(57)【要約】  対象でのクロストリジウム・ディフィシル感染症の処置または予防のための組成物および方法を提供する。本組成物はクロストリジウム・ディフィシルＢ毒素に対する抗体を含む。本方法は、クロストリジウム・ディフィシル細菌感染症の再発を低減または排除または予防するのに有効な量で対象に抗体を投与することを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部であって、重鎖可変領域が３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、配列番号１１０、１１１および１１２に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域が３つのＣＤＲ、配列番号１０２、１０３、および１０４に示されるアミノ酸と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸をそれぞれ有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、
単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部。
【請求項２】
重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部であって、重鎖可変領域が３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、配列番号１２６、１２７および１２８に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域が３つのＣＤＲ、配列番号１１８、１１９および１２０に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、
単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部。
【請求項３】
重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部であって、重鎖可変領域が３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、配列番号１４２、１４３および１４４に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域が３つのＣＤＲ、配列番号１３４、１３５および１３６に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、
単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部。
【請求項４】
重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部であって、重鎖可変領域が３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、配列番号２０６、２０７および２０８に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域が３つのＣＤＲ、配列番号１９８、１９９および２００に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、
単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部。
【請求項５】
重鎖可変領域および軽鎖領域を含む単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部であって、重鎖可変領域が３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、配列番号２２２、２２３および２２４に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域が３つのＣＤＲ、配列番号２１４、２１５および２１６に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部。
【請求項６】
重鎖領域および軽鎖領域を含む単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部であって、重鎖可変領域が３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、配列番号２３８、２３９および２４０に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域が３つのＣＤＲ、配列番号２３０、２３１および２３２に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部。
【請求項７】
重鎖可変領域および軽鎖領域を含む単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部であって、重鎖可変領域が３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、配列番号２３８、２３９および２４０に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域が３つのＣＤＲ、配列番号２３０、２３１および２３２に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部。
【請求項８】
重鎖可変領域および軽鎖領域を含む単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部であって、重鎖可変領域が配列番号７１０と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域が配列番号７０８と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部。
【請求項９】
抗体、またはその抗原結合部がＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅＢ毒素に結合し、かつ抗体、またはその抗原結合部の解離定数（ＫＤ）が約１×１０−８Ｍ未満である、請求項１に記載の単離型モノクローナル抗体またはその抗原結合部。
【請求項１０】
抗体またはその抗原結合部がヒト化されているまたはキメラである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合部。
【請求項１１】
重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部であって、重鎖可変領域が３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、配列番号７６、７７および７８に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域が３つのＣＤＲ、配列番号６８、６９および７０に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部。
【請求項１２】
重鎖可変領域が配列番号７５に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域が配列番号６７に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の抗体またはその抗原結合部。
【請求項１３】
重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部であって、重鎖可変領域が３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、配列番号４４、４５および４６に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域が３つのＣＤＲ、であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、配列番号３６、３７および３８にそれぞれ示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部。
【請求項１４】
重鎖可変領域が配列番号４３に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域が配列番号３５に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の単離型モノクローナル抗体またはその抗原結合部。
【請求項１５】
抗体またはその抗原結合部が（ａ）免疫グロブリン分子全体；（ｂ）ｓｃＦｖ；（ｃ）Ｆａｂフラグメント；（ｄ）Ｆ（ａｂ'）２；および（ｅ）ジスルフィド結合したＦｖからなる群から選択される、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合部。
【請求項１６】
抗体またはその抗原結合部が（ａ）ＩｇＧ定常ドメイン、（ｂ）ＩｇＡ定常ドメイン、（ｃ）ＩｇＤ定常ドメイン、および（ｄ）ＩｇＥ定常ドメインからなる群から選択される少なくとも１つの定常ドメインを含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合部。
【請求項１７】
抗体またはその抗原結合部がＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｂ毒素のフラグメント１に結合する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合部。
【請求項１８】
抗体またはその抗原結合部がＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｂ毒素のフラグメント４に結合する、請求項４に記載の抗体またはその抗原結合部。
【請求項１９】
Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｂ毒素に結合しかつ重鎖可変領域を含む単離型モノクローナル抗体またはその抗原結合部であって、重鎖可変領域が配列番号１０９、１２５、１４１、１５７、１７３、１８９、２０５、２２１および２３７に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域が配列番号１０１、１１７、１３３、１４９、１６５、１８１、１９７、２１３および２２９に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、
単離型モノクローナル抗体またはその抗原結合部。
【請求項２０】
Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｂ毒素に結合しかつ重鎖可変領域を含む単離型モノクローナル抗体またはその抗原結合部であって、重鎖可変領域が配列番号３８９、４０５、４２１、４３７、４５３、４６９、４８５、５０１、５１７、５３３、５４９、５６５、５７１、５８７、６０３、６１９、６３５、６５１および７０９に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域が配列番号３８１、３９７、４１３、４２９、４４５、４６１、４７７、４９３、５０９、５２５、５４１、５５７、５６３、５７９、５９５、６１１、６２７、６４３および７０７に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列を含む、
単離型モノクローナル抗体またはその抗原結合部。
【請求項２１】
ｉｎ  ｖｉｖｏＢ毒素投与実験において、抗体またはその抗原結合部を哺乳類が約７５ｎｇ超のＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｂ毒素に曝露される約２４時間前に約８ｍｇ／ｋｇ体重〜約１３ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で哺乳類に投与した場合、哺乳類の生存の確率がＢ毒素への曝露後約４日以内で約８０％超である、請求項１に記載の単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部。
【請求項２２】
抗体、またはその抗原結合部が約２５μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度でｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和アッセイにおいて約５ｎｇ／ｍｌのＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅＢ毒素の約４０％超を中和する、請求項１に記載の単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部。
【請求項２３】
請求項２４に記載の核酸を含む細胞。
【請求項２４】
細胞が細菌細胞である、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２５】
細胞が真核細胞である、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２６】
細胞が哺乳類細胞である、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２７】
細胞がＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＳＰ２／０、ＨｅＬａ、Ｐｅｒ．Ｃ６、骨髄腫細胞またはリンパ腫細胞である、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２８】
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合部および少なくとも１つの薬学的に許容可能なキャリアーを含む組成物。
【請求項２９】
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合部の有効量を対象に投与することを含むＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連疾患を予防または処置する方法。
【請求項３０】
抗体またはその抗原結合部が静脈内、皮下、筋肉内または経皮的に投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
対象に第２の薬剤を投与するステップをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
第２の薬剤が抗菌剤である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
抗菌剤がバンコマイシン、メトロニダゾール、またはフィダキソマイシンである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
第２の薬剤がＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ａ毒素を結合する抗体またはその抗原結合部である、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロストリジウム・ディフィシルＢ毒素に対するモノクローナル抗体に関する。本発明は、脊椎動物の対象における細菌クロストリジウム・ディフィシルによる感染症の診断、処置または予防用の組成物および方法にさらに関する。感染症由来の再発を低減、排除、または予防するために抗体を脊椎動物の対象に有効量で投与する方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は一般的な院内病原体であり、世界中の入院患者の罹患率および死亡数の主要な原因である（Ｋｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．，  ３３０：２５７−６２，  １９９４）。多様な抗生剤の使用の増加および著しく病原性のあるＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株の発生により、免疫療法がこの細菌に関連する疾患および死亡を低減するためにうまく適し得ると考えられるようになった。Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、従来より抗生剤の選択肢がほとんどなく、疾患の再発を頻繁に引き起こす（事例のうち２５％）。医療行為を行っていても、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅにより、１年あたり米国のみで２０，０００人の命が失われており、５００，０００件前後の感染症が引き起こされていることが確認されている。近年では、Ｂ１／ＮＡＰ１／０２７株などの高いレベルの毒素を産生する、より病原性のあるＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株が登場し、これらはまた、メトロニダゾールに対する感受性が低い。Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅが発生した場合、疾患の拡大を促進する胞子の持続性のため、病棟および部分的な病院の閉鎖が必要とされる。高齢者人口の増加および人口動態の変化に伴い、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、２１世紀における大きな問題となっている。Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ疾患の範囲は、無症状の保因〜軽度の下痢〜劇症の偽膜性大腸炎の範囲にある。
【０００３】
Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは二形性のライフサイクルを有し、それにより感染性でありかつ強靭な胞子の形態、および代謝的に活性な毒素産生増殖型細胞として存在する。Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連疾患（ＣＤＡＤ）は、増殖型細胞により引き起こされ、より具体的には２つの毒素、エンテロトキシンのＡ毒素および細胞毒のＢ毒素の作用により引き起こされると考えられている。今日まで、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関するワクチンおよび免疫療法は、毒素（ＡおよびＢ）、ＡおよびＢのトキソイド、ＡおよびＢの組み換えフラグメント、および増殖型細胞表面層タンパク質（ＳＬＰＡ）に焦点が当てられている。
【０００４】
Ｂ毒素（ＴｃｄＢ、〜２６９ｋＤａ）は、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの病原性遺伝子座位（ＰａＬｏｃ）にコードされる約２３６６残基の単一ポリペプチド毒素であり、この遺伝子座位は毒素発現の２つのレギュレータ（ＴｃｄＣおよびＴｃｄＲ）、推定ホリン（ＴｃｄＥ）、およびＡ毒素（ＴｃｄＡ）の遺伝子をも含んでいる。ＴｃｄＢは、細胞の細胞質ゾル内の低分子ＧＴＰアーゼの細胞移入およびグリコシル化に寄与する少なくとも４つの機能的ドメインを有する。ＴｃｄＢのグリコシルトランスフェラーゼドメインは毒素の最初の５４３残基に含まれており、かつ生物学的に活性なドメインであり、保存されているＤＸＤモチーフ（Ａｓｐ２８６／Ａｓｐ２８８）およびＴｒｐｌ０２をも含み、Ｍｎ２＋およびＵＤＰグルコースと複合体を形成する。残基５４４〜９５５のシステインプロテアーゼドメインは、自己タンパク質分解活性および酵素的ドメインのサイトゾルへの送達に必要である。システインプロテアーゼドメインおよびＣ末端結合ドメインの間に送達ドメインが示唆されており、これは膜を介する毒素の転位および標的細胞のサイトゾルへのグリコシルトランスフェラーゼの送達に関与している。最後に、ＴｃｄＢの第４の機能的ドメインが毒素のカルボキシ末端領域内（１８５１〜２３６６）に配置されており、標的細胞上のレセプターと相互作用すると予測される。しかしながら、ヒトの正確な毒素レセプターは同定されていない。結合の後、毒素は、クラスリンおよびダイナミン依存型の経路を介して取り込まれて酸性エンドソーム区画へ達し、そこから毒素はサイトゾル内に転位される。おそらくサイトゾル中で、システインプロテアーゼドメインがＩｎｓＰ６の結合により活性化され、グリコシルトランスフェラーゼドメインの自己切断および放出をもたらし、これが次いでＲｈｏタンパク質（ＲｈｏＡ、−Ｂ、および−Ｃ）、ＲａｃおよびＣｄｃ４２を標的とする。これらの小さな制御タンパク質のグリコシル化により、細胞内の重要なシグナリング経路が破壊され、アクチンの縮合および結果として細胞の円形化（ｒｏｕｎｄｉｎｇ）、膜の小疱形成、および最終的なアポトーシスおよび標的細胞の死をもたらす。ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢはいずれも幅広い範囲の細胞種に対し活性を有するが、ＴｃｄＢはＴｃｄＡよりも高い酵素活性率を示し、いくつかの細胞種では細胞変性効果の速度を速める。細胞の種類に応じて、ＴｃｄＢは、異なる試験でＴｃｄＡよりも４倍〜２００倍の範囲のより高い細胞傷害性を有した。
【０００５】
ＣＤＡＤの再発予防を含む、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連感染症の効果的な処置および予防のための未だに対処されていない要望が存在する。本発明は、これらのおよび他の要望を満たすための、Ｂ毒素に対するマウス抗体およびヒト化抗体を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、１つの実施形態で、重鎖可変領域および軽可変領域を含む、単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部であって、重鎖可変領域が、配列番号１１０、１１１、および１１２に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域が、配列番号１０２、１０３および１０４に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部を含む。
【０００７】
別の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域および軽可変領域を含む、単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部であって、重鎖可変領域が、配列番号１２６、１２７および１２８に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域が、配列番号１１８、１１９および１２０に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部を含む。
【０００８】
第３の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、単離型モノクローナル抗体またはその抗原結合部であって、重鎖可変領域が、配列番号１４２、１４３および１４４に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域が、配列番号１３４、１３５および１３６に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部を含む。
【０００９】
第４の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、重単離型モノクローナル抗体またはその抗原結合部であって、重鎖可変領域が、配列番号２０６、２０７および２０８に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域が、配列番号１９８、１９９および２００に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部を含む。
【００１０】
第５の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖領域を含む、単離型モノクローナル抗体またはその抗原結合部であって、重鎖可変領域が、配列番号２２２、２２３および２２４に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変配列が、配列番号２１４、２１５および２１６に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部を含む。
【００１１】
第６の実施形態では、本発明は、重鎖領域および軽鎖領域を含む、単離型モノクローナル抗体またはその抗原結合部であって、重鎖可変領域が、配列番号２３８、２３９および２４０に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域が、配列番号２３０、２３１および２３２に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部を含む。
【００１２】
第７の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖領域を含む、単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部であって、重鎖可変領域が、配列番号２３８、２３９および２４０に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域が、配列番号２３０、２３１および２３２に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部を含む。
【００１３】
第８の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖領域を含む、単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部であって、重鎖可変領域が配列番号７１０と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域が配列番号７０８と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部を含む。
【００１４】
第９の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部であって、重鎖可変領域が、配列番号７６、７７および７８に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域が、配列番号６８、６９および７０に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部を含む。この実施形態では、重鎖可変領域が配列番号７５に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域が配列番号６７に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む。
【００１５】
第１０の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部であって、重鎖可変領域が、配列番号４４、４５および４６に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域が、配列番号３６、３７および３８に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部を含む。この実施形態では、重鎖可変領域が配列番号４３に示されるアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域が配列番号３５に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む。
【００１６】
第１１の実施形態では、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｂ毒素に結合する単離型モノクローナル抗体またはその抗原結合部は、配列番号１０９、１２５、１４１、１５７、１７３、１８９、２０５、２２１および２３７に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、かつ、配列番号１０１、１１７、１３３、１４９、１６５、１８１、１９７、２１３および２２９に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００１７】
第１２の実施形態では、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｂ毒素に結合する単離型モノクローナル抗体またはその抗原結合部は、配列番号３８９、４０５、４２１、４３７、４５３、４６９、４８５、５０１、５１７、５３３、５４９、５６５、５７１、５８７、６０３、６１９、６３５、６５１および７０９に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列を含む重鎖可変領域を含み、かつ、軽鎖可変領域が配列番号３８１、３９７、４１３、４２９、４４５、４６１、４７７、４９３、５０９、５２５、５４１、５５７、５６３、５７９、５９５、６１１、６２７、６４３および７０７に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列を含む。
【００１８】
本発明はまた、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部であって、重鎖可変領域が、配列番号７６、７７および７８に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域が、配列番号６８、６９および７０に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部を提供する。
【００１９】
本発明は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）Ｂ毒素に結合する単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部であって、
（１）重鎖可変領域であって、重鎖可変領域が、配列番号７６、７７および７８に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域、
（２）軽鎖可変領域であって、軽鎖可変領域が、配列番号６８、６９および７０に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域、
（３）重鎖可変領域であって、重鎖可変領域が配列番号７５に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域が配列番号６７に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域、
（４）重鎖可変領域および軽鎖可変領域であって、重鎖可変領域が、配列番号４４、４５および４６に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域が、配列番号３６、３７および３８に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域および軽鎖可変領域、
（５）重鎖可変領域であって、重鎖可変領域が、配列番号４４、４５および４６に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域、
（６）軽鎖可変領域であって、軽鎖可変領域が、配列番号３６、３７および３８に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域、
（７）重鎖可変領域であって、重鎖が配列番号４３に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域が配列番号３５に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域、
（８）重鎖可変領域および軽鎖可変領域であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号１１０、１１１および１１２；（ｉｉ）配列番号１２６、１２７および１２８；もしくは（ｉｉｉ）配列番号１４２、１４３および１４４に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号１０２、１０３および１０４；（ｉｉ）配列番号１１８、１１９および１２０；もしくは（ｉｉｉ）配列番号１３４、１３５および１３６に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同するアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域および軽鎖可変領域、
（９）重鎖可変領域であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号１１０、１１１および１１２；（ｉｉ）配列番号１２６、１２７および１２８；もしくは（ｉｉｉ）配列番号１４２、１４３および１４４に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域、
（１０）軽鎖可変領域であって、軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号１０２、１０３および１０４；（ｉｉ）配列番号１１８、１１９および１２０；もしくは（ｉｉｉ）配列番号１３４、１３５および１３６に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域、
（１１）重鎖可変領域であって、重鎖が配列番号１０９、１２５もしくは１４１に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域が配列番号１０１、１１７もしくは１３３に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域、
（１２）重鎖可変領域および軽鎖可変領域であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号２０６、２０７および２０８；（ｉｉ）配列番号２２２、２２３および２２４；もしくは（ｉｉｉ）配列番号２３８、２３９および２４０に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％未満相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号１９８、１９９および２００；（ｉｉ）配列番号２１４、２１５および２１６；もしくは（ｉｉｉ）配列番号２３０、２３１および２３２に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域および軽鎖可変領域、
（１３）重鎖可変領域であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号２０６、２０７および２０８；（ｉｉ）配列番号２２２、２２３および２２４；もしくは（ｉｉｉ）配列番号２３８、２３９および２４０に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域、
（１４）軽鎖可変領域であって、軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号１９８、１９９および２００；（ｉｉ）配列番号２１４、２１５および２１６；もしくは（ｉｉｉ）配列番号２３０、２３１および２３２に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ有する、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域、
（１５）重鎖可変領域であって、重鎖が配列番号２０５、２２１もしくは２３７に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の相同であるアミノ酸配列を有し、かつ軽鎖可変領域が、配列番号１９７、２１３もしくは２２９に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域、
（１６）重鎖可変領域および軽鎖可変領域であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号４８６、４８７および４８８；（ｉｉ）配列番号５０２、５０３および５０４；もしくは（ｉｉｉ）配列番号５１８、５１９および５２０に示される核酸配列と約８０〜約１００％相同である核酸によりそれぞれコードされる、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号４７８、４７９および４８０；（ｉｉ）配列番号４９４、４９５および４９６；もしくは（ｉｉｉ）配列番号５１０、５１１および５１２に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸によりそれぞれコードされる、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域および軽鎖可変領域、
（１７）重鎖可変領域であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号４８６、４８７および４８８；（ｉｉ）配列番号５０２、５０３および５０４；もしくは（ｉｉｉ）配列番号５１８、５１９および５２０に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸によりそれぞれコードされる、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域、
（１８）軽鎖可変領域であって、軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号４７８、４７９および４８０；（ｉｉ）配列番号４９４、４９５および４９６；もしくは（ｉｉｉ）配列番号５１０、５１１および５１２に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列によりそれぞれコードされる、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域、
（１９）重鎖可変領域および軽鎖可変領域であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号３９０、３９１および３９２；（ｉｉ）配列番号４０６、４０７および４０８；もしくは（ｉｉｉ）配列番号４２２、４２３および４２４に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸によりそれぞれコードされる、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号３８２、３８３および３８４；（ｉｉ）配列番号３９８、３９９および４００；もしくは（ｉｉｉ）配列番号４１４、４１５および４１６に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列によりそれぞれコードされる、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域および軽鎖可変領域、
（２０）重鎖可変領域であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号３９０、３９１および３９２；（ｉｉ）配列番号４０６、４０７および４０８；もしくは（ｉｉｉ）配列番号４２２、４２３および４２４に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列によりそれぞれコードされる、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域、
（２１）軽鎖可変領域であって、（ｉ）配列番号３８２、３８３および３８４；（ｉｉ）配列番号３９８、３９９および４００；もしくは（ｉｉｉ）配列番号４１４、４１５および４１６に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列によりそれぞれコードされる、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域、
（２２）重鎖可変領域および軽鎖可変領域であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６２０、６２１および６２２；（ｉｉ）配列番号６３６、６３７および６３８；もしくは（ｉｉｉ）配列番号６５２、６５３および６５４に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列によりそれぞれコードされる、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６１２、６１３および６１４；（ｉｉ）配列番号６２８、６２９および６３０；もしくは（ｉｉｉ）配列番号６４４、６４５および６４６に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列によりそれぞれコードされる、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域および軽鎖可変領域、
（２３）重鎖可変領域であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６２０、６２１および６２２；（ｉｉ）配列番号６３６、６３７および６３８；もしくは（ｉｉｉ）配列番号６５２、６５３および６５４に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列によりそれぞれコードされる、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域、
（２４）軽鎖可変領域であって、軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６１２、６１３および６１４；（ｉｉ）配列番号６２８、６２９および６３０；もしくは（ｉｉｉ）配列番号６４４、６４５および６４６に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列によりそれぞれコードされる、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域、
（２５）重鎖可変領域および軽鎖可変領域であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号５３４、５３５および５３６；（ｉｉ）配列番号５５０、５５１および５５２；もしくは（ｉｉｉ）配列番号５５６、５６７および５６８に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列によりそれぞれコードされる、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号５２６、５２７および５２８；（ｉｉ）配列番号５４２、５４３および５４４；もしくは（ｉｉｉ）配列番号５５８、５５９および５６０に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列によりそれぞれコードされる、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域および軽鎖可変領域、
（２６）重鎖可変領域であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号５３４、５３５および５３６；（ｉｉ）配列番号５５０、５５１および５５２；もしくは（ｉｉｉ）配列番号５６６、５６７および５６８に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列によりそれぞれコードされる、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域、
（２７）軽鎖可変領域であって、軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号５２６、５２７および５２８；（ｉｉ）配列番号５４２、５４３および５４４；もしくは（ｉｉｉ）配列番号５５８、５５９および５６０に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列によりそれぞれコードされる、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域、
（２８）配列番号４８５、５０１および５１７に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列によりコードされる重鎖可変領域であって、軽鎖可変領域が配列番号４７７、４９３および５０９に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列によりコードされる、重鎖可変領域、
（２９）重鎖可変領域であって、配列番号３８９、４０５もしくは４２１に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列によりコードされ、かつ軽鎖可変領域が配列番号３８１、３９７もしくは４１３に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列によりコードされる、重鎖可変領域、
（３０）重鎖可変領域であって、配列番号６１９、６３５もしくは６５１に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列によりコードされ、かつ軽鎖可変領域が配列番号６１１、６２７もしくは６４３に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列によりコードされる、重鎖可変領域、
（３１）重鎖可変領域であって、配列番号５３３、５４９もしくは５６５に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列によりコードされ、かつ軽鎖可変領域が配列番号５２５、５４１もしくは５５７に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列によりコードされる、重鎖可変領域、
（３２）重鎖可変領域であって、重鎖可変領域が配列番号１１、２７、４３、５９、７５もしくは９３に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域、
（３３）軽鎖可変領域であって、軽鎖可変領域が配列番号３、１９、３５、５１、６７もしくは８５に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域、
（３４）重鎖可変領域であって、重鎖可変領域が配列番号１０９、１２５、１４１、１５７、１７３、１８９、２０５、２２１、２３７もしくは７１０に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域、
（３５）軽鎖可変領域であって、軽鎖可変領域が配列番号１０１、１１７、１３３、１４９、１６５、１８１、１９７、２１３、２２９もしくは７０８に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域、
（３６）重鎖可変領域であって、重鎖可変領域が配列番号２５３、２６９、２８５、３０１、３１７、３４１、３５７もしくは３７３に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列によりコードされる、重鎖可変領域、
（３７）軽鎖可変領域であって、軽鎖可変領域が配列番号２４５、２６１、２７７、２９３、３０９、３２５、３３３、３４９もしくは３６５に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列によりコードされる、軽鎖可変領域、
（３８）重鎖可変領域であって、重鎖可変領域が配列番号３８９、４０５、４２１、４３７、４５３、４６９、４８５、５０１、５１７、５３３、５４９、５６５、５７１、５８７、６０３、６１９、６３５もしくは６５１に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列によりコードされる、重鎖可変領域、
（３９）軽鎖可変領域であって、軽鎖可変領域が配列番号３８１、３９７、４１３、４２９、４４５、４６１、４７７、４９３、５０９、５２５、５４１、５５７、５７９、５９５、６１１、６２７、６４３もしくは７１４に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列によりコードされる、軽鎖可変領域、もしくは
（４０）配列番号７５および６７に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ含む、重鎖可変領域および軽鎖可変領域
を含む、単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部を提供する。
【００２０】
単離型モノクローナル抗体またはその抗原結合部はＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅＢ毒素に結合し、かつ約１×１０−８Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）を有していてもよい。
【００２１】
単離型モノクローナル抗体または抗原結合部は、ヒト化されているかまたはキメラであってもよく、たとえば、マウス−ヒトであってもよく、かつ（ａ）全免疫グロブリン分子、（ｂ）ｓｃＦｖ、（ｃ）Ｆａｂフラグメント、（ｄ）Ｆ（ａｂ'）２、または（ｅ）ジスルフィド結合型Ｆｖであってもよく、かつ少なくとも１つの定常ドメイン、たとえば、（ａ）ＩｇＧ定常ドメイン、（ｂ）ＩｇＭ定常ドメイン、（ｃ）ＩｇＤ定常ドメイン、（ｄ）ＩｇＥ定常ドメイン、または（ｅ）ＩｇＡ定常ドメインを含んでもよい。本発明の抗体または抗原結合部は翻訳後修飾のために、融合パートナーまたは組み込みドメインにインフレームで融合して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの安定性を促進して製剤化／有効期間に影響を与えてもよく（たとえば被包、アシル化）、またはｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性を促進してＰＫ／ＰＤに影響を与えてもよい（たとえば、ペグ化、シアル酸付加（ｓｉａｌｙａｔｉｏｎ）、グリコシル化）。融合パートナーは、治療的または診断的適用のためのリガンドとして作用してもよい。抗体または抗原結合部は、結合価（多価）を介して結合活性が増大するよう改変されてもよく、または、他の抗原に対する抗体もしくは抗原結合部（たとえば、ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、二成分の毒素）との融合により、もしくは会合により特異性が補完されてもよい。
【００２２】
単離型モノクローナル抗体または抗原結合部は、（ｉ）Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅＢ毒素のフラグメント４；および／または（ｉｉ）Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅＢ毒素のフラグメント１に結合してもよい。
【００２３】
本発明は、単離型モノクローナル抗体、または抗原結合部であって、抗体、またはその抗原結合部が、（１）配列番号４３および３５に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域；（２）（ｉ）配列番号１０９および１０１；（ｉｉ）配列番号１２５および１１７；（ｉｉｉ）配列番号１４１および１３３に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域；（３）（ｉ）配列番号２０５および１９７；（ｉｉ）配列番号２２１および２１３；または（ｉｉｉ）配列番号２３７および２２９に示されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域；（４）（ｉ）配列番号３８９および３８１；（ｉｉ）配列番号４０５および３９７；（ｉｉｉ）配列番号４２１および４１３；または（ｉｖ）配列番号７０９および７０７に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列をそれぞれ含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域；もしくは、（５）（ｉ）配列番号４８５および４７７；（ｉｉ）配列番号５０１および４９３；もしくは（ｉｉｉ）配列番号５１７および５０９に示される核酸配列と約８０％〜約１００％相同である核酸配列によりそれぞれコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体により認識されるＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅＢ毒素と同一のまたは抗原的に類似するエピトープに結合する、単離型モノクローナル抗体または抗原結合部を提供する。
【００２４】
本発明は、ＣＡＮ３３Ｇ１、ＣＡＮ４６Ｇ４、ＣＡＮ４６Ｇ１３、ＣＡＮ４６Ｇ１３ａ、ＣＡＮ４６Ｇ１９もしくはＣＡＮ４６Ｇ２４と命名されたハイブリドーマにより産生される単離型モノクローナル抗体、またはＣＡＮ３３Ｇ１、ＣＡＮ４６Ｇ４、ＣＡＮ４６Ｇ１３、ＣＡＮ４６Ｇ１３ａ、ＣＡＮ４６Ｇ１９もしくはＣＡＮ４６Ｇ２４と命名されたハイブリドーマを提供する。
【００２５】
本発明は、単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部を提供し、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＢ毒素の実験の際に、哺乳類を約７５ｎｇまたは約７５ｎｇ超のＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅＢ毒素に曝露する約２４時間前に、抗体、またはその抗原結合部が約８ｍｇ／ｋｇ体重〜約１３ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で哺乳類に投与される場合、哺乳類の生存率が、毒素Ｂへの曝露後約４時間以内に約８０％超である。致死量または致死濃度は、毒素の毒性に依存する。したがって毒素を中和するために必要な抗体の量は変動してもよい。
【００２６】
本発明は、単離型モノクローナル抗体、またはその抗原結合部であって、抗体、またはその抗原結合部が約２５μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの中和アッセイにて約５ｎｇ／ｍｌのＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅＢ毒素の約４０％超を中和する。毒素の毒性は、細胞株間で変動するため、それが単離された株に依存する。したがって、毒素を中和するために必要な抗体の濃度は、毒素の供給源に依存する。
【００２７】
本発明に使用し得る細胞としては、限定するものではないが、細菌細胞、真核細胞、または哺乳類細胞が挙げられる。たとえば、細胞はＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１ＳＶ、Ｐｅｒ．Ｃ６、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＳＰ２／０、ＨｅＬａ、骨髄腫細胞またはリンパ腫細胞であってよい。
【００２８】
本発明は、
（１）ＣＡＮ４６Ｇ１３−１−８（ハイブリドーマはＡＴＣＣ特許寄託指定（Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）ＰＴＡ-１３２５７を有するアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されている。ＰＴＡ−１３２５７の寄託物は２０１２年８月２３日に作製された。本明細書に使用されるように、ＣＡＮ４６Ｇ１３ａは、ハイブリドーマクローンＣＡＮ４６Ｇ１３−１−８または対応するクローンにより産生されたモノクローナル抗体を指す）、
（２）ＣＡＮ４６Ｇ４−１−２（ハイブリドーマはＡＴＣＣ特許寄託指定ＰＴＡ−  １３２５８を有するアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されている。ＰＴＡ−１３２５８の寄託物は２０１２年８月２３日に作製された。本明細書に使用されるように、ＣＡＮ４６Ｇ４は、クローンＣＡＮ４６Ｇ４−１−２または対応するクローンにより産生されるモノクローナル抗体を指す）、
（３）ＣＡＮ４６Ｇ１９−３−２（ハイブリドーマはＡＴＣＣ特許寄託指定ＰＴＡ−１３２５９を有するアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されている。ＰＴＡ−１３２５９の寄託物は２０１２年８月２３日に作製された。本明細書で使用されるように、ＣＡＮ４６Ｇ１９は、クローンＣＡＮ４６Ｇ１９−３−２または対応するクローンにより産生されるモノクローナル抗体を指す）、
（４）ＣＡＮ４６Ｇ１３−１−５（ハイブリドーマはＡＴＣＣ特許寄託指定ＰＴＡ−１３２６０を有するアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されている。ＰＴＡ−１３２６０は２０１２年８月２３日に作製された。本明細書に使用されるように、ＣＡＮ４６Ｇ１３およびＣＡＮ４６Ｇ２４は、クローンＣＡＮ４６Ｇ１３−１−５または対応するクローンにより産生されるモノクローナル抗体を指す。ＣＡＮ４６Ｇ１３およびＣＡＮ４６Ｇ２４により産生されるモノクローナル抗体の配列は同一である）
と命名されたハイブリドーマにより産生される抗体を提供する。
【００２９】
本発明は、単離型モノクローナル抗体またはその抗原結合部、および少なくとも一つの薬学的に許容可能なキャリアーを含む、組成物を提供する。この組成物は、本発明の抗体またはその抗原結合部の有効量を対象に投与することを含む、Ｃ．  ｄｉｆｆｌｃｉｌｅ関連疾患を予防または処置する方法として使用されてもよい。抗体またはその抗原結合部は、静脈内に、皮下に、筋肉内に、または経皮的に投与されてもよい。本発明の方法は、異なる抗体またはそのフラグメント（たとえばＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅＡ毒素を結合する抗体またはその抗原結合部）、抗寄生虫薬（たとえばニタゾキサニド（ｎｉｔｒａｚｏｘａｎｉｄｅ））、抗生剤（たとえばバンコマイシン、メトロニダゾール、メトロニダゾール、リファキシミン、もしくはフィダキソマイシン）、プロバイオティクス（サッカロマイセス・ブラウディ、ビフィズス菌、もしくは乳酸桿菌を備える組成物）、または糞便移植片（ｆｅｃａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）などの第２の薬剤、または複数の薬剤（たとえば、第３、第４、第５および第６の薬剤）を対象に投与するステップをさらに含んでもよい。本発明の方法は、異なる抗体またはそのフラグメント（たとえば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅＢ毒素の異なるフラグメントを結合する抗体またはその抗原結合部）などの１つ以上の追加的な薬剤を対象に投与するステップをさらに含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】全Ｂ毒素（ＴｃｄＢ）、Ｂ毒素のフラグメント４（ＴｃｄＢ  Ｆ４）、およびＢ毒素のフラグメント１（ＴｃｄＢ  Ｆ１）に対するＣＡＮ３３およびＣＡＮ４６モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異的な結合を示すＥＬＩＳＡである。対照抗体ｈＰＡ−４１、マウス抗Ｂ毒素ポリクローナル（マウスｐＡＢ）、および抗Ｂ毒素（ＣＡＮ２０Ｇ２）と共に、ＴｃｄＡ（Ａ毒素）陰性対照を示す。
【図２】マウスＣＡＮ３３およびＣＡＮ４６ｍＡｂが異なるエピトープと結合し、かつＢ毒素に関するｍＡｂ  ＭＤＸ−１３８８  （Ｍｅｄａｒｅｘ）と競合しないことを示す競合ＥＬＩＳＡである。
【図３】マウスＣＡＮ３３およびＣＡＮ４６ｍＡｂが異なるエピトープと結合し、かつＢ毒素に関するｍＡｂ  ｈＰＡ−４１（Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．）と競合しないことを示す競合ＥＬＩＳＡである。
【図４】精製したマウスＣＡＮ４６Ｇ４およびＣＡＮ４６Ｇ１９  ｍＡｂのウェスタン免疫ブロットを示す。
【図５】精製したマウスＣＡＮ４６Ｇ１３およびＣＡＮ４６Ｇ１３ａ  ｍＡｂのウェスタン免疫ブロットを示す。
【図６】精製したマウスＣＡＮ４６Ｇ２４  ｍＡｂのウェスタン免疫ブロットを示す。
【図７】マウスＣＡＮ４６Ｇ４、ＣＡＮ４６Ｇ１３ａおよびＣＡＮ４６Ｇ２４に関するエピトープビニンググラフ（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｂｉｎｎｉｎｇ  ｇｒａｐｈ）である。
【図８】ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅプラットフォームを使用したＨＴ−２９細胞でのＴｃｄＢの４−ＰＬ毒素の滴定曲線を示す。
【図９】マウスの生存に関するＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅＢ毒素の効果およびＢ毒素試験に対するマウスＣＡＮ３３およびマウスＣＡＮ４６ｍＡｂの有効性を示す棒グラフである。
【図１０】ＲＮＡ由来の可変（ｖａｒｉｂａｂｌｅ）（Ｖ）鎖遺伝子増幅に使用されるプライマーを示す。
【図１１】マウスＣＡＮ４６およびＣＡＮ３３Ｇ１の部分的クローン由来のＶＨおよびＶＬの両方の配列を含む、マウスＣＡＮ４６Ｇ４、ＣＡＮ４６Ｇ１３ａ、ＣＡＮ４６Ｇ１９、ＣＡＮ４６Ｇ２４、ＣＡＮ４６Ｇ１３、およびＣＡＮ３３Ｇ１に関する可変（Ｖ）遺伝子シークエンシングを示す。
【図１２】ヒト化ＣＤＲ移植ＣＡＮ４６  ｍＡｂのアミノ酸可変Ｖ領域配列を示す。
【図１３】ヒト化ｈｕＣＡＮ４６Ｇ  ｍＡｂのアミノ酸可変Ｖ領域配列を示す。
【図１４】再表面化した、ヒト化ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ  ｍＡｂのアミノ酸可変Ｖ領域配列を示す。
【図１５ａ】棒グラフとして示される２５０ｐｇ／ｍｌでのＨＥＫ２９３Ｆ細胞中で発現させたＰｅｒ．Ｃ６構築物の精製済みヒト化ＣＡＮ４６Ｇ４バリアントのｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和データを表す棒グラフを示す。
【図１５ｂ】棒グラフとして示される２５０ｐｇ／ｍｌでのＨＥＫ２９３Ｆ細胞中で発現させたＰｅｒ．Ｃ６構築物の精製済みヒト化ＣＡＮ４６Ｇ１９バリアントのｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和データを表す棒グラフを示す。
【図１６】マウスの生存に関するＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅＢ毒素の効果およびＢ毒素試験に対するヒト化ＣＡＮ４６Ｇ１３ａ  ｍＡｂ（Ｐｅｒ．Ｃ６ベース構築物を発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞から精製）の効果を示すカプラン・マイヤープロットである。
【図１７】マウスの生存に関するＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅＢ毒素の効果およびＢ毒素試験に対するヒト化ＣＡＮ４６  ｍＡｂ（Ｐｅｒ．Ｃ６−ベース構築物を発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞から精製）の効果を示すカプラン・マイヤープロットである。
【図１８】Ｂ毒素試験前（試験の１２時間前）および後（試験の７２時後）のヒト化ＣＡＮ４６ｍＡｂを注射したマウスからの総ヒトＩｇＧのＥＬＩＳＡの結果を示す表である。
【図１９】ヒト化ＣＡＮ４６Ｇ２４  ｍＡｂのＩｎ  ｖｉｔｒｏＢ毒素中和を示す折れ線グラフである。
【図２０】ヒト化ＣＡＮ４６Ｇ１３ａ  ｍＡｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏＢ毒素中和を示す折れ線グラフである。
【図２１】ヒト化ＣＡＮ４６Ｇ１９  ｍＡｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏＢ毒素中和を示す折れ線グラフである。
【図２２】ヒト化ｈｕＣＡＮ４６Ｇ  ｍＡｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏＢ毒素中和を能力示す折れ線グラフである。
【図２３】ヒト化ＣＡＮ４６Ｇ  ｍＡｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏＢ毒素中和能力を示す折れ線グラフである。
【図２４】ヒト化ＣＡＮ４６Ｇ４、ＣＡＮ４６Ｇ１３ａ、およびＣＡＮ４６Ｇ１９  Ｔｅｄ  Ｂ  ｍＡｂの親和性解析を示す表である。
【図２５】ＣＨＯベース構築物を発現するＣＨＯＫ１ＳＶ細胞から精製したヒト化ＣＡＮ４６Ｇ  ｍＡｂのＩｎ  ｖｉｔｒｏＢ毒素中和を示す折れ線グラフである。
【図２６】様々なＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ臨床単離物に対するヒト化ＣＡＮ４６ｍＡｂのＥＣ５０を示す複数の棒グラフを含む。
【図２７】Ｂ１  Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ胞子での感染に対するヒトＣＤＡ１／ＭＤＸ１３８８およびヒト化ＨｅＣＡＮ２０Ｇ２／ＨｕＣＡＮ４６Ｇ２４ｍＡｂの用量のハムスターの生存に関する防御効果を示すカプラン・マイヤープロットである。
【図２８Ａ】Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｂ１胞子での感染後のハムスターの体重におけるベースラインからの変化を示す。
【図２８Ｂ】Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｂ１胞子での感染後のハムスターにおける毒素特異的ヒトＣＤＡ１／ＭＤＸ１３８８  ｍＡｂおよびヒト化ＨｅＣＡＮ２０Ｇ２／ＨｕＣＡＮ４６Ｇ２４  ｍＡｂのレベルを示す。
【図２９】異なるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株由来の部分精製した毒素に対するＰｅｒ．Ｃ６ベース構築物を発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞から精製した異なるｍＡｂの、直接的なＥＬＩＳＡにより測定したｉｎ  ｖｉｔｒｏでの免疫反応性応答を示す表である。
【図３０】Ｂ１およびＮＡＰ１株（ＢＩ−１、ＢＩ−６、およびＢＩ−１７）についての異なる実験を通して行われた独立アッセイから決定された、異なる抗体の組み合わせの％中和を示す。
【図３１】サンドイッチＥＬＩＳＡによる、異なるＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ非ＮＡＰ  １およびＮＡＰ１株から捕捉した毒素に対するヒト化ＣＡＮ４６ｍＡｂの結合の特徴を示すグラフを含む。
【図３２】ＥＬＩＳＡによる、異なるＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ非ＮＡＰ１株から捕捉した毒素に対するヒト化ＣＡＮ４６の免疫反応性を示すグラフである。
【図３３】ＥＬＩＳＡによる、異なるＮＡＰ１  Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株から捕捉したＢ毒素に対するヒト化ＣＡＮ４６Ｇ  ｍＡｂの免疫反応性を示すグラフである。
【図３４】ＣＨＯ構築物を発現するＣＨＯＫＳ１Ｖ細胞から精製したヒト化ＣＡＮ４６  ｍＡｂのウェスタン免疫ブロットを示す。
【図３５】Ｐｅｒ．Ｃ６ベース構築物を発現するＨＥＫ２９３細胞から精製したヒト化ＣＡＮ４６  ｍＡｂのウェスタン免疫ブロットを示す。
【図３６】ＣＨＯベース構築物を発現するＣＨＯＫ１ＳＶ細胞から精製したＴｅｄＢヒト化ｍＡｂ  ＣＡＮ４６Ｇ２４およびＣＡＮ４６Ｇ１３ａの親和性解析を示す表である。
【図３７】Ｂ毒素およびＡ毒素に対するヒト化ＣＡＮ４６  ｍＡｂの結合特異性を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細菌感染症または細菌保因の診断、予防または処置のための組成物および方法を提供する。本組成物は、マウスモノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体（マウス／ヒト）、または上記のいずれかの抗原結合部を含む、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＢ毒素を認識する抗体（または抗原結合部）を含む。これらの抗体（またはその抗原結合部）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏでＢ毒素を中和でき、かつ／または哺乳類細胞へのＢ毒素の結合を阻害できる。したがって、本発明の抗体または抗原結合部は、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連疾患（ＣＤＡＤ）を予防または処置するための受動免疫の方法またはプロトコルに使用できる。
【００３２】
１つの実施形態では、本発明の抗体または抗原結合部は、以下の効果：対象におけるＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ媒介型大腸炎、抗生剤関連大腸炎、偽膜性大腸炎（ＰＭＣ）もしくは他の腸疾患からの保護、または上記疾患の処置；対象における下痢からの保護もしくは下痢の処置；および／またはＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ媒介疾患の再発の処置もしくは阻害のうちの１つ以上の効果を提供する。哺乳類に投与された場合、本発明の抗体または抗原結合部は、抗体またはその抗原結合部を投与してない哺乳類には致死的である量で投与されたＢ毒素に対し哺乳類を保護してもよい。
【００３３】
本発明の抗体または抗原結合部は、ハイブリドーマＣＡＮ４６Ｇ４、ＣＡＮ４６Ｇ１３、ＣＡＮ４６Ｇ１３ａ、ＣＡＮ４６Ｇ１９、ＣＡＮ４６Ｇ２４およびＣＡＮ３３Ｇ１により産生されるマウス抗体ならびに本明細書に記載される同一のハイブリドーマ由来のヒト化抗体を含む。
【００３４】
本発明はまた、ハイブリドーマＣＡＮ４６Ｇ４、ＣＡＮ４６Ｇ１３、ＣＡＮ４６Ｇ１３ａ、ＣＡＮ４６Ｇ１９、ＣＡＮ４６Ｇ２４またはＣＡＮ３３Ｇ１により産生される抗体の抗原結合部を含む、抗体または抗原結合部を含む。本明細書に使用されるように、ＣＡＮ４６Ｇ４、ＣＡＮ４６Ｇ１３、ＣＡＮ４６Ｇ１３ａ、ＣＡＮ４６Ｇ１９、ＣＡＮ４６Ｇ２４およびＣＡＮ３３Ｇ１は、ハイブリドーマクローンまたは対応するハイブリドーマクローンにより作製されるモノクローナル抗体を指す。
【００３５】
抗体または抗原結合部は、Ｂ毒素のフラグメント１内のエピトープ：（ｉ）、たとえば、Ｂ毒素のアミノ酸残基１〜５９２の間のエピトープに特異的に結合でき（ＣＡＮ４６Ｇ１３ａ）；またはＢ毒素のフラグメント４内のエピトープ、たとえば、Ｂ毒素のアミノ酸残基１７７７〜２３６６の間のエピトープに特異的に結合できる（ＣＡＮ４６Ｇ４、ＣＡＮ４６Ｇ１３、ＣＡＮ４６Ｇ１９、ＣＡＮ４６Ｇ２４またはＣＡＮ３３Ｇ１）（Ｂａｂｃｏｃｋ，  Ｇ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  ７４：  ６３３９−６３４７  （２００６））。
【００３６】
他の実施形態では、抗体または抗原結合部は、Ｂ毒素のフラグメント２（アミノ酸残基５９３〜１１８３）またはフラグメント３（アミノ酸残基１１８４〜１７７６）内のエピトープと特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体または抗原結合部は、Ｂ毒素のアミノ酸残基１〜６００、４００〜６００、４１５〜５４０、１〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００、９００〜１０００、１１００〜１２００、１２００〜１３００、１３００〜１４００、１４００〜１５００、１５００〜１６００、１６００〜１７００、１８００〜１９００、１９００〜２０００、２０００〜２１００、２１００〜２２００もしくは２２００〜２３６６、またはそれらの任意の間隔、一部もしくは範囲の中のエピトープと特異的に結合する。
【００３７】
本発明の抗体、または抗原結合部は、限定するものではないが、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、および上記の抗原結合部を含む。抗体の抗原結合部は、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素（たとえばＢ毒素）に特異的に結合する抗体の一部を含んでもよく、かつ抗体分子の重鎖または軽鎖のみを含んでもよい。
【００３８】
ＣＤＲおよび可変領域
本発明の抗体または抗原結合部のＣＤＲは、たとえばマウス（ハツカネズミ）などの非ヒト原料またはヒト原料（ホモサピエンス）由来であってよい。本発明の抗体または抗原結合部のフレームワークは、ヒト、ヒト化、非ヒト（たとえば、ヒトでの抗原性を低下させるために改変したマウスのフレームワーク）、または合成フレームワーク（たとえばコンセンサス配列）であってよい。
【００３９】
１つの実施形態では、本発明の抗体、または抗原結合部は、少なくとも１つの重鎖可変領域および／または少なくとも１つの軽鎖可変領域を含む。重鎖可変領域（または軽鎖可変領域）は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置される３つのＣＤＲおよび４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含む（Ｋａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−３２４２，  １９９１．  Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７，  １９８７）。
【００４０】
本発明の抗体または抗原結合部は、約１０−７Ｍ未満、約１０−８Ｍ未満、約１０−９Ｍ未満、約１０−１０Ｍ未満、約１０−１１Ｍ未満、または約１０−１２Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）でＢ毒素へ特異的に結合できる。
【００４１】
クローンＣＡＮ４６Ｇ４、ＣＡＮ４６Ｇ１３、ＣＡＮ４６Ｇ１３ａ、ＣＡＮ４６Ｇ１９、ＣＡＮ４６Ｇ２４またはＣＡＮ３３Ｇ１により産生される抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約９０％〜約１００％、約９５％〜約１００％、約９５％〜約１００％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％相同である重鎖可変領域および軽鎖可変領域を備える抗体もまたＢ毒素に結合でき、本発明に包有される。
【００４２】
関連する実施形態では、抗Ｂ毒素抗体または抗原結合部は、たとえば、ＣＡＮ４６Ｇ４、ＣＡＮ４６Ｇ１３、ＣＡＮ４６Ｇ１３ａ、ＣＡＮ４６Ｇ１９、ＣＡＮ４６Ｇ２４またはＣＡＮ３３Ｇ１の可変重鎖および／または可変軽鎖のＣＤＲを含む。これらのクローン由来の重鎖可変領域のＣＤＲ、およびこれらのクローン由来の軽鎖可変領域のＣＤＲを表１に示す。
【表１】
2016501877.tif 000002
2016501877.tif 000003
2016501877.tif 000004
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2016501877.tif 000056
【００４３】
表１では、アミノ酸配列についてＣＤＲは下線が引かれており、ヌクレオチド配列についてＣＤＲはＩＭＧＴによりナンバリングされている（Ｈ：重鎖、Ｋ：κ鎖）。ＣＤＲ領域は、カバット、ＩＭＧＴ、Ｈｏｎｎｅｇｇｅｒ、およびＣｈｏｔｈｉａを使用して同定でき、したがって変動し得る。
【００４４】
本明細書に使用されるように、「〜と相同である」は、定義した配列、アミノ酸またはヌクレオチドと、「少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約９０％〜約１００％、約９５％〜約１００％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％相同である」ことを意味する。範囲が、たとえば約８０％〜約１００％と特定されている場合、ここで使用される相同性という用語は、特定した範囲の相同性を指す。
【００４５】
抗体または抗原結合部は、（１）クローンＣＡＮ３３Ｇ１（配列番号：９３）、ＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：１１）、ＣＡＮ４６Ｇ１３（配列番号：２７）、ＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：４３）、ＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：５９）、またはＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：７５）により産生される抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と；および／または、（２）クローンＣＡＮ３３Ｇ１（配列番号：８５）、ＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：３）、ＣＡＮ４６Ｇ１３（配列番号：１９）、ＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：３５）、ＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：５１）、またはＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：６７）により産生される抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含んでよい。抗体または抗原結合部は、先行する段落に列挙される重鎖可変領域（１）および軽鎖可変領域（２）に示されるアミノ酸配列の任意の組み合わせを含んでよい。
【００４６】
抗体または抗原結合部は、これらのクローンＣＡＮ４６Ｇ４、ＣＡＮ４６Ｇ１３、ＣＡＮ４６Ｇ１３ａ、ＣＡＮ４６Ｇ１９、ＣＡＮ４６Ｇ２４またはＣＡＮ３３Ｇ１に由来するヒト化抗体を含むが限定されない、クローンにより産生される抗体によって結合されるエピトープと、アミノ酸または核酸配列レベルで重複する、抗原的に類似している、または相同であるエピトープと特異的に結合でき、かつＢ毒素への結合についてクローンＣＡＮ４６Ｇ４、ＣＡＮ４６Ｇ１３、ＣＡＮ４６Ｇ１３ａ、ＣＡＮ４６Ｇ１９、ＣＡＮ４６Ｇ２４またはＣＡＮ３３Ｇ１により産生される抗体と競合できる。
【００４７】
１つの実施形態では、本発明の抗体または抗原結合部は、（１）クローンＣＡＮ３３Ｇ１（配列番号：９４、９５および／もしくは９６）、ＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：１２、１３および／もしくは１４）、ＣＡＮ４６Ｇ１３（配列番号：２８、２９および／もしくは３０）、ＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：４４、４５および／もしくは４６）、ＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：６０、６１および／もしくは６２）、もしくはＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：７６、７７および／もしくは７８）により産生される抗体の１、２、３もしくはそれを超えるＣＤＲと相同である、１、２、３もしくはそれを超える相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域；または、（２）クローンＣＡＮ３３Ｇ１（配列番号：８６、８７および／もしくは８８）、ＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：４、５および／もしくは６）、ＣＡＮ４６Ｇ１３（配列番号：２０、２１および／もしくは２２）、ＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：３６、３７および／もしくは３８）、ＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：５２、５３および／もしくは５４）、もしくはＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：６８、６９および／もしくは７０）により産生される抗体の１、２、３、もしくはそれを超えるＣＤＲと相同である１、２、３またはそれを超えるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む。抗体または抗原結合部は、先行する段落に列挙される重鎖可変領域（１）および軽鎖可変領域（２）に示されるアミノ酸配列の任意の組み合わせを含んでよい。
【００４８】
別の実施形態では、抗体または抗原結合部は、（ｉ）クローンｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：１１０、１１１および／もしくは１１２）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：１２６、１２７および／もしくは１２８）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：１４２、１４３および／もしくは１４４）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：１５８、１５９および／もしくは１６０）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：１７４、１７５および／もしくは１７６）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：１９０、１９１および／もしくは１９２）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：２０６、２０７および／もしくは２０８）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：２２２、２２３および／もしくは２２４）もしくはｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：２３８、２３９および／もしくは２４０）により産生される抗体の１、２、３もしくはそれを超えるＣＤＲと相同である１、２、３もしくはそれを超える相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体もしくは抗原結合部の重鎖可変領域；または（ｉｉ）クローンｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：１０２、１０３および／もしくは１０４）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：１１８、１１９および／もしくは１２０）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：１３４、１３５および／もしくは１３６）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：１５０、１５１および／もしくは１５２）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：１６６、１６７および／もしくは１６８）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：１８２、１８３および／もしくは１８４）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：１９８、１９９および／もしくは２００）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：２１４、２１５および／もしくは２１６）もしくはｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：２３０、２３１、および／もしくは２３２）により産生される抗体の軽鎖可変領域の１、２、３もしくはそれを超えるＣＤＲと相同である１、２、３もしくはそれを超えるＣＤＲを含む抗体もしくは抗原結合部の軽鎖可変領域を含んでよい。抗体または抗原結合部は、先行する段落に列挙される重鎖可変領域および軽鎖可変領域のＣＤＲに示されるアミノ酸配列の任意の組み合わせを含んでよい。
【００４９】
第３の実施形態では、抗体または抗原結合部は、（ｉ）クローンｄｒＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：１１０、１１１および／もしくは１１２）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：１２６、１２７および／もしくは１２８）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：１４２、１４３および／もしくは１４４）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：１５８、１５９および／もしくは１６０）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：１７４、１７５および／もしくは１７６）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：１９０、１９１、および／もしくは１９２）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：２０６、２０７および／もしくは２０８）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：２２２、２２３および／もしくは２２４）もしくはｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：２３８、２３９および／もしくは２４０）により産生される抗体の１、２、３もしくはそれを超えるＣＤＲと相同である１、２、３もしくはそれを超える相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体もしくは抗原結合部の重鎖可変領域；または（ｉｉ）クローンｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：１０２、１０３および／もしくは１０４）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：１１８、１１９および／もしくは１２０）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：１３４、１３５および／もしくは１３６）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：１５０、１５１および／もしくは１５２）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：１６６、１６７および／もしくは１６８）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：１８２、１８３および／もしくは１８４）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：１９８、１９９および／もしくは２００）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：２１４、２１５および／もしくは２１６）もしくはｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：２３０、２３１および／もしくは２３２）により産生される抗体の軽鎖可変領域の１、２、３もしくはそれを超えるＣＤＲと相同である１、２、３もしくはそれを超えるＣＤＲを含む抗体もしくは抗原結合部の軽鎖可変領域を含む。
【００５０】
特定の実施形態では、抗体または抗原結合部は、クローンｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：１０１および１０９、それぞれ軽鎖可変領域−重鎖可変領域）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：１１７および１２５、それぞれ軽鎖可変領域−重鎖可変領域）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：１３３および１４１、それぞれ軽鎖可変領域−重鎖可変領域）、キメラＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：７０８および７１０、それぞれ軽鎖可変領域−重鎖可変領域）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：１４９および１５７、それぞれ軽鎖可変領域−重鎖可変領域）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：１６５および１７３、それぞれ軽鎖可変領域−重鎖可変領域、軽鎖可変領域−重鎖可変領域）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（それぞれ配列番号：１８１および１８９）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ２４（それぞれ配列番号：１９７および２０５）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：２１３および２２１、それぞれ軽鎖可変領域−重鎖可変領域）またはｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：２２９および２３７、それぞれ軽鎖可変領域−重鎖可変領域）により産生される抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域と相同である軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。
【００５１】
抗体または抗原結合部は、（ｉ）配列番号１０１、１１７、１３３、７０８、１４９、１６５もしくは１８１、１９７、２１３もしくは２２９に示される軽鎖可変領域と相同である軽鎖可変領域；または（ｉｉ）配列番号１０９、１２５、１４１、７１０、１５７、１７３、１８９、２０５、２２１もしくは２３７に示される重鎖可変領域と相同である重鎖可変領域を含んでよい。特定の実施形態では、抗体または抗原結合部は、重鎖可変領域（ｉ）および軽鎖可変領域（ｉｉ）の両方を含む。
【００５２】
抗体または抗原結合部は、（ｉ）配列番号６６７、６８３、６９９、３８９、４０５、４２１、５３３、５４９、５６５、７０９、４３７、４５３、４６９、５７１、５８７、６０３、４８５、５０１、５１７、６１９、６３５、もしくは６５１に示される核酸配列と相同である核酸配列によりコードされる重鎖可変領域；（ｉｉ）配列番号６５９、６７５、６９１、３８１、３９７、４１３、５２５、５４１、５５７、７０７、４２９、４４５、４６１、５５７、５７９、５９５、４７７、４９３、５０９、６１１、６２７、もしくは６４３に示される核酸配列と相同である核酸配列によりコードされる軽鎖可変領域；ならびに／または、（ｉｉｉ）配列番号６６７、６８３、６９９、３８９、４０５、４２１、５３３、５４９、５６５、７０９、４３７、４５３、４６９、５７１、５８７、６０３、４８５、５０１、５１７、６１９、６３５、もしくは６５１に示される核酸配列と相同である核酸配列によりコードされる重鎖可変領域、および配列番号６５９、６７５、６９１、３８１、３９７、４１３、５２５、５４１、５５７、７０７、４２９、４４５、４６１、５５７、５７９、５９５、４７７、４９３、５０９、６１１、６２７、もしくは６４３に示される核酸配列と相同である核酸配列によりコードされる軽鎖可変領域の両方を含んでよい。
【００５３】
抗体または抗原結合部は、（ｉ）ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：６６８、６６９および／もしくは６７０）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：６８４、６８５および／もしくは６８６）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：７００、７０１および／もしくは７０２）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：（ａ）３９０、３９１および／もしくは３９２、もしくは（ｂ）５３４、５３５および／もしくは５３６）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：（ａ）４０６、４０７および／もしくは４０８、もしくは（ｂ）５５０、５５１および／もしくは５５２）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：（ａ）４２２、４２３および／もしくは４２４、もしくは（ｂ）５６６、５６７および／もしくは５６８）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：（ａ）４３８、４３９および４４０、もしくは（ｂ）５７２、５７３および／もしくは５７４）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：（ａ）４５４、４５５および／もしくは４５６、もしくは（ｂ）５８８、５８９および／もしくは５９０）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：（ａ）４７０、４７１および／もしくは４７２、もしくは（ｂ）６０４、６０５および／もしくは６０６）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：（ａ）４８６、４８７および／もしくは４８８、もしくは（ｂ）６２０、６２１および／もしくは６２２）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：（ａ）５０２、５０３および／もしくは５０４、もしくは（ｂ）６３６、６３７および／もしくは６３８）もしくはｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：（ａ）５１８、５１９および／もしくは５２０、もしくは（ｂ）６５２、６５３および／もしくは６５４に示される重鎖可変領域のｃｄｒ；または、（ｉｉ）ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：６６０、６６１および／もしくは６６２）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：６７６、６７７および／もしくは６７８）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：６９２、６９３および／もしくは６９４）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：（ａ）３８２、３８３、および／もしくは３８４、もしくは（ｂ）５２６、５２７および／もしくは５２８）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：（ａ）３９８、３９９および／もしくは４００、もしくは（ｂ）５４２、５４３および／もしくは５４４）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：（ａ）４１４、４１５および／もしくは４１６、もしくは（ｂ）５５８、５５９および／もしくは５６０）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：（ａ）４３０、４３１および／もしくは４３２、もしくは（ｂ）７１５、７１６および／もしくは７１７）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：（ａ）４４６、４４７および／もしくは４４８、もしくは（ｂ）５８０、５８１および５８２）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：（ａ）４６２、４６３および／もしくは４６４、もしくは（ｂ）５９６、５９７および／もしくは５９８）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：（ａ）４７８、４７９および／もしくは４８０、もしくは（ｂ）６１２、６１３および／もしくは６１４）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：（ａ）４９４、４９５および／もしくは４９６もしくは（ｂ）６２８、６２９および／もしくは６３０）もしくはｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：（ａ）５１０、５１１、および５１２、もしくは（ｂ）６４４、６４５および／もしくは６４６）に示される軽鎖可変領域のｃｄｒの核酸配列によりコードされる、１、２、３またはそれを超えるＣＤＲと相同である核酸配列によりコードされる、１、２、３またはそれを超える相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでよい。
【００５４】
特定の実施形態では、抗体または抗原結合部は、重鎖可変領域（ｉ）および軽鎖可変領域（ｉｉ）の両方を含む。具体的には、抗体もしくは抗原結合部は、（ｉ）ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：６６８、６６９および／もしくは６７０）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：６８４、６８５および／もしくは６８６）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：７００、７０１および／もしくは７０２）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：（ａ）３９０、３９１および／もしくは３９２、もしくは（ｂ）５３４、５３５および／もしくは５３６）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：（ａ）４０６、４０７および／もしくは４０８、もしくは（ｂ）５５０、５５１および／もしくは５５２）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：（ａ）４２２、４２３および／もしくは４２４、もしくは（ｂ）５６６、５６７および／もしくは５６８）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：（ａ）４３８、４３９、および４４０、もしくは（ｂ）５７２、５７３および／もしくは５７４）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：（ａ）４５４、４５５および／もしくは４５６、もしくは（ｂ）５８８、５８９および／もしくは５９０）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：（ａ）４７０、４７１および／もしくは４７２、もしくは（ｂ）６０４、６０５および／もしくは６０６）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：（ａ）４８６、４８７および／もしくは４８８、もしくは（ｂ）６２０、６２１および／もしくは６２２）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：（ａ）５０２、５０３および／もしくは５０４、もしくは（ｂ）６３６、６３７および／もしくは６３８）もしくはｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：（ａ）５１８、５１９および／もしくは５２０、もしくは（ｂ）６５２、６５３および／もしくは６５４）に示される重鎖可変領域のｃｄｒ；ならびに、（ｉｉ）ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：６６０、６６１および／もしくは６６２）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：６７６、６７７および／もしくは６７８）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：６９２、６９３および／もしくは６９４）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：（ａ）３８２、３８３、および／もしくは３８４、もしくは（ｂ）５２６、５２７および／もしくは５２８）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：（ａ）３９８、３９９および／もしくは４００、もしくは（ｂ）５４２、５４３および／もしくは５４４）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：（ａ）４１４、４１５および／もしくは４１６、もしくは（ｂ）５５８、５５９および／もしくは５６０）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：（ａ）４３０、４３１および／もしくは４３２、もしくは（ｂ）７１５、７１６および／もしくは７１７）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：（ａ）４４６、４４７および／もしくは４４８、もしくは（ｂ）５８０、５８１および５８２）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：（ａ）４６２、４６３および／もしくは４６４、もしくは（ｂ）５９６、５９７および／もしくは５９８）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：（ａ）４７８、４７９および／もしくは４８０、もしくは（ｂ）６１２、６１３および／もしくは６１４）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：（ａ）４９４、４９５および／もしくは４９６もしくは（ｂ）６２８、６２９および／もしくは６３０）もしくはｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：（ａ）５１０、５１１および５１２、もしくは（ｂ）６４４、６４５および／もしくは６４６）に示される軽鎖可変領域のｃｄｒの核酸配列によりコードされる、１、２、３またはそれを超えるＣＤＲと相同である核酸配列によりコードされる、１、２、３またはそれを超える相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでよい。抗体または抗原結合部は、先行する段落に示される重鎖可変領域および軽鎖可変領域の核酸配列によりコードされるＣＤＲの１、２、３またはそれを超える任意の組み合わせを含んでよい。
【００５５】
抗体または抗原結合部は、（ｉ）ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：６６８、６６９および６７０）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：６８４、６８５および６８６）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：７００、７０１および７０２）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：（ａ）３９０、３９１および３９２；もしくは（ｂ）５３４、５３５および５３６）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：（ａ）４０６、４０７および４０８、もしくは（ｂ）５５０、５５１および５５２）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：（ａ）４２２、４２３および４２４、もしくは（ｂ）５６６、５６７および５６８）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：（ａ）４３８、４３９および４４０、もしくは（ｂ）５７２、５７３および５７４）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：（ａ）４５４、４５５および４５６、もしくは（ｂ）５８８、５８９および５９０）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：（ａ）４７０、４７１および４７２、もしくは（ｂ）６０４、６０５および６０６）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：（ａ）４８６、４８７および４８８、もしくは（ｂ）６２０、６２１および６２２）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：（ａ）５０２、５０３および５０４、もしくは（ｂ）６３６、６３７および６３８）もしくはｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：（ａ）５１８、５１９および５２０、もしくは（ｂ）６５２、６５３および６５４）に示される核酸配列と相同である核酸配列によりコードされる３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域；または、（ｉｉ）ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：６６０、６６１および６６２）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：６７６、６７７および６７８）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：６９２、６９３および６９４）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：（ａ）３８２、３８３および３８４、もしくは（ｂ）５２６、５２７および５２８）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：（ａ）３９８、３９９および４００、もしくは（ｂ）５４２、５４３および５４４）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：（ａ）４１４、４１５および４１６、もしくは（ｂ）５５８、５５９および５６０）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：（ａ）４３０、４３１および４３２、もしくは（ｂ）７１５、７１６および７１７）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：（ａ）４４６、４４７および４４８、もしくは（ｂ）５８０、５８１および５８２）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：（ａ）４６２、４６３および４６４、もしくは（ｂ）５９６、５９７および５９８）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：（ａ）４７８、４７９および４８０、もしくは（ｂ）６１２、６１３および６１４）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：（ａ）４９４、４９５および４９６、もしくは（ｂ）６２８、６２９および６３０）もしくはｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：（ａ）５１０、５１１および５１２、もしくは（ｂ）６４４、６４５および６４６）に示される核酸配列と相同である核酸配列によりコードされる３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含んでよい。
【００５６】
特定の実施形態では、抗体または抗原結合部は、重鎖可変領域（ｉ）および軽鎖可変領域（ｉｉ）の両方を含む。具体的には、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、（ｉ）ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：６６８、６６９、および６７０）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：６８４、６８５、および６８６）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：７００、７０１および７０２）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：（ａ）３９０、３９１および３９２；もしくは（ｂ）５３４、５３５および５３６）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：（ａ）４０６、４０７および４０８、もしくは（ｂ）５５０、５５１および５５２）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：（ａ）４２２、４２３および４２４、もしくは（ｂ）５６６、５６７および５６８）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：（ａ）４３８、４３９および４４０、もしくは（ｂ）５７２、５７３および５７４）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：（ａ）４５４、４５５および４５６、もしくは（ｂ）５８８、５８９および５９０）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：（ａ）４７０、４７１および４７２、もしくは（ｂ）６０４、６０５、および６０６）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：（ａ）４８６、４８７および４８８、もしくは（ｂ）６２０、６２１および６２２）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：（ａ）５０２、５０３および５０４、もしくは（ｂ）６３６、６３７および６３８）もしくはｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：（ａ）５１８、５１９および５２０、もしくは（ｂ）６５２、６５３および６５４）に示される核酸配列と相同である核酸配列によりコードされる３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域；または、（ｉｉ）ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：６６０、６６１および６６２）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：６７６、６７７および６７８）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：６９２、６９３および６９４）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：（ａ）３８２、３８３、および３８４、もしくは（ｂ）５２６、５２７および５２８）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：（ａ）３９８、３９９および４００、もしくは（ｂ）５４２、５４３および５４４）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：（ａ）４１４、４１５および４１６、もしくは（ｂ）５５８、５５９および５６０）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：（ａ）４３０、４３１および４３２、もしくは（ｂ）７１５、７１６および７１７）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：（ａ）４４６、４４７および４４８、もしくは（ｂ）５８０、５８１および５８２）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：（ａ）４６２、４６３および４６４、もしくは（ｂ）５９６、５９７および５９８）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：（ａ）４７８、４７９および４８０、もしくは（ｂ）６１２、６１３および６１４）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：（ａ）４９４、４９５および４９６、もしくは（ｂ）６２８、６２９および６３０）もしくはｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：（ａ）５１０、５１１および５１２、もしくは（ｂ）６４４、６４５および６４６）に示される核酸配列と相同である核酸配列によりコードされる３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域に示される核酸配列と相同である核酸配列によりコードされる３つのＣＤＲを含む。抗体または抗原結合部は、先行する段落に示される重鎖可変領域および軽鎖可変領域の核酸配列によりコードされるＣＤＲSの１、２、３またはそれを超える任意の組み合わせを含んでよい。
【００５７】
１つの実施形態では、抗体または抗原結合部は、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：６５９および６６７、それぞれ軽鎖可変および重鎖可変領域）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：６７５および６８３、それぞれ軽鎖可変および重鎖可変領域）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ４（６９１および６９９、それぞれ軽鎖可変および重鎖可変領域）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（それぞれ配列番号：（ａ）３８１および３８９、または（ｂ）５２５および５３３）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：（ａ）３９７および４０５、または（ｂ）５４１および５４９、それぞれ軽鎖可変および重鎖可変領域）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：（ａ）４１３および４２１、または（ｂ）５５７および５６５、それぞれ軽鎖可変および重鎖可変領域）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：（ａ）４２９および４３７、または（ｂ）７１４および５７１、それぞれ軽鎖可変および重鎖可変領域）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：（ａ）４４５および４５３、または（ｂ）５７９および５８７、それぞれ軽鎖可変および重鎖可変領域）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：（ａ）４６１および４６９、または（ｂ）５９５および６０３、それぞれ軽鎖可変および重鎖可変領域）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：（ａ）４７７および４８５、または（ｂ）６１１および６１９、それぞれ軽鎖可変および重鎖可変領域）、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：（ａ）４９３および５０１、または（ｂ）６２７および６３５、それぞれ軽鎖可変および重鎖可変領域）またはｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：（ａ）５０９および５１７、または（ｂ）６４３および６５１、それぞれ軽鎖可変および重鎖可変領域）に示される核酸配列と相同である核酸配列によりコードされる軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。抗体または抗原結合部は、先行する段落に列挙される重鎖可変領域（１）および軽鎖可変領域（２）に示される核酸配列の任意の組み合わせを含んでよい。
【００５８】
別の実施形態では、抗体または抗原結合部は、ＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：６５９、６７５、または６９１）、ＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：３８１、３９７、４１３、５２５、５４１、５５７、または７０７）、ＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：４２９、４４５、４６１、７１４、５７９、または５９５）、またはＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：４７７、４９３、５０９、６１１、６２７、または６４３）に示される核酸配列と相同である核酸配列によりコードされる軽鎖可変領域を含む。
【００５９】
抗体または抗原結合部は、ＣＡＮ４６Ｇ４（配列番号：６６７、６８３、または６９９）、ＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（配列番号：３８９、４０５、４２１、５３３、５４９、５６５、または７０９）、ＣＡＮ４６Ｇ１９（配列番号：４３７、４５３、４６９、５７１、５８７、または６０３）、またはＣＡＮ４６Ｇ２４（配列番号：４８５、５０１、５１７、６１９、６３５、または６５１）に示される核酸配列と相同である核酸配列によりコードされる重鎖可変領域を含む。
【００６０】
ヒト化抗体
本発明のヒト化抗体は非ヒト種由来の抗体であり、非抗原結合領域（および／または抗原結合領域）のアミノ酸配列が、抗体がより密接にヒト抗体に類似し、かつ同等の特異性および親和性をなお保持するように変更されている。
【００６１】
ヒト化抗体は、抗原結合に直接関与しない可変領域の配列をヒト可変領域由来の等価配列と交換することにより作製できる。これらの方法は、重鎖または軽鎖の少なくとも１つからの可変領域のすべてまたは一部をコードする核酸配列の単離、操作、および発現を含む。このような核酸の供給源は当業者によく知られており、たとえば、Ｂ毒素に対する抗体を産生するハイブリドーマから入手してもよい。ヒト化抗体またはフラグメントをコードする組み換えＤＮＡは、その後適切な発現ベクター内にクローン化できる。
【００６２】
抗体の軽鎖可変領域または重鎖可変領域は、相補決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの高頻度可変性領域により中断されるフレームワーク領域からなる。１つの実施形態では、ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１、２またはすべてのＣＤＲ、およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する非ヒト種由来の抗体分子である。
【００６３】
本発明のヒト化抗体は、当業者によく知られている方法により産生できる。たとえば、非ヒト（たとえばマウス）抗体を入手して、可変領域をシークエンシングし、ＣＤＲおよびフレームワークの残基の位置を決定できる（Ｋａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−  ３２４２．  Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９６：９０１−９１７）。軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、任意に、対応する定常領域に連結できる。ＣＤＲ移植型抗体は、ＣＤＲ移植またはＣＤＲ置換により産生できる。免疫グロブリン鎖の１、２、またはすべてのＣＤＲを置換することができる。たとえば、特定の抗体のすべてのＣＤＲが非ヒト動物（たとえば表１に示されるＣＤＲなどのマウス）の少なくとも一部に由来してもよく、またはいくつかのＣＤＲのみが置換されてもよい。所定の抗原（たとえばＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＢ毒素）に対する抗体の結合に必要とされるＣＤＲを保存することのみが必要である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｓ．  Ｌ．，  １９８５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２９：１２０２−１２０７．  Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ４：２１４．  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．  ５，５８５，０８９；  ５，２２５，５３９；  ５，６９３，７６１  ａｎｄ  ５，６９３，７６２．  ＥＰ  ５１９５９６．  Ｊｏｎｅｓ  ｅｔａｌ．，  １９８６，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２１：５５２−  ５２５．  Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３９：１５３４．  Ｂｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４１：４０５３−４０６０）。
【００６４】
本発明にはまた、限定するものではないが、ヒト、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、サル、類人猿、ゴリラ、チンパンジー、アヒル、ガチョウ、ニワトリ、両生類、爬虫類および他の動物を含む、少なくとも１つの異なる種由来の配列に置換された他の領域を備える、本明細書に開示されるような１、２、またはすべてのＣＤＲを含む抗体または抗原結合部が包有される。
【００６５】
キメラ抗体
キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。たとえば抗体は、マウスのｍＡｂ由来の可変領域およびヒトの免疫グロブリン定常領域を含んでもよい。キメラ抗体は組み換えＤＮＡ技術により産生できる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，  ８１：６８５１−６８５５  （１９８４））。たとえば、マウス（または他の種）のモノクローナル抗体分子をコードする遺伝子を制限酵素で切断してマウスのＦｃをコードする領域を除去し、ヒトのFｃ定常領域をコードする遺伝子の同等部分と置換する。キメラ抗体はまた、マウスのＶ領域をコードするＤＮＡを、ヒトの定常領域をコードするＤＮＡに連結できる組み換えＤＮＡ技術により作製できる（Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９８８，  ２４０：１０４１−１０４３．  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＮＡＳ，  １９８７  ８４：３４３９−３４４３．  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １９８７，  １３９：３５２１−３５２６．  Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＮＡＳ，  １９８７，  ８４：２１４−２１８．  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｅ．  Ｒｅｓ．，  １９８７，  ４７：９９９−１００５．  Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，  １９８５，  ３１４：４４６−４４９．  Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，  １９８８，  ８０：１５５３−１５５９．国際特許公開公報第１９８７００２６７１号および第８６／０１５３３号、．欧州特許出願公開公報第１８４，  １８７号、第１７１，４９６号、第１２５，０２３号、および第１７３，４９４号、米国特許第４，８１６，５６７号）。
【００６６】
抗体の種類
抗体は完全長であってよく、または、限定するものではないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’、Ｆｖ、単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二価ｓｃＦｖ（ｂｉ−ｓｃＦｖ）、三価ｓｃＦｖ（ｔｒｉ−ｓｃＦｖ）、Ｆｄ、ｄＡｂフラグメント（たとえばＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４１：５４４−５４６（１９８９））、単離ＣＤＲ、二重特性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、線形抗体、単一鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成される多特異性抗体を含む、抗原結合部を有する抗体のフラグメント（または複数のフラグメント）を含んでよい。組み換え方法または合成リンカーを使って抗体フラグメントを結合することによって生産された単一鎖抗体分子も本発明に含まれている。Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９８８，  ２４２：２４３−４２６．  Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  １９８８，  ８５：５８７９−５８８３．
【００６７】
本発明の抗体または抗原結合部は、単一特異性、二重特異性または多特異性であってもよい。多特異性または二重特異性の抗体またはそのフラグメントは、１つの標的ポリペプチド（たとえばＢ毒素）の異なるエピトープに特異的であってもよく、または、１超の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメイン（たとえばＡ毒素およびＢ毒素に特異的な抗原結合ドメイン、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＢ毒素および他の抗原に特異的な抗原結合ドメイン、またはＢ毒素および他の種の細菌もしくはウイルスに特異的な抗原結合ドメイン）を含んでもよい。１つの実施形態では、多特異性抗体またはその抗原結合部は、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインが、別々の抗原にまたは同一抗原上の異なるエピトープに対して特異的に結合できる（Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７：６０−６９．  Ｋｕｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２２：２３８−２４４）。本発明の抗体は、たとえば別のペプチドまたはタンパク質などの別の機能的分子と連結でき、または共発現できる。たとえば、抗体またはそのフラグメントを別の抗体または抗体フラグメントなどの１つ以上の他の分子実体へ機能的に連結して（たとえば化学的カップリング、遺伝的融合、非共有結合などにより）第２の結合特異性を有する二重特異性または多特異性抗体を産生できる。たとえば、本発明は、免疫グロブリンの１つのアームがＢ毒素に特異的であり、かつ免疫グロブリンの他のアームが第２の治療上の標的に特異的であるか、またはトリプシン阻害剤などの治療的部分に結合される、二重特異性抗体を含む。
【００６８】
本発明には、ＩｇＧ（たとえば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡｌ、ＩｇＡ２）、ＩｇＤまたはＩｇＥを含むすべての抗体のアイソタイプが包有される。抗体または抗原結合部は、哺乳類（たとえばマウス、ヒト）の抗体または抗原結合部であってもよい。抗体の軽鎖はκ型またはλ型であってもよい。抗体または抗原結合部はまた、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）とも呼ばれる軽鎖を欠いたラクダ類（フタコブラクダ、ヒトコブラクダ、およびラマ）の抗体に基づいてもよい。
【００６９】
抗体のバリエーション
抗体または抗原結合部はペプチドである。ペプチドはまた、たとえば抗原の結合などの生物学的活性を示す、ペプチドの変異体、類似体、オルソログ、相同体および誘導体を含んでもよい。ペプチドは、アミノ酸の類似体（たとえば、天然に存在しないアミノ酸、別個の生体系にのみ天然に存在するアミノ酸、哺乳類系由来の改変アミノ酸などを含む）、結合が置換されたペプチド、および当業者に知られている他の改変を１つ以上含んでもよい。
【００７０】
特異的なアミノ酸が置換、欠失、または添加されている抗体または抗原結合部もまた本発明の範囲内である。これらの変更は、結合活性などのペプチドの生物学的特性に対して実質的な影響を有していない。たとえば、抗体は、抗原に対する結合性を改善し、溶解度を改変し、かつ／または薬物動態／薬力学に影響を与えるために、フレーム領域においてアミノ酸置換を有していてもよい。別の例では、選択された少数の受容体(acceptor)のフレームワーク残基が、対応するドナーのアミノ酸により置換できる。ドナーのフレームワークは、成熟または生殖系列のヒト抗体フレームワーク配列またはコンセンサス配列であり得る。表現型的に無変化であるアミノ酸置換を作製する方法に関するガイドラインは、Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４７：  １３０６−１３１０  （１９９０）．  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４４：  １０８１−１０８５  （１９８９）．  Ａｕｓｕｂｅｌ  （ｅｄ．），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  （１９９４）．  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９）．  Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２４３：３０７−３１  （１９９４）．  Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−４５  （１９９２）に提供されている。
【００７１】
抗体、または抗原結合部は、別の機能的分子へと誘導体化または連結できる。たとえば、抗体は、別の抗体、検出可能な薬剤、細胞傷害剤、医薬品、別の分子と関連して媒介できるタンパク質またはペプチド（ストレプトアビジンコア領域またはポリヒスチジンタグなど）、アミノ酸リンカー、シグナル配列、免疫原性キャリアー、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、およびブドウ球菌性タンパク質Ａなどのタンパク質精製に有用なリガンドなどの、１つ以上の他の分子実体に機能的に連結できる（化学的カップリング、遺伝的融合、非共有相互作用などにより）。誘導体化タンパク質の１種は、（同種または異なる種の）２つ以上のタンパク質の架橋により産生される。適切な架橋は、適切なスペーサーにより分離される２つの別々の反応基を有するヘテロ二機能性の架橋（たとえばｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）またはホモ二機能性の架橋（たとえばスベリン酸ジサクシンイミジル）を含む。このようなリンカーはＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  １１１から入手可能である。タンパク質をそれと共に誘導体化（または標識化）できる有用な検出可能な薬剤は、蛍光化合物、多様な酵素、補欠分子族、発光物質、生物発光物質、および放射性活性物質を含む。限定するものではないが、例示的な蛍光検出可能な薬剤は、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、およびフィコエリトリンを含む。また、タンパク質または抗体は、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出可能な酵素と共に誘導体化できる。またタンパク質は、補欠分子族（たとえばストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン）と共に誘導体化できる。
【００７２】
本発明のペプチドは、たとえば約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満または約１％未満のアミノ酸残基の置換または欠損を有する本明細書に開示される抗原結合部の抗体の機能的に活性な変異体であってもよいが、Ｂ毒素への結合を含むがそれに限定されない同一の免疫学的特性を本質的に保持している。
【００７３】
抗体、またはその抗原結合部はコドン最適化され得る。たとえば、宿主細胞の翻訳系では一般的に使用されないクローン化遺伝子内のコドンは、合成される抗体のアミノ酸を変化させることなく、宿主細胞の好ましいコドンへと、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異により変えられる。
【００７４】
抗体可変領域をコードする核酸
本発明はまた、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＢ毒素に特異的に結合する本発明の抗体またはその抗原結合部をコードする核酸を包有する。核酸を細胞内で発現して、本発明の抗体またはその抗原結合部を産生してもよい。本発明の単離型核酸は、配列番号３、１１、１９、２７、３５、４３、５１、５９、６７、７５、８５または９３と相同であるペプチドをコードする配列を含む。
【００７５】
本発明はまた、（ｉ）配列番号３、１１、１９、２７、３５、４３、５１、５９、６７、７５、８５または９３のアミノ酸配列と相同であるペプチドをコードする核酸；（ｉｉ）配列番号１０１、１０９、１１７、１２５、１３３、１４１、１４９、１５７、１６５、１７３、１８１、１８９、１９７、２０５、２１３、２２１、２２９、２３７、７０８および７１０のアミノ酸と相同であるペプチドをコードする核酸；または（ｉｉｉ）配列番号３８１、３８９、３９７、４０５、４１３、４２１、４２９、４３７、４４５、４５３、４６１、４６９、４７７、４８５、４９３、５０１、５０９、５１７、５２５、５３３、５４１、５４９、５６５、５５７、７１４、５７１、５７９、５８７、５９５、６０３、６１１、６１９、６２７、６３５、６４３および６５１のアミノ酸配列と相同であるペプチドをコードする核酸を含む、発現ベクターを包有する。
【００７６】
本発明の抗体またはその抗原結合部の機能的に活性な変異体をコードする核酸分子もまた、本発明に包有される。これらの核酸分子は、中程度に厳密な、非常に厳密な、または非常に高度に厳密な条件下で、本発明の抗体またはその抗原結合部のいずれかをコードする核酸とハイブリッド形成してもよい。ハイブリッド反応を実施するガイダンスは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．Ｙ．  ６．３．１−６．３．６，  １９８９に見出すことができ、この文献は本明細書に参照として援用される。本明細書に示される特定のハイブリッド形成条件は、以下の通りである。１）中程度に厳密なハイブリッド形成条件：約４５℃での６×ＳＳＣ、続いて６０℃にて０．２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで１回以上洗浄；２）非常に厳密なハイブリッド形成条件：約４５℃での６×ＳＳＣ、続いて６５℃にて０．２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで１回以上洗浄；および３）非常に高度に厳密なハイブリッド形成条件：６５℃での０．５Ｍリン酸ナトリウム，７％ＳＤＳ、続いて６５℃にて０．２×ＳＳＣ，１％ＳＤＳで１回以上洗浄。
【００７７】
本発明の抗体または抗原結合部をコードする核酸を、適切な発現系で発現できる発現ベクターに導入し、次いで発現した抗体またはその抗原結合部を単離または精製してもよい。任意に、本発明の抗体またはその抗原結合部をコードする核酸は、無細胞翻訳系で翻訳できる（米国特許第４，８１６，５６７号、  Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ８６：１００２９−１００３３  （１９８９））。
【００７８】
抗毒素抗体またはその一部は、所望の抗体の軽鎖および重鎖（またはそれらの一部）をコードするＤＮＡで形質転換した宿主細胞により産生できる。抗体は、標準的な技術を使用してこれらの培養液上清および／または細胞から単離かつ精製できる。たとえば、宿主細胞は、抗体の軽鎖、重鎖、またはその両方をコードするＤＮＡで形質転換されてもよい。また、組み換えＤＮＡ技術を使用して、結合のために必要でない軽鎖および重鎖、たとえば定常領域、のいずれかまたは両方をコードするＤＮＡの一部またはすべてを除去してもよい。
【００７９】
本発明の核酸は、たとえば、細菌細胞（たとえばＥ．ｃｏｌｉ）、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞などの、原核細胞および真核細胞を含む、様々な適切な細胞中で発現できる。多くの哺乳類細胞株が当業者に知られており、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手可能な不死化細胞株を含む。細胞の非限定的な例は、限定するものではないが、サルの腎臓細胞（ＣＯＳ、たとえばＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７）、ＨＥＫ２９３、ベビーハムスターの腎臓（ＢＨＫ、たとえばＢＨＫ２１）、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ、たとえばＣＨＯＳＫＶ１）、ＮＳ０、ＰｅｒＣ６、ＢＳＣ−１、ヒト肝細胞癌細胞（たとえばＨｅｐ  Ｇ２）、ＳＰ２／０、ＨｅＬａ、メイディン・ダービー  ウシ腎臓（ＭＤＢＫ）、骨髄腫細胞およびリンパ腫の細胞の親細胞、誘導体および／または改変変異体を含む、哺乳類を起源とする、または哺乳類様の特徴を有するすべての細胞株を含む。改変変異体は、たとえば、グリカンプロファイル改変および／または部位特異的組み込み部位変異体を含む。
【００８０】
本発明はまた、本明細書に記載される核酸を含む細胞を提供する。細胞はハイブリドーマまたはトランスフェクタントであってもよい。細胞の種類は上述されている。
【００８１】
本発明の抗体または抗原結合部位は様々な細胞中で発現できる。細胞の種類は上述されている。
【００８２】
本発明の抗体またはその抗原結合部は、無細胞翻訳系、ウイルス感染構築物またはトランスジェニック動物において発現できる。
【００８３】
あるいは、本発明の抗体または抗原結合部は、当業者に良く知られている固相の手法により合成できる（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｂｙ  Ｅ．  Ａｔｈｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｃ．  Ｓｈｅｐｐａｒｄ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ＩＲＬ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ３５：  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （ｅｄ．  Ｍ．  Ｗ．Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｂ．  Ｍ．  Ｄｕｎｎ），  ｃｈａｐｔｅｒ  ７．  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ  （１９８４）．  Ｇ．  Ｂａｒａｎｙ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｂ．  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｅ．  Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，  Ｖｏｌ．  １  ａｎｄ  Ｖｏｌ．  ２，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  （１９８０），  ｐｐ．  ３−２５４．  Ｍ．  Ｂｏｄａｎｓｋｙ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ  （１９８４））。
【００８４】
Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素
本発明は、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅＢ毒素に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部を作製する方法を提供する。たとえば、非ヒト動物を、不活性化したＢ毒素、トキソイドＢ、Ｂ毒素のフラグメント、Ｂ毒素の改変フラグメント（合成変異体）を含む組成物で免疫し、次いで、特異的抗体を動物から単離する。方法は、Ｂ毒素に対する抗体の結合性を評価することをさらに含んでもよい。
【００８５】
クロストリジウム・ディフィシルの様々な毒素タンパク質のいずれか、特にＢ毒素が、本発明の実務に使用され得る。１つの実施形態では、Ｂ毒素は細胞株ＶＰＩ１０４６３から単離される。Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＡ毒素およびＢ毒素は、複数の機能的ドメイン、フラグメントまたはドメインともよばれる、を有する高分子量タンパク質（２８０〜３１０ｋＤａ）である。両毒素のＮ末端ドメインは、Ｒｈｏ−様ＧＴＰａｓｅｓを修飾するグルコシルトランスフェラーゼ活性を含む。この修飾は、毒素に侵された細胞における細胞骨格の調節不全および結腸の上皮のタイトジャンクションの破壊を引き起こす。中心のドメインは、疎水性領域およびカベオリン結合部位が存在することから膜輸送に関与していると予測されている。毒素の３分の１のＣ末端は、標的細胞表面上で発現する糖鎖受容体と相互作用すると考えられている反復サブユニットを含む。Ａ毒素と糖鎖の相互作用はまた、ウサギ赤血球の血球凝集を誘導し、かつＡ毒素受容体結合の試験用のモデルを提供する。両毒素は、細胞傷害性であり、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性アッセイで試験した場合、Ｂ毒素はＡ毒素よりも１０００倍効力があり、かつ両毒素は、マウスに静脈内注射または腹腔内（ｉ．ｐ）注射した場合致死である。Ａ毒素はまた、マウス結紮腸管ループ下痢モデル（ｌｉｇａｔｅｄ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｌｏｏｐ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｍｏｄｅｌ）での流体蓄積の誘導により示されるように、強力なエンテロトキシンである。たとえば、Ｂａｂｃｏｃｋ，  Ｇ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  ７４：  ６３３９−６３４７  （２００６）およびこの文献に背景として含まれる参照文献を参照されたい。
【００８６】
表２は、クロストリジウム・ディフィシルＢ毒素のアミノ酸配列を提供する。以下に提供する配列の変異体およびフラグメントもまた、抗体を作製するための抗原として使用できる。
【表２】
2016501877.tif 000057
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【００８７】
表３は、表２のタンパク質をコードする核酸配列を提供する。
【表３】
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【００８８】
抗体の調製
１つの実施形態では、本発明は、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅＢ毒素に特異的に結合する抗体を発現するハイブリドーマを作製する方法を提供する。本方法は以下の、不活性化Ｂ毒素（たとえばトキソイドＢ）を含む組成物で動物を免疫するステップと、動物から脾細胞を単離するステップと、脾細胞からハイブリドーマを作製するステップと、Ｂ毒素に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択するステップとを含む（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：  ４９５，  １９７５．  Ｈａｒｌｏｗ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ｄ．  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８８）。
【００８９】
毒素は、たとえば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ＵＤＰ−ジアルデヒド、ペルオキシド、酸素での処置または変異（たとえば組み換え法を使用する）により不活性化できる（Ｒｅｌｙｖｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ９３：２４，  １９８３．  Ｗｏｏｄｒｏｗ  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｅ，  ｅｄｓ．，  Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９０．  Ｇｅｎｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆ．  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎ．，  ６８（３）：  １０９４−１１０１，  ２０００）。毒性が低下した変異Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素は、組み換え法えを使用して産生できる（米国特許第５，０８５，８６２号、第５，２２１，６１８号、５，２４４，６５７号、５，３３２，５８３号、５，３５８，８６８号、および５，４３３，９４５号）。毒素またはトキソイドの完全長またはフラグメントを免疫原として使用できる。
【００９０】
１つの実施形態では、不活性化型Ｂ毒素を使用して、腹腔内または静脈内でマウスを免疫する。１つ以上の追加免疫を行ってもよくまたは行わなくてもよい。血漿中の抗体の力価は、たとえばＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）またはフローサイトメトリーによりモニタリングできる。十分な力価の抗Ｂ毒素抗体を有するマウスを融合に使用する。屠殺および脾臓の除去の３日前に、抗原を用いてマウスに追加免疫を行ってもよくまたは行わなくてもよい。マウスの脾細胞を単離し、ＰＥＧを用いてマウスの骨髄腫細胞株と融合させる。結果として得られるハイブリドーマを次いで、抗原特異的抗体の産生に関してスクリーニングする。細胞をプレートに播種し、次いで、選択培地でインキュベートする。次に、個々のウェルからの上清を、ヒト抗毒素モノクローナル抗体に関してＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。抗体分泌ハイブリドーマを再度播種し、再びスクリーニングし、未だに抗毒素モノクローナル抗体に対して陽性である場合には、限界希釈によりサブクローニングできる。たとえば、本発明のハイブリドーマのクローンＣＡＮ４６Ｇ４、ＣＡＮ４６Ｇ１３、ＣＡＮ４６Ｇ１３ａおよびＣＡＮ４６Ｇ１９はサブクローニングされた。サブクローンは、たとえば、ＣＡＮ４６Ｇ４−１−２、ＣＡＮ４６Ｇ１３−１−５、ＣＡＮ４６Ｇ１３−１−８およびＣＡＮ４６Ｇ１９−３−２を含む。ハイブリドーマＣＡＮ４６Ｇ１３−１−８、ＣＡＮ４６Ｇ４−１−２、ＣＡＮ４６Ｇ１３−１−５およびＣＡＮ４６Ｇ１９−３−２は、バージニア州マナサスのＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている（２０１２年８月２３日に寄託）。ハイブリドーマのそれぞれのＡＴＣＣ特許の寄託名は以下の、ＰＴＡ−１３２５７（ＣＡＮ４６Ｇ１３−１−８）、ＰＴＡ−１３２５８（ＣＡＮ４６Ｇ４−１−２）、ＰＴＡ−１３２５９（ＣＡＮ４６Ｇ１９−３−２）およびＰＴＡ−１３２６０（ＣＡＮ４６Ｇ１３−１−５）である。
【００９１】
１つ以上のクロストリジウム・ディフィシル毒素の抗原、特にＢ毒素の抗原の免疫原性を増大させるために使用し得るアジュバントは、任意の化合物またはペプチドまたはペプチドの組み合わせに対する免疫反応を増大するよう作用する化合物である。アジュバントの非限定的な例として、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＭＦ５９（４．３ｗ／ｖ％スクアレン、０．５ｗ／ｖ％ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０）、０．５ｗ／ｖ％ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ  ８５））、ＣｐＧ−含有核酸、ＱＳ２１（サポニンアジュバント）、ＭＰＬ（モノホスホリルリピドＡ）、３ＤＭＰＬ（３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ）、Ａｑｕｉｌｌａからの抽出物、ＩＳＣＯＭＳ（たとえば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｊ．  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．  ６４：７１３；国際特許公開公報第９０／０３１８４号、第９６／１１７１１号、第００／４８６３０号、第９８／３６７７２号、第００／４１７２０号、第０６／１３４４２３号、および第０７／０２６１９０号参照）、ＬＴ／ＣＴ変異体、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微小粒子、Ｑｕｉｌ  Ａ、インターロイキン、フロイントアジュバント、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ｎｏｒ−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ  １１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰとも呼ばれる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１´−２'−ジパルミトイル（ｄｉｐ−  ａｌｍｉｔｏｙｌ）−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ  １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）、ならびに細菌から抽出した３つの成分モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコール酸および細胞壁骨格（（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％  スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルジョン中に含むＲＩＢＩ、を含む。
【００９２】
免疫動物は、限定するものではないが、マウス、ウサギ、ラット、ハムスター、ヤギ、ウマ、サル、ヒヒおよびヒトなどの、免疫原を投与した場合回収可能な抗体を産生できる任意の動物である。宿主はトランスジェニックであってもよいが、ヒト抗体を産生する／米国特許第８，２３６，３１１号、第７，６２５，５５９号、および第５，７７０，４２９号。これらの各開示は全体が参照により本明細書に援用される（Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：  ８５６−８５９，  １９９４．  Ｌｏｎｂｅｒｇ，  Ｎ．，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１，  １９９４．  Ｌｏｎｂｅｒｇ，  Ｎ．  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，  Ｄ．，  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３：  ６５−９３，  １９９５．  Ｈａｒｄｉｎｇ，  Ｆ．  ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，  Ｎ．，  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ７６４：５３６−  ５４６，１９９５）。
【００９３】
抗体アッセイ
宿主を免疫して抗体を産生した後に、抗体をアッセイしてそれらが目的の抗原に特異的であることを確認し、かつ他の抗原と何らかの交差反応性を示すかどうかを決定する。このようなアッセイを行う１つの方法は、米国特許公開公報第２０００４／０１２６８２９号に記載される血清スクリーニングアッセイである。抗毒素抗体は、様々な既知の技術により、毒素への結合について特徴付けできる。たとえばＥＬＩＳＡでは、マイクロタイタープレートを、毒素またはトキソイド抗原を含むＰＢＳでコートし、その後ＰＢＳで希釈したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの無関係なタンパク質でブロッキングする。毒素免疫化マウス由来の血漿の希釈物を各ウェルに添加してインキュベートする。プレートを洗浄し、次いで、酵素（たとえばアルカリホスファターゼ）に結合した二次抗体とインキュベートする。洗浄した後、プレートを、酵素基質（たとえばＡＢＴＳ）で処理し、特異的なＯＤで解析する。他の実施形態では、選択したモノクローナル抗体が固有のエピトープに結合するかどうかを決定するために、抗体をビオチン化して、それからビオチン化抗体をストレプトアビジン標識プローブを用いて検出できる。抗毒素抗体はウェスタンブロッティングにより毒素との反応性を試験できる。
【００９４】
また、中和アッセイを使用して、抗毒素抗体の活性を測定できる。たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和アッセイを使用して、抗体が培養物中の細胞に対する細胞変性作用を阻害する能力を測定できる（以下の実施例７参照）。１つの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和アッセイにおいて、本発明の抗体、またはその抗原結合部は、約０．０１μＭ〜約５０μＭ、約０．２μＭ〜約４０μＭ、約０．６μＭ〜約３０μＭ、約２μＭ〜約２０μＭ、約４μＭ〜約１０μＭ、約０．２μＭ〜約７μＭ、約０．２μＭ〜約１０μＭ、約４μＭ〜約７μＭ、約５μＭ〜約１５μＭ、約１０μＭ、約０．０１μｇ／ｍｌ〜約２００μｇ／ｍｌ、約０．０１μｇ／ｍｌ〜約１５０μｇ／ｍｌ、約０．０１〜約１００μｇ／ｍｌ、約０．０１μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ、約０．０１μｇ／ｍｌ〜約２５μｇ／ｍｌ、約０．０１μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、約０．０１μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約２μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約２μｇ／ｍｌ、約０．５μｇ／ｍｌ〜約２μｇ／ｍｌ、約０．２５μｇ／ｍｌ〜約２μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約２μｇ／ｍｌ、約０．０６μｇ／ｍｌ〜約２μｇ／ｍｌ、または約０．０３μｇ／ｍｌ〜約２μｇ／ｍｌの範囲の濃度で、約５ｎｇ／ｍｌ、約２００ｐｇ／ｍｌ、約２５０ｐｇ／ｍｌ、または約２００〜２５０ｐｇ／ｍｌのＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅＢ毒素のある割合（百分率）を中和する。本発明の抗体、またはその抗原結合部により中和されるB毒素の割合（百分率）は、約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、約９５％超、または約９９％超であってもよい。
【００９５】
ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイもまた毒素中和の測定に使用できる。別の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏＢ毒素試験の実験（たとえば実施例８、およびＢａｂｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｔｏｘｉｎｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ  ｐｒｅｖｅｎｔ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｈａｍｓｔｅｒｓ．  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  （２００６）  ７４（１１）：６３３９に記載の手法）において、抗体、またはその抗原結合部を哺乳類に約１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約２ｍｇ／ｋｇ体重〜約４０ｍｇ／ｋｇ体重、約３ｍｇ／ｋｇ体重〜約３０ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約８ｍｇ／ｋｇ体重〜約１３ｍｇ／ｋｇ体重、または約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で、哺乳類が約７５ｎｇ超、または約７５ｎｇのＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｂ毒素に曝露される２４時間前に投与する場合、哺乳類は生存する可能性を有する。哺乳類の生存の可能性は、約７日以内または約４日以内で、約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、約９５％超、または約９９％超であってよい。
【００９６】
毒素に、好ましくは高い親和性で、結合する抗体を産生するハイブリドーマをサブクローニングし、さらに特徴付けることができる。親細胞の反応性を保持している（ＥＬＩＳＡによる）各ハイブリドーマ由来の１つのクローンは、次いで細胞バンクを作製するため、かつ抗体精製のために選択される。
【００９７】
抗毒素抗体を精製するため、Ａ‐セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いるアフィニティークロマトグラフィーの前に、培養したハイブリドーマからの上清を濾過し、濃縮できる。
【００９８】
本開示の抗体、または抗原結合フラグメント、その変異体または誘導体はまた、抗原に対する結合親和性の観点から記載または特定できる。抗原に対する抗体の親和性は、いずれかの適切な方法を使用して実験的に決定できる（たとえば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｐａｕｌ，  Ｗ．  Ｅ．，  Ｅｄ．，  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８４）；  Ｋｕｂｙ，  Ｊａｎｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．  （１９９２）；および本明細書に記載される方法を参照）。測定した特定の抗体‐抗原相互作用の親和性は、異なる条件下（たとえば塩濃度、ｐＨ）で測定された場合変動し得る。したがって、親和性および他の抗原結合パラメータ（たとえばＫＤ、Ｋａ、Ｋｄ）の測定は、好ましくは、抗体および抗原の標準化溶液、ならびに標準化緩衝液を用いて行われる。
【００９９】
医薬品組成物
本発明はまた、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合部、および薬学的に許容可能なキャリアーを含む組成物を提供する。本組成物は、本発明の抗体またはその抗原結合部をコードする単離型核酸、および薬学的に許容可能なキャリアーを含んでもよい。薬学的に許容可能なキャリアーは、生理学的に適合する、任意かつすべての溶媒、分散媒体、等張剤および吸収遅延剤などを含む。１つの実施形態では、本組成物は、対象においてクロストリジウム・ディフィシル細菌感染症を低減、排除、または予防するために有効である。
【０１００】
本発明はまた、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ疾患を阻害するために有効な量で、本発明の抗体または抗原結合部を対象に投与することにより、対象においてＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ疾患を処置する方法を特徴とする。本組成物の投与経路は、限定するものではないが、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与、局所投与、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与、皮内投与、経皮投与、真皮下投与、非経口投与、直腸投与、脊髄投与、または上皮投与が挙げられる。
【０１０１】
本発明の組成物は、液状の溶液もしくは懸濁液、または注射前に液状ビヒクル中への溶解もしくは懸濁に適した固体形態のいずれかとして注射可能なように調製できる。本組成物はまた、固体の形態で、乳化されまたは活性成分がリポソームビヒクルまたは持続性送達に使用される他の粒子キャリアーにカプセル化されて調製できる。たとえば、本組成物は、油状エマルジョン、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、部位特異的エマルジョン、長期滞留（ｌｏｎｇ−ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ）エマルジョン、粘着性エマルジョン（ｓｔｉｃｋｙｅｍｕｌｓｉｏｎ）、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、リポソーム、微粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、ナノ粒子ならびに、エチレン酢酸ビニルコポリマーおよびＨｙｔｒｅｌ（登録商標）コポリマーなどの非吸着性非浸透型ポリマー、ハイドロゲルなどの膨張可能なポリマー、またはコラーゲンおよび特定のポリ酸あるいは吸収性縫合を作製するために使用されるものなどのポリエステルなどの吸着性ポリマー、などのワクチンの徐放を可能にする多様な天然または合成ポリマーの形態であってよい。
【０１０２】
本発明の抗体または抗原結合部は、哺乳類の対象に送達するための組成物に製剤化される。本組成物は、単独で、および／または薬学的に許容可能なビヒクルもしくは賦形剤と混合して投与する。適切なビヒクルは、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、ビヒクルは、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはアジュバントなどの少量の補助剤を含んでよい。本発明の組成物はまた、薬理剤、サイトカイン、または他の生物学的応答修飾因子などの補助的な物質を含んでよい。製剤を調製する方法は当業者に知られており、または当業者に明らかである。たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，  ２１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎを参照されたい。
【０１０３】
組成物は、対象の年齢、体重および状態、使用する特定の組成物、ならびに投与経路に対して適切なスケジュールまたは期間にわたり単一用量処置でまたは複数回用量処置で投与できる。
【０１０４】
１つの実施形態では、単一用量の本発明に係る組成物を投与する。他の実施形態では、複数回用量を投与する。投与の頻度は、たとえば、症状の重症度、所望の免疫保護の度合い、本組成物を予防的または治療的目的で使用するかどうかなどの、様々な要因のいずれかに応じて変動してよい。たとえば、１つの実施形態では、本発明に係る組成物を、１ヶ月あたり１回、１ヶ月あたり２回、１ヶ月あたり３回、隔週ごと（ｑｏｗ）、１週間に１回（ｑｗ）、１週間に２回（ｂｉｗ）、１週間に３回（ｔｉｗ）、１週間に４回、１週間に５回、１週間に６回、１日おき（ｑｏｄ）、毎日（ｑｄ）、１日に２回（ｑｉｄ）、または１日に３回（ｔｉｄ）投与する。
【０１０５】
本発明に係るポリペプチドの投与の期間、たとえば、本組成物を投与する期間は、たとえば対象の応答など様々な要因のいずれかに応じて変動してよい。たとえば、本組成物を、約１０分〜約１日、約３０分〜約２０時間、約１時間〜約１５時間、約２時間〜約１０時間、約３時間〜約８時間、約４時間〜約６時間、約１日〜約１週間、約２週間〜約４週間、約１ヶ月〜約２ヶ月、約２ヶ月〜約４ヶ月、約４ヶ月〜約６ヶ月、約６ヶ月〜約８ヶ月、約８ヶ月〜約１年、約１年〜約２年、または約２年〜約４年、またはそれを超える範囲の期間にわたり投与する。
【０１０６】
本発明の抗体またはその抗原結合部は、薬学的に許容可能なキャリアーと組み合わせることができる。薬学的に許容可能なキャリアーは、たとえば、本発明の抗体またはその抗原結合部の吸収またはクリアランスの速度を安定化、または増大または減少させるよう作用する生理学的に許容可能な化合物を含んでよい。生理学的に許容可能な化合物は、たとえば、グルコース、スクロース、もしくはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸もしくはグルタチオンなどの抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、界面活性剤、リポソームキャリアー、もしくは賦形剤もしくは他の安定剤および／または緩衝液を含んでよい。他の生理学的に許容可能な化合物は、湿潤剤、乳化剤、分散剤または保存剤を含む。たとえば、ｔｈｅ  ２１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．  （“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ”）を参照されたい。
【０１０７】
１つの態様では、本発明の抗体またはその抗原結合部は、たとえば、水性キャリアーなどの、薬学的に許容可能なキャリアーに溶解される。水性溶液の例は、たとえば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ハンクス溶液、リンガー溶液、ブドウ糖／生理食塩水、グルコース溶液などを含む。本製剤は、緩衝剤、浸透圧調整剤、湿潤剤、界面活性剤などの、適切な生理学的条件に必要とされる薬学的に許容可能な補助物質を含んでよい。添加剤はまた、殺菌剤などの追加的な活性成分、または安定剤を含んでよい。たとえば、溶液は、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレートまたはトリエタノールアミンオレエートを含んでよい。
【０１０８】
固体製剤を本発明で使用できる。これらは、たとえば、ピル、錠剤、粉体またはカプセルとして製剤化できる。固体組成物では、従来の固体キャリアーが使用でき、それらはたとえば、マンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含む。適切な薬学的賦形剤は、たとえば、スターチ、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、コムギコ、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールを含む。
【０１０９】
経粘膜投与または経皮投与では、透過する障壁に対して適切な浸透剤（ｐｅｎｅｔｒａｎｔ）を本製剤に使用できる。このような浸透剤は当業者に一般的に知られており、たとえば、経粘膜投与では胆汁塩およびフシジン酸誘導体を含む。さらに、浸透を促進するために界面活性剤を使用できる。
【０１１０】
経粘膜投与は、経鼻スプレーを介した投与または座薬を用いる投与であってよい（Ｓａｙａｎｉ，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．  １３：  ８５−１８４，  １９９６）。局所投与、経皮投与では、薬剤を、軟膏、クリーム、膏薬、粉体およびゲルに製剤化する。経皮送達システムはまた、たとえばパッチを含んでよい。
【０１１１】
本発明の組成物はまた、持続型送達または徐放機構において投与できる。たとえば、ペプチドを持続的に送達できる生物分解性（ｂｉｏｄｅｇｒａｄｅａｂｌｅ）ミクロスフェアまたはカプセルまたは他の生物分解性ポリマー構成を本発明の製剤に含んでよい（たとえばＰｕｔｎｅｙ，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：  １５３−１５７，  １９９８）参照）。
【０１１２】
吸入では、本発明の組成物は、乾燥粉体エアロゾル、液体送達システム、エアジェットネブライザー、噴霧システムなどを含む当業者に知られている任意のシステムを使用して送達できる（Ｐａｔｔｏｎ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １６：  １４１−１４３，  １９９８）。また本発明において、たとえば、Ｄｕｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（カリフォルニア州サンディエゴ）、Ａｒａｄｉｇｍ（カリフォルニア州ヘイワード）、Ａｅｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州サンタクララ）、Ｉｎｈａｌｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州サン・カルロス）などによるポリペプチド巨大分子の産物および吸入送達システムを使用できる。たとえば、医薬製剤は、エアロゾルまたはミストの形態で投与できる。エアロゾル投与では、本製剤は、界面活性剤および噴霧剤と共に細かく分割した形態で供給できる。別の態様では、製剤を呼吸組織に送達する装置は吸入器であり、本製剤はそこで蒸発する。他の液体送達システムは、たとえばエアジェットネブライザーを含む。
【０１１３】
本発明の組成物または核酸、ポリペプチド、または抗体は、たとえば、動脈内、髄腔内（ＩＴ）、静脈内（ＩＶ）、非経口、胸膜腔内、局所、経口、または皮下、気管内（エアロゾルによる）もしくは経粘膜（たとえば頬側、膀胱、膣、子宮、直腸、鼻粘膜）としての局所投与により、全身的、領域的、または局所的に、当業者に知られている任意の手段により単独でまたは医薬組成物として送達できる。非経口的に投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に良く知られており、または当業者に明らかであり、Ｂａｉ，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．  ８０：  ６５−７５，  １９９７．  Ｗａｒｒｅｎ，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｓｃｉ．  １５２：  ３１−３８，  １９９７．  Ｔｏｎｅｇａｗａ，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８６：  ５０７−５１５，  １９９７に詳細に記載されている。
【０１１４】
１つの態様では、本発明の核酸、ポリペプチド、または抗体を含む医薬製剤は、たとえばリポソームなどの脂質単分子膜または二分子膜に組み込まれる（米国特許第６，１１０，４９０号、第６，０９６，７１６号、第５，２８３，１８５号、および第５，２７９，８３３号）。本発明の態様はまた、本発明の核酸、ペプチドまたはポリペプチドが単分子膜または二分子膜の表面に付着している製剤を提供する。たとえば、ペプチドは、ヒドラジド−ＰＥＧ−（ジステアロイルホスファチジル）エタノールアミンを含むリポソームに付着される（たとえばＺａｌｉｐｓｋｙ，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．  ６：  ７０５−７０８，  １９９５参照）。リポソームまたは平面脂質膜などの任意の形態の脂質膜またはたとえば赤血球などの無傷の細胞の細胞膜が使用できる。リポソーム製剤は、静脈内投与、経皮投与（たとえばＶｕｔｌａ，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ８５：  ５−８，  １９９６参照）、経粘膜投与、または経口投与を含む任意の手段により投与できる。本発明はまた、本発明の核酸、ペプチドおよび／またはポリペプチドがミセルおよび／またはリポソームの中に組み込まれる医薬調製物を提供する（たとえばＳｕｎｔｒｅｓ，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ４６：  ２３−２８，  １９９４；  Ｗｏｏｄｌｅ，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ９：  ２６０−２６５，  １９９２参照）。リポソームおよびリポソーム製剤は、標準的な方法にしたがって調製でき、かつ当業者に良く知られている（Ａｋｉｍａｒｕ，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  １：  １９７−２１０，  １９９５．  Ａｌｖｉｎｇ，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  １４５：  ５−３１，  １９９５．  Ｓｚｏｋａ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ９：  ４６７，  １９８０．米国特許第４，２３５，８７１号；第４，５０１，７２８号および第４，８３７，０２８号）。
【０１１５】
１つの態様では、本組成物を、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む、徐放製剤などの、ペプチドを身体からの急速な排出から保護するキャリアーと共に調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生物分解性の生体適合ポリマーを使用できる。このような製剤を調製する方法は当業者に明らかである。リポソーム懸濁物もまた、薬学的に許容可能なキャリアーとして使用できる（米国特許第４，５２２，８１１号）。
【０１１６】
投与の容易さおよび用量の均一性のために、非経口組成物または経口組成物を単位剤形で製剤化することが有益である。本明細書で使用される単位剤形は、処置される対象にとって均一用量として適した物理的に個別の単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的キャリアーと関連した所望の治療上の作用を産生するよう計算された所定量の活性化合物を含む。
【０１１７】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータを、ヒトに使用するためのさまざまな用量を定めるために使用できる。１つの実施形態では、このような化合物の用量は、毒性がほとんどないまたは全くないＥＤ５０を含むさまざまな循環濃度内にある。用量は、使用する剤形および利用する投与経路に応じてこの範囲内で変動してよい。別の実施形態では、治療上有効用量がまず細胞培養アッセイから評価できる。用量は、細胞培養液中で決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するよう、動物モデルにおいて定めることができる（Ｓｏｎｄｅｒｓｔｒｕｐ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  Ｓｅｍ．  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．  ２５：  ３５−４５，  ２００３．  Ｎｉｋｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｈａｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  ４（１２）：  １２３−５３，  ２０００）。
【０１１８】
本発明の抗体または抗原結合部の治療上有効量または予防上有効量の例示的で非限定的な範囲は、約０．００１〜約６０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１〜約３０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．５〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．７５〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約２〜約９ｍｇ／ｋｇ体重、約１〜約２ｍｇ／ｋｇ体重、約３〜約８ｍｇ／ｋｇ体重、約４〜約７ｍｇ／ｋｇ体重、約５〜約６ｍｇ／ｋｇ体重、約８〜約１３ｍｇ／ｋｇ体重、約８．３〜約１２．５ｍｇ／ｋｇ体重、約４〜約６ｍｇ／ｋｇ体重、約４．２〜約６．３ｍｇ／ｋｇ体重、約１．６〜約２．５ｍｇ／ｋｇ体重、約２〜約３ｍｇ／ｋｇ体重、または約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１１９】
本組成物は、本発明の抗体またはその抗原結合部の有効量を含むように製剤化されており、その量は処置すべき動物および処置される状態に依存する。１つの実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合部は、約０．０１ｍｇ〜約１０ｇ、約０．１ｍｇ〜約９ｇ、約１ｍｇ〜約８ｇ、約１ｇ〜約７ｇ、約５ｍｇ〜約６ｇ、約１０ｍｇ〜約５ｇ、約２０ｍｇ〜約１ｇ、約５０ｍｇ〜約８００ｍｇ、約１００〜約５００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約１０ｇ、約０．０５μｇ〜約１．５ｍｇ、約１０μｇ〜約１ｍｇのタンパク質、約３０μｇ〜約５００μｇ、約４０ｐｇ〜約３００ｐｇ、約０．１μｇ〜約２００ｍｇ、約０．１μｇ〜約５μｇ、約５μｇ〜約１０μｇ、約１０μｇ〜約２５μｇ、約２５μｇ〜約５０μｇ、約５０μｇ〜約１００μｇ、約１００μｇ〜約５００μｇ、約５００μｇ〜約１ｍｇ、約１ｍｇ〜約２ｍｇの範囲の用量で投与される。任意の特定の対象に対する特定の用量レベルは、特異的なペプチドの活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、および排泄率、薬剤の併用および治療中である特定の疾患の重症度を含む、様々な要因に依存する。
【０１２０】
治療上の適用では、本組成物は、クロストリジウム・ディフィシル細菌感染症のリスクを有するか、また活性型の感染症を罹患している対象に、状態または疾患および／またはその合併症を少なくとも部分的に停止または予防するために十分な量で投与される。
【０１２１】
抗体の用途
本発明の抗体または抗原結合部は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの治療上の、予防上の、かつ／または診断上の有用性を有する。たとえば、これらの抗体を培養中の細胞に、たとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ  ｖｉｖｏで、またはある対象に、たとえばｉｎ  ｖｉｖｏで投与して、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅおよびＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する疾患を処置、阻害、再発予防、かつ／または診断できる。
【０１２２】
本抗体または抗原結合部は、培養中の細胞に、たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで使用できる。たとえば、細胞を、培養培地中ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養して抗毒素抗体またはそのフラグメントと接触させることができる。本方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏプロトコル（たとえば治療上または予防上プロトコル）の一部として、対象に存在する細胞に対して実施できる。Ｉｎ  ｖｉｖｏ実施形態では、接触ステップは対象において行われ、かつ、抗毒素抗体またはそれらの一部を、たとえば対象の腸の中のＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅにより発現する毒素（たとえばＢ毒素）に抗体またはそれらの一部を結合させるのに有効な条件下で、対象に投与することを含む。
【０１２３】
本抗体またはその抗原結合部は、単独で投与でき、またはたとえば第２のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体またはその抗原結合部などの別の治療剤と組み合わせて投与できる。１つの例では、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅＢ毒素に特異的に結合する本抗体またはその抗原結合部は、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＡ毒素に特異的に結合する抗体（モノクローナルもしくはポリクローナル）またはその抗原結合部と組み合わされる。別の例では、第２の薬剤は、たとえば、バンコマイシン、バシトラシン、またはメトロニダゾールなどの抗生剤である。本抗体は、サッカロマイセス・ブラウディなどの生菌剤と組み合わせて使用できる。本抗体はまた、たとえばトキソイドワクチンなどの、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅワクチンと組み合わせて投与できる。
【０１２４】
本抗体またはその抗原結合部はまた、たとえば第２および第３のモノクローナルまたはポリクローナル抗体またはその抗原結合部などの、１つ以上の追加的な治療剤と組み合わせて投与できる。１つの例では、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅＢ毒素に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部は、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ａ毒素に特異的に結合する抗体（モノクローナルもしくはポリクローナル）またはその抗原結合部、および第１のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅＢ毒素とは異なるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅＢ毒素の領域に特異的に結合する別の抗体（モノクローナルもしくはポリクローナル）と組み合わされる。別の例では、第２または第３のモノクローナルまたはポリクローナル抗体またはその抗原結合部は、二成分の毒素、またはＣ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ胞子に特異的である。別の例では、第２の薬剤は、たとえばバンコマイシン、バシトラシン、またはメトロニダゾールなどの抗生剤である。別の例では、第２の薬剤は、たとえばニタゾキサニド（ｎｉｔｒａｚｏｘａｎｉｄｅ）などの駆虫薬である。本抗体は、サッカロマイセス・ブラウディなどの生菌剤と組み合わせて使用できる。また本抗体は、たとえばトキソイドワクチンなどのＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅワクチンと組み合わせて投与できる。さらなる別の用途では、本抗体またはその抗原結合部は、糞便移植片と組み合わせて投与できる。
【０１２５】
抗毒素抗体（たとえばモノクローナル抗体）はまた、アフィニティ―クロマトグラフィーまたは免疫沈降法などの標準的な技術により毒素を単離するために使用できる。さらに、抗毒素抗体は、たとえば、試料（たとえば便試料、血液試料、培養液試料、食品試料）をＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの存在に関してスクリーニングして毒素を検出するために使用できる。抗毒素抗体は、たとえば、所定の処置レジメンの有効性を判定するための臨床試験手法の一部として、組織中の毒素のレベルをモニタリングするために診断的に使用できる。
【０１２６】
ワクチン
本発明は、ワクチンおよび免疫原含有組成物をさらに包有する。ワクチンまたは免疫原含有組成物は、本発明の抗体またはその抗原結合部の１つ以上により認識され、かつ／または結合される１つ以上のエピトープを含んでもよい。１つの実施形態では、ワクチンまたは免疫原含有組成物は、ＣＡＮ４６Ｇ４、ＣＡＮ４６Ｇ１３、ＣＡＮ４６Ｇ１３ａ、ＣＡＮ４６Ｇ１９、ＣＡＮ４６Ｇ２４、ＣＡＮ３３Ｇ１、これらの抗体のいずれかの抗原結合部、これらの抗体のいずれかのヒト化形態、またはこれら抗体のいずれかのキメラ形態の１つ以上により認識されかつ／または結合される１つ以上のエピトープを含む。ワクチンまたは免疫原含有組成物は、エピトープを含んでもよく、またはエピトープを有するペプチドまたはタンパク質を含んでもよい。１つの実施形態では、エピトープ含有タンパク質、フラグメント、またはペプチドは、Ｂ毒素に由来する。たとえば、Ｂ毒素のエピトープ含有部、フラグメント、またはペプチドは、タンパク質切断（たとえばエンテロキナーゼ、カスパーゼなど）によりＢ毒素タンパク質から得られる。また、エピトープ含有部、フラグメント、またはペプチドは、化学的にまたは組み換え的に合成されてもよい。
【０１２７】
このような毒素のエピトープ含有タンパク質、フラグメント、またはペプチドは、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染するか、またはＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連疾患に罹患している対象にワクチンまたは免疫原の形態で投与された場合、対象において体液性の応答、すなわち、Ｂ毒素に特異性を有する抗体を誘発し、それにより対象が毒素に対する免疫応答を構築でき、かつ対象におけるＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連疾患、感染症、またはＣＤＡＤを中和、阻害、低減、軽減、治癒、もしくは処置できる。したがって、別の実施形態は、その必要のある対象におけるＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症またはＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連疾患を、中和、阻害、低減、軽減、治癒、または処置する方法であって、上述したワクチンまたは免疫原の有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、対象は、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＢ毒素への体液性応答を誘発し、それにより対象におけるＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連疾患、感染症、またはＣＤＡＤを中和、阻害、低減、低減、治癒、または処置する。別の実施形態では、対象は、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＢ毒素に対する細胞性免疫応答を誘発する。別の実施形態では、対象は、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＢ毒素に対する体液性および細胞性免疫応答の両方を誘発する（国際特許公報第Ｗ０２０１１１３０６５０号）。
【０１２８】
キット
本発明はまた、抗毒素抗体またはその抗原結合部を含むキットを提供する。本キットのさらなる構成要素は、以下の、使用説明書；別の治療剤、抗体を標識もしくは治療剤と結合させるために有用な薬剤、他の試薬、または抗体を投与用に調製するための他の試薬；薬学的に許容可能なキャリアー；および対象に投与するための装置もしくは他の材料、のうちの１つ以上を含んでもよい。
【０１２９】
様々な組み合わせの抗体を共にパッケージングできる。たとえば、キットは、Ｂ毒素に結合する抗体およびＡ毒素に結合する抗体（たとえばモノクローナル抗Ａ毒素抗体またはＡ毒素と反応するポリクローナル抗血清）を含んでよい。抗体は共に混合されるか、またはキット内で別々にパッケージングされる。
【０１３０】
使用説明書は、たとえば、ＣＤＡＤの症状を伴う患者における目安となる用量および／または投与モードを含む、治療上の適用のための説明書を含んでよい。他の説明書は、標識または治療剤への抗体の結合に関する説明、またはたとえば反応しない結合成分からの、結合した抗体の精製に関する説明を含んでもよい。本キットは、たとえば、毒素を検出する、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの存在に関して試料（たとえば便の試料において）をスクリーニングするための、診断上の用途のためであってもよい。本キットは、たとえば、所定の処置レジメンの有効性を判定するための臨床試験手法の一部として、組織での毒素のレベルをモニタリングするために診断上使用できる。
【０１３１】
本キットは、抗毒素抗体またはそのフラグメントをコードする少なくとも１つの核酸、および核酸の発現に関する説明書を含んでもよく、または含まなくてもよい。本キットの他の可能な構成要素として、発現ベクターおよび細胞が含まれる。
【０１３２】
本発明の抗体または抗原結合部、組成物および方法は、たとえば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、サル、類人猿、ゴリラ、チンパンジー、ウサギ、アヒル、ガチョウ、ニワトリ、両生類、爬虫類および他の動物を含む哺乳類および非哺乳類などのすべての脊椎動物に使用できる。
【０１３３】
本発明を実行する特定の態様である以下の実施例は、例示的な目的でのみ提示しており、いかなる意味でも本発明の範囲を限定するよう意図するものではない。
【０１３４】
実施例
実施例１：ハイブリドーマ融合
モノクローナル抗体を作製する方法および試薬は良く知られており、かつ免疫プロトコルならびに脾細胞を単離かつ融合する技術を包有する。従来のハイブリドーマ融合は、標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を使用して実施した（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：  ４９５，  １９７５）。一般的には、Ｈａｒｌｏｗ，  Ｅ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ｄ．  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  １９８８．を参照。一般に、マウスを、不活性化毒素、またはトキソイド、毒素のフラグメント、または全毒素を用いて免疫する。マウスの最初の抗原での免疫は完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）または他のアジュバントを用いて行い、次いで、抗原および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を用いて隔週で追加免疫（合計で４回まで）を行った。内側伏在静脈から試験のための採血を行い、血清を試験して抗Ｂ毒素抗体の力価を確認した。ＩｇＧの力価が十分な場合、１度に１匹または２匹のマウスを使用して融合を実施した。融合の３日前に、マウスに、トキソイドＢ／Ｂ毒素の組み合わせを含むＰＢＳを最終的に腹腔内（ＩＰ）投与した。
【０１３５】
融合の当日、マウスを屠殺して脾臓を取り出す。脾細胞を、シリンジおよび針を使用して脾臓から洗い落とし、骨髄腫細胞との融合のために５０ｍｌのチューブに収集する。骨髄腫細胞は融合パートナーとして使用される不死腫瘍細胞であり、サルベージ経路を阻害する毒性ヌクレオチド類似体、８−アザグアニン（８−ａｚａ）の存在下で増殖される。８−ａｚａの存在下で増殖される細胞は、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）遺伝子における欠損変異をもつことによってのみ生き残る。Ｂ細胞を、ポリエチレングルコール１５００を使用して骨髄腫細胞と融合させる。融合した細胞を、薬物選択を含む半固体アガロースに混合し、ペトリ皿にプレーティングする。ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含むＨＡＴ培地を、薬剤選択に使用する。アミノプテリンは、ＨＧＰＲＴを欠損している骨髄腫株の生存／細胞増殖に必ず必要とされるヌクレオチド代謝の新生経路を阻害する薬物であり、かつ通常２４〜４８時間以内に選択を可能とする。
【０１３６】
実施例２：ハイブリドーマのスクリーニング
次のステップは、増殖するハイブリドーマのスクリーニングである。その中で細胞が３Ｄマトリックス中での細胞集合として増殖する、市販の半固体アガロースを使用した。これは、手作業によるクラスターの採取（目視検査による）を容易にし、かつこれらのクローンのクラスターを適切な培地を含む９６ウェルプレート中に移すことを容易にする。細胞を３〜７日間増殖させ、次いでスクリーニングのために上清を除去し、新鮮な培地に交換した。ＥＬＩＳＡ（または他の試験）で陽性結合を示したハイブリドーマは、体積を増大させるより大きな組織培養容器に移すことにより増殖を続けた。ｍＡｂは、使われた上清を用い、マウスｍＡｂ用の適切な市販のアイソタイピングキットを使用してアイソタイプを決定した。クローンを選択の次のステージへ進める決定は、ＥＬＩＳＡおよび細胞の生存を使用した天然のＢ毒素に対しての反応性に基づいており、通常少なくとも１／８または１／１６以上の段階希釈および反応性ならびにＩｇＧ分類に基づき；したがって、クローンの数は選択手順を通して減少した。さらなる特徴付けに供したマウスｍＡｂはＣＡＮ３３Ｇ１、ＣＡＮ４６Ｇ４、ＣＡＮ４６Ｇ１３、ＣＡＮ４６Ｇ１３ａ、ＣＡＮ４６Ｇ１９およびＣＡＮ４６Ｇ２４であった。
【０１３７】
実施例３：マウスモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡアッセイ
ＥＬＩＳＡを使用して、全Ｂ毒素ならびに組み換えＢ毒素フラグメント１および４に対するｍＡｂの結合性を試験し、かつ全Ａ毒素に対する交差反応性があるかどうかを決定した。ｍＡｂクローンを、精製した抗トキソイドＢマウスｐＡｂ（ポリクローナルＡｂ）と比較した。ＥＬＩＳＡプレートを、コーティングが等モル量であるように１００ｎｇのＢ毒素フラグメント１、フラグメント４、または４００ｎｇの全Ｂ毒素でコーティングした。ウェルを５％のスキムミルクでブロッキングし、次いで、段階希釈したＣＡＮ４６シリーズのｍＡｂ（０．１μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ）でプローブし、市販のヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体を用いて結合を検出した。陰性対照および陽性対照の実験も行った。ポリクローナルトキソイドＢ抗体（ｐＡｂ）を陽性対照として用い、これは免疫化マウスに由来する。マウス抗Ａ毒素ｍＡｂ  ＣＡＮ２０Ｇ２はＡ毒素に特異的であり、陰性対照として使用した。二次抗体の対照は、マウスの二次抗体に関するものである。プレートを基質とのインキュベーションの１５分後に４０５ｎｍで読み取った。各抗体の滴定曲線のデータを図１に示す。
【０１３８】
結果：図１に示すようにＣＡＮ４６シリーズのｍＡｂは、ＣＡＮ３３Ｇ１での低い結合を除き、全Ｂ毒素およびＢ毒素フラグメントにマウスｐＡｂと同様のレベルで結合する。ＣＡＮ４６Ｇ４、ＣＡＮ４６Ｇ１９およびＣＡＮ４６Ｇ２４は、マウスｐＡｂと同様のレベルでＢ毒素フラグメント４に結合する。ＣＡＮ４６Ｇ１３ａはマウスｐＡｂと同様のレベルでＢ毒素フラグメント１に結合する。Ａ毒素に対する交差反応性を示すＣＡＮ４６  ｍＡｂはなかった
。
【０１３９】
実施例４：マウスモノクローナル抗体の競合ＥＬＩＳＡアッセイ
ＥＬＩＳＡを実施して、ＣＡＮ３３またはＣＡＮ４６ｍＡｂが、Ｂ毒素への結合についてＭＤＸ  １３８８（Ｍｅｄａｒｅｘ、米国特許公開公報第２００５／０２８７１５０号）またはｈＰＡ−４１（Ｐｒｏｇｅｎｉｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＷＯ  ２０１１／１３０６５０；  Ｍａｒｏｚｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  Ａｎｔｉｔｏｘｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ２０１２  Ｓｅｐ；２０６（５）：７０６−１３）と競合するかどうかを試験した。ＥＬＩＳＡプレートを４００ｎｇの全Ｂ毒素でコーティングした。ウェルを５％のスキムミルクでブロッキングし、次いで以下のようにｍＡｂ混合物でプローブした：マウスＣＡＮ３３およびＣＡＮ４６ｍＡｂを１μｇ／ｍｌで調製し、２倍で段階希釈した。およそ１．０のＯＤのベースラインを提供するために、対照として使用したＭＤＸ１３８８抗Ｂ毒素ｍＡｂは１／１，６５０，０００の希釈で調製し、希釈は自家製の以前のデータに基づき、ＣＡＮ３３およびＣＡＮ４６ｍＡｂと１：１で混合した。同様に、ｈＰＡ−４１を１／３３５，０００に希釈し、上記のように段階希釈したＣＡＮ３３およびＣＡＮ４６ｍＡｂと１：１で混合した。ＣＡＮ３３およびＣＡＮ４６ｍＡｂについての結合は、市販のヤギ抗マウスＩｇＧ-ＨＲＰ抗体を用いて検出した。ＭＤＸ１３８８およびｈＰＡ−４１についての結合は、市販のヤギ抗ヒトＩｇＧ-ＨＲＰ抗体を用いて検出した。陰性対照および陽性対照実験も行った。ＭＤＸ１３８８またはｈＰＡ−４１のいずれかと１：１で混合した過剰のＢ毒素を陽性対照として用いた。ＭＤＸ１３８８およびｈＰＡ−４１はまた、競合ｍＡｂを用いない陰性対照とするため単にリン酸緩衝食塩水で希釈した。基質とのインキュベートの１５分後に、プレートを４０５ｎｍで読み取った。
【０１４０】
結果：図２および３に示すように、ＣＡＮ３３およびＣＡＮ４６ｍＡｂは、全Ｂ毒素への結合についてＭＤＸ−１３−８８およびｈＰＡ−４１と競合しない。すべてのｍＡｂは、競合ｍＡｂを含まない陰性対照のものと同様の結合パターンを示す。ＭＤＸ−１３８８またはｈＰＡ−４１のいずれかとの競合を示したｍＡｂがないことは、それらが全Ｂ毒素上の異なるエピトープと結合することを示唆する。
【０１４１】
実施例５：マウスモノクローナル抗体のウェスタンブロット
Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅタンパク質の組み合わせ：組み換えＢ毒素フラグメント１（８２ｋｄａ）、組み換えＢ毒素フラグメント４（８５ｋＤａ）、全Ｂ毒素（２８０ｋＤａ）、および市販のＢＳＡを、４〜１２％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで２００ボルトにて１．５時間泳動させた。次いでゲルをニトロセルロース膜に、４５ボルトで１時間１５分で転写した。膜を、１×ＴＢＳＴ中２．５％のスキムミルクで、４℃一晩ブロッキングした。次の日に、ｍＡｂ（１°Ａｂ）を１×ＴＢＳＴ中２．５％のスキムミルクに、抗体に応じて２μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌの範囲の濃度で希釈し、これを使用して、転写した産物を含む膜を、振盪機上で、室温（ＲＴ）で２時間プローブした。次いで膜を１×ＴＢＳＴで洗浄して結合していない１°Ａｂを除去し、振盪機上で、１：４０００〜１：５０００に希釈した抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（２°Ａｂ）を用いて、振盪機上で、１．５時間室温でプローブした。
【０１４２】
結果：図４、５、および６に示すように、ＣＡＮ４６Ｇ４、ＣＡＮ４６Ｇ１３、ＣＡＮ４６Ｇ１９およびＣＡＮ４６Ｇ２４は、組み換えＢ毒素フラグメント４および全Ｂ毒素への結合を示した。ＣＡＮ４６Ｇ１３ａは、組み換えＢ毒素フラグメント１および全Ｂ毒素への結合を示した。これらはすべて陰性対照（ＢＳＡ）に対する交差反応性を示さなかった。
【０１４３】
実施例６：マウスモノクローナル抗体の親和性解析
Ｂｉｏｌａｙｅｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙを使用して、全Ｂ毒素および抗Ｂ毒素抗体の間の相互作用を測定した。Ｏｃｔｅｔ  ＱＫｅ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）は、ストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサを備えていた。４０μｇ／ｍｌのビオチン化抗体をＳＡセンサに結合させ、Ｂ毒素を５０ｎＭ〜０．７８ｎＭに段階希釈して、抗体コートしたピン上で反応させ、その後ＰＢＳ‐トリトンで解離ステップを行った。結果を、ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ解析ソフトウェアを使用して解析し、抗体と抗原との間の結合強度を表すために使用される尺度である解離定数（ＫＤ）、そこで抗体抗原複合体が形成されるｏｎ速度Ｋｏｎ（１／Ｍｓ）、およびそこで抗体抗原複合体が解離するｏｆｆ速度ｋｄｉｓ（１／Ｓ）を決定した。表４は、精製したマウスＣＡＮ３３およびＣＡＮ４６ｍＡｂの親和性（抗体と抗原との間のｋｄｉｓ／ｋｏｎの平衡解離定数（ＫＤ）の比率は親和性と逆に相関しており、これによりＫＤが低いほど親和性が高くなる）を示す。
【０１４４】
【表４】
2016501877.tif 000063
【０１４５】
実施例７：マウスモノクローナル抗体のエピトープ結合
Ｏｃｔｅｔ  ＱＫｅは、バイオレイヤー干渉法を介して生体分子の相互作用を検出する使い捨てのファイバ光学センサを使用する、標識フリーのリアルタイムバイオセンサである。以前に特徴付けたＭＤＸ１３８８ｍAbに対してエピトープ結合アッセイを実施して、本発明のＢ毒素ｍＡｂがＭＤＸ１３８８と類似または異なるエピトープを共有しているかどうかを試験した。次に、アッセイを使用して、Ｂ毒素ｍＡｂ間で共有される単一または可能な複数のエピトープビンを確認した。従来のサンドイッチ法を使用し、センサへのｍＡｂのカップリング、抗原の結合、および別のｍＡＢへの結合を含める。第２のｍＡｂは、そのエピトープが固定化されたｍＡｂのエピトープと重複していない場合にのみ捕捉したＡｇを結合できる。たとえば、ビオチン化ＣＡＮ４６Ｇ２４抗体をストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサと結合する。次いで、結合抗体を、遊離Ｂ毒素および遊離ＣＡＮ４６Ｇ２４とインキュベートする。ＣＡＮ４６Ｇ２４‐Ｂ毒素複合体を、再び遊離抗体とインキュベートする。波長での大きなｎｍのシフトは分析物の結合を示し、ＣＡＮ４６Ｇ２４および遊離抗体が異なるエピトープを有することを示唆する。１  ＳＡバイオセンサに対するビオチン化ＣＡＮ４６Ｇ２４；２  ＣＡＮ４６Ｇ２４と複合体を形成する遊離全Ｂ毒素；３  ビオチン化ＡＮ４６Ｇ２４−Ｂ毒素複合体と会合している遊離ＣＡＮ４６Ｇ２４；４会合試料曲線；５解離ステップ。
【０１４６】
結果：図７では、ＭＤＸ１３８８およびＣＡＮ４６Ｇ１３ａの試料の両方でのｎｍのシフトは、露出した、かつ別々のエピトープに対する結合を示す。ＣＡＮ４６Ｇ４およびＣＡＮ４６Ｇ２４試料でｎｍのシフトがないことは、ＣＡＮ４６Ｇ１９に対する共通のエピトープまたは空間的に関連するエピトープを示唆する。
【０１４７】
実施例８：ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）プラットフォームを使用したＨＴ−２９細胞（ヒト結腸カルシノーマ上皮細胞）でのクロストリジウム・ディフィシルＢ毒素中和アッセイ
細胞株
ＨＴ−２９細胞はヒト結腸カルシノーマ上皮細胞株である。これらの細胞は、それらがＴｃｄＢの感染に関連するｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを代表することから、選択された。
【０１４８】
ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）プラットフォーム
ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）は、リアルタイムで細胞の特徴をの変化を評価する電子インピーダンス細胞検知測定に基づくリアルタイムの標識フリー細胞解析（ＲＴＣＡ）である。細胞増殖および細胞傷害性は、細胞指標（ＣＩ）と呼ばれる無次元パラメータの増加または減少をモニタリングすることにより検出できる。接着細胞をカスタム９６ウェルプレート内で培養する場合、細胞増殖の特徴は、各ウェルの中に埋め込まれている金電極により測定される電気インピーダンスの変化により、リアルタイムでモニタリングできる。
【０１４９】
ＣＩ測定は、４つのパラメータ：１）細胞数、２）細胞寸法および形態、３）細胞生存率、および４）細胞接着に基づく。これらのパラメータのいずれか１つが増加することによりＣＩが増大する。逆に、これらのパラメータのいずれか１つの減少によりＣＩが減少する。
【０１５０】
手法
ＨＴ−２９細胞を、Ｔ−７５のフラスコからトリプシン処理し、８０００細胞／ウェルでＲｏｃｈｅ９６−ｗｅｌｌ  Ｅ−  ｐｌａｔｅ（登録商標）に添加し、３７℃で４時間インキュベートした。４時間のインキュベーションの最中に、試料の希釈を、９６ウェルのＵ底プレートで調製した。次いで試料に、適切に希釈したＴｃｄＢ（０．５〜５０ｎｇ／ｍＬの範囲、毒素のロットに応じて希釈）で覆った。次いでプレートを３７℃で約６０分インキュベートした。最初の細胞インキュベーションが完了した後に、毒素／試料調製物で細胞を覆い、次いで３７℃で最低７２時間インキュベーションした。インピーダンス測定を、インキュベーション期間にわたり３０分ごとに行った。このデータを、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）ＲＴＣＡソフトウェアを使用してリアルタイプでプロットする。最適な時点を表す単一の時点（毒素の細胞傷害性または中和のいずれかに関する）を選択した。この単一の時点からのデータを使用して、解析用の４−パラメータロジスティック（４−ＰＬ）曲線を作成した。試料の効力が決定される場合、試料の曲線は、「基準の」試料に対して制約される。曲線の制約は、上部／下部の漸近線、および曲線の勾配を制約するために使用する。このことにより各曲線が、曲線のＩＣ５０に基づきｘ軸に沿って水平にシフトすることが可能となる。効力決定のため、標準のＩＣ５０値を試料のＩＣ５０値で除算する。
【０１５１】
ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを用いたＴｃｄＢ細胞病原性検出の初期評価
ＨＴ−２９細胞に対するＢ毒素の細胞病原性を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）プラットフォームの適合性を決定するためにまず評価した。図８は、２倍希釈でのＴｃｄＢの用量応答曲線を示し、ＨＴ−２９細胞に対するＴｃｄＢ細胞の濃度増加は、細胞指数の減少により示唆されるように細胞病原性をもたらすことを示している。ＴｃｄＢの濃度減少に伴う細胞指数の増加は、細胞病原性の適切な検出を示す。５ｎｇ／ｍｌのＴｃｄＢ濃度は、およそ最大の細胞病原効果を示しており、これが毒素中和を評価するための適切な濃度と示唆している。
【０１５２】
細胞付着段階−ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ（商標）法
この段階は、以下のステップを含んだ。（１）ソースフラスコ内で細胞をトリプシン処理した。（２）２ｍｌのトリプシンをフラスコに添加し細胞を洗浄して培地の残りを除去し、次いで吸引した。（３）３ｍｌのトリプシンを添加し、３７℃で約８分インキュベートした。（４）６ｍｌのアッセイ培地をフラスコに添加した。（４）懸濁した細胞を、８００ｒｐｍで７分間遠心した。（５）上清を吸引し、６ｍｌのアッセイ培地で細胞を再懸濁した。（６）細胞を計数し、８０００細胞／ウェルでプレーティングするために必要な細胞の容量を計算した。（７）９６ウェルＥプレートの全てのウェルに１００μｌのアッセイ培地を添加した。（８）ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅでバックグラウンドの読み取りを行った。（１０）１．０×１０６細胞／ｍｌの懸濁液５０μｌを、最終的に８０００細胞／ウェルの播種密度となるようこれらのウェルに添加した。（１１）（１５）細胞が均一に定着するように、２０〜３０分間室温でプレートをインキュベートした。（１６）５％のＣＯ２の充填を伴う３７℃のインキュベーターに４〜５時間プレートを置いた。
【０１５３】
Ｂ毒素の調製：（１）原液（４０９．６μｇ／ｍｌ）を５ｎｇ／ｍｌに希釈することによりＢ毒素のオーバーレイを調製した（２）原液を８０ｎｇ／ｍｌに希釈することにより滴定用のＢ毒素を調製した。（３）原液の希釈は表５に示す通りに実施した。
【表５】
2016501877.tif 000064
【０１５４】
試料の調製：効力を試験するために、すべてのモノクローナル抗体を表６に示すように適切な濃度に調製した。
【表６】
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【０１５５】
希釈プレートの調製−ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ
Ｕ底の９６ウェルプレートを使用して以下を実施した。（１）１１２．５μｌのアッセイ培地をウェルＢ２〜Ｈ１１、およびＥ１２〜Ｈ１２に添加した。（２）２２５μｌの培地をウェルＡ１２〜Ｄ１２に添加した。（３）１００μｌのアッセイ培地をウェルB１〜H１に添加した。（４）１５０μｌの試料を、下の表７に示すように対応するウェルに添加した。（５）列Ａから３７．５μｌを移して列Ｂに添加し、混合して列Ｈまで反復することにより、各試料を４倍段階希釈した。（６）列Ａから列Ｂに５０μｌを移し、混合し、次いで列Ｈまで段階希釈を続けることにより、毒素滴定ウェルを３倍段階希釈した。（７）試料および毒素対照（ＴＣ）に、１１２．５μｌのＢ毒素を添加した。（８）毒素滴定ウェルに、１００μｌのアッセイ培地を添加した。（９）プレートを、均一になるまでプレート振盪機上で振盪した。（１０）５％のＣＯ２と３７℃で６０〜９０分インキュベートした。
表７はｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ希釈プレートのレイアウトを示す。
【表７】
2016501877.tif 000066
【０１５６】
細胞プレートへの試料の添加：（１）インキュベートの完了後、細胞および希釈プレートをインキュベーターから取り出した。（２）（３）希釈プレートから５０μｌの試料を、細胞プレートの適切なウェルに移した。（４）５％のＣＯ２充填下３７℃で７２時間インキュベートした。
【０１５７】
データ解析：（１）７２時間の時点でのプレートのデータを、Ｓｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏ  （ｖ．５．４）ソフトウェアを使用してそれぞれ個々の試料について４‐パラメータ（４−ＰＬ）ロジスティック曲線に合わせた。（２）標準および試料の曲線を制約し（上部／下部漸近線、および勾配）、標準のＩＣ５０値を試料のＩＣ５０で除算し、効力評価を決定した（適用可能な場合）。
【０１５８】
この実施例の手順を、ｍＡｂに関しても実施した。
【０１５９】
結果
マウスＣＡＮ４６ｍＡｂはＭＤＸ−１３８８と同様のＥＣ５０値を示し、ここでＣＡＮ４６Ｇ２４は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでより高いレベルの中和を示す。
表８は各ｍＡｂのＥＣ５０データをまとめており、ＣＡＮ４６Ｇ２４およびＣＡＮ４６Ｇ１３が、ＭＤＸ１３８８と比較した場合最も中和するクローンであることを示している。
【表８】
2016501877.tif 000067
ＥＣ５０値は、ＴｃｄＢ毒素の用量の５０％を中和する抗体の濃度である。
【０１６０】
実施例９：ＨＴ−２９細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和アッセイにおけるクロストリジウム・ディフィシルＢ毒素
ＨＴ−２９の細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和アッセイでは、表９の％中和の範囲は、マウス抗体由来のデータからまとめられている。使用したＢ毒素の濃度は５μｇ／ｍｌであった。
【表９】
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【０１６１】
実施例１０：マウスのｉｎ  ｖｉｖｏでの毒素試験
マウスのｉｎ  ｖｉｖｏ毒素試験は、いくつかの改変を伴い従来の公開に基づいた（Ｂａｂｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｔｏｘｉｎｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ  ｐｒｅｖｅｎｔ  Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｈａｍｓｔｅｒｓ，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  （２００６））。２０〜３０ｇの体重のＢａｌｂ／ｃマウスに、２５０μｇのｍＡｂまたは対照を０日目に与え、休息をとらせた。２４時間後に、マウスに致死量のＴｃｄＢ（７５ｎｇ）を与えた。この用量は、未保護の状態の動物の９０〜１００％を２４時間以内に死に至らしめる。マウスを４日間、異常性ならびに局所性および全身性の疾患に関して観察した。すべての観察を記録し、％生存を各処置グループについて決定した。
【０１６２】
結果：
図９に示されるように、試験結果は、ＣＡＮ４６  ｍＡｂがマウスをＢ毒素から保護することを示す。すべてのＣａｎ４６  ｍＡｂ、ＣＡＮ４６Ｇ４、ＣＡＮ４６Ｇ１３、ＣＡＮ４６Ｇ１３ａ、ＣＡＮ４６Ｇ１９およびＣＡＮ４６Ｇ２４は、致死量のＢ毒素投与からの保護において、０．２５ｍｇ／マウスの用量で有効であり、Ｂ毒素投与後４日の生存は１００％であった。ＣＡＮ３３Ｇ１は０．２５ｍｇ／マウスの用量でマウスを保護できず、Ｂ毒素投与後４日の生存は０％であった。
【０１６３】
実施例１１：Ｖ遺伝子のシークエンシング
ＲＮｅａｓｙミニキットを使用して、ＣＡＮ４６Ｇ親ハイブリドーマクローン細胞株のそれぞれからＲＮＡを単離した。ＲＮＡからのＶ遺伝子の増幅を、Ｑｉａｇｅｎ  ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキットを使用して実施した。いくつかのプライマーセットの組み合わせを以下のように使用した。ハイブリドーマからの免疫グロブリン可変領域遺伝子配列を確認するために、１連の可変領域遺伝子（Ｖ遺伝子）サブグループ特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用する。これらは、５’ｍＶＫ−Ｌｅａｄ−ｌ、３’ＫａｐｐａＣｏｎｓｔＲＴ、５’ｍＶＨ−Ｌｅａｄ−２、５’ｍＶＨ−Ｌｅａｄ−２Ａ、および３’ｍＩＧｌ−２Ｃ  ＲＴを含んでよい。既知でかつ内在性の異常なκ軽鎖Ｖ遺伝子のｍＲＮＡ（Ｐ３Ｘ６３骨髄腫で見出された）（Ｙｕａｎ，  Ｘ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２９４：  １９９−２０７  （２００４））からのコンタミネーションの可能性を除外するために、５’ｍＶＫ−Ｌｅａｄ−ｌＡ、５’ｍＶＫ−Ｌｅａｄ−ｌＡ、５’ｍＶＫ−Ｌｅａｄ−３、５’ｍＶＫ−Ｌｅａｄ−３Ａ、５’ｍＶＨ−ＩＧＨＶｌ−Ｌｅａｄ、５’ｍＶＨ−Ｌｅａｄ−ｌ、５’ｍＶＨ−Ｌｅａｄ−３、５’ｍＶＨ−Ｌｅａｄ−４、および５’ｍＶＨ−Ｌｅａｄ−５を含み得る、非サブグループ特異的プライマーセットを使用するＲＴ−ＰＣＲも実施した。図１０では、プライマーおよびそれらの配列の一覧が表されている。プライマー中の縮重塩基の記号は、縮重ヌクレオチド配列パターンを表すＩＵＰＡＣ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｒｅ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）コードである。
【０１６４】
ＰＣＲ増幅反応の結果を、解析アガロースゲル上のＰＣＲ産物を調べることにより決定し、約３００〜５００ｂｐの視覚化されたバンドを、クローニング用にゲル単離した。抽出したＤＮＡを、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングマニュアルにおける低融点アガロース法を使用して、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター内に直接ＴＡクローニングした。各ＣＡＮ４６Ｇクローン反応物を、Ｍ１３順方向およびＭ１３逆方向プライマーを使用して、両方向でシークエンスした。配列データを、ＤＮＡＳｔａｒ  Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアを使用して解析した。図１１は、ＩＭＧＴ／Ｖ−Ｑｕｅｓｔ参照ディレクトリセットおよびＮＣＢＩ免疫グロブリンＢｌａｓｔサーチと比較した、得られた再配置Ｖ遺伝子配列を示す。図は、マウスの親クローンＣＡＮ４６Ｇ４、ＣＡＮ４６Ｇ１３ａ、ＣＡＮ４６Ｇ１９、ＣＡＮ４６Ｇ２４、ＣＡＮ４６Ｇ１３およびＣＡＮ３３Ｇ１のＶＨ配列およびＶＬ配列の両方に関する結果を含む。ＣＡＮ４６Ｇ２４およびＣＡＮ４６Ｇ１３の解析により、マウス親クローンのＶＨ配列及びＶＬ配列に関して同一の配列が明らかとなった。
【０１６５】
実施例１２：  ＣＡＮ４６Ｇのヒト化
各ＣＡＮ４６Ｇ  ｍＡｂの３つのヒト化ＩｇＧ／ｋバージョンを作製した。ヒト化バージョンでは、ヒ化生殖系列の対立遺伝子との最大同一性アライメントを使用して（ＮＣＢＩウェブサイト）、受容体（ａｃｃｅｐｔｏｒ）フレームワークの同定を支援した。重鎖および軽鎖に対応する６つのすべてのＣＤＲを挿入した。他の残基は、表面露出またはフォールディングもしくは鎖間の接触への関与によりそれぞれ変化させたか、または維持された。これは、総フレームワークよりむしろＣＤＲのマッチングが受容体フレームワークとしての生殖系列配列の使用のバリエーションに使用されている、「超ヒト化（ｓｕｐｅｒｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）」手法に類似している。Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２，  １６９：１１１９−１１２５の場合では、著者らはＣＤＲ配列を使用して、カバト分類システムに基づくいわゆるＣＤＲの古典的な分類と一致させようと試みた。しかしながら、特定のＣＤＲは生殖系列にコードされており、かつ特定の古典的なコンフォメーションは特定のフレームワークにおいて見出される傾向があるため、受容体フレームワークを選択する「超ヒト化」方法は、異なる候補受容体フレームワークの選択を必ずしももたらさない。それは経験的であり、複数のｍＡｂ特異性についてはまだ試験されていない。これは、同定のためのフレームワークの直接アライメントがＣＤＲを本質的に含み、比較の際にもＣＤＲを含むことが原因の一部である。
【０１６６】
ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ  ＣＤＲ移植のみ（図１２）
VHおよびVｋに関して最も一致したヒト生殖系列の対立遺伝子を、CDRを移植する受容体フレームワークとして使用した。他の変更は受容体フレームワークに対して行わなかった。
【０１６７】
ｈｕＣＡＮ４６およびｒｅｈｕＣＡＮ４６「ヒト改変」（図１３および１４）
このヒト化バージョンを、ＣＤ５に対するマウスのｍＡｂをヒト化するためにＳｔｕｄｎｉｃｋａらにより使用された「ヒト改変」戦略（Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｈｕｍａｎ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｒｅｔａｉｎ  ｆｕｌｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  ｎｏｎ−ＣＤＲ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  １９９４  Ｊｕｎ；７（６）：８０５−１４）と最も類似した戦略を使用して作製した。基本的に、ＣＡＮ４６Ｇ  ｍＡｂのＶＨおよびＶＫと最も近いヒト生殖系列対立遺伝子を個々に同定し、受容体フレームワークとして使用するための設計を行った。ｒｅｈｕＣＡＮ４６  ｍＡｂは、ＣＤＲを破壊することなく、採用したヒトフレームワークに対応する表面露出アミノ酸上で行われた置換により、さらに再度表面化した。
【０１６８】
実施例１３：ヒト化モノクローナル抗体のＥＬＩＳＡアッセイ
ＥＬＩＳＡを使用して、全Ｂ毒素およびＡ毒素に対するｍＡｂの結合を試験し、それらが全Ａ毒素に対して交差反応性を有するかどうかを決定した。ＥＬＩＳＡプレートを、コーティングが等モルであるように、４００ｎｇの全Ｂ毒素またはＡ毒素で被覆した。ウェルを５％のスキムミルクでブロッキングし、次いで段階希釈したＣＡＮ４６シリーズのｍＡｂ（０．１μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ）でプローブし、結合を市販のヤギ抗ヒトＩｇＧ‐ＨＲＰ抗体を用いて検出した。陰性対照および陽性対照も試験した。プレートを、基質とのインキュベートの１５分後に４０５ｎｍで読み取った。各抗体の滴定データを図４０に示す。
【０１６９】
結果：図３７に示すように、ＣＨＯ構築物由来のＣＨＯＫ１ＳＶ細胞で発現させたヒト化ＡＮ４６  ｍＡｂは、それぞれのマウスｍＡｂｎの結合特徴を保持し、かつ全Ｂ毒素に結合する。ヒト化ＣＡＮ４６Ｇ１３ａ  ｍＡｂは、他のＣａｎｇｅｎｅ  ｍＡｂおよび対照ｍＡｂと比較してより低いレベルでＢ毒素に結合する。どのＣＡＮ４６  ｍＡｂもＡ毒素に対する交差反応性を示さなかった。
【０１７０】
実施例１４：ヒト化モノクローナル抗体のウェスタンブロット
４〜１２％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのタンパク質の組み合わせ：全Ｂ毒素、組み換えＢ毒素フラグメント１、組み換えＢ毒素フラグメント４、および全Ａ毒素を２００ボルト、１．０時間で泳動させた。次いでゲルをニトロセルロース膜に４５ボルトで１時間転写した。膜を、１×ＴＢＳＴ中５％のスキムミルクを用いて、室温で１時間または４℃で１晩ブロッキングした。ｍＡｂ（１°Ａｂ）を、抗体に応じて０．０３８μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌの範囲の濃度で、１×ＴＢＳＴ中５％のスキムミルクに希釈し、振盪機上で室温で５時間または４℃で１晩、転写産物を含む膜をプローブするのに使用した。次いで膜を１×ＴＢＳＴで洗浄して結合していない１°Ａｂを除去し、振盪機上で１．５時間、室温で、１：４０００〜１：５０００に希釈した抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（２°Ａｂ）を用いて、プローブした。
【０１７１】
結果：図３４および３５に示すように、ＣＡＮ４６Ｇ１９およびＣＡＮ４６Ｇ２４のヒト化バージョンは、組み換えＢ毒素フラグメント４（８５ｋＤａ）および全Ｂ毒素（２８０ｋＤａ）に対する結合を示した。ヒト化バージョンのＣＡＮ４６Ｇ１３ａは、組み換えＢ毒素フラグメント１（８２ｋＤａ）および全Ｂ毒素（２８０ｋＤａ）に対する結合を示した。試験したヒト化ＣＡＮ４６  ｍＡｂはいずれも、Ａ毒素（３０８ｋＤａに対する交差反応性はなかった。
【０１７２】
実施例１５：ヒト化抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和アッセイ
ＣＴ．２６細胞を使用したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和アッセイを、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅＢ毒素に対するヒト化ｍＡｂ変異体の中和能力を試験するために実施した。ＣＴ．２６細胞を、２．５〜３×１０４細胞／１００μｌ／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播種し、プレートを５％ＣＯ２インキュベーターで、３７℃で４〜５時間インキュベートした。培地を含む２つのブランクウェル（細胞なし）も、このプレートに含まれた。
【０１７３】
毒素および毒素／Ａｂ原液を調製し、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）培地を使用して、所望の濃度に希釈した。希釈した毒素対照および毒素／Ａｂ試験混合物を、室温で１時間インキュベートした。その後、培地をウェルから除去し、培地単独（細胞対照）、毒素単独（毒素対照）、または毒素／Ａｂ混合物のいずれかの存在下で、３７℃および５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。プレートを、３７℃および５％ＣＯ２で４８時間インキュベートするために戻した。
【０１７４】
次に、各ウェルにＷＳＴ−１検出試薬を添加して（ウェル中の容積は試薬１０μｌ／１００μｌ）３７℃および５％ＣＯ２でさらに1時間インキュベートし、それからプレートを１分間振盪し、４５０ｎｍの吸光度を読み取った。
【０１７５】
細胞の生存率を、以下のように細胞対照に基づき判定した：
％細胞生存率＝試験の平均ＯＤ／細胞対照の平均ＯＤ×１００。
毒素中和を、以下の式により計算した：
％中和＝（試料のＯＤ−毒素対照のＯＤ）／細胞対照のＯＤ‐毒素対照のＯＤ）×１００。
【０１７６】
結果
図１５ａおよび１５ｂに示すように、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ４、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ４、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９およびｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９は、全てのｍＡｂ濃度で最も高いレベルの保護（中和）を提供した。これらの中和レベルは、本来のマウスバージョンと同等であった。ＭＤＸ１３８８  ｍＡｂもまた同等の中和活性を示す一方、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ４およびｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１９の両方は本来のマウスバージョンまたは対照ｍＡｂ  ＭＤＸ１３８８と比較した場合、活性がかなり低下するか、まったく活性を示さない。
【０１７７】
ＣＴ．２６wt細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和アッセイについて、表１０の％中和範囲が、２つのヒト化ｍＡｂ、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ４およびｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９からのデータよりまとめられた。Ｂ毒素の濃度は２００〜２５０ｐｇ／ｍｌであった。
【表１０】
2016501877.tif 000069
2016501877.tif 000070
【０１７８】
さらに、図１９〜２３は、ＣＴ−２６細胞に対するＢ毒素投与の中和における、Ｐｅｒ．Ｃ６ベースの構築物を発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞（図面の説明文では２９３Ｆとして表される）またはＣＨＯベースの構築物を発現するＣＨＯＫ１ＳＶ細胞（図面の説明文ではＣＨＯとして表される）のいずれかから精製したＣＡＮ４６ｍＡｂの能力を例示する。特に、ＣＨＯおよびＰｅｒ．Ｃ６構築物両方におけるｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４  ｍＡｂは、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４構築物よりも優れた中和を示した（図１９）。図２０では、キメラＣＡＮ４６Ｇ１３ａ  ｍＡｂは、ＣＨＯでのｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａおよび両構築物でのｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａよりも優れた中和を示した。図２１では、両構築物（ＣＨＯおよびＨＥＫ２９３Ｆ）でのｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９  ｍＡｂは、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９構築物よりも優れた中和を示した。図２２では、３つのｍＡｂ、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ４、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９およびｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４は、同等の中和を示し、１〜２μｇ／ｍｌで１００％中和した。図２３では、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４は、Ｂ毒素の中程度の中和を示し、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａおよびｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ  ｍＡｂは、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４と比較してＢ毒素の弱い中和を示した。図２５では、ＣＨＯでのｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４  ｍＡｂは、試験したＣＨＯヒト化ＣＡＮ４６ｍＡｂの最も高い中和能力を示し、約０．１８μｇ／ｍｌで１００％中和した。ＣＨＯでのｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９およびｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４は中程度の中和を示し、約０．３μｇ／ｍｌで１００％中和した。まとめると、これらの結果は、Ｂ毒素のドメイン１または４に対して特異性を有する本発明に記載されるヒト化モノクローナル抗体を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＴ２６に対するＢ毒素の細胞傷害性作用をＣＡＮ４６  ｍAbが中和することを示す。
【０１７９】
実施例１６：マウスｉｎ  ｖｉｖｏ毒素試験
マウスｉｎ  ｖｉｖｏ毒素試験は、一部の改変を伴い従来の公開に基づいた（Ｂａｂｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｔｏｘｉｎｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ  ｐｒｅｖｅｎｔ  Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｈａｍｓｔｅｒｓ，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  （２００６））。０日目に、２５０μｇのｍＡｂまたは対照を２０〜３０ｇの体重のＢａｌｂ／ｃマウスに与え、休息させた。２４時間後、マウスに致死量のＴＣｄＢ（７５ｎｇ）を与えた。この用量は、保護されていない段階の動物の９０〜１００％を２４時間以内に死に至らしめる。マウスを、異常性、局所性および全身性の疾患の兆候について４日間観察した。すべての観察を記録し、各処置グループの％生存を決定した。
【０１８０】
結果
図１６〜１７に示すように、試験結果は、ヒト化したバージョンのＣＡＮ４６  ｍＡｂ（Ｐｅｒ．Ｃ６ベースの構築物を発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞から精製）が、マウスをＢ毒素投与から保護することを示す。図１６は、すべてのＣＡＮ４６Ｇ１３ａヒト化ｍAb、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（１０％）、ｃｄｒＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（２０％）、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ（３０％）が、Ｂ毒素の試験から３日後に、致死量のＢ毒素投与からの保護において、０．２５ｍｇ／マウスの用量で有効でなかったことを示す。図１７は、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ４、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４が、致死量のＢ毒素投与からの保護において、０．２５ｍｇ／マウスの用量で有効であり、ここでＢ毒素投与後３日の生存は１００％であった。
【０１８１】
実施例１７：総ヒトＩｇＧＥＬＩＳＡ
総ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡを、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製のヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ定量セット（Ｃａｔ  Ｎｏ．  Ｅ８０−１０４）を使用しキットの説明に従って実施した。ＥＬＩＳＡを、Ｂ毒素投与をされたマウスから収集した血清試料に関して実施した。血清を、毒素試験の１２時間前に、ｍＡｂ注射後１２時間のマウスから収集し、それから試験の最後の第４日に再度収集した。第１の試料と第２の試料との間の時間は８４時間であった。検出可能な循環ｍＡｂの減少の線形速度を、以下の計算によって決定した。
［（試験の１２時間前の血清中のｍＡｂの濃度）−（試験から９６時間後の血清中のｍＡｂの濃度）］／８４時間
【０１８２】
結果
図１８に示すように、ｍＡｂの濃度は、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４  ｍＡｂ（７５μｇおよび２５０μｇ）またはｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９  ｍＡｂ（２５０μｇ）のいずれかを注射したマウスにおいて、８４時間にわたり相対的に安定していた。ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１９（７５μｇおよび２５０μｇ）またはｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４（２５０μｇ）のいずれかを注射したマウスは、検出可能な循環ｍＡｂの５０〜７５％を喪失した。試験したすべてのｍＡｂについて、マウスの循環ｍＡｂの濃度は、試験から４日後に１２μｇ／ｍｌ未満には低下しなかった。試験したｍＡｂは、Ｐｅｒ．Ｃ６ベースの構築物を発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞から精製した。
【０１８３】
実施例１８：Ｂ毒素の親和性
ヒト化ＣＡＮ４６  ｍＡｂ変異体およびＢ毒素の親和性を、バイオレイヤー干渉法を用いて試験した。原液抗体を、ＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌに希釈し、それから１ｍｍｏｌのビオチン／１ｍｍｏｌのＡｂの比率を使用して商業的に入手可能なキット（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃａｔ  Ｎｏ．  Ｐ１２１３２９）を使用して、室温で３０分間ビオチン化した。脱塩カラムを使用して、過度のまたは結合していないビオチンを除去した。Ｏｃｔｅｔ  ＱＫｅ器具は、ストレプトアビジン（ＳＡ）、抗ヒトＦｃ（ＡＨＣ）、または抗マウスＦｃ（ＡＭＣ）センサのいずれかを備えた。センサを、安定なベースラインを得るまでＰＢＳＴ中で予め洗浄した。４０μｇ／ｍｌのｍＡｂを８つのセンサのそれぞれに結合／充填した。センサを、安定したベースラインを取得し、かつ結合していないｍａｂが除去されるまでＰＢＳＴ中で再度洗浄した。センサを、Ｂ毒素の希釈系列（５０ｎｍ〜０ｎＭ）と関連させ、それからＰＢＳＴ中で洗浄して、各ｍＡｂからの毒素の解離を評価した。結果をＦｏｒｔｅＢｉｏデータ解析ソフトウェアを使用して解析して、平衡解離定数（ＫＤ）または結合の強度、ｍＡｂ：毒素複合体が形成される速度（ｋｏｎ）、およびｍＡｂ：毒素複合体が解離する速度（ｋｄｉｓ）を決定した。
【０１８４】
結果
試験した抗体を、Ｐｅｒ．Ｃ６ベース構築物を発現したＨＥＫ２９３Ｆ細胞から精製した。図２４に示されるように、ｈｕＣＡＮ４６  ｍAbは、マウスの対応物と比較して、ＴｃｄＢに関してより小さなＫＤ値を有し、それゆえより高い親和性を有した。ｒｅｈｕＣＡＮ４６  ｍAbは、マウスの対応物よりも小さなＫＤ値を示したが、顕著に異なるＫｄｉｓ値は有さなかった。すべてのヒト化ｍＡｂバージョンは、類似したＫＤ値、０．１５〜０．４２Ｍを示し、Ｂ毒素に対する高親和性の類似のレベルが示唆された。
【０１８５】
ＣＨＯベースの構築物を発現するＣＨＯＫ１ＳＶ細胞から精製したヒト化変異体の同様の解析を図３６に示す。同様の親和定数がＣＡＮ４６Ｇ１３a変異体で得られ、一方でＣＡＮ４６Ｇ２４変異体は、ヒト化プロトコルに従いｎＭ以下の親和定数を示した。
【０１８６】
実施例１９：ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）プラットフォームを使用したＶｅｒｏ細胞でのクロストリジウム・ディフィシル臨床単離Ｂ毒素中和アッセイ
細胞株−Ｖｅｒｏ細胞は、サルの腎臓線維芽細胞である。これらの細胞は、Ａ毒素に対して相対的に耐性がある一方で、Ｂ毒素に対して非常に感受性があるため、選択される。
【０１８７】
ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）プラットフォーム
ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）は、リアルタイムで細胞の特徴の変化を評価する電子インピーダンス細胞検知測定に基づく、リアルタイム標識フリー細胞解析（ＲＴＣＡ）システムである。細胞増殖および細胞傷害性を、細胞指数（ＣＩ）と呼ばれる無次元パラメータの増加または減少をモニタリングすることにより検出できる。接着細胞をカスタム９６ウェルプレート内で培養する場合、細胞増殖の特徴を、各ウェルに埋め込まれた金の電極により測定される電子インピーダンスの変化によりリアルタイムでモニタリングできる。
【０１８８】
ＣＩの測定は、４つのパラメータ：１）細胞の数、２）細胞の寸法および形態、３）細胞の生存率、ならびに４）細胞接着に基づく。これらのパラメータのいずれか１つの増加はＣＩの増加をもたらす。反対に、これらのパラメータのいずれか１つの減少はＣＩの減少をもたらす。
【０１８９】
Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ臨床単離培養上清の調製
９つの普及している臨床単離物および１つの参照株（ＡＴＣＣ４３２５５）を、Ｂ毒素中和試験のため選択した。胞子の貯蔵物を、ブレインハートインフュージョン＋０．１％のタウロコール酸塩（ＢＨＩ−Ｔ）のプレートにストリークして、嫌気チャンバ内で、３５℃で４８時間培養した。単一クローンを、５０ｍｌのＴＹ培地に移し、４日間培養した。細菌培養物を遠心し、上清を０．２μｍのフィルターを介して濾過した。上清を４℃で保存し、無菌を確認するため４８時間ＢＨＩ−Ｔプレート内で培養した。培養上清を、Ｖｅｒｏ細胞の８０〜９０％の細胞傷害性を誘導する予め判定した濃度（表１１）まで、Ｖｅｒｏ培地で希釈した。
【表１１】
2016501877.tif 000071
【０１９０】
Ｖｅｒｏ細胞をＴ−７５フラスコからトリプシン処理し、ロシュ９６ウェルＥプレート（登録商標）に７５００細胞／ウェルで添加し、３７℃で４時間インキュベートした。４時間のインキュベートの中に、抗ＴｃｄＢ  ｍＡｂ希釈物を、９６ウェルのＵ底プレート上で調製した。次いで、試料を、繰り返しピペッティングすることにより適切なＴｃｄＢの希釈物（０．５〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲、毒素ロットに応じて希釈）と混合した。次いで、プレートを３７℃で６０分間インキュベートした。最初の細胞インキュベーションの完了後、細胞に毒素／ｍＡｂ調製物を添加し、少なくとも７２時間３７℃でインキュベートした。インピーダンス測定を、インキュベーション期間にわたり３０分ごとに行った。このデータを、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）ＲＴＣＡソフトウェアを使用してリアルタイムでプロットした。最適な時点を表す単一の時点（毒素の細胞傷害性または中和のいずれかに関する）を選択した。その単一の時点からのデータを使用して、解析のため４−パラメータのロジスティック曲線を作成した。試料の効力が決定された場合、試料曲線は、「参照」試料に対して制約される。曲線の制約を使用して、曲線の上部／下部の漸近線、および勾配を制約する。このことにより、各曲線を、曲線のＩＣ５０値に基づいてx軸に沿って水平にシフトさせることが可能である。効力を決定するため、標準物のＩＣ５０値を試料のＩＣ５０値により除算する。
【０１９１】
細胞付着段階‐ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ（商標）法
この段階は、以下のステップを含んだ。（１）ソースフラスコ中で細胞をトリプシン処理した。（２）２ｍｌのトリプシンをフラスコに添加し細胞を洗浄して培地の残りを除去し、次いで吸引した。（３）３ｍｌのトリプシンを添加し、約８分３７℃でインキュベートした。（４）６ｍｌのアッセイ培地をフラスコに添加した。（４）懸濁した細胞を、３６８ｘｇで８分間遠心した。（５）上清を吸引し、細胞を６ｍｌのアッセイ培地で再度懸濁した。（６）細胞を計数し、７５００細胞／ウェルでプレーティングするために必要な細胞の容量を計算し、（７）９６ウェルEプレートの全てのウェルに１００μｌのアッセイ培地を添加した。（８）ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅでバックグラウンドの読み取りを実施した。（１０）これらのウェルに１．５×１０５細胞／ｍｌの懸濁液５０μｌを、最終的に７５００細胞／ウェル播種密度となるよう添加した。（１１）細胞が均一に定着するように、２０〜３０分間室温でプレートをインキュベートした。（１２）５％のＣＯ２の充填を備える３７℃のインキュベーターにプレートを４〜５時間置いた。
【０１９２】
Ｂ毒素の調製：（１）原液（４０９．６μｇ／ｍｌ）を２００ｐｇ／ｍｌに希釈することにより、Ｂ毒素オーバーレイを調製した。（２）原液を８０ｎｇ／ｍｌに希釈することにより、滴定用のＢ毒素を調製した。（３）原液の希釈は、表１２に示すように実施した。
【表１２】
2016501877.tif 000072
【０１９３】
試料の調製：効力を試験するために、すべてのモノクローナル抗体を表１３に示すように適切な濃度に調製した。
【表１３】
2016501877.tif 000073
【０１９４】
希釈プレートの調製−ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ
以下を、Ｕ底の９６ウェルプレートを使用して実施した。（１）４５μｌのアッセイ培地をウェルＢ３〜Ｈ９、およびＣ１０〜Ｄ１１に添加した。（２）１００μｌの培地をウェルＢ１０〜１１に添加した。（３）以下の表１４に示すように、５０μｌの希釈したｍＡｂ（１０−６Ｍまたは３００μｇ／ｍｌ）を対応するウェルＢ２〜Ｈ２に添加した。（４）列２から５μｌを移して列３に添加し、混合して列９まで反復し、列９から５μｌを廃棄することにより各試料を１０倍段階希釈した。（５）４５μｌの希釈したＢ毒素（２００ｐｇ／ｍｌ）をＣ１０、１１に添加し、４５μｌの希釈した単離培養上清（表１１）をＤ１０、１１に添加した。（６）希釈した単離物１培養上清（表１１）をウェルＢ２〜Ｈ９に添加した。（７）プレートを、均一になるまで振盪機上で振盪した。（８）５％のＣＯ２と３７℃で６０分間インキュベートした。表１３は、ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅの希釈プレートのレイアウトを示す。
【表１４】
2016501877.tif 000074
【０１９５】
細胞プレートへの試料の添加：（１）インキュベーションが完了した後、細胞および希釈プレートをインキュベーターから取り出した。（２）希釈プレートから５０μｌの試料を細胞プレートの適切なウェルに移した。（３）５％のＣＯ２充填下３７℃で７２時間インキュベートした。
【０１９６】
データ解析：（１）７２時間の時点でのプレートのデータを、Ｓｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏ  （ｖ．５．４）ソフトウェアを使用して、各個々の試料について４‐パラメータロジスティック（４‐ＰＬ）曲線に合わせた。（２）標準および試料の曲線を制約し（上部／下部の漸近線、および勾配）、かつ、標準のＩＣ５０値を、試料のＩＣ５０で除算し、効力評価を決定した（適用可能な場合）。
【０１９７】
結果
図２６は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ臨床単離物の毒性を中和するため、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞で産生したヒト化ＣＡＮ４６Ｇ２４、ＣＡＮ４６Ｇ１３ａ、およびＣＡＮ４６Ｇ１９変異体の能力を示す、各ｍＡｂについでのＥＣ５０データをまとめた。棒グラフは、特異的なＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ臨床単離物に対する各ｍＡｂのＥＣ５０を示す。単離物は、１つの参照株（ＡＴＣＣ４３２５５）および３つの超毒性（ｈｙｐｅｒｖｉｒｕｌｅｎｔ）０２７株（ＢＩ−１、ＢＩ−６、およびＢＩ−１７）を含む９つの代表的な臨床単離物を含む。ＥＣ５０は、各臨床単離物に対して、各ｍＡｂで異なる。一般的に、ヒト化ＣＡＮ４６Ｇ２４およびＣＡＮ４６Ｇ１９  ｍＡｂは非ＮＡＰＩ株を中和し、対してヒト化ＣＡＮ４６Ｇ１３ａ  ｍＡｂはＮＡＰ１株に対してより有効であった。
【０１９８】
実施例２０：Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｂ１胞子を用いた、ハムスターの胃腸性一次感染モデルにおけるヒト化Ｂ毒素ｍＡｂの有効性
感染する前の４日間のそれぞれの日に、高用量（５０ｍｇ／ｋｇ体重）または低用量（２０ｍｇ／ｋｇ体重）のいずれかで抗Ａ毒素および抗Ｂ毒素のｍＡｂを、ハムスターのグループに４回注射した。抗体注射の３日目に、ハムスターに、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ胞子感染を高めるよう腸の細菌叢を排除するために、１０ｍｇ／ｋｇ（体重）のクリンダマイシンも与えた。抗体注射の最終日と同時に、ハムスターに、１４０Ｂ１胞子を胃中に与え、２日ごとの体重の記録に加え、臨床徴候および生存を、２２日間、１日に２回記録した。感染から２２日後に、すべての生存しているハムスターを安楽死させ、収集した血清を、抗毒素抗体レベルについて、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ（登録商標）ＭＡＧＰＩＸ（商標）複合アッセイによりアッセイした。完全な実験手法については表１５を参照し、ハムスターの各グループに与えた注射については表１６を参照されたい。
【０１９９】
生存、臨床徴候および体重の生データを、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアにより解析した。血清を、抗体を注射する前（３日目）にすべての動物で収集し、２２日目に生存するすべてのハムスターで収集した。血清試料を、注射した毒素特異的抗体に関して、Ｍａｇｐｌｅｘにより解析した。
【表１５】
2016501877.tif 000075
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【表１６】
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【０２００】
結果：
ハムスターを、１１７ＣＦＵ／動物でＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｂ１胞子に感染させ、２２日間、１日に２回観察した。ＣＨＯベースの構築物を発現したＣＨＯＫ１ＳＶから精製した抗ＴｃｄＡおよびＴｃｄＡＢ  ｍＡｂを、感染の前に３、２、および１日間、５０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇで１日に１回投与し、および感染の当日０日目に胞子と共に投与した。Ｂ１胞子および生存率の検証を、Ｂ１胞子の接種材料の段階希釈をブレインハートインフュージョン＋０．１％タウロコール酸塩（ＢＨＩ−Ｔ）アガー上に配置して４８時間嫌気チャンバ内でインキュベートすることにより実施し、感染の間１１７ＣＦＵ／ハムスターに投与されたことを確認した。図２７は、ハムスターの一次感染モデルからの生存データを示す。５匹の対照ハムスター（グループＡ；処置なし）のうち４匹が感染から４８時間以内に死亡し、第５のハムスターが胞子を投与してから９６時間後に死亡したことから、感染が確立していたことが示唆される。抗体で処置した動物（グループＢ〜グループＥ）では、最終的な生存率は４０％〜８０％超で可変であり、対照のグループＡ（抗体処置なし）と顕著に異なることから、毒素特異的な抗体処置の保護的な機能が示唆される。ｍＡｂで処置したハムスターの生存率は、用量依存性および供給源依存性であることがわかった。グループＢ（ＣＤＡ１／ＭＤＸ−１３８８  ５０ｍｇ／ｋｇ）由来の７匹のハムスターのうち３匹が感染症により死亡し（１匹は感染後日数（DAI）２日に死亡し、別の２匹は１３ＤＡＩに死亡した）、一方でグループＣ（ＨｅＣａｎ２０Ｇ２／ＨｕＣＡＮ４６Ｇ２４  ５０ｍｇ／ｋｇ）由来の７匹のハムスターの１匹のみが、実験期間中の１２日目に感染症により死亡した。低用量（２０ｍｇ／ｋｇ）の処置グループでは、グループＤ（ＣＤＡ１／ＭＤＸ−１３８８）の８匹の動物のうち５匹が死亡し、グループＥ（ＨｅＣａｎ２０Ｇ２／ＨｕＣＡＮ４６Ｇ２４）処置グループでは８匹のハムスターのうち４匹が死亡した。ＣａｎｇｅｎｅｍＡｂのＨＥＣＡＮ２０Ｇ２およびｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４は、５０ｍｇ／ｋｇの用量で有効であり、１２日後では１００％が生存し、２２日後では８０％が生存していた。この組み合わせはまた２０ｍｇ／ｋｇの用量でも有効であり、１６日後で１００％が生存し、２０日後で６０％が生存した。したがって、等量の用量では、ＨｅＣａｎ２０Ｇ２／ＨｕＣＡＮ４６Ｇ２４処置は、ＣＤＡ１／ＭＤＸ−１３８８処置と比較してより多くの生存をもたらし、その一方、同一供給源のｍＡｂでは、より高い用量がより高い／より長い生存率と相関した。
【０２０１】
図２８Ａは、感染後すべてのグループの平均体重（ＢＷ）が減少し、一次感染モデルの処理の過程中に回復することを示す。グループＢ（ＣＤＡ１／ＭＤＸ−１３８８  ５０ｍｇ／ｋｇ）のＢＷは、１３ＤＡＩまでに本来のベースラインＢＷの５５％に減少した。グループＣ（ＨｅＣａｎ２０Ｇ２／ＨｕＣＡＮ４６Ｇ２４  ５０ｍｇ／ｋｇ）では、ＢＷは感染後７３％に減少し、８ＤＡＩまでに回復が始まり、１６ＤＡＩまでにベースラインＢＷの８７％に達し、かつ約９０％で安定し続けた。２０ｍｇ／ｋｇの処置グループでは、グループＤ（ＣＤＡ１／ＭＤＸ−１３８８）およびグループＥ（ＨｅＣａｎ２０Ｇ２／ＨｕＣＡＮ４６Ｇ２４）の両方のＢＷは、ベースラインの６５％に減少し、その後回復し始めた。実験の最後では、グループＤの動物のＢＷは、本来の体重の８５％に達し、一方グループＥのＢＷは本来のベースラインのＢＷの８０％に達した。
【０２０２】
図２８Ｂは、処置済のグループ（グループＢ、Ｃ、Ｄ、およびＥ）における、２２日目に生存しているハムスターの血清中の毒素ｍＡｂの濃度を示す。感染後（２２日目）のハムスターの血清試料は、８．８３μｇ／ｍｌ〜３０８．７２μｇ／ｍｌの間の濃度の抗Ａ毒素ＩｇＧ抗体を示した。抗Ｂ毒素ＩｇＧ抗体の濃度は、８．９２μｇ／ｍｌ〜８５．１１μｇ／ｍｌの範囲であった。
【０２０３】
この試験からの結果は、両方の用量レベル（５０ｍｇ／ｌｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ）でのヒト化ＨｅＣａｎ２０Ｇ２／ＨｕＣＡＮ４６Ｇ２４の組み合わせを用いたＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｂ１感染済ハムスターの処置は、感染後のおよびその後の再発の疾患からハムスターを有効かつ強力に保護し、ＣＤＡ１／ＭＤＸ−１３８８で処置したハムスターと比較して長期間生存を改善したことを示す。
【０２０４】
実施例２１：Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ臨床単離物に対するＰｅｒ．Ｃ６ベクター由来のヒト化ｍＡｂの特徴づけ
Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ上清の濃度
Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを、ヒトでＣＤＩを引き起こすと知られている細胞株を含む、様々な細胞株を表すのに選択した（ＰＦＧＥによるＮＡＰ１）。これらの細胞株由来のＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌を、ＴＹブロス（２００ｍｌ）中で、３５℃で４日間嫌気チャンバ内で増殖させた。細菌懸濁物を遠心によりペレット化し、残存する胞子および増殖細胞を除去するために上清を濾過した（０．２２μｍ）。上清を濃縮して（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ７０ｐｌｕｓ）、硫酸アンモニウムで沈殿させた。スラリーを、４℃で１０〜１２時間ゆっくりと撹拌することにより混合し、遠心した。結果として得られるペレットを、Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌで５回洗浄し、残存する硫酸アンモニウムを除去した。結果として得られる毒素を、上記のようにＣｅｎｔｒｉｃｏｎにより濃縮し、試験するまで４〜８℃で保存した（Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌ中で）。
【０２０５】
ＥＬＩＳＡ‐Ｂ毒素決定、サンドイッチＥＬＩＳＡ
この試験の全てのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株は、ＣＦ２（Ａ−Ｂ＋）を除き、Ａ毒素およびＢ毒素の両方（Ａ＋Ｂ＋）を産生する。サンドイッチＥＬＩＳＡを、臨床単離株由来の濃縮上清中のＢ毒素の濃度を決定するために実施した。マイクロタイタープレートを、１μｇ／ｍｌの試験物質（様々なｍＡｂ）でコーティングした（４℃で１６時間）。コーティング後、過度の捕捉ｍＡｂを除去し、プレートをブロッキングした（５％のミルク、３７℃で１時間）。ブロッキング試薬を廃棄してプレートを洗浄した（ＰＢＳＴで３回）。希釈した標準物質および濃縮物（２．５％のミルク中）をプレートに添加し、インキュベートした（３７℃で１時間）。標準物質／試料を除去し、プレートを洗浄し、検出抗体（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ａｂ）（Ｂ毒素に対するウサギｐＡｂ）を添加した（３７℃で１時間）。検出抗体を除去し、プレートを洗浄し、コンジュゲート抗体（抗ウサギＨＲＰ）を添加した（３７℃で１時間）。コンジュゲートを除去し、洗浄した後、基質（ＴＭＢ）を添加して発色させた。反応を１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を用いて停止させた。プレートを４５０ｎｍで読み取った。ＳｏｆｔＭａｘにより解析を行った。
【０２０６】
直接ＥＬＩＳＡ―交差反応性ＥＬＩＳＡ
さらに、臨床単離株とのヒト化ＣＡＮ４６ｍＡｂの交差反応性を試験するために直接ＥＬＩＳＡを実施した。マイクロタイタープレートを、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ濃縮物でコーティングした（４℃で１６時間）。コーティング後、過度の濃縮物を除去し、プレートをブロッキングした（５％のミルク、３７℃で１時間）。ブロッキング試薬を廃棄し、プレートを洗浄した（ＰＢＳＴを用いて３回）。希釈した抗体（ウサギｐＡｂ、マウスおよびヒト化ｍＡｂ、２．５％のミルク中）をプレートに添加し、インキュベートした（３７℃で１時間）。抗体を除去し、プレートを洗浄した。適切なコンジュゲートを添加した（抗ウサギ、抗マウス、および抗ヒト、３７℃で１時間）。コンジュゲートの除去および洗浄の後、基質（ＴＭＢ）を添加し、発色させた。反応を１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を用いて停止させた。プレートを４５０ｎｍで読み取った。
【０２０７】
中和アッセイ−ＣＴ２６細胞
ＲＰＭＩ−１６００培地中でＣＴ細胞を増殖させ（１０％のＦＢＳ、３７℃、５％  ＣＯ２を用いる）、３×１０４細胞／ウェルでプレーティングし、プレートに付着させた（〜３時間）。使用した毒素濃度／希釈物は細胞傷害性試験の間に予め決定した（％生存率）。毒素および抗体調製物を混合して（１：１）インキュベートした（室温で１時間）。細胞付着後、ＣＴ‐２６細胞プレートから培地を除去し、１００μｌの各毒素／抗体混合物をＣＴ‐２６プレートに添加した。プレートを〜４８時間インキュベートした（３７℃、５％のＣＯ２）。インキュベート後、プレートを、細胞の球形化（ｃｅｌｌ  ｒｏｕｎｄｉｎｇ）を決定するために観察した。細胞の生存率に関して、１０μｌ／ウェルのＷＳＴ‐１を各ウェルに添加してさらにインキュベートした（３７℃で１時間、５％のＣＯ２）。プレートを４４０ｎｍで読み取り、細胞対照と比較することにより％生存率を解析した。
【０２０８】
結果：Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株由来の濃縮した毒素をプレートにコーティングし、ｍＡｂはコーティング毒素と結合した。コーティングした毒素に対する結合を以下のように定義した：
高い結合＝ＯＤ＞０．８００、中程度の結合＝ＯＤ＜０．８００かつ＞０．２００、低い結合＝ＯＤ＜０．２。
図２９は、全てのｍＡｂが参照細胞株ＡＴＣＣ４３２５５に対し高い結合を示したことを示す。ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａは、試験した臨床株を通して低レベルより上の最大の結合を示した。一般的にＴｃｄＢフラグメント１に結合する抗体は、ＴｃｄＢフラグメント４結合ｍＡｂと比較して、単離毒素への良好な結合を示した。これらの応答を標準化するために、ウサギのｐＡｂ（ｒｐＡｂ）と比較した免疫反応性を以下のように行った：
試験したｍＡｂのＯＤ×１００／ｒｐＡｂのＯＤ。ＣＡＮ４６Ｇ２４およびＣＡＮ４６Ｇ１３ａに関する両方の変異体（Ｈｕおよびｒｅｈｕ）が、異なるＣ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅＢ毒素に対して免疫反応性であった。サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して同様の解析を実施した際、異なる臨床単離物由来のＢ毒素は異なる程度に免疫反応性であった（図３１）。図３１は、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ  ｍＡｂおよびＰｒｏｇｅｎｉｃｓ  ｍＡｂが、試験したすべてのＮＡＰＩ株と同様の結合特性を示したことを示す。ｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４  ｍＡｂおよびＭｅｄａｒｅｘ  ｍＡｂは、試験したすべての株と同様の結合特性を示した。２つのＥＬＩＳＡ法の間の相関を示すために、ピアソン相関により結果を解析した。いくつかのｍＡｂの相関および有効数字（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｖａｌｕｅ）が表１７に表されている。
【表１７】
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ｒ値＞０は、２つのＥＬＩＳＡの結果の間での正の関係を示す。ｐ値≦０．０５は、結果の間に統計的に有意な相関が存在することを示す。ｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４、ｈｐＡ４１ＢおよびＭＤＸ−１３８８では、ピアソン相関は正でありかつ統計的に有意である。ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａでは、相関は正であるが統計的に有意ではなかった。まとめると、このことは、いずれかの方法で、異なる臨床単離物にわたるＴｃｄＢ：抗ＴｃｄＢ相互作用を相対的に決定できることを示唆している。Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ濃縮物はＡ毒素およびＢ毒素の両方を含むため、濃縮物が中和実験に使用される際に、Ａ毒素ｍＡｂ（ＨＥＣＡＮ２０Ｇ２）が、試験されているＢ毒素ｍＡｂと組み合わされて、ＴｃｄＡの細胞傷害活性をクエンチした。モノクローナル抗体濃度は、１０μｇ／ｍｌ〜０．８μｇ／ｍｌで試験され、各抗体濃度で％中和を計算した。応答を標準化するために、５〜０．１６ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ濃度の間の平均％中和を計算して、試験したｍＡｂの有効性のランクを付けるために使用した。これらは、図３０において例示的に示される。ＨＥＣＡＮ２０Ｇ２／ｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４はＢ１を中和したが、ＮＡＰ１株（ＢＩ−１、ＢＩ−６、ＢＩ−１７）に対する保護は低減した。対照的に、ＨＥＣＡＮ２０Ｇ２／ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａは逆の傾向を示した；試験した非ＮＡＰＩ株（Ｂ１）に対する保護が低減したがＢＩ−１、ＢＩ−６およびＢＩ−１７を中和した。ＨＥＣＡＮ２０Ｇ２を競合物質抗Ｂ毒素の候補（ｈｐＡ４１またはＭＤＸ１３８８）と組み合わせた場合、競合物質の組み合わせのみ（ＰｒｏＡ／ＰｒｏＢ、ＭＤＸＡ／ＭＤＸＢ）と比較して優れた中和が観察された。
【０２０９】
図３２では、非ＮＡＰ１株に対する免疫反応性が、Ｂ毒素に対するウサギポリクローナルと比較したパーセントとして提示される。試験した６つのｍＡｂは、ＡＴＣＣ参照株に対する高い免疫反応性および株Ｊ９、ＣＦ２、Ｒ２３に対する低い免疫反応性を示した。大部分のｍＡｂは、Ｂ１、Ｋ１４およびＹ２に対して弱い結合を示したが、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａは、Ｂ１およびＹ２に対する高い免疫反応性およびＫ１４に対する中程度の免疫反応性を示した。
【０２１０】
図３３では、ＮＡＰ１株に対する免疫反応性を、Ｂ毒素に対するウサギポリクローナルと比較した％として提示する。ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ  ｍＡｂおよびＰｒｏｇｅｎｉｃｓ  ｍＡｂは、試験したすべての株に対して高い免疫反応性を示した。試験した他のｍＡｂ、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４、ｒｅｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａ、およびＭｅｄａｒｅｘのｍＡｂは、試験したすべての株に対して弱い免疫反応性を示した。
【０２１１】
まとめると、４つの試験したｍＡｂは、試験したすべての細胞株に対し類似する結合特性を示した。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株Ｊ９由来の毒素に対する結合性は、ｍＡｂを通して最も多様であり、ｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａは最も弱い結合を示した。
【０２１２】
実施例２２：ヒト化Ｃ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素ｍＡｂの産生
ヒト化Ｃ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素ｍＡｂの産生のために、重鎖および軽鎖をコードする個々のＩｇＧ配列を、Ｋｏｚａｋ／ＨＡＶＴ２０リーダー配列およびターミネーターを含むプロモーターの制御下のベクターに共発現させる。イントロン／エクソン配列を各可変配列の３´末端に追加し、その後ろに転写翻訳の終結を示すための２重のストップコドンを追加した。κ軽鎖では、これは１つのイントロン／エクソン（定常エクソン）を含んだ。重鎖では、これはイントロン／エクソンの４つの組（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３定常エクソン）を含んだ。イントロンは、真核生物のｍＲＮＡ転写処理を可能にするために配列に含まれた。発現構築物は、リポフェクタミンによる一過性のトランスフェクションに適合された哺乳類細胞株（ＨＥＫ２９３Ｆ、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯＫ１ＳＶ、Ｐｅｒ．Ｃ６）での一過性の発現に使用してもよい。発現ベクターはまた、エレクトロポレーションを使用して、哺乳類細胞培養での安定した発現を可能にするために、各発現システムにとって適切な選択可能マーカを含んだ。比較解析を必要とする実験では、ｍＡｂを、ＣＤＡ１（３Ｄ８  κ鎖  ＧｅｎＢａｎｋ  寄託番号  ＤＪ４４４５２５；重鎖  ＧｅｎＢａｎｋ  寄託番号  ＣＳ４８３８２３）、ＭＤＸ−１３８８（１２４−１５２  κ鎖  寄託番号  ＣＳ４８３８４６、重鎖  ＣＳ４８３８４２）をコードする公開された配列、ならびに国際特許公開公報第２０１１１３０６５０(Ａ２)号からのｈｐＡ４１およびｈｐＡ５０配列から合成した。重鎖および軽鎖を合成し、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ、ＨＥＫ２９３Ｆ、Ｐｅｒ．Ｃ６系での発現のために、完全長ＩｇＧ１ベクター中にクローン化した。ＩｇＧ１  ｍＡｂを発現させ、上記に概略するように精製して、ＨｅＣＡＮ２０Ｇ２については抗ＴｃｄＡ活性（ＣＤＡ１、ＴｃｄＡフラグメント４に対して特異的）に関する陽性対照、またはＣＡＮ４６Ｇ１３aについてはフラグメント１（ｈｐＡ４１）に対して特異性を有する抗ＴｃｄＢ活性に関する陽性対照、またはＣＡＮ４６Ｇ２４、ＣＡＮ４６Ｇ１９、およびＣＡＮ４６Ｇ４についてはフラグメント４（ＭＤＸ−１３８８）に対して特異性を有する抗ＴｃｄＢ活性に関する陽性対照として用いた。一過性の遺伝子導入の後に、上清をデカントし、濾過（０．２２μｍ）し、ｓｔｉｒ−ｃｅｌ濃縮装置および３０ｋＤａ膜を使用して濃縮した。濃縮物を、精製前に濾過した（０．２２μｍ）。安定した遺伝子導入のために、クローンをスクリーニングし、バッチ培養法および流加培養法における評価のために単離した。上清を濃縮して濾過し、IgGをタンパク質Ｇカラム上で精製し、バッファーを交換して濃縮した、最終的な濃縮物のため、タンパク質含量を、ＢＣＡアッセイにより、またはヒトＩｇＧ等価物の標準曲線に対するタンパク質Ａバイオセンサを備えたＯｃｔｅｔ  ＱＫｅ器具を用いて決定した。
【０２１３】
結果：表１８は、一過性および安定した遺伝子導入におけるｈｕＣＡＮ４６Ｇ２４およびｈｕＣＡＮ４６Ｇ１３ａの代表的な発現を示す。これらの平均値から、物質を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ特徴付けおよびｉｎ  ｖｉｖｏ解析を行うために供給した。
【表１８】
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【０２１４】
本発明の特定の態様を記載および例示してきたが、このような態様は、本発明の例示として考慮され、かつ、添付する特許請求の範囲にしたがって構築されるため、本発明を限定するものではない。この明細書に引用されるすべての公開および特許出願公報は、特定してかつ個々に、すべての目的のため参照により援用されるものとして表される。上記の発明が、理解を明確にする目的のために、例示および実施例の方法により、いくらか詳細に記載されているが、特定の変化および改変が、添付される特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなくなされることは、本発明の技術の観点から当業者に容易に理解されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３４−３】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３５−３】
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【図３６】
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【図３７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2016501877.tif 000130
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