(57)【要約】  本発明は、筋萎縮性側索硬化症の処置のための医薬組成物、キット、方法、および使用に関する。特に、本発明は、ミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの阻害および運動ニューロン死を阻止することによる、筋萎縮性側索硬化症の処置のための医薬組成物、キット、方法、および使用に関する。本発明はさらに、アストロサイトにおけるＳＯＤ−１の阻害と組み合わせて、ミクログリアにおけるＮＦ−κＢを阻害することによる、筋萎縮性側索硬化症の処置のための医薬組成物、キット、方法および使用に関する。本発明はまた、ミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現または活性を阻害して、またはそれとアストロサイトにおけるＳＯＤ−１発現を阻害することとを組み合わせて、運動ニューロン死を阻止するための方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者におけるＮＦ−κＢの発現を減少させることにより、筋萎縮性側索硬化症を有する患者を処置するための方法であって、
該患者のミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現を減少させる有効量の化合物を含む組成物を該患者に投与し、そして
該患者における運動ニューロン死を阻止する
工程を含む、方法。
【請求項２】
ＮＦ−κＢの発現をミクログリアにおいて減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＮＦ−κＢの発現をマクロファージにおいて減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ミクログリアにおけるＮＦ−κＢの発現の減少が、筋萎縮性側索硬化症の症状の軽減に有効である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アストロサイトにおけるＮＦ−κＢの発現レベルの減少が、筋萎縮性側索硬化症の症状の軽減に有効ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
組成物が水溶液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
化合物が核酸である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
核酸が、ＲＮＡ干渉により機能するか、またはアンチセンスＲＮＡ分子である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
核酸がｓｈＲＮＡである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
核酸が、細菌ベクターまたはウイルスベクターを用いて患者に送達される、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
核酸が、配列番号：１または配列番号：２の配列を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
ベクターがウイルスベクターである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
筋萎縮性側索硬化症が特発性筋萎縮性側索硬化症である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
筋萎縮性側索硬化症が家族性筋萎縮性側索硬化症である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり約１ｎｇから約１ｍｇの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり約１ｎｇから約５００ｎｇの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり約１ｎｇから約１００ｎｇの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
組成物が、担体、添加剤もしくは希釈剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
組成物が、薬学的に許容される担体を含み、該薬学的に許容される担体が液体担体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
液体担体が、食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
組成物が、単回用量または複数回用量レジメンで投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
患者のミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの活性を阻害することによる筋萎縮性側索硬化症の処置のための方法であって、
該患者のミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの活性を阻害する有効量の化合物を含む組成物を該患者に投与し、そして
該患者における運動ニューロン死を阻止する
工程を含む、方法。
【請求項２５】
ＮＦ−κＢの活性をミクログリアにおいて減少させる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＮＦ−κＢの活性をマクロファージにおいて減少させる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ミクログリアにおけるＮＦ−κＢ活性の低下が、筋萎縮性側索硬化症の症状の軽減に有効である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
アストロサイトにおけるＮＦ−κＢ活性レベルの低下が、筋萎縮性側索硬化症の症状の軽減に有効ではない、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
組成物が水溶液を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
化合物が核酸である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
核酸が、細菌ベクターまたはウイルスベクターを用いて患者に送達される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ベクターがウイルスベクターである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ベクターが、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびアデノウイルスベクターからなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
核酸が、配列番号：１または配列番号：２の配列を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
筋萎縮性側索硬化症が特発性筋萎縮性側索硬化症である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
筋萎縮性側索硬化症が家族性筋萎縮性側索硬化症である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３８】
化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり約１ｎｇから約１ｍｇの範囲である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３９】
化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり約１ｎｇから約５００ｎｇ／ｋｇの範囲である、請求項２４に記載の方法。
【請求項４０】
化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり約１ｎｇから約１００ｎｇの範囲である、請求項２４に記載の方法。
【請求項４１】
組成物が、担体、添加剤もしくは希釈剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項４２】
組成物が、薬学的に許容される担体を含み、該薬学的に許容される担体が液体担体である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
液体担体が、食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
組成物が、単回用量または複数回用量レジメンで投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項４５】
筋萎縮性側索硬化症を有する患者のミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現を減少させるのに有効な化合物の投与量形態を含む、医薬組成物。
【請求項４６】
ミクログリアにおけるＮＦ−κＢの発現を減少させる、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
マクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現を減少させる、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４８】
化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４９】
化合物が核酸である、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡからなる群より選択される、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
化合物がアンチセンスＲＮＡ分子である、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
核酸がｓｈＲＮＡである、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５３】
核酸が、配列番号：１または配列番号：２の配列を有する、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５４】
組成物が、１またはそれ以上の担体、希釈剤もしくは添加剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項５５】
組成物が、薬学的に許容される担体を含み、該薬学的に許容される担体が液体担体である、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
該液体担体が、食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
化合物の純度が、重量％に基づき少なくとも９８％である、請求項４５に記載の組成物。
【請求項５８】
組成物が、アンプルまたは密封バイアル中に存在する、請求項４５に記載の組成物。
【請求項５９】
再構成可能な凍結乾燥形態である、請求項４５に記載の組成物。
【請求項６０】
筋萎縮性側索硬化症を有する患者のミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢ活性を低下させるのに有効な化合物の投与量形態を含む、医薬組成物。
【請求項６１】
ミクログリアにおけるＮＦ−κＢの発現を減少させる、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６２】
マクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現を減少させる、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６３】
化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６４】
化合物が核酸である、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡからなる群より選択される、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６６】
化合物がアンチセンスＲＮＡ分子である、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６７】
核酸がｓｈＲＮＡである、請求項６５に記載の組成物。
【請求項６８】
核酸が、配列番号：１または配列番号：２の配列を有する、請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
組成物が、１またはそれ以上の担体、希釈剤もしくは添加剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項６０に記載の組成物。
【請求項７０】
組成物が、薬学的に許容される担体を含み、該薬学的に許容される担体が液体担体である、請求項６９に記載の組成物。
【請求項７１】
液体担体が、食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
化合物の純度が、重量％に基づき少なくとも９８％である、請求項６０に記載の組成物。
【請求項７３】
組成物が、アンプルまたは密封バイアル中に存在する、請求項６０に記載の組成物。
【請求項７４】
再構成可能な凍結乾燥形態である、請求項６０に記載の組成物。
【請求項７５】
組成物が、吸入投与量形態、経口投与量形態、および非経腸投与量形態からなる群より選択される投与量形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項７６】
組成物が非経腸投与量形態であり、該非経腸投与量形態が、皮内投与量形態、皮下投与量形態、筋肉内投与量形態、腹腔内投与量形態、静脈内投与量形態、および髄腔内投与量形態からなる群より選択される、請求項７５に記載の方法または医薬組成物。
【請求項７７】
凍結乾燥形態である、請求項４５に記載の組成物。
【請求項７８】
固体形態である、請求項４５に記載の組成物。
【請求項７９】
滅菌バイアル、請求項４５から７８のいずれかに記載の組成物、および筋萎縮性側索硬化症を有する患者の処置のための組成物の使用を説明する指示書を含む、キット。
【請求項８０】
化合物または組成物が、再構成可能な凍結乾燥形態である、請求項７９に記載のキット。
【請求項８１】
化合物の用量が、患者の体重１ｋｇ当たり、１から５μｇの範囲である、請求項７９に記載のキット。
【請求項８２】
化合物の純度が、重量％に基づき少なくとも９９％である、請求項７９に記載のキット。
【請求項８３】
化合物または組成物が非経腸投与量形態である、請求項７９に記載のキット。
【請求項８４】
非経腸投与量形態が、皮内投与量形態、皮下投与量形態、筋肉内投与量形態、腹腔内投与量形態、静脈内投与量形態、および髄腔内投与量形態からなる群より選択される、請求項８３に記載のキット。
【請求項８５】
組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項７９に記載のキット。
【請求項８６】
薬学的に許容される担体が、生理食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される液体担体である、請求項８５に記載のキット。
【請求項８７】
筋萎縮性側索硬化症の処置のための医薬の製造を目的とする、請求項４５に記載の組成物の使用。
【請求項８８】
筋萎縮性側索硬化症の処置に使用するための請求項４５に記載の医薬組成物。
【請求項８９】
核酸が、ウイルスベクターを用いて患者に送達され、該ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項９０】
組成物の投与が、患者の生存期間を９０日またはそれ以上延長する、請求項１に記載の方法。
【請求項９１】
患者が、ＳＯＤ１遺伝子に変異を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９２】
化合物の純度が、重量％に基づき少なくとも９０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項９３】
炎症マーカーの発現を減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項９４】
炎症マーカーが、ＣＤ６８、ＣＤ８６およびＮＯＳからなる群より選択される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
ミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現または活性を阻害して、運動ニューロン死を阻止するための方法であって、
ミクログリアまたはマクロファージを、該ミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現または活性を減少させる有効量の外因性化合物を含む組成物と接触させて、そして
運動ニューロン死を阻止する
工程を含む、方法。
【請求項９６】
ＮＦ−κＢの発現をミクログリアにおいて減少させる、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
ＮＦ−κＢの発現をマクロファージにおいて減少させる、請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
組成物が水溶液を含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９９】
化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、請求項９５に記載の方法。
【請求項１００】
化合物が核酸である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
核酸がＲＮＡ干渉により機能するか、またはアンチセンスＲＮＡ分子である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡからなる群より選択される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
核酸がｓｈＲＮＡである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０４】
核酸が、細菌ベクターまたはウイルスベクターにより送達される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０５】
核酸が、配列番号：１または配列番号：２の配列を有する、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０６】
筋萎縮性側索硬化症を有する患者の処置方法であって、
該患者のミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現または活性を減少させる有効量の第一の化合物を含む第一の組成物を該患者に投与し、
該患者のアストロサイト、運動ニューロン、神経細胞、および／またはオリゴデンドロサイトにおけるＳＯＤ−１の発現を減少させる有効量の第二の化合物を含む第二の組成物を該患者に投与し、そして
該患者における運動ニューロン死を阻止する
工程を含む、方法。
【請求項１０７】
筋萎縮性側索硬化症を有する患者のミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現または活性を阻害する方法ならびに該患者におけるＳＯＤ−１の発現を阻害する方法であって、
該患者のミクログリアまたはマクロファージを、該患者のミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現または活性を減少させる有効量の第一の化合物を含む第一の組成物と接触させて、
該患者のアストロサイトを、該患者のアストロサイト、運動ニューロン、神経細胞、および／またはオリゴデンドロサイトにおけるＳＯＤ−１の発現を減少させる有効量の第二の化合物を含む第二の組成物と接触させて、そして
運動ニューロン死を阻止する
工程を含む、方法。
【請求項１０８】
ＮＦ−κＢの発現をミクログリアにおいて減少させる、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０９】
ＮＦ−κＢの発現をマクロファージにおいて減少させる、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１０】
ミクログリアにおけるＮＦ−κＢの発現の低下が、筋萎縮性側索硬化症の症状の軽減に有効である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１１】
アストロサイトにおけるＮＦ−κＢの発現レベルの低下が、筋萎縮性側索硬化症の症状の軽減に有効ではない、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１２】
組成物が水溶液を含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１３】
第一の化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１４】
第二の化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１５】
化合物が核酸である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１６】
核酸がＲＮＡ干渉により機能するか、またはアンチセンスＲＮＡ分子である、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡからなる群より選択される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
核酸がｓｈＲＮＡである、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
核酸が、細菌ベクターまたはウイルスベクターを用いて患者に送達される、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
核酸が、配列番号：１または配列番号：２の配列を有する、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
ベクターがウイルスベクターである、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２２】
筋萎縮性側索硬化症が特発性筋萎縮性側索硬化症である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１２３】
筋萎縮性側索硬化症が家族性筋萎縮性側索硬化症である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１２４】
化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり約１ｎｇから約１ｍｇである、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１２５】
化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり約１ｎｇから約５００ｎｇの範囲である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１２６】
化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり約１ｎｇから約１００ｎｇの範囲である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１２７】
組成物が、担体、添加剤もしくは希釈剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１２８】
組成物が、薬学的に許容される担体を含み、該薬学的に許容される担体が液体担体である、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
液体担体が、食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
組成物が、単回用量または複数回用量レジメンで投与される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１３１】
組成物が、吸入投与量形態、経口投与量形態、および非経腸投与量形態からなる群より選択される投与量形態である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１３２】
組成物が非経腸投与量形態であり、該非経腸投与量形態が、皮内投与量形態、皮下投与量形態、筋肉内投与量形態、腹腔内投与量形態、静脈内投与量形態、および髄腔内投与量形態からなる群より選択される、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
第一または第二の組成物の投与が、患者の生存期間を９０日またはそれ以上延長する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１３４】
患者が、ＳＯＤ１遺伝子に変異を有する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１３５】
第一または第二の化合物の純度が、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、および少なくとも９９．５％からなる群より選択される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１３６】
化合物の純度が、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、および少なくとも９９．５％からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３７】
第一の組成物および／または第二の組成物が、水溶液を含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１３８】
化合物がアデノ随伴ウイルスベクターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３９】
化合物の投与が、該化合物で処置されない患者と比較して、該患者の生存期間を、少なくとも２０日、少なくとも３０日、少なくとも３５日、少なくとも４０日、少なくとも４５日、少なくとも５０日、少なくとも５５日、少なくとも６０日、少なくとも６５日、少なくとも７０日、少なくとも７５日、少なくとも８０日、少なくとも８５日、少なくとも９０日、少なくとも９５日、少なくとも１００日、少なくとも１５０日、少なくとも２００日、少なくとも２５０日、および少なくとも３００日からなる群より選択される日数延長する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４０】
第一の化合物または第二の化合物の投与が、第一または第二の化合物で処置されない患者と比較して、該患者の生存期間を、少なくとも２０日、少なくとも３０日、少なくとも３５日、少なくとも４０日、少なくとも４５日、少なくとも５０日、少なくとも５５日、少なくとも６０日、少なくとも６５日、少なくとも７０日、少なくとも７５日、少なくとも８０日、少なくとも８５日、少なくとも９０日、少なくとも９５日、少なくとも１００日、少なくとも１５０日、少なくとも２００日、少なくとも２５０日、および少なくとも３００日からなる群より選択される日数延長する、請求項１０６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
２０１３年１１月５日に出願された米国仮特許出願第６１／９００，１０５号に基づいて、米国特許法第１１９条（ｅ）に規定される優先権の利益を主張し、その開示は、引用によりその全体を本明細書に包含される。
【０００２】
政府の権利
本発明は、ＮＩＨ／ＮＩＮＤＳから、助成金番号Ｔ３２ＮＳ０７７９８４号、同Ｒ０１  ＮＳ６４４９１２号により助成を受けて行った。米国政府は、本発明に一定の権利を保有する。
【０００３】
技術分野
本発明は、筋萎縮性側索硬化症の処置のための組成物、キット、方法および使用に関する。特に、本発明は、ミクログリアにおいてＮＦ−κＢを阻害すること、および運動ニューロン(ＭＮ)死を阻止することによる、筋萎縮性側索硬化症の処置のための組成物、キット、方法および使用に関する。本発明はさらに、アストロサイト、運動ニューロン、神経細胞、およびオリゴデンドロサイトにおいてＳＯＤ−１を阻害することと組み合わせて、ミクログリアにおいてＮＦ−κＢを阻害することによる、筋萎縮性側索硬化症の処置のための組成物、キット、方法および使用に関する。本発明はまた、ミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現または活性を阻害して運動ニューロン死を阻止する方法、およびミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現または活性を阻害し、かつアストロサイトにおけるＳＯＤ−１発現を阻害して、運動ニューロン死を阻止するための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景および概要
筋萎縮性側索硬化症は、俗に、ルー・ゲーリッグ病と言われ、運動皮質、脳幹および脊髄における運動ニューロンの選択的な早期の変性および細胞死により特徴付けられる。運動ニューロンの喪失は、呼吸器不全から最終的に死に至る進行性の筋肉の麻痺の原因となる。全ての筋萎縮性側索硬化症のおよそ９０％は、家族性疾患ではない特発性筋萎縮性側索硬化症であり、残り約１０％は、家族性筋萎縮性側索硬化症である。危険因子および潜在的感受性遺伝子を同定するための多大な努力にも関わらず、特発性筋萎縮性側索硬化症の病因は、ほとんど未知のままである。
【０００５】
家族性筋萎縮性側索硬化症の約２０％の原因である、ヒトのスーパーオキシドジスムターゼ(ＳＯＤ１)の優性突然変異を有する多数のげっ歯動物モデルが、筋萎縮性側索硬化症おける運動ニューロン毒性のモデルとして有用となっている。これらのモデルは、運動ニューロンのみではなく、ミクログリアおよびアストロサイトを含む非神経細胞もまた、疾患の発症および進行に重要な役割を果たすことを証明している。筋萎縮性側索硬化症における未解決の炎症性機構により運動ニューロン死のメディエーターとして、複数の報告がミクログリアを同定している。神経炎症作用の結果としての筋萎縮性側索硬化症における運動ニューロン死の発生機序に関する考察が、筋萎縮性側索硬化症の治療法の開発成功に関係している。
【発明の概要】
【０００６】
従って、本発明者らは、神経炎症の結果としての運動ニューロン死の発生機序がミクログリアにおけるＮＦ−κＢの活性化であることを発見し、この知見を筋萎縮性側索硬化症の治療法の開発に用いた。本明細書に記載の医薬組成物、方法および使用、ならびにキットは、特発性または家族性筋萎縮性側索硬化症の処置に使用することができる。
【０００７】
本発明のいくつかの態様を、以下に番号を付して列挙する項目に分けて記載する。
１．患者におけるＮＦ−κＢの発現を減少させることにより、筋萎縮性側索硬化症を有する患者を処置するための方法であって、
該患者のミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現を減少させる有効量の化合物を含む組成物を該患者に投与し、そして
該患者における運動ニューロン死を阻止する
工程を含む、方法。
２．ＮＦ−κＢの発現をミクログリアにおいて減少させる、項目１に記載の方法。
３．ＮＦ−κＢの発現をマクロファージにおいて減少させる、項目１に記載の方法。
４．ミクログリアにおけるＮＦ−κＢの発現の減少が、筋萎縮性側索硬化症の症状の軽減に有効である、項目１から３のいずれかに記載の方法。
５．アストロサイトにおけるＮＦ−κＢの発現レベルの減少が、筋萎縮性側索硬化症の症状の軽減に有効ではない、項目１から５のいずれかに記載の方法。
６．組成物が水溶液を含む、請求項１に記載の方法。
【０００８】
７．化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、項目１から６のいずれかに記載の方法。
８．化合物が核酸である、７に記載の方法。
９．核酸が、ＲＮＡ干渉により機能するか、またはアンチセンスＲＮＡ分子である、項目８に記載の方法。
１０．核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡからなる群より選択される、項目８に記載の方法。
１１．核酸がｓｈＲＮＡである、項目１０に記載の方法。
１２．核酸が、細菌ベクターまたはウイルスベクターを用いて患者に送達される、項目８から１１のいずれかに記載の方法。
１３．核酸が、配列番号：１または配列番号：２の配列を有する、項目８から１１のいずれかに記載の方法。
１４．ベクターがウイルスベクターである、項目１２から１３のいずれかに記載の方法。
【０００９】
１５．筋萎縮性側索硬化症が特発性筋萎縮性側索硬化症である、項目１から１４のいずれかに記載の方法。
１６．筋萎縮性側索硬化症が家族性筋萎縮性側索硬化症である、項目１から１４のいずれかに記載の方法。
１７．化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり約１ｎｇから約１ｍｇの範囲である、項目１から１６のいずれかに記載の方法。
１８．化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり約１ｎｇから約５００ｎｇの範囲である、項目１から１７のいずれかに記載の方法。
１９．化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり約１ｎｇから約１００ｎｇの範囲である、項目１から１８のいずれかに記載の方法。
２０．組成物が、担体、添加剤もしくは希釈剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、項目１から１９のいずれかに記載の方法。
【００１０】
２１．組成物が、薬学的に許容される担体を含み、該薬学的に許容される担体が液体担体である、項目２０に記載の方法。
２２．液体担体が、食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目２１に記載の方法。
２３．組成物が、単回用量または複数回用量レジメンで投与される、項目１から２２のいずれかに記載の方法。
２４．患者のミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの活性を阻害することによる筋萎縮性側索硬化症の処置のための方法であって、
該患者のミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの活性を阻害する有効量の化合物を含む組成物を該患者に投与し、そして
該患者における運動ニューロン死を阻止する
工程を含む、方法。
２５．ＮＦ−κＢの活性をミクログリアにおいて減少させる、項目２４に記載の方法。
２６．ＮＦ−κＢの活性をマクロファージにおいて減少させる、項目２４に記載の方法。
２７．ミクログリアにおけるＮＦ−κＢ活性の低下が、筋萎縮性側索硬化症の症状の軽減に有効である、項目２４から２６のいずれかに記載の方法。
２８．アストロサイトにおけるＮＦ−κＢ活性レベルの低下が、筋萎縮性側索硬化症の症状の軽減に有効ではない、項目２４から２７のいずれかに記載の方法。
【００１１】
２９．組成物が水溶液を含む、項目２４から２８のいずれかに記載の方法。
３０．化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、項目２４から２９のいずれかに記載の方法。
３１．化合物が核酸である、項目３０に記載の方法。
３２．核酸が、細菌ベクターまたはウイルスベクターを用いて患者に送達される、項目３１に記載の方法。
３３．ベクターがウイルスベクターである、項目３２に記載の方法。
３４．ベクターが、レンチウイルスベクター（Ｌｖ）、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、およびアデノウイルスベクターからなる群より選択される、項目３３に記載の方法。
３５．核酸が、配列番号：１または配列番号：２の配列を有する、項目３１から３４のいずれかに記載の方法。
３６．筋萎縮性側索硬化症が特発性筋萎縮性側索硬化症である、項目２４から３５のいずれかに記載の方法。
３７．筋萎縮性側索硬化症が家族性筋萎縮性側索硬化症である、項目２４から３５のいずれかに記載の方法。
３８．化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり約１ｎｇから約１ｍｇの範囲である、項目２４から３７のいずれかに記載の方法。
３９．化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり約１ｎｇから約５００ｎｇ／ｋｇの範囲である、項目２４から３８のいずれかに記載の方法。
【００１２】
４０．化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり約１ｎｇから約１００ｎｇの範囲である、項目２４から３９のいずれかに記載の方法。
４１．組成物が、担体、添加剤もしくは希釈剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、項目２４から４０のいずれかに記載の方法。
４２．組成物が、薬学的に許容される担体を含み、該薬学的に許容される担体が液体担体である、項目４１に記載の方法。
４３．液体担体が、食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目４２に記載の方法。
４４．組成物が、単回用量または複数回用量レジメンで投与される、項目２４から４３のいずれかに記載の方法。
４５．筋萎縮性側索硬化症を有する患者のミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現を減少させるのに有効な化合物の投与量形態を含む、医薬組成物。
４６．ミクログリアにおけるＮＦ−κＢの発現を減少させる、項目４５に記載の組成物。
４７．マクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現を減少させる、項目４５に記載の組成物。
４８．化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、項目４５から４７のいずれかに記載の組成物。
４９．化合物が核酸である、項目４８に記載の組成物。
【００１３】
５０．核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡからなる群より選択される、項目４９に記載の組成物。
５１．化合物がアンチセンスＲＮＡ分子である、項目５０に記載の組成物。
５２．核酸がｓｈＲＮＡである、項目５０に記載の組成物。
５３．核酸が、配列番号：１または配列番号：２の配列を有する、項目４９から５２のいずれかに記載の組成物。
５４．組成物が、１またはそれ以上の担体、希釈剤もしくは添加剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、項目４５から５３のいずれかに記載の組成物。
５５．組成物が、薬学的に許容される担体を含み、該薬学的に許容される担体が液体担体である、項目５４に記載の組成物。
５６．該液体担体が、食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目５５に記載の組成物。
５７．化合物の純度が、重量％に基づき少なくとも９８％である、項目４５から５６のいずれかに記載の組成物。
５８．組成物が、アンプルまたは密封バイアル中に存在する、項目４５から５７のいずれかに記載の組成物。
５９．再構成可能な凍結乾燥形態である、項目４５から５４および５７から５８のいずれかに記載の組成物。
６０．筋萎縮性側索硬化症を有する患者のミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢ活性を低下させるのに有効な化合物の投与量形態を含む、医薬組成物。
【００１４】
６１．ミクログリアにおけるＮＦ−κＢの発現を減少させる、項目６０に記載の組成物。
６２．マクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現を減少させる、項目６０に記載の組成物。
６３．化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、項目６０から６２のいずれかに記載の組成物。
６４．化合物が核酸である、項目６３に記載の組成物。
６５．核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡからなる群より選択される、項目６４に記載の組成物。
６６．化合物がアンチセンスＲＮＡ分子である、項目６３から６５のいずれかに記載の組成物。
６７．核酸がｓｈＲＮＡである、項目６５に記載の組成物。
６８．核酸が、配列番号：１または配列番号：２の配列を有する、項目６７に記載の組成物。
６９．組成物が、１またはそれ以上の担体、希釈剤もしくは添加剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、項目６０から６８のいずれかに記載の組成物。
７０．組成物が、薬学的に許容される担体を含み、該薬学的に許容される担体が液体担体である、項目６９に記載の組成物。
７１．液体担体が、食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目７０に記載の組成物。
７２．化合物の純度が、重量％に基づき少なくとも９８％である、項目６０から７１のいずれかに記載の組成物。
【００１５】
７３．組成物が、アンプルまたは密封バイアル中に存在する、項目６０から７２のいずれかに記載の組成物。
７４．再構成可能な凍結乾燥形態である、項目６０から６９および７２から７３のいずれかに記載の組成物。
７５．組成物が、吸入投与量形態、経口投与量形態、および非経腸投与量形態からなる群より選択される投与量形態である、項目１から７４のいずれかに記載の方法または医薬組成物。
７６．組成物が非経腸投与量形態であり、該非経腸投与量形態が、皮内投与量形態、皮下投与量形態、筋肉内投与量形態、腹腔内投与量形態、静脈内投与量形態、および髄腔内投与量形態からなる群より選択される、項目７５に記載の方法または医薬組成物。
７７．凍結乾燥形態である、項目５９または７４に記載の組成物。
７８．固体形態である、項目４５から５４、５７から６９および７２から７７のいずれかに記載の組成物。
７９．滅菌バイアル、項目４５から７８のいずれかに記載の組成物、および筋萎縮性側索硬化症を有する患者の処置のための組成物の使用を説明する指示書を含む、キット。
８０．化合物または組成物が、再構成可能な凍結乾燥形態である、項目７９に記載のキット。
８１．化合物の用量が、患者の体重１ｋｇ当たり、１から５μｇの範囲である、項目７９または８０に記載のキット。
８２．化合物の純度が、重量％に基づき少なくとも９９％である、項目７９から８１のいずれかに記載のキット。
【００１６】
８３．化合物または組成物が非経腸投与量形態である、項目７９から８２のいずれかに記載のキット。
８４．非経腸投与量形態が、皮内投与量形態、皮下投与量形態、筋肉内投与量形態、腹腔内投与量形態、静脈内投与量形態、および髄腔内投与量形態からなる群より選択される、項目８３に記載のキット。
８５．組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む、項目７９から８４のいずれかに記載のキット。
８６．薬学的に許容される担体が、生理食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される液体担体である、項目８５に記載のキット。
８７．筋萎縮性側索硬化症の処置のための医薬の製造を目的とする、項目４５から７８のいずれかに記載の組成物の使用。
８８．筋萎縮性側索硬化症の処置に使用するための項目４５から７８のいずれかに記載の医薬組成物。
８９．核酸が、ウイルスベクターを用いて患者に送達され、該ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、項目１２、３３または３４に記載の方法。
９０．組成物の投与が、患者の生存期間を９０日またはそれ以上延長する、項目１から８９のいずれかに記載の方法または組成物。
９１．患者がＳＯＤ１遺伝子に変異を有する、項目１から９０のいずれかに記載の方法または組成物。
９２．化合物の純度が、重量％に基づき少なくとも９０％である、項目１から９１に記載の方法。
９３．炎症マーカーの発現を減少させる、項目１から４４のいずれかに記載の方法。
９４．炎症マーカーが、ＣＤ６８、ＣＤ８６およびＮＯＳからなる群より選択される、項目９３に記載の方法。
【００１７】
９５．ミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現または活性を阻害して、運動ニューロン死を阻止するための方法であって、
ミクログリアまたはマクロファージを、該ミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現または活性を減少させる有効量の外因性化合物を含む組成物と接触させて、そして
運動ニューロン死を阻止する
工程を含む、方法。
９６．ＮＦ−κＢの発現をミクログリアにおいて減少させる、項目９５に記載の方法。
９７．ＮＦ−κＢの発現をマクロファージにおいて減少させる、項目９５に記載の方法。
９８．組成物が水溶液を含む、項目９５から９７のいずれかに記載の方法。
９９．化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、項目９５から９８のいずれかに記載の方法。
１００．化合物が核酸である、項目９９に記載の方法。
１０１．核酸がＲＮＡ干渉により機能するか、またはアンチセンスＲＮＡ分子である、項目１００に記載の方法。
１０２．核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡからなる群より選択される、項目１００に記載の方法。
１０３．核酸がｓｈＲＮＡである、項目１００に記載の方法。
１０４．核酸が、細菌ベクターまたはウイルスベクターにより送達される、項目１００から１０３のいずれかに記載の方法。
１０５．核酸が、配列番号：１または配列番号：２の配列を有する、項目１００から１０４のいずれかに記載の方法。
【００１８】
１０６．筋萎縮性側索硬化症を有する患者の処置方法であって、
該患者のミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現または活性を減少させる有効量の第一の化合物を含む第一の組成物を該患者に投与し、
該患者のアストロサイト、運動ニューロン、神経細胞、および／またはオリゴデンドロサイトにおけるＳＯＤ−１の発現を減少させる有効量の第二の化合物を含む第二の組成物を該患者に投与し、そして
該患者における運動ニューロン死を阻止する
工程を含む、方法。
１０７．筋萎縮性側索硬化症を有する患者のミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現または活性を阻害する方法ならびに該患者におけるＳＯＤ−１の発現を阻害する方法であって、
該患者のミクログリアまたはマクロファージを、該患者のミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現または活性を減少させる有効量の第一の化合物を含む第一の組成物と接触させて、
該患者のアストロサイトを、該患者のアストロサイト、運動ニューロン、神経細胞、および／またはオリゴデンドロサイトにおけるＳＯＤ−１の発現を減少させる有効量の第二の化合物を含む第二の組成物と接触させて、そして
運動ニューロン死を阻止する
工程を含む、方法。
１０８．ＮＦ−κＢの発現をミクログリアにおいて減少させる、項目１０６または１０７に記載の方法。
１０９．ＮＦ−κＢの発現をマクロファージにおいて減少させる、項目１０６または１０７に記載の方法。
【００１９】
１１０．ミクログリアにおけるＮＦ−κＢの発現の低下が、筋萎縮性側索硬化症の症状の軽減に有効である、項目１０６から１０９のいずれかに記載の方法。
１１１．アストロサイトにおけるＮＦ−κＢの発現レベルの低下が、筋萎縮性側索硬化症の症状の軽減に有効ではない、項目１０６から１１０のいずれかに記載の方法。
１１２．組成物が水溶液を含む、項目１０６から１１１のいずれかに記載の方法。
１１３．第一の化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、項目１０６から１１２のいずれかに記載の方法。
１１４．第二の化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、項目１０６から１１３のいずれかに記載の方法。
１１５．化合物が核酸である、項目１１３または１１４に記載の方法。
１１６．核酸がＲＮＡ干渉により機能するか、またはアンチセンスＲＮＡ分子である、項目１１５に記載の方法。
１１７．核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡからなる群より選択される、項目１１６に記載の方法。
１１８．核酸がｓｈＲＮＡである、項目１１７に記載の方法。
１１９．核酸が、細菌ベクターまたはウイルスベクターを用いて患者に送達される、項目１１８に記載の方法。
１２０．核酸が、配列番号：１または配列番号：２の配列を有する、項目１１９に記載の方法。
【００２０】
１２１．ベクターがウイルスベクターである、項目１１９に記載の方法。
１２２．筋萎縮性側索硬化症が特発性筋萎縮性側索硬化症である、項目１０６から１２１のいずれかに記載の方法。
１２３．筋萎縮性側索硬化症が家族性筋萎縮性側索硬化症である、項目１０６から１２１のいずれかに記載の方法。
１２４．化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり約１ｎｇから約１ｍｇである、項目１０６から１２３のいずれかに記載の方法。
１２５．化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり約１ｎｇから約５００ｎｇの範囲である、項目１０６から１２４のいずれかに記載の方法。
１２６．化合物の量が、患者の体重１ｋｇ当たり約１ｎｇから約１００ｎｇの範囲である、項目１０６から１２５のいずれかに記載の方法。
１２７．組成物が、担体、添加剤もしくは希釈剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、項目１０６から１２６のいずれかに記載の方法。
１２８．組成物が、薬学的に許容される担体を含み、該薬学的に許容される担体が液体担体である、項目１２７に記載の方法。
１２９．液体担体が、食塩水、グルコース、アルコール、グリコール、エステル、アミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目１２８に記載の方法。
１３０．組成物が、単回用量または複数回用量レジメンで投与される、項目１０６から１２９のいずれかに記載の方法。
【００２１】
１３１．組成物が、吸入投与量形態、経口投与量形態、および非経腸投与量形態からなる群より選択される投与量形態である、項目１０６から１３０のいずれかに記載の方法。
１３２．組成物が非経腸投与量形態であり、該非経腸投与量形態が、皮内投与量形態、皮下投与量形態、筋肉内投与量形態、腹腔内投与量形態、静脈内投与量形態、および髄腔内投与量形態からなる群より選択される、項目１３１に記載の方法。
１３３．第一または第二の組成物の投与が、患者の生存期間を９０日またはそれ以上延長する、項目１０６から１３２のいずれかに記載の方法。
１３４．患者が、ＳＯＤ１遺伝子に変異を有する、項目１０６から１３３に記載の方法。
１３５．第一または第二の化合物の純度が、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、および少なくとも９９．５％からなる群より選択される、項目１０６から１３４のいずれかに記載の方法。
１３６．化合物の純度が、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、および少なくとも９９．５％からなる群より選択される、項目１から４４、７５、７６および９０から１０５のいずれかに記載の方法。
１３７．第一の組成物および／または第二の組成物が、水溶液を含む、項目１０６から１３５のいずれかに記載の方法。
１３８．化合物がアデノ随伴ウイルスベクターを含む、項目１から４４、７５、７６および９０から１３７のいずれかに記載の方法。
１３９．化合物の投与が、該化合物を用いて処置されない患者と比較して、該患者の生存期間を、少なくとも２０日、少なくとも３０日、少なくとも３５日、少なくとも４０日、少なくとも４５日、少なくとも５０日、少なくとも５５日、少なくとも６０日、少なくとも６５日、少なくとも７０日、少なくとも７５日、少なくとも８０日、少なくとも８５日、少なくとも９０日、少なくとも９５日、少なくとも１００日、少なくとも１５０日、少なくとも２００日、少なくとも２５０日、および少なくとも３００日からなる群より選択される日数延長する、項目１から４４、７５、７６および８９から１０５のいずれかに記載の方法。
１４０．第一の化合物または第二の化合物の投与が、第一または第二の化合物で処置されない患者と比較して、該患者の生存期間を、少なくとも２０日、少なくとも３０日、少なくとも３５日、少なくとも４０日、少なくとも４５日、少なくとも５０日、少なくとも５５日、少なくとも６０日、少なくとも６５日、少なくとも７０日、少なくとも７５日、少なくとも８０日、少なくとも８５日、少なくとも９０日、少なくとも９５日、少なくとも１００日、少なくとも１５０日、少なくとも２００日、少なくとも２５０日、および少なくとも３００日からなる群より選択される日数延長する、項目１０６から１３２、１３４、１３５および１３７のいずれかに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１。ＮＦ−κＢ経路は、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスモデルにおいて疾患の進行と共に活性化し、アストログリアのＮＦ−κＢの阻害は、神経保護を与えない。（Ａ）１２０日齢の野生型マウス、ならびに発症前（pre-symptomatic；Ｐｒｅ）、発症時（onset；Ｏｎｓ）、症候性（symptomatic；Ｓｙｍ）、後期（late-symptomatic；ＬＳｙｍ）および終末期（end-stage；ＥＳ）のＳＯＤ１−Ｇ９３Ａメスマウスから単離された腰部脊髄タンパク質の免疫ブロットは、疾患の進行に伴うホスホ−ｐ６５の増加を示す（上）。ブロットは、総ｐ６５（中）およびローディング対照としてのアクチン（下）について再ブロットした。各時点でｎ＝３である。（Ｂ）（Ａ）における免疫ブロットの変化倍数。ホスホ−ｐ６５は、後期で１３．７倍、終末期で８．７倍に顕著に上方制御されることが見出された。バンド強度は、ｐ６５／アクチンに対して正規化した。（Ｃ）後期ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａおよび野生型同腹仔から得られたアストロサイトから単離されたタンパク質の免疫ブロットは、活性化ＮＦ−κＢの４．４倍増加を示す。（ＤおよびＥ）ＡＡＶ９−ＤＮ−ＩκＢαを注射したＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウス（平均生存日数＝１２８、ｎ＝１６）および非注射対照マウス（平均生存日数＝１３６．５、ｎ＝１４）のカプラン・マイヤー生存曲線（Ｄ）ならびに加速ロータロッド試験（accelerating rotarod test）での運動パフォーマンス（Ｅ）。（ＦおよびＧ）ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβｆ／ｆ；ＧＦＡＰ−ｃｒｅ−マウス（平均生存日数＝１５４、ｎ＝１０）およびＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβｆ／ｆ；ＧＦＡＰ−ｃｒｅ＋マウス（平均生存日数＝１４９、ｎ＝１４）のカプラン・マイヤー生存曲線（Ｆ）ならびに加速ロータロッド試験での運動パフォーマンス（Ｇ）。エラーバーは、平均標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）を示す。＊、Ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．０１。
【図２】図２。ＮＦ−κＢ活性化は、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスモデルにおいてミクログリアで主に起こる。（ＡおよびＢ）後期ＮＦ−κＢＥＧＦＰ；ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスの腰部脊髄前角におけるＮＦ−κＢ−ＧＦＰ−陽性細胞（緑）の代表的な高倍率イメージ。最も優勢なＧＦＰ＋細胞（Ａ）は、ミクログリアマーカーＩｂａ１＋（赤）にも陽性である。他のＧＦＰ＋細胞は、アストロサイトマーカーＧＦＡＰ（青）に陽性である。スケールバー＝５ミクロン（Ａ）および２０ミクロン（Ｂ）。（Ｃ）後期ＳＯＤ１−Ｇ９３ＡマウスおよびＷＴの同腹仔から得られた初代ミクログリアから単離されたタンパク質の免疫ブロットは、ＮＦ−κＢが、対照同腹仔と比較してＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアにおいて１２．４倍活性化されること確認する。６匹のマウスからのミクログリアをタンパク質単離のために共に集めた。変化倍を、ｐ６５／アクチンに対して正規化したホスホ−ｐ６５のバンド強度によって決定した。（Ｄ）１２０日齢のＷＴ；ＮＦ−κＢ−ＧＦＰ、ならびに発症前（Ｐｒｅ−ｓｙｍｐ）、発症時（Ｏｎｓｅｔ）、症候性（Ｓｙｍｐ）、後期（Ｌａｔｅ−ｓｙｍｐ）および終末期（Ｅｎｄ−Ｓｔａｇｅ）のＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＮＦ−κＢ−ＧＦＰマウスの、腰部脊髄前角の免疫組織化学。ＮＦ−κＢ活性化を、ＮＦ−κＢＥＧＦＰ（緑）で示し、ミクログリアをトマトレクチン（赤）で示した。スケールバー＝５０ミクロン。（Ｅ）ＧＦＰ＋細胞は、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＮＦ−κＢ−ＧＦＰマウスの腰部脊髄切片においてトマトレクチンと共局在する。  エラーバーは平均標準誤差を示す。＊＊、Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。
【００２３】
【図３】図３。成熟ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアは、インビトロにおいて運動ニューロンに毒性である。（ＡおよびＢ）ＷＴおよびＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアの、プロトタイプのミクログリアマーカーＩｂａ−１、ＣＤ１１ｂ、Ｆ４／８０、ならびにアストロサイト（ＧＦＡＰ）、オリゴデンドロサイト前駆体（ＮＧ２）および運動ニューロン（ＣｈＡＴ）の免疫細胞化学。１ウェル当たりの陽性ミクログリア細胞の定量（Ｂ）。ＤＡＰＩ（青）。スケールバー＝２０ミクロン。（Ｃ）ＣＤ４５およびＣＤ１１ｂについての成熟ミクログリアのフローサイトメトリー。（ＤおよびＥ）非感染（黒色バー）またはＬｖ−ＲＦＰ感染（破線バー）またはＬｖ−ｓｈＲＮＡ−ＳＯＤ１感染（白色バー）させた、ＷＴまたはＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアとの共培養の３日（７２時間）後の、生存するＨｂ９−ＧＦＰ＋運動ニューロンの代表的顕微鏡視野（Ｄ）およびウェル全体の定量（Ｅ）。スケールバー＝２００ミクロン。（Ｆ）ＥＬＩＳＡにより決定された、Ｌｖ−ＲＦＰおよびＬｖ−ｓｈＲＮＡ−ＳＯＤ１を感染させたＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアにおけるヒトＳＯＤ１タンパク質の定量。エラーバーは平均標準誤差を示す。＊＊＊、Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。
【図４】図４。成熟ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアは、インビトロにてＮＦ−κＢ依存的機序で運動ニューロン死を引き起こす。（ＡおよびＢ）非感染（黒色バー）、Ａｄ−ＲＦＰ感染（破線バー）またはＡｄ−ＤＮｉｋＢα感染（白色バー）させた、ＷＴまたはＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアとの共培養の１２時間後および７２時間後の、Ｈｂ９−ＧＦＰ＋運動ニューロンの代表的顕微鏡視野（Ａ）およびウェル全体のカウント（Ｂ）。Ａｄ−ｃｒｅ感染させたＷＴ；ＩＫＫβｆ／ｆまたはＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβｆ／ｆミクログリアのいずれかと共培養したＭＮを、破線バーで示した。スケールバー＝２００ミクロン。（ＣおよびＤ）共培養培地におけるＴＮＦ−α（Ｃ）および一酸化窒素（Ｄ）のＥＬＩＳＡによる定量。一酸化窒素は、硝酸塩および亜硝酸塩の合計によって間接的に測定した。（Ｅ）ミクログリア−ＭＮの共培養からのホスホ−ｐ６５のＥＬＩＳＡによる定量。ホスホ−ｐ６５を、ＥＬＩＳＡにより決定されたｐ６５の合計レベルに対して正規化した。エラーバーは平均標準誤差を示す。＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１、＊＊＊、Ｐ＜０．００１。
【００２４】
【図５】図５。ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアは、インビボにてＮＦ−κＢ依存的機序で運動ニューロン死を誘導する。（Ａ）ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ；ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−（ｎ＝２２）およびＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ；ＣＳＦ−１Ｒ−ｃｒｅ＋マウス（ｎ＝２５）のカプラン・マイヤー生存曲線。平均生存日数は、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ；ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−＝１３３日、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ；ＣＳＦ−１Ｒ−ｃｒｅ＋＝１５３日である。平均生存日数は、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ；ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−＝１３４．９±１．４日、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ；ＣＳＦ−１Ｒ−ｃｒｅ＋＝１５３．７±０．９日であり、Ｐ＜．０００１である。（Ｂ）疾患の発症を、ピーク重量が達成された時の日齢によって決定した。ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ；ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−は、１０２．８±１．１日で発症ピークに達し、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ；ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋マウスは、１０１．２±１．３日で発症ピークに達した。（Ｃ）疾患の進行は、疾患の発症から終末期までの期間として定義した。ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ；ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−は、３４．８±１．４日の平均の疾患の進行を有し、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ；ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋は、平均５１．１±１．７日の疾患の進行を有した。（Ｄ）ＷＴ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ；ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋、ＷＴ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ；ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−、および終末期ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ；ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋マウスから単離された腰部脊髄タンパク質の、ホスホ−ｐ６５（上）、総ｐ６５、ＩＫＫβ、ヒトＳＯＤ１およびアクチン（下）についての免疫ブロット。変化倍を、ｐ６５／アクチンに対して正規化したホスホ−ｐ６５およびアクチンに対して正規化したＩＫＫβのバンド強度で示した。（Ｅ）終末期ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ  ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−、ならびに日齢を合わせたＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβｆ／ｗｔ  ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋、およびＷＴ  ＩＫＫβｆ／ｗｔ  ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋同腹仔の腰部脊椎におけるＩｂａ１−陽性ミクログリア（赤）およびＧＦＡＰ−陽性アストロサイト（緑）の免疫組織化学。スケールバー＝２００ミクロン。（ＦおよびＧ）（Ｅ）に示した、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ  ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−および日齢を合わせたＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβｆ／ｗｔ  ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋免疫組織化学における、ＧＦＡＰおよびＩｂａ−１シグナル強度の定量。
【図６】図６。ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアにおけるＮＦ−κＢ阻害は、炎症性の神経毒性表現型へのミクログリアの活性化を損なう。（Ａ）疾患を合わせた終末期ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ  ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−およびＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ  ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋同腹仔の腰部脊髄におけるＣＤ６８（赤）およびＩｂａ１（緑）細胞の免疫組織化学。スケールバー＝２００ミクロン。（Ｂ）ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ  ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−およびＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ  ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋の、切片当たりのＣＤ６８＋／Ｉｂａ−１＋細胞の定量。（Ｃ）疾患を合わせた終末期ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ  ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−およびＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ  ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋同腹仔の腰部脊髄におけるｉＮＯＳ（赤）およびＩｂａ１（緑）細胞の免疫組織化学。スケールバー＝２０ミクロン。（Ｄ）ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ  ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−およびＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ  ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋の切片当たりのｉＮＯＳ＋／Ｉｂａ−１＋細胞の定量。（Ｅ）疾患を合わせた終末期ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ  ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−およびＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ  ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋同腹仔の腰部脊髄におけるＣＤ８６（赤）およびＩｂａ１（緑）細胞の免疫組織化学。スケールバー＝２０ミクロン。（Ｆ）ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ  ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−およびＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ  ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋の切片当たりのＣＤ８６＋／Ｉｂａ−１＋細胞の定量。
【００２５】
【図７】図７。ミクログリアにおけるＮＦ−κＢの活性化は、運動ニューロン死を誘導する。（ＡおよびＢ）野生型ミクログリア（ＷＴ）（白色バー）または恒常的に活性化されたＩＫＫβ（ＩＫＫβＣＡ）を有する野生型ミクログリア（黒色バー）との共培養の１日（１２時間）後および３日（７２時間）後の、Ｈｂ９−ＧＦＰ＋運動ニューロンの代表的顕微鏡視野（Ａ）およびウェル全体の細胞数（Ｂ）。（Ｃ）総ｐ６５に対して正規化したＮＦ−κＢ活性化（ホスホ−ｐ６５）の定量（両方とも、ＥＬＩＳＡにより決定された）。（Ｄ）ＷＴおよびＩＫＫβＣＡマウスからの腰部脊髄タンパク質の免疫ブロット。ブロットを、ｐ−ｐ６５（上）、ＩＫＫβ（中央上）、ｐ６５（中央下）およびアクチン（下）に対してプローブした。ｐ−ｐ６５バンド強度を、ｐ６５／アクチンに対して正規化した。変化倍を、イメージＪにおけるデンシトメトリーによって決定した。（Ｅ）８月齢のＷＴおよびＩＫＫβＣＡ同腹仔の腰部脊髄の免疫組織化学。Ｉｂａ１−陽性ミクログリア（赤）、ＧＦＡＰ−陽性アストロサイト（青）、ＣｈＡＴ−陽性ＭＮ（緑）。スケールバー＝１００ミクロン。（Ｆ）８月齢のＩＫＫβＣＡおよびＷＴ同腹仔からの腰部脊髄前角でのＣｈＡＴ＋ＭＮ数（ｎ＝３）。（Ｇ）ＩＫＫβＣＡ（ｎ＝６）およびＷＴ同腹仔（ｎ＝８）の重量。（Ｈ）ＩＫＫβＣＡ（ｎ＝６）およびＷＴ同腹仔の握力（ｎ＝８）．（Ｉ）４月齢および８月齢のＷＴおよびＩＫＫβＣＡ同腹仔の腰部脊髄の免疫組織化学。Ｉｂａ１−陽性ミクログリア（赤）、ＧＦＡＰ−陽性アストロサイト（緑）、ＣｈＡＴ−陽性運動ニューロン（青）。スケールバー＝２００ミクロン。
【００２６】
【図８】図８。古典的ＮＦ−κＢ経路は、ミクログリア活性化および運動ニューロン死を媒介する。（Ａ）ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアが、ＡＬＳにおいて運動ニューロン死を誘導するメカニズムのモデル。ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアは、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ依存的機序によるＮＦ−κＢ経路を開始して、Ｉｂａ−１、ＣＤ６８、ｉＮＯＳおよびＣＤ８６細胞性マーカーの増加により特徴付けられる、ミクログリアの活性化を誘導する。その後、活性化型ミクログリアは、炎症経路を介して運動ニューロン死を誘導する。ＡＬＳマウスにおけるＮＦ−κＢの阻害は、ミクログリアの活性化を阻害し、炎症マーカーを下方制御し、そして運動ニューロン死を遅延させる。（Ｂ）ＩＫＫβＣＡマウスモデルにおいて、ＮＦ−κＢは、骨髄細胞でのみ恒常的に活性化されている。これらのマウスにおけるミクログリアは、短く太い突起を有し、Ｉｂａ−１、ＣＤ６８、ｉＮＯＳおよびＣＤ８６マーカーの増加によって特徴付けられる炎症性表現型を示す。これらの活性化型ミクログリアは、変異体ＳＯＤ１非依存的機構における運動ニューロン死を誘導する。
【図Ｓ１】図Ｓ１。古典的ＮＦ−κＢ経路は、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスにおいて活性化されている。（Ａ）１３０日齢の野生型マウスおよび終末期ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスからの全脊髄核抽出物の電気泳動移動度シフトアッセイ。（Ｂ）ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ サンプル＃３および＃２からの核抽出物のスーパーシフト。矢印は、ｐ６５抗体からのスーパーシフトバンドを示す。（Ｃ）および（Ｄ）ｐ６５、ｐ５０およびチューブリンに対してプローブされた核抽出物の免疫ブロット。（Ｅ）野生型（ｎ＝２）、後期（Ｌａｔｅ−ｓｙｍ）（ｎ＝６）および終末期（Ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ）（ｎ＝６）ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスからの腰部脊髄タンパク質溶解物の免疫ブロット。ブロットは、ホスホ−ｐ６５に対してプローブし、ローディングコントロールとして総ｐ６５（中央）およびアクチン（下）に対して再プローブした。（Ｆ）ｐ６５／アクチンに対して正規化されたホスホ−ｐ６５のバンド強度を測定するために、イメージＪを用いて決定された（Ａ）の免疫ブロットの変化倍。ホスホ−ｐ６５は、後期の野生型と比較して１３．４±１．６倍、および終末期の野生型と比較して１４．１±４．８倍上方制御される。
【図Ｓ２】図Ｓ２。アストロサイトにおけるＮＦ−ＫＢ阻害は、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスモデルにおいて、インビトロまたはインビボで神経保護を与えない。（Ａ）Ａｄ−ＲＦＰ（黒）もしくはＡｄ−ＩκＢα−ＳＲ（灰色）で感染させた野生型（破線）またはＳＯＤ１−Ｇ９３Ａアストロサイトと共に６日間共培養し、１ウェル当たりのＨｂ９−ＧＦＰ＋運動ニューロンの生存を定量。（ｎ＝３）（Ｂ）Ａｄ−ＲＦＰまたはＡｄ−ＩκＢα−ＳＲで感染させ、１０ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ−αで１２時間刺激した、野生型およびＳＯＤ１−Ｇ９３Ａアストロサイトにおける、ＥＬＩＳＡによるホスホ−ｐ６５の定量。（ＣおよびＤ）ＧＦＡＰ−ｃｒｅ−陰性および陽性Ｒｏｓａ２６−ＳｔｏｐＦｌｏｘ−ＣＡＧ−ｔｄＴｏｍａｔｏマウスの代表的イメージ。ネイティブＲＦＰ蛍光を、（Ｃ）アストロサイト（ＧＦＡＰおよびＥＡＡＴ２）、ミクログリア（Ｉｂａ１）および（Ｄ）運動ニューロン（ＣｈＡＴ）の免疫組織化学マーカーとの共局在について分析した。スケールバー＝１００ミクロン（上）５０ミクロン（下）。（Ｅ）ホスホ−ｐ６５（上）およびアクチン（下）に対してプローブした、ＷＴ；ＩＫＫβｆ／ｆ；ＧＦＡＰ−ｃｒｅ−、ＷＴ；ＩＫＫβｆ／ｆ；ＧＦＡＰ−ｃｒｅ＋、および症候性ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβｆ／ｆ；ＧＦＡＰ−ｃｒｅ−、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβｆ／ｆ；ＧＦＡＰ−ｃｒｅ＋マウスから単離した腰部脊髄タンパク質の免疫ブロットは、ｃｒｅ＋マウスにおけるＮＦ−κＢ活性化の減少を確認する。変化倍は、イメージＪにより決定されるホスホ−ｐ６５／アクチンのバンド強度を示す。エラーバーは平均標準誤差を示す。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。
【００２７】
【図Ｓ３】図Ｓ３。ＣＳＦ−１Ｒ−ｃｒｅは、ＣＮＳ（中枢神経系）におけるミクログリアに選択的に発現する。（ＡおよびＢ）ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−陰性および陽性Ｒｏｓａ２６−ＳｔｏｐＦｌｏｘ−ＣＡＧ−ｔｄＴｏｍａｔｏマウスの代表的イメージ。ネイティブＲＦＰ蛍光を、（Ａ）ミクログリア（Ｉｂａ−１）およびアストロサイト（ＧＦＡＰ）、ならびに（Ｂ）運動ニューロン（ＣｈＡＴ）の免疫組織化学マーカーとの共局在について分析した。スケールバー＝１００ミクロン（上）および１０ミクロン（下）。（Ｃ）ＩＫＫβ（赤）およびＩＫＫγ（緑）およびトマトレクチン（青）についての終末期ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ；ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ陰性および陽性マウスの免疫組織化学分析。スケールバー＝５０ミクロン。
【図Ｓ４】図Ｓ４。インビトロでの野生型ミクログリアでのＮＦ−κＢ活性化は、炎症性の、神経毒性表現型へのミクログリアの活性化を誘導する。（ＡおよびＢ）ＥＬＩＳＡによる、共培養培地中のＴＮＦ−α（Ａ）および一酸化窒素（Ｂ）の定量。一酸化窒素は、硝酸塩および亜硝酸塩の合計によって間接的に測定する。エラーバーは平均標準誤差を示す。＊、Ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．０１。
【図Ｓ５】図Ｓ５。野生型ミクログリアにおけるＮＦ−κＢ活性化は、炎症性の、神経毒性表現型へのミクログリアの活性化を誘導する。（Ａ）４および８月齢でのＷＴおよびＩＫＫβＣＡ同腹仔の腰部脊髄におけるＣＤ６８（赤）およびＩｂａ１（緑）細胞の免疫組織化学。スケールバー＝５０ミクロン。（Ｂ）４および８月齢でのＷＴおよびＩＫＫβＣＡ同腹仔の腰部脊髄におけるＣＤ６８（赤）およびＩｂａ１（緑）細胞の免疫組織化学。スケールバー＝２０ミクロン。（Ｃ）８月齢でのＷＴおよびＩＫＫβＣＡ同腹仔の腰部脊髄におけるＣＤ６８（赤）およびＩｂａ１（緑）細胞の免疫組織化学。スケールバー＝１０ミクロン。
【００２８】
【図９】図９（Ａ）。ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ；ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−（“Ａ”と表示、ｎ＝３３）、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ；ＣＳＦ−１Ｒ−ｃｒｅ＋マウス（“Ｂ”と表示、ｎ＝１３）、ｐ２１でＳＯＤ１−ｓｈＲＮＡを注入したＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−マウス（“Ｃ”と表示、ｎ＝１４）、およびｐ２１でＳＯＤ１−ｓｈＲＮＡを注入したＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋マウス（“Ｄ”と表示、ｎ＝１３）のカプラン・マイヤー生存曲線。図９（Ｂ）。ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ；ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−（“Ａ”と表示、ｎ＝３３）、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβＦ／ｗｔ；ＣＳＦ−１Ｒ−ｃｒｅ＋マウス（“Ｂ”と表示、ｎ＝１３）、ｐ２１でＳＯＤ１−ｓｈＲＮＡを注入したＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−マウス（“Ｃ”と表示、ｎ＝１４）、およびｐ２１でＳＯＤ１−ｓｈＲＮＡを注入したＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋マウス（“Ｄ”と表示、ｎ＝１３）の平均生存グラフ。平均生存日数：非注入ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−＝１３７日、非注入ＣＳＦ−１Ｒ−ｃｒｅ＋＝１５７日、ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−ｐ２１注入＝１６０日、ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋ｐ２１注入＝１６８日。
【図１０】図１０（Ａ）。ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβｆｌｏｘ／ｗｔマウス：ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−；非注入（“Ａ”と表示）、ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋；非注入（“Ｂ”と表示）、ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−；ｐ２１注入（“Ｃ”と表示）、ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋；ｐ２１注入（“Ｄ”と表示）の重量プロット。図１０（Ｂ）。発症を示すグラフは、全ての非注入マウス（それぞれ“Ｂ”および“Ｄ”と表示）およびＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−；ｐ２１注入マウス（“Ｃ”と表示）と比較して、ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋；ｐ２１注入マウス（“Ｄ”と表示）で遅れた。図１０（Ｃ）。疾患の進行を示すグラフは、未処理対照（“Ａ”と表示）と比較して、標的としたミクログリア（“Ｂ”と表示）、アストロサイト（“Ｃ”と表示）、または両方（“Ｄ”と表示）のいずれかを有する全てのマウスで遅延した。
【図１１】図１１（Ａ）。ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫｆｌｏｘ／ｗｔ；ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋；ｐ１注入マウス（“Ｄ”と表示）を示すロータロッド試験のプロットは、未処理対照マウス（“Ａ”と表示）よりも改善された運動パフォーマンスを示す。全ての処理群（“Ａ”と表示、“Ｂ”と表示、および“Ｃ”と表示）は、未処理対照マウス（赤）よりも改善された運動パフォーマンスを示した。図１１（Ｂ）。ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫｆｌｏｘ／ｗｔ；ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋；ｐ１注入マウス（“Ｄ”と表示）を示す前肢握力プロットは、未処理対照マウスよりも改善された運動パフォーマンスを示す（“Ａ”と表示）。図１１（Ｃ）。ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫｆｌｏｘ／ｗｔ；ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋；ｐ１注入マウス（“Ｄ”と表示）を示す後肢握力プロットは、未処理対照マウスよりも改善された運動パフォーマンスを示す（“Ａ”と表示）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
例示的態様の詳細な説明
本発明のいくつかの態様は、本願明細書の詳細な説明部分に記載され、本願明細書の詳細な説明部分に記載される各態様は、本願明細書の背景技術および概要部分に列挙される各態様またはその組み合わせに適用される。
【００３０】
本明細書に記載の種々の態様のいずれにおいても、適用可能なとき以下の特徴が存在してよく、本発明のさらなる態様を提供する。すべての態様について、態様の任意の適用可能な組み合わせもまた、企図される。
【００３１】
一態様では、患者においてＮＦ−κＢの発現を減少させることによる、筋萎縮性側索硬化症の患者を処置するための方法を提供する。この方法は、患者のミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現を低下させ、患者において運動ニューロン（ＭＮ）死を阻止する有効量の化合物を含む組成物を該患者に投与する工程（複数可）を含む。
【００３２】
別の態様において、患者のミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの活性を阻害することより筋萎縮性側索硬化症を処置するための方法が提供される。この方法は、患者のミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの活性を阻害し、患者において運動ニューロン死を阻止する有効量の化合物を含む組成物を該患者に投与する工程を含む。
【００３３】
さらに別の態様において、ミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現または活性を阻害して、運動ニューロン死を阻止するための方法が提供される。この方法は、ミクログリアまたはマクロファージと、ミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現または活性を減少させ、そして運動ニューロン死を阻止する有効量の外因性化合物を含む組成物とを接触させる工程（複数可）を含む。
【００３４】
さらに別の態様において、筋萎縮性側索硬化症を有する患者を処置する方法を提供する。この方法は、患者のミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現または活性を減少させる有効量の第一の化合物を含む第一の組成物を該患者に投与する工程、および患者のアストロサイトにおけるＳＯＤ−１の発現を減少させ、患者における運動ニューロン死を阻止する有効量の第二の化合物を含む第二の組成物を該患者に投与する工程を含む。この態様において、第一および第二の組成物は、異なる化合物（すなわち、活性剤）を含んでいてよく、従って、第一および第二の化合物は、異なる化合物（すなわち、活性剤）であってよい。
【００３５】
別の例示的面において、筋萎縮性側索硬化症を有する患者のミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現または活性を阻害し、該患者におけるＳＯＤ−１の発現を阻止する方法が提供される。この方法は、患者におけるミクログリアまたはマクロファージと、患者におけるミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現または活性を減少させる有効量の第一の化合物を含む第一の組成物とを接触させる工程、および患者のアストロサイトと、該患者においてアストロサイトにおけるＳＯＤ−１の発現を減少させ、そして運動ニューロン死を阻止する有効量の第二の化合物を含む第二の組成物とを接触させる工程を含む。この態様において、第一および第二の組成物は、異なる化合物（すなわち、活性剤）を含んでいてよく、従って、第一および第二の化合物は、異なる化合物（すなわち、活性剤）であってよい。
【００３６】
これらの方法の態様、または任意の対応する使用のいずれかにおいて、患者のミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの減少した発現または活性が、化合物の投与後の、運動ニューロン数の増加、細胞体萎縮（soma atrophy）の減少、および神経突起長の伸張からなる群より選択されるが、これらに限定されない、患者の運動ニューロンへの影響をもたらす。種々の態様において、運動ニューロンは、患者の運動皮質、脳幹もしくは脊髄、またはそれらの組み合わせであってもよい。本明細書に記載の方法の態様のいずれかにおいて、患者のミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの減少した発現または活性はまた、筋萎縮性側索硬化症の進行を遅延させ得る。
【００３７】
別の例示的面において、医薬組成物が提供される。この組成物は、筋萎縮性側索硬化症を有する患者のミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現または活性を減少させるのに有効な化合物の投与量形態を含む。これらの医薬組成物を含むキットもまた提供される。他の面において、筋萎縮性側索硬化症を処置するための医薬の製造を目的とする、これらの医薬組成物の使用が提供される。さらに他の態様において、これらの医薬組成物は、筋萎縮性側索硬化症の処置における使用のために提供される。
【００３８】
本発明の別の例示的面において、本明細書に記載の方法および使用は、炎症マーカーの発現を減少させ得る。一態様において、炎症マーカーは、ＣＤ６８、ＣＤ８６およびＮＯＳからなる群より選択される。
【００３９】
本明細書に記載の方法、キット、使用および医薬組成物は、特発性または家族性筋萎縮性側索硬化症のいずれかの処置のために使用され得て、ヒトの臨床医薬（すなわち、患者がヒト患者である）および動物用薬剤の両方に使用され得る。一態様において、患者は、ＳＯＤ１遺伝子に変異を有し、ヒト患者であり得る。一態様において、特発性または家族性筋萎縮性側索硬化症の処置に使用され得る本明細書に記載の化合物は、筋萎縮性側索硬化症の患者のミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現を減少させるか、またはその活性を減少させるのに有効な化合物である。別の態様において、本明細書に記載の化合物は、患者のアストロサイトにおけるＳＯＤ−１の発現を減少させせるのに有効であり得る。化合物は、薬物、ペプチド、および核酸、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００４０】
ＮＦ−κＢの発現または活性は、例えば、筋萎縮性側索硬化症を有する患者のミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現または活性を減少させる、薬物、ペプチドもしくは核酸、またはそれらの組み合わせを用いて該患者を処置することにより、減少させ得る。例えば、ＮＦ−κＢの活性を減少させる化合物には、ウィザフェリンＡが含まれる。別の態様において、筋萎縮性側索硬化症を有する患者のミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現または活性は、ＮＦ−κＢの発現または活性を阻害する、アンチセンスＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのような核酸を含む医薬組成物を用いて患者を処置することにより減少させ得る。ＮＦ−κＢ発現または活性の阻害剤にはまた、例えば、Ｂａｙ１１−７０８２［（Ｅ）−３−（４−メチルフェニルスルホニル）−２−プロペンニトリル］、ウェデロラクトン、ＢＭＳ−３４５５４１［Ｎ−（１，８−ジメチルイミダゾ［１，２−ａ］キノキサリン−４−イル）−１，２−エタンジアミンヒドロクロライド］、ウィザフェリンＡ、レスベラトロール、ＩＭＤ０３５４［Ｎ−（３，５−ビス−トリフルオロメチルフェニル）−５−クロロ−２−ヒドロキシベンズアミド］、ＢＯＴ−６４［６，６−ジメチル−２−（フェニルイミノ）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［１，３］オキサチオール−４−オン］、ＣＡＹ１０６５［３−［（アミノカルボニル）アミノ］−５−［４−（４−モルホリニルメチル）フェニル］−２−チオフェンカルボキサミド］、アスプリン、サリチル酸ナトリウム、ＮＦ−κＢ必須モジュレーター結合ドメイン（ＮＢＤ）ペプチド、ＳＣ−５１４［４−アミノ−［２，３’−ビチオフェン］−５−カルボキサミド］、ＡＳ６０２８６８ Ｉｋｋ２ 阻害剤、アンチセンスＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のＡＡＶ９−ＤＮｉＫβ−αコンストラクト）、またはｍｉＲＮＡのような核酸であるＩＫＫβ阻害剤、ＰＳ−１１４５［Ｎ−（６−クロロ−９Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］インドール−８−イル）−３−ピリジンカルボキサミド ジヒドロクロライド］、ＭＬ１２０Ｂ［Ｎ−（６−クロロ−７−メトキシ−９Ｈ−β−カルボリン−８−イル）−２−メチルニコチンアミド］、およびＴＰＣＡ−１［［５−（ｐ−フルオロフェニル）−２−ウレイド］チオフェン−３−カルボキサミド］が含まれる。
【００４１】
別の態様において、患者におけるＳＯＤ−１の発現は、例えば、筋萎縮性側索硬化症を有する患者のアストロサイトにおけるＳＯＤ−１の発現を減少させる、薬物、ペプチドもしくは核酸、またはそれらの組み合わせを用いて該患者を処置することにより、減少させ得る。例えば、ＳＯＤ−１の発現を減少させる化合物には、アストロサイトにおけるＳＯＤ−１の発現を阻害する、アンチセンスＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのような核酸を含む医薬組成物が含まれ得る。一態様において、かかるｓｈＲＮＡは、本明細書に記載の配列番号：１のｓｈＲＮＡである。
【００４２】
患者へのアンチセンスＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡの送達のための好適な方法には、細菌またはレンチウイルスベクターもしくはアデノウイルスベクターのようなウイルスベクターが含まれる。別の態様において、好適な送達方法は、アデノ随伴ウイルスベクターである。かかるＲＮＡ分子の例としては、本発明者により示されたＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアにおけるヒトＳＯＤ１導入遺伝子を標的として、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアにおいて変異ＳＯＤ１遺伝子の発現を効率的に除去し、結果としてミクログリアに暴露された運動ニューロンにおける運動ニューロン毒性の有効な抑制をもたす、配列番号：１の核酸である（実施例１８参照）。別の態様において、配列番号：２の核酸が送達され得る。配列番号：１のＲＮＡ分子もまた、野生型ＳＯＤ−１の発現を阻害し得る。
【００４３】
これらの態様に従い、医薬組成物は、配列番号１の配列を含むか、またはそれからなる精製された核酸を含んで提供される。精製された核酸はまた、配列番号１の相補鎖、または配列番号１の配列の相補鎖に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含んで提供される。ｃＤＮＡもまた考慮され、本発明において意図される。本発明によれば、”高度にストリンジェントな条件”とは、５Ｘ ＳＳＰＥおよび５０％ホルムアミド中、６５℃にてハイブリダイゼーションさせ、６５℃にて０．５Ｘ ＳＳＰＥ中で洗浄することを意味する。高度、低度、および中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は、Sambrook et al., “Molecular Cloning：A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)に記載されており、それは引用により本明細書に包含される。いくつかの例示的面において、ハイブリダイゼーションは、核酸の全長に亘って起こる。
【００４４】
本発明は、単離されたか、または実質的に精製された核酸を含む。“単離された”または“精製された”核酸分子は、化学的に合成されたとき、化学的前駆体または他の化合物を実質的に含まないか、または組み換えＤＮＡ技術により作製されたとき、細胞物質（例えば、ｃＤＮＡ）を実質的に含まない。本明細書に記載の種々の態様において、本明細書に記載の方法、組成物およびキットに使用するための核酸は、二本鎖(例えば、アンチセンスＲＮＡ)または一本鎖であってよいが、核酸は典型的に、一本鎖である。
【００４５】
本明細書に記載の方法、使用、医薬組成物およびキットにおける使用のための核酸は、置換、欠失、切断（truncation）により修飾されて得て、および／または他の核酸分子と融合して、配列番号１の核酸の相補鎖に高度にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸を生じ得て、例えば、該修飾された核酸は、本明細書に記載の方法または使用に有用である。ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、およびメチルホスホネート誘導体のような誘導体もまた製造され得る(Goodchild, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83:4143−4146 (1986)、引用により本明細書に包含される)。
【００４６】
別の態様において、核酸分子は、配列番号１に、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の相同性を有して提供される。配列間の同一または類似度の決定は、例えば、ＧＡＰプログラム (Genetics Computer Group、ソフトウェア；現在、Accelrys により利用可能。http:／／www.accelrys.com)を用いることにより実施可能であり、アライメントは、例えば、ClustalW アルゴリズム (VNTI ソフトウェア、InforMax Inc.)を用いて行うことができる。配列データベースは、目的の核酸配列を用いて検索することができる。データベース検索のためのアルゴリズムは、典型的には、BLAST ソフトウェアに基づく(Altschul et al., 1990)。いくつかの態様において、同一性パーセントは、核酸の全長に沿って決定され得る。
【００４７】
本明細書に記載の核酸、例えば配列番号１またはそのフラグメントの核酸の合成技術は、当技術分野でよく知られており、化学合成法が含まれる。かかる方法は、Sambrook et al., “Molecular Cloning：A Laboratory Manual”, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)に記載されており、引用により本明細書中に包含される。本明細書に記載の方法に使用するための核酸は、商業的に作製されてよい。本明細書に記載の核酸の精製または単離方法は、当技術分野でよく知られている。かかる方法は、Sambrook et al., “Molecular Cloning：A Laboratory Manual”, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)に記載されており、引用により本明細書中に包含される。
【００４８】
一態様において、ミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの発現を無くす（ablate）ため、ミクログリアまたはマクロファージにおけるＮＦ−κＢの活性を阻害するため、またはアストロサイトにおけるＳＯＤ−１の発現を阻止するための本明細書に記載の化合物（すなわち、薬物、ペプチド、または核酸）は、１またはそれ以上の薬学的に許容される担体と共に製剤として投与され得る。担体は、添加剤であり得る。担体の選択は、特定の投与方法、溶解性および安定性に対する担体の効果、ならびに投与量形態の特性などの因子に大きく依存し得る。化合物の送達に好適な医薬組成物、または化合物と共に投与されるべきさらなる治療剤、およびそれらの製造方法は、当業者に容易になされ得る。かかる組成物およびそれらの製造方法は、例えば、Remington：The Science ＆ Practice of Pharmacy, 21st Edition (Lippincott Williams ＆ Wilkins, 2005)に見出され得て、引用により本明細書中に包含される。
【００４９】
種々の例示的態様において、本明細書に記載の組成物および化合物は、吸入投与量形態、経口投与量形態、および非経腸投与量形態からなる群より選択される投与量形態であり得る。非経腸投与量形態は、皮内投与量形態、皮下投与量形態、筋肉内投与量形態、腹腔内投与量形態、静脈内投与量形態、および髄腔内投与量形態からなる群より選択され得る。
【００５０】
一態様において、薬学的に許容される担体は、生理学的に適合する、任意かつ全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等から選択され得る。いくつかの態様において、担体は、非経腸投与に好適である。薬学的に許容される担体には、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の製造のための滅菌粉末が含まれる。補助的に活性化する化合物もまた、本発明の医薬組成物に組み込まれ得る。
【００５１】
種々の態様において、液体製剤には、懸濁液および溶液が含まれ得る。かかる製剤は、担体、例えば、水、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース、または好適な油、および１種またはそれ以上の乳化剤および／または懸濁化剤を含み得る。液体製剤はまた、固体の、例えば凍結乾燥物の再構成によりにより製造され得る。従って、一態様において、凍結乾燥物は、再構成可能な凍結乾燥物であり得る。
【００５２】
１つの例示的面において、懸濁水溶液は、活性物質を適当な添加剤と混合して含み得る。かかる添加剤は、懸濁化剤であり、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガム；天然のフォスファチド、例えばレシチンであってよい、分散剤または湿潤剤；アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合物、例えばポリオキシエチレンステアラート；エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合物、例えばヘプタデカエチレン−オキシセタノール；エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステルとの縮合物、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート；または、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートである。懸濁液はまた、１つもしくはそれ以上の防腐剤、例えば、アスコルビン酸、エチル、ｎ−プロピル、またはｐ−ヒドロキシ安息香酸塩；または１つもしくはそれ以上の着色剤を含んでいてよい。他の態様において、等張剤、例えば、糖類、ポリアルコール類、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムは、医薬組成物に包含され得る。
【００５３】
１つの態様において、添加剤はバッファーを含む。一態様において、バッファーのｐＨは、約５．０から約８．０である。バッファーは、記載のｐＨ範囲および生理的に適合性の許容されるバッファーであり得る。さらに、バッファーは、安定化剤としてもさらに作用し得る。一態様において、バッファーは、アスコルビン酸バッファー、ソルベートバッファー、ギ酸バッファー、乳酸バッファー、フマル酸バッファー、酒石酸バッファー、グルタミン酸バッファー、酢酸バッファー、クエン酸バッファー、グルコン酸バッファー、ヒスチジンバッファー、リンゴ酸バッファー、リン酸バッファーまたはコハク酸バッファーを含む。
【００５４】
一面において、本明細書に記載の化合物（すなわち、薬物、ペプチド、または核酸）、またはさらなる治療剤は、血液、筋肉、または組織内に直接投与され得る。非経腸投与に好適な経路は、静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、硬膜外、脳室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、および皮下送達を含む。好適な非経腸投与のための経路は、注射(極微針を含む)、無針注射および点滴技術を含む。非経腸投与量形態の例は、等張食塩水中の活性剤、グルコース (例えば、５％グルコース溶液)、または他の公知の薬学的に許容される液体担体、例えば液体アルコール、グリコール、エステル、およびアミドの水溶液を含む。注射可能組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによって実現し得る。
【００５５】
本発明は、本明細書に記載の医薬組成物を含むキットもまた意図する。別の態様において、滅菌バイアル、上記の態様のいずれか１つの医薬組成物、および筋萎縮性側索硬化症の患者を処置するための組成物の使用を記載する使用のための指示書を含むキットが記載される。
【００５６】
別の態様において、化合物または組成物が再構成可能な凍結乾燥物である上記の態様のキットが記載される。
別の態様において、医薬組成物中の化合物の用量が１から５μｇ／ｋｇである、上記のキットの態様のいずれかが記載される。
別の態様において、医薬組成物中の化合物の用量が１から３μｇ／ｋｇである、上記のキットの態様のいずれかが記載される。
【００５７】
別の態様において、化合物の純度が少なくとも９０重量％である、上記のキットの態様のいずれかのキットが記載される。別の態様において、化合物の純度が少なくとも９５重量％である、上記の態様のいずれかのキットが記載される。別の態様において、化合物の純度が少なくとも９８重量％である、上記のキットの態様のいずれかのキットが記載される。別の態様において、化合物の純度が少なくとも９９重量％である、上記のキットの態様のいずれかのキットが記載される。
【００５８】
別の例示的側面において、化合物または組成物が非経腸投与量形態である、上記のキットの態様のいずれかのキットが記載される。非経腸投与量形態は、皮内投与量形態、皮下投与量形態、筋肉内投与量形態、腹腔内投与量形態、静脈内投与量形態、および髄腔内投与量形態からなる群より選択され得る。さらに別の態様において、キットは組成物を含んでいてよく、組成物は薬学的に許容される担体をさらに含んでいてよい。薬学的に許容される担体は、生理食塩水、グルコース、アルコール類、グリコール類、エステル類、アミド類、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される液体担体であり得る。
【００５９】
化合物を投与するための効果的なレジメンが用いられ得る。例えば、化合物は、単回用量で投与され得るか、または一日複数用量のレジメンとして分割して投与され得る。さらに、例えば、毎週１日〜５日だけ投与するような非連続的（staggered）レジメンが毎日の処置の代わりに用いられることもあり、本明細書に記載の医薬組成物、キット、方法、および使用の目的に関して、かかる間欠的または変則的レジメンは、毎日の処置と均等であるとみなされ、考慮される。１つの例示的態様において、疾患状態(すなわち、筋萎縮性側索硬化症)を排除するため、または疾患の症状の軽減もしくは安定化のために、化合物の複数回注射で処置される。一態様において、患者は、複数回(好ましくは、約２回から約５０回まで)、例えば、１２〜７２時間または４８〜７２時間の間隔をあけて注射される。さらなる化合物の注射は、化合物の最初の注射の数日または数ヶ月後に患者に投与され得て、このような処置は、疾患の再発を防止するか、または疾患の症状の重症度の悪化を防止し得る。
【００６０】
一態様において、本発明の方法および使用に従う、本明細書に記載の化合物および組成物の投与は、患者の生存期間を９０日またはそれ以上延長し得る。別の態様において、本発明の方法および使用に従う、本明細書に記載の化合物および組成物の投与は、本明細書に記載の処置を受容しない患者と比較して、該患者の生存期間を、少なくとも２０日、少なくとも３０日、少なくとも３５日、少なくとも４０日、少なくとも４５日、少なくとも５０日、少なくとも５５日、少なくとも６０日、少なくとも６５日、少なくとも７０日、少なくとも７５日、少なくとも８０日、少なくとも８５日、少なくとも９０日、少なくとも９５日、少なくとも１００日、少なくとも１５０日、少なくとも２００日、少なくとも２５０日、または少なくとも３００日延長し得る。
【００６１】
合物の一日単一投与量は、患者の状態、化合物の純度およびその投与経路および組織分布、ならびに他の治療処置剤の共投与の可能性によって顕著に代わり得る。患者に投与されるべき有効量は、体表面積、質量、および患者状態の医者による評価に基づく。有効用量は、例えば、約１ｎｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇから約５００μｇ／ｋｇ、および約１μｇ／ｋｇから約１００μｇ／ｋｇの範囲であり得る。これらの用量は、患者の平均体重が約７０ｋｇに基づいており、該ｋｇは、患者の体重(質量)についてのｋｇである。一態様において、化合物または医薬組成物は複数回用量形態である。別の態様において、化合物または医薬組成物は、単回用量形態(すなわち、単一用量形態または投与量形態)である。
【００６２】
一態様において、化合物は、約１．０ｎｇ／ｋｇから約１０００μｇ／ｋｇ、約１０ｎｇ／ｋｇから約１０００μｇ／ｋｇ、約５０ｎｇ／ｋｇから約１０００ｇ／ｋｇ、約１００ｎｇ／ｋｇから約１０００ｇ／ｋｇ、約５００ｎｇ／ｋｇから約１０００ｇ／ｋｇ、約１ｎｇ／ｋｇから約５００ｇ／ｋｇ、約１ｎｇ／ｋｇから約１００ｇ／ｋｇ、約１ｇ／ｋｇから約５０ｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇから約１０ｇ／ｋｇ、約５μｇ／ｋｇから約５００μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇから約１００μｇ／ｋｇ、約２０μｇ／ｋｇから約２００ｇ／ｋｇ、約１０ｇ／ｋｇから約５００ｇ／ｋｇ、または約５０ｇ／ｋｇから約５００μｇ／ｋｇの用量で投与され得る。全用量は、単回または分割用量で投与されてよく、医師の判断で、本明細書に記載の一般的範囲外でもよい。これらの投与量は、平均的な患者の体重約７０ｋｇに基づいており、該ｋｇは患者の体重についてのキログラムである。医師は、重量がこの範囲から外れている対象、例えば、乳幼児および高齢者、に対する用量を容易に決定することができる。
【００６３】
別の態様において、化合物は、約１μｇ／ｍ２から約５００ｍｇ／ｍ２、約１μｇ／ｍ２から約３００ｍｇ／ｍ２、または約１００μｇ／ｍ２から約２００ｍｇ／ｍ２の用量で投与され得る。他の態様において、化合物は、約１ｍｇ／ｍ２から約５００ｍｇ／ｍ２、約１ｍｇ／ｍ２から約３００ｍｇ／ｍ２、約１ｍｇ／ｍ２から約２００ｍｇ／ｍ２、約１ｍｇ／ｍ２から約１００ｍｇ／ｍ２、約１ｍｇ／ｍ２から約５０ｍｇ／ｍ２、または約１ｍｇ／ｍ２から約６００ｍｇ／ｍ２の用量で投与され得る。合計用量は、単回用量または分割用量で投与されてもよく、医師の裁量で本明細書に記載の典型的な範囲から外れていてもよい。これらの投与量は体表面積（ｍ２）に基づく。
【００６４】
ウイルスベクターを使用する態様において、力価は、１ｍｌ当たり、約１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、または１×１０１４のＤＮａｓｅ抵抗性粒子（DNase resistant particle）であり得る。
【００６５】
別の態様において、医薬組成物および／または投与のための化合物の投与量形態は、少なくとも約９０％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％、または約９９．５％の純度の化合物から製造される。別の態様において、医薬組成物および／または投与のための化合物の投与量形態は、少なくとも９０％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％、または９９．５％の純度の化合物から製造される。化合物の純度は、種々のクロマトグラフィーまたは分光学的技法、例えば、高圧もしくは高速液体クロマトグラフィー、核磁気共鳴分光法、TLC、UV吸光分光法、蛍光分光法などを含むいずれかの従来技法を用いて測定され得る。
【００６６】
本明細書で用いる通り、純度決定は、重量パーセント、モルパーセントなどに基づいていてよい。加えて、純度決定は、ある特定の所定の成分の不存在または実質的な不存在に基づいていてよい。また、該純度決定は本明細書に記載の方法により製造された化合物および組成物の溶液に適用可能であると理解される。そのような場合、純度測定（重量パーセントおよびモルパーセント測定を含む）は、溶媒を除く溶液の成分に関係する。別の態様において、化合物または医薬組成物は滅菌容器(例えば、バイアル)またはパッケージ、例えばアンプルもしくは密封バイアルで提供される。
【００６７】
別の態様において、本明細書に記載の方法、医薬組成物、使用、およびキットは、以下の実施例を含む。該実施例は、本明細書に記載の本発明の種々の態様のさらなる特徴をさらに説明する。しかしながら、実施例は例示のためのものであって、本明細書に記載の本発明の他の態様を制限すると解釈されるものではないと理解されるべきである。加えて、実施例の他のバリエーションが本明細書に記載の本発明の各種態様に含まれると解されるべきである。
【実施例】
【００６８】
実施例１
トランスジェニックマウス
全ての手順は、脊椎動物の管理および使用に関するＮＩＨガイドラインに従って行われ、全国小児病院施設内動物管理使用委員会により承認を受けた。動物を、明／暗(１２：１２時間)サイクル下、餌および水の自由摂取下で飼育した。各世代において、ＳＯＤ１ 導入遺伝子コピー数およびＳＯＤ１ タンパク質発現レベルを、それぞれＰＣＲおよびウェスタンブロット分析により確認した。トランスジェニックメスＢ６ＳＪ／Ｌ（ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊマウスおよび非トランスジェニック同腹仔（Jackson Laboratories）を、時間経過による免疫ブロット試験および初代細胞の単離のために利用した。トランスジェニックマウスＢ６ＳＪ／Ｌ（ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊマウスを、他のトランスジェニック系統との繁殖のために使用した。ＳＯＤ１導入遺伝子のコピー数を、リアルタイムＰＣＲにより確認した。ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ−ＮＦκＢ ＥＧＦＰレポーターマウスを、Ｃ５７ＢＬ／６ ＮＦκＢ ＥＧＦＰマウス（Christian Jobin）にＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスを交配することにより作製した（Magness et al., 2004）。ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ｈＧＦＡＰ−ｃｒｅ；ＩＫＫβｆｌｏｘ／ｆｌｏｘを、Ｃ５７ＢＬ／６ ＩＫＫβｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスと交配されたＦＶＢ ｈＧＦＡＰ−ｃｒｅ（Jackson Labs）マウスにＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスを交配させることにより作製した（Li et al., 2003）。ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＣＳＦ−１Ｒ−ｉｃｒｅ；ＩＫＫβｆｌｏｘ／ｗｔを、ＩＫＫβｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスと交配されたＣ５７ＢＬ／６  ＣＳＦ−１Ｒ−ｃｒｅマウス（Deng et al., 2010）にＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスを交配させることにより作製した。ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ；ＩＫＫβＣＡを、Ｃ５７ＢＬ／６  Ｒｏｓａ２６−ＳｔｏｐＦｌｏｘＩＫＫβＣＡマウス（Jackson Labs）にＣＳＦ−１Ｒ  ｃｒｅマウスを交配させることにより作製した。Ｃｒｅ特異性は、Ｃ５７ＢＬ／６  Ｒｏｓａ２６−ＳｔｏｐＦｌｏｘ−ＣＡＧ−ｔｄＴｏｍａｔｏマウスにｃｒｅ系統を交配することにより確認され、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を免疫組織化学により評価した。図８Ａおよび８Ｂ参照。遺伝子型を、表１に記載のプライマーを用いる定量的ＰＣＲにより決定した。
【００６９】
【表１】
2016538276.tif 000003
【表２】
2016538276.tif 000004
【００７０】
実施例２
ＡＡＶ９−ＤＮｉκＢα注入
成熟マウスの尾静脈注射を、ＰＢＳと、ｓｃＡＡＶ９−ＣＢ−ＤＮｉκＢαまたはｓｃＡＡＶ９−ＣＢ−ＧＦＰ（Ｖｉｒａｐｕｒ）の４×１０１２ ＤＮａｓｅ抵抗性粒子との混合物を含む１００μｌのウイルス溶液を用いて、上記の通り６０日齢のＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウス（Foust et al., 2009; 2010）で実施した。
【００７１】
実施例３
疾患スコアリングと挙動解析
マウスを、それらが疾患の臨床症状を示さず、ピーク重量に達しなかったとき、“発症前”に分類した。“発症”は、マウスがピーク体重に達した段階で決定した。マウスが重量の１０％を失い、運動障害の振戦または後肢開脚（splay）反射の障害を示したとき、“症候性”段階であると決定した。マウスが顕著な後肢麻痺を有するが、前肢を用いて餌および水に到達し得たとき、“後期”段階であると決定した。動物が、該動物を仰向けにした後、３０秒以内にもはや“正常姿勢”を取れないとき、“終末期”であると決定した。
【００７２】
ロータロッド装置（Columbus Instruments, Columbus, OH）を用いる運動機能試験を、５０日齢で開始した。各セッションは３回の試験からなり、５r.p.m.／分で始まる上昇加速ロータロッド上で、マウスが該ロッド上に残ることができた時間を測定して平均した。後肢握力の測定は握力計（Columbus Instruments）を用いて行し、毎週試験した。核セッションは、動物当たり３回の試験からなり、値は平均された。
【００７３】
実施例４
成熟初代アストロサイトの単離および培養
ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａおよび野生型同腹仔の脳からの成熟アストロサイト培養物を、わずかに修正して、既報（Noble and Mayer-Proschel, 1998）の通りに調製し、精製した。酵素的に分離させた細胞を、２から３週間培養し、その後、細胞がコンフルエントに達したときに、一晩振盪した。付着したコンフルエントのアストロサイトを、シトシンアラビノース（２０μＭ）で４８時間処理して、急速に分裂する細胞を殺した。アストロサイトを、ＤＭＥＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ  ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋Ｎ２＋抗生物質−抗真菌剤（全てLife Technologiesから購入）中で培養した。
【００７４】
実施例５
成熟初代ミクログリアの単離および培養
成熟ミクログリアを、わずかに修正して、既報（Moussaud and Draheim, 2010）の通り、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａおよび野生型同腹仔の脳から単離した。４月齢のＳＯＤ１−Ｇ９３Ａおよび野生型同腹仔マウスを十分に麻酔し、氷冷リンゲル溶液（Fisher Scientific）で経灌流した。完全に放血されていないと思われた脳は廃棄した。脳をメスで断片化し、パパインを含む酵素溶液中で、３７℃、５％ＣＯ２中で６分間、インキュベートした。該パパイン溶液をＨＢＳＳ中の２０％ＦＢＳでクエンチし、２００ｇで４分間、遠心した。ペレットを、２ｍｌの０．５ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅＩ（Worthington Biochemical）のＨＢＳＳ溶液中に再懸濁し、室温で５分間インキュベートした。脳組織を、先端を熱加工したパスツールピペットを用いて穏やかに破砕し、次いで７０ミクロンの細胞ストレイナー（Fischer Scientific）で濾過し、２００ｇで４分間、遠心した。得られたペレットを、２０ｍｌの２０％等張パーコール（GE healthcare）のＨＢＳＳ溶液中に再懸濁した。２０ｍＬの純粋なＨＢＳＳを、注意深くパーコール層上に入れ、遠心を、２００ｇで２０分間、遅い加速およびブレーキなしで行った。ミエリンおよび細胞破片を含む相間層を捨て、混合グリア細胞集団を含むペレットをＨＢＳＳで１回洗浄し、１０％熱不活化ＦＢＳ、抗生物質−抗真菌薬（全てLife Technologiesから購入）および５ｎｇ／ｍｌの担体不含有マウス組み換え顆粒球およびマクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（R&D systems）を添加したＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）を含むダルベッコの改変イーグル／Ｆ１２培地に懸濁した。４匹のマウス脳からの細胞懸濁液を、ポリ−ｌ−リシン（Sigma）でコーティングした１５ｃｍ２プレート（Corning）上に播き、３７℃にて、９５％空気／５％ＣＯ２中で培養した。培地を、細胞がコンフルエントに達するまで（約２週間後）、３日毎に交換した。グリア層がコンフルエントになった後、ミクログリアは、収集し、再播種し、長期間に亘って培養することができる、非接着性の浮遊細胞層を形成する。浮遊層を回収した後、ミクログリアを、運動ニューロンと共培養するために再プレーティングする前に、ＧＭ−ＣＳＦなしで３日間インキュベートした。集めたミクログリアは、免疫細胞化学およびフローサイトメトリーにより特徴付けた（抗体を表２に列記する）。ウェスタンブロット分析のためのミクログリアの直接単離を、既報（Cardona et al., 2006; Henry et al., 2009）の通りに行った。
【００７５】
【表３】
2016538276.tif 000005
【表４】
2016538276.tif 000006
【表５】
2016538276.tif 000007
【００７６】
【表６】
2016538276.tif 000008
【表７】
2016538276.tif 000009
【００７７】
実施例６
ミクログリア培養物のフローサイトメトリー
ミクログリア細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析は、初めに、Ｆｃ受容体を抗ＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（eBiosciences, CA）でブロッキングすることにより行った。次に、細胞を抗ＣＤ１１ｂ  ＡＰＣ、抗ＣＤ４５  ＦＩＴＣ（eBiosciences）と共にインキュベートした。これらの表面受容体の発現を、ベクトン・ディッキンソンのＬＳＲ  ＩＩサイトメーターを用いてフローサイトメトリーにより決定した。１万事象を集め、アイソタイプ対照とインキュベートしたミクログリアを、陰性対照として用いた。フローデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Tree Star, San Carlos, CA）を用いて分析した。
【００７８】
実施例７
運動ニューロンの分化
Ｈｂ９プロモーターによって駆動されるＧＦＰを発現するマウス胚性幹細胞（ＨＢＧ３細胞）を、初代マウス胚線維芽細胞（Millipore）上で培養し、２μＭのレチノイン酸（Sigma）および２μＭのパルモファミン（Calbiochem）を添加して運動ニューロンに分化させた。分化の５日後、胚様体を、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ／ＤｉＶａソーター（Becton Dickinson社製）によりＧＦＰについて分離および選別した。
【００７９】
実施例８
ミクログリア／運動ニューロン共培養
Ｈｂ９−ＧＦＰ＋運動ニューロンを、ラミニン（５μｇ／ｍｌ、Invitrogen）でコーティングした９６ウェルプレートに１ウェル当たり６，０００細胞の密度で播種した。翌日、運動ニューロン培地（ＤＭＥＭ：Ｆ１２（Invitrogen）、５％ウマ血清、２％  Ｎ２（Invitrogen）、２％  Ｂ２７（Invitrogen）＋ＧＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、Invitrogen）、ＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、Invitrogen）、ＣＮＴＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、Invitrogen））中、１ウェル当たり３５，０００細胞の密度で、ミクログリアを運動ニューロンの上に播種した。共培養プレートを、IN Cell Analyzer 6000（GE Healthcare）により、毎日、画像化した。画像を処理し、IN Cell Developer Toolbox 1.9 および IN Cell Analyzer Workstation 3.7 ソフトウェア（GE Healthcare）を用いて分析し、１ウェル当たりのＧＦＰ＋運動ニューロンの生存数を定量した。
【００８０】
実施例９
ウイルス産生
ミクログリアにおけるトランスジェニックＳＯＤ１発現を、既報の短鎖干渉ＲＮＡ配列を発現するレンチウイルス形質導入によってノックダウンした（Haidet-Phillips et al., 2011; Miller et al., 2006）。レンチウイルスＳＯＤ１−ｓｈＲＮＡおよびスクランブル−ｓｈＲＮＡを、リン酸カルシウムを使用してＨＥＫ２９３細胞への一過性トランスフェクションを行い、次いで上清から超遠心分離によりウイルス精製することにより作製した。アデノウイルスベクター（Ａｄ−ＲＦＰ、Ａｄ−ｃｒｅ、Ａｄ−ＤＮｉκＢα、およびＡｄ−ＩκＢα−ＳＲ）をVector Biolabs社から購入した。ミクログリアを一晩ＭＯＩ＝２５で感染させ、その後ＨＢＳＳで洗浄し、３日間インキュベート後に、運動ニューロンと共培養した。
【００８１】
実施例１０
ウェスタンブロット法
細胞および組織を、ＥＤＴＡ、完全プロテアーゼ阻害剤(Roche)およびホスホ−ＳＴＯＰ(Roche)を含む組織タンパク質抽出試薬(Pierce)中で均質化した。サンプルを、ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％  ビス−トリスポリアクリルアミドゲル上で泳動し、ＰＶＤＦ膜（Life Technologies）に移した。ブロットを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中の５％ミルク粉末、０．５％ＢＳＡ中で１時間ブロッキングし、その後、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。結合した一次抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体と反応させ、その後化学発光（ECL Western Blot Substrate, Pierce）により検出した。抗体は表２に記載される。
【００８２】
実施例１１
免疫組織化学
動物を致死量のキシラジン／ケタミンで深麻酔し、生理食塩水、その後４％パラホルムアルデヒドで経心腔的灌流した。脊髄を、振動刃ミクロトーム（Leica microsystems）を用いて４０μｍの厚さに切断した。切片を、ＴＢＳ＋１％トライトン−Ｘ＋１０％ロバ血清中、室温にて２時間、インキュベートした。サンプルを、４℃にて７２時間、一次抗体と共にインキュベートし、次いで、室温にて２時間、二次抗体とインキュベートした。全ての画像をツァイス共焦点顕微鏡（Carl Zeiss Microscopy, Thornwood, NY, USA）で得た。抗体は表２に記載される。ＭＮおよびミクログリアの定量化のために、腰部脊髄を、仙骨部レベル１から胸部レベル１４の末端まで厚さ４０μｍで切断した。ＭＮ数を計数するために、腰部脊髄切片を、最初の識別可能なＬ１切片からＬ６の５切片毎に選択し、切片を、ミクログリアの定量化のために８切片毎に選択した。
【００８３】
実施例１２
ＥＬＩＳＡ
ＴＮＦα  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（R＆D Systems）を製造業者の指示に従って用いて、共培養培地中のＴＮＦα濃度を定量した。共培養培地中の一酸化窒素濃度を、全一酸化窒素および硝酸塩／亜硝酸塩パラメータキット（R＆D Systems）を製造業者の指示に従って用いて決定した。共培養培地を集め、２００ｇで２分間遠心し、そして分析のために５０ｕＬの培地を各ウェルに添加した。ホスホ−ｐ６５および総ｐ６５  ＥＬＩＳＡキットを製造業者の指示に従って用いて、細胞溶解物中のＮＦ−κＢ活性化を定量化した（Cell Signaling）。全ての条件を三重(triplicate)で試験した。
【００８４】
実施例１３
統計分析
全ての統計的検定のために、グラフパッドプリズム６ソフトウェア（La Jolla, CA）を用いた。グループ間の平均差異の統計分析は、スチューデントのｔ検定または一方向ＡＮＯＶＡにより行い、次いで、ボンフェローニ事後解析を各試験の変数に応じて行った。全てのｐ値とｎ値は、図面の簡単な説明の欄に記載されている。
【００８５】
実施例１４
ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスにおける疾患の進行とＮＦ−κＢ活性化
ＡＬＳにおけるＮＦ−κＢ制御への考察を得るために、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスモデルからの全脊髄核溶解物にＥＭＳＡ分析を行った。ＮＦ−κＢ  ＤＮＡ結合活性は、野生型同腹仔と比較して終末期ＡＬＳマウスにおいて増加することが見出された（図Ｓ１Ａ）。スーパーシフトＥＭＳＡおよび核ウェスタン分析は、ＮＦ−κＢのｐ６５およびｐ５０サブユニットの結合寄与（図１Ｂ）およびｃ−ＲｅｌまたはＲｅｌＢサブユニットの無結合寄与（図Ｓ１Ｂ、Ｓ１ＣおよびＳ１Ｄ）を明らかにした。疾患の異なる段階でＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスモデルにおける古典的ＮＦ−κＢ（ｐ６５／ｐ５０）活性化の程度を調べるために、全腰部脊髄タンパク質を、発症前（ｐｒｅ−ＳＹＭ）、疾患発症、症候性（ＳＹＭ）、後期（ｌａｔｅ−ＳＹＭ）および終末期（ＥＳ）にて、３匹のＳＯＤ１−Ｇ９３Ａメスマウスからのホスホ−ｐ６５（ＮＦ−κＢの活性型）について分析した。ＡＬＳ動物において疾患が進行するにつれて、ホスホ−ｐ６５レベルが発症前（ｐｒｅ−ＳＹＭ）から疾患発症（ＳＹＭ）へ緩やかに増加したが、変化倍は統計的に有意ではなかった。しかしながら、後期のホスホ−ｐ６５レベルは、野生型と比較してＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスで１３．７倍増加し、ＥＳにて野生型よりも８．７倍高かった（図１Ａおよび１Ｂ）。
【００８６】
後期−ＳＹＭ段階で観察されたホスホ−ｐ６５レベルの上昇が、終末期（ＥＳ）でのレベルと比較して統計的に異なっているかどうかを決定するために、腰部脊髄溶解物を、さらなる後期（ｎ＝６）および終末期（ＥＳ）ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウス（ｎ＝６）から分析した。この試験は、後期と終末期（ＥＳ）との間のＮＦ−κＢ活性化には統計的な差がないことを明らかにした（図Ｓ１ＥおよびＳ１Ｆ）。この増加に対するアストロサイトの寄与を決定するために、初代アストロサイトを、後期段階で野生型およびＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスの脊髄から単離した。ウェスタンブロット分析は、野生型と比較してＡＬＳのアストロサイトにおけるホスホ−ｐ６５の４．４倍増加を示した（図１Ｃ）。
【００８７】
実施例１５
アストロサイトにおけるＮＦ−κＢ阻害は、インビトロまたはインビボにおいて神経保護を付与しない。
ＡＬＳにおいてアストロサイトが介在するＭＮ死へのＮＦ−κＢ活性化の関連性を決定するために、ＮＦ−κＢ阻害を、家族性ＡＬＳの共培養モデルにてインビトロで試験した。ＡＬＳグリアと共培養したとき、ＭＮ病理および細胞死を複数回再現して示されている、Ｈｂ９−ＧＦＰレポーターを含む胚性幹細胞株を用いた（Di Giorgio et al., 2007; Haidet-Phillips et al., 2011; Nagai et al., 2007）。さらに、Ｈｂ９−ＧＦＰレポーターは、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）およびアストロサイトと共培養したＭＮの簡易な可視化によって、ＭＮの精製を可能にする（Wichterle et al., 2002）。共培養の５日後、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａアストロサイト上に存在するＭＮ数は、野生型アストロサイト上に存在するＭＮと比較して統計的に４９％減少した（図Ｓ２Ａ）。ＳＯＤ１−Ｇ９３ＡアストロサイトにおけるＮＦ−κＢの役割を試験するために、リン酸化誘導分解に抵抗性であり、ＮＦ−κＢの核移行およびトランス活性化機能を阻害する（Wang et al., 1999）、ＮＦ−κＢのトランスドミナントスーパーリプレッサー（ＩκＢα−ＳＲ）阻害剤を発現しているアデノウイルスを用いた。アデノウイルスベクターは、インビトロでアストロサイトのほぼ１００％を標的とすることができた（データ示さず）（Miranda et al., 2012）。しかしながら、ＳＯＤ１−Ｇ９３ＡアストロサイトにおけるＩκＢα−ＳＲの過剰発現は、ホスホ−ｐ６５レベルを低下させるにもかかわらず、インビトロでのＭＮ死を救済しなかった（図Ｓ２ＡおよびＳ２Ｂ）。実際には、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａアストロサイトと比較して、ＩκＢα−ＳＲを過剰発現するＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ アストロサイトとの共培養の４日後に生存するＭＮは減少したが、有意性は、その後数日で失われた（３００．７±１０．８および１９２．０±２２．０、Ｐ＜０．０１）（図Ｓ２Ａ）。
【００８８】
ＮＦ−κＢ阻害はまた、２つの独立した、細胞型特異的なアプローチ：ウイルス媒介遺伝子送達およびトランスジェニックｃｒｅ−ｌｏｘ組換え、を用いてインビボで試験した。ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスにアデノ随伴ベクターの血清型９（ＡＡＶ９）を注入してＩκＢα−ＳＲを送達した。マウスに、ＣＮＳにおいて＞５０％アストロサイトを優先的に標的とするために、生後６０日目に注入した（Foust et al., 2008; 2013）。ＡＡＶ９を用いるアストロサイトにおけるＩκＢα−ＳＲの過剰発現は、非注入対照マウス（図１ＤおよびＥ）またはＡＡＶ９−ＧＦＰを注入したＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスと比較して、生存率も変えず、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスの運動パフォーマンスも改善しなかった（Foust 2013）。
【００８９】
ＳＯＤ１−Ｇ９３ＡマウスのアストロサイトにおけるＮＦ−κＢを遺伝子導入により阻害するために、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスを、ｌｏｘＰ部位に隣接するｉｋｂｋｂ（ＩＫＫβ）遺伝子のエクソン３を有する、ＩＫＫβの条件付突然変異を有するマウス（ＩＫＫβｆ／ｆ）と交配した（Li et al., 2003; Park et al., 2002）。次いで、これらのマウスを、アストロサイトのグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターの制御下でｃｒｅリコンビナーゼを発現するマウス系統と交配して、ＩＫＫβおよび下流のＮＦ−κＢ活性をアストロサイトにおいて特異的になくす。
【００９０】
ｃｒｅ発現が脊髄におけるＧＦＡＰを発現するアストロサイトに限定されることの確認は、全てのｃｒｅ発現細胞においてｔｄＴｏｍａｔｏ（ＲＦＰ）を発現するＲｏｓａ２６系統にＧＦＡＰ−ｃｒｅマウスを交配することにより完了した（図Ｓ２Ｃ）。ロバストなＲＦＰ発現が、ＧＦＡＰ＋およびＥＡＡＴ２＋細胞で観察された（図Ｓ２Ｄ）；ＲＦＰ発現は、脊髄において、Ｉｂａ−１＋ミクログリアならびにＣｈＡＴ＋ニューロンには存在しなかった（図Ｓ２Ｃ）。ＷＴ；ＩＫＫβｆ／ｆおよびＳＯＤ１；ＩＫＫβｆ／ｆマウスからの腰部脊髄タンパク質の免疫ブロットは、疾患の症候性段階のＳＯＤ１ ｃｒｅ−マウスと比較して、ＳＯＤ１；ＩＫＫβｆ／ｆ；ＧＦＡＰ−ｃｒｅ＋マウスにおけるホスホ−ｐ６５レベルの５８％の減少を示した（図Ｓ２Ｅ）。ホスホ−ｐ６５の減少にもかかわらず、ＳＯＤ１；ＩＫＫβｆ／ｆ；ＧＦＡＰ−ｃｒｅ＋マウスにおける運動障害および生存率は、ＧＦＡＰ−ｃｒｅ−陰性対照と比較して改善されなかった（図１Ｆおよび１Ｇ）。これらの知見は、生存または運動パフォーマンスの改善が認められなかった、ＧＦＡＰプロモーター下でＩκＢα−ＳＲを過剰発現する株とＡＬＳマウスを交配する最近の研究と一致している（Crosio et al., 2011）。
【００９１】
実施例１６
ＮＦ−κＢ活性化は、主にミクログリアで起こる。
アストロサイトが腰部ＮＦ−κＢ活性化の増加に寄与する主な、または唯一の細胞であるかどうかを評価するために、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスを、ＮＦ−κＢ ｃｉｓ エレメントの制御下にＧＦＰを発現するＮＦ−κＢ−ＧＦＰレポーターマウス系統と交配させた（Magness et al., 2004）。ＳＯＤ１−Ｇ９３ＡにおけるロバストなＮＦ−κＢ活性化は、腰部脊髄タンパク質において疾患の後期段階で明らかであったため、ＧＦＰ発現について後期ＳＯＤ１；ＮＦ−κＢ−ＧＦＰマウスからの腰部脊髄切片を分析した。明るいＧＦＰ＋細胞集団が観察され、重複するＩｂａ−１染色によりミクログリアと同定された（図２Ａ）。ＧＦＡＰ＋アストロサイトの薄暗いＧＦＰ＋集団（図２Ｂ）もまた、観察された。これらの知見は、後期ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスから単離したミクログリアからのタンパク質においてホスホ−ｐ６５レベルを分析することにより確認された。ホスホ−ｐ６５は、ＷＴ ミクログリアよりもＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアで１２．４倍高かった（図２Ｃ）。
【００９２】
実施例１７
ＮＦ−κＢ活性化の時間経過
疾患が進行するにつれてミクログリアにおけるＮＦ−κＢ活性化の経過を決定するために、免疫組織化学を、前症候性段階、疾患発症、症候性、後期および終末期のＳＯＤ１；ＮＦ−κＢ−ＧＦＰ腰部脊髄切片にて行った。ＧＦＰ＋細胞は、疾患発症時に観察され、疾患が進行するにつれて数およびＧＦＰ強度の増加が観察された。さらに、ＮＦ−κＢ活性をを示すミクログリア（トマトレクチン）のマーカーと共局在するＧＦＰ＋細胞の大部分は、ミクログリア活性化およびグリオーシスと一致している（図２ＤおよびＥ）。これらのデータは、ミクログリアが、ＡＬＳ疾患の進行中に起こるロバストなＮＦ−κＢ活性化に寄与することを明らかにする。
【００９３】
実施例１８
成熟ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアは、インビトロにて運動ニューロンに毒性である。
ミクログリアがＡＬＳにおける運動ニューロン死を媒介する機序、およびこの過程におけるＮＦ−κＢ活性化の寄与の可能性をさらに試験するために、ＡＬＳのインビトロ共培養モデルを確立した。素晴らしい研究が、新生仔マウスから単離された変異体ＳＯＤ１ミクログリアが、野生型ミクログリアと比較して、運動ニューロン生存のおよそ１８％の低下を誘導することを実証した（Xiao et al., 2007）。このモデルにおける運動ニューロン毒性はわずかであるため、これらの若い細胞は、成熟発症の神経変性疾患の重要な面を再現しなかった可能性がある。従って、症候性ＡＬＳマウスから単離された初代成熟ミクログリアを用いる共培養法を確立した。密度分離および培養選択を組み合わせる既報の方法を用いた（Moussaud and Draheim, 2010）。簡単には、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスおよび野生型同腹仔からの脳を機械的および酵素的に解離し、グリア細胞の混合集団を得るためにパーコール勾配に付した。該グリア細胞を平板培養し、コンフルエントに達した後は、ミクログリアを該平板から剥がし、培地に浮遊させて回収した。この方法によって得られた成熟ミクログリアの免疫細胞化学的特性化は、この方法によって得られたミクログリアの９０％以上が、Ｉｂａ−１、ＣＤ１１ｂおよびＦ４／８０について陽性であり、かつＧＦＡＰ、ＣｈＡＴおよびＮＧ２について陰性であることを示した（図３ＡおよびＢ）。フローサイトメトリーは、均質なＣＤ４５＋およびＣＤ１１ｂ＋ミクログリア集団を示す（図３Ｃ）。従って、この方法で得られたミクログリアは、全てのプロトタイプのミクログリアマーカーを発現する。脊髄または脳由来のミクログリアを用いたとき、アッセイにおいて差異はなかった。従って、実験は、使用する動物数を少なくするために、脳のミクログリアを用いて行った。
【００９４】
運動ニューロン死を誘導するＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ成熟ミクログリアの能力を測定するために、ＷＴ Ｈｂ９：：ＧＦＰ＋運動ニューロンを、ＷＴまたはＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアと共培養した。７２時間後、５０％の統計的減少が、ＷＴ同腹仔から単離したミクログリアと比較して、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアと共培養した運動ニューロンで観察された（図３Ｄおよび３Ｅ）。さらに、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアと共培養した運動ニューロンは、顕著に短くなった突起を有していた（図３Ｄ）。
【００９５】
この運動ニューロン死が、原因となるＳＯＤ１変異に特異的であったことを確認するために、ｓｈＲＮＡを、レンチウイルスにより、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアにおけるヒトＳＯＤ１導入遺伝子を標的として発現させた。ＥＬＩＳＡ結果は、ｓｈＲＮＡが、変異タンパク質を７５％減少させたことを示した（図３Ｆ）。変異ＳＯＤ１タンパク質がＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアにおいて減少したとき、運動ニューロン生存率は、ＲＦＰを感染させたＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアと比較して、完全に回復した（図３Ｄおよび３Ｅ）。用いたｓｈＲＮＡは、配列ＣＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＡ（配列番号：１）を有した。
【００９６】
実施例１９
成熟ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアは、インビトロにおいて、ＮＦ−κＢ依存性の機序により運動ニューロン死を誘導する。
ミクログリアにおけるＮＦ−κＢ活性が、ＡＬＳのインビトロ共培養モデルにおける運動ニューロン死に関与するかどうかを調べるために、２つの独立した方法を採用して、ミクログリアにおけるＮＦ−κＢ活性化を阻止した。初めに、ＤＮ−ｉκＢα（ｉκβα−ＳＲとも言う）を、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａおよび野生型ミクログリアにおいて、アデノウイルス（Vector Biolabs, Philadelphia, PA）を介して過剰発現させた。ＲＦＰを発現するアデノウイルスを用いる最初の実験の間、ＭＯＩ＝２５は、ミクログリアの顕著に効率のよい形質導入をもたらした。ＤＮ−ｉκＢαの配列（配列番号：２）は以下の通りである。
【００９７】
配列番号：２
atgtttcagccggcgggccatggccaggattgggcgatggaaggcccgcgcgatggcctg 
aaaaaagaacgcctggtggatgatcgccatgatgcgggcctggatgcgatgaaagatgaa 
gaatatgaacagatggtgaaagaactgcgcgaaattcgcctgcagccgcaggaagcgccg
ctggcggcggaaccgtggaaacagcagctgaccgaagatggcgatagctttctgcatctg 
gcgattattcatgaagaaaaaccgctgaccatggaagtgattggccaggtgaaaggcgat 
ctggcgtttctgaactttcagaacaacctgcagcagaccccgctgcatctggcggtgatt 
accaaccagccgggcattgcggaagcgctgctgaaagcgggctgcgatccggaactgcgc 
gattttcgcggcaacaccccgctgcatctggcgtgcgaacagggctgcctggcgagcgtg
gcggtgctgacccagacctgcaccccgcagcatctgcatagcgtgctgcaggcgaccaac 
tataacggccatacctgcctgcatctggcgagcattcatggctatctggcgattgtggaa 
catctggtgaccctgggcgcggatgtgaacgcgcaggaaccgtgcaacggccgcaccgcg 
ctgcatctggcggtggatctgcagaacccggatctggtgagcctgctgctgaaatgcggc 
gcggatgtgaaccgcgtgacctatcagggctatagcccgtatcagctgacctggggccgc
ccgagcacccgcattcagcagcagctgggccagctgaccctggaaaacctgcagatgctg 
ccggaaagcgaagatgaagaaagctatgataccgaaagcgaatttaccgaagatgaactg 
ccgtatgatgattgcgtgtttggcggccagcgcctgaccctg
【００９８】
遺伝子的アプローチもまた、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβｆ／ｆマウスからミクログリアを単離し、インビトロで該ミクログリアにｃｒｅリコンビナーゼを発現するアデノウイルスを感染させて、単離後のミクログリアにおけるＩＫＫβｆ／ｆを除去するために用いた。１２時間後、ＷＴ対照と比較して、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアと共培養した運動ニューロンの運動ニューロン生存率または軸索の長さにおける差異は観察されなかった（図４Ａ）。しかしながら、運動ニューロンを、ＷＴと比較してＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアと共培養したとき、共培養の７２時間後に、運動ニューロン生存率の６１％の減少および軸索の長さの顕著な短縮が観察された（図４Ｂ）。これらの共培養のライブイメージングは、ミクログリアの動的性質およびＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアにより誘発された迅速な運動ニューロン死を捉えた。最初に、野生型ミクログリアは、ＦＡＣＳソーティングおよびプレーティングから生じた運動ニューロン残屑（debris）を貪食した。次いで、野生型ミクログリアは、運動ニューロンのシナプスを積極的に検査して（actively survey）処理しているが、無傷のシナプスを破壊しない。逆に、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアは、無傷のシナプスを攻撃し、運動ニューロン死を誘導し、その後死んだニューロンを貪食する。驚くべきことに、遺伝子導入またはＤＮ−ＩκＢα−ＳＲの過剰発現のいずれかによるＮＦ−κＢ阻害は、運動ニューロンの軸索の長さおよびインビトロでの生存率を、野生型レベルに完全に回復した（図４Ａおよび４Ｂ）。ＮＦ−κＢ阻害を有するＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアを示すライブイメージングは、無傷の運動ニューロンを野生型ミクログリアと同様に保護した。
【００９９】
ＮＦ−κＢ阻害の程度を調べるために、それぞれＮＦ−κＢ活性化の産物および炎症誘発ミクログリアのマーカーである、一酸化窒素（ＮＯ）およびＴＮＦ−αレベルを、共培養培地において測定した（Ghosh and Karin, 2002）。ＴＮＦ−αレベルｇは、ＮＦ−κＢが、Ａｄ−ＤＮ−ｉκＢαおよびＡｄ−ｃｒｅをそれぞれ用いるＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアにおいて阻害されるとき、４５％および６４％減少した（図４Ｃ）。一酸化窒素（ＮＯ）レベルは、Ａｄ−ＤＮ−ｉκＢαおよびＡｄ−ｃｒｅをそれぞれ用いるＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアにおいて、７１％および５６％減少した（図４Ｄ）。ＴＮＦ−αおよびＮＯレベルに対応して、ホスホ−ｐ６５は、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアと比較して、それぞれＡｄ−ＩκＢα−ＳＲおよびＡｄ−ｃｒｅを用いて、７９％および８１％減少した（図４Ｅ）。これらのデータは、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアが、ＮＦ−κＢ依存的機序で運動ニューロン死を誘導することを示唆する。
【０１００】
実施例２０
ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアは、インビボにて、ＮＦ−κＢ依存的機序で運動ニューロン死を誘導する。
（１）ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスにおける疾患発症(disease course)中のＮＦ−κＢ活性化は、ミクログリアで主に起こり（図２）、および（２）ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアは、ＮＦ−κＢ依存性の機序を利用して、インビトロにて運動ニューロン死を誘導することが明らかである（図４）ことが確立されたため、ミクログリアにおけるＮＦ−κＢ阻害が、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスモデルにおいて疾患の経過を変化させるかどうかを決定した。ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβｆ／ｆマウスを、コロニー刺激因子受容体１（ＣＳＦ−１Ｒ）をコード化する遺伝子ｃ−ｆｍｓのためのプロモーターにより駆動されるｃｒｅリコンビナーゼを発現するマウスと交配した。ｃ−ｆｍｓプロモーターの制御下にＧＦＰを発現するレポーターマウスにおいて、ＣＳＦ−１Ｒは、マウスの単核食細胞系全体で発現されるが、出生後のマウス脳においては、ミクログリアのみがＣＳＦ−１Ｒを発現する（Erblich et al., 2011; Sasmono et al., 2003）。ｃ−ｆｍｓ（ＣＳＦ−１Ｒ）プロモーターにより駆動されるｃｒｅ発現の細胞型特異性を確認するために、ＣＳＦ−１Ｒ−ｃｒｅマウスを、全てのｃｒｅ発現細胞でＲＦＰを発現するＲｏｓａ２６−Ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏマウス系統と交配した。ＲＦＰ発現は、成熟マウス脊髄のＩｂａ−１−陽性ミクログリアにおいてのみ観察され、ＲＦＰ発現は、運動ニューロンおよびアストロサイトには存在しなかった（図Ｓ３ＡおよびＳ３Ｂ）。
【０１０１】
野生型およびＳＯＤ１ ＣＳＦ−１Ｒ−ｃｒｅ＋マウスのＩＫＫβｆ／ｆに対するホモ接合体は、ＮＦ−κＢを欠く骨髄細胞を有するマウスで既に報告されている、脾腫、眼感染症および歯の欠落または非常に脆い歯のような深刻な免疫機能障害を示した（Ruocco et al., 2005; Vallabhapurapu and Karin, 2009）。これらのマウスは、生存率を評価するのに十分長くコロニーで維持することができず、従って、floxed ＩＫＫβアレル（ＩＫＫβＦ／ｗｔ）についてのマウスヘテロ接合体を分析した。ヘテロ接合体マウスにおけるＩＫＫβノックダウン効率を決定するために、免疫組織化学を、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβｆ／ｗｔ；ＣＳＦ−１Ｒ−ｃｒｅ＋およびｃｒｅ−マウスからの腰部脊髄切片においてＩＫＫβに対して行った。ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβｆ／ｗｔ；ＣＳＦ−１Ｒ−ｃｒｅ＋は、ｃｒｅ陰性対照と比較してＩＫＫβ染色の減少を示した（図Ｓ３Ｃ）。ノックダウンがＩＫＫβに特異的であったことを確実にするために、本発明者らは、ＩＫＫシグナル伝達複合体の調節サブユニットであるＩＫＫγを評価し、ＣＳＦ−１Ｒ−ｃｒｅ＋マウスとｃｒｅ−マウスとの差異は観察されなかった（図Ｓ３Ｃ）。ＩＫＫβを減少させ、従ってＮＦ−κＢ活性化を減少させると、結果として、ｃｒｅ−対照マウスと比較して、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβｆ／ｗｔ；ＣＳＦ−１Ｒ−ｃｒｅ＋マウスの平均生存日数が２０日間延長された（ｃｒｅ−で１３３±日およびｃｒｅ＋で１５３±日）（図５Ａ）。疾患の発症は変化しなかったが（ｃｒｅ−で１０２．８±１．１日およびｃｒｅ＋で１０１．１±１．３日）、疾患の進行は、ｃｒｅ−マウスと比較してｃｒｅ＋マウスで４７％延長された（ｃｒｅ−で３４．８±１．４日およびｃｒｅ＋で５１．１．１±１．７日）（図５Ｂおよび５Ｃ）。日齢を合わせた同腹仔のビデオは、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβｆ／ｗｔ；ＣＳＦ−１Ｒ−ｃｒｅ＋マウスはケージの周りを移動することができたが、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβｆ／ｗｔ；ＣＳＦ−１Ｒ−ｃｒｅ−同腹仔は終末期であることを示した。疾患の進行の４７％遅延を達成したＮＦ−κＢ阻害のレベルを確認するために、腰部脊髄タンパク質を、終末期のＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβｆ／ｗｔ；ＣＳＦ−１Ｒ−ｃｒｅ＋またはｃｒｅ−マウスからホスホ−ｐ６５について調べた。驚くことに、ホスホ−ｐ６５は、ｃｒｅ−ＳＯＤ１対照と比較して、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβｆ／ｗｔ；ＣＳＦ−１Ｒ−ｃｒｅ＋マウスで４４％減少していたが（図５Ｄ）、ｐ６５は、ＷＴ対照よりも７．５倍以上発現していた。特に、ＮＦ−ｋＢ阻害は、ｃｒｅ−ＳＯＤ１対照マウスと比較して、ＣＳＦ−１Ｒ−ｃｒｅ＋マウスにおいて変異ＳＯＤ１のレベルを減少させなかった（図５Ｄ）。
【０１０２】
アストログリオーシスおよびミクログリオーシスに対するＮＦ−κＢ阻害の影響を決定するために、腰部脊髄切片を、それぞれＧＦＡＰおよびＩｂａ−１の強度について免疫組織化学により調べた。グリオーシスにおける差異は、終末期ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβｆ／ｗｔ；ＣＳＦ−１Ｒ−ｃｒｅ＋マウスとｃｒｅ−マウスとの間で検出されなかった。しかしながら、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβｆ／ｗｔ；ＣＳＦ−１Ｒ−ｃｒｅ＋マウスが、対照マウスと比較してさらに３週間、疾患に耐えたことを考慮すると、疾患において早期に達成されるグリオーシスの相違は、終末期に失われる可能性がある。実際に、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβｆ／ｗｔ；ＣＳＦ−１Ｒ−ｃｒｅ＋マウスを、ｃｒｅ−同腹仔対照が終末期に達したのと同月齢で屠殺すると、Ｉｂａ−１（２５％）およびＧＦＡＰシグナル強度（３１％）のかなりの減少が観察され、ミクログリオーシスおよびアストログリオーシスが、月齢を合わせた対照マウスと比較してＣＳＦ−１Ｒ−ｃｒｅ＋マウスで減少したことが示された（図５Ｅ、５Ｆおよび５Ｇ）。
【０１０３】
実施例２１
ＮＦ−κＢは、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアの炎症促進性、神経毒性表現型への変換を調節する。
ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβｆ／ｗｔ；ＣＳＦ−１Ｒ−ｃｒｅ＋で観察された生存率の増加は、低下した炎症促進性ミクログリア応答によるものであり得るため、ミクログリアは、ＣＤ６８、ｉＮＯＳおよびＣＤ８６のようなミクログリア活性化の既知のマーカーについて特徴付けられたと考えられた（Kigerl et al., 2009）。疾患が進行するにつれて、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスは、終末期で最大であるＣＤ６８−陽性ミクログリアにおけるロバスト誘導を示すことが観察された（データ示さず）（Beers et al., 2011b）。ＳＯＤ１ ｃｒｅ−陰性対照と比較して、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβｆ／ｗｔ；ＣＳＦ−１Ｒ−ｃｒｅ＋マウスにおけるＣＤ６８陽性ミクログリア数の顕著な減少が、観察された（図６Ａ）。腰部脊髄切片におけるＣＤ６８＋／Ｉｂａ１＋細胞の定量化は、切片当たり、平均４３８．３±１３．４細胞を有するＳＯＤ１ ｃｒｅ−同腹仔と比較して、ミクログリアのＮＦ−κＢ阻害を有するマウスでは平均１１２．４±４．７細胞であることを明らかにした（図６Ｂ）。切片当たりのｉＮＯＳ＋／Ｉｂａ１＋細胞数はまた、ＳＯＤ１対照における２５１．１±１５．０から、ミクログリアＮＦ−κＢ阻害を有するマウスにおいて４７．８±３．１に、顕著に減少した（図６Ｃ、６Ｄ）。同じ傾向で、ミクログリアＮＦ−κＢ阻害を有するマウスは、ＳＯＤ１対照（切片当たり、３２０．３±１５．６細胞）と比較して、ＣＤ８６＋／Ｉｂａ１＋細胞（切片当たり、９７．８±７．４）の顕著な減少を示した（図６Ｅおよび６Ｆ）。Ｍ２マーカーであるＣＤ２０６、アルギナーゼおよびＣＤ２０４における変化は、免疫組織化学によって観察されなかった。
【０１０４】
実施例２２
ミクログリアにおける選択的なＮＦ−κＢ活性化は、インビトロにて運動ニューロン死を誘導する。
ＮＦ−κＢ活性化は、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアが運動ニューロン死を誘導することによる機序であるならば、野生型ミクログリアにおける恒常的に活性化されたＮＦ−κＢは、運動ニューロン死を誘導するのに十分であり得ると考えられた。ミクログリアを、ｃｒｅリコンビナーゼの発現により誘導される恒常的に活性化されたＩＫＫβ（ＩＫＫβ ＣＡ）を有するＲｏｓａ２６−ＳｔｏｐＦｌｏｘＩＫＫβＣＡマウスから単離した。単離後、これらのマウスからのミクログリアを、ｃｒｅリコンビナーゼ（Ａｄ−ｃｒｅ）を発現するアデノウイルスを感染させて、恒常的に活性化されたＩＫＫβ（ミクログリアはＩＫＫβＣＡと称される）または対照としてＡｄ−ＲＦＰ（ミクログリアはＷＴと称される）の転写を誘導した。ＷＴまたはＩＫＫβＣＡミクログリアとの共培養の１２時間後、運動ニューロンの軸索の長さまたは生存率に差異は観察されなかった（図７Ａ）。７２時間後、ＩＫＫβＣＡミクログリアとの共培養は、対照と比較して、運動ニューロン生存率の５０％の統計的減少を誘導した（図７Ａ、７Ｂ）。ライブイメージングは、ＩＫＫβＣＡミクログリアが運動ニューロン死を迅速に誘導するのを示した。ＮＦ−κＢ活性化は、野生型と比較して、ＩＫＫβＣＡミクログリアでホスホ−ｐ６５／総ｐ６５の１．７倍増加をもたらしたことを、ＥＬＩＳＡにより確認した（図７Ｃ）。効率は、共培養培地中の一酸化窒素（ＮＯ）およびＴＮＦ−αレベルを測定することによってＮＦ−κＢ誘導を評価した。ＴＮＦ−αレベルは、ＷＴミクログリアと比較してＩＫＫβＣＡミクログリアとの共培養で２．３倍増加し、それは、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ ミクログリアおよび活性化型ミクログリアの特性によるＴＮＦ−α誘導に匹敵する（図Ｓ４Ａ）。ＩＫＫβＣＡミクログリア／運動ニューロン共培養における一酸化窒素（ＮＯ）レベルは、野生型（図Ｓ４Ｂ）よりも１．５倍高かった。これらのデータは、ミクログリアにおける恒常的ＮＦ−κＢ活性化が、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ変異に無関係に運動ニューロン死を誘導するのに十分であることを示す。
【０１０５】
実施例２３
ＮＦ−κＢは、ミクログリア活性化を調節して、炎症促進性の、神経毒性表現型する。
恒常的に活性なＩＫＫβ（ＩＫＫβＣＡ）は、インビボにおいて、骨髄細胞で選択的に発現されて、ＡＬＳマウスにて観察されたのと同様に野生型ミクログリアにおける炎症状態を誘導する。ＣＳＦ−１Ｒ−ｃｒｅを発現するマウスを、Ｒｏｓａ２６−ＳｔｏｐＦｌｏｘＩＫＫβＣＡマウスと交配する（ＩＫＫβＣＡと称する）。ＩＫＫβＣＡマウスは、ｃｒｅ陰性同腹仔と比較して、腰部脊髄タンパク質中のホスホ−ｐ６５の８．２倍増加を示した（図７Ｄ）。４月齢および８月齢のＷＴおよびＩＫＫβＣＡ同腹仔の腰部脊髄の免疫組織化学を行った（図７Ｉ）。これらのマウスにおける４月齢および８月齢での増強されたミクログリアの活性化もまた、アストロサイトと顕著に関係していた（図７Ｅ）。８月齢では、腰部脊髄中のＣｈＡＴ＋ＭＮの顕著な４０％の減少が観察された（図７Ｆ）。脊髄におけるＭＮの損失は、野生型同腹仔と比較してＩＫＫβＣＡマウスにおける減少した重量および後肢握力と一致した（図７Ｇおよび７Ｈ）。従って、骨髄細胞におけるＮＦ−κＢシグナル伝達の感性的活性化は、脊髄におけるＡＬＳの病理学的特徴、すなわち、グリオーシスおよびＭＮ死をもたらした。他のニューロンおよび脳領域は、おそらく、ＩＫＫβＣＡマウスにおけるミクログリア活性化の影響を受けているだろう。
【０１０６】
ＩＫＫβＣＡマウスにおけるミクログリアが活性化マーカーを発現するかどうかを決定するために、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスからの活性化型（Ｍ１）ミクログリア、ＩＫＫβＣＡおよびｃｒｅ陰性同腹仔からのミクログリアについて上記と同様の活性マーカー、ＣＤ６８、ｉＮＯＳおよびＣＤ８６について分析した。ＣＤ６８およびＣＤ８６の顕著な上方制御が、４月齢および８月齢のＩＫＫβＣＡマウスからのミクログリアにおいて観察された（図Ｓ５ＡおよびＳ５Ｂ）。ＩＫＫβＣＡマウスからのミクログリアはまた、野生型対照で見られるものとは大幅に異なり、Ｉｂａ−１染色により示される、より短く、太い突起を有する、分枝の少ない形態を示した。ＩＫＫβＣＡマウスにおいて、８月齢の野生型対照と比較して、ｉＮＯＳ＋ミクログリアの増加が観察されたが、４月齢では観察されなかった（図Ｓ５Ｃ）。４月齢の対照マウスと比較して、８月齢の野生型対照マウスで、ＣＤ６８およびＣＤ８６−陽性ミクログリアの増加が観察され、これは、ミクログリア活性化が加齢に伴い増加するという以前の報告を支持している（Norden and Godbout, 2013）。これらのデータは、慢性的なＮＦ−κＢ活性化が、ＭＮ死を引き起こす炎症性（Ｍ１）ミクログリア表現型を誘導することを示唆している。
【０１０７】
実施例２４
ＳＯＤ１−Ｇ９３ＡマウスのミクログリアにおけるＮＦ−κＢの減少と組み合わせた、アストロサイトにおける変異ＳＯＤ１の減少
ミクログリアにおける抑制されたＮＦ−κＢ活性化を有するマウスのアストロサイトにおける、ＳＯＤ１の減少率を評価するために、ＳＯＤ１；ＩＫＫβｆｌｏｘ／ｗｔ；ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−陽性およびＳＯＤ１；ＩＫＫβｆｌｏｘ／ｗｔ；ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−陰性マウスに、生後２１日目（ｐ２１）にＡＡＶ９−ＳＯＤ１−ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ配列は、配列番号：１である）を静脈内注射した。ＳＯＤ１−ｓｈＲＮＡと共に、ＡＡＶ９ベクターは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコード化し、ＡＡＶ９形質導入の視覚化を可能にする。免疫組織化学により示されるとおり、腰部脊髄のアストロサイトにおける多数の導入が観察された。ミクログリアマーカーＩｂａ−１とのＧＦＰ共局在は観察されず、従って、ミクログリアが形質導入された可能性は低い。免疫ブロット分析により、変異ＳＯＤ１レベルは、全腰部脊髄ホモジネートにおいて６０％減少した。同様に、ＳＯＤ１；ＩＫＫβｆｌｏｘ／ｗｔ；ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋マウスは、ホスホ−ｐ６５およびＩＫＫβの５０％減少を示し、ＮＦ−κＢシグナル伝達の低下が示された。ＮＦ−κＢ抑制および変異ＳＯＤ１減少を主に標的とする細胞タイプは、表３に記載される。マウスウイルスを注射しなかったＳＯＤ１；ＩＫＫβｆｌｏｘ／ｗｔ；ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−マウスは対象群であった。ミクログリアのみが、ＳＯＤ１；ＩＫＫβｆｌｏｘ／ｗｔ；ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋マウスにおいて標的とされた。アストロサイトは、ＡＡＶ９−ＳＯＤ１−ｓｈＲＮＡをｐ２１に注射したマウスにおいて標的とされる主要な細胞であった。しかしながら、運動ニューロンの約１０％は、ｐ２１での血管内注射で脊髄に形質導入された。ミクログリアおよびアストロサイトの両方は、ＡＡＶ９−ＳＯＤ１−ｓｈＲＮＡをｐ２１に注射されたＳＯＤ１；ＩＫＫβｆｌｏｘ／ｗｔ；ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋マウスにおいて標的とされた。
【０１０８】
ミクログリアにおけるＮＦ−κＢ活性化およびアストロサイトにおけるＳＯＤ１の減少の両方を標的とすることは、平均生存日数を、未処理の対照マウスの１３６日と比較して、１６８日に延ばした（図９Ａ，Ｂ）。これは、平均生存日数の２２．６％増加に当たる。ミクログリアでのみのＮＦ−κＢ活性化の阻害は、平均生存日数を１４％増加させた。主にアストロサイトでの変異ＳＯＤ１の低下は、平均生存日数を１６．８％増加させた。ＳＯＤ１−Ｇ９３ＡトランスジーンおよびＣＳＦ−１Ｒ−ｃｒｅの両方を保有するマウス数が限られているため、メスマウスにのみＡＡＶ９−ＳＯＤ１−ｓｈＲＮＡを注射するのではなく、オスおよびメスの両方に注射した。
【０１０９】
ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−ｐ２１注射マウスとＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋ｐ２１注射マウスとの間の平均重量の差はなかったが、動物重量は、ｃｒｅ＋同腹仔において生存中維持された（図１０Ａ）。個々のマウスを、マウスがピーク重量に達した日齢として定義されている、疾患の発症について評価したとき、ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋；ｐ２１注射したマウスは、ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−；ｐ２１注射したマウスの１０９．５±１．６日と比較して、平均１２６．４±２．１日で発症した。このことは、ミクログリアおよびアストロサイトを別個に標的とすることが未処理対照と比較して疾患の発症を変化させなかったために、驚くべきことであった（図１０Ｂ）。
【０１１０】
疾患の進行は、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβｆｌｏｘ／ｗｔ；ＣＳＦ１Ｒｃｒｅ＋未処理マウス、ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−ｐ２１注射マウスおよびＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋ｐ２１注射マウスにおいて遅延した（図１０Ｃ）。従って、アストロサイトおよび／またはミクログリアを標的とする全ての条件が、疾患の進行遅延をもたらした。
【０１１１】
加速ロータロッド（図１１Ａ）、前肢（図１１Ｂ）および後肢握力（図１１Ｃ）により測定された運動パフォーマンスは、アストロサイトおよび／またはミクログリアを標的とする全ての条件において改善された。ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβｆｌｏｘ／ｗｔ；ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋未処理マウスは、ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−未処理同腹仔と比較して、ロータロッド性能を維持し、前肢および後肢握力が増加した（図１１Ａ，Ｂ，Ｃ）。未処理のＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋マウスおよびＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−マウスにおける後期での相違と同様に、ｐ２１で注射した群（ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋およびＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−）は、ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋マウスが生存率の増加に伴い運動機能をより長く維持したとき、疾患の後期まで同様の運動パフォーマンスを示した。これらのデータは、ミクログリアおよびアストロサイトが、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスモデルにおいて有益であったことを示唆している。
【０１１２】
【表８】
2016538276.tif 000010
【０１１３】
ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋およびＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ；ＩＫＫβｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−マウスを作製し、３つの群に分けた：非注入、ｐ２１で注射、およびｐ１で注射。非注入のＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−マウスを、標的とされる任意の細胞を含まない未処理群であった。ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋マウスは、１００％のミクログリアで減少したＮＦ−κＢシグナル伝達を有した。ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−；ｐ２１注射マウスは、ミクログリアにおける完全なＮＦ−κＢ活性を有し、アストロサイトの減少したＳＯＤ１レベルを有した。ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋；ｐ２１注射マウスは、減少したミクログリアのＮＦ−κＢシグナル伝達を有し、アストロサイトにおける減少したＳＯＤ１レベルを有した。ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ−；ｐ１注射マウスは、運動ニューロンおよびいくつかのアストロサイトにおける、完全なＮＦ−κＢシグナル伝達および減少したＳＯＤ１レベルを有した。ＣＳＦ１Ｒ−ｃｒｅ＋；ｐ１注射マウスは、ミクログリアにおける減少したＮＦ−κＢシグナル伝達を有し、運動ニューロンおよびいくつかのアストロサイトにおける減少したＳＯＤ１レベルを有した。
【０１１４】
実施例２５
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）および核ウェスタンブロット
ＥＭＳＡ分析およびスーパーシフト分析は、上記の通り、全脊髄核溶解物で行った（Dahlman & Guttridge, 2012）。核ウェスタンブロットを、ＥＭＳＡに用いたのと同じ核溶解物を用いて行った。ｐ６５、ｐ６０、ｃ−ＲｅｌおよびＲｅｌＢに対する抗体は、表２に記載されている。
【図１０−２】
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【図１１−３】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図Ｓ１−１】
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【図Ｓ１−２】
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【図Ｓ２−１】
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【図Ｓ２−２】
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【図Ｓ２−３】
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【図Ｓ３−１】
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【図Ｓ３−２】
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【図Ｓ４−１】
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【図Ｓ５−１】
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【図Ｓ５−２】
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【図Ｓ５−３】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年7月7日(2016.7.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋萎縮性側索硬化症の処置のための医薬組成物の製造を目的とする、筋萎縮性側索硬化症を有する患者のミクログリアにおけるＮＦ−κＢの発現を減少させ、そして該患者における運動ニューロン死を阻止する化合物の使用。
【請求項２】
該化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
該化合物が核酸である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
該核酸がｓｈＲＮＡである、請求項２または３に記載の使用。
【請求項５】
該核酸が、配列番号：１または配列番号：２の配列を有する、請求項２から４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
該核酸が配列番号：１の配列を有する、請求項２から５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
該核酸が配列番号：２の配列を有する、請求項２から５のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
筋萎縮性側索硬化症が特発性筋萎縮性側索硬化症である、請求項１から７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
組成物の投与が、患者の生存期間を４０日またはそれ以上延長する、請求項１から８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
患者がＳＯＤ１遺伝子に変異を有する、請求項１から９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
化合物の純度が、重量％に基づき少なくとも９８％である、請求項１から１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
組成物が、患者のアストロサイト、運動ニューロン、神経細胞、および／またはオリゴデンドロサイトにおけるＳＯＤ−１の発現を減少させる有効量で該患者に投与される、請求項１から１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
筋萎縮性側索硬化症を有する患者のミクログリアにおけるＮＦ−κＢの発現を減少させるのに有効な化合物の投与量形態であって薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
該化合物が、薬物、ペプチドおよび核酸からなる群より選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
該化合物が核酸である、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
該核酸が、配列番号：１または配列番号：２の配列を有する、請求項１４または１５に記載の組成物。
【請求項１７】
核酸が、配列番号：１の配列を有する、請求項１４から１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
核酸が、配列番号：２の配列を有する、請求項１４から１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
化合物の純度が、重量％に基づき少なくとも９８％である、請求項１３から１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
化合物がアデノ随伴ウイルスベクターを含む、請求項１３から１９のいずれかに記載の組成物。
【国際調査報告】
2016538276.tif 000055
2016538276.tif 000056