(57)【要約】  本発明は、肝疾患、それらの分類および診断の技術分野に関する。本発明は、遺伝子発現プロファイルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定および参照サンプルで較正されたアルゴリズムを用いた発現プロファイルの分析に基づき、肝臓サンプルを非肝細胞性サンプル；サブグループＧ１〜Ｇ６のうちの１つにさらに分類される肝細胞癌（ＨＣＣ）サンプル；限局性結節性異形成(focal nodule dysplasia)（ＦＮＨ）サンプル；ＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡ、炎症性ＨＣＡ、βカテニン変異型ＨＣＡまたはその他のＨＣＡサンプルにさらに分類される肝細胞腺腫（ＨＣＡ）サンプル；およびその他の良性肝臓サンプルに分類するための新規方法を提供する。本発明はまた、肝臓サンプルの分類のためのキット、および前記被験体の肝臓サンプルの予備分類に基づく被験体における肝疾患の治療方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて肝臓サンプルを非肝細胞性サンプル、肝細胞癌（ＨＣＣ）サンプル、限局性結節性異形成(focal nodule dysplasia)（ＦＮＨ）サンプル、肝細胞腺腫（ＨＣＡ）サンプルまたは他の良性肝臓サンプルとして分類するための方法であって、
ａ）前記肝臓サンプルからｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて３８の下記の遺伝子：ＥＰＣＡＭ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＹＰ３Ａ７、ＦＡＢＰ１、ＨＡＬ、ＡＦＰ、ＧＮＭＴ、ＴＦＲＣ、Ｃ８Ａ、ＣＡＰ２、ＬＣＡＴ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＣ２０、ＤＨＲＳ２、ＬＹＶＥ１、ＡＤＭ、ＡＮＧＰＴＬ７、ＧＬＵＬ、ＡＮＧＰＴ１、ＨＭＧＢ３、ＧＭＮＮ、ＲＡＭＰ３、ＲＨＢＧ、ＵＧＴ２Ｂ７、ＬＧＲ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＲＢＭ４７、ＧＩＭＡＰ５、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＧＬＳ２、ＫＲＴ１９、ＥＳＲ１、ＳＤＳ、ＭＥＲＴＫ、ＥＰＨＡ１、ＣＣＬ５、およびＣＹＰ２Ｃ９、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるまたはからなる発現プロファイルを決定すること；
ｂ）少なくとも１つの参照肝臓サンプルで較正された少なくとも１つのアルゴリズムを用いて、９つの下記遺伝子：ＥＰＣＡＭ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＹＰ３Ａ７、ＦＡＢＰ１、ＨＡＬ、ＡＦＰ、ＧＮＭＴ、ＴＦＲＣ、およびＣ８Ａ、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるまたはからなる発現プロファイルに関して測定された発現レベルに基づき、前記肝臓サンプルが肝細胞性サンプルであるか非肝細胞性サンプルであるかを決定すること；
ｃ）前記肝臓サンプルが肝細胞性サンプルであれば、少なくとも１つの参照肝臓サンプルで較正された少なくとも１つのアルゴリズムを用いて、９つの下記遺伝子：ＡＦＰ、ＣＡＰ２、ＬＣＡＴ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＣ２０、ＤＨＲＳ２、ＬＹＶＥ１、およびＡＤＭ、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるまたはからなる発現プロファイルに関して測定された発現レベルに基づき、前記肝細胞性サンプルがＨＣＣサンプルであるか良性肝細胞性サンプルであるかを決定すること；
ｄ）前記肝臓サンプルが良性肝細胞性サンプルであれば、少なくとも１つの参照肝臓サンプルで較正された少なくとも１つのアルゴリズムを用いて、１３の下記遺伝子：ＨＡＬ、ＡＮＧＰＴＬ７、ＧＬＵＬ、ＡＮＧＰＴ１、ＨＭＧＢ３、ＧＭＮＮ、ＲＡＭＰ３、ＲＨＢＧ、ＵＧＴ２Ｂ７、ＬＧＲ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＲＢＭ４７、およびＧＩＭＡＰ５、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるまたはからなる発現プロファイルに関して測定された発現レベルに基づき、前記良性肝細胞性サンプルがＦＮＨサンプルであるかどうかを決定すること；
ｅ）前記肝臓サンプルが良性肝細胞性サンプルであれば、少なくとも１つの参照肝臓サンプルで較正された少なくとも１つのアルゴリズムを用いて、１３の下記の遺伝子：ＨＡＬ、ＣＹＰ３Ａ７、ＬＣＡＴ、ＬＹＶＥ１、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＧＬＳ２、ＫＲＴ１９、ＥＳＲ１、ＳＤＳ、ＭＥＲＴＫ、ＥＰＨＡ１、ＣＣＬ５、およびＣＹＰ２Ｃ９、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるまたはからなる発現プロファイルに関して測定された発現レベルに基づき、前記良性肝細胞性サンプルがＨＣＡサンプルであるかどうか決定すること；
ｆ）前記良性肝細胞性サンプルがＦＮＨサンプルでもＨＣＡサンプルでもなければ、それは別の良性肝臓サンプルとして分類されること
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記肝臓サンプルがＨＣＡサンプルと診断されれば、
ａ）前記ＨＣＡサンプルからｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて８つの付加的な下記遺伝子：ＨＡＭＰ、ＳＡＡ２、ＮＲＣＡＭ、ＲＥＧ３Ａ、ＡＭＡＣＲ、ＴＡＦ９、ＬＡＰＴＭ４Ｂ、およびＩＧＦ２ＢＰ３を含んでなるまたはからなる発現プロファイルをさらに決定すること；
ｂ）少なくとも１つの参照肝臓サンプルで較正された少なくとも１つのアルゴリズムを用い、４つの下記遺伝子：ＦＡＢＰ１、ＡＮＧＰＴ２、ＤＨＲＳ２、およびＵＧＴ２Ｂ７、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるまたはからなる発現プロファイルに関して測定された発現レベルに基づいて、前記ＨＣＡサンプルがＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡサンプルであるかどうかを決定すること；
ｃ）少なくとも１つの参照肝臓サンプルで較正された少なくとも１つのアルゴリズムを用い、７つの下記遺伝子：ＡＮＧＰＴ２、ＧＬＳ２、ＥＰＨＡ１、ＣＣｌ５、ＨＡＭＰ、ＳＡＡ２、およびＮＲＣＡＭ、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるまたはからなる発現プロファイルに関して測定された発現レベルに基づいて、前記ＨＣＡサンプルが炎症性ＨＣＡサンプルであるかどうかを決定すること；
ｄ）少なくとも１つの参照肝臓サンプルで較正された少なくとも１つのアルゴリズムを用い、１３の下記遺伝子：ＴＦＲＣ、ＨＡＬ、ＣＡＰ２、ＧＬＵＬ、ＨＭＧＢ３、ＬＧＲ５、ＧＩＭＡＰ５、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＲＥＧ３Ａ、ＡＭＡＣＲ、ＴＡＦ９、ＬＡＰＴＭ４Ｂ、およびＩＧＦ２ＢＰ３、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるまたはからなる発現プロファイルに関して測定された発現レベルに基づいて、前記ＨＣＡサンプルがβカテニン変異型ＨＣＡサンプルであるかどうかを決定すること；
ｅ）前記ＨＣＡサンプルがＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡサンプルでも炎症性ＨＣＡサンプルでもβカテニン変異型ＨＣＡサンプルでもなければ、それは別のＨＣＡサンプルとして分類されること
により、前記ＨＣＡサンプルを下記のＨＣＡサブグループ：ＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡ、炎症性ＨＣＡ、βカテニン変異型ＨＣＡまたはその他のＨＣＡのうちの１つに分類することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記肝臓サンプルがＨＣＣサンプルと診断されれば、前記ＨＣＣサンプルを下記の臨床的および遺伝的主要特徴：
【表１】
2016500512.tif 000045
により定義されるサブグループＧ１〜Ｇ６のうちの１つに分類することをさらに含んでなり、前記分類が
ａ）前記ＨＣＣサンプルからｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて１１の付加的な下記遺伝子：ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＰＩＲ、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、およびＳＡＥ１を含んでなるまたはからなる発現プロファイルをさらに決定すること；および
ｂ）１６の下記遺伝子：ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、およびＳＡＥ１、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるまたはからなる発現プロファイルに関して測定された発現レベルに基づき６つのサブグループ距離を計算すること；および
ｃ）前記ＨＣＣ腫瘍をサブグループ距離が最小のサブグループに分類すること
により成される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
各発現プロファイルを解釈するために使用されるアルゴリズムを較正するために使用される参照サンプルが下記：
ａ）肝臓サンプルが肝細胞性サンプルであるかどうかを決定するためには、少なくとも１つの（好ましくは、複数の）肝細胞性サンプルおよび少なくとも１つの（好ましくは、複数の）非肝細胞性サンプル；
ｂ）肝細胞性サンプルがＨＣＣサンプルであるかどうかを決定するためには、少なくとも１つの（好ましくは、複数の）良性サンプルおよび少なくとも１つの（好ましくは、複数の）ＨＣＣサンプル；
ｃ）良性肝細胞性サンプルがＦＮＨサンプルであるかどうかを決定するためには、少なくとも１つの（好ましくは、複数の）ＦＮＨサンプルおよび少なくとも１つの（好ましくは、複数の）非ＦＮＨ良性肝細胞性サンプル；
ｄ）良性肝細胞性サンプルがＨＣＡサンプルであるかどうかを決定するためには、少なくとも１つの（好ましくは、複数の）ＨＣＡサンプルおよび少なくとも１つの（好ましくは、複数の）非ＨＣＡ良性肝細胞性サンプル；
ｅ）ＨＣＡサンプルがＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡサンプルであるかどうかを決定するためには、少なくとも１つの（好ましくは、複数の）ＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡサンプルおよび少なくとも１つの（好ましくは、複数の）非ＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡサンプル；
ｆ）ＨＣＡサンプルが炎症性ＨＣＡサンプルであるかどうかを決定するためには、少なくとも１つの（好ましくは、複数の）炎症性ＨＣＡサンプルおよび少なくとも１つの（好ましくは、複数の）非炎症性ＨＣＡサンプル；
ｇ）ＨＣＡサンプルがβカテニン変異型ＨＣＡサンプルであるかどうかを決定するためには、少なくとも１つの（好ましくは、複数の）βカテニン変異型ＨＣＡサンプルおよび少なくとも１つの（好ましくは、複数の）非βカテニン変異型ＨＣＡサンプル；ならびに
ｈ）ＨＣＣサンプルをサブグループＧ１〜Ｇ６のうちの１つに分類するためには、各Ｇ１〜Ｇ６サブグループのうちの少なくとも１つの（好ましくは、複数の）サンプル
である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記肝臓サンプルが肝臓生検または部分的または全肝臓腫瘍外科的切除である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
１または複数の前記発現プロファイルが核酸レベルで決定される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
１または複数の前記発現プロファイルが定量的ＰＣＲを用いて決定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
任意の発現プロファイルを解釈するために使用される１または複数のアルゴリズムが、
ａ）マイクロアレイの推定分析（ＰＡＭ）：
PAM(サンプルX)=Arg max(θYes(サンプルX); θNo(サンプルX))
式中、
【数１】
2016500512.tif 000046
ここで、
・ｘｉ、１≦ｉ≦Ｎは、発現プロファイルの遺伝子の発現レベルから導き出されたＮ個の変数のｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定された値を表し、かつ、
・πｉ、γｉ、πＹｅｓ，ｉ、πＮｏ，ｉ、１≦ｉ≦Ｎ、ＫＹｅｓおよびＫＮｏは、少なくとも１つの参照サンプルで較正された固定パラメーターである；
ｂ）対角線形判別分析（ＤＬＤＡ）：
DLDA(サンプルX)=Arg min(ΔYes(サンプルX) ; ΔNo(サンプルX))
式中、
【数２】
2016500512.tif 000047
ここで、
・ｘｉ、１≦ｉ≦Ｎは、発現プロファイルの遺伝子の発現レベルから導き出されたＮ個の変数のｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定された値を表し、かつ、
・υｉ、μＹｅｓ，ｉ、およびμＮｏ，ｉ、１≦ｉ≦Ｎは、少なくとも１つの参照サンプルで較正された固定パラメーターである；
ｃ）対角二次判別分析（ＤＱＤＡ）：
DQDA(サンプルX)=Arg min(▽Yes(サンプルX) ; ▽No(サンプルX))
式中、
【数３】
2016500512.tif 000048
ここで、
・ｘｉ、１≦ｉ≦Ｎは、発現プロファイルの遺伝子の発現レベルから導き出されたＮ個の変数のｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定された値を表し、かつ、
・υＹｅｓ，ｉ、υＮｏ，ｉ、μＹｅｓ，ｉ、μＮｏ，ｉ、１≦ｉ≦Ｎは、少なくとも１つの参照サンプルで較正された固定パラメーターであり、かつ、
【数４】
2016500512.tif 000049
である；
ｄ）またはそれらの任意の組合せ
から選択される、請求項１〜２および４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
各発現プロファイルを解釈するために使用されるアルゴリズムが
診断(サンプルX)=多数決原理(PAM(サンプルX), DLDA(サンプルX), DQDA(サンプルX))
である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
１または複数の前記発現プロファイルが定量的ＰＣＲを用いて決定され、かつ、ＰＡＭ、ＤＬＤＡおよびＤＱＤＡアルゴリズムの変数およびパラメーターが下記の通りである：
ａ）肝臓サンプルが肝細胞性サンプルであるかどうかを決定するためには、
・６個の変数ｘ１〜ｘ６は下記のように使用され、
【表２】
2016500512.tif 000050
・ＰＡＭパラメーターは下記であり、
【表３】
2016500512.tif 000051
・ＤＬＤＡおよびＤＱＤＡパラメーターは同じであって、下記の通りであり、
【表４】
2016500512.tif 000052
ｂ）肝細胞性サンプルがＨＣＣサンプルであるかどうかを決定するためには、
・６個の変数ｘ１〜ｘ６は下記のように使用され、
【表５】
2016500512.tif 000053
・ＰＡＭパラメーターは下記であり、
【表６】
2016500512.tif 000054
・ＤＬＤＡおよびＤＱＤＡパラメーター同じであって、下記の通りであり、
【表７】
2016500512.tif 000055
ｃ）良性肝細胞性サンプルがＦＮＨサンプルであるかどうかを決定するためには、
・１２個の変数ｘ１〜ｘ１２は次のように使用され、
【表８】
2016500512.tif 000056
・ＰＡＭパラメーターは下記であり、
【表９】
2016500512.tif 000057
・ＤＬＤＡおよびＤＱＤＡパラメーターは同じであって、下記の通りであり、
【表１０】
2016500512.tif 000058
ｄ）良性肝細胞性サンプルがＨＣＡサンプルであるかどうかを決定するためには、
・１０個の変数ｘ１〜ｘ１０は次のように使用され、
【表１１】
2016500512.tif 000059
・ＰＡＭパラメーターは下記であり、
【表１２】
2016500512.tif 000060
・ＤＬＤＡおよびＤＱＤＡパラメーターは同じであって、下記の通りであり、
【表１３】
2016500512.tif 000061
ｅ）ＨＣＡサンプルがＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡサンプルであるかどうかを決定するためには、
・２個の変数ｘ１〜ｘ６は次のように使用され、
【表１４】
2016500512.tif 000062
・ＰＡＭパラメーターは下記であり、
【表１５】
2016500512.tif 000063
・ＤＬＤＡおよびＤＱＤＡパラメーターは同じであって、下記の通りであり、
【表１６】
2016500512.tif 000064
ｆ）ＨＣＡサンプルが炎症性ＨＣＡサンプルであるかどうかを決定するためには、
・４個の変数ｘ１〜ｘ６は次のように使用され、
【表１７】
2016500512.tif 000065
・ＰＡＭパラメーターは下記であり、
【表１８】
2016500512.tif 000066
・ＤＬＤＡおよびＤＱＤＡパラメーターは同じであって、下記の通りであり、
【表１９】
2016500512.tif 000067
ｇ）ＨＣＡサンプルがβカテニン変異型ＨＣＡサンプルであるかどうかを決定するためには、
・９個の変数ｘ１〜ｘ６は次のように使用され、
【表２０】
2016500512.tif 000068
・ＰＡＭパラメーターは下記であり、
【表２１】
2016500512.tif 000069
・ＤＬＤＡおよびＤＱＤＡパラメーターは同じであって、下記の通りである、
【表２２】
2016500512.tif 000070
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＨＣＣサンプルが、前記ＨＣＣサンプルから各サブグループＧｋ、１≦ｋ≦６までの距離を計算するための下式：
【数５】
2016500512.tif 000071
を用いて、サブグループＧ１〜Ｇ６のうちの１つに分類され、式中、各遺伝子ｔおよびサブグループＧｋに関してμ（サブグループＧｋ、遺伝子ｔ）およびσ（遺伝子ｔ）値は下記である、
【表２３】
2016500512.tif 000072
請求項３〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
多くて６５の異なる遺伝子を含んでなる発現プロファイルの決定のための試薬を含んでなるキットであって、前記発現プロファイルは、
・下記の３８の遺伝子：ＥＰＣＡＭ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＹＰ３Ａ７、ＦＡＢＰ１、ＨＡＬ、ＡＦＰ、ＧＮＭＴ、ＴＦＲＣ、Ｃ８Ａ、ＣＡＰ２、ＬＣＡＴ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＣ２０、ＤＨＲＳ２、ＬＹＶＥ１、ＡＤＭ、ＡＮＧＰＴＬ７、ＧＬＵＬ、ＡＮＧＰＴ１、ＨＭＧＢ３、ＧＭＮＮ、ＲＡＭＰ３、ＲＨＢＧ、ＵＧＴ２Ｂ７、ＬＧＲ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＲＢＭ４７、ＧＩＭＡＰ５、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＧＬＳ２、ＫＲＴ１９、ＥＳＲ１、ＳＤＳ、ＭＥＲＴＫ、ＥＰＨＡ１、ＣＣＬ５、およびＣＹＰ２Ｃ９、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル；
・下記の４６の遺伝子：ＥＰＣＡＭ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＹＰ３Ａ７、ＦＡＢＰ１、ＨＡＬ、ＡＦＰ、ＧＮＭＴ、ＴＦＲＣ、Ｃ８Ａ、ＣＡＰ２、ＬＣＡＴ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＣ２０、ＤＨＲＳ２、ＬＹＶＥ１、ＡＤＭ、ＡＮＧＰＴＬ７、ＧＬＵＬ、ＡＮＧＰＴ１、ＨＭＧＢ３、ＧＭＮＮ、ＲＡＭＰ３、ＲＨＢＧ、ＵＧＴ２Ｂ７、ＬＧＲ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＲＢＭ４７、ＧＩＭＡＰ５、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＧＬＳ２、ＫＲＴ１９、ＥＳＲ１、ＳＤＳ、ＭＥＲＴＫ、ＥＰＨＡ１、ＣＣＬ５、ＣＹＰ２Ｃ９、ＨＡＭＰ、ＳＡＡ２、ＮＲＣＡＭ、ＲＥＧ３Ａ、ＡＭＡＣＲ、ＴＡＦ９、ＬＡＰＴＭ４Ｂ、およびＩＧＦ２ＢＰ３、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル；
・下記の４９の遺伝子：ＥＰＣＡＭ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＹＰ３Ａ７、ＦＡＢＰ１、ＨＡＬ、ＡＦＰ、ＧＮＭＴ、ＴＦＲＣ、Ｃ８Ａ、ＣＡＰ２、ＬＣＡＴ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＣ２０、ＤＨＲＳ２、ＬＹＶＥ１、ＡＤＭ、ＡＮＧＰＴＬ７、ＧＬＵＬ、ＡＮＧＰＴ１、ＨＭＧＢ３、ＧＭＮＮ、ＲＡＭＰ３、ＲＨＢＧ、ＵＧＴ２Ｂ７、ＬＧＲ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＲＢＭ４７、ＧＩＭＡＰ５、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＧＬＳ２、ＫＲＴ１９、ＥＳＲ１、ＳＤＳ、ＭＥＲＴＫ、ＥＰＨＡ１、ＣＣＬ５、ＣＹＰ２Ｃ９、ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＰＩＲ、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、およびＳＡＥ１、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル；または
・下記の５５の遺伝子：ＥＰＣＡＭ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＹＰ３Ａ７、ＦＡＢＰ１、ＨＡＬ、ＡＦＰ、ＧＮＭＴ、ＴＦＲＣ、Ｃ８Ａ、ＣＡＰ２、ＬＣＡＴ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＣ２０、ＤＨＲＳ２、ＬＹＶＥ１、ＡＤＭ、ＡＮＧＰＴＬ７、ＧＬＵＬ、ＡＮＧＰＴ１、ＨＭＧＢ３、ＧＭＮＮ、ＲＡＭＰ３、ＲＨＢＧ、ＵＧＴ２Ｂ７、ＬＧＲ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＲＢＭ４７、ＧＩＭＡＰ５、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＧＬＳ２、ＫＲＴ１９、ＥＳＲ１、ＳＤＳ、ＭＥＲＴＫ、ＥＰＨＡ１、ＣＣＬ５、ＣＹＰ２Ｃ９、ＨＡＭＰ、ＳＡＡ２、ＮＲＣＡＭ、ＲＥＧ３Ａ、ＡＭＡＣＲ、ＴＡＦ９、ＬＡＰＴＭ４Ｂ、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＲＡＢ１Ａ、ＮＲＡＳ、ＰＩＲ、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＣＤＨ２、およびＳＡＥ１、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル
から選択される、キット。
【請求項１３】
ａ）特異的な増幅プライマー対および／もしくはプローブ、または
ｂ）核酸マイクロアレイ
を含んでなる、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の分類方法によりＨＣＣサンプルとして分類された肝臓サンプルに基づいてＨＣＣに罹患していると診断された被験体におけるＨＣＣの治療に使用するための、ＩＧＦＲ１阻害剤、Ａｋｔ／ｍＴｏｒ阻害剤、プロテアソーム阻害剤および／またはｗｎｔ阻害剤。
【請求項１５】
肝臓サンプルを分類するためのシステム１であって、
ａ）肝臓サンプルを受容し、
・下記の３８の遺伝子：ＥＰＣＡＭ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＹＰ３Ａ７、ＦＡＢＰ１、ＨＡＬ、ＡＦＰ、ＧＮＭＴ、ＴＦＲＣ、Ｃ８Ａ、ＣＡＰ２、ＬＣＡＴ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＣ２０、ＤＨＲＳ２、ＬＹＶＥ１、ＡＤＭ、ＡＮＧＰＴＬ７、ＧＬＵＬ、ＡＮＧＰＴ１、ＨＭＧＢ３、ＧＭＮＮ、ＲＡＭＰ３、ＲＨＢＧ、ＵＧＴ２Ｂ７、ＬＧＲ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＲＢＭ４７、ＧＩＭＡＰ５、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＧＬＳ２、ＫＲＴ１９、ＥＳＲ１、ＳＤＳ、ＭＥＲＴＫ、ＥＰＨＡ１、ＣＣＬ５、およびＣＹＰ２Ｃ９、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル；
・下記の４６の遺伝子：ＥＰＣＡＭ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＹＰ３Ａ７、ＦＡＢＰ１、ＨＡＬ、ＡＦＰ、ＧＮＭＴ、ＴＦＲＣ、Ｃ８Ａ、ＣＡＰ２、ＬＣＡＴ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＣ２０、ＤＨＲＳ２、ＬＹＶＥ１、ＡＤＭ、ＡＮＧＰＴＬ７、ＧＬＵＬ、ＡＮＧＰＴ１、ＨＭＧＢ３、ＧＭＮＮ、ＲＡＭＰ３、ＲＨＢＧ、ＵＧＴ２Ｂ７、ＬＧＲ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＲＢＭ４７、ＧＩＭＡＰ５、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＧＬＳ２、ＫＲＴ１９、ＥＳＲ１、ＳＤＳ、ＭＥＲＴＫ、ＥＰＨＡ１、ＣＣＬ５、ＣＹＰ２Ｃ９、ＨＡＭＰ、ＳＡＡ２、ＮＲＣＡＭ、ＲＥＧ３Ａ、ＡＭＡＣＲ、ＴＡＦ９、ＬＡＰＴＭ４Ｂ、およびＩＧＦ２ＢＰ３、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル；
・下記の４９の遺伝子：ＥＰＣＡＭ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＹＰ３Ａ７、ＦＡＢＰ１、ＨＡＬ、ＡＦＰ、ＧＮＭＴ、ＴＦＲＣ、Ｃ８Ａ、ＣＡＰ２、ＬＣＡＴ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＣ２０、ＤＨＲＳ２、ＬＹＶＥ１、ＡＤＭ、ＡＮＧＰＴＬ７、ＧＬＵＬ、ＡＮＧＰＴ１、ＨＭＧＢ３、ＧＭＮＮ、ＲＡＭＰ３、ＲＨＢＧ、ＵＧＴ２Ｂ７、ＬＧＲ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＲＢＭ４７、ＧＩＭＡＰ５、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＧＬＳ２、ＫＲＴ１９、ＥＳＲ１、ＳＤＳ、ＭＥＲＴＫ、ＥＰＨＡ１、ＣＣＬ５、ＣＹＰ２Ｃ９、ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＰＩＲ、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、およびＳＡＥ１、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル；または
・下記の５５の遺伝子：ＥＰＣＡＭ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＹＰ３Ａ７、ＦＡＢＰ１、ＨＡＬ、ＡＦＰ、ＧＮＭＴ、ＴＦＲＣ、Ｃ８Ａ、ＣＡＰ２、ＬＣＡＴ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＣ２０、ＤＨＲＳ２、ＬＹＶＥ１、ＡＤＭ、ＡＮＧＰＴＬ７、ＧＬＵＬ、ＡＮＧＰＴ１、ＨＭＧＢ３、ＧＭＮＮ、ＲＡＭＰ３、ＲＨＢＧ、ＵＧＴ２Ｂ７、ＬＧＲ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＲＢＭ４７、ＧＩＭＡＰ５、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＧＬＳ２、ＫＲＴ１９、ＥＳＲ１、ＳＤＳ、ＭＥＲＴＫ、ＥＰＨＡ１、ＣＣＬ５、ＣＹＰ２Ｃ９、ＨＡＭＰ、ＳＡＡ２、ＮＲＣＡＭ、ＲＥＧ３Ａ、ＡＭＡＣＲ、ＴＡＦ９、ＬＡＰＴＭ４Ｂ、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＲＡＢ１Ａ、ＮＲＡＳ、ＰＩＲ、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＣＤＨ２、およびＳＡＥ１、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル
に関する発現レベル情報を決定するように構成された決定モジュール２；
ｂ）前記決定モジュールからの発現レベル情報を保存するように構成された保存デバイス３；
ｃ）前記保存デバイスに保存された発現レベル情報を参照データと比較し、比較結果を提供するように適合された比較モジュール４、ここで、前記比較結果は肝臓サンプルのタイプの指標となる；および
ｄ）ユーザー向けに前記分類結果に部分的に基づくコンテント６を表示するための表示モジュール５、ここで、前記コンテントは肝臓サンプルのタイプの指標となる信号である、
を含んでなる、システム。
【請求項１６】
発現プロファイルデータの解釈に関する請求項１〜１１のいずれか一項に記載の予後方法のコンピューターステップへの実装のためのソフトウエアモジュールを定義するためのコンピューター可読命令が記録されたコンピューター可読媒体７。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝疾患、それらの分類および診断の技術分野に関する。本発明は、遺伝子発現プロファイルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定および参照サンプルで較正されたアルゴリズムを用いた発現プロファイルの分析に基づき、肝臓サンプルを非肝細胞性サンプル；サブグループＧ１〜Ｇ６のうちの１つにさらに分類される肝細胞癌（ＨＣＣ）サンプル；限局性結節性異形成(focal nodule dysplasia)（ＦＮＨ）サンプル；ＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡ、炎症性ＨＣＡ、βカテニン変異型ＨＣＡまたはその他のＨＣＡサンプルにさらに分類される肝細胞腺腫（ＨＣＡ）サンプル；およびその他の良性肝臓サンプルに分類するための新規方法を提供する。本発明はまた、肝臓サンプルの分類のためのキット、および前記被験体の肝臓サンプルの予備分類に基づく被験体における肝疾患の治療方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞癌（ＨＣＣ）は、世界的な癌による主な死因の１つに当たる(El Serag H NEJM 2011)。硬変上に発症したＨＣＣの診断に撮像法／非侵襲的判定基準が広く用いられているにも関わらず、ＨＣＣと他の肝臓腫瘍と示差的診断は、専門の病理学者にとってさえなお困難である(international consensus group 2009)。このような状況にあっては、再生性および異形成大結節、胆管癌または他の組織起源の癌の転移は分類の落とし穴となる(Forner A Lancet 2012)。さらに、西洋諸国では症例の１０％および東洋諸国では２０％超に寄与する非硬変肝上に発症したＨＣＣの診断に関して、妥当性が評価された非侵襲的判定基準はない(Forner A Hepatology 2008)。このような状況にあっては、腫瘍生検が必須であり、良性肝細胞性腫瘍（限局性結節性過形成ＦＮＨおよび肝細胞腺腫ＨＣＡ）の示差的診断は、特に分化状態が極めて良いＨＣＣとＨＣＡの間では難しいことがある(Bioulac-Sage P, sem liv dis 2011)。
【０００３】
さらに、ＨＣＡは異質な良性肝臓腫瘍群を構成し、予後に関連した遺伝子型／表現型分類が最近特定された(Zucman Rossi J Hepatology 2006; Van aalten SM J hepatol 2011)。４群のＨＣＡ（ＨＮＦ１Ａ変異型、βカテニン変異型、炎症性および未分類肝細胞腺腫）が記載され、βカテニンを活性化する突然変異を有するＨＣＡはＨＣＣの高い悪性化リスクとの関連が見出された。
【０００４】
よって、良性および悪性の肝細胞性腫瘍は、特定の表現型および分子の特徴によって定義される種々の腫瘍サブグループを含んでなり、このことが診断の落とし穴およびそれらの予後を評価する難しさにつながっている。
【０００５】
従って、肝臓サンプル中に存在し得る種々のタイプの組織の間で（肝細胞性かどうか；肝細胞性の場合、良性か悪性か；良性肝細胞性の場合、限局性結節性過形成か肝細胞腺腫か、またはどちらでもないか；肝細胞腺腫の場合、どのタイプか）信頼性をもって識別するため、および従って、肝臓腫瘍に罹患している疑いのある被験体から採取した肝臓サンプルを、信頼性をもって分類するための臨床実践において臨床医および病理学者の助けとなる新規なツールの必要がある。
【０００６】
実際に、肝臓サンプルの分類、および従って最終診断によって、患者は同じ治療を施されない：
・良性限局性結節性過形成（ＦＮＨ）の場合には、経過観察無しの治療回避が推奨される；
・良性肝細胞腺腫（ＨＣＡ）の場合には、通常治療としては、外科的切除または経過観察を伴う治療回避が含まれる。最良の治療の選択はまた、ＨＣＡの、ＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡ、炎症性ＨＣＡ、およびβカテニン変異型ＨＣＡへのより厳密な分類によって決まり得る。例えば、サンプルが５ｃｍより小さいＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡと診断されれば、出血および悪性化のリスクが低いために、撮像法による経過観察／臨床経過観察のみが特に有用であり得る。サンプルが５ｃｍを超えるサイズのＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡと診断されれば、出血リスクのために、外科的切除による治療が特に有用であり得る。サンプルが５ｃｍ未満のサイズの炎症性ＨＣＡと診断されれば、出血および悪性化のリスクが低いために、撮像法による経過観察／臨床経過観察のみが特に有用であり得る。サンプルが５ｃｍを超えるサイズの炎症性ＨＣＡと診断されれば、出血リスクのために、外科的切除による治療が特に有用であり得る。サンプルがサイズによらずβカテニン変異型ＨＣＡと診断されれば、悪性化のリスクが高いために、外科的切除による治癒的治療が特に有用であり得る。
【０００７】
・肝細胞癌（ＨＣＣ）の場合、腫瘍の外科的切除が可能でなければ別の治療が使用可能であるが、第一治療は一般に腫瘍の外科的切除からなる。さらに、腫瘍の外科的切除後に種々の補助療法が投与され得る。このような補助療法としては、細胞傷害性化学療法（特に、ドキソルビシンまたはゲムシタビンとオキサリプラチンの併用）および／または標的療法（特に、ソラフェニブ）が含まれる。最良の治療戦略（補助療法の使用または不使用を含む）の選択は、より厳密なＨＣＣのタイプ（ＷＯ２００７／０６３１１８Ａ１に記載の、ＨＣＣのサブグループＧ１〜Ｇ６の１つへの分類を参照）および／または患者の予後によって決まり得る。特に、不良な予後の場合、補助療法が一般に投与されるが、予後が良好であれば必ずしもこの限りでない。さらに、肝臓サンプルがＨＣＣサブグループＧ１としてさらに分類された場合には、インスリン増殖因子経路が活性化されているために、ＩＧＦＲ１阻害剤による治療が特に有用であり得る。肝臓サンプルがＨＣＣサブグループＧ１またはＧ２にさらに分類された場合には、ａｋｔ／ｍｔｏｒ経路が活性化されているために、Ａｋｔ／ｍｔｏｒ阻害剤による治療が特に有用であり得る。肝臓サンプルがＨＣＣサブグループＧ３としてさらに分類された場合には、細胞／周期遺伝子が調節を欠いているために、プロテアソーム阻害剤による治療が特に有用であり得る。肝臓サンプルがＨＣＣサブグループＧ５またはＧ６にさらに分類された場合には、Ｗｎｔ／カテニン経路が活性化されているために、Ｗｎｔ阻害剤による治療が特に有用であり得る。
【０００８】
このような状況にあっては、被験体の肝臓サンプルの分子プロファイリングに基づく簡単な分類／診断ツールが極めて有用となる。
【０００９】
いくつかの遺伝子が、肝臓サンプルの分類または特定の肝疾患の診断に関連付けられている。例えば、肝細胞性および非肝細胞性組織で示差的に発現される遺伝子がOdom et al-2004に記載されている。良性または悪性肝細胞性腫瘍に関連する遺伝子は、Llovet et al-2006、Capurro et al-2003、Chuma et al-2003、Tsunedomi et al-2005およびKondoh et al-1999で同定されている。限局性結節性過形成（ＦＮＨ）で示差的に発現される遺伝子は、Rebouissou et al-2008およびParadis et al-2003に開示されている。ＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡで示差的に発現される遺伝子は、Rebouissou et al-2007およびBioulac Sage et al-2007に開示されている。βカテニン突然変異に関連する遺伝子は、Boyault et al-2007、Bioulac Sage et al-2007、Cadoret et al-2002、Yamamoto et al-2005、Benhamouche et al-2006、およびRebouissou et al-2008に記載されている。炎症性ＨＣＡで示差的に発現される遺伝子は、Rebouissou et al-2009およびBioulac Sage et al-2007に開示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、従来技術には、肝臓サンプルを種々のタイプの肝疾患に簡単かつ信頼性をもって分類すること、および肝臓における非肝細胞性組織の存在、悪性肝細胞癌（ＨＣＣ）、良性限局性結節性過形成（ＦＮＨ）、肝細胞腺腫およびそのサブタイプの存在を簡単かつ信頼性をもって診断することを可能とする真の方法の開示は存在しない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
種々のタイプの肝臓サンプルから得られたマイクロアレイおよび定量的ＰＣＲデータの分析の新規戦略に基づき、本発明者らは、肝臓サンプルの厳密な分類および診断のための簡単かつ信頼性のある分子アルゴリズムを構築した。特に、本発明者らは、下記のことが可能ないくつかのシグネチャーを確立した：
・肝細胞性サンプルと非肝細胞性サンプル（その他の組織起源の転移、胆管癌腫）とを、または良性と悪性（肝細胞癌）肝細胞性サンプルとを信頼性をもって識別すること；
・良性肝細胞性サンプルの中で限局性結節性過形成（ＦＮＨ）または肝細胞腺腫（ＨＣＡ）の存在を厳密に診断すること；および
・ＨＣＡサンプルの中でＨＣＡサンプルのタイプ、すなわち、ＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡ、炎症性ＨＣＡ、βカテニン変異型ＨＣＡ、またはその他のＨＣＡを厳密に診断すること。
【００１２】
５５の遺伝子のグローバルセットは、肝臓をこのような全タイプの肝臓サンプルに信頼性をもって分類することを可能とする。
【００１３】
発明の説明
よって、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて肝臓サンプルを非肝細胞性サンプル、肝細胞癌（ＨＣＣ）サンプル、限局性結節性異形成(focal nodule dysplasia)（ＦＮＨ）サンプル、肝細胞腺腫（ＨＣＡ）サンプルまたは他の良性肝臓サンプルとして分類するための方法であって、
ａ）前記肝臓サンプルからｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて３８の下記の遺伝子：ＥＰＣＡＭ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＹＰ３Ａ７、ＦＡＢＰ１、ＨＡＬ、ＡＦＰ、ＧＮＭＴ、ＴＦＲＣ、Ｃ８Ａ、ＣＡＰ２、ＬＣＡＴ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＣ２０、ＤＨＲＳ２、ＬＹＶＥ１、ＡＤＭ、ＡＮＧＰＴＬ７、ＧＬＵＬ、ＡＮＧＰＴ１、ＨＭＧＢ３、ＧＭＮＮ、ＲＡＭＰ３、ＲＨＢＧ、ＵＧＴ２Ｂ７、ＬＧＲ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＲＢＭ４７、ＧＩＭＡＰ５、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＧＬＳ２、ＫＲＴ１９、ＥＳＲ１、ＳＤＳ、ＭＥＲＴＫ、ＥＰＨＡ１、ＣＣＬ５、およびＣＹＰ２Ｃ９、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイルを決定すること；
ｂ）少なくとも１つの参照肝臓サンプルで較正された少なくとも１つのアルゴリズムを用いて、９つの下記遺伝子：ＥＰＣＡＭ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＹＰ３Ａ７、ＦＡＢＰ１、ＨＡＬ、ＡＦＰ、ＧＮＭＴ、ＴＦＲＣ、およびＣ８Ａ、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイルに関して測定された発現レベルに基づき、前記肝臓サンプルが肝細胞性サンプルであるか非肝細胞性サンプルであるかを決定すること；
ｃ）前記肝臓サンプルが肝細胞性サンプルであれば、少なくとも１つの参照肝臓サンプルで較正された少なくとも１つのアルゴリズムを用いて、９つの下記遺伝子：ＡＦＰ、ＣＡＰ２、ＬＣＡＴ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＣ２０、ＤＨＲＳ２、ＬＹＶＥ１、およびＡＤＭ、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイルに関して測定された発現レベルに基づき、前記肝細胞性サンプルがＨＣＣサンプルであるか良性肝細胞性サンプルであるかを決定すること；
ｄ）前記肝臓サンプルが良性肝細胞性サンプルであれば、少なくとも１つの参照肝臓サンプルで較正された少なくとも１つのアルゴリズムを用いて、１３の下記遺伝子：ＨＡＬ、ＡＮＧＰＴＬ７、ＧＬＵＬ、ＡＮＧＰＴ１、ＨＭＧＢ３、ＧＭＮＮ、ＲＡＭＰ３、ＲＨＢＧ、ＵＧＴ２Ｂ７、ＬＧＲ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＲＢＭ４７、およびＧＩＭＡＰ５、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイルに関して測定された発現レベルに基づき、前記良性肝細胞性サンプルがＦＮＨサンプルであるかどうかを決定すること；
ｅ）前記肝臓サンプルが良性肝細胞性サンプルであれば、少なくとも１つの参照肝臓サンプルで較正された少なくとも１つのアルゴリズムを用いて、１３の下記の遺伝子：ＨＡＬ、ＣＹＰ３Ａ７、ＬＣＡＴ、ＬＹＶＥ１、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＧＬＳ２、ＫＲＴ１９、ＥＳＲ１、ＳＤＳ、ＭＥＲＴＫ、ＥＰＨＡ１、ＣＣＬ５、およびＣＹＰ２Ｃ９、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイルに関して測定された発現レベルに基づき、前記良性肝細胞性サンプルがＨＣＡサンプルであるかどうか決定すること；
ｆ）前記良性肝細胞性サンプルがＦＮＨサンプルでもＨＣＡサンプルでもなければ、それは別の良性肝臓サンプルとして分類されること
を含んでなる方法に関する。
【００１４】
有利な実施態様では、本発明による方法は、前記肝臓サンプルがＨＣＡサンプルと診断されれば、
ａ）前記ＨＣＡサンプルからｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて８つの付加的な下記遺伝子：ＨＡＭＰ、ＳＡＡ２、ＮＲＣＡＭ、ＲＥＧ３Ａ、ＡＭＡＣＲ、ＴＡＦ９、ＬＡＰＴＭ４Ｂ、およびＩＧＦ２ＢＰ３を含んでなるまたはからなる発現プロファイルをさらに決定すること；
ｂ）少なくとも１つの参照肝臓サンプルで較正された少なくとも１つのアルゴリズムを用い、４つの下記遺伝子：ＦＡＢＰ１、ＡＮＧＰＴ２、ＤＨＲＳ２、およびＵＧＴ２Ｂ７、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイルに関して測定された発現レベルに基づいて、前記ＨＣＡサンプルがＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡサンプルであるかどうかを決定すること；
ｃ）少なくとも１つの参照肝臓サンプルで較正された少なくとも１つのアルゴリズムを用い、７つの下記遺伝子：ＡＮＧＰＴ２、ＧＬＳ２、ＥＰＨＡ１、ＣＣｌ５、ＨＡＭＰ、ＳＡＡ２、およびＮＲＣＡＭ、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイルに関して測定された発現レベルに基づいて、前記ＨＣＡサンプルが炎症性ＨＣＡサンプルであるかどうかを決定すること；
ｄ）少なくとも１つの参照肝臓サンプルで較正された少なくとも１つのアルゴリズムを用い、１３の下記遺伝子：ＴＦＲＣ、ＨＡＬ、ＣＡＰ２、ＧＬＵＬ、ＨＭＧＢ３、ＬＧＲ５、ＧＩＭＡＰ５、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＲＥＧ３Ａ、ＡＭＡＣＲ、ＴＡＦ９、ＬＡＰＴＭ４Ｂ、およびＩＧＦ２ＢＰ３、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイルに関して測定された発現レベルに基づいて、前記ＨＣＡサンプルがβカテニン変異型ＨＣＡサンプルであるかどうかを決定すること；
ｅ）前記ＨＣＡサンプルがＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡサンプルでも炎症性ＨＣＡサンプルでもβカテニン変異型ＨＣＡサンプルでもなければ、それは別のＨＣＡサンプルとして分類されること
により、前記ＨＣＡサンプルを下記のＨＣＡサブグループ：ＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡ、炎症性ＨＣＡ、βカテニン変異型ＨＣＡまたはその他のＨＣＡのうちの１つに分類することをさらに含んでなる。
【００１５】
別の有利な実施態様では、本発明による方法は、前記肝臓サンプルがＨＣＣサンプルと診断されれば、前記ＨＣＣサンプルを下記の表１に記載される臨床的および遺伝的主要特徴：
【００１６】
【表１】
2016500512.tif 000002
により定義されるサブグループＧ１〜Ｇ６のうちの１つに分類することをさらに含んでなり、前記分類は
ａ）前記ＨＣＣサンプルからｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて１１の付加的な下記遺伝子：ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＰＩＲ、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、およびＳＡＥ１を含んでなるまたはからなる発現プロファイルをさらに決定すること；および
ｂ）１６の下記遺伝子：ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、およびＳＡＥ１、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるまたはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイルに関して測定された発現レベルに基づき６つのサブグループ距離を計算すること；および
ｃ）前記ＨＣＣ腫瘍をサブグループ距離が最小のサブグループに分類すること
により成される。
【００１７】
このようなＨＣＣサンプルのサブグループＧ１〜Ｇ６への分類はＷＯ２００７／０６３１１８Ａ１にすでに記載されており、このような分類に関する内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
【００１８】
好ましい実施態様では、ＨＣＣサンプルは、前記ＨＣＣサンプルから各サブグループＧｋ、１≦ｋ≦６までの距離を計算するための下式：
【数１】
2016500512.tif 000003
を用いて、サブグループＧ１〜Ｇ６のうちの１つに分類され、式中、各遺伝子ｔおよびサブグループＧｋに関してμ（サブグループＧｋ、遺伝子ｔ）およびσ（遺伝子ｔ）値は下記である。
【００１９】
【表２】
2016500512.tif 000004
【００２０】
本発明による上記方法は、ＨＣＣサンプルがサブグループＧ１〜Ｇ６のうちの１つにさらに分類される場合、またはＨＣＡサンプルがＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡサンプル、炎症性ＨＣＡサンプル、もしくはβカテニン変異型ＨＣＡサンプルとしてさらに分類される場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて一般分類のための第１の発現プロファイルおよびさらなるサブグループ分類のための第２の発現プロファイルを決定する２つの工程は、同時に１工程のみとして、または別々に異なる２工程としてのいずれで行ってもよい。好ましくは、それらは同時に１工程のみとして行われ、これがそれを行うのに最も簡単な様式であるからである。
【００２１】
本発明による上記方法では、アルゴリズムまたは距離関数を較正するために参照サンプルが使用され、その後、これらのアルゴリズムまたは距離関数は新たな肝臓サンプルを分類するために使用できる。本発明の方法の有利な実施態様では、発現プロファイルを解釈するために使用されるアルゴリズムまたは距離関数を較正するために使用される参照サンプルは下記：
ａ）肝臓サンプルが肝細胞性サンプルであるかどうかを決定するためには、少なくとも１つの（好ましくは、複数の）肝細胞性サンプルおよび少なくとも１つの（好ましくは、複数の）非肝細胞性サンプル；
ｂ）肝細胞性サンプルがＨＣＣサンプルであるかどうかを決定するためには、少なくとも１つの（好ましくは、複数の）良性サンプルおよび少なくとも１つの（好ましくは、複数の）ＨＣＣサンプル；
ｃ）良性肝細胞性サンプルがＦＮＨサンプルであるかどうかを決定するためには、少なくとも１つの（好ましくは、複数の）ＦＮＨサンプルおよび少なくとも１つの（好ましくは、複数の）非ＦＮＨ良性肝細胞性サンプル；
ｄ）良性肝細胞性サンプルがＨＣＡサンプルであるかどうかを決定するためには、少なくとも１つの（好ましくは、複数の）ＨＣＡサンプルおよび少なくとも１つの（好ましくは、複数の）非ＨＣＡ良性肝細胞性サンプル；
ｅ）ＨＣＡサンプルがＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡサンプルであるかどうかを決定するためには、少なくとも１つの（好ましくは、複数の）ＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡサンプルおよび少なくとも１つの（好ましくは、複数の）非ＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡサンプル；
ｆ）ＨＣＡサンプルが炎症性ＨＣＡサンプルであるかどうかを決定するためには、少なくとも１つの（好ましくは、複数の）炎症性ＨＣＡサンプルおよび少なくとも１つの（好ましくは、複数の）非炎症性ＨＣＡサンプル；
ｇ）ＨＣＡサンプルがβカテニン変異型ＨＣＡサンプルであるかどうかを決定するためには、少なくとも１つの（好ましくは、複数の）βカテニン変異型ＨＣＡサンプルおよび少なくとも１つの（好ましくは、複数の）非βカテニン変異型ＨＣＡサンプル；ならびに
ｈ）ＨＣＣサンプルをサブグループＧ１〜Ｇ６のうちの１つに分類するためには、各Ｇ１〜Ｇ６サブグループのうちの少なくとも１つの（好ましくは、複数の）サンプル
である。
【００２２】
「被験体」とは、性別または年齢を問わず、任意のヒト被験体を意味する。
【００２３】
「肝臓サンプル」とは、被験体の肝臓の一部を採取することによって得られる任意のサンプルを意味する。「肝細胞性」肝臓サンプルとは、分析された肝臓サンプルが主として肝細胞または肝細胞の前駆体から形成されることを意味するものとし、悪性転換を受けていても受けていなくてもよい。対照的に、「非肝細胞性」肝臓サンプルとは、肝臓サンプルが主として肝細胞または肝細胞の前駆体以外の細胞から形成されることを意味するものとする。非肝細胞性肝臓サンプルには、特に、非肝細胞性起源（例えば、肺、乳房、結腸、または皮膚癌など）の癌の転移から主として形成される肝臓サンプル、および肝臓から小腸に胆汁を排出する胆管に起源する変異した上皮細胞（または上皮分化の特徴を示す細胞）から構成される癌である胆管癌腫から主として形成される肝臓サンプルが含まれる。よって、胆管癌腫は肝臓内に存在するが、非肝細胞性細胞から形成される。
【００２４】
「悪性肝細胞性サンプル」、「肝細胞癌」または「ＨＣＣ」とは、肝臓の肝細胞または肝細胞前駆体の原発性悪性腫瘍を意味するものとする。ＨＣＣは一般に組織学的分析により診断され、高い核／細胞質比、小柱構造および非定型核を有する肝細胞増殖を特徴とする。
【００２５】
良性肝細胞性サンプルには、ＦＮＨまたはＨＣＡに罹患しているサンプル、およびその他の良性肝細胞性サンプルが含まれる。「限局性結節性過形成」または「ＦＮＨ」とは、症例の６０〜７０％に見られる星芒状中心瘢痕を一般に特徴とする肝臓の良性腫瘍を意味するものとする。顕微鏡的には、胆管増殖および線維性瘢痕内の奇形血管を伴う、軽度に見える(bland-appearing)肝細胞の小葉増殖が最も多いパターンである。その他のパターンとしては、毛細管拡張性、過形成腺腫様、および限局性大細胞異形成を伴う病変が含まれる。それは一般に組織学的分析により診断される。「肝細胞腺腫」、「肝腺腫」、「ヘパデノーマ(hepadenoma)」または「ＨＣＡ」とは、泡状空胞化細胞質を有する肝細胞のシートからなる境界明瞭な結節を特徴とする良性肝腫瘍を意味するものとする。肝細胞は、規則的なレチクリン足場上にあり、３細胞以下の厚さである。それは一般に組織学的分析により診断される。ＨＣＡのサブグループには、ＨＮＦ１Ａ遺伝子における１または複数の突然変異の存在を特徴とするＨＣＡである「ＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡ」、βカテニン遺伝子における１または複数の突然変異の存在を特徴とするＨＣＡである「βカテニン変異型ＨＣＡ」、組織学的および免疫組織化学分析法において炎症性浸潤物、類洞拡張、異形成動脈およびＳＡＡタンパク質の過剰発現の存在を特徴とするＨＣＡである「炎症性ＨＣＡ」、およびＨＮＦ１Ａ”変異型ＨＣＡでもβカテニン変異型ＨＣＡでも炎症性ＨＣＡでもないＨＣＡサンプルに相当する「その他のＨＣＡ」が含まれる。その他の良性肝細胞性サンプルには、健常肝臓サンプル、硬変肝臓サンプル、および再生性大結節性サンプル（異形成有りまたは無し）が含まれる。「再生性大結節性」とは、細胞の異形成を伴うまたは伴わない良性肝細胞を特徴とする、壊死、循環の変化、またはその他の刺激に応答して生じる３ｍｍより大きい肝臓結節を意味するものとする。それは一般に組織学的分析により診断される。
【００２６】
本発明による方法では、肝臓サンプルが分析される。このような肝臓サンプルは、特に、肝臓生検または部分的もしくは全肝臓腫瘍外科的切除であり得る。アルゴリズムおよび距離関数を較正するために使用される参照サンプルもまた肝臓サンプルであり、好ましくは、分析されるものと同じタイプのものである。
【００２７】
本発明による上記方法は、特定の遺伝子を含んでなるまたはからなる特定の発現プロファイルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ決定に基づく。最も完全な分類（非肝細胞性；サブグループＧ１〜Ｇ６のうちの１つへのさらなる分類を持つＨＣＣ；ＦＮＨ；ＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡ、炎症性ＨＣＡ、βカテニン変異型ＨＣＡまたはその他のＨＣＡへのさらなる分類を持つＨＣＡ；およびその他の良性肝臓サンプル）を行うためには５５の遺伝子が必要とされる。これら５５の遺伝子に関する情報を下表２に示す。
【００２８】
【表３】
2016500512.tif 000005
2016500512.tif 000006
2016500512.tif 000007
2016500512.tif 000008
2016500512.tif 000009
2016500512.tif 000010
2016500512.tif 000011
【００２９】
本発明による上記方法では、肝細胞性／非肝細胞性サンプル、良性／悪性肝細胞性サンプル、ＦＮＨ／非ＦＮＨ良性肝細胞性サンプル、ＨＣＡ／非ＨＣＡ良性肝細胞性サンプル、ＨＮＦ１Ａ変異型／非ＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡサンプル、炎症性／非炎症性ＨＣＡサンプル、およびβカテニン変異型／非βカテニン変異型ＨＣＡサンプルを識別するために、特定の遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイルが分析される。「発現プロファイル」とは、発現プロファイルに含まれる遺伝子群の発現レベルを意味する。「含んでなる」とは、発現プロファイルが他の遺伝子をさらに含んでなり得ることを意味するものとする。これに対して、「からなる」とは、分析される発現プロファイルにさらなる遺伝子が存在しないことを意味するものとする。「その等価発現プロファイル」または「ＥＥＰ」とは、それらの遺伝子のうちいくつか（好ましくは、多くて１つまたは２つの遺伝子）の付加、欠失または置換がその診断の信頼性を有意に変化させない、すなわち、感度（Ｓｅｎ）、特異度（Ｓｐｅ）、陽性反応的中度（ＰＰＶ）、および陰性反応的中度（ＮＰＶ）の値が１０％より大きく下回らない、オリジナルの発現プロファイル（それと前記ＥＥＰが等価である）を意味するものとする。
【００３０】
感度、特異度、ＰＰＶおよびＮＰＶは、当業者に周知の通常の統計パラメーターである。
【００３１】
感度は、その検査の陽性結果識別能に関し、その疾患を持つ人で陽性判定の人の割合である。
【００３２】
特異度は、その検査の陰性結果識別能に関し、その疾患を持たない人で陰性判定の人の割合と定義される。
【００３３】
陽性反応的中度（ＰＰＶ）は、陽性判定結果で、真の陽性である割合である。
【００３４】
陰性反応的中度（ＮＰＶ）は、陰性判定結果を持つ被験者で、正確に診断された割合と定義される。
【００３５】
好ましい実施態様では、等価発現プロファイルとしては、選択された遺伝子組合せの遺伝子のうち１つが等価な遺伝子で置換された発現プロファイルが含まれる。本明細書において、第１の遺伝子（「遺伝子Ａ」）は、発現プロファイルの「遺伝子Ａ」を「遺伝子Ｂ」で置き換えてもその検査の性能に有意に影響を及ぼさない、すなわち、感度（Ｓｅｎ）、特異度（Ｓｐｅ）、陽性反応的中度（ＰＰＶ）、および陰性反応的中度（ＮＰＶ）の値が１０％より大きく下回らない場合に、別の第２の遺伝子（「遺伝子Ｂ」）と等価と見なすことができる。これは一般に「遺伝子Ａ」が「遺伝子Ｂ」と相関する場合であり、ピアソンの相関係数などの尺度によって判定した場合に、「遺伝子Ａ」の発現が「遺伝子Ｂ」の発現レベルと統計学的に相関があることを意味する。相関は正（患者において「遺伝子Ａ」がアップレギュレートされている場合に、同じ患者で「遺伝子Ｂ」もアップレギュレートされていることを意味する）であってもよいし、または負（患者において「遺伝子Ａ」がアップレギュレートされている場合に、同じ患者で「遺伝子Ｂ」はダウンレギュレートされていることを意味する）であってもよい。本発明者らによって定量的ＰＣＲを用いて分析された１０３の遺伝子のうち、完全な分類に必要な５５の遺伝子のそれぞれと最も良く相関し、平均ピアソン相関係数が≧０．３または≦−０．３である最大１０の遺伝子を上記の表２に記載する。
【００３６】
「発現プロファイルを決定する」とは、選択された遺伝子の群の発現レベルの測定を意味する。各遺伝子の発現レベルは、当技術分野で公知の任意の技術を用い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、タンパク質レベルまたは核酸レベルのいずれかで決定することができる。
【００３７】
例えば、タンパク質レベルでの、特定のタンパク質の発現レベルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定は、限定されるものではないが、ＥＬＩＳＡまたは質量分析などの、当業者に公知の任意の方法によって行うことができる。これらの技術はいずれの肝臓サンプルにも容易に適合される。実際に、肝臓サンプルのタンパク質は、溶液法でＥＬＩＳＡまたは質量分析に関して当業者に周知の種々の技術を用いて抽出することができる。あるいは、肝臓サンプル中のタンパク質の発現レベルは、直接、組織切片での質量分析を用いて分析してもよい。
【００３８】
本発明による方法の好ましい実施態様では、発現プロファイルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて核酸レベルで決定される。核酸レベルにおいて、ある遺伝子の発現レベルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定は、直接的にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に対して、または逆転写した相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に対して行うことができる。限定されるものではないが、マイクロアレイ分析、定量的ＰＣＲ、サザン分析を含め、発現レベルを測定するためのいずれの方法も使用可能である。本発明による方法の好ましい実施態様では、発現プロファイルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて核酸マイクロアレイ、特に、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて決定される。本発明による方法の別の好ましい実施態様では、発現プロファイルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて定量的ＰＣＲを用いて決定される。いずれにせよ、いずれの遺伝子の発現レベルも正規化されることが好ましい。得られた発現データを正規化するためには、発現の測定に使用される技術によって多くの方法が存在する。このような方法は当業者に周知である。いくつかの実施態様では、正規化は、内部対照遺伝子、一般には、限定されるものではないが、リボソームＲＮＡ（例えば、１８ＳリボソームＲＮＡなど）またはＨＰＲＴ１（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１）、ＵＢＣ（ユビキチンＣ）、ＹＷＨＡＺ（チロシン３−モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、ゼータポリペプチド）、Ｂ２Ｍ（β−２−ミクログロブリン）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＦＰＧＳ（ホリルポリグルタミン酸シンターゼ）、ＤＥＣＲ１（２，４−ジエノイルＣｏＡレダクターゼ１、ミトコンドリア）、ＰＰＩＢ（ペプチジルプロリルイソメラーゼＢ（シクロフィリンＢ））、ＡＣＴＢ（アクチンβ）、ＰＳＭＢ２（プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット，βタイプ，２）、ＧＰＳ１（Ｇタンパク質経路サプレッサー１）、ＣＡＮＸ（カルネキシン）、ＮＡＣＡ（新生ポリペプチド関連複合体αサブユニット）、ＴＡＸ１ＢＰ１（Ｔａｘ１（ヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプＩ）結合タンパク質１）、およびＰＳＭＤ２（プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）２６Ｓサブユニット，非ＡＴＰアーゼ，２）などの遺伝子を含む、ハウスホールド遺伝子の発現レベルと比較して行うことができる。
【００３９】
本発明に関して、予後に使用される遺伝子の「発現値」（「発現レベル」とも呼ばれる）は、下記の両方を含む：
・正規化されてない生の発現値、および
・正規化に使用される方法に関わらず、さらに正規化されていてもよい生の発現値の導関数。
【００４０】
特に、予後に使用される遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現値を測定するために定量的ＰＣＲが使用される場合、ΔＣｔ、−ΔＣｔ、ΔΔＣｔ、または−ΔΔＣｔ値から選択される生の発現値の導関数が使用できる。
【００４１】
予後に使用される遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現値を測定するためにマイクロアレイが使用される場合、生の発現値（さらに正規化されていてもされていなくてもよい）の対数導関数（特に、ｌｏｇ２導関数）が通常使用される。
【００４２】
これらの技術もまた、いずれの肝臓サンプルにも容易に適合される。実際に、いくつかの周知の技術が、組織サンプルからｍＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するために当業者に利用可能である。
【００４３】
肝細胞性／非肝細胞性サンプル、良性／悪性肝細胞性サンプル、ＦＮＨ／非ＦＮＨ良性肝細胞性サンプル、ＨＣＡ／非ＨＣＡ良性肝細胞性サンプル、ＨＮＦ１Ａ変異型／非ＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡサンプル、炎症性／非炎症性ＨＣＡサンプル、およびβカテニン変異型／非βカテニン変異型ＨＣＡサンプルを識別するために発現プロファイルを解釈する目的で、多くのアルゴリズムが使用可能である。特に、適当なアルゴリズムとしては、ＰＬＳ（部分最小二乗）回帰アルゴリズム、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）アルゴリズム、線形回帰またはその派生アルゴリズム（ＧＬＭと略される一般化線形モデル、ロジスティック回帰を含む）、線形判別分析（ＬＤＡ、対角線形判別分析（ＤＬＤＡ）を含む）アルゴリズム、対角二次判別分析（ＤＱＤＡ）アルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、ｋ−ＮＮ（近傍）アルゴリズム、およびＰＡＭ（マイクロアレイ予測分析）アルゴリズムが含まれる。
【００４４】
参照サンプル群（一般に、トレーニングデータとも呼ばれる）は、良好な予後を不良な予後から最良に分離する最適な統計アルゴリズム（決定則など）を選択するために使用される。最良の分離は通常、分類を誤るサンプルができる限り少なく、異なるデータセットに対しても十分同等に遂行できる可能性が最も高いものである。
【００４５】
良好／不良な予後などの二元転帰では、ロジスティック回帰を含む線形回帰または一般化線形モデル（ＧＬＭと略される）が使用可能である。
【００４６】
線形回帰は、線形回帰関数の決定に基づき、その一般式は、
【数２】
2016500512.tif 000012
として表すことができる。
【００４７】
ロジスティック回帰は、ロジスティック回帰関数：
【数３】
2016500512.tif 000013
（式中、ｚは通常、
【数４】
2016500512.tif 000014
と定義される）
の決定に基づく。
【００４８】
上記の線形またはロジスティック回帰関数では、ｘ１〜ｘＮは、シグネチャーのＮ個の遺伝子の発現値（または定量的ＰＣＲの場合にはΔＣｔ、−ΔＣｔ、ΔΔＣｔ、もしくは−ΔΔＣｔ、もしくはマイクロアレイの場合には対数値などのその導関数）であり、β０は切片であり、かつ、β１〜βＮは回帰係数である。
【００４９】
切片および回帰係数の値は、参照サンプルの群（「トレーニングデータ」）に基づいて決定される。次に、線形またはロジスティック回帰関数の値は、検定発現プロファイルが良好または不良な予後を有する確率を定義する（トレーニングデータに基づいて線形またはロジスティック回帰関数を定義する場合、ユーザーが、その確率が良好な予後の確率か不良な予後の確率かを決定する）。その後、検定発現プロファイルは、それが良好な予後または不良な予後を有する確率が特定の閾値（これもまたトレーニングデータに基づいて決定される）より低いか高いかによって、良好な予後または不良な予後を有するとして分類される。場合によっては、未確定領域を画定する２つの閾値が使用される。ロジスティック回帰以外のタイプの一般化線形モデルも使用可能である。
【００５０】
新規なサンプルには、そのサンプルが良好な予後の群に近いか不良な予後の群に近いかに基づく近傍法（ｋ−ＮＮと略される）などの別法も慣用される。「より近い」という概念は、予後に有用なＮ個の遺伝子（従って、正規化目的で使用される潜在的ハウスキーピング遺伝子を除く）からなるシグネチャーにより画定されるｎ次元空間における距離（限定されるものではないが、ユークリッド距離などのメトリック）の選択に基づく。検定発現プロファイルと総ての参照良好または不良予後発現プロファイルの間の距離が計算され、そのサンプルがｋ最近接参照サンプルの解析により分類され（ｋは、少なくとも１、多くても一般に３または５の正の整数である）、分類の規則は、ｋ最近接参照発現プロファイル中の良好または不良予後参照発現プロファイルの数によって予め設定される。例えば、ｋが１であるとき、検定発現プロファイルは、最近接参照発現プロファイルが良好予後発現プロファイルであれば良好な予後として、最近接参照発現プロファイルが不良予後発現プロファイルであれば不良な予後として分類される。ｋが２であるとき、検定発現プロファイルは、その２つの最近接参照発現プロファイルが良好予後発現プロファイルであれば応答として、その２つの最近接参照発現プロファイルが不良予後発現プロファイルであれば不応答として分類され、その２つの最近接参照発現プロファイルが良好予後および不良予後参照発現プロファイルを含むかどうかは判定されない。ｋが３であるとき、検定発現プロファイルは、その３つの最近接参照発現プロファイルのうち少なくとも２つが良好予後発現プロファイルであれば良好な予後として、その３つの最近接参照発現プロファイルのうち少なくとも２つが不良な予後発現プロファイルであれば不良な予後として分類される。より一般には、ｋがｐであるとき、検定発現プロファイルは、そのｐ個の最近接参照発現プロファイルのうち半数を超えるものが良好予後発現プロファイルであれば良好な予後として、そのｐ個の最近接参照発現プロファイルのうち半数を超えるものが不良予後発現プロファイルであれば不良な予後として分類される。良好予後参照発現プロファイルと不良予後参照発現プロファイルの数が等しい場合には、その検定発現プロファイルは未確定として分類される。
【００５１】
統計学、数学または工学分野由来の他の方法論も存在し、例えば、限定されるものではないが、決定木、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、ニューラルネットワークおよび線形判別分析（ＬＤＡ）がある。これらのアプローチは当業者に周知である。
【００５２】
要約すると、線形回帰またはその派生法、例えば、一般化線形モデル（ＧＬＭ、ロジスティック回帰を含む）、近傍法（ｋ−ＮＮ）、決定木、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、ニューラルネットワーク、線形判別分析（ＬＤＡ）、ランダムフォレスト、またはマイクロアレイの推定分析（ＰＡＭ）から選択され得るアルゴリズムは参照サンプルの群（好ましくは、複数の良好予後参照発現プロファイルと複数の不良予後参照発現プロファイルを含む）に基づいて較正された後、検定サンプルに適応される。簡単に言えば、患者は、シグネチャー内の総ての遺伝子が、良好な予後の群（トレーニングデータ）から構築された参照プロファイル由来の総ての遺伝子にいかに匹敵するかに基づいて良好な予後（または不良な予後）として分類される。
【００５３】
発現プロファイルの個々の遺伝子が不良予後サンプルに対して良好予後サンプルで増加しているか減少しているかという概念は科学的に着目される。各個の遺伝子について、良好予後群の遺伝子発現レベルは、スチューデントのｔ検定または同等の方法の使用によって不良予後群と比較することができる。しかしながら、このような二元比較は、シグネチャーが数種の異なる遺伝子を含んでなる場合の予後には、一般に使用されない。
【００５４】
好ましい実施態様では、上記サンプルを識別するために有用として本明細書に記載される任意の発現プロファイルを解釈するために使用される１または複数のアルゴリズムは、
ａ）マイクロアレイの推定分析（ＰＡＭ）：
PAM(サンプルX)=Arg max(θYes(サンプルX); θNo(サンプルX))
式中、
【数５】
2016500512.tif 000015
ここで、
・ｘｉ、１≦ｉ≦Ｎは、発現プロファイルの遺伝子の発現レベルから導き出されたＮ個の変数のｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定された値を表し、かつ、
・πｉ、γｉ、πＹｅｓ，ｉ、πＮｏ，ｉ、１≦ｉ≦Ｎ、ＫＹｅｓおよびＫＮｏは、少なくとも１つの参照サンプルで較正された固定パラメーターである；
ｂ）対角線形判別分析（ＤＬＤＡ）：
DLDA(サンプルX)=Arg min(ΔYes(サンプルX) ; ΔNo(サンプルX))
式中、
【数６】
2016500512.tif 000016
ここで、
・ｘｉ、１≦ｉ≦Ｎは、発現プロファイルの遺伝子の発現レベルから導き出されたＮ個の変数のｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定された値を表し、かつ、
・υｉ、μＹｅｓ，ｉ、およびμＮｏ，ｉ、１≦ｉ≦Ｎは、少なくとも１つの参照サンプルで較正された固定パラメーターである；
ｃ）対角二次判別分析（ＤＱＤＡ）：
DQDA(サンプルX)=Arg min(▽Yes(サンプルX) ; ▽No(サンプルX))
式中、
【数７】
2016500512.tif 000017
ここで、
・ｘｉ、１≦ｉ≦Ｎは、発現プロファイルの遺伝子の発現レベルから導き出されたＮ個の変数のｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定された値を表し、かつ、
・υＹｅｓ，ｉ、υＮｏ，ｉ、μＹｅｓ，ｉ、μＮｏ，ｉ、１≦ｉ≦Ｎは、少なくとも１つの参照サンプルで較正された固定パラメーターであり、かつ、
【数８】
2016500512.tif 000018
である；
ｄ）またはそれらの任意の組合せ
から選択される。
【００５５】
肝細胞性／非肝細胞性サンプル、良性／悪性肝細胞性サンプル、ＦＮＨ／非ＦＮＨ良性肝細胞性サンプル、ＨＣＡ／非ＨＣＡ良性肝細胞性サンプル、ＨＮＦ１Ａ変異型／非ＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡサンプル、炎症性／非炎症性ＨＣＡサンプル、およびβカテニン変異型／非βカテニン変異型ＨＣＡサンプルを識別するために発現プロファイルを解釈する目的で、特に有利なアルゴリズムは、
診断(サンプルX)=多数決原理(PAM(サンプルX), DLDA(サンプルX), DQDA(サンプルX))
である。
【００５６】
好ましい実施態様では、肝細胞性／非肝細胞性サンプル、良性／悪性肝細胞性サンプル、ＦＮＨ／非ＦＮＨ良性肝細胞性サンプル、ＨＣＡ／非ＨＣＡ良性肝細胞性サンプル、ＨＮＦ１Ａ変異型／非ＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡサンプル、炎症性／非炎症性ＨＣＡサンプル、およびβカテニン変異型／非βカテニン変異型ＨＣＡサンプルを識別するために発現プロファイルを解釈する目的で、１または複数の発現プロファイルが定量的ＰＣＲを用いて決定され、かつ、ＰＡＭ、ＤＬＤＡおよびＤＱＤＡアルゴリズムの変数およびパラメーターが下記の通りである：
【００５７】
ａ）肝臓サンプルが肝細胞性サンプルであるかどうかを決定するためには、
・６個の変数ｘ１〜ｘ６は下記のように使用され、
【００５８】
【表４】
2016500512.tif 000019
【００５９】
・ＰＡＭパラメーターは下記であり、
【００６０】
【表５】
2016500512.tif 000020
【００６１】
・ＤＬＤＡおよびＤＱＤＡパラメーターは同じであって、下記の通りであり、
【００６２】
【表６】
2016500512.tif 000021
【００６３】
ｂ）肝細胞性サンプルがＨＣＣサンプルであるかどうかを決定するためには、
・６個の変数ｘ１〜ｘ６は下記のように使用され、
【００６４】
【表７】
2016500512.tif 000022
【００６５】
・ＰＡＭパラメーターは下記であり、
【００６６】
【表８】
2016500512.tif 000023
【００６７】
・ＤＬＤＡおよびＤＱＤＡパラメーター同じであって、下記の通りであり、
【００６８】
【表９】
2016500512.tif 000024
【００６９】
ｃ）良性肝細胞性サンプルがＦＮＨサンプルであるかどうかを決定するためには、１２個の変数ｘ１〜ｘ１２は次のように使用され、
【００７０】
【表１０】
2016500512.tif 000025
【００７１】
・ＰＡＭパラメーターは下記であり、
【００７２】
【表１１】
2016500512.tif 000026
【００７３】
・ＤＬＤＡおよびＤＱＤＡパラメーターは同じであって、下記の通りであり、
【００７４】
【表１２】
2016500512.tif 000027
【００７５】
ｄ）良性肝細胞性サンプルがＨＣＡサンプルであるかどうかを決定するためには、
・１０個の変数ｘ１〜ｘ１０は次のように使用され、
【００７６】
【表１３】
2016500512.tif 000028
【００７７】
・ＰＡＭパラメーターは下記であり、
【００７８】
【表１４】
2016500512.tif 000029
【００７９】
・ＤＬＤＡおよびＤＱＤＡパラメーターは同じであって、下記の通りであり、
【００８０】
【表１５】
2016500512.tif 000030
【００８１】
ｅ）ＨＣＡサンプルがＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡサンプルであるかどうかを決定するためには、
・２個の変数ｘ１〜ｘ６は次のように使用され、
【００８２】
【表１６】
2016500512.tif 000031
【００８３】
・ＰＡＭパラメーターは下記であり、
【００８４】
【表１７】
2016500512.tif 000032
【００８５】
・ＤＬＤＡおよびＤＱＤＡパラメーターは同じであって、下記の通りであり、
【００８６】
【表１８】
2016500512.tif 000033
【００８７】
ｆ）ＨＣＡサンプルが炎症性ＨＣＡサンプルであるかどうかを決定するためには、
・４個の変数ｘ１〜ｘ６は次のように使用され、
【００８８】
【表１９】
2016500512.tif 000034
【００８９】
・ＰＡＭパラメーターは下記であり、
【表２０】
2016500512.tif 000035
【００９０】
・ＤＬＤＡおよびＤＱＤＡパラメーターは同じであって、下記の通りであり、
【００９１】
【表２１】
2016500512.tif 000036
【００９２】
ｇ）ＨＣＡサンプルがβカテニン変異型ＨＣＡサンプルであるかどうかを決定するためには、
・９個の変数ｘ１〜ｘ６は次のように使用され、
【００９３】
【表２２】
2016500512.tif 000037
【００９４】
・ＰＡＭパラメーターは下記であり、
【００９５】
【表２３】
2016500512.tif 000038
【００９６】
・ＤＬＤＡおよびＤＱＤＡパラメーターは同じであって、下記の通りである。
【００９７】
【表２４】
2016500512.tif 000039
【００９８】
本発明はまた、多くて６５の異なる遺伝子を含んでなる発現プロファイルの決定のための試薬を含んでなるキットに関し、前記発現プロファイルは、
・下記の３８の遺伝子：ＥＰＣＡＭ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＹＰ３Ａ７、ＦＡＢＰ１、ＨＡＬ、ＡＦＰ、ＧＮＭＴ、ＴＦＲＣ、Ｃ８Ａ、ＣＡＰ２、ＬＣＡＴ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＣ２０、ＤＨＲＳ２、ＬＹＶＥ１、ＡＤＭ、ＡＮＧＰＴＬ７、ＧＬＵＬ、ＡＮＧＰＴ１、ＨＭＧＢ３、ＧＭＮＮ、ＲＡＭＰ３、ＲＨＢＧ、ＵＧＴ２Ｂ７、ＬＧＲ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＲＢＭ４７、ＧＩＭＡＰ５、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＧＬＳ２、ＫＲＴ１９、ＥＳＲ１、ＳＤＳ、ＭＥＲＴＫ、ＥＰＨＡ１、ＣＣＬ５、およびＣＹＰ２Ｃ９、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイル；
・下記の４６の遺伝子：ＥＰＣＡＭ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＹＰ３Ａ７、ＦＡＢＰ１、ＨＡＬ、ＡＦＰ、ＧＮＭＴ、ＴＦＲＣ、Ｃ８Ａ、ＣＡＰ２、ＬＣＡＴ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＣ２０、ＤＨＲＳ２、ＬＹＶＥ１、ＡＤＭ、ＡＮＧＰＴＬ７、ＧＬＵＬ、ＡＮＧＰＴ１、ＨＭＧＢ３、ＧＭＮＮ、ＲＡＭＰ３、ＲＨＢＧ、ＵＧＴ２Ｂ７、ＬＧＲ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＲＢＭ４７、ＧＩＭＡＰ５、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＧＬＳ２、ＫＲＴ１９、ＥＳＲ１、ＳＤＳ、ＭＥＲＴＫ、ＥＰＨＡ１、ＣＣＬ５、ＣＹＰ２Ｃ９、ＨＡＭＰ、ＳＡＡ２、ＮＲＣＡＭ、ＲＥＧ３Ａ、ＡＭＡＣＲ、ＴＡＦ９、ＬＡＰＴＭ４Ｂ、およびＩＧＦ２ＢＰ３、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイル；
・下記の４９の遺伝子：ＥＰＣＡＭ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＹＰ３Ａ７、ＦＡＢＰ１、ＨＡＬ、ＡＦＰ、ＧＮＭＴ、ＴＦＲＣ、Ｃ８Ａ、ＣＡＰ２、ＬＣＡＴ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＣ２０、ＤＨＲＳ２、ＬＹＶＥ１、ＡＤＭ、ＡＮＧＰＴＬ７、ＧＬＵＬ、ＡＮＧＰＴ１、ＨＭＧＢ３、ＧＭＮＮ、ＲＡＭＰ３、ＲＨＢＧ、ＵＧＴ２Ｂ７、ＬＧＲ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＲＢＭ４７、ＧＩＭＡＰ５、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＧＬＳ２、ＫＲＴ１９、ＥＳＲ１、ＳＤＳ、ＭＥＲＴＫ、ＥＰＨＡ１、ＣＣＬ５、ＣＹＰ２Ｃ９、ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＰＩＲ、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、およびＳＡＥ１、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイル；あるいは
・下記の５５の遺伝子：ＥＰＣＡＭ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＹＰ３Ａ７、ＦＡＢＰ１、ＨＡＬ、ＡＦＰ、ＧＮＭＴ、ＴＦＲＣ、Ｃ８Ａ、ＣＡＰ２、ＬＣＡＴ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＣ２０、ＤＨＲＳ２、ＬＹＶＥ１、ＡＤＭ、ＡＮＧＰＴＬ７、ＧＬＵＬ、ＡＮＧＰＴ１、ＨＭＧＢ３、ＧＭＮＮ、ＲＡＭＰ３、ＲＨＢＧ、ＵＧＴ２Ｂ７、ＬＧＲ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＲＢＭ４７、ＧＩＭＡＰ５、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＧＬＳ２、ＫＲＴ１９、ＥＳＲ１、ＳＤＳ、ＭＥＲＴＫ、ＥＰＨＡ１、ＣＣＬ５、ＣＹＰ２Ｃ９、ＨＡＭＰ、ＳＡＡ２、ＮＲＣＡＭ、ＲＥＧ３Ａ、ＡＭＡＣＲ、ＴＡＦ９、ＬＡＰＴＭ４Ｂ、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＲＡＢ１Ａ、ＮＲＡＳ、ＰＩＲ、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＣＤＨ２、およびＳＡＥ１、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイル
から選択される。
【００９９】
本発明によるキットは、好ましくは、上記発現プロファイルの１つの決定(the determination or one of the above mentioned expression profile)に特化され、よって、対象とする最大数の遺伝子を含む発現プロファイルが５５の遺伝子と任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなることが分かっているので、多くて６５の異なる遺伝子を含んでなる発現プロファイルの決定のための試薬を含んでなる。発現プロファイルが対象とする５５未満の遺伝子を含んでなる場合、本キットは好ましくは、対象とする遺伝子の数と、内部対照遺伝子および／または少数の付加的遺伝子を含み得る約１０以下の付加的遺伝子とを含んでなる発現プロファイルの決定のための試薬を含んでなる。このような付加的遺伝子は、例えば、そのサンプルがＨＣＣサンプルと判定されれば、疾患の予後に使用可能なさらなる発現プロファイルに相当し得る。
【０１００】
例えば、発現プロファイルが対象とする４９の遺伝子と任意で１以上の内部対照遺伝子とを含んでなる場合、本キットは好ましくは、多くて５９の異なる遺伝子を含んでなる発現プロファイルの決定のための試薬を含んでなる。発現プロファイルが対象とする４６の遺伝子と任意で１以上の内部対照遺伝子とを含んでなる場合、本キットは好ましくは、多くて５６の異なる遺伝子を含んでなる発現プロファイルの決定のための試薬を含んでなる。発現プロファイルが対象とする３８の遺伝子と任意で１以上の内部対照遺伝子とを含んでなる場合、本キットは好ましくは、多くて４８の異なる遺伝子を含んでなる発現プロファイルの決定のための試薬を含んでなる。
【０１０１】
多くてＮ個（Ｎは前述のとおり整数である）の異なる遺伝子を含んでなる発現プロファイルの決定のための試薬を含んでなるキットの上記実施態様の総てにおいて、キットに含まれる試薬は、Ｎ個を超える遺伝子を含んでなる発現プロファイルの決定はできない。特に、本発明によるこのようなキットは、何千もの遺伝子の発現プロファイルの決定を可能とする全ゲノムマイクロアレイを排除する。
【０１０２】
Ｎ個の遺伝子を含んでなる発現プロファイルの決定のための試薬は、前記発現プロファイルに含まれる遺伝子の発現レベルを特異的に定量することを可能とするいずれの試薬を含んでもよい。例えば、発現プロファイルがタンパク質レベルで決定される場合、このような試薬は、発現プロファイルに含まれる各遺伝子に特異的な抗体を含み得る。好ましくは、発現は核酸レベルで決定される。この場合、本発明のキット中の試薬は特に、発現プロファイルに含まれる各遺伝子に特異的なプライマー対（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）および／またはプローブ（特に、発現プロファイルの定量的ＰＣＲ決定に有用）または核酸マイクロアレイ、特に、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを含み得る。後者の場合、核酸マイクロアレイは、前段落で定義されるように、最大数の遺伝子の検出のためのプローブを含んでなる専用の核酸マイクロアレイである。言い換えれば、前記核酸マイクロアレイは、発現プロファイルに含まれる最大数を超える遺伝子を含んでなる発現プロファイルの決定はできない。
【０１０３】
導入において示したように、本発明による分類方法は、独特かつ簡単な検査に基づいて、被験体がどんなタイプの肝疾患に罹患しているかを厳密に知り、従って、その厳密な診断に対する治療を採用することを可能とするので、臨床医にとって重要である。
【０１０４】
よって、本発明はまた、本発明の分類方法によってＨＣＣサンプルとして分類された肝臓サンプルに基づいてＨＣＣに罹患していると診断された被験体におけるＨＣＣの治療に使用するための、ＩＧＦＲ１阻害剤、Ａｋｔ／ｍＴｏｒ阻害剤、プロテアソーム阻害剤および／またはｗｎｔ阻害剤に関する。本発明はまた、本発明の分類方法によってＨＣＣサンプルとして分類された肝臓サンプルに基づいてＨＣＣに罹患していると診断された被験体におけるＨＣＣの治療を意図した薬剤の調製のための、ＩＧＦＲ１阻害剤、Ａｋｔ／ｍＴｏｒ阻害剤、プロテアソーム阻害剤および／またはｗｎｔ阻害剤の使用に関する。前記被験体の肝臓サンプルがサブグループＧ１としてさらに分類されている場合には、ＩＧＦＲ１阻害剤またはＡｋｔ／ｍＴｏｒ阻害剤が好ましい。前記被験体の肝臓サンプルがサブグループＧ２としてさらに分類されている場合には、Ａｋｔ／ｍＴｏｒ阻害剤が好ましい。前記被験体の肝臓サンプルがサブグループＧ３としてさらに分類されている場合には、プロテアソーム阻害剤が好ましい。前記被験体の肝臓サンプルがサブグループＧ５またはＧ６としてさらに分類されている場合には、ｗｎｔ阻害剤が好ましい。しかしながら、現行のＷＮＴ阻害剤には毒性の問題があり、より有効かつ安全なＷＮＴ阻害剤の必要がなおある。
【０１０５】
本発明はまた、必要とする被験体において肝疾患を治療するための方法であって、
ａ）前記被験体の肝臓サンプルを、本発明による分類方法を用いて、非肝細胞性サンプル、肝細胞癌（ＨＣＣ）サンプル、限局性結節性異形成(focal nodule dysplasia)（ＦＮＨ）サンプル、肝細胞腺腫（ＨＣＡ）サンプルまたはその他の良性肝臓サンプルとして分類すること；
ｂ）前記サンプルが非肝細胞性サンプルであれば、サンプルの厳密な組織学的サブタイプを特定し、特定された組織学的サブタイプに従って前記被験体に治療を投与すること；
ｃ）前記サンプルがＨＣＣサンプルであれば、補助療法を伴いまたは伴わずに外科的切除を行うこと；
ｄ）前記サンプルがＦＮＨサンプルであれば、治療行為を行わないこと；
ｅ）前記サンプルがＨＣＡサンプルであれば、ＨＣＡサブグループに応じて被験体の経過観察のみか外科的切除を行うこと；
ｆ）前記サンプルがその他の良性肝細胞性サンプルであれば、治療行為を行わないこと
を含んでなる方法に関する。
【０１０６】
本発明の治療方法は、前記肝臓サンプルがＨＣＣサンプルである場合、
ｉ．前記ＨＣＣサンプルを上記のようにサブグループＧ１〜Ｇ６のうちの１つに分類すること；および
ｉｉ．前記ＨＣＣサンプルがＧ１サブグループに分類されれば、前記患者に有効量のＩＧＦＲ１阻害剤またはＡｋｔ／ｍＴｏｒ阻害剤を投与すること；
ｉｉｉ．前記ＨＣＣサンプルがＧ１〜Ｇ２サブグループに分類されれば、前記患者に有効量のｈｅｎ  Ａｋｔ／ｍＴｏｒ阻害剤を投与すること；
ｉｖ．前記ＨＣＣサンプルがＧ３サブグループに分類されれば、前記患者に有効量のプロテアソーム阻害剤を投与すること；
ｖ．前記ＨＣＣサンプルがＧ５〜Ｇ６サブグループに分類されれば、前記患者に有効量のｗｎｔ阻害剤を投与すること
をさらに含んでなり得る。
【０１０７】
本発明の治療方法は、前記肝臓サンプルがＨＣＣサンプルである場合、
ｉ．全生存期間および／または無再発生存期間を予測すること；および
ｉｉ．前記ＨＣＣサンプルが良好な予後を示せば、補助療法が行われないこと；
ｉｉｉ．前記ＨＣＣサンプルが不良な予後を示せば、前記被験体に細胞傷害性化学療法および／または標的療法などの補助療法を投与すること
をさらに含んでなり得る。
【０１０８】
本発明によれば、ＨＣＣ進行の「予測」は、特定のＨＣＣ腫瘍の、この特定のＨＣＣ腫瘍に罹患している患者に相対的な将来の進行の推定を意味する。本発明による方法は、全生存期間予測と無再発生存期間予測の両方を同時に可能とする。
【０１０９】
「全生存期間予測」とは、再発有りまたは無しの生存期間の予測を意味する。前述のように、ＨＣＣに対する主要な現行治療は、腫瘍の外科的切除である。結果として、「不良な全生存期間予測」は、肝臓切除後３年以内の死亡の発生と定義され、「良好な全生存期間予測」は、術後５年間死亡が無いことと定義される。
【０１１０】
「無再発生存期間予測」とは、再発の無い生存期間の予測を意味する。「不良な無再発生存期間予測」は、肝臓切除後２年以内の腫瘍再発の存在と定義され、「良好な無再発生存期間予測」は、術後４年間の再発が無いことと定義される。
【０１１１】
このような全生存期間および／または無再発生存期間の予測は、いずれの好適な方法を用いて行ってもよい。このような方法の例は特に、ＷＯ２００７／０６３１１８Ａ１に記載されている。
【０１１２】
補助療法は不良な予後の場合に投与される。前記補助療法は、下記から選択され得る。
ａ）細胞傷害性化学療法、すなわち、癌細胞を死滅させるのに有用な任意の好適な化学薬剤による療法。ＨＣＣの補助療法として現行使用され、かつ、本発明において好ましい細胞傷害性化学療法薬は、ドキソルビシン、ゲムシタビン、オキサリプラチン、およびそれらの組合せである。ドキソルビシンまたはゲムシタビンとオキサリプラチンの併用が特に好ましい。
ｂ）標的療法、すなわち、ＨＣＣ悪性化に関与するシグナル伝達経路の酵素を選択的に阻害する任意の好適な薬剤による療法。現在、数種のチロシンタンパク質キナーゼ（ＶＥＧＦＲおよびＰＤＧＦＲ）およびＲａｆキナーゼ（Ｂ−ＲａｆよりもＣ−Ｒａｆに注力されている）の小分子阻害剤であるソラフェニブがＨＣＣの補助療法に承認されており、本発明において好ましい。ソラフェニブは、式：
【化１】
2016500512.tif 000040
のビアリール尿素である。
【０１１３】
本発明の治療方法はまた、前記肝臓サンプルがＨＣＡサンプルである場合、
ｉ．前記ＨＣＡサンプルを上記のようなＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡ、炎症性ＨＣＡ、βカテニン変異型ＨＣＡまたはその他のＨＣＡのサブグループのうちの１つに分類すること；および
ｉｉ．前記ＨＣＡサンプルがＨＮＦ１Ａ変異型ＨＣＡサンプルとして分類されれば、ＨＣＡ＜５ｃｍの場合には前記被験体の経過観察のみを行い、またはＨＣＡ＞５ｃｍの場合には外科的切除を行うこと；
ｉｉｉ．前記ＨＣＡサンプルが炎症性ＨＣＡサンプルとして分類されれば、ＨＣＡ＜５ｃｍの場合には前記被験体の経過観察のみを行い、またはＨＣＡ＞５ｃｍの場合には外科的切除を行うこと；
ｉｖ．前記ＨＣＡサンプルがβカテニン変異型ＨＣＡサンプルとして分類されれば、ＨＣＡサイズによらず外科的切除を行うこと
をさらに含んでなり得る。
【０１１４】
本発明はまた、本発明による肝臓サンプルの分類方法を遂行するためのシステム（およびコンピューターシステムにそれを遂行させるためのコンピューター可読媒体）に関する。
【０１１５】
一つの実施態様において、本発明は、肝臓サンプルを分類するためのシステム１であって、
ａ）肝臓サンプルを受容し、
・下記の３８の遺伝子：ＥＰＣＡＭ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＹＰ３Ａ７、ＦＡＢＰ１、ＨＡＬ、ＡＦＰ、ＧＮＭＴ、ＴＦＲＣ、Ｃ８Ａ、ＣＡＰ２、ＬＣＡＴ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＣ２０、ＤＨＲＳ２、ＬＹＶＥ１、ＡＤＭ、ＡＮＧＰＴＬ７、ＧＬＵＬ、ＡＮＧＰＴ１、ＨＭＧＢ３、ＧＭＮＮ、ＲＡＭＰ３、ＲＨＢＧ、ＵＧＴ２Ｂ７、ＬＧＲ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＲＢＭ４７、ＧＩＭＡＰ５、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＧＬＳ２、ＫＲＴ１９、ＥＳＲ１、ＳＤＳ、ＭＥＲＴＫ、ＥＰＨＡ１、ＣＣＬ５、およびＣＹＰ２Ｃ９、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイル；
・下記の４６の遺伝子：ＥＰＣＡＭ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＹＰ３Ａ７、ＦＡＢＰ１、ＨＡＬ、ＡＦＰ、ＧＮＭＴ、ＴＦＲＣ、Ｃ８Ａ、ＣＡＰ２、ＬＣＡＴ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＣ２０、ＤＨＲＳ２、ＬＹＶＥ１、ＡＤＭ、ＡＮＧＰＴＬ７、ＧＬＵＬ、ＡＮＧＰＴ１、ＨＭＧＢ３、ＧＭＮＮ、ＲＡＭＰ３、ＲＨＢＧ、ＵＧＴ２Ｂ７、ＬＧＲ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＲＢＭ４７、ＧＩＭＡＰ５、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＧＬＳ２、ＫＲＴ１９、ＥＳＲ１、ＳＤＳ、ＭＥＲＴＫ、ＥＰＨＡ１、ＣＣＬ５、ＣＹＰ２Ｃ９、ＨＡＭＰ、ＳＡＡ２、ＮＲＣＡＭ、ＲＥＧ３Ａ、ＡＭＡＣＲ、ＴＡＦ９、ＬＡＰＴＭ４Ｂ、およびＩＧＦ２ＢＰ３、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイル；
・下記の４９の遺伝子：ＥＰＣＡＭ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＹＰ３Ａ７、ＦＡＢＰ１、ＨＡＬ、ＡＦＰ、ＧＮＭＴ、ＴＦＲＣ、Ｃ８Ａ、ＣＡＰ２、ＬＣＡＴ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＣ２０、ＤＨＲＳ２、ＬＹＶＥ１、ＡＤＭ、ＡＮＧＰＴＬ７、ＧＬＵＬ、ＡＮＧＰＴ１、ＨＭＧＢ３、ＧＭＮＮ、ＲＡＭＰ３、ＲＨＢＧ、ＵＧＴ２Ｂ７、ＬＧＲ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＲＢＭ４７、ＧＩＭＡＰ５、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＧＬＳ２、ＫＲＴ１９、ＥＳＲ１、ＳＤＳ、ＭＥＲＴＫ、ＥＰＨＡ１、ＣＣＬ５、ＣＹＰ２Ｃ９、ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＰＩＲ、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、およびＳＡＥ１、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイル；あるいは
・下記の５５の遺伝子：ＥＰＣＡＭ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＹＰ３Ａ７、ＦＡＢＰ１、ＨＡＬ、ＡＦＰ、ＧＮＭＴ、ＴＦＲＣ、Ｃ８Ａ、ＣＡＰ２、ＬＣＡＴ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＣ２０、ＤＨＲＳ２、ＬＹＶＥ１、ＡＤＭ、ＡＮＧＰＴＬ７、ＧＬＵＬ、ＡＮＧＰＴ１、ＨＭＧＢ３、ＧＭＮＮ、ＲＡＭＰ３、ＲＨＢＧ、ＵＧＴ２Ｂ７、ＬＧＲ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＲＢＭ４７、ＧＩＭＡＰ５、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＧＬＳ２、ＫＲＴ１９、ＥＳＲ１、ＳＤＳ、ＭＥＲＴＫ、ＥＰＨＡ１、ＣＣＬ５、ＣＹＰ２Ｃ９、ＨＡＭＰ、ＳＡＡ２、ＮＲＣＡＭ、ＲＥＧ３Ａ、ＡＭＡＣＲ、ＴＡＦ９、ＬＡＰＴＭ４Ｂ、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＲＡＢ１Ａ、ＮＲＡＳ、ＰＩＲ、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＣＤＨ２、およびＳＡＥ１、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイル
に関する発現レベル情報を決定するように構成された決定モジュール２；
ｂ）前記決定モジュールからの発現レベル情報を保存するように構成された保存デバイス３；
ｃ）前記保存デバイスに保存された発現レベル情報を参照データと比較し、比較結果を提供するように適合された比較モジュール４、ここで、前記比較結果は肝臓サンプルのタイプの指標となる；および
ｄ）ユーザー向けに前記分類結果に部分的に基づくコンテント６を表示するための表示モジュール５、ここで、前記コンテントは肝臓サンプルのタイプの指標となる信号である、
を含んでなるシステムに関する。
【０１１６】
別の実施態様では、本発明は、発現プロファイルデータの解釈に関する本発明による分類方法のコンピューターステップへの実装のためのソフトウエアモジュールを定義するためのコンピューター可読命令が記録されたコンピューター可読媒体７に関する。好ましくは、前記ソフトウエアモジュールは、
ａ）発現レベル情報をユーザーにより入力可能とし、さらなる比較のために保存（少なくとも一時的に）可能とするエントリーモジュール８、ここで、前記発現レベル情報は、
・下記の３８の遺伝子：ＥＰＣＡＭ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＹＰ３Ａ７、ＦＡＢＰ１、ＨＡＬ、ＡＦＰ、ＧＮＭＴ、ＴＦＲＣ、Ｃ８Ａ、ＣＡＰ２、ＬＣＡＴ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＣ２０、ＤＨＲＳ２、ＬＹＶＥ１、ＡＤＭ、ＡＮＧＰＴＬ７、ＧＬＵＬ、ＡＮＧＰＴ１、ＨＭＧＢ３、ＧＭＮＮ、ＲＡＭＰ３、ＲＨＢＧ、ＵＧＴ２Ｂ７、ＬＧＲ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＲＢＭ４７、ＧＩＭＡＰ５、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＧＬＳ２、ＫＲＴ１９、ＥＳＲ１、ＳＤＳ、ＭＥＲＴＫ、ＥＰＨＡ１、ＣＣＬ５、およびＣＹＰ２Ｃ９、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイル；
・下記の４６の遺伝子：ＥＰＣＡＭ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＹＰ３Ａ７、ＦＡＢＰ１、ＨＡＬ、ＡＦＰ、ＧＮＭＴ、ＴＦＲＣ、Ｃ８Ａ、ＣＡＰ２、ＬＣＡＴ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＣ２０、ＤＨＲＳ２、ＬＹＶＥ１、ＡＤＭ、ＡＮＧＰＴＬ７、ＧＬＵＬ、ＡＮＧＰＴ１、ＨＭＧＢ３、ＧＭＮＮ、ＲＡＭＰ３、ＲＨＢＧ、ＵＧＴ２Ｂ７、ＬＧＲ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＲＢＭ４７、ＧＩＭＡＰ５、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＧＬＳ２、ＫＲＴ１９、ＥＳＲ１、ＳＤＳ、ＭＥＲＴＫ、ＥＰＨＡ１、ＣＣＬ５、ＣＹＰ２Ｃ９、ＨＡＭＰ、ＳＡＡ２、ＮＲＣＡＭ、ＲＥＧ３Ａ、ＡＭＡＣＲ、ＴＡＦ９、ＬＡＰＴＭ４Ｂ、およびＩＧＦ２ＢＰ３、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイル；
・下記の４９の遺伝子：ＥＰＣＡＭ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＹＰ３Ａ７、ＦＡＢＰ１、ＨＡＬ、ＡＦＰ、ＧＮＭＴ、ＴＦＲＣ、Ｃ８Ａ、ＣＡＰ２、ＬＣＡＴ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＣ２０、ＤＨＲＳ２、ＬＹＶＥ１、ＡＤＭ、ＡＮＧＰＴＬ７、ＧＬＵＬ、ＡＮＧＰＴ１、ＨＭＧＢ３、ＧＭＮＮ、ＲＡＭＰ３、ＲＨＢＧ、ＵＧＴ２Ｂ７、ＬＧＲ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＲＢＭ４７、ＧＩＭＡＰ５、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＧＬＳ２、ＫＲＴ１９、ＥＳＲ１、ＳＤＳ、ＭＥＲＴＫ、ＥＰＨＡ１、ＣＣＬ５、ＣＹＰ２Ｃ９、ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＰＩＲ、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、およびＳＡＥ１、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイル；あるいは
・下記の５５の遺伝子：ＥＰＣＡＭ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＹＰ３Ａ７、ＦＡＢＰ１、ＨＡＬ、ＡＦＰ、ＧＮＭＴ、ＴＦＲＣ、Ｃ８Ａ、ＣＡＰ２、ＬＣＡＴ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＣ２０、ＤＨＲＳ２、ＬＹＶＥ１、ＡＤＭ、ＡＮＧＰＴＬ７、ＧＬＵＬ、ＡＮＧＰＴ１、ＨＭＧＢ３、ＧＭＮＮ、ＲＡＭＰ３、ＲＨＢＧ、ＵＧＴ２Ｂ７、ＬＧＲ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＲＢＭ４７、ＧＩＭＡＰ５、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＧＬＳ２、ＫＲＴ１９、ＥＳＲ１、ＳＤＳ、ＭＥＲＴＫ、ＥＰＨＡ１、ＣＣＬ５、ＣＹＰ２Ｃ９、ＨＡＭＰ、ＳＡＡ２、ＮＲＣＡＭ、ＲＥＧ３Ａ、ＡＭＡＣＲ、ＴＡＦ９、ＬＡＰＴＭ４Ｂ、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＲＡＢ１Ａ、ＮＲＡＳ、ＰＩＲ、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＣＤＨ２、およびＳＡＥ１、ならびに任意で１以上の内部対照遺伝子を含んでなるもしくはからなる発現プロファイル、またはその等価発現プロファイル
に関する；
ｂ）ユーザーにより入力された発現レベル情報を参照データと比較し、比較結果を提供するように適合された比較モジュール４、ここで、前記比較結果は肝臓サンプルのタイプの指標となる；および
ｃ）ユーザー向けに前記比較結果に部分的に基づくコンテント６を表示するための表示モジュール５、ここで、前記コンテントは肝臓サンプルのタイプの指標となる信号である、
を含んでなる。
【０１１７】
システムおよびコンピューター可読媒体に関する本発明の実施態様はファンクションモジュールによって記述されており、コンピューター可読媒体に記録されているコンピューター実行可能命令により定義され、実行された際にコンピューターにメソッドステップを遂行させる。これらのモジュールは、分かりやすくするために機能によって分離されている。しかしながら、これらのモジュールは個々の(discreet)コードブロックに対応する必要はなく、記載されている機能が様々な媒体に保存され、様々な時点で実行される様々なコード部分の実行によって遂行できると理解されるべきである。さらに、これらのモジュールは他の機能を遂行してもよく、従って、これらのモジュールは任意の特定の機能または機能セットを持つことに限定されないと認識されるべきである。
【０１１８】
コンピューター可読媒体は、コンピューターによりアクセス可能な任意の利用可能な有形媒体であり得る。コンピューター可読媒体としては、コンピューター可読命令、データストラクチャー、プログラムモジュールまたは他のデータなどの情報の保存のための任意の方法または技術に実装される揮発性および不揮発性、リムーバブルおよび非リムーバブル有形媒体が含まれる。コンピューター可読媒体としては、限定されるものではないが、ＲＡＭ（ランダム・アクセス・メモリ）、ＲＯＭ（リード・オンリー・メモリ）、ＥＰＲＯＭ（イレイサブル・プログラマブル・リード・オンリー・メモリ）、ＥＥＰＲＯＭ（エレクトリカリー・イレイサブル・プログラマブル・リード・オンリー・メモリ）、フラッシュメモリまたは他のメモリ技術、ＣＤ−ＲＯＭ（コンパクト・ディスク・リード・オンリー・メモリ）、ＤＶＤ（デジタル・バーサタイル・ディスク）または他の光学保存媒体、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク保存または他の磁気保存媒体、他のタイプの揮発性および不揮発性メモリ、および所望の情報を保存するために使用可能であり、かつ、コンピューターによりアクセス可能である任意の他の有形媒体（上記の任意の好適な組合せを含む）が挙げられる。
【０１１９】
１以上のコンピューター可読媒体に具現化されたコンピューター可読データは、例えば、コンピューターにより実行される結果として、コンピューターに本明細書に記載される１以上の機能（例えば、システム１、またはコンピューター可読媒体７に関する）、ならびに／または種々の実施態様、変形形態およびそれらの組合せを遂行するように命令する１以上のプログラムの一部としての命令を定義し得る。このような命令は、複数のプログラミング言語、例えば、Ｊａｖａ、Ｊ＃、Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ、Ｃ、Ｃ＃、Ｃ＋＋、Ｆｏｒｔｒａｎ、Ｐａｓｃａｌ、Ｅｉｆｆｅｌ、Ｂａｓｉｃ、ＣＯＢＯＬアセンブリ言語など、またはそれらの様々な任意の組合せのいずれで書かれていてもよい。このような命令が具現化されているコンピューター可読媒体は、本明細書に記載のシステム１またはコンピューター可読媒体６のいずれかの１以上の成分に存在してよく、このような成分の１以上にわたって記載されてもよく、その間で移行してもよい。
【０１２０】
コンピューター可読媒体は、そこに保存されている命令が、本明細書に述べられている本発明の態様を実施するために任意のコンピューターリソースにロードされ得るように転送可能である。さらに、上記の１または複数のコンピューター可読媒体に保存されている命令は、ホストコンピューター上で実行中のアプリケーションプログラムの一部として具現化された命令に限定されないと認識されるべきである。むしろ、これらの命令は、コンピューターを本発明の態様を実施するようにプログラムするために使用可能な任意のタイプのコンピューターコード（例えば、ソフトウエアまたはマイクロコード）として具現化できる。コンピューター実行可能命令は、好適なコンピューター言語または数種の言語の組合せで書かれてよい。基礎計算生物学法は当業者に公知であり、例えば、Setubal and Meidanis et al., Introduction to Computational Biology Methods (PWS Publishing Company, Boston, 1997, ref 38); Salzberg, Searles, Kasif, (Ed.), Computational Methods in Molecular Biology, (Elsevier, Amsterdam, 1998, ref 39); Rashidi and Buehler, Bioinformatics Basics: Application in Biological Science and Medicine (CRC Press, London, 2000, ref 40)およびOuelette and Bzevanis Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins (Wiley & Sons, Inc., 2nd ed., 2001)に記載されている。
【０１２１】
本発明の特定の実施態様の機能モジュールは、決定モジュール２、保存デバイス３、比較モジュール４および表示モジュール５を含む。機能モジュールは、１または複数のコンピューターで、または１または複数のコンピューターネットワークを使用することにより実行できる。決定モジュール２は、コンピューター可読形式で発現レベル情報を提供するためのコンピューター実行可能命令を含む。
【０１２２】
本明細書で使用する場合、「発現レベル情報」とは、全長または部分的いずれかの、任意のヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）および／またはアミノ酸配列の発現レベルに関する情報を意味する。好ましい実施態様では、発現レベル情報は、種々の技術により測定されるｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの発現レベルを意味する。この情報は、質的（転写産物の有無）であっても量的であってもよい。好ましくは、情報は量的である。
【０１２３】
発現レベル情報を決定するための方法、すなわち、決定モジュール２は、タンパク質およびＤＮＡ／ＲＮＡ分析のためのシステム、特に、核酸レベルまたはタンパク質レベルにおける発現プロファイルの決定に関して上記したものを含む。
【０１２４】
決定モジュールにおいて決定される発現レベル情報は、保存デバイス３により読み取り可能である。本発明で使用する場合、「保存デバイス」３は、データまたは情報を保存するために構成または適合された、任意の好適な計算もしくは処理装置またはその他のデバイスを含むことを意図する。本発明とともに使用するために好適な電子装置の例としては、スタンドアローン計算装置、データテレコミュニケーションネットワーク（ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）、インターネット、イントラネット、およびエクトラネットを含む）、ならびにローカルおよび分散コンピュータープロセシングシステムが挙げられる。保存デバイス３はまた、限定されるものではないが、磁気保存媒体（例えば、フロッピーディスク、ハードディスク保存媒体、磁気テープ）、光学保存媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ）、電子保存媒体（例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ）など、一般ハードディスクおよびこれらのカテゴリーのハイブリッド、例えば、磁気／光学保存媒体を含む。保存デバイス３は、発現レベル情報が記録されるように適合または構成される。このような情報は、例えば、インターネット、ディスケット、ＵＳＢ（ユニバーサル・シリアル・バス）またはデバイス間の無線通信を含む任意の他の好適な通信様式を介して伝送および電子読み取り可能なデジタル形式で提供できる。
【０１２５】
本発明で使用する場合、「保存」とは、保存デバイス３の情報をコード化するプロセスを意味する。当業者ならば、発現レベル情報を含んでなる製品を作製するために、既知の媒体に情報を記録するために現在知られている方法のいずれかを容易に採用することができる。
【０１２６】
発現レベル情報を保存デバイスに保存するためには、様々なソフトウエアプログラムおよびフォーマットを使用することができる。発現レベル情報が記録されている媒体を取得または作出するために、いずれの数のデータプロセッサーストラクチャリングフォーマット（例えば、テキストファイル、スプレッドシートまたはデータベース）を使用してもよい。
【０１２７】
発現レベル情報をコンピューター可読形式で提供することにより、比較モジュール４において、発現レベル情報を可読形式で用いて、特異的な発現プロファイルを保存デバイス３内の参照データと比較することができる。比較は特に、上記の種々のアルゴリズムを用いて行うことができる。コンピューター可読形式で行われた比較はコンピューター可読比較結果を提供し、これは種々の手段によって処理することができる。比較結果に基づく内容は比較モジュール４から検索でき、表示モジュール５により表示させて肝臓サンプルのタイプを示すことができる。
【０１２８】
好ましくは、参照データは、本発明による分類方法によって見られる可能性のあるあらゆるタイプの肝臓サンプルの指標となる発現レベルプロファイルである。
【０１２９】
「比較モジュール」４は、すでに上記したものなどの統計分類アルゴリズムを提供する任意のソフトウエアを直接的または間接的に用い、決定モジュール２で決定された発現レベル情報を参照データと比較するように働く、比較のための様々な利用可能なソフトウエアプログラムおよびフォーマットを使用することができる。
【０１３０】
比較モジュール４、または本発明の任意の他のモジュールは、リレーショナルデータベース管理システム、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂアプリケーション、およびＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂサーバーを動かすオペレーティングシステム（例えば、Ｗｉｎｄｏｗｓ、Ｌｉｎｕｘ、Ｍａｃ  ＯＳまたはＵＮＩＸ）を含み得る。Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂアプリケーションは、データベース言語ステートメント（例えば、構造化問合せ言語(Structured Query Language)（ＳＱＬ）ステートメント）の生成に必要な実行可能コードを含む。一般に、実行可能には、埋め込みＳＱＬステートメントを含む。さらに、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂアプリケーションは、サーバーならびにユーザーリクエストに応えるためにアクセスされなければならない種々の外部および内部データベースを含んでなる種々のソフトウエア実体に対するポインターおよびアドレスを含む設定ファイルを含み得る。必要に応じて、サーバーが２以上の分離したコンピューターに分散されていれば、設定ファイルはまた、サーバーリソースに対するリクエストを適当なハードウエアに割り当てる。一つの実施態様では、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂサーバーは、ＴＣＰ／ＩＰプロトコールをサポートする。このようなローカルネットワークは「イントラネット」と呼ばれる場合がある。このようなイントラネットの利点は、それらがＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ上に存在するパブリックドメインデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋまたはＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂサイト）との容易な通信を可能とするということである。従って、本発明の特定の好ましい実施態様では、ユーザーは、ウェブブラウザおよびウェブサーバーによって提供されるＨＴＭＬインターフェースを用い、インターネットデータベース上に存在するデータに直接アクセスすることができる（例えば、ハイパーテキストリンクを介する）。
【０１３１】
比較モジュール４は、既定義の判定基準、またはユーザーにより定義される判定基準によりコンピューター可読形式で処理可能なコンピューター可読比較結果を提供し、ユーザーにより要求される場合には、表示モジュール５を用いて保存および出力が可能な比較結果に部分的に基づくコンテント６を提供する。表示モジュール５は、ユーザー向けに、比較結果に部分的に基づくコンテント６の表示を可能とし、このコンテントは肝臓サンプルのタイプの指標となる信号である。このような信号は、例えば、コンピューターモニター上への肝臓サンプルのタイプの指標となるコンテントの表示、プリンターからの肝臓サンプルのタイプを示すコンテントの出力ページもしくは出力レポート、または肝臓サンプルのタイプの指標となる光もしくは音であり得る。
【０１３２】
表示モジュール５は、コンピューターからコンピューター可読情報を受容し、ユーザーに対して表示するように構成されたいずれの好適なデバイスであってもよい。限定されない例としては、例えば、Ｉｎｔｅｌ  ＰＥＮＴＩＵＭタイププロセッサー、Ｍｏｔｏｒｏｌａ  ＰｏｗｅｒＰＣ、Ｓｕｎ  ＵｌｔｒａＳＰＡＲＣ、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ＰＡ−ＲＩＳＣプロセッサー、カリフォルニア州サニーベールのＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（ＡＭＤ）から、もしくはＡＲＭ  Ｈｏｌｄｉｎｇｓから入手可能な様々なプロセッサーのいずれか、または任意の他のタイプのプロセッサー、フラットパネルディスプレー、カソードレイチューブなどのビジュアルディスプレーデバイス、ならびに種々のタイプのコンピュータープリンターまたは集積デバイス、例えば、ラップトップまたはタブレット、特に、ｉＰａｄに基づくものなどの汎用コンピューターが挙げられる。
【０１３３】
一つの実施態様では、比較結果に基づくコンテント６の表示のためのユーザーインターフェースを提供するためにＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂブラウザが使用される。本発明の他のモジュールはウェブブラウザインターフェースを備えるように適合させることができると理解されるべきである。このウェブブラウザを介して、ユーザーは比較モジュールからのデータを検索するためのリクエストを構築することができる。そして、ユーザーは一般に、グラフィックユーザーインターフェースにおいて従来使用されている、ボタン、プルダウンメニュー、スクロールバーなどのユーザーインターフェースエレメントにポインターを置き、クリックする。このようにユーザーのウェブブラウザで作成されたリクエストはＷｅｂアプリケーションに伝送され、ウェブアプリケーションは、適切な情報を抽出するために使用可能なクエリを作成するためにそれらを初期化する。
【０１３４】
一つの実施態様では、表示モジュール５は比較結果、およびその比較結果は肝臓サンプルのタイプの指標となる。
【０１３５】
一つの実施態様では、表示される比較結果に基づくコンテント６は、肝臓サンプルのタイプの指標となる信号（例えば、陽性または陰性の信号）であり、従って、陽性または陰性の指標のみが表示され得る。
【０１３６】
従って、本発明は、発現プロファイル情報に基づいて肝臓サンプルを分類する方法を遂行するためのシステム１（およびコンピューターシステムにそれを遂行させるためのコンピューター可読媒体７）を提供する。
【０１３７】
システム１、およびコンピューター可読媒体７は、単に、発現プロファイルに基づいて肝臓サンプルを分類する方法を遂行するための本発明の例示的実施態様であり、本発明の範囲を限定することを意図しない。システム１、およびコンピューター可読媒体７の変形形態も可能であり、本発明の範囲内に入るものとする。
【０１３８】
システム１の、またはコンピューター可読媒体で使用されるモジュールは、多くの構成を想定し得る。例えば、機能は単独機に提供されてもよいし、または複数機に分散されてもよい。
【０１３９】
本発明を全般的に記載してきたが、本発明の特徴および利点のさらなる理解は具体例および図面を参照することで得られる。これらの具体例および図面は、単に例示の目的で本明細書に示されるものであり、特に断りのない限り、限定することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】肝細胞性腫瘍の分類および診断のための５５の遺伝子の分子アルゴリズム。腫瘍の各サブセットの下に感度（ｓｅｎ）、特異度（ｓｐｅ）、陰性反応的中度（ＰＮＶ）、陽性反応的中度（ＰＰＶ）および精度（ａｃｃ）を詳細に示した。アルゴリズムの各分岐の遺伝子は、グレーの四角の中にまとめた。
【実施例】
【０１４１】
実施例１．肝臓サンプルを種々のタイプの肝疾患に分類することを可能とする分子シグネチャーの同定
患者および方法
患者および組織サンプル
肝臓サンプルは、ボルドー（１９９８〜２００７）およびクレテイユ（２００３〜２００７）の２つのフランス大学病院で、腫瘍に関する肝臓切除の後に系統的に冷凍した。合計５５０サンプルを本研究に含め、本研究は施設内ＩＲＢ委員会(CCPRB Paris Saint Louis, 1997および2004)により承認され、フランス法に従って総ての患者からインフォームド・コンセントを得た。（１）壊死＞８０％の腫瘍、（２）不良な質または不十分な量のＲＮＡを有する腫瘍、（３）非治癒切除のＨＣＣ：Ｒ１またはＲ２切除または手術時に過度な肝転移、（４）肝移植により処置されたＨＣＣが除外された。
【０１４２】
よって、以下のサンプルが含まれた：
・肝内胆管癌腫（ｎ＝１９）、結腸直腸癌転移（ｎ＝１４）および神経内分泌癌転移（ｎ＝２）、血管脂肪腫（ｎ＝３）、平滑筋腫（ｎ＝１）および血管腫（ｎ＝１）を含んでなる４０の非肝細胞性腫瘍、
・３２４のＨＣＣ、
・限局性結節性過形成（ＦＮＨ、ｎ＝２５）、肝細胞腺腫（ＨＣＡ、ｎ＝１１１）、再生性大結節（異形成を伴うｎ＝１５、または伴わないｎ＝５）を含む１５６の良性肝細胞性腫瘍、および
・硬変（ｎ＝２３、ＨＣＶ関連ｎ＝１０、ＨＢＶに関連ｎ＝３、アルコール関連ｎ＝７、ＮＡＳＨ関連ｎ＝１、原発性胆汁性肝硬変関連ｎ＝１、α−１抗トリプシン欠乏症関連ｎ＝１）および７つの正常肝臓組織を含む３０の非腫瘍サンプル。
【０１４３】
ＨＣＡの分子サブタイプ（β−カテニン活性化ｎ＝２３、ＨＮＦ１Ａ不活性化ｎ＝２６、炎症性ｎ＝６８および未分類ｎ＝８）は、遺伝子突然変異および免疫組織化学染色を用い、Zucman Rossi J, et al. Hepatology 2006に記載されている従前の分子分類に従って決定した。１４（１２．６％）のＨＣＡは、炎症性表現型とβ−カテニンの活性化突然変異の両方を示した。
【０１４４】
腫瘍および非腫瘍性肝臓サンプルは手術直後に冷凍し、−８０℃で保存した。また、冷凍対応物からの組織サンプルを１０％ホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン包埋し、ヘマトキシリンおよびエオジンおよびマッソンの三重染色で染色した。ＨＣＡ、ＨＣＣ、ＦＮＨ、粗大再生結節および総ての非肝細胞性腫瘍の診断は、確立された組織学的判定基準に基づいた(International working party Hepatology 1995, international consensus group Hepatology 2009)。腫瘍は総て患者の転帰および初期診断を知らない２名の専門病理学者（ＪＣおよびＰＢＳ）によって独立に評価された。肝細胞性腫瘍のサブタイプ診断に関して、または予後分析に含まれるＨＣＣの病理学的特徴に関して不一致がある場合には、切片を再調査し、一致を見てから試験に用いた。複数の腫瘍の場合は、利用可能な最大結節を本発明者らの予後試験で分析した。
【０１４５】
定量的ＰＣＲによるさらなる分析のための遺伝子の選択
本発明者らは１０３遺伝子を定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析に関して選択した。同じプラットフォームで行ったＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ１３３Ａ遺伝子チップＴＭマイクロアレイハイブリダイゼーションを用い、５７のＨＣＣ（Ｅ−ＴＡＢＭ−３６）、５つのＨＮＦ１Ａ不活性化腺腫（ＧＳＥ７４７３）、７つの炎症性腺腫（ＧＳＥ１１８１９）、４つの限局性結節性過形成（ＧＳＥ９５３６）、９つの非腫瘍性肝臓サンプル（硬変および正常肝臓（Ｅ−ＴＡＢＭ−３６およびＧＳＥ７４７３を含む）を含む８２の肝臓サンプルのｍＲＮＡ発現を分析した。腫瘍の特定のサブグループで示差的に発現される遺伝子を３つの包含基準に従って選択した：
（１）３８の遺伝子が本発明者らによって得られ、boyault et al and rebouissou JBC Rebouissou Nature and rebouissou J Hepatolに記載されたこれまでのマイクロアレイデータから選択された：ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、ＳＡＥ１、ＮＴＳ、ＨＡＬ、ＳＤＳ、ｃｍｋＯＲ１／ＣＸＣＲ７、ＩＤ２、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＣＤＴ６、ＵＧＴ２Ｂ７、ＬＦＡＢＰ、ＧＬＵＬ、ＬＧＲ５／ＧＰＲ４９、ＴＢＸ３、ＲＨＢＧ、ＳＬＰＩ、ＡＭＡＣＲ、ＳＡＡ２、ＣＲＰ、ＭＭＥ、ＤＨＲＳ２、ＳＬＣ１６Ａ１、ＧＬＳ２、およびＧＮＭＴ；
（２）９つの遺伝子がこれまで文献に記載されている(Odom DT, et al. 2004; Paradis V, et al. 2003; Rebouissou S, et al. 2008; Llovet J, et al. 2006; Capurro M, et al. 2003; Chuma M, et al. 2003; Tsunedomi 2005; Kondoh N 1999)：ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＳＥＲＰＩＮ、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ２、ＸＬＫＤ１−ＬＹＶＥ１、ＧＰＣ３、ＨＳＰ７０／ＨＳＰＡ１Ａ、およびＣＹＰ３Ａ７；ならびに
（３）１３の遺伝子が本発明者らのこれまでのマイクロアレイデータの新たな分析から選択された：ＳＴＥＡＰ３、ＲＲＭ２、ＧＳＮ、ＣＹＰ２Ｃ１９、Ｃ８Ａ、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＥＳＲ１、ＧＭＮＮ、ＣＡＰ２、ＤＰＰ８、ＬＣＡＴ、ＮＥＫ７、ＬＡＰＴＭ４Ｂ。
【０１４６】
合計６０の遺伝子を定量的ＰＣＲによりその後の分析のために選択した。
【０１４７】
この段階で、本発明者らはまた、ＨＣＣの簡単かつ信頼性のある予後のための新規なツールを提供したいと考え、従って、ＨＣＣ予後に関連することが判明した、または既に記載されているさらなる遺伝子もさらなる定量的ＰＣＲ分析に含めた：
（１）根本的に異なる予後によって特徴付けられたＨＣＣ患者間で最も差次的に発現される（有意性および倍率）４１遺伝子のパネルを、治癒的切除により処置された４４のＨＣＣの発現パターンのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイＥ−ＴＡＢＭ−３６分析を用いて得られた新たなマイクロアレイデータにより同定した：ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＰＳＭＤ１、ＡＲＦＧＥＦ２、ＳＰＰ１、ＣＤＣ２０、ＮＲＡＳ、ＥＮＯ１、ＲＲＡＧＤ、ＣＨＫＡ、ＲＡＮ、ＴＲＩＰ１３、ＩＭＰ−３／ＩＧＦ２ＢＰ３、ＫＬＲＢ１、Ｃ１４ｏｒｆ１５６、ＮＰＥＰＰＳ、ＰＤＣＤ２、ＰＨＢ、ＫＩＡＡ００９０、ＫＰＮＡ２、ＫＩＡＡ０２６８／ＵＮＱ６０７７／ＬＯＣ４４０７５１、Ｇ６ＰＤ、ＳＴＫ６、ＴＦＲＣ、ＧＬＡ、ＡＫＲ１Ｃ１／ＡＫＲ１Ｃ２、ＧＩＭＡＰ５、ＡＤＭ、ＣＣＮＢ１、ＴＫＴ、ＡＧＰＳ、ＮＵＤＴ９、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＮＥＵ１、ＲＡＲＲＥＳ２、ＢＩＲＣ５、ＦＬＪ２０２７３、ＨＭＧＢ３、ＭＰＰＥ１、ＣＣＬ５、およびＤＬＧ７；ならびに
（２）ＨＣＣ予後に関連するとして文献に記載されている２つの遺伝子（ＫＲＴ１９およびＥＰＣＡＭ）(Lee JS nat med 2006, Yamashita T gastroenterology 2008)。
【０１４８】
合計４３の遺伝子をＨＣＣ予後との関連に関して選択した。
【０１４９】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡ抽出および定量的ＲＴ−ＰＣＲは、従前に記載されているように行った。１０３の選択遺伝子の発現を、ＴａｑＭａｎ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｃａｒｄ  ＴＬＤＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）遺伝子発現アッセイを用い、５５０の全サンプルにおいて二反復で分析した。遺伝子発現を、ＲＮＡリボゾーム１８Ｓを用いて正規化し、腫瘍サンプルの発現レベルを正常肝臓組織での対応する遺伝子発現の平均レベルと比較し、ｎ倍率として表した。ＲＮＡの相対量を、２ΔΔＣＴ法を用いて算出した。
【０１５０】
突然変異スクリーニング
ＤＮＡを抽出し、質を評価した。総てのＨＣＡサンプルは、ＣＴＮＮＢ１（エキソン２〜４）、ＨＮＦ１Ａ（エキソン１〜１０）、ＩＬ６ＳＴ（エキソン６および１０）、ＧＮＡＳ（エキソン８）およびＳＴＡＴ３（エキソン２、５および２０）に関して配列決定が行われていた。総てのＨＣＣサンプルは、ＣＴＮＮＢ１（エキソン２〜４）およびＴＰ５３（エキソン２〜１１）に関して配列決定が行われていた。総ての突然変異を、両鎖において、二次的な独立増幅産物を配列決定することにより確認し、生殖細胞系突然変異を検出するために、適合する非腫瘍サンプルにおける突然変異のスクリーニングを行った。
【０１５１】
診断のエンドポイント
病理学者間での一致を診断の最も良い判断基準と考えた。本発明者らは、ＨＣＣ、ＦＮＨ、ＨＣＡおよびＨＣＡのサブタイプの違いの診断の感度（Ｓｅｎ）、特異度（Ｓｐｅ）、陰性的中度（ＰＮＶ）、陽性的中度（ＰＰＶ）および精度を評価した。分子アルゴリズムの、ＨＣＣ、ＦＮＨおよびＨＣＡからの識別能を評価するために、非肝細胞性腫瘍、再生性大結節および非腫瘍性肝臓サンプル（硬変および正常肝臓）を含めた。本試験は、非肝細胞性腫瘍の特異的サブタイプ、非腫瘍性肝臓サンプル（正常肝臓および硬変）および再生性大結節のサブタイプの違いを診断するようには設計されていなかった。
【０１５２】
分子診断のアルゴリズムの構築
５５０のサンプルをグローバルトレーニングセットＳ１（ｎ＝３０６）とグローバルバリデーションセットＳ２（ｎ＝２４４）に分けた。この区切りは推定する各変数Ｖ（肝細胞タイプ、悪性、…）にトレーニングセットＳ１Ｖ（⊆Ｓ１）とバリデーションセットＳ２Ｖ（⊆Ｓ２）（両者はこの変数に関して分析されるサンプルのおよそ５０％を含有し、「陽性」例の割合が同等である）（ここで、総ての変数は二元であり、値はイエスまたはノーであり；「陽性」例はイエスの値をとるサンプルを意味する）を与えるように無作為に設けた。
【０１５３】
１０３の遺伝子を測定し（−ΔΔＣｔ尺度）、および４つの演算（和、差、最小、最大）を異なる遺伝子（ｎ＝５８８６）の総ての対に適用して新たな変数を作成し、合計２３６５３（最初の１０３、作成された２３５４４）の変数とした。
【０１５４】
変数Ｖが推定されれば、対応するトレーニングセットＳ１Ｖを等しい*サイズで「陽性」例の割合も等しい*（*：またはｎに支障がある場合にはほとんど等しい）２つのサブセットＳ１Ｖ．ＡとＳ１Ｖ．Ｂに無作為に分けた。
【０１５５】
次に、推定される変数に応じて（すなわち、臨床的意味に応じて）、陽性反応的中度（限局性結節性過形成、ＨＮＦ１Ａ、炎症性、βカテニン）にウエイトをかけるか、感度（肝細胞性、悪性、腺腫）にウエイトをかけるか基準を選択した。全症例において、最終的基準は０．８基準１４＋０．２基準２（基準１および基準２はそれぞれＰＰＶおよび感度またはその逆に相当する）として得られた。
【０１５６】
次に、Ｓ１Ｖ．Ａにて２３６５３の各変数についてＡＵＣ判定基準を計算し（ＰｒｅｓｅｎｃｅＡｂｓｅｎｃｅ  Ｒパッケージ）、その後、上位２０００の変数（ＡＵＣ−２ｓｄの降順によりランク付けした）をさらなる工程のために選択した。
【０１５７】
次に、Ｓ１Ｖ．Ａを用い、これら２０００変数間の距離行列を１−ピアソン相関係数として計算した。その後、この距離行列に対して階層クラスタリングを行い、得られた樹形図を５０のクラスターに切り分けた。各クラスターにおいて、ＡＵＣ−２ｓｄ（前工程で取得）の値がより高くなる変数を維持した。
【０１５８】
次に、これら５０の遺伝子をステップワイズ手順に用いてＳ１Ｖで多変量モデルを構築した。推定変数の組合せが与えられている場合、Ｓ１Ｖ．Ａにて３つのアルゴリズム（ＤＬＤＡ、ＤＱＤＡ、ＰＡＭ）のトレーニングを行って３つの予測因子を得、これらを次にＳ１Ｖ．Ｂの推定に用いた。その後、Ｓ１Ｖ．ＡおよびＳ１Ｖ．Ｂで独立に、３つの各予測因子に関して基準を計算した。そして、３つの予測因子で基準値の平均を求め、現モデルがＳ１Ｖ．Ａに対する競合モデルと同等であり、かつ、Ｓ１Ｖ．Ｂに対する競合モデルよりも良好であれば、競合モデルよりも優れているとした。
【０１５９】
改変型ステップワイズフォワード法を用い、ｋ＞２での実施の場合（すなわち、（ｋ−１）個の変数で事前に得られたモデルに基づいてｋ個の変数でのモデルを構築する）、一変数を加え、その後、一変数を除き、再び一変数を加える。加えるまたは除くべき変数は、判定基準を最適化するものの中から選択される。複数の変数が判定基準を最適化している場合には、最初に直面するものが選択される。１から１５の遺伝子の範囲の１５個のモデルを構築した。次に、最小のモデル、すなわち、判定基準を最適化する変数ができる限り少ないものを選択した。このモデルの妥当性を評価するために、それを用いてバリデーションセットＳ２Ｖからのサンプルを推定した。このモデルで３つのアルゴリズムを用いる場合、独特なクラス帰属関係を得るために多数決原理を用いる。
【０１６０】
統計分析
連続変数および離散変数を、それぞれマン・ホイットニーおよびカイ二乗またはフィッシャーの正確確率検定を用いて比較した。単変量および多変量解析はコックスモデルを用いて行った。統計分析はＲ統計ソフトウエアおよびｒｍｓパッケージを用いて行った。
【０１６１】
結果
診断のために、決定木に用いる階層ツールとしての分子アルゴリズムを構築した（図１参照）。
【０１６２】
１０３の選択された全遺伝子の発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。５５０の包含サンプルの全系統において、サンプルの各サブグループを分子アルゴリズムの作出および妥当性評価を行うためにそれぞれトレーニングセットとバリデーションセットに無作為に分けた（１／１比）。段階的分析を用い、３つの最近接セントロイド法（ＤＬＤＡ、ＤＬＱＡおよびＰＡＭ、患者および方法で詳説）間の一致を用いて、サンプルを各特定のサブグループに分類できた５５の遺伝子を特定した（表２に記載）。次に、これらの分子分類因子のロバスト性を腫瘍のバリデーションセットで試験した（図１および下表３に記載のとおり）。
【０１６３】
【表２５】
2016500512.tif 000041
【０１６４】
まず、９つの遺伝子（ＥＰＣＡＭ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＹＰ３Ａ７、ＦＡＢＰ１、ＨＡＬ、ＡＦＰ、ＧＮＭＴ、ＴＦＲＣ、およびＣ８Ａ、図１参照）を組み合わせることにより、非肝細胞性腫瘍から肝細胞性サンプルが効率的に同定され、次に、９つの遺伝子（ＡＦＰ、ＣＡＰ２、ＬＣＡＴ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＣ２０、ＤＨＲＳ２、ＬＹＶＥ１、およびＡＤＭ、図１参照）の組合せを用いてＨＣＣから良性肝細胞性サンプルが識別された。また、ＨＣＣはＷＯ２００７／０６３１１８Ａ１に従前に記載されているＧ１〜Ｇ６分類を用いて分類され、ＨＣＣの大コホートにおけるこの方法の信頼性、ならびに遺伝的および臨床的特徴でこれまでに記載されていた関係を確認することができた（下表４参照）。
【０１６５】
【表２６】
2016500512.tif 000042
【０１６６】
次に、肝細胞性腫瘍の良性サブタイプに絞ったところ、ＦＮＨに関する１３の遺伝子（ＨＡＬ、ＡＮＧＰＴＬ７、ＧＬＵＬ、ＡＮＧＰＴ１、ＨＭＧＢ３、ＧＭＮＮ、ＲＡＭＰ３、ＲＨＢＧ、ＵＧＴ２Ｂ７、ＬＧＲ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＲＢＭ４７、およびＧＩＭＡＰ５、図１参照）およびＨＣＡに関する１３の遺伝子（ＨＡＬ、ＣＹＰ３Ａ７、ＬＣＡＴ、ＬＹＶＥ１、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＧＬＳ２、ＫＲＴ１９、ＥＳＲ１、ＳＤＳ、ＭＥＲＴＫ、ＥＰＨＡ１、ＣＣＬ５、およびＣＹＰ２Ｃ９、図１参照）を用いて、その他の良性肝細胞性組織（再生性大結節組織、異形成大結節組織および非腫瘍性肝臓組織）からＨＣＡまたはＦＮＨを同定することができた。
【０１６７】
最後に、ＨＣＡの種々のサブタイプが分類された：ＨＮＦ１Ａ変異型（４つの遺伝子：ＦＡＢＰ１、ＡＮＧＰＴ２、ＤＨＲＳ２、およびＵＧＴ２Ｂ７、図１参照）、βカテニン変異型（１３の遺伝子：ＴＦＲＣ、ＨＡＬ、ＣＡＰ２、ＧＬＵＬ、ＨＭＧＢ３、ＬＧＲ５、ＧＩＭＡＰ５、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＲＥＧ３Ａ、ＡＭＡＣＲ、ＴＡＦ９、ＬＡＰＴＭ４Ｂ、およびＩＧＦ２ＢＰ３、図１参照）、ならびに炎症性腺腫（７つの遺伝子：ＡＮＧＰＴ２、ＧＬＳ２、ＥＰＨＡ１、ＣＣｌ５、ＨＡＭＰ、ＳＡＡ２、およびＮＲＣＡＭ、図１参照）。
【０１６８】
上記表３に示されるように、腫瘍の各タイプに対して、トレーニングセットとバリデーションセットの両方で診断木の各分岐のほとんどにおいて感度、特異度、陰性反応的中度、陽性反応的中度および精度に９０％を超える値が得られた。これらのデータは、本発明による５５遺伝子分類／診断アルゴリズムのロバスト性を強調する。
【０１６９】
結論
本試験で、特定のサブグループにおいて良性肝細胞性腫瘍と悪性肝細胞性腫瘍の両方を分類するために分子的５５遺伝子アルゴリズムが初めて同定され、妥当性評価が行われた。肝細胞性腫瘍の診断分野において、従来の試験は早期ＨＣＣ、ＨＣＡまたはＦＮＨの診断に焦点を当ててきたが、それらは決して良性および悪性肝細胞性新生物全体を捉えたものではなかった(Bioulac Sage P hepatology 2007, Rebouissou S J hepatol 2008, Llovet JM gastroenterology 2006)。難しい症例において、本発明によるアルゴリズムは、分子サブクラスを評価することにより病理学的診断を補助することができた。
【０１７０】
異なる分子サブグループは異なる潜在的治療標的を構成する（Ｇ１ならばＩＧＦＲ１阻害剤を用い、Ｇ１〜Ｇ２ならばｍＴｏｒ阻害剤を用い、Ｇ５〜Ｇ６ならばｗｎｔ阻害剤を用いる）ことから、従前にＷＯ２００７／０６３１１８Ａ１に記載されているＧ１〜Ｇ６分類の１６の遺伝子も一般アルゴリズムに維持し、これによりさらなる臨床試験を導くことができた。
【０１７１】
結論として、本試験は、肝臓サンプルの全体的評価を行うために分類／診断分子アルゴリズムを提供することにより、個別化医療の新たな段階を構成する。これは腫瘍学者が肝臓腫瘍に罹患している疑いのある患者に対して治療決定を行うのに役立ち得る。
【０１７２】
書誌参照
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2016500512.tif 000044
【図１】
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【国際調査報告】
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2016500512.tif 000075
2016500512.tif 000076
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