(57)【要約】  本発明は、キイチゴ属の種の植物の油性抽出物並びに医療及び美容分野におけるその使用に関する。より詳細には、本発明は、キイチゴ属の種の油性抽出物の使用、並びに皮膚及び粘膜の病態並びに皮膚病変の局所治療に関する。本発明はさらに、このような抽出物を、室温において油中で抽出することにより得る方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キイチゴ属（Ｒｕｂｕｓ）の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）の植物の油性抽出物であって、前記植物のポリフェノール系植物複合体を含み、前記ポリフェノール系植物複合体は、コーヒー酸、ラムネチン、ケルセチン、ケンペロールを含む、上記油性抽出物。
【請求項２】
前記ポリフェノール系植物複合体が、少なくとも０．２％（ｗ／ｗ）の濃度のコーヒー酸、少なくとも０．３％（ｗ／ｗ）の濃度のラムネチン、少なくとも０．３％（ｗ／ｗ）の濃度のケルセチン、及び少なくとも０．２％（ｗ／ｗ）の濃度のケンペロールを含み、前記パーセンテージは抽出物の重量に対する各化合物の重量パーセンテージである、請求項１に記載の抽出物。
【請求項３】
キイチゴ属の種が、ルーバス・アルミフォリウス（Ｒｕｂｕｓ  Ｕｌｍｉｆｏｌｉｕｓ）、ヨーロッパキイチゴ（Ｒｕｂｕｓ  Ｉｄａｅｕｓ）、ルーバス・カエシウス（Ｒｕｂｕｓ  ｃａｅｓｉｕｓ）、ルーバス・サクサティリス（Ｒｕｂｕｓ  ｓａｘａｔｉｌｌｉｓ）からなる群から選択され、好ましくはルーバス・アルミフォリウス（Ｒｕｂｕｓ  Ｕｌｍｉｆｏｌｉｕｓ）の群から選択され、好ましくはルーバス・アルミフォリウス・フルティコサス・スコット（Ｒｕｂｕｓ  ｕｌｍｉｆｏｌｉｕｓ  ｆｒｕｔｔｉｃｏｓｕｓ  ｓｃｈｏｔｔ）である、請求項１又は２項に記載の抽出物。
【請求項４】
前記油が、アーモンド油、ホホバ油、ヒマワリ油、ヴァージンオリーブ油、エクストラヴァージンオリーブ油、好ましくは、ヴァージンオリーブ油及びエクストラヴァージンオリーブ油からなる植物油の群から選択される、請求項１から３までのいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項５】
１種又は複数の賦形剤及び／又は薬学的に許容される補助剤と共に、活性成分としての請求項１から４までのいずれか一項に記載のキイチゴ属の種の植物油中抽出物を含む又はそれからなる医薬組成物。
【請求項６】
局所使用のための、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
キイチゴ属の種の植物の油性抽出物を製造する方法であって、キイチゴ属の種の植物の乾燥部分を、１８から３２℃まで、好ましくは２２から２８℃まで変動する温度、より好ましくは２５℃において油中でインキュベートすることにより抽出が行われることを特徴とする、上記方法。
【請求項８】
キイチゴ属の種が、ルーバス・アルミフォリウス（Ｒｕｂｕｓ  Ｕｌｍｉｆｏｌｉｕｓ）、ヨーロッパキイチゴ（Ｒｕｂｕｓ  Ｉｄａｅｕｓ）、ルーバス・カエシウス（Ｒｕｂｕｓ  ｃａｅｓｉｕｓ）、ルーバス・サクサティリス（Ｒｕｂｕｓ  ｓａｘａｔｉｌｌｉｓ）からなる群から選択され、好ましくはルーバス・アルミフォリウス（Ｒｕｂｕｓ  Ｕｌｍｉｆｏｌｉｕｓ）の群から選択され、好ましくはルーバス・アルミフォリウス・フルティコサス・スコット（Ｒｕｂｕｓ  ｕｌｍｉｆｏｌｉｕｓ  ｆｒｕｔｔｉｃｏｓｕｓ  ｓｃｈｏｔｔ）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
油が、アーモンド油、ホホバ油、ヒマワリ油、ヴァージンオリーブ油、エクストラヴァージンオリーブ油、好ましくは、ヴァージンオリーブ油及びエクストラヴァージンオリーブ油からなる群から選択される、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
キイチゴ属の種の植物が、春から夏の季節に収穫されたものである、請求項７から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
皮膚及び粘膜の障害又は病態の治療において使用するための、請求項１から４までのいずれか一項に記載の抽出物又は請求項５又は６に記載の組成物。
【請求項１２】
前記皮膚又は粘膜の障害又は病態が、熱傷、擦り傷、擦過傷、亀裂、静脈瘤性潰瘍、放射線皮膚炎、褥瘡、遅鈍型触痛、軽い出血、鼻血、外傷性創傷、紅皮症状態、湿疹、凍瘡、異汗症、そう痒、糖尿病性そう痒、昆虫咬傷、疱疹性及び紅斑性病変、アトピー性皮膚炎や乾癬のような皮膚炎、皮膚症、酒さ性及び尋常性ざ瘡、毛嚢炎及びせつ腫症、レーザー照射後紅斑、おむつかぶれ及び日焼け、口腔内潰瘍、扁平苔癬からなる群から選択され、好ましくは熱傷であり、手術創の変化における補助剤としてである、請求項１１に記載の使用のための、請求項１から４までのいずれか一項に記載の抽出物又は請求項５又は６に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１から４までのいずれか一項に記載の抽出物を含む化粧品組成物。
【請求項１４】
請求項１から４までのいずれか一項に記載の抽出物又は請求項１２に記載の化粧品組成物の、皮膚用化粧品としての、たとえば、老化防止用の皮膚用化粧品、抗酸化用の皮膚用化粧品としての又は皮膚欠陥、たとえば、しみ、瘢痕、セルライト及び皮膚線条などに対する、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キイチゴ属（Ｒｕｂｕｓ）の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）の植物の油性抽出物、並びに医療及び美容分野におけるその使用に関する。より詳細には、本発明は、キイチゴ属の種の植物の油性抽出物の使用、並びに皮膚及び粘膜の病態、及び皮膚病変の局所治療に関する。本発明はさらに、このような抽出物を、室温において油中で抽出することにより得る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
よく知られているように、植物抽出物をベースとする多くの配合物が、その皮膚保護作用、並びに瘢痕化治癒、抗炎症、抗菌、乾燥防止、及び緩和特性のために、様々な拡張度及び性質の皮膚病変の治療に現在使用されている。たとえば、プロポリスをベースとするクリームは、創傷又はただれの場合において組織再生を刺激し、コラーゲンの合成にとって重要であるビタミンＣの吸収を促進し得ることから、現在商品化されている。
【０００３】
２００５年に、Ｍａｈａ  Ｆ．  Ｅｌ  Ｇｏｗｅｎｉら（２００５）によって、バイオフラボノイドのケルセチンが、肥厚性瘢痕の治療において予防的及び治癒的両方の効果を有することが実証されている。引き続いて、Ｉｐｅｋ  Ｓｕｎｔａｒら（２００９）が行った研究「ルーバス・サンクタス・スクレバー（Ｒｕｂｕｓ  Ｓａｎｃｔｕｓ  Ｓｃｈｒｅｂｅｒ）（バラ科）の創傷治癒活性：動物モデルにおける前臨床研究（Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｕｂｕｓ  Ｓａｎｃｔｕｓ  Ｓｃｈｒｅｂｅｒ  （Ｒｏｓａｃｅｅ）：Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ）」により、Ｒｕｂｕｓ  Ｓａｎｃｔｕｓ種に属する植物の気中部分から得た抽出物によって創傷の治癒がどのようにもたらされ得るのかが提示された。しかし、このような抽出物は、よく知られているとおり、毒性及び費用の両方の点から一連の問題をはらんでいる、溶媒（ｎ−ヘキサン、メタノール、クロロホルム、酢酸エチルなど）での抽出によって得られている。たとえば、Ｅｓｒａ  Ｓａｒｉｂｕｒｕｎら（Ｅｓｒａ  Ｓａｒｉｂｕｒｕｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第７５巻、４号、２０１０年、Ｃ３２８〜３３５頁）及びＳｉｒｉｗｏｈａｒｎら（Ｓｉｒｉｗｏｈａｒｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第６９巻、４号、２００４年、２３３〜２４０頁）の発表が知られており、水／メタノールの含水アルコール溶液、又はクロロホルムやジクロロメタンなどの有機溶媒の使用による、キイチゴ属の種の抽出プロセスが述べられている。上で言及した抽出方法によって得た抽出物は、したがって、健康に有害である有機溶媒の残留物を含有する可能性がある。さらに、様々な溶媒の使用によって、使用した溶媒に対する各成分の異なる親和性に基づき、特定の区分の成分が植物から抽出可能になることを考慮しなければならない。したがって、有機溶媒を使用、又は様々な有機溶媒を順次使用、たとえば、２種若しくは３種の有機溶媒を順次使用すれば、植物複合体（ｐｈｙｔｏｃｏｍｐｌｅｘ）のすべての活性物質又は補助物質が存在するとは限らない最終抽出物を生じかねない。
【０００４】
特許ＩＴ０００１２６５６４９は、高温の使用及び新鮮な芽の使用を特徴とする、キイチゴ属植物の油中での抽出プロセスを記載している。しかし、この先行技術のプロセス条件では、ポリフェノール性の成分は、取るに足らない最小限のパーセンテージしか溶媒に移らなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記を踏まえると、既知の方法の欠点を克服する新たな方法を使用できることが必要なことは明らかと思われる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
皮膚及び粘膜病変の治療に好適な、高いポリフェノール含有量を特徴とするキイチゴ属植物の油性抽出物を得ることを目指す、本発明による解決策は、これに関連する。
【０００７】
さらに、抽出が、乾燥植物サンプルから出発する冷油抽出であることを特徴とする、前記抽出物を得る方法を見出した。
【０００８】
本発明の主題をなす抽出物では、抗生物質及び／又はコルチゾンをベースとする既存の皮膚科学及び瘢痕化治癒療法と比べて、目に見えてより顕著、有効、及び急速な有益な治療効果を得ることが可能になる。実際に、前記抽出物は、顕著な収れん、消炎、消毒、止血、及び緩和活性を有するが、これは、市場にすでに存在する製品に起因する単一の溶液に含めるのは難しい。
【０００９】
本発明による抽出物の作用は、一般に、化学的、細菌性、機械的、及び刺激性作用因に対する組織タンパク質の沈着及び変質のために保護性の角皮が形成されることにより、皮膚及び粘膜の表面に現れる。これにより、炎症過程において実際に起こるように組織からの水の除去が激しいほど前記組織がより浸潤される、分泌過程が短縮される。特に、熱傷において、本発明による抽出物は、疼痛を緩和し、血清の損失を防ぎ、創傷を細菌の侵入から保護する。抽出物はさらに、損傷組織の完全な回復を伴い、瘢痕性陥凹のない、優秀な組織瘢痕化治癒を促進して、新たに形成された組織に優れた弾性を与える。こうした特殊な特性により、本発明の主題は、このような病態において伝統的に使用される製品と比べて革新的な解決策を提案する。
【００１０】
さらに、有機溶媒を使用して取得したキイチゴ属抽出物とは異なり、本発明による抽出物は、油、特に天然植物油を使用して得られる。本発明による抽出プロセスは、親油性又は親水性どちらの有機溶媒を使用することも想定しない。したがって、本発明による抽出物は、健康に有害である溶媒残留物を含有しない。
【００１１】
本発明による抽出物のさらなる利点は、本発明による抽出プロセスが熱を加えずに実施されるので、抽出物が植物の易熱性成分の分解産物を含有しないということである。実際に、活性物質の分解は、抽出物の抗酸化力の損失又は低下につながることになる。
【００１２】
本記述の例において報告する分析結果によれば、本発明による抽出物が、たとえば、コーヒー酸、ケルセチン、ラムネチン、及びケンペロールなどの植物複合体のすべての活性ポリフェノール成分をかなりの量で含有することも、認めることができる。
【００１３】
対照研究が不足している臨床的証拠からは、本発明による抽出物を使用して得られた臨床結果が、抽出物に含まれ、また抽出にかけられた植物種由来である、抗酸化物質の量及び／又は種類と、単独且つ限定的には相互関係を明らかにできないことがわかる。対照研究が不足している臨床結果は、抽出物に含まれている植物複合体と抽出に使用した油との間に備わった一連の相乗効果、並びに抽出物を含有する医薬品形態の残りの成分とのさらなる相乗効果による可能性もある。
【００１４】
高温及び新鮮な芽の使用を特徴とする、上で言及したイタリア国特許ＩＴ０００１２６５６４９に報告されている抽出プロセスとは異なり、乾燥薬及び低温を使用する本発明による抽出物の製造方法では、皮膚科学分野において活性及び潜在的可能性を有する一連の物質を確かに含む、特に、フラボン、フラボノール、及びフラボノイドの豊富な、非常に高濃度のポリフェノール画分を得ることが可能になる。本特許出願の例２に示すとおり、本発明の方法に従って得た抽出物中のポリフェノールの含有量を、イタリア国特許ＩＴ０００１２６５６４９に記載のプロセスによって得たものと比較した。本発明による抽出物のフェノール成分は、使用した分析機器によって検出されなかったほどに前記フェノール成分がほとんど実在しない、上で言及した特許の成分よりはるかに多かった。さらに、先行技術で使用された抽出条件では、たとえば、コーヒー酸、ラムネチン、ケルセチン、及びケンペロールなどのすべての活性物質を抽出することができない可能性がある。本発明による抽出物では、コーヒー酸、ラムネチン、ケルセチン、及びケンペロールを含むポリフェノール複合体の有意且つ有効な量の存在をはっきりと検出することが可能である。特に、本発明による抽出物は、少なくとも０．２％（ｗ／ｗ）の濃度のコーヒー酸、少なくとも０．３％（ｗ／ｗ）の濃度のラムネチン、少なくとも０．３％（ｗ／ｗ）の濃度のケルセチン、及び少なくとも０．２％（ｗ／ｗ）の濃度のケンペロールを含有する。
【００１５】
さらに、同じ含有量の抽出物について、本発明による生成物は、イタリア国特許ＩＴ０００１２６５６４９に記載の先行技術の組成物と比べて、皮膚及び粘膜の障害又は病態の治療により有効であり、皮膚の再生及び迅速な治癒を促進するより顕著な作用を示すことが認められた。
【００１６】
最後に、市販品として入手可能であり、本発明による抽出物と同じ用途に使用されるクリームとの比較研究では、本発明による抽出物のはるかに高い有効性が示されている。
【００１７】
したがって、本発明の特定の目的は、キイチゴ属の種の植物の油性抽出物であって、前記植物のポリフェノール系植物複合体を含み、前記ポリフェノール系植物複合体は、コーヒー酸、ラムネチン、ケルセチン、ケンペロールを含む、油性抽出物である。特に、本発明による抽出物は、少なくとも０．２％（ｗ／ｗ）の濃度のコーヒー酸、少なくとも０．３％（ｗ／ｗ）の濃度のラムネチン、少なくとも０．３％（ｗ／ｗ）の濃度のケルセチン、及び少なくとも０．２％（ｗ／ｗ）の濃度のケンペロールを含有するものでよく、前記パーセンテージは、抽出物の重量に対する各化合物の重量パーセンテージである。実際には、本発明による抽出物は、ラムネチンなどのフラボノイド、ケルセチン、ケンペロールを含むフラボノール、３−ヒドロキシフラバノン又は２，３−ジヒドロフラボノールなどのフラバノノールを含有する。本発明による抽出物の製造方法によって、植物複合体それ自体に存在する、結果として完成した医薬品形態に存在する相乗効果を低減させることになる中間プロセスを必要とすることなく、活性成分が存在する植物の植物複合体を抽出することが可能になる。
【００１８】
キイチゴ属の種の植物は、好ましくはルーバス・アルミフォリウス（Ｒｕｂｕｓ  Ｕｌｍｉｆｏｌｉｕｓ）、ヨーロッパキイチゴ（Ｒｕｂｕｓ  Ｉｄａｅｕｓ）、ルーバス・カエシウス（Ｒｕｂｕｓ  ｃａｅｓｉｕｓ）、ルーバス・サクサティリス（Ｒｕｂｕｓ  ｓａｘａｔｉｌｌｉｓ）からなる群から選択され、好ましくはルーバス・アルミフォリウスの群から選択され、好ましくはルーバス・アルミフォリウス・フルティコサス・スコット（Ｒｕｂｕｓ  ｕｌｍｉｆｏｌｉｕｓ  ｆｒｕｔｔｉｃｏｓｕｓ  ｓｃｈｏｔｔ）である。
【００１９】
さらに、本発明によれば、油は、アーモンド油、ホホバ油、ヒマワリ油、ヴァージンオリーブ油、及びエクストラヴァージンオリーブ油、好ましくは、ヴァージンオリーブ油及びエクストラヴァージンオリーブ油からなる群から選択される、多価不飽和脂肪酸成分の際立った植物油からなる群から選択される。前記植物油は、たとえば、リノレン酸、γリノレン酸などの、際立った多価不飽和脂肪酸成分を特徴とする。
【００２０】
本発明はさらに、１種又は複数の薬学的に許容される賦形剤及び／又は補助剤と共に、活性成分としての上で定義したキイチゴ属の植物の油性抽出物を含む又はそれからなる医薬組成物に関する。本発明による医薬組成物は、局所使用のための医薬組成物であることが好ましい。
【００２１】
本発明の別の態様は、キイチゴ属の植物の油性抽出物を製造する方法であって、キイチゴ属の種の植物の乾燥部分を、１８から３２℃まで、好ましくは２２から２８℃まで変動する温度、より好ましくは２５℃において油中でインキュベートすることにより抽出が行われることを特徴とする方法である。抽出において植物のどの部分を使用してもよいが、しかし、葉及び芽が好ましく、芽（若い苗条）が好ましい。
【００２２】
特に、前記方法において、キイチゴ属の種は、ルーバス・アルミフォリウス、ヨーロッパキイチゴ、ルーバス・カエシウス、ルーバス・サクサティリスからなる群から選択され、好ましくはルーバス・アルミフォリウスの群から選択され、好ましくはルーバス・アルミフォリウス・フルティコサス・スコットである。
【００２３】
好ましくは、前記方法において、油は、アーモンド油、ホホバ油、ヒマワリ油、ヴァージンオリーブ油、及びエクストラヴァージンオリーブ油、好ましくは、ヴァージンオリーブ油及びエクストラヴァージンオリーブ油からなる群から選択される、多価不飽和脂肪酸成分の際立った植物油からなる群から選択される。前記植物油は、たとえば、リノレン酸、γリノレン酸などの、際立った多価不飽和脂肪酸成分を特徴とする。
【００２４】
さらに、本発明によれば、前述の方法において、キイチゴ属の種の植物は、春から夏の季節に収穫されたものである。
【００２５】
本発明のさらなる態様は、皮膚又は粘膜の障害又は病態の治療において使用するための、前に定義した抽出物又は医薬組成物である。皮膚又は粘膜の障害又は病態としては、たとえば、熱傷、擦り傷（ｇｒａｚｅ）、擦過傷（ａｂｒａｓｉｏｎ）、亀裂、静脈瘤性潰瘍、放射線皮膚炎、褥瘡、遅鈍型触痛（ｔｏｒｐｉｄ  ｓｏｒｅ）、軽い出血、鼻血、外傷性創傷、紅皮症状態、湿疹、凍瘡、異汗症、そう痒、糖尿病性そう痒、昆虫咬傷、疱疹性及び紅斑性病変、皮膚炎、たとえば、乾癬、アトピー性皮膚炎、皮膚症、酒さ性及び尋常性ざ瘡、毛嚢炎及びせつ腫症、レーザー照射後紅斑、おむつかぶれ及び日焼け（ｓｕｎｒａｓｈ）、口腔内潰瘍、扁平苔癬、好ましくは熱傷が挙げられ、手術創の変化における補助剤としてである。
【００２６】
本発明による抽出物及び医薬組成物は、医療及び獣医学の分野において、すなわち、ヒト及び動物両方の治療に使用することができる。
【００２７】
前記抽出物及び／又は前記組成物は、治療する身体の傷害部分に直接、１日１回、数時間適用してもよく、又は絆創膏、ガーゼ、及び同様の材料で塞ぐことによって、１日２〜３回、３０〜６０分間適用してもよい。
【００２８】
好ましい実施形態では、本発明による医薬組成物は、以下に列挙する量の次の原材料を含む：（保存用抗菌剤としての）安息香酸ナトリウム１ｇ、（保存用酸化防止剤としての）ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）０．１ｇ、１２０〜３５０ｇ、好ましくは２００〜３００ｇ、なおさらに好ましくは２５０ｇのラノリン、５０〜１５０ｇ、好ましくは６５〜１２０、なおさらに好ましくは８０ｇの蝋、７５〜３５０、好ましくは１２０〜２５０、なおさらに好ましくは２１９ｇの水を含み、ＲＵＢ油性抽出物の量は、１００〜８００、好ましくは２００〜５００、より好ましくは４５０ｇである。
【００２９】
本発明はさらに、上で定義した抽出物を含む化粧品組成物に関する。さらに、本発明は、本発明による抽出物及び上で定義した化粧品組成物の、皮膚用化粧品としてのたとえば、老化防止用の皮膚用化粧品、抗酸化用の皮膚用化粧品としての又は皮膚欠陥、たとえば、しみ、瘢痕、皮膚線条及びセルライトなどに対する使用に関する。
【００３０】
ここで、本発明について、その好ましい実施形態に従って、特に添付の図面の図に関して、非限定的な例示目的で記載する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】４０℃の乾燥炉中での期間に対する芽の重量変動を示すグラフである。
【図２】（乾燥薬を使用して製造された抽出物で得た）乾燥させたＯＬＥＯ−ＲＵＢサンプルで得られたクロマトグラムである。
【図３】分析条件を変更しないままとして、より高濃度の抽出物を有する製造されたサンプルで得られたクロマトグラムである。
【図４】新鮮なサンプル（新鮮薬）から得られたクロマトグラムである。
【図５】乾燥サンプル（乾燥薬）から得られたクロマトグラムである。
【図６】５回の分画にかけたサンプルの最初の分画のＨＰＬＣクロマトグラム、同じ最初の分画に関する質量スペクトル、１ｍｇ／ｍｌ（メタノール）の濃度のコーヒー酸の標準液で得られたクロマトグラムである。
【図７】５回の分画にかけたサンプルの２回目の分画のＨＰＬＣクロマトグラム、同じ２回目の分画に関する質量スペクトル、１ｍｇ／ｍｌ（メタノール）の濃度のケンペロールの標準液で得られたクロマトグラムである。
【図８】５回の分画にかけたサンプルの３回目の分画のＨＰＬＣクロマトグラム、同じ３回目の分画に関する質量スペクトル、１ｍｇ／ｍｌ（メタノール）の濃度のラムネチンの標準液で得られたクロマトグラムである。
【図９】５回の分画にかけたサンプルの４回目の分画のＨＰＬＣクロマトグラム、同じ３回目の分画に関する質量スペクトル、１ｍｇ／ｍｌ（メタノール）の濃度のケルセチンの標準液で得られたクロマトグラムである。
【図１０】５回の分画にかけたサンプルの５回目の分画のＨＰＬＣクロマトグラム、同じ５回目の分画に関する質量スペクトルである。
【図１１】生理（食塩）水のみ、市販の製品Ｃｏｎｎｅｔｔｉｖｉｎａ、及び本発明によるクリーム（ＭＶＴ  Ｓｋｉｎ  Ｃａｒｅ）で長期にわたり処置したラットにおける熱傷からの異なる時点での創傷の治癒過程の傾向を示す写真である。
【図１２】熱傷からの時間に応じた創傷の面積の変化を示すグラフである。
【図１３】熱傷からの時間に応じたＷＣＲ％値の変化を示すグラフである。
【図１４ａ】生理（食塩）水のみで長期にわたり処置したラット、及び本発明によるクリーム（ＭＶＴ  Ｓｋｉｎ  Ｃａｒｅ）で長期にわたり処置したラットからの、ヘマトキシリン及びエオシンで着色された肝臓組織の顕微鏡写真である。画像は、対物１０倍（左側の像）及び対物２０倍（右側の像）で取得した。
【図１４ｂ】生理（食塩）水のみで長期にわたり処置したラット、及び本発明によるクリーム（ＭＶＴ  Ｓｋｉｎ  Ｃａｒｅ）で長期にわたり処置したラットからの、ヘマトキシリン及びエオシンで着色された腎臓組織の顕微鏡写真である。画像は、対物５倍（左側の像）及び対物１０倍（右側の像）で取得した。
【図１５ａ】生理（食塩）水のみで集中的に処置したラット、及びＭＶＴ  Ｓｋｉｎ  Ｃａｒｅクリームで集中的に処置したラットからの、ヘマトキシリン及びエオシンで着色された肝臓組織の顕微鏡写真である。画像は、対物１０倍（左側の像）及び対物２０倍（右側の像）で取得した。
【図１５ｂ】生理（食塩）水のみで集中的に処置したラット、及び本発明によるクリーム（ＭＶＴ  Ｓｋｉｎ  Ｃａｒｅ）で長期にわたり処置したラットからの、ヘマトキシリン及びエオシンで着色された腎臓組織の顕微鏡写真である。画像は、対物１倍（左側の像）及び対物１０倍（右側の像）で取得した。
【図１６】イタリア国特許ＩＴ０００１２６５６４９に記載の方法に従って、熱を加えて得た抽出物で行ったＨＰＬＣ分析の結果を示すグラフである。
【図１７】本発明に記載の方法に従って得た抽出物で行ったＨＰＬＣ分析の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
ここで、本発明について、特にいくつかの詳細な実施形態に関して、非限定的な例示目的で記載する。
【実施例】
【００３３】
（例１）
第１部  配合物及び特徴付け
乾燥
ルーバス・アルミフォリウスの芽を、４０±５℃の通気された乾燥炉に、最低でも２４時間及び最高で４８時間、好ましくは３５時間入れておく。
【００３４】
抽出
（ＯＬＥＯ−ＲＵＢ．ＥＳＳサンプル）（すなわち、乾燥薬を使用して製造した抽出物）
乾燥炉で乾燥させた７．５ｇ（最低で４日〜最高で１０日）のルーバス・アルミフォリウスの芽を、９２．５ｇ（最低で７５ｇ〜最高で１１０ｇ）の精製オリーブ油（公式薬局方）に浸す。薬は、室温、表示としては２５℃（最低で１８℃〜最高で３２℃）で１０日間（最低で５日〜最高で１５日）、油と接触したままにする。所定の時間経過後、サンプルを濾過し、適切に貯蔵する。
【００３５】
品質検証ＯＬＥＯ−ＲＵＢ．ＥＳＳ
図２（クロマトグラムＡ）に、ＯＬＥＯ−ＲＵＢ  ＥＳＳサンプルについて得られたクロマトグラム（ＯｌｅｏＲｕｂ  Ａ）を示す。ピークＲＴの５３．２３は、まず間違いなく、抽出ステップの間にルーバス・アルミフォリウスからオリーブ油（公式薬局方）に移ったポリフェノール画分を表すものである。対象のピークを可視化するために、分析にかけるサンプルをより高濃度の抽出物（２ｇに代えて１０ｇ）で製造し、分析条件は、変更しないままとした（図３、クロマトグラムＢ）。クロマトグラムＢからわかるとおり、より高濃度の抽出物で行った分析によって、相対的に十分に分割された、５つの異なるピークを同定することが可能になった。抽出物のより高い濃度が、２５ｃｍ×直径４．６ｍｍ、５ミクロンの新たなＷａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙカラムを分析に使用したことと連動して、保持時間の約５ポイントの全体的なずれの決め手となったことも留意される。以下は、クロマトグラムＢ（１０ｇ抽出物）に関連して分析に使用した方法であるが、以前に言及したとおり、やはりＯＬＥＯ−ＲＵＢ．ＥＳＳサンプルに関連して、クロマトグラムＡを可視化する研究の最初のステップにすでに適用したものと同じものである。
・使用した機器：ＨＰＬＣ  Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ２０１０、ＬＣ−１０ＡＤｖｐポンプ、
・カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  ＲＰ１８−  ２５ｃｍ×直径４．６ミリメートル  ５ミクロン、
・移動相：水：酢酸  ９７：３（溶媒Ａ）−アセトニトリル：メタノール  ５０：５０（溶媒Ｂ）、
・クロマトグラフィー実施時間：６７分  室温、
・流量  １ｍｌ／分
【００３６】
サンプルを処理する：
最初に１０グラムのＯＬＥＯ−ＲＵＢ．ＥＳＳを秤量し、これに５０ｍｌのヘキサンを引き続いて加える。次いで、サンプルを１０分間電磁撹拌機に載せ、次いで、２０ｍｌの８０：２０  メタノール：水溶液を加えながら３回行う、分液漏斗での液体−液体抽出にかけた。次いで、抽出物をｒｏｔａｖａｐｏｒに移して乾燥させ、再水和させた後、ＨＰＬＣにおいて１ｍｌのメタノールと共に注入した。
【００３７】
新鮮薬−乾燥薬比較
乾燥プロセスが、薬中、結果的に抽出物中のポリフェノールの存在の減少をいかに決定しないかを確かめるために、新鮮薬及び乾燥薬のスクリーニングによって得られたクロマトグラムを以下で比較する。分析にかける乾燥薬のサンプルは、以下に要約する、新鮮薬に使用されるものと同じプロトコールに従って製造した。
【００３８】
サンプルは、１グラムの乾燥薬（芽）を、１０ｍｌのメタノールを含有するガラスカラムに入れ、引き続いて、室温で２〜３分間Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘを作動させて粉砕にかけることにより製造した。次いで、カラムの中身を、セラミックブフナー及び真空濾過用のフィルターを備え付けた真空のフラスコに注ぎ、次いで濾液をガラス製丸底フラスコに入れ、溶媒を完全に除去するために、ｒｏｔａｖａｐｏｒに設置し、３０〜３５℃を超えない温度で作動させる。フィルターに残存する薬のサンプルを、もう２回同じプロセスにかけ、得られる濾液を、先行の画分を含有する丸底フラスコに加える。溶媒が完全に除去されたなら、１ｍｌのメタノールに溶解し直し、ＨＰＬＣ分析を行う。使用した機器：ＨＰＬＣ  Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ２０１０、ＬＣ−１０ＡＤｖｐポンプ、カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  ＲＰ１８−  ２５ｃｍ×直径４．６ミリメートル  ５ミクロン。クロマトグラフィー実施時間  ３５分  室温、移動相（Ａ）：メタノール：水−９０：１０、（Ｂ）水：メタノール−９０：１０。
【００３９】
図で示すクロマトグラムからわかるとおり、乾燥プロセスは、新鮮薬に見出されるポリフェノール成分の存在の妨げとならない。それどころか、保持時間のわずかなずれの決め手となるとしても、多くのピークが、クロマトグラムＦ（図５）（乾燥薬）において確かにより濃縮されている。
【００４０】
ＯＬＥＯ−ＲＵＢ．ＥＳＳの定性的／定量的な特徴付け
クロマトグラムＢに示すとおりＯＬＥＯ−ＲＵＢ．ＥＳＳサンプルにおいて同定されたピークの質／量を決定するために、サンプルを５回の分画にかけた。次いで、ピークの原因である成分を定性的に同定するために、各画分をＨＰＬＣ−ＭＳ検証にかけ、同定されたなら、それぞれの標準溶液及び検量線を準備した後、定量化した。分画したピークに使用した分析条件は、次のとおりである。
・使用した機器：ＨＰＬＣ  Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ２０１０、ＬＣ−１０ＡＤｖｐポンプ、
・カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  ＲＰ１８−  ２５ｃｍ×直径４．６ミリメートル  ５ミクロン、
・移動相  水：メタノール  ９０：１０（溶媒Ａ）−メタノール：水  ９０：１０（溶媒Ｂ）、
・クロマトグラフィー実施時間：３５分  室温、
質量について：
・使用した機器：ＨＰＬＣ−ＭＳ  Ｔｈｅｒｍｏ  ＬＴＸ  ＸＬ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｉｏｎ  Ｔｒａｐ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、
・カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  ＲＰ１８−  ２５ｃｍ×直径４．６ミリメートル  ５ミクロン
・移動相  水：酢酸  ９７：３（溶媒Ａ）  アセトニトリル：メタノール  ５０：５０（溶媒Ｂ）、
・クロマトグラフィー実施時間：６７分  室温
【００４１】
ピーク５において定性的に同定された成分（イソケルセチン）（図１０）は、標準液を見出すことが可能でなかったので、同定されなかった。しかし、同時に存在するイソケルセチン二水和物と合わせてわずか４００，０００の総面積であるため、全体の約４０％の存在、すなわち、１０グラムのＯＬＥＯ−ＲＵＢ．ＥＳＳ中のイソケルセチンが０．０５４ｍｇを超えないはずである濃度が示唆される。
【００４２】
ＯＬＥＯ−ＲＵＢ．ＥＳＳ  １０グラムあたりの成分の一覧：
【表１】
2016521725.tif 000002
【００４３】
製造方法
ＯＬＥＯ−ＲＵＢ１プロトタイプ
イタリア国特許ＩＴ００１１２６５６４９に記載の製品に対して、次の成分を入れ替えた。
ラム／羊脂を無水ラノリン（公式薬局方）に替え、
エクストラヴァージンオリーブ油をヴァージンオリーブ油（公式薬局方）に替え、
蜜蝋を白蝋（ｃｅｒａ  ａｌｂａ／ｗｈｉｔｅ  ｆｌａｋｅｓ）（公式薬局方）に替えた。
精製オリーブ油（公式薬局方）を富栄養化し、上で示した特許のオリーブ油（エクストラヴァージンオリーブ油）の特性に近付けるために、一定分量のオリーブ油不けん化物（ポリフェノール成分の最も豊富なオリーブ油画分である）も加えた。
【００４４】
１００グラムあたりの成分の量：
【表２】
2016521725.tif 000003
３０〜５０ｇ、好ましくは４０ｇの、乾燥させたキイチゴ属の芽の公式薬局方からのオリーブ油中抽出物［ＯＬＥＯ−ＲＵＢ．ＥＳＳ］、
１５〜３５ｇ、好ましくは２５ｇの無水ラノリン（公式薬局方）、
６〜１０ｇ、好ましくは８ｇの白蝋（公式薬局方）、
３〜５ｇ、好ましくは４．８９ｇのオリーブ油不けん化物（公式薬局方）、
１６〜２６ｇ、好ましくは２１ｇの滅菌水、
０．００５〜０．０１５ｇ、好ましくは０．０１ｇの酸化防止剤（たとえば、ＢＨＴ）、
０．０５〜０．０１５ｇ、好ましくは０．１ｇの保存剤（たとえば、安息香酸ナトリウム）。
【００４５】
製造：
ＯＬＥＯ−ＲＵＢ１プロトタイプ
適切な量のラノリン及び白蝋を約７０℃で融解させ、引き続いて抽出物（ＯＬＥＯ−ＲＵＢ．ＥＳＳ）及びオリーブ油不けん化物を加える。脂肪質の塊に、保存剤（安息香酸ナトリウム）及び酸化防止剤（ＢＨＴ）を加える。次いで、半加工された製品を、最初に乳化ふるい（粗目）を介して２０００ｒｐｍで作動するターボ乳化機にかけ、約１０分続くこの段階の間、想定された量の水も加え、融解した塊が即座に凝固しないようにするために、まず約７０℃に加熱する。よりゆっくりとしたプロセスによって、水は、エマルションの内相に確実により効率よく安定して組み込まれる。約１５分後、ターボ乳化機での均質化を、目の細かい乳化ふるいを介して３０００／３５００ｒｐｍで続け、約３０分間続行する。この段階で、最初は流体の塊が年度を増し始め、プロセスは、ターボ乳化機のスピードを緩め（１５００ｒｐｍ）、遊星撹拌を作動させながら、もう３０分間続行する。最後に、この段階の後、配合物は、遊星撹拌にかけるだけにしておき、塊の温度が約３７℃に達したとき、したがって、最終粘度に到達してしまう前に、容器に注ぎ、凝固が完了したなら、すなわち、温度が２７℃前後に落ち着いたときに限り、密封する。
【００４６】
ＯＬＥＯ−ＲＵＢ２プロトタイプ
このプロセスは、不けん化物の画分をオリーブ油（公式薬局方）に替えることを除き、以前のものＯＬＥＯ−ＲＵＢ１と同じである。
【００４７】
１００グラムあたりの組成：
【表３】
2016521725.tif 000004
【００４８】
ＯＬＥＯ−ＲＵＢ３プロトタイプ
このプロトタイプでは、以前の配合物とは異なり、Ｗ／Ｏエマルションに特有であるよりクリーミーな稠度を配合物に与える機能を有する、セトステアリルアルコール及びセトマクロゴール１０００で構成された乳化系を使用した。
【００４９】
１００グラムあたりの組成：
【表４】
2016521725.tif 000005
【００５０】
以下の表に、最終製品１００ｇあたりのｍｇで示す、コーヒー酸、ラムネチン、ケンペロール、ケルセチン、ケルセチン二水和物、及びイソケルセチンの量を報告する。
【表５】
2016521725.tif 000006
【００５１】
最終製品の安定性評価
ａ．化学的／物理的及び官能的安定性
化学的／物理的及び官能的安定性の評価は、この部類の製品について科学界に一般に受け入れられている方法を使用して行った。プロトタイプ（ＯＬＥＯ−ＲＵＢ１、ＯＬＥＯ−ＲＵＢ２、及びＯＬＥＯ−ＲＵＢ３）を、次のとおりに運用される、加熱、凍結、及び遠心機のサイクルにかけた。
・通気された乾燥炉において１時間５０℃に加熱する
・室温で１時間の安定化
・２時間−２１℃に凍結させる
・室温で２時間の安定化
・３０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離
・１８時間後に検査する
【００５２】
このプロトコールは、製造の２４時間後から開始し、製造日の後の２か月間、試験を１５日毎に繰り返して、３種すべてのプロトタイプに適用しており、結果は次のとおりである。
【表６】
2016521725.tif 000007
【００５３】
微生物学的安定性
微生物学的安定性の検査に使用する検証は、製造から２４時間後のサンプルから２か月のサンプルまでで行った。このプロトコールでは、サブローデキストロース寒天／トリプチックソイ寒天の使用を想定しており、寒天上にサンプルを異なる希釈度で播き、引き続いて、必要とされる温度で、４８時間から、かび及び酵母の場合の３週間の間を含む期間にかけてインキュベートする。
【表７】
2016521725.tif 000008
【００５４】
予想どおり、好適な保存剤の存在は別として、自由水がほとんど完全に存在しないことで、おそらくは、微生物の増殖に全く不都合な条件が作り出されるが、これは、特殊なタイプの包装（エアレス）と併せて、いかなる保存剤も加えなくて済む可能性を考慮すると、興味深いことになり得る。
【００５５】
ｂ．多成分残留農薬分析
乾燥薬のサンプルでの分析を、農薬由来の残留物の存在を検証する目的で行い、特に、検証は、アラルコル（Ａｌａｌｃｏｒ）、アルドリン＋エルドリン（Ｅｌｄｒｉｎ）、アジンホス−メチル、二硫化炭素、クロルピリホス、クロルピリホスメチル、ＤＤＴ、ジクロルボス、ジメトアート、ジスルホトン、ジチオカルバマート、エンドスルファン（ａ及びβ）、エンドリン、ヘプタクロル＋エポキシド、ヘキサクロロベンゼン、フェンクロルホス（Ｆｅｎｃｈｌｏｒｐｈｏｓ）、フェノホス（Ｆｅｎｏｆｏｓ）、ホサロン（Ｐｈｏｓａｌｏｎｅ）、ａ−、β−、ＨＣＨ、ｙ、５、及びＥ−ＨＣＨ、リンデン、マラチオン、メトキシクロル、パラチオン、パラチオン−メチル、ペルタン（Ｐｅｒｔｈａｎｅ）、ピリミホス−メチル（Ｐｉｒｉｍｉｐｈｏｓ−ｍｅｔｈｙｌ）を調べることに的を絞ったＧＣ−ＩＴＭＳ、ＨＰＬＣ−ＤＡＤによって行った。
多成分残留農薬分析の結果＜０．０１ｐｐｍ
【００５６】
ｃ．重金属分析
重金属濃度は、乾燥薬のサンプルについて、電子レンジで王水を用いて無機質化した後、光学的ＩＣＰ−ＡＥＳ（誘導結合プラズマ−発光分光分析）を使用して測定した。この分析を使用して、
アンチモン、ヒ素、ホウ素、カドミウム、コバルト、総クロム、水銀、ニッケル、鉛、セレン、スズ、ストロンチウム、タリウム、テルル、チタン、バナジウム、亜鉛
の存在を評価した。
重金属分析の結果＜０．５ｐｐｍ
【００５７】
特徴付け分析に関して、本発明者らは、抽出物が、栄養補助食品及び皮膚科学の両方の領域で大いに活用されるその優れた抗酸化剤特性について広く文献に記載されている、コーヒー酸、ケンペロール、ケルセチンとその誘導体などの、ポリフェノールの性質の物質を別々の濃度で示すことを言明することができる。
【００５８】
第２部：有効性及び毒性評価
この研究活動では、本発明によるクリームＭＶＴ  Ｓｋｉｎ  Ｃａｒｅの、局所投与後の有効性及び忍容性の予備評価を行うことを目指した。特に、その意図は、審査される生成物の第２度の熱傷後の皮膚の組織再生を促進する能力を試験することであった。さらに、研究では、ＭＶＴ  Ｓｋｉｎ  Ｃａｒｅクリームでの短期及び長期の処置を受けた実験動物の健康状態の一般評価を行い、肝臓及び腎臓の機能及び構造の変化があるかを検査することに着手した。
【００５９】
１）実験プロトコール
２．１．有効性研究−治癒過程の肉眼的評価
２．１．１．動物
雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｃａｌｃｏ、Ｃｏｍｏ、イタリア国）を研究に使用し、１２時間の明／暗サイクルで、温度を２２±２℃、相対湿度を５５±１０％に保ち、食物及び水を自由に与えた。実験活動は、動物が新たな環境条件にうまく適応できるように、動物が実験室の仕切りのある設備に到着してから少なくとも７日後に始めた。
【００６０】
２．１．２．実験モデル
介入当日に、ラットをエクイテシン（Ｅｑｕｉｔｈｅｓｉｎ）の腹腔内投与によって麻酔した。実験動物が深い意識喪失状態に達した後、動物の背中を剃り（背中の前方部）、次いで消毒し、一点を熱源に曝露した。熱源は、８０℃の温度に加熱された小さい円形の金属板（直径１．５ｃｍ）を含むものであった。金属板を動物の皮膚に１５秒間当てた。方法を標準化する目的で、板は、板それ自体の重量（１００ｇ）と関連するものは別として、圧力をかけずに動物の皮膚に載せた。熱い板と接触させた後直ちに、皮膚を４℃の生理溶液で１０秒間冷やした。
【００６１】
２．１．３．局所処置及び治癒過程の肉眼的評価
１５日間にわたり１日２回局所投与を行った。投与は、審査する十分な量の化合物を、予め熱源に曝露した皮膚の全面を覆うように載せることからなるものであった。創傷は、あらゆる包帯法の前に滅菌生理溶液で洗浄した。
【００６２】
実験プロトコールは、次の実験群を含むものであった。
１）熱源に曝露され、処置されない（創傷が滅菌生理溶液で洗浄されるだけであった）ラット
２）熱源に曝露され、市販の製品で処置されるラット
３）熱源に曝露され、クリームＭＶＴ  Ｓｋｉｎ  Ｃａｒｅ（ＯＬＥＯ−ＲＵＢ２配合物）で処置されるラット
【００６３】
各実験群は、１５匹のラットからなった。
【００６４】
創傷の治癒過程の肉眼的評価は、１日目、３日目、５日目、７日目、１３日目、及び１５日目に行った。創傷をデジタルカメラ（Ｃｏｏｌｐｉｘ、Ｎｉｋｏｎ、米国）で撮影し、画像解析ソフトウェア（Ｄｉｇｉｍｉｚｅｒ  ４．２、ＭｅｄＣａｌｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ベルギー国）を使用して分析して、治癒状態を評価した。特に、痂皮又は明確な赤みの存在のために、巨視的構造が変化しているように見える創傷の面積を算出した。
【００６５】
熱傷の治癒スピードは、創傷収縮比（ＷＣＲ％）：
【数１】
2016521725.tif 000009
として示した。ここで、Ａ０及びＡｔは、それぞれ、創傷の最初の面積、及び時間ｔでの面積を指す。
【００６６】
実験データの統計的分析は、繰り返される試験に両側検定ＡＮＯＶＡを、続いて群の内部比較にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定を使用して行った。
【００６７】
実験動物の肝臓及び腎臓は、必要なら組織学的分析のために取り出し、４％のパラホルムアルデヒドに浸した。
【００６８】
２．２．全身毒性研究
２．２．１．設計及び実験群
全処置の経過の間、審査される生成物での処置を受ける実験群において望ましくない現象が明らかになる場合があるかどうか評価するために、製品の毒性を実験的に評価する目的で、いくつかのパラメータを診断した。診断した最初の与件は、処置の間、健康状態の変化のせいとされる、いずれかの個体の死亡又は明確な行動の変容の存在が観察される場合があったかどうかであった。
【００６９】
審査される生成物の、短期及び長期の局所投与（１５日、１日２回）後の、起こり得る毒性又は有害な影響を明らかにする目的で、剖検及び組織学検査によって、肝臓及び腎臓組織の形態学的変容の存在も評価した。最後に、肝機能又は腎機能の障害を示し得る、いくつかの尿及び血液検査を行った。
【００７０】
特に、肝機能の起こり得る損傷を、次のマーカーの血漿レベルを分析することにより評価した。
・アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）
・アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）
・アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）
【００７１】
生成物での処置に続く、瘢痕化治癒現象の有効性だけでなく、その起こり得る悪化を評価するために、いくつかの血液パラメータ、たとえば、
・アルブミン（ＡＬＢ）
・プロトロンビン時間（ＰＴ）
・フィブリノゲン
を測定した。
【００７２】
腎機能の起こり得る損傷の評価には、次のマーカーを測定した。
・クレアチニン
・高窒素血症
・化学的−物理的尿分析：比重、ｐＨ、
（順序尺度での）タンパク質、血液、白血球、ビリルビン、グルコース、ケトンの有無
【００７３】
用意した実験群は、
１）熱源に曝露され、処置されない（創傷が滅菌生理溶液で洗浄されるだけであった）ラット
２）熱源に曝露され、クリームＭＶＴ  Ｓｋｉｎ  Ｃａｒｅで処置されるラット
であった。
【００７４】
実験は、実験群あたり６匹の動物で実施した。
【００７５】
２．２．２．実験手順
２．２．２．１．長期処置
熱傷の後、ラットに、以前に示したように、長期の局所処置（１５日、１日２回投与）を施した。ＭＶＴ  Ｓｋｉｎ  Ｃａｒｅクリーム及び生理溶液のみでの最後の局所投与から２時間後、尿サンプルを採取し、実験動物を麻酔した。実験動物が、エクイテシンの腹腔内投与によって誘発された深い意識喪失状態に達したなら、心臓内の血液サンプルを採取し、腹腔に存在する臓器の肉眼的分析を行った。
【００７６】
最後に、肝臓及び腎臓を取り出し、その巨視的構造を観察して、次いで速やかに４％パラホルムアルデヒドで固定した。
【００７７】
２．２．２．２．短期の処置
以前に述べた熱傷プロトコールを実施できるように、実験動物を麻酔した。熱板を適用してから２時間後、ＭＶＴ  Ｓｋｉｎ  Ｃａｒｅクリーム又は生理溶液のみの局所投与を行った。投与から２時間後、尿サンプルを採取し、実験動物を麻酔した。実験動物が深い意識喪失状態に達したなら、心臓内の血液サンプルを採取し、腹腔に存在する臓器の肉眼的分析を行った。最後に、肝臓及び腎臓を取り出し、その巨視的構造を観察して、次いで速やかに４％パラホルムアルデヒドで固定した。
【００７８】
腎臓パラメータに関しては、エクイテシンを麻酔剤として使用したが、肝臓パラメータは、モルヒネ（５ｍｇ／ｋｇ皮下）及びメデトミジン（０．１ｍｇ／ｋｇ、筋肉内）で麻酔／鎮痛を施した動物において判断した。
【００７９】
エクイテシンを繰り返し投与すると、肝機能パラメータの過剰な変化が引き起こされたという苦情のために、異なる種類の麻酔剤／鎮痛剤の使用が必要であった。その結果として、肝機能に及ぶ影響の少ない鎮痛／麻酔手順を使用して実験を繰り返すことが好ましかった。
【００８０】
２．２．３．分析手順
２．２．３．１．血液及び尿分析
生化学／臨床分析（ＡＬＢ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＡＬＰ、尿素、及びクレアチニン）は、自動生化学分析装置（ＢＳ−１２０  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｍｉｎｄｒａｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、ミラノ、イタリア国）、及びＭｉｎｄｒａｙから購入した特殊な反応物を使用して行った。化学的／物理的尿検査は、反射光度計（ＵＡ  Ｖｅｔｌａｂ  ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｉｄｅｘｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、ノヴァラ、イタリア国）及びＩｄｅｘｘ  ＵＡ  ｓｔｒｉｐｅｓ反応物を使用して行い、プロトロンビン時間及びフィブリノゲンは、凝固計（ＡＣＬ  ７０００、ＩＬ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ミラノ、イタリア国）及びＩＬ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ反応物を使用して測定した。フィブリノゲンは、Ｃｌａｕｓｓ法を使用して測定した。
【００８１】
２．２．３．１．組織学分析
４％パラホルムアルデヒドで固定した腎臓及び肝臓組織は、クリオスタット（ＣＭ−３０５０、Ｌｅｉｃａ、ドイツ国）を使用して、厚さ１５μｍの薄片に切断した。組織の薄片をスライドに設置し、ヘマトキシリンエオシン着色法を使用して着色した。明視野顕微鏡（ＢＸ−６０、Ｏｌｙｍｐｕｓ、イタリア国）を使用して、微視的構造を可視化した。
【００８２】
３）結果
本発明は、一般には、熱傷及び特に炎症型の皮膚病態の治療、創傷のコントロール及び軽傷化における補助剤として非常に有効な、局所使用のための皮膚科学的治療用製品であると説明され、その起源を考慮に入れると、伝統的な植物医薬品とみなすことができる。必須要件（有効性及び安全性）の証明は、既存の臨床データ及び特別な臨床研究に基づく慎重な臨床的評価をもって実現された。製品の臨床的評価では、基本的な安全性及びその固有の性能要件が熟考されたことを言明することができる。薬用植物からの植物抽出物だけを含む製品は、２００年間を超える、十分に長く不断の伝統をもち、非常に長い期間使用されており、今日までに、長期の使用及び経験に基づき、その確かな有効性が実証されている。通常の使用条件下では無害であることが示されている本発明は、単一の溶液で、収れん、消炎、消毒（病原菌の外からの侵入及びその成長に対する防護壁を意味する）、止血、及び緩和作用を有する。抽出物は、熱傷、及び、一般に、上皮の再生組織形成過程の再活性化が必要となる、皮膚−粘膜のすべての病態、すなわち、熱傷、挫傷、擦り傷、擦過傷、亀裂、潰瘍、放射線皮膚炎、褥瘡、遅鈍型触痛、外傷性創傷及び手術創、湿疹、凍瘡、異汗症、そう痒、アレルギー性発疹、昆虫咬傷、疱疹性及び紅斑性病変、皮膚炎、皮膚症、毛嚢炎、せつ腫症、日焼け、レーザー照射後紅斑、おむつかぶれ、外陰炎及び膣炎、酒さ性及び尋常性ざ瘡の治療において、また手術創などの瘢痕化治癒における補助剤として、非常に有効である。製品の有益な有効且つ急速な著しい補助治療的作用は、おそらくは組織タンパク質の沈着及び変質のために、一般に、化学的、細菌性、機械的、及び刺激性作用因に対して保護性の角皮が形成されることにより、皮膚及び粘膜の表面で果たされる。これにより、組織分泌及び炎症組織からの水の除去が軽減される。特に、熱傷において、製品は、痛みを緩和し、血清の損失を軽減し、創傷を細菌の侵入から保護し、優れた組織瘢痕化治癒を促進して、新たに形成された組織を完全に回復させながら、瘢痕性陥凹をほとんど完全に軽減し、皮膚及び粘膜に優れた弾性を与える。使用される以前、又は使用されている最近の２０年間にかけて、上で指摘した病態において製品を繰り返し適用することにより、即時型及び／又は遅延型の局所又は全身副作用が明らかになったことはなく、製品に対する個体の過敏性又は有害反応の事例も生じていない。
【００８３】
３．１．有効性研究−治癒過程の肉眼的評価
熱板の適用は、第２度の熱傷の特徴をなす水疱の明確な出現を来した（図１１）。創傷の正常な進展によって、数日残る痂皮の形成に至った（図１１）。痂皮が取れた後、全般に、大きくはないサイズの残存病変が皮膚組織上に認められた（図１１）。熱傷を負った皮膚の面積に対する、異なる局所処置（生理溶液、Ｃｏｎｎｅｔｔｉｖｉｎａ、ＭＶＴ  ｏｌｅｏ  ｒｕｂ２）の効果から、すべての実験群において、時間が経過するにつれて創傷の面積の有意な縮小が見られたが、上で言及した製品で処置した創傷の面積の値間に有意な差があったことが明らかになり、これにより、本発明者らが次の結論を導くことが可能になった。すなわち、創傷の肉眼的分析は、ＭＶＴ  Ｓｋｉｎ  Ｃａｒｅクリームが第２度の熱傷の病変の治癒時間を加速させることを示唆する。
【００８４】
本発明について、その好ましい実施形態に従って、非限定的な例示目的で述べてきたが、変更及び／又は改変は、添付の特許請求の範囲によって規定される、関係する保護範囲から逸脱することなく、当業者によってなされてよいと考えるべきである。
【００８５】
（例２）
本発明による抽出物と、イタリア国特許ＩＴ０００１２６５６４９に従って得た抽出物の植物化学的特徴の比較、並びに得られる軟膏の、皮膚及び粘膜病変の治療における有効性の評価
【００８６】
ＩＴ０００１２６５６４９（ＩＴＣＡ９３０００３）文書に記載の手順によって得た抽出物（ＯＬＥＯ−ＲＵＢサンプル）と、本特許出願による方法によって得た抽出物（ＯＬＥＯ−ＲＵＢ．ＥＳＳサンプル）を比較すると、本発明による抽出手順によって、ポリフェノールの性質の活性植物複合体、すなわち、得られる軟膏において見出される治療活性を担う主な物質に関して、疑いもなくより高い抽出能力がいかにもたらされるかが明らかになる。
【００８７】
ＯＬＥＯ  ＲＵＢサンプル−  ２５グラムのルーバス・アルミフォリウスの芽を、予め１５０℃に加熱した７５グラムの精製オリーブ油（公式薬局方規格）に浸すことによって得たもの。芽は、温度をモニターしながら、２分間油中に入れたままにし、温度は、最初に約２５℃下げ（すなわち、温度は１２５℃になる）、次いで、抽出プロセスが終わる時間である２分後に１４２℃まで戻す。油及び芽を熱源から遠ざけ、油を濾過し、適切に保存する。
【００８８】
ＯＬＥＯ−ＲＵＢ．ＥＳＳサンプル  通気された乾燥炉において４０℃で２４時間予め乾燥させた７．５グラム（２５グラムの新鮮な芽に相当する７．５グラムの乾燥した芽）のルーバス・アルミフォリウスの芽を、９２．５グラムの精製オリーブ油（公式薬局方規格）に浸すことによって得たもの。抽出は、薬を室温（±２５℃）で２４０時間（１０日間）油と接触させたままにして行った。１０日後、サンプルを濾過し、好適な分析のために適切に保存した。
【００８９】
図１６に、先行技術に従って熱を加えて得た抽出物（ＯＬＥＯ−ＲＵＢサンプル）で行ったＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【００９０】
薬用油及び先行技術の方法による抽出を使用して、すなわち、油を１５０℃に加熱し、次いで適切な量の芽を加えて得たＯＬＥＯ−ＲＵＢサンプルの分析から、ブランクに対していくつかの差異が明らかになる。まず最初に、対象の主領域（５２〜５７）に、ある特定のバックグラウンドノイズを認めることができ、微小であるとしても、芽に由来する何かの存在が示唆されるが、おそらくは抽出時間の短縮、また（分析においても）絶対的な使用量の縮小のために、十分に分割されたピークとならない。したがって、どの活性物質が抽出物又はその濃縮物に潜在的に存在するのかを機器によって分析することは不可能であった。次に、保持時間の小さなずれ以外に、ブランクには存在しなかった、６２．１７６及び６３．２３２にある２つの小さいピークを認めることができる。これらのピークについては、保持時間６１．８２３及び６２．６８６にあるこのシグナルの原因である成分（単数又は複数）それぞれの分画及び／又は変更に由来すると考えるのがもっともであり、したがって、これらのピークは、芽に由来するのでなく、油中にすでに存在する成分に由来することが示唆される。
【００９１】
図１７に、本発明に従って得た抽出物（ＯＬＥＯ−ＲＵＢ  ＥＳＳサンプル）で行ったＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【００９２】
ＯＬＥＯ−ＲＵＢ  ＥＳＳサンプルの分析は、前回のサンプルに反して、５３〜５４の範囲、また５６前後に明確なピークを示し、この抽出技術によって、本件ではルーバス・アルミフォリウス乾燥芽である薬由来のポリフェノールの性質の成分がかなりの量で存在することが証明される。最初のピーク、すなわち、５３．２３の時間の最大のピークの起源とすることのできる物質の正体は、適切な分画過程を標準液の使用と併せて使用して検出された。最後に、ＯＬＥＯ−ＲＵＢ  ＥＳＳサンプル中の油成分に関してピークを分析しても、ピークの分画及び／又は変更は、６２．１７６及び６３．２３２において可視化されず、ともかく、「存在するノイズ」は、非常に少ない量でしか、その存在に寄与しないといえる。この考慮すべき事項は、たとえば、穏やかな酸化現象を促進し、結果として元の種の保持時間が６２．１７６及び６３．２３２前後のピークの生成を伴って変更される可能性のある、加熱が存在しないことと、相互に関連付けられることになる。
【００９３】
本発明による抽出物の最初のピークに存在する成分の分画及び同定に続いて、主な成分が、コーヒー酸、ラムネチン、ケンペロール、及びケルセチンであると同定することが可能であった。
【００９４】
上記のとおりのポリフェノール成分に関連したピークを明らかにすることが難しい、ＩＴＣＡ９３０００３文書に含まれる記述とは異なり、本発明による抽出プロセスでは、先行技術に従って取得した抽出物において単に検出可能なだけである痕跡について、はるかに多いかなりの量のポリフェノール成分の抽出が可能になる。したがって、本発明による軟膏は、ＩＴＣＡ９３０００３文書に示された製品と比べて疑いなくより高濃度の活性植物複合体を特徴とする。特徴付けがなされており、抽出物中に存在する活性植物複合体の重要な指標であることが確かである活性種は、たとえば、
０．３％（ｗ／ｗ）或いは少なくとも０．２％（ｗ／ｗ）のコーヒー酸、０．４１％（ｗ／ｗ）或いは少なくとも０．３％（ｗ／ｗ）のラムネチン、０．３５％（ｗ／ｗ）或いは少なくとも０．３％（ｗ／ｗ）のケルセチン、及び０．２５％（ｗ／ｗ）或いは少なくとも０．２％（ｗ／ｗ）のケンペロールである。
【００９５】
本発明による抽出物は、イタリア国特許ＩＴ０００１２６５６４９に記載の抽出物と比べて、皮膚及び粘膜の病態の治療においてより有効である。特に、同じ皮膚又は粘膜の病変及び投与について、本発明による抽出物は、先行技術に従って製造された抽出物と比べて、皮膚の再生を促進するより顕著な作用、及びより迅速な治癒の決め手となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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