(57)【要約】新規な多特異的抗体構築物および多特異的抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、ならびにこのような抗体およびＡＤＣを使用してがんを処置する方法を提供する。ＩｇＧ様の二特異的抗体は、異なる結合特異性をこの抗体の各アーム上に有する。これらはＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を有する２本の重鎖、ならびにＶＬおよびＣＬ領域を有する２本の軽鎖を含有する点で、単一特異的ＩｇＧに構造的に類似する。本発明のある特定の好ましい実施形態は、ＩｇＧ１の供給源抗体のＣＬドメインまたはＣＨ１ドメインにおける静電電荷の分布を変更することを含む。
2016509014.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のＣＬドメインおよび第１のＣＨ１ドメインを有する第１の結合領域と、第２のＣＬドメインおよび第２のＣＨ１ドメインを有する第２の結合領域とを含む多特異的抗体であって、該多特異的抗体は、該第１のＣＬドメイン、該第１のＣＨ１ドメイン、該第２のＣＬドメイン、および該第２のＣＨ１ドメインからなる群から選択されるドメインにおける静電電荷の分布を変更する少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、該変更された電荷の分布が、単一特異的抗体に比べて多特異的抗体の優先的なアセンブリを促進する、多特異的抗体。
【請求項２】
１つより多くのドメインがアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の多特異的抗体。
【請求項３】
前記第１のＣＬドメインおよび第１のＣＨ１ドメインの両方がアミノ酸置換を有する、請求項１に記載の多特異的抗体。
【請求項４】
前記アミノ酸置換が、ＣＬドメインにおいてＳ１７６、Ｓ１７４、Ｎ１３８、Ｎ１３７、およびこれらの組合せからなる群から選択される位置に生じる、請求項１に記載の多特異的抗体。
【請求項５】
前記アミノ酸置換が、ＣＨ１ドメインにおいてＳ１８８、Ｈ１７２、Ｔ１９２、およびこれらの組合せからなる群から選択される位置に生じる、請求項１に記載の多特異的抗体。
【請求項６】
前記ＣＬがカッパ鎖を含む、請求項１に記載の多特異的抗体。
【請求項７】
アミノ酸置換が、前記第１のＣＬドメインおよび前記第２のＣＨ１ドメインに正の電荷を授け、前記第２のＣＬドメインおよび前記第１のＣＨ１ドメインに負の電荷を授ける、請求項１に記載の多特異的抗体。
【請求項８】
アミノ酸置換が、前記第１のＣＬドメインおよび前記第２のＣＨ１ドメインに負の電荷を授け、前記第２のＣＬドメインおよび前記第１のＣＨ１ドメインに正の電荷を授ける、請求項１に記載の多特異的抗体。
【請求項９】
前記第１の結合領域が第１の決定基を認識する第１の結合部位を含み、前記第２の結合領域が第２の決定基を認識する第２の結合部位を含み、前記第１の決定基および第２の決定基は同等ではない、請求項１に記載の多特異的抗体。
【請求項１０】
前記第１の決定基および第２の決定基が単一の抗原上に存在する、請求項９に記載の多特異的抗体。
【請求項１１】
前記第１の決定基および第２の決定基が異なる抗原上に存在する、請求項９に記載の多特異的抗体。
【請求項１２】
前記第１の決定基または前記第２の決定基が、ＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＴＡＴ３、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ２４、ＣＤ３４、ＮＢ８４、ＴｒｋＡ、ＧＤ２、ＣＤ１３３、ＣＤ２０、ＣＤ５６、ＣＤ２９、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ４６、トランスフェリン受容体、ＪＡＭ３、カルボキシペプチダーゼＭ、オンコスタチンＭ、Ｌｇｒ５、Ｌｇｒ６、ＣＤ３２５、ネクチン−４、ネスチン、Ｓｏｘ１、Ｂｍｉ−１、ｅｅｄ、ｅａｓｙｈ１、ｅａｓｙｈ２、ｍｆ２、ｙｙ１、ｓｍａｒｃＡ３、ｓｍａｒｃｋＡ５、ｓｍａｒｃＤ３、ｓｍａｒｃＥ１、ｍｌｌｔ３、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１６、ＡＸＩＮ１、ＢＣＬ９、ＭＹＣ、（ＴＣＦ４）ＳＬＣ７Ａ８、ＳＬＣ４４Ａ４、ＩＬ１ＲＡＰ、ＴＥＭ８、ＴＭＰＲＳＳ４、ＭＵＣ１６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ４Ａ１１、ＰＰＡＰ２Ｃ、ＣＡＶ１、ＣＡＶ２、ＰＴＰＮ３、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ９、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＥＦＮＡ１、ＥＦＮＡ２、ＥＦＮＡ３、ＥＦＮＡ５、ＥＦＮＡ６、ＥＦＮＢ１、ＥＦＮＢ２、ＥＦＮＢ３、ＳＬＣ１Ａ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＭＰＺＬ１、ＦＬＪ１００５２、Ｃ４．４Ａ、ＥＤＧ３、ＲＡＲＲＥＳ１、ＴＭＥＰＡＩ、ＰＴＳ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＮＩＤ２、ＳＴＥＡＰ、ＡＢＣＡ３、ＣＲＩＭ１、ＩＬ１Ｒ１、ＯＰＮ３、ＤＡＦ、ＭＵＣ１、ＣＰＤ、ＮＭＡ、ＡＤＡＭ９、ＧＪＡ１、ＳＬＣ１９Ａ２、ＡＢＣＡ１、ＰＣＤＨ７、ＡＤＣＹ９、ＳＬＣ３９Ａ１、ＮＰＣ１、ＥＮＰＰ１、Ｎ３３、ＧＰＮＭＢ、ＬＹ６Ｅ、ＣＥＬＳＲ１、ＬＲＰ３、Ｃ２０ｏｒｆ５２、ＴＭＥＰＡＩ、ＦＬＶＣＲ、ＰＣＤＨＡ１０、ＧＰＲ５４、ＴＧＦＢＲ３、ＳＥＭＡ４Ｂ、ＰＣＤＨＢ２、ＡＢＣＧ２、ＣＤ１６６、ＡＦＰ、ＢＭＰ−４、β−カテニン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ９、ＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ９０、ＣＸＣＲ４、デコリン、ＡＰＣＤＤ１、ＰＴＫ７、ＥＧＦＲ、ＣＤ１０５、ＣＤ６４、ＣＤ１６、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｅおよびＣＤ４９ｆからなる群から選択される抗原上に存在する、請求項１０または１１のいずれかに記載の多特異的抗体。
【請求項１３】
二特異的抗体を含む、請求項１から１２のいずれかに記載の多特異的抗体。
【請求項１４】
細胞毒性剤をさらに含む、請求項１から１３のいずれかに記載の多特異的抗体。
【請求項１５】
第１の結合部位および第２の結合部位を含み、該第１の結合部位または第２の結合部位が、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ、アルシツモマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、カンツズマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ、シクスツムマブ、クリバツズマブ、コナツムマブ、ダラツムマブ、ドロジツマブ、ズリゴツマブ、ズシギツマブ、デツモマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、エクロメキシマブ、エロツズマブ、エンシツキシマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フツキシマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、グレンバツムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、イムガツズマブ、インダツキシマブ、イノツズマブ、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、レキサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モキセツモマブ、ナルナツマブ、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ノフェツモマブ、オカラツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、パルサツズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツモマブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、ソリトマブ、タカツズマブ、タプリツモマブ、テナツモマブ、テプロツムマブ、チガツズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ、ウブリツキシマブ、ベルツズマブ、ボルセツズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ＣＣ４９、および３Ｆ８からなる群から選択される抗体に由来する、請求項１から１４のいずれかに記載の多特異的抗体。
【請求項１６】
医療において使用するための、請求項１から１５のいずれかに記載の多特異的抗体。
【請求項１７】
副腎がん、膀胱がん、子宮頚がん、子宮体がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、膵臓がん、前立腺がん、および乳がんからなる群から選択される、患者におけるがんを処置するための請求項１から１６のいずれかに記載の多特異的抗体。
【請求項１８】
多特異的抗体を製作するための方法であって、該抗体が第１のＣＬドメインおよび第１のＣＨ１ドメインを有する第１の結合領域と、第２のＣＬドメインおよび第２のＣＨ１ドメインを有する第２の結合領域とを含み、該方法が、該第１のＣＬドメイン、該第１のＣＨ１ドメイン、該第２のＣＬドメインおよび該第２のＣＨ１ドメインからなる群から選択されるドメイン中の静電電荷分布を変更する少なくとも１つのアミノ酸置換を施す工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照される出願
本出願は、その全体が参照によって本明細書中に援用される２０１３年２月８日に出願された米国仮出願第６１／７６２，７５５号に対して優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本出願は、一般に、２つもしくはそれより多くの抗原に結合することができる多特異的抗体を産生する改善された方法、結果として生じる化合物および組成物、ならびに臨床および非臨床の適用におけるこれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＩｇＧ様の二特異的抗体は、異なる結合特異性を抗体の各アーム上に有する。二特異的抗体は、ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域を有する２本の重鎖、ならびにＶＬおよびＣＬ領域を有する２本の軽鎖を含有するという点で、単一特異的ＩｇＧに構造的に類似する。しかし、異なる特異性を各アーム上に作り出すために、ＩｇＧ様の二特異的抗体は、ホモ二量体的と反対に、ヘテロマーの様式、または非対称の様式で対形成する、２本の異なる重鎖（少なくともＶＨ領域において）を有するのが好ましい。さらに、機能的な二特異的分子のアセンブリは、２本の異なる軽鎖（少なくともＶＬ領域が異なる）の、それぞれの重鎖に対する相補的な対形成を必要とする。
【０００４】
非対称性の重鎖の対形成の問題を解決するために様々な戦略が提唱されている。一方法は、これらのヘテロ二量体化（すなわち、重鎖Ａの重鎖Ｂとの対形成）を促進するため、およびこれらのホモ二量体化を防ぐために、抗体のＣＨ３ドメインを変異させることである。この方法論の周知の一実施形態は、「ノブイントゥホール（ｋｎｏｂ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅｓ）」アプローチを伴う（Ｒｉｄｇｅｗａｙら、１９９６年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、９巻（７）、６１７〜６２１頁）。小型のアミノ酸を大型のアミノ酸によって置き換えることからなる「ノブ」変異を、抗体Ａの重鎖のＣＨ３二量体の界面に導入するとホモ二量体化を防止する立体障害をもたらす。同時に、ヘテロ二量体化を促進するために、大型のアミノ酸を小型のアミノ酸によって置き換えることからなる、相補的な「ホール」変異を、抗体ＢのＣＨ３ドメインに導入する。
【０００５】
別の一方法は静電気の使用であり、静電気的に適合したＦｃ鎖の同時発現が、好都合な引力相互作用を支援し、それにより所望のＦｃヘテロ二量体の形成を促進し、不都合な反発性の電荷相互作用が望まないＦｃホモ二量体形成を抑制するように、抗体のＦｃ領域のＣＨ３ドメインの界面を選択された変異で修飾して、Ｆｃ二量体の界面を横切る変更された電荷極性を作り出す（例えば、各々が参照により本明細書に援用される、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎら、２０１０年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２８５巻（２５）、１９６３７〜１９６４６頁、ＷＯ／２００６／１０６９０５、米国特許出願第２０１１／０１２３５３２号を参照されたい）。非対称性の重鎖対形成のためのさらに他の方法も公開されている（各々が参照により本明細書に遂行される、Ｍｅｒｃｈａｎｔら、１９９８年、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１６巻、６７７〜６８１頁；Ｍｏｏｒｅら、２０１１年、ＭＡｂｓ、３巻、５４６〜５６７頁；およびＤａｖｉｓ  ＪＨら、２０１０年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ、２３巻、１９５〜２０２頁、および米国特許出願第２０１２／０１４９８７６号を参照されたい）。
【０００６】
二特異的抗体を作り出すのにクアドローマ技術も使用されている。クアドローマ技術（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、１９８３年、Ｎａｔｕｒｅ、３０５巻（５９３４）、５３７〜４０頁）は、所望の特異性の二特異的抗体を有するマウスモノクローナル抗体を発現する２つの異なるハイブリドーマ細胞株の体細胞融合に基づく。しかし、結果として生じるハイブリッド−ハイブリドーマ（またはクアドローマ）の細胞株内の２つの異なるＩｇの重鎖および軽鎖のランダムな対形成があるため、最高１０種類の異なる免疫グロブリン種が産生され、そのうち１個だけが機能的な二特異的抗体である。重鎖／軽鎖が誤対合した副生成物が存在し、生成収率が大幅に減少することは、機能的な二特異的抗体を十分量得るために、洗練された精製手順が必要であることを意味する。
重鎖／軽鎖の誤対合を減少させようと、ｓｃＦｖファージライブラリーから以前に同定された、特異性が異なるが共通の軽鎖を共有する抗体を使用する方法が用いられた（例えば、Ｍｅｒｃｈａｎｔら、１９９８年、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１６巻、６７７〜６８１頁；米国特許第７，１８３，０７６号を参照されたい）。このアプローチの欠点は、共通の軽鎖を有する抗体を同定するのが困難なことである。すなわち、抗体を、無視できる軽鎖のエネルギー寄与で抗原に結合させるように操作し、したがって二特異的ＩｇＧを操作する場合に共通の軽鎖を使用することができるようにすることが可能であるが、抗体は、抗原に高親和性で結合するのに、重鎖および軽鎖両方のエネルギー寄与を必要とするのがより一般的である。２つの単一特異的抗体を、単一の二特異的抗体として再構成する場合、各重鎖を、それらの対応する軽鎖と正しく対形成させることが、オリジナルの単一特異的ＩｇＧ抗体の結合特性を保持するのに重要となる。これは、既存の抗体を二特異的として再構成する場合、共通の軽鎖の使用を著しく制限する。正しい重鎖／軽鎖の対形成を確実にするためのさらなる分子メカニズムなしで、２本の重鎖と２本の軽鎖とを同時発現させると、誤対合した重鎖および軽鎖の混合の生成物がもたらされる。
このような試みにかかわらず、重鎖および軽鎖の対形成において比較的高い正確さを示す、両方の抗原に高親和性を有するアセンブルした構築物を提供する、二特異的抗体を含めた多特異的抗体を生成する改善された方法が、当技術分野において必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００６／１０６９０５号
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１１／０１２３５３２号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号明細書
【特許文献４】米国特許第７，１８３，０７６号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｒｉｄｇｅｗａｙら、１９９６年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、９巻（７）、６１７〜６２１頁
【非特許文献２】Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎら、２０１０年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２８５巻（２５）、１９６３７〜１９６４６頁
【非特許文献３】Ｍｅｒｃｈａｎｔら、１９９８年、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１６巻、６７７〜６８１頁
【非特許文献４】Ｍｏｏｒｅら、２０１１年、ＭＡｂｓ、３巻、５４６〜５６７頁
【非特許文献５】Ｄａｖｉｓ  ＪＨら、２０１０年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ、２３巻、１９５〜２０２頁
【非特許文献６】ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、１９８３年、Ｎａｔｕｒｅ、３０５巻（５９３４）、５３７〜４０頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この目的で、本発明は、多特異的な構築物における抗体の重鎖および軽鎖の改善された対形成を提供する、新規な方法、化合物、および組成物を提供する。本明細書で使用し、以下により詳しく記載する「多特異的な構築物」という用語は、少なくとも２種類の抗原決定基に同時に結合する能力を有する任意の抗体または抗体成分を意味するものとする。より具体的に述べると、好ましい実施形態において、本発明は、対応する重鎖および軽鎖の正しい対形成が支援され、非対応の重鎖および軽鎖の正しくない対形成が嫌われるように静電力を利用するための、ＣＨ１（抗体重鎖定常領域１）およびＣＬ（軽鎖定常領域）ドメインにおけるある種のアミノ酸残基の、荷電したアミノ酸残基での選択的な置換を提供する。このような修飾されたＣＨ１およびＣＬドメインは優先的に、多特異的な構築物のアセンブリを提供することが理解されよう。ある特定の好ましい実施形態において、選択された重鎖および軽鎖の優先的なアセンブリを支援する、開示する対形成のメカニズムを使用して、ＩｇＧ−Ｆａｂ融合物などを含む、二価、三価、または四価の構築物を提供し得る。
【００１０】
本発明のより特に好ましい実施形態は、ＣＨ１および／またはＣＬ（すなわち、カッパもしくはラムダ軽鎖定常領域）中の選択されたアミノ酸が変異されて、鎖の電荷分布が変更され、多特異的抗体のアセンブリおよび安定性が改善されている多特異的構築物を提供する。各鎖のそれぞれの定常領域に対する変異は、以下のいずれかの目的で導入される：（ｉ）ホモマーの様式よりもむしろヘテロマーの様式における、特異性の異なる重鎖の優先的な対形成（非対称性の重鎖の対形成）、または（ｉｉ）少なくとも２種類の決定基に対する免疫特異性を有する構築物を提供するための、各重鎖の、予め選択された対応する軽鎖との優先的な対形成（重鎖／軽鎖対形成）。下記の実施例に見られるように、これらの構築物は、細胞の死滅の媒介において特に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、標準的な二価の単一特異的抗体、および本発明の二特異的抗体構築物の模式図を示す（ＸおよびＺは異なる免疫原性の決定基を表す）。例示的な二特異的抗体は、ヘテロ二量体の様式で対形成する２本の重鎖と、ＣＨ１およびＣＬドメインでの荷電した残基への置換のため、正しい重鎖と優先的に対形成する対応する軽鎖とを含む。
【００１２】
【図２】図２は、置換のための候補の残基を強調した、リボン構造図を示す。ＣＨ１を暗灰色で示し、ＣＬを明灰色で示す。ＣＬドメインから残基１６４〜１７２を、ならびにＣＨ１ドメインから残基１７４〜１７６および残基１３０〜１３７を、分かりやすいように省略した。番号付けは、Ｋａｂａｔの番号付けスキームに基づく。
【００１３】
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｃは、完全なＩｇＧアセンブリのための候補の変異を有する候補の重鎖および軽鎖をスクリーニングするのに使用した、代表的なＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｃは、完全なＩｇＧアセンブリのための候補の変異を有する候補の重鎖および軽鎖をスクリーニングするのに使用した、代表的なＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｃは、完全なＩｇＧアセンブリのための候補の変異を有する候補の重鎖および軽鎖をスクリーニングするのに使用した、代表的なＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【００１４】
【図４Ａ】図４は、二特異的ＩｇＧ、および対応する二価の単一特異的ＩｇＧについてのＢｉａｃｏｒｅ曲線を示す。二特異的曲線を破線で表し、対照の抗体を実線で表す。
【図４Ｂ】図４は、二特異的ＩｇＧ、および対応する二価の単一特異的ＩｇＧについてのＢｉａｃｏｒｅ曲線を示す。二特異的曲線を破線で表し、対照の抗体を実線で表す。
【００１５】
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、ＲＰ−ＬＣ／ＭＳによって得た、二特異的抗体であるＫｉＨ−ＫＫ（図５Ａ）およびＫｉＨ−ＫＲ（図５Ｂ）の、再構築した、インタクトな質量スペクトルを示す。
【００１６】
【図６】図６は、２つの標準的な二価の単一特異的抗体、および本発明の２つの例示的な四価の二特異的抗体構築物（すなわち、ＩｇＧ−Ｆａｂ構築物）の模式図を示す（ＸおよびＺは異なる免疫原性の決定基を表す）。例示的な構築物はホモ二量体の全長の重鎖（黒色楕円）を含み、これは本明細書の教示にしたがい、課された静電電荷のため軽鎖（白色楕円）と優先的に対形成しており、この軽鎖は第２の軽鎖（構築物Ａ、明灰色楕円）またはＣＨ１／ＶＨ（構築物Ｂ、暗灰色楕円）抗体断片と共有結合で連結している。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
Ｉ．序文
本発明は、多くの異なる形態で具体化され得る。本明細書に開示するのは、本発明の原理を例示する、具体的で非限定的で例示的なその実施形態である。本明細書で使用する全ての節の表題は系統化の目的にすぎず、記載する主題を限定するものと理解してはならない。本開示の目的では、識別配列受託番号は全て、別段の記述がなければ、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＲｅｆＳｅｑ）データベースおよび／またはＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アーカイブ配列データベースに見出すことができる。
【００１８】
本発明は、一般に、少なくとも２種類の抗原決定基に高親和性で結合することができる、二特異的抗体を含めた多特異的抗体を産生する新規な方法に関する。これに関して、別個の決定基は同じ抗原（例えば、タンパク質）上もしくは細胞上に存在してもよく、または異なる抗原もしくは細胞上に存在してもよいことに留意することが重要である。より具体的には、驚くべきことに、多特異的抗体は、抗体成分の選択された成分またはドメインに沿った静電電荷の付与（ｉｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）および適切な分散により優先的にアセンブルし得ることが見出されている。すなわち、ある静電電荷を特定の抗体ドメイン、特にＣＨ１およびＣＬドメインに授けることにより、規定する多特異的抗体の構築物が優先的にアセンブルし得ることを、本発明者らは発見した。特に好ましい実施形態において、静電電荷の付与は、供給源抗体成分の適切な位置の選択されたアミノ酸残基を排除、置換、または変異（例えば、荷電したアミノ酸残基を非荷電のアミノ酸残基に）することによってもたらされる。選択された静電電荷を付与しなければ、分泌供給源抗体成分および可溶性の供給源抗体成分は方向性なくアセンブルし、動作不能の（すなわち非結合性の）構築物、単一特異的な構築物および多特異的な構築物を含む、所望の抗体と非所望の抗体との実質的に均一な混合物を生成する。このような非駆動性のアセンブリは実質的により低収率の所望の多特異的な構築物を提供し、それにより費用は上昇し、精製のプロトコルは複雑になる。反対に、開示する方法を使用すると所望の多特異的な構築物の収率は劇的に上昇し、誤ってアセンブルした、動作不能で、分離するのが困難な構築物の生成は大幅に減少する。
【００１９】
ＩＩ．多特異的抗体
以下および添付の実施例において詳しく論じる通り、本発明の多特異的構築物を製作するのに使用する単一特異的抗体は様々な供給源から得ることができる。一例として、このような「供給源」抗体は、慣用的な免疫化およびハイブリドーマの技術を使用して産生してもよく、または完全ヒト抗体を提供するように操作した動物から得てもよい。他の実施形態において、供給源抗体は、現在診療所または臨床試験で使用されている治療用および診断用の抗体を含めた、公知の、または市販の抗体から得ても、これに由来しても、またはこれから産生してもよい。本質的に、重鎖および／または軽鎖の可変領域の核酸またはアミノ酸の配列が由来するものであるかまたは既知である任意の単一特異的抗体が、本開示の目的のための供給源抗体として役立ち得、本発明の多特異的抗体を製作するのに使用し得る。
【００２０】
本開示の多特異的な構築物は、広範囲の供給源抗体（またはその断片）を組み入れることができるが、本発明は、大部分において、所望の生成物の優先的なアセンブリを前提とすることが理解されよう。指摘する通り、構築物の優先的なアセンブリは、特定のアミノ酸残基の欠失、置換、変異、または排除によって、１つまたは複数の供給源抗体またはその断片の結合領域に静電電荷を選択的に付与することにより駆動され得る。特に好ましい実施形態において、変更するアミノ酸残基の位置は、１つまたは複数の供給源抗体またはその断片のＣＨ１またはＣＬドメイン中に位置する。他の好ましい実施形態において、反対の電荷（すなわち、＋および−）が、アセンブリが望ましいそれぞれ重鎖および軽鎖の結合領域中で産生され、そして／またはそこに付与される。反対の電荷の引力によって駆動されることで、変更された重鎖および軽鎖は、非共有結合の様式で優先的に会合する。特定の重鎖および軽鎖の結合領域の会合を駆動するために適切な電荷を分配することにより、予め選択された多特異的な構築物が優先的にアセンブルし得る。
【００２１】
例えば、図１に示す通り、選択された重鎖および軽鎖の結合領域に正および負の電荷を特異的に付与し、分配することにより、本発明の多特異的抗体は産生される。より具体的に述べると、２つの単一特異的な供給源抗体中のアミノ酸配列を変更して、選択した抗体のＣＨ１またはＣＬドメインのそれぞれに正または負の電荷を授けた。これに関して、単一特異的抗体１のＣＨ１ドメイン（黒色楕円）を負の電荷を授けるように変更し、同じ抗体のＣＬドメイン（白色楕円）を正の電荷を授けるように変更する。逆に、単一特異的抗体２では、ＣＨ１ドメイン（明灰色楕円）を正の電荷を帯びるように変更し、ＣＬドメイン（暗灰色楕円）を負の電荷を帯びるように変更する。さらに、両方の重鎖のＦｃ領域を、「ノブイントゥホール」の構造を示すように操作して（例えば、米国特許第８，２１６，８０５号を参照されたい）、重鎖のヘテロ二量体化を促進する。分泌に際して、２本の重鎖を、それぞれのＦｃ領域のノブイントゥホール構造によって非対称にアセンブルするように駆動させる。重大なのは、付与された電荷のため、変更された２本の軽鎖が、適切な（反対に授けられた電荷を有するという意味で）重鎖と優先的に会合して、抗原特異性の異なる２つの結合部位（ＸおよびＺ）を提供することである。本明細書の教示に従うと、ＣＨ１／ＣＬドメインに同じ電荷を有する軽鎖／重鎖対のアセンブリは、強烈に嫌われ、稀にしか生じない。
【００２２】
当業者であれば、選択する重鎖の非対称性の会合を促進するための様々な方法が存在することが理解されよう。例えば、重鎖の優先的なヘテロ二量体化は、Ｆｃ領域の相補的な位置に反対の電荷を授けることにより実現され得る。選択された実施形態において、静電電荷を付与するとヘテロ二量体対の形成が促進され、ホモ二量体対の形成が妨害される。さらに、Ｆｃ領域の表面構造および付随する力の分布のため、このような電荷を付与しても、重鎖および軽鎖の結合領域の優先的なアセンブリを著しく妨害しないはずである。さらに、「ノブイントゥホール」以外の当技術分野で認められている技術（例えば、化学的連結、共有結合を形成するための分子操作、ジスルフィド連結など）を使用して、本明細書の以下に論じる通り、重鎖のヘテロ二量体化を促進してもよい。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態は、適切な位置の特定のアミノ酸残基の欠失、置換、または変異により所望の部位特異的な静電電荷を授け、または産生する。適切な重鎖および／または軽鎖の配列を提示すれば、当業者であれば、本教示を鑑みて、変更して所望の電荷の分布を提供することができる適切な位置または残基を識別することができる。この点に関して、そして添付の実施例により詳しく示す通り、本発明に従う変更および電荷の付与を受け入れられる残基の位置は、当技術分野で認められている結晶学の技術およびコンピュータモデリングを使用して決定することができる。より詳しくは、ある特定の実施形態において、選択される抗体の結合領域の結晶構造を、タンパク質データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）（ＰＤＢ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓにより維持されている）を使用して分析して、相互に比較的近位にある重鎖および軽鎖の残基の位置を提供してもよい。図２は、本明細書の教示にしたがって行った例示的な分析の結果を示す。この実施例では、分析により、相互に比較的近位にあり、置き換えのための良好な候補を提供する７個の残基（３個はＣＨ１上、および４個はＣＬ上）を有するＣＨ１ドメインおよびＣＬカッパドメインの三次元構造が提供された。このような残基を同定するほかに、隣接する残基、潜在的な立体障害、ならびに重鎖および軽鎖の界面の構造に関するさらなる情報も得てもよい。まとめると、このような情報を使用して、どの残基を次に変更して重鎖または軽鎖の選択された位置に効果的な正または負の電荷を授けることができるかを決定することができる。
【００２４】
より詳しく述べると、本発明のある特定の好ましい実施形態は、ＩｇＧ１の供給源抗体のＣＬドメインまたはＣＨ１ドメインにおける静電電荷の分布を変更することを含む。選択された実施形態において、そして添付の実施例に示す通り、ＣＬドメインはカッパＣＬドメインを含む。他の実施形態において、供給源抗体はラムダＣＬドメインを含むことができる。全てのヒトＩｇＧのＣＬドメインの配列は周知であるので、当業者であれば、本開示にしたがってラムダおよびカッパ配列の両方を容易に分析することができ、これを用いて適合性の多特異的抗体の構築物を提供することができる。同様に、説明および実証の目的で、以下の議論および添付の実施例はＩｇＧ１のＣＨ１ドメインを主に特集する。軽鎖定常領域と同様に、異なるアイソタイプ（ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ）およびサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）に由来する全てのヒトＣＨ１ドメインの配列は周知であり、特徴付けられている。したがって、当業者であれば、任意のアイソタイプまたはサブクラスを含む供給源抗体を容易に活用し、本開示が教示する通りに別個の各ドメインにおける静電電荷の分布を変更または修飾して本発明の多特異的抗体を提供することができる。
【００２５】
所望の構築物がカッパＣＬドメインを用いる場合、好ましい実施形態はアミノ酸置換Ｎ１３７Ｘ、Ｎ１３８Ｘ、Ｓ１７６Ｘ、およびＳ１７４Ｘを含み、Ｘは、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸を含めた任意の荷電したアミノ酸から選択することができる。同様に、所望の構築物がＩｇＧ１のＣＨ１ドメインを用いる場合、好ましい実施形態はアミノ酸置換Ｈ１７２Ｘ、Ｓ１８８Ｘ、およびＴ１９２Ｘを含み、Ｘは、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸を含めた任意の荷電したアミノ酸から選択することができる。本教示にしたがうと、正確な置換は、反対の静電電荷の分布を最適化し、所望の重鎖および軽鎖の効果的なアセンブリを促進するために行われることが理解されよう。
【００２６】
より一般的には、本明細書で論じる通り、同定された残基または重鎖もしくは軽鎖の位置は、当技術分野において標準的な分子生物学または生化学的な技術を使用するいくつかの方法で変更され得る。これに関して、選択されるアミノ酸残基を欠失しても、他の残基で置換しても、またはランダムに変異させ、スクリーニングして電荷の分布に対するその後の影響を決定してもよい。同定された残基を置き換え、または置換しようとする場合、置換アミノ酸は正または負に荷電した天然のアミノ酸または非天然のアミノ酸（すなわち、ヒトにおいて天然に見出されないもの）を含むことが好ましい。特に好ましい実施形態において、アミノ酸は、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群から選択される天然の荷電アミノ酸を含む。当業者であれば、授けようとする電荷が正であれば、選択される置換アミノ酸は、リジン、アルギニン、またはヒスチジンを含み、所望の電荷が負であれば、置換アミノ酸はアスパラギン酸またはグルタミン酸を含むことが理解されよう。選択される実施形態において、１本の鎖に配置されるアミノ酸はリジン、アルギニン、またはヒスチジンを含み、対応する反対の鎖に組み入れられるアミノ酸はアスパラギン酸またはグルタミン酸を含む。どの置換アミノ酸を挿入するかの正確な選択は、電荷の所望の強度、その位置におけるアミノ酸の適合、および周囲の静電環境（相補的な鎖上に配置される全ての電荷を含む）に依存し、これらは各々過度の実験なしに容易に決定することができる。さらに、任意の置換アミノ酸は、重鎖および軽鎖の界面の野生型の残基の組成および構造を可能な限り維持したまま電荷の分布を最適化するために非近接の位置に配置または挿入してもよい。
【００２７】
図１に示す例示的な構築物の他に、本発明の方法および原理を使用して、本開示に従う様々な多特異的な構築物を提供することができることが理解されよう。すなわち、付与される電荷の分布を、多特異的な構築物の優先的なアセンブリのために使用すると、複数の構造の適合性の抗体が提供される。これに関して、図６は、ＩｇＧ−Ｆａｂ構築物を含む推定上の例示的な四価の二特異的抗体を示す。選択するドメインに正および負の電荷を配置することにより、この構築物の優先的なアセンブリが実現され得る。より詳しく述べると、負の電荷を単一特異的な供給源抗体１のＣＨＩドメイン（黒色楕円）に授け、正の電荷を同じ抗体のＣＬドメイン（白色楕円）に授ける。反対に、単一特異的な供給源抗体２では、正の電荷を重鎖のＣＨ１ドメイン（暗灰色楕円）に授け、負の電荷を軽鎖のＣＬドメイン（明灰色楕円）に授ける。次いで、標準的な分子生物学の技術を使用して、ｉ）抗体２の軽鎖結合領域（構築物Ａ）、またはｉｉ）抗体２の重鎖結合領域（構築物Ｂ）のいずれかに共有結合で連結している抗体１の軽鎖結合領域を含む単鎖の構築物を操作する。３種類の構築物の鎖（抗体１の重鎖、抗体２の軽鎖または重鎖結合領域、および軽鎖−Ｆａｂ）の分泌に際して、二特異的な四価の構築物ＡおよびＢが優先的にアセンブルし、決定基ＸおよびＺと反応する。図１に示す例示的な実施形態と異なり、図６の多特異的な構築物は、ホモ二量体の重鎖を含む。さらに、重鎖および軽鎖の天然の立体構造および結果として生じる界面は、反対の電荷の付与にもかかわらず、２種類の軽鎖の結合領域の対形成または２種類の重鎖の結合領域の対形成を実質的に阻害する。
【００２８】
上記に言及した通り、本発明にしたがって静電電荷を付与することにより、所望の構築物の形成が駆り立てられ、望まない（例えば、単一特異的な）構築物および動作不能の（例えば、部分的または全体的に非結合性の）構築物の形成は阻害される。すなわち、本発明の方法は、所望の多特異的抗体の優先的なアセンブリを提供する。本明細書で使用するとき、「優先的なアセンブリ」という用語は、静電電荷が本明細書に記載する通りに授けられない場合に得られる所望の多特異的な構築物よりも高率で、所望の多特異的な構築物が生成またはアセンブルされることを意味するものとする。この優先的なアセンブリの比率は、荷電した抗体成分を発現する操作された細胞の上清に存在する、適切にアセンブルした作動可能な多特異的な構築物のパーセント値として測定および定量され得る。これに関して、本発明は、作動可能な多特異的な構築物が、全構築物（例えば、誤ってアセンブルした／作動不能な構築物を含めて）のパーセントとして、細胞上清中に約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、またはさらに約５５％の純度を超えて存在することをもたらす。下記の実施例に示す通り、「作動可能な多特異的な構築物」の特徴付けは、結合アッセイ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡなど）と分子構造分析（質量分析法、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動など）との組合せによって遂行することができる。このような分析技術は当技術分野において周知であり、当業者であれば容易に用いて作動可能な多特異的な純度の度合いを決定することができる。好ましい実施形態において、細胞上清は、約６０％、約６２％、約６４％、約６６％、約６８％、約７０％、約７２％、約７４％、約７６％、約７８％、またはさらに約８０％を超える純度の、作動可能な多特異的な構築物を含む。特に好ましい実施形態において、細胞上清は、約８２％、約８４％、約８６％、約８８％、約９０％、約９２％、またはさらに約９５％を超える純度の、作動可能な多特異的な構築物を含む。
【００２９】
本発明（または優先的なアセンブリ）の有効性は、開示する構築物の最終濃度を、静電電荷を付与しなかった同等の構築物と比べることによって、経験的に定量することができることがさらに理解されよう。すなわち、当業者であれば、静電電荷を付与して、および付与せずに、多特異的な構築物を発現する別個の細胞株を調製することができ、各細胞株からの作動可能な多特異的な構築物の収率を比較することができる。上記に論じた通り、作動可能な多特異的な構築物の特徴付けは、結合アッセイ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡなど）と分子構造分析（質量分析法、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動など）とを組み合わせることにより遂行してもよい。これらの別個の細胞株の発現レベルが同等であるか、または説明されると想定すると、本発明の荷電した作動可能な多特異的な構築物の上清濃度は、同等の荷電していない構築物よりも少なくとも５％高い。好ましい実施形態において、この荷電した構築物の濃度は、この同等の荷電していない構築物より少なくとも７％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１５％、少なくとも１７％、少なくとも２０％、少なくとも２３％、少なくとも２５％、少なくとも２７％、または少なくとも３０％高い。特に好ましい実施形態において、この荷電した構築物の濃度は、この同等の荷電していない構築物よりも少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％高い。さらに他の実施形態において、この荷電した構築物の濃度は、この同等の荷電していない構築物よりも、少なくとも１００％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１７５％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、または少なくとも２００％高い。なお他の実施形態において、この荷電した構築物の濃度は、この同等の荷電していない構築物よりも、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、または少なくとも５００％高い。
【００３０】
純度におけるこの上昇および本発明の利点は、静電電荷の付与を選択的に適用して適切な構築物のアセンブリを奨励することができるので、多くの異なる多特異的な構築物に適用できることが理解されよう。これに関して、本明細書に開示する方法は、様々な多価の構築物（例えば、二価、三価、四価など）、および多特異的な構築物に適用できる。定義上、多特異的な構築物は、二価の構築物を少なくとも含む。本明細書で使用する「価（ｖａｌｅｎｃｙ）」という用語、または「価（ｖａｌｅｎｔ）」という接尾語は、抗体に付随する潜在的な抗原結合部位の数を指す。抗体結合領域内の各抗原結合部位は、１つの決定基（例えば、細胞表面タンパク質上のエピトープ）に免疫特異的に結合する。四価の二特異的抗体を図示する図６によって示す通り、１つより多くの結合部位が同じ決定基に結合することができる。より一般的には、抗体が１つより多くの抗原結合部位を含む場合（多価）、各抗原結合部位は、構築物が最終的に少なくとも２つの別個の決定基と反応するのであれば、同じまたは異なる決定基に免疫特異的に結合してよい（例えば、異なるリガンドもしくは異なる抗原、または同じ抗原上の異なるエピトープもしくは位置に結合してよい）。これに関して、決定基は同じ抗原上（例えば、別個のエピトープもしくはドメイン）にあってもよく、または別々の抗原上にあってもよいことに留意することが重要である。同様に、決定基は、同じ細胞上に存在してもよく、または異なる細胞もしくは異なるクラスの細胞上に存在してもよい。
【００３１】
再度述べると、「多特異的抗体」という用語は最も広い意味で使用されて、多重決定基（ｐｏｌｙｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）の特異性を有する（すなわち、１つの生物学的分子上の２つもしくはそれより多くの異なる決定基に特異的に結合することが可能であるか、または２つもしくはそれより多くの異なる生物学的分子上の別個の決定基と特異的に結合することが可能である）抗原結合部位を含む抗体を具体的に網羅することを繰り返さなければならない。このような多特異的抗体には、それだけには限定されないが、全長の抗体、２つもしくはそれより多くのＶＬおよびＶＨドメインを有する抗体、ＣＬまたはＣＨ１領域を含む抗体断片、例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ  二特異的なダイアボディおよびトリアボディ、ならびに共有結合または非共有結合で連結している他の適合性の抗体断片が含まれる。各場合とも、静電電荷は、選択された抗体ドメインまたは領域に適切に分布して、所望の構築物の優先的なアセンブリを提供し得る。本開示の目的のために、「二特異的抗体」は、１分子上の２つの異なるエピトープを特異的に認識し、もしくは結合することができる、または２つの異なる分子上のエピトープを特異的に認識し、もしくは結合することができる、抗原結合ドメインを含む多特異的抗体である。二特異的抗体はまた、本明細書で「二重特異性」を有する、または「二重特異的」であると言及する。例えば、米国特許第２００９／０１３０１０５号、第２０１２／０１２１５９６号、第２００９／０１５５２５５号、および第２０１１／０３０１３３１号を参照されたい。他の適合性の構築物は、その各々が参照によって本明細書に援用される、米国特許第２０１３／００１７２００号、第２０１３／０００４４１６号、および第２０１２／０３１６３２４号、ならびに米国特許第８，３４９，３３２号および第７，５２１，０５６号、ならびにＷＯ２０１２／１６２５８３、ＷＯ２０１３／００５１９４、ＷＯ９４／０４６９０、およびＷＯ９６／２７０１１；Ｓｕｒｅｓｈら、１９８６年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１巻、２１０頁；Ｃｏｌｏｍａ，  Ｍ．  Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、１５巻（１９９７年）１５９〜１６３頁；ＷＯ２００１／０７７３４２；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｓ．  Ｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、２５巻（２００７年）１２３３〜１２３４頁）に見出すことができる。
【００３２】
本発明の文脈において、好ましくは、ＣＨ１およびＣＬドメインを含み、第１の決定基（例えば、エピトープ）を認識する結合部位、および第１の決定基と異なる第２の決定基を認識する少なくとも１つの第２の結合部位を含む、任意の当技術分野で認識されている二特異的または多特異的な構築物は、適合性であり、本明細書の教示と組み合わせてアセンブルし得る。好ましい実施形態において、本発明は、２つの異なる抗原結合部位が単一の分子中に組み込まれている二特異的抗体を提供する。二特異的抗体は、化学的架橋（Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻、８１頁（１９８５年）；Ｒａｓｏら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７２巻、２７６２３頁（１９９７年））、ジスルフィド交換、ハイブリッド−ハイブリドーマ（クアドローマ）の生成によって、二特異的抗体を具現化させる単一のポリペプチド鎖を生成するための転写および翻訳によって、または共有結合で会合して二特異的抗体を生成することができる１つより多くのポリペプチド鎖を生成するための転写および翻訳によって調製してもよい。企図される二特異的抗体は、完全に化学的合成によって作製することもできる。二特異的抗体は、２つの異なる可変領域、２つの異なる定常領域、可変領域および定常領域、または他の変形を含むことができる。各場合において、静電電荷の選択的な付与により、所望の構築物の優先的なアセンブリ、およびその改善された収率を提供することができる。
【００３３】
ＩＩＩ．抗体の構造および特徴
下記および添付の実施例において詳しく論じる通り、本発明の多特異的な構築物を製作するために使用する単一特異的抗体は、様々な供給源から得ることができる。一例として、このような「供給源」抗体は、慣例的な免疫化およびハイブリドーマ技術を使用して産生してもよく、または完全に提供するように操作した動物から得てもよい。
【００３４】
以下の議論は、開示する多特異的抗体の構築物を提供するために、本明細書の教示と組み合わせて使用することができる抗体の一般的構造、特徴、および供給源に対するものである。これらの「供給源抗体」の構造および特性は、多かれ少なかれ開示する多特異的抗体に組み入れられることが理解されよう。一例として、供給源抗体をヒト化して免疫原性を比較的低くする場合、ヒト化供給源抗体の全てまたは一部を含む多特異的抗体は、比較的免疫原性が低いことが判明する可能性がある。同様に、供給源抗体が内部移行抗体であることが決定される場合、このような抗体の全てまたは一部含む本発明の多特異的な構築物は、投与すると内部移行することが見出される可能性がある。したがって、抗体の構造および特徴の以下の議論は、供給源抗体および本発明の多特異的抗体の両方に適用できる。
【００３５】
１．抗体の構造
抗体ならびにそのバリアントおよび由来物は、承認された命名法および番号付けシステムを含め、例えば、Ａｂｂａｓら（２０１０年）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第６版）、Ｗ．Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ；またはＭｕｒｐｈｅｙら（２０１１年）Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（第８版）、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅに広範囲に記載されている。
【００３６】
「抗体」または「インタクトな抗体」は、典型的には、共有結合性のジスルフィド結合および非共有結合性の相互作用によって束ねられている２本の重鎖（Ｈ）ポリペプチド鎖および２本の軽鎖（Ｌ）ポリペプチド鎖を含むＹ形状の四量体タンパク質を指す。ヒト軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を含み、定常ドメインは、アミノ酸配列に基づいてカッパまたはラムダに容易に分類することができる。各重鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）および定常領域を含み、定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤの場合、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３と呼ばれる３つのドメインを含む（ＩｇＭおよびＩｇＥは第４のドメインであるＣＨ４を有する）。ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤクラスでは、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインは、柔軟なヒンジ領域によって分けられており、このヒンジ領域は、プロリンおよびシステインに富む可変の長さのセグメントである（一般的に、ＩｇＧではアミノ酸約１０個から約６０個である）。軽鎖および重鎖両方における可変ドメインは、アミノ酸約１２個もしくはそれより多くの「Ｊ」領域により定常ドメインに接続されており、重鎖はさらなるアミノ酸約１０個の「Ｄ」領域も有する。各クラスの抗体は、対形成したシステイン残基によって形成される、鎖間および鎖内のジスルフィド結合をさらに含む。
【００３７】
本明細書で用いるとき、「抗体」という用語は、広範囲に解釈することができ、ポリクローナル抗体、マルチクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および霊長動物化抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ヒト抗体、組換え生成された抗体、イントラボディ、多特異的抗体、二特異的抗体、一価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、ムテインおよびそのバリアントを含めた合成抗体、免疫特異的抗体断片、例えば、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）断片、一本鎖断片（例えば、ＳｃＦｖおよびＳｃＦｖＦｃ）；およびＦｃ融合物および他の修飾を含むこれらの由来物、ならびに任意の他の免疫反応性分子（決定基との優先的な会合または結合を示す限り）を含む。
【００３８】
抗体の可変ドメインは、アミノ酸組成におけるかなりの変動を抗体間で示し、抗原の認識および結合を主に担っている。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、インタクトなＩｇＧ抗体が２つの結合部位を有する（すなわち、二価である）ように、抗体結合部位を形成する。ＶＨおよびＶＬドメインは、可変性が極端である３つの領域を含み、これらは超可変領域と呼ばれる、またはより一般的には相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれ、フレームワーク領域（ＦＲ）として知られている可変性のより低い４つの領域によって組み立てられ、分けられる。ＶＨ領域とＶＬ領域との間の非共有性の会合は、抗体の２つの抗原結合部位の１つを含有するＦｖ断片（「可変断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ）」を表す）を形成する。ＳｃＦｖ断片（単鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ）を表す）は遺伝子操作によって得ることができ、単一のポリペプチド鎖である、抗体のＶＨおよびＶＬ領域において会合し、ペプチドリンカーによって分けられている。
【００３９】
本明細書で使用するとき、各ドメイン、フレームワーク領域、およびＣＤＲへのアミノ酸の割り当ては、別段の記載がなければ、Ｋａｂａｔら（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  （第５版）、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＰＨＳ、ＮＩＨ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ番号９１−３２４２；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８７年、ＰＭＩＤ：３６８１９８１；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年、ＰＭＩＤ：２６８７６９８巻、；ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６年、ＰＭＩＤ：８８７６６５０；またはＤｕｂｅｌ編集（２００７年）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第３版、Ｗｉｌｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ａｎｄ  Ｃｏ．によって提供される番号付けスキームの１つに従うものであってよい。Ａｂｙｓｉｓウェブサイトのデータベース（下記）から得た通りであり、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、およびＭａｃＣａｌｌｕｍによって規定される通りのＣＤＲを含むアミノ酸残基を、以下の表１に記載する。
【表１】
2016509014.tif 000003
【００４０】
抗体配列における可変領域およびＣＤＲは、当技術分野において開発された一般的なルールにしたがって（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステムなど、上記に記載した通り）、または配列を既知の可変領域のデータベースに対して割り当てることによって同定することができる。これらの領域を同定するための方法は、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ編集、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２００１年、ならびにＤｉｎａｒｅｌｌｏら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ、２０００年に記載されている。Ｒｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３３巻（データベース特集号）、Ｄ６７１〜Ｄ６７４頁（２００５年）に記載されているように、抗体配列の例示的なデータベースは、ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓの「Ａｂｙｓｉｓ」ウェブサイト（Ａ．Ｃ．  Ｍａｒｔｉｎ、ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｌｏｎｄｏｎ，  Ｌｏｎｄｏｎ、英国によって維持されている）およびｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇのＶＢＡＳＥ２ウェブサイトに記載されており、これにより入手することができる。Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）からの配列データをＰＤＢからの構造データと統合した、Ａｂｙｓｉｓデータベースを使用して配列を分析するのが好ましい。Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ（編集：Ｄｕｅｂｅｌ，  Ｓ．およびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，  Ｒ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ＩＳＢＮ−１３：９７８−３５４０４１３５４７の中のＤｒ．  Ａｎｄｒｅｗ  Ｃ．  Ｒ．  Ｍａｒｔｉｎ’ｓ  ｂｏｏｋ  ｃｈａｐｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ、ウェブサイトｂｉｏｉｎｆｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ上でも入手できる）を参照されたい。Ａｂｙｓｉｓデータベースのウェブサイトは、本明細書の教示にしたがって使用することができ、ＣＤＲを同定するために開発された一般的なルールをさらに含む。別段の指摘がなければ、本明細書に記載するＣＤＲは全て、ＫａｂａｔによるＡｂｙｓｉｓデータベースウェブサイトに由来するものである。
【００４１】
本発明において論じる重鎖定常領域のアミノ酸の位置について、番号付けは、ミエローマタンパク質であるＥｕのアミノ酸配列を記載する、Ｅｄｅｌｍａｎら、１９６９年、Ｐｒｏｃ，  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、６３巻（１）、７８〜８５頁（配列決定された最初のヒトＩｇＧ１を報告した）において最初に記載されたＥｕインデックスにしたがうものである。ＥｄｅｌｍａｎのＥｕインデックスは、Ｋａｂａｔら、１９９１年（上述）にも記載されている。よって、重鎖の文脈における、「Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックス」または「ＫａｂａｔのＥＵインデックス」という用語は、Ｋａｂａｔら、１９９１年（上述）に記載されている通りであるＥｄｅｌｍａｎらのヒトＩｇＧ１のＥｕ抗体に基づく残基の番号付けシステムを指す。軽鎖定常領域のアミノ酸配列に用いる番号付けシステムは、同様にＫａｂａｔら、１９９１年に記載されている。
【００４２】
本発明の多特異的抗体または免疫グロブリンは、任意の関連の決定基に特異的に結合し、それを認識し、またはそれと会合する抗体から製作されてもよい。本明細書で使用されるとき、「決定基」は、特定の細胞、細胞集団、組織、またはタンパク質において、またはその上で、識別可能に会合し、または特異的に見出される、任意の免疫特異的に検出できる形質、特質、マーカー、または因子を意味する。決定基は、性質において形態学的、機能的、または生化学的なものであってよく、好ましくは表現型によるものである。ある特定の好ましい実施形態において、決定基は、特定の細胞型によって、または特定条件下の細胞によって（例えば、細胞周期の特定の時点の間の、もしくは特定のニッチにおける細胞）差次的に発現される（過剰発現もしくは過小発現される）ペプチドまたはタンパク質を含む。このような場合、決定基は、細胞、タンパク質、またはペプチドによって提示されるエピトープを含むことができる。本発明の目的のために、決定基は、好ましくは異常ながん細胞上に差次的に発現され、ＣＤ３２４もしくはネクチン−４タンパク質上、またはこれらのスプライスバリアント、アイソフォーム、もしくはファミリーメンバーのいずれか、あるいはその特定のドメイン、領域、もしくはエピトープの上に見出すことができる。「免疫原性の決定基」、「抗原決定基」は、免疫応答性の動物に導入した場合に免疫応答を刺激することができ、この免疫応答から生成される抗体によって認識される、任意のタンパク質、または任意のその断片、領域、ドメイン、もしくはエピトープを意味する。
【００４３】
本発明の選択された実施形態は、ＣＤ３２４またはネクチン−４のいずれかに免疫特異的に結合する、単一特異的な「供給源」抗体またはその断片を組み入れている構築物を含む。先に論じた通り、「供給源」抗体は、標準の分子生物学または生化学の技術を使用して、所望の結合の特徴を保持しながら、本発明の多特異的抗体に組み入れることができる任意の単一特異的抗体またはその断片を含む。ある特定の実施形態において、本発明が企図する多特異的抗体は、供給源抗体の定常領域またはエピトープ結合性のアミノ酸配列を任意選択で修飾することにより、このような「供給源」抗体に由来し得る。一実施形態において、多特異的抗体は、このような供給源抗体（例えば、二特異的であり、ＣＤ３２４およびネクチン−４に同時に結合することができる抗体）に由来し得る。他の実施形態において、多特異的抗体は、変異、置換、統合、除去、またはこれらの組合せによって、供給源抗体中の選択されたアミノ酸を変更し、欠失させ、または置き換えることにより、供給源抗体に「由来」する。さらに他の実施形態において、「由来」抗体は、供給源抗体の断片（例えば、１つまたは複数のＣＤＲ）がアクセプタ抗体の配列と組み合わされ、またはこの配列中に組み入れられて、派生的な抗体（例えば、キメラもしくはヒト化多特異的抗体）を提供するものである。これらの「由来」（例えば、ヒト化またはＣＤＲグラフト化）多特異的抗体は、様々な理由、例えば、決定基に対する親和性を改善するため、細胞培養物における生成および収率を改善するため、ｉｎ  ｖｉｖｏの免疫原性を低下させるため、毒性を低下させるため、または活性部分もしくは細胞毒素のコンジュゲーションを促進するためにで標準的な分子生物学の技術を使用して産生することができる。このような抗体は、化学的手段または翻訳後修飾による成熟分子の修飾によって（例えば、グリコシル化パターンもしくはペグ化）、供給源抗体または多特異的な構築物に由来し得る。
【００４４】
２．抗体の産生および生成
本発明に適合性の供給源抗体は、当技術分野において公知である様々な方法を使用して生成することができる。
【００４５】
Ａ．宿主動物におけるポリクローナル抗体の生成
様々な宿主動物におけるポリクローナル抗体の生成は、当技術分野において周知である（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編集）（１９８８年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ；ならびにＨａｒｌｏｗら（１９８９年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＮＹ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。ポリクローナル抗体を産生するために、免疫応答性の動物を、抗原決定基（例えば、ペプチドもしくはタンパク質）、または抗原決定基を含む細胞もしくは調製物で免疫化する。ある期間の後、動物を採血する、または屠殺することにより、ポリクローナル抗体を含有する血清が得られる。動物から得た形態の血清を使用してもよく、または抗体を部分的もしくは完全に精製して均一な供給源抗体調製物を提供してもよい。
【００４６】
任意の形態の抗原、または抗原を含有する細胞もしくは調製物を使用して、決定基に特異的である抗体を産生することができる。「抗原」という用語は広い意味で使用され、単一のエピトープ、複数のエピトープ、単一もしくは複数のドメイン、または細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む、選択された標的の任意の免疫原性の断片または決定基を含むことができる。抗原は、単離された全長のタンパク質、細胞表面タンパク質（例えば、抗原の少なくとも部分をその表面上に発現する細胞で免疫化する）、または可溶性タンパク質（例えば、タンパク質のＥＣＤ部分だけで免疫化する）であってよい。抗原は、遺伝子修飾された細胞中で生成され得る。任意の上述の抗原を、単独で、または当技術分野において公知である１つもしくは複数の免疫原性増強性のアジュバントと組み合わせて使用してもよい。抗原をコードするＤＮＡは、ゲノムでも、または非ゲノム（例えば、ｃＤＮＡ）でもよく、好ましくは免疫原性の応答を誘発するのに十分な少なくとも一部のＥＣＤをコードしていてもよい。それだけには限定されないが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、プラスミド、および陽イオン性脂質などの非ウイルスベクターを含めた、任意の遺伝子ベクターを用いて、その抗原が発現される細胞を形質転換してもよい。
【００４７】
Ｂ．モノクローナル抗体
一実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体の使用を企図するものである。当技術分野において公知である通り、「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得た抗体を指し、すなわち、この集団構成する個々の抗体は、微量存在し得る可能な変異（例えば、自然に発生する変異）以外は同一である。
【００４８】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え操作、ファージディスプレイ技術、トランスジェニック動物（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標））、またはこれらのいくつかの組合せを含めた、当技術分野において公知の広範囲の技術を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、Ａｎ，  Ｚｈｉｇｉａｎｇ（編集）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｆｒｏｍ  Ｂｅｎｃｈ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、第１版、２００９年；Ｓｈｉｒｅら（編集）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＋  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ  ＬＬＣ、第１版、２０１０年；Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８年；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、５６３〜６８１頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１年）により詳しく記載されているものなどの、ハイブリドーマならびに生化学的および遺伝子操作の技術を使用して生成することができる。このような技術では、適切な遺伝子材料を、所望の供給源抗体を生成する細胞（例えば、スクリーニングしたハイブリドーマ細胞）から単離し、当技術分野において公知の技術を使用して操作する。選択された決定基に免疫特異的に結合する複数のモノクローナル抗体を生成させた後、特に有効な抗体を、決定基に対する親和性などに基づく様々なスクリーニングプロセスによって選択してもよい。
【００４９】
Ｃ．キメラ抗体およびヒト化抗体
他の実施形態において、本発明の多特異的抗体は、少なくとも２つの異なる種（例えば、マウスおよびヒト）またはクラスの抗体に由来し、共有結合で接続されたタンパク質セグメントに由来するキメラ抗体を含むことができる。「キメラの」という用語は、重鎖および／または軽鎖の部分が、特定の種に由来する、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一である、または相同である一方、鎖（複数可）の残りの部分は、別の種に由来する、または別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一である、または相同である構築物、ならびにこのような抗体の断片に対するものである（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４年、ＰＭＩＤ：６４３６８２２）。
【００５０】
一実施形態において、キメラの多特異的抗体は、マウスのＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列、ならびにヒトの供給源に由来する定常領域、例えば、以下に記載するヒト化抗体を含むことができる。一部の実施形態において、抗体は、「ＣＤＲグラフト化」されていてもよく、この抗体は、特定の種に由来する、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する１つまたは複数のＣＤＲを含み、残りの抗体鎖（複数可）は、別の種に由来する、または別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一である、または相同である。ヒトにおいて使用するために、選択した齧歯動物ＣＤＲ、例えばマウスＣＤＲを、ヒト抗体中にグラフト化、ヒト抗体の天然に存在するＣＤＲの１つまたは複数を置き換えてもよい。これらの構築物は一般的に、被検体による抗体に対する望まない免疫応答を低減しながら、完全な強度の抗体機能、例えば、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を提供するという利点がある。
【００５１】
ＣＤＲグラフト化抗体と同様であるものは「ヒト化」抗体である。本明細書で使用するとき、非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、１つまたは複数の非ヒトの免疫グロブリンに由来するアミノ酸配列を含むキメラ抗体である。一実施形態において、ヒト化抗体は、レシピエントのＣＤＲに由来する残基が、非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒトの霊長動物の１つまたは複数のＣＤＲに由来する残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエントもしくはアクセプタ抗体）である。ヒト受容体の抗体を用いる場合、ＣＤＲグラフト化抗体はヒト化抗体であってよい。ある特定の好ましい実施形態において、ヒト免疫グロブリンの重鎖または軽鎖可変ドメインにおける１つまたは複数のＦＲ中の残基は、グラフト化ＣＤＲ（複数可）の適切な３次元構造の維持を助け、それにより親和性を改善するために、ドナー抗体に由来する対応する非ヒト残基によって置き換えられている。これは、「復帰突然変異」の導入と言うことができる。さらに、ヒト化抗体は、抗体の性能をさらに洗練するなどのために、レシピエントの抗体中またはドナー抗体中に見出されない残基を含むことができる。
【００５２】
ヒト化抗体においてどのヒト配列を使用するかを決定するために様々な供給源を使用することができる。このような供給源には、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，  Ｉ．  Ａ．ら（１９９２年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２７巻、７７６〜７９８頁；Ｃｏｏｋ，  Ｇ．  Ｐ．ら（１９９５年）Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ、１６巻、２３７〜２４２頁；Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｄ．ら（１９９２年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２７巻、７９９〜８１７頁；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５年）ＥＭＢＯ  Ｊ、１４巻、４６２８〜４６３８頁に開示されているヒト生殖系列配列；ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的な総覧を提供するＶ−ＢＡＳＥ総覧（ＶＢＡＳＥ２−Ｒｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、３３巻、６７１〜６７４頁、２００５年）（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，  Ｉ．  Ａ．ら、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫにより編纂）；または例えば、米国特許第６，３００，０６４号に記載されているコンセンサスヒトＦＲが含まれる。
【００５３】
ＣＤＲグラフト化供給源抗体およびヒト化供給源抗体は、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号および第５，６９３，７６２号に記載されている。さらに詳しくは、例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６年、ＰＭＩＤ：３７１３８３１）、ならびに米国特許第６，９８２，３２１号および第７，０８７，４０９号を参照されたい。
【００５４】
別の一方法は、「ヒューマニア化（ｈｕｍａｎｅｅｒｉｎｇ）」と呼ばれ、これは、米国特許第２００５／０００８６２５号などに記載されている。別の一実施形態において、非ヒト抗体は、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に開示されている方法によって、ヒトＴ細胞エピトープの特異的な欠失、または「脱免疫化」によって修飾してもよい。
【００５５】
選択される実施形態において、ヒト化またはＣＤＲグラフト化供給源抗体の重鎖または軽鎖の可変領域のアミノ酸残基の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％は、レシピエントのヒト配列のものに対応する。他の実施形態において、ヒト化供給源抗体の可変領域の残基の少なくとも８３％、８５％、８７％、または９０％は、レシピエントのヒト配列のものに対応する。さらなる好ましい一実施形態において、ヒト化供給源抗体の可変領域の残基の各々の９５％より多くが、レシピエントのヒト配列のものに対応する。
【００５６】
Ｄ．ヒト抗体
別の一実施形態において、供給源抗体は、完全ヒト抗体を含むことができる。「ヒト抗体」という用語は、ヒトによって天然に生成された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を所有する抗体、および／または以下に記載するヒト抗体を作製するための技術のいずれかを使用して作製された抗体を指す。
【００５７】
ヒト供給源抗体は、当技術分野において公知である様々な技術を使用して生成することができる。一実施形態において、組換えヒト抗体を、ファージディスプレイを使用して調製した組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより単離してもよい。一実施形態において、ライブラリーは、Ｂ細胞から単離したｍＲＮＡから調製した、ヒトＶＬおよびＶＨのｃＤＮＡを使用して産生した、ｓｃＦｖファージまたは酵母菌のディスプレイライブラリーである。
【００５８】
ヒト供給源抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内在性の免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化され、ヒト免疫グロブリン遺伝子が導入された、マウスなどのトランスジェニック動物中に導入することにより作製することもできる。抗体誘発すると、ヒト抗体の生成が観察されるが、これは、遺伝子再編成、アセンブリ、および抗体レパートリーを含めて全ての点でヒトに見られるものに非常に類似している。このアプローチは、米国特許第５，５４５，８０７号、第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，６６１，０１６号、ならびにＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術に関する米国特許第６，０７５，１８１号および第６，１５０，５８４号、ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、１９９５年、ＰＭＩＤ：７４９４１０９）などに記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的の抗原に対する抗体を生成するヒトＢリンパ球を不死化することによって調製してもよい（このようなＢリンパ球は、新生物障害に罹患している個体から回収してもよく、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫誘導してもよい）。例えば、Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５年）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、１９９１年、ＰＭＩＤ：２０５１０３０；および米国特許第５，７５０，３７３号を参照されたい。
【００５９】
Ｅ．抗体の組換え生成
供給源抗体およびその断片、ならびに本発明の構築物は、抗体生成細胞および組換え操作から得られる遺伝子材料を使用して生成または修飾してもよい（例えば、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（編集）（２０００年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、ＮＹ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００２年）Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ，  Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．；ならびに米国特許第７，７０９，６１１号を参照されたい）。本発明は、荷電した多特異的抗体およびその断片、ならびに該抗体をコードする核酸を含む。本明細書で使用するとき、「核酸」という用語は、一本鎖でも、または二本鎖でも、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、およびこれらの人工的なバリアントを含む。より具体的に述べると、本発明は単離された核酸を含み、これは所望の静電気的な特性を有するポリペプチドを提供するように修飾されていてもよく、組換えの多特異的抗体を製造するために定常領域および可変領域の配列をクローニングするのに使用されてもよい、。本発明は、プロモーターに作動可能に連結し得るこのような核酸（例えば、ＷＯ８６／０５８０７、ＷＯ８９／０１０３６、および米国特許第５，１２２，４６４号を参照されたい）、ならびに真核生物の分泌経路の他の転写制御エレメントおよびプロセシング制御エレメントを含むベクターをさらに提供する。さらに、本発明は、このようなベクターおよび宿主発現系を含む、原核生物および真核生物の宿主細胞も提供する。
【００６０】
本明細書で使用する「宿主発現系」という用語は、本発明の多特異的抗体および核酸またはポリペプチドのいずれかを産生するように操作することができる任意の種類の細胞系を含む。このような宿主発現系には、それだけには限定されないが、組換えのバクテリオファージＤＮＡもしくはプラスミドＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトした微生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉもしくはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；組換えの酵母菌発現ベクターでトランスフェクトした酵母菌（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）；または哺乳動物細胞またはウイルスのゲノムに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター）を含有する組換え発現構築物を持つ哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ−Ｓ、ＨＥＫ−２９３Ｔ、３Ｔ３細胞）が含まれる。宿主細胞は、２つの発現ベクター、例えば、重鎖由来のポリペプチドをコードする第１のベクター、および軽鎖由来のポリペプチドをコードする第２のベクターで共トランスフェクトしてもよい。
【００６１】
哺乳動物細胞を形質転換する方法は、当技術分野において周知である。例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，９１２，０４０号、第４，７４０，４６１号、および第４，９５９，４５５号を参照されたい。宿主細胞をまた、様々な特徴を有する抗原結合分子を生成させるように操作してもよい（例えば、修飾された糖型またはＧｎＴＩＩＩ活性を有する多特異的抗体）。
【００６２】
組換えタンパク質を長期に高収率で生成するには、安定した発現が好ましい。したがって、選択された多特異的抗体の成分を安定に発現する細胞株を、標準的な当技術分野で認められている技術を使用して操作し、本発明の一部を形成してもよい。ウイルスの複製開始点を含有する発現ベクターを使用するよりもむしろ、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーターまたはエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択マーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換することができる。ある条件下の発現を増強するための効果的なアプローチを提供するグルタミンシンテターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）を含めた、当技術分野において周知である任意の選択系を使用することができる。ＧＳ系は、全体的にまたは部分的に、ＥＰ第０  ２１６  ８４６号、ＥＰ第０  ２５６  ０５５号、ＥＰ第０  ３２３  ９９７号、およびＥＰ第０  ３３８  ８４１号、ならびに米国特許第５，５９１，６３９号および第５，８７９，９３６号に関連して論じられている。安定な細胞株を開発するのに好ましい別の発現系は、Ｆｒｅｅｄｏｍ（商標）ＣＨＯ−Ｓ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。
【００６３】
本発明の抗体を、組換え発現または任意の他の開示されている技術により生成し、分泌させ、アセンブルさせた後、これを当技術分野において公知の方法により精製または単離することができ、これは、この抗体を同定し、天然の環境から分離および／または回収し、抗体の診断的もしくは治療的使用を妨害する汚染物質から分離することを意味する。単離された抗体には、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕの抗体が含まれる。
【００６４】
これらの単離された調製物は、例えば、イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィー、透析、ダイアフィルトレーション、およびアフィニティークロマトグラフィー、特にプロテインＡまたはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーなどの様々な当技術分野で認められている技術を使用して精製することができる。
【００６５】
Ｆ．生成後選択
どのようにして得たものかによらず、抗体生成細胞（例えば、ハイブリドーマ、酵母菌コロニーなど）は、例えば、強固な増殖、抗体の高生成を含めた所望の特徴、および対象の抗原に対する高親和性などの所望の抗体の特徴について、選択し、クローニングし、さらにスクリーニングすることができる。ハイブリドーマは、細胞培養物中ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、または同系間の免疫不全の動物中ｉｎ  ｖｉｖｏで拡大させることができる。ハイブリドーマおよび／またはコロニーを選択し、クローニングし、拡大させる方法は当業者には周知である。所望の供給源抗体を同定した後は、通常の、当技術分野で認められている分子生物学および生化学の技術を使用して関連の遺伝子材料を単離し、操作し、発現させて、本発明の多特異的抗体を提供することができる。
【００６６】
例えば、ナイーブのライブラリー（天然または合成のいずれか）によって生成される供給源抗体は、中等度の親和性であってよい（約１０６〜１０７Ｍ−１のＫａ）。親和性を増強するために、抗体ライブラリーを構築し（例えば、エラープローンポリメラーゼを用いることによってｉｎ  ｖｉｔｒｏでランダム変異を導入することにより）、これら２次ライブラリーから抗原に高親和性を有する抗体を再び選ぶことにより（例えば、ファージまたは酵母菌ディスプレイを使用することにより）、親和性成熟をｉｎ  ｖｉｔｒｏで擬してもよい。ＷＯ９６０７７５４は、免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲ中の突然変異を誘発して軽鎖遺伝子のライブラリーを作り出すための方法を記載している。
【００６７】
供給源抗体または多特異的抗体を選択するために、それだけには限定されないが、ファージまたは酵母菌ディスプレイを含めた様々な技術を用いることができ、これらの技術では、ヒトコンビナトリアル抗体またはｓｃＦｖ断片のライブラリーをファージまたは酵母菌上で合成し、ライブラリーを対象の抗原またはその抗体結合部分でスクリーニングし、抗原に結合するファージまたは酵母菌を単離し、それから抗体または免疫反応性の断片を得ることができる（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６年、ＰＭＩＤ：９６３０８９１；Ｓｈｅｅｔｓら、１９９８年、ＰＭＩＤ：９６００９３４；Ｂｏｄｅｒら、１９９７年、ＰＭＩＤ：９１８１５７８；Ｐｅｐｐｅｒら、２００８年、ＰＭＩＤ：１８３３６２０６）。ファージまたは酵母菌ディスプレイライブラリーを産生するためのキットは市販されている。抗体ディスプレイライブラリーを産生およびスクリーニングする上で使用することができる他の方法および試薬も存在する（米国特許第５，２２３，４０９号；ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９２／１５６７９、ＷＯ９３／０１２８８、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／０９６９０；およびＢａｒｂａｓら、１９９１年、ＰＭＩＤ：１８９６４４５を参照されたい）。このような技術により、多数の候補の抗体をスクリーニングできるようになり、比較的容易な配列の操作（例えば、組換えシャフリング）がもたらされることは有益である。
【００６８】
３．抗体の特徴
抗体。開示する多特異的抗体は、ある特徴を表し得、これらは、親和性、薬物動態学、安全性プロファイルなどのある所望の特徴を増強または洗練するように、スクリーニングされ、特定の抗原で抗体生成動物を免疫化することにより授けられ、または上記に記載した組換え遺伝子技術によって操作され得る。
【００６９】
Ａ．内部移行、アンタゴニスト、および枯渇性の抗体
特に好ましい実施形態において、本発明の多特異的抗体は、決定基に結合し、腫瘍細胞を含めた異常細胞中に内部移行（コンジュゲートしている薬学的に活性な任意の部分と一緒に）するような内部移行抗体を含むことができる。内部移行はｉｎ  ｖｉｔｒｏでもまたはｉｎ  ｖｉｖｏでも生じ得る。治療適用のために、内部移行は、それを必要とする対象中ｉｎ  ｖｉｖｏで生じることが好ましい。内部移行した抗体分子の数は、抗原発現細胞を死滅させるのに十分であり得る。抗体、または場合により抗体薬物コンジュゲートの作用強度に応じて、単一の抗体分子の細胞中への取込みが、抗体が結合する標的細胞を死滅させるのに十分であり得る。抗体が哺乳動物細胞に結合すると内部移行するか否かは、米国特許第７，６１９，０６８号に記載されているものを含めた様々なアッセイによって決定することができる。
【００７０】
他の選択された実施形態において、本発明の抗体は「アンタゴニスト」または「中和性の」抗体であってもよく、これはこの抗体が決定基と会合し、前記決定基の活性を、直接的にか、またはリガンドもしくは受容体などの結合パートナーと決定基の会合を防ぐことによってかのいずれかで、遮断または阻害し、それによりこれらがなかったときにこれら分子の相互作用からもたらされる生物学的応答を妨害し得ることを意味する。過剰の抗体が決定基に結合した結合パートナーの量を、測定したとき（例えば、標的分子の活性またはｉｎ  ｖｉｔｒｏの競合結合アッセイによって）、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはそれより多くだけ減少させる場合、中和抗体またはアンタゴニスト抗体は、そのリガンドまたは基質に対する決定基の結合を実質的に阻害している。修飾された活性は、当技術分野で認められた技術を使用して直接測定してもよく、または変更された活性が下流に及ぼす影響（例えば、発がんもしくは細胞生存）によって測定してもよいことが理解されよう。
【００７１】
さらなる一実施形態において、本明細書に開示する抗体または抗体薬物コンジュゲートは「枯渇性の」抗体であり、これはこの抗体が、細胞表面上または表面付近の決定基と会合し、その細胞の死または排除（例えば、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、もしくは細胞毒性剤の導入によって）を誘発することを意味する。枯渇性の抗体は、ＣＤ３２４および／またはネクチン−４発現腫瘍細胞などの規定された細胞集団中における決定基を発現する細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、もしくは９９％を活動不能にする、または排除することができることが好ましい。一部の実施形態において、細胞集団は単離された腫瘍細胞を含むことができる。他の実施形態において、細胞集団は全腫瘍試料または不均一な腫瘍抽出物を含むことができる。標準的な生化学的技術を使用して、腫瘍細胞の枯渇をモニタリングおよび定量してもよい。
【００７２】
Ｂ．結合親和性
本明細書に開示するのは、ＣＤ３２４またはネクチン−４など、特定の決定基（複数可）に高い結合親和性を有する多特異的抗体である。「ＫＤ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数または見かけの親和性を指す。本発明の抗体は、解離定数ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が≦１０−７Ｍである場合に、その標的の抗原に免疫特異的に結合することができる。抗体は、ＫＤが≦５×１０−９Ｍである場合に高親和性で、ＫＤが≦５×１０−１０Ｍである場合に非常に高い親和性で抗原に特異的に結合する。本発明の一実施形態において、抗体のＫＤは≦１０−９Ｍであり、オフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）は約１×１０−４／秒である。本発明の一実施形態において、オフ速度は＜１×１０−５／秒である。本発明の他の実施形態において、抗体は、約１０−７Ｍから１０−１０Ｍの間のＫＤで決定基に結合し、さらに別の一実施形態において、ＫＤ≦２×１０−１０Ｍで結合する。本発明のなお他の選択された実施形態は、１０−６Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１５Ｍ未満、または５×１０−１５Ｍ未満のＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を有する抗体を含む。
【００７３】
ある特定の実施形態において、決定基に免疫特異的に結合する本発明の抗体は、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも２×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１の会合速度定数すなわちｋｏｎ（またはｋａ）速度（抗体＋抗原（Ａｇ）ｋｏｎ←抗体−Ａｇ）を有することができる。
【００７４】
別の一実施形態において、決定基（複数可）に免疫特異的に結合する本発明の抗体は、ｌ０−１ｓ−１未満、５×ｌ０−１ｓ−１未満、ｌ０−２ｓ−１未満、５×ｌ０−２ｓ−１未満、ｌ０−３ｓ−１未満、５×ｌ０−３ｓ−１未満、ｌ０−４ｓ−１未満、５×ｌ０４ｓ−１未満、ｌ０−５ｓ−１未満、５×ｌ０−５ｓ−１未満、ｌ０−６ｓ−１未満、５×ｌ０−６ｓ−１未満、ｌ０−７ｓ−１未満、５×ｌ０−７ｓ−１未満、ｌ０−８ｓ−１未満、５×ｌ０−８ｓ−１未満、ｌ０−９ｓ−１未満、５×ｌ０−９ｓ−１未満、またはｌ０−１０ｓ−１未満の解離速度定数すなわちｋｏｆｆ（またはｋｄ）速度（抗体＋抗原（Ａｇ）ｋｏｆｆ←抗体−Ａｇ）を有することができる。
【００７５】
結合親和性は、当技術分野において公知である様々な技術、例えば、表面プラズモン共鳴、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（以下の実施例を参照されたい）、バイオレイヤー干渉分光法、二重偏波干渉法、静的光散乱、動的光散乱、等温滴定型熱量計、ＥＬＩＳＡ、超遠心分析法、およびフローサイトメトリーを使用して決定することができる。
【００７６】
ＩＶ．例示的な供給源抗体
多特異的な構築物を製作するためにどのような多特異的なフレームワークまたは構造が最終的に選択されても（そしてどのような定常領域変異が導入されても）、選択される抗原結合部位は、多数の標的抗原のいずれか１つに結合または会合するように選ぶことができ、入手可能な（市販または別の方法で）抗体に由来し得ることが理解されよう。すなわち、標準的な分子操作技術を使用して、構築物を製作して、核酸またはアミノ酸配列が公知である任意の抗体または反応性断片に由来する抗原結合領域またはＣＤＲを組み入れてもよい。これに関して、抗原結合部位は、好ましい実施形態において、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ、アルシツモマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、カンツズマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ、シクスツムマブ、クリバツズマブ、コナツムマブ、ダラツムマブ、ドロジツマブ、ズリゴツマブ（ｄｕｌｉｇｏｔｕｍａｂ）、ズシギツマブ（ｄｕｓｉｇｉｔｕｍａｂ）、デツモマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、エクロメキシマブ、エロツズマブ、エンシツキシマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フツキシマブ（ｆｕｔｕｘｉｍａｂ）、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、グレンバツムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、イムガツズマブ、インダツキシマブ（ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ）、イノツズマブ、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、レキサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モキセツモマブ、ナルナツマブ、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ノフェツモマブ（ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂｎ）、オカラツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、パルサツズマブ（ｐａｒｓａｔｕｚｕｍａｂ）、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ（ｒａｄｒｅｔｕｍａｂ）、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツモマブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、ソリトマブ（ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）、タカツズマブ、タプリツモマブ、テナツモマブ、テプロツムマブ、チガツズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ、ウブリツキシマブ、ベルツズマブ、ボルセツズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ＣＣ４９、および３Ｆ８からなる群から選択される抗体から得ても、またはこれに由来してもよい。構成成分のアミノ酸配列がこれらの各抗体について公知であることを考慮すると、１つまたは複数のこれらの抗体、またはその免疫特異的な断片を選択し、この選択された構造を、本明細書に記載する適合性の多特異的構築物に組み入れることは十分に当技術分野の範囲内である。
【００７７】
既知の抗体結合ドメインを組み入れることに加えて、公知の抗原に対する抗体を産生し、結果として生じる抗原結合部位またはその由来物を適合性の多特異的配列中に操作することは十分に当技術分野の範囲内である。本発明の特に好ましい実施形態は、ＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＴＡＴ３、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ２４、ＣＤ３４、ＮＢ８４、ＴｒｋＡ、ＧＤ２、ＣＤ１３３、ＣＤ２０、ＣＤ５６、ＣＤ２９、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ４６、トランスフェリン受容体、ＪＡＭ３、カルボキシペプチダーゼＭ、オンコスタチンＭ、Ｌｇｒ５、Ｌｇｒ６、ＣＤ３２５、ネクチン−４、ネスチン、Ｓｏｘ１、Ｂｍｉ−１、ｅｅｄ、ｅａｓｙｈ１、ｅａｓｙｈ２、ｍｆ２、ｙｙ１、ｓｍａｒｃＡ３、ｓｍａｒｃｋＡ５、ｓｍａｒｃＤ３、ｓｍａｒｃＥ１、ｍｌｌｔ３、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１６、ＡＸＩＮ１、ＢＣＬ９、ＭＹＣ、（ＴＣＦ４）ＳＬＣ７Ａ８、ＳＬＣ４４Ａ４、ＩＬ１ＲＡＰ、ＴＥＭ８、ＴＭＰＲＳＳ４、ＭＵＣ１６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ４Ａ１１、ＰＰＡＰ２Ｃ、ＣＡＶ１、ＣＡＶ２、ＰＴＰＮ３、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ９、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＥＦＮＡ１、ＥＦＮＡ２、ＥＦＮＡ３、ＥＦＮＡ５、ＥＦＮＡ６、ＥＦＮＢ１、ＥＦＮＢ２、ＥＦＮＢ３、ＳＬＣ１Ａ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＭＰＺＬ１、ＦＬＪ１００５２、Ｃ４．４Ａ、ＥＤＧ３、ＲＡＲＲＥＳ１、ＴＭＥＰＡＩ、ＰＴＳ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＮＩＤ２、ＳＴＥＡＰ、ＡＢＣＡ３、ＣＲＩＭ１、ＩＬ１Ｒ１、ＯＰＮ３、ＤＡＦ、ＭＵＣ１、ＣＰＤ、ＮＭＡ、ＡＤＡＭ９、ＧＪＡ１、ＳＬＣ１９Ａ２、ＡＢＣＡ１、ＰＣＤＨ７、ＡＤＣＹ９、ＳＬＣ３９Ａ１、ＮＰＣ１、ＥＮＰＰ１、Ｎ３３、ＧＰＮＭＢ、ＬＹ６Ｅ、ＣＥＬＳＲ１、ＬＲＰ３、Ｃ２０ｏｒｆ５２、ＴＭＥＰＡＩ、ＦＬＶＣＲ、ＰＣＤＨＡ１０、ＧＰＲ５４、ＴＧＦＢＲ３、ＳＥＭＡ４Ｂ、ＰＣＤＨＢ２、ＡＢＣＧ２、ＣＤ１６６、ＡＦＰ、ＢＭＰ−４、β−カテニン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ９、ＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ９０、ＣＸＣＲ４、デコリン、ＡＰＣＤＤ１、ＰＴＫ７、ＥＧＦＲ、ＣＤ１０５、ＣＤ６４、ＣＤ１６、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｅおよびＣＤ４９ｆからなる群から選択される抗原を認識する（例えば、抗原と結合または会合する）抗原結合部位（複数可）を含む。本発明の抗体は、前述の抗原の任意の組合せと、またはこれらの抗原の１つおよび他の公知の抗原のいずれかと反応するように製作することができることが理解されよう。ある特定の好ましい実施形態において、多特異的構築物は、これらの抗原のいずれかの上の２つもしくはそれより多くの別個の決定基に結合することができる。添付の実施例に示す通り、ネクチン−４、ＣＤ２３４、またはこれらの組合せに結合する、特に好ましい抗体を製作することが���きる。
【００７８】
Ｖ．多特異的抗体の使用
１．治療
本発明は、多特異的抗体およびその抗体薬物コンジュゲートの、様々な障害の診断、セラグノシス（ｔｈｅｒａｇｎｏｓｉｓ）、処置、および／または予防のための製作および使用に対するものである。好ましい実施形態において、本発明の二特異的抗体を使用して、それを必要とする被検体対象における、固形腫瘍および血液悪性疾患の両方を含めた様々な増殖性または新生物性の障害を処置することができる。これに関して、開示する抗体は、単独で、または化学療法もしくは放射線療法などの補助的治療と組み合わせて投与することができることが理解されよう。処置しようとする「被検体」または「患者」はヒトであるのが好ましいが、本明細書で使用するとき、この用語は、任意の哺乳動物種を含むものと明白に考えられている。
【００７９】
本発明による処置に供される例示的な新生物性または増殖性の状態は、良性でも、または悪性でもよく；固形腫瘍でも、または他の血液の新生物でもよく；それだけには限定されないが、副腎腫瘍、ＡＩＤＳ関連のがん、胞巣状軟部肉腫、星細胞系腫瘍、膀胱がん（扁平上皮がんおよび移行上皮がん）、胞胚腔の障害、骨がん（エナメル上皮腫、動脈瘤様骨嚢腫、骨軟骨腫、骨肉腫）、脳および脊髄のがん、転移性の脳腫瘍、乳がん、頚動脈小体腫瘍、子宮頚がん、軟骨肉腫、脊索腫、嫌色素性腎細胞がん、明細胞がん、結腸がん、結腸直腸がん、皮膚の良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣腫、上皮性障害、ユーイング腫瘍、骨外性粘液型軟骨肉腫、骨線維形成不全症、線維性骨形成異常症、胆嚢および胆管のがん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、胃腸、妊娠性絨毛疾患、胚細胞性腫瘍、腺性障害、頭頚部がん、視床下部、腸がん、島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん（腎芽細胞腫、乳頭状腎細胞がん）、白血病、脂肪腫／良性脂肪腫様腫瘍、脂肪肉腫／悪性脂肪腫様腫瘍、肝臓がん（肝芽腫、肝細胞がん）、リンパ腫、肺がん（小細胞がん、腺がん、扁平上皮がん、大細胞がんなど）、マクロファージの障害、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌腫瘍症、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、甲状腺乳頭癌、副甲状腺腫瘍、小児がん、末梢神経鞘腫瘍、クロム親和細胞腫、下垂体腫瘍、前立腺がん、後部ブドウ膜黒色腫（ｐｏｓｔｅｒｉｏｕｓ  ｕｎｖｅａｌ  ｍｅｌａｎｏｍａ）、稀な血液障害、腎臓転移がん、横紋筋様腫瘍、横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｓａｒｃｏｍａ）、肉腫、皮膚がん、軟部組織肉腫、扁平上皮がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、間質性障害、滑膜肉腫、精巣がん、胸腺がん、胸腺腫、甲状腺転移がんおよび子宮がん（頚部の癌、子宮内膜がんおよび平滑筋腫）を含む群から選択されてもよい。
【００８０】
特に好ましい実施形態において、本発明の抗体は新生物障害を処置するために使用され、新生物障害またはがんは、副腎がん、膀胱がん、子宮頚がん、子宮体がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん（小細胞および非小細胞）、卵巣がん、結腸直腸がん、膵臓がん、前立腺がんならびに乳がんからなる群から選択される。
【００８１】
２．診断
治療的使用に加えて、本発明は、増殖性障害の進行を検出し、診断し、またはその進行をモニタリングするｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの方法、および腫瘍原性細胞を同定するために患者における、または患者からの細胞をスクリーニングする方法を提供する。このような方法は、患者または患者から得た試料（すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれか）を、本明細書に記載する通りの多特異的抗体と接触させ、試料中の細胞に結合した抗体または遊離の抗原分子の存在もしくは非存在、または会合のレベルを検出することを含む、処置するためのがんを有する個体を同定するステップ、またはがんの進行をモニタリングするステップを含む。特に好ましい実施形態において、抗体は検出可能な標識またはレポーター分子を含む。
【００８２】
３．抗体薬物コンジュゲート
本明細書の教示にしたがって、開示する二特異的および多特異的な構築物は、コンジュゲート（例えば、細胞毒性剤との）または非コンジュゲートの状態において使用することができることがさらに理解されよう。
【００８３】
示す通り、本発明の抗体は、薬学上活性な分子（例えば、細胞毒素）、診断用部分、または生体適合性の修飾因子（例えば、ポリエチレングリコールポリマー）とコンジュゲートしていてよい。「コンジュゲート」という用語は広範囲に使用され、いわゆる「抗体−薬物コンジュゲート」（ＡＤＣ）の生成をもたらす、会合の方法にかかわらない任意の生物学的に活性または検出可能な分子または薬物の、開示する抗体との共有結合性または非共有結合性の会合を意味する。結果として生じる本発明のＡＤＣは、治療目的および診断目的の両方に使用することができる。
【００８４】
ＡＤＣは典型的には、式：Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］によって表すことができ、式中、「Ａｂ」は多特異的抗体であり、「Ｄ」は好ましくは治療用または診断用部分であり、「Ｌ」はリンカーである。「Ａｂ」および「Ｄ」部分は両方ともＡＤＣの必要な成分であるが、「Ｌ」部分の存在は任意選択である。本発明のＡＤＣは、ペプチド、ｉｎ  ｖｉｖｏで有効薬剤に代謝されるプロドラッグ、ポリマー、核酸分子、小分子、結合剤、模倣剤、合成薬物、無機分子、有機分子、および放射性同位元素を含むことができる。好ましい一実施形態において、「Ａｂ」は本発明の二特異的抗体である。
【００８５】
いくつかの変種またはタイプのリンカーを使用して、「Ａｂ」部分を「Ｄ」部分と会合させてもよい。一部の実施形態において、リンカーは切断可能であるが、他の実施形態において、リンカーは非切断性である。選択された抗体はまた、放射性同位元素に直接コンジュゲートしていてもよく、または放射金属イオン（ｒａｄｉｏｍｅｔａｌ  ｉｏｎ）をコンジュゲートさせるのに有用な大環状キレーターを含んでいてもよい。
【００８６】
本発明の多特異的抗体は、例えば、生物学的分子（例えば、ペプチドもしくはヌクレオチド）、小分子、フルオロフォア、または放射性同位元素であり得る様々なタイプの診断薬または検出薬、マーカー、またはレポーターにコンジュゲートしていてよい。標識された抗体は、増殖性障害の診断のためおよびその発生もしくは進行をモニタリングするために有用であり得、または開示する抗体（すなわち、セラグノスティクス）を含む特定の治療の有効性を決定するためのまたは処置の未来の経過を決定するための臨床試験手順の一部として、有用であり得る。このようなマーカーまたはレポーターはまた、選択された修飾因子を精製する上で、抗体分析学（例えば、エピトープ結合もしくは抗体結合）において、がん細胞を分離もしくは単離する上で、あるいは前臨床の手順またはは毒性学研究においても有用であり得る。
【００８７】
同様に、本発明の多特異的抗体は、それだけには限定されないが、細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤、血管新生阻害剤、減量剤（ｄｅｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、化学療法剤、放射線療法および放射線療法剤、標的化抗がん剤、生物学的応答調節物質、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法剤、放射線療法剤および転移抑制剤、ならびに免疫療法薬を含めた抗がん剤などの「治療的部分」または「薬物」にコンジュゲートしていてもよい。
【００８８】
ＶＩ．医薬調製物および臨床使用
１．製剤および投与経路
本発明の組成物は、当技術分野で認められた技術を使用して、望みどおりに製剤化することができる。一部の実施形態において、本発明の二特異的抗体は、不純物なしで、または最小のさらなる成分と一緒に投与してもよく、その他は、必要に応じて、当技術分野で周知の賦形剤および補助剤を含む適切な薬学的に許容される担体を含有するように製剤化することができる（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ｗｉｔｈ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ：  Ｄｒｕｇｆａｃｔｓ  Ｐｌｕｓ、第２０版（２００３年）；Ａｎｓｅｌら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第７版、  Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００４年）；Ｋｉｂｂｅら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第３版、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０００年）を参照されたい）。全身投与用の開示する抗体は、腸内、非経口または局所投与を含めた任意の投与のタイプに製剤化することができる。
【００８９】
本発明の化合物および組成物は、それを必要とする被検体に、それだけには限定されないが、経口、静脈内、動脈内、皮下、非経口、経鼻、筋肉内、心臓内、脳室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、気管内、頬側、直腸、腹腔内、皮内、局所、経皮、および髄腔内を含めた様々な経路により、または別の方法では埋め込みもしくは吸入によって、ｉｎ  ｖｉｖｏに投与することができる。適切な製剤および投与経路は、意図する適用および治療レジメンにしたがって選択することができる。
【００９０】
２．併用療法
併用療法は、本発明の抗体、および治療用部分（例えば、抗がん剤）を含む１つまたは複数の活性部分の投与を指す。
【００９１】
併用療法は、新生細胞増殖、がん、がんの再発、またはがんの転移を防止または処置する上で特に有用であり得る。本発明の抗体は、それがなければ腫瘍集団を支援し、不死化させる腫瘍原性細胞を低減させることにより、感作剤または化学感作剤として機能し得、それにより現在の標準であるケア減量剤または抗がん剤をより有効に使用することができるようにする。
【００９２】
組み合わせた結果が、各処置（例えば、抗体または抗がん剤）を別々に行う場合に観察される効果の相加となる必要はない。相加効果が一般に望ましいが、単一治療法の効果を上回る任意の増大した抗腫瘍効果が有益である。さらに、本発明は、併用処置が相乗効果を示すことを必要としない。しかし、当業者であれば、好ましい実施形態を含むある選択された組合せで、相乗作用が観察され得ることを理解されたい。
【００９３】
併用療法を実践する上で、抗体（ＡＤＣの形態であるのが好ましい）および治療的部分を、単一組成物において、または２つもしくはそれより多くの異なる組成物としてのいずれかで、同じまたは異なる投与経路を使用して、被検体に同時に投与してもよい。あるいは、抗体での処置は、例えば、分から週までの範囲の間隔での治療的部分処置の前であっても、または後であってもよい。一実施形態において、治療的部分および抗体の両方は、互いに約５分〜約２週間以内で投与する。さらに他の実施形態において、抗体の投与と治療的部分の投与との間に、数日（２、３、４、５、６、もしくは７）、数週（１、２、３、４、５、６、７、もしくは８）、または数か月（１、２、３、４、５、６、７、もしくは８）が経過してもよい。
【００９４】
併用療法では、１日に１回、１日に２回、または１日に３回、２日ごとに１回、３日ごとに１回、週に１回、２週ごとに１回、月に１回、２月ごとに１回、３月ごとに１回、６月ごとに１回など様々なスケジュールで、状態が処置され、緩和され、または治癒されるまで投与してもよく、または継続的に投与してもよい。併用療法では任意の経路によって投与することができる。
【００９５】
一実施形態において、抗体は、１つまたは複数の治療的部分と併用して、短期または長期の処置サイクルでそれを必要とする対象に投与する。本発明は、非連続的な投与または数回の部分的な投与に分割した一日量を企図するものである。抗体および治療用部分は、互換的に隔日または隔週で投与してもよいし、あるいは一連の抗体処置を施し、その後、治療的部分での１つまたは複数の処置を施してもよい。
【００９６】
別の一実施形態において、本発明の抗体は、疾患が最初に現れた後の腫瘍の再発の可能性を低下させ、または排除するための維持療法において使用してもよい。障害は、本発明の抗体によって、または他の治療剤によって処置し、最初の腫瘍集団は除去、低減、または別の方法で軽減し、その結果患者が無症候性または寛解状態になるのが好ましい。標準的な診断手順を使用して疾患の示差が殆どまたは全く存在しなくても、このようなときには、被検体に、薬学的に有効な量の開示する抗体を１回または複数回投与してもよい。一部の実施形態において、このエフェクターは、毎週、２週間ごと、毎月、６週間ごと、２か月ごと、３か月ごと、６か月ごと、または毎年など、ある期間にわたる規則的なスケジュールで投与する。当業者であれば、好ましい投与量および投薬レジメンを容易に決定して、疾患の再発の可能性を低減させることができる。このような処置は、患者の応答、ならびに臨床上および診断上のパラメータに応じて、数週、数か月、数年の期間、またはさらに無期限に継続し得る。
【００９７】
別の一実施形態において、本発明の抗体を予防的に使用して、減量手順後の腫瘍の転移を防止またはその可能性を低減させてもよい。本開示で用いるとき、「減量手順」は、広範囲に規定され、腫瘍または腫瘍の増殖を排除し、低減させ、処置し、または軽減する任意の手順、技術、または方法を意味する。例示的な減量手順には、それだけには限定されないが、外科手術、照射処置（すなわち、ビーム照射）、化学療法、免疫療法、または切除が含まれる。抗体を１回または複数回、標準的な技術を使用して決定した通りの薬学的に有効な投与量を投与してもよい。投薬レジメンは、このレジメンを修飾することができる、適切な診断またはモニタリングの技術を伴うのが好ましい。
【００９８】
ＶＩＩ．製造品
１つまたは複数の用量の本発明の組成物を含む１つまたは複数の容器を含む医薬品のパックおよびキットもまた提供される。本発明の組成物の用量は、それだけには限定されないが、単回使用の予め充填された注射用シリンジ、または適切な液体を加えると再構成することができる凍結乾燥粉末を含めた任意の形態で供給することができる。組成物は任意の関連の添加剤を含むことができる。
【００９９】
ＶＩＩＩ．その他
本明細書に別段の規定がなければ、本発明に関連して使用する科学および技術用語は、当業者が通常理解している意味を有するものとする。さらに、文脈によって別段の要求がなされなければ、単数形の語は複数を含み、複数形の語は単数を含む。本明細書および添付の特許請求の範囲で用いるとき、単数形の語である「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別段に明らかに記載しなければ、複数の指示対象を含む。さらに、本明細書および添付の特許請求の範囲に提供される範囲は、両方の終点、およびこの終点の間の全ての点を含む。
【０１００】
一般的に、本明細書に記載する、細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸の化学、ならびにハイブリダイゼーションの技術およびこれらに関連して用いる命名法は周知のものであり、当技術分野において一般的に使用されるものである。本発明の方法および技術は、一般的に、当技術分野で周知である慣例的な方法にしたがって、そして別段の示唆がなければ本明細書を通して引用され、論じられる様々な参考文献に記載されている通りに行われる。
【実施例】
【０１０１】
本発明についてこのように全般的に上記に記載したが、これは、例示により提供するものであり、本発明を限定しようとするものではない以下の実施例を参照することによってより容易に理解されよう。以下の実験が全ての、または唯一の行った実験であることを、本実施例は表そうとするものではない。別段の示唆がなければ、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧であるかまたは大気圧付近である。
【０１０２】
（実施例１）
重鎖／軽鎖の対形成のための構築物のデザイン
ＩｇＧおよびＦａｂ断片の結晶構造を研究して、２つの異なる重鎖と２つの異なる軽鎖との間の対形成における特異性を作り出すために、残基置換のための候補部位を同定した。最初の分析はＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）モデルＩＤ  ２ＸＲＡ上で行い、候補部位の対の確認はＰＤＢモデルＩＤ  ３ＤＶＮ上で行った。候補の残基セットを、ＣＨ１ドメイン上およびＣＬのドメイン上で選択した。これを表２に概要し、図２に示す。残基の番号付けはＫａｂａｔの番号付けスキームにしたがい、アミノ酸１文字表記を使用する。ＣＨ１上のＨ１７２が、ＣＬドメイン上の２つの残基であるＳ１７４およびＮ１３８の近傍であることを見出し、そのため両部位を残基置換のために選んだ。さらに、ＣＨ１上のＨ１７２もＣＬ上のＮ１３７と潜在的に相互作用することができた。
【０１０３】
この分析および後続の多特異的な構築物には、本発明の概念を実証する目的でカッパ軽鎖を使用することに留意されたい。本開示に鑑みて、同じ分析手順をラムダ軽鎖に容易に適用することができ、次いでラムダ軽鎖を過度の実験なしで開示する構築物に組み入れることができた。同様に、例示の目的で、ＩｇＧ１重鎖定常領域を後続の分析のために使用し、結果として生じた構築物に組み入れた。繰り返すと、当業者であれば、他の公知の重鎖定常領域（例えば、ＩｇＧ３）を容易に組み入れ、開示する技術および原理を使用して本発明にしたがう多特異的な構築物を産生することができる。
【表２】
2016509014.tif 000004
【０１０４】
所望の静電気力を授け、それにより重鎖／軽鎖の対形成に対する選択性を作り出す（ゆえに優先的なアセンブリをもたらす）ために、荷電した残基を提供するための残基置換を行った。アルギニンまたはリジンへの置換を使用して正の電荷を作り出し（他の場合にはヒスチジンを置換することが可能であり得るが）、アスパラギン酸またはグルタミン酸への置換を使用して負の電荷を作り出した。候補の変異を評価する目的で（実施例２に詳しく記載する）、残基置換は、抗ＣＤ３２４抗体であるｈＳＣ１０．１７（「抗ＣＤ３２４抗体」と呼ぶ；米国特許第２０１３／００５８９４７号を参照されたい）に対するＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して行った。置換を、単独および組み合わせの両方で表２に記載する部位に、行った。電荷適合性の置換が対応する軽鎖上（例えば、対応するＣＬ上のＳ１７６Ｄ  Ｎ１３７Ｋ）に組み入れられ、電荷不適合性の置換が非対応の軽鎖上（例えば、非対応のＣＬ上のＳ１７６Ｋ、Ｎ１３８Ｄ）に組み入れられる限り、それぞれの相互作用する残基セットは潜在的に相互に排他的であるため、重鎖の異なる部位上に電荷の異なる残基が存在することができた（例えば、ＣＨ１上のＳ１８８Ｋ  Ｔ１９２Ｄ）。したがって、重鎖構築物は以下のＣＨ１残基置換：Ｓ１８８Ｘ１  Ｈ１７２Ｘ２  Ｔ１９２Ｘ３およびその組合せ全てを含有し、ここにおいて、Ｘ１、Ｘ２またはＸ３は各々、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、または野生型の残基であってよかった。同様に、軽鎖構築物は以下のＣＬ残基置換：Ｓ１７４Ｘ１  Ｓ１７４Ｘ２  Ｎ１３７Ｘ３  Ｎ１３８Ｘ４およびその組合せ全てを含有し、ここにおいて、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、またはＸ４は各々、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、または野生型の残基であってよかった。１本の鎖について選択した置換は、対応する鎖上の置換を規定することが理解されよう。すなわち、正の電荷を重鎖に授ける場合、負の電荷が所望の軽鎖のパートナーに（または、正の電荷が所望ではない軽鎖に）授けられる。
【０１０５】
（実施例２）
候補のＣＨ１／ＣＬ変異の評価
例示的な二特異的抗体は、２本の異なる軽鎖と、非対称性の重鎖の対形成のためにＦｃ領域中に修飾を有する２本の異なる重鎖とを含有していた。しかし、候補のＣＨ１およびＣＬ変異のスクリーニングを単純化するために、１本の重鎖および１本の軽鎖のみを、一度、非対称性の重鎖の対形成のない完全ＩｇＧへのアセンブリについて試験した。候補の重鎖および軽鎖の構築物を、非修飾のＦｃ領域を有する、ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１およびｐＥＥ１２．４Ｈｕ−カッパ発現ベクター（両方ともＬｏｎｚａ  ＡＧから）にクローニングした。候補のＣＨ１変異およびＣＬ変異を有する重鎖および軽鎖を含有するプラスミドを、トランスフェクション試薬として２９３Ｆｅｃｔｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に共トランスフェクションした。各ＣＨ１の候補の変異について、共トランスフェクションを、別々の反応において、対応するＣＬ部位に反対の電荷および同じ電荷の両方の変異を含有する軽鎖を使用して行った。例えば、Ｔ１９２Ｋ重鎖構築物を、Ｎ１３７Ｋ、Ｎ１３７Ｒ、Ｎ１３７ＤまたはＮ１３７Ｅ変異のいずれかを有する、軽鎖構築物とともに共トランスフェクションをした。
【０１０６】
２日から３日後、ＥＬＩＳＡ分析を使用して完全ＩｇＧアセンブリを測定した。ヤギ抗ヒトＦｃポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を、炭酸水素ナトリウムバッファーｐＨ８．０中、高タンパク質結合性ＥＬＩＳＡプレート上に終夜コーティングした。次いで、プレートを３回洗浄し、ＰＢＳ＋３％ＢＳＡ＋０．１％Ｔｗｅｅｎでブロックした。次いで、プレートを３回洗浄し、ブロッキングバッファーで希釈した未精製の細胞培養物上清とともにインキュベートし、引き続きさらに３回洗浄し、セイヨウワサビのペルオキシダーゼをコンジュゲートさせたヤギ抗ヒトカッパ軽鎖（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともにインキュベートした。次いで、プレートを３回洗浄し、１−Ｓｔｅｐ  Ｔｕｒｂｏ  ＴＭＢ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して展開し、２Ｍ硫酸でクエンチした。抗Ｆｃ捕獲および抗カッパ軽鎖検出の使用により、完全にアセンブルしたＩｇＧの特異的な検出が可能になる。
【０１０７】
反対に荷電した残基の対の完全ＩｇＧアセンブリを、同等に荷電した残基の対と比較することにより、重鎖／軽鎖の誤対合の可能性を評価することが可能になる。図３Ａは、反対に荷電した対であるＣＨ１  Ｓ１８８Ｄ／ＣＬ  Ｓ１７６ＫのＩｇＧアセンブリの、同等に荷電した対であるＣＨ１  Ｓ１８８Ｄ／ＣＬ  Ｓ１７６Ｄとの比較を示す。ＣＨ１  Ｓ１８８Ｄ／ＣＬ  Ｓ１７６Ｋ構築物は、ＣＨ１  Ｓ１８８Ｄ／ＣＬ  Ｓ１７６Ｄ構築物に比べてＩｇＧアセンブリの増強を示した。これは、この部位が重鎖／軽鎖の対形成にとってエネルギー的に重要であることを示唆する。さらに、ＣＨ１  Ｓ１８８Ｄを有する重鎖はＣＬ  Ｓ１７６Ｄを有する軽鎖との対形成を嫌うことができ、したがって、ＣＬ  Ｓ１７６ＤはＣＨ１  Ｓ１８８Ｄを有する重鎖に対応しない軽鎖についての候補の変異である。
【０１０８】
図３Ｂおよび３Ｃは、ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメイン上の残基置換の組合せを有するＩｇＧアセンブリの例を示す。（図３Ｂでは線が２本重なっている）。全ての場合において、反対に荷電した対は、同等に荷電した対よりもはるかに良好なＩｇＧアセンブリを有する。さらに、図３Ａにおける単一の変異と比べた場合、ＩｇＧアセンブリにおける相違、したがって重鎖／軽鎖の対形成における選択性が顕著に改善される。
【０１０９】
実験からの結果は、ＩｇＧ二特異的抗体の２本のアーム上でどのように重鎖変異および軽鎖変異を組み合わせるかについての効果的な一例を提供する。１本のアームについて選択した軽鎖構築物は、同じアームについての重鎖構築物と効果的にアセンブルしなければならず、同時に他方のアームの重鎖構築物と非効果的にアセンブルしなければならない。例えば、図３Ｃに示す結果に基づいて、ＣＨ１  Ｓ１８８Ｄ  Ｔ１９２Ｄ／ＣＬ  Ｓ１７６Ｋ  Ｎ１３７Ｋは二特異的の１本のアーム上で使用することができ、ＣＨ１  Ｓ１８８Ｋ  Ｔ１９２Ｋ／ＣＬ  Ｓ１７６Ｄ  Ｎ１３７Ｄは別のアーム上で使用することができる。両方のアーム上で同等に荷電した残基のＩｇＧアセンブリがないということは、ＣＬ  Ｓ１７６Ｄ  Ｎ１３７Ｄを有する軽鎖がＣＨ１  Ｓ１８８Ｄ  Ｔ１９２Ｄを有する重鎖と効果的に対形成しないことを示し、逆もまた同じである。
【０１１０】
（実施例３）
二特異的抗体の産生
実施例２で同定した部位の有用性を、図１に示すものなどのＩｇＧ様の二特異的フォーマットにおいて評価した。二特異的抗体を、抗ＣＤ３２４抗体であるｈＳＣ１０．１７（米国特許第２０１３／００５８９４７号を参照されたい）、およびネクチン−４に結合するＨａ２２−２（２，４）６．１（「抗ネクチン−４抗体」とも呼ばれる；米国特許第２０１２／００７８０２８号を参照されたい）からの可変領域を使用して構築した。最終的な二特異的抗体を、抗ＣＤ３２４／Ｎ４抗体と呼んだ。安定化性のジスルフィドを有するノブイントゥホール（「ＫｉＨ」）を、非対称性の重鎖対形成のために使用した（Ｍｅｒｃｈａｎｔら、上述）。ノブイントゥホールの残基変異の番号付けは、ＥＵ番号付けスキームにしたがう。選択した実施例２からのＣＨ１変異およびＣＬ変異を、ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインにおいて使用した。全ての変異を、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットを使用して製造業者（Ａｇｉｌｅｎｔ）の説明書にしたがって組み入れた。これらの変異を表３に概要する。第１の構築物は、ＨＣ１の定常領域にノブイントゥホール変異を有し、上記の実施例１に記載した重鎖および軽鎖の可変領域に様々な変異を有する抗ＣＤ３２４／Ｎ４二特異的構築物である。重鎖／軽鎖の対形成のための変異は、一般的な戦略と、ノブイントゥホールの非対称性の重鎖対形成に選択される特異的な変異とで相互に排他的である。例えば、両構築物の重鎖番号１において、Ｓ１８８Ｄ  Ｓ１９２Ｄは、Ｔ３６６Ｗ  Ｓ３５４Ｃとの対形成に必要とされない。
【表３】
2016509014.tif 000005
【０１１１】
二特異的抗体を、当技術分野で認められている、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の懸濁液もしくは粘着性培養物または懸濁液ＣＨＯ−Ｓ細胞の技術を使用して一過性トランスフェクションにおいて産生した。ポリエチレンイミンポリマーをトランスフェクト試薬として用い、２本の重鎖および２本の軽鎖の各々に対する等質量比の４つの発現ベクターを共トランスフェクションに使用した。トランスフェクションの７日から１０日後、清澄にした細胞上清物からＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、二特異的抗体を精製した。
【０１１２】
識別の目的で、本明細書および図面では、ＣＤ３２４のＬＣ１変異Ｓ１７６Ｋ、Ｎ１３７Ｒを有する多特異的抗体を「ＫＲ」（すなわち、ＫｉＨ−ＫＲ）と表記し、ＣＤ３２４のＬＣ１変異Ｓ１７６Ｋ、Ｎ１３７Ｋを有する多特異的抗体を「ＫＫ」（すなわちＫｉＨ−ＫＫ）と表記する。
【０１１３】
次いで、二特異的抗体を、（ｉ）抗体がＣＤ３２４およびネクチン−４の両方に特異的に結合することができることを確認するための架橋ＥＬＩＳＡアッセイ、ならびに（ｉｉ）二特異的抗体が内部移行し、細胞毒素の生存細胞への送達を媒介する能力を実証するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの死滅アッセイを使用して特徴付けた。
【０１１４】
ネクチン−４タンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、次いでこのプレートをＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎおよび３％ＢＳＡでブロックすることにより、架橋ＥＬＩＳＡアッセイを行った。プレートを、抗ＣＤ３２４／Ｎ４二特異的抗体、単一特異的抗ネクチン−４抗体または単一特異的抗ＣＤ３２４抗体のいずれかとともにインキュベートした。ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、プレートを、２位にトリプトファンからアラニンへの置換を有するビオチン化ＣＤ３２４タンパク質とともにインキュベートした。この置換により可溶性が改善されるが、抗ＣＤ３２４抗体の結合性には影響はない。さらに３回洗浄した後、プレートを、セイヨウワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートしたストレプトアビジンとともにインキュベートした。３回洗浄した後、プレートを、１ステップのＴｕｒｂｏ  ＴＭＢ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して展開し、２Ｍ硫酸でクエンチした。ＥＬＩＳＡ分析により、上記の表３に示す４つの二特異的構築物は全て、ネクチン−４とＣＤ３２４とを架橋させることが可能であるが、各単一特異的抗体は個々には可能でないことが示された（データは示さず）。これらの結果により、これら二特異的構築物は正しくアセンブルし、ネクチン−４およびＣＤ３２４の両方に特異性を示すことが確認される。
【０１１５】
（実施例４）
二特異的抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏの特徴付け
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ死滅アッセイを使用して、実施例３で産生した二特異的抗体の、標的抗原に結合し、内部移行し、細胞毒素の生細胞への送達を媒介する能力を決定した。アッセイには、サポリンに、および二次抗体であるＦＡＢ断片に連結している抗体を用いる。サポリンは、リボソームを不活性化し、それによりタンパク質合成を阻害し、細胞の死滅をもたらす植物毒素である。サポリンは、細胞内でのみ細胞毒性であり、細胞内でリボソームに接近するが、自力で内部移行することができない。したがって、これらのアッセイにおけるサポリン媒介性の細胞の細胞毒性は、ＦＡＢ−サポリン抗体コンジュゲートが、抗体の結合および内部移行の際のみ標的細胞中に内部移行する能力を示すものである。
【０１１６】
表４は、３つの細胞株、ネクチン−４およびＣＤ３２４の両方を発現するＭＣＦ−７、ネクチン−４だけを発現するＳＫＢＲ３、ならびにＣＤ３２４を過剰発現しネクチン−４を発現しない操作されたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株であるＨＥＫ−２９３Ｔ−ｈＣＤ３２４、を使用して行ったｉｎ  ｖｉｔｒｏ死滅アッセイの結果を示す。ＨＥＫ−２９３Ｔ−ｈＣＤ３２４細胞株は、ヒトＣＤ３２４およびＧＦＰの両方を発現するバイシストロン性のレンチウイルスベクターを用いたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の形質導入、ならびにＣＤ３２４＋でＦＡＣＳソートしたサブセットの拡大によって作製した。１０％ウシ胎児血清を補ったＤＭＥＭ中、５００個の細胞／ウエルのＭＣＦ−７、ＳＫＢＲ３またはＨＥＫ−２９３Ｔ−ｈＣＤ３２４を、９６ウエルの組織培養物処理プレート中にプレーティングした。２４時間インキュベートした後、２ｎＭのサポリンに共有結合で連結させた抗ヒトＩｇＧＦａｂ断片（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、０．０１ｐＭ〜１０００ｐＭの間の可変濃度の、非標識の抗ＣＤ３２４／Ｎ４二特異的抗体または抗ＣＤ３２４もしくは抗ネクチン−４単一特異的抗体と合わせた。Ｆａｂ−サポリン抗体複合体を細胞に加えた。複合体の内部移行し、細胞を死滅させる能力を、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の説明書にしたがって使用して、７２、９６または１４４時間後に、それぞれＭＣＦ−７、ＨＥＫ−２９３Ｔ−ｈＣＤ３２４またはＳＫＢＲ３細胞の細胞生存性を測定することにより測定した。Ｆａｂ−サポリン断片に曝露した細胞を含有する培養物を用いた、生の発光の計数を、１００％参照値として設定し、他の計数値全てをそれにしたがい算出した（「標準化したＲＬＵ」と呼ぶ）。
【０１１７】
直下の表４に示す結果は、ＣＤ３２４＋ネクチン−４＋細胞株であるＭＣＦ−７において、抗ＣＤ３２４／Ｎ４二特異的抗体（上記の表３に記載する通り）は、単一特異的抗ＣＤ３２４または抗ネクチン−４抗体として毒素を送達するのと等しく有効であったか、またはそれより有効であったことを実証するものである。結果はまた、抗ＣＤ３２４／ネクチン−４二特異的抗体は、ＳＫＢＲ３  ＣＤ３２４−ネクチン−４＋細胞株およびＨＥＫ−２９３Ｔ−ｈＣＤ３２４  ＣＤ３２４＋ネクチン−４−細胞株の両方において毒素を送達することができるが、それぞれ単一特異的抗ネクチン−４または抗ＣＤ３２４抗体のいずれかほど毒素を送達するのに有効ではないことも実証した。これらのデータは、実施例３で産生した二特異的抗体はｉｎ  ｖｉｔｒｏで内部移行し、細胞を死滅させることができ、これは、両方の抗原を発現する細胞株に対する特異性の増大を伴うが、単一特異的抗体と比べたときの単一ポジティブ細胞に対するオフターゲット毒性の低減を伴ったという知見を支持するものである。
【表４】
2016509014.tif 000006
【０１１８】
（実施例５）
二特異的抗体の特徴付け
選択した抗体のヒスチジンタグを付したＣＤ３２４およびネクチン−４（ＲｎＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ）タンパク質に対する親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した表面プラズモン共鳴を使用して決定した。抗ヒト抗体捕獲キットを使用してＣＭ５バイオセンサーチップ上にこれらの抗体を固定化した。各抗体注入サイクルの前に、抗ＣＤ３２４／Ｎ４二特異的抗体または単一特異的抗ＣＤ３２４もしくは抗ネクチン−４抗体各々２μｇ／ｍＬを、接触時間４０秒および流速５μＬ／分で表面上に捕獲させた。捕獲した抗体のベースラインからのローディングは１３０〜１４０応答単位で一定であった。抗体捕獲および１分間のベースラインの後、モノマーのＣＤ３２４またはネクチン−４抗原を２分の会合段階の間、表面上に流し、その後、４分間流速１０μＬ／分の解離段階を行った。抗ヒト抗体捕獲チップは、各サイクルの後、１０μＬ／分での３Ｍ塩化マグネシウムとの接触時間３０秒で再生させた。
【０１１９】
特異的抗体の表面応答から対照ヒトＩｇＧ１の表面応答を差し引くことによってデータを処理し、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエア３．１（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において会合および解離段階へとデータを切り出し、次いでＰｒｉｓｍで可視化した。抗原注入開始の１１５〜１２０秒後からの解離段階の終点での応答単位を平均することにより、平衡結合応答（Ｒｅｑ）を決定し、これを使用して、抗ＣＤ３２４または抗ネクチン−４単一特異的抗体の対照と比較した二特異的抗体によるＣＤ３２４またはネクチン−４のパーセント結合を算出した。単一特異的な親抗体からのＲｅｑで二特異的のＲｅｑを除し、ローディングにおける差を考慮してローディングＲＵの比率をかけることによって、パーセント結合を決定した（図４）。図４Ａおよび４Ｂは、抗ＣＤ３２４／Ｎ４  ＫｉＨ−ＫＲ構築物（表３を参照されたい）および抗ＣＤ３２４／Ｎ４  ＫｉＨ−ＫＫ構築物（表３を参照されたい）は、親の単一特異的な二価抗体の結合動力学は保持するが、およそ半分の抗原しか結合しないことを示す。抗ＣＤ３２４／Ｎ４  ＫｉＨ−ＫＫは、対照の抗ＣＤ３２４単一特異的ＩｇＧに比べて３８％のＣＤ３２４に対する結合を示し、対照の抗ネクチン−４抗体に比べて５６％のネクチン−４タンパク質に対する結合を示した（図４Ａ）。抗ＣＤ３２４／Ｎ４  ＫｉＨ−ＫＲは、対照の抗ＣＤ３２４単一特異的ＩｇＧに比べて４０％のＣＤ３２４に対する結合を示し、対照の抗ネクチン−４抗体に比べて５４％のネクチン−４タンパク質に対する結合を示した（図４Ｂ）。これらのデータは、作動可能な多特異的抗体がアセンブルしたこと、およびこれらの抗体がこれらの成分供給源抗体の免疫特異的結合特性を保持することを示す。
【０１２０】
（実施例６）
二特異的抗体の質量分析法特徴付け
二特異的抗ＣＤ３２４／Ｎ４  ＫｉＨ−ＫＲおよび抗ＣＤ３２４／Ｎ４  ＫｉＨ−ＫＫ構築物の純度（表３）を、そのインタクト質量から決定した。インタクト質量は、意図する二特異的抗体が、４つの異なるポリペプチド鎖（ＬＣ１ＨＣ１ＨＣ２ＬＣ２）から正しくアセンブルしたことを確証するものである。インタクト質量は、逆相液体クロマトグラフィー質量分析法（ＲＰ−ＬＣ／ＭＳ）によって測定した。
【０１２１】
二特異的抗体の試料を、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５で２ｍｇ／ｍＬに希釈し、次いで、３７℃で終夜、２μＬのＰＮＧａｓｅＦで脱グリコシル化した。ＲＰ−ＬＣ／ＭＳ分析を、ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ５６００＋にカップリングさせた、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ３００  Ｃ４（２．１×５０、１．７ｕｍ）カラムを装着したＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ上で行った。移動相Ａは水中０．１％ギ酸であり、移動相Ｂはアセトニトリル中０．１％ギ酸であった。２０μｇのタンパク質ロードをカラムに注入し、９分間でＢ相３０％から８０％に移行する勾配で溶出した。カラム温度を８０℃に維持し、流速は０．２ｍＬ／分であった。質量分析計をポジティブモードで操作し、８００〜４０００のｍ／ｚ範囲にわたってデータを収集した。２．８〜５．３分からの質量スペクトルを平均し、次いでＡＢ  ＳｃｉｅｘからのＡｎａｌｙｓｔソフトウエアを使用して再構成を行った。
【０１２２】
図５Ａおよび５Ｂに示すデコンボリューション質量スペクトルは、正しい二特異的抗ＣＤ３２４／Ｎ４  ＫｉＨ−ＫＲおよび抗ＣＤ３２４／Ｎ４  ＫｉＨ−ＫＫ構築物が６９％〜７２％の純度で生成したことを実証する。単一の不純物が、両方の構築物中に２６％〜３１％存在した。抗ＣＤ３２４／Ｎ４  ＫｉＨ−ＫＫ構築物の不純物について観察された質量差は９４０Ｄａであった。これは、正しくない軽鎖の対形成であるＬＣ１ＨＣ１ＨＣ２ＬＣ１について予想される質量差に適合する（図５Ａ）。抗ＣＤ３２４／Ｎ４  ＫｉＨ−ＫＲ構築物の不純物についての質量差は９６６Ｄａであった。これは、正しくない対形成であるＬＣ１ＨＣ１ＨＣ２ＬＣ１について予想されるものである（図５Ｂ）。
【０１２３】
（実施例７）
ＩｇＧ−Ｆａｂ融合二特異的抗体
多くの多特異的抗体のフォーマットが、様々な異なる戦略に対して開発されている（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  （２０１２年）Ｍａｂｓ、１；４巻（２）、１８２〜１９７頁）。一般的に、二特異的なフォーマットは以下の２つの広範なカテゴリーの１つに当てはまる傾向がある：標準的な単一特異的ＩｇＧと同様の構造を有するが、１つより多くの決定基と反応する結合領域を有する非対称性のＩｇＧ、および様々な特異性／結合価構造を含み得るＩｇＧ融合タンパク質を含めた融合タンパク質。
【０１２４】
融合タンパク質には、一般的に、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）またはＦａｂ断片などの、融合パートナーのための抗体断片を用いる。ｓｃＦｖ断片は、複数の鎖の正しい対形成が問題となり得るＦａｂ断片とは反対に、単鎖として働く単純さのために一般的に使用される。しかし、親のＩｇＧクローンを抗体断片に変換する場合、ｓｃＦｖフォーマットへの再フォーマット化は必ずしも簡単ではなく、最適化のために広範囲な操作上の努力を必要とし得る。一方、Ｆａｂ断片は、親のＩｇＧクローンからの再フォーマット化をより受けやすい。
【０１２５】
ＣＬ／ＣＨ１界面における残基置換を用いた重鎖および軽鎖の正しい対形成は、Ｆａｂフォーマットにおける異なる鎖の正しい対形成も可能にし得る。これにより、共通の軽鎖またはｓｃＦｖ断片を使用せずに新規の二特異的なフォーマットを開発できるようになる。例えば、図６は、表２および表３に記載する残基置換の使用を用いる、推定上のＩｇＧ−Ｆａｂ融合フォーマットを示す。図６の概説は、別個の決定基であるＸおよびＺに結合する四価の二特異的抗体を含む２つの多特異的な構築物（ＡおよびＢ）を示す。本明細書で論じる他の構築物同様、静電電荷の選択的な付与により、操作した多特異的抗体の優先的なアセンブリがもたらされる。重鎖または軽鎖いずれかのＮまたはＣ末端に対するＦａｂ融合など、異なる付与電荷分布を示すこのＩｇＧ−Ｆａｂ融合のさらなる形態も可能である。このような構築物は、本開示を鑑みて十分に当業者の理解の範囲内にあり、過度の実験なしに製作することができる。例示する新規なＩｇＧ−Ｆａｂ融合物などの構築物は、現在はｓｃＦｖを使用する他のフォーマットのために有用であり得るが、これはＦａｂ断片のときより効果的である。ｓｃＦｖを使用する代わりに、その場所のＦａｂ断片、およびＦａｂにおける正しい鎖の対形成を確実にするためのＣＬ／ＣＨ１界面の修飾を用いることが現在可能である。
【０１２６】
本明細書に列挙する、全ての特許、特許出願、および刊行物の完全な開示、ならびに電子的に入手できる材料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑなどにおける提出されたヌクレオチド配列の、ならびにＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＢＤなどにおける提出されたアミノ酸配列、ならびにＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにおけるアノテーションされたコード領域からの翻訳物）は参照により援用するものである。前述の詳細な記載および実施例は、理解を明確にするためだけに示すものである。不必要な限定をそれから理解してはならない。当業者には明らかである変形は特許請求の範囲によって規定される本発明内に含まれるため、本発明は、示し、記載する厳密な詳細に限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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