(57)【要約】本発明は、リアソータントインフルエンザ株を提供する。一局面において、外部ドメイン、５’−非コード領域、３’−非コード領域、シグナルペプチド、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有するキメラインフルエンザ赤血球凝集素セグメントが提供され、上記外部ドメインは、第１のインフルエンザ株由来であり、上記５’−非コード領域、上記３’−非コード領域、上記シグナルペプチド、上記膜貫通ドメインおよび上記細胞質ドメインのうち１種または複数は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４、Ａ／ＷＳＮ／３３またはＢ／Ｌｅｅ／４０ではない第２のインフルエンザ株由来であり、上記第１のインフルエンザ株および上記第２のインフルエンザ株は、両者共にインフルエンザＡ株またはインフルエンザＢ株である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
外部ドメイン、５’−非コード領域、３’−非コード領域、シグナルペプチド、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有するキメラインフルエンザ赤血球凝集素セグメントであって、前記外部ドメインは、第１のインフルエンザ株由来であり、前記５’−非コード領域、前記３’−非コード領域、前記シグナルペプチド、前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ドメインのうち１種または複数は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４、Ａ／ＷＳＮ／３３またはＢ／Ｌｅｅ／４０ではない第２のインフルエンザ株由来であり、前記第１のインフルエンザ株および前記第２のインフルエンザ株は、両者共にインフルエンザＡ株またはインフルエンザＢ株である、キメラインフルエンザ赤血球凝集素セグメント。
【請求項２】
外部ドメイン、５’−非コード領域、３’−非コード領域、シグナルペプチド、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有するキメラインフルエンザ赤血球凝集素セグメントであって、前記外部ドメインは、Ｈ１インフルエンザ株またはＨ５インフルエンザ株ではない第１のインフルエンザＡ株由来であり、前記５’−非コード領域、前記３’−非コード領域、前記シグナルペプチド、前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ドメインのうち１種または複数は、第２のインフルエンザ株由来であり、前記第１のインフルエンザ株および前記第２のインフルエンザ株は、両者共にインフルエンザＡ株またはインフルエンザＢ株である、キメラインフルエンザ赤血球凝集素セグメント。
【請求項３】
外部ドメイン、５’−非コード領域、３’−非コード領域、シグナルペプチド、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有するキメラインフルエンザ赤血球凝集素セグメントであって、前記外部ドメインは、第１のインフルエンザＢ株由来であり、前記５’−非コード領域、前記３’−非コード領域、前記シグナルペプチド、前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ドメインのうち１種または複数は、インフルエンザＢ株またはＨ１株もしくはＨ３株ではないインフルエンザＡ株である第２のインフルエンザ株由来である、キメラインフルエンザ赤血球凝集素セグメント。
【請求項４】
外部ドメイン、５’−非コード領域、３’−非コード領域、シグナルペプチド、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有するキメラインフルエンザ赤血球凝集素セグメントであって、前記外部ドメインは、第１のインフルエンザ株由来であり、前記５’−非コード領域、前記３’−非コード領域、前記シグナルペプチド、前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ドメインのうち１種または複数は、第２のインフルエンザ株由来であり、前記セグメントは、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号１５と整列させた場合、以下：  
ａ）配列番号１５のヌクレオチド２４に対応する位置におけるグアニン、および／または
ｂ）配列番号１５のヌクレオチド３８に対応する位置におけるアデニン、および／または
ｃ）配列番号１５のヌクレオチド４０に対応する位置におけるチミン、および／または
ｄ）配列番号１５のヌクレオチド４４に対応する位置におけるアデニン、および／または
ｅ）配列番号１５のヌクレオチド５３に対応する位置におけるチミン、および／または
ｆ）配列番号１５のヌクレオチド６３に対応する位置におけるアデニン、および／または
ｇ）配列番号１５のヌクレオチド６６に対応する位置におけるチミン、および／または
ｈ）配列番号１５のヌクレオチド６９に対応する位置におけるアデニン、および／または
ｉ）配列番号１５のヌクレオチド７５に対応する位置におけるアデニン、および／または
ｊ）配列番号１５のヌクレオチド７８に対応する位置におけるチミン、および／または
ｋ）配列番号１５のヌクレオチド１６３７に対応する位置におけるアデニン、および／または
ｌ）配列番号１５のヌクレオチド１６４９に対応する位置におけるシトシン、および／または
ｍ）配列番号１５のヌクレオチド１６５５に対応する位置におけるチミン、および／または
ｎ）配列番号１５のヌクレオチド１６８２に対応する位置におけるシトシン、および／または
ｏ）配列番号１５のヌクレオチド１６９７に対応する位置におけるシトシン、および／または
ｐ）配列番号１５のヌクレオチド１７０３に対応する位置におけるグアニン、および／または
ｑ）配列番号１５のヌクレオチド１７１５に対応する位置におけるチミン、および／または
ｒ）配列番号１５のヌクレオチド１７２９に対応する位置におけるアデニン、および／または
ｓ）配列番号１５のヌクレオチド１７３３に対応する位置におけるシトシン、および／または
ｔ）配列番号１５のヌクレオチド１７３４に対応する位置におけるシトシン、および／または
ｕ）配列番号１５のヌクレオチド１７４６に対応する位置におけるアデニン、および／または
ｖ）配列番号１５のヌクレオチド１７５１に対応する位置におけるアデニン
のうち１種または複数を含む、キメラインフルエンザ赤血球凝集素セグメント。
【請求項５】
（ａ）〜（ｖ）の前記ヌクレオチドの全てを含む、請求項４に記載のキメラ赤血球凝集素セグメント。
【請求項６】
配列番号１０５の前記５’−ＮＣＲドメイン、および／または配列番号１０６の前記ＳＰ、および／または配列番号１０７の前記ＴＭドメイン、および／または配列番号１０８の前記ＣＴドメイン、および／または配列番号１０９の前記３’−ＮＣＲのうち１種または複数を含む、前記請求項のいずれかに記載のキメラ赤血球凝集素セグメント。
【請求項７】
前記第１のインフルエンザ株および前記第２のインフルエンザ株が、両者共にインフルエンザＡウイルスまたはインフルエンザＢウイルスである、請求項４〜６のいずれか一項に記載のキメラ赤血球凝集素セグメント。
【請求項８】
前記５’−非コード領域、前記３’−非コード領域、前記シグナルペプチド、前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ドメインが全て、前記第２のインフルエンザ株由来である、前記請求項のいずれかに記載のキメラ赤血球凝集素セグメント。
【請求項９】
前記セグメントが、配列番号７と整列させた場合、アミノ酸５４５に対応する位置にチロシンを有さないタンパク質をコードする、前記請求項のいずれかに記載のキメラ赤血球凝集素セグメント。
【請求項１０】
外部ドメイン、５’−非コード領域、３’−非コード領域、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有するキメラインフルエンザノイラミニダーゼセグメントであって、前記外部ドメインは、第１のインフルエンザ株由来であり、前記５’−非コード領域、前記３’−非コード領域、前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ドメインのうち１種または複数は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４またはＡ／ＷＳＮ／３３ではない第２のインフルエンザ株由来である、キメラインフルエンザノイラミニダーゼセグメント。
【請求項１１】
外部ドメイン、５’−非コード領域、３’−非コード領域、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有するキメラインフルエンザノイラミニダーゼセグメントであって、前記外部ドメインは、第１のインフルエンザ株由来であり、前記５’−非コード領域、前記３’−非コード領域、前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ドメインは、第２のインフルエンザ株由来であり、前記第１のインフルエンザ株および前記第２のインフルエンザ株は、両者共にインフルエンザＡ株であるまたは両者共にインフルエンザＢ株である、キメラインフルエンザノイラミニダーゼセグメント。
【請求項１２】
外部ドメイン、５’−非コード領域、３’−非コード領域、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有するキメラノイラミニダーゼセグメントであって、前記外部ドメインは、第１のインフルエンザ株由来であり、前記５’−非コード領域、前記３’−非コード領域、前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ドメインのうち１種または複数は、第２のインフルエンザ株由来であり、前記セグメントは、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号１６と整列させた場合、以下：
ａ）配列番号１６のヌクレオチド１３に対応する位置におけるアデニン、および／または
ｂ）配列番号１６のヌクレオチド３５に対応する位置におけるアデニン、および／または
ｃ）配列番号１６のヌクレオチド６０に対応する位置におけるアデニン、および／または
ｄ）配列番号１６のヌクレオチド６３に対応する位置におけるアデニン、および／または
ｅ）配列番号１６のヌクレオチド６５に対応する位置におけるアデニン、および／または
ｆ）配列番号１６のヌクレオチド６７に対応する位置におけるシトシン、および／または
ｇ）配列番号１６のヌクレオチド６９に対応する位置におけるアデニン、および／または
ｈ）配列番号１６のヌクレオチド７５に対応する位置におけるアデニン、および／または
ｉ）配列番号１６のヌクレオチド８３に対応する位置におけるチミン、および／または
ｊ）配列番号１６のヌクレオチド８９に対応する位置におけるグアニン、および／または
ｋ）配列番号１６のヌクレオチド１０１に対応する位置におけるアデニン、および／または
ｌ）配列番号１６のヌクレオチド１０７に対応する位置におけるチミン、および／または
ｍ）配列番号１６のヌクレオチド１１０に対応する位置におけるチミン、および／または
ｎ）配列番号１６のヌクレオチド１２０に対応する位置におけるグアニン、および／または
ｏ）配列番号１６のヌクレオチド１２１に対応する位置におけるシトシン、および／または
ｐ）配列番号１６のヌクレオチド１２５に対応する位置におけるチミン、および／または
ｑ）配列番号１６のヌクレオチド１２７に対応する位置におけるチミン
を含む、キメラノイラミニダーゼセグメント。
【請求項１３】
（ａ）〜（ｑ）の前記ヌクレオチドの全てを含む、請求項１２に記載のキメラノイラミニダーゼセグメント。
【請求項１４】
配列番号１１０の前記５’−ＮＣＲドメイン、および／または配列番号１１１の前記ＣＴドメイン、および／または配列番号１１２の前記ＴＭドメイン、および／または配列番号１１３の前記３’−ＮＣＲのうち１種または複数を含む、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のキメラノイラミニダーゼセグメント。
【請求項１５】
前記５’−非コード領域、前記３’−非コード領域、前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ドメインが全て、前記第２のインフルエンザ株由来である、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のキメラノイラミニダーゼセグメント。
【請求項１６】
前記第２のインフルエンザ株が、Ｈ１インフルエンザ株である、前記請求項のいずれかに記載のキメラ赤血球凝集素セグメントまたはキメラノイラミニダーゼセグメント。
【請求項１７】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のキメラ赤血球凝集素セグメントにコードされるキメラ赤血球凝集素タンパク質、または請求項１０〜１６のいずれかに記載のキメラノイラミニダーゼセグメントにコードされるキメラノイラミニダーゼタンパク質。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のキメラ赤血球凝集素セグメントおよび／またはキメラノイラミニダーゼセグメントを含む、リアソータントインフルエンザウイルス。
【請求項１９】
前記バックボーンセグメントの全てが、１０５ｐ３０およびＰＲ８−Ｘからなる群より選択されるインフルエンザ株由来である、請求項１８に記載のリアソータントインフルエンザウイルス。
【請求項２０】
リアソータントインフルエンザウイルスであって、以下：
ａ）外部ドメイン、５’−非コード領域、３’−非コード領域、シグナルペプチド、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有するキメラ赤血球凝集素タンパク質であって、前記外部ドメインは、第１のインフルエンザ株由来であり、前記５’−非コード領域、前記３’−非コード領域、前記シグナルペプチド、前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ドメインのうち１種または複数は、第２のインフルエンザ株由来であるキメラ赤血球凝集素タンパク質；ならびに／あるいは外部ドメイン、５’−非コード領域、３’−非コード領域、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有するキメラノイラミニダーゼタンパク質であって、前記外部ドメインは、第１のインフルエンザ株由来であり、前記非コード領域、前記細胞質ドメインおよび前記膜貫通ドメインのうち１種または複数は、第２のインフルエンザ株由来である、キメラノイラミニダーゼタンパク質と、
ｂ）以下：
ｉ．２種またはそれを超える異なるドナー株由来のバックボーンセグメント、
ｉｉ．２種またはそれを超えるドナー株由来のバックボーンセグメントであって、ＰＢ１セグメントおよびＰＢ２セグメントが、同じドナー株由来である、バックボーンセグメント、
ｉｉｉ．２または３種のドナー株由来のバックボーンセグメントであって、各ドナー株が、２種以上のバックボーンセグメントを提供する、バックボーンセグメント、
ｉｖ．２種またはそれを超えるドナー株由来のバックボーンセグメントであって、ＰＢ１セグメントが、Ａ／Ｔｅｘａｓ／１／７７インフルエンザ株由来でない、バックボーンセグメント、
ｖ．２種またはそれを超えるドナー株由来のバックボーンセグメントであって、少なくともＰＡセグメント、ＮＰセグメントまたはＭセグメントが、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４由来でない、バックボーンセグメント、
ｖｉ．２種またはそれを超えるドナー株由来のバックボーンセグメントであって、ＨＡセグメントおよびＰＢ１セグメントが、同じインフルエンザウイルスＨＡサブタイプを有する異なるインフルエンザＡ株由来である、バックボーンセグメント、
ｖｉｉ．２種またはそれを超えるドナー株由来のバックボーンセグメントであって、ＨＡセグメントおよびＰＢ１セグメントが、同じインフルエンザウイルスＨＡサブタイプを有する異なるインフルエンザＡ株由来である、バックボーンセグメント
のうち１種または複数と
を含む、リアソータントインフルエンザウイルス。
【請求項２１】
前記キメラ赤血球凝集素の前記５’−非コード領域、前記３’−非コード領域、前記シグナルペプチド、前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ドメインが全て、前記第２のインフルエンザ株由来である、および／または前記キメラノイラミニダーゼタンパク質の前記５’−非コード領域、前記３’−非コード領域、前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ドメインが全て、前記第２のインフルエンザ株由来である、請求項２０に記載のリアソータントインフルエンザウイルス。
【請求項２２】
前記第２のインフルエンザ株が、１０５ｐ３０およびＰＲ８−Ｘからなる群より選択される、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のリアソータントインフルエンザウイルス。
【請求項２３】
ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号３３と整列させた場合、配列番号３３のアミノ酸９５に対応する位置にリシンを有するＭゲノムセグメントを含む、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載のリアソータントインフルエンザウイルス。
【請求項２４】
１０５ｐ３０およびＰＲ８−Ｘからなる群より選択されるドナー株由来の少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントを含む、請求項１８または２０〜２３のいずれか一項に記載のリアソータントインフルエンザウイルス。
【請求項２５】
前記少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントが、配列番号９〜１４または配列番号１７〜２２からなる群より選択される配列と少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有する配列を有する、請求項２４に記載のリアソータントインフルエンザウイルス。
【請求項２６】
前記少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントが、配列番号１７または配列番号２０の配列を有する、請求項２４または請求項２５に記載のリアソータントインフルエンザウイルス。
【請求項２７】
前記ＰＢ１ウイルスセグメントおよび前記ＰＢ２ウイルスセグメントが、配列番号１８および１９の配列と少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有する、請求項２４または請求項２５に記載のリアソータントインフルエンザウイルス。
【請求項２８】
配列番号１７〜２２からなる群より選択される配列と少なくとも９５％の同一性を有するウイルスセグメントをさらに含む、請求項２７に記載のリアソータントインフルエンザウイルス。
【請求項２９】
配列番号９〜１４の全セグメントを含む、請求項２５に記載のリアソータントインフルエンザウイルス。
【請求項３０】
配列番号９の前記ＰＡセグメント、配列番号１３の前記Ｍセグメント、配列番号１４の前記ＮＳセグメント、配列番号１８の前記ＰＢ１セグメント、配列番号１９の前記ＰＢ２セグメントおよび配列番号２０の前記ＮＰセグメントを含む、請求項２５に記載のリアソータントインフルエンザウイルス。
【請求項３１】
配列番号９の前記ＰＡセグメント、配列番号１３の前記Ｍセグメント、配列番号１４の前記ＮＳセグメント、配列番号５２の前記ＰＢ１セグメント、配列番号１１の前記ＰＢ２セグメントおよび配列番号１２の前記ＮＰセグメントを含む、請求項２５に記載のリアソータントインフルエンザウイルス。
【請求項３２】
リアソータントインフルエンザＡウイルスを調製する方法であって、前記方法は、以下：
（ｉ）培養宿主に、請求項１８〜２８のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルスの産生に必要とされるウイルスセグメントをコードする１種または複数の発現構築物（複数可）を導入するステップと、
（ｉｉ）リアソータントウイルスを産生するために前記培養宿主を培養するステップと
を含む、方法。
【請求項３３】
リアソータントインフルエンザウイルスを調製する方法であって、前記方法は、以下：
（ａ）請求項１７〜３１に記載のリアソータントインフルエンザウイルスまたは請求項３２に記載の方法によって得られるウイルスに培養宿主を感染させるステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記宿主を培養して、前記ウイルスを産生するステップと、
任意選択で（ｃ）ステップ（ｂ）において得られる前記ウイルスを精製するステップと
を含む、方法。
【請求項３４】
ワクチンを調製する方法であって、前記方法は、以下：
（ａ）請求項３２または請求項３３に記載の方法によってウイルスを調製するステップと、
（ｂ）前記ウイルスからワクチンを調製するステップと
を含む、方法。
【請求項３５】
前記培養宿主が、孵化鶏卵である、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記培養宿主が、哺乳動物細胞である、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞が、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞またはＰｅｒＣ６細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞が、接着して成長する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞が、懸濁物中で成長する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＭＤＣＫ細胞が、細胞株ＭＤＣＫ  ３３０１６（ＤＳＭ  ＡＣＣ２２１９）のものである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ステップ（ｂ）が、前記ウイルスの不活化を伴う、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ワクチンが、全ビリオンワクチンである、請求項３４〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ワクチンが、スプリットビリオンワクチンである、請求項３４〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ワクチンが、表面抗原ワクチンである、請求項３４〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ワクチンが、ビロソームワクチンである、請求項３４〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ワクチンが、用量当たり１０ｎｇ未満の残留宿主細胞ＤＮＡを含有する、請求項３４〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
請求項１７〜３１のいずれか一項に記載のリアソータントインフルエンザウイルスのセグメントをコードする１種または複数の発現構築物（複数可）を含む発現系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１３年６月６日に出願された米国仮出願第６１／８３２，０９１号および２０１３年９月２６日に出願された欧州特許出願第１３１７９０１３．１号（これら両方の完全な内容は、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ（ＢＡＲＤＡ）によって付与された助成金第ＨＨＳＯ１００２０１０００６１Ｃ号の下、政府の支援を一部受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、インフルエンザウイルス再集合の分野に存する。さらに、本発明は、インフルエンザウイルスから保護するためのワクチンの製造に関する。
【背景技術】
【０００４】
インフルエンザ感染からの最も効率的な保護は、循環株に対するワクチン接種であり、可能な限り迅速にワクチン産生のためのインフルエンザウイルスを産生することが重要である。
【０００５】
野生型インフルエンザウイルスは、多くの場合、卵および細胞培養において低力価まで成長する。ワクチン産生のためにより良く成長するウイルス株を得るために、より速く成長する高収量ドナー株と循環ワクチン株を再集合させることが現在の一般的な実施である。これは、培養宿主を循環インフルエンザ株（ワクチン株）および高収量ドナー株に同時感染させ、ワクチン株由来の赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）セグメントならびにドナー株由来の他のウイルスセグメント（即ち、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１およびＮＳ２をコードするセグメント）を含有するリアソータントウイルスを選択することにより達成することができる。別のアプローチは、逆遺伝学によりインフルエンザウイルスを再集合させることである（例えば、参考文献１および２を参照）。
【０００６】
参考文献３および４は、ワクチン株由来の外部ドメインおよびＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４由来の他のドメインを含むキメラＨＡセグメントを有するインフルエンザウイルスが、野生型ワクチン株と比較してより速く卵において成長したことを報告する。参考文献５は、Ａ／ＰＲ／８／３４由来の膜貫通およびストークドメインを含有するキメラＮＡタンパク質を有するインフルエンザウイルスを教示する。参考文献６および７は、インフルエンザＡおよびＢウイルスの両方に由来するドメインを有するキメラＨＡセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスを教示する。
【０００７】
キメラＨＡタンパク質による研究の大部分は、卵において為されており、参考文献３は、「［記載された］キメラウイルスに見られる改善が、卵基材に非常に特異的である可能性が高い」ことを教示する。細胞培養における成長を検査した研究は、検査したウイルスが、細胞培養において不十分な成長を示したことを見出した。したがって、本技術分野において依然として、特に細胞培養において、高収量のリアソータントインフルエンザウイルスを提供する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００７／００２００８号
【特許文献２】国際公開第２００７／１２４３２７号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｈａｒｖｅｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，（２０１１）８５（１２）：６０８６−６−９０
【非特許文献２】Ｈａｒｖｅｙら、Ｖａｃｃｉｎｅ，（２０１０）２３；２８（５０）：８００８〜１４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
好ましい実施形態の概要
本発明は、外部ドメイン、５’−非コード領域、３’−非コード領域、シグナルペプチド、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有するキメラインフルエンザ赤血球凝集素セグメントであって、前記外部ドメインが、第１のインフルエンザ株由来であり、前記５’−非コード領域、前記３’−非コード領域、前記シグナルペプチド、前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ドメインのうち１種または複数が、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４、Ａ／ＷＳＮ／３３またはＢ／Ｌｅｅ／４０ではない第２のインフルエンザ株由来であるキメラインフルエンザ赤血球凝集素セグメントを提供する。
【００１１】
外部ドメイン、５’−非コード領域、３’−非コード領域、シグナルペプチド、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有するキメラインフルエンザ赤血球凝集素セグメントであって、前記外部ドメインが、Ｈ１インフルエンザ株またはＨ５インフルエンザ株ではない第１のインフルエンザＡ株由来であり、前記５’−非コード領域、前記３’−非コード領域、前記シグナルペプチド、前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ドメインのうち１種または複数が、第２のインフルエンザ株由来であるキメラインフルエンザ赤血球凝集素セグメントも提供される。
【００１２】
本発明は、外部ドメイン、５’−非コード領域、３’−非コード領域、シグナルペプチド、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有するキメラインフルエンザ赤血球凝集素セグメントであって、前記外部ドメインが、第１のインフルエンザＢ株由来であり、前記５’−非コード領域、前記３’−非コード領域、前記シグナルペプチド、前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ドメインのうち１種または複数が、インフルエンザＢ株であるまたはＨ１株もしくはＨ３株ではないインフルエンザＡ株である第２のインフルエンザ株由来であるキメラインフルエンザ赤血球凝集素セグメントも提供する。本キメラ赤血球凝集素セグメントは、好ましくは、前記第２のインフルエンザウイルスに由来する前記５’−非コード領域、前記３’−非コード領域、前記シグナルペプチド、前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ドメインの全てを含む。なぜなら、本発明者らが、かかるキメラ赤血球凝集素セグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスが、細胞培養において特に優れたＨＡ収量をもたらすことを見出したからである。
【００１３】
外部ドメイン、５’−非コード領域、３’−非コード領域、シグナルペプチド、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有するキメラインフルエンザ赤血球凝集素セグメントであって、前記外部ドメインが、第１のインフルエンザ株由来であり、前記５’−非コード領域、前記３’−非コード領域、前記シグナルペプチド、前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ドメインのうち１種または複数が、第２のインフルエンザ株由来であり、前記セグメントが、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号１５と整列させた場合、（ａ）ヌクレオチド２４に対応する位置におけるグアニン；および／または（ｂ）ヌクレオチド３８に対応する位置におけるアデニン；および／または（ｃ）ヌクレオチド４０に対応する位置におけるチミン；および／または（ｄ）ヌクレオチド４４に対応する位置におけるアデニン；および／または（ｅ）ヌクレオチド５３に対応する位置におけるチミン；および／または（ｆ）ヌクレオチド６３に対応する位置におけるアデニン；および／または（ｇ）ヌクレオチド６６に対応する位置におけるチミン；および／または（ｈ）ヌクレオチド６９に対応する位置におけるアデニン；および／または（ｉ）ヌクレオチド７５に対応する位置におけるアデニン；および／または（ｊ）ヌクレオチド７８に対応する位置におけるチミン；および／または（ｋ）ヌクレオチド１６３７に対応する位置におけるアデニン；および／または（ｌ）ヌクレオチド１６４９に対応する位置におけるシトシン、および／または（ｍ）ヌクレオチド１６５５に対応する位置におけるチミン、および／または（ｎ）ヌクレオチド１６８２に対応する位置におけるシトシン；および／または（ｏ）ヌクレオチド１６９７に対応する位置におけるシトシン；および／または（ｐ）ヌクレオチド１７０３に対応する位置におけるグアニン、および／または（ｑ）ヌクレオチド１７１５に対応する位置におけるチミン、および／または（ｒ）ヌクレオチド１７２９に対応する位置におけるアデニン、および／または（ｓ）ヌクレオチド１７３３に対応する位置におけるシトシン、および／または（ｔ）ヌクレオチド１７３４に対応する位置におけるシトシン、および／または（ｕ）ヌクレオチド１７４６に対応する位置におけるアデニン、および／または（ｖ）ヌクレオチド１７５１に対応する位置におけるアデニンのうち１種または複数を含むキメラインフルエンザ赤血球凝集素セグメントも提供される。好ましくは、本キメラ赤血球凝集素は、（ａ）〜（ｖ）のヌクレオチドの全てを含む。
【００１４】
本発明は、外部ドメイン、５’−非コード領域、３’−非コード領域、シグナルペプチド、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有するキメラ赤血球凝集素セグメントであって、前記外部ドメインが、第１のインフルエンザ株由来であり、前記５’−非コード領域、前記３’−非コード領域、前記シグナルペプチド、前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ドメインのうち１種または複数が、第２のインフルエンザ株由来であり、前記セグメントが、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号６３と整列させた場合、配列番号６３のアミノ酸３に対応する位置にアラニンを有さない；および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号６３と整列させた場合、配列番号６３のアミノ酸４に対応する位置にアスパラギンを有さない；および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号６３と整列させた場合、配列番号６３のアミノ酸１１に対応する位置にアラニンを有さない；および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号６３と整列させた場合、配列番号６３のアミノ酸１２に対応する位置にロイシンを有さない；および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号６３と整列させた場合、配列番号６３のアミノ酸１３に対応する位置にアラニンを有さない；および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号６３と整列させた場合、配列番号６３のアミノ酸１５に対応する位置にアラニンを有さない；および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号６３と整列させた場合、配列番号６３のアミノ酸１６に対応する位置にアスパラギン酸を有さないタンパク質をコードするキメラ赤血球凝集素セグメントも提供する。
【００１５】
一部の態様において、本キメラ赤血球凝集素セグメントは、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号６３と整列させた場合、配列番号６３のアミノ酸３に対応する位置におけるバリン；および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号６３と整列させた場合、配列番号６３のアミノ酸４に対応する位置におけるリシン；および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号６３と整列させた場合、配列番号６３のアミノ酸１１に対応する位置におけるスレオニン；および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号６３と整列させた場合、配列番号６３のアミノ酸１２に対応する位置におけるフェニルアラニン；および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号６３と整列させた場合、配列番号６３のアミノ酸１３に対応する位置におけるスレオニン；および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号６３と整列させた場合、配列番号６３のアミノ酸１５に対応する位置におけるスレオニン；および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号６３と整列させた場合、配列番号６３のアミノ酸１６に対応する位置におけるチロシンのうち１種または複数を有するタンパク質をコードすることができる。本キメラＨＡセグメントは、好まれるこれらのアミノ酸の全てを含み得る。なぜなら、かかるキメラ赤血球凝集素セグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスが、細胞培養における特に優れたＨＡ収量をもたらすからである。
【００１６】
本キメラ赤血球凝集素セグメントは、配列番号１１０の５’−ＮＣＲドメイン；および／または配列番号１１１のＣＴドメイン；および／または配列番号１１２のＴＭドメイン；および／または配列番号１１３の３’−ＮＣＲのうち１種または複数を含むことができる。
【００１７】
本発明は、外部ドメイン、５’−非コード領域、３’−非コード領域、シグナルペプチド、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有するキメラ赤血球凝集素セグメントであって、前記外部ドメインが、第１のインフルエンザ株由来であり、前記５’−非コード領域、前記３’−非コード領域、前記シグナルペプチド、前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ドメインのうち１種または複数が、第２のインフルエンザ株由来であり、前記セグメントが、位置２４におけるグアニン、位置３８におけるアデニン、位置４０におけるチミン、位置５３におけるチミン、位置６３におけるアデニン、位置６６におけるチミン、位置６９におけるアデニン、位置７５におけるアデニン、位置７８におけるチミン、位置１７０３におけるグアニン、位置１７１５におけるチミン、位置１７２９におけるアデニン、位置１７３３におけるシトシン、位置１７３４におけるシトシン、位置１７４６におけるアデニンおよび／または位置１７５１におけるアデニンのうち１種または複数（好ましくは全て）を含むキメラ赤血球凝集素セグメントも提供する。これらの位置は全て、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号１５と整列させた場合、配列番号１５における対応する位置に対するものである。
【００１８】
本キメラ赤血球凝集素セグメントは、後述する１０５ｐ３０インフルエンザ株に由来する前記５’−非コード領域、前記３’−非コード領域、前記シグナルペプチド、前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ドメインのうち１種または複数を含むことができる。好ましくは、本キメラ赤血球凝集素セグメントは、１０５ｐ３０インフルエンザ株に由来する前記５’−非コード領域、前記３’−非コード領域、前記シグナルペプチド、前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ドメインの全てを含む。なぜなら、かかるキメラ赤血球凝集素セグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスが、細胞培養における特に優れたＨＡ収量をもたらすからである。
【００１９】
本発明のキメラＨＡセグメントにコードされるキメラＨＡタンパク質も提供される。
【００２０】
本発明者らは、本発明のキメラＨＡセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスが、同じ時間枠および同じ条件下で、キメラＨＡセグメントを含まないリアソータントインフルエンザウイルスと比較して最大５倍高いＨＡ収量をもたらすことができることを発見した。
【００２１】
外部ドメイン、５’−非コード領域、３’−非コード領域、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有するキメラインフルエンザノイラミニダーゼセグメントであって、前記外部ドメインが、第１のインフルエンザ株由来であり、前記５’−非コード領域、前記３’−非コード領域、前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ドメインのうち１種または複数が、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４またはＡ／ＷＳＮ／３３ではない第２のインフルエンザ株由来であるキメラインフルエンザノイラミニダーゼセグメントがさらに提供される。
【００２２】
外部ドメイン、５’−非コード領域、３’−非コード領域、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有するキメラインフルエンザノイラミニダーゼセグメントであって、前記外部ドメインが、第１のインフルエンザ株であり、前記５’−非コード領域、前記３’−非コード領域、前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ドメインが、第２のインフルエンザ株由来であり、前記第１のインフルエンザ株および前記第２のインフルエンザ株が、両者共にインフルエンザＡ株であるまたは両者共にインフルエンザＢ株であるキメラインフルエンザノイラミニダーゼセグメントも提供される。
【００２３】
本発明は、外部ドメイン、５’−非コード領域、３’−非コード領域、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有するキメラノイラミニダーゼセグメントであって、前記外部ドメインが、第１のインフルエンザ株由来であり、前記５’−非コード領域、前記３’−非コード領域、前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ドメインのうち１種または複数が、第２のインフルエンザ株由来であり、前記セグメントが、ヌクレオチド１３に対応する位置におけるアデニン；および／またはヌクレオチド３５に対応する位置におけるアデニン；および／またはヌクレオチド６０に対応する位置におけるアデニン；および／またはヌクレオチド６３に対応する位置におけるアデニン；および／またはヌクレオチド６５に対応する位置におけるアデニン；および／またはヌクレオチド６７に対応する位置におけるシトシン；および／またはヌクレオチド６９に対応する位置におけるアデニン；および／またはヌクレオチド７５に対応する位置におけるアデニン；および／またはヌクレオチド８３に対応する位置におけるチミン；および／またはヌクレオチド８９に対応する位置におけるグアニン；および／またはヌクレオチド１０１に対応する位置におけるアデニン；および／またはヌクレオチド１０７に対応する位置におけるチミン；および／またはヌクレオチド１１０に対応する位置におけるチミン；および／またはヌクレオチド１２０に対応する位置におけるグアニン；および／またはヌクレオチド１２１に対応する位置におけるシトシン；および／またはヌクレオチド１２５に対応する位置におけるチミン；および／またはヌクレオチド１２７に対応する位置におけるチミンのうち１種または複数（好ましくは全て）を含むキメラノイラミニダーゼセグメントも提供する。これらの位置は全て、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号１６と整列させた場合、配列番号１６における対応する位置に対するものである。
【００２４】
本発明は、外部ドメイン、５’−非コード領域、３’−非コード領域、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有するキメラノイラミニダーゼセグメントであって、前記外部ドメインが、第１のインフルエンザ株由来であり、前記５’−非コード領域、前記３’−非コード領域、前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ドメインのうち１種または複数が、第２のインフルエンザ株由来であり、前記セグメントが、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号６４と整列させた場合、配列番号６４のアミノ酸１４に対応する位置にシステインを有さない、および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号６４と整列させた場合、配列番号６４のアミノ酸１５に対応する位置にロイシンを有さない；および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号６４と整列させた場合、配列番号６４のアミノ酸１６に対応する位置にバリンを有さない；および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号６４と整列させた場合、配列番号６４のアミノ酸１７に対応する位置にバリンを有さない；および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号６４と整列させた場合、配列番号６４のアミノ酸１９に対応する位置にロイシンを有さない；および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号６４と整列させた場合、配列番号６４のアミノ酸２３に対応する位置にイソロイシンを有さない；および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号６４と整列させた場合、配列番号６４のアミノ酸３４に対応する位置にイソロイシンを有さないタンパク質をコードするキメラノイラミニダーゼセグメントも提供する。
【００２５】
一部の態様において、本キメラノイラミニダーゼセグメントは、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号６４と整列させた場合、配列番号６４のアミノ酸１４に対応する位置におけるセリン、および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号６４と整列させた場合、配列番号６４のアミノ酸１５に対応する位置におけるイソロイシン；および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号６４と整列させた場合、配列番号６４のアミノ酸１６に対応する位置におけるアラニン；および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号６４と整列させた場合、配列番号６４のアミノ酸１７に対応する位置におけるイソロイシン；および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号６４と整列させた場合、配列番号６４のアミノ酸１９に対応する位置におけるイソロイシン；および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号６４と整列させた場合、配列番号６４のアミノ酸２３に対応する位置におけるメチオニン；および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号６４と整列させた場合、配列番号６４のアミノ酸３４に対応する位置におけるアラニンのうち１種または複数を含むタンパク質をコードすることができる。本キメラＮＡセグメントは、好まれるこれらのアミノ酸の全てを含むことができる。なぜなら、かかるキメラ赤血球凝集素セグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスが、細胞培養における特に優れたＨＡ収量をもたらすからである。
【００２６】
本キメラノイラミニダーゼセグメントは、配列番号１１０の５’−ＮＣＲドメイン；および／または配列番号１１１のＣＴドメイン；および／または配列番号１１２のＴＭドメイン；および／または配列番号１１３の３’−ＮＣＲのうち１種または複数を含むことができる。
【００２７】
本発明は、外部ドメイン、５’−非コード領域、３’−非コード領域、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有するキメラノイラミニダーゼセグメントであって、前記外部ドメインが、第１のインフルエンザ株由来であり、前記５’−非コード領域、前記３’−非コード領域、前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ドメインのうち１種または複数が、第２のインフルエンザ株由来であり、前記セグメントが、位置１３におけるアデニン、位置３５におけるアデニン、位置６３におけるアデニン、位置６５におけるアデニン、位置６７におけるシトシン、位置６９におけるアデニン、位置７５におけるアデニン、位置８３におけるチミン、位置８９におけるグアニン、位置１０１におけるアデニン、位置１０７におけるチミン、位置１１０におけるチミン、位置１２０におけるグアニン、位置１２１におけるシトシン、位置１２５におけるチミン、位置１３８５におけるシトシン、位置１３８６におけるチミン、位置１３８７におけるシトシンおよび／または位置１３９２におけるグアニンのうち１種または複数（好ましくは全て）を含むキメラノイラミニダーゼセグメントも提供する。これらの位置は全て、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号１６と整列させた場合、配列番号１６における対応する位置に対するものである。
【００２８】
キメラノイラミニダーゼセグメントは、後述する１０５ｐ３０インフルエンザ株に由来する５’−非コード領域、３’−非コード領域、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインのうち１種または複数を含むことができる。好ましくは、本キメラ赤血球凝集素セグメントは、１０５ｐ３０インフルエンザ株に由来する５’−非コード領域、３’−非コード領域、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの全てを含む。なぜなら、かかるキメラノイラミニダーゼセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスが、細胞培養における特に優れたＨＡ収量をもたらすからである。
【００２９】
本発明のキメラＮＡセグメントにコードされるキメラＮＡタンパク質も提供される。
【００３０】
本発明者らは、本発明のキメラＮＡセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスが、同じ時間枠および同じ条件下で、キメラＮＡセグメントを含まないリアソータントインフルエンザウイルスと比較して最大２倍高いＨＡ収量をもたらすことができることを発見した。
【００３１】
本発明は、本発明のキメラＨＡおよび／またはＮＡセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスを提供する。好ましくは、本リアソータントインフルエンザウイルスは、本発明のキメラＨＡおよびキメラＮＡセグメントの両方を含む。なぜなら、本発明者らが、かかるリアソータントインフルエンザウイルスが、キメラＨＡまたはキメラＮＡセグメントのみを含むリアソータントインフルエンザウイルスよりも速く成長し、より優れたＨＡ収量をもたらすことを発見したからである。
【００３２】
本発明は、以下：
ａ）外部ドメイン、５’−非コード領域、３’−非コード領域、シグナルペプチド、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有するキメラ赤血球凝集素タンパク質であって、前記外部ドメインが、第１のインフルエンザ株由来であり、前記５’−非コード領域、前記３’−非コード領域、前記シグナルペプチド、前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ドメインのうち１種または複数が、第２のインフルエンザ株由来であるキメラ赤血球凝集素タンパク質；および／または外部ドメイン、５’−非コード領域、３’−非コード領域、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有するキメラノイラミニダーゼタンパク質であって、前記外部ドメインが、第１のインフルエンザ株由来であり、前記非コード領域、前記細胞質ドメインおよび前記膜貫通ドメインのうち１種または複数が、第２のインフルエンザ株由来であるキメラノイラミニダーゼタンパク質と、
（ｂ）以下：
ｉ．２種またはそれを超える異なるドナー株由来のバックボーンセグメント、
ｉｉ．ＰＢ１セグメントおよびＰＢ２セグメントが同じドナー株由来である、２種またはそれを超えるドナー株由来のバックボーンセグメント、
ｉｉｉ．各ドナー株が２種以上のバックボーンセグメントを提供する、２または３種のドナー株由来のバックボーンセグメント、
ｉｖ．ＰＢ１セグメントが、Ａ／Ｔｅｘａｓ／１／７７インフルエンザ株に由来しない、２種またはそれを超えるドナー株由来のバックボーンセグメント、
ｖ．少なくともＰＡセグメント、ＮＰセグメントまたはＭセグメントが、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４に由来しない、２種またはそれを超えるドナー株由来のバックボーンセグメント、
ｖｉ．ＨＡセグメントおよびＰＢ１セグメントが、同じインフルエンザウイルスＨＡサブタイプを有する異なるインフルエンザＡ株由来である、２種またはそれを超えるドナー株由来のバックボーンセグメント
のうち１種または複数と
を含むリアソータントインフルエンザウイルスも提供する。
【００３３】
本発明者らは、２種またはそれを超えるインフルエンザドナー株由来のバックボーンセグメントを含むインフルエンザウイルスが、同じドナー株由来の全バックボーンセグメントを含有するリアソータントインフルエンザウイルスと比較して、培養宿主においてより速く成長し得ることを発見したため、これらのリアソータントインフルエンザウイルスは、特に有用である。特に、本発明者らは、２種の高収量ドナー株由来のバックボーンセグメントを含むインフルエンザウイルスが、前記２種の本来のドナー株のいずれかで構成されたリアソータントよりも標的ワクチン関連ＨＡ／ＮＡ遺伝子を有する高収量のリアソータントを産生し得ることを見出した。前記第１のインフルエンザ株および前記第２のインフルエンザ株は、好ましくは、両者共にインフルエンザＡ株またはインフルエンザＢ株である。
【００３４】
本発明は、リアソータントインフルエンザウイルスを調製する方法であって、（ａ）本発明のリアソータントインフルエンザウイルスまたは本発明の方法により産生されたリアソータントインフルエンザウイルスに培養宿主を感染させるステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の前記宿主を培養して、前記ウイルスを産生するステップと、任意選択で（ｃ）ステップ（ｂ）において得られる前記ウイルスを精製するステップとを含む方法も提供する。
【００３５】
本リアソータントインフルエンザウイルスは、ワクチンへと製剤化することができる。よって、本発明は、ワクチンを調製する方法であって、（ａ）本発明に係る方法によりリアソータントインフルエンザウイルスを調製するステップと、（ｂ）前記ウイルスからワクチンを調製するステップとを含む方法を提供する。また、本発明のリアソータントインフルエンザウイルスからワクチンを調製する方法も提供される。
【００３６】
本発明のリアソータントインフルエンザウイルスのｖＲＮＡをコードする１種または複数の発現構築物（複数可）を含む発現系がさらに提供される。
【００３７】
キメラＨＡおよびＮＡセグメント
本発明は、キメラＨＡおよびＮＡセグメントを提供する。
【００３８】
構造的には、本インフルエンザＨＡセグメントは、ＨＡセグメントのシグナルペプチド（ＳＰ）、膜貫通（ＴＭ）、細胞質ドメイン（ＣＴ）および外部ドメインを挟む、５’−および３’−非コード領域（ＮＣＲ）で構成されている（図４Ａを参照）。ＨＡ外部ドメインは、インフルエンザワクチンにおける最も重要なインフルエンザ抗原であり、一方、末端ドメイン（ＮＣＲ、ＳＰ、ＴＭおよびＣＴ）の抗原的な重要性はより低い。本インフルエンザＮＡセグメントも、５’−および３’−ＮＣＲ、ＣＴドメインならびにＴＭドメインである末端ドメインと共に外部ドメインを含有するが、ＮＡは、シグナルペプチドを含有しない（図４Ｃを参照）。末端ドメインは、ＮＡ外部ドメインよりも抗原的な重要性が低い。
【００３９】
当業者であれば、いずれか所定のＨＡおよびＮＡセグメント内の末端ドメインの配列を容易に決定することができる。さらに、配列番号１０５〜１０９および配列番号１１４〜１１８は、それぞれ１０５ｐ３０およびＰＲ８ＸのＨＡ末端ドメインの配列を示す。配列番号１１０〜１１４および配列番号１１９〜１２２は、それぞれ１０５ｐ３０およびＰＲ８Ｘの末端ドメインの配列を示す。この配列情報を使用して、当業者は、他のＨＡおよびＮＡ配列における対応するドメインを見出すことができる。
【００４０】
本発明のキメラＨＡセグメントは、ワクチン株に由来する外部ドメインおよび第２のインフルエンザウイルスに由来する末端ドメインのうち１種または複数を含む。ワクチン株は、任意のインフルエンザ株で有り得、ＨＡ外部ドメインを提供するインフルエンザ株として定義される。第２のインフルエンザ株は、ワクチン株と異なる。ワクチン株および第２のインフルエンザ株は、好ましくは、両者共にインフルエンザＡ株であるまたは両者共にインフルエンザＢ株である。
【００４１】
本発明のキメラＮＡセグメントは、第１のインフルエンザ株由来の外部ドメインおよび第２のインフルエンザウイルス由来の末端ドメインのうち１種または複数を含む。「第２のインフルエンザ株」は、「第１のインフルエンザ株」とは異なる。第１および第２のインフルエンザ株は、好ましくは、両者共にインフルエンザＡ株であるまたは両者共にインフルエンザＢ株である。
【００４２】
キメラＨＡおよびＮＡセグメントは、第２のインフルエンザ株由来である末端ドメインの全てを含むことが好ましい。なぜなら、本発明者らが、かかるキメラＨＡおよび／またはＮＡタンパク質を含むリアソータントインフルエンザウイルスが、細胞培養において特に十分に成長し得ることを示したからである。
【００４３】
「第２のインフルエンザ株」は、インフルエンザＡウイルスＨＡサブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６またはＨ１７を有する株であり得る。これは、インフルエンザＡウイルスＮＡサブタイプＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８またはＮ９を有することもできる。第２のインフルエンザウイルスは、Ｈ１インフルエンザ株であることが好ましい。なぜなら、本発明者らは、かかるキメラＨＡおよび／またはＮＡセグメントを含有するリアソータントインフルエンザウイルスが、細胞培養において特に十分に成長することを発見したからである。最も好ましくは、第２のインフルエンザ株は、後述する通り、１０５ｐ３０またはＰＲ８−Ｘである。
【００４４】
キメラＨＡセグメントが、１０５ｐ３０に由来する１種または複数の末端ドメインを含む場合、５’−ＮＣＲドメインは、配列番号１０５の配列を有することができる；および／または配列番号１０６のＳＰ；および／または配列番号１０７のＴＭドメイン；および／または配列番号１０８のＣＴドメイン；および／または配列番号１０９の３’−ＮＣＲを有することができる。好ましくは、キメラＨＡセグメントは、これらの配列の全てを含有する。
【００４５】
キメラＮＡセグメントが、１０５ｐ３０に由来する１種または複数の末端ドメインを含む場合、５’−ＮＣＲドメインは、配列番号１１０の配列を有することができる；および／または配列番号７１のＣＴドメイン；および／または配列番号１１２のＴＭドメイン；および／または配列番号１１３の３’−ＮＣＲを有することができる。好ましくは、キメラＮＡセグメントは、これらの配列の全てを含有する。
【００４６】
キメラＨＡセグメントが、ＰＲ８−Ｘに由来する１種または複数の末端ドメインを含む場合、５’−ＮＣＲドメインは、配列番号１１４の配列を有することができる；および／または配列番号１１５のＳＰ；および／または配列番号１１６のＴＭドメイン；および／または配列番号１１７のＣＴドメイン；および／または配列番号１１８の３’−ＮＣＲを有することができる。好ましくは、キメラＨＡセグメントは、これらの配列の全てを含有する。
【００４７】
キメラＮＡセグメントが、ＰＲ８−Ｘに由来する１種または複数の末端ドメインを含む場合、５’−ＮＣＲドメインは、配列番号１１９の配列を有することができる；および／または配列番号１２０のＣＴドメイン；および／または配列番号１２１のＴＭドメイン；および／または配列番号１２２の３’−ＮＣＲを有することができる。好ましくは、キメラＮＡセグメントは、これらの配列の全てを含有する。
【００４８】
第２のインフルエンザ株は、インフルエンザＢ株であり得る。
【００４９】
外部ドメインおよび１種または複数の末端ドメインは全て、インフルエンザＡウイルスまたはインフルエンザＢウイルスに由来することができる。インフルエンザＡウイルスに由来する外部ドメインおよびインフルエンザＢウイルスに由来する末端ドメインのうち１種または複数を有することも可能であり、逆もまた同じである。キメラＨＡまたはキメラＮＡセグメントにおける全てのセグメントが、インフルエンザＡ株またはインフルエンザＢ株に由来することが最も好ましい。
【００５０】
一部の実施形態において、本発明のキメラＨＡセグメントは、配列番号７と整列させた場合、アミノ酸５４５に対応する位置にチロシンを有さないタンパク質をコードする。
【００５１】
リアソータントウイルス
本発明は、本発明のキメラＨＡおよび／またはＮＡセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスを提供する。本リアソータントインフルエンザウイルスは、ワクチン株に由来するＨＡ外部ドメインを含む。ワクチン株は、任意のインフルエンザ株で有り得、ＨＡ外部ドメインがキメラＨＡセグメントに含まれるか否かとは無関係に、ＨＡ外部ドメインを提供するインフルエンザ株として定義される。ＮＡセグメントの外部ドメイン（キメラまたは非キメラＮＡセグメントにおける）は、ワクチン株に由来することができる、あるいは異なるインフルエンザ株に由来することができる。
【００５２】
リアソータントインフルエンザウイルスのバックボーンセグメントのうち１種または複数（即ち、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１およびＮＳ２をコードするセグメント）は、バックボーンセグメントのうち１種または複数を提供するが、インフルエンザＨＡセグメントの外部ドメインを提供しないインフルエンザウイルスであるドナー株に由来することができる。ＮＡセグメントの外部ドメインは、ドナー株によって提供されることもできる、あるいはワクチン株によって提供されることができる。本発明のリアソータントインフルエンザ株は、ワクチン株由来のバックボーンセグメントのうち１種または複数（ただし全てではない）を含むこともできる。
【００５３】
ドナー株は、キメラＨＡまたはＮＡセグメントのうち１種または複数の末端ドメインを提供する「第２のインフルエンザ株」と同じであってよい。これらのリアソータントインフルエンザウイルスにおいて、ＰＡ、Ｍおよび／またはＮＳセグメント（複数可）は、好ましくは、第２のインフルエンザウイルスに由来する。第２のインフルエンザウイルスは、ドナー株とは異なっていてもよい。
【００５４】
本リアソータントインフルエンザウイルスは、細胞培養および／または卵において、同じ時間（例えば、１２時間、２４時間、４８時間または７２時間）および同じ成長条件下で、野生型ワクチン株と比較して、より高いまたは同様のウイルス価まで成長することができる。特に、これは、ＭＤＣＫ細胞（ＭＤＣＫ  ３３０１６等）において、同じ時間および同じ成長条件下で、野生型ワクチン株と比較して、より高いまたは同様のウイルス価まで成長することができる。ウイルス価は、当業者に公知の標準方法により決定することができる。有用には、本発明のリアソータントウイルスは、同じ時間枠および同じ条件下で、野生型ワクチン株のウイルス価よりも少なくとも５％高い、少なくとも１０％高い、少なくとも２０％高い、少なくとも５０％高い、少なくとも１００％高い、少なくとも２００％高いまたは少なくとも５００％高いウイルス価を達成することができる。それに加えてまたはそれに代えて、本発明のリアソータントインフルエンザウイルスは、キメラＨＡまたはＮＡセグメントを有さないことが予想される同じウイルスセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスのウイルス価よりも少なくとも５％高い、少なくとも１０％高い、少なくとも２０％高い、少なくとも５０％高い、少なくとも１００％高い、少なくとも２００％高いまたは少なくとも５００％高いウイルス価を達成することができる。
【００５５】
本リアソータントインフルエンザウイルスは、同じ時間および同じ成長条件下で、野生型ワクチン株と比較して、同様のウイルス価まで成長することもできる。この文脈における同様の力価は、リアソータントインフルエンザウイルスが、同じ時間および同じ成長条件下で、野生型ワクチン株により達成されるウイルス価の３％以内の力価まで成長する（即ち、野生型力価±３％）ことを意味する。
【００５６】
本リアソータントウイルスは、細胞培養および／または卵において、同じ時間（例えば、１２時間、２４時間、４８時間または７２時間）および同じ成長条件下で、野生型ワクチン株と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍または少なくとも１０倍高いＨＡ収量をもたらすこともできる。
【００５７】
本発明のリアソータントウイルスが、単一ドナー株由来のバックボーンセグメントを含むリアソータントである場合、本リアソータントウイルスは、一般に、ドナー株およびワクチン株由来のセグメントを、１：７、２：６、３：５、４：４、５：３、６：２または７：１の比で含むであろう。古典的リアソータントは、通常、ドナー株由来のセグメントの大部分を、特に、６：２の比で有する。単一ドナー株のみが使用される場合、あらゆるバックボーンセグメントが、ＰＲ８−Ｘ由来であることが好ましい。なぜなら、かかるリアソータントインフルエンザウイルスが、細胞培養において速く成長するからである。
【００５８】
本発明のリアソータントウイルスは、２種またはそれを超える（即ち、３、４、５または６種の）ドナー株由来のバックボーンセグメントを含有することができる。本リアソータントウイルスが、２種のドナー株由来のバックボーンセグメントを含む場合、本リアソータントウイルスは、一般に、第１のドナー株、第２のドナー株およびワクチン株由来のセグメントを、１：１：６、１：２：５、１：３：４、１：４：３、１：５：２、１：６：１、２：１：５、２：２：４、２：３：３、２：４：２、２：５：１、３：１：２、３：２：１、４：１：３、４：２：２、４：３：１、５：１：２、５：２：１または６：１：１の比で含むであろう。本リアソータントインフルエンザウイルスは、３種以上、例えば、３、４、５または６種のドナー株由来のウイルスセグメントを含むこともできる。
【００５９】
本リアソータントインフルエンザウイルスが、２または３種のドナー株由来のバックボーンセグメントを含む場合、各ドナー株は、リアソータントインフルエンザウイルスのバックボーンセグメントのうち２種以上を提供することができるが、ドナー株のうち１または２種は、単一のバックボーンセグメントのみを提供することもできる。
【００６０】
本リアソータントインフルエンザウイルスが、２、３、４または５種のドナー株由来のバックボーンセグメントを含む場合、ドナー株のうち１または２種は、リアソータントインフルエンザウイルスのバックボーンセグメントのうち２種以上を提供することができる。一般に、本リアソータントインフルエンザウイルスは、７種以上のバックボーンセグメントを含むことができない。したがって、例えば、ドナー株のうち１種が、ウイルスセグメントのうち５種を提供する場合、リアソータントインフルエンザウイルスは、合計２種の異なるドナー株由来のバックボーンセグメントのみを含むことができる。
【００６１】
一般に、リアソータントインフルエンザウイルスは、各バックボーンセグメントのうち１種のみを含有するであろう。例えば、インフルエンザウイルスが、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９に由来するＮＰセグメントを含む場合、これは、別のインフルエンザ株由来のＮＰセグメントを同時に含まないであろう。
【００６２】
本リアソータントインフルエンザウイルスは、インフルエンザＡ株に由来するＨＡ外部ドメインを含むことができる。例えば、本リアソータントインフルエンザウイルスは、インフルエンザＡウイルスＨＡサブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６またはＨ１７を有することができる。それに加えてまたはそれに代えて、本リアソータントインフルエンザウイルスは、インフルエンザＡウイルスに由来するＮＡ外部ドメインを含むことができる。例えば、これは、インフルエンザＡウイルスＮＡサブタイプＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８またはＮ９を有することができる。ワクチン株が、季節性インフルエンザ株である場合、これは、Ｈ１またはＨ３サブタイプを有することができる。本発明の一態様において、ワクチン株は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２またはＨ７Ｎ９株である。
【００６３】
本リアソータントインフルエンザウイルスは、好ましくは、ドナー株ＰＲ８−Ｘに由来する少なくとも１種のバックボーンセグメントを含む。よって、本発明のインフルエンザウイルスは、配列番号９の配列に対し少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有するＰＡセグメント、配列番号１０の配列に対し少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有するＰＢ１セグメント、配列番号１１の配列に対し少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有するＰＢ２セグメント、配列番号１２の配列に対し少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有するＮＰセグメント、配列番号１３の配列に対し少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有するＭセグメントおよび／または配列番号１４の配列に対し少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有するＮＳセグメントから選択される１種または複数のセグメントを含むことができる。本リアソータントインフルエンザウイルスは、これらのバックボーンセグメントの全てを含むことができる。このようなウイルスが特に好ましい。なぜなら、本発明者らが、このバックボーンと組み合わせたキメラＨＡおよび／またはＮＡセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスが、細胞培養において特に十分に成長することを示したからである。
【００６４】
それに代えてまたはそれに加えて、本リアソータントインフルエンザウイルスは、１０５ｐ３０株に由来する１種または複数のバックボーンウイルスセグメントを含むことができる。よって、リアソータントインフルエンザウイルスが、１０５ｐ３０株に由来する１種または複数のセグメントを含む場合、ウイルスセグメントは、配列番号４２の配列に対し少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有するＰＡセグメント、配列番号４３の配列に対し少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有するＰＢ１セグメント、配列番号４４の配列に対し少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有するＰＢ２セグメント、配列番号４５の配列に対し少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有するＮＰセグメント、配列番号４６の配列に対し少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有するＭセグメントおよび／または配列番号４７の配列に対し少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有するＮＳセグメントから選択される配列を有することができる。本リアソータントインフルエンザウイルスは、これらのバックボーンセグメントの全てを含むことができる。
【００６５】
２種またはそれを超えるインフルエンザドナー株由来のバックボーンセグメントを有するリアソータントインフルエンザウイルスは、異なるインフルエンザ株由来のＨＡセグメントおよびＰＢ１セグメントを含むことができる。これらのリアソータントインフルエンザウイルスにおいて、ＰＢ１セグメントは、ワクチン株と同じインフルエンザウイルスＨＡサブタイプを有するドナーウイルスに由来し得る。例えば、ＰＢ１セグメントおよびＨＡセグメントは両者共に、Ｈ１サブタイプを有するインフルエンザウイルスに由来し得る。本リアソータントインフルエンザウイルスは、異なるインフルエンザウイルスＨＡサブタイプを有する異なるインフルエンザ株由来のＨＡセグメントおよびＰＢ１セグメントを含むこともでき、前記ＰＢ１セグメントは、Ｈ３ＨＡサブタイプを有するインフルエンザウイルスに由来せず、および／または前記ＨＡセグメントは、Ｈ１またはＨ５ＨＡサブタイプを有するインフルエンザウイルスに由来しない。例えば、ＰＢ１セグメントは、Ｈ１ウイルスに由来し得る、および／またはＨＡセグメントは、Ｈ３インフルエンザウイルスに由来し得る。リアソータントが、２種以上のインフルエンザドナー株由来のウイルスセグメントを含有する場合、さらなるドナー株（複数可）は、いずれかのドナー株であり得る。例えば、ウイルスセグメントのいくつかは、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４またはＡ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０インフルエンザ株に由来し得る。例えば、リアソータントウイルスが弱毒化生インフルエンザワクチンにおいて使用される場合、Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０株由来のウイルスセグメントを含有するリアソータントが有利であり得る。
【００６６】
本リアソータントインフルエンザウイルスは、２種またはそれを超えるインフルエンザドナー株由来のバックボーンセグメントを含むこともでき、そのＰＢ１セグメントは、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９インフルエンザ株由来である。このセグメントは、配列番号２４の配列と少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有することができる。本リアソータントインフルエンザウイルスは、Ｈ１ＨＡサブタイプを有することができる。本発明の本態様に係るリアソータントインフルエンザウイルスが、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９に由来するＨＡおよび／またはＮＡセグメントを含まないことが理解できよう。
【００６７】
本リアソータントインフルエンザ株は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／４／０９株由来のＨＡ外部ドメインおよび／またはＮＡ外部ドメインを含むことができる。よって、例えば、ＨＡ遺伝子セグメントは、その外部ドメインが配列番号５０よりも配列番号７０に密接に関係する（即ち、同じアルゴリズムおよびパラメータを使用して配列番号７０と比較した場合、配列番号５０と比較した場合よりも高い程度の配列同一性を有する）Ｈ１赤血球凝集素をコードすることができる。配列番号７０および５０は、８０％同一である。同様に、ＮＡ遺伝子は、配列番号５１よりも配列番号９９に密接に関係するＮ１ノイラミニダーゼをコードすることができる。配列番号９９および５１は、８２％同一である。
【００６８】
本リアソータントインフルエンザウイルスは、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９インフルエンザ株に由来する少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントを含むこともできる。少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントがＰＡセグメントである場合、これは、配列番号２３の配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の同一性を有する配列を有することができる。少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントがＰＢ１セグメントである場合、これは、配列番号２４の配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の同一性を有する配列を有することができる。少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントがＰＢ２セグメントである場合、これは、配列番号２５の配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の同一性を有する配列を有することができる。少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントがＮＰセグメントである場合、これは、配列番号２６の配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の同一性を有する配列を有することができる。少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントがＭセグメントである場合、これは、配列番号２７の配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の同一性を有する配列を有することができる。少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントがＮＳセグメントである場合、これは、配列番号２８の配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の同一性を有する配列を有することができる。
【００６９】
リアソータントインフルエンザウイルスが、Ａ／Ｔｅｘａｓ／１／７７に由来するＰＢ１セグメントを含む場合、これは、好ましくは、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４に由来するＰＡセグメント、ＮＰセグメントまたはＭセグメントを含まない。リアソータントインフルエンザＡウイルスが、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４に由来するＰＡセグメント、ＮＰセグメントまたはＭセグメントを含む場合、これは、好ましくは、Ａ／Ｔｅｘａｓ／１／７７に由来するＰＢ１セグメントを含まない。一部の実施形態において、本発明は、Ａ／Ｔｅｘａｓ／１／７７に由来するＰＢ１セグメントならびにＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４に由来するＰＡ、ＮＰおよびＭセグメントを有するリアソータントインフルエンザウイルスを包含しない。Ａ／Ｔｅｘａｓ／１／７７に由来するＰＢ１タンパク質は、配列番号２９の配列を有することができ、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４に由来するＰＡ、ＮＰまたはＭタンパク質は、それぞれ配列番号３０、３１または３２の配列を有することができる。
【００７０】
本発明に係るキメラＨＡおよび／またはＮＡセグメント（好ましくは両方）、１０５ｐ３０に由来するＮＰ、ＰＢ１セグメントおよびＰＢ２セグメント、ならびにＰＲ８−Ｘに由来するＭ、ＮＳおよびＰＡセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスが特に好まれる。本発明に係るキメラＨＡおよび／またはＮＡセグメント（好ましくは両方）、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／４／０９に由来するＰＢ１セグメントならびにＰＲ８−Ｘに由来する他のバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスも特に好まれる。かかるリアソータントインフルエンザウイルスは好ましい。なぜなら、本発明者らが、このようなウイルスが、細胞培養において非常によく成長し、非常に優れたＨＡ収量をもたらすことを見出したからである。
【００７１】
本バックボーンウイルスセグメントは、特異的培養宿主における培養のために最適化されたウイルスタンパク質をコードすることができる。例えば、リアソータントインフルエンザウイルスが、哺乳動物細胞において培養される場合、培養宿主における最適な成長のために、ウイルスセグメントのうち少なくとも１種を適応させることが有利である。例えば、発現宿主が、ＭＤＣＫ細胞株等、イヌ細胞である場合、ウイルスセグメントは、この細胞におけるウイルス成長を最適化する配列を有するタンパク質をコードすることができる。よって、本発明のリアソータントインフルエンザウイルスは、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号３と整列させた場合に配列番号３のアミノ酸３８９に対応する位置にリシンおよび／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号３と整列された場合に配列番号３のアミノ酸５５９に対応する位置にアスパラギンを有するＰＢ２タンパク質をコードするＰＢ２セグメントを含むことができる。ＰＡセグメントが、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号１と整列させた場合に配列番号１のアミノ酸３２７に対応する位置にリシンおよび／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号１と整列させた場合に配列番号１のアミノ酸４４４に対応する位置にアスパラギン酸および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号１と整列させた場合に配列番号１のアミノ酸６７５に対応する位置にアスパラギン酸を有するＰＡタンパク質をコードする、本発明に従ったリアソータントインフルエンザウイルスも提供される。本発明のリアソータントインフルエンザ株は、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号４と整列させた場合に配列番号４のアミノ酸２７に対応する位置にスレオニンおよび／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号４と整列させた場合に配列番号４のアミノ酸３７５に対応する位置にアスパラギンを有するＮＰタンパク質をコードするＮＰセグメントを有することもできる。改変体インフルエンザ株は、これらの変異のうち２種またはそれ超を含むこともできる。改変体インフルエンザウイルスが、上に同定されるアミノ酸変化の両方を有する改変体ＰＢ２タンパク質および／または上に同定されるアミノ酸変化のうち全３種を含有するＰＡタンパク質および／または上に同定されるアミノ酸変化の両方を含有するＮＰタンパク質を含有することが好ましい。インフルエンザウイルスは、Ｈ１株であり得る。
【００７２】
それに代えてまたはそれに加えて、本リアソータントインフルエンザウイルスは、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号２と整列される場合に配列番号２のアミノ酸２００に対応する位置にイソロイシンおよび／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号２と整列される場合に配列番号２のアミノ酸３３８に対応する位置にアスパラギンおよび／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号２と整列される場合に配列番号２のアミノ酸５２９に対応する位置にイソロイシンおよび／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号２と整列される場合に配列番号２のアミノ酸５９１に対応する位置にイソロイシンおよび／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号２と整列される場合に配列番号２のアミノ酸６８７に対応する位置にヒスチジンおよび／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号２と整列される場合に配列番号２のアミノ酸７５４に対応する位置にリシンを有するＰＢ１タンパク質をコードするＰＢ１セグメントを含むことができる。
【００７３】
本発明の方法における使用のためのドナー株の選択は、再集合しようとするワクチン株に依存し得る。進化上遠い株の間のリアソータントは、細胞培養において十分に複製できないため、ドナー株およびワクチン株が、同じＨＡおよび／またはＮＡサブタイプを有する可能性がある。しかし、他の実施形態において、ワクチン株およびドナー株は、異なるＨＡおよび／またはＮＡサブタイプを有することができ、この構成は、ワクチン株に由来するＨＡおよび／またはＮＡセグメントを含有するリアソータントウイルスの選択を容易にすることができる。したがって、１０５ｐ３０およびＰＲ８−Ｘ株は、Ｈ１インフルエンザサブタイプを含有するが、これらのドナー株は、Ｈ１インフルエンザサブタイプを含有しないワクチン株に使用することができる。
【００７４】
よって、インフルエンザウイルスは、１０５ｐ３０またはＰＲ８−Ｘ株に由来する１、２、３、４、５、６または７種のウイルスセグメントおよびＨ１サブタイプのものではないＨＡセグメントを含むことができる。リアソータントドナー株は、Ｎ１サブタイプのものではないＮＡセグメントをさらに含むことができる。
【００７５】
ワクチン株として使用することができる株は、耐性汎流行性株［９］を含む、抗ウイルス療法に耐性の株を含む（例えば、オセルタミビルに耐性［８］および／またはザナミビルに耐性）。
【００７６】
本リアソータントインフルエンザウイルスは、インフルエンザＢウイルスであり得る。例えば、本リアソータントインフルエンザウイルスは、第１のインフルエンザＢウイルスに由来するＨＡ外部ドメイン、ならびにＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株である第２のインフルエンザＢウイルスに由来するＮＰおよび／またはＰＢ２セグメントを含むことができる。Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株は、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８であり得る。
【００７７】
本リアソータントインフルエンザＢウイルスは、第１のインフルエンザＢウイルスに由来するＨＡ外部ドメインおよびＢ／Ｌｅｅ／４０またはＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６またはＢ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０ではない第２のインフルエンザＢウイルスに由来するＮＰセグメントを含むことができる。例えば、本リアソータントインフルエンザＢウイルスは、配列番号８０、１００、１０３または１０４の配列を有さないＮＰセグメントを有することができる。本リアソータントインフルエンザＢウイルスは、配列番号１９、２３、４４または４５のタンパク質をコードしないＮＰセグメントを有することもできる。本リアソータントインフルエンザＢウイルスは、第２のインフルエンザＢウイルスに由来するＮＰおよびＰＢ２セグメントの両方を含むことができる。第２のインフルエンザＢウイルスは、好ましくは、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株である。Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株は、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８であり得る。
【００７８】
本リアソータントインフルエンザＢウイルスは、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株に由来するＨＡ外部ドメインおよびＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株に由来する少なくとも１種のバックボーンセグメントを含むことができる。本リアソータントインフルエンザＢウイルスは、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株に由来する２、３、４、５または６種のバックボーンセグメントを含むことができる。好ましい実施形態において、本リアソータントインフルエンザＢウイルスは、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株に由来する全バックボーンセグメントを含む。Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株は、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８であり得る。
【００７９】
本リアソータントインフルエンザＢウイルスは、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株およびＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株に由来するウイルスセグメントを含むことができ、前記Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株および前記Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株に由来するセグメントの比は、１：７、２：６、４：４、５：３、６：２または７：１である。７：１、６：２、４：４、３：４または１：７の比、特に、４：４の比が好ましい。なぜなら、かかるリアソータントインフルエンザＢウイルスが、培養宿主において特によく成長するからである。Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株は、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８であり得る。Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株は、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０であり得る。これらの実施形態において、本リアソータントインフルエンザＢウイルスは通常、同じインフルエンザＢドナー株由来の全バックボーンセグメントを含まない。
【００８０】
本リアソータントインフルエンザＢウイルスは、
ａ）配列番号７１のＰＡセグメント、配列番号７２のＰＢ１セグメント、配列番号７３のＰＢ２セグメント、配列番号７４のＮＰセグメント、配列番号７６のＮＳセグメントおよび配列番号７５のＭセグメント；または
ｂ）配列番号７１のＰＡセグメント、配列番号７８のＰＢ１セグメント、配列番号７３のＰＢ２セグメント、配列番号７４のＮＰセグメント、配列番号８２のＮＳセグメントおよび配列番号８１のＭセグメント；または
ｃ）配列番号７１のＰＡセグメント、配列番号７８のＰＢ１セグメント、配列番号７９のＰＢ２セグメント、配列番号７４のＮＰセグメント、配列番号７６のＮＳセグメントおよび配列番号７５のＭセグメント；または
ｄ）配列番号３０のＰＡセグメント、配列番号７２のＰＢ１セグメント、配列番号７３のＰＢ２セグメント、配列番号７４のＮＰセグメント、配列番号７６のＮＳセグメントおよび配列番号７５のＭセグメント、または
ｅ）配列番号７１のＰＡセグメント、配列番号７２のＰＢ１セグメント、配列番号７３のＰＢ２セグメント、配列番号７４のＮＰセグメント、配列番号８２のＮＳセグメントおよび配列番号８１のＭセグメント
を含むことができる。
【００８１】
インフルエンザＢウイルスは、現在、異なるＨＡサブタイプを示さないが、インフルエンザＢウイルス株は、２種の別個の系統内に収まる。これらの系統は、１９８０年代後半に出現し、互いに抗原的におよび／または遺伝的に区別することができるＨＡを有する［１０］。現在のインフルエンザＢウイルス株は、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様またはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様のいずれかである。これらの株は通常、抗原的に区別されるが、アミノ酸配列の差も、この２系統を区別するために記載されており、例えば、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株は多くの場合（ただし、必ずしもそうであるとは限らない）、「Ｌｅｅ４０」ＨＡ配列に対して番号付けたアミノ酸残基１６４に欠失を有するＨＡタンパク質を有する［１１］。一部の実施形態において、本発明のリアソータントインフルエンザＢウイルスは、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株に由来するウイルスセグメントを含むことができる。これは、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株に由来するウイルスセグメントを含むことができる。あるいは、これは、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株およびＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株に由来するウイルスセグメントを含むことができる。
【００８２】
本リアソータントインフルエンザＢウイルスが、２種またはそれを超えるインフルエンザＢウイルス株に由来するウイルスセグメントを含む場合、これらのウイルスセグメントは、関連するノイラミニダーゼを有するインフルエンザ株に由来し得る。例えば、ウイルスセグメントを提供するインフルエンザ株は、両者共にＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様ノイラミニダーゼ［１２］を有しても、あるいは両者共にＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様ノイラミニダーゼを有してもよい。例えば、２種のＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様ノイラミニダーゼは、両者共に次の配列特徴のうち１種または複数を有することができる：（１）残基２７にセリンではなく、好ましくはロイシンがある；（２）残基４４にグルタミン酸ではなく、好ましくはリシンがある；（３）残基４６にスレオニンではなく、好ましくはイソロイシンがある；（４）残基５１にプロリンではなく、好ましくはセリンがある；（５）残基６５にアルギニンではなく、好ましくはヒスチジンがある；（６）残基７０にグリシンではなく、好ましくはグルタミン酸がある；（７）残基７３にロイシンではなく、好ましくはフェニルアラニンがある；および／または（８）残基８８にプロリンではなく、好ましくはグルタミンがある。同様に、一部の実施形態において、ノイラミニダーゼは、残基４３に欠失を有することができる、あるいはスレオニンを有することができる；ＮＡ遺伝子におけるトリヌクレオチド欠失に起因する残基４３における欠失は、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株の特徴として報告されたが、近年の株は、Ｔｈｒ−４３を回復した［１２］。逆に、当然ながら、反対の特徴が、２種のＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様ノイラミニダーゼによって共有されてよく、例えば、Ｓ２７、Ｅ４４、Ｔ４６、Ｐ５１、Ｒ６５、Ｇ７０、Ｌ７３および／またはＰ８８が挙げられる。これらのアミノ酸は、「Ｌｅｅ４０」ノイラミニダーゼ配列［１３］に対して番号付けられた。本リアソータントインフルエンザＢウイルスは、上述の特徴を有するＮＡセグメントを含むことができる。それに代えてまたはそれに加えて、本リアソータントインフルエンザＢウイルスは、上述の特徴を有するＮＡセグメントを有するインフルエンザ株由来のウイルスセグメント（ＮＡ以外の）を含むことができる。
【００８３】
Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株であるインフルエンザＢウイルスのバックボーンウイルスセグメントは、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７に由来する対応するウイルスセグメントに対し、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８の対応するウイルスセグメントに対するよりも高レベルの同一性を有することができ、逆もまた同じである。例えば、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０（Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株である）のＮＰセグメントは、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８のＮＰセグメントに対し９９％の同一性を有し、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７のＮＰセグメントに対し９６％しか同一性を有さない。
【００８４】
本発明のリアソータントインフルエンザＢウイルスが、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株に由来するバックボーンウイルスセグメントを含む場合、ウイルスセグメントは、次の配列を有するタンパク質をコードすることができる。ＰＡタンパク質は、配列番号８３の配列に対し少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有することができる。ＰＢ１タンパク質は、配列番号８４の配列に対し少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有することができる。ＰＢ２タンパク質は、配列番号８５の配列と少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有することができる。ＮＰタンパク質は、配列番号８６の配列に対し少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有することができる。Ｍ１タンパク質は、配列番号８７の配列に対し少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有することができる。Ｍ２タンパク質は、配列番号８８の配列に対し少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有することができる。ＮＳ１タンパク質は、配列番号８９の配列に対し少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有することができる。ＮＳ２タンパク質は、配列番号９０の配列に対し少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有することができる。一部の実施形態において、本リアソータントインフルエンザＢウイルスは、これらのバックボーンセグメントの全てを含むこともできる。
【００８５】
本発明のリアソータントインフルエンザＢウイルスが、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株に由来するバックボーンウイルスセグメントを含む場合、ウイルスセグメントは、次の配列を有するタンパク質をコードすることができる。ＰＡタンパク質は、配列番号９１の配列に対し少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有することができる。ＰＢ１タンパク質は、配列番号９２の配列に対し少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有することができる。ＰＢ２タンパク質は、配列番号９３の配列と少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有することができる。ＮＰタンパク質は、配列番号９４の配列に対し少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有することができる。Ｍ１タンパク質は、配列番号９５の配列に対し少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有することができる。Ｍ２タンパク質は、配列番号９６の配列に対し少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有することができる。ＮＳ１タンパク質は、配列番号９７の配列に対し少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有することができる。ＮＳ２タンパク質は、配列番号９８の配列に対し少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有することができる。
【００８６】
本発明は、配列番号７１〜７６または７７〜８２の配列に対し少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％または１００％の同一性を有するウイルスセグメントを有するドナー株により実施することができる。遺伝暗号の縮重のため、異なる配列を有する数種類の核酸にコードされる同じポリペプチドを有することが可能である。例えば、配列番号３３および３４の核酸配列は、同じウイルスタンパク質をコードするにもかかわらず、７３％の同一性しか有さない。よって、本発明は、配列番号７１〜７６または７７〜８２の配列と同じポリペプチドをコードするウイルスセグメントにより実施することができる。
【００８７】
本リアソータントインフルエンザウイルスは、大流行間期（ｉｎｔｅｒ−ｐａｎｄｅｍｉｃ）（季節性）インフルエンザワクチン株であるワクチン株に由来するセグメントを含むことができる。これは、汎流行性株または潜在的汎流行性株であるワクチン株に由来するセグメントを含むこともできる。汎流行性アウトブレイクを引き起こす潜在力を与えるインフルエンザ株の特徴を次に示す：（ａ）ヒト集団が、その株の赤血球凝集素に対して免疫学的にナイーブとなるように、現在循環しているヒト株における赤血球凝集素と比較して新たな赤血球凝集素を含有すること、即ち、十年間を超えてヒト集団において明らかではなかった株（例えば、Ｈ２）、またはヒト集団において以前に全く観察されたことがない株（例えば、一般にトリ集団においてのみ見出されたことがあるＨ５、Ｈ６またはＨ９）；（ｂ）ヒト集団において水平方向に伝達され得ること；および（ｃ）ヒトに対し病原性であること。リアソータントウイルスが、Ｈ５Ｎ１株等、汎流行性インフルエンザに対し免疫化するためのワクチンにおいて使用される場合、Ｈ５赤血球凝集素型を有するワクチン株が好まれる。他の可能な株は、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ７およびＨ７Ｎ９ならびに他のいずれかの顕現性の潜在的汎流行性株を含む。本発明は、非ヒト動物集団からヒトへと伝播し得るまたは伝播した潜在的汎流行性ウイルス株、例えば、ブタ起源Ｈ１Ｎ１インフルエンザ株から保護するためのワクチンにおける使用のための、リアソータントウイルスの産生に特に適している。
【００８８】
発現構築物
本発明は、本発明のキメラＨＡまたはＮＡセグメントをコードする発現構築物を提供する。本発明のリアソータントインフルエンザウイルスのウイルスセグメントをコードする発現構築物がさらに提供される。
【００８９】
本発明は、本発明のキメラＨＡおよび／またはＮＡセグメントのＨＡおよび／またはＮＡ末端ドメインをコードする発現構築物も提供する。インフルエンザワクチンに含まれることを必要とするＨＡおよびＮＡ外部ドメインは、シーズン毎に変化するため、これらの発現構築物が有用である。本発明の本態様の発現構築物は、バックボーンセグメントのうち１種または複数をさらにコードすることができる。発現構築物に末端ドメインを含むことにより、キメラＨＡおよび／またはＮＡ分子を提供するために、循環株のＨＡおよび／またはＮＡセグメントの外部ドメインをクローニングすることのみが必要とされる。本発現構築物は、ＳＰおよびＴＭドメインの間に制限部位を含むことができ、これは、外部ドメインのクローニングを容易にすることから有用である。外部ドメインが、末端ドメインとインフレームでクローニングされることを必要とするが、このことは、十分に当業者の能力範囲内であることが理解される。
【００９０】
発現構築物は、一方向性または双方向性発現構築物であり得る。２種以上の発現構築物が、リアソータントインフルエンザウイルスのウイルスセグメントの発現に使用される場合、一方向性および／または双方向性発現を使用することが可能である。
【００９１】
インフルエンザウイルスは、感染性のためにタンパク質を必要とするが、一般に、宿主細胞に必要とされる発現構築物の総数を低下させることから、双方向性発現構築物を使用することが好ましい。よって、本発明の方法は、遺伝子またはｃＤＮＡが、上流ｐｏｌ  ＩＩプロモーターおよび下流非内在性ｐｏｌ  Ｉプロモーターの間に位置する、少なくとも１種の双方向性発現構築物を利用することができる。ｐｏｌ  ＩＩプロモーターからの遺伝子またはｃＤＮＡの転写は、タンパク質へと翻訳され得るキャッピングされたプラス・センスウイルスｍＲＮＡを産生し、一方、非内在性ｐｏｌ  Ｉプロモーターからの転写は、マイナス・センスｖＲＮＡを産生する。双方向性発現構築物は、双方向性発現ベクターであり得る。
【００９２】
双方向性発現構築物は、同じ構築物から異なる方向（即ち、５’から３’および３’から５’の両方）における発現を駆動する少なくとも２種のプロモーターを含有する。この２種のプロモーターは、同じ二本鎖ＤＮＡの異なる鎖に作動可能に連結することができる。好ましくは、プロモーターの１種は、ｐｏｌ  Ｉプロモーターであり、他のプロモーターのうち少なくとも１種は、ｐｏｌ  ＩＩプロモーターである。ｐｏｌ  Ｉプロモーターは、キャッピングされていないｖＲＮＡの発現に使用することができる一方、ｐｏｌ  ＩＩプロモーターは、その後にタンパク質へと翻訳することができるｍＲＮＡの転写に使用することができ、これにより、同じ構築物からのＲＮＡおよびタンパク質の同時発現を可能にするため、これは有用である。ある発現系内で２種以上の発現構築物が使用される場合、プロモーターは、内在性および非内在性プロモーターの混合物であり得る。
【００９３】
発現構築物において使用されるｐｏｌ  Ｉおよびｐｏｌ  ＩＩプロモーターは、宿主細胞が由来する同じ分類学上の目由来の生物に対し内在性であり得る。あるいは、プロモーターは、宿主細胞とは異なる分類学上の目における生物に由来し得る。用語「目」は、従来の分類学的な順位を指し、目の例は、霊長目、齧歯目、食肉目、有袋目、クジラ目等である。ヒトおよびチンパンジーは、同じ分類学上の目（霊長目）に属すが、ヒトおよびイヌは、異なる目（霊長目ｖｓ．食肉目）に属す。例えば、ヒトｐｏｌ  Ｉプロモーターは、イヌ細胞（例えば、ＭＤＣＫ細胞）におけるウイルスセグメントの発現に使用することができる［１４］。
【００９４】
発現構築物は、典型的に、ＲＮＡ転写終結配列を含むであろう。終結配列は、内在性終結配列または宿主細胞にとって内在性ではない終結配列であり得る。適した終結配列は、当業者に明らかとなり、その例として、ＲＮＡポリメラーゼＩ転写終結配列、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写終結配列およびリボザイムが挙げられるがこれらに限定されない。さらに、本発現構築物は、特に、その発現がｐｏｌ  ＩＩプロモーターによって制御される遺伝子の末端に、ｍＲＮＡのための１種または複数のポリアデニル化シグナルを含有することができる。
【００９５】
発現構築物は、プラスミドまたは他のエピソーム構築物等、ベクターであり得る。かかるベクターは、典型的に、少なくとも１種の細菌および／または真核生物の複製起点を含むであろう。さらに、ベクターは、原核生物および／または真核生物細胞における選択を可能にする選択マーカーを含むことができる。かかる選択マーカーの例は、アンピシリンまたはカナマイシン等、抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子である。ベクターは、ＤＮＡ配列のクローニングを容易にするための１種または複数の多重クローニング部位をさらに含むことができる。
【００９６】
代替案として、発現構築物は、線状発現構築物であり得る。かかる線状発現構築物は、典型的に、いかなる増幅および／または選択配列も含有しないであろう。しかし、かかる増幅および／または選択配列を含む線状構築物も、本発明の範囲内にある。参考文献１５は、ウイルスセグメント毎の個々の線状発現構築物を表す線状発現構築物を記載する。同じ線状発現構築物に２種以上、例えば、２、３、４、５または６種のウイルスセグメントを含むことも可能である。かかるシステムは、例えば、参考文献１６に記載されている。
【００９７】
発現構築物は、本技術分野において公知の方法を使用して作製することができる。かかる方法は、例えば、参考文献１７に記載されている。発現構築物が、線状発現構築物である場合、単一の制限酵素部位を利用して、宿主細胞への導入前にこれを線状化することが可能である。あるいは、少なくとも２種の制限酵素部位を使用して、ベクターから発現構築物を切り出すことが可能である。さらに、核酸増幅技法（例えば、ＰＣＲによる）を使用してこれを増幅することにより、線状発現構築物を得ることも可能である。
【００９８】
本発現構築物は、非細菌発現構築物であり得る。これは、本構築物が、これにコードされるウイルスＲＮＡセグメントの、真核生物細胞における発現を駆動し得るが、これが、細菌における構築物の繁殖に必要とされる構成成分を含まないことを意味する。よって、本構築物は、細菌複製起点（ｏｒｉ）を含まず、通常、細菌選択マーカー（例えば、抗生物質耐性マーカー）を含まないであろう。かかる発現構築物は、参考として援用される参考文献１８に記載されている。
【００９９】
本発現構築物は、化学合成により調製することができる。本発現構築物は、化学合成により全体的にまたは部分的に調製することができる。化学合成により発現構築物を調製するために適した方法は、例えば、参考文献１８に記載されている。
【０１００】
本発明の発現構築物は、当業者に公知のいずれかの技法を使用して、宿主細胞に導入することができる。例えば、本発明の発現構築物は、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム、マイクロインジェクションまたは微粒子銃を用いることにより、宿主細胞に導入することができる。
【０１０１】
本発現構築物（複数可）を同じ細胞型に導入し、これをその後、インフルエンザウイルスの繁殖に使用することができる。あるいは、発現構築物が導入される細胞およびインフルエンザウイルスの繁殖に使用される細胞は、異なっていてもよい。
【０１０２】
一部の実施形態において、参考文献１９に記載されている通り、細胞は、細胞への発現構築物（複数可）の導入後に加えることができる。ウイルスのレスキュー効率をさらに増加させ、よって、ウイルスレスキューに必要とされる時間の短縮に役立つことができるため、これが特に好まれる。加えられる細胞は、発現構築物（複数可）が導入される細胞と同じまたは異なる細胞型のものであり得るが、規制当局の承認を容易にし、矛盾する培養条件を回避するため、同じ細胞型の細胞を使用することが好ましい。
【０１０３】
本発明は、本発明の発現構築物のうち１種または複数を含む発現系も提供する。本発現系は、本発明のリアソータントインフルエンザウイルスのウイルスセグメントを全てコードする１種または複数の発現構築物を含むことができる。
【０１０４】
本発現系は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１または少なくとも１２種の発現構築物を含むことができる。
【０１０５】
逆遺伝学
本発明は、逆遺伝学技法による本発明のリアソータントインフルエンザウイルスの産生に特に適しており、前記ウイルスは、本発明の発現構築物のうち１種または複数を含む発現系を使用して、培養宿主において産生される。このような技法において、ウイルスが、発現系において発現構築物（複数可）から産生されることが理解される。
【０１０６】
インフルエンザＡおよびＢウイルスのための逆遺伝学は、複製および転写の開始に必要とされる４種のタンパク質（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡおよびＮＰ）を発現させるための１２種のプラスミドならびに全８種のウイルスゲノムセグメントにより実施することができる。しかし、構築物の数を低下させるために、複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（ウイルスＲＮＡ合成のための）が、単一のプラスミドに含まれて（例えば、１、２、３、４、５、６、７または全８種のインフルエンザｖＲＮＡセグメントをコードする配列）、別のプラスミドにＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを有する複数のタンパク質コード領域が含まれてよい（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８種のインフルエンザｍＲＮＡ転写物をコードする配列）［２０］。ｐｏｌ  Ｉプロモーターの制御下における１種または複数のインフルエンザｖＲＮＡセグメントおよび別のプロモーター、特に、ｐｏｌ  ＩＩプロモーターの制御下における１種または複数のインフルエンザタンパク質コード領域を同じプラスミドに含むことも可能である。これは、好ましくは、双方向性プラスミドを使用することにより為される。
【０１０７】
参考文献２０の方法の好ましい態様は、（ａ）単一の発現構築物におけるＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡ  ｍＲＮＡコード領域；ならびに（ｂ）単一の発現構築物における全８種のｖＲＮＡコードセグメントを伴う。新たに出現するインフルエンザウイルス株は、通常、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）および／または赤血球凝集素（ＨＡ）セグメントに変異を有するため、ＮＡおよびＨＡセグメントを一方の発現構築物に、６種の他のウイルスセグメントを別の発現構築物に含むことが特に好まれる。したがって、別個の発現構築物にＨＡおよび／またはＮＡセグメントを有することの利点は、ＨＡおよびＮＡ配列を含むベクターのみを置き換える必要があることである。よって、本発明の一態様において、ワクチン株のＮＡおよび／またはＨＡセグメントは、１種の発現構築物に含まれてよく、ＨＡおよび／またはＮＡセグメント（複数可）を除く本発明のドナー株（複数可）に由来するｖＲＮＡコードセグメントは、異なる発現構築物に含まれる。よって、本発明は、本発明のドナー株の１、２、３、４、５または６種のｖＲＮＡコードバックボーンウイルスセグメントを含む発現構築物を提供する。本発現構築物は、機能的ＨＡおよび／またはＮＡタンパク質を産生するＨＡおよび／またはＮＡウイルスセグメントを含まなくてよい。
【０１０８】
公知の逆遺伝学システムは、ｐｏｌ  Ｉプロモーター、細菌ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、バクテリオファージポリメラーゼプロモーター等からの、所望のウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）分子をコードするＤＮＡ分子の発現を伴う。インフルエンザウイルスは、生活環の開始にウイルスポリメラーゼの存在を必要とするため、システムは、これらのタンパク質を提供することもでき、例えば、両方の種類のＤＮＡの発現が、完全な感染性ウイルスのアセンブリをもたらすように、本システムは、ウイルスポリメラーゼタンパク質をコードするＤＮＡ分子をさらに含む。タンパク質としてウイルスポリメラーゼを供給することも可能である。
【０１０９】
逆遺伝学が、インフルエンザｖＲＮＡの発現に使用される場合、当業者であれば、互いに対する配列エレメントの正確なスペーシングが、ポリメラーゼが複製を開始するために重要であることが明らかとなろう。したがって、ウイルスＲＮＡをコードするＤＮＡ分子が、ｐｏｌ  Ｉプロモーターおよび終結配列の間に正確に配置されることが重要であるが、この位置決めは、十分に逆遺伝学システム分野の当業者の能力の範囲内である。
【０１１０】
組換えウイルスを産生するために、細胞は、ビリオンのアセンブルに必要なウイルスゲノムのあらゆるセグメントを発現する必要がある。本発明の発現構築物へとクローニングされるＤＮＡは、好ましくは、ウイルスＲＮＡおよびタンパク質の全てを提供するが、ヘルパーウイルスを使用して、ＲＮＡおよびタンパク質の一部を提供することも可能である、ただし、ヘルパーウイルスを使用しないシステムが好まれる。インフルエンザウイルスは、セグメント化されたウイルスであるため、ウイルスゲノムは、通常、本発明の方法において２種以上の発現構築物を使用して発現されるであろう。しかし、単一の発現構築物においてウイルスゲノムの１種もしくは複数のセグメントまたはさらには全セグメントを組み合わせることも想定される。
【０１１１】
一部の実施形態において、宿主細胞におけるアクセサリータンパク質の発現をもたらす発現構築物も含まれるであろう。例えば、逆遺伝学システムの一部として非ウイルス性セリンプロテアーゼ（例えば、トリプシン）を発現することが有利であり得る。
【０１１２】
細胞
本発明における使用のための培養宿主は、目的のウイルスを産生し得るいずれかの真核生物細胞であり得る。本発明は、典型的に、細胞株を使用するであろうが、例えば、初代細胞を代替物として使用することもできる。細胞は、典型的に、哺乳動物のものまたは鳥類のものとなるであろう。適した哺乳動物細胞として、ハムスター、ウシ、霊長目（ヒトおよびサルを含む）およびイヌ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。腎細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞等、様々な細胞型を使用することができる。適したハムスター細胞の例は、名称ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣを有する細胞株である。適したサル細胞は、例えば、Ｖｅｒｏ細胞株におけるような腎細胞等、アフリカミドリザル細胞である［２１〜２３］。適したイヌ細胞は、例えば、ＣＬＤＫおよびＭＤＣＫ細胞株におけるような腎細胞である。
【０１１３】
さらに適した細胞として、ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；ＭＲＣ  ５；ＰＥＲ．Ｃ６［２４］；ＦＲｈＬ２；ＷＩ−３８；等が挙げられるがこれらに限定されない。適した細胞は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクション［２５］、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［２６］またはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から広く入手することができる。例えば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ  ８１、ＣＣＬ  ８１．２、ＣＲＬ  １５８６およびＣＲＬ−１５８７により様々な異なるＶｅｒｏ細胞を供給し、カタログ番号ＣＣＬ  ３４によりＭＤＣＫ細胞を供給する。ＰＥＲ．Ｃ６は、寄託番号９６０２２９４０によりＥＣＡＣＣから入手することができる。
【０１１４】
本発明における使用に好ましい細胞は、メイディン・ダービー・イヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞［２７〜２９］である。本来のＭＤＣＫ細胞は、ＣＣＬ  ３４としてＡＴＣＣから入手することができる。ＭＤＣＫ細胞の派生物が使用されることが好ましい。かかる派生物は、例えば、懸濁培養における成長に適応されたＭＤＣＫ細胞を開示する参考文献２７に記載されている（「ＭＤＣＫ  ３３０１６」または「３３０１６−ＰＦ」、ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９として寄託）。さらに、参考文献３０は、無血清培養において懸濁状態で成長するＭＤＣＫ由来細胞を開示する（「Ｂ−７０２」、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４４９として寄託）。一部の実施形態において、使用されるＭＤＣＫ細胞株は、腫瘍形成性であり得る。非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞を使用することも想定される。例えば、参考文献３１は、「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０２）および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０３）を含む非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞を開示する。参考文献３２は、「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １２０４２）を含む、感染に対し高い感受性を有するＭＤＣＫ細胞を開示する。
【０１１５】
本発明の方法において使用される細胞は、好ましくは、ヒトへの投与に使用することができるインフルエンザワクチンの産生に適した細胞である。かかる細胞は、ワクチン製造に承認され、国の監督官庁により登録された細胞バンクシステムに由来する必要があり、ワクチン産生に許される最大継代数以内である必要がある（概要のため、参考文献３３を参照）。ワクチン製造に承認される適した細胞の例として、ＭＤＣＫ細胞（ＭＤＣＫ３３０１６等；参考文献２７を参照）、ＣＨＯ細胞、Ｖｅｒｏ細胞およびＰＥＲ．Ｃ６細胞が挙げられる。本発明の方法は、２９３Ｔ細胞を使用しなくてもよい（この細胞はワクチン製造に承認されていないため）。
【０１１６】
２種以上の細胞型の混合物を使用して、本発明の方法を実施することが可能である。しかし、本発明の方法は、単一の細胞型、例えば、モノクローナル細胞により実施されることが好ましい。好ましくは、本発明の方法において使用される細胞は、単一の細胞株に由来する。さらに、同じ細胞株を、ウイルスの再集合およびいずれかその後のウイルス繁殖に使用することができる。
【０１１７】
好ましくは、細胞は、夾雑物の一般的な供給源を回避するために、血清の非存在下で培養される。真核生物細胞培養のための様々な無血清培地は、当業者に公知である（例えば、Ｉｓｃｏｖｅ培地、ｕｌｔｒａ  ＣＨＯ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、ＥＸ−ＣＥＬＬ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））。さらに、無タンパク質培地を使用することができる（例えば、ＰＦ−ＣＨＯ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））。その他にも、複製のための細胞は、通例の血清含有培地（例えば、０．５％〜１０％のウシ胎仔血清を有するＭＥＭまたはＤＭＥＭ培地）において培養することもできる。
【０１１８】
細胞は、接着培養物中または懸濁物中にあり得る。
【０１１９】
ウイルス調製
一実施形態において、本発明は、インフルエンザウイルスを産生するための方法であって、（ａ）培養宿主を本発明のリアソータントウイルスに感染させるステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の宿主を培養して、前記ウイルスを産生するステップと、任意選択で（ｃ）ステップ（ｂ）において得られるウイルスを精製するステップとを含む方法を提供する。
【０１２０】
培養宿主は、細胞または孵化鶏卵であり得る。本発明の本態様における培養宿主として細胞が使用される場合、細胞培養条件（例えば、温度、細胞密度、ｐＨ値等）が、用いられる細胞株およびウイルスに依存して広範囲にわたり可変性であり、適用要件に適応させることができることが公知である。したがって、次の情報は、単に指針を表す。
【０１２１】
上述の通り、細胞は、好ましくは無血清または無タンパク質培地において培養される。
【０１２２】
細胞の増殖は、当業者に公知の方法に従って行うことができる。例えば、細胞は、遠心分離または濾過等の通常の支持方法を使用して、灌流システムにおいて培養することができる。さらに、細胞は、感染前に流加システムにおいて、本発明に従って増殖させることができる。本発明の文脈において、培養システムは、流加システムと称され、このシステムでは、細胞が初期にバッチシステムにおいて培養され、培地における栄養素（または栄養素の一部）の枯渇は、濃縮栄養素の制御された供給によって補償される。これは、感染前の細胞の増殖の間における培地のｐＨ値の、ｐＨ６．６〜ｐＨ７．８の間の値、特に、ｐＨ７．２〜ｐＨ７．３の間の値への調整に有利であり得る。細胞の培養は、好ましくは、３０〜４０℃の間の温度で行われる。感染された細胞を培養する場合（ステップｉｉ）、細胞は、好ましくは、３０℃〜３６℃の間または３２℃〜３４℃の間または３３℃の温度で培養される。この温度範囲における感染された細胞のインキュベーションが、ワクチンへと製剤化される場合に改善された有効性をもたらすウイルスの産生をもたらすことが示されたため［３４］、これが特に好まれる。
【０１２３】
酸素分圧は、感染前の培養の際に、好ましくは、２５％〜９５％の間の値、特に、３５％〜６０％の間の値に調整することができる。本発明の文脈で記述される酸素分圧の値は、空気の飽和に基づく。細胞の感染は、好ましくは、バッチシステムにおいて約８〜２５×１０５細胞／ｍＬまたは好ましくは、灌流システムにおいて約５〜２０×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で行われる。細胞は、１０−８〜１０の間、好ましくは、０．０００１〜０．５の間のウイルス用量（ＭＯＩ値、「感染多重度」；感染時における細胞当たりのウイルス単位の数に対応）に感染させることができる。
【０１２４】
ウイルスは、接着培養物または懸濁物中の細胞において成長させることができる。マイクロキャリア培養を使用することができる。よって、一部の実施形態において、細胞は、懸濁物中の成長に適応させることができる。
【０１２５】
本発明に係る方法は、ウイルスまたはこれによって作製されたタンパク質の収集および単離も含む。ウイルスまたはタンパク質の単離の間、細胞は、分離、濾過または限外濾過等の標準方法によって培養培地から分離される。続いて、ウイルスまたはタンパク質は、勾配遠心分離、濾過、沈殿、クロマトグラフィー等、当業者に十分に公知の方法に従って濃縮され、続いて精製される。本発明において、ウイルスが、精製の間またはその後に不活化されることも好ましい。ウイルス不活化は、例えば、精製プロセス内のいずれかの時点で、β−プロピオラクトンまたはホルムアルデヒドにより行うことができる。
【０１２６】
培養宿主は、卵であり得る。ワクチン用のインフルエンザウイルス成長のための現在の標準方法は、孵化ＳＰＦ鶏卵を使用し、ウイルスは、卵内容物（尿膜腔液）から精製される。卵によりウイルスを継代し、その後、これを細胞培養において繁殖させることも可能であり、逆もまた同じである。
【０１２７】
ワクチン
本発明は、ワクチンを産生するための方法に従って産生されたウイルスを利用する。
【０１２８】
ワクチン（特に、インフルエンザウイルス用の）は、一般に、生ウイルスまたは不活化ウイルスのいずれかに基づく。不活化ワクチンは、全ビリオン、「スプリット」ビリオンまたは精製された表面抗原に基づくことができる。抗原は、ビロソームの形態で提示することもできる。本発明は、これらの種類のワクチンのいずれかを製造するために使用することができる。
【０１２９】
不活化ウイルスが使用される場合、ワクチンは、全ビリオン、スプリットビリオンまたは精製された表面抗原を含むことができる（インフルエンザについては、赤血球凝集素を含み、通常、ノイラミニダーゼも含む）。ウイルスを不活化するための化学的手段は、次の薬剤の１種または複数の有効量による処理を含む：洗剤、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、バイナリーエチルアミン、アセチルエチレンイミンまたはこれらの組合せ。ウイルス不活化の非化学的方法は、本技術分野において公知であり、例えば、ＵＶ光またはガンマ線照射等が挙げられる。
【０１３０】
ビリオンは、ウイルス含有流体、例えば、尿膜腔液または細胞培養上清から様々な方法により収集することができる。例えば、精製プロセスは、ビリオンを破壊するための洗剤を含む線形スクロース勾配溶液を使用した、ゾーン遠心分離を伴い得る。続いて、任意選択の希釈の後に、ダイアフィルトレーションによって、抗原を精製することができる。
【０１３１】
スプリットビリオンは、精製されたビリオンを洗剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコール酸塩、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１、臭化セチルトリメチルアンモニウム、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ９等）で処理して、サブビリオン調製物を産生することにより得られ、これは、「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」スプリットプロセスを含む。例えば、インフルエンザウイルスをスプリットする方法は、本技術分野において周知であり、例えば、参考文献３５〜４０等を参照されたい。ウイルスのスプリットは、典型的に、感染性であれ非感染性であれ、全ウイルスを破壊濃度のスプリット剤により破壊または断片化することにより行われる。破壊は、ウイルスタンパク質の完全または部分的可溶化をもたらし、ウイルスの完全性を変更する。好まれるスプリット剤は、非イオン性およびイオン性（例えば、カチオン性）界面活性剤、例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−Ｇｌｕｃａｍｉｄｅ類、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、ＮＰ９、四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、セタブロン（Ｃｅｔａｖｌｏｎ）、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミンおよびＤＯＴ−ＭＡ、オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１等、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレン（ｅｔｈｌｅｎｅ）エステル等である。有用なスプリット手順の１つは、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの連続的効果を使用し、スプリットは、初期ビリオン精製の際に（例えば、スクロース密度勾配溶液において）行うことができる。よって、スプリットプロセスは、ビリオン含有材料の清澄化（非ビリオン材料を除去するため）、収集されたビリオンの濃縮（例えば、ＣａＨＰＯ４吸着等、吸着方法を使用）、非ビリオン材料からの全ビリオンの分離、密度勾配遠心分離ステップにおけるスプリット剤を使用したビリオンのスプリット（例えば、デオキシコール酸ナトリウム等、スプリット剤を含有するスクロース勾配を使用）に続く、望まれない材料を除去するための濾過（例えば、限外濾過）を伴い得る。スプリットビリオンは、リン酸ナトリウム緩衝等張性塩化ナトリウム溶液に有用に再懸濁することができる。スプリットインフルエンザワクチンの例は、ＢＥＧＲＩＶＡＣ（商標）、ＦＬＵＡＲＩＸ（商標）、ＦＬＵＺＯＮＥ（商標）およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤ（商標）製品である。
【０１３２】
精製されたインフルエンザウイルス表面抗原ワクチンは、表面抗原赤血球凝集素を含み、典型的にノイラミニダーゼも含む。精製形態のこれらのタンパク質を調製するためのプロセスは、本技術分野において周知である。ＦＬＵＶＩＲＩＮ（商標）、ＡＧＲＩＰＰＡＬ（商標）およびＩＮＦＬＵＶＡＣ（商標）製品は、インフルエンザサブユニットワクチンである。
【０１３３】
別の形態の不活化抗原は、ビロソーム［４１］（無核酸ウイルス様リポソーム粒子）である。ビロソームは、洗剤によるウイルスの可溶化と、続くヌクレオカプシドの除去およびウイルス糖タンパク質を含有する膜の再構成により調製することができる。ビロソームを調製するための代替方法は、過剰量のリン脂質にウイルス膜糖タンパク質を添加して、その膜内にウイルスタンパク質を有するリポソームを得ることを伴う。
【０１３４】
本発明の方法は、生ワクチンの産生に使用することもできる。かかるワクチンは通常、ビリオン含有流体からビリオンを精製することにより調製される。例えば、流体は、遠心分離により清澄化し、緩衝液（例えば、スクロース、リン酸カリウムおよびグルタミン酸一ナトリウムを含有）により安定化することができる。様々な形態のインフルエンザウイルスワクチンを現在利用できる（例えば、参考文献４２の第１７＆１８章を参照）。生ウイルスワクチンは、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅのＦＬＵＭＩＳＴ（商標）製品を含む。
【０１３５】
ウイルスは、弱毒化することができる。ウイルスは、温度感受性であり得る。ウイルスは、低温適応させることができる。これら３種の特色は、抗原として生ウイルスを使用する場合に特に有用である。
【０１３６】
ＨＡは、現在の不活化インフルエンザワクチンにおける主要な免疫原であり、ワクチン用量は、ＳＲＩＤにより典型的に測定されるＨＡレベルを参照することにより標準化される。現存するワクチンは、典型的に、株当たり約１５μｇのＨＡを含有するが、例えば、小児用にまたは汎流行性の状況においてまたはアジュバントを使用する場合に、より低用量を使用してもよい。より高用量（例えば、３×または９×用量［４３、４４］）と同様に、１／２（即ち、株当たり７．５μｇのＨＡ）、１／４および１／８等、分割量が使用されている。よって、ワクチンは、インフルエンザ株当たり０．１〜１５０μｇの間のＨＡ、好ましくは、０．１〜５０μｇの間、例えば、０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇ等を含むことができる。特定の用量は、例えば、株当たり約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約３．７５、約１．９、約１．５等を含む。
【０１３７】
生ワクチンのため、投薬は、ＨＡ含量ではなく５０％組織培養感染量（ｍｅｄｉａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｏｓｅ）（ＴＣＩＤ５０）により測定され、株当たり１０６〜１０８の間（好ましくは、１０６．５〜１０７．５の間）のＴＣＩＤ５０が典型的である。
【０１３８】
本発明により使用されるインフルエンザ株は、野生型ウイルスに存在する天然ＨＡまたは改変ＨＡを有することができる。例えば、鳥類種においてウイルスを高度に病原性にする決定基（例えば、ＨＡ１／ＨＡ２開裂部位付近の高塩基性領域）を除去するようＨＡを改変することが公知である。逆遺伝学の使用は、かかる改変を容易にする。
【０１３９】
大流行間期株に対する免疫化に適するのみならず、本発明の組成物は、汎流行性または潜在的汎流行性株に対する免疫化に特に有用である。本発明は、ヒトと共に非ヒト動物のワクチン接種に適する。
【０１４０】
その抗原が組成物に有用に含まれ得る他の株は、耐性汎流行性株［４６］を含む、抗ウイルス療法に耐性（例えば、オセルタミビルに耐性［４５］および／またはザナミビルに耐性）の株である。
【０１４１】
少なくとも１種のインフルエンザ株が、本発明のリアソータントインフルエンザ株であることを条件とすると、本発明の組成物は、インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスを含む、１種または複数の（例えば、１、２、３、４種またはそれを超える）インフルエンザウイルス株に由来する抗原（複数可）を含むことができる。抗原のうち少なくとも２種、少なくとも３種または全種が本発明のリアソータントインフルエンザ株に由来する組成物も想定される。ワクチンが、インフルエンザの２種以上の株を含む場合、異なる株は、典型的に、別々に成長させ、ウイルスが収集され抗原が調製された後に混合する。よって、本発明のプロセスは、２種以上のインフルエンザ株由来の抗原を混合するステップを含むことができる。２種のインフルエンザＡウイルス株および１種のインフルエンザＢウイルス株に由来する抗原を含む、三価ワクチンが典型的である。２種のインフルエンザＡウイルス株および２種のインフルエンザＢウイルス株、または３種のインフルエンザＡウイルス株および１種のインフルエンザＢウイルス株に由来する抗原を含む、四価ワクチンも有用である［４７］。
【０１４２】
医薬組成物
本発明に従って製造されたワクチン組成物は、薬学的に許容される。これは通常、抗原に加えた構成成分を含む、例えば、典型的に、１種または複数の医薬品担体（複数可）および／または賦形剤（複数可）を含む。後述する通り、アジュバントが含まれてもよい。かかる構成成分の徹底的な考察は、参考文献４８に見ることができる。
【０１４３】
ワクチン組成物は、一般に、水性形態となるであろう。しかし、一部のワクチンは、乾燥形態、例えば、注射用固体またはパッチにおける乾燥もしくは重合調製物の形態となることができる。
【０１４４】
ワクチン組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノール等、保存剤を含むことができる。しかし、ワクチンは、水銀材料を実質的に含むべきではない（即ち、５μｇ／ｍｌ未満）、例えば、チオメルサールを含まないことが好ましい［３９、４９］。水銀を含有しないワクチンがより好まれる。α−トコフェロールスクシネートは、水銀化合物の代替物として含まれ得る［３９］。保存剤を含まないワクチンが特に好まれる。
【０１４５】
張度を制御するために、ナトリウム塩等、生理的な塩を含むことが好ましい。１〜２０ｍｇ／ｍｌの間で存在し得る塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好まれる。存在し得る他の塩は、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、無水リン酸二ナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、塩化マグネシウム、塩化カルシウム等を含む。
【０１４６】
ワクチン組成物は、一般に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、好ましくは、２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の質量オスモル濃度を有し、より好ましくは、２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内に収まるであろう。質量オスモル濃度は、ワクチン接種による疼痛に影響がないことが以前に報告されたが［５０］、にもかかわらず、質量オスモル濃度をこの範囲に維持することが好まれる。
【０１４７】
ワクチン組成物は、１種または複数の緩衝剤を含むことができる。典型的な緩衝剤は、リン酸塩緩衝剤；Ｔｒｉｓ緩衝剤；ホウ酸塩緩衝剤；コハク酸塩緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤（特に、水酸化アルミニウムアジュバントで）；またはクエン酸塩緩衝剤を含む。緩衝剤は、典型的に、５〜２０ｍＭ範囲で含まれるであろう。
【０１４８】
ワクチン組成物のｐＨは、一般に、５．０〜８．１の間、より典型的には、６．０〜８．０の間、例えば、６．５〜７．５または７．０〜７．８の間となるであろう。したがって、本発明のプロセスは、パッケージ前のバルクワクチンのｐＨを調整するステップを含むことができる。
【０１４９】
ワクチン組成物は、好ましくは無菌である。ワクチン組成物は、好ましくは、非発熱性であり、例えば、用量当たり＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準尺度）、好ましくは用量当たり＜０．１ＥＵを含有する。ワクチン組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。
【０１５０】
本発明のワクチン組成物は、特に、スプリットまたは表面抗原ワクチンのために、洗剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎ類」として公知）、オクトキシノール（オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール等）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）またはデオキシコール酸ナトリウムを含むことができる。洗剤は、微量のみが存在することができる。よって、ワクチンは、オクトキシノール−１０およびポリソルベート８０のそれぞれの１ｍｇ／ｍｌ未満を含むことができる。他の残りの微量の構成成分は、抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。
【０１５１】
ワクチン組成物は、単回の免疫化のための材料を含むことができる、あるいは複数回の免疫化のための材料を含むことができる（即ち、「複数用量」キット）。保存剤を含めることは、複数用量の構成（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）において好ましい。複数用量組成物中に保存剤を含める代替として（もしくはそれに加えて）、上記組成物は、材料の取り出しのための無菌アダプタを有する容器中に含まれ得る。
【０１５２】
インフルエンザワクチンは、典型的に、約０．５ｍｌの投薬容量で投与されるが、半分の用量（即ち、約０．２５ｍｌ）を小児に投与することができる。
【０１５３】
組成物およびキットは、好ましくは、２℃〜８℃の間で貯蔵される。これらは凍結するべきではない。理想的には、直射光を遮断するべきである。
【０１５４】
宿主細胞ＤＮＡ
ウイルスが単離され、そして／または細胞株上で増殖させられた場合、最終ワクチン中に残っている細胞株ＤＮＡのいかなる潜在的な腫瘍形成活性をも最小限にするために、上記ＤＮＡの量を最小限にすることは、標準的な実施である。
【０１５５】
従って、本発明に従って調製されるワクチン組成物は、好ましくは、１用量あたり１０ｎｇ（好ましくは、１ｎｇ未満、より好ましくは、１００ｐｇ未満）の残留宿主細胞ＤＮＡを含むが、微量の宿主細胞ＤＮＡが存在し得る。
【０１５６】
あらゆる残留宿主細胞ＤＮＡの平均長が５００ｂｐ未満（例えば、４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満など）であることは、好ましい。
【０１５７】
夾雑するＤＮＡは、標準的精製手順（例えば、クロマトグラフィーなど）を使用するワクチン調製の間に除去され得る。残留宿主細胞ＤＮＡの除去は、ヌクレアーゼ処理によって（例えば、ＤＮａｓｅを使用することによって）増強され得る。宿主細胞ＤＮＡ夾雑物を減らすための便利な方法は、２工程処理（第１は、ＤＮａｓｅ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（これは、ウイルス増殖の間に使用され得る）を、次いで、カチオン性洗剤（例えば、ＣＴＡＢ）（これは、ビリオン破壊の間に使用され得る）使用する）を含む参考文献５１および５２において開示される。アルキル化剤（例えば、β−プロピオラクトン）での処理はまた、宿主細胞ＤＮＡを除去するために使用され得、有利なことには、ビリオンを不活化するためにも使用され得る［５３］。
【０１５８】
アジュバント
本発明の組成物は、有利には、アジュバントを含み得る。これは、上記組成物を受ける被験体において誘発される免疫応答（液性および／もしくは細胞性）を高めるように機能し得る。好ましいアジュバントは、水中油型エマルジョンを含む。種々のこのようなアジュバントは公知であり、それらは、代表的には、少なくとも１種の油および少なくとも１種の界面活性剤を含み、上記油および界面活性剤は、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。上記エマルジョン中の油滴は、一般に、直径５μｍ未満であり、理想的には、サブミクロンの直径を有し、これら小さなサイズは、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ）で達成されて、安定なエマルジョンを提供する。２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴は、濾過滅菌に供され得るので、好ましい。
【０１５９】
前記エマルジョンは、動物（例えば魚類）供給源または植物供給源からのものなどの油を含むことができる。植物油の供給源としては、堅果、種子および穀粒が挙げられる。ラッカセイ油、ダイズ油、ヤシ油およびオリーブ油が、最も一般的に利用できる堅果油の例である。例えばホホバ豆から得られる、ホホバ油を使用することができる。種子油としては、紅花油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油およびこれらに類するものが挙げられる。穀粒の群の中で、トウモロコシ油が最も容易に入手できるが、他の穀類の穀粒、例えばコムギ、オートムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギおよびこれらに類するものの油も使用することができる。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油中に天然に存在しないが、堅果油および種子油から出発して適切な材料の加水分解、分離およびエステル化によって調製することができる。哺乳動物の乳からの脂肪および油は代謝性であり、従って、本発明の実施の際に使用することができる。動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、鹸化および他の手段についての手順は、当該技術分野において周知である。殆どの魚類は、容易に回収できる代謝性の油を含有する。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨油、例えば鯨ろうが、ここで使用することができる魚油のいくつかの例である。多数の分岐鎖油が５炭素イソプレン単位で生化学的に合成されており、一般にテルペノイドと呼ばれる。サメ肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサン、として公知の、分岐した不飽和テルペノイドを含有し、これは、ここで特に好ましい。スクワラン、スクアレンの飽和類似体、も好ましい油である。スクアレンおよびスクワランを含む、魚油は、商業的供給源から容易に入手することができ、または当該技術分野において公知の方法によって得ることができる。別の好ましい油は、α−トコフェロールである（以下を参照のこと）。
【０１６０】
油の混合物を使用することができる。
【０１６１】
界面活性剤をそれらの「ＨＬＢ」（親水親油バランス）によって分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、およびさらに好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；商品名ＤＯＷＦＡＸＴＭで販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば、線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；反復エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が様々であり得るオクトキシノール、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、すなわちｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質、例えばホスファチジルコリン（レシチン）；ノニルフェノールエトキシレート、例えばＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭＮＰシリーズ；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールから誘導されたポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）、例えばトリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０）；ならびにソルビタンエステル（一般にＳＰＡＮとして公知）、例えばソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ  ８５）およびソルビタンモノラウレートを含む（しかしこれらに限定されない）界面活性剤と共に用いることができる。非イオン性界面活性剤が好ましい。前記エマルジョンに含めるために好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ  ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【０１６２】
界面活性剤の混合物、例えばＴｗｅｅｎ  ８０／Ｓｐａｎ  ８５混合物、を使用することができる。ポリオキシエチレンソルビタンエステル、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ  ８０）、およびオクトキシノール、例えばｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、の組み合わせも適する。別の有用な組み合わせは、ラウレス９とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。
【０１６３】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０）０．０１％から１％、特に約０．１％；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の洗剤）０．００１％から０．１％、特に０．００５％から０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス９）０．１％から２０％、好ましくは０．１％から１０％および特に０．１％から１％または約０．５％である。
【０１６４】
上記ワクチンがスプリットウイルスを含む場合、上記ワクチンは、水相中に遊離界面活性剤を含むことが好ましい。これは、上記遊離界面活性剤が、上記抗原に対して「スプリット効果」を発揮し得、それによって、他の状態で存在し得る任意の非スプリットビリオンおよび／もしくはビリオン凝集物を破壊するので、有利である。これは、スプリットウイルスワクチンの安全性を改善し得る［５４］。
【０１６５】
好ましいエマルジョンは、＜１μｍの平均液滴サイズ（例えば、≦７５０ｎｍ、≦５００ｎｍ、≦４００ｎｍ、≦３００ｎｍ、≦２５０ｎｍ、≦２２０ｎｍ、≦２００ｎｍ、もしくはこれより小さい）を有し得る。これら液滴サイズは、便利なことには、微小流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓａｔｉｏｎ）のような技術によって達成され得る。
【０１６６】
本発明で有用な特定の水中油型エマルジョンアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６７】
・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ  ８０、およびＳｐａｎ８５のサブミクロンエマルジョン。上記エマルジョンの体積での組成は、約５％  スクアレン、約０．５％  ポリソルベート８０および約０．５％  Ｓｐａｎ  ８５であり得る。重量では、これらの比は、４．３％  スクアレン、０．５％  ポリソルベート８０および０．４８％  Ｓｐａｎ  ８５になる。このアジュバントは、引用文献５８の第１０章および引用文献５９の第１２章により詳細に記載されるように、「ＭＦ５９」として公知である［５５〜５７］。上記ＭＦ５９エマルジョンは、有利なことには、クエン酸イオン（例えば、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム緩衝液）を含む。
【０１６８】
・スクアレン、α−トコフェロール、およびポリソルベート８０を含むエマルジョン。このエマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水を含み得る。これらエマルジョンは、体積で２〜１０％  スクアレン、２〜１０％  トコフェロールおよび０．３〜３％  ポリソルベート８０を有し得、スクアレン：トコフェロールの重量比は、好ましくは、＜１（例えば、０．９０）である。なぜなら、これは、より安定なエマルジョンを提供し得るからである。スクアレンおよびポリソルベート８０は、約５：２の体積比もしくは約１１：５の重量比で存在し得る。それゆえ、これら３種の成分（スクアレン、トコフェロール、ポリソルベート８０）は、１０６８：１１８６：４８５またはおおよそ５５：６１：２５の重量比で存在し得る。１つのこのようなエマルジョン（「ＡＳ０３」）は、Ｔｗｅｅｎ  ８０をＰＢＳ中に溶解して、２％溶液を与え、次いで、この溶液９０ｍｌと、（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌ  スクアレン）の混合物とを混合し、次いで、上記混合物を微小流動化する（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅ）ことによって、作製され得る。得られたエマルジョンは、例えば、１００〜２５０ｎｍの間、好ましくは、約１８０ｎｍの平均直径を有するサブミクロン油滴を有し得る。上記エマルジョンはまた、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３−ｄｅ−Ｏ−ａｃｙｌａｔｅｄ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）（３ｄ−ＭＰＬ）を含み得る。このタイプの別の有用なエマルジョンは、ヒトの用量あたり、例えば、上記で検討した比で０．５〜１０ｍｇ  スクアレン、０．５〜１１ｍｇ  トコフェロール、および０．１〜４ｍｇ  ポリソルベート８０を含み得る［６０］。
【０１６９】
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）のエマルジョン。上記エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬ（下記を参照のこと）を含み得る。上記エマルジョンは、リン酸緩衝液を含み得る。
【０１７０】
・ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）およびトコフェロール（例えば、α−トコフェロールスクシネート）を含むエマルジョン。上記エマルジョンは、約７５：１１：１０（例えば、７５０μｇ／ｍｌ  ポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１００μｇ／ｍｌ  α−トコフェロールスクシネート）の質量比でこれら３種の成分を含み得、これら濃度は、抗原由来のこれら成分の何らかの寄与を含むはずである。上記エマルジョンはまた、スクアレンを含み得る。上記エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬ（下記を参照のこと）を含み得る。その水相は、リン酸緩衝液を含み得る。
【０１７１】
・スクアラン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭ  Ｌ１２１」）のエマルジョン。上記エマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中に処方され得る。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドの有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバント中でトレオニル−ＭＤＰとともに使用されてきた［６１］（０．０５〜１％  Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％  スクアラン、２．５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％  ポリソルベート８０）。このエマルジョンはまた、「ＡＦ」アジュバントでのように［６２］（５％  スクアラン、１．２５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％  ポリソルベート８０）、上記Ｔｈｒ−ＭＤＰなしでも使用され得る。微小流動化が好ましい。
【０１７２】
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルもしくはマンニドエステル（ｍａｎｎｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）（例えば、ソルビタンモノオレエート（ｍｏｎｏｌｅａｔｅ）もしくは「Ｓｐａｎ  ８０」））を含むエマルジョン。上記エマルジョンは、好ましくは、熱可逆性であり、そして／または上記油滴のうちの少なくとも９０％（体積で）が、２００ｎｍ未満のサイズを有する［６３］。上記エマルジョンはまた、アルジトール；凍結保護剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）（例えば、糖（例えば、ドデシルマルトシドおよび／もしくはスクロース））；および／またはアルキルポリグリコシドのうちの１種以上を含み得る。上記エマルジョンは、ＴＬＲ４アゴニストを含み得る［６４］。このようなエマルジョンは、凍結乾燥され得る。
【０１７３】
・スクアレン、ポロキサマー１０５およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅのエマルジョン［６５］。アジュバント化ワクチン中のこれら成分の最終濃度（重量）は、５％  スクアレン、４％  ポロキサマー１０５（プルロニックポリオール）および２％  Ａｂｉｌ−Ｃａｒｅ  ８５（ビス−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６  ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ジメチコン；カプリル／カプリントリグリセリド）である。
【０１７４】
・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献６６に記載されるように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロン液滴サイズが有利である。
【０１７５】
・非代謝性の油（例えば、軽油（ｌｉｇｈｔ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｏｉｌ））および少なくとも１種の界面活性剤（例えば、レシチン、Ｔｗｅｅｎ  ８０もしくはＳｐａｎ  ８０）のサブミクロン水中油型エマルジョン。添加剤が含まれ得る（例えば、ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−親油性結合体（例えば、参考文献６７に記載され、グルクロン酸のカルボキシル基を介して、脂肪族アミンを、デスアシルサポニン（ｄｅｓａｃｙｌｓａｐｏｎｉｎ）に添加することにより生成されるＧＰＩ−０１００）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｍｅｔｈｙｉｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）および／もしくはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミン）。
【０１７６】
・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡもしくはＱＳ２１）およびステロール（例えば、コレステロール）が螺旋状ミセルとして会合されるエマルジョン［６８］。
【０１７７】
・鉱油、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／もしくはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［６９］。
【０１７８】
・鉱油、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／もしくはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［６９］。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、エマルジョンは、送達時に抗原と即座に混合され得、従って、上記アジュバントおよび抗原は、パッケージされたもしくは配布されたワクチン（使用時に最終処方物の準備ができている）では別個に保持され得る。他の実施形態において、エマルジョンは、製造の間に抗原と混合され、従って、上記組成物は、液体アジュバント化形態（ｌｉｑｕｉｄ  ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ｆｏｒｍ）においてパッケージされる。上記抗原は、一般に、水性形態にあり、その結果、上記ワクチンは、２種の液体を混合することによって最終的に調製される。混合するための上記２種の液体の体積比は、変動し得る（例えば、５：１〜１：５の間）が、一般に、約１：１である。成分濃度が、上記の特定のエマルジョンの説明において与えられる場合、これら濃度は、代表的には、非希釈組成物に関するものであり、したがって抗原溶液と混合した後の濃度は低下する。
【０１８０】
ワクチン組成物のパッケージング
本発明の組成物（もしくはキット成分）に適した容器としては、バイアル、シリンジ（例えば、使い捨てシリンジ）、鼻スプレーなどが挙げられる。これら容器は、滅菌であるべきである。
【０１８１】
組成物／成分がバイアル中に配置される場合、上記バイアルは、好ましくは、ガラス材料もしくはプラスチック材料から作製され得る。上記バイアルは、好ましくは、上記組成物が上記バイアルに添加される前に、滅菌される。ラテックス感受性患者に伴う問題を回避するために、バイアルは、好ましくは、ラテックス非含有ストッパーでシールされ、全てのパッケージング材料中にラテックスが存在しないことが好ましい。上記バイアルは、ワクチンの単一用量を含んでいてもよいし、１用量より多い用量（「複数用量」バイアル）、例えば、１０用量を含んでいてもよい。好ましいバイアルは、無色ガラスから作製される。
【０１８２】
バイアルは、あらかじめ充填されたシリンジがキャップに挿入され得るように適合されたキャップ（例えば、ルアーロック）を有し得、上記シリンジの内容物は、上記バイアルへと排出され得（例えば、その中の凍結乾燥物質を再構成するために）、上記バイアルの内容物は、取り出されて上記シリンジへと戻され得る。上記バイアルから上記シリンジを取り出した後、次いで、ニードルが取り付けられ得、上記組成物が、患者へと投与され得る。上記キャップは、好ましくは、シールもしくはカバーの内部に配置され得る。その結果、上記シールもしくはカバーは、上記キャップに到達し得る前に除去されなければならない。バイアルは、特に、複数用量バイアルについては、その内容物の無菌的取り出しを可能にするキャップを有し得る。
【０１８３】
成分がシリンジにパッケージされる場合、上記シリンジは、これに取り付けられるニードルを有し得る。ニードルが取り付けられていない場合、別個のニードルが、組み立ておよび使用のために、上記シリンジと共に供給され得る。このようなニードルは、鞘に入れられ得る。安全ニードル（ｓａｆｅｔｙ  ｎｅｅｄｌｅ）が好ましい。１インチ  ２３ゲージ、１インチ  ２５ゲージおよび５／８インチ  ２５ゲージのニードルが代表的である。シリンジは、記録保持を容易にするために、ロット番号、インフルエンザ流行期、および内容物の使用期限がプリントされ得るピールオフラベルとともに提供され得る。上記シリンジにおけるプランジャーは、好ましくは、上記プランジャーが吸引の間に偶発的に除去されてしまわないように、ストッパーを有し得る。上記シリンジは、ラテックスゴムキャップおよび／もしくはプランジャーを有し得る。使い捨てシリンジは、単一用量のワクチンを含む。上記シリンジは、一般に、ニードルの取り付け前に、先端をシールするために先端キャップを有し、上記先端キャップは、好ましくは、ブチルゴムから作製され得る。上記シリンジおよびニードルが別個にパッケージされる場合、上記ニードルは、好ましくは、ブチルゴムシールドと適合させられる。好ましいシリンジは、商品名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」ＴＭの下で市販されるものである。
【０１８４】
容器は、例えば、小児への送達を容易にするために、半用量の体積を示すために印が付けられ得る。例えば、０．５ｍｌ用量を含むシリンジは、０．２５ｍｌ体積を示す印を有し得る。
【０１８５】
ガラス容器（例えば、シリンジもしくはバイアル）が使用される場合、ソーダ石灰ガラスよりむしろホウケイ酸ガラスから作製された容器を使用することが好ましい。
【０１８６】
キットもしくは組成物は、（例えば、同じボックスの中に）上記ワクチンの詳細（例えば、投与の説明書、上記ワクチン内の抗原の詳細など）を含むリーフレットとともにパッケージされ得る。上記説明書はまた、警告（例えば、ワクチン接種後のアナフィラキシー反応の場合に容易に利用可能なアドレナリン溶液を保持することなど）を含み得る。
【０１８７】
処置方法、および上記ワクチンの投与
本発明は、本発明に従って製造されるワクチンを提供する。これらワクチン組成物は、ヒト被験体もしくはヒト以外の動物被験体（例えば、ブタまたはトリ）への投与に適しており、本発明は、上記被験体に本発明の組成物を投与する工程を包含する、被験体における免疫応答を惹起するための方法を提供する。本発明はまた、医薬として使用するための本発明の組成物を提供し、被験体における免疫応答を惹起するための医薬の製造のための、本発明の組成物の使用を提供する。
【０１８８】
これら方法および使用によって惹起される免疫応答は、一般に、抗体応答（好ましくは、防御的抗体応答）を含む。インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能力および防御を評価するための方法は、当該分野で周知である。ヒトでの研究から、ヒトインフルエンザウイルスのヘマグルチニンに対する抗体力価が、防御と相関する（約３０〜４０の血清サンプル赤血球凝集阻害力価が、同種のウイルスによる感染から約５０％防御を与える）ことが示された［７０］。抗体応答は、代表的には、赤血球凝集阻害によって、マイクロ中和によって、単一放射免疫拡散（ｓｉｎｇｌｅ  ｒａｄｉａｌ  ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）（ＳＲＩＤ）によって、および／もしくは単一放射溶血（ＳＲＨ）によって、測定される。これらアッセイ技術は、当該分野で周知である。
【０１８９】
本発明の組成物は、種々の方法において投与され得る。最も好ましい免疫化経路は、筋肉内注射（例えば、腕もしくは脚への）によるが、他の利用可能な経路としては、皮下注射、鼻内［７１〜７３］、経口［７４］、皮内［７５、７６］、経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）［７７］などが挙げられる。
【０１９０】
本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。インフルエンザワクチンは、６ヶ月齢からの小児および成人での免疫化における使用に関して現在推奨されている。従って、ヒト被験体は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、もしくは少なくとも５５歳であってもよい。上記ワクチンを受けるのに好ましい被験体は、高齢（例えば、≧５０歳、≧６０歳、および好ましくは、≧６５歳）、若年齢（例えば、≦５歳）、入院している被験体、ヘルスケアワーカー、軍隊および軍職員、妊婦、慢性疾患の、免疫不全の被験体、上記ワクチンを受ける７日前までに抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルおよびザナミビル化合物；以下を参照のこと）を摂取している被験体、卵アレルギーがある人々、および外国に旅行する人々である。上記ワクチンは、これらの群に適しているのみではないが、一般に、集団においてより多く使用され得る。汎流行性株については、すべての年齢群への投与が好ましい。
【０１９１】
好ましい本発明の組成物は、効力についてＣＰＭＰ基準のうちの１つ、２つもしくは３つを満たす。成人（１８〜６０歳）において、これら基準は、以下である：（１）≧７０％血清保有率（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）；（２）≧４０％セロコンバージョン；および／もしくは（３）ＧＭＴ増加≧２．５倍。高齢者（＞６０歳）において、これら基準は、以下である：（１）≧６０％血清保有率；（２）≧３０％セロコンバージョン；および／もしくは（３）ＧＭＴ増加≧２倍。これら基準は、少なくとも５０名の患者でのオープンラベル研究に基づく。
【０１９２】
処置は、単一用量スケジュールもしくは複数用量スケジュールによってであり得る。複数用量は、初回免疫化スケジュールおよび／もしくは追加免疫化スケジュールにおいて使用され得る。複数用量スケジュールにおいて上記種々の用量は、同じ経路もしくは異なる経路によって与えられ得る（例えば、非経口の初回免疫（ｐｒｉｍｅ）および粘膜の追加免疫（ｂｏｏｓｔ）、粘膜の初回免疫および非経口の追加免疫など）。１より多くの用量の投与（代表的には、２用量）は、免疫学的に経験したことがない患者（例えば、これまでインフルエンザワクチンを受けたことのない人に関して）において、または新たなＨＡサブタイプ（汎流行性アウトブレイクにおけるような）に対するワクチン接種のために、特に有用である。複数用量は、代表的には、少なくとも１週間空けて（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）投与される。
【０１９３】
本発明によって生成されるワクチンは、他のワクチン（例えば、麻疹ワクチン、ムンプス・ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合体化Ｂ型インフルエンザワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合型ワクチン（例えば、四価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチン）、ＲＳウイルスワクチン、肺炎球菌結合型ワクチンなど）と実質的に同時（例えば、同じ医療相談の間に、またはヘルスケア専門家およびワクチン接種施設への訪問の間に）に患者に投与され得る。肺炎球菌ワクチンおよび／もしくは髄膜炎菌ワクチンと実施的に同時の投与は、高齢の患者において特に有用である。
【０１９４】
同様に、本発明のワクチンは、抗ウイルス化合物、および特に、インフルエンザウイルスに対して活性な抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルおよび／もしくはザナミビル）と実質的に同時（例えば、同じ医療相談の間に、またはヘルスケア専門家への訪問の間に）に、患者に投与され得る。これら抗ウイルス剤としては、ノイラミニダーゼインヒビター（例えば、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸もしくは５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン−２−エノン酸（ｅｎｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（そのエステル（例えば、そのエチルエステル）およびその塩（例えば、そのリン酸塩）を含む）が挙げられる。好ましい抗ウイルス剤は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸、エチルエステル、ホスフェート（１：１）（オセルタミビルホスフェート（ＴＡＭＩＦＬＵＴＭ）としても公知）である。
【０１９５】
一般
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を含み、例えば、Ｘを「含む」組成物は、もっぱらＸからなってもよいし、さらなる何かを含んでいてもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【０１９６】
語句「実質的に」は、「完全に」を排除しない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、完全にＹを含まなくてもよい。必要であれば、語句「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
【０１９７】
数値ｘに関する用語「約」とは、任意であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１９８】
本発明による使用に好まれるペアワイズアラインメントアルゴリズムは、デフォルトパラメータ（例えば、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを使用した、ギャップ開始ペナルティ＝１０．０およびギャップ伸長ペナルティ＝０．５による）を使用したＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズム［７８］である。このアルゴリズムは、ＥＭＢＯＳＳパッケージ内のｎｅｅｄｌｅツールにおいて簡便に実行される［７９］。
【０１９９】
特に記述されていなければ、２種またはそれを超える構成成分を混合するステップを含むプロセスは、いかなる特定の混合順序も必要としない。よって、構成成分は、いかなる順序で混合することもできる。３種の構成成分が存在する場合、２種の構成成分を互いに組み合わせ、この組合せを第３の構成成分と組み合わせること等ができる。
【０２００】
方法の様々なステップは、同じまたは異なる時点で、同じまたは異なる地理的位置、例えば、国において、同じまたは異なる人物または実体により行うことができる。
【０２０１】
動物（特にウシ）材料は、細胞の培養において使用される場合、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まない、特に、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から得るべきである。全体的に見て、動物由来材料の完全な非存在下で細胞を培養することが好ましい。
【０２０２】
化合物が、組成物の一部として身体に投与される場合、該化合物は、あるいは、適したプロドラッグに置き換えることができる。
【０２０３】
２種のアミノ酸配列の間のパーセンテージ配列同一性に対する言及は、整列された場合、該パーセンテージのアミノ酸が、該２配列の比較において同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、本技術分野において公知のソフトウェアプログラム、例えば、参考文献８０のセクション７．７．１８に記載されているプログラムを使用して決定することができる。好まれるアラインメントは、ギャップ開始ペナルティ１２およびギャップ伸長ペナルティ２、ＢＬＯＳＵＭマトリクス６２によるアフィンギャップ検索を使用した、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献８１に教示されている。
【０２０４】
２種の核酸配列の間のパーセンテージ配列同一性に対する言及は、整列された場合、該パーセンテージの塩基が、該２配列の比較において同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、本技術分野において公知のソフトウェアプログラム、例えば、参考文献８０のセクション７．７．１８に記載されているプログラムを使用して決定することができる。好まれるアラインメントプログラムは、好ましくは、次のデフォルトパラメータ：開始ギャップ＝３；伸長ギャップ＝１を使用した、ＧＣＧ  Ｇａｐ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｓｕｉｔｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．１）である。
【図面の簡単な説明】
【０２０５】
【図１】図１は、バックボーン由来ウイルスが、成長およびＨＡ収量においてｗｔ  Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０ウイルスよりも優れることを示す図である。（Ａ）ＨＡ  ＥＬＩＳＡによって測定されるＨＡ収量。ｙ軸は、ＨＡ収量（μｇ／ｍＬ）を示す。（Ｂ）ＥＬＩＳＡによるＨＡ収量の倍数増加（ｆｏｌｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ）は、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０  ＷＴ  ウイルスの値に対しＨＡ  ＥＬＩＳＡ値を正規化することにより計算した。ｙ軸は、ＨＡ収量の倍数増加を示す。（Ｃ）０．５％モルモットＲＢＣを使用したＨＡ力価。ｙ軸は、ｌｏｇ２  ＨＡ力価を示す。（Ｄ）ＦＦＡアッセイによって決定される、感染６０時間後のウイルス価。ｙ軸は、ＦＦＵ／ｍＬを示す。バーは、３回の独立した実験の平均プラスＳＥＭを表す。一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、統計的有意性を決定した。各群の平均値を、ダネットの多重比較検定を使用してＷＴウイルスと比較した。＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．０１、＊＊＊＝Ｐ＜０．００１；白色バーは、ｗｔ  Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０による結果を表し、ドット入りのカラムは、ＰＲ８Ｘバックボーンによる結果を示し、斜線カラムは、＃１９カラムによる結果を示し、灰色カラムは、＃２１バックボーンによる結果を示す。
【図２】図２は、野生型（ＷＴ）または逆遺伝学由来（ＲＧ）Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８株と比べた、ＭＤＣＫ細胞における異なるリアソータントインフルエンザＢ株のＨＡ収量を比較する。被験インフルエンザＢウイルスのウイルスセグメントを表１に示す。ｙ軸は、ＨＡ収量をμｇ／ｍＬ単位で示す。
【図３】図３は、野生型（ＷＴ）または逆遺伝学由来（ＲＧ）Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０株と比べた、ＭＤＣＫ細胞における異なるリアソータントインフルエンザＢ株のＨＡ収量を比較する。被験インフルエンザＢウイルスのウイルスセグメントを表１に示す。ｙ軸は、ＨＡ収量をμｇ／ｍＬ単位で示す。
【図４Ａ】図４（Ａ）は、キメラＨＡ構築物の模式図および配列アラインメントである。野生型Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０  ＨＡ（ＷＴ  Ｂｒｉｓ）は、白色で示す。Ｈ１Ｎ１の２種の研究室適応株、ＰＲ８Ｘ（ドット入りの区域）および１０５ｐ３０（斜線区域）に由来する、ＨＡの末端領域、非コード領域（ＮＣＲ）、シグナルペプチド（ＳＰ）、膜貫通領域（ＴＭ）および細胞質ドメイン（ＣＴ）を、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０外部ドメインに融合して、図示されているキメラＨＡセグメントを産生する。（Ｂ）Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０（Ｂｒｉｓ）、ＰＲ８Ｘおよび１０５ｐ３０  ＨＡの末端領域の配列アラインメント。ダッシュ記号は、株間で保存されたヌクレオチドを表す。３’ＮＣＲは、実線バーによってシグナルペプチド配列から隔てられる。簡潔にするため、外部ドメイン配列を省略する（．．／．．）。膜貫通領域は、破線によって細胞質テイルから隔てられる。終止コドンは下線が引かれ、５’ＮＣＲが続く。（Ｃ）キメラＮＡ構築物の模式図および配列アラインメント。野生型Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０  ＮＡ（ＷＴ  Ｂｒｉｓ）は、白色で示す。ＰＲ８Ｘ（灰色）および１０５（斜め線）に由来するＮＡの末端領域、非コード領域（ＮＣＲ）、細胞質ドメイン（ＣＴ）および膜貫通領域（ＴＭ）を、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０外部ドメインにグラフトして、図示されているキメラＮＡセグメントを産生する。（Ｄ）Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０（Ｂｒｉｓ）、ＰＲ８Ｘおよび１０５  ＮＡの末端領域の配列アラインメント。ダッシュ記号は、株間で保存されたヌクレオチドを表す。細胞質テイルは、実線バーによって３’ＮＣＲから隔てられ、破線によって膜貫通領域から隔てられる。簡潔にするため、外部ドメイン配列を省略する（．．／．．）。終止コドンは下線が引かれ、５’ＮＣＲが続く。
【図４Ｂ】図４（Ａ）は、キメラＨＡ構築物の模式図および配列アラインメントである。野生型Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０  ＨＡ（ＷＴ  Ｂｒｉｓ）は、白色で示す。Ｈ１Ｎ１の２種の研究室適応株、ＰＲ８Ｘ（ドット入りの区域）および１０５ｐ３０（斜線区域）に由来する、ＨＡの末端領域、非コード領域（ＮＣＲ）、シグナルペプチド（ＳＰ）、膜貫通領域（ＴＭ）および細胞質ドメイン（ＣＴ）を、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０外部ドメインに融合して、図示されているキメラＨＡセグメントを産生する。（Ｂ）Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０（Ｂｒｉｓ）、ＰＲ８Ｘおよび１０５ｐ３０  ＨＡの末端領域の配列アラインメント。ダッシュ記号は、株間で保存されたヌクレオチドを表す。３’ＮＣＲは、実線バーによってシグナルペプチド配列から隔てられる。簡潔にするため、外部ドメイン配列を省略する（．．／．．）。膜貫通領域は、破線によって細胞質テイルから隔てられる。終止コドンは下線が引かれ、５’ＮＣＲが続く。（Ｃ）キメラＮＡ構築物の模式図および配列アラインメント。野生型Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０  ＮＡ（ＷＴ  Ｂｒｉｓ）は、白色で示す。ＰＲ８Ｘ（灰色）および１０５（斜め線）に由来するＮＡの末端領域、非コード領域（ＮＣＲ）、細胞質ドメイン（ＣＴ）および膜貫通領域（ＴＭ）を、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０外部ドメインにグラフトして、図示されているキメラＮＡセグメントを産生する。（Ｄ）Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０（Ｂｒｉｓ）、ＰＲ８Ｘおよび１０５  ＮＡの末端領域の配列アラインメント。ダッシュ記号は、株間で保存されたヌクレオチドを表す。細胞質テイルは、実線バーによって３’ＮＣＲから隔てられ、破線によって膜貫通領域から隔てられる。簡潔にするため、外部ドメイン配列を省略する（．．／．．）。終止コドンは下線が引かれ、５’ＮＣＲが続く。
【図４Ｃ】図４（Ａ）は、キメラＨＡ構築物の模式図および配列アラインメントである。野生型Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０  ＨＡ（ＷＴ  Ｂｒｉｓ）は、白色で示す。Ｈ１Ｎ１の２種の研究室適応株、ＰＲ８Ｘ（ドット入りの区域）および１０５ｐ３０（斜線区域）に由来する、ＨＡの末端領域、非コード領域（ＮＣＲ）、シグナルペプチド（ＳＰ）、膜貫通領域（ＴＭ）および細胞質ドメイン（ＣＴ）を、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０外部ドメインに融合して、図示されているキメラＨＡセグメントを産生する。（Ｂ）Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０（Ｂｒｉｓ）、ＰＲ８Ｘおよび１０５ｐ３０  ＨＡの末端領域の配列アラインメント。ダッシュ記号は、株間で保存されたヌクレオチドを表す。３’ＮＣＲは、実線バーによってシグナルペプチド配列から隔てられる。簡潔にするため、外部ドメイン配列を省略する（．．／．．）。膜貫通領域は、破線によって細胞質テイルから隔てられる。終止コドンは下線が引かれ、５’ＮＣＲが続く。（Ｃ）キメラＮＡ構築物の模式図および配列アラインメント。野生型Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０  ＮＡ（ＷＴ  Ｂｒｉｓ）は、白色で示す。ＰＲ８Ｘ（灰色）および１０５（斜め線）に由来するＮＡの末端領域、非コード領域（ＮＣＲ）、細胞質ドメイン（ＣＴ）および膜貫通領域（ＴＭ）を、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０外部ドメインにグラフトして、図示されているキメラＮＡセグメントを産生する。（Ｄ）Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０（Ｂｒｉｓ）、ＰＲ８Ｘおよび１０５  ＮＡの末端領域の配列アラインメント。ダッシュ記号は、株間で保存されたヌクレオチドを表す。細胞質テイルは、実線バーによって３’ＮＣＲから隔てられ、破線によって膜貫通領域から隔てられる。簡潔にするため、外部ドメイン配列を省略する（．．／．．）。終止コドンは下線が引かれ、５’ＮＣＲが続く。
【図４Ｄ】図４（Ａ）は、キメラＨＡ構築物の模式図および配列アラインメントである。野生型Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０  ＨＡ（ＷＴ  Ｂｒｉｓ）は、白色で示す。Ｈ１Ｎ１の２種の研究室適応株、ＰＲ８Ｘ（ドット入りの区域）および１０５ｐ３０（斜線区域）に由来する、ＨＡの末端領域、非コード領域（ＮＣＲ）、シグナルペプチド（ＳＰ）、膜貫通領域（ＴＭ）および細胞質ドメイン（ＣＴ）を、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０外部ドメインに融合して、図示されているキメラＨＡセグメントを産生する。（Ｂ）Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０（Ｂｒｉｓ）、ＰＲ８Ｘおよび１０５ｐ３０  ＨＡの末端領域の配列アラインメント。ダッシュ記号は、株間で保存されたヌクレオチドを表す。３’ＮＣＲは、実線バーによってシグナルペプチド配列から隔てられる。簡潔にするため、外部ドメイン配列を省略する（．．／．．）。膜貫通領域は、破線によって細胞質テイルから隔てられる。終止コドンは下線が引かれ、５’ＮＣＲが続く。（Ｃ）キメラＮＡ構築物の模式図および配列アラインメント。野生型Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０  ＮＡ（ＷＴ  Ｂｒｉｓ）は、白色で示す。ＰＲ８Ｘ（灰色）および１０５（斜め線）に由来するＮＡの末端領域、非コード領域（ＮＣＲ）、細胞質ドメイン（ＣＴ）および膜貫通領域（ＴＭ）を、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０外部ドメインにグラフトして、図示されているキメラＮＡセグメントを産生する。（Ｄ）Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０（Ｂｒｉｓ）、ＰＲ８Ｘおよび１０５  ＮＡの末端領域の配列アラインメント。ダッシュ記号は、株間で保存されたヌクレオチドを表す。細胞質テイルは、実線バーによって３’ＮＣＲから隔てられ、破線によって膜貫通領域から隔てられる。簡潔にするため、外部ドメイン配列を省略する（．．／．．）。終止コドンは下線が引かれ、５’ＮＣＲが続く。
【図５】図５は、ＰＲ８Ｘ（ｔｅｒｍ）ＨＡ／ＮＡセグメントが、ＰＲ８Ｘ（ｔｅｒｍ）ＨＡまたはＮＡのみよりもＨＡ収量を増強することを示す図である。ＭＤＣＫ  ３３０１６ＰＦ細胞を、表示のＨＡ／ＮＡ遺伝子セグメント組合せを使用したＰＲ８Ｘバックボーンを有するウイルスに０．００１のＭＯＩで感染させる。（Ａ）ＨＡ  ＥＬＩＳＡによって測定され、ＷＴ  Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０  ＨＡおよびＮＡセグメントを使用した収量と比較された倍数増加。ｙ軸は、ＨＡ収量の倍数増加を示す。（Ｂ）モルモットに由来する０．５％赤血球細胞を使用して決定されるＨＡ力価。ｙ軸は、ｌｏｇ２  ＨＡ力価を示す。（Ｃ）ＦＦＡアッセイによって決定される感染６０時間後のウイルス価。ｙ軸は、ＦＦＵ／ｍＬを示す。バーは、３回の独立した実験の平均プラスＳＥＭを表す。一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、統計的有意性を決定した。各群の平均値を、ダネットの多重比較検定を使用してＢｒｉｓ  ＨＡ／ＮＡと比較する。＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．０１。
【図６】図６は、キメラＨＡ／ＮＡセグメントが、全３種の最適化されたバックボーンによりＨＡ収量を増強することを示す図である。ＭＤＣＫ  ３３０１６ＰＦ細胞を、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０（Ｂｒｉｓ）（白色カラム）、ＰＲ８Ｘ（斜線カラム）および１０５ｐ３０（灰色カラム）に由来する末端領域を有するＨＡおよびＮＡ遺伝子セグメントを使用した３種の最適化されたバックボーンに由来するウイルスに０．００１のＭＯＩで感染させる。上パネル（Ａ、ＢおよびＣ）は、ＨＡ  ＥＬＩＳＡによって測定され、ＷＴ  ＨＡ／ＮＡセグメント（Ｂｒｉｓ）を使用した収量と比較された、ＨＡ収量の倍数増加を示す。ｙ軸は、ＨＡ力価の倍数増加を示す。中央パネル（Ｄ、ＥおよびＦ）は、ＨＡアッセイによって決定される感染６０時間後のＨＡ力価を示す。ｙ軸は、ｌｏｇ２  ＨＡ力価を示す。下パネル（Ｇ、ＨおよびＩ）は、ＦＦＡアッセイによって決定される感染６０時間後のウイルス価を示す。ｙ軸は、ＦＦＵ／ｍＬを示す。バーは、３回の独立した実験の平均プラスＳＥＭを表す。一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、統計的有意性を決定した。各群の平均値を、ダネットの多重比較検定を使用してＢｒｉｓ  ＨＡ／ＮＡと比較した。＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．０１。
【図７】図７は、キメラＨＡおよびＮＡセグメントが、＃２１バックボーンによりＨＡ収量を増強することを示す図である。ＭＤＣＫ  ３３０１６ＰＦ細胞を、Ｘ１８７作業用シード（Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９古典的リアソータント、白色カラム）および表示のＨＡおよびＮＡ遺伝子セグメント組合せ：ＷＴ  Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９（Ｖｉｃ、灰色カラム）、ＰＲ８Ｘ（ドット入りのカラム）または１０５（斜線カラム）の末端領域を有する＃２１バックボーンに由来するウイルスに０．００１のＭＯＩで感染させた。（Ａ）は、ＦＦＡアッセイによって決定される感染６０時間後のウイルス価を示す。ｙ軸は、ＦＦＵ／ｍＬを示す。（Ｂ）は、ＨＡ  ＥＬＩＳＡによって決定される感染６０時間後のＨＡ収量を示す。ｙ軸は、ＨＡ収量（μｇ／ｍＬ）を示す。バーは、２回の独立した実験の平均プラスＳＥＭを表す。一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、統計的有意性を決定した。各群の平均値を、ダネットの多重比較検定を使用してＢｒｉｓ  ＨＡ／ＮＡと比較した。＊＝Ｐ＜０．０５。
【図８】図８は、キメラＨＡ／ＮＡセグメントを有する＃２１バックボーン由来ウイルスの増強されたＨＡ含量を示す図である。（Ａ）Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０（Ｂｒｉｓ）（白色カラム）、ＰＲ８Ｘ（斜線カラム）および１０５ｐ３０（灰色カラム）に由来する末端領域を有するＨＡおよびＮＡ遺伝子セグメントを含有する＃２１由来ウイルスに０．００１のＭＯＩで感染させたＭＤＣＫ  ３３０１６ＰＦ細胞のラージスケール培養（６０ｍＬ）のＨＡ収量。スクロース勾配密度遠心分離によりウイルスを濃縮および精製した後に、ＨＰＬＣによってＨＡ収量を測定する。ｙ軸は、μｇ  ＨＡ／ｍＬ培養物を示す。（Ｂ）ＰＮＧａｓｅを使用してＨＡの脱グリコシル化（ｄＨＡ）を行い、ウイルスをその後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＳＹＰＲＯ−Ｒｕｂｙを使用してウイルスタンパク質を染色する。（Ｃ）ゲルデンシトメトリーアッセイおよびＨＰＬＣ／ＢＣＡアッセイによって評価される、表示のＨＡおよびＮＡセグメントを有する＃２１のＨＡ含量。ＢＣＡアッセイによって決定される画分における総タンパク質濃度で（Ａ）の値を割ることにより、ゲルデンシトメトリーおよびＨＰＬＣからＨＡ含量を計算する。カラムは、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０（Ｂｒｉｓ）（白色カラム）、ＰＲ８Ｘ（斜線カラム）および１０５ｐ３０（灰色カラム）に由来する末端領域を有するＨＡおよびＮＡ遺伝子セグメントによる結果を示す。ｙ軸は、％ＨＡ含量を示す。ＨＡ含量値を、１の値を割り当てたＢｒｉｓ（ｔｅｒｍ）ＨＡおよびＮＡ（ＷＴ対照）の値と比較した。バーは、２回の独立した実験の平均プラスＳＥＭを表す。一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、統計的有意性を決定する。各群の平均値を、ダネットの多重比較検定を使用してＢｒｉｓ  ＨＡ／ＮＡと比較した。＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【０２０６】
材料および方法
細胞、ウイルスおよびプラスミド
２９３Ｔ細胞および懸濁ＭＤＣＫ３３０１６ＰＦ細胞を、以前に記載された通りに［８２］維持する。
【０２０７】
ＰＲ８Ｘおよび１０５ｐ３０に由来する８種のセグメント、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９に由来するＰＢ１セグメント、ならびにＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０に由来するＨＡ／ＮＡセグメントを、以前に記載された通りに［８２］ウイルスレスキューのためにプラスミドｐＫＳ１０にクローニングする。重複ＰＣＲを使用してＨＡ末端領域キメラを作製し、以前に記載された通りに［８２］ｐＫＳ１０にクローニングする。重複ＰＣＲおよびＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ）変異誘発を使用して、ＮＡ末端領域キメラを作製する。レスキュー実験における使用前に全プラスミドを配列検証する。
【０２０８】
ＭＤＣＫ細胞におけるウイルス成長
ＭＤＣＫ３３０１６ＰＦ培養物（１×１０６細胞／ｍｌ）の１０ｍＬ懸濁培養物に、０．００１の感染多重度（ＭＯＩ）のウイルスを接種し、ＴｕｂｅＳｐｉｎ（商標）Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ５０（ＴＰＰ）においてインキュベートする。感染０および６０時間後に試料を採取し、処理まで−８０℃で凍結する。１２５ｍｌ振盪フラスコにおいて育成した６０ｍＬの培養物の調製のために、類似の方法を使用する。以前に記載されたフォーカス形成アッセイ［８３］を僅かに改変して使用して、ウイルス価を決定する。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して感染フォーカスを検出し、ＢｉｏＳｐｏｔ（商標）分析器（ＣＴＬ）により定量化する。
【０２０９】
ＨＡ  ＥＬＩＳＡ
３８４ｗプレート（Ｃｏｓｔａｒ）を、Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ（ＧＮＡ）レクチン（Ｓｉｇｍａ）でＯ／Ｎコーティングする。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ＋３％スクロース＋１％ＢＳＡ、ｐＨ７．６８（ブロッキング緩衝液）で１時間室温にてブロッキングする。１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４（Ｓｉｇｍａ）の最終濃度を含有する試料の３倍系列希釈を調製し、プレートに２連で添加し、３７℃で３０分間、振盪機においてインキュベートする。Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０と抗原的に同様）に対して惹起された、プールされたヒツジ抗血清（ＮＩＢＳＣ  ｃａｔ＃１１／１１０）から精製されたビオチン化ＩｇＧを添加し、３７℃で３０分間、振盪機においてさらにインキュベートする。次に、プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄し、洗浄緩衝液中のストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ＫＰＬ）で、３７℃で３０分間、振盪機においてインキュベートする。プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄し、ＤＥＡ緩衝液ホスファターゼ基質（ＫＰＬ）における１ｍｇ／ｍｌ  ｐ−ニトロフェニルホスフェートｐＮＰＰ（Ｓｉｇｍａ）を使用して発色する。暗所での４０〜５０分間のインキュベーション後に、ＩｎｆｉｎｉｔｅＴＭ  ２００  ＰＲＯプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を使用して４０５ｎｍにおいてプレートを読み取る。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータを解析する。
【０２１０】
赤血球凝集阻害アッセイ
赤血球凝集阻害アッセイ（ＨＡＩ）は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９（ＩＲＲ）に対して惹起されたフェレット抗血清ＦＲ−３５９およびニワトリ赤血球の０．７５％懸濁液（Ｌａｍｐｉｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を使用して行われる。
【０２１１】
赤血球凝集阻害アッセイ（ＨＡＩ）は、Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａに記載されている通りに行われる。Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９（ＩＲＲ）に対して惹起されたフェレット抗血清ＦＲ−３５９およびリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）において調製されたニワトリ赤血球の０．７５％懸濁液（Ｌａｍｐｉｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を使用する。
【０２１２】
スクロース密度勾配分離
遠心分離による限外濾過（３００ｋＤ  ＭＷＣＯを有するＶｉｖａｓｐｉｎ  ２０、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ−Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により、４０ｍＬの収集された培地をほぼ１６倍に濃縮し、ウイルスを精製する。０．５％モルモット赤血球細胞（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による赤血球凝集アッセイを行って、最大のビリオン含量を有する画分を同定し、続いてこれをプールする。製造者の指示に従ってＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、プールされた画分のタンパク質含量を決定する。
【０２１３】
逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）
精製されたビリオンをＨＰＬＣにより解析する。同一方法を使用して調製された、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９試薬（ＮＩＢＳＣ  ｃａｔ＃０９／１４６および０９／１７４）に由来する精製ＨＡ１（ＨＡ成熟開裂断片）を使用して、ＨＡ１濃度を定量化する。
【０２１４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＰＮＧａｓｅＦ脱グリコシル化アッセイ
プールされたウイルス含有画分から得た等容量を、軽微な改変を伴う参考文献３のプロトコールに従って脱グリコシル化する。４〜１２％Ｎｕ−ＰＡＧＥプレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して試料を分離し、ＳＹＰＲＯ−Ｒｕｂｙ染色（Ｓｉｇｍａ）を使用して室温で振盪することにより一晩染色し、１０％メタノールにおいて３０分間室温で振盪することにより脱染する。Ｃｈｅｍｉｄｏｃ  ＸＲＳ  Ｉｍａｇｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を使用してゲルをスキャンし、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して解析する。
【０２１５】
結果
３種の最適化されたバックボーンは、ＭＤＣＫ細胞培養における成長およびＨＡ収量が、現在のワクチンシードウイルスよりも優れる
インフルエンザワクチンを製造するためのシードウイルスとして卵由来高度成長リアソータントを使用することの限界を克服するために、３種のＭＤＣＫ細胞最適化バックボーン（ＰＲ８−Ｘ、＃１９および＃２１）を開発する。ＰＲ８Ｘは、細胞適応ＰＲ８Ｘ株に由来する全バックボーンセグメントを含有する。＃１９バックボーンは、細胞適応１０５ｐ３０株に由来するＰＢ１、ＰＢ２およびＮＰならびにＰＲ８Ｘに由来する残りのバックボーンセグメントを含有する。＃２１バックボーンは、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９様ＰＢ１およびＰＲ８Ｘに由来する残りのバックボーンセグメントを含有する。図１は、これら３種の最適化されたバックボーン（ＰＲ８Ｘ、＃１９および＃２１）およびＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０  ＨＡ／ＮＡセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスと、ＷＴウイルスＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０のＨＡ収量（図１Ａおよび図１Ｂ）および成長（図１Ｃ）を比較する、３回の独立した実験から集められたデータを示す。全リアソータントインフルエンザウイルスは、ＷＴ  Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０ウイルスと比べてより優れた性能を示す。＃２１バックボーンを有するウイルスは、ＥＬＩＳＡによる最高のＨＡ収量増加を生じ（野生型より７．５倍大きい、Ｐ＜０．００１）、最高の赤血球凝集（ＨＡ）（ほぼ１０倍大きい、Ｐ＜０．００１）、ウイルス価（ＷＴよりもほぼ５０倍大きい、Ｐ＜０．０５）を有する。
【０２１６】
リアソータントインフルエンザＢウイルスの成長特徴
リアソータントインフルエンザＢウイルスは、逆遺伝学により産生され、これは、様々なインフルエンザ株に由来するＨＡおよびＮＡタンパク質ならびにＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８および／またはＢ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０に由来する他のウイルスセグメントを含有する。対照として、対応する野生型インフルエンザＢ株を使用する。これらのウイルスを孵化ニワトリ卵またはＭＤＣＫ細胞のいずれかにおいて培養する。次のインフルエンザＢ株を使用する：
【０２１７】
【表１】
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結果は、リアソータントウイルス＃２、＃９、＃３０、＃３１、＃３２、＃３３、＃３４および＃３５が、対応する野生型株と等しく良好に、あるいはさらにはより良く培養宿主において成長することを示す（図２および図３を参照）。これらの株の大部分は、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８に由来するＮＰセグメントを含み、一部（特に、最も良く成長した株）は、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８に由来するＰＢ２セグメントをさらに含有する。これらのウイルスは全て、７：１、６：２、４：４、３：４または１：７の比で、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株およびＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株に由来するウイルスセグメントも含有する。
【０２１８】
細胞適応株に由来する末端領域を有するキメラＨＡおよびＮＡセグメント
ＰＲ８Ｘおよび１０５ｐ３０に由来するＨＡ（ＮＣＲ、シグナルペプチド、膜貫通および細胞質ドメイン）およびＮＡ（ＮＣＲ、細胞質および膜貫通ドメイン）に由来する非抗原性末端領域を、それぞれＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０  ＨＡおよびＮＡセグメントの外部ドメインと組み合わせた、キメラＨＡおよびＮＡセグメントを構築する。図４は、ＨＡ（パネルＡ、Ｂ）およびＮＡ（パネルＣ、Ｄ）の末端領域の構築物および配列アラインメントの図表を示す。
【０２１９】
ＰＲ８Ｘ（ｔｅｒｍ）ＨＡおよびＮＡ構築物は、ＰＲ８ＸバックボーンによりＨＡ収量を有意に増強する
Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０（Ｈ１Ｎ１）ｗｔ  ＨＡおよびＮＡセグメント、またはＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０に由来する外部ドメインおよびＰＲ８Ｘに由来する他のドメイン（ＰＲ８Ｘ（ｔｅｒｍ））を含むキメラＨＡおよびＮＡセグメントのいずれかと組み合わせたＰＲ８Ｘバックボーンを含有する、リアソータントインフルエンザウイルスをレスキューする。異なるレスキューウイルスの成長およびＨＡ収量を比較する。
【０２２０】
ＨＡ  ＥＬＩＳＡによって測定されるＨＡ収量（図５Ａ）は、ＰＲ８Ｘ（ｔｅｒｍ）ＨＡおよびＮＡセグメントを有するウイルスが、ＷＴ  ＨＡおよびＮＡセグメントを有するウイルスよりも４倍高い（Ｐ＜０．０１）。ＰＲ８Ｘ（ｔｅｒｍ）ＨＡセグメントおよびＷＴ  ＮＡセグメントを有するウイルスは、ＷＴ  ＨＡおよびＮＡを有するウイルスと比較して、ＨＡの３倍増加を生じる（Ｐ＜０．０５）。ＰＲ８Ｘ（ｔｅｒｍ）ＨＡおよびＮＡセグメントを有するウイルスは、ＷＴ  ＨＡおよびＮＡセグメントを有するウイルスよりも２倍高いＨＡ力価（Ｐ＜０．０５）および４倍高いウイルス価を有する（図５Ｂ、図５Ｃ）。全体的に見て、これらのデータは、キメラＰＲ８Ｘ（ｔｅｒｍ）ＨＡおよびＮＡセグメントを有するウイルスが、キメラＰＲ８Ｘ（ｔｅｒｍ）ＨＡまたはＮＡセグメントのみを含有するウイルスよりも多いＨＡを生じることを示す。
【０２２１】
キメラＨＡおよびＮＡ構築物は、全３種の最適化されたバックボーンによりＨＡ収量を増強する
次に、本発明者らは、ＰＲ８Ｘ（ｔｅｒｍ）または１０５ｐ３０（ｔｅｒｍ）ＨＡ／ＮＡセグメントが、全３種の最適化されたバックボーンにおける結果として生じるウイルスの成長およびＨＡ収量を増強し得るか検査した（図１Ａ）。ＥＬＩＳＡによって測定され、ＷＴ  ＨＡおよびＮＡセグメントの収量に対して正規化されるＨＡ収量は、ＰＲ８Ｘ（ｔｅｒｍ）ＨＡおよびＮＡセグメントによりほぼ４倍増加し、ＰＲ８Ｘバックボーンを使用した１０５（ｔｅｒｍ）ＨＡおよびＮＡセグメントによりほぼ５倍増加する（Ｐ＜０．０５）（図６Ａ）。ＨＡ収量増加は、ＰＲ８Ｘ（ｔｅｒｍ）および１０５（ｔｅｒｍ）ＨＡおよびＮＡ構築物を使用したＨＡ力価およびウイルス価の増加と相関する（図６Ｄ、図６Ｇ）。＃１９バックボーンにより、ＨＡ収量は、ＷＴ  ＨＡおよびＮＡセグメントを有するウイルスよりも、ＰＲ８Ｘ（ｔｅｒｍ）ＨＡおよびＮＡセグメントによりほぼ２．５倍高く（Ｐ＜０．０５）、１０５（ｔｅｒｍ）ＨＡおよびＮＡセグメントによりほぼ３倍高い（Ｐ＜０．０５）（図６Ｂ）。ＨＡ収量増加は、ウイルス価の増加ともＨＡ力価の増加とも関連しない（図６Ｅ、図６Ｈ）。
【０２２２】
＃２１バックボーンを使用する場合、本発明者らは、ＷＴ  ＨＡおよびＮＡセグメントを含有するウイルスを上回る、ＰＲ８Ｘ（ｔｅｒｍ）および１０５（ｔｅｒｍ）ＨＡおよびＮＡセグメントによる、それぞれほぼ２．５倍（Ｐ＜０．０１）およびほぼ３倍（Ｐ＜０．０１）のＨＡ収量、ＨＡ力価（２倍（Ｐ＜０．０５））およびウイルス価における有意な増加を見出す（図６Ｃ、図６Ｆ、図６Ｉ）。全体的に見て、これらのデータは、細胞適応株に由来する末端領域を有するキメラＨＡおよびＮＡセグメントの使用が、使用したバックボーンに依存せずＨＡ収量を増加させることを示す。
【０２２３】
本発明者らは、＃２１バックボーン、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９に由来するＨＡおよびＮＡ外部ドメインならびにＷＴ  Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９、ＰＲ８Ｘまたは１０５ｐ３０に由来する末端領域を含むリアソータントインフルエンザウイルスを調製することにより、これらの結果が、特異的なワクチン株に限定されないことを確認する。結果（図７）は、キメラＨＡまたはＮＡセグメントを含むリアソータントが、より良いＨＡ収量をもたらすことを示す。
【０２２４】
ＷＴまたはキメラＨＡおよびＮＡセグメントを有する全バックボーンから回収されたウイルスの配列解析は、それとウイルスレスキューにおいて使用したプラスミドとの配列同一性を確認した。キメラＨＡおよびＮＡセグメントを有するウイルスが、その正確な抗原性を維持することを確認するために、ＷＴ  Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／１０と抗原的に同様であるＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９に対して惹起されたフェレット抗血清を使用して赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）アッセイを行う。表２は、予想される通り、キメラＨＡおよびＮＡセグメントを有するウイルスが、ＷＴ  ＨＡおよびＮＡセグメントを含有する参照抗原と抗原的に区別不能である（ＨＡＩアッセイにおいて２倍以内）ことを示す。
【０２２５】
【表２】
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キメラＨＡ／ＮＡセグメントを含有するウイルスの増加したＨＡ含量
未精製の細胞培養上清を使用して観察される結果が、精製ウイルスのＨＡ収量を反映することをさらに検証するために、本発明者らは、最高量のＨＡを産生する、＃２１バックボーンに由来するウイルスの追加的な特徴付けを行った（図１）。この目的のため、これらのウイルスのラージスケール増幅（６０ｍＬ）を行い、方法に記載されているスクロース密度勾配遠心分離を使用してウイルスを精製する。ＨＰＬＣを使用してＨＡ１収量（本来の培養容量６０ｍＬに対し正規化）を決定する。ｗｔ  ＨＡ／ＮＡセグメントを有するウイルスと比較して、キメラＰＲ８Ｘ（ｔｅｒｍ）および１０５ｐ３０（ｔｅｒｍ）ＨＡ／ＮＡセグメントを有するウイルスは、それぞれＨＡ収量のほぼ１．８倍増加（１１．３ｕｇ／ｍＬ  ｖｓ  ６．２ｕｇ／ｍＬ）およびほぼ２．２倍増加（１３．６ｕｇ／ｍＬ  ｖｓ  ６．２ｕｇ／ｍＬ）を有する（図８Ａ）。
【０２２６】
これらの精製された調製物におけるＨＡ含量は、ゲルデンシトメトリー、またはＨＡのＨＰＬＣ測定およびＢＣＡアッセイによる総タンパク質測定の組合せのいずれかを使用することにより決定される。ゲルデンシトメトリー決定のため、プールされた画分をＰＮＧａｓｅＦで処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、続いてＳＹＰＲＯ−Ｒｕｂｙで染色して、デンシトメトリーによるＮＰ、ＨＡ１、ＭおよびＨＡ２の正確な決定を可能にする。図８Ｂは、染色したゲルにおけるこれらのバンドの位置を示し、図８Ｃは、ＰＲ８Ｘ（ｔｅｒｍ）および１０５（ｔｅｒｍ）ＨＡおよびＮＡセグメントを有するウイルスが、ＷＴ  ＨＡおよびＮＡセグメントを含有するウイルスと比較して、それぞれ１４％（Ｐ＜０．０５）および３２％（Ｐ＜０．０１）の増加を有したことを示す。
【０２２７】
ＨＰＬＣデータを使用してＨＡ１含量を定量化するために、ＨＰＬＣによって得られるＨＡ１値（図８Ａ）は、プールされた画分の総タンパク質含量（ＢＣＡアッセイによって測定）の割合として表す。図８Ｃにおける結果は、ＰＲ８Ｘ（ｔｅｒｍ）および１０５（ｔｅｒｍ）ＨＡおよびＮＡセグメントを有するウイルスが、ＷＴ  ＨＡおよびＮＡ含有ウイルスと比較して、それぞれ２９％および４６％の増加したＨＡ含量を有したことを示す。
【０２２８】
結論として、これらのデータは、ウイルスレスキューのための３種の最適化されたバックボーンの生産性が、細胞適応株に由来するセグメントによりＨＡおよびＮＡセグメントの末端領域を改変することにより増強され得ることを示す。
【０２２９】
本発明が、ほんの一例として記載されており、本発明の範囲および精神内にとどまりつつ改変を行ってよいことが理解できよう。
【０２３０】
【化１】
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【０２３１】
【化２】
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【０２３２】
【化３】
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【０２３３】
【化４】
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【０２３４】
【化５】
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【０２３５】
【化６】
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【０２３６】
【化７】
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【０２３７】
【化８】
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【０２３８】
【化９】
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【０２３９】
【化１０】
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【０２４０】
【化１１】
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【０２４１】
【化１２】
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【０２４２】
【化１３】
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【０２４３】
【化１４】
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【０２４４】
【化１５】
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【０２４５】
【化１６】
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【０２４６】
【化１７】
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【０２４７】
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【０２４８】
【化１９】
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【０２５０】
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【０２５１】
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【０２５２】
【化２３】
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【０２５３】
【化２４】
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【０２５４】
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【０２５５】
【化２６】
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【０２５６】
【化２７】
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【０２５７】
【化２８】
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【０２５８】
【化２９】
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【０２５９】
【化３０】
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【０２６０】
【化３１】
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【０２６１】
【化３２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｃ】
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【図６】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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