(57)【要約】  腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）およびインターロイキン−１７（ＩＬ−１７）の両方に特異的に結合する二重特異性抗体が提供される。本発明の二重特異性抗体は、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、および強直性脊椎炎（ＡＳ）を含む、種々の自己免疫疾患を治療するのに有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む二重特異性抗体であって、前記第１のポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を有し、前記第２のポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を有する、二重特異性抗体。
【請求項２】
２つの第１のポリペプチドおよび２つの第２のポリペプチドを含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子。
【請求項５】
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子。
【請求項６】
請求項３に記載のＤＮＡ分子および請求項４に記載のＤＮＡ分子を含む、哺乳動物細胞であって、前記細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドおよび配列番号２のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドを含む二重特異性抗体を発現できる、哺乳動物細胞。
【請求項７】
前記二重特異性抗体が発現するような条件下で請求項６に記載の哺乳動物細胞を培養する工程、および発現した二重特異性抗体を回収する工程を含む、二重特異性抗体を産生する方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法によって産生された二重特異性抗体。
【請求項９】
治療有効量の請求項２または８に記載の二重特異性抗体を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、関節リウマチ、乾癬性関節炎、または強直性脊椎炎を治療する方法。
【請求項１０】
療法に使用するための請求項２または８に記載の二重特異性抗体。
【請求項１１】
関節リウマチ、乾癬性関節炎、または強直性脊椎炎の治療に使用するための請求項２または８に記載の二重特異性抗体。
【請求項１２】
請求項２または８に記載の二重特異性抗体と、１種以上の医薬的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬の分野、特に腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）およびインターロイキン−１７（ＩＬ−１７Ａ）に対する二重特異性抗体の新規分野である。本発明の二重特異性抗体は、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、および強直性脊椎炎（ＡＳ）の治療に有用であると考えられる。
【背景技術】
【０００２】
ＲＡは、全身性、慢性、炎症性疾患である。炎症は主に、ＴＮＦαおよびＩＬ−１７を含む、複数のサイトカインによって引き起こされる。現在、ＦＤＡにより承認されている生物学的製剤（例えば、ＴＮＦαに結合し、中和するＨＵＭＩＲＡ（登録商標））は、患者の小集団においてＲＡの兆候および症状を減少させ、ＲＡの進行を遅延させる効果を実証している。ＩＬ−１７抗体はまた、関節リウマチなどの種々の自己免疫疾患についての臨床試験（セクキヌマブ、イクセキズマブ、およびブロダルマブ）において研究されている。しかしながら、炎症は複数のサイトカインによって引き起こされるため、単一抗体において２つのサイトカインを標的とすることが有益である。したがって、ＲＡ患者において炎症を緩和し、免疫反応を最小限まで減少させるためにＴＮＦαおよびＩＬ−１７の両方を同時に標的とすることが有益である。
【０００３】
現在、ＴＮＦα抗体およびＩＬ−１７抗体の同時投与は、２つの別個の製品の注射または２つの異なる抗体の複合製剤の単回注射を必要とする。２つの注射は用量およびタイミングの柔軟性を許容するが、コンプライアンスおよび痛みの両方のために患者に不都合である。複合製剤はまた、用量のいくらかの柔軟性を提供できるが、２つの異なる抗体の異なる分子特性に起因して両方の抗体の化学的および物理的安定性を許容する製剤条件を見つけることはかなり困難または不可能である。さらに、同時投与または複合製剤は、患者および／または支払者の費用を増加させ得る、２つの異なる薬物療法の追加の費用に関係するのに対して、単一の二重特異性抗体は、送達される有益性に最適化される価格を可能にする。
【０００４】
特許文献１は、ＴＮＦαおよびＩＬ−１７に結合する二重可変ドメイン免疫グロブリン（「ＤＶＤ−Ｉｇ」）を開示している。ＤＶＤ−Ｉｇは、同一の特異性および同一のＣＤＲ配列を有する２つの同一の抗原結合アームを有する多特異的免疫グロブリンであり、それが結合する各抗原について二価である。各々の抗原結合アームは、可変ドメイン間に介在する定常領域を有さないタンデムに連結される２つの異なる可変ドメインを有し、各々の可変ドメインは異なる抗原に対する特異性を有する。特許文献２は、異なる特異性を有する完全な抗体に融合した一本鎖抗体を産生することによって組換えＤＮＡ技術を使用して二重特異性、四価抗体を産生する方法を開示している。この遺伝子融合は二重特異性を有する四価抗体を生じるトランスフェクションによって発現される。特許文献３は、ｈＴＮＦαに結合し、中和するヒト抗体を開示している。特許文献４は、ヒトＩＬ−１７に結合し、中和する抗ＩＬ−１７抗体を開示している。
【０００５】
上記の開示にもかかわらず、本発明の二重特性抗体を構築する場合、化学および物理的安定性に関連する重要な問題に遭遇した。多くの変更が、一本鎖断片可変領域のＶＨ／ＶＬインターフェースを安定化すること、熱安定性を増加させること、凝集を減少させること、および全て両方の抗原に対する結合親和性を維持しながら、二重特異性抗体の結合面における静電気分布を再平衡化することを含む、多数の問題を十分に克服するために、開始二重特異性抗体に必要とされた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１０／１０２２５１号
【特許文献２】国際公開第１９９５／０９９１７号
【特許文献３】米国特許第６，０９０，３８２号
【特許文献４】国際公開第２００７／０７０７５０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ヒトＴＮＦαおよびヒトＩＬ−１７の両方を中和する単一の二重特異性抗体についての必要性が依然として存在する。低い凝集を示し、ヒトＴＮＦαおよびヒトＩＬ−１７を中和する、熱的に安定、物理的に安定である二重特異性抗体を提供することが望まれる。また、ヒトＴＮＦαおよびヒトＩＬ−１７の両方を中和する単一の二重特異性抗体を含む医薬組成物を提供し、それにより、２つの異なる別個の抗体の異なる分子特性を満たさなければならない製剤条件を見つけることの困難性を回避することが望まれる。したがって、本発明は上述の問題の１つ以上に対処することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む二重特異性抗体であって、第１のポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を有し、第２のポリペプチドは配列番号２のアミノ酸を有する、二重特異性抗体を提供する。
【０００９】
本発明は、２つの第１のポリペプチドおよび２つの第２のポリペプチドを含む二重特異性抗体であって、第１のポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を有し、第２のポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を有する、二重特異性抗体を提供する。
【００１０】
本発明はまた、第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供する。
【００１２】
本発明は、第１および第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供する。
【００１３】
本発明はまた、ＤＮＡ分子で形質転換された哺乳動物細胞であって、細胞は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む二重特異性抗体を発現できる、哺乳動物細胞を提供する。
【００１４】
本発明は、２つの第１のポリペプチドおよび２つの第２のポリペプチドを含む二重特異性抗体を産生する方法であって、二重特異性抗体が発現される条件下で哺乳動物細胞を培養する工程を含む、方法を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、前記方法によって産生される二重特異性抗体を提供する。
【００１６】
本発明はまた、治療有効量の本開示に係る二重特異性抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、関節リウマチ、乾癬性関節炎、または強直性脊椎炎を治療する方法を提供する。
【００１７】
本発明は、療法に使用するための本開示に係る二重特異性抗体を提供する。
【００１８】
本発明はさらに、関節リウマチ、乾癬性関節炎、または強直性脊椎炎の治療に使用するための医薬を製造するための本開示に係る二重特異性抗体の使用を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、関節リウマチ、乾癬性関節炎、または強直性脊椎炎の治療に使用するための本開示に係る二重特異性抗体を提供する。
【００２０】
本発明はまた、本発明の二重特異性抗体および１種以上の医薬的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書で使用される場合、「ヒトＩＬ−１７」という用語は、２つの１５ｋＤヒトＩＬ−１７Ａタンパク質（「ヒトＩＬ−１７Ａ」としても知られている）を含むホモ二量体タンパク質、ならびに１５ｋＤヒトＩＬ−１７Ａタンパク質および１５ｋＤヒトＩＬ−１７Ｆタンパク質（「ヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆ」としても知られている）を含むヘテロ二量体タンパク質を含むと理解される。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「二重特異性抗体」という用語は、本明細書に記載される２つの第１のポリペプチドおよび２つの第２のポリペプチドを含むと理解される。二重特異性抗体は、各抗原に対する特異性を有する２つの異なる抗原に結合する。二重特異性抗体は、単独で各抗原または同時に各抗原に結合できる。この用語は、限定されないが、グリコシル化プロファイルを含む、二重特異性抗体に対する任意の細胞の翻訳後修飾を含むことがさらに理解される。
【００２３】
本発明の二重特異性抗体は２つの第１のポリペプチドおよび２つの第２のポリペプチドを含む。第１のポリペプチドの一方は第２のポリペプチドの一方と鎖間ジスルフィド結合を形成する。２つの第１のポリペプチドの各々は互いに２つの鎖間ジスルフィド結合を形成し、第１のポリペプチドの各々は少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を形成する。ポリペプチドおよびジスルフィド結合の関係は例示目的のみのための以下の略図に示される：
【化１】
2016510743.tif 000002
【００２４】
第１のポリペプチドのアミノ酸配列は以下である：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＴＷＮＳＧＨＩＤＹＡＤＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＶＳＹＬＳＴＡＳＳＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＫＦＴＤＹＨＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＣＬＥＷＭＧＶＩＮＰＴＹＧＴＴＤＹＮＱＲＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＤＹＦＴＧＴＧＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＲＳＬＶＨＳＲＧＥＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＩＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＳＴＨＬＰＦＴＦＧＣＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１）。
【００２５】
配列番号３のＤＮＡ配列を含有する発現ベクターは配列番号１のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドをコードする。
【００２６】
第２のポリペプチドのアミノ酸配列は以下である：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＲＹＮＲＡＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２）。
【００２７】
配列番号４のＤＮＡ配列を含有する発現ベクターは配列番号２のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドをコードする。
【００２８】
第１のポリペプチドの１つおよび第２のポリペプチドの１つの鎖間ジスルフィド結合は、配列番号１のシステイン残基１３５と配列番号２のシステイン残基２１４との間に形成する。一方の第１のポリペプチドは他方の第１のポリペプチドと２つの鎖間ジスルフィド結合を形成する。第１の鎖間ジスルフィド結合は、配列番号１の第１のポリペプチドのシステイン残基２２７と、配列番号１の他方の第１のポリペプチドのシステイン残基２２７との間に形成する。第２の鎖間ジスルフィド結合は、配列番号１の第１のポリペプチドのシステイン残基２３０と、配列番号１の他方の第１のポリペプチドのシステイン残基２３０との間に形成する。
【００２９】
少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合は、第１のポリペプチドの各々において配列番号１のシステイン残基５０５と、配列番号１のシステイン残基７０５との間に形成される。
【００３０】
第１のポリペプチドは、第１の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ１）、重鎖定常領域（ＣＨ）、第２の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ２）および第２の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ２）を含む。第２のポリペプチドは、第１の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ１）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）が散在している、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変領域にさらに細分されてもよい。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの各々は、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシル末端まで配列される、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。
【００３１】
ＨＣＶＲ１の３つのＣＤＲは、本明細書において、ＣＤＲＨ１−１、ＣＤＲＨ１−２、およびＣＤＲＨ１−３と称される。ＨＣＶＲ２の３つのＣＤＲは、ＣＤＲＨ２−１、ＣＤＲＨ２−２、およびＣＤＲＨ２−３と称される。同様に、ＬＣＶＲ１の３つのＣＤＲは、ＣＤＲＬ１−１、ＣＤＲＬ１−２、およびＣＤＲＬ１−３と称され、ＬＣＶＲ２の３つのＣＤＲは、ＣＤＲＬ２−１、ＣＤＲＬ２−２、およびＣＤＲＬ２−３と称される。
【００３２】
ＣＨはアミノ酸リンカー（Ｌ１）によってＨＣＶＲ２に融合する。ＨＣＶＲ２はアミノ酸リンカー（Ｌ２）によってＬＣＶＲ２に融合する。
【００３３】
本発明はまた、ダイアボディを含む。ダイアボディは、ＨＣＶＲ２およびＬＣＶＲ２領域が、単一ポリペプチド鎖で発現されるが、同じ鎖の相補性ドメインと対になる可変ドメインの代わりに、可変ドメインが他の鎖の相補性ドメインと対になる、二重特異性抗体である。例えば、二重特異性抗体が、２つの第１のポリペプチド（簡便性のために、１Ａおよび１Ｂ）および２つの第２のポリペプチド（簡便性のために、２Ａおよび２Ｂ）を含む場合、１ＡポリペプチドのＨＣＶＲ２は、１ＡポリペプチドのＬＣＶＲ２と対になる代わりに、１ＢポリペプチドのＬＣＶＲ２の相補性ドメインと対になり、その逆も同様である。本明細書に記載される二重特異性ダイアボディは、ヒトＴＮＦαおよびヒトＩＬ−１７の両方に対する結合親和性および中和能力を維持する。
【００３４】
あるいは、上記の二重特異性抗体からダイアボディを精製することは有益であり得る。ダイアボディ含有量は、細胞増殖後、最大で１７％になり得、精製後、１％未満まで減少し得る。
【００３５】
様々な領域およびリンカーの関係は以下の通りであり、Ｋａｂａｔ番号付け法に従って、アミノ末端からカルボキシ末端まで並べられる：
【００３６】
【表１】
2016510743.tif 000003
【００３７】
二重特異性抗体操作
本発明の二重特異性抗体を構築しているときに、化学および物理的安定性に関連する重大な問題に出くわした。例えば、高い濃度で親ＩＬ−１７抗体は物理的安定性の欠点（例えば相分離）を示した。さらに、親ＩＬ−１７抗体から構築した二重特異性抗体は、濃度依存性自己凝集を示した。したがって、化学および物理的安定性を改善し、濃度依存性凝集を減少させるために二重特異性抗体のＣＤＲＬ２−１およびＣＤＲＨ２−２部分において化学修飾を行った。ＬＣ／ＭＳとの組み合わせにおける広範なタンパク質安定性および溶解度研究により、ＣＤＲＬ２−１およびＣＤＲＨ２−２において化学的に不安定な残基が確認された。これらの不安定な残基をコドン欠失によって構築された標的ライブラリーを使用して電荷中性アミノ酸と置き換えた。これらの不安定な残基を置き換えることにより、改善された化学安定性が導かれた。さらに、二重特異性抗体の静電面を算出し、荷電したパッチを確認した。これらの荷電したパッチの破壊により、タンパク質自己凝集の減少が導かれた。したがって、表面静電分布を再平衡し、熱安定性を改善し、凝集を減少させ、化学安定性を改善した（特定の脱アミドおよび酸化部位を取り除く）、二重特異性抗体のＣＤＲＨ２−１およびＣＤＲＬ−２部分において変異が確認された。上記の修飾のどれも、親単一抗体の最初の特徴で確認されなかった。これらの変化は二重特異性抗体を構築する状況においてのみ出くわし、単一抗体の変異領域周囲の局所環境が二重特異性抗体の状況において異なることが示唆される。
【００３８】
二重特異性抗体凝集を減少させるためにさらなる化学修飾を行った。特に、二重特異性抗体のＩＬ−１７部分におけるＶＨ／ＶＬインターフェースを安定化するために化学修飾を行った。二重特異性抗体凝集の働きをする因子を決定するために行った研究により、観察されたタンパク質自己会合が、個々のＶＨまたはＶＬドメインの立体配座不安定性によって誘導されず、むしろ、ＶＨ−ＶＬインターフェースの開口または「呼吸」によって、分子間タンパク質相互作用を導くことが示された。したがって、種々の鎖内ジスルフィド結合を二重特異性抗体のＩＬ−１７部分のＶＨ−ＶＬインターフェース内に導入した。１つのこのような鎖内ジスルフィド結合は配列番号１のシステイン残基５０５と配列番号１のシステイン残基７０５との間の第１のポリペプチドの各々において生じる。このジスルフィド結合は二重特異性抗体のＩＬ−１７部分においてＶＨおよびＶＬインターフェースに共有結合しており、ＶＨ−ＶＬインターフェースを安定化し、物理的不安定性および好ましくない製剤の欠点を導き得る分子間タンパク質相互作用を減少させる。試験した９つの異なるジスルフィド結合のうち、８つが機能的タンパク質を発現し、親和性消失の大きさは約２〜約３５倍の範囲であった。配列番号１のシステイン残基５０５と配列番号１のシステイン残基７０５との間の第１のポリペプチドの各々における鎖内ジスルフィド結合は、ＩＬ−１７に対する最適な結合親和性を維持しながら、ＶＨ／ＶＬインターフェースを最も安定化した。
【００３９】
さらに、研究により、Ｌ１についてのリンカーの長さは、二重特異性抗体の機能的活性、特に結合キネティクスに影響を与えることが示された。（表面プラズミン共鳴による）キネティクス解析により、１０アミノ酸リンカーが、１５アミノ酸および２０アミノ酸リンカーと比較してＫｏｎ速度を２倍遅延させたことが示された。したがって、１５の最小リンカー長さを本発明の二重特異性抗体に導入した。
【００４０】
本発明の二重特異性抗体をまた、Ｆｃγ受容体との相互作用により免疫系の活性を減少または排除するように操作した。免疫活性化は本発明の二重特異性抗体の作用の意図する機構の部分ではない。そのために、本発明の二重特異性抗体を、Ｆｃγ受容体または補体系の成分に対する低い結合親和性を有することが知られている、ＩｇＧ４アイソタイプとして構築した。さらに、２つのアラニン変異を、この結合能をさらに減少させるために下方のヒンジ領域に作製した。
【００４１】
二重特異性抗体結合
本発明の二重特異性抗体はヒトＴＮＦαおよびヒトＩＬ−１７の両方に結合する。本発明の二重特異性抗体はインビトロまたはインビボで少なくとも１つのヒトＴＮＦα生物活性および少なくとも１つのヒトＩＬ−１７生物活性を中和する。本発明の二重特異性抗体は、インビトロでＩＬ−１７、ならびにインビトロで可溶性および膜結合ＴＮＦαの両方の有効な阻害剤である。
【００４２】
本発明の二重特異性抗体は、約３０ｐＭ〜約１ｐＭの範囲のヒトＴＮＦαに対する結合親和性（ＫＤ）および約４０ｐＭ〜約１ｐＭの範囲のヒトＩＬ−１７Ａに対する結合親和性（ＫＤ）を有する。さらに、本発明の二重特異性抗体は、約５０ｐＭ〜約１ｐＭの範囲のヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆヘテロ二量体に対するＫＤを有する。一態様において、本発明の二重特異性抗体は約２１ｐＭ〜約３ｐＭの範囲のヒトＴＮＦαに対するＫＤを有する。別の態様において、本発明の二重特異性抗体は約８ｐＭ〜約１０ｐＭの範囲のヒトＩＬ−１７Ａに対するＫＤを有する。
【００４３】
二重特異性抗体発現
作動可能に連結される遺伝子の発現を誘導できる発現ベクターは当該分野において周知である。発現ベクターは宿主細胞からポリペプチドの分泌を促進するシグナルペプチドをコードできる。シグナルペプチドは免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチドであってもよい。第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、１つのベクターにおいて作動可能に連結される異なるプロモーターから独立して発現され得るか、または代替的に、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、２つのベクター（一方は第１のポリペプチドを発現し、他方は第２のポリペプチドを発現する）において作動可能に連結される異なるプロモーターから独立して発現され得る。
【００４４】
宿主細胞は、本発明の第１のポリペプチド、第２のポリペプチドまたは第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの両方を発現する１つ以上の発現ベクターで安定または一過性にトランスフェクトされ、形質転換され、形質導入され、または感染される細胞を含む。本発明の二重特異性抗体を産生する宿主細胞株の作製および単離は当該分野において公知の標準的技術を使用して達成され得る。哺乳動物細胞は二重特異性抗体の発現に好ましい宿主細胞である。特定の哺乳動物細胞はＨＥＫ２９３、ＮＳ０、ＤＧ−４４およびＣＨＯである。好ましくは、二重特異性抗体は、宿主細胞が培養される培地内に分泌され、そこから本発明の二重特異性抗体が回収または精製され得る。
【００４５】
抗体の哺乳動物発現はグリコシル化をもたらすことは当該分野において周知である。典型的に、グリコシル化は高度に保存されたＮ−グリコシル化部位で抗体のＦｃ領域において生じる。Ｎ−グリカンは、典型的に、アスパラギンに結合する。第１のポリペプチドの各々は配列番号１のアスパラギン残基３００でグリコシル化される。
【００４６】
配列番号１のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドをコードする特定のＤＮＡポリヌクレオチド配列は以下である：
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＧＡＣＴＡＴＧＣＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＴＣＡＧＣＴＡＴＴＡＣＴＴＧＧＡＡＴＡＧＴＧＧＴＣＡＣＡＴＡＧＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＧＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＧＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＡＧＴＡＣＴＧＣＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＴＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＧＣＴＣＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＴＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＡＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＡＧＴＴＣＡＣＴＧＡＣＴＡＣＣＡＴＡＴＴＣＡＴＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＴＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＧＴＡＡＴＴＡＡＴＣＣＴＡＣＴＴＡＴＧＧＴＡＣＴＡＣＴＧＡＣＴＡＣＡＡＴＣＡＧＣＧＧＴＴＣＡＡＡＧＧＣＣＧＴＧＴＣＡＣＣＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＡＣＧＡＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＴＡＴＧＡＴＴＡＣＴＴＴＡＣＴＧＧＧＡＣＧＧＧＴＧＴＧＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＴＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＡＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＧＴＣＡＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧＣＣＧＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＡＧＴＡＧＧＡＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＴＣＧＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＡＴＴＴＡＣＡＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＡＴＣＴＣＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＡＡＴＴＴＡＴＡＡＡＧＴＴＴＣＣＡＡＣＣＧＧＴＴＴＡＴＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＡＧＧＣＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＴＧＧＡＧＧＣＣＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＴＣＴＣＡＡＡＧＴＡＣＡＣＡＴＣＴＴＣＣＡＴＴＣＡＣＧＴＴＴＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ
（配列番号３）
【００４７】
配列番号２のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドをコードする特定のＤＮＡポリヌクレオチド配列は以下である：
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＧＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＣＧＣＡＡＴＴＡＴＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＴＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＡＡＴＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＴＣＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＧＣＴＡＴＡＡＣＣＧＴＧＣＣＣＣＴＴＡＣＡＣＧＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＧＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ（配列番号４）
【００４８】
二重特異性抗体が分泌される培地は従来の技術によって精製され得る。例えば、培地は従来の方法を使用してプロテインＡまたはＧカラムに適用されてもよく、プロテインＡまたはＧカラムから溶出されてもよい。可溶性の凝集体および多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む、一般的な技術によって効果的に除去され得る。生成物は、例えば−７０℃にて即座に凍結されてもよく、または凍結乾燥されてもよい。
【００４９】
培地中に存在するダイアボディのレベルを減少させる必要があり得る。例えば、ダイアボディを含有する培地は、強カチオン交換樹脂に適用されてもよく、強カチオン交換樹脂から溶出されてもよい。例えば、ＳＰ−セファロースＨＰ強カチオン交換樹脂は、ダイアボディから正しく折り畳まれた二重特異性抗体を精製するために使用される。ダイアボディを含有する培地のｐＨは、２０ｍＭ  Ｂｉｃｉｎｅを使用してｐＨ８．１に調整される。培地を、２カラム体積の２０ｍＭ  Ｂｉｃｉｎｅ（ｐＨ８．１）で洗浄した、ＳＰ−セファロースＨＰカラムに負荷し、２０カラム体積（１０〜９０ｍＭ  ＮａＣｌ）以上の２０ｍＭ  Ｂｉｃｉｎｅおよび１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．１）で溶出した。回収したプールは主要ピークに対して高分子量について評価できる。典型的な結果は約６８％の回収率で約１７％のダイアボディから１％未満のダイアボディまでの改善である。
【００５０】
任意に、ダイアボディは以下の非限定的な手順に従って精製できる：二重特異性抗体およびダイアボディが分泌されている無菌培地を、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）などの相溶性のある緩衝液で平衡にされているプロテインＡ親和性カラムに適用できる。カラムを洗浄して、非特異的結合成分を除去できる。結合した二重特異性抗体およびダイアボディは、例えばｐＨ勾配（０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ６．８〜０．１Ｍクエン酸ナトリウム  ｐＨ２．５など）によって溶出され得る。二重特異性抗体画分は、Ｆｃ領域とＳｃＦｖ／ダイアボディ領域との間を切断するための制限されたリシルエンドペプチダーゼ（ＬｙｓＣ）消化によって検出でき、続いて逆相ＨＰＬＣ定量分析が行われる。簡潔に述べると、１５μｇの試料を、５０μＬの全体積で２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０＋０．１ｍｇ／ｍＬヨードアセトアミド中の０．２μｇのＬｙｓＣ（Ｗａｋｏ、Ｐ／Ｎ  １２５−０５０６１）を用いて３７℃にて約２０時間、消化できる。試料は、ＰＬＲＰ−Ｓ  ５０×２．１ｍｍ逆相カラム（Ｖａｒｉａｎ  Ｐ／Ｎ  ＰＬ１９１２−１８０２）に２０μＬ（６μｇ）を注入することによって分析できる。流速は０．６ｍＬ／分であってもよく、カラム温度は８０℃であってもよく、検出は２１４ｎｍであってもよく、緩衝液Ａは水中に０．０５％ＴＦＡであってもよく、緩衝液Ｂはアセトニトリル中に０．０４％ＴＦＡであってもよい。ＳｃＦｖおよびダイアボディピーク（ＬＣ−ＭＳによって以前に確認された）は適切なピークを積分することによって求めることができる。二重特異性ダイアボディを含有するカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーからの材料は、プールでき、ＰＢＳ、ｐＨ７．０中でジフィルタ（ｄｉ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ）できる。高分子量の凝集体を除去するために、ＣＥＸプールを、ＰＢＳ、ｐＨ７中で７ｍＬ／分で流すＳｕｐｅｒｄｅｘ２００  ５０／６０ＳＥＣカラム上に置くことができる。二重特異性抗体プールは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析的ＳＥＣ分析によって測定できる。次いでＳＥＣプールは以下の緩衝系：３．３ｍＭ  ＭＥＳ、３．３ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、３．３ｍＭ  Ｔｒｉｓ、３．３ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、３．３ｍＭ  ＣＨＥＳ、３．３ｍＭ  ＣＡＰＳ、ｐＨ５．８中で５倍に希釈できる。次いで希釈したタンパク質プールを、１５ｍＬ／分にて分取ＰｒｏＰＡＣ  ＷＣＸ−１０  ＢｉｏＬＣカチオン交換カラム（２２×２５０ｍｍ  ｐｒｅｐスケール）に負荷できる。以前に記載した緩衝系を使用して、二重特異性ダイアボディは、４５分にわたって１５ｍＬ／分にてｐＨ８．４〜ｐＨ１１の線形ｐＨ勾配を使用した溶出によって二重特異性抗体から分離でき、７．５ｍＬの画分を回収した。作製したＰｒｏＰａｃ  ＣＥＸプールは、分析的ＳＥＣ（ＴＳＫ３０００）、分析的ＣＥＸ（ＰｒｏＰａｃ  ＷＣＸ−１０）、ゲル分析（ＭＥＳ緩衝系を用いたＮｕＰＡＧＥ）、および各画分中のダイアボディ含有量を測定するためのＬｙｓＣ消化に基づき得る。最終的なＰｒｏＰａｃ  ＣＥＸプールはＰＢＳ、ｐＨ７中で透析できる。
【００５１】
この精製プロセスは、ダイアボディ含有量を最大１２％のダイアボディから５％未満のダイアボディまで除去し、減少させることができる。
【００５２】
医薬組成物および治療的使用
本発明の二重特異性抗体は、関節リウマチ、乾癬性関節炎、および強直性脊椎炎を治療することが予想される。「患者」とは、ＴＮＦおよび／もしくはＩＬ−１７の減少したレベルまたはＴＮＦおよび／もしくはＩＬ−１７の減少した生物活性から利益を受ける、疾患、障害、または病態を有する哺乳動物、好ましくはヒトを指す。
【００５３】
「治療」および／または「治療する」は、全ての障害の症状の全体の排除を必ずしも示す必要はないが、本明細書に記載される障害の進行を遅延、遮断、停止、抑制または中断できる全てのプロセスを指すことを意図する。治療は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患または病態を治療するための本発明の二重特異性抗体の投与を含み、（ａ）疾患のさらなる進行を阻害すること、すなわちその発生を停止すること；および（ｂ）疾患を軽減すること、すなわち疾患もしくは障害の退行を生じること、または症状もしくはその合併症を緩和することを含む。
【００５４】
本発明の二重特異性抗体は被験体への投与に適した医薬組成物に組み込まれてもよい。典型的に、医薬組成物は、本発明の二重特異性抗体および医薬的に許容可能な担体を含む。本明細書で使用する場合、「医薬的に許容可能な担体」は、生理学的に適合性のある、任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。医薬的に許容可能な担体は二重特異性抗体の保存可能期間または有効性を高める少量の補助物質をさらに含んでもよい。
【００５５】
本発明の組成物は種々の形態であってもよい。好ましい形態は、意図する投与様式および治療用途に依存する。典型的な好ましい組成物は、他の抗体でのヒトの受動免疫に使用されるものと類似した組成物などの注射可能または注入可能溶液の形態である。好ましい投与様式は非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。一実施形態において、二重特異性抗体は皮下注射により投与される。しかしながら、当業者に理解されるように、投与経路および／または投与様式は所望の結果に応じて変化する。
【００５６】
本発明の医薬組成物は、「治療的に有効な量」の本発明の二重特異性抗体を含んでもよい。「治療的に有効な量」とは、所望の治療結果を達成するのに必要な投薬量および期間で有効な量を指す。二重特異性抗体の治療的に有効な量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の反応を誘発する二重特異性抗体の能力などの要因に応じて変化し得る。治療的に有効な量はまた、治療的に有益な効果が、二重特異性抗体のあらゆる毒性または有害な作用を上回るものである。
【００５７】
投薬レジメンは最適な所望の反応（例えば、治療反応）を提供するように調節され得る。例えば、単回ボーラスが投与されてもよく、複数回の分割用量が経時的に投与されてもよく、または用量は、治療状況の危急によって示されるように比例的に減少もしくは増加されてもよい。
【００５８】
用量の値は軽減される病態の種類および重症度により変化してもよい。任意の特定の被験体について、特定の用量レジメンが、個体の必要性および組成物の投与を管理または監督している専門家の判断に応じて経時的に調節されるべきであることがさらに理解される。
【００５９】
別の実施形態において、本発明は、自己免疫疾患、特に炎症に関連する自己免疫疾患、例えば関節リウマチ、乾癬性関節炎、および強直性脊椎炎を治療する方法を提供する。典型的に、二重特異性抗体が全身的に投与されるが、特定の障害について、炎症部位における二重特異性抗体の局所投与が有益であり得る。
【００６０】
本発明は以下の非限定的な実施例によってさらに示される。
【実施例】
【００６１】
二重特異性抗体の発現および精製
二重特異性抗体は実質的に以下のように発現および精製され得る。配列番号３（配列番号１のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドをコードする）および配列番号４（配列番号２の軽鎖アミノ酸配列をコードする）のＤＮＡを含有するグルタミン合成酵素（ＧＳ）発現ベクターは、エレクトロポレーションによってチャイニーズハムスター細胞株、ＣＨＯＫ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ＰＬＣ、Ｓｌｏｕｇｈ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）をトランスフェクトするために使用される。発現ベクターは、ＳＶ早期（シミアンウイルス４０Ｅ）プロモーターおよびＧＳについての遺伝子をコードする。ＧＳの発現は、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞によって必要とされるアミノ酸であるグルタミンの生化学的合成を可能にする。トランスフェクション後、細胞は５０μＭのＬ−メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）によるバルク選択を受ける。ＭＳＸによるＧＳの阻害は選択のストリンジェンシーを増加させるために利用される。発現ベクターｃＤＮＡを宿主細胞ゲノムの転写活性領域内に組み込んだ細胞は、ＧＳの内因性レベルを発現する、ＣＨＯＫ１ＳＶ野生型細胞に対して選択される。トランスフェクトされたプールは、安定発現細胞のクローンに近い（ｃｌｏｓｅ−ｔｏ−ｃｌｏｎａｌ産物を可能にする低密度で播種される。マスターウェルは二重特異性抗体発現についてスクリーニングされ、次いで精製に使用するために無血清懸濁培地中でスケールアップされる。二重特異性抗体が分泌される無菌培地が、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）などの適合緩衝液で平衡化されるプロテインＡアフィニティーカラムに適用される。カラムは非特異的結合成分を除去するために洗浄される。結合した二重特異性抗体は、例えば、ｐＨ勾配（０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ６．８から０．１Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ２．５など）によって溶出される。二重特異性抗体画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは分析的サイズ排除などによって検出され、次いでプールされる。可溶性凝集体および多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む、一般的な技術によって効果的に除去され得る。二重特異性抗体は、一般的な技術を使用して濃縮および／または濾過滅菌され得る。これらのクロマトグラフィー工程後の二重特異性抗体の純度は９８％超である。二重特異性抗体は−７０℃にて即座に凍結または数ヶ月間、４℃にて保存され得る。
【００６２】
ＴＮＦαおよびＩＬ−１７に対する結合親和性
ＴＮＦα
ヒトＴＮＦαに対する二重特異性抗体の結合親和性は、ランニング緩衝液および試料希釈のためのＰＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ）中のＢｌｏｃｋｅｒ  Ｃａｓｅｉｎを使用して３７℃にてＳａｐｉｄｙｎｅ  ＫｉｎＥｘＡ３０００機器で溶解平衡結合アッセイを使用して測定する。ヒトＴＮＦαは標準的なアミンカップリング化学によりＮＨＳセファロースに固定される。試料は、２０ｐＭの一定濃度で二重特異性抗体を、２００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１３、１．５６、０．７８、０．３９および０（ブランク）ｐＭの濃度のヒトＴＮＦαと混合することによって調製する。試料は３７℃にて１８時間インキュベートして、分析前に平衡に到達させる。各分析サイクルは、（１）１ｍＬ／分にて３６７μＬのビーズを注入することによってヒトＴＮＦαビーズのカラムを充填すること、（２）０．５ｍＬ／分にてカラムに対して１０ｍＬ（２０分）の二重特異性抗体／ヒトＴＮＦα複合体を注入すること、（３）０．２５ｍＬ／分にて０．５ｍＬ（２分）の緩衝液を注入して、未結合の試料を洗い流すこと、（４）１ｍＬ（３０秒）の５００ｎｇ／ｍＬ  ＤｙＬｉｇｈｔ−６４９ウサギ抗ヒトＩｇＧ検出抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を注入すること、（５）１．５ｍＬ／分にて２．２５ｍＬ（９０秒）の緩衝液を注入して、未結合の検出抗体を洗い流すこと、および（６）１Ｎ  ＮａＯＨの１ｍＬ（６０秒）の注入、続いてバックフラッシュによりシステムを洗浄することからなる。データは、ＫｉｎＥｘＡ  Ｐｒｏソフトウェア、バージョン２．０．１．１４を使用した２つの反復実験のＮ曲線分析を使用して適合する。平衡解離定数（ＫＤ）は遊離二重特異性抗体のパーセントから算出する。本発明の二重特異性抗体は、４．４ｐＭ（０．６から１６．３ｐＭの９５％信頼区間）のヒトＴＮＦαに対するＫＤを示した。
【００６３】
ＩＬ−１７
ヒトＩＬ−１７に対する二重特異性抗体の結合親和性は、ＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ＋３ｍＭ  ＥＤＴＡ＋０．０５％界面活性剤Ｐ２０）ランニング緩衝液で準備したＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器で表面プラズモン共鳴アッセイおよび３７℃に設定した分析温度を使用して測定する。全ての４つのフローセル（Ｆｃ）上で固定したプロテインＡ（標準的なＮＨＳ−ＥＤＣアミンカップリングを使用して生成した）を含有するＣＭ４チップを、捕捉法を利用するために使用する。抗体試料はランニング緩衝液中での希釈によって４μｇ／ｍＬにて調製する。ヒトＩＬ−１７は、ランニング緩衝液中での希釈によって８０．０、４０．０、２０．０、１０．０、５．０、２．５、１．２５および０（ブランク）ｎＭの最終濃度にて調製する。各分析サイクルは、（１）別のフローセル（Ｆｃ２、Ｆｃ３、およびＦｃ４）上で抗体試料を捕捉すること、（２）１００μＬ／分にて全てのフローセルに対して２００μＬ（１２０秒）のヒトＩＬ−１７を注入すること、（３）解離相をモニタするために２０分間、緩衝液の流れを戻すこと、（４）グリシン、ｐＨ２．０の１０μＬ（２０秒）の注入によりチップ面を再生することからなる。標準的な二重参照を使用してデータを処理し、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェア、バージョン１．０を使用して１：１結合モデルに適合して、会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）を求める。平衡解離定数（ＫＤ）は関係ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎから算出する。
【００６４】
【表２】
2016510743.tif 000004
【００６５】
これらの結果により、本発明の二重特異性抗体がヒトＴＮＦαおよびヒトＩＬ−１７に別々に結合できることが実証される。
【００６６】
ヒトＴＮＦαおよびヒトＩＬ−１７に対する同時結合
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器を使用して、ヒトＴＮＦαおよびヒトＩＬ１７が、二重特異性抗体に同時に結合できるかどうかを求める。全てのＢｉａｃｏｒｅ試薬および材料は、他に示さない限り、Ｂｉａｃｏｒｅから購入する。全ての測定は２５℃で実施する。ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）界面活性剤Ｐ−２０、および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）を、ランニング緩衝液および試料緩衝液として使用する。プロテインＡを、アミンカップリングキットを使用してＣＭ４センサチップのフローセル１および２上に固定する。３μｇ／ｍＬに希釈した二重特異性抗体を、３０μＬ／分にて３５秒の注入によりフローセル２上で最初に捕捉して、１６５共鳴単位（ＲＵ）の捕捉した抗体を得る。この捕捉に続いて、緩衝液の３５秒の注入を行う。次いで流量を１００μＬ／分に増加させ、流れをフローセル１（Ｆｃ１）およびフローセル２（Ｆｃ２）に対して誘導する。ＴＮＦα結合を飽和させるために、５０ｎＭのヒトＴＮＦαを２分間注入する。参照から差し引いたデータをＦｃ２−Ｆｃ１として収集する。４５ＲＵの結合信号を観察する。ヒトＴＮＦαの注入後、８０ｎＭのヒトＩＬ−１７をさらに２分間注入して、ＩＬ−１７結合を飽和させる。再び、参照から差し引いたデータをＦｃ２−Ｆｃ１として収集する。３７ＲＵのさらなる結合信号を観察する。次いで１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５を使用してチップ面を再生する。これらの結果により、本発明の二重特異性が、二重特異性抗体に結合する２つのリガンドからの共鳴単位の増加（最初にＴＮＦαから４５ＲＵ、次いでヒトＩＬ−１７からさらに３７ＲＵ）によって示されるように、ヒトＴＮＦαおよびヒトＩＬ１７に同時に結合できることが実証される。
【００６７】
ＨＴ−２９細胞からのインビトロでのＩＬ−１７により誘導されるＣＸＣＬ１産生の阻害
ＨＴ−２９細胞はＩＬ−１７受容体を天然に発現するヒト結腸直腸腺癌上皮細胞である。ヒトＩＬ−１７とのＨＴ−２９細胞のインキュベーションは、市販のＥＬＩＳＡを使用して測定され得る、ＣＸＣＬ１の産生を生じる。
【００６８】
２０ｐＭ〜１０ｎＭの二重特異性抗体の用量範囲が評価される（二重特異性抗体のＭＷは２００ｋＤａである）。各試験濃度の二重特異性抗体が、５０μＬの２ｎＭ（最終濃度）の組換えＩＬ−１７を含有するウェルに加えられる（５０μＬ）。試験を処理ごとに二連のウェルで実施する。アッセイ培地が「培地単独」および「ＩＬ−１７単独」対照のために使用される。ＩＬ−１７中和抗体（米国特許第７，８３８，６３８号）がアッセイにおける陽性対照として使用される。対照抗体を二重特異性抗体と同じモル範囲で試験する。ＩＬ−１７および抗体混合物を含有するプレートを、組織培養処理した９６ウェルプレート中で、６０〜９０分間（３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ２にて）、インキュベートする。
【００６９】
ＨＴ−２９細胞を、アッセイ培地（１０％ＦＢＳ、ペニシリンＧ（０．２Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（０．２μｇ／ｍＬ）を含有するＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ）中で通常のように培養する。細胞をアッセイの日の前日に収集する。細胞を１×ＰＢＳでリンスし、細胞解離緩衝液、酵素を含まないＰＢＳを用いて培養フラスコから分離する。完全なアッセイ培地を分離した細胞に加える。次いで細胞を、室温にて５分間、３１０×ｇにて遠心分離する。細胞ペレットをアッセイ培地中で再懸濁する。細胞密度を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｕｎｔｅｓｓを用いて測定し、２０，０００ＨＴ−２９細胞（１００μＬ中）を９６ウェルプレートの各々に加える。９６ウェルプレートを組織培養インキュベータ（３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ２）に一晩入れる。抗体／ＩＬ−１７混合物（１００μＬ）をＨＴ−２９細胞に加え、２４〜４８時間インキュベート（３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ２）する。
【００７０】
アッセイの終わりに、プレートを遠心分離し（室温にて５分間、５００×ｇ）、細胞培養培地をポリプロピレン９６ウェルプレートに移し、それを密封し、−８０℃にて凍結する。ＥＬＩＳＡによりＣＸＣＬ１を測定する日に、プレートを室温にて解凍する。培地中のＣＸＣＬ１レベルは、製造業者の指示書に従って、ＣＸＣＬ１サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＤｕｏＳｅｔ＃ＤＹ２７５）を用いて測定する。ＥＬＩＳＡ反応の終わりに、プレートをマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＶｅｒｓａＭａｘ  Ｔｕｎａｂｌｅ）で４５０ｎｍにて読み取る。結果は、ＩＬ−１７により誘導される反応の５０％が二重特性抗体または陽性対照のいずれかにより阻害される濃度（ＩＣ５０）を、データの４パラメータシグモイド適合（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）を使用して算出したものとして表す。
【００７１】
この結果により、本発明の二重特異性抗体が、濃度依存的にＨＴ−２９細胞によってＣＸＣＬ１のＩＬ−１７により誘導される分泌を阻害したことが実証される。この阻害は、陽性対照抗体［陽性対照抗体についての０．６１４±０．０９９ｎＭに対して、０．６２８±０．０７２ｎＭの二重特異性抗体についてのＩＣ５０（平均３回の独立した実験±ＳＥＭ）］で観察されたものに匹敵するのに対して、陰性対照抗体はＣＸＣＬ１産生を阻害しなかった。本発明の二重特異性抗体はＩＬ−１７を効果的に中和した。
【００７２】
ＨＴ−２９細胞からのインビトロでのＴＮＦにより誘導されるＣＸＣＬ１産生の阻害
ＨＴ−２９細胞はＴＮＦ受容体を天然に発現するヒト結腸直腸腺癌上皮細胞である。ヒトＴＮＦαとのＨＴ−２９細胞のインキュベーションにより、市販のＥＬＩＳＡを使用して測定され得る、ＣＸＣＬ１の産生が生じる。
【００７３】
０．５ｐＭ〜１０ｎＭの二重特異性抗体の用量範囲を評価する（二重特異性抗体のＭＷは２００ｋＤａである）。次いで各試験濃度の二重特異性抗体を、５０μＬの３０ｐＭ（最終濃度）の組換えＴＮＦαを含有するウェルに加える（５０μＬ）。試験を処理ごとに二連のウェルで実施する。アッセイ培地は、「培地単独」および「ＴＮＦ単独」対照のために使用する。ＴＮＦ中和抗体（アダリムマブ）をアッセイにおいて陽性対照として使用する。対照抗体は二重特異性抗体と同じモル範囲で試験する。ＴＮＦαおよび抗体混合物を含有するプレートを、組織培養処理した９６ウェルプレート中で、６０〜９０分間（３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ２にて）、インキュベートする。
【００７４】
ＨＴ−２９細胞を、アッセイ培地（１０％ＦＢＳ、ペニシリンＧ（０．２Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（０．２ｍｃｇ／ｍＬ）を含有するＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ）中で通常のように培養する。細胞をアッセイの日の前日に収集する。細胞を１×ＰＢＳでリンスし、細胞解離緩衝液、酵素を含まないＰＢＳを用いて培養フラスコから分離する。完全なアッセイ培地を分離した細胞に加える。次いで細胞を、室温にて５分間、３１０×ｇにて遠心分離する。細胞ペレットをアッセイ培地中で再懸濁する。細胞密度を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｕｎｔｅｓｓを用いて測定し、２０，０００ＨＴ−２９細胞（１００μＬ中）を９６ウェルプレートの各々に加える。９６ウェルプレートを組織培養インキュベータ（３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ２）に一晩入れる。抗体／ＴＮＦα混合物をＨＴ−２９細胞に加え、２４時間インキュベート（３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ２）する。
【００７５】
アッセイの終わりに、プレートを遠心分離し（室温にて５分間、５００×ｇ）、細胞培養培地を、ポリプロピレン９６ウェルプレートに移し、それを密封し、−８０℃にて凍結する。ＥＬＩＳＡによりＣＸＣＬ１を測定する日に、プレートを室温にて解凍する。培地中のＣＸＣＬ１レベルを、製造業者の指示書に従ってＣＸＣＬ１サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＤｕｏＳｅｔ＃ＤＹ２７５）を用いて測定する。ＥＬＩＳＡ反応の終わりに、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＶｅｒｓａＭａｘ  Ｔｕｎａｂｌｅ）上でプレートを４５０ｎｍにて読み取る。結果は、ＴＮＦにより誘導される反応の５０％が二重特性抗体または陽性対照のいずれかにより阻害される濃度（ＩＣ５０）を、データの４パラメータシグモイド適合（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）を使用して算出したものとして表す。
【００７６】
この結果により、本発明の二重特異性抗体が、濃度依存的にＨＴ２９細胞によってＣＸＣＬ１のＴＮＦにより誘導される分泌を阻害することが実証される。この阻害は、陽性対照抗体［陽性対照抗体についての１４．０±２ｐＭに対して、１８．８±１ｐＭの二重特異性抗体についてのＩＣ５０（平均３回の独立した実験±ＳＥＭ）］で観察されたものに匹敵するのに対して、陰性対照抗体はＣＸＣＬ１産生を阻害しなかった。本発明の二重特異性抗体はＴＮＦαを効果的に中和した。
【００７７】
ＩＬ−１７およびＴＮＦの組み合わせによって誘導されるＨＴ−２９細胞からのＣＸＣＬ１産生の阻害
上記のように、ＨＴ−２９細胞はＩＬ−１７およびＴＮＦ受容体を天然に発現するヒト結腸直腸腺癌細胞である。ヒトＴＮＦαおよびヒトＩＬ−１７とのＨＴ−２９細胞のインキュベーションにより、市販のＥＬＩＳＡを使用して測定され得る、ＣＸＣＬ１の産生が生じる。
【００７８】
抗体を一定用量の４ｎＭにて試験する（二重特異性抗体のＭＷは２００ｋＤａである）。次いで二重特異性抗体を、５０μＬの３ｐＭ組換えＴＮＦαおよび５０μＬの２００ｐＭ組換えＩＬ−１７を含有するウェルに加える（５０μＬ）。試験は処理ごとに５つの反復ウェルにおいて実施する。アッセイ培地は、「培地単独」および「ＩＬ−１７＋ＴＮＦ単独」のために使用する。抗ＩＬ−１７抗体（米国特許第７，８３８，６３８号）；抗ＴＮＦα抗体（アダリムマブ）；および抗ＩＬ−１７抗体／抗ＴＮＦ抗体の組み合わせをアッセイにおける対照として使用する。対照抗体を二重特異性抗体と同じモル範囲で試験する。ＴＮＦ＋ＩＬ−１７および抗体混合物を含有するプレートを、組織培養処理した９６ウェルプレート中で６０〜９０分間（３７℃、９５％相対湿度、および５％ＣＯ２にて）、インキュベートする。
【００７９】
ＨＴ−２９細胞を、アッセイ培地［１０％ＦＢＳ、ペニシリンＧ（０．２Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（０．２ｍｃｇ／ｍＬ）を含有するＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ］中で通常のように培養する。細胞をアッセイの日の前日に収集する。細胞を１×ＰＢＳでリンスし、細胞解離緩衝液、酵素を含まないＰＢＳを用いて培養フラスコから分離する。完全なアッセイ培地を分離した細胞に加える。次いでＨＴ−２９細胞を、室温にて５分間、３１０×ｇにて遠心分離する。細胞ペレットをアッセイ培地中で再懸濁する。細胞密度を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｕｎｔｅｓｓを用いて測定し、２０，０００ＨＴ−２９細胞（１００μＬ中）を９６ウェルプレートの各々に加える。９６ウェルプレートを組織培養インキュベータ（３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ２）に一晩入れる。二重特異性抗体／ＩＬ−１７／ＴＮＦ混合物をＨＴ−２９細胞に加え、２４〜４８時間インキュベート（３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ２）する。
【００８０】
アッセイの終わりに、プレートを遠心分離し（室温にて５分間、５００×ｇ）、細胞培養培地をポリプロピレン９６ウェルプレートに移し、それを密封し、−８０℃にて凍結する。ＥＬＩＳＡによりＣＸＣＬ１を測定する日に、プレートを室温にて解凍する。培地中のＣＸＣＬ１レベルを、製造業者の指示書に従ってＣＸＣＬ１サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＤｕｏＳｅｔ＃ＤＹ２７５）で測定する。ＥＬＩＳＡ反応の終わりに、プレートをマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＶｅｒｓａＭａｘ  Ｔｕｎａｂｌｅ）で４５０ｎｍにて読み取る。その結果は、種々の抗体：二重特異性抗体０．８５＋／−０．１２％；抗ＴＮＦα８．９７＋／−２．６５％；抗ＩＬ−１７  ２７＋／−２．０７％；抗ＴＮＦα＋抗ＩＬ−１７  ０．５９＋／−１．２３％とのインキュベーション後に残ったヒトＣＸＣＬ１のパーセント（ＴＮＦ＋ＩＬ−１７単独で１００％である）として表す。この結果により、本発明の二重特異性抗体が、単一薬剤単独よりも良好にＨＴ−２９細胞によって同時に起こるＣＸＣＬ１のＴＮＦαおよびＩＬ−１７により誘導される分泌を阻害したことが実証される。
【００８１】
インビトロでのＬ９２９細胞における可溶性ＴＮＦαにより誘導される細胞毒性の阻害
Ｌ９２９細胞はＴＮＦ受容体を天然に発現するマウス線維肉腫細胞である。ヒトＴＮＦαとのＬ９２９細胞のインキュベーションは反応性酸素中間体の過剰形成に起因する迅速な細胞死を生じる。細胞死は、生存細胞におけるミトコンドリアコハク酸デヒドロゲナーゼがテトラゾリウム塩をホルマザン産物に還元し、蛍光プレートリーダーで検出できる、ＭＴＴ細胞毒性アッセイを使用して測定され得る。
【００８２】
２０ｎＭ〜１０ｐＭの二重特異性抗体の用量範囲を評価する（二重特異性抗体のＭＷは２００ｋＤａである）。各試験濃度の二重特異性抗体（１００μＬ）、２００ｐｇ／ｍＬの組換えヒトＴＮＦα（１００μＬ）、および６．２５μｇ／ｍＬのアクチノマイシン−Ｄ（１００μＬ）を、Ｌ９２９細胞を含有するウェルに加える。試験を処理ごとに二連のウェルで実施する。ＴＮＦα中和抗体（ＩｇＧ４アイソタイプでのアダリムマブ）を、アッセイにおける陽性対照として使用する。抗体混合物を含有するプレートを、室温にて６０分間、インキュベートする。
【００８３】
Ｌ９２９細胞をアッセイ培地（１×ＤＭＥＭ  Ｃｅｌｌｇｒｏ、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、１％ＭＥＭ必須アミノ酸、１％Ｌ−グルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム）中で通常のように培養する。アッセイの日に、細胞を１×ＰＢＳ（Ｃａ＋＋もＭｇ＋＋も含まない）でリンスし、０．２５％トリプシン＋ＥＤＴＡを含む培養フラスコから分離する。アッセイ培地によりトリプシンを不活性化する。Ｌ９２９細胞を、室温にて５分間、２１５×ｇにて遠心分離する。細胞ペレットをアッセイ培地中で再懸濁する。血球計を用いて細胞密度を測定し、１０，０００個のＬ９２９細胞（１００μＬ中）を９６ウェルプレートに加え、一晩、組織培養インキュベータ（３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ２）に入れる。抗体／ＴＮＦα／アクチノマイシン−Ｄ混合物をＬ９２９付着細胞と共に９６ウェルプレートに移し、３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ２にて１８時間インキュベートする。アッセイ培地を取り除き、ＭＴＴ基質混合物をウェル（１２０μＬ）に加える。プレートを３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ２にて３時間置く。細胞死をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  １９０）で４９０ｎｍにてプレートを読み取ることによって測定する。結果は、ＴＮＦαにより誘導される反応の５０％が、データの４パラメータシグモイド適合（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）を使用して、二重特異性抗体または陽性対照抗体のいずれかによって阻害される濃度（ＩＣ５０）（４回の独立した実験の平均＋／−ＳＥＭ）として表す。
【００８４】
この結果により、本発明の二重特異性抗体が、２２６＋／−５２ｐＭのＩＣ５０で用量依存的にＬ９２９細胞のＴＮＦαにより誘導される殺傷を阻害したことが実証される。この阻害は、陽性対照抗体で観察されたもの（ＩＣ５０＝２４３＋／−４９ｐＭ）に匹敵したのに対して、陰性対照抗体はヒトＴＮＦαを阻害しなかった。本発明の二重特異性抗体はヒトＴＮＦαを効果的に中和した。
【００８５】
Ｌ９２９細胞においてインビトロで膜結合ヒトＴＮＦαにより誘導される細胞毒性の阻害
膜結合ＴＮＦαを阻害する二重特異性抗体の能力を研究するために、ＴＮＦαの既知の切断部位を、ＴＮＦ切断の非存在下で、細胞表面上で生物活性ＴＮＦαの発現を可能にすることを以前に実証した変異のセット（Ｍｕｅｌｌｅｒら、１９９９）を使用して不活性化する。切断されていないＴＮＦα構築物はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に安定にトランスフェクトする。これらの細胞はフローサイトメトリーによって示されるように膜結合ＴＮＦαを発現する。ヒト非切断膜結合ＴＮＦαを発現するＣＨＯ細胞とのＬ９２９細胞のインキュベーションにより、急速なＬ９２９細胞死が生じる。
【００８６】
膜結合ヒトＴＮＦαを発現するＣＨＯ細胞を、選択培地（ＡＭ２００１培地、ＭＳＸを含まないＣＨＯ内部増殖培地、８ｍＭグルタミン、ＧＳ補足物、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を有するＨＴ補足物）中で通常のように維持する。アッセイの日に、細胞を計数し、１×ＰＢＳ（Ｃａ＋＋もＭｇ＋＋も含まない）でリンスし、２１５×ｇにて５分間、遠心分離し、アクチノマイシン−Ｄ（６．２５μｇ／ｍＬ）と一緒にＬ９２９アッセイ培地中の５０，０００個の細胞／ｍＬにて再懸濁する。５００個の細胞（１０μＬ中）の細胞懸濁液を、３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ２にて６０分間インキュベートした各濃度の抗体混合物に加える。二重特異性抗体、ヒト非切断膜結合ＴＮＦα  ＣＨＯ細胞、およびアクチノマイシン−Ｄを含有する混合物を、Ｌ９２９付着細胞と共に９６ウェルプレートに移し、３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ２にて１８時間インキュベートする。可溶性ＴＮＦαＬ９２９アッセイについての上記のようにＭＴＴ細胞毒性アッセイを使用して細胞死を測定する。結果は、ＴＮＦαにより誘導される反応の５０％が、二重特異性抗体または陽性対照抗体のいずれかによって阻害される濃度（ＩＣ５０）（３回の独立した実験の平均＋／−ＳＥＭ）として表す。
【００８７】
この結果により、本発明の二重特異性抗体が、６４６＋／−８９．５ｐＭのＩＣ５０で用量依存的にヒト非切断膜結合ＴＮＦαＣＨＯ細胞によりＬ９２９細胞の殺傷を阻害したことが実証される。この阻害は、陽性対照抗体（ＩｇＧ４アイソタイプでのアダリムマブ）（ＩＣ５０＝６６９＋／−１３４ｐＭ）で観察されたものに匹敵したのに対して、陰性対照抗体はヒトＴＮＦαを阻害しなかった。本発明の二重特異性抗体は膜結合ヒトＴＮＦαを効果的に中和した。
【００８８】
インビボでのＣＸＣＬ１のヒトＩＬ−１７またはＴＮＦαにより誘導される産生物の阻害
ヒトＩＬ−１７またはＴＮＦαの注射は、循環しているマウスＣＸＣＬ１の急速および一時的な増加を導く。通常のＣ５７ＢＩ／６Ｊマウス（ｎ＝７／群）を、以下を用いて皮下注射する（１６．７ｎｍｏｌ／ｋｇ）：（ａ）二重特異性抗体、（ｂ）陽性対照抗ＩＬ−１７抗体（ＢＡＦＦ／ＩＬ−１７二重特異性抗体）、（ｃ）陽性対照抗ＴＮＦα抗体（ＩｇＧ４アイソタイプでのアダリムマブ）；または（ｄ）陰性対照抗体（ヒトＩｇＧ４）。２日後、マウスにヒトＩＬ−１７（３μｇ／マウス）またはヒトＴＮＦα（１μｇ／マウス）の単回の腹腔内注射を与える。サイトカインチャレンジの２時間後、マウスを屠殺し、市販のＥＬＩＳＡを使用してＣＸＣＬ１について血漿を分析する。
【００８９】
【表３】
2016510743.tif 000005
【００９０】
この結果により、本発明の二重特異性抗体は、陰性対照抗体を与えた動物と比べて、ヒトＩＬ−１７およびＴＮＦαにより誘導されるＣＸＣＬ１産生物を有意に阻害したことが実証される（ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙ’ｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ検定によって算出した）。二重特異性抗体によるＣＸＣＬ１産生物の減少は陽性対照抗体で観察されたものに匹敵した。したがって、本発明の二重特異性抗体は、マウスにおいてヒトＩＬ−１７およびＴＮＦαによって誘導される生物学的作用を効果的に中和した。
【００９１】
結合アッセイ
ＣＤ１６ａ、ＣＤ３２ａ、およびＣ１ｑ
９６ウェルマイクロプレートを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中１μｇ／ｍＬにて、１００μＬ／ウェルの、Ｃ末端１０−Ｈｉｓタグ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を有するＣＤ３２ａまたはＣ末端６−Ｈｉｓタグ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を有する組換えヒトＣＤ１６ａでコーティングする。９６ウェルマイクロプレートを、ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬにて１００μＬ／ウェルのヒトＣ１ｑ（ＭＰ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）でコーティングする。プレートを密封し、４℃にて一晩インキュベートする。コーティング試薬を各ウェルから取り除き、２００μＬ／ウェルのカゼイン遮断試薬（Ｔｈｅｒｍｏ）を加える。プレートを密封し、室温（ＲＴ）にて１時間インキュベートする。各ウェルを洗浄緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．５）で２回洗浄する。全てカゼイン遮断試薬中で希釈した、本発明の二重特異性抗体、ヒトＩｇＧ１陽性対照、またはヒトＩｇＧ４陰性対照の連続希釈物を各ウェル（１００μＬ／ウェル）に加え、ＲＴにて２時間インキュベートする（抗体は２倍連続希釈で６．２５〜２００μｇ／ｍＬの濃度範囲で試験する）。試験は二連のウェルで実施する。次いでプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、その後、カゼイン遮断試薬中の１００μＬ／ウェルの１：１２，５００希釈のＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈカタログ１０９−０３６−０９７）を加え、ＲＴにて１時間インキュベートする。このポリクローナル抗体はヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４の両方を認識する（データは示さず）。プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄し、ＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ、１００μＬ／ウェル）を加える。インキュベーション時間は、ＣＤ１６ａについて４．５分、ＣＤ３２ａについて９分、およびＣ１ｑについて３０分、全て暗所およびＲＴである。最後に、１００μＬの１．０ＮのＨＣｌを各ウェルに加える。４５０ｎｍに設定した比色分析マイクロプレートリーダーを使用して吸光度を即座に測定する。
【００９２】
ＣＤ６４
９６ウェルマイクロプレートを、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬにて１００μＬ／ウェルの、Ｃ末端６−Ｈｉｓタグ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を有するＣＤ６４でコーティングする。プレートを密封し、４℃にて一晩インキュベートする。コーティング試薬を各ウェルから取り除き、２００μＬ／ウェルのカゼイン遮断試薬を加える。プレートを密封し、ＲＴにて１時間インキュベートする。各ウェルを洗浄緩衝液で２回洗浄する。全てカゼイン遮断試薬中で希釈した、本発明の二重特異性抗体、ヒトＩｇＧ１陽性対照、またはヒトＩｇＧ４陰性対照の連続希釈物を各ウェル（１００μＬ／ウェル）に加え、ＲＴにて１時間インキュベートする（抗体は４倍連続希釈で０．００１〜３００μｇ／ｍＬの濃度で試験する）。試験は二連のウェルで実施する。次いでプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、その後、カゼイン遮断試薬中の１００μＬ／ウェルの１：１２，５００希釈のＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２を加え、ＲＴにて１時間インキュベートする。プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質を加え、暗所中でＲＴにて４．５分間、インキュベートし、そのときに１００μＬの１．０ＮのＨＣｌを各ウェルに加える。４５０ｎｍに設定した比色分析マイクロプレートリーダーを使用して吸光度を即座に測定する。
【００９３】
インビトロ結合実験の結果により、ＣＤ１６ａ、ＣＤ３２ａ、ＣＤ６４、またはＣ１ｑのいずれかに結合する本発明の二重特異性抗体は、ヒトＩｇＧ４陰性対照抗体で観察されるものと同等であることが示される。ヒトＩｇＧ１陽性対照抗体は試験した４つ全ての分子に結合し、アッセイの有効性を実証している。
【００９４】
インビトロでのＣＤ４Ｔ細胞および関節リウマチ滑膜細胞での共培養により誘導されるＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＩＬ−８およびＧ−ＣＳＦ産生の阻害
関節リウマチ（ＲＡ−ＦＬＳ）を有する患者由来のヒト線維芽細胞様滑膜細胞との活性化ヒトＣＤ４Ｔ細胞のインキュベーションにより、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＩＬ−８およびＧ−ＣＳＦなどの炎症性メディエータが産生され、軟骨および骨が破壊される。本発明の二重特異性抗体（二重特異性）（３０ｎＭ（ＭＷまたは２００ｋＤａに基づく））または対照抗体（Ａｂ）を、５０μＬのＣＤ４  Ｔ細胞（１：１のビーズ／細胞比のＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓで活性化した５０，０００個のＴ細胞）を含有するウェルに５０μＬで加える。Ａｂを有するまたは有さない１００μＬの活性化したＣＤ４  Ｔ細胞を次いで、前の晩に１００μＬ中に播種したＲＡ−ＦＬＳ上に加える。試験を処理ごとに８〜９回の反復ウェルにおいて実施する。ヒトＩｇＧ４アイソタイプを陰性対照として使用する。ＩＬ−１７中和ＡｂおよびＴＮＦ中和Ａｂをアッセイにおける陽性対照として使用する。対照Ａｂを二重特異性抗体と同じモル濃度で試験した。
【００９５】
Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋから得た軟膜［Ｌｅｕｋｏ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＲＳ）チャンバ］からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ法を使用してヒトＰＢＭＣを単離する。７ｍＬのＬＲＳ産物をＰＢＳで１４０ｍＬにする。３５ｍＬの軟膜／ＰＢＳを１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ／Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に置いた。管を平衡化し、中断せずに室温（ＲＴ）にて９００×ｇで３０分間、回転させる。間期細胞を血清用ピペットで採取し、ＰＢＳで２回洗浄する。単離したＰＢＭＣを、１０％ＦＢＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬ）、Ｌ−グルタミン（１００単位／ｍＬ）および５×１０−５Ｍの２−ベータメルカプトエタノールを含有するＩｓｃｏｖｅｓ改変ダルベッコ培地中で一晩、４℃で保存する。ＣＤ４  Ｔ細胞を製造業者の指示書に従って陰性選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ単離キット）によって単離する。
【００９６】
Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．からのＲＡ−ＦＬＳ細胞を、Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃからの完全滑膜細胞成長培地中で通常のように培養する。ＲＡ−ＦＬＳをアッセイの日の前日に収集する。細胞を１×ＰＢＳでリンスし、トリプシン−ＥＤＴＡで培養フラスコから分離する。完全なアッセイ培地を分離した細胞に加える。ＲＡ−ＦＬＳをＲＴにて５分間、３１０×ｇにて遠心分離する。細胞ペレットを、アッセイ培地［１０％ＦＢＳ、ペニシリンＧ（１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬ）を含有するアッセイ培地ダルベッコ改変イーグル培地］中で再懸濁する。細胞密度をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｕｎｔｅｓｓで測定し、１０，０００個のＲＡ−ＦＬＳ細胞（１００μＬ中）を９６ウェルプレートの各ウェルに加える。９６ウェル平底プレートを組織培養インキュベータ（３７℃、５％）中に入れる。
【００９７】
Ｔ細胞活性化を抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でコーティングしたＤｙｎａｂｅａｄｓで達成する。使用前に、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを等量の洗浄緩衝液（０．１％ウシ血清アルブミンおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄する。ビーズをＤｙｎａｍａｇｎｅｔ上に置き、１分後、上清を除去する。ビーズをＤｙｎａｍａｇｎｅｔから除去し、ＰＢＭＣ培地［１０％ＦＢＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬ）、Ｌ−グルタミン（１００単位／ｍＬ）および５×１０−５Ｍ２−ベータメルカプトエタノールを含有するＩｓｃｏｖｅｓ改変ダルベッコ培地］中に再懸濁して、４×１０７ビーズ／ｍＬの最初のビーズ濃度を得た。１．２５μＬ中の５０，０００個の洗浄ビーズを５０，０００個のＴ細胞に加える。本発明の二重特異性抗体または対照抗体（Ａｂ）を、ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓと共にＣＤ４  Ｔ細胞上に加える。抗体を有するまたは有さないｄｙｎａｂｅａｄ活性化ＣＤ４  Ｔ細胞を、ＲＡ−ＦＬＳを含有する９６ウェルプレート上に加える。プレートを、６日間、組織培養インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）中に入れる。
【００９８】
アッセイの終わりに、プレートを遠心分離し（ＲＴにて５分間５００×ｇ）、細胞培養培地をポリプロピレン９６ウェルプレートに移し、−８０℃にて凍結する。ＥＬＩＳＡによってＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＩＬ−８およびＧ−ＣＳＦを測定する日に、プレートをＲＴにて解凍する。培地中のＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＩＬ−８およびＧ−ＣＳＦレベルを製造業者の指示書に従ってサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＤｕｏＳｅｔ  Ｎｏ．ＤＹ９０１、ＤＹ５１３、ＤＹ２０８、ＤＹ２１４のそれぞれ）によって測定した。ＥＬＩＳＡ反応の終わりに、プレートをマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＶｅｒｓａＭａｘ  Ｔｕｎａｂｌｅ）で４５０ｎｍにて読み取る。結果をサイトカイン産生（ｎｇ／ｍＬ）として表す。活性化ＣＤ４  Ｔ細胞：ＲＡ−ＦＬＳ共培養での本発明の二重特異性抗体によるサイトカイン阻害は、Ａｂ処理の不在での活性化ＣＤ４  Ｔ細胞：ＲＡ−ＦＬＳ共培養と比較して残ったサイトカインの平均％として示す。
【００９９】
【表４】
2016510743.tif 000006
【０１００】
本発明の二重特性抗体は、対照Ａｂと比較して活性化ヒトＣＤ４  Ｔ細胞：ＲＡ−ＦＬＳ共培養により誘導されたＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＩＬ−８およびＧ−ＣＳＦの産生を阻害した。アッセイは３回実施し、同様の結果であった。
【０１０１】
ヒト化関節炎マウスモデルにおけるインビボでの試験
ヒトＴＮＦのトランスジェニック発現により、マウスにおいて自然発生の進行性炎症性関節炎が引き起こされる（Ｈａｙｗａｒｄ  Ｍ．Ｄ．ら、ＢＭＣ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｄｅｃ  １０；７：１３（２００７））。これらのマウスにおけるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）によるヒトＩＬ−１７のさらなる発現は、自然発生の進行性多発性関節炎をさらに悪化させる。オスのヒトＴＮＦ−トランスジェニックマウス（（Ｂ６．Ｃｇ（ＳＪＬ）−Ｔｇ（ＴＮＦ）Ｎ２１、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ、Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ、ＮＹ、モデル１００６）は、全ての組織においてヒトＴＮＦαの低い構成的発現を生じるプロモーターおよび安定化３’ＵＴＲを含む全ヒトＴＮＦα遺伝子を保有する。動物を食物および水に自由にアクセスさせた状態で１ケージにつき２匹収容する。標準化したスコア付けシステムを使用して、前足および後足においてそれらの関節炎疾患をスコア付けする（前足：０＝変形または腫れの証拠なし、１＝足関節の軽度の腫れ、２＝中度の腫れまたは軽度の変形、３＝重度の腫れまたは重度の変形、４＝重度の腫れおよび重度の変形。後足：０＝変形または腫れの証拠なし、１＝軽度の変形／足指を真っ直ぐ伸ばすことができない、２＝中度の変形／足指を伸ばすことができない、３＝重度中間の変形／軽度の腫れ、４＝顕著な腫れを有する重度中間の変形）。８週齢のマウスに、ヒトＩＬ−１７（ｎ＝３２）についての遺伝子または無関係の遺伝子（ｌａｃｚ、ｎ＝８）を保有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の１×１０１０ゲノムコピーを静脈注射する（尾静脈を介して１００ｕＬ／マウス）。ヒトＩＬ−１７のウイルス発現を、製造業者の指示書に従って市販のＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を使用して尾の断片から得たマウス血漿中で検出する。平均血漿レベルは約５００ｐｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１７である。１２週齢にて、マウスを、それらの臨床関節炎スコア、ヒトＩＬ−１７血漿レベル、および体重に基づいて研究群にランダム化する。異なる抗体による処置をグループ分けの日に開始する。動物に、９週間にわたって毎週、本発明の二重特異性抗体（二重特異性）またはＴＮＦ中和抗体（ＴＮＦ  Ａｂ）またはアイソタイプ対照抗体（Ｎｅｇ  Ｃｔｒｌ  Ａｂ）（２０ｎｍｏｌ／ｋｇ）の２つの異なる用量（２０および３．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）を皮下投与する。臨床関節炎スコアは通常のように盲目様式で決定する。終了時に血漿を心穿刺によって得、後肢を１０％ホルマリンに固定する。後肢をＥＤＴＡ中で脱塩し、トリムし、通常のように処理し、パラフィンに包埋し、切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。関節炎スコア付けを以下の分類について行う：０〜５のスケールで炎症、骨吸収、軟骨損傷、およびパンヌス形成：２０の潜在的合計について０＝正常、１＝最小、２＝軽度、３＝中度、４＝顕著、５＝重度。
【０１０２】
全ての抗体を適切な濃度にてＰＢＳ中で製剤化して、２００ｕＬ／マウスの皮下投与量を得る。
【０１０３】
【表５】
2016510743.tif 000007
【０１０４】
このデータにより、本発明の二重特異性抗体がヒトサイトカインにより誘導される疾患の疾患モデルにおいて有効であることが実証される。
【０１０５】
ヒト化乾癬マウスモデルのインビボ試験
乾癬のヒト化マウスモデルは、免疫不全マウスの背中の皮膚に対する乾癬患者由来のヒト非病変皮膚生検の移植に関与するモデルである。ヒト皮膚を移植した後（３〜４週後）、同じドナー由来のＴ細胞活性化ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を移植片内に皮内注射して、乾癬様表皮肥厚を誘導する（Ｗｒｏｎｅ−ＳｍｉｔｈおよびＮｉｃｋｏｌｏｆｆ  Ｊ．、Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１５；９８（８）：１８７８−８７（１９９６））。
【０１０６】
マウス（１０〜２７匹／群）を、ＰＢＭＣ注射の前日に開始して本発明の二重特異性抗体（二重特異性）（６６．６、３．３または０．６７ｎｍｏｌ／ｋｇ）、ＴＮＦ中和抗体（ＴＮＦ  Ａｂ）（６６．６または３．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）、ＰＢＳまたはベタメタゾン（１日２回、局所）で１週間に１回処置する。３週後、マウスを安楽死させ、移植した皮膚を単離し、表皮の厚さを測定する。
【０１０７】
本発明の二重特異性抗体（６６．６ｎｍｏｌ／ｋｇ）はＰＢＳ対照と比較してヒト皮膚移植片の表皮厚さを有意に減少させた（ｐ＝０．０４７）。本発明の二重特異性抗体（６６．６ｎｍｏｌ／ｋｇ）は、ＴＮＦ  Ａｂ（６６．６ｎｍｏｌ／ｋｇ）より良くヒト皮膚移植片の表皮厚さを減少させることができる（ｐ＝０．００５７）。これらの結果により、乾癬のヒト化マウスモデルにおける本発明の二重特異性抗体の有効性が実証される。
【０１０８】
【表６】
2016510743.tif 000008
【０１０９】
安定解析
二重特異性抗体を１０ｍＭクエン酸塩＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６中で製剤化する。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  ３０，０００ＭＷＣＯ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して１００ｍｇ／ｍＬにて二重特異性抗体を濃縮する。Ｔｗｅｅｎ−８０を０．０２％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで加える。濃縮した試料を４週間にわたって２５℃にて保存する。１週間後、および４週間後、ゼロ時点にてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて高分子量のパーセント（％ＨＭＷ）について試料を解析する。ＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷ−ＸＬ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）カラムを使用したＡｇｉｌｅｎｔ１１００システムでＳＥＣを実施する。５０ｍＭリン酸ナトリウム＋０．３５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を、３５分間、０．５ｍＬ／分で流す移動相として使用する。１ｕＬの体積の濃縮した二重特異性抗体をカラムに注入し、２８０ｎｍにてモニタする。ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎを使用してクロマトグラムを解析し、モノマーピークの前に溶出したピークのＡＵＣ対全ＡＵＣの比を使用して％ＨＭＷを算出する。異なる時点にて２５℃に保存した試料を％ＨＭＷについて解析する。ゼロ時点にて、％ＨＭＷは１．５２であり；１週間にて、％ＨＭＷは２．０１であり；４週間にて、％ＨＭＷは２．３７であった。
【０１１０】
この結果により、４週間後、可溶性凝集体の有意な変化が存在しなかったので、本発明の二重特異性抗体は安定であることが実証される。
【０１１１】
配列
ＨＣ−ＳｃＦｖ：配列番号１
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＴＷＮＳＧＨＩＤＹＡＤＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＶＳＹＬＳＴＡＳＳＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＫＦＴＤＹＨＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＣＬＥＷＭＧＶＩＮＰＴＹＧＴＴＤＹＮＱＲＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＤＹＦＴＧＴＧＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＲＳＬＶＨＳＲＧＥＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＩＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＳＴＨＬＰＦＴＦＧＣＧＴＫＬＥＩＫ
ＬＣ：配列番号２
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＲＹＮＲＡＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＨＣ−ＳｃＦｖ：配列番号３
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＧＡＣＴＡＴＧＣＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＴＣＡＧＣＴＡＴＴＡＣＴＴＧＧＡＡＴＡＧＴＧＧＴＣＡＣＡＴＡＧＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＧＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＧＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＡＧＴＡＣＴＧＣＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＴＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＧＣＴＣＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＴＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＡＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＡＧＴＴＣＡＣＴＧＡＣＴＡＣＣＡＴＡＴＴＣＡＴＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＴＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＧＴＡＡＴＴＡＡＴＣＣＴＡＣＴＴＡＴＧＧＴＡＣＴＡＣＴＧＡＣＴＡＣＡＡＴＣＡＧＣＧＧＴＴＣＡＡＡＧＧＣＣＧＴＧＴＣＡＣＣＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＡＣＧＡＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＴＡＴＧＡＴＴＡＣＴＴＴＡＣＴＧＧＧＡＣＧＧＧＴＧＴＧＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＴＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＡＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＧＴＣＡＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧＣＣＧＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＡＧＴＡＧＧＡＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＴＣＧＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＡＴＴＴＡＣＡＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＡＴＣＴＣＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＡＡＴＴＴＡＴＡＡＡＧＴＴＴＣＣＡＡＣＣＧＧＴＴＴＡＴＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＡＧＧＣＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＴＧＧＡＧＧＣＣＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＴＣＴＣＡＡＡＧＴＡＣＡＣＡＴＣＴＴＣＣＡＴＴＣＡＣＧＴＴＴＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ
ＬＣ：配列番号４
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＧＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＣＧＣＡＡＴＴＡＴＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＴＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＡＡＴＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＴＣＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＧＣＴＡＴＡＡＣＣＧＴＧＣＣＣＣＴＴＡＣＡＣＧＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＧＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ
【配列表】
2016510743000001.app
【国際調査報告】
2016510743.tif 000009
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