(57)【要約】  ＴＢ  ｅｓａｔ−６タンパク質をコードする核酸分子を含む組成物を開示する。個体におけるＴＢに対する免疫応答の誘発方法を開示する。ＴＢと診断された個体の治療方法を開示する。個体におけるＴＢ感染の予防方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷコード配列を含む核酸分子と、ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥコード配列を含む核酸分子と、ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴコード配列を含む核酸分子と、ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵコード配列を含む核酸分子と、ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦコード配列を含む核酸分子との組み合わせ；
ｂ）配列番号１９または配列番号１を含む核酸分子と、配列番号２１または配列番号３を含む核酸分子と、配列番号２３または配列番号５を含む核酸分子と、配列番号２５または配列番号７を含む核酸分子と、配列番号２７または配列番号９を含む核酸分子との組み合わせ；
ｃ）配列番号１９を含む核酸分子と、配列番号２１を含む核酸分子と、配列番号２３を含む核酸分子と、配列番号２５を含む核酸分子と、配列番号２７を含む核酸分子との組み合わせ；
ｄ）配列番号２０をコードする核酸分子と、配列番号２２をコードする核酸分子と、配列番号２４をコードする核酸分子と、配列番号２６をコードする核酸分子と、配列番号２８をコードする核酸分子との組み合わせ；
ｅ）配列番号１を含む核酸分子、配列番号３を含む核酸分子、配列番号５を含む核酸分子、配列番号７を含む核酸分子、配列番号９を含む核酸分子、配列番号１１を含む核酸分子、配列番号１３を含む核酸分子、配列番号１５を含む核酸分子、配列番号１７を含む核酸分子、配列番号１９を含む核酸分子、配列番号２１を含む核酸分子、配列番号２３を含む核酸分子、配列番号２５を含む核酸分子、配列番号２７を含む核酸分子、全長の少なくとも９０％を有するその断片、少なくとも９５％の相同性を持つ相同配列、少なくとも９５％の相同性を持つ相同配列の断片、全長の少なくとも９０％を有する少なくとも９５％の相同性を持つ相同配列の前記断片からなる群から選択される１つ以上の核酸分子；
ｆ）：配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、全長の少なくとも９０％を有するその断片、少なくとも９５％の相同性を持つ相同配列、少なくとも９５％の相同性を持つ相同配列の断片、全長の少なくとも９０％を有する少なくとも９５％の相同性を持つ相同配列の前記断片からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする１つ以上の核酸分子；
からなる群から選択される組成物。
【請求項２】
配列番号１９を含む核酸分子と、配列番号２１を含む核酸分子と、配列番号２３を含む核酸分子と、配列番号２５を含む核酸分子と、配列番号２７を含む核酸分子との組み合わせを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
配列番号１９を含む前記核酸分子がプラスミドであり、配列番号２１を含む前記核酸分子がプラスミドであり、配列番号２３を含む前記核酸分子がプラスミドであり、配列番号２５を含む前記核酸分子がプラスミドであり、配列番号２７を含む前記核酸分子がプラスミドである請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷコード配列を含む核酸分子と、ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥコード配列を含む核酸分子と、ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴコード配列を含む核酸分子と、ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵコード配列を含む核酸分子と、ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦコード配列を含む核酸分子との組み合わせを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
配列番号１９または配列番号１を含む核酸分子と、配列番号２１または配列番号３を含む核酸分子と、配列番号２３または配列番号５を含む核酸分子と、配列番号２５または配列番号７を含む核酸分子と、配列番号２７または配列番号９を含む核酸分子との組み合わせを含む請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
核酸分子が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、および配列番号２７からなる群から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記核酸分子がプラスミドである請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
配列番号１を含む核酸分子と、配列番号３を含む核酸分子と、配列番号５を含む核酸分子と、配列番号７を含む核酸分子と、配列番号９を含む核酸分子とを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＩＬ−２８からなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
エレクトロポレーションを用いて個体に送達するために調合された請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
ＴＢに対する免疫応答の誘発方法であって、
請求項１に記載の組成物を、個体で免疫応答を誘発するのに効果的な量で前記個体に投与することを含む方法。
【請求項１２】
ＴＢと診断された個体の治療方法であって、
治療有効量の請求項１に記載の組成物を個体に投与することを含む方法。
【請求項１３】
個体におけるＴＢ感染の予防方法であって、
予防有効量の請求項１に記載の組成物を個体に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫原性ＴＢ抗原をコードする結核（ＴＢ）免疫原をコードする多価構築物に関する。各構築物は、複数の免疫原性ＴＢ抗原をコードし、高レベルな発現用に設計されたコード配列を有する。予防および治療ワクチン、同ワクチンを作成し、同ワクチンを用いて免疫応答を誘発する方法、ＴＢ感染の予防方法、およびＴＢウイルスに感染した個体の治療方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
結核（ＴＢ）は、世界中でかなりの罹患率および死亡率を占める主要な感染症である。ＴＢに対して現在認可されている唯一のワクチンは、カルメット・ゲラン菌（ＢＣＧ）ワクチンである。残念なことに、このワクチンは、成人の肺ＴＢに対する防御があまり良くなく、有害事象を伴うものであった。従って、ＴＢに対する長期防御を誘発する新規の有効なワクチンの開発が至急必要とされている。しかしながら、様々な要因により、ＴＢに対するＴ細胞免疫を誘発すると判断されている抗原は、今までのところほんの僅かしか研究されていない。それらの抗原としては、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ６、ＴＢ１０．４、およびＭｔｂ３９ａが挙げられる。１つの問題は、選択すべき多くのＴＢ抗原が存在し、現在の技術では、ＴＢ抗原の送達は限定され、高価である。
【０００３】
免疫原性ＴＢ抗原に対する免疫応答を誘発し、ＴＢに対する感染を防御し、かつ、ＴＢに感染した個体に有効な治療をもたらすことができる経済的かつ有効なＴＢワクチンおよび方法が必要とされている。ＴＢに対する大量の予防接種を可能にする費用効果的な送達システムも必要とされている。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１Ａ】多価ｅｓｘワクチンプラスミドの構築物と三価発現ベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現とを示す。
【図１Ｂ】５つのｅｓｘ構築物に対する抗原発現を示すデータを提供する。
【図２Ａ】多価ＴＢワクチン構築物に対する修飾アミノ酸挿入配列を示す。
【図２Ｂ−１】多価ＴＢワクチン構築物に対する修飾アミノ酸挿入配列を示す。
【図２Ｂ−２】多価ＴＢワクチン構築物に対する修飾アミノ酸挿入配列を示す。
【図３】多価ワクチン投与に反応した体液性免疫応答を示す。
【図４Ａ】多価ワクチンに対する細胞性免疫応答を示す棒グラフを提供する。
【図４Ｂ】多価ワクチンに対する細胞性免疫応答を示す棒グラフを提供する。
【図４Ｃ】多価ワクチンに対する細胞性免疫応答を示す棒グラフを提供する。
【図５Ａ】新しいバージョンのｐＶＳＷ、ｐＢＣＵ、ｐＤＱＥ、ｐＨＡＴ、およびｐＯＲＦ（ｐＶＳＷ．２、ｐＢＣＵ．２、ｐＤＱＥ．２、ｐＨＡＴ．２、およびｐＯＲＦ．２）インサートおよびプラスミドの構築物を示し、プラスミドでトランスフェクトした哺乳類細胞でインサートが発現されることを示す実験結果を含む。
【図５Ｂ】新しいバージョンのｐＶＳＷ、ｐＢＣＵ、ｐＤＱＥ、ｐＨＡＴ、およびｐＯＲＦ（ｐＶＳＷ．２、ｐＢＣＵ．２、ｐＤＱＥ．２、ｐＨＡＴ．２、およびｐＯＲＦ．２）インサートおよびプラスミドの構築物を示し、プラスミドでトランスフェクトした哺乳類細胞でインサートが発現されることを示す実験結果を含む。
【図６Ａ】実験計画、および、５つの新しいバージョンのプラスミド（新しいバージョンのｐＶＳＷ、ｐＢＣＵ、ｐＤＱＥ、ｐＨＡＴ、およびｐＯＲＦ（ｐＶＳＷ．２、ｐＢＣＵ．２、ｐＤＱＥ．２、ｐＨＡＴ．２、およびｐＯＲＦ．２））の各々に含まれる３つのｅｓｘ−特異的な抗原の各々に対して誘発された免疫応答を比較した実験結果を示す。図６Ａは、実験計画を示す。
【図６Ｂ】実験計画、および、５つの新しいバージョンのプラスミド（新しいバージョンのｐＶＳＷ、ｐＢＣＵ、ｐＤＱＥ、ｐＨＡＴ、およびｐＯＲＦ（ｐＶＳＷ．２、ｐＢＣＵ．２、ｐＤＱＥ．２、ｐＨＡＴ．２、およびｐＯＲＦ．２））の各々に含まれる３つのｅｓｘ−特異的な抗原の各々に対して誘発された免疫応答を比較した実験結果を示す。図６Ｂは、新しいバージョンのプラスミドｐＤＱＥを接種したマウスにおけるｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥに対する免疫応答の実験結果を示す。
【図６Ｃ】実験計画、および、５つの新しいバージョンのプラスミド（新しいバージョンのｐＶＳＷ、ｐＢＣＵ、ｐＤＱＥ、ｐＨＡＴ、およびｐＯＲＦ（ｐＶＳＷ．２、ｐＢＣＵ．２、ｐＤＱＥ．２、ｐＨＡＴ．２、およびｐＯＲＦ．２））の各々に含まれる３つのｅｓｘ−特異的な抗原の各々に対して誘発された免疫応答を比較した実験結果を示す。図６Ｃは、新しいバージョンのプラスミドｐＶＳＷを接種したマウスにおけるｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷに対する免疫応答の実験結果を示す。
【図６Ｄ】実験計画、および、５つの新しいバージョンのプラスミド（新しいバージョンのｐＶＳＷ、ｐＢＣＵ、ｐＤＱＥ、ｐＨＡＴ、およびｐＯＲＦ（ｐＶＳＷ．２、ｐＢＣＵ．２、ｐＤＱＥ．２、ｐＨＡＴ．２、およびｐＯＲＦ．２））の各々に含まれる３つのｅｓｘ−特異的な抗原の各々に対して誘発された免疫応答を比較した実験結果を示す。図６Ｄは、新しいバージョンのプラスミドｐＢＣＵを接種したマウスにおけるｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵに対する免疫応答の実験結果を示す。
【図６Ｅ】実験計画、および、５つの新しいバージョンのプラスミド（新しいバージョンのｐＶＳＷ、ｐＢＣＵ、ｐＤＱＥ、ｐＨＡＴ、およびｐＯＲＦ（ｐＶＳＷ．２、ｐＢＣＵ．２、ｐＤＱＥ．２、ｐＨＡＴ．２、およびｐＯＲＦ．２））の各々に含まれる３つのｅｓｘ−特異的な抗原の各々に対して誘発された免疫応答を比較した実験結果を示す。図６Ｅは、新しいバージョンのプラスミドｐＨＡＴを接種したマウスにおけるｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴに対する免疫応答の実験結果を示す。
【図６Ｆ】実験計画、および、５つの新しいバージョンのプラスミド（新しいバージョンのｐＶＳＷ、ｐＢＣＵ、ｐＤＱＥ、ｐＨＡＴ、およびｐＯＲＦ（ｐＶＳＷ．２、ｐＢＣＵ．２、ｐＤＱＥ．２、ｐＨＡＴ．２、およびｐＯＲＦ．２））の各々に含まれる３つのｅｓｘ−特異的な抗原の各々に対して誘発された免疫応答を比較した実験結果を示す。図６Ｆは、新しいバージョンのプラスミドｐＯＲＦを接種したマウスにおけるｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦに対する免疫応答の実験結果を示す。
【図７Ａ】新しいバージョンのｐＶＳＷ、ｐＢＣＵ、ｐＤＱＥ、ｐＨＡＴ、およびｐＯＲＦ（ｐＶＳＷ．２、ｐＢＣＵ．２、ｐＤＱＥ．２、ｐＨＡＴ．２、およびｐＯＲＦ．２）の組み合わせを接種した後のｅｓｘ−特異的なＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞応答を評価した実験結果を示す。図７Ａは、ＩＦＮ−およびＴＮＦ−サイトカインの両方に対して陽性であるＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の周波数の分析に用いたゲーティング手法（ｇａｔｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）を示す。
【図７Ｂ】新しいバージョンのｐＶＳＷ、ｐＢＣＵ、ｐＤＱＥ、ｐＨＡＴ、およびｐＯＲＦ（ｐＶＳＷ．２、ｐＢＣＵ．２、ｐＤＱＥ．２、ｐＨＡＴ．２、およびｐＯＲＦ．２）の組み合わせを接種した後のｅｓｘ−特異的なＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞応答を評価した実験結果を示す。図７Ｂは、ｅｓｘ−特異的なＣＤ４  Ｔ細胞の免疫応答を示す。
【図７Ｃ】新しいバージョンのｐＶＳＷ、ｐＢＣＵ、ｐＤＱＥ、ｐＨＡＴ、およびｐＯＲＦ（ｐＶＳＷ．２、ｐＢＣＵ．２、ｐＤＱＥ．２、ｐＨＡＴ．２、およびｐＯＲＦ．２）の組み合わせを接種した後のｅｓｘ−特異的なＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞応答を評価した実験結果を示す。図７Ｃは、ｅｓｘ−特異的なＣＤ４  Ｔ細胞の免疫応答を示す。
【図８Ａ】実験計画、および、ＲＳＱ−１５（新しいバージョンのｐＶＳＷ、ｐＢＣＵ、ｐＤＱＥ、ｐＨＡＴ、およびｐＯＲＦ（ｐＶＳＷ．２、ｐＢＣＵ．２、ｐＤＱＥ．２、ｐＨＡＴ．２、およびｐＯＲＦ．２）の各々のカクテル）で免疫化した動物における免疫応答と、ＴＢワクチンＢＣＧにより誘発された免疫応答とを比較した実験結果を示す。
【図８Ｂ】実験計画、および、ＲＳＱ−１５（新しいバージョンのｐＶＳＷ、ｐＢＣＵ、ｐＤＱＥ、ｐＨＡＴ、およびｐＯＲＦ（ｐＶＳＷ．２、ｐＢＣＵ．２、ｐＤＱＥ．２、ｐＨＡＴ．２、およびｐＯＲＦ．２）の各々のカクテル）で免疫化した動物における免疫応答と、ＴＢワクチンＢＣＧにより誘発された免疫応答とを比較した実験結果を示す。
【図８Ｃ】実験計画、および、ＲＳＱ−１５（新しいバージョンのｐＶＳＷ、ｐＢＣＵ、ｐＤＱＥ、ｐＨＡＴ、およびｐＯＲＦ（ｐＶＳＷ．２、ｐＢＣＵ．２、ｐＤＱＥ．２、ｐＨＡＴ．２、およびｐＯＲＦ．２）の各々のカクテル）で免疫化した動物における免疫応答と、ＴＢワクチンＢＣＧにより誘発された免疫応答とを比較した実験結果を示す。
【図９Ａ】実験計画、および、ＢＣＧで免疫化し、かつ、ＲＳＱ−１５を１回もしくは２回ブーストしたかもしくはＲＳＱ−１５をブーストしなかった動物におけるｅｓｘ−特異的な免疫応答を比較したプライムブースト実験結果を示す。
【図９Ｂ】実験計画、および、ＢＣＧで免疫化し、かつ、ＲＳＱ−１５を１回もしくは２回ブーストしたかもしくはＲＳＱ−１５をブーストしなかった動物におけるｅｓｘ−特異的な免疫応答を比較したプライムブースト実験結果を示す。
【図９Ｃ】実験計画、および、ＢＣＧで免疫化し、かつ、ＲＳＱ−１５を１回もしくは２回ブーストしたかもしくはＲＳＱ−１５をブーストしなかった動物におけるｅｓｘ−特異的な免疫応答を比較したプライムブースト実験結果を示す。
【図１０Ａ】新しいバージョンのｐＯＲＦ、ｐＨＡＴ、またはｐＶＳＷ（ｐＯＲＦ．２、ｐＨＡＴ．２、またはｐＶＳＷ．２）で誘発された、サブファミリーのオルソログメンバーに対する免疫応答の交差反応を示す。
【図１０Ｂ】新しいバージョンのｐＯＲＦ、ｐＨＡＴ、またはｐＶＳＷ（ｐＯＲＦ．２、ｐＨＡＴ．２、またはｐＶＳＷ．２）で誘発された、サブファミリーのオルソログメンバーに対する免疫応答の交差反応を示す。
【図１０Ｃ】新しいバージョンのｐＯＲＦ、ｐＨＡＴ、またはｐＶＳＷ（ｐＯＲＦ．２、ｐＨＡＴ．２、またはｐＶＳＷ．２）で誘発された、サブファミリーのオルソログメンバーに対する免疫応答の交差反応を示す。
【発明の概要】
【０００５】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、全長の少なくとも９０％を有するその断片、少なくとも９５％の相同性を持つ相同配列、少なくとも９５％の相同性を持つ相同配列の断片、全長の少なくとも９０％を有する少なくとも９５％の相同性を持つ相同配列の前記断片からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む組成物を提供する。
【０００６】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、および配列番号２７からなる群から選択される核酸分子を含む組成物を提供する。
【０００７】
配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、および配列番号２７を提供する。
【０００８】
配列番号１９を含むプラスミドと、配列番号２１を含むプラスミドと、配列番号２３を含むプラスミドと、配列番号２５を含むプラスミドと、配列番号２７を含むプラスミドとを含む組成物を提供する。
【０００９】
Ｖ−Ｓ−Ｗ構築物を含むプラスミドと、Ｄ−Ｑ−Ｅ構築物を含むプラスミドと、Ｈ−Ａ−Ｔ構築物を含むプラスミドと、Ｂ−Ｃ−Ｕ構築物を含むプラスミドと、Ｏ−Ｒ−Ｆ構築物を含むプラスミドとを含む組成物を提供する。
【００１０】
個体におけるＴＢに対する免疫応答の誘発方法を提供する。
【００１１】
ＴＢと診断された個体の治療方法を提供する。
【００１２】
個体におけるＴＢ感染の予防方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ＤＮＡワクチン技術を用いた実施形態を含めて、安全で有効かつ経済的なＴＢワクチンを提供する。免疫原性ＴＢ抗原に対して免疫応答を誘発し、ＴＢに対する感染を防御し、かつ、ＴＢに感染した個体に有効な治療を提供することができる方法において、ＴＢワクチンを用いることができる。ＤＮＡワクチン技術を用いて、大規模な個体群に対するＴＢワクチンの費用効果的な送達を提供することができ、ＴＢに対する大量の予防接種を可能にする。
【００１４】
ワクチンの安価な生産、保管、輸送、および投与は、大規模な集団に費用効果的な方法でワクチン投与するのに最適である。表１は、ワクチンとしての使用が現在研究されているＴＢ抗原を示す。
【００１５】
【表１】
2016516075.tif 000002
【００１６】
多価ワクチンアプローチは、複数の抗原を同時標的とすることで広範な免疫応答を生み出すことができる点で魅力的である。遺伝子の全ファミリーを一度に標的とすることは、細菌が宿主免疫から逃れる能力を限定するため、大きな利点である。この点に関して、ＴＢからの遺伝子の全ファミリーを標的とする最初の包括的な多価ワクチンを本明細書で提供する。多価ワクチンは、２３個のタンパク質からなる早期分泌抗原標的６−ｋＤａ（ｅｓａｔ−６）タンパク質ファミリーに的を絞っている。これらのタンパク質は、重要な病原性因子であるため魅力的な標的であり、異なる生理学的条件下で発現する可能性がある。そのため、これらのメンバー全てを標的にできれば、細菌のライフサイクルにおける複数の段階に対する防御をもたらすものである。先の研究では、このファミリーのごく僅かなメンバーをワクチン免疫原として分析するに限られていた。現行のワクチンは、この遺伝子ファミリーにおいて２、３以上の数の遺伝子を標的としていない。ここでは、筋肉内注射およびｉｎ  ｖｉｖｏエレクトロポレーションで送達される最適化ＤＮＡワクチン候補を用いて、抗原レパートリーを増やし、ＴＢに対して広範な免疫を生み出す新規のアプローチを開発した。多価ＴＢワクチンにおいて全てのｅｓｘファミリーメンバーを表わすｅｓｘファミリー遺伝子全体を組み込んだ合成ＴＢ  ＤＮＡワクチンを開発した。かかるワクチンは、免疫標的化の飛躍的な改善と、ＴＢワクチン開発への期待を表わしている。この開発に寄与したプラスミド技術における複数の改善について以下に概説する。
【００１７】
早期分泌抗原標的６−ｋＤａ（ｅｓａｔ−６）タンパク質ファミリーは、有効なＴＢワクチンに対する免疫原性標的を提供する。多価ワクチンは、広範な標的を提供する。２３個の異なるｅｓａｔ−６タンパク質ファミリーメンバーのうち、いくつかのｅｓａｔ−６タンパク質は、単一のタンパク質標的が複数のＴＢ  ｅｓａｔ−６タンパク質を認識する免疫応答を誘発できるように、十分な相同性を持つ。ＤＮＡワクチンを用いて、複数の免疫原性タンパク質のコード配列を単一の多価タンパク質に含めることができる。複数の異なる構築物を組み合わせて使用し、ｅｓａｔ−６タンパク質ファミリーメンバーに対する免疫応答を誘発することができる。
【００１８】
ｅｓａｔ−６ファミリーは、２３個の低質量タンパク質（ｅｓｘＡ〜ｅｓｘＷ）からなり、少なくとも１０個はさらに、配列に関する高い相同性によりサブファミリーに分割することができる。一方のサブファミリーは、９２〜９８％のタンパク質相同性を持つ５つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなるＭｔｂ９．９サブファミリーである（表２）。他方のサブファミリーは、９８％を超えるタンパク質レベルの個別同一性を共有する５つの隣接ＯＲＦからなるＱＩＬＳＳサブファミリーである。
【００１９】
本明細書に開示されているワクチンにおいて、Ｍｔｂ９．９サブファミリーからの２つの抗原、ｅｓｘＯおよびｅｓｘＶを、広範な免疫応答を誘発するのに有用な代表的な抗原として選択した。ＴＢ抗原ｅｓｘＩ、ｅｓｘＬ、およびｅｓｘＮは使用していないが、ｅｓｘＯおよびｅｓｘＶと近い構造関係により、ｅｓｘＯおよびｅｓｘＶを、ＭＴｂ９．９サブファミリーの抗原に対する標的とすることができる。
【００２０】
同様に、ｅｓｘＷをＱＬＩＳＳサブファミリーから選び、５つの抗原ｅｓｘＪ、ｅｓｘＫ、ｅｓｘＭ、ｅｓｘＰ、およびｅｓｘＷを含むサブファミリーを表わした。
【００２１】
さらに、２つの他のｅｓａｔ−６タンパク質ｅｓｘＳおよびｅｓｘＧは、９６％の相同性を共有するため、ｅｓｘＳは、両方の抗原を表わす。
【００２２】
高レベルの相同性を持つ他の抗原の代表としてこれらの抗原を選択することで、ＴＢの制御に関連する全てのメンバーに交差反応性免疫応答を誘発しなくてはならない。残りの１１個のｅｓａｔ−６遺伝子は互いに相同性をほとんど持たないため、全て単一の抗原カセットとして組み込んだ。全体として、全部で１５個のｅｓａｔ−６抗原を使用し、これら１５個のｅｓａｔ−６抗原は、ｅｓａｔ−６ファミリーの２３個のメンバー全てに対する標的を提供する。
【００２３】
【表２】
2016516075.tif 000003
【００２４】
表３は、ＴＢ感染を予防し、かつ、ＴＢに感染した個体を治療することができるワクチンに使用することができる９個の構築物を示す。上に記載されているように、ｅｓｘＯ、ｅｓｘＶ、ｅｓｘＷ、およびｅｓｘＳを選択し、広範な免疫応答を誘発する抗原のプレゼンテーションにおいて密接に関連付けられた抗原としてそれらを表わした。
【００２５】
【表３】
2016516075.tif 000004
【００２６】
これら１４個のベクターの各々の構築物はＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを有する。ＩｇＥシグナルペプチドは任意であり、本開示はＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含む配列を明示的に開示し、残基を持たないかあるいはＮ末端メチオニンを持つＩｇＥシグナルペプチドを除く配列、または、別のタンパク質からシグナルペプチドの付加を受け入れる部位も明示的に開示しているものと理解されるべきである。
【００２７】
同様に、各配列は、Ｃ末端にＨＡタグを含む。この構造は必要ではなく、いくつかの実施形態においては望ましくない。本開示は、Ｃ末端にＨＡタグを含む配列を明示的に開示し、ＨＡタグを除いた配列も明示的に開示しているものと理解されるべきである。
【００２８】
構築物は、フリン開裂部位を提供する。ワクチン投与を受けた個体の細胞に一般に存在するプロテアーゼにより処理される他のプロテアーゼ開裂部位は、フリン部位に代えて用いることができる。
【００２９】
実施例に記載のように、タンパク質配列を修飾して、翻訳後の炭水化物の付加パターンを変更させた。これらの修飾を維持することは、いくつかの実施形態において非常に望ましい。
【００３０】
構築物は、所与のプラスミドの抗原の順序を変更するかあるいはグルーピングを並べ替えることで、再配列してもよいし、そうでなければ、変更してもよい。
【００３１】
ＴＢ抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、ｅｓｘＷ、ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、ｅｓｘＥ、ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＴ、ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、ｅｓｘＵ、ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、ｅｓｘＦをコードする複数のプラスミドの核酸配列を含むワクチンを提供し、タンパク質配列は、Ｃマンノシル化変異株およびＮ連結グリコシル化変異株に対して修飾される。抗原（ｅｓｘＡ、ｅｓｘＥ、ｅｓｘＦ、ｅｓｘＵ、ｅｓｘＷ）は、変異（Ｎ−Ｘ−Ｓ／ＴからＮ−Ｘ−Ａ）したＮ連結グリコシル化カノニカル配列部位のアミノ酸を有する。Ｃマンノシル化カノニカル配列部位を持つアミノ酸も変異させる（Ｗ−Ｘ−Ｘ−Ｗ（配列番号２９）からＷ−Ｘ−Ｘ−Ａ（配列番号３０）、または、Ｗ−Ｘ−Ｘ−Ｗ（配列番号２９）からＡ−Ｘ−Ｘ−Ｗ（配列番号３１））。
【００３２】
いくつかの実施形態において、５つのプラスミドを含むワクチンを提供し、各プラスミドは、ｅｓｘ抗原に対するコード配列を有する。いくつかの実施形態において、ワクチンは、Ｖ−Ｓ−Ｗ構築物を含むプラスミドと、Ｄ−Ｑ−Ｅ構築物を含むプラスミドと、Ｈ−Ａ−Ｔ構築物を含むプラスミドと、Ｂ−Ｃ−Ｕ構築物を含むプラスミドと、Ｏ−Ｒ−Ｆ構築物を含むプラスミドとを含む組成物である。いくつかのかかる実施形態において、Ｖ−Ｓ−Ｗ構築物を含むプラスミドは、配列番号１９または配列番号１を含み得る。いくつかのかかる実施形態において、Ｄ−Ｑ−Ｅ構築物を含むプラスミドは、配列番号２１または配列番号３を含み得る。いくつかのかかる実施形態において、Ｈ−Ａ−Ｔ構築物を含むプラスミドは、配列番号２３または配列番号５を含み得る。いくつかのかかる実施形態において、Ｂ−Ｃ−Ｕ構築物を含むプラスミドは、配列番号２５または配列番号７を含み得る。いくつかのかかる実施形態において、Ｏ−Ｒ−Ｆ構築物を含むプラスミドは、配列番号２７または配列番号９を含み得る。いくつかの実施形態において、ワクチンは、ａ）配列番号１９または配列番号１を含むプラスミドと、ｂ）配列番号２１または配列番号３を含むプラスミドと、ｃ）配列番号２３または配列番号５を含むプラスミドと、ｄ）配列番号２５または配列番号７を含むプラスミドと、ｅ）配列番号２７または配列番号９を含むプラスミドとを含む組成物である。いくつかの実施形態において、ワクチンは、ａ）配列番号１９を含むプラスミドと、ｂ）配列番号２１を含むプラスミドと、ｃ）配列番号２３を含むプラスミドと、ｄ）配列番号２５を含むプラスミドと、ｅ）配列番号２７を含むプラスミドとを含む組成物である。
【００３３】
１．定義
本明細書で使用する専門用語は、特定の実施形態を説明することだけを目的としており、限定することを意図していない。本明細書および添付請求項で用いられるように、単数形である「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上例外が明記されていない限り、複数形の意味を持つこともある。
【００３４】
本明細書中の数値範囲の記述について、同程度の精度でその間に入る各数が明示的に企図される。例えば、６〜９という範囲の場合、６および９に加えて７および８という数が企図され、６．０〜７．０という範囲の場合、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０という数が明示的に企図される。
【００３５】
ａ．アジュバント
本明細書で用いられる「アジュバント」は、本明細書の以下に記載されるＤＮＡプラスミドおよびコード核酸配列によりコードされる１つ以上のＴＢ抗原の抗原性を高めるために本明細書に記載のＤＮＡプラスミドワクチンに添加される任意の分子を意味し得る。
【００３６】
ｂ．抗体
「抗体」は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥの抗体、またはその断片もしくは誘導体（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄを含む）、ならびにその一本鎖抗体、ダイアボディ、二重特異性抗体、二機能性抗体、および誘導体を意味し得る。抗体は、哺乳動物の血清サンプルから単離された抗体、ポリクローナル抗体、親和性精製抗体、またはこれらの混合物のうち、所望のエピトープまたはそれに由来する配列に対する十分な結合特異性を示すものであり得る。
【００３７】
ｃ．コード配列
本明細書で使用する、「コード配列」または「コード化核酸」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、核酸の投与先である個体または哺乳動物の細胞中の発現を誘導できるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントと機能的に連結した、開始および終了シグナルをさらに含むことができる。
【００３８】
ｄ．相補体
本明細書で使用する、「相補体」または「相補的」は、ある核酸が、ヌクレオチド間または核酸分子のヌクレオチド類似体間にワトソン・クリック（例えば、Ａ-Ｔ／ＵおよびＣ-Ｇ）またはフーグスティーン塩基対を表わすことを意味し得る。
【００３９】
ｅ．コンセンサスまたはコンセンサス配列
本明細書で用いられる「コンセンサス」または「コンセンサス配列」は、特定のＴＢ抗原の複数のサブタイプのアライメント分析に基づいて構築された合成核酸配列またはそれに対応するポリペプチド配列を意味し得る。配列を用いて、特定のＴＢ抗原の複数のサブタイプまたは血清型に対する幅広い免疫を誘導することができる。コンセンサスＴＢ抗原は、本明細書に記載のｅｓａｔ−６ファミリーのタンパク質のコンセンサスアミノ酸配列を含み得る。コンセンサスアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列も提供される。また、融合タンパク質などの合成抗原を操作して、コンセンサス配列（またはコンセンサス抗原）に含めることができる。
【００４０】
ｆ．定電流
本明細書で使用する、「定電流」は、組織、または該組織を規定する細胞が、同組織に送達される電気パルスの持続期間中に受容するまたは経験する電流を定義する。電気パルスは、本明細書に記載の電気穿孔装置から送達される。この電流は、電気パルスの寿命期間中、該組織に定電流量で留まるが、それは、本明細書で提供される電気穿孔装置が、好ましくは瞬間的フィードバックを有する、フィードバック素子を有するからである。フィードバック素子は、パルスの持続期間中の組織（または細胞）の抵抗を測定し、電気穿孔装置に自身の電気エネルギー出力を変化させる（例えば、電圧を上げる）ようにすることができるので、同組織中の電流は、電気パルスの間ずっと（約マイクロ秒）、およびパルス間において、一定であり続ける。いくつかの実施形態において、フィードバック素子は、制御器を含む。
【００４１】
ｇ．電流フィードバックまたはフィードバック
本明細書で使用する、「電流フィードバック」または「フィードバック」は互換的に使用されており、提供される電気穿孔装置の活発な応答を意味し得るが、これは、電極間の組織の電流を測定することと、電流を一定レベルで維持するために、ＥＰ装置が送達するエネルギー出力を適宜変化させることとを含む。この一定レベルは、パルスシーケンスまたは電気処理を開始する前に、ユーザが予め設定する。電気穿孔装置の中の電気回路が、電極間の組織の電流を連続的にモニターし、そのモニターされた電流（または組織中の電流）を予め設定された電流と比較し、連続的にエネルギー出力の調整を行なって、モニターされた電流を予め設定されたレベルで維持することができるように、フィードバックは、電気穿孔装置の電気穿孔構成要素、例えば、制御器によって達成され得る。フィードバックループは瞬時のものであり得、それは、フィードバックループがアナログ閉ループフィードバックであるからである。
【００４２】
ｈ．分散電流
本明細書で使用する、「分散電流」は、本明細書に記載の電気穿孔装置の様々な針電極アレイから送達される電流のパターンを意味し得、これらのパターンは、電気穿孔される任意の組織領域に対する電気穿孔関連の熱ストレスの発生を最小限に抑えるか、または好ましくは消失させる。
【００４３】
ｉ．電気穿孔
本明細書で互換的に使用する、「電気穿孔」、「電気透過処理」、「界面動電増強」（「ＥＰ」）は、生体膜に微細経路（細孔）を生じさせるための膜貫通電場パルスの使用を意味し得る。こうした微細経路の存在により、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬剤、イオン、および水などの生体分子が、細胞膜の片側から他方の側に通過することが可能になる。
【００４４】
ｊ．フィードバック機構
本明細書で使用する、「フィードバック機構」は、ソフトウェアまたはハードウェア（もしくはファームウェア）のいずれかによって実行されるプロセスであって、（エネルギーパルスの送達前、送達中、および／または送達後の）所望の組織のインピーダンスを受容し、それを現在値、好ましくは電流と比較し、送達されるエネルギーパルスを調整して、予め設定された値を達成するプロセスを指し得る。フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路により実施され得る。
【００４５】
ｋ．断片
「断片」は、特定のＴＢ抗原を認識することで哺乳類においてＴＢに対する免疫応答を誘発することができるＴＢ抗原またはポリプロテインのポリペプチド断片を意味し得る。ＴＢ抗原は、ＩｇＥシグナルペプチドを備えているかまたは備えていないかのいずれの場合にも、ｅｓａｔ−６タンパク質ファミリー：ｅｓｘＡ〜ｅｓｘＷの２３個のメンバーのみならずＴＢ抗原Ａｇ８５ＡおよびＡｇ８５Ｂの１つであってもよく、シグナルペプチドおよび／または１位にメチオニンを備えているかまたは備えていないかのいずれの場合にも、本明細書に記載のコンセンサス配列に９８％以上相同であるタンパク質、本明細書に記載のコンセンサス配列に９９％以上相同であるタンパク質、本明細書に記載のコンセンサス配列に１００％同一のタンパク質の１つであってもよい。断片とは、これらのタンパク質の全長未満のものを指し得る。断片は、例えば、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥシグナルペプチドまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドに連結したＴＢ免疫原の断片を含んでいてもよく、含んでいなくともよい。
「断片」は、上述のＴＢ抗原断片をコードする核酸断片のことも意味し得る。
【００４６】
ｌ．遺伝子構築物
本明細書で使用する、「遺伝子構築物」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を指す。コード配列は、核酸分子の投与先である個体の細胞中の発現を誘導できるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントと機能的に連結した、開始および終了シグナルを含む。本明細書で使用する「発現可能な形態」という用語は、個体の細胞中に存在しているときにコード配列が発現するように、タンパク質をコードするコード配列に機能的に連結している必要な調節要素を含んでいる遺伝子構築物を指す。
【００４７】
ｍ．相同性
本明細書で使用する「相同性」は、相補性の度合いのことを指す。部分的相同性または完全相同性（即ち、同一性）があり得る。部分的に相補的な配列とは、完全に相補的な配列が標的核酸配列とハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害するもののことであり、これは「実質的に相同な」という機能的用語を用いて呼ばれる。ｃＤＮＡまたはゲノムクローンなどの二本鎖核酸配列に言及して用いる場合、「実質的に相同な」という用語は、低ストリンジェンシー条件下で二本鎖核酸配列のストランドとハイブリダイズし得るプローブのことを指す。一本鎖核酸配列に言及して用いる場合、「実質的に相同な」という用語は、低ストリンジェンシー条件下で一本鎖核酸鋳型配列（たとえば、その相補体）とハイブリダイズし得るプローブのことを指す。
【００４８】
ｎ．同一
本明細書において２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈で使用する「同一」または「同一性」は、当該配列が指定領域に渡って指定の割合の同一残基を有することを意味し得る。この割合を計算するには、２つの配列を最適に整列させ、指定領域に渡って２つの配列を比較し、両配列の同一残基が発生する位置の数を確定して一致位置の数を得て、一致位置の数を指定領域の総位置数で割り、計算結果に１００を掛けることにより、配列同一性のパーセント値が得られる。２つの配列の長さが異なるか、アライメントにより１つ以上の付着末端が生じ、指定の比較領域に単一配列のみが含まれる場合には、単一配列の残基を計算の分母に含めるが、分子には含めない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合には、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）を同等とみなすことができる。同一性の計算は、手動で行っても、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ  ２．０等のコンピューター配列アルゴリズムを使用して行ってもよい。
【００４９】
ｏ．インピーダンス
本明細書で使用する、「インピーダンス」は、フィードバック機構を論ずる際に用いられ、かつ、オームの法則に従って電流値に変換することができるため、予め設定された電流と比較することができる。
【００５０】
ｐ．免疫応答
本明細書で使用する、「免疫応答」は、提供されたＤＮＡプラスミドワクチンを介した１つ以上のＴＢ抗原の導入に応答して、宿主の免疫系、例えば哺乳動物の免疫系が活性化することを意味し得る。この免疫応答は、細胞性もしくは体液性の形態、またはその両方であり得る。
【００５１】
ｑ．核酸
本明細書で使用する、「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、互いに共有結合している少なくとも２つのヌクレオチドを意味し得る。一本鎖を表現することにより、相補鎖の配列も定義される。したがって、核酸は、表現される一本鎖の相補鎖も包含する。ある核酸の多くの変異体を、所与の核酸として同一目的で使用できる。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸およびその相補体も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズできるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
【００５２】
核酸は、一本鎖または二本鎖であってもよく、二本鎖と一本鎖の両方の配列の一部分を含むこともできる。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであってもよく、核酸はデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組み合わせを含むことができ、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含むことができる。核酸は、化学合成法または組み換え法により取得できる。
【００５３】
ｒ．機能的に連結
本明細書で使用する、「機能的に連結」は、遺伝子と空間的に接続しているプロモーターの制御下で遺伝子が発現することを意味し得る。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置できる。プロモーターと遺伝子の間の距離は、プロモーターの派生元遺伝子において当該プロモーターが制御する遺伝子とプロモーターの間の距離とほぼ同一であってもよい。当技術分野で知られているように、プロモーター機能を失うことなく、この距離の変化に適応することができる。
【００５４】
ｓ．プロモーター
本明細書で使用する、「プロモーター」は、核酸の細胞中発現を授与、活性化、または増強することのできる合成分子または天然由来分子を意味し得る。プロモーターは、発現をさらに増強し、かつ／または空間的発現および／またはその一時的発現を改変する目的で、１つ以上の特定の転写調節配列を含むことができる。プロモーターは遠位のエンハンサーエレメントまたは抑制エレメントを含むこともでき、このエンハンサーエレメントまたは抑制エレメントは、転写開始部位から数千塩基対も離れた場所に位置できる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む源に由来してよい。プロモーターは、発現が発生する細胞、組織、もしくは臓器に関して、もしくは発現が生じる発生段階に関して、恒常的もしくは差次的に遺伝子成分の発現を調節でき、または、例えば生理的ストレス、病原体、金属イオン、誘発剤等の外部刺激に応答して遺伝子成分の発現を調節できる。プロモーターの代表例として、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ  ＩＥプロモーターが挙げられる。
【００５５】
ｔ．シグナルペプチド
「シグナルペプチド」および「リーダー配列」は、本明細書で互換的に使用され、本明細書に記載のタンパク質のアミノ末端に結合することができるアミノ酸配列を指す。一般に、シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質の局在化を指示する。本明細書で使用するシグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質を産生する細胞からタンパク質を分泌し易くすることが好ましい。シグナルペプチド／リーダー配列は、細胞からの分泌時に、タンパク質（しばしば成熟タンパク質と呼ばれる）の残余から切断されることが多い。シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のＮ末端に結合する。
【００５６】
ｕ．ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
本明細書で使用する、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、例えば核酸の複合混合物において、第１の核酸配列（例えばプローブ）が第２の核酸配列（例えば標的）とハイブリダイズする際の条件を意味し得る。ストリンジェントな条件は配列に依存するため、状況によって異なる。ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度ｐＨにおける特定の配列に対する融点（Ｔm）より約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔmは、（規定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である（標的配列は過剰に存在するので、Ｔmにおいて、プローブの５０％が平衡状態で占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３において約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、例えば約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）では最低約３０℃、長いプローブ（例えば約５０ヌクレオチド超）では最低約６０℃であり得る。ストリンジェントな条件は、ホルムアミド等の不安定化剤の添加によって達成することもできる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルはバックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍であり得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件例には、以下の条件が含まれる：５０％ホルムアミド、５倍ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベート。または、５倍ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベート、０．２倍ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６５℃での洗浄。
【００５７】
ｖ．実質的に相補的
本明細書で使用する、「実質的に相補的」は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域に渡って、第１の配列が第２の配列の相補体と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であること、あるいは、２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味し得る。
【００５８】
ｗ．実質的に同一
本明細書で使用する、「実質的に同一」は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域に渡って、第１の配列と第２の配列が少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であること、あるいは、核酸に関して、第１の配列が第２の配列の相補体と実質的に相補的である場合を意味し得る。
【００５９】
ｘ．サブタイプ
「サブタイプ」または「血清型」は、本明細書で互換的に使用され、ＨＢＶに関連し、あるサブタイプが異なるサブタイプとは別の免疫系により認識されるような、ＨＢＶの遺伝的変異体を意味する。
【００６０】
ｙ．変異体
核酸に関して本明細書で使用する、「変異体」は、（ｉ）基準ヌクレオチド配列の一部分もしくは断片；（ｉｉ）基準ヌクレオチド配列もしくはその一部分の相補体；（ｉｉｉ）基準核酸もしくはその相補体と実質的に同一の核酸；または（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、基準核酸、その相補体、もしくはその実質的に同一の配列とハイブリダイズする核酸を意味し得る。
【００６１】
ペプチドまたはポリペプチドに関して使用する、「変異体」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によりアミノ酸配列が異なっているが、少なくとも１つの生物活性を保持しているものである。また、変異体は、基準タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、あるアミノ酸を類似特性（例えば、荷電領域の親水性、程度、および分布）の別のアミノ酸に置換することは、当技術分野では、通常は軽微な変化を伴うものと認識されている。こうした軽微な変化は、当技術分野で理解されているように、アミノ酸の疎水性親水性指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）を検討することにより部分的に特定できる。Ｋｙｔｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性親水性指標は、その疎水性と電荷の考察に基づく。類似の疎水性親水性指標を有するアミノ酸は置換可能であり、その後もタンパク質機能を維持することが当技術分野において公知である。一態様において、±２の疎水性親水性指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性を用いて、生物機能を保持したタンパク質となる置換を明らかにすることもできる。ペプチドに関連してアミノ酸の親水性を検討することにより、そのペプチドの局所的な最大平均親水性を計算でき、抗原性および免疫原性と良く相関すると報告されている有用な尺度となる。米国特許第４，５５４，１０１号（この文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。当技術分野で理解されているように、類似の親水性値を有するアミノ酸を置換すると、例えば免疫原性等の生物活性を保持したペプチドが得られる。親水性値が互いに±２以内のアミノ酸を用いて、置換を実施できる。アミノ酸の疎水性指標と親水性値の両方とも、そのアミノ酸の特定の側鎖の影響を受ける。こうした知見と一致して、生物機能に適合するアミノ酸置換とは、アミノ酸の相対的類似性、特に当該アミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存するものと理解されており、この相対的類似性は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、その他の特性により明らかになる。
【００６２】
ｚ．ベクター
本明細書で使用する、「ベクター」は、複製起点を含む核酸配列を意味し得る。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であってもよい。ベクターは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。ベクターは、自己複製過剰染色体ベクターまたは宿主ゲノムに組み込むベクターのいずれかであってもよい。
【００６３】
２．ＴＢ抗原およびＴＢ抗原のコード配列
１４個の多価構築物を提供し、各々は、２つ以上のＴＢ抗原の融合タンパク質をコードする。コード配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、および配列番号２８に記載のアミノ酸配列に含まれるＴＢ抗原をコードし得る。
【００６４】
配列番号２は、３つのＴＢ抗原：ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのアミノ酸配列を有する単一のポリプロテインを含む。配列番号２はＮ末端に任意のＩｇＥリーダー配列を含む。この構築物は、２つの選択肢：ＩｇＥリーダーを持つものと持たないものとして見なされるべきものである。後者の場合、開始コドンは、ＩｇＥリーダーをコードする配列の代わりに設けてもよい。配列番号１は、高レベルの発現用に設計された配列番号２をコードする特定のコード配列を提供する。構築物は、ｐＶＳＷと呼んでもよい。配列番号１は、Ｖ−Ｓ−Ｗコード配列である。
【００６５】
配列番号４は、３つのＴＢ抗原：ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのアミノ酸配列を有する単一のポリプロテインを含む。配列番号４はＮ末端に任意のＩｇＥリーダー配列を含む。この構築物は、２つの選択肢：ＩｇＥリーダーを持つものと持たないものとして見なされるべきものである。後者の場合、開始コドンは、ＩｇＥリーダーをコードする配列の代わりに設けてもよい。配列番号３は、高レベルの発現用に設計された配列番号４をコードする特定のコード配列を提供する。構築物は、ｐＤＱＥと呼んでもよい。配列番号３は、Ｄ−Ｑ−Ｅコード配列である。
【００６６】
配列番号６は、３つのＴＢ抗原：ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのアミノ酸配列を有する単一のポリプロテインを含む。配列番号６はＮ末端に任意のＩｇＥリーダー配列を含む。この構築物は、２つの選択肢：ＩｇＥリーダーを持つものと持たないものとして見なされるべきものである。後者の場合、開始コドンは、ＩｇＥリーダーをコードする配列の代わりに設けてもよい。配列番号５は、高レベルの発現用に設計された配列番号６をコードする特定のコード配列を提供する。構築物は、ｐＨＡＴと呼んでもよい。配列番号５は、Ｈ−Ａ−Ｔコード配列である。
【００６７】
配列番号８は、３つのＴＢ抗原：ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのアミノ酸配列を有する単一のポリプロテインを含む。配列番号８はＮ末端に任意のＩｇＥリーダー配列を含む。この構築物は、２つの選択肢：ＩｇＥリーダーを持つものと持たないものとして見なされるべきものである。後者の場合、開始コドンは、ＩｇＥリーダーをコードする配列の代わりに設けてもよい。配列番号７は、高レベルの発現用に設計された配列番号８をコードする特定のコード配列を提供する。構築物は、ｐＢＣＵと呼んでもよい。構築物は、ｐＨＡＴと呼んでもよい。配列番号７は、Ｂ−Ｃ−Ｕコード配列である。
【００６８】
配列番号１０は、３つのＴＢ抗原：ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのアミノ酸配列を有する単一のポリプロテインを含む。配列番号１０はＮ末端に任意のＩｇＥリーダー配列を含む。この構築物は、２つの選択肢：ＩｇＥリーダーを持つものと持たないものとして見なされるべきものである。後者の場合、開始コドンは、ＩｇＥリーダーをコードする配列の代わりに設けてもよい。配列番号９は、高レベルの発現用に設計された配列番号１０をコードする特定のコード配列を提供する。構築物は、ｐＯＲＦと呼んでもよい。配列番号９は、Ｏ−Ｒ−Ｆコード配列である。
【００６９】
配列番号１２は、ＴＢ抗原ｅｓｘ−Ａの３つのコピーを有する単一のポリプロテインを含む。配列番号１２は、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＡをコードし、Ｎ末端に任意のＩｇＥリーダー配列を含む。この構築物は、２つの選択肢：ＩｇＥリーダーを持つものと持たないものとして見なされるべきものである。後者の場合、開始コドンは、ＩｇＥリーダーをコードする配列の代わりに設けてもよい。配列番号１２は、高レベルの発現用に設計された配列番号１１をコードする特定のコード配列を提供する。構築物は、ＴＥ６と呼んでもよい。
【００７０】
配列番号１４は、２つのＴＢ抗原：Ａｇ８５ＡおよびｅｓｘＡのアミノ酸配列を有する単一のポリプロテインを含む。配列番号１４はＮ末端に任意のＩｇＥリーダー配列を含む。この構築物は、２つの選択肢：ＩｇＥリーダーを持つものと持たないものとして見なされるべきものである。後者の場合、開始コドンは、ＩｇＥリーダーをコードする配列の代わりに設けてもよい。配列番号１３は、高レベルの発現用に設計された配列番号１４をコードする特定のコード配列を提供する。構築物は、ＡＥ６と呼んでもよい。
【００７１】
配列番号１６は、２つのＴＢ抗原：Ａｇ８５ＢおよびｅｓｘＡのアミノ酸配列を有する単一のポリプロテインを含む。配列番号１６はＮ末端に任意のＩｇＥリーダー配列を含む。この構築物は、２つの選択肢：ＩｇＥリーダーを持つものと持たないものとして見なされるべきものである。後者の場合、開始コドンは、ＩｇＥリーダーをコードする配列の代わりに設けてもよい。配列番号１５は、高レベルの発現用に設計された配列番号１６をコードする特定のコード配列を提供する。構築物は、ＢＥ６と呼んでもよい。
【００７２】
配列番号１８は、６つのＴＢ抗原：ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＵ、ｅｓｘＳ、ｅｓｘＤ、およびｅｓｘＶのアミノ酸配列を有する単一のポリプロテインを含む。配列番号１８はＮ末端に任意のＩｇＥリーダー配列を含む。この構築物は、２つの選択肢：ＩｇＥリーダーを持つものと持たないものとして見なされるべきものである。後者の場合、開始コドンは、ＩｇＥリーダーをコードする配列の代わりに設けてもよい。配列番号１７は、高レベルの発現用に設計された配列番号１８をコードする特定のコード配列を提供する。構築物は、ｐｈＤＶと呼んでもよい。
【００７３】
配列番号２０は、３つのＴＢ抗原：ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのアミノ酸配列を有する単一のポリプロテインを含む。配列番号２０はＮ末端に任意のＩｇＥリーダー配列を含む。配列番号２０は、Ｃ末端に任意のＨＡ−Ｔａｇ配列も含む。この構築物は、選択肢：ＩｇＥリーダーを有していてもよいし、有していなくてもよい構築物、かつ、独立して、ＨＡ−Ｔａｇを有していてもよいし、有していなくてもよい構築物として見なされるべきものである。ＩｇＥリーダーを持たないこれらの実施形態の場合において、開始コドンは、ＩｇＥリーダーをコードする配列の代わりに設けてもよい。配列番号１９は、高レベルの発現用に設計された配列番号２０をコードする特定のコード配列を提供する。配列番号１９は、ｅｓｘ抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷをコードするコード配列を含む新しいバージョンのｐＶＳＷ（１００５ｂｐ）最適化配列の核酸配列である。構築物は、新しいバージョンのｐＯＲＦ（ｐＯＲＦ．２）と呼んでもよい。配列番号１９は、Ｖ−Ｓ−Ｗコード配列である。
【００７４】
配列番号２２は、３つのＴＢ抗原：ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのアミノ酸配列を有する単一のポリプロテインを含む。配列番号２２はＮ末端に任意のＩｇＥリーダー配列を含む。配列番号２２は、Ｃ末端に任意のＨＡ−Ｔａｇ配列も含む。この構築物は、選択肢：ＩｇＥリーダーを有していてもよいし、有していなくてもよい構築物、かつ、独立して、ＨＡ−Ｔａｇを有していてもよいし、有していなくてもよい構築物として見なされるべきものである。ＩｇＥリーダーを持たないこれらの実施形態の場合において、開始コドンは、ＩｇＥリーダーをコードする配列の代わりに設けてもよい。配列番号２１は、高レベルの発現用に設計された配列番号２２をコードする特定のコード配列を提供する。配列番号２１は、ｅｓｘ抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥをコードするコード配列を含む新しいバージョンのｐＤＱＥ（１０８９ｂｐ）最適化配列の核酸配列である。構築物は、新しいバージョンのｐＤＱＥ（ｐＤＱＥ．２）と呼んでもよい。配列番号２１は、Ｄ−Ｑ−Ｅコード配列である。
【００７５】
配列番号２４は、３つのＴＢ抗原：ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのアミノ酸配列を有する単一のポリプロテインを含む。配列番号２４はＮ末端に任意のＩｇＥリーダー配列を含む。配列番号２４は、Ｃ末端に任意のＨＡ−Ｔａｇ配列も含む。この構築物は、選択肢：ＩｇＥリーダーを有していてもよいし、有していなくてもよい構築物、かつ、独立して、ＨＡ−Ｔａｇを有していてもよいし、有していなくてもよい構築物として見なされるべきものである。ＩｇＥリーダーを持たないこれらの実施形態の場合において、開始コドンは、ＩｇＥリーダーをコードする配列の代わりに設けてもよい。配列番号２３は、高レベルの発現用に設計された配列番号２４をコードする特定のコード配列を提供する。配列番号２３は、ｅｓｘ抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴをコードするコード配列を含む新しいバージョンのｐＨＡＴ（１０１１ｂｐ）最適化配列の核酸配列である。構築物は、新しいバージョンのｐＨＡＴ（ｐＨＡＴ．２）と呼んでもよい。配列番号２３は、Ｈ−Ａ−Ｔコード配列である。
【００７６】
配列番号２６は、３つのＴＢ抗原：ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのアミノ酸配列を有する単一のポリプロテインを含む。配列番号２６はＮ末端に任意のＩｇＥリーダー配列を含む。配列番号２６は、Ｃ末端に任意のＨＡ−Ｔａｇ配列も含む。この構築物は、選択肢：ＩｇＥリーダーを有していてもよいし、有していなくてもよい構築物、かつ、独立して、ＨＡ−Ｔａｇを有していてもよいし、有していなくてもよい構築物として見なされるべきものである。ＩｇＥリーダーを持たないこれらの実施形態の場合において、開始コドンは、ＩｇＥリーダーをコードする配列の代わりに設けてもよい。配列番号２５は、高レベルの発現用に設計された配列番号２６をコードする特定のコード配列を提供する。配列番号２５は、ｅｓｘ抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵをコードするコード配列を含む新しいバージョンのｐＢＣＵ（１０９８ｂｐ）最適化配列の核酸配列である。構築物は、新しいバージョンのｐＢＣＵ（ｐＢＣＵ．２）と呼んでもよい。配列番号２５は、Ｂ−Ｃ−Ｕコード配列である。
【００７７】
配列番号２８は、３つのＴＢ抗原：ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのアミノ酸配列を有する単一のポリプロテインを含む。配列番号２８はＮ末端に任意のＩｇＥリーダー配列を含む。配列番号２８は、Ｃ末端に任意のＨＡ−Ｔａｇ配列も含む。この構築物は、選択肢：ＩｇＥリーダーを有していてもよいし、有していなくてもよい構築物、かつ、独立して、ＨＡ−Ｔａｇを有していてもよいし、有していなくてもよい構築物として見なされるべきものである。ＩｇＥリーダーを持たないこれらの実施形態の場合において、開始コドンは、ＩｇＥリーダーをコードする配列の代わりに設けてもよい。配列番号２７は、高レベルの発現用に設計された配列番号２８をコードする特定のコード配列を提供する。配列番号２７は、ｅｓｘ抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦをコードするコード配列を含む新しいバージョンのｐＯＲＦ（１０１７ｂｐ）最適化配列の核酸配列である。構築物は、新しいバージョンのｐＯＲＦ（ｐＯＲＦ．２）と呼んでもよい。配列番号２７は、Ｏ−Ｒ−Ｆコード配列である。
【００７８】
ＴＢ抗原は、ＩｇＥシグナルペプチドを備えているかまたは備えていないかのいずれの場合にも、ｅｓａｔ−６タンパク質ファミリー：ｅｓｘＡ〜ｅｓｘＷの２３個のメンバーのみならずＴＢ抗原Ａｇ８５ＡおよびＡｇ８５Ｂの１つであってもよく、シグナルペプチドおよび／または１位にメチオニンを備えているかまたは備えていないかのいずれの場合にも、本明細書に記載のコンセンサス配列に９８％以上相同であるタンパク質、本明細書に記載のコンセンサス配列に９９％以上相同であるタンパク質、本明細書に記載のコンセンサス配列に１００％同一のタンパク質の１つであってもよい。断片は、例えば、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥシグナルペプチドまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドに連結したＴＢ免疫原の断片を含んでいてもよく、含んでいなくともよい。
【００７９】
ＴＢ抗原は、任意のＩｇＥシグナルペプチドを除くいずれの場合にも、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、または配列番号２８、または、配列番号２における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つ、または、配列番号４における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つ、または、配列番号６における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つ、または、配列番号８における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つ、または、配列番号１０における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つ、または、配列番号１２における抗原ｅｓｘＡ、または、配列番号１４における個々の抗原Ａｇ８５ＡおよびｅｓｘＡのいずれか１つ、または、配列番号１６における個々の抗原Ａｇ８５ＢおよびｅｓｘＡのいずれか１つ、または、配列番号１８における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＵ、ｅｓｘＳ、ｅｓｘＤ、およびｅｓｘ−Ｖのいずれか１つ、または、配列番号２０における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つ、または、配列番号２２における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つ、または、配列番号２４における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つ、または、配列番号２６における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つ、または、配列番号２８における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つを含み得る。
【００８０】
ＴＢタンパク質の相同タンパク質は、ＩｇＥシグナルペプチドを除く配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、および配列番号２８に９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上相同であってもよく、任意のＩｇＥシグナルペプチドを除くいずれの場合にも、配列番号２における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つに、配列番号４における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つに、配列番号６における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つに、配列番号８における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つに、配列番号１０における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つに、配列番号１２における抗原ｅｓｘＡに、配列番号１４における個々の抗原Ａｇ８５ＡおよびｅｓｘＡのいずれか１つに、配列番号１６における個々の抗原Ａｇ８５ＢおよびｅｓｘＡのいずれか１つに、配列番号１８における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＵ、ｅｓｘＳ、ｅｓｘＤ、およびｅｓｘ−Ｖのいずれか１つに、配列番号２０における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つに、配列番号２２における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つに、配列番号２４における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つに、配列番号２６における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つに、配列番号２８における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つに９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上相同であるタンパク質であってもよい。
【００８１】
ＴＢタンパク質の断片は、ＩｇＥシグナルペプチドを除いて、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、および配列番号２８の２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み得る。断片は、任意のＩｇＥシグナルペプチドを除くいずれの場合にも、配列番号２における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つ、配列番号４における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つ、配列番号６における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つ、配列番号８における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つ、配列番号１０における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つ、配列番号１２における抗原ｅｓｘＡ、配列番号１４における個々の抗原Ａｇ８５ＡおよびｅｓｘＡのいずれか１つ、配列番号１６における個々の抗原Ａｇ８５ＢおよびｅｓｘＡのいずれか１つ、配列番号１８における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＵ、ｅｓｘＳ、ｅｓｘＤ、およびｅｓｘ−Ｖのいずれか１つ、配列番号２０における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つ、配列番号２２における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つ、配列番号２４における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つ、配列番号２６における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つ、配列番号２８における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上も含み得る。
【００８２】
ＴＢタンパク質の断片は、相同タンパク質の断片であってもよい。かかる断片は、ＩｇＥシグナルペプチドを除く配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、および配列番号２８のいずれか１つに９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上相同であるタンパク質の２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含む。ＴＢタンパク質の断片は、任意のＩｇＥシグナルペプチドを除くいずれの場合にも、配列番号２における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つに、配列番号４における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つに、配列番号６における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つに、配列番号８における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つに、配列番号１０における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つに、配列番号１２における抗原ｅｓｘＡに、配列番号１４における個々の抗原Ａｇ８５ＡおよびｅｓｘＡのいずれか１つに、配列番号１６における個々の抗原Ａｇ８５ＢおよびｅｓｘＡのいずれか１つに、配列番号１８における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＵ、ｅｓｘＳ、ｅｓｘＤ、およびｅｓｘ−Ｖのいずれか１つに、配列番号２０における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つに、配列番号２２における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つに、配列番号２４における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つに、配列番号２６における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つに、配列番号２８における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つに９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上相同であるタンパク質の２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み得る。
【００８３】
ＴＢ抗原コード配列は、ＩｇＥシグナルペプチドのコード配列を除く配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、または配列番号２７を含み得る。ＴＢ抗原コード配列は、任意のＩｇＥシグナルペプチドを除くいずれの場合にも、配列番号２における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つ、配列番号４における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つ、または、配列番号６における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つ、または、配列番号８における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つ、または、配列番号１０における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つ、配列番号１２における抗原ｅｓｘＡ、または、配列番号１４における個々の抗原Ａｇ８５ＡおよびｅｓｘＡのいずれか１つ、または、配列番号１６における個々の抗原Ａｇ８５ＢおよびｅｓｘＡのいずれか１つ、または、配列番号１８における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＵ、ｅｓｘＳ、ｅｓｘＤ、およびｅｓｘ−Ｖのいずれか１つ、配列番号２０における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つ、配列番号２２における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つ、または、配列番号２４における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つ、または、配列番号２６における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つ、または、配列番号２８における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つをコードする核酸配列も含み得る。
【００８４】
ＴＢ抗原をコードするコード配列に相同であるコード配列は、ＩｇＥシグナルペプチドのコード配列を除く配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、および配列番号２７に９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上相同であってもよい。ＴＢ抗原をコードするコード配列に相同であるコード配列は、任意のＩｇＥシグナルペプチドをコードするコード配列を除くいずれの場合にも、配列番号１における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つのコード配列に、配列番号３における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つのコード配列に、配列番号５における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つのコード配列に、配列番号７における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つのコード配列に、配列番号９における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つのコード配列に、配列番号１１における抗原ｅｓｘ−Ａに、配列番号１３における個々の抗原Ａｇ８５ＡおよびｅｓｘＡのいずれか１つのコード配列に、配列番号１５における個々の抗原Ａｇ８５ＢおよびｅｓｘＡのいずれか１つのコード配列に、配列番号１７における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＵ、ｅｓｘＳ、ｅｓｘＤ、およびｅｓｘ−Ｖのいずれか１つのコード配列に、配列番号１９における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つのコード配列に、配列番号２１における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つのコード配列に、配列番号２３における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つのコード配列に、配列番号２５における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つのコード配列に、および、配列番号２７における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つのコード配列に９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上相同であるコード配列であってもよい。
【００８５】
ＴＢ抗原コード配列の断片は、特定の全長ＴＢ抗原コード配列のコード配列の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である全長コード配列の断片を含み得る。ＴＢ抗原コード配列の断片は、任意のＩｇＥシグナルペプチドを除くいずれの場合にも、配列番号２における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つ、配列番号４における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つ、配列番号６における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つ、配列番号８における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つ、配列番号１０における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つ、配列番号１２における抗原ｅｓｘＡ、配列番号１４における個々の抗原Ａｇ８５ＡおよびｅｓｘＡのいずれか１つ、配列番号１６における個々の抗原Ａｇ８５ＢおよびｅｓｘＡのいずれか１つに、配列番号１８における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＵ、ｅｓｘＳ、ｅｓｘＤ、およびｅｓｘ−Ｖのいずれか１つ、配列番号２０における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つ、配列番号２２における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つ、配列番号２４における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つ、配列番号２６における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つ、配列番号２８における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上をコードする核酸配列を含み得る。
【００８６】
ＴＢ抗原コード配列に相同であるコード配列の断片は、ＩｇＥシグナルペプチドを除く配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、および配列番号２８に９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上相同であるコード配列の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み得る。
【００８７】
ＴＢ抗原コード配列に相同であるコード配列の断片は、任意のＩｇＥシグナルペプチドを除くいずれの場合にも、配列番号２における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つに、配列番号４における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つに、配列番号６における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つに、配列番号８における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つに、配列番号１０における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つに、配列番号１２における抗原ｅｓｘＡに、配列番号１４における個々の抗原Ａｇ８５ＡおよびｅｓｘＡのいずれか１つに、配列番号１６における個々の抗原Ａｇ８５ＢおよびｅｓｘＡのいずれか１つに、配列番号１８における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＵ、ｅｓｘＳ、ｅｓｘＤ、およびｅｓｘ−Ｖのいずれか１つに、配列番号２０における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つに、配列番号２２における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つに、配列番号２４における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つに、配列番号２６における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つに、配列番号２８における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つに９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上相同であるコード配列の２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み得る。
【００８８】
遺伝子構築物は、核酸のコード配列の遺伝子発現の調節エレメントを含み得る。調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、停止コドン、またはポリアデニル化シグナルであり得る。
【００８９】
核酸配列は、ベクターになり得る遺伝子構築物を作成することができる。ベクターは、哺乳類内において免疫応答を誘発するのに有効な量の抗原を該哺乳類の細胞内で発現することができる。ベクターは、組み換えであり得る。ベクターは、抗原をコードする異種核酸を含み得る。ベクターは、プラスミドであり得る。ベクターは、抗原をコードする核酸で細胞をトランスフェクトするのに有用であり得、形質転換された宿主細胞を、抗原の発現が起こる条件下で培養し、維持する。
【００９０】
コード配列は、安定性および高レベルな発現のために最適化され得る。場合によっては、コドンを選択し、ＲＮＡの二次構造の形成、例えば、分子間結合により形成されるものを減らす。
【００９１】
３．プラスミド
本明細書で提供されるのは、哺乳類内において免疫応答を誘発するのに有効な量の多価ＴＢ構築物を該哺乳類の細胞内で発現することができるベクターである。ベクターは、１つ以上のＴＢ抗原をコードする異種核酸を含み得る。ベクターは、プラスミドであり得る。プラスミドは、ＴＢ抗原をコードする核酸で細胞をトランスフェクトするのに有用であり得、形質転換された宿主細胞を、ＴＢ抗原の発現が起こる条件下で培養し、維持する。
【００９２】
プラスミドは、ＩｇＥリーダーを備えているかまたは備えていない配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、および配列番号２８をコードするコード配列を含み得る。プラスミドは、任意のＩｇＥシグナルペプチドを除くいずれの場合にも、配列番号２における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つ、または、配列番号４における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つ、または、配列番号６における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つ、または、配列番号８における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つ、配列番号１０における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つ、配列番号１２における抗原ｅｓｘＡに、または、配列番号１４における個々の抗原Ａｇ８５ＡおよびｅｓｘＡのいずれか１つ、または、配列番号１６における個々の抗原Ａｇ８５ＢおよびｅｓｘＡのいずれか１つ、または、配列番号１８における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＵ、ｅｓｘＳ、ｅｓｘＤ、およびｅｓｘ−Ｖのいずれか１つ、または、配列番号２０における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つ、または、配列番号２２における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つ、または、配列番号２４における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つ、または、配列番号２６における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つ、配列番号２８における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つをコードするコード配列を含み得る。
【００９３】
プラスミドは、ＩｇＥリーダーを備えているかまたは備えていない配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、および配列番号２８に９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上相同であるタンパク質をコードするコード配列を含み得る。プラスミドは、任意のＩｇＥシグナルペプチドを除くいずれの場合にも、配列番号２における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つに、配列番号４における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つに、配列番号６における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つに、配列番号８における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つに、配列番号１０における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つに、配列番号１２における抗原ｅｓｘＡに、配列番号１４における個々の抗原Ａｇ８５ＡおよびｅｓｘＡのいずれか１つに、配列番号１６における個々の抗原Ａｇ８５ＢおよびｅｓｘＡのいずれか１つに、配列番号１８における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＵ、ｅｓｘＳ、ｅｓｘＤ、およびｅｓｘ−Ｖのいずれか１つに、配列番号２０における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つに、配列番号２２における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つに、配列番号２４における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つに、配列番号２６における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つに、配列番号２８における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つに９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上相同であるタンパク質をコードするコード配列を含み得る。
【００９４】
プラスミドは、ＩｇＥリーダーを備えているかまたは備えていない配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、および配列番号２８のコード配列の２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上をコードするコード配列を含み得る。プラスミドは、任意のＩｇＥシグナルペプチドを除くいずれの場合にも、配列番号２における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つ、または、配列番号４における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つ、または、配列番号６における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つ、または、配列番号８における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つ、または、配列番号１０における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つ、または、配列番号１２における抗原ｅｓｘＡ、または、配列番号１４における個々の抗原Ａｇ８５ＡおよびｅｓｘＡのいずれか１つ、または、配列番号１６における個々の抗原Ａｇ８５ＢおよびｅｓｘＡのいずれか１つ、または、配列番号１８における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＵ、ｅｓｘＳ、ｅｓｘＤ、およびｅｓｘ−Ｖのいずれか１つ、配列番号２０における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つ、または、配列番号２２における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つ、または、配列番号２４における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つ、または、配列番号２６における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つ、または、配列番号２８における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つをコードするコード配列の２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上をコードするコード配列を含み得る。
【００９５】
プラスミドは、ＩｇＥリーダーを備えているかまたは備えていない配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、および配列番号２８に９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上相同であるコード配列の２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上をコードするコード配列を含み得る。プラスミドは、任意のＩｇＥシグナルペプチドを除くいずれの場合にも、配列番号２における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つに、配列番号４における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つに、配列番号６における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つに、配列番号８における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つに、配列番号１０における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つに、配列番号１２における抗原ｅｓｘＡに、配列番号１４における個々の抗原Ａｇ８５ＡおよびｅｓｘＡのいずれか１つに、配列番号１６における個々の抗原Ａｇ８５ＢおよびｅｓｘＡのいずれか１つに、配列番号１８における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＵ、ｅｓｘＳ、ｅｓｘＤ、およびｅｓｘ−Ｖのいずれか１つに、配列番号２０における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つに、配列番号２２における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つに、配列番号２４における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つに、配列番号２６における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つに、配列番号２８における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つに９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上相同であるタンパク質をコードするコード配列の２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上をコードするコード配列を含み得る。
【００９６】
プラスミドは、ＩｇＥリーダーを備えているかまたは備えていない配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、または配列番号２７を含み得る。プラスミドは、任意のＩｇＥシグナルペプチドを除くいずれの場合にも、配列番号１における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つ、または、配列番号３における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つ、または、配列番号５における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つ、または、配列番号７における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つ、または、配列番号９における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つ、または、配列番号１１における抗原ｅｓｘＡ、または、配列番号１３における個々の抗原Ａｇ８５ＡおよびｅｓｘＡのいずれか１つ、または、配列番号１５における個々の抗原Ａｇ８５ＢおよびｅｓｘＡのいずれか１つ、または、配列番号１７における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＵ、ｅｓｘＳ、ｅｓｘＤ、およびｅｓｘ−Ｖのいずれか１つ、または、配列番号１９における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つ、または、配列番号２１における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つ、または、配列番号２３における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つ、または、配列番号２５における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つ、または、配列番号２５における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つをコードするコード配列を含み得る。
【００９７】
プラスミドは、ＩｇＥリーダーを備えているかまたは備えていない配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、および配列番号２７に９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上相同であるタンパク質をコードするコード配列を含み得る。プラスミドは、任意のＩｇＥシグナルペプチドを除くいずれの場合にも、配列番号１における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つに、配列番号３における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つに、配列番号５における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つに、配列番号７における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つに、配列番号９における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つに、配列番号１１における抗原ｅｓｘＡに、配列番号１３における個々の抗原Ａｇ８５ＡおよびｅｓｘＡのいずれか１つに、配列番号１５における個々の抗原Ａｇ８５ＢおよびｅｓｘＡのいずれか１つに、および、配列番号１７における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＵ、ｅｓｘＳ、ｅｓｘＤ、およびｅｓｘ−Ｖのいずれか１つに９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上相同であるタンパク質をコードするコード配列を含み得る。
【００９８】
プラスミドは、ＩｇＥリーダーを備えているかまたは備えていない配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、および配列番号２７のコード配列の２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上をコードするコード配列を含み得る。プラスミドは、任意のＩｇＥシグナルペプチドを除くいずれの場合にも、配列番号１における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つ、または、配列番号３における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つ、配列番号５における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つ、または、配列番号７における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つ、または、配列番号９における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つ、配列番号１１における抗原ｅｓｘＡ、または、配列番号１３における個々の抗原Ａｇ８５ＡおよびｅｓｘＡのいずれか１つ、または、配列番号１５における個々の抗原Ａｇ８５ＢおよびｅｓｘＡのいずれか１つ、または、配列番号１７における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＵ、ｅｓｘＳ、ｅｓｘＤ、およびｅｓｘ−Ｖのいずれか１つ、または、配列番号１９における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つ、または、配列番号２１における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つ、配列番号２３における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つ、または、配列番号２５における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つ、または、配列番号２７における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つをコードするコード配列の２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上をコードするコード配列を含み得る。
【００９９】
プラスミドは、ＩｇＥリーダーを備えているかまたは備えていない配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、および配列番号２７に９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上相同であるコード配列の２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上をコードするコード配列を含み得る。プラスミドは、任意のＩｇＥシグナルペプチドを除くいずれの場合にも、配列番号１における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つに、配列番号３における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つに、配列番号５における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つに、配列番号７における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つに、配列番号９における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つに、配列番号１１における抗原ｅｓｘＡに、配列番号１３における個々の抗原Ａｇ８５ＡおよびｅｓｘＡのいずれか１つに、配列番号１５における個々の抗原Ａｇ８５ＢおよびｅｓｘＡのいずれか１つに、配列番号１７における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＵ、ｅｓｘＳ、ｅｓｘＤ、およびｅｓｘ−Ｖのいずれか１つに、配列番号１９における個々の抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷのいずれか１つに、配列番号２１における個々の抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥのいずれか１つに、配列番号２３における個々の抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴのいずれか１つに、配列番号２５における個々の抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵのいずれか１つに、配列番号２７における個々の抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦのいずれか１つに９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上相同であるタンパク質をコードするコード配列の２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上をコードするコード配列を含み得る。
【０１００】
本明細書に開示されている実施形態は、３０個のタンパク質のコード配列を含む９つのプラスミドからなる。いくつかの重複はあるが、９つのプラスミドによりコードされる３０個のタンパク質が依然として存在する。いくつかの実施形態において、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個のプラスミドがある。コード配列は、異なる順序でもよい。コード配列は、本明細書に開示されている実施形態における他のプラスミド上であると示されるコード配列を持つプラスミド上に含まれる異なるプラスミド上であってもよい。
【０１０１】
プラスミドは、コード配列の上流であってもよい開始コドンと、コード配列の下流であってもよい終止コドンとをさらに含み得る。開始コドンおよび終止コドンは、コード配列とインフレームであり得る。
【０１０２】
プラスミドは、コード配列に機能的に連結しているプロモーターを含み得る。コード配列に機能的に連結しているプロモーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター、エプステインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであり得る。プロモーターは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子からのプロモーターであってもよい。プロモーターは、筋肉または皮膚特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターでよく、天然もしくは合成であってもよい。かかるプロモーターの例は、米国特許公開公報ＵＳ２００４０１７５７２７に記載され、その内容は全体として本明細書に組み入れられる。
【０１０３】
プラスミドは、ポリアデニル化シグナルを含み得、これは、コード配列の下流であり得る。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ−グロビンポリアデニル化シグナルであってもよい。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４プラスミド（インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州）からのポリアデニル化シグナルであってもよい。
【０１０４】
プラスミドは、コード配列の上流にエンハンサーを含み得る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、または、ＣＭＶ、ＦＭＤＶ、ＲＳＶ、またはＥＢＶなどのウイルスエンハンサーであってもよい。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号、およびＷＯ９４／０１６７３７に記載されており、それぞれの内容は参照により全体が組み入れられる。
【０１０５】
プラスミドは、プラスミドを染色体外に維持し、かつ、細胞中でプラスミドの複数のコピーを産生するために哺乳類の複製起点も含んでいてもよい。プラスミドは、インビトロジェン（サンディエゴ、カリフォルニア州）からのｐＶＡＸＩ、ｐＣＥＰ４、またはｐＲＥＰ４であって、これらは、エプステイン・バー・ウイルスの複製起点と、核抗原ＥＢＮＡ−１のコード領域とを含んでいてもよく、統合しないで高いコピーのエピソーム複製を生じる。
【０１０６】
ベクターは、本明細書に記載の変異体プラスミドなどの、変化を有するｐＶＡＸ１またはｐＶａｘ１変異体であってもよい。変異体ｐＶａｘ１プラスミドは、骨格ベクタープラスミドｐＶＡＸ１（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州）の２９９８塩基対変異体である。ＣＭＶプロモーターは、塩基１３７〜７２４に位置する。Ｔ７プロモーター／プライミング部位は、塩基６６４〜６８３にある。複数のクローニング部位は、塩基６９６〜８１１にある。ウシＧＨポリアデニル化シグナルは、塩基８２９〜１０５３にある。カナマイシン耐性遺伝子は、塩基１２２６〜２０２０にある。ｐＵＣオリジンは、塩基２３２０〜２９９３にある。
【０１０７】
インビトロジェン社から入手可能なｐＶＡＸ１の配列に基づき、本明細書に記載のプラスミド１〜６の骨格として使用されたｐＶＡＸ１の配列中に以下の変異が見つかった：
Ｃ＞Ｇ２４１         ＣＭＶプロモーター中
Ｃ＞Ｔ １９４２      骨格、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）の下流
Ａ＞−  ２８７６     骨格、カナマイシン遺伝子の下流
Ｃ＞Ｔ ３２７７      ｐＵＣ複製起点（Ｏｒｉ）多コピー変異中（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９８５参照）
Ｇ＞Ｃ ３７５３      ＲＮＡＳｅＨ部位の上流のｐＵＣ  Ｏｒｉの末端中
塩基対２、３、及び４は、ＣＭＶプロモーター上流の骨格中でＡＣＴからＣＴＧに変化している。
ベクターの骨格は、ｐＡＶ０２４２であってもよい。ベクターは、複製欠損アデノウイルス５型（Ａｄ５）ベクターであってもよい。
【０１０８】
プラスミドは、調節配列も含んでもよく、これは、プラスミドを投与された細胞中での遺伝子発現に十分に適し得る。コード配列は、宿主細胞内においてコード配列をより効率的に転写することができるコドンを含み得る。
【０１０９】
コード配列は、Ｉｇリーダー配列を含み得る。リーダー配列は、コード配列の５’であり得る。この配列によりコードされるコンセンサス抗原は、コンセンサス抗原タンパク質に続くＮ末端Ｉｇリーダーを含み得る。Ｎ末端Ｉｇリーダーは、ＩｇＥまたはＩｇＧであり得る。
【０１１０】
プラスミドは、ｐＳＥ４２０（インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州）であってもよく、それを大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）中でのタンパク質産生のために用いてもよい。プラスミドは、ｐＹＥＳ２（インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州）であってもよく、それを酵母のサッカロマイセス・セレビシエ株でのタンパク質産生に用いてもよい。プラスミドは、ＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州）のものであってもよく、それを昆虫細胞中でのタンパク質産生に用いてもよい。プラスミドは、ｐｃＤＮＡ  ＩまたはｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州）であってもよく、それを哺乳類細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中でのタンパク質産生に用いてもよい。
【０１１１】
４．医薬組成物およびワクチン
核酸分子を含む組成物が提供される。例えば、組成物は、複数（６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の異なるプラスミドを含み得る。
【０１１２】
組成物は、ベクターｐＶＳＷ、ｐＤＱＥ、ｐＨＡＴ、ｐＢＣＵ、ｐＯＲＦ、ＴＥ６。ＡＥ６、ＢＥ６、ｐｈＤＶ、ｐＶＳＷ．２、ｐＤＱＥ．２、ｐＨＡＴ．２、ｐＢＣＵ．２、ｐＯＲＦ．２を含み得る。様々な数のプラスミドとの他の組み合わせを用いてもよい。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、５つのプラスミドを含むワクチンを提供し、各プラスミドは、ｅｓｘ抗原に対するコード配列を有する。いくつかの実施形態において、ワクチンは、Ｖ−Ｓ−Ｗ構築物を含むプラスミドと、Ｄ−Ｑ−Ｅ構築物を含むプラスミドと、Ｈ−Ａ−Ｔ構築物を含むプラスミドと、Ｂ−Ｃ−Ｕ構築物を含むプラスミドと、Ｏ−Ｒ−Ｆ構築物を含むプラスミドとを含む組成物である。いくつかのかかる実施形態において、Ｖ−Ｓ−Ｗ構築物を含むプラスミドは、配列番号１９または配列番号１を含み得る。いくつかのかかる実施形態において、Ｄ−Ｑ−Ｅ構築物を含むプラスミドは、配列番号２１または配列番号３を含み得る。いくつかのかかる実施形態において、Ｈ−Ａ−Ｔ構築物を含むプラスミドは、配列番号２３または配列番号５を含み得る。いくつかのかかる実施形態において、Ｂ−Ｃ−Ｕ構築物を含むプラスミドは、配列番号２５または配列番号７を含み得る。いくつかのかかる実施形態において、Ｏ−Ｒ−Ｆ構築物を含むプラスミドは、配列番号２７または配列番号９を含み得る。いくつかの実施形態において、ワクチンは、ａ）配列番号１９または配列番号１を含むプラスミドと、ｂ）配列番号２１または配列番号３を含むプラスミドと、ｃ）配列番号２３または配列番号５を含むプラスミドと、ｄ）配列番号２５または配列番号７を含むプラスミドと、ｅ）配列番号２７または配列番号９を含むプラスミドとを含む組成物である。いくつかの実施形態において、ワクチンは、ａ）配列番号１９を含むプラスミドと、ｂ）配列番号２１を含むプラスミドと、ｃ）配列番号２３を含むプラスミドと、ｄ）配列番号２５を含むプラスミドと、ｅ）配列番号２７を含むプラスミドとを含む組成物である。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、組成物は、ケモカインＣＣＬ２０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、および／またはＩＬ−２８のコード配列をさらに含む。ケモカインＣＣＬ２０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、および／またはＩＬ−２８のコード配列は、１つ以上のＴＢ抗原のコード配列を含む１つ以上の核酸分子上に含まれていてもよい。ケモカインＣＣＬ２０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、および／またはＩＬ−２８のコード配列は、別個のプラスミドなどの別個の核酸分子上に含まれていてもよい。
【０１１５】
本明細書で提供されるのは、ＴＢに対する免疫応答を哺乳類内で生成することが可能なワクチンである。ワクチンは、上述の各プラスミドを含み得る。ワクチンは、複数のプラスミド、またはその組み合わせを含み得る。治療的または予防的な免疫応答を誘発するワクチンが提供される。
【０１１６】
ワクチンは、医薬組成物の形態であり得る。医薬組成物は、ワクチンを含み得る。
【０１１７】
ワクチンは、コンセンサス抗原およびプラスミドを約１ナノグラム〜約１００ミリグラム；約１マイクログラム〜約１０ミリグラム；好ましくは約０．１マイクログラム〜約１０ミリグラム；さらに好ましくは約１ミリグラム〜約２ミリグラムの量で含んでいてもよい。いくつかの好ましい実施形態において、本発明による医薬組成物は、ＤＮＡを約５ナノグラム〜約１０００マイクログラム含む。いくつかの好ましい実施形態において、医薬組成物は、ＤＮＡを約１０ナノグラム〜約８００マイクログラム含む。いくつかの好ましい実施形態において、医薬組成物は、コンセンサス抗原またはそのプラスミドを約２５〜約２５０マイクログラム、約１００〜約２００マイクログラム、約１ナノグラム〜１００ミリグラム；約１マイクログラム〜約１０ミリグラム；約０．１マイクログラム〜約１０ミリグラム；約１ミリグラム〜約２ミリグラム、約５ナノグラム〜約１０００マイクログラム、約１０ナノグラム〜約８００マイクログラム、約０．１〜約５００マイクログラム、約１〜約３５０マイクログラム、約２５〜約２５０マイクログラム、約１００〜約２００マイクログラム含む。医薬組成物は、ワクチンＤＮＡを約５ナノグラム〜約１０ｍｇ含み得る。いくつかの実施形態において、本発明による医薬組成物は、ワクチンＤＮＡを約２５ナノグラム〜約５ｍｇ含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＤＮＡを約５０ナノグラム〜約１ｍｇ含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＤＮＡを約０．１〜約５００マイクログラム含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＤＮＡを約１〜約３５０マイクログラム含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＤＮＡを約５〜約２５０マイクログラム含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＤＮＡを約１０〜約２００マイクログラム含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＤＮＡを約１５〜約１５０マイクログラム含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＤＮＡを約２０〜約１００マイクログラム含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＤＮＡを約２５〜約７５マイクログラム含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＤＮＡを約３０〜約５０マイクログラム含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＤＮＡを約３５〜約４０マイクログラム含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＤＮＡを約１００〜約２００マイクログラム含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＤＮＡを約１０マイクログラム〜約１００マイクログラム含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＤＮＡを約２０マイクログラム〜約８０マイクログラム含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＤＮＡを約２５マイクログラム〜約６０マイクログラム含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＤＮＡを約３０ナノグラム〜約５０マイクログラム含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＤＮＡを約３５ナノグラム〜約４５マイクログラム含む。いくつかの好ましい実施形態において、医薬組成物は、ＤＮＡを約０．１〜約５００マイクログラム含む。いくつかの好ましい実施形態において、医薬組成物は、ＤＮＡを約１〜約３５０マイクログラム含む。いくつかの好ましい実施形態において、医薬組成物は、ＤＮＡを約２５〜約２５０マイクログラム含む。いくつかの好ましい実施形態において、医薬組成物は、ＤＮＡを約１００〜約２００マイクログラム含む。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、本発明による医薬組成物は、ワクチンのＤＮＡを少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ナノグラム含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ワクチンのＤＮＡを少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、または１０００マイクログラム含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ワクチンのＤＮＡを少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０ｍｇあるいはそれ以上含む。
【０１１９】
他の実施形態において、医薬組成物は、ワクチンのＤＮＡを最大で１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ナノグラム含み得る。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ワクチンのＤＮＡを最大で１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、または１０００マイクログラム含み得る。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ワクチンのＤＮＡを最大で１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０ｍｇ含み得る。
【０１２０】
医薬組成物は、使用される投与形態に従った製剤目的のための他の薬剤をさらに含み得る。医薬組成物が注射可能な医薬組成物である場合、それらは無菌であり、発熱性物質を含まず、微粒子を含まない。好ましくは、等張性の製剤が使用される。一般的に、等張性のための添加物には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースが含まれ得る。場合によっては、リン酸緩衝生理食塩水などの等張液が好ましい。安定化剤にはゼラチンおよびアルブミンが含まれる。いくつかの実施形態において、製剤に血管収縮剤が添加される。
【０１２１】
ワクチンは、薬学的に許容しうる賦形剤をさらに含んでいてもよい。薬学的に許容しうる賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤としての機能的分子であり得る。薬学的に許容しうる賦形剤は、界面活性剤を含みうるトランスフェクション促進剤、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質ＡをはじめとするＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンおよびスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知のトランスフェクション促進剤であり得る。
【０１２２】
トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマート（ＬＧＳ）をはじめとするポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマートであり、ポリ−Ｌ−グルタマートは、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度でワクチン中に存在するのがより好ましい。トランスフェクション促進剤は、界面活性剤、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質ＡをはじめとするＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレンおよびスクアレンなどの小胞を含んでいてもよく、ヒアルロン酸を用いて、遺伝子構築物と一体化させて投与してもよい。いくつかの実施形態において、ＤＮＡベクターワクチンは、トランスフェクション促進剤、例えば脂質、レシチンリポソームまたはＤＮＡリポソーム混合物（例えば、ＷＯ０９３２４６４０参照）などの当該技術分野で公知の他のリポソームをはじめとするリポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知トランスフェクション促進剤を含んでいてもよい。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマート（ＬＧＳ）をはじめとするポリアニオン、ポリカチオン、または脂質であるのが好ましい。ワクチン中のトランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
【０１２３】
薬学的に許容可能な賦形剤は、アジュバントであり得る。アジュバントは、別のプラスミドから発現される、または、ワクチン中に上記プラスミドと組み合わせてタンパク質として脱神経支配される他の遺伝子であり得る。アジュバントは、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘因性ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、欠失され、かつ、ＩｇＥ由来のシグナルペプチドを任意に含むシグナル配列を有するＩＬ−１５を含むＣＤ８６からなる群から選択され得る。アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、またはそれらの組み合わせであり得る。例示実施形態において、アジュバントは、ＩＬ−１２である。
【０１２４】
アジュバントとして有用であり得る他の遺伝子としては、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、変異体型ＩＬ−１８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮細胞増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびその機能的断片またはそれらの組み合わせをコードするものが挙げられる。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、アジュバントは、１つ以上のタンパク質、および／または、ＣＣＬ−２０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ、またはＲＡＮＴＥＳからなる群から選択されるタンパク質をコードする核酸分子であり得る。ＩＬ−１２構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９７／０１９５０２号と対応する米国特許出願第０８／９５６，８６５号、および２０１１年１２月１２日に提出された米国仮特許出願第６１／５６９６００号に開示され、それらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ−１５構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／１８９６２号と対応する米国特許出願第１０／５６０，６５０号、およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／００８８６号と対応する米国特許出願第１２／１６０，７６６号、およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／０４８８２７号に開示され、それらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ−２８構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／０３９６４８号と対応する米国特許出願第１２／９３６，１９２号に開示され、それらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳ、他の構築物、および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００４３３２号と対応する米国特許出願第０９／６２２４５２号に開示され、それらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳ構築物および配列の他の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０２４０９８号に開示され、それは参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳ、他の構築物、および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００４３３２号と対応する米国特許出願第０９／６２２４５２号に開示され、それらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳ構築物および配列の他の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０２４０９８に開示され、それは参照により本明細書に組み込まれる。ケモカインＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫおよびＭＥＣ構築物、ならびに配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４２２３１号と対応する米国特許出願第１１／７１９，６４６号に開示され、それらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＯＸ４０および他の免疫調節因子の例は、米国特許出願第１０／５６０，６５３号に開示され、それは参照により本明細書に組み込まれる。ＤＲ５および他の免疫調節因子の例は、米国特許出願第０９／６２２４５２号に開示され、それは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２６】
ワクチンは、参照により完全に組み込まれる、１９９４年４月１日に提出された米国特許出願第０２１，５７９号に記載されるような遺伝的ワクチン促進剤をさらに含み得る。
【０１２７】
ワクチンは、用いられる投与様式に従って配合してもよい。注射可能なワクチン医薬組成物は、滅菌されたパイロジェンフリーおよび微粒子フリーであってもよい。等張性配合剤または溶液が用いられてもよい。等張性のための添加剤として、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを挙げることができる。ワクチンは、血管収縮剤を含んでいてもよい。等張性溶液は、リン酸緩衝生理食塩水を含んでいてもよい。ワクチンは、ゼラチンおよびアルブミンをはじめとする安定化剤をさらに含んでいてもよい。ＬＧＳまたはポリカチオンまたはポリアニオンなどの安定化により、ワクチン製剤を室温または周囲温度で長時間安定にさせることができる。
【０１２８】
ワクチンは、ＤＮＡワクチンであり得る。ＤＮＡワクチンは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，７３９，１１８号、同第５，８１７，６３７号、同第５，８３０，８７６号、同第５，９６２，４２８号、同第５，９８１，５０５号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号、および同第５，６７６，５９４号に開示され、それらはそれぞれ参照により本明細書に完全に組み込まれる。ＤＮＡワクチンは、染色体に組み込まれることを防ぐエレメントまたは試薬をさらに含んでもよい。
【０１２９】
弱毒化生菌ワクチン、外来抗原に組み換えベクターを用いたワクチン、サブユニットワクチン、および糖タンパク質ワクチンの例が、米国特許第４，５１０，２４５号；同第４，７９７，３６８号；同第４，７２２，８４８号；同第４，７９０，９８７号；同第４，９２０，２０９号；同第５，０１７，４８７号；同第５，０７７，０４４号；同第５，１１０，５８７号；同第５，１１２，７４９号；同第５，１７４，９９３号；同第５，２２３，４２４号；同第５，２２５，３３６号；同第５，２４０，７０３号；同第５，２４２，８２９号；同第５，２９４，４４１号；同第５，２９４，５４８号；同第５，３１０，６６８号；同第５，３８７，７４４号；同第５，３８９，３６８号；同第５，４２４，０６５号；同第５，４５１，４９９号；同第５，４５３，３６４号；同第５，４６２，７３４号；同第５，４７０，７３４号；同第５，４７４，９３５号；同第５，４８２，７１３号；同第５，５９１，４３９号；同第５，６４３，５７９号；同第５，６５０，３０９号；同第５，６９８，２０２号；同第５，９５５，０８８号；同第６，０３４，２９８号；同第６，０４２，８３６号；同第６，１５６，３１９号、及び同第６，５８９，５２９号に記載されており、それらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３０】
遺伝子構築物は、組み換えアデノウイルス、組み換えアデノウイルス随伴ウイルス、組み換えワクシニアなどの組み換えウイルスベクターのゲノムの一部であってもよい。遺伝子構築物は、弱毒化された生きた微生物中または細胞中で生きる組み換え微生物ベクター中に含まれる遺伝物質の一部であってよい。
【０１３１】
５．ワクチンの送達方法
免疫応答を誘導することができるＴＢの免疫原に対して特に有効となるエピトープを含む遺伝子構築物およびコンセンサス抗原のタンパク質を供給するためのワクチンを送達する方法が本明細書において提供される。治療的免疫応答および予防的免疫応答を誘導するためのワクチンを送達する方法またはワクチン投与の方法が提供され得る。ワクチン投与過程は、哺乳類内でＴＢに対する免疫応答を生成し得る。ワクチンは、哺乳類の免疫系の活性を調節し、免疫応答を高めるために、個体にワクチンを送達し得る。ワクチンの送達は、細胞内で発現し、その上で免疫系が認識し、細胞性応答、体液性応答、または細胞性応答と体液性応答を誘導する細胞表面に送達される核酸分子としてのコンセンサス抗原のトランスフェクションであり得る。哺乳類に先に考察したようなワクチンを投与することにより、ＴＢに対する免疫応答を哺乳類内で誘導または誘発するために、ワクチンの送達を用いることができる。
【０１３２】
哺乳類の細胞にワクチンとプラスミドが送達されると、トランスフェクト細胞は、ワクチンから注入されたプラスミドそれぞれに対するコンセンサス抗原を発現し、分泌する。これらのタンパク質は免疫系によって異物として認識され、それらに対して抗体が生成される。これらの抗体は免疫系によって維持され、その後のＴＢ感染に効果的に反応することができる。
【０１３３】
ＤＮＡワクチンを送達する方法は、米国特許第４，９４５，０５０号及び同第５，０３６，００６号に記載されており、それらの内容全体は両方とも参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３４】
哺乳類内で免疫応答を誘発するために、哺乳類にワクチンを投与することができる。哺乳類は、ヒト、霊長類、非ヒト霊長類、ウシ、畜牛、ヒツジ、ヤギ、レイヨウ、バイソン、水牛、バイソン、ウシ属、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、およびニワトリであってもよい。
【０１３５】
ワクチンは、治療的または予防的免疫応答を含む免疫応答を哺乳類内で生成するために使用され得る。免疫応答により、１つ以上のＴＢ抗原に関する抗体および／またはキラーＴ細胞が生成され得る。かかる抗体及びＴ細胞を単離してもよい。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、１つ以上のＴＢ抗原に対して免疫応答を生成する方法を提供し、該方法は、個体にワクチンを投与することを含む。いくつかの実施形態において、ＴＢ感染に対して個体に予防的にワクチン接種をする方法を提供し、該方法は、ワクチンを投与することを含む。いくつかの実施形態において、ＴＢに感染した個体に治療的にワクチン接種をする方法を提供し、該方法は、ワクチンを投与することを含む。ワクチン投与前のＴＢ感染の診断は定期的に行ってもよい。
【０１３７】
ワクチンは、体液性免疫原性を誘発し、本明細書に記載の多価ＴＢワクチン構築物を接種した後のＴＢの致死的抗原投与に対して、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の防御をもたらす。
【０１３８】
ａ．併用治療
他のタンパク質および／またはＣＣＬ２０、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘因性ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、欠失され、かつ、ＩｇＥのシグナルペプチドなどの異なるシグナルペプチドを任意に含むシグナル配列を有するＩＬ−１５を含むＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ−２８、ＩＬ−ｌ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌα、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、変異体型ＩＬ−１８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮細胞増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ1、ＴＡＰ２、およびそれらの機能的断片またはそれらの組み合わせをコードする遺伝子と組み合わせてワクチンを投与することができる。いくつかの実施形態において、以下の核酸分子および／またはタンパク質の１つ以上と組み合わせてワクチンを投与する：ＣＣＬ２０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ、およびＲＡＮＴＥＳ、またはそれらの機能的断片の１つ以上をコードするコード配列を含む核酸分子からなる群から選択される核酸分子、ならびに、ＣＣＬ２０、ＩＬ−１２タンパク質、ＩＬ−１５タンパク質、ＩＬ−２８タンパク質、ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質、ＲＡＮＴＥＳタンパク質、またはそれらの機能的断片からなる群から選択されるタンパク質。
【０１３９】
ワクチンを、経口、非経口、舌下、経皮、経直腸、経粘膜、局所、吸入、口腔投与、胸腔内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻内、髄腔内、および関節内、またはそれらの組み合わせをはじめとする異なる経路で投与してもよい。獣医学的使用では、通常の獣医学的実践に従い、組成物を適切に許容しうる配合剤として投与してもよい。獣医は、特定の動物に最も適した投与レジメンおよび投与経路を、容易に決定することができる。ワクチンを、伝統的なシリンジ、針なし注射装置、「微粒子衝撃遺伝子銃」、または他の物理的方法、例えば電気穿孔法（ＥＰ）、「水力学的方法」、または超音波により投与してもよい。
【０１４０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔法、リポソーム介在法、ナノ粒子促進法、組み換えアデノウイルス、組み換えアデノウイルス関連ウイルスおよび組み換えワクシニアウイルスなどの組み換えベクターを用いる、および用いないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン投与とも称される）を含むいくつかの周知の技術により哺乳類にワクチンのプラスミドを送達することができる。ＤＮＡ注入により、ｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔法と共にコンセンサス抗原を送達することができる。
【０１４１】
ｂ．電気穿孔法
ワクチンまたは医薬組成物は、エレクトロポレーションにより投与してもよい。ワクチンのプラスミドの電気穿孔によるワクチンの投与は、細胞膜に可逆的な孔を形成させるのに効果的なエネルギーパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するように構成することができる電気穿孔装置を用いて達成され得、好ましくは、エネルギーパルスは、ユーザーにより入力されたプリセット電流に近い定電流である。電気穿孔装置は、電気穿孔構成要素および電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを含んでいてもよい。電気穿孔構成要素は、制御器、電流波形発生器、インピーダンステスタ、波形ロガー、入力要素、ステータス報告要素、コミュニケーションポート、メモリー成分、電源、および電源スイッチをはじめとする電気穿孔装置の１種以上の様々な要素を含み、それらを組み込んでいてもよい。電気穿孔は、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを容易化するｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔装置、例えばＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）  ＥＰシステム（イノビオファーマシューティカルズ社製、ペンシルベニア州ブルーベル）またはＥｌｇｅｎエレクトロポレーター（イノビオファーマシューティカルズ社製、）を用いて達成され得る。
【０１４２】
電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の一要素として機能してもよく、他の要素は、電気穿孔構成要素と連通する別々の要素（または構成要素）である。電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の１つを超える要素として機能してもよく、それが電気穿孔構成要素とは別々の電気穿孔装置の他の要素とも連通していてもよい。１つの電気機械的または機械的装置の一部として存在する電気穿孔装置の要素は、その要素が１つの装置として、または互いに連通する別々の要素として機能しうるように限定しなくてもよい。電気穿孔構成要素は、所望の組織内で定電流を生成するエネルギーパルスを送達することができてもよく、フィードバック機構を含む。電極アセンブリは、空間的配置内に複数の電極を有する電極アレイを含んでいてもよく、電極アセンブリは、電気穿孔構成要素からエネルギーパルスを受け、電極を介して所望の組織にそれを送達する。複数の電極のうちの少なくとも１つは、エネルギーパルスの送達時にはニュートラルであり、所望の組織中のインピーダンスを測定して、そのインピーダンスを電気穿孔構成要素に連通する。フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受けてもよく、電気穿孔構成要素により送達されたエネルギーパルスを調整して定電流を維持することができる。
【０１４３】
複数の電極が、分散パターンでエネルギーパルスを送達してもよい。複数の電極は、プログラムされたシーケンス下の電極制御を介して、分散パターンでエネルギーパルスを送達してもよく、プログラムされたシーケンスは、ユーザーにより電気穿孔構成要素に入力される。プログラムされたシーケンスは、順に送達された複数のパルスを含んでいてもよく、複数のパルスの各パルスが、インピーダンスを測定する１つのニュートラル電極を含む少なくとも２つの活性電極により送達され、複数のパルスの次のパルスが、インピーダンスを測定する１つのニュートラル電極を含む少なくとも２つの活性電極の異なる１つにより送達される。
【０１４４】
フィードバック機構は、ハードウエアまたはソフトウエアのいずれかにより実施してもよい。フィードバック機構は、アナログ閉回路により実施してもよい。フィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓまたは１μｓごとに起こるが、好ましくは実時間フィードバックまたは瞬時（すなわち、応答時間を決定するための入手可能な技術により決定すると実質的に瞬時）である。ニュートラル電極で所望の組織中のインピーダンスを測定してもよく、そのインピーダンスをフィードバック機構に連通し、フィードバック機構がインピーダンスに応答してエネルギーパルスを調整し、プリセット電流と類似の値の定電流を維持する。フィードバック機構は、エネルギーパルスの送達時に定電流を連続および瞬時的に維持してもよい。
【０１４５】
本発明のＤＮＡワクチンの送達を促進しうる電気穿孔装置および電気穿孔法の例としては、内容が全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらにより提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されたそれらのものが挙げられる。ＤＮＡワクチンの送達を促進するのに用いられうる他の電気穿孔装置および電気穿孔法としては、その全てが全体として参照により本明細書に組み入れられた、２００６年１０月１７日出願の米国特許仮出願第６０／８５２，１４９号および２００７年１０月１０日出願の同第６０／９７８，９８２号に対して３５ＵＳＣ  １１９（ｅ）による利益を主張する、２００７年１０月１７日出願の同時係属中および共有の米国特許出願第１１／８７４０７２号に提供されたものが挙げられる。
【０１４６】
Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号には、体内または植物内の選択された組織の細胞中への生体分子の導入を促進するためのモジュラー電極システムおよびその使用が記載されている。モジュラー電極システムは、複数の針電極；皮下注射針；プログラム可能な定電流パルス制御器から複数の針電極への導電的連結を提供する電気コネクター；および電源を含んでいてもよい。オペレータが、支持構造上に搭載された複数の針電極を掴み、体内または植物内の選択された組織にそれらをしっかりと挿入することができる。その後、皮下注射針を介して、生体分子を選択された組織へ送達する。プログラム可能な定電流パルス制御器を活性化して、定電流の電気パルスを複数の針電極に印加する。印加された定電流電気パルスは、複数の電極間での細胞への生体分子導入を促進する。米国特許第７，２４５，９６３号の全体的内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１４７】
Ｓｍｉｔｈらにより提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号には、体内または植物内の選択された組織の細胞中への生体分子導入を効果的に促進するために用いられうる電気穿孔装置が記載されている。該電気穿孔装置は、操作がソフトウエアまたはファームウエアに特定される電気運動装置（「ＥＫＤ装置」）を含む。ＥＫＤ装置は、ユーザ制御に基づく一列の電極とパルスパラメータ入力との間で一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを生成し、電流波形データの保存および取得を可能にする。電気穿孔装置は、針電極、注射針用の中央注入チャネル、および取り外し可能なガイドディスクのアレイを有する交換可能な電極ディスクも含む。米国特許公開第２００５／００５２６３０号の全体的内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１４８】
米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載された電極アレイおよび方法は、筋肉などの組織だけでなく、他の組織または臓器にも深く浸透させるように適合され得る。電極アレイの形態によって、注射針（選択された生体分子を送達する）が、標的臓器にも完全に挿入され、電極によってあらかじめ描かれた領域の標的組織に垂直に注射投与される。米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３号に記載された電極は、好ましくは２０ｍｍ長および２１ゲージである。
【０１４９】
加えて、電気穿孔装置およびその使用を組み込んだいくつかの実施形態で予期される通り、以下の特許：１９９３年１２月２８日発行の米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日発行の米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日発行の同第６，２６１，２８１号、２００５年１０月２５日発行の同第６，９５８，０６０号、および２００５年９月６日発行の米国特許第６，９３９，８６２号に記載された電気穿孔装置が存在する。さらに、様々な装置のいずれかを用いたＤＮＡの送達に関係する２００４年２月２４日発行の米国特許第６，６９７，６６９号、およびＤＮＡ注入の方法が注目された２００８年２月５日発行の米国特許第７，３２８，０６４号に提供された主題を含む特許が、本明細書で企図される。先の特許は、全体として参照により組み入れられる。
【０１５０】
ｃ．ＤＮＡプラスミドの調製方法
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のＤＮＡワクチンを含むＤＮＡプラスミドの調製方法である。ＤＮＡプラスミドは、哺乳類用発現プラスミド中への最後のサブクローニングステップ後、当該技術分野で公知の方法を用いて大規模発酵タンク中の細胞培養液への接種に使用することができる。
【０１５１】
本発明のＥＰ装置で使用するためのＤＮＡプラスミドは、公知の装置および技術を組み合わせて用いることにより調合または製造することができるが、好ましくは、ライセンスされた、２００７年５月２３日付で提出された同時係属中の米国仮出願第６０／９３９，７９２号に記載されている最適化されたプラスミド製造技術を用いて製造される。いくつかの例において、これらの研究で使用されるＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で調合され得る。また、製造技術には、米国特許出願第６０／９３９７９２号に記載されているものに加え、当業者に一般的に知られている種々の装置およびプロトコルが含まれ、ライセンスされた、２００７年７月３日に付与された米国特許第７，２３８，５２２号に記載されているものも含まれる。上記の出願および特許である米国特許出願第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号それぞれの全体を参照により本明細書に組み入れる。
【０１５２】
実施例
以下に実施例を用いて本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示すものであるが、説明のためだけに記載されるものと理解されるべきである。上記の説明及びこれらの実施例から、当業者であれば、本発明の必須の特徴を確認することができ、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の用途及び条件に適合させるために本発明の種々の変更例及び改変例を作ることができる。したがって、本明細書中に示され説明されているものに加え、本発明の種々の改変例が上記の説明から当業者には明らかであろう。そのような改変例も特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【０１５３】
実施例１
全部で９つの多価ＴＢ構築物を最初に作成した。それらは、以下からなる：１５個のｅｓａｔ−６ファミリー（ｅｓｘ）タンパク質を含む６つの三価ｐＶａｘベクターと；ｅｓａｔ６（ｅｓｘＡ）を２つの他の免疫原性ＴＢ抗原：Ａｇ８５ＡおよびＡｇ８５Ｂと組み合わせて融合した２つの二価ベクターと；６つの選択されたｅｓｘタンパク質を発現する多価ベクターとからなる。構築物におけるｅｓｘファミリーメンバーの分布を表３に記載する。
【０１５４】
全ての多価ベクターを細胞内タンパク質分解（フリン）開裂部位で分離したことで、各個別のタンパク質を分泌することができる。さらに、構築物を合成的に設計し、発現を改善するためにコドンおよびＲＮＡを最適化した。さらに、Ｃマンノシル化（Ｗ−Ｘ−Ｘ−Ｗ（配列番号２９））カノニカル配列またはＮ連結グリコシル化（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）カノニカル配列のいずれかを有する全ての推定抗原を、図２に示すように点変異によって修飾した。哺乳類宿主内で産生されたバクテリア由来の配列の哺乳類グリコシル化を防ぐことが構築物の目的であった。５’末端にｋｏｚａｋコンセンサス配列およびＩｇＥリーダー配列を含むｐＵＣ５７ベクター内に全ての配列を合成させて、タンパク質効率および合成の両方の増強を支援し、かつ、ポリＡ尾部を支援して翻訳を終了させた。ＢａｍＨＩおよびＸｈｏｌ部位間のｐＶＡＸ発現プロモーター内にインサートをクローンした。多価プラスミドの構築物設計を図１Ａに示す。マウスにおける免疫原性研究の前に、全ての構築物の発現をウェスタンブロッティングで確認した。図１Ｂは、いくつかの例を示す。全ての構築物のアミノ酸配列を図２に示す。
【０１５５】
Ｂ６マウスにおける新規のｅｓｘワクチンにより誘発された体液性および細胞性免疫応答の大きさを評価した。インターフェロン−ガンマＥＬＩＳｐｏｔによって細胞性免疫応答を決定した。我々の多価ベクターに対する特異的な結合抗体の産生についていくつかの例が観察された。酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）を用いて抗原特異的な抗体を検出した。我々の構築物に対する体液性および細胞性免疫原性の両方の例について、図３および図４で報告する。
【０１５６】
図１Ａは、多価ｅｓｘワクチンプラスミドの構築物および三価発現ベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を示す。多価ＴＢ  ｅｓｘワクチンプラスミドを構築した。図１aは、ＥＳＸ配列をｐＶＡＸ１ベクター内でクローンした部位および方法を示す。
【０１５７】
図１Ｂは、５つのｅｓｘ構築物に対する抗原発現を示すデータを提供する。データは、ウェスタンブロッティングにより生成した。ＴｕｒｂｏｆｅｃｔｉｎでトランスフェクトしたＲＤ細胞を用いて発現を確認した。２４時間後、細胞を採取し、全細胞溶解物を得て、タンパク質を定量化した。抗ＨＡ抗体（ＨＡタグは、導入遺伝子のＣ末端領域に位置する）を用いて合成タンパク質を検出した。ｐＶＡＸ１は、陰性対照として用いた。
【０１５８】
図２Ａおよび図２Ｂは、多価ＴＢワクチン構築物の改変アミノ酸挿入配列を示す。タンパク質配列は、最初の１８個のアミノ酸として青色のイタリック体で下線が引かれた新規のＩｇＥリーダー配列を各Ｎ末端に持つ全ての構築物を示し、フリン開裂配列部位は、小文字で、破線の下線が引かれ、黄色でハイライトされておりＣマンノシル化変異株は赤色で下線が引かれＮ連結グリコシル化変異株は太線で下線が引かれている。太線で下線が引かれたアミノ酸を持つ抗原（ｅｓｘＡ、ｅｓｘＥ、ｅｓｘＦ、ｅｓｘＵ、ｅｓｘＷ）は、Ｎ連結グリコシル化カノニカル配列部位変異（Ｎ−Ｘ−Ｓ／ＴからＮ−Ｘ−Ａ）を有した。赤色で二重下線が引かれたアミノ酸は、Ｃマンノシル化カノニカル配列部位変異（Ｗ−Ｘ−Ｘ−Ｗ−配列番号２９からＷ−Ｘ−Ｘ−Ａ−配列番号３０、または、Ｗ−Ｘ−Ｘ−ＷからＡ−Ｘ−Ｘ−Ｗ−配列番号３１）を有した。
【０１５９】
図３は、多価ワクチン投与に反応した体液性免疫応答を示す。異なる時点でＥＬＩＳＡで測定した、免疫スケジュール後の（ｎ＝５／群）ナイーブマウスおよびベクター特異的免疫化マウス由来の血清中の抗抗原特異的なＴＢ  ＩｇＧ応答を示す。ＡＥ６構築物のＡｇ８５Ａ特異的な応答、多価ＢＥ６構築物のＡｇ８５Ｂ特異的な応答およびＥｓａｔ−６特異的な応答を示す。
【０１６０】
図４Ａ〜図４Ｃは、多価ワクチンに対する細胞性免疫応答を示す棒グラフを提供する。多価構築物の細胞性免疫原性は、ＩＦＮガンマＥＬＩＳｐｏｔにより決定した。細胞性免疫原性を試験するため、４５μｇの各抗原を、筋肉内注射によりＢ６マウスの前脛骨筋に送達した後、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ適応定電流装置（イノビオファーマスーティカルズ社）を用いてエレクトロポレーションを行った。２週間間隔（０、２、および４週間目）で３回、マウス（ｎ＝５／群）を免疫化した。最後の免疫化から８日後（５週間目）に細胞性応答を評価した。９６ウェルプレート（ミリポア）を用いて、製造者指示書（Ｒ＆Ｄシステムズ社）ごとにＥＬＩＳｐｏｔを行った。免疫された各マウスから得た２００，０００個の脾細胞を、プレートの各ウェルに加えて、Ｒ１０（陰性対照）、コンカナバリンＡ（陽性対照）、または抗原特異的ペプチドプールの存在下で、３７℃、５％ＣＯ２で一晩刺激した。ペプチドプールは、全タンパク質にわたって、９または１１個のアミノ酸ずつ重複する１５−ｍｅｒのペプチドからなる。
【０１６１】
合成多価免疫原の一群は、ＥＳＡＴ６遺伝子ファミリーメンバーの広範なスペクトルに対して多様かつ関連した免疫を惹起するために本明細書に示す。この免疫アプローチは、ＴＢ患者の免疫治療において、または、プライムブースト治療法において有用で有り得、もしくは、ＴＢ感染を制御する単独のアプローチとしても有用で有り得る。
【０１６２】
参照文献（その内容全体を参照により本明細書に組み込む）:
１．    Cayabyab,M.J.ら、Current and novel approaches to vaccine development against tuberculosis（結核に対するワクチン開発の現在および新規のアプローチ）。Front Ceil infect Microbiol.2:154（2012）。
２．    Skjot,R.L.ら、Comparative evaluation of low-molecular-mass proteins from Mtb identifies members of the ESAT-6 family as immunodominant T-cell antigens（免疫優勢Ｔ細胞抗原として、ＥＳＡＴ−６ファミリーのＭｔｂ同一メンバーの低分子量タンパク質の比較評価）、Infect Immun。68:214-220（2000）.
３．    Brodin P.ら、ESAT-6 proteins:protective antigens and virulence factors?（ＥＳＡＴ−６タンパク質：防御抗原および毒性因子？）Trends Microbiol 12: 500-8（2004）.
４．    Sutcliffe I.C.New insights into the distribution of EXG100 protein secretion systems（ＥＸＧ１００タンパク質分泌システムの分布における新たな洞察）。Antonie Van Leuuwenhoek 99: 127-131（2011）
【０１６３】
実施例２
最適化発現用に設計されたコード配列を用いて、さらなるｅｓｘ構築物を構築し、発現について試験した。図５Ａは、全部で１５個のｅｓｘ抗原のコード配列を包含する新規の５つの三価ｅｓｘ構築物全ての概略図である。他の構築物と同様に、全ての遺伝子をｐＶＡＸ１哺乳類ベクター内にクローンし、ＣＭＶプロモーター下においた。各インサートは、Ｎ末端ＩｇＥリーダーペプチドのコード配列と、２つの隣接するｅｓｘ抗原コード配列間にプロテアーゼ開裂部位のコード配列を持つ一連の３つのｅｓｘ抗原のコード配列と、Ｃ末端ＨＡタグのコード配列とを含む。これらのインサートは、ＣＭＶプロモーター配列とＢＧＨポリＡシグナル配列との間のｐＶＡＸ１ベクター内に挿入される。ｐＶＡＸ１ベクターは、カナマイシン耐性遺伝子およびｐＵＣオリジンも含む。
【０１６４】
５つのインサートの各々を図５Ａに示し、Ｉ〜Ｖと表記した。
図５Ａに示すインサートＩは、Ｎ末端ＩｇＥリーダーペプチドのコード配列と、ｅｓｘ抗原ｅｓｘＯのコード配列と、フランタンパク質開裂部位のコード配列と、ｅｓｘ抗原ｅｓｘＲのコード配列と、フランタンパク質開裂部位のコード配列と、ｅｓｘ抗原ｅｓｘＦのコード配列と、Ｃ末端ＨＡタグのコード配列とを含む。このインサートのコード配列は、配列番号１９であり、新しいバージョンのｐＯＲＦ（ｐＯＲＦ．２）インサートと呼ばれ、ｐＶＡＸ１内にクローンした場合、新しいバージョンのｐＯＲＦ（ｐＯＲＦ．２）プラスミドと指定した。
【０１６５】
図５Ａに示すインサートＩＩは、Ｎ末端ＩｇＥリーダーペプチドのコード配列と、ｅｓｘ抗原ｅｓｘＢのコード配列と、フランタンパク質開裂部位のコード配列と、ｅｓｘ抗原ｅｓｘＣのコード配列と、フランタンパク質開裂部位のコード配列と、ｅｓｘ抗原ｅｓｘＵのコード配列と、Ｃ末端ＨＡタグのコード配列とを含む。このインサートのコード配列は、配列番号２１であり、新しいバージョンのｐＢＣＵ（ｐＢＣＵ．２）インサートと呼ばれ、ｐＶＡＸ１内にクローンした場合、新しいバージョンのｐＢＣＵ（ｐＢＣＵ．２）プラスミドと指定した。
【０１６６】
図５Ａに示すインサートＩＩＩは、Ｎ末端ＩｇＥリーダーペプチドのコード配列と、ｅｓｘ抗原ｅｓｘＨのコード配列と、フランタンパク質開裂部位のコード配列と、ｅｓｘ抗原ｅｓｘＡのコード配列と、フランタンパク質開裂部位のコード配列と、ｅｓｘ抗原ｅｓｘＴのコード配列と、Ｃ末端ＨＡタグのコード配列とを含む。このインサートのコード配列は、配列番号２３であり、新しいバージョンのｐＨＡＴ（ｐＨＡＴ．２）インサートと呼ばれ、ｐＶＡＸ１内にクローンした場合、新しいバージョンのｐＨＡＴ（ｐＨＡＴ．２）プラスミドと指定した。
【０１６７】
図５Ａに示すインサートＩＶは、Ｎ末端ＩｇＥリーダーペプチドのコード配列と、ｅｓｘ抗原ｅｓｘＤのコード配列と、フランタンパク質開裂部位のコード配列と、ｅｓｘ抗原ｅｓｘＱのコード配列と、フランタンパク質開裂部位のコード配列と、ｅｓｘ抗原ｅｓｘＥのコード配列と、Ｃ末端ＨＡタグのコード配列とを含む。このインサートのコード配列は、配列番号２５であり、新しいバージョンのｐＤＱＥ（ｐＤＱＥ．２）インサートと呼ばれ、ｐＶＡＸ１内にクローンした場合、新しいバージョンのｐＤＱＥ（ｐＤＱＥ．２）プラスミドと指定した。
【０１６８】
図５Ａに示すインサートＶは、Ｎ末端ＩｇＥリーダーペプチドのコード配列と、ｅｓｘ抗原ｅｓｘＶのコード配列と、フランタンパク質開裂部位のコード配列と、ｅｓｘ抗原ｅｓｘＳのコード配列と、フランタンパク質開裂部位のコード配列と、ｅｓｘ抗原ｅｓｘＷのコード配列と、Ｃ末端ＨＡタグのコード配列とを含む。このインサートのコード配列は、配列番号２７であり、新しいバージョンのｐＶＳＷ（ｐＶＳＷ．２）インサートと呼ばれ、ｐＶＡＸ１内にクローンした場合、新しいバージョンのｐＶＳＷ（ｐＶＳＷ．２）プラスミドと指定した。
【０１６９】
図５Ｂは、インサートＩ〜Ｖを有するｅｓｘの発現を試験した実験結果を示す。新しいバージョンのｐＶＳＷ、ｐＢＣＵ、ｐＤＱＥ、ｐＨＡＴ、およびｐＯＲＦ（ｐＶＳＷ．２、ｐＢＣＵ．２、ｐＤＱＥ．２、ｐＨＡＴ．２、およびｐＯＲＦ．２）プラスミドの１つ、または、対照プラスミドｐＶＡＸでＲＤ細胞をトランスフェクトした。ウエスタンブロット分析で発現を分析し、抗ＨＡ  ｍＡｂを用いて検出した。アクチン染色によるローディングコントロールも示し、相対的な大きさを示す（ＫＤａ）。ｐＶＡＸ試料を除く全ての試験分析において、抗ＨＡ  ｍＡｂでタンパク質が検出されたことをデータは示している。新しいバージョンのｐＶＳＷ、ｐＢＣＵ、ｐＤＱＥ、ｐＨＡＴ、およびｐＯＲＦプラスミド（ｐＶＳＷ．２、ｐＢＣＵ．２、ｐＤＱＥ．２、ｐＨＡＴ．２、およびｐＯＲＦ．２プラスミド）内のインサートが、哺乳類細胞内で発現されることが実験により実証された。
【０１７０】
新しいバージョンのｐＶＳＷ、ｐＢＣＵ、ｐＤＱＥ、ｐＨＡＴ、およびｐＯＲＦプラスミド（ｐＶＳＷ．２、ｐＢＣＵ．２、ｐＤＱＥ．２、ｐＨＡＴ．２、およびｐＯＲＦ．２プラスミド）によりコードされて発現したｅｓｘ抗原の免疫原性についてマウスを用いて実験で比較した。図６Ａは、実験プロトコルの概要を示す。新しいバージョンのｐＶＳＷ、ｐＢＣＵ、ｐＤＱＥ、ｐＨＡＴ、およびｐＯＲＦプラスミド（ｐＶＳＷ．２、ｐＢＣＵ．２、ｐＤＱＥ．２、ｐＨＡＴ．２、およびｐＯＲＦ．２プラスミド）の１つをエレクトロポレーション（ＥＰ）によりＣＢ６Ｆ１マウス（ｎ＝５／群）に２週間隔で（０週間目、２週間目、および４週間目）３回ワクチン投与し、最後の免疫化から１週間後（５週間目）に脾臓を採取し、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより細胞性免疫応答を分析した。
【０１７１】
図６Ｂ〜図６Ｆは、ワクチン接種に用いた新しいバージョンのｐＶＳＷ、ｐＢＣＵ、ｐＤＱＥ、ｐＨＡＴ、およびｐＯＲＦプラスミド（ｐＶＳＷ．２、ｐＢＣＵ．２、ｐＤＱＥ．２、ｐＨＡＴ．２、およびｐＯＲＦ．２プラスミド）の１つによりコードされた３つの個々のｅｓｘ抗原の各々に対する細胞性免疫応答の測定結果のデータを示す。各々の抗原のペプチドプールに対するＥｓｘ特異的なＴ細胞応答をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔにより測定した。誤差バーはＳＥＭを示し、実験を独立して少なくとも２回行い、同様の結果が得られた。
【０１７２】
図６Ｂは、新しいバージョンのプラスミドｐＤＱＥ（ｐＤＱＥ．２）をマウスに接種した実験結果を示す。抗原ｅｓｘＤ、ｅｓｘＱ、およびｅｓｘＥの各々に対する免疫応答を検出したが、ｅｓｘＱに対する応答が最も大きかった。
【０１７３】
図６Ｃは、新しいバージョンのプラスミドｐＶＳＷ（ｐＶＳＷ．２）をマウスに接種した実験結果を示す。抗原ｅｓｘＶ、ｅｓｘＳ、およびｅｓｘＷの各々に対する免疫応答を検出したが、ｅｓｘＳおよびｅｓｚＷに対する応答が最も大きかった。
【０１７４】
図６Ｄは、新しいバージョンのプラスミドｐＢＣＵ（ｐＢＣＵ．２）をマウスに接種した実験結果を示す。抗原ｅｓｘＢ、ｅｓｘＣ、およびｅｓｘＵの各々に対する免疫応答を検出したが、ｅｓｘＵに対する応答が最も大きかった。
【０１７５】
図６Ｅは、新しいバージョンのプラスミドｐＨＡＴ（ｐＨＡＴ．２）をマウスに接種した実験結果を示す。抗原ｅｓｘＨ、ｅｓｘＡ、およびｅｓｘＴの各々に対する免疫応答を検出したが、ｅｓｘＨに対する応答が最も大きかった。
【０１７６】
図６Ｆは、新しいバージョンのプラスミドｐＯＲＦ（ｐＯＲＦ．２）をマウスに接種した実験結果を示す。抗原ｅｓｘＯ、ｅｓｘＲ、およびｅｓｘＦの各々に対する免疫応答を検出したが、ｅｓｘＲに対する応答が最も大きかった。
【０１７７】
新しいバージョンのｐＶＳＷ、ｐＢＣＵ、ｐＤＱＥ、ｐＨＡＴ、およびｐＯＲＦプラスミド（ｐＶＳＷ．２、ｐＢＣＵ．２、ｐＤＱＥ．２、ｐＨＡＴ．２、およびｐＯＲＦ．２プラスミド）の１つでＤＮＡワクチン接種した後のｅｓｘ特異的なＣＤ４  Ｔ細胞応答およびＣＤ８  Ｔ細胞応答を評価した。２０μｇの個々の新しいバージョンのｐＶＳＷ、ｐＢＣＵ、ｐＤＱＥ、ｐＨＡＴ、およびｐＯＲＦ（ｐＶＳＷ．２、ｐＢＣＵ．２、ｐＤＱＥ．２、ｐＨＡＴ．２、およびｐＯＲＦ．２）をｉ．ｍ．／ＥＰでＣＢ６Ｆ１マウス（ｎ＝５）に３週間隔で３回注射して免疫化した。最後のワクチン接種から１週間後に脾細胞を回収し、各々のペプチドプールで刺激し、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αに対する抗体を用いて細胞内染色を施した後にフローサイトメトリーで分析した。結果を図７Ａ〜図７Ｃに示す。
【０１７８】
図７Ａは、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αサイトカインの両方に対して陽性であるＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の周波数の分析に用いたゲーティング手法を示す。
【０１７９】
図７Ｂは、ｅｓｘ特異的なペプチド抗原に反応した二重サイトカインＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−α（およびｐＶＡＸ対照）を放出するｅｓｘ特異的なＣＤ４  Ｔ細胞を示す棒グラフである。
【０１８０】
図７Ｃは、ｅｓｘ特異的なペプチド抗原に反応した二重サイトカインＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−α（およびｐＶＡＸ対照）を放出するｅｓｘ特異的なＣＤ８  Ｔ細胞を示す棒グラフである。
【０１８１】
図７Ｂおよび図７Ｃにおけるこれらの実験結果を測定するために、培地のみで刺激した細胞からバックグラウンド染色を引いている。誤差バーは、５匹のマウス／群のＳＥＭを表わす。実験を独立して少なくとも２回行い、同様の結果が得られた。
【０１８２】
各個別の新しいバージョンのｐＶＳＷ、ｐＢＣＵ、ｐＤＱＥ、ｐＨＡＴ、およびｐＯＲＦプラスミド（ｐＶＳＷ．２、ｐＢＣＵ．２、ｐＤＱＥ．２、ｐＨＡＴ．２、およびｐＯＲＦ．２プラスミド）の組み合わせであるＲＳＱ−１５ワクチンにより誘発された免疫応答と、デンマークのＳｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社（ＳＳＩ  ＢＣＧ）からカルメット・ゲラン菌（ＢＣＧ）菌株とも呼ばれるＢＣＧ  Ｓｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ（ＳＳＩ）菌株であるＢＣＧワクチンＳＳＩ、すなわち、図面においてＢＣＧと呼ばれるものにより誘発された免疫応答とを比較するために実験を行った。ＢＣＧと比較して、より広範かつ強力なｅｓｘ特異的なＴｈ１免疫応答がＲＳＱ−１５ワクチンにより誘発された。
【０１８３】
図８Ａは、ＲＳＱ−１５およびＢＣＧワクチン接種の免疫スケジュールに関わる概要プロトコルを示す。全てのｅｓｘ構築物（各個別の新しいバージョンのｐＶＳＷ、ｐＢＣＵ、ｐＤＱＥ、ｐＨＡＴ、およびｐＯＲＦプラスミド（ｐＶＳＷ．２、ｐＢＣＵ．２、ｐＤＱＥ．２、ｐＨＡＴ．２、およびｐＯＲＦ．２プラスミド））をカクテル（ＲＳＱ−１５ワクチン；２０ｕｇ／ｅｓｘ構築物）として共送達し、ＣＢ６Ｆ１マウス（ｎ＝５）を２週間間隔（０週間目、２週間目、および４週間目）で３回免疫化した。ＣＢ６Ｆ１マウス（ｎ＝５）を１週間目に単回ｓ．ｃ．ＢＣＧワクチン注射（１０６ＣＦＵ）で免疫化した。ＲＳＱ−１５群における最後の免疫化から１カ月後およびＢＣＧ群におけるＢＣＧワクチン接種から９週間後となる８週間目で、ＲＳＱ−１５でプライムされたマウスまたはＢＣＧでプライムされたマウス由来の脾細胞を用いてＴ細胞応答を分析した。脾細胞を全ての個々のｅｓｘ特異的なペプチドプールで刺激し、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより測定した。
【０１８４】
図８Ｂおよび図８Ｃは、ＲＳＱ−１５群およびＢＣＧ群それぞれの結果を示す。誤差バーはＳＥＭを示し、実験を独立して少なくとも２回行い、同様の結果が得られた。ＲＳＱ−１５での免疫により、ＢＣＧに比べてより広範かつ強力なｅｓｘ特異的なＴｈ１免疫応答が誘発された。
【０１８５】
ＢＣＧワクチンでプライムされた動物における免疫応答と、ＲＳＱ−１５ワクチンで単回ブーストされたかもしくは２回ブーストされた動物における免疫応答とを比較するために実験を行った。ｐＶＡＸ１およびＢＣＧのみの対照が含まれた。ＲＳＱ−１５  ＤＮＡワクチンをプライムブーストＢＣＧワクチン接種することによりｅｓｘ特異的なＢＣＧ誘発応答が増す結果が示された。
【０１８６】
図９Ａは、２つの異なるプライムブーストレジメン：ＢＣＧプライム、単回ＲＳＱ−１５ブースト群対ＢＣＧプライム、２回ＲＳＱ−１５ブースト群の免疫スケジュールに関わる概要プロトコルを示す。ＣＢ６Ｆ１マウスを０週間目でＢＣＧ  ＳＳＩを１０６ＣＦＵ皮下注射して免疫化した。６週間後（６週間目）、単回ブーストのマウス群には、１００μｇ（２０μｇ／ｅｓｘ構築物、即ち、新しいバージョンのｐＶＳＷ、ｐＢＣＵ、ｐＤＱＥ、ｐＨＡＴ、およびｐＯＲＦプラスミド（ｐＶＳＷ．２、ｐＢＣＵ．２、ｐＤＱＥ．２、ｐＨＡＴ．２、およびｐＯＲＦ．２プラスミド））のＲＳＱ−１５ワクチンを筋肉内注射によりブーストし、１週間後（７週間目）に屠殺した。２回ブーストのマウス群には、６週間目で１００μｇのＲＳＱ−１５ワクチンを筋肉内注射によりブーストし、１００μｇのＲＳＱ−１５ワクチンの２回目のブーストを２週間後（８週間目）に行い、２回目のブーストの７日後（９週間目）に屠殺した。屠殺マウス由来の脾臓をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔにより評価した。結果は、５匹のマウス／群のＳＥＭを表わす。実験を独立して少なくとも２回行い、同様の結果が得られた。暗色バーは、ＢＣＧ対照のデータであり、ブースト動物群は両方とも、ＢＣＧ対照により誘発された免疫応答と比較して、著しく高い免疫応答が得られたことを示している。
【０１８７】
新しいバージョンのｐＯＲＦ、ｐＨＡＴ、およびｐＶＳＷ（ｐＯＲＦ．２、ｐＨＡＴ．２、およびｐＶＳＷ．２）プラスミドを用いて実験を行い、新しいバージョンの１つで免疫化した動物における、そのサブファミリーオルソログメンバー由来のものとして選択された他のｅｓｘペプチドプールに対する免疫応答を測定した。これらのオルソログに対する免疫応答の交差反応を評価した。マウスは、新しいバージョンのｐＯＲＦ（ｐＯＲＦ．２）２０μｇで２週間隔で３回免疫化したか、あるいは、新しいバージョンのｐＨＡＴ（ｐＨＡＴ．２）２０μｇで２週間隔で３回免疫化したか、あるいは、新しいバージョンのｐＶＳＷ（ｐＶＳＷ．２）２０μｇで２週間隔で３回免疫化した。最後の免疫化から１週間後に、脾臓を採取した後、各々のオルソログｅｓｘ特異的なペプチドプールで刺激し、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔにより決定されたｅｓｘ抗原間の交差反応の度合いをモニタリングした。
【０１８８】
図１０Ａは、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔマウスにより分析した、新しいバージョンのｐＯＲＦ（ｐＯＲＦ．２）プラスミドで免疫化した屠殺マウス由来の脾臓における結果を示す。ｅｓｘＯに対する免疫応答に加えて、ｅｓｘＶ、ｅｓｘＲ、ｅｓｘＨ、ｅｓｘＮ、およびｅｓｘＬを認識する免疫応答が観察された。誤差バーはＳＥＭを示し、図１０Ａに示したデータは、同様の結果を生み出した２つの独立した実験における５匹のマウス／群の代表例である。
【０１８９】
図１０Ｂは、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔマウスにより分析した、新しいバージョンのｐＨＡＴ（ｐＨＡＴ．２）プラスミドで免疫化した屠殺マウス由来の脾臓における結果を示す。ｅｓｘＨに対する免疫応答に加えて、ｅｓｘＲを認識する免疫応答が観察された。誤差バーはＳＥＭを示し、図１０Ｂに示したデータは、同様の結果を生み出した２つの独立した実験における５匹のマウス／群の代表例である。
【０１９０】
図１０Ｃは、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔマウスにより分析した、新しいバージョンのｐＶＳＷ（ｐＶＳＷ．２）プラスミドで免疫化した屠殺マウス由来の脾臓における結果を示す。ｅｓｘＶに対する免疫応答に加えて、ｅｓｘＯ、ｅｓｘＫ、ｅｓｘＰ、ｅｓｘＭ、およびｅｓｘＧを認識する免疫応答が観察された。誤差バーはＳＥＭを示し、図１０Ｃに示したデータは、同様の結果を生み出した２つの独立した実験における５匹のマウス／群の代表例である。
【図１Ｂ】
2016516075.tif 000005
【図１Ａ】
2016516075.tif 000006
【図２Ａ】
2016516075.tif 000007
【図２Ｂ−１】
2016516075.tif 000008
【図２Ｂ−２】
2016516075.tif 000009
【図３】
2016516075.tif 000010
【図４Ａ】
2016516075.tif 000011
【図４Ｂ】
2016516075.tif 000012
【図４Ｃ】
2016516075.tif 000013
【図５Ａ】
2016516075.tif 000014
【図５Ｂ】
2016516075.tif 000015
【図６Ａ】
2016516075.tif 000016
【図６Ｂ】
2016516075.tif 000017
【図６Ｃ】
2016516075.tif 000018
【図６Ｄ】
2016516075.tif 000019
【図６Ｅ】
2016516075.tif 000020
【図６Ｆ】
2016516075.tif 000021
【図７Ａ】
2016516075.tif 000022
【図７Ｂ】
2016516075.tif 000023
【図７Ｃ】
2016516075.tif 000024
【図８Ａ】
2016516075.tif 000025
【図８Ｂ】
2016516075.tif 000026
【図８Ｃ】
2016516075.tif 000027
【図９Ａ】
2016516075.tif 000028
【図９Ｂ】
2016516075.tif 000029
【図９Ｃ】
2016516075.tif 000030
【図１０Ａ】
2016516075.tif 000031
【図１０Ｂ】
2016516075.tif 000032
【図１０Ｃ】
2016516075.tif 000033
【配列表】
2016516075000001.app
【国際調査報告】
2016516075.tif 000034