(57)【要約】  本発明は、感染、ガン、自己免疫及び他の疾患の治療に使用するための、γδＴ細胞活性化因子及びＩＬ−３３の組み合わせを用いてγδＴ細胞の無ＩＬ−２増殖を誘導する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
γδＴ細胞の増殖を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ方法であって、該γδＴ細胞をγδＴ細胞活性化因子及びＩＬ−３３との組み合わせで処置することを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ方法。
【請求項２】
γδＴ細胞がＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞である、請求項１記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ方法。
【請求項３】
血液試料から末梢血単核細胞を単離する予備段階を含む、請求項１又は２記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ方法。
【請求項４】
γδＴ細胞活性化因子がリン酸化抗原（phosphoantigen）である、前記請求項のいずれか一項記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ方法。
【請求項５】
リン酸化抗原がＢｒＨＰＰである、請求項４記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ方法。
【請求項６】
γδＴ細胞の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導するための、γδＴ細胞活性化因子及びＩＬ−３３の使用。
【請求項７】
γδＴ細胞活性化因子がリン酸化抗原であり、かつ／又はγδＴ細胞がＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞である、請求項６記載のγδＴ細胞活性化因子及びＩＬ−３３の使用。
【請求項８】
γδＴ細胞活性化因子及びＩＬ−３３を含む培地。
【請求項９】
γδＴ細胞活性化因子がリン酸化抗原である、請求項８記載の培地。
【請求項１０】
請求項８又は９のいずれか一項記載の培地を用いてγδＴ細胞を培養する段階を含む、γδＴ細胞の増殖を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項１１】
γδＴ細胞がＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞である、請求項１０記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項１２】
（ｉ）少なくとも１種のγδＴ細胞活性化因子及び（ｉｉ）ＩＬ−３３を含むキット。
【請求項１３】
γδＴ細胞活性化因子及びＩＬ−３３及び場合により薬学的に許容されうる担体を含む薬学的組成物。
【請求項１４】
γδＴ細胞活性化因子がリン酸化抗原である、請求項１４記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
感染、自己免疫、ガン、及び他の増殖性疾患の処置に使用するための、請求項１４から１５のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、感染症の処置又はガン治療のためにインターロイキン−３３（ＩＬ−３３）及びγδＴ細胞活性化因子との組み合わせを使用してγδＴリンパ球の増殖を誘導するための方法に関する。
【０００２】
発明の背景：
γδＴリンパ球は、自然免疫及び適応免疫の境界域でのそれらの特徴について非従来的リンパ球として公知である。それらは、それらのＴＣＲを用いるが、主要組織適合複合体分子(molecules of the complex major histocompatibility)による提示も拘束もなしに抗原を認識する。ヒト血液におけるγδＴリンパ球の主要亜集団であるＶγ９Ｖδ２Ｔリンパ球は、特にリン酸化抗原（phosphoantigen）（ＰＡｇ）と呼ばれる非ペプチド抗原を認識する。これらのＰＡｇは、いくつかの病原性微生物及びヒトガン細胞によって産生される（Poupot M, Fournie JJ Immunol Lett 2004）。これらのリンパ球は、炎症性サイトカインを産生する能力及びそれらの活性化時に誘導される細胞傷害性により、抗腫瘍免疫の非常に重要な主体である。それらは、実際、樹立ガン細胞系又はガン患者からの細胞（腎ガン又は前立腺ガン又は多発性骨髄腫）などの数多くのガン細胞型に対して高い細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ溶解能を有する（Viey E et al. Immunol 2005; Liu Z et al. J Urol 2005; Kunzmann V et al. Blood 2000）。それらの細胞溶解能は、また、ヒト腫瘍異種移植片を有する免疫欠損マウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでも示された（Kabelitz D et al. J Immunol 2004）。さらに、リン酸化抗原及びＩＬ２の投与に基づく臨床試験は、患者の血中Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞数の増加及び腫瘍縮小を示した（Wilhelm M et al. Blood 2003; Bonneville M, Scotet E Curr Opin Immunol 2006）。
【０００３】
実際、Ｖγ９Ｖδ２Ｔリンパ球が血中総リンパ球のわずか１％に相当する場合、ＰＡｇ／ＩＬ−２の組み合わせは、これらの細胞の増殖に繋がる。そのうえ、ＰＡｇ及びＩＬ−２の存在下でＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）をｉｎ  ｖｉｔｒｏ成長させることによってこの細胞集団をかなり増幅させ、純度約８０％に到達させることが可能である。この方法によって数十億個の細胞傷害性Ｖγ９Ｖδ２Ｔリンパ球を得ることができ、続いて抗腫瘍免疫療法をトリガーするためにそれらの細胞を患者に再注射することができる。行われた第Ｉ相臨床試験は、ｅｘ  ｖｉｖｏ増幅された自己Ｖγ９Ｖδ２Ｔリンパ球移植片の良好な安全性を示した。しかし、ＰＡｇ及びＩＬ−２を患者に直接注射することの方が技術的に簡単である（Bennouna J et al. Cancer Immunol Immunother 2008）。転移性腎ガン、前立腺ガン及び濾胞性リンパ腫の患者を今日現在約１００人含むいくつかの第Ｉ相及び第ＩＩ相臨床試験がこの併用療法を用いて行われた。異なる試験の結果から、Ｖγ９Ｖδ２Ｔリンパ球の治療潜在性は非常に良好であるが、不幸なことにＩＬ−２は強毒性であることが判明している。
【０００４】
まとめると、これらの治療的進歩は、Ｖγ９Ｖδ２Ｔリンパ球に基づく治療アプローチのために、ＰＡｇと、Ｖγ９Ｖδ２Ｔリンパ球の増殖を活性化できる、ＩＬ−２とは異なる（ＩＬ−２Ｒγｃ非依存性）安全な化合物とを組み合わせる新しいアプローチを要する。ＩＬ−２Ｒγｃ依存性サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１）との種々の組み合わせは、ＩＬ−２と類似のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性を示したが、類似の毒性をも示した。ＴＬＲリガンドとの組み合わせも世界中の種々のチームによって調査されたが、厳密なＩＬ−２依存性が判明した。
【０００５】
したがって、Ｖγ９Ｖδ２Ｔリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで増幅するためのＩＬ−２の代替物を見い出す必要がある。
【０００６】
本発明者らは、今回驚くべきことに、ＩＬ−３３及びリン酸化抗原などのγδＴ細胞活性化因子との組み合わせが、新鮮ヒトＰＢＭＣの培養物からγδＴリンパ球のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖を誘導するには効率的であることを発見した。
【０００７】
実施例に示すように、２種の分子の組み合わせがγδＴのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖を誘導及び維持するために効率的であり、ＩＬ−３３がＩＬ２レセプターに結合せず（ＩＬ−２Ｒγｃ非依存性）、したがってＩＬ−２の毒性を回避できるので、この発見は、いっそう予想外である。
【０００８】
ＩＬ−３３は、血管内皮細胞によって発現されるＩＬ−１ファミリーのサイトカインである（Cayrol C, Girard JP, Proc Natl Acad Sci U S A 2009）。このサイトカインは核局在性を有するが、ストレスを受けた細胞又は壊死細胞によって放出される場合があり、ＩＬ−３３をアラーミン（alarmin）として見なすことに導く。アラーミンは、感染又は組織損傷（機械的損傷又は化学療法もしくは放射線療法によって誘導される損傷）に応答して細胞から急速に放出される内因性シグナルであり、化学誘引ならびに自然免疫及び適応免疫の活性化を促進することによって免疫系に警告する（Haraldsen G et al. Trends Immunol 2009）。本発明の発明者らは、病原体、アレルゲン及び他の環境因子と頻繁に出会う、環境と接触している皮膚及び消化管などの組織の上皮細胞によってＩＬ−３３が高度に発現されることを示した。そのうえ本発明者らは、リンパ器官へのリンパ球の動員を仲介する専門の血管であるＨＥＶ（高内皮細静脈）由来の血管内皮細胞によってＩＬ−３３が高度に発現されることを示した（Moussion C et al. PLoS One 2008）。
【０００９】
しかし、これまでのところ、文献のデータは、Ｔ  Ｖγ９Ｖδ２リンパ球にＩＬ−３３が果たす役割を全く示さなかった。
【００１０】
発明の概要：
第１の局面によると、本発明は、γδＴ細胞の増殖を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ方法であって、該γδＴ細胞をＩＬ−３３及びγδＴ細胞活性化因子との組み合わせで処置することを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ方法を提供する。
【００１１】
他の局面によると、本発明は、ＩＬ−３３及びγδＴ細胞活性化因子（例えばリン酸化抗原）を含む培地又はキットに関する。
【００１２】
さらなる一局面によると、本発明は、γδＴ細胞療法の必要のある対象を処置するための、つまり感染、自己免疫、ガン及び他の増殖性疾患の処置するための、ｅｘ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提供する。
【００１３】
別の局面によると、本発明は、ＩＬ−３３及びγδＴ細胞活性化因子（例えばリン酸化抗原）ならびに場合により薬学的に許容されうる担体を含む薬学的組成物、ならびに抗ガン治療又は抗感染治療におけるこの薬学的組成物の使用を提供する。
【００１４】
発明の詳細な説明：
本発明は、γδＴリンパ球の増殖を誘導するために、及びγδＴリンパ球に基づく治療法のさらなる開発を可能にするために、ＩＬ−３３が、ＩＬ−２の代わりにリン酸化抗原ＢｒＨＰＰと組み合わせて有利に使用できるという本発明者らによる予想外の発見から生じている。実際、本発明の組み合わせは、γδＴリンパ球の増殖誘導がＰＡｇ／ＩＬ−２の組み合わせと同程度に効率的であり、ＩＬ２レセプターを活性化しない（ＩＬ−２Ｒγｃ非依存性）。
【００１５】
定義
「機能保存型変異体」は、アミノ酸の類似の性質（例えば極性、水素結合ポテンシャル、酸性、塩基性、疎水性、芳香族性など）を有するアミノ酸へ置換を非限定的に含む、ポリペプチドの全体的コンフォメーション及び機能を変化させずにタンパク質又は酵素中の所与のアミノ酸残基が変えられた、本発明のペプチド由来のペプチドである。保存されていると表示されたアミノ酸以外のアミノ酸がタンパク質中で異なりうるので、類似の機能の任意の２種のタンパク質の間のタンパク質配列又はアミノ酸配列の類似パーセントは、変動する場合があり、例えば、類似性が、ＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくＣｌｕｓｔｅｒ法などのアライメントスキームによって決定されたとき７０％〜９９％の場合がある。「機能保存型変異体」には、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定されたとき少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも８５％、いっそうより好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドであって、比較対象のネイティブなタンパク質又は親タンパク質と同じ又は実質的に類似の性質又は機能を有するポリペプチドも含まれる。
【００１６】
本明細書においてタンパク質又はポリペプチドに関して使用するときの用語「アナログ」は、タンパク質又はポリペプチドと類似又は同一の機能を有するペプチドであるが、そのタンパク質もしくはポリペプチドのアミノ酸配列と類似もしくは同一のアミノ酸配列、又はそのタンパク質もしくはポリペプチドと類似もしくは同一の構造を必ずしも含む必要がないペプチドを表す。好ましくは、本発明に関連して、アナログは、タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を有する。ある好ましい態様では、本発明のペプチドバイオマーカーのアナログは、サイトカインペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、又は少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を有する。
【００１７】
本明細書に使用する用語「相同な」（又は「相同性」）は、用語「同一性」と同義であり、２種のポリペプチド分子の間又は２種の核酸分子の間の配列類似性を表す。比較対象の両配列中のある位置が同じ塩基又は同じアミノ酸残基によって占有されている場合、それぞれの分子はその位置で相同である。２種の配列間の相同率は、その２種の配列によって共有されるマッチ位置又は相同位置の数を、比較対象の位置の数で割って１００をかけたものに対応する。一般に、２種の配列が最大の相同性を示すようにアライメントされるとき、比較が行われる。相同アミノ酸配列は、同一又は類似のアミノ酸配列を共有する。類似の残基は、参照配列中の対応するアミノ酸残基についての保存的置換又は「許容されうる点突然変異」である。参照配列中の残基の「保存的置換」は、対応する参照残基に物理的又は機能的に類似の置換、例えば類似のサイズ、形状、電荷、共有結合又は水素結合を形成する能力を含む化学的性質などを有する置換である。特に好ましい保存的置換は、Dayhoffら（“Atlas of Protein Sequence and Structure”, 1978, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, DC, Suppl. 3, 22: 354-352）による「容認点突然変異」について定義された基準を満たす保存的置換である。
【００１８】
その最も広い意味で、用語「処置すること」又は「処置」は、そのような用語が適用される障害もしくは状態の進行、又はそのような障害もしくは状態の一つもしくは複数の症状を後退、緩和、阻害することを表す。
【００１９】
用語「患者」は、感染症（細菌性もしくはウイルス性）、ガン又は別の増殖性疾患を患う又は患いやすい任意の対象（好ましくはヒト）を表す。
【００２０】
γδＴ細胞活性化因子及びＩＬ−３３を使用してγδＴ細胞の増殖を誘導するための方法
本発明は、γδＴ細胞の増殖を誘導するための新規な方法であって、γδＴ細胞が、ＩＬ−３３及びγδＴ細胞活性化因子を含有する培地中で活性化される方法に関する）。
【００２１】
第１の局面によると、本発明は、γδＴ細胞の増殖を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ方法であって、ＩＬ−３３及びγδＴ細胞活性化因子との組み合わせで該γδＴ細胞を処置することを含む方法を提供する。
【００２２】
好ましい一態様では、γδＴ細胞活性化因子はリン酸化抗原である。
【００２３】
より好ましい一態様では、リン酸化抗原はＢｒＨＰＰである。
【００２４】
本発明の組み合わせで処置されるγδＴ細胞は、好ましくはＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞である。
【００２５】
特定の一態様では、γδＴ細胞の増殖を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ方法は、血液試料から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離する予備段階を含む。
【００２６】
別の一態様では、本発明は、ＩＬ−３３及びγδＴ細胞活性化因子との組み合わせでγδＴ細胞を処置することを含む、γδＴ細胞の無ＩＬ２増殖を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ方法を提供する。
【００２７】
「ＩＬ−３３」（「インターロイキン−３３」又は「ＤＶＳ２７関連タンパク質」又は「ＩＬ−１Ｆ１１」又は「インターロイキン−１ファミリーメンバー１１」又は「高内皮細静脈核因子」又は「高内皮細静脈由来核因子」とも呼ばれる）は、「ＩＬ−３３」と呼ばれるサイトカインタンパク質を表す。本発明に使用することができるＩＬ−３３タンパク質の配列ならびにＩＬ−３３タンパク質の種々の転写変異体及び／又は種々の生物学的活性形態については、表Ａに見い出すことができる：
【００２８】
【表１】
2016501013.tif 000002
2016501013.tif 000003
【００２９】
本発明に使用するためのＩＬ３３ヒト天然変異体は、国際公開公報第２０１２１１３９２７号に開示されており、これら全ては、参照により本明細書に組み入れられる。
【００３０】
好ましい一態様では、ＩＬ−３３は、ヒトＩＬ−３３の第１天然切断産物である（ＩＬ−３３  ＡＡ９５−２７０：配列番号２）。
【００３１】
別の好ましい態様では、ＩＬ−３３は、ヒトＩＬ−３３の人工的切断形態である（ＩＬ−３３  ＡＡ１１２−２７０：配列番号５）。
【００３２】
サイトカインタンパク質ＩＬ−３３は、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）／ＩＬ−１レセプターファミリーの一メンバーであるＩＬ−１レセプター関連タンパク質ＳＴ２（ＩＬ−１Ｒ４）に対するリガンドとして機能することが示されている（Schmitz J et al. Immunity 2005）。ＳＴ２は、Ｔｈ２リンパ球、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞上、ならびにマスト細胞、好塩基球及び好酸球上に発現される。相互作用ＩＬ−３３／ＳＴ２は、ＭＹＤ８８、ＭＡＰＫ及びＮＦ−κＢのカスケードを伴う警告性細胞内シグナルに繋がる。したがって、ＩＬ−３３は、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ）及び／又はＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３）の産生を推進するだけでなく（Pecaric-Petkovic T et al. Blood 2009, Bourgeois E et al. Eur J Immunol 2009）、炎症部位への免疫細胞の走化性も誘導することも見い出された（Komai-Koma M et al. Eur J Immunol 2007）。
【００３３】
概して、用語「インターロイキン−３３」は、タンパク質ＩＬ−３３自体、本発明のポリペプチドと機能的に等価のポリペプチド及びタンパク質を含めたタンパク質アナログ、ならびに「機能保存型変異体」を表す。本発明に使用する意味においては、表現「機能的に等価」は、問題となるポリペプチドが、本発明のサイトカインの生物学的活性の少なくとも一つを、例えばＭＹＤ８８、ＭＡＰＫ及びＮＦ−κＢのカスケードを含む警告性細胞内シグナルに繋がるＳＴ２レセプター活性化因子としての作用などを、有することを意味する。
【００３４】
本発明のタンパク質のＳＴ２活性化能は、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ）及び／又はＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３）の産生を評価するため（Schmitz et al. Immunity 2005, Pecaric-Petkovic T et al. Blood 2009, Bourgeois E et al. Eur J Immunol 2009, Cayrol and Girard PNAS 2009, Lefrancais et al. PNAS 2012）だけでなく、炎症部位への免疫細胞の走化性を誘導するための（Komai-Koma M et al. Eur J Immunol 2007）簡単な検査を実行することにより、当業者に明らかになる。
【００３５】
用語「γδＴ細胞」（「ガンマデルタＴ細胞」又は「γδＴリンパ球」とも呼ばれる）は、自然免疫と適応免疫の境界域での健康な免疫系の重要な成分を表す。γδＴ細胞は、それらのＴＣＲ（抗原に対するＴ細胞レセプター）を用いるが、主要組織適合複合体分子による提示も拘束もなしに抗原を認識するので、非従来的リンパ球として知られている。
【００３６】
γδＴ細胞は、当技術分野において公知の、数多くの認知されたバイオマーカーを有する。これらには、ＣＤ３＋、ＣＤ４−、ＣＤ８−が挙げられ、ＴＣＲ鎖は、ガンマ鎖（γ）及びデルタ鎖（δ）から形成される。
【００３７】
それらの対応物であるαβＴ細胞とは異なり、γδＴ細胞は、末梢血中の循環リンパ球のわずかな比率（＜６％）に相当する。それらは、上皮組織及びリンパ器官中にずっと多く存在し、そこで、それらはＴリンパ球の最大５０％に相当しうる。しかし、結核、髄膜炎、又は野兎病などの多様な細菌感染ならびにマラリア、トキソプラズマ症及びリーシュマニア症などの原生動物感染の間に、γδＴ細胞は、循環Ｔ細胞の大部分に相当しうるレベルまで増幅される（一部の個体では最大４０％。
【００３８】
本発明によるγδＴ細胞は、霊長類γδＴ細胞、最も好ましくはヒトγδＴ細胞である。
【００３９】
γδＴ細胞増殖の検出は、標準法によって行うことができる。γδＴ細胞の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出するための具体的な一方法は、実施例１に説明する。
【００４０】
「Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞」（「Ｖγ９Ｖδ２Ｔリンパ球」とも呼ばれる）は、霊長類（ヒト及び非ヒト）にのみ存在する、Ｖγ９Ｖδ２型ＴＣＲを有するγδＴ細胞サブグループを意味する。ヒトＶγ９Ｖδ２Ｔリンパ球によって選択的に認識される抗原は、リン酸化抗原（ＰＡｇ）と呼ばれる非ペプチド抗原である。
【００４１】
それらの炎症性サイトカイン産生及びそれらの活性化により誘導されるそれらの細胞傷害性によって、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞は抗腫瘍免疫の非常に重要な主体である。それらは、樹立ガン細胞系又はガン患者由来細胞のような数多くのガン細胞型に対して実際に高いｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞溶解能を有する。
【００４２】
「Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞」は、当技術分野において公知の任意の適切な方法によってＰＢＭＣから単離することができる。そのような方法の例は、実施例の節に述べる。
【００４３】
例えば、最初の細胞調製物は、新鮮又は凍結サイタフェレーシスのいずれかからの血液由来ＰＢＭＣから成る。特殊(unique)なＰＡｇ刺激の後に培地に所定用量のＩＬ−３３を連続添加して、細胞を閉鎖系で２週間エクスパンションさせる。製造工程は、従来的ＣＤ８＋Ｔ細胞系又はクローンを使用する大多数の現行の細胞治療アプローチよりもずっと単純であり、最終的な分離又は精製段階もフィーダー細胞の使用もなく、ＰＡｇによって提供される特異的ＴＣＲ介在性シグナルは、培養物中に優占的になるＶγ９Ｖδ２サブセットのＩＬ−３３依存性エクスパンションをトリガーするために十分である。１回の凍結サイタフェレーシスから数回分のγδ細胞産物を製造することができる。
【００４４】
典型的には、γδＴ細胞特異的刺激（例えばリン酸化抗原）及びＩＬ−２を用いた古典的増幅法でサイタフェレーシスからの１億個の凍結ＰＢＭＣから２０〜５０億個の細胞が生じる。
【００４５】
Ｖγ９Ｖδ２  γδＴ細胞は、好ましくは腫瘍細胞に対して細胞傷害機能を示さなければならない。細胞傷害機能の実証は、当技術分野において公知の任意の適切な方法によって判定することができる。特に、そのような検査の例を、実施例の節に述べる。具体的には、実施例及び図１に具体化される検査が、Ｖγ９Ｖδ２  γδＴ細胞機能の評価のための標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ検査として見なされる。
【００４６】
用語「γδＴ細胞活性化因子」は、γδＴリンパ球を活性化する、好ましくは人工的に産生された分子を意味する。それは、より好ましくは、γδＴリンパ球のＴＣＲ及びＮＫ細胞の活性化因子レセプター（ＮＫＧ２Ｄ…）のようなγδＴ細胞上に発現された他のレセプターに対するリガンドから成る。この活性化因子は、ペプチド、脂質などの様々な性質の場合があり、又は低化学分子（例えばリン酸化抗原）である。それは、また、γδＴリンパ球のＴＣＲ及びＮＫ細胞の活性化レセプター（ＮＫＧ２Ｄ…）のようなγδＴ細胞の他のレセプターに対して実質的に同じ特異性を有するリガンド又はそのフラグメントもしくは誘導体又は抗体でありうる。
【００４７】
特定の態様では、γδＴ細胞活性化因子は、全てのリンパ球の間でγδＴリンパ球だけを活性化する（例えば、２４nM以下のＥＣ５０を有する）γδＴ細胞特異的活性化因子である。
【００４８】
γδＴ細胞活性化因子は、好ましくは細胞から精製されるか、又は他の方法で人工的に産生される（例えば、化学合成又は微生物工程による）。
【００４９】
「リン酸化抗原」（「ＰＡｇ」とも呼ばれる）は、γδＴ細胞活性化因子の生物活性を有する非ペプチド性リン酸化合物、典型的には直鎖Ｃ５イソプレノイドのモノリン酸エステル及びピロリン酸エステルを表す。全てのリン酸化抗原の抗原生物活性は、それらのリン酸エステル部分のおかげであり、その生物活性はホスファターゼによって打ち消される。
【００５０】
γδＴ細胞活性化因子であるリン酸化抗原は、ＩＬ−２のようなインターロイキンに関連したγδＴ細胞の増殖又はエクスパンションのさらなる刺激の存在下又は不在下で、好ましくはγδＴ細胞の生物活性を増加させ、又は増殖を引き起こし、好ましくはγδＴ細胞の活性化を、特にγδＴ細胞からのサイトカイン分泌又はγδＴ細胞の細胞溶解活性を、増加させる。
【００５１】
したがって、γδＴ細胞活性化因子は、細胞培養物に添加されるか、又は対象におけるγδＴ細胞の活性を増加させるために十分な量及び条件で、好ましくはγδＴ細胞によるサイトカイン分泌を増加させるために、かつ／もしくはγδＴ細胞の細胞溶解活性を増加させるために十分な量及び条件で投与される。サイトカイン分泌及び細胞溶解活性は、任意の適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって評価することができる。
【００５２】
サイトカイン分泌は、ＴＮＦ−α感受性細胞を使用するバイオアッセイでのＴＮＦ−α放出の測定を記載している、Espinosaら（J Biol. Chern., 2001, Vol. 276, Issue 21, 18337-18344）に記載の方法により決定することができる。
【００５３】
本発明に使用するためのリン酸化抗原は、微生物及び植物からの精製、又は当業者に周知の任意の合成法もしくは微生物工程によって得ることができる。
【００５４】
米国特許第５，６３９，６５３号記載のイソペンテニルピロホスフェート（ＩＰＰ）、ジメチルアリルピロホスフェート（ＤＭＡＰＰ）、３−ホルミル−ブチル−ピロホスフェート、及び４−ヒドロキシ−３−ジメチルアリルピロホスフェート（ＨＤＭＡＰＰ）（（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−ブタ−２−エニルピロホスフェート（ＨＭＢＰＰ）と同義である）などの天然ＰＡｇ。これらの分子は、いくつかの微生物及び植物から同定されている。文献は、同じ上記分子（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−ブタ−２−エニルピロホスフェート構造としてＨＤＭＡＰＰ又はＨＭＢＰＰに等しく言及している。
【００５５】
顕著なγδＴ細胞活性化活性を有する本発明に使用するための他のリン酸化抗原は、国際公開公報第９５／２０６７３号、国際公開公報第２００４／０５００９６号、国際公開公報第２００７／０５７４４０号、国際公開公報第２００７０３９６３５号及びBelmantら（Drug Discovery Today: Therapeutic Strategies 2006 (3), 17-23）に開示されており、それらの全ては、参照により本明細書に組み入れられる。さらなる他のＰＡｇは、アルキルアミン（例えばエチルアミン、イソプロピルアミン（iso-propyulamine）、ｎプロピルアミン、ｎ−ブチルアミン及びイソブチルアミンなど）である。イソブチルアミン及び３−アミノプロピルホスホン酸は、Aldrich（Chicago, IL）から得られる。
【００５６】
好ましくは、リン酸化抗原は、式（Ｉ）：
【化１】
2016501013.tif 000004
［式中、Ｃａｔ＋は、１個の（又は複数の、同一又は異なる）有機又は無機陽イオン（水素イオンを含む）を表し；
ｍは、０〜３の整数であり；
Ｂは、Ｏ、ＮＨ、又は加水分解可能な任意の基であり；
Ｙは、Ｏ−Ｃａｔ＋、Ｃ１−Ｃ３アルキル基、基−Ａ−Ｒ、又はヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、単糖、オリゴ糖、多糖、脂肪酸、単純脂質、複合脂質、葉酸、テトラヒドロ葉酸、リン酸、イノシトール、ビタミン、補酵素、フラボノイド、アルデヒド、エポキシド及びハロヒドリンから成る群より選択される基であり；
Ａは、Ｏ、ＮＨ、ＣＨＦ、ＣＦ２又はＣＨ２であり；
Ｒは、少なくとも１個のヘテロ原子が介在していてもよい、直鎖、分岐、又は環式の、芳香族又は非芳香族の、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ５０炭化水素基であり、ここで、該炭化水素基は、アルキル、アルキレニル、アルキニル、エポキシアルキル、アリール、複素環、アルコキシ、アシル、アルコール、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、エステル、アミン、アミノ基（−ＮＨ２）、アミド（−ＣＯＮＨ２）、イミン、ニトリル、ヒドロキシル（−ＯＨ）、アルデヒド基（−ＣＨＯ）、ハロゲン、ハロゲノアルキル、チオール（−ＳＨ）、チオアルキル、スルホン、スルホキシド、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される１個又は複数の置換基によって置換されていてもよい、アルキル、アルキレニル、又はアルキニル、好ましくはアルキル又はアルキレンを含む］
で示される化合物である。
【００５７】
より好ましい一態様では、リン酸化抗原は、式（ＩＩ）：
【化２】
2016501013.tif 000005
［式中、Ｘは、ハロゲン（好ましくはＩ、Ｂｒ及びＣｌより選択される）であり、Ｂは、Ｏ又はＮＨであり、ｍは、１〜３の整数であり、Ｒ１は、メチル又はエチル基であり、Ｃａｔ＋は、１個の（又は複数の同一又は異なる）有機又は無機陽イオンを表し（水素イオンを含む）、ｎは、２〜２０の整数であり、Ａは、Ｏ、ＮＨ、ＣＨＦ、ＣＦ２又はＣＨ２であり、Ｙは、Ｏ−Ｃａｔ＋である］
で示される化合物である。
【００５８】
Ｘ＝Ｂｒ、Ｒ１＝メチル、Ａ＝Ｏ、Ｂ＝Ｏの場合、γδＴ細胞活性化因子はＢｒＨＰＰと称される。
【００５９】
Ｘ＝Ｂｒ、Ｒ１＝メチル、Ａ＝Ｏ、Ｂ＝ＣＨＦ、ＣＦ２又はＣＨ２の場合、γδＴ細胞活性化因子はＣ−ＢｒＨＰＰと称される。
【００６０】
Ｘ＝Ｂｒ、Ｒ１＝メチル、Ａ＝Ｏ、Ｂ＝ＮＨの場合、γδＴ細胞活性化因子はＮ−ＢｒＨＰＰと称される。
【００６１】
特に、γδＴ細胞活性化因子は、ＢｒＨＰＰ、Ｃ−ＢｒＨＰＰ又はＮ−ＢｒＨＰＰでありうる。
【００６２】
別のより好ましい態様では、リン酸化抗原は、式（ＩＩＩ）：
【化３】
2016501013.tif 000006
［式中、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同一又は異なり、水素又は（Ｃ１−Ｃ３）アルキル基であり、Ｗは、−ＣＨ−又は−Ｎ−であり、Ｒ６は、（Ｃ２−Ｃ３）アシル、アルデヒド、（Ｃ１−Ｃ３）アルコール、又は（Ｃ２−Ｃ３）エステルであり、Ｃａｔ＋は、１個の（又は複数の同一又は異なる）有機又は無機陽イオンを表し（水素イオンを含む）、Ｂは、Ｏ又はＮＨであり、ｍは、１〜３の整数であり、Ａは、Ｏ、ＮＨ、ＣＨＦ、ＣＦ２又はＣＨ２であり、Ｙは、Ｏ−Ｃａｔ＋である］
で示される化合物である。
【００６３】
特に、γδＴ細胞活性化因子は、ＨＭＢＰＰ、Ｃ−ＨＭＢＰＰ又はＮ−ＨＭＢＰＰと同義であるＨＤＭＡＰＰ、Ｃ−ＨＤＭＡＰＰ又はＮ−ＨＤＭＡＰＰでありうる。
【００６４】
Ｒ６＝ＣＨ２ＯＨ、Ｒ５＝メチル、Ｗ＝ＣＨ、Ｒ３＝Ｒ４＝Ｈ、Ａ＝Ｏ、Ｂ＝Ｏの場合、γδＴ細胞活性化因子は、ＨＤＭＡＰＰ又はＨＭＢＰＰと等しく称される。
【００６５】
Ｒ６＝ＣＨ２ＯＨ、Ｒ５＝メチル、Ｗ＝ＣＨ、Ｒ３＝Ｒ４＝Ｈ、Ａ＝ＣＨＦ、ＣＦ２又はＣＨ２、Ｂ＝Ｏの場合、γδＴ細胞活性化因子は、Ｃ−ＨＤＭＡＰＰ又はＣ−ＨＭＢＰＰと等しく称される。
【００６６】
Ｒ６＝ＣＨ２ＯＨ、Ｒ５＝メチル、Ｗ＝ＣＨ、Ｒ３＝Ｒ４＝Ｈ、Ａ＝ＮＨ、Ｂ＝Ｏの場合、γδＴ細胞活性化因子は、Ｎ−ＨＤＭＡＰＰ又はＮ−ＨＭＢＰＰと等しく称される。
【００６７】
好ましくは、γδＴ細胞活性化因子は、式ＩＶ：
【化４】
2016501013.tif 000007
［式中、Ｒ’は、直鎖、分岐、又は環式の、芳香族又は非芳香族の、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ５０炭化水素基であり、ここで、該炭化水素基は、アミン、アミノ基（−ＮＨ２）、アミド（−ＣＯＮＨ２）、イミン、及びこれら組み合わせから成る群より選択される１個又は複数の置換基によって置換された、アルキル、アルキレニル、又はアルキニル、好ましくはアルキル又はアルキレンを含む］
で示されるアミノホスホネートでありうる。
【００６８】
好ましい一態様では、式ＩＶで示されるＲ’は、アミン、アミノ基、ピリジン基、ピリミジン基、ピロール基、イミダゾール基、ピラゾール基、トリアゾール基によって置換された、直鎖、分岐、又は環式の、芳香族又は非芳香族の、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ１０炭化水素基である。
【００６９】
なおより好ましい一態様では、式ＩＶのＲ’は、
【化５】
2016501013.tif 000008
から成る群より選択される。
【００７０】
特に、γδＴ細胞活性化因子は、パミドロネート、アレンドロネート、イバンドロネート、リセドロネート及びゾレドロネートから成る群より選択することができる。
【００７１】
本発明の別の局面は、γδＴ細胞の増殖を誘導するためのＩＬ−３３及びγδＴ細胞活性化因子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｅｘ−ｖｉｖｏ使用である。
【００７２】
好ましい一態様では、γδＴ細胞活性化因子はリン酸化抗原である。
【００７３】
その好ましい態様では、リン酸化抗原はＢｒＨＰＰである。
【００７４】
好ましい一態様では、本発明の組み合わせで処置されるγδＴ細胞は、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞である。
【００７５】
最も好ましい態様では、γδＴ細胞の増殖を誘導することは、ＩＬ３３及びＢｒＨＰＰを用いてＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖を誘導することを含む。
【００７６】
ＩＬ−３３のために使用される用量は、１から１０００ng/mlの間、好ましくは１０ng/mlから１０００ng/mlの間、最も好ましくは５００ng/mlである。
【００７７】
ＢｒＨＰＰのために使用される用量は、１から１０００nMの間、好ましくは１０nMから２００nMの間、最も好ましくは１００nMである。
【００７８】
本発明の方法によってエクスパンションされたＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、４から２１日間、好ましくは４から５０日間、最も好ましくは１４日間培養することができる。
【００７９】
ｅｘ  ｖｉｖｏ刺激は、治療目的にとって重大な(critical)数のＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の産生を可能にする。ＢｒＨＰＰで刺激されたγδＴ細胞は、２週間の製造工程によって得ることができる。
【００８０】
本発明の主要な利点が、ＩＬ２非依存性過程によってγδＴ細胞の特異的増殖を誘導することであることに留意されたい。これは、今日までに示された主要な効果がＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞のエクスパンションであるが、ＩＬ２の高い毒性を伴うことになる先行技術と対照的である。
【００８１】
Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖をＩＬ２非依存的に活発に誘導する機会は、本発明の顕著な利点であり、より高い増殖速度を有する安全なＩＬ２代替物に相当する（実施例２及び図１Ａを参照されたい）。
【００８２】
Ｔｒｅｇ細胞をエクスパンションするための培地、キット及び方法
本発明は、また、γδＴ細胞活性化因子及びＩＬ３３を含む培地に関する。
【００８３】
本発明の培地は、γδＴ細胞の治療機能を活性化するためにそれらの細胞の増殖を誘導するために適する。
【００８４】
本明細書に使用する用語「培地」は、好ましくは臨床グレードで製造された、γδＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養に適した液体培地を表す。典型的には、本発明の培地は：
−  エネルギー基質としての、グルコース、ガラクトース又はピルビン酸ナトリウムなどの炭素源；
−  必須アミノ酸；
−  ビオチン、葉酸、Ｂ１２などのビタミン；
−  核酸前駆体としての少なくとも１種のプリン類及びピリミジン類；
−  無機塩
を含有する。
【００８５】
培地は、また、培地のｐＨを細胞成長に適した値に維持するためにｐＨ緩衝剤を含有しうる。
【００８６】
本発明の培地は、ウシ胎仔血清を補充されたＲＰＭＩ１６４０などの市販の培地に基づきうる。
【００８７】
本発明の別の局面は、γδＴ細胞の増殖を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、上記培地でγδＴ細胞を培養する段階を含む方法に関する。
【００８８】
本発明の培地を用いてγδＴ細胞を培養する段階は、γδＴ細胞の機能の産生のために要する必要時間にわたり実施するものとする。典型的には、本発明の培地を用いたγδＴ細胞の培養は、少なくとも４日間、好ましくは少なくとも５日間、好ましくは少なくとも１０日間、いっそうより好ましくは少なくとも１４日間実施するものとする。
【００８９】
必要ならば、本発明の培地は、定期的な間隔で部分的又は全体的に更新することができる。典型的には、本発明の培地は新鮮な本発明の培地と定期的に、例えば培養物全体について３日毎に交換される。
【００９０】
本発明の別の局面は、（ｉ）γδＴ細胞活性化因子及び（ｉｉ）ＩＬ−３３を含むキットである。
【００９１】
好ましい一態様では、γδＴ細胞活性化因子はリン酸化抗原である。
【００９２】
その好ましい態様では、リン酸化抗原はＢｒＨＰＰである。
【００９３】
処置方法及び薬学的組成物
本発明のさらなる一局面は、γδＴ細胞療法を必要とする対象を処置するための、すなわち感染、自己免疫、ガン、及び他の増殖性疾患の処置のためのｅｘ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提供する。
【００９４】
したがって、本発明のさらなる一局面は、γδＴ細胞療法を必要とする対象を処置するｅｘ  ｖｉｖｏ方法であって、
（ｉ）対象からγδＴ細胞を含む血液試料を取り出すこと、
（ｉｉ）血液試料からＰＢＭＣを単離すること
（ｉｉｉ）１０億から５０億個の間のγδＴ細胞を得るために、ＰＢＭＣを（ｉ）γδＴ細胞活性化因子及び（ｉｉ）ＩＬ−３３で処置すること、
（ｉｖ）そのように得られた（増幅された）γδＴ細胞に富むＰＢＭＣ培養物を該対象に再導入すること
を含むｅｘ  ｖｉｖｏ方法に関する。
【００９５】
典型的には、サイタフェレーシスからの１億個の凍結ＰＢＭＣは、２０億〜５０億個の細胞を生じる。
【００９６】
リン酸化抗原で刺激されたγδＴ細胞は、以前に、転移性腎細胞ガン（ｍＲＣＣ）での第Ｉ相臨床試験に使用された。その試験は、最初の１０億個の細胞用量が正しい耐容能(correct tolerance)を達成した後、４０億個の細胞という第２用量レベルで行われた。
【００９７】
好ましい一態様では、処置されるγδＴ細胞はＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞である。
【００９８】
好ましい一態様では、γδＴ細胞活性化因子はリン酸化抗原である。
【００９９】
その好ましい態様では、リン酸化抗原はＢｒＨＰＰである。
【０１００】
本発明の別の局面は、感染、自己免疫、ガン、及び他の増殖性疾患を治療又は予防するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法であって、それを必要とする対象に、上記のように治療有効量の（ｉ）γδＴ細胞活性化因子及び（ｉｉ）ＩＬ−３３を投与することを含むｉｎ  ｖｉｖｏ方法に関する。
【０１０１】
この局面では、本発明は、感染、自己免疫、ガン、及び他の増殖性疾患、より好ましくは固形腫瘍、特に転移を有する固形腫瘍の処置のための方法であって、γδＴ細胞活性化因子、特にリン酸化抗原、特に式Ｉ〜ＩＶによるγδＴ細胞活性化因子、特にＢｒＨＰＰ及びＨＤＭＡＰＰから成る群より選択されるγδＴ細胞活性化因子が、対象におけるγδＴ細胞集団のエクスパンションを刺激するために、特に総循環リンパ球の３０〜９０％、典型的には４０〜９０％、より好ましくは５０〜９０％に到達するために、十分な量及び条件でＩＬ−３３と共に投与される方法に関する。典型的な態様では、本発明は、対象におけるγδＴ細胞を選択的にエクスパンションさせて、総循環リンパ球の６０〜９０％、好ましくは７０〜９０％、より好ましくは８０〜９０％に到達させることができる。総循環リンパ球のパーセンテージは、当技術分野で公知の方法により決定することができる。総循環リンパ球中のγδＴ細胞のパーセンテージを決定するための好ましい方法は、フローサイトメトリーによる。
【０１０２】
本発明による使用のための方法及び組み合わせは、γδＴ細胞療法を必要とする患者に、すなわち感染、自己免疫、ガン、及び他の増殖性疾患の処置のために、使用される。
【０１０３】
非限定的に以下のものを含む多様なガン及び他の増殖性疾患は、本発明の方法及び組成物を使用して処置することができる：
−  膀胱ガン、乳ガン、結腸ガン、腎臓ガン、肝臓ガン、肺ガン、卵巣ガン、膵臓ガン、胃ガン、子宮頸ガン、甲状腺ガン及び皮膚ガン（扁平上皮ガンを含む）を含むガン腫；
−  線維肉腫及び横紋筋肉腫（rhabdomyoscarcoma）を含む間葉由来腫瘍；
−  黒色腫、セミノーマ、奇形ガン、神経芽腫及び神経膠腫を含む他の腫瘍；
−  星状細胞腫、神経芽腫、神経膠腫、及びシュワン腫を含む中枢及び末梢神経系の腫瘍；
−  線維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫を含む間葉由来の腫瘍；ならびに
−  黒色腫、色素性乾皮症、ケラトアカルチノーマ（keratoacarcinoma）、２０セミノーマ、甲状腺濾胞ガン及び奇形ガンを含む他の腫瘍。
−  非限定的に、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病など）及び骨髄異形成症候群、慢性白血病（非限定的に慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリーセル白血病など）などの白血病；真性赤血球増加症；
−  非限定的にホジキン病、非ホジキン病などのリンパ腫；非限定的にくすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞白血病、孤立性形質細胞腫及び髄外性形質細胞腫などの多発性骨髄腫。
【０１０４】
本明細書前記又は下記に腫瘍、腫瘍疾患、ガン腫又はガンに言及する場合、その腫瘍及び／又は転移の位置が何であれ、本来の器官もしくは組織及び／又は任意の他の位置における転移が、代替的又は追加的に暗黙的に意味される。
【０１０５】
一態様では、ガンは、腎ガン、前立腺ガン及び濾胞性リンパ腫から成る群より選択される。
【０１０６】
非限定的に以下のものを含む多様な感染症は、本発明の方法及び組成物を使用して処置することができる：ウイルス感染、細菌感染、寄生虫（原生動物）感染、及び真菌感染。
【０１０７】
非限定的に以下のものを含む多様な自己免疫疾病は、本発明の方法及び組成物を使用して処置することができる：強直性脊椎炎、クローン(Crohns)病（２種類の特発性炎症性腸疾患「ＩＢＤ」の一つ）、皮膚筋炎、１型糖尿病、エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、血管炎。
【０１０８】
別の局面によると、本発明は、（ｉ）ＩＬ−３３及び（ｉｉ）γδＴ細胞活性化因子（例えばリン酸化抗原）及び場合により薬学的に許容されうる担体を含む薬学的組成物、ならびに感染、自己免疫、ガン、及び他の増殖性疾患の治療におけるこの薬学的組成物の使用を提供する。
【０１０９】
本発明の治療用成分は、薬学的に許容されうる賦形剤及び場合により生分解性ポリマーなどの徐放マトリックスと組み合わせて、治療用組成物を形成させることができる。
【０１１０】
「薬学的に」又は「薬学的に許容されうる」は、必要に応じて哺乳類、特にヒトに投与した場合に、有害反応、アレルギー反応又は他の不都合な反応を引き起こさない分子実体及び組成物を表す。薬学的に許容されうる担体又は賦形剤は、無毒性の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、カプセル封じ材料(encapsulating material)又は任意の種類の製剤補助物質を表す。
【０１１１】
薬学的組成物の剤形、投与経路、投薬量及び投与方法は、当然、処置されるべき状態、病気の重症度、患者の年齢、体重、及び性別などに依存する。
【０１１２】
本発明の薬学的組成物は、局所、経口、鼻腔内、非経口、眼内、静脈内、筋肉内又は皮下投与用などに製剤化することができる。
【０１１３】
別の局面では、本発明は、感染、自己免疫、ガン、及び他の増殖性疾患の処置用の薬学的組成物の調製のために使用することができる、上記のような（ｉ）γδＴ細胞活性化因子及び（ｉｉ）ＩＬ−３３の組み合わせを提供する。
【０１１４】
本発明の化合物は、下記に定義される薬学的組成物の形態で投与することができる。
【０１１５】
「治療有効量」は、ガン及び感染症の１種又は複数の症状を治療及び／又は予防、軽減及び／又は緩和するために十分な量の化合物を意味する。
【０１１６】
組み合わせ処置の施与
本発明の化合物及び組成物の合計１日使用量は、担当医師によって健全な医学的判断の範囲内で決定されることが理解されよう。任意の特定の患者のための具体的な治療有効用量レベルは、処置される障害及び障害の重症度；採用された特定の化合物の活性；採用された特定の組成物、患者の年齢、体重、全体的健康、性別及び食事；投与時間、投与経路、及び採用された特定の化合物の排泄速度；処置期間；採用された特定の化合物と組み合わせて又は同時に使用される薬物；ならびに医学分野で周知の類似の要因を含む、多様な要因に依存する。例えば、当業者の技能の範囲内で、化合物の用量を、所望の治療効果を達成するために必要な用量よりも低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで投薬量を徐々に増加させることが周知である。
【０１１７】
一態様では、サイトカインＩＬ−３３及びγδＴ細胞活性化因子（又は活性化γδＴ細胞）は、対象に同時又は逐次的に投与される。第１の態様では、γδＴ細胞活性化因子（又は活性化γδＴ細胞）は、サイトカインＩＬ−３３の前に対象に投与される。第２の態様では、サイトカインＩＬ−３３は、γδＴ細胞活性化因子（又は活性化γδＴ細胞）の前に対象に投与される。γδＴ細胞活性化因子（又は活性化γδＴ細胞）及びサイトカインＩＬ−３３は、併用効果が得られるように投与される。
【０１１８】
別の局面では、本発明は、感染、自己免疫、ガン、及び他の増殖性疾患の処置のためのγδＴ細胞活性化因子及びＩＬ−３３との組み合わせであって、γδＴ細胞活性化因子及びＩＬ−３３が同時又は逐次的に投与される組み合わせを提供する。
【０１１９】
γδＴ細胞活性化因子は、個体に単に単回投与として投与することができる。別の局面では、γδＴ細胞活性化因子は多回投与され、γδＴ細胞活性化因子の連続投与は、少なくとも２、３又は４週間以上の間隔である。一般に、γδＴ細胞の割合(rate)（γδＴ細胞数）は、化合物の２回目の投与の前に実質的にベース割合に戻るようにされる。患者のγδＴ細胞の割合が実質的にベース割合に戻るために、少なくとも約１週間、より好ましくは少なくとも約２週間、又は最大８週間が必要とされる。例えば、γδＴ細胞活性化因子は、個体に単に単回投与として投与することができ、それは、通常、γδＴ細胞活性化因子が１ヶ月に１回以下又は２、３もしくは６ヶ月に１回投与されることを意味する。
【０１２０】
好ましい一局面では、γδＴ細胞活性化因子は、γδＴ細胞の生物学的活性を増加することができ、好ましくはγδＴ細胞の活性化を増加させ、特にγδＴ細胞からのサイトカイン分泌を増加させ、又はγδＴ細胞の細胞溶解活性を増加させ、ＩＬ３３と共にγδＴ細胞のエクスパンションを刺激する。したがって一局面では、本発明は、感染、自己免疫、ガン、及び他の増殖性疾患、より好ましくは固形腫瘍、特に転移を有する固形腫瘍の処置のための方法であって、γδＴ細胞活性化因子、特にリン酸化抗原、特に式Ｉ〜ＩＶによるγδＴ細胞活性化因子、特にＢｒＨＰＰ及びＨＤＭＡＰＰから成る群より選択されるγδＴ細胞活性化因子が、ＩＬ−３３と共にγδＴ細胞によるサイトカイン分泌を増加させるために、及び／又はγδＴ細胞の細胞溶解活性を増加させるために十分な量及び条件で投与される方法に関する。典型的な態様では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定されるとき、γδＴ細胞活性化因子は、γδＴ細胞によるサイトカイン分泌を少なくとも２、３、４、１０、５０、１００倍増加させることができる。
【０１２１】
好ましくは、処置のための式Ｉで示される化合物の投薬量（単回投与）は、約１mg/kgから約１．２g/kgの間である。
【０１２２】
例示的な化合物について本明細書にさらに記載するように、上記投薬量は１群の化合物に関したものであり、各特定の化合物の最適用量は変動しうることが理解されよう。それにもかかわらず、化合物は、好ましくはγδＴ細胞の生物学的活性を顕著に増加させるために、又は対象中のγδＴ細胞集団を顕著に増加させるために十分な用量で投与される。該用量は、好ましくは、２〜１８０分間、好ましくは２〜１２０分間、より好ましくは約５〜約６０分間、又は最も好ましくは約３０分間又は約６０分間の静脈内（ｉ．ｖ．）投与によりヒトに投与される。
【０１２３】
好ましい例示的な化合物では、式ＩＩに示される化合物は、約０．１mg/kgから約１．２g/kgの間、好ましくは約１０mg/kgから約１．２g/kgの間、より好ましくは約５mg/kgから約１００mg/kgの間、いっそうより好ましくは約５mg/kgから６０mg/kgの間の投薬量で投与される（単回投与）。最も好ましくは、３週間毎又は４週間毎の処置（３週間ごと又は３週間に１回の処置）のための投薬量（単回投与）は、約０．１mg/kgから約１．２g/kgの間、好ましくは約１０mg/kgから約１．２g/kgの間、より好ましくは約５mg/kgから約１００mg/kgの間、いっそうより好ましくは約５mg/kgから６０mg/kgの間である。この用量は、好ましくは２〜１８０分間、好ましくは２〜１２０分間、より好ましくは約５〜約６０分間、又は最も好ましくは約３０分間もしくは約６０分間、静脈内（ｉ．ｖ．）投与によってヒトに投与される。
【０１２４】
γδＴ細胞増殖誘導活性を有するＩＬ−３３サイトカイン、最も好ましくはＩＬ−３３ポリペプチドは、低用量で、典型的には１から１０日の間に含まれる期間にわたり投与される。γδＴ細胞活性化因子は、好ましくは単回で、典型的にはγδＴ細胞活性化因子処置の開始時に投与される。
【０１２５】
好ましい局面では、ＩＬ−３３サイトカインは、毎日、最大約１０日間、好ましくは約３から１０日の間の期間、又は最も好ましくは約５日間投与される。好ましくは、サイトカインの投与は、γδＴ細胞活性化因子の投与と同じ日に（例えばその２４時間以内に）開始する。サイトカインは、約３から１０日間の該投与方法内の任意の適切なスキームで投与できることが理解されよう。サイトカインが約７〜約１４日間投与されるとき、４週間毎の処置サイクルが好ましい。第１の成分が約４日間投与されるとき、３週間毎（3-weekly day）の処置サイクルが好ましい。
【０１２６】
ＩＬ−３３ポリペプチドは、好ましくは低用量で、すなわちＩＬ−１レセプター関連タンパク質ＳＴ２（ＩＬ−１Ｒ４）として定義される、ＩＬ−３３に対する高親和性レセプターを発現する細胞をｉｎ  ｖｉｖｏターゲティングするために十分な用量で投与される。実際にヒトにおいて、そのような用量は、皮下注射したとき、１平方メートルあたり２０万から２００万ユニットの間に含まれると実験的に定義されている（ＩＬ２の臨床試験で）。ＩＬ−３３ポリペプチドは、好ましくは、１日に１０万から３００万ユニット（１００万ユニット＝MU）の間の注射により１〜１０日間投与される。好ましくは、０．２から２MU/日の間、いっそうより好ましくは０．２から１．５MUの間、さらに好ましくは０．２から１MUの間の１日用量が、投与される。１日用量は、単回注射として、又は数回で、典型的には２回の等しい注射で投与することができる。ＩＬ−３３処置は、好ましくは１から９日間、いっそうより好ましくは３〜７日間維持される。最適な効果は、５日処置後に達成されるように見える。
【０１２７】
本発明の治療剤は、さらに、他の活性成分、例えば化学療法剤、抗転移剤又は抗ガン剤又は抗増殖剤と組み合わせることができる。
【０１２８】
特定の一態様では、そのような化合物は、ガン療法に適切な化合物薬物(compounds drugs)、例えば、免疫治療薬（Imids）、治療用モノクローナル抗体、及び生物学的治療薬から成る群より選択される薬物と組み合わせることができる。
【０１２９】
別の局面では、本発明は、感染症の処置のために、特にＣＭＶ感染の処置のために、より詳細にはＢ型肝炎の処置のためにインターフェロンと組み合わせて使用することができる上記のような（ｉ）γδＴ細胞活性化因子及び（ｉｉ）ＩＬ−３３を提供する。
【０１３０】
本発明を以下の図面及び実施例によりさらに例示する。しかし、これらの実施例及び図面は、いかなる場合も本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１Ａ】ＩＬ−３３がＶγ９Ｖδ２Ｔリンパ球の増殖を増加させることを示す図である。ＩＬ−２（１０UI/ml）及びＩＬ−３３（１、１０、１０００ng/ml）の存在下又は不在下でＢｒＨＰＰ（１００nM）を用いて活性化された又はされていないＰＢＭＣの６日培養後のゲーティングされたＶγ９Ｖδ２Ｔリンパ球のＣＦＳＥ希釈；ｃｔｒｌ：ＩＬ−３３なしの対照。７人中１人のドナーの代表的な実験。
【図１Ｂ】ＩＬ−３３がＶγ９Ｖδ２Ｔリンパ球の増殖を増加させることを示す図である。ＩＬ−３３（１０００ng/ml）又はＩＬ−２（１０UI/ml）の存在下又は不在下でＢｒＨＰＰ（１００nM）を用いて活性化されたＰＢＭＣの６日培養後のＶγ９Ｖδ２Ｔリンパ球の絶対数（７回の独立した実験からの平均±ＳＤ）。
【図２Ａ】ＩＬ−３３と共に又はＩＬ−３３なしに１日又は３日培養後のγδＴ細胞によるアネキシンＶ及びＰＩの発現を示す図である。
【図２Ｂ】ＩＬ−３３と共に又はＩＬ−３３なしに１日又は３日培養後の生存γδＴ細胞及び生存ＰＢＭＣのパーセンテージを示す図である（２人の独立したドナーの平均）。
【０１３２】
実施例１：方法
ＰＢＭＣ及びＰＢＬの調製
健康なドナーから新鮮血液試料を採取し、ＰＢＭＣをFicoll-Paque密度勾配（Amersham Biosciences AB, Upssala, Sweden）で遠心分離（８００ｇ、３０分、室温）により調製した。
【０１３３】
ＰＢＬ（末梢血リンパ球）は、CD14 MicroBead Kit（Miltenyi Biotec, Auburn, CA）を製造業者の説明書により使用した磁気活性化細胞ソーティングによってＰＢＭＣから単球を枯渇させて調製した。
【０１３４】
細胞培養
細胞培養は、完全培地：ペニシリン１００UI/ml、ストレプトマイシン１００μg/ml、Ｌ−グルタミン２mM、ピルビン酸ナトリウム１mM及び１０％ＦＣＳを補充されたＲＰＭＩ１６４０中で行った。
【０１３５】
増殖アッセイ
ＰＢＭＣ又はＰＢＬは、０．１２５μM ＣＦＳＥ（Invitrogen, France）を用いて３７℃で８分間ラベルし、９６ウェルプレート（細胞３×１０５個／ウェル）の、ＢｒＨＰＰ［１００nM］、ＩＬ−３３［０〜１０００ng/ml］を有する又は有しない、ｒｈＩＬ−２［１０UI/ml］（Sanofi Aventis, France）を有する又は有しない完全培地２００μl中で培養した。６日培養後、γδＴ細胞（ＣＤ３＋γ９ＴＣＲ＋細胞）でのＣＦＳＥ希釈をフローサイトメトリーによって評価した。
【０１３６】
細胞カウンターを用いてヨウ化プロピジウム検出に基づき細胞増幅を評価した。
【０１３７】
本実施例に使用されたＩＬ−３３形態は、ヒトＩＬ−３３の天然切断産物（ＩＬ−３３  ａａ９５−２７０）及びヒトＩＬ−３３の切断型（ＩＬ−３３ａａ１１２−２７０）であった。
【０１３８】
抗体染色
フローサイトメトリーによってＶγ９Ｖδ２Ｔリンパ球を選択するために、抗ＴＣＲ  γ９−ＡＰＣ及び抗ＣＤ３−パシフィックブルーを使用した。
【０１３９】
統計解析
有意差は、SigmaStatソフトウェア（Systat Software Inc., San Jose, CA）を使用することによってスチューデントのｔ検定で評価した。
【０１４０】
実施例２：結果
本発明者らは、特異的リン酸化抗原ＢｒＨＰＰと組み合わせたＩＬ−３３がヒトＶγ９Ｖδ２Ｔリンパ球の増殖に及ぼす効果を検討した。この目的で、新鮮ＰＢＭＣをＣＦＳＥで染色し、ＢｒＨＰＰ、ＩＬ−３３及びＩＬ−２の存在下又は不在下で培養した。６日培養後、Ｖγ９Ｖδ２Ｔリンパ球の増殖を、フローサイトメトリーによってゲーティングしたＶγ９Ｖδ２Ｔリンパ球上のＣＦＳＥ蛍光強度の減少によって分析した。本発明者らは、図１Ａにおいて特異的ＢｒＨＰＰ活性化なしでは、Ｖγ９Ｖδ２Ｔリンパ球がＩＬ−３３の存在化又は不在下で増殖できないことを示した。培養物に１００nM  ＢｒＨＰＰを添加すると、Ｖγ９Ｖδ２Ｔリンパ球の増殖が誘導される。ＢｒＨＰＰ及び１０００ng/ml  ＩＬ−３３の組み合わせは、ＢｒＨＰＰ及びＩＬ−２の組み合わせよりも有意に大きくこの増殖を増幅する。６日培養後に得られたＶγ９Ｖδ２Ｔリンパ球の絶対数に関して、ＩＬ−３３とＢｒＨＰＰとの組み合わせは、この数をＢｒＨＰＰ及びＩＬ−２との組み合わせに類似した方法で増加させる（図１Ｂ）。
【０１４１】
考察
今日、Ｖγ９Ｖδ２Ｔリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで増幅する唯一のツールは、ＰＡｇと組み合わせたＩＬ−２の使用である。Ｖγ９Ｖδ２Ｔリンパ球に基づく抗腫瘍臨床試験は、今日、ＰＡｇ及びＩＬ−２と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養することにより得られた高い量のＶγ９Ｖδ２Ｔリンパ球の注射、又はＶγ９Ｖδ２Ｔリンパ球のｉｎ  ｖｉｖｏ増幅を可能にするこれらの２種の分子の直接注射のいずれかから成る。残念ながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生したリンパ球を患者に注射した後の抗腫瘍機能に不足があるので、最初のプロトコールには限界がある。ＰＡｇ及びＩＬ−２の直接注射は、ガン細胞に対するＶγ９Ｖδ２Ｔリンパ球の細胞傷害性のおかげで、良好な抗腫瘍効力を示す。しかし、ＩＬ−２の有益効果にかかわらず、高い毒性がこの治療法の重要な限界を表している。実際に、利益（Ｖγ９Ｖδ２Ｔリンパ球の抗腫瘍細胞傷害性）／リスク（ＩＬ−２の毒性）比は、この治療法に味方しない。
【０１４２】
本発明は、これらの問題を打開しようと努力し、このように(thus)Ｖγ９Ｖδ２Ｔリンパ球に基づく抗腫瘍治療におけるＩＬ−３３の使用のための真の見通しを開くものである。実際にＰＡｇと組み合わせたＩＬ−３３がＶγ９Ｖδ２Ｔリンパ球を増幅する能力には、重要な使い道がある可能性がある。ＩＬ−３３はＩＬ−２よりも毒性が小さいので、ＰＡｇ／ＩＬ−２の組み合わせの注射に基づく治療法のＩＬ−２をＩＬ−３３に置き換えて利益／リスク比を増大することができよう。
【０１４３】
実施例３：ＩＬ−３３のｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験
材料及び方法
健康ドナー由来の血液試料から新鮮分離されたＰＢＭＣを、１０％ＦＣＳを補充された完全ＲＭＰＩ中でＩＬ−３３（０、１００、５００、１０００、１００００ng/ml）の存在化又は不在下で６日間培養した。
【０１４４】
１及び３日目に、ＰＢＭＣをアネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色し、続いてフローサイトメトリーによって分析してＰＢＭＣの生存率を試験した。
【０１４５】
結果
図２Ａに、アネキシンＶ及びＰＩを用いた染色によりゲーティングしたＴ細胞の生存率を示す。アネキシンＶ及びＰＩが陰性の細胞の率は生存細胞を表す。ＩＬ−３３の存在下又は不在下で１又は３日培養後に、９５％を超えるＴ細胞が生存していた。
【０１４６】
図２Ｂに、生存ＰＢＭＣ又は生存Ｔ細胞の率がＩＬ−３３濃度に関わらず一定であることを示す。
【０１４７】
したがって、本発明者らは、高用量のＩＬ−３３であってもＩＬ−３３が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養されたヒトＰＢＭＣについて、特にヒトγδＴ細胞について無毒性であることを実証した。
【０１４８】
参考文献：
本出願を通じて、本発明が属する技術の現状を様々な参考文献が記載している。これらの参考文献の開示は、これによって参照により本開示に組み入れられる。
【表２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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