(57)【要約】本発明は、試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸の混合物を濃縮し、配列決定を行う方法に関する。本出願は、一態様では、試験試料（例えば、試験ヒト試料など）から、目的の核酸が濃縮された集団を得る方法であって、（ａ）試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸の混合物を提供するステップ；（ｂ）核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；および（ｃ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップを含む方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験試料から、目的の核酸が濃縮された集団を得る方法であって、
（ａ）前記試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸の混合物を提供するステップ；
（ｂ）前記核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸が前記プローブにハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；および
（ｃ）前記プローブがハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記核酸の混合物が、前記試験試料から作製されたゲノムＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーを混合することによって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸の混合物が、（ｉ）前記試験試料中のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するステップ、および（ｉｉ）ゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含むＤＮＡライブラリーを作製して核酸の混合物を提供するステップによって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記プローブの少なくとも１つが、ゲノムＤＮＡ配列中に存在する目的の核酸およびｃＤＮＡ配列中に存在する目的の核酸と相補的である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列が前記混合物中に所定の比率で存在する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記試験試料がヒト試料である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記目的の核酸が、複数のエクソン配列、複数のイントロン配列、複数のイントロン−エクソン接合部、または非コード領域中の複数の配列を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記プローブのセットが、少なくとも約１００種の異なるプローブを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記プローブが、前記核酸混合物内の相補領域と比較して少なくとも約１０×モル過剰で存在する、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記プローブが、癌遺伝子、腫瘍抑制因子、チロシンキナーゼ、ホスファターゼ、または血管遺伝子と相補的な配列を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記プローブを、前記核酸の混合物と接触させる前または接触させた後に固体支持体に付着させる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記プローブおよび前記プローブにハイブリダイズした目的の核酸を前記固体支持体から溶出させるステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記目的の核酸を増幅するステップをさらに含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記濃縮された核酸を分析するステップをさらに含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記分析が、目的の前記濃縮された核酸の配列決定を行うステップを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
試験試料中の核酸を特徴付ける方法であって、（ａ）前記試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸の混合物を提供するステップ；および（ｂ）前記混合物中の前記ゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を同時に行うステップを含む方法。
【請求項１７】
前記核酸の混合物が前記試験試料から作製されたゲノムＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーを混合することによって得られる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸の混合物が、（ｉ）前記試験試料中のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するステップ、および（ｉｉ）ゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含むＤＮＡライブラリーを作製して核酸の混合物を提供するステップによって得られる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記特徴付けが、前記試験試料中の前記ゲノムＤＮＡ配列における変異の決定を含む、請求項１６から１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ゲノムＤＮＡ配列における前記変異が、染色体再編成、一塩基変異（ＳＮＶ）、またはコピー数変異（ＣＮＶ）を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記染色体再編成が、ＤＮＡ配列の欠失、挿入、および転座を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記特徴付けが、前記試験試料中のＲＮＡ転写物における変異の決定を含む、請求項１６から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＲＮＡ転写物における前記変異が、欠失、挿入、転座、ＳＮＶ、または示差的な遺伝子発現を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記配列決定ステップの前に、前記核酸混合物を目的の核酸について濃縮するステップを含む、請求項１６から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記濃縮が、
（ａ）前記核酸の混合物を、前記核酸混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸が前記プローブにハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；および
（ｂ）前記プローブにハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ
を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記配列決定ステップの前に、前記核酸が濃縮された集団に最初の核酸の混合物を添加するステップをさらに含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記配列決定ステップの前に、前記核酸が濃縮された集団にゲノムＤＮＡ配列を添加するステップをさらに含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記配列決定ステップの前に、前記核酸が濃縮された集団にｃＤＮＡ配列を添加するステップをさらに含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸混合物が、対照試料由来のゲノムＤＮＡ配列をさらに含む、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸混合物が、対照試料由来のｃＤＮＡ配列をさらに含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記対照試料と前記試験試料が同じ個体由来である、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記対照試料と前記試験試料が異なる個体由来である、請求項２９または３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、「全核酸の濃縮および次世代シークエンシング」という発明の名称の、２０１３年３月１１日に出願され米国仮出願第６１／７７６，６６６号の利益を請求し、すべての目的についてその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、核酸の混合物を分析することによる、次世代シークエンシングおよびがん診断などの疾患診断に関する。
【背景技術】
【０００３】
核酸配列解析ツールが遺伝子の改変を同定するための基礎になり、それが今度は、遺伝病を診断するため、薬物治療に対する応答性を予測するため、および薬物の薬理ゲノミクスを解析するために有用になる。がん診断が１つの例である。がんにつながる遺伝的変異としては、一塩基変異（ＳＮＶ）、挿入および欠失（Ｉｎｄｅｌ）、コピー数変異（ＣＮＶ）、ならびに転座などが挙げられる。解析には限られた量の試料における稀な遺伝的改変の決定が必要であることが多いので、感度が大きな難題になっている。これは、特に、体細胞突然変異を、当該突然変異を有する細胞に混じって正常な細胞が含有されることが多い組織試料（例えば、がん試料など）において解析する際に当てはまる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）は、がんなどの疾患に関連する異なる種類の遺伝的変異の分子プロファイリングおよび特徴付けのための強力なツールである。ヒトゲノムＤＮＡは複雑であり、多くの反復配列を有する。これにより、配列解析に関するさらなる難題が生じる。第１に、目的の核酸は核酸の混合物の中で著しく不十分に表される可能性がある。第２に、複雑なＤＮＡ試料を分析するための費用は、特にゲノムＤＮＡの解析および多数の遺伝子突然変異の検出に関しては法外に高いことがある。多くの次世代シークエンシング法が開発されてきたが、核酸の調製および配列決定解析のための、高感度であり、正確であり、効率的な方法が依然として必要である。
【０００５】
本明細書において引用されている全ての参考文献の内容は、その全体が参照により組み込まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本出願は、一態様では、試験試料（例えば、試験ヒト試料など）から、目的の核酸が濃縮された集団を得る方法であって、（ａ）試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸の混合物を提供するステップ；（ｂ）核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；および（ｃ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、核酸の混合物は、試験試料から作製されたゲノムＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーを混合することによって得られる。一部の実施形態では、核酸の混合物は、（ｉ）試験試料中のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するステップ、および（ｉｉ）ゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含むＤＮＡライブラリーを作製して核酸の混合物を提供するステップによって得られる。
【０００７】
上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）一部の実施形態では、プローブの少なくとも１つは、ゲノムＤＮＡ配列中に存在する目的の核酸およびｃＤＮＡ配列中に存在する目的の核酸と相補的である。
【０００８】
上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列は、混合物中に所定の比率で存在する。
【０００９】
上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）一部の実施形態では、目的の核酸は、複数のエクソン配列、複数のイントロン配列、複数のイントロン−エクソン接合部、または非コード領域中の複数の配列を含む。
【００１０】
上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）一部の実施形態では、プローブのセットは、少なくとも約１００種の異なるプローブを含む。
【００１１】
上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）一部の実施形態では、プローブは、核酸混合物内の相補領域と比較して少なくとも約１０×モル過剰で存在する。
【００１２】
上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）一部の実施形態では、プローブは、癌遺伝子、腫瘍抑制因子、チロシンキナーゼ、ホスファターゼ、または血管遺伝子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅ）と相補的な配列を含む。
【００１３】
上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）一部の実施形態では、プローブを、核酸の混合物と接触させる前または接触させた後に固体支持体に付着させる。一部の実施形態では、当該方法は、プローブおよびプローブとハイブリダイズした目的の核酸を固体支持体から溶出させるステップをさらに含む。
【００１４】
上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）一部の実施形態では、前記目的の核酸を増幅するステップをさらに含む。
【００１５】
上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）一部の実施形態では、濃縮された目的の核酸の配列決定などの、濃縮された核酸を分析するステップをさらに含む。
【００１６】
別の態様では、試験試料中の核酸を特徴付ける方法であって、（ａ）試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸の混合物を提供するステップ；および（ｂ）混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を同時に行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、核酸の混合物は、試験試料から作製されたゲノムＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーを混合することによって得られる。一部の実施形態では、核酸の混合物は、（ｉ）試験試料中のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するステップ、および（ｉｉ）ゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含むＤＮＡライブラリーを作製して核酸の混合物を提供するステップによって得られる。
【００１７】
上記の実施形態のいずれかに従う一部の実施形態では、特徴付けは、これらに限定されないが、染色体再編成、一塩基変異（ＳＮＶ）、またはコピー数変異（ＣＮＶ）を含めた、試験試料中のゲノムＤＮＡ配列における変異の決定を含む。一部の実施形態では、染色体再編成は、ＤＮＡ配列の欠失、挿入、および転座を含む。
【００１８】
上記の実施形態のいずれかに従う一部の実施形態では、特徴付けは、これらに限定されないが、欠失、挿入、転座、ＳＮＶ、または示差的な遺伝子発現を含めた、試験試料中のＲＮＡ転写物における変異の決定を含む。
【００１９】
上記の実施形態のいずれかに従う一部の実施形態では、方法は、配列決定ステップの前に、核酸混合物を目的の核酸について濃縮するステップを含む。一部の実施形態では、濃縮は、（ａ）核酸の混合物を、前記核酸混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；および（ｂ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップを含む。
【００２０】
上記の実施形態のいずれかに従う一部の実施形態では、方法は、配列決定ステップの前に、核酸が濃縮された集団に最初の核酸の混合物を添加するステップをさらに含む。代替の実施形態では、当該方法は、配列決定ステップの前に、核酸が濃縮された集団にゲノムＤＮＡ配列を添加するステップをさらに含む。さらに別の代替的な実施形態では、当該方法は、配列決定ステップの前に、核酸が濃縮された集団にｃＤＮＡ配列を添加するステップをさらに含む。
【００２１】
上記の実施形態のいずれかに従う一部の実施形態では、核酸混合物は、対照試料、例えば、同じまたは異なる個体由来の対照試料由来のゲノムＤＮＡ配列をさらに含む。
【００２２】
上記の実施形態のいずれかに従う一部の実施形態では、核酸混合物は、対照試料、例えば、同じまたは異なる個体由来の対照試料由来のｃＤＮＡ配列をさらに含む。
【００２３】
本明細書に記載の方法のいずれか１つに適したキットおよび製造品も提供される。
【００２４】
本発明のさらなる実施形態、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から、また本発明の実施を通して明らかになるであろう。
【００２５】
簡潔にするために、本明細書において引用されている特許を含めた刊行物の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、同じ試験試料（例えば、単一の個体由来の試験試料）に由来するゲノムＤＮＡとＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を同時に分析および配列決定することを可能にする核酸調製および濃縮方法を提供する。同時に分析することにより、希少かつ貴重な試料が最大限利用されるようになり、また、臨床の場での核酸の操作および分析が単純化される。ゲノムＤＮＡとＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の複合分析により、試験試料中のゲノムおよびトランスクリプトームに関する補完的な情報がもたらされる。これにより、ゲノムの変異と転写レベルでの変異の両方を反映する試験試料の完全な核酸プロファイルを得ることが可能になる。さらに、ゲノムＤＮＡを分析することによって得られる情報およびＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を分析することによって得られる情報は互いに重複する場合があり、したがって、相互検証が可能になり、核酸分析における信頼度が増す。
【００２７】
したがって、本発明は、一態様では、同じ試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸の混合物から、目的の核酸が濃縮された集団を得る方法を提供する。
【００２８】
別の態様では、同じ試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸の混合物中の核酸を特徴付ける（例えば、配列決定する）方法が提供される。
【００２９】
本明細書に記載の方法に有用なキット、組成物、および製造品も提供される。
定義
【００３０】
「濃縮」という用語は、試料中の特定の核酸配列の相対的な存在量を、濃縮前に前記試料中に最初に存在していた核酸配列全体のレベルと比較して増加させるプロセスを指す。したがって、濃縮ステップにより、例えば目的の核酸配列の絶対的なコピー数が直接増加するのではなく、相対的な百分率または分数としての増加がもたらされる。濃縮のステップ後には、当該試料を、濃縮された核酸集団と称することができる。
【００３１】
本明細書で使用される場合、核酸試料の「複雑さ」とは、その試料中に存在する異なる独特の配列の数を指す。試料は、それが由来する核酸試料よりも複雑でなければ、「複雑さが低い」とみなされる。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「固体支持体」とは、タグと結合する性質を、本質的にまたは当該性質を付与するいくつかの構成成分（例えば、抗体、ストレプトアビジン、核酸、または他の結合性リガンド）の付着によって有する固体または半固体材料を指す。そのような結合は、直接的であっても間接的であってもよい。固体支持体の例としては、これらに限定されないが、ニトロセルロースおよびナイロンメンブレン、アガロースまたはセルロースに基づくビーズ（例えば、セファロース）および常磁性ビーズが挙げられる。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「ライブラリー」という用語は、核酸配列の収集物を指す。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「特異的にハイブリダイズする」という用語は、核酸が、配列が相補的な核酸とハイブリダイズすることを意味する。本明細書で使用される場合、核酸分子の一部が別の核酸分子の相補配列と特異的にハイブリダイズし得る。すなわち、そのような配列の一部が別の分子と「特異的にハイブリダイズ」するために、核酸配列の全長が必ずしもハイブリダイズする必要はない。
【００３５】
本明細書では互換的に使用される、核酸またはオリゴヌクレオチドの「部分」または「領域」とは、２またはそれ超の塩基の連続した配列である。他の実施形態では、領域または部分は、少なくとも約３個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個のいずれかの連続したヌクレオチドである。
【００３６】
配列「突然変異」または「変異」とは、本明細書で使用される場合、参照配列と比較した、目的の配列における任意の配列の改変を指す。参照配列は野生型配列であっても目的の配列と比較したい配列であってもよい。突然変異は、置換、欠失または挿入などの機構に起因する配列内の２つ以上のヌクレオチドの一塩基の変化または改変を含む。
【００３７】
核酸またはプライマーは、例えば、第１の核酸またはプライマーの少なくとも２つの連続した塩基が第２の核酸の少なくとも部分配列と逆平行の関係で組み合わさってまたはハイブリダイズして２重鎖を形成し得る場合、別の核酸と「相補的」である。一部の実施形態では、例えばプライマーと標的核酸配列の間の相補性は１００％完全なものではない。
【００３８】
本明細書で使用される「目的の核酸」という用語は、研究者が目的とする核酸を指す。
【００３９】
「増幅」とは、本明細書で使用される場合、一般に、所望の配列の２つまたはそれ超のコピーを生成するプロセスを指す。「核酸」とは、本明細書で使用される場合、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドもしくは塩基、および／もしくはそれらの類似体、またはＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに組み入れられ得る任意の基質であってよい。核酸は、修飾されたヌクレオチド、例えば、メチル化されたヌクレオチドおよびそれらの類似体などを含んでよい。
【００４０】
「オリゴヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、一般に、必ずしもではないが一般に約２００ヌクレオチド以下の長さである、短く、一般に一本鎖であり、一般に合成の核酸を指す。「オリゴヌクレオチド」および「核酸」という用語は相互排他的なものではない。核酸についての上記の説明がオリゴヌクレオチドに同等にかつ完全に適用可能である。
【００４１】
本明細書で使用される核酸の「断片化」とは、核酸を壊して異なる核酸断片にすることを指す。断片化は、例えば、せん断することによって、または酵素的な反応によって実現することができる。
【００４２】
「プライマー」とは、一般に、標的配列とハイブリダイズすることによって目的の標的に結合し、その後、標的と相補的な核酸の重合を促進する、一般に遊離の３’−ＯＨ基を有する短い一本鎖核酸である。
【００４３】
「ハイブリダイゼーション」および「アニーリング」とは、１つまたは複数の核酸が反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化された複合体が形成される反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対合によって、フーグスティーン結合によって、または任意の他の配列特異的な様式で起こり得る。
【００４４】
本明細書で使用される「アダプター」とは、核酸断片と接合することができるオリゴヌクレオチドを指す。
【００４５】
「ライゲーション」という用語は、アダプターと核酸断片などの２つの核酸に関して本明細書で使用される場合、２つの別々の核酸を共有結合により付着させて、連続した骨格を有する単一のより大きな核酸を生成することを指す。
【００４６】
「３’」という用語は、一般に、核酸またはオリゴヌクレオチド内の、同じ核酸またはオリゴヌクレオチド内の別の領域または位置に対して下流の領域または位置を指す。
【００４７】
「５’」という用語は、一般に、核酸またはオリゴヌクレオチド内の、同じ核酸またはオリゴヌクレオチド内の別の領域または位置に対して上流の領域または位置を指す。
【００４８】
本明細書で使用される「アレイ」とは、核酸または他の分子を担持する、空間的または光学的にアドレス指定可能な領域の配置を含む。アレイが核酸のアレイである場合、核酸は、核酸鎖に沿って任意の点（複数可）でアレイに物理的に吸収させることもでき、化学的に吸収させることもでき、共有結合により付着させることもできる。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「一塩基変異」または略して「ＳＮＶ」という用語は、野生型対立遺伝子と比較した、ゲノム配列内の一塩基位置における変化を指す。
【００５０】
「コピー数変異」または略して「ＣＮＶ」という用語は、野生型ゲノムＤＮＡと比較した、ゲノム配列内の遺伝子コピー数の変化を指す。
【００５１】
「変性」という用語とは、本明細書で使用される場合、核酸２重鎖が２つの単一の鎖に分離することを指す。
【００５２】
本明細書に記載の本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「からなる（consisting）」および／または「から本質的になる（consisting  essentially  of）」を含むことが理解される。
【００５３】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、および「ｔｈｅ（その）」は、別段の指定のない限り、複数の参照対象を包含する。
【００５４】
当業者には理解される通り、「約」値またはパラメータとの言及は、本明細書では、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（かつそれを記載する）。例えば、「約Ｘ」と言及される説明は、「Ｘ」の記載を含む。
【００５５】
本発明の方法
本出願は、一部の実施形態では、試験試料から、目的の核酸が濃縮された集団を得る方法であって、（ａ）試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；および（ｂ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップを含む方法を提供する。
【００５６】
一部の実施形態では、試験試料から、目的の核酸が濃縮された集団を得る方法であって、（ａ）試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸の混合物を提供するステップ；（ｂ）核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；および（ｃ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップを含む方法が提供される。
【００５７】
一部の実施形態では、試験試料から、目的の核酸が濃縮された集団を得る方法であって、（ａ）試験試料から作製されたゲノムＤＮＡライブラリーと、試験試料から作製されたｃＤＮＡライブラリーを混合して核酸の混合物を提供するステップ；（ｂ）核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；および（ｃ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料から、目的の核酸が濃縮された集団を得る方法であって、（ａ）試験試料から作製されたゲノムＤＮＡライブラリーと、試験試料から作製されたｃＤＮＡライブラリーを、所定の比率（例えば、約１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０の比率）で混合して、核酸の混合物を提供するステップ；（ｂ）核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；および（ｃ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ｃＤＮＡライブラリーは、例えば、ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、核内ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、キャップ形成されたＲＮＡ、および低分子ＲＮＡを含む試験試料中の全ＲＮＡから調製されたものである。一部の実施形態では、ｃＤＮＡライブラリーは、リボソームＲＮＡが除去された処理済みＲＮＡ試料から調製されたものである。一部の実施形態では、ｃＤＮＡライブラリーはｍＲＮＡから調製されたものである。
【００５８】
一部の実施形態では、試験試料から、目的の核酸が濃縮された集団を得る方法であって、（ａ）試験試料中のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するステップ；（ｂ）ゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含むＤＮＡライブラリーを作製して核酸の混合物を提供するステップ；（ｂ）核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；および（ｃ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、逆転写は、例えば、ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、核内ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、キャップ形成されたＲＮＡ、および低分子ＲＮＡを含む試験試料中の全ＲＮＡを用いて行われる。一部の実施形態では、逆転写は、リボソームＲＮＡが除去された処理済みＲＮＡ試料を用いて行われる。一部の実施形態では、逆転写は、ｍＲＮＡを用いて行われる。
【００５９】
一部の実施形態では、当該方法は、濃縮された目的の核酸を分析する（例えば、配列決定する）ステップをさらに含む。一部の実施形態では、当該方法は、分析前に目的の核酸を増幅するステップをさらに含む。
【００６０】
別の態様では、本出願は、試験試料中の核酸を特徴付ける方法であって、試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を同時に行うステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける方法であって、（ａ）試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸の混合物を提供するステップ；および（ｂ）混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける方法であって、（ａ）試験試料から作製されたゲノムＤＮＡライブラリーと、試験試料から作製されたｃＤＮＡライブラリーを混合して核酸の混合物を提供するステップ；および（ｂ）混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける方法であって、（ａ）試験試料から作製されたゲノムＤＮＡライブラリーと、試験試料から作製されたｃＤＮＡライブラリーを、所定の比率（例えば、約１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０の比率）で混合して、核酸の混合物を提供するステップ；および（ｂ）混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ｃＤＮＡライブラリーは、例えば、ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、核内ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、キャップ形成されたＲＮＡ、および低分子ＲＮＡを含む試験試料中の全ＲＮＡから調製されたものである。一部の実施形態では、ｃＤＮＡライブラリーは、リボソームＲＮＡが除去された処理済みＲＮＡ試料から調製されたものである。一部の実施形態では、ｃＤＮＡライブラリーはｍＲＮＡから調製されたものである。
【００６１】
一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける方法であって、（ａ）試験試料中のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するステップ；（ｂ）ゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含むＤＮＡライブラリーを作製して核酸の混合物を提供するステップ；および（ｃ）混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、逆転写は、例えば、ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、核内ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、キャップ形成されたＲＮＡ、および低分子ＲＮＡを含む試験試料中の全ＲＮＡを用いて行われる。一部の実施形態では、逆転写は、リボソームＲＮＡが除去された処理済みＲＮＡ試料を用いて行われる。一部の実施形態では、逆転写は、ｍＲＮＡを用いて行われる。
【００６２】
一部の実施形態では、核酸の混合物を、分析前に濃縮ステップに供する。したがって、例えば、一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける方法であって、（ａ）試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｂ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ；および（ｃ）目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。
【００６３】
一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける方法であって、（ａ）試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸の混合物を提供するステップ；（ｂ）核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｃ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ；および（ｄ）目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける方法であって、（ａ）試験試料から作製されたゲノムＤＮＡライブラリーと、試験試料から作製されたｃＤＮＡライブラリーを混合して核酸の混合物を提供するステップ；（ｂ）核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｃ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ；および（ｄ）目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーは、所定の比率（例えば、約１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０の比率）で混合される。
【００６４】
一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける方法であって、（ａ）試験試料中のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するステップ；（ｂ）ゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含むＤＮＡライブラリーを作製して核酸の混合物を提供するステップ；（ｃ）核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｄ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ；および（ｅ）目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。
【００６５】
一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける方法であって、（ａ）試験試料から作製されたゲノムＤＮＡライブラリーを、前記ゲノムＤＮＡライブラリー中に存在する目的の核酸と相補的な第１のプローブのセットと、前記ゲノムＤＮＡと前記第１のプローブのセットがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｂ）前記第１のプローブのセットとハイブリダイズしたゲノムＤＮＡをハイブリダイズしていないゲノムＤＮＡから分離し、それにより、目的のゲノムＤＮＡが濃縮された集団を得るステップ；（ｃ）試験試料から作製されたｃＤＮＡライブラリーを、前記ｃＤＮＡライブラリー中に存在する目的のｃＤＮＡと相補的な第２のプローブのセットと、前記ｃＤＮＡと前記第２のプローブのセットがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｄ）前記第２のプローブのセットとハイブリダイズしたｃＤＮＡをハイブリダイズしていないｃＤＮＡから分離し、それにより、目的のｃＤＮＡが濃縮された集団を得るステップ；（ｄ）濃縮された前記目的のゲノムＤＮＡと濃縮された前記目的のｃＤＮＡを混合して目的の核酸の集団を得るステップ；および（ｅ）目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、濃縮された目的のゲノムＤＮＡおよび濃縮された目的のｃＤＮＡは、所定の比率（例えば、約１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０の比率）で混合される。
【００６６】
本明細書に記載の方法は、これらに限定されないが、ゲノムおよび／またはトランスクリプトームの核酸プロファイルを得ること、核酸の配列決定を行うこと、核酸における変異の有無を決定すること、核酸の多型を分析すること、核酸におけるコピー数変異を分析すること、試験試料における遺伝子発現レベルを分析することなどを含めた核酸分析方法のいずれか１つに対して有用であり得る。
【００６７】
したがって、例えば、一部の実施形態では、試験試料中のゲノムおよびトランスクリプトームの核酸プロファイルを得る方法であって、試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を同時に行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中のゲノムおよびトランスクリプトームの核酸プロファイルを得る方法であって、（ａ）試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸の混合物を提供するステップ；および（ｂ）混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中のゲノムおよびトランスクリプトームの核酸プロファイルを得る方法であって、（ａ）試験試料から作製されたゲノムＤＮＡライブラリーと、試験試料から作製されたｃＤＮＡライブラリーを混合して核酸の混合物を提供するステップ；および（ｂ）混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中のゲノムおよびトランスクリプトームの核酸プロファイルを得る方法であって、（ａ）試験試料から作製されたゲノムＤＮＡライブラリーと、試験試料から作製されたｃＤＮＡライブラリーを、所定の比率（例えば、約１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０の比率）で混合して、核酸の混合物を提供するステップ；および（ｂ）混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ｃＤＮＡライブラリーは、例えば、ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、核内ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、キャップ形成されたＲＮＡ、および低分子ＲＮＡを含む試験試料中の全ＲＮＡから調製されたものである。一部の実施形態では、ｃＤＮＡライブラリーは、リボソームＲＮＡが除去された処理済みＲＮＡ試料から調製されたものである。一部の実施形態では、ｃＤＮＡライブラリーはｍＲＮＡから調製されたものである。
【００６８】
一部の実施形態では、試験試料中のゲノムおよびトランスクリプトームの核酸プロファイルを得る方法であって、（ａ）試験試料中のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するステップ；（ｂ）ゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含むＤＮＡライブラリーを作製して核酸の混合物を提供するステップ；および（ｃ）混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、逆転写は、例えば、ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、核内ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、キャップ形成されたＲＮＡ、および低分子ＲＮＡを含む試験試料中の全ＲＮＡを用いて行われる。一部の実施形態では、逆転写は、リボソームＲＮＡが除去された処理済みＲＮＡ試料を用いて行われる。一部の実施形態では、逆転写は、ｍＲＮＡを用いて行われる。
【００６９】
一部の実施形態では、試験試料中の目的のゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの核酸プロファイルを得る方法であって、（ａ）試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｂ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ；および（ｃ）目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中の目的のゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの核酸プロファイルを得る方法であって、（ａ）試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸の混合物を提供するステップ；（ｂ）核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｃ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ；および（ｄ）目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中の目的のゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの核酸プロファイルを得る方法であって、（ａ）試験試料から作製されたゲノムＤＮＡライブラリーと、試験試料から作製されたｃＤＮＡライブラリーを混合して核酸の混合物を提供するステップ；（ｂ）核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｃ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ；および（ｄ）目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーは、所定の比率（例えば、約１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０の比率）で混合される。
【００７０】
一部の実施形態では、試験試料中の目的のゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの核酸プロファイルを得る方法であって、（ａ）試験試料中のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するステップ；（ｂ）ゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含むＤＮＡライブラリーを作製して核酸の混合物を提供するステップ；（ｃ）核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｄ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ；および（ｅ）目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。
【００７１】
一部の実施形態では、試験試料中の目的のゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの核酸プロファイルを得る方法であって、（ａ）試験試料から作製されたゲノムＤＮＡライブラリーを、前記ゲノムＤＮＡライブラリー中に存在する目的の核酸と相補的な第１のプローブのセットと、前記ゲノムＤＮＡと前記第１のプローブのセットがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｂ）前記第１のプローブのセットとハイブリダイズしたゲノムＤＮＡをハイブリダイズしていないゲノムＤＮＡから分離し、それにより、目的のゲノムＤＮＡが濃縮された集団を得るステップ；（ｃ）試験試料から作製されたｃＤＮＡライブラリーを、前記ｃＤＮＡライブラリー中に存在する目的のｃＤＮＡと相補的な第２のプローブのセットと、前記ｃＤＮＡと前記第２のプローブのセットがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｄ）前記第２のプローブのセットとハイブリダイズしたｃＤＮＡをハイブリダイズしていないｃＤＮＡから分離し、それにより、目的のｃＤＮＡが濃縮された集団を得るステップ；（ｄ）濃縮された前記目的のゲノムＤＮＡと濃縮された前記目的のｃＤＮＡを混合して目的の核酸の集団を得るステップ；および（ｅ）目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、濃縮された目的のゲノムＤＮＡおよび濃縮された目的のｃＤＮＡは、所定の比率（例えば、約１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０の比率）で混合される。
【００７２】
一部の実施形態では、試験試料における、遺伝的変異およびＲＮＡ転写物における変異を同時に決定する方法であって、試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を同時に行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、遺伝的変異およびＲＮＡ転写物における変異を同時に決定する方法であって、（ａ）試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸の混合物を提供するステップ；および（ｂ）混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、遺伝的変異およびＲＮＡ転写物における変異を同時に決定する方法であって、（ａ）試験試料から作製されたゲノムＤＮＡライブラリーと、試験試料から作製されたｃＤＮＡライブラリーを混合して核酸の混合物を提供するステップ；および（ｂ）混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、遺伝的変異およびＲＮＡ転写物における変異を同時に決定する方法であって、（ａ）試験試料から作製されたゲノムＤＮＡライブラリーと、試験試料から作製されたｃＤＮＡライブラリーを、所定の比率（例えば、約１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０の比率）で混合して、核酸の混合物を提供するステップ；および（ｂ）混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ｃＤＮＡライブラリーは、例えば、ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、核内ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、キャップ形成されたＲＮＡ、および低分子ＲＮＡを含む試験試料中の全ＲＮＡから調製されたものである。一部の実施形態では、ｃＤＮＡライブラリーは、リボソームＲＮＡが除去された処理済みＲＮＡ試料から調製されたものである。一部の実施形態では、ｃＤＮＡライブラリーはｍＲＮＡから調製されたものである。
【００７３】
一部の実施形態では、試験試料における、遺伝的変異およびＲＮＡ転写物における変異を同時に決定する方法であって、（ａ）試験試料中のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するステップ；（ｂ）ゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含むＤＮＡライブラリーを作製して核酸の混合物を提供するステップ；および（ｃ）混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、逆転写は、例えば、ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、核内ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、キャップ形成されたＲＮＡ、および低分子ＲＮＡを含む試験試料中の全ＲＮＡを用いて行われる。一部の実施形態では、逆転写は、リボソームＲＮＡが除去された処理済みＲＮＡ試料を用いて行われる。一部の実施形態では、逆転写は、ｍＲＮＡを用いて行われる。
【００７４】
一部の実施形態では、試験試料における、遺伝的変異およびＲＮＡ転写物における変異を同時に決定する方法であって、（ａ）試験試料から作製されたゲノムＤＮＡライブラリーを、前記ゲノムＤＮＡライブラリー中に存在する目的の核酸と相補的な第１のプローブのセットと、前記ゲノムＤＮＡと前記第１のプローブのセットがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｂ）前記第１のプローブのセットとハイブリダイズしたゲノムＤＮＡをハイブリダイズしていないゲノムＤＮＡから分離し、それにより、目的のゲノムＤＮＡが濃縮された集団を得るステップ；（ｃ）試験試料から作製されたｃＤＮＡライブラリーを、前記ｃＤＮＡライブラリー中に存在する目的のｃＤＮＡと相補的な第２のプローブのセットと、前記ｃＤＮＡと前記第２のプローブのセットがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｄ）前記第２のプローブのセットとハイブリダイズしたｃＤＮＡをハイブリダイズしていないｃＤＮＡから分離し、それにより、目的のｃＤＮＡが濃縮された集団を得るステップ；（ｄ）濃縮された前記目的のゲノムＤＮＡと濃縮された前記目的のｃＤＮＡを混合して目的の核酸の集団を得るステップ；および（ｅ）目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、濃縮された目的のゲノムＤＮＡおよび濃縮された目的のｃＤＮＡは、所定の比率（例えば、約１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０の比率）で混合される。
【００７５】
一部の実施形態では、試験試料中の目的の核酸の遺伝的変異およびＲＮＡ転写物における変異を同時に決定する方法であって、（ａ）試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｂ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ；および（ｃ）目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中の目的の核酸の遺伝的変異およびＲＮＡ転写物における変異を同時に決定する方法であって、（ａ）試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸の混合物を提供するステップ；（ｂ）核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｃ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ；および（ｄ）目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中の目的の核酸の遺伝的変異およびＲＮＡ転写物における変異を同時に決定する方法であって、（ａ）試験試料から作製されたゲノムＤＮＡライブラリーと、試験試料から作製されたｃＤＮＡライブラリーを混合して核酸の混合物を提供するステップ；（ｂ）核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｃ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ；および（ｄ）目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーは、所定の比率（例えば、約１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０の比率）で混合される。
【００７６】
一部の実施形態では、試験試料中の目的の核酸の遺伝的変異およびＲＮＡ転写物における変異を同時に決定する方法であって、（ａ）試験試料中のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するステップ；（ｂ）ゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含むＤＮＡライブラリーを作製して核酸の混合物を提供するステップ；（ｃ）核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｄ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ；および（ｅ）目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。
【００７７】
本明細書に記載の方法は、これらに限定されないが、１）個体における疾患（例えば、がんなど）の診断、２）個体における疾患（例えば、がんなど）が発生するリスクの評価、３）治療レジメ（例えば、がん治療など）に対する個体の応答性の決定、４）個体に対する治療（例えば、がん治療など）の有効性の評価、５）個体に対する継続治療（例えば、がん治療など）の決定；および６）治療レジメ（例えば、がんなど）に対する個体の応答性の予測を含めた目的に有用であり得る、個体由来の核酸試料の分析に有用であり得る。一部の実施形態では、当該方法は、遺伝子検査（例えば、出生前スクリーニングなど）に有用である。一部の実施形態では、当該方法は、個体における薬物の薬物動態学を予測するために有用である。
【００７８】
本明細書に記載の方法は、個人向けの薬の状況において特に有用であり、その場合、個体のゲノムＤＮＡおよびＲＮＡに関する情報を含めた核酸プロファイルを決定し、それを個人向けの治療レジメを考案するための指針として使用する。個体の試料からゲノムＤＮＡおよびＲＮＡに関する情報を得ることができることにより、試料が最大限使用されるようになり、また、臨床試験が単純かつ効率的なものになる。
【００７９】
一部の実施形態では、試験試料由来の核酸の混合物は、対照ゲノムＤＮＡ配列および／または対照ｃＤＮＡ配列をさらに含んでよい。データの解析および比較を容易にするために、これらの対照配列には別々に指標を付ける。対照配列は同じ個体に由来してもよい。例えば、試験試料が腫瘍試料である一部の実施形態では、対照配列は同じ個体の正常な組織由来の対照試料由来であってよい。一部の実施形態では、対照配列は、疾患の診断を受けていない個体などの別の個体から得た対照試料に由来する。
【００８０】
一部の実施形態では、濃縮前の核酸混合物と目的の核酸が濃縮された集団を所定の比率（例えば、約１００，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１，０００、１：１０，０００、または１：１００，０００のいずれかの比率）で組み合わせることによって核酸の混合物を得ることができる。これにより、ゲノムワイドなレベルおよび／またはトランスクリプトームワイドなレベルでの広範な配列決定（または分析）と目的の核酸のディープシークエンシングの両方が可能になる。
【００８１】
したがって、例えば、一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける（例えば、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの核酸プロファイルを得、かつ／または遺伝的変異およびＲＮＡ転写物における変異を同時に検出するなどの）方法であって、（ａ）試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｂ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ；（ｃ）目的の核酸が濃縮された集団に最初の核酸の混合物を所定の比率（例えば、混合物：濃縮物について約１００，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１，０００、１：１０，０００、または１：１００，０００のいずれかの重量比）で添加するステップ、および（ｄ）新しい混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、核酸を特徴付ける（例えば、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの核酸プロファイルを得、かつ／または遺伝的変異およびＲＮＡ転写物における変異を同時に検出するなどの）方法であって、（ａ）試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸の混合物を提供するステップ；（ｂ）核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｃ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ；（ｄ）目的の核酸が濃縮された集団に最初の核酸の混合物を所定の比率（例えば、混合物：濃縮物について約１００，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１，０００、１：１０，０００、または１：１００，０００のいずれかの重量比）で添加するステップ、および（ｅ）新しい混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける（例えば、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの核酸プロファイルを得、かつ／または遺伝的変異およびＲＮＡ転写物における変異を同時に検出するなどの）方法であって、（ａ）試験試料から作製されたゲノムＤＮＡライブラリーと、試験試料から作製されたｃＤＮＡライブラリーを混合して核酸の混合物を提供するステップ；（ｂ）核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｃ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ；（ｄ）目的の核酸が濃縮された集団に最初の核酸の混合物を所定の比率（例えば、混合物：濃縮物について約１００，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１，０００、１：１０，０００、または１：１００，０００のいずれかの重量比）で添加するステップ、および（ｅ）新しい混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーは、所定の比率（例えば、約１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０の比率）で混合される。
【００８２】
一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける（例えば、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの核酸プロファイルを得、かつ／または遺伝的変異およびＲＮＡ転写物における変異を同時に検出するなどの）方法であって、（ａ）試験試料中のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するステップ；（ｂ）ゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含むＤＮＡライブラリーを作製して核酸の混合物を提供するステップ；（ｃ）核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｄ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ；（ｅ）目的の核酸が濃縮された集団に最初の核酸の混合物を所定の比率（例えば、混合物：濃縮物について約１００，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１，０００、１：１０，０００、または１：１００，０００のいずれかの重量比）で添加するステップ、および（ｆ）新しい混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。
【００８３】
一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける（例えば、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの核酸プロファイルを得、かつ／または遺伝的変異およびＲＮＡ転写物における変異を同時に検出するなどの）方法であって、（ａ）試験試料から作製されたゲノムＤＮＡライブラリーを、前記ゲノムＤＮＡライブラリー中に存在する目的の核酸と相補的な第１のプローブのセットと、前記ゲノムＤＮＡと前記第１のプローブのセットがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｂ）前記第１のプローブのセットとハイブリダイズしたゲノムＤＮＡをハイブリダイズしていないゲノムＤＮＡから分離し、それにより、目的のゲノムＤＮＡが濃縮された集団を得るステップ；（ｃ）試験試料から作製されたｃＤＮＡライブラリーを、前記ｃＤＮＡライブラリー中に存在する目的のｃＤＮＡと相補的な第２のプローブのセットと、前記ｃＤＮＡと前記第２のプローブのセットがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｄ）前記第２のプローブのセットとハイブリダイズしたｃＤＮＡをハイブリダイズしていないｃＤＮＡから分離し、それにより、目的のｃＤＮＡが濃縮された集団を得るステップ；（ｅ）濃縮された前記目的のゲノムＤＮＡと濃縮された前記目的のｃＤＮＡを混合して目的の核酸の集団を得るステップ；（ｆ）目的の核酸の集団に濃縮前のゲノムＤＮＡライブラリーとｃＤＮＡライブラリーの混合物を所定の比率（例えば、未濃縮物：濃縮物について約１００，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１，０００、１：１０，０００、または１：１００，０００のいずれかの重量比）で添加するステップ、および（ｆ）新しい混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。
【００８４】
一部の実施形態では、同じ試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列を濃縮された核酸混合物に添加することができる。ゲノムＤＮＡ配列を添加することにより、例えば、ゲノムワイドなレベルでの広範な配列決定（または分析）と目的の核酸のディープシークエンシングの両方が可能になる。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡ配列と核酸混合物の所望の比率は、約１００，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１，０００、１：１０，０００、または１：１００，０００のいずれかである。
【００８５】
したがって、例えば、一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける（例えば、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの核酸プロファイルを得、かつ／または遺伝的変異およびＲＮＡ転写物における変異を同時に検出するなどの）方法であって、（ａ）試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｂ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ；（ｃ）目的の核酸が濃縮された集団に試験試料由来のゲノムＤＮＡ配列を添加して、所定の比率（例えば、約１００，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１，０００、１：１０，０００、または１：１００，０００のいずれかの重量比）の、ゲノムＤＮＡ配列と濃縮された核酸の混合物を得るステップおよび（ｄ）新しい混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける（例えば、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの核酸プロファイルを得、かつ／または遺伝的変異およびＲＮＡ転写物における変異を同時に検出するなどの）方法であって、（ａ）試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸の混合物を提供するステップ；（ｂ）核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｃ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ；（ｄ）目的の核酸が濃縮された集団に試験試料由来のゲノムＤＮＡ配列を添加して、所定の比率（例えば、約１００，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１，０００、１：１０，０００、または１：１００，０００のいずれかの重量比）の、ゲノムＤＮＡ配列と濃縮された核酸の混合物を得るステップおよび（ｅ）新しい混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける（例えば、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの核酸プロファイルを得、かつ／または遺伝的変異およびＲＮＡ転写物における変異を同時に検出するなどの）方法であって、（ａ）試験試料から作製されたゲノムＤＮＡライブラリーと、試験試料から作製されたｃＤＮＡライブラリーを混合して核酸の混合物を提供するステップ；（ｂ）核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｃ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ；（ｄ）目的の核酸が濃縮された集団に試験試料由来のゲノムＤＮＡ配列を添加して、所定の比率（例えば、約１００，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１，０００、１：１０，０００、または１：１００，０００のいずれかの重量比）の、ゲノムＤＮＡ配列と濃縮された核酸の混合物を得るステップ、および（ｅ）新しい混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーを、濃縮前に所定の比率（例えば、約１０：１、５：１、２：１、１：１、１：０、０：１、１：２、１：５、１：１０の比率）で混合する。
【００８６】
一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける（例えば、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの核酸プロファイルを得、かつ／または遺伝的変異およびＲＮＡ転写物における変異を同時に検出するなどの）方法であって、（ａ）試験試料中のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するステップ；（ｂ）ゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含むＤＮＡライブラリーを作製して核酸の混合物を提供するステップ；（ｃ）核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｄ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ；（ｅ）目的の核酸が濃縮された集団に試験試料由来のゲノムＤＮＡ配列を添加して、所定の比率（例えば、約１００，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１，０００、１：１０，０００、または１：１００，０００のいずれかの重量比）の、ゲノムＤＮＡ配列と濃縮された核酸の混合物を得るステップおよび（ｆ）新しい混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。
【００８７】
一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける（例えば、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの核酸プロファイルを得、かつ／または遺伝的変異およびＲＮＡ転写物における変異を同時に検出するなどの）方法であって、（ａ）試験試料から作製されたゲノムＤＮＡライブラリーを、前記ゲノムＤＮＡライブラリー中に存在する目的の核酸と相補的な第１のプローブのセットと、前記ゲノムＤＮＡと前記第１のプローブのセットがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｂ）前記第１のプローブのセットとハイブリダイズしたゲノムＤＮＡをハイブリダイズしていないゲノムＤＮＡから分離し、それにより、目的のゲノムＤＮＡが濃縮された集団を得るステップ；（ｃ）試験試料から作製されたｃＤＮＡライブラリーを、前記ｃＤＮＡライブラリー中に存在する目的のｃＤＮＡと相補的な第２のプローブのセットと、前記ｃＤＮＡと前記第２のプローブのセットがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｄ）前記第２のプローブのセットとハイブリダイズしたｃＤＮＡをハイブリダイズしていないｃＤＮＡから分離し、それにより、目的のｃＤＮＡが濃縮された集団を得るステップ；（ｅ）濃縮された前記目的のゲノムＤＮＡと濃縮された前記目的のｃＤＮＡを混合して目的の核酸の集団を得るステップ；（ｆ）目的の核酸の集団に試験試料由来のゲノムＤＮＡ配列を添加して、所定の比率（例えば、約１００，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１，０００、１：１０，０００、または１：１００，０００のいずれかの重量比）の、ゲノムＤＮＡ配列と濃縮された核酸の混合物を得るステップ、および（ｆ）新しい混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。
【００８８】
一部の実施形態では、同じ試験試料から得たｃＤＮＡ配列を濃縮された核酸混合物に添加することができる。ｃＤＮＡ配列を添加することにより、例えば、トランスクリプトームワイドなレベルでの広範な配列決定（または分析）と目的の核酸のディープシークエンシングの両方が可能になる。一部の実施形態では、ｃＤＮＡ配列と核酸混合物の所望の比率は、約１００，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１，０００、１：１０，０００、または１：１００，０００のいずれかである。
【００８９】
したがって、例えば、一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける（例えば、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの核酸プロファイルを得、かつ／または遺伝的変異およびＲＮＡ転写物における変異を同時に検出するなどの）方法であって、（ａ）試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｂ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ；（ｃ）目的の核酸が濃縮された集団に試験試料由来のｃＤＮＡ配列を添加して、所定の比率（例えば、約１００，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１，０００、１：１０，０００、または１：１００，０００のいずれかの重量比）の、ｃＤＮＡ配列と濃縮された核酸の混合物を得るステップ、および（ｄ）新しい混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける（例えば、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの核酸プロファイルを得、かつ／または遺伝的変異およびＲＮＡ転写物における変異を同時に検出するなどの）方法であって、（ａ）試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸の混合物を提供するステップ；（ｂ）核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｃ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ；（ｄ）目的の核酸が濃縮された集団に試験試料由来のｃＤＮＡ配列を添加して、所定の比率（例えば、約１００，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１，０００、１：１０，０００、または１：１００，０００のいずれかの重量比）の、ｃＤＮＡ配列と濃縮された核酸の混合物を得るステップ、および（ｅ）新しい混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける（例えば、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの核酸プロファイルを得、かつ／または遺伝的変異およびＲＮＡ転写物における変異を同時に検出するなどの）方法であって、（ａ）試験試料から作製されたゲノムＤＮＡライブラリーと、試験試料から作製されたｃＤＮＡライブラリーを混合して核酸の混合物を提供するステップ；（ｂ）核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｃ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ；（ｄ）目的の核酸が濃縮された集団に試験試料由来のｃＤＮＡ配列を添加して、所定の比率（例えば、約１００，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１，０００、１：１０，０００、または１：１００，０００のいずれかの重量比）の、ｃＤＮＡ配列と濃縮された核酸の混合物を得るステップ、および（ｅ）新しい混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーを、濃縮前に所定の比率（例えば、約１０：１、５：１、２：１、１：１、１：０、０：１、１：２、１：５、１：１０の比率）で混合する。
【００９０】
一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける（例えば、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの核酸プロファイルを得、かつ／または遺伝的変異およびＲＮＡ転写物における変異を同時に検出するなどの）方法であって、（ａ）試験試料中のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するステップ；（ｂ）ゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含むＤＮＡライブラリーを作製して核酸の混合物を提供するステップ；（ｃ）核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｄ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ；（ｅ）目的の核酸が濃縮された集団に試験試料由来のｃＤＮＡ配列を添加して、所定の比率（例えば、約１００，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１，０００、１：１０，０００、または１：１００，０００のいずれかの重量比）の、ｃＤＮＡ配列と濃縮された核酸の混合物を得るステップ、および（ｆ）新しい混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。
【００９１】
一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける（例えば、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの核酸プロファイルを得、かつ／または遺伝的変異およびＲＮＡ転写物における変異を同時に検出するなどの）方法であって、（ａ）試験試料から作製されたゲノムＤＮＡライブラリーを、前記ゲノムＤＮＡライブラリー中に存在する目的の核酸と相補的な第１のプローブのセットと、前記ゲノムＤＮＡと前記第１のプローブのセットがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｂ）前記第１のプローブのセットとハイブリダイズしたゲノムＤＮＡをハイブリダイズしていないゲノムＤＮＡから分離し、それにより、目的のゲノムＤＮＡが濃縮された集団を得るステップ；（ｃ）試験試料から作製されたｃＤＮＡライブラリーを、前記ｃＤＮＡライブラリー中に存在する目的のｃＤＮＡと相補的な第２のプローブのセットと、前記ｃＤＮＡと前記第２のプローブのセットがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｄ）前記第２のプローブのセットとハイブリダイズしたｃＤＮＡをハイブリダイズしていないｃＤＮＡから分離し、それにより、目的のｃＤＮＡが濃縮された集団を得るステップ；（ｅ）濃縮された前記目的のゲノムＤＮＡと濃縮された前記目的のｃＤＮＡを混合して目的の核酸の集団を得るステップ；（ｆ）目的の核酸の集団に試験試料由来のｃＤＮＡ配列を添加して、所定の比率（例えば、約１００，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１，０００、１：１０，０００、または１：１００，０００のいずれかの重量比）の、ｃＤＮＡ配列と濃縮された核酸の混合物を得るステップ、および（ｆ）新しい混合物中のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。
【００９２】
一部の実施形態では、核酸は、対照試料から得たゲノムＤＮＡ配列および／またはｃＤＮＡ配列をさらに含む。対照試料中のこれらの配列は違うように指標付けされるが、他の点では試験試料と同じように処理される。一部の実施形態では、対照試料は同じ個体由来である。一部の実施形態では、対照試料は異なる個体由来である。
【００９３】
核酸の混合物を提供すること
本出願の方法は、一部の実施形態では、同じ試料、例えばヒト試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸の混合物を提供することを含む。一部の実施形態では、試料は、組織試料または組織試料から抽出された核酸である。一部の実施形態では、試料は、細胞試料（例えば、ＣＴＣ試料）または細胞試料から抽出された核酸である。一部の実施形態では、試料は、単一細胞または単一細胞から抽出された核酸である。一部の実施形態では、試料は、腫瘍試料または腫瘍試料から抽出された核酸である。一部の実施形態では、試料は、生検試料または生検試料から抽出された核酸である。一部の実施形態では、試料は、ホルムアルデヒド固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料またはＦＦＰＥ試料から抽出された核酸である。
【００９４】
本出願は、本明細書に記載のいずれかの核酸混合物も包含する。本明細書に記載の核酸混合物は、例えば、試験試料由来のゲノムＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーを別々に調製し、次いで、これらの２つのライブラリーを、例えば所定の比率で混合することによって得ることができる。
【００９５】
ゲノムＤＮＡライブラリーは、例えば、試料中のゲノムＤＮＡをゲノムＤＮＡ断片に断片化することによって得ることができる。核酸を断片化する方法は当技術分野で周知である。例示的な方法としては、これらに限定されないが、エキソヌクレアーゼ消化またはエンドヌクレアーゼ消化などの酵素による消化、化学的切断、光切断、およびせん断などの機械力およびこれらの方法の組合せが挙げられる。
【００９６】
次世代シークエンシングを容易にするために、一部の実施形態では、ＤＮＡ断片をプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチドアダプターにライゲーションして、配列決定の準備ができたライブラリーを得る。一部の実施形態では、ライブラリー内のゲノムＤＮＡ配列は、同じ混合物中のゲノムＤＮＡ配列とｃＤＮＡ配列の弁別を可能にする指標を含む。当該指標は、ゲノムＤＮＡ配列を示すために使用され、また、試験試料中のゲノムＤＮＡ配列のみに関連し、同じ実験に関与する可能性がある他の核酸配列には関連しない情報を報告することができるものである。これにより、ゲノムＤＮＡ配列が他の配列（例えばｃＤＮＡ配列など）と物理的に混在しており、物理的に分離または区別することができない場合でさえも、分析の間に得られた情報をゲノムＤＮＡ配列にまでたどることが可能になる。
【００９７】
本明細書に記載のゲノムＤＮＡは１つまたは複数の染色体を有してよい。例えば、染色体を１つ含む原核生物のゲノムＤＮＡを使用することができる。あるいは、染色体を複数含む真核生物のゲノムＤＮＡを本明細書に開示されている方法において使用することができる。したがって、当該方法は、例えば、２もしくはそれ超、４もしくはそれ超、６もしくはそれ超、８もしくはそれ超、１０もしくはそれ超、１５もしくはそれ超、２０もしくはそれ超、２３もしくはそれ超、２５もしくはそれ超、３０もしくはそれ超、または３５もしくはそれ超の染色体と同等のｎ（ｎは一倍体染色体数であり、二倍体染色体数は２ｎになる）を有するゲノムＤＮＡを選択、増幅または分析するために使用することができる。本発明の方法において使用されるゲノムＤＮＡのサイズは、染色体組の塩基対の数またはヌクレオチドの長さに従って測定することもできる。本発明において有用であるゲノムのいくつかの例示的なサイズ推定値は、約３.１Ｇｂｐ（ヒト）、２．７Ｇｂｐ（マウス）、２．８Ｇｂｐ（ラット）、１．７Ｇｂｐ（ゼブラフィッシュ）、１６５Ｍｂｐ（ショウジョウバエ）、１３．５Ｍｂｐ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、３９０Ｍｂｐ（ｆｉｉｇｕ）、２７８Ｍｂｐ（蚊）または１０３Ｍｂｐ（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）である。例えば、より小さなまたはより大きなゲノムを含めた、上に例示されているもの以外のサイズを有するゲノムも使用することができることが当業者には理解されよう。
【００９８】
ｃＤＮＡライブラリーは、例えば、試料中のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することによって得ることができる。一部の実施形態では、ＲＮＡは、例えば、ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、核内ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、キャップ形成されたＲＮＡ、および低分子ＲＮＡを含む試験試料中の全ＲＮＡである。一部の実施形態では、ＲＮＡは、リボソームＲＮＡが除去された処理済みＲＮＡ試料である。一部の実施形態では、ＲＮＡはｍＲＮＡである。次世代シークエンシングを容易にするために、一部の実施形態では、ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡ断片をプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチドアダプターにライゲーションして配列決定の準備ができたライブラリーを得る。一部の実施形態では、クローニングされたｃＤＮＡ配列は、同じ混合物中のゲノムＤＮＡ配列とｃＤＮＡ配列の弁別を可能にする指標を含む。
【００９９】
ゲノムＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーは、所定の比率で混合することができる。一部の実施形態では、核酸混合物中のゲノムＤＮＡライブラリーとｃＤＮＡライブラリーの重量比は、約１００：１、９０：１、８０：１、７０：１、６０：１、５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、または１：１００のいずれかである。一部の実施形態では、核酸混合物中のゲノムＤＮＡライブラリーとｃＤＮＡライブラリーの重量比は、約１０：１、約５：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：５、または約１：１０である。
【０１００】
一部の実施形態では、試料中のＤＮＡとＲＮＡの両方を含有する全核酸を直接使用して核酸の混合物を作製することができる。全核酸を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡの集団を作製することができる。あるいは、リボソームＲＮＡを除去した後にｃＤＮＡの集団を作製することができる。逆転写プロセスの間に、例えば逆転写反応に使用するランダムなプライマーの突出部を使用することによって指標を付加することができ、したがって、それにより、作製したｃＤＮＡ配列をゲノムＤＮＡ配列と区別することができる。次いで、ゲノムＤＮＡ配列とｃＤＮＡ配列の両方を含有する単一のライブラリーを作製することができる。
【０１０１】
一部の実施形態では、試験試料由来のゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡを別々に濃縮し、次いで、混合して、濃縮されたゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの単一の混合物を提供する。
【０１０２】
目的の核酸を濃縮すること
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、目的の核酸を濃縮するステップを含む。当該方法は、一般には、核酸の混合物（または本明細書に記載のゲノムＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリー）を、混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップを含む。本明細書に記載の濃縮方法により、分析される核酸配列の複雑さが低下し、プール内で目的の核酸がより良好に表されることが可能になる。
【０１０３】
したがって、一部の実施形態では、試験試料中の目的の核酸が濃縮された集団を得る方法であって、（ａ）試験試料から得たゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸の混合物を、核酸の混合物中に集合的に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；および（ｂ）前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップを含む方法が提供される。
【０１０４】
一部の実施形態では、試験試料中の目的の核酸が濃縮された集団を得る方法であって、（ａ）試験試料から作製されたゲノムＤＮＡライブラリーを、前記ゲノムＤＮＡライブラリー中に存在する目的の核酸と相補的な第１のプローブのセットと、前記ゲノムＤＮＡと前記第１のプローブのセットがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｂ）前記第１のプローブのセットとハイブリダイズしたゲノムＤＮＡをハイブリダイズしていないゲノムＤＮＡから分離し、それにより、目的のゲノムＤＮＡが濃縮された集団を得るステップ；（ｃ）試験試料から作製されたｃＤＮＡライブラリーを、前記ｃＤＮＡライブラリー中に存在する目的のｃＤＮＡと相補的な第２のプローブのセットと、前記ｃＤＮＡと前記第２のプローブのセットがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ；（ｄ）前記第２のプローブのセットとハイブリダイズしたｃＤＮＡをハイブリダイズしていないｃＤＮＡから分離し、それにより、目的のｃＤＮＡが濃縮された集団を得るステップ；（ｅ）濃縮された前記目的のゲノムＤＮＡと濃縮された前記目的のｃＤＮＡを混合して目的の核酸の集団を得るステップを含む方法が提供される。
【０１０５】
一部の実施形態では、当該方法は、プローブのセットと混合物を接触させるステップの前に、核酸混合物（または本明細書に記載のゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ）を変性させるステップを含む。一部の実施形態では、当該方法は、プローブと混合物を接触させるステップの後に、核酸混合物（または本明細書に記載のゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ）を変性させるステップを含む。次いで、混合物を、プローブが目的の核酸が濃縮された集団とハイブリダイズすることが可能になるアニーリング条件に供する。
【０１０６】
一部の実施形態では、目的の核酸は、癌遺伝子が位置する１つまたは複数の所望の領域を含む。一部の実施形態では、目的の核酸は、腫瘍抑制因子が位置する１つまたは複数の所望の領域を含む。一部の実施形態では、目的の核酸は、チロシンキナーゼが位置する１つまたは複数の所望の領域を含む。一部の実施形態では、目的の核酸は、ホスファターゼが位置する１つまたは複数の所望の領域を含む。一部の実施形態では、目的の核酸は、血管遺伝子が位置する１つまたは複数の所望の領域を含む。一部の実施形態では、目的の核酸は、遺伝子突然変異が位置する１つまたは複数の所望の領域を含む。
【０１０７】
一部の実施形態では、目的の核酸は、疾患を示す一塩基変異を含む。一部の実施形態では、目的の核酸は、疾患試料において示差的に発現する遺伝子転写物に対応する。一部の実施形態では、目的の核酸は、疾患試料における転座事象を反映する。一部の実施形態では、目的の核酸は、疾患試料におけるコピー数変異を生じた核酸に対応する。一部の実施形態では、目的の核酸は、本明細書に記載の特性の２つ以上を集合的に有する核酸を含む。例えば、一部の実施形態では、目的の核酸は、一塩基変異を有する少なくとも１つの核酸および示差的に発現する遺伝子転写物に対応する少なくとも１つの核酸を含む。一部の実施形態では、目的の核酸は、転座事象を反映する少なくとも１つの核酸およびコピー数変異を伴う少なくとも１つの核酸を含む。一部の実施形態では、目的の核酸としては、これらに限定されないが、ゲノム、ゲノム内の遺伝子、コード領域、エクソン、イントロン、遺伝子間領域、イントロン／エクソン接合部、示差的に発現する遺伝子転写物、転座部位などの独特の配列が挙げられる。
【０１０８】
プローブの数は、配列決定が望まれる試料材料の複雑さおよび配列の長さに基づいて選択することができる。本明細書に記載の方法は、単一のプローブまたは複数（すなわち、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００、またはそれ超の混合物）の異なるプローブを使用して行うことができる。これらのプローブを使用して、核酸配列の複数（すなわち、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００、またはそれ超）の異なる領域を濃縮することができる。
【０１０９】
本明細書に記載の方法において使用されるプローブのセットは、所望の目的の核酸に基づいて選択される。本発明の方法を使用した目的の核酸の濃縮は、一部の実施形態では、これらの配列の所定の集団と相補的なプローブを設計し、それらを親和性結合体として使用して目的の核酸を核酸混合物内の望ましくない配列から分離することを伴う。
【０１１０】
核酸の所定の部分と相補的なプローブは、当技術分野で周知の種々の供給源および方法から入手可能な核酸配列情報を使用して設計することができる。例えば、ゲノム配列を含めた核酸配列は、当業者に周知の種々の供給源のいずれかから入手することができる。そのような供給源としては、例えば、ユーザー由来の、公共のまたは民間のデータベース、定期購読供給源およびオンラインの公共のまたは民間の供給源が挙げられる。例えば、ゲノム配列および遺伝子配列を得るための例示的な公共のデータベースとしては、例えば、ＵＣＳＣヒトゲノムデータベース、ｄｂＥＳＴ−ｈｕｍａｎ、ＵｎｉＧｅｎｅ−ｈｕｍａｎ、ｇｂ−ｎｅｗ−ＥＳＴ、Ｇｅｎｂａｎｋ、Ｇｂ＿ｐａｔ、Ｇｂ＿ｈｔｇｓ、Ｒｅｆｓｅｑ、Ｄｅｒｗｅｎｔ  ＧｅｎｅｓｅｑおよびＲａｗ  Ｒｅｅｄデータベースが挙げられる。さらに、使用者が核酸配列情報を作製し、直接使用すること、または、例えばローカルデータベースに保存することができる。ゲノム情報およびトランスクリプトーム情報に関する当業者に周知の種々の他の供給源も存在し、プローブを作製するために同様に使用され得る。
【０１１１】
本明細書に記載の方法において使用されるプローブは、これらに限定されないが、約１０〜約５０、約５０〜約１００、約１００〜約１２０、約１２０〜約１４０、約１４０〜約１６０、約１６０〜約１８０、約１８０〜約２００、約２００〜約３００、約３００〜約４００、または約４００〜約５００ヌクレオチドの長さを含めた任意の長さであってよい。一部の実施形態では、プローブは、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１４５または約１５０ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、プローブは濃縮される核酸に対して過剰にもたらされる。例えば、一部の実施形態では、プローブは、濃縮される核酸の量の少なくとも約１倍、２倍、５倍、１０倍、１０２倍、１０３倍、１０４倍、またはそれ超のいずれかである。一部の実施形態では、プローブは、濃縮される核酸の量の約１０倍、１０２倍、１０３倍、または１０４倍以下である。一部の実施形態では、目的の核酸と比較してモル過剰（例えば、少なくとも約２×、５×、１０×、１５×、２０×、３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、１００×、または１０００×、またはそれ超のいずれか）のプローブを使用する。
【０１１２】
一部の実施形態では、プローブの少なくとも１つは、ゲノムＤＮＡ配列中に存在する目的の核酸およびｃＤＮＡ配列中に存在する目的の核酸と相補的である。例えば、実施形態のいくつかでは、プローブは、ゲノムＤＮＡ配列とｃＤＮＡ配列のどちらにおいても見出され得る遺伝子のエクソンと相補的である。一部の実施形態では、プローブは一本鎖である。一部の実施形態では、プローブは二本鎖であり、それにより、目的の核酸の両方の鎖に対する相補性を有する配列を含む。一部の実施形態では、プローブは、癌遺伝子、腫瘍抑制因子、キナーゼ、ホスファターゼ、細胞周期遺伝子、増殖因子遺伝子、受容体遺伝子、および／または血管遺伝子などの領域と相補的な配列を含む。一部の実施形態では、プローブは、Ｅｌｉｍ  ＲｉｇｈｔＯｎ（商標）１０００  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｅ  ｐａｎｅｌを含む。
【０１１３】
接触させるステップは、固体支持体の不在下の溶液相プロセスで実施することができる。あるいは、接触させるステップは、固定化した試料核酸を用いて、または固定化したプローブを用いて実施することができる。プローブと核酸のハイブリダイゼーションを可能にするために、プローブと接触させる前またはプローブを添加した後に核酸の混合物を変性ステップに供する。
【０１１４】
本明細書に記載のプローブと本明細書に記載の核酸の混合物を、核酸とプローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させる。ハイブリダイゼーションの条件は、本発明では、一般に、当技術分野で公知の高ストリンジェンシー条件であるが、異なるストリンジェンシー条件を使用することができる。ストリンジェンシー条件は、例えば、Sambrookら、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、第３版（２００１年）またはAusubelら、Current  Protocols  in  Molecular  Biology（１９９８年）に記載されている。高ストリンジェンシー条件はハイブリダイゼーションにおける忠実度の増大に有利であり、一方、ストリンジェンシーが低下するとより低い忠実度が許容される。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる状況では異なるものになる。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範囲にわたる指針は、Tijssen、「Overview  of  principles  of  hybridization  and  the  strategy  of  nucleic  acid  assays」、Techniques  in  Biochemistry  and  Molecular  Biology  8212;  Hybridization  with  Nucleic  Acid  Probes（１９９３年）に見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、定義済みのイオン強度およびｐＨで、特異的な配列の熱的融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、標的と相補的なプローブの５０％が標的配列と平衡状態でハイブリダイズする温度である（すなわち、標的配列は過剰に存在するので、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態で占有される）（定義済みのイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度の下で）。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどのへリックス不安定化剤の添加を用いて実現することもできる。ストリンジェンシーは、温度またはホルムアミドの濃度、塩、カオトロピック塩、ｐＨ、および／または有機溶媒などの熱力学的変数であるステップパラメータを変更することによって制御することができる。これらのパラメータは、米国特許第５，６８１，６９７号において概説されている通り、非特異的な結合を制御するためにも使用することができる。したがって、非特異的な結合を減少させるために、ある特定のステップをより高いストリンジェンシー条件で実施することが望ましい場合がある。
【０１１５】
一部の実施形態では、プローブは、プローブおよびそれとハイブリダイズした核酸を認識し、分離することを可能にするタグを含む。ある場合では、タグは、リガンドに特異的に結合し、それにより、分離が容易になる。タグ／リガンドの例示的な対としては、これらに限定されないが、抗体／抗原、抗原／抗体、アビジン／ビオチン、ビオチン／アビジン、ストレプトアビジン／ビオチン、ビオチン／ストレプトアビジン、グルタチオン／ＧＳＴ、ＧＳＴ／グルタチオン、マルトース結合性タンパク質／アミロース、アミロース／マルトース結合性タンパク質、セルロース結合性タンパク質／セルロース、セルロース／セルロース結合性タンパク質などが挙げられる。タグを認識するリガンドを支持材料にカップリング（直接的または間接的に）することができ、それにより今度は分離の物理的手段または化学的手段がもたらされる。
【０１１６】
一部の実施形態では、プローブを、核酸の混合物と接触させる前または接触させた後に、固体支持体（直接またはタグを介して）に付着させる。次いで、プローブとハイブリダイズしていない核酸は洗浄することによって分離して除くことができ、次いで、プローブとハイブリダイズした核酸は溶出ステップによって回収することができる。
【０１１７】
適切な固体支持体としては、これらに限定されないが、プレート、チューブ、ビン、フラスコ、ビーズ、磁気ビーズ、磁気シート、多孔質マトリックス、または任意の固体表面などが挙げられる。例えば、濾過、単離、磁場、遠心分離、洗浄などによって物理的な分離を実施することができる。
【０１１８】
一部の実施形態では、固体支持体は、ビーズ、膜、カートリッジ、フィルター、マイクロタイタープレート、試験管、固体粉末、流し込み成形または押出成形されたモジュール、メッシュ、繊維、磁気粒子複合物、または任意の他の固体材料である。固体支持体は、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン（methulbutene））、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリエチレンテレフタレート、レーヨン、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＣＤＦ）、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロースなどの物質でコーティングされていてよい。一部の実施形態では、固体支持体は、リガンドでコーティングされたものであってもよく、リガンドを浸透させたものであってもよい。
【０１１９】
本明細書に記載の方法において使用することができる他の固体支持体としては、これらに限定されないが、ゼラチン、ガラス、セファロースマクロビーズ、ＣＹＴＯＤＥＳ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）などのデキストランマイクロキャリアが挙げられる。多糖、例えばアガロース、アルギン酸、カラギーナン、キチン、セルロース、デキストランもしくはデンプンなど、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリアクロレイン、ポリビニルアルコール、ポリメチルアクリレート、パーフルオロカーボン、無機化合物、例えばシリカ、ガラス、珪藻土（kieselquhr）、アルミナ、酸化鉄もしくは他の金属酸化物など、または２つもしくはそれ超の天然に存在するポリマー、合成ポリマーもしくは無機化合物の任意の組合せからなる共重合体も意図されている。一部の実施形態では、固体支持体は、カラム（例えば、セファロースカラムなど）である。
【０１２０】
プローブは、当技術分野で公知のいくつかの方法によって固体支持体に付着させることができる。そのような方法としては、例えば、固体支持体上での直接化学合成による付着、化学的付着、光化学的付着、熱による付着、酵素による付着、および／または吸収が挙げられる。一部の実施形態では、プローブを、共有結合的に固体支持体に付着させる。一部の実施形態では、プローブを、共有結合によって固体支持体に付着させる。一部の実施形態では、プローブを、非共有結合的に、例えば、リガンド／タグ相互作用によって固体支持体に付着させる。
【０１２１】
濃縮方法によって得られる複雑さのレベルの低下により、最初の核酸プールの複雑さを１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、またはそれ超低下させることが可能になり得る、または、必要な選択が核酸のほんの数パーセント、さらには数千の塩基対になり得る。例えば、核酸の複雑さは、最初のゲノムおよびトランスクリプトームのサイズならびに必要な低下のレベルに応じて、３０億塩基対から１０百万塩基対またはそれ未満までに低下し得る。この方法を使用して、例えばヒトゲノムＤＮＡの４０％を含む高度に反復性のＤＮＡ配列を複雑な集団から迅速かつ効率的に取り出すことができる。
【０１２２】
一部の実施形態では、当該方法は、分析前に、例えばＰＣＲによって目的の核酸を増幅するステップをさらに含む。そのような増幅は、例えば、目的の核酸を上記の固体支持体から溶出させる前またはその後に行うことができる。
【０１２３】
核酸の分析
本明細書に記載のゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸混合物をさらに分析に供することができる。当該分析は、核酸混合物に対して直接行うことができ、または本明細書に記載の濃縮方法の後に目的の核酸が濃縮された集団に対して行う。
【０１２４】
分析としては、これらに限定されないが、核酸配列決定、突然変異分析、多型の決定などを挙げることができる。本明細書に記載の方法は、核酸試料における突然変異を同定するため、薬物に対する個体の応答性を予測するため；個体における薬物の薬物動態学を予測するため、個体における治療の治療転帰を予測するために特に有用である。当該方法は、出生前スクリーニングのための遺伝子検査などの遺伝子検査にも有用であり得る。
【０１２５】
核酸は、これらに限定されないが、例えば、ＤＮＡ配列決定（Ｒｏｃｈｅ／４５４、Ｈｅｌｉｃｏｓ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ、およびＡＢＩ（ＳＯＬＩＤ）のＳａｎｇｅｒ、パイロシークエンシングまたはシークエンシングシステムを使用する）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ）、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、ビーズアレイアッセイ、プライマー伸長アッセイ、酵素ミスマッチ切断アッセイ、分枝ハイブリダイゼーションアッセイ、ＮＡＳＢＡアッセイ、分子ビーコンアッセイ、サイクリングプローブアッセイ、リガーゼ連鎖反応アッセイ、侵入型切断構造アッセイ、ＡＲＭＳアッセイ、またはサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイを含めた任意の分析方法によって分析することができる。核酸分子の配列決定を行うこと、またはＳＮＰもしくは参照配列と比較した他の差異の存在について分析することができる。
【０１２６】
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって作製された核酸を、２つまたはそれ超のＳＮＰＳを含有する染色体領域のＮＰハプロタイプ決定のため、ペアエンド配列決定方法のためにＤＮＡ配列を濃縮するため、長い読み取り配列、隔離性逆位、欠失、および転座切断点に対する標的断片を作製するため、遺伝子領域全体（エクソンおよびイントロン）の配列決定を行って異常なスプライシングまたは調節を引き起こす突然変異を明らかにするために使用することができる。
【０１２７】
一塩基多型（「ＳＮＰ」）などの多型は、基本的にゲノム全体を通してランダムに分布している。多型は、一塩基の欠失、挿入、または塩基変化を含めた、任意の長さの配列の挿入、欠失、重複、または再編成であってよい。多型は、天然に存在するものであってもよく、変異表現型に関連するものであってもよい。本明細書に記載の方法の使用により、例えば、目的の配列の濃縮を通じて、集団内の異なる個体における、さらには単一の個体由来の異なる試料における実質的に類似した、複雑さが低下した亜集団の実質的に再現性のある利用が可能になる。多型は基本的にゲノム全体を通してランダムに分布しているので、核酸配列の複雑さが低下した集団にはいくつかの多型配列が存在する。そのような複雑さが低下した亜集団を分析して、多型を同定することもでき、その亜集団における多型遺伝子座の遺伝子型を決定することもできる。
【０１２８】
本明細書に記載の方法は、例えば、多型遺伝子座の特定の対立遺伝子に関する知見と、集団内の個体の特定の薬物に対する応答の仕方の相互関係を明らかにしようとするものである薬理ゲノミクスの分野においても有用であり得る。あらゆる薬物について、個体の１０％から４０％までの間が最適に応答しないことが広く推定される。所与の薬物に対する応答プロファイルを作成するために、当該薬物を受けている個体の多型遺伝子座に関する遺伝子型と当該薬物の治療転帰の相互関係を明らかにしなければならない。これは、多数の多型遺伝子座の分析を用いて実施されることが多い。集団における多型遺伝子座を分析することにより遺伝学的な薬物応答プロファイルが推定されたら、特定の薬物に対する応答に関連する遺伝子座に関する臨床的な患者の遺伝子型を決定しなければならない。したがって、臨床的適用のための、薬物応答プロファイルの確立と個体の遺伝子型の同定の両方のために、多数の個体における多数の多型遺伝子座の配列を同定できることが重要である。
【０１２９】
本明細書に記載の方法を使用して作製された核酸（例えば、アダプター（複数可）を含む一本鎖核酸およびプローブによって濃縮された核酸など）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシング法を使用した配列決定分析に供す。Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシング法は、ＳＢＳ前の液相一本鎖核酸の伸長および増幅において固相に結合したプライマーを使用する橋増幅技術を含む。（例えば、Mercierら（２００５年）「Solid  Phase  DNA  Amplification:  A  Brownian  Dynamics  Study  of  Crowding  Effects.」Biophysical  Journal  ８９巻：３２〜４２頁；Bingら（１９９６年）「Bridge  Amplification:  A  Solid  Phase  PCR  System  for  the  Amplification  and  Detection  of  Allelic  Differences  in  Single  Copy  Genes.」Proceedings  of  the  Seventh  International  Symposium  on  Human  Identification、Promega  Corporation  Madison、WI.を参照されたい）。
【０１３０】
Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシング技術には、ペアエンドアダプター配列が隣接した一本鎖核酸を調製することが伴う。ペアエンドアダプターのそれぞれは、独特のプライマーハイブリダイゼーション配列を含有する。核酸を、一本鎖核酸に隣接したアダプター上に存在するプライマーハイブリダイゼーション配列に対応する一本鎖オリゴヌクレオチドでコーティングされたフローセル表面上に分布させる。アダプターとライゲーションした一本鎖核酸はフローセルの表面に結合し、ポリメラーゼに基づく伸長のために試薬に曝露される。ライゲーションした断片の遊離／遠位末端が表面上の相補的なオリゴヌクレオチドと「架橋する」と刺激が起こり、アニーリングステップの間に、結合したプライマーの１つからの伸長産物が他の結合したプライマーと第２の橋鎖を形成する。変性および伸長の繰り返しにより、数百万の独特の位置に局在化した単一分子の増幅がもたらされ、フローセル表面にわたってクローンの「クラスター」が創製される。
【０１３１】
次いで、フローセルを配列決定モジュール内のフルイディクスカセットに入れ、そこで、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および蛍光標識した可逆的に終結したヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴを添加して、各クラスター内の各クローンＤＮＡへの一塩基の組み入れを可能にする。各組み入れステップの後に、フローセル全体の高分解能イメージングを行って、フローセル上の各クラスター位置に組み入れられたヌクレオチドを同定する。イメージングステップの後、化学的なステップを実施して、組み入れられたヌクレオチドの３’末端を遮断解除してその後の別のヌクレオチドの組み入れを可能にする。反復サイクルを実施して、それぞれが特異的なクラスターにおける一塩基伸長を示す一連の画像を作製する。このシステムにより、一般には、２０〜５０ヌクレオチドまでの配列読み取りが生じる。このシークエンシングシステムに関するさらなる詳細は、例えば、Bennettら（２００５年）「Toward  the  1,000  dollars  human  genome.」Pharmacogenomics  ６巻：３７３〜３８２頁；Bennett,  S.（２００４年）「Solexa  Ltd.」Pharmacogenomics  ５巻：４３３〜４３８頁；およびBentley,  D.  R.（２００６年）「Whole  genome  re-sequencing.」Curr  Opin  Genet  Dev  １６巻：５４５〜５２頁において考察されている。
【０１３２】
Ｉｌｌｕｍｉｎａシステムのための鋳型の調製の第１段階は、音エネルギー断片化（sound  energy  fragmentation）（Ｃｏｖａｒｉｓ）によるものなどのＤＮＡ断片化である。
【０１３３】
本明細書において提供される方法は、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームを用いた使用に容易に適合させることができる。具体的には、本明細書に記載のアダプター配列は、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシング法の目的に合うことが理想的である。
【０１３４】
一部の実施形態では、配列決定は、ハイスループットな計器でのマルチプレックスシークエンシングにより、多数の試験試料（および対照試料）を同時に用いて行うことができる。これは、例えば、各試料について個々のバーコード配列を使用することによって実現することができ、したがって、これらをデータ解析の間に弁別することができる。
【０１３５】
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって作製された核酸を、単一分子リアルタイムシークエンシングを使用して分析する。単一分子リアルタイムシークエンシング（ＳＭＲＴ）は、環状化一本鎖核酸についてハイスループットな様式で配列決定するために使用することができる別の大規模並列処理のシークエンシング技術である。Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより開発され、市販されているＳＭＲＴ技術は、例えば、何千もの配列決定反応を同時に行うことができる多重化ゼロモード導波管（ＺＭＷ）のアレイに依拠する。ＺＭＷは、例えば、単一のＤＮＡポリメラーゼによる一本鎖ＤＮＡ分子の鋳型依存性の合成を観察するのに十分に小さな、照らされた観察体積を創製する構造である（例えば、Leveneら（２００３年）「Zero  Mode  Waveguides  for  Single  Molecule  Analysis  at  High  Concentrations」、Science  ２９９巻：６８２〜６８６頁を参照されたい）。ＤＮＡポリメラーゼにより、相補的な蛍光標識されたヌクレオチドが合成されているＤＮＡ鎖に組み入れられると、当該酵素により検出体積内に各ヌクレオチドが数十ミリ秒、例えば、組み入れられなかったヌクレオチドが検出体積を出入りして拡散するのにかかる時間の量よりも長い桁にわたって保持される。この時間の間に、フルオロフォアにより蛍光が放出され、その色がヌクレオチド塩基の同一性に対応する。次いで、ヌクレオチドの組み入れサイクルの一部として、ポリメラーゼにより、定位置に予め保持されたフルオロフォアの結合が切断され、色素が検出体積の外に拡散する。組み入れ後、シグナルはすぐにベースラインに戻り、プロセスが繰り返される。ＺＭＷの追加的な説明およびＳＭＲＴシークエンシングなどの単一分子分析へのそれらの適用は、例えば、そのそれぞれの全体があらゆる目的について参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３／００４４７８１号、および米国特許第６，９１７，７２６号に見出すことができる。Leveneら（２００３年）「Zero  Mode  Waveguides  for  single  Molecule  Analysis  at  High  Concentrations」、Science  ２９９巻：６８２〜６８６頁およびEidら（２００９年）「Real-Time  DNA  Sequencing  from  Single  Polymerase  Molecules.」Science  ３２３巻：１３３〜１３８頁も参照されたい。
【０１３６】
本明細書に記載の方法によって作製された核酸は、ＳＭＲＴシークエンシングプラットフォームを用いた使用に適合させることができる。例えば、合成後、一本鎖ＤＮＡ断片の分子内のライゲーションを触媒する酵素、例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＴｍ、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＴｍ  ＩＩ、またはＴｈｅｒｍｏＰｈａｇｅＴｍを使用して一本鎖核酸を環状化し、ＺＭＷに分布させることができる。あるいは、娘鎖を、環状化する前に断片化することができる。場合によって、断片化された娘鎖の集団から、例えば、上記の通り、環状化前に目的の配列を濃縮することができる。
【０１３７】
一部の実施形態では、当該方法は、データ解析をさらに含む。例えば、新規の配列決定には、配列決定読み取りの集合が必要である。全ゲノム／トランスクリプトーム解析には、参照データベースと比較することが必要である。ＲＮＡ発現レベルの決定には、読み取り数を数量化するアルゴリズムが必要である。一塩基変異の決定には、参照配列と比較することが必要である。データ解析のためのツールおよびソフトウェアが当技術分野で公知である。
【０１３８】
キットおよび製造品
本出願は、さらに、本明細書に記載の方法のいずれか１つのためのキットおよび製造品を提供する。方法の実行に使用される構成成分または物品はいずれも、キット内に、役立つように包装することができる。
【０１３９】
例えば、キットは、逆転写酵素、プライマー、アダプター、ライブラリー構築用の試薬などを含めた、核酸混合物を作製するために有用な構成成分を含んでよい。一部の実施形態では、キットは、これらに限定されないが、プローブのセット、ハイブリダイゼーション試薬、固体支持体、増幅用試薬などを含めた、目的の核酸を濃縮するために有用な構成成分を含むまたはそれをさらに含む。一部の実施形態では、キットは、例えば、配列決定分析用試薬を含めた、混合物中の核酸を分析する（濃縮を伴うまたは伴わない）ために有用な構成成分を含むまたはそれをさらに含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法のいずれか１つまたは複数を実行するための説明書をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、データを解析し、報告するためのソフトウェアをさらに含む。
【国際調査報告】
2016510992.tif 000002
2016510992.tif 000003