(57)【要約】  本発明は、多量体複合体の会合を促進する修飾重鎖IgG定常領域を有する抗体または融合タンパク質に関する。抗体または融合タンパク質単位内に、２個の重鎖が存在し、各々少なくともCH2領域およびCH3領域を含む。２個の重鎖は、単位内での重鎖のカップリングを促進するための相補的修飾(例えば、ノブとホール)を担持する。単位内の唯一の重鎖が、そのＣ末端でホモ多量体化ペプチドに融合する。ホモ多量体化ペプチドの存在は、単位間の会合を促進する。例えば、ホモ多量体化ペプチドがホモ三量体化ペプチドであるならば、３個の単位の会合が促進され、三量体複合体が形成される。
2016532692.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
互いにヘテロ二量体として会合する第一重鎖定常領域および第二重鎖定常領域を含み、各鎖がIgG CH2領域およびCH3領域を含み、一方の鎖がCH3領域のＣ末端に結合したホモ多量体化ペプチドを含む、抗体または融合タンパク質。
【請求項２】
ホモ多量体化ペプチドが三量体化ペプチドである、請求項１に記載の抗体または融合タンパク質。
【請求項３】
ホモ多量体化ペプチドが二量体化ペプチドである、請求項１に記載の抗体または融合タンパク質。
【請求項４】
モ多量体化ペプチドが四量体化ペプチドである、請求項１に記載の抗体または融合タンパク質。
【請求項５】
ホモ多量体化ペプチドが五量体化ペプチドである、請求項１に記載の抗体または融合タンパク質。
【請求項６】
第一および第二重鎖定常領域と融合した第一および第二重鎖可変領域ならびに第一および第二重鎖と結合した第一および第二軽鎖をさらに含む抗体である、請求項１〜５のいずれかに記載の抗体または融合タンパク質。
【請求項７】
さらに第一および第二重鎖定常領域に融合した第一および第二異種タンパク質を含む二量体型融合タンパク質である、請求項１〜５のいずれかに記載の抗体または融合タンパク質。
【請求項８】
異種タンパク質が受容体の細胞外ドメインおよび／または受容体に対するリガンドである、請求項７に記載の抗体または融合タンパク質。
【請求項９】
第一および第二定常領域がさらにIgGヒンジ領域を含み、異種タンパク質が１個以上の、Gly-Gly-Ala-Alaのような可動性リンカーを経て、定常領域の第一および第二定常領域のIgGヒンジ領域に結合する、請求項７または８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
第一および第二重鎖がヘテロ二量体の形成を促進する修飾を天然IgG配列に組み込む、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体または融合タンパク質。
【請求項１１】
第一重鎖がホール、第二重鎖ノブを組み込み、ここで、ノブのホールへのカップリングがヘテロ二量体の形成を促進する、請求項１０に記載の抗体または融合タンパク質。
【請求項１２】
各第一および第二重鎖がヒトIgG1 CH2領域およびCH3領域を含み、第一重鎖がT366S変異、L368A変異およびY407V変異を有し、第二重鎖がT366W変異を有し、アミノ酸はEU番号付け規約に従い番号付けしている、請求項１１に記載の抗体または融合タンパク質。
【請求項１３】
ホモ多量体化ペプチドが第二重鎖のCH3ドメインに結合する三量体化ペプチドである、請求項１２に記載の抗体または融合タンパク質。
【請求項１４】
三量体化ペプチドがイソロイシンジッパーまたはTNFスーパーファミリーメンバーもしくはテトラネクチンの細胞外ドメインを含む、請求項１４に記載の抗体または融合タンパク質。
【請求項１５】
第一および第二重鎖可変領域が同一である、請求項６に記載の抗体または融合タンパク質。
【請求項１６】
第一および第二重鎖可変領域が異なる、請求項６に記載の抗体または融合タンパク質。
【請求項１７】
第一および第二重鎖可変領域が異なる標的に結合する複数抗体由来である、請求項１６に記載の抗体または融合タンパク質。
【請求項１８】
第一および第二軽鎖が同一である、請求項６に記載の抗体または融合タンパク質。
【請求項１９】
第一および第二軽鎖が異なる軽鎖可変領域を有する、請求項６に記載の抗体または融合タンパク質。
【請求項２０】
第一および第二軽鎖が異なる標的に結合する複数抗体由来の異なる軽鎖可変領域を有する、請求項１９に記載の抗体または融合タンパク質。
【請求項２１】
ホモ多量体化ペプチドが、三単位の抗体または融合タンパク質がこれら単位の三量体化ペプチドの会合により三量体を形成する三量体化ペプチドである、請求項１、２および６〜２０のいずれかに記載の抗体または融合タンパク質。
【請求項２２】
ホモ多量体化ペプチドが、抗体または融合タンパク質の２個の単位が該単位の二量体化ペプチドの会合により二量体を形成する二量体化ペプチドである、請求項１、３および６〜２０のいずれかに記載の抗体または融合タンパク質。
【請求項２３】
ホモ多量体化ペプチドが、四単位の抗体または融合タンパク質がこれら単位の四量体化ペプチドの会合により四量体を形成する四量体化ペプチドである、請求項１、４および６〜２０のいずれかに記載の抗体または融合タンパク質。
【請求項２４】
ホモ多量体化ペプチドが、五単位の抗体または融合タンパク質がこれら単位の五量体化ペプチドの会合により五量体を形成する五量体化ペプチドである、請求項１および５〜２０のいずれかに記載の抗体または融合タンパク質。
【請求項２５】
六単位の本抗体または融合タンパク質がこれら単位の六量体化ペプチドの会合により六量体を形成する六量体形態である、請求項１および６〜２０のいずれかに記載の抗体または融合タンパク質。
【請求項２６】
各単位がヘテロ二量体として互いに会合した第一および第二重鎖定常領域を含み、各鎖がIgG CH2領域およびCH3領域を含み、鎖の一方がCH3領域のＣ末端に結合した三量体化ペプチドを含み、ここで、単位は単位上の三量体化ペプチドの三量体化により三量体複合体として会合する、三単位の抗体または融合タンパク質を含む三量体複合体。
【請求項２７】
三単位の各々が第一および第二重鎖定常領域と融合した第一および第二重鎖可変領域ならびに第一および第二重鎖と結合した第一および第二軽鎖をさらに含む抗体である、請求項２６に記載の三量体複合体。
【請求項２８】
各単位がヘテロ二量体として互いに会合した第一および第二重鎖定常領域を含み、各鎖がIgG CH2領域およびCH3領域を含み、鎖の一方がCH3領域のＣ末端に結合した多量体化ペプチドを含み、ここで、単位は、単位の多量体化ペプチドの多量体化により多量体複合体として会合する、複数単位の抗体または融合タンパク質を含む多量体複合体。
【請求項２９】
IgG CH2領域およびCH3領域がヒトIgGである、請求項１〜２８のいずれかに記載の抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体。
【請求項３０】
さらにヒトIgG CH1およびヒンジ領域を含む、請求項１〜２９のいずれかに記載の抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体。
【請求項３１】
ヒトIgG CH1およびヒンジ(存在するならば)、CH2領域およびCH3領域がヒトIgG1である、請求項２９または３０に記載の抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体。
【請求項３２】
ヒトIgG CH1およびヒンジ(存在するならば)、CH2領域およびCH3領域がヒトIgG2である、請求項２９または３０に記載の抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体。
【請求項３３】
ヒトIgG CH1およびヒンジ(存在するならば)、CH2領域およびCH3領域がヒトIgG3である、請求項２９または３０に記載の抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体。
【請求項３４】
ヒトIgG CH1およびヒンジ(存在するならば)、CH2領域およびCH3領域がヒトIgG4である、請求項２９または３０に記載の抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体。
【請求項３５】
デスレセプターファミリータンパク質に特異的に結合し、該タンパク質を担持する細胞のアポトーシスを誘発する、請求項１〜３６のいずれかに記載の抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体。
【請求項３６】
デスレセプターファミリータンパク質がDR4またはDR5である、請求項３５に記載の抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体。
【請求項３７】
TNF受容体スーパーファミリータンパク質に特異的に結合し、該タンパク質を担持する細胞のアポトーシスまたは細胞分裂停止を誘発する、請求項１〜３４のいずれかに記載の抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体。
【請求項３８】
OX40、CD40、FAS、CD27、CD30、4-1BB、DR3、DR4、DR5、DR6、DcR1、DcR2、DcR3、RANK、OPG、Fn14、TACI、BAFFR、BCMA、HVEM、LNGFR、GITR、TROY、RELT、EDARまたはXEDARと特異的に結合し、刺激して、それにより免疫応答を刺激する、請求項１〜３４のいずれかに記載の抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体。
【請求項３９】
プロテインＧに特異的に結合し、プロテインＡに特異的に結合し、ADCC、CDCおよび／またはオプソニン作用を示す、請求項１〜３４のいずれかに記載の抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体。
【請求項４０】
存在するときはCH1領域ならびにヒンジ領域およびCH2領域およびCH3領域がヒトIgG1領域であり、該抗体または融合タンパク質がプロテインＧに特異的に結合し、そしてプロテインＡに特異的に結合する、請求項３５〜３９のいずれかに記載の抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体。
【請求項４１】
ADCC、CDCおよびオプソニン作用を示す、請求項４０に記載の抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体。
【請求項４２】
存在するときはCH1領域ならびにヒンジ、CH2領域およびCH3領域がヒトIgG2またはIgG4領域であり、該抗体または融合タンパク質はプロテインＧに特異的に結合し、そしてプロテインＡに特異的に結合する、請求項３５〜３９のいずれかに記載の抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体。
【請求項４３】
ヒト化、キメラ、ベニア化またはヒト抗体である、請求項１〜４２のいずれかに記載の抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体。
【請求項４４】
受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する、請求項１〜３４のいずれかに記載の抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体。
【請求項４５】
CD79a、CD30、DR5またはDR4に特異的に結合する抗体である、請求項４４に記載の抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体。
【請求項４６】
TNF-α受容体、LFA-3またはIL-1受容体の細胞外ドメインを含む融合タンパク質である、請求項１〜５、７〜１４または２０〜３４のいずれかに記載の抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体。
【請求項４７】
TRAILタンパク質を含む融合タンパク質またはその三量体複合体である、請求項１〜５、７〜１４または２０〜３４のいずれかに記載の抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体。
【請求項４８】
毒性部分にコンジュゲートしている、請求項１〜４７のいずれかに記載の抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体。
【請求項４９】
毒性部分が細胞毒性である、請求項４８に記載の抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体。
【請求項５０】
CD40、OX40、4-1BB、GITRまたはCD27に特異的に結合する抗体または融合タンパク質である、請求項１〜３４のいずれかに記載の抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体。
【請求項５１】
請求項１〜５０のいずれかに記載の抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体を含む、医薬組成物。
【請求項５２】
癌の処置法であって、癌を有するまたは癌のリスクがある患者に請求項１〜５１のいずれかに記載の抗体もしくは融合タンパク質またはその三量体もしくは多量体複合体を有効なレジメで投与することを含む、方法。
【請求項５３】
免疫学的障害の処置法であって、該障害を有するまたは該障害のリスクがある患者に請求項１〜５２のいずれかに記載の抗体もしくは融合タンパク質またはその三量体もしくは多量体複合体を有効なレジメで投与することを含む、方法。
【請求項５４】
ａ. 細胞を請求項１〜５３のいずれかに記載の第一および第二重鎖をコードする１個または複数個のベクターでトランスフェクトし、ここで、抗体または融合タンパク質単位が発現され、複数単位の多量体化ペプチドの会合により多量体複合体に集合し；
ｂ. 該細胞培養から抗体および／または融合タンパク質の多量体複合体を単離する
ことを含む、抗体および／または融合タンパク質の多量体複合体の製造法。
【請求項５５】
第一および第二重鎖が異なるベクターによりコードされる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
多量体複合体が三量体複合体であり、多量体化ペプチドは三量体化ペプチドである、請求項５４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本出願は非仮出願であり、２０１３年８月２日に出願した６１／８６１,９２８号出願に基づく優先権を主張し、引用によりその全体をあらゆる目的で本明細書に包含させる。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、２０１４年７月２３日に作製し、引用により本明細書に包含させた９９kbの448627SEQLISTなる名称のテキストファイルに記載した配列を含む。
【背景技術】
【０００３】
背景
抗体は、免疫系において必須の役割を演ずるＢ細胞により産生される糖タンパク質である(Schroeder et al., J. Allergy Clin. Immunol. 125:S41-S52, 2010)。５群の抗体、すなわちIgM、IgD、IgG、IgAおよびIgEが哺乳動物で産生される。ヒトでは、４サブクラスのIgG抗体(IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4)および２サブクラスのIgA抗体(IgA1およびIgA2)が産生される。各抗体は、単量体型で２個の同一軽鎖および２個の同一重鎖からなる。これら４個の鎖は、共有結合と非共有結合の組み合わせにより互いに連結され、Ｙ字型分子を形成する。哺乳動物にはκおよびλの２タイプの軽鎖がある。数種の異なるタイプの重鎖が存在し、これが抗体のクラスを規定する。ヒトにおいて、μ重鎖がIgMに、δ重鎖がIgDに、γ１重鎖がIgG1に、γ２重鎖がIgG2、γ３重鎖がIgG3に、γ４重鎖がIgG4に、α１重鎖がIgA1に、α２重鎖がIgA2に、そしてε重鎖がIgEに組み込まれる。単量体型のこれらの抗体は２個の抗原結合部位を有し、それゆえに抗原結合については二価である。IgG、IgDおよびIgEは専ら単量体として産生されるが、IgMは、Ｊ鎖非存在下では六量体として産生され、ゆえに抗原結合について十二価であり、そしてＪ鎖が存在するとき十価の五量体を形成する(Gilmour et al., Trans. Med. 18:167-174, 2008)。IgAは、Ｊ鎖と共に四価の二量体を形成し、一方でIgAはＪ鎖非存在下では単量体であるが、Ｊ鎖を伴わない二量体型IgAの自然発生的形成が報告されている(Johansen et al., Scand. J. Immunol. 52:240-248, 2000)。
【０００４】
米国食品医薬品局は、２０１２年末までにヒト治療剤として３３種のモノクローナル抗体を承認している。これらの治療抗体全てがIgG抗体またはその誘導体である。特異的抗原結合以外に、IgG抗体は、Fc領域が介在する多様な生物学的機能を発揮する(Schroeder et al. supra; Desjarlais et al., Exp. Cell Res. 317:1278-1285, 2011)。ヒトにおいて、細胞結合性IgG1およびIgG3抗体は、Fc領域の、NK細胞上に発現されるFcγ受容体タイプIII(CD16)への結合により抗体依存性細胞傷害(ADCC)を介在する(Hulett et al., Adv. Immunol. 57:1-127, 1994)。同様に、細胞結合性IgG1およびIgG3抗体は、Fc領域と補体成分の相互作用により効率的に補体依存性細胞傷害(CDC)を誘発できる(Bindon et al., J. Exp. Med. 168:127-142, 1988)。
【０００５】
ヒトIgG抗体の全４サブグラスのFc領域は、膜貫通型α鎖およびβ２ミクログロブリンからなるヘテロ二量体である新生児Fc受容体(FcRn)に結合し、pH依存性に、ピノサイトーシスにより内在化されたIgG抗体のリソソームおける異化分解からの救出を生じ、それらの循環系への再循環を可能にする(Ghetie et al., Annu. Rev. Immunol. 18:739-766, 2000)。それゆえに、IgG抗体は循環系からのクリアランスが遅く、これにより、典型的にヒトで２３日の、長い血清半減期となる(Kindt et al., Chapter 4, Kuby Immunology, Sixth Edition, W. H. Freeman & Co., 2006)。さらに、IgG抗体のFc領域はプロテインＡ(IgG3以外)およびプロテインＧに結合し、その結果プロテインＡまたはプロテインＧ親和性クロマトグラフィーによるIgG抗体の精製が可能である(Andrew et al., Unit 2.7, Chapter III, Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc. 1997)。
【０００６】
細胞表面上の特異的分子の二量体化は、しばしば１種以上の生物学的応答を誘発できる。モノクローナルIgG抗体の、細胞表面上のPSMA(前立腺特異的膜抗原)タンパク質への結合は、PSMA内在化の割合を高める(Liu et al., Cancer Res. 58:4055-4060, 1998)。Ｉ型膜貫通型タンパク質MUC1の内在化および下方制御は、マウスIgG1抗体への結合により誘発される(Hisatsune et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 388:677-382, 2009)。c-Metに対するモノクローナル抗体は、細胞表面上のc-Metタンパク質を二量体化し、細胞増殖に至る細胞内シグナル伝達を開始する(Prat et al., J. Cell Sci. 111:237-247, 1998)。同様に、モノクローナル抗EPO受容体抗体は、表面上のEPO受容体のホモ二量体化により、細胞増殖のためのアゴニストとして機能できる(Schneider et al., Blood 89:473-482, 1997)。しかしながら、細胞表面上の、腫瘍壊死因子受容体(TNFR)スーパーファミリーの一員であるデスレセプター５(DR5)の抗体介在二量体化は、必ずしもシグナル伝達を誘発せず、一方、例えば、マウスモノクローナル抗DR5 IgG抗体とヤギ抗マウスIgGポリクローナル抗体の混合物によるDR5タンパク質の多量体化は、細胞質でシグナル伝達を誘発し、アポトーシスの引き金を引く(Griffith et al., J. Immunol. 162:2597-2605, 1999)。
【０００７】
IgM抗体は、Ｊ鎖があれば五量体として、そしてＪ鎖がなければ六量体として存在する(Gilmour et al., supra)。抗原を二量体化することのみが可能であるIgG抗体とは対照的に、IgMはその十価または十二価抗原結合能により、細胞表面タンパク質を多量体化できる。TNFRスーパーファミリー(Cosman, Stem Cells 12:440-455, 1994)の一員であるFasに対する特異性を有するモノクローナルIgM抗体は、表面上のFasタンパク質の多量体化により、Fas発現細胞のアポトーシスを効率的に誘発できるが(Yonehara et al., J. Exp. Med. 169:1747-1756, 1989)、一方抗Fas IgG抗体は、それらが架橋しない限り誘発しない(Matsuno et al., J. Rheumatol. 29:1609-1614, 2002)。IgGと比較して、FcRnとの結合ができないために、IgMの循環半減期ははるかに短く、典型的にヒトで５日である(Kindt et al., supra)。IgM抗体はまた、CD16への結合を欠くため、ADCCへの介在も不可能である。さらに、IgMによるプロテインＡおよびプロテインＧへの結合がないことにより、IgMをプロテインＡおよびプロテインＧ親和性クロマトグラフィーでそれぞれ精製することは不可能である(Gautam et al., Biotechnol. Adv. 29:84-849, 2011)。
【０００８】
新規形態の多価抗体を産生する試みにおいて、多様な構造形式が利用されている。多価抗体の操作における最近の進歩が、Cuesta et al.(Trends Biotech., 28:355-362, 2010)のレビュー文献に要約されている。好ましい多価IgG抗体は、細胞表面上で抗原を効率的に多量体化できる。ADCC、CDC、オプソニン作用、pH依存性FcRn結合ならびにプロテインＡおよびプロテインＧと結合する能力のような、γ重鎖のFc領域が介在する特性がこのような多価IgG抗体で維持されることも重要である。
【０００９】
多価IgG抗体を産生するために、Caron et al.(J. Exp. Med., 176:1191-1195, 1992)は、ヒト化抗CD33 IgG1／κ抗体であるHuG1-M195におけるヒトγ１重鎖のカルボキシル末端から四番目の位置のセリンからシステインへの置換を導入した。Hd-IgGと名づけられた、このように修飾されたHuG1-M195を精製し、架橋のためにエルマン試薬(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)で処理し、次いで過剰のスルフヒドリル部位を遮断した。単量体HuG1-M195を、フェニルセファロースカラムクロマトグラフィーによりHd-IgGから除去した。得られたHd-IgGは、CD33分子を内在化させる能力の劇的な改善を示し、ADCCおよびCDCでHuG1-M195より強力であった。Miller et al.(J. Immunol., 170:4854-4861, 2003)は、ヒト化抗HER2 IgG1モノクローナル抗体であるhu4D5の重鎖のVH-CH1領域の複製により、四価IgG抗体を構築した。修飾されたγ重鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向で、VH領域、CH1領域、VH領域、CH1領域、ヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域からなった。１個の軽鎖が修飾されたIgGにおける４個のVH-CH1領域に結合され、四価hu4D5抗体(TA-HER2)を形成した。TA-HER2は、HER2発現細胞上で親二価hu4D5より迅速に内在化した。Miller et al.(supra)はまた、TA-HER2と同じ重鎖形式で、TA-DR5と呼ばれる四価抗DR5 IgG抗体も構築した。TA-DR5は、親二価抗DR5 IgGモノクローナル抗体より〜１００倍低濃度でアポトーシスを誘発した。
【００１０】
Rossi et al.(Cancer Res., 68:8384-8392, 2008)は、Hex-hA20と名づけられた六価抗CD20 IgG抗体の、Dock-and-Lock法を使用する構築を報告した。６個のFab領域と２個のFc領域からなるHex-hA20を産生するために、２個の成分を構築し、哺乳動物細胞において別々に産生した。最初に、Ａ−キナーゼアンカータンパク質のアンカードメイン(AD)を、ヒト化抗CD20 IgG1抗体であるhA20における重鎖のカルボキシル末端と遺伝子融合させた。この構築物はCH3-AD2-IgG-hA20と呼ばれた。次に、サイクリックAMP依存性タンパク質キナーゼのドッキングドメイン(DDD)を、h20のFabフラグメントのカルボキシル末端と遺伝子融合させた。この構築物はCH1-DDD2-Fab-hA20と呼ばれた。CH3-AD2-IgG-hA20およびCH1-DDD2-Fab-hA20をそれぞれプロテインＡおよびタンパク質Ｌ親和性クロマトグラフィーで精製した。精製したCH3-AD2-IgG-hA20およびCH1-DDD2-Fab-hA20の酸化還元条件下の混合と、続くプロテインＡでの精製により、Hex-hA20を得た。Hex-h20は、架橋結合抗体を必要とせずにCD20発現Ｂリンパ腫細胞株の増殖を阻害した。Hex-h20はhA20のADCC活性を保持するが、CDC活性は失った。
【００１１】
Yoo et al.(J. Biol. Chem., 47:33771-33777, 1999)は、γ２重鎖の部分がヒトα１重鎖の対応する部分に置き換えられた、バリアントヒト抗DNS IgG2抗体を構築した。γγγ-αtpと名づけられた構築物において、αtp(別名α尾部)と呼ばれる、ヒトα１重鎖のＣ末端に存在する１８アミノ酸ポリペプチドを、ヒトγ２重鎖のＣ末端に結合した。γγγ-αtp構築物をさらに修飾して、次の３種のバリアントIgG2抗体を産生した。αγγ-αtpにおいて、γ２重鎖のCH1領域を、ヒトα１重鎖の対応部位で置き換えた。ααγ-αtpにおいて、CH1、ヒンジおよびCH2領域を、ヒトα１重鎖の対応部位で置き換えた。γαγ-αtpにおいて、ヒンジおよびCH2領域を、ヒトα１重鎖の対応部位で置き換えた。これらの構築物は、Ｊ鎖を産生するマウス骨髄腫細胞株Sp2／0で安定に発現された。精製されたγγγ-αtp、αγγ-αtp、ααγ-αtpおよびγαγ-αtp抗体の各々は、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体および六量体の混合物であった。混合物中の六量体と五量体の合計パーセンテージは、γγγ-αtpで２０％、αγγ-αtpで２５％、ααγ-αtpで４５％およびγαγ-αtpで３２％であった。
【００１２】
Sorensen et al.(J. Immunol. 156:2858-2865, 1996)は、第一、第二および第三ヒンジ領域が欠失した、ヒトモノクローナル抗NIP(３−ニトロ−４−ヒドロキシ−５−ヨードフェニル酢酸)IgG3抗体バリアントに基づく多価抗体を産生した。このバリアントIgG3抗体のγ３重鎖遺伝子は、二箇所で修飾された。第一に、μtp(別名μ尾部)と呼ばれる、ヒトμ重鎖のＣ末端に存在する１８−アミノ酸ポリペプチドを、重鎖のＣ末端に結合した。第二に、CH2領域の３０９位のロイシン残基をシステイン残基に変えた。IgGL309Cμtpと呼ばれる、このように修飾されたモノクローナルIgG3抗体を、Ｊ鎖を産生するマウス骨髄腫細胞株J558Lで発現させ、NIP−セファロースカラムを使用して精製した。分泌レベルは、親IgG3抗体よりもIgGL309Cμtpが低いと報告され、IgGL309Cμtpの大部分は細胞内に保持された。サイズ分析により、五量体および六量体が精製IgGL309Cμtpの８１％を占めることが示された。
【００１３】
Sorensen et al.(Int. Immunol., 12:19-27, 2000)はまた、γ３重鎖のCH2領域およびCH3領域を、ヒトμ重鎖の、μtpを含むCH3およびCH4領域で置き換えることによっても、上記と同じヒト抗NIP IgG3抗体バリアントを修飾した。IgG-Cμ3-Cμ4と呼ばれる、このように修飾されたIgG3／IgMハイブリッド分子の重鎖は、Ｎ末端から、抗NIP VH領域、CH1およびヒトγ３重鎖の四番目のヒンジ領域ならびにヒトμ重鎖のμtpを含むCH3およびCH4領域からなった。IgG-Cμ3-Cμ4を、Ｊ鎖を産生するJ558L細胞で発現させ、NIP−セファロースカラムを使用して精製した。六量体および五量体は、それぞれ、精製IgG-Cμ3-Cμ4の１４.０％および６６.７％を占めた。IgG-Cμ3-Cμ4がヒトγ３重鎖のCH2領域およびCH3領域を有しないため、ADCC、pH依存性FcRn結合およびプロテインＡおよびプロテインＧに結合する能力のようなFcγ介在特性を欠くであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Schroeder et al., J. Allergy Clin. Immunol. 125:S41-S52, 2010
【非特許文献２】Gilmour et al., Trans. Med. 18:167-174, 2008
【非特許文献３】Johansen et al., Scand. J. Immunol. 52:240-248, 2000
【非特許文献４】Desjarlais et al., Exp. Cell Res. 317:1278-1285, 2011
【非特許文献５】Hulett et al., Adv. Immunol. 57:1-127, 1994
【非特許文献６】Bindon et al., J. Exp. Med. 168:127-142, 1988
【非特許文献７】Ghetie et al., Annu. Rev. Immunol. 18:739-766, 2000
【非特許文献８】Kindt et al., Chapter 4, Kuby Immunology, Sixth Edition, W. H. Freeman & Co., 2006
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【非特許文献１０】Liu et al., Cancer Res. 58:4055-4060, 1998
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【非特許文献２３】Yoo et al., J. Biol. Chem., 47:33771-33777, 1999
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【非特許文献２５】Sorensen et al., Int. Immunol., 12:19-27, 2000
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
ADCC、CDC、オプソニン作用、長い血清半減期およびプロテインＡおよびプロテインＧへの結合のようなFcγ介在機能を失うことなく、TNF受容体ファミリーメンバーのような細胞表面タンパク質の効率的架橋結合により、アポトーシス、細胞分裂停止および／または細胞内シグナル伝達を誘発できる、多量体IgG抗体に対する要望がある(Hehlgans and Pfeffer, Immunol. 115:1-20, 2005; Mahmood and Shukla, Exp. Cell Res. 316:887-899, 2010)。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の要約
本発明は、互いにヘテロ二量体として会合する第一重鎖定常領域および第二重鎖定常領域を含み、各鎖がIgG CH2領域およびCH3領域を含み、一方の鎖がCH3領域のＣ末端に結合したホモ多量体化ペプチドを含む、抗体または融合タンパク質を提供する。本ホモ多量体化ペプチドは、例えば、二量体化ペプチド、三量体化ペプチド、四量体化ペプチドまたは五量体化ペプチドであり得る。本抗体または融合タンパク質は、第一および第二重鎖定常領域と融合した第一および第二重鎖可変領域ならびに第一および第二重鎖と結合した第一および第二軽鎖をさらに含む抗体であり得る。
【００１７】
本抗体または融合タンパク質は、さらに第一および第二重鎖定常領域に融合した第一および第二異種タンパク質を含む二量体型融合タンパク質であり得る。異種タンパク質は、受容体の細胞外ドメインおよび／または受容体に対するリガンドであり得る。第一および第二定常領域はさらにIgGヒンジ領域を含んでよく、異種タンパク質は、１個以上の、Gly-Gly-Ala-Alaのような可動性リンカーを経て、定常領域の第一および第二定常領域のIgGヒンジ領域に結合する。
【００１８】
いくつかの抗体または融合タンパク質において、第一および第二重鎖は、ヘテロ二量体の形成を促進する修飾を天然IgG配列に組み込む。例えば、第一重鎖がホール(hole)を、そして第二重鎖がノブ(knob)を組み込むことができ、ここで、ノブのホールへのカップリングがヘテロ二量体の形成を促進する。所望により、各第一および第二重鎖はヒトIgG1 CH2領域およびCH3領域を含み、第一重鎖はT366S変異、L368A変異およびY407V変異を有し、第二重鎖はT366W変異を有し、アミノ酸はEU番号付け規約に従い番号付けしている。所望により、三量体化ペプチドは第二重鎖のCH3ドメインに結合する。
【００１９】
ある抗体または融合タンパク質において、三量体化ペプチドは、イソロイシンジッパーまたはTNFファミリーメンバーもしくはテトラネクチンの細胞外ドメインを含む。
【００２０】
ある抗体において、第一および第二重鎖可変領域は同一であり、他のものにおいては第一および第二重鎖可変領域は異なる。ある抗体において、第一および第二重鎖可変領域は、異なる標的に結合する複数抗体由来である。ある抗体において、第一および第二軽鎖は同一であり、他のものにおいては異なり、例えば異なる標的に結合する複数抗体由来である。
【００２１】
上記抗体または融合タンパク質は、三単位の抗体または融合タンパク質が、これら単位の三量体化ペプチドの会合により三量体を形成する、三量体形態で存在できる。
【００２２】
上記抗体または融合タンパク質は、四単位の抗体または融合タンパク質が、これら単位の四量体化ペプチドの会合により四量体を形成する、四量体形態で存在できる。
【００２３】
上記抗体または融合タンパク質は、五単位の抗体または融合タンパク質が、これら単位の五量体化ペプチドの会合により五量体を形成する、五量体形態で存在できる。
【００２４】
本発明は、さらに、各単位がヘテロ二量体として互いに会合した第一および第二重鎖定常領域を含み、各鎖がIgG CH2領域およびCH3領域を含み、鎖の一方がCH3領域のＣ末端に結合した三量体化ペプチドを含み、ここで、これら単位が単位上の三量体化ペプチドの三量体化により三量体複合体として会合する、三単位の抗体または融合タンパク質を含む三量体複合体を提供する。所望により、三単位の各々は、第一および第二重鎖定常領域と融合した第一および第二重鎖可変領域ならびに第一および第二重鎖と結合した第一および第二軽鎖をさらに含む、抗体である。
【００２５】
本発明は、さらに、各単位がヘテロ二量体として互いに会合した第一および第二重鎖定常領域を含み、各鎖がIgG CH2領域およびCH3領域を含み、鎖の一方がCH3領域のＣ末端に結合した多量体化ペプチドを含み、ここで、これら単位が単位の多量体化ペプチドの多量体化により多量体複合体として会合する、複数単位の抗体または融合タンパク質を含む多量体複合体を提供する。
【００２６】
ある抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体において、IgG CH2領域およびCH3領域はヒトIgGである。ある抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体は、さらにヒトIgG CH1およびヒンジ領域を含む。ある抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体において、ヒトIgG CH1領域、ヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域はヒトIgG1である。ある抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体において、ヒトIgG CH1領域、ヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域はヒトIgG2である。ある抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体において、ヒトIgG CH1領域、ヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域はヒトIgG3である。ある抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体において、ヒトIgG CH1領域、ヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域はヒトIgG4である。
【００２７】
ある抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体は、DR4のようなデスレセプターファミリータンパク質に特異的に結合し、該タンパク質を担持する細胞のアポトーシスを誘発する。ある抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体はTNF受容体ファミリータンパク質に特異的に結合し、該タンパク質を担持する細胞のアポトーシスまたは細胞分裂停止を誘発する。ある抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体はプロテインＧに特異的に結合し、プロテインＡに特異的に結合し、ADCC、CDCおよび／またはオプソニン作用を示す。ある抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体において、存在するときCH1領域ならびにヒンジ領域およびCH2領域およびCH3領域はヒトIgG1領域であり、本抗体または融合タンパク質はプロテインＧに特異的に結合し、そしてプロテインＡに特異的に結合する。ある抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体はADCC、CDCおよびオプソニン作用を示す。ある抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体において、存在するときCH1領域ならびにヒンジ、CH2領域およびCH3領域はヒトIgG2またはIgG4領域であり、本抗体または融合タンパク質はプロテインＧに特異的に結合し、そしてプロテインＡに特異的に結合する。
【００２８】
ある抗体または三量体もしくは多量体複合体において、抗体はヒト化、キメラ、ベニア化(veneered)またはヒト抗体である。ある抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体は、CD79a、CD30、DR5またはDR4のような受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する。ある融合タンパク質または三量体または多量体複合体は、TNF-α受容体、LFA-3もしくたはIL-1受容体の細胞外ドメインまたはTRAILタンパク質を含む。
【００２９】
ある抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体は、毒性部分、所望により細胞毒性とコンジュゲートする。
【００３０】
ある抗体または三量体または多量体複合体は、CD40、OX40、4-1BB、GITRまたはCD27に特異的に結合する。
【００３１】
ある抗体または三量体または多量体複合体は、細胞から発現されるTNF受容体スーパーファミリーメンバーと特異的に結合し、それにより該受容体の三量体化と、該受容体を介する細胞内シグナル伝達を誘発する。TNF受容体スーパーファミリーメンバーの例は、TNFRI(CD120a)、TNFRII(CD120b)、LtβR(リンホトキシンβ受容体)、OX40(CD134)、CD40、FAS(CD95)、CD27、CD30、4-1BB(CD137)、DR3、DR4(CD261)、DR5(CD262)、DR6(CD358)、DcR1(CD263)、DcR2(CD264)、DcR3、RANK(CD265)、OPG、Fn14(CD266)、TACI(CD267)、BAFFR(CD268)、BCMA(CD269)、HVEM(CD270)、LNGFR(CD271)、GITR(CD357)、TROY、RELT、EDARまたはXEDARを含む。
【００３２】
本発明は、さらに、上に定義した抗体もしくは融合タンパク質または三量体もしくは多量体複合体を含む医薬組成物を提供する。
【００３３】
本発明は、さらに、癌の処置法であって、癌を有するまたは癌のリスクがある患者に上に定義した抗体もしくは融合タンパク質またはその三量体もしくは多量体複合体を有効なレジメで投与することを含む、方法を提供する。
【００３４】
本発明は、さらに、免疫学的障害の処置法であって、該障害を有するまたは該障害のリスクがある患者に上に定義した抗体もしくは融合タンパク質またはその三量体もしくは多量体複合体を有効なレジメで投与することを含む、方法を提供する。
【００３５】
本発明は、さらに、抗体および／または融合タンパク質の多量体複合体の製造法であって、(ａ)上に定義した第一および第二重鎖をコードする１種以上のベクターで細胞をトランスフェクトし、ここで、抗体または融合タンパク質単位が発現され、複数単位の多量体化ペプチドの会合により多量体複合体に集合し；そして(ｂ)細胞培養から抗体および／または融合タンパク質の多量体複合体を単離することを含む、方法を提供する。所望により、第一および第二重鎖は、異なるベクターによりコードされる。所望により、多量体複合体は三量体複合体であり、多量体化ペプチドは三量体化ペプチドである。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】抗体発現ベクターの模式的構造。
【図２Ａ−Ｃ】単量体および三量体抗体の模式的構造。
【図３Ａ−Ｃ】スーパーロース６ゲル濾過カラムからのサイズマーカー(Ａ)およびHuYON007抗体(ＢおよびＣ)の溶出パターン。
【図４】単量体(HuYON007-KH)および三量体(HuYON007-THB)抗DR4 IgG1抗体によるラモス細胞のアポトーシス。
【図５】scFv抗体のための発現ベクターの模式的構造。
【図６Ａ−Ｂ】IgG重鎖定常領域の配列。
【図７Ａ−Ｃ】スーパーロース６ゲル濾過カラムからのサイズマーカー(Ａ)およびHuOHX10抗体(ＢおよびＣ)の溶出パターン。
【図８】ラモス細胞上のCD95の発現。
【図９】スーパーロース６ゲル濾過カラムからのHuYON007二量体の溶出パターン。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
定義
抗体または融合タンパク質は、典型的に単離された形態で提供される。これは、抗体または融合タンパク質が、その産生または精製に起因する妨害タンパク質および他の混入物から典型的に少なくとも５０％w／w純粋であることを意味するが、モノクローナル抗体または融合タンパク質が、その使用を促進することを目的とした過剰の薬学的に許容される担体または他の媒体と組み合わせられている可能性を除外するものではない。時々、抗体または融合タンパク質は、産生または精製からの妨害タンパク質および混入物から少なくとも６０％w／w、７０％w／w、８０％w／w、９０％w／w、９５％w／wまたは９９％w／w純粋である。しばしば、抗体または融合タンパク質は、その精製後も残る優勢な高分子種である。
【００３８】
抗体または融合タンパク質のその標的抗原への特異的結合は、少なくとも１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１または１０１０Ｍ−１の親和性を意味する。特異的結合は、検出可能な程度に高い強度であり、少なくとも１種の無関係の標的に対して生じる非特異的結合と区別可能である。特異的結合は、特定の官能基の間の結合の形成または特定の空間的適合(例えば、鍵穴と鍵タイプ)の結果であり得て、一方、非特異的結合は通常ファンデルワールス力の結果である。しかしながら、特異的結合は抗体または融合タンパク質が、１個の、そして１個のみの標的に結合することを必ずしも意味しない。
【００３９】
基本的抗体構造単位は、サブユニットの四量体である。各四量体は、２個の同一対のポリペプチド鎖を含み、各対は１個の“軽”鎖(約２５kDa)と、１個の“重”鎖(約５０〜７０kDa)を含む。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識を受け持つ、約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。この可変領域は、最初は切断可能シグナルペプチドと結合して発現される。シグナルペプチドを伴わない可変領域は、成熟可変領域と呼ばれることがある。それゆえに、例えば、軽鎖成熟可変領域は、軽鎖シグナルペプチドを伴わない軽鎖可変領域を意味する。しかしながら、可変領域への言及は、シグナル配列が必然的に存在することを意味せず、実際、本発明の抗体または融合タンパク質が発現および分泌されたら、シグナル配列は開裂される。重鎖可変領域および軽鎖可変領域の対は、抗体の結合領域を規定する。軽鎖および重鎖のカルボキシ末端部分は、それぞれ軽鎖および重鎖定常領域を規定する。重鎖定常領域は、主にエフェクター機能を受け持つ。IgG抗体において、重鎖定常領域はCH1領域、ヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域に分けられる。図６Ａ、ＢはIgG配列例を示す。CH1領域は、ジスルフィド結合および非共有結合性結合により軽鎖定常領域に結合する。ヒンジ領域は、抗体の結合領域とエフェクター領域の間の柔軟性を提供し、四量体サブユニットの２個の重鎖定常領域間の分子間ジスルフィド結合のための部位も提供する。CH2領域およびCH3領域は、主に、エフェクター機能およびFcRn結合の部位である。軽鎖はκまたはλと分類される。重鎖はγ、μ、α、δまたはεと分類され、それぞれ、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEとしての抗体のアイソタイプを規定する。軽鎖および重鎖内で、可変領域と定常領域は、約１２個またはそれ以上のアミノ酸の“Ｊ”セグメントにより連結され、重鎖はまた約１０個またはそれ以上のアミノ酸の“Ｄ”セグメントも含む。(一般に、Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989), Ch. 7参照)(その全体を全ての目的のために本明細書に引用により包含させる)。
【００４０】
各軽／重鎖対の成熟可変領域は抗体結合部位を形成する。それゆえに、インタクトな抗体は２個の結合部位を有し、すなわち、二価である。天然抗体において、これら結合部位は同一である。しかしながら、２個の結合部位が異なる二重特異性抗体を製造できる(例えば、Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-53 (1992)参照)。可変領域は、全て、相補性決定領域またはCDRsとも呼ばれる３個の超可変領域に結合した、相対的に保存されたフレームワーク領域(ＦＲ)の同一の共通構造を示す。各対の２鎖からのCDRsはフレームワーク領域で並べられ、特異的エピトープへの結合が可能となる。Ｎ末端からＣ末端方向で、軽鎖および重鎖のいずれもドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991)またはChothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989)の定義に従う。Kabatはまた広く使用される番号付け規約(Kabat番号付け)も提供し、ここで、異なる重鎖可変領域間または異なる軽鎖可変領域間の対応する残基に同一番号が割り当てられる。Kabat番号付けを抗体定常領域に使用できるが、本明細書の場合にはEUインデックスがより広く使われている。
【００４１】
多量体化単位としても知られる抗体または融合タンパク質単位は、ホモ多量体化ペプチドを含む抗体または融合タンパク質の単量体単位である。多量体化単位は、それ自体典型的に二価である。単一特異性二価抗体単位において、２個の重鎖と２個の軽鎖可変領域は同一である。二重特異性二価抗体単位において、異なる結合特異性を有する、２個の異なる重鎖可変領域および軽鎖可変領域対合が存在する。融合タンパク質単位は、定常領域に結合した２コピーの同一異種タンパク質を含むホモ二量体型または定常領域に結合した２個の異なる異種タンパク質を含むヘテロ二量体型であり得る。
【００４２】
多量体化は、ホモ多量体化ペプチドの会合による、少なくとも２個の多量体化単位、より典型的には３個、４個、５個または６個のこのような単位の会合を意味する。結合価は、結合領域の数、または換言すれば、抗体または融合タンパク質により結合され得る標的抗原の分子の最大数を意味する。正常ホモ二量体型IgG抗体は、２の結合価を有する。単量体単位が二価である本発明の抗体または融合タンパク質は、三量体複合体では６、四量体複合体では８または五量体複合体では１０、六量体複合体では１２などの結合価を有し得る。これらの結合価は理論上の最大値である。実際面では、結合する抗原のコピー数は、立体障害のために理論上の最大値より少ないことがあり得る。
【００４３】
本発明の抗体または融合タンパク質は、その抗原(またはリガンド)結合領域全てが同一特異性を有するならば、単一特異性である。抗体または融合タンパク質は、その抗原結合領域が少なくとも２個の異なる特異性を含むならば、多特異性である。多特異性抗体または融合タンパク質における異なる特異性の数は、典型的に２である。
【００４４】
用語“抗体”は、一価フラグメント、２個の重鎖と軽鎖の二価四量体単位および二価単位の高次複合体、特に三量体、四量体および五量体を含む、少なくとも１個の結合領域を有するあらゆる形態の抗体を含む。抗体は単一特異性であってよく、この場合、全結合領域が同一特異性または多特異性を有し、ここで、結合部位は少なくとも２個の特異性を有する。同様に、融合タンパク質は単量体または二量体型融合タンパク質単位または高次複合体、特に三量体、四量体または五量体を含む。
【００４５】
用語“エピトープ”は、抗体または融合タンパク質が結合する、抗原上の部位をいう。エピトープは、隣接アミノ酸群または１個以上のタンパク質の三次折りたたみにより並置された非隣接アミノ酸群から形成され得る。隣接アミノ酸群から形成されるエピトープ(直鎖状エピトープとしても知られる)は、典型的に変性溶媒に暴露されても維持されるが、三次折りたたみにより形成されるエピトープ(高次構造的エピトープとしても知られる)は、典型的に変性溶媒での処理により失われる。ある抗体は末端特異的エピトープに結合するとは、抗体が他のポリペプチドと融合した同一ポリペプチドに比して優先的に遊離末端を有するポリペプチドと結合し、遊離末端の喪失に至ることを意味する。エピトープは、典型的に少なくとも３個、さらに一般的には、少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を独特な空間的高次構造を有する。エピトープの空間的高次構造を決定する方法は、例えば、ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴を含む。例えば、Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996)参照。
【００４６】
用語“抗原”または“標的抗原”は、抗体または融合タンパク質により結合される標的分子を指す。抗原は、数ある分子の中でも、任意の長さのタンパク質(天然、合成または組み換え発現)、核酸または炭水化物であり得る。抗原は、受容体、リガンド、対抗受容体およびコートタンパク質を含む。
【００４７】
融合タンパク質内の異種ポリペプチドは、免疫グロブリン定常領域に天然では結合しないポリペプチドである。このようなポリペプチドは、完全長タンパク質または該完全長タンパク質により結合される抗原に対する特異的結合を保持するのに十分な長さのあらゆるそのフラグメントであり得る。例えば、異種ポリペプチドは受容体細胞外ドメインまたはそれに対するリガンドであり得る。
【００４８】
同一または重複エピトープを認識する抗体は、標的抗原に対する結合について一方の抗体が他方の抗体と競合する能力を示す、単純免疫アッセイにより同定できる。抗体のエピトープはまた、接触残基を同定するためのその抗原と結合する抗体のＸ線結晶学によっても同定できる。あるいは、抗原における、一方の抗体の結合を低下させるまたは消滅させるアミノ酸変異全てが、他方の結合を低下させるかまたは消滅させるならば、２個の抗体は同一エピトープを有する。一方の抗体の結合を低下させるまたは消滅させるアミノ酸変異のいくつかが他方の結合を低下させるかまたは消滅させるならば、２個の抗体は重複エピトープを有する。
【００４９】
複数抗体間の競合は、被検抗体が共通抗原への対照抗体の特異的結合を阻害する、アッセイにより決定する(例えば、Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990参照)。試験抗体は、競合結合アッセイで測定して、過剰の試験抗体(例えば、少なくとも２×、５×、１０×、２０×または１００×)が対照抗体の結合を、少なくとも５０％、しかし好ましくは７５％、９０％または９９％阻害するならば、対照抗体と競合する。競合アッセイにより同定される抗体(競合抗体)は、対照抗体と同一エピトープに結合する抗体および対照抗体が結合するエピトープと立体障害が生じるのに十分近位の隣接エピトープに結合する抗体を含む。
【００５０】
用語“患者”は、予防または治療処置を受けるヒトおよび他の哺乳動物対象を含む。
【００５１】
アミノ酸置換を保存的または非保存的と分類する目的で、アミノ酸を次のとおり分類する。グループＩ(疎水性側鎖)：met、ala、val、leu、ile；グループII(中性親水性側鎖)：cys、ser、thr；グループIII(酸性側鎖)：asp、glu；グループIV(塩基性側鎖)：asn、gln、his、lys、arg；グループＶ(鎖配向に影響する残基)：gly、pro；およびグループVI(芳香族側鎖)：trp、tyr、phe。保存的置換は、同一クラス内のアミノ酸間の置換を含む。非保存的置換は、これらのクラスのいずれか一つのメンバーを、他のクラスのメンバーと交換することからなる。
【００５２】
配列同一性パーセンテージは、可変領域についてKabat番号付け規約または定常領域についてEU番号付けにより最大限整列させた抗体配列により決定する。他のタンパク質について、配列同一性は、デフォルトギャップパラメータを使用して、または精査および最大整列により、Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0（Genetics Computer Group,575 Science Dr., Madison, WI)におけるBESTFIT、FASTAおよびTFASTAのようなアルゴリズムを使用して、決定できる。整列後、対象抗体領域(例えば、重鎖または軽鎖の成熟可変領域全体)を対照抗体の同一領域と比較する場合には、対象抗体領域と対照抗体領域との配列同一性パーセンテージは、対象抗体領域および対照抗体領域の両者において同一アミノ酸により占拠されている位置の数を、２個の領域の整列させた位置の総数(ギャップは数えない)で除し、１００を乗じてパーセンテージに変換した数である。
【００５３】
１個以上の指定された要素を“含む”組成物または方法は、具体的に指定されていない他の要素を含み得る。例えば、抗体を含む組成物は、該抗体を単独でまたは他の成分と組み合わせて含み得る。
【００５４】
用語“抗体依存性細胞傷害”またはADCCは抗体被覆標的細胞(すなわち、結合した抗体を伴う細胞)と溶解活性を有する免疫細胞(エフェクター細胞とも呼ばれる)の相互作用による、細胞死を誘発する機構である。このようなエフェクター細胞は、ナチュラルキラー細胞、単球／マクロファージおよび好中球を含む。ADCCは、細胞に結合した抗体のFc領域と、好中球、マクロファージおよびナチュラルキラー細胞のような免疫エフェクター細胞上のFcγ受容体、特にFcγRIおよびFcγRIIIの相互作用により誘発される。標的細胞は、介在するエフェクター細胞のタイプによって、食作用または溶解により除去される。抗体被覆標的細胞の死が、エフェクター細胞活性の結果として起こる。
【００５５】
“抗体依存性細胞貪食”またはADCPとしても知られる用語オプソニン化は、抗体被覆細胞が、免疫グロブリンFc領域に結合する食作用性免疫細胞(例えば、マクロファージ、好中球および樹状細胞)により、全体であれ一部であれ、内在化される過程をいう。
【００５６】
用語“補体依存性細胞傷害”またはCDCは、標的結合抗体のFcエフェクタードメインが、最終的に標的細胞膜に孔を形成するに至る一連の酵素反応を活性化する細胞死を誘発する機構をいう。典型的に、抗体被覆標的細胞上の複合体のような抗原−抗体複合体は、補体成分C1qと結合し、活性化し、これが次に標的細胞死に至る補体カスケードを活性化する。補体の活性化はまた白血球上の補体受容体(例えば、CR3)への結合によりADCCを促進し、標的細胞表面上の補体成分の沈着ももたらす。
【００５７】
抗体のFcRn受容体へのpH依存性結合は、抗体が、pH７.５よりもpH６.０のときにこのような受容体に強く結合することを意味する。飲作用による内在化後のエンドソームにおける低pHでのFcRnの結合は、IgG抗体をリソソームによる異化分解から救済する。救済されたIgG抗体は、その後、中性pHでFcRnから遊離され、循環血中へ再循環される。このようなpH依存性FcRn結合は、IgG抗体の長い血清半減期の分子機構の基礎をなす(Ghetie et al., Annu. Rev. Immunol. 18:739-766, 2000)。例えば、ヒトIgG抗体は、pH６.０でヒト新生児Fc受容体(FcRn)に結合するが、一方pH７.５ではFcRnに弱くしか結合しない。IgG抗体におけるFcRn結合部位は、CH2ドメインとCH3ドメインの接合部に位置する。μ重鎖がpH６.０または７.５でFcRnと結合しないため、天然IgMはリソソームにおける分解からの抗体の救済にFcRn介在経路を利用できず、それゆえに、一般に天然IgG抗体より半減期が短い。
【００５８】
ヒト化抗体は、非ヒト“ドナー”抗体からのCDRsがヒト“アクセプター”抗体配列に移植された、遺伝子操作された抗体である(例えば、QueenのUS5,530,101および5,585,089；WinterのUS5,225,539、CarterのUS6,407,213、AdairのUS5,859,205および6,881,557、FooteのUS6,881,557参照)。アクセプター抗体配列は、例えば、成熟ヒト抗体配列、このような配列の複合体、ヒト抗体配列のコンセンサス配列または生殖系列領域配列であり得る。それゆえに、ヒト化抗体は、完全にまたは実質的にドナー抗体由来の一部または全CDRsと、完全にまたは実質的にヒト抗体配列由来の可変領域フレームワーク配列および存在するならば定常領域を有する抗体である。同様に、ヒト化重鎖は、完全にまたは実質的にドナー抗体重鎖由来の少なくとも１個、２個、通常全３個のCDRsと、実質的にヒト重鎖可変領域フレームワークおよび存在するならば定常領域配列由来の重鎖可変領域フレームワーク配列および重鎖定常領域を有する。同様に、ヒト化軽鎖は、完全にまたは実質的にドナー抗体軽鎖由来の少なくとも１個、２個、通常全３個のCDRsと、実質的にヒト軽鎖可変領域フレームワークおよび存在するならば定常領域配列由来の軽鎖可変領域フレームワーク配列および軽鎖定常領域を有する。ナノボディおよびdAbs以外、ヒト化抗体はヒト化重鎖およびヒト化軽鎖を含む。ヒト化抗体中のCDRは、それぞれのCDRs間が対応する残基(Kabatにより規定)の少なくとも８５％、９０％、９５％または１００％が同一であるとき、実質的に非ヒト抗体における対応するCDR由来である。抗体鎖の可変領域フレームワーク配列または抗体鎖の定常領域は、Kabatにより規定される対応する残基の少なくとも８５％、９０％、９５％または１００％が同一であるとき、実質的にそれぞれヒト可変領域フレームワーク配列またはヒト定常領域由来である。
【００５９】
ヒト化抗体はしばしばマウス抗体からの全６個のCDRs(好ましくはKabatにより規定)を組み込むが、全てよりは少ないCDRs(例えば、マウス抗体由来の少なくとも３個、４個または５個のCDRs)から作製され得る(例えば、Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079-1091, 1999; Tamura et al, Journal of Immunology, 164:1432-1441, 2000参照)。
【００６０】
キメラ抗体は、非ヒト抗体(例えば、マウス)の軽鎖および重鎖の成熟可変領域がヒト軽鎖および重鎖定常領域と組み合わさった抗体である。このような抗体は、実質的にまたは完全に、マウス抗体の結合特異性を維持し、約２／３ヒト配列である。
【００６１】
ベニア化抗体は、非ヒト抗体のCDRsのいくつか、通常全ておよび非ヒト可変領域フレームワーク残基のいくつかを保持するが、Ｂ細胞またはＴ細胞エピトープに寄与し得る他の可変領域フレームワーク残基、例えば露出残基(Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991)が、ヒト抗体配列の対応する位置由来の残基で置換されている、ヒト化抗体の一種である。その結果がCDRsが完全にまたは実質的に非ヒト抗体由来であり、非ヒト抗体の可変領域フレームワークが、置換されてよりヒト様になっている抗体である。
【００６２】
ヒト抗体はヒトから単離できるか、そうでなければヒト免疫グロブリン遺伝子の発現の結果であり得る(例えば、トランスジェニックマウスで、インビトロでまたはファージディスプレイによる)。ヒト抗体を産生する方法は、トリオーマ法(Oestberg et al., Cys muoma 2:361-367 (1983)；Oestberg、米国特許番号4,634,664；およびEngleman et al.、米国特許4,634,666)、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスの使用(例えば、Lonberg et al.、WO93／12227(1993)；US5,877,397、US5,874,299、US5,814,318、US5,789,650、US5,770,429、US5,661,016、US5,633,425、US5,625,126、US5,569,825、US5,545,806、Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91／10741 (1991))およびファージディスプレイ法(例えばDower et al.、WO91／17271およびMcCafferty et al.、WO92／01047、US5,877,218、US5,871,907、US5,858,657、US5,837,242、US5,733,743およびUS5,565,332参照)を含む。
【００６３】
プロテインＡは、もともと細菌黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)の細胞壁から発見された４０〜６０kDa表面タンパク質である。プロテインＡは、ヒトIgG1、IgG2およびIgG4ならびにマウスIgG2aおよびIgG2bと高親和性で特異的に結合する。これはヒトIgG3またはIgAまたはIgMとは結合しない。プロテインＡは、抗体の親和性精製に使用される。
【００６４】
プロテインＧは、６５kDa(G148プロテインＧ)および５８kDa(C40プロテインＧ)連鎖球菌細胞表面タンパク質である。これは、IgG結合に不要な血清アルブミン結合ドメインを含み、後者はしばしば削除される。プロテインＧは、ヒトIgGアイソタイプの全てと特異的に結合するが、IgAまたはIgMとは結合しない。プロテインＧもまた抗体精製に有用である。
【００６５】
本発明の抗体(本抗体)が、その由来元である親抗体の特性(重鎖定常領域の修飾がなく、ホモ多量体化ペプチドの付加がない)を維持しているとされるとき、保持は一部でも完全でもあり得る。本発明の抗体とその由来元の親抗体の間での活性の完全な維持は、本抗体の活性が、実験誤差の範囲内で同一であるか、親抗体より大きいことを意味する。活性の一部維持は、本抗体の活性が陰性対照のバックグラウンドレベルより有意に高く(すなわち、実験誤差を超える)、好ましくは親抗体の対応する活性の少なくとも５０％であることを意味する。
【００６６】
詳細な記載
Ｉ. 概要
本発明は、多量体複合体の会合を促進する修飾重鎖IgG定常領域を有する抗体または融合タンパク質を提供する。抗体または融合タンパク質単位内には、各々少なくともCH2領域およびCH3領域を含む２個の重鎖がある。２個の重鎖は、単位内の重鎖のカップリングを促進するための相補的修飾(例えば、ノブとホール)を担持できる。単位内の一つの重鎖のみが、そのＣ末端でホモ多量体化ペプチドと融合する。ホモ多量体化ペプチドの存在が、複数単位間の会合を促進する。例えば、ホモ多量体化ペプチドがホモ三量体化ペプチドであるならば、３個の単位の結合を促進して、三量体複合体を形成する。このような複合体は、典型的に、各単位に２個で、計６個の結合部位を有する。結合部位は同一または異なる特異性を有し得る。異なるならば、複合体の各単位は、典型的に２個の結合特異性のそれぞれを有する。
【００６７】
本抗体および融合タンパク質は、プロテインＧと特異的に結合し、これは精製を促進する。本抗体および融合タンパク質は、所望により相対的に長いインビボ半減期と関係するpH依存性FcRn結合を含むIgG特性を完全または部分的の何れかで保持する。アイソタイプおよびサブタイプ、抗原の性質ならびにさらなるIgG CH1ドメインおよびヒンジドメインの存在によって、本発明のIgG重鎖定常領域はまたプロテインＡへの特異的結合ならびにエフェクター機能であるADCC、CDCおよびオプソニン作用の特性を完全にまたは部分的に保持する。
【００６８】
IgGエフェクター機能、相対的に長い半減期および精製の容易さと多量体化の能力の組み合わせは、新規組み合わせの特性を備えた抗体または融合タンパク質を生じる。例えば、このような抗体または融合タンパク質のいくつかは、非修飾IgGアイソタイプを有する抗体と比較して、Fcγ介在特性、例えばADCC、CDC、オプソニン作用、pH依存性FcRn結合ならびにプロテインＡおよびプロテインＧに結合する能力を完全にまたは一部維持しながら、あるいは増強しながら、受容体を効率的に多量体化でき、または細胞表面上のリガンドに結合できる。種々のアイソタイプ群由来の特性の組み合わせにより、癌および他の疾患の処置のために従来のIgG、IgMまたはIgA抗体より高い能力を提供する可能性がもたらされる。
【００６９】
上記利益は、修飾された形態の重鎖定常領域が組み込まれた本抗体または融合タンパク質の発現のための核酸構築物の製造に関係するもの以外のインビトロ操作を実施せずに達成できる。
【００７０】
II. 定常領域の成分
重鎖定常領域は、少なくともIgG CH2領域およびCH3領域を含むIgG部分を含む。抗体または融合タンパク質単位内の定常領域の一つだけが、そのＣ末端でホモ多量体化ペプチドと融合する。２個の重鎖定常領域は、会合を促進するために相補的変異を含み得る。変異のために選択される位置は、好ましくは望ましいエフェクター機能が実質的に障害されることなく、抗体または融合タンパク質単位の複数重鎖間の分子間会合を支持しなければならない。CH2領域およびCH3領域は、少なくとも一部FcRn結合、プロテインＡおよびＧ結合、ADCC、CDCおよびオプソニン作用を受け持つ。IgG部分はまた好ましくはヒンジ領域および／またはCH1領域を含む。ヒンジ領域は、抗体または融合タンパク質の結合領域とエフェクター領域の間に柔軟性を提供し、効率的エフェクター機能、例えばADCC、オプソニン作用およびCDCに貢献する。ヒンジ領域はまたIgG重鎖の対を一緒に結び付けるジスルフィド結合の部位である。CH1領域は軽鎖定常領域と結合し、一般に、軽鎖定常領域を有する軽鎖が存在するが、融合タンパク質では削除され得る形態または軽鎖定常領域が存在しない一本鎖抗体形態を含む。CH1領域は、下に述べる“交差”形態では軽鎖定常領域と置き換え得る。
【００７１】
上記成分は、Ｎ末端からＣ末端方向で、IgG CH1領域(存在するならば)、IgGヒンジ領域(存在するならば)、IgG CH2領域、IgG CH3領域、ホモ多量体化ペプチド(それが存在する鎖内)の順に配列する。
【００７２】
通常、IgG領域の全ては、同一アイソタイプおよびサブタイプである。例えば、全IgG領域がIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4のいずれか由来である。
【００７３】
好ましくは、IgG領域はヒトIgGである。成分(CH1、ヒンジ、CH2、CH3)の説明を伴うヒトIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4重鎖の配列例を図６Ａ、Ｂに示す。しかしながら、非ヒト霊長類、ラクダ類、軟骨魚類、マウスまたはラットを含む他の種由来の領域も使用できる。
【００７４】
ヒトIgG領域(すなわち、CH1、ヒンジ、CH2、CH3)についての言及は、例示配列またはそのアロタイプもしくは同型アロタイプまたは例示配列と少なくとも９０、９５、９８または９９％配列同一性を有するおよび／または例示配列とCH1、CH2、CH3の場合最大１、２、３、４、５、１０または１５アミノ酸欠失、置換または内部挿入によりおよびIgG1、２または４ヒンジ領域では最大１、２または３欠失、置換または内部置換によりおよびIgG3ヒンジでは最大１、２、３、４、５または６欠失、置換または内部置換により異なる他のバリアント配列をいう。置換は、存在するならば、好ましくは保存的である。ヒト定常領域は、異なる個体間でアロタイプ変異および同型アロタイプ変異を示し、すなわち、定常領域は、異なる個体で１箇所以上の多型位置が異なり得る。同型アロタイプは、同型アロタイプを認識する血清が、１個以上の他のアイソタイプの非多型領域に結合する点で、アロタイプと異なる。ヒト定常領域についての言及は、何らかの天然アロタイプ(同型アロタイプを含む)を有する定常領域または天然アロタイプにおける多型位置を占拠する残基群の何らかの並べ替えを含む。非ヒト定常領域の配列は、例えば、Swiss-ProtまたはGenbankデータベースにより提供される。非ヒト定常領域についての言及は、同様に、そのアロタイプまたは同型アロタイプ変異および並べ替えまたは天然配列と異なる他のバリアント配列を含む。多様性の範囲は、ヒト定常領域に関するバリアントの上記記載に準じた方法での、非ヒト定常領域の天然配列に対する配列同一性および／または置換の数により規定する。Eu番号付け規約を、アイソタイプまたは異なる種の対応する位置の規定または変異位置の規定に使用する。
【００７５】
軽鎖および／または重鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端の１個または数個のアミノ酸、例えば、重鎖のＣ末端リシンは、分子の一部または全てで欠損していても誘導体化されていてもよい。補体依存性細胞傷害またはADCCのようなエフェクター機能を低下または増強させるために(例えば、Winter et al., US特許番号5,624,821；Tso et al., US特許番号5,834,597；およびLazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006参照)またはヒトにおける半減期を延長するために(例えば、Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004参照)、定常領域に置換を行ってよい。置換の例は、抗体の半減期を延長するための２５０位のGlnおよび／または４２８位のLeu(EU番号付け)である。２３４位、２３５位、２３６位および／または２３７位のいずれかの置換は、Fcγ受容体、特にFcγRI受容体に対する親和性を低下させる(例えば、US6,624,821参照)。所望により、ヒトIgG2における２３４位、２３６位および／または２３７位をアラニンで置換し、２３５位をグルタミンで置換する(例えば、US5,624,821参照)。
【００７６】
ヒンジ領域を使用するならば、ヒンジの一部を合成リンカー分子で置換できる。融合タンパク質の結合領域が、例えば、１０個までのＮ末端残基が合成可動性リンカーで置換されているヒンジ領域を経てCH2およびCH3 IgGまたはIgA定常領域に結合している融合タンパク質の場合、しばしばそうする。Gly-Gly-Ala-Ala、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser、Leu-Ala-Ala-Ala-Alaおよびその多量体がこのようなリンカーの例である。ヒンジ領域はまた、その全体を合成リンカーで置き換えられても、置換なく削除されてもよい。
【００７７】
ヒンジ領域の一部または全てを置き換える合成リンカーおよびさらに下に記載するようなエフェクター機能またはFcRn結合を増強または抑制するための１個または数個のアミノ酸置換、一つの鎖がそのＣ末端でホモ多量体化ペプチドに会合および結合するのを促進するための鎖あたり１〜４変異の可能性を除いて、定常領域が上記CH1領域、ヒンジ領域、CH2領域、CH3領域以外の配列を含まないことが好ましい。それにもかかわらず、例えば、ヘキサヒスチジンタグのような他の配列を付加できるが、必須ではない。
【００７８】
III. 多量体化ペプチド
本発明は、単独で、そして本発明の重鎖定常領域に結合したとき、ホモ多量体に集合するホモ多量体化(“多量体化”と略すこともある)ペプチドを用いる。本ペプチドは、相対的に短い長さ(例えば、最大５０または１００アミノ酸)であってよい(しかし必須ではない)。
【００７９】
ホモ二量体化能を有するペプチドは、タンパク質内の共通三次元構造モチーフである、ロイシンジッパーである。これらのモチーフは、通常多様な転写因子のDNA結合ドメインに見られる。１個のロイシンジッパーは、約７残基間隔で多数のロイシン残基を含み、片側に並んでいる疎水性領域を伴う両親媒性αヘリックスを形成する。配列番号４２はロイシンジッパーの例を提供する。ホモ二量体化能を有するペプチドの他の例は、Jones(Genome Biol. 5:226, 2004)、Woolfson(Adv. Protein Chem. 70:79-112, 2005)、Parry et al. (J. Struc. Biol. 163:258-69, 2008)、Zaccai et al.(Nat. Chem. Biol. 7:935-941, 2011)およびIvarsson(FEBS Lett. 586:2638-2647, 2012)により報告されている。
【００８０】
既知三量体化ペプチド(すなわち、ホモ三量体を形成するペプチド)は、イソロイシン残基が過剰提示され(一般にヒトタンパク質と比較して)、ホモ三量体を形成する能力を有するアミノ酸配列を有するペプチドである、イソロイシンジッパーを含む。ヒトおよび他の種におけるイソロイシンジッパー配列の数例がSwiss Protデータベース(例えば、Q86TE4、Q86V48)に提供されている。本例で使用するイソロイシンジッパーペプチドは、配列MKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGERAG(配列番号１２)を有する。これと少なくとも９０％または９５％配列同一性を有するSwiss Protデータベース内のこの配列のバリアントまたは他の既知配列または機能的フラグメントまたは指定する配列を含む(すなわち、さらなるフランキング領域を伴う)ペプチドを、このようなバリアントが三量体化能を保持する限り、使用しできる。
【００８１】
三量体化能を有する他のペプチドはテトラネクチンである。ヒトテトラネクチンの例示的形態は、Swis Prot. P05452により提供される。テトラネクチンへの言及は、この配列、種ホモログ(そのうち数個は既知)、対立遺伝子変異型(そのうち数個はSwiss-Protデータベースに記載されている)、P05442に少なくとも９０％または９５％配列同一性を有する他の配列および／またはP05442の機能的フラグメントからなるまたはこれらを含むアミノ酸配列を有するペプチドをいう。このようなバリアントは三量体化能を保持すべきである。他の三量体化ペプチドは、TNFスーパーファミリーメンバーの細胞外ドメインからなるまたはこれを含むペプチドを含む。TNFスーパーファミリーメンバーの例は、ヒトTNF(Swiss Prot P01375)、ヒトCD40リガンド(P29965)およびOX40-L(P23510)を含む。
【００８２】
好ましい三量体化ペプチドは、配列VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSSQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL(配列番号１３)を有するTNF(Swiss Prot P01375)の細胞外ドメインである。天然ヒトTNFスーパーファミリーメンバーとアミノ酸配列が少なくとも９０％または９５％同一性を有するTNFスーパーファミリーメンバー細胞外ドメインのバリアントおよび機能的フラグメントを、該バリアントが望ましい三量体化能を保持するならば、使用できる。
【００８３】
抗体または融合タンパク質の三量体複合体を製造するための戦略および原理は、三量体化ペプチドを、望ましい数の単位のホモ多量体へと会合する多量体化ペプチドに変えることにより高次多量体に拡張できる。抗体または融合タンパク質単位の四量体複合体を製造するための四量体化ペプチドの例は、テトラブラチオン(Stetefeld et al., Naure Struc. Biol. 7:772-776, 2000)、修飾GCN4ロイシンジッパー(Harbury et al., Science 262:1401-1407, 1993)およびセンダイウイルスリン酸化タンパク質(Tarbouriech et al., Nature Struc. Biol. 7:777-781, 2000)である。五量体IgG抗体およびFc融合タンパク質を製造するために、五量体化ペプチド、例えば、Trpジッパータンパク質(別名Trp-14；Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:16156-16161. 2004)または軟骨オリゴマー基質タンパク質(COMP；Malashkevich et al., Science 274:761-765, 1996)を使用できる。六量体IgG抗体および融合タンパク質を製造するために、CC-Hexのような六量体化ペプチド(Zaccai et al., Nature Chem. Biol. 7:935-941, 2011)を使用できる。アミノ酸レベルでこれらに対して少なくとも９０％または９５％配列同一性を有する開示したペプチドからなるまたはこれを含む開示した四量体化ペプチド、五量体化ペプチドまたは六量体化ペプチドのいずれかのバリアントまたはその機能的フラグメントを、該バリアントが望ましい多量体化能を保持する限り、使用できる。
【００８４】
IV. 重鎖定常領域の修飾
本発明の２個の異なる重鎖(すなわち多量体化ペプチドを伴うものと伴わないもの)の対形成は、同一重鎖定常領域のホモ二量体型対形成よりも、ヘテロ二量体としての異なる鎖の会合を好む天然IgG配列の相補的修飾の導入により達成する。一つのこのような修飾は、ノブのホールへのカップリングが望ましいヘテロ二量体形成を促進するように、一方の重鎖へのノブ、そして他方の重鎖へのホールの導入である。ノブおよびホールは抗体分野の技術用語である。ノブは、１個または数個(例えば、４個まで)連続したまたはそうでなければ空間的に近位のアミノ酸の、大きなアミノ酸(分子量で)への置き換えをいう。逆に、ホールは、１個または数個(例えば、４個まで)連続したまたはそうでなければ空間的に近位のアミノ酸の、小さなアミノ酸への置き換えをいう。ノブおよびホールは、通常各重鎖のCH3領域に挿入される(Ridgway et al., Protein Eng 9, 617-21 (1996); Atwell et al., J. Mol. Biol. 270, 26-35 (1997))。サイズを大きくまたは小さくし、ノブまたはホールを作るために導入されるアミノ酸は、好ましくは保存的置換である。ヒトIgG1にホールを作るための好ましい修飾は、T366S、L368AおよびY407V変異(天然アミノ酸が最初、Eu番号付けが２番目、変異アミノ酸が３番目)の組み合わせである。ヒトIgG1においてノブを作るための好ましい修飾はT366W変異である。他の既知ノブ：ホール対はT366Y：Y407TおよびT366W：Y407Aである。
【００８５】
IgG抗体のヘテロ二量体型Fc対Fc相互作用はまた界面の電荷相補性を変えることによっても達成できる。このような修飾の例は、一方のヒトIgG Fcにおける界面に正電荷を付与する二重変異(E356K＋D399K)と、他方のヒトIgG Fcにおける界面に負電荷を付与する二重変異(K362D＋K409D)である(Gunasekaran et al., J. Biol. Chem. 285:19637-19646, 2010; Liu et al., J. Biol. Chem. 289:3571-3590, 2014)。Fc対Fcヘテロ二量体形成を促進する他のFc変異は、Choi et al.(Mol. Cancer 12:2748-2759, 2013)およびMoore et al.(MABs 3:546-557, 2011)により報告された。
【００８６】
あるアミノ酸が他のものに置換されたというとき、これは、これらのアミノ酸がタンパク質の２個のバリアントにおける対応する位置を占拠することを意味する。抗体の状況では、対応する位置は、可変領域についてはKabat番号付けシステムおよびCH領域についてはEUインデックスにより決定する。導入したアミノ酸が置き換えられたアミノ酸より大きいか小さいかは、ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4配列のいずれかのような天然重鎖定常領域配列との関係で決定できる。
【００８７】
IV. 本発明の修飾を組み込んだ抗体および融合タンパク質の特性
上記重鎖定常領域を組み込んだ抗体または融合タンパク質の特性は、一部、CH1、ヒンジ(存在するならば)、CH2領域およびCH3領域のアイソタイプおよびサブタイプ、CH1および／またはヒンジ領域が存在するか否かおよび本抗体または融合タンパク質により結合される抗原の性質に依存する。
【００８８】
本発明の定常領域を組み込んだ抗体および融合タンパク質は、少なくとも一価または二価単位を高次結合価に多量体化する能力およびIgG抗体の少なくとも１個の特性を保持する。CH1、ヒンジ(存在するならば)、CH2およびCH3がIgG起源であるとき、抗体は、少なくともプロテインＧを結合するIgG様特性ならびに標的抗原に特異的に結合する能力を完全にまたは一部保持する。pH依存性FcRn結合もまた一部または完全に保持され得る。
【００８９】
アイソタイプまたはサブタイプの選択は望まれる特性に依存する。強エフェクター機能が望まれるならばIgG1またはIgG3を選択し(癌細胞、病原体に対する場合にはよくある)、弱いCDC、ADCCおよびオプソニン作用が必要であるかこれら作用を必要としないならば、IgG2またはIgG4を選択する(機序が受容体−リガンド相互作用の阻害である場合当てはまり得る)。
【００９０】
CH1領域およびヒンジ領域(存在するならば)、CH2領域およびCH3領域がヒトIgG1であるならば、本発明の重鎖定常領域を組み込んだ抗体または融合タンパク質は、プロテインＡおよびプロテインＧに対する特異的結合を有し、結合した抗原によってADCC、CDC、オプソニン作用のようなpH依存性FcRn結合およびエフェクター機能を有し得る。このようなエフェクター機能は、結合した抗原が表面受容体(例えば、細胞またはウイルス上)であるならば、通常存在する。抗原が通常は可溶性形態であるならば、エフェクター機能は通常可溶性抗原に対しては発揮されないが、結合形態の抗原を発現させることにより(例えば、細胞表面上)証明できる。
【００９１】
CH1領域およびヒンジ領域(存在するならば)、CH2領域およびCH3領域がヒトIgG2、IgG4であるならば、本発明の重鎖定常領域を組み込んだ抗体または融合タンパク質は、少なくともプロテインＡおよびプロテインＧへの特異的結合を示し、pH依存性FcRn結合を有し得る。ヒトIgG2アイソタイプおよびIgG4アイソタイプは、一般にCDCを欠く。IgG4は、結合抗原に対して若干のADCCおよびオプソニン作用を有するが、ヒトIgG1またはIgG3より小さい。
【００９２】
CH1領域およびヒンジ領域(存在するならば)、CH2領域およびCH3領域がヒトIgG3であるならば、本発明の重鎖定常領域を組み込んだ抗体または融合タンパク質は、少なくともプロテインＧへの特異的結合を示し、pH依存性FcRn結合を有し得る。このような抗体または融合タンパク質はまた、IgG1の場合のように、結合した抗原が表面抗原であるか可溶性であるかによって、ADCC、CDC、オプソニン作用のようなエフェクター機能も示し得る。
【００９３】
CDC、ADCCまたはオプソニン作用が存在する、本発明の定常領域を有する抗体または融合タンパク質において、CDC、ADCCまたはオプソニン作用のレベルは、他の点では同等な従来のIgG定常領域を有する抗体または融合タンパク質と同一(実験誤差範囲内)であることも、それより高いこともある。
【００９４】
Ｖ. 抗体および融合タンパク質形式
本発明の重鎖定常領域は、多量体形態に集合できる単一または二重特異性抗体または融合タンパク質に組み込まれ得る。単一特異性抗体の発現について、同一重鎖可変領域は、本発明の２個の異なる定常領域に結合した２個の発現単位から発現される。軽鎖は、可変領域および定常領域を含んで発現される。重鎖の各々は、軽鎖に重鎖のCH1領域および軽鎖の軽鎖定常領域を経て結合し(または交差形式ではその逆)、ヘテロ二量体を形成する。２個のヘテロ二量体は、従来の抗体の場合と同様、その後重鎖のIgG部分のヒンジ、CH2領域およびCH3領域の会合により対形成して、四量体単位を形成する。しかしながら、ヘテロ二量体の、同一定常領域ではなく異なる定常領域との会合が、異なる重鎖定常領域(例えば、ノブとホール)における、これらの相互会合を促進する相補的修飾の存在により支持される。それゆえに、四量体は、好ましくは２個の異なる重鎖定常領域を含んで会合し、そのうち１個のみが結合した多量体化ペプチドを有する。その後、四量体単位は、多量体化ペプチドの会合により多量体化する。
【００９５】
重鎖定常領域は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ベニア化抗体またはヒト抗体を含む、あらゆるタイプの操作された抗体で用いることができる。抗体は、モノクローナル抗体でも、遺伝子操作されたポリクローナル抗体調製物でもよい(US6,986,986参照)。
【００９６】
単一特異性融合タンパク質について、各々同一異種ポリペプチドに結合した、本発明の重鎖定常領域が発現される。異種ポリペプチドは定常領域のＮ末端に結合領域を提供し、単に結合領域と呼ぶこともある。IgG CH1領域は融合タンパク質のための定常領域に典型的に含まれない。IgGヒンジ領域は含まれていても、含まれていなくてもよい。ある融合タンパク質において、ヒンジ領域の一部または全てが融合タンパク質の結合部分と重鎖定常領域の間に柔軟性を与える合成リンカーペプチドで置き換えられる。
【００９７】
融合タンパク質の結合領域は、(とりわけ)今日まで製造されている他の融合タンパク質で使用されるどんなタイプの結合部分でもよい。結合領域の例は、細胞受容体もしくはそのリガンドの細胞外ドメインまたは対抗受容体である(例えば、TNF-α受容体、細胞死ファミリー受容体、LFA3またはIL-1受容体またはTrail)。
【００９８】
抗体および融合タンパク質のいずれも多特異性(典型的に二重特異性)形式で、すなわち、異なる標的特異性を有する抗体または融合タンパク質単位を含む複合体として発現できる。抗体について、これは、２個の異なる可変領域の２個の異なる重鎖定常領域への融合により達成する。例えば、異なる可変領域は、異なる標的に特異性を有し得る。軽鎖可変領域は同一でも異なってもよい。複数軽鎖が異なるならば、各ヘテロ二量体を形成するための軽鎖と重鎖の正しい対形成は、ヘテロ二量体の一方の中の重鎖ドメインと軽鎖ドメインの“交差”により促進できる(Schaefer et al., Proc Natl Acad Sci USA 108:11187-92, 2011；WO2009／080251；WO2009／080252；WO2009／080253)。
【００９９】
２個の異なる重鎖可変領域および２個の異なる軽鎖可変領域を有するいくつかの二重特異性抗体において、一方の重鎖可変領域と一方の軽鎖可変領域は一つの親抗体由来であり、他方の抗体重鎖可変領域および軽鎖可変領域は他の親抗体由来である。このような発現は、例えば、２個の異なる標的に対する２個の特異性を有する抗体単位をもたらす。このような抗体単位が多量体化されたとき、得られた多量体複合体における単位の各々は、両特異性を含む。異なる発現単位由来の同一定常領域に結合したさらなる重鎖可変領域および軽鎖可変領域の発現により、高次多特異性を得ることができる。例えば、４個の結合特異性を有する複合体の発現のために、１個の本発明の重鎖定常領域(別の発現単位由来)に結合した２個の異なる重鎖可変領域を発現でき、そして他の本発明の重鎖定常領域(同様に別の発現単位由来)に結合した２個のさらに異なる重鎖可変領域を発現できる。最大４個までの軽鎖定常領域(または交差形式ではCH1領域)に結合した軽鎖可変領域も別の単位から発現できる。多特異性複合体は、いずれの複合体でも等比である必要はないが、４個の結合特異性を含んで集合する。
【０１００】
融合タンパク質は、同様に２個の異なる異種ポリペプチドを２個の本発明の定常領域に融合させることにより、多特異性形態で発現させ得る。それにより、多特異性融合タンパク質の単位は、異なる異種ポリペプチドの各々を含む。高次多特異性は、本発明の定常領域の一方または両方に結合した別の発現単位由来のさらなる異種ポリペプチドの発現により得ることができる。
【０１０１】
抗体と融合タンパク質のハイブリッドも形成できる。この場合、１個の本発明の重鎖定常領域を１個の抗体重鎖可変領域と融合し、定常領域および可変領域を含む軽鎖と共に発現させる。他の本発明の重鎖定常領域を異種ポリペプチドと融合させる。得られたハイブリッド抗体融合タンパク質単位は、一方が重軽鎖対により与えられ、他方が異種ポリペプチドにより与えられ、異なる結合特異性が異なる重鎖の会合により一体となった２個の結合特異性を有する。このようなハイブリッド単位は、抗体または融合タンパク質単位のように多量体化ペプチドにより多量体化できる。
【０１０２】
多特異性抗体または融合タンパク質は、標的上(例えば、癌細胞または病原体)の抗原およびエフェクター細胞上の抗原(例えば、Ｔ細胞上のCD3)に対する結合特異性を含み得る。このような多特異性複合体は、標的細胞とエフェクター細胞の間に架橋を形成し、エフェクター細胞の細胞毒性またはオプソニン作用活性を促進する。多特異性抗体または融合タンパク質は、これに加えてまたは代替的に同一標的(例えば、癌細胞または病原体)上の２個の異なる抗原に対する結合特異性を含み得る。このような抗体または融合タンパク質は、単独抗原に対する特異性を有する抗体または融合タンパク質よりも、標的細胞に対して大きな選択的毒性を有し得る。他の多特異性抗体または融合タンパク質は、受容体およびそのリガンドの両者または対抗受容体に対する結合領域を含む。このような抗体または融合タンパク質は、抗体または融合タンパク質結合受容体またはリガンド／対抗受容体単独よりも大きな阻害を発揮できる。これらの特異性およびその他のいずれかも、同一多特異性複合体に組み合わせ得る。
【０１０３】
VI. 遺伝子操作および発現
上記修飾を含む抗体または融合タンパク質は、組み換え発現により産生する。抗体の産生は、典型的に、異なる重鎖について各１個ずつおよび軽鎖が同一であるか異なるかによって軽鎖について１個または２個の、幾つかの発現単位を必要とする。該発現単位は別のベクターにまたは２個以上のベクターに分割して存在でき、または全て同一ベクター上に存在できる。Fc融合タンパク質の産生は、典型的に、各重鎖について１個の、計２個の発現単位を必要とする。該発現単位は同一ベクター上にあっても異なるベクター上にあってもよい。一方の重鎖発現ベクターは、Ｃ末端で多量体化ペプチドに融合し、Ｎ末端で、さらにシグナルペプチドに融合した重鎖可変領域または異種ポリペプチドに融合した領域を含む重鎖を含む。他方の重鎖発現ベクターは他方の重鎖定常領域(多量体化ペプチド不在)を発現し、同様にそのＮ末端で重鎖可変領域または異種ポリペプチドに融合し、これがシグナル配列に融合している。これら重鎖発現単位は、会合を促進するために天然IgG配列の異なる修飾を有する。このような修飾は、部位特異的変異誘発またはカセット式変異誘発のような方法で導入でき、またはデノボ核酸合成で導入される。軽鎖発現単位(抗体産生のため)は、抗体の標準的発現のように、Ｎ末端からＣ末端方向でシグナルペプチド、可変領域および軽鎖定常領域を含む。
【０１０４】
数個の要素をコードする構築物の構築において実施する遺伝要素の融合の順番は重要ではない。例えば、重鎖可変領域をコードするDNAセグメントは、IgG重鎖定常領域をコードするDNAと結合でき、続いてこれを多量体化ペプチドをコードするDNAと結合でき、または重鎖定常領域をコードするセグメントと多量体化ペプチドを、最初に互いに結合できる。これらセグメントを、重複ＰＣＲタイプ反応において各セグメントをコードする重複オリゴヌクレオチドの連結により同時に結合することもできる。実際面では、本発明の重鎖定常領域をコードする発現単位が産生されたら、重鎖成分の全てをコードするDNAセグメントを再構築することなく、同一発現単位を使用して任意の重鎖可変領域または融合タンパク質(そして時々軽鎖可変領域)の場合他の結合領域を挿入できる。
【０１０５】
哺乳動物細胞は、本発明の抗体または融合タンパク質をコードするヌクレオチドセグメントの発現に好ましい宿主である(Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987)参照)。インタクトな異種タンパク質を分泌できる多数の適当な宿主細胞株が当分野で開発されており、CHO細胞株、多様なCOS細胞株、HeLa細胞、HEK293細胞、Ｌ細胞ならびにSp2／0およびNS0を含む非抗体産生骨髄腫を含む。好ましくは、細胞は非ヒトである。好ましくは、本発明の抗体または融合タンパク質はモノクローナル細胞株から発現される。
【０１０６】
これらの細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、エンハンサーのような発現制御配列(Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986))およびリボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写ターミネーター配列のような必要なプロセシング情報部位を含み得る。好ましい発現制御配列は、内在性遺伝子、サイトメガロウイルス、SV40、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなど由来のプロモーターである。Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992)参照。
【０１０７】
細胞を、発現すべき抗体または融合タンパク質をコードする１個以上のベクターでトランスフェクトする。多鎖抗体のために、重鎖および軽鎖を同一または異なるベクター上で発現させ得る。多特異性複合体の発現のために、複合体の複数成分(すなわち、異なる抗体または融合タンパク質)をコードするDNAは同一ベクター上にあっても異なるベクター上にあってもよい。
【０１０８】
抗体または融合タンパク質鎖は発現され、シグナルペプチドを除去するために処理され、集合させ、宿主細胞から分泌される。異なる重鎖の会合、重鎖と軽鎖の会合(抗体の場合)および抗体または融合タンパク質単位の多量体化は、抗体または融合タンパク質が主に多量体として、特に三量体化ペプチドを使用したとき三量体として(または四量体化または五量体化ペプチドを使用するならば四量体または五量体として)分泌されるように、細胞内で少なくとも優勢的に起こる。
【０１０９】
抗体または融合タンパク質を、慣用の抗体精製方法により細胞培養上清から精製できる。精製は、親和性物質としてプロテインＡまたはプロテインＧを使用するクロマトグラフィー工程を含む。イオン交換、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフまたはHPLCのような慣用の抗体精製法も使用できる(一般的に、Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)を参照)。
【０１１０】
VII. 標的
上記重鎖修飾および多量体化ペプチドが組み込まれた抗体または融合タンパク質は、任意の標的分子に対して製造できる。本抗体または融合タンパク質は、標的タンパク質の会合が望ましい応答を誘発する表面結合性標的タンパク質(例えば、細胞またはウイルス上)に対して特に有用である。望ましい応答は、例えば、標的を担持する細胞またはウイルスの浄化、受容体を介するシグナル伝達、例えば、アポトーシスまたは細胞分裂停止の誘発、リガンドまたは対抗受容体への受容体結合阻害または毒性物質とコンジュゲートした抗体または融合タンパク質の内在化であり得る。抗体または融合タンパク質は、既存の市販抗体または融合タンパク質と同一の標的に対して製造でき、または既存の定常領域が本発明の重鎖定常領域で置き換えられた市販の抗体または融合タンパク質の誘導体化バージョンであり得る。本抗体または融合タンパク質はまた、表面結合抗原に結合する標的リガンドへの結合によっても、表面結合抗原を凝集できる。
【０１１１】
一つの可能性のある作用機構を説明するために、本発明の重鎖定常領域が組み込まれ、腫瘍壊死因子(TNF)受容体スーパーファミリーのメンバーに対する特異性を有する抗体または融合タンパク質を作製する。このような受容体は、シグナル伝達のために三量体化を必要とする。本発明の抗体または融合タンパク質が多価であるため(例えば、二量体、三量体または四量体)、細胞表面上の抗原を多量体化できる。三量体化TNF受容体スーパーファミリーメンバーは細胞質において腫瘍壊死因子受容体関連因子(TRAFs)と複合体を形成し、TNF受容体ファミリーメンバー担持細胞のNF-κBおよびストレス活性化タンパク質キナーゼ(SAPキナーゼ)細胞内シグナル経路およびまたアポトーシスの活性化、増殖停止、分化および増殖(スーパーファミリーメンバーによる)を含む広範な細胞応答の誘発に至る(Bradley and Pober, Oncogene 20:6482-6491, 2001; Baker and Reddy, Oncogene 17:3261-3270, 1998; Chung et al., J. Cell Sci. 115:679-688, 2002; Hildebrand et al., Immunol. Rev. 244:55-74, 2011)。所望により、本発明の抗体または融合タンパク質は、対照抗体または融合体(下に定義)がシグナル伝達しない(すなわち、無関係な対照抗体と区別不可能なバックグラウンドレベル)状況における表面上でTNF受容体スーパーファミリーを担持する細胞はシグナル伝達を誘発する。ある本発明の抗体または融合タンパク質について、シグナル(上記応答のいずれかについて評価)は、対照抗体または融合タンパク質より少なくとも２倍、５倍、１０倍、５０倍または１００倍高い。癌または他の疾患を処置するためのこのような多価抗体または融合タンパク質の効力は、癌のマウス異種移植モデルまたは他の適切な動物疾患モデルで試験できる。
【０１１２】
TNF受容体スーパーファミリーのメンバーに結合する、ある本発明の抗体または融合タンパク質は、腫瘍細胞上に発現される抗原を認識し、該腫瘍細胞のアポトーシスおよび／または増殖停止を誘発する。好ましくは、このような本発明の抗体または融合タンパク質はCD30、TNFRI(CD120a)、FAS(CD95)、DR3、DR4(CD261)、DR5(CD262)またはDR6(CD358)と結合する。より好ましくは、本発明の抗体または融合タンパク質は、TNF受容体スーパーファミリーメンバーを担持する腫瘍細胞(例えば、ラモス細胞)のアポトーシスを、１００ng／ml未満または１０ng／ml未満のEC５０で誘発する。本発明の抗体または融合タンパク質がアポトーシスを誘発する能力は、対照抗体または融合タンパク質(すなわち、同一の可変領域およびIgG領域を有するが、ヘテロ二量体型Fc対Fc相互作用および多量体形成ポリペプチドについての変異を欠く抗体または同様に同一の結合領域およびIgG領域を有するが、ヘテロ二量体型Fc対Fc相互作用および多量体形成ポリペプチドについての変異を欠く融合タンパク質)と比較できる。本発明の抗体または融合タンパク質が１００ng／ml未満のEC５０でアポトーシスを誘発する条件下で、対照抗体または融合タンパク質は、１０００ng／mlを超えるEC５０でアポトーシスを誘発する場合があり、あるいはアポトーシスを誘発しない(すなわち、無関係な陰性対照抗体と区別不可能なレベル)場合もある。
【０１１３】
TNF受容体スーパーファミリーのメンバーに結合する他の本発明の抗体または融合タンパク質は、受容体の三量体化を起こし、該TNF受容体スーパーファミリーメンバーを担持する免疫細胞(例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、好中球、NK細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、マクロファージまたは樹状細胞)を活性化し、これは次に挙げる１つ以上の結果をもたらす：良好な生存および細胞のさらなる増殖ならびに該細胞によるサイトカインおよび表面分子の高い産生(Watts, Annu. Rev. Immunol. 23:23-68, 2005; Grewal and Flavell, Annu. Rev. Immunol. 16:111-135, 1998; Hehlgans and Pfeffer, Immunology 115:1-20, 2005)。より好ましくは、このような本発明の抗体または融合タンパク質は、TNF受容体スーパーファミリーの免疫共刺激分子(例えば、CD40、OX40、CD27、CD30、HVEM、GITRおよび4-1BB)に結合する。一例では、本発明の抗体または融合タンパク質が免疫細胞を活性化する能力を、表面上のCD23、CD54またはCD95の発現の測定により対照抗体または融合タンパク質(すなわち、同一の可変領域およびIgG領域を有するが、ヘテロ二量体型Fc対Fc相互作用および多量体形成ポリペプチドについての変異を欠く抗体または同様に同一の結合領域およびIgG領域を有するが、ヘテロ二量体型Fc対Fc相互作用および多量体形成ポリペプチドについての変異を欠く融合タンパク質)と比較できる(Henriquez et al., J. Immunol. 162:3298-3307, 1999)。本発明の抗体または融合タンパク質が免疫細胞のCD95発現を５倍以上増加させる条件下で、対照抗体または融合タンパク質は、CD95発現を２倍未満増加させることがある。癌または他の疾患を処置するためのこのような多価抗体の効力を、癌のマウス異種移植モデルまたは他の適切な動物モデルで試験できる。
【０１１４】
本発明の他の抗体または融合タンパク質は正常細胞または悪性細胞の表面上に発現されているCD19、CD20、CD21、CD22、CD37、CD38またはCD45に結合し、架橋結合により抗原を多量体化し、抗原担持細胞の細胞死または増殖停止を誘発する(Ghetie et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 94:7509-7514, 1997; Rossi et al. Cancer Res. 68:8384-8392, 2008; Lapalombella et al. Cancer Cell 21:694-708, 2012; Lund et al. Int. Immunol. 18:1029-1042, 2006; Steff et al. Crit. Rev. Immunol. 23:421-440, 2003)。
【０１１５】
もう一つの機構を説明するために、本発明の重鎖定常領域が組み込まれ、免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、好中球または樹状細胞の表面上に発現される抗原に対する特異性を有する抗体または融合タンパク質を作製した。このような抗体は、免疫細胞の表面上の抗原を多量体化し、正常または異常シグナル伝達を誘発できる。あるいは、このような抗体は、細胞表面抗原の内在化を誘発できる。このような免疫細胞の機能は、抗原、細胞のタイプおよび結合しているエピトープによって増強または抑制され、免疫系の調節に至る。免疫障害を処置するためのこのような抗体の効力を、免疫障害の適切なインビトロ系または動物モデルで試験する。
【０１１６】
もう一つの機構を説明するために、本発明の重鎖定常領域が組み込まれ、感染性細菌、酵母、真菌またはウイルスのような病原体により発現される抗原に対する特異性を有する抗体または融合タンパク質作成する。抗体は、感染性微生物またはウイルスを(例えば、ADCC、CDC、オプソニン作用によりまたは病原体と細胞受容体の間の相互作用阻害によりまたは抗体に結合した毒性部分の作用により)中和する。感染症を処置するためのこのような抗体の効力を、感染症の適切なインビトロ系または動物モデルで試験できる。
【０１１７】
目的の標的は、癌細胞上の受容体およびそれらのリガンドまたは対抗受容体(例えば、CD3、CD20、CD22、CD30、CD34、CD40、CD44、CD52 CD70、CD79a、DR4、DR5、EGFR、CA-125／Muc-16、MC1受容体、PEM抗原、gp72、EpCAM、Her-2、VEGFまたはVEGFR、ガングリオシドGD3、CEA、AFP、CTLA-4、αvβ3、HLA-DR10β、SK-1)である。他の目的の標的は、自己免疫疾患に介在する自己抗体またはＴ細胞サブセットである。他の目的の標的は増殖因子受容体(例えば、FGFR、HGFR、PDGFR、EFGR、NGFRおよびVEGFR)およびそれらのリガンドである。他の標的はプロテインＧ受容体であり、サブスタンスＫ受容体、アンギオテンシン受容体、αおよびβアドレナリン受容体、セロトニン受容体およびＰＡＦ受容体を含む。例えば、Gilman, Ann. Rev. Biochem. 56:625 649 (1987)参照。他の標的は、イオンチャネル(例えば、カルシウムチャネル、ナトリウムチャネル、カリウムチャネル)、ムスカリン受容体、アセチルコリン受容体、GABA受容体、グルタミン酸受容体およびドーパミン受容体を含む(Harpold、米国特許5,401,629および米国特許5,436,128参照)。他の標的は、インテグリン、セレクチンおよび免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーのような接着タンパク質である(Springer, Nature 346:425 433 (1990). Osborn, Cell 62:3 (1990); Hynes, Cell 69:11 (1992)参照)。他の標的は、インターロイキン(IL)-1からこれまでのおよそIL-37まで、腫瘍壊死因子、インターフェロンおよび腫瘍増殖因子β、コロニー刺激因子(CSF)および顆粒球単球コロニー刺激因子(GM-CSF)のようなサイトカインならびに細胞死受容体ファミリーメンバー、特にDR4またはDR5である。Human Cytokines: Handbook for Basic &amp; Clinical Research (Aggrawal et al. eds., Blackwell Scientific, Boston, Mass. 1991)参照。他の標的は、Aβ、αシヌクレインまたはプリオンペプチドのようなアミロイド形成ペプチドである。他の標的は、ホルモン、酵素および細胞内ならびにアデニルシクラーゼ、グアニルシクラーゼおよびホスホリパーゼＣのような細胞間メッセンジャーである。標的分子はヒト、哺乳動物または細菌であり得る。他の標的は、ウイルスおよび細菌の両者である微生物病原体および腫瘍由来のタンパク質、糖タンパク質および炭水化物のような抗原である。他の標的は、CD40、OX40、4-1BB、GITRおよびCD27のような共刺激分子である。このような分子の刺激は免疫系を刺激し、癌または感染因子に対する免疫療法のために有用である。
【０１１８】
市販の抗体およびそれらの標的のいくつかの例は、アレムツズマブ、CD52、リツキシマブ、CD20、トラスツズマブHer／neu、ニモツズマブ、セツキシマブ、EGFR、ベバシズマブ、VEGF、パリビズマブ、RSV、アブシキシマブ、GpIIb／IIIa、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ、ゴリムマブTNF-α、バシリキシマブ、ダクリズマブ、IL-2、オマリズマブ、IgE、ゲムツズマブ、CD33、ナタリズマブ、VLA-4、ベドリズマブα4β7、ベリムマブ、BAFF、オテリキシズマブ、テプリズマブCD3、オファツムマブ、オクレリズマブCD20、エピラツズマブCD22、アレムツズマブCD52、エクリズマブC5、カナキヌマブIL-1β、メポリズマブIL-5、レスリズマブ、トシリズマブIL-6R、ウステキヌマブ、ブリアキヌマブIL-12、23を含む。市販の融合タンパク質の例は、TNF-αに結合するエタネルセプト、アレファセプト(CD2に結合するLFA3−Fc融合体)、BAFFおよびAPRILに結合するTACI-Fc融合体、アバタセプト(CD80およびCD86に結合するCTLA-4-Fc)およびロミプロスチム(Fcに融合したトロンボポエチンのペプチドアナログ)である。市販の抗体または融合タンパク質のいずれも、修飾して、既存の重鎖定常領域を本発明の重鎖定常領域で置き換えることができる。あるいは、本発明の重鎖定常領域領域を、上記市販の抗体または融合タンパク質のいずれかのように、同一標的特異性(例えば、競合アッセイで決定して)を有する他の抗体と結合できる。
【０１１９】
VIII. イムノコンジュゲート
抗体または融合タンパク質を毒性物質とコンジュゲートできる。毒性物質は、細胞毒性または細胞増殖抑制性であり得る。毒性物質のいくつかの例は、抗チューブリン剤、オーリスタチン、DNA副溝結合剤、DNA複製阻害剤、アルキル化剤(例えば、シスプラチン、モノ(白金)、ビス(白金)および三核白金複合体およびカルボプラチンのような白金複合体)、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸剤、代謝拮抗剤、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、カンプトテシン、エトポシド、フッ素化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソウレア、プラチノール、予備成形(pre-forming)化合物、プリン代謝拮抗剤、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどを含む。多様な放射性核種が、放射線がコンジュゲートした抗体の産生のために利用可能である。例は、２１２Bi、１３１Ｉ、１３１In、９０Ｙおよび１８６Reを含む。抗体と毒性物質のコンジュゲートは、Ｎ−サクシニミジル−３−(２−ピリジルジチオール)プロピオネート(SPDP)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二機能性誘導体(例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ)、活性エステル(例えばジサクシニミジルスベラート)、アルデヒド(例えばグルタラルデヒド)、ビス−アジド化合物(例えばビス(ｐ−アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス−ジアゾニウム誘導体(例えばビス−(ｐ−ジアゾニウムベンゾイル)−エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えばトルエン２,６−ジイソシアネート)およびビス−活性フッ素化合物(例えば１,５−ジフルオロ−２,４−ジニトロベンゼン)のような多様な二機能性タンパク質カップリング剤を使用して製造できる。毒性物質を、細胞内条件下で切断可能であり得るリンカーにより抗体と結合させることもできる(US2003-0083263、2005-0238649および2005-0009751)。上記毒性物質の多くは、細胞内に内在化したときのみ有効であるか、最も有効である。本発明の抗体または融合タンパク質は、細胞受容体への結合により内在化され得て、例えば、細胞受容体の架橋は内在化を促進できる。
【０１２０】
IX. 処置法および医薬組成物
本発明の抗体または融合タンパク質を、上記の市販の抗体が使用されている癌を含む、癌の処置に使用できる。本方法は、固形腫瘍および特に白血病(例えば、Ｔ細胞大型顆粒リンパ球白血病)、リンパ腫(ホジキンまたは非ホジキン)または多発性骨髄腫のような血液系腫瘍の処置に使用できる。固形腫瘍は、皮膚(例えば、黒色腫)、卵巣、子宮内膜、膀胱、乳房、直腸、結腸、胃、膵臓、肺、胸腺、腎臓および脳の腫瘍を含む。
【０１２１】
本発明の抗体および融合タンパク質は、上記の市販の抗体が利用しているものを含む、多様な望ましくない免疫応答の抑制にも使用できる。
【０１２２】
本発明の抗体または融合タンパク質により処置可能な免疫障害の一つのカテゴリーは移植片拒絶である。同種細胞または臓器(例えば、皮膚、腎臓、肝臓、心臓、肺、膵臓および骨髄)を宿主に移植したとき(すなわち、送り手と受け手は同一種の異なる個体である)、宿主免疫系は、移植片における外来性抗原に対する免疫応答(宿主対移植片病)を開始し、移植組織の破壊に至る可能性がある。本発明の抗体は、とりわけ、受け手における同種抗原誘発免疫応答の遮断に有用である。
【０１２３】
本発明の抗体または融合タンパク質の関連用途は、“移植片対宿主”病(GVHD)に関与する免疫応答の調節である。GVHDは、免疫適格細胞を同種レシピエントに導入したときに生じる、致死の可能性のある疾患である。この状況で、ドナーの免疫適格性細胞は、レシピエントの組織を攻撃し得る。皮膚、腸上皮および肝臓の組織が頻繁に標的となり、GVHDの経過中に破壊され得る。本疾患は、骨髄移植のような免疫組織が移植されるとき特に深刻な問題を起こすが、低重症度GVHDがまた心臓および肝移植片を含む他の症例でも同様に報告されている。
【０１２４】
免疫抑制が望ましいさらなる状況は、Ｉ型糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、全身硬直症候群、リウマチ性関節炎、重症筋無力症およびエリテマトーデスのような自己免疫疾患の処置にある。これらの疾患において、生体は、自身の抗原の一つに対する細胞性および／または体液性免疫応答を発現させ、その抗原の破壊ならびに壊滅的および／または致死的となり得る結果に至る。自己免疫疾患を、本発明の抗体または融合タンパク質の一つの投与により処置する。
【０１２５】
本発明の抗体または融合タンパク質により処置可能な他の免疫障害は喘息、アレルギー、セリアック病、乾癬およびブドウ膜炎を含む。セリアック病、乾癬およびブドウ膜炎は自己免疫疾患である。
【０１２６】
本抗体または融合タンパク質はまたウイルス、細菌、原生動物または真菌感染症のような病原性感染症の処置にも使用できる。ウイルス感染症のいくつかの例は、HIV、肝炎(Ａ、ＢまたはＣ)、ヘルペスウイルス(例えば、VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II、CMVおよびエプスタイン・バーウイルス)、アデノウイルス、XMRV、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、HTLVウイルス、デングウイルス、MLV関連ウイルス、パピローマウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、JCウイルスおよびアルボウイルス脳炎ウイルスを含む。細菌感染症のいくつかの例は、クラミジア、リケッチア性細菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌および淋菌(conococci)、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、テタヌス、ボツリヌス中毒、炭疽、ペスト、レプトスピラ症、ライム病細菌、連鎖球菌またはナイセリアを含む。病原性真菌のいくつかの例は、カンジダ、アスペルギルス、クリプトコッカス、ヒストプラズマ、ニューモシスチスおよびスタキボトリス属を含む。原生動物の例は、クリプトスポリジウム、ランブル鞭毛虫およびマラリア原虫を含む。
【０１２７】
抗体または融合タンパク質を、障害の徴候または症状の少なくとも１個の発症を遅延させ、重症度を軽減させ、さらなる悪化を阻止しおよび／または回復させる投与量、投与経路および投与頻度を意味する、有効なレジメで投与する。患者がすでに障害に罹患しているならば、このレジメは、治療に有効なレジメということができる。患者が、一般集団と比較して障害のリスクが高まっているが、まだ症状を経験していないならば、本レジメは、予防に有効なレジメということができる。ある状況において、治療または予防効力が、同一患者における歴史的対照または過去の経験と比較して、一患者で観察できる。他の状況において、治療または予防効力を、前臨床試験または臨床試験において、未処置患者の対照集団と比較した処置患者の集団で証明できる。
【０１２８】
抗体または融合タンパク質の投与量の例は、０.０１〜２０mg／kg体重または０.５〜５mg／kg体重または０.０１〜１mg／kg体重または０.０１〜０.５mg／kg体重または０.０５〜０.５mg／kg体重(例えば０.１mg／kg、０.５mg／kg、１mg／kg、２mg／kg、３mg／kg、４mg／kgまたは５mg／kg)または固定投与量として１０〜１５００mgである。投与量は、数ある因子の中で、特に患者の状態およびもし行っていれば以前の処置に対する応答、処置が予防的であるかまたは治療的であるかおよび障害が急性であるかまたは慢性であるかによる。
【０１２９】
投与は非経腸、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔内または筋肉内であり得る。静脈内投与または皮下投与による全身循環系への投与が好ましい。静脈内投与は、例えば、３０〜９０分のような期間の点滴により得る。
【０１３０】
投与頻度は、数ある因子の中で、特に血中での抗体または融合タンパク質の半減期、患者の状態および投与経路による。頻度は、患者の状態または処置する障害の進行の変化に応じて、毎日、毎週、毎月、四半期毎または不規則な間隔であり得る。静脈内投与の頻度の例は、連続的処置過程の間、毎週から３ヶ月毎の間であるが、より高頻度または低頻度の投薬も可能である。皮下投与について、投薬頻度の例は毎日から毎月であるが、より高頻度または低頻度の投薬も可能である。
【０１３１】
投与する投薬数は障害が急性であるか慢性であるか、および処置に対する障害の応答による。急性障害または慢性障害の急性増悪に対しては、１〜１０投与量がしばしば十分である。所望により分割された形態の単回ボーラス投与量が、急性障害または慢性障害の急性増悪に十分であることがある。急性障害または急性増悪の再発について処置を反復できる。慢性障害に対して、抗体を、少なくとも１年、５年もしくは１０年または患者の生涯にわたり、一定間隔で、例えば、毎週、隔週、毎月、３ヶ月毎、６ヶ月毎に投与し得る。
【０１３２】
非経腸投与用医薬組成物は好ましくは無菌かつ実質的等張であり、GMP条件下に製造される。医薬組成物は、単位投与量形態(すなわち、１回投与用投与量)で提供できる。医薬組成物は、１種以上の生理学的に許容される担体、希釈剤、添加物または助剤を使用して製剤できる。製剤は選択した投与経路による。注射用には、抗体を、好ましくはハンクス液、リンゲル液または生理食塩水のような生理学的に適合性の緩衝液または酢酸緩衝液(注射部位の不快感を軽減するため)中の水溶液として製剤できる。溶液は、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤のような製剤化剤を含み得る。あるいは、抗体は、使用前に適当な媒体、例えば、無菌発熱性物質除去水で再構成するための凍結乾燥形態であり得る。
【０１３３】
本発明の抗体での処置を、処置する障害に対して有効な他の処置と組み合わせ得る。免疫障害の処置のために、慣用の処置は肥満細胞脱顆粒阻害剤、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症剤および強力な抗炎症剤、例えばアザチオプリン、シクロホスファミド、ロイケラン、FK506およびシクロスポリンを含む。生物学的抗炎症剤、例えばタイサブリ(登録商標)(ナタリズマブ)またはヒュミラ(登録商標)(アダリムマブ)も使用できる。癌の処置に使用するとき、本発明の抗体は化学療法、放射線、幹細胞処置、手術またはHER2抗原に対するハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)、VEGFに対するアバスチン(登録商標)(ベバシズマブ)もしくはアービタックス(登録商標)(セツキシマブ)およびベクティビックス(登録商標)(パニツムマブ)のようなEGF受容体に対する抗体のような他の生物製剤での処置と組み合わせ得る。化学療法剤はクロラムブシル、シクロホスファミドまたはメルファラン、カルボプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシンおよびミトキサントロン、メトトレキサート、フルダラビンおよびシタラビン、エトポシドまたはトポテカン、ビンクリスチンおよびビンブラスチンを含む。感染症に対して、処置は抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤または抗原生動物剤などと組み合わせ得る。
【０１３４】
Ｘ. 他の適用
本抗体または融合タンパク質を臨床的診断もしくは処置の状況または研究においてその標的分子の検出のために使用できる。例えば、本抗体を使用して、患者が処置の可能性のある免疫介在障害を有する指標として、癌関連抗原を検出できる。本抗体はまた多様な刺激に対する標的およびその応答の検出の実験研究のための研究試薬としても販売できる。このような用途では、抗体または融合タンパク質を蛍光分子、スピン標識分子、酵素または放射性同位体で標識でき、アッセイの実施に必要な全試薬を含むキットの形で提供できる。本抗体または融合タンパク質はまた、例えば、親和性クロマトグラフィーによるその標的抗原の精製のためにも使用できる。
【０１３５】
上にまたは下に引用する全ての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、受託番号などは、各個々の記事が特異的におよび個々に引用により包含されると示したのと同程度に、全ての目的で、その全体を引用により本明細書に包含させる。配列の異なるバージョンが、違う時期にある受託番号と結び付けられるならば、本出願の有効な出願日当時に当該受託番号と結び付けられたバージョンを意味する。有効な出願日とは、適用可能であるならば受託番号を言及している実際の出願日または優先権出願のいずれか早い方を意味する。同様に、異なるバージョンの刊行物、ウェブサイトなどが違う時期に公開されたならば、特に断らない限り、本願の有効な出願日の直近に公開されたバージョンを意味する。本発明のあらゆる特色、工程、要素、態様または面を、他に具体的に異なって指示されない限り、任意の他のものと組み合わせ得る。本発明を、明確さおよび理解の目的で、説明および例示として若干詳細に記載しているが、ある変化および修飾を添付する特許請求の範囲の範囲内で実施し得ることは明らかである。
【実施例】
【０１３６】
実施例１：三量体IgG抗体のための発現ベクター
本研究における遺伝子クローニング、突然変異誘発およびプラスミド構築は、Sambrook and Russel(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)、Kostelny et al.(Int. J. Cancer 93:556-565, 2001)、Cole et al.(J. Immunol. 159:3613-3621, 1997)およびTsurushita et al.(Methods 36:69-83, 2005)に記載されているような、標準的分子生物学技術を用いて実施した。
【０１３７】
抗ヒトデスレセプター４(DR4；別名Apo2、TRAIL受容体１およびTNFRSF10A)モノクローナルIgG1／λ抗体YON007を産生するマウスハイブリドーマを、免疫原としてヒトγ１重鎖のFc領域に融合したヒトDR4の細胞外領域(DR4-Fc)(配列番号１)を使用し、GenomONE CF EX細胞融合試薬(Cosmo Bio, Carlsbad, CA)(US61／679,045)のような標準的ハイブリドーマ技術に従って、JN Biosciences(Mountain View, CA)で製造した。それぞれHuYON007 VHおよびVLを産生するためのYON007 VH領域およびVL領域のヒト化を、Tsurushita et al.(supra)に記載の方法により実施した。
【０１３８】
HuYON007 VHをコードする遺伝子を、コード領域の３'末端にスプライスドナーシグナル、フラグメントの５'末端にSpeI部位およびフラグメントの３'末端にHindIII部位を含むエクソンとして合成した。シグナルペプチドを含むHuYON007 VHのアミノ酸配列は、MNRLTSSLLLLIVPAYVLSQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCTRRGEYGNFDYWGQGTLVTVSS(配列番号２)である。成熟HuYON007 VH配列は、配列番号２の２０位から始まる。
【０１３９】
HuYON007 VLをコードする遺伝子を、コード領域の３'末端にスプライスドナーシグナル、フラグメントの５'末端にNheI部位およびフラグメントの３'末端にEcoRI部位を含むエクソンとして合成した。HuYON007 VLのアミノ酸配列はMAWISLILSLLALSSGAISQTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSSGAVTTSNFANWVQQTPGQAPRGLIGGTNNRAPGVPDRFSGSLLGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVL(配列番号３)である。成熟HuYON007 VL配列は配列番号３の２０位から始まる。
【０１４０】
ヒト化抗ヒトDR4 IgG1／λ抗体(HuYON007)の産生のための哺乳動物発現ベクターpHuYON007(図１)は、次の遺伝成分を含む。図１におけるpHuYON007のSalI部位から時計方向に進んで、プラスミドは、抗体重鎖遺伝子の転写を開始するためのヒトサイトメガロウイルス(CMV)主要前初期プロモーターおよびエンハンサー(図のCMV-P)から始まる重鎖転写単位を含む。CMVプロモーターの後は、SpeI部位およびHindIII部位と隣接したヒト化抗ヒトDR4モノクローナル抗体HuYON007の重鎖可変領域(VH)をコードするエクソン、介在するイントロンを伴うCH1エクソン、ヒンジエクソン、CH2エクソンおよびCH3エクソンを含むヒトγ１重鎖定常領域を含むゲノム配列およびヒトγ１重鎖遺伝子のポリアデニル化部位である。重鎖遺伝子配列の後、軽鎖転写単位はCMVプロモーターおよびエンハンサー(CMV-P)から始まり、NheI部位およびEcoRI部位と隣接したヒト化抗ヒトDR4モノクローナル抗体HuYON007の軽鎖可変領域(VL)をコードするエクソン、前にイントロンを伴うヒトλ鎖定常領域エクソン(Cλ)を含むゲノム配列およびCλエクソン後のヒトλ鎖遺伝子のポリアデニル化部位が続く。軽鎖遺伝子の後は、SV40初期プロモーター(SV40-P)、ピューロマイシン耐性のためのピューロマイシンＮ−アセチル−トランスフェラーゼ遺伝子(puro)およびSV40ポリアデニル化部位を含むセグメント(SV40-A)である。最後に、pHuYON007は、細菌複製起点(pUC ori)およびβラクタマーゼ遺伝子(βラクタマーゼ)を含むプラスミドpUC19の一部を含む。図中の矢印は転写の方向を示す。pHuYON007において、CH1領域、ヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域を含む重鎖定常領域のアミノ酸配列は、ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号４)である。
【０１４１】
三量体IgG抗体の発現のために、pHuYON007における重鎖遺伝子を、最初に２種の異なる方法で修飾した。得られた発現ベクター(pHuYON007-H；図１)の２個のうち１個に、３個のアミノ酸置換(３６６位でThrからSer、３６８位でLeuからAlaおよび４０７位でTyrからVal；それぞれT366S、L368AおよびY407V)を、CH3領域に部位特異的突然変異誘発により導入した。Kabat et al.(Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991)によるEu番号付けを、ヒトγ重鎖におけるアミノ酸位置の指定のために使用する。pHuYON007-Hから発現された、修飾されたγ重鎖は、ヘテロ二量体型Fc対Fc相互作用のためのノブ−イントゥ−ホール構造のホールとして働く(Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26-35, 1997)。pHuYON007-Hでコードされる修飾重鎖定常領域のアミノ酸配列は、ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号５)である。発現ベクターpHuYON007-Hを、G418での選択のために、ピューロマイシンＮ−アセチル−トランスフェラーゼ遺伝子(puro)をネオマイシン耐性遺伝子(neo)に置き換えることによりさらに修飾した。得られたプラスミドをpHuYON007-H-neoと名づけた(図１)。
【０１４２】
他の構築物(pHuYON007-K；図１)において、１アミノ酸置換(３６６位のThrからTrp；T366W)をCH3領域に導入した。T366W変異を担持する重鎖定常領域は、ヘテロ二量体型Fc対Fc相互作用のためのノブ−イントゥ−ホール構造のノブとして作用した(Atwell et al., supra)。pHuYON007-Kでコードされる修飾重鎖定常領域のアミノ酸配列はASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号６)である。
【０１４３】
pHuYON007-Kでコードされる重鎖遺伝子を、CH3領域のカルボキシル末端で、ポリペプチドリンカーと、続くホモ三量体を形成できる(Harbury et al. Nature 371:80-83, 1994)、イソロイシンジッパーとして知られるポリペプチドを融合することによりさらに修飾した。得られた発現ベクターをpHuYON007-K-ILE(図１)と名づけた。pHuYON007-K-ILEでコードされる修飾重鎖定常領域のアミノ酸配列はASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGGSGGGSMKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGERAG(配列番号７)である。
【０１４４】
pHuYON007-HおよびpHuYON007-H-neoでコードされる重鎖は、アミノ酸配列が互いに同一である。pHuYON007-H、pHuYON007-H-neoおよびpHuYON007-Kでコードされる軽鎖は、アミノ酸配列が互いに同一である。pHuYON007-H(またはpHuYON007-H-neo)から発現される重鎖およびpHuYON007-Kから発現される重鎖は、優先的にFc対Fcヘテロ二量体型分子を形成する(Atwell, supra)。pHuYON007-H(またはpHuYON007-H-neo)およびpHuYON007-Kからの重鎖および軽鎖が同時に細胞で発現されたら、各々pHuYON007-H(またはpHuYON007-H-neo)由来の１個のHuYON007重鎖、pHuYON007-K由来の１個のHuYON007重鎖および２個のHuYON007軽鎖からなる単量体HuYON007抗体(HuYON007-KH；図２Ａに模式的に説明)が産生される。
【０１４５】
pHuYON007-H、pHuYON007-H-neoおよびpHuYON007-K-ILEでコードされる軽鎖は、アミノ酸配列が互いに同一である。pHuYON007-H(またはpHuYON007-H-neo)から発現される重鎖およびpHuYON007-K-ILEから発現される重鎖は、優先的にFc対Fcヘテロ二量体型分子を形成する(Atwell, supra)。pHuYON007-H(またはpHuYON007-H-neo)およびpHuYON007-K-ILE由来の重鎖および軽鎖が同時に細胞で発現されたとき、各々pHuYON007-H由来の１個のHuYON007重鎖、pHuYON007-K由来の１個のHuYON007重鎖-ILEおよび２個のHuYON007軽鎖からなるHuYON007抗体(HuYON007-THB；図２Ｂに単量体として模式的に説明)が産生される。さらに、HuYON007-THB抗体は、pHuYON007-K-ILEから生じた重鎖のCH3領域のカルボキシル末端に融合したイソロイシンジッパーのホモ三量体会合のために、三量体を形成する(Harbury et al., supra)。三量体HuYON007-THBの構造は図２Ｃに模式的に説明する。
【０１４６】
実施例２：三量体抗DR4 IgG抗体の発現
発現ベクターpHuYON007-HおよびpHuYON007-K-ILEを、製造業者のプロトコールに従いリポフェクタミン２０００試薬(Invitrogen, Carlsbad, CA)を使用して、個々にまたは一緒にヒト胚性腎細胞株HEK293にトランスフェクトした。HEK293細胞を１０％ウシ胎児血清(FBS; HyClone, Logan, UT)含有DME培地で、３７℃で、７.５％ＣＯ２インキュベーターで増殖させた。一過性に発現されたHuYON007抗体を含む培養上清を、５〜５,０００キロダルトン(kDa)の球状タンパク質の分離範囲を有するスーパーロース6 10/300 GLカラムを用いるAKTA Basic FPLCシステムを使用するゲル濾過により分画した(GE Healthcare, Indianapolis, IN)。PBS(リン酸緩衝化食塩水、pH７.４)を溶出緩衝液として使用した。
【０１４７】
各スーパーロース６フラクションにおけるHuYON007抗体の存在を、サンドイッチELISAにより分析した。典型的な実験において、ELISAプレートを、PBS中ヤギ抗ヒトγ重鎖ポリクローナル抗体で被覆し、洗浄緩衝液(０.０５％Tween 20含有PBS)で洗浄し、そしてブロッキング緩衝液(２％脱脂乳および０.０５％Tween 20含有PBS)でブロックした。洗浄緩衝液で洗浄後、ELISA緩衝液(１％脱脂乳および０.０２５％Tween 20含有PBS)で適当に希釈した試験サンプルをELISAプレートに適用した。ELISAプレートを１時間、室温でインキュベートし、洗浄緩衝液で洗浄後、結合したHuYON007抗体を、HRP結合ヤギ抗ヒトλ鎖ポリクローナル抗体を使用して検出した。インキュベーションおよび洗浄後、ABTS基質の添加により発色を開始させ、２％シュウ酸で停止させた。吸光度を４０５nmで読んだ。
【０１４８】
pHuYON007-H単独をHEK293細胞にトランスフェクトしたとき、IgG1／λ抗体の存在についてのELISAシグナルの単一主要ピークが、pHuYON007-Hで産生される単量体HuYON007 IgG抗体の予測されたサイズである約１５０kDaタンパク質に対応するスーパーロース６フラクションで観察された。これは、ホール変異を有するFc領域が、互いに会合してFc対Fcホモ二量体型分子を形成できるという、Atwell et al.(supra)の観察と一致する。
【０１４９】
pHuYON007-K-ILEのみをHEK293細胞にトランスフェクトしたとき、約２５０kDaタンパク質に対応するELISAシグナルのピークがスーパーロース６フラクションで観察された。HEK293細胞でpHuYON007-K-ILEで産生されるHuYON007抗体の主要な種は、各重鎖のカルボキシル末端でのイソロイシンジッパーの存在により、互いに会合して三量体を形成する３個の軽鎖(各約２５kDa)と３個の重鎖(各約５５kDa)からなる可能性がある。
【０１５０】
pHuYON007-HとpHuYON007-K-ILEをコトランスフェクトしたとき、IgG1／λ抗体の存在についてのELISAシグナルの主要なピークが、約５００kDaタンパク質に対応するスーパーロース６フラクションで観察され、それゆえに、各々pHuYON007-H由来の３個の重鎖、pHuYON007-K-ILE由来の３個の重鎖および６個のHuYON007軽鎖からなる三量体HuYON007抗体(図２Ｃ)の形成が示された。
【０１５１】
実施例３：三量体抗DR4 IgG抗体の精製および特徴づけ
発現ベクターpHuYON007-H-neoおよびpHuYON007-K-ILEを、チャイニーズハムスター卵巣細胞株CHO-K1(ATCC, Manassas, VA)の染色体に共に導入し、HuYON007-THBを安定に産生する細胞株を得た。別に、発現ベクターpHuYON007-HおよびpHuYON007-KをCHO-K1細胞にコトランスフェクトして、HuYON007-KHを産生する細胞株を得た。
【０１５２】
CHO-K1細胞をSFM4CHO培地(HyClone)で、３７℃で、７.５％ＣＯ２インキュベーター中で増殖させた。CHO-K1への安定なトランスフェクションをエレクトロポレーションにより実施した。トランスフェクション前、各発現ベクターを、FspIを使用して直線化した。典型的な実験において、約１０７細胞を２０μgの直線化プラスミドでトランスフェクトし、SFM4CHO培地に懸濁し、そして細胞を適当に希釈した後、数個の９６ウェルプレートに播種した。４８時間後、安定なトランスフェクタントの単離用に適切な選択培地を添加した。選択開始約１０日後、トランスフェクタントの培養上清を抗体産生についてアッセイした。
【０１５３】
HuYON007抗体の発現を、上記のとおりのサンドイッチELISAにより測定した。適切なヒトまたはヒト化IgG／λ抗体を標準として使用した。HuYON007-THBおよびHuYON007-KHの各々を産生する安定なCHO-K1トランスフェクタントを、細胞生存能が５０％未満となるまでSFM4CHOで拡張した。遠心分離および濾過後、培養上清を４℃で保存した。抗体精製のために、培養上清をプロテインＡカラム(HiTrap MABSelect SuRe, GE Healthcare, Piscataway, NJ)に載せた。カラムをPBSで洗浄し、その後抗体を０.１Ｍ  グリシン−HCl(pH３.０)で溶出した。溶出抗体の緩衝液を１Ｍ  Tris-HCl(pH８)で中和し、その後透析によりPBSに変えた。抗体濃度を２８０nmの吸光度の測定により決定した(１mg／ml＝１.４OD)。
【０１５４】
天然形態の精製HuYON007-KHおよびHuYON007-THBの分子サイズを、上記のとおりスーパーロース６カラムを使用するゲル濾過により分析した。１個の支配的ピークが精製HuYON007-KHについて観察された。分子サイズマーカーの溶出パターンと比較したとき、天然形態のHuYON007-KHのサイズは約１５０kDaと概算され、これは、２個の重鎖と２個の軽鎖からなる単量体ヒトIgG1抗体のサイズと一致する。精製HuYON007-THBは溶出パターンで２個のピークを示し、単量体HuYON007-THB抗体のサイズである約１６０kDaに対応する小ピーク(図２Ｂ)と三量体HuYON007-THB抗体のサイズに一致する約６００kDaに対応する大ピーク(図２Ｃ)である。三量体HuYON007-THB抗体を、さらなる分析のためにスーパーロース６カラムを使用するゲル濾過により分画した。精製HuYON007-HKおよび三量体HuYON007-THB抗体のスーパーロース６溶出パターンを、分子量標準(図３Ａ)と対比させてそれぞれ図３Ｂおよび３Ｃに示す。
【０１５５】
変性条件下のSDS-PAGE分析は、三量体HuYON007-THBが３個のポリペプチドからなることを示した。約５５kDaの最大ポリペプチドは、pHuYON007-K-ILEから発現される重鎖に対応する。約５０kDaの二番目に大きなポリペプチドは、pHuYON007-Hから発現される重鎖に対応する。５５kDaバンドと５０kDaバンドの強度は、互いに極めて類似した。約２５kDaの最小ポリペプチドは、pHuYON007-K-ILEおよびpHuYON007-Hの両者から発現される軽鎖に対応する。HuYON007-KHは、変性条件下のSDS-PAGE分析で２個のポリペプチドからなるように見えた。約５０kDaの最大ポリペプチドは２個の異なる、しかしほぼ同一の、pHuYON007-KおよびpHuYON007-Hから発現される重鎖に対応する。約２５kDaの小さなポリペプチドは、HuYON007軽鎖に対応する。
【０１５６】
実施例４：三量体抗DR4抗体によるアポトーシスの誘発
ヒトバーキットリンパ腫細胞株ラモスは、細胞表面にDR4を発現する(Daniel et al. Blood:110:4037-4046, 2007)。架橋結合による表面上のDR4の多量体化が細胞のアポトーシスを誘発することが知られている(Griffith et al. J. Immunol. 162:2597-2605, 1999)。ラモス細胞(CRL-1596; ATCC, Manassas, VA)を、１０％FBS含有DME培地で、３７℃で７.５％ＣＯ２インキュベーター中増殖させた。精製HuYON007-KH(図２Ａ)および三量体HuYON007-THB(図２Ｃ)が表面上のDR4の架橋結合によりラモス細胞のアポトーシスを誘発する能力を評価するために、これら２種の精製HuYON007抗体の各々を、２個ずつのウェルで多様な濃度でラモス細胞とインキュベートした。一夜インキュベーション後、細胞生存能を、製造者のプロトコールに従い、アラマーブルー(Invitrogen)で測定した。細胞生存能パーセントを、試験抗体存在下の吸光度値を、試験抗体非存在下の吸光度値に対して標準化することにより計算した。無細胞での吸光度値をバックグラウンドとして使用した。三量体HuYON007-THBは、HuYON007-KHよりも効率的にラモス細胞のアポトーシスを誘発した(図４)。アポトーシスを誘発するEC５０値は、三量体HuYON007-THBで６ng／mlであり、HuYON007-KHで１,０００ng／mlを超え、それゆえに三量体抗DR4抗体によるアポトーシスの効率的な誘発が示される。
【０１５７】
実施例５：三量体六価抗DR4抗体の異なる形態の発現、精製および特徴づけ
三量体IgG抗体の異なる形態の発現を、pHuYON007-K-ILEにおけるイソロイシンジッパーのコード領域を、TNFスーパーファミリーメンバー(Bodmer et al., Trends Biochem. Sci. 27:19-26, 2002; Croft et al., Nat. Rev. Drug Discovery 12:147-168, 2013)、コレクチン(Hakansson et al., Protein. Sci. 9:1607-1617, 2000)およびテトラネクチン(Nielsen et al., FEBS Lett. 412:388-396, 1997)を含むＣ型レクチン(Zelensky, FEBS J. 272:6179-6217, 2055)ならびにコラーゲン(Hulmes, J. Struc. Biol. 137:2-10, 2002)由来の三量体形成ドメインを含む他の三量体化ペプチドのコード領域に置き換え、このような修飾重鎖遺伝子をpHuYON007-Hにおける重鎖および軽鎖遺伝子と共に発現させることにより達成できる。
【０１５８】
本発明の三量体IgG抗体のもう一つの例を得るために、pHuYON007-K-ILEにおけるイソロイシンジッパーコード領域を、可溶性ヒト腫瘍壊死因子(TNF；別名TNFSF1A)をコードするDNAフラグメントに置き換えた。さらに、TNFの８７位のアミノ酸をTyrからSerに変え(Y８７Ｓ)、三量体を形成させる能力を失わせることなく、TNF受容体との相互作用を排除した(Zhang et al., J. Mol. Biol. 267:24069-24075, 1992)。得られた発現ベクターをpHuYON007-K-TNF(図１)と名づけた。pHuYON007-K-TNFにおける修飾重鎖定常領域のアミノ酸配列はASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGGGSVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSSQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL(配列番号８)である。
【０１５９】
pHuYON007-HおよびpHuYON007-K-TNFからの重鎖および軽鎖の同時発現は、各々、単量体としてpHuYON007-H由来の１個の重鎖、pHuYON007-K-TNF由来の１個の重鎖および２個のHuYON007軽鎖からなるHuYON007抗体(HuYON007-THA)を生じることが予測される(図２Ｂ)。HuYON007-THAは、pHuYON007-K-TNFから発現された重鎖に融合したTNFのホモ三量体会合により三量体(図２Ｃ)を形成する。
【０１６０】
HuYON007-THAを安定に生じるCHO-K1細胞を、上記のとおりpHuYON007-HおよびpHuYON007-K-TNFのコトランスフェクションにより得た。HuYON007-THA抗体を、上記のとおりプロテインＡカラムクロマトグラフィーを使用して精製した。上記のとおりのスーパーロース６カラムを使用するゲル濾過分析は、溶出パターンに２個の主要なピークを示し、一方のピークは単量体HuYON007-THA抗体に対応する約１８０kDa(図２Ｂ)および他方のピークは三量体HuYON007-THA抗体に対応する約６４０kDa(図２Ｃ)であった。
【０１６１】
三量体サイズに対応するプロテインＡ−精製HuYON007-THA抗体を、スーパーロース６カラムを使用するゲル濾過により分画した。このような分画HuYON007-THA抗体の変性条件下のSDS-PAGE分析は、三量体HuYON007-THAが３個のポリペプチドからなることを示した。これらのサイズは約６５kDa、５０kDaおよび２５kDaであり、それぞれpHuYON007-K-TNFから発現される重鎖、pHuYON007-Hから発現される重鎖およびHuYON007軽鎖のサイズに対応する。
【０１６２】
三量体HuYON007-THAがラモス細胞のアポトーシスを誘発する能力を、実施例４に記載のとおり分析した。ラモス細胞の生存能は、１,０００ng／mlの三量体HuYON007-THAと一夜インキュベーション後２０％未満であった。ラモス細胞を１,０００ng／mlのHuYON007-KH存在下一夜インキュベートしたとき、生存能は、本アッセイでほぼ１００％であった。この結果は、本発明の三量体IgG抗体が細胞のアポトーシスを効率的に誘発できることを再確認する。
【０１６３】
実施例６：二重特異性三量体抗体
本発明の三量体IgG抗体を、例えば、発現ベクターpHuYON007-Hを次の方法で修飾することにより、一本鎖Fv(scFv)形式で産生できる(Ahmad et al., Clin. Dev. Immunol. 2012:980250, 2012)。
【０１６４】
CMVプロモーター(CMV-P)およびポリアデニル化部位を含む、HuYON007軽鎖のための転写単位を、最初にpHuYON007-Hで除去し、次いでVH、CH1およびヒンジをコードする領域を、５’から３’方向で、シグナルペプチド、成熟HuYON007 VL、可動性ポリペプチドリンカー、成熟HuYON007 VH、ポリペプチドリンカーおよびヒトγ１ヒンジ領域(HuYON007.scFv-ヒンジ)をコードするエクソンに置き換える。AgeI部位をVH領域とヒンジコード領域の間に置く。シグナルペプチドを含むHuYON007.scFv-ヒンジのアミノ酸配列は、MAWISLILSLLALSSGAISQTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSSGAVTTSNFANWVQQTPGQAPRGLIGGTNNRAPGVPDRFSGSLLGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCTRRGEYGNFDYWGQGTLVTVSSTGGGEPKSCDKTHTCPPCP(配列番号９)である。成熟ポリペプチドは、配列番号９の２０位から始まる。
【０１６５】
得られたプラスミド、pHuYON007.scFv-Hの模式的構造を図５に示す。pHuYON007.scFv-Hでコードされる成熟HuYON007 scFv-Fc融合タンパク質のアミノ酸配列は、QTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSSGAVTTSNFANWVQQTPGQAPRGLIGGTNNRAPGVPDRFSGSLLGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCTRRGEYGNFDYWGQGTLVTVSSTGGGEPKSCDKTHTCPPCPASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLSSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号１０)である。
【０１６６】
プラスミドpHuYON007.scFv-Hを、CH3エクソンを、pHuYON007-K-ILEのCH3領域およびイソロイシンジッパーをコードするエクソンに置き換えることによりさらに修飾して、pHuYON007.scFv-K-ILEを産生する(図５)。pHuYON007.scFv-K-ILEでコードされる、イソロイシンジッパーに融合した成熟HuYON007 scFv-Fc(HuYON007 scFv-Fc-ILE)のアミノ酸配列は、QTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSSGAVTTSNFANWVQQTPGQAPRGLIGGTNNRAPGVPDRFSGSLLGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCTRRGEYGNFDYWGQGTLVTVSSTGGGEPKSCDKTHTCPPCPASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGGSGGGSMKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGERAG(配列番号１１)である。
【０１６７】
プラスミドpHuYON007.scFv-Hは、ヘテロ二量体型Fc−Fc相互作用のためのノブ−イントゥ−ホール構造のホール機能を有するHuYON007 scFv-Fc(H)融合タンパク質を産生する(Atwell et al., supra)。プラスミドpHuYON007.scFv-K-ILEは、ヘテロ二量体型Fc−Fc相互作用のためのノブ−イントゥ−ホール構造のノブ機能を有するHuYON007 scFv-Fc(K)-ILE融合タンパク質を産生する(Atwell et al., supra)。pHuYON007.scFv-HおよびpHuYON007.scFv-K-ILEの両者が同時にCHO-K1のような細胞に導入されたとき、pHuYON007.scFv-Hから発現されるHuYON007 scFv-Fc(H)融合タンパク質およびpHuYON007.scFv-K-ILEから発現されるHuYON007 scFv-Fc(K)-ILE融合タンパク質がヘテロ二量体型HuYON007.scFv抗体を形成する。さらに、このようなヘテロ二量体型scFv抗体は、イソロイシンジッパーによるホモ三量体形成のために、三量体六価HuYON007.scFv抗体を形成する。
【０１６８】
二重特異性三量体scFv抗体の発現のために、pHuYON007.scFv-HにおけるVHコード領域およびVLコード領域を、最初に、例えば、ヒトデスレセプター５(DR5；別名TRAIL受容体１およびTNFRSF10B)に対する抗体のVHコード領域およびVLコード領域と置き換える。これにより得られたpADR5.scFv-Hと名づけた発現ベクターは、ノブ−イントゥ−ホール構造のホール機能を有する抗DR5 scFv-Fc融合タンパク質(ADR5 scFv-Fc(H))を生じる。細胞においてscFv抗体がpADR5.scFv-HおよびpHuYON007.scFv-K-ILEから同時に発現されたとき、ADR5 scFv-Fc(H)はHuYON007 scFv-Fc(K)-ILEと会合して二重特異性抗体を形成し、これは、HuYON007 scFv-Fc(K)-ILEのカルボキシル末端のイソロイシンジッパーの存在により、さらに三量体を形成する。このように産生された三量体scFv抗体は、DR4とDR5の両者に結合する。
【０１６９】
実施例７：三量体Fc融合タンパク質
この研究の本発明は、三量体Fc融合タンパク質の産生に適用可能である。例えば、pHuYON007.scFv-H(図５)におけるVL領域、リンカー領域およびVH領域をコードするSpeI-AgeIフラグメントを、ヒトTNF受容体II型(TNFR-II；別名CD120bおよびTNFRSF1b)の細胞外領域をコードするSpeI-AgeIフラグメントに置き換えて、pTNFR-Fc-Hと名づけた新規発現ベクターを構築する。ヒトTNFR-IIの細胞外領域の、ノブ−イントゥ−ホール構造(Atwell et al., supra)のホール機能を有するヒトγ1 Fc領域への融合タンパク質(TNFR-Fc(H))は、細胞においてpTNFR-Fc-Hで産生される。TNFR-IIの細胞外領域をコードする同じSpeI-AgeIフラグメントを、pHuYON007-K-ILEのSpeI-AgeIフラグメントの置き換えにも使用して、pTNFR-Fc-K-ILEを構築する。さらにイソロイシンジッパーと融合させた、ヒトTNF-R-IIの細胞外領域の、ノブ−イントゥ−ホール構造(Atwell et al., supra)のノブ機能を有するヒトγ1 Fc領域への融合タンパク質(TNFR-Fc(K)-ILEは、細胞においてpTNFR-Fc-K-ILEで産生される。細胞におけるTNFR-Fc(H)融合タンパク質とTNFR-Fc(K)-ILE融合タンパク質の同時発現により、各々３個のTNFR-Fc(H)ポリペプチドおよび３個のTNFR-Fc(K)-ILEポリペプチドからなる三量体六価Fc融合タンパク質が産生される。
【０１７０】
pTNFR-Fc-K-ILEにおけるTNFR-IIの細胞外領域をコードするSpeI-AgeIフラグメントを、さらに、例えば、ヒトIL-1受容体Ｉ型(IL1RA；別名CD121A)の細胞外領域をコードするSpeI-AgeIフラグメントと置き換えて、新規発現ベクターpIL1RA-Fc-K-ILEを構築する。さらにイソロイシンジッパーと融合させた、ヒトIL1RAの細胞外領域のノブ−イントゥ−ホール構造(Atwell et al., supra)のノブ機能を有するヒトγ1 Fc領域への融合タンパク質(IL1RA−Fc(K)-ILE)は、細胞においてpIL1RA-Fc-K-ILEで産生される。細胞におけるTNFR-Fc(H)とIL1RA−Fc(K)-ILEの同時発現により、３個のTNFR-Fc(H)ポリペプチドおよび３個のIL1RA−Fc(K)-ILEポリペプチドからなる三量体六価Fc融合タンパク質が産生される。このような三量体Fc融合タンパク質は、一方はTNFに、他方はIL-1に特異的である、リガンド結合について二特異性を有する。
【０１７１】
実施例８：多量体IgG抗体およびFc融合タンパク質
多量体IgG抗体およびFc融合タンパク質を、pHuYON007-K-ILEおよびpTNFR-Fc-K-ILEのような発現ベクターにおける三量体化ペプチドを、多量体化ペプチドと置き換えて、先の実施例に記載のものと同様の方法で産生する(Grigoryan et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 18:477-483, 2008; Lupas, Trends Biol. Sci. 21:375-382, 1996)。
【０１７２】
四量体IgG抗体は、pHuYON007-K-ILEのような発現ベクターにおける三量体化ペプチドを、四量体化ペプチドに置き換えることにより産生する。四量体化ペプチドの例は、テトラブラチオン(Stetefeld et al., Naure Struc. Biol. 7:772-776, 2000)、修飾GCN4ロイシンジッパー(Harbury et al., Science 262:1401-1407, 1993)およびセンダイウイルスリン酸化タンパク質(Tarbouriech et al., Nature Struc. Biol. 7:777-781, 2000)である。細胞における、四量体化ペプチドがCH3ドメインのカルボキシル末端に結合したこのように修飾されたpHuYON007-K-ILE(pHuYON007-K-Tet)と、pHuYON007-Hの共発現は、各々、pHuYON007-K-Tetから発現されたノブ機能を有する１個のHuYON007重鎖、pHuYON007-H由来のホール機能を有する１個のHuYON007重鎖および２個のHuYON007軽鎖を含む、HuYON007抗体の産生に至る。このように産生されたHuYON007抗体は、pHuYON007-K-Tetで産生された重鎖のCH3領域のカルボキシル末端に結合した四量体化ペプチドのホモ四量体会合により、さらに四量体を形成する。
【０１７３】
細胞における、四量体化ペプチドがCH3ドメインのＣ末端に結合した修飾pTNFR-Fc-K-ILEベクター(pTNFR-Fc-K-Tet)と、pTNFR-Fc-Hの共発現は、各々、pTNFR-Fc-K-Tetから発現されたノブ機能を有する１個のTNFR-Fc融合タンパク質およびpTNFR-Fc-H由来のホール機能を有する１個のTNFR-Fc融合タンパク質からなる、TNFR-Fc融合タンパク質の産生に至る。このようなヘテロ二量体型TNFR-Fc融合タンパク質は、さらに、pTNFR-Fc-K-Tetで産生されるFc融合タンパク質のCH3領域のカルボキシル末端に結合した四量体形成ポリペプチドのホモ四量体会合により、四量体を形成する。
【０１７４】
他のタイプの多量体IgG抗体およびFc融合タンパク質を、上記と同じ方法で産生する。五量体IgG抗体およびFc融合タンパク質の産生のために、五量体化ペプチド、例えば、Trpジッパータンパク質(別名Trp-14；Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:16156-16161. 2004)および軟骨オリゴマー基質タンパク質(COMP；Malashkevich et al., Science 274:761-765, 1996)を、pHuYON007-K-ILEおよびpTNFR-Fc-K-ILEのような発現ベクターにおける三量体化ペプチドの代わりに使用する。六量体IgG抗体およびFc融合タンパク質については、CC-Hex(Zaccai et al., Nature Chem. Biol. 7:935-941, 2011)のような六量体化ペプチドを代わりに使用する。
【０１７５】
実施例９：三量体抗OX40 IgG抗体
OX40(別名CD134およびTNFRSF4)は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーである。抗ヒトOX40モノクローナルIgG1／κ抗体OHX10を産生するマウスハイブリドーマは、免疫原として細胞表面上に組み換えヒトOX40の細胞外領域(配列番号１４)を発現するマウスNS0骨髄腫細胞株を使用し、標準的ハイブリドーマ技術に従い、JN Biosciences(Mountain View, CA)で産生した。OHX10 VHおよびVLのアミノ酸配列を、Tsurushita et al.(supra)により記載された方法のような、標準的実験法により決定した。シグナルペプチド配列を含むOHX10 VHのアミノ酸配列は、MGRLTSSFLLLIVPAYVLSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGVGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKYYNTALKSGLTISKDTSKNQVFLKIASVDTADTATYYCARIDWDGIAYWGQGTLVTVSA(配列番号１５)である。成熟OHX10 VHは、配列番号１５の２０位から始まる。Kabat et al.(supra)の定義に基づく、OHX10 VHのCDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列は、それぞれTSGVGVG(配列番号１６)、HIWWDDDKYYNTALKS(配列番号１７)およびIDWDGIAY(配列番号１８)である。シグナルペプチド配列を含むOHX10 VLのアミノ酸配列は、MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGQIVLSQSPAILSTSPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQEKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSNPWTFGGGTKLEIK(配列番号１９)である。成熟OHX10 VLは、配列番号１９の２３位から始まる。Kabat et al.(supra)の定義に基づく、OHX10 VLのCDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列は、それぞれRASSSVSYMH(配列番号２０)、ATSNLAS(配列番号２１)およびQQWSSNPWT(配列番号２２)である。
【０１７６】
OHX10 VHおよびVLのヒト化を、Tsurushita et al.(supra)に記載のとおり実施した。シグナルペプチドを含むヒト化OHX10(HuOHX10)VHのアミノ酸配列は、MGRLTSSFLLLIVPAYVLSQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDDKYYNTALKSGLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARIDWDGIAYWGQGTLVTVSS(配列番号２３)である。成熟HuOHX10 VH配列は、配列番号２３の２０位から始まる。シグナルペプチドを含むHuOHX10 VLのアミノ酸配列は、MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYMHWYQQKPGQAPRPWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPWTFGGGTKVEIK(配列番号２４)である。成熟HuOHX10 VL配列は、配列番号２４の２３位から始まる。
【０１７７】
HuOHX10 VHをコードする遺伝子(配列番号２５)を、コード領域の３'末端にスプライスドナーシグナル、フラグメントの５'末端にSpeI部位およびフラグメントの３'末端にHindIII部位を含むエクソンとして合成した。HuOHX10 VLをコードする遺伝子(配列番号２６)を、コード領域の３'末端にスプライスドナーシグナル、フラグメントの５'末端にNheI部位およびフラグメントの３'末端にEcoRI部位を含むエクソンとして合成した。三量体HuOHX10 IgG抗体の発現のために、２個の哺乳動物発現ベクター、pHuOHX10-K-ILEおよびpHuOHX10-Hを構築した。発現ベクターpHuOHX10-K-ILEおよびpHuOHX10-Hは、pHuOHX10-K-ILEおよびpHuOHX10-Hの両者で、(ａ)SpeI部位とHindIII部位の間で、HuYON007 VH遺伝子がHuOHX10 VH遺伝子に置き換えられており、(ｂ)NheI部位とEcoRI部位の間で、HuYON007 VL遺伝子がHuOHX10 VL遺伝子に置き換えられており、そして(ｃ)ヒトλ定常領域のコード領域が、ヒトκ定常領域のコード領域で置き換えられている以外、それぞれpHuYON007-K-ILEおよびpHuYON007-H(図１)に類似した構造を有する。
【０１７８】
pHuOHX10-K-ILEおよびpHuOHX10-Hでコードされる軽鎖(HuOHX10軽鎖)は、アミノ酸配列が互いに同一である。pHuOHX10-K-ILEおよびpHuOHX10-Hから発現される重鎖は、ノブ−イントゥ−ホール機構により優先的にFc対Fcヘテロ二量体型分子を形成する(Atwell, supra)。細胞においてpHuOHX10-K-ILEおよびpHuOHX10-Hからの重鎖および軽鎖が同時に発現されたとき、各々、pHuOHX10-K-ILE由来の１個の重鎖、pHuOHX10-H由来の１個の重鎖および２個のHuOHX10軽鎖からなる、HuOHX10抗体(HuOHX10-THB；図２Ｂに単量体として模式的に説明)が産生される。さらに、HuOHX10-THB抗体は、pHuOHX10-K-ILEで産生される重鎖のカルボキシル末端に融合したイソロイシンジッパーのホモ三量体会合により、三量体を形成する(Harbury et al., supra)。三量体HuOHX10-THBの構造は図２Ｃに模式的に説明する。
【０１７９】
ヒトIgG1／κ形態のHuOHX10の発現のためのもう一つのベクター(HuOHX10-IgG1)も構築した。得られた発現ベクター、pHuOHX10-IgG1は、(ａ)SpeI部位とHindIII部位の間で、HuYON007 VHエクソンがHuOHX10 VHエクソンに置き換えられており、(ｂ)NheI部位とEcoRI部位の間で、HuYON007 VLエクソンがHuOHX10 VLエクソンに置き換えられており、そして(ｃ)ヒトλ定常領域のコード領域が、ヒトκ定常領域のコード領域で置き換えられている以外、pHuYON007(図１)に類似する構造を有する。
【０１８０】
発現ベクターpHuOHX10-HおよびpHuOHX10-K-ILEを、チャイニーズハムスター卵巣細胞株CHO-K1(ATCC, Manassas, VA)の染色体に一緒に導入し、HuOHX10-THBを安定に発現する細胞株を得た。別に、発現ベクターpHuOHX10-IgG1をCHO-K1細胞にトランスフェクトして、HuOHX10-IgG1を産生する細胞株を得た。CHO-K1細胞への安定なトランスフェクションは上記のとおり実施した。HuOHX10抗体の発現を、結合した抗体をHRP結合ヤギ抗ヒトκ鎖ポリクローナル抗体を使用して検出した以外、上記のとおりのサンドイッチELISAにより測定した。HuOHX10-THBおよびHuOHX10-IgG1の各々を産生する安定なCHO-K1トランスフェクタントを、SFM4CHO培地で拡張した。HuOHX10-THB抗体およびHuOHX10-IgG1抗体を、上記のとおりプロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製した。HuOHX10-THB三量体を、上記のとおりスーパーロース６サイズ排除カラムを使用するさらなる分画により得た。
【０１８１】
精製したHuOHX10-IgG1および三量体HuOHX10-THBは、OX40発現細胞を使用するフローサイトメトリーにより、ヒトOX40に対する特異的結合を示した。変性条件下のSDS-PAGE分析は、精製三量体HuOHX10-THBが３個のポリペプチドからなることを示した。約５５kDaの最大ポリペプチドは、pHuOHX10-K-ILEから発現された重鎖に対応する。約５０kDaの二番目に大きなポリペプチドは、pHuOHX10-Hから発現される重鎖に対応する。５５kDaバンドと５０kDaバンドの強度は互いに類似した。約２５kDaの最小ポリペプチドは、pHuOHX10-K-ILEおよびpHuOHX10-Hの両者から発現される軽鎖に対応する。HuOHX10-IgG1は、変性条件下のSDS-PAGE分析において、２個のポリペプチドからなった。約５０kDaの大きなポリペプチドは重鎖に対応し、約２５kDaの小さなポリペプチドは軽鎖に対応する。
【０１８２】
天然形態の精製HuOHX10-IgG1および三量体HuOHX10-THBの分子サイズを、５〜５,０００キロダルトン(kDa)の球状タンパク質の分離範囲を有するスーパーロース6 10/300 GLカラムを用いるAKTA Basic FPLCシステムを使用するゲル濾過により分析した(GE Healthcare, Indianapolis, IN)。PBSを溶出緩衝液として使用した。分子サイズマーカーの溶出パターン(図７Ａ)と比較したとき、HuOHX10-IgG1のサイズは約１６０kDa(図７Ｂ)と概算され、これは、２個の重鎖と２個の軽鎖からなる単量体ヒトIgG1抗体のサイズに対応する。HuOHX10-THB三量体について、単一支配的ピークが１２.２mlの溶出で観察され(図７Ｃ)、これは、サイズマーカーの溶出パターン(図７Ａ)と比較したとき、三量体IgGの溶出のおおよその位置である。
【０１８３】
抗OX40抗体の共刺激活性を試験するために、表面上に組み換えヒトOX40を安定に発現するヒト皮膚Ｔリンパ球細胞株HuT-78(Cat No. TIB-161, ATCC, Manassas, VA)(HuT-78／OX40)をJN Biosciencesで産生した。HuT-78／OX40細胞の表面上のOX40の架橋結合は、細胞を抗CD3および抗CD28抗体で同時に処置したとき、IL-2産生を増加させることが知られている(US2008002498)。OX40の架橋結合はまた、CD3分子単独が同時に架橋しているとき、HuT-78／OX40細胞におけるIL-2産生を増加させる。
【０１８４】
１０％FBSを含む０.２mlのRPMI-1640培地中の１０万個のHuT-78／OX40細胞を、下に明記するように、１μg／ml  マウス抗ヒトCD3モノクローナル抗体(OKT3, Cat. No. 70-0030, Tonbo Biosciences, San Diego, CA)、５μg／ml  ヤギ抗マウスIgGポリクローナル抗体(Cat. No. 115-005-071, Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)および１μg／mlの試験抗OX40抗体の存在下、９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。バックグラウンド対照として、HuT-78／OX40細胞を、いずれの抗体も不含で増殖させた。３７℃で、７.５％ＣＯ２インキュベーターでの７２時間のインキュベーション後、培養上清のIL-2濃度をELISAにより測定した(Human IL-2 ELISA MAXTM Standard Kit, Cat No. 431801, BioLegend, San Diego, CA)。HuT-78／OX40細胞を、いずれの抗体も不含(すなわちCD3架橋結合無し)でインキュベートしたとき、培養上清におけるIL-2濃度は７８pg／ml未満であった。HuT-78／OX40細胞をOKT3およびヤギ抗マウスIgG抗体と共にインキュベートしたとき(すなわちCD3分子が架橋)、IL-2濃度は、抗OHX10抗体不在で１０３pg／ml、HuOHX10-IgG1存在下１０３pg／mlおよび三量体HuOHX10-THB存在下６２７pg／mlであった。それゆえに、本発明の三量体抗OX40 IgG抗体は、抗OX40 IgG抗体よりもはるかに効率的に、表面上のOX40分子の架橋結合によりＴ細胞におけるIL-2発現を誘発した。
【０１８５】
実施例１０：三量体抗CD40 IgG抗体
CD40(別名TNFRSF5)は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーである。抗ヒトCD40モノクローナルIgG1／κ抗体11D1を産生するマウスハイブリドーマを、免疫原としてヒトγ１重鎖のFc領域に融合したヒトCD40の細胞外領域(CD40-Fc)(配列番号２７)を使用し、標準的ハイブリドーマ技術に従い、JN Biosciences(Mountain View, CA)で産生した。11D1 VHおよびVLのアミノ酸配列を、Tsurushita et al.(supra)により記載された方法のような、標準的実験法により決定した。シグナルペプチド配列を含む11D1 VHのアミノ酸配列は、MDIRLSLAFLVLFIKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSMKLSCAASGFTFSYFPMAWVRQAPTKGLEWVATISTSGGNIYYRDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMNSLRSEDTATYYCTRDTAPYYFDYWGQGVMVTVSS(配列番号２８)である。成熟11D1 VHは、配列番号２８の２０位から始まる。Kabat et al.(supra)の定義に基づく、11D1 VHのCDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列は、それぞれYFPMA(配列番号２９)、TISTSGGNIYYRDSVKG(配列番号３０)およびDTAPYYFDY(配列番号３１)である。シグナルペプチド配列を含む11D1 VLのアミノ酸配列は、MRAHAQFLGLLLLWFPGARCDIQMTQSPSSISVSLGDRFTITCRASQDIGNYLNWYQQKPEKSPKLMIYRATNLEDGVPSRFSGSRSGSDYSLTINSLESEDTGFYFCVQHKQYPLTFGSGTKLEIK(配列番号３２)である。成熟11D1 VLは、配列番号３２の２１位から始まる。Kabat et al.(supra)の定義に基づく、11D1 VLのCDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列は、それぞれRASQDIGNYLN(配列番号３３)、RATNLED(配列番号３４)およびVQHKQYPLT(配列番号３５)である。
【０１８６】
11D1 VHおよびVLのヒト化を、Tsurushita et al.(supra)に記載のとおり実施した。シグナルペプチドを含むヒト化11D1(Hu11D1)VHのアミノ酸配列は、MDIRLSLAFLVLFIAGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYFPMAWVRQAPGKGLEWVATISTSGGNIYYRDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDTAPYYFDYWGQGTMVTVSS(配列番号３６)である。成熟Hu11D1 VH配列は、配列番号３６の２０位から始まる。シグナルペプチドを含むHu11D1 VLのアミノ酸配列は、MRAHAQFLGLLLLWFPGARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGNYLNWYQQKPGKAPKLLIYRATNLEDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCVQHKQYPLTFGGGTKVEIK(配列番号３７)である。成熟Hu11D1 VL配列は、配列番号３７の２１位から始まる。
【０１８７】
Hu11D1 VH(配列番号３８)およびHu11D1 VL(配列番号３９)の各々をコードする遺伝子を、実施例９に記載のとおり合成した。三量体Hu11D1 IgG抗体の発現のために、２個の哺乳動物発現ベクター、pHu11D1-K-ILEおよびpHu11D1-Hを構築した。発現ベクターpHu11D1-K-ILEおよびpHu11D1-Hは、(ａ)SpeI部位とHindIII部位の間で、HuOHX10 VH遺伝子がHu11D1 VHエクソンに置き換えられており、そして(ｂ)NheI部位とEcoRI部位の間で、HuOHX10 VLエクソンがHu11D1 VLエクソンに置き換えられている以外、それぞれ実施例９に記載するpHuOHX10-K-ILEおよびpHuOHX10-Hに類似する構造を有する。
【０１８８】
pHu11D1-K-ILEおよびpHu11D1-Hでコードされる軽鎖(Hu11D1軽鎖)は、アミノ酸配列が互いに同一である。pHu11D1-K-ILEおよびpHu11D1-Hから発現される重鎖は、優先的にFc対Fcヘテロ二量体型分子を形成する(Atwell, supra)。細胞においてpHu11D1-K-ILEおよびpHu11D1-Hからの重鎖および軽鎖が同時に発現されたとき、各々pHu11D1-K-ILEからの１個の重鎖、pHu11D1-Hからの１個の重鎖および２個のHu11D1軽鎖(Hu11D1-THB；図２Ｂに単量体として模式的に説明)からなるHu11D1抗体が産生される。さらに、Hu11D1-THB抗体は、pHu11D1-K-ILEで産生される重鎖のカルボキシル末端に融合したイソロイシンジッパーのホモ三量体会合により、三量体を形成する(Harbury et al., supra)。
【０１８９】
発現ベクターpHu11D1-K-ILEおよびpHu11D1-Hを、マウス骨髄腫細胞株NS0(European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire, UK)の染色体に同時に導入し、Hu11D1-THB抗体を安定に産生する細胞株を得た。NS0細胞を、１０％ウシ胎児血清(FBS; HyClone, Logan, UT)含有DME培地で、３７℃で、７.５％ＣＯ２インキュベーターで増殖させた。NS0細胞への安定なトランスフェクションは、Bebbington et al.(Bio/Technology 10: 169-175, 1992)に記載されているようなエレクトロポレーションにより実施した。トランスフェクション前、２個の発現ベクターを、FspIを使用して直線化した。典型的な実験において、約１０７細胞を２０μgの直線化プラスミドでトランスフェクトし、１０％FBS含有DME培地に懸濁し、数個の９６ウェルプレートに播種した。４８時間後、選択培地(１０％FBSおよび３μg／ml  ピューロマイシン含有DME培地)を適用した。培養上清におけるHu11D1-THBの発現を、実施例９に記載のようなサンドイッチELISAにより測定した。高レベルのHu11D1-THBを産生する安定なNS0トランスフェクタントを、ハイブリドーマSFM(Invitrogen)を使用して無血清培地で拡張した。Hu11D1-THB抗体を、プロテインＡ親和性カラムを使用して精製した。Hu11D1-THB三量体を、上記のとおりスーパーロース６サイズ排除カラムを使用するさらなる分画により得た。
【０１９０】
ヒトIgG1／κ形態のHu11D1の発現のためのもう一つのベクター(Hu11D1-IgG1)も構築した。得られた発現ベクター、pHu11D1-IgG1は、(ａ)SpeI部位とHindIII部位の間で、HuOHX10 VH遺伝子がHu11D1 VH遺伝子に置き換えられており、そして(ｂ)NheI部位とEcoRI部位の間で、HuOHX10 VL遺伝子がHu11D1 VL遺伝子に置き換えられている以外、pHuOHX10-IgG1と同一の構造を有する。発現ベクターpHu11D1-IgG1を、チャイニーズハムスター卵巣細胞株CHO-K1(ATCC, Manassas, VA)の染色体に導入して、Hu11D1-IgG1を安定に産生する細胞株を得た。CHO-K1細胞への安定なトランスフェクション、高抗体生産体の選択、無血清培地での拡張およびプロテインＡカラムを使用するHu11D1-IgG1抗体の精製は、上記のとおり実施した。
【０１９１】
ヒトバーキットＢリンパ腫細胞株ラモスは、表面上にCD40を発現する(Henriquez et al., J. Immunol. 162:3298-3307, 1999)。ラモス細胞の表面上のCD40と、可溶性三量体CD40リガンド(別名CD40L、CD154およびTNFSF5)の架橋結合は、CD95の高発現を誘発することが知られている(Henriquez et al., supra)。抗CD40抗体が抗原提示細胞を活性化する能力を試験するために、精製Hu11D1-THB三量体およびHu11D1-IgG1抗体を、１０００ng／mlから始まり、３倍連続希釈する多様な濃度で、３７℃で４８時間、７.５％ＣＯ２インキュベーター中、１０％FBS含有DME培地のラモス細胞と個々にインキュベートした。次いで、ラモス細胞をPE標識マウス抗CD95モノクローナル抗体(Cat. No. 305608, BioLegend, San Diego, CA)で染色し、細胞表面上のCD95の発現レベルを測定するためにフローサイトメトリーで分析した。図８は、各抗体濃度(ｘ軸)でのラモス細胞の幾何平均チャネル蛍光(MCF)のプロット(ｙ軸)を示す。図８に示すように、Hu11D1-IgG1は、１０００ng／mlでも、ラモス細胞上でCD95の発現を有意に誘発できない。他方で、本発明の三量体抗CD40 IgG抗体(Hu11D1-THB三量体)がCD95発現を誘発する能力は４.１ng／mlで明瞭に観察され、約１０ng／mlで最高レベルに達した。データの例として、抗体非存在下、１２.３ng／mlのHu11D1-IgG1および１２.３ng／mlのHu11D1-THB三量体存在下のラモス細胞増殖のMCF値は、それぞれ２.６、３.１および１５.７であった。
【０１９２】
実施例１１：三量体IgG抗体形成のためのCD40リガンドの使用
本発明の三量体IgG抗体のもう一つの例を得るために、pHuYON007-K-ILEにおけるイソロイシンジッパーコード領域を、ホモ三量体を形成することが知られる、TNFスーパーファミリーのメンバーであるヒトCD40Lの細胞外領域をコードするDNAフラグメントに置き換えた(Bodmer et al., Trends Biochem. Sci. 27:19-26, 2002)。さらに、CD40Lの１４３位のアミノ酸をLysからThr(K143T)に変えて、三量体を形成する能力を失うことなく、CD40との相互作用を排除した(An et al., J. Biol. Chem. 286:11226-11235, 2011)。K143T変異を有するヒトCD40Lの細胞外領域のアミノ酸配列は、GDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAETGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL(配列番号４０)である。得られた発現ベクターをpHuYON007-K-CD40Lと名づけた。この構築物において、γ重鎖のCH3ドメインにおけるカルボキシル末端リシン残基も除去した。pHuYON007-K-CD40Lにおける修飾重鎖定常領域のアミノ酸配列は、ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSGGGSGGGSGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAETGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL(配列番号４１)である。
【０１９３】
２個の発現ベクター、pHuYON007-HおよびpHuYON007-K-CD40Lを、実施例２に記載のようなリポフェクタミン2000試薬を使用してHEK293細胞に一緒にトランスフェクトした。pHuYON007-HおよびpHuYON007-K-CD40Lでコードされる軽鎖(HuYON007軽鎖)は、アミノ酸配列が互いに同一である。pHuYON007-K-CD40LおよびpHuYON007-Hから発現される重鎖は、優先的にFc対Fcヘテロ二量体型分子を形成する(Atwell, supra)。細胞において、pHuYON007-K-CD40LおよびpHuYON007-Hからの重鎖および軽鎖が同時にされるとき、各々pHuYON007-K-CD40L由来の１個の重鎖、pHuYON007-H由来の１個の重鎖および２個のHuYON007軽鎖(HuYON007-THF；図２Ｂに単量体として模式的に説明)からなるHuYON007抗体が産生される。さらに、HuYON007-THF抗体は、pHuYON007-K-CD40Lで産生された重鎖のカルボキシル末端に融合したCD40Lのホモ三量体会合により、三量体を形成する(図２Ｃにおいて模式的に説明)(Bodmer et al., supra)。
【０１９４】
pHuYON007-K-CD40LおよびpHuYON007-HでトランスフェクトしたHEK293細胞の培養上清をスーパーロース6 10/300 GLカラムを使用するゲル濾過により分画し、各フラクションにおけるHuYON007抗体の存在を、実施例２に記載するようなサンドイッチELISAにより分析した。HuYON007-THF抗体は、HuYON007-THF三量体の予測されるサイズに一致する、約６７０kDaに対応するフラクションで溶出した。
【０１９５】
実施例１２：二量体型IgG抗体
二量体型四価IgG抗体の発現のための新規ベクターを、pHuYON007-K-ILEにおけるイソロイシンジッパーのコード領域を、ホモ二量体を形成できるロイシンジッパーとして知られるポリペプチドをコードするDNAフラグメント(配列番号４２)に置き換えることにより構築した(Harbury et al., Science 262:1401-1407, 1993)。得られた発現ベクターをpHuYON007-K-LEUと名づけた。pHuYON007-K-LEUにおいてコードされる修飾重鎖定常領域のアミノ酸配列は、ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGGSGGGSHMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGERAG(配列番号４３)である。pHuYON007-K-LEUおよびpHuYON007-Hでコードされる軽鎖は、アミノ酸配列が互いに同一である。
【０１９６】
発現ベクターpHuYON007-HおよびpHuYON007-K-LEUを、上記トランスフェクション法によりチャイニーズハムスター卵巣細胞株CHO-K1(ATCC, Manassas, VA)の染色体に一緒に導入して、各単量体がpHuYON007-Hから発現される１個の重鎖、pHuYON007-K-Leuから発現される１個の重鎖およびpHuYON007-HおよびpHuYON007-K-Leuから発現される２個の軽鎖からなるHuYON007-THDを安定に産生する細胞株を得た。HuYON007-THD抗体は、pHuYON007-K-LEUで産生される重鎖のカルボキシル末端に融合したロイシンジッパーのホモ二量体型会合により二量体を形成する(Harbury et al., supra)。
【０１９７】
安定なCHO-K1トランスフェクタントにおけるHuYON007抗体の発現を、上記のとおりのサンドイッチELISAにより測定した。HuYON007-THDを産生する安定なCHO-K1トランスフェクタントをSFM4CHO培地で拡張した。プロテインＡおよびスーパーロース６カラムを用いる培養上清からのHuYON007-THDの精製を、上記のとおり実施した。
【０１９８】
HuYON007 IgG1単量体の発現のために、pHuYON007を、上記のとおりCHO-K1に安定にトランスフェクトした。HuYON007 IgG1を産生する安定なCHO-K1トランスフェクタントをSFM4CHO培地で拡張した。プロテインＡを用いる培養上清からのHuYON007 IgG1の精製を、上記のとおり実施した。
【０１９９】
変性条件下のSDS-PAGE分析は、精製HuYON007-THDが３個のポリペプチドからなることを示した。約５５kDaの最大ポリペプチドは、pHuYON007-K-LEUから発現される重鎖に対応する。約５０kDaの二番目に大きなポリペプチドは、pHuYON007-Hから発現される重鎖に対応する。５５kDaバンドと５０kDaバンドの強度は互いに類似した。約２５kDaの最小ポリペプチドは、pHuYON007-K-LEUおよびpHuYON007-Hの両者から発現される軽鎖に対応する。
【０２００】
天然形態の精製HuYON007-THDの分子サイズを、実施例２に記載のとおりスーパーロース６カラムを使用するゲル濾過により分析した。図９に示すように、精製HuYON007-THDは１３.６mlで溶出のピークを示し、これは、分子マーカーの溶出パターン(図３Ａ)に基づき、約４００kDaの分子サイズに対応する。これは二量体型HuYON007-THD抗体の予測されるサイズに対応する。同一溶出条件下、HuYON007-KH(単量体IgG)およびHuYON007-THB(三量体IgG)は、それぞれ１５.６mlおよび１２.５mlで溶出のピークを示した(図３ＢおよびＣ)。
【０２０１】
DR4介在アポトーシスを誘発する能力を評価するために、細胞表面上にDR4を発現するヒトバーキットリンパ腫細胞株ラモスを、HuYON007 IgG1(単量体IgG)、HuYON007-THD(二量体型IgG)またはHuYON007-THB(三量体IgG)存在下、２個ずつで増殖させた。一夜インキュベーション後、細胞生存能を、製造業者のプロトコールに従い、アラマーブルー(Invitrogen)で測定した。細胞生存能パーセントを試験抗体の非存在下の吸光度値(１００％生存能)に対して各試験抗体存在下の吸光度値を標準化することにより計算した。無細胞での吸光度値をバックグラウンドとして使用した(０％生存能)。ラモス細胞の生存能は、抗体濃度が１１１ng／mlであるとき、HuYON007 IgG1で７８.３％、HuYON007-THDで２９.２％およびHuYON007-THBで５.６％であった。抗体濃度が１２.３ng／mlであるとき、生存能はHuYON007-KHで８１.４％、HuYON007-THDで５１.８％およびHuYON007-THBで１０.３％であった。アポトーシスの誘発に関して、HuYON007-THD(二量体型IgG)はHuYON007-THB(三量体IgG)ほどには強力ではなかったが、HuYON007-THDはHuYON007(単量体IgG)より強力であった。
【０２０２】
実施例１３：四量体IgG抗体
四量体八価IgG抗体の発現のための新規ベクターを、pHuYON007-K-ILEにおけるイソロイシンジッパーのコード領域を、ホモ四量体を形成できるGCN4ロイシンジッパー由来のポリペプチドをコードするDNAフラグメント(配列番号４４)(ここではテトラジッパーと称す)に置き換えることにより構築した(Harbury et al., Science 262:1401-1407, 1993)。得られた発現ベクターをpHuYON007-K-Tetraと名づけた。pHuYON007-K-Tetraでコードされる重鎖定常領域のアミノ酸配列は、ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGGSGGGSHMKQIEDKLEEILSKLYHIENELARIKKLLGERAG(配列番号４５)である。pHuYON007-K-TetraおよびpHuYON007-Hでコードされる軽鎖は、アミノ酸配列が互いに同一である。
【０２０３】
発現ベクターpHuYON007-HおよびpHuYON007-K-Tetraを、上記のトランスフェクション法によりCHO-K1(ATCC, Manassas, VA)にコトランスフェクトし、各単量体がpHuYON007-Hから発現される１個の重鎖、pHuYON007-K-Tetraから発現される１個の重鎖およびpHuYON007-HおよびpHuYON007-K-Tetraから発現される２個の軽鎖からなるHuYON007-THGを安定に産生する細胞株を得た。HuYON007-THG抗体は、pHuYON007-K-Tetraで産生される重鎖のカルボキシル末端に融合したテトラジッパーのホモ四量体会合により、四量体を形成する(Harbury et al., supra)。
【０２０４】
プロテインＡカラムおよびスーパーロース６サイズ排除カラムを使用するHuYON007抗体の精製を上記のとおり実施した。変性条件下のSDS-PAGE分析は、精製HuYON007-THGが３個のポリペプチドからなることを示した。約５５kDaの最大ポリペプチドは、pHuYON007-K-Tetraから発現される重鎖に対応する。約５０kDaの二番目に大きなポリペプチドは、pHuYON007-Hから発現される重鎖に対応する。５５kDaバンドと５０kDaバンドの強度は互いに類似した。約２５kDaの最小ポリペプチドは、pHuYON007-K-TetraおよびpHuYON007-Hの両者から発現される軽鎖に対応する。
【０２０５】
天然形態の精製HuYON007-THGの分子サイズを、実施例２に記載のようなスーパーロース６カラムを使用するゲル濾過により評価した。精製HuYON007-THGは、分子マーカーの溶出パターンに基づき、約８００kDaの分子サイズに対応する、１１.８mlで溶出のピークを示した。これは四量体HuYON007-THG抗体の予測されるサイズと一致する。同一溶出条件下、HuYON007-KH(単量体IgG；図３Ｂ)、HuYON007-THD(二量体型IgG；図８)およびHuYON007-THB(三量体IgG；図３Ｃ)は、それぞれ１５.６ml、１３.６mlおよび１２.５mlで溶出のピークを示した。
【０２０６】
HuYON007-THGがラモスのDR4介在アポトーシスを誘発する能力を、実施例１２に記載のとおり試験した。ラモス細胞の生存能は、抗体濃度が６.２ng／mlのとき、HuYON007 IgG1でほぼ１００％およびHuYON007-THGで約６％であり、四量体HuYON007-THGが、単量体HuYON007 IgG1より効率的にDR4介在アポトーシスを誘発できることを示す。
【０２０７】
実施例１４：二重特異性三量体抗DR4／DR5 IgG抗体
標準的なハイブリドーマおよびヒト化の方法を使用してJN Biosciencesで産生したヒト化抗ヒトデスレセプター５(DR5；別名TRAIL受容体２、TNFRSF10B、CD262)IgG1／κモノクローナル抗体HuGOH729Sは先に報告されている(US20140037621)。HuGOH729Sの親抗体を産生するマウスハイブリドーマを、免疫原としてヒトγ１重鎖のFc領域に融合したヒトDR5の細胞外領域(DR5-Fc)(配列番号４６)を使用して産生した。シグナルペプチド配列を含むHuGOH729S VHのアミノ酸配列は、MEWCWVFLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIIHWVRQAPGQGLEWIGWFYPGNNNIKSNEKFKDRVTLTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARNEDNYGNFFGYWGQGTLVTVSS(配列番号４７)である。成熟HuGOH729S VHは配列番号４７の２０位から始まる。シグナルペプチド配列を含むHuGOH729S VLのアミノ酸配列は、MESQIQAFVFVFLWLSGVDGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVNTAAAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPYTFGQGTKLEIK(配列番号４８)である。成熟HuGOH729S VLは、配列番号４８の２１位から始まる。
【０２０８】
Fc領域にホール変異を有するHuGOH729S scFv-Fc融合タンパク質(配列番号４９)の発現のために、HuGOH729S VLおよびVHコード領域をpHuYON007.scFv-H(実施例６)にクローン化して、それぞれHuYON007 VLおよびVHコード領域を置き換えた。得られたプラスミドをpHuGOH729S.scFv-Hと名づけた。同様に、ノブ変異を有するFc領域にそしてさらにイソロイシンジッパーに融合したHuGOH729S scFv(配列番号５０)の発現のために、HuGOH729S VLおよびVHコード領域をpHuYON007.scFv-K-ILE(実施例６)にクローン化して、それぞれHuYON007 VLおよびVHコード領域を置き換えた。得られたプラスミドをpHuGOH729S.scFv-K-ILEと名づけた。
【０２０９】
HEK293細胞における一本鎖Fv抗体の一過性発現を、発現ベクターの次の４個の組み合わせを用いて、上記のとおり実施した。(１)007/007 scFv抗体を産生するpHuYON007.scFv-K-ILEおよびpHuYON007.scFv-H、(２)729/729 scFv抗体を産生するpHuGOH729S.scFv-K-ILEおよびpHuGOH729S.scFv-H、(３)007/729抗体を産生するpHuYON007.scFv-K-ILEおよびpHuGOH729S.scFv-Hおよび(４)729/007抗体を産生するpHuGOH729S.scFv-K-ILEおよびpHuYON007.scFv-H。
【０２１０】
これらの４個の抗体のDR4およびDR5への二重特異性結合を、次の形式のELISAにより試験した。マイクロタイタープレートのウェルをDR4-Fc(配列番号１)で被覆した。ブロッキング緩衝液でウェルをブロック後、適当に希釈したHEK293細胞の培養上清をウェルに適用し、１時間、室温でインキュベートした。洗浄緩衝液でウェルを洗浄後、ELISA緩衝液中のＣ末端でヒトλ２定常領域に融合した組み換えヒトDR5細胞外領域(DR5-Cλ；配列番号５１)をウェルに適用した。ELISAプレートを３０分、室温でインキュベートし、洗浄緩衝液でウェルを洗浄後、結合したDR5-CλをHRP結合ヤギ抗ヒトλ鎖ポリクローナル抗体により検出した。ABTS基質の添加により発色を開始させ、２％シュウ酸で停止させた。吸光度を４０５nmで読んだ。この形式のELISAで、DR4およびDR5の両者に結合できる二重特異性三量体IgG抗体の存在を示す強いシグナルが007/729抗体および729/007抗体の両者でのみ観察された。007/007抗体も729/729抗体も、顕著なELISAシグナルは何も生じなかった。
【０２１１】
二重特異性抗DR4／DR5抗体の存在は、異なる形式のELISAで確認された。マイクロタイタープレートのウェルをDR5-Fc(配列番号４６)で被覆した。ブロッキング緩衝液でウェルをブロック後、HEK293細胞の培養上清をウェルに適用し、１時間、室温でインキュベートした。洗浄緩衝液でウェルを洗浄後、ELISA緩衝液中、Ｃ末端でヒトλ２定常領域に融合した組み換えヒトDR4細胞外領域(DR4-Cλ；配列番号５２)をウェルに適用した。ELISAプレートで３０分、室温でインキュベートし、洗浄緩衝液で洗浄後、結合したDR4-CλをHRP結合ヤギ抗ヒトλ鎖ポリクローナル抗体により検出した。強いシグナルが007/729抗体および729/007抗体で観察され、二重特異性三量体抗DR4／DR5 IgG抗体の存在を示す。ELISAシグナルは、007/007抗体または729/729抗体では観察されなかった。
【０２１２】
実施例１５：TNF受容体スーパーファミリーのメンバーに対する多量体IgG抗体の産生、発現および特徴づけ
TNF受容体スーパーファミリーを、Human Genome Organization(HUGO)のような当分野の関係当局の慣習に従い使用し、とりわけTNFRI(CD120a)、TNFRII(CD120b)、LtβR(リンホトキシンβ受容体)、OX40(CD134)、CD40、FAS(CD95)、CD27、CD30、4-1BB(CD137)、DR3、DR4 (CD261)、DR5(CD262)、DR6(CD358)、DcR1(CD263)、DcR2(CD264)、DcR3、RANK(CD265)、OPG、Fn14(CD266)、TACI(CD267)、BAFFR(CD268)、BCMA(CD269)、HVEM(CD270)、LNGFR(CD271)、GITR(CD357)、TROY、RELT、EDARおよびXEDARを含む。これらの受容体のヒト形態が好ましいが、他の哺乳動物または他の種の同族体形式も使用できる。スーパーファミリーのメンバーは、２−６システイン・リッチモチーフの細胞外ドメインにより特徴付けられる。対応する三量体リガンドによる膜結合性TNF受容体スーパーファミリーメンバーの三量体化は細胞内シグナル伝達を誘発する(レビューのために、Hehlgans and Pfeffer, Immunology 115:1-20, 2005; Bossen et al., J. Biol. Chem. 281: 13964-13971, 2006; Tansey and Szymkowski, Drug Discovery Today 14: 23-24, 2009を参照のこと)。
【０２１３】
TNF受容体スーパーファミリーのメンバーに対するモノクローナル抗体を、標準ハイブリドーマ法により賛成する。単離モノクローナル抗体のVH遺伝子およびVL遺伝子の各々のコード領域は、上記のとおりのシグナルペプチドコード配列、スプライスドナーシグナルおよび隣接制限酵素部位を含むエクソンに変換される。このように構築されたVH遺伝子およびVL遺伝子を、上記のとおり本発明の多量体IgGの発現のためにpHuYON007-THB、pHu11D1-THBまたはその誘導体の対応する部位に導入する。得られた多量体IgG抗体は哺乳動物細胞で産生され、プロテインＡクロマトグラフィーにより精製され、そのサイズについて上記のとおりスーパーロース６カラムを使用して分析され、適切なインビトロアッセイおよび動物効力モデルを使用して細胞応答を調節するその活性について試験される。
【０２１４】
配列の簡単な記載
配列番号１
ヒトγ１重鎖のFc領域に融合したヒトDR4の細胞外領域のアミノ酸配列(DR4-Fc)
【化１】
2016532692.tif 000003
【０２１５】
配列番号２
ヒト化YON007 VHのアミノ酸配列
【化２】
2016532692.tif 000004
【０２１６】
配列番号３
ヒト化YON007 VLのアミノ酸配列
【化３】
2016532692.tif 000005
【０２１７】
配列番号４
pHuYON007でコードされるCH1領域、ヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域のアミノ酸配列
【化４】
2016532692.tif 000006
【０２１８】
配列番号５
pHuYON007-HおよびpHuYON007-H-neoでコードされるCH1領域、ヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域のアミノ酸配列
【化５】
2016532692.tif 000007
【０２１９】
配列番号６
pHuYON007-KでコードされるCH1領域、ヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域のアミノ酸配列
【化６】
2016532692.tif 000008
【０２２０】
配列番号７
pHuYON007-K-ILEでコードされるCH1領域、ヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域のアミノ酸配列
【化７】
2016532692.tif 000009
【０２２１】
配列番号８
pHuYON007-K-TNFでコードされるCH1領域、ヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域のアミノ酸配列
【化８】
2016532692.tif 000010
【０２２２】
配列番号９
HuYON007.scFv-ヒンジのアミノ酸配列
【化９】
2016532692.tif 000011
【０２２３】
配列番号１０
pHuYON007.scFv-Hでコードされる成熟HuYON007 scFvタンパク質のアミノ酸配列
【化１０】
2016532692.tif 000012
【０２２４】
配列番号１１
pHuYON007.scFv-K-ILEでコードされる成熟HuYON007 scFvタンパク質のアミノ酸配列
【化１１】
2016532692.tif 000013
【０２２５】
配列番号１２
ホモ三量体化可能なイソロイシンジッパーのアミノ酸配列
【化１２】
2016532692.tif 000014
【０２２６】
配列番号１３
ホモ三量体化可能なヒトTNFの細胞外ドメインのアミノ酸配列
【化１３】
2016532692.tif 000015
【０２２７】
配列番号１４
ヒトOX40の細胞外領域のアミノ酸配列
【化１４】
2016532692.tif 000016
【０２２８】
配列番号１５
OHX10 VHのアミノ酸配列
【化１５】
2016532692.tif 000017
【０２２９】
配列番号１６
OHX40 VHのCDR1のアミノ酸配列
【化１６】
2016532692.tif 000018
【０２３０】
配列番号１７
OHX40 VHのCDR2のアミノ酸配列
【化１７】
2016532692.tif 000019
【０２３１】
配列番号１８
OHX40 VHのCDR3のアミノ酸配列
【化１８】
2016532692.tif 000020
【０２３２】
配列番号１９
OHX10 VLのアミノ酸配列
【化１９】
2016532692.tif 000021
【０２３３】
配列番号２０
OHX40 VLのCDR1のアミノ酸配列
【化２０】
2016532692.tif 000022
【０２３４】
配列番号２１
OHX40 VLのCDR2のアミノ酸配列
【化２１】
2016532692.tif 000023
【０２３５】
配列番号２２
OHX40 VLのCDR3のアミノ酸配列
【化２２】
2016532692.tif 000024
【０２３６】
配列番号２３
ヒト化OHX10(HuOHX10)VHのアミノ酸配列
【化２３】
2016532692.tif 000025
【０２３７】
配列番号２４
ヒト化OHX10(HuOHX10)VLのアミノ酸配列
【化２４】
2016532692.tif 000026
【０２３８】
配列番号２５
HuOHX10 VHコード領域をコードする遺伝子のヌクレオチド配列
【化２５】
2016532692.tif 000027
【０２３９】
配列番号２６
HuOHX10 VLコード領域をコードする遺伝子のヌクレオチド配列
【化２６】
2016532692.tif 000028
【０２４０】
配列番号２７
ヒトγ１重鎖のFc領域に融合したヒトCD40の細胞外領域(CD40-Fc)のアミノ酸配列
【化２７】
2016532692.tif 000029
【０２４１】
配列番号２８
11D1 VHのアミノ酸配列
【化２８】
2016532692.tif 000030
【０２４２】
配列番号２９
11D1 VHのCDR1のアミノ酸配列
【化２９】
2016532692.tif 000031
【０２４３】
配列番号３０
11D1 VHのCDR2のアミノ酸配列
【化３０】
2016532692.tif 000032
【０２４４】
配列番号３１
11D1 VHのCDR3のアミノ酸配列
【化３１】
2016532692.tif 000033
【０２４５】
配列番号３２
11D1 VLのアミノ酸配列
【化３２】
2016532692.tif 000034
【０２４６】
配列番号３３
11D1 VLのCDR1のアミノ酸配列
【化３３】
2016532692.tif 000035
【０２４７】
配列番号３４
11D1 VLのCDR2のアミノ酸配列
【化３４】
2016532692.tif 000036
【０２４８】
配列番号３５
11D1 VLのCDR3のアミノ酸配列
【化３５】
2016532692.tif 000037
【０２４９】
配列番号３６
Hu11D1 VHのアミノ酸配列
【化３６】
2016532692.tif 000038
【０２５０】
配列番号３７
Hu11D1 VLのアミノ酸配列
【化３７】
2016532692.tif 000039
【０２５１】
配列番号３８
Hu11D1 VHコード領域をコードする遺伝子のヌクレオチド配列
【化３８】
2016532692.tif 000040
【０２５２】
配列番号３９
Hu11D1 VLコード領域をコードする遺伝子のヌクレオチド配列
【化３９】
2016532692.tif 000041
【０２５３】
配列番号４０
ホモ三量体化可能なK143T変異を有するヒトCD40Lの細胞外領域ののアミノ酸配列
【化４０】
2016532692.tif 000042
【０２５４】
配列番号４１
pHuYON007-K-CD40Lでコードされる重鎖定常領域のアミノ酸配列
【化４１】
2016532692.tif 000043
【０２５５】
配列番号４２
ホモ二量体化可能なロイシンジッパーのアミノ酸配列
【化４２】
2016532692.tif 000044
【０２５６】
配列番号４３
pHuYON007-K-LeuでコードされるCH1領域、ヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域のアミノ酸配列
【化４３】
2016532692.tif 000045
【０２５７】
配列番号４４
ホモ四量体化可能なテトラジッパーのアミノ酸配列
【化４４】
2016532692.tif 000046
【０２５８】
配列番号４５
pHuYON007-K-TetraでコードされるCH1領域、ヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域のアミノ酸配列
【化４５】
2016532692.tif 000047
【０２５９】
配列番号４６
ヒトγ１重鎖のFc領域に融合したヒトDR5の細胞外領域のアミノ酸配列(DR5-Fc)
【化４６】
2016532692.tif 000048
【０２６０】
配列番号４７
HuGOH729S VHのアミノ酸配列
【化４７】
2016532692.tif 000049
【０２６１】
配列番号４８
HuGOH729S VLのアミノ酸配列
【化４８】
2016532692.tif 000050
【０２６２】
配列番号４９
pHuGOH729S.scFv-Hでコードされる成熟HuGOH729S scFv-Fc融合タンパク質のアミノ酸配列
【化４９】
2016532692.tif 000051
【０２６３】
配列番号５０
pHuGOH729S.scFv-K-ILEでコードされる成熟HuGOH729S scFv-Fc融合タンパク質のアミノ酸配列
【化５０】
2016532692.tif 000052
【０２６４】
配列番号５１
Ｃ末端でヒトλ２定常領域に融合した組み換えヒトDR5細胞外領域のアミノ酸配列(DR5-Cλ)
【化５１】
2016532692.tif 000053
【０２６５】
配列番号５２
Ｃ末端でヒトλ２定常領域に融合した組み換えヒトDR4細胞外領域ののアミノ酸配列(DR4-Cλ)
【化５２】
2016532692.tif 000054
【図１】
2016532692.tif 000055
【図２Ａ−Ｃ】
2016532692.tif 000056
【図３Ａ−Ｃ】
2016532692.tif 000057
【図４】
2016532692.tif 000058
【図５】
2016532692.tif 000059
【図６Ａ】
2016532692.tif 000060
【図６Ｂ】
2016532692.tif 000061
【図７Ａ−Ｃ】
2016532692.tif 000062
【図８】
2016532692.tif 000063
【図９】
2016532692.tif 000064
【配列表】
2016532692000001.app
【国際調査報告】
2016532692.tif 000065
2016532692.tif 000066
2016532692.tif 000067
2016532692.tif 000068