(57)【要約】本発明は、少なくとも１種類のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）活性化両親媒性脂質および少なくとも１種類のヘモグロビン由来ペプチドおよび場合により医薬的に許容できるキャリヤーを含む医薬組成物に関する。本発明はまた、腫瘍の予防および／または治療、感染症の予防および／または治療、アレルギーの予防および／または治療、年齢関連性免疫不均衡の予防および／または治療、先天および適応免疫系の刺激、および／または照射の有害な副作用の緩和における使用のための、本発明に従う医薬組成物に関する。さらに、本発明は、ヘモグロビン由来ペプチドならびに細菌感染症の治療におけるその使用にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種類のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）活性化両親媒性脂質および少なくとも１種類のヘモグロビン由来ペプチドおよび場合により医薬的に許容できるキャリヤーを含む医薬組成物であって、該ヘモグロビン由来ペプチドが以下：
（ａ）式Ｉの配列からなるアミノ酸配列：
Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７−Ａ１８−Ａ１９（式Ｉ）
式中、
Ａ１はスレオニン、システインおよびセリンからなる群から選択され；
Ａ２はバリン、アラニン、ロイシン、メチオニンおよびイソロイシンからなる群から選択され；
Ａ３はロイシン、アラニン、イソロイシン、メチオニンおよびバリンからなる群から選択され；
Ａ４はアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンおよびバリンからなる群から選択され；
Ａ５はイソロイシン、ヒスチジン、アラニン、ロイシン、メチオニンおよびバリンからなる群から選択され；
Ａ６はヒスチジン、アルギニンおよびロイシンからなる群から選択され；
Ａ７はフェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、イソロイシンおよびバリンからなる群から選択され；
Ａ８はグリシンおよびアラニンからなる群から選択され；
Ａ９はリジン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群から選択され；
Ａ１０はグルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択され；
Ａ１１はフェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、イソロイシンおよびバリンからなる群から選択され；
Ａ１２はスレオニンおよびセリンからなる群から選択され；
Ａ１３はプロリンおよびグリシンからなる群から選択され；
Ａ１４はグルタミン酸、プロリンおよびアスパラギン酸からなる群から選択され；
Ａ１５はバリン、アラニン、ロイシン、メチオニンおよびイソロイシンからなる群から選択され；
Ａ１６はグルタミンおよびアスパラギンからなる群から選択され；
Ａ１７はアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンおよびバリンからなる群から選択され；
Ａ１８はセリン、アラニンおよびスレオニンからなる群から選択され；そして
Ａ１９はトリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシンおよびバリンからなる群から選択される；
ならびに
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列のＮ末端に位置するアミノ酸配列および／または（ａ）のアミノ酸配列のＣ末端に位置するアミノ酸配列、
ここで、
（ｂ−ｉ）（ａ）のアミノ酸配列のＮ末端に位置するアミノ酸配列は以下のものからなる群から選択され：
Ｎ１：Ｖ；
Ｎ２：ＬＶ；
Ｎ３：ＶＬＶ：
Ｎ４：ＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８）：
Ｎ５：ＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９）；
Ｎ６：ＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）：
Ｎ７：ＬＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０）：
Ｎ８：ＫＬＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１）：
Ｎ９：ＦＫＬＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２）：
Ｎ１０：ＮＦＫＬＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３）：
Ｎ１１：ＥＮＦＫＬＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４）：
Ｎ１２：ＰＥＮＦＫＬＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５）：
Ｎ１３：ＤＰＥＮＦＫＬＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６）：
Ｎ１４：ＶＤＰＥＮＦＫＬＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７）：
Ｎ１５：ＨＶＤＰＥＮＦＫＬＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８）：および
Ｎ１６：ＬＨＶＤＰＥＮＦＫＬＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）：
かつ、ここで、
（ｂ−ｉｉ）（ａ）のアミノ酸配列のＣ末端に位置するアミノ酸配列は以下のものからなる群から選択され：
（１）式ＩＩの配列からなるアミノ酸配列：
Ｃ１−Ｃ２−Ｃ３−Ｃ４−Ｃ５（式ＩＩ）
式中、
Ｃ１はグルタミン、アスパラギンおよびチロシンからなる群から選択され；
Ｃ２はリジン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群から選択され；
Ｃ３はメチオニン、バリン、アラニン、ロイシンおよびイソロイシンからなる群から選択され；
Ｃ４はバリン、アラニン、ロイシン、メチオニンおよびイソロイシンからなる群から選択され；
Ｃ５はスレオニン、アラニン、セリンおよびリジンからなる群から選択される；
（２）式ＩＩＩの配列からなるアミノ酸配列：
Ｃ１−Ｃ２−Ｃ３−Ｃ４−Ｃ５−Ｃ６−Ｃ７−Ｃ８−Ｃ９−Ｃ１０−Ｃ１１−Ｃ１２（式ＩＩＩ）
式中、
Ｃ１〜Ｃ５は（ｂ−ｉｉ）（１）におけるように定義され；
Ｃ６はアラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンおよびバリンからなる群から選択され；
Ｃ７はバリン、アラニン、ロイシン、メチオニンおよびイソロイシンからなる群から選択され；
Ｃ８はアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンおよびバリンからなる群から選択され；
Ｃ９はセリン、アスパラギンおよびスレオニンからなる群から選択され；
Ｃ１０はアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンおよびバリンからなる群から選択され；
Ｃ１１はロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、メチオニンおよびバリンからなる群から選択され；そして
Ｃ１２はアミノ酸配列ＳＳＲＹＨからなるペプチドであるか、または存在しない；ならびに
（３）式ＩＶの配列からなるアミノ酸配列：
Ｃ１−Ｃ２−Ｃ３−Ｃ４−Ｃ５−Ｃ６−Ｘ（式ＩＶ）
式中、
Ｃ１〜Ｃ５は（ｂ−ｉｉ）（１）におけるように定義され；
Ｃ６はアラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンおよびバリンからなる群から選択され；
Ｘはあらゆる順序の５アミノ酸残基アラニン、バリン、セリン、アラニンおよびロイシンからなるペプチドである；
またはそれらのペプチド模倣物からなる医薬組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の医薬組成物であって、（ａ）のアミノ酸配列がＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＣＶＬＡＨＨＦＧＫＥＦＴＰＰＶＱＡＡＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）からなる群から選択される医薬組成物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の医薬組成物であって、（ｂ−ｉ）のアミノ酸配列が以下：
（ｉ）Ｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、
（ｉｉ）ＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）および
（ｉｉｉ）ＬＨＶＤＰＥＮＦＫＬＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）からなる群から選択され、および／または
（ｂ−ｉｉ）のアミノ酸配列が以下：
（ｉ）ＱＫＭＶＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、
（ｉｉ）ＱＫＶＶＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、
（ｉｉｉ）ＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、
（ｉｖ）ＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、
（ｖ）ＱＫＭＶＴＧＶＡＳＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、
（ｖｉ）ＱＫＶＶＡＧＶＡＮＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）および
（ｖｉｉ）ＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＬＳＳＲＹＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）からなる群から選択される医薬組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、ヘモグロビン由来ペプチドが以下：
（ｉ）ＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、
（ｉｉ）ＶＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、
（ｉｉｉ）ＶＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＬＳＳＲＹＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、
（ｉｖ）ＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、
（ｖ）ＬＧＮＶＬＶＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷＱＫＭＶＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、
（ｖｉ）ＬＨＶＤＰＥＮＦＫＬＬＧＮＶＬＶＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、
（ｖｉｉ）ＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷＱＫＭＶＴＧＶＡＳＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、および
（ｖｉｉｉ）ＣＶＬＡＨＨＦＧＫＥＦＴＰＰＶＱＡＡＹＱＫＶＶＡＧＶＡＮＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる医薬組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、ＴＬＲ活性化両親媒性脂質が内毒素、またはその内毒素的に活性な部分、および細菌性リポペプチドからなる群から選択される医薬組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の医薬組成物であって、内毒素が細菌性または合成のＳまたはＲ型リポ多糖（ＬＰＳ）である医薬組成物。
【請求項７】
請求項５または６に記載の医薬組成物であって、内毒素の内毒素的に活性な部分がＬＰＳ由来の多糖を含まない天然または合成のリピドＡ構成要素である医薬組成物。
【請求項８】
請求項５または６に記載の医薬組成物であって、内毒素が天然または合成のペンタおよび／またはヘキサアシルリピドＡである医薬組成物。
【請求項９】
請求項５または６に記載の医薬組成物であって、内毒素が天然または合成のペンタおよび／またはヘキサアシルリピドＡモノホスフェートである医薬組成物。
【請求項１０】
請求項５または６に記載の医薬組成物であって、細菌性リポペプチドがＳ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−システイン骨格を有するモノ−、ジ−またはトリアシル化リポペプチドである医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、腫瘍の予防および／または治療、感染症の予防および／または治療、アレルギーの予防および／または治療、年齢関連性免疫不均衡の予防および／または治療、先天および適応免疫系の刺激、および／または照射の有害な副作用の緩和における使用のための医薬組成物。
【請求項１２】
以下：
（ａ）アミノ酸配列ＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）；ならびに
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列のＮ末端に位置するアミノ酸配列および／または（ａ）のアミノ酸配列のＣ末端に位置するアミノ酸配列、
ここで、
（ｂ−ｉ）（ａ）のアミノ酸配列のＮ末端に位置するアミノ酸配列は以下の配列からなる群から選択され：
（ｉ）Ｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、
（ｉｉ）ＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）および
（ｉｉｉ）ＬＨＶＤＰＥＮＦＫＬＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）および／または
そして
（ｂ−ｉｉ）（ａ）のアミノ酸配列のＣ末端に位置するアミノ酸配列は以下の配列からなる群から選択される：
（ｉ）ＱＫＭＶＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、
（ｉｉ）ＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、
（ｉｉｉ）ＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、
（ｉｖ）ＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＬＳＳＲＹＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）；
からなるヘモグロビン由来ペプチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のヘモグロビン由来ペプチドであって、該ヘモグロビン由来ペプチドが以下：
（ｉ）ＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、
（ｉｉ）ＶＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、
（ｉｉｉ）ＶＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＬＳＳＲＹＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、
（ｉｖ）ＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、
（ｖ）ＬＧＮＶＬＶＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷＱＫＭＶＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）および
（ｖｉ）ＬＨＶＤＰＥＮＦＫＬＬＧＮＶＬＶＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）
からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるヘモグロビン由来ペプチド。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載のヘモグロビン由来ペプチドであって、細菌感染症の治療における使用のためのヘモグロビン由来ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１種類のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）活性化両親媒性脂質および少なくとも１種類のヘモグロビン由来ペプチドおよび場合により医薬的に許容できるキャリヤーを含む医薬組成物に関する。本発明はまた、腫瘍の予防および／または治療、感染症の予防および／または治療、アレルギーの予防および／または治療、年齢関連性免疫不均衡の予防および／または治療、先天および適応免疫系の刺激、および／または照射の有害な副作用の緩和における使用のための、本発明に従う医薬組成物に関する。さらに、本発明は、ヘモグロビン由来ペプチドならびに細菌感染症の治療におけるその使用にも関する。
【０００２】
本明細書において、特許出願および製造業者の説明書が含まれるいくつかの文書が引用される。これらの文書の開示を（本発明の特許性に関連するとは考えられないが）参照によりそのまま本明細書に援用する。より詳細には、全ての参照される文書はあたかもそれぞれの個々の文書が参照により具体的かつ個々に援用されることが示された場合と同程度まで参照により援用される。
【背景技術】
【０００３】
過去には、胎児器官、組織、または細胞の移植は疾患、例えば癌または重篤な感染症に対する（そして加齢のプロセスに対しても）予防的または療法的手段として広められてきた。従って、胎児組織の抽出物は有益な医学的作用を有するようであり、時には特に癌および特定の感染症の治療または予防において推奨された。これらの胎児組織抽出物における医学的に有効な原理は、その分野におけるかなりの関心にもかかわらず、しばしば理解しづらかった。そのような組成物の登録に関する問題は自明である。
【０００４】
加えて、一世紀よりも前から、生菌および／または加熱死菌の注射による癌の治療が広められた(Coley, W.B.: Am. J. Med. Sci 105, 487-511 (1893))。約５０年前、そのような治療の腫瘍壊死作用が細菌の内毒素によるものであることが示された。リポ多糖類（ＬＰＳ）とも呼ばれる内毒素は、グラム陰性細菌の細胞壁の構成成分である。内毒素は先天免疫系を活性化し、適応免疫系の活性化に寄与する。重篤なグラム陰性感染症の間、内毒素は敗血症性ショック(Rietschel et al. 1994)の発現において重要な役割を果たしている。しかし、低濃度のＬＰＳは、そしてＬＰＳの部分構造、例えばモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）も、宿主に有益な作用を示す。これらの作用は、その著しい免疫刺激および免疫調節活性による高められた感染に対する耐性および悪性腫瘍に対する保護を含む(Fox et al. 2010)。有害でも有益でもある宿主応答は、ＬＰＳにより直接誘導されるのではなく、むしろ免疫調節因子分子、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキンファミリーのメンバー（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２）、インターフェロン、還元酸素種および脂質により媒介される。これらの媒介物質は主に単球／マクロファージにより放出されるが、他の細胞型、例えば脈管細胞、上皮細胞、多形核細胞、および肥満細胞によっても放出される(Galanos et al. (1992), Loppnow (1994); Supajatura et al. (2001))。以前に、Ｔ細胞もＬＰＳへの応答に参加していることが示されている(Mattern et al. (1994))。
【０００５】
ヒツジまたはヒト由来の胎児性ヘモグロビン（ＨｂＦ）は、インビトロでのマウスマクロファージおよびヒト末梢血単球からのサイトカインの誘導においてＬＰＳおよびリピドＡと相乗作用することが分かっている。加えて、ＨｂＦによる先天および適応免疫応答のＬＰＳに誘導される調節がインビボで観察された(Gorczynski et al. (2006); Howe et al. (2008a);国際公開第２００４／０７３７２８  Ａ２号)。この相乗的活性は、主に胎児性ＨｂＦのγ鎖（Ｈｂγ）に存在することが示されることができた。ＨｂγおよびリピドＡの間の協同作用に関する１つの説明は、結果として高められた生物学的活性をもたらすＨｂに誘導されるリピドＡの立体構造変化である。生物物理学的分析は、ＨｂならびにＨｂ鎖は、Ｈｂが内毒素の凝集体中にインターカレーションし、続いて脱凝集プロセスが起こることにより、リピドＡの内毒素性立体構造のより円錐形の形状への変化をもたらすことを示した(Howe et al. (2008a); Brandenburg et al. (2003); Howe et al. (2007); Howe et al. (2008b))。最近、ＨｂのＨｂαおよびＨｂβサブユニットがＬＰＳ結合部位を有することが示された。これらの結合部位がＨｂαおよびＨｂβサブユニット配列から得られた別個の合成ペプチドにより特性付けられ、それはＬＰＳの内毒素活性を中和することができたが、相乗作用はしなかった(Bahl et al. (2011))。
【０００６】
これらの進展にもかかわらず、完全長胎児性ヘモグロビンまたはその単一の鎖の使用は、前記の完全長タンパク質は組織から精製によるかまたは組み替えもしくは（半）合成的手段によるかのどちらかで提供されなければならず、その全てが費用がかかり、そして時間がかかるという欠点を有する。
【０００７】
従って、疾患、例えば腫瘍もしくは重篤な感染症に対する、または加齢に対する戦いにおいて好都合に用いられることができ、調製が容易であり、かつ上記で論じた不都合と関係していない手段を提供する必要性がまだ存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００４／０７３７２８  Ａ２号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Coley, W.B.: Am. J. Med. Sci 105, 487-511 (1893)
【非特許文献２】Rietschel et al. 1994
【非特許文献３】Fox et al. 2010
【非特許文献４】Galanos et al. (1992)
【非特許文献５】Loppnow (1994)
【非特許文献６】Supajatura et al. (2001)
【非特許文献７】Mattern et al. (1994)
【非特許文献８】Gorczynski et al. (2006)
【非特許文献９】Howe et al. (2008a)
【非特許文献１０】Brandenburg et al. (2003)
【非特許文献１１】Howe et al. (2007)
【非特許文献１２】Howe et al. (2008b)
【非特許文献１３】Bahl et al. (2011)
【発明の概要】
【００１０】
この必要性は、特許請求の範囲において特性付けられる態様の提供により取り組まれる。
従って、本発明は、少なくとも１種類のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）活性化両親媒性脂質および少なくとも１種類のヘモグロビン由来ペプチドおよび場合により医薬的に許容できるキャリヤーを含む医薬組成物に関し、ここでヘモグロビン由来ペプチドは以下のものからなる：
（ａ）式Ｉの配列からなるアミノ酸配列：
Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７−Ａ１８−Ａ１９（式Ｉ）
式中、
Ａ１はスレオニン、システインおよびセリンからなる群から選択され；
Ａ２はバリン、アラニン、ロイシン、メチオニンおよびイソロイシンからなる群から選択され；
Ａ３はロイシン、アラニン、イソロイシン、メチオニンおよびバリンからなる群から選択され；
Ａ４はアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンおよびバリンからなる群から選択され；
Ａ５はイソロイシン、ヒスチジン、アラニン、ロイシン、メチオニンおよびバリンからなる群から選択され；
Ａ６はヒスチジン、アルギニンおよびロイシンからなる群から選択され；
Ａ７はフェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、イソロイシンおよびバリンからなる群から選択され；
Ａ８はグリシンおよびアラニンからなる群から選択され；
Ａ９はリジン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群から選択され；
Ａ１０はグルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択され；
Ａ１１はフェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、イソロイシンおよびバリンからなる群から選択され；
Ａ１２はスレオニンおよびセリンからなる群から選択され；
Ａ１３はプロリンおよびグリシンからなる群から選択され；
Ａ１４はグルタミン酸、プロリンおよびアスパラギン酸からなる群から選択され；
Ａ１５はバリン、アラニン、ロイシン、メチオニンおよびイソロイシンからなる群から選択され；
Ａ１６はグルタミンおよびアスパラギンからなる群から選択され；
Ａ１７はアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンおよびバリンからなる群から選択され；
Ａ１８はセリン、アラニンおよびスレオニンからなる群から選択され；そして
Ａ１９はトリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシンおよびバリンからなる群から選択される；
ならびに
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列のＮ末端に位置するアミノ酸配列および／または（ａ）のアミノ酸配列のＣ末端に位置するアミノ酸配列、
ここで、
（ｂ−ｉ）（ａ）のアミノ酸配列のＮ末端に位置するアミノ酸配列は以下のものからなる群から選択され：
Ｎ１：Ｖ；
Ｎ２：ＬＶ；
Ｎ３：ＶＬＶ：
Ｎ４：ＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８）：
Ｎ５：ＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９）；
Ｎ６：ＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）：
Ｎ７：ＬＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０）：
Ｎ８：ＫＬＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１）：
Ｎ９：ＦＫＬＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２）：
Ｎ１０：ＮＦＫＬＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３）：
Ｎ１１：ＥＮＦＫＬＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４）：
Ｎ１２：ＰＥＮＦＫＬＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５）：
Ｎ１３：ＤＰＥＮＦＫＬＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６）：
Ｎ１４：ＶＤＰＥＮＦＫＬＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７）：
Ｎ１５：ＨＶＤＰＥＮＦＫＬＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８）：および
Ｎ１６：ＬＨＶＤＰＥＮＦＫＬＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）：
かつ、ここで、
（ｂ−ｉｉ）（ａ）のアミノ酸配列のＣ末端に位置するアミノ酸配列は以下のものからなる群から選択され：
（１）式ＩＩの配列からなるアミノ酸配列：
Ｃ１−Ｃ２−Ｃ３−Ｃ４−Ｃ５（式ＩＩ）
式中、
Ｃ１はグルタミン、アスパラギンおよびチロシンからなる群から選択され；
Ｃ２はリジン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群から選択され；
Ｃ３はメチオニン、バリン、アラニン、ロイシンおよびイソロイシンからなる群から選択され；
Ｃ４はバリン、アラニン、ロイシン、メチオニンおよびイソロイシンからなる群から選択され；
Ｃ５はスレオニン、アラニン、セリンおよびリジンからなる群から選択される；
（２）式ＩＩＩの配列からなるアミノ酸配列：
Ｃ１−Ｃ２−Ｃ３−Ｃ４−Ｃ５−Ｃ６−Ｃ７−Ｃ８−Ｃ９−Ｃ１０−Ｃ１１−Ｃ１２（式ＩＩＩ）
式中、
Ｃ１〜Ｃ５は（ｂ−ｉｉ）（１）におけるように定義され；
Ｃ６はアラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンおよびバリンからなる群から選択され；
Ｃ７はバリン、アラニン、ロイシン、メチオニンおよびイソロイシンからなる群から選択され；
Ｃ８はアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンおよびバリンからなる群から選択され；
Ｃ９はセリン、アスパラギンおよびスレオニンからなる群から選択され；
Ｃ１０はアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンおよびバリンからなる群から選択され；
Ｃ１１はロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、メチオニンおよびバリンからなる群から選択され；そして
Ｃ１２はアミノ酸配列ＳＳＲＹＨからなるペプチドであるか、または存在しない；ならびに
（３）式ＩＶの配列からなるアミノ酸配列：
Ｃ１−Ｃ２−Ｃ３−Ｃ４−Ｃ５−Ｃ６−Ｘ（式ＩＶ）
式中、
Ｃ１〜Ｃ５は（ｂ−ｉｉ）（１）におけるように定義され；
Ｃ６はアラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンおよびバリンからなる群から選択され；
Ｘはあらゆる順序の５アミノ酸残基アラニン、バリン、セリン、アラニンおよびロイシンからなるペプチドである；
またはそれらのペプチド模倣物。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】スクリーニングのために用いられた、Ｎ末端にリジンが結合したＨｂγ１ペプチド。図は、ヒトＨｂγ１タンパク質のアミノ酸配列を示す。この配列が、１５または１６アミノ酸からなる２７種類の重複するペプチドに細分された。それぞれのペプチドにはＮ末端に５個のリジンが結合していた。
【図２】スクリーニング試験：ＭＰＬＡによるＭＮＣの刺激に対するＫ５−Ｈｂγ１ペプチドの作用。ヒトＭＮＣを、図１において示されているＫ５−Ｈｂγ１ペプチドライブラリー（１０μＭ）のペプチドの存在下または非存在下でＭＰＬＡ（１０μｇ／ｍｌ）で刺激した。対照培養物はＭＰＬＡなしで維持された。２０時間の培養期間の後、上清中のＩＬ−８濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。それぞれの値は、３つの独立した実験の平均を表す。これらの３つの独立した実験のそれぞれにおいて、２通りの（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）培養が実施された。
【図３】スクリーニングのために用いられたＨｂγ１ペプチド。図はヒトＨｂγ１タンパク質のアミノ酸配列を示している。この配列が、１５または１６アミノ酸からなる２７種類の重複するペプチドに細分された。
【図４】スクリーニング試験：ＭＰＬＡによるＭＮＣの刺激に対するＨｂγ１ペプチドの作用。ヒトＭＮＣを、図３において示されているＨｂγ１ペプチドライブラリー（１０μＭ）のペプチドの存在下または非存在下でＭＰＬＡ（１０μｇ／ｍｌ）で刺激した。対照培養物はＭＰＬＡなしで維持された。２０時間の培養期間の後、上清中のＩＬ−８濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。それぞれの値は、２通りの培養物の平均±ＳＤを表す。
【図５】様々なＨｂｇペプチドの存在下でのＭＰＬＡによるヒトＭＮＣの刺激。ヒトＭＮＣを、１、３、および１０μＭの濃度のＨｂｇ−２３−１１０、Ｈｂｇ−２４−１１１、およびＨｂｇ−３４−１１２の存在下または非存在下でＭＰＬＡ（１μｇ／ｍｌ）で刺激した。対照培養物はＭＰＬＡなしで維持された。２０時間の培養期間の後、上清中のＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。それぞれの値は、２通りの培養物の平均±ＳＤを表す。
【図６】Ｈｂγ１タンパク質の部分配列に由来する３つの長い鎖の重複するペプチド。Ｈｂｇ−３０−１０５（Ｈｂγ８６−１１５）、Ｈｂｇ−３１−１０６（Ｈｂγ９９−１２８）、およびＨｂｇ−３２−１０７（Ｈｂγ１１２−１４１）。
【図７】ＭＰＬＡによるヒトＭＮＣの刺激に対するＨｂγ１ペプチドの相乗作用。ヒトＭＮＣを、Ｈｂγ１に由来するペプチドＨｂｇ−２３、Ｈｂｇ−２４、Ｈｂｇ−３０−１０５、Ｈｂｇ−３１−１０６、およびＨｂｇ−３２−１０７（３および１０μＭ）の存在下または非存在下でＭＰＬＡ（３μｇ／ｍｌ）で刺激した。対照培養物はＭＰＬＡなしで維持された。２０時間の培養期間の後、上清中のＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。それぞれの値は、２通りの培養物の平均±ＳＤを表す。
【図８】ヒト血清の存在下または非存在下での、ＭＰＬＡによるヒトＭＮＣの刺激に対するＨｂγ１ペプチドの作用。ヒトＭＮＣを、Ｈｂγ１ペプチドＨｂｇ−２３およびＨｂｇ−３２−１０７（１、３および１０μＭ）の存在下または非存在下でＭＰＬＡ（３μｇ／ｍｌ）で刺激した。対照培養物はＭＰＬＡなしで維持された。培地には１０％のヒト血清が補われ、または補われなかった。２０時間の培養期間の後、上清中のＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。それぞれの値は、２通りの培養物の平均±ＳＤを表す。
【図９】ＭＰＬＡによるヒト単球の刺激に対するＨｂｇ−２３およびＨｂｇ−３２ペプチドの相乗作用。精製されたヒト単球（＞９５％）を、Ｈｂγ１ペプチドＨｂｇ−２３およびＨｂｇ−３２−１０７（１、３および１０μＭ）の存在下または非存在下でＭＰＬＡ（１μｇ／ｍｌ）で刺激した。対照培養物はＭＰＬＡなしで維持された。２０時間の培養期間の後、上清中のＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。それぞれの値は、２通りの培養物の平均±ＳＤを表す。
【図１０】合成Ｈｂｇ−３２ペプチドの３種類の異なる調製物の存在下でのＭＰＬＡによるヒトＭＮＣの刺激。ヒトＭＮＣを、Ｈｂγ１ペプチドＨｂｇ−３２の３種類の異なる調製物、すなわちＨｂｇ−３２−１０７、Ｈｂｇ−３２−１０８、およびＨｂｇ−３２−ＫＢ（１、３、および１０μＭ）の存在下または非存在下でＭＰＬＡ（３μｇ／ｍｌ）で刺激した。対照培養物はＭＰＬＡなしで維持された。２０時間の培養期間の後、上清中のＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。それぞれの値は、２通りの培養物の平均±ＳＤを表す。
【図１１】ヒトＭＮＣにおける様々なサイトカインの誘導の間のＨｂｇ−３２ペプチドのＭＰＬＡとの相乗作用。ヒトＭＮＣを、Ｈｂｇ−３２−１１３（３、および１０μＭ）の存在下または非存在下でＭＰＬＡ（３μｇ／ｍｌ）で刺激した。対照培養物はＭＰＬＡなしで維持された。２０時間の培養期間の後、上清中のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＴＮＦα濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。それぞれの値は、２通りの培養物の平均±ＳＤを表す。
【図１２】ＭＰＬＡおよびＬＰＳによるヒトＭＮＣの刺激に対するＨｂｇ−３２の相乗作用。ヒトＭＮＣを、Ｈｂｇ−３２−１１３（１、３、および１０μＭ）の存在下または非存在下でＭＰＬＡ（３μｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ（１ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。対照培養物はＭＰＬＡまたはＬＰＳなしで維持された。２０時間の培養期間の後、上清中のＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。それぞれの値は、２通りの培養物の平均±ＳＤを表す。
【図１３】ＭＰＬＡによるヒトＭＮＣの刺激に対するＨｂｇ−３２−１０７および天然Ｈｂｇ−γ１鎖の相乗作用の比較。ヒトＭＮＣを、天然Ｈｂγ１鎖タンパク質およびＨｂγ１ペプチドＨｂｇ−３２−１０７（３および１０μＭ）の存在下または非存在下でＭＰＬＡ（３μｇ／ｍｌ）で刺激した。対照培養物はＭＰＬＡなしで維持された。２０時間の培養期間の後、上清中のＩＬ−８濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。それぞれの値は、２通りの培養物の平均±ＳＤを表す。
【図１４】ＭＰＬＡによるヒトＭＮＣの刺激の間の、Ｈｂγ１１１２−１４１ペプチド（Ｈｂｇ−３２−１１３）のＨｂγ１１１２−１４１［Ｌ１４１Ｑ］ペプチド（Ｈｂｇ−３５−１１４）との比較。ヒトＭＮＣを、Ｈｂγ１１１２−１４１ペプチド（Ｈｂｇ−３２−１１３）またはＨｂγ１１１２−１４１［Ｌ１４１Ｑ］ペプチド（Ｈｂｇ−３５−１１４）（１、３、および１０μＭ）の存在下または非存在下でＭＰＬＡ（３μｇ／ｍｌ）で刺激した。対照培養物はＭＰＬＡなしで維持された。細胞培養は、（Ａ）ヒト血清の非存在下または（Ｂ）１０％ヒト血清の存在下で実施された。２０時間の培養期間の後、上清中のＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。それぞれの値は、２通りの培養物の平均±ＳＤを表す。
【図１５】ＭＰＬＡによるヒトＭＮＣの刺激に対する様々なＨｂｇ−γ１ペプチドの相乗作用。ヒトＭＮＣを、１、３および１０μＭの様々なＨｂｇペプチド、すなわちＨｂｇ−３５−１１４（Ｈｂγ１１１２−１４１）、Ｈｂｇ−３３−１０９（Ｈｂγ１１０６−１３５）、Ｈｂｇ−３４−１１２（Ｈｂγ１１１１−１３０）、Ｈｂｇ−３６−１１５（Ｈｂγ１９６−１３０）の存在下または非存在下でＭＰＬＡ（３μｇ／ｍｌ）で刺激した。対照培養物はＭＰＬＡなしで維持された。２０時間の培養期間の後、上清中のＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。それぞれの値は、２通りの培養物の平均±ＳＤを表す。
【図１６】ＭＰＬＡによるヒトＭＮＣの刺激に対する様々なＨｂｇ−γ１ペプチドの相乗作用。ヒトＭＮＣを、１、３および１０μＭの様々なＨｂｇペプチド、すなわちＨｂｇ−３５−１１４（Ｈｂγ１１１２−１４１）、Ｈｂｇ−３８−１１７（Ｈｂγ１１０６−１４０）、およびＨｂｇ−３９−１１８（Ｈｂγ１１１１−１４６）の存在下または非存在下でＭＰＬＡ（３μｇ／ｍｌ）で刺激した。対照培養物はＭＰＬＡなしで維持された。２０時間の培養期間の後、上清中のＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。それぞれの値は、２通りの培養物の平均±ＳＤを表す。
【図１７】Ｈｂｇ−３５ペプチドのアラニンスキャン。Ｈｂｇ−３５配列のそれぞれのアミノ酸を、個々にアラニンで置き換えた。図は合成されたペプチドの配列を示す。
【図１８】Ｈｂｇ−３５のアラニンスキャンに由来するペプチドの、ＭＰＬＡで刺激されたヒトＭＮＣへの作用。ヒトＭＮＣを、Ｈｂｇ−３５のアラニンスキャンに由来する様々なＨｂｇペプチドの存在下または非存在下でＭＰＬＡ（３μｇ／ｍｌ）で刺激した。対照培養物はＭＰＬＡなしで維持された。２０時間の培養期間の後、上清中のＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。それぞれの値は、２通りの培養物を用いて実施された２つのの個々の実験の平均±ＳＥＭを表す。＊Ｈｂｇ−３５に関するｐ＜０．０５での有意性（必要に応じてマン・ホイットニーの順位和検定またはスチューデントの対応のあるｔ検定）。
【図１９】ＭＰＬＡによるヒトＭＮＣの刺激に対する様々なＨｂｇ−γ１ペプチドの相乗作用。ヒトＭＮＣを、０．１、１、３および１０μＭの様々なＨｂｇペプチド、すなわちＨｂｇ−３５−１１４（Ｈｂγ１１１２−１４１）、Ｈｂｇ−６８−１５５（Ｈｂγ１［１１３−１３０］）、Ｈｂｇ−６９−１５６（Ｈｂγ１［１２３−１３８］）の存在下または非存在下でＭＰＬＡ（１μｇ／ｍｌ）で刺激した。Ｈｂｇ−６８−１５５は、ペプチドＨｂｇ−３２〜Ｈｂｇ−３９の共通部分の構造に相当する。Ｈｂｇ−６９−１５６の配列は、脂質膜貫通領域内のＨｂｇペプチドのアルファらせん構造の原因であると仮定されている。対照培養物はＭＰＬＡなしで維持された。２０時間の培養期間の後、上清中のＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。それぞれの値は、２通りの培養物の平均±ＳＤを表す。
【図２０】リコール抗原による記憶Ｔ細胞の刺激の間のＭＰＬＡのアジュバント作用。ヒトＭＮＣを、ＭＰＬＡ（１０、１００、および１０００ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、Ｍ．ツベルクローシスの精製されたタンパク質の誘導体（ＰＰＤ）（１μｇ／ｍｌ）または破傷風トキソイド（ＴＴ）（０．１フロキュレーション限界［ＬＦ］／ｍｌ）で刺激した。６日間の培養後、細胞を３Ｈ−チミジン（３ＨＴｄＲ；２Ｃｉ／ｍｍｏｌ、０．２μＣｉ／培養）で標識し、さらに１日培養した後、細胞をガラスフィルターマット上にＤＮＡ中に組み込まれた放射活性の測定のために回収した。結果は２通りの培養物の平均±ＳＤとして表されている。
【図２１】ＰＰＤおよびＴＴによるヒト記憶Ｔ細胞の刺激の間のＭＰＬＡのアジュバント活性に対するＨｂｇ−３５の相乗作用。ヒトＭＮＣを、ＭＰＬＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＨｂｇ−３５（１または３μＭ）の存在下または非存在下で、ＰＰＤ（１μｇ／ｍｌ）またはＴＴ（０．１ＬＦ／ｍｌ）で刺激した。６日間の培養後、細胞を３ＨＴｄＲ（２Ｃｉ／ｍｍｏｌ、０．２μＣｉ／培養）で標識し、さらに１日培養した後、細胞をガラスフィルターマット上にＤＮＡ中に組み込まれた放射活性の測定のために回収した。結果は２通りの培養物の平均±ＳＤとして表されている。
【図２２】単独（Ａ）またはＨｂｇ−３２の存在下（Ｂ）でのＭＰＬＡの小角Ｘ線散乱パターン。散乱強度の対数が散乱ベクトルｓ（＝１／ｄ、ｄ＝間隔）に対してプロットされている。ペプチドの非存在下では、４．１１ｎｍにおける鋭い反射は多層状の周期性の存在を示しており、ペプチドの存在下では、様々な追加の反射の発生は立方体状凝集体構造の存在に特徴的である。
【図２３】Ｈｂｇ−３２が添加されたＭＰＬＡ凝集体のフェルスター共鳴エネルギー移動分光法（ＦＲＥＴ）。ＭＰＬＡ凝集体を色素ＮＢＤ−ＰＥ（供与体）およびＲｈｏＰＥ（受容体）で標識し、強度比ＩＤ／ＩＡは、ここで観察されるＨｂｇ−３２ペプチドのような外部の化合物の組み込みの高感度な尺度である。
【図２４】単独またはＨｂｇ−３２の存在下でのＭＰＬＡ分散物の９０°におけるレーザー光散乱。破線：ＭＰＬＡ単独（０．１ｍＭ）。実線：ＭＰＬＡ（０．１ｍＭ）＋Ｈｂｇ−３２（０．１ｍＭ）。ペプチドによるＭＰＬＡの明白な脱凝集作用が、ＭＰＬＡ単独に関する約１０００ｎｍ（右のピーク）の大きさの変化および等モル濃度のＨｂｇ−３２の存在の減少（左の２つのピーク）により示されている。
【図２５】単独（Ａ）および等モル濃度のＨｂｇ−３２の存在下（Ｂ）でのＭＰＬＡ（１ｍＭ）のフリーズフラクチャー電子顕微鏡観察。ペプチドの非存在下では、ＭＰＬＡ凝集体は密に充填されて大きな多重二重層の（ｍｕｌｔｉ−ｂｉｌａｙｅｒｅｄ）配置を形成している。ペプチドの非存在下では、これらの凝集体は分散し、より球状になる。
【図２６】Ｈｂｇ−３２の存在下または非存在下でのＭＰＬＡの原子間力顕微鏡観察。（Ａ）雲母表面上のＭＰＬＡ（２５μＭ）の原子間力顕微鏡写真。示されているのは、脂質凝集体のｘ−ｙ＝５．０×５．０μｍ２断面の深度プロフィールである。異なる起伏の陰影処理は、ＭＰＬＡ会合体の異なる高さを表しており、ｚ＝５０〜３００ｎｍのコンパクトな層を示している。（Ｂ）雲母上の等モル含有量のＨｂγ３２の存在下でのＭＰＬＡ（２５μＭ）の原子間力顕微鏡写真。示されているのは、脂質凝集体の５．０×５．０μｍ２断面の深度プロフィールである。異なる起伏の陰影処理は、１０ｎｍまでの最大の高さを有するＭＰＬＡ会合体の異なる高さを表している。平面の９０％より多くがおおよそ５ｎｍの厚さの二重層構造を示している。
【図２７】Ｈｂγ３５によるモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）の等温滴定型熱量測定。時間に依存するＨｂγ３５によるＭＰＬＡの等温滴定型熱量測定（上）および結果としてもたらされるエンタルピー変化ΔＨを、ペプチド対ＭＰＬＡのモル比の関数として決定した。ペプチドを、３μｌずつ５分ごとに、一定の撹拌の下で、ＭＰＬＡを含有するセル中に滴定し、ＩＴＣ機器により測定されたそれぞれの注入後の相互作用の熱を時間に対してプロットした。
【図２８】単独およびＭＰＬＡ存在下でのＨｂγ３５に関する赤外スペクトル。赤外スペクトルは、単独（上）および等モル含有量のＭＰＬＡの存在下（下）でのＨｂγ３５に関して１７００〜１５９０ｃｍ−１のアミドＩ振動バンド（主にＣ＝Ｏの伸縮振動）の範囲で測定された。約１６５９および１６２８ｃｍ−１の吸収極大は、それぞれαらせんおよびβシート二次構造の存在を示している。
【図２９】ＭＰＬＡによるヒトＭＮＣの刺激の間の、Ｈｂｇ−３５の相乗作用のＨｂα−、Ｈｂβ−、およびＨｂγ２鎖の相同ペプチドとの比較。ヒトＭＮＣを、１、３および１０μＭの様々なＨｂペプチド、すなわちＨｂｇ−３５−１５８（Ｈｂγ１［１１２−１４１］）、Ｈｂａ−６６−１５３（Ｈｂα［１０７−１３６］）、Ｈｂｂ−６７−１５４（Ｈｂβ［１１２−１４１］）、およびＨｂｇ２−７０−１５７（Ｈｂγ２［１１２−１４１］）の存在下または非存在下でＭＰＬＡ（３０００ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。対照培養物はＭＰＬＡなしで維持された。２０時間の培養期間の後、上清中のＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。それぞれの値は、２通りの培養物の平均±ＳＤを表す。
【図３０】合成リポペプチドによるヒトＭＮＣの刺激に対するＨｂｇ−３５ペプチドの相乗作用。ヒトＭＮＣを、１、３および１０μＭのＨｂｇ−３５の存在下または非存在下でＰａｍ３Ｃ−ＳＫ４（１０ｎＭ）、ＦＳＬ−１（１ｎＭ）、またはＭＰＬＡ（３μｇ／ｍｌ）で刺激した。対照培養物はリポペプチドまたはＭＰＬＡなしで維持された。２０時間の培養期間の後、上清中のＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。それぞれの値は、２通りの培養物の平均±ＳＤを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明によれば、用語“医薬組成物”は、患者、好ましくはヒトの患者への投与のための組成物に関する。本発明の医薬組成物は、少なくとも１種類のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）活性化両親媒性脂質および少なくとも１種類のヘモグロビン由来ペプチドを含む。本発明の医薬組成物は、場合により、そして加えて、医薬的に許容できるキャリヤーを含むことができる。“医薬的に許容できるキャリヤー”により、あらゆるタイプの非毒性の固体、半固体または液体の増量剤、希釈剤、賦形剤、封入（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ）材料または配合補助剤を意味する。適切な医薬用キャリヤーの例は当該技術で周知であり、塩化ナトリウム溶液、リン酸緩衝塩化ナトリウム溶液、水、エマルジョン、例えば、油／水エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌溶液、有機溶媒等を含む。好ましくは、キャリヤーは、非経口用キャリヤー、より好ましくは受容者の血液と等張である溶液である。用語“非経口”は、本明細書で用いられる際、静脈内、筋内、腹腔内および皮下注射および注入を含む投与方式を指す。これらの投与方式は、筋内、皮内、鼻内、経口、バッカル、舌下、（例えば鼻内スプレー、点鼻薬もしくは点眼薬または鼻もしくは眼用クリーム（ｃｒｅｍｅｓ）、ならびに直腸または膣用（ゲル）配合物のような）粘膜または気管支内投与と共に、本発明に従う好ましい投与方式である。本発明に従う最も好ましい投与方式は、筋内投与または経口適用である。キャリヤーは、場合により微量の添加剤、例えば等張性および化学的安定性を高める物質を含有する。そのような物質は、用いられる投与量および濃度において受容者に非毒性であり、緩衝剤、例えばホスフェート、シトレート、スクシネート、酢酸、および他の有機酸もしくはそれらの塩類；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸；低分子量（約１０残基未満）（ポリ）ペプチド、例えばポリアルギニンもしくはトリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、もしくはアルギニン；単糖類、二糖類、およびセルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノース、もしくはデキストリンが含まれる他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール類、例えばマンニトールもしくはソルビトール；対イオン、例えばナトリウム；および／または非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート類、ポロキサマー類、もしくはＰＥＧを含む。
【００１３】
そのようなキャリヤーを含む組成物は、周知の従来の方法により配合され得る。一般に、配合物は、医薬組成物の構成要素を液体キャリヤーまたは微細に分割された固体キャリヤーまたは両方と均一かつ密接に接触させることにより調製される。次いで、必要であれば、生成物は所望の配合物へと形作られる。これらの医薬組成物は適切な用量で対象に投与され得る。投与計画は主治医および臨床要因により決定されるであろう。医学の技術分野では周知であるように、あらゆる１人の患者に関する投与量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される予定の特定の化合物、性別、投与の時間および経路、全身の健康状態、ならびに同時に投与されている他の薬物が含まれる多くの要因に依存する。所与の状況に関する療法上有効量は、ルーチン的な実験法によりすぐに決定されると考えられ、普通の臨床家または医師の技術および判断の範囲内である。医薬組成物は、１回の投与のためのための、または延長された期間にわたる規則的な投与のためのものであってよい。一般に、１回量の形態の医薬組成物の投与は、投与経路に応じて、例えば０．１ｎｇ／ｋｇ体重〜２０μｇ／ｋｇ体重のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）活性化両親媒性脂質、および本発明のヘモグロビン由来ペプチドに関して例えば０．１ｎｇ／ｋｇ体重〜２００μｇ／ｋｇ体重の範囲であるべきである。しかし、有効化合物のそれぞれのより好ましい投与量は、１回量に関して０．０５〜１０μｇ／ｋｇ体重の範囲、さらにもっと好ましくは０．１〜１μｇ／ｋｇ体重の範囲である可能性がある。より具体的には、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）活性化両親媒性脂質およびヘモグロビン由来ペプチドそれぞれに関して、静脈内投与に関する好ましい１回量は０．１〜１０ｎｇ／ｋｇ体重の範囲であってよく、皮下、筋内、もしくは皮内投与に関する好ましい１回量は５〜５００ｎｇ／ｋｇ体重の範囲であってよく、または経口投与に関する好ましい１回量は２０μｇ／ｋｇ体重までであってよい。本発明の薬剤とさらなる医薬的に有効な化合物、例えば本明細書の他の箇所で記載されている化合物の組み合わせの場合のこれらの投与量の調節は、普通の臨床家または医師の技術および判断の範囲内である。好ましくは、構成要素の重量関係は、１：１〜１００：１のヘモグロビン由来ペプチド対Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）活性化両親媒性脂質の範囲である。
【００１４】
療法的投与のために用いられる予定の医薬組成物の構成要素は、無菌でなければならない。無菌性は、滅菌濾過膜（例えば０．２ミクロン膜）を通す濾過によりすぐに成し遂げられるが、本発明はこの典型的な無菌性を達成する方法に限定されない。本発明の医薬組成物は、国法およびＧＭＰ基準に従う規制条件に従って配合される。
【００１５】
医薬組成物の構成要素は、通常は単位用量または多数回用量の容器、例えば密封されたアンプルまたはバイアル中に、水溶液として、または再構成のための凍結乾燥された配合物として保管されるであろう。凍結乾燥された配合物の例として、１０ｍｌバイアルに５ｍｌの滅菌濾過された１％（ｗ／ｖ）水溶液を入れ、得られた混合物を凍結乾燥させる。輸液は、例えば凍結乾燥された化合物（単数または複数）を静菌性注射用水を用いて再構成することにより調製される。保存剤ならびに例えば抗微生物薬、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス等のような他の添加剤も存在していてよい。医薬組成物は、医薬組成物の意図される用途に応じてさらなる薬剤を含んでいてよい。
【００１６】
用語“含んでいる”は、本明細書で用いられる際、“で構成されている”ならびに“包含している”（すなわち、他のものの中で）の両方を指す。有効成分であるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）活性化両親媒性脂質（単数または複数）およびヘモグロビン由来ペプチド（単数または複数）に関して、この用語は、これらの２種類の化合物のみが有効化合物として存在すること（すなわち「で構成されている」）またはこれらの２タイプの有効化合物および追加の薬剤が存在すること（すなわち「含んでいる／包含している」）のどちらも指している。そのような追加の薬剤は、例えば本明細書において下記で記載する疾患の治療において有効であることが当該技術において既知である薬剤、例えば腫瘍の予防および／または治療、感染症の予防および／または治療、アレルギーの予防および／または治療、年齢関連性免疫不均衡の予防および／または治療、先天および適応免疫系の刺激、および／または照射の有害な副作用の緩和における使用のための薬剤であることができる。これらの疾患は、本明細書において下記でより詳細に記載される。本発明の医薬製剤は上記で言及した化合物、すなわちＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）活性化両親媒性脂質（単数または複数）をヘモグロビン由来ペプチド（単数または複数）と組み合わせたものに頼っているため、さらなる薬剤は、例えば前記のさらなる薬剤によりもたらされる副作用を低減するため、補助剤として、すなわち唯一の薬物として用いられる場合の推奨用量と比較して低減した用量でのみ用いられることが好ましい。
【００１７】
用語“少なくとも”は、本明細書で用いられる際、具体的に列挙された量を指すが、具体的に言及された量または数よりも多い量または数も指す。例えば、用語“少なくとも１種類のＴＬＲ活性化両親媒性脂質”は、少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類のＴＬＲ活性化両親媒性脂質等も包含する。さらに、この用語は、ちょうど２種類、ちょうど３種類、ちょうど４種類、ちょうど５種類のＴＬＲ活性化両親媒性脂質等も包含する。
【００１８】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）活性化両親媒性脂質は、当該技術で周知である。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、最初に遺伝学的手段により、微生物に特有であり、微生物分類群の間で広く示されている分子サインを検出するセンサーとして同定された；例えばBlasius and Beutler, “Intracellular Toll-like Receptors.” Immunity 32: 305-315 (2010)を参照。最初にＬＰＳ（ＴＬＲ５）、次いでＤＮＡ（ＴＬＲ９）、ＲＮＡ（ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８）、リポペプチド（ＴＬＲ２）、次いでフラジェリン（ＴＬＲ５）がＴｏｌｌ様受容体を活性化するリガンドであることが示された。従って、例えばＬＰＳまたはリポペプチドのようなＴｏｌｌ様受容体を活性化することができる両親媒性脂質は、当該技術において長年知られてきた。さらに、脂質ＬＰＳおよびリポペプチド／リポタンパク質が両親媒性脂質の例として考えられているという事実も、当該技術で周知であり、例えばChemistry and Biological Activities of Bacterial Surface Amphiphiles, 編者Gerald Shockman and Anthony J. Wicken, Academic Press, eBook ISBN 9780323151986 (2012), p.1-9における“Properties of Amphiphiles.”を参照。好ましくは、ＴＬＲ活性化両親媒性脂質は、内毒素、またはその内毒素的に活性な部分、および細菌性リポペプチドからなる群から選択される。
【００１９】
用語“内毒素”（本明細書においてリポ多糖類、ＬＰＳとも呼ばれる）は、一般にグラム陰性細菌により産生され、それからそれらが生物学的または化学的に放出され得る細菌の外膜の主要構成要素を構築している生理活性化合物を指す。内毒素は、親水性多糖部分およびリピドＡと呼ばれる共有結合した疎水性脂質構成要素からなる両親媒性分子である。一般に、リピドＡ構成要素は、７個までのアシル残基を有するリン酸化されたβ−１，６結合したＤ−グルコサミン二糖で構成される。それでもなお、脂肪酸の長さ、位置および数における変動が存在する。ＬＰＳの生物学的作用は多糖を含まないリピドＡにより再現されるため、リピドＡはＬＰＳの内毒素原理を構成することが示されている(Galanos et al. (1985))。この発見は、後に完全に化学合成されたリピドＡおよび対応するリピドＡ部分構造、例えば大腸菌のリピドＡを用いることにより確証された(Imoto et al. (1987))。さらに、そのような合成化合物はＬＰＳおよびリピドＡの構造活性関係に関する研究に関する基礎であった(Rietschel et al. (1987))。サイトカイン誘導能力と関係するリピドＡの生理活性に関する最小限の必要条件は、大腸菌のリピドＡまたはインフルエンザ菌に存在するような、２個のＤ−グルコ−立体配置のヘキソサミン残基、２個のホスホリル基、および６個の脂肪酸からなる分子である(Rietschel et al. (1994))。構造活性関係に関する大規模なデータから、大腸菌のリピドＡの天然型は強い単球／マクロファージ活性化能力に関する最適な立体配置であると結論付けられた。大腸菌のリピドＡの全ての化学的に異なる部分構造または誘導体は、ヘキソサミン二糖のリン酸化またはアシル化パターンのどちらにおいて異なっていても、モノカインの誘導において活性がより低いか、または不活性でさえある。
【００２０】
本発明によれば、本発明の医薬組成物において用いられる内毒素は、あらゆるグラム陰性の内毒素を有する細菌に由来することができることが理解されている。好ましくは、前記の内毒素は大腸菌に由来する。
【００２１】
内毒素の“内毒素的に活性な部分”という用語は、天然存在の内毒素の内毒素活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも１００％を示す部分を指す。内毒素の内毒素的に活性な部分は、例えばＬＰＳの化学的もしくは酵素的断片化により、またはＬＰＳの（生）化学的修飾により得ることができ、それにより医薬的に有益な活性が（本質的に）維持される、または向上する。そのような内毒素的に活性な部分は、部分的酵素的／加水分解的脱グリコシル化、脱リン酸化および脱アシル化により生成された断片、またはグリコシル、ホスホリルもしくはアシルトランスフェラーゼの作用により、もしくは哺乳類組織において、特に肝臓において起こっていることが知られている他の酵素的修飾段階により生成された誘導体を含む。前記の内毒素的に活性な部分は、ＬＰＳ由来の多糖を含まない天然または合成リピドＡ構成要素であることが好ましい。最も好ましいのは、内毒素的に活性な部分がＭＰＬＡであることである。
【００２２】
生物物理学的研究において、全ての内毒素的に高度に活性なリピドＡ構造は特定の‘内毒素的立体構造’、すなわち親水性領域のような疎水性領域のより高次の断面に対応するリピドＡ部分の円錐形の形状を有する（ｐｏｓｓｅｓ）ことが示されることができた(Seydel et al. (2000))。円錐形の形状と関係するのがリピドＡジグルコサミン主鎖の傾きであり、膜の法線、すなわちアシル鎖の方向に関しておおよそ５０°の傾斜角を有する(Seydel et al. (2000))。
【００２３】
モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）は、例えばサルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）のＬＰＳの制御された酸加水分解により、または化学合成により得られるリピドＡの部分構造である(Fox et al. (2010))。ＭＰＬＡは低い毒性しか示さず、アジュバント活性を含む有益な免疫刺激特性を有する。従って、ワクチンアジュバントＭＰＬＡは“内毒素の無毒化形態”と呼ばれる。この構造は、ヒトにおいてワクチンアジュバントとして用いられている最初のＴｏｌｌ様受容体活性化両親媒性脂質に相当する(Fox et al. (2010))。
【００２４】
好ましくは、内毒素は細菌性または合成のＳまたはＲ型リポ多糖（ＬＰＳ）である。
本発明の医薬組成物のさらなる好ましい態様において、内毒素の内毒素的に活性な部分は、天然または合成のペンタおよび／またはヘキサアシルリピドＡである。本発明の医薬組成物の別の好ましい態様において、内毒素の内毒素的に活性な部分は、天然または合成のペンタおよび／またはヘキサアシルリピドＡモノホスフェートである。これらの特定の内毒素の使用は、それらの急性毒性がヘキサアシルビスホスホリルリピドＡまたはＬＰＳの毒性よりもかなり低い（約１００倍）ため、好都合である。
【００２５】
ＬＰＳ低応答であるＣ３Ｊ／ＨｅＪマウス系統のｌｐｓ遺伝子の特性付けは、Ｔｏｌｌ様受容体ＴＬＲ４がＬＰＳシグナル伝達受容体であることを同定した(Poltorak et al. (1998))。シグナル伝達に関して、ＴＬＲ４はＭＤ−２と呼ばれるアダプタータンパク質の同時発現を必要とする(Shimazu et al. (1999))。このタンパク質は２量体サブユニットの大きなジスルフィド連結されたオリゴマーからなり、単球および樹状細胞により生成および分泌され、ＴＬＲ４に密接に結合し、ＬＰＳ応答に必須である(Shimazu et al. (1999); Akashi et al. (2000))。放射性標識したＬＰＳを用いて、ＬＰＳ、ＴＬＲ４、およびＭＤ−２間の物理的接触はＣＤ１４と呼ばれるさらなる分子が存在する場合のみ実証されることができた(da Silva et al. (2001))。ＣＤ１４はＬＰＳのＴＬＲ４への結合およびＬＰＳによる細胞の活性化に関わっていることが示されている(da Silva et al. (2001))。ＣＤ１４は単核球細胞、多形核白血球、一部のＢリンパ球(Haziot et al. (1988))、および上皮細胞(Pugin et al. (1993))の表面上にグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー膜タンパク質（ｍＣＤ１４）として位置している。
【００２６】
細菌性リポタンパク質は、グラム陽性およびグラム陰性細菌の膜の構成要素である。加えて、それらはマイコプラズマおよびマイコバクテリアの膜においても見付かっている。これらのリポタンパク質は、ジ−Ｏ−アシル化−Ｓ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−システイニル残基からなり、それは別個のポリペプチドのＮ末端に連結されている。Ｓ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−システインは、大腸菌のようなグラム陰性細菌における場合のように、第３の脂肪酸によりＮ−アシル化されている可能性がある。モノアシル化されたリポタンパク質も記載されている(Salunke et al. (2012))。ポリペプチドの脂肪酸パターンおよびアミノ酸配列は様々であり得るが、Ｓ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−システインの骨格はこれらのリポタンパク質の不可欠な構成要素である。
【００２７】
ＬＰＳおよびＭＰＬＡと同様に、リポタンパク質は疎水性部分（脂肪酸）および親水性部分（タンパク質）を有する両親媒性分子である。線維芽細胞刺激リポペプチド−１（ＦＳＬ−１）はマイコプラズマ・サリバリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓａｌｖａｒｉｕｍ）由来の合成ジ−アシル化リポペプチド（ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄ）である。Ｐａｍ３Ｃ−ＳＫ４は大腸菌のリポタンパク質に由来する。上記で言及したように、ＭＬＰＡはＴＬＲ４／ＭＤ２ホモマー性受容体を通してシグナル伝達し、一方でＰａｍ３Ｃ−ＳＫ４およびＦＳＬ−１のような細菌性リポタンパク質は、ＴＬＲ２を通してそれぞれＴＬＲ１またはＴＬＲ６依存性の様式でシグナル伝達する。ＴＬＲ２はＭｙＤ８８シグナル伝達経路のみを誘導し、それは結果として炎症促進性サイトカインの誘導をもたらすが、ＴＬＲ４／ＭＤ２はＭｙＤ８８経路およびＴＲＩＦ経路を誘導する。この後者の経路はＩＦＮ−アルファおよびＩＦＮ−ベータの誘導を媒介する。
【００２８】
本発明の医薬組成物の好ましい態様において、細菌性リポペプチドはＳ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−システイン骨格を有するモノ−、ジ−またはトリアシル化リポペプチドである。そのようなリポペプチドの例は、線維芽細胞刺激リポペプチド−１（ＦＳＬ−１）、マイコプラズマ・ファーメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）からのマクロファージ活性化リポペプチド（ＭＡＬＰ２）、Ｐａｍ２Ｃ−ＳＫ４、およびＰａｍ３Ｃ−ＳＫ４である。さらなる合成的修飾が、例えば補遺において列挙されているようなBuwitt-Beckmann et al (Buwitt-Beckmann et al. (2005), FEBS J.)により、そしてＥＭＣ−ｍｉｃｒｏｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎの生化学カタログ２０１２／２０１３(ドイツ、テュービンゲン；microcollections.de/pdf/EMC%20Biochemicals.pdfのワールドワイドウェブを参照)において記載されている。
【００２９】
本発明の医薬組成物は、さらに少なくとも１種類のヘモグロビン由来ペプチドを含む。用語“ペプチド”は、本明細書で用いられる際、ペプチド結合により共有結合した５５個までのアミノ酸を含有するアミノ酸の線状分子鎖を指す。ペプチドは、少なくとも２個の同一の分子または異なる分子からなるオリゴマーを形成し得る。そのような多量体の対応する高次構造は、対応して、ホモ２量体またはヘテロ２量体、ホモ３量体またはヘテロ３量体等と呼ばれる。本発明によれば、示された配列はＮ末端からＣ末端へと伸びている。本発明全体を通してアミノ酸を同定するために用いられているような１文字および３文字コードの略称は、アミノ酸に関して一般的に用いられている略称と一致する。
【００３０】
本発明のペプチドは、ヘモグロビン、より詳細にはヒト胎児性ヘモグロビンに由来する。
ヘモグロビン（Ｈｂ）は、おおよそ６４，５００Ｄａの分子量の４量体ヘムタンパク質複合体である。ヘモグロビンの主な生物学的機能は、循環における酸素（Ｏ２）の輸送である(Perutz (1979))。成人のヒトＨｂ（ＨｂＡ）は２個のα鎖および２個のβ鎖からなり、これらのサブユニットのそれぞれが１個のヘム基を補欠分子族として含有する。胎児性Ｈｂ（ＨｂＦ）は、それらのヘムと複合体化した形態である２個のα鎖および２個のγ鎖からなる。ヒトの個体発生において、ＨｂＡは出生後の生涯期間において骨髄で合成され、一方でＨｂＦは主に肝臓および胎児の脾臓で産生される(Karlsson and Nienhuis (1985))。胎児性ヘモグロビンという用語は、典型的にはＨｂＦならびにヘムを含まないＨｂＦの４量体形態を意味する。α、β、およびγ鎖は、ＨｂＡおよび／またはＨｂＦに由来する単量体のヘムを含まないグロビン鎖である。
【００３１】
本発明によれば、用語“ヘモグロビン由来の”は、そのペプチドが完全長ヘモグロビンタンパク質から（例えばその消化により）得られることを必要とせず、むしろ本発明のペプチド（単数または複数）の配列はヘモグロビンの配列の一部に対応する、または類似している配列である事実を指す。
【００３２】
従って、本発明のペプチドは合成により生成することができる。ペプチドの化学合成は当該技術で周知である。固相合成が一般的に用いられており、様々な商業的な合成装置、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州フォスターシティ；Ｂｅｃｋｍａｎ；ＭｕｌｔｉＳｙｎｔｅｃｈ、ドイツ、ボーフム等による自動化された合成装置が入手可能である。液相合成法を用いることもできるが、それらは利便性がより低い。例えば、ペプチド合成は、Ｎａ−９−フルオレニルメトキシカルボニルアミノ酸および事前に装填された（ｐｒｅｌｏａｄｅｄ）トリチル樹脂またはｐ−カルボキシトリチルアルコールリンカーを有するアミノメチル化ポリスチレン樹脂を用いて実施され得る。カップリングは、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールおよび２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートを用いてジメチルホルムアミド中で実施され得る。一般に用いられる側鎖保護基は、Ｄ、ＥおよびＹに関してｔｅｒｔ−ブチル；Ｎ、Ｑ、ＳおよびＴに関してトリチル；Ｒに関して２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロキシベンゾフラン−５−スルホニル；そしてＫに関してブチルオキシカルボニルである。合成後、ペプチドは脱保護され、例えば９２％トリフルオロ酢酸／４％トリエチルシラン／４％Ｈ２Ｏを用いた処理によりポリマー支持体から切断される。ペプチドをｔｅｒｔ−ブチルエーテル／ペンタン（８：２）の添加により沈殿させて逆相ＨＰＬＣにより精製することができる。ペプチドは一般にマトリックス支援レーザー脱離飛行時間型質量分析法により分析される。これらの標準的な技法を用いることにより、天然存在アミノ酸を非天然アミノ酸、特にＤ−立体異性体により置換することができ、異なる長さまたは官能性を有する側鎖を有するアミノ酸によっても置換することができる。小分子、標識部分、ペプチド、またはタンパク質にコンジュゲートさせるための官能基を、化学合成の間に分子中に導入することができる。加えて、小分子および標識部分を、合成プロセスの間に結合させることができる。好ましくは、官能基の導入および他の分子へのコンジュゲーションは、対象ペプチドの構造および機能に影響を及ぼさないか、最小限にしか影響を及ぼさない。
【００３３】
Ｎ末端およびＣ末端は、従来の化学合成法を用いて誘導体化されてよい。本発明のペプチドは、アシル基、例えばアセチル基を含有することができる。アシル化するための、特にＮ末端の遊離アミノ基をアセチル化するための方法は、当該技術で周知である。Ｃ末端に関して、カルボキシル基はアルコール類とのエステル化により修飾されてよく、またはアミド化されて−ＣＯＮＨ２またはＣＯＮＨＲを形成してよい。エステル化およびアミド化の方法は、当該技術で周知である。さらに、本発明のペプチドは、半合成的に、例えば組み替えおよび合成的生成の組み合わせにより生成されてもよい。ペプチドの断片が合成により生成される場合、ペプチドの残りの部分は、他の方法で、例えば当該技術で周知であるように組み替えにより生成されなければならず、次いで断片に連結されて本発明のペプチドが形成されるであろう。
【００３４】
さらに、本発明は、上記で定義されたようなペプチドのペプチド模倣物を包含する。ペプチド模倣物は、ペプチドを模倣するように設計された小さいタンパク質またはペプチド様の鎖である。ペプチド模倣物は、典型的には、ペプチドの特性を変化させるような既存のペプチドの修飾から生じる。例えば、それらはペプチドの安定性を変化させるような修飾から生じ得る。これらの修飾は、アミノ酸またはペプチド結合の機能的類似体による置換を含む、天然には起こらないであろうペプチドに対する変化（例えば、変化した主鎖および非天然アミノ酸の組み込み）を含む。そのような機能的類似体は、例えばセレノシステインのような、２０種類の遺伝子にコードされるアミノ酸以外の全ての既知のアミノ酸を含む。ペプチド模倣物の使用は、他の模倣物と比較して、いくつかの特定の利点を有する。例えば、それらの立体構造的に制限された構造は、非標的化合物への結合を最小限にし、所望の標的における活性を増進することを可能にする。疎水性残基の付加および／またはアミド結合の置換により、細胞膜を通るペプチド模倣物の輸送が向上し得る。さらに、ペプチド模倣物、例えばイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｓ）、レトロ−インベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）（全−ｄレトロまたはレトロエナンチオ（ｒｅｔｒｏｅｎａｎｔｉｏ））ペプチドおよび環状ペプチドは、ペプチダーゼおよび他の酵素による分解をより受けにくい。天然存在ペプチドのレトロ−インベルソ修飾は、対応するＬ−アミノ酸のα炭素の立体化学とは反対のα炭素の立体化学を有するアミノ酸、すなわちＤ−またはＤ−アロ−アミノ酸の、天然のペプチド配列に関して逆の順序での合成による組み立てを含む。従って、レトロ−インベルソ類似体は、逆転した末端および逆転したペプチド結合の方向を有する一方で、天然のペプチド配列におけるような側鎖のトポロジーをおおよそ維持している。
【００３５】
本発明のヘモグロビン由来ペプチドのアミノ酸配列は、本明細書において上記で定義されている通りである。従って、ペプチドは定義される通りのアミノ酸Ａ１〜Ａ１９により表されるコア配列（すなわち式Ｉ）を含む。さらに、ペプチドは、前記のコア配列のＮもしくはＣ末端において、またはＮおよびＣ末端の両方において、追加のアミノ酸配列を含む。Ｎ末端配列は、Ｎ１６として示された配列、またはＮ１〜Ｎ１５として示されたようなその断片に基づいている。Ｃ末端配列は、式ＩＩ、式ＩＩＩまたは式ＩＶのいずれかに基づいている。式ＩＩ（Ｃ１〜Ｃ５）は、式ＩＩＩおよびＩＶの断片に相当する。
【００３６】
本発明の医薬組成物のより好ましい態様において、式Ｉのアミノ酸残基は以下の通りである：
Ａ１はスレオニンおよびシステインからなる群から選択され；
Ａ２はバリンであり；
Ａ３はロイシンであり；
Ａ４はアラニンであり；
Ａ５はイソロイシンおよびヒスチジンからなる群から選択され；
Ａ６はヒスチジンであり；
Ａ７はフェニルアラニンであり；
Ａ８はグリシンであり；
Ａ９はリジンであり；
Ａ１０はグルタミン酸であり；
Ａ１１はフェニルアラニンであり；
Ａ１２はスレオニンであり；
Ａ１３はプロリンであり；
Ａ１４はグルタミン酸およびプロリンからなる群から選択され；
Ａ１５はバリンであり；
Ａ１６はグルタミンであり；
Ａ１７はアラニンであり；
Ａ１８はセリンおよびアラニンからなる群から選択され；そして
Ａ１９はトリプトファンおよびチロシンからなる群から選択される。
【００３７】
この好ましい態様によれば、式Ｉは：Ａ１−ＶＬＡ−Ａ５−ＨＦＧＫＥＦＴＰ−Ａ１４−ＶＱＡ−Ａ１８−Ａ１９であり、式中、残基Ａ１、Ａ５、Ａ１４、Ａ１８およびＡ１９は上記で定義された通りである。
【００３８】
本発明の医薬組成物の別のより好ましい態様において、（ａ）のアミノ酸配列のＮ末端に位置するアミノ酸配列は、Ｎ１、Ｎ６およびＮ１６からなる群から選択される。
本発明の医薬組成物のさらにもっと好ましい態様において、式ＩＩのアミノ酸残基は以下の通りである：
Ｃ１はグルタミンであり；
Ｃ２はリジンであり；
Ｃ３はメチオニンおよびバリンからなる群から選択され；
Ｃ４はバリンであり；
Ｃ５はスレオニンおよびアラニンからなる群から選択される。
【００３９】
この好ましい態様によれば、式ＩＩは：ＱＫ−Ｃ３−Ｖ−Ｃ５であり、式中、残基Ｃ３およびＣ５は上記で定義された通りである。
本発明の医薬組成物のその上さらにもっと好ましい態様において、式ＩＩＩのアミノ酸残基は以下の通りである：
Ｃ１〜Ｃ５は、先行する段落における式ＩＩに関するように定義され；
Ｃ６は、アラニンおよびグリシンからなる群から選択され；
Ｃ７はバリンであり；
Ｃ８はアラニンであり；
Ｃ９はセリンおよびアスパラギンからなる群から選択され；
Ｃ１０はアラニンであり；
Ｃ１１はロイシンおよびグルタミンからなる群から選択され；そして
Ｃ１２はアミノ酸配列ＳＳＲＹＨからなるペプチドであるか、または存在しない。
【００４０】
この好ましい態様によれば、式ＩＩＩは：ＱＫ−Ｃ３−Ｖ−Ｃ５−Ｃ６−ＶＡ−Ｃ９−Ａ−Ｃ１１−Ｃ１２であり、式中、残基Ｃ３、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１１およびＣ１２は上記で定義された通りである。
【００４１】
本発明の医薬組成物のその上さらにもっと好ましい態様において、式ＩＶのアミノ酸残基は以下の通りである：
Ｃ１〜Ｃ５は、先行する段落における式ＩＩおよびＩＩＩに関するように定義され；
Ｃ６はアラニンおよびグリシンからなる群から選択され；
Ｘはアミノ酸配列ＶＡＳＡＬからなるペプチドである。
【００４２】
この好ましい態様によれば、式ＩＶは：ＱＫ−Ｃ３−Ｖ−Ｃ５−Ｃ６−ＶＡＳＡＬであり、式中、残基Ｃ３、Ｃ５およびＣ６は上記で定義された通りである。
本発明によれば、式が代替物を列挙する場合、それにより包含される主題のあらゆる組み合わせが明確に開示されたものと考えられる。例えば、第１の残基１に関して３つの代替物Ａ、ＢおよびＣが列挙され、第２の残基２に関して３つの代替物Ｄ、ＥおよびＦが列挙され、第３の残基３に関して３つの代替物Ｇ、ＨおよびＩが列挙されている場合、別途明確に言及しない限り、本明細書は組み合わせＡ、Ｄ、Ｇ；Ａ、Ｄ、Ｈ；Ａ、Ｄ、Ｉ；Ａ、Ｅ、Ｇ；Ａ、Ｅ、Ｈ；Ａ、Ｅ、Ｉ；Ａ、Ｆ、Ｇ；Ａ、Ｆ、Ｈ；Ａ、Ｆ、Ｉ；Ｂ、Ｄ、Ｇ；Ｂ、Ｄ、Ｈ；Ｂ、Ｄ、Ｉ；Ｂ、Ｅ、Ｇ；Ｂ、Ｅ、Ｈ；Ｂ、Ｅ、Ｉ；Ｂ、Ｆ、Ｇ；Ｂ、Ｆ、Ｈ；Ｂ、Ｆ、Ｉ；Ｃ、Ｄ、Ｇ；Ｃ、Ｄ、Ｈ；Ｃ、Ｄ、Ｉ；Ｃ、Ｅ、Ｇ；Ｃ、Ｅ、Ｈ；Ｃ、Ｅ、Ｉ；Ｃ、Ｆ、Ｇ；Ｃ、Ｆ、Ｈ；Ｃ、Ｆ、Ｉに対応する態様を明確に開示していることは理解されるべきである。
【００４３】
同じ考慮は異なる式の組み合わせにも当てはまり、すなわち、コア配列（式Ｉ）のそれぞれの態様は、（（ｂ−ｉ）において定義されたような）Ｎ末端配列のそれぞれの態様と、および／または（（ｂ−ｉｉ）において定義されたような）Ｃ末端配列のそれぞれの態様と組み合わせることができることが意図されている。例えば、それぞれの場合においてアミノ酸Ａ１〜Ａ１９として最初に列挙されたアミノ酸、すなわちＡ１に関してスレオニン、Ａ２に関してバリン、Ａ３に関してロイシン、Ａ４に関してアラニン、Ａ５に関してイソロイシン、等を有するコア配列は、Ｎ１〜Ｎ１６から選択されるあらゆるＮ末端配列と、および／または上記の（ｂ−ｉｉ）において列挙されたＣ末端配列のいずれか１つと組み合わせられてよい。従って、（ａ）のあらゆるアミノ酸配列は、例えばＮ１と組み合わせられてよく；（ａ）のあらゆるアミノ酸配列は、例えばＮ１およびアミノ酸配列ＱＫＭＶＴを有する（ｂ−ｉｉ）（１）のアミノ酸配列と組み合わせられてよく；（ａ）のあらゆるアミノ酸配列は、例えばＮ１およびアミノ酸配列ＮＲＶＡＡを有する（ｂ−ｉｉ）（１）のアミノ酸配列と組み合わせられてよく；（ａ）のあらゆるアミノ酸配列は、例えばＮ１およびアミノ酸配列ＱＫＭＶＡを有する（ｂ−ｉｉ）（１）のアミノ酸配列と組み合わせられてよく、等；（ａ）のあらゆるアミノ酸配列は、例えばＮ２およびアミノ酸配列ＱＫＭＶＴを有する（ｂ−ｉｉ）（１）のアミノ酸配列と組み合わせられてよく；（ａ）のあらゆるアミノ酸配列は、例えばＮ２およびアミノ酸配列ＮＲＶＡＡを有する（ｂ−ｉｉ）（１）のアミノ酸配列と組み合わせられてよく；（ａ）のあらゆるアミノ酸配列は、例えばＮ２およびアミノ酸配列ＱＫＭＶＡを有する（ｂ−ｉｉ）（１）のアミノ酸配列と組み合わせられてよい、等。
【００４４】
医薬組成物の精製された、または部分的に精製された構成要素は、当該技術において既知のあらゆる方法により、そしてあらゆる所望の割合（重量）、好ましくは本明細書において上記で詳述された割合で一緒に混合されることができる。
【００４５】
本発明によれば、驚くべきことに、天然のヒトＨｂγ１鎖に由来する特定のペプチドは、精製されたヒトの単球の刺激において内毒素または細菌性リポタンパク質と相乗作用し、それにより先天および適応免疫応答を調節することができることが分かった。特に、ペプチド：
Ｈｂｇ−３２：ＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）
Ｈｂｇ−３３：ＬＧＮＶＬＶＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷＱＫＭＶＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）
Ｈｂｇ−３４：ＶＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）
Ｈｂｇ−３５：ＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）
Ｈｂｇ−３６：ＬＨＶＤＰＥＮＦＫＬＬＧＮＶＬＶＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）
Ｈｂｇ−３９：ＶＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＬＳＳＲＹＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）
は、添付された実施例において、前記の相乗作用を提供することが示された。さらに、例えば図１３において示されているように、これらのペプチドは、天然のＨｂγ１と比較して高められた内毒素または細菌性リポタンパク質との相乗的活性を提供する。
【００４６】
全てのこれらのペプチドは、優勢なアルファらせん構造を有する。理論により束縛されることを望むわけではないが、発明者らは、この構造はそのペプチドが二重層状脂質、例えばＭＰＬＡを横切ることを可能にし、そうしてこれらの化合物を脱凝集させると仮定している。具体的には、多種多様な相乗的に活性なペプチド中に存在する配列ＴＰＥＶＱＡＳＷＱＫＭＶＴＡＶＡは、脂質膜貫通領域内のＨｂｇペプチドのアルファらせん構造に関して重要であると仮定される。今までに試験した全ての相乗的に活性なペプチド中に存在する別の構造は、配列ＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷである。
【００４７】
しかし、添付された実施例において示されるように、これらの２つのアミノ酸配列のみからなるペプチドは、ほぼ相乗的に不活性であることが分かった（例えば図１９参照）。これは、上記で定義されたようなＮおよび／またはＣ末端アミノ酸配列の存在に反映されているように、隣接するアミノ酸が相乗的活性に重要であることを示した。
【００４８】
加えて、保存的アミノ酸置換に基づくアミノ酸配列の変種は、それらは添付された実施例においてペプチドＨｂｇ−３５として示したペプチドと同一または少なくとも類似の相乗的活性を有すると考えられるため、本明細書において上記で定義されたアミノ酸配列中に含まれる。これは、保存的置換、すなわちその側鎖が類似の生化学的特性を有するアミノ酸の置換は、ペプチドの機能に影響を及ぼさない、またはその機能に最小限にしか影響を及ぼさないと考えられるためである。Ｈｂｇ−３５の残基の保存的アミノ酸置換の要約が、下記の表１において提供されている。
【００４９】
さらに、下記の実施例５において示されるように、ペプチドＨｂｇ−３５の相同配列を有する、Ｈｂα−、Ｈｂβ−およびＨｂγ２鎖に由来するペプチドが、本明細書において追加で調べられた。驚くべきことに、Ｈｂβ−およびＨｂγ２由来のペプチドのみが、Ｈｂｇ−３５と類似の範囲において相乗的に活性であることが分かり、一方でＨｂα由来のペプチドは、最小限の相乗的活性しか示さなかった。この発見の１つの説明は、そのペプチドに関する基礎を形成する構造領域におけるＨｂβ−およびＨｂγ２鎖の、Ｈｂα鎖と比較した場合により近いＨｂγ１鎖に対するアミノ酸配列類似性にある可能性がある（例えば、図２９における四角の中の配列の比較を参照）。
【００５０】
従って、本明細書において上記で定義された構造は、そのようなＨｂβ−およびＨｂγ２由来のペプチドを包含するが、Ｈｂα由来のペプチドは包含しない。
本発明に従う比較的短いペプチドは、より費用対効果が高く、より時間がかからずに生成され、それにより当該技術で以前に用いられていたような完全長胎児性ヘモグロビンの使用を超える利点を提供することができる。
【００５１】
本発明の医薬組成物の好ましい態様において、（ａ）のアミノ酸配列は、ＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＣＶＬＡＨＨＦＧＫＥＦＴＰＰＶＱＡＡＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）からなる群から選択される。
【００５２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列は、添付された実施例においてペプチドＨｂｇ−３２〜Ｈｂｇ−３６、Ｈｂｇ−３９およびＨｂｇ２−７０として示されている特定のペプチドのコア配列であるが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の配列は、特定のペプチドＨｂｂ−６７のコア配列である。添付された実施例において示されているように、全てのこれらのペプチドは、精製されたヒトの単球の刺激において内毒素または細菌性リポタンパク質と相乗作用し、それにより先天および適応免疫応答を調節することができる。
【００５３】
本発明の医薬組成物の別の好ましい態様において、（ｂ−ｉ）のアミノ酸配列は、（ｉ）Ｖ（配列Ｎ１）、（ｉｉ）ＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）および（ｉｉｉ）ＬＨＶＤＰＥＮＦＫＬＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）からなる群から選択され、および／または（ｂ−ｉｉ）のアミノ酸配列は、（ｉ）ＱＫＭＶＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、（ｉｉ）ＱＫＶＶＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、（ｉｉｉ）ＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、（ｉｖ）ＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、（ｖ）ＱＫＭＶＴＧＶＡＳＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、（ｖｉ）ＱＫＶＶＡＧＶＡＮＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）および（ｖｉｉ）ＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＬＳＳＲＹＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）からなる群から選択される。
【００５４】
Ｎ１の配列は、添付された実施例において示されているペプチドＨｂｇ−３４およびＨｂｇ−３９のＮ末端に存在し、一方でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４は、添付された実施例においてペプチドＨｂｇ−３３として示されているペプチドのＮ末端に存在する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の配列は、添付された実施例においてペプチドＨｂｇ−３６として示されているペプチドのＮ末端に存在する。
【００５５】
さらに、Ｃ末端配列は、添付された実施例において示されているペプチド中に以下のように存在する：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６はＨｂｇ−３３中に存在し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７はＨｂｂ−６７中に存在し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８はＨｂｇ−３５中に存在し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９はＨｂｇ−３２中に存在し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０はＨｂｇ２−７０中に存在し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１はＨｂｂ−６７中に存在し、そしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２はＨｂｇ−３９中に存在する。
【００５６】
本発明の医薬組成物のさらにもっと好ましい態様において、ヘモグロビン由来ペプチドは以下の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる：
（ｉ）ＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、
（ｉｉ）ＶＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、
（ｉｉｉ）ＶＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＬＳＳＲＹＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、
（ｉｖ）ＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、
（ｖ）ＬＧＮＶＬＶＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷＱＫＭＶＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、
（ｖｉ）ＬＨＶＤＰＥＮＦＫＬＬＧＮＶＬＶＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、
（ｖｉｉ）ＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷＱＫＭＶＴＧＶＡＳＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、および
（ｖｉｉｉ）ＣＶＬＡＨＨＦＧＫＥＦＴＰＰＶＱＡＡＹＱＫＶＶＡＧＶＡＮＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）。
【００５７】
その活性が添付された実施例において示されているこれらのペプチドは、本発明によれば特に好ましい。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３は、添付された実施例においてペプチドＨｂｇ−３５として示されているペプチドに相当し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４は、添付された実施例においてペプチドＨｂｇ−３４として示されているペプチドに相当し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５は、添付された実施例においてペプチドＨｂｇ−３９として示されているペプチドに相当し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６は、添付された実施例においてペプチドＨｂｇ−３２として示されているペプチドに相当し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７は、添付された実施例においてペプチドＨｂｇ−３３として示されているペプチドに相当し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８は、添付された実施例においてペプチドＨｂｇ−３６として示されているペプチドに相当し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９は、添付された実施例においてペプチドＨｂｇ２−７０として示されているペプチドに相当し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０は、添付された実施例においてペプチドＨｂｂ−６７として示されているペプチドに相当する。ヘモグロビン由来ペプチドは、アミノ酸配列ＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＡＱＡＳＷＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）で構成されていない、またはそれを含まないことが、さらに好ましい。
【００５８】
本発明はさらに、腫瘍の予防および／または治療、感染症の予防および／または治療、アレルギーの予防および／または治療、年齢関連性免疫不均衡の予防および／または治療、先天および適応免疫系の刺激、および／または照射の有害な副作用の緩和における使用のための本発明の医薬組成物に関する。
【００５９】
本発明に従う用語“腫瘍”は、制御されない細胞の分裂を特徴とするクラスの疾患または障害を指し、例えば癌性腫瘍および良性腫瘍ならびに固形腫瘍および非固形腫瘍のような全てのタイプの腫瘍を包含する。癌性腫瘍は、浸潤による隣接組織中への直接の増殖によるか、または転移（ここで、腫瘍細胞は血流またはリンパ系を通して輸送される）による遠隔部位中への移植によるかのどちらかによりこれらの腫瘍が広がる能力により、さらに特性付けられる。
【００６０】
好ましくは、腫瘍は癌性腫瘍（本明細書において癌とも呼ばれる）である。本発明の組成物の投与により治療または予防され得る癌性腫瘍は、例えば前立腺の腺癌などの前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、唾液腺癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、腎臓癌、肺癌、上部胃腸管に関する癌、結腸癌、結腸直腸癌、頭部および首の、または頸部の扁平上皮癌、グリア芽細胞腫、悪性腹水、リンパ腫および白血病ならびに膵臓の腺癌を含むが、それらに限定されない。
【００６１】
本発明に従う感染症は、外来種による宿主生物の有害なコロニー形成である。感染症において、感染する生物は、（通常は宿主を犠牲にして）増殖するために宿主の資源を利用しようとする。感染症に対する宿主の応答は炎症である。感染症は、例えば細菌、ウイルスおよび酵母細胞、真菌、蠕虫等のような単細胞または多細胞構造のどちらかの真核生物による感染症を含む。
【００６２】
本発明に従う細菌感染症、またはそれに起因する病気は、細菌性髄膜炎、コレラ、ジフテリア、リステリア症、百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）（百日咳（Ｗｈｏｏｐｉｎｇ  Ｃｏｕｇｈ））、肺炎球菌性肺炎、サルモネラ症、破傷風、チフスまたは尿管感染症を含むが、それらに限定されない。
【００６３】
本発明に従うウイルス感染症、またはそれに起因する病気は、単核細胞症、ＡＩＤＳ、水痘、感冒、サイトメガロウイルス感染、デング熱、エボラ出血熱、手足口病、ヘルペス、肝炎、インフルエンザ、流行性耳下腺炎、急性灰白髄炎、狂犬病、天然痘、ウイルス性脳炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性肺炎または黄熱を含むが、それらに限定されない。
【００６４】
本発明に従う真菌感染症、またはそれに起因する病気は、アスペルギルス症、分芽菌症、カンジダ症、コクシジオイデス症、クリプトコッカス症、ヒストプラスマ症または足部白癬を含むが、それらに限定されない。
【００６５】
本発明に従って特に好ましいのは、前記の感染症がウイルス感染症、特に慢性ウイルス感染症、より好ましくはヘルペス、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎感染症であることである。
本発明に従うアレルギーは、１型アレルギー、枯草熱およびアレルギー性喘息を含む。
【００６６】
本発明に従う年齢関連性免疫不均衡は、通常は不可逆的な時間の経過に伴う免疫不均衡の発生に関する。本発明の医薬組成物の好ましい態様において、前記の年齢関連性免疫不均衡は、異常なサイトカイン産生を含む。本発明の医薬組成物のより好ましい態様において、前記の年齢関連性の異常なサイトカイン産生は、増大したＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８および／またはＩＬ−１０産生および／または減少したＩＬ−２産生である。本発明の医薬組成物によれば、前記の年齢関連性免疫不均衡の予防および／または治療がマクロファージの活性化に関連することがさらに好ましい。
【００６７】
場合により、本発明の医薬組成物は、腫瘍、感染およびアレルギーに対する増大した易罹患性を含む、加齢の生理学的または病態生理学的結果を停止させる、または遅らせるために開発されたさらなる医薬的に有効な化合物と一緒に投与されてよい。
【００６８】
腫瘍の治療および感染症の予防を含むＬＰＳの医学的適用は、１世紀よりも前から広められたが、発熱および低血圧のような副反応によりしばしば妨げられた。最近、本発明者らにより、内毒素および胎児性ヘモグロビンを含む製剤は、強くマクロファージを活性化し、腫瘍細胞毒性を誘導し、腫瘍増殖を阻害し、そして加齢と関連する免疫状態を若者の免疫状態へと逆行させることが示された（国際公開第２００４／０７３７２８号）。これらの製剤は、照射の有害な反応を阻止するための手段として、例えば照射による腫瘍の治療における有害な副作用を回避または低減するためのアジュバントとして適切であることも分かった。
【００６９】
添付された実施例において示されているように、本発明のペプチドは、ＴＬＲ活性化両親媒性脂質、特に内毒素または細菌性リポタンパク質との、天然のＨｂγ１と比較して高められた相乗的活性を提供し（例えば図１３を参照）、結果として、上記で列挙された医学的アプローチにおいて好都合に用いられ得る。
【００７０】
本発明は、さらに以下のものからなるヘモグロビン由来ペプチドに関する：
（ａ）アミノ酸配列ＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）；ならびに
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列のＮ末端に位置するアミノ酸配列および／または（ａ）のアミノ酸配列のＣ末端に位置するアミノ酸配列、
ここで、
（ｂ−ｉ）（ａ）のアミノ酸配列のＮ末端に位置するアミノ酸配列は以下の配列からなる群から選択され：
（ｉ）Ｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、
（ｉｉ）ＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）および
（ｉｉｉ）ＬＨＶＤＰＥＮＦＫＬＬＧＮＶＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）および／または
そして
（ｂ−ｉｉ）（ａ）のアミノ酸配列のＣ末端に位置するアミノ酸配列は以下の配列からなる群から選択される：
（ｉ）ＱＫＭＶＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、
（ｉｉ）ＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、
（ｉｉｉ）ＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、
（ｉｖ）ＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＬＳＳＲＹＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）。
【００７１】
本発明のこの新規のヘモグロビン由来ペプチドは、本明細書において上記で記載した用途のいずれかにおいて好都合に用いられ得る。従って、本明細書において上記で医薬組成物に関して提供された定義ならびに好ましい態様は、必要な変更を加えて本発明のヘモグロビン由来ペプチドに関する態様にも適用される。例えば、医薬組成物の調製、投与または使用の好ましい態様は、上記で定義されたペプチドの好ましい態様においてそれらの対応物を有する。
【００７２】
本発明のヘモグロビン由来ペプチドの好ましい態様において、ペプチドは以下の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる：
（ｉ）ＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、
（ｉｉ）ＶＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、
（ｉｉｉ）ＶＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＬＳＳＲＹＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、
（ｉｖ）ＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、
（ｖ）ＬＧＮＶＬＶＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷＱＫＭＶＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）および
（ｖｉ）ＬＨＶＤＰＥＮＦＫＬＬＧＮＶＬＶＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）。
【００７３】
本発明のヘモグロビン由来ペプチドのより好ましい態様において、ペプチドは細菌感染症の治療における使用のためのものである。
リポタンパク質は、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、マイコプラズマおよびマイコバクテリアの細胞膜の一部である。さらに、内毒素も、グラム陰性細菌の細胞壁の外膜の一部である。従って、本発明のペプチドは、本発明のペプチドのリポタンパク質または内毒素との組み合わせの相乗的、療法的作用から利益を得るために、そのような病原体に感染した患者に単独で（ｏｎ  ｉｔｓ  ｏｗｎ）投与されてよい。例えば医薬的に許容できるキャリヤーまたはアジュバントのような追加の構成要素も、患者に投与されてよい。本明細書において上記で医薬組成物に関して提供された定義ならびに好ましい態様の全部が、細菌感染症の治療における使用のための本発明のヘモグロビン由来ペプチドに関するこの態様にも適用される。
【００７４】
本発明のペプチドを用いた治療を施すことができる細菌感染症を引き起こすグラム陰性病原体の非限定的な例は、大腸菌、サルモネラ属、シゲラ属、シュードモナス属、ナイセリア属、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）およびビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）を含む。加えて、本発明のペプチドを用いた治療を施すことができる細菌感染症を引き起こすグラム陽性病原体の非限定的な例は、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、バシラス属、クロストリジウム属およびリステリア属を含み、一方で本発明のペプチドを用いた治療を施すことができる細菌感染症を引き起こすマイコプラズマの非限定的な例は、マイコプラズマ・ファーメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）およびマイコプラズマ・サリバリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓａｌｖａｒｉｕｍ）を含み、そして本発明のペプチドを用いた治療を施すことができる細菌感染症を引き起こすマイコバクテリアの非限定的な例は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｏｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム・レプレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、およびマイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）を含む。
【００７５】
本発明によれば、独立項および／または従属項が代替物を列挙しない場合、従属項が複数の先行する請求項を戻って参照するならば、それにより包含される主題のあらゆる組み合わせが明確に開示されたものと考えられることは理解されている。例えば、独立項１、請求項１を戻って参照する従属項２、および請求項２および１の両方を戻って参照する従属項３の場合、請求項３および１の主題の組み合わせは明白かつ明確に開示されており、請求項３、２および１の主題の組み合わせも明白かつ明確に開示されていることになる。請求項１〜３のいずれか１項を参照するさらなる従属項４が存在する場合、請求項４および１の、請求項４、２および１の、請求項４、３および１の、ならびに請求項４、３、２および１の主題の組み合わせが明白かつ明確に開示されていることになる。
【実施例】
【００７６】
実施例は本発明を説明する：
実施例１：材料および方法
Ｈｂγ、ペプチド、およびＭＰＬＡ
全ての合成ペプチドは、ＥＭＣ  ｍｉｃｒｏｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ＧｍｂＨ（ドイツ、テュービンゲン）において調製され、そこから得られた。短い長さのペプチド（１５〜１６アミノ酸）は、沈殿により精製され、それらの構造がＭＳ分析により検証された。長い長さのペプチドは、ＨＰＬＣにより精製され、９５％より大きい純度を有することが示された。ペプチドライブラリーのペプチドは、ＤＭＳＯ中で１０ｍＭの濃度において溶解された。全ての他のペプチドは、０．９％ＮａＣｌ中で１０ｍＭの濃度において溶解された。Ｈｂγ鎖に由来するペプチドは、Ｈｂｇ−＃＃−＊＊＊と名付けられた。＃＃の数はペプチドの番号を指し、＊＊＊の数はロット番号を指す。対応して、Ｈｂα鎖またはＨｂβ鎖に由来するペプチドはそれぞれＨｂａおよびＨｂｂと名付けられた。
【００７７】
化学精製された天然Ｈｂγ鎖はＪ．Ｐ  Ｍａｃｈ教授（ローザンヌ）により調製された。それらは０．９％ＮａＣｌ中で１００μＭの濃度において溶解された。
ＭＰＬＡはＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ｉｎｃ．（米国アラバマ州アラバスター）から得られた。ＭＰＬＡは、ａｑｕａ  ａｄ  ｉｎｊｅｃｔａｂｉｌｉａ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ  ＡＧ、ドイツ、メルズンゲン）中で５サイクルのボルテックス（３０分間）および音波浴中でのインキュベーション（１５分間）により２５０μｇ／ｍｌの濃度で溶解された。
【００７８】
細胞培養
ヒト単核細胞（ＭＮＣ）を、健康な提供者の末梢血から、Ｆｉｃｏｌｌ勾配媒体（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ、オーストリア、パシング）上での密度勾配遠心分離により単離した。細胞を、１μｇ／ｍｌのペニシリンおよび１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で懸濁および培養した。５０μｌのペプチド溶液を、５０μｌのＭＰＬＡ溶液と共にＵ型９６ウェルマイクロ細胞培養プレート＃３７９９（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  ＧｍｂＨ、ドイツ、ボーデンハイム）中で３７℃において１５分間インキュベートした。このインキュベーション期間の後、２０μｌの熱非働化（５６℃／３０分間）ヒト血清またはＲＰＭＩ−１６４０培地を添加した。最後に、８０μｌのＭＮＣ細胞懸濁液を添加して、ヒト血清の非存在下での培養に関して１〜２×１０６細胞または血清の存在下での培養に関して１×１０６細胞の終濃度を得た。２０時間の培養時間の後、細胞を遠心沈殿させ、培養上清を回収した。上清中のサイトカイン濃度を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｍｂＨ、ダルムシュタット（ドイツ）から得たＥＬＩＳＡのための対応する抗体の対により決定した。大部分は、それぞれの値は２通りの培養物の平均±ＳＤを表す。図３では、３つの独立した実験が与えられ、これらの３つの独立した実験のそれぞれが２通りの培養物を有する。
【００７９】
Ｔリンパ球の刺激に関して、ヒトＭＮＣを、１μｇ／ｍｌのペニシリン、１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン、および１０％の非働化ヒト血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で、１ｍｌあたり０．５〜１．０×１０６細胞の濃度で、平底９６ウェル組織培養プレートにおいて培養した。ＭＰＬＡおよびＨｂｇペプチドのアジュバント作用を調べるため、リコール抗原である破傷風トキソイド（ＴＴ）およびＭ．ツベルクローシスの精製されたタンパク質の誘導体（ＰＰＤ）（両方ともＳｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、デンマーク、コペンハーゲンから）を用いた。６日間の培養後、細胞を３Ｈ−チミジン（３ＨＴｄＲ；２Ｃｉ／ｍｍｏｌ、０．２μＣｉ／培養）で標識し、さらに１日培養した後、細胞をガラスフィルターマット上にＤＮＡ中に組み込まれた放射活性の測定のために回収した。結果は２通りの培養物の平均±ＳＤとして表されている。
【００８０】
ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションおよび培養のため、細胞を、９６ウェルプレートにおいて１．５×１０５／ｍｌの密度で、１０％ＦＣＳ、０．５単位／ｍｌのペニシリンおよび０．５μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補ったＤＭＥＭ中でまいた。次の日に、細胞をＰｏｌｙｆｅｃｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ、ドイツ、ヒルデン）を製造業者のプロトコルに従って用いて一過性トランスフェクションした。ｈｕＴＬＲ４、ｈｕＭＤ２、およびｈｕＣＤ１４を含有する発現プラスミドを、トランスフェクションあたり２００ｎｇで用いた。６時間のトランスフェクション後、細胞を洗浄し、図中に示されているようなリガンドを用いてさらに２０時間刺激した。培養上清中のＩＬ−８含有量を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｍｂＨ、ダルムシュタット（ドイツ）から得たＥＬＩＳＡのための対応する抗体の対を用いて定量化した。それぞれの値は２通りの培養物の平均±ＳＤを表す。
【００８１】
統計学的分析を、必要に応じてスチューデントの対応のあるｔ検定またはマン・ホイットニーの順位和検定をＳｉｇｍａ  Ｐｌｏｔソフトウェアの助けにより用いて実施した。差はｐ＜０．０５において有意であると考えられた。
【００８２】
レーザー光散乱
異なる濃度でのＨｂｇ−３２ペプチドの非存在下および存在下におけるＭＰＬＡ懸濁液（０．１ｍＭ）の大きさおよび大きさの分布を、Ｍａｌｖｅｒｎ粒径測定器（Ｍａｌｖｅｒｎ、ドイツ、ヘルシング）上で実施した。光散乱強度を９０°の散乱角においてモニターし、強度を記録し、球状粒径を仮定することにより評価した。
【００８３】
フリーズフラクチャー透過型電子顕微鏡観察（ＦＦＴＥＭ）
少量の試料を２つの銅プロフィールの間に挟み、そのサンドイッチをすぐに液体窒素中で冷却した液化エタン−プロパン混合物中に沈めることにより凍結させた。破砕およびレプリカ作製を、電子銃および薄膜シート厚モニターを備えたＢＡＦ  ４００Ｔフリーズフラクチャー装置（ＢＡＬ−ＴＥＣ、リヒテンシュタイン、バルザース）において−１５０℃で実施した。レプリカ作製に関して、Ｐｔ（Ｃ）を３５°の角度の下で蒸発させ、（Ｃ）を９０°の角度の下で蒸発させた。レプリカを銅格子上に置き、クロロホルム−メタノール混合物により洗浄した。
【００８４】
小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）
ＳＡＸＳ測定は、欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）支所においてハンブルクシンクロトロン放射施設ＨＡＳＹＬＡＢでカメラＸ３３を用いて実施された。散乱ベクトル０．１＜ｓ＜１．０ｎｍ−１（ｓ＝２ｓｉｎθ／λ、２θは散乱角であり、λは波長＝０．１５ｎｍである）の範囲の回折パターンを、オンライン読み出しを有するイメージプレート検出器（ＭＡＲ３４５、ＭａｒＲｅｓｅａｒｃｈ、ノルダーシュテット／ドイツ）を用いて、４０℃において１分間の曝露時間で記録した。脂質濃度は全ての場合において２０ｍＭであった。ｓ軸を、５８．４ｎｍの周期性を有するベヘン酸Ａｇを用いて較正した。回折パターンを、以前に記載された(Howe et al. (2008a))ように評価し、主な散乱極大の間隔比率を定められた三次元構造に割り当てた。層状および立方体構造がここでは最も関連している。以下の特徴は、超分子構造を特性付ける：
（１）層状：反射は、層反復距離ｄλの等距離の比率、すなわち１、１／２、１／３、１／４等にグループ化される；
（２）立方体状：これらの非層状三次元構造の異なる空間群は、それらの間隔の比率において異なっている。間隔の逆数ｓｈｋｌ＝１／ｄｈｋｌおよび格子定数ａの間の関係は以下の通りである：
ｓｈｋｌ＝［（ｈ２＋ｋ２＋ｌ２）／ａ］１／２
（ｈｋｌ＝対応する平面のセットのミラー指数）
フェルスター（蛍光）共鳴エネルギー移動分光法（ＦＲＥＴ）
Ｈｂｇ−３２のＭＰＬＡ凝集体中へのインターカレーションを、プローブ希釈アッセイとして適用されたＦＲＥＴ分光法により決定した。ＭＰＬＡを供与体色素ＮＢＤ−ホスファチジルエタノールアミン（ＮＢＤ−ＰＥ）および受容体色素ローダミン−ＰＥにより標識した。供与体色素を４７０ｎｍにおいて励起し、その発光強度を５３１ｎｍにおいて測定した。ＦＲＥＴ方法論において、供与体発光蛍光強度は無放射過程（ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｌｅｓｓ  ｐｒｏｃｅｓｓ）において受容体に移動し、それは供与体発光波長（５３１ｎｍ）に対応する励起波長を有する。Ｈｂγペプチドを、ＭＰＬＡ（０．０１ｍＭ）に０．０１または１ｍＭの終濃度で添加した。インターカレーションを、時間依存的様式での５３１ｎｍにおける供与体発光強度Ｉｄの比率の［５９３ｎｍ（ＦＲＥＴシグナル）における］受容体発光強度ＩＡの比率に対する増大としてモニターした。
【００８５】
原子間力顕微鏡分析
原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）は、ほぼ生理的条件下における分子スケールでの脂質凝集体の形態への直接の観察を可能にする。これは、１ｎｍより低い解像限界に至るまでのＭＰＬＡ分散物の深度プロフィールを得ることを可能にする。その分析のために、ＭＰＬＡ分散物を、等モル含有量のＨｂｇ−３２の非存在下および存在下で、生理食塩水中で２５μＭの濃度で調製した。
【００８６】
等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）
ＭＰＬＡに結合するペプチドの微量熱量測定を、ＭＣＳ等温滴定型熱量計（Ｍｉｃｒｏｃａｌ  Ｉｎｃ．）において３７℃で、最近記載された(Kaconis et al. (2011))ように実施した。ＭＰＬＡ（０．０５ｍＭ）（上記のように調製した）を微量熱量測定セル（容積１．３ｍｌ）中に分注し、ペプチド溶液（１ｍＭ）を注射器区画（容積１００μｌ）中に充填した。温度平衡後、ペプチドを３μｌずつ５分ごとに、一定の撹拌の下で、脂質を含有するセル中に滴定し、ＩＴＣ機器により測定されたそれぞれの注入後の相互作用の熱を時間に対してプロットした。このアッセイにおいて、２つのリガンド間の吸熱反応は上向きのピークをもたらし、発熱反応は下向きのピークをもたらす。
【００８７】
フーリエ変換赤外分光法
赤外分光測定を、ＩＦＳ−５５分光計（Ｂｒｕｋｅｒ）において実施した。ペプチドおよびＭＰＬＡ：ペプチド混合物を２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．０中で分散させ、ＺｎＳｅ減衰全反射（ＡＴＲ）ユニット上で広げた。フリーの（ｆｒｅｅ）緩衝溶液を蒸発させた後、試料の１００インターフェログラムを蓄積し、アポダイズし、フーリエ変換し、吸光度スペクトルに変換した。赤外スペクトルをアミドＩ振動（主にＣ＝Ｏの伸縮振動）の範囲で評価し、そのピークの位置はＨｂγ３５ペプチドの二次構造に特徴的である。通常、αらせん構造は１６５５〜１６６２ｃｍ−１のピーク位置においてみつかり、一方でβシート構造は約１６３０ｃｍ−１の主な吸収極大を示す。
【００８８】
実施例２：合成Ｈｂγ由来ペプチドおよびＭＰＬＡの間の相乗作用
既知のｈｕＨｂ−γ１アミノ酸配列（uniprot.org/uniprot/P69891におけるワールドワイドウェブを参照）からの、それぞれ１５または１６個のアミノ酸を有する２７種類の重複するヒト（ｈｕ）Ｈｂ由来ペプチドのペプチドライブラリーを生成した。そのペプチドは、水溶液中でのペプチドの可溶性を高めるために、Ｎ末端で５個のリジン残基に連結されていた（図１）。これらのリジンに連結されたペプチドのいくつかは、ＭＰＬＡによるＭＮＣの刺激の間に増強活性を示した（図２）。しかし、これらのペプチドの一部は、ＭＰＬＡの非存在下でもかなりの刺激活性を有し（図２）、加えて、リジンに連結されたペプチドは多形核白血球を非特異的な方式で活性化することが知られている。従って、２７種類の天然の（すなわち非修飾の）重複するペプチドの対応するライブラリー（図３）を代わりに生成した。これらの天然のＨｂγ由来ペプチドのいくつかの天然ペプチドは、ＭＰＬＡによるＭＮＣの刺激の間に相乗的活性を示すことが分かった（図４）。特に、ペプチド２３番（Ｈｂγ１１−１２５）および２４番（Ｈｂγ１１６−１３０）は、ヒトＭＮＣにおけるＭＰＬＡに誘導されるサイトカイン放出の増強において強い相乗的活性を示した。これらの天然ペプチドのいずれも、ＭＰＬＡの非存在下ではサイトカイン誘導能力を一切示さなかった。
【００８９】
ペプチドＨｂｇ−２３およびＨｂｇ−２４は最高の成功を示した。従って、両方の混合されたアミノ酸を有するペプチド、すなわちＶＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷを合成し、それをＨｂｇ−３４（Ｈｂγ１１１１−１３０）と呼んだ。このペプチドは、Ｈｂｇ−２３およびＨｂｇ２４と類似した程度のＭＰＬＡとの相乗的活性を示した（図５）。
【００９０】
Ｃ末端ペプチドのほとんど（ペプチド２０番〜２７番）は生理活性であったため、Ｈｂｇ−３０−１０５（Ｈｂγ８６−１１５）、Ｈｂｇ−３１−１０６（Ｈｂγ９９−１２８）、およびＨｂｇ−３２−１０７（Ｈｂγ１１２−１４１［Ｌ１４１Ｑ］）と名付けた３種類のより長い重複するペプチドを合成した（図６）。Ｈｂｇ−２３と比較して、延長されたペプチドＨｂｇ−３２−１０７はＭＰＬＡに誘導される免疫刺激に関して増大した相乗作用を示すことが分かった（図７）。
【００９１】
Ｈｂｇ−２３およびＨｂｇ−３２−１０７は両方とも、ＭＮＣのＭＰＬＡ刺激の間にヒト血清の非存在下ならびに存在下において相乗作用を示した（図８）。ＭＮＣの刺激における相乗作用に加えて、Ｈｂｇ−２３およびＨｂｇ−３２−１０７は精製されたヒト単球の刺激においてもＭＰＬＡと相乗作用することが示された（図９）。
【００９２】
Ｃ末端が延長されたＨｂｇペプチドのこれらの相乗作用を確証するため、２種類の追加のＨｂｇ−３２−１０７の調製物、すなわちＨｂｇ−３２−１０８、およびＨｂｇ−３２−ＫＢを生成し、分析した。Ｈｂｇ−３２−１０８およびＨｂｇ−３２−ＫＢは、Ｈｂｇ−３２−１０７に匹敵する相乗作用を示すことが分かった（図１０）。しかし、Ｈｂｇ−２３の第２バッチは、ヒトＭＮＣにおけるＩＬ放出の誘導の間にＭＰＬＡとの相乗作用を示さなかった（データは示していない）。
【００９３】
これらのデータは、Ｈｂｇペプチド、特にＨｂｇ−３２はＭＮＣにおけるＩＬ−６およびＩＬ−８の放出の誘導の間にＭＰＬＡと相乗作用することを示している。図１１において示されているように、Ｈｂ−３２（バッチ１１３）のこの相乗作用はＩＬ−６およびＩＬ−８の放出に限定されるだけでなく、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαの放出に関しても見られた。
【００９４】
ＭＰＬＡはＬＰＳの部分構造であるため、Ｈｂｇ−３２は、このペプチドのＭＰＬＡに関連する作用と比較して、完全なＬＰＳによるＭＮＣの刺激においても相乗作用を示すかどうかを調べた。図１２において示されているように、両方の内毒素化合物の免疫刺激活性は、Ｈｂｇ−３２により相乗的に高められることが分かった。
【００９５】
最後に、Ｈｂｇ−３２の相乗作用を完全なＨｂγ鎖、すなわちＨｂ−γ−１３３の相乗作用と比較した。天然のＨｂγと比較して、Ｈｂｇ−３２−１０７はＭＮＣの刺激の間により高い相乗的活性を示すことが分かった（図１３）。これらの結果は、Ｈｂｇ−３２のＭＰＬＡとの相乗的活性は天然のＨｂγ鎖全体の活性を超えていることを示している。
【００９６】
研究のこの段階において、データ転送におけるエラーにより、Ｈｇｂ−３２ペプチドの合成においてＣ末端アミノ酸残基が不正確に選択されていたことが認められた。天然のＨｂγ１配列に存在するようなロイシン（Ｌ１４１）の代わりに、Ｈｇｂ−３２ではグルタミン（Ｑ）残基が導入されていた。従って、Ｈｂγ配列の正確な天然のアミノ酸を有するＨｇｂペプチド、すなわち配列ＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷＱＫＭＶＴＡＶＡＳＡＬを有するＨｂｇ−３５が合成された。このペプチドの相乗作用は、細胞の培養の間のヒト血清の存在下または非存在下でＨｂｇ−３２により媒介される相乗作用に似ていた（図１４Ａおよび１４Ｂ）。Ｈｇｂ−３２に存在するようなＣ末端の極性／中性のグルタミンは、ＭＰＬＡによる相乗作用を損なうことなく非極性／中性のロイシンにより置き換えられ得る、と結論付けることができる。従って、以下の実験では、天然の配列を使用するために、Ｈｇｂ−３２ペプチドの代わりにＨｂｇ−３５ペプチドが用いられた。
【００９７】
以下の実験は、相乗作用の原因であるＨｂｇ−３５の活性領域を特性付けるために行われた。従って、Ｈｂｇ−３５ペプチドの配列をＨｂｇタンパク質のＮ末端およびＣ末端に対して伸長した、もしくは切り詰めた、および／またはＨｂγ１タンパク質のＮ末端に向けて移動させたＨｂｇ由来のペプチドを合成した。図１４および１５において示されているデータは、全ての合成されたＨｂｇペプチドはインビトロでのＭＰＬＡの炎症活性との相乗作用に関して生物学的に活性であることを示している。しかし、Ｃ末端を切り詰めた、および／またはＮ末端側に移動させたペプチドは、Ｈｂｇ３５と比較してより低い程度の相乗的活性を示し（図１５および１６）、一方でＨｂｇ−３５配列のＣ末端の天然のＨｂγ１タンパク質の末端までの伸長は、相乗作用をいくらか増進する（図１６）ことを示す傾向が存在する。
【００９８】
次に、特定のアミノ酸のＨｂｇ−３５の安定性または機能への寄与を決定するため、アラニンスキャンを実施した。この技法では、図１７においてＨｂｇ−３５に関して示されているように、ペプチドの全ての個々のアミノ酸をアラニンにより置き換える。合成した２５種類のＨｂｇペプチドから、Ｈｂｇ−５１、Ｈｂｇ−５４、およびＨｂｇ−５５に存在するような３種類のアラニン置換は、Ｈｂｇ−３５の相乗的活性に影響を及ぼすことが分かった（図１８）。Ｈｂｇ−５１に存在するようなＰｈｅ１２２／Ａｌａ置換はＨｂｇ−３５の相乗的活性を増強したが、Ｇｌｕ１２５／ＡｌａおよびＶａｌ１２６／Ａｌａの置換は相乗作用を消滅させた。全ての３種類の置換は、強い相乗的活性を有することが分かったＨｂｇ−２３およびＨｂｇ−２４の配列内に位置している（図５）。しかし、やはりこれらのアミノ酸が含まれているＨｂｇ−２５は、不活性である。これは、Ｆ１２２、Ｅ１２５、およびＶ１２６と一緒に、追加のアミノ酸がＨｂｇ−３５の安定性および／または機能に参加していることを示している。
【００９９】
全ての相乗的に活性なＨｂｇペプチドは、優勢なアルファらせん構造、すなわちＴＰＥＶＱＡＳＷＱＫＭＶＴＡＶＡを有し、それはＭＰＬＡのような二重層状脂質を横切り、そうしてこれらの化合物を脱凝集させると仮定され得る。その二次構造は、ＬＯＭＥＴＳおよび３Ｄ−ＪＩＧＳＡＷのようなインターネットプログラムにより予測された。加えて、これらのＨｂｇペプチドの共通する部分構造はＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷである。従って、これらのペプチドを合成し、それらのＭＰＬＡとの相乗的活性を決定した。しかし、これらのペプチドは微小な相乗的活性しか示さないか、または全く活性を示さないことが分かった（図１９）。これは、これらの配列は最適な相乗作用に十分ではなく、追加のＮおよび／またはＣ末端アミノ酸が必要であることを示している。
【０１００】
実施例３：リコール抗原によるＴリンパ球の活性化におけるＭＰＬＡおよびＨｂｇ−３５の寄与
単球および樹状細胞により与えられるような先天免疫系、ならびにＴリンパ球およびＢリンパ球により与えられるような適応免疫系の間には、密接な相互作用が存在する。単球および樹状細胞は、適応免疫系の細胞に抗原断片を提示して特異的な免疫反応を開始する。加えて、それらは、サイトカインの放出により免疫応答の強さおよび極性化を支援する。本研究に関して、Ｍ．ツベルクローシスの精製されたタンパク質の誘導体（ＰＰＤ、皮膚ツベルクリン感受性検査のために用いられる）および破傷風トキソイド（ＴＴ、破傷風ワクチンとして用いられる）によるヒトＭＮＣの細胞調製物中のＴ記憶リンパ球の活性化のモデルを用いた。この細胞系において、記憶Ｔリンパ球のみが特異的な方式でこれらの抗原に応答する。これは、血液の供与者が細菌感染のエピソードの間に、またはワクチン接種の間にこれらの抗原との一次接触を有していることを必要とする。
【０１０１】
ヒトＭＮＣのＰＰＤおよびＴＴによる刺激後に、ＭＰＬＡはリコール抗原による記憶Ｔ細胞の刺激に対する非常に有効なアジュバント活性を有することが分かった。１０ｎｇ／ｍｌほどの少ないＭＰＬＡでも、ほぼ最適なアジュバント作用を発揮するために十分である（図２０）。一部の実験（例えば図２０Ａ）において、ＭＰＬＡ単独によるＴリンパ球の増殖が観察された。しかし、ＭＰＬＡのアジュバント作用は、ＭＰＬＡ単独に対するＴリンパ球の応答が検出されない実験（例えば図２０Ｂ）においても観察された。ＰＰＤおよびＴＴに誘導されるＴリンパ球の増殖に対するＭＰＬＡのアジュバント作用は、Ｈｂｇ−３５の添加により増強されることができ（図２１Ａおよび２１Ｂ）、これは、ＭＰＬＡおよびＨｂｇ−３５を含む組成物は適応免疫系においても相乗的に活性であることを示している。
【０１０２】
実施例４；合成Ｈｂγ由来ペプチドおよびＭＰＬＡの間の相乗作用の機序
Ｈｂｇ−３２ペプチドのＭＰＬＡとの相乗的活性の分子機序を調べるため、物理学的方法を適用した。内毒素の凝集体構造は、免疫細胞においてサイトカインを誘導するそれの能力の決定要因である。この凝集体構造を、ペプチドの非存在下および存在下でシンクロトロン放射Ｘ線小角散乱を実施することにより特性付けた。ＭＰＬＡ単独の構造は、大部分が多層状であることが分かり（図２２Ａ）、これは生理活性を有しないか低い生理活性しか有しない凝集形態に対応する。ペプチドの存在下では、この凝集体は、以前に内毒素の生理活性形態に相当することが示された（１０）立方体状の対称性を有する形態へと変換されることが分かった（図２２Ｂ）。
【０１０３】
内毒素の凝集体中に組み込まれるＨｂの能力は、相乗作用に関する重要な特性であることが示された。フェルスター（蛍光）共鳴エネルギー移動分光法を適用して、Ｈｂｇ−３２ペプチドのＭＰＬＡ凝集体中へのインターカレーション挙動をモニターした。既に１０：１の［ＭＰＬＡ］：［Ｈｂｇ−３２］モル比においてペプチドのＭＰＬＡ中へのかなりのインターカレーションが見付かっており、これは等モル濃度においてはるかに顕著であった（図２３）。
【０１０４】
Ｈｂの作用による内毒素の脱凝集は、生理活性の増進に関するさらなる必要条件である(Howe et al. (2008a); Brandenburg et al. (2003); Howe et al. (2007); Howe et al. (2008b))。従って、ペプチドを伴う、または伴わないＭＰＬＡ凝集体の大きさの分布を、粒子をセル中でのレーザー光散乱によりモニターすることにより決定した。その結果は、ペプチドなしでのＭＰＬＡに関して５００〜２０００ｎｍの範囲のかなり大きいＭＰＬＡの粒径を示している（図２４）。ペプチドを添加すると、８０〜３００ｎｍの範囲の広い分布を有するこれらの大きさの劇的な減少が観察された。
【０１０５】
レーザー光散乱からの大きさの分布のデータは球状粒子を仮定することによってのみ有効であるため、ＭＰＬＡの形態を、独立した方法であるフリーズフラクチャー電子顕微鏡法により研究した。これは、試料を衝撃凍結することにより脂質の構造を維持することを可能にする。ＭＰＬＡ単独に関する結果は、上記の結果と一致して、マイクロメートルの範囲の大きな大きさを有する、非常に密に、そして層状に充填された凝集体を示している（図２５Ａ）。ペプチドの存在下では、形態における変化を伴う粒径の強い低減があり、これは充填配置の２０〜数１００ｎｍの大きさの範囲の球形様の凝集体への溶解をもたらす（図２５）。これらの結果は、光散乱により得られたデータと一致している。
【０１０６】
原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）は、ほぼ生理的条件下における分子スケールでの脂質凝集体の形態への直接の観察を可能にする。これは、１ｎｍより低い解像限界に至るまでのＭＰＬＡ分散物の深度プロフィールを得ることを可能にする。そのデータは、雲母プレート上に広がった純粋なＭＰＬＡに関して、ｚ方向において数１００ｎｍの伸びを有する密に充填された多層状凝集体の存在を示している。脂質分散物上に注意深く広げたペプチドは、脂質凝集体と受動拡散によってのみ相互作用する。この投与技法は、通常は数分間の時間尺度で起こる２種類の化合物の間の混合プロセスが数時間まで減速され、そうして相互作用プロセスの詳細な分析を可能にする利点を有する。
【０１０７】
ＭＰＬＡの会合を見れば分かるように、Ｈｂｇ−３２の存在下（図２６Ａおよび２６Ｂ；１時間後に記録した）では、密に充填された層が、多層を崩して二層構造にすることにより劇的に脱凝集している。ペプチドの作用様式は、そのＭＰＬＡ二層中への膜貫通性の組み込みであり、そうして層状の単位の大きさをかなり低減する。
【０１０８】
これらのデータは、フリーズフラクチャーによる電子顕微鏡データ（図２５Ａおよび２５Ｂ）およびＳＡＸＳ実験（図２２）と一致しており、ここでペプチドが生物学的活性における増大を引き起こすという観察の明確な画像を与えている：相当により小さいＭＰＬＡ粒子は、ＭＰＬＡにより誘導される炎症反応の原因であるＣＤ１４およびＬＢＰのような血清タンパク質および膜タンパク質にはるかによく結合することができる。
【０１０９】
等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）により、２種類の異なる分子種の相互作用の熱力学を推測することができる。図２７において、［Ｈｂγ３５］：［ＭＰＬＡ］モル比に対して測定された相互作用の力およびエンタルピー変化は、（ｉ）吸熱反応（ピークが上方向を向いている）のみが起こっていること、ならびに（ｉｉ）時間およびモル比に対するエンタルピー変化のわずかな低下しか存在しないことを示している。この観察は、さらに高いモル比に関しても当てはまることが分かり、すなわち、ペプチドのＭＰＬＡ凝集体との相互作用は非飽和性の挙動を示す。これは、（複合体を形成するであろう）典型的な結合反応ではなく触媒的であることを示しており、発熱反応が起こり結合の飽和をもたらす抗微生物性ペプチドの内毒素との作用とは対照的である。
【０１１０】
最後に、ペプチドの二次構造に関する情報を得るため、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）を適用した。図２８において、純粋なＨｂγ３５のスペクトル（上）およびＨｂγ３５：ＭＰＬＡ混合物のスペクトル（下、１：１のモル濃度）がプロットされている。見て分かるように、両方の図は、約１６５９ｃｍ−１の主要な吸収極大および約１６２８ｃｍ−１の第２のピークを示しており、それは主要なαらせん構造およびより小さいβシート構成要素を示すものである。重要なことだが、脂質の添加はペプチドの二次構造に影響を及ぼさない。これもやはり、触媒反応ではなくペプチドの直接の結合はその二次構造の変化をもたらすと考えられるため、上記で示したデータと一致している。
【０１１１】
実施例５：Ｈｂα、ＨｂβおよびＨｂγ２鎖に由来するペプチド
Ｈｂｇ−３５の相同配列を有するＨｂα、ＨｂβおよびＨｂγ２鎖に由来するペプチドを、追加で調べた。これらの３種類のペプチドは以下の配列を有する：
Ｈｂａ−６６−１５３：Ｈｂα［１０７−１３６］  ＶＴＬＡＡＨＬＰＡＥＦＴＰＡＶＨＡＳＬＤＫＦＬＡＳＶＳＴＶＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）
Ｈｂｂ−６７−１５４：Ｈｂβ［１１２−１４１］  ＣＶＬＡＨＨＦＧＫＥＦＴＰＰＶＱＡＡＹＱＫＶＶＡＧＶＡＮＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）
Ｈｂｇ２−７０−１５７：Ｈｂγ２［１１２−１４１］  ＴＶＬＡＩＨＦＧＫＥＦＴＰＥＶＱＡＳＷＱＫＭＶＴＧＶＡＳＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）。
【０１１２】
これらのペプチドも優勢なアルファらせん構造を有し、それはＭＰＬＡのような二重層状脂質を横切り、そうしてこれらの化合物を脱凝集させると仮定され得る。図２９において示されているように、Ｈｂｂ−６７−１５４およびＨｂｇ２−７０−１５７は両方ともＨｂｇ−３５−１４６ｍと類似の範囲で相乗的に活性であることが分かり、一方でＨｂａ−６６−１５３は最小限の相乗的活性しか示さなかった。
【０１１３】
実施例６：Ｈｂペプチドの細菌性リポタンパク質との相乗的活性
細菌性リポタンパク質、例えばＰａｍ３Ｃ−ＳＫ４またはＦＳＬ−１は、ＬＰＳおよびＭＰＬＡに類似して、ヒトＭＮＣにおけるサイトカインの誘導においてＨｂｇ−３５と相乗作用するかどうかを、追加で調べた。図３０において示されている結果は、実際に合成リポペプチドのＨｂｇ−３５との相乗的活性が存在することを示している。
【０１１４】
参考文献リスト
【０１１５】
【化１】
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【０１１６】
【化２】
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【０１１７】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
2016516760.tif 000035
2016516760.tif 000036
2016516760.tif 000037