(57)【要約】本発明は、眼の不適合創傷治癒（maladapted wound healing）に関与する遺伝子のプロモーターを標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質（polydactyl zinc finger proteins）を含む人工転写因子に関する。そのような人工転写因子は、網膜グリオーシス、増殖性硝子体網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、および網膜上膜などの線維収縮性網膜障害（fibrocontractive retinal disorders）の治療、および緑内障手術に伴う線維増殖の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化もしくは抑制性タンパク質ドメイン、核局在化配列、およびタンパク質形質導入ドメインと融合したポリダクチルジンクフィンガータンパク質であって、エンドソーム特異的プロテアーゼ認識部位と融合していてもよく、眼の不適合創傷治癒（maladapted wound healing）に関与する遺伝子のプロモーターを特異的に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含む、人工転写因子。
【請求項２】
エンドソーム特異的プロテーゼ認識部位を含む、請求項１に記載の人工転写因子。
【請求項３】
配列番号８８から１２８までより成る群から選択されるタンパク質配列のジンクフィンガータンパク質を含む、請求項１に記載の人工転写因子。
【請求項４】
配列番号８８から１２８までより成る群から選択されるタンパク質配列のジンクフィンガータンパク質を含み、ここで、３個までの個々のジンクフィンガーモジュールが、代わりとなる結合特性を持つ他のジンクフィンガーモジュールと交換される、および／または、ここで、１２個までの個々のアミノ酸が交換される、請求項１に記載の人工転写因子。
【請求項５】
ポリエチレングリコール残基をさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の人工転写因子。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の人工転写因子を含む医薬組成物。
【請求項７】
遺伝子プロモーターからの発現の増加または減少に用いるための請求項１から５のいずれか一項に記載の人工転写因子。
【請求項８】
線維収縮性網膜障害（fibrocontractive retinal disorders）の治療のための請求項１から５のいずれか一項に記載の人工転写因子。
【請求項９】
網膜グリオーシス、増殖性硝子体網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、および／または網膜上膜の治療のための請求項１から５のいずれか一項に記載の人工転写因子。
【請求項１０】
緑内障手術後の線維増殖の治療のための請求項１から５のいずれか一項に記載の人工転写因子。
【請求項１１】
請求項１から５のいずれか一項に記載の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、線維増殖および線維収縮性網膜障害を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、眼の不適合創傷治癒（maladapted wound healing）に関与する遺伝子のプロモーターを標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質（複数フィンガーのジンクフィンガータンパク質）（polydactyl zinc finger proteins）を含む人工転写因子、ならびに抑制性もしくは活性化ドメイン、核局在化配列、タンパク質形質導入ドメイン、およびエンドソーム特異的プロテアーゼ認識部位と融合し、疾患関連遺伝子プロモーターを特に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含むそのような人工転写因子を用いた眼の創傷治癒プロセスを調節する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
傷害によって誘発される種々の細胞型の増殖を介する創傷治癒は、瘢痕形成をもたらし、機械的または免疫学的損傷に応答して器官の機能を維持または回復するために必要なプロセスである。しかし、不適合な創傷治癒は、適切な器官の機能を部分的にしか回復しないか、またはそれを阻害さえする瘢痕形成をもたらし得る。そのような不適合創傷修復は、生化学的だけでなく、機械的、光学的、および空間的にも非常に規則正しい様式で多くの異なる細胞型が正しく相互作用し合うことに依存している精巧な器官である眼で発生することが多い。従って、眼における不適合創傷修復による瘢痕形成は、患者の視覚障害における主要な因子である。
【０００３】
網膜グリオーシス、増殖性硝子体網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、および網膜上膜などの線維収縮性網膜障害（fibrocontractive retinal disorders）は、例えば硝子体網膜手術、糖尿病性変化、または低酸素性損傷に応答しての不適合網膜創傷修復に起因する眼の疾患である。さらに、そのような不適合創傷治癒はまた、老化および付随する硝子体の収縮とも関連付けられるが、特発性の線維収縮性網膜障害も見られる。臨床結果は、黄斑パッカー、黄斑浮腫、網膜歪み（retinal distortion）、網膜剥離、および最終的には失明である。このような疾患に対する標準的な治療は、高用量のステロイドを用いた非特異的抗炎症治療、または網膜上膜の手術による除去、または膜剥離術（membrane peeling）である。疾患の初期ステージにおいて、グリアおよびミューラー細胞、免疫細胞、（線維性）星状細胞、色素上皮細胞、ならびにミクログリアを含む網膜の種々の細胞型の活性化が、網膜を覆う透明細胞層の形成を引き起こす。疾患の後期ステージでは、この透明細胞層が、締め付けおよび収縮を開始し、最初は網膜を歪ませ、最終的には、網膜の剥離および破壊を引き起こす。この透明層を形成する網膜細胞の活性化は、増殖因子のホストおよびそれらに付随する増殖因子受容体、ならびに組織リモデリングおよび炎症と関係するその他の因子によって支配される。線維収縮性網膜障害と関係する因子は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−ベータ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢＥＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−アルファ）であるが、さらにマトリックスメタロプロテアーゼ２および９（ＭＭＰ２、ＭＭＰ９）、ならびに組織ＭＭＰ２阻害因子（ＴＩＭＰ２）である（Moysidis S.N. et al., 2012, Mediators Inflamm, 2012:815937）。
【０００４】
緑内障は、世界中で６０００万人以上が罹患しており、二番目に最も多い失明性疾患である。眼圧の上昇に伴う緑内障に対する標準的な治療は、眼圧を低下させる薬物療法、または眼の手術である。緑内障ろ過手術は、薬物療法およびレーザー手術が不充分であることが分かった場合に、眼圧を制御するための至適基準である。しかし、線維芽細胞増殖の増加、または線維増殖症に起因する瘢痕組織が形成して房水の流れを妨害し、ろ過が不成功となる場合がある。現行の診療では、術後の眼における瘢痕組織形成を制限する補助とするために、抗代謝剤であるマイトマイシン−Ｃおよび５−フルオロウラシル（手術中に局所適用され、手術後に濾過胞へ注射される）が用いられる。このような薬剤は、手術の予後を改善することが示されているが、非選択的な形で行われる。その結果、抗代謝剤治療は、低眼圧、濾過胞炎、眼内炎、濾過胞漏出などを含む著しい副作用プロファイルを伴う。
【０００５】
組織線維症を予防する別の選択肢としての方法に関する最近の研究では、特に種々の増殖因子の制御による、線維芽細胞増殖の阻害に焦点が当てられてきた。ＶＥＧＦおよびＴＧＦ−ベータを阻害することによる瘢痕形成低減のある程度の成功が最近の文献に報告されている（Lockwood A. et al., 2013、Curr Opin Pharmacol 13 (1), 65-71）。ヒトテノン嚢線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化転換が、瘢痕形成にとって最も決定的なイベントの１つであり、手術後のＴＧＦ−ベータによる組織リモデリングが、この分化転換にとって不可欠であることが実証された。ＴＧＦファミリーは、増殖、分化、アポトーシス、および細胞外マトリックスの産生などの細胞機能の制御において類似の能力を共有している。眼の場合、房水（濾過胞へ流入する）は、ＴＧＦ−ベータ２を大量に含有しているが、ＴＧＦ−ベータ１およびベータ２は、濾過胞の細胞において局所的に発現される。
【０００６】
手術後のギャップ結合情報伝達の調節は、瘢痕形成を低減するための別の可能性である。ギャップ結合は、細胞間の直接のシグナル伝達を可能とする構造である。６つのコネキシンタンパク質サブユニットがオリゴマー化して、コネクソンと称されるヘミチャネル（hemichannel）を形成し；隣接する細胞からの２つのコネクソンがドッキングして、完全な細胞間結合チャネルを形成する。ギャップ結合は、炎症、細胞遊走、および組織収縮において役割を担っている。げっ歯類での研究により、コネキシン４３タンパク質の発現の一時的な減少が、皮膚の創傷治癒および瘢痕低減に有益であることが示されている（Deva N.C. et al., 2012, Inflammation 35 (4), 1276-86）。
【０００７】
人工転写因子（ＡＴＦ）が、遺伝子発現の調節に有用なツールであるとして提案されている（Sera T., 2009, Adv Drug Deliv Rev 61, 513-526）。遺伝子転写の抑制または活性化のいずれかを通して発現に影響を与える多くの天然転写因子は、特定のＤＮＡ配列を認識するための複雑な特異的ドメインを持っている。このために、その特異性および（１もしくは複数の）標的遺伝子を改変することを意図する場合、それらは、操作の対象として魅力的なものとならない。しかし、転写因子の特定のクラスは、いくつかのいわゆるジンクフィンガー（ＺＦ）ドメインを含有しており、それは、モジュラー構造であることから、遺伝子操作に適している。ジンクフィンガーは、ほとんど独立して３つのＤＮＡ塩基対を標的とする短鎖（３０アミノ酸）ＤＮＡ結合モチーフである。そのようないくつかのジンクフィンガーを一緒に融合して含有するタンパク質は、従って、より長いＤＮＡ配列を認識することができる。六量体ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）は、全ヒトゲノムの中でほとんど唯一である１８塩基対（ｂｐ）ＤＮＡ標的を認識する。最初は、完全に状況非依存的（context independent）であると考えられていたが、より詳細な分析により、ジンクフィンガーのある程度の状況特異性（context specificity）が明らかとなった（Klug A., 2010, Annu Rev Biochem 79, 213-231）。ジンクフィンガー認識表面の特定のアミノ酸を変異させてＺＦモジュールの結合特異性を変化させることにより、５’−ＧＮＮ−３’、５’−ＣＮＮ−３’、５’−ＡＮＮ−３’コドンのほとんど、およびいくつかの５’−ＴＮＮ−３’コドンに対する確定されたＺＦ構成要素が得られた（いわゆるＢａｒｂａｓモジュール、Dreier B., Barbas C.F. 3rd et al., 2005, J Biol Chem 280, 35588-35597参照）。人工転写因子に関する初期の研究は、予め選択されたジンクフィンガーを既知の３ｂｐ標的配列と組み合わせることに基づく合理的な設計に集中していたが、ジンクフィンガーのある程度の状況特異性が認識されたことで、細菌もしくは酵母ワンハイブリッド、ファージディスプレイ、区画化リボソームディスプレイ（compartmentalized ribosome display）、またはＦＡＣＳ分析を用いた生体内選別などの高度な方法を用いて情報が得られる大規模ジンクフィンガーライブラリーの作製が必要となった。
【０００８】
そのような人工ジンクフィンガータンパク質を用いることで、ヒトゲノムのＤＮＡ座位を、高い特異性で標的とすることができる。従って、このようなジンクフィンガータンパク質は、転写調節活性を持つタンパク質ドメインを特定のプロモーター配列へ運搬し、その結果として目的の遺伝子の発現を調節するための理想的なツールである。転写のサイレンシングに適するドメインは、Ｎ末端（配列番号１）またはＣ末端（配列番号２）ＫＲＡＢドメインとしてのクルッペル関連ドメイン（ＫＲＡＢ）、Ｓｉｎ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ、配列番号３）、およびＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ、配列番号４）であり、一方、遺伝子転写の活性化は、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６（配列番号５）またはＶＰ６４（ＶＰ１６の四量体リピート、配列番号６）ドメインを介して達成される（Beerli R.R. et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95, 14628-14633）。転写活性化を付与すると考えられるさらなるドメインは、ＣＪ７（配列番号７）、ｐ６５−ＴＡ１（配列番号８）、ＳＡＤ（配列番号９）、ＮＦ−１（配列番号１０）、ＡＰ−２（配列番号１１）、ＳＰ１−Ａ（配列番号１２）、ＳＰ１−Ｂ（配列番号１３）、Ｏｃｔ−１（配列番号１４）、Ｏｃｔ−２（配列番号１５）、Ｏｃｔ−２＿５ｘ（配列番号１６）、ＭＴＦ−１（配列番号１７）、ＢＴＥＢ−２（配列番号１８）、およびＬＫＬＦ（配列番号１９）である。加えて、ジーンオントロジー  ＧＯ：０００１０７１（http://amigo.geneontology.org/cgibin/amigo/term_details?term=GO:0001071）によって定められるタンパク質の転写活性ドメインは、標的タンパク質の転写制御を達成するものと考えられる。
【０００９】
いわゆるタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）は、細胞膜を通してのサイトゾル／核質へのタンパク質の移行を促進することが示された。ＨＩＶ誘導ＴＡＴペプチド（配列番号２０）、ｍＴ０２（配列番号２１）、ｍＴ０３（配列番号２２）、Ｒ９（配列番号２３）、ＡＮＴＰ（配列番号２４）などの短鎖ペプチドは、カーゴタンパク質と融合された場合、細胞型に依存しないマクロピノサイトーシスによる取り込みを誘発することが示された（Wadia J.S. et al., 2004, Nat Med 10, 310-315）。サイトゾルに到達後、そのような融合タンパク質は、生物学的活性を有することが示された。興味深いことに、ミスフォールドタンパク質であっても、恐らくは細胞内シャペロンの作用により、タンパク質形質導入後に機能性となることができる。しかし、治療カーゴを細胞へ送達するためにタンパク質形質導入ドメインを用いることに対する主たる障害は、エンドソームコンパートメントから核などのその他の細胞内位置へのそのようなタンパク質の放出が限定的であることである（Koren E and Torchilin V.P., 2012, Trends in Mol Med 18, 385-393）。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、抑制性もしくは活性化タンパク質ドメイン、核局在化配列、およびタンパク質形質導入ドメインと融合しており、エンドソーム特異的プロテアーゼ認識部位と融合していてもよい、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域を特異的に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含む人工転写因子、ならびにそのような人工転写因子を含む医薬組成物に関する。
【００１１】
さらに、本発明は、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子の発現を増加または減少させるための、およびそのような遺伝子によって引き起こされる、または影響を受ける疾患の治療における本発明の人工転写因子の使用にも関する。
【００１２】
同様に、本発明は、本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子によって引き起こされるまたは調節される疾患を治療する方法にも関する。
【００１３】
本発明の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、ＡＧＥＲ（ＲＡＧＥ）プロモーター（配列番号２５）である。この特定の実施形態では、本発明は、ＡＧＥＲレベルの低下または上昇によってＡＧＥＲの活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのＡＧＥＲプロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、ＡＧＥＲプロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、ＡＧＥＲによって調節される疾患を治療する方法にも関する。
【００１４】
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、ＥＧＦＲプロモーター（配列番号２６）である。この特定の実施形態では、本発明は、ＥＧＦＲレベルの低下または上昇によってＥＧＦＲの活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのＥＧＦＲプロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、ＥＧＦＲプロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、ＥＧＦＲによって調節される疾患を治療する方法にも関する。
【００１５】
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、ＦＧＦＲ１プロモーター（配列番号２７）である。この特定の実施形態では、本発明は、ＦＧＦＲ１レベルの低下または上昇によってＦＧＦＲ１の活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのＦＧＦＲ１プロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、ＦＧＦＲ１プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、ＦＧＦＲ１によって調節される疾患を治療する方法にも関する。
【００１６】
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、ＦＧＦＲ２プロモーター（配列番号２８）である。この特定の実施形態では、本発明は、ＦＧＦＲ２レベルの低下または上昇によってＦＧＦＲ２の活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのＦＧＦＲ２プロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、ＦＧＦＲ２プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、ＦＧＦＲ２によって調節される疾患を治療する方法にも関する。
【００１７】
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、ＦＧＦＲ３プロモーター（配列番号２９）である。この特定の実施形態では、本発明は、ＦＧＦＲ３レベルの低下または上昇によってＦＧＦＲ３の活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのＦＧＦＲ３プロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、ＦＧＦＲ３プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、ＦＧＦＲ３によって調節される疾患を治療する方法にも関する。
【００１８】
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、ＦＧＦＲ４プロモーター（配列番号３０）である。この特定の実施形態では、本発明は、ＦＧＦＲ４レベルの低下または上昇によってＦＧＦＲ４の活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのＦＧＦＲ４プロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、ＦＧＦＲ４プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、ＦＧＦＲ４によって調節される疾患を治療する方法にも関する。
【００１９】
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、ＦＬＴ１（ＶＥＧＦＲ−１）プロモーター（配列番号３１）である。この特定の実施形態では、本発明は、ＦＬＴ１レベルの低下または上昇によってＦＬＴ１の活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのＦＬＴ１プロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、ＦＬＴ１プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、ＦＬＴ１によって調節される疾患を治療する方法にも関する。
【００２０】
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、ＦＬＴ４（ＶＥＧＦＲ−３）プロモーター（配列番号３２）である。この特定の実施形態では、本発明は、ＦＬＴ４レベルの低下または上昇によってＦＬＴ４の活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのＦＬＴ４プロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、ＦＬＴ４プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、ＦＬＴ４によって調節される疾患を治療する方法にも関する。
【００２１】
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、ＧＪＡ１（ＣＸ４３）プロモーター（配列番号３３）である。この特定の実施形態では、本発明は、ＧＪＡ１レベルの低下または上昇によってＧＪＡ１の活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのＧＪＡ１プロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、ＧＪＡ１プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、ＧＪＡ１によって調節される疾患を治療する方法にも関する。
【００２２】
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、ＩＧＦ１Ｒプロモーター（配列番号３４）である。この特定の実施形態では、本発明は、ＩＧＦ１Ｒレベルの低下または上昇によってＩＧＦ１Ｒの活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのＩＧＦ１Ｒプロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、ＩＧＦ１Ｒプロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、ＩＧＦ１Ｒによって調節される疾患を治療する方法にも関する。
【００２３】
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）プロモーター（配列番号３５）である。この特定の実施形態では、本発明は、ＫＤＲレベルの低下または上昇によってＫＤＲの活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのＫＤＲプロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、ＫＤＲプロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、ＫＤＲによって調節される疾患を治療する方法にも関する。
【００２４】
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、ＭＥＴ（ＨＧＦＲ）プロモーター（配列番号３６）である。この特定の実施形態では、本発明は、ＭＥＴレベルの低下または上昇によってＭＥＴの活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのＭＥＴプロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、ＭＥＴプロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、ＭＥＴによって調節される疾患を治療する方法にも関する。
【００２５】
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、ＰＤＧＦＲＡプロモーター（配列番号３７）である。この特定の実施形態では、本発明は、ＰＤＧＦＲＡレベルの低下または上昇によってＰＤＧＦＲＡの活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのＰＤＧＦＲＡプロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、ＰＤＧＦＲＡプロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、ＰＤＧＦＲＡによって調節される疾患を治療する方法にも関する。
【００２６】
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、ＰＤＧＦＲＢプロモーター（配列番号３８）である。この特定の実施形態では、本発明は、ＰＤＧＦＲＢレベルの低下または上昇によってＰＤＧＦＲＢの活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのＰＤＧＦＲＢプロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、ＰＤＧＦＲＡプロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、ＰＤＧＦＲＢによって調節される疾患を治療する方法にも関する。
【００２７】
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、ＰＮＰＬＡ２（ＰＥＤＦ−Ｒ）プロモーター（配列番号３９）である。この特定の実施形態では、本発明は、ＰＮＰＬＡ２レベルの低下または上昇によってＰＮＰＬＡ２の活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのＰＮＰＬＡ２プロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、ＰＮＰＬＡ２プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、ＰＮＰＬＡ２によって調節される疾患を治療する方法にも関する。
【００２８】
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域はＴＧＦＢＲ１プロモーター（配列番号４０）である。この特定の実施形態では、本発明は、ＴＧＦＢＲ１レベルの低下または上昇によってＴＧＦＢＲ１の活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのＴＧＦＢＲ１プロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、ＴＧＦＢＲ１プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、ＴＧＦＢＲ１によって調節される疾患を治療する方法にも関する。
【００２９】
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域はＴＧＦＢＲ２プロモーター（配列番号４１）である。この特定の実施形態では、本発明は、ＴＧＦＢＲ２レベルの低下または上昇によってＴＧＦＢＲ２の活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのＴＧＦＢＲ２プロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、ＴＧＦＢＲ２プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、ＴＧＦＢＲ２によって調節される疾患を治療する方法にも関する。
【００３０】
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域はＴＧＦＢＲ３プロモーター（配列番号４２）である。この特定の実施形態では、本発明は、ＴＧＦＢＲ３レベルの低下または上昇によってＴＧＦＢＲ３の活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのＴＧＦＢＲ３プロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、ＴＧＦＢＲ３プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、ＴＧＦＢＲ３によって調節される疾患を治療する方法にも関する。
【００３１】
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域はＴＮＦＲＳＦ１Ａプロモーター（配列番号４３）である。この特定の実施形態では、本発明は、ＴＮＦＲＳＦ１Ａレベルの低下または上昇によってＴＮＦＲＳＦ１Ａの活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのＴＮＦＲＳＦ１Ａプロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、ＴＮＦＲＳＦ１Ａプロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、ＴＮＦＲＳＦ１Ａによって調節される疾患を治療する方法にも関する。
【００３２】
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域はＴＮＦＲＳＦ１Ｂプロモーター（配列番号４４）である。この特定の実施形態では、本発明は、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂレベルの低下または上昇によってＴＮＦＲＳＦ１Ｂの活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのＴＮＦＲＳＦ１Ｂプロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂプロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂによって調節される疾患を治療する方法にも関する。
【００３３】
さらに、本発明は、網膜グリオーシス、増殖性硝子体網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、および網膜上膜などの線維収縮性網膜障害、緑内障手術後の線維増殖を治療するための記載した人工転写因子、ならびに本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む線維増殖および線維収縮性網膜障害を治療する方法にも関する。
【００３４】
本発明はさらに、本発明の人工転写因子をコードする核酸、これらを含むベクター、およびそのようなベクターを含む宿主細胞にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、プロテアーゼ感受性形質導入可能人工転写因子を用いた遺伝子発現の調節の概略図である。  タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、エンドソーム特異的プロテアーゼ開裂部位（ＰＳ）、転写制御活性を持つドメイン（ＲＤ）、核局在化配列（ＮＬＳ）、および遺伝子（Ｇ）のプロモーター領域（Ｐ）に特異的であるポリダクチルジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質を含む人工転写因子が、エンドサイトーシス機構を介して細胞内に進入する。（Ａ）では、そのような人工転写因子は、エンドソームコンパートメント（ｅ）の内部にトラップされ、核（ｎ）に効率的に到達することができない。（Ｂ）では、エンドソーム特異的プロテアーゼ（ハサミの記号で示す）が、エンドソーム成熟の過程で活性化され、ＰＳを認識し、人工転写因子を開裂し、そうして、ＰＴＤがＲＤ−ＮＬＳ−ＺＦnから分離される。エンドソームベシクルの破裂後、この時点では開裂されている人工転写因子は、エンドソームコンパートメントを離れることができ、核へと輸送されている（（Ｃ）を参照されたい）。遺伝子Ｇのプロモーター領域Ｐにあるその標的部位と結合すると、ｍＲＮＡ（ｍ）の産生が、制御ドメインＲＤの転写制御活性に応じて、上方または下方制御（＋または−）される。
【発明の詳細な説明】
【００３６】
本発明は、抑制性もしくは活性化タンパク質ドメイン、核局在化配列、およびタンパク質形質導入ドメインと融合しており、エンドソーム特異的プロテアーゼ認識部位と融合していてもよい、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーターを特異的に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含む人工転写因子、ならびにそのような人工転写因子を含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子の発現を調節するための、およびそのような遺伝子によって引き起こされる、または調節される疾患の治療におけるそのような人工転写因子の使用にも関する。
【００３７】
本発明の文脈において、プロモーターは、本技術分野で公知であるように、遺伝子の制御領域として定義される。やはり本文脈において、遺伝子は、本技術分野で公知であるように、制御配列とタンパク質またはＲＮＡの産生をもたらす遺伝子産物のための配列とを含有するゲノム領域として定義される。本文脈において、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子は、その遺伝子産物が眼の組織損傷部位での細胞増殖調節に積極的に関与しているか、またはその遺伝子産物が傷害のない場合であっても誤って活性化状態であり、過剰な細胞増殖または瘢痕形成を促進する遺伝子である。
【００３８】
本発明の文脈において、エンドソーム特異的プロテアーゼ認識部位は、エンドソームコンパートメントに存在するプロテアーゼによって配列特異的な形で認識され、開裂されるペプチド配列である。やはり本発明の文脈において、タンパク質形質導入ドメインは、人工転写因子などのタンパク質を、細胞膜を通して細胞内コンパートメント中に輸送することができるペプチドとして定義される。
【００３９】
本発明の文脈において、遺伝子プロモーターを「特異的に」標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質は、そのＤＮＡ標的に対して２０ｎＭ以下の結合親和性を有する。
【００４０】
本発明において眼の不適合創傷治癒に関与すると考えられる遺伝子は、ＡＧＥＲ（ＲＡＧＥ）、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ１（ＶＥＧＦＲ１）、ＦＬＴ４（ＶＥＧＦＲ−３）、ＧＪＡ１（ＣＸ４３）、ＩＧＦ１Ｒ、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）、ＭＥＴ（ＨＧＦＲ）、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＮＰＬＡ２（ＰＥＤＦ−Ｒ）、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、およびＴＮＦＲＳＦ１Ｂである。
【００４１】
人工転写因子は、遺伝子発現の調節に有用であり、従って、遺伝子発現の調節が有益である疾患の治療に有用である。従来の薬物は、特定のタンパク質の活性を、例えばアゴニストまたはアンタゴニスト活性によって調節するものであるが、人工転写因子は、遺伝子発現を増加または減少させることにより、このようなタンパク質の利用度を変化させるものである。
【００４２】
従来の小分子による手法を用いる場合、タンパク質活性の調節を通して作用する治療活性小分子の同定は、異なる物質のクラスからの広範な様々な異なる分子の中から大規模な時間の掛かるスクリーニング手順を行うことにほとんど依存しており、小分子による遺伝子発現の調節は、これまでのところ可能ではない。対照的に、本発明の人工転写因子はすべて、高度に確定された全体組成を有する同じ物質クラスに属している。２つの非常に多様なプロモーター配列を標的とする２つの六量体ジンクフィンガータンパク質に基づく人工転写因子は、それでも、少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を持ち、全体として類似する三次構造であり、迅速かつ経済的に、標準化された方法（以下で述べるように）を介して作製することができる。従って、本発明の人工転写因子は、１つの分子クラスに含まれ、非常に広く多様な一式の標的に対する極めて高い特異性と、類似する全体組成とを組み合わせるものである。すべての生物学的製剤に関しては、抗薬物抗体の形態の免疫原性およびそれに伴う免疫反応は懸念事項である。しかし、ジンクフィンガーモジュールの高い保存性により、そのような免疫反応は、本発明の人工転写因子の適用後、軽いかもしくは発生せず、または免疫原性は排除するが標的部位への結合、従って機能は依然として維持する全体構造への小さい変更によって、回避可能であるか、もしくはさらに最小限に抑制可能である。さらに、免疫原性を低減するために、本発明の人工転写因子をポリエチレングリコールで修飾することも考えられる。
【００４３】
人工転写因子は、特定の遺伝子のプロモーター領域へ特異的に作用するように仕立てられることから、人工転写因子の使用は、密接に関連するタンパク質であっても、それらを選択的に標的とすることを可能とする。これは、密接に関連するタンパク質であっても、プロモーター領域の保存性が緩いものでしかないことに基づいている。本発明の人工転写因子の高い選択性を利用することで、任意のタンパク質ファミリーの特定のメンバーの発現が多くの場合組織特異的であり、人工転写因子を用いて個々に対処可能であることに基づき、薬物作用の組織特異的な標的化さえも可能である。
【００４４】
加えて、人工転写因子の薬物への製剤は、過去の経験に頼ることが可能であり、それによって創薬プロセスがさらに加速される。
【００４５】
しかし、人工転写因子は、遺伝子発現の調節を通して作用することから、効果的となるためには、細胞の核コンパートメント中に存在する必要がある。現在のところ、人工転写因子の治療的送達のための方法の選択肢は、トランスフェクションを通してのプラスミドＤＮＡの形態であるか、またはウイルスベクターを用いることによるものである。治療目的でのプラスミドトランスフェクションは効力が低く、一方ウイルスベクターは、極めて高い免疫原性の可能性を持ち、従って、これらを特定の治療に繰り返し適用することは制限される。従って、核酸としてではなくタンパク質の形態としての送達を例とする人工転写因子を送達するその他の方法が求められている。
【００４６】
タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）の媒介による人工転写因子の細胞内送達は、人工転写因子の高い選択性および多機能性を新規な様式で利用する新しい方法である。タンパク質形質導入ドメインは、細胞膜バリアを通過してカーゴタンパク質を細胞内へ送達することができる小ペプチドである。そのようなタンパク質形質導入ドメインは、例えば、ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、ｍＴ０２、ｍＴ０３、Ｒ９、ＡＮＴＰなどである。細胞への取り込みの様式は、恐らくはエンドサイトーシスによると考えられ、ＴＡＴペプチドは、カーゴタンパク質と融合された場合、細胞型に依存しないマクロピノサイトーシスによる取り込みを誘発可能であることが示された（Wadia J.S. et al., 2004, Nat Med 10, 310-315）。細胞膜のバリアを通過し、エンドソーム小胞内に取り込まれることは、細胞へ進入する第一の工程であるが、位相幾何学的には、エンドソームコンパートメントの内部と細胞の外部とは同一である。従って、エンドソーム局在化は、細胞質または核質局在化と同等ではない。しかし、恐らくはエンドソームコンパートメントの漏出および／または膜の完全性の調節という意味でのカーゴもしくはタンパク質形質導入ドメインの何らかの固有の特性を通して、送達されたタンパク質は、エンドソームから脱出し、他の実際の細胞内標的に到達することができる。膜活性膜融合性ペプチドＴＡＴ−ＨＡ２、またはＧＡＬＡもしくはＫＡＬＡペプチドなどのその他のペプチドを共送達することにより、エンドソーム小胞の崩壊にある程度起因して、送達されたタンパク質のエンドソーム脱出が改善された。
【００４７】
しかし、膜融合性ペプチドは、期待された程は送達の促進に有効ではない。これは、タンパク質形質導入ドメインの固有の特性に起因している可能性がある。タンパク質形質導入ドメインは、細胞膜と強く相互作用を起こすことが知られている。この強い膜との相互作用は、タンパク質の内部移行、および従ってタンパク質の送達が引き起こされる機構の一部である。従って、エンドソームへの内部移行後、ここではエンドソーム膜の内部に対してであるタンパク質形質導入ドメインのこの強い膜相互作用が、エンドソーム小胞の破裂後であっても、再分布を実際に阻害している可能性がある。ＴＡＴ融合人工転写因子は、ある程度の核局在化と共に、主としてエンドソームコンパートメントに存在し得る。興味深いことに、ＴＡＴ−人工転写因子を染色した細胞の大部分において、破裂したエンドソーム小胞がサイトゾルに対して開放され、エンドソーム膜が明らかにＴＡＴ融合タンパク質で染色されていることを見出すことができ、このことは、エンドソーム膜の破裂後であっても、送達されたタンパク質のかなりの量がエンドソームにトラップされていることと一致する。従って、タンパク質形質導入ドメインは、細胞内への取り込みにとって不可欠ではあるが、タンパク質形質導入の発生後、有効な細胞内局在化を妨げる可能性がある。
【００４８】
エンドソームは、成熟して、プロテアーゼの獲得、ならびにリソソームコンパートメントとの融合前に小胞内ｐＨの低下を示すこと、およびエンドソーム内容物のタンパク質分解などのリソソーム特性を獲得することが知られている非常に動的な小器官である。内腔のタンパク質分解活性の上昇を伴うエンドソーム成熟のプロセスは、タンパク質形質導入ドメインを用いて送達された治療タンパク質にとって有害であり、それは、そこでそのようなタンパク質がタンパク質分解を受けるからである。しかし、このプロセスは、利点に変えることができる。エンドソーム成熟は、異なるセットのプロテアーゼがｐＨ依存的様式で異なる段階で活性化される逐次プロセスである。興味深いことに、タンパク質プロセッシングに関与するプロセスの初期に活性化されるプロテアーゼは、タンパク質の全般的な加水分解に不可欠である成熟過程の後期に活性化されるプロテアーゼよりも配列特異的である。ここで、タンパク質形質導入ドメインとカーゴタンパク質との間に初期エンドソームプロテアーゼの開裂部位を組み込むことにより、治療タンパク質がエンドソーム内腔に到達した後、カーゴタンパク質からタンパク質形質導入ドメインを分離する治療タンパク質の配列特異的消化が引き起こされる。従って、人工転写因子のＴＡＴ媒介送達後によく見られるエンドソームの破裂後、カーゴタンパク質は、タンパク質形質導入ドメインの固有の特性に起因してエンドソーム膜の内部にはもはや結合されず、サイトゾル中へと脱出するために膜から脱離される。
【００４９】
さらに、本発明の人工転写因子は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。考慮される核局在化配列は、ジーンオントロジーＧＯ：０００８１３９によって定められるタンパク質との結合を通して核内移行を付与するアミノ酸モチーフであり、例えば、リジン残基（Ｋ）、続いてリジン（Ｋ）またはアルギニン残基（Ｒ）、続いて任意のアミノ酸（Ｘ）、続いてリジンまたはアルギニン残基を含有する塩基性アミノ酸のクラスター（Ｋ−Ｋ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒコンセンサス配列、Chelsky D. et al., 1989 Mol Cell Biol 9, 2487-2492）、またはＳＶ４０  ＮＬＳ（配列番号４５）であり、ＳＶ４０  ＮＬＳが好ましい。
【００５０】
本発明の人工転写因子はまた、ジーンオントロジーＧＯ：０００１０７１によって定められるタンパク質のその他の転写活性タンパク質ドメインも含有してよく、Ｎ末端ＫＲＡＢ、Ｃ末端ＫＲＡＢ、ＳＩＤ、およびＥＲＤドメインなどであり、ＫＲＡＢまたはＳＩＤが好ましい。考慮される活性化タンパク質ドメインは、ジーンオントロジーＧＯ：０００１０７１によって定められるタンパク質の転写活性ドメインであり、ＶＰ１６またはＶＰ６４（ＶＰ１６の四量体リピート）、ＣＪ７、ｐ６５−ＴＡ１、ＳＡＤ、ＮＦ−１、ＡＰ−２、ＳＰ１−Ａ、ＳＰ１−Ｂ、Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−２、Ｏｃｔ−２＿５ｘ、ＭＴＦ−１、ＢＴＥＢ−２、およびＬＫＬＦなどであり、ＶＰ６４が好ましい。
【００５１】
さらに、トランスフェクションによって、またはヘルペスウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス系ベクターなどのウイルスベクターを介して導入される核酸の形態としての、本発明の人工転写因子のための別の選択肢としての送達方法も考慮される。
【００５２】
また、五量体、六量体、七量体、または八量体ジンクフィンガータンパク質を含有する本発明の人工転写因子も考慮され、ここで、対応する核内受容体プロモーター遺伝子の標的部位に対する結合親和性を改善するために、または許容度改善のためにジンクフィンガータンパク質の免疫学的プロファイルを改変するために、個々のジンクフィンガーモジュールが交換される。
【００５３】
本発明の人工転写因子のドメインは、短鎖フレキシブルリンカー（short flexible linkers）で連結されていてよい。短鎖フレキシブルリンカーは、２から８個のアミノ酸を有し、好ましくは、グリシンおよびセリンである。考慮される特定のリンカーは、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号４６）である。人工転写因子はさらに、その検出および処理を容易とするために、エピトープタグなどのマーカーを含有してもよい。
【００５４】
任意のプロモーター領域内の標的部位の選択
標的部位の選択は、機能的人工転写因子作製の成功のために極めて重要である。人工転写因子が標的遺伝子発現を生体内で調節するためには、それは、標的遺伝子のゲノム状況（genomic context）におけるその標的部位と結合する必要がある。これには、ＤＮＡ標的部位へのアクセス性が必要であり、それは、この領域中の染色体ＤＮＡがヒストンの周囲に密に充填されたヌクレオソームとなっていないこと、およびメチル化などのＤＮＡ修飾が人工転写因子の結合に干渉しないことを意味する。ヒトゲノムの大部分は、密に充填され、転写不活性であるが、活発に転写される遺伝子の転写開始部位のすぐ近傍（−１０００から＋２００ｂｐ）は、内在性転写因子およびＲＮＡポリメラーゼなどの転写装置にとってアクセス可能である必要がある。従って、いずれの任意の標的遺伝子においても、この領域中の標的部位を選択することは、生体内での所望される機能を有する人工転写因子作製の成功率を大きく高めることになる。
【００５５】
眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター内の標的部位選択
転写開始部位の２０００ｂｐ上流および５００ｂｐ下流である不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域を、（Ｇ／ＣＡＮＮ）6の一般組成を有する潜在的１８ｂｐ標的部位の存在について分析し、ここで、Ｇはヌクレオチドグアニンであり、Ｃはヌクレオチドシトシン、Ａはヌクレオチドアデニン、ならびにＮは、グアニン、シトシン、アデニン、およびチミンの４つのヌクレオチドの各々を表す。各プロモーター中の２つの標的部位を、転写開始部位に対するその位置に基づいて選択した。これらの標的部位は：ＡＧＥＲ＿ＴＳ１（配列番号４７）、ＡＧＥＲ＿ＴＳ２（配列番号４８）、ＥＧＦＲ＿ＴＳ１（配列番号４９）、ＥＧＦＲ＿ＴＳ２（配列番号５０）、ＦＧＦＲ１＿ＴＳ１（配列番号５１）、ＦＧＦＲ１＿ＴＳ２（配列番号５２）、ＦＧＦＲ２＿ＴＳ１（配列番号５３）、ＦＧＦＲ２＿ＴＳ２（配列番号５４）、ＦＧＦＲ３＿ＴＳ１（配列番号５５）、ＦＧＦＲ３＿ＴＳ２（配列番号５６）、ＦＧＦＲ４＿ＴＳ１（配列番号５７）、ＦＧＦＲ４＿ＴＳ２（配列番号５８）、ＦＬＴ１＿ＴＳ１（配列番号５９）、ＦＬＴ１＿ＴＳ２（配列番号６０）、ＦＬＴ４＿ＴＳ１（配列番号６１）、ＦＬＴ４＿ＴＳ２（配列番号６２）、ＧＪＡ１＿ＴＳ１（配列番号６３）、ＧＪＡ１＿ＴＳ２（配列番号６４）、ＩＧＦ１Ｒ＿ＴＳ１（配列番号６５）、ＩＧＦ１Ｒ＿ＴＳ２（配列番号６６）、ＫＤＲ＿ＴＳ１（配列番号６７）、ＫＤＲ＿ＴＳ２（配列番号６８）、ＭＥＴ＿ＴＳ１（配列番号６９）、ＭＥＴ＿ＴＳ２（配列番号７０）、ＰＤＧＦＲＡ＿ＴＳ１（配列番号７１）、ＰＤＧＦＲＡ＿ＴＳ２（配列番号７２）、ＰＤＧＦＲＢ＿ＴＳ１（配列番号７３）、ＰＤＧＦＲＢ＿ＴＳ２（配列番号７４）、ＰＮＰＬＡ２＿ＴＳ１（配列番号７５）、ＰＮＰＬＡ２＿ＴＳ２（配列番号７６）、ＴＧＦＢＲ１＿ＴＳ１（配列番号７７）、ＴＧＦＢＲ１＿ＴＳ２（配列番号７８）、ＴＧＦＢＲ１＿ＴＳ−３９０（配列番号７９）、ＴＧＦＢＲ２＿ＴＳ１（配列番号８０）、ＴＧＦＢＲ２＿ＴＳ２（配列番号８１）、ＴＧＦＢＲ３＿ＴＳ１（配列番号８２）、ＴＧＦＢＲ３＿ＴＳ２（配列番号８３）、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ＿ＴＳ１（配列番号８４）、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ＿ＴＳ２（配列番号８５）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ＿ＴＳ１（配列番号８６）、およびＴＮＦＲＳＦ１Ｂ＿ＴＳ２（配列番号８７）である。
【００５６】
眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーターを標的とする人工転写因子
眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター内の特定の標的部位を標的とする特定の六量体ジンクフィンガータンパク質は、ＺｉＦｉｔソフトウェアｖ３．３（Sander J.D., Nucleic Acids Research 35, 599-605）を用いたＢａｒｂａｓジンクフィンガーモジュールセット（Gonzalez B., 2010, Nat Protoc 5, 791-810）から成るか、または改良酵母ワンハイブリッドスクリーニングを用いて選択される。
【００５７】
眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター内の標的部位に特異的である六量体ジンクフィンガーは：ＡＧＥＲ＿１（配列番号８８）、ＡＧＥＲ＿２（配列番号８９）、ＥＧＦＲ＿１（配列番号９０）、ＥＧＦＲ＿２（配列番号９１）、ＦＧＦＲ１＿１（配列番号９２）、ＦＧＦＲ１＿２（配列番号９３）、ＦＧＦＲ２＿１（配列番号９４）、ＦＧＦＲ２＿２（配列番号９５）、ＦＧＦＲ３＿１（配列番号９６）、ＦＧＦＲ３＿２（配列番号９７）、ＦＧＦＲ４＿１（配列番号９８）、ＦＧＦＲ４＿２（配列番号９９）、ＦＬＴ１＿１（配列番号１００）、ＦＬＴ１＿２（配列番号１０１）、ＦＬＴ４＿１（配列番号１０２）、ＦＬＴ４＿２（配列番号１０３）、ＧＪＡ１＿１（配列番号１０４）、ＧＪＡ１＿２（配列番号１０５）、ＩＧＦ１Ｒ＿１（配列番号１０６）、ＩＧＦ１Ｒ＿２（配列番号１０７）、ＫＤＲ＿１（配列番号１０８）、ＫＤＲ＿２（配列番号１０９）、ＭＥＴ＿１（配列番号１１０）、ＭＥＴ＿２（配列番号１１１）、ＰＤＧＦＲＡ＿１（配列番号１１２）、ＰＤＧＦＲＡ＿２（配列番号１１３）、ＰＤＧＦＲＢ＿１（配列番号１１４）、ＰＤＧＦＲＢ＿２（配列番号１１５）、ＰＮＰＬＡ２＿１（配列番号１１６）、ＰＮＰＬＡ２＿２（配列番号１１７）、ＴＧＦＢＲ１＿１（配列番号１１８）、ＴＧＦＢＲ１＿２（配列番号１１９）、ＴＧＲＢＲ１−３９０Ｂ（配列番号１２０）、ＴＧＦＢＲ２＿１（配列番号１２１）、ＴＧＦＢＲ２＿２（配列番号１２２）、ＴＧＦＢＲ３＿１（配列番号１２３）、ＴＧＦＢＲ３＿２（配列番号１２４）、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ＿１（配列番号１２５）、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ＿２（配列番号１２６）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ＿１（配列番号１２７）、およびＴＮＦＲＳＦ１Ｂ＿２（配列番号１２８）である。
【００５８】
抑制性形質導入可能人工転写因子を作製するために、六量体ジンクフィンガータンパク質を、タンパク質形質導入ドメインＴＡＴならびに転写抑制ドメインＳＩＤと融合させて、人工転写因子ＡＧＥＲ＿１ｒｅｐ（配列番号１２９）、ＡＧＥＲ＿２ｒｅｐ（配列番号１３０）、ＥＧＦＲ＿１ｒｅｐ（配列番号１３１）、ＥＧＦＲ＿２ｒｅｐ（配列番号１３２）、ＦＧＦＲ１＿１ｒｅｐ（配列番号１３３）、ＦＧＦＲ１＿２ｒｅｐ（配列番号１３４）、ＦＧＦＲ２＿１ｒｅｐ（配列番号１３５）、ＦＧＦＲ２＿２ｒｅｐ（配列番号１３６）、ＦＧＦＲ３＿１ｒｅｐ（配列番号１３７）、ＦＧＦＲ３＿２ｒｅｐ（配列番号１３８）、ＦＧＦＲ４＿１ｒｅｐ（配列番号１３９）、ＦＧＦＲ４＿２ｒｅｐ（配列番号１４０）、ＦＬＴ１＿１ｒｅｐ（配列番号１４１）、ＦＬＴ１＿２ｒｅｐ（配列番号１４２）、ＦＬＴ４＿１ｒｅｐ（配列番号１４３）、ＦＬＴ４＿２ｒｅｐ（配列番号１４４）、ＧＪＡ１＿１ｒｅｐ（配列番号１４５）、ＧＪＡ１＿２ｒｅｐ（配列番号１４６）、ＩＧＦ１Ｒ＿１ｒｅｐ（配列番号１４７）、ＩＧＦ１Ｒ＿２ｒｅｐ（配列番号１４８）、ＫＤＲ＿１ｒｅｐ（配列番号１４９）、ＫＤＲ＿２ｒｅｐ（配列番号１５０）、ＭＥＴ＿１ｒｅｐ（配列番号１５１）、ＭＥＴ＿２ｒｅｐ（配列番号１５２）、ＰＤＧＦＲＡ＿１ｒｅｐ（配列番号１５３）、ＰＤＧＦＲＡ＿２ｒｅｐ（配列番号１５４）、ＰＤＧＦＲＢ＿１ｒｅｐ（配列番号１５５）、ＰＤＧＦＲＢ＿２ｒｅｐ（配列番号１５６）、ＴＧＦＢＲ１＿１ｒｅｐ（配列番号１５７）、ＴＧＦＢＲ１＿２ｒｅｐ（配列番号１５８）、ＴＧＦＢＲ１−３９０Ｂｒｅｐ（配列番号１５９）、ＴＧＦＢＲ２＿１ｒｅｐ（配列番号１６０）、ＴＧＦＢＲ２＿２ｒｅｐ（配列番号１６１）、ＴＧＦＢＲ３＿１ｒｅｐ（配列番号１６２）、ＴＧＦＢＲ３＿２ｒｅｐ（配列番号１６３）、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ＿１ｒｅｐ（配列番号１６４）、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ＿２ｒｅｐ（配列番号１６５）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ＿１ｒｅｐ（配列番号１６６）、およびＴＮＦＲＳＦ１Ｂ＿２ｒｅｐ（配列番号１６７）を得た。
【００５９】
標的化した活性化形質導入可能人工転写因子を作製するために、六量体ジンクフィンガータンパク質を、タンパク質形質導入ドメインＴＡＴならびに転写活性化ドメインＶＰ６４と融合させて、人工転写因子ＰＮＰＬＡ２＿１ａｋｔ（配列番号１６８）およびＰＮＰＬＡ２＿２ａｋｔ（配列番号１６９）を得た。
【００６０】
また、五量体、六量体、七量体、または八量体ジンクフィンガータンパク質を含有する本発明の人工転写因子も考慮され、ここで、対応する核内受容体プロモーター遺伝子の標的部位に対する結合親和性を改善するために、または許容度改善のためにジンクフィンガータンパク質の免疫学的プロファイルを改変するために、個々のジンクフィンガーモジュールが交換される。
【００６１】
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーターを標的とする本発明の人工転写因子は、配列番号８８から１２８のジンクフィンガーモジュール組成に基づくジンクフィンガータンパク質を含み、ここで、３個までの、好ましくは１もしくは２個の個々のジンクフィンガーモジュールが、その標的配列への人工転写因子の結合を調節するために、別の選択肢としての結合特性を持つその他のジンクフィンガーモジュールと交換され、および／またはここで、１２個までの、例えば１２、１１、１０、もしくは９、特に、８、７、６、もしくは５、好ましくは、４、もしくは３、最も好ましくは、１もしくは２個の個々のアミノ酸が、意図する標的部位への結合親和性は維持すると同時に考え得る免疫原性を最小限に抑える目的で、交換される。
【００６２】
特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーターを標的とする人工転写因子は、配列番号８８から１２８のジンクフィンガーモジュール組成に基づくジンクフィンガータンパク質を含み、ここで、３個までの、好ましくは１もしくは２個の個々のジンクフィンガーモジュールが、その標的配列への人工転写因子の結合を調節するために、別の選択肢としての結合特性を持つその他のジンクフィンガーモジュールと交換されていてよく、および／または、ここで、１２個までの、最も好ましくは、１もしくは２個の個々のアミノ酸が、意図する標的部位への結合親和性は維持すると同時に考え得る免疫原性を最小限に抑える目的で、交換されていてよく、ならびにここで、転写調節ドメインは、ＶＰ１６、ＶＰ６４、Ｎ−ＫＲＡＢ、Ｃ−ＫＲＡＢ、ＳＩＤ、またはＥＲＤである。
【００６３】
受容体プロモーター活性の制御における人工転写因子の活性
眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーターによって駆動される転写に影響を与える人工転写因子の能力を評価するために、ルシフェラーゼレポーターアッセイが用いられる。この目的を達成するために、そのようなプロモーターからの発現を駆動させることのできる細胞が、デュアルレポータープラスミドと共に人工転写因子発現プラスミドで共トランスフェクトされる。デュアルレポータープラスミドは、ＮＥＧ−ＰＧ０４およびＥＦ１ａ−ＰＧ０４プラスミド（ジーンコポエイア（GeneCopoeia）、ロックビル、メリーランド州）をベースとして、調べられるべき遺伝子プロモーターの制御下の分泌型ガウシアルシフェラーゼ遺伝子を、構成的ＣＭＶプロモーターの制御下の分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）に対する遺伝子と共に含有する。この共トランスフェクションは、レポータープラスミドでトランスフェクトされた細胞中における人工転写因子発現の存在を確保するために、３：１の人工転写因子発現プラスミド：レポータープラスミド比で行われ、ガウシアルシフェラーゼおよびＳＥＡＰの活性が、製造元の推奨に従って測定される（Ｇａｕｓｓｉａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｇｌｏｗ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、ピアース（Pierce）；ＳＥＡＰ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、ロシュ（Roche））。ルシフェラーゼの値は、ＳＥＡＰの活性に対して標準化され、ジンクフィンガードメイン内のすべてのシステイン残基がセリン残基に交換された人工転写因子の不活性変異体を発現するコントロール細胞と比較される。トランスフェクトされた細胞の上澄中におけるルシフェラーゼ活性とＳＥＡＰ活性との間の比率を測定することにより、人工転写因子プラスミドでトランスフェクトされた細胞のみにおける、受容体プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼ発現のＳＥＡＰ発現に対する標準化が可能である。このルシフェラーゼ発現試験は、３つの反復サンプルで少なくとも３回行われ、平均され、コントロールトランスフェクション細胞と比較され、コントロールに対する％による相対ルシフェラーゼ活性（ＲＬｕＡ）として表され、ＳＥＭを示すエラーバーと共にプロットされる。
【００６４】
眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子に対する人工転写因子活性の評価
不適合創傷治癒プロセスにプラスの影響を与えるために、本発明の人工転写因子は、傷害後の細胞増殖を制限する。本発明の人工転写因子のこの機能を評価するために、不適合創傷治癒に関与する遺伝子を発現する細胞は、本発明の特定の人工転写因子で処理され、傷害後の創傷治癒速度が、電気細胞−基質インピーダンスセンシング（electric cell-substrate impedance sensing）（ＥＣＩＳ）を用いて測定される。このために、細胞は、９６ウェルプレート（アプライドバイオフィジクス（Applied BioPhysics））中の金電極上で増殖され、人工転写因子で０、２４、４８、７２、および９６時間処理される。人工転写因子の不活性変異体で処理された細胞が、コントロールとして用いられる。ＥＣＩＳを用いて、高電圧の短パルスを適用することによって、細胞層の傷害前の細胞層のベースラインインピーダンスが、＞４０ｋＨｚで測定される。傷害後、コントロール細胞が閉じた細胞層を形成するまで、ＥＣＩＳを用いて細胞層の再形成がリアルタイムで追跡される。処理細胞のインピーダンス測定をコントロール細胞と比較することで、不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーターに特異的である人工転写因子の細胞増殖制限活性が明らかとなる。
【００６５】
ポリエチレングリコール残基の結合
本発明の人工転写因子へのポリエチレングリコール残基の共有結合による結合（ＰＥＧ化）が、人工転写因子の溶解性向上、その腎クリアランスの低減、およびその免疫原性の制御のために考慮される。考慮されるのは、サイズが１から４０キロダルトンの範囲であるアミンさらにはチオール反応性ポリエチレングリコールである。チオール反応性ポリエチレングリコールを用いることで、人工転写因子の部位特異的ＰＥＧ化が達成される。本発明の人工転写因子中の唯一の必須チオール基含有アミノ酸は、ジンク配位に必須であるジンクフィンガーモジュール中に位置するシステイン残基である。このようなチオール基は、そのジンク配位に起因してＰＥＧ化のためのアクセス性がなく、従って、１もしくは複数のシステイン残基を本発明の人工転写因子に含めることで、チオール特異的ポリエチレングリコール試薬を用いたＰＥＧ化のための遊離チオール基が提供される。
【００６６】
医薬組成物
本発明はまた、上記で定める人工転写因子を含む医薬組成物にも関する。考慮される医薬組成物は、温血動物、特にはヒトに対する注射全身投与用の組成物、特に静脈内投与用の組成物、吸入投与用の組成物、および局所投与用の組成物、特に経眼局所投与用の組成物（例えば点眼剤としての経眼局所投与用の組成物）、または硝子体内、結膜下、眼球周囲（parabulbar）、もしくは眼球後投与用の組成物である。点眼剤、および硝子体内、結膜下、眼球周囲、もしくは眼球後投与用組成物が特に好ましい。組成物は、活性成分を単独で含むか、または、好ましくは、薬学的に許容されるキャリアと一緒に含む。さらに、遅延放出製剤も考慮される。活性成分の用量は、治療されるべき疾患に応じて異なり、ならびに、種、その年齢、体重、および個々の病状、個々の薬物動態データ、ならびに投与の様式に応じて異なる。
【００６７】
さらに、経口送達に有用である医薬組成物、特に、適切にカプセル化された活性成分を含む組成物、またはそれ以外で胃での分解に対して保護された組成物も考慮される。例えば、そのような医薬組成物は、膜透過性向上剤、プロテアーゼ酵素阻害剤を含有してよく、腸溶コーティングで覆われてもよい。
【００６８】
医薬組成物は、およそ１％からおよそ９５％の活性成分を含む。単位剤形は、例えば、アンプル、バイアル、吸入器、点眼剤などである。
【００６９】
本発明の医薬組成物は、それ自体公知である方法で作製され、例えば、従来の混合、溶解、または凍結乾燥プロセスである。
【００７０】
活性成分の溶液の使用、ならびに懸濁液または分散液、特には等張性水溶液、分散液、または懸濁液の使用が好ましく、これらは、例えば、活性成分を単独で、またはマンニトールを例とするキャリアと共に含む凍結乾燥組成物の場合、使用前に作製されてよい。医薬組成物は、滅菌されてよく、ならびに／または保存剤、安定化剤、湿潤剤および／もしくは乳化剤、可溶化剤、浸透圧制御のための塩、および／もしくはバッファーを例とする賦形剤を含んでよく、例えば従来の溶解および凍結乾燥プロセスによるなど、それ自体公知である方法で作製される。前記溶液または懸濁液は、典型的にはカルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、もしくはゼラチンである増粘剤、またはＴｗｅｅｎ  ８０（商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン  モノオレエート）を例とする可溶化剤も含んでよい。
【００７１】
油中の懸濁液は、油成分として、注射目的として慣習的である植物油、合成油、または半合成油を含む。それに関して、８から２２個、特には１２から２２個の炭素原子を有する長鎖脂肪酸を酸成分として含有する液体脂肪酸エステルが特に言及されてよい。このような脂肪酸エステルのアルコール成分は、最大で６個の炭素原子を有し、一価または多価であり、例えば、一価、二価、または三価アルコールであり、特には、グリコールおよびグリセロールである。脂肪酸エステルの混合物として、綿実油、アーモンド油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油、大豆油、および落花生油などの植物油が特に有用である。
【００７２】
注射用製剤の製造は、通常、滅菌条件下で行われ、例えばアンプルまたはバイアルへの充填、および容器のシールも同様である。
【００７３】
非経口投与の場合、水溶性形態、例えば水溶性塩である活性成分の水溶液、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／もしくはデキストランを例とする増粘剤、ならびに所望される場合は安定化剤を含有する水性注射用懸濁液が特に適している。活性成分は、所望に応じて賦形剤と一緒に、凍結乾燥剤の形態であってもよく、非経口投与の前に、適切な溶媒を添加することによって溶液とされてよい。
【００７４】
吸入用組成物は、スプレーとしてのエアロゾルの形態で、ミスト、または液滴の形態で投与されてよい。エアロゾルは、定量噴霧式吸入器またはネビュライザーで、すなわち、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、またはその他の適切なガスを例とする適切な噴射剤を用いて、患者によって吸入されるエアロゾル化された医薬の短い噴出の形態で気道または肺へ特定量の医薬を送達する装置で送達することができる溶液または懸濁液から作製される。また、ラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末ベースと共に、吸入用粉末スプレーを提供することも可能である。
【００７５】
点眼剤は、好ましくは、組成物を涙液と等張性（２９５〜３０５ｍＯｓｍ／Ｌ）とする適切な剤を含む活性成分の等張性水溶液である。考慮される剤は、塩化ナトリウム、クエン酸、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、エチレングリコール、プロピレングリコール、デキストロースなどである。さらに、組成物は、ｐＨを５から８、好ましくは７．０から７．４に維持するために、リン酸バッファー、リン酸−クエン酸バッファー、またはＴｒｉｓバッファー（トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）を例とするバッファーも含む。組成物はさらに、パラベン、塩化ベンザルコニウムなどの四級アンモニウム塩、ポリヘキサメチレンビグアニジン（ＰＨＭＢ）などを例とする抗微生物保存剤を含有してよい。点眼剤はさらに、ゲル様点眼剤を作製するためにキサンタンガムを、および／またはヒアルロン酸、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、もしくはポリビニルピロリドンなどのその他の増粘剤を含有してもよい。
【００７６】
治療方法における人工転写因子の使用
さらに、本発明は、眼の局所的傷害後の細胞応答に影響を及ぼすのに用いるための、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーターに対して指向される人工転写因子に関する。同様に、本発明は、網膜グリオーシス、増殖性硝子体網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、および網膜上膜などの線維収縮性網膜障害、ならびに緑内障手術に関連する線維増殖を治療する方法にも関し、その方法は、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーターに指向される人工転写因子の治療有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む。本発明の人工転写因子の有効量は、治療されるべき特定の疾患の種類に応じて異なり、ならびに、種、その年齢、体重、および個々の病状、個々の薬物動態データ、ならびに投与のモードに応じて異なる。眼への投与の場合、月１回の０．５から１ｍｇの硝子体内注射が好ましい。全身投与の場合、月１回の１０ｍｇ／ｋｇの注射が好ましい。加えて、眼の硝子体内に遅延放出デポ剤（slow release deposits）を埋め込むことも好ましい。
【実施例】
【００７７】
ＤＮＡプラスミドのクローニング
すべてのクローニング工程において、制限エンドヌクレアーゼおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼは、ニューイングランドバイオラボズ（New England Biolabs）から購入する。エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）は、プロメガ（Promega）からである。高正確性Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン（Invitrogen））を、すべての標準的ＰＣＲ反応に適用する。ＤＮＡ断片およびプラスミドは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ｋｉｔ、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｋｉｔ、またはＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  Ｘｔｒａ  Ｍｉｄｉ  Ｐｌｕｓ  ｋｉｔ（マッハライ・ナーゲル（Macherey-Nagel））を用い、製造元の説明書に従って単離する。オリゴヌクレオチドは、シグマ・アルドリッチ（Sigma-Aldrich）から購入する。新たに作製されたプラスミドのすべての該当するＤＮＡ配列は、配列決定によって確認した（マイクロシンス（Microsynth））。
【００７８】
酵母ワンハイブリッド用の六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーのクローニング
ＧＮＮおよび／またはＣＮＮおよび／またはＡＮＮ結合ジンクフィンガー（ＺＦ）モジュールを含有する六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーを、以下の改良を加えたGonzalez B. et al,. 2010, Nat Protoc 5, 791-810に従ってクローニングする。ＧＮＮ、ＣＮＮ、およびＡＮＮ  ＺＦモジュールをコードするＤＮＡ配列を合成し、ｐＵＣ５７（ゲンスクリプト（GenScript））に挿入することで、それぞれ、ｐＡＮ１０４９（配列番号１７０）、ｐＡＮ１０７３（配列番号１７１）、およびｐＡＮ１６７０（配列番号１７２）を得た。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）ベクター中に、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ライブラリーを段階的に組み立てる。各個別のクローニング工程の過程で複数のＺＦモジュールが挿入されて非機能性タンパク質が得られることを回避するために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（および１ＺＦＰ、２ＺＦＰ、または３ＺＦＰを含有するその誘導産物）、およびｐＡＮ１０４９、ｐＡＮ１０７３、またはｐＡＮ１６７０を、まず１つの制限酵素でインキュベートし、その後、ＳＡＰで処理する。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ｋｉｔを用いて酵素を除去し、その後、第二の制限エンドヌクレアーゼを添加する。
【００７９】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−１ＺＦＰＬのクローニングは、５μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを、ＸｈｏＩ、ＳＡＰ、および続いてＳｐｅＩで処理することによって行う。インサートは、１０μｇのｐＡＮ１０４９（１６の異なるＧＮＮ  ＺＦモジュールを放出）またはｐＡＮ１０７３（１５の異なるＣＮＮ  ＺＦモジュールを放出）またはｐＡＮ１６７０（１５の異なるＡＮＮ  ＺＦモジュールを放出）を、ＳｐｅＩ、ＳＡＰ、および続いてＸｈｏＩと共にインキュベートすることによって作製する。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−２ＺＦＰＬおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−３ＺＦＰＬの作製の場合、７μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−１ＺＦＰＬまたはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−２ＺＦＰＬを、ＡｇｅＩで切断し、脱リン酸化し、ＳｐｅＩで切断する。インサートは、それぞれ１０μｇのｐＡＮ１０４９またはｐＡＮ１０７３またはｐＡＮ１６７０に、ＳｐｅＩ、ＳＡＰ、および続いてＸｍａｌを適用することによって得る。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−６ＺＦＰＬのクローニングは、１４μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−３ＺＦＰＬを、ＡｇｅＩ、ＳＡＰ、およびその後ＳｐｅＩで処理することによって行い、切断ベクターを得た。３ＺＦＰＬインサートは、ＳｐｅＩ、ＳＡＰ、および続いてＸｍａＩと共にインキュベートすることにより、２０μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−３ＺＦＰＬから放出された。
【００８０】
１、２、および３つのＺＦＰを含有するライブラリーにおける連結反応は、インサート：ベクターのモル比３：１で設定し、２００ｎｇの切断ベクター、４００ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼを合計体積２０μＬで用い、室温で一晩行った。六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーの連結反応は、２０００ｎｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−３ＺＦＰＬ、５００ｎｇの３ＺＦＰＬインサート、４０００ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼを合計体積２００μＬ中に含有させ、これを、１０の２０μＬに分割し、別々に室温で一晩インキュベートした。連結反応の一部を、各ライブラリーに対して必要とされるクローンの数に応じたいくつかの方法によって大腸菌中にトランスフォームした。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−１ＺＦＰＬおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−２ＺＦＰＬの作製の場合、３μＬの連結反応を、大腸菌ＮＥＢ５−アルファのヒートショックトランスフォーメーションに直接用いた。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−３ＺＦＰＬの連結反応のプラスミドＤＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ｋｉｔを用いて精製し、エレクトロコンピテント大腸菌ＮＥＢ５−アルファにトランスフォームした（エクイバイオ（EquiBio）製ＥａｓｙｊｅｃＴ  Ｐｌｕｓエレクトロポレーターまたはエッペンドルフ（Eppendorf）製Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ、２．５ｋＶおよび２５μＦ、バイオラッド（Bio-Rad）製２ｍｍ  エレクトロポレーションキュベット）。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−６ＺＦＰライブラリーの連結反応は、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ｋｉｔに適用し、ＤＮＡを１５μＬの脱イオン水で溶出した。約６０ｎｇの脱塩ＤＮＡを、５０μＬのＮＥＢ  １０−ベータ  エレクトロコンピテント大腸菌（ニューイングランドバイオラボズ）と混合し、ＥａｓｙｊｅｃＴ  ＰｌｕｓまたはＭｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ、２．５ｋＶ、２５μＦ、および２ｍｍ  エレクトロポレーションキュベットを用い、製造元の推奨に従ってエレクトロポレーションを行った。各ライブラリーに対して複数のエレクトロポレーションを行い、その後、細胞を直接プールしてライブラリーのサイズを拡張した。ヒートショックトランスフォーメーションまたはエレクトロポレーションの後、ＳＯＣ媒体をこの細菌に適用し、３７℃および２５０ｒｐｍでの１時間のインキュベーションの後、３０μＬのＳＯＣ培養物を段階希釈に用い、アンピシリンを含有するＬＢプレートに播種した。翌日、得られたライブラリークローンの総数を特定した。加えて、各ライブラリーの１０のクローンを選択して、プラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素消化によってインサートの組み込みを確認した。これらのプラスミドのうちの少なくとも３つを配列決定し、ライブラリーの多様性を確認した。残りのＳＯＣ培養物を、アンピシリンを含有する１００ｍＬのＬＢ培地に移し、３７℃および２５０ｒｐｍで一晩培養した。これらの細胞を用いて、各ライブラリーに対するプラスミドＭｉｄｉ  ＤＮＡを作製した。
【００８１】
酵母ワンハイブリッドスクリーンのために、六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーを、互換性プレイベクター（compatible prey vector）に導入する。この目的のために、ｐＧＡＤ１０（クロンテック（Clontech））の多重クローニング部位を、ベクターをＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニーリングしたオリゴヌクレオチドＯＡＮ９７１（ＴＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧＧＡＴＡＴＣＡＴＧＡＴＧＡＣＴＡＧＴＧＧＣＣＡＧＧＣＣＧＧＣＣＣ、配列番号１７３）およびＯＡＮ９７２（ＡＡＴＴＧＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＣＡＴＣＡＴＧＡＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧ、配列番号１７４）を挿入することによって修飾した。得られたベクターｐＡＮ１０２５（配列番号１７５）を切断し、脱リン酸化し、６ＺＦＰライブラリーインサートを、ＸｈｏＩ／ＳｐｅＩによってｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−６ＺＦＰＬから放出させる。連結反応、およびＮＥＢ  １０−ベータ  エレクトロコンピテント大腸菌へのエレクトロポレーションは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−６ＺＦＰライブラリーについて上述した通りに行った。
【００８２】
改良酵母ワンハイブリッドスクリーニングのために、六量体ジンクフィンガーライブラリーを、改良プレイベクターｐＡＮ１３７５（配列番号１７６）にも導入する。このプレイベクターは、以下のようにして構築した：ｐＲＳ３１５（配列番号１７７）を、ＡｐａＩ／ＮａｒＩで切断し、アニーリングしたＯＡＮ１１４３（ＣＧＣＣＧＣＡＴＧＣＡＴＴＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣ、配列番号１７８）およびＯＡＮ１１４４（ＴＧＣＡＴＧＡＡＴＧＣＡＴＧＣＧＧ、配列番号１７９）を挿入して、ｐＡＮ１３７３（配列番号１８０）を得た。ｐＡＮ１０２５からのＳｐｈＩインサートを、ＳｐｈＩで切断したｐＡＮ１３７３に連結して、ｐＡＮ１３７５を得た。
【００８３】
さらなる改良酵母ワンハイブリッドスクリーニングのために、六量体ジンクフィンガーライブラリーを、改良プレイベクターｐＡＮ１９２０（配列番号１８１）にも導入する。
【００８４】
なおさらなる改良酵母ワンハイブリッドスクリーニングのために、六量体ジンクフィンガーライブラリーを、プレイベクターｐＡＮ１９９２（配列番号１８２）にも挿入する。
【００８５】
酵母ワンハイブリッドスクリーニング用のベイトプラスミドのクローニング  各ベイトプラスミドにおいて、中心部に１８ｂｐの潜在的人工転写因子標的部位を持つ６０ｂｐの配列を選択し、制限分析のためにＮｃｏＩ部位を含める。オリゴヌクレオチドの設計およびアニーリングは、５’ＨｉｎｄＩＩＩおよび３’ＸｈｏＩ部位が生成されるように行い、それによって、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩで切断されたｐＡｂＡｉ（クロンテック）に直接連結可能となる。産物のＮｃｏＩによる消化および配列決定を用いて、ベイトプラスミドの組み立てを確認する。
【００８６】
酵母株および培地
サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）Ｙ１Ｈ  Ｇｏｌｄを、クロンテックから、ＹＰＤ培地およびＹＰＤカンテンをカールロス（Carl Roth）から購入した。合成ドロップアウト（ＳＤ）培地は、２０ｇ／Ｌ  グルコース、６．８ｇ／Ｌ  Ｎａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ、９．７ｇ／Ｌ  ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ（すべてカールロスより）、１．４ｇ／Ｌ  酵母合成ドロップアウト培地サプリメント、６．７ｇ／Ｌ  酵母窒素ベース、０．１ｇ／Ｌ  Ｌ−トリプトファン、０．１ｇ／Ｌ  Ｌ−ロイシン、０．０５ｇ／Ｌ  Ｌ−アデニン、０．０５ｇ／Ｌ  Ｌ−ヒスチジン、０．０５ｇ／Ｌ  ウラシル（すべてシグマアルドリッチより）を含有していた。ＳＤ−Ｕ培地は、ウラシル以外のすべての成分を含有し、ＳＤ−Ｌは、Ｌ−ロイシンなしで作製した。ＳＤカンテンプレートは、リン酸ナトリウムを含有していないが、１６ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒ（ＢＤ）を含有していた。オーレオバシジンＡ（ＡｂＡ）は、クロンテックから購入した。
【００８７】
ベイト酵母株の調製
約５μｇの各ベイトプラスミドを、全体積２０μＬ中、ＢｓｔＢＩで線状化し、反応ミックスの半分を、Ｓ・セレビシエ  Ｙ１Ｈ  Ｇｏｌｄのヒートショックトランスフォーメーションに直接用いる。トランスフォーメーションの前日に、酵母細胞を用いて５ｍＬのＹＰＤ培地に播種し、室温にてローラー上で一晩増殖させる。このプレ培養物の１ミリリットルを、新しいＹＰＤ培地で１：２０に希釈し、３０℃、２２５ｒｐｍで２〜３時間インキュベートする。各トランスフォーメーション反応において、１ＯＤ600の細胞を遠心分離で回収し、酵母細胞を、１ｍＬの滅菌水で１回、１ｍＬのＴＥ／ＬｉＡｃ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  酢酸リチウム）で１回洗浄する。最後に、酵母細胞を、５０μＬのＴＥ／ＬｉＡｃに再懸濁し、５０μｇのサケ精子由来一本鎖ＤＮＡ（シグマアルドリッチ）、１０μＬのＢｓｔＢＩ線状化ベイトプラスミド（上記参照）、および３００μＬのＰＥＧ／ＴＥ／ＬｉＡｃ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  酢酸リチウム、５０％（重量／体積）ＰＥＧ３３５０）と混合する。細胞およびＤＮＡを、ローラー上、室温にて２０分間インキュベートし、その後、４２℃のウォーターバス中に１５分間配置する。最後に、酵母細胞を遠心分離で回収し、１００μＬの滅菌水に再懸濁し、ＳＤ−Ｕカンテンプレート上に広げる。３０℃での３日間のインキュベーションの後、各トランスフォーメーション反応からのＳＤ−Ｕ上で増殖する８つのクローンを選択して、オーレオバシジンＡ（ＡｂＡ）に対する感受性を分析する。プレ培養物を、ローラー上、室温にて一晩増殖させた。各培養物において、ＯＤ600を測定し、滅菌水でＯＤ600＝０．３に調節した。この第一の希釈物から、滅菌水を用いて、さらに５つの１：１０の段階希釈物を作製した。各クローンにおいて、各段階希釈物からの５μＬを、ＳＤ−Ｕ、ＳＤ−Ｕ  １００ｎｇ／ｍＬ  ＡｂＡ、ＳＤ−Ｕ  １５０ｎｇ／ｍＬ  ＡｂＡ、およびＳＤ−Ｕ  ２００ｎｇ／ｍＬ  ＡｂＡを含有するカンテンプレート上にスポッティングした。３０℃で３日間のインキュベーションの後、ＳＤ−Ｕ上で良好に増殖し、ＡｂＡに対して最も感受性の高い３つのクローンを選択して、さらなる分析を行う。ベイトプラスミドの酵母ゲノム中への安定な組み込みは、Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ  Ｉｎｓｅｒｔ  Ｃｈｅｃｋ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ  １（クロンテック）によって、製造元の説明に従って確認する。３つのクローンのうちの１つを、続いてのＹ１Ｈスクリーニングに用いる。
【００８８】
六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーを用いたベイト酵母株の形質導入
約５００μＬの酵母ベイト菌株プレ培養物を、１ＬのＹＰＤ培地中に希釈し、ＯＤ600＝１．６〜２．０まで（およそ２０時間）、３０℃および２２５ｒｐｍでインキュベートする。細胞を、スイングアウトローターによる遠心分離で回収する（５分間、１５００×ｇ、４℃）。エレクトロコンピテント細胞の作製は、Benatuil L. et al., 2010, Protein Eng Des Sel 23, 155-159に従って行う。各トランスフォーメーション反応において、４００μＬのエレクトロコンピテントベイト酵母細胞を、１μｇの６ＺＦＰライブラリーをコードするプレイプラスミドと混合し、氷上にて３分間インキュベートする。細胞−ＤＮＡ懸濁液を、予め冷却しておいた２ｍｍ  エレクトロポレーションキュベットに移す。複数のエレクトロポレーション反応を（ＥａｓｙｊｅｃＴ  ＰｌｕｓエレクトロポレーターまたはＭｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ、２．５ｋＶ、および２５μＦ）、すべての酵母細胞懸濁液がトランスフォームされるまで行う。エレクトロポレーションの後、酵母細胞を、１００ｍＬのＹＰＤ：１Ｍ  ソルビトール  １：１ミックスに移し、３０℃、２２５ｒｐｍで６０分間インキュベートする。細胞を遠心分離で回収し、１〜２ｍＬのＳＤ−Ｌ培地に再懸濁する。２００μＬのアリコートを、１０００〜４０００ｎｇ／ｍＬ  ＡｂＡを含有する１５ｃｍ  ＳＤ−Ｌカンテンプレート上に広げる。さらに、５０μＬの細胞懸濁液を用いて、１／１００および１／１０００希釈物を作製し、５０μＬの未希釈および希釈細胞を、ＳＤ−Ｌ上に播種する。すべてのプレートを、３０℃で３日間インキュベートする。得られたクローンの総数を、希釈形質転換体のプレートから算出する。未希釈細胞のＳＤ−Ｌプレートは、すべての形質転換体の増殖を示しているが、ＡｂＡ含有ＳＤ−Ｌプレートは、プレイ６ＺＦＰがそのベイト標的部位と良好に結合した場合にのみ、コロニー形成が見られた。
【００８９】
正の相互作用の検証と６ＺＦＰをコードするプレイプラスミドの回復
初期分析において、４０の良好なサイズのコロニーを、最も高い濃度のＡｂＡを含有するＳＤ−Ｌプレートから取り出し、酵母細胞を、１０００〜４０００ｎｇ／ｍＬ  ＡｂＡのＳＤ−Ｌ上に２回再度画線し、単一コロニーを得た。各クローンにおいて、１つのコロニーを用いて、５ｍＬ  ＳＤ−Ｌ培地に播種し、細胞を室温で一晩増殖させる。翌日、滅菌水でＯＤ600＝０．３に調節し、さらに５つの１／１０希釈物を作製し、各段階希釈物の５μＬを、ＳＤ−Ｌ、ＳＤ−Ｌ  ５００ｎｇ／ｍＬ  ＡｂＡ、１０００ｎｇ／ｍＬ  ＡｂＡ、ＳＤ−Ｌ  １５００ｎｇ／ｍＬ  ＡｂＡ、ＳＤ−Ｌ  ２０００ｎｇ／ｍＬ  ＡｂＡ、ＳＤ−Ｌ  ２５００ｎｇ／ｍＬ  ＡｂＡ、ＳＤ−Ｌ  ３０００ｎｇ／ｍＬ  ＡｂＡ、およびＳＤ−Ｌ  ４０００ｎｇ／ｍＬ  ＡｂＡプレート上にスポッティングする。クローンを、高ＡｂＡ濃度で増殖する能力に従ってランク付けする。最も良好に増殖したクローンから、５ｍＬの初期ＳＤ−Ｌプレ培養物を用いて細胞の遠心沈殿を行い、それらを１００μＬの水または残りの培地に再懸濁する。５０Ｕのリチカーゼ（lyticase）（シグマアルドリッチ、Ｌ２５２４）を添加後、細胞を３７℃、３００ｒｐｍにて、水平振とう機上で数時間インキュベートする。生成されたスフェロブラスト（spheroblasts）を、１０μＬの２０％（重量／体積）ＳＤＳ溶液を添加することで溶解し、１分間のボルテックス撹拌によって激しく混合し、−２０℃で少なくとも１時間凍結させる。その後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｋｉｔからの２５０μＬのＡ１バッファー、およびスパチュラ１杯分のガラスビーズ（シグマアルドリッチ、Ｇ８７７２）を添加し、チューブを、１分間のボルテックス撹拌によって激しく混合する。プラスミドの単離は、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｋｉｔからの２５０μＬのＡ２バッファーを添加し、室温で少なくとも１５分間インキュベートし、その後ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｋｉｔプロトコルを継続することによってさらに改善される。３０μＬの溶出バッファーによる溶出後、５μＬのプラスミドＤＮＡを、ヒートショックトランスフォーメーションによって大腸菌ＤＨ５アルファにトランスフォームする。２つの別々のコロニーを、アンピシリン含有ＬＢプレートから取り出し、プラスミドを単離し、ライブラリーインサートを配列決定する。得られた結果を、各標的部位に対する６ＺＦＰ間のコンセンサス配列について分析する。
【００９０】
形質導入可能人工転写因子活性を試験するための安定したルシフェラーゼ／分泌アルカリホスファターゼリポーター細胞株の作製用のリポータープラスミドのクローニング
ハイブリッドＣＭＶ／人工転写因子標的部位プロモーターの支配下のガウシアルシフェラーゼを、構成的ＣＭＶプロモーターの支配下の分泌型アルカリホスファターゼと共に含有するレポーターコンストラクトを作製するために、人工転写因子結合部位を含有する４２ｂｐを、ＡｆｌＩＩＩ／ＳｐｅＩでｐＡＮ１６６０（配列番号１８３）中にクローニングした。このようなレポーターコンストラクトは、ＨＥＫ  ２９３  ＦｌｐＩｎ  ＴＲｅx（インビトロジェン）細胞などのＦｌｐＩｎ部位含有細胞への安定な組み込みのためのＦｌｐＩｎ部位を含有する。
【００９１】
定量的ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現レベルの決定
ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン（Qiagen）、ヒルデン、ドイツ）を製造元の説明書に従って用いて、全ＲＮＡを細胞から単離する。凍結細胞ペレットを、１０μＬ／ｍＬ  β−メルカプトエタノールを含有するＲＬＴ  Ｐｌｕｓ  Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒに再懸濁させる。ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムを用いた均質化後、すべてのライセートをｇＤＮＡ  Ｅｌｉｍｉｎａｔｏｒスピンカラムに移し、ゲノムＤＮＡを除去する。１容量分の７０％エタノールを添加し、すべてのライセートをＲＮｅａｓｙスピンカラムに移す。複数回の洗浄工程の後、ＲＮＡを、最終体積３０μＬのＲＮａｓｅフリー水で溶出する。ＲＮＡは、次に使用するまで−８０℃で保存する。ｃＤＮＡの合成は、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）、ブランチバーグ、ニュージャージー州、米国）を製造元の説明書に従って用いて行う。ｃＤＮＡの合成は、２μＬ  １０×バッファー、０．８μＬ  ２５×ｄＮＴＰミックス、２μＬ  １０×ＲＴ  ランダムプライマー、１μＬ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ逆転写酵素、および４．２μＬ  Ｈ2Ｏを含有する２０μＬの合計反応体積中で行う。最終体積１０μＬのＲＮＡを添加し、反応を、以下の条件下で行う：２５℃にて１０分間、続いて３７℃で２時間、および最終工程として８５℃で５分間。定量的ＰＣＲは、１μＬ  ２０×ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、１０．０μＬ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（いずれも、アプライドバイオシステムズ、ブランチバーグ、ニュージャージー州、米国）、および８μＬ  Ｈ2Ｏを含有する２０μＬの合計反応体積中で行う。各反応において、１μＬのｃＤＮＡを添加する。ｑＰＣＲは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ、ブランチバーグ、ニュージャージー州、米国）を以下の条件で用いて行う：５０℃で２分間の初期工程、続いて９５℃で１０分間の第一の変性、ならびに９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の４０サイクルから成るさらなる工程。
【００９２】
哺乳類トランスフェクション用の人工転写因子のクローニング
ポリダクチルジンクフィンガータンパク質をコードするＤＮＡ断片を、標準的な手順（ＡｇｅＩ／ＸｈｏＩ）を用いて、目的のジンクフィンガーアレイ、ＳＶ４０  ＮＬＳ、３×  ｍｙｃエピトープタグ、およびＮ末端ＫＲＡＢドメイン（ｐＡＮ１２５５−配列番号１８４）、Ｃ末端ＫＲＡＢドメイン（ｐＡＮ１２５８−配列番号１８５）、ＳＩＤドメイン（ｐＡＮ１２５７−配列番号１８６）、またはＶＰ６４活性化ドメイン（ｐＡＮ１５１０−配列番号１８７）の融合タンパク質として哺乳類細胞中で発現するための哺乳類発現ベクター中にクローニングする。
【００９３】
安定にトランスフェクトされたテトラサイクリン誘導性細胞を作製するためのプラスミドを、以下のようにして作製した：ポリダクチルジンクフィンガードメイン、制御ドメイン（Ｎ末端ＫＲＡＢ、Ｃ末端ＫＲＡＢ、ＳＩＤ、またはＶＰ６４）、およびＳＶ４０  ＮＬＳを含む人工転写因子をコードするＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＶ／ＡｇｅＩを用いてｐＡＮ２０７１（配列番号１８８）中にクローニングする。これらの人工転写因子発現プラスミドは、ＡＡＶＳ１  Ｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮおよびＡＡＶＳ１  Ｒｉｇｈｔ  ＴＡＬＥＮ（ジーンコポエイア）を用いた共トランスフェクションにより、ヒトゲノムのＡＡＶＳ１座位に組み込むことができる。
【００９４】
細胞培養およびトランスフェクション
ＨｅＬａ細胞を、４．５ｇ／Ｌ  グルコース、１０％  熱失活ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（すべてシグマアルドリッチから）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、５％  ＣＯ2、３７℃で増殖させる。ルシフェラーゼレポーターアッセイのために、７０００ＨｅＬａ細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種する。翌日、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬（キアゲン）を製造元の説明書に従って用いて、共トランスフェクションを行う。人工転写因子を、およびルシフェラーゼをコードするプラスミドｍｉｄｉ製剤（Plasmid midi preparations）を、３：１の比率で用いる。トランスフェクションの６時間後および２４時間後に、ウェルあたり１００μＬの新しいＤＭＥＭで培地を入れ替える。
【００９５】
Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−Ｒｅｘ（商標）２９３発現細胞株の作製および維持
安定なテトラサイクリン誘導性Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−Ｒｅｘ（商標）２９３発現細胞株を、Ｆｌｐリコンビナーゼ媒介組み込みによって作製する。Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−Ｒｅｘ（商標）Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔを用い、ｐＦＲＴ／ｌａｃＺｅｏ標的部位ベクターおよびｐｃＤＮＡ６／ＴＲベクターをトランスフェクトすることによって、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−Ｒｅｘ（商標）宿主細胞株を作製する。誘導性２９３発現細胞株を作製するために、目的の遺伝子を含有するｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ発現ベクターを、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−Ｒｅｘ（商標）宿主細胞株のＦＲＴ部位に、Ｆｌｐリコンビナーゼ媒介ＤＮＡ組換えを介して組み込む。安定なＦｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−Ｒｅｘ（商標）発現細胞株を、（ＤＭＥＭ；１０％  Ｔｅｔ−ＦＢＳ；２ｍＭ  グルタミン；１５μｇ／ｍＬ  ブラストサイジン、および１００μｇ／ｍＬ  ハイグロマイシン）を含有する選択培地で維持する。遺伝子発現の誘導のために、テトラサイクリンを最終濃度１μｇ／ｍＬまで添加する。
【００９６】
ＴＡＬＥＮを用いる安定して人工転写因子を発現する細胞株の作製および維持
テトラサイクリン誘導性プロモーターの支配下で人工転写因子を安定に発現する細胞株を作製するために、細胞を、目的の人工転写因子およびＡＡＶＳ１  Ｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮおよびＡＡＶＳ１  Ｒｉｇｈｔ  ＴＡＬＥＮ（ジーンコポエイア）プラスミドを含有するｐＡＮ２０７１をベースとする発現コンストラクトにより、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（キアゲン）トランスフェクション試薬を製造元の推奨に従って用いて共トランスフェクトする。トランスフェクションの８時間後、増殖培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄し、新しい増殖培地を添加した。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、抗生物質を含まないＴｅｔ−ａｐｐｒｏｖｅｄ  ＦＢＳ（テトラサイクリンフリーＦＢＳ、タカラ）を含有する増殖培地に、１：１０の比率で分割した。トランスフェクションの４８時間後、ピューロマイシン選択を細胞型特異的濃度で開始し、細胞を、７〜１０日間選択圧下に維持した。安定な細胞のコロニーをプールし、選択培地で維持した。
【００９７】
細菌発現のための人工転写因子のクローニング
人工転写因子とＴＡＴタンパク質形質導入ドメインとの間のＨｉｓ6タグ融合タンパク質としての大腸菌での発現ために、人工転写因子をコードするＤＮＡ断片を、標準的な手順を用い、ＥｃｏＲＶ／ＮｏｔＩにより、ｐＥＴ４１ａ＋（ノバゲン（Novagen））をベースとする細菌発現ベクターｐＡＮ９８３（配列番号１８９）中にクローニングする。
【００９８】
人工転写因子タンパク質の作製
ある人工転写因子の発現プラスミドでトランスフォームされた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、１００μＭ  ＺｎＣｌ2を添加した１Ｌ  ＬＢ培地中、ＯＤ600が０．８から１の間に到達するまで増殖させ、１ｍＭ  ＩＰＴＧで２時間誘導した。細菌を遠心分離で回収し、細菌ライセートを超音波処理によって作製し、封入体（inclusion bodies）を精製した。このために、封入体を遠心分離で回収し（５０００ｇ、４℃、１５分間）、２０ｍＬの結合バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール；ｐＨ７．５）で３回洗浄した。精製した封入体を、３０ｍＬの結合バッファーＡ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール、６Ｍ  ＧｕＨＣｌ；ｐＨ７．５）中にて１時間、氷上で可溶化した。可溶化した封入体を、４℃および１３０００ｇで４０分間遠心分離し、０．４５μｍ  ＰＶＤＦフィルターを通してろ過した。Ｈｉｓタグ人工転写因子を、結合バッファーＡおよび溶出バッファーＢ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  イミダゾール、６Ｍ  ＧｕＨＣｌ；ｐＨ７．５）を用いて、Ａｋｔａｐｒｉｍｅ  ＦＰＬＣ（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare））上のＨｉｓ−トラップカラムを用いて精製した。精製人工転写因子を含有する画分をプールし、人工転写因子がＳＩＤドメインを含有している場合は、バッファーＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  アルギニン、１００μＭ  ＺｎＣｌ2、５ｍＭ  ＧＳＨ、０．５ｍＭ  ＧＳＳＧ、５０％  グリセロール；ｐＨ７．５）に対して、またはＫＲＡＢドメイン含有人工転写因子の場合は、バッファーＫ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  アルギニン、１００μＭ  ＺｎＣｌ2、５ｍＭ  ＧＳＨ、０．５ｍＭ  ＧＳＳＧ、５０％  グリセロール；ｐＨ８．５）に対して、４℃で一晩透析した。透析の後、タンパク質サンプルを、１４０００ｒｐｍで３０分間、４℃で遠心分離し、０．２２μｍ  Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶフィルターチップ（ミリポア（Millipore））を用いて滅菌ろ過した。ＶＰ６４活性化ドメインを含有する人工転写因子の場合、タンパク質は、Ｈｉｓ−Ｂｏｎｄ  Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（ノバゲン）を製造元の推奨に従って用いて、可溶性画分（結合バッファー：５０ｍＭ  ＮａＰＯ4  ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール；溶出バッファー  ５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  イミダゾール）から作製した。タンパク質を、ＶＰ６４バッファー（５５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ  ７．４、４００ｍＭ  アルギニン、１００μＭ  ＺｎＣｌ2）に対して透析した。
【００９９】
ＥＬＤＩＡ（酵素結合ＤＮＡ相互作用アッセイ）を用いた人工転写因子のＤＮＡ結合活性の決定
ＢＳＡで予めブロッキングしたニッケルコーティングプレート（ピアース）を、洗浄バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ＢＳＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄する。プレートを、保存バッファー中の飽和条件下（５０ｐｍｏｌ／ウェル）、精製人工転写因子でコーティングし、軽く振とうしながら室温で１時間インキュベートする。３回の洗浄工程後、１×１０-12から５×１０-7Ｍの６０ｂｐプロモーター配列を含有するアニーリングしたビオチン化オリゴを、結合バッファー中（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．５、６０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２％  グリセロール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、および１００μＭ  ＺｎＣｌ2）、非特異的競合相手（０．１ｍｇ／ｍＬ  サケ精子由来ｓｓＤＮＡ、シグマ）の存在下、結合した人工転写因子と共に室温で１時間インキュベートする。洗浄後（５回）、ウェルを、３％  ＢＳＡを用いて室温で３０分間ブロッキングする。抗ストレプトアビジン−ＨＲＰを、結合バッファーに室温で１時間添加する。５回の洗浄工程後、ＴＭＢ基質（シグマ）を添加し、２から３０分間室温でインキュベートする。ＴＭＢ停止溶液（シグマ）を添加して反応を停止し、サンプル励起を、４５０ｎｍで読み取る。リガンド結合動態のデータ分析を、ヒルに従ってＳｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ  Ｖ８．１を用いて行う。
【０１００】
タンパク質形質導入
約８０％のコンフルエンシーまで増殖した細胞を、３７℃のＯｐｔｉＭＥＭまたは増殖培地中、２時間から１２０時間にわたって、０．０１から１μＭの人工転写因子で処理するか、または疑似処理し、所望に応じて、２４時間ごとに人工転写因子を添加する。所望に応じて、１０〜５００μＭ  ＺｎＣｌ2を増殖培地に添加してよい。免疫蛍光のために、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、トリプシン処理し、カバーガラス上に播種してさらに試験する。
【０１０１】
免疫蛍光
細胞を、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１５分間処理し、１０％  ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングし、マウス抗ＨＡ抗体（１：５００、Ｈ９６５８、シグマ）またはマウス抗ｍｙｃ（１：５００、Ｍ５５４６、シグマ）で一晩インキュベートする。サンプルを、ＰＢＳ／１％  ＢＳＡで３回洗浄し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６（１：１０００、インビトロジェン）と結合したヤギ抗マウス抗体と共にインキュベートし、ＤＡＰＩ（１ｍｇ／ｍＬの１：１０００で３分間、シグマ）を用いて対比染色する。サンプルを、蛍光顕微鏡を用いて分析する。
【０１０２】
ルシフェラーゼ／ＳＥＡＰプロモーター活性組み合せアッセイ
人工転写因子の活性を試験するために、レポーター細胞株を用いた。このレポーター細胞株は、ハイブリッドＣＭＶ／人工転写因子標的部位プロモーターの支配下のガウシアルシフェラーゼおよび構成的ＣＭＶプロモーターの支配下の分泌型アルカリホスファターゼを含有するＨＥＫ  ２９３ＦｌｐＩｎ  ＴＲｅx細胞をベースとする。
【０１０３】
１×１０5  レポーター細胞／ウェルを、タンパク質形質導入の２４時間前に６ウェルプレートに播種する。播種の２４時間後、培地をプレートから吸引し、細胞をＰＢＳで１回洗浄する。タンパク質処理のために、人工転写因子またはコントロールタンパク質を、ＯｐｔｉＭＥＭ中、１μＭの最終濃度まで希釈し、細胞に添加し、インキュベーター中にて（３７℃；５％ＣＯ2）２時間インキュベートする。タンパク質形質導入の後、細胞を通常の増殖培地で２４時間増殖させた。上澄を９６ウェルプレートに移し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ガウシアルシフェラーゼの測定の場合、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）Ｇａｕｓｓｉａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｇｌｏｗ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック（Thermo Scientific））を、製造元の説明書に従って用いた。希釈標準溶液を室温に平衡化し、セレンテラジンを１：１００の希釈率で添加した。２０μＬの細胞上澄を、不透明９６ウェルプレートに移し、５０μＬの希釈標準溶液を添加した。１０分間のインキュベーションの後、ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔＰｌｕｓ（ベルトールドテクノロジーズ（Berthold Technologies））を用い、１．０秒の積分時間で発光を測定した。分泌型アルカリホスファターゼ活性の測定の場合、化学発光ＳＥＡＰ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙ（ロシュ）を、製造元の説明書に従って用いた。細胞上澄を、希釈バッファーで１：４に希釈し、６５℃で５分間の熱失活を行った。熱失活サンプルの５０μＬを、不透明９６ウェルプレートに移し、５０μＬの不活性化バッファーを添加した。室温で５分間のインキュベーションの後、基質バッファー中１：２０のＡＰ基質から成る基質試薬の５０μＬを添加し、緩やかに撹拌しながら室温で１０分間インキュベートした。ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔＰｌｕｓ（ベルトールドテクノロジーズ）を用い、１．０秒の積分時間で発光を測定した。
【０１０４】
細胞インピーダンスの測定またはＥＣＩＳ
人工転写因子またはコントロールタンパク質で処理した細胞を、８ウェルラインアレイまたは８Ｗ１Ｅ  ＥＣＩＳ培養器（アプライドバイオフィジクス）中、２４時間、またはインピーダンスが一定となるまで増殖させる。細胞層の創傷を、ＥＣＩＳ  ＺＴｈｅｔａ（アプライドバイオフィジクス）の創傷プロトコルを用いて誘導し、治癒を、リアルタイムで２４時間、またはコントロール処理細胞のインピーダンスが一定となるまで追跡する。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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