(57)【要約】  腸管損傷を治療および予防するための方法および組成物を記載する。具体的には、腸管損傷、例えば運動によって誘発された腸管損傷、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の摂取によって誘発されたかもしくは悪化した腸管損傷、または運動によって誘発され、ＮＳＡＩＤによって悪化した腸管損傷を治療および予防するための方法ならびにグリセロリン酸塩の遅延放出型で腸溶性被覆剤を施された組成物を記載する。治療上有効量のグリセロリン酸塩、特にグリセロリン酸カルシウムを、運動を日常的に行っている対象に、特に運動を日常的に行って、かつ、運動に起因する骨格筋の痛みを治療または予防するためにＮＳＡＩＤを摂取している対象に経口的にまたは経鼻的に投与すると、運動によって誘発された腸管損傷、特に運動によって誘発され、ＮＳＡＩＤによって悪化した腸管損傷が軽減する。また、それを必要とする対象における密着結合の保全を向上させる方法も記載する。この方法は、対象に、有効量のグリセロリン酸、例えばグリセロリン酸カルシウムを投与することを伴う。さらに、密着結合の機能不全に関連する疾患、例えば炎症性疾患または癌を治療するまたは予防する方法も記載する。
2016509059.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸管損傷またはその症状を治療するまたは予防するように、対象に治療上有効量のグリセロリン酸塩を含んでいる組成物を投与することを含む、前記対象における腸管損傷またはその症状を治療するまたは予防する方法。
【請求項２】
前記グリセロリン酸塩がグリセロリン酸カルシウムである、請求項１の方法。
【請求項３】
前記腸管損傷またはその症状が運動によって誘発されたものであり、ここで前記対象が日常的に運動を行っている、請求項１の方法。
【請求項４】
前記組成物が、
（ｉ）前記治療上有効量のグリセロリン酸塩を含有している核；および、
（ｉｉ）前記核を覆っている腸溶性被覆剤、
を含んでいる腸溶性被覆剤を施された組成物である、請求項１の方法。
【請求項５】
前記腸管損傷またはその症状を治療するまたは予防するように、前記腸溶性被覆剤が、前記組成物が少なくとも前記対象の小腸または大腸に達するまでは前記核からの前記グリセロリン酸塩の放出を防止する、請求項４の方法。
【請求項６】
前記腸管損傷またはその症状が運動によって誘発されたものであり、ここで前記対象が日常的に運動を行っている、請求項４の方法。
【請求項７】
前記組成物の前記核および前記腸溶性被覆剤のうちの少なくとも１つが、遅延放出剤をさらに含む、請求項４の方法。
【請求項８】
前記核が非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）をさらに含む、請求項４の方法。
【請求項９】
前記組成物が経口または経鼻で投与される、請求項１の方法。
【請求項１０】
対象における非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）によって悪化した腸管損傷およびその症状の治療または予防する方法であって、ここで前記対象には前記ＮＳＡＩＤが投与されており、前記方法が、前記ＮＳＡＩＤによって悪化した前記腸管損傷またはその症状を治療するまたは予防するように、前記対象に治療上有効量のグリセロリン酸塩を含んでいる組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１１】
前記グリセロリン酸塩がグリセロリン酸カルシウムである、請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記組成物が、前記治療上有効量のグリセロリン酸塩と前記ＮＳＡＩＤを含む、請求項１０の方法。
【請求項１３】
前記腸管損傷またはその症状が運動によって誘発されたものであり、ここで前記対象が日常的に運動を行っている、請求項１０の方法。
【請求項１４】
前記組成物が、
（ｉ）前記治療上有効量のグリセロリン酸塩を含有している核；および、
（ｉｉ）前記核を覆っている腸溶性被覆剤、
を含んでいる腸溶性被覆剤を施された組成物である、請求項１０の方法。
【請求項１５】
前記腸管損傷またはその症状を治療するまたは予防するように、前記腸溶性被覆剤が、前記組成物が少なくとも前記対象の小腸または大腸に達するまでは前記核からの前記グリセロリン酸塩の放出を防止する、請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記腸管損傷またはその症状が運動によって誘発されたものであり、ここで前記対象が日常的に運動を行っている、請求項１４の方法。
【請求項１７】
前記組成物の前記核および前記腸溶性被覆剤のうちの少なくとも１つが、遅延放出剤をさらに含む、請求項１４の方法。
【請求項１８】
前記核が非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）をさらに含む、請求項１４の方法。
【請求項１９】
前記組成物が経口または経鼻で投与される、請求項１０の方法。
【請求項２０】
腸溶性被覆剤を施された組成物であって、
（ｉ）治療上有効量のグリセロリン酸塩を含有している核；および、
（ｉｉ）前記核を覆っている腸溶性被覆剤、
を含んでいる組成物。
【請求項２１】
前記グリセロリン酸塩がグリセロリン酸カルシウムである、請求項２０の組成物。
【請求項２２】
前記腸溶性被覆剤が、前記組成物が少なくとも前記対象の小腸または大腸に達するまでは前記核からの前記グリセロリン酸塩の放出を防止する、請求項２０の組成物。
【請求項２３】
前記核が非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）をさらに含む、請求項２０の組成物。
【請求項２４】
前記核および前記腸溶性被覆剤のうちの少なくとも１つが、遅延放出剤をさらに含む、請求項２０の組成物。
【請求項２５】
それを必要とする対象における密着結合の保全を向上させる方法であって、有効量のグリセロリン酸を含有している組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２６】
前記組成物が、
（ｉ）前記治療上有効量のグリセロリン酸塩を含有している核；および、
（ｉｉ）前記核を覆っている腸溶性被覆剤、
を含んでいる腸溶性被覆剤を施された組成物である、請求項２５の方法。
【請求項２７】
それを必要とする対象における密着結合の機能不全に関連する疾患を治療するまたは予防する方法であって、有効量のグリセロリン酸を含有している組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２８】
前記疾患が炎症性疾患および癌からなる群より選択される、請求項２７の方法。
【請求項２９】
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、セリアック、スプルー、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、遺伝性疾患、視力喪失、ウイルス感染、細菌性毒素、神経炎症、肺組織の保全に関する疾患、リンパ球輸送に関する疾患、および別の免疫学的な疾患からなる群より選択される、請求項２８の方法。
【請求項３０】
前記グリセロリン酸がグリセロリン酸カルシウムである、請求項２８の方法。
【請求項３１】
前記組成物が、
（ｉ）前記治療上有効量のグリセロリン酸塩を含有している核；および、
（ｉｉ）前記核を覆っている腸溶性被覆剤、
を含んでいる腸溶性被覆剤を施された組成物である、請求項２８の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１３年２月２０日に出願の米国特許出願第６１／７６６，９７６号、２０１３年５月２４日に出願の同第６１／８２７，０８０号および２０１３年１０月３０日に出願の同第６１／８９７，６７２号の優先権を主張し、これらの開示は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、腸管損傷を治療するおよび予防するための方法および組成物に関する。本発明は具体的には、腸管損傷、例えば運動によって誘発された、または非ステロイド性抗炎症薬の摂取によって誘発されたもしくは悪化した対象における腸管損傷を、グリセロリン酸塩を使用することで低減する、緩和する、または予防する方法を提供する。本発明また、密着結合を調節するための、ならびに密着結合の機能不全に関連する疾患を予防または治療するための方法および組成物にも関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトや動物の体内における血流分布は酸素要求性の機能であり、これは活性に依存している。つまり血流は、血管床となっている器官の中でも酸素要求量が最も高い器官に特異的に分布している。このことは、酸素低要求性の器官に血液を供給している血管を収縮させ、高要求性の器官に供給している血管を弛緩させることによって行われている。
【０００４】
血流は血管壁に対するせん断力となっていて、一酸化窒素やプロスタグランジンなどの細胞保護物質の合成を刺激している。血流が緩衝されるかまたは減少するとせん断力が下がってこのような物質の合成量が減少し、組織は虚血性の損傷（つまり血流が減少したことまたは抑制されたことに起因する損傷）をおこし始める。
【０００５】
臓器循環とは、胃、小腸、結腸、膵臓、肝臓、および脾臓などの消化器を血流が循環することを指す。このような臓器への流れ（消化管への血流）は変動が大きく、消化管への血流が減少した場合には、消化管は軽度から中程度の虚血状態で機能することになり得る。
【０００６】
具体的には、激しい運動を行っている間には骨格筋、心臓、および皮膚に血流が回されるため、臓器循環は減少する。従って、精力的に運動をしている間、消化管は軽度から中等度の虚血状態で動いていることが多い。この影響は、非ステロイド性抗炎症薬、つまりＮＳＡＩＤであるイブプロフェンを同時に摂取している場合に非常に大きくなる（これ以降「ファン・ヴィック（ｖａｎ  Ｗｉｊｋ）」と呼ぶ、ファン・ヴィックら、スポーツと運動における医療と科学（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ＆Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｓｐｏｒｔｓ＆Ｅｘｅｒｃｉｓｅ）４４，２２５７〜２２６２（２０１２）；を参照のこと）。
【０００７】
ＮＳＡＩＤは、疼痛および炎症を媒介する物質であるプロスタグランジンの合成を遮断する。しかしながら、プロスタグランジンは細胞保護的な、特に胃腸（ＧＩ）管に対して保護的な物質でもある。従って、ＮＳＡＩＤを慢性的に利用することはＧＩへの有害事象、例えば潰瘍および腸管のバリア機能障害と関連し、その結果、消化管の透過性が亢進する（Ｅ．フォカリン，臨床および実験科学紀要（Ａｎｎ．Ｃｌａｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．）２，６７〜８１（１９９８））。
【０００８】
運動選手は、運動によって誘発される身体の痛みを予防し、それによって身体能力を高める方法を慣習的に探し求めている。運動選手は一般的に、すでに発症している筋骨格の痛み、または運動や身体活動に関連するまたは活動によって誘発される筋骨格の痛みを考慮に入れて、身体活動の前、活動を行っている最中および／または活動後にＮＳＡＩＤを使用している。ＮＳＡＩＤを単独で使用することは腸管損傷を引き起こす可能性がある。しかしながら、運動とＮＳＡＩＤを併用すると、腸管損傷に対するＮＳＡＩＤの影響、特に腸管のバリア機能不全および胃腸管の透過性亢進に対する影響が非常に大きくなる。
【０００９】
腸型脂肪酸結合タンパク質（Ｉ−ＦＡＢＰ）は１５ｋＤａのタンパク質で、その血漿中における発現は、（腸吸収細胞）損傷のマーカーとなっている。ファン・ヴィックは最近、運動によって誘発された僅かな腸管損傷をイブプロフェンが悪化させること、具体的には、強度が中くらいの運動を日常的に行っている人にイブプロフェンを投与すると、十二指腸と小腸の透過性が亢進することを報告した。この試験では、所定の運動課題（自転車漕ぎ）を行う前、行っている最中、そして運動後の末梢血漿におけるＩ−ＦＡＢＰの発現を測定した。運動を行う前にイブプロフェンの４００ｍｇを対象に投与した場合には、血漿Ｉ−ＦＡＢＰレベルは、運動のみを行った群の血漿Ｉ−ＦＡＢＰレベルと比較して有意に上昇した。また対象は、通常は腸管バリアによって排出される非代謝性の単糖および二糖の取り込みを測定することで評価される腸の透過性の有意な亢進を経験した。まとめると、運動とイブプロフェンは両方とも、腸の透過性を亢進させた。この２つを併用した場合の効果は、それぞれを単独で使用した場合の効果の和よりも大きかった。このことは、この両者がいずれも、腸細胞の生存と腸細胞間のバリア機能に収束する、異なる経路によって作用することを示唆している。
【００１０】
ＮＳＡＩＤは、僅かな痛みおよび疼痛を緩和するため、ならびに発熱および炎症を低減するために一般の人々によく利用されている。加えて、リスクがあるにも関わらず、ＮＳＡＩＤは、既に生じている筋骨格の疼痛を治療するため、および運動に関連すると予想されるまたは運動によって誘発されると予想されるいずれもの筋骨格の疼痛を予防するために、運動選手によっても頻繁に利用されている。特定のスポーツに関しては、その利用率が参加者の９０％にも上ることが報告されている（Ｔ．ゴルスキーら、英国スポーツ医学雑誌（Ｂｒ．Ｊ．Ｓｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ．）４５（２），８５〜９０（２０１１）；Ｅ．タイオリ，英国スポーツ医学雑誌，４１（７），４３９〜４４１（２００７）；Ｗ．Ｖ．チュイン，スポーツ医学の臨床雑誌（Ｃｌｉｎ．Ｊ．Ｓｐｏｒｔ  Ｍｅｄ．）１８（２），１４３〜１４７（２００８））。
【００１１】
上皮細胞間または内皮細胞間の間隙は、ある層から別の層に輸送された分子が拡散してこれらの間隙を通って戻ってこないように密着している必要がある。密着結合は上皮細胞および内皮細胞の中にバリアを形成し、傍細胞間隙を介した水や溶質の移動を調節している。密着結合はまた、頂端膜中の分子が外側膜中の分子と混合するのを防止するための囲いを形成することで細胞の極性を維持する機能をもっている。癌または炎症性疾患など、多くの疾患では密着結合の機能不全が起きている。（例えば、Ｃ．フォスター；組織化学と細胞生物学（Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．）；１３０（１）：５５〜７０（２００８年７月）を参照のこと。
【００１２】
血清由来の生理活性脂質であるスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）が密着結合関連タンパク質の閉鎖帯（Ｚｏｎｕｌａ  Ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ）−１（ＺＯ−１）を活性化し、これが次に、内皮の走化性およびバリア保全の調節に重要な役割を担っていることが報告された。（リーら、生物化学雑誌（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．）２９；２８１（３９）：２９１９０〜２００（２００６年９月）；２００６年８月６日電子出版、を参照のこと）。
【００１３】
ＮＳＡＩＤＳが２つの機序によって作用して腸細胞密着結合の「緊密性」を弱め、その結果、腸管の透過性の亢進を引き起こすのだろうと考えられている。米国で店頭販売されているＮＳＡＩＤＳのうちの一部には酸化的リン酸化を阻害するという副作用がある。その結果、ＮＳＡＩＤＳは細胞エネルギーの産生を干渉する。この点で、ＮＳＡＩＤＳは運動中に認められる消化管への血流の減少効果を悪化させると予想される。血流の減少によって利用できる酸素が減り、同時にＮＳＡＩＤは、細胞が酸素を利用する能力を（たとえ酸素があったとしても）低下させる。
【００１４】
近年になって、培養した腸細胞では、Ｓ１Ｐが特定の密着結合タンパク質の発現を制御しているだけでなく、既存の密着結合の「緊密性」を高めるという証拠が示された（グリーンスポンら、消化器病と科学（Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．）５６，１３４２〜１３５３（２０１１））。緊密性保全の効果は、Ｓ１Ｐに暴露させた後、僅か３０分後には認めることができた。Ｓ１Ｐは細胞のスフィンゴ脂質であるスフィンゴシンのリン酸化によって生成される。スフィンゴシンはＳ１Ｐと同様、重要な制御である「シグナル伝達」効果をすぐに発揮できるリン酸化形態でのみ存在する。しかしながらリン酸化された状態のＳ１Ｐは、脱リン酸ホスファターゼの連続的な活性によって一定に下方調節されている。
【００１５】
当該分野では腸管損傷を、具体的にはＮＳＡＩＤの摂取が原因のまたは運動によって誘発される腸管損傷を治療および予防するための組成物および方法へのニーズがある。より具体的には、運動に関連した筋肉の凝りまたは疼痛を低減するおよび／または予防するために、運動の前、運動中または運動直後にＮＳＡＩＤを頻繁に摂取している対象における運動によって誘発される腸管損傷を治療および予防するための組成物および方法へのニーズがある。そのような方法は毒性がなく、無害で、かつ、重大な副作用がないことが好ましい。また、密着結合の機能不全に関連する疾患の予防または治療に利用可能な、密着結合を調節するための新規方法および組成物に対する要求もある。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、運動に関連がある骨格筋の疼痛を治療または予防するための、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の摂取によって誘発されたもしくは悪化した腸管損傷、運動によって誘発された腸管損傷、および運動によって誘発され、ＮＳＡＩＤの摂取によって悪化した腸管損傷またはその症状を治療または予防するための方法および組成物を提供する。本発明の態様によると、対象へのグリセロリン酸塩の投与、特にグリセロリン酸カルシウムの投与は、対象における腸管損傷またはその症状を低減する、緩和する、および／または予防するための有効な方法である。
【００１７】
基本的な一側面において本発明は、対象における腸管損傷またはその症状を治療または予防する方法に関し、この方法は、対象に治療上有効量のグリセロリン酸塩を含んでいる組成物を投与し、腸管損傷またはその症状を治療または予防することを含む。一態様では、内部損傷またはその症状は運動によって誘発され、かつ、対象は日常的に運動を行っている。組成物は、好ましくは経口的にまたは経鼻的に投与され、より好ましくは経口的に投与される。
【００１８】
別の基本的な側面において本発明は、対象における非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）によって悪化した腸管損傷およびその症状を治療するまたは予防する方法に関し、ここで対象にはＮＳＡＩＤが投与されており、この方法は、対象に治療上有効量のグリセロリン酸塩を含んでいる組成物を投与し、ＮＳＡＩＤによって悪化した腸管損傷またはその症状を治療または予防することを含む。組成物は、好ましくは経口的にまたは経鼻的に投与され、より好ましくは経口的に投与される。一態様では、内部損傷またはその症状は運動によって誘発され、かつ、対象は日常的に運動を行っている。
【００１９】
本発明の態様によると、対象に治療上有効量のグリセロリン酸塩、好ましくはグリセロリン酸カルシウムを投与すると、腸管損傷および／または１つ以上のその症状、例えば運動によって誘発された腸管損傷および／またはその症状が、グリセロリン酸塩を投与していない対象に比べて、低減、緩和または予防される。グリセロリン酸塩、好ましくはグリセロリン酸カルシウムは、例えば運動によって誘発された腸管損傷および／またはその症状であって、ＮＳＡＩＤの摂取によってさらに悪化した腸管損傷および／または１つ以上のその症状を、グリセロリン酸塩を投与していない対象が生じ得る腸管損傷および／またはその症状と比較して、低減する、緩和するまたは予防するのにも有効である。
【００２０】
本発明はまた、治療上有効量のグリセロリン酸塩含有している新規腸溶性被覆剤を施された組成物ならびに対象における腸管損傷を治療または予防する、対象における密着結合の保全を向上させる、および対象における密着結合の機能不全に関連する疾患を治療または予防する方法に関し、この方法は、本発明による腸溶性被覆剤を施された組成物、例えば部位特異的に送達される組成物を対象に投与することを含む。
【００２１】
基本的な一側面において本発明は、治療上有効量のグリセロリン酸塩を含有している腸溶性被覆剤を施された組成物を提供する。本発明の態様によると、腸溶性被覆剤を施された組成物は、
治療上有効量のグリセロリン酸塩を含有している核；および、
核を覆っている腸溶性被覆剤、
を含む。
【００２２】
好ましい態様では、腸溶性被覆剤は、組成物が少なくとも対象の小腸の空腸／回腸部分ならびに大腸に実質的に達していることが確実になるまで、核からのグリセロリン酸塩の放出を防止する。
【００２３】
別の基本的な側面において本発明は、それを必要とする対象における密着結合の保全を向上させる方法にも関し、この方法は、有効量のグリセロリン酸を含有している組成物を対象に投与することを含む。
【００２４】
別の基本的な側面において本発明は、それを必要とする対象における密着結合の機能不全に関連する疾患を治療または予防する方法に関し、この方法は、有効量のグリセロリン酸を含有している組成物を対象に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
添付の図面と合わせて読むことで、以降に記載する本発明の詳細な説明をより深く理解できるだろう。本発明を例示する目的で、現時点で好ましい態様を図に示している。しかしながら、本発明は図に示している態様には限定されないと理解される。
【００２６】
【図１】図１は、様々な濃度のＣＧＰを含むおよび含まない条件での基準となるマンニトールの流を時間に対して表したグラフである。
【図２】図２は、様々な濃度のＣＧＰが経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）に及ぼす効果を示しているグラフである。
【図３】図３は、Ｃａｃｏ−２細胞中でのスフィンゴシン１−リン酸の基準となる合成に及ぼすＣＧＰの効果を示しているグラフである。
【図４】図４は、グリセロリン酸カルシウム（ＣＧＰ）をＣａｃｏ−２細胞に投与すると、４時間後にはマンニトールの透過性が亢進することを示しているグラフである。
【図５】図５は低酸素状態での経上皮マンニトール流を示すグラフである。
【図６】図６は低酸素状態でのＴＥＥＲを示すグラフである。
【図７】図７は、サイトミックス（ｃｙｔｏｍｉｘ）によって誘導された経上皮マンニトール流にＣＧＰが及ぼす効果を示しているグラフである。
【図８】図８は、サイトミックス（（ＴＮＦ−α）、（ＩＦＮ−γ）および（ＩＬ−β））を処理している間の、経上皮電気抵抗に及ぼすＣＧＰの効果を示しているグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
別段の規定が無い限り、本明細書で使用される全ての技術的なおよび科学的な用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書で参照する全ての出版物および特許は、参照することによって本明細書に組み込まれる。本明細書に包含される文書、操作、材料、装置、記事などに関する議論は、本発明の流れを提供する目的のためのものである。そのような議論は、開示するまたは特許請求する発明のいずれに関しても、これらの対象物のいずれかがまたは全てが先行技術の一部を形成しているということを了解するものではない。
【００２８】
本明細書および添付の請求項で使用する場合、単数形の「１つ」「１種」および「この」は、そうでないことが明示されていない限り、複数の参照物を含むことに留意されたい。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「グリセロリン酸塩」という用語は、グリセロリン酸部分と毒性のない陽イオンを含有している全ての塩を指す。毒性のない陽イオンの非限定的な例としては、カルシウム、ナトリウム、カリウム、およびマグネシウムが挙げられる。本発明に使用するのに好適なグリセロリン酸塩の例としては、これらには限定されないが、グリセロリン酸カルシウム、グリセロリン酸ナトリウム、グリセロリン酸カリウム、およびグリセロリン酸マグネシウムが挙げられる。グリセロリン酸塩がグリセロリン酸カルシウムであることが好ましい。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「グリセロリン酸カルシウム」または「ＣＧＰ」という用語は、Ｃ3Ｈ7ＣａＯ6Ｐの分子式を有し、無水の形態で分子量が２１０．０４の化合物を指す。また「ＣＧＰ」は、一水和物や二水和物などの水和物の形態でも存在し得る。「ＣＧＰ」は、１，２，３−プロパントリオール、モノ（二水素リン酸）カルシウム塩（１：１）、グリセリノリン酸カルシウム、ホスホグリセリン酸カルシウムおよびニューロシン（ＮＥＵＲＯＳＩＮ）（登録商標）としても知られている。ＣＧＰには３つの異性体、すなわちβ−グリセロリン酸カルシウム塩（（ＨＯＣＨ2）2ＣＨＯＰＯ3Ｃａ）ならびにＤ（＋）およびＬ（−）−ａ−グリセロリン酸カルシウム塩（ＨＯＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2ＯＰＯ3Ｃａ）が存在する。いずれか１種類の異性体、または２種類以上の異性体の任意の組み合わせを、本発明によるＣＧＰとして使用することができる。
【００３１】
ＣＧＰは当該分野で知られている方法によって合成することができる。またＣＧＰは、市販されている様々な供給源から得ることもできる。市販されているＣＧＰ調整物としては、これらには限定されないが、エーケーファーマ（ＡｋＰｈａｒｍａ  Ｉｎｃ．、プレザントビル、ＮＪ  ０８２３２）、アスタ・ラボラトリー（Ａｓｔｈａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｐｖｔ，Ｌｔｄ），（Ｂ−４，工業団地，サナス・ナガー，ハイデラバード−１８，インド），セピック社（Ｓｅｐｐｉｃ  Ｉｎｃ．）（３０、トゥーブリッジス通り，フェアフィールド，ＮＪ  ０７００４）、および他の多くの製造業者および世界中の販売業者から入手できるものが挙げられる。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「非ステロイド性抗炎症薬」または「ＮＳＡＩＤ」という用語は、鎮痛性（疼痛を和らげる）、解熱性（発熱を低減する）、および／または抗炎症性の効果を有する、ある分類の化合物を指す。ＮＳＡＩＤの例としては、これらには限定されないが、イブプロフェン、アスピリン、ナプロキセン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、オキサプロジン、インドメタシン、スリンダク、エトドラク、ジクロフェナク、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、およびイソキシカム（ｉｓｏｘｉｃａｍ）、およびそれらの薬学上許容可能な塩が挙げられる。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「運動」という用語は、いかなる形態もの身体活動を指す。一態様において運動とは、柔軟性を向上すること、または筋肉や関節の可動範囲を広げることを目的とした任意の活動、例えばストレッチを指す場合がある。別の態様において運動は、心血管の持久力を向上させることを目的とした任意の有酸素運動、例えば、これらには限定されないが、自転車漕ぎ、水泳、歩くこと、船を漕ぐこと、走ること、ハイキングおよびテニスを指す場合がある。一層さらに別の態様において運動は、短期筋力を向上させることを目的とした任意の無酸素運動、例えば、ウェイトトレーニング、インターバルトレーニング、テニス、あらゆる年代層のおよび競技者レベルのフットボール、サッカー、短距離走、または他の肉体に負荷のかかる全てのスポーツもしくは活動を指す場合がある。本開示を考慮すれば、本発明の方法はいかなる形態の運動によって誘導された腸管損傷をも治療することができるが、腸管損傷は、無酸素運動よりも有酸素運動の後に起こることが多い傾向にある。これは、有酸素運動の方が酸素要求量が多いためで、その結果、有酸素運動後の治療に対する要求の方が高いであろう。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、全ての動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味し、本発明の態様による組成物または化合物を対象に投与するか、それらが既に対象に投与されている。哺乳動物の例としては、これらには限定されないが、ウシ、ウマ（最も具体的には競走馬）、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなどが挙げられるが、最も好ましくはヒトである。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「腸」という用語は、腸管を指す。腸管には小腸と大腸が含まれる。小腸は、十二指腸（つまり胃に近い最も上側の部分）、空腸（つまり中央部／セグメント）、および回腸（つまり大腸に近い最後の部分）から構成されている。本明細書で使用する場合、「十二指腸と空腸部分との間の結合」とは、小腸の中でも、十二指腸セグメントが空腸セグメントと接触している部分を指す。本明細書で使用する場合、「十二指腸と空腸部分との間の結合」とは、小腸の中でも、十二指腸セグメントが空腸セグメントと接触している部分を指す。
【００３６】
腸細胞の透過性を妨げる腸バリアは、隣接している腸細胞（つまり腸の細胞）同士の間の密着結合の形成に依存している。密着結合は、腸管腔の近くにある細胞を取り巻いているタンパク質（主にクローディン類とオクルーディン類）の束から構成されている。ある細胞を隣接している細胞と結合している接着帯は、ちょうど床板をつないでいるさね継ぎと同じように、細胞間の蓋を形成している。細胞間の密着結合の「緊密性」は束の数の一次関数であり、細胞の酸化状態や細胞表面にある可溶性因子による影響を受ける可能性がある。
【００３７】
物質は、経細胞（細胞内を横断する）経路または傍細胞（細胞の間を通る）経路のいずれかによって腸バリアを通過する。定義によれば、細胞間を移動する物質は密着結合を横切ることができる。物質が密着結合を横断する速度は、物質の分子量と密着結合の「緊密性」の両方に依存する。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「腸管損傷」という用語は、腸の損傷、具体的には腸細胞（腸の細胞）それ自体の損傷を指す。腸細胞は小腸および大腸粘膜の多くを占める細胞であり、消化の最終段階と、栄養素、電解質、および水の吸収に関わっている。「腸管損傷」はまた、正常な腸のバリア機能を損なう、低下するまたは劣化させるような腸の細胞間の結合、つまり腸細胞間の密着結合の損傷も指す。本明細書で使用する場合、「腸管損傷」という用語の範囲にはさらに、腸細胞間の密着結合が損なわれた結果、腸の透過性が亢進し、それによって腸上皮バリアの保全が損なわれ、通常は排出される物質が腸バリアを横切って拡散されることを包含することを意図する。本明細書で使用する場合、「腸管損傷」はまた、腸管損傷の症状および症状の発症も指し、これらの症状には例えば、これらには限定されないが、心窩部痛、鼓腸、ディスペプシア（消化不良）、およびおくびが挙げられる。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「消化管の透過性の亢進」および「腸の透過性の亢進」という用語は、腸細胞間の密着結合の「緊密性」の低下を指す。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「治療上有効量」とは、腸管損傷を低減する、緩和する、腸管損傷が広がる程度を抑える、または腸管損傷を予防するのに有効なグリセロリン酸塩の量を意味する。「治療上有効量」とはまた、腸管損傷に関連がある症状の全てまたは腸管損傷の指標を低減する、緩和する、腸管損傷の症状または指標が発展する程度を抑える、または腸管損傷の症状または指標を予防するのに有効なグリセロリン酸塩の量を意味する。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「治療している」、「治療する」または「治療」という用語は、対象における腸管損傷および／または腸管損傷に関連がある１つ以上の症状を低減する、緩和する、または予防するのに有効な量のグリセロリン酸塩を投与することを指す。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「予防している」、「予防する」または「予防」という用語は、任意の腸管損傷または関連する症状が両方とも予防される、両方の発症が時間的に遅らされる、またはそれでもなお発症してしまった場合にも、グリセロリン酸塩を投与しないよりもその程度が抑えられるように、腸管損傷に関連する症状が発症する前に、対象に治療上有効量のグリセロリン酸塩を投与することを指す。
【００４３】
本発明の態様は、対象における腸管損傷を治療するまたは予防する方法を含む。腸の透過性の亢進は、運動をしている最中に起こる骨格筋の酸素要求量の増加を満たすために、運動によって誘発された臓器循環からの血流の転換（つまり消化管への血流）である場合があるので、運動だけによっても腸管損傷が引き起こされる可能性がある。運動によって誘発された腸管損傷は、ＮＳＡＩＤの摂取によってさらに悪化または増悪する可能性がある。従って本発明の態様はさらに、対象における運動によって誘発された腸管損傷を治療または予防する方法、対象におけるＮＳＡＩＤによって悪化した腸管損傷を治療または予防する方法、および対象における運動によって誘発され、ＮＳＡＩＤの摂取によって悪化した腸管損傷を治療または予防する方法も含む。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「運動によって誘発された腸管損傷」という句は、運動によって引き起こされた腸管損傷または腸管損傷の症状であって、運動をしなかった場合に生じる可能性のある腸管損傷または腸管損傷の症状よりも程度の大きな腸管損傷または腸管損傷の症状を指す。本明細書で使用する場合、「運動によって誘発され、ＮＳＡＩＤによって悪化した腸管損傷」という句は、運動によって引き起こされ、ＮＳＡＩＤを摂取したことによって悪化または増大した腸管損傷または腸管損傷の症状であって、運動をせず、ＮＳＡＩＤを摂取しなかった場合に生じる可能性のある腸管損傷または腸管損傷の症状よりも程度の大きな腸管損傷または腸管損傷の症状を指す。
腸管損傷または症状を治療または予防する方法
【００４５】
本発明の態様によると、対象における腸管損傷またはその症状を治療するまたは予防する方法は、対象に治療上有効量のグリセロリン酸塩を投与することを含む。一態様では、治療または予防される腸管損傷またはその症状は、運動によって誘発される腸管損傷またはその症状である。別の態様では、治療または予防される腸管損傷またはその症状は、運動によって誘発され、ＮＳＡＩＤの摂取によってさらに悪化した腸管損傷またはその症状である。
【００４６】
従って本発明の態様によると、有効量のグリセロリン酸塩の投与を受ける対象は、治療または予防される腸管損傷が運動誘発性であるように、日常的に運動を行っている対象である可能性がある。また、有効量のグリセロリン酸塩の投与を受ける対象は、治療または予防される腸管損傷またはその症状がＮＳＡＩＤ誘発性であるように、ＮＳＡＩＤを摂取している対象である可能性がある。本発明によるグリセロリン酸塩の投与を受ける対象はさらに、運動を日常的に行っていて、かつ、ＮＳＡＩＤを摂取している、例えば既に発症しているまたは予想される運動に関連した筋骨格の痛みを和らげるためにＮＳＡＩＤを摂取している対象である可能性もある。ＮＳＡＩＤを摂取することで治療することが可能な運動に関連する筋骨格疼痛の非限定的な例としては、関節、例えば膝または肘の炎症；関節損傷、例えば捻挫；腱の炎症（腱炎）；靱帯の伸びまたは断裂、例えば前十字靭帯（ＡＣＬ）の断裂；脛骨疲労症候群（過労性頸部痛）；足底筋膜炎；および大腿屈筋、四頭筋、臀部、二頭筋または三頭筋（引っ張り筋）の延びが挙げられる。ＮＳＡＩＤを摂取することで治療することが可能な運動に関連する筋骨格の疼痛にはまた、特定の外傷を経験していないまたは特定の外傷を今示しているのではない、運動後の筋肉や関節の単純な痛みが含まれる。本開示の目的では、任意の場所で感じられる疼痛または予想される疼痛の緩和にＮＳＡＩＤが実際に有効かどうかは当面議論せず、ただ、運動を行っているヒトがそのような運動をしている時点でまたはそれに近い時点でＮＳＡＩＤを摂取して、それによって腸細胞が特定のリスクにさらされているという事実のみを議論する。
【００４７】
本発明によると、対象によるＮＳＡＩＤの摂取と運動への取り組みは同時である必要はないが、運動をすぐに行うつもりであるか、または運動の開始時に有効量のＮＳＡＩＤが対象の体内に存在し、そのため、運動自体によって誘発される腸管損傷のいずれもが、運動を開始した時点から増悪するまたは悪化するように、単に同時期にまたは並行している必要がある。例えば、イブプロフェンなどのＮＳＡＩＤを、走ることのような運動に取り組む６０分前に摂取する場合がある。
【００４８】
本発明の一態様では、治療上有効量のグリセロリン酸塩を投与すると、腸管損傷の１つ以上症状の低減、緩和または予防において臨床的に観察できる有益な効果が、つまり、対象が治療上有効量のグリセロリン酸塩の投与を受けていなければ腸管損傷によって生じ得る症状の約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％以下になるような、効果が得られる。
【００４９】
本発明の別の態様では、治療上有効量のグリセロリン酸塩を投与すると、ＮＳＡＩＤによって悪化した腸管損傷の１つ以上症状の低減、緩和または予防において臨床的に観察できる有益な効果が、つまり、対象が治療上有効量のグリセロリン酸塩の投与を受けていなければＮＳＡＩＤの摂取によって生じ得る症状の約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％以下になるような、効果が得られる。
【００５０】
本発明のさらに別の態様では、治療上有効量のグリセロリン酸塩を投与すると、運動によって誘発される腸管損傷の１つ以上症状の低減、緩和または予防において臨床的に観察できる有益な効果が、つまり、対象が治療上有効量のグリセロリン酸塩の投与を受けていなければ運動だけによって生じ得る症状の約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％以下になるような、効果が得られる。
【００５１】
また本発明のさらに別の態様では、治療上有効量のグリセロリン酸塩を投与すると、運動によって誘発され、ＮＳＡＩＤによって悪化した腸管損傷の１つ以上症状の低減、緩和または予防において臨床的に観察できる有益な効果が、つまり、対象が治療上有効量のグリセロリン酸塩の投与を受けていなければ運動とＮＳＡＩＤによって誘発された症状の約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％以下になるような、効果が得られる。
【００５２】
本発明の一層さらに別の態様において臨床的に観察できる有益な効果とは、腸管損傷、ＮＳＡＩＤによって悪化した腸管損傷、運動によって誘発された腸管損傷または運動によって誘発され、ＮＳＡＩＤによって悪化した腸管損傷、および／または１つ以上のその症状が、さらに悪化もしくは進行するのが予防される、あるいはその後、対象が治療上有効量のグリセロリン酸塩の投与を受けなければ生じるであろう程度よりも、低い程度に抑えられる状況となる場合がある。
【００５３】
本発明のさらに別の態様において臨床的に観察できる有益な効果とは、腸管損傷、ＮＳＡＩＤによって悪化した腸管損傷、運動によって誘発された腸管損傷または運動によって誘発され、ＮＳＡＩＤによって悪化した腸管損傷、および／または１つ以上のその症状の発症が予防される、つまり、対象が治療上有効量のグリセロリン酸塩の投与を受けなければ生じるであろう腸管損傷または腸管損傷の症状を対象がいずれも経験しないように予防される状況となる場合がある。
【００５４】
好ましい態様では、対象に投与されるグリセロリン酸塩はグリセロリン酸カルシウムである。
【００５５】
本開示を考慮すれば、標準的な手順に従って対象に投与するグリセロリン酸塩の効果を評価することができる。従って当業者は、対象に投与するグリセロリン酸の有効量を決定することができる。対象は、グリセロリン酸塩の臨床上有益な効果を容易に理解することができる。例えば、運動を行う前にＮＳＡＩＤを摂取し、有効量のグリセロリン酸塩の投与を受けた対象は、その後の運動中および運動後に、グリセロリン酸塩の投与を受けていなければ経験するであろう程度の消化不良、心窩部痛、または鼓腸と比べて、消化不良、心窩部痛、または鼓腸を経験しない。また対象が直接観察できる症状としては、便秘もしくは下痢または炎症の症状、例えば関節の痛み、筋肉の圧痛などを挙げることができる。評価する症状は、筋肉痛または関節痛などの、強度の運動を行った後に起こることが一般的に予想される、筋骨格の症状になぞらえることもできる。
【００５６】
グリセロリン酸塩の臨床学的に有益な効果は、腸バリアの保全を維持し、それによって腸管損傷を治療するまたは予防するグリセロリン酸塩の効果を評価するための臨床学的なアッセイによって決定することもできる。この場合、臨床上有益な効果を客観的に決定することができ、また、臨床上有益な効果を対象が直接観察できる必要も、容易に理解できる必要もない。例えば、酸素の利用可能性および／または利用の低下によって生じ得る腸細胞損傷などの腸細胞損傷によって腸型脂肪酸結合タンパク質（Ｉ−ＦＡＢＰ）が細胞から放出される。次いでＩ−ＦＡＢＰは血行に入り、血漿中のＩ−ＦＡＢＰを検出することができる。従って、血漿Ｉ−ＦＡＢＰは腸細胞損傷のマーカーであり、Ｉ−ＦＡＢＰレベルは酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などによって容易に測定することができるため、腸管損傷の低減に及ぼすグリセロリン酸塩の効果を決定することができる。腸管損傷および腸管損傷の予防または低減におけるグリセロリン酸塩の効力を評価するための臨床学的なアッセイの別の例としては、参照することによって本明細書に組み入れられる、クロマトグラフィー雑誌Ｂ、生物化学および生命科学における分析技術（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．Ｂ  Ａｎａｌｙｔ．Ｔｅｃｈ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．），８７９（２６），２７９４〜２８０１（２０１１）に記載されている、各種糖を使ったアッセイがある。この各種糖を使ったアッセイでは、非代謝性単糖および二糖の取り込みおよび尿中排泄を測定することで、腸細胞の透過性を測定する。これらの糖類は傍細胞（細胞間）経路から取り込まれるが、それは腸細胞間の結合の緊密性が弱まっている場合のみに限られる。
【００５７】
治療上有効量のグリセロリン酸塩を提供するための対象に投与するグリセロリン酸塩の用量は特定の値に限定されない。当業者であれば、臨床上有益な効果を観察するのに必要とされるグリセロリン酸塩の治療上有効量は、治療する対象の体重、年齢、性別などのさらなる要因、ならびに開始時点での対象の腸の健康状態に依存することを理解し、また、当業者は、治療上有効量となる適切な用量を容易に決定することができる。投与計画および本発明に従って対象に投与するグリセロリン酸塩の治療上有効量を決定する点で考慮されるさらなる要因としては、これらには限定されないが、対象のＮＳＡＩＤに対する感受性ならびに対象が日常的に行っている運動の強度および頻度が挙げられる。例えば、運動によって誘発され、ＮＳＡＩＤの摂取によって悪化した対象における腸管損傷を治療または予防するために、対象はＣＧＰの投与を受ける場合がある。ＮＳＡＩＤと比較したＣＧＰの用量は広い範囲にわたる可能性があるが、好ましくはＣＧＰは、ＣＧＰ：ＮＳＡＩＤのモル比が０．１：１〜１０：１の範囲で投与される。一例を挙げると、使用されるＮＳＡＩＤがイブプロフェンの場合、典型的な投与量は、ＣＧＰとイブプロフェンの分子量がほぼ同じ（ＣＧＰの分子量＝２１０．０４；イブプロフェンの分子量＝２０６．２９ｇ／ｍｏｌ）であることを考慮して、ＣＧＰ：イブプロフェンが重量比で１：１となる。この例では、イブプロフェン２００ｍｇの投与に対して２００ｍｇのＣＧＰを投与することができる。同様に、例えばイブプロフェン４００  ｍｇの投与に対して４００  ｍｇのＣＧＰなどを投与することができる。ＮＳＡＩＤとしてアスピリン（ＭＷ＝１８９ｇ／ｍｏｌ）を投与する場合、アスピリンの推奨用量は６５０ｍｇとなってもよく、この場合、ＣＧＰの対応する用量は８００ｍｇとなり得る。他のＮＳＡＩＤについても、ＣＧＰの投与量を同様に、推奨されるまたは典型的なＮＳＡＩＤの投与量を一致させるだろう。ＮＳＡＩＤが存在しない場合に、対象における運動によって誘発された腸管損傷を治療または予防するために投与するＣＧＰ、または他のグリセロリン酸塩の用量は、ＮＳＡＩＤも摂取された時に投与される用量と同じであってよい。
【００５８】
グリセロリン酸塩とＮＳＡＩＤは、単一の組成物、例えば錠剤またはカプセルの組み合わせとして、あるいはそれらを別個の組成物、例えば２つの別個の錠剤またはカプセルとして投与することができる。どちらの例にしても、グリセロリン酸塩とＮＳＡＩＤの両方が同時に摂取される必要はないが、グリセロリン酸塩とＮＳＡＩＤがもう一方と同時期に脆弱な腸細胞に接触するように、同時期にまたは並行して摂取されなければならない。
【００５９】
本発明の一態様によると、治療上有効量のグリセロリン酸塩は、固体または液体の形状で、例えば粉末または液体の混合物として、対象に経口投与される。固体として経口投与する場合、グリセロリン酸塩は例えば、粉末、錠剤、カプセル、カプレット、ジェルカプセル、または液体ゲルの形状である可能性がある。液体として経口投与する場合、グリセロリン酸塩は例えば、乳剤、溶液、懸濁液、シロップ、またはエリキシルの形状である可能性がある。
【００６０】
本発明の別の態様によると、治療上有効量のグリセロリン酸塩は、点鼻スプレー／吸入用混合物に入った固体の粉末または液体混合物として、対象に経鼻投与される。点鼻スプレー／吸入用混合物として経鼻的に投与する場合、グリセロリン酸塩は、顆粒の形態であっても、または液体の乳剤、溶液状のシロップ、もしくは水溶性の担体溶液／懸濁液に溶解／懸濁されたエリキシルであってもよい。この態様では、遅延放出性は必須ではない。
【００６１】
好ましい態様では、グリセロリン酸塩は経口投与される。鼻粘膜レベルでの実質的な吸収のせいで経鼻投与は腸への直接的な経路とはならないため、経口投与が好ましい方法であるが、経鼻的に投与された製剤のいくらかは上気道の背側を伝わって食道まで容易に飲み込まれ、それによって腸管への直接的な経路になる場合もある。しかしながら、そのような経路を介する場合、胃腸内を進むそのような部分に関する遅延放出製剤は存在しない。
【００６２】
本発明の別の態様によると、グリセロリン酸塩を、運動用に開発された食品または飲料と一緒に経口投与することができる。本明細書で使用する場合、「運動用に開発された食品または飲料」という用語は、体操、練習、運動能力または運動もしくは運動能力に関するいずれもの活動の成績を向上させるため、あるいは体操、練習、運動能力または運動もしくは運動能力に関するいずれもの活動からの回復を向上させるために、特に運動選手に向けて販売されている全ての飲料または食品を指す。運動用に開発された食品および飲料の非限定的な例としては、エネルギーバー（栄養補助食品）、タンパク質粉末、タンパク質シェイクおよびスポーツ飲料、特に運動後の水分補給または電解質の補充を補助するために設計されているスポーツ飲料が挙げられる。グリセロリン酸塩を運動用に開発された飲料に溶解または懸濁し、対象が運動用に開発された飲料を摂取する際に対象に経口的に投与することができる。また、グリセロリン酸塩を運動用に開発された食品と組み合わせて、それによって、対象が運動用に開発された食品を摂取する際に対象に経口的に投与することもできる。例えば、ＣＧＰ粉末をタンパク質粉末と混合することが、またはタンパク質バーに分散もしくは懸濁することができる。
【００６３】
本発明で使用するための治療上有効量のグリセロリン酸塩を含んでいる組成物は、本開示を考慮しながら、当業者に知られているいかなる方法によっても製剤化することができる。対象に投与するための組成物を準備するには、標準的な医薬品配合技術に従ってグリセロリン酸塩を薬学上許容可能な担体と混合する。本発明で使用するための組成物は治療上有効量のグリセロリン酸塩を含む場合があり、治療上有効量のグリセロリン酸塩とは組成物の総重量の約１０〜９０％のグリセロリン酸塩、好ましくは５０〜９０％、最も好ましくは７５〜９０％のグリセロリン酸塩である。組成物の有効成分は、このましくは１００％のグリセロリン酸塩を含有するが、製剤化された化合物全体におけるグリセロリン酸のパーセンテージは、活性をもつ塩が小腸および大腸の適切な部分に確実に達するようにする保護的な被覆剤のさらなる重量に応じる。グリセロリン酸塩の重量は、グリセロリン酸塩の特定の陽イオンに依存する。このましくは、核が組成物の少なくとも約９５％を含み、保護的な被覆剤が残りを含む。しかしながら、これらのパーセンテージは限定的なものではなく、パーセンテージは慣習的な実験方法によって決めることができる。
【００６４】
薬学上許容可能な担体は、１種類以上の賦形剤、例えば結合剤、沈殿防止剤、乳化剤、湿潤剤、滑沢剤、香料、甘味料、防腐剤、色素、および被覆剤を含む場合がある。担体は、投与することが望まれる調製物の形態によって、態様な形態をとり得る。液体の経口用調整物、例えば、懸濁液、エリキシルおよび溶液の場合、好適な担体および添加剤としては、水、グリコール、油、アルコール、矯味剤、防腐剤、着色剤などが挙げられる。固体の経口用調整物、例えば、粉末、カプセル、カプレット、ジェルカプセルおよび錠剤の場合、好適な担体および添加剤としては、デンプン、糖類、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などが挙げられる。点鼻スプレー／吸入用混合剤の場合、水溶液／懸濁液は、水、グリコール、油、軟化剤、安定剤、湿潤剤、防腐剤、芳香剤、香料などを好適な担体および添加剤として含む場合がある。
【００６５】
ＣＧＰの水への溶解度は、水１００ｍＬに対しおよそ１グラムである。従って、ＣＧＰの溶液／懸濁液を本発明に従って、例えばＣＧＰの粉末または錠剤を水に溶解する／分散させるおよび懸濁することで経口投与用に調製することができる。懸濁液が許容可能であると見なされる場合には、１％を超える濃度のＣＧＰを使用することができ、また、一般的に知られている安定剤、例えば、寒天、カルボキシメチルセルロースナトリウムガム、グアーガムなどを含むがこれらには限定されない安定剤をいくつでも使用することで、懸濁液として保存することができる。特定の態様では、ＣＧＰ粉末または錠剤を運動用に開発された飲料に溶解する、または運動用に開発された食品に分散、懸濁もしくは混合することができる。またＣＧＰを、本発明において数時間使用するのに好適な持続放出形態として製剤化することもできる。持続放出性の投与形態を製造するための方法は当業者に知られている。点鼻スプレーの典型的な投与量は、必要に応じて、また対象が摂取するＮＳＡＩＤの量に依存して、各鼻腔に１日１回スプレーから、各鼻腔に２回スプレーすることを１日２回以上となるだろう。他のグリセロリン酸塩、例えばグリセロリン酸ナトリウム、グリセロリン酸マグネシウム、またはグリセロリン酸カリウムを含む組成物もＣＧＰの組成物と同様に調製することができる。
【００６６】
本発明の態様によると、腸管損傷を治療するまたは予防するために投与されるグリセロリン酸塩は、対象にいつの時点で投与してもよい。例えば、腸管損傷を治療または予防するために、グリセロリン酸塩を１日１回、もしくは１日２回、または要望に応じてそれを超える頻度で、悪影響を伴うことなく、投与することができる。
【００６７】
本発明の態様によると、ＮＳＡＩＤによって悪化した腸管損傷を治療するまたは予防するために投与されるグリセロリン酸塩は、グリセロリン酸塩の治療上の効果が、ＮＳＡＩＤの投与およびその腸管損傷をいっそう悪化させる作用に重複し、グリセロリン酸塩の治療上有益な効果が観察できる時点であればいつの時点でも対象に投与することができる。グリセロリン酸塩は、例えば、ＮＳＡＩＤと同時に、ＮＳＡＩＤを摂取する直前に、またはＮＳＡＩＤを摂取した直後に投与することができる。
【００６８】
本発明の態様によると、運動によって誘発された腸管損傷を治療するまたは予防するために投与されるグリセロリン酸塩は、グリセロリン酸塩の治療上の効果が、運動によって誘発された腸管損傷の発症またはその持続に重複し、グリセロリン酸塩の治療上有益な効果が観察できる時点であればいつの時点でも対象に投与することができる。グリセロリン酸塩を、運動を開始する直前、運動中、または運動が終わった直後に投与することが好ましい。
【００６９】
本発明の態様によると、運動によって誘発され、ＮＳＡＩＤによって悪化した腸管損傷を治療するまたは予防するために投与されるグリセロリン酸塩は、グリセロリン酸塩の治療上の効果が、ＮＳＡＩＤの投与およびその運動によって誘発された腸管損傷をいっそう悪化させる作用に重なり、グリセロリン酸塩の治療上有益な効果が観察できる時点であればいつの時点でも対象に投与することができる。グリセロリン酸塩を例えば、ＮＳＡＩＤを摂取した後ではあるが運動を開始する前、またはＮＳＡＩＤを摂取した後で一連の運動を行っている間に投与することができる。グリセロリン酸塩はＮＳＡＩＤを摂取する前で、かつ、運動を開始する前に投与することもできる。またグリセロリン酸塩を、ＮＳＡＩＤを摂取した後であって、かつ、運動が全て終了した後に、または運動を開始する前にＮＳＡＩＤの摂取と同時に投与することもできる。
【００７０】
グリセロリン酸塩、特にＣＧＰは毒性がなく、無害であり、かつ、既知の副作用がないため、グリセロリン酸塩を投与することができる回数には全く制限がない。従ってグリセロリン酸塩は１日に何回でも、例えば１日１回、２回、３回、または４回以上、投与することができる。例えば、運動によって誘発される腸管損傷を治療するまたは予防する場合、グリセロリン酸塩、例えばＣＧＰを複数回、例えば運動の前後、または運動の開始前、運動中および運動後に投与することができる。目的がＮＳＡＩＤによって悪化する腸管損傷を予防することである場合には、ＮＳＡＩＤを摂取するたびにグリセロリン酸塩を投与することができる。運動によって誘発され、ＮＳＡＩＤによって悪化すると予想される腸管損傷およびそれに関連する症状を予防することが目的である場合には、ＮＳＡＩＤを摂取する前、またはＮＳＡＩＤの摂取と同時にグリセロリン酸塩を投与することが好ましい。前に提示した状況は非限定的な例であることを意図したものであり、当業者であれば本発明に従って、いつＣＧＰまたは他のグリセロリン酸塩を投与すれば、特に、ＮＳＡＩＤの摂取に対していつＣＧＰまたは他のグリセロリン酸塩を投与すれば、さらに、ＮＳＡＩＤの摂取と運動習慣に対していつＣＧＰまたは他のグリセロリン酸塩を投与すれば臨床上有益な効果が現れるかを認識すると理解される。
【００７１】
本発明で使用するための、治療上有効量のグリセロリン酸塩を含んでいる組成物は場合により、ＮＳＡＩＤを含むさらなる治療用添加剤、例えば前で議論したような添加剤を含む場合がある。従って、本発明の特定の態様では、グリセロリン酸塩とＮＳＡＩＤは対象に、同じ組成物の一部として同時に投与される場合がある。グリセロリン酸塩がＣＧＰであることが好ましい。本発明で使用されるＣＧＰとＮＳＡＩＤを組み合わせた組成物は好ましくは、ＣＧＰとＮＳＡＩＤの混合物に含まれるＮＳＡＩＤの重量に対して約１０％〜約１０００％重量のＣＧＰを、好ましくは組成物に含まれるＮＳＡＩＤの重量の３０％〜７０％、より好ましくは４０％〜６０％、最も好ましくは５０％のＣＧＰを含む。ＮＳＡＩＤと同時に摂取されるが、ＮＳＡＩＤと共通した組成物の一部として摂取されるのではない場合、ＣＧＰの重量とＮＳＡＩＤの重量が１：１であることが好ましい。好ましい態様においてＮＳＡＩＤはイブプロフェンである。例示的ではあるが非限定的な例として、ＣＧＰとイブプロフェンを含んでいる組成物を本発明に従って、運動によって誘発された腸管損傷を治療するおよび／または予防するために、運動、例えば走ることに取り組む６０分前に対象に投与することができる。
【００７２】
運動に関連する骨格筋の痛みを軽減するために、ＮＳＡＩＤを運動前、運動中、または運動の直後に慢性的に摂取している対象は、激しい運動を必要とする厳しい練習計画をほぼ毎日行っている運動選手である場合がある。そのような対象には、運動によって誘発され、ＮＳＡＩＤによって悪化した腸管損傷を治療するまたは予防するためのグリセロリン酸塩の持続放出製剤が好ましい場合がある。グリセロリン酸塩の持続放出性製剤を使うことで、その治療効果を犠牲にすることなく、グリセロリン酸塩の投与回数を限定することができるだろう。しかしながら、前述したように、グリセロリン酸塩、特にＣＧＰは毒性がなく、無害で、かつ、既知の副作用がないため、グリセロリン酸塩の持続放出性製剤を処方される対象は場合により、自身の投与計画に標準的なグリセロリン酸塩製剤を追加して、治療効果を最大限引き出してもよい。本発明で使用する持続放出性製剤または遅延放出性製剤はＣＧＰを含むことが好ましい。
密着結合の保全を向上させる方法および密着結合の機能不全に関連する疾患を治療または予防する方法。
【００７３】
驚くべきことに、グリセロリン酸、例えばグリセロリン酸カルシウム（ＣＧＰ）が密着結合の保全を高め、経上皮透過性を低減することが本発明で発見された。
【００７４】
従って、本発明の基本的な側面は、それを必要とする対象における密着結合の保全を向上させる方法に関し、この方法は、有効量のグリセロリン酸、例えばグリセロリン酸カルシウム（ＣＧＰ）を含有している組成物を対象に投与することを含む。グリセロリン酸の有効量、投与の有効性、投与方法および組成物に含まれる要素の決定については、腸管損傷またはその症状を治療する方法の観点から既に記載している。
【００７５】
本発明の別の基本的な側面は、それを必要とする対象における密着結合の機能不全に関連する疾患を治療するまたは予防する方法に関する。この方法は、有効量のグリセロリン酸、例えばグリセロリン酸カルシウム（ＣＧＰ）を含んでいる組成物を対象に投与することを含む。グリセロリン酸の有効量、投与の有効性、投与方法および組成物に含まれる要素の決定については、腸管損傷またはその症状を治療する方法の観点から既に記載している。
【００７６】
本方法によって、いずれの密着結合の機能不全に関連する疾患も予防するまたは治療することが可能である。
【００７７】
本発明の一態様において密着結合の機能不全に関連する疾患とは、癌、例えば乳癌、侵襲性の乳管癌など；前立腺癌、前立腺の腺癌など；甲状腺腫瘍、濾胞性腺腫；胃食道逆流症、例えばバレット食道（異形成）；肺癌、例えば類基底扁平上皮癌；などである（Ｃ．フォスター；組織化学と細胞生物学；１３０（１）：５５〜７０（２００８年７月）を参照のこと。その開示は全体として参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【００７８】
本発明の別の態様において密着結合の機能不全に関連する疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、モルブス・クローン（Ｍｏｒｂｕｓ  Ｃｒｏｈｎ）コラーゲン性大腸炎など；セリアック、スプルー、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症；遺伝性の疾患、例えば遺伝性の聴覚喪失、遺伝性低マグネシウム血症、神経の炎症（グリンキナら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７（５）：ｅ３６４７５．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００３６４７５（２０１２）を参照のこと、その開示は全体として参照することにより本明細書に組み込まれる）、嚢胞性線維症；視力喪失、例えば糖尿病性眼疾患：糖尿病性網膜症；ウイルス感染、例えばレトロウイルス感染（水頭症、脳炎）；細菌性毒素、例えばウェルシュ菌のエンテロトキシン；肺組織の保全に関する疾患；リンパ球輸送に関する疾患（マンデラら、サイエンス２９６，３４６（２００２）を参照のこと、その開示は全体として参照することにより本明細書に組み込まれる、または他の免疫学的な疾患（ローゼンら、ネイチャー・レビュー・イムノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）５，５６０〜５７０（７月２００５）を参照のこと、その開示は全体として参照することにより本明細書に組み込まれる）などを含むがこれらには限定されない炎症性疾患である。好ましい態様において本発明は、それを必要とする対象における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を予防または治療する方法に関し、この方法は、有効量のグリセロリン酸、例えばグリセロリン酸カルシウム（ＣＧＰ）を含有している組成物を対象に投与することを含む。より好ましくは、ＩＢＤは、初期症状として下痢を伴い、主に上皮バリアの機能不全が原因で、それによって「水様性の下痢」によって体液の損失量が増大するモルブス・クローン（Ｍｏｒｂｕｓ  Ｃｒｏｈｎ）コラーゲン性大腸炎またはクローン病である。
【００７９】
理論に拘束されることは望まないが、グリセロリン酸カルシウム（ＣＧＰ）などのグリセロリン酸が上皮細胞もしくは内皮細胞でのスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）の濃度および／または活性を上げ、その結果、経上皮透過性が低減させると考えられている。理論に拘束されることは望まないが、グリセロリン酸塩は少なくとも部分的には、Ｓ１Ｐを脱リン酸化するホスファターゼなどの作用を阻害することで機能し、その結果、グリセロリン酸塩がＳ１Ｐの生成と長期間の維持を仲介し、そしてＮＳＡＩＤの負荷がかかり、運動によって虚血状態になった消化管における密着結合の保全の維持に利用できるＳ１Ｐを増やすとも考えられている。
腸溶性被覆剤を施された組成物
【００８０】
本発明はさらに、治療上有効量のグリセロリン酸塩を含有している腸溶性被覆剤を施された組成物を提供する。本発明の態様によると、本発明の腸溶性被覆剤を施された組成物は、腸管損傷、ＮＳＡＩＤによって悪化した腸管損傷、運動によって誘発された腸管損傷、および運動によって誘発され、ＮＳＡＩＤによってさらに悪化した腸管損傷の治療に使用することができる遅延放出性製剤である。従って本発明の態様はさらに、本発明の腸溶性被覆剤を施された組成物を対象に投与することを含む、対象における腸管損傷またはその症状を治療するまたは予防する方法を包含する。本発明の態様にはまた、本発明の腸溶性被覆剤を施された組成物を対象に投与することを含む、対象における密着結合の保全を向上させる方法および対象における密着結合の機能不全に関連する疾患を治療するまたは予防する方法も包含される。
【００８１】
本発明の態様によると、腸溶性被覆剤を施された組成物は、（ｉ）治療上有効量のグリセロリン酸塩を含有している核；および（ｉｉ）核を覆っている腸溶性被覆剤、を含む。好ましい態様では、グリセロリン酸塩はグリセロリン酸カルシウムである。
【００８２】
本明細書で使用する場合、「腸溶性被覆剤を施された組成物」という用語は、組成物の核の外側を取り囲み、包んでいる腸溶性被覆剤を有している組成物を指し、ここで核は、治療的にまたは薬学的に活性な化合物を含む。本明細書で使用する場合、「核」という用語は、治療的に活性な成分を含む腸溶性被覆剤を施された組成物の構成要素を指す。本発明による腸溶性被覆剤を施された組成物に用いられる核は、好ましくは、経口投与用の固体の剤形、例えば、粉末、錠剤、カプセル、カプレット、ジェルカプセル、液体ゲルまたはペレットなどの形態で製剤化される。本発明による組成物の核は腸溶性被覆剤によって取り囲まれ、包まれているため、核は組成物の内層または内部を構成している。
【００８３】
本明細書で使用する場合、「腸溶性被覆剤」という用語は、組成物の核を取り囲み、包んでいる層を指し、また、腸溶性被覆剤は組成物の最外層である。対象への投与に際し、腸溶性被覆剤が溶解するかまたは崩壊するまで、核がいかなる体液（例えば唾液、胃液）にも曝されないように腸溶性被覆剤が核を完全に取り囲み、包んでいることが好ましい。腸溶性被覆剤は、組成物の核に含まれている治療的にまたは薬学的に活性な成分が、腸溶性被覆剤が分解する、溶解するまたは崩壊するまで、放出されるのを防ぐが、一旦腸溶性被覆剤が溶解するかもしくは分解する、または溶解もしくは分解が始まれば、治療的活性成分の放出が可能となる。組成物が腸に達するまでは腸溶性被覆剤が分解、溶解または崩壊せず、核からの治療的活性成分の放出が可能とならないことが好ましく、核から対象の腸の空腸または回腸部分まで治療的活性成分の定量的な放出が可能になること、また、実質的に大腸にも達することがより好ましい。特定の態様では、治療的活性成分の放出が空腸部分で始まり、有効量の組成物が少なくとも小腸の末端（回腸）ならびに大腸に達するまで継続されるように、腸溶性被覆剤によって、組成物が十二指腸と小腸の空腸部分との接合部に達した時点で、治療的活性成分の核からの放出が可能になる。
【００８４】
グリセロリン酸塩が部位特異的に送達されるように、本発明による腸溶性被覆剤を施された組成物の腸溶性被覆剤を利用して、グリセロリン酸塩が組成物の核から放出される胃腸管内の部位を制御することができる。本明細書で使用する場合、「部位特異的な送達」という用語は、目的とする送達部位において組成物の核から治療的活性成分が放出されることを指す。本発明の態様によると、腸溶性被覆剤を施された組成物は、グリセロリン酸塩を腸に、好ましくは小腸または大腸に、より好ましくは小腸に、最も好ましくは十二指腸と小腸の空腸部分との接合部に部位特異的に送達する。従って、腸溶性被覆剤が施されていることで、組成物はグリセロリン酸塩を放出せずに対象の胃を通って移動し、組成物が腸管に入って腸溶性被覆剤が分解または溶解を始めた時点からのみ、グリセロリン酸塩が放出されるようになる。
【００８５】
好ましい態様では、本発明による腸溶性被覆剤を施された組成物の腸溶性被覆剤が崩壊または溶解すると、実質的に全てのグリセロリン酸塩が、実質的に同時に組成物の核から放出される。より好ましい態様では、実質的に全てのグリセロリン酸塩は組成物の核から、組成物が対象の小腸に達した時に放出される。
【００８６】
一態様では、本発明による腸溶性被覆剤を施された組成物は、グリセロリン酸塩を小腸に部位特異的に送達する。部位特異的な送達が小腸への送達である場合、この送達は、小腸の十二指腸、空腸または回腸部分いずれかへの送達であってよい。別の態様では、部位特異的な送達は大腸への送達である。好ましくは、本発明による腸溶性被覆剤を施された組成物は、組成物が少なくとも空腸（ここでは栄養素と同様に体内に吸収されない見込みが高い）に達するまでグリセロリン酸塩の最大放出が始まらないが、しかし、小腸の回腸部分と大腸に進んでこれらの部分が浸されるように、グリセロリン酸塩を十二指腸と空腸部分との接合部に部位特異的に送達する。
【００８７】
本発明の態様によると、腸溶性被覆剤は高分子材料から構成されている。高分子材料が強度に酸性のｐＨでも完全性を保つかまたは安定であり、しかし、弱酸性のｐＨでは分解、溶解、または崩壊するように、高分子材料がｐＨ感受性であることが好ましい。本発明で使用するのに好適なｐＨ感受性の高分子は、胃の低ｐＨ環境（つまりおよそｐＨ３）では完全性を保ち、安定であるが、腸管で一般的に見られるｐＨ（つまりｐＨ約５〜ｐＨ約７）では崩壊または溶解するものである。
【００８８】
本発明の態様によると、高分子材料は合成の材料、例えばアクリル酸もしくはマレイン酸を使用した高分子およびポリビニル誘導体または有機材料、例えばセルロースを使用した高分子であってよい。高分子材料がｐＨ感受性であることが好ましい。本発明で使用することが可能なｐＨ感受性のアクリル系高分子の例としては、これらには限定されないが、メタクリル酸、メタクリル酸メチルおよびアクリル酸エチルなどのポリマー（同種重合体または共重合体）、例えばメタクリル酸とアクリル酸エチルの共重合体、メタクリル酸／メタクリル酸メチルの共重合体が挙げられる。メタクリル酸とアクリル酸エチルの共重合体は、オイドラギット（登録商標）Ｌ−３０−Ｄ５５という商品名で市販されており、エボニック社から購入することができる。本発明で使用可能なｐＨ感受性のセルロース由来高分子の例としては、これらには限定されないが、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）、カルボキシメチルエチルセルロース（ＣＭＥＣ）、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、セルロースアセテートスクシネート（ＣＡＳ）、およびセルロースアセテートトリメリテート（ＣＡＴ）が挙げられる。本発明と共に使用することが可能な市販されている他の高分子および腸溶性被覆系としては、いずれもカラコン社（Ｃｏｌｏｒｃｏｎ，Ｌｔｄ．）から入手可能なアクリル−ＥＺＥ（Ａｃｒｙｌ−ＥＺＥ）（登録商標）、シュアテリック（Ｓｕｒｅｔｅｒｉｃ）（登録商標）、ニュートラテリック（Ｎｕｔｒａｔｅｒｉｃ）（登録商標）ＩＩ、およびオパドライ（Ｏｐａｄｒｙ）（登録商標）腸溶性被覆剤が挙げられる。
【００８９】
本発明の態様による腸溶性被覆剤は、本開示を考慮して、いずれの高分子材料またはそれらの組み合わせで構成してもよい。高分子材料は、腸溶性被覆剤の総重量に対して約５〜９０重量％、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を構成する場合がある。
【００９０】
本発明の態様による腸溶性被覆剤は、ｐＨがおよそ３の胃の酸性環境において安定であるが、例えば腸管で見られるｐＨが約５またはそれを超える酸性度の低い環境では溶解または分解される。例えば、腸溶性被覆剤は、ｐＨが約１、１．５、２、２．５、３、３．５もしくは４、４．５または５のときに安定である可能性があるが、ｐＨが約５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５または９の時に溶解または崩壊する可能性がある。
【００９１】
本発明による腸溶性被覆剤は、腸溶性被覆剤の特性を向上させるための添加剤、例えば可塑剤、滑沢剤、色素、着色剤、消泡剤、乳化剤、界面活動剤などをさらに含む場合がある。例えば、可塑剤を使用することで腸溶性被覆剤の柔軟性や弾性が向上し、脆性が低下する可能性がある。可塑剤は親水性の可塑剤であってもまたは疎水性の可塑剤であってもよい。本発明の腸溶性被覆剤に使用することが可能な可塑剤の例としては、これらには限定されないが、フタル酸誘導体、フタル酸ジブチル、プロピレングリコール、トリアセチン、シリコーンオイル、フタル酸ジエチル、クエン酸トリエチル、セバシン酸ジブチルおよびポリエチレングリコールなどが挙げられる。腸溶性被覆剤に使用することが可能な滑沢剤の例としては、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどが挙げられる。
【００９２】
好ましい態様では、腸溶性被覆剤はさらに可塑剤を含む。可塑剤は、腸溶性被覆剤の総重量に対して約５〜６０重量％、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または６０％を構成する場合がある。
【００９３】
腸管のｐＨは、小腸の上部、例えば十二指腸で見られるおよそ５のｐＨから、小腸の末端部分、例えば回腸や大腸で見られるおよそ７．０〜８．０のｐＨへと徐々に上昇する。本発明による腸溶性被覆剤を施された組成物は、組成物が胃を通過し、少なくとも小腸の上部に達するまでは腸溶性被覆剤が溶解せず、グリセロリン酸塩が放出されないように製剤化される。従って腸溶性被覆剤は、十二指腸のｐＨ範囲において溶解し始め、小腸で見られるｐＨの範囲で溶解し続ける可能性がある。また腸溶性被覆剤は、小腸の末端部分（つまり回腸）または大腸に達するまで溶解し始めないものであってもよい。
【００９４】
本発明による腸溶性被覆剤を施された組成物は、組成物が少なくとも対象の小腸または大腸に達した時に、グリセロリン酸塩を核から定量的に放出させることができるものであることが好ましい。本発明による腸溶性被覆剤を施された組成物は、組成物が少なくとも小腸の回腸部分に達した時に、グリセロリン酸塩を核から定量的に放出させることができるものであることがより好ましい。
【００９５】
グリセロリン酸塩が本発明による腸溶性被覆剤を施された組成物から放出される腸管内の部位は、腸溶性被覆剤の厚み、腸溶性被覆剤に含まれている高分子の特性、腸溶性被覆剤のｐＨ感受性、加えられる添加剤などのいくつかの指標を変化させることで調節することができる。腸溶性被覆剤が実質的に腸管を移動している間に溶解し、腸管、好ましくは空腸または回腸の部分にグリセロリン酸塩の最大放出が生じる腸溶性被覆剤であることが好ましい。
【００９６】
一態様において腸溶性被覆剤は、約５．５のｐＨで溶解し、グリセロリン酸塩を小腸の十二指腸部分に部位特異的に送達する。別の態様において腸溶性被覆剤は、約５．５〜７．０のｐＨで溶解し、グリセロリン酸塩を小腸の空腸部分または回腸部分のいずれかに部位特異的に送達する。別の態様において腸溶性被覆剤は、約７．０以上のｐＨで溶解し、グリセロリン酸塩を大腸に部位特異的に送達する。好ましくは、腸溶性被覆剤は約５．５〜７．０のｐＨで溶解する。
【００９７】
本発明の態様による腸溶性被覆剤の重量比は、核に対して約５％〜６０％の範囲、好ましくは５％〜３０％、例えば１０％、２５％、２０％、または２５％など（例えば、腸溶性被覆剤が核の総重量の５重量％）となる可能性がある。しかしながら、当業者であれば、腸溶性被覆剤の重量比および組成物自体の重量比はグリセロリン酸塩を送達する目的部位に応じて調節可能であることが分かるだろう。例えば、小腸の十二指腸および空腸部分に送達するのに適切な重量比は、核に対して約５％〜３０％の範囲となる可能性があるが、小腸の回腸部分または大腸に送達する場合には、重量比は３０％を超える可能性がある。
【００９８】
本発明の態様によると、腸溶性被覆剤の厚みおよび／または技術的な精巧さ（つまり層の数、高分子の種類など）は腸溶性被覆剤の溶解速度、従って、それに続くグリセロリン酸塩の核からの放出部位（つまり部位特異的に送達される部位）に影響を及ぼす可能性がある。本明細書で使用する場合、「薄い」および「厚い」という用語は、被覆剤の厚みとその技術的精巧さの両方を包含する。例えば、薄い腸溶性被覆剤は厚い腸溶性被覆剤よりも早く溶解または分解され、薄い腸溶性被覆剤を含んでいる組成物からのグリセロリン酸塩の放出は腸の中でも胃に近い部分、例えば十二指腸で生じ、一方、より厚い腸溶性被覆剤を含んでいる組成物からグリセロリン酸塩が放出される腸の位置は、より胃から遠い部分、例えば空腸、回腸または大腸になる可能性がある。
【００９９】
本発明による腸溶性被覆剤を施された組成物の腸溶性被覆剤の厚みは、例えば腸溶性被覆剤の層の数を調節することで制御することが可能である。一態様では、腸溶性被覆剤を施された組成物は１層の腸溶性被覆剤を含む。別の態様では、腸溶性被覆剤を施された組成物は２層以上の腸溶性被覆剤、例えば１、２、３、４、もしくは５層またはそれ以上の層数の腸溶性被覆剤を含む。例えば、小腸の末端部分、例えば回腸または大腸に部位特異的に送達するための腸溶性被覆剤を施された組成物を製剤化するために、多層の腸溶性被覆剤を用いることができる。
【０１００】
本発明の態様による腸溶性被覆剤を施された組成物は、腸溶性被覆剤と核との間にサブコーティングをさらに含む場合がある。本明細書で使用する場合、「サブコーティング」という用語は、治療的な活性成分を含んでいる核と、核を覆っている腸溶性被覆剤との間の物理的障壁として機能し、腸溶性被覆剤と核とが物理的に接触するのを予防するフィルムまたはコーティング剤を指す。サブコーティングは、腸溶性被覆剤を施す前に、核を覆う層として適用される。サブコーティングの機能としては、核の構成要素と腸溶性被覆剤の構成要素との間の有害作用が起こらないように核の構成要素を保護することが挙げられる。例えば、腸溶性層は酸性である場合があり、核と酸性の腸溶性層が直接接触すると、治療的有効成分の不安定化または分解、不純物の生成などが生じる可能性がある。サブコーティングは、腸溶性被覆剤を均一に施すための核を覆う滑らかな土台としても機能する。サブコーティングとして使用するのに好適な材料の例としては、これらには限定されないが、セルロース系高分子、例えばメチルセルロース、エチルセルロースなど、アクリル酸、例えば同種重合体またはメタクリル酸とメタクリル酸メチルとの共重合体など、およびビニル、例えばポリビニルアルコールなどが挙げられる。サブコーティングは、可塑剤、滑沢剤、色素、着色剤、消泡剤、乳化剤、界面活動剤などの添加剤をさらに含む場合もある。
【０１０１】
本発明による腸溶性被覆剤を施された組成物は経口投与用に製剤化される。本発明の態様による腸溶性被覆剤を施された組成物の核は、固体、例えば錠剤、カプセル、ペレット、液体ゲル、顆粒、粉末などであることが好ましい。好ましくは、核は錠剤の形態である。腸溶性被覆剤を施された組成物を準備するには、標準的な医薬品配合技術に従ってグリセロリン酸塩を薬学上許容可能な担体と混合する。
【０１０２】
本開示を考慮して、核には任意の薬学上許容可能な担体を含めることができる。例えば薬学上許容可能な担体は、１種類以上の賦形剤、例えば結合剤、沈殿防止剤、乳化剤、湿潤剤、滑沢剤、香料、甘味料、防腐剤、色素、および被覆剤を含む場合がある。具体的には、核を固体（例えば、錠剤、カプセルなど）として製剤化するのに好適な担体および添加剤としては、デンプン、糖類、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などが挙げられる。
【０１０３】
本発明で使用する腸溶性被覆剤を施された組成物の核は治療上有効量のグリセロリン酸塩を含む場合があり、治療上有効量のグリセロリン酸塩とは核の総重量の約１０〜１００％のグリセロリン酸塩、好ましくは５０〜１００％、最も好ましくは７５〜９９．９％のグリセロリン酸塩である。グリセロリン酸塩の量は、グリセロリン酸塩の特定の陽イオンに依存する。例えば、グリセロリン酸カルシウムを使用する場合、核が核の総重量の約９９．６２５重量％のグリセロリン酸カルシウムと０．３７５重量％の担体、好ましくは０．３７５重量％のステアリン酸マグネシウムを含み、他の担体は含まないことが好ましい。
【０１０４】
本発明の態様によると、腸溶性被覆剤を施された組成物の核は、ＮＳＡＩＤをさらに含む場合がある。核は、グリセロリン酸塩とＮＳＡＩＤの混合物に含まれるＮＳＡＩＤの重量に対して約１０％〜約１０００％重量のＣＧＰを、好ましくは核に含まれるＮＳＡＩＤの重量の３０％〜７０％、より好ましくは４０％〜６０％、最も好ましくは５０％のグリセロリン酸塩を含む場合がある。好ましい態様においてＮＳＡＩＤはイブプロフェンである。
【０１０５】
本発明の態様によると、本発明の腸溶性被覆剤を施された組成物は、核または腸溶性被覆剤の少なくとも１つに、放出制御剤をさらに含んでいる場合がある。本明細書で使用する場合、「放出制御剤」という用語は、組成物が投与された対象において、組成物の治療的活性成分が利用可能になる速度を制御する化合物または添加剤、あるいは治療的活性成分が利用可能になる部位を管理するための特定の遅延が生じるように作成された化合物または添加剤を指す。放出制御剤の例としては、持続放出剤（持続放出つまり徐放のため）、即時放出剤（すぐに放出または分散させるため）、および遅延放出剤（放出を遅らせるため）が挙げられる。
【０１０６】
本明細書で使用する場合、「持続放出」および「徐放」という用語は、医薬組成物からの治療的有効成分の放出が長期間続くことを指す。本明細書で使用する場合、「即時放出」という用語は、投与した直後または投与してまもなく、対象の投与部位で、治療的有効成分が医薬組成物から放出または分散されることを指す。また即時放出は、本発明による腸溶性被覆剤を施された組成物の腸溶性被覆剤の溶解が始まった直後に分散することも指す。本明細書で使用する場合、「遅延放出」という用語は、放出が部位特異的にまたは望ましい位置で起こるように、対象への投与に続いて組成物が対象の体内の望ましい位置に達した後にのみ、または、対象に投与した後一定の期間が経過してから、治療的有効成分が医薬組成物から放出されることを指す。
【０１０７】
本発明による組成物が遅延放出剤である放出制御剤を含むことが好ましい。
【０１０８】
本明細書で使用する場合、「遅延放出剤」という用語は、部位特異的または望ましい位置で放出が起こるように、治療的活性成分の組成物からの放出を制御するための化合物または添加剤を指す。遅延放出剤は、所望の位置に組成物が達して、そのため、治療的活性成分が望ましい位置にもしくは部位特異的に送達されるように、望ましい位置に達した時点で実質的に全ての治療的活性成分を同時に放出するものであっても、または組成物を対象に投与した後一定の期間が経過してから、治療的有効成分が放出されるものであってもよい。本発明の態様によると、遅延放出剤は核の一部として、または腸溶性被覆剤の一部として組成物に含めることができる。好ましくは、遅延放出剤は腸溶性被覆剤の一部として存在する。
【０１０９】
本発明の態様によると、腸溶性被覆剤を施され、さらに遅延放出剤を含んでいる組成物では、組成物が少なくとも小腸または大腸に進入した時点でのみ、好ましくは十二指腸と小腸の空腸部分との接合部に達した時点でのみ、グリセロリン酸塩が核から放出される。好ましくは、グリセロリン酸塩の組成物の核からの放出は、管理されているｐＨの範囲、少なくとも５．０を上回るｐＨ、例えば５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、または８．０以上で起こる可能性があり、好ましくは、少なくとも７．０以上のｐＨで起こる。
【０１１０】
本発明による組成物中に含まれる遅延放出剤の量は、グリセロリン酸塩の所望の放出プロファイルに依存する。例えば、遅延放出剤は、組成物の総重量の約１０〜９０重量％の範囲の重量パーセンテージ、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％で含まれる場合がある。遅延放出剤が、特にｐＨ耐性（つまりより高いｐＨ、少なくとも７．０のｐＨなどになるまで溶解しない）放出プロファイルを有する場合には、遅延放出剤は組成物の総重量に対してより少ない重量パーセンテージで、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％で含まれる場合もある。
【０１１１】
本発明で使用するのに好適な遅延放出剤の例としては、これらには限定されないが、ゲル、ろう、脂質、乳化剤、脂質と乳化剤の組み合わせ、高分子、デンプン、セルロース系高分子などおよびその組み合わせが挙げられる。遅延放出をもたらすために使用することが可能な蝋および蝋様の材料の例としては、カルナバ蝋、鯨蝋、カンデリラ蝋、ココアバター、セトステアリルアルコール、蜜蝋、半硬化植物油、セレシン、パラフィン、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、セチルアルコール、およびステアリン酸が挙げられる。
【０１１２】
好ましくは、遅延放出剤は放出速度制御ポリマーを含む。本明細書で使用する場合、「放出速度制御ポリマー」という用語は、組成物が望ましい位置または目的の送達部位に達するまで治療的活性成分が放出されないように、治療的活性成分が組成物から放出される速度を制御するポリマーを指す。放出速度制御ポリマーの例としては、セルロース系ポリマー、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、およびそれらの混合物が挙げられる。本発明の態様によると、所望の放出プロファイルを達成するために、遅延放出剤として用いられるセルロース系ポリマーの分子量を変化させてグリセロリン酸の核からの制御放出速度を最適化することができる。
【０１１３】
本発明での使用に好適な数種類の放出速度制御ポリマーが市販されている。これらには、カラコン社から購入可能なメトセル（ＭＥＴＨＯＣＥＬ）（登録商標）セルロースエーテルおよびエトセル（ＥＴＨＯＣＥＬ）（登録商標）エチルセルロースポリマーが含まれる。
【０１１４】
本発明の好ましい態様によると放出速度制御ポリマーはｐＨ感受性のポリマーで、本発明による組成物中に、腸溶性被覆剤の一部として含まれる。この態様では、腸溶性被覆剤自体が組成物に遅延放出特性をもたらしており、ｐＨ感受性ポリマーが溶解、分解または崩壊するｐＨをもつ腸管の部位に組成物が達するまで腸溶性被覆剤は溶解せず、グリセロリン酸塩は核から放出されない。
【０１１５】
腸溶性被覆剤を施された組成物を成形するための方法、特に、組成物が経口投与用の固形の剤形である腸溶性被覆剤を施された組成物を成形するための方法は当該分野で知られている。本発明の方法において使用する腸溶性被覆剤を施された組成物は、腸溶性被覆剤の溶液または懸濁液のいずれかに治療上有効量のグリセロリン酸塩を含有している核を適用することで生産することができ、ここで核は好ましくは固形の経口投与用の剤形、例えば、錠剤、カプセル、ペレット、液体ゲル、顆粒、粉末などであり、より好ましくは錠剤である。
【０１１６】
本発明の態様によると、最初に、核に施すための被覆用調製物を生産する。本明細書で使用する場合、「被覆用調製物」という用語は、懸濁液／分散液または溶液の形態をとっている本発明の腸溶性被覆剤を指す。従って被覆用調製物は、溶媒（有機溶媒または水性溶媒）に懸濁したまたは溶解したいずれかの状態の腸溶性被覆剤の全構成要素を含む。被覆用調製物は水性の懸濁液もしくは分散液であってもよく、または有機溶液であってもよい。
【０１１７】
水性の懸濁液または分散液の形態をとっている被覆用調製物は、高分子材料と任意の添加剤、例えば滑沢剤、可塑剤、遅延放出剤などを水性の溶媒、好ましくは水に希釈または懸濁することで準備することができる。溶液の形態をとっている被覆用調製物は、高分子材料と任意の添加剤を有機溶媒に分散または溶解することで準備することができる。使用することが可能な好適な溶媒の例としては、アセトン、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、酢酸エチル、塩化メチレンまたはそれらの混合物などが挙げられる。水性の懸濁液／分散液または溶液であろうとなかろうと、被覆用調製物に可塑剤を加えることが好ましい。
【０１１８】
本開示を考慮して、懸濁液および溶液を生成するための当該分野で知られているいずれの方法をも利用することができ、そのような方法としては、これらには限定されないが、混合、調製、撹拌などが含まれる。
【０１１９】
次いで被覆用調製物を核に適用し、本発明による腸溶性被覆剤を施された組成物を得る。被覆用調製物を核に適用し、本発明による腸溶性被覆剤を施された組成物を生産するための当該分野で知られているいかなる方法をも利用することができる。被覆用調製物を適用するための典型的な被覆法としては、吹き付けコーティング法、例えば流動層造粒法、噴霧乾燥、およびサイドベント型パンコーティング法が挙げられる。吹き付けコーティング法の実施に使用することが可能な装置の例としては、流動層造粒装置、遠心転動造粒コーティング装置、パンコーティング装置などが挙げられる。基本的には、このような方法は前述した被覆用調製物をスプレーの吹き出し口を使って核に吹き付け、その後、被覆用調製物に最初から含まれていた溶媒を蒸発させるために乾燥させることを伴う。乾燥させる工程の温度は、使用している特定の腸溶性被覆剤の製造業者が推奨する温度範囲に入っているとよい。
【０１２０】
本発明の態様によると、被覆用調製物を核に少なくとも１回適用するが、核に２回以上適用して、１層以上の腸溶性被覆剤を有する腸溶性被覆剤を施された組成物を得ることもできる。一定の態様では、２層以上の腸溶性被覆剤を適用することが有利な場合があり、この場合、それぞれの層は、腸溶性被覆剤を施された組成物由来のグリセロリン酸塩の溶解特性または放出プロファイルを最適するために、異なる高分子材料または添加剤成分を含む。
【０１２１】
また、腸溶性被覆剤を施す前に、サブコーティングを核に適用してもよい。サブコーティングを経口投与用の固形の医薬組成物に適用するための技術は当該分野で知られている。そのような技術には、サブコーティングを粒子に吹き付けること、例えば流動層造粒コーティング装置などを使って、回転ドラム（パン）の中に入れた錠剤やカプセルなどに吹き付けることが含まれる。
【０１２２】
グリセロリン酸塩の腸溶性被覆剤を施された組成物の核からの放出プロファイルは、腸溶性被覆剤の厚み、被覆剤に含まれている添加剤、グリセロリン酸塩の溶解度および高分子材料のｐＨ感受性などの様々な指標による影響を受ける。当業者であれば、本発明の方法において使用するための、望ましい溶解プロファイルまたは放出プロファイルを有する腸溶性被覆剤を施された組成物を得るために、これらの指標を容易に最適化することができる。
腸溶性被覆剤を施された組成物を使った治療方法
【０１２３】
治療上有効量のグリセロリン酸塩、好ましくはグリセロリン酸カルシウムを含んでいる腸溶性被覆剤を施された組成物は、本開示を考慮して腸管損傷またはその症状を治療する、低減する、緩和するまたは予防するための任意の方法において使用することができる。
【０１２４】
本発明の態様によると、治療または予防される腸管損傷は、ＮＳＡＩＤ（好ましくはイブプロフェン）によって悪化したもの、運動によって誘発されたもの、または運動によって誘発され、さらにＮＳＡＩＤの摂取によって悪化したものであってよい。好ましくは、治療または予防される腸管損傷は、ＮＳＡＩＤによって悪化した腸管損傷である。例えば、本発明による腸溶性被覆剤を施された組成物を、対象におけるＮＳＡＩＤによって悪化した腸管損傷またはその症状を治療するまたは予防する方法に、対象における運動によって誘発された腸管損傷またはその症状治療するまたは予防する方法に、あるいは、対象における運動によって誘発され、ＮＳＡＩＤによってさらに悪化した腸管損傷またはその症状治療するまたは予防する方法に使用することができる。
【０１２５】
腸溶性被覆剤を施された組成物を対象に経口投与することが好ましい。グリセロリン酸塩がグリセロリン酸カルシウムであることが好ましい。
【０１２６】
特に好ましい態様において本発明は、運動によって誘発された、ＮＳＡＩＤによって悪化したものなどを含む、ＮＳＡＩＤを摂取している対象における腸管損傷またはその症状を治療するまたは予防する方法を提供し、この方法は、腸溶性被覆剤を施された、本発明による組成物を対象に経口投与することを含み、ここで、組成物の核に含まれているグリセロリン酸塩はグリセロリン酸カルシウムである。好ましい態様においてＮＳＡＩＤはイブプロフェンである。
【０１２７】
別の特に好ましい態様において方法は、ＮＳＡＩＤおよびグリセロリン酸カルシウムが同じ組成物の一部として同時に投与されるように、有効量のグリセロリン酸塩、好ましくはグリセロリン酸カルシウムを含んでいる核を有する腸溶性被覆剤を施された組成物および有効量のＮＳＡＩＤ、好ましくはイブプロフェンを対象に投与することを含む。
【０１２８】
別の特に好ましい態様において腸溶性被覆剤を施された組成物は、遅延放出剤をさらに含む。
【０１２９】
治療上有効量のグリセロリン酸塩、好ましくはグリセロリン酸カルシウムを含有している腸溶性被覆剤を施された組成物は、本開示を考慮して、それを必要とする対象における密着結合の保全を向上させるためのいかなる方法にも、およびそれを必要とする対象における前述したような密着結合の機能不全に関連する疾患を治療するまたは予防するためのいかなる方法にも、使用することができる。
【０１３０】
グリセロリン酸塩の機能する部分はグリセロリン酸成分であると考えられている。カルシウムがグリセロリン酸塩についての好ましい陽イオンであるとはいえ、グリセロリン酸成分と共にカルシウムが存在することは、グリセロリン酸のこの領域における活性にとって必須ではなく、本発明で使用することが可能な他の好適で毒性のない陽イオンとしては、これらには限定されないが、グリセロリン酸のナトリウム塩、カリウム塩およびマグネシウム塩が挙げられる。しかしながら、ＣＧＰには、ゆるく結合しているカルシウムイオンが含まれていて、これが湿気を帯びると直ちにグリセロリン酸部分から有利し、その結果、水性環境で両方のイオンが瞬時に利用可能となること、また、カルシウムイオンが既存のカルシウムに対して最小限の量で存在しても、それでもなお、ＳＩＰの生成と維持に対するグリセロリン酸の効果を補強することに関与するため、ＣＧＰが好ましいグリセロリン酸塩である。さらに、カルシウムは、正常なＥ−カドヘリンが機能する程度までのいかなる量でも有益である；「カドヘリン」という名前は、「カルシウム依存性接着（ｃａｌｃｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）」に由来する。しかしながら、培地には既に１ｍＭのカルシウムが含まれており、また、１μＭのＧＣＰでも効果が認められることから、ＣＧＰの効果はカルシウムを添加した結果ではないことが強調される。
【０１３１】
本出願では開示していない別の目的に対するＣＧＰおよび他のグリセロリン酸塩の使用に関しては、種々の他の特許に記載されており、いずれも継続中および特許が付与されている。例えば、米国特許第５，８６９，１１９号には、酸性の食品と飲料のｐＨを上げて、胸焼けと胃腸疲労を軽減するためのＣＧＰの使用が記載されており、米国特許第７，４０２，３２３号には、細胞修復に有益なＣＧＰの効果が記載されている。理論により束縛されることは望まないが、種々の用途におけるＣＧＰの有益な効果は、ＣＧＰ分子中に存在するカルシウムイオンとグリセロリン酸部分との相乗効果によって達成されると考えられている。運動によって誘発された腸管損傷および運動によって誘発されＮＳＡＩＤの摂取によって悪化した腸管損傷の本発明による予防および／または治療においてＣＧＰは、他の有効性の中でも、腸細胞同士の密着結合の促進に関与し得る。そのため、ＣＧＰは、密着結合の保全の向上、および密着結合の機能不全に関連する疾患の予防または治療に有効である。
【０１３２】
本発明は、以下に記載する非限定的な実施例を参照することでより深く理解できる。しかしこれらの実施例は、さらにその後に記載している特許請求項でより詳細に記述する本発明を例示しているだけであることを、当業者は容易に理解できる。
【実施例】
【０１３３】
実験は、結腸直腸癌に由来の異種ヒト上皮結腸直腸癌細胞の細胞株であり、トランズウェル透過性インサート上で生育させたＣａｃｏ−２細胞を使用して行った。その由来にも関わらずこれらの細胞は長期間培養すると、培養中で小腸の細胞の特徴を示す（Ｃ．  Ｊｕｍａｒｉｅら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １４９：  ２４−３３，  （１９９１））。これらは小腸における経上皮輸送のモデルとして広く使用されており、また、セリアック病のモデルであるとも見なされている（Ｇ．  Ｉａｃｏｍｉｎｏら、Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  ６；６１（５）：１０８８−９６２０１３  （２０１３）；  Ｉ．  Ｃａｐｕｔｏら、  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ７（９）：ｅ４５２０９  （２０１２）；  Ｔ．  Ｒａｕｈａｖｉｒｔａら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．；  ３３（１）：１３４−４２  （２０１３））。
【０１３４】
（１）経上皮電気抵抗の測定：輸送を行っている上皮の密着結合の緊密性は、膜の電気抵抗、つまり経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定することで評価できる。ＴＥＥＲでは、細胞の中を通る（経細胞）および細胞の間を通る（傍細胞）イオンの移動を測定する。非常に密着した単層では、ほとんど全ての輸送は経細胞的であり、そのため電気抵抗が高い。細胞を透過性バリア（例えばトランズウェルシステム）上で生育させ、膜の電気抵抗をこの目的にために特別に設計された抵抗計（例えばＥＶＯＭ２上皮電圧抵抗計）で測定する。培養後３〜４週目の時点で、ＴＥＥＲは７００〜８００Ω／ｃｍ2の範囲をとり得る。
【０１３５】
（２）マンニトール流：ＴＥＥＲの結果を、細胞単層を横断するマンニトール（ポリヒドロキシアルコール）流を測定して確認する。マンニトール流は傍細胞経路のみによるため、マンニトールの動きは密着結合の緊密性と反比例する。頂端側から基底側への流動と基底側から頂端側への流動の、両方向のマンニトール流を測定する。流動速度を使用して単層についての透過係数を算出する。マンニトールの等価係数はＴＥＥＲと逆の相関関係をとり得る。
【０１３６】
（３）Ｅ−カドヘリンの発現：Ｅ−カドヘリンは密着結合の根本をなすタンパク質である。破砕したＣａｃｏ−２細胞におけるＥ−カドヘリンのレベルを市販されている抗体を使ったウェスタンブロットで測定する。Ｅ−カドヘリンがタンパク質として発現し、しかし細胞膜から離れてしまう可能性もあるが、表面Ｅ−カドヘリンもフローサイトメトリーかまたは蛍光顕微鏡のいずれかを使用して測定する。Ｅ−カドヘリン全体に対する表面Ｅ−カドヘリンとの比を算出する。Ｃａｃｏ−２細胞におけるＥ−カドヘリンの発現レベルをＣＧＰが含まれるおよび含まれない条件で測定する。Ｃａｃｏ−２細胞における密着結合の他のタンパク質のＣＧＰが含まれるまたは含まれない条件での発現レベルも、本開示を考慮し、当該分野で知られている方法で測定することができる。
【０１３７】
（４）スフィンゴシン−１−リン酸：グリセロリン酸カルシウムはホスファターゼ阻害剤としての活性を有する。ＣＧＰは脱リン酸化を阻害することでＳ１Ｐの濃度を上昇させると考えられている。市販されているＥＬＩＳＡのキット（例えば、Ｅｃｈｅｌｏｎ社のカタログ番号Ｋ−１９００）を使用して、Ｃａｃｏ−２細胞の培地中のＳ１Ｐ濃度を測定する。Ｃａｃｏ−２細胞の培地中のＳ１Ｐ濃度を、ＣＧＰが含まれるおよび含まれない条件で測定する。
実験条件
【０１３８】
刺激していない細胞を使い、様々な濃度のＣＧＰが含まれるおよび含まれない条件で、これらそれぞれの指標に関する基準を得た。ＴＥＥＲの経時変化ならびにＣＧＰの適切な濃度を実験から決定した。Ｃａｃｏ−２細胞におけるＴＥＥＲの変化は単層がコンフルエンスに達した後１８〜２４日間続き、この間のＣＧＰ濃度は１μＭ〜１ｍＭの範囲だと考えられる。マンニトール流およびＴＥＥＲのデータを使用して、経細胞性のおよび傍細胞性の透過性の差を出す。基準の点では、傍細胞性の透過性は経細胞性の透過性に対して非常に低く、これは密着結合の「緊密性」を反映している。
【０１３９】
経上皮透過性に対する低酸素の効果を、各指標に対してＣＧＰが含まれるおよび含まれない条件で測定した。正常酸素圧条件で細胞をコンフルエンスに達するまで、トランズウェルインサート上で生育させ、その後、低酸素チャンバー（９５％  Ｎ2／５％  ＣＯ2）に移し、培地を、９５％  Ｎ2／５％  ＣＯ2を分散させ、グルコースを含まないものと交換した。虚血を模倣するこのような条件では、残留酸素の分圧は２５ｍｍＨｇ（６％）未満となる。対照には培地だけを含め、その他のウェルには様々な濃度のグリセロリン酸カルシウムを加えた。ＴＥＥＲとマンニトール流を低酸素チャンバー内で測定した。低酸素チャンバー内で準備した試料を使い、室内の大気中で、Ｅ−カドヘリンの発現またはＳ１Ｐの量を決定した。低酸素条件はＴＥＥＲとＳ１Ｐを低下させ、頂端側から基底側へのマンニトール流と基底側から頂端側へのマンニトール流の両方を、Ｅ−カドヘリンの発現を変化させることなく、上昇させる可能性がある。これらの効果はＣＧＰによって軽減され得る。
【０１４０】
各指標に対する外因性サイトカインの効果を、ＣＧＰが含まれるおよび含まれない条件で測定した。低酸素症およびセリアック病はいずれも、免疫系細胞からのサイトカインの放出を特徴とする。これらの炎症メディエーターは単層透過性を亢進させる（Ｍ．バヤルドら、臨床および実験免疫学（Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．）；１６８（１）：９５〜１０４（２０１２））。細胞をトランズウェルインサート上でコンフルエンスに達するまで生育させ、その後、サイトカインであるＴＮＦα（腫瘍壊死因子アルファ）、ＩＬβ（インターロイキンベータ）、およびＩＦγ（インターフェロンガンマ）の混合物（「サイトミックス（ｃｙｔｏｍｉｘ）」）を、様々な濃度のＣＧＰが含まれるまたは含まれない条件で加えた。適切な時点で、頂端側から基底側へのマンニトール流を測定した。ＴＥＥＲ、Ｅ−カドヘリンの発現および培地中のＳ１Ｐ濃度を個別の実験で測定した。加えて、ｉＮＯＳの発現を測定したサイトカインの処理によって炎症反応が起きたことを確認した。外因性サイトカインによってＴＥＥＲが低下し、マンニトール流が上昇し得る。
【０１４１】
各指標に対するα−グリアジンペプチドの効果を測定する。α−グリアジンは、感受性のある患者においてセリアック病の症状を開始している有害タンパク質である。胃および膵臓のプロテアーゼはα−グリアジンを、腸疾患の直接の原因となり得るペプチドに切断する。文献からは、α−グリアジンの３１〜５５番目のアミノ酸を含むペプチドが候補だろうと示唆されている（Ｇ．イアコミノら、農業および食品化学雑誌（Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．）６；６１（５）：１０８８〜９６２０１３（２０１３））。候補として最も可能性の高いもの（他の研究者らと一致している）を選択し、表１に示すように、これらの実験条件において各指標を測定した。
【表１】
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【０１４２】
ペプチドは透過性を高める可能性があり、かつ、サイトカインと相乗的に作用する可能性がある。ＣＧＰは、透過性を正常な状態に戻す可能性がある。
【０１４３】
マンニトール流アッセイを以下のように実施した。実験の開始時に（０時）、細胞を入れていた培地を、グルコースとウシ胎仔血清の入っていない培地に交換し、環境を、酸素９５％／ＣＯ2  ５％から酸素１％、ＣＯ2  ５％および窒素９４％に変更した。これらの条件は虚血（食料と酸素のない）の条件を模倣するものである。
実験の結果と考察
【０１４４】
基準：マンニトール流。トランズウェル透過性インサート上で生育させたＣａｃｏ−２を使って測定したマンニトール流の基準に対するＣＧＰの効果を図１に示す。バリアを横断するマンニトール流に対し、ＣＧＰの有意な効果は認められなかった。しかしながら、いつの時点でも、マンニトールの透過性は未処理細胞において最大であったことは注目される。
【０１４５】
基準：ＴＥＥＲ。ＴＥＥＲの基準に対するＣＧＰの効果を図２に示す。クエン酸が僅かではあるが統計的に有意にＴＥＥＲを低下させるようであり、この効果は、特に２時間目の時点で顕著である。この低下はＣＧＰによって阻害されるが、ＣＧＰの効果は４時間で失われる。
【０１４６】
基準：Ｓ１Ｐ。培地中のスフィンゴシン１−リン酸濃度に対するＣＧＰの効果を図３に示す。様々な濃度のＣＧＰが含まれる条件で、細胞を２４時間インキュベートした。培地を除去し、酵素標識免疫測定（ＥＬＩＳＡ）でＣＧＰについて調べた。基準となる条件では、ＣＧＰはスフィンゴシン１−リン酸の濃度に対し、いかなる影響をも及ぼさないようである。
【０１４７】
基準：Ｅ−カドヘリン。ＣＧＰはＥ−カドヘリンの発現量を上昇させ得ることが観察されたが、発現量を変化させない可能性が高い。
【０１４８】
まとめるとこれらのデータは、基準の条件では、ＣＧＰが経上皮透過性に僅かな影響しか及ぼさないことを示している。
【０１４９】
マンニトール流アッセイ。細胞が、必須でない機能、例えば密着結合の維持を手放すことで、虚血の条件に関与していることが観察された。ＣＧＰを加えることで、細胞が密着結合の保全をより長いこと保持できると考えられる。
【０１５０】
具体的には、表２および図４で、ＣＧＰの投与後２時間目と４時間目の時点でのマンニトール透過性の亢進（％）を示している。マンニトールの移動は、密着結合の緊密性と逆の相関関係にある。また、密着結合の緊密性（またはマンニトール流が低下する）程度が、培地中のＣＧＰ濃度と比例していること分かる。細胞がグリセロールリン酸だけを使用してグルコースを置き換えている可能性もあるが、わずか０．０００００１モル濃度のＣＧＰで効果が持続することから、この可能性は非常に低い。通常、培地中のグルコース濃度はおよそ１０ｍＭであり、これはＣＧＰの最高濃度の１０倍、かつ、ＣＧＰの最低濃度の１０，０００倍である。従って、表２および図４の結果は、ＣＧＰを細胞に投与するとより長い期間、密着結合が高く保全されることを示している。
【表２】
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【０１５１】
低酸素症／虚血とは、酸素と栄養素の供給が低下し、細胞の要求が満たされない状態である。これまでに、激しい運動、例えば長距離の自転車走行が、イブプロフェンなどの非ステロイド性抗炎症薬によって悪化する、経上皮透過性の高まった状態を誘発することが観察されている。経上皮透過性の高まりが腸の低酸素症（これ自体は、激しい運動を行っている間に血流が消化管から流用されることによる）の結果であり、透過性はＣＧＰによって緩和され得ると推定した。Ｃａｃｏ−２細胞を低酸素チャンバー内に置き、頂端側から基底側へのマンニトール流とＴＥＥＲの両方を測定することで、この仮説を試験した。
【０１５２】
マンニトール流。図５は、低酸素状態のマンニトール流に及ぼすＣＧＰの効果を示している。これらの試験では、［14Ｃ］マンニトールをトランズウェルの上側チャンバーに加え、下側チャンバーから試料を回収した。ＣＧＰは、点酸素によって誘導されたマンニトール流を、濃度依存的に有意に低減させた。この効果は時間依存的で、４時間で低下し、５時間目には消失した。
【０１５３】
ＴＥＥＲ。図６は、低酸素状態のＴＥＥＲに及ぼすＣＧＰの効果を示している。これらの試験用に細胞をトランズウェルユニット上でコンフルエンスに達するまで、ＴＥＥＲで測定した場合に６００ｍΩ／ｃｍ2を超えるまで、生育させた。基準のＴＥＥＲにいくらか変動があるため、データは全て、ＴＥＥＲの基準に対する％で表している。低酸素条件にしてから１時間後、対照の細胞ではＴＥＥＲが有意に低下した。実験の間、対照のＴＥＥＲは下がり続けた。しかしながら、ＣＧＰは濃度依存的にＴＥＥＲを維持した。マンニトールの場合と同様に、ＣＧＰの効果は時間経過と共に低下し、５時間目には確認できる効果はもはや認められなかった。
【０１５４】
Ｓ１ＰおよびＥ−カドヘリン。（理論上の実施例）ＣＧＰの効果にはＳ１Ｐが介在すると仮定する。細胞を、ＣＧＰが含まれるまたは含まれない条件で低酸素チャンバーに置き、この仮説について試験する。２時間目と４時間目に試料から培地を除去し、Ｓ１Ｐに関するアッセイおよびＥ−カドヘリン（密着結合の主要なタンパク質）に関するアッセイを行う。ＣＧＰを処理した細胞ではＳ１Ｐが高いが、Ｅ−カドヘリンは変化しないことが予想される。これらの結果は、経上皮保全の維持には、Ｅ−カドヘリンよりもＳ１Ｐが介在していることを示す。
サイトカインで刺激した後の経上皮透過性
【０１５５】
サイトカインは細胞間シグナル伝達に重要な小さいタンパク質の分類である。サイトカインには多くの種類と機能がある。３種類のサイトカイン、ＴＮＦα（腫瘍壊死因子アルファ）、ＩＬβ（インターロイキンベータ）、およびＩＦγ（インターフェロンガンマ）は、炎症を起こしている間の細胞間シグナル伝達に関与している。従って、ＴＮＦ−α、ＩＦ−γおよびＩＬ−βの組み合わせで処理した細胞は、炎症反応の初期状態を模倣する。炎症は２つの理由から本試験に関係する。第一に、免疫応答に介在している好中球および他の細胞は虚血性組織に補充される。第二に、セリアック病における腸損傷は炎症に依存している。サイトカインで刺激するとＣａｃｏ−２細胞での経上皮透過性が亢進し、ＣＧＰを同時に処理するとこの効果が軽減されるだろうと予想した。
【０１５６】
マンニトール流。図７に示すように、サイトミックス単独では、経上皮マンニトール透過性が時間依存的に亢進し、ＣＧＰはこの透過性の亢進を濃度依存的に遅らせた。興味深いことに、これらの実験では、対照のマンニトール透過性がＣＧＰ／サイトミックスを処理した細胞のものより有意に高かった。これは、ＣＧＰ単独ではマンニトール流に及ぼす影響が、あったとしても非常に小さいと考えられる基準の実験とは対照的である。
【０１５７】
ＴＥＥＲ。サイトミックス／ＴＥＥＲ実験の結果は、非常に異なっていて、かつ、予想外のものであった。図８に示すように、サイトミックスを暴露しても、８時間暴露するまではＴＥＥＲの低下は起こらないことが明らかである。１０時間目の時点で、１μＭのＣＧＰを処理した群を除き、全てのＣＧＰ処理群でＴＥＥＲは、サイトミックス単独の群よりも有意に高く、かつ、対照との差はなかった。ＣＧＰの効果は２４時間目までに全て消失した。これらの結果はマンニトール流とは正反対で、マンニトール流とＴＥＥＲの維持では分子機序が異なる可能性を示唆している。この結果は、８時間目と１０時間目の間の時点でさらに実験を行うことが有効であることを示している。
【０１５８】
Ｓ１ＰおよびＥ−カドヘリン。（理論上の実施例）ＣＧＰの効果にはＳ１Ｐが介在すると仮定する。細胞を、ＣＧＰが含まれるまたは含まれない条件でサイトミックスで処理し、この仮説について試験する。２時間目と４時間目に試料から培地を除去し、Ｓ１Ｐに関するアッセイおよびＥ−カドヘリン（密着結合の主要なタンパク質）に関するアッセイを行う。
【０１５９】
α−グリアジンペプチドの効果（理論上の実施例）
【０１６０】
α−グリアジンペプチド断片３１〜５５は、感受性をもつ患者においてセリアック病の症状を開始している有害ペプチドである。マンニトール流およびＴＥＥＲを以下のように設定した実験で測定する。
ペプチドのみ
ペプチドと１ｍＭのＣＧＰ
ペプチドとサイトミックス
ペプチドとサイトミックスと１ｍＭのＣＧＰ
【０１６１】
ＴＥＥＲ実験の最後に、培地のＳ１ＰとＥ−カドヘリンに関するアッセイを行い、細胞自体はＥ−カドヘリン用に処理する。
【０１６２】
当業者は、これまで記載してきた態様に、その上位の発明的概念から逸脱することなく変更を施すことが可能であることを理解する。従って、本発明は開示した特定の態様には限定されず、添付の請求項によって規定される本発明の精神および範囲に入る修正をも含むことを意図していると理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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