(57)【要約】本発明の主題は、癌化学療法に使用される薬物を製造するための式１によって表される一般式【化１】2016500102.tif 000006（式中、それぞれのエーテルは、Ｃ−８およびＣ−９原子において以下の絶対配置：（８Ｒ，９Ｓ）−シンコニン配置または（８Ｓ，９Ｒ）−シンコニジン配置または（８Ｒ，９Ｒ）−９−エピシンコニン配置または（８Ｓ，９Ｓ）−９−エピシンコニジン配置を有する）のキナアルカロイドの９−Ｏ−プロパルギルエーテルの使用である。【選択図】なし
2016500102.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌化学療法に使用される薬物を製造するための式１によって表される一般式
【化１】
2016500102.tif 000005
（式中、それぞれのエーテルは、Ｃ−８およびＣ−９原子において以下の絶対配置：
（８Ｒ，９Ｓ）−シンコニン配置または
（８Ｓ，９Ｒ）−シンコニジン配置または
（８Ｒ，９Ｒ）−９−エピシンコニン配置または
（８Ｓ，９Ｓ）−９−エピシンコニジン配置
を有する）
のキナアルカロイドの９−Ｏ−プロパルギルエーテルの使用。
【請求項２】
９−Ｏ−プロパルギルシンコニンまたは９−Ｏ−プロパルギルシンコニジンが、乳癌化学療法に使用される薬物を製造するために使用される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
９−Ｏ−プロパルギルシンコニンまたは９−Ｏ−プロパルギルシンコニジンが、子宮頸癌化学療法に使用される薬物を製造するために使用される、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
９−Ｏ−プロパルギルシンコニンまたは９−Ｏ−プロパルギルシンコニジンが、肺癌化学療法に使用される薬物を製造するために使用される、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
９−Ｏ−プロパルギルシンコニンまたは９−Ｏ−プロパルギルシンコニジンが、鼻咽頭癌化学療法に使用される薬物を製造するために使用される、請求項１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、抗癌治療に使用される薬物を製造するための９−Ｏ−プロパルギルシンコニンおよび９−Ｏ−プロパルギルシンコニジンの使用である。
【背景技術】
【０００２】
癌疾患は、最も高い死亡率を有し、新たな症例の数が増加しており、第一に寿命期間の増加およびライフスタイルに関連している、ヒトにおいて報告されている主要な健康障害の１つである。癌疾患の処置は困難であり、費用がかかり、多くの場合、効果的でない。したがって、細胞増殖抑制作用を有する新規物質についての差し迫った必要性が存在している。それらは頻繁に、天然産物、特にアルカロイドおよびその誘導体、例えばタキソール、カンプトテシンまたはビンカアルカロイドを起源とする（レビューのために、非特許文献１を参照のこと）。例えば、キニーネ、キニジンおよびシンコニジンおよびシンコニンなどのキナ皮アルカロイドは特定の抗癌特性を有さない。多剤耐性（ＭＤＲ）を有する癌疾患のための実験的治療において、シクロホスファミド、ドキソルビシン、メチルプレドニゾロンまたはビンブラスチンなどの抗癌剤と、抗癌作用のないキナアルカロイド（キニーネまたはシンコニン）との組み合わせが使用されている。これらのアルカロイドは、多剤耐性癌性細胞からの上述の抗癌剤の除去を抑制し、結果として、このような薬物の作用を増加させる（非特許文献２および非特許文献３）。
【０００３】
次に、実験的抗癌分化療法において、使用される化合物は、癌性細胞を破壊する従来の化学療法剤と併せて、癌増殖に関連する遺伝子の発現に対する効果を有し得る。インビトロの乳癌細胞（ＭＣＦ−７）の増殖および分化の弱い阻害が、高濃度のキニーネおよびキニジン（それぞれ、ＩＣ５０：４０および１１３μＭ）について報告され、化学療法標準によれば、これらの物質は有効薬物として与えられていない（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｔａｇｌｉａｌａｔｅｌａ−Ｓｃａｆａｔｉ，Ｏ．  Ｍｏｄｅｒｎ  Ａｌｋａｌｏｉｄｓ、Ｆａｔｔｏｒｕｓｓｏ  Ｅ．（ｅｄ．）、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２００７、ｐ．２５
【非特許文献２】Ｌｅｅ，Ｓ．Ｙ．ら、Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｔｏｘ．、２０１１、２６、４２４
【非特許文献３】Ｓｏｌａｒｙ，Ｅら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２０００、１４、２０８５
【非特許文献４】Ｍａｒｔｉｒｏｓｙａｎ，Ａ．Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００４、６８、１７２９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、抗癌治療において細胞毒性活性を有するキナアルカロイド誘導体の新規用途を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の主題は、癌化学療法に使用される薬物を製造するための式１によって表される一般式
【化１】
2016500102.tif 000003
（式中、それぞれのエーテルは、Ｃ−８およびＣ−９原子において以下の絶対配置：
（８Ｒ，９Ｓ）−シンコニン配置または
（８Ｓ，９Ｒ）−シンコニジン配置または
（８Ｒ，９Ｒ）−９−エピシンコニン配置または
（８Ｓ，９Ｓ）−９−エピシンコニジン配置
を有する）
の９−Ｏ−プロパルギルエーテルの使用である。キナアルカロイド化学物質に使用される一般的な番号付けを絶対配置を定義するために使用した。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
ＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）から得た以下の癌細胞株：ＭＣＦ−７（乳癌）、ＨｅＬａ（子宮頸癌）、Ａ５４９（肺癌）およびＫＢ（鼻咽頭癌）を使用して細胞毒性活性試験を実施した。
【０００８】
スルホローダミンＢを用いた標準的な手段を使用して細胞傷害試験を実施した。それらは、７２時間、試験化合物と共に、対数増殖期における癌細胞株のインキュベーション、続いて、細胞タンパク質に結合する色素（スルホローダミンＢ）の吸着を使用した細胞増殖阻害の程度の分光光度定量を含んだ。その定量は、Ｖｉｃｈａｉ，Ｖ．，Ｋｉｒｔｉｋａｒａ，Ｋ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２００６、１、１１１２に報告されている手順に従って実施した。
【０００９】
実験のための細胞の調製：
対数増殖期に試験した細胞株の癌性細胞を、２０，０００細胞／２ｍＬ増殖培地／ウェルの量で２４ウェルプレート上に播種し、続いて、５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃にて２４時間、インキュベータでインキュベートした。
【００１０】
試験化合物溶液の調製：
試験化合物溶液は、以下の濃度範囲：０．０５；０．１；０．５；１；５；１０；５０；１００μＭでＤＭＳＯ中で調製した。
【００１１】
試験した細胞株を、以下の手段に従って無菌作業条件を確実にする層流チャンバ内で試験化合物の溶液で処理した：最初に対照として３つのウェルを使用した：それらは２０μＬのＤＭＳＯのみを含有した；最も低い濃度で開始する、試験化合物の連続溶液を後のウェル（２０μＬ）に加えた（各々の濃度レベルについて３つのウェル）。続いて、プレートを７２時間インキュベータに入れた。
【００１２】
インキュベーションの終了後、５００μＬの冷（４℃）５０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加えることによって接着細胞を固定し、４℃にて１時間インキュベートした。続いて、各ウェルを滅菌水でリンスし、乾燥させた。操作を５回繰り返した。１％酢酸に溶解した５００μＬの０．４％の色素溶液（スルホローダミンＢ）を加えることによって、固定した細胞を３０分間染色した。プレートからデカントすることによって未結合の色素を除去し、細胞を１％酢酸で４回洗浄した。続いて、プレートを約５分間空気中で乾燥させた。１５００μＬの１０ｍＭのＴｒｉｓ−塩基性緩衝液（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）を各ウェルに加えることによって未結合の色素を溶解し、オービタルシェーカーを使用して５分間振盪した。続いて、各ウェルからの２００μＬの溶液を新たな９６ウェルプレート上の２つのウェルの各々に移し、溶液の吸収を、プレートリーダーを使用して４９０〜５３０ｎｍの波長にて分光光度法で定量した。対照溶液の吸収を１００％と仮定して、試験化合物による細胞増殖の阻害パーセントを計算した。
【００１３】
細胞株の種類に応じて、以下の増殖培地を使用した：
・  ＭＣＦ−７株はＳｉｇｍａ（カタログ番号Ｄ５７９６）製のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥ）中で増殖させた。
・  ＨｅＬａ、Ａ５４９およびＫＢ株はＳｉｇｍａ（カタログ番号Ｒ８７５８）製のＲＰＭＩ−１６４０培地中で増殖させた。
【００１４】
細胞増殖の５０％阻害を得るのに必要な化合物の濃度を示すＩＣ５０値を、試験した全ての誘導体について算出した。ＩＣ５０＜４μｇ／ｍＬの誘導体は一般に活性であると仮定され（Ａと省略される）、４〜３０μｇ／ｍＬの範囲のＩＣ５０の値を有する誘導体は中間の活性とみなされ（ＭＡと省略される）、一方、ＩＣ５０＞３０μｇ／ｍＬの誘導体は非活性とみなされる（ＮＡと省略される）（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ．Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｃｈａｎｇｅ  ｎｏｔｉｃｅ、ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  １４．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｄａｔａ  ｓｕｍｍａｒｙ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｕｔｌｉｎｅ  ｏｆ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｅｄｉｔｉｏｎ  ＮＣＩ、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｖ．、１９８０、６、３１−６２）。
【００１５】
比較を可能にするために、公知の細胞毒性物質：５−フルオロ−２’−デオキシウリジンおよび５−フルオロウラシルならびに他のキナアルカロイドおよびそれらの誘導体：シンコニンおよび９−Ｏ−プロパルギルキニンおよび９−Ｏ−プロパルギルキニジンを使用して同一の試験を実施した。
【００１６】
一般式１の化合物についての細胞毒性活性試験の結果を表１に示す。値は３回の独立した定量の平均の結果である。
【００１７】
【表１】
2016500102.tif 000004
【００１８】
ＰＣＮ化合物の乳癌、子宮頸癌、肺癌および鼻咽頭癌の癌細胞株に対するインビトロ細胞毒性は高活性の範囲内であるのに対して、ＰＣＤ化合物についてのものは中間の活性の範囲である。各場合における両方の化合物（ＰＣＮおよびＰＣＤ）の細胞毒性は、５−フルオロ−２’−デオキシウリジンおよび５−フルオロウラシルなどの現在使用されている抗癌剤のものより高かった。
【００１９】
本発明の主題は、乳癌化学療法に使用される薬物を製造するための９−Ｏ−プロパルギルシンコニン（ＰＣＮ）および９−Ｏ−プロパルギルシンコニジン（ＰＣＤ）の使用である。
【００２０】
実施した試験により、ＰＣＮが、３．０μｇ／ｍＬのＩＣ５０値で、ＭＣＦ−７株に対して最も高い活性を有することを確認した。これは、抗癌治療に現在使用されている対照化合物である５ＦＵの細胞毒性の６倍より大きく、５ＦｄＵの３．８倍である。ＰＣＤ化合物（ＩＣ５０、９．３μｇ／ｍＬ）もまた、対照化合物である５ＦＵおよび５ＦｄＵ（ＩＣ５０値について、それぞれ１８．２および１１．４μｇ／ｍＬである）より高い活性を有する。
【００２１】
本発明の別の態様は、子宮頸癌化学療法に使用される薬物を製造するための９−Ｏ−プロパルギルシンコニン（ＰＣＮ）および９−Ｏ−プロパルギルシンコニジン（ＰＣＤ）の使用である。
【００２２】
実施した試験により、ＰＣＮが、３．５μｇ／ｍＬのＩＣ５０値で、最も高い活性を有することを確認した。ＰＣＮは、５ＦＵ（対照化合物）の細胞毒性の６倍であり、５ＦｄＵの細胞毒性の３．７倍である。ＰＣＤ化合物（ＩＣ５０、１０．０μｇ／ｍＬ）もまた、５ＦＵおよび５ＦｄＵ（ＩＣ５０値について、それぞれ２１．０および１３．０μｇ／ｍＬである）より高い活性を有する。
【００２３】
本発明の別の態様は、肺癌化学療法に使用される薬物を製造するための９−Ｏ−プロパルギルシンコニン（ＰＣＮ）および９−Ｏ−プロパルギルシンコニジン（ＰＣＤ）の使用である。
【００２４】
実施した試験により、ＰＣＮが、３．９μｇ／ｍＬのＩＣ５０値で、最も高い活性を有することを確認した。ＰＣＮは、５ＦＵ（対照化合物）の細胞毒性の５倍高く、５ＦｄＵの細胞毒性の３倍超である。１６．０μｇ／ｍＬのＩＣ５０を有するＰＣＤ化合物は５ＦＵ（ＩＣ５０、２１．４μｇ／ｍＬ）より高く、５ＦｄＵ（ＩＣ５０、１３．４μｇ／ｍＬ）よりわずかに低い活性である。
【００２５】
本発明の別の態様は、鼻咽頭癌化学療法に使用される薬物を製造するための９−Ｏ−プロパルギルシンコニン（ＰＣＮ）および９−Ｏ−プロパルギルシンコニジン（ＰＣＤ）の使用である。
【００２６】
実施した試験により、ＰＣＮが、３．２μｇ／ｍＬのＩＣ５０値で、最も高い活性を有することを確認した。５ＦＵおよび５ＦｄＵと比較して、ＰＣＮは、それぞれ６．８および４．３倍高い活性を有する。ＰＣＤ化合物（ＩＣ５０、９．５μｇ／ｍＬ）はまた、ＩＣ５０値についてそれぞれ２２．０および１３．７μｇ／ｍＬである、５ＦＵおよび５ＦｄＵ（対照化合物）より高い活性を有する。
【００２７】
一般式１の化合物の細胞毒性はＣ−８およびＣ−９原子における絶対配置に関連しており、最も高い活性を有するＰＣＮ化合物は、（８Ｒ，９Ｓ）配置を有するシンコニン誘導体であり、反対の構造の変化である、（８Ｓ，９Ｒ）が、ＰＣＤ誘導体およびそれから調製されるシンコニジンにおいて見出され、細胞毒性活性の約３倍の減少を導く。
【００２８】
本発明の主題は、ＰＣＮ化合物の合成を示す実施形態によって説明される。
【００２９】
キナアルカロイド９−Ｏ−プロパルギルエーテルを、欧州特許第１４７７４８８号に開示されている手順を使用してキナ皮から単離した天然アルカロイドから調製した。
【実施例】
【００３０】
実施例１
シンコニン（８８３ｍｇ；３ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１２ｍＬ）に溶解し；続いて、溶液を氷浴に入れた。混合物を約５℃に冷却し、水素化ナトリウム（鉱油中に５０％ＮａＨ、３００ｍｇ、２当量）を０．５時間にわたって滴下して加えた。溶液を２時間撹拌し、トルエン中の８０％溶液として臭化プロパルギル（０．４２ｍＬ；３．７５ｍｍｏｌ、１．２５当量）を、シリンジを使用して加えた。反応混合物を室温にて一晩静置させた。続いて、ジクロロメタン（５０ｍｌ）を反応混合物に加え、有機溶液を飽和ＮａＣｌ溶液（３０ｍｌ）および蒸留水（３０ｍＬ）で連続して洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、続いて、乾燥剤を濾過し、真空エバポレーターを使用して溶媒を蒸発させ、水浴温度を４０〜４５℃の範囲に維持した。粗生成物、９−Ｏ−プロパルギルシンコニン（ＰＣＮ）を、勾配：ＣＨ２Ｃｌ２／ｎ−ヘキサン、ＣＨ２Ｃｌ２、１％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２、５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２において、シリカゲル（６０Ｈ、０．０４５〜０．０７５ｍｍ／２００〜３００メッシュ、Ｍｅｒｃｋ製）を有するクロマトグラフカラムで精製した。ＰＣＮ化合物を、＞９９％の純度および約８０％の収率で油として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００／４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．２４（ｍ，１Ｈ），１．５２（ｍ，２Ｈ），２．１１（ｍ，１Ｈ），２．２８（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），２．４６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），２．７２−２．９７（ｍ，３Ｈ），３．１１（ｍ，１Ｈ），３．４９（ｓ，１Ｈ），３．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），３．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），４．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），４．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），５．０１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），５．１４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ），６．１０（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１７．３，１０．１，７．６Ｈｚ），７．２６（ｓ，１Ｈ），７．４８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３Ｈｚ），７．５９（ｍ，１Ｈ），７．７３（ｍ，１Ｈ），８．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），８．１８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），８．９１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３Ｈｚ）
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ２０．３５，２８．１０，４０．００，４９．２２，４９．９８，５６．４８，６０．３０，７５．１３，１１４．７４，１２３．２４，１２６．８１，１２９．１８，１３０．４６，１４８．５１，１５０．０８．
ＭＳ  ＥＳ（ｍ／ｚ）：（−）３３１（Ｍ−Ｈ）−，３６７／３６９（Ｍ＋Ｃｌ）−；（＋）３３３（Ｍ＋Ｈ）＋，３５５（Ｍ＋Ｎａ）＋．
【手続補正書】
【提出日】平成27年6月4日(2015.6.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌化学療法に使用される薬物を製造するための式１によって表される一般式
【化１】
2016500102.tif 000007
（式中、それぞれのエーテルは、Ｃ−８およびＣ−９原子において以下の絶対配置：
（８Ｒ，９Ｓ）−シンコニン配置または
（８Ｒ，９Ｒ）−９−エピシンコニン配置
を有する）
のキナアルカロイドの９−Ｏ−プロパルギルエーテルの使用。
【請求項２】
９−Ｏ−プロパルギルシンコニンまたは９−Ｏ−プロパルギルシンコニジンが、乳癌化学療法に使用される薬物を製造するために使用される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
９−Ｏ−プロパルギルシンコニンまたは９−Ｏ−プロパルギルシンコニジンが、子宮頸癌化学療法に使用される薬物を製造するために使用される、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
９−Ｏ−プロパルギルシンコニンまたは９−Ｏ−プロパルギルシンコニジンが、肺癌化学療法に使用される薬物を製造するために使用される、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
９−Ｏ−プロパルギルシンコニンまたは９−Ｏ−プロパルギルシンコニジンが、鼻咽頭癌化学療法に使用される薬物を製造するために使用される、請求項１に記載の使用。
【国際調査報告】
2016500102.tif 000008
2016500102.tif 000009
2016500102.tif 000010