(57)【要約】ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２を標的にする一価抗原結合性構築物を本明細書に提供する。当該一価抗原結合性構築物は、重鎖可変ドメインを含む少なくとも１つの抗原結合性ポリペプチドであって、ここでＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２と特異的に結合する、抗原結合性ポリペプチドと；ヘテロ二量体Ｆｃドメインであって、ここでＦｃドメインは、少なくとも２つのＣＨ３ドメインを含み、Ｆｃドメインは、リンカーを伴ってまたは伴わずに、抗原結合性ポリペプチドに結合する、ヘテロ二量体Ｆｃドメインとを含むことができる。当該構築物を作製する方法及び当該構築物を使用する方法も提供する。【選択図】図１
2016538283.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）発現腫瘍を有する対象を処置する方法であって、前記腫瘍を、ヘテロ二量体Ｆｃにリンカーを伴ってまたは伴わずに結合した重鎖可変ドメインを含む少なくとも１つの抗原結合性ポリペプチドを含む、有効量の単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物と接触させることを含み、前記抗原結合性ポリペプチドはＥＧＦＲに結合または特異的に結合し、かつ前記構築物は、ＥＧＦＲと結合または特異的に結合する対応する単離された単一特異性二価抗原結合性構築物と比較して、より大きなＢｍａｘでＥＧＦＲに結合する、前記方法。
【請求項２】
前記Ｆｃが、鎖ＡにＥＵ番号付けに従う変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、及び鎖ＢにＥＵ番号付けに従う変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを有するヘテロ二量体ヒトＩｇＧ１  Ｆｃであり、前記抗原結合性ポリペプチドがＥＧＦＲの細胞外ドメインに位置するエピトープに結合し、前記対象が、ＥＧＦＲと結合または特異的に結合する前記単離された対応する単一特異性二価抗原結合性構築物で処置された対象と比較して前記処置から経験する皮膚毒性は少なく、かつ前記腫瘍が、Ａ４３１、Ａ５４９、ＢＴ４７４、ＣＡＣＯ２、ＨＣＴ１１６、ＪＩＭＴ１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＫＯＶ３、ＭＣＦ７、またはＳＫＢＲ３のうちの１つまたはそれ以上の細胞株の第二レベルの細胞表面ＥＧＦＲ以下の第一レベルの細胞表面ＥＧＦＲを発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物が、ＯＡ−ＣＴＸ（ｖ４３５３）またはＯＡ−ＥＧ２（ｖ１３２３）である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｆｃがヘテロ二量体ＩｇＧ１  Ｆｃであり、前記Ｆｃは少なくとも２つのＣＨ３配列を含み、前記Ｆｃがリンカーを伴ってまたは伴わずに抗原結合性ポリペプチドに結合する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｆｃが、鎖ＡにＥＵ番号付けに従う変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、及び鎖ＢにＥＵ番号付けに従う変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを有するヒトヘテロ二量体ＩｇＧ１  Ｆｃである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３を含み、かつ前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３は、表Ｂに示す対応する配列である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物が、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに位置するエピトープに結合する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記構築物が、請求項３５〜７３のいずれか一項に記載の構築物である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記一価ＥＧＦＲ結合性構築物が、アフコシル化される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記一価ＥＧＦＲ結合性構築物が、薬物にコンジュゲートされ、任意選択的に前記薬物がマイタンシノイドまたはＤＭ１である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
有効性の増加及び有害作用の減少を伴う前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物を用いる対象の処置の期間が、ＥＧＦＲと結合または特異的に結合する前記対応する単離された単一特異性二価抗原結合性構築物を用いた処置の期間を超える、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記腫瘍が、上皮細胞由来の癌、肺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、乳管癌、胃癌、卵巣癌、ＨＥＲ２陽性癌、膠芽腫、子宮頸癌、腎癌、子宮癌、または結腸直腸癌である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物が、前記腫瘍上のＥＧＦＲへのＥＧＦの結合を遮断する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物が、前記腫瘍における恒常的なＥＧＦＲシグナル伝達を遮断する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記腫瘍を前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物と接触させることが、ＡＤＣＣをもたらす、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記腫瘍を前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物と接触させることが、前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物の細胞内部移行をもたらす、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍が、Ａ４３１、Ａ５４９、ＢＴ４７４、ＣＡＣＯ２、ＨＣＴ１１６、ＪＩＭＴ１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＫＯＶ３、ＭＣＦ７、またはＳＫＢＲ３のうちの１つまたはそれ以上の細胞株の第二レベルの細胞表面ＥＧＦＲ以下の第一レベルの細胞表面ＥＧＦＲを発現する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記腫瘍の試料が、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を使用して評価されて、３＋以下、２＋以下、または１＋以下の中央値レベルのＥＧＦＲを発現する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍が、細胞当たり３．５×１０６またはそれ未満、２．８×１０６またはそれ未満、１．２×１０６またはそれ未満、２．４×１０５またはそれ未満、２．６×１０５またはそれ未満、あるいは４．２×１０４またはそれ未満の中央値のＥＧＦＲを発現する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記処置が、前記腫瘍の縮小、前記腫瘍の増殖の阻害、前記腫瘍の腫瘍増殖停止時間の増加、前記対象の無病生存期間の延長、転移の低減、前記対象の無増悪生存期間の増加、または対象の集団の全生存期間の増加をもたらす、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象が固定用量の前記構築物を投与され、かつＥＧＦＲと結合または特異的に結合する固定用量の前記対応する単離された単一特異性二価抗原結合性構築物で処置された対象と比較して、前記対象が前記処置から経験する皮膚毒性が低く、かつ前記固定用量がモルベースで決定される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象のケラチノサイトの増殖が、ＥＧＦＲと結合または特異的に結合する固定用量の前記対応する単離された単一特異性二価抗原結合性構築物で処置された対象と比較して、固定用量の前記構築物を用いた処置後に減少されより少なくなり、かつ前記固定用量がモルベースで決定される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記腫瘍が、トラスツズマブ及び／またはペルツズマブ及び／またはセツキシマブに抵抗性または不応性である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象が、ヒト対象である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
追加の薬剤を提供することをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記追加の薬剤が、ＨＥＲ２と結合する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記追加の薬剤が、ペルツズマブまたはトラスツズマブである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記一価ＥＧＦＲ結合性構築物及び前記追加の薬剤が、同時に提供される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記一価ＥＧＦＲ結合性構築物及び前記追加の薬剤が、別々に提供される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記追加の薬剤が、第二の単離された抗原結合性構築物である、請求項２５から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記第二の単離された抗原結合性構築物が、ＨＥＲ２またはＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合または特異的に結合する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第二の単離された抗原結合性構築物が、ＨＥＲ２のＥＣＤ２及び／またはＥＣＤ４に結合または特異的に結合する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記処置が、前記腫瘍の縮小、前記腫瘍の増殖の阻害、前記腫瘍の腫瘍増殖停止時間の増加、前記対象の無病生存期間の延長、または前記対象の生存期間の増加をもたらす、請求項２４から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記第二の単離された抗原結合性構築物が、前記第二の単離された抗原結合性構築物の前記抗原結合ポリペプチドがＨＥＲ２またはＨＥＲ２の細胞外ドメインと結合または特異的に結合することを除いて、請求項３５から７３のいずれか一項に記載の単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物と同一である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
単離された一価抗原結合性構築物であって、
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と結合または特異的に結合する、重鎖可変ドメインを含む少なくとも１つの抗原結合性ポリペプチドと；
ヘテロ二量体Ｆｃであって、前記Ｆｃは少なくとも２つのＣＨ３配列を含み、前記Ｆｃは、リンカーを伴ってまたは伴わずに、前記抗原結合性ポリペプチドに結合する、ヘテロ二量体Ｆｃ
とを含み；
ここで、前記一価抗原結合性構築物は、ＥＧＦＲと結合または特異的に結合する、単離された対応する単一特異性二価抗原結合性構築物と比較して、より大きなＢｍａｘを伴って、ＥＧＦＲを選択的に及び／または結合または特異的に結合し；かつ
ここで、二量体化ＣＨ３配列は、約６８℃またはより高い融解温度（Ｔｍ）を有する、
前記単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項３６】
前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物が、ＯＡ−ＣＴＸ（ｖ４３５３）またはＯＡ−ＥＧ２（ｖ１３２３）である、請求項３５に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項３７】
１：１の構築物対標的比率で、前記単一特異性二価抗原結合性構築物に対するＢｍａｘにおける増加が、前記構築物の観察される平衡定数（Ｋｄ）を超えて飽和濃度までの濃度で観察される、先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項３８】
前記単離された一価抗原結合性構築物が、ＥＧＦＲと結合または特異的に結合する単離された、対応する単一特異性二価抗原結合性構築物に比べて、ＥＧＦＲに対するより低い親和性を有する、先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項３９】
前記単離された一価抗原結合性構築物が、ＥＧＦＲの細胞外ドメイン１、２、３、もしくは４またはＥＧＦＲの細胞外ドメインに位置するエピトープに結合する、先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項４０】
前記抗原結合性ポリペプチドが、軽鎖可変ドメイン、軽鎖ＣＬ１ドメイン、及び／または重鎖ＣＨ１ドメインをさらに含む、先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項４１】
前記重鎖可変ドメインのアミノ酸配列が、表Ｂに記載するＥＧＦＲ特異的抗原結合性ポリペプチド重鎖可変ドメインのアミノ酸配列に、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であり、かつ前記軽鎖可変ドメインの前記アミノ酸配列が、表Ｂに記載するＥＧＦＲ特異的抗原結合性ポリペプチド軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列に、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一である、先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項４２】
前記軽鎖ＣＬ１ドメインのアミノ酸配列が、表Ｂに記載するＥＧＦＲ特異的抗原結合性ポリペプチド軽鎖ＣＬ１ドメインのアミノ酸配列に、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であり、かつ前記重鎖ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列が、表Ｂに記載するＥＧＦＲ特異的抗原結合性ポリペプチド重鎖ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列に、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一である、先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項４３】
前記抗原結合性ポリペプチドが、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、抗原結合性ペプチド、または前記抗原と結合することができるタンパク質ドメインである、先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項４４】
前記抗原結合性ポリペプチドが、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドを含む、先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項４５】
前記重鎖ポリペプチドが、表Ｂに記載するＥＧＦＲ特異的抗原結合性ポリペプチド重鎖のアミノ酸配列に、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖ポリペプチドが、表Ｂに記載するＥＧＦＲ特異的抗原結合性ポリペプチド軽鎖のアミノ酸配列に、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項４６】
１．１６Ｅ−８Ｍから８．５１Ｅ−１０Ｍ以下のＥＧＦＲへの結合親和性（ＫＤ）を有する、先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項４７】
ＥＧＦＲに結合した時、対照と比べてＡ４３１細胞増殖を阻害する、及び／または対照と比べてＢＴ−４７４細胞のＡＤＣＣ媒介性標的細胞溶解率（％）を増加させる、及び／またはＥＧＦＲの細胞内部移行を引き起こす、及び／またはＥＧＦＲの下方制御を引き起こす、先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項４８】
前記細胞上のＥＧＦＲへの結合の際に細胞内に細胞内部移行される、先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項４９】
前記Ｆｃがリンカーにより前記抗原結合性ポリペプチドに融合される、先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項５０】
前記リンカーがポリペプチドリンカーである、請求項４９に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項５１】
前記リンカーがＩｇＧ１ヒンジ領域を含む、請求項４９に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項５２】
ＥＧＦＲがＥＧＦＲアイソフォームＡまたはＥＧＦＲｖＩＩＩである、先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項５３】
少なくとも１つの薬物にコンジュゲートされる、先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項５４】
前記薬物がマイタンシノイドである、請求項５３に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項５５】
前記マイタンシノイドがＤＭ１である、請求項５４に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項５６】
前記マイタンシノイドがＳＭＣＣリンカーを通して前記構築物にコンジュゲートされる、請求項５４または請求項５５に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項５７】
前記構築物または前記抗原結合性ポリペプチドが、中和性である、先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項５８】
前記構築物または前記抗原結合性ポリペプチドが、非中和性である、先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項５９】
前記ＦｃがヒトＦｃである、先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項６０】
前記ヒトＦｃがヒトＩｇＧ１  Ｆｃである、請求項５９に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項６１】
前記二量体化ＣＨ３配列が、約６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７７．５、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または８５℃またはより高い融解温度（Ｔｍ）を有する、先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項６２】
前記Ｆｃが、発現されるとき、約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％を超える純度で形成されたヘテロ二量体である、先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項６３】
前記Ｆｃが、単一細胞を介して発現される時、約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％を超える純度で形成されたヘテロ二量体である、請求項６２に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項６４】
前記ヘテロ二量体Ｆｃが、前記ＣＨ３配列の少なくとも１つに、１つまたは複数の修飾を含む、先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項６５】
前記ヘテロ二量体Ｆｃドメインが、野生型ホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を伴ってヘテロ二量体の形成を促進する、１つまたは複数の修飾を前記ＣＨ３配列の少なくとも１つに含む、先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項６６】
前記ヘテロ二量体Ｆｃドメインが含むのは、鎖ＡにＥＵ番号付けに従う変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、及び鎖ＢにＥＵ番号付けに従う変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを有するヘテロ二量体ＩｇＧ１  Ｆｃである、先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項６７】
前記ヘテロ二量体Ｆｃが、少なくとも１つのＣＨ２ドメインをさらに含む、先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項６８】
前記ヘテロ二量体Ｆｃの前記ＣＨ２ドメイン（複数可）が１つまたは複数の修飾を含む、請求項６７に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項６９】
前記ヘテロ二量体Ｆｃが、Ｆｃガンマ受容体の選択的結合を促進するための１つまたは複数の修飾を含む、先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項７０】
ＥＧＦＲへの結合について先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物と競合する第二の単離された一価抗原結合性構築物であって、任意選択的に、前記第二の単離された一価抗原結合性構築物が、先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物を、５０％を超えて、６０％を超えて、７０％を超えて、８０％を超えて、９０％を超えて、９５％を超えて、９９％を超えて、または１００％置換する、前記第二の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項７１】
前記構築物が、前記細胞が前記構築物により接触された時に、
ｄ．ＥＧＦＲと結合または特異的に結合する前記対応する単離された単一特異性二価抗原結合性構築物と比較して、ＢＴ４７４細胞、ＨＣＴ１１６細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３４細胞、またはＳＫＯＶ３細胞のうちの１つまたは複数への、ＦＡＣＳにより決定される、より高い細胞表面結合性（ＢＭＡＸ）、
ｅ．ＥＧＦＲと結合または特異的に結合する前記対応する単離された単一特異性二価抗原結合性構築物により媒介される抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と比較して、ＢＴ−４７４細胞の増加した抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の媒介、または
ｆ．ＪＩＭＴ１細胞による細胞内部移行
のうちの１つまたは複数によって特徴付けられる、先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項７２】
アフコシル化され、かつ、ＥＧＦＲと結合または特異的に結合する前記対応する単離された単一特異性二価抗原結合性構築物が媒介するＡＤＣＣに対して、Ａ５４９細胞のＡＤＣＣにおいて１．９倍の増加及び／またはＨＣＴ１１６細胞のＡＤＣＣにおいて１．４倍の増加を媒介する、先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項７３】
前記抗原結合性構築物が少なくとも１つの修飾を含み、かつ前記修飾がアフコシル化である、先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物。
【請求項７４】
請求項３５から７３のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物をコードする少なくとも１つの配列を含む、単離ポリヌクレオチドまたは単離ポリヌクレオチドのセット。
【請求項７５】
前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットがｃＤＮＡである、請求項７４に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項７６】
先行するポリヌクレオチド請求項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットのうちの１つまたは複数を含む、ベクターまたはベクターのセット。
【請求項７７】
プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター、発現ベクター、及び組換え発現ベクターからなる群より選択される、請求項７６に記載のベクターまたはベクターのセット。
【請求項７８】
先行するポリヌクレオチド請求項のいずれか一項または先行するベクター請求項のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットを含む、単離細胞。
【請求項７９】
ハイブリドーマ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはＨＥＫ２９３細胞である、請求項７８に記載の単離細胞。
【請求項８０】
請求項３５から７３のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物及び薬学的に許容され得るキャリアを含む、医薬組成物。
【請求項８１】
緩衝剤、抗酸化剤、低分子量分子、薬物、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、脂質、キレート剤、安定剤、及び賦形剤からなる群より選択される１つまたは複数の物質をさらに含む、請求項８０に記載の医薬組成物。
【請求項８２】
第二の単離された抗原結合性構築物をさらに含む、先行する医薬組成物請求項のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８３】
前記第二の構築物が、ＨＥＲ２またはＨＥＲ２の細胞外ドメインに特異的に結合する、請求項８２に記載の医薬組成物。
【請求項８４】
前記第二の構築物が、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）２及び／またはＥＣＤ４に特異的に結合する、請求項８２８２に記載の医薬組成物。
【請求項８５】
前記第二の構築物が、前記抗原結合ポリペプチドがＨＥＲ２またはＨＥＲ２の細胞外ドメインと特異的に結合することを除いて、請求項３５から７３のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物と同一である、請求項８２に記載の医薬組成物。
【請求項８６】
医療薬において使用するための、先行する医薬組成物請求項のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８７】
癌性状態の処置において使用するための、先行する医薬組成物請求項のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８８】
前記癌性状態が、ＥＧＦＲ発現癌、上皮細胞由来の癌、乳癌、ＨＥＲ２発現癌、肺癌、トリプルネガティブ乳癌、乳管癌、胃癌、卵巣癌、頭頚部癌、膠芽腫、子宮頸癌、腎癌、子宮癌、膵癌、または結腸直腸癌である、請求項８７に記載の医薬組成物。
【請求項８９】
請求項３５から７３のいずれか一項に記載の単離された一価抗原結合性構築物を得る方法であって、（ａ）宿主細胞培養物を得るステップであって、前記宿主細胞は前記抗原結合性構築物をコードする１つまたは複数の核酸配列を含む、ステップと；（ｂ）前記宿主細胞培養物を前記単離された一価抗原結合性構築物を発現するのに十分な条件下で培養するステップと；（ｃ）前記抗原結合性構築物を前記宿主細胞培養物から回収するステップとを含む、前記方法。
【請求項９０】
対象においてＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲシグナル伝達に関連する癌または障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、先行する医薬組成物請求項のいずれか一項または先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の医薬組成物を提供することを含む、前記方法。
【請求項９１】
前記癌が、ＥＧＦＲ発現癌、上皮細胞由来の癌、乳癌、ＨＥＲ２発現癌、肺癌、トリプルネガティブ乳癌、乳管癌、胃癌、卵巣癌、膠芽腫、子宮頸癌、腎癌、子宮癌、または結腸直腸癌である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記方法が、追加の薬剤に加えて単離された一価構築物を提供することを含む、請求項９０から９１のいずれかに記載の方法。
【請求項９３】
前記単離された一価構築物が、前記追加の薬剤と同時に提供される、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記単離された一価構築物が、前記追加の薬剤とは別に提供される、請求項９２に記載の方法。
【請求項９５】
前記追加の薬剤が、第二の、異なる単離された抗原結合性構築物である、請求項９２から９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記第二の構築物が、ＨＥＲ２またはＨＥＲ２の細胞外ドメインに特異的に結合する、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記第二の構築物が、ＨＥＲ２のＥＣＤ２及び／またはＥＣＤ４に特異的に結合する、請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
前記第二の構築物が、前記抗原結合ポリペプチドがＨＥＲ２またはＨＥＲ２の細胞外ドメインと特異的に結合することを除いて、請求項１に記載の単離された一価抗原結合性構築物と同一である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９９】
前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物が、腫瘍上のＥＧＦＲへのＥＧＦの結合を遮断する、請求項９０に記載の方法。
【請求項１００】
前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物が、腫瘍における恒常的なＥＧＦＲシグナル伝達を遮断する、請求項９０に記載の方法。
【請求項１０１】
腫瘍を前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物と接触させることが、ＡＤＣＣをもたらす、請求項９０に記載の方法。
【請求項１０２】
腫瘍を前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物と接触させることが、前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物の細胞内部移行をもたらす、請求項９０に記載の方法。
【請求項１０３】
腫瘍の増殖を阻害する、腫瘍を縮小させる、または腫瘍を有する対象の生存期間を増加させる方法であって、前記腫瘍を、有効量の、先行する医薬組成物請求項のいずれか一項に記載の組成物または先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の構築物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項１０４】
前記腫瘍が、上皮細胞由来の腫瘍またはＨＥＲ２陽性腫瘍である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物が、前記腫瘍上のＥＧＦＲへのＥＧＦの結合を遮断する、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物が、前記腫瘍における恒常的なＥＧＦＲシグナル伝達を遮断する、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０７】
前記腫瘍を前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物と接触させることが、ＡＤＣＣをもたらす、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０８】
前記腫瘍を前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物と接触させることが、前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物の細胞内部移行をもたらす、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０９】
細胞におけるＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲシグナル伝達を阻害する、減少させるまたは遮断する方法であって、前記細胞を、有効量の、先行する医薬組成物請求項のいずれか一項に記載の組成物に係る前記構築物または先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の構築物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項１１０】
前記細胞が、ＥＧＦＲ発現癌細胞、乳癌細胞、上皮細胞由来の腫瘍細胞、ＨＥＲ２陽性腫瘍細胞、肺癌細胞、トリプルネガティブ乳癌細胞、乳管癌細胞、胃癌細胞、及び頭頚部癌細胞、膵癌細胞、卵巣癌細胞、膠芽腫細胞、子宮頸癌細胞、腎癌細胞、子宮癌細胞、または結腸直腸癌細胞である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された抗原結合性構築物及び使用説明書を含み、任意選択的に第二の単離された抗原結合性構築物をさらに含む、キット。
【請求項１１２】
疾患を処置するための医薬の製造において使用するための先行する構築物請求項のいずれか一項に記載の単離された抗原結合性構築物であって、任意選択的に、前記疾患が癌である、前記構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１１月１３日に出願された、米国仮出願第６１／９０３，８２５号の利益を主張し、これはその全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出されており、その全体において参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０ＸＸ年  月ＸＸ日に作成され、その名称は、ＸＸＸＸＸＰＣＴ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔであり、Ｘ，ＸＸＸ，ＸＸＸバイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
背景
ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ−１またはＥｒｂ−Ｂ１としても知られる）は、ｃ−ｅｒｂＢプロトオンコジーンによってコードされる１７０ｋＤａの膜貫通型受容体であり、内因性チロシンキナーゼ活性を呈する（Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７３：２２８−２３５（１９９６）（非特許文献１）；Ｈｅｒｂｓｔ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  ９４：１５９３−１６１１（２００２）（非特許文献２））。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース登録番号Ｐ００５３３が、ＥＧＦＲの配列を提供する。また、ＥＧＦＲのアイソフォーム及び変異体も存在し（例えば、選択的ＲＮＡ転写産物、切断型、多型、等）、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベース登録番号Ｐ００５３３−１、Ｐ００５３３−２、Ｐ００５３３−３及びＰ００５３３−４により特定されるものを含むがこれらに限定されない。ＥＧＦＲは、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、アンフィレギュリン、ヘパリン結合性ＥＧＦ（ｈｂ−ＥＧＦ）、ベータセルリン、エピレギュリンを含むリガンドと結合することが知られている（Ｈｅｒｂｓｔ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  ９４：１５９３−１６１１（２００２）（非特許文献２）；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ａｎｄ  Ｂａｓｅｌｇａ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９：６５５０−６５６５（２０００）（非特許文献３））。ＥＧＦＲは、チロシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路を介して、細胞増殖、分化、細胞生存、アポトーシス、血管新成、有糸分裂誘発及び転移を制御するシグナル伝達経路の活性化を含むがこれに限定されない、多数の細胞プロセスを調節する（Ａｔａｌａｙら、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １４：１３４６−１３６３（２００３）（非特許文献４）；Ｔｓａｏ  ａｎｄ  Ｈｅｒｂｓｔ，Ｓｉｇｎａｌ  ４：４−９（２００３）（非特許文献５）；Ｈｅｒｂｓｔ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  ９４：１５９３−１６１１（２００２）（非特許文献２）；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７３：２２８−２３５（１９９６）（非特許文献１））。
【０００４】
ＥＧＦＲの過剰発現が、膀胱、脳、頭頸部、膵臓、肺、乳房、卵巣、結腸、前立腺及び腎臓の癌を含む、多くのヒト悪性腫瘍状態において報告されている（Ａｔａｌａｙら、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １４：１３４６−１３６３（２００３）（非特許文献４）；Ｈｅｒｂｓｔ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  ９４：１５９３−１６１１（２００２）（非特許文献２）；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７３：２２８−２３５（１９９６）（非特許文献１））。これらの状態の多くでは、ＥＧＦＲの過剰発現は患者の予後不良と相関または関連する（Ｈｅｒｂｓｔ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  ９４：１５９３−１６１１（２００２）（非特許文献２）；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７３：２２８−２３５（１９９６）（非特許文献１））。ＥＧＦＲは、正常組織の細胞、具体的には、皮膚、肝臓及び胃腸管の上皮組織の細胞においても発現するが、発現レベルは、概して悪性腫瘍細胞よりも低い（Ｈｅｒｂｓｔ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  ９４：１５９３−１６１１（２００２）（非特許文献２））。
【０００５】
ＥＧＦＲを標的し、ＥＧＦＲシグナル伝達経路を遮断するための様々なストラテジーが報告されている。ゲフィチニブ、エルロチニブ、及びＣＩ−１０３３のような小分子チロシンキナーゼ阻害剤は、細胞内チロシンキナーゼ領域におけるＥＧＦＲの自己リン酸化を遮断し、それにより下流シグナル伝達事象を阻害する（Ｔｓａｏ  ａｎｄ  Ｈｅｒｂｓｔ，Ｓｉｇｎａｌ  ４：４−９（２００３）（非特許文献５））。一方、モノクローナル抗体は、ＥＧＦＲの細胞外部分を標的し、その結果、リガンド結合を遮断し、それにより細胞増殖などの下流の事象を阻害する（Ｔｓａｏ  ａｎｄ  Ｈｅｒｂｓｔ，Ｓｉｇｎａｌ  ４：４−９（２００３）（非特許文献５））。
【０００６】
２以上の異なる種（例えば、マウス及びヒト）に由来する抗体の部分を含むキメラ抗体が、「コンジュゲート」抗体の代替物として開発されている。例えば、米国特許第５，８９１，９９６号（Ｍａｔｅｏ  ｄｅ  Ａｃｏｓｔａ  ｄｅｌ  Ｒｉｏら）（特許文献１）は、ＥＧＦＲに対するマウス／ヒトキメラ抗体、Ｒ３、について記載しており、米国特許第５，５５８，８６４号（特許文献２）は、マウス抗ＥＧＦＲ  ＭＡｂ４２５のキメラ及びヒト化形態の生成について記載している。また、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）は、様々なヒト異種移植モデルにおいて抗腫瘍有効性を実証すると報告されているキメラマウス／ヒト抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（ヒト臨床試験においてＨＡＭＡ応答を生じる、マウスＭ２２５モノクローナル抗体に基づく）である（Ｈｅｒｂｓｔ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  ９４：１５９３−１６１１（２００２）（非特許文献２））。Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）の有効性は、ＥＧＦＲシグナル伝達経路により、及び可能である場合には抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性の増加により、調節される細胞事象の阻害を含む、いくつかの機序に起因する（Ｈｅｒｂｓｔ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  ９４：１５９３−１６１１（２００２）（非特許文献２））。Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）は、放射線療法及び化学療法との併用を含む臨床試験においても使用された（Ｈｅｒｂｓｔ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  ９４：１５９３−１６１１（２００２）（非特許文献２））。Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州フリーモント）は、癌治療のためのＡＢＸ−ＥＧＦを開発した。ＡＢＸ−ＥＧＦは、完全ヒト抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体である（Ｙａｎｇら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍａｔｏｌ．３８：１７−２３（２００１）（非特許文献６））。米国特許第８，０９７，４３６号（特許文献３）は、ＥＧＦＲ標的抗体のさらなる例を提供する。
【０００７】
抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体及び他のＥＧＦＲ阻害剤を用いた治療は、皮膚毒性の高い有症率と関連することが知られており、これは表皮、皮脂腺及び毛包上皮（ｅｐｅｉｔｈｅｌｉｕｍ）の正常組織でのＥＧＦＲの発現に起因して生じると考えられる。非常に頻繁に報告される副作用は、主に脂漏性領域における膿疱性丘疹であり、これは患者の約９０％までで見られ、そのうちの３０％は医療介入を受けるのに十分に重度である。いくつかの場合では、皮膚科の副作用は、抗ＥＧＦＲモノクローナルを用いた治療を中断、投与量を減らして継続、または中止するのに十分に重度である（Ｂｏｏｎｅら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ７２：１５２−１５９（２００７）（非特許文献７））。
【０００８】
本出願は、共所有される、特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１１／００１２３８（特許文献４）（２０１１年１１月４日に出願）、ＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０５０７８０（特許文献５）（２０１２年１１月２日に出願）、ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／００４７１（特許文献６）（２０１３年５月１０日に出願）、及びＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０５０３５８（特許文献７）（２０１３年５月８日に出願）にも関連し、それぞれの全開示は、全ての目的のためにその全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５，８９１，９９６号
【特許文献２】米国特許第５，５５８，８６４号
【特許文献３】米国特許第８，０９７，４３６号
【特許文献４】特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１１／００１２３８
【特許文献５】特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０５０７８０
【特許文献６】特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／００４７１
【特許文献７】特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０５０３５８
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７３：２２８−２３５（１９９６）
【非特許文献２】Ｈｅｒｂｓｔ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  ９４：１５９３−１６１１（２００２）
【非特許文献３】Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ａｎｄ  Ｂａｓｅｌｇａ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９：６５５０−６５６５（２０００）
【非特許文献４】Ａｔａｌａｙら、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １４：１３４６−１３６３（２００３）
【非特許文献５】Ｔｓａｏ  ａｎｄ  Ｈｅｒｂｓｔ，Ｓｉｇｎａｌ  ４：４−９（２００３）
【非特許文献６】Ｙａｎｇら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍａｔｏｌ．３８：１７−２３（２００１）
【非特許文献７】Ｂｏｏｎｅら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ７２：１５２−１５９（２００７）
【発明の概要】
【００１１】
概要
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）発現腫瘍を有する対象を処置する方法であって、腫瘍を、ヘテロ二量体Ｆｃにリンカーを伴ってまたは伴わずに結合した重鎖可変ドメインを含む少なくとも１つの抗原結合性ポリペプチドを含む、有効量の単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物と接触させることを含み、抗原結合性ポリペプチドは、ＥＧＦＲに結合または特異的に結合し、構築物は、ＥＧＦＲと結合または特異的に結合する対応する単離された単一特異性二価抗原結合性構築物と比較して、より大きなＢｍａｘでＥＧＦＲに結合する、前記方法を本明細書に提供する。
【００１２】
いくつかの態様では、Ｆｃは、鎖Ａに変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ（ＥＵ番号付けに従う）、及び鎖Ｂに変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ（ＥＵ番号付けに従う）を有するヘテロ二量体ヒトＩｇＧ１  Ｆｃであり、抗原結合性ポリペプチドはＥＧＦＲの細胞外ドメイン内に位置するエピトープに結合し、対象は、ＥＧＦＲと結合または特異的に結合する単離された対応する単一特異性二価抗原結合性構築物で処置された対象と比較して処置から経験する皮膚毒性が少なく、腫瘍は、Ａ４３１、Ａ５４９、ＢＴ４７４、ＣＡＣＯ２、ＨＣＴ１１６、ＪＩＭＴ１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＫＯＶ３、ＭＣＦ７、またはＳＫＢＲ３のうちの１つまたはそれ以上の細胞株の第二レベルの細胞表面ＥＧＦＲ以下の第一レベルの細胞表面ＥＧＦＲを発現する。
【００１３】
いくつかの態様では、単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物は、ＯＡ−ＣＴＸ（ｖ４３５３）またはＯＡ−ＥＧ２（ｖ１３２３）である。
【００１４】
いくつかの態様では、Ｆｃはヘテロ二量体ＩｇＧ１  Ｆｃであり、Ｆｃは少なくとも２つのＣＨ３配列を含み、Ｆｃは、リンカーを伴ってまたは伴わずに、抗原結合性ポリペプチドに結合する。いくつかの態様では、Ｆｃは、鎖Ａに変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ（ＥＵ番号付けに従う）、及び鎖Ｂに変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ（ＥＵ番号付けに従う）を有するヒトヘテロ二量体ＩｇＧ１  Ｆｃである。いくつかの態様では、単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３は、表Ｂに示す対応する配列である。いくつかの態様では、単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに位置するエピトープに結合する。いくつかの態様では、構築物は、本明細書に記載の構築物、例えば、単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物である。
【００１５】
いくつかの態様では、一価ＥＧＦＲ結合性構築物は、アフコシル化される。いくつかの態様では、一価ＥＧＦＲ結合性構築物は、薬物にコンジュゲートされ、任意選択的に薬物はマイタンシノイドまたはＤＭ１である。いくつかの態様では、有効性の増加及び有害作用の減少を伴う単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物を用いる対象の処置の期間は、ＥＧＦＲと結合または特異的に結合する対応する単離された単一特異性二価抗原結合性構築物を用いた処置の期間を超える。いくつかの態様では、腫瘍は、上皮細胞由来の癌、肺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、乳管癌、胃癌、卵巣癌、ＨＥＲ２陽性癌、膠芽腫、子宮頸癌、腎癌、子宮癌、または結腸直腸癌である。
【００１６】
いくつかの態様では、単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物は、腫瘍上のＥＧＦＲへのＥＧＦの結合を遮断する。いくつかの態様では、単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物は、腫瘍における恒常的なＥＧＦＲシグナル伝達を遮断する。いくつかの態様では、腫瘍を単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物と接触させることは、ＡＤＣＣをもたらす。いくつかの態様では、腫瘍を単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物と接触させることは、単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物の細胞内部移行をもたらす。
【００１７】
いくつかの態様では、腫瘍は、Ａ４３１、Ａ５４９、ＢＴ４７４、ＣＡＣＯ２、ＨＣＴ１１６、ＪＩＭＴ１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＫＯＶ３、ＭＣＦ７、またはＳＫＢＲ３のうちの１つまたはそれ以上の細胞株の第二レベルの細胞表面ＥＧＦＲ以下の第一レベルの細胞表面ＥＧＦＲを発現する。いくつかの態様では、腫瘍の試料は、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を使用して評価されて、３＋以下、２＋以下、または１＋以下の中央値レベルのＥＧＦＲを発現する。いくつかの態様では、腫瘍は、細胞当たり３．５×１０６またはそれ未満、２．８×１０６またはそれ未満、１．２×１０６またはそれ未満、２．４×１０５またはそれ未満、２．６×１０５またはそれ未満、４．２×１０４またはそれ未満の中央値のＥＧＦＲを発現する。
【００１８】
いくつかの態様では、処置は、腫瘍の縮小、腫瘍の増殖の阻害、腫瘍の腫瘍増殖停止時間の増加、対象の無病生存期間の延長、転移の低減、対象の無増悪生存期間の増加、または対象の集団の全生存期間の増加をもたらす。
【００１９】
いくつかの態様では、対象は、固定用量の構築物を投与され、ＥＧＦＲと結合または特異的に結合する固定用量の対応する単離された単一特異性二価抗原結合性構築物で処置された対象と比較して、処置から経験する皮膚毒性が低く、ここで、任意選択的に固定用量はモルベースで決定される。いくつかの態様では、対象のケラチノサイトの増殖が、ＥＧＦＲと結合または特異的に結合する固定用量の対応する単離された単一特異性二価抗原結合性構築物で処置された対象と比較して、固定用量の当該構築物を用いた処置後に減少されより少なくなり、ここで、任意選択的に固定用量はモルベースで決定される。
【００２０】
いくつかの態様では、腫瘍は、トラスツズマブ及び／またはペルツズマブ及び／またはセツキシマブに対して抵抗性または不応性である。
【００２１】
いくつかの態様では、対象は、ヒト対象である。
【００２２】
いくつかの態様では、本方法は、追加の薬剤を提供することをさらに含む。いくつかの態様では、追加の薬剤は、ＨＥＲ２と結合する。いくつかの態様では、追加の薬剤は、ペルツズマブまたはトラスツズマブである。いくつかの態様では、一価ＥＧＦＲ結合性構築物及び追加の薬剤は、同時に提供される。いくつかの態様では、一価ＥＧＦＲ結合性構築物及び追加の薬剤は、別々に提供される。いくつかの態様では、追加の薬剤は、第二の単離された抗原結合性構築物である。いくつかの態様では、第二の単離された抗原結合性構築物は、ＨＥＲ２またはＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合または特異的に結合する。いくつかの態様では、第二の単離された抗原結合性構築物は、ＨＥＲ２のＥＣＤ２及び／またはＥＣＤ４に結合または特異的に結合する。
【００２３】
いくつかの態様では、処置は、腫瘍の縮小、腫瘍の増殖の阻害、腫瘍の腫瘍増殖停止時間の増加、対象の無病生存期間の延長、または対象の生存期間の増加をもたらす。いくつかの態様では、第二の単離された抗原結合性構築物は、第二の単離された抗原結合性構築物の抗原結合ポリペプチドが、ＨＥＲ２またはＨＥＲ２の細胞外ドメインと結合または特異的に結合することを除いて、本明細書に記載の単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物と同一である。
【００２４】
単離された一価抗原結合性構築物であって、重鎖可変ドメインを含む少なくとも１つの抗原結合性ポリペプチドであって、ここで上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と結合または特異的に結合する、抗原結合性ポリペプチドと；ヘテロ二量体Ｆｃであって、ここでＦｃは少なくとも２つのＣＨ３配列を含み、Ｆｃは、リンカーを伴ってまたは伴わずに、抗原結合性ポリペプチドに結合する、ヘテロ二量体Ｆｃとを含み；一価抗原結合性構築物は、ＥＧＦＲと結合または特異的に結合する単離された対応する単一特異性二価抗原結合性構築物と比較して、より大きなＢｍａｘを伴ってＥＧＦＲを選択的に及び／または結合または特異的に結合し；二量体化ＣＨ３配列は約６８℃またはより高い融解温度（Ｔｍ）を有する、前記構築物も本明細書に提供する。
【００２５】
いくつかの態様では、単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物は、ＯＡ−ＣＴＸ（ｖ４３５３）またはＯＡ−ＥＧ２（ｖ１３２３）である。
【００２６】
いくつかの態様では、本明細書に記載の構築物は、１：１の構築物対標的比率で、単一特異性二価抗原結合性構築物に対するＢｍａｘにおける増加が、構築物の観察される平衡定数（Ｋｄ）を超えて飽和濃度までの濃度で観察される。
【００２７】
いくつかの態様では、単離された一価抗原結合性構築物は、ＥＧＦＲと結合または特異的に結合する単離された、対応する単一特異性二価抗原結合性構築物に対して、より低いＥＧＦＲへの親和性を有する。
【００２８】
いくつかの態様では、単離された一価抗原結合性構築物は、ＥＧＦＲの細胞外ドメイン１、２、３、または４またはＥＧＦＲの細胞外ドメインに位置するエピトープに結合する。
【００２９】
いくつかの態様では、抗原結合性ポリペプチドは、軽鎖可変ドメイン、軽鎖ＣＬ１ドメイン、及び／または重鎖ＣＨ１ドメインをさらに含む。いくつかの態様では、重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、表Ｂに記載するＥＧＦＲ特異的抗原結合性ポリペプチド重鎖可変ドメインのアミノ酸配列に、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であり、軽鎖可変ドメインのアミノ酸は、表Ｂに記載するＥＧＦＲ特異的抗原結合性ポリペプチド軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列に、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一である。いくつかの態様では、軽鎖ＣＬ１ドメインのアミノ酸配列は、表Ｂに記載するＥＧＦＲ特異的抗原結合性ポリペプチド軽鎖ＣＬ１ドメインのアミノ酸配列に、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であり、重鎖ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、表Ｂに記載するＥＧＦＲ特異的抗原結合性ポリペプチド重鎖ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列に、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一である。いくつかの態様では、抗原結合性ポリペプチドは、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、抗原結合性ペプチド、または抗原と結合することができるタンパク質ドメインである。
【００３０】
いくつかの態様では、抗原結合性ポリペプチドは、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドを含む。いくつかの態様では、重鎖ポリペプチドは、表Ｂに記載するＥＧＦＲ特異的抗原結合性ポリペプチド重鎖のアミノ酸配列に、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、軽鎖ポリペプチドは、表Ｂに記載するＥＧＦＲ特異的抗原結合性ポリペプチド軽鎖のアミノ酸配列に、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００３１】
いくつかの態様では、本明細書に記載の構築物は、１．１６Ｅ−８Ｍから８．５１Ｅ−１０Ｍ以下のＥＧＦＲへの結合親和性（ＫＤ）を有する。
【００３２】
いくつかの態様では、本明細書に記載の構築物は、ＥＧＦＲに結合した時、対照と比べてＡ４３１細胞増殖を阻害する、及び／または対照と比べてＢＴ−４７４細胞のＡＤＣＣ媒介性標的細胞溶解率（％）を増加させる、及び／またはＥＧＦＲの細胞内部移行を引き起こす、及び／またはＥＧＦＲの下方制御を引き起こす。
【００３３】
いくつかの態様では、構築物は、細胞内に細胞上のＥＧＦＲへの結合の際に細胞内部移行する。
【００３４】
いくつかの態様では、Ｆｃは、リンカーにより抗原結合性ポリペプチドに融合される。いくつかの態様では、リンカーは、ポリペプチドリンカーである。いくつかの態様では、リンカーは、ＩｇＧ１ヒンジ領域を含む。
【００３５】
いくつかの態様では、ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲアイソフォームＡまたはＥＧＦＲｖＩＩＩである。
【００３６】
いくつかの態様では、構築物は、少なくとも１つの薬物にコンジュゲートされる。いくつかの態様では、薬物は、マイタンシノイドである。いくつかの態様では、マイタンシノイドは、ＤＭ１である。いくつかの態様では、マイタンシノイドは、ＳＭＣＣリンカーを通して構築物にコンジュゲートされる。
【００３７】
いくつかの態様では、構築物または抗原結合性ポリペプチドは、中和性である。いくつかの態様では、構築物または抗原結合性ポリペプチドは、非中和性である。
【００３８】
いくつかの態様では、ＦｃはヒトＦｃである。いくつかの態様では、ヒトＦｃはヒトＩｇＧ１  Ｆｃである。
【００３９】
いくつかの態様では、二量体化ＣＨ３配列は、約６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７７．５、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または８５℃またはより高い融解温度（Ｔｍ）を有する。いくつかの態様では、Ｆｃは、発現する時、約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％を超える純度で形成されたヘテロ二量体である。いくつかの態様では、Ｆｃは、単一細胞を介して発現する時、約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％を超える純度で形成されたヘテロ二量体である。
【００４０】
いくつかの態様では、ヘテロ二量体Ｆｃは、ＣＨ３配列の少なくとも１つに、１つまたは複数の修飾を含む。いくつかの態様では、ヘテロ二量体Ｆｃドメインは、野生型ホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を伴ってヘテロ二量体の形成を促進する１つまたは複数の修飾をＣＨ３配列の少なくとも１つに含む。いくつかの態様では、ヘテロ二量体Ｆｃドメインが含むのは、鎖Ａに変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ（ＥＵ番号付けに従う）、及び鎖Ｂに変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ（ＥＵ番号付けに従う）を有するヘテロ二量体ＩｇＧ１  Ｆｃである。
【００４１】
いくつかの態様では、ヘテロ二量体Ｆｃは、少なくとも１つのＣＨ２ドメインをさらに含む。いくつかの態様では、ヘテロ二量体ＦｃのＣＨ２ドメイン（複数可）は、１つまたは複数の修飾を含む。
【００４２】
いくつかの態様では、ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｆｃガンマ受容体の選択的結合を促進するための１つまたは複数の修飾を含む。
【００４３】
本明細書に記載の単離された一価抗原結合性構築物とＥＧＦＲへの結合を競合する第二の単離された一価抗原結合性構築物であって、任意選択的に、第二の単離された一価抗原結合性構築物が、先行する構築物請求項のいずれかに記載の単離された一価抗原結合性構築物を、５０％を超えて、６０％を超えて、７０％を超えて、８０％を超えて、９０％を超えて、９５％を超えて、９９％を超えて、または１００％置換する、前記第二の単離された一価抗原結合性構築物も本明細書に記載する。
【００４４】
単離された一価抗原結合性構築物であって、細胞が構築物により接触された時に、
ａ．ＥＧＦＲと結合または特異的に結合する対応する単離された単一特異性二価抗原結合性構築物と比較して、ＢＴ４７４細胞、ＨＣＴ１１６細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３４細胞、またはＳＫＯＶ３細胞のうちの１つまたは複数への、ＦＡＣＳにより決定される、より高い細胞表面結合性（ＢＭＡＸ）、
ｂ．ＥＧＦＲと結合または特異的に結合する対応する単離された単一特異性二価抗原結合性構築物により媒介されるそれと比較して、ＢＴ−４７４細胞の増加した抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の媒介、または
ｃ．ＪＩＭＴ１細胞による細胞内部移行、のうちの１つまたは複数によって、特徴付けられる、前記構築物も本明細書に記載する。
【００４５】
単離された一価抗原結合性構築物であって、構築物がアフコシル化され、構築物が、ＥＧＦＲと結合または特異的に結合する対応する単離された単一特異性二価抗原結合性構築物が媒介するそれに対して、Ａ５４９細胞のＡＤＣＣにおいて１．９倍増加及び／またはＨＣＴ１１６細胞のＡＤＣＣにおいて１．４倍増加を媒介する、前記構築物も本明細書に記載する。
【００４６】
いくつかの態様では、抗原結合性構築物は、少なくとも１つの修飾を含み、修飾はアフコシル化である。
【００４７】
本明細書に記載の単離された一価抗原結合性構築物をコードする少なくとも１つの配列を含む、単離ポリヌクレオチドまたは単離ポリヌクレオチドのセットも本明細書に記載する。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットは、ｃＤＮＡである。
【００４８】
本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットのうちの１つまたは複数を含む、ベクターまたはベクターのセットも本明細書に記載する。いくつかの態様では、ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター、発現ベクター、及び組換え発現ベクターからなる群より選択される。
【００４９】
本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットまたは本明細書に記載のベクターを含む、単離細胞も本明細書に記載する。いくつかの態様では、細胞は、ハイブリドーマ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはＨＥＫ２９３細胞である。
【００５０】
本明細書に記載の単離された一価抗原結合性構築物及び薬学的に許容され得るキャリアを含む医薬組成物も本明細書に記載する。いくつかの態様では、組成物は、緩衝剤、抗酸化剤、低分子量分子、薬物、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、脂質、キレート剤、安定剤、及び賦形剤からなる群より選択される１つまたは複数の物質をさらに含む。
【００５１】
いくつかの態様では、組成物は、第二の単離された抗原結合性構築物をさらに含む。いくつかの態様では、第二の構築物は、ＨＥＲ２またはＨＥＲ２の細胞外ドメインに特異的に結合する。いくつかの態様では、第二の構築物は、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）２及び／またはＥＣＤ４に特異的に結合する。いくつかの態様では、第二の構築物は、抗原結合ポリペプチドが、ＨＥＲ２またはＨＥＲ２の細胞外ドメインと特異的に結合することを除いて、本明細書に記載の単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物と同一である。
【００５２】
医療薬において使用するための、本明細書に記載の構築物を含む医薬組成物も本明細書に記載する。いくつかの態様では、組成物は、癌性状態の処置において使用するためのものである。いくつかの態様では、癌性状態は、ＥＧＦＲ発現癌、上皮細胞由来の癌、乳癌、ＨＥＲ２発現癌、肺癌、トリプルネガティブ乳癌、乳管癌、胃癌、卵巣癌、頭頚部癌、膠芽腫、子宮頸癌、腎癌、子宮癌、膵癌、または結腸直腸癌である。
【００５３】
本明細書に記載の単離された一価抗原結合性構築物を得る方法であって、（ａ）宿主細胞培養物を得るステップであって、ここで宿主細胞は抗原結合性構築物をコードする１つまたは複数の核酸配列を含む、ステップと；（ｂ）宿主細胞培養物を単離された一価抗原結合性構築物を発現するのに十分な条件下で培養するステップと；（ｃ）抗原結合性構築物を宿主細胞培養物から回収するステップとを含む、前記方法も本明細書に記載する。
【００５４】
対象においてＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲシグナル伝達に関連する癌または障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、本明細書に記載の医薬組成物または構築物を提供することを含む、前記方法も本明細書に記載する。
【００５５】
いくつかの態様では、癌は、ＥＧＦＲ発現癌、上皮細胞由来の癌、乳癌、ＨＥＲ２発現癌、肺癌、トリプルネガティブ乳癌、乳管癌、胃癌、卵巣癌、膠芽腫、子宮頸癌、腎癌、子宮癌、または結腸直腸癌である。
【００５６】
いくつかの態様では、本方法は、追加の薬剤に加えて単離された一価構築物を提供することを含む。いくつかの態様では、単離された一価構築物は、追加の薬剤と同時に提供される。いくつかの態様では、単離された一価構築物は、追加の薬剤とは別に提供される。いくつかの態様では、追加の薬剤は、第二の、異なる単離された抗原結合性構築物である。いくつかの態様では、第二の構築物は、ＨＥＲ２またはＨＥＲ２の細胞外ドメインに特異的に結合する。いくつかの態様では、第二の構築物は、ＨＥＲ２のＥＣＤ２及び／またはＥＣＤ４に特異的に結合する。いくつかの態様では、第二の構築物は、抗原結合ポリペプチドがＨＥＲ２またはＨＥＲ２の細胞外ドメインと特異的に結合することを除いて、請求項１に記載の単離された一価抗原結合性構築物と同一である。
【００５７】
いくつかの態様では、単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物は、腫瘍上のＥＧＦＲへのＥＧＦの結合を遮断する。いくつかの態様では、単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物は、腫瘍における恒常的なＥＧＦＲシグナル伝達を遮断する。いくつかの態様では、腫瘍を単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物と接触させることは、ＡＤＣＣをもたらす。いくつかの態様では、腫瘍を単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物と接触させることは、単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物の細胞内部移行をもたらす。
【００５８】
腫瘍の増殖を阻害、腫瘍を縮小、または腫瘍を有する対象の生存期間を増加させる方法であって、腫瘍を有効量の本明細書に記載の組成物または構築物と接触させることを含む、前記方法も本明細書に記載する。
【００５９】
いくつかの態様では、腫瘍は、上皮細胞由来の腫瘍またはＨＥＲ２陽性腫瘍である。いくつかの態様では、単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物は、腫瘍上のＥＧＦＲへのＥＧＦの結合を遮断する。いくつかの態様では、単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物は、腫瘍における恒常的なＥＧＦＲシグナル伝達を遮断する。いくつかの態様では、腫瘍を単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物と接触させることは、ＡＤＣＣをもたらす。いくつかの態様では、腫瘍を単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物と接触させることは、単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物の細胞内部移行をもたらす。
【００６０】
細胞におけるＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲシグナル伝達を阻害する、減少させるまたは遮断する方法であって、細胞を有効量の本明細書に記載の構築物または組成物と接触させることを含む、前記方法も本明細書に記載する。
【００６１】
いくつかの態様では、細胞は、ＥＧＦＲ発現癌細胞、乳癌細胞、上皮細胞由来の腫瘍細胞、ＨＥＲ２陽性腫瘍細胞、肺癌細胞、トリプルネガティブ乳癌細胞、乳管癌細胞、胃癌細胞、及び頭頚部癌細胞、膵癌細胞、卵巣癌細胞、膠芽腫細胞、子宮頸癌細胞、腎癌細胞、子宮癌細胞、または結腸直腸癌細胞である。
【００６２】
本明細書に記載の単離された抗原結合性構築物及び使用説明書を含み、任意選択的に第二の単離された抗原結合性構築物をさらに含む、キットも本明細書に記載する。
【００６３】
疾患を処置するための医薬の製造において使用するための本明細書に記載される単離された抗原結合性構築物であって、任意選択的に、疾患は癌、例えば、ＥＧＦＲ発現癌、上皮細胞由来の癌、乳癌、ＨＥＲ２発現癌、肺癌、トリプルネガティブ乳癌、乳管癌、胃癌、卵巣癌、膠芽腫、子宮頸癌、腎癌、子宮癌、または結腸直腸癌である、前記構築物も本明細書に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
本発明のこれら及び他の特徴、態様、及び利点は、以下の説明及び添付の図面に関して、より良好に理解されるだろう。
【図１】図１は、例示的な１アーム（ｏｎｅ  ａｒｍｅｄ）抗ＥＧＦＲ抗体（ＯＡ−ＥＧＦＲ）、ｖ４３５３及び１３２３の純度の評価を示す。図１Ａは、７９．９５ｍｌの保持容量で主ピークを有するｖ４３５３のＳＥＣプロファイルを示す。図１Ｂは、８４．７４ｍｌの保持容量で主ピークを有するｖ１３２３のＳＥＣプロファイルを示す。図１Ｃは、各種それぞれ、おおよそ１１０ｋＤａ及び６６ｋＤＡでのｖ４３５３及びｖ１３２３両方のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。図１Ｄは、ｖ４３５３の型の例示的な１アーム抗ＥＧＦＲ抗体の概略図である。図１Ｅは、ｖ１３２３の型の例示的な１アーム抗ＥＧＦＲ抗体の概略図である。図１Ｅは、ｖ７１８０の型の二価（フルサイズ）抗ＥＧＦＲ抗体の概略図である。
【図２】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定された、例示的な中和性及び非中和性ＯＡ−ＥＧＦＲ抗体のＥＧＦＲに結合する能力を示す。図２Ａ及び２Ｂは、ｖ４３５３（中和性抗体）のセンサーグラムを示し、それぞれＥＧＦＲに結合するその能力及びＨＥＲ２への結合の欠如を示す。図２Ｃ及び２Ｄは、ｖ１３２３（非中和性）のセンサーグラムを示し、それぞれＥＧＦＲに結合するその能力及びＨＥＲ２への結合の欠如を示す。
【図３】ＨＥＲ２  ３＋ＥＧＦＲ発現乳癌ＢＴ−４７４細胞に濃度依存的及び可飽和様式で結合する例示的なＯＡ−ＥＧＦＲ抗体の能力を示す。ＯＡ−ＥＧＦＲ抗体は、フルサイズの二価抗ＥＧＦＲ抗体であるＥｒｂｉｔｕｘ（商標）と比較してより高いＢｍａｘを示す。
【図４】５日間の曝露にわたる、ＥＧＦＲを発現するＡ４３１肺癌細胞の増殖を阻害する、例示的な中和性及び非中和性ＯＡ−ＥＧＦＲ抗体の能力を示し、阻害は中和性ＯＡ−ＥＧＦＲ  ｖ４３５３で見られたが、非中和性ＯＡ−ＥＧＦＲ  ｖ１３２３では見られなかった。
【図５】乳房ＢＴ−４７４癌細胞において２５：１のエフェクター対標的Ｅ：Ｔ比率で濃度依存性ＡＤＣＣを媒介する、例示的な中和性及び非中和性ＯＡ−ＥＧＦＲ抗体の能力を示す。
【図６】細胞内部移行する及びＥＧＦＲ発現を下方制御する例示的なＯＡ−ＥＧＦＲ抗体の能力の測定を示す。図６Ａは、ＪＩＭＴ−１細胞に細胞内部移行する及びＪＩＭＴ−１細胞におけるＥＧＦＲ発現を下方制御する２０ｎＭのｖ４３５３の効果を示す。図６Ｂは、単独でまたは他の抗体と組み合わせて、ＪＩＭＴ−１細胞に内部移行する及びＪＩＭＴ−１細胞におけるＥＧＦＲ発現を下方制御する１００ｎＭ及び２００ｎＭのｖ４３５３の効果を示す。６Ａ及び６Ｂの各実験群について、左バーは４℃の表面；真ん中のバーは、３７℃の表面；右バーは３７℃の内部である。
【図７】マウス異種移植モデルにおけるＣＴＸ−抵抗性株化卵巣腫瘍ＳＫＯＶ３の増殖を阻害する、例示的なＯＡ−ＥＧＦＲとＯＡ−ＨＥＲ２抗体の組み合わせの能力を示す。
【図８】図７のＳＫＯＶ３異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｐｈ）モデルにおける例示的なＯＡ−ＥＧＦＲとＯＡ−ＨＥＲ２抗体の組み合わせに曝露したマウスの生存データを示す、カプラン・マイヤープロットを示す。
【図９】プロテインＡ及びＳＥＣ精製後の例示的なアフコシル化ＯＡ−ＥＧＦＲ  ｖ４３５３（ｖ７１９２）抗体のＵＰＬＣ−ＳＥＣクロマトグラムを示す。
【図１０】例示的なアフコシル化ＯＡ−ＥＧＦＲ  ｖ４３５３最終産物（ｖ７１９２）のＵＰＬＣ−ＳＥＣクロマトグラム（図１０Ａ及び１０Ｂ）及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１０Ｃ）を示す。
【図１１】ＬＣ−ＭＳによる例示的なアフコシル化抗体ｖ７１９２のトリプシン消化物の糖鎖分析を示す。
【図１２】非コンジュゲートｖ７１０４及びＤＭ１コンジュゲートｖ７１９２例示的ＯＡ−ＥＧＦＲ抗体のＨＩＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムのオーバーレイを示す。
【図１３】非コンジュゲートｖ７１０４及びコンジュゲートｖ７１９２例示的ＯＡ−ＥＧＦＲ抗体のＨＰＬＣ−ＳＥＣクロマトグラムのオーバーレイを示す。
【図１４】様々なヒト腫瘍細胞株への全細胞飽和結合を示す。対応する二価抗体と比較してＯＡ−ＥＧＦＲのＢｍａｘは、それぞれ結腸直腸ＨＣＴ１１６（図１４Ａ）、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１４Ｂ）及び卵巣ＳＫＯＶ３（図１４Ｃ）において、１．５５倍、１．６８倍及び１．３８倍増加した。
【図１５】図１５Ａ及び１５Ｂは、５０：１のＰＢＭＣエフェクター対標的Ｃａｃｏ２のＥ：Ｔ比率で評価した、Ｃａｃｏ２細胞株に対する例示的なＯＡＡの濃度依存性ＡＤＣＣ用量反応曲線を示す。
【図１６】５：１のＮＫ９２（ＣＤ１６ａ：１５８Ｖ／Ｖ）エフェクター対標的ＴＮＢＣ  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１のＥ：Ｔ比率で評価した、ＴＮＢＣ  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するアフコシル化（ｖ７１９２）及び非アフコシル化（ｖ４３５３）例示的なＯＡ−ＥＧＦＲのＡＤＣＣ用量反応曲線を示す。
【図１７】ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対する例示的なＯＡＡＤＣの増殖阻害用量反応曲線を示す。
【図１８】図１８Ａは、血清の存在下で不死化ＨＡＣＡＴケラチノサイト細胞株に対する、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）と比較した例示的なＯＡ−ＥＧＦＲ抗体ｖ４３５３及びｖ７１９２の増殖阻害用量反応曲線を示す。図１８Ｂは、血清の不存在下でＥｒｂｉｔｕｘ（商標）のそれと比較したＯＡ−ＥＧＦＲ抗体ｖ１３２３の増殖阻害用量反応曲線を示す。
【図１９】それぞれ、その細胞表面上に高、中及び低レベルのＥＧＦＲを発現する、Ａ４３１細胞、Ａ５４９細胞及びＨＣＴ１１６細胞に対する、アフコシル化（ｖ７１９２）例示的ＯＡ−ＥＧＦＲ及びＥｒｂｉｔｕｘ（商標）（ｖ７１８０）のＡＤＣＣ用量反応曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
詳細な説明
一価的に抗原と結合する抗原結合性ポリペプチド構築物を含む、一価抗原結合性構築物を本明細書に提供する。いくつかの態様では、構築物は、それぞれがＣＨ３ドメインを含む２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含む二量体Ｆｃポリペプチド構築物を含み、１つの前記単量体Ｆｃポリペプチドは、抗原結合性ポリペプチド構築物からの少なくとも１つのポリペプチドに融合し、前記一価抗原結合性構築物は、２つの抗原結合性領域を有する対応する単一特異性二価抗原結合性構築物と比較して、前記抗原を提示する標的細胞に対する結合密度及びＢｍａｘにおける増加を示し、前記一価抗原結合性構築物は、対応する二価抗原結合性構築物と比較して、より優れた有効性及び／または生物活性を示し、前記より優れた有効性及び／または生物活性は、結合密度の増加の結果であり、標的細胞の装飾（ｄｅｃｏｒａｔｉｏｎ）における増加をもたらす。ここに提供する一価抗原結合性構築物によるＢｍａｘまたは結合密度における増加及び結果生じる標的装飾における増加は、特異的標的結合の効果であり、非特異的結合によるものではない。ある特定の実施形態では、最大結合は、１：１の標的対抗体比率で生じる。
【００６６】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供する一価抗原結合性構築物は、以下の特性のうちの少なくとも１つまたは複数を所有する：対応する単一特異性二価抗原結合性構築物（ＦＳＡ）と比較して増加したＢｍａｘ；対応するＦＳＡに匹敵するＫｄ；対応するＦＳＡと比較して同等またはより遅いオフ速度；低減したまたは部分的なアゴニズム；標的の架橋及び二量体化がない；対象となる標的細胞への特異性及び／または選択性；完全な、または部分的な標的細胞増殖の阻害、または標的細胞増殖の阻害が無い；エフェクター活性を誘発することができる完全Ｆｃ；及び標的細胞により細胞内部移行される能力。
【００６７】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供する一価抗原結合性構築物は、以下の最低限の特性を所有する：対応するＦＳＡと比較して増加したＢｍａｘ；対応するＦＳＡに匹敵するＫｄ；対応するＦＳＡと比較して同等またはより遅いオフ速度；低減したまたは部分的なアゴニズム；標的の架橋及び二量体化がない；対象となる標的細胞への特異性及び／または選択性；完全な、または部分的な標的細胞増殖の阻害、または標的細胞増殖の阻害が無い；エフェクター活性を誘発することができる完全Ｆｃ；及び任意選択的に、標的細胞により細胞内部移行される能力。
【００６８】
一価抗原結合性構築物であって、前記構築物が、一価溶解性抗体、一価細胞内部移行性抗体及びそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つである、前記構築物を本明細書に提供する。いくつかの実施形態では、抗原結合性構築物は、以下の有効性因子：ａ）細胞内部移行される一価抗原結合性構築物の能力、ｂ）一価抗原結合性構築物の増加したＢｍａｘ及びＫｄ／オン−オフ速度、及びｃ）一価抗体構築物のアゴニズム／部分的アゴニズムの程度、の間でこれらの抗体が示すバランスに依存する一価溶解性抗体及び／または一価細胞内部移行性抗体である。
【００６９】
少なくとも１つの標的細胞において抗体濃度を増加させる方法であって、抗原に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物と、二量体Ｆｃドメインを含む一価抗原結合性構築物を標的細胞に提供することを含み、前記一価抗原結合性構築物が、２つの抗原結合領域を有する対応する二価抗原結合性構築物と比較して、前記抗原を提示する標的細胞に対する結合密度及びＢｍａｘ（最大結合量）における増加を示し、前記一価抗原結合性構築物が、対応する二価抗原結合性構築物と比較して、より良好な治療有効性を示し、前記有効性は、抗原の架橋、抗原二量体化、抗原調節の防止、または抗原活性化の防止によって引き起こされない、前記方法を本明細書に提供する。反対に、抗原調節または抗原活性化が正味の死滅効果に打ち勝たない限り、有効性は抗原調節または抗原活性化によって引き起こされ得るということは事実である。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の単離された一価抗原結合性構築物であり、前記抗原結合性構築物は結合活性を呈さない。
【００７１】
単離された一価抗原結合性構築物であって、一価的に抗原と結合する抗原結合性ポリペプチド構築物と；それぞれがＣＨ３ドメインを含む２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含む二量体Ｆｃポリペプチド構築物とを含み、１つの前記単量体Ｆｃポリペプチドが抗原結合性ポリペプチド構築物からの少なくとも１つのポリペプチドに融合し、前記一価抗原結合性構築物が、２つの抗原結合領域を有する対応するＦＳＡ構築物と比較して、前記抗原を提示する標的細胞に対する結合密度及びＢｍａｘ（最大結合量）における増加を示し、前記一価抗原結合性構築物は、対応する二価抗原結合性構築物と比較して、より優れた有効性及び／または生物活性を示し、前記より優れた有効性及び／または生物活性が、結合密度における増加の結果である、前記構築物を本明細書に提供する。
【００７２】
本明細書に記載の単離された一価抗原結合性構築物であって、単一特異性二価抗体に対して、結合密度及びＢｍａｘにおける増加が、抗体の観察される平衡定数（Ｋｄ）を超える濃度及び飽和濃度で観察される、前記構築物を、ある特定の実施形態において提供する。いくつかの実施形態では、より優れた有効性及び／または生物活性は、増加したＦｃγＲまたは補体（Ｃ１ｑ）結合、及び前記対応する二価抗原結合性構築物と比較してより高いＡＤＣＣ、より高いＡＤＣＰ及びより高いＣＤＣのうちの少なくとも１つの結果である。特定の実施形態では、単離された一価抗原結合性構築物は、抗増殖性であり、細胞内部移行される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の単離された一価抗原結合性構築物であり、ＦＳＡに対する結合密度及びＢｍａｘにおける前記増加は、標的細胞上の抗原の密度に依存しない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の単離された一価抗原結合性構築物が提供され、標的細胞は、癌細胞、またはＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２を発現する疾患細胞である。一実施形態では、本明細書に記載の単離された一価抗原結合性構築物は、結合活性を呈さない。
【００７３】
定義
本発明が、特定のプロトコル；本明細書に記載の細胞株、構築物、及び試薬に限定されず、それ自体が変化し得ることが理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本発明の範囲を限定することを意図せず、それは添付の特許請求の範囲によってのみ限定され得ることも理解されたい。
【００７４】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法、装置、及び材料が、本発明の実施または試験において使用されることができるが、好ましい方法、装置、及び材料をここに記載する。
【００７５】
本明細書にて言及された全ての刊行物及び特許は、例えば、本発明に関連して使用され得る刊行物に記載された構築物及び方法論を説明及び開示する目的のために参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日の前のその開示のために単に提供される。本明細書におけるいかなるものも、本発明者らが、先行の発明またはいずれの他の理由により、そのような開示に先行する権限がないことの承認であるとは解釈されない。
【００７６】
「二量体」または「ヘテロ二量体」は、少なくとも第一の単量体ポリペプチド及び第二の単量体ポリペプチドを含む分子である。ヘテロ二量体の場合、前記単量体のうちの一方は、少なくとも１つのアミノ酸残基によって、他方の単量体と異なる。ある特定の実施形態では、二量体の会合は、表面領域の埋没によって行われる。いくつかの実施形態では、単量体ポリペプチドは、所望の二量体形成を支持する、及び／または他の所望されない検体の形成を避けることによって二量体形成を行う静電相互作用及び／または塩橋相互作用によって、互いに相互作用する。いくつかの実施形態では、単量体ポリペプチドは、所望の二量体形成を支持する、及び／または他の会合型の形成を避けることによって所望の二量体形成を行う疎水性相互作用によって、互いに相互作用する。ある特定の実施形態では、単量体ポリペプチドは、共有結合形成によって互いに相互作用する。ある特定の実施形態では、共有結合は、天然に存在するか、または導入される、所望の二量体形成を行うシステインの間で形成される。本明細書に記載のある特定の実施形態では、共有結合は、単量体間で形成されない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、所望の二量体形成を支持する、及び／または他の所望されない実施形態の形成を避けることによって二量体形成を行うパッキング／サイズ相補性／ノブ・イントゥー・ホール（ｋｎｏｂ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅ）／隆起（ｐｒｏｔｒｕｂｅｒａｎｃｅ）−空洞タイプ相互作用によって互いに相互作用する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、二量体形成を行うカチオン−ｐｉ相互作用によって互いに相互作用する。ある特定の実施形態では、個々の単量体ポリペプチドは、溶液中で単離された単量体として存在することはできない。
【００７７】
用語「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ」は、本明細書で用いる時、一般に、免疫グロブリン重鎖のＣ末端ポリペプチド配列を含む二量体複合体を指し、Ｃ末端ポリペプチド配列はインタクト抗体のパパイン消化から得ることができるものである。Ｆｃドメインは、未変性または変異Ｆｃ配列を含み得る。免疫グロブリン重鎖のＦｃ配列の境界は変わり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ配列は、およそＣｙｓ２２６位におけるアミノ酸残基から、またはおよそＰｒｏ２３０位からＦｃ配列のカルボキシル末端まで広がると通常定義される。免疫グロブリンのＦｃ配列は、一般に、２つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含み、任意選択的にＣＨ４ドメインを含む。本明細書において「Ｆｃポリペプチド」は、Ｆｃドメインを作り上げるポリペプチドのうちの１つを意味する。Ｆｃポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭなどの任意の好適な免疫グロブリンから得られ得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、野生型ヒンジ配列の部分または全てを（一般に、そのＮ末端で）含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、機能的または野生型ヒンジ配列を含まない。
【００７８】
抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃドメイン（未変性配列Ｆｃドメインまたはアミノ酸配列変異Ｆｃドメイン）に起因し得る生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）；貪食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などが含まれる。
【００７９】
「抗体依存性細胞媒介細胞傷害」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介反応を指す。
【００８０】
「補体依存性細胞傷害」及び「ＣＤＣ」は、補体の存在下における標的の溶解を指す。補体活性化経路は、補体系（Ｃ１ｑ）の第一の成分の同族抗原と複合化する分子（例えば、抗体）への結合によって開始される。
【００８１】
「抗体依存性細胞貪食作用」及び「ＡＤＣＰ」は、単球またはマクロファージ媒介性貪食作用を介した標的細胞の破壊を指す。
【００８２】
用語「Ｆｃ受容体」及び「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃドメインに結合する受容体を記述するために使用される。例えば、ＦｃＲは、未変性配列ヒトＦｃＲであることができる。一般に、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）と結合するものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、対立遺伝子の変異体及びあるいはこれらの受容体のスプライス形態も含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体は、それらの細胞質ドメインにおいて主に異なる類似のアミノ酸配列を有する、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含む。他のアイソタイプの免疫グロブリンもまた、ある特定のＦｃＲによって結合されることができる（例えば、Ｊａｎｅｗａｙら、Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，ＮＹ）（第４版、１９９９）を参照されたい）。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）をその細胞質ドメイン内に含有する。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）をその細胞質ドメイン内に含有する（Ｄａeｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）に概説される）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；及びｄｅ  Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）において概説される。将来的に同定されるものを含む他のＦｃＲは、本明細書における「ＦｃＲ」という用語に包含される。本用語はまた、母体ＩｇＧの胎児への転移の原因である新生児受容体ＦｃＲｎを含む（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）；及びＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。
【００８３】
「障害」は、本発明の抗体または方法を用いる処置から利益を受けるだろう任意の状態である。これは、哺乳動物を問題となる障害にさせる病理学的状態のものを含む、慢性及び急性障害または疾患を含む。本明細書において処置される障害の非限定的な例としては、悪性及び良性腫瘍；非白血病及びリンパ系悪性腫瘍；神経細胞、膠細胞、星状細胞、視床下部及び他の腺性、マクロファージ、上皮性、間質性、及び胞胚腔障害；及び炎症性、免疫性、及び他の血管新生関連障害が挙げられる。
【００８４】
用語「癌」及び「癌性」は、典型的に無秩序な細胞成長／増殖によって特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指すか、または記述する。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽癌腫、肉腫、及び白血病が含まれるが、これらに限定されない。そのような癌のより具体的な例としては、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌腫、腹膜の癌、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、肝細胞癌、胃腸癌、膵癌、膠芽腫／神経膠腫（例えば、退形成性星細胞腫、多形性膠芽細胞腫、退形成性乏突起膠腫、退形成性乏突起星細胞腫）、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎癌、肝癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌腫、及び種々のタイプの頭頸部癌が挙げられる。
【００８５】
本明細書で用いる時、「処置」は、処置される個体または細胞の自然経過を変化させることを試みる臨床的介入を指し、予防のためにまたは臨床病理の経過中のいずれかで実施することができる。処置の望ましい効果としては、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、疾患進行の速度の減少、疾患状態の回復または緩和、及び寛解または改善された予後が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、疾患または障害の発症を遅らせるために使用される。一実施形態では、本発明の抗体及び方法は、腫瘍退縮に効果を与える。一実施形態では、本発明の抗体及び方法は、腫瘍／癌増殖の阻害に効果を与える。
【００８６】
「組換え宿主細胞」または「宿主細胞」は、挿入に用いられる方法、例えば、直接取込み、形質導入、ｆ接合、または当該技術分野で知られている組換え宿主細胞を作製するための他の方法にかかわらず、外来性ポリヌクレオチドを含む細胞を指す。外来性ポリヌクレオチドは、非統合ベクター、例えばプラスミドとして維持されてもよく、または代替として、宿主ゲノムに統合されてもよい。
【００８７】
本明細書で用いる時、用語「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」または「培地（ｍｅｄｉａ）」は、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、真核宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、ＣＨＯ細胞、原核宿主細胞、大腸菌、またはシュードモナス宿主細胞を含む任意の宿主細胞及び細胞含有物を支持し得るかまたは含有し得る、任意の培養培地、溶液、固体、半固体、または剛性支持体を含む。ゆえに、本用語は、そこで宿主細胞が増殖している培地、例えば、増殖ステップの前か後のいずれかの培地を含む、その中にタンパク質が分泌されている培地を包含し得る。本用語は、本明細書に記載の抗原結合性構築物が細胞内で生成され、そのヘテロ多量体を放出するように宿主細胞が溶解されるかまたは崩壊される場合などのように、宿主細胞ライセートを含有する緩衝剤または試薬も包含し得る。
【００８８】
本明細書で用いる時、用語「調節された血清半減期」は、その未調節の形態に対して、本明細書に記載の抗原結合性構築物により含まれる抗原結合性ポリペプチドの循環半減期における正または負の変化を意味する。血清半減期は、構築物の投与後の様々な時点で血液試料を採取して、各試料におけるその分子の濃度を決定することによって測定される。血清濃度と時間との相関が血清半減期の算出を可能にする。血清半減期の増加は、少なくとも約２倍であることが望ましいが、それよりも少ない増加は、例えば、満足な投薬レジメンを可能にするかまたは毒性効果を回避する場合に、有用であり得る。いくつかの実施形態では、増加は少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍である。
【００８９】
本明細書で用いる時、用語「調節された治療半減期」は、本明細書に記載の一価抗原結合性構築物により含まれる治療有効量の抗原結合性ポリペプチドの半減期における、その非修飾形態に対する、正または負の変化を意味する。治療半減期は、投与後の様々な時点でその分子の薬物動態学的及び／または薬力学的性質を測定することによって測定される。治療半減期の増加は、特定の有益な投薬レジメン、特定の有益な総用量を可能にするか、または望ましくない効果を回避することが望ましい。いくつかの実施形態では、治療半減期の増加は、効力の増加、その標的に対する修飾された分子の結合性の増加または減少、プロテアーゼなどの酵素による分子の分解の増加または減少、または非修飾分子の作用の別のパラメーターまたは機構における増加または減少、または分子の受容体媒介性クリアランスにおける増加または減少に起因する。
【００９０】
核酸またはタンパク質に適用される時、用語「単離された」は、核酸またはタンパク質が天然の状態において会合する細胞内成分の少なくともいくつかを含まないか、または核酸またはタンパク質がそのインビボまたはインビトロ生成物の濃度を超えるレベルに濃縮されていることを示す。それは、均一な状態であることができる。単離された物質は、乾燥または半乾燥状態のいずれか、または水溶液を含むがこれに限定されない溶液であることができる。それは、追加の薬学的に許容され得るキャリア及び／または賦形剤を含む医薬組成物の成分であることができる。純度及び均一性は典型的に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高性能液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を用いて決定される。調製物中に存在する大部分を占める種であるタンパク質は、実質的に精製されている。特に、単離された遺伝子は、この遺伝子に隣接し、対象となる遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離している。用語「精製された」は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲルにおいて実質的に一本のバンドを生じさせることを示す。特に、この用語は、核酸またはタンパク質が、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９９％純粋、またはそれ以上純粋であることを意味し得る。
【００９１】
用語「核酸」は、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはリボヌクレオチド、及び一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のそれらのポリマーを指す。具体的に限定されない限り、本用語は、参照の核酸と同様の結合特性を有し、天然に生じるヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別途具体的に限定されない限り、本用語は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）を含むオリゴヌクレオチド類似体、アンチセンス技術に使用されるＤＮＡの類似体（ホスホロチオエート、ホスホロアミダート等）も指す。別途指示されない限り、特定の核酸配列は、それらの保存的に修飾された変異体（縮重コドン置換体を含むが、これに限定されない）、及び相補的配列、ならびに明確に示された配列も、潜在的に包含する。具体的には、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３位が、混合された塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって、縮重コドン置換体が達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【００９２】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書において互換可能に使用されて、アミノ酸残基のポリマーを指す。つまり、ポリペプチドに対する記述は、ペプチドの記述及びタンパク質の記述に等しく適用され、その逆もまた同様である。これらの用語は、天然に生じるアミノ酸ポリマー、ならびに１つまたは複数のアミノ酸残基が非天然にコードされるアミノ酸であるアミノ酸ポリマーにも適用される。本明細書で用いる時、これらの用語は、完全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含し、ここでアミノ酸残基は共有ペプチド結合によって連結される。
【００９３】
用語「アミノ酸」は、天然に生じるアミノ酸及び非天然に生じるアミノ酸、ならびに、天然に生じるアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。天然にコードされたアミノ酸は、２０個の一般的なアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン（ｐｒａｌｉｎｅ）、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリン）及びピロリジン及びセレノシステインである。アミノ酸類似体は、天然に生じるアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合するａ炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）、または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然に生じるアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸への言及には、例えば、天然に生じるタンパク新生Ｌ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸、化学的に修飾されたアミノ酸、例えば、アミノ酸変異体及び誘導体；天然に生じる非タンパク新生アミノ酸、例えば、βアラニン、オルニチン等；及びアミノ酸の特徴であると当該技術分野において知られている性質を有する化学的に合成された化合物を含む。非天然に生じるアミノ酸の例としては、αメチルアミノ酸（例えば、αメチルアラニン）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（例えば、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン）、余分なメチレンを側鎖に有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）、及び側鎖中のカルボン酸官能基がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（例えばシステイン酸）が挙げられるが、これらに限定されない。合成の未変性でないアミノ酸、置換されたアミノ酸、または１つまたは複数のＤ−アミノ酸を含む、非天然アミノ酸を本発明のタンパク質に組み込むことは、多くの異なる方法において有利であり得る。Ｄ−アミノ酸含有ペプチド等は、Ｌ−アミノ酸含有対応物と比較して、インビトロまたはインビボにおける増加した安定性を呈する。ゆえに、Ｄ−アミノ酸を組み込んだ、ペプチドの構築等は、細胞内でのより高い安定性が望まれるか必要とされる場合、特に有用であることができる。より具体的には、Ｄ−ペプチド等は、内因性ペプチダーゼ及びプロテアーゼに対して耐性を示し、それにより、このような特性が望ましいときに、分子のバイオアベイラビリティを改善し、インビボにおける寿命を延長する。加えて、Ｄ−ペプチド等は、Ｔヘルパー細胞への、主要組織適合性複合体クラスＩＩの拘束性提示について効率良く処理されることができず、従って、全生物において体液性免疫応答を誘導する可能性が低い。
【００９４】
本明細書においてアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会が推薦する、それらの一般的に知られた３文字表記または１文字表記のどちらかによって示してよい。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的に許容されている１文字コードによって示してよい。
【００９５】
「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に修飾された変異体」は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一の配列を指す。遺伝コードの縮重のため、多くの機能的に同一の核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、及びＧＣＵのコドンは全て、アミノ酸アラニンをコードする。ゆえに、コドンによってアラニンが特定される全ての位置では、コードされるポリペプチドを変化させることなく、記載された対応するコドンのいずれかへコドンを変化させることができる。そのような核酸の変異は「サイレント変異」であり、保存的に修飾された変異の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書の全ての核酸配列はまた、核酸の全ての可能性のあるサイレント変異を表している。当業者は、機能的に同一の分子が得られるように、核酸における各コドンが修飾され得ることを理解するだろう（メチオニンに対する通常唯一のコドンであるＡＵＧ、及びトリプトファンに対する通常唯一のコドンであるＴＧＧは除く）。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列に潜在的に含まれる。
【００９６】
アミノ酸配列に関しては、コードされた配列内の単一アミノ酸または数％のアミノ酸を変更、付加、または欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失、または付加は、その変更が、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、または化学的に類似するアミノ酸でのアミノ酸の置換をもたらす「保存的に修飾された変異体」であることを当業者は理解するだろう。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は当業者に既知である。このような保存的に修飾された変異体は、本発明の、多型変異体、種間ホモログ及び対立遺伝子に加えられるものであり、それらを排除するものではない。
【００９７】
機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換は当業者に既知である。以下の８群は、それぞれ互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び［０１３９］８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ  Ｈ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．；第２版（１９９３年１２月）を参照されたい。
【００９８】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、用語「同一」またはパーセント「同一性」は、２つ以上の配列またはサブ配列が同じであることを指す。以下の配列比較アルゴリズム（または当業者に利用可能な他のアルゴリズム）の１つを使用して測定するか、または手動で整列させて目視検査により測定して、配列を比較ウィンドウまたは指定された領域にわたって最大限に対応するように比較及び整列させるときに、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドのある割合（％）を配列が有する（すなわち、特定の領域にわたって約６０％同一性、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一性）場合、配列は「実質的に同一」である。この定義は、試験配列の相補性にも言及する。同一性は、少なくとも約５０アミノ酸またはヌクレオチド長の領域にわたって、または７５〜１００アミノ酸またはヌクレオチド長の領域にわたって、または、指定されない場合は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列全体にわたって存在することができる。本発明のポリヌクレオチド配列またはその断片を有する標識されたプローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でライブラリーをスクリーニングするステップと、前記ポリヌクレオチド配列を含有する完全長ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを単離するステップとを含むプロセスによって、ヒト以外の種からのホモログを含む、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得られ得る。そのようなハイブリダイゼーション技術は、当業者に周知である。
【００９９】
配列比較については、典型的に、一方の配列を基準配列として、これと試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する時、試験配列及び基準配列をコンピューターに入力し、サブ配列の座標を指定し、必要に応じて配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。プログラムのデフォルトのパラメーターを使用することができ、または代替のパラメーターを指定することができる。そして、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて基準配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を算出する。
【０１００】
本明細書で用いる時、「比較ウィンドウ」は、２０〜６００、一般的に約５０〜約２００、より一般的に約１００〜約１５０からなる群より選択される、いくつかの連続する位置のいずれか１つの区分への参照を含み、ここにおいて配列は、２つの配列が最適に整列された後に、連続する位置の同数の基準配列と比較され得る。比較のための配列整列の方法は、当業者に既知である。比較のための最適な配列整列は、これに限定されないが、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性探索方法により、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩの中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）により、または手動での整列及び目視の検査（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５補遺）を参照のこと）により、行うことができる。
【０１０１】
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するために好適なアルゴリズムの一例は、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２及びＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されているＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、ワールドワイドウェブのｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにて利用可能である全米バイオテクノロジー情報センターを通して公的に入手可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターであるＷ、Ｔ、及びＸは、整列の感度及び速度を決定する。（ヌクレオチド配列用の）ＢＬＡＳＴＮプログラムは、１１の語長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を、規定値として使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３の語長、１０の期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照されたい）の５０のアライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を、規定値として使用する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、典型的に「低複雑性」フィルタをオフにして実施される。
【０１０２】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析も実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の尺度の１つは、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間に偶然に一致が生じ得る確率の指標を提供する。例えば、基準核酸に対する試験核酸の比較における最小合計確率が、約０．２未満、または約０．０１未満、または約０．００１未満であるとき、核酸は基準配列に類似するとみなされる。
【０１０３】
語句「に選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」は、特定のヌクレオチド配列が複合混合物（全細胞、ライブラリーＤＮＡ、またはＲＮＡを含むが、これらに限定されない）内に存在するときに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、特定のヌクレオチド配列に対してのみ分子が結合すること、二重鎖を形成すること、またはハイブリダイズすることを指す。
【０１０４】
語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、当該技術分野において知られているような低イオン強度及び高温の条件下における、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の核酸の配列、またはそれらの組合せのハイブリダイゼーションを指す。典型的には、ストリンジェントな条件下において、プローブは、核酸の複合混合物（全細胞、ライブラリーＤＮＡ、またはＲＮＡを含むが、これらに限定されない）中のその標的サブ配列とハイブリダイズするが、この複合混合物中の他の配列とはハイブリダイゼーションしない。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる環境においては異なるだろう。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ，"Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ"（１９９３）に見られる。
【０１０５】
本明細書で用いる時、用語「真核生物（ｅｕｋａｒｙｏｔｅ）」は、動物（哺乳動物、昆虫、爬虫類、鳥類等を含むが、これらに限定されない）、繊毛虫類、植物（単子葉植物、双子葉植物、藻類等を含むが、これらに限定されない）、菌類、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物等の系統学的ドメイン（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ）の真核生物（Ｅｕｃａｒｙａ）に属する生物を指す。
【０１０６】
本明細書で用いる時、用語「原核生物」は、原核の生物を指す。例えば、非真核の生物は、真正細菌（大腸菌、サーマス・サーモフィラス、バチルス・ステアロサーモフィルス、シュードモナス・フルオレセンス、シュードモナス・エルギノーサ、シュードモナス・プチダ等を含むが、これらに限定されない）系統学的ドメイン、または古細菌（メタノコッカス・ジャナスキー（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモアウトトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ハロフェラックス・ボルカニ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ）及びハロバクテリウム種（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＲＣ−１等のハロバクテリウム属、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、アエロピラム・ペルニクス（Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ）等を含むが、これらに限定されない）系統学的ドメインに属することができる。
【０１０７】
本明細書で用いる時、用語「対象」は、処置、観察、または実験の対象である動物を指し、いくつかの実施形態では哺乳動物、他の実施形態ではヒトを指す。動物は、ペット（例えば、イヌ、ネコ等）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等）、または実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモット等）であり得る。
【０１０８】
本明細書で用いる時、用語「有効量」は、投与される一価抗原結合性構築物の量であって、処置される疾患、状態、または障害の症状のうちの１つまたは複数をある程度軽減し得る量を指す。本明細書に記載の構築物を含有する組成物は、予防的、増強的、及び／または治療的な処置のために投与することができる。
【０１０９】
用語「増強する」または「増強」は、所望の効果を、効力または持続時間のいずれかにおいて、増加または延長することを意味する。ゆえに、薬物分子または治療剤の効果の増強に関して、用語「増強」は、系への治療剤の効果を、効力または持続時間のいずれかにおいて増加または延長する能力を指す。本明細書で用いる時、「増強に有効な量」は、所望の系において別の治療剤または薬物の効果を増強するのに十分な量を指す。患者に使用するとき、この使用に有効な量は、疾患、障害、または状態の重症度及び経過、治療歴、患者の健康状態及び薬物に対する応答、及び処置担当医の判断に依存するだろう。
【０１１０】
本明細書で用いる時、用語「修飾」は、ポリペプチドの長さ、アミノ酸配列、化学構造への変化、ポリペプチドの翻訳時修飾（ｃｏ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、または翻訳後修飾などの、所与のポリペプチドに対してなされる任意の変更を指す。書式「（修飾）」という用語は、議論されているポリペプチドが任意選択的に修飾される、つまり、議論下にあるポリペプチドが修飾または非修飾であることができることを意味する。
【０１１１】
用語「翻訳後修飾」は、天然または非天然アミノ酸の、ポリペプチド鎖内にそれが組み込まれた後にそのようなアミノ酸に生じる、任意の修飾を指す。本用語は、単に例として、インビボにおける翻訳時修飾、インビトロにおける翻訳時修飾（例えば、無細胞翻訳系）、インビボにおける翻訳後修飾、及びインビトロにおける翻訳後修飾を包含する。
【０１１２】
本明細書で用いる時、用語「単一特異性二価抗原結合性構築物」は、その両方が同じエピトープ／抗原に結合する（単一特異性である）２つの抗原結合性ドメイン（二価）を有する抗原結合性構築物を指す。抗原結合性ドメインは、Ｆａｂ（断片抗原結合）、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）、及びｓｄａｂ（単一ドメイン抗体）などのタンパク質構築物であり得るが、これらに限定されない。単一特異性二価抗原結合性構築物は、本明細書において「フルサイズ抗体」または「ＦＳＡ」とも称される。いくつかの実施形態では、単一特異性二価抗原結合性構築物は、それに対して一価抗原結合性構築物の特性が測定される基準である。他の実施形態では、２つの単一特異性二価抗原結合性構築物の組み合わせは、それに対して２つの一価抗原結合性構築物の組み合わせの特性が測定される基準である。２つの単一特異性二価抗原結合性構築物の組み合わせが使用される場合には、単一特異性二価抗原結合性構築物は、ＥＧＦＲ上のオーバーラップしないエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、２つの単一特異性二価抗原結合性構築物の組み合わせが使用される場合、１つの単一特異性二価抗原結合性構築物を基準として使用し、その１つの単一特異性二価抗原結合性構築物は、標準治療（ＳＯＣ）療法、例えば、Ｅｒｂｉｔｕｘを表す。
【０１１３】
構築物が標的に「特異的に結合する」という語句は、他の生物学の異種集団の存在下における標的の存在を決定する結合反応を指す。ゆえに、指定したイムノアッセイ条件下では、特定の構築物が特定の標的に特異的に結合し、試料内に存在する他の生物学に有意な量で結合しない。そのような条件下での標的への抗原結合性構築物の特異的結合には、抗原結合性構築物が標的に特異的であることが必要とされる。様々なイムノアッセイ形式を使用して、特定のタンパク質に特異的に免疫反応する抗原結合性構築物を選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイを通常使用して、あるタンパク質と特異的に免疫反応する抗原結合性構築物（例えば、モノクローナル抗体）を選択する。特異的な免疫反応を決定するために使用することができるイムノアッセイ形式及び条件の記載について、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
【０１１４】
用語「結合活性」は、本明細書において、治療用単一特異性二価抗体の結合親和性と主要構造と生物学的特質とを組み合わせた相乗的強度を指すために使用される。結合活性の欠如及び結合の相乗的強度の喪失は、見かけの標的結合親和性の減少をもたらし得る。一方で、固定数の抗原を有する標的細胞上では、多価（または二価）結合からもたらされる結合活性は、一価の結合を示す抗体と比べてより少ない数の抗体分子で標的抗原の占有率の増加を引き起こす。二価溶解性抗体の利用において、より少ない数の抗体分子が標的細胞に結合することで、抗体依存性の細胞傷害死滅機序が効率的に生じず、効果の減少をもたらし得る。ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、ＡＤＣＰを媒介するのに十分な抗体が結合されず、それは、これらのタイプのエフェクター機能が通常Ｆｃ濃度閾値依存性と見なされるためである。アゴニスト抗体の場合では、結合活性の減少は、抗原を架橋及び二量体化し、経路を活性化するそれらの効率を減少させる。
【０１１５】
ラクダ科のＶｈＨドメインなどの「単一ドメイン抗体」または「Ｓｄａｂ（Ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、個々の免疫グロブリンドメインである。Ｓｄａｂは、かなり安定しており、抗体のＦｃ鎖との融合パートナーとして容易に発現する（Ｈａｒｍｓｅｎ  ＭＭ，Ｄｅ  Ｈａａｒｄ  ＨＪ（２００７）．"Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃａｍｅｌｉｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ"．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７（１）：１３−２２）。
【０１１６】
本明細書で用いる時、用語「ＥＧＦＲ」は、上皮成長因子受容体（ＨＥＲ−１またはＥｒｂ−Ｂ１としても知られる）を指し、それはヒト形態（複数可）（Ｕｌｒｉｃｈ，Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：４１８−４２５（１９８４）；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ００５３３；セカンダリーアクセッション番号：Ｏ００６８８、Ｏ００７３２、Ｐ０６２６８、Ｑ１４２２５、Ｑ９２７９５、Ｑ９ＢＺＳ２、Ｑ９ＧＺＸ１、Ｑ９Ｈ２Ｃ９、Ｑ９Ｈ３Ｃ９、Ｑ９ＵＭＤ７、Ｑ９ＵＭＤ８、Ｑ９ＵＭＧ５）、ならびに天然に生じるそのアイソフォーム及び変異体を含む。そのようなアイソフォーム及び変異体には、ＥＧＦＲｖＩＩＩ変異体、選択的スプライシング生成物（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ００５３３−１、Ｐ００５３３−２、Ｐ００５３３−３、Ｐ００５３３−４により同定される）、変異体ＧＬＮ−９８、ＡＲＧ−２６６、Ｌｙｓ−５２１、ＩＬＥ−６７４、ＧＬＹ−９６２、及びＰＲＯ−９８８（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｊ．ら、ＮＩＥＨＳ−ＳＮＰｓ，ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｇｅｎｏｍｅ  ｐｒｏｊｅｃｔ，ＮＩＥＨＳ  ＥＳ１５４７８，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．（２００４））、及び以下のアクセッション番号により同定されるその他：ＮＭ００５２２８．３、ＮＭ２０１２８２．１、ＮＭ２０１２８３．１、ＮＭ２０１２８４．１（ＲＥＦＳＥＱ  ｍＲＮＡ）；ＡＦ１２５２５３．１、ＡＦ２７７８９７．１、ＡＦ２８８７３８．１、ＡＩ２１７６７１．１、ＡＫ１２７８１７．１、ＡＬ５９８２６０．１、ＡＵ１３７３３４．１、ＡＷ１６３０３８．１、ＡＷ２９５２２９．１、ＢＣ０５７８０２．１、ＣＢ１６０８３１．１、Ｋ０３１９３．１、Ｕ４８７２２．１、Ｕ９５０８９．１、Ｘ００５８８．１、Ｘ００６６３．１；Ｈ５４４８４Ｓ１、Ｈ５４４８４Ｓ３、Ｈ５４４８４Ｓ２（ＭＩＰＳアセンブリ）；ＤＴ．４５３６０６、ＤＴ．８６８５５６５１、ＤＴ．９５１６５５９３、ＤＴ．９７８２２６８１、ＤＴ．９５１６５６００、ＤＴ．１００７５２４３０、ＤＴ．９１６５４３６１、ＤＴ．９２０３４４６０、ＤＴ．９２４４６３４９、ＤＴ．９７７８４８４９、ＤＴ．１０１９７８０１９、ＤＴ．４１８６４７、ＤＴ．８６８４２１６７、ＤＴ．９１８０３４５７、ＤＴ．９２４４６３５０、ＤＴ．９５１５３００３、ＤＴ．９５２５４１６１、ＤＴ．９７８１６６５４、ＤＴ．８７０１４３３０、ＤＴ．８７０７９２２４（ＤＯＴＳアセンブリ）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に言及される全てのアクセッション番号は、２０１３年１１月８日時点で、ＮＣＢＩデータベース（または他の関連のある参照データベース）から取得したものである。
【０１１７】
「ＨＥＲ受容体」は、ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）ファミリーに属する受容体タンパク質チロシンキナーゼであり、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＨＥＲ４受容体を含む。ＨＥＲ受容体は、一般に、ＨＥＲリガンドと結合し得る細胞外ドメイン；親油性膜貫通ドメイン；保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン；及びリン酸化され得るいくつかのチロシン残基を抱えるカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを含む。
【０１１８】
ＨＥＲ２の細胞外（ｅｃｔｏ）ドメインは、４つのドメイン、ドメインＩ（ＥＣＤ１、約１〜１９５のアミノ酸残基）、ドメインＩＩ（ＥＣＤ２、約１９６〜３１９のアミノ酸残基）、ドメインＩＩＩ（ＥＣＤ３、約３２０〜４８８のアミノ酸残基）、及びドメインＩＶ（ＥＣＤ４、約４８９〜６３０のアミノ酸残基）（シグナルペプチドを伴わない残基番号）を含む。Ｇａｒｒｅｔｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１１：４９５−５０５（２００３）、Ｃｈｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ４２１：７５６−７６０（２００３）、Ｆｒａｎｋｌｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：３１７−３２８（２００４）、Ｔｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｖ．２０１２  Ａｐｒ；３８（２）：１３３−４２（２０１２）、またはＰｌｏｗｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１７４６−１７５０（１９９３）を参照されたい。
【０１１９】
「ＥｒｂＢ２」及び「ＨＥＲ２」という表現は、本明細書において互換可能に使用され、例えば、Ｓｅｍｂａら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８２：６４９７−６５０１（１９８５）及びＹａｍａｍｏｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：２３０−２３４（１９８６）に記載されるヒトＨＥＲ２タンパク質を指す（ジーンバンクアクセッション番号Ｘ０３３６３）。用語「ｅｒｂＢ２」及び「ｎｅｕ」は、ヒトＥｒｂＢ２タンパク質をコードする遺伝子を指す。ｐ１８５またはｐ１８５ｎｅｕは、ｎｅｕ遺伝子のタンパク質生成物を指す。好ましいＨＥＲ２は、未変性配列ヒトＨＥＲ２である。
【０１２０】
「ＨＥＲリガンド」とは、ＨＥＲ受容体に結合する及び／またはそれを活性化するポリペプチドを意味する。本明細書において特に対象となるＨＥＲリガンドは、上皮成長因子（ＥＧＦ）（Ｓａｖａｇｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４７：７６１２−７６２１（１９７２））；トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）（Ｍａｒｑｕａｒｄｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１０７９−１０８２（１９８４））；シュワン細胞腫（ｓｃｈｗａｎｏｍａ）またはケラチノサイト自己分泌型成長因子としても知られるアンフィレギュリン（Ｓｈｏｙａｂら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１０７４−１０７６（１９８９）；Ｋｉｍｕｒａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：２５７−２６０（１９９０）；及びＣｏｏｋら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２５４７−２５５７（１９９１））；ベータセルリン（Ｓｈｉｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１６０４−１６０７（１９９３）；及びＳａｓａｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９０：１１７３（１９９３））；ヘパリン結合上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）（Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：９３６−９３９（１９９１））；エピレギュリン（Ｔｏｙｏｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：７４９５−７５００（１９９５）；及びＫｏｍｕｒａｓａｋｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：２８４１−２８４８（１９９７））；ヘレグリン（以下を参照されたい）；ニューレグリン２（ＮＲＧ−２）（Ｃａｒｒａｗａｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：５１２−５１６（１９９７））；ニューレグリン３（ＮＲＧ−３）（Ｚｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：９５６２−９５６７（１９９７））；ニューレグリン４（ＮＲＧ−４）（Ｈａｒａｒｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：２６８１−８９（１９９９））、またはクリプト（ｃｒｉｐｔｏ）（ＣＲ−１）（Ｋａｎｎａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（６）：３３３０−３３３５（１９９７））等の未変性配列ヒトＨＥＲリガンドである。ＥＧＦＲと結合するＨＥＲリガンドには、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレギュリン、ベータセルリン、ＨＢ−ＥＧＦ、及びエピレギュリンが挙げられる。ＨＥＲ３と結合するＨＥＲリガンドには、ヘレグリンが挙げられる。ＨＥＲ４と結合することができるＨＥＲリガンドには、ベータセルリン、エピレギュリン、ＨＢ−ＥＧＦ、ＮＲＧ−２、ＮＲＧ−３、ＮＲＧ−４、及びヘレグリンが挙げられる。
【０１２１】
本明細書で用いる時、「ヘレグリン」（ＨＲＧ）は、米国特許第５，６４１，８６９号またはＭａｒｃｈｉｏｎｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：３１２−３１８（１９９３）に開示されるヘレグリン遺伝子生成物によってコードされるポリペプチドを指す。ヘレグリンの例には、ヘレグリン−α、ヘレグリン−β１、ヘレグリン−β２、及びヘレグリン−β３（Ｈｏｌｍｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：１２０５−１２１０（１９９２）；及び米国特許第５，６４１，８６９号）；ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）（Ｐｅｌｅｓら、Ｃｅｌｌ  ６９：２０５−２１６（１９９２））；アセチルコリン受容体誘導活性（ＡＲＩＡ）（Ｆａｌｌｓら、Ｃｅｌｌ  ７２：８０１−８１５（１９９３））；グリア成長因子（ＧＧＦ）（Ｍａｒｃｈｉｏｎｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：３１２−３１８（１９９３））；感覚及び運動神経由来因子（ＳＭＤＦ）（Ｈｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４５２３−１４５３２（１９９５））；γ−へレグリン（Ｓｃｈａｅｆｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：１３８５−１３９４（１９９７））が挙げられる。本用語は、そのＥＧＦ様ドメイン断片等の未変性配列ＨＲＧポリペプチドの生物学的に活性な断片及び／またはアミノ酸配列変異体を含む（例えば、ＨＲＧβ１１７７−２４４）。
【０１２２】
「ＨＥＲ活性化」または「ＨＥＲ２活性化」は、任意の１つまたは複数のＨＥＲ受容体またはＨＥＲ２受容体の活性化、またはリン酸化を指す。一般に、ＨＥＲ活性化は、シグナル伝達をもたらす（例えば、ＨＥＲ受容体または基質ポリペプチド内のチロシン残基をリン酸化するＨＥＲ受容体の細胞内キナーゼドメインによって引き起こされるもの）。ＨＥＲ活性化は、対象とするＨＥＲ受容体を含むＨＥＲ二量体に結合するＨＥＲリガンドによって媒介され得る。ＨＥＲ二量体に結合するＨＥＲリガンドは、二量体内のＨＥＲ受容体のうちの１つまたは複数のキナーゼドメインを活性化し得、それによりＨＥＲ受容体のうちの１つまたは複数におけるチロシン残基のリン酸化を、及び／またはＡｋｔまたはＭＡＰＫ細胞内キナーゼなどの追加的基質ポリペプチド（複数可）におけるチロシン残基のリン酸化をもたらす。
【０１２３】
抗体の「Ｆａｂ断片」（断片抗原結合とも称される）は、それぞれ、軽鎖及び重鎖上の可変ドメインＶＬ及びＶＨとともに、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。可変ドメインは、抗原結合に関与する相補性決定ループ（ＣＤＲ、超可変領域とも称される）を含む。Ｆａｂ′断片は、抗体ヒンジ領域から１つまたは複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での少数の残基の追加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。
【０１２４】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖内に存在する。一実施形態では、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，第１１３号，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。ＨＥＲ２抗体ｓｃＦｖ断片は、ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；及び米国特許第５，５８７，４５８号に記載される。
【０１２５】
非ヒト（例えば、齧歯動物）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンから得られる最小限の配列を含有するキメラ抗体である。多くの部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類等の非ヒト種の超可変領域由来の残基（ドナー抗体）によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの事例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体中に見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに洗練させるために行なわれる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的に２つの可変ドメインの実質的に全てを含み得、このドメイン内では、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応しており、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、任意選択的に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も含むだろう。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
【０１２６】
ヒト化ＨＥＲ２抗体には、参照により本明細書に明示的に組み込まれる米国特許第５，８２１，３３７号の表３に記載されるようなｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７、及びｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８、またはトラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）；ヒト化５２０Ｃ９（ＷＯ９３／２１３１９）及び米国特許公開第２００６／００１８８９９号に記載のような２０'ヒト化２Ｃ４抗体が含まれる。
【０１２７】
「エピトープ２Ｃ４」は、抗体２Ｃ４が結合するＨＥＲ２の細胞外ドメイン内の領域である。２Ｃ４エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載のものなどの通常の交差遮断アッセイを実施することができる。あるいは、抗体がＨＥＲ２の２Ｃ４エピトープに結合するかどうかを評価するために、当該技術分野で既知の方法を使用してエピトープマッピングを行うことができ、及び／またはＨＥＲ２のどのドメイン（複数可）が抗体によって結合されるかを見るために、抗体ＨＥＲ２構造を研究（Ｆｒａｎｋｌｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：３１７−３２８（２００４））することができる。エピトープ２Ｃ４は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインのドメインＩＩ由来の残基を含む。２Ｃ４及びペルツズマブは、ドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩの結合部でＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合する。Ｆｒａｎｋｌｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：３１７−３２８（２００４）。
【０１２８】
「エピトープ４Ｄ５」は、抗体４Ｄ５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４６３）及びトラスツズマブが結合するＨＥＲ２の細胞外ドメイン内の領域である。このエピトープは、ＨＥＲ２の膜貫通ドメインに近接しており、ＨＥＲ２のドメインＩＶ内にある。４Ｄ５エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載のものなどの通常の交差遮断アッセイを行うことができる。あるいは、抗体がＨＥＲ２の４Ｄ５エピトープに結合するかどうかを評価するために、エピトープマッピングを行うことができる（例えば、約残基５２９から約残基６２５（両端を含む）の領域における任意の１つまたは複数の残基、米国特許公開第２００６／００１８８９９号の図１を参照されたい）。
【０１２９】
「エピトープ７Ｃ２／Ｆ３」は、７Ｃ２及び／または７Ｆ３抗体（それぞれＡＴＣＣで沈着、以下を参照）が結合するＨＥＲ２の細胞外ドメインのドメインＩ内のＮ末端での領域である。７Ｃ２／７Ｆ３エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載のものなどの通常の交差遮断アッセイを行うことができる。あるいは、抗体がＨＥＲ２上の７Ｃ２／７Ｆ３エピトープに結合するかどうかを確証するために、エピトープマッピングを行うことができる（例えば、ＨＥＲ２の約残基２２から約残基５３までの領域における残基のうちの任意の１つまたは複数、米国特許公開第２００６／００１８８９９号の図１を参照されたい）。
【０１３０】
本明細書で用いる時、「抗原調節」という用語は、ＡＤＣにおけるものなどの細胞内部移行または下方制御）を介する表面受容体密度の変更または喪失を指す。
【０１３１】
抗原結合性構築物
ある実施形態で提供されるのは、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２に一価的に結合する抗原結合性ポリペプチド構築物と；各々がＣＨ３ドメインを含む２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含む二量体Ｆｃポリペプチド構築物とを含む、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２を低ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２発現を有する標的細胞上に結合する単離された一価抗原結合性構築物であり、１つの前記単量体Ｆｃポリペプチドは、抗原結合性ポリペプチド構築物由来のうちの少なくとも１つのポリペプチドに融合し；前記抗原結合性構築物は、抗増殖性で、標的細胞によって内部移行され、前記構築物は、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２に結合する対応する二価抗原結合性構築物と比較して、標的細胞上に表示されたＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２への結合密度及びＢｍａｘ（最大結合量）の増加を示し、前記構築物は、前記対応する二価ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２結合抗原結合性構築物と比較して、より高いＡＤＣＣ、より高いＡＤＣＰ、及びより高いＣＤＣのうちの少なくとも１つを示す。ある特定の実施形態において、低ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２発現を有する標的細胞は、癌細胞である。いくつかの実施形態において、低ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２発現を有する標的細胞は、上皮細胞由来の癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、トリプルネガティブ乳癌細胞、乳管癌細胞、胃癌細胞、頭部及び頸部癌細胞、膵臓癌細胞、卵巣癌細胞、または大腸癌細胞である。いくつかの実施形態において、低ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２発現を有する標的細胞は、乳癌細胞である。
【０１３２】
ある特定の実施形態において、抗原に一価的に結合する抗原結合性ポリペプチド構築物は、公知の抗体または抗原結合性ドメインに由来していてもよく、または新規の抗体または抗原結合性ドメインに由来していてもよい。一価抗原結合性構築物に対する抗原結合性ポリペプチド構築物の同定は、標的細胞の選択、及び標的細胞の表面上に発現した抗原の選択に基づくものである。例えば、標的細胞が選択されると、ａ）標的細胞の細胞表面上では発現するが、他の細胞の表面上では発現しない抗原、またはｂ）標的細胞の細胞表面上ではより高いレベルで発現するが、他の細胞の表面上ではより低いレベルで発現する抗原を選択する。これにより、標的細胞を選択的に標的にすることができる。
【０１３３】
ＥＧＦＲ結合性構築物
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の一価抗原結合性構築物は、ＥＧＦＲを発現する細胞を標的にするように設計され、抗原結合性ポリペプチド構築物は、ＥＧＦＲに結合する。ＥＧＦＲは、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーに属する癌原遺伝子であり、癌サブセットで過剰発現されることが多い。いくつかの実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物は、ＥＧＦＲに結合し、標的細胞は、低、中、または高ＥＧＦＲ発現細胞である。一実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物は、ＥＧＦＲに結合し、標的細胞は、低ＥＧＦＲ発現細胞である。別の実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物は、ＥＧＦＲに結合し、標的細胞は、二価ＥＧＦＲ結合性抗体への結合が低下した低ＥＧＦＲ発現細胞である。別の実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物は、ＥＧＦＲに結合し、標的細胞は、低ＥＧＦＲ発現細胞である。一実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物は、ＥＧＦＲに結合し、標的細胞は、癌細胞である。ある特定の実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物は、ＥＧＦＲに結合し、標的細胞は、上皮細胞由来の癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、トリプルネガティブ乳癌細胞、乳管癌細胞、胃癌細胞、頭部及び頸部癌細胞、膵臓癌細胞、卵巣癌細胞、または大腸癌細胞である。
【０１３４】
本明細書に記載の一価抗原結合性構築物のいくつかの実施形態において、二量体Ｆｃポリペプチド構築物は、ヘテロ二量体である。本明細書に記載の一価抗原結合性構築物のいくつかの実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物は、ＥＧＦＲに結合する。いくつかの実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物は、ＥＧＦＲ細胞外ドメインのうちの少なくとも１つに結合する。ある特定の実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物は、低、中、または高ＥＧＦＲ発現細胞である標的細胞により発現されたＥＧＦＲに結合する。ある特定の実施形態において、ＥＧＦＲ発現細胞は、二価ＥＧＦＲ結合性抗体への低下した結合を示す。一実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物は、ＥＧＦＲに結合し、標的細胞は、エストロゲン受容体陰性細胞、プロゲステロン受容体陰性細胞、及び二価ＥＧＦＲ結合性抗体への結合が低下した抗ＥＧＦＲ抗体耐性腫瘍細胞のうちの少なくとも１つである。
【０１３５】
本明細書に記載の一価抗原結合性構築物のいくつかの実施形態において、二量体Ｆｃポリペプチド構築物は、ヘテロ二量体である。本明細書に記載の一価抗原結合性構築物のある特定の実施形態において、一価抗原結合性ポリペプチド構築物は、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、及びｓｄＡｂ、抗原に結合することが可能な抗原結合ペプチドまたはタンパク質ドメインである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるように単離された一価抗原結合性構築物が提供され、一価抗原結合性ポリペプチド構築物は、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドを含むＦａｂ断片である。
【０１３６】
本明細書で提供されるのは、ＥＧＦＲに一価的に結合する抗原結合性ポリペプチド構築物と；各々がＣＨ３ドメインを含む２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含む二量体Ｆｃポリペプチド構築物とを含むＥＧＦＲに結合する単離された一価抗原結合性構築物であり、１つの前記単量体Ｆｃポリペプチドは、抗原結合性ポリペプチド構築物由来のうちの少なくとも１つのポリペプチドに融合し；前記抗原結合性構築物は、抗増殖性で、標的細胞によって内部移行され、前記構築物は、ＥＧＦＲに結合する対応する二価抗原結合性構築物と比較して、標的細胞上に表示されたＥＧＦＲへの結合密度及びＢｍａｘ（最大結合量）の増加を示し、前記構築物は、前記対応する二価ＥＧＦＲ結合抗原結合性構築物と比較して、より高いＡＤＣＣ、より高いＡＤＣＰ、及びより高いＣＤＣのうちの少なくとも１つを示す。
【０１３７】
ある実施形態で提供されるのは、ＥＧＦＲに一価的に結合する抗原結合性ポリペプチド構築物と；各々がＣＨ３ドメインを含む２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含む二量体Ｆｃポリペプチド構築物とを含む、低ＥＧＦＲ発現を有する標的細胞上でＥＧＦＲに結合する単離された一価抗原結合性構築物であり、１つの前記単量体Ｆｃポリペプチドは、抗原結合性ポリペプチド構築物由来のうちの少なくとも１つのポリペプチドに融合し；前記抗原結合性構築物は、抗増殖性で、標的細胞によって内部移行され、前記構築物は、ＥＧＦＲに結合する対応する二価抗原結合性構築物と比較して、標的細胞上に表示されたＥＧＦＲへの結合密度及びＢｍａｘ（最大結合量）の増加を示し、前記構築物は、前記対応する二価ＥＧＦＲ結合抗原結合性構築物と比較して、より高いＡＤＣＣ、より高いＡＤＣＰ、及びより高いＣＤＣのうちの少なくとも１つを示す。ある特定の実施形態において、低ＥＧＦＲ発現を有する標的細胞は、癌細胞である。いくつかの実施形態において、低ＥＧＦＲ発現を有する標的細胞は、上皮細胞由来の癌細胞である。
【０１３８】
一実施形態において、本明細書に記載の単離された一価抗原結合性構築物であり、抗原結合性構築物は、標的細胞増殖を阻害する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された一価抗原結合性構築物であり、前記一価ＥＧＦＲ結合ポリペプチド構築物は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、またはポリペプチドのうちの少なくとも１つである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された一価抗原結合性構築物であり、前記構築物は、２つの抗原結合性ポリペプチド構築物を有する対応する二価抗原結合性構築物のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣのうちの少なくとも１つを高度に有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された一価抗原結合性構築物であり、前記構築物は、２つの抗原結合性ポリペプチド構築物を有する対応する二価抗原結合性構築物のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣのうちの少なくとも１つの少なくとも約１０５％を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された一価抗原結合性構築物であり、前記構築物は、２つの抗原結合性ポリペプチド構築物を有する対応する二価抗原結合性構築物のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣのうちの少なくとも１つの少なくとも約１１０％を超えて有する。
【０１３９】
ＨＥＲ２結合性構築物
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の一価抗原結合性構築物は、ＨＥＲ２を発現する細胞を標的にするように設計され、抗原結合性ポリペプチド構築物は、ＨＥＲ２に結合する。ＨＥＲ２は、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーに属する癌原遺伝子であり、乳癌サブセットで過剰発現されることが多い。ＨＥＲ２タンパク質は、ｎｅｕ遺伝子、ＥＧＦＲ２、ＣＤ３４０、ＥｒｂＢ２、及びｐ１８５の産物とも呼ばれる。いくつかの実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物は、ＨＥＲ２に結合し、標的細胞は、低、中、または高ＨＥＲ２発現細胞である。一実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物は、ＨＥＲ２に結合し、標的細胞は、低ＨＥＲ２発現細胞である。別の実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物は、ＨＥＲ２に結合し、標的細胞は、二価ＨＥＲ２結合性抗体への結合が低下した低ＨＥＲ２発現細胞である。別の実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物は、ＨＥＲ２に結合し、標的細胞は、トラスツズマブへの結合が低下した低ＨＥＲ２発現細胞である。一実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物は、ＨＥＲ２に結合し、標的細胞は、癌細胞である。ある特定の実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物は、ＨＥＲ２に結合し、標的細胞は、乳癌細胞である。
【０１４０】
本明細書に記載の一価抗原結合性構築物のいくつかの実施形態において、二量体Ｆｃポリペプチド構築物は、ヘテロ二量体である。本明細書に記載の一価抗原結合性構築物のいくつかの実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物は、ＨＥＲ２に結合する。いくつかの実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物は、ＨＥＲ２細胞外ドメインのうちの少なくとも１つに結合する。ある特定の実施形態において、細胞外ドメインは、ＥＣＤ１、ＥＣＤ２、ＥＣＤ３、及びＥＣＤ４のうちの少なくとも１つである。ある特定の実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物は、低、中、または高ＨＥＲ２発現細胞である標的細胞により発現されたＨＥＲ２に結合する。ある特定の実施形態において、ＨＥＲ２発現細胞は、二価ＨＥＲ２結合性抗体への結合が低下したことを示す。一実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物は、ＨＥＲ２に結合し、標的細胞は、エストロゲン受容体陰性細胞、プロゲステロン受容体陰性細胞、及び二価ＨＥＲ２結合性抗体への結合が低下した抗ＨＥＲ２抗体耐性腫瘍細胞のうちの少なくとも１つである。
【０１４１】
本明細書に記載の一価抗原結合性構築物のいくつかの実施形態において、二量体Ｆｃポリペプチド構築物は、ヘテロ二量体である。本明細書に記載の一価抗原結合性構築物のある特定の実施形態において、一価抗原結合性ポリペプチド構築物は、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、及びｓｄＡｂ、抗原に結合することが可能な抗原結合ペプチドまたはタンパク質ドメインである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるように単離された一価抗原結合性構築物が提供され、一価抗原結合性ポリペプチド構築物は、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドを含むＦａｂ断片である。
【０１４２】
本明細書で提供されるのは、ＨＥＲ２に一価的に結合する抗原結合性ポリペプチド構築物と；各々がＣＨ３ドメインを含む２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含む二量体Ｆｃポリペプチド構築物とを含む、ＨＥＲ２に結合する単離された一価抗原結合性構築物であり、１つの前記単量体Ｆｃポリペプチドは、抗原結合性ポリペプチド構築物由来のうちの少なくとも１つのポリペプチドに融合し；前記抗原結合性構築物は、抗増殖性で、標的細胞によって内部移行され、前記構築物は、ＨＥＲ２に結合する対応する二価抗原結合性構築物と比較して、標的細胞上に表示されたＨＥＲ２への結合密度及びＢｍａｘ（最大結合量）の増加を示し、前記構築物は、前記対応する二価ＨＥＲ２結合抗原結合性構築物と比較して、より高いＡＤＣＣ、より高いＡＤＣＰ、及びより高いＣＤＣのうちの少なくとも１つを示す。
【０１４３】
ある実施形態で提供されるのは、ＨＥＲ２に一価的に結合する抗原結合性ポリペプチド構築物と；各々がＣＨ３ドメインを含む２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含む二量体Ｆｃポリペプチド構築物とを含む、低ＨＥＲ２発現を有する標的細胞上のＨＥＲ２に結合する単離された一価抗原結合性構築物であり、１つの前記単量体Ｆｃポリペプチドは、抗原結合性ポリペプチド構築物由来のうちの少なくとも１つのポリペプチドに融合し；前記抗原結合性構築物は、抗増殖性で、標的細胞によって内部移行され、前記構築物は、ＨＥＲ２に結合する対応する二価抗原結合性構築物と比較して、標的細胞上に表示されたＨＥＲ２への結合密度及びＢｍａｘ（最大結合量）の増加を示し、前記構築物は、前記対応する二価ＨＥＲ２結合抗原結合性構築物と比較して、より高いＡＤＣＣ、より高いＡＤＣＰ、及びより高いＣＤＣのうちの少なくとも１つを示す。ある特定の実施形態において、低ＨＥＲ２発現を有する標的細胞は、癌細胞である。いくつかの実施形態において、低ＨＥＲ２発現を有する標的細胞は、乳癌細胞である。
【０１４４】
本明細書で提供されるのは、ＥＣＤ１、ＥＣＤ２、及びＥＣＤ３〜４のうちの少なくとも１つである細胞外ドメイン（ＥＣＤ）でＨＥＲ２に一価的に結合する抗原結合性ポリペプチド構築物と；各々がＣＨ３ドメインを含む２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含む二量体Ｆｃポリペプチド構築物とを含む、ＨＥＲ２に結合する単離された一価抗原結合性構築物であり、１つの前記単量体Ｆｃポリペプチドは、抗原結合性ポリペプチド構築物由来のうちの少なくとも１つのポリペプチドに融合し；前記抗原結合性構築物は、抗増殖性で、標的細胞によって内部移行され、前記構築物は、ＨＥＲ２に結合する対応する二価抗原結合性構築物と比較して、標的細胞上に表示されたＨＥＲ２  ＥＣＤ１、２、及び３〜４のうちの少なくとも１つへの結合密度及びＢｍａｘ（最大結合量）の増加を示し、前記構築物は、前記対応する二価ＨＥＲ３結合抗原結合性構築物と比較して、より高いＡＤＣＣ、より高いＡＤＣＰ、及びより高いＣＤＣのうちの少なくとも１つを示す。
【０１４５】
本明細書で提供されるのは、ＥＣＤ１、ＥＣＤ２、ＥＣＤ３、及びＥＣＤ４のうちの少なくとも１つである細胞外ドメイン（ＥＣＤ）でＨＥＲ２に一価的に結合する抗原結合性ポリペプチド構築物と；各々がＣＨ３ドメインを含む２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含む二量体Ｆｃポリペプチド構築物とを含む、ＨＥＲ２に結合する単離された一価抗原結合性構築物であり、１つの前記単量体Ｆｃポリペプチドは、抗原結合性ポリペプチド構築物由来のうちの少なくとも１つのポリペプチドに融合し；前記抗原結合性構築物は、抗増殖性で、標的細胞によって内部移行され、前記構築物は、ＨＥＲ２に結合する対応する二価抗原結合性構築物と比較して、標的細胞上に表示されたＨＥＲ２  ＥＣＤ１、２、３、及び４のうちの少なくとも１つへの結合密度及びＢｍａｘ（最大結合量）の増加を示し、前記構築物は、前記対応する二価ＨＥＲ２結合抗原結合性構築物と比較して、より高いＡＤＣＣ、より高いＡＤＣＰ、及びより高いＣＤＣのうちの少なくとも１つを示す。
【０１４６】
一実施形態において、本明細書に記載の単離された一価抗原結合性構築物であり、抗原結合性構築物は、標的細胞増殖を阻害する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された一価抗原結合性構築物であり、前記一価ＨＥＲ２結合ポリペプチド構築物は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、またはポリペプチドのうちの少なくとも１つである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された一価抗原結合性構築物であり、前記構築物は、２つの抗原結合性ポリペプチド構築物を有する対応する二価抗原結合性構築物のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣのうちの少なくとも１つを高度に有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された一価抗原結合性構築物であり、前記構築物は、２つの抗原結合性ポリペプチド構築物を有する対応する二価抗原結合性構築物のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣのうちの少なくとも１つの少なくとも約１０５％を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された一価抗原結合性構築物であり、前記構築物は、２つの抗原結合性ポリペプチド構築物を有する対応する二価抗原結合性構築物のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣのうちの少なくとも１つの少なくとも約１１０％を超えて有する。
【０１４７】
標的細胞の選択
標的細胞は、一価抗原結合性構築物の目的とする使用に基づいて選択される。一実施形態において、標的細胞は、癌、感染症、自己免疫疾患、または炎症性疾患で活性されるかまたは増幅される細胞である。
【０１４８】
一実施形態において、一価抗原結合性構築物が、癌の処置において使用されることが意図される場合、標的細胞は、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２  ３＋過剰発現を示す腫瘍に由来する。一実施形態において、標的細胞は、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２低発現を示す腫瘍に由来する。一実施形態において、標的細胞は、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２耐性を示す腫瘍に由来する。一実施形態において、標的細胞は、トリプルネガティブ（ＥＲ／ＰＲ／ＨＥＲ２）腫瘍である腫瘍に由来する。
【０１４９】
一価抗原結合性構築物が癌の処置において使用されることが意図される実施形態において、標的細胞は、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２  ３＋過剰発現を代表する癌細胞株である。一実施形態において、標的細胞は、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２低発現を代表する癌細胞株である。一実施形態において、標的細胞は、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２耐性を代表する癌細胞株である。一実施形態において、標的細胞は、乳癌トリプルネガティブ、例えば、ＭＤＡ−ＭＤ−２３１細胞を代表する癌細胞株である。
【０１５０】
一実施形態において、本発明による一価抗原結合性構築物は、乳癌細胞または上皮細胞由来の癌細胞を標的にするように設計される。
【０１５１】
一実施形態において、本明細書に記載の一価抗原結合性構築物は、胃及び食道腺癌を標的にするように設計される。例示的な組織学的タイプには、腸管表現型を有するＨＥＲ２陽性近位胃癌腫、及びＨＥＲ２陽性遠位瀰漫性胃癌腫が挙げられる。胃癌細胞の例示的なクラスには、（Ｎ−８７、ＯＥ−１９、ＳＮＵ−２１６、及びＭＫＮ−７）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５２】
別の実施形態において、本明細書に記載の一価抗原結合性構築物は、脳内の転移性ＨＥＲ２＋乳癌腫瘍を標的にするように設計される。胃癌細胞の例示的なクラスには、ＢＴ４７４が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５３】
本発明による一価抗原結合性構築物が癌細胞を標的にするように設計される実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物は、癌細胞の表面上で発現される抗原に一価的に結合する。適当な抗原には、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物が標的細胞上の標的抗原の細胞外ドメインに結合するエピトープ。
【０１５４】
一価抗原結合性構築物がＥＧＦＲに結合する抗原結合性ポリペプチド構築物を含む実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物は、ＥＧＦＲに、またはＥＧＦＲの特定のドメインもしくはエピトープに結合する。一実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合する。
【０１５５】
抗体の選択
一価抗原結合性構築物がＥＧＦＲに結合する抗原結合性ポリペプチド構築物を含む実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物は、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖｓ、及びｓｄａｂを含む種々の形式で、既知の抗ＥＧＦＲ抗体または抗ＥＧＦＲ結合ドメインから得ることができる。ある特定の実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物は、それらの抗体のヒト化またはキメラ型から得ることができる。一実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、セツキシマブ、またはそれらのヒト化型のＦａｂ断片から得られる。一実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物は、ｓｃＦｖから得られる。一実施形態において、抗原結合性ポリペプチド構築物は、ｓｄａｂから得られる。
【０１５６】
ＦＣ
抗原結合性構築物は、Ｆｃ、例えば、二量体Ｆｃを含み得る。
【０１５７】
本明細書における用語「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体体Ｆｃ領域を含む。本明細書で他に指定されない限り、Ｆｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ， １９９１に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵナンバリングシステムによるものである。本明細書で使用する場合、二量体Ｆｃの「Ｆｃポリペプチド」は、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドの１つ、すなわち、安定的に自己会合できる、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、二量体ＩｇＧ  ＦｃのＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３定常ドメイン配列を含む。
【０１５８】
Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメインまたはＣＨ３及びＣＨ２ドメインのいずれかを含む。ＣＨ３ドメインは、２つのＣＨ３配列を含み、１つは、二量体Ｆｃの２つのＦｃポリペプチドの各々からである。ＣＨ２ドメインは、２つのＣＨ２配列を含み、１つは、二量体Ｆｃの２つのＦｃポリペプチドの各々からである。
【０１５９】
いくつかの態様において、Ｆｃは、少なくとも１つまたは２つのＣＨ３配列を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、１つまたは複数のリンカーを伴ってまたは伴わずに、第一の抗原結合性構築物及び／または第二の抗原結合性構築物と結合する。いくつかの態様において、Ｆｃは、ヒトＦｃである。いくつかの態様において、Ｆｃは、ヒトＩｇＧまたはＩｇＧ１  Ｆｃである。いくつかの態様において、Ｆｃは、ヘテロ二量体Ｆｃである。いくつかの態様において、Ｆｃは、少なくとも１つまたは２つのＣＨ２配列を含む。
【０１６０】
いくつかの態様において、Ｆｃは、ＣＨ３配列のうちの少なくとも１つにおける１つまたは複数の修飾を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、ＣＨ２配列のうちの少なくとも１つにおける１つまたは複数の修飾を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、単一ポリペプチド、例えば、二量体Ｆｃであり、二量体の２つのポリペプチドは、ポリペプチドリンカーによって結合されている。いくつかの態様において、Ｆｃは、複数のペプチド、例えば、２つのポリペプチドである。
【０１６１】
いくつかの態様において、Ｆｃは、２０１１年１１月４日に出願された特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１１／００１２３８、または２０１２年１１月２日に出願された特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０５０７８０に記載されるＦｃであり、これらの各々の開示全体は全ての目的のために参照によって本明細書に組み込まれている。
【０１６２】
改変ＣＨ３ドメイン
【０１６３】
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、非対称的に修飾される改変ＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体Ｆｃを含む。ヘテロ二量体Ｆｃは、２つの重鎖定常ドメインポリペプチド：第一のＦｃポリペプチドと第二のＦｃポリペプチドとを含み得、これらは、Ｆｃが１つの第一のＦｃポリペプチドと１つの第二のＦｃポリペプチドを含むならば、交換可能に使用することができる。一般に、第一のＦｃポリペプチドは、第一のＣＨ３配列を含み、第二のＦｃポリペプチドは、第二のＣＨ３配列を含む。
【０１６４】
非対称様式で導入される１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む２つのＣＨ３配列は、概して、２つのＣＨ３配列が二量体化するときに、ホモ二量体よりもむしろ、ヘテロ二量体Ｆｃをもたらす。本明細書で使用する場合、「非対称性アミノ酸修飾」とは、第一のＣＨ３配列上の特定の位置でのアミノ酸が、同じ位置での第二のＣＨ３配列上のアミノ酸とは異なり、第一及び第二のＣＨ３配列が、ホモ二量体ではなくヘテロ二量体を形成するために優先的に対合する、任意の修飾を指す。このヘテロ二量体化は、各配列上の同じそれぞれのアミノ酸位置での２つのアミノ酸のうちの１つのみの修飾、または第一及び第二の各々のＣＨ３配列上の同じそれぞれの位置での各配列上の両方のアミノ酸の修飾の結果であり得る。ヘテロ二量体Ｆｃの第一及び第二のＣＨ３配列は、１つまたはそれ以上の非対称性アミノ酸修飾を含み得る。
【０１６５】
表Ａは、完全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸２３１〜４４７に対応する、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ配列のアミノ酸配列を提供する。ＣＨ３配列は、完全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸３４１〜４４７を含む。
【０１６６】
典型的には、Ｆｃは、二量体化することができる２つの連続した重鎖配列（Ａ及びＢ）を含み得る。いくつかの態様において、Ｆｃのうちの１つまたは両方の配列は、ＥＵナンバリングを用いた、Ｌ３５１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｔ３６６、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｔ３５０、Ｓ４００、及び／またはＮ３９０の位置で１つまたは複数の突然変異または修飾を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、表Ａに示される突然変異配列を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、変異体１Ａ−Ｂの突然変異を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、変異体２Ａ−Ｂの突然変異を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、変異体３Ａ−Ｂの突然変異を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、変異体４Ａ−Ｂの突然変異を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、変異体５Ａ−Ｂの突然変異を含む。
【０１６７】
（表Ａ）ＩｇＧ１  Ｆｃ配列
2016538283.tif 000003
2016538283.tif 000004
【０１６８】
第一及び第二のＣＨ３配列は、完全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸２３１〜４４７に関して本明細書に記載のアミノ酸突然変異を含み得る。一実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｆ４０５及びＹ４０７の位置でアミノ酸修飾を有する第一のＣＨ３配列、及びＴ３９４の位置でアミノ酸修飾を有する第二のＣＨ３配列を有する改変ＣＨ３ドメインを含む。一実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖから選択される１つまたは複数のアミノ酸修飾を有する第一のＣＨ３配列、ならびにＴ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、及びＴ３９４Ｗから選択される１つまたは複数のアミノ酸修飾を有する、第二のＣＨ３配列を有する改変ＣＨ３ドメインを含む。
【０１６９】
一実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｌ３５１、Ｆ４０５、及びＹ４０７の位置でアミノ酸修飾を有する第一のＣＨ３配列と、Ｔ３６６、Ｋ３９２、及びＴ３９４の位置でアミノ酸修飾を有する第二のＣＨ３配列とを有する改変ＣＨ３ドメインを含み、第一または第二のＣＨ３配列のうちの１つは、Ｑ３４７の位置でアミノ酸修飾をさらに含み、他のＣＨ３配列は、Ｋ３６０の位置でアミノ酸修飾をさらに含む。別の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｌ３５１、Ｆ４０５、及びＹ４０７の位置でアミノ酸修飾を有する第一のＣＨ３配列と、Ｔ３６６、Ｋ３９２、及びＴ３９４の位置でアミノ酸修飾を有する第二のＣＨ３配列とを有する改変ＣＨ３ドメインを含み、第一または第二のＣＨ３配列のうちの１つは、Ｑ３４７の位置でアミノ酸修飾を有するアミノ酸修飾をさらに含み、他のＣＨ３配列は、Ｋ３６０の位置でアミノ酸修飾をさらに含み、前記ＣＨ３配列のうちの１つまたは両方は、アミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖをさらに含む。
【０１７０】
一実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｌ３５１、Ｆ４０５、及びＹ４０７の位置でアミノ酸修飾を有する第一のＣＨ３配列と、Ｔ３６６、Ｋ３９２、及びＴ３９４の位置でアミノ酸修飾を有する第二のＣＨ３配列とを有する改変ＣＨ３ドメインを含み、前記第一及び第二のＣＨ３配列のうちの１つは、Ｄ３９９ＲまたはＤ３９９Ｋのアミノ酸修飾をさらに含み、他のＣＨ３配列は、Ｔ４１１Ｅ、Ｔ４１１Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、及びＫ３９２Ｄのうちの１つまたは複数を含む。別の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｌ３５１、Ｆ４０５、及びＹ４０７の位置でアミノ酸修飾を有する第一のＣＨ３配列と、Ｔ３６６、Ｋ３９２、及びＴ３９４の位置でアミノ酸修飾を有する第二のＣＨ３配列とを有する改変ＣＨ３ドメインを含み、前記第一または第二のＣＨ３配列のうちの１つは、Ｄ３９９ＲまたはＤ３９９Ｋのアミノ酸修飾をさらに含み、他のＣＨ３配列は、Ｔ４１１Ｅ、Ｔ４１１Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、及びＫ３９２Ｄのうちの１つまたは複数を含み、前記ＣＨ３配列のうちの１つまたは両方は、アミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖをさらに含む。
【０１７１】
一実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｌ３５１、Ｆ４０５、及びＹ４０７の位置でアミノ酸修飾を有する第一のＣＨ３配列と、Ｔ３６６、Ｋ３９２、及びＴ３９４の位置でアミノ酸修飾を有する第二のＣＨ３配列とを有する改変ＣＨ３ドメインを含み、前記ＣＨ３配列のうちの１つまたは両方は、Ｔ３５０Ｖのアミノ酸修飾をさらに含む。
【０１７２】
一実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、以下のアミノ酸修飾を含む改変ＣＨ３ドメインを含み、「Ａ」は、第一のＣＨ３配列に対するアミノ酸修飾を表し、「Ｂ」は、第二のＣＨ３配列に対するアミノ酸修飾を表す：Ａ：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｂ：Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ、Ａ：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｂ：Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ、Ａ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｂ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ、Ａ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｂ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ、Ａ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｓ４００Ｅ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、及び／またはＢ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｎ３９０Ｒ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ。
【０１７３】
１つまたは複数の非対称性アミノ酸修飾は、ヘテロ二量体ＣＨ３ドメインが野生型ホモ二量体ＣＨ３ドメインに匹敵する安定性を有する、ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進し得る。一実施形態において、１つまたは複数の非対称性アミノ酸修飾は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインが野生型ホモ二量体Ｆｃドメインに匹敵する安定性を有する、ヘテロ二量体Ｆｃドメインの形成を促進する。一実施形態において、１つまたは複数の非対称性アミノ酸修飾は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインが示差走査熱量測定研究における融解温度（Ｔｍ）を介して観察された安定性を有する、ヘテロ二量体Ｆｃドメインの形成を促進し、この融解温度は、対応する対称性の野生型ホモ二量体Ｆｃドメインに関して観察されたものの４℃以内である。いくつかの態様において、Ｆｃは、野生型ホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を有するヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進する、ＣＨ３配列のうちの少なくとも１つにおける１つまたは複数の修飾を含む。
【０１７４】
一実施形態において、ＣＨ３ドメインの安定性は、例えば、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によりＣＨ３ドメインの融解温度を測定することにより評価され得る。従って、さらなる実施形態において、ＣＨ３ドメインは、約６８℃以上の融解温度を有する。別の実施形態において、ＣＨ３ドメインは、約７０℃以上の融解温度を有する。別の実施形態において、ＣＨ３ドメインは、約７２℃以上の融解温度を有する。別の実施形態において、ＣＨ３ドメインは、約７３℃以上の融解温度を有する。別の実施形態において、ＣＨ３ドメインは、約７５℃以上の融解温度を有する。別の実施形態において、ＣＨ３ドメインは、約７８℃以上の融解温度を有する。いくつかの態様において、二量体化されたＣＨ３配列は、約６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７７．５、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または８５℃、またはそれより高い融解温度（Ｔｍ）を有する。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、改変ＣＨ３配列を含むヘテロ二量体Ｆｃは、発現産物においてホモ二量体Ｆｃと比較して少なくとも約７５％の純度で形成され得る。別の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、約８０％超の純度で形成される。別の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、約８５％超の純度で形成される。別の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、約９０％超の純度で形成される。別の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、約９５％超の純度で形成される。別の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、約９７％超の純度で形成される。いくつかの態様において、Ｆｃは、発現されるとき、約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％超の純度で形成されるヘテロ二量体である。いくつかの態様において、Ｆｃは、単一細胞により発現されるとき、約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％超の純度で形成されるヘテロ二量体である。
【０１７６】
ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進するために単量体Ｆｃポリペプチドを修飾するためのさらなる方法は、国際特許公開ＷＯ９６／０２７０１１（ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ））、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎら（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８５，１９６３７−４６，ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏ ａｃｈｉｅｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、Ｄａｖｉｓら（Ｄａｖｉｓ，ＪＨ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ；２３（４）：１９５−２０２、鎖交換遺伝子操作ドメイン（ＳＥＥＤ）技術）、及びＬａｂｒｉｊｎら［Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｂｌｅ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ１ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｆａｂ−ａｒｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ．Ｌａｂｒｉｊｎ ＡＦ，Ｍｅｅｓｔｅｒｓ ＪＩ，ｄｅ Ｇｏｅｉｊ ＢＥ，ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｅｍｅｒ ＥＴ，Ｎｅｉｊｓｓｅｎ Ｊ，ｖａｎ Ｋａｍｐｅｎ ＭＤ，Ｓｔｒｕｍａｎｅ Ｋ，Ｖｅｒｐｌｏｅｇｅｎ Ｓ，Ｋｕｎｄｕ Ａ，Ｇｒａｍｅｒ ＭＪ，ｖａｎ Ｂｅｒｋｅｌ ＰＨ，ｖａｎ ｄｅ ＷｉｎｋｅｌＪＧ，Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ Ｊ，Ｐａｒｒｅｎ ＰＷ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３ Ｍａｒ ２６；１１０（１３）：５１４５−５０に記載されている。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された抗原結合性構築物は、抗原に結合する抗原結合性ポリペプチド構築物と；同じ二量体Ｆｃを含まない抗原結合性構築物に対して、安定性及び製造の容易さ等の優れた生物物理学的特性を有する二量体Ｆｃとを含む。Ｆｃ領域における多くの突然変異は、異なるＦｃガンマ受容体に対するＦｃの親和性を選択的に変化させるために、当該技術分野で知られている。いくつかの態様において、Ｆｃは、Ｆｃガンマ受容体の選択的結合を促進する１つまたは複数の修飾を含む。これらのタイプのアミノ酸修飾は、典型的には、ＣＨ２ドメインまたは抗原結合性構築物のヒンジ領域に位置する。
【０１７８】
ＣＨ２ドメイン
ＦｃのＣＨ２ドメインは、表Ａに示されるアミノ酸２３１〜３４０である。例示的な突然変異は、以下に列挙される。
・Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ／Ｋ３２６Ａ（Ｌｕ Ｙ，Ｖｅｒｎｅｓ ＪＭ，Ｃｈｉａｎｇ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１１ Ｆｅｂ ２８；３６５（１−２）：１３２−４１）；
・Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｌ２３５Ｖ／Ｐ３９６Ｌ（Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ ＪＢ， Ｇｏｒｌａｔｏｖ Ｓ， Ｔｕａｉｌｌｏｎ Ｎ， ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７ Ｓｅｐ １５；６７（１８）：８８８２−９０， Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ ＪＬ， Ｇｏｒｌａｔｏｖ Ｓ， Ｚｈａｎｇ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１１ Ｎｏｖ ３０；１３（６）：Ｒ１２３）；
・Ｆ２４３Ｌ（Ｓｔｅｗａｒｔ Ｒ， Ｔｈｏｍ Ｇ， Ｌｅｖｅｎｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ． ２０１１ Ｓｅｐ；２４（９）：６７１−８．）， Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ（ＳｈｉｅｌｄｓＲＬ，Ｎａｍｅｎｕｋ ＡＫ，Ｈｏｎｇ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００１ Ｍａｒ ２；２７６（９）：６５９１−６０４）；
・Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（Ｌａｚａｒ ＧＡ， Ｄａｎｇ Ｗ， Ｋａｒｋｉ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２００６ Ｍａｒ １４；１０３（１１）：４００５−１０）；
・Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ（Ｃｈｕ ＳＹ， Ｖｏｓｔｉａｒ Ｉ， Ｋａｒｋｉ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００８ Ｓｅｐ；４５（１５）：３９２６−３３）；
・Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｓ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｓ２９８Ａ／Ｋ３２６Ａ／Ａ３２７Ｈ、Ｇ２３７Ｆ／Ｓ２９８Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｅ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８Ａ、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２７０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｄ、Ｌ２３４Ｆ／Ｓ２６７Ｅ／Ｎ３２５Ｌ、Ｇ２３７Ｆ／Ｖ２６６Ｌ／Ｓ２６７Ｄ、ならびに国際公開ＷＯ２０１１／１２０１３４及び同ＷＯ２０１１／１２０１３５（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される他の突然変異。Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｗｉｌｌｉａｍ Ｒ． Ｓｔｒｏｈｌ ａｎｄ Ｌｉｌａ Ｍ． Ｓｔｒｏｈｌによる、Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｎｏ １１， ＩＳＢＮ １ ９０７５６８ ３７ ９，Ｏｃｔ ２０１２）は、２８３頁に突然変異を記載する。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、ＣＨ２ドメインは、１つまたは複数の非対称性アミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＣＨ２ドメインは、ＦｃγＲの選択的結合を促進するために１つまたは複数の非対称性アミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＣＨ２ドメインは、本明細書に記載の単離された構築物の分離及び精製を可能にする。
【０１８０】
エフェクター機能を改善するためのさらなる修飾
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、そのエフェクター機能を改善するように修飾され得る。そのような修飾は、当該技術分野で知られており、アフコシル化、または活性化受容体、主にＡＤＣＣのＦＣＧＲ３ａに対する、及びＣＤＣのＣ１ｑに対する、Ｆｃの親和性の遺伝子操作を含む。以下の表Ｂ１は、エフェクター機能の遺伝子操作に関する文献において報告される様々な設計を要約する。
【０１８１】
従って、一実施形態において、本明細書に記載の構築物は、改善されたエフェクター機能を与える表Ｂ１に示される１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む二量体Ｆｃを含むことができる。別の実施形態において、構築物は、エフェクター機能を改善するためにアフコシル化され得る。
【０１８２】
（表Ｂ１）ＣＨ２ドメイン及びエフェクター機能の遺伝子操作
2016538283.tif 000005
【０１８３】
ＦｃγＲ及び／または補体結合及び／またはエフェクター機能を減少させるＦｃ修飾は、当該技術分野で知られている。近年の刊行物には、エフェクター活性を減少もしくは沈黙させた抗体を遺伝子操作するために使用されている戦略が記載されている（Ｓｔｒｏｈｌ， ＷＲ （２００９）， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０：６８５−６９１， ａｎｄ Ｓｔｒｏｈｌ， ＷＲ ａｎｄ Ｓｔｒｏｈｌ ＬＭ， 「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｅｎｇｉｎｎｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ」 Ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ （２０１２）， ｐｐ ２２５−２４９を参照されたい）。これらの戦略には、グリコシル化の修飾、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４骨格の使用、またはＦｃのヒンジ領域またはＣＨ２領域における突然変異の導入を介したエフェクター機能の減少が含まれる。例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２１２０８７号（Ｓｔｒｏｈｌ）、国際特許公開ＷＯ２００６／１０５３３８（Ｘｅｎｃｏｒ）、米国特許出願公開第２０１２／０２２５０５８号（Ｘｅｎｃｏｒ）、米国特許出願公開第２０１２／０２５１５３１号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、及びＳｔｒｏｐら（（２０１２）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４２０：２０４−２１９）には、ＦｃγＲまたはＦｃへの補体結合を減少させるための特異的修飾が記載されている。
【０１８４】
公知のアミノ酸修飾の具体的な非限定的な例には、以下の表で同定されたものが挙げられる。
【０１８５】
（表Ｃ）ＦｃγＲ、またはＦｃへの補体結合を減少させる修飾
2016538283.tif 000006
【０１８６】
一実施形態において、Ｆｃは、上の表で同定された少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。別の実施形態において、Ｆｃは、Ｌ２３４、Ｌ２３５、またはＤ２６５のうちの少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。別の実施形態において、Ｆｃは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＤ２６５でアミノ酸修飾を含む。別の実施形態において、Ｆｃは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ｓでアミノ酸修飾を含む。
【０１８７】
ＦｃＲｎ結合及びＰＫパラメーター
当該技術分野で知られているように、ＦｃＲｎへの結合は、エンドサイトーシスされた抗体をエンドソームから血流へと戻して再利用する（Ｒａｇｈａｖａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １２：１８１−２２０、Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８：７３９−７６６）。このプロセスは、完全長分子のサイズが大きいことによる腎臓濾過の除外と合わさって、１〜３週間の範囲の好都合な抗体血清半減期をもたらす。ＦｃのＦｃＲｎへの結合はまた、抗体輸送において重要な役割を果たす。従って、一実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、ＦｃＲｎに結合することができる。
【０１８８】
リンカー
本明細書に記載の抗原結合性構築物は、本明細書に記載のＦｃに操作可能に結合された１つまたは複数の抗原結合性ポリペプチド構築物を含むことができる。いくつかの態様において、Ｆｃは、１つまたは複数のリンカーにより１つまたは複数の抗原結合性ポリペプチド構築物と結合する。いくつかの態様において、Ｆｃは、１つまたは複数の抗原結合性ポリペプチド構築物と直接結合する。いくつかの態様において、Ｆｃは、リンカーにより各抗原結合性ポリペプチドの重鎖と結合する。
【０１８９】
いくつかの態様において、１つまたは複数のリンカーは、１つまたは複数のポリペプチドリンカーである。いくつかの態様において、１つまたは複数のリンカーは、１つまたは複数のＩｇＧ１ヒンジ領域を含む。
【０１９０】
機能を改善させるための抗原結合性構築物のさらなる修飾
いくつかの実施形態において、抗原に一価的に結合する抗原結合性ポリペプチド構築物と；ＣＨ３ドメインを含み、変異体ＣＨ２ドメインをさらに含む二量体Ｆｃポリペプチド構築物とを含む、本明細書に記載の単離された一価抗原結合性構築物である。いくつかの実施形態において、変異体ＣＨ２ドメインは、ＦｃγＲの選択的結合を促進するために非対称性アミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、変異体ＣＨ２ドメインは、本明細書に記載の単離された一価抗体の分離及び精製を可能にする。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、抗原に一価的に結合する抗原結合性ポリペプチドを含む、本明細書に記載の単離された一価抗原結合性構築物であり；抗原結合性ポリペプチドは、ポリペプチドを介して、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む単量体Ｆｃポリペプチドに融合する。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、抗原に一価的に結合する抗原結合性ポリペプチドを含む、本明細書に記載の単離された一価抗原結合性構築物であり；抗原結合性ポリペプチドは、Ｆａｂであり、Ｆａｂの重鎖は、ポリペプチドを介して、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む単量体Ｆｃポリペプチドに融合し、Ｆａｂの軽鎖は、ポリペプチドを介して、第二のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む単量体Ｆｃポリペプチドに融合する。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、抗原に一価的に結合する抗原結合性ポリペプチドを含む、本明細書に記載の単離された一価抗原結合性構築物であり；抗原結合性ポリペプチドは、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む単量体Ｆｃポリペプチドと、いずれの抗原にも結合することができない第二のポリペプチドとに融合し；第二のポリペプチドは、第二のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む単量体Ｆｃポリペプチドに融合し；２つの単量体Ｆｃポリペプチドは、二量体を形成するために対合する。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、本発明による一価抗原結合性構築物は、それらのエフェクター機能を改善するように修飾してもよい。そのような修飾は、当該技術分野で知られており、アフコシル化、または活性化受容体、主にＡＤＣＣのＦＣＧＲ３ａに対する、及びＣＤＣのＣ１ｑに対する、抗体Ｆｃ部分の親和性の遺伝子操作を含む。以下の表Ａ３は、エフェクター機能の遺伝子操作に関する文献において報告される異なる設計を要約する。
【０１９５】
（表Ａ３）
2016538283.tif 000007
【０１９６】
従って、一実施形態において、一価抗原結合性構築物は、改善されたエフェクター機能を与える上の表に示されるように１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む二量体Ｆｃポリペプチド構築物を含むことができる。別の実施形態において、一価抗原結合性構築物は、エフェクター機能を改善するためにアフコシル化される。
【０１９７】
アミノ酸配列を変化させずにＦｃγグリコシル化部位（Ａｓｎ２９７  ＥＵナンバリング）上にフコースをほとんどまたは全く有さない抗原結合性構築物の産生方法は、当該技術分野で周知である。ＧｌｙｍａＸ（登録商標）技術（ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ  ＡＧ）は、フコース生合成の細胞経路を偏向させる酵素の遺伝子の、抗原結合性構築物産生に用いる細胞への導入に基づくものである。これにより、抗原結合性構築物を産生する細胞によって、「フコース」という糖がＮ結合型抗体炭水化物部に付加されるのを防ぐ（ｖｏｎ Ｈｏｒｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１０ Ｄｅｃ；２０ （１２）：１６０７−１８）。フコシル化レベルが低下した抗原結合性構築物を得るための別のアプローチは、米国特許第８，４０９，５７２号に見ることができ、抗原結合性構築物上でより低いレベルのフコシル化をもたらす能力に対して抗原結合性構築物産生のための細胞株を選択することを教示している。抗原結合性構築物は、完全にアフコシル化（検出可能なフコースを全く含んでいないことを意味する）されていてもよく、または部分的にアフコシル化されていてもよく、これは、単離された抗体が、哺乳類発現系により産生された類似の抗体に対して正常に検出されたフコースの量の９５％未満、８５％未満、７５％未満、６５％未満、５５％未満、４５％未満、３５％未満、２５％未満、１５％未満、または５％未満を含むことを意味する。
【０１９８】
その同族の抗原に対する抗原結合性ポリペプチド構築物の親和性を増加させることが望ましい事例において、当該技術分野で知られている方法を使用して、その抗原に対する抗原結合性ポリペプチド構築物の親和性を増加させることができる。そのような方法の例は、以下の参照文献内に記載されている、Ｂｉｒｔａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＪＭＢ ３７７，１５１８−１５２８；Ｇｅｒｓｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ（２００２）ＪＭＢ ３２１，８５１−８６２；Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３２（２７），６８２８−６８３５；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＪＢＣ ２８５（６），３８６５−３８７１、及びＶａｊｄｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＪＭＢ ３２０，４１５−４２８。
【０１９９】
そのような方法の１つの例は、親和性成熟である。ＨＥＲ２抗原結合性ドメインの親和性成熟のための１つの例示的な方法は、以下に記載されている。トラスツズマブ／ＨＥＲ２（ＰＤＢコード１Ｎ８Ｚ）複合体及びペルツズマブ／ＨＥＲ２複合体（ＰＤＢコード１Ｓ７８）の構造をモデル化に使用する。分子動力学（ＭＤ）を用いて、水性環境におけるＷＴ複合体の内在性の動的性質を評価することができる。柔軟な骨格と共に平均場及びデッドエンド排除法を使用して、スクリーニングされる突然変異体のモデル構造を最適化及び調製することができる。パッキングに続いて、接触密度、クラッシュスコア、疎水性、及び静電気を含む、多くの特徴が点数化される。一般化ボルン法によって、溶媒環境の効果の正確なモデル化が可能となり、残基型を交代させるタンパク質の特定位置の突然変異に従って、その自由エネルギー差を算出する。接触密度及びクラッシュスコアは、有効なタンパク質パッキングの重要な側面である相補性の尺度を提供する。スクリーニング手順は、知識ベースのポテンシャル、ならびに対ごとの残基相互作用エネルギー及びエントロピー計算に依存する結合分析スキームを用いる。ＨＥＲ２結合を増強することが知られている文献の突然変異体及びそれらの組み合わせを以下の表に要約する。
【０２００】
（表Ａ４）トラスツズマブ−ＨＥＲ２系に対するＨＥＲ２への結合を増加することが知られているトラスツズマブ突然変異体体
2016538283.tif 000008
【０２０１】
（表Ａ５）ペルツズマブ−ＨＥＲ２系に対するＨＥＲ２への結合を増加することが知られているペルツズマブ突然変異体
2016538283.tif 000009
【０２０２】
本明細書に記載の一価抗原結合性構築物は、一旦標的細胞に結合すると内部移行される。一実施形態において、一価抗原結合性構築物は、対応する単一特異性二価抗原結合性構築物と比較して同程度に内部移行される。いくつかの実施形態において、一価抗原結合性構築物は、対応する単一特異性二価抗原結合性構築物と比較してより効率的に内部移行される。
【０２０３】
解離定数（ＫＤ）及び最大結合量（ＢＭＡＸ）
いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は、限定するものではないが、解離定数及び最大結合量を含む機能特性によって記載される。
【０２０４】
本明細書で使用する場合、「解離定数（ＫＤ）」という用語は、特定のリガンド−タンパク質相互作用の平衡解離定数を指すものである。本明細書で使用する場合、リガンド−タンパク質相互作用とは、限定されないが、タンパク質−タンパク質相互作用または抗体−抗原相互作用を指す。ＫＤは、より小さい成分（Ａ＋Ｂ）に可逆的に解離するために２つのタンパク質（例えば、ＡＢ）の傾向を測定し、「オフ速度（ｋｏｆｆ）」とも呼ばれる解離速度の会合速度すなわち「オン速度（ｋｏｎ）」に対する比として定義される。従って、ＫＤは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎに等しく、モル濃度（Ｍ）として表される。ＫＤが小さくなるほど、結合の親和性は強くなることが分かる。従って、１ｍＭのＫＤは、１ｎＭのＫＤと比較して弱結合親和性を示す。抗原結合性構築物のＫＤ値は、当該技術分野で十分に確立された方法を用いて決定することができる。抗原結合性構築物のＫＤを決定する１つの方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、典型的には、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを用いてである。等温滴定熱測定（ＩＴＣ）は、決定に使用することができる別の方法である。
【０２０５】
抗原結合性構築物の結合特性は、種々の技術で決定することができる。そのうちの１つは、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ、蛍光活性化セルソーティング）によって抗原を発現する標的細胞への結合の測定である。一般に、そのような実験において、対象となる抗原を発現する標的細胞を異なる濃度で抗原結合性構築物でインキュベートし、洗浄し、抗原結合性構築物を検出するための二次剤でインキュベートし、洗浄し、フローサイトメーターで分析し、細胞上の検出信号の強度を表す中央蛍光強度（ＭＦＩ）を測定し、これは、細胞に結合した抗原結合性構築物の数に関連する。次いで、抗原結合性構築物濃度対ＭＦＩデータを飽和結合式に適合させて、２つの重要な結合パラメーターであるＢｍａｘと見かけのＫＤとを得る。
【０２０６】
見かけのＫＤ、すなわち見かけの平衡解離定数は、最大細胞結合の半分が観察される抗原結合性構築物濃度を表す。明らかに、ＫＤ値が小さいほど、少ない抗原結合性構築物濃度が、最大細胞結合に到達するのに要するため、抗原結合性構築物の親和性はより強くなる。見かけのＫＤは、細胞上に発現した異なる受容体レベルやインキュベーションなどの、細胞結合実験の条件に依存しているため、見かけのＫＤは、ＳＰＲ及びＩＴＣなどの無細胞分子実験から決定されたＫＤ値とは一般的に異なる。しかしながら、異なる方法の間では良好な一致が一般に得られる。
【０２０７】
「Ｂｍａｘ」、すなわち最大結合量という用語は、抗原結合性構築物の飽和濃度での細胞上の最大抗原結合性構築物結合レベルを指す。このパラメーターは、相対比較のために任意単位ＭＦＩで報告してもよく、または標準曲線を利用して細胞に結合した抗原結合性構築物の数に対応する絶対値に変換してもよい。いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は、参照抗原結合性構築物のＢｍａｘの１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２．０倍であるＢｍａｘを示す。
【０２０８】
本明細書に記載の抗原結合性構築物に関しては、飽和濃度においてＢｍａｘがＦＳＡでそれ以上増加されないところで、ＦＳＡに対するＢｍａｘにおいて明らかな分離が生じる。この有意性は、不飽和濃度においてはあまりない。一実施形態において、参照抗原結合性構築物と比較して抗原結合性構築物のＢｍａｘ及びＫＤの増加は、標的細胞上の標的抗原発現のレベルに左右されない。
【０２０９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された抗原結合性構築物であり、前記抗原結合性構築物は、対応する参照抗原結合性構築物と比較して、前記抗原を提示する標的細胞に対するＢｍａｘ（最大結合量）の増加を示す。いくつかの実施形態において、Ｂｍａｘの前記増加は、対応する参照抗原結合性構築物のＢｍａｘの少なくとも約１２５％である。ある特定の実施形態において、Ｂｍａｘの増加は、対応する参照抗原結合性構築物のＢｍａｘの少なくとも約１５０％である。いくつかの実施形態において、Ｂｍａｘの増加は、対応する参照抗原結合性構築物のＢｍａｘの少なくとも約２００％である。いくつかの実施形態において、Ｂｍａｘの増加は、対応する参照抗原結合性構築物のＢｍａｘの少なくとも約１１０％を超える。
【０２１０】
抗原結合性構築物及び抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）
ある特定の実施形態において、抗原結合性構築物は、薬剤、例えば、毒素、化学療法剤、免疫モジュレーター、または放射性同位体にコンジュゲートされる。ＡＤＣ（抗体薬剤コンジュゲートまたは抗原結合性構築物薬剤コンジュゲート）を調製するいくつかの方法は、当該技術分野で知られており、例えば、米国特許第８，６２４，００３号（ポット方法）、同第８，１６３，８８８号（一段階）、及び同第５，２０８，０２０号（二段階方法）に記載されている。
【０２１１】
いくつかの実施形態において、薬剤は、マイタンシン、アウリスタチン、カリチェアミシン、またはそれらの誘導体から選択される。他の実施形態において、薬剤は、ＤＭ１及びＤＭ４から選択されるマイタンシンである。さらなる例を以下に記載する。
【０２１２】
いくつかの実施形態において、薬剤は、ＳＭＣＣリンカー（ＤＭ１）またはＳＰＤＢリンカー（ＤＭ４）を有する、単離された抗原結合性構築物にコンジュゲートされる。さらなる例を以下に記載する。薬剤対抗原結合タンパク質比（ＤＡＲ）は、例えば、１．０〜６．０または３．０〜５．０または３．５〜４．２であってもよい。
【０２１３】
いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は、細胞傷害性剤にコンジュゲートされる。本明細書で使用する場合、「細胞傷害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害するかまたは抑制する、及び／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１，Ｉ１３１，Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、及びＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、及び細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素または酵素的に活性な毒素などの毒素、その断片及び／またはその変異体を含むものである。さらなる例を以下に記載する。
【０２１４】
薬剤
ＡＤＣの種々の実施形態で使用した薬剤またはペイロードの例としては、ＤＭ１（マイタンシン、Ｎ２'−デアセチル−Ｎ２'−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−またはＮ２'−デアセチル−Ｎ２'−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン）、ｍｃ−ＭＭＡＤ（６−マレイミドカプロイル−モノメチルアウリスタチン−ＤまたはＮ−メチル−Ｌ−バリル−Ｎ−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−メトキシ−４−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−［［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（２−チアゾリル）エチル］アミノ］プロピル］−１−ピロリジニル］−１−［（１Ｓ）−１−メチルプロピル］−４−オキソブチル］−Ｎ−メチル−（９Ｃｌ）−Ｌ−バリンアミド）、ｍｃ−ＭＭＡＦ（マレイミドカプロイル−モノメチルアウリスタチンＦまたはＮ−［６−（２，５−ジヒドロ−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−１−オキソヘキシル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−５−メチル−４−（メチルアミノ）ヘプタノイル−（αＲ，βＲ，２Ｓ）−β−メトキシ−α−メチル−２−ピロリジンプロパノイル−Ｌ−フェニルアラニン）及びｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＥ（６−マレイミドカプロイル−ＶａｌｃＣｉｔ−（ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル）−モノメチルアウリスタチンＥまたはＮ−［［［４−［［Ｎ−［６−（２，５−ジヒドロ−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−１−オキソヘキシル］−Ｌ−バリル−Ｎ５−（アミノカルボニル）−Ｌ−オルニチル］アミノ］フェニル］メトキシ］カルボニル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｎ−［（１Ｓ，２Ｒ）−４−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−［［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヒドロキシ−１−メチル−２−フェニルエチル］アミノ］−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］−１−ピロリジニル］−２−メトキシ−１−［（１Ｓ）−１−メチルプロピル］−４−オキソブチル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）が挙げられる。ＤＭ１は、チューブリン阻害剤であるマイタンシンの誘導体であり、一方、ＭＭＡＤ、ＭＭＡＥ、及びＭＭＡＦは、アウリスタチン誘導体である。
【０２１５】
マイタンシノイド薬剤部分
いくつかの実施形態において、薬剤は、マイタンシノイドである。マイタンシン化合物は、マイクロチューブリンタンパク質であるチューブリンの重合阻害によって有糸分裂中の微小管の形成を阻害することによって、細胞増殖を阻害する（Ｒｅｍｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ （１９７５） Ｓｃｉｅｎｃｅ １８９：１００２−１００５；米国特許第５，２０８，０２０号）。マイタンシン及びマイタンシノイドは、非常に細胞傷害性であるが、癌治療におけるそれらの臨床用途は、それらの乏しい腫瘍選択性に主に起因するそれらの重篤な全身有害作用によって非常に制限されている。マイタンシンを用いた臨床試験は、中枢神経系及び胃腸系に対する深刻な有害作用に起因して中断された（Ｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ （１９７８） Ｃａｎ． Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ． Ｒｅｖ． ５：１９９−２０７）。
【０２１６】
マイタンシノイド薬剤部分は、抗体−薬剤コンジュゲートにおいて魅力的な薬剤部分である。なぜなら、これらは以下であるからである：（ｉ）発酵または化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために比較的入手しやすい、（ｉｉ）非ジスルフィドリンカーを介して抗体に対するコンジュゲーションに適している官能基を用いた誘導体化に適している、（ｉｉｉ）血漿中で安定である、及び（ｉｖ）様々な腫瘍細胞株に対して有効である。
【０２１７】
マイタンシノイド薬剤部分としての使用に適しているマイタンシン化合物は、当該技術分野で周知であり、公知の方法に従って天然の供給源から単離してもよいし、遺伝子工学技術を用いて産生してもよい（Ｙｕ ｅｔ ａｌ （２００２） ＰＮＡＳ ９９：７９６８−７９７３を参照されたい）。また、メイタンシノール及びメイタンシノール類似体は、公知の方法に従って合成して調製されてもよい。
【０２１８】
例示的なマイタンシノイド薬剤部分には、修飾した芳香族環を有するもの、例えば、Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，２５６，７４６号）（アンサマイトシンＰ２のリチウムアルミニウム水素化物の還元によって調製される）；Ｃ−２０−ヒドロキシ（またはＣ−２０−デメチル）＋／−Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号及び同第４，３０７，０１６号）（ストレプトミセス属またアクチノミセス属を用いた脱メチル化またはＬＡＨを用いた脱塩素により調製される）；及びＣ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシロキシ（−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）（アシル塩化物を用いたアシル化により調製される）、及び他の位置に修飾を有するものが含まれる。
【０２１９】
また、例示的なマイタンシノイド薬剤部分には、修飾を有するもの、例えば、Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）（Ｈ２ＳまたはＰ２Ｓ５を有するメイタンシノールの反応により調製される）；Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ２ ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号）；Ｃ−１４−ヒドロキシメチルまたはアシロキシメチル（ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号）；Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシロキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）（ストレプトミセス属によるメイタンシノールの変換によって調製される）；Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号及び米国特許第４，３１５，９２９号）（トレウィア ヌドロフローラ（Ｔｒｅｗｉａ ｎｕｄｌｆｌｏｒａ）より単離）；Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第４，３６２，６６３号及び米国特許第４，３６２，６６３号）（ストレプトミセス属によるメイタンシノールの脱メチル化により調製される）；及び４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号）（メイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元により調製される）が含まれる。
【０２２０】
マイタンシン化合物の多くの位置は、連結のタイプに依存して、結合位置として有用であることが知られている。例えば、エステル結合を形成するためには、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ−１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ−２０位が、全て適切である。
【０２２１】
マイタンシノイド薬剤部分の全ての立体異性体、すなわち、Ｄのキラル炭素でのＲ及びＳ配位の任意の組み合わせは、本発明の化合物のために考慮される。ＡＤＣの実施形態としては、ＤＭ１、ＤＭ３、ＤＭ４が挙げられる（ＵＳ２００９０２０２５３６を参照されたい）。
【０２２２】
ＤＭ３及びＤＭ４の硫黄原子に隣接する炭素上の、メチル基等のアルキル基によってもたらされる立体障害は、ＡＤＣの細胞内切断の速度に影響を与える場合がある（ＵＳ２００４／０２３５８４０Ａｌ）。よって、可変アルキル単位、（ＣＲ２）ｍ、は、インビトロ及びインビボにおける効力、有効性、及び安全性／毒性に影響を与える場合がある。
【０２２３】
アウリスタチン
いくつかの実施形態において、薬剤は、アウリスタチンＥ（ドラスタチン−１０の誘導体としても当該技術分野で知られている）などのアウリスタチン、またはその誘導体である。アウリスタチンは、例えば、アウリスタチンＥとケト酸との間で形成されるエステルであり得る。例えば、アウリスタチンＥは、パラアセチル安息香酸またはベンゾイル吉草酸と反応して、それぞれＡＥＢ及びＡＥＶＢを産生し得る。他の典型的なアウリスタチンには、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、及びＭＭＡＥが含まれる。例示的なアウリスタチンの合成及び構造は、米国特許第６，８８４，８６９号、同第７，０９８，３０８号、同第７，２５６，２５７号、同第７，４２３，１１６号、同第７，４９８，２９８号、及び同第７，７４５，３９４号において記載されており、そのそれぞれは、その全体が全ての目的で参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２２４】
アウリスタチンは、微小管の動態ならびに核及び細胞の分裂に干渉し、抗癌活性を有することが示されている。本発明のアウリスタチンは、チューブリンと結合し、５Ｔ４を発現する細胞または細胞株に対して細胞傷害性または細胞増殖抑制性の効果を及ぼし得る。アウリスタチンまたは得られた抗体−薬剤コンジュゲートが所望の細胞または細胞株に対して細胞増殖抑制性または細胞傷害性の効果を及ぼすかどうかを決定するために用いることができる多くの異なるアッセイが、当該技術分野で知られている。化合物がチューブリンと結合するかどうかを決定するための方法は、当該技術分野で知られている。例えば、Ｍｕｌｌｅｒら， Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ ２００６， ７８， ４３９０〜４３９７；Ｈａｍｅｌら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， １９９５ ４７：９６５〜９７６；及びＨａｍｅｌら， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９０ ２６５：２８， １７１４１〜１７１４９を参照されたい。
【０２２５】
化学療法剤
いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は、化学療法剤にコンジュゲートされる。例としては、シスプラチン及びラパチニブが挙げられるが、これらに限定されない。「化学療法剤」は、癌の処置に有用な化学化合物である。
【０２２６】
化学療法剤の例としては、チオテパ及びシクロスフォスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファンなどのアルキルスルホン酸塩；ベンゾドーパ、カルボクオン、メツレドーパ、及びウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、及びトリメチロールメラミンを含むエチレンイミン及びメチラメラミン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソウレア；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、プロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝産物；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン、５−ＦＵなどのピリミジン類似体；カルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメト；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ７；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２'，２"−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミ���；チオテパ；タキサン、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、ニュージャージー州プリンストン）及びドキセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ、アントニー、フランス）；クロラムブシル；ゲンシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン及びカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラマイシン；カペシタビン；及び上記のいずれかの薬学的に許容され得る塩、酸、または誘導体が挙げられる。また、この定義に含められるのは、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼを阻害する４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む抗エストロゲン；及びフラタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリンなどの抗アンドロゲン；及び上記のいずれかの薬学的に許容され得る塩、酸、または誘導体などの、腫瘍に対するホルモン作用を調節するまたは阻害するように作用する抗ホルモン剤である。
【０２２７】
コンジュゲートリンカー
いくつかの実施形態において、薬剤は、リンカーによって抗原結合性構築物、例えば、抗体に結合される。抗体へのリンカーの付着は、表面リジンを介して、酸化糖質への還元カップリング、鎖間ジスルフィド結合を還元することで遊離されるシステイン残基を介してなど様々な方法で達成することができる。ヒドラゾン系、ジスルフィド系、及びペプチド系結合を含む、様々なＡＤＣ結合システムが、当該技術分野で知られている。
【０２２８】
適切なリンカーには、例えば、切断可能なリンカー及び切断不可能なリンカーが含まれる。切断可能なリンカーは、典型的には、細胞内条件下で切断を受けやすい。適切な切断可能なリンカーには、例えば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼなどの細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーが含まれる。例示的な実施形態において、リンカーは、ジペプチドリンカー、例えば、バリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ）リンカー、フェニルアラニン−リジン（ｐｈｅ−ｌｙｓ）リンカー、またはマレイミドカプロニック−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ）リンカーであり得る。別のリンカーは、スルホスクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓｍｃｃ）である。スルホ−ｓｍｃｃコンジュゲーションは、スルフヒドリル（チオール、−ＳＨ）と反応するがそのスルホ−ＮＨＳエステルは第一級アミン（リジン及びタンパク質またはペプチドのＮ末端において見られる）に対して反応性である、マレイミド基を介して生じる。さらに別のリンカーは、マレイミドカプロイル（ｍｃ）である。他の適切なリンカーには、特異的なｐＨまたはｐＨ範囲で加水分解可能なリンカー、例えば、ヒドラゾンリンカーが含まれる。さらなる適切な切断可能なリンカーには、ジスルフィドリンカーが含まれる。リンカーは、薬剤が放出されるために抗体が細胞内で分解されなければならない程度まで、抗体に共有結合され得る（例えばｍｃリンカーなど）。
【０２２９】
リンカーは、抗体に結合するための基を含み得る。例えば、リンカーは、アミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、またはスルフィドリル反応性の基（例えば、マレイミド、ハロアセトアミド（例えば、ヨード、ブロモ、またはクロロ）、ハロエステル（例えば、ヨード、ブロモ、またはクロロ）、ハロメチルケトン（例えば、ヨード、ブロモ、またはクロロ）、ハロゲン化ベンジル（例えば、ヨウ化物、臭化物、または塩化物）、ビニルスルホン、及びピリジルチオ）を含み得る。一般的には、Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ；ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９１を参照されたい。
【０２３０】
一実施形態において、抗体及び薬剤部分の共有結合は、リンカーが２つの反応性官能基を有する、すなわち、反応性の意味で二価であることを必要とする。２つ以上の官能性または生物学的に活性な部分、例えば、ペプチド、核酸、薬剤、毒素、抗体、ハプテン、及びレポーター群を結合させるのに有用な二価のリンカー試薬は知られており、方法はその得られたコンジュゲートと共に記載されている（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｇｒｅｇ Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ２０１３ ＩＳＢＮ−１３：９７８−０１２３８２２３９０）。
【０２３１】
別の実施形態において、リンカーは、溶解性または反応性を調節する基で置換されてもよい。例えば、スルホネート置換基は、試薬の水溶性を改善し、抗体または薬剤部分とのリンカー試薬のカップリング反応を容易にし、またはＡＤＣを調製するために用いられる合成経路に応じてＡｂ−ＬのＤとの、またはＤ−ＬのＡｂとのカップリング反応を容易にし得る。
【０２３２】
別の実施形態において、リンカーは、抗体上に存在する求電子基と反応性である求核基を有する反応性官能基を有している。抗体上の有用な求電子基としては、アルデヒド及びケトンカルボニル基が挙げられるが、これらに限定されない。リンカーの求核基のヘテロ原子は、抗体上の求電子基と反応し、抗体単位に対する共有結合を形成することができる。リンカー上の有用な求核基としては、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジドが挙げられるが、これらに限定されない。抗体上の求電子基は、リンカーに好都合な結合部分を提供する。
【０２３３】
リンカーは、１つまたは複数のアミノ酸単位を含むペプチド性であり得る。ペプチドリンカー試薬は、ペプチド化学の分野でよく知られている固相または液相合成法（Ｅ． Ｓｃｈｒoｄｅｒ ａｎｄ Ｋ． Ｌuｂｋｅ， Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐｐ ７６−１３６ （１９６５） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、例えば、ｔ−ＢＯＣ化学（Ｇｅｉｓｅｒら「Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」 ｉｎ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， １９８８， ｐｐ． １９９−２１８）及びＦｍｏｃ／ＨＢＴＵ化学（Ｆｉｅｌｄｓ， Ｇ． ａｎｄ Ｎｏｂｌｅ， Ｒ． （１９９０）「Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ９−ｆｌｕｏｒｏｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ」， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ３５：１６１−２１４）によって、自動合成装置、例えば、Ｒａｉｎｉｎ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ （Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｔｕｃｓｏｎ， Ａｒｉｚ）、またはモデル４３３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆ）を用いて調製され得る。
【０２３４】
化合物は、限定するものではないが、以下のクロスリンカー試薬：ＢＭＰＥＯ、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＰＤＢ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）、例えば、ビスマレイミド試薬：ＤＴＭＥ、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＭ（ＰＥＯ）２、及びＢＭ（ＰＥＯ）３にて調製したＡＤＣが特に考えられる。これらは、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．， Ｃｕｓｔｏｍｅｒ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ， Ｐ．Ｏ． Ｂｏｘ １１７， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ． ６１１０５ Ｕ．Ｓ．Ａ， Ｕ．Ｓ．Ａ １−８００−８７４−３７２３， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＋８１５−９６８−０７４７から市販されている。２００３−２００４ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ａｎｄ Ｃａｔａｌｏｇの４６７−４９８頁を参照されたい。
【０２３５】
ビスマレイミド試薬により、連続した様式または同時の様式で、チオール含有薬剤成分、標識、またはリンカー中間生成物に、抗体のシステイン残基の遊離チオール基が付着することができる。抗体、マイタンシノイド薬剤部分、またはリンカー中間生成物のチオール基と反応性があるマレイミド以外の他の官能基には、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネート、及びイソチオシアネートが含まれる。
【０２３６】
また、有用なリンカー試薬は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．（Ｂｏｕｌｄｅｒ， Ｃｏｌｏ．）などの他の商業的供給源を介して得てもよいし、Ｔｏｋｉら （２００２） Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６７：１８６６−１８７２；米国特許第６，２１４，３４５号；Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅら；ＷＯ０２／０８８１７２；ＵＳ２００３１３０１８９；ＵＳ２００３０９６７４３；ＷＯ０３／０２６５７７；ＷＯ０３／０４３５８３；及びＷＯ０４／０３２８２８に記載の手段に従って合成してもよい。
【０２３７】
リンカーは、分岐状の多機能性リンカー部分を介してにより２つ以上の薬剤成分が抗体に共有結合するための樹枝型のリンカーであってもよい（Ｓｕｎら （２００２） Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １２：２２１３−２２１５；Ｓｕｎら （２００３） Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１：１７６１−１７６８；Ｋｉｎｇら （２００２） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４３：１９８７−１９９０）。樹枝状のリンカーは、抗体に対する薬剤のモル比を増す、すなわち負荷することができ、これはＡＤＣの力価に関連がある。従って、抗体が１つの反応性のシステインチオール基のみを有する場合、多くの薬剤成分は、樹枝状のリンカーを介して付着してもよい。
【０２３８】
ＡＤＣの調製
ＡＤＣは、当業者に公知の有機化学的反応、条件、及び試薬を用いたいくつかの経路、例えば、（１）抗体の求核基または求電子基を二価リンカー試薬と反応させて、共有結合を介して抗体−リンカー中間生成物Ａｂ−Ｌを形成させ、その後に活性薬剤成分Ｄと反応させる；及び（２）薬剤成分の求核基または求電子基をリンカー試薬と反応させて、共有結合を介して薬剤−リンカー中間生成物Ｄ−Ｌを形成させ、その後に抗体の求核基または求電子基と反応させることによって調製されてもよい。コンジュゲート方法（１）及び（２）は、様々な抗体、薬剤成分、及びリンカーを用いて行い、本明細書に記載の抗体−薬剤コンジュゲートを調製してもよい。
【０２３９】
ＡＤＣの調製方法のいくつかの具体的な例は、当該技術分野で知られており、米国特許第８，６２４，００３号（ポット方法）、同第８，１６３，８８８号（一段階）、及び同第５，２０８，０２０号（二段階方法）に記載されている。
【０２４０】
抗体上の求核基としては、（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えば、リジン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えば、システイン、及び（ｉｖ）抗体がグリコシル化される場合は糖ヒドロキシル基またはアミノ基が挙げられるが、これらに限定されない。アミン、チオール、及びヒドロキシル基は、求核であり、反応して、（ｉ）活性エステル、例えば、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸、及び酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハライド、例えば、ハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、及びマレイミド基を含む、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子基と共有結合を形成することができる。ある抗体は、還元性の鎖間ジスルフィド、すなわち、システイン架橋を有する。抗体は、ＤＴＴ（クリーランド試薬、ジチオトレイトール）またはＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩などの還元剤で処理することで、リンカー試薬とのコンジュゲーションに反応性であるようにしてもよい；Ｇｅｔｚら（１９９９） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｖｏｌ ２７３：７３−８０；Ｓｏｌｔｅｃ Ｖｅｎｔｕｒｅｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓ．）。よって、各システインジスルフィド架橋は、理論的には、２つの反応性のチオール求核基を形成する。さらなる求核基は、チオールにアミンを変換させる２−イミノチオラン（トラウト試薬）を用いてリジンを反応させることによって抗体に導入することができる。
【０２４１】
また、抗体薬剤コンジュゲートは、抗体を修飾して求電子性の部分（リンカー試薬または薬剤上の求核置換基と反応させることができる）を導入することによって生成してもよい。グリコシル化された抗体の糖は、例えば、過ヨウ素酸酸化試薬によって酸化されて、リンカー試薬または薬剤部分のアミン基と反応し得るアルデヒド基またはケトン基を形成してもよい。得られるイミンＳｃｈｉｆｆ塩基の基は、安定な結合を形成してもよく、または、例えば、ホウ化水素試薬によって還元されて安定なアミン結合を形成してもよい。一実施形態において、ガラクトースオキシダーゼまたはメタ過ヨウ素酸ナトリウムのいずれかとのグリコシル化された抗体の糖質部分の反応は、薬剤上の適当な基と反応することができるタンパク質におけるカルボニル（アルデヒド及びケトン）基を生じ得る（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ｇ． Ｔ． （１９９６） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐ２３４−２４２）。別の実施形態において、Ｎ末端セリンまたスレオニン残基を含有するタンパク質は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応して、第一のアミノ酸の代わりにアルデヒドの産生を生じることができる（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ ＆ Ｓｔｒｏｈ， （１９９２） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ３：１３８−１４６；米国特許第５，３６２，８５２号）。そのようなアルデヒドは、薬剤部分またはリンカー求核基と反応することができる。
【０２４２】
同様に、薬剤部分上の求核基としては、リンカー部分上の求電子基及び（ｉ）活性エステル、例えば、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸、及び酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハライド、例えば、ハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、及びマレイミド基を含むリンカー試薬と反応して共有結合を形成可能なアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジド基が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４３】
マイタンシンは、例えば、Ｍａｙ−ＳＳＣＨ３に変換されてもよく、これは、遊離チオール、Ｍａｙ−ＳＨに還元することができ、改変抗体と反応して（Ｃｈａｒｉら （１９９２） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７−１３１）、ジスルフィドリンカーを有するマイタンシノイド−抗体イムノコンジュゲートを生成することができる。ジスルフィドリンカーを有する抗体−マイタンシノイドコンジュゲートは報告されている（ＷＯ０４／０１６８０１；米国特許第６，８８４，８７４号；ＵＳ２００４／０３９１７６Ａｌ；ＷＯ０３／０６８１４４；ＵＳ２００４／００１８３８Ａｌ；米国特許第６，４４１，１６３号、第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号；ＷＯ０１／０２４７６３）。ジスルフィドリンカーＳＰＰは、リンカー試薬Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエートを用いて構築される。本発明のＡＤＣは、ＳＭＣＣリンカーとＤＭ１マイタンシノイド薬剤部分とを含む。
【０２４４】
Ａｂ−（ＳＭＣＣ−ＤＭ１）ｐの一実施形態において、ｐの平均は、１、２、３、または４である（ＷＯ２００５／０３７９９２）。ＡＤＣの別の実施形態は、Ａｂ−（ＳＩＡＢ−ＤＭ１）ｐである。
【０２４５】
薬剤は、抗体上のコンジュゲーション点と反応性の基を有するか、またはそれを含むように修飾されている。例えば、薬剤は、アルキル化（例えば、抗体のイプシロン−アミノ基のリジン、またはＮ末端で）、酸化糖質の還元的アミノ化、ヒドロキシル基とカルボキシル基との間のトランスエステル化、アミノ基またはカルボキシル基でのアミド化、及びチオールへのコンジュゲーションによって付着させることができる。いくつかの実施形態において、抗体１分子当たりのコンジュゲートした薬剤部分の数ｐは、平均１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、または１〜２の範囲である。いくつかの実施形態において、ｐは、平均２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、または２〜３の範囲である。他の実施形態において、ｐは、平均１、２、３、４、５、６、７、または８である。いくつかの実施形態において、ｐは、平均約１〜約８、約１〜約７、約１〜約６、約１〜約５、約１〜約４、約１〜約３、または約１〜約２の範囲である。いくつかの実施形態において、ｐは、約２〜約８、約２〜約７、約２〜約６、約２〜約５、約２〜約４、または約２〜約３の範囲である。コンジュゲーションに用いることができる化学の例については、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、第１５章（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を参照されたい（この文献の開示は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０２４６】
例えば、タンパク質の化学的活性化によって遊離チオール基が形成される場合、タンパク質は、スルフヒドリル反応性の作用物質とコンジュゲートし得る。一態様において、作用物質は、遊離チオール基に実質的に特異的なものである。そのような作用物質には、例えば、マレイミド、ハロアセトアミド（例えば、ヨード、ブロモ、またはクロロ）、ハロエステル（例えば、ヨード、ブロモ、またはクロロ）、ハロメチルケトン（例えば、ヨード、ブロモ、またはクロロ）、ハロゲン化ベンジル（例えば、ヨウ化物、臭化物、または塩化物）、ビニルスルホン、及びピリジルチオが含まれる。
【０２４７】
一価抗原結合性構築物の試験
本発明による一価抗原結合性構築物は、対応する単一特異性二価抗原結合性構築物と比較して増加したエフェクター機能を示すことができる。一価抗原結合性構築物のエフェクター機能は、以下のように試験することができる。インビトロ及び／またはインビボ細胞傷害性アッセイを行って、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ、及び／またはＡＤＣＣ活性を評価することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、ＦｃγＲ結合を測定する。ＡＤＣＣに介在する初代細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血系細胞におけるＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４ページの表３にて要約されている。対象分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの例は、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されている。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいはまたはさらに、対象分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら， ＰＮＡＳ （ＵＳＡ） ９５：６５２−６５６ （１９９８）にて開示されたもののような動物モデルにてインビボで評価され得る。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを行って、一価抗原結合性構築物がＣｌｑに結合できるためＣＤＣを活性化させるかどうかを判断してもよい。補体活性化を評価するには、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３ （１９９６）に記載されるようなＣＤＣアッセイを行ってもよい。例えば、ＳＰＲによるＦｃＲｎ結合、及び抗体のインビボＰＫ決定は、当該技術分野で周知の方法で行うこともできる。
【０２４８】
本明細書に記載の抗原結合性構築物の存在及び量は、当該技術分野で周知の免疫アッセイ法であるＥＬＩＳＡを用いて決定することができる。本明細書に記載のヘテロ多量体を検出／定量するのに有用なＥＬＩＳＡプロトコルの１つは、下記の段階を含んでなる：ＥＬＩＳＡプレートを抗ヒト血清アルブミン抗体でコーティングし、プレートをブロッキングすることにより非特異的結合を阻止し、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、本明細書に記載のタンパク質を含む溶液（１つまたは複数の異なる濃度で）を添加し、検出可能な標識に結合した二次抗抗原結合性構築物ポリペプチド特異的抗体（本明細書に記載した、あるいは、当業者には公知の）を添加し、二次抗体の存在を検出する。
【０２４９】
本明細書に示されるように、本明細書に記載の一価抗原結合性構築物は、対応する単一特異性二価抗原結合性構築物と比較して優れた有効性及び／または生物活性を示す。本発明による一価抗原結合性構築物の有効性及び／または生物活性の１つの非限定的な例は、標的細胞の成長を阻害する一価抗原結合性構築物の能力に代表される。一実施形態において、一価抗原結合性構築物の優れた有効性及び／または生物活性は、主として、単一特異性二価抗原結合性構築物と比較して増加した一価抗原結合性構築物のエフェクター機能の結果である。一価抗原結合性構築物のこのタイプの例は、一価溶解性抗体（ＭＶ−Ｌ）に代表される。
【０２５０】
試験することができる増加したエフェクター機能は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、またはＣＤＣのうちの少なくとも１つを含む。
【０２５１】
ＡＤＣＣ
一実施形態において、一価抗原結合性構築物は、対応する単一特異性二価抗原結合性構築物よりも高いレベルのＡＤＣＣによる細胞死滅を示す。この実施形態によれば、一価抗原結合性構築物は、対応する単一特異性二価抗原結合性構築物のＡＤＣＣ活性の約１．２〜１．６倍の活性増加を示す。一実施形態において、一価抗原結合性構築物は、対応する単一特異性二価抗原結合性構築物よりもＡＤＣＣによる細胞死滅において約１．３倍の増加を示す。一実施形態において、一価抗原結合性構築物は、対応する単一特異性二価抗原結合性構築物よりもＡＤＣＣによる細胞死滅において約１．４倍の増加を示す。一実施形態において、一価抗原結合性構築物は、対応する単一特異性二価抗原結合性構築物よりもＡＤＣＣによる細胞死滅において約１．５倍の増加を示す。
【０２５２】
一実施形態において、一価抗原結合性構築物は、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２に結合する抗原結合性ポリペプチド構築物を含み、対応する単一特異性二価抗原結合性構築物のＡＤＣＣ活性の約１．２〜１．６倍の活性増加を示す。一実施形態において、一価抗原結合性構築物は、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２に結合する抗原結合性ポリペプチド構築物を含み、対応する単一特異性二価抗原結合性構築物よりもＡＤＣＣによる細胞死滅において約１．３倍の増加を示す。一実施形態において、一価抗原結合性構築物は、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２に結合する抗原結合性ポリペプチド構築物を含み、対応する単一特異性二価抗原結合性構築物よりもＡＤＣＣによる細胞死滅において約１．５倍の増加を示す。
【０２５３】
一実施形態において、一価抗原結合性構築物は、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２に結合して、対応する非アフコシル化抗原結合のものに対してＡＤＣＣ活性の増加を示すアフコシル化抗原結合性ポリペプチド構築物を含む。いくつかの態様において、ＡＤＣＣの増加は、約１〜３倍またはそれ以上、例えば、１、２、または３倍である。
【０２５４】
ＡＤＣＰ
一実施形態において、一価抗原結合性構築物は、対応する単一特異性二価抗原結合性構築物よりも高いレベルのＡＤＣＰによる細胞死滅を示す。
【０２５５】
ＣＤＣ
一実施形態において、一価抗原結合性構築物は、対応する単一特異性二価抗原結合性構築物よりも高いレベルのＣＤＣによる細胞死滅を示す。一実施形態において、一価抗原結合性構築物は、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２に結合する抗原結合性ポリペプチド構築物を含み、対応する単一特異性二価抗原結合性構築物よりもＣＤＣによる細胞死滅において約１．５倍の増加を示す。
【０２５６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された一価抗原結合性構築物であり、前記構築物は、２つの抗原結合性ポリペプチド構築物を有する対応する二価抗原結合性構築物のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣのうちの少なくとも１つの少なくとも約１２５％を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された一価抗原結合性構築物であり、前記構築物は、２つの抗原結合性ポリペプチド構築物を有する対応する二価抗原結合性構築物のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣのうちの少なくとも１つの少なくとも約１５０％を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された一価抗原結合性構築物であり、前記構築物は、２つの抗原結合性ポリペプチド構築物を有する対応する二価抗原結合性構築物のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣのうちの少なくとも１つの少なくとも約３００％を有する。
【０２５７】
ＦｃγＲへの増加した結合能
いくつかの実施形態において、一価抗原結合性構築物は、１つまたは複数のＦｃγＲに対してより高い結合能（Ｒｍａｘ）を示す。一価抗原結合性構築物がＨＥＲ２に結合する抗原結合性ポリペプチド構築物を含む一実施形態において、一価抗原結合性構築物は、対応する単一特異性二価抗原結合性構築物を超える約１．３〜２倍の１つまたは複数のＦｃγＲに対するＲｍａｘの増加を示す。一価抗原結合性構築物がＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２に結合する抗原結合性ポリペプチド構築物を含む一実施形態において、一価抗原結合性構築物は、対応する単一特異性二価抗原結合性構築物を超える約１．３〜１．８倍のＣＤ１６ ＦｃγＲに対するＲｍａｘの増加を示す。一価抗原結合性構築物がＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２に結合する抗原結合性ポリペプチド構築物を含む一実施形態において、一価抗原結合性構築物は、対応する単一特異性二価抗原結合性構築物を超える約１．３〜１．８倍のＣＤ３２ ＦｃγＲに対するＲｍａｘの増加を示す。一価抗原結合性構築物がＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２に結合する抗原結合性ポリペプチド構築物を含む一実施形態において、一価抗原結合性構築物は、対応する単一特異性二価抗原結合性構築物を超える約１．３〜１．８倍のＣＤ６４ ＦｃγＲに対するＲｍａｘの増加を示す。
【０２５８】
ＦｃγＲへの増加した親和性
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される一価抗原結合性構築物は、対応する二価抗原結合性構築物と比較してＦｃγＲの予想外に増加した親和性を有する。装飾の結果として得られる増加したＦｃ濃度は、増加したＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ活性と一致している。
【０２５９】
いくつかの実施形態において、一価抗原結合性構築物は、１つまたは複数のＦｃγＲの増加した親和性を示す。一価抗原結合性構築物がＨＥＲ２に結合する抗原結合性ポリペプチド構築物を含む一実施形態において、一価抗原結合性構築物は、少なくとも１つのＦｃγＲの増加した親和性を示す。この実施形態によれば、一価抗原結合性構築物は、ＣＤ３２の増加した親和性を示す。
【０２６０】
別の実施形態において、本明細書に記載の一価抗原結合性構築物であり、該一価抗原結合性構築物は、対応する単一特異性二価抗原結合性構築物と比較して増加した細胞内部移行を示し、それにより優れた有効性及び／または生物活性をもたらす。
【０２６１】
薬物動態パラメーター
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される一価抗原結合性構築物は、市販の治療用抗体に相当する薬物動態（ＰＫ）特性を示す。一実施形態において、本明細書に記載の一価抗原結合性構築物は、血清濃度、ｔ１／２、β半減期、及び／またはＣＬに関して、既知の治療用抗体と同様のＰＫ特性を示す。一実施形態において、一価抗原結合性構築物は、前記単一特異性二価抗原結合性構築物に相当するか、またはそれを超えるインビボ安定性を示す。そのようなインビボ安定性パラメーターは、血清濃度、ｔ１／２、β半減期、及び／またはＣＬを含む。
【０２６２】
一実施形態において、本明細書に提供される一価抗原結合性構築物は、対応する単一特異性二価抗原結合性構築物と比較してより高い分布容積（Ｖｓｓ）を示す。抗体の分布容積は、血漿または血液の容積（Ｖｐ）、組織の容積（ＶＴ）、及び組織対血漿分割（ｋＰ）に関連する。線形条件下において、ＩｇＧ抗体は、動物またはヒトにおける血管内投与に従って、まず血漿区画及び血管外液中に分配される。いくつかの実施形態において、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）による取込みなどの能動輸送過程はまた、抗体生体内分布、中でも結合タンパク質に影響する。
【０２６３】
別の実施形態において、本発明による一価抗原結合性構築物は、対応する単一特異性二価抗原結合性構築物と比較してより高い分布容積（Ｖｓｓ）を示し、同様の親和性でＦｃＲｎに結合する。
【０２６４】
競合アッセイ
抗原結合性構築物間の競合は、試験中の抗原結合性構築物が共通の抗原への参照抗原結合性構築物の特異的結合を阻害するアッセイにおいて決定することができる（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：１４９５，１９９０を参照されたい）。過剰の試験抗原結合性構築物（例えば、少なくとも２ｘ，５ｘ，１０ｘ，２０ｘ、または１００ｘ）が、競合結合アッセイで測定して、参照抗原結合性構築物の結合を、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％阻害する場合、試験抗原結合性構築物は、参照抗原結合性構築物と競合する。競合アッセイで同定された抗原結合性構築物（競合抗原結合性構築物）には、参照抗原結合性構築物と同じエピトープに結合する抗原結合性構築物、及び、立体障害が生じるに足るほど、参照抗原結合性構築物が結合するエピトープに近い隣接エピトープに結合する抗原結合性構築物が含まれる。例えば、ＥＧＦＲへの結合について、本明細書に記載の第一の単離された一価抗原結合性構築物と競合する第二の、競合の単離された一価抗原結合性構築物を同定することができる。ある例では、第二の構築物は、競合結合アッセイで測定して、第一の構築物の結合を、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％阻害することができる。ある例では、第二の構築物は、第一の構築物に、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％を超えて置換することができる。
【０２６５】
キット
本明細書で提供されるのは、個人においてバイオマーカーの存在を検出するための対象キットであり、前記キットは、（ａ）本明細書に記載の単離された一価抗原結合性構築物と；（ｂ）使用説明書とを含む。ある特定の実施形態において、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２及びその可溶性ＥＣＤのうちの少なくとも１つの検出のためのキットであり、前記キットは、（ａ）本明細書に記載の単離された一価ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２結合抗原結合性構築物と；（ｂ）使用説明書とを含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２及びその可溶性ＥＣＤのうちの少なくとも１つの濃度を決定するためのキットであり、前記キットは、（ａ）本明細書に記載の単離された一価ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２結合抗原結合性構築物と；（ｂ）使用説明書とを含む。
【０２６６】
抗原結合性構築物の産生
抗原結合性構築物は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているような組換え方法及び組成物を用いて作製され得る。一実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物をコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗原結合性構築物のＶＬを含むアミノ酸配列及び／またはＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗原結合性構築物の軽鎖及び／または重鎖）をコードし得る。別の実施形態において、そのような核酸を含む１つまたは複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。一実施形態において、核酸は、マルチシストロン性ベクターで提供される。別の実施形態において、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような一実施形態において、宿主細胞は：（１）抗原結合性構築物のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗原結合性ポリペプチド構築物のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗原結合性ポリペプチド構築物のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一のベクター及び抗原結合性ポリペプチド構築物のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二のベクター、を含む（例えば、トランスフォーメーションされている）。一実施形態において、宿主細胞は、真核性であり、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、またはリンパ細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態において、抗原結合性構築物を作製する方法が提供され、前記方法は、抗原結合性構築物の発現に好適な条件下で、上記に提供されるように抗原結合性構築物をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、必要に応じて宿主細胞（また宿主細胞培地）から抗原結合性構築物を回収することとを含む。
【０２６７】
抗原結合性構築物の組換え作製に関して、例えば、上記のように、抗原結合性構築物をコードする核酸は、単離され、宿主細胞における更なるクローニング及び／または発現のために１つまたは複数のベクターに挿入される。そのような核酸は、従来の手順を用いて（例えば、抗原結合性構築物の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離され、配列決定され得る。
【０２６８】
抗原結合性構築物をコードするベクターのクローニングまたは発現に適当な宿主細胞は、本明細書に記載の原核または真核細胞を含む。例えば、抗原結合性構築物は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合、細菌において作製され得る。細菌における抗原結合性構築物断片及びポリペプチドの発現に関しては、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、及び同第５，８４０，５２３号を参照されたい（また、Ｅ．ｃｏｌｉにおける抗体断片の発現を記載するＣｈａｒｌｔｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２４８ （Ｂ．Ｋ．Ｃ． Ｌｏ， ｅｄ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ， ２００３）、２４５〜２５４ページも参照されたい）。発現後、抗原結合性構築物は、可溶性画分における細菌細胞ペーストから単離され得、さらに精製され得る。
【０２６９】
原核生物に加えて、糸状真菌または酵母などの真核微生物は、抗原結合性構築物をコードするベクターに適したクローニングホストまたは発現ホストであり、それには、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的または完全ヒトグリコシル化パターンを有する抗原結合性構築物の産生をもたらす真菌株及び酵母株が含まれる。Ｇｅｍｇｒｏｓｓ， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２２：１４０９−１４１４ （２００４）， ａｎｄ Ｌｉら．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２４：２１０−２１５ （２００６）を参照されたい。
【０２７０】
グリコシル化抗原結合性構築物の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞と共に、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために使用することができる多数のバキュロウイルス株が同定されている。
【０２７１】
植物細胞培養物は、ホストとしても利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗原結合性構築物を産生させるためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照されたい。
【０２７２】
脊椎動物細胞を宿主として使用してもよい。例えば、懸濁状態での成長に順化された哺乳類細胞株が、有用であり得る。有用な哺乳類宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０によってトランスフォーメーションされたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胎児腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ． ＧｅｎＶｉｒｏｌ． ３６：５９ （１９７７）に記載されたような２９３または２９３細胞）；幼ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ２３：２４３−２５２ （１９８０）に記載されたようなＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えば、Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ３８３：４４−６８ （１９８２）に記載されたようなＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳類宿主細胞株には、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞などのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６ （１９８０）；ならびにＹ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗原結合性構築物の産生に適した、ある種の哺乳類宿主細胞株の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２４８，（Ｂ．Ｋ．Ｃ． Ｌｏ， （ｅｄ．）， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， Ｎ.Ｊ.）， ｐｐ．２５５−２６８（２００３）を参照されたい。
【０２７３】
一実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、少なくとも１つの安定した哺乳類細胞に、抗原結合性構築物をコードする核酸を所定の比でトランスフェクトすることと；少なくとも１つの哺乳類細胞中で核酸を発現させることとを含む方法によって、安定した哺乳類細胞中で産生される。いくつかの実施形態において、核酸の所定の比は、トランジェントトランスフェクション実験で決定し、発現産物中で最も高い割合の抗原結合性構築物をもたらす入力核酸の相対比を決定する。
【０２７４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるように、安定した哺乳類細胞中で一価抗原結合性構築物を産生する方法であり、少なくとも１つの安定した哺乳類細胞の発現産物は、単量体重鎖または軽鎖ポリペプチドと比較して割合が多い所望のグリコシル化一価抗体、または他の抗体を含む。
【０２７５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の安定した哺乳類細胞中でグリコシル化一価抗原結合性構築物を産生する方法であり、前記方法は、所望のグリコシル化一価抗体を同定することと、精製することとを含む。いくつかの実施形態において、前記同定は、液体クロマトグラフィー及び質量分析の１つまたは両方によるものである。
【０２７６】
必要に応じて、抗原結合性構築物は、発現後に精製または単離することができる。タンパク質は、当業者に周知の様々なやり方で単離または精製し得る。標準的な精製方法には、イオン交換、疎水性相互作用、親和性、サイズまたはゲル濾過、及び逆相を含むクロマトグラフィー技法が含まれ、大気圧または高圧でＦＰＬＣやＨＰＬＣなどのシステムを使用して実行される。精製方法には、電気泳動、免疫学、沈殿、透析、及び等電点電気泳動の技法も含まれる。タンパク質濃縮と共に限外濾過及びダイアフィルトレーション技法も有用である。当該技術分野で周知の通り、様々な天然タンパク質が、Ｆｃ及び抗体に結合し、これらのタンパク質は、抗原結合性構築物のために本発明において用途を見出し得る。例えば、細菌のプロテインＡ及びＧは、Ｆｃ領域に結合する。同様に、細菌のプロテインＬは、いくつかの抗体のＦａｂ領域に結合する。精製は、しばしば特定の融合体パートナーにより可能にすることができる。例えば、抗体は、ＧＳＴ融合体が用いられているならばグルタチオン樹脂を、Ｈｉｓ−タグが用いられているならばＮｉ＋２親和性クロマトグラフィーを、ｆｌａｇ−タグが使用されているならば固定化抗ｆｌａｇ抗体を使用して、精製し得る。適する精製技法の一般的手引きには、例えば、参照によりその全体が組み込まれるＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ３ｒｄ Ｅｄ．， Ｓｃｏｐｅｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， ＮＹ， １９９４を参照されたい。必要な精製度は、抗原結合性構築物の用途に依存して変動する。いくつかの例では、精製は必要ない。
【０２７７】
ある特定の実施形態において、抗原結合性構築物は、アニオン交換クロマトグラフィーを使用して精製される。アニオン交換クロマトグラフィーとしては、Ｑ−セファロースカラム、ＤＥＡＥセファロースカラム、ポロスＨＱカラム、ポロスＤＥＡＦカラム、トーヨーパールＱカラム、トーヨーパールＱＡＥカラム、トーヨーパールＤＥＡＥカラム、リソース／ソースＱカラム及びＤＥＡＥカラム、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ Ｑカラム及びＤＥＡＥカラムでのクロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７８】
特定の実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製される。陽イオン交換クロマトグラフィーとしては、ＳＰ−セファロースカラム、ＣＭセファロースカラム、ポロスＨＳカラム、ポロスＣＭカラム、トーヨーパールＳＰカラム、トーヨーパールＣＭカラム、リソース／ソースＳカラム及びＣＭカラム、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ Ｓカラム及びＣＭカラム、ならびにこれらの等価物及び類似物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７９】
さらに、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、当該技術分野で公知の技術を用いて化学合成され得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， １９８３， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｎ．Ｙ．及びＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ， ３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照されたい）。例えば、ポリペプチドの断片に対応するポリペプチドは、ペプチド合成機の使用により合成され得る。さらに、所望の場合、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸類似体が、置換または付加としてこのポリペプチド配列に導入され得る。非古典的アミノ酸としては、通常のアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（例えば、β−メチルアミノ酸）、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、及び一般のアミノ酸類似体が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、アミノ酸は、Ｄ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。
【０２８０】
また、翻訳の間または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって示差的に修飾される抗原結合性構築物も提供される。任意の多数の化学修飾は、限定されるものではないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成；などを含む公知の技術によって実施され得る。
【０２８１】
本明細書に包含されるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、Ｎ結合型またはＯ結合型の炭水化物鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング）、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ結合型またはＯ結合型の炭水化物鎖の化学修飾、及び原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加または欠失が挙げられる。抗原結合性構築物は、検出可能な標識、例えば、酵素標識、蛍光標識、同位体標識、または親和性標識を用いて修飾して、このタンパク質の検出及び単離が可能にされ得る。
【０２８２】
適切な酵素の例としては、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンが挙げられる；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられる；及び適切な放射活性物質の例としては、ヨウ素、炭素、硫黄、トリチウム、インジウム、テクネチウム、タリウム、ガリウム、パラジウム、モリブデン、キセノン、フッ素が、挙げられる。
【０２８３】
特定の実施形態において、抗原結合性構築物または断片またはその変異体は、放射性金属イオンと会合する大環状のキレーターに結合する。
【０２８４】
上記のように、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、天然プロセス（例えば、翻訳後プロセシング）または当該技術分野で周知の化学修飾技術のいずれかによって、修飾することができる。同じ型の修飾が、所定のポリペプチドにおけるいくつかの部位で同じ程度または種々の程度で存在し得ることが、理解されるであろう。本発明のポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分枝状であり得、そのポリペプチドは、分枝を含むかまたは含まない環状であり得る。環状ポリペプチド、分枝状ポリペプチド、及び分枝した環状のポリペプチドは、天然の翻訳後プロセスから生じ得るか、または合成方法によって作製され得る。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリチル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介付加（例えば、アルギニル化）、及びユビキチン化が挙げられる。（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，第二版，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１−１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら，Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら，Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６６３：４８−６２（１９９２）を参照されたい）。
【０２８５】
ある特定の実施形態において、抗原結合性構築物は、固体支持体にも付着され得、これは、本発明のアルブミン融合タンパク質よって結合されるか、それに結合するか、またはそれと会合するポリペプチドの免疫アッセイまたは精製に特に有用である。そのような固体支持体は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリビニルクロライド、またはポリプロピレンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８６】
本発明によってまた提供されるのは、ポリペプチドの増加した溶解度、安定性、及び循環時間、または低下した免疫原性のようなさらなる利点を提供し得る、抗原結合性構築物の化学的に修飾された誘導体である（米国特許第４，１７９，３３７号を参照されたい）。誘導体化のための化学部分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどのような水溶性ポリマーから選択され得る。タンパク質は、分子内のランダムな位置、または分子内の所定の位置で修飾してもよく、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の付加された化学部分を含み得る。
【０２８７】
このポリマーは、任意の分子量であってよく、分枝または非分枝であってもよい。ポリエチレングリコールについては、好ましい分子量は、取扱い及び製造における容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間である（用語「約」は、ポリエチレングリコールの調製物中で、いくつかの分子が述べられた分子量よりいくらか大きいか、または小さい重量であることを示す）。他のサイズは、所望の治療プロファイル（例えば、所望の持続放出の持続期間、存在する場合、生物学的活性に対する効果、取扱いの容易さ、抗原性の程度または欠如、及び治療タンパク質または類似体に対するポリエチレングリコールの他の既知の効果）に依存して用いられ得る。例えば、ポリエチレングリコールは、約２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１０５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、または１００，０００ｋＤａの平均分子量を有し得る。ある実施形態で提供されるのは、安定した哺乳類細胞中でグリコシル化一価抗原結合性構築物を産生する方法であり、該方法は、少なくとも１つの安定した哺乳類細胞に、重鎖可変ドメイン及び第一のＦｃドメインポリペプチドを含む第一の重鎖ポリペプチドをコードする第一のＤＮＡ配列と；第二のＦｃドメインポリペプチドを含む第二の重鎖ポリペプチドをコードする第二のＤＮＡ配列であって、ここで、前記第二の重鎖ポリペプチドは可変ドメインを欠く、第二のＤＮＡ配列と；軽鎖可変ドメインを含む軽鎖ポリペプチドをコードする第３のＤＮＡ配列とを、前記第一のＤＮＡ配列、前記第二のＤＮＡ配列、及び前記第３のＤＮＡ配列が前記哺乳類細胞中で所定の比でトランスフェクトされるように、トランスフェクトすること；前記重鎖及び軽鎖ポリペプチドが、前記少なくとも１つの安定した哺乳類細胞中で所望のグリコシル化一価非対称抗体として発現されるように、少なくとも１つの哺乳類細胞中の前記第一のＤＮＡ配列、前記第二のＤＮＡ配列、及び前記第３のＤＮＡ配列を翻訳することとを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の安定した哺乳類細胞中でグリコシル化一価抗原結合性構築物を産生する方法であり、該方法は、２つの細胞の各々が重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドを異なる比で発現するように、少なくとも２つの異なる細胞に、異なる所定比の前記第一のＤＮＡ配列、前記第二のＤＮＡ配列、及び前記第３のＤＮＡ配列をトランスフェクトすることとを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の安定した哺乳類細胞中でグリコシル化一価抗原結合性構築物を産生する方法であり、該方法は、少なくとも１つの哺乳類細胞に、前記第一、第二、及び第３のＤＮＡ配列を含むマルチシストロン性ベクターをトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの哺乳類細胞は、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ、ＨＥＫ２９３、ＮＳ０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、Ｃａｃｏ−２及びＭＤＣＫ細胞、及びサブクラス及びその変異体からなる群から選択される。
【０２８８】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の安定した哺乳類細胞中でグリコシル化一価抗原結合性構築物を産生する方法であり、第一のＤＮＡ配列：第二のＤＮＡ配列：第３のＤＮＡ配列の所定の比は、約１：１：１である。いくつかの実施形態において、第一のＤＮＡ配列：第二のＤＮＡ配列：第３のＤＮＡ配列の前記所定の比は、翻訳された第一の重鎖ポリペプチドの量が、第二の重鎖ポリペプチドの量と軽鎖ポリペプチド量とほぼ等しくなるようにである。
【０２８９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の安定した哺乳類細胞中でグリコシル化一価抗原結合性構築物を産生する方法であり、少なくとも１つの安定した哺乳類細胞の発現産物は、単量体重鎖または軽鎖ポリペプチドと比較して割合が多い所望のグリコシル化一価抗体、または他の抗体を含む。
【０２９０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の安定した哺乳類細胞中でグリコシル化一価抗原結合性構築物を産生する方法であり、前記方法は、所望のグリコシル化一価抗体を同定することと、精製することとを含む。いくつかの実施形態において、前記同定は、液体クロマトグラフィー及び質量分析の１つまたは両方によるものである。
【０２９１】
本明細書で提供されるのは、改善されたＡＤＣＣを有する抗原結合性構築物を産生する方法であり、該方法は、少なくとも１つの安定した哺乳類細胞に、重鎖可変ドメイン及び第一のＦｃドメインポリペプチドを含む第一の重鎖ポリペプチドをコードする第一のＤＮＡ配列と；第二のＦｃドメインポリペプチドを含む第二の重鎖ポリペプチドをコードする第二のＤＮＡ配列であって、ここで、前記第二の重鎖ポリペプチドは可変ドメインを欠く、第二のＤＮＡ配列と；軽鎖可変ドメインを含む軽鎖ポリペプチドをコードする第３のＤＮＡ配列とを、前記第一のＤＮＡ配列、前記第二のＤＮＡ配列、及び前記第３のＤＮＡ配列が前記哺乳類細胞中で所定の比でトランスフェクトされるように、トランスフェクトすること；前記重鎖及び軽鎖ポリペプチドが、前記少なくとも１つの安定した哺乳類細胞中でグリコシル化一価非対称抗体として発現されるように、少なくとも１つの哺乳類細胞中の前記第一のＤＮＡ配列、前記第二のＤＮＡ配列、及び前記第３のＤＮＡ配列を翻訳することとを含み、前記グリコシル化一価非対称抗体は、対応する野生型抗体と比較してより高いＡＤＣＣを有する。
【０２９２】
本明細書で提供されるのは、安定した哺乳類細胞中でグリコシル化一価抗原結合性構築物を産生する方法であり、該方法は、少なくとも１つの安定した哺乳類細胞に、重鎖可変ドメイン及び第一のＦｃドメインポリペプチドを含む第一の重鎖ポリペプチドをコードする第一のＤＮＡ配列と；第二のＦｃドメインポリペプチドを含む第二の重鎖ポリペプチドをコードする第二のＤＮＡ配列であって、ここで、前記第二の重鎖ポリペプチドは可変ドメインを欠く、第二のＤＮＡ配列と；軽鎖可変ドメインを含む軽鎖ポリペプチドをコードする第３のＤＮＡ配列とを、前記第一のＤＮＡ配列、前記第二のＤＮＡ配列、及び前記第３のＤＮＡ配列が前記哺乳類細胞中で所定の比でトランスフェクトされるように、トランスフェクトすること；前記重鎖及び軽鎖ポリペプチドが、前記少なくとも１つの安定した哺乳類細胞中で所望のグリコシル化一価非対称抗体として発現されるように、少なくとも１つの哺乳類細胞中の前記第一のＤＮＡ配列、前記第二のＤＮＡ配列、及び前記第３のＤＮＡ配列を翻訳することとを含む。
【０２９３】
本明細書に記載の一価抗原結合性構築物をコードし、発現するために本明細書に記載の核酸分子を含むように改変されたトランスジェニック生物も提供される。
【０２９４】
医薬組成物
本明細書に記載の抗原結合性構築物は、当業者に周知の任意の方法により、かつ、用途に応じて製剤化され、投与することができる。いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は、抗原結合性構築物の医薬組成物と、薬学的に許容され得るキャリアとで製剤化される。
【０２９５】
「薬学的に許容され得る」という用語は、動物における、さらに特にヒトにおける使用のために、連邦規制当局もしくは米国政府により認められたか、または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されたことを意味する。「キャリア」という用語は、治療剤とともに投与される、希釈剤、アジュバンド、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような薬学的キャリアは、水及び油（石油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など）を含む）のような滅菌した液体であり得る。いくつかの態様において、キャリアは、天然では見られない人工のキャリアである。水は、医薬組成物を静脈内に投与する場合に、キャリアとして使用することができる。生理食塩水溶液、ならびに水性デキストロース及びグリセロール溶液は、特に注射可能な溶液のために、液体キャリアとしても使用され得る。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、フラワー、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、所望の場合、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含み得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤などの形態を取り得る。組成物は、従来の結合剤及びトリグリセリドなどのキャリアとともに、坐剤として製剤化され得る。経口製剤は、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準キャリアを含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。そのような組成物は、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形態で、適切な量のキャリアとともに含んで、患者への適切な投与のための形態を提供する。製剤は、投与形態に適するべきである。
【０２９６】
ある特定の実施形態において、抗原結合性構築物を含む組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投与のために採用された医薬組成物として、製剤化される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物は、可溶化剤及び注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部麻酔も含み得る。一般に、成分は、別々にかまたは単一投薬形態で一緒に混合してのどちらかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたは小袋のような密封された容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組成物は、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配され得る。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０２９７】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、中性のまたは塩の形態として製剤化される。薬学的に許容され得る塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもののようなアニオンとともに形成される塩、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するもののようなカチオンとともに形成される塩が挙げられる。
【０２９８】
この処置（タンパク質の異常な発現及び／または活性と関連する疾患または障害の抑制及び予防）において効果的である本明細書に記載の組成物の量は、標準的な臨床技術により決定することができる。さらに、インビトロアッセイは、必要に応じて、使用して、最適な投薬量の範囲を同定するのを助け得る。製剤において使用されるべき正確な用量は、投与の経路、及び疾患または障害の重篤さにも依存し、開業医の判断及び各患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から外挿される。
【０２９９】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載の一価抗原結合性構築物とアジュバントとを含む医薬組成物である。ある特定の実施形態において、一価抗原結合性構築物にコンジュゲートされる薬剤分子をさらに含む本明細書に記載の医薬組成物である。ある特定の実施形態において、薬剤分子は、自己免疫疾患の処置用である。いくつかの実施形態において、薬剤分子は、癌の処置用である。いくつかの実施形態において、薬剤分子は、化学療法剤である。
【０３００】
生物学的及び治療用途
ある特定の実施形態において、本明細書に記載の構築物は、１つまたは複数の生物学的活性を試験するアッセイにおいて使用される。構築物が特定のアッセイにおいて活性を示す場合、抗原結合性構築物からなる抗原結合性構築物は、その生物学的活性に関連する疾患に関与している可能性がある。従って、構築物は、関連する疾患の処置に使用される。
【０３０１】
ある特定の実施形態において、抗原分子の多量体化を阻害するための医薬の製造のための本明細書に記載の一価抗原結合性構築物の使用である。ある特定の実施形態において、抗原がその同族の結合パートナーに結合することを阻害する一価抗原結合性構築物の使用である。
【０３０２】
ある特定の実施形態において、そのような処置、予防、または改善を望んでいる患者に、本明細書に記載の抗原結合性構築物を、疾患または障害を処置、予防、または改善するのに有効な量で投与することを含む、該疾患または障害を処置する方法を提供する。
【０３０３】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、内分泌系の疾患及び／または障害の診断、予後、予防、及び／または処置において使用される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、神経系の疾患及び／または障害の診断、予後、予防、及び／または処置において使用される。
【０３０４】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、免疫系の疾患及び／または障害の診断、予後、予防、及び／または処置において使用される。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、呼吸器系の疾患及び／または障害の診断、予後、予防、及び／または処置において使用される。
【０３０５】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、心臓血管系の疾患及び／または障害の診断、予後、予防、及び／または処置において使用される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、生殖系の疾患及び／または障害の診断、予後、予防、及び／または処置において使用される。
【０３０６】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、消化系の疾患及び／または障害の診断、予後、予防、及び／または処置において使用される。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、血液に関連する疾患及び／または障害の診断、予後、予防、及び／または処置において使用される。
【０３０７】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物及び／または本明細書に記載の抗原結合性構築物をコードするポリヌクレオチドは、以下の活性に関連する疾患及び／または障害の診断、検知、及び／または処置に使用され、これらの活性としては、プロホルモン活性化、神経伝達物質活性、細胞シグナル伝達、細胞増殖、細胞分化、及び細胞移動が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０８】
一態様において、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、開示された疾患、障害、または状態のうちの１つまたは複数を処置するために、抗原結合性構築物を患者に投与することを伴う抗体ベース治療に関する。本明細書に記載の治療化合物としては、本明細書に記載の抗原結合性構築物、本明細書に記載の抗原結合性構築物をコードする核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０９】
特定の実施形態において、抗体ベースの治療であり、この治療は、１つまたは複数の疾患、障害、または状態（以下が挙げられるが、これらに限定されない：神経障害、免疫系障害、筋障害、生殖障害、胃腸障害、肺障害、心血管障害、腎障害、増殖障害、及び／または癌性の疾患及び状態、及び／または本明細書中の他の箇所に記載されるもの）を処置するために、患者に、抗体の少なくとも断片または変異体を含む本明細書に記載の抗原結合性構築物を投与することを伴う。
【０３１０】
抗体の少なくとも断片または変異体を含む本明細書に記載の抗原結合性構築物は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線治療、化学療法、ホルモン治療、免疫治療、及び抗腫瘍薬剤）と併用して投与され得る。一般に、患者のそれと同じ種である本来の種または反応性種の産物の投与（抗体の場合において）は、好まれる。従って、一実施形態において、ヒト抗体、断片誘導体、類似体、または核酸は、治療または予防のためにヒト患者に投与される。
【０３１１】
提供されるのは、対象への有効量の本明細書に記載の抗原結合性構築物または医薬組成物の投与による処置、阻害、及び予防の方法である。一実施形態において、抗原結合性構築物は、実質的に精製される（例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない有害作用を生じる物質は実質的にない）。ある特定の実施形態において、対象としては、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない動物であり、ある実施形態においては哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
【０３１２】
様々な送達系が公知であり、本明細書に記載の抗原結合性構築物製剤を投与するために用いることができる（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、化合物の発現が可能な組換え細胞中でのカプセル化、レセプター媒介エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照されたい）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築など）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。化合物または組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜、及び腸粘膜など）を通しての吸収により）投与してもよく、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与してもよい。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、ある実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物または組成物を、脳室内注射及び髄腔内注射を含む任意の適切な経路により中枢神経系に導入することが望ましい。脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバなどのリザーバに取り付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る。例えば、吸入器または噴霧器、及びエアゾール化剤を用いた製剤の使用により、肺投与も使用することができる。
【０３１３】
特定の実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物または組成物を、処置の必要な領域に局所的に投与することが望ましい；これは、制限する目的ではないが、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯と組み合わせること）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラント（このインプラントは、シアラスティック膜などの膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料である）により達成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する際、タンパク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない。
【０３１４】
別の実施形態において、抗原結合性構築物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中へ送達することができる（Ｌａｎｇｅｒ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３ （１９９０）；Ｔｒｅａｔら， Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ， Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（編）， Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書３１７〜３２７頁を参照されたい；広く同書を参照されたい）。
【０３１５】
さらに別の実施形態において、抗原結合性構築物または組成物は、制御された放出系において送達することができる。一実施形態において、ポンプを用いてもよい（Ｌａｎｇｅｒ，（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ， ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｆ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇ． １４：２０１ （１９８７）； Ｂｕｃｈｗａｌｄら， Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７ （１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２１：５７４ （１９８９）を参照されたい）。別の実施形態において、高分子材料を用いることができる（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（編）， ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌａ （１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ， Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ， Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（編）， Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ， Ｊ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｓｃｉ． Ｒｅｖ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２３：６１ （１９８３）を参照されたい；Ｌｅｖｙら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０ （１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら， Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２５：３５１ （１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． ７１：１０５ （１９８９）も参照されたい）。さらに別の実施形態において、制御された放出系は、治療標的、例えば、脳の近くに置くことができるため、全身用量の一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ， Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出）， 第二巻， １１５〜１３８頁 （１９８４）を参照されたい）。
【０３１６】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載の１アーム一価抗原結合性構築物は、非重複結合標的エピトープを有する他の１アーム一価または多価抗体と併用して投与される。
【０３１７】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする患者に提供することを含む、免疫系障害を処置する方法である。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の一価抗原結合性構築物の有効量を含む組成物を腫瘍に接触させることを含む、該腫瘍の成長を阻害する方法である。本明細書に記載の一価抗原結合性構築物の有効量を含む組成物を腫瘍に接触させることを含む、該腫瘍を縮小させる方法を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の一価抗原結合性構築物の有効量を含む組成物に抗原に接触させることを含む、該抗原分子の多量体化を阻害する方法である。本明細書で提供されるのは、抗原に結合させるのに十分な一価抗原結合性構築物の量を含む組成物に抗原に接触させることを含む、該抗原のその同族の結合パートナーへの結合を阻害する方法である。
【０３１８】
本明細書で提供されるのは、抗原に一価的に結合する抗原結合性ポリペプチド構築物と；二量体Ｆｃドメインとを含む一価抗原結合性構築物を標的細胞に提供することを含む、少なくとも１つの標的細胞中の抗体濃度を増加させる方法であり；前記一価抗原結合性構築物は、２つの抗原結合領域を有する対応する二価抗原結合性構築物と比較して、前記抗原を示している標的細胞への結合密度及びＢｍａｘ（最大結合量）の増加を示し、前記一価抗原結合性構築物は、対応する二価抗原結合性構築物に比較してより良い治療効果を示し、前記効果は、抗原の架橋、抗原二量体化、抗原調節の防止、または抗原活性化の防止に起因しない。
【０３１９】
本明細書で提供されるのは、抗原に一価的に結合する抗原結合性ポリペプチド構築物と；ＣＨ３ドメインを含む二量体Ｆｃポリペプチド構築物とを含む単離された一価抗原結合性構築物であり；前記一価抗原結合性構築物は、２つの抗原結合領域を有する対応する二価抗原結合性構築物と比較して、前記抗原を示している標的細胞への結合密度及びＢｍａｘ（最大結合量）の増加を示し、前記一価抗原結合性構築物は、対応する二価抗原結合性構築物に比較してより良い治療効果を示し、前記効果は、抗原の架橋、抗原二量体化、抗原調節の防止、または抗原活性化の防止に起因しない。
【０３２０】
本明細書で提供されるのは、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２に一価的に結合する抗原結合性ポリペプチド構築物と；ＣＨ３ドメインを含む二量体Ｆｃポリペプチド構築物とを含む、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２に結合する単離された一価抗原結合性構築物であり；前記抗原結合性構築物は、標的細胞によって内部移行され、前記構築物は、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２に二価的に結合する対応する二価抗原結合性構築物と比較して、標的細胞上に表示されたＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２への結合密度及びＢｍａｘ（最大結合量）の増加を示し、前記構築物は、前記対応する二価ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２結合抗原結合性構築物と比較して、より高いＡＤＣＣ、より高いＡＤＣＰ、及びより高いＣＤＣのうちの少なくとも１つを示す。
【０３２１】
また、提供されるのは、本明細書に提供される一価抗原結合性構築物に抗原を結合させることで、抗原細胞外ドメインタンパク質分解切断を防止する方法である。
【０３２２】
癌の処置
本明細書で提供されるのは、癌を処置するための医薬の製造のための本明細書に記載の一価抗原結合性構築物の使用である。また、提供されるのは、免疫系障害のための医薬の製造のための本明細書に記載の一価抗原結合性構築物の使用である。ある特定の実施形態において、腫瘍の成長を阻害するための医薬の製造のための本明細書に記載の一価抗原結合性構築物の使用である。ある特定の実施形態において、腫瘍を縮小させるための医薬の製造のための本明細書に記載の一価抗原結合性構築物の使用である。
【０３２３】
本明細書で提供されるのは、癌を処置するための医薬の製造のための本明細書に記載の一価ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２結合抗原結合性構築物の使用である。ある特定の実施形態において、癌は、低ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２を発現する癌である。ある特定の実施形態において、癌は、二価ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２抗体での処置に耐性がある。本明細書で提供されるのは、トラスツズマブでの処置に耐性がある癌を処置するための医薬の製造のための本明細書に記載の一価ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２結合抗原結合性構築物の使用である。
【０３２４】
一実施形態において、本明細書に記載の一価抗原結合性構築物は、癌の処置に使用される。一実施形態において、本明細書に記載のＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２結合ポリペプチド構築物を含む一価抗原結合性構築物は、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ機能不全（ＨＥＲ１機能不全、ＨＥＲ２機能不全、ＨＥＲ３機能不全、及び／またはＨＥＲ４機能不全を含む）と関連する癌または任意の増殖性疾患の処置に有用である。ある特定の実施形態において、癌は、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、ＫＲＡＳ突然変異陽性の癌、胃癌、脳癌、肺癌、卵巣癌、上皮由来の癌、膀胱癌、頭部及び頸部癌、膵臓癌のうちの少なくとも１つであり、または癌腫の少なくとも１つの型である。
【０３２５】
一実施形態において、本明細書に記載のＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２結合一価抗原結合性構築物は、乳癌細胞の処置に使用される。ある特定の実施形態において、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２結合一価抗原結合性構築物は、癌を患っている個人に投与するための医薬組成物の調製に使用される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の少なくとも１つのＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２結合一価抗原結合性構築物の有効量を個人に提供することによる前記個人における癌の処置である。
【０３２６】
一実施形態において、本明細書に記載のＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２結合一価抗原結合性構築物は、現在の治療に部分的に反応する患者の処置に使用される。一実施形態において、本明細書に記載のＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２結合一価抗原結合性構築物は、現在の治療に耐性がある患者の処置に使用される。別の実施形態において、本明細書に記載のＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２結合一価抗原結合性構築物は、現在の治療に耐性を生じつつある患者の処置に使用される。
【０３２７】
一実施形態において、本明細書に記載のＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２結合一価抗原結合性構築物は、現在の治療に反応しない患者の処置に有用である。ある特定の実施形態において、これらの患者は、トリプルネガティブ癌を患っている。いくつかの実施形態において、トリプルネガティブ癌は、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、及びＨｅｒ２の遺伝子の発現が低いか疎かにしている乳癌である。特定の他の実施形態において、本明細書に記載のＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２結合一価抗原結合性構築物は、現在の治療に反応しない患者に、必要に応じて、１つまたは複数の現在の抗ＨＥＲ２治療と併用して提供される。いくつかの実施形態において、現在の抗ＨＥＲ２治療は、抗ＨＥＲ２または抗ＨＥＲ３単一特異性二価抗体、トラスツズマブ、ペルツズマブ、Ｔ−ＤＭ１、二重特異性ＨＥＲ２／ＨＥＲ３  ｓｃＦｖ、またはその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、一価本明細書に記載の抗原結合性構築物は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、Ｔ−ＤＭ１、抗ＨＥＲ２、または抗ＨＥＲ３に反応しない患者を処置するために単独または併用して使用する。
【０３２８】
一実施形態において、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２に結合する抗原結合性ポリペプチド構築物を含むＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２結合一価抗原結合性構築物は、転移性乳癌を有する患者の処置に使用することができる。一実施形態において、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２結合一価抗体は、局所進行または進行した転移性癌を有する患者の処置に有用である。一実施形態において、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２結合一価抗体は、難治性癌を有する患者の処置に有用である。一実施形態において、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２結合一価抗体は、先に行われた抗ＨＥＲ２治療で患者が改善している場合に、転移性癌の処置のために前記患者に提供する。一実施形態において、本明細書に記載のＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２結合一価抗体は、トリプルネガティブ乳癌を有する患者の処置に使用することができる。一実施形態において、本明細書に記載のＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２結合一価抗体は、進行した難治性のＨＥＲ２増幅されたヘレグリン陽性癌を有する患者の処置に使用される。
【０３２９】
ＥＧＦＲを発現する癌のいくつかの型において、例えば、二価抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブを用いた非小細胞肺癌治療は、ＥＧＦＲ発現レベルが高い場合、癌に対してより効果的である（Ｐｉｒｋｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ １３：３３−４２ （２１０２））。細胞のＥＧＦＲ発現レベルを決定し、腫瘍中のＥＧＦＲ発現レベルを決定する方法は、当該技術分野で知られており、市販のキット、例えば、ＤＡＫＯ ｐｈａｒｍＤＸキット（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）は、この目的のために利用可能である。腫瘍は、試料中の個々の腫瘍細胞の膜染色強度（１＋〜３＋の尺度で）と、各強度での試料染色における腫瘍細胞画分とについて点数をつけてもよい。膜染色は、以下のように格付けした：０＝無染色；１＋＝高倍率でのみ目視可能な弱染色；２＋＝１＋〜３＋の間；３＋＝低倍率で目視可能な暗い線形膜染色。Ｐｉｒｋｅｒらは、染色の強度を腫瘍試料の染色頻度と一体化させた研究で報告している。腫瘍試料ごとに１〜３００の縮尺の免疫化学（ＩＨＣ）スコアを、最大スコアを３００（３＋の細胞染色率１００％に対して）として、式：１×（１＋の細胞染色率）＋２×（２＋の細胞染色率）＋３×（３＋の細胞染色率）を用いて算出した。２００以上のＩＨＣスコアを有する腫瘍は、高ＥＧＦＲ発現腫瘍であると見なされた。このスコアリング法は、その後の研究で再現性が高いことが示された（Ｒｕｓｃｈｏｆｆら、Ａｒｃｈ Ｐａｔｈｏｌ Ｌａｂ Ｍｅｄ １３７：１２５５−１２６１ （２０１３））。
【０３３０】
また、本明細書で開示されるのは、腫瘍を、リンカーを伴ってまたは伴わずに、ヘテロ二量体Ｆｃに結合した重鎖可変ドメインを含む少なくとも１つの抗原結合性ポリペプチドを含む単離された一価ＥＧＦＲ−結合性構築物の有効量で接触させることを含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を発現する腫瘍を有する対象を処置する方法であって、抗原結合性ポリペプチドは、ＥＧＦＲに特異的に結合する方法である。いくつかの態様において、構築物は、ＥＧＦＲに特異的に結合する対応する単離された単一特異性二価抗原結合性構築物と比較して、Ｂｍａｘがより大きいＥＧＦＲに結合する。
【０３３１】
ある態様において、本明細書に開示の方法で処置される腫瘍は、低レベルのＥＧＦＲを発現する。ある態様において、腫瘍は、対照腫瘍に対して低レベルのＥＧＦＲを発現する。いくつかの態様において、腫瘍は、Ａ４３１、Ａ５４９、ＢＴ４７４、ＣＡＣＯ２、ＨＡＣＡＴ、ＨＣＴ１１６、ＪＩＭＴ１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＫＯＶ３、ＭＣＦ７、またはＳＫＢＲ３の１つまたはそれ以上の細胞株の細胞表面ＥＧＦＲの第二レベルと等しいかまたはそれ未満である第一レベルの細胞表面ＥＧＦＲを発現する。さらなる詳細については以下の表ＡＡを参照されたい。ある態様において、腫瘍は、細胞１つ当たり約３．５×１０６個未満の中央値でＥＧＦＲを発現する。ある態様において、腫瘍は、細胞１つ当たり約２．８×１０６個未満の中央値でＥＧＦＲを発現する。ある態様において、腫瘍は、細胞１つ当たり約１．２×１０６個未満の中央値でＥＧＦＲを発現する。ある態様において、腫瘍は、細胞１つ当たり約２．４×１０５個未満の中央値でＥＧＦＲを発現する。ある態様において、腫瘍は、細胞１つ当たり約２．６×１０５個未満の中央値でＥＧＦＲを発現する。ある態様において、腫瘍は、細胞１つ当たり約４．２×１０５個未満の中央値でＥＧＦＲを発現する。ある態様において、腫瘍の試料は、免疫組織化学染色を用いて評価した場合、３＋未満の中央値レベルでＥＧＦＲを発現する。ある態様において、腫瘍の試料は、免疫組織化学染色を用いて評価した場合、２＋未満の中央値レベルでＥＧＦＲを発現する。ある態様において、腫瘍の試料は、免疫組織化学染色を用いて評価した場合、１＋未満の中央値レベルでＥＧＦＲを発現する。ある態様において、腫瘍は、Ｐｉｒｋｅｒらに記載の方法で評価した場合、３００未満のレベルでＥＧＦＲを発現する。ある態様において、腫瘍は、Ｐｉｒｋｅｒらに記載の方法で評価した場合、２００未満のレベルでＥＧＦＲを発現する。ある態様において、腫瘍は、Ｐｉｒｋｅｒらに記載の方法で評価した場合、１００未満のレベルでＥＧＦＲを発現する。
【０３３２】
ある態様において、本明細書に開示の方法で処置され、かつ、本明細書に開示の単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物の固定用量を投与された対象には、ＥＧＦＲに特異的に結合する対応する単離された単一特異性二価抗原結合性構築物の固定用量で処置した対象と比較して、処置からの皮膚毒性が少ない。
【０３３３】
ある態様において、対象は、本明細書に開示の方法で処置され、かつ、本明細書に開示の単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物の固定用量を投与される、ここで、処置後、ＥＧＦＲに特異的に結合する対応する単離された単一特異性二価抗原結合性構築物の固定用量で処置した対象と比較して、対象のケラチノサイトの成長は減少する。
【０３３４】
ある態様において、単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物で処置されているＥＧＦＲ発現腫瘍は、表皮細胞由来の癌、肺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、乳管癌、膵臓癌、頭部及び頸部癌、胃癌、卵巣癌、ＨＥＲ２＋陽性癌、または大腸癌である。ある態様において、癌は、ＫＲＡＳ突然変異陽性である。ある態様において、単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物は、アフコシル化される。いくつかの態様において、処置の結果は、腫瘍を縮小させること、腫瘍の成長を阻害すること、腫瘍の無増悪期間を増すこと、対象の無病生存を延ばすこと、または対象の生存を増すことである。
【０３３５】
本発明によってまた提供されるのは、癌の処置のための他の公知の治療と併用して投与されるＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２結合一価抗原結合性構築物である。この実施形態によれば、一価抗原結合性構築物を、他の一価抗原結合性構築物または非重複結合標的エピトープを有する多価抗体と併用して投与し、Ｂｍａｘ及び抗体依存性細胞傷害性活性をＦＳＡを超えて著しく増加することができる。例えば、本発明による一価ＥＧＦＲ結合性構築物は、１）ＯＡ−ＴｒａｓまたはＯＡ−Ｐｅｒｔなどの１つまたは複数の一価ＨＥＲ２結合性構築物と併用して、または２）ペルツズマブまたはトラスツズマブなどの１つまたは複数の二価ＨＥＲ２結合性構築物と併用して、または３）同じ標的細胞上の同じかつ異なる表面抗原に向けられた非競合抗体と複数回併用して投与することができる。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の一価抗原結合性構築物は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）、ＴＤＭ１、アフコシル化抗体、ＤＭ１またはＰｅｒｊｅｔａ（商標）などの毒素にコンジュゲートした抗体から選択される治療と併用して投与される。
【０３３６】
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の医薬組成物の有効量をそれを必要とする患者に提供することを含む、癌を処置する方法である。一実施形態において、処置される疾患は、癌である。別の実施形態において、処置される癌は、乳癌であり、例えば、乳癌細胞は、ＨＥＲ２タンパク質を高密度、中密度、または低密度で発現する。以下の表Ａ６は、いくつかの代表的な乳癌細胞株におけるＨＥＲ２の発現レベルを記載している（Ｓｕｂｉｋら、（２０１０） Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ：Ｂａｓｉｃ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：４；３５−４１；Ｐｒａｎｇら、（２００５） Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：９２；３４２−３４９）。表に示すように、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、低ＨＥＲ２発現細胞であると考えられ；ＳＫＯＶ３細胞は、中ＨＥＲ２発現細胞であると考えられ、及びＳＫＢＲ３細胞は、高ＨＥＲ２発現細胞であると考えられる。
【０３３７】
（表Ａ６）
2016538283.tif 000010
【０３３８】
遺伝子治療：
特定の実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物をコードする配列を含む核酸を投与して、遺伝子治療によって、タンパク質の異常発現及び／または異常活性と関連する疾患または障害を処置、抑制、または予防する。遺伝子治療とは、発現核酸または発現可能な核酸を対象に投与することで行われる治療を指す。本発明のこの実施形態において、核酸は、治療効果を媒介する核酸コードタンパク質を産生する。当該技術分野において利用可能な任意の遺伝子治療法を使用することができる。
【０３３９】
本明細書に記載の抗原結合性構築物をコードする核酸を含む特定の実施形態において、核酸は、その核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、それを細胞内に入るように、例えば、レトロウイルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号を参照されたい）によって、または直接注入によって、または微粒子ボンバードメント（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ， Ｄｕｐｏｎｔ）、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクト剤を用いたコーティングを用いて、または核内に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドと連結させて投与することによって（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８：１８６４−１８６８ （１９９１）を参照されたい）、その他で投与することによって、それがコードするタンパク質の発現を促進するためにインビボで投与することができる。あるいは、核酸を細胞内に導入し、相同組換えによって発現のために宿主細胞のＤＮＡ中に組み込むことができる。
【０３４０】
様々な刊行物を本明細書で引用し、これらの開示は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３４１】
参考文献：
2016538283.tif 000011
2016538283.tif 000012
【実施例】
【０３４２】
以下は、本発明を実施するための具体的な実施形態の実施例である。実施例は、単にあくまで例示を目的としたものであり、本発明の範囲をいかようにも限定しようとするものではない。使用された数字（例えば、量、温度など）に関して精度を保証するための努力はなされたが、それに対するいくつかの実験誤差または偏差は、当然許容されるべきである。
【０３４３】
本発明の実施には、他に特に規定がなければ、当該技術分野内のタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術、及び薬理学の慣用的方法を用いるであろう。そのような技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ （Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９３）； Ａ．Ｌ． Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）； Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （第２版，１９８９）； Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ｓ． Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ． Ｋａｐｌａｎ編， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）； Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ： Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９０）； Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｃｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第３版（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ） Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照されたい。
【０３４４】
表ＡＡは、本明細書に示す具体的な実施形態の実施例で使用した細胞株のリストを提供する。
【０３４５】
（表ＡＡ）ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２発現の起源及びレベルを示す実施例で使用した細胞株
2016538283.tif 000013
＊発現レベルは、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔに記載されている基準に従って、報告されている免疫組織学的染色（利用可能な場合）からの結果に基づくものである。細胞１つ当たり受容体数についての参照は、ＭｃＤｏｎａｇｈら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ． ２０１２ Ｍａｒ；１１（３）：５８２−９３， Ｓｕｂｉｋら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ （Ａｕｃｋｌ）． ２０１０ Ｍａｙ ２０；４：３５−４１， Ｋｕｒａｉら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００７；１３（５）： １５５２−６１， Ｇａｂｏｒｉｔら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０１１ Ａｐｒ １；２８６（１３）： １１３３７−４５， Ｓｐａｎｇｌｅｒら、ＰＮＡＳ ２０１０； １０７（３０）： １３２５２−１３２５７， Ａｎｉｄｏら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００３；９：１２７４−１２８３， Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２３０ （２００５） ３３−４６， Ｂｕｎｎら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００１；７：３２３９−３２５０， Ｘｕら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２００５；４：４３５−４４２， Ｒａｏら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ （２０１２） ３１， ２８８８−２８９８， Ｄｒａｇｏｗｓｋａら、ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ ２０１１， １１：４２０， Ｔａｎｎｅｒら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２００４；３：１５８５−１５９２ ａｎｄ Ｎｅｖｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２００６ Ｄｅｃ； １０（６）：５１５−２７に報告されている。受容体数のいくつかの軽微な変化は、測定用に用いた方法に応じて観察されている。
【０３４６】
実施例１−例示的なＯＡ−ＥＧＦＲ抗体と対照の調製
表１は、調製されたＯＡ−ＥＧＦＲ抗体及び対照の同定を提供する。
【０３４７】
（表１）ＯＡ−ＥＧＦＲ抗体及び対照のリスト
2016538283.tif 000014
【０３４８】
ｈＩｇＧ１（Ｃａｔ番号００９−０００−００３）は、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）から購入した。
【０３４９】
Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）（トラスツズマブ）は、Ｒｏｃｈｅから購入した。トラスツズマブは、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン４（ＥＣＤ４）に結合する。
【０３５０】
Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）（セツキシマブ）は、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂから購入した。セツキシマブは、ＥＧＦＲのＥＣＤ３に結合する。
【０３５１】
ＦＳＡ−Ｔｒａｓ（ｖ５０６）は、対照としてＣＨＯ細胞中でインハウス産生した野生型トラスツズマブである。両方のＦａｂ ＨＥＲ２結合ドメインは、トラスツズマブと同じであり、Ｆｃは、野生型ホモ二量体であり；抗原結合性ドメインのエピトープは、ＨＥＲ２のドメイン４である。
【０３５２】
ＯＡ−Ｔｒａｓ（ｖ１０４０）は、一価抗ＨＥＲ２抗体であり、ここで、ＨＥＲ２結合ドメインは、鎖Ａ上のＦａｂであり、Ｆｃ領域は、鎖Ａ中に突然変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ（ＥＵナンバリング）、鎖Ｂ中にＴ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ（ＥＵナンバリング）を有するヘテロ二量体であり；抗原結合性ドメインのエピトープは、ＨＥＲ２のドメイン４である。
【０３５３】
ＯＡ−Ｐｅｒｔ（ｖ４１８２）は、一価抗ＨＥＲ２抗体であり、ここで、ＨＥＲ２結合ドメインは、鎖Ａ上のＦａｂであり、Ｆｃ領域は、鎖Ａ中に突然変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、鎖Ｂ中にＴ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを有するヘテロ二量体である。抗原結合性ドメインのエピトープは、ＨＥＲ２のドメイン２である。
【０３５４】
ＯＡ−ＣＴＸ（ｖ４３５３）は、ヘテロ二量体ＩｇＧ１  Ｆｃを有する一価抗ＥＧＦＲ抗体である。Ｆａｂ（そのタンパク質配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号１ＹＹ８＿Ｂ及び１ＹＹ８＿Ａ（それぞれ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／６６３６１２４８及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／６６３６１２４７；２０１４年１１月１０日にアクセス）から得られた）を、Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを含む重鎖Ａと、及びＴ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを有するＦｃ断片に対応する重鎖Ｂとの上に載置する。抗原結合性ドメインにより認識されるエピトープは、ＥＧＦＲのドメイン３である。その分子は、ＥＧＦＲのリガンド依存性活性化及びリガンド非依存性活性化の両方を防止することが可能であるという点で、セツキシマブなどを中和することも考えられる（Ｆｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ． ２００５ Ａｐｒ；７（４）：３０１−１１）。
【０３５５】
ＯＡ−ＥＧ２（ｖ１３２３）は、ヘテロ二量体ＩｇＧ１ Ｆｃ上の単一ドメイン抗体ＥＧ２（Ｂｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｆｅｔｔ． ２０１０ Ｍａｒ １；２８９（１）：８１−９０）の１アーム抗体である。Ｆａｂを、Ｔ３５０Ｖ＿Ｆ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを含む重鎖Ａと、及びＴ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｆ＿Ｋ３９２Ｆ＿Ｔ３９４Ｗを有するＦｃ断片に対応する重鎖Ｂとの上に載置する。ＯＡ−ＥＧ２は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合し、ＥＧＦＲ結合のためのセツキシマブまたはＥＧＦと競合しない。
【０３５６】
ＯＡ−ＣＴＸ−アフコは、ＯＡ−ＣＴＸのアフコシル化形態である（実施例９を参照）。
【０３５７】
ＯＡ−ＣＴＸ−アフコ−ＡＤＣは、ＤＭ１にコンジュゲートされているＯＡ−ＣＴＸのアフコシル化形態である（実施例１０を参照）。
【０３５８】
配列を表Ｂに提供する。
【０３５９】
（表Ｂ）配列
2016538283.tif 000015
2016538283.tif 000016
2016538283.tif 000017
2016538283.tif 000018
2016538283.tif 000019
2016538283.tif 000020
2016538283.tif 000021
2016538283.tif 000022
シグナルペプチドを除いた最終発現配列
【０３６０】
実施例２：ＯＡ−ＥＧＦＲ抗体及び対照の発現及び精製
実施例１に記載のＯＡ−ＥＧＦＲ抗体及び対照を発現し、以下のように５０ｍＬ培養物中で精製した。
【０３６１】
抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を、ヒト／哺乳類発現用に最適化したコドンを用いて、遺伝子合成を介して構築した。最終遺伝子産物を哺乳類発現ベクターｐＴＴ５（ＮＲＣ−ＢＲＩ、Ｃａｎａｄａ）中にサブクローニングし、ＣＨＯ細胞中で発現した（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ， Ｙ．， Ｐｅｒｒｅｔ， Ｓ． ＆ Ｋａｍｅｎ， Ａ． Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ａｎｄ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｇｒｏｗｉｎｇ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０， Ｅ９ （２００２））。抗体構築物の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子のＤＮＡは、標準分子生物学ＤＮＡ組換え技術を用いてクローニングしたｖ１３２３以外は全て遺伝子合成によって生成した。
【０３６２】
対数増殖期（１５０〜２００万細胞／ｍＬ）にあるＣＨＯ細胞を、水性１ｍｇ／ｍＬ ２５ｋＤａポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、２．５：１のＰＥＩ：ＤＮＡ比でトランスフェクトした（Ｒａｙｍｏｎｄ Ｃ．ら、Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ａｎｄ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． ５５（１）：４４−５１ （２０１１））。Ｆｃヘテロ二量体を形成するための最適濃度範囲を決定するために、重鎖Ａ（ＨＣ−Ａ）、軽鎖（ＬＣ）、及び重鎖Ｂ（ＨＣ−Ｂ）のＤＮＡを、最初に異なる比でトランスフェクトした。ｖ４３５３の最適なＨＣ：Ｆｃ：ＬＣ ＤＮＡ比は、３６：２４：４０であった。ｖ１３２３の最適なＨＣ：Ｆｃ ＤＮＡ比は、６０：４０であった。培地を４０００ｒｐｍで遠心分離後に収集し、０．４５μｍフィルターを用いて浄化した５〜６日後にトランスフェクト細胞を収穫した。
【０３６３】
浄化培地をＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）プロテインＡカラム上に載置し、ｐＨ７．２の１０カラム体積のＰＢＳ緩衝液で洗浄した。抗体をｐＨ３．６の１０カラム体積のクエン酸緩衝液で溶出し、抗体を含むプール画分をｐＨ１１のＴＲＩＳで中和した。次いで、Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ １０ＤＧカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてタンパク質を脱塩した。
【０３６４】
タンパク質をゲル濾過によってさらに精製し、３．５ｍｇの抗体混合物を１．５ｍＬに濃縮し、１ｍＬ／分の流速でＡＫＴＡ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＦＰＬＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を介してＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨｉＬｏａｄ １６／６００ ２００ｐｇカラム上に載置した。ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を１ｍＬ／分の流速で用いた。精製抗体に対応する画分を収集し、〜１ｍｇ／ｍＬに濃縮し、−８０℃で保存した。
【０３６５】
図１Ａは、保持が７９．９５で主ピークの、プロテインＡ精製後のｖ４３５３のＳＥＣプロファイルを示す。図１Ｂは、保持が８４．７４で主ピークの、プロテインＡ精製後のｖ１３２３のＳＥＣプロファイルを示す。図１Ｃは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により種がそれぞれおよそ１１０ｋＤａ及び６６ｋＤａと測定した際の、プロテインＡ及びＳＥＣ精製後のｖ４３５３及びｖ１３２３両方の純度を示す。
【０３６６】
以下の表２は、精製プロセスを介した抗体の収率の概要を提供する。
【０３６７】
（表２）
2016538283.tif 000023
【０３６８】
最適化したＤＮＡ比を用いて発現させた場合、例示的な１アーム抗体ｖ４３５３及びｖ１３２３は、プロテインＡ精製工程後のＳＥＣクロマトグラムで見られるように、相当量のホモ二量体汚染物質または高分子量凝集体を示さなかった（図１Ａ及び１Ｂ）。プールＳＥＣ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、高レベル純度のヘテロ二量体Ｆｃを示した（図１Ｃ）。純度は９５％を超えることが、ＵＰＬＣ ＳＥＣ及び質量分析によってさらに確認された。
【０３６９】
Ｖ４３５３は、問題なく最大１０Ｌ産生までスケールアップし、プロテインＡ及びＳＥＣ精製後に最大９７．５ｍｇ／Ｌの力価が得られた。
【０３７０】
実施例３：ＥＧＦＲに特異的に結合するＯＡ−ＥＧＦＲ抗体
２つの例示的なＯＡ−ＥＧＦＲ抗体ｖ４３５３及びｖ１３２３がＥＧＦＲに特異的に結合する能力を評価するために、この実験を行った。ＥＧＦＲへの特異的結合は、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた以下に記載の方法に従って、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて測定した。
【０３７１】
抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ番号１０９−００５−０９８）は、一級アミン基を介してＳｅｒｉｅｓ ＳセンサーチップＣＭ５（Ｃａｔ番号ＢＲ−１００５−３０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に共有結合した。まず、チップをＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）で１０μｌ／分の流速で５分間平衡化した。次いで、１０μｌ／分の流速で７分間、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）とＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）の１：１混合物を注入することで、チップを活性化した。その後、捕捉抗体を１０μｌ／分の流速で７分間注入し、最後に、エタノールアミンを１０μｌ／分の流速で７分間注入することで、過剰な反応性基を失活させた。
【０３７２】
抗体抗原結合は、以下のように試験した。まず、チップ表面を３回の同一分析サイクルのＨＢＳ−ＥＰランニング緩衝液で安定化させた。試料抗体を、１００ｎＭで捕捉するために、１０μｌ／分で２０秒〜２分間注入し、約１００ＲＵ（反応単位）の捕捉レベルを達成した。次いで、ランニング緩衝液を用いてチップを平衡化した。次いで、抗原（ＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＥＧＦＲ ＥＣＤ）を、３０μｌ／分の流速で３〜４分にわたって、抗体結合を測定するために濃度を増しながら（例えば、１、３、９、２７〜８１ｎＭ）注入した。その後、解離工程を行い、抗原が完全に解離するまで、ランニング緩衝液を３０μｌ／分で約２０分間流した。その表面を、毎回１０μｌ／分の流速で０．５分間流したランニング緩衝液で２回再生した後、１０μｌ／分で０．２５分間流した６回の再生緩衝液（グリシン−ＨＣＬ ｐＨ１．７）注入サイクルを行った。これは、一連の結合センサーグラムが完了するまで、次に高い抗原濃度を用いて繰り返した。
【０３７３】
結果を図２Ａ〜２Ｄに示す。図２Ｂ及び２Ｄでは、ＨＥＲ２結合の不在が確認され、ここで、小区分「ａ」は、抗体捕捉のセンサーグラムに対応し、小区分「ｂ」は、ＨＥＲ２注入後のセンサーグラムに対応する。
【０３７４】
ＯＡ−ＥＧＦＲ抗体に対するＥＧＦＲ結合特性の概要を表３に示す。
【０３７５】
（表３）
2016538283.tif 000024
【０３７６】
ＥＧＦＲへのＯＡ−ＣＴＸの結合は、約０．８５ｎＭのＫＤでＳＰＲにより定量化した（図２Ａ）。これは、一価結合相互作用を特徴付ける抗体捕捉プロトコルを用いた類似のＳＰＲ実験によって決定されたセツキシマブ（１ｎＭ）について報告されたＫＤに匹敵する。ＨＥＲ２への結合は観察されなかった。ＥＧＦＲへのＯＡ−ＥＧ２の結合は、約１２ｎＭのＫＤでも決定した。ＯＡ−ＥＧ２の結合は、ＥＧＦＲにも特異的であった。一緒にすると、これらの結果は、１アーム抗体が、設計によりＥＧＦＲの異なるエピトープに結合することができ、かつ、異なるエピトープが得られる対応する二価抗体と比較して同じ一価結合親和性を保持することができることを示すものである。
【０３７７】
実施例４：例示的なＯＡ−ＥＧＦＲ抗体が低レベルのＥＧＦＲ（低ＥＧＦＲ）を発現する細胞に結合する能力
この実験は、ＯＡ−ＥＧＦＲ抗体が、低レベルのＥＧＦＲを発現する細胞株であるＢＴ−４７４乳癌細胞株に結合することを評価するために行った（ＭｃＤｏｎａｇｈら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ． ２０１２ Ｍａｒ；１１（３）：５８２−９３）。実験は、以下に記載のように行った。
【０３７８】
ＢＴ−４７４細胞を種々の濃度の抗体（０．３ｐＭ〜３００ｎＭの幾何学的に分布させた８つの濃度点）で４℃で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣを過剰に添加した。細胞を暗中で４℃にて１時間さらにインキュベートし、ＰＢＳで再び３回洗浄した。最後に、細胞をＰＢＳ中に再懸濁させ、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＭＦＩを測定した。
【０３７９】
結果を図３に示す。表４Ａは、ＢＴ−４７４上の細胞結合データの概要を提供する。
【０３８０】
（表４Ａ）
2016538283.tif 000025
【０３８１】
１アーム抗体は、飽和濃度に向かって対応する二価抗体よりも高いＢｍａｘを示したことが、ＦＡＣＳ結合結果より示された。ＯＡ−ＣＴＸは、ＯＡ−ＥＧ２よりも高いＢｍａｘを示し、これは、ＥＧＦＲへの異なる結合速度及び解離速度によって説明することができるだろう。
【０３８２】
実施例５：例示的なＯＡ−ＥＧＦＲ抗体がＥＧＦＲを発現するＡ４３１細胞の成長を阻害する能力の評価
この実験は、例示的なＯＡ−ＥＧＦＲ抗体が、高レベルのＥＧＦＲを発現する扁平上皮癌細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５５５）の成長を阻害する能力を決定するために行った。成長阻害アッセイは、以下に記載のように行った。
【０３８３】
５０００個のＡ４３１細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。抗体ＯＡ−ＣＴＸ  ｖ４３５３、ＯＡ−ＥＧ２  ｖ１３２３またはＥｒｂｉｔｕｘ（商標）を３通りに添加し、３００ｎＭ、３０ｎＭ、３ｎＭ、及び０．３ｎＭの最終濃度にした。成長培地の最終的なアッセイ容積は２００μＬであり、９６ウェルプレートを３７℃で５日間インキュベートした。培地をプレートから除去し、５０μＬのＰＢＳを各ウェルに添加した。その後、５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）反応混合物を各ウェルに添加し、プレートを１０分間インキュベートした。最後に、ＲＬＵ（相対発光量）値をＰｈｅｒａｓｔａｒプレートリーダーで読み取った。未処置対照に対する細胞成長率は、以下のように算出した：
細胞成長率（％）＝１００％×（ＲＬＵ試料）／（ＲＬＵ未処置）
【０３８４】
結果を図４に示す。ＯＡ−ＣＴＸは、飽和条件でＥｒｂｉｔｕｘ（商標）と同じ程度にＡ４３１の成長を阻害したが、ＯＡ−ＥＧ２は、Ａ４３１の成長を阻害しなかった。Ａ４３１細胞を発現する高ＥＧＦＲにおけるＥＧＦＲ依存性成長の阻害は、ＯＡ−ＣＴＸがＥＧＦを中和できることと、ＯＡ−ＥＧ２がＥＧＦを中和できないことと一致している。特異的活性は、ＯＡＡ（結合エピトープに依存する）が、細胞成長を推進するＥＧＦＲ構成的受容体シグナル伝達を遮断する異なる能力も反映している。
【０３８５】
実施例６：例示的なＯＡ−ＥＧＦＲ抗体がＡＤＣＣを仲介する能力
ＯＡ−ＥＧＦＲ抗体が乳管癌由来細胞株であるＢＴ−４７４中のＡＤＣＣを仲介する能力を測定した。ＡＤＣＣアッセイは、以下に記載のように行った。
【０３８６】
ＢＴ−４７４標的細胞（１０，０００個の細胞、５０μｌ）を９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、これに、異なる濃度の抗体を添加し、３ｐＭ〜３００ｎＭ（最終濃度）に幾何学的に分布させた。プレートを３０分間インキュベートした後、ＰＢＭＣエフェクター細胞を、エフェクター細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比が２５：１で添加した。細胞をクロス振動で穏やかに混合し、プレートを３７℃／５％ＣＯ２で６時間さらにインキュベートした。
【０３８７】
溶解細胞率は、ＬＤＨキット及びＦｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ ３を用いて上清中に放出されたＬＤＨの量を測定することで決定した。４９２ｎｍでの吸光度値は全て、６５０ｎｍでのものからバックグラウンド減算した。結果は以下に示すように算出し、用量反応曲線パラメーターをＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍに適合させた：
細胞溶解率（％）＝１００％×（ＯＤ試料−ＯＤ非特異的）／（ＯＤｍａｘ−ＯＤｍｉｎ）
【０３８８】
ここで、ＯＤ試料は、試料のバックグラウンド減算値に対応し；ＯＤ非特異的は、他の処置なしで、標的細胞をエフェクター細胞でインキュベートした場合のＬＤＨアッセイでの読み出しに対応し；ＯＤｍａｘは、標的溶解細胞の最大量に対応する。この読み出しは、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を、標的細胞に添加することで生成し、その標的細胞は、エフェクター細胞ではなく抗体でインキュベートし；ＯＤｍｉｎは、標的溶解細胞の最小量に対応する。その標的細胞は、エフェクター細胞及び抗体がないアッセイ緩衝液中でインキュベートした。
【０３８９】
結果を図５に示す。ＯＡ−ＣＴＸ（ｖ４３５３）及びＯＡ−ＥＧ２（ｖ１３２３）は、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）と比較してより大きなＡＤＣＣ仲介細胞溶解を示した。
【０３９０】
表５は、ＢＴ−４７４細胞のＡＤＣＣ溶解の用量反応パラメーターの概要を提供する。
【０３９１】
（表５）
2016538283.tif 000026
＊試験した最も高い抗体濃度での溶解
【０３９２】
両方の例示的なＯＡ−ＥＧＦＲは、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）と比較してより高い標的細胞溶解率を示し、試験した最も高い抗体濃度で約２倍の差があった。この結果は、実施例４に示す対応するフルサイズ抗体を超えて、１アーム抗体で観察された細胞表面装飾のレベルが増したことに基づくと考えられた。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）も陽性対照として含まれ、かつ、ＢＴ−４７４は、ＥＧＦＲよりも１３倍も高いレベルでＨＥＲ２受容体を発現するが、ＯＡ−ＣＴＸ  ｖ４３５３及びＯＡ−ＥＧ２  ｖ１３２３の両方とも、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）と同様のＡＤＣＣ最大溶解率を達成することができた。１アーム抗体が、対応するフルサイズ抗体では達成できないより高いＡＤＣＣ溶解を達成することができたことを、これらの結果は示すものである。これは恐らく、受容体レベルが、通常、効率的なエフェクター仲介細胞死滅を誘発するのに十分ではない場合に特に重要となるであろう。さらに、１アーム抗体により仲介されたＡＤＣＣのレベルは、細胞表面上で著しく高いレベルで発現される異なる受容体を標的にするフルサイズ抗体により仲介されたものと一致してもよい。
【０３９３】
実施例７：例示的なＯＡ−ＥＧＦＲが内部移行され、表面ＥＧＦＲ発現を下方制御する能力
ｖ４３５３が内部移行され、表面ＥＧＦＲ発現を下方制御する能力は、トラスツズマブ耐性乳癌ＪＩＭＴ１細胞（高レベルのＥＧＦＲを発現する）中で測定した。
【０３９４】
この実験は、例示的な１アーム抗ＥＧＦＲ抗体がＥＧＦＲ発現細胞中で内部移行されるかどうかを決定し、ならびに抗ＨＥＲ２抗体との組み合わせの特性を特徴付けるために行った。直接細胞内部移行方法は、Ｓｃｈｍｉｄｔ， Ｍ．ら、Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｎｔｉ−ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ： ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｆｆｉｎｉｔｙ， ｂｉｖａｌｅｎｃｙ， ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ （２００８） ５７：１８７９−１８９０に詳述のプロトコルに従って行った。具体的には、抗体は、製造者の指示に従って、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８タンパク質標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ番号Ａ１０２３５）を用いて直接標識した。
【０３９５】
細胞内部移行アッセイにおいて、１２ウェルプレートに１×１０５個の細胞／ウェルで播種し、３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、標識抗体を２００ｎＭでＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中に添加し、３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。暗条件下で、培地を吸引し、ウェルを２×５００μＬ  ＰＢＳで洗浄した。細胞を収穫するため、細胞解離緩衝液（２５０μＬ）を３７℃で添加した。細胞をペレット状にし、ウサギＩｇＧ画分である抗Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ａ１１０９４、ロット１２１４７１１）を伴わずにまたは伴って１００μＬのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中に５０μｇ／ｍＬで再懸濁させ、氷上で３０分間インキュベートした。３００μＬのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを分析する前に、４μｌのヨウ化プロピジウムで濾過させた試料を添加した。ＬＳＲＩＩフローサイトメーターを用いて試料を分析した。
【０３９６】
下方制御アッセイにおいて、４℃でインキュベートした細胞に対する抗体の蛍光レベルも測定した。
【０３９７】
２０ｎＭでの細胞内部移行及び下方制御実験の結果を図６Ａに示す。１００ｎＭと２００ｎＭの組み合わせで測定した結果を図６Ｂに示す。組み合わせにおいて、フルオロフォアを運ぶ分子は、「＊」を付与する。１０４０＋４３５３＊の「表面４度（ｓｕｒｆａｃｅ  ４  ｄｅｇ）」に対する測定は、得られなかった。
【０３９８】
２０ｎＭで、ＯＡ−ＣＴＸ（ｖ４３５３）は、Ｅｒｂｉｔｕｘと比較して同程度まで内部移行され、ＯＡ−ＣＴＸ（ｖ４３５３）は、表面ＥＧＦＲを下方制御したが、Ｅｒｂｉｔｕｘほどではなかった。
【０３９９】
１００ｎＭで、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）は、ＦＳＡ−Ｔｒａｓ（ｖ５０６）の細胞内部移行もＨＥＲ２下方制御も促進させなかった。
【０４００】
２００ｎＭで、ＯＡ−ＣＴＸ  ｖ４３５３＋ＯＡ−Ｔｒａｓの併用において、ＯＡ−ＣＴＸは、ＯＡ−Ｔｒａｓの細胞内部移行にもＯＡ−Ｔｒａｓにより誘発されたＨＥＲ２受容体レベルにも影響を及ぼさず、ＯＡ−Ｔｒａｓ（ｖ１０４０）は、ＯＡ−ＣＴＸの細胞内部移行をわずかに減少させるが、ＥＧＦＲ受容体レベルは減少させないようであった。ＯＡ−ＣＴＸ  ｖ４３５３は、２０ｎＭで見られるように、それほどではないにせよ表面ＥＧＦＲを下方制御した。
【０４０１】
受容体下方制御及び細胞内部移行の程度は、異なる抗体濃度で試験した。２０ｎＭで、ＯＡ−ＣＴＸ  ｖ４３５３で試験した場合に５３％のＥＧＦＲが表面上に残っていたが、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）は、３６％でわずかに高いレベルの受容体下方制御を仲介した。しかしながら、両方の分子は、ほとんど同じ程度に内部移行された。２００ｎＭで試験したＯＡ−ＣＴＸと比較した場合、受容体下方制御及び細胞内部移行には濃度依存性が観察された点にも留意されたい。
【０４０２】
１００ｎＭで、ＦＳＡ−Ｔｒａｓ細胞内部移行へのＥｒｂｉｔｕｘ（商標）の影響を試験し、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）は、ＨＥＲ２細胞内部移行及びＦＳＡ−Ｔｒａｓの下方制御特性に影響を及ぼさないことが、結果により示された。
【０４０３】
２００ｎＭで、１アーム抗体の組み合わせの挙動について調査した。ここで、ＯＡ−ＣＴＸ  ｖ４３５３は、ＨＥＲ２細胞内部移行及びＯＡ−Ｔｒａｓ  ｖ１０４０により仲介された上方制御を変化させず、これは、フルサイズ対応物についての観察と一致していた。しかしながら、ＯＡ−Ｔｒａｓは、ＯＡ−ＣＴＸ  ｖ４３５３により仲介された細胞内部移行の量を１３００ＭＦＩから１０５０ＭＦＩにわずかに減少させるようであった。ＥＧＦＲ下方制御の程度は、組み合わせで減少したようであった。
【０４０４】
例示的な１アーム抗体の細胞内部移行プロファイルは、抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の適切な候補になり得ることを示している。
【０４０５】
実施例８：ＳＫＯＶ３異種移植モデルにおけるＯＡ−ＥＧＦＲとＯＡ−ＨＥＲ２抗体との組み合わせの抗腫瘍活性
この実験は、ＯＡ−ＥＧＦＲとＯＡ−ＨＥＲ２との組み合わせが、腫瘍容積を減少させ、細胞株由来の異種移植モデルの生存を増すことができるかどうかを決定するために行った。
【０４０６】
異種移植モデル由来のヒト卵巣細胞株であるＳＫＯＶ−３を用いて、腫瘍成長を抑制するための抗ＥＧＦＲ１アームモノクローナル抗体と組み合わせた抗ＨＥＲ２アーム抗体の抗腫瘍効果を、単一薬剤または併用して評価した。皮下組織に１ｍｍ３腫瘍断片の挿入を介して、雌のＦｏｘｌｎヌードマウスに腫瘍を接種した。２００ｍｍ３の容積に到達するまで、腫瘍測定を隔週で行った後；動物を３つの処置群に無作為化した。処置群は：
・群（ａ）非特異的ｈＩｇＧ対照、週２回投与した。
・群（ｂ）１アームトラスツズマブ（ＯＡ−Ｔｒａｓ；ｖ１０４０）、２１日間週２回投与した後、処置を２２日目に１アームトラスツズマブ＋１アームペルツズマブ（ＯＡ−Ｐｅｒｔ；ｖ４１８２）に変換した。
・群（ｃ）１アームトラスツズマブ＋１アームセツキシマブ（ＯＡ−ＣＴＸ；ｖ４３５３）、週２回投与した。
【０４０７】
処置群に、Ｔ０に１５ｍｇ／ｋｇの負荷用量と、最高で４週間の投与計画に従って１０ｍｇ／ｋｇの維持用量とを静脈内投与した。腫瘍容積は、処置期間中に隔週で、かつ、追跡期間中に週１回で腫瘍の直径を測定することで評価した。
【０４０８】
１１日目の血清濃度は、試験コホートについて決定した。群（ｂ）（ＯＡ−Ｔｒａｓ）において、平均血清濃度は、７０．９μｇ／ｍｌ（３５〜９５μｇ／ｍｌの範囲）であり、群（ｃ）（ＯＡ−Ｔｒａｓ＋ＯＡ−ＣＴＸ）において、全ての試験抗体の平均血清濃度は、１６５．６μｇ／ｍｌ（１００〜２８０μｇ／ｍｌの範囲）であった。
【０４０９】
群（ｃ）のＳＫＯＶ−３腫瘍担持マウスの処置は、群（ａ）と比較して腫瘍の成長を最も効率的に阻害した。
【０４１０】
腫瘍容積におけるＯＡ抗体の組み合わせの効果を図７に示す。
【０４１１】
表６は、選択したコホートで薬剤変換が起こった２２日目でのインビボ腫瘍成長阻害結果の概要を提供する。
【０４１２】
（表６）
2016538283.tif 000027
＊コホートにわたり同様のマウス体重。
＊＊ｘ＝ベースラインからのＴＶの％変化
【０４１３】
生存率におけるＯＡ抗体の組み合わせの効果を示す結果を図８に示す。
【０４１４】
ＳＫＯＶ３マウス異種移植モデルでは、ＯＡ−ＣＴＸ＋ＯＡ−Ｔｒａｓの組み合わせは、定着腫瘍の成長の阻害において最も高い有効性を実証した。統計的な有意性は、対照と他の処置群に関して２週間以内の処置で確立された（図７）。ＯＡ−Ｔｒａｓと比較して、ＯＡ−ＣＴＸの追加は、さらなる腫瘍成長阻害をもたらす。１アームペルツズマブの追加によりＯＡ−Ｔｒａｓコホートを組み合わせ群に変換した場合に、２つの抗ＨＥＲ２アーム抗体の組み合わせで間接比較を行い、その後腫瘍成長率は有意に減少しなかった。異なる受容体を標的にする１アーム抗体の組み合わせで処置した場合に、腫瘍成長阻害はより効果的であったことをデータは示唆している。同じ癌細胞株においてインビトロで観察された例示的な１アーム抗体の生物学的活性に基づいて、さらなる有効性は、さらなる細胞表面装飾からの抗体仲介エフェクター機能から生じると思われる。
【０４１５】
ＯＡ−ＣＴＸ＋ＯＡ−Ｔｒａｓの有効性も、生存率の代理読出しとして機能するターミナルエンドポイントとして２０００ｍｍ３の腫瘍容積を用いたカプランマイヤープロット（図８）から明らかであった。図８に示すように、ｈＩｇＧ対照群のマウスは、処置後３３日に一匹も生存しなかった。比較として、ＯＡ−Ｔｒａｓ／＋ＯＡ−Ｐｅｒｔ群におけるマウスの生存率は、６０日目に３３％未満に減少した。しかしながら、ＯＡ−ＣＴＸ＋ＯＡ−Ｔｒａｓ群では、全ての動物が生き続けており、１アーム抗体組み合わせの有効性がさらに実証された。
【０４１６】
全体として、例示的なＯＡＡの組み合わせは、対照と比較して、インビボで優れた腫瘍成長阻害特性を実証した。ＯＡＡ組み合わせコホートにおける全ての腫瘍は、内部基準に従って処置に応答した。さらに、ＯＡＡ組み合わせは、進行性疾患の数を減少させるのみならず、固形腫瘍成長のＲＥＣＩＳＴ評価に従って、対照と比較して平均の無増悪期間を少なくとも２．３倍に延長させた。
【０４１７】
表７は、カプランマイヤープロットに示す結果の概要を提供する（図８）。
【０４１８】
（表７）
2016538283.tif 000028
【０４１９】
表８は、腫瘍成長速度における結果の概要を提供する。
【０４２０】
（表８）
2016538283.tif 000029
**安定疾患として同定された腫瘍は、計算の目的で進行の開始の期限としてｔ＝２２日を割り当てた。
【０４２１】
実施例９：アフコシル化された例示的な抗体の一過性のＣＨＯ発現、精製、及び収率
アフコシル化抗体は、ＡＤＣＣ及び他の抗体エフェクター機能を増強することが知られている。アフコシル化された例示的な抗体（ＯＡ−ＣＴＸ−アフコ、ｖ７１９２）は、緑膿菌ＰＡＯ１由来のＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）をコードする余分なクローンをトランスフェクトされた全ＤＮＡの１５％に添加した状態、（ｖｏｎ Ｈｏｒｓｔｅｎら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ （２０１０） ２０ （１２）：１６０７−１６１８）、すなわち、ＨＣ：Ｆｃ：ＬＣ：ＲＭＤの最終ＤＮＡ比は、３０．６：２０．４：３４：１５であった状態で、実施例２に記載されているのと同じ一過性のＣＨＯ発現系及びプロテインＡ及びサイズ排除クロマトグラフィー精製手順を用いて作製した。
【０４２２】
アフコシル化された例示的な抗体は、１０Ｌ培養液中発現させた。プロテインＡ精製（図９Ａ）後、１ｇのタンパク質を回収した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーによるさらなる精製時に（図９Ｂ）、９７５ｍｇのタンパク質を回収した。
【０４２３】
内毒素レベルは、０．００１ＥＵ／ｍｇ未満であった。純度は、ＵＰＦＣ−ＳＥＣで評価されたように、９９．８１％であった。図１０Ａ及び１０Ｂは、精製したｖ７１９２のＵＰＬＣ−ＳＥＣクロマトグラムを示す。図１０Ｃは、最終ｖ７１９２産物の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【０４２４】
簡単に言えば、抗体のグリカン分析は、まず、試料を１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を用いて５６℃で１時間還元させて、５５ｍＭヨードアセトアミドにより室温で１時間アルキル化させた後、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中のトリプシンで３７℃にて一晩消化させることで行った。消化させた試料をＱ−Ｔｏｆ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＭＳ上のｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。ＮＣＢＩデータベースをＭａｓｃｏｔで検索し、タンパク質配列を同定した。ＭａｘＥｎｔ３（ＭａｓｓＬｙｎｘ）を用いて、グリコペプチドイオンをデコンボリュートし、異なる糖型の相対豊富度を定量化した。
【０４２５】
有意なフコシル化は、ＬＣ−ＭＳによって例示的な抗体中で検出されなかった（＞９８％アフコシル化）。図１１は、ＬＣ−ＭＳによる例示的なアフコシル化抗体ｖ７１９２−アフコのトリプシン消化物のグリカン分析を示す。
【０４２６】
例示的なＯＡＡ抗体が、アフコシル化抗体として大規模に作製し、標準手順を用いて非常に高純度で精製できることが、これらの結果により示される。
【０４２７】
表９は、アフコシル化された例示的な抗体の純度及び収率の概要である。
【０４２８】
（表９）
2016538283.tif 000030
【０４２９】
実施例１０：ＡＤＣを生成するための毒性薬物ペイロードへの例示的な抗体のコンジュゲーション
例示的なＯＡ−ＣＴＸ−アフコｖ７１９２をメルタンシン（ＤＭ１）にコンジュゲートさせて、一段階手順を用いて抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ、ｖ７１０４）を形成した。
【０４３０】
コンジュゲーションは、以下のように行った。まず、出発タンパク質試料を、ＰＤ−１０カラムを用いて５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び２ｍＭ  ＥＤＴＡからなる緩衝液に交換し、タンパク質濃度を１０ｍｇ／ｍｌに調整した。次いで、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）に溶解させたＳＭＣＣ−ＤＭ１（インハウス調製）の１０ｍＭ溶液を７．５モル当量のタンパク質試料に添加した。ＤＭＡをさらに添加し、最終濃度を１０％ｖ／ｖにして、試料を軽く混合した。反応混合物を混合しながら２５℃で一晩インキュベートした。非コンジュゲートタンパク質試料の含有量により決定された反応の進行は、疎水性相互作用クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）によって監視した。これは、Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｂｕｔｙｌ−ＮＰＲカラム（４．６ｍｍ×３．５ｍｍ×２．５ｍｍ）を用いて行った。溶出は、１０〜９０％緩衝液Ｂの勾配を用いて１ｍｌ／分で２５分間にわたって行った後、１００％緩衝液Ｂで４分間行った。緩衝液Ａは、２０ｍＭリン酸ナトリウムと、１．５Ｍ硫酸アンモニウムｐＨ７．０とを含む。緩衝液Ｂは、２０ｍＭリン酸ナトリウムと、２５％ｖ／ｖイソプロパノールｐＨ７．０とを含む。非コンジュゲートタンパク質の量が５％未満になるまで、ＳＭＣＣ−ＤＭ１をわずかに増加させて添加した。生成物を、ＰＤ−１０カラムを用いて２０ｍＭコハク酸ナトリウムｐＨ５．０からなる緩衝液に交換し、タンパク質濃度及び薬剤／抗体比（ＤＡＲ）は、２５２ｎｍ及び２８０ｎｍでの吸光度に基づいて算出した。緩衝液を、２０ｍＭコハク酸ナトリウム、６％ｗ／ｖトレハロース、及び０．０２％ｗ／ｖポリソルベート２０、ｐＨ５．０の最終組成物に調整した。高速液体クロマトグラフィー−サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＳＥＣ）を行い、Ｔｏｓｏｈ  Ｇ３０００−ＳＷＸＬカラム（７．８ｍｍ×３０ｃｍ）を用いて、１ｍｌ／分の流速で１００ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中のＡＤＣの純度を決定した。
【０４３１】
２３４ｍｇのアフコシル化された例示的な抗体上でコンジュゲーションを行い、９８％純度のＡＤＣと３．０９のＤＡＲを生成した。３．６３％の非コンジュゲート抗体と、４．８１％の高分子量（ＨＭＷ）汚染物質が存在した。回収率は７３％であり、内毒素レベルは＜０．２５ＥＵ／ｍｇであった。図１２は、非コンジュゲートＯＡ−ＣＴＸ−アフコｖ７１９２とコンジュゲートＯＡ−ＣＴＸ−アフコｖ７１０４のＨＩＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムのオーバーレイを示す。ｖ７１９２の遅延溶出プロファイルは、ＳＭＣＣ−ＤＭ１への化学的コンジュゲーションの結果として、ＡＤＣの疎水性が増したことに基づくと考えられた。ｖ７１９２クロマトグラムの幅は、抗体上のランダムな数値（典型的には、０〜１０）の接触可能なリジン残基へのＳＭＣＣ−ＤＭ１のコンジュゲーションとも一致している。図１３は、例示的な非コンジュゲートアフコシル化ＯＡ−ＣＴＸ  ｖ７１９２とコンジュゲートアフコシル化ＯＡ−ＣＴＸ  ｖ７１０４のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。抗体の全体的な構造的完全性が保持され、例示的なＯＡ−ＣＴＸ−アフコが、任意の望ましくないＨＭＷ汚染物質を形成することなく標準的なコンジュゲーション手順に適していることが、クロマトグラムの密接な重ね合わせにより示される。
【０４３２】
例示的な抗体は、標準大規模コンジュゲーション手順に適していることが、これらの結果により示される。
【０４３３】
実施例１１：例示的なＯＡ−ＥＧＦＲは、対応する二価抗体よりも高いＢｍａｘを有する細胞に結合する
異なるレベルの標的抗原ＥＧＦＲを発現するヒト腫瘍細胞上での例示的なＯＡ−ＥＧＦＲと対応する二価抗体との間の結合レベルを比較するために、全細胞結合アッセイを行った（細胞株について表１を参照されたい）。
【０４３４】
一次抗体のインキュベーションを２時間に修正した上で、実施例４に記載のようにフローサイトメトリーを行った。また、ＡＦ４８８抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）は、検出用の二次抗体として代わりに使用した。
【０４３５】
試験した全てのヒト腫瘍細胞株では、例示的なＯＡ−ＣＴＸ  ｖ４３５３は、試験した細胞株に応じて、対応する二価抗体よりも約１．３８〜１．６８倍高いＢｍａｘを示した。さらに、ＯＡ−ＣＴＸ＋ＯＡ−Ｔｒａｓ  ｖ１０４０の組み合わせのＢｍａｘは、それらによる個々のＯＡＡの各々よりも高く、個々のＢｍａｘの合計とほぼ等しい。
【０４３６】
図１４Ａ、１４Ｂ及び１４Ｃは、大腸ＨＣＴ１１６、乳ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、及び卵巣ＳＫＯＶ３細胞株における全細胞結合実験の結果を示す。
【０４３７】
例示的なＯＡ−ＥＧＦＲは、より多くの抗体分子が細胞に結合するという点で、対応する二価抗体よりも高いレベルでヒト腫瘍細胞に結合することができることが、ＦＡＣＳ結合結果により示される。細胞結合のレベルは、同じ結合部位について競合しない抗体の組み合わせを用いることでさらに増すことができる。
【０４３８】
実施例１２：例示的なＯＡＡがヒト大腸癌細胞Ｃａｃｏ２中のＡＤＣＣを仲介する能力
例示的な抗ＥＧＦＲ  ＯＡＡが、異なるＥＧＦＲ発現細胞であるヒト大腸癌細胞株Ｃａｃｏ２中のＡＤＣＣを仲介する能力を、フルサイズ二価抗ＥＧＦＲ抗体のものと比較した。
【０４３９】
ＡＤＣＣアッセイは、ＰＢＭＣ  Ｅ：Ｔ比が５０：１であった以外は実施例６に記載のように行った。
【０４４０】
例示的な抗ＥＧＦＲ  ＯＡＡ  ｖ４３５３及びｖ１３２３の双方は、３００ｎＭ抗体濃度で二価Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）よりもわずかに高い％標的細胞溶解（すなわち、より高い有効性）を示した。しかしながら、ＥＣ５０には大きな差異が存在し；例示的なｖ１３２３のかなり低い有効性は、細胞表面ＥＧＦＲからのその相対的に高い解離率と一致している。それにもかかわらず、ｖ１０４０（１アーム抗ＨＥＲ２抗体）とｖ１３２３の組み合わせは、ほぼ飽和濃度でわずかに高い％標的細胞溶解をもたらす。図１５Ａ及び１５Ｂは、Ｃａｃｏ２細胞上の例示的なＯＡＡのＡＤＣＣ用量反応曲線を示す。
【０４４１】
これらの結果は、抗ＥＧＦＲ  ＯＡＡが二価抗ＥＧＦＲ抗体と比較してより高いＡＤＣＣ効果を仲介することを実証した。異なるエピトープに結合する抗体の組み合わせも、より高いＡＤＣＣ効果をもたらす。これは、標的細胞に結合する抗体のレベルが増したことと一致している。しかしながら、細胞結合とＡＤＣＣ効果の相対的増加は、標的細胞の関連受容体発現レベルに応じて変わると思われる。
【０４４２】
実施例１３：例示的なＯＡＡは、対応する二価抗体よりも高いＡＤＣＣ効果を示す
抗体のアフコシル化は、エフェクター機能を増強することが知られている。例示的なアフコシル化ＯＡ−ＣＴＸ−アフコｖ７１９２を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＥＧＦＲ中／高）上のＡＤＣＣアッセイにおいて非アフコシル化対応物ｖ４３５３に対して試験し、アフコシル化の結果としての有効性及び効力の変化を評価した。
【０４４３】
ＡＤＣＣアッセイは、ＮＫ９２／ＣＤ１６ａ（１５８Ｖ／Ｖ）細胞（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔにより生成された）をＥ：Ｔ比が５：１でエフェクター細胞として用いた以外は、実施例６に記載のように行った。結果を図１６に示す。
【０４４４】
アフコシル化例示的なＯＡＡ  ｖ７１９２は、非アフコシル化対応物ｖ４３５３（６２％対４５％の標的細胞溶解）よりも高い効果を示した。アフコシル化抗体も、９ｐＭのＥＣ５０で、さらに大きな効力があり、これは、対応する非アフコシル化ＯＡＡのＥＣ５０よりも約１６倍低かった。
【０４４５】
アフコシル化ＯＡＡ  ｖ７１９２も、同様の効力を示したが、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）（ｖ７１８０）と比較してわずかに高い％標的細胞溶解を示した。
【０４４６】
これらの結果は、例示的なＯＡＡのアフコシル化がＡＤＣＣなどのエフェクター仲介機能の有効性及び効力を増強することができることを実証した。
【０４４７】
実施例１４：例示的なＯＡ−ＡＤＣは、ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の成長を阻害した
ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＥＧＦＲ中／高、ＨＥＲ２低、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ突然変異）上の例示的なＯＡ−ＣＴＸ−アフコ−ＡＤＣ  ｖ７１０４の効力及び有効性は、インビトロ成長阻害アッセイを用いて決定した。
【０４４８】
簡単に言えば、２，０００個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を９６ウェルプレートに播種し、１０％ＦＢＳで補充したＲＰＭＩ中で３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。その後、抗体を３通りで添加し、３０ｎＭの最終濃度から開始し、段階的に３倍希釈して０．００４５７ｎＭにした。細胞をさらに５日間インキュベートした。製造者推奨のプロトコルに従って、スルホローダミンＢ（Ｓｉｇｍａ）アッセイを用いて細胞成長を測定した。未処置対照細胞は、実験期間にわたって約６倍に成長した。
【０４４９】
例示的なＯＡ−ＣＴＸ−アフコ−ＡＤＣ  ｖ７１０４が、陰性対照ｖ６２４９（ＩｇＧ−ＡＤＣ）と比較して有意な成長阻害（最大５０％）を示したことを図１７の結果は示し、これは、１０ｎＭまではで有意な成長阻害を示さなかった。３０ｎＭで、対照の非特異的活性が観察されたが、例示的なＯＡ−ＣＴＸ−アフコ−ＡＤＣは、約６７％のより高い成長阻害レベルを示した。より高い抗体濃度は試験しなかった。ｖ７１０４のＥＣ５０は、３〜１０ｎＭであると推定されるが、ｖ６２４９のＥＣ５０は、約３０ｎＭであると推定される。
【０４５０】
Ｔ−ＤＭ１（ｖ６２４６、インハウス産生したトラスツズマブ・エムタンシン）も別の対照として試験したが、陰性対照ｖ６２４９と同じ用量反応プロファイルを示した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上の非常に低いＨＥＲ２発現ステータスを考慮すると、これは意外なことではない。
【０４５１】
これらの結果は、例示的なＯＡ−ＣＴＸ−アフコ−ＡＤＣがヒトトリプルネガティブ乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を発現するＥＧＦＲに対して効力及び有効性があることを実証した。この結果は、抗ＥＧＦＲ  ＯＡＡが標的癌細胞によって内部移行される能力と一致している。さらに、ＯＡ−ＣＴＸ−アフコ−ＡＤＣは、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ突然変異（これは、セツキシマブなどの従来の抗ＥＧＦＲ処置に耐性をもたらすことが知られている）を有する細胞株での有効性を実証した。
【０４５２】
実施例１５：例示的なＯＡＡ成長は、効力を減少させたケラチノサイトを阻害した
皮膚発疹は、セツキシマブなどの抗ＥＧＦＲ抗体を含むＥＧＦＲ阻害剤で処置した患者の間で頻繁に観察された有害作用である。ケラチノサイトへのＥＧＦＲ阻害剤の直接毒性が、皮膚発疹を引き起こすメカニズムの１つであると考えられる。例示的な抗ＥＧＦＲ  ＯＡＡの潜在的な皮膚毒性は、ＨＡＣＡＴケラチノサイト（ＥＧＦＲ中発現体）上の成長阻害アッセイを用いて評価した。
【０４５３】
成長阻害アッセイは、実施例５に記載のように行った。簡単に言えば、５，０００または１０，０００個のＨＡＣＡＴ細胞を各ウェルに播種した。一晩インキュベーション後、細胞を抗体で処理し、３７℃／５％ＣＯ２で３日または５日間インキュベートした。成長のレベルは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）水性非放射性細胞増殖アッセイ（ＭＴＳ）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて決定した。ＯＡ−ＣＴＸ  ｖ４３５３及びＯＡ−ＣＴＸ−アフコｖ７１９２は、１０％ＦＢＳの存在下で試験し、ＯＡ−ＥＧ２  ｖ１３２３は、ＦＢＳの不在下で試験した。結果を図１８Ａ及び１８Ｂに示す。
【０４５４】
例示的な抗体ＯＡ−ＣＴＸ  ｖ４３５３は、試験した抗体の最も高い濃度（３００ｎＭ）でＥｒｂｉｔｕｘ（商標）と同様の成長阻害特性を示した。しかしながら、ＯＡ−ＣＴＸは、より低い抗体濃度ではるかに低い細胞成長阻害から明らかなように、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）と比較してはるかに低い効力を示した。ＯＡ−ＣＴＸ−アフコは、ＯＡ−ＣＴＸのものと同様の用量反応を示した。
【０４５５】
比較では、ＯＡ−ＥＧ２は、試験した濃度で有意な成長阻害を示さなかった。これは、ＥＧ２がＥＧＦＲを中和しない抗体であることと一致している。
【０４５６】
例示的なＯＡ−ＣＴＸ抗体が、対応する二価抗体よりも皮膚細胞に対する毒性が低いことを結果は示している。
【０４５７】
実施例１４：異なるＥＧＦＲレベルを発現するヒト癌細胞中の例示的なＯＡＡのＡＤＣＣ活性
異なるレベルのＥＧＦＲを発現するさらなるヒト癌細胞株をさらに試験し、二価対応物を超える一価抗ＥＧＦＲ  ＯＡＡの優れたＡＤＣＣ活性を実証した。
【０４５８】
癌細胞株上のＥＧＦＲ発現及び抗体結合（３００ｎＭで）の相対レベルは、二次抗体としてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆａｂ断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を用いて実施例１１に記載のように行った。
【０４５９】
ＡＤＣＣアッセイは、実施例６に記載のように行った。Ａ４３１及びＡ５４９細胞ＡＤＣＣは、ＮＫ９２／ＦｃγＲ３ａ（１５８Ｖ／Ｖ）細胞を用いたが、ＨＣＴ１１６細胞は、ＩＬ２により一晩予め刺激したＰＭＢＣを用いた。
【０４６０】
（表１４．１）中央蛍光強度（ＭＦＩ）値として表された、ヒト癌細胞株上の相対ＥＧＦＲレベル
2016538283.tif 000031
【０４６１】
３つのさらなるヒト癌細胞株の相対ＥＧＦＲ発現を決定した。上記の表に示すように、高、中、及び低ＥＧＦＲ発現細胞株を試験した。これらの定性的な用語は、Ａ４３１のＥＧＦＲレベルについて報告された文献に基づいて割り当て、これは、細胞１つ当たり百万のオーダーの受容体分子であり、高レベルの受容体発現として考えられる。
【０４６２】
高ＥＧＦＲ発現Ａ４３１扁平上皮癌細胞では、例示的なｖ７１９２と対照ｖ７１８０の間のＡＤＣＣ効力（０．０９ｎＭ対０．０７ｎＭのＥＣ５０）及び有効性（５３％対５１％）は、ほとんど同様であった。
【０４６３】
中ＥＧＦＲ発現Ａ５４９肺癌細胞では、ｖ７１９２は、ｖ７１８０と同様の効力（０．１３ｎＭ対０．０５２ｎＭのＥＣ５０）を示したが、ＡＤＣＣ効果は１．９倍（６８％対３５％）に増した。
【０４６４】
同様に、低ＥＧＦＲ発現ＨＣＴ１１６大腸癌細胞では、一価ｖ７１９２と二価ｖ７１８０の間の効力は類似（ＥＣ５０  ８ｐＭ対４ｐＭ）であったが、ＯＡＡは、１．４倍の有効性の向上をもたらす。
【０４６５】
これらの結果は、ＯＡＡが、異なるＥＧＦＲ発現癌細胞中で対応する二価抗体と等しい有効性またはよりも良い有効性を仲介することを示す。具体的には、一価抗体は、高ＥＧＦＲ発現細胞中で二価対応物と類似であると考えられるが、いずれの有意な効力損失なく、より低いＥＧＦＲ発現細胞の有効性を有意に増強すると考えられる。
【０４６６】
実施例で用いた試薬は、市販されているかまたは市販の機器、方法、または当該技術分野において公知の試薬を用いて調製され得る。前出の実施例は、本発明の種々の態様及び本発明の方法の実施を説明する。本実施例は、本発明の多くの異なる実施形態の網羅的な説明を提供することを意図しない。従って、前出の本発明は、理解を明瞭にする目的のために、説明及び実施例によっていくらか詳細に記載されているが、当業者には、多くの変化及び改変が、添付の請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解されるであろう。
【０４６７】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各々個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個別にその全体が参照として組入れられるのと同程度に、それらの全体が本明細書に参照として組み入れられる。
【図１】
2016538283.tif 000032
【図２】
2016538283.tif 000033
【図３】
2016538283.tif 000034
【図４】
2016538283.tif 000035
【図５】
2016538283.tif 000036
【図６】
2016538283.tif 000037
【図７】
2016538283.tif 000038
【図８】
2016538283.tif 000039
【図９Ａ】
2016538283.tif 000040
【図９Ｂ】
2016538283.tif 000041
【図１０Ａ】
2016538283.tif 000042
【図１０Ｂ】
2016538283.tif 000043
【図１１】
2016538283.tif 000044
【図１２】
2016538283.tif 000045
【図１３】
2016538283.tif 000046
【図１４】
2016538283.tif 000047
【図１５】
2016538283.tif 000048
【図１６】
2016538283.tif 000049
【図１７】
2016538283.tif 000050
【図１８】
2016538283.tif 000051
【図１９】
2016538283.tif 000052
【手続補正書】
【提出日】平成28年8月5日(2016.8.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出されており、その全体において参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１４年１１月１９日に作成され、その名称は、２７９５１ＰＣＴ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔであり、７１，１８２バイトのサイズである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
疾患を処置するための医薬の製造において使用するための本明細書に記載される単離された抗原結合性構築物であって、任意選択的に、疾患は癌、例えば、ＥＧＦＲ発現癌、上皮細胞由来の癌、乳癌、ＨＥＲ２発現癌、肺癌、トリプルネガティブ乳癌、乳管癌、胃癌、卵巣癌、膠芽腫、子宮頸癌、腎癌、子宮癌、または結腸直腸癌である、前記構築物も本明細書に記載する。
[本発明1001]
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）発現腫瘍を有する対象を処置する方法であって、前記腫瘍を、ヘテロ二量体Ｆｃにリンカーを伴ってまたは伴わずに結合した重鎖可変ドメインを含む少なくとも1つの抗原結合性ポリペプチドを含む、有効量の単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物と接触させることを含み、前記抗原結合性ポリペプチドはＥＧＦＲに結合または特異的に結合し、かつ前記構築物は、ＥＧＦＲと結合または特異的に結合する対応する単離された単一特異性二価抗原結合性構築物と比較して、より大きなＢｍａｘでＥＧＦＲに結合する、前記方法。
[本発明1002]
前記Ｆｃが、鎖ＡにＥＵ番号付けに従う変異Ｔ350Ｖ＿Ｌ351Ｙ＿Ｆ405Ａ＿Ｙ407Ｖ、及び鎖ＢにＥＵ番号付けに従う変異Ｔ350Ｖ＿Ｔ366Ｌ＿Ｋ392Ｌ＿Ｔ394Ｗを有するヘテロ二量体ヒトＩｇＧ1  Ｆｃであり、前記抗原結合性ポリペプチドがＥＧＦＲの細胞外ドメインに位置するエピトープに結合し、前記対象が、ＥＧＦＲと結合または特異的に結合する前記単離された対応する単一特異性二価抗原結合性構築物で処置された対象と比較して前記処置から経験する皮膚毒性は少なく、かつ前記腫瘍が、Ａ431、Ａ549、ＢＴ474、ＣＡＣＯ2、ＨＣＴ116、ＪＩＭＴ1、ＭＤＡ−ＭＢ−231、ＳＫＯＶ3、ＭＣＦ7、またはＳＫＢＲ3のうちの1つまたはそれ以上の細胞株の第二レベルの細胞表面ＥＧＦＲ以下の第一レベルの細胞表面ＥＧＦＲを発現する、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物が、ＯＡ−ＣＴＸ（ｖ4353）またはＯＡ−ＥＧ2（ｖ1323）である、先行する本発明のいずれかの方法。
[本発明1004]
前記Ｆｃがヘテロ二量体ＩｇＧ1  Ｆｃであり、前記Ｆｃは少なくとも2つのＣＨ3配列を含み、前記Ｆｃがリンカーを伴ってまたは伴わずに抗原結合性ポリペプチドに結合する、先行する本発明のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記Ｆｃが、鎖ＡにＥＵ番号付けに従う変異Ｔ350Ｖ＿Ｌ351Ｙ＿Ｆ405Ａ＿Ｙ407Ｖ、及び鎖ＢにＥＵ番号付けに従う変異Ｔ350Ｖ＿Ｔ366Ｌ＿Ｋ392Ｌ＿Ｔ394Ｗを有するヒトヘテロ二量体ＩｇＧ1  Ｆｃである、先行する本発明のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物が、ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及び／またはＣＤＲ3を含み、かつ前記ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及び／またはＣＤＲ3は、表Ｂに示す対応する配列である、先行する本発明のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物が、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに位置するエピトープに結合する、先行する本発明のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記構築物が、本発明1035〜1073のいずれかの構築物である、先行する本発明のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記一価ＥＧＦＲ結合性構築物が、アフコシル化される、先行する本発明のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記一価ＥＧＦＲ結合性構築物が、薬物にコンジュゲートされ、任意選択的に前記薬物がマイタンシノイドまたはＤＭ1である、先行する本発明のいずれかの方法。
[本発明1011]
有効性の増加及び有害作用の減少を伴う前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物を用いる対象の処置の期間が、ＥＧＦＲと結合または特異的に結合する前記対応する単離された単一特異性二価抗原結合性構築物を用いた処置の期間を超える、先行する本発明のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記腫瘍が、上皮細胞由来の癌、肺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、乳管癌、胃癌、卵巣癌、ＨＥＲ2陽性癌、膠芽腫、子宮頸癌、腎癌、子宮癌、または結腸直腸癌である、先行する本発明のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物が、前記腫瘍上のＥＧＦＲへのＥＧＦの結合を遮断する、先行する本発明のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物が、前記腫瘍における恒常的なＥＧＦＲシグナル伝達を遮断する、先行する本発明のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記腫瘍を前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物と接触させることが、ＡＤＣＣをもたらす、先行する本発明のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記腫瘍を前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物と接触させることが、前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物の細胞内部移行をもたらす、先行する本発明のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記腫瘍が、Ａ431、Ａ549、ＢＴ474、ＣＡＣＯ2、ＨＣＴ116、ＪＩＭＴ1、ＭＤＡ−ＭＢ−231、ＳＫＯＶ3、ＭＣＦ7、またはＳＫＢＲ3のうちの1つまたはそれ以上の細胞株の第二レベルの細胞表面ＥＧＦＲ以下の第一レベルの細胞表面ＥＧＦＲを発現する、先行する本発明のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記腫瘍の試料が、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を使用して評価されて、3＋以下、2＋以下、または1＋以下の中央値レベルのＥＧＦＲを発現する、先行する本発明のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記腫瘍が、細胞当たり3．5×106またはそれ未満、2．8×106またはそれ未満、1．2×106またはそれ未満、2．4×105またはそれ未満、2．6×105またはそれ未満、あるいは4．2×104またはそれ未満の中央値のＥＧＦＲを発現する、先行する本発明のいずれかの方法。
[本発明1020]
前記処置が、前記腫瘍の縮小、前記腫瘍の増殖の阻害、前記腫瘍の腫瘍増殖停止時間の増加、前記対象の無病生存期間の延長、転移の低減、前記対象の無増悪生存期間の増加、または対象の集団の全生存期間の増加をもたらす、先行する本発明のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記対象が固定用量の前記構築物を投与され、かつＥＧＦＲと結合または特異的に結合する固定用量の前記対応する単離された単一特異性二価抗原結合性構築物で処置された対象と比較して、前記対象が前記処置から経験する皮膚毒性が低く、かつ前記固定用量がモルベースで決定される、先行する本発明のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記対象のケラチノサイトの増殖が、ＥＧＦＲと結合または特異的に結合する固定用量の前記対応する単離された単一特異性二価抗原結合性構築物で処置された対象と比較して、固定用量の前記構築物を用いた処置後に減少されより少なくなり、かつ前記固定用量がモルベースで決定される、先行する本発明のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記腫瘍が、トラスツズマブ及び／またはペルツズマブ及び／またはセツキシマブに抵抗性または不応性である、先行する本発明のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記対象が、ヒト対象である、先行する本発明のいずれかの方法。
[本発明1025]
追加の薬剤を提供することをさらに含む、先行する本発明のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記追加の薬剤が、ＨＥＲ2と結合する、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記追加の薬剤が、ペルツズマブまたはトラスツズマブである、本発明1025の方法。
[本発明1028]
前記一価ＥＧＦＲ結合性構築物及び前記追加の薬剤が、同時に提供される、本発明1025の方法。
[本発明1029]
前記一価ＥＧＦＲ結合性構築物及び前記追加の薬剤が、別々に提供される、本発明1025の方法。
[本発明1030]
前記追加の薬剤が、第二の単離された抗原結合性構築物である、本発明1025から1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
前記第二の単離された抗原結合性構築物が、ＨＥＲ2またはＨＥＲ2の細胞外ドメインに結合または特異的に結合する、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記第二の単離された抗原結合性構築物が、ＨＥＲ2のＥＣＤ2及び／またはＥＣＤ4に結合または特異的に結合する、本発明1030の方法。
[本発明1033]
前記処置が、前記腫瘍の縮小、前記腫瘍の増殖の阻害、前記腫瘍の腫瘍増殖停止時間の増加、前記対象の無病生存期間の延長、または前記対象の生存期間の増加をもたらす、本発明1024から1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
前記第二の単離された抗原結合性構築物が、前記第二の単離された抗原結合性構築物の前記抗原結合ポリペプチドがＨＥＲ2またはＨＥＲ2の細胞外ドメインと結合または特異的に結合することを除いて、本発明1035から1073のいずれかの単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物と同一である、本発明1030の方法。
[本発明1035]
単離された一価抗原結合性構築物であって、
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と結合または特異的に結合する、重鎖可変ドメインを含む少なくとも1つの抗原結合性ポリペプチドと；
ヘテロ二量体Ｆｃであって、前記Ｆｃは少なくとも2つのＣＨ3配列を含み、前記Ｆｃは、リンカーを伴ってまたは伴わずに、前記抗原結合性ポリペプチドに結合する、ヘテロ二量体Ｆｃ
とを含み；
ここで、前記一価抗原結合性構築物は、ＥＧＦＲと結合または特異的に結合する、単離された対応する単一特異性二価抗原結合性構築物と比較して、より大きなＢｍａｘを伴って、ＥＧＦＲを選択的に及び／または結合または特異的に結合し；かつ
ここで、二量体化ＣＨ3配列は、約68℃またはより高い融解温度（Ｔｍ）を有する、
前記単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1036]
前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物が、ＯＡ−ＣＴＸ（ｖ4353）またはＯＡ−ＥＧ2（ｖ1323）である、本発明1035の単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1037]
1：1の構築物対標的比率で、前記単一特異性二価抗原結合性構築物に対するＢｍａｘにおける増加が、前記構築物の観察される平衡定数（Ｋｄ）を超えて飽和濃度までの濃度で観察される、先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1038]
前記単離された一価抗原結合性構築物が、ＥＧＦＲと結合または特異的に結合する単離された、対応する単一特異性二価抗原結合性構築物に比べて、ＥＧＦＲに対するより低い親和性を有する、先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1039]
前記単離された一価抗原結合性構築物が、ＥＧＦＲの細胞外ドメイン1、2、3、もしくは4またはＥＧＦＲの細胞外ドメインに位置するエピトープに結合する、先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1040]
前記抗原結合性ポリペプチドが、軽鎖可変ドメイン、軽鎖ＣＬ1ドメイン、及び／または重鎖ＣＨ1ドメインをさらに含む、先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1041]
前記重鎖可変ドメインのアミノ酸配列が、表Ｂに記載するＥＧＦＲ特異的抗原結合性ポリペプチド重鎖可変ドメインのアミノ酸配列に、少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100％同一であり、かつ前記軽鎖可変ドメインの前記アミノ酸配列が、表Ｂに記載するＥＧＦＲ特異的抗原結合性ポリペプチド軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列に、少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100％同一である、先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1042]
前記軽鎖ＣＬ1ドメインのアミノ酸配列が、表Ｂに記載するＥＧＦＲ特異的抗原結合性ポリペプチド軽鎖ＣＬ1ドメインのアミノ酸配列に、少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100％同一であり、かつ前記重鎖ＣＨ1ドメインのアミノ酸配列が、表Ｂに記載するＥＧＦＲ特異的抗原結合性ポリペプチド重鎖ＣＨ1ドメインのアミノ酸配列に、少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100％同一である、先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1043]
前記抗原結合性ポリペプチドが、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、抗原結合性ペプチド、または前記抗原と結合することができるタンパク質ドメインである、先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1044]
前記抗原結合性ポリペプチドが、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドを含む、先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1045]
前記重鎖ポリペプチドが、表Ｂに記載するＥＧＦＲ特異的抗原結合性ポリペプチド重鎖のアミノ酸配列に、少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖ポリペプチドが、表Ｂに記載するＥＧＦＲ特異的抗原結合性ポリペプチド軽鎖のアミノ酸配列に、少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100％同一であるアミノ酸配列を含む、本発明1044の単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1046]
1．16Ｅ−8Ｍから8．51Ｅ−10Ｍ以下のＥＧＦＲへの結合親和性（ＫＤ）を有する、先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1047]
ＥＧＦＲに結合した時、対照と比べてＡ431細胞増殖を阻害する、及び／または対照と比べてＢＴ−474細胞のＡＤＣＣ媒介性標的細胞溶解率（％）を増加させる、及び／またはＥＧＦＲの細胞内部移行を引き起こす、及び／またはＥＧＦＲの下方制御を引き起こす、先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1048]
前記細胞上のＥＧＦＲへの結合の際に細胞内に細胞内部移行される、先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1049]
前記Ｆｃがリンカーにより前記抗原結合性ポリペプチドに融合される、先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1050]
前記リンカーがポリペプチドリンカーである、本発明1049の単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1051]
前記リンカーがＩｇＧ1ヒンジ領域を含む、本発明1049の単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1052]
ＥＧＦＲがＥＧＦＲアイソフォームＡまたはＥＧＦＲｖＩＩＩである、先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1053]
少なくとも1つの薬物にコンジュゲートされる、先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1054]
前記薬物がマイタンシノイドである、本発明1053の単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1055]
前記マイタンシノイドがＤＭ1である、本発明1054の単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1056]
前記マイタンシノイドがＳＭＣＣリンカーを通して前記構築物にコンジュゲートされる、本発明1054または本発明1055の単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1057]
前記構築物または前記抗原結合性ポリペプチドが、中和性である、先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1058]
前記構築物または前記抗原結合性ポリペプチドが、非中和性である、先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1059]
前記ＦｃがヒトＦｃである、先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1060]
前記ヒトＦｃがヒトＩｇＧ1  Ｆｃである、本発明1059の単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1061]
前記二量体化ＣＨ3配列が、約68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、77．5、78、79、80、81、82、83、84、または85℃またはより高い融解温度（Ｔｍ）を有する、先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1062]
前記Ｆｃが、発現されるとき、約75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％を超える純度で形成されたヘテロ二量体である、先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1063]
前記Ｆｃが、単一細胞を介して発現される時、約75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％を超える純度で形成されたヘテロ二量体である、本発明1062の単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1064]
前記ヘテロ二量体Ｆｃが、前記ＣＨ3配列の少なくとも1つに、1つまたは複数の修飾を含む、先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1065]
前記ヘテロ二量体Ｆｃドメインが、野生型ホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を伴ってヘテロ二量体の形成を促進する、1つまたは複数の修飾を前記ＣＨ3配列の少なくとも1つに含む、先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1066]
前記ヘテロ二量体Ｆｃドメインが含むのは、鎖ＡにＥＵ番号付けに従う変異Ｔ350Ｖ＿Ｌ351Ｙ＿Ｆ405Ａ＿Ｙ407Ｖ、及び鎖ＢにＥＵ番号付けに従う変異Ｔ350Ｖ＿Ｔ366Ｌ＿Ｋ392Ｌ＿Ｔ394Ｗを有するヘテロ二量体ＩｇＧ1  Ｆｃである、先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1067]
前記ヘテロ二量体Ｆｃが、少なくとも1つのＣＨ2ドメインをさらに含む、先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1068]
前記ヘテロ二量体Ｆｃの前記ＣＨ2ドメイン（複数可）が1つまたは複数の修飾を含む、本発明1067の単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1069]
前記ヘテロ二量体Ｆｃが、Ｆｃガンマ受容体の選択的結合を促進するための1つまたは複数の修飾を含む、先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1070]
ＥＧＦＲへの結合について先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物と競合する第二の単離された一価抗原結合性構築物であって、任意選択的に、前記第二の単離された一価抗原結合性構築物が、先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物を、50％を超えて、60％を超えて、70％を超えて、80％を超えて、90％を超えて、95％を超えて、99％を超えて、または100％置換する、前記第二の単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1071]
前記構築物が、前記細胞が前記構築物により接触された時に、
ｄ．ＥＧＦＲと結合または特異的に結合する前記対応する単離された単一特異性二価抗原結合性構築物と比較して、ＢＴ474細胞、ＨＣＴ116細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−234細胞、またはＳＫＯＶ3細胞のうちの1つまたは複数への、ＦＡＣＳにより決定される、より高い細胞表面結合性（ＢＭＡＸ）、
ｅ．ＥＧＦＲと結合または特異的に結合する前記対応する単離された単一特異性二価抗原結合性構築物により媒介される抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と比較して、ＢＴ−474細胞の増加した抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の媒介、または
ｆ．ＪＩＭＴ1細胞による細胞内部移行
のうちの1つまたは複数によって特徴付けられる、先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1072]
アフコシル化され、かつ、ＥＧＦＲと結合または特異的に結合する前記対応する単離された単一特異性二価抗原結合性構築物が媒介するＡＤＣＣに対して、Ａ549細胞のＡＤＣＣにおいて1．9倍の増加及び／またはＨＣＴ116細胞のＡＤＣＣにおいて1．4倍の増加を媒介する、先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1073]
前記抗原結合性構築物が少なくとも1つの修飾を含み、かつ前記修飾がアフコシル化である、先行する構築物本発明のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物。
[本発明1074]
本発明1035から1073のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物をコードする少なくとも1つの配列を含む、単離ポリヌクレオチドまたは単離ポリヌクレオチドのセット。
[本発明1075]
前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットがｃＤＮＡである、本発明1074の単離ポリヌクレオチド。
[本発明1076]
先行するポリヌクレオチド本発明のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットのうちの1つまたは複数を含む、ベクターまたはベクターのセット。
[本発明1077]
プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター、発現ベクター、及び組換え発現ベクターからなる群より選択される、本発明1076のベクターまたはベクターのセット。
[本発明1078]
先行するポリヌクレオチド本発明のいずれかまたは先行するベクター本発明のいずれかのポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットを含む、単離細胞。
[本発明1079]
ハイブリドーマ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはＨＥＫ293細胞である、本発明1078の単離細胞。
[本発明1080]
本発明1035から1073のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物及び薬学的に許容され得るキャリアを含む、医薬組成物。
[本発明1081]
緩衝剤、抗酸化剤、低分子量分子、薬物、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、脂質、キレート剤、安定剤、及び賦形剤からなる群より選択される1つまたは複数の物質をさらに含む、本発明1080の医薬組成物。
[本発明1082]
第二の単離された抗原結合性構築物をさらに含む、先行する医薬組成物本発明のいずれかの医薬組成物。
[本発明1083]
前記第二の構築物が、ＨＥＲ2またはＨＥＲ2の細胞外ドメインに特異的に結合する、本発明1082の医薬組成物。
[本発明1084]
前記第二の構築物が、ＨＥＲ2の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）2及び／またはＥＣＤ4に特異的に結合する、本発明1082の医薬組成物。
[本発明1085]
前記第二の構築物が、前記抗原結合ポリペプチドがＨＥＲ2またはＨＥＲ2の細胞外ドメインと特異的に結合することを除いて、本発明1035から1073のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物と同一である、本発明1082の医薬組成物。
[本発明1086]
医療薬において使用するための、先行する医薬組成物本発明のいずれかの医薬組成物。
[本発明1087]
癌性状態の処置において使用するための、先行する医薬組成物本発明のいずれかの医薬組成物。
[本発明1088]
前記癌性状態が、ＥＧＦＲ発現癌、上皮細胞由来の癌、乳癌、ＨＥＲ2発現癌、肺癌、トリプルネガティブ乳癌、乳管癌、胃癌、卵巣癌、頭頚部癌、膠芽腫、子宮頸癌、腎癌、子宮癌、膵癌、または結腸直腸癌である、本発明1087の医薬組成物。
[本発明1089]
本発明1035から1073のいずれかの単離された一価抗原結合性構築物を得る方法であって、（ａ）宿主細胞培養物を得るステップであって、前記宿主細胞は前記抗原結合性構築物をコードする1つまたは複数の核酸配列を含む、ステップと；（ｂ）前記宿主細胞培養物を前記単離された一価抗原結合性構築物を発現するのに十分な条件下で培養するステップと；（ｃ）前記抗原結合性構築物を前記宿主細胞培養物から回収するステップとを含む、前記方法。
[本発明1090]
対象においてＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲシグナル伝達に関連する癌または障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、先行する医薬組成物本発明のいずれかまたは先行する構築物本発明のいずれかの医薬組成物を提供することを含む、前記方法。
[本発明1091]
前記癌が、ＥＧＦＲ発現癌、上皮細胞由来の癌、乳癌、ＨＥＲ2発現癌、肺癌、トリプルネガティブ乳癌、乳管癌、胃癌、卵巣癌、膠芽腫、子宮頸癌、腎癌、子宮癌、または結腸直腸癌である、本発明1090の方法。
[本発明1092]
前記方法が、追加の薬剤に加えて単離された一価構築物を提供することを含む、本発明1090から1091のいずれかの方法。
[本発明1093]
前記単離された一価構築物が、前記追加の薬剤と同時に提供される、本発明1092の方法。
[本発明1094]
前記単離された一価構築物が、前記追加の薬剤とは別に提供される、本発明1092の方法。
[本発明1095]
前記追加の薬剤が、第二の、異なる単離された抗原結合性構築物である、本発明1092から1094のいずれかの方法。
[本発明1096]
前記第二の構築物が、ＨＥＲ2またはＨＥＲ2の細胞外ドメインに特異的に結合する、本発明1095の方法。
[本発明1097]
前記第二の構築物が、ＨＥＲ2のＥＣＤ2及び／またはＥＣＤ4に特異的に結合する、本発明1095の方法。
[本発明1098]
前記第二の構築物が、前記抗原結合ポリペプチドがＨＥＲ2またはＨＥＲ2の細胞外ドメインと特異的に結合することを除いて、本発明1001の単離された一価抗原結合性構築物と同一である、本発明1095の方法。
[本発明1099]
前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物が、腫瘍上のＥＧＦＲへのＥＧＦの結合を遮断する、本発明1090の方法。
[本発明1100]
前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物が、腫瘍における恒常的なＥＧＦＲシグナル伝達を遮断する、本発明1090の方法。
[本発明1101]
腫瘍を前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物と接触させることが、ＡＤＣＣをもたらす、本発明1090の方法。
[本発明1102]
腫瘍を前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物と接触させることが、前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物の細胞内部移行をもたらす、本発明1090の方法。
[本発明1103]
腫瘍の増殖を阻害する、腫瘍を縮小させる、または腫瘍を有する対象の生存期間を増加させる方法であって、前記腫瘍を、有効量の、先行する医薬組成物本発明のいずれかの組成物または先行する構築物本発明のいずれかの構築物と接触させることを含む、前記方法。
[本発明1104]
前記腫瘍が、上皮細胞由来の腫瘍またはＨＥＲ2陽性腫瘍である、本発明1103の方法。
[本発明1105]
前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物が、前記腫瘍上のＥＧＦＲへのＥＧＦの結合を遮断する、本発明1103の方法。
[本発明1106]
前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物が、前記腫瘍における恒常的なＥＧＦＲシグナル伝達を遮断する、本発明1103の方法。
[本発明1107]
前記腫瘍を前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物と接触させることが、ＡＤＣＣをもたらす、本発明1103の方法。
[本発明1108]
前記腫瘍を前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物と接触させることが、前記単離された一価ＥＧＦＲ結合性構築物の細胞内部移行をもたらす、本発明1103の方法。
[本発明1109]
細胞におけるＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲシグナル伝達を阻害する、減少させるまたは遮断する方法であって、前記細胞を、有効量の、先行する医薬組成物本発明のいずれかの組成物に係る前記構築物または先行する構築物本発明のいずれかの構築物と接触させることを含む、前記方法。
[本発明1110]
前記細胞が、ＥＧＦＲ発現癌細胞、乳癌細胞、上皮細胞由来の腫瘍細胞、ＨＥＲ2陽性腫瘍細胞、肺癌細胞、トリプルネガティブ乳癌細胞、乳管癌細胞、胃癌細胞、及び頭頚部癌細胞、膵癌細胞、卵巣癌細胞、膠芽腫細胞、子宮頸癌細胞、腎癌細胞、子宮癌細胞、または結腸直腸癌細胞である、本発明1109の方法。
[本発明1111]
先行する構築物本発明のいずれかの単離された抗原結合性構築物及び使用説明書を含み、任意選択的に第二の単離された抗原結合性構築物をさらに含む、キット。
[本発明1112]
疾患を処置するための医薬の製造において使用するための先行する構築物本発明のいずれかの単離された抗原結合性構築物であって、任意選択的に、前記疾患が癌である、前記構築物。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
本発明のこれら及び他の特徴、態様、及び利点は、以下の説明及び添付の図面に関して、より良好に理解されるだろう。
【図１】図１は、例示的な１アーム（ｏｎｅ  ａｒｍｅｄ）抗ＥＧＦＲ抗体（ＯＡ−ＥＧＦＲ）、ｖ４３５３及び１３２３の純度の評価を示す。図１Ａは、７９．９５ｍｌの保持容量で主ピークを有するｖ４３５３のＳＥＣプロファイルを示す。図１Ｂは、８４．７４ｍｌの保持容量で主ピークを有するｖ１３２３のＳＥＣプロファイルを示す。図１Ｃは、各種それぞれ、おおよそ１１０ｋＤａ及び６６ｋＤＡでのｖ４３５３及びｖ１３２３両方のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。図１Ｄは、ｖ４３５３の型の例示的な１アーム抗ＥＧＦＲ抗体の概略図である。図１Ｅは、ｖ１３２３の型の例示的な１アーム抗ＥＧＦＲ抗体の概略図である。図１Ｅは、ｖ７１８０の型の二価（フルサイズ）抗ＥＧＦＲ抗体の概略図である。
【図２】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定された、例示的な中和性及び非中和性ＯＡ−ＥＧＦＲ抗体のＥＧＦＲに結合する能力を示す。図２Ａ及び２Ｂは、ｖ４３５３（中和性抗体）のセンサーグラムを示し、それぞれＥＧＦＲに結合するその能力及びＨＥＲ２への結合の欠如を示す。図２Ｃ及び２Ｄは、ｖ１３２３（非中和性）のセンサーグラムを示し、それぞれＥＧＦＲに結合するその能力及びＨＥＲ２への結合の欠如を示す。
【図３】ＨＥＲ２  ３＋ＥＧＦＲ発現乳癌ＢＴ−４７４細胞に濃度依存的及び可飽和様式で結合する例示的なＯＡ−ＥＧＦＲ抗体の能力を示す。ＯＡ−ＥＧＦＲ抗体は、フルサイズの二価抗ＥＧＦＲ抗体であるＥｒｂｉｔｕｘ（商標）と比較してより高いＢｍａｘを示す。
【図４】５日間の曝露にわたる、ＥＧＦＲを発現するＡ４３１肺癌細胞の増殖を阻害する、例示的な中和性及び非中和性ＯＡ−ＥＧＦＲ抗体の能力を示し、阻害は中和性ＯＡ−ＥＧＦＲ  ｖ４３５３で見られたが、非中和性ＯＡ−ＥＧＦＲ  ｖ１３２３では見られなかった。
【図５】乳房ＢＴ−４７４癌細胞において２５：１のエフェクター対標的Ｅ：Ｔ比率で濃度依存性ＡＤＣＣを媒介する、例示的な中和性及び非中和性ＯＡ−ＥＧＦＲ抗体の能力を示す。
【図６】細胞内部移行する及びＥＧＦＲ発現を下方制御する例示的なＯＡ−ＥＧＦＲ抗体の能力の測定を示す。図６Ａは、ＪＩＭＴ−１細胞に細胞内部移行する及びＪＩＭＴ−１細胞におけるＥＧＦＲ発現を下方制御する２０ｎＭのｖ４３５３の効果を示す。図６Ｂは、単独でまたは他の抗体と組み合わせて、ＪＩＭＴ−１細胞に内部移行する及びＪＩＭＴ−１細胞におけるＥＧＦＲ発現を下方制御する１００ｎＭ及び２００ｎＭのｖ４３５３の効果を示す。６Ａ及び６Ｂの各実験群について、左バーは４℃の表面；真ん中のバーは、３７℃の表面；右バーは３７℃の内部である。
【図７】マウス異種移植モデルにおけるＣＴＸ−抵抗性株化卵巣腫瘍ＳＫＯＶ３の増殖を阻害する、例示的なＯＡ−ＥＧＦＲとＯＡ−ＨＥＲ２抗体の組み合わせの能力を示す。
【図８】図７のＳＫＯＶ３異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｐｈ）モデルにおける例示的なＯＡ−ＥＧＦＲとＯＡ−ＨＥＲ２抗体の組み合わせに曝露したマウスの生存データを示す、カプラン・マイヤープロットを示す。
【図９】プロテインＡ及びＳＥＣ精製後の例示的なアフコシル化ＯＡ−ＥＧＦＲ  ｖ４３５３（ｖ７１９２）抗体のＵＰＬＣ−ＳＥＣクロマトグラムを示す。
【図１０】例示的なアフコシル化ＯＡ−ＥＧＦＲ  ｖ４３５３最終産物（ｖ７１９２）のＵＰＬＣ−ＳＥＣクロマトグラム（図１０Ａ及び１０Ｂ）及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１０Ｃ）を示す。
【図１１】ＬＣ−ＭＳによる例示的なアフコシル化抗体ｖ７１９２のトリプシン消化物の糖鎖分析を示す。「ＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ」はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６９として開示され、「ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ」はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７０として開示されている。
【図１２】非コンジュゲートｖ７１０４及びＤＭ１コンジュゲートｖ７１９２例示的ＯＡ−ＥＧＦＲ抗体のＨＩＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムのオーバーレイを示す。
【図１３】非コンジュゲートｖ７１０４及びコンジュゲートｖ７１９２例示的ＯＡ−ＥＧＦＲ抗体のＨＰＬＣ−ＳＥＣクロマトグラムのオーバーレイを示す。
【図１４】様々なヒト腫瘍細胞株への全細胞飽和結合を示す。対応する二価抗体と比較してＯＡ−ＥＧＦＲのＢｍａｘは、それぞれ結腸直腸ＨＣＴ１１６（図１４Ａ）、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１４Ｂ）及び卵巣ＳＫＯＶ３（図１４Ｃ）において、１．５５倍、１．６８倍及び１．３８倍増加した。
【図１５】図１５Ａ及び１５Ｂは、５０：１のＰＢＭＣエフェクター対標的Ｃａｃｏ２のＥ：Ｔ比率で評価した、Ｃａｃｏ２細胞株に対する例示的なＯＡＡの濃度依存性ＡＤＣＣ用量反応曲線を示す。
【図１６】５：１のＮＫ９２（ＣＤ１６ａ：１５８Ｖ／Ｖ）エフェクター対標的ＴＮＢＣ  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１のＥ：Ｔ比率で評価した、ＴＮＢＣ  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するアフコシル化（ｖ７１９２）及び非アフコシル化（ｖ４３５３）例示的なＯＡ−ＥＧＦＲのＡＤＣＣ用量反応曲線を示す。
【図１７】ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対する例示的なＯＡＡＤＣの増殖阻害用量反応曲線を示す。
【図１８】図１８Ａは、血清の存在下で不死化ＨＡＣＡＴケラチノサイト細胞株に対する、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）と比較した例示的なＯＡ−ＥＧＦＲ抗体ｖ４３５３及びｖ７１９２の増殖阻害用量反応曲線を示す。図１８Ｂは、血清の不存在下でＥｒｂｉｔｕｘ（商標）のそれと比較したＯＡ−ＥＧＦＲ抗体ｖ１３２３の増殖阻害用量反応曲線を示す。
【図１９】それぞれ、その細胞表面上に高、中及び低レベルのＥＧＦＲを発現する、Ａ４３１細胞、Ａ５４９細胞及びＨＣＴ１１６細胞に対する、アフコシル化（ｖ７１９２）例示的ＯＡ−ＥＧＦＲ及びＥｒｂｉｔｕｘ（商標）（ｖ７１８０）のＡＤＣＣ用量反応曲線を示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６７】
（表Ａ）ＩｇＧ１  Ｆｃ配列
2016538283.tif 000053
2016538283.tif 000054
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５９】
（表Ｂ）配列
2016538283.tif 000055
2016538283.tif 000056
2016538283.tif 000057
2016538283.tif 000058
2016538283.tif 000059
2016538283.tif 000060
2016538283.tif 000061
2016538283.tif 000062
シグナルペプチドを除いた最終発現配列
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2016538283000001.app
【国際調査報告】
2016538283.tif 000063
2016538283.tif 000064
2016538283.tif 000065
2016538283.tif 000066