20 ng/mlのEGF又を補ったDMEM/F12/N2、又はNeurocultのProliferation-A培地に播種する。各種培地中の細胞は37℃の加湿恒温器で生育する。実施形態において本発明の方法で用いる前に、細胞は低酸素条件下で生育する。例えば20%以下、15%以下、10%以下、及び好ましくは4%又は5%の酸素である。
【０１６８】
［細胞からのガングリオシドの分離］
本発明の細胞培養物からのガングリオシドの抽出及び精製は公知の方法で行う。例えば、細胞の沈渣を最少量の水で30分間超音波処理して均質化する。20倍体積の2:1クロロホルム：メタノールに希釈する。30分間超音波処理する。2000 rpmで15分間遠心し細胞材料を沈殿させる。デカントして上清を保存する。沈渣を10倍体積の5%含水2:1クロロホルム：メタノールに希釈する。30分間超音波処理する。前記同様に遠心及びデカントを行う。上清同士を混合する。クロロホルム：メタノール添加、超音波処理及び遠心を２−３回さらに繰り返すことで、十分に全てのガングリオシドを抽出する。大多数のガングリオシドは初めの２回の抽出サイクルで抽出される。混合した上清に対して0.2倍体積の0.1NのKCl又はNaClを添加する。よく混合する。2000rpmで15分間遠心し層を分離する。上層を保存する。残された有機層（下層）に、0.2倍体積の1:1のメタノール：0.1NのKCl又はNaClを添加する。よく混合する。KCl又はNaClの添加、遠心、抽出の工程を繰り返す。残った有機層（下層）に、0.2倍体積の1:1のメタノール：水を添加する。保存しておいた上層を混合し、濃縮する。得られた抽出物はガングリオシドのプールを含有する。所望の分子種はさらにセファロース又はコレラ毒素B等のカラムクロマトグラフィーを用いて分離することができる。
【０１６９】
［細胞培養物中のガングリオシド量の定量］
本発明は本発明のガングリオシド生成方法を実行した後で、細胞培養物中GM1等のガングリオシド量を定量する方法を提供するものである。このため、本発明は標準曲線を生成する方法を提供するものである。かかる標準曲線はプレートによるGM1等の定量のためのものであり、サンプルを比較するためのものである。
【０１７０】
所定の実施形態において、標準曲線はヒツジ又はヒトのGM1のようなGM1等のガングリオシドの希釈液を調製し、Nunc MaxiSorp（登録商標）プレートのようなELISAプレートに希釈液を加えることで作成する。プレートを恒温で保ちGM1等のガングリオシドをプレートに吸着させる。4℃で8から24時間行い、好ましくは12から16時間行う。恒温で保ったのち、プレートを洗浄するとともにブロックし、GM1等のガングリオシドをCTBと接触させる。CTBは色素又は基質と接することで呈色する最終産物を生成する酵素と共役している。CTB複合体と接触した後、色素又は呈色最終産物の発光又は吸光を測定する。測定値はプレートを被覆する、精製されたGM1等のガングリオシド中のGM1等のガングリオシドの量を示す。実施形態において、吸光は標準的なプレートリーダーで測定される。標準曲線は吸光データから生成される。試験データを標準曲線と比較する。
【０１７１】
次に標準曲線を試験ウェルの測定値と比較するために用いることで細胞内に蓄積したGM1等のガングリオシドを定量する。または実施形態において、可溶化後にGM1等のガングリオシドの量を計る。典型的な実施形態において、試験ウェルに接着性のガングリオシド含有細胞を含むようにする。かかるウェルは上記試料プレートと同様に洗浄しブロックする。接着細胞はCTBと接触する。CTBは色素又は基質と接することで呈色する最終産物を生成する酵素と共役している。色素又は呈色最終産物の発光又は吸光を測定する。標準曲線と比較することで接着細胞中のガングリオシドの蓄積量を決定する。かかる測定の終了後、ガングリオシドを例えば1%のSDSを含むPBSで可溶化する。プレートリーダー上でプレートを再度測定する。ガングリオシドは細胞中の他の分子と結合する場合がある。この場合CTB結合部位にCTB-HRPやCTB-Alexa488等の検出試薬が到達しない。可溶化により、かかる結合を開放し、又はガングリオシドの凝集を開放することでさらに定量値を得られるようにする。
【０１７２】
実施形態において色素は緑色蛍光色素のような蛍光色素である。実施形態において色素はFITC又はAlexa488である。他の実施形態において、CTBと共役している酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼ（「HRP」）である。CTB-HRP複合体では、ABTS試薬を接着細胞に接触させることで呈色産物を生成し、呈色産物の吸光を測定する。
【０１７３】
［本発明の方法により生成されたガングリオシドを分離し判別する方法］
本発明の方法で形成されたガングリオシドを当業者に知られる方法を用いて分離する。典型的な手順は（１）細胞を溶解し、（２）得られた抽出物を収集し、かつ（３）抽出物をカラム精製する。実施形態において、抽出物中のガングリオシドを濃縮するために、単一の精製工程を用いる。
【０１７４】
当業者に知られる方法で本発明のガングリオシドの存在を判別する。またガングリオシドを精製する。典型的な方法は薄層クロマトグラフィー（「TLC」）である。ガングリオシドの存在及び種類はタンデム質量分析（MS/MS）で判別することができる。例えばカラム精製で得られた抽出物をTLCに供することでガングリオシド及び他の脂質成分の存在を検出する。実施形態において樹脂基板プレート（J.T. Bakerの2.5×7.5 cmのBaker-flexシリカゲルIB2-F）を移動相と接触させる。移動相は例えばクロロホルム：メタノール：0.2%塩化カルシウムが50:42:11の比率のものである。TLCを展開した後、りんモリブデン酸溶液（4.8% w/vエタノール溶液）に浸漬することでプレートを染色し、ヒートガンで加熱する。
【０１７５】
他の実施形態において、ガングリオシドの存在を判別し、ガングリオシドを精製することをTLCで行う。実施形態において2.5×7.5 cmの超高純度のシリカゲル（Silicycle）の250μｍの層で被覆されたガラスプレートを移動相と接触させる。移動相は例えばクロロホルム、メタノール及び0.2%のカルシウムを50：42：11の比率としたものである。TLCを展開後、プレートを80mLの濃塩酸、0.25mLの0.1M硫酸銅、10mLの2%レゾルシノール及び10mLの水を含有する溶液中に浸漬することで染色するともに、かかるガラスプレートを溶液中で20分間100℃に加熱する。実施形態において開示されるTLC法によりガングリオシドを極性に基づき分離する。
【０１７６】
他の実施形態において、MS/MSを用いてガングリオシドの存在を判別する。実施形態において、細胞からの抽出物（処理したものと、していないもの）をMS/MSに供する。当業者であればMS/MSデータを陰性対照若しくは／又は陽性対象、又は公知のデータベースと比較することでガングリオシドの存在を判別できる。
【０１７７】
［本発明の新規のガングリオシドを含有する製剤］
【０１７８】
本発明は本発明の新規なガングリオシドを含有する製剤を提供するものである。「製剤」の用語は疾病又は疾患の処置のための対象への投与に適した治療用組成物に関する。本発明はガングリオシド混合物を含有する製剤を提供するものである。ここで混合物はGM1、GM2及びGM3を含有する。これらの百分率はガングリオシドの発現誘導を受けていない細胞中では見られないものである。実施形態において、本発明の製剤は本発明の新規なガングリオシド及び公知のガングリオシドを含有する。
【０１７９】
実施形態において、製剤中に存在するガングリオシド混合物中の各ガングリオシドの百分率は：（ａ）GM1−5-20%、好ましくは10-14%及び好ましくは12.9%又は約13%、（ｂ）GM2−55-75%、好ましくは60-70%、及び好ましくは68.1%又は約68%、並びに（ｃ）GM3−10-30%、好ましくは15-25%、及び好ましくは18.9%又は約19%である。好ましくは誘導された神経芽細胞種のGM1は細胞内のガングリオシド混合物の12.9%を占め；GM2は混合物の68.1%を占め；GM3は混合物の18.9%を占める。 
【０１８０】
他の実施形態
【０１８１】
実施形態X1  液体クロマトグラフィーシステム中でガングリオシドが液体クロマトグラフィーに供された時に、保持時間が7.4であることを特徴とするガングリオシド。ここで液体クロマトグラフィーシステムは以下で構成される：
ａ．  アジレント1200バイナリーUPLCシステムポンプ；
ｂ．  移動相Ａ及び移動相Ｂを含む移動相、ここで移動相は10mMの酢酸アンモニウムからなる移動相Ａと、メタノールからなる移動相Ｂとからなる；及び
ｃ．逆相カラム、ここでかかるカラムはウォーターズのAcquity C18 (2.1 x 50 mm)である、
ここで、かかるカラムは40℃で保持され、移動相は毎分0.4 mLの速度で流動する。０分から４分において移動相は65%の移動相Ａと35%の移動相Ｂとからなり、４分から７．５分において移動相は15%の移動相Ａと85%の移動相Ｂとからなり、７．６分から１５分において移動相は65%の移動相Ａと35%の移動相Ｂとからなる、ここでガングリオシドは、注入体積20μｌの混合物となっている試料の状態で液体クロマトグラフィーシステムに注入される、ここでかかるガングリオシドは一以上のガングリオシドからなる。
【０１８２】
実施形態X2  液体クロマトグラフィーシステム中でガングリオシドが液体クロマトグラフィーに供された時に、保持時間が7.8であることを特徴とするガングリオシド。ここで液体クロマトグラフィーシステムは以下で構成される：
ａ．  アジレント1200バイナリーUPLCシステムポンプ；
ｂ．  移動相Ａ及び移動相Ｂを含む移動相、ここで移動相は10mMの酢酸アンモニウムからなる移動相Ａと、メタノールからなる移動相Ｂとからなる；及び
ｃ．逆相カラム、ここでかかるカラムはウォーターズのAcquity C18 (2.1 x 50 mm)である、
ここで、かかるカラムは40℃で保持され、移動相は毎分0.4 mLの速度で流動する。０分から４分において移動相は65%の移動相Ａと35%の移動相Ｂとからなり、４分から７．５分において移動相は15%の移動相Ａと85%の移動相Ｂとからなり、７．６分から１５分において移動相は65%の移動相Ａと35%の移動相Ｂとからなる、ここでガングリオシドは、注入体積20μｌの混合物となっている試料の状態で液体クロマトグラフィーシステムに注入される、ここでかかるガングリオシドは一以上のガングリオシドからなる。
【０１８３】
実施形態X3：一以上のガングリオシドを過剰発現するように誘導された細胞。ここで細胞は神経芽細胞腫又は成人骨髄細胞である。
【０１８４】
実施形態X4：実施形態X3の細胞。ここで細胞は神経芽細胞腫である。
【０１８５】
実施形態X5：実施形態X4の神経芽細胞腫。ここで神経芽細胞腫はGM1、GM2及びGM3を含有するガングリオシド混合物を発現するように誘導される。ここでGM1はかかる混合物の12.9%を占め；GM2はかかる混合物の68.1%を占め；GM3はかかる混合物の18.9%を占める。
【０１８６】
実施形態X6：実施形態X5の神経芽細胞腫。ここで神経芽細胞腫はSHSY細胞である。
【０１８７】
実施形態X7：実施形態X1のガングリオシドの発現を誘導されたSHSY細胞。
【０１８８】
実施形態X8：実施形態X2のガングリオシドの発現を誘導されたSHSY細胞。
【０１８９】
実施形態X9：実施形態X3の細胞。ここで細胞は成人骨髄細胞である。
【０１９０】
実施形態X10：実施形態X1のガングリオシドの発現を誘導された成人骨髄細胞。
【０１９１】
実施形態X11：実施形態X1のガングリオシドの発現を誘導された成人骨髄細胞。
【０１９２】
実施形態X12：実施形態X2のガングリオシドの発現を誘導された成人骨髄細胞。
【０１９３】
実施形態X13：GM1、GM2及びGM3を含有するガングリオシド混合物を含有する製剤。ここでGM1はかかる混合物の12.9%を占め；GM2はかかる混合物の68.1%を占め；GM3はかかる混合物の18.9%を占める。
【０１９４】
実施形態X14：本発明のガングリオシドを含有する製剤。
【実施例】
【０１９５】
［実施例１］
T-225組織培養フラスコ（コーニング、Cat＃431081）中のアルファ−MEM増殖培地（10%FBS含有）にヒツジ骨髄由来細胞（継代１又は２）を密度8,000細胞/cm2で播種した。
【０１９６】
翌朝、培地を30mlのニューロン誘導培地（NIM）：Neurobasal培地＋B27にレチノイン酸、EGF（25 μｇ／ｍｌ）及びFGF（10 ng/ml）を補ったもの、に交換した。
【０１９７】
夕方に、50μＭのクロロキンをフラスコに加えた。3日目に観察したところ約70%の細胞が死んでいた。PBSですすぐことで、フラスコから浮遊している細胞を除去した。細胞をトリプシン処理して生存している細胞を収集した。細胞を遠心により沈殿させ、新たな増殖培地に再懸濁した。新しいフラスコに8,000細胞／cm2にて播種した。標本をとり、24ウェルプレート上にまいて、Alexa488と共役させたコレラ毒素で染色することによりGM1の誘導を確認した。図１Ａ及びＢに示すように、処理していない（対照）細胞に比べて、NIM/CLQで処理したSBM（48h CQ in NIM）はGM1がとても強く染色されていた。
【０１９８】
生存していた細胞は2日でフラスコ内に広がったので、その後、細胞を回収した。
【０１９９】
2回目の処理として、回収前に、生存している細胞を50μＭのCLQで24時間処理してもよい。
【０２００】
［実施例２］
標準的な組織培養フラスコ中のアルファ−MEM増殖培地（10%FBS含有）に成人骨髄細胞を播種密度8,000細胞/cm2で播種した。
【０２０１】
翌日、必要に応じて培地を交換し、50μＭのCLQをフラスコに加えた。48時間後、細胞を回収した。観察したところ約10-20%の細胞が死んでいた。細胞を固定し、CTB-Alexa488で染色することでGM1の水準を可視化した。上部のパネル（対照）に比べて、CLQ-処理した細胞（下部パネル）では有意にGM1の蓄積が高いことが示された。
【０２０２】
［実施例３］
本実施例の主題はヒト神経芽細胞腫細胞株におけるGM1の発現を促進することである。細胞株はSHSY-5Y、ヒツジ骨髄細胞（SBM）及びヒト骨髄細胞（HBM）である。
【０２０３】
一の実験において、SHSY-5Y、SBM及びHBMを24ウェルプレート上の10%の血清を含む増殖培地に播種した。翌日、細胞を異なる３つの処方に供した。また増殖培地中に放置した（10%FBS含有AMEM）：
無血清培地（SFM）
ニューロン誘導培地（NIM）
50μＭのクロロキン（CLQ）
【０２０４】
48時間後、100μｌのアラマーブルー色素をウェルに加え、１時間恒温を保った。アラマーブルーの吸光を、プレートリーダーを用いて測定した。その後、プレートを洗浄して固定するとともに、CTB-HRPを用いてGM1染色を行った。CTB-HRPの値はアラマーブルーの値で標準化した。アラマーブルーの値は生存細胞の指標となる。
【０２０５】
図３に示すように、NIMでは三つの細胞種の全てでGM1の発現がいくらか促進された（NIMの対照実験と比較）。NIMにおいてSHSY-5Y細胞では誘導が約2倍となった。一方でSMBCでは誘導が約4倍となった。GM1の発現の促進が最も著しく場合で、約8倍であり、これはHMBCのCLQ処理において見られた（HBMに対するCLQの対照実験と比較）（図３参照）。
【０２０６】
SHSY-5Yに係る試験の中で、ヒツジ骨髄由来細胞及びヒト骨髄由来細胞をガングリオシド経路に影響を与えることが知られる化合物で処理した。クロロキンは酸性の（acidotropic）薬剤であり、エンドソームからリソソームへの膜輸送を攪乱する。A23187はカルシウムイオノフォアであり、CLQ処理後のエキソソーム分泌を促進する。N-アセチルグルコサミンはヘキソサミン経路を活性化する。ヘキソサミン経路は複合糖質の合成のための中間体を供給する。糖質としてガラクトースに転換することでガングリオシドの組成を改変する。ニューロンは他の細胞種よりもGM1化合物を発現していることから、ニューロン分化を誘導することが知られる化合物及び培地で処理する（NIM）ことで細胞はニューロンの表現型を有するように後押しされる。
【０２０７】
SHSY-5Y細胞は24ウェルプレートに10,000細胞／ウェルで播種した。下記表１に列挙した条件に沿って処理した。処理後に細胞を固定してCTB-Alexa 488で染色することでGM1を検出した。染色の強さ、細胞死の量及び他の観察事項を記録しまとめた。結果を表１に示す。NIM2培地でのSHSY-5Yの処理において最も強く染色された（プラスが５個の表示）。また細胞死が無かった（マイナスが１個の表示）。グルコサミン及びCLQプラスA23187、カルシウムイオノフォア処理においてもまたGM1の強い誘導（プラスが４個）が見られた。CLQプラスA23187の集団では細胞死が見られた。CLQ単独では対照実験の処理後細胞よりも染色が強かった。
表１：異なる処理条件におけるSHSY-5Y細胞でのGM1の誘導
【０２０８】
【表１】
2016521967.tif 000004
【０２０９】
罹患ヒツジ骨髄細胞（SBM）を20,000細胞／ウェルで播種した。下記表２に列挙した条件に沿って処理した。処理後に細胞を固定してCTB-Alexa 488で染色することでGM1を検出した。染色の強さ、細胞死の量及び他の観察事項を記録しまとめた。結果を表２に示す。NIM培地中のCLQでのSBMの処理において最も強く染色された（プラスが４個の表示）。また最も細胞死が見られた（プラスが３個の表示）。CLQ単独でもGM1を誘導したものの、CLQ/NIMには及ばなかった。他の条件では、無血清培地、NIM(1)培地、グルコサミン及びPDGFにおいてもGM1が誘導されたが、より弱かった。
表２：異なる処理条件における罹患ヒツジ骨髄細胞でのGM1の誘導
【０２１０】
【表２】
2016521967.tif 000005
【０２１１】
ヒト骨髄細胞（HBM）を24ウェルプレートに20,000細胞／ウェルで播種した。下記表２に列挙した条件に沿って処理した。処理後に細胞を固定してCTB-Alexa 488で染色することでGM1を検出した。染色の強さ、細胞死の量及び他の観察事項を記録しまとめた。結果を表３に示す。CLQでのHBM細胞の処理において最も強く染色された（プラスが５個の表示）。また若干の細胞死が見られた（プラスが２個の表示）。SBMと異なり、NIM-CLQ処理により細胞の大部分が死滅した。無血清培地でもGM1が誘導されたがCLQに及ばなかった。
表３：異なる処理条件におけるヒト骨髄由来細胞でのGM1の誘導
【０２１２】
【表３】
2016521967.tif 000006
【０２１３】
［実施例４］
マウスNeuro2A神経芽細胞腫細胞を標準増殖培地（高ブドウ糖DMEM F12、2mMグルタミン、25mM HEPESプラス10% FBS）で培養した。細胞を標準培養培地で維持した（Ctrl）。またはノイラミニダーゼ、１ユニット/mlで３時間処理した（Treated）。細胞を2%のパラホルムアルデヒドで固定しCTB-Alexa 488で染色することでGM1を検出した。固定前の細胞培養物の明視野像を図４のパネルＡ及びＣに表す。GM1陽性染色の蛍光画像を図４のパネルＢ及びＤに表す。ノイラミニダーゼ処理をした後のマウスNeuro 2A細胞においてGM1染色は著しく強かった（パネルＢからＤと比較）。
【０２１４】
［実施例５］
hABM-SCを標準増殖培地（AMEM、10% FBS、2mMグルタミン）で培養した。細胞を標準培養培地（Control）で培養し、または3時間ノイラミニダーゼ、１ユニット/mlで処理した（Treated）。細胞を2%のパラホルムアルデヒドで固定しCTB-Alexa 488で染色することでGM1を検出した。図５はGM1陽性染色を示す蛍光画像である。GM1はノイラミニダーゼ処理をした後のhABM-SCにおいてより富んでおり、大きな凝集体としてよく観察された。
【０２１５】
［実施例６］
マウスNeuro2A神経芽細胞腫を20,000細胞/cm2よりも高い密密度で蒔いた。標準増殖培地（高ブドウ糖DMEM F12、2mMグルタミン、25mM HEPESプラス10% FBS）で培養した。細胞は標準増殖培地で３又は９日間維持した（Ctrl）。培地は３日置きに交換した。細胞を2%のパラホルムアルデヒドで固定しCTB-Alexa 488で染色することでGM1を検出した。固定前の細胞培養物の明視野像をパネルＡ及びＣに表す。GM1陽性染色の蛍光画像を図６のパネルＢ及びＤに表す。低密度培養で３日間又はそれ未満の期間、維持された細胞中のGM1の基底水準に比べて長期間、高密度培養で維持されたマウスNeuro 2A細胞においてGM1染色は著しく強いことが示された（図６のパネルＢからＤと比較）。
【０２１６】
［実施例７］
ヒツジ脳由来細胞を標準増殖培地（AMEM、10% FBS、2mMグルタミン）で培養した。細胞を標準増殖培地で３又は９日間維持した。培地は３日置きに交換した。細胞を2%のパラホルムアルデヒドで固定しCTB-Alexa 488で染色することでGM1を検出した。固定前の細胞培養物の明視野像を図７のパネルＡ及びＣに表す。GM1陽性染色の蛍光画像を図７のパネルＢ及びＤに表す。低密度培養で３日間又はそれ未満の期間、維持された細胞中のGM1の基底水準に比べて、長期間、高密度培養で維持されたヒツジ由来細胞において非常に高いGM1の集積がみられることが示された（図７のパネルＢからＤと比較）。
【０２１７】
［実施例８］
精製したヒツジGM1の希釈液を調製しNuncのmaxisorpプレートに加えた（各希釈液について100μｌ）。プレートを４℃に保った。翌日プレートを洗浄し、ブロックした。CTB-HRP（ウェル当たり75μｌ、1:4000）を加え、プレートを１時間、暗所で室温に保った。プレートを洗浄してから、ABTS試薬（ウェル当たり100μｌ）加えた。緑色に呈色させた。反応を６６μｌの停止液（0.1%SDSを含むPBS）で停止した。シグナルを標準的なプレートリーダーで測定した。図８においてデータをプロットし、標準曲線を示した。感度の範囲は３ｎｇ−０ｎｇである。
【０２１８】
［実施例９］
精製したヒツジGM1の希釈液を調製しNuncのmaxisorpプレートに加えた（各希釈液について100μｌ）。プレートを４℃に保った。翌日プレートを洗浄し、ブロックした。CTB-Alexa488（1:200）を加え、プレートを１時間、暗所で室温に保った。プレートを洗浄し、シグナルを標準的なプレートリーダーで測定した。1%SDSを含むPBSを加え10-15分かけてGM1を可溶化した。プレートを再びプレートリーダーで測定した。図９においてデータをプロットし、標準曲線を示した。感度の範囲は５００μｇ−３０μｇである。
【０２１９】
［実施例１０］
一人の提供者からの骨髄吸引によってマスターセルバンク、MCB105を作出した。骨髄の回収はCambrex Bioscience の方法に従いCambrex（Gaithersburg、MD）によって行った。標準的な臨床的手法により提供者の骨盤の後方から左右対称に吸引することで、全量で124 mLの骨髄が得られた。吸引物を滅菌した血液袋に入れた。血液袋にはヘパリンが含まれている。血液袋を温度記録器と保冷剤とともに輸送容器に入れた。処理は骨髄の提供から４時間以内に開始した。
【０２２０】
［骨髄の処理］
骨髄吸引物に係る全ての無菌処理はクラス100の生物学的安全キャビネット内で行った。吸引物を血液袋から移した滅菌済の250mL容器に移した。血液袋の内容物の体積を測定し、吸引物の試料を別に分けた。10倍量のACK-LYS溶液（BioSource International：NH4Cl [8.29 g/L]、KHCO3 [1.0 g/L]、EDTA [0.037g/L]）を吸引物に加えることで赤血球を溶解した。懸濁液を延伸することで有核細胞を分離した。上清を廃棄し、細胞をAFG104増殖培地（アルファ-MEM、10% (v/v)のウシ胎児血清及び4mMのL-グルタミン添加）に懸濁した。希釈及び遠心により増殖培地で２回洗浄した。最後の洗浄工程の後、細胞をAFG104増殖培地に再懸濁した。溶解／洗浄後の懸濁液の試料を別に分けた。有核細胞の数を数え、生存を確認した。骨髄吸引物から単核細胞を分離し、５個の培養容器、Nuncセルファクトリーに播種するのに用いた。播種は60,000±2000細胞/cm2で行った（ファクトリー当たり3.79×108細胞）。各ファクトリーに１リットルのAFG104増殖培地を添加した。セルファクトリーを３７℃の恒温器で恒温に保った。培養に際して5%CO2及び4%O2を通気した。培養の監視は２回行った。汚染の指標及び恒温器の培養条件が特定の範囲（37℃±2℃、4.0%±0.5% O2、5.0%±0.5% CO2）にあること確認した。７日間培養後、培地を各ファクトリーから取り出し、新しい培地に交換した。
【０２２１】
MCB105中での最初の増殖における集団倍加は、9.4回の集団倍加であった。MCB105を2mL分注し低温バイアル（cryovial）に詰めた。低温で保存した。液体窒素の気相中で-130℃にて貯蔵した。ワーキングセルバンク１（WCB1）をMCB105による増殖産物から作製した。WCB1は7.5から9.5回、集団倍化する。このため累積で16.9から18.9回集団倍加する。回収した細胞を0.8から1mL分注し（バイアル当たり1000万から2000万の生細胞）した。分注は低温バイアルに対して行い低温で保存した。液体窒素の気相中で-130℃にて貯蔵した。
【０２２２】
増殖、低温凍結及び試験工程をWCB2及びWCB3において繰り返した。WCB2及びWCB3は7.5から9.5回、集団倍化した。このためWCB2は累積で24.4から28.4回、集団倍加し、WCB3は累積で31.9から37.9回、集団倍加した。
【０２２３】
マスターセルバンク、ワーキングセルバンク（WCB1、WCB2、WCB3）、及びGBT900を低温バイアルに分注し、低温で保存し、液体窒素の気相中で-130℃にて貯蔵した。
【０２２４】
［セルバンクシステム］
セルバンクシステムは５つの異なるバンク作成法：MCB105、WCB1、WCB2、WCB3及びGBT009によって成り立っている。MCB105は9.4回倍加している。連続するWCBにおいて、各WCBは7.5から9.5回集団倍加し増殖している。GBT009の集団倍加回数の目標に到達している。このため、MCB105は累積で37.5から47.5回集団倍加し増殖がなされている。
【０２２５】
かかるセルバンクシステムではバンクが枯渇した場合にはWCB1、WCB2、WCB3及びGBT009の新しいロットをMCB105から作製できる。例えば枯渇したWCB2、ロット#S1はWCB1の同じロット、すなわちS1を作製するのに用いられるロット#F1-5のバイアルを増殖することでロット#S2として再生することができる。バンクを解凍し、同じ増殖方法と集団倍加を繰り返す。かかる増殖工程は全てのワーキングセルバンクを確立したときと同じである。現在のWCB3バンク、ロット#T2が枯渇した後、ロット#T3を再作製する。ロット#T2を作製したときと同じWCB2を用いる。かかる方法論によりWCB1、WCB2、WCB3及び最終産物、GBTのバイアル、ロット番号P5、P6、P7、その他の再作製を繰り返す。かかる手法により製造工程及び細胞製品に高い再現性、一貫性及び品質をもたらす。全ての細胞バンクを液体窒素の気相に貯蔵する（≦-130℃）。
【０２２６】
５日間さらに恒温で保ち（播種後１２日間）、接着性のコロニーの回収をトリプシン処理により行う。培養物から培養後の培地を取出し、微生物の液体培養の試験を行った（増殖せず）。またマイコプラズマの試験を行った（検出せず）。細胞がセルファクトリーに付着するが、500 mLのdPBS（カルシウム及びマグネシウム不含のダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した。溶液を除去し、廃棄物として廃棄した。トリプシン-EDTAを添加して細胞をファクトリーから分離した。細胞を滅菌済みの容器に移し、トリプシン処理した細胞と等量のAFG104を加えて、トリプシン-EDTAを中和した。細胞を遠心し細胞沈渣を増殖培地に再懸濁した。
【０２２７】
再懸濁した各細胞懸濁液を標本抽出し、細胞の計数、生存性及び純度を試した。工程内にあるという試験結果が受けいられるものであれば、細胞懸濁液をプール化した。プール化した懸濁液は標本抽出し、細胞数、生存性、純度及び性状を試験した。懸濁液をその後遠心し、上清をデカントして廃棄した。細胞の沈渣を低温保存緩衝液、CSM-55（平衡塩類緩衝液、米国薬局方5% v/v ジメチルスルホキシドを加えた米国薬局方4.5% w/vブドウ糖及び米国薬局方5% v/vヒト血清アルブミンからなる低温保存培地）に再懸濁した。懸濁液の細胞数に依拠してCSM-55の体積を計算した。CSM-55を加えることで濃度を1mL当たり100万細胞とした。CSM-55に細胞を再懸濁した後、低温保存する前に懸濁液を標本抽出し、細胞数、生存性、純度及び性状を確認した。
【０２２８】
クラス100生物学的安全キャビネットにおいて、259バイアルのMCB105を無菌操作により手作業で充填した。5 mLの各バイアルには2mLのCSM-55細胞懸濁液が含まれている。充填作業中、バイアル化作業における一貫性を保つために30バイアルごとに重量の確認を行った。目標体積（1.8から2.2mL）から外れていないことを確認した。バイアル化作業の完了後、バイアルを速度制御型の冷凍機で凍結した。細胞懸濁液は周囲の温度から4℃まで冷却した。バイアルが４℃で平衡化したら、その温度を-120℃まで段階的に下げた。永久貯蔵から取り出すまでの間この温度を維持するものとした。MCB105のバイアルを液体窒素保存容器（-130℃）の気相に貯蔵した。貯蔵容器の開封は制限した。
【０２２９】
［ワーキングセルバンク（WCB1、WCB2、WCB3）の調製］
製造工程は３つのWCBの連続的な生成からなる。連続する各セルバンクは一つ前のバンクの低温貯蔵細胞の標本に由来する。すなわちMCB105→WCB1→WCB2→WCB3となる。全ての培養操作は能動的な環境監視プログラムとともにクラス100の生物学的安全キャビネット内で行った。適当な上述のセルバンクから細胞を解凍することで各セルバンクの作製を開始した。MCB105の細胞の標本を低温貯蔵庫から取り出し、解凍し、AFG104増殖培地に再懸濁することでストック細胞懸濁液を作製した。ストック液から標本抽出し、細胞数及び生存性を試した。各ワーキングセルバンクに対して培養容器、Nuncセルファクトリーを用い、1cm2あたり30±5細胞を播種した。AFG104増殖培地で培養した。セルファクトリーを３７℃の恒温器で恒温に保った。培養に際して5%CO2及び4%O2を通気した。７日間培養後、培地を各ファクトリーから取り出し、新しい培地に交換した。培養後の培地にて微生物の液体培養の試験を行った。集団倍加の回数が7.5から9.5になるまでの期間さらにファクトリーを恒温に保った。
【０２３０】
接着性のコロニーの分離（回収）をトリプシン処理により行った。培養物から培養後の培地を取出し、微生物の液体培養の試験を行った。またマイコプラズマの試験を行った。細胞がセルファクトリーに付着していたが、dPBSで洗浄した。溶液を除去し、廃棄物として廃棄した。培養物にトリプシン-EDTAを添加して細胞をファクトリーから取出した。細胞を培養容器から分離した。細胞を滅菌済みの容器に移し、トリプシン処理した細胞にAFG104増殖培地を加えて、トリプシン-EDTAを中和した。細胞を遠心し細胞沈渣を増殖培地に再懸濁した。各セルファクトリーにおいて再懸濁した各細胞懸濁液を標本抽出し、工程内にあるかどうかを試した（細胞数、生存性及び純度）。プール化した細胞懸濁液として混合する前において、個々のファクトリーの細胞懸濁液は基準を満たすものであった。細胞懸濁液を混合する際、プール化した懸濁液は標本抽出し、細胞数、生存性、純度及び性状を試験した。懸濁液をその後遠心した。遠心後、上清をデカントして廃棄した。細胞の沈渣を低温保存緩衝液、CSM-55に再懸濁した。濃度を1mL当たり20万細胞とした。懸濁液は再度、標本抽出し、細胞数、生存性、純度及び性状を確認した。クラス100生物学的安全キャビネットにおいて、バイアルを無菌操作により手作業で充填した。2 mLのポリプロピレンのコーニング低温バイアルに1.0±0.2 mLを分注した。バイアル化作業における一貫性を保つために25バイアルごとに重量の確認を行った。バイアル化作業の完了後、バイアルを速度制御型の冷凍機で凍結した。細胞懸濁液は周囲の温度から4℃まで冷却した。その温度を-120℃まで段階的に下げた。取り出すまで液体窒素（-130℃）の気相に貯蔵した。
【０２３１】
［実施例１１］
ヒト骨髄由来間質細胞、脂質由来間質細胞、真皮繊維芽細胞、及びGM1ガングリオシド蓄積症と診断された対象の繊維芽細胞と同様に、不死化神経芽細胞腫細胞（SHSY-5Y、SHSY-S及びSK-N-AS）、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（CHO-K1）及びヒト胚腎臓細胞（HEK293）を流通元から入手した。細胞を24ウェルプレート上の標準培養培地に播種した。細胞は一晩の間、2000-20,000細胞／ウェルの密度で培養した。また標準培養培地で維持した（CONTROL）。また下記表４に列挙した条件に沿ってクロロキンで処理した（CLQ）。細胞は組織培養用恒温器にて、約37℃、加湿した大気下、約5%のCO2及び約21%のO2を含みN2で調整された条件で維持した。48-120時間の処理後、細胞を4%のパラホルムアルデヒドで固定しCTB-Alexa 488で染色することでGM1ガングリオシドを検出した。図１０及び１１はGM1陽性染色を示す蛍光画像である。標準培養培地のみにて維持された対照群と比べて、大部分の細胞でGM1の集積がみられることが示された（図１０及び１１並びに表４）。
表４．異なる細胞腫におけるCLQ処理によるGM1誘導
【０２３２】
【表４】
2016521967.tif 000007
【０２３３】
［実施例１２］
一頭の正常なヒツジと一頭の（ヒツジGM1ガングリオシド蓄積症に）罹患したヒツジ、生後４か月、サウスダコタのHoller Farmにて安楽死させた。5-10 mlの範囲の骨髄を大腿骨から採取し、標識を付した滅菌済みの50-mlの円錐状の試験管に分注した。試験管を輸送用の溶液（Brain BitsのHibernate A、Invitrogenの１×ペニシリン／ストレプトマイシン）で満たした。試料を氷上に置いてペンシルバニアのMalvernに24時間以内に輸送した。到着後、試験管の外側を清潔にし、滅菌済みの生物学的安全キャビネットに運び入れた。輸送用の溶液をデカントして、各骨髄に25mlのダルベッコのリン酸緩衝液（DPBS）を加えた。丁寧に繰り返し、骨髄／DPBS溶液を練和すことで細胞懸濁液を作製した。各細胞懸濁液を２本の500 mlの遠沈管（Corning Life Sciences）に分けた。各遠沈管に150 mlのACK溶解液（Invitrogen）を加えた。細胞懸濁液を10-20回、上下にピペッティングすることで溶液を混合した。各管に蓋をして２秒間ボルテックスした。細胞懸濁液を1350±50 RPMで10分間遠心し、低速でブレーキをかけた。Allegra 6R遠心機と振り子式のバケットを用いた。各試料の上清を吸引して除去した。残った細胞沈渣を10 mlのAFG104増殖培地（アルファ-MEM、10%ウシ胎児血清及び4mMのglutamax、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、１×ゲンタマイシン）に再懸濁した。正常なヒツジの骨髄由来の２つの細胞懸濁液を混合して50 mlの円錐管に入れた。罹患ヒツジ骨髄由来の２つの細胞懸濁液を混合して別の50 mlの円錐管に入れた。AFG104増殖培地を各細胞懸濁液に加えて最終的に体積を40 mlとした。試料を1350±50 RPMで10分間遠心し、低速でブレーキをかけた。Allegra 6R遠心機と振り子式のバケットを用いた。上清を廃棄した。細胞沈渣を20 mlのAFG104増殖培地にそれぞれ再懸濁した。AFG104増殖培地を加えて体積を40 mlに調整した。試料を1350±50 RPMで10分間遠心し、低速でブレーキをかけた。Allegra 6R遠心機と振り子式のバケットを用いた。上清を廃棄し細胞沈渣をAFG104増殖培地にそれぞれ再懸濁し、最終的に体積を30 mlとした。各試料の全細胞数と生存性を確認した。細胞をT-225フラスコ内のAFG104増殖培地に60,000±2000細胞/cm2で播種した。細胞を加湿した恒温器中で、4%O2、5%CO2及び37℃に設定し培養した。培養細胞に対して5日目に新しいAFG104増殖培地を与え、8日目に回収した（正常なヒツジの骨髄由来細胞）、又は9日目に回収した（罹患ヒツジの骨髄由来細胞）。かかる最初の回収物を世代1（P1）又はマスターセルバンク（MCB）とする。細胞の一部を低温保管した。残りの細胞を60細胞／cm2にて播種し、AFG104増殖培地にて5日間培養した。加湿した恒温器中で、4%O2、5%CO2及び37℃に設定した。培養細胞に対して5日目に新しいAFG104増殖培地を与え、9日目に回収した（正常なヒツジの骨髄由来細胞）、又は8日目に回収した（罹患ヒツジの骨髄由来細胞）。かかる次の世代の回収物を世代2（P2）又はワーキングセルバンク1（WCB1）とした。細胞の一部を低温保管した。残りの細胞を60細胞／cm2にて播種し、AFG104増殖培地にて5日間培養した。加湿した恒温器中で、4%O2、5%CO2及び37℃に設定した。培養細胞に対して5日目に新しいAFG104増殖培地を与え、10日目に回収した（正常なヒツジ及び罹患ヒツジの骨髄由来細胞）。かかる次の世代の回収物を世代3（P2）又はワーキングセルバンク2（WCB2）とした。正常なヒツジの骨髄由来細胞の倍加の時間はMCB、WCB1、及びWCB2のそれぞれにおいて22.14、23.03及び26.71時間であった。罹患ヒツジの骨髄由来細胞の倍加の時間はMCB、WCB1、及びWCB2のそれぞれにおいて22.19、22.77及び26.31時間であった。正常なヒツジの骨髄由来細胞の培養中の世代ごとの倍加回数はMCB、WCB1、及びWCB2のそれぞれにおいて8.67、9.38、及び8.09であった。罹患ヒツジの骨髄由来細胞の培養中の世代ごとの倍加回数はMCB、WCB1、及びWCB2のそれぞれにおいて89.73、8.43、及び8.21であった。
【０２３４】
［実施例１３］
以下に示すウシ及びヒツジのGMIの比較データは市販されているGM1研究用材料（Avanti & Matreya）及びFidiaにより製造されたGM1原料により製造された。Fidiaは先の臨床試験で用いられたものと同じ原料を製造している。全ての試験は研究開発用の環境で行った（GMP非準拠／非認証試験方法）。分析作業はヒツジ由来のGM1製剤を開発する中で行った。
【０２３５】
HPLC法を改良することで個別のGM1分子変異体の量比を測定した。試験結果はGM1分子のアルキル鎖の長さが異なることを示している。アルキル鎖は各GM1分子の非極性の末端部を構成している。GM1変異体のプロフィールを表す試験結果は下記表５に示す。試験した全てのロットにおいて、主として2種の変異体で占められており、存在する全GM1変異体の80%を超えていた。これらはd18:1 C18:0変異体及びd20:1 C18:0変異体であった。
表５：個々のGM1分子種の組成
【０２３６】
【表５】
2016521967.tif 000008
【０２３７】
［実施例１４］
本明細書で述べる低酸素、低密度条件に沿って生成された成人骨髄間質細胞に対してクロロキンを用いてガングリオシドの生成を誘導した。その後、細胞を回収し、溶解し、植えられた抽出物をカラム精製した。一回の精製後、試料を一緒に吸引した。精製カラムから得た抽出物を樹脂基板のTLCプレート（J.T. Bakerの2.5×7.5 cmのBaker-flexシリカゲルIB2-F）上でヒツジGM1標準（「GM1」）のとなりに展開した。展開はクロロホルム：メタノール：0.2%カルシウム（50：42：11）で行った。展開した後、りんモリブデン酸溶液（4.8% w/vエタノール）に浸漬することでプレートを染色し、ヒートガンで加熱した。図１２に示される通りGM1よりも溶解度の高い複数のバンドが見られた。GM1及び本発明のガングリオシドのRf値はそれぞれ0.45及び0.58であった。Rf値の比は1.26であった。Rf値は開始点からバンドすなわちスポットの中心までの長さを測定することで得た。
【０２３８】
さらにTLC試験を行い、抽出物がガングリオシドを含有することを確かめた。抽出物をさらにTLCに供した。超高純度のシリカゲル（Silicycle）の250μｍの層で被覆された2.5×7.5 cmのガラスプレートを用いた。クロロホルム：メタノール：0.2%カルシウム（50：42：11）で展開した。80mLの濃塩酸、0.25mLの0.1M硫酸銅、10mLの2%レゾルシノール及び10mLの水を含む溶液に浸漬して染色した。オーブンにて20分間100℃に加熱した。精製カラムから得られた抽出物をGM1の隣で展開した。
【０２３９】
図１３に示される通り、抽出物中のガングリオシドは、プレート上でより長く展開された。このことから、かかるガングリオシドの極性はGM1より高いことが示された。GM1及びかかるガングリオシドのRf値はそれぞれ0.53及び0.65であった。Rf値の比は1.23であった。Rf値は開始点からバンドすなわちスポットの中心までの長さを測定することで得た。
【０２４０】
また抽出物中には極性の異なる不純物が存在していた。図１２と図１３とを比較した時消失するバンドのあることから、ガングリオシドと無関係な、極性の異なる不純物の存在が示された。しかしながら、極性の異なる不純物はクロマトグラフィーをさらに行った後に中和することで、そのたびに除去される。
【０２４１】
次にガングリオシドの存在をタンデム質量分析（「MS/MS」）で確認した。誘導した細胞及び誘導していない細胞を回収し、溶解して得た抽出物をMS/MSに供した。図１５及び１６に示されるように、ガングリオシドの分子量の領域で反応強度が増加した。このことから誘導した細胞でガングリオシドの生成が高まることが示された。
【０２４２】
［実施例１５］
【０２４３】
［試料抽出］
【０２４４】
実施例１０の方法に沿って作製した成人骨髄間質細胞（「ABMSC（GBT009）」）の細胞試料を冷凍機から取り出し、室温で解凍した。分注する前に細胞試料をボルテックスで混合した。
【０２４５】
100μＬの分量のヒトABMSC（GBT009）細胞を900μＬの水と混合して10倍希釈液を作製した。その後、10倍希釈した細胞のうち100μＬのをとりさらに900μＬの水と混合して100倍希釈液を作製した。かかる画分を較正標準及びQC試料の調製に用いた。構成要素に合わせて体積の増減を調整した。
【０２４６】
100μＬの分量の上記画分をガラス遠心管に移した。試料には以下の表に示す試験用標準溶液10μＬを添加した：
【０２４７】
【表６】
2016521967.tif 000009
【０２４８】
270μＬのメタノールを各管に加えた。135μＬのクロロホルムを各管に加えた。試料を５分間ボルテックスした。試料を14,000rpmで〜10分間遠心した。上清を各新しい管に移して沈渣を廃棄した。130μＬの水を各管に加えて１分間ボルテックスした。試料を14,000rpmで〜10分間遠心した。上層の300μＬをLC-MS/MS分析用の挿入器具に取り付けたガラスバイアルに移した。
【０２４９】
［LC-MS/MSの条件］
【０２５０】
［HPLCの条件］
【０２５１】
HPLCシステム：シマヅLC-20A；カラム：Fortis、30×2.1 mm、5 μｍ；MPA：5 mM NH4OAc水溶液；MPB：Methanol；流速：0.5 mL/mL；時間（分）0、0.5、1、3、3.1、4.5；B(%) 70、70、95、95、70、70；インジェクション容量：10 μＬ
【０２５２】
［質量分析の条件］
【０２５３】
装置：API 4000 LC-MS/MSシステム；イオン化モード：ターボイオンスプレー、ネガティブ（ESI-）；スキャンモード：多重反応モニタリング（MRM）；イオンスプレー電圧（IS）：-4500 V；温度（TEM）：500℃；カーテンガス（N2）（CUR）；衝突ガス（CAD）：6；ガス１：60；ガス２：60；デクラスタリング電位（DP）：-80 V；衝突エネルギー（CE）：-90 V；エントランス電位（EP）：-10 V
【０２５４】
［MRMトランジション］
【０２５５】
GM1及びGM1bが主要な２つのガングリオシドである。これらは市販のヒトGM1標準試料の材料において2:1の比で含まれている。これらのトランジションイオンを他の14の可能なバリアンス（variances）とともに以下に列挙する。
【０２５６】
【表７】
2016521967.tif 000010
【０２５７】
［較正標準］
［画分較正標準］
【０２５８】
較正標準は希釈したヒトABMSC（GBT009）細胞画分（1:100水希釈）で準備し、上述の方法に従い抽出した。GM1標準試料は約2:1のGM1（m/z 1544.8）及びGM1b（m/z 1572.9）を含有する。このためGM1（m/z 1544.8）に対する較正曲線の範囲は10 ng/mLから5,000 ng/mLであった。またGM1b（m/z 1572.9）に対する較正曲線の範囲は5 ng/mLから2,500 ng/mLであった。GM1及びGM1bに対する典型的な較正曲線を図１７及び図１８にそれぞれ示す。較正曲線はGM1及びGM1bの双方において線形性があった。標準試料が無いことから、他のGM1のバリアンスでは較正曲線を生成できなかった。
【０２５９】
［画分較正標準対溶媒構成標準］
【０２６０】
ヒトABMSC（GBT009）細胞画分は内因性のGM1を含有しているのでこれらが定量を阻害する。このため定量のため他の方法を用いた。水のみ（細胞不含）を用い、同一水準の標準ワーキング溶液を添加し、同じ方法で抽出した。結果を図１９及び２０に示す。黒い点を伴う線は細胞画分の較正曲線である。一方、輪になっている点は水抽出標準である。水抽出標準は細胞画分から抽出した標準と同様であることを示す結果となった。このため、ブランクのヒトABMSC（GBT009）細胞画分では内因性のGM1の水準が高いものの、複数のGM1の定量分析において細胞画分を水標準曲線で置き換えることが可能である。
【０２６１】
［正確度及び精度］
品質管理（QC）試料を３つの濃度水準で調製した。５回繰り返した。各水準についてヒトABMSC（GBT009）細胞画分において行った。試料は上述の方法で抽出した（「試料抽出」）。これらのQC試料はヒトABMSC（GBT009）細胞画分の較正曲線に沿って分析した。逆算した濃度を表８及び９（Tables 6 and 7）に示す。３つの平行試験（ラン）においてGM1（m/z 1544.8）に対するイントララン精度（%CV）の範囲は1.9%から15.3%であった。GM1（m/z 1544.8）に対するイントララン正確度（%Bias）は-12.0%から3.8%であった（Table 1）。GM1b (m/z 1572.9)に対するイントララン精度（%CV）の範囲は3.2%から18.6%であった。GM1b (m/z 1572.9)に対するイントララン正確度（%Bias）は-14.6%から3.5%であった（Table 2）。GM1（m/z 1544.8）に対するインターラン精度（%CV）の範囲は4.2%から11.7%であった。GM1（m/z 1544.8）に対するインターラン正確度（%Bias）は-9.6%から-1.6%であった（Table 1）。GM1b (m/z 1572.9)に対するインターラン精度（%CV）の範囲は4.0%から16.2%であった。GM1b (m/z 1572.9)に対するインターラン正確度（%Bias）は-11.2%から-5.3%であった（Table 2）。分析方法はヒトABMSC（GBT009）細胞画分のGM1及びGM1bの分析に対して正確であり再現性があることを示す結果となった。
表８（Table 6）：逆算したGM1のQC試料−ヒトABMSC（GBT009）細胞画分における確認
表９（Table 7）：逆算したGM1bのQC試料−ヒトABMSC（GBT009）細胞画分における確認
【０２６２】
【表８】
2016521967.tif 000011
【０２６３】
【表９】
2016521967.tif 000012
【０２６４】
［クロマトグラム］
ヒトABMSC（GBT009）細胞画分のブランク及び標準を添加したもののクロマトグラムの代表をいくつか図２１から２７に示す。
【０２６５】
図２１はヒトABMSC（GBT009）の100倍希釈後の細胞ブランクの１６個のトランジションイオンのクロマトグラムを表す。100倍希釈後において、なお細胞ブランク画分中に複数のGM1が検出されることを示す。m/z 1516.8（d18:1/C16:0又はd16:1/C18:0）が最も豊富であった。
【０２６６】
図２２はヒトABMSC（GBT009）の100倍希釈後の細胞ブランクのGM1 (m/z 1544.8)のMRMイオンクロマトグラムである。図２３は細胞画分（100×希釈）中に10 ng/mLの濃度で調製されたGM1 (m/z 1544.8)標準のMRMイオンクロマトグラムである。同様に図２４はヒトABMSC（GBT009）の100倍希釈後の細胞ブランクのGM1b (m/z1572.9)のMRMイオンクロマトグラムである。また図２５は細胞画分（100×希釈）中に5 ng/mLの濃度で調製されたGM1b (m/z1572.9)標準のMRMイオンクロマトグラムである。
【０２６７】
こららのクロマトグラムは、希釈されたヒトABMSC（GBT009）の細胞画分がなお少量のGM1 (m/z 1544.8)及びGM1b (m/z1572.9)を含有しているにも関わらず、GM1 (m/z 1544.8)に対して10 ng/mLのLLOQにて、またGM1b (m/z1572.9)に対して5 ng/mLのLLOQにて定量用の較正曲線の作成に用いることができることを示す。
【０２６８】
図２６及び図２７はGM1 (m/z 1544.8)及びGM1b (m/z1572.9)のクロマトグラムである。希釈細胞画分中に高い濃度水準、GM1に対して2,500 ng/mLまたGM1b に対して1,250 ng/mLで調製されている。
【０２６９】
［結論］
【０２７０】
上記方法はヒトABMSC（GBT009）細胞画分におけるGM1 (m/z 1544.8)及びGM1b (m/z1572.9)の定量分析において良好な線形性、正確性及び再現性を示す。
【０２７１】
水で作成した較正標準及び希釈したヒトABMSC（GBT009）細胞画分で作成した構成標準は同等の結果を示した。このため、ヒトABMSC（GBT009）の内因性の複数のGM1のレベルがより高い場合は、水較正曲線で置き換えて、ヒトABMSC（GBT009）の複数のGM1の定量ができる。GM1 (m/z 1544.8)及びGM1b (m/z1572.9)に加えて、他の14の可能なバリアンスもまた観察した。各測定可能なバリアンスの面積カウント（area counts）をヒトABMSC（GBT009）細胞画分中の量の推定に用いることができる。
【０２７２】
［実施例１６］
【０２７３】
この試験の目的は実施例１５で議論したLC-MS/MS法を適用し最適化することである。かかる方法では陰イオンMS/MS検出とともに逆相クロマトグラフィーを用いることで細胞画分中の定量可能なGM1及び関連するガングリオシドに充当する。この試験では試料群に対するGM1の存在の分析の前に方法を最適化する。
【０２７４】
［試料］
試料に以下の個別のSGS Mスキャン番号を割り振る。
【０２７５】
【表１０】
2016521967.tif 000013
【０２７６】
直接注入試験をするために、ヒツジGM1標準（M-Scan # 108484）をメタノールに溶解することで１mg/mlのストック溶液を作製した。かかるストック溶液を移動相Ａ：移動相Ｂ（1:1）v/v（下記の移動相の組成参照）で希釈することで濃度を10 μl/mlとした。一定分量のかかる溶液を直接注入試験に用いることでMS及びMS/MSの条件を最適化した。標準ストック溶液をメタノールで50 ng/ml、100 ng/ml、250 ng/ml及び1000 ng/mlの濃度に希釈することで較正線を得た。各溶液に等体積の水を更に加えて希釈することで、最終的なGM1の濃度を25 ng/ml、50 ng/ml、125 ng/ml及び500 ng/mlとした。ヒトGM1標準（M-Scan # 108483）に対して、一定分量（１μｌ）をメタノールで１ｍｌに希釈した。かかる溶液をさらに各溶液に等体積の水を更に加えて希釈することで、最終的な濃度を500 ng/mlとした。
【０２７７】
一定分量の（200μｌ）の各試料に200μｌの水を加えて希釈した。これらの溶液をLC-MS/MSで分析した。
【０２７８】
［LC・MSクロマトグラフィー］
【０２７９】
ポンプ：アジレント1200バイナリーUPLCシステム
【０２８０】
移動相Ａ：10mMの酢酸アンモニウム
【０２８１】
移動相Ｂ：メタノール
【０２８２】
勾配：時間（分）0、4、7.5、7.6、15及びＢ（％）35、95、95、35、35
【０２８３】
流速：0.4 ml／分
【０２８４】
カラム：ウォーターズAcquity C18 (2.1 x 50 mm)、S/N 011336234151 03
【０２８５】
カラム温度：４０℃
【０２８６】
注入（インジェクション）体積：２０μｌ
【０２８７】
［検出］
【０２８８】
検出はABI Sci ex 4000 Q-TRAP質量分析器を陽イオンESIモードで運転しながら行った。LC-MS/MS分析において、m/z 290.1の断片とともにm/z 1545.0の親イオンを用いてMRMトランジションを監視した。
【０２８９】
［結果］
【０２９０】
［初回の直接注入］
【０２９１】
次のLC-MS/MS分析のために、一定分量のヒツジGM1標準を装置ソースに直接注入することでMS及びMS/MSの条件を最適化した。擬似分子（pseudomolecular）イオンの強度及び断片イオンの強度を最適化するためにソース電圧を調整した
【０２９２】
下記は最終的な最適化された各数値の詳細である。
【０２９３】
File Information for Sample 1 (M-Scan#108484 Ovine GM1 Std) of 10746.wiff
【０２９４】
File Name: 107 46.wiff
【０２９５】
Original Name: 107 46.wiff
【０２９６】
Log Information from Devices at Start of acquisition:
【０２９７】
Mass Spectrometer 4000 Q TRAP 0
【０２９８】
Config Table Version 30
【０２９９】
Firmware Version M401402 B4T0301 M3L 1415 B3T0300
【０３００】
Component Name Linear Ion Trap Quadrupole LC/MS/MS Mass Spectrometer
【０３０１】
Component 10 4000 Q TRAP
【０３０２】
Manufacturer AB Sciex Instruments
【０３０３】
Model 10226430
【０３０４】
Serial Number AR20490710
【０３０５】
Time from start =0.0000 min Mass Spectrometer 4000 Q TRAP
【０３０６】
Start of Run - Detailed Status
【０３０７】
Vacuum Status At Pressure
【０３０８】
Vacuum Gauge (1 Oe-5 Torr) 3.2
【０３０９】
Backing Pump Ok
【０３１０】
Interface Turbo Pump Normal
【０３１１】
Analyzer Turbo Pump Normal
【０３１２】
Sample Introduction Status Ready
【０３１３】
Source/Ion Path Electronics On
【０３１４】
Source Type Turbo Spray
【０３１５】
Source Temperature (at setpoint) 0.0 C
【０３１６】
Source Exhaust Pump Ok
【０３１７】
Interface Heater Ready
【０３１８】
Time from start =0.0167 min Stopping acquisition.
【０３１９】
Time from start =0.5500 min Mass Spectrometer 4000 Q TRAP
【０３２０】
-End of Run - Detailed Status
【０３２１】
Vacuum Status At Pressure
【０３２２】
Vacuum Gauge (1 Oe-5 Torr) 3.2
【０３２３】
Backing Pump Ok
【０３２４】
Interface Turbo Pump Normal
【０３２５】
Analyzer Turbo Pump Normal
【０３２６】
Sample Introduction Status Ready
【０３２７】
Source/Ion Path Electronics On
【０３２８】
Source Type Turbo Spray
【０３２９】
Source Temperature (at setpoint) 0.0 C
【０３３０】
Source Exhaust Pump Ok
【０３３１】
Interface Heater Ready
【０３３２】
Time from start =0.5667 min
【０３３３】
Acquisition InfoAcquisition Method: \testTune.dam
【０３３４】
Sample Acq Duration: 59min60sec
【０３３５】
Number of Scans: 3582
【０３３６】
Periods in File:  1
【０３３７】
Batch Name: \ManuaITune.bat
【０３３８】
Submitted by:  4000TRAP\Fred(Fred)
【０３３９】
Logged-on User: 4000TRAP\Fred
【０３４０】
Synchronization Mode:  No Sync
【０３４１】
Auto-Equilibration:  Off
【０３４２】
Comment:
【０３４３】
Software Version:  Analyst 1.4.2
【０３４４】
Set Name:  Set 1
【０３４５】
Sample Name    M-Scan#108484 Ovine GM1 Std
【０３４６】
Sample ID    TuneSamplelD
【０３４７】
Sample Comments:
【０３４８】
Quantitation Information:
【０３４９】
Sample Type: Unknown
【０３５０】
Dilution Factor: 0.000000
【０３５１】
Custom Data:
【０３５２】
Quantitation Table:
【０３５３】
Period 1:
【０３５４】
Scans in Period: 3582
【０３５５】
Relative Start Time:  0.00 msec
【０３５６】
Experiments in Period:  1
【０３５７】
Period 1 Experiment 1:  
【０３５８】
Scan Type:  Product Ion (MS2)
【０３５９】
Polarity:  Negative
【０３６０】
Scan Mode: Profile
【０３６１】
Ion Source: Turbo Spray
【０３６２】
Product Of: 1545.00 amu
【０３６３】
Resolution Q1: Unit
【０３６４】
Resolution Q3:  Low
【０３６５】
Intensity Thres.: 0.00 cps
【０３６６】
Settling Time: 0.0000 msec
【０３６７】
MR Pause: 5.0070 msec
【０３６８】
MCA:  Yes
【０３６９】
Center/Width: No
【０３７０】
Step Size: 0.10 amu
【０３７１】
Start (amu)  150.00; Stop (amu) 400.00; 
【０３７２】
Time (sec) 1.00; Param; Start; Stop
【０３７３】
Parameter Table (Period 1 Experiment 1)
【０３７４】
CUR: 15.00
【０３７５】
TEM: 0.00
【０３７６】
GS1: 15.00
【０３７７】
GS2: 0.00
【０３７８】
ihe: ON
【０３７９】
IS: -4500.00
【０３８０】
CAD: 7.00
【０３８１】
DP -200.00
【０３８２】
EP -10.00
【０３８３】
CE -90.00
【０３８４】
CXP -40.00
【０３８５】
Resolution tables
【０３８６】
Quad 1;  Negative;  Unit
【０３８７】
IE1      -1.000
【０３８８】
Mass (al11u)    Offset Value
【０３８９】
44.998    0.065
【０３９０】
585.385    0.348
【０３９１】
933.636    0.524
【０３９２】
1223.845    0.671
【０３９３】
1572.097    0.855
【０３９４】
1863.306    1.015
【０３９５】
2037.431    1.110
【０３９６】
2800.000    1.525
【０３９７】
Quad 3;  Negative;  Low
【０３９８】
Mass (al11u)    Offset Value
【０３９９】
44.998    0.030
【０４００】
585.385    0.368
【０４０１】
933.636    0.573
【０４０２】
1223.845    0.734
【０４０３】
1572.097    0.946
【０４０４】
1863.306    1.130
【０４０５】
2037.431    1.240
【０４０６】
12800.000    1.760
【０４０７】
Calibration tables
【０４０８】
Quad 1;  Negative;  Unit Resolution
【０４０９】
Mass (amu)    Dac Value
【０４１０】
646.524    12264
【０４１１】
906.334    17203
【０４１２】
1166.144    22142
【０４１３】
1425.954    27081
【０４１４】
1685.764    32018
【０４１５】
Quad 3;  Negative;  Unit Resolution
【０４１６】
Mass (amu)    Dac Value
【０４１７】
180.973    3406
【０４１８】
248.960    4698
【０４１９】
316.947    5989
【０４２０】
384.935    7281
【０４２１】
Instrument Parameters:
【０４２２】
Detector Parameters (Negative):
【０４２３】
CEM 2300.0
【０４２４】
Keyed Text:
【０４２５】
File was created with the software version: Analyst 1.4.2
【０４２６】
［LC-MS/MS］
【０４２７】
［ヒツジGM1標準］
各ヒツジGM1標準溶液（上述の通り調製）を上述の通りLC-MS/MSで順に分析し、これを繰り返した。これらの分析で得られたデータを以下の表１１（Table 8）にまとめる。
表１１（Table 8）ヒツジ標準のデータの要約
【０４２８】
【表１１】
2016521967.tif 000014
【０４２９】
これらの値の相関係数（r2）は0.99973である。このため傾き28の合理的な直線相関のあることが示された。
【０４３０】
［ヒトGM1］
【０４３１】
ヒトGM1標準について繰り返し行った分析におけるLC-MS/MSプロフィールより平均ピーク面積1.0845e4が得られた。ヒツジ標準の較正データを用いた場合、かかる結果は約304μｇ／μｌの濃度を示しており、61%の回収率であった。
【０４３２】
［試料分析］
【０４３３】
以下の表１２（Table 9）にまとめられる通り、各試験の分析データは全ての被験試料中にGM1が存在することを表す。
表１２（Table 9）被験試料中のGM1の要約
【０４３４】
【表１２】
2016521967.tif 000015
【０４３５】
［結論］
GM1の検出のためのLC-MS/MS法の適用と最適化は成功した。順に得られた標準調製液のデータよりLOOが約10 ng/mlであることを示された。試験された全ての試料中に約15-300 ng/mlの水準でGM1が含まれていた。しかしながら、全ての試料のクロマトグラフィーのプロフィールはトランジションm/z 1545---7290における分解された反応が３つあることを示しており、これらの試料中には、どの標準中にも存在しない、密接に相関する分子種がいくつか存在することを示唆している。
【０４３６】
［実施例１７］
【０４３７】
実施例１６に示したGM1分析の要約表をさらに添付した。これには分析中に観察された付加的な反応が含まれている。
［LC-MS/MSにおける主要な反応の要約］
【０４３８】
【表１３】
2016521967.tif 000016
【０４３９】
［実施例１８］
以下の実施例は実施例１６の方法で作成された対照と誘導済みABMSCとの対比に係るスキャン結果を示す。図２８及び２９は対照及び誘導済みABMSCにおけるMS TICプロフィールとUVプロフィールとの重ね合わせである。
【０４４０】
［実施例１９］
【０４４１】
以下の試料を用いて新たに試験した。
【０４４２】
１）1mg以上のヒツジGM1標準；
【０４４３】
２）1mg以上のヒトGM1標準；
【０４４４】
３）誘導済み及び未誘導のSHSY細胞抽出物；及び
【０４４５】
４）0.1mg以上のGM2及びGM3標準。
【０４４６】
［分析方法］
【０４４７】
分析はMRM検出付きのLC-MSで行った。全てのGM-1関連ガングリオシドをモニタリングした。検出はまたUV吸光でも行った。
【０４４８】
［結果］
【０４４９】
これらのスキャンは特定のガングリオシドの分子種に特異的なイオンについて行った。例えば、Acqファイル：12136（BRW675-191のデータ）において、GM2イオンはm/z 1439 (d20:1-20:0)、1383 (d18:1-18:0)及び1355 (d18:1-16:0)にプロットされた。同様のプロットがGM1及びGM3の分子種並びに全てのBRW675-191で得られた。スキャン結果は図３０−３５に示す。
【０４５０】
これらは、これらの条件下で割り当てることのできたガングリオシド成分だけである。これらのスキャン結果からはGM1a、GA1、GT1b又はGQ1bのいずれの存在についても明らかにならない。GM3分子種のいくつかが比較的豊富な点を除き、全般的にサンプル間でプロフィールは同様である。
【０４５１】
［実施例２０］
【０４５２】
本実施例では実施例１９のスキャン結果に対するさらなる分析について論じる。分析
実施例１９で得られたデータを分析したところ、GM分子種の相対的存在量を推定した：
【０４５３】
BRW675-175 (対照SHSY):
【０４５４】
GM1：  2.4%
【０４５５】
GM2：  25.7%
【０４５６】
GM3：  71.9%
【０４５７】
BRW675-191 (誘導済みSHSY)：
【０４５８】
GM1：  12.9%
【０４５９】
GM2：  68.1%
【０４６０】
GM3：  18.9%
【０４６１】
市販されている標準を用いて、神経芽細胞腫SHSY細胞の対照及び誘導されたものの抽出物におけるGM1、GM2及びGM3の相対的存在量を測定した。標準に特異的に存在することのない付加的なピークがスキャン結果中に存在していた。これらは新しいガングリオシド変異体が存在することを示す。なぜなら、かかるスキャン結果はガングリオシド分子種特異的なイオンにより生じたものだからである。
【０４６２】
請求項の解釈には要約及び抜粋の章ではなく詳細な説明の章が用いられるべきである。発明者の熟慮の上で、要約及び抜粋の章において一以上の典型的な本発明の実施形態が明らかにされているが、すべてが明らかにされているわけではない。このため要約及び抜粋の章はいかなる場合も本発明及び列挙された請求項を限定的に解釈するのに用いられるべきではない。
【０４６３】
本発明は特定の機能の実施及びそれらの相関を詳述する機能的な構成部分に依拠して上記の通り説明した。これらの機能的な構成部分の境界は記載の用のために適宜定義される。境界の変更は特定の機能及びそれらの関係が適切に実行できるの限り定義できる。
【０４６４】
特定の実施形態にかかる上述の記載は本発明の一般的な性質、すなわち他者が当該分野の技術の範囲の知識を用いることで特定の実施形態のように、過度の実験を伴わずに、本発明の一般的なコンセプトから離れることなく、様々な応用へと容易に改変できる及び／又は適用できることを完全に明らかする。このため、本明細書の教示及び示唆に基づきかかる適用及び改変は開示された実施形態と等しい意味及び範囲を有する。本明細書の表記又は語法は記述のためのものであり、限定のためのものではなく、本詳細な説明における表記又は語法は教示及び示唆に照らして当業者に解釈されるよう理解されるべきである。
【０４６５】
本発明の広がりと範囲は上述の典型的な実施形態によって限定されるべきではないが、以下の請求項及びそれと等価な範囲に沿って定義される。
【図１Ａ】
2016521967.tif 000017
【図１Ｂ】
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【図２】
2016521967.tif 000019
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2016521967.tif 000033
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【国際調査報告】
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