(57)【要約】  本発明は、予め選択された配列を有するＤＮＡ分子の等温増幅のためのプロセスに関する。本発明は、いくつかの位置に、２−アミノプリンまたはジアミノプリンで置換されたアデニン、イノシンで置換されたグアニン、２−チオチミンで置換されたチミン、およびＮ４−エチルシトシンで置換されたシトシンを有するプライマー（「ＳＡＭＲＳヌクレオチド」）が、標準ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）において使用される酵素によって受け入れられたという、予想外の発見に基づいている。さらに予想外なことに、標的ヌクレオチドが、置換プライマーを使用したＨＤＡ様プロセス（以降、単にＨＤＡと略記する）において効率的に増幅されることが発見された。さらに、ＳＡＭＲＳ置換プライマーの使用による偽産物の減少も見出された。
2016527887.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ＤＮＡ分子に対して相補的なＤＮＡ分子を合成する方法であって、前記標的ＤＮＡ分子が、二本鎖体として相補的なＤＮＡ分子にハイブリダイズされ、前記方法が、前記二本鎖体を、ヘリカーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、２’−デオキシヌクレオシド三リン酸、および置換プライマーを含む緩衝水溶液中でインキュベートする工程を含み、前記置換プライマーが、前記標的ＤＮＡ分子内のあるセグメントに対して配列において実質的に相補的であり、前記置換プライマー内において、少なくとも１つのアデニンが２−アミノプリンまたはジアミノプリンで置換されており、または少なくとも１つのグアニンがイノシンで置換されており、または少なくとも１つのチミンが２−チオチミンで置換されており、または少なくとも１つのシトシンがＮ４−エチルシトシンで置換されており、ならびに前記置換の総数が２から６である、方法。
【請求項２】
標的ＤＮＡ分子に対して相補的な複数のＤＮＡ分子を合成する方法であって、前記標的ＤＮＡ分子が、二本鎖体として相補的なＤＮＡ分子にハイブリダイズされ、前記方法が、前記二本鎖体を、緩衝水溶液中で、ヘリカーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、２’−デオキシヌクレオシド三リン酸、および２つの置換プライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）と接触させる工程を含み、前記フォワードプライマーが、前記標的ＤＮＡ分子内のあるセグメントに対して配列において実質的に相補的であり、前記リバースプライマーが、前記標的ＤＮＡ分子内の下流のセグメントに対して配列において実質的に同一であり、両方の前記置換プライマー内において、少なくとも１つのアデニンが２−アミノプリンまたはジアミノプリンで置換されており、または少なくとも１つのグアニンがイノシンで置換されており、または少なくとも１つのチミンが２−チオチミンで置換されており、または少なくとも１つのシトシンがＮ４−エチルシトシンで置換されており、ならびに前記置換の総数が２から６である、方法。
【請求項３】
【化１】
2016527887.tif 000009
（式中、Ｘは、ＮおよびＣＨからなる群より選択され、Ｗは、ニトロ、シアノ、または別の電子求引基であり、Ｒは、オリゴヌクレオチドへの示された複素環の結合点である）
からなる群より選択される少なくとも１つの核酸塩基を含む予め選択されたオリゴヌクレオチドを含むタグが、前記置換プライマーの５’末端の１つまたは複数に追加されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
【化２】
2016527887.tif 000010
（式中、Ｘは、ＮおよびＣＨからなる群より選択され、Ｗは、ニトロ、シアノ、または別の電子求引基であり、Ｒは、オリゴヌクレオチドへの示された複素環の結合点である）
からなる群より選択される少なくとも１つの複素環を含む予め選択されたオリゴヌクレオチドを含むタグが、前記置換プライマーの５’末端の１つまたは複数に追加されている、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記置換が、前記プライマーの３’末端の７部位に位置されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記置換が、前記プライマーの３’末端の７部位に位置されている、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記置換の総数が４であり、これらが、前記プライマーの３’末端の５部位に位置されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記置換の総数が４であり、これらが、前記プライマーの３’末端の５部位に位置されている、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の技術分野は核酸化学であり、より詳細には、予め選択された標的配列を有するＤＮＡ分子の数を増加させる（標的配列を「増幅する」）方法に関する分野であり、最も詳細には、古典的なポリメラーゼ連鎖反応において使用される温度サイクリングを用いずに等温的に行われる増幅手順に関する分野である。
【背景技術】
【０００２】
生物試料中のＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を標的とする診断手順を含む、多くの分野での実用的応用のために、特定の核酸配列を「増幅する」方法が望まれている。古典的には、これは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われてきた［R.K.Saiki, D.H.Gelfand, S.Stoffel, S.J.Scharf, R.Higuchi, G.T.Horn, K.B.Mullis, H.A.Erlich(1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.Science 239, 487-491］。ここで、予め選択された標的オリゴヌクレオチドに結合する「フォワードプライマー」は、標的配列にアニールして二本鎖体を形成する。次いで、プライマーは、標的のオリゴヌクレオチドに対して（ワトソン−クリックのセンスにおいて）相補産物を得るために、ＤＮＡポリメラーゼおよび適切な２’−デオキシヌクレオシド三リン酸と共にインキュベートされ、標的およびその相補鎖は、それが形成されるときに、二本鎖化した二重らせんで結合する。次いで、この二本鎖は、典型的に７５℃を超える温度に加熱することによって「融解」し、一本鎖としての２つの相補的なＤＮＡ鎖をもたらす。各鎖は、加熱することによってそれらの相補鎖から解放される。次いで、元の標的は、第２のフォワードプライマーに結合することができ、その一方で、ＤＮＡ分子産物は、「リバースプライマー」に結合することができ、これは、ＤＮＡ分子産物下流の予め選択された部位に結合するように設計されている。次いでポリメラーゼ伸長を繰り返して両プライマーを伸長し、再び二本鎖体として（ここで、その数は２）全長産物を提供する。次いでこの二本鎖を加熱によって分離し、より多くのフォワードプライマーおよびリバースプライマーをアニールすることを可能とし、サイクルを繰り返す。結果として、標的ＤＮＡ分子とその相補鎖両方の複数の複製が得られる。非対称ＰＣＲでは、これら２つの比率が１とは異なる。
【０００３】
古典的ＰＣＲは、研究、科学、および技術全体において広く使用されており、複雑な生物試料中の少量のＤＮＡを検出する際に選択される方法である。それにもかかわらず、二本鎖体産物における２つの鎖を分離するために温度サイクリングを使用することは、医局および現場において、ポイント・オブ・ケアで標的ＤＮＡを増幅したいような用途を含め、多くの用途において望ましくない。温度サイクリングを反復して行う必要なく標的ＤＮＡ分子を増幅したいという要望は、特に、「レコンビナーゼポリメラーゼ増幅」（ＲＰＡ）［Piepenburg, O., Williams, C.H., Stemple, D.L., Armes, N.A.(2006) DNA Detection using recombination proteins.PLoS Biol 4(7):e204］、ローリングサークル増幅（rolling circle amplification）（ＲＣＡ）、ＮＡＳＢＡ、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）［Tong, Y., Lemieux,B.,;Kong, H.(2011) Multiple strategies to improve sensitivity, speed and robustness of isothermal nucleic acid amplification for rapid pathogen detection.BMC Biotechnol.11 Art.No:50］［Lemieux, B., Li, Y.;Kong, H.M., Tang, Y.W.(2012) Near instrument-free, simple molecular device for rapid detection of herpes simplex viruses:Expert Review Molec. Diagnostics 12, 437-443 DOI:10.1586/ERM.12.34］、およびＬＡＭＰとして知られるものなど、温度サイクリングを必要としない増幅法を探求する文献によって示されている。これらは、「等温増幅」法と呼ばれる。
【０００４】
しかしながら、等温増幅法は、良好に機能しないことがしばしばある。多くの場合、増幅の程度は、増幅される特定の配列または（おそらく）増幅において使用されるプローブおよび／またはプライマーの配列に依存するようである。場合によっては、増幅は完全に失敗する。多くの場合、標的のアンプリコンに加えて、過剰な「偽」産物が生じるのが観察される。偽産物は、とりわけ、単一の試料中の複数の標的核酸に対して等温増幅が試みられる場合に見られる（「多重化」）。
【０００５】
基本的に、これらおよび他の様々な結果を説明する理論はないが、官民の技術において推測を見出すことができるが、そのいくつかは矛盾し、他の説明は非公式なものである。全ての試みをし尽くしたわけではないが、推測的提案としては、低温において、非ワトソンクリックの相互作用により、関連するＤＮＡ分子のいくつか（プライマー、プローブ、または検体）が増幅プロセスを阻止するようにフォールドするかもしれないという可能性が挙げられる。他のものとして、（多くの場合、未知の）分子内相互作用または分子間相互作用が人工物としてのシステムを捉えるのを防ぐために定期的に高温にしなければならないことも提案されている。とりわけ多重化が試みられる場合、様々な等温増幅システムの不具合を説明するために、プライマー−プライマー相互作用が提案されている。
【０００６】
これらの説明はいずれも確立されていない。説明に優劣を付けるにも、データが少ない。結果として、この技術は、これらの問題を克服するため、ならびに全ての標的配列に対して、とりわけ複数（２つ以上）の標的配列に対して等温増幅を実施するための信頼できる手順を得るためにどのような実験が試みられ得るかに関して、明確な指針を持っていない。
【０００７】
このことは、特に、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）として知られる等温増幅法に対して当てはまる。ＨＤＡでは、二本鎖体産物を分離するために温度を上げる代わりに、ヘリカーゼとして知られるタンパク質が用いられる。理論上、ヘリカーゼは、２つの鎖を引き離して、元の単一の二本鎖体から２つの二本鎖体を作り出すためにプライマーが結合できるようにする。ＨＤＡは、多くの標的に対して上々の増幅を達成するが、残念ながら、ほとんどの標的に対してはそうではない。さらに、ＨＤＡが単一のＤＮＡ分子を標的にした、追加の産物がしばしば見られるが、これは、等温増幅が失敗する原因となることが多い。複数のＨＤＡに対する試みは、ほとんど常に失敗する。さらに、偽産物は、場合により、「プライマー二量体」と呼ばれるが、構造が証明されている例は、あったとしてごくわずかである。どのような場合でも、これらの偽産物の形成は、感度および多重化を制限する。さらに、標準ＨＤＡは、およそ０．２μＭより高いプライマー濃度を使用することができず、これは検出速度を制限する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣ核酸塩基の少なくともいくつかが、いくつかの（しかし全てではない）部位（場所）において、Ａ＊、Ｔ＊、Ｇ＊、およびＣ＊に命名された類似体で置換されているプライマー（「置換プライマー」）が、ＨＤＡ様増幅に効果を及ぼすためにヘリカーゼと一緒に協働する酵素によって受け入れられるという、予想外の発見に基づいている。現時点で好ましい置換は、アデニンを２−アミノプリンまたはジアミノプリン（どちらかがＡ＊として定義される）で置き換え、グアニンをイノシン（Ｇ＊として定義される）で置き換え、チミンを２−チオチミン（Ｔ＊として定義される）で置き換え、ならびにシトシンをＮ４−エチルシトシン（Ｃ＊として定義される）で置き換える。本発明はさらに、標的ヌクレオチドが本当に、これらの置換プライマーを使用したＨＤＡ様プロセス（以降、単にＨＤＡとして略記する）において増幅されるという、予想外の発見に基づいている。
【０００９】
さらに、本発明は、その置換プライマーが、人工的に拡張された遺伝子情報システム（ＡＥＧＩＳ、本明細書において定義される）から選択されるヌクレオチドを組み入れたオリゴヌクレオチドでタグ付けされているＨＤＡ様プロセスも、良好に機能するという発見に基づいている。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】置換プライマーにおいてＧ、Ｃ、Ａ、およびＴと置換される、現時点での好ましい核酸塩基類似体、ここで、Ｒは、オリゴヌクレオチドへの結合点である。
【図２】人工的に拡張された遺伝子情報システムから選択される現時点での好ましい成分、ここで、Ｒは、オリゴヌクレオチドへの結合点であり、Ｗは、ニトロまたはシアノなどの電子求引基である。
【図３】（レーン１および２）：標準プライマー（Ｓｔｄ）が、ＫＩＴ遺伝子（予め選択された標的、レーン１、−）非存在下およびＫＩＴ遺伝子存在下（レーン２、＋）の両方で、偽産物、おそらくプライマー二量体を生成する；（レーン３および４）：本発明のＳＡＭＲＳプライマーが、ＫＩＴ遺伝子を有する産物（レーン４、＋）を生成するが、ＫＩＴ遺伝子標的を有さない偽産物を生成しない（レーン３、−）；（レーン５および６）：標準プライマー（Ｓｔｄ）が、ＨＩＶ標的を有さない偽産物（レーン５、−）、あるいはＨＩＶ標的を有するいくつかの偽産物および産物（レーン６、＋）を生成する；（レーン７および８）：ＳＡＭＲＳプライマーが、ＨＩＶ標的を有する産物（レーン８、＋）を生成するが、ＨＩＶ標的を有さない偽産物（レーン７、−）を生成しない。
【図４】実施例１からのデータ。（レーン１および２）：Ｂｓｔ２．０およびＩｓｏＡｍｐＩＩＩ（ＢｉｏＨｅｌｉｘ、Ｂｅｖｅｒｌｙ  ＭＡ、各２μＬ）であり、プライマーの全ての部位に標準（Ｓｔｄ）ヌクレオチドを含有するＫＩＴプライマーを有する標的０ｎｇまたは２０ｎｇ（それぞれ）を含む；（レーン３）：Ｂｓｔ２．０およびＩｓｏＡｍｐＩＩＩ（各２μＬ）であり、置換プライマーにおいて８つのＳＡＭＰＳヌクレオチドを有するＳＡＭＲＳ８プライマーを含有する標的の２０ｎｇを含む；（レーン４）：Ｂｓｔ２．０＋ＩｓｏＡｍｐＩＩＩ（各２μＬ）であり、置換プライマーにおいて４つのＳＡＭＲＳヌクレオチドによって占められているＳＡＭＲＳ４プライマーを有する標的２０ｎｇを含む；（レーン５および６）：ＧｓｐＭおよびＩｓｏＡｍｐＩＩＩ（各２μＬ）であり、全ての部位が標準（Ｓｔｄ）ヌクレオチドで占められているＫＩＴプライマーを有する標的０ｎｇまたは２０ｎｇ（それぞれ）を含む；（レーン７）：ＧｓｐＭ＋ＩｓｏＡｍｐＩＩＩ（各２μＬ）であり、示された位置のプライマーにおいて８つのＳＡＭＲＳヌクレオチドを含有するＳＡＭＲＳ８プライマーを有する標的２０ｎｇを含む；（レーン８）：ＧｓｐＭおよびＩｓｏＡｍｐＩＩＩ（各２μＬ）であり、置換プライマーにおいて４つのＳＡＭＲＳヌクレオチドを含有するＳＡＭＲＳ４プライマーを有する標的２０ｎｇを含む；（レーン９および１０）：ＧｓｐＭ２．０およびＩｓｏＡｍｐＩＩＩ（各２μＬ）であり、ｓｔｄ  ＫＩＴプライマーを有する標的０ｎｇまたは２０ｎｇを含む；（レーン１１）：ＧｓｐＭ２．０およびＩｓｏＡｍｐＩＩＩ（各２μＬ）であり、示された位置において８つのＳＡＭＲＳヌクレオチドを含有するＳＡＭＲＳ８プライマーを有する標的２０ｎｇを含む；（レーン１２）：ＧｓｐＭ２．０およびＩｓｏＡｍｐＩＩＩ（各２μＬ）であり、示された位置において４つのＳＡＭＲＳヌクレオチドを含有するＳＡＭＲＳ４プライマーを有する標的２０ｎｇを含む；（レーン１３および１４）：ＧｓｐＳＳＤおよびＩｓｏＡｍｐＩＩＩ（各２μＬ）であり、全ての部位が標準（Ｓｔｄ）ヌクレオチドで占められているＫＩＴプライマーを有する標的０ｎｇまたは２０ｎｇ（それぞれ）を含む；（レーン１５）：ＧｓｐＳＳＤおよびＩｓｏＡｍｐＩＩＩ（各２μＬ）であり、示された位置において８つのＳＡＭＲＳヌクレオチドを含有するＳＡＭＲＳ８プライマーを有する標的２０ｎｇを含む；（レーン１６）：ＧｓｐＳＳＤおよびＩｓｏＡｍｐＩＩＩ（各２μＬ）であり、示された位置において４つのＳＡＭＲＳヌクレオチドを含有するＳＡＭＲＳ４プライマーを有する標的２０ｎｇを含む。
【図５】実施例２からのデータ。（レーン１、２、および３）：Ｂｓｔ２．０＋ＩｓｏＡｍｐＩＩＩ（各２μＬ）、２０ｎｇの標的、および４、５、または６ｍＭのＭｇＳＯ４（それぞれ）；（レーン４、５、および６）：Ｂｓｔ２．０およびＩｓｏＡｍｐＩＩＩ（各２μＬ）、２０ｎｇの標的、ならびに４、５、または６ｍＭのＭｇＳＯ４＋１Ｍのベタイン；（レーン７、８、および９）：ＧｓｐＳＳＤおよびＩｓｏＡｍｐＩＩＩ（各２μＬ）、２０ｎｇの標的、ならびに４、５、または６ｍＭのＭｇＳＯ４；（レーン１０、１１、および１２）：ＧｓｐＳＳＤおよびＩｓｏＡｍｐＩＩＩ（各２μＬ）、２０ｎｇの標的、ならびに４、５、または６ｍＭのＭｇＳＯ４＋１Ｍのベタイン。
【図６】実施例３からのデータ。Ｍレーンは、マーカーであり、５０ｂｐ（左）および２５ｂｐ（右）で分けられたＤＮＡラダーである。（レーン１、２、３、および４）：ＳＡＭＲＳ成分を含有しないＫＩＴ−標準プライマー。（レーン５、６、７、８、９、１０、および１１）：示された位置においてＳＡＭＲＳヌクレオチドを有するＫＩＴ−ＳＡＭＲＳプライマー。標的は、標的を有する（＋）または標的を有しない（−）ヒトゲノムＤＮＡ（男性、２０ｎｇ／反応）であり、後者は陰性対照であった。各反応における最終ＭｇＳＯ４濃度は、様々なレーンにおいて、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、および１０ｍＭであった。
【図７】実施例４からのデータ。Ｍレーンは、マーカーであり、５０ｂｐ（左）および２５ｂｐ（右）で分けられたＤＮＡラダーである。（レーン１、２、３、および４）：標準プライマーを使用して増幅を試みたＨＩＶ標的。（レーン５、６、７、８、９、１０、および１１）：ＨＩＶ  ＳＡＭＲＳプライマー。標的は、ＨＩＶ標的を有する（＋）またはＨＩＶ標的を有さない（−）、合成ＨＩＶ−ＤＮＡ−９６ｍｅｒ（０．２ｆｍｏｌｅ／反応）であった。各反応における最終ＭｇＳＯ４濃度は、様々なレーンにおいて、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、および１０ｍＭであった。
【図８】ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＡＤ）反応のメカニズムを示す概略図。ステップ１は、ヘリカーゼがほどかれてプライマーが結合する。ステップ２は、ＤＮＡの重合である。ステップ３は、ＤＮＡの増幅である。丸い円はヘリカーゼ分子である。楕円はＤＮＡポリメラーゼの分子である。
【図９】ヒトゲノムＤＮＡにおけるＴＯＰおよびＭＹＣ遺伝子を別々におよび一緒に増幅するためにＡＥＧＩＳ含有タグ配列およびＡＥＧＩＳ−ＳＡＭＲＳ含有プライマーを使用した、ネステッドＨＤＡアッセイ産物を示すＰＡＧＥ。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の主要な発明上の特徴は、そのＡ、Ｔ、Ｇ、およびＣ核酸塩基のいくつかが、いくつかの部位（位置）において、（それぞれ）Ａ＊、Ｔ＊、Ｇ＊、およびＣ＊に命名された類似体（「ＳＡＭＲＳ」ヌクレオチド）で置換されているフォワードプライマーおよびリバースプライマーである。当技術分野において、ならびに古典的ＰＣＲおよび等温ＰＣＲの両方において標準であるように、プライマー設計における第１ステップは、増幅したいＤＮＡ分子の一部、またはセグメント、または配列を選択することである。次いで、複製される標的の一部に３’に隣接する標的配列の一部またはセグメントに対して相補的であるように、フォワードプライマーの配列が選択される。同じく当技術分野において標準的であるように、リバースプライマーは、フォワードプライマーが鋳型指示重合によって伸長された後の産物「下流」のセグメントに対して相補的である。当技術分野において標準であるように、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、合理的なサイズのアンプリコン産物を得るために設計されている。
【００１２】
古典的ＨＤＡを実践するためのプライマーの配列の設計について説明する参考文献は、以下の文献ならびにそれらにおいて引用される参考文献に見出すことができ、なお、それらは、引用によりその全体が本明細書に組み入れられる［Tong, Y., Lemieux, B.,;Kong, H.(2011) Multiple strategies to improve sensitivity, speed and robustness of isothermal nucleic acid amplification for rapid pathogen detection.BMC Biotechnol.11 Art.No:50］［Lemieux, B., Li, Y.;Kong, H.M., Tang, Y.W.(2012) Near instrument-free, simple molecular device for rapid detection of herpes simplex viruses:Expert Review Molec.Diagnostics 12, 437-443 DOI:10.1586/ERM.12.34］。
【００１３】
所望のアンプリコンを産生するようにプライマーを選択した後、プライマー中の標準ヌクレオチドのいくつかをそれらの対応するＳＡＭＲＳヌクレオチド類似体で置換しなければならない。本明細書およびその実施例は、全ての部位を置換すべきというわけではないことを教示している。むしろ、本明細書およびその実施例は、好ましくは２つ以上および好ましくは６つ以下において置換が為されるべきであることを教示している。現時点での置換の好ましい数は４である。
【００１４】
現時点で好ましくは、プライマーの３’末端付近、最も好ましくは部位ｎ−１、ｎ−２、ｎ−３…、での置換であり、この場合、ｎは、プライマーの最後である３’部位である。ＳＡＭＲＳヌクレオチドの数が４の場合、これらは、好ましくは、現時点において部位ｎ−１、ｎ−２、ｎ−３、およびｎ−４に位置され、この場合、部位ｎは、オリゴヌクレオチドプライマーにおける３’末端（最後）である。現時点での好ましいｎ個の置換は、３’末端のｎ＋１部位（すなわち、最大置換（６）の場合は３’末端の７部位および好ましい置換の最小数（２）の場合は３’末端の３部位、ならびに置換の最も好ましい数（４）の場合は３’末端の５部位）以内である。現時点での好ましいＳＡＭＲＳヌクレオチドは、プライマーにおけるアデニン（Ａ）が２−アミノプリンまたはジアミノプリン（いずれかが、Ａ＊として定義される）で置換されており、プライマーにおけるグアニン（Ｇ）がイノシン（Ｇ＊として定義される）で置換されており、プライマーのチミン（Ｔ）が２−チオチミン（Ｔ＊として定義される）で置換されており、ならびにプライマーにおけるシトシン（Ｃ）がＮ４−エチルシトシン（Ｃ＊として定義される）で置換されている。これらのヌクレオシド類似体の固相ＤＮＡ合成に好適な保護されたホスホルアミダイトは、当技術分野において周知である。
【００１５】
ＳＡＭＲＳ含有プライマーは、それらが設計された後、対応する保護されたホスホルアミダイトから、自動化された固相合成によって合成される。そのようなプライマーを合成する方法は、以下の２つの参考文献に記載されており、なお、これらの文献は、その全体が本明細書に組み入れられる［Hoshika, S., Leal, N., Chen, F., Benner, S.A.(2010) Artificial genetic systems. Self-avoiding DNA in PCR and multiplexed PCR.Angew.Chem.Int.Edit.49, 5554-5557］［Yang, Z., Chen, F., Alvarado, J.B., Benner, S.A.(2011) Amplification, mutation, and sequencing of a six-letter synthetic genetic system. J.Am.Chem.Soc.133, 15105-15112］。
【００１６】
プライマーが調製されると、本発明の等温増幅プロセスは、関連する多くの点において、標準ＨＤＡと全く同じように進められる［Tong, Y., Lemieux, B., Kong, H.(2011) Multiple strategies to improve sensitivity, speed and robustness of isothermal nucleic acid amplification for rapid pathogen detection. BMC Biotechnol.11 Art.No:50］［Lemieux, B., Li, Y.;Kong, H.M., Tang, Y.W.(2012) Near instrument-free, simple molecular device for rapid detection of herpes simplex viruses: Expert Review Molec. Diagnostics 12, 437-443 DOI:10.1586/ERM.12.34］。この理由から、このアッセイは、「ＨＤＡ様」と呼ばれる。特に、本発明の置換ＳＡＭＲＳプライマーを用いる本発明は、標準ＨＤＡのためのＢｉｏＨｅｌｉｘ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）によって販売されているＩｓｏＡｍｐ（商標）キットに含まれるヘリカーゼ酵素およびトリホスフェートを使用して実践することができる。しかしながら、実施例において開示されるように、ある特定のポリメラーゼが本発明に例外的に非常に適していることが判明した。さらに、任意により、本発明のアッセイは、一本鎖結合タンパク質を含んでいてもよい。
【実施例】
【００１７】
２．実施例
実施例１：
実施例１は、ヒトゲノムＤＮＡ（２０ｎｇ、約６０００複製に相当する）内に示される標的ＤＮＡ分子（ＫＩＴ遺伝子）の増幅を説明している。この実施例は、ＳＡＭＲＳ含有プライマーが使用された場合でさえも高効率および低ノイズで標的を増幅する、様々なポリメラーゼとの併用におけるヘリカーゼの驚くべき能力を実証している。それは、ＨＤＡ様プロセスにおいて８つのＳＡＭＲＳヌクレオチドではなく、４つのＳＡＭＲＳヌクレオチド（Ｇ＊、Ｃ＊、Ｔ＊、およびＡ＊）を含有するプライマーの現時点での好ましい使用のための実験証拠も提供する。この実施例は、ＳＡＭＲＳ置換プライマーが、様々なＧｓｐ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ２．０、ＧｓｐＭ、Ｇｓｐｍ２．０、およびＧｓｐＳＳＤ、これらは全てＯｐｔｉＧｅｎｅ製）によるこのＨＤＡ様アッセイにおいて機能することも実証する。これらの実験はさらに、以下のことを示した。
１）標準プライマーは、試験した全てのポリメラーゼにおいて、所望のアンプリコン産物よりも多くの偽産物（仮説上は「プライマー二量体」）を与えた。
２）４つのＳＡＭＲＳ成分を含有するプライマーは、所望のアンプリコンを産生したが、ＧｓｐＭおよびＧｓｐｍ２．０  ＤＮＡポリメラーゼでは偽産物は産生しなかった。８つのＳＡＭＲＳ成分を含有するプライマーは、ポリメラーゼを使用したか否かにかかわらず、「プライマー二量体」または所望のアンプリコン産物を産生しなかった。
３）４つのＳＡＭＲＳ成分を含有するプライマーは、ＧｓｐＳＳＤ  ＤＮＡポリメラーゼが使用された場合、微量の産物しか産生しなかった。したがって、ＧｓｐＭおよびＧｓｐｍ２．０  ＤＮＡポリメラーゼは好ましい。
【００１８】
この研究において使用したＳＡＭＲＳ含有プライマーを以下に示す。下線の太字のセグメントは、２−アミノプリンとしてＡ＊；２−チオ−ＴとしてＴ＊；イノシンとしてＧ＊；およびＮ−エチル−ｄＣとしてＣ＊による、ＳＡＭＲＳ置換を示している。
ＫＩＴ−９０−Ｆ−２５ｍｅｒ−ｓｔｄ：５’−ＡＧＡＴＴＴＧＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＴＡＧＣＣＡＧ−３’  配列番号１
ＫＩＴ−９０−Ｒ−２５ｍｅｒ−ｓｔｄ：５’−ＴＧＴＣＡＡＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＧＧＴＡＣＴＣＡＣ−３’  配列番号２
ＫＩＴ−９０−Ｆ−２５ｍｅｒ：５’−ＡＧＡＴＴＴＧＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＴＡＧＣＣＡＧ−３’  配列番号３
ＫＩＴ−９０−Ｒ−２５ｍｅｒ：５’−ＴＧＴＣＡＡＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＧＧＴＡＣＴＣＡＣ−３’  配列番号４
ＫＩＴ−９８−Ｆ−２９ｍｅｒ：５’−ａｃａａＡＧＡＴＴＴＧＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＴＡＧＣＣＡＧ−３’  配列番号５
ＫＩＴ−９８−Ｒ−２９ｍｅｒ：５’−ｇｇａｃＴＧＴＣＡＡＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＧＧＴＡＣＴＣＡＣ−３’  配列番号６
【００１９】
これらのプライマーを、ＢｉｏＨｅｌｉｘ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）製のＩｓｏＡｍｐ混合物中におけるヘリカーゼおよび他の成分、表１に一覧されるものからのＤＮＡポリメラーゼ、２’−デオキシヌクレオシド三リン酸、および表１に一覧される様々な他の成分を含む緩衝水溶液中で、セグメントとして標的ＤＮＡ配列を有するヒトゲノムＤＮＡの２０ｎｇと、室温で混合した。次いでこの混合物を６５℃で９０分間インキュベートした。条件は、以下に示す通りである。
【００２０】
【表１】
2016527887.tif 000003
【００２１】
各反応物を６５℃で９０分間インキュベートした後、試料（１０μＬ）を、ローディングダイ溶液（４μＬ）で希釈した。これを、当技術分野において周知のように、２．５％アガロースゲル上にローディングした。電気泳動を使用して、ＰＣＲ産物を分離した。結果を図４に示す。
【００２２】
実施例２：ＧｓＳＳＤおよびＢｓｔ２．０  ＤＮＡポリメラーゼを使用した、ＫＩＴ遺伝子を標的とするＨＤＡ様アッセイにおけるＳＡＭＲＳ置換プライマーの官能化の実証
４つのＳＡＭＲＳ塩基（Ｇ＊、Ｃ＊、Ｔ＊、およびＡ＊）を有するＫＩＴプライマー対の効率を、Ｂｓｔ２．０およびＧｓｐＳＳＤならびに様々な濃度のＭｇＳＯ４（４ｍＭ、５ｍＭ、および６ｍＭ）を含むヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）様構造を使用して実証した。これらの実験は、以下を示した。
１）ＭｇＳＯ４の濃度を４ｍＭから６ｍＭに増加させることにより、Ｂｓｔ２．０およびＧｓｐＳＳＤ  ＤＮＡポリメラーゼの両方によって所望のアンプリコンが得られる効率が上がった。
２）ベタイン（１Ｍ）を加えることにより、所望のアンプリコンが得られる効率が上がり、効率は、ＧＣリッチな標的に対して現時点で好ましい。
【００２３】
この実施例において使用したプライマーを以下に示す。下線の太字のセグメントは、やはり、標準ヌクレオチドが、対応するＳＡＭＲＳヌクレオチドで置換された部位である。したがって、下線のＡは、ＤＡＰ（２、６−ジアミノプリン）としてのＡ＊を示し；下線のＴは２−チオ−ＴとしてのＴ＊を示し；下線のＧは、イノシンとしてのＧ＊を示し；下線のＣは、Ｎ−エチル−ｄＣとしてのＣ＊を示す。
ＫＩＴ−９８−Ｆ−２９ｍｅｒ：５’−ａｃａａＡＧＡＴＴＴＧＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＴＡＧＣＣＡＧ−３’  配列番号７
ＫＩＴ−９８−Ｒ−２９ｍｅｒ：５’−ｇｇａｃＴＧＴＣＡＡＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＧＧＴＡＣＴＣＡＣ−３’  配列番号８
【００２４】
ポリメラーゼおよび２’−デオキシヌクレオシド三リン酸を含有するＩｓｏＡｍｐ溶液を、室温において、表２に示される成分と混合した。次いでこの混合物を６５℃で９０分間インキュベートし、試料（１０μＬ）を、ローディングダイの溶液（４μＬ）で希釈し、２．５％アガロースゲル上にローディングし、ＰＣＲ産物を分離するために電気泳動を行った。結果を図５に示す。
【００２５】
【表２】
2016527887.tif 000004
【００２６】
実施例３：ＧｓＳＳＤ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した、ＫＩＴ遺伝子を標的とするＨＤＡ様アッセイにおけるＳＡＭＲＳ置換プライマーの機能の実証
この実施例は、異なるＭｇＳＯ４濃度下（６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、および１０ｍＭ）においてＧｓｐＳＳＤを使用して標的の二本鎖ＤＮＡ分子（全ヒトゲノムＤＮＡ内に示される）およびＨＩＶ  ＤＮＡ（ＨＩＶ−ＤＮＡ−９６ｍｅｒ、合成模倣物として示される）としてＫＩＴ遺伝子を増幅するための、ＳＡＭＲＳヌクレオチドで置換されたプライマー（Ｇ＊、Ｃ＊、Ｔ＊、およびＡ＊を含有する）の効率および特異性を、標準ヌクレオチドのみを含有するプライマー（ＳＡＭＲＳヌクレオチドを有さない）と比較した。まとめると、これらの実験は以下のことを示した。
１．ＭｇＳＯ４濃度を６ｍＭから１０ｍＭに増加させると、ＳＡＭＲＳ置換プライマーを使用したＨＤＡ様増幅の効率が減少することが示された。したがって、現時点において、６ｍＭのＭｇＳＯ４濃度が好ましい。
２．ＳＡＭＲＳプライマーは、標的が存在する場合、偽「プライマー二量体」を形成することなく標的（ゲノムＤＮＡまたはＨＩＶ−ＤＮＡ−９６ｍｅｒ）の存在下において産物を生じ、標的を含まない陰性対照実験では産物を生じなかった。しかしながら、標準プライマーは、標的が存在する場合も標的が存在しない場合も、偽「プライマー二量体」産物を産生した。
【００２７】
ヒトゲノムＤＮＡにおけるＫＩＴ遺伝子の増幅において使用したオリゴヌクレオチドを以下に示す。下線の太字のＡは、２−アミノプリンとしてのＡ＊を示し；下線の太字のＴは２−チオ−ＴとしてのＴ＊を示し；下線の太字のＧは、イノシンとしてのＧ＊を示し；下線の太字のＣは、Ｎ−エチル−ｄＣとしてのＣ＊を示す。全ての成分（表３、プライマー、置換もしくは標準、２’−デオキシヌクレオシド三リン酸、ポリメラーゼ、ＢｉｏＨｅｌｉｘから入手したＩｓｏＡｍｐキットの一部としてのヘリカーゼ）を室温で混合した。次いで、それらを、６５℃で９０分間インキュベートした。
ＫＩＴ−９０−Ｆ−２５ｍｅｒ−ｓｔｄ：５’−ＡＧＡＴＴＴＧＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＴＡＧＣＣＡＧ−３’  配列番号９
ＫＩＴ−９０−Ｒ−２５ｍｅｒ−ｓｔｄ：５’−ＴＧＴＣＡＡＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＧＧＴＡＣＴＣＡＣ−３’  配列番号１０
ＫＩＴ−９８−Ｆ−２９ｍｅｒ：５’−ａｃａａＡＧＡＴＴＴＧＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＴＡＧＣＣＡＧ−３’  配列番号１１
ＫＩＴ−９８−Ｒ−２９ｍｅｒ：５’−ｇｇａｃＴＧＴＣＡＡＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＧＧＴＡＣＴＣＡＣ−３’  配列番号１２
【００２８】
【表３】
2016527887.tif 000005
【００２９】
各反応物を６５℃で９０分間インキュベートした後、試料（１０μＬ）を、ローディングダイの溶液（４μＬ）で希釈し、２．５％アガロースゲル上にローディングした。電気泳動を使用して、ＰＣＲ産物を分離した。結果を図６に示す。
【００３０】
実施例４．ＧｓＳＳＤ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した、ＨＩＶ遺伝子を標的とするＨＤＡ様アッセイにおけるＳＡＭＲＳ置換プライマーの機能の実証
ＨＩＶ−ＤＮＡ標的の増幅において使用したヌクレオチドを以下に示す。下線の太字のＡは、２−アミノプリンとしてのＡ＊を示し；下線の太字のＴは２−チオ−ＴとしてのＴ＊を示し；下線の太字のＧは、イノシンとしてのＧ＊を示し；下線の太字のＣは、Ｎ−エチル−ｄＣとしてのＣ＊を示す。全ての成分（プライマー、置換もしくは標準、２’−デオキシヌクレオシド三リン酸、ポリメラーゼ、ＢｉｏＨｅｌｉｘから入手した、ＩｓｏＡｍｐキットの一部としてのヘリカーゼ）を室温で混合した。次いで、それらを、表４に示されるように６５℃で９０分間インキュベートした。この実施例におけるプライマーは、４つのヌクレオチド（小文字で示された）によってそれらの５’末端において伸長されている。
５’−ＧａｇＦ＿Ｓｔｄ＿３０ｍｅｒ：５’−ａａａｃＡＣＣＡＴＧＣＴＡＡＡＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＧＧＡＣＡ−３’  配列番号１３
６’−ＧａｇＲ＿Ｓｔｄ＿３１ｍｅｒ：５’−ａｔｃｔＡＴＣＣＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴ−３’  配列番号１４
５−ＧａｇＦ＿ＳＭＳ＿３０ｍｅｒ：５’−ａａａｃＡＣＣＡＴＧＣＴＡＡＡＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＧＧＡＣＡ−３’  配列番号１５
６−ＧａｇＲ＿ＳＭＳ＿３１ｍｅｒ：５’−ａｔｃｔＡＴＣＣＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴ−３’  配列番号１６
【００３１】
【表４】
2016527887.tif 000006
【００３２】
各反応物を６５℃で９０分間インキュベートした後、試料（１０μＬ）を、ローディングダイの溶液（４μＬ）で希釈し、２．５％アガロースゲル上にローディングした。電気泳動を使用して、ＰＣＲ産物を分離した。結果を図７に示す。
【００３３】
実施例５．非標準ヌクレオチドを含有する外部タグによるネステッド式等温増幅
画一化された多重化ＨＤＡアッセイは、１つまたは複数のＳＡＭＲＳ含有プライマーの５’末端に追加されたタグ配列に、人工的に拡張された遺伝子情報システム（ＡＥＧＩＳ）から追加のオリゴヌクレオチドを組み込んで１つまたは複数のＡＥＧＩＳ−ＳＡＭＲＳ含有プライマーを生じさせることによって得ることができる。ここで、使用したＡＥＧＩＳヌクレオチドは、６−アミノ−５−ニトロ−３−（１’−β−Ｄ−２’−デオキシリボフラノシル）−２（１Ｈ）−ピリドン（簡潔に、Ｚと呼ぶ）および２−アミノ−８−（１’−β−Ｄ−２’−デオキシリボフラノシル）−イミダゾ［１，２−ａ］−１，３，５−トリアジン−４（８Ｈ）−オン（簡潔に、Ｐと呼ぶ）であった。ＨＤＡアッセイにおいて、等温増幅を開始するために、標的特異的ＡＥＧＩＳ−ＳＡＭＲＳ含有プライマーを低濃度（０．０１μＭ）において使用し、ＨＤＡアッセイの後の段階において各タグ付け標的をさらに増幅するために、高濃度のユニバーサルＡＥＧＩＳ含有タグ配列（ユニバーサル−４Ｐ、０．１〜０．２μＭ）を使用することによって、画一化された多重化ＨＤＡを達成した。
【００３４】
ＨＤＡアッセイにおいて使用した、ＡＥＧＩＳおよびＳＡＭＲＳを含有するプライマー：
ユニバーサル−４Ｐ：５’−ＧＧＡＰＣＡＡＰＴＡＣＰＣＧＣＰＡＣ  配列番号１７
ＴＯＰ−Ｆ−４Ｐ：５’−ＧＧＡＰＣＡＡＰＴＡＣＰＣＧＣＰＡＣＧＡＣＡＧＣＣＣＣＧＧＡＴＧＡＧＡＡＣ−３’  配列番号１８
ＴＯＰ−Ｒ−４Ｐ：５’−ＧＧＡＰＣＡＡＰＴＡＣＰＣＧＣＰＡＣＡＡＧＡＡＴＴＧＣＡＡＣＡＧＣＴＣＧＡＴＴＧ−３’  配列番号１９
ＭＹＣ−Ｆ−４Ｐ：５’−ＧＧＡＰＣＡＡＰＴＡＣＰＣＧＣＰＡＣＴＣＣＴＣＣＴＴＡＴＧＣＣＴＣＴＡＴＣＡＴ−３’  配列番号２０
ＭＹＣ−Ｒ−４Ｐ：５’−ＧＧＡＰＣＡＡＰＴＡＣＰＣＧＣＰＡＣＣＣＧＣＧＣＴＴＴＧＡＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣ−３’  配列番号２１
【００３５】
【表５−１】
2016527887.tif 000007
【００３６】
【表５−２】
2016527887.tif 000008
【００３７】
各陽性反応と併せて、陰性対照も実施した。全成分を室温で混合し、２５μＬの反応混合物を６５℃で１２０分間インキュベートした。ＨＤＡアッセイでは、ヒトゲノムＤＮＡにおけるＴＯＰおよびＭＹＣ遺伝子を増幅するためにＡＥＧＩＳ含有タグ配列およびＡＥＧＩＳ−ＳＡＭＲＳ含有プライマーが使用された。産物は、３％のアガロースゲルにおいて分離し、図９に示す。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の方法は、感染因子からＤＮＡおよびＲＮＡを検出するためのＤＮＡおよびＲＮＡ標的化診断アッセイを含む、多くの産業分野において有用である。
【図１】
2016527887.tif 000011
【図２】
2016527887.tif 000012
【図３】
2016527887.tif 000013
【図４】
2016527887.tif 000014
【図５】
2016527887.tif 000015
【図６】
2016527887.tif 000016
【図７】
2016527887.tif 000017
【図８】
2016527887.tif 000018
【図９】
2016527887.tif 000019
【配列表】
2016527887000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年4月19日(2016.4.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2016527887000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年5月11日(2016.5.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
予め選択された標的ＤＮＡ分子を合成する方法であって、前記標的ＤＮＡ分子が、相補的なＤＮＡ分子に結合して二本鎖体を形成し、前記方法が、前記二本鎖体を、緩衝水溶液中で、ヘリカーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、一本鎖結合タンパク質、２’−デオキシヌクレオシド三リン酸、および置換プライマーと接触させる工程を含み、前記置換プライマーが、前記標的ＤＮＡ分子内のあるセグメントに対して配列において相補的であり、前記置換プライマー内において、少なくとも１つのその２’−デオキシアデノシンヌクレオチドにおける１つのアデニンが２−アミノプリンまたはジアミノプリンで置換されており、または少なくとも１つのその２’−デオキシグアノシンヌクレオチドにおける１つのグアニンがイノシンで置換されており、または少なくとも１つのそのチミジンヌクレオチドにおける１つのチミンが２−チオチミンで置換されており、または少なくとも１つのその２’−デオキシシチジンヌクレオチドにおける少なくとも１つのシトシンがＮ４−エチルシトシンで置換されており、ならびに前記置換の総数が２から６の間であり、前記ポリメラーゼがＢｓｔ２．０、ＧｓｐＳＳＤ、ＧｓｐＭ、またはＧｓｐＭ２．０である、方法。
【請求項２】
標的ＤＮＡ分子の複数の複製を調製する増幅方法であって、前記方法が、前記二本鎖体を、緩衝水溶液中で、ヘリカーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、一本鎖結合タンパク質、２’−デオキシヌクレオシド三リン酸、および２つの置換プライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）と接触させる工程を含み、前記フォワードプライマーが、前記標的ＤＮＡ分子内のあるセグメントに対して結合し、前記リバースプライマーが、前記標的ＤＮＡ分子内の下流のセグメントに対して配列において実質的に同一であり、両方の前記置換プライマー内において、少なくとも１つのその２’−デオキシアデノシンヌクレオチドにおける１つのアデニンが２−アミノプリンまたはジアミノプリンで置換されており、または少なくとも１つのその２’−デオキシグアノシンヌクレオチドにおける１つのグアニンがイノシンで置換されており、または少なくとも１つのそのチミジンヌクレオチドにおける１つのチミンが２−チオチミンで置換されており、または少なくとも１つのその２’−デオキシシチジンヌクレオチドにおける少なくとも１つのシトシンがＮ４−エチルシトシンで置換されており、ならびに前記置換の総数が２から６の間であり、前記ポリメラーゼがＢｓｔ２．０、ＧｓｐＳＳＤ、ＧｓｐＭ、またはＧｓｐＭ２．０である、方法。
【請求項３】
【化１】
2016527887.tif 000020
（式中、Ｘは、ＮおよびＣＨからなる群より選択され、Ｗは、ニトロ、シアノ、または別の電子求引基であり、Ｒは、オリゴヌクレオチドへの示された複素環の結合点である）
からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチドを含む予め選択されたオリゴヌクレオチドを含むタグが、前記置換プライマーの５’末端の１つまたは複数に追加されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
【化２】
2016527887.tif 000021
（式中、Ｘは、ＮおよびＣＨからなる群より選択され、Ｗは、ニトロ、シアノ、または別の電子求引基であり、Ｒは、オリゴヌクレオチドへの示された複素環の結合点である）
からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチドを含む予め選択されたオリゴヌクレオチドを含むタグが、前記置換プライマーの５’末端の１つまたは複数に追加されている、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記置換が、前記プライマーの３’末端の７部位に位置されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記置換が、前記プライマーの３’末端の７部位に位置されている、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記置換の総数が４であり、これらが、前記プライマーの３’末端の５部位に位置されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記置換の総数が４であり、これらが、前記プライマーの３’末端の５部位に位置されている、請求項２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
本発明の方法は、感染因子からＤＮＡおよびＲＮＡを検出するためのＤＮＡおよびＲＮＡ標的化診断アッセイを含む、多くの産業分野において有用である。
本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］  標的ＤＮＡ分子に対して相補的なＤＮＡ分子を合成する方法であって、前記標的ＤＮＡ分子が、二本鎖体として相補的なＤＮＡ分子にハイブリダイズされ、前記方法が、前記二本鎖体を、ヘリカーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、２’−デオキシヌクレオシド三リン酸、および置換プライマーを含む緩衝水溶液中でインキュベートする工程を含み、前記置換プライマーが、前記標的ＤＮＡ分子内のあるセグメントに対して配列において実質的に相補的であり、前記置換プライマー内において、少なくとも１つのアデニンが２−アミノプリンまたはジアミノプリンで置換されており、または少なくとも１つのグアニンがイノシンで置換されており、または少なくとも１つのチミンが２−チオチミンで置換されており、または少なくとも１つのシトシンがＮ４−エチルシトシンで置換されており、ならびに前記置換の総数が２から６である、方法。
［２］  標的ＤＮＡ分子に対して相補的な複数のＤＮＡ分子を合成する方法であって、前記標的ＤＮＡ分子が、二本鎖体として相補的なＤＮＡ分子にハイブリダイズされ、前記方法が、前記二本鎖体を、緩衝水溶液中で、ヘリカーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、２’−デオキシヌクレオシド三リン酸、および２つの置換プライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）と接触させる工程を含み、前記フォワードプライマーが、前記標的ＤＮＡ分子内のあるセグメントに対して配列において実質的に相補的であり、前記リバースプライマーが、前記標的ＤＮＡ分子内の下流のセグメントに対して配列において実質的に同一であり、両方の前記置換プライマー内において、少なくとも１つのアデニンが２−アミノプリンまたはジアミノプリンで置換されており、または少なくとも１つのグアニンがイノシンで置換されており、または少なくとも１つのチミンが２−チオチミンで置換されており、または少なくとも１つのシトシンがＮ４−エチルシトシンで置換されており、ならびに前記置換の総数が２から６である、方法。
［３］
【化１】
2016527887.tif 000022
（式中、Ｘは、ＮおよびＣＨからなる群より選択され、Ｗは、ニトロ、シアノ、または別の電子求引基であり、Ｒは、オリゴヌクレオチドへの示された複素環の結合点である）
からなる群より選択される少なくとも１つの核酸塩基を含む予め選択されたオリゴヌクレオチドを含むタグが、前記置換プライマーの５’末端の１つまたは複数に追加されている、上記［１］に記載の方法。
［４］
【化２】
2016527887.tif 000023
（式中、Ｘは、ＮおよびＣＨからなる群より選択され、Ｗは、ニトロ、シアノ、または別の電子求引基であり、Ｒは、オリゴヌクレオチドへの示された複素環の結合点である）
からなる群より選択される少なくとも１つの複素環を含む予め選択されたオリゴヌクレオチドを含むタグが、前記置換プライマーの５’末端の１つまたは複数に追加されている、上記［２］に記載の方法。
［５］  前記置換が、前記プライマーの３’末端の７部位に位置されている、上記［１］に記載の方法。
［６］  前記置換が、前記プライマーの３’末端の７部位に位置されている、上記［２］に記載の方法。
［７］  前記置換の総数が４であり、これらが、前記プライマーの３’末端の５部位に位置されている、上記［１］に記載の方法。
［８］  前記置換の総数が４であり、これらが、前記プライマーの３’末端の５部位に位置されている、上記［２］に記載の方法。
【国際調査報告】
2016527887.tif 000024