(57)【要約】  本開示が、インフルエンザウイルス及び呼吸器合胞体ウイルスの両方に対する混合免疫原性組成物を同時に投与することによって、これら両方のウイルスに対する免疫応答を高める組成物及び方法に関する。この混合組成物は、ＲＳＶ成分及び１つ、２つ、３つ、又は４つ以上のインフルエンザ成分を含む。この混合組成物は、ＲＳＶ成分及びインフルエンザ成分を別個に投与することによって得られる免疫応答よりも強い免疫応答を誘導する。
2016509015.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）成分及びインフルエンザ成分を含む免疫原性組成物。
【請求項２】
前記ＲＳＶ  Ｆ成分がＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記インフルエンザ成分がインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記インフルエンザＶＬＰが、インフルエンザＨＡタンパク質、インフルエンザＮＡタンパク質、及びインフルエンザＭ１タンパク質を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
２つ、３つ、又は４つのインフルエンザＶＬＰをさらに含み、各ＶＬＰが異なる株に由来するＨＡタンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
各インフルエンザＶＬＰが、前記ＨＡタンパク質と同じ株に由来するＮＡタンパク質をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
各インフルエンザＶＬＰが、インフルエンザ株A/Indonesia/5/05に由来するＭ１タンパク質を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）成分及び３つのインフルエンザ成分を含む免疫原性組成物であって、
各インフルエンザ成分がＶＬＰを含み、
各ＶＬＰが、インフルエンザＭ１タンパク質、インフルエンザＮＡタンパク質、及びインフルエンザＨＡタンパク質を含み；かつ
各ＶＬＰの前記ＮＡタンパク質及び前記ＨＡタンパク質が、同じインフルエンザ株に由来し、
第１、第２、及び第３のＶＬＰのインフルエンザタンパク質が、互いに異なる株に由来し、
前記第１、前記第２、及び前記第３のＶＬＰがそれぞれ、同じ株に由来するＭ１タンパク質を含む、免疫原性組成物。
【請求項９】
第４のインフルエンザ成分をさらに含み、前記第４のインフルエンザ成分がＶＬＰを含み、前記第４のＶＬＰが、前記第１、前記第２、及び前記第３のＶＬＰの株とは異なる株に由来するＨＡタンパク質及びＮＡタンパク質を含み；かつ前記Ｍ１タンパク質が、前記第１、前記第２、及び前記第３のＶＬＰと同じ株に由来する、請求項８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記Ｍ１タンパク質がトリインフルエンザウイルスに由来する、請求項８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記トリインフルエンザウイルスがA/Indonesia/5/05インフルエンザウイルス株である、請求項１０に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、一次切断部位又は二次切断部位を不活化する変異を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）の１３３位のアルギニン、１３５位のアルギニン、及び１３６位のアルギニンに対応する位置における少なくとも１つのアミノ酸置換を導入することによって不活化される一次切断部位を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、前記野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）の１３７〜１４６位のアミノ酸に対応するアミノ酸の欠失を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質が配列番号８を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項１６】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）成分及び少なくとも１つのインフルエンザ成分を含むキットであって、各成分が別個の容器に入れられている、キット。
【請求項１７】
請求項１の組成物を投与するステップを含む、ＲＳＶ株及びインフルエンザ株に対する防御応答を誘導する方法。
【請求項１８】
前記投与するステップが、
（ａ）前記ＲＳＶ成分を容器内で２〜８℃で保存するステップ、
（ｂ）前記インフルエンザ成分を容器内で２〜８℃で保存するステップ、
（ｃ）ＲＳＶ成分と前記インフルエンザ成分を混合して混合組成物を調製するステップ；及び
（ｄ）前記組成物を動物に筋肉注射し、これによりインフルエンザ及びＲＳＶによる感染に対する防御免疫応答が得られるステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記動物がヒトである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヒトが乳児である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記防御応答が抗ＲＳＶ  Ｆ中和抗体を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記防御応答が赤血球凝集阻害を含み、前記赤血球凝集阻害が、各成分のみの投与と比べると前記ＲＳＶ成分と前記インフルエンザ成分とが同時に投与されるときの方が大きい、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗ＲＳＶ  Ｆ中和抗体応答が、各成分のみの投与と比べると前記ＲＳＶ成分と前記インフルエンザ成分とが同時に投与されるときの方が大きい、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記防御応答が抗パリビズマブ抗体応答を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
抗パリビズマブ抗体応答が、各成分のみの投与と比べると前記ＲＳＶ成分と前記インフルエンザ成分とが同時に投与されるときの方が大きい、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、あらゆる目的のためにそれぞれの全開示内容が本明細書で援用される２０１３年２月１１日出願の米国特許仮特許出願第６１／７６３，３０９号及び２０１３年９月９日出願の同第６１／８７５，３２７号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本出願は、あらゆる目的のために次の特許出願の開示内容を本明細書に組み込むものとする：２０１２年９月２７日出願の米国特許出願第１３／２６９，１０７号、２００７年１２月２０日出願の米国仮特許出願第６１／０１５，４４０号、２００６年１０月１８日出願の米国特許出願第１１／５８２，５４０号（米国特許出願公開第２００７／０１８４５２６号）、２００５年１０月１８日出願の米国仮特許出願第６０／７２７，５１３号；２００６年３月１０日出願の米国仮特許出願第６０／７８０，８４７号；２００６年５月１５日出願の米国仮特許出願第６０／８００，００６号；２００６年７月１７日出願の米国仮特許出願第６０／８３１，１９６号；２００６年７月２１日出願の米国仮特許出願第６０／８３２，１１６号、２００６年９月１９日出願の米国仮特許出願第６０／８４５，４９５号、２００３年７月１１日出願の米国特許出願第１０／６１７，５６９号（米国特許出願公開第２００５／０００９００８号）、２００８年１２月１９日出願の米国特許出願第１２／３４０，１８６号（米国特許出願公開第２０１０／１２９４０１号）、及び２０１０年１月１９日出願の米国特許出願第１２／６８９，８２６号（米国特許出願公開第２０１０／０１８４１９２号）。
【０００３】
配列表の相互参照
本明細書と共に電子出願されるテキストファイルの内容は、参照によりその全てが本明細書で援用される：コンピュータ可読形式の配列表のコピー（ファイル名：NOW_53_Seq_List.txt、記録された日付：２０１４年２月１１日；ファイルサイズ：７４キロバイト）。
【０００４】
技術分野
本明細書の開示は、全体として、ＲＳＶ及びインフルエンザウイルスによる感染の処置及び／又は予防用の免疫原性組成物、例えば、ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、パラミクソウイルス（Paramyxoviridae）科の肺炎ウイルス（Pneumovirus）属のメンバーである。ヒトＲＳＶ（ＨＲＳＶ）は、幼児における重篤な下気道疾患の主な原因であり、ヒトで高い罹患率及び死亡率を引き起こす。ＲＳＶはまた、免疫が低下した成人及び高齢者における疾患の重要な病原体としても認識されている。自然感染後の感染宿主でのＲＳＶに対する耐性は不完全であるため、小児期及び成人期にＲＳＶに複数回感染し得る。
【０００６】
このウイルスは、一本鎖マイナスセンスＲＮＡから構成されるゲノムを有し、この一本鎖マイナスセンスＲＮＡは、ウイルスタンパク質に密に結合してヌクレオカプシドを形成する。ウイルスエンベロープは、ウイルスによりコードされる構造タンパク質を含む、原形質膜由来の脂質二重層から構成されている。ウイルスポリメラーゼが、ビリオンと共にパッケージングされ、ゲノムＲＮＡをｍＲＮＡに転写する。ＲＳＶゲノムは、３つの膜貫通型構造タンパク質、Ｆ、Ｇ、及びＳＨ、２つのマトリクスタンパク質、Ｍ及びＭ２、３つのヌクレオカプシドタンパク質、Ｎ、Ｐ、及びＬ、並びに２つの非構造タンパク質、ＮＳ１及びＮＳ２をコードする。
【０００７】
ＨＲＳＶと細胞膜との融合は、細胞表面で起こると考えられ、感染初期におけるウイルスリボ核タンパク質の細胞質への移動に必要なステップである。このプロセスは、融合（Ｆ）タンパク質によって媒介され、この融合（Ｆ）タンパク質はまた、感染細胞の膜と隣接細胞の膜との融合を促進して特徴的な合胞体を形成させ、この合胞体の形成は、顕著な細胞変性効果があり、かつウイルス伝播の別の機構である。従って、融合活性の中和は、宿主の免疫において重要である。実際、Ｆタンパク質に対して開発されたモノクローナル抗体は、ウイルス感染力を中和し、かつ膜融合を阻害することが示されている（Calder et al., 2000, Virology 271:1221-131）。
【０００８】
ＲＳＶのＦタンパク質は、他のパラミクソウイルス（paramyxovirus）のＦ糖タンパク質と構造的特徴、及び限定的であるが重要なアミノ酸配列同一性を共有する。このＦタンパク質は、５７４のアミノ酸の不活性前駆体（Ｆ０）として合成され、小胞体においてアスパラギン上で共翻訳的にグリコシル化され、そこで集合してホモオリゴマーになる。細胞表面に到達する前に、Ｆ０前駆体はプロテアーゼによって切断され、Ｎ末端から延びたＦ２とＣ末端から延びたＦ１となる。Ｆ２鎖及びＦ１鎖は、１つ以上のジスルフィド結合によって共有結合が維持される。
【０００９】
免疫親和性精製された完全長Ｆタンパク質は、他の完全長ウイルス膜糖タンパク質で観察されるものに類似したミセル（ロゼットとしても特徴付けられる）の形態で蓄積することが分かっている（Wrigley et al, 1986, in Electron Microscopy of Proteins, Vol 5, p. 103-163, Academic Press, London）。電子顕微鏡下では、ロゼット内の分子は、逆円錐形ロッド構造（約７０％）又はロリポップ形構造（約３０％）のいずれかとして見え、これらの広い端部が、ロゼットの中心から離れる方向に突き出ている。ロッドの高次構造状態は、融合前の不活性状態にあるＦ糖タンパク質に関連するが、ロリポップの高次構造状態は、融合後の活性状態にあるＦ糖タンパク質に関連している。
【００１０】
Calder et al., 2000, Virology 271:122-131によって実証されているように、電子顕微鏡検査を使用して、融合前と融合後（あるいは、前融合性及び融合性と表される）の高次構造を区別することができる。融合前高次構造はまた、リポソーム結合アッセイによって融合性（融合後）高次構造と区別することもできる。加えて、融合前高次構造及び融合性高次構造は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前形態又は融合性形態のいずれか一方で存在するが、他方の形態では存在しない高次構造エピトープを特異的に認識する抗体（例えば、モノクローナル抗体）を用いて区別することができる。このような高次構造エピトープは、分子の表面上にある抗原決定基の優先的な露出に起因し得る。あるいは、高次構造エピトープは、直鎖状ポリペプチドにおける非連続的なアミノ酸の並置から生じ得る。
【００１１】
以前に、Ｆ前駆体が２つの部位（部位Ｉ、残基１０９位の後、及び部位ＩＩ、残基１３６位の後）で切断され、フューリン様プロテアーゼによって認識されるモチーフがこれらの両方の部位に先行することが示されている。部位ＩＩは融合ペプチドに隣接し、膜融合には、両方の部位でのＦタンパク質の切断が必要である（Gonzalez-Reyes et al., 2001, PNAS 98(17): 9859-9864）。両方の部位で切断が完了すると、円錐形ロッドからロリポップ形ロッドへの変化が存在すると考えられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
本明細書では、ＲＳＶ  Ｆ成分及び少なくとも１つのインフルエンザ成分を含む免疫原性組成物が提供される。同時に、ＲＳＶ  Ｆ成分及びインフルエンザ成分を使用して、動物、例えば、ヒトの、組成物中に含まれるＲＳＶ株及びインフルエンザ株による感染を防御する免疫応答を刺激することができる。
【００１３】
ＲＳＶ  ＦとインフルエンザＶＬＰの混合ワクチンは、マウスにおいて十分に耐容性であり、かつ免疫原性である。予想外に、成分の混合により、成分を別個に投与する場合と比較して、混合ではウイルス抗原に対する免疫応答が高まる。メカニズムに縛られるものではないが、免疫原性データは、恐らくは、ＲＳＶ緩衝液；例えば、インフルエンザ緩衝液よりも低いｐＨのＲＳＶ緩衝液、又はヒスチジンの存在によって、インフルエンザ抗原が（場合によってはＨＡタンパク質も）ＲＳＶ  Ｆ応答を強化し、逆にＲＳＶ成分がＨＡ応答を強めたことを示している。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、患者に投与する前のＲＳＶ成分とインフルエンザ成分とを混合することによる、開示される混合組成物の調製を例示している。
【図２】図２は、ＲＳＶ  Ｆ成分及びインフルエンザ成分と比較した、開示される混合組成物によってＲＳＶに対して誘導された特異的な抗体を示している。
【図３】図３は、ＲＳＶ  Ｆ成分及びインフルエンザ成分と比較した、開示される混合組成物によってＲＳＶに対して誘導された中和抗体を示している。
【図４】図４は、ＲＳＶ  Ｆ成分及びインフルエンザ成分と比較した、開示される混合組成物によってＲＳＶに対して誘導されたパリビズマブ−競合抗体を示している。
【図５】図５は、A-California株に対する免疫化によって誘導された赤血球凝集阻害応答を例示している。データは、ＲＳＶ／三価インフルエンザ混合組成物によって誘導された応答と、ＲＳＶ組成物のみ及び三価インフルエンザ組成物のみによって誘導された応答とを比較している。
【図６】図６は、A/Victoria株に対する免疫化によって誘導された赤血球凝集阻害応答を例示している。データは、ＲＳＶ／三価インフルエンザ混合組成物によって誘導された応答と、ＲＳＶ組成物のみ及び三価インフルエンザ組成物のみによって誘導された応答とを比較している。
【図７】図７は、B/Wisconsin株に対する免疫化によって誘導された赤血球凝集阻害応答を例示している。データは、ＲＳＶ／三価インフルエンザ混合組成物によって誘導された応答と、ＲＳＶ組成物のみ及び三価インフルエンザ組成物のみによって誘導された応答とを比較している。
【図８】図８は、ＲＳＶ  Ｆ成分に対する免疫化によって誘導された抗ＲＳＶ  Ｆ  ＩｇＧ応答を例示している。データは、リン酸アルミニウムアジュバントの存在下又は非存在下、異なるＲＳＶ抗原処置レベルでのＲＳＶ／ＴＩＶ（三価インフルエンザワクチン）組成物成分の連続投与によって誘導された応答を比較している。
【図９】図９は、競合ＥＬＩＳＡによって測定されたパリビズマブ様抗体の推定レベルを例示している。データは、リン酸アルミニウムアジュバントの存在下又は非存在下、異なるＲＳＶ抗原処置レベルでのＲＳＶとＴＩＶインフルエンザ組成物成分の連続投与によって誘導された応答を比較し、この誘導された免疫応答が抗原干渉（antigen interference）の影響を受けないことを実証している。
【図１０】図１０は、抗原部位ＩＩ（Ａｇ部位ＩＩ）に結合するＩｇＧを例示している。データは、リン酸アルミニウムアジュバントの存在下又は非存在下、異なるＲＳＶ抗原処置レベルでのＲＳＶ／ＴＩＶインフルエンザ組成物の連続同時投与によって誘導された応答を比較し、この組成物が抗原の干渉の影響を受けない免疫応答を誘導することを実証している。
【図１１Ａ】図１１Ａは、マウスでの実験における抗ＲＳＶ  ＩｇＧ応答を例示している。図１１Ａは、ＲＳＶ−Ｆ組成物、四価インフルエンザ組成物、及びＲＳＶ−Ｆ組成物及び四価組成物の両方を含む混合ワクチンに対する抗ＲＳＶ  ＩｇＧ応答のＧＭＴを例示している。マウス（ｎ＝１０）を、０日目及び２１日目に四価インフルエンザＶＬＰ（Ｑ−Ｆｌｕ）＋ＲＳＶ  Ｆ混合ワクチン、ＲＳＶ  Ｆ  ＶＬＰワクチンのみ、又はＱ−Ｆｌｕ  ＶＬＰワクチンのみで免疫化した。３５日目に全ての群から血清を採取して、方法のセクション３．２に記載されているようにＥＬＩＳＡによってＲＳＶ  Ｆ  ＩｇＧ応答を決定した。データを、SoftMax proソフトウェア（Molecular Devices）を用いて分析した。４パラメータロジスティクス（ＰＬ）曲線をデータにフィッティングさせて、力価を、１．０のＯＤ４５０となった血清希釈度の逆数値として決定した。各群の幾何平均力価（ＧＭＴ）が、この図に示されている棒グラフで表されている。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、マウスでの実験における抗ＲＳＶ  ＩｇＧ応答を例示している。図１１Ｂは、データを表形式で示している。＊ｐ＜０．０５、ＲＳＶ  Ｆ単独ワクチンと比較。
【図１２Ａ】図１２Ａは、マウスでの実験におけるパリビズマブ−競合抗体（ＰＣＡ）応答を例示している。図１２Ａは、ＲＳＶ−Ｆ組成物、四価インフルエンザ組成物、及びＲＳＶ−Ｆ組成物及び四価組成物の両方を含む混合ワクチンに対する抗ＲＳＶ  ＩｇＧ応答のＰＣＡ（μｇ／ｍｌ）を例示している。マウス（ｎ＝１０）を、０日目及び２１日目に四価インフルエンザＶＬＰ（Ｑ−Ｆｌｕ）＋ＲＳＶ  Ｆ混合ワクチン、ＲＳＶ  Ｆ  ＶＬＰワクチンのみ、又はＱ−Ｆｌｕ  ＶＬＰワクチンのみで免疫化した。３５日目に血清を全ての群から採取して、パリビズマブ競合抗体力価（ＰＣＡ）を決定した。ＰＣＡ力価は、組換えＲＳＶ  Ｆに結合するパリビズマブモノクローナル抗体の５０％阻害となった血清希釈度の逆数値として報告された。５０％阻害が得られなかった場合は、そのサンプルに対して＜２０の力価が報告された。ＰＣＡ（μｇ／ｍｌ）のＧＭＴが、この図に示されている棒グラフで各群について表されている。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、マウスでの実験におけるパリビズマブ−競合抗体（ＰＣＡ）応答を例示している。図１２Ｂは、データを表形式で示している。＊ｐ＜０．０１、ＲＳＶ  Ｆ単独ワクチンと比較、＋ｐ＜０．０５、ＲＳＶ  Ｆ単独ワクチンと比較。
【図１３Ａ】図１３Ａは、マウスでの実験におけるＲＳＶ中和抗体応答を例示している。図１３Ａは、ＲＳＶ−Ｆ組成物、四価インフルエンザ組成物、及びＲＳＶ−Ｆ組成物及び四価組成物の両方を含む混合ワクチンに対する抗ＲＳＶ抗体応答のＧＭＴを例示している。マウス（ｎ＝１０）を、０日目及び２１日目に四価インフルエンザＶＬＰ（Ｑ−Ｆｌｕ）＋ＲＳＶ  Ｆ混合ワクチン、ＲＳＶ  Ｆ  ＶＬＰワクチンのみ、又はＱ−Ｆｌｕ  ＶＬＰワクチンのみで免疫化した。免疫化から３５日後に採取した血清を、実施例１０及び１１に記載されているマイクロ中和アッセイに使用した。（細胞変性効果）ＣＰＥの１００％阻害を達成する、ＲＳＶ  Ａ２に対するＲＳＶ中和力価を、この図に示されている棒グラフから各群について決定した。ＧＭＴが示されている。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、マウスでの実験におけるＲＳＶ中和抗体応答を例示している。図１３Ｂは、データを表形式で示している。＊ｐ＜０．０１、ＲＳＶ  Ｆ単独ワクチンと比較。
【図１４】図１４は、赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）抗体アッセイを行うために使用される試薬を示している。
【図１５Ａ】図１５Ａは、ＲＳＶ−Ｆ組成物、四価インフルエンザ組成物、並びにＲＳＶ−Ｆ組成物及び四価組成物の両方を含む混合ワクチンの投与後に誘導された抗ＨＡ応答を例示している。この四価組成物は、４つの株：A/California/04/09、A/Victoria/361/11、B/Brisbane/60/08、及びB/Massachusetts/2/12に由来するＨＡ及びＮＡタンパク質を含むＶＬＰを含む。図１５Ａは、A/California/04/09（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザ株ＨＡタンパク質に対する応答のＨＡＩ分析を示している。マウス（ｎ＝１０）を、０日目及び２１日目に四価インフルエンザＶＬＰ（Ｑ−Ｆｌｕ）＋ＲＳＶ  Ｆ混合ワクチン、ＲＳＶ  Ｆ  ＶＬＰワクチンのみ、又はＱ−Ｆｌｕ  ＶＬＰワクチンのみで免疫化した。３５日目に、血清を使用してA/California、A/Victoria、B/Brisbane、及びB/Massachusettsに対するＨＡＩ力価を決定した。各群の幾何平均（ＧＭＴ）が示されている。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ＲＳＶ−Ｆ組成物、四価インフルエンザ組成物、並びにＲＳＶ−Ｆ組成物及び四価組成物の両方を含む混合ワクチンの投与後に誘導された抗ＨＡ応答を例示している。図１５Ｂは、A/California/04/09インフルエンザ株のＨＡＩデータを表形式で示している。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、ＲＳＶ−Ｆ組成物、四価インフルエンザ組成物、並びにＲＳＶ−Ｆ組成物及び四価組成物の両方を含む混合ワクチンの投与後に誘導された抗ＨＡ応答を例示している。この四価組成物は、４つの株：A/California/04/09、A/Victoria/361/11、B/Brisbane/60/08、及びB/Massachusetts/2/12に由来するＨＡ及びＮＡタンパク質を含むＶＬＰを含む。図１５Ｃは、A/Victoria/361/11（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザ株ＨＡタンパク質に対する応答のＨＡＩ分析を示している。マウス（ｎ＝１０）を、０日目及び２１日目に四価インフルエンザＶＬＰ（Ｑ−Ｆｌｕ）＋ＲＳＶ  Ｆ混合ワクチン、ＲＳＶ  Ｆ  ＶＬＰワクチンのみ、又はＱ−Ｆｌｕ  ＶＬＰワクチンのみで免疫化した。３５日目に、血清を使用してA/California、A/Victoria、B/Brisbane、及びB/Massachusettsに対するＨＡＩ力価を決定した。各群の幾何平均（ＧＭＴ）が示されている。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、ＲＳＶ−Ｆ組成物、四価インフルエンザ組成物、並びにＲＳＶ−Ｆ組成物及び四価組成物の両方を含む混合ワクチンの投与後に誘導された抗ＨＡ応答を例示している。図１５ＤはA/Victoria/361/11インフルエンザ株のＨＡＩデータを表形式で示している。
【図１５Ｅ】図１５Ｅは、ＲＳＶ−Ｆ組成物、四価インフルエンザ組成物、並びにＲＳＶ−Ｆ組成物及び四価組成物の両方を含む混合ワクチンの投与後に誘導された抗ＨＡ応答を例示している。この四価組成物は、４つの株：A/California/04/09、A/Victoria/361/11、B/Brisbane/60/08、及びB/Massachusetts/2/12に由来するＨＡ及びＮＡタンパク質を含むＶＬＰを含む。図１５Ｅは、B/Brisbane/60/08インフルエンザ株ＨＡタンパク質に対する応答のＨＡＩ分析を示している。マウス（ｎ＝１０）を、０日目及び２１日目に四価インフルエンザＶＬＰ（Ｑ−Ｆｌｕ）＋ＲＳＶ  Ｆ混合ワクチン、ＲＳＶ  Ｆ  ＶＬＰワクチンのみ、又はＱ−Ｆｌｕ  ＶＬＰワクチンのみで免疫化した。３５日目に、血清を使用してA/California、A/Victoria、B/Brisbane、及びB/Massachusettsに対するＨＡＩ力価を決定した。各群の幾何平均（ＧＭＴ）が示されている。
【図１５Ｆ】図１５Ｆは、ＲＳＶ−Ｆ組成物、四価インフルエンザ組成物、並びにＲＳＶ−Ｆ組成物及び四価組成物の両方を含む混合ワクチンの投与後に誘導された抗ＨＡ応答を例示している。図１５Ｆは、B/Brisbane/60/08インフルエンザ株のＨＡＩデータを表形式で示している。
【図１５Ｇ】図１５Ｇは、ＲＳＶ−Ｆ組成物、四価インフルエンザ組成物、並びにＲＳＶ−Ｆ組成物及び四価組成物の両方を含む混合ワクチンの投与後に誘導された抗ＨＡ応答を例示している。この四価組成物は、４つの株：A/California/04/09、A/Victoria/361/11、B/Brisbane/60/08、及びB/Massachusetts/2/12に由来するＨＡ及びＮＡタンパク質を含むＶＬＰを含む。図１５Ｇは、B/Brisbane/60/08インフルエンザ株ＨＡタンパク質に対する応答のＨＡＩ分析を示している。マウス（ｎ＝１０）を、０日目及び２１日目に四価インフルエンザＶＬＰ（Ｑ−Ｆｌｕ）＋ＲＳＶ  Ｆ混合ワクチン、ＲＳＶ  Ｆ  ＶＬＰワクチンのみ、又はＱ−Ｆｌｕ  ＶＬＰワクチンのみで免疫化した。３５日目に、血清を使用してA/California、A/Victoria、B/Brisbane、及びB/Massachusettsに対するＨＡＩ力価を決定した。各群の幾何平均（ＧＭＴ）が示されている。
【図１５Ｈ】図１５Ｈは、ＲＳＶ−Ｆ組成物、四価インフルエンザ組成物、並びにＲＳＶ−Ｆ組成物及び四価組成物の両方を含む混合ワクチンの投与後に誘導された抗ＨＡ応答を例示している。図１５Ｈは、B/Brisbane/60/08インフルエンザ株のＨＡＩデータを表形式で示している。
【図１６】図１６は、A/California株についてのマウスでの実験の３５日目のＨＡＩ力価のデータの概要を示している。
【図１７】図１７は、A/Victoria株についてのマウスでの実験の３５日目のＨＡＩ力価のデータの概要を示している。
【図１８】図１８は、B/Brisbane/60/08株についてのマウスでの実験の３５日目のＨＡＩ力価のデータの概要を示している。
【図１９】図１９は、B/Massachusetts/2/12株についてのマウスでの実験の３５日目のＨＡＩ力価のデータの概要を示している。
【図２０】図２０は、マウスでの実験における２１日目のＲＳＶ  ＩｇＧ力価についてのデータを示している。
【図２１】図２１は、マウスでの実験における３５日目のＲＳＶ  ＩｇＧ力価についてのデータを示している。
【図２２】図２２は、マウスでの実験における３５日目の競合パリビズマブ抗体力価についてのデータを示している。
【図２３】図２３は、マウスでの実験における３５日目のマイクロ中和力価についてのデータを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
定義
本明細書で使用される「アジュバント」という語は、製剤中で特定の免疫原と組み合わせて使用されると、得られる免疫応答を増強する、又は改変もしくは修飾する化合物を指す。免疫応答の修飾には、抗体応答及び細胞性免疫応答の一方又は両方の特異性の強化又は拡大が含まれる。免疫応答の修飾はまた、特定の抗原特異的免疫応答の低下又は抑制も意味し得る。
【００１６】
本明細書で使用される「抗原製剤」又は「抗原組成物」という語は、脊椎動物、特に鳥類又は哺乳動物に投与されると免疫応答を誘導する調製物を指す。
【００１７】
本明細書で使用される「約」は、表示値の±１０％を意味する。
【００１８】
本明細書で使用される「トリインフルエンザウイルス」という語は、主として鳥類に見られるが、ヒト又は他の動物にも感染し得るインフルエンザウイルスを指す。ある場合には、トリインフルエンザウイルスはヒトからヒトに伝染又は伝播し得る。ヒトに感染するトリインフルエンザウイルスは、インフルエンザの大流行、すなわちヒトに罹患率及び／又は死亡率を引き起こす可能性がある。大流行は、新種のインフルエンザウイルス株（ヒトが自然免疫を有していないウイルス）が現れたときに起こり、個々の地域を越えて、場合によっては全世界的に伝播し、多くの人に同時に感染する。
【００１９】
本明細書で使用される「有効用量」は、通常は、免疫を誘導する、感染を予防及び／又は改善する、又は感染もしくは疾患の少なくとも１つの症状を軽減するのに十分な本発明で開示される組成物の量を指す。有効用量は、後の感染病原体又は疾患への曝露に対する対象（例えば、ヒト）の自己免疫応答を亢進させるのに十分な量とすることもできる。免疫レベルは、例えば、中和分泌及び／又は血清抗体の量を、例えば、プラーク中和、補体固定、酵素結合免疫吸着、もしくはマイクロ中和アッセイで測定することによって、又は細胞性応答、例えば、限定されるものではないが、細胞傷害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞及び／又は他の細胞性応答を測定することによって監視することができる。Ｔ細胞応答は、例えば、蛍光フローサイトメトリー又はＴ細胞アッセイ、例えば、限定されるものではないが、Ｔ細胞増殖アッセイ、Ｔ細胞傷害性アッセイ、ＴＥＴＲＡＭＥＲアッセイ、及び／又はＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって特異的マーカーを用いて、例えば、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の存在量を測定することによって監視することができる。ワクチンの場合、「有効用量」は、疾患を予防し、かつ／又は症状の重症度を軽減する用量である。
【００２０】
本明細書で使用される「有効量」という語は、所望の生物学的効果を実現するのに必要な又は十分な本明細書で開示される組成物の量を指す。組成物の有効量は、選択された結果を達成する量であり得、かつこのような量は、当業者によってルーチンの実験として決定することができる。例えば、感染を予防、処置、及び／又は改善するための有効量は、免疫系の活性化を引き起こし、これにより抗原特異的な免疫応答を生じさせるために必要な量であり得る。この用語はまた、「十分な量」と同義語でもある。
【００２１】
本明細書で使用される「発現」という語は、ポリ核酸がｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリ核酸がゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、適切な真核宿主細胞又は生物が選択される場合は、ｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。本発明の開示の文脈では、この語はまた、ＲＳＶ  Ｆ遺伝子ｍＲＮＡ及びその発現後に得られるＲＳＶ  Ｆタンパク質の産生も包含する。
【００２２】
本明細書で使用される「Ｆタンパク質」又は「融合タンパク質」又は「Ｆタンパク質ポリペプチド」又は「融合タンパク質ポリペプチド」という語は、ＲＳＶ融合タンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の全て又は一部を有するポリペプチド又はタンパク質を指す。同様に、「Ｇタンパク質」又は「Ｇタンパク質ポリペプチド」という語は、ＲＳＶ付着タンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の全て又は一部を有するポリペプチド又はタンパク質を指す。多数のＲＳＶ融合タンパク質及びＲＳＶ付着タンパク質が記載されており、これらは、当業者に公知である。参照によりその全開示内容が本明細書で援用される国際公開第２００８／１１４１４９号に、例示的なＦタンパク質変異体及びＧタンパク質変異体（例えば、天然に存在する変異体）が詳述されている。
【００２３】
本明細書で使用される「免疫原」又は「抗原」という語は、免疫応答を誘発することができる物質、例えば、タンパク質、ペプチド、及び核酸を指す。両方の語は、エピトープも包含し、互換的に使用される。
【００２４】
本明細書で使用される「免疫刺激因子」という語は、生体自体の化学メッセンジャー（サイトカイン）を介した免疫応答を亢進させる化合物を指す。このような分子には、免疫刺激活性、免疫強化活性、及び炎症誘導活性を有する様々なサイトカイン、リンホカイン、及びケモカイン、例えば、インターフェロン（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３）；成長因子（例えば、顆粒球マクロファージ（ＧＭ）コロニー刺激因子（ＣＳＦ））；及び他の免疫刺激分子、例えば、マクロファージ炎症性因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１；Ｂ７．２などが含まれる。免疫刺激因子分子は、本開示のＶＬＰと同じ製剤で投与しても良いし、又は別個に投与しても良い。タンパク質又はタンパク質をコードする発現ベクターのいずれかを投与して、免疫刺激効果をもたらすことができる。
【００２５】
本明細書で使用される「免疫原性製剤」という語は、脊椎動物、例えば、哺乳動物に投与されると免疫応答を誘導する調製物を指す。
【００２６】
本明細書で使用される「感染病原体」という語は、脊椎動物に感染を引き起こす微生物を指す。通常、生物は、ウイルス、細菌、寄生生物、原生動物、及び／又は真菌である。
【００２７】
本明細書で使用される「変異した」、「修飾された」、「突然変異」、又は「修飾」という語は、改変された核酸又はポリペプチドをもたらす核酸及び／又はポリペプチドのあらゆる修飾のことである。突然変異には、例えば、遺伝子のタンパク質コード領域内に生じる改変及びタンパク質コード配列、例えば、限定されるものではないが、調節配列又はプロモーター配列の外側の領域における改変を含む、ポリヌクレオチドの単一又は複数の残基の点突然変異、欠失、又は挿入が含まれる。遺伝子改変は、あらゆるタイプの突然変異であり得る。例えば、突然変異は、遺伝子の一部又は全ての点突然変異、フレームシフト突然変異、挿入、又は欠失を構成し得る。一部の実施形態では、突然変異は自然発生する。他の実施形態では、突然変異は人工的な突然変異圧力の結果である。なお他の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質における突然変異は、遺伝子操作の結果である。
【００２８】
本明細書で使用される「多価」という語は、感染病原体又は疾患の複数のタイプ又は株に対する１つ以上の抗原タンパク質／ペプチド又は免疫原を有する組成物を指す。
【００２９】
本明細書で使用される「薬学的に許容され得るワクチン」という語は、脊椎動物に投与することが可能な形態であると共に、感染又は疾患を予防及び／又は改善し、かつ／又は感染もしくは疾患の少なくとも１つの症状を軽減する免疫を誘導するのに十分な防御免疫応答を誘導する製剤を指す。典型的には、ワクチンは、本開示の組成物が懸濁又は溶解された従来の生理食塩水又は緩衝水溶液媒体を含む。この形態では、本開示の組成物を感染の予防、改善、又はその他の処置に便利に使用することができる。宿主に導入されると、ワクチンは、限定されるものではないが、抗体及び／もしくはサイトカインの産生、並びに／又は細胞傷害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞の活性化、及び／もしくは他の細胞性応答を含む免疫応答を引き起こすことができる。
【００３０】
本明細書で使用される「防御免疫応答」又は「防御応答」という熟語は、感染を予防もしくは改善する、又はその少なくとも１つの疾患症状を軽減する、脊椎動物（例えば、ヒト）によって示される、感染病原体又は疾患に対する抗体により媒介される免疫応答を指す。本明細書に開示される組成物は、例えば、感染病原体を中和し、感染病原体が細胞に侵入するのを阻止し、感染病原体の複製を阻止し、かつ／又は宿主細胞を感染及び破壊から保護する抗体の産生を刺激することができる。
【００３１】
本明細書で使用される「脊椎動物」又は「対象」又は「患者」という語は、限定されるものではないが、ヒト、非ヒト霊長類、例えば、チンパンジー及び他の類人猿及びサル種を含む他の霊長類を含め、脊索動物亜門（subphylum cordata）のあらゆるメンバーを指す。農場動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、及びウマ；家畜化された哺乳動物、例えば、イヌ及びネコ；げっ歯類、例えば、マウス、ラット（コットンラットを含む）、及びモルモットを含む実験動物；家禽、野鳥、及び狩猟鳥、例えば、ニワトリ、七面鳥、及び他のキジ類の鳥、アヒル、及びガチョウなどを含む鳥類もまた、非限定の例である。「哺乳動物」及び「動物」という語は、この定義に含まれる。成体及び新生児の両方の個体が含まれるものとする。特に、乳児及び幼児は、インフルエンザ及びＲＳＶの免疫に適した対象又は患者である。
【００３２】
本明細書で使用される「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）という語は、少なくとも１つの属性がウイルスに類似しているが、伝染性であると実証されていない構造を指す。本開示に従ったウイルス様粒子は、ウイルス様粒子のタンパク質をコードする遺伝情報を有していない。一般に、ウイルス様粒子は、ウイルスゲノムが欠損しており、従って非感染性である。加えて、ウイルス様粒子は、しばしば、異種発現によって大量に産生することができ、かつ容易に精製することができる。
【００３３】
本明細書で使用される「キメラＶＬＰ」という語は、少なくとも２つの異なる感染病原体由来のタンパク質（異種タンパク質）又はその一部分を含むＶＬＰを指す。通常は、このタンパク質の１つは、宿主細胞からのＶＬＰの形成を駆動することができるウイルスに由来する。例示を目的とする例として、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質及び／又はＨＲＳＶ  ＧもしくはＦタンパク質が挙げられる。
【００３４】
本明細書で使用される「ワクチン」という語は、ウイルスに対する保護免疫応答を誘導するために使用される１つ以上のウイルス抗原を含む組成物を指す。
【００３５】
組成物
本明細書に開示される混合組成物は、ＲＳＶ及び複数のインフルエンザウイルスに対して強い免疫応答を示す。複数の病原体に対して応答を示すことは、多くの点で有利である。例えば、これにより、予防接種の一部としてワクチンの投与に関連したコストが低減され、患者コンプライアンスが、複数の免疫化が１回の注射によって達成されるため改善される。
【００３６】
本明細書に記載される組成物は、ＲＳＶ成分及び１つ以上のインフルエンザ成分を含む。ＲＳＶ成分は、ＲＳＶに対する免疫応答を誘導する。インフルエンザ成分は、インフルエンザ株に対する応答を誘導する。
【００３７】
ＲＳＶ  Ｆ成分
本開示の一態様では、ＲＳＶ  Ｆ成分はＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む。適切なＲＳＶ  Ｆタンパク質及びその産生方法が米国特許出願第１３／２６９，１０７号に記載されている。
【００３８】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（例えば、配列番号２に例示；Genbankアクセッション番号ＡＡＢ５９８５８）と比較して修飾された又は変異したアミノ酸配列を含み得る。一実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のＰ１０２位に対応するアミノ酸に修飾又は変異を含む。別の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のＩ３７９位に対応するアミノ酸に修飾又は変異を含む。別の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のＭ４４７位に対応するアミノ酸に修飾又は変異を含む。一実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、上記の位置に対応するアミノ酸に２つ以上の修飾又は変異を含む。別の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、上記の位置に対応するアミノ酸に３つの修飾又は変異を含む。
【００３９】
一実施形態では、１０２位のプロリンはアラニンで置換されている。別の実施形態では、３７９位のイソロイシンはバリンで置換されている。なお別の実施形態では、４４７位のメチオニンはバリンで置換されている。特定の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、これらの特定の実施形態に記載された位置に対応するアミノ酸に２つ以上の修飾又は変異を含む。特定の他の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、これらの特定の実施形態に記載された位置に対応するアミノ酸に３つの修飾又は変異を含む。例示的な一実施形態では、ＲＳＶタンパク質は、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する。
【００４０】
一実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のコード配列は、適切な宿主細胞でのその発現を促進するようにさらに最適化される。一実施形態では、宿主細胞は、昆虫細胞である。例示的な一実施形態では、昆虫細胞はＳｆ９細胞である。
【００４１】
一実施形態では、コドン最適化ＲＳＶ  Ｆ遺伝子のコード配列は配列番号３である。別の実施形態では、コドン最適化ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する。
【００４２】
一実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、Ｆ２の潜在ポリ（Ａ）部位に少なくとも１つの修飾をさらに含む。別の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、一次切断部位（ＣＳ）に１つ以上のアミノ酸変異をさらに含む。一実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）又はコドン最適化ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号４）のＲ１３３位に対応するアミノ酸に修飾又は変異を含む。別の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）又はコドン最適化ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号４）のＲ１３５位に対応するアミノ酸に修飾又は変異を含む。なお別の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）又はコドン最適化ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号４）のＲ１３６位に対応するアミノ酸に修飾又は変異を含む。
【００４３】
一実施形態では、１３３位のアルギニンはグルタミンで置換されている。別の実施形態では、１３５位のアルギニンはグルタミンで置換されている。なお別の実施形態では、１３６位のアルギニンはグルタミンで置換されている。特定の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、これらの特定の実施形態に記載された位置に対応するアミノ酸に２つ、３つ又はそれを超える数の修飾又は変異を含む。例示的な一実施形態では、ＲＳＶタンパク質は、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する。
【００４４】
別の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、配列番号２、配列番号４、及び配列番号６のアミノ酸１３７〜１４６位に対応する融合ドメインのＮ末端半分に欠失をさらに含む。例示的な一実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する。代替の一実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有する。
【００４５】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、株Ａ及び株Ｂを含む様々なヒト株、並びに限定されるものではないが、ウシ又はトリＲＳＶ株を含む非ヒト株に由来し得る。
【００４６】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり得る。一部の実施形態では、ＶＬＰは、１つ以上の別のタンパク質をさらに含む。ＲＳＶ  Ｆ成分は、さらなるタンパク質を含み得る。例えば、一実施形態では、ＶＬＰは、マトリクス（Ｍ）タンパク質をさらに含む。一実施形態では、Ｍタンパク質はヒトＲＳＶ株に由来する。別の実施形態では、Ｍタンパク質はウシＲＳＶ株に由来する。他の実施形態では、マトリクスタンパク質は、インフルエンザウイルス株由来のＭ１タンパク質であり得る。一実施形態では、インフルエンザウイルス株はトリインフルエンザウイルス株である。他の実施形態では、Ｍタンパク質は、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）株に由来し得る。
【００４７】
さらなる実施形態では、ＶＬＰは、ＲＳＶ糖タンパク質Ｇをさらに含む。別の実施形態では、ＶＬＰは、ＲＳＶ糖タンパク質ＳＨをさらに含む。なお別の実施形態では、ＶＬＰは、ＲＳＶヌクレオカプシドＮタンパク質をさらに含む。
【００４８】
修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ＲＳＶ感染の予防及び／又は処置に使用することができる。従って、別の態様では、ＲＳＶに対する免疫応答を誘発する方法が開示される。この方法は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む組成物を免疫学的に有効な量、対象、例えば、ヒト又は動物対象に投与するステップを含む。
【００４９】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする単離核酸配列も提供される。例示的な一実施形態では、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする単離核酸は、配列番号３、配列番号５、配列番号７、又は配列番号９からなる群から選択される。ＲＳＶ  Ｆに加えて、他のＲＳＶタンパク質も含まれ得る。例えば、ＲＳＶ成分は、１つ以上の追加のＲＳＶタンパク質、例えば、Ｍ、Ｎ、Ｇ、及びＳＨをさらに含み得る。
【００５０】
インフルエンザ成分
本明細書で使用される「インフルエンザ成分」は、インフルエンザ株に対して応答を誘導することができる少なくとも１つの抗原を含む分子を意味する。一部の態様では、分子は、タンパク質又は糖タンパク質である。他の態様では、分子はインフルエンザＶＬＰである。例えば、実施例１に記載される臨床試験では、投与される混合ワクチンは、３つのインフルエンザ成分を含み、各成分は、株Ａ−Ｐｅｒｔｈ  Ｈ３Ｎ２  Ｓ２０５、Ａ−Ｃａｌ  Ｈ１Ｎ１、及びB-Wisconsinに由来するＨＡ及びＮＡタンパク質を含むＶＬＰであった。３つのＶＬＰはそれぞれ、同じ株、A/Indonesia/5/05に由来するＭ１タンパク質を含んでいた。
【００５１】
適切なインフルエンザ成分を調製及び産生させるための組成物及び方法は、上記の参考文献に含まれる出願書類に記載されている。インフルエンザＶＬＰは、インフルエンザマトリクス（Ｍ１）タンパク質、ＨＡタンパク質、及びＮＡタンパク質の１つ以上を含み得る。一部の態様では、インフルエンザＶＬＰは３つ全てのタンパク質を含む。追加のインフルエンザタンパク質も含まれ得る。インフルエンザＭ２はＶＬＰに含まれ得る；しかしながら、好ましくは、少なくとも１つのインフルエンザＶＬＰは、インフルエンザＭ２タンパク質を含まない。より好ましくは、どのインフルエンザＶＬＰもＭ２タンパク質を含まない。
【００５２】
インフルエンザタンパク質は、任意の適切なインフルエンザ株から得ることができる。一部の態様では、インフルエンザタンパク質は全て、同じ株に由来し得る。他の態様では、各タンパク質は異なる株に由来する。なお他の態様では、Ｍ１タンパク質は１つの株に由来し、ＨＡ及びＮＡタンパク質は第２の株に由来し、この第２の株は、Ｍ１タンパク質インフルエンザ株とは異なる株である。なお他の態様では、Ｍ１タンパク質とＮＡタンパク質又はＨＡタンパク質の両方ではなくいずれかは、同じ株に由来する。一部の態様では、Ｍ１タンパク質は鳥類株に由来する。他の態様では、Ｍ１タンパク質は季節性株に由来する。
【００５３】
例示的な株には、限定されるものではないが、以下のＨＡ又はＮＡタンパク質を有する株が含まれる。ＨＡタンパク質は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、及びＨ１６からなる群から選択することができる。ＮＡタンパク質は、Ｎｌ、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、及びＮ９からなる群から選択することができる。特定の一態様では、ＨＡ及びＮＡタンパク質はそれぞれ、Ｈ５及びＮ１である。別の態様では、ＨＡ及びＮＡタンパク質はそれぞれ、Ｈ９及びＮ２である。なお別の態様では、ＨＡ及びＮＡタンパク質はそれぞれ、Ｈ７及びＮ９である。ＨＡタンパク質は、赤血球凝集素活性を示し得る。ＮＡタンパク質は、ノイラミニダーゼ活性を示し得る。
【００５４】
一部の態様では、四価インフルエンザ組成物を混合組成物に使用することができる。四価インフルエンザ組成物は、４つのインフルエンザＶＬＰ型を含み、各型は、異なるインフルエンザ株に由来するＨＡタンパク質及びＮＡタンパク質を含む。一部の態様では、ＶＬＰはそれぞれ、A/Indonesia/5/05インフルエンザ株に由来するＭ１タンパク質を含む。一部の態様では、ＨＡ及びＮＡタンパク質は、インフルエンザの感染を防止するのに有用なＦＤＡによって識別される季節性インフルエンザ株に由来する。他の態様では、３つの季節性インフルエンザ株のみに適したＶＬＰを含む三価組成物を使用することができる。
【００５５】
用量
開示される組成物は、有効用量となるように投与することができる。例えば、送達される各インフルエンザ成分の上限値は、約：１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１５μｇ、又は２０μｇとすることができる。送達される各インフルエンザ成分の下限値は、約：０．５μｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、又は１５μｇとすることができる。一部の態様では、インフルエンザ成分の用量は約１μｇ〜約３μｇの範囲である。他の態様では、インフルエンザ成分の用量は約３μｇ〜約９μｇの範囲である。送達されるＲＳＶ成分の上限値は、約：１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１５μｇ、又は２０μｇとすることができる。送達されるＲＳＶ  Ｆ成分の下限値は、約：１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１５μｇ、又は２０μｇとすることができる。一部の態様では、ＲＳＶ成分の用量は、約１〜約３μｇの範囲である。他の態様では、ＲＳＶ成分の用量は約３μｇ〜約９μｇの範囲である。
【００５６】
他の態様では、各インフルエンザ成分は高量で存在し得る。例えば、上限値は約：５０μｇ、５１μｇ、５２μｇ、５３μｇ、５４μｇ、５５μｇ、５６μｇ、５７μｇ、５８μｇ、５９μｇ、６０μｇ、６１μｇ、６２μｇ、６３μｇ、６４μｇ、６５μｇ、６６μｇ、６７μｇ、６８μｇ、６９μｇ、７０μｇ、７１μｇ、７２μｇ、７３μｇ、７４μｇ、７５μｇ、７６μｇ、７７μｇ、７８μｇ、７９μｇ、８０μｇ、８１μｇ、８２μｇ、８３μｇ、８４μｇ、８５μｇ、８６μｇ、８７μｇ、８８μｇ、８９μｇ、９０μｇ、９１μｇ、９２μｇ、９３μｇ、９４μｇ、９５μｇ、９６μｇ、９７μｇ、９８μｇ、９９μｇ、１００μｇ、１０１μｇ、１０２μｇ、１０３μｇ、１０４μｇ、１０５μｇ、１０６μｇ、１０７μｇ、１０８μｇ、１０９μｇ、１１０μｇ、１１１μｇ、１１２μｇ、１１３μｇ、１１４μｇ、１１５μｇ、１１６μｇ、１１７μｇ、１１８μｇ、１１９μｇ、１２０μｇ、１２１μｇ、１２２μｇ、１２３μｇ、１２４μｇ、１２５μｇ、１２６μｇ、１２７μｇ、１２８μｇ、１２９μｇ、１３０μｇ、１３１μｇ、１３２μｇ、１３３μｇ、１３４μｇ、１３５μｇ、１３６μｇ、１３７μｇ、１３８μｇ、１３９μｇ、１４０μｇ、１４１μｇ、１４２μｇ、１４３μｇ、１４４μｇ、１４５μｇ、１４６μｇ、１４７μｇ、１４８μｇ、１４９μｇ、又は１５０μｇとすることができる。各インフルエンザ成分の下限値は約：２０μｇ、２１μｇ、２２μｇ、２３μｇ、２４μｇ、２５μｇ、２６μｇ、２７μｇ、２８μｇ、２６μｇ、３０μｇ、３１μｇ、３２μｇ、３３μｇ、３４μｇ、３５μｇ、３６μｇ、３７μｇ、３８μｇ、３９μｇ、４０μｇ、４１μｇ、４２、４３μｇ、４４μｇ、４５μｇ、４６μｇ、４７μｇ、４８μｇ、４９μｇ、５０μｇ、５１μｇ、５２μｇ、５３μｇ、５４μｇ、５５μｇ、５６μｇ、５７μｇ、５８μｇ、５９μｇ、又は６０μｇとすることができる。
【００５７】
他の実施形態では、例えば、ヒトへの投与では、送達されるＲＳＶ成分の上限値は約５０μｇ、５１μｇ、５２μｇ、５３μｇ、５４μｇ、５５μｇ、５６μｇ、５７μｇ、５８μｇ、５９μｇ、６０μｇ、６１μｇ、６２μｇ、６３μｇ、６４μｇ、６５μｇ、６６μｇ、６７μｇ、６８μｇ、６９μｇ、７０μｇ、７１μｇ、７２μｇ、７３μｇ、７４μｇ、７５μｇ、７６μｇ、７７μｇ、７８μｇ、７９μｇ、８０μｇ、８１μｇ、８２μｇ、８３μｇ、８４μｇ、８５μｇ、８６μｇ、８７μｇ、８８μｇ、８９μｇ、９０μｇ、９１μｇ、９２μｇ、９３μｇ、９４μｇ、９５μｇ、９６μｇ、９７μｇ、９８μｇ、９９μｇ、１００μｇ、１０１μｇ、１０２μｇ、１０３μｇ、１０４μｇ、１０５μｇ、１０６μｇ、１０７μｇ、１０８μｇ、１０９μｇ、１１０μｇ、１１１μｇ、１１２μｇ、１１３μｇ、１１４μｇ、１１５μｇ、１１６μｇ、１１７μｇ、１１８μｇ、１１９μｇ、１２０μｇ、１２１μｇ、１２２μｇ、１２３μｇ、１２４μｇ、１２５μｇ、１２６μｇ、１２７μｇ、１２８μｇ、１２９μｇ、１３０μｇ、１３１μｇ、１３２μｇ、１３３μｇ、１３４μｇ、１３５μｇ、１３６μｇ、１３７μｇ、１３８μｇ、１３９μｇ、１４０μｇ、１４１μｇ、１４２μｇ、１４３μｇ、１４４μｇ、１４５μｇ、１４６μｇ、１４７μｇ、１４８μｇ、１４９μｇ、又は１５０μｇとすることができる。一部の実施形態では、例えば、ヒトへの投与では、送達されるＲＳＶ  Ｆ成分の下限値は約：２０μｇ、２１μｇ、２２μｇ、２３μｇ、２４μｇ、２５μｇ、２６μｇ、２７μｇ、２８μｇ、２６μｇ、３０μｇ、３１μｇ、３２μｇ、３３μｇ、３４μｇ、３５μｇ、３６μｇ、３７μｇ、３８μｇ、３９μｇ、４０μｇ、４１μｇ、４２、４３μｇ、４４μｇ、４５μｇ、４６μｇ、４７μｇ、４８μｇ、４９μｇ、５０μｇ、５１μｇ、５２μｇ、５３μｇ、５４μｇ、５５μｇ、５６μｇ、５７μｇ、５８μｇ、５９μｇ、又は６０μｇとすることができる。一部の態様では、ＲＳＶ成分の用量は約４０μｇ〜約１２０μｇの範囲である。他の態様では、ＲＳＶ成分の用量は約６０μｇ〜約９０μｇの範囲である。
【００５８】
アジュバント
また当分野で周知であるように、特定の組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られる、免疫応答の非特異的刺激因子の使用によって増強することができる。アジュバントは実験的に使用して、未知の抗原に対する全身の免疫の増加を促進することができる（例えば、米国特許第４，８７７，６１１号）。免疫プロトコルは、応答を刺激するためにアジュバントを何年も使用しており、従って、アジュバントは当業者に周知である。一部のアジュバントは、抗原が提示される方法に影響を与える。例えば、免疫応答は、タンパク質抗原がミョウバンによって沈殿されるときに増加する。また、抗原の乳化が抗原提示の期間を長くする。あらゆる目的のために参照によりその全開示内容が本明細書で援用されるVogel et al.,“A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (第2版)“に記載されている任意のアジュバントを含むことは、本開示の範囲内で想定される。
【００５９】
本明細書に開示される組成物は、薬学的に許容され得るアジュバントと組み合わせることができる。薬学的に許容され得るアジュバントとしては、限定されるものではないが、特に、アルミニウムベースのアジュバント、無機塩アジュバント、張力活性アジュバント（tensoactive advjuvant）、細菌由来アジュバント、エマルションアジュバント、リポソームアジュバント、サイトカインアジュバント、糖アジュバント、並びにＤＮＡ及びＲＮＡオリゴアジュバントが挙げられる（Petrovsky and Aguilar 2004, immunology and Cell biology 82,488-496を参照されたい）。
【００６０】
例示的なアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（死結核菌（Mycobacterium tuberculosis）を含む免疫応答の非特異的な刺激因子）及び不完全フロイントアジュバントが挙げられる。他のアジュバントとしては、ＧＭＣＳＰ、ＢＣＧ、ＭＤＰ化合物、例えば、ｔｈｕｒ−ＭＤＰ及びｎｏｒ−ＭＤＰ、ＣＧＰ（ＭＴＰ−ＰＥ）、リピドＡ、及びモノホスフォリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ＭＦ−５９、細菌から抽出された３つの成分を含むＲＩＢＩ、ＭＰＬ、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）、２％スクアレン／Tween（登録商標）８０エマルション中の細胞壁骨格（ＣＷＳ）、ＡＳ０１、ＡＳ０３（スクアレン／トコフェロールエマルション）、ＡＳ０４、ＡＦ３（スクアレン水中油滴型エマルション）、グルコピラノシルリピドアジュバント−安定エマルション（ＧＬＡ−ＳＥ）、CoVaccine、Flagellin、及びＩＣ３１（ｄＩ：ｄＣ−ＴＬＲ９  ａｇｏ）が挙げられる。
【００６１】
一部の実施形態では、アルミニウムベースのアジュバント（Alum）は、リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウムとすることができる。特定の態様では、２％アルハイドロゲル（Ａｌ（ＯＨ）３が使用される。一部の実施形態では、投与されるミョウバンアジュバントの上限値は、２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１０００μｇ、１１００μｇ、１２００μｇ、１３００μｇ、１４００μｇ、１５００μｇ、１６００μｇ、１７００μｇ、１８００μｇ、１９００μｇ、２０００μｇである。一部の実施形態では、投与されるミョウバンアジュバントの下限値は、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、１００μｇ、２００μｇである。一部の実施形態では、投与されるミョウバンアジュバントの量は、約２００μｇ〜約８００μｇの範囲である。
【００６２】
好ましいアジュバントには、サポニンベースのアジュバント、特に、ＩＳＣＯＭ形式又はマトリクス形式の特定のサポニン画分の組み合わせが含まれる。ＩＳＣＯＭ形式では、抗原は、アジュバントケージ様構造に含められる。マトリクス形式では、まずアジュバントを用意し、次いで本明細書に記載される抗原組成物に結合して所望の製剤にする。特に適したマトリクスアジュバントには、Matrix-M（商標）（AbISCO（登録商標）-100, Isconova AB, Uppsala, Sweden）、約８５：１５の比のMatrix-A（商標）とMatrix-C（商標）の混合物が含まれる。簡単に述べると、Matrix-A（商標）及びMatrix-C（商標）は、キラヤ（Quillaja saponaria）の別個に精製された画分から調製し、続いてコレステロール及びリン脂質で製剤してマトリクス粒子にし、次いで抗原と混合する。Reimer et al, “Matrix-M（商標） Adjuvant Induces Local Recruitment, Activation and Maturation of Central Immune Cells in Absence of Antigen,”PLoS ONE 7(7): e41451. doi: 10.1371/journal.pone.0041451を参照されたい；また米国特許出願公開第２００６／０１２１０６５号も参照されたい。これらの画分の他の比も使用することができる；例えば、マトリクスアジュバント組成物におけるMatrix-AとMatrix-Cの比は、約８６：１４、８７：１３、８８：１２、８９：１１、９０：１０、９１：９、９２：８、９３：７、９４：６、９５：５、又は９６：４とすることができる。典型的には、この範囲は、約８５〜９５のMatrix Aと約１５〜５のMatrix Cである。一部の態様では、サポニン画分ＱＳ−７及びＱＳ−２１は、Matrix A画分及びMatrix C画分の代わりに使用することができる。例示的なＱＳ−７及びＱＳ−２１画分及びそれらの使用は、米国特許第５，０５７，５４０号、同第６，２３１，８５９号、同第６，３５２，６９７号、同第６，５２４，５８４号、同第６，８４６，４８９号、同第７，７７６，３４３号、及び同第８，１７３，１４１号に記載されている。
【００６３】
本開示の一実施形態では、アジュバントは、脂質二重層のない大きい非晶質中心キャビティを取り囲む水層によって離間された実質的に球形のシェルの形態に配置された約２〜１０の二重層を有する少重膜（paucilamellar）脂質小胞である。少重膜脂質小胞は、いくつかの方法、即ち、非特異的免疫刺激因子として、抗原の担体として、追加のアジュバントの担体として、及びこれらの組み合わせで免疫応答を刺激するように機能し得る。少重膜脂質小胞は、例えば、ワクチンが、抗原が小胞に対して細胞外部に維持されるように抗原が予め形成された小胞との混合によって調製されると、非特異的刺激因子として機能する。小胞の中心キャビティ内に抗原を封入することにより、小胞が、免疫刺激因子及び抗原の担体の両方として機能する。別の実施形態では、小胞は、主に非リン脂質小胞から形成される。他の実施形態では、小胞はNovasome（登録商標）である。Novasome（登録商標）は、約１００ｎｍ〜約５００ｎｍの範囲の少重膜非リン脂質小胞である。Novasome（登録商標）は、Brij 72、コレステロール、オレイン酸、及びスクアレンを含む。Novasomeは、インフルエンザ抗原の有効なアジュバントであることが示されている（あらゆる目的のために参照によりそれらの全開示内容が本明細書で援用される米国特許第５，６２９，０２１号、同第６，３８７，３７３号、及び同第４，９１１，９２８号を参照されたい）。
【００６４】
免疫刺激因子
本開示の組成物は、「免疫刺激因子」を用いて製剤化することもできる。これらの免疫刺激因子は、免疫系の応答を増強する体自体の化学メッセンジャー（サイトカイン）である。免疫刺激因子としては、限定されるものではないが、免疫刺激性、免疫増強性、及び炎症誘導活性を有する様々なサイトカイン、リンホカイン、及びケモカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３）；成長因子（例えば、顆粒球−マクロファージ（ＧＭ）−コロニー刺激因子（ＣＳＦ）；及び他の免疫刺激性分子、例えば、マクロファージ炎症因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１；Ｂ７．２などが挙げられる。この免疫刺激性分子は、本開示の組成物と同じ製剤で投与しても良いし、又は別個に投与しても良い。タンパク質又はタンパク質をコードする発現ベクターのいずれかを、免疫刺激効果を発生させるために投与することができる。従って、一実施形態では、本開示は、アジュバント及び／又は免疫刺激因子を含む抗原性製剤及びワクチン製剤を含む。
【００６５】
免疫応答
組成物に加えて、本開示は、ＲＳＶ及び複数のインフルエンザ株に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。本明細書に開示される組成物は、脊椎動物（例えば、ヒト）に投与されると、この脊椎動物に実質的な免疫を誘導することができる。従って、一実施形態では、本開示は、対象におけるＲＳＶウイルス感染及びインフルエンザ感染、又は各疾患の少なくとも１つの症状に対する実質的な免疫を誘導する方法を提供し、この方法は、少なくとも１つの有効用量のＲＳＶ成分及びインフルエンザ成分を投与するステップを含む。別の実施形態では、本開示は、哺乳動物にＲＳＶのワクチン接種をする方法を提供し、この方法は、防御誘導量の修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  ＶＬＰを１つ以上のインフルエンザＶＬＰ及び／又は１つ以上の単離インフルエンザタンパク質と組み合わせて哺乳動物に投与するステップを含む。
【００６６】
一部の態様では、免疫応答は中和抗体を含む。中和抗体の力価は、約：８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、又は２５０の上限値を有し得る。中和抗体の力価は、約：７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、又は２２５の下限値を有し得る。一部の態様では、力価の範囲は、約８０〜約２５０、約１００〜約２００、又は約１５０〜約２２５である。中和抗体の力価は、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定することができる。
【００６７】
複数の抗原が投与されると、１つ以上に対する免疫応答が低下し得る。この現象は、抗原干渉と呼ばれる。好ましくは、本明細書で開示される組成物は、各抗原が別個に投与されるときに得られる免疫応答とそれほど異ならない免疫応答を誘導する。従って、好ましい態様では、本組成物は、抗原干渉を誘導しない。他の態様では、各抗原に対する混合組成物の免疫応答は、各抗原のみを用いて得られる免疫応答の少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％である。
【００６８】
有利には、本明細書に開示される混合組成物は、ＲＳＶ成分のみの投与と比較して、ＲＳＶに対する免疫応答の性質を強化することができる。例えば、免疫応答は、抗ＩｇＧ応答、抗ＲＳＶ応答の中和、及びパリビズマブ−競合抗体応答を含み得る。一部の態様では、抗ＩｇＧ応答は、約１．１倍、１．４倍、約１．６倍、約１．８倍、約２．０倍、約２．２倍、約２．４倍、約２．６倍、約２．８倍、約３．０倍、約３．２倍、約３．４倍、約３．６倍、約３．８倍、約４．０倍、約４．５倍、又は約５倍増強される。特定の態様では、抗ＲＳＶ  ＩｇＧ応答における増加倍数は、約２．０〜約３．０である。他の態様では、抗ＲＳＶ  ＩｇＧ応答における増加倍数は、約１．４〜約２．８である。一部の態様では、増強された応答を投与後２１日間測定する；他の態様では、増強された応答を投与後３５日間測定する。
【００６９】
中和抗ＲＳＶ応答はまた、ＲＳＶ成分のみの投与と比較して増強され得る。一部の態様では、中和抗ＲＳＶ応答は、約１．１倍、１．４倍、約１．６倍、約１．８倍、約２．０倍、約２．２倍、約２．４倍、約２．６倍、約２．８倍、約３．０倍、約３．２倍、約３．４倍、約３．６倍、約３．８倍、約４．０倍、約４．５倍、又は約５倍増強される。特定の態様では、中和抗ＲＳＶ応答における増加倍数は、１．１〜約２．０である。他の態様では、中和抗ＲＳＶ応答における増加倍数は、約２．３〜約２．８である。一部の態様では、増強された応答を投与後２１日間測定する；他の態様では、増強された応答を投与後３５日間測定する。
【００７０】
パリビズマブ−競合抗体応答はまた、ＲＳＶ成分のみの投与と比較して増強され得る。一部の態様では、パリビズマブ−競合抗体応答は、約２．０倍、約２．２倍、約２．４倍、約２．６倍、約２．８倍、約３．０倍、約３．２倍、約３．４倍、約３．６倍、約３．８倍、約４．０倍、約４．５倍、又は約５．０倍増強される。特定の態様では、パリビズマブ−競合抗体応答における増加倍数は、約２．０〜約３．０である。他の態様では、パリビズマブ−競合抗体応答における増加倍数は、約２．３〜約２．８である。一部の態様では、増強された応答を投与後２１日間測定する；他の態様では、増強された応答を投与後３５日間測定する。
【００７１】
タンパク質及び変異体の同定及びクローニング
本開示はまた、ＶＬＰ上又はＶＬＰ内で発現されるタンパク質の変異体も包含する。変異体は、構成タンパク質のアミノ酸配列の改変を含み得る。タンパク質に対する「変異体」という語は、基準配列に対して１つ以上のアミノ酸が改変されたアミノ酸配列を指す。変異体は、置換されるアミノ酸が類似の構造又は化学特性を有する「保存的」変化、例えば、ロイシンのイソロイシンでの置換を有し得る。あるいは、変異体は、「非保存的」変化、例えば、グリシンのトリプトファンでの置換を有し得る。類似の小さな変化は、アミノ酸の欠失もしくは挿入、又はその両方も含み得る。生物学的又は免疫学的活性を失わずにどのアミノ酸残基を置換、挿入、又は欠失させることができるかの決定のガイダンスを、当分野で周知のコンピュータプログラム、例えば、DNASTARソフトウェアを用いて確認することができる。
【００７２】
天然の変異体が、タンパク質の変異によって起こり得る。このような変異は、感染性病原体、例えば、インフルエンザの個々の群内での抗原変異性をもたらし得る。従って、例えば、インフルエンザ株に感染した人は、そのウイルスに対する抗体を産生し、新たなウイルス株が出現すると、古い株に対する抗体は、もはや新たなウイルスを認識できず、再感染が起こり得る。本開示は、ＶＬＰを作製するための、感染性病原体からのタンパク質の抗原変異性及び遺伝変異性の全てを包含する。
【００７３】
本開示に適用可能な分子生物学的技術、例えば、クローニング、変異、及び細胞培養などを記載する一般的なテキストには、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger); Sambrook et al. Molecular Cloning -- A Laboratory Manual (第3版), Vol. 1 -3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000 (“Sambrook”) and Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al.編, Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc. とJohn Wiley & Sons, Inc.,とによるジョイントベンチャー(“Ausubel”)が含まれる。これらのテキストには、変異誘発、ベクターの使用、プロモーター、並びに、例えば、ＲＳＶのＦ及び／又はＧ分子のクローニング及び変異などに関連した多数の他の適切なトピックが記載されている。従って、本開示は、本開示のＶＬＰ上又はＶＬＰ内で発現されるタンパク質の特性を改善又は改変する、タンパク質操作の既知の方法及び組換えＤＮＡ技術の使用も包含する。様々なタイプの変異誘発を使用して、タンパク質分子をコードする変異核酸を作製及び／又は単離し、かつ／又は本開示のＶＬＰ内又はＶＬＰ上のタンパク質をさらに修飾／変異させることができる。これらの変異誘発としては、限定されるものではないが、部位特異的なランダム点変異誘発、相同組換え（ＤＮＡシャフリング）、ウラシル含有鋳型を使用する変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ変異誘発、ギャップドデュプレックスＤＮＡを使用する変異誘発などが挙げられる。さらなる適切な方法として、点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を用いる変異誘発、制限選択及び制限精製、欠失変異誘発、全遺伝子合成による変異誘発、二本鎖切断修復などが挙げられる。例えば、キメラ構築物に関わる変異誘発もまた、本開示に含まれる。一実施形態では、変異誘発は、天然に存在する分子、又は改変されたもしくは変異した天然に存在する分子の既知の情報、例えば、配列、配列比較、物理的特性、又は結晶構造などによって誘導することができる。
【００７４】
本開示は、実質的な生物活性を示す、例えば、本開示のＶＬＰ上又はＶＬＰ内で発現すると有効な抗体応答を誘発することができるタンパク質変異体をさらに含む。このような変異体は、活性に対して殆ど影響を有しないように、当分野で公知の通則に従って選択される欠失、挿入、逆位、反復、及び置換を含む。
【００７５】
タンパク質をクローニングする方法は、当分野で公知である。例えば、特定のＲＳＶタンパク質をコードする遺伝子は、ＲＳＶウイルスに感染させた細胞から抽出されたポリアデニル化ｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって単離することができる。得られる産物遺伝子は、ＤＮＡインサートとしてベクターにクローニングすることができる。「ベクター」という語は、核酸を増殖させ、かつ／又は生物、細胞、もしくは細胞成分間で移動することができる手段を指す。ベクターには、自己複製する又は宿主細胞の染色体に組み込まれ得るプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、及び人工染色体などが含まれる。ベクターはまた、自己複製しない裸ＲＮＡポリヌクレオチド、裸ＤＮＡポリヌクレオチド、同じ株内のＤＮＡとＲＮＡとの両方から構成されるポリヌクレオチド、ポリ−リジン結合ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ペプチド結合ＤＮＡもしくはＲＮＡ、又はリポソーム結合ＤＮＡなどとすることができる。全てではないが、多くの共通する実施形態では、本開示のベクターはプラスミド又はバクミドである。
【００７６】
従って、本開示は、本開示のＶＬＰの形成を誘導する細胞内で発現させることができる発現ベクターにクローニングされた、キメラ分子を含むタンパク質をコードするヌクレオチドを含む。「発現ベクター」は、発現を促進することができ、かつそこに組み込まれた核酸の複製を促進することができるプラスミドなどのベクターである。典型的には、発現される核酸は、プロモーター及び／又はエンハンサーに「作動可能に連結」されており、かつプロモーター及び／又はエンハンサーによる転写調節制御を受ける。一実施形態では、ヌクレオチドは、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質（上記のように）をコードする。別の実施形態では、ベクターは、Ｍ及び／又はＧ  ＲＳＶタンパク質をコードするヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態では、ベクターは、Ｍ及び／又はＮ  ＲＳＶタンパク質をコードするヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態では、ベクターは、Ｍ、Ｇ及び／又はＮ  ＲＳＶタンパク質をコードするヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態では、ベクターは、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質及び／又はＮ  ＲＳＶタンパク質をコードするヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態では、ベクターは、ＢＲＳＶ  Ｍ及び／又はＧタンパク質、又はインフルエンザＨＡ及び／又はＮＡタンパク質をコードするヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態では、ヌクレオチドは、インフルエンザＨＡ及び／又はＮＡタンパク質と共に、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆ及び／又はＲＳＶ  Ｇタンパク質をコードする。別の実施形態では、発現ベクターはバキュロウイルスベクターである。
【００７７】
加えて、ヌクレオチドを配列決定して、正しいコード領域がクローニングされ、かつ不所望の変異を一切含まないことを確認することができる。ヌクレオチドは、任意の細胞で発現させるために発現ベクター（例えばバキュロウイルス）にサブクローニングすることができる。上記は、どのようにしてＲＳＶウイルスタンパク質をクローニングできるかの一例に過ぎない。当業者であれば、さらなる方法が利用可能であり、かつ実施可能であることを理解されよう。
【００７８】
本開示はまた、Ｆ、Ｍ、Ｇ、Ｎ、ＳＨ、もしくはその一部分、及び／又は上記の任意のキメラ分子を含むＲＳＶ構造遺伝子をコードするＲＳＶヌクレオチドを含む構築物及び／又はベクターも提供する。ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルス、又はレトロウイルスベクターとすることができる。Ｆ、Ｍ、Ｇ、Ｎ、ＳＨ、もしくはその一部分、及び／又は上記の任意のキメラ分子を含むＲＳＶ構造遺伝子を含む構築物及び／又はベクターは、適切なプロモーターに作動可能に連結されるべきであり、例えば、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーター（又は他のバキュロウイルス）、ファージλＰＬプロモーター、大腸菌（E. coli）lac、phoA、及びtacプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、並びにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターなどが非限定の例である。宿主細胞及び／又は所望の発現速度に応じて決まる他の適切なプロモーターは、当業者に公知であろう。発現構築物は、転写開始、終結のための部位、及び転写領域中の翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含む。構築物によって発現される転写産物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるべきポリペプチドの始端に翻訳開始コドン、及び終端に適切に配置された終止コドンを含む。
【００７９】
発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択可能なマーカーを含む。このようなマーカーには、真核細胞培養用のジヒドロ葉酸還元酵素、Ｇ４１８、又はネオマイシン耐性、並びに大腸菌（E. coli）及び他の細菌における培養のためのテトラサイクリン、カナマイシン、又はアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。ベクターのなかで好ましいのは、ウイルスベクター、例えば、バキュロウイルス、ポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アビポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、鷄痘ウイルス、アライグマポックスウイルス、豚痘ウイルスなど）、アデノウイルス（例えば、イヌアデノウイルス）、ヘルペスウイルス、及びレトロウイルスなどである。本開示で使用できる他のベクターは、細菌に使用されるベクターを含み、このようなベクターは、pQE70、pQE60、及びpQE-9、pBluescriptベクター、Phagescriptベクター、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5を含む。好ましい真核生物ベクターの中には、pFastBac1  pWINEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、及びpSG、pSVK3、pBPV、pMSG、及びpSVLがある。他の適切なベクターは当業者に容易に明らかであろう。一実施形態では、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆ遺伝子、及びＭ、Ｇ、Ｎ、ＳＨ、もしくはその一部分、及び／又は上記の任意のキメラ分子の遺伝子を含むＲＳＶ遺伝子をコードするヌクレオチドを含むベクターはpFastBacである。
【００８０】
上述の組換え構築物を使用して、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質及び少なくとも１つの免疫原を含む、ＲＳＶタンパク質をトランスフェクトし、感染させ、又は形質転換させて、これを発現させることができる。一実施形態では、組換え構築物は、真核細胞及び／又は原核細胞中に入る、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆ、Ｍ、Ｇ、Ｎ、ＳＨ、もしくはその一部分、及び／又は上記の任意の分子を含む。従って、本開示は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆ；及び少なくとも１つの免疫原、例えば、限定されるものではないが、ＲＳＶ  Ｇ、Ｎ、及びＳＨ、又はその一部分、及び／又は上記に記載の任意の分子を含むＲＳＶ構造遺伝子をコードする核酸を含む１つのベクター（又は複数のベクター）を含む宿主細胞を提供し、このベクターは、ＶＬＰの形成を可能にする条件下で宿主細胞において、ＲＳＶ  Ｆ、Ｇ、Ｎ、Ｍ、もしくはＳＨもしくはその一部分、及び／又は上記の任意の分子を含む遺伝子の発現を可能にする。
【００８１】
真核宿主細胞の中には、酵母、昆虫、鳥類、植物、Ｃ．エレガンス（C. elegans）（又は線虫）、及び哺乳動物宿主細胞がある。昆虫細胞の非限定の例は、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（Ｓｆ）細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）細胞、例えば、High Five細胞、及びショウジョウバエ属（Drosophila）Ｓ２細胞である。真菌（酵母を含む）宿主細胞の例としては、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）（Ｋ．ラクチス（K. lactis））、Ｃ．アルビカンス（C. albicans）及びＣ．グラブラタ（C. glabrata）を含むカンジダ属（Candida）の種、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）（Ｓ．ポンベ（S. pombe））、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、及びヤロウイア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）が挙げられる。哺乳動物細胞の例としては、ＣＯＳ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、マウスＬ細胞、ＬＮＣａＰ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、及びアフリカミドリザル細胞、ＣＶ１細胞、ヒーラー細胞、ＭＤＣＫ細胞、ベロ、及びＨｅｐ−２細胞が挙げられる。アフリカツメガエル卵母細胞、又は両生類起源の他の細胞も使用することができる。原核宿主細胞の例としては、細菌細胞、例えば、大腸菌（E. coli）、Ｂ．スブチリス（B. subtilis）、サルモネラ・チフィ（Salmonella typhi）、及びマイコバクテリアが挙げられる。
【００８２】
ベクター、例えば、本明細書に記載されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、当分野において周知の方法に従って宿主細胞にトランスフェクトされ得る。例えば、真核細胞への核酸の導入は、リン酸カルシウム共沈殿、電気穿孔法、マイクロインジェクション、リポフェクション、及びポリアミントランスフェクション試薬を用いるトランスフェクションによって行うことができる。一実施形態では、ベクターは組換えバキュロウイルスである。別の実施形態では、組換えバキュロウイルスは真核細胞にトランスフェクトされる。好ましい一実施形態では、細胞は昆虫細胞である。別の実施形態では、昆虫細胞はＳｆ９細胞である。
【００８３】
本開示はまた、ＶＬＰ産生の効率を高める構築物及び方法も提供する。例えば、タンパク質にリーダー配列を付加して、細胞内でのタンパク質輸送の効率を改善することができる。例えば、異種シグナル配列、例えば、昆虫細胞遺伝子に由来するシグナル配列を、タンパク質と融合させることができる。一実施形態では、シグナルペプチドはキチナーゼシグナル配列であり、この配列は、バキュロウイルス発現系で効率的に機能する。
【００８４】
ＶＬＰ産生の効率を高める別の方法は、ＲＳＶタンパク質をコードするヌクレオチドをコドン最適化することである。Ｓｆ９細胞における発現についてのコドン最適化核酸の例については、配列番号３、５、７、９、１３、１７、１９、及び２５を参照されたい。
【００８５】
本開示はまた、ＶＬＰを産生する方法も提供する。一部の態様では、この方法は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、及び、限定されるものではないが、ＲＳＶ  Ｍ、Ｇ、Ｎ、ＳＨ、又はその一部分を含む少なくとも１つのさらなるタンパク質、及び／又は上記の任意のキメラ又は異種分子を含むＲＳＶ遺伝子を、ＶＬＰの形成を可能にする条件下で発現させるステップを含む。他の態様では、インフルエンザＶＬＰを産生させる方法が提供される。インフルエンザＶＬＰに関するさらなる開示は、あらゆる目的のために参照により本明細書で援用される米国特許出願公開第２００５／０００９００８号、同第２０１０／０１２９４０１号、及び同第２０１０／０１８４１９２号に記載されている。選択される発現系及び宿主細胞によって、ＶＬＰは、組換えタンパク質が発現してＶＬＰが形成される条件下で発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を成長させることによって産生される。一実施形態では、本開示は、ＶＬＰを産生する方法を含み、この方法は、少なくとも１つの修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードするベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクトするステップ、及びＶＬＰの形成を可能にする条件下で修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を発現させるステップを含む。別の実施形態では、真核細胞は、酵母、昆虫、両生類、鳥類、又は哺乳動物細胞からなる群から選択される。適切な成長条件の選択は、当分野の技術又は当業者の範囲内である。
【００８６】
本開示のＶＬＰを産生するように操作された細胞を成長させる方法には、限定されるものではないが、バッチ、フェドバッチ、連続及び灌流細胞培養技術が含まれる。細胞培養とは、細胞が増殖し、かつ精製及び単離されるタンパク質（例えば、組換えタンパク質）を発現するバイオリアクター（発酵チャンバ）内での細胞の成長及び増殖を意味する。典型的には、細胞培養は、バイオリアクターにおいて、無菌、制御された温度及び気圧条件下で実施される。バイオリアクターは、細胞を培養するために使用されるチャンバであり、環境条件、例えば、温度、気圧、撹拌、及び／又はｐＨを監視することができる。一実施形態では、バイオリアクターはステンレス鋼チャンバである。別の実施形態では、バイオリアクターは、予め滅菌されたプラスチックバッグ（例えば、Cellbag（登録商標）、Wave Biotech、Bridgewater、NJ）である。他の実施形態では、予め滅菌されたプラスチックバッグは、約５０Ｌ〜１０００Ｌのバッグである。
【００８７】
次いで、ＶＬＰは、勾配遠心分離、例えば、塩化セシウム、スクロース、及びイオジキサノール、並びに、例えば、イオン交換及びゲルろ過クロマトグラフィーを含む標準的な精製技術によって、その完全性を維持する方法を用いて単離される。
【００８８】
以下は、どのようにして本開示のＶＬＰを作製し、単離し、そして精製することができるかの一例である。通常、ＶＬＰは、細胞が細胞培養（上記を参照）で成長するとＶＬＰを産生するように操作された組換え細胞系から産生される。当業者であれば、本開示のＶＬＰの作製及び精製に利用することのできるさらなる方法があり、従って本開示が記載される方法に限定されないことを理解されよう。
【００８９】
本開示のＶＬＰの産生は、Ｓｆ９細胞（非感染）を振盪フラスコに播種し、次いで、細胞を増殖させて細胞が成長して増加したら規模を拡大する（例えば１２５ｍｌフラスコから５０Ｌのウェーブバッグにする）ことよって開始することができる。細胞を成長させるために使用される培地は、適切な細胞系に対して調製される（好ましくは無血清培地、例えば、昆虫培地ExCe11-420、JRH）。次に、細胞を、最も効率的な感染多重度（例えば、１細胞当たり約１〜約３プラーク形成単位）で組換えバキュロウイルスに感染させる。感染が起こると、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、Ｍ、Ｇ、Ｎ、ＳＨ、もしくはその一部分、及び／又は上記の任意のキメラもしくは異種分子がウイルスゲノムから発現され、ＶＬＰ内で自己組織化し、そして感染の約２４〜７２時間後に細胞から分泌される。通常は、感染は、細胞が増殖の対数増殖期中期（４〜８×１０６細胞／ｍｌ）にあるとき最も効率的であり、少なくとも約９０％が生存可能である。
【００９０】
本開示のＶＬＰは、細胞培養培地中のＶＬＰのレベルがほぼ最大になるが広範な細胞溶解が起きる前の感染の約４８〜９６時間後に回収することができる。回収時点でのＳｆ９細胞の密度及び生存率は、色素排除アッセイによって示されるように、約０．５×１０６細胞／ｍｌ〜約１．５×１０６細胞／ｍｌ及び少なくとも２０％の生存率であり得る。次に、培地を取り除き、清澄化する。ＶＬＰの凝集を回避するために、約０．４〜約１．０Ｍ、好ましくは約０．５Ｍの濃度までＮａＣｌを培地に添加することができる。本開示のＶＬＰを含む細胞培養培地からの細胞及び細胞デブリの除去は、使い捨ての予め滅菌された中空糸０．５又は１．００μｍフィルタカートリッジ又は同様のデバイスを用いたタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）によって達成することができる。
【００９１】
次に、清澄培養培地中のＶＬＰを、使い捨ての予め滅菌された、５００，０００分子量カットオフ中空糸カートリッジを用いた限外ろ過によって濃縮することができる。濃縮したＶＬＰは、０．５ＭのＮａＣｌを含む１０容量のｐＨ７．０〜８．０のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で透析ろ過して、残留培地成分を除去することができる。
【００９２】
濃縮して透析ろ過したＶＬＰを、０．５ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．２のＰＢＳ緩衝液中、２０％〜６０％不連続スクロース勾配で、約４℃〜約１０℃、６，５００×ｇで１８時間遠心分離することによってさらに精製することができる。通常は、ＶＬＰは、約３０％スクロースと約４０％スクロースの間、又は界面に（２０％及び６０％の段階的勾配において）特徴的な目に見えるバンドを形成し、これを勾配から回収して保存することができる。この生成物を、精製プロセスにおける次のステップの準備として２００ｍＭのＮａＣｌを含むように希釈することができる。この生成物は、ＶＬＰを含み、かつ無傷のバキュロウイルス粒子を含み得る。
【００９３】
ＶＬＰのさらなる精製は、陰イオン交換クロマトグラフィー、又は４４％等密度スクロースクッション遠心分離によって達成することができる。陰イオン交換クロマトグラフィーでは、スクロース勾配（上記を参照）からのサンプルが、陰イオンを含む媒体が入ったカラム（例えば、Matrix Fractogel EMD TMAE）に充填され、ＶＬＰを他の混入物（例えば、バキュロウイルス及びＤＮＡ／ＲＮＡ）と分離することができる塩勾配（約０．２Ｍ〜約１．０ＭのＮａＣｌ）によって溶出される。スクロースクッション法では、ＶＬＰを含むサンプルが、４４％スクロースクッションに添加され、３０，０００ｇで約１８時間遠心分離される。ＶＬＰは、４４％スクロースの最上部にバンドを形成するが、バキュロウイルスは底に沈殿し、かつ他の夾雑タンパク質は最上部の０％スクロース層に留まる。ＶＬＰのピーク又はバンドは回収される。
【００９４】
必要に応じて、無傷のバキュロウイルスを不活化することができる。不活化は、化学的な方法、例えば、ホルマリン又はβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）によって達成することができる。無傷のバキュロウイルスの除去及び／又は不活化もまた、上に例示されたように、当分野で公知の選択的沈殿及びクロマトグラフ法を用いることによって概ね達成することができる。不活化の方法は、ＶＬＰを含むサンプルを０．２％のＢＰＬ中、３時間、約２５℃〜約２７℃でインキュベートするステップを含む。バキュロウイルスはまた、ＶＬＰを含むサンプルを０．０５％ＢＰＬで、４℃で３日間、次いで３７℃で１時間インキュベートすることによって不活化することもできる。
【００９５】
不活化／除去ステップの後に、ＶＬＰを含む生成物を、別の透析ろ過ステップに通して不活化ステップの全ての試薬及び／又はあらゆる残留スクロースを除去して、ＶＬＰを所望の緩衝液（例えば、ＰＢＳ）に入れることができる。ＶＬＰを含む溶液は、当分野で公知の方法によって滅菌（例えば、滅菌ろ過）し、冷蔵庫又は冷凍庫で保存することができる。
【００９６】
上記の技術は、様々な規模で実施することができる。例えば、Ｔ型フラスコ、振盪フラスコ、スピナーボトル、工業規模のバイオリアクターまでの規模である。バイオリアクターは、ステンレス鋼タンク又は予め滅菌されたプラスチックバッグ（例えば、Wave Biotech、Bridgewater、NJが販売するシステム）のいずれかを含み得る。当業者であれば、このような目的に何が最も望ましいかが分かるであろう。
【００９７】
バキュロウイルス発現ベクターの増幅及び産生、並びに組換えＶＬＰを産生するための細胞の組換えバキュロウイルスでの感染は、既に記載されたように昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９昆虫細胞で達成することができる。一実施形態では、細胞は、ＶＬＰを産生するように操作された組換えバキュロウイルスに感染したＳＦ９である。
【００９８】
医薬製剤又はワクチン製剤及び投与
本明細書で有用な医薬組成物は、任意の適切な希釈剤又は賦形剤を含む薬学的に許容され得る担体を含む。本明細書で使用される「薬学的に許容され得る」という語は、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されていること、又は米国薬局方、ヨーロッパ薬局方もしくは哺乳動物及びより詳細にはヒトでの使用が一般に認められている他の薬局方に掲載されていることを意味する。このような組成物は、脊椎動物において防御免疫応答を誘導するためのワクチン及び／又は抗原組成物として有用であり得る。このような組成物は、ＲＳＶ成分及び少なくとも１つのインフルエンザ成分を含む。
【００９９】
本開示は、少なくとも１つのインフルエンザ抗原と組み合わせられた、ＶＬＰを含む薬学的に許容され得るワクチン組成物を包含し、このＶＬＰは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質、及び、限定されるものではないが、ＲＳＶ  Ｍ、Ｇ、Ｎ、ＳＨ、もしくはその一部分を含む少なくとも１つのさらなるタンパク質、及び／又は上記の任意のキメラ又は異種分子を含む。一実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、少なくとも１つのＲＳＶ  Ｆタンパク質及び少なくとも１つのさらなる免疫原を含むＶＬＰを含む。別の実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、少なくとも１つのＲＳＶ  Ｆタンパク質及び少なくとも１つのＲＳＶ  Ｍタンパク質を含むＶＬＰを含む。別の実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、少なくとも１つのＲＳＶ  Ｆタンパク質及び少なくとも１つのＢＲＳＶ  Ｍタンパク質を含むＶＬＰを含む。別の実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、少なくとも１つのＲＳＶ  Ｆタンパク質及び少なくとも１つのインフルエンザＭ１タンパク質を含むＶＬＰを含む。別の実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、少なくとも１つの修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質及び少なくとも１つのトリインフルエンザＶＬＰを含むＶＬＰを含む。
【０１００】
別の実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、限定されるものではないが、ＨＲＳＶ、ＢＲＳＶ、又はトリＲＳＶ  Ｇタンパク質を含むＲＳＶ  Ｇタンパク質をさらに含むＶＬＰを含む。別の実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、限定されるものではないが、ＨＲＳＶ、ＢＲＳＶ、又はトリＲＳＶ  Ｎタンパク質を含むＲＳＶ  Ｎタンパク質をさらに含むＶＬＰを含む。別の実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、限定されるものではないが、ＨＲＳＶ、ＢＲＳＶ、又はトリＲＳＶ  ＳＨタンパク質を含むＲＳＶ  ＳＨタンパク質をさらに含むＶＬＰを含む。
【０１０１】
別の実施形態では、本開示は、キメラＶＬＰ、例えば、ＢＲＳＶ  Ｍ及び修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質及び／又はＲＳＶ由来のＧ、Ｈ、又はＳＨタンパク質、及び任意選択のインフルエンザウイルス由来のＨＡ又はＮＡタンパク質を含むＶＬＰを含む薬学的に許容され得るワクチン組成物を包含し、このＨＡ又はＮＡタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質尾部に融合する。
【０１０２】
本開示はまた、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は上記の修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰを含む薬学的に許容され得るワクチン組成物も包含する。
【０１０３】
一実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質及び少なくとも１つのさらなるタンパク質を含むＶＬＰを含む。別の実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、ＲＳＶ  Ｍタンパク質、限定されるものではないが、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質をさらに含むＶＬＰを含む。別の実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、限定されるものではないが、ＨＲＳＶ  Ｇタンパク質を含むＲＳＶ  Ｇタンパク質をさらに含むＶＬＰを含む。別の実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、限定されるものではないが、ＨＲＳＶ、ＢＲＳＶ、又はトリＲＳＶ  Ｎタンパク質を含むＲＳＶ  Ｎタンパク質をさらに含むＶＬＰを含む。別の実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、限定されるものではないが、ＨＲＳＶ、ＢＲＳＶ、又はトリＲＳＶ  ＳＨタンパク質を含めたＲＳＶ  ＳＨタンパク質をさらに含むＶＬＰを含む。別の実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質及びＨＲＳＶ  Ａ群由来のＦ及び／又はＧタンパク質を含むＶＬＰを含む。別の実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質及びＨＲＳＶ  Ｂ群由来のＦ及び／又はＧタンパク質を含むＶＬＰを含む。別の実施形態では、本開示は、キメラＶＬＰ、例えば、ＢＲＳＶ由来のキメラＭタンパク質及び任意選択のインフルエンザウイルスに由来するＨＡタンパク質を含むＶＬＰを含む薬学的に許容され得るワクチン組成物を包含し、このＭタンパク質は、インフルエンザＨＡタンパク質に融合する。別の実施形態では、本開示は、キメラＶＬＰ、例えば、ＢＲＳＶ  Ｍ、及びＲＳＶ由来のキメラＦ及び／又はＧタンパク質、及び任意選択のインフルエンザウイルスに由来するＨＡタンパク質を含むＶＬＰを含む薬学的に許容され得るワクチン組成物を包含し、このキメラインフルエンザＨＡタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質尾部に融合する。別の実施形態では、本開示は、キメラＶＬＰ、例えば、ＢＲＳＶ  Ｍ、及びＲＳＶ由来のキメラＦ及び／又はＧタンパク質、及び任意選択のインフルエンザウイルスに由来するＨＡ又はＮＡタンパク質を含むＶＬＰを含む薬学的に許容され得るワクチン組成物を包含し、このＨＡ又はＮＡタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質尾部に融合する。
【０１０４】
本開示はまた、少なくとも１つのＲＳＶタンパク質を含むキメラＶＬＰを含む薬学的に許容され得るワクチン組成物も包含する。一実施形態では、薬学的に許容され得るワクチン組成物は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、及び異種感染病原体又は異常細胞由来の少なくとも１つの免疫原を含むＶＬＰを含む。別の実施形態では、異種感染病原体由来の免疫原はウイルスタンパク質である。別の実施形態では、異種感染病原体由来のウイルスタンパク質は、エンベロープ関連タンパク質である。別の実施形態では、異種感染病原体由来のウイルスタンパク質は、ＶＬＰの表面上に発現する。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質は、脊椎動物において防御免疫応答を生じさせるエピトープを含む。
【０１０５】
本開示はまた、少なくとも１つのＲＳＶタンパク質を含むＶＬＰを含む、脊椎動物、例えば、ヒト対象を免疫するためのキットでも包含する。一実施形態では、このキットは、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰを含む。一実施形態では、このキットは、ＲＳＶ  Ｍタンパク質、例えば、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質をさらに含む。別の実施形態では、このキットは、ＲＳＶ  Ｇタンパク質をさらに含む。別の実施形態では、本開示は、ＢＲＳＶ由来のキメラＭタンパク質及び任意選択のインフルエンザウイルスに由来するＨＡタンパク質を含むＶＬＰを含むキットを包含し、このＭタンパク質はＢＲＳＶ  Ｍに融合する。別の実施形態では、本開示は、ＢＲＳＶ由来のキメラＭタンパク質、ＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質、及び異種感染病原体由来の免疫原を含むＶＬＰを含むキットを包含する。別の実施形態では、本開示は、ＢＲＳＶ由来のＭタンパク質、キメラＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質、及び任意選択のインフルエンザウイルスに由来するＨＡタンパク質を含むＶＬＰを含むキットを包含し、このＨＡタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆ又はＧタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質尾部に融合する。別の実施形態では、本開示は、ＢＲＳＶ由来のＭタンパク質、キメラＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質、及び任意選択のインフルエンザウイルスに由来するＨＡ又はＮＡタンパク質を含むＶＬＰを含むキットを包含し、このＨＡタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質尾部に融合する。
【０１０６】
一実施形態では、本開示は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を少なくとも１つの有効用量を含む免疫原性製剤を含む。別の実施形態では、本開示は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセルを少なくとも１つの有効用量を含む免疫原性製剤を含む。なお別の実施形態では、本開示は、上記の修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰを少なくとも１つの有効用量を含む免疫原性製剤を含む。
【０１０７】
本明細書に開示される組成物は、薬学的に許容され得る担体又は賦形剤と組み合わせることができる。薬学的に許容され得る担体には、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、無菌等張水性緩衝液、及びこれらの組み合わせが含まれる。薬学的に許容され得る担体、希釈剤、及び他の賦形剤についての十分な考察が、Remington’s Pharmaceutical Sciences（Mack Pub. Co. N.J. 最新版）に示されている。製剤は、投与方式に適合させるべきである。好ましい一実施形態では、製剤は、ヒトへの投与に適し、好ましくは無菌、非粒子状、及び／又は非発熱性である。
【０１０８】
組成物はまた、所望に応じて、少量の湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含み得る。組成物は、固形形態、例えば、もどすのに適した凍結乾燥粉末、液体溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤、又は粉末とすることができる。経口製剤は、標準的な担体、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含み得る。
【０１０９】
本開示はまた、ワクチン製剤の１つ以上の成分で充填された１つ以上の容器を含む医薬パック又はキットも提供する。好ましい一実施形態では、キットは、２つの容器を含み、一方の容器は、ＲＳＶ成分として、ナノ粒子形態の修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰを含み、他方の容器は、インフルエンザ成分、例えば、インフルエンザＶＬＰを含む。各成分は、アジュバントを用いて製剤化しても良いし、又は異なる緩衝剤を用いて製剤化しても良い。このような容器（複数可）には、医薬品又は生物学的製品の製造、使用、又は販売を規制する政府機関によって指示される形式の注意書きを添えることができ、この注意書きは、ヒトへの投与に関する製造、使用、又は販売の機関による認可を反映している。
【０１１０】
一部の態様では、本組成物は、別個の容器、例えば、バイアルで提供され、そして投与の直前に１つの容器で混合される。他の態様では、本組成物は、別個に調製され、混合され、そして使用するまで同じ容器に保存される。
【０１１１】
本開示はまた、組成物の分量を表示する密閉容器、例えば、アンプル又はサシェ（sachette）にパッケージされた製剤も提供する。一実施形態では、本組成物は、液体として、別の実施形態では、密閉容器に入れられた乾燥滅菌凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として供給され、例えば、水又は生理食塩水でもどして対象への投与に適切な濃度にすることができる。
【０１１２】
代替の一実施形態では、本組成物は、その量及び濃度を表示する密閉容器に入れられた液体形態で供給される。好ましくは、本組成物の液体形態は、少なくとも約５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも約１００μｇ／ｍｌ、少なくとも約２００μｇ／ｍｌ、少なくとも５００μｇ／ｍｌ、又は少なくとも１ｍｇ／ｍｌが密閉容器に入れられて供給される。
【０１１３】
一例として、本開示の修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むキメラＲＳＶ  ＶＬＰは、それぞれ１つ以上のＲＳＶ株に対する応答である免疫応答を刺激するのに十分な有効量又は有効数量（上で定義された）で投与される。本開示の修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又はＶＬＰの投与が、ＲＳＶに対する免疫を誘発する。典型的には、用量は、例えば、年齢、健康状態、体重、性別、食習慣、投与時間、及び他の臨床因子に基づいてこの範囲内で調整することができる。予防ワクチン製剤は、例えば、針及びシリンジを用いた皮下又は筋肉内注射、又は無針注射デバイスによって全身投与される。あるいは、ワクチン製剤は、液滴、大粒子エアロゾル（約１０ミクロンより大きい）、又は上気道への噴霧のいずれかによって鼻腔内投与される。上記の送達経路はいずれも免疫応答を生じさせるが、鼻腔内投与は、ＲＳＶ及びインフルエンザを含む多くのウイルスの侵入部位における粘膜免疫を誘発するというさらなる利点をもたらす。
【０１１４】
従って、本開示はまた、哺乳動物に対して、感染又はその少なくとも１つの疾患症状に対する免疫を誘導するワクチン又は抗原組成物を製剤化する方法も含み、この方法は、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰを有効用量、製剤に添加するステップを含む。一実施形態では、この感染はＲＳＶ感染である。
【０１１５】
単回用量での免疫の刺激は可能であるが、同じ又は異なる経路によってさらなる用量を投与して所望の効果を達成することができる。例えば、新生児及び乳児では、十分なレベルの免疫を誘発するためには複数回投与が必要であろう。投与を、必要に応じて小児期全体を通じて一定の間隔で継続して、感染、例えば、ＲＳＶ感染に対する十分なレベルの防御を維持することができる。同様に、特に繰り返しやすい又は重篤感染しやすい成人、例えば、医療従事者、介護従事者、幼児の家族、高齢者、及び心肺機能が低下した人などは、防御免疫応答を確立し、かつ／又は維持するために複数回の免疫を必要とし得る。誘導される免疫のレベルは、例えば、分泌液中及び血清中の中和抗体の量を測定することによって監視し、かつ所望の防御レベルを誘発して維持するために必要に応じて用量を調整する又はワクチン接種を繰り返すことができる。
【０１１６】
本組成物の投与
本明細書に開示される混合組成物を投与する方法には、限定されるものではないが、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、静脈内、及び皮下）、硬膜外、及び粘膜（例えば、鼻腔内及び経口もしくは経肺経路又は坐薬によって）が含まれる。投与は、好ましくは筋肉内投与である。本組成物は、任意の従来の経路によって、例えば、注入又はボーラス注射によって、上皮又は皮膚粘膜内層（例えば、口腔粘膜、結腸、結膜、鼻咽腔、中咽頭、腟、尿道、膀胱、及び腸粘膜など）を介した吸収によって投与することができ、かつ他の生物学的に活性な物質と共に投与することができる。一部の実施形態では、本開示の組成物の鼻腔内又は他の粘膜投与経路は、他の投与経路より実質的に高い抗体又は他の免疫応答を誘導し得る。投与は、全身投与でも良いし、又は局所的でも良い。
【０１１７】
一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆとインフルエンザ成分が混合された組成物を、同じ針で同時に投与（即ち、共投与）することができる。他の実施形態では、インフルエンザとＲＳＶ  Ｆ成分を連続的に投与することができる（即ち、短い期間に亘る各成分の別々の投与による；例えば、これらの成分は、約１分おき、約２分おき、又は約５分おきに投与することができる。一部の実施形態では、投与は、間隔を丸一日開けることができる。一部の実施形態では、ＲＳＶ及びインフルエンザ成分は、同じ領域に投与することができる。一部の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆ及びインフルエンザ成分は、体の異なる部分に連続的に投与することができる；例えば、これらの成分を、両腕、腕と臀部、又は両側の尻に連続的に投与することができる。
【０１１８】
なお別の実施形態では、ワクチン及び／又は免疫原性製剤は、免疫部位に免疫応答を誘発するために粘膜組織を標的とするような方式で投与される。例えば、特定の粘膜を標的とする特性を有するアジュバントを含む組成物を経口投与することによって、粘膜組織、例えば、消化管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）を免疫化の標的とすることができる。さらなる粘膜組織、例えば、鼻咽頭リンパ組織（ＮＡＬＴ）及び気管支関連リンパ組織（ＢＡＬＴ）も標的化することができる。
【０１１９】
本開示のワクチン及び／又は免疫原性製剤はまた、ある投与計画で投与することができ、例えば、ワクチン組成物の初回投与とそれに続く追加免疫投与が行われる。特定の実施形態では、この組成物の第２の用量は、初回投与から２週間から１年間まで、好ましくは約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月から約６ヶ月までの任意の時期に投与される。加えて、第３の用量を、第２の投与から約３ヶ月から約２年間又はそれ以降、好ましくは初回投与から約４ヶ月、約５ヶ月、又は約６ヶ月、又は約７ヶ月から約１年の間に投与することができる。第３の用量は、任意選択で、特定の免疫グロブリンが、第２の投与後に対象の血清及び／又は尿又は粘膜分泌物中で検出されない又は低レベルで検出される場合に投与することができる。好ましい一実施形態では、第２の用量は、第１の投与から約１ヶ月後に投与され、第３の用量は、第１の投与から約６ヶ月後に投与される。別の実施形態では、第２の用量は、第１の投与から約６ヶ月後に投与される。別の実施形態では、本開示の組成物は、併用療法の一部として投与することができる。例えば、本開示の組成物は、他の免疫原性組成物、抗ウイルス薬、及び／又は抗生物質と共に製剤化することができる。
【０１２０】
医薬組成物の投与量は、例えば、ウイルス特異的免疫グロブリンの血清力価を測定して、又は血清サンプル、もしくは尿サンプル、もしくは粘膜分泌物中の抗体の抑制率を測定して、例えば、最初に予防的又は治療的免疫応答を誘発するのに有効な用量を割り出すことによって、当業者が容易に決定することができる。投与量は、動物試験から決定することができる。ワクチンの効力を調べるために使用される動物の非限定のリストには、モルモット、ハムスター、フェレット、チンチラ、マウス、及びコットンラットが含まれる。殆どの動物は、感染病原体の天然の宿主ではないが、疾患の様々な面の研究においてなお役立ち得る。例えば、上記のどの動物にも、ワクチン候補、例えば、本開示の修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又はＶＬＰを投与して、誘導された免疫応答を部分的に特徴付け、かつ／又は何らかの中和抗体が産生されたか否かを決定することができる。例えば、マウスはサイズが小さく、かつその費用の低さにより研究者が大規模で研究を行うことができるため、多くの研究がマウスモデルで行われている。
【０１２１】
加えて、当業者がヒト臨床試験を実施して、ヒトに好ましい有効用量を決定することができる。このような臨床試験は、ルーチンであり、当分野で周知である。利用される正確な用量はまた、投与経路によって決まる。有効用量は、インビトロ又は動物試験系から得られる用量反応曲線から推定することができる。
【０１２２】
一部の態様では、ＲＳＶ及びインフルエンザ成分は、小児、青年、出産年齢の女性、及び高齢者に投与することができる。一部の実施形態では、高齢患者は、５０歳、５５歳、６０歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳、８５歳、９０歳、９５歳、１００歳、又は１０５歳であり得る。一部の実施形態では、高齢患者は、５０歳〜１００歳である。一部の実施形態では、高齢患者は、約６５歳〜約８５歳である。
【０１２３】
免疫応答を刺激する方法
本開示の修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、並びにＲＳＶ及びインフルエンザＶＬＰは、感染病原体に対する免疫又は実質的な免疫を付与する免疫応答を刺激する組成物の調製に有用である。粘膜免疫及び細胞性免疫の両方が、感染病原体及び疾患に対する免疫に寄与し得る。上気道において局所的に分泌される抗体は、自然感染に対する抵抗性の主な因子である。分泌性免疫グロブリンＡ（ｓＩｇＡ）が上気道の防御に関与し、かつ血清ＩｇＧが下気道の防御に関与する。感染によって誘導される免疫応答は、同じウイルス又は抗原的に類似したウイルス株による再感染を防御する。例えば、ＲＳＶは、頻繁かつ予測不可能な変化を受ける；従って、自然感染後、宿主の免疫によって提供される防御の有効期間は、社会全体に蔓延するウイルスの新株に対しては数年間のみ有効であり得る。
【０１２４】
従って、本開示は、対象における感染又はその少なくとも１つの疾患症状に対する免疫を誘導する方法を包含し、この方法は、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの少なくとも１つの有効用量を投与するステップを含む。一実施形態では、この方法は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質及び少なくとも１つのさらなるタンパク質を含むＶＬＰを投与するステップを含む。別の実施形態では、この方法は、ＲＳＶ  Ｍタンパク質、例えば、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質をさらに含むＶＬＰを投与するステップを含む。別の実施形態では、この方法は、ＲＳＶ  Ｎタンパク質をさらに含むＶＬＰを投与するステップを含む。別の実施形態では、この方法は、ＲＳＶ  Ｇタンパク質をさらに含むＶＬＰを投与するステップを含む。別の実施形態では、この方法は、ＲＳＶ  ＳＨタンパク質をさらに含むＶＬＰを投与するステップを含む。別の実施形態では、この方法は、ＨＲＳＶ  Ａ群及び／又はＢ群由来のＦ及び／又はＧタンパク質をさらに含むＶＬＰを投与するステップを含む。別の実施形態では、この方法は、ＢＲＳＶ由来のＭタンパク質及びキメラＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質又はＭＭＴＶエンベロープタンパク質、例えば、インフルエンザウイルスに由来するＨＡ又はＮＡタンパク質を含むＶＬＰを投与するステップを含み、このＨＡ及び／又はＮＡタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質又はＭＭＴＶエンベロープタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質尾部に融合する。別の実施形態では、この方法は、ＢＲＳＶ由来のＭタンパク質及びキメラＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質及び任意選択のインフルエンザウイルスに由来するＨＡ又はＮＡタンパク質を含むＶＬＰを投与するステップを含み、このＨＡ又はＮＡタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質尾部に融合する。別の実施形態では、対象は哺乳動物である。別の実施形態では、哺乳動物はヒトである。別の実施形態では、ＲＳＶ  ＶＬＰは、アジュバント又は免疫刺激因子と共に製剤化される。
【０１２５】
一実施形態では、本開示は、対象におけるＲＳＶ感染又はその少なくとも１つの疾患症状に対する免疫を誘導する方法を含み、この方法は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質の少なくとも１つの有効用量を投与するステップを含む。別の実施形態では、本開示は、対象におけるＲＳＶ感染又はその少なくとも１つの疾患症状に対する免疫を誘導する方法を含み、この方法は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセルの少なくとも１つの有効用量を投与するステップを含む。なお別の実施形態では、本開示は、対象におけるＲＳＶ感染又はその少なくとも１つの疾患症状に対する免疫を誘導する方法を含み、この方法は、ＲＳＶ  ＶＬＰの少なくとも１つの有効用量を投与するステップを含み、このＶＬＰは、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、Ｍ、Ｇ、ＳＨ、及び／又はＮタンパク質を含む。別の実施形態では、対象におけるＲＳＶ感染又はその少なくとも１つの症状に対する免疫を誘導する方法は、ＲＳＶ  ＶＬＰの少なくとも１つの有効用量を投与するステップを含み、このＶＬＰは、ＢＲＳＶ  Ｍ（キメラＭを含む）並びにＲＳＶ  Ｆ、Ｇ、及び／又はＮタンパク質から本質的になる。ＶＬＰは、さらなるＲＳＶタンパク質及び／又は無視できる濃度のタンパク質夾雑物を含み得る。別の実施形態では、対象におけるＲＳＶ感染又はその少なくとも１つの症状に対する免疫を誘導する方法は、ＲＳＶ  ＶＬＰの少なくとも１つの有効用量を投与するステップを含み、このＶＬＰは、ＢＲＳＶ  Ｍ（キメラＭを含む）、ＲＳＶ  Ｇ、及び／又はＦからなる。別の実施形態では、対象におけるＲＳＶ感染又はその少なくとも１つの疾患症状に対する免疫を誘導する方法は、ＲＳＶタンパク質を含むＲＳＶ  ＶＬＰの少なくとも１つの有効用量を投与するステップを含み、このＲＳＶタンパク質は、ＢＲＳＶ  Ｍ（キメラＭを含む）、キメラＦ、キメラＧ、及び／又はキメラＮタンパク質を含むＦ、Ｇ、及び／又はＮタンパク質からなる。これらのＶＬＰは、ＢＲＳＶ  Ｍ（キメラＭを含む）、ＲＳＶ  Ｆ、Ｇ、及び／又はＮタンパク質を含み、かつさらなる細胞構成要素、例えば、細胞タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物などを含み得るが、（ＢＲＳＶ  Ｍ（キメラＭを含む）、ＢＲＳＶ／ＲＳＶ  Ｆ、Ｇ、及び／又はＮタンパク質の断片以外の）さらなるＲＳＶタンパク質は含まない。別の実施形態では、対象は脊椎動物である。一実施形態では、脊椎動物は哺乳動物である。別の実施形態では、哺乳動物はヒトである。別の実施形態では、この方法は、製剤を単回投与で投与することによりＲＳＶ感染又はその少なくとも１つの疾患症状に対する免疫を誘導するステップを含む。別の実施形態では、この方法は、製剤を複数回投与で投与することによりＲＳＶ感染又はその少なくとも１つの疾患症状に対する免疫を誘導するステップを含む。
【０１２６】
本開示はまた、感染病原体によって引き起こされる対象の感染又はその少なくとも１つの症状に対する免疫を誘導することを包含し、この誘導は、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの少なくとも１つの有効用量を投与することを含む。一実施形態では、この方法は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質及び異種感染病原体由来の少なくとも１つのタンパク質を含むＶＬＰを投与するステップを含む。一実施形態では、この方法は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質及び同種又は異種の感染病原体由来の少なくとも１つのタンパク質を含むＶＬＰを投与するステップを含む。別の実施形態では、異種感染病原体由来のタンパク質は、ウイルスタンパク質である。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質は、エンベロープ関連タンパク質である。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質は、ＶＬＰの表面に発現する。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質は、脊椎動物において防御免疫応答を生じさせるエピトープを含む。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質は、ＲＳＶ  Ｍタンパク質、例えば、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質、ＲＳＶ  Ｆ、Ｇ、及び／又はＮタンパク質に結合し得る。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質は、ＲＳＶタンパク質、例えば、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質、ＲＳＶ  Ｆ、Ｇ、及び／又はＮタンパク質に融合する。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質の一部分のみが、ＲＳＶタンパク質、例えば、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質、ＲＳＶ  Ｆ、Ｇ、及び／又はＮタンパク質に融合する。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質の一部分のみが、ＲＳＶタンパク質、例えば、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質、ＲＳＶ  Ｆ、Ｇ、及び／又はＮタンパク質の一部に融合する。別の実施形態では、ＲＳＶタンパク質に融合した感染病原体由来のタンパク質の一部分が、ＶＬＰの表面に発現する。他の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質に融合したＲＳＶタンパク質又はその一部分は、ＲＳＶ  Ｍタンパク質に結合する。他の実施形態では、ＲＳＶタンパク質又はその一部分は、ＲＳＶ  Ｆ、Ｇ、Ｎ、及び／又はＰに由来する。別の実施形態では、キメラＶＬＰは、ＲＳＶ由来のＮ及び／又はＰタンパク質をさらに含む。別の実施形態では、キメラＶＬＰは、同種及び／又は異種の感染病原体由来の２つ以上のタンパク質を含む。別の実施形態では、キメラＶＬＰは、２つ以上の感染病原体タンパク質を含み、従って多価ＶＬＰを形成する。
【０１２７】
本開示の組成物は、脊椎動物（例えばヒト）に投与されるとこの脊椎動物に実質的な免疫を誘導することができる。実質的な免疫は、脊椎動物の感染を防御もしくは改善する、又はこの感染の症状を少なくとも軽減する本開示の組成物に対する免疫応答によって生じる。ある場合には、脊椎動物が感染しても、この感染は無症状である。この免疫応答は、完全な防御応答ではない場合もある。この場合、脊椎動物が感染病原体に感染すると、この脊椎動物は、非免疫脊椎動物と比較して症状が軽い、又は症状の持続時間が短い。
【０１２８】
一実施形態では、本開示は、対象におけるＲＳＶウイルス感染又はその少なくとも１つの疾患症状に対する実質的な免疫を誘導する方法を含み、この方法は、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの少なくとも１つの有効用量を投与するステップを含む。別の実施形態では、本開示は、哺乳動物にＲＳＶに対するワクチン接種をする方法を含み、この方法は、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの防御誘導量を哺乳動物に投与するステップを含む。一実施形態では、この方法は、ＲＳＶ  Ｍタンパク質、例えば、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質をさらに含むＶＬＰを投与するステップを含む。別の実施形態では、この方法は、ＲＳＶ  Ｇタンパク質、例えば、ＨＲＳＶ  Ｇタンパク質を含むＶＬＰを投与するステップをさらに含む。別の実施形態では、この方法は、ＨＲＳＶ  Ａ群由来のＮタンパク質を含むＶＬＰを投与するステップをさらに含む。別の実施形態では、この方法は、ＨＲＳＶ  Ｂ群由来のＮタンパク質を含むＶＬＰを投与するステップをさらに含む。別の実施形態では、この方法は、ＢＲＳＶ由来のキメラＭタンパク質及びＲＳＶ由来のＦ及び／又はＧタンパク質を含むＶＬＰを投与するステップを含み、このＦ及び／又はＧタンパク質は、Ｍタンパク質の膜貫通及び細胞質尾部に融合する。別の実施形態では、この方法は、ＢＲＳＶ由来のＭタンパク質及びキメラＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質を含むＶＬＰを投与するステップを含み、このＦ及び／又はＧタンパク質は、インフルエンザＨＡ及び／又はＮＡタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質尾部に融合する。別の実施形態では、この方法は、ＢＲＳＶ由来のＭタンパク質及びキメラＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質及び任意選択のインフルエンザＨＡ及び／又はＮＡタンパク質を含むＶＬＰを投与するステップを含み、このＦ及び／又はＧタンパク質は、ＨＡタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質尾部に融合する。別の実施形態では、この方法は、ＢＲＳＶ由来のＭタンパク質及びキメラＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質、及び任意選択のインフルエンザＨＡ及び／又はＮＡタンパク質を含むＶＬＰを投与するステップを含み、このＨＡ及び／又はＮＡタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質尾部に融合する。
【０１２９】
本開示はまた、感染病原体によって引き起こされる対象における感染、又はその少なくとも１つの疾患症状に対する実質的な免疫を誘導する方法も包含し、この方法は、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの少なくとも１つの有効用量を投与するステップを含む。一実施形態では、この方法は、ＲＳＶ  Ｍタンパク質、例えば、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質、及び別の感染病原体由来の少なくとも１つのタンパク質をさらに含むＶＬＰを投与するステップを含む。一実施形態では、この方法は、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質及び同種又は異種の感染病原体由来の少なくとも１つのタンパク質をさらに含むＶＬＰを投与するステップを含む。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質は、ウイルスタンパク質である。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質は、エンベロープ関連タンパク質である。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質は、ＶＬＰの表面に発現する。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質は、脊椎動物において防御免疫応答を生じさせるエピトープを含む。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質は、ＲＳＶ  Ｍタンパク質に結合することができる。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質は、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質に結合することができる。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質は、ＲＳＶタンパク質に融合する。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質の一部分のみが、ＲＳＶタンパク質に融合する。別の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質の一部分のみが、ＲＳＶタンパク質の一部分に融合する。別の実施形態では、ＲＳＶタンパク質に融合する感染病原体由来のタンパク質の一部分はＶＬＰの表面に発現する。他の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質に融合するＲＳＶタンパク質又はその一部分は、ＲＳＶ  Ｍタンパク質に結合する。他の実施形態では、感染病原体由来のタンパク質に融合するＲＳＶタンパク質又はその一部分は、ＢＲＳＶ  Ｍタンパク質に結合する。他の実施形態では、ＲＳＶタンパク質又はその一部分は、ＲＳＶ  Ｆ、Ｇ、Ｎ、及び／又はＰに由来する。別の実施形態では、ＶＬＰは、ＲＳＶ由来のＮ及び／又はＰタンパク質をさらに含む。別の実施形態では、ＶＬＰは、感染病原体由来の２つ以上のタンパク質を含む。別の実施形態では、ＶＬＰは２つ以上の感染病原体タンパク質を含み、従って多価ＶＬＰを形成する。
【０１３０】
別の実施形態では、本開示は、対象における感染又はその少なくとも１つの症状に対する防御抗体応答を誘導する方法を含み、この方法は、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質、修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセル、又は上記の修飾もしくは変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＶＬＰの少なくとも１つの有効用量を投与するステップを含む。
【０１３１】
本明細書で使用される「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的に又は部分的にコードされる１つ以上のポリペプチドを含むタンパク質のことである。認識される免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、及びμ定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、κ又はλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、又はεとして分類され、これらがそれぞれ、免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥを規定する。典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は四量体を含む。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖対から構成され、各対が１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端が、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。抗体は、無傷の免疫グロブリンとして、又は様々なペプチダーゼによる消化によって生成される多数の十分に特徴付けられた断片として存在する。
【０１３２】
一実施形態では、本開示は、対象におけるＲＳＶ感染及びインフルエンザ感染又はそれぞれの疾患の少なくとも１つの症状に対する防御細胞性応答を誘導する方法を含み、この方法は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質及びインフルエンザ成分の少なくとも１つの有効用量を投与するステップを含む。別の実施形態では、本開示は、対象におけるＲＳＶ感染又はその少なくとも１つの疾患症状に対する防御細胞性応答を誘導する方法を含み、この方法は、修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むＲＳＶ  Ｆミセルを少なくとも１つの有効用量投与するステップを含む。なお別の実施形態では、本開示は、対象におけるＲＳＶ感染又はその少なくとも１つの症状に対する防御細胞性応答を誘導する方法を含み、この方法は、ＶＬＰを少なくとも１つの有効用量の投与するステップを含み、このＶＬＰは、上記の修飾又は変異ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む。細胞性免疫はまた、ＲＳＶ感染からの回復において一定の役割を果たすことができ、かつＲＳＶに関連した合併症を予防することができる。ＲＳＶ特異的細胞リンパ球が、感染した対象の血液及び下気道分泌物中で検出された。ＲＳＶ感染細胞の細胞溶解は、ＲＳＶ特異的抗体及び補体と協働してＣＴＬにより媒介される。一次細胞傷害性応答は、感染した人又はワクチン接種された人において６〜１４日後に血液中で検出可能であり、２１日目には消失する（Ennis et al., 1981）。細胞性免疫はまた、ＲＳＶ感染からの回復において一定の役割を果たすことができ、かつＲＳＶに関連した合併症を予防することができる。ＲＳＶ特異的細胞リンパ球が、感染した対象の血液及び下気道分泌物において検出された。
【０１３３】
上述のように、本開示の免疫原性組成物は、対象におけるＲＳＶ感染の少なくとも１つの症状を予防又は軽減する。ＲＳＶの症状は当分野で公知である。ＲＳＶの症状には、鼻漏、咽頭痛、頭痛、嗄声、咳、喀痰、発熱、ラ音、喘鳴音、及び呼吸困難が含まれる。従って、本開示の方法は、ＲＳＶ感染に関連する少なくとも１つの症状の予防又は軽減を含む。症状の軽減は、例えば、対象による自己評価、臨床医の評価、又は適切なアッセイもしくは測定（例えば、体温）を行うことによって主観的又は客観的に決定することができ、この適切なアッセイもしくは測定には、例えば、生活の質の評価、ＲＳＶ感染もしくはさらなる症状の進行の遅延、ＲＳＶ症状の重症度の軽減、又は適切なアッセイ（例えば、抗体価及び／又はＴ細胞活性化アッセイ）が含まれる。客観的な評価には、動物の評価及びヒトの評価の両方が含まれる。
【０１３４】
本開示は、限定として解釈されるべきではない以下の例によってさらに実証される。本明細書で言及された全ての参考文献、特許、及び公開特許出願の内容並びに添付の図面及び配列表は、あらゆる目的のために参照により本明細書で援用される。
【実施例】
【０１３５】
実施例１：マウスでの実験
６〜８週齢の８０匹のＢａｌｂ／ｃマウスに、表１に示されているプロトコルに従って候補ワクチンを注射した。
【０１３６】
【表１】
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【０１３７】
緩衝液１「Ｆｌｕ緩衝液」は、２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２、５００ｍＭの塩化ナトリウム、０．３ｍＭのＣａＣｌ２、及び０．０１％ｗ／ｖＰＳ８０を含んでいた。緩衝液２「ＲＳＶ緩衝液」は、２５ｍＭのリン酸塩、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１％（Ｗ／Ｖ）ＰＳ８０、（ｗ／ｖ）ヒスチジン、ｐＨ６．２を含んでいた。
【０１３８】
３つのインフルエンザ成分を含む三価組成物を使用して抗インフルエンザ応答を刺激した。三価組成物は、次の株：A-Perth H3N2 S205 (Victoria)、A-Cal H1N1、及びB-Wisconsinの３つのＶＬＰを含んでいた。各ＶＬＰは、言及した株に由来するＨＡ及びＮＡタンパク質の両方を含む。３つ全ての株のＭ１タンパク質は、A/Indonesia/5/05に由来した。そのロットには、ロット番号７５５１１０１３、７５５１１００８Ａ、５５１１００９が付されている。インフルエンザ成分は、０．２５％ＢＰＬ処置し、０．２μｍフィルターでろ過し、一元放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ）で測定した。それぞれのＨＡレベルは：３５４、６２６、２８０μｇ  ＨＡ／ｍｌであった。この成分を、緩衝液：２５ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．２／０．５ＭのＮａＣｌ／０．０１％ＰＳ−８０／３００μＭのＣａＣｌ２に２〜８℃で保存した。ＲＳＶ  Ｆ成分（配列番号８；米国特許出願第１３／２６９，１０７号に記載されているように調製され精製された；ロット番号６８３．１５Ｐ）を緩衝液：２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１％（Ｗ／Ｖ）ＰＳ−８０、１％（Ｗ／Ｖ）ヒスチジンｐＨ６．２で２〜８℃で保存した。
【０１３９】
ＲＳＶ成分及び三価インフルエンザ成分をそれぞれ、緩衝液１「Ｆｌｕ」緩衝液及び緩衝液２、「ＲＳＶ」緩衝液に含めて投与した。緩衝液１は、２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２、５００ｍＭの塩化ナトリウム、０．３ｍＭのＣａＣｌ２、及び０．０１％ｗ／ｖＰＳ８０を含んでいた。緩衝液２「ＲＳＶ緩衝液」は、２５ｍＭのリン酸塩、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１％（Ｗ／Ｖ）ＰＳ８０、（ｗ／ｖ）ヒスチジンｐＨ６．２を含んでいた。０日目及び２１日目にマウスに注射した。０日目、２１日目、及び３５日目にマウスから血液サンプルを採取した。表１の群１及び２では、ＲＳＶ成分及び三価インフルエンザ成分を注射の前に混合した。
【０１４０】
実施例２：ＲＳＶ  Ｆ抗体の特徴付け
実施例１に記載された混合組成物をマウスに投与した。図２は、ＥＬＩＳＡアッセイによる測定で得られた抗ＲＳＶ  Ｆ応答を示している。０日目の力価は＜１００であった（不図示）。予想通り、ｆｌｕ成分のみでは、抗ＲＳＶ  Ｆ応答を誘導しなかった。ＲＳＶ成分のみの投与は、ロバストな抗ＲＳＶ  Ｆ応答を誘導した。ロバストな応答が、３μｇ及び９μｇの用量の緩衝液１及び緩衝液２で、３５日目（Ｄ３５）及び２１日目（Ｄ２１）の両方で得られた。３５日目の力価の方が高かった。注目すべきことに、三価インフルエンザ成分がＲＳＶ成分と併用されると、高い抗ＲＳＶ  Ｆ応答が達成された。
【０１４１】
同様のデータが、中和抗体の産生を決定するために免疫応答を評価したときに得られた。図３は、実施例１に記載された試験で得られた中和抗体を示している。中和抗体は、各サンプルについて３５日目に測定した。０日目の血清サンプルの力価は＜２０であった（不図示）。中和抗ＲＳＶ応答は、９５〜２２６の範囲であった。
【０１４２】
実施例３：ＲＳＶ  Ｆパリビズマブ−競合抗体の特徴付け
パリビズマブ（Synagis（商標））は、ヒトのＲＳＶウイルスに結合して中和するモノクローナル抗体である。パリビズマブは、ＲＳＶ  Ｆのエピトープ（配列番号３５）に結合する。有利には、ＲＳＶ成分は、同じエピトープに対する免疫応答を刺激する。図４は、混合組成物によって誘導された抗体応答がパリビズマブによって認識される同じエピトープに結合することを示すパリビズマブ−競合ＥＬＩＳＡである。０日目の血清力価は＜２０であった（不図示）。２１日目及び３５日目の両方で、エピトープに対するロバストな応答が、３μｇ及び９μｇの用量の緩衝液１及び緩衝液２で得られた。３つのｆｌｕ成分及びＲＳＶ成分が同時投与されたときに同様の応答が得られた。
【０１４３】
実施例４：抗インフルエンザ応答の特徴付け
マウスに、実施例１に記載されたワクチン組成物を投与した。赤血球凝集阻害アッセイを行って、各インフルエンザ成分の赤血球凝集阻害を決定した。図５〜図７が実証するように、実質的な阻害は３つ全ての株で達成された。図５は、A-California株の結果を示している。図６は、A/Victoria株の結果を示している。図７は、B/Wisconsin株の結果を示している。０日目の血清力価は＜２０であった（不図示）。３５日目に、ロバストな赤血球凝集阻害力価が、３μｇ及び９μｇの用量の緩衝液１及び緩衝液２で得られた。三価ｆｌｕ組成物（ＶＬＰ形態の３つのインフルエンザ成分を含む）及びＲＳＶ成分を含む混合組成物が、三価ｆｌｕ組成物のみよりも優れた応答を誘導した。
【０１４４】
実施例５：ヒトでの実験
高齢者集団において、インフルエンザ免疫原性組成物を用いたＲＳＶ  Ｆ連続投与の臨床試験を行った。この試験では、２２０人のヒト対象に無作為に、１２００μｇのＡｌＰＯ４アジュバントを含む又は含まない６０又は９０μｇのＲＳＶ  Ｆタンパク質；又はプラセボを単回投与した。また、全ての対象にインフルエンザワクチン（ＴＩＶ）を投与して、使用中に行われる可能性の高い連続投与を模倣した。投与は、同じ対象の両方の腕へのＲＳＶ  Ｆ及びＴＩＶ用量の別の筋肉注射によって連続投与で行った。プロトコル及び実験の文書は、適切に構成された施設内倫理委員会によって調査され承認された；全ての対象が書面で同意した。実験デザインを、無作為、年齢別、及び観察者盲検とした。アッセイの実施者には患者の処置が分からないようにした。実験的な処置の概要は以下から分かるであろう。
【０１４５】
【表２】
2016509015.tif 000004
【０１４６】
赤血球凝集阻害アッセイを行って、各インフルエンザ成分の赤血球凝集阻害を決定した。インフルエンザ赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）アッセイを、確立された世界保健機関の方法に本質的に従ってNovavax社で実施した。免疫化後ＨＡＩセロコンバージョン及びＧＭＴによって測定されたＴＩＶ応答は、ＲＳＶ  Ｆ連続投与による影響を全く受けなかった。
【０１４７】
実施例６：ヒトでの実験におけるＲＳＶ  Ｆ抗体の特徴付け
ヒト対象に、実施例５に記載されているようにＲＳＶ  Ｆ組成物及びＴＩＶ組成物を連続投与した。図８は、（Falsey AR, et al. Vaccine 2013;31:524）に記載されているプロトコルを用いたＥＬＩＳＡアッセイによる測定で得られた抗ＲＳＶ  Ｆ応答を示している。予想通り、プラセボ処置のみでは、抗ＲＳＶ  Ｆ応答を誘導しなかった。ＲＳＶ  Ｆ成分の投与では、ロバストな抗ＲＳＶ  Ｆ応答が誘導された。血清抗Ｆ  ＩｇＧのレベルは、３．１〜５．６倍に上昇し、９０μｇ＋Ａｌ処置を受けたときに最適な応答であった。ＡＬアジュバント添加群での血清応答率は８９〜９２％であった。
【０１４８】
実施例７：ヒトでの実験におけるＲＳＶ  Ｆパリビズマブ−競合抗体の特徴付け
パリビズマブ（Synagis（商標））は、ヒトのＲＳＶウイルスに結合して中和するモノクローナル抗体である。パリビズマブは、ＲＳＶ  Ｆのエピトープ（配列番号３５）に結合する。有利には、ＲＳＶ成分は、同じエピトープに対する免疫応答を刺激する。図９は、連続投与によって誘導された抗体応答がパリビズマブによって認識される同じエピトープに結合することを示すパリビズマブ−競合ＥＬＩＳＡの結果を含む。２８日目及び５６日目に、エピトープに対するロバストな応答が、ミョウバンを用いる又は用いない６０μｇ及び９０μｇの両方の処置で得られた。パリビズマブと競合する抗体は、実験的なＲＳＶ処置において０日目の検出不能から８５〜１８５ｍｇ／ｍｌに上昇した；応答率は、ミョウバンを用いないと７４〜７８％であり、アジュバントを用いると９７．４％であった。
【０１４９】
実施例８：ヒトでの実験における抗原部位に対する抗体の特徴付け
ヒト対象に、実施例５に記載されているようにＲＳＶ  Ｆ及びＴＩＶ組成物を連続投与した。図１０が実証するように、抗原部位ＩＩに対する実質的な免疫原性応答は、全ての非プラセボ処置で達成された。抗原部位ＩＩペプチドに応答するＩｇＧの力価は、５．３〜１２．５倍に上昇し、９０μｇ＋Ａｌ処置で最も高い力価であった。これらの結果は、組成物が、抗原干渉を受けない免疫応答を誘導することを実証している。
【０１５０】
実施例９：ヒトＲＳＶ  Ｆ及びＴＩＶ実験の重要な安全性の結果
ヒト対象に、実施例５に記載されているようにＲＳＶ  Ｆ及びＴＩＶ組成物を連続投与した。安全性を、反応源性日誌（reactogenicity diaries）、安全性の実験室試験、健康の変化に関する自由回答形式の質問を用いて評価した。処置群の平均年齢は、６７．７〜６９．１歳であった；１５％は≧７５歳であった。対象の大部分は、白人であり、男性が全体の４３％を占めた；対象の９９％で５６日目までデータが得られた。プラセボレシピエントのうちの７０％が、様々な群における活性ワクチンの５８〜７５％と比較して、少なくとも１つの有害事象（ＡＥ）を報告した。一過性の注射部位の痛みは、活性ワクチンで１５〜２０％以上頻繁であるが、その他では、ワクチンの安全性のプロフィールは、プラセボと殆ど変わらなかった；プラセボ群で１件の重大なＡＥが起きた。結果の概要が以下に示される。
【０１５１】
【表３】
2016509015.tif 000005
【０１５２】
これらの結果は、ＲＳＶ  Ｆワクチンが、ＴＩＶ連続投与に適合し、高齢者にとって十分に耐容性であり、潜在的に防御特異性の抗体の増加を誘発することを実証している。免疫原性応答の増加が、全てのリン酸アルミニウムアジュバントの実験的な処置で見られた。
【０１５３】
実施例１０：四価インフルエンザ（Ｑ−Ｆｌｕ）とＲＳＶ  Ｆの混合ワクチンのマウスでの実験
合計９０匹の６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（各群１０匹）をこの実験に使用した。６．０、１．５、又は０．５μｇの用量のＲＳＶ  Ｆ又は四価季節性インフルエンザＶＬＰワクチン又は表１に示されているＲＳＶ  ＦとインフルエンザＶＬＰの混合ワクチンを用いて、０日目及び２１日目に全ての動物に合計２回のＩＭワクチン接種を行った。四価インフルエンザワクチンは、１株当たり１．５、０．３７５、又は０．１２５μｇを含んでいた（各株の２５％）。
【０１５４】
免疫原性評価のために０日目、２１日目、３５日目に血液サンプルを採取した。
【０１５５】
【表４】
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【０１５６】
【表５】
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【０１５７】
群１、２、及び３は、ＲＳＶ  Ｆ緩衝液：２５ｍＭのリン酸塩、ｐＨ６．２、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、１％（ｗ／ｖ）ヒスチジンで処置した。群４、５、及び６は、インフルエンザ緩衝液：２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、０．３ＭのＮａＣｌ、３００μＭのＣａＣｌ２、及び０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０で処置した。群７、８、及び９は、５０％インフルエンザと５０％ＲＳＶの混合緩衝液で処置した。
【０１５８】
免疫学的方法
（ａ）抗ＲＳＶ  Ｆ  ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ
ＲＳＶ  Ｆ特異的抗体の力価を、０日目、２１日目、及び３５日目に採取した血清サンプルでの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって評価した。簡単に述べると、NUNC MaxiSorpマイクロタイタープレートに、２μｇ／ｍｌのＲＳＶ  Ｆタンパク質をコーティングし、２〜８℃で一晩インキュベートした。未処置表面を、スターティングブロック（starting block）（Pierce biological）で、室温で１時間ブロックした。マウス血清の段階希釈（５倍、１：１００〜１：３９０，６２５）を２連で行い、これをＲＳＶ  Ｆタンパク質がコーティングされたプレートに添加し、室温で２時間インキュベートし、tween、PBS-T (Quality Biologicals)を含むリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Southern Biotech）の添加後、マイクロタイタープレートを１時間インキュベートし、tweenを含むリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、タンパク質が結合した抗ＲＳＶ  ＦマウスＩｇＧ抗体を検出するために、ペルオキシダーゼ基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Sigma）をこのプレートに添加した。発色のために約５〜６分間放置した。ＴＭＢ停止緩衝液（Scy Tek Laboratories）の添加後、SpectraMaxとプレートリーダー（Molecular Devices）で、４５０ｎｍでプレートを測定した。データを、SoftMax proソフトウェア（Molecular Devices）を用いて分析した。４ＰＬ曲線をデータにフィッティングさせて、力価を、１．０のＯＤ４５０となった血清希釈度の逆数値として決定した。陽性ＲＳＶ  Ｆマウス血清を対照として使用した。力価＜１００の前採血マウス血清が、陰性対照としての機能を果たした。
【０１５９】
（ｂ）パリビズマブ−競合ＥＬＩＳＡ
ＲＳＶ  Ｆマウス血清及びビオチン標識パリビズマブ（MedImmune LLC）のＲＳＶ  Ｆ抗原に対する競合結合を、９６ウェルマイクロタイタープレートで行った。パリビズマブ（１０ｍｇ／ｍｌ）を、製造者の取扱説明書に従ってビオチン標識キット（Pierce）を用いてビオチン標識した。Nunc MaxiSorbマイクロタイタープレートを２μｇ／ｍｌのＲＳＶ  Ｆ抗原でコーティングし、２〜８℃で一晩インキュベートした。次いで、反応しなかった部位を、室温で１時間、１％乳でブロックした。マウス血清の２倍段階希釈（１：２０〜１：１２８０）を２連で調製して、１２０ｎｇ／ｍｌのビオチン化パリビズマブを用いてスパイクした。プレートを室温で２時間インキュベートし、tweenを含むリン酸緩衝生理食塩水（Quality Biologicals）で洗浄した。ストレプトアビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼ（e-Bioscience）の添加後、マイクロタイタープレートを室温で１時間インキュベートした。tweenを含むリン酸緩衝生理食塩水での３回の洗浄後、抗原が結合したビオチン化パリビズマブを検出するために、ペルオキシダーゼ基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Sigma）をこのプレートに添加した。ＴＭＢ停止緩衝液（Scy Tek Laboratories）の添加後、SpectraMaxとプレートリーダー（Molecular Devices）で、４５０ｎｍでプレートを測定した。緩衝液中にビオチン化パリビズマブを含むウェルは非競合を示し、ビオチン標識パリビズマブを一切含まないＰＢＳのみを含むウェルをこのアッセイで陰性対照として使用した。陽性ＲＳＶ  Ｆマウス血清及び免疫前マウス血清をアッセイの対照として使用した。SoftMax Proソフトウェア（Molecular Devices）を用いてデータを分析した。競合した結合力価を、５０％阻害力価として表した。阻害力価率（％）を、次の式を用いて各血清希釈度について計算した：（ＯＤｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ−ＯＤｓａｐｍｌｅ／ＯＤｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）×１００％。
【０１６０】
４ＰＬ曲線をデータにフィッティングさせて、力価を、ビオチン化パリビズマブ結合の５０％阻害となった血清希釈度の逆数値として決定した。５０％阻害が得られなかった場合は、サンプルについて＜２０の力価が報告され、１０の値を計算群ＧＭＴで使用した。
【０１６１】
（ｃ）マイクロ中和
ＲＳＶ  Ｆ粒子ワクチンがＲＳＶ中和抗体を誘発できるかを決定するために、３５日目の血清サンプルを、RSV-A Long strain中和アッセイで分析した。１：２０で開始したマウス血清の２倍段階希釈物を９６ウェルプレートに添加した。等量（５０μｌ）のウイルス（約２００ＰＦＵ）を希釈した血清に添加し、３６℃で１時間インキュベートした。成長培地（Ｌ−１５、１０％ウシ胎児血清及び２ｍＭのグルタミン）中、新たにトリプシン処理された１００μｌのＨＥｐ−２細胞（５×１０５細胞／ｍｌ）を、ウイルス／血清混合物に添加し、３６℃で６〜７日間、又は陽性対照（ウイルスのみ）ウェルが１００％の細胞変性効果（ＣＰＥ）を示すまでインキュベートした。
【０１６２】
５％グルテルアルデヒド中、０．２５％クリスタルバイオレットで固定及び染色する前及び／又は後で、細胞をＣＰＥ顕微鏡によって計数した。染色したプレートを空気乾燥させて、解剖顕微鏡でＣＰＥについて評価した。ＣＰＥ形成の１００％阻害となる最後の希釈度を、そのサンプルの抗体力価を中和する終点として決定した。２０未満の力価となる全てのサンプルに１０の値を割り当てた。各群の幾何平均を計算した。力価が６４００のヒツジＲＳＶ  Ｆ血清を陽性対照として使用した。
【０１６３】
（ｄ）ＨＡＩ抗体測定
インフルエンザA/California/04/09、A/Victoria/361/11、B/Brisbane/60/08、及びB/Massachusetts/2/12に対するＨＡＩ応答を、３５日目に得た血清サンプルに対して評価した。七面鳥赤血球（Lampire Biological Laboratories）をＰＢＳ中、１％懸濁液に調製した。血清サンプル及び血清対照をＲＤＥで処置して非特異的阻害剤を不活化した。ＲＤＥ処置血清を、９６ウェルＶ底プレートにおいてＰＢＳで段階希釈した（１：１０で開始）。七面鳥赤血球及び標準ＨＡ抗原を希釈した血清に添加し、プレートを室温で４５〜５０分間インキュベートした。プレートを傾けて、赤血球対照のウェルと同じ速度で流れるサンプルのウェル内の赤血球細胞の涙型ストリーミングを検出することによって赤血球凝集阻害を決定した。ＨＡＩ阻害力価を、赤血球凝集阻害が観察された最も高い血清希釈度の逆数として記録した。血清の最終力価を、再現ＨＡＩ力価の幾何平均（ＧＭＴ）として報告した。力価が１０未満となる全てのサンプルに５の値を割り当てた（図１４を参照）。
【０１６４】
（ｅ）統計的方法
幾何平均力価（ＧＭＴ）及び対応する９５％ＣＩを用いて結果を表す。ワクチン群の一対比較を分析して、２テールスチューデントｔ検定（two-tailed student’s t-test）を用いることによって推定した。ｐ値＜０．０５を、ワクチン群の比較で有意と見なした。
【０１６５】
実施例１１：四価インフルエンザ（Ｑ−Ｆｌｕ）とＲＳＶ  Ｆの混合ワクチンについてのマウスでの実験の結果
実施例１０に記載されているようにマウスを免疫化した。ＲＳＶ  Ｆ免疫応答を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、パリビズマブ競合ＥＬＩＳＡ、マイクロ中和（ＭＮ）アッセイを用いた抗Ｆ  ＩｇＧ力価決定によって評価する一方、インフルエンザ免疫応答は、同様に実施例１０に記載されているように赤血球凝集阻害アッセイ（ＨＡＩ）によって測定した。
【０１６６】
（ａ）ＩｇＧ応答
ＲＳＶ  Ｆ単独ワクチン及びＲＳＶ  Ｆ／インフルエンザＶＬＰ混合ワクチンで免疫化したマウスの全ての群は、非常に高い用量依存性の血清ＩｇＧ応答を示した（図２０）。全ての群の第２の免疫化で有意な追加免疫効果が見られた（ｐ＜０．０１）（図２０及び図２１）。混合ワクチンは、ＲＳＶ  Ｆ投与のみと比較して、全ての用量で抗ＲＳＶ  Ｆ  ＩｇＧ力価が上昇し、６μｇ及び１．５μｇの用量で有意な差が出た（ｐ＜０．０５）（図１１Ａ、図１１Ｂ、及び図２１）。３５日目のＲＳＶ  Ｆのみの抗ＲＳＶ  Ｆ  ＧＭＴ範囲は４６，０８７〜１０８，９３２であったが、混合ワクチンのＧＭＴの範囲は１０８，１７８〜２８４，６３９（図２１）であり、２．３〜２．８倍の上昇を示した（図１１Ｂ）。
【０１６７】
（ｂ）パリビズマブ−競合抗体
全てのワクチン群で産生された抗体の機能的能力を、パリビズマブに対して５０％阻害力価を示すように設定された競合ＥＬＩＳＡによって決定した。ＲＳＶＦ  ＩｇＧ応答と同様に、パリビズマブ競合抗体（ＰＣＡ）力価も、ＲＳＶ  Ｆのみが投与された群と比較すると、ＲＳＶ  Ｆ／インフルエンザＶＬＰ混合ワクチンが投与された群で有意に高かった（ｐ＜０．０５）（図１２Ａ、図１２Ｂ、及び図２２）。ＲＳＶ  ＦのみのＰＣＡの範囲は５５〜９５μｇ／ｍｌであったが、混合ワクチンの範囲は、１２５〜２６８μｇ／ｍｌ（図２２）であり、２．２〜２．８倍の上昇を示した（図１２Ｂ）。
【０１６８】
（ｃ）ＲＳＶ  Ｆ中和抗体
ＲＳＶウイルスを中和する抗体の能力を決定するためにマイクロ中和アッセイを行った。全ての群で、中和力価のレベルが用量依存的に上昇した（図１３Ａ及び図１３Ｂ）。混合ワクチンは、混合ワクチンが投与された全ての群の力価を上昇させ、０．５μｇの用量で有意差が生じた（ｐ＜０．０１）（図２３）。
【０１６９】
（ｄ）インフルエンザ特異的応答
インフルエンザ特異的応答を評価するために、ＨＡＩ力価を４つ全ての個々の株、A/California/04/09（Ｈ１Ｎ１）（図１５Ａ、図１５Ｂ、及び図１６を参照）、A/Victoria/361/11（Ｈ３Ｎ２）（図１５Ｃ、図１５Ｄ、及び図１７を参照）、及びB/Brisbane/60/08（図１５Ｅ、図１５Ｆ、及び図１８を参照）、及びB/Massachusetts/2/12（図１５Ｇ、図１５Ｈ、及び図１９を参照）について決定した。最終Ｑ−Ｆｌｕ調製物が各株を１．５μｇ、０．３７５μｇ、又は０．１２５μｇしか含んでいなかったにもかかわらず、ＨＡＩ力価が高かった。ＲＳＶ  Ｆ応答とは対照的に、Ｑ−ＦｌｕワクチンのみでのＨＡＩ応答は、ＲＳＶ  Ｆ／インフルエンザＶＬＰ混合ワクチンのＨＡＩ応答と有意差がなかった（図１５〜図１９）。この結果は、インフルエンザＶＬＰワクチンの免疫原性が、ＲＳＶ  Ｆとの同時投与によって低減されなかったことを示唆した。
【０１７０】
（ｅ）倍数増加比較
以下の表６は、抗ＲＳＶ  Ｆ応答の大きさ及び特徴に対するＲＳＶ成分とＱ−ｆｌｕ成分の両方を混合する増強効果を例示している。実験識別番号２７ではA/Perth株を使用し、実験４６ではA/Victoria/361/11株を使用したことに留意されたい。
【０１７１】
【表６】
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【０１７２】
前述の詳細な説明は、単に理解しやすくするために記載されたものであり、当業者には変更形態が明らかであるため、この説明から不要な限定と解釈されるべきものではない。
【０１７３】
本開示は、その特定の実施形態に関連付けて記載されているが、さらなる変更が可能であり、かつ本出願が、一般に本開示の原理に従い、かつ本開示が属する分野のうちの公知又は慣行の範囲内である本開示からの逸脱を含む、本開示のあらゆる変形形態、使用、又は適応形態を包含することを意図するものであり、かつ上文で説明された、添付の特許請求の範囲のような本質的な特徴に適用できることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１５Ｇ】
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【図１５Ｈ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
2016509015.tif 000037
【図２０】
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【図２１】
2016509015.tif 000039
【図２２】
2016509015.tif 000040
【図２３】
2016509015.tif 000041
【配列表】
2016509015000001.app
【国際調査報告】
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