(57)【要約】  本発明は早期乳癌予後予測診断用遺伝子およびその用途に関するものであり、詳細には乳癌患者の予後予測診断に必要な情報を提供するためのTRBC1  (T  cell  receptor  beta  constant  1)、BTN3A2(butyrophilin,  subfamily  3,  member  A2)、またはHLA-DPA1(major  histocompatibility  complex,  class  II,  DP  alpha  1)の乳癌予後予測診断遺伝子マーカーおよびその用途に関するものである。本発明の遺伝子マーカーは乳癌患者の予後予測診断が可能であるため抗癌治療の必要性の判断を始め、以後の乳癌治療の方向に対する端緒を提示する目的に有用に使用することができる。
2016516426.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記段階を含む乳癌予後予測方法：
(a)  試料からmRNAを分離する段階、
(b)  TRBC1(T  cell  receptor  beta  constant  1),  BTN3A2(butyrophlin,  subfamily  3,  member  A2)、およびHLA-DPA1(major  histocompatibility  complex,  class  II,  DP  alpha  1)からなる群より選別された一つ以上の遺伝子のmRNA発現レベルを測定する段階、
(c)  上記遺伝子のmRNA発現レベルを標準化する段階および
(d)  上記遺伝子の過剰発現は乳癌予後が良いものと判別する段階。
【請求項２】
上記発現レベルの測定は対象遺伝子に対するPCR増幅を通して行われることを特徴とする請求項1記載の方法。
【請求項３】
上記試料は患者の癌細胞を含む組織のホルマリン固定パラフィン包埋(formalin-fixed  paraffin-embedded,  FFPE)試料であることを特徴とする請求項1記載の方法。
【請求項４】
上記標準化はCTBP1(C-terminal-binding  protein  1)、TBP(TATA-binding  protein)、HMBS(hydroxymethylbilane  synthase)、CUL1(cullin  1)、およびUBQLN1(Ubiquilin-1)からなる群より選別された一つ以上の標準遺伝子の平均発現量に対する比率を算出することにより行なわれることを特徴とする請求項1記載の方法。
【請求項５】
TRBC1  (T  cell  receptor  beta  constant  1),  BTN3A2(butyrophlin,  subfamily  3,  member  A2)、およびHLA-DPA1  (major  histocompatibility  complex,  class  II,  DP  alpha  1)からなる群より選別された一つ以上の遺伝子に対するプライマー対であり、上記プライマー対はPCR増幅により対象遺伝子を増幅することができるものであることを特徴とするプライマー対を有効成分として含む乳癌予後予測診断用組成物。
【請求項６】
請求項5の組成物を含む乳癌予後予測診断キット。
【請求項７】
乳癌患者の予後予測診断に必要な情報を提供するため、患者の試料から下記段階を含む乳癌予後予測値を算出する方法：
(a)  試料からmRNAを分離する段階、
(b)  TRBC1  (T  cell  receptor  beta  constant  1),  BTN3A2(butyrophlin,  subfamily  3,  member  A2)、およびHLA-DPA1(major  histocompatibility  complex,  class  II,  DP  alpha  1)からなる群より選別された一つ以上の遺伝子のmRNA発現レベルを測定する段階、
(c)  上記遺伝子のmRNA発現レベルを標準化する段階、
(d)  標準化された数値を予め定められた計算式に代入して数値を計算する段階、
(e)  上記数値によって乳癌予後が良いもの、または乳癌予後が悪いものに算出する段階。
【請求項８】
上記発現レベルの測定は対象遺伝子に対するPCR増副を通して行なわれることを特徴とする請求項7項記載の方法。
【請求項９】
上記試料は患者の癌細胞を含む組織のホルマリン固定パラフィン包埋試料であることを特徴とする請求項7記載の方法。
【請求項１０】
上記標準化はCTBP1(C-terminal-binding  protein  1)、TBP(TATA-binding  protein)、HMBS(hydroxymethylbilane  synthase)、CUL1(cullin  1)、およびUBQLN1(Ubiquilin-1)からなる群より選別された一つ以上の標準遺伝子の平均発現量に対する比率を算出することにより行なわれることを特徴とする請求項7記載の方法。
【請求項１１】
TRBC1(T  cell  receptor  beta  constant  1)、BTN3A2(butyrophlin,  subfamily  3,  member  A2)、およびHLA-DPA1(major  histocompatibility  complex,  class  II,  DP  alpha  1)からなる群より選別されたいずれか一つの遺伝子に対するプライマー対であり、上記プライマー対はPCR増幅によって対象遺伝子を増幅することができるものであることを特徴とするプライマー対を利用し乳癌患者の試料から上記選別された遺伝子のmRNA発現レベルを測定する段階を含む乳癌予後予測診断方法。
【請求項１２】
TRBC1(T  cell  receptor  beta  constant  1)、BTN3A2(butyrophilin,  subfamily  3,  member  A2)、およびHLA-DPA1(major  histocompatibility  complex,  class  II,  DP  alpha  1)からなる群より選別されたいずれか一つの遺伝子に対するプライマー対であり、上記プライマー対はPCR増幅によって対象遺伝子を増幅することができるものであることを特徴とするプライマー対。
【請求項１３】
TRBC1(T  cell  receptor  beta  constant  1)、BTN3A2(butyrophilin,  subfamily  3,  member  A2)、およびHLA-DPA1(major  histocompatibility  complex,  class  II,  DP  alpha  1)からなる群より選別されたいずれか一つの遺伝子に対するプライマー対であり、上記プライマー対はPCR増幅によって対象遺伝子を増幅することができるものであることを特徴とするプライマー対の乳癌予後予測用製剤の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は2013年04月18日に出願された大韓民国特許出願第10-2013-0043160号（出願番号）に基づく優先権を主張するものであり、上記明細書全体は本出願の参考文献である。
【０００２】
本発明は早期乳癌の予後予測診断用遺伝子およびその用途に関するものであり、詳しくは乳癌患者の予後予測診断に必要な情報を提供するためのTRBC1(T  cell  receptor  beta  constant  1)、BTN3A2(butyrophilin,  subfamily  3,  member  A2)、またはHLA-DPA1(major  histocompatibility  complex,  class  II,  DP  alpha  1)の乳癌予後予測診断遺伝子マーカーおよびその用途に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
ヒトの遺伝子情報が活発に活用されることで、癌研究は遺伝子レベルでのメカニズムを究明する方向に進みつつある。特に、マイクロアレイを利用して数万の遺伝子発現パターンや、遺伝子数の増加または減少に対する情報を基に巨視的観点で癌細胞の特性を究明するに至っている。このような遺伝子レベルの情報を分析することは有機的で複雑な生命現象を理解するに極めて画期的な方法であり、今後一層活性化されると考えられる。特に癌のような複合疾病(complex  disease)の場合、少数の特定遺伝子に対する分析では偏狭的な結果が得られやすく、癌の発生および発達に対する大きな行動パターンを捕捉することが重要であることから遺伝子情報分析が必ず必要である。このように癌研究の基本となる遺伝子情報はマイクロアレイ等の遺伝子チップを利用して製作されるが、数万の遺伝子に対する情報を網羅的に得られる技術は日々に進化し、高費用の短所があるにもかかわらずマイクロアレイを利用した研究活動が活発に展開されながら関連情報の量も爆発的に増加している。2000年度中盤からこのような遺伝子情報が収集されてデータベース化され始めてこのように収集された情報を利用し2次および3次分析を行うことは生命現象研究の求心点になっている。
【０００４】
一般的な発現(expression)遺伝子チップの場合、約2万から3万個の遺伝子のprobeが植え付けられていて、SNPのような精密な情報を測定するマイクロアレイは100万個以上のprobeを有している場合もある。このようなマイクロアレイは実験方法が比較的簡単で標準化されていて、大量の情報を短時間で得られるため極めて効率的であるが、得られた結果を分析することが核心かつ難しい絞り口地点となった。従来の少数の遺伝子を分析することとは比較にならない数万個の遺伝子に対する総合的分析は、統計的分析技術のみならず遺伝子に対する幅広い知識があってこそ、初めて有用な情報を導出できる。その上、大量の情報の貯蔵および分析を遂行できる高性能電算装備も必要であり、関連電算技術も必須である。伝統的な生物学的研究範囲と実験方法のみに慣れた研究者が遂行し難いため、遺伝子情報がおびただしい速度で増加しても、有用に活用できないのが国内の現状である。北米やヨーロッパに比べ少ない資本と研究技術力に対する国内事情を考えると、公開された遺伝子情報を積極的に活用することが生物情報学で先頭指揮すべき部分である。特に、癌に対する研究は最も活発に遺伝子分析を導入しており、相当量の関連情報が蓄積されている。
【０００５】
乳癌は自己診断が可能で、自己診断の重要性が広く広報されながら早期に発見される場合が多い。このような早期乳癌患者に対し手術後抗癌治療の可否を決定することが難しかった。病理学的観察で大略的な予後の予測はできるが、観察結果に対する標準化と定量化が難しく予後予測に対する信頼性が低いため、実際臨床では大体の早期乳癌患者に抗癌治療を勧めている。抗癌治療の特性上、患者への苦痛が極めて大きく、また経済的支出が要求されるが、早期乳癌の場合、抗癌治療が不要な患者が半数以上と推測される。従って、早期乳癌の特性を分析し患者の予後を予測することで不要な抗癌治療を減らせれば、患者の生活の質に大きく足しになると考えられる。マイクロアレイを利用し乳癌において数万個の遺伝子の発現量に対する情報を一度に得られるようになって、分子レベルで乳癌を分類し癌の発生と発達に対するメカニズムを究明しようとする研究が開発に行われている。早期乳癌患者の予後を予測することは臨床において重要なことであり、マイクロアレイを使用して予後を予測する遺伝子を発掘することは、既に2000年代早期から始まっている。マイクロアレイを使用した研究が高費用であるにもかかわらず、相当数の乳癌組織に対する発現プロファイルが製作され、研究者達に公開された。2002年、78名の早期乳癌組織と約10年間追跡された患者の生存情報を分析し、70個の予後予測遺伝子が発掘されたことを初めとし以後約10種の予後予測遺伝子が発表され、その内数遺伝子は常用化されて臨床で活用されている(Chang,  H.Y.,  et  al.,  Gene  expression  signature  of  fibroblast  serum  response  predicts  human  cancer  progression:  similarities  between  tumors  and  wounds.  PLoS  Biol  2(2):  p.  E7(2004);  van  de  Vijver,  M.J.,  et  al.,  A  gene-expression  signature  as  a  predictor  of  survival  in  breast  cancer.  N  Engl  J  Med  347(25):1999-2009(2002);  van  't  Veer,  L.J.,  et  al.,  Gene  expression  profiling  predicts  clinical  outcome  of  breast  cancer.  Nature  415(6871):  530-536(2002);  Wang,  Y.,  et  al.,  Gene-expression  profiles  to  predict  distant  metastasis  of  lymph-node-negative  primary  breast  cancer.  Lancet  365(9460):  671-679(2005);  Buyse,  M.,  et  al.,  Validation  and  clinical  utility  of  a  70-gene  prognostic  signature  for  women  with  node-negative  breast  cancer.  J  Natl  Cancer  Inst,  98(17):1183-92(2006);  Paik,  S.,  Development  and  clinical  utility  of  a  21-gene  recurrence  score  prognostic  assay  in  patients  with  early  breast  cancer  treated  with  tamoxifen.  Oncologist  12(6):631-635(2007);  Paik,  S.,  et  al.,  A  multigene  assay  to  predict  recurrence  of  tamoxifen-treated,  node-negative  breast  cancer.  N  Engl  J  Med  351(27)  :2817-2826(2004);  Sotiriou,  C.,  et  al.,  Gene  expression  profiling  in  breast  cancer:  understanding  the  molecular  basis  of  histologic  grade  to  improve  prognosis.  J  Natl  Cancer  Inst  98(4):262-72(2006);  Pawitan,  Y.,  et  al.,  Gene  expression  profiling  spares  early  breast  cancer  patients  from  adjuvant  therapy:  derived  and  validated  in  two  population-based  cohorts.  Breast  Cancer  Res  7(6):R953-964(2005);  Miller,  L.D.,  et  al.,  An  expression  signature  for  p53  status  in  human  breast  cancer  predicts  mutation  status,  transcriptional  effects,  and  patient  survival.  Proc  Natl  Acad  Sci  USA,  102(38):13550-13555(2005);  Bild,  A.H.,  et  al.,  Oncogenic  pathway  signatures  in  human  cancers  as  a  guide  to  targeted  therapies.  Nature  439(7074):353-357(2006);  Teschendorff,  A.E.,  et  al.,  A  consensus  prognostic  gene  expression  classifier  for  ER  positive  breast  cancer.  Genome  Biol  7(10):R101(2006);  Desmedt,  C.,  et  al.,  Strong  time  dependence  of  the  76-gene  prognostic  signature  for  node-negative  breast  cancer  patients  in  the  TRANSBIG  multicenter  independent  validation  series.  Clin  Cancer  Res  13(11):  3207-3214(2007))。代表的にmammaprint(Agendia)とOncotype  DX(genomic  health)があり、臨床で現在活用されているが、いまだに予後に対する一つの参考資料として使用される場合が多い（vande  Vijver,  M.J.,et  al.,  A  gene-expression  signature  as  a  predictor  of  survival  in  breast  cancer.  N  Engl  J  Med  347(25):1999-2009(2002);Paik,S.,et  al.,A  multigene  assay  to  predict  recurrence  of  tamoxifen-treated,  node-ngative  breast  cancer.  N  Engl  J  Med  351(27):2817-2826(2004)）。
【０００６】
本明細書には多数の論文および特許文献が参照されており、その引用が表示されている。引用された論文および特許文献の開示内容はその全体が本明細書に参照として挿入され本発明が属する技術分野のレベルおよび本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、患者の癌細胞を含む組織のFFPE試料を利用し早期乳癌患者に対する予後予測および抗癌治療の可否などを診断できる遺伝子診断システムを開発するために鋭意研究努力した結果、早期乳癌組織から得たマイクロアレイデータと臨床情報を収集、分析し予後予測と関連した遺伝子を発掘した。発掘された遺伝子の内、FFPE試料に適用できる遺伝子とそのセットを選別し、有用性を確認することで本発明を完成した。
【０００８】
従って、本発明の目的は乳癌患者を予後予測診断する遺伝子マーカーおよびその用途を提供することである。
【０００９】
本発明の目的は乳癌患者を予後予測診断する新たな方法を提供することである。
【００１０】
本発明の目的は乳癌患者の予後予測診断用のキットを提供することである。
【００１１】
本発明の目的は乳癌患者の予後予測診断に必要な情報を提供するために、患者の試料からmRNA分離、遺伝子発現レベル測定、その標準化および予測値の算出段階を含む乳癌予後予測値を算出する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の目的を達成するため、本発明は乳癌患者を予後予測診断する遺伝子マーカーおよびその用途を提供する。
【００１３】
本発明の目的を達成するため、本発明は乳癌患者を予後予測診断する新たな方法を提供する。
【００１４】
本発明の目的を達成するため、本発明は乳癌患者の予後予測診断用のキットを提供する。
【００１５】
本発明の目的を達成するため、本発明は乳癌患者の予後予測診断に必要な情報を提供するために、患者の試料からmRNA分離、遺伝子発現レベル測定、その標準化および予測値の算出段階を含む乳癌予後予測値を算出する方法を提供する。
【００１６】
本発明の目的を達成するため、本発明はTRBC1(T  cell  receptor  beta  constant  1)、BTN3A2(butyrophilin,  subfamily  3,  member  A2)、およびHLA-DPA1(major  histocompatibility  complex,  class  II,  DP  alpha  1)からなる群より選別されたいずれか一つの遺伝子に対するプライマー対であり、上記プライマー対はPCR増幅によって対象遺伝子を増幅できるプライマー対を提供する。
【００１７】
本発明の目的を達成するため、本発明はTRBC1、BTN3A2およびHLA-DPA1からなる群より選別されたいずれか一つの遺伝子に対するプライマー対であり、上記プライマー対はPCR増幅により対象遺伝子を増幅できるプライマー対の乳癌の予後予測用製剤の調製のための用途を提供する。
【００１８】
他の定義がない限り、本明細書に使用された全ての技術的および科学的用語は当業者らにより通常的に理解される同一な意味を持つ。次の参考文献は本発明の明細書に使用された数々の用語の一般的な定義を持つ技術(skill)のひとつを提供する：Singleton  et  al.,DICTIONARY  OF  MICROBIOLOGY  AND  MOLECULARBIOLOGY(2ded.1994);  THE  CAMBRIDGE  DICTIONARY  OF  SCIENCE  AND  TECHNOLOGY(Walkered.,1988);およびHale＆Marham,THE  HARPER  COLLINS  DICTIONARY  OF  BIOLOGY.
【００１９】
以下、本発明の内容をより詳細に説明する。
【００２０】
本発明は乳癌患者を予後予測診断する遺伝子マーカーおよびその用途を提供する。具体的には本発明は乳癌、特に早期乳癌の予後予測診断のため、TRBC1(T  cell  receptor  beta  constant  1)、BTN3A2(butyrophilin,  subfamily  3,  member  A2)、またはHLA-DPA1(major  histocompatibility  complex,  class  II,  DP  alpha  1)の遺伝子マーカーを提供する。したがって、本発明は(a)試料からmRNAを分離する段階、(b)TRBC1(T  cell  receptor  beta  constant  1)、BTN3A2(butyrophilin,  subfamily  3,  member  A2)、およびHLA-DPA1(major  histocompatibility  complex,  class  II,  DP  alpha  1)からなる群より選別された一つ以上の遺伝子のmRNA発現レベルを測定する段階、(c)上記遺伝子のmRNA発現レベルを標準化する段階、および(d)上記遺伝子の過剰発現は乳癌予後が良いと判別する段階を含む乳癌予後予測方法を提供する。
【００２１】
本発明で遺伝子マーカーとして機能するのはTRBC1(T  cell  receptor  beta  constant  1)、BTN3A2(butyrophilin,  subfamily  3,  member  A2)、またはHLA-DPA1(major  histocompatibility  complex,  class  II,  DP  alpha  1)がある。これらは各々独立的に選別されるか、二つ遺伝子の組み合わせ、または三つ遺伝子の組み合わせにより早期乳癌の予後予測診断に利用される。各遺伝子は当業界に公知された各遺伝子の配列、または各遺伝子の同義語(synonym)の配列、好ましくはヒト由来の各遺伝子の配列であり、より好ましくは、TRBC1はGenbank  Accession  No.BC030533.1、BTN3A2はGenbank  Accession  No.NM  007047.3、HLA-DPA1はGenbank  Accession  No.NM  001242524.1,  NM-033554.3に記載された配列である。各遺伝子に対する同義語およびその配列は、GenbankまたはSwissprotで検索することができる。
【００２２】
本発明で乳癌は浸潤乳癌、またはI期、II期、またはIII期乳癌である。さらに、本発明の乳癌はエストロゲン受容体陽性(Estrogen  receptor  positive,  ER+)である。
【００２３】
本発明で“予後(prognosis)”とは、疾患を診断し判断された将来の症状または経過に対する見通しを意味する。癌患者において予後は通常的に癌発病または外科的施術後一定期間内の転移可否または生存期間を意味する。予後の予測（または予後の診断）は特に早期乳癌患者の化学治療可否を始め以後の乳癌治療の方向に対する端緒を提示するので極めて重要な臨床的課題である。予後予測は疾患治療剤に対する患者の反応、治療経過に対する予測も含む。
【００２４】
本発明で試料は乳癌患者の乳癌組織である。上記乳癌組織には一部正常細胞も含まれることがあり、好ましくは患者の癌細胞を含む乳癌組織のホルマリン固定パラフィン包埋(formalin-fixed  paraffin-embedded,  FFPE)試料である。
【００２５】
本発明の乳癌予後予測診断マーカーの検出は対象遺伝子に対するPCR増幅を通して行う。本発明の対象遺伝子の検出は、好ましくは対象遺伝子の発現量の検出、より好ましくは対象遺伝子の発現量の定量的検出である。発現量の検出のため、試料組織内mRNAの分離およびmRNAからのcDNAの合成過程を必要とすることがある。mRNAの分離のためには、当業界に公知された試料におけるRNA分離方法が利用でき、好ましいのはFFPE試料に適合したmRNAの分離方法である。cDNA合成過程はmRNAを鋳型にし、当業界に公知されたcDNA合成方法が利用できる。本発明の乳癌予後予測診断マーカーの検出は、FFPE試料でのmRNA発現の定量的検出であるため、FFPE試料に対するmRNA分離方法およびRT-qPCR(reverse  transcription  quantitative  polymerase  chain  reaction)方法による検出である。
【００２６】
本発明での検出はmRNA発現レベルの測定である。発現レベルの測定は当業界に公知された方法により行えるが、レポーター蛍光染料および／またはクエンチャー(quencher)蛍光染料で標識されたプローブを使用した光学的定量分析システムにより測定することができる。上記測定は産業的に販売されている装備、例えば、ABI  PRISM  7700TM  Sequence  Detection  SystemTM、Roche  Molecular  Biochemicals  Lightcyclerおよびこれらに付属するソフトウェアなどのシステムにより行う。このような測定データは測定値または閾値サイクル(CtまたはCp)で表現される。測定された蛍光値が初めて統計学的に有意なものに記録される時の地点が閾値サイクルであり、これは検出対象がPCR反応の鋳型として存在する早期値に反比例して表れるので、閾値サイクル値が小さい場合、定量的により多い検出対象が存在することを示す。
【００２７】
一方、本発明は、TRBC1,  BTN3A2およびHLA-DPA1からなる群より選別されたいずれか一つの遺伝子に対するプライマー対(primer  pair)であり、プライマー対はPCR増幅により対象遺伝子を増幅できるプライマー対を有効成分として含む乳癌予後予測診断用組成物を提供する。
【００２８】
本明細書で使用される用語“プライマー”は、オリゴヌクレオチドを意味するものであり、核酸鎖（鋳型）に相補的なプライマー延長産物の合成が誘導される条件、つまり、ヌクレオチドとDNA重合酵素のような重合剤の存在、さらに、適合した温度とpHの条件で合成の開始点に作用する。好ましくは、プライマーは単一鎖のジオキシリボヌクレオチドである。本発明で利用されるプライマーは自然(naturally  occurring)dNMP（dAMP,dGMP,dCMPおよびdTMP）、変形ヌクレオチドまたは非自然ヌクレオチドを含む。さらに、プライマーはリボヌクレオチドを含むことができる。
【００２９】
本発明のプライマーはターゲット核酸にアニーリングし鋳型依存性核酸重合酵素によりターゲット核酸に相補的な配列を形成する延長プライマーであり、これは固定化プローブがアニーリングされている位置まで延長されプローブがアニーリングされいる部位を占める。
【００３０】
本発明で利用される延長プライマーはターゲット核酸の第１位置に相補的な混成化ヌクレオチド配列を含む。用語“相補的”とは所定のアニーリングまたは混成化条件下でのプライマーまたはプローブがターゲット核酸配列に選択的に混成化する程十分に相補的なことを意味し、実質的に相補的(substantially  complementary)および完全に相補的(perfectly  complementary)であることを全て包括する意味を有し、好ましくは完全に相補的であることを意味する。本明細書でプライマー配列と関連して使用される用語“実質的に相補的な配列”とは、完全に一致する配列だけでなく、特定配列にアニーリングしてプライマーの役割をすることができる範囲内で比較対象の配列と部分的に不一致する配列も含む。
【００３１】
プライマーは、重合体の存在下で延長産物の合成をプライミングできる度十分長くなければならない。プライマーの適合した長さは多数の要素、例えば、温度、応用分野およびプライマーのソースによって決定されるが、典型的に15-30ヌクレオチドである。短いプライマー分子は鋳型と十分安定した混成複合体を形成するために、一般的に、より低い温度を要求する。用語“アニーリング”または“プライミング”は鋳型核酸にオリゴジオキシヌクレオチドまたは核酸が併置されることを意味し、上記併置とは重合酵素がヌクレオチドを重合させ鋳型核酸またはその一部分に相補的な核酸分子を形成するようになる。
【００３２】
プライマーの配列は鋳型の一部配列と完全に相補的な配列を有する必要はなく、鋳型と混成化されプライマー固有の作用ができる範囲内で十分な相補性を有すればよい。したがって、本発明におけるプライマーは鋳型である前述したヌクレオチド配列に完璧に相補的な配列を有する必要はなく、この遺伝子配列に混成化されてプライマーとして作用できる範囲内で十分な相補性を有すれば十分である。このようなプライマーのデザインは前述したヌクレオチド配列を参照して当業者により容易に実施することができ、例えば、プライマーデザイン用プログラム（例：PRIMER  3プログラム）を利用することができる。
【００３３】
本発明は本発明のプライマー対を含む乳癌の予後予測診断キットを提供する。本発明のキットはTRBC1,BTN3A2および／またはHLA-DPA1のPCRによる増幅が可能なプライマー対以外にPCR反応、試料におけるRNA分離およびcDNAの合成に使用される当業界に公知された道具および／または試薬を追加して含むことができる。本発明のキットは必要に応じて各成分の混合に使用されるチューブ、ウェルプレートおよび使用方法を記載した指示資料などを追加して含むことができる。
【００３４】
本発明は乳癌患者の予後予測診断に必要な情報を提供するため、患者の試料から下記段階を含む乳癌予後予測値を算出する方法を提供する：
(a)  試料からmRNAを分離する段階、
(b)  TRBC1,BTN3A2およびHLA-DPA1からなる群より選別された一つ以上の遺伝子のmRNA発現レベルを測定する段階、
(c)  上記遺伝子のmRNA発現レベルを標準化する段階および
(d)  標準化された数値を予め定められた計算式に代入して数値を計算する段階、
(e)  上記数値のレベルにより乳癌予後が良いまたは悪いと算出する段階
【００３５】
本発明における検出対象の発現レベルは、対象患者または試料によって全体的遺伝子発現量または発現レベルに差があり得るため標準化が必要である。標準化は基本発現量または発現レベルの差を示し得る遺伝子の発現量または発現レベルの差により行われ、好ましくはCTBP1(C-terminal-binding  protein  1)、TBP(TATA-binding  protein)、HMBS(hydroxymethylbilane  synthase)、CUL1(cullin  1)およびUBQLN1(Ubiquilin-1)の内一つまたは五つの遺伝子の発現量（または複数の遺伝子が選別された場合これらの発現量の平均）を測定し、これらに対する比を算出することにより行われる。
【００３６】
一方、本発明はTRBC1,BTN3A2およびHLA-DPA1からなる群より選別されたいずれか一つの遺伝子に対するプライマー対であり、上記プライマー対はPCR増幅により対象遺伝子を増幅できるプライマー対を利用し乳癌患者の試料から上記の選別された遺伝子のmRNA発現レベルを測定する段階を含む乳癌予後予測診断方法を提供する。
【００３７】
本発明のTRBC1,  BTN3A2およびHLA-DPA1からなる群より選別されたいずれか一つの遺伝子に対するプライマー対であり、上記プライマー対はPCR増幅により対象遺伝子を増幅できるプライマー対を提供する。
【００３８】
本発明はTRBC1,BTN3A2およびHLA-DPA1からなる群より選別されたいずれか一つの遺伝子に対するプライマー対であり、上記プライマー対はPCR増幅により対象遺伝子を増幅できるプライマー対の乳癌予後予測用製剤の製造のための用途を提供する。
【００３９】
参考に、上記で言及したヌクレオチドおよびタンパク質作業には下記の文献を参照することができる。(Maniatis  et  al.,  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  Cold  Spring  Harbor,  N.Y.(1982);  Sambrook  et  al.,  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  2d  Ed.,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press(1989);  Deutscher,  M.,  Guide  to  Protein  Purification  Methods  Enzymology,  vol.  182.  Academic  Press.  Inc.,  San  Diego,  CA(1990);  Ausubel  et  al.,  Current  Protocols  of  Molecular  Biology,  John  Wiley  and  Sons  (1997);  Rupp  and  Locker,  Lab  Invest.  56:  A67  (1987);  De  Andres  et  al.,  BioTechniques  18:  42044  (1995);  Held  et  al.,  Genome  Research  6:986-994  (1996);  T.E.  Godfrey  et  al.  J.  Molec.  Diagnostics  2:  84-91  (2000);  K.  Specht  et  al.,  Am.  J.  Pathol.  158:  419-29  (2001)).
【発明の効果】
【００４０】
本発明は早期乳癌の予後予測診断用の遺伝子マーカーを提供する。本発明の遺伝子マーカーは乳癌患者の予後および予測の診断が可能であるため抗癌治療の必要性の判断を始め、以後乳癌治療の方向に対する端緒を提示する目的で有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１ａ】図1aは乳癌組織のマイクロアレイデータのキュレーション(curation)および前処理(pre-processing)による標準化過程を示した模式図である。
【図１ｂ】図1ｂはディスカバリーデータセットから予後予測遺伝子を発掘する過程を示した図である。
【図２】図2は予後予測モデル（凍結試料）をディスカバリーデータセットにおいて検証した結果である。9aは予後予測モデルを利用した全体患者の予後予測指数を4等分して4個の予後集団に分類した後、各予後集団の観察された生存確率がよく分離されたかを確認している。観察された生存確率と予測された生存確率も比較した。9bは全患者の観察された生存確率と予後予測モデルを利用し予測された生存確率を比較したものである。9cは最も影響力が高いp.meanに対して全患者を四つの集団に分けて各集団の観察された生存確率が予後予測モデルを利用して予測された生存確率と一致するかを調べた図である。9dは、5年生存率に対して観察された生存確率と予測された生存確率がどれ程一致するかを調べた図である。
【図３】図3は予後予測モデルを検証セット1で検証した結果である。ディスカバリーデータセットで検証した方法と同一である。10aは判別に対する検証結果であり、10bは観察された時間に対する矯正の検証結果である。10cは5年生存率に対する矯正の検証結果である。
【図４】図4は予後予測モデルを検証セット2で検証した結果である。ディスカバリーデータセットで検証した方法と同一である。11aは判別に対する検証結果であり、11bは観察された時間に対する矯正の検証結果である。11cは5年生存率に対する矯正の検証結果である。
【図５】図5は予後予測モデルを検証セット3で検証した結果である。ディスカバリーデータセットで検証した方法と同一である。
【図６】図6は選別されたp-geneに対するFFPE試料(siemens,縦軸)／凍結試料(frozen、横軸）間の関連性測定結果であり、遺伝子の名称および関連性の値(cor)はそれぞれ記載された通りである。
【図７】図7は選別されたi-geneに対するFFPE試料(siemens,縦軸)／凍結試料(frozen、横軸）間の関連性測定結果であり、遺伝子の名称および関連性の値(cor)はそれぞれ記載された通りである。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
【００４３】
但し、下記実施例は本発明を例示するのみであり、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【００４４】
本明細書の実施例は大韓民国特許公開公報第10-2012-0079295号およびPCT公開公報WO2012093821A2に開示された内容がその全体として本明細書に参照として挿入され、本発明が属する技術分野のレベルおよび本発明の内容がより明確に説明される。
【００４５】
<実験方法>
早期乳癌組織の発現プロファイルの収集
早期乳癌患者の冷凍癌組織を利用して得た発現プロファイルと臨床情報を公開データベースであるGEO（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）から収集した。総9個の独立した発現プロファイルセットらは各々100個以上のサンプルで構成された比較的大きいデータセットであり、全て早期乳癌患者の予後と関連した研究を行うために作られた(2,4,9,10,13,25,32,33)。その内8個のデータセットはAffymetrix  U133Aマイクロアレイプラットフォームで作られ、残りの一つのみAgilent  Hu25Kで製作された。多くの場合、患者の重要臨床情報（年齢、性別、癌の大きさ、転移状態および分化程度）と生存情報が共に収集されている。8個のAffymetrix  U133Aで製作されたデータセットの内、6個のデータセットは生存情報が外部組織への転移(distant  metastasis  free  survival)に対するものであり、残りの2個は生存期間(overall  survival)である。Agilentデータは外部組織転移に対する生存情報を有している。外部組織の転移が予後決定において最も決定的な事件であること、外部組織転移は癌の固有の特性により決定されること、また収集されたデータに最も多い患者が外部組織転移に対する情報を有していることから、外部組織の転移の可否を基にし生存分析をすることにした。収集された全ての患者の情報を比較して重複した186名の患者の発現プロファイルを取除き、総1,861名のユニークな患者に対し研究を行った。同一のプラットホーム(Affymetrix  U133A)で製作された7個のデータセットに対して該当する全ての患者の発現プロファイルの原本フアィル(.CEL)を集め、標準化を行った。標準化方法はrma  (background  correction:  rma,  normalization:  quantile,summarization:  medianpolish)方法で行い、標準化遂行時Manhong  Daiらが開発したcostom  CDF(http://brainarray.mbni.med.umich.edu/Brainarray/)  ENTREZG  verion13を利用した(34)。標準化後、各プローブの発現量はディスカバリーデータセット内のプローブ別平均値を差引くことで、1-色(color)発現量を2-色発現量と同じ形態に変換させた。総8個の標準化されたデータセットの内5個のデータセットは一つにまとめてディスカバリーデータセットとして使用し、2個は別にまとめて検証データセット1とし、残りの一つは検証データセット2として使用した。Agilentデータセットも検証データセット3として使用した。
【００４６】
患者の予後およびER状態に対する定義設定
患者の予後と関連した遺伝子を発掘するために、収集された患者を予後が良い集団と予後が悪い集団に分類した。一般的に、臨床では5年生存あるいは転移情報を利用して分類する。つまり、5年内に転移が発生したり死亡する場合、予後が悪いと言い、5年以上転移がなかったり生存した場合、予後が良いという。ディスカバリーデータセットの患者情報を利用して転移が発生した患者らの生存時間の分布を調べた。転移が発生した患者の73%以上が5年以内に転移が発生し、10年以後に転移が観察された場合は7%未満であった。これを基にディスカバリーデータセットの患者の内5年以内に転移が発生した217名の患者を“予後が悪い集団”に、10年以上転移が発生しない281名の患者を“予後が良い集団”に分類した。分類結果、予後が悪い集団の生存時間中央値は2.4年で、予後が良い集団の生存時間中央値は12.9年であった。予後が悪い集団と良い集団を明確に分類することで、不確実な生存情報による誤謬を最小限に減らすことができた。エストロゲン受容体（Estrogen  receptor,  ER）の発現可否は乳癌患者をサブタイプに分類する際、最も普遍的に使用する基準である。普通、臨床では病理学者によるER  IHC(immunohistochemistry)判読結果により、ER+あるいはER-に分ける。収集されたディスカバリーデータセットで約200名の患者がER  IHC情報がなく、ディスカバリーデータセットを構成する5個のデータセットが独立的にER  IHCの決定がなされたことを考慮し、患者別発現プロファイル内のESR1遺伝子のmRNA発現量を利用してER状態を決定した。ER  IHC情報がある患者に対して、ER  IHC情報とESR1  mRNA発現量を利用してROC(region  of  convergence)分析を行った。ER  IHC結果とESR1  mRNA発現量を比較して最も正確度(0.88)が高い発現量地点をカットオフし、カットオフ以上の発現量を示す場合はER+、カットオフ以下の発現量を示す場合はER-に分類した。ディスカバリーデータセットで864名をER+に240名をER-に配置した。
【００４７】
予後予測遺伝子の選択
ディスカバリーデータセットで予後が良い集団と悪い集団をER+、ER-の場合に分類した。予後が良い患者は総275名、予後が悪い患者は218名であった。SAM(Significant  Analysis  of  Microarray)分析を通して予後集団間の発現量に差が生じる遺伝子を調べた。SAM分析結果のq-値を利用し予後が良い集団で過発現された遺伝子、悪い集団で過発現された遺伝子を選択した。選択された遺伝子を一つにまとめた結果、総302個の重複していない遺伝子セットが作られ、これら遺伝子の発現パターンを調べるための群集分析を主成分分析(Principal  Component  Analysis,  PCA)方法を利用して行った。二つの主成分を選択して各主成分に対して関連した生物学的機能を調べるため、群集別にGO機能分析を行った。
【００４８】
GO分析結果、主成分1は増殖に集中し、主成分2は免疫反応に集中していることが示された。増殖と免疫反応に関与する二つの主成分に属する遺伝子を対象に、予後集団間発現量が最も大きい遺伝子をそれぞれ選択した。各遺伝子セットは、遺伝子は増殖の発現パターンを代表する意味でp-gene、免疫反応の発現パターンを示すi-geneと命名した。
【００４９】
母数的生存分析を利用した予後予測モデル構成
母数型生存モデルの内、加速化故障時間モデル(accelerated  failure  time  model,  AFT)を利用してp-geneとi-geneの発現量を共変数とする回帰分析を行った。4個のp-geneは患者別に平均値を求めてp.meanに変換し、5個のi-geneも患者別に平均値を求めてi.meanに変換し適用した。加速化故障時間モデルは
Ti  =T0exp(β1x1+β2x2+・・・+βqxq)εi    (1)
であり、ここでTiはi番目個体の生存時間、T0は基底線生存時間、xjは共変数のベクター(j=1.2、・・q)、βは対応する共変数の係数であり、εは誤差である。このモデルでは共変数が基底線生存時間に上昇的影響を及ぼすため、これを頻繁に利用する産業界で加速化故障時間モデルと呼んでいる。生存時間に上昇的に作用する効果Φ＝β1x1+β2x2+・・・+βqxqを加速要因と称する。
【００５０】
式(1)に自然対数をとれば
logTi＝logT0＋β1x1＋β2x2＋・・・＋βqxq＋ε*    (2)
になりAFTモデルは一般線型回帰モデルと同一な形態をとる。しかし従属変数logTは正規分布を示さず、また生存分析試料には線型回帰モデルにおいて受入られない中途切断例が存在し易いので式(2)を線型回帰モデルのように処理することができない。式(2)のε*は一般線型回帰モデルから正規分布を仮定するのとは異なり、データセットによって分布が異なり得るので実際的な統計処理が煩わしい。これを克服するために、logT0とε*を変形して下記のように表現する。
【００５１】
logTi＝logT0＋β1x1＋β2x2＋・・・＋βqxq＋σW    (3)
【００５２】
ここでWはlogTの分布を従い、その分散は標準化分布の値で固定されている。σは尺度母数とする定数であり、その値は扱うデータセットによって決定される。
【００５３】
AFTモデルを利用して多様な候補予後予測モデルに対して、ワイブル(weibull)分布、対数ロジスティック(loglogistic)分布、対数正規(lognormal)分布に合わせて見て、最も適合したモデルを選択した。AFTモデルに合わせる危険度分布はディスカバリーデータセットの生存情報の世代生命表を製作して得られるハザード関数を利用した。世代生命表を得たハザード関数は単峰(unimodal)形態を示すのでワイブル、対数ロジステイック、対数正規分布が適合するものと予測された。最終モデルの選択はAkaike's  information  criterion(AIC)とR  square(R2)を考慮して選択された。
【００５４】
予後予測モデルの検証
選択されたモデルに対する検証は“矯正(calibration)”と“判別(discrimination)”に対して行った。“矯正”とは作られた予後予測モデルを利用し、予測された生存確率と実際観察された生存確率がどれ程一致するかを調べるもので、“判別”は予後予測モデルにより与えられた患者集団を予後集団に分類したときの分離性を調べるものである。ここで述べる実際観察される生存確率はKaplan-Meier法により求められた値を意味する。AFT基盤の予後予測モデルは患者別生存確率を全ての時間帯に対して求めることができる。モデルにより予測された生存確率とKaplan-Meier法による生存確率を比較した。Kaplan-Meier  (KM)のように全時間による予測生存確率を得るために、全患者の生存確率曲線は0yr-25yrsまで0.1単位で求め各時間別平均生存確率を計算して求めた。全生存時間に対する生存確率比較と共に、5年生存確率も比較した。与えられたデータセットで患者らの5年生存確率を予後予測モデルを利用して予測した生存確率を、ハザード回帰分析のHareを利用して計算される5年生存確率を予測値にして比較した。
【００５５】
“判別”は与えられたデータセットの全ての患者の予後予測指数を4区間に分けて、各区間に属する患者らの生存確率はKMグラフで比較した。予後予測指数は生存モデルの従属変数である。四つの予測された予後集団に対するKMグラフがはっきり分けられる程判別の機能が良いモデルである。
【００５６】
ディスカバリーデータセットと三つの独立的な検証データセットに対して全て“矯正”と“判別”を調べた。
【００５７】
統計分析に使用された重要Rパッケージは下記の通りである:
affy:  .CELファイルに対してrmaアルゴリズムを利用した前処理(pre-processing)。
samr:  予後集団間発現量に差がある遺伝子発掘。
GOstats:  選択された遺伝子セットと関連した機能の調査
KMsurv:  ディスカバリーデータセットの生存試料を利用して生命表を製作
rma:  AFTモデルを利用し予後予測モデルの計数を測定・モデルに対する矯正
【００５８】
FFPEサンプルに適用可能な遺伝子セットの選別
FFPE(formalin-fixed  paraffin  embedded)組織、試料から抽出したRNAは組織または試料の処理過程で組織間のcross-linkingを引起こす固定などRNAの安定性を阻害する多くの過程により発現分析に適合したものとは受け入れられなかった。本発明では実際乳癌治療過程に基づいてFFPEサンプルに適合した乳癌予後予測方法を開発するため、上記主成分分析および主成分分析に対する機能分析（GO機能分析またはGO分析）によって得た増殖の発現パターンを代表するp-gene（増殖関連遺伝子セット）、免疫反応の発現パターンを表すi-gene（免疫反応関連遺伝子セット）において、各々最も寄与度の高い遺伝子順にIQR(interquartile  range)が高く、さらに平均発現量が高い優先順位を設けて遺伝子セットを選別した。
【００５９】
本発明でそれぞれのp-gene、i-geneの同一なパターンの遺伝子を複数個選択したのはmicrorrayデータが正確な発現量を測定するのに限界があり、パターンを代表する遺伝子一つの発現量よりもパターン内の複数個の遺伝子の平均発現量が実際発現パターンをより代表することができるからである。
【００６０】
FFPE試料とFrozen試料間において遺伝子間の関連性測定および遺伝子選別
同じ患者から採取したFFPE試料と凍結試料を27種確保し、各々に対してFFPEまたは凍結試料におけるRNA抽出方法によりRNAを抽出した。抽出されたRNAを鋳型にし、選別された32種の遺伝子に対して発現量を測定した。
【００６１】
遺伝子の発現量は個体間の差があり得るため、標準化する必要があることから標準化用遺伝子に選別された5種の遺伝子、つまりCTBP1(C-terminal-binding  protein1)、TBP(TATA-binding  protein)、HMBS(hydroxymethylbilane  synthase)、CUL1(cullin)およびUBQLN1(Ubiquilin-1)の発現量で標準化しFFPE試料と凍結試料間の遺伝子発現の関連性を測定した。
【００６２】
関連性測定結果と各遺伝子別試料における発現量結果を基に、関連性値が高くサンプル間遺伝子発現分布が多様な遺伝子を早期乳癌予後予測に信頼性が高い遺伝子として最終選別した。
【００６３】
<実験結果>
予後予測モデルのための予後遺伝子の選択
早期乳癌組織の発現プロファイルからなる5個のデータセットを全てまとめ、1,104個のサンプルのディスカバリーデータセットを構成した。全ての患者らは化学治療を受けず、大半が腋窩リンパ節転移が全くないか(N0  or  N-)、乳癌早期（1期または2期）である。その内、外部組織転移に対する生存情報を有する1,072名を対象に統計的分析を行った。予後と関連した遺伝子を探すために予後が良い集団（10年以上転移がない場合）と予後が悪い集団（5年以内に転移がある場合）の発現プロファイルで別けて比較した。予後が良い集団で高い発現量を示した182個の遺伝子と、予後が悪い集団で高い発現量を示した120個の遺伝子を選択した（結果未図示。FDR<0.001）。
【００６４】
選択された302個の遺伝子の発現量に対して主成分分析を行った。主成分1と主成分2に対してGO分析を行った。主成分1は極めてはっきり増殖に関連していて、主成分2は免疫反応と強い関連示された。これを基に主成分1に属する遺伝子を選択し、主成分2に属する遺伝子を選択することで2個の発現パターンを予後予測モデルに反映することにした。
【００６５】
選択された9個の遺伝子は予後と関連があるだけでなく、予後集団間の発現差が最も大きい遺伝子に選ばれた。増殖を示す主成分1で選ばれた遺伝子はp-geneに免疫反応を示す主成分2で選ばれた遺伝子はi-genesに命名した。
【００６６】
ER+乳癌とER-乳癌の比較
エストロゲン受容体の発現有無は乳癌の発生および発達と密接な関連があると知られている。予後と関連して選ばれた遺伝子らが示す二つの機能、つまり増殖と免疫反応は癌のメカニズムにおいて興味深い機能である。選ばれた16個の遺伝子を利用しER-乳癌とER+乳癌を比較した。各機能の強度を示すために、p-genesとi-genesは平均発現量によって3段階(p1,p2,p3またはi1,i2,i3)に層化した。p1はp-geneの発現量が最も低い集団で、増殖が最も遅いものと仮定した。p3はp-genesの発現量が最も高い集団で、増殖が最も活発に起こり得ると仮定した。p2は中間発現量を示し、中間程度の増殖を仮定した。i1はi-genesが最も少なく発現する集団で、弱い免疫反応があると仮定した。i3はi-genesが最も多く発現する集団で、極めて強い免疫反応があると見られた。i2は中間程度の発現量と活動を示すと見做した。
【００６７】
ディスカバリーデータセット内の1,072名に対してp-geneとi-geneの発現量によって分類し、ER状態別に各機能の強度に対する構成を調べた。ER-乳癌はER+乳癌に比べて極めて活発に増殖するp3タイプの比率が極めて高かった。約62%のER-乳癌が極めて高いp-genes発現量(p3)を示した反面、18%のER+乳癌だけが高いp-genes発現量を示していて、ER-乳癌がER+乳癌より遥かに攻撃的な性向を示すもという知見と一致していた。約35%のER+乳癌が低いp-genes(p1)を示し、ER-の場合はp1の比率が9%しかならなかった。活発な免疫反応機能はER-乳癌の特徴であり、38%以上のER-乳癌はi-genes(i3)の発現量が極めて高かった。反面、ER+乳癌は21%程が高いi-genes発現量を示した。ER+とER-全てにおいて増殖が活発になるほど免疫反応も活発になることが観察されたが、ER-乳癌が免疫反応をより積極的なものに示された。
【００６８】
その他、乳癌の分化程度も増殖と密接な関係があると示された。分化が良くなされていない乳癌(G3)であるほど速い増殖を示し、分化が良くなされている乳癌(G1)は弱い増殖を示した。患者の予後も増殖と相関関係があると示された。5年内に転移が生じた予後が悪い患者の多数が、増殖が速い集団により多く集まっているのが観察された。
【００６９】
総合的にER-乳癌は増殖と免疫反応全てER+乳癌に比べて極めて活発であり、ERの発現量が乳癌の発生および発達のメカニズムに影響を与えるものと推測される。
【００７０】
予後予測モデルの確立
ディスカバリーデータセットの生存情報と選別されたp-geneとi-geneを利用して早期乳癌患者の転移に対するAFT予後予測モデルを製作した。ディスカバリーデータセットの生存情報を利用し1年単位の世代生命表を製作して概略的な危険度を計算した。
【００７１】
世代生命表から得た死亡確率は単峰状を示すことからワイブル、対数ロジステイック、対数正規分布が適合すると予測された。予後予測モデルに含まれる共変数はp.meanとi.meanである。p.meanはp-genesの平均値であり、i.meanはi-genesの平均値である。
【００７２】
三つのモデルに対してワイブル、対数ロジステイック、対数正規分布に対して適用した結果、対数正規分布と最も良く適合した。AIC(Akaikes  information  criterion)を利用して対数正規分布に伴う最終モデルを選択した。
【００７３】
log(T)=-0.689×p.mean+0.274×i.mean+3.219
【００７４】
上記の推定されたモデルによると、p.mean、つまり増殖は生存時間(T)と陰の相関関係(-0.689,p値=2.47×e-17)を有し、増殖が活発になるほど生存時間は短くなる。逆にi.meanは生存時間と陽の相関関係(0.247,p値=3.69×e-11)を有し、免疫反応が活発化するにつれて生存時間が伸びることを意味する。上記の推定された変数を解釈すれば、増殖が乳癌の予後に決定的な役割を果たし活発化するにつれて予後が悪い反面、免疫反応が速い増殖に対する防御メカニズムとして活動すると結論付けられる。
【００７５】
予後予測モデルの検証
ディスカバリーデータセットの1,072名の早期乳癌患者の発現プロファイルを利用して作った予後予測モデルの検証は“矯正”と“判別”について行われた。“矯正”とは、モデルを通して予測された生存確率が実際観察された生存確率とどれほど一致しているかを調べるもので、この際、実際観察された生存確率はKaplan-Meier法を利用して得た生存確率を意味する。“判別”はモデルを利用して患者を予後集団にいかに良く分類するかである。二つの性能についての検証はモデルを開発したディスカバリーデータセットと三つの独立した検証データセットで行った。
【００７６】
予後予測モデルを開発したディスカバリーデータセットに対して予後予測指数(prognostic  index,  PI)を4等分して四つの予後集団に分類した。予後予測指数により分類された四つの予後グループに対して観察された生存確率であるKMグラフを利用して比較した。その結果、四つの予後グループが良く分類されたことを確認することができ、各予後集団の予測された生存確率と観察された生存確率が一致することが見られる。
【００７７】
KM生存確率と予後予測モデルにより予測された生存確率をグラフを利用して比較した。予後予測モデルは全ての患者に対して全ての時間別生存確率を求めるので、KM生存曲線のように全体の生存時間に対する確率曲線を得るため、各患者の時間別(0年-25年、0.1間隔）平均生存確率を利用して生存確率グラフを描いた。予測された生存確率がKMによる生存確率より若干高く示されたものの全体的に近似している。生存時間に対する生存確率比較の他に5年次生存確率に対しても比較した。モデルによる5年生存確率も実際観察された5年生存確率と類似しており、特に予測された5年生存確率が高い程予測確率と観察確率が一致した。
【００７８】
より客観的検証のため、三つの独立的な検証データセットらを利用して予後予測モデルを検証した。一番目の検証データセットはAffymetrix  U133Aプラットフォームで製作された二つのデータセットを合わせたものである。二番目の検証データセットはAffymetrix  U133Aプラットフォームで製作されたデータであって、全てtamoxifenを5年間服用したER+患者である。三番目の検証データセットは70個の予後予測遺伝子（現在mammaprintに常用化）の発掘および検証のために使用されたデータセットでAgilent  Hu25Kプラットフォームで製作された。検証データセット1と2の場合、ディスカバリーデータセットと同じAffymetrix  U133Aプラットフォームに製作されたものであり、ディスカバリーデータセットと共に発現量を標準化した。検証データセット1と2は矯正と判別の性能を評価し、検証データセット3は発現量標準化に問題があり、判別の性能のみを評価した。
【００７９】
FFPEサンプルに適用可能な遺伝子セットの選別
1,104個のディスカバリーデータセットの内、予後が良い集団で高い発現量を示した182個の遺伝子と、予後が悪い集団で高い発現量を示した120個の遺伝子に対し、各々最も寄与度が高い遺伝子順にIQR(interquartile  range)が高く、また平均発現量が高い遺伝子に優先順位をおいて32種の遺伝子を選別した。
【００８０】
FFPE試料とFrozen試料間の遺伝子間関連性測定および遺伝子選別
FFPE試料／凍結試料間の関連性を測定するため、患者または癌組織からFFPE試料と凍結試料が全て確保されたサンプルが必要である。このように確保された27対のFFPE試料および凍結試料に対して選別された32種の遺伝子それぞれの発現量およびFFPE試料／凍結試料間の関連性を測定した。その結果の内、関連性値が高くサンプル間遺伝子発現分布が多様な遺伝子をp-geneから12種、i-geneから15種を早期乳癌予後予測に信頼性が高い遺伝子として選別した。
【００８１】
上記選別された遺伝子の内、予後診断用キットに包含させる遺伝子として9種のp-geneと6種のi-geneを選別した。
【００８２】
各々の遺伝子に対する関連性を測定した結果は図6および図7の通りである。図における実線は横軸および縦軸の等価値（傾き1、つまり横軸と縦軸の同じ値を続けて線で表示したもの）を表示する。
【００８３】
一方、上記各遺伝子の内、TRBC1,  BTN3A2,  HLA-DPA1の予後が良い集団と、予後が悪い集団においての発現レベルに有意的な差があった。このような分析を通してTRBC1,BTN3A2,HLA-DPA1が予後が良い集団で有意的に発現が増加されていることが分かり、したがって、発現が増加したこと（過剰発現）が良い乳癌予後を示すことが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
以上察した通り、本発明は早期乳癌の予後予測診断用の遺伝子マーカーを提供する。本発明の遺伝子マーカーは乳癌患者の予後の予測、診断が可能であるため抗癌治療の必要性の判断を始め以後乳癌治療の方向に対する端緒を提示する目的で有用に使用することができる。
【図２ａ】
2016516426.tif 000003
【図２ｂ】
2016516426.tif 000004
【図２ｃ】
2016516426.tif 000005
【図２ｄ】
2016516426.tif 000006
【図３ａ】
2016516426.tif 000007
【図３ｂ】
2016516426.tif 000008
【図３ｃ】
2016516426.tif 000009
【図４ａ】
2016516426.tif 000010
【図４ｂ】
2016516426.tif 000011
【図４ｃ】
2016516426.tif 000012
【図５】
2016516426.tif 000013
【図６ａ】
2016516426.tif 000014
【図６ｂ】
2016516426.tif 000015
【図６ｃ】
2016516426.tif 000016
【図６ｄ】
2016516426.tif 000017
【図６ｅ】
2016516426.tif 000018
【図６ｆ】
2016516426.tif 000019
【図６ｇ】
2016516426.tif 000020
【図６ｈ】
2016516426.tif 000021
【図６ｉ】
2016516426.tif 000022
【図７ａ】
2016516426.tif 000023
【図７ｂ】
2016516426.tif 000024
【図７ｃ】
2016516426.tif 000025
【図７ｄ】
2016516426.tif 000026
【図７ｅ】
2016516426.tif 000027
【図７ｆ】
2016516426.tif 000028
【図１ａ】
2016516426.tif 000029
【図１ｂ】
2016516426.tif 000030
【手続補正書】
【提出日】平成27年12月17日(2015.12.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記段階を含む乳癌予後予測方法：
(a)  試料からmRNAを分離する段階、
(b)  TRBC1(T  cell  receptor  beta  constant  1),  BTN3A2(butyrophlin,  subfamily  3,  member  A2)、およびHLA-DPA1(major  histocompatibility  complex,  class  II,  DP  alpha  1)からなる群より選別された一つ以上の遺伝子のmRNA発現レベルを測定する段階、
(c)  上記遺伝子のmRNA発現レベルを標準化する段階および
(d)  上記遺伝子の過剰発現は乳癌予後が良いものと判別する段階。
【請求項２】
上記発現レベルの測定は対象遺伝子に対するPCR増幅を通して行われることを特徴とする請求項1記載の方法。
【請求項３】
上記試料は患者の癌細胞を含む組織のホルマリン固定パラフィン包埋(formalin-fixed  paraffin-embedded,  FFPE)試料であることを特徴とする請求項1記載の方法。
【請求項４】
上記標準化はCTBP1(C-terminal-binding  protein  1)、TBP(TATA-binding  protein)、HMBS(hydroxymethylbilane  synthase)、CUL1(cullin  1)、およびUBQLN1(Ubiquilin-1)からなる群より選別された一つ以上の標準遺伝子の平均発現量に対する比率を算出することにより行なわれることを特徴とする請求項1記載の方法。
【請求項５】
TRBC1  (T  cell  receptor  beta  constant  1),  BTN3A2(butyrophlin,  subfamily  3,  member  A2)、およびHLA-DPA1  (major  histocompatibility  complex,  class  II,  DP  alpha  1)からなる群より選別された一つ以上の遺伝子に対するプライマー対であり、上記プライマー対はPCR増幅により対象遺伝子を増幅することができるものであることを特徴とするプライマー対を有効成分として含む乳癌予後予測診断用組成物。
【請求項６】
請求項5の組成物を含む乳癌予後予測診断キット。
【請求項７】
乳癌患者の予後予測診断に必要な情報を提供するため、患者の試料から下記段階を含む乳癌予後予測値を算出する方法：
(a)  試料からmRNAを分離する段階、
(b)  TRBC1  (T  cell  receptor  beta  constant  1),  BTN3A2(butyrophlin,  subfamily  3,  member  A2)、およびHLA-DPA1(major  histocompatibility  complex,  class  II,  DP  alpha  1)からなる群より選別された一つ以上の遺伝子のmRNA発現レベルを測定する段階、
(c)  上記遺伝子のmRNA発現レベルを標準化する段階、
(d)  標準化された数値を予め定められた計算式に代入して数値を計算する段階、
(e)  上記数値によって乳癌予後が良いもの、または乳癌予後が悪いものに算出する段階。
【請求項８】
上記発現レベルの測定は対象遺伝子に対するPCR増副を通して行なわれることを特徴とする請求項7項記載の方法。
【請求項９】
上記試料は患者の癌細胞を含む組織のホルマリン固定パラフィン包埋試料であることを特徴とする請求項7記載の方法。
【請求項１０】
上記標準化はCTBP1(C-terminal-binding  protein  1)、TBP(TATA-binding  protein)、HMBS(hydroxymethylbilane  synthase)、CUL1(cullin  1)、およびUBQLN1(Ubiquilin-1)からなる群より選別された一つ以上の標準遺伝子の平均発現量に対する比率を算出することにより行なわれることを特徴とする請求項7記載の方法。
【請求項１１】
TRBC1(T  cell  receptor  beta  constant  1)、BTN3A2(butyrophlin,  subfamily  3,  member  A2)、およびHLA-DPA1(major  histocompatibility  complex,  class  II,  DP  alpha  1)からなる群より選別されたいずれか一つの遺伝子に対するプライマー対であり、上記プライマー対はPCR増幅によって対象遺伝子を増幅することができるものであることを特徴とするプライマー対を利用し乳癌患者の試料から上記選別された遺伝子のmRNA発現レベルを測定する段階を含む乳癌予後予測診断方法。
【請求項１２】
TRBC1(T  cell  receptor  beta  constant  1)、BTN3A2(butyrophilin,  subfamily  3,  member  A2)、およびHLA-DPA1(major  histocompatibility  complex,  class  II,  DP  alpha  1)からなる群より選別されたいずれか一つの遺伝子に対するプライマー対であり、上記プライマー対はPCR増幅によって対象遺伝子を増幅することができるものであることを特徴とするプライマー対。
【請求項１３】
TRBC1(T  cell  receptor  beta  constant  1)、BTN3A2(butyrophilin,  subfamily  3,  member  A2)、およびHLA-DPA1(major  histocompatibility  complex,  class  II,  DP  alpha  1)からなる群より選別されたいずれか一つの遺伝子に対するプライマー対であり、上記プライマー対はPCR増幅によって対象遺伝子を増幅することができるものであることを特徴とするプライマー対の乳癌予後予測用製剤の製造のための使用。
【請求項１４】
乳癌患者の予後予測診断に必要な情報を提供するために、患者の試料から下記段階を含む乳癌予後予測値を算出する方法：
(a)  試料からmRNAを分離する段階
(b)  TRBC1(T cell receptor beta constant 1)、BTN3A2(butyrophilin、subfamily 3,member A2)及び HLA-DPA1 (major histocompatibility complex,class II, DP alpha 1)からなるi-gene群より選ばれた一つ以上の遺伝子のmRNA発現レベル及びAURKA (Aurora kinase A)、CCNB2 (Cycln B2)、FOXM1(Forkhead box M1)、MMP11(Matrix metallo peptidase 11)、PTTG1(Pituitary tumor-transforming 1)、RACGAP1(Rac GTPase activating protein 1)、RRM2(Ribonucleotide reductase M2)、TOP2A(Topoisomerase II alpha)及び UBE2C(Ubiquitin-conjugating enzyme E2C)からなるp-gene群より選ばれた一つ以上の遺伝子のmRNA発現レベルを測定する段階、
(c)  前記選ばれた遺伝子のmRNA発現レベルを標準化する段階及び
(d)  前記遺伝子の組合わせを通じて乳房癌予後予測値を算出する段階。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
本発明は乳癌患者の予後予測診断に必要な情報を提供するため、患者の試料から下記段階を含む乳癌予後予測値を算出する方法を提供する：
(a)  試料からmRNAを分離する段階、
(b)  TRBC1,BTN3A2およびHLA-DPA1からなる群より選別された一つ以上の遺伝子のmRNA発現レベルを測定する段階、
(c)  上記遺伝子のmRNA発現レベルを標準化する段階および
(d)  標準化された数値を予め定められた計算式に代入して数値を計算する段階、
(e)  上記数値のレベルにより乳癌予後が良いまたは悪いと算出する段階
また、本発明は乳癌患者の予後予測診断に必要な情報を提供するために、患者の試料から下記段階を含む乳癌予後予測値を算出する方法を提供する。
(a)  試料からmRNAを分離する段階、
(b)  TRBC1(T cell receptor beta constant 1)、BTN3A2(butyrophilin、subfamily 3,member A2)およびHLA-DPA1 (major histocompatibility complex,class II, DP alpha 1)からなるi-gene群より選ばれた一つ以上の遺伝子のmRNA発現レベル及びAURKA (Aurora kinase A)、CCNB2 (Cycln B2)、FOXM1(Forkhead box M1)、MMP11(Matrix metallo peptidase 11)、PTTG1(Pituitary tumor-transforming 1)、RACGAP1(Rac GTPase activating protein 1)、RRM2(Ribonucleotide reductase M2)、TOP2A(Topoisomerase II alpha)および UBE2C(Ubiquitin-conjugating enzyme E2C)からなるp-gene群より選ばれた一つ以上の遺伝子のmRNA発現レベルを測定する段階、
(c)  前記選ばれた遺伝子のmRNA発現レベルを標準化する段階および
(d)  前記遺伝子の組合わせを通じて乳癌予後予測値を算出する段階
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
【図１ａ】図1aは乳癌組織のマイクロアレイデータのキュレーション(curation)および前処理(pre-processing)による標準化過程を示した模式図である。
【図１ｂ】図1ｂはディスカバリーデータセットから予後予測遺伝子を発掘する過程を示した図である。
【図２】図2は予後予測モデル（凍結試料）をディスカバリーデータセットにおいて検証した結果である。2aは予後予測モデルを利用した全体患者の予後予測指数を4等分して4個の予後集団に分類した後、各予後集団の観察された生存確率がよく分離されたかを確認している。観察された生存確率と予測された生存確率も比較した。2bは全患者の観察された生存確率と予後予測モデルを利用し予測された生存確率を比較したものである。2cは最も影響力が高いp.meanに対して全患者を四つの集団に分けて各集団の観察された生存確率が予後予測モデルを利用して予測された生存確率と一致するかを調べた図である。2dは、5年生存率に対して観察された生存確率と予測された生存確率がどれ程一致するかを調べた図である。
【図３】図3は予後予測モデルを検証セット1で検証した結果である。ディスカバリーデータセットで検証した方法と同一である。3aは判別に対する検証結果であり、3bは観察された時間に対する矯正の検証結果である。3cは5年生存率に対する矯正の検証結果である。
【図４】図4は予後予測モデルを検証セット2で検証した結果である。ディスカバリーデータセットで検証した方法と同一である。4aは判別に対する検証結果であり、4bは観察された時間に対する矯正の検証結果である。4cは5年生存率に対する矯正の検証結果である。
【図５】図5は予後予測モデルを検証セット3で検証した結果である。ディスカバリーデータセットで検証した方法と同一である。
【図６】図6は選別されたp-geneに対するFFPE試料(siemens,縦軸)／凍結試料(frozen、横軸）間の関連性測定結果であり、遺伝子の名称および関連性の値(cor)はそれぞれ記載された通りである。
【図７】図7は選別されたi-geneに対するFFPE試料(siemens,縦軸)／凍結試料(frozen、横軸）間の関連性測定結果であり、遺伝子の名称および関連性の値(cor)はそれぞれ記載された通りである。
【国際調査報告】
2016516426.tif 000031
2016516426.tif 000032
2016516426.tif 000033
2016516426.tif 000034