(57)【要約】本発明は、治療用ＨＰＶワクチンを初回刺激−追加刺激レジメンで粘膜組織に投与し、それにより抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫応答およびＣＤ８＋Ｔ細胞における組織常在記憶Ｔ細胞（Ｔｒｍ）マーカーの発現を生じさせる方法を提供する。一部の実施形態では、本発明の方法において、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチンおよびＴＡ−ＨＰＶを初回刺激−追加刺激レジメンで使用し、これにより、頸腟路におけるものを含めた、感染粘膜組織へのワクチン接種により、当該組織および所属リンパ節において筋肉内ワクチン接種と比較して強力な抗腫瘍効果およびより有効な局所免疫応答が惹起されることが示される。さらに、Ｔｒｍ媒介性免疫応答の誘導を標的とすることは、特に治療用ＨＰＶワクチンに関して理想的な方法体系としての機能を果たし得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の粘膜組織におけるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連疾患に対する免疫応答を生じさせるための方法であって、前記方法は、以下：
ａ）前記被験体の筋組織または粘膜組織にｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０からなる第１のワクチン構築物を含む組成物の有効量を投与するステップ、および
ｂ）前記粘膜組織に第２のワクチン構築物を含む組成物の有効量を投与するステップ
を包含する、方法。
【請求項２】
前記第２のワクチン構築物が、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０またはＴＡ−ＨＰＶである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２のワクチン構築物が、ＴＡ−ＨＰＶである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第２のワクチン構築物が、前記第１のワクチン構築物の投与後５〜３０日以内に投与される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第２のワクチン構築物が、前記第１のワクチン構築物の投与後６日以内に投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記組織が、口腔粘膜、鼻粘膜、頸腟部粘膜および肛門粘膜からなる群より選択される粘膜組織である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記粘膜組織が、前記頸腟部粘膜である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＨＰＶ関連疾患が、がんまたはがんの前駆病変である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＨＰＶ関連疾患が、がんであり、前記がんが、子宮頸がんである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記被験体が、ＨＰＶ関連疾患であると診断されている、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記被験体が、子宮頸がんまたはがんの前駆病変であると診断されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記被験体が、ＨＰＶ関連疾患であると診断されていない、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
組成物を投与するステップが、前記組成物を注射することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
粘膜組織に組成物を投与するステップが、前記組成物を前記粘膜組織の粘膜下領域内に注射することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
子宮頸がんまたはがんの前駆病変の処置を必要とする被験体において子宮頸がんまたはがんの前駆病変を処置するための方法であって、前記方法は、以下：
ａ）前記被験体の頸腟部の筋組織または粘膜組織にｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０からなる第１のワクチン構築物を含む組成物の有効量を投与するステップ、および
ｂ）前記頸腟部の筋組織または粘膜組織に第２のワクチン構築物を含む組成物の有効量を投与するステップ
を包含する、方法。
【請求項１６】
前記第２のワクチン構築物が、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０またはＴＡ−ＨＰＶである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２のワクチン構築物が、ＴＡ−ＨＰＶである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２のワクチン構築物が、前記第１のワクチン構築物の投与後５〜３０日以内に投与される、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２のワクチン構築物が、前記第１のワクチン構築物の投与後６日以内に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が少なくとももう１回繰り返される、請求項１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法が繰り返されない、請求項１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
組成物を投与するステップが、前記組成物を注射することを含む、請求項１５から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
粘膜組織に組成物を投与するステップが、前記組成物を前記粘膜組織の粘膜下領域内に注射することを含む、請求項１５から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１のワクチン構築物を投与した後に、少なくとも１種の生物学的に活性な作用因子の有効量を投与するステップを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記生物学的に活性な作用因子が、イミキモド（１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン）である、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１３年８月６日に出願された米国仮特許出願第６１／８６２，７６８号（この内容は、参考として本明細書に援用される）への優先権の利益を主張する。
【０００２】
政府の利益についての声明
この発明は、ＮＩＨに付与された助成金番号ＣＡ０９８２５２およびＣＡ１１４４２５の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、子宮頸がん、外陰がん、腟がん、陰茎がん、口腔がん、咽頭がんおよび肛門がん、ならびに肛門生殖器コンジローマまたは性器いぼなどの非腫瘍形成性疾患（ｎｏｎ−ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）の主要な病原体である。子宮頸がんは世界的に３番目に多い女性のがんである。ＨＰＶが子宮頸がんの病原因子として同定されたことにより、確立されたＨＰＶ感染がＨＰＶによる前がん性病変およびがん性病変に進行するのを阻害するための治療用ＨＰＶワクチンを開発する機会が生じている。２種のＨＰＶウイルス腫瘍性タンパク質、Ｅ６およびＥ７が細胞の形質転換の誘導および維持に必要であり、ＨＰＶ関連がんにおいて一貫して同時発現する。したがって、Ｅ６およびＥ７は治療用ＨＰＶワクチンを開発するための理想的な標的を代表する。
【０００４】
子宮頸がんは、子宮頸部の上皮で生じる細胞変化であり、ゆっくりと次第に進展する前駆病変（子宮頸部上皮内新形成（ＣＩＮ））によって最初に明らかになり、これは、低悪性度の扁平上皮内病変と高悪性度の扁平上皮内病変（それぞれＬＳＩＬおよびＨＳＩＬ）に分類することができる。ＨＳＩＬの５０％が最終的に子宮頸がんに進行する。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）腫瘍性タンパク質によって媒介される細胞周期制御の変化が子宮頸がんにおける主要な分子作用機構である。ＨＰＶ感染は極めて一般的であり、生殖可能な女性の生涯リスクは約８０％である。しかし、大多数の女性では、ＨＰＶの型に関係なく感染が排除され、有害な健康への影響は生じない。子宮頸部の病変に最も頻繁に関与するＨＰＶの型はＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８であり、これらにより、合わせて子宮頸がんの症例の７０％が引き起こされる。腫瘍形成性ＨＰＶ感染は、子宮頸部上皮細胞の腫瘍形成性形質転換の因子として十分ではなくとも、必要なものである。ウイルス排除を導く有効な免疫応答などの追加的な補因子により、ＨＰＶ感染が子宮頸がんに至るかどうかが決定される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、子宮頸がんを含めたＨＰＶ関連疾患に対するより良好な処置レジメンが依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ある実施形態によると、本発明は、被験体の粘膜組織におけるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連疾患に対する免疫応答を生じさせるための方法であって、ａ）被験体の筋組織または粘膜組織にｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０からなる第１のワクチン構築物を含む組成物の有効量を投与するステップ、およびｂ）その後、被験体の粘膜組織に第２のワクチン構築物を含む組成物の有効量を投与し、それにより、被験体におけるＨＰＶ感染に対する免疫応答を引き出すステップを含む方法を提供する。
【０００７】
別の実施形態によると、本発明は、被験体における子宮頸がんを処置するための方法であって、ａ）被験体の筋肉または腟の粘膜組織にｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０からなる第１のワクチン構築物を含む組成物の有効量を投与するステップ、およびｂ）その後、被験体の粘膜組織に第２のワクチン構築物を含む組成物の有効量を投与し、それにより、被験体における子宮頸がんに対する免疫応答を惹起するステップを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、細胞内ＩＦＮ−ｇサイトカイン染色、その後フローサイトメトリー分析を使用したＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答の特徴付けを例示する。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群当たり５匹）に対して、筋肉内へのｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡ（マウス当たり５０μｇ）での初回刺激（ｐｒｉｍｅ）、続いて、６日後に、腹腔内注射によるＴＡ−ＨＰＶ（マウス当たり１×１０７ｐｆｕ）での追加刺激（ｂｏｏｓｔ）を用いたワクチン接種を行ったか、ＤＮＡでの初回刺激、続いてＤＮＡでの追加刺激を用いたワクチン接種を行ったか、ＴＡ−ＨＰＶのみを用いたワクチン接種を行ったか、またはワクチン接種を行わなかった。最後の免疫化の１週間後、脾細胞をフローサイトメトリーによって分析した。示されているデータは代表的なフローサイトメトリー分析からのものである。右上端の数字は、総脾細胞１０５個中のＣＤ８＋ＩＦＮ−ｙ＋Ｅ７特異的Ｔ細胞の数を示す。
【図２】図２は、Ｅ７ペプチド負荷Ｈ−２Ｄｂ四量体染色を使用した、脾臓中のＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の特徴付けである。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群当たり５匹）に対して、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０（マウス当たり５０μｇ）での初回刺激、続いて、６日後にＴＡ−ＨＰＶ（マウス当たり１×１０７個）での追加刺激を頸腟部内（ＩＣＶ）または筋肉内（ＩＭ）のいずれかに投与してワクチン接種を行った。２回目の免疫化の１週間後、脾細胞をフローサイトメトリーによって分析した。Ａ．代表的なフローサイトメトリー分析である。Ｂ．棒グラフである。値は平均±ＳＤとして示されている。＊ｐ＜：０．０５、＊＊ｐ＜：０．０１、ｎｓ、有意でない。
【図３】図３は、Ｅ７ペプチド負荷Ｈ−２Ｄｂ四量体染色を使用した、末梢血中のＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の特徴付けである。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群当たり５匹）に対して、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０（マウス当たり５０μｇ）での初回刺激、続いて、６日後にＴＡ−ＨＰＶ（マウス当たり１×１０７個）での追加刺激をＩＣＶまたはＩＭのいずれかで用いてワクチン接種を行った。２回目の免疫化の１週間後、血液をフローサイトメトリーによって分析した。Ａ．代表的なフローサイトメトリー分析である。Ｂ．棒グラフである。値は平均±ＳＤとして示されている。＊ｐ＜：０．０５、＊＊ｐ＜：０．０１、ｎｓ、有意でない。
【図４】図４は、Ｅ７ペプチド負荷Ｈ−２Ｄｂ四量体染色を使用した、頸腟路（ｃｅｒｖｉｃｏｖａｇｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ）中のＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の特徴付けを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群当たり５匹）に対して、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０（マウス当たり５０μｇ）での初回刺激、続いて、６日後にＴＡ−ＨＰＶ（マウス当たり１×１０７個）での追加刺激をＩＣＶまたはＩＭのいずれかで用いてワクチン接種を行った。２回目の免疫化の１週間後、頸腟部組織をフローサイトメトリーによって分析した。Ａ．頸腟路中のＣＤ８＋Ｔ細胞の数の棒グラフである。Ｂ．頸腟路中のＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数の棒グラフである。値は平均±ＳＤとして示されている。＊ｐ＜：０．０５、＊＊ｐ＜：０．０１、ｎｓ、有意でない。
【図５】図５は、Ｅ７ペプチド負荷Ｈ−２Ｄｂ四量体染色を使用した、腸骨リンパ節（ＩＬＮ）中のＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の特徴付けを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群当たり５匹）に対して、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０（マウス当たり５０μｇ）での初回刺激、続いて、６日後にＴＡ−ＨＰＶ（マウス当たり１×１０７個）での追加刺激をＩＣＶまたはＩＭのいずれかで用いてワクチン接種を行った。２回目の免疫化の１週間後、ＩＬＮをフローサイトメトリーによって分析した。ＩＬＮ中のＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を示す棒グラフである。値は平均±ＳＤとして示されている。＊ｐ＜：０．０５、＊＊ｐ＜：０．０１、ｎｓ、有意でない。
【図６】図６は、頸腟部組織におけるＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によるα４β７発現およびＣＣＲ９発現を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群当たり５匹）に対して、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０（マウス当たり５０μｇ）での初回刺激、続いて、６日後にＴＡ−ＨＰＶ（マウス当たり１×１０７個）での追加刺激をＩＣＶまたはＩＭのいずれかで用いてワクチン接種を行った。２回目の免疫化の１週間後、頸腟部組織を、Ｅ７ペプチド負荷四量体染色を使用してフローサイトメトリーによって分析した。Ａ．α４β７発現を示す棒グラフである。α４β７は、頸腟部組織においてＭＡｄＣＡＭ−１と結合するＴ細胞の表面マーカーである。Ｂ．ＣＣＲ９発現を示す棒グラフである。ＣＣＲ９は、ＣＣＬ２５に結合するケモカイン受容体である。値は平均±ＳＤとして示されている。＊ｐ＜：０．０５、＊＊ｐ＜：０．０１、ｎｓ、有意でない。
【図７】図７は、腸骨リンパ節におけるＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によるα４β７発現およびＣＣＲ９発現の特徴付けである。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群当たり５匹）に対して、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０（マウス当たり５０μｇ）での初回刺激、続いて、６日後にＴＡ−ＨＰＶ（マウス当たり１×１０７個）での追加刺激をＩＣＶまたはＩＭのいずれかで用いてワクチン接種を行った。２回目の免疫化の１週間後、ＩＬＮを、Ｅ７ペプチド負荷四量体染色を使用してフローサイトメトリーによって分析した。Ａ．α４β７発現を示す棒グラフである。Ｂ．ＣＣＲ９発現を示す棒グラフである。値は平均±ＳＤとして示されている。＊ｐ＜：０．０５、＊＊ｐ＜：０．０１、ｎｓ、有意でない。
【図８】図８は、頸腟部組織および脾臓におけるＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によるα４β７発現、ＣＣＲ９発現およびＣＤ１０３発現を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群当たり５匹）に対して、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０（マウス当たり５０μｇ）での初回刺激、続いて、６日後にＴＡ−ＨＰＶ（マウス当たり１×１０７個）での追加刺激をＩＣＶ投与によって用いてワクチン接種を行った。２回目の免疫化の１週間後、頸腟部組織および脾臓から組織浸潤性リンパ球を単離し、ＣＤ８染色、Ｅ７ペプチド負荷四量体染色ならびにα４β７染色、ＣＣＲ９染色およびＣＤ１０３染色を使用してフローサイトメトリーによって分析した。α４β７発現、ＣＣＲ９発現およびＣＤ１０３発現のさらなる分析のためにＥ７ペプチド負荷四量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞をゲーティングした。Ａ．示されているデータは代表的なフローサイトメトリー分析である。Ｂ．α４β７発現、ＣＣＲ９発現およびＣＤ１０３発現を示す棒グラフである。値は平均±ＳＤとして示されている。＊ｐ＜：０．０５、＊＊ｐ＜：０．０１、ｎｓ、有意でない。
【図９】図９は、ＩＣＶまたはＩＭワクチン接種によるｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０での初回刺激およびＴＡ−ＨＰＶでの追加刺激によって生じるｉｎ  ｖｉｖｏにおける治療的な抗腫瘍効果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群当たり５匹）に対して、腟の粘膜下組織にルシフェラーゼ発現ＴＣ−１細胞（マウス当たり２×１０４個）を用いて攻撃を行った。１日後に、マウスを、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０を用いて免疫化し、６日後に、マウスを、ＴＡ−ＨＰＶを用いて免疫化した。腟におけるシグナルを、ＴＣ−１ルシフェラーゼ発現細胞の注射後７日目および１４日目に発光によってモニターした。
【図１０−１】図１０は、異なるワクチン接種経路によって生じる局所免疫応答および全身免疫応答をである。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群当たり５匹）に対して、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０（マウス当たり５０μｇ）を用いて７日間の間隔で２回、筋肉内（ＩＭ）または頸腟部内（ＩＣＶ）にワクチン接種を行い、続いて、２回目のＤＮＡワクチン接種の７日後にＴＡ−ＨＰＶでの追加刺激を筋肉内（ＩＭ）または頸腟部内（ＩＣＶ）に用いてワクチン接種を行った。最後の免疫化の７日後に、マウスを屠殺し、脾細胞および頸腟部細胞を単離し、フローサイトメトリーによって分析した。Ａ．代表的なフローサイトメトリー分析である。Ｂ、脾細胞中のＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を示す棒グラフである。Ｃ、代表的なフローサイトメトリーである。Ｄ、頸腟部細胞中のＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を示す棒グラフである。値は平均±ＳＤとして示されている。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ｎｓ、有意でない。
【図１０−２】図１０は、異なるワクチン接種経路によって生じる局所免疫応答および全身免疫応答をである。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群当たり５匹）に対して、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０（マウス当たり５０μｇ）を用いて７日間の間隔で２回、筋肉内（ＩＭ）または頸腟部内（ＩＣＶ）にワクチン接種を行い、続いて、２回目のＤＮＡワクチン接種の７日後にＴＡ−ＨＰＶでの追加刺激を筋肉内（ＩＭ）または頸腟部内（ＩＣＶ）に用いてワクチン接種を行った。最後の免疫化の７日後に、マウスを屠殺し、脾細胞および頸腟部細胞を単離し、フローサイトメトリーによって分析した。Ａ．代表的なフローサイトメトリー分析である。Ｂ、脾細胞中のＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を示す棒グラフである。Ｃ、代表的なフローサイトメトリーである。Ｄ、頸腟部細胞中のＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を示す棒グラフである。値は平均±ＳＤとして示されている。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ｎｓ、有意でない。
【図１１】図１１は、抗腫瘍ワクチン接種に使用したｐＮＧＶＬ４ａ−Ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０プラスミドベクターの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明者らはこれまで、ＨＰＶ−１６  Ｅ７抗原および熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）と連結したシグナルペプチド（ｓｉｇ）からなるキメラタンパク質をコードする、治療用ＨＰＶ  ＤＮＡワクチン、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０の開発（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１０／５５５，６６９号）を含め、ＨＰＶ関連疾患における使用のためにＥ６および／またはＥ７を標的とするＤＮＡワクチンおよびワクシニアワクチンを使用してきた。さらに、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチンを、高悪性度の上皮内病変を有する患者に対する臨床試験において使用し、これが安全であることが証明されている（Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１５巻：３６１〜７頁（２００９年））。現在、ＤＮＡワクチンであるｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０は、グレード３の子宮頸部上皮内新形成（ＮＣＴ００７８８１６４）を有する患者における筋肉内へのＤＮＡでの初回刺激およびワクシニアでの追加刺激レジメンに関して、組換え治療用ＨＰＶワクチンであるＴＡ−ＨＰＶと組み合わせて使用されている（Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．  ６巻、２２１ｒａ１３（２０１４年））。ＴＡ−ＨＰＶは、ＨＰＶ−１６／１８のＥ６タンパク質およびＥ７タンパク質をコードする組換えワクシニアワクチンである。ＴＡ−ＨＰＶはいくつかの臨床試験において使用されており、安全であることが証明されている（Ｌａｎｃｅｔ、３４７巻：１５２３〜７頁（１９９６年））。そのように、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチンおよびＴＡ−ＨＰＶは、初回刺激−追加刺激レジメンに使用するのに都合がよい。
【００１０】
最近、組織常在記憶Ｔ細胞（Ｔｒｍ）が感染症および免疫化に関与する局所免疫応答において重要な役割を果たすことが示された。そのように、Ｔｒｍによりもたらされるロバストな防御免疫の活用を可能にする本発明の部位特異的ワクチン接種が特に粘膜腫瘍に対する理想的な方法体系として役立つものと本発明者らは現在考える。
【００１１】
本発明の方法によって、粘膜組織において生じるＨＰＶ関連疾患を制御するために本発明者らの治療用ＨＰＶワクチンによってＴｒｍを生じさせるための独特の戦略を検討することが重要であることが示される。
【００１２】
一部の実施形態によると、本発明者らは、治療用ＨＰＶワクチンを初回刺激−追加刺激レジメンで腟内投与することの、全身および局所的な抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫応答の発生、ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴｒｍマーカーの発現に対する効果を調査した。ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチンおよびＴＡ−ＨＰＶを使用し、腟内投与により、頸腟路および所属リンパ節においてより有効な局所免疫応答が惹起されることが見いだされた。重要なことに、初回刺激−追加刺激ワクチン接種により生成したＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は粘膜組織に特異的なＴｒｍのマーカーを発現した。したがって、本発明の方法により、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡおよびＴＡ−ＨＰＶを使用する頸腟部内ワクチン接種レジメンにより、ＴＣ−１腫瘍モデルに対する強力なＥ７特異的Ｔｒｍ免疫応答および抗腫瘍効果が生じることが示された。本明細書で使用される場合、「頸腟部の」という用語は「腟の」という単語と互換的に使用され、腟および子宮頸部の全ての筋組織および粘膜組織を包含する。
【００１３】
ある実施形態によると、本発明は、被験体の粘膜組織におけるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連疾患に対する免疫応答を生じさせるための方法であって、
ａ）被験体の筋組織または粘膜組織にｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０からなる第１のワクチン構築物を含む組成物の有効量を投与するステップ、およびｂ）粘膜組織に第２のワクチン構築物を含む組成物の有効量を投与するステップを含む方法を提供する。
【００１４】
他の実施形態では、本発明は、それを必要とする被験体において子宮頸がん、その前駆病変および他のＨＰＶ関連病変を処置するための方法であって、ａ）被験体の筋肉または頸腟部の粘膜組織にｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０からなる第１のワクチン構築物を含む組成物の有効量を投与するステップ、およびｂ）前記頸腟部の粘膜組織に第２のワクチン構築物を含む組成物の有効量を投与するステップを含む方法を提供する。
【００１５】
一部の実施形態によると、第２のワクチン構築物は、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０またはＴＡ−ＨＰＶであり得る。
【００１６】
ある実施形態によると、第２のワクチン構築物は、ＴＡ−ＨＰＶである。
【００１７】
本発明の方法は、多くのバリエーションのレジメンにおいて使用することができ、いかなる特定の例によっても限定されるべきではないことが当業者には理解されよう。ワクチン接種レジメンは処置によって変動し得る。ある実施形態によると、第２のワクチン構築物は、第１のワクチン構築物の投与後５〜３０日以内に投与される。別の実施形態では、第２のワクチン構築物は、第１のワクチン構築物の投与後６日以内に投与される。
【００１８】
一部の実施形態では、第２のワクチン構築物は、第１のワクチン構築物の投与の１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１３日後、１４日後、１５日後、１６日後、１７日後、１８日後、１９日後、２０日後、２１日後、２２日後、２３日後、２４日後、２５日後、２６日後、２７日後、２８日後、２９日後、または３０日後に投与される。一部の実施形態では、第２のワクチン構築物は、第１のワクチン構築物の投与後１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、または３０日未満に投与される。
【００１９】
本発明の方法は、ワクチンを被験体の感染粘膜組織に投与することを対象とすることが当業者には理解されよう。一部の実施形態では、粘膜組織は、口腔粘膜、鼻粘膜、頸腟部粘膜および肛門粘膜からなる群より選択される。ある実施形態では、粘膜組織は、頸腟部粘膜である。
【００２０】
ヒトパピローマウイルスは、皮膚表面および粘膜表面における上皮の増殖を引き起こすＤＮＡ腫瘍ウイルスである。このウイルスには、ヒト生殖管に感染するおよそ３０〜４０種の株を含めた、１００種を超える異なる型が存在する。これらには、子宮頸がん、外陰がん、腟がん、陰茎がん、口腔がん、咽頭がんおよび肛門がんに関連する腫瘍形成性または高リスク型（１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、および５８）と、肛門生殖器コンジローマまたは性器いぼに関連する非腫瘍形成性または低リスク型（６、１１、４０、４２、４３、４４、および５４）が存在する。ＨＰＶ１６が最も腫瘍形成性が高く、全ての子宮頸がんのほぼ半分を占め、ＨＰＶ１６とＨＰＶ１８を合わせると子宮頸がんのおよそ７０％を占める。ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１は性器いぼに関連する最も一般的な株であり、これらの病変のおよそ９０％に関与する。
【００２１】
ある実施形態によると、本発明の方法により処置されるＨＰＶ関連疾患は、子宮頸がん、外陰がん、腟がん、陰茎がん、口腔がん、咽頭がんおよび肛門がんを含めたがんである。一部の実施形態では、がんは子宮頸がんである。
【００２２】
一部の実施形態では、被験体は、ＨＰＶ関連疾患であると診断されている。
【００２３】
一部の実施形態によると、本発明の方法は、ＨＰＶに感染している皮膚表面および粘膜表面にワクチン接種することを含む。
【００２４】
一部の実施形態では、被験体は、ＨＰＶ関連疾患であると診断されていない。
【００２５】
本発明のワクチン接種レジメンは、被験体に少なくとも１回適用することができる。一部の実施形態では、ワクチン接種方法は、少なくとももう１回繰り返される。一部の実施形態では、ワクチン接種方法は、繰り返されない。
【００２６】
一部の実施形態によると、本発明の方法は、第１のワクチン構築物を投与した後に、少なくとも１種の生物学的に活性な作用因子の有効量を投与するステップを含む。生物学的に活性な作用因子は、イミキモド（１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン）であってよい。
【００２７】
一部の実施形態では、組成物を投与するステップは、組成物を注射することを含む。組成物を粘膜組織に投与するステップは、組成物を粘膜組織の粘膜下領域に注射することを含み得る。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「被験体」という用語は、子宮頸がんを有する疑いがあるまたは子宮頸部新形成を有するリスクが上昇している疑いがある被験体を意味し得、子宮頸部上皮内新形成（ＣＩＮ）、ならびに／または低グレードの扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）および／もしくは高グレードの扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）、または任意の他のＰａｐ塗抹標本または細胞学的検査の異常を示す患者を含み得る。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「被験体」という用語は、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ関連疾患を有する疑いがある被験体も意味し得、ＨＰＶに曝露しているか、または任意のバリアント株のＨＰＶへの感染の証拠を有する被験体も包含する。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「被験体」という用語は、これだけに限定されないが、マウスおよびハムスターなどのＲｏｄｅｎｔｉａ目の哺乳動物、ならびにウサギなどのＬｏｇｏｍｏｒｐｈａ目の哺乳動物を含めた任意の哺乳動物を指す。被験体は、Ｆｅｌｉｎｅ（ネコ）およびＣａｎｉｎｅ（イヌ）を含めたＣａｒｎｉｖｏｒａ目のものであってよい。あるいは、被験体は、Ｂｏｖｉｎｅ（ウシ）およびＳｗｉｎｅ（ブタ）を含めたＡｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ目のもの、またはＥｑｕｉｎｅ（ウマ）を含めたＰｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ目のものであってよい。あるいは、被験体は、Ｐｒｉｍａｔｅ目、Ｃｅｂｏｉｄ目、もしくはＳｉｍｏｉｄ目（サル）のもの、またはＡｎｔｈｒｏｐｏｉｄ目（ヒトおよび類人猿）のものであってよい。被験体はヒトであってよい。
【００３１】
本発明の１つまたは複数の実施形態によると、本明細書において提供される方法を使用して成されるがん診断の種類は、必ずしも限定されるものではないことが理解されよう。本発明の目的に関して、がんは任意のがんであってよい。本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、リンパ系または血流を通じて身体の他の部分に拡散し得る、異常なおよび制御されていない細胞分裂によって引き起こされる任意の悪性増殖または腫瘍を意味する。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「処置する」という用語ならびにそれから派生する単語は、診断的処置および予防的処置、ならびに被験体の状態もしくは被験体の状態の少なくとも１つの症状を改善するためまたは被験体の状態もしくは状態の症状が悪化するのを予防するための処置を包含する。
【００３３】
「処置する」および「予防する」という用語ならびにそれから派生する単語は、本明細書で使用される場合、必ずしも１００％または完全な処置または予防を意味するものではない。むしろ、潜在的な利益または治療効果があると当業者に認識される処置または予防の程度は様々である。この点において、本発明の方法は、任意の量の任意のレベルの、被験体または被験体の集団におけるがんの処置または予防を提供し得る。さらに、本発明の方法により提供される処置または予防は、処置または予防される疾患、例えばがんの１つまたは複数の状態または症状の処置または予防を含み得る。また、本発明の目的に関しては、「予防」とは、疾患、またはその症状もしくは状態の発症を遅延させることを包含し得る。
【００３４】
ある実施形態では、本発明の方法は、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチンおよびＴＡ−ＨＰＶを担体と併せて含み得る。担体は薬学的に許容される担体であることが好ましい。医薬組成物に関して、担体は、慣習的に使用される担体のいずれであってもよく、溶解度および活性化合物（複数可）との反応性がないことなどの、物理化学上の検討事項によって、ならびに投与経路によってのみ限定される。本明細書に記載の薬学的に許容される担体、例えば、ビヒクル、アジュバント、賦形剤、および希釈剤は当業者に周知であり、一般に容易に入手可能である。薬学的に許容される担体は、活性な作用因子（複数可）に対して化学的に不活性なもの、および使用の条件下で有害な副作用も毒性もないものであってよい。
【００３５】
担体の選択は、一部において、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチンおよびＴＡ−ＨＰＶの化学的性質によって、ならびにｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチンおよびＴＡ−ＨＰＶを投与するために使用する特定の方法によって決定される。したがって、本発明の医薬組成物の種々の適切な製剤が存在する。以下の非経口投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、髄腔内投与、頸腟部内投与および腹腔内投与用の製剤は例示的なものであり、決して限定的なものではない。ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチンおよびＴＡ−ＨＰＶを投与するために２つ以上の経路を使用することができ、特定の例では、特定の経路により、別の経路よりも速やかかつ有効な応答がもたらされ得る。
【００３６】
注射製剤は本発明によるものである。注射用組成物に対する有効な医薬担体に関する要件は当業者に周知である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｊ．Ｂ．  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、ＢａｎｋｅｒおよびＣｈａｌｍｅｒｓ編、２３８〜２５０頁（１９８２年）、およびＡＳＨＰ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇｓ、Ｔｒｉｓｓｅｌ、第１４版、（２００７年）を参照されたい）。
【００３７】
本発明の目的に関して、投与するｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチンおよびＴＡ−ＨＰＶの量または用量は、例えば治療的または予防的応答を、被験体において妥当な時間枠にわたってもたらすために十分なものであるべきである。用量は、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチンおよびＴＡ−ＨＰＶの有効性およびヒトの状態、ならびに処置されるヒトの体重によって決定される。
【００３８】
主治医は、個々の患者それぞれを処置するために用いるｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチンおよびＴＡ−ＨＰＶの投薬量を、年齢、体重、全体的な健康、食事、性別、投与されるもの、投与経路、および処置される状態の重症度などの種々の因子を考慮して決定することができる。例として、また本発明を限定するものではなく、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチンおよびＴＡ−ＨＰＶの用量は、処置される被験体に対して、約１〜１０ｍｇのｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチンと約１×１０５〜約２×１０７ｐｆｕのＴＡ−ＨＰＶであり得る。一部の実施形態では、投薬量範囲は約３ｍｇのｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチンと約１．６×１０７ｐｆｕのＴＡ−ＨＰＶである。
【００３９】
「活性な作用因子」および「生物学的に活性な作用因子」は、本明細書では互換的に使用され、所望の薬理効果および／または生理効果を誘導する化学的または生物学的な化合物を指し、その効果は予防的なものであっても治療的なものであってもよい。この用語は、本明細書で具体的に記載されている活性な作用因子の、これだけに限定されないが、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝産物、類似体などを含めた、薬学的に許容される、薬理学的に活性な誘導体も包含する。「活性な作用因子」、「薬理学的に活性な作用因子」および「薬物」という用語が使用されている場合には、本発明が、活性な作用因子それ自体、ならびに薬学的に許容される、薬理学的に活性な塩、エステル、アミド、プロドラッグ、代謝産物、類似体などを包含することが理解されるべきである。活性な作用因子は、天然に存在するものであるか、形質転換されたものなどの操作されたものであるかにかかわらず、ウイルスまたは細胞などの生物学的実体であってよい。
【００４０】
生物学的に活性な作用因子は、組成物の意図された目的によって広範に変動し得る。活性なという用語は当技術分野で認知されており、被験体において局所的にまたは全身的に作用する、生物学的に活性な、生理学的に活性な、または薬理学的に活性な物質である任意の部分を指す。「薬物」と称することができる生物学的に活性な作用因子の例は、Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、およびＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓなどの周知の参考文献に記載されており、それらとしては、これらに限定されないが、医薬；ビタミン；ミネラルサプリメント；疾患もしくは疾病の処置、予防、診断、治癒もしくは緩和のために使用される物質；身体の構造もしくは機能に影響を及ぼす物質；または生理的環境に置かれた後に生物学的に活性になる、もしくはより活性になるプロドラッグが挙げられる。
【００４１】
上記のカテゴリーの有用な生物学的に活性な作用因子の特定の例としては、アンドロゲン阻害剤、アルキル化剤、ナイトロジェンマスタードアルキル化剤、ニトロソウレアアルキル化剤、代謝拮抗剤、プリン類似体代謝拮抗剤、ピリミジン類似体代謝拮抗剤、ホルモン性抗新生物薬、天然抗新生物薬、抗菌性天然抗新生物薬、カルボプラチンおよびシスプラチンなどの抗新生物薬；カルムスチン（ＢＣＮＵ）などのニトロソウレアアルキル化抗新生物剤；メトトレキサートなどの代謝拮抗抗新生物剤；フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびゲムシタビンなどのピリミジン類似体抗新生物剤；ゴセレリン、ロイプロリド、およびタモキシフェンなどのホルモン性抗新生物薬；アルデスロイキン、インターロイキン２、ドセタキセル、エトポシド、インターフェロン；パクリタキセル、他のタキサン誘導体、およびトレチノイン（ＡＴＲＡ）などの天然抗新生物薬；ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、およびマイトマイシンなどの抗菌性天然抗新生物薬；ビンブラスチンおよびビンクリスチンなどのビンカアルカロイド天然抗新生物薬が挙げられる。
【００４２】
他の生物学的に活性な作用因子としては、変異体および類似体を含めた、ペプチド、タンパク質、および他の大きな分子、例えばインターロイキン１〜１８など；軟骨再生に対して有用であり得るインターフェロンα、γ、ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）および類似体、ゴナドトロピン放出ホルモン形質転換増殖因子（ＴＧＦ）；線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）；腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）；神経増殖因子（ＮＧＦ）；成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、結合組織活性化骨形成因子（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、線維芽細胞増殖因子相同因子（ＦＧＦＨＦ）；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）；インスリン増殖因子（ＩＧＦ）；浸潤阻害因子（ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）−２（ＩＩＦ−２）；骨形成タンパク質  １〜７（ＢＭＰ１〜７）；ソマトスタチン；チモシン−α−γ−グロブリン；スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）；および補体因子、ならびにそのような因子、例えば、増殖因子の生物学的に活性な類似体、断片、および誘導体を挙げることができる。
【００４３】
ある実施形態によると、生物学的に活性な作用因子は、イミキモド（１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン）である。
【００４４】
１つまたは複数の実施形態によると、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡおよびＴＡ−ＨＰＶワクチンは注射、ｉ．ｍ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｖ．、皮下、頸腟部内、遺伝子銃などによってもたらされる。
【実施例】
【００４５】
実施例１〜６の材料および方法
マウス。６週齢〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）から購入した。動物に関する手順は全て認可されたプロトコールに従い、また、実験動物の適切な使用および世話に関する推奨に従って実施した。
【００４６】
細胞。ＨＰＶ１６  Ｅ６−Ｅ７タンパク質を発現するＴＣ−１細胞およびホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現するＴＣ−１細胞（ＴＣ−１  ｌｕｃ）は本発明者らの研究室で開発し、以前に記載したものである（Ｖａｃｃｉｎｅ、２５巻：７８２４〜３１頁、（２００７年））。
【００４７】
抗体および四量体。蛍光色素と結合体化した抗マウスモノクローナル抗体（Ａｂ）ＣＤ８ａ−ＡＰＣ、ＣＤ１０３−ＡＰＣ、α４β７−ＡＰＣはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し、ＣＤ８Ａ−ＦＩＴＣ、７ＡＡＤはＢＯ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入し、ＣＣＲ９−ＦＩＴＣはＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入し、Ｅ−７ペプチドに結合する細胞の染色を可能にするＨ２Ｄｂ  Ｅ−７四量体はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｔｅｔｒａｍｅｒ  ｃｏｒｅ  ｆａｃｉｌｉｔｙから提供された。塩化アンモニウム溶液（ＡＣＫ）はＱｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃから購入した。
【００４８】
リンパ球の調製。マウスの尾部血管から血液を得、ＰＢＳと混合した。マウスを安楽死させ、切開により器官を取り出した。ＲＰＭＩ  １６４０消化緩衝液中、３７℃で１時間、振とうしながら酵素的に分散させることによって頸腟部（子宮頸部および腟の組織）細胞浮遊液を得た。頸腟部細胞を、７０μＭの細胞ストレーナー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を通過させた。腸骨リンパ節および脾臓細胞浮遊液を機械的に破壊し、７０μＭの細胞ストレーナーを通して濾過した。血液細胞浮遊液、頸腟部細胞浮遊液、脾臓細胞浮遊液およびリンパ節細胞浮遊液をＲＰＭＩ／ＦＢＳ２％中で洗浄し、塩化アンモニウム溶液を用いた処理によって赤血球を除いた。
【００４９】
免疫化手順。マウスを、０日目（ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチン、５０μｇ）および７日目（ＴＡ−ＨＰＶ、１×１０７ＰＦＵ）に、マウス当たり約１〜５０μｇの範囲のｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチンおよび１×１０６〜１×１０７ＰＦＵ／マウスＴＡ−ＨＰＶを用いて頸腟部内経路または筋肉内経路によって免疫化した。注射の総体積はどちらの経路でも５０μｌであった。マウスは免疫化前に麻酔した。
【００５０】
細胞表面染色およびフローサイトメトリー分析。全ての染色を、流管中、最終体積３００μｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）中４℃で１時間実施した。表面Ｆｃ受容体による非特異的な抗体結合を回避するために、全ての細胞をＣＤ１６／３２マウスＢＤ  Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋ（商標）（ＢＤ  ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と一緒にプレインキュベートした。Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎ  ｗｉｔｈ  ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ  ｓｏｆｔａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）で解析を実施した。
【００５１】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍保護および画像化技術。約２×１０４個のＴＣ−１  ｌｕｃ細胞をマウスの生殖管の粘膜下領域に注射した。マウスに、腫瘍による攻撃後２日目（ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチン）および７日目（ＴＡＨＰＶ）にワクチン接種を行った。生殖器の腫瘍の成長を週に１回、Ｘｅｎｏｇｅｎ画像化システムにおいて生物発光によってモニターした。簡単に述べると、Ｄ−ルシフェリンをＰＢＳ中に７．８ｍｇ／ｍＬまで溶解させ、濾過滅菌し、−８０℃で保管した。マウスにＤ−ルシフェリンをｉ．ｐ．注射によって与え（マウス当たり２００μｌ、７５ｍｇ／ｋｇ）、イソフルランで麻酔した。極低温に冷却したＩＶＩＳ  ｓｙｓｔｅｍでＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎおよびａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用してルシフェラーゼについてのｉｎ  ｖｉｖｏにおける生物発光画像化を行った。次いで、マウスを、光を通さないカメラボックスの内側の温めた台に載せ、１％〜２％イソフルランに継続的に曝露させた。Ｄ−ルシフェリン投与の１０分後に画像を取得し、２分にわたって画像化した。生物発光細胞からの光のレベルをＩＶＩＳ  ｃａｍｅｒａ  ｓｙｓｔｅｍによって検出し、統合し、デジタル化した。表示された画像からの目的の領域を頸腟路周辺に指定し、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ２．５０ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用して総光子数として定量化した。
【００５２】
統計解析。データは全て平均±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）として表されており、少なくとも２つの別々の実験の代表的なものである。個々のデータ点間の比較はスチューデントのｔ検定を使用して行った。２つの異なる群を比較するためにはノンパラメトリックなマン・ホイットニー検定を使用した。全てｐ値＜０．０５を有意であるとみなした。
【００５３】
（実施例１）
ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチンでの初回刺激、続いてＴＡ−ＨＰＶでの追加刺激を用いたワクチン接種により、同種ＤＮＡ−ＤＮＡ初回刺激−追加刺激レジメンと比較してより強力なＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が惹起される。
【００５４】
最初の狙いはｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡおよびＴＡ−ＨＰＶワクチンの種々の組合せを使用して抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成させるために最適な初回刺激−追加刺激ワクチン接種レジメンを決定することであった。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群当たり５匹）に対して、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチン、続いてＴＡ−ＨＰＶを用いる異種初回刺激−追加刺激を用いてワクチン接種を行ったか、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチンを用いる同種初回刺激−追加刺激を用いてワクチン接種を行ったか、ＴＡ−ＨＰＶを単独で用いてワクチン接種を行ったか、またはワクチン接種を行わなかった。図１に示されている通り、異種初回刺激−追加刺激レジメンでは、同種初回刺激−追加刺激ワクチン接種またはＴＡ−ＨＰＶ単独と比較して、総脾細胞の中で生成したＩＦＮ−ｇ分泌Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数が最大であった。このデータにより、ＤＮＡでの初回刺激、続いてワクシニアに基づく追加刺激が、活性化されたＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成させるために有効な初回刺激−追加刺激レジメンであることが示唆される。
【００５５】
（実施例２）
ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡでの初回刺激、続いてＴＡ−ＨＰＶでの追加刺激を頸腟部内送達により用いたワクチン接種では、筋肉内注射によるワクチン接種と比較してより多数のＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が頸腟路において生成する。
【００５６】
ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチンでの初回刺激、ＴＡ−ＨＰＶでの追加刺激からなるワクチン接種レジメンに関して、異なる投与経路の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の生成に対する影響を調査した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対して、頸腟部内（ＩＣＶ）または筋肉内（ＩＭ）のいずれかで、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチン、続いて、６日後にＴＡ−ＨＰＶを用いてワクチン接種を行った。ＴＡ−ＨＰＶワクチン接種の１週間後、マウスを、Ｅ７ペプチド負荷Ｈ−２Ｄｂ四量体染色を使用したフローサイトメトリー分析により種々の位置におけるＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞について試験した。図２に示されている通り、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチン、続いてＴＡ−ＨＰＶを用いたＩＣＶによるワクチン接種およびＩＭによるワクチン接種では、ナイーブマウスのものと比較して、マウスの脾細胞の中で生成したＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率が有意に高かった。しかし、ＩＭ経路によるワクチン接種とＩＶＡＧ経路によるワクチン接種の間に有意差はないと思われた。図３には、ＩＭによりｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチンおよびＴＡ−ＨＰＶを用いてワクチン接種を行ったマウスでは、ＩＣＶによるワクチン接種を行ったマウスと比較して、末梢血中に生成したＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が有意に多かった。さらに、ＩＣＶによるワクチン接種を行ったマウスでは、生成したＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞がナイーブマウスよりも有意に多かった。対照的に、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチンおよびＴＡ−ＨＰＶを用いたＩＣＶによるワクチン接種では、ＩＭによるワクチン接種を行ったマウスおよびナイーブマウスと比較して、マウス頸腟路において誘導されたＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率が最も高かった（図４）。総合すると、このデータにより、頸腟路において多くのＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成させるためには、頸腟部内送達によるワクチン接種が筋肉内注射によるワクチン接種と比較して有意に効率が高い方法であることが示される。
【００５７】
（実施例３）
ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチンでの初回刺激、続いてＴＡ−ＨＰＶでの追加刺激を用いた頸腟部内ワクチン接種では、所属リンパ節において生成するＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数が筋肉内ワクチン接種よりも有意に多い。
【００５８】
次に、ワクチン投与経路の、所属リンパ節における抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する影響を試験した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対して、ＩＣＶまたはＩＭのいずれかで、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチン、続いて、６日後にＴＡ−ＨＰＶを用いてワクチン接種を行った。最後のワクチン接種の１週間後、腸骨リンパ節（ＩＬＮ）を単離し、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞について、Ｅ７ペプチド負荷Ｈ−２Ｄｂ四量体染色を使用してフローサイトメトリー分析によって試験した。図５に示されている通り、本発明者らは、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチンおよびＴＡ−ＨＰＶを用いてＩＣＶによるワクチン接種を行ったマウスでは、ＩＭによるワクチン接種を行ったマウスおよびナイーブマウスと比較して、ＩＬＮにおけるＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率が最も高いことを見いだした。これらの結果により、強力な局所Ｅ７特異的細胞媒介性免疫応答を誘導するためには、ＩＣＶによるワクチン接種がＩＭによるワクチン接種と比較してより効率の高いやり方であることが示される。
【００５９】
（実施例４）
ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチンでの初回刺激、続いてＴＡ−ＨＰＶでの追加刺激を用いた頸腟部内ワクチン接種により、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるａ４β７およびＣＣＲ９の発現が誘導される。
【００６０】
初回刺激−追加刺激レジメンによって誘導されるＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が組織常在記憶Ｔ細胞（Ｔｒｍ）であるかどうかを決定するために、本発明者らは、これらを、組織特異的分子であるα４β７およびＣＣＲ９の発現について評価した。α４β７は、粘膜アドレシン細胞接着分子−１（ＭＡｄＣＡＭ−１）と相互作用することによって機能する粘膜関連ホーミングインテグリンである。リガンドがＣＣＬ２５であり、一般に呼吸器、胃腸および泌尿生殖器の組織の上皮に発現するケモカイン受容体であるＣＣＲ９もリンパ球の粘膜組織へのホーミングおよび保持に関与する。図６に示されている通り、ＩＣＶによりｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチンおよびＴＡ−ＨＰＶを用いて処置したマウスでは、頸腟路における全てのＥ７四量体陽性細胞の中で、ａ４β７またはＣＣＲ９を発現するＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率が最も高かった。さらに、ＩＣＶによるワクチン接種を行ったマウスでは、所属ＩＬＮにおいてａ４β７またはＣＣＲ９を発現するＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率が最も高かった（図７）。これらのデータにより、α４β７またはＣＣＲ９を発現する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成させるためにはＩＣＶによるワクチン接種が有効な方法であることが示される。
【００６１】
（実施例５）
ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチンでの初回刺激、続いてＴＡ−ＨＰＶでの追加刺激を用いた腟内ワクチン接種により、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるα４β７、ＣＣＲ９およびＣＤ１０３の同時発現が誘導される。
【００６２】
ＩＣＶでの初回刺激−追加刺激ワクチン接種レジメンの、局所的および全身的な粘膜組織常在記憶Ｔ細胞（Ｔｒｍ）に対する影響を決定するために、ワクチン接種を行ったマウスの脾臓および頸腟路におけるＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞でのａ４β７、ＣＣＲ９およびＣＤ１０３の発現を調査した。マウスに対して、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチン、続いてＴＡ−ＨＰＶを用いてＩＣＶによりワクチン接種を行い、それらの脾細胞および頸腟部組織をフローサイトメトリーによって分析した。図８に示されている通り、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞でのａ４β７発現とＣＣＲ９発現の両方が頸腟路において脾臓と比較して有意に高かった。このデータにより、本発明者らのＤＮＡ−ワクシニア初回刺激−追加刺激レジメンを用いたＩＣＶによるワクチン接種により、頸腟路内の粘膜Ｔｒｍのものと一致する表面表現型を有するＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在が増加することが示唆される。
【００６３】
（実施例６）
ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡでの初回刺激、続いてＴＡＨＰＶでの追加刺激を用いた頸腟部内ワクチン接種により、筋肉内ワクチン接種と比較して治療的な抗腫瘍効果が有意に改善される。
【００６４】
さらに、異なる経路によって投与した本発明の初回刺激−追加刺激レジメンの治療効果を、ルシフェラーゼ発現ＴＣ−１腫瘍モデルを使用して評価した。ルシフェラーゼ活性のレベルはマウスにおける腫瘍負荷量を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対して、Ｅ７発現ＴＣ−１腫瘍細胞およびルシフェラーゼ発現ＴＣ−１腫瘍細胞を用いて皮下に攻撃を行った。１日後に、マウスを、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチンを用いて免疫化し、６日後に、マウスを、ＴＡ−ＨＰＶを用いて免疫化した。腫瘍による攻撃後７日目および１４日目にマウスを腫瘍の成長について発光画像化によってモニターした。図９に示されている通り、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチンおよびＴＡ−ＨＰＶを用いたＩＣＶによるワクチン接種を受けたマウスでは、１４日目に、ＩＭによるワクチン接種を受けたマウスまたはワクチン接種を受けなかったマウスと比較して、発光の減少によって測定される抗腫瘍効果が有意に大きかった。ＩＣＶによるワクチン接種を行ったマウスでは、１４日目には検出可能な発光がなく、これにより、ＴＣ−１腫瘍細胞が根絶されたことが示唆される。これらのデータにより、強力な治療的な抗腫瘍効果の発生に関して、ＩＣＶによるワクチン接種がＩＭ注射によるワクチン接種と比較してより効率的であることが示される。
【００６５】
（実施例７）
筋肉内ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡでの初回刺激、続いて頸腟部内ＴＡ−ＨＰＶでの追加刺激により誘導されるＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は脾臓と頸腟路のどちらにおいても最も多い。
【００６６】
最後に、初回刺激−追加刺激送達経路の異なる組合せによって誘導される全身（脾臓）および局所（頸腟路）ＨＰＶ  Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫応答を評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群当たり５匹）に対して、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡ（マウス当たり５０μｇ）を用いて筋肉内または頸腟部内に、ワクチン接種間に７日間の間隔を空けて２回ワクチン接種を行い、続いて、２回目のＤＮＡワクチン接種の７日後に、筋肉内または頸腟部内にＴＡ−ＨＰＶでの追加刺激を行った。最後のワクチン接種の７日後に脾細胞および頸腟部細胞を回収し、フローサイトメトリーによって分析した。図１０には、２回のＩＭによるＤＮＡでの初回刺激、続いてＩＣＶによるＴＡ−ＨＰＶでの追加刺激により、頸腟路と脾臓のどちらにおいても最も高いＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞産生が誘発されることが示されている。さらに、ＤＮＡでの初回刺激の部位にかかわらず、ＩＣＶによるＴＡ−ＨＰＶでの追加刺激により、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の優れた局所的産生が生じた（図１０Ｄ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の全身産生のためにはＩＭによるＤＮＡでの初回刺激、続いてＩＭによるＴＡ−ＨＰＶでの追加刺激が有効であるが、この組合せは、頸腟路における局所ＨＰＶ  Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の産生には有効ではない。総合すると、これらの結果により、頸腟路と脾臓の両方においてＨＰＶ  Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成するためには、ＩＭによるＤＮＡでの初回刺激、続いてＩＣＶによるＴＡ−ＨＰＶでの追加刺激が最も望ましい組合せであることが示唆される。
【００６７】
本試験では、本発明者らは、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を誘導するためには、同種ＤＮＡ−ＤＮＡ初回刺激−追加刺激レジメンと比較して、異種ＤＮＡ−ワクシニア初回刺激−追加刺激ワクチン接種レジメンが最適であることを同定した。本発明の方法では、ＴＡ−ＨＰＶワクシニアを用いたＩＣＶ投与経路では、ＩＭ投与と比較して、脾臓、末梢血、頸腟路および所属リンパ節において生成するＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞がより多いことが示される。さらに、本発明者らは、驚いたことに、これらの治療用ワクシニアワクチンを用いたＩＣＶによるワクチン接種によって誘導されるＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が粘膜関連ホーミングインテグリンであるα４β７およびＣＣＲ９を発現し、これにより、それらが粘膜Ｔｒｍと一致することが示されることを見いだした。最後に、ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡワクチン、続いてＩＣＶによりＴＡ−ＨＰＶを用いてワクチン接種を行ったマウスでは、ＴＣ−１腫瘍に対して、ＩＭによりワクチン接種を行ったマウスと比較して有意により強力な治療的な抗腫瘍効果が惹起されることが実証された。総合すると、これらのデータにより、ＨＰＶ関連疾患を制御するための細胞媒介性免疫応答を生じさせるためには、治療用ＨＰＶワクチンを本発明の頸腟部内経路によって投与することが最も有効であり得ることが示される。
【００６８】
本発明の方法では、治療用ＨＰＶワクチンを頸腟内経路によって投与することにより、粘膜Ｔｒｍ表現型を有する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびに、驚いたことに筋肉内ワクチン接種によって生じるものよりも優れた強力な抗腫瘍効果が生じることが示される。さらに、本結果により、当該投与経路の、ＩＭによるｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０  ＤＮＡでの初回刺激、続いてＩＣＶによるＴＡ−ＨＰＶでの追加刺激を使用する臨床試験への即時の臨床的変換が支持される。結論として、結果により、Ｔｒｍ媒介性免疫応答が誘導されるようにワクチン接種経路を改変することによって現行の治療用ＨＰＶワクチン接種レジメンを改善することができることが示されている。
【００６９】
本明細書において引用されている刊行物、特許出願、および特許を含めた参考文献は全て、これによって、参考文献のそれぞれが個別にかつ明確に参照により組み込まれることが示され、その全体が本明細書に記載されているのと同じく参照により組み込まれる。
【００７０】
「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」という用語ならびに同様の指示対象の使用は、本発明の記載に関しては（特に以下の特許請求の範囲と関連して）、本明細書において特に指定がある場合、または文脈から明らかに矛盾する場合を除き、単数と複数の両方を包含すると解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、特に断りのない限り、制約のない用語である（すなわち、「これらに限定されないが、〜が挙げられる」を意味する）と解釈されるべきである。本明細書では、値の範囲の列挙は、本明細書において別段の指定のない限りただ単にその範囲内に入る別々の値のそれぞれについて個々に参照する簡潔な方法としての機能を果たすものとし、別々の値のそれぞれが、それが本明細書において個々に列挙されたのと同じく本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の方法は全て、本明細書において別段の指定がある場合、または文脈から明らかに矛盾する場合を除き、任意の適切な順番で実施することができる。本明細書において提供される任意のかつ全ての例、または例示的な言葉（例えば、「などの（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、ただ単に本発明をよりよく照らすためのものであり、別段特許請求されていない限り、本発明の範囲に対する限定を提起するものではない。本明細書のどの言葉も、任意の特許請求されていない要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈されるべきではない。
【００７１】
本発明を実行するための本発明者らに公知の最良の方式を含めた、本発明の例示的な実施形態が本明細書に記載されている。それらの実施形態の変形は前述の説明を読めば当業者には明らかになろう。本発明者らは、そのような変形を必要に応じて当業者が使用することを予想し、本発明者らは、本明細書で具体的に記載されているものとは別のやり方で本発明が実施されることを意図している。したがって、本発明は、開示されている主題の改変および等価物を全て包含する。さらに、本明細書において別段の指定がある場合、または文脈から明らかに矛盾する場合を除き、その可能性のある変形全てにおける上記の要素の任意の組合せが本発明に包含される。
【化１】
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【化２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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