(57)【要約】  既知の細菌株バチルス・コアグランスＡＴＣＣ３１２８４、バチルス・コアグランスＮＢＲＣ３８８７およびバチルス・コアグランスＡＴＣＣ７０５０と９９％の遺伝子相同性を示すプロバイオティクス細菌株バチルス・コアグランスＳＢＣ−３７（マイクロバイアル・タイプ・カルチャー・コレクションおよびジーン・バンクに菌株番号ＭＴＣＣ５８５６として寄託）から部分精製された細胞外代謝産物調製物を生成するための方法を開示する。約６１％ｗ／ｗのチモール、約３８％のモノラウリンおよび約１％ｗ／ｗのマグノリア・オフィシナリスの超臨界流体抽出物から得たマグノロールを含む相乗的な保存剤配合物を組み合わせた場合の調製物の相乗的な抗菌効果を含めた、一群の微生物病原体に対する前記細胞外代謝産物調製物の抗菌性プロファイルも開示する。細胞外代謝産物調製物単独、または前記細胞外代謝産物調製物と保存剤配合物の組合せも、相乗的に微生物バイオフィルム形成を抑制する。
2016523104.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
既知の細菌株バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＡＴＣＣ３１２８４、バチルス・コアグランスＮＢＲＣ３８８７およびバチルス・コアグランスＡＴＣＣ７０５０と９９％の遺伝子相同性を示すプロバイオティクス細菌株バチルス・コアグランスＳＢＣ３７−０１（マイクロバイアル・タイプ・カルチャー・コレクションおよびジーン・バンクに寄託され菌株番号ＭＴＣＣ５８５６を付与）から部分精製された細胞外代謝産物調製物を生成するための精製方法であって、
１．既知の細菌株バチルス・コアグランスＡＴＣＣ３１２８４、バチルス・コアグランスＮＢＲＣ３８８７およびバチルス・コアグランスＡＴＣＣ７０５０と９９％の遺伝子相同性を示すバチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６の培養物を、１．０リットルのグルコース酵母エキスアセテートブロス培地または０．５％ｔｗｅｅｎ８０含有ＭＲＳブロスまたはコーンスティープ粉末培地に接種する工程、
２．工程１の接種培地における発酵を、３７℃、１２０ｒｐｍで２４〜４８時間進行させる工程、
３．工程２の発酵ブロスを、４０００〜７０００ｒｐｍで遠心分離する工程、
４．５０℃でロータリーエバポレーターを使用することにより、工程３の上清を１０倍濃縮する工程、
５．冷やしたアセトン１５０ｍＬを、工程４の１０倍濃縮上清１００ｍＬに滴下により添加し、続いて混合する工程、
６．工程５の混合物を、０℃で３０分間インキュベートし、続いて７０００〜８０００ｒｐｍで遠心分離する工程、
７．工程６で得たペレットを廃棄し、６０％アセトン飽和上清（〜２００ｍＬ）を回収する工程、
８．工程７のアセトン飽和上清を、ロータリーエバポレーターにより５０ｍＬに濃縮する工程、
９．ｐＨを、４ＮのＨＣｌを使用することにより５．０に調節し、濾過（０．２２μｍ；マイレクス、ミリポア、インド）して、さらに使用するまで−２０℃で保存する工程、
１０．工程８の上清を、凍結乾燥／噴霧乾燥／トレイ乾燥する工程
を含むことを特徴とする、精製方法。
【請求項２】
微生物防除の方法であって、
既知の細菌株バチルス・コアグランスＡＴＣＣ３１２８４、バチルス・コアグランスＮＢＲＣ３８８７およびバチルス・コアグランスＡＴＣＣ７０５０と９９％の遺伝子相同性を示すプロバイオティクス細菌株バチルス・コアグランスＳＢＣ３７−０１（マイクロバイアル・タイプ・カルチャー・コレクションおよびジーン・バンクに寄託され菌株番号ＭＴＣＣ５８５６を付与）から部分精製された有効濃度の細胞外代謝産物調製物と、標的微生物細胞とを接触させる工程を含むことを特徴とする、微生物防除の方法。
【請求項３】
前記微生物細胞が、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）およびサルモネラ・アボニー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ａｂｏｎｙ）を含む群から選択される１種である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
微生物細胞に、既知の細菌株バチルス・コアグランスＡＴＣＣ３１２８４、バチルス・コアグランスＮＢＲＣ３８８７およびバチルス・コアグランスＡＴＣＣ７０５０と９９％の遺伝子相同性を示すプロバイオティクス細菌株バチルス・コアグランスＳＢＣ３７−０１（マイクロバイアル・タイプ・カルチャー・コレクションおよびジーン・バンクに寄託され菌株番号ＭＴＣＣ５８５６を付与）から部分精製された細胞外代謝産物調製物から本質的になる有効濃度の調製物と、約６１％ｗ／ｗのチモール、約３８％のモノラウリンおおよび約１％ｗ／ｗのマグノリア・オフィシナリス（Ｍａｇｎｏｌｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の超臨界流体抽出物から得たマグノロールを含む相乗的な保存剤配合物とを接触させる工程を含む、微生物防除の方法。
【請求項５】
微生物細胞が、緑膿菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、ストレプトコッカス・ミュータンス、プロピオニバクテリウム・アクネス、セレウス菌およびサルモネラ・アボニーを含む群から選択される１種である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
微生物バイオフィルム形成を抑制する方法であって、バイオフィルム生成微生物細胞と、既知の細菌株バチルス・コアグランスＡＴＣＣ３１２８４、バチルス・コアグランスＮＢＲＣ３８８７およびバチルス・コアグランスＡＴＣＣ７０５０と９９％の遺伝子相同性を示すプロバイオティクス細菌株バチルス・コアグランスＳＢＣ３７−０１（マイクロバイアル・タイプ・カルチャー・コレクションおよびジーン・バンクに寄託され菌株番号ＭＴＣＣ５８５６を付与）から部分精製された細胞外代謝産物調製物から本質的になる調製物単独、または、約６１％ｗ／ｗのチモール、約３８％のモノラウリンおよび約１％ｗ／ｗのマグノリア・オフィシナリスの超臨界流体抽出物から得たマグノロールを含む相乗的な保存剤配合物を組み合わせた前記調製物とを接触させる工程を含むことを特徴とする、方法。
【請求項７】
前記バイオフィルム生成微生物細胞が、緑膿菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、ストレプトコッカス・ミュータンスを含む群から選択される１種である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
スクロースの存在下でのｐＨ低下およびストレプトコッカス・ミュータンスのバイオフィルムのさらなる蓄積を防止する方法であって、バイオフィルム／プラーク生成ストレプトコッカス・ミュータンスと、既知の細菌株バチルス・コアグランスＡＴＣＣ３１２８４、バチルス・コアグランスＮＢＲＣ３８８７およびバチルス・コアグランスＡＴＣＣ７０５０と９９％の遺伝子相同性を示すプロバイオティクス細菌株バチルス・コアグランスＳＢＣ３７−０１（マイクロバイアル・タイプ・カルチャー・コレクションおよびジーン・バンクに寄託され菌株番号ＭＴＣＣ５８５６を付与）から部分精製された細胞外代謝産物調製物から本質的になる調製物単独、または、約６１％ｗ／ｗのチモール、約３８％のモノラウリンおよび約１％ｗ／ｗのマグノリア・オフィシナリスの超臨界流体抽出物から得たマグノロールとを含む相乗的な保存剤配合物を組み合わせた前記調製物とを接触させる工程を含むことを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本特許出願は、「METHOD OF PRODUCING PARTIALLY PURIFIED EXTRACELLULAR METABOLITE PRODUCTS FROM BACILLUS COAGULANS AND BIOLOGICAL APPLICATIONS THEREOF」という表題の発明に関する２０１３年１２月２４日に出願された米国仮特許出願第６１９２０５６７号の非仮出願である。
【０００２】
（技術分野）
本発明は一般に、プロバイオティクス調製物の抗菌効果に関する。より具体的には本発明は、（１）既知の細菌株バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＡＴＣＣ３１２８４、バチルス・コアグランスＮＢＲＣ３８８７およびバチルス・コアグランスＡＴＣＣ７０５０と９９％の遺伝子相同性を示すプロバイオティクス細菌株バチルス・コアグランスＳＢＣ３７−０１（マイクロバイアル・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）およびジーン・バンクに寄託され菌株番号ＭＴＣＣ５８５６を付与）から部分精製された細胞外代謝産物調製物を生成するための方法、および（２）約６１％ｗ／ｗのチモールと、約３８％のモノラウリンと、マグノリア・オフィシナリス（Ｍａｇｎｏｌｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の超臨界流体抽出物から得た約１％ｗ／ｗのマグノロールとを含む相乗的な保存剤配合物と組み合わせた場合の調製物の相乗的な抗菌効果を含めた、一群の微生物病原体に対する前記細胞外代謝産物調製物の抗菌性プロファイルに関する。細胞外代謝産物調製物単独、または前記細胞外代謝産物調製物と保存剤配合物の組合せも、相乗的に微生物バイオフィルム形成を抑制することが示されている。
【背景技術】
【０００３】
（先行技術の説明）
哺乳動物の皮膚または粘膜への局所施用に適しており、したがって細菌、酵母、真菌、ウイルスおよびそれらの組合せの増殖を抑制するために利用することができる、培養バチルス・コアグランス菌株の上清または濾過液を含むバチルス・コアグランスの細胞外産物は当技術分野で知られている（米国特許第６，９０５，６９２号、「Topical compositions containing probiotic Bacillus bacteria, spores, and extracellular products and uses thereof」）。本発明は、約６１％ｗ／ｗのチモールと、約３８％のモノラウリンと、マグノリア・オフィシナリスの超臨界流体抽出物から得た約１％ｗ／ｗのマグノロールとを含む相乗的な保存剤配合物と組み合わせた場合と、上清単独の両方と比較すると、高い抗菌効果を示す濃縮細胞外代謝産物調製物を得るための、プロバイオティクスであるバチルス・コアグランスＳＢＣ３７−０１（マイクロバイアル・タイプ・カルチャー・コレクションおよびジーン・バンクに寄託され菌株番号ＭＴＣＣ５８５６を付与）の培養物の細胞外成分のさらなる精製に関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の主な目的は、以下のことを開示することである。
１）既知の細菌株バチルス・コアグランスＡＴＣＣ３１２８４、バチルス・コアグランスＮＢＲＣ３８８７およびバチルス・コアグランスＡＴＣＣ７０５０と９９％の遺伝子相同性を示すプロバイオティクス細菌株バチルス・コアグランスＳＢＣ３７−０１（マイクロバイアル・タイプ・カルチャー・コレクションおよびジーン・バンクに寄託され菌株番号ＭＴＣＣ５８５６を付与）から部分精製された細胞外代謝産物調製物を生成するための方法。
２）約６１％ｗ／ｗのチモールと、約３８％のモノラウリンと、マグノリア・オフィシナリスの超臨界流体抽出物から得た約１％ｗ／ｗのマグノロールとを含む相乗的な保存剤配合物に組み合わせた場合の調製物の相乗的な抗菌効果を含めた、一群の微生物病原体に対する前記細胞外代謝産物調製物の抗菌性プロファイル。
３）前記細胞外代謝産物調製物単独、または約６１％ｗ／ｗのチモールと、約３８％のモノラウリンと、マグノリア・オフィシナリスの超臨界流体抽出物から得た約１％ｗ／ｗのマグノロールとを含む相乗的な保存剤配合物と組み合わせた前記細胞外代謝産物調製物の微生物バイオフィルム抑制能。
【０００５】
本発明は前述の目的を果たし、さらなる関連利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下のことを記載する。
（１）既知の細菌株バチルス・コアグランスＡＴＣＣ３１２８４、バチルス・コアグランスＮＢＲＣ３８８７およびバチルス・コアグランスＡＴＣＣ７０５０と９９％の遺伝子相同性を示すプロバイオティクス細菌株バチルス・コアグランスＳＢＣ３７−０１（マイクロバイアル・タイプ・カルチャー・コレクションおよびジーン・バンクに寄託され菌株番号ＭＴＣＣ５８５６を付与）から部分精製された細胞外代謝産物調製物を生成するための方法、
（２）約６１％ｗ／ｗのチモールと、約３８％のモノラウリンと、マグノリア・オフィシナリスの超臨界流体抽出物から得た約１％ｗ／ｗのマグノロールとを含む相乗的な保存剤配合物と組み合わせた場合の調製物の相乗的な抗菌効果を含めた、一群の微生物病原体に対する前記細胞外代謝産物調製物の抗菌性プロファイル、および
（３）前記細胞外代謝産物調製物単独、または約６１％ｗ／ｗのチモールと、約３８％のモノラウリンと、マグノリア・オフィシナリスの超臨界流体抽出物から得た約１％ｗ／ｗのマグノロールとを含む相乗的な保存剤配合物と組み合わせた前記細胞外代謝産物調製物の微生物バイオフィルム抑制能。
（４）前記細胞外代謝産物調製物単独、または約６１％ｗ／ｗのチモールと、約３８％のモノラウリンと、マグノリア・オフィシナリスの超臨界流体抽出物から得た約１％ｗ／ｗのマグノロールとを含む相乗的な保存剤配合物と組み合わせた前記細胞外代謝産物調製物のＳ．ミュータンスの粘着性非水溶性グルカンに対する抗菌活性および制酸効果。
【０００７】
本発明は以下の利点を提供する。
１）既知の細菌株バチルス・コアグランスＡＴＣＣ３１２８４、バチルス・コアグランスＮＢＲＣ３８８７およびバチルス・コアグランスＡＴＣＣ７０５０と９９％の遺伝子相同性を示すプロバイオティクス細菌株バチルス・コアグランスＳＢＣ３７−０１（マイクロバイアル・タイプ・カルチャー・コレクションおよびジーン・バンクに寄託され菌株番号ＭＴＣＣ５８５６を付与）から部分精製された細胞外代謝産物調製物を生成するための精製方法の開示、
２）約６１％ｗ／ｗのチモールと、約３８％のモノラウリンと、マグノリア・オフィシナリスの超臨界流体抽出物から得た約１％ｗ／ｗのマグノロールとを含む相乗的な保存剤配合物に組み合わせた場合の前記部分精製された細胞外調製物の相乗的な抗菌効果を含めた、一群の微生物病原体に対する部分精製物の抗菌性プロファイルの開示。
３）前記細胞外代謝産物調製物単独、または約６１％ｗ／ｗのチモールと、約３８％のモノラウリンと、マグノリア・オフィシナリスの超臨界流体抽出物から得た約１％ｗ／ｗのマグノロールとを含む相乗的な保存剤配合物と組み合わせた前記細胞外代謝産物調製物の微生物バイオフィルム抑制能の開示。
４）前記細胞外代謝産物調製物単独、または約６１％ｗ／ｗのチモールと、約３８％のモノラウリンと、マグノリア・オフィシナリスの超臨界流体抽出物から得た約１％ｗ／ｗのマグノロールとを含む相乗的な保存剤配合物と組み合わせた前記細胞外代謝産物調製物のＳ．ミュータンスの粘着性非水溶性グルカンに対する抗菌活性および制酸効果の開示。
【０００８】
本発明の他の特徴および利点は、添付のイメージと共に得る以下のより詳細な記載から明らかとなり、これらは例えば本発明の原理を例示する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】既知の細菌株バチルス・コアグランスＡＴＣＣ３１２８４、バチルス・コアグランスＮＢＲＣ３８８７およびバチルス・コアグランスＡＴＣＣ７０５０と９９％の遺伝子相同性を示すプロバイオティクス細菌株バチルス・コアグランスＳＢＣ３７−０１（マイクロバイアル・タイプ・カルチャー・コレクションおよびジーン・バンクに寄託され菌株番号ＭＴＣＣ５８５６を付与）から部分精製された細胞外代謝産物調製物を生成するための精製方法に関するプロセスのフローチャートを示す図である。
【図２】相乗的抗菌性試験に関するチェッカーボードブロスマイクロ希釈法の内訳を示す図である。
【図３Ａ−３Ｐ】緑膿菌ＡＴＣＣ９０２７、大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２、サルモネラ・アボニーＮＣＩＭ２２５７、ストレプトコッカス・ミュータンスＭＴＣＣ１９４３、プロピオニバクテリウム・アクネスＡＴＣＣ１１８２７、黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２９２１３、表皮ブドウ球菌ＡＴＣＣ１４９９０およびセレウス菌ＡＴＣＣ１４５７９の増殖と生存能力に対する、天然保存剤配合物とＢ．コアグランスＭＴＣＣ５８５６の細胞外代謝産物の単独および組合せの影響のグラフ図をそれぞれ示す図である。
【図４Ａ−４Ｅ】緑膿菌ＡＴＣＣ９０２７、大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２、ストレプトコッカス・ミュータンスＭＴＣＣ１９４３、黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２９２１３および表皮ブドウ球菌ＡＴＣＣ１４９９０のバイオフィルム形成に対する、天然保存剤配合物とＢ．コアグランスＭＴＣＣ５８５６の細胞外代謝産物の単独および組合せの影響のグラフ図をそれぞれ示す図である。
【図５Ａ−５Ｂ】２％スクロースの存在下での増殖／ｐＨ低下およびＳ．ミュータンスＭＴＣＣ１９４３バイオフィルムの非水溶性グルカンの形成に対する、天然保存剤配合物とＢ．コアグランスＭＴＣＣ５８５６の細胞外代謝産物の影響のグラフ図をそれぞれ示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
最も好ましい実施形態において、本発明は、既知の細菌株バチルス・コアグランスＡＴＣＣ３１２８４、バチルス・コアグランスＮＢＲＣ３８８７およびバチルス・コアグランスＡＴＣＣ７０５０と９９％の遺伝子相同性を示すプロバイオティクス細菌株バチルス・コアグランスＳＢＣ３７−０１（マイクロバイアル・タイプ・カルチャー・コレクションおよびジーン・バンクに寄託され菌株番号ＭＴＣＣ５８５６を付与）から部分精製された細胞外代謝産物調製物を生成するための精製方法であって、
１．既知の細菌株バチルス・コアグランスＡＴＣＣ３１２８４、バチルス・コアグランスＮＢＲＣ３８８７およびバチルス・コアグランスＡＴＣＣ７０５０と９９％の遺伝子相同性を示すバチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６の培養物を、１．０リットルのグルコース酵母エキスアセテートブロス培地（ＨｉＭｅｄｉａ、Ｍｕｍｂａｉ、インド）または０．５％ｔｗｅｅｎ８０含有ＭＲＳブロスまたはコーンスティープ（Ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ）粉末培地に接種する工程、
２．工程１の接種培地における発酵を、３７℃および１２０ｒｐｍで２４〜４８時間進行させる工程、
３．工程２の発酵ブロスを、４０００〜７０００ｒｐｍで遠心分離する工程、
４．５０℃でロータリーエバポレーターを使用することにより、工程３の上清を１０倍濃縮する工程、
５．冷やしたアセトン１５０ｍＬを、工程４の１０倍濃縮上清１００ｍＬに滴下により添加し、続いて混合する工程、
６．工程５の混合物を、０℃で３０分間インキュベートし、続いて７０００〜８０００ｒｐｍで遠心分離する工程、
７．工程６で得たペレットを廃棄し、６０％アセトン飽和上清（〜２００ｍＬ）を回収する工程、
８．工程７のアセトン飽和上清を、ロータリーエバポレーターにより５０ｍＬに濃縮する工程、
９．ｐＨを、４ＮのＨＣｌを使用することにより５．０に調節し、濾過（０．２２μｍ；マイレクス（Ｍｉｌｌｅｘ）、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、インド）して、さらに使用するまで−２０℃で保存する工程、
１０．工程８の上清を、凍結乾燥／噴霧乾燥／トレイ乾燥する工程
を含む精製方法に関する。
【００１１】
別の最も好ましい実施形態において、本発明は、既知の細菌株バチルス・コアグランスＡＴＣＣ３１２８４、バチルス・コアグランスＮＢＲＣ３８８７およびバチルス・コアグランスＡＴＣＣ７０５０と９９％の遺伝子相同性を示すプロバイオティクス細菌株バチルス・コアグランスＳＢＣ３７−０１（マイクロバイアル・タイプ・カルチャー・コレクションおよびジーン・バンクに寄託され菌株番号ＭＴＣＣ５８５６を付与）から部分精製された有効濃度の細胞外代謝産物調製物と、標的微生物細胞とを接触させる工程を含む、微生物防除の方法に関する。より具体的な実施形態において、微生物細胞は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）およびサルモネラ・アボニー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ａｂｏｎｙ）を含む群から選択される１種であってよい。
【００１２】
さらに別の最も好ましい実施形態において、本発明は、微生物細胞に、既知の細菌株バチルス・コアグランスＡＴＣＣ３１２８４、バチルス・コアグランスＮＢＲＣ３８８７およびバチルス・コアグランスＡＴＣＣ７０５０と９９％の遺伝子相同性を示すプロバイオティクス細菌株バチルス・コアグランスＳＢＣ３７−０１（マイクロバイアル・タイプ・カルチャー・コレクションおよびジーン・バンクに寄託され菌株番号ＭＴＣＣ５８５６を付与）から部分精製された細胞外代謝産物調製物から本質的になる有効濃度の調製物と、約６１％ｗ／ｗのチモール、約３８％のモノラウリンおよび約１％ｗ／ｗのマグノリア・オフィシナリスの超臨界流体抽出物から得たマグノロールを含む相乗的な保存剤配合物とを接触させる工程を含む、微生物防除の方法に関する。より具体的な実施形態において、微生物細胞は、緑膿菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、ストレプトコッカス・ミュータンス、プロピオニバクテリウム・アクネス、セレウス菌およびサルモネラ・アボニーを含む群から選択される１種であってよい。
【００１３】
さらに別の最も好ましい実施形態において、本発明はさらに、微生物バイオフィルム形成を抑制する方法であって、バイオフィルム生成微生物細胞と、既知の細菌株バチルス・コアグランスＡＴＣＣ３１２８４、バチルス・コアグランスＮＢＲＣ３８８７およびバチルス・コアグランスＡＴＣＣ７０５０と９９％の遺伝子相同性を示すプロバイオティクス細菌株バチルス・コアグランスＳＢＣ３７−０１（マイクロバイアル・タイプ・カルチャー・コレクションおよびジーン・バンクに寄託され菌株番号ＭＴＣＣ５８５６を付与）から部分精製された細胞外代謝産物調製物から本質的になる調製物単独、または、約６１％ｗ／ｗのチモール、約３８％のモノラウリンおよび約１％ｗ／ｗのマグノリア・オフィシナリスの超臨界流体抽出物から得たマグノロールを含む相乗的な保存剤配合物を組み合わせた前記調製物とを接触させる工程を含む方法に関する。
【００１４】
以下の例は、本発明の例示的実施形態を例証するため本明細書において示す。
【実施例】
【００１５】
（実施例１）
微生物および培養条件
この試験で使用した細菌株は、ストレプトコッカス・ミュータンスＭＴＣＣ１９４３、黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２９２１３、表皮ブドウ球菌ＡＴＣＣ１４９９０、大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２、緑膿菌ＡＴＣＣ９０２７、サルモネラ・アボニーＮＣＩＭ２２５７およびセレウス菌ＡＴＣＣ１４５７９を含んでいた。参照菌株はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）、ＭＴＣＣ（ＩＭＴＥＣＨ、Ｃｈａｎｄｉｇａｒｈ、インド）およびＮＣＩＭ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、Ｐｕｎｅ、インド）から購入した。Ｓ．ミュータンスおよびＰ．アクネスは、それぞれ脳−心臓輸液用寒天培地（ＢＨＩ；Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ、ＵＳＡ）および強化クロストリジウム寒天培地（ＲＣＡ；ＨｉＭｅｄｉａ、Ｍｕｍｂａｉ、インド）において維持した。黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、大腸菌、緑膿菌、Ｓ．アボニーおよびセレウス菌は、３７℃でトリプティカーゼダイズ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において維持した。Ｓ．ミュータンスおよびＰ．アクネスは、嫌気性チャンバー（Ｃｏｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ、ミシガン）内で最大４８時間３７℃において、嫌気的にインキュベートした（８０％Ｎ2、１０％Ｈ2および１０％ＣＯ2）。この試験で使用したバチルス・コアグランスＳＢＣ３７−０１は特徴付けされ、インド・チャンディーガルのマイクロバイアル・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、この菌株はバチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６として割り当てられた。
【００１６】
手法  −  相乗作用試験のためのチェッカーボード法
これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗菌剤の組合せを利用するのに最も頻繁に使用される方法である。用語「チェッカーボード」は、試験する二剤の複数回希釈により形成される（試験管またはマイクロタイタープレートウエルの）パターンを指す（Eliopoulos GM, Moellering RC: Antimicrobial combinations. In Antibiotics in laboratory medicine. Edited by Lorian V. Baltimore, The Williams and Wilkins Co; 1991:432-492）。この試験において、チェッカーボードは、各試験管（またはウエル）がＸ軸（行）に沿って希釈したプロバイオティクス細菌株バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６から部分精製された同量の細胞外代謝産物調製物を含有する列と、各試験管（またはウエル）がＹ軸に沿って希釈した同量の保存剤配合物を含有する行とからなっていた（図２）。結果として、チェッカーボード内の各四角形（１つの試験管／ウエルまたはプレートを表す）は、プロバイオティクス細菌株バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６から部分精製された細胞外代謝産物調製物と保存剤配合物の独自の組合せを含有していた。この試験における保存剤配合物の濃度範囲は２０００μｇ／ｍＬ〜３１．２５μｇ／ｍＬ、および幾つかの場合これより低く、一方でプロバイオティクス細菌株バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６から部分精製された細胞外代謝産物調製物は８％（ｖ／ｖ）〜０．０１５％（ｖ／ｖ）の範囲で試験した。このチェッカーボード技法は液体または半固体（寒天）培地で実施することができる。ＢＨＩブロスおよびＲＣブロスはそれぞれＳ．ミュータンスおよびＰ．アクネスに使用し、プレートは、嫌気性チャンバー内で最大４８時間３７℃において、嫌気的にインキュベートした（８０％Ｎ2、１０％Ｈ2および１０％ＣＯ2）。Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｈｉｎｔｏｎブロス（Ｄｉｆｃｏ）は黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、大腸菌、緑膿菌、Ｓ．アボニーおよびセレウス菌に使用し、プレートは３７℃で１８時間インキュベートした。
【００１７】
殺菌動態
保存剤配合物と菌株バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６から部分精製された細胞外代謝産物調製物の時間−殺菌試験を緑膿菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、Ｓ．ミュータンス、Ｐ．アクネス、セレウス菌およびサルモネラ・アボニーに対して実施し、以前に記載されたように時間−殺菌曲線法を使用して評価した（Eliopoulus GM, Moellering RCJ. Antimicrobial combinations. In: Lorian V, ed. Antibiotics in Laboratory Medicine, 4th edn. Baltimore: Williams & Wilkins, 1996; 330-6）。その対数期における細菌懸濁液（１×１０6ｃｆｕ／ｍＬ）を種菌として使用した。保存剤配合物と菌株バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６から部分精製された細胞外代謝産物調製物は、チェッカーボードアッセイ中で測定したように、異なる濃度において単独および組合せで試験した。ｃｆｕ／ｍＬとしての細胞集団はそれぞれの培地において三連で連続希釈法により測定し、それぞれの増殖条件でインキュベートした。生存数および吸光度（ＯＤ610）は０時間（未処置対照）に、および３７℃でインキュベートして２４時間に得た。生存数はＬｏｇ10ｃｆｕ／ｍＬで表し、吸光度は６１０ｎｍにおけるＯＤ値で表した。
【００１８】
バイオフィルム感受性アッセイ
保存剤配合物と、菌株バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６から部分精製された細胞外代謝産物調製物単独、および組合せのバイオフィルム抑制効果を、マイクロ希釈法（Wei et al. Journal of Antimicrob. Chemother. 2006. 57:1100-1109）により、Ｓ．ミュータンス、大腸菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌および緑膿菌に対して調べた。この方法はプランクトン細胞用のチェッカーボード法と類似していた。Ｓ．ミュータンスのバイオフィルムアッセイ用に、２％スクロースを補充したＢＨＩブロスを使用した。他の生物の場合、２％グルコースを補充したＴＳＢをこの試験では使用した。細菌懸濁液は一晩増殖培養物から調製し、懸濁液の濁度は６１０ｎｍ（Ａ610）において０．７（１×１０9ＣＦＵ／ｍＬ）の光学濃度に調節した。この試験における保存剤配合物の濃度範囲は２０００μｇ／ｍＬ〜３１．２５μｇ／ｍＬ、および幾つかの場合これより低い濃度であり、一方で菌株バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６から部分精製された細胞外代謝産物調製物は８％（ｖ／ｖ）〜０．０１５％（ｖ／ｖ）の範囲で試験した。４０マイクロリットルの新たな培地ブロスをそれぞれのウエルに加え、次に６０μＬの前述の懸濁液をプレートのそれぞれのウエルに加えた。これはそれぞれのウエルにおいて６×１０7ＣＦＵ／ｍＬの最終種菌をもたらした。３７℃で４８時間のインキュベーション後、それぞれのウエルからの培養上清を別の容器に移し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．２）でウエルを洗浄することによって浮遊細胞を除去した。バイオフィルムは１５分間メタノールで固定し、次いで室温において空気乾燥させた。乾燥プレートのウエルは１０分間０．１％（ｗ／ｖ）クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で染色し、陰性対照ウエルが無色状態になるまで水で完全にすすいだ。２００μＬの９５％エタノールをクリスタルバイオレット染色ウエルに加え、５９５ｎｍ（Ａ595）において吸光度を記録することによって、バイオフィルム形成を定量化した。バイオフィルム抑制の割合は、等式（試験物質で処置したバイオフィルムのＡ595／未処置対照のＡ595）×１００を使用して計算した。試験物質を含まない培養物は未処置対照として使用した。
【００１９】
Ｓ．ミュータンスの粘着性非水溶性グルカンに対する抗菌活性
Ｓ．ミュータンスＭＴＣＣ１９４３による非水溶性グルカンの形成を、以前に記載された方法（Katsura et al., Antimicrob. Agents Chemother. 2001. 45:3009-3013）によって実施した。簡単に言うと、Ｓ．ミュータンスＭＴＣＣ１９４３の培養物の１００μＬアリコート（約１×１０8細胞／ｍＬ）を試験管中の２％スクロース（ｗ／ｖ）を含有する１０ｍＬの新鮮ＢＨＩブロスに接種し、３０°の勾配で２４時間３７℃においてインキュベートした。プランクトン細胞を含有する流体は軽く除去した。Ｓ．ミュータンスＭＴＣＣ１９４３の非水溶性グルカンを含有する細胞は１０ｍＬの滅菌水で軽く洗浄し、保存剤配合物と菌株バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６から部分精製された細胞外代謝産物調製物の単独および組合せを含有する１０ｍＬのリン酸バッファー（１０ｍＭ、ｐＨ５．０）に再懸濁し、次いで５分間３７℃においてインキュベートした。クロルヘキシジン０．１２％（ｖ／ｖ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をこの試験において内部参照として使用した。混合物を滅菌生理食塩水（０．８９％ＮａＣｌ、ｗ／ｖ）で再度軽く洗浄し、次いで２％スクロース（ｗ／ｖ）を含有する１０ｍＬのＢＨＩブロス中に処置した細胞を再懸濁した。３７℃で６、１２、１８および２４時間の細胞のインキュベーション後、培養によって生じた酸はｐＨメーターを使用することによって測定した。Ｓ．ミュータンスＭＴＣＣの遊離細胞を含有する流体は軽く除去した。非水溶性グルカンは１０ｍＬの１Ｎ  ＮａＯＨ溶液中に再懸濁して均質化し、濁度は６１０ｎｍで測定した。
【００２０】
結果
表１は、Ａ．部分精製細胞外代謝産物（ＰＰＥＭ）または天然保存剤配合物（ＮＰＢ）のみを含有する製剤、およびＢ．部分精製細胞外代謝産物（ＰＰＥＭ）と天然保存剤配合物（ＮＰＢ）の両方を取り込んだ製剤との接触時の、ヒト微生物病原体の減少倍率を示す。部分精製細胞外代謝産物（ＰＰＥＭ）と天然保存剤配合物（ＮＰＢ）の両方を取り込んだ製剤は、病原体緑膿菌に関して有意な８倍の低下、および病原体大腸菌に関して４倍の低下を引き起こすことに注目してもよい。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
好ましい実施形態を参照しながら本発明を記載してきたが、本発明がそれに限られないことは当業者によって明らかに理解されるはずである。むしろ、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲と共にのみ解釈されるはずである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図３Ｍ】
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【図３Ｎ】
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【図３Ｏ】
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【図３Ｐ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【国際調査報告】
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