(57)【要約】  哺乳動物における肥満及び肥満関連障害を治療する方法が提供される。上記方法は、Ｔｐｈ１阻害剤またはセロトニン受容体阻害剤を含む、末梢セロトニンの合成または活性を阻害する化合物を哺乳動物に投与するステップを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における体重過多、肥満または肥満関連障害の哺乳動物を治療する方法であって、末梢セロトニンの合成または活性を阻害する化合物を前記哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記化合物が、肥満に関連する末梢セロトニンを標的とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物が、消化管内のセロトニン以外の末梢セロトニンを標的とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物が、脂肪組織の代謝活性を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物が、トリプトファンヒドロキシラーゼ１（ＴＰＨ１）を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物が、以下の一般式（Ｉ）：
【化１】
2016509017.tif 000008
を有する化合物であって、式中、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立して、単環式の任意選択で置換されたシクロアルキル、アリール、または複素環であり；Ｘは結合（すなわち、ＡがＤに直接結合している）、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｒ４）＝、＝Ｃ（Ｒ４）−、−Ｃ（Ｒ３Ｒ４）−、−Ｃ（Ｒ４）＝Ｃ（Ｒ４）−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｎ（Ｒ５）−、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）−、−Ｃ（Ｒ３Ｒ４）Ｎ（Ｒ５）−、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｒ３Ｒ４）−、−ＯＮＣ（Ｒ３）−、−Ｃ（Ｒ３）ＮＯ−、−Ｃ（Ｒ３Ｒ４）Ｏ−、−ＯＣ（Ｒ３Ｒ４）−、−Ｓ（Ｏ２）−、−Ｓ（Ｏ２）Ｎ（Ｒ５）−、−Ｎ（Ｒ５）Ｓ（Ｏ２）−、−Ｃ（Ｒ３Ｒ４）Ｓ（Ｏ２）−、または−Ｓ（Ｏ２）Ｃ（Ｒ３Ｒ４）−であり；Ｄは任意選択で置換されたアリールまたは複素環であり；Ｅは任意選択で置換されたアリールまたは複素環であり；Ｒ１は水素または任意選択で置換されたアルキル、アルキル−アリール、アルキル−複素環、アリール、または複素環であり；Ｒ２は水素または任意選択で置換されたアルキル、アルキル−アリール、アルキル−複素環、アリール、または複素環であり；Ｒ３はそれぞれ独立して水素、アルコキシ、アミノ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、または任意選択で置換されたアルキルであり；Ｒ４はそれぞれ独立して水素、アルコキシ、アミノ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、または任意選択で置換されたアルキルもしくはアリールであり；Ｒ５はそれぞれ独立して水素または任意選択で置換されたアルキルもしくはアリールであり；ｎは０〜３である、化合物またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくは水和物である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物が、（２Ｓ）−２−アミノ−３−（４−（２−アミノ−６−（２，２，２−トリフルオロ−１−（３’−フルオロ−［１，１’−ビフェニル］−４−イル）エトキシ）ピリミジン−４−イル）フェニル）プロパン酸である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物が、（２Ｓ）−２−アミノ−３−（４−（２−アミノ−６−（２，２，２−トリフルオロ−１−（３’−フルオロ−［１，１’−ビフェニル］−４−イル）エトキシ）ピリミジン−４−イル）フェニル）プロパン酸エチルである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物が、セロトニン受容体を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記セロトニン受容体が、５−ＨＴ１ａ、５−ＨＴ１ｂ、５−ＨＴ２ｂ、５−ＨＴ４及び５−ＨＴ５ａから成る群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物が、Ｔｐｈ１の発現のポリヌクレオチド阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物が、Ｔｐｈ１の抗体阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物が、全身投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物が、局所投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物が、脂肪組織に投与されるか、脂肪組織の近傍に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物が、高脂肪食を摂食している、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記肥満関連状態が、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、軽度の慢性炎症、インスリン抵抗性、リポジストロフィー、及びメタボリックシンドロームから選択される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、末梢セロトニン合成の阻害剤を用いた肥満及び関連する障害の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、エネルギー消費がエネルギー摂取よりも少ないという慢性的なエネルギーの不均衡により生じる。褐色脂肪組織（ＢＡＴ）は、そのミトコンドリア脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１）の発現を介したエネルギー消費の重要なレギュレーターであり、マウスにおけるＵＣＰ１の異所発現は、肥満の進展ならびに、インスリン抵抗性及び糖尿病を含む肥満に関連する合併症の進展を防ぐ。対照的に、マウスにおいてＵＣＰ１を欠失させると、熱中性（３０℃）でマウスを飼育した場合に、より肥満が進む。しかし、これらの熱産生に障害のあるマウスに対してストレス環境である２２℃では進まない。重要なことに、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）イメージングによって、老化及び肥満の両方を伴うヒトにおいてＢＡＴの活性が低いことが示されている。しかし、ＢＡＴ活性の低下を媒介するメカニズムは現在のところ理解されていない。
【０００３】
５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）としても知られるセロトニンは、中枢神経系を介した行動、食欲及びエネルギー消費の調節におけるその役割；神経系を有する全ての門にわたって広く保存されている機能について広く研究されている生体アミンである。脳内のセロトニンが詳細に理解されているにもかかわらず、体内のセロトニンの圧倒的大部分（〜９５％）は、食餌性トリプトファンからの５−ＨＴ合成の律速段階を触媒する酵素であるトリプトファンヒドロキシラーゼ１（Ｔｐｈ１）によってセロトニンが生産される末梢に見出される。Ｔｐｈ１は、脳幹及び腸のニューロンにおいて優勢であるＴｐｈ２とは遺伝学的に異なる。
【０００４】
循環セロトニンは極めて低いレベルであるが、中枢セロトニンの生産を制御するＴｐｈ２が持続的に存在するために脳内のセロトニンは正常レベルに維持されるＴｐｈ１欠損（Ｔｐｈ１−／−）マウスが作製されている。Ｔｐｈ１−／−マウスは生存可能であり、行動に関して野生型動物と差異を示さず、固形飼料を与えられた場合に正常な体重及びインスリン感受性を有する。セロトニンは血液脳関門を通過しないため、Ｔｐｈ１−／−マウスは、胃腸及び肝臓の炎症、インスリン分泌ならびに骨形成の調節における末梢セロトニンの重要性の解明において有用な援助となっている。
【０００５】
脊椎動物及び無脊椎動物の両方におけるエネルギー平衡の調節におけるセロトニンの古典的役割に加えて、近年、Ｔｐｈ１遺伝子及びセロトニン受容体（ＨＴＲ２Ａ）遺伝子の遺伝子多型が、肥満及び妊娠性糖尿病と関連付けられている。さらに、高脂肪食誘発性肥満が、マウスにおいて循環セロトニンレベルの増加を引き起こすことが見出されている。しかし、末梢セロトニンの変化が肥満に、あるいはエネルギー消費の変化に、直接つながるかについては現在のところ不明である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、肥満における末梢セロトニンの役割を決定すること、ならびに肥満の治療方法を開発することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
体重過多の哺乳動物、あるいは肥満及び関連する状態の哺乳動物の治療に末梢セロトニンの阻害が有用であることが今回見出されている。
【０００８】
従って、本発明の一態様において、哺乳動物における肥満及び肥満関連障害の治療方法が提供される。上記方法は、末梢セロトニンの合成または活性を阻害する化合物を哺乳動物に投与するステップを含む。
【０００９】
本発明の別の態様において、トリプトファンヒドロキシラーゼ１を阻害する化合物を哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物における肥満及び肥満関連障害の治療方法が提供される。
【００１０】
以下の図面を参照して、以下の詳細な説明において本発明のこれらの態様及び他の態様を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】固形飼料（低脂肪対照飼料）を与えたＴｐｈ１＋／＋マウス及びＴｐｈ１−／−マウスにおける正常体重（Ａ）、経時的血糖濃度（Ｂ）、耐糖能（Ｃ）及びインスリン耐性（Ｄ）を図示する（データは平均値±ＳＥＭ、ｎ＝７〜１０である）。
【図２−１】Ｔｐｈ１＋／＋マウス及びＴｐｈ１−／−マウスそれぞれについての（ａ）体重、（ｂ）脂肪蓄積、（ｃ）ＥＷＡＴ炎症、（ｄ）肝臓重量、（ｅ）食事介入過程中の血糖、（ｆ）空腹時血清インスリン濃度、（ｇ）ＧＴＴ、（ｈ）１０〜１２週間後に実施されたＩＴＴ、（ｉ）生理食塩水または０．５Ｕ／ｋｇのインスリンを注入して１５分後に屠殺した後の肝臓、ＥＷＡＴ及び混合腓腹筋における総Ａｋｔに対するＡｋｔＳ４７３のリン酸化の比較によって示されるように、Ｔｐｈ１−／−マウスが、肥満、慢性的な軽度の炎症、ＮＡＬＦＤ及びインスリン抵抗性から保護されることを図示する。データは平均値±ＳＥＭである。＊：固形飼料を与えたマウスまたはＴｐｈ１＋／＋マウスに対してＰ＜０．０５。＃：全ての他の群に対してＰ＜０．０５。†：生理食塩水条件に対してＰ＜０．０５。ＥＷＡＴ：精巣上体白色脂肪組織。ＩＴＴ：インスリン耐性試験。ＧＴＴ：耐糖能試験。ＡＵＣ：曲線下面積。
【図２−２】Ｔｐｈ１＋／＋マウス及びＴｐｈ１−／−マウスそれぞれについての（ａ）体重、（ｂ）脂肪蓄積、（ｃ）ＥＷＡＴ炎症、（ｄ）肝臓重量、（ｅ）食事介入過程中の血糖、（ｆ）空腹時血清インスリン濃度、（ｇ）ＧＴＴ、（ｈ）１０〜１２週間後に実施されたＩＴＴ、（ｉ）生理食塩水または０．５Ｕ／ｋｇのインスリンを注入して１５分後に屠殺した後の肝臓、ＥＷＡＴ及び混合腓腹筋における総Ａｋｔに対するＡｋｔＳ４７３のリン酸化の比較によって示されるように、Ｔｐｈ１−／−マウスが、肥満、慢性的な軽度の炎症、ＮＡＬＦＤ及びインスリン抵抗性から保護されることを図示する。データは平均値±ＳＥＭである。＊：固形飼料を与えたマウスまたはＴｐｈ１＋／＋マウスに対してＰ＜０．０５。＃：全ての他の群に対してＰ＜０．０５。†：生理食塩水条件に対してＰ＜０．０５。ＥＷＡＴ：精巣上体白色脂肪組織。ＩＴＴ：インスリン耐性試験。ＧＴＴ：耐糖能試験。ＡＵＣ：曲線下面積。
【図３】ＨＦＤを与えたＴｐｈ１＋／＋マウス及びＴｐｈ１−／−マウスそれぞれについての（ａ）酸素消費量、（ｂ）経時的活動レベル、（ｃ）基礎代謝率、（ｄ）ＰＥＴ／ＣＴイメージング解析から得られた組織のＦＤＧの取り込み、（ｅ）ウェスタンブロットにより評価されたＢＡＴのＵＣＰ１タンパク質含有量、（ｆ）酸素摂取量及び（ｇ）生理食塩水またはβ３−アドレナリン作動性活性化剤（β３−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）ＣＬ−３１５，２４３の注入後におけるプラズマ背側肩甲骨間の表面温度（ｐｌａｓｍａ  ｄｏｒｓａｌ  ｉｎｔｅｒｓｃａｐｕｌａｒ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）により図示されるように、Ｔｐｈ１を欠失したマウスでは代謝率及び褐色脂肪組織の活性が増加していることを示す。データは平均値±ＳＥＭ、ｎ＝７〜１２である。＊：Ｔｐｈ１＋／＋マウスに対してＰ＜０．０５。＃は遺伝子型の全体的な効果を示す（Ｐ＜０．０５）。†：生理食塩水条件に対してＰ＜０．０５。
【図４−１】ＨＦＤを与えて、プラシーボペレットまたはセロトニンを産生するペレットを皮下に移植したＴｐｈ１−／−マウスにおける血清セロトニン（ａ）、体重（ｂ）、ＥＷＡＴ質量（ｃ）、経時的摂食時血糖（ｄ）、耐糖能（ｅ）及びインスリン感受性（ｆ）の比較により、Ｔｐｈ１欠損マウスにおいてセロトニンを補充すると脂肪蓄積が増加し、耐糖能及びインスリン感受性が低下し、基礎代謝率及びＵＣＰ１媒介性熱産生が抑制されることを図示する。ＨＦＤを与えて、プラシーボペレットまたはセロトニンを産生するペレットを皮下に移植したＴｐｈ１−／−マウスにおいて、活動（ｈ）または食物摂取量（ｉ）に変化なく低下した酸素消費量（ｇ）。生理食塩水またはβ３−アドレナリン作動性活性化剤ＣＬ−３１５，２４３の急性注入後における、ＨＦＤを与えて、プラシーボペレットまたはセロトニンを産生するペレットを皮下に移植したＴｐｈ１−／−マウスの（ｊ）酸素摂取量及び（ｋ）プラズマ背側肩甲骨間の表面温度。データは平均値±ＳＥＭ、ｎ＝６〜８である。＊：プラシーボペレットのマウスに対してＰ＜０．０５。
【図４−２】ＨＦＤを与えて、プラシーボペレットまたはセロトニンを産生するペレットを皮下に移植したＴｐｈ１−／−マウスにおける血清セロトニン（ａ）、体重（ｂ）、ＥＷＡＴ質量（ｃ）、経時的摂食時血糖（ｄ）、耐糖能（ｅ）及びインスリン感受性（ｆ）の比較により、Ｔｐｈ１欠損マウスにおいてセロトニンを補充すると脂肪蓄積が増加し、耐糖能及びインスリン感受性が低下し、基礎代謝率及びＵＣＰ１媒介性熱産生が抑制されることを図示する。ＨＦＤを与えて、プラシーボペレットまたはセロトニンを産生するペレットを皮下に移植したＴｐｈ１−／−マウスにおいて、活動（ｈ）または食物摂取量（ｉ）に変化なく低下した酸素消費量（ｇ）。生理食塩水またはβ３−アドレナリン作動性活性化剤ＣＬ−３１５，２４３の急性注入後における、ＨＦＤを与えて、プラシーボペレットまたはセロトニンを産生するペレットを皮下に移植したＴｐｈ１−／−マウスの（ｊ）酸素摂取量及び（ｋ）プラズマ背側肩甲骨間の表面温度。データは平均値±ＳＥＭ、ｎ＝６〜８である。＊：プラシーボペレットのマウスに対してＰ＜０．０５。
【図５】（ａ）８週間のＬＰ５３３４０１または溶媒による処置後の、ＨＦＤを与えたＣ５７Ｂ１６マウスの血清セロトニン濃度、（ｂ）最後の１２週間に溶媒またはＬＰ５３３４０１で処置した、ＨＦＤを与えたＣ５７Ｂ１６マウスの１４週間にわたる体重、（ｃ）溶媒またはＬＰ５３３４０１で処置したマウスの脂肪蓄積及び肝臓重量（ｄ）、（ｅ）経時的摂食時血糖、（ｆ）溶媒及びＬＰ５３３４０１ＨＦＤを与えたマウスのＧＴＴ及びＡＵＣ、（ｇ）０．５Ｕ／ｋｇのインスリンを注入して１５分後の、溶媒及びＬＰ５３３４０１で処置したマウス由来の肝臓、ＥＷＡＴ及び混合腓腹筋における総Ａｋｔに対するＡｋｔＳ４７３のリン酸化により示されるように、Ｔｐｈ１の化学的阻害が、高脂肪食を与えたＣ５７Ｂ１６マウスにおいて肥満及びインスリン抵抗性を防ぐことを示す。ｎ＝７〜１０。データは平均値±ＳＥＭである。＊：溶媒と比較してＰ＜０．０５。
【図６−１】１０週間の溶媒またはＴｐｈ１阻害剤による処置の前にＨＦＤを８週間与えたＣ５７Ｂ１６マウスの経時的体重（ａ）、ＥＷＡＴ及び肝臓の重量（ｂ）、％体脂肪（ｃ）、及び基礎酸素消費量（ｄ）、耐糖能（ｅ）、及びインスリン感受性（ｆ）の比較によって、Ｔｐｈ１の化学的阻害による肥満の改善（ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｏｂｅｓｉｔｙ）を示す。データは平均値±ＳＥＭである。ｎ＝３〜４。＊：溶媒に対してＰ＜０．０５。
【図６−２】１０週間の溶媒またはＴｐｈ１阻害剤による処置の前にＨＦＤを８週間与えたＣ５７Ｂ１６マウスの経時的体重（ａ）、ＥＷＡＴ及び肝臓の重量（ｂ）、％体脂肪（ｃ）、及び基礎酸素消費量（ｄ）、耐糖能（ｅ）、及びインスリン感受性（ｆ）の比較によって、Ｔｐｈ１の化学的阻害による肥満の改善（ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｏｂｅｓｉｔｙ）を示す。データは平均値±ＳＥＭである。ｎ＝３〜４。＊：溶媒に対してＰ＜０．０５。
【図７】溶媒またはＬＰ５３３４０１で処置したマウスにおける酸素消費量（ａ）、活動レベル（ｂ）、及び組織のＦＤＧの取り込み（ｃ）の比較により図示されるように、Ｔｐｈ１の阻害が、褐色脂肪組織の活性を亢進することによりエネルギー消費を増加させることを示す。データは平均値±ＳＥＭである。ｎ＝７〜１０。＊：溶媒に対してＰ＜０．０５。
【図８】ＨＦＤを与えたＵｃｐ１＋／＋マウス及びＵｃｐ１−／−マウスにおける溶媒またはＬＰ５３３４０１による処置それぞれについての６週間後の体重の変化（ａ）、耐糖能試験（ＧＴＴ）及びＡＵＣ（ｂ）、ならびに生理食塩水またはＣＬ−３１５，２４３を急性注入した際の酸素摂取量（ｃ）及び背側肩甲骨間の表面温度（ｄ）の変化のグラフによる比較によって、肥満に対するＴｐｈ１阻害の代謝に関する有益性にＵＣＰ１の発現が必要であることを示す。データは平均値±ＳＥＭ、ｎ＝７〜１０である。＊：溶媒で処置したマウスに対してＰ＜０．０５。＃は処置の全体的な効果を示す（Ｐ＜０．０５）。†：生理食塩水条件に対してＰ＜０．０５。
【図９】ＨＦＤを与えたＴｐｈ１−／−マウスのＢＡＴにおけるｃＡＭＰ（ａ）の比較により示されるように、褐色脂肪細胞におけるｃＡＭＰ及び熱産生プログラム（ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｇｒａｍ）の増加をセロトニンが阻害することを示す。セロトニンは、イソプレナリンが誘発するｃＡＭＰ（ｂ）、ＰＫＡの基質（ｃ）ならびにＰｇｃ１ａ（ｄ）、Ｐｄｋ４（ｅ）及びＵｃｐ１（ｆ）が関与する熱産生プログラムの増加を鈍化させる。マウス由来のデータは平均値±ＳＥＭ、ｎ＝７である。ＢＡＴ細胞由来のデータは、２連でおこなった３回の独立した実験である。＊：Ｔｐｈ＋／＋マウスに対してＰ＜０．０５。†：溶媒での処置に対してＰ＜０．０５。
【図１０】（ａ）ＨＦＤを与えたＴｐｈ１−／−マウスまたはＬＰ５３３４０１で処置したＣ５７Ｂ１６マウスのｅＷＡＴへのＦＤＧの取り込みの増加、ＨＦＤを与えたＴｐｈ１−／−マウスの（ｂ）ｅＷＡＴ及び（ｃ）ｉＷＡＴにおけるベージュ／ブライト細胞の発現の増加により、Ｔｐｈ１の阻害が、代謝活性の増加及び白色脂肪細胞の「褐色化（ｂｒｏｗｎｉｎｇ）」を促進することを図示する。データは平均値±ＳＥＭ、ｎ＝７〜１０である。＊：溶媒で処置したマウスに対してＰ＜０．０５。
【図１１】ｃＡＭＰが誘発する脂肪組織の脂肪分解に対するセロトニン受容体の阻害の間接的効果を示す。
【図１２−１】ヒトＴｐｈ１のアミノ酸配列（Ａ）及び核酸コード配列（Ｂ）を示す。
【図１２−２】ヒトＴｐｈ１のアミノ酸配列（Ａ）及び核酸コード配列（Ｂ）を示す。
【図１３−１】マウスＴｐｈ１のアミノ酸配列（Ａ）及び核酸コード配列（Ｂ）を示す。
【図１３−２】マウスＴｐｈ１のアミノ酸配列（Ａ）及び核酸コード配列（Ｂ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
哺乳動物における肥満及び肥満関連障害の治療方法が提供される。上記方法は、末梢セロトニン、例えば、肥満に関連する末梢セロトニンの合成または活性を阻害する化合物を哺乳動物に投与するステップを含む。
【００１３】
用語「末梢セロトニン」は、中枢神経系のセロトニン以外のセロトニンを包含することを意味する。
【００１４】
用語「肥満に関連する末梢セロトニン」は、哺乳動物において肥満に関して役割を担う末梢セロトニンを指すことを意味する。上記末梢セロトニンは消化管において合成されるか、別の場所で合成されるセロトニンであってよい。しかし、上記末梢セロトニンは一般に、消化管内には局在しないセロトニンであり、脂肪組織に直接的または間接的に関連するセロトニン、すなわち、脂肪組織あるいは肥満状態において増加する細胞、例えば肥満細胞、Ｂ細胞、マクロファージ等などの免疫細胞に存在するセロトニンであってよい。
【００１５】
用語「肥満」は、健康に悪影響を及ぼす程度にまで過剰な体脂肪を哺乳動物が蓄積する状態を指す。「体重過多」とみなされる哺乳動物は、この定義に包含される。一般に、８５パーセンタイルを超える重量を有する哺乳動物は体重過多であり、９５パーセンタイルを超えるものは肥満である。成人は、個人の質量をその身長の２乗で割ることにより得られる測定値であるボディマス指数（ＢＭＩ）が２５ｋｇ／ｍ２を超える場合に体重過多であるとみなされ、ＢＭＩが３０ｋｇ／ｍ２を超える場合に肥満であるとみなされる。
【００１６】
用語「肥満関連障害」は、限定されるものではないが、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、軽度の慢性炎症、インスリン抵抗性、リポジストロフィー、及びメタボリックシンドロームを含む、肥満に関連する障害を包含する。当業者であれば理解するように、肥満及び肥満関連障害は、心機能障害、内分泌障害、呼吸障害、肝障害、生殖障害、及び癌を含む、種々の他の疾病状態または障害につながる可能性がある。
【００１７】
本明細書において哺乳動物における肥満に関して使用される用語「治療する」または「治療」は、少なくとも１つの肥満の有害作用の低減、あるいは体重増加の防止による肥満の予防をもたらす末梢セロトニンの阻害を指し、基底レベルと比較して、代謝活性、酸素利用、褐色脂肪活性、及び炎症の低減のうちの１つ以上を増強することを包含してよい。用語「哺乳動物」は、ヒト及びヒト以外の哺乳動物の両方を指す。
【００１８】
本発明の一態様において、肥満及び関連する障害の治療方法は、末梢セロトニンの合成を阻害する化合物、例えば、トリプトファンの５−ヒドロキシトリプトファンへの変換を触媒するトリプトファンヒドロキシラーゼ１（Ｔｐｈ１）を阻害する化合物の投与を含む。
【００１９】
Ｔｐｈ１の阻害は、例えば、Ｔｐｈ１活性を直接的または間接的に遮断するよう設計された阻害剤を用いて、タンパク質レベルで達成されてよい。Ｔｐｈ１阻害剤には、例えば、合成小分子、生物学的化合物またはそのような生物学的化合物に基づくペプチド模倣物が包含されてよい。好適なＴｐｈ１阻害剤はＴｐｈ２を阻害してもよく、または阻害しなくてもよい。この点について、Ｔｐｈ１の標的は末梢であるため、血液脳関門を通過しないＴｐｈ１阻害剤が好適であることが留意される。従って、好適なＴｐｈ１阻害剤はＴｐｈ２を有意に阻害する必要はない。
【００２０】
本方法において有用なＴｐｈ１の合成小分子阻害剤の例は、例えば、国際公開第０９／１２３９７８号、国際公開第１０／０５６９９２号、国際公開第０８／０７３９３３号、国際公開第０９／００２９６４号、国際公開第０９／００２９７０号、国際公開第０９／００９５６１号、国際公開第０９／０１４９７２号、国際公開第０９／０２９４９９号、国際公開第０９／０４２７３３号、国際公開第０９／０４８８６４号、国際公開第１０／０６５３３３号、国際公開第０７／０８９３３５号、米国特許第７５５３８４０号、米国特許出願公開第２００７／０１９１３７０号、米国特許出願公開第２００８／０１５３８５２号、米国特許出願公開第２００９／０００５３８１号、米国特許出願公開第２００９／０００５３８２号、米国特許出願公開第２００９／００２９９９３号、米国特許出願公開第２００９／００５４３０８号、米国特許出願公開第２００９／００６２５４０号、米国特許出願公開第２００９／００８８４４７及び米国特許出願公開第２００９／００９９２０６号に記載されるように、当技術分野において公知である。
【００２１】
その薬学的に許容可能な塩、水和物及び溶媒和物を含む、本方法において有用なＴｐｈ１阻害剤の特定のファミリーの例は、式（１）：
【化１】
2016509017.tif 000003
によって表わされ、式中、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立して、単環式の任意選択で置換されたシクロアルキル、アリール、または複素環であり；Ｘは結合（すなわち、ＡがＤに直接結合している）、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｒ４）＝、＝Ｃ（Ｒ４）−、−Ｃ（Ｒ３Ｒ４）−、−Ｃ（Ｒ４）＝Ｃ（Ｒ４）−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｎ（Ｒ５）−、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）−、−Ｃ（Ｒ３Ｒ４）Ｎ（Ｒ５）−、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｒ３Ｒ４）−、−ＯＮＣ（Ｒ３）−、−Ｃ（Ｒ３）ＮＯ−、−Ｃ（Ｒ３Ｒ４）Ｏ−、−ＯＣ（Ｒ３Ｒ４）−、−Ｓ（Ｏ２）−、−Ｓ（Ｏ２）Ｎ（Ｒ５）−、−Ｎ（Ｒ５）Ｓ（Ｏ２）−、−Ｃ（Ｒ３Ｒ４）Ｓ（Ｏ２）−、または−Ｓ（Ｏ２）Ｃ（Ｒ３Ｒ４）−であり；Ｄは任意選択で置換されたアリールまたは複素環であり；Ｅは任意選択で置換されたアリールまたは複素環であり；Ｒ１は水素または任意選択で置換されたアルキル、アルキル−アリール、アルキル−複素環、アリール、または複素環であり；Ｒ２は水素または任意選択で置換されたアルキル、アルキル−アリール、アルキル−複素環、アリール、または複素環であり；Ｒ３はそれぞれ独立して水素、アルコキシ、アミノ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、または任意選択で置換されたアルキルであり；Ｒ４はそれぞれ独立して水素、アルコキシ、アミノ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、または任意選択で置換されたアルキルもしくはアリールであり；Ｒ５はそれぞれ独立して水素または任意選択で置換されたアルキルもしくはアリールであり；ｎは０〜３である。
【００２２】
Ａ１及び／またはＡ２は、任意選択で置換されたシクロアルキル（例えば、６員環及び５員環）、任意選択で置換されたアリール（例えば、フェニルまたはナフチル）、または任意選択で置換された複素環（例えば、６員環及び５員環）であってよい。６員環の複素環の例としては、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、及びトリアジンが挙げられる。５員環の複素環の例としては、ピロール、イミダゾール、トリアゾール、チアゾール、チオフェン、及びフランが挙げられる。一部の化合物において、Ａ１及び／またはＡ２は芳香族である。他の化合物において、Ａ１及び／またはＡ２は芳香族ではない。
【００２３】
Ｄは、任意選択で置換されたアリール（例えば、フェニルまたはナフチル）、任意選択で置換された複素環（例えば、６員環及び５員環）、または任意選択で置換された二環式部分（例えば、インドール、イソ−インドール、ピロロ−ピリジン、またはナフチレン）であってよい。６員環の複素環の例としては、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、及びトリアジンが挙げられる。５員環の複素環の例としては、ピロール、イミダゾール、トリアゾール、チアゾール、チオフェン、及びフランが挙げられる。一部の化合物において、Ｄは芳香族である。他の化合物において、Ｄは芳香族ではない。
【００２４】
Ｅは、任意選択で置換されたアリール（例えば、フェニルまたはナフチル）、任意選択で置換された複素環（例えば、上記のように６員環及び５員環）、または任意選択で置換された二環式部分（上記の通り）であってよい。一部の化合物において、Ｅは芳香族である。他の化合物において、Ｅは芳香族ではない。
【００２５】
特定の化合物には、Ｒ１及びＲ２が水素または任意選択で置換されたアルキルである化合物、あるいはｎが１または２である化合物が包含される。
【００２６】
一部の化合物において、Ｘは結合またはＳであってよく、あるいは、Ｘは−Ｃ（Ｒ４）＝、＝Ｃ（Ｒ４）−、ｂ−Ｃ（Ｒ３Ｒ４）−、−Ｃ（Ｒ４）＝Ｃ（Ｒ４）−、または−Ｃ≡Ｃ−であってよく、例えば、Ｒ４は独立して水素または任意選択で置換されたアルキルであってよい。他の化合物において、Ｘは−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ３Ｒ４）Ｏ−、または−ＯＣ（Ｒ３Ｒ４）−であってよく、例えば、Ｒ３は水素または任意選択で置換されたアルキルであってよく、Ｒ４は水素または任意選択で置換されたアルキルであってよい。一実施形態において、Ｒ３は水素であり、Ｒ４はトリフルオロメチルである。他の実施形態において、Ｘは−Ｓ（Ｏ２）−、−Ｓ（Ｏ２）Ｎ（Ｒ５）−、−Ｎ（Ｒ５）Ｓ（Ｏ２）−、−Ｃ（Ｒ３Ｒ４）Ｓ（Ｏ２）−、または−Ｓ（Ｏ２）Ｃ（Ｒ３Ｒ４）−であり、例えば、Ｒ３は水素または任意選択で置換されたアルキルであり、Ｒ４は水素または任意選択で置換されたアルキルであり、Ｒ５は水素または任意選択で置換されたアルキルである。別の実施形態において、Ｘは−Ｎ（Ｒ５）−、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）−、−Ｃ（Ｒ３Ｒ４）Ｎ（Ｒ５）−、または−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｒ３Ｒ４）−であり、例えば、Ｒ３は水素または任意選択で置換されたアルキルであり、Ｒ４は水素または任意選択で置換されたアルキルであり、Ｒ５はそれぞれ独立して水素または任意選択で置換されたアルキルである。
【００２７】
本明細書において使用される用語「任意選択で置換された」は、原子、化学部分または、限定されるものではないが、アルコール、アルデヒド、アルコキシ、アルカノイルオキシ、アルコキシカルボニル、アルケニル、アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ｔ−ブチル）、アルキニル、アルキルカルボニルオキシ（−ＯＣ（Ｏ）アルキル）、アミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−アルキル−または−アルキルＮＨＣ（Ｏ）アルキル）、アミジニル（−Ｃ（ＮＨ）ＮＨ−アルキルまたは−Ｃ（ＮＲ）ＮＨ２）、アミン（アルキルアミノ、アリールアミノ、アリールアルキルアミノなどの一級、二級及び三級）、アロイル、アリール、アリールオキシ、アゾ、カルバモイル（−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−アルキル−またはＯＣ（Ｏ）ＮＨ−アルキル）、カルバミル（例えば、ＣＯＮＨ２、ならびにＣＯＮＨ−アルキル、ＣＯＮＨ−アリール、及びＣＯＮＨ−アリールアルキル）、カルボニル、カルボキシル、カルボン酸、カルボン酸無水物、カルボン酸塩化物、シアノ、エステル、エポキシド、エーテル（例えば、メトキシ、エトキシ）、グアニジノ、ハロ、ハロアルキル（例えば、−ＣＣＩ３、−ＣＦ３、−Ｃ（ＣＦ３）３）、ヘテロアルキル、ヘミアセタール、イミン（一級及び二級）、イソシアネート、イソチオシアネート、ケトン、ニトリル、ニトロ、酸素（すなわち、オキソ基を提供する）、リン酸ジエステル、硫化物、スルホンアミド（例えば、ＳＯ２ＮＨ２）、スルホン、スルホニル（アルキルスルホニル、アリールスルホニル及びアリールアルキルスルホニルを含む）、スルホキシド、チオール（例えば、スルフヒドリル、チオエーテル）及び尿素（−ＮＨＣＯＮＨ−アルキル−）などの官能基で所定の部分が置換されていることを示す。
【００２８】
用語「アルキル」は、１〜２０個（例えば、１〜１０個または１〜４個）の炭素原子を有する直鎖状、分枝状及び／または環状（「シクロアルキル」）の炭化水素を意味する。１〜４個の炭素を有するアルキル部分は「低級アルキル」と呼称される。アルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、４，４−ジメチルペンチル、オクチル、２，２，４−トリメチルペンチル、ノニル、デシル、ウンデシル及びドデシルが挙げられる。シクロアルキル部分は単環式または多環式であってよく、例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、及びアダマンチルが挙げられる。アルキル部分のさらなる例は、直鎖状部分、分枝状部分及び／または環状部分（例えば、１−エチル−４−メチル−シクロヘキシル）を有する。用語「アルキル」には、飽和炭化水素、ならびに、２〜２０個（例えば、２〜１０個または２〜６個）の炭素原子を有し、且つ少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含むアルケニル部分、及び２〜２０個（例えば、２〜２０個または２〜６個）の炭素原子を有し、且つ少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含むアルキニル部分が包含される。
【００２９】
好ましいＴＰＨ１阻害剤としては、ＬＰ−５３３４０１（（２Ｓ）−２−アミノ−３−（４−（２−アミノ−６−（２，２，２−トリフルオロ−１−（３’−フルオロ−［１，１’−ビフェニル］−４−イル）エトキシ）ピリミジン−４−イル）フェニル）プロパン酸）：
【化２】
2016509017.tif 000004
及びＬＰ−６１５８１９（（２Ｓ）−２−アミノ−３−（４−（２−アミノ−６−（２，２，２−トリフルオロ−１−（３’−フルオロ−［１，１’−ビフェニル］−４−イル）エトキシ）ピリミジン−４−イル）フェニル）プロパン酸エチル）：
【化３】
2016509017.tif 000005
が包含される。
【００３０】
Ｔｐｈ１阻害剤は、米国特許第７５５３８４０号に記載される方法など、化学合成の確立された方法を用いて容易に合成される可能性がある。また、これらの阻害剤の一部は市販されている。また、当業者であれば理解するように、いずれの前述の化合物のプロドラッグ、あるいはその薬学的に許容可能な塩、水和物または溶媒和物が使用されてもよい。用語「薬学的に許容可能な」は、無毒性の塩、水和物及び溶媒和物、及びそうでなければ生理学的に許容可能な塩、水和物及び溶媒和物に対して適用される。用語「プロドラッグ」は、インビボで変換されて阻害剤またはその薬学的に許容可能な類似体、塩、水和物または溶媒和物を生ずる化合物（例えば、薬剤の前駆体）を指す。上記変換は、例えば、血中での加水分解によってなど、様々なメカニズムによって（例えば、代謝プロセスまたは化学プロセスによって）起こる可能性がある。用語「塩」は、本明細書において使用される場合、無機酸及び／または有機酸と形成される酸性塩、ならびに無機塩基及び／または有機塩基と形成される塩基性塩の両方を意味する。酸付加塩（ａｃｉｄ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｓａｌｔ）の例としては、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの無毒性の無機酸に由来する塩、ならびに、脂肪族モノカルボン酸及び脂肪族ジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸（ｐｈｅｎｙｌ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ａｌｋａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸などの無毒性の有機酸に由来する塩が挙げられる。塩基付加塩（ｂａｓｅ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｓａｌｔ）の例としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等などのアルカリ土類金属に由来する塩、ならびに、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等などの無毒性の有機アミンに由来する塩が挙げられる。「溶媒和物」は、好ましくは薬学的に許容可能な溶媒中における阻害剤の混合によって形成される。「水和物」は、溶媒が水の場合に形成される溶媒和物である。
【００３１】
生物学的なＴｐｈ１阻害剤の例としては、ポリクローナル抗体、あるいはＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７（１９７５））によって開発された、確立されたハイブリドーマ技術を用いて調製されたモノクローナル抗体などの免疫学的阻害剤が挙げられる。Ｔｐｈ１タンパク質の選択された領域に対して特異的に反応する抗体を生産するためにハイブリドーマ細胞を免疫化学的にスクリーニングでき、モノクローナル抗体を単離できる。本明細書において使用される用語「抗体」は、本発明によるＴｐｈ１タンパク質に対してやはり特異的に反応するそのフラグメント、ならびにキメラ抗体派生物（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、すなわち、ヒト以外の動物のペプチドの可変領域とヒトのペプチドの定常領域との組み合わせの結果生じる抗体分子を包含することが意図される。Ｔｐｈ１抗体の例としては、例えば、ＥＰ１３１１Ｙ、ＰｈｏｓｐｈｏＳ２６０、ａｂ４６７５７、ａｂ７８９６９及びａｂ１１１８７２が挙げられ、これらは市販されている（Ａｂｃａｍ  Ｉｎｃ．）。
【００３２】
また、例えば、Ｔｐｈ１の機能を阻害する公知の生物学的阻害剤に基づいて、Ｔｐｈ１のペプチド模倣物阻害剤が調製されてもよい。このようなペプチド模倣物は、増大した安定性、例えば生化学的分解に対する耐性などの望ましい特徴を組み込むように設計されてよい。一般に、このようなペプチド模倣物は、コンピュータモデリングを含む、当技術分野において確立された技術を用いて設計され、ペプチド合成の標準的な方法を用いて調製される。
【００３３】
別の実施形態において、Ｔｐｈ１をコードする核酸分子に由来する、アンチセンス、ｓｎｐまたはｓｉＲＮＡ技術などの、ポリヌクレオチドを利用する確立された方法論を用いてＴｐｈ１遺伝子の発現を阻害してよい。用語「Ｔｐｈ１をコードする核酸分子」は、ヒトのＴｐｈ１、ならびにヒト以外のＴｐｈ１をコードする核酸分子（遺伝子）を指す。Ｔｐｈ１をコードする核酸分子の配列は当技術分野において公知であり、ＧｅｎＢａｎｋなどの配列データベース等において利用可能である。ヒト及びマウスの配列を含む、このような配列の例を図１２Ｂ／１３Ｂにそれぞれ示す。Ｔｐｈ１をコードする核酸に結合し、その発現を阻害する効果のあるアンチセンスオリゴヌクレオチドを調製するために、Ｔｐｈ１をコードする核酸分子を使用してよい。本明細書において使用される用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的のＴｐｈ１をコードする核酸配列の少なくとも一部に対して相補的なヌクレオチド配列を意味する。用語「オリゴヌクレオチド」は、天然に存在する塩基、糖、及び糖間（骨格）結合から成るヌクレオチドまたはヌクレオシドのモノマーのオリゴマーまたはポリマーを指す。また、上記用語は、同様に機能する、天然には存在しないモノマーを含む修飾もしくは置換されたオリゴマーまたはその一部も包含する。このような修飾または置換されたオリゴヌクレオチドは、細胞内への取り込みの向上あるいはヌクレアーゼ存在下における安定性の増大などの特性のおかげで、天然に存在する形態よりも好ましい可能性がある。また、上記用語は、２以上の化学的に異なった領域を含むキメラオリゴヌクレオチド（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）も包含する。例えば、キメラオリゴヌクレオチドは、有利な特性（例えば、ヌクレアーゼ耐性の増加、細胞への取り込みの増加）を付与する修飾ヌクレオチドの領域を少なくとも１つ、ならびにアンチセンス結合領域を含んでよい。さらに、２つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを連結して、キメラオリゴヌクレオチドを形成してよい。
【００３４】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボ核酸またはデオキシリボ核酸であってよく、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン及びウラシルを含む天然に存在する塩基を含んでよい。また、上記オリゴヌクレオチドは、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルアデニン、２−プロピルアデニン及び他のアルキルアデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザチミン、プソイドウラシル、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオールアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニン及び他の８−置換アデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオールアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニン及び他の８−置換グアニン、他のアザウラシル及びデアザウラシル、他のアザチミジン及びデアザチミジン、他のアザシトシン及びデアザシトシン、他のアザアデニン及びデアザアデニン、または他のアザグアニン及びデアザグアニン、５−トリ−フルオロメチルウラシル及び５−トリフルオロシトシンなどの修飾塩基を含んでもよい。
【００３５】
本発明の他のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾された亜リン酸、リン酸骨格中の酸素ヘテロ原子、短鎖アルキル糖間結合またはシクロアルキル糖間結合あるいは短鎖ヘテロ原子糖間結合または複素環式糖間結合を含んでよい。例えば、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、リン酸トリエステル、メチルホスホネート及びホスホロジチオエートを含んでよい。さらに、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは結合の組み合わせを含んでよく、例えば、ホスホロチオエート結合が、４〜６つの３’−末端塩基のみを連結してよく、全てのヌクレオチドを連結してよく、あるいは１対の塩基のみを連結してよい。
【００３６】
また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、治療試薬または実験試薬としてより適している可能性のあるヌクレオチド類似体を含んでもよい。オリゴヌクレオチド類似体の例は、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）中のデオキシリボース（またはリボース）リン酸骨格が、ペプチドに見出されるものと類似のポリミド（ｐｏｌｙｍｉｄｅ）骨格で置換されたペプチド核酸（ＰＮＡ）である（Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１，２５４，１４９７）。ＰＮＡ類似体は、酵素による分解に対して耐性であること、ならびにインビボ及びインビトロにおいて寿命がより長いことが示されている。また、ＰＮＡ鎖とＤＮＡ鎖との間に電荷の反発がないため、ＰＮＡは相補的なＤＮＡ配列とより強い結合を形成する。他のオリゴヌクレオチド類似体は、ポリマー骨格、環状骨格、または非環状骨格を有するヌクレオチドを含んでよい。例えば、ヌクレオチドは、モルホリノ骨格構造を有してよい（米国特許第５，０３４，５０６号）。また、オリゴヌクレオチド類似体は、レポーター基、保護基及びオリゴヌクレオチドの薬物動態特性を向上させるための基などの基を含んでもよい。また、当業者に理解されるように糖模倣物をアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込んでもよい。
【００３７】
アンチセンス核酸分子は、本明細書において提供されるものなどの所与のＴｐｈ１の核酸配列に基づいて、当技術分野において公知の手順を用いる化学合成及び酵素による連結反応を用いて構築されてよい。本発明のアンチセンス核酸分子、またはそのフラグメントは、天然に存在するヌクレオチド、あるいは分子の生物学的安定性を高めるかまたはｍＲＮＡもしくはネイティブの遺伝子と形成される二重鎖の物理的安定性を高めるように設計された様々に修飾されたヌクレオチド、例えばホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチドを用いて化学的に合成されてよい。また、アンチセンス配列は生物学的に生産されてもよい。この場合、アンチセンスをコードする核酸は発現ベクター中に組み込まれ、次に、上記発現ベクターが、高効率の調節領域の制御下でアンチセンス配列を生産する組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒ウイルスの形態で細胞に導入され、その活性は、ベクターが導入される細胞型により決定されてよい。
【００３８】
別の実施形態において、Ｔｐｈ１の発現を阻害するためにｓｉＲＮＡ技術が適用されてよい。Ｔｐｈ１遺伝子内の領域に合致し、選択的にＴｐｈ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡフラグメントなどの核酸フラグメントの適用を用いてＴｐｈ１の発現を遮断してよい。このような遮断は、ｓｉＲＮＡフラグメントが上記遺伝子に結合し、それによって、機能的なＴｐｈ１を産生する上記遺伝子の翻訳を妨げる場合に起こる。
【００３９】
Ｔｐｈ１遺伝子内の領域に合致するｓｉＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関して上記で概説される核酸合成の確立された方法を用いて作製される。標的のＴｐｈ１遺伝子の構造は公知であるため、それと合致するＲＮＡのフラグメントを容易に作製できる。選択されたｓｉＲＮＡのＴＰＨ１の発現を遮断する効力は、ＴＰＨ１を発現する細胞株を用いて確認することができる。要するに、選択されたｓｉＲＮＡを、ＴＰＨ１を発現する細胞株とともに適切な増殖条件下でインキュベートしてよい。十分な反応時間の後、すなわちｓｉＲＮＡがＴＰＨ−１をコードするｍＲＮＡに結合してフリーのＴＰＨ１  ｍＲＮＡのレベルが低下するのに十分な反応時間の後、反応混合物を試験してそのような低下が起こっているかどうかを決定する。適切なｓｉＲＮＡは、機能的なタンパク質を産生するＴＰＨ１遺伝子のプロセシングを妨げる。これは、例えば、ＴＰＨ−１の結合により調節されるレポーター遺伝子の発現を同定するための、細胞に基づくアッセイにおいてＴＰＨ１の活性についてアッセイすることにより検出することができる。
【００４０】
本方法において有用なｓｉＲＮＡフラグメントは、遺伝子発現のより効果的な阻害をもたらす可能性のあるＴｐｈ１をコードする核酸の特定の領域、例えば、遺伝子の５’末端の領域または中央の領域に由来してよいことが当業者には理解されるであろう。さらに、当業者であれば理解するように、有用なｓｉＲＮＡフラグメントはＴｐｈ１標的遺伝子に正確に合致する必要はないが、配列の修飾を、例えば、その中のヌクレオチド塩基のうちの１つ以上の付加、欠失または置換を、その修飾されたｓｉＲＮＡが標的遺伝子に選択的に結合する能力を保持するのであれば組み込んでよい。より使用に望ましいフラグメントを得るために、選択されたｓｉＲＮＡフラグメントをさらに修飾してよい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて説明されるものと同様の様式で安定性の増大を達成するためにｓｉＲＮＡフラグメントを修飾してよい。
【００４１】
本発明による阻害性のオリゴヌクレオチドは、限定されるものではないが、連続したヌクレオチド約１５〜約１００個の長さ、連続したヌクレオチド約１５〜約５０個、連続したヌクレオチド約１８〜３０個またはヌクレオチド約１９〜２５個の長さを含む、任意の適切なサイズであってよい。このようなオリゴヌクレオチドの長さは、オリゴヌクレオチドが標的遺伝子の発現を阻害できるように決定される。
【００４２】
調製されると、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡなどの、Ｔｐｈ１遺伝子の発現を阻害するのに有用であると決定されたオリゴヌクレオチドは、哺乳動物における肥満及び関連する障害を治療するための治療方法において使用されてよい。適切なオリゴヌクレオチドは、ベクター（レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びＤＮＡウイルスベクター）を含む当技術分野の手法を用いて、あるいはマイクロインジェクションなどの物理的手法を用いることにより、哺乳動物の組織または細胞に導入されてよい。
【００４３】
本発明の別の態様において、脂肪組織内のセロトニン受容体ならびにそれ以外では肥満において普遍的なセロトニン受容体を含む、肥満及び／または脂肪組織に関連する末梢セロトニン受容体の活性を遮断することによって末梢セロトニンの活性を阻害してよい。例えば、脂肪組織において非常に豊富であるセロトニン受容体には、限定されてよいものではないが、５−ＨＴ１ａ、５−ＨＴ１ｂ、５−ＨＴ２ｂ、５−ＨＴ４及び５−ＨＴ５ａが包含される。従って、肥満及び／または脂肪組織に関連するセロトニン受容体の阻害剤もまた、本発明に従って肥満を治療するために使用されてよい。セロトニン受容体阻害剤の例としては、決して限定されるものではないが、シアノピンドロール、アルプレノロール、メチセルジド、アゴメラチン、ケタンセリン、リタンセリン、ピボセロド、ラトレピルジン、トロピセトロン及びパロノセトロンが挙げられる。
【００４４】
肥満及び関連する障害の治療において、末梢セロトニンの治療的阻害剤を、単独で、または適切な薬学的に許容可能な担体と組み合わせて、哺乳動物に投与してよい。「薬学的に許容可能な」なる表現は、薬学分野及び獣医学分野における使用について許容可能であること、すなわち、許容できない程の毒性ではないこと、あるいはそうでなければ許容できない程不適切ではないこと、を意味する。薬学的に許容可能な担体の例としては、希釈剤、賦形剤等が挙げられる。一般に、薬剤の製剤に関する手引きについて、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」（２１ｓｔ  Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５）を参照してよい。補助剤の選択は、阻害剤の種類ならびに意図される組成物の投与様式に依存する。本発明の一実施形態において、化合物は、点滴による投与、あるいは皮下への注入、静脈内への注入、くも膜下腔内への注入、脊髄内への注入または人工マトリックスの一部としての注入のいずれかによる投与のために製剤化され、従って、無菌及びパイロジェンフリーの形態の任意選択で緩衝化または等張化された水溶液として使用される。従って、選択された化合物は、蒸留水中で、あるいは、より望ましくは生理食塩水、リン酸緩衝食塩水または５％ブドウ糖溶液中で投与されてよい。錠剤、カプセルまたは懸濁液による経口投与のための組成物は、ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖；トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロースを含む、セルロース及びその誘導体；トラガント末；麦芽；ゼラチン；滑石；ステアリン酸；ステアリン酸マグネシウム；硫酸カルシウム；ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油及びトウモロコシ油などの植物油；プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール；寒天；アルギン酸；水；等張の生理食塩水及びリン酸バッファ溶液を含む、補助剤を用いて調製される。また、湿潤剤、ラウリル硫酸ナトリウムなどの潤滑剤、安定剤、錠剤化剤（ｔａｂｌｅｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、抗酸化剤、防腐剤、着色剤及び香味料が存在してもよい。別の実施形態において、局所的または経皮的塗布のために、組成物はクリーム、ローションまたは軟膏として製剤化されてよい。このような局所的／経皮的塗布のために、組成物は、トリグリセリド基材などの適切な基材、及び／または皮膚を通じた吸収を促進する担体を含んでよい。また、このようなクリーム、ローション及び軟膏は、界面活性剤及び、皮膚軟化剤等ならびに芳香剤などの他の化粧品添加物を含んでもよい。例えば、経鼻送達のために、適切な噴霧補助剤が使用されるエアロゾル製剤が調製されてもよい。また、本発明の組成物は、巨丸剤、舐剤、または糊状剤として投与されてもよい。また、どのように投与されるべきかにかかわらず、他の補助剤が組成物に添加されてもよく、例えば、長期の保存期間にわたって微生物の増殖を防ぐために抗菌剤が組成物に添加されてよい。
【００４５】
本発明によれば、選択された末梢セロトニン阻害剤は、肥満に関連する末梢セロトニン、例えば、脂肪組織に関連するセロトニンあるいは肥満において役割を担う細胞及び組織、例えば免疫細胞に関連するセロトニンを標的とするように、肥満の治療において哺乳動物に投与される。従って、上記阻害剤は、適切な投与可能経路を介して投与され、標的の末梢セロトニンに到達する。適切な投与経路には、全身投与、あるいは局部的投与となる経路、例えば注入、局所投与または経皮投与等が包含される。また、経口投与など、他の投与経路が、肥満に関連する末梢セロトニンを標的とする担体の使用によって所望の標的法を達成するように適合化されてもよい。
【００４６】
本発明によれば、肥満の治療における、肥満に関連する末梢セロトニンを標的とする末梢セロトニン阻害剤の使用は、肥満の治療を向上させるために他の治療剤または治療と併せて利用されてよい。例えば、上記阻害剤は、食事及び身体活動レベルの変化を含む生活習慣への治療介入などの、肥満に対する従来の治療と併せて利用されてよい。また、肥満を治療するための末梢セロトニン阻害剤の使用は、体重減少を誘発するハーブ療法と組み合わせて、あるいはグルカゴン様ペプチドアゴニスト（すなわちエクセナチド、リラグルチド）、５ＨＴ２Ｃ阻害剤、またはナトリウムグルコーストランスポーター（ｓｏｄｉｕｍ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）（ＳＧＬＴ２）に対する阻害剤を含む減量療法と併せて利用されてもよい。また、上記阻害剤は、肥満のための外科的治療、例えば減量のための肥満外科手術、と併せて、あるいはその前に、使用されてもよい。
【００４７】
別の実施形態において、本発明による末梢セロトニン阻害剤の使用は、末梢循環セロトニンを増加させて、それによって体重増加を誘発する可能性のある治療と併せて使用されてよい。このような内科的治療には、例えば、ＳＳＲＩ／抗うつ治療が包含される。
【００４８】
本発明の方法に従って肥満を治療するために、治療上有効な量の末梢セロトニンの阻害が、説明される方法などの方法によって達成される。末梢セロトニンの阻害に関しての「治療上有効な」なる用語は、赤外線サーモグラフィー技術により測定した場合に代謝活性を少なくとも約５％増加させるように機能する阻害レベル、あるいは、基礎代謝率の測定により決定した場合に酸素利用を少なくとも約５％増加させる阻害レベル、あるいは、Ｔｎｆ−アルファ、ＩＬ６及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）などの炎症マーカーの血清中レベルの低下、アディポカイン、レプチンの血清中レベルの少なくとも約５％の低下、またはアディポネクチンの血清中レベルの少なくとも約５％の増加をもたらす阻害レベルを指すことを意味する。
【００４９】
当業者であれば理解するように、治療上有効な末梢セロトニンの阻害を達成するのに十分な末梢セロトニン阻害剤の用量は、適切に管理された臨床試験を用いて容易に決定できる。ＴＰＨ１の合成小分子阻害剤については、これらの阻害剤についての現在の知見に基づいて適切な用量を決定してもよい。例えば、ＬＰ５３３４０１などのＴＰＨ１阻害剤の治療上有効な用量は、約０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは約０．５〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲内、及びより好ましくは約１〜２５０ｍｇ／ｋｇの範囲内であることが予測される。同様に、セロトニン受容体阻害剤の用量を、このような阻害剤の知見に基づいて決定してよい。セロトニン受容体阻害剤の治療上有効な用量もまた、約０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇの範囲内にあってよいことが予測される。
【００５０】
一実施形態では、本発明の肥満の治療において、高脂肪食を摂食している哺乳動物またはレプチンが欠損した哺乳動物に末梢セロトニン阻害剤が投与される。
【００５１】
本発明の別の実施形態において、治療を必要とする哺乳動物に対して末梢セロトニン阻害剤が上記哺乳動物の脂肪組織部位に局所的に投与される。
【００５２】
本発明の実施形態が以下の特定の実施例において説明されるが、これらの実施例は限定するものとして解釈されるべきではない。
【００５３】
実施例１−肥満に対するＴｐｈ１阻害の効果
動物：全ての実験は、マクマスター大学の動物倫理委員会（ｔｈｅ  ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｉｍａｌ  ｅｔｈｉｃｓ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認され、動物研究のためのカナダのガイドライン（Ｃａｎａｄｉａｎ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ａｎｉｍａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ）の下でおこなわれた。Ｃｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００，１３５２５−１３５３０（２００３））に記載された通りに遺伝子突然変異によってＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＴｐｈ１−／−マウスを最初に作製した。ヘテロ欠損（Ｔｐｈ１＋／−）マウスを交配させてＴｐｈ１−／−及びＴｐｈ１＋／＋の同腹仔を作製した。８週齢の時点で開始して１２週間、雄のＴｐｈ１−／−マウス及びＴｐｈ１＋／＋マウスに固形飼料（１７％ｋｃａｌ脂肪；Ｄｉｅｔ８６４０，Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）または高脂肪食（ＨＦＤ、４５％ｋｃａｌ脂肪、Ｄ１２４５１，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ；Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）のいずれかを給餌し、水を適宜与えた。最初の化学的阻害剤研究のために、６週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスをＪａｃｋｓｏｎ’ｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、直ちに上述のＨＦＤで飼育した。８週齢の時点で開始して、ＨＦＤを与えたＣ５７Ｂｌ６マウスに毎日、ＤＭＳＯに溶解させて水で希釈（ＤＭＳＯの終濃度は５％）したＴｐｈ１阻害剤ＬＰ５３３４０１（２５ｍｇ／ｋｇ体重、Ｄａｌｔｏｎ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｃａｎａｄａ）または等体積の溶媒（水中で５％のＤＭＳＯ）を腹腔内注射した。このプロトコルは循環セロトニンを効果的に抑制することが以前に示されている。０７００に照明を点灯する１２時間の明／暗周期にて、２３℃の一定温度に維持される部屋に置かれたＳＰＦマイクロアイソレーターケージ（ＳＰＦ  ｍｉｃｒｏ−ｉｓｏｌａｔｏｒ  ｃａｇｅ）内で全てのマウスを飼育した。
【００５４】
Ｕｃｐ１ヘテロ欠損マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得て、繁殖させてＵＣＰ１欠損（Ｕｃｐ１−／−）及び野生型（Ｕｃｐ１＋／＋）の同腹仔を作製した。熱ストレスを防ぐために、この集団のマウスについては、３０℃に維持される部屋で繁殖させ、及び飼育した。ＣＬ−３１６，２４３チャレンジを除き、全ての試験をこの温度にておこなった。
【００５５】
Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｌａｂ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＡＭＳ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＯＨ，ＵＳＡ）にて代謝のモニタリングを以前（Ｓａｃｈｉｔｈａｎａｎｄａｎ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５２，１６３２−１６４２（２０１０）；Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｈ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０８，１６０９２−１６０９７（２０１１））に記載された通りに実施した。また、ＣＬ−３１６，２４３チャレンジ実験もＣＬＡＭＳの機器を用いて記載された通りに実施した。代謝のモニタリングは全て、２６〜２８℃に維持される部屋にておこなった。Ｔｐｈ１−／−マウス実験では１６週間の食事介入後に、ＬＰ５３３４０１注入実験では６〜１０週間のＨＦＤ週間の後に、以前（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｇ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８５，３７１９８−３７２０９（２０１０））に記載された通りにインスリン耐性試験及び耐糖能試験をおこなった。血清インスリン及び血清サイトカインの測定のために、ヘパリン処置されていない毛細管を用いて１６〜１８週目の間に空腹時及び摂食時の血液試料を後眼窩採血により採取し、インスリン、アディポネクチン、レプチンを、（Ｗａｔｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １２，５４１−５４８（２００６）に）記載された通りに測定した。多重化ビーズに基づいたイムノアッセイ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｂｅａｄ−ｂａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を製造業者の指示に従って用いて血清サイトカイン（ＭＣＰ−１、ＴＮＦα及びＩＬ−６）を測定した。
【００５６】
インビボでのグルコースの取り込み及び体組成：マクマスター大学にてＦＤＧ合成装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，ＵＳＡ）及びサイクロトロン（Ｓｉｅｍａｎｓ２０−３０ｇｂ）を用いて求核置換法により１８Ｆ−フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）を合成した。８時間の絶食後、０．９％の生理食塩水で希釈したインスリン（０．５Ｕ／ｋｇ）をマウスに注入し、５分後にＦＤＧ（１０．８±１．２ＭＢｑ／ｇ）の静脈内投与をおこなった。注入後、マウスを意識のある状態に維持し、ヒーティングパッドを用いて加温した。生理食塩水またはインスリンの注入後２８分の時点においてイソフロラン（ｉｓｏｆｌｏｒａｎｅ）でマウスに麻酔をかけ、３０分の時点において、小動物陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ、Ｐｈｉｌｉｐ  Ｍｏｓａｉｃ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ）イメージング及びｍｉｃｒｏ−ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＣＴ）（Ｇａｍｍａ  Ｍｅｄｉｃａ−Ｉｄｅａｓ  Ｘｓｐｅｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＮｏｒｔｈＲｉｄｇｅ，ＣＡ）イメージングを、ＰＥＴについては１５分の収集時間、その後のＣＴについては５分の収集時間でおこなった。以前に記載された通りに３１、減衰補正ならびに断層写真撮影装置の部分容積効果の補正をせずに３Ｄ−ＲＡＭＬＡアルゴリズムを用いて画像を再構築した。Ａｍｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｗｏｒｋｐｌａｃｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてＲｅｇｉｏｎ−ｏｆ−ｉｎｔｅｒｅｓｔ（ＲＯＩ）解析により定量化をおこない、（Ｐａｌａｎｉｖｅｌ  Ｒ，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．５５（１１）：３０８３−９３（２０１２）に）記載された通りに、標準取り込み値（ＳＵＶ）の平均値を用いて組織によるＦＤＧの取り込みを算出した。総体脂肪組成の解析は、Ａｍｉｒａ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｖｉｓａｇｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ）を用いて測定し、セグメント化された脂肪のボクセルの平均値を算出して総体重に対して表した。
【００５７】
解析方法：ｍＲＮＡ解析のために、組織をＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）中で溶解させ、ｑＲＴ−ＰＣＲ用にＲＮＡを抽出した。（Ｂｅｃｋ  Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ（２００９）に）記載される抗体ならびに手法を用いて組織のイムノブロッティングをおこなった。免疫組織化学のために、（Ｇａｌｉｃ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １２１，４９０３−４９１５（２０１１）に）記載された通りに、パラフィンで包埋した精巣上体の脂肪、褐色脂肪組織、及び肝臓を切片化して、脱ワックス処理し、抗原の検出（ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）前に再水和した。
【００５８】
統計解析：示される結果は全て、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）である。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、スチューデントｔ−検定あるいは適切な場合には２要因ＡＮＯＶＡにより結果を解析した。Ｂｏｎｆｅｒｏｎｎｉ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃテストを用いて、ＡＮＯＶＡにより示された有意差について試験した。ｐ≦０．０５で有意とされた。
【００５９】
結果
固形飼料を与えたＴｐｈ１−／−マウスは、野生型（Ｔｐｈ１＋／＋）対照と比較して、正常な体重、血糖、耐糖能及びインスリン感受性を有することが見出された（図１ａ〜ｄ）。しかし、高脂肪食（ＨＦＤ）を与えた場合、Ｔｐｈ１−／−マウスは、飼料により誘発される体重増加の進展から著しく保護された（図２ａ）。さらなる解析により、ＨＦＤを与えたＴｐｈ１−／−マウスでは、脂肪組織の炎症のマーカーの実質的な減少（図２ｃ）と関連する脂肪蓄積の劇的な減少（図２ｂ）が起こったことが明らかとなった。また、ＨＦＤを与えたＴｐｈ１−／−マウスでは、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）からの保護を示す少ない脂質蓄積を特徴とする肝臓重量の減少も起こった（図２ｄ）。これらのデータは、Ｔｐｈ１−／−マウスが肥満ならびに低度の慢性炎症及びＮＡＦＬＤを含む関連する合併症から保護されることを示す。
【００６０】
肥満はインスリン抵抗性の進展に寄与するが、体重の減少と合致してＴｐｈ１−／−マウスでは、インスリン感受性の向上を示唆する空腹時血糖（図２ｅ）及び血清インスリン（図２ｆ）の減少が起こった。これらの変化と合致して、Ｔｐｈ１−／−マウスでは、耐糖能（図２ｇ）及びインスリン感受性（図２ｈ、ｉ）が著しく向上した。これらのデータは、Ｔｐｈ１−／−マウスがインスリン抵抗性の進展から保護されることを示す。
【００６１】
ＨＦＤを与えたＴｐｈ１−／−マウスの体重増加の鈍化に寄与するメカニズムを調べるために、代謝ケージを用いてエネルギー摂取及びエネルギー消費を調べた。Ｔｐｈ１−／−マウスにおいて酸素消費量（ＶＯ２）は約２０％高く（図３ａ）、この効果は身体活動レベルには依存せず、体重について補正していない場合でさえ麻酔したマウスにおいても観察された（図３ｃ）。従ってこれらは基礎代謝率の上昇を示している。遺伝子型の間で、１日当たりの平均食物摂取量に差はなかった（Ｔｐｈ１＋／＋＝１５．９±０．５ｇ、Ｔｐｈ１−／−＝１４．６±０．６ｇ、Ｐ＞０．０５、ｎ＝８）。どの組織が基礎代謝率の上昇に寄与しているかを決定するために、ＰＥＴ／ＣＴを用いて１８フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）の取り込みを測定した。ＦＤＧの取り込みはＴｐｈ１−／−マウスのＢＡＴにおいて劇的に増加したが、その他の器官では変化しなかった（図３ｄ）。まとめると、これらの解析は、Ｔｐｈ１−／−マウスがＢＡＴにおける代謝活性の増加を反映する特性を示したことを示す。これらの発見と合致して、Ｔｐｈ１−／−マウス由来のＢＡＴではＵＣＰ１が豊富に存在した（図３ｅ）。さらに、β３−アドレナリン作動性アゴニストＣＬ−３１６，２４３でチャレンジした場合、Ｔｐｈ１−／−マウスでは酸素摂取量（図３ｆ）及び熱産生がより多かった。これらはＢＡＴの活性がより高いことを示している。これらの発見は、Ｔｐｈ１欠失の抗肥満効果が褐色脂肪組織の活性の増加と関連することを示す。
【００６２】
セロトニンが褐色脂肪組織を直接阻害していることを確認するために、遺伝学的なＴｐｈ１欠失の利点を調べるため及び該利点を逆転させるための手段としてＨＦＤを与えたＴｐｈ１−／−マウスに徐放性（６０日）セロトニンペレットまたはプラシーボペレットを皮下移植した。予測された通りに、セロトニンペレットは循環セロトニンの穏やかな増加を誘発したこと（図４ａ）、ならびに、体重に検出可能な変化はなかったものの（図４ｂ）、もしかするとセロトニンレベルの比較的小さな増加（それでもＨＦＤを与えたＷＴのマウスと比較すると大きく減少していた）に起因して、セロトニンペレットを移植したマウスでは、ＥＷＡＴ組織の重量が約２０％増加したこと（図４ｃ）が見出された。さらに、Ｔｐｈ１−／−マウスにおける末梢セロトニンの増加は、空腹時血糖の小さな増加を引き起こし、また、耐糖能及びインスリン感受性の低下も引き起こした（図４ｄ〜ｆ）。重要なことに、ＨＦＤを与えたＴｐｈ１−／−マウスでは、ケージ活動または食物摂取量において行動上変化がないにもかかわらず、基礎代謝率も低下した（図４ｇ〜ｉ）。さらに、ＣＬ−３１６，２４３でチャレンジした場合、セロトニンペレットを移植したマウスでは酸素摂取の刺激が弱まり、熱産生がより低い傾向にあった（図４ｊ〜ｋ）。これらの発見は、セロトニンがインビボにおいてＢＡＴ活性を直接調節していることを示す。
【００６３】
ＨＦＤを与えたＣ５７Ｂ１６マウスを、２５ｍｇ／ｋｇ体重の用量のＬＰ５３３４０１（Ｔｐｈ１阻害剤）（Ｄａｌｔｏｎ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｃａｎａｄａ）の腹腔内注射で１０週間処置した。ＬＰ５３３４０１のｉｐ注射は循環セロトニンレベルを減少させたことが見出された（図５ａ）。予測された通りに、ＨＦＤを与えたマウスを溶媒で処置した場合、処置期間にわたって１週間当たり約１〜２グラム体重が増加したが、驚くべきことに、ＬＰ５３３４０１で処置したマウスにおいては、この体重増加が抑制された（図５ｂ）。Ｔｐｈ１欠失の効果と同様に、ＬＰ５３３４０１での処置によって、体脂肪の蓄積の低下（図５ｃ及び表１）、肝臓サイズの減少（図５ｄ）、グルコース恒常性の向上（図５ｅ〜ｆ）及びインスリン感受性の増加（図５ｇ）が生じた。
【表１】
2016509017.tif 000006
データは値±ＳＥＭであり、ｎは１群当たり７〜８匹のマウスである。
【００６４】
重要なことに、Ｔｐｈ１阻害剤での毎日の処置を開始する前に８週間ＨＦＤを与えることによってマウスを最初に肥満化させた場合にも同様の結果が得られた（図６ａ〜ｆ）。従って、Ｔｐｈ１の化学的阻害は、肥満ならびにＮＡＦＬＤ及びインスリン抵抗性を含む関連する合併症を予防すること及び改善させることに関してＴｐｈ１の遺伝子欠失の効果を表現型模写する。ＬＰ５３３４０１で処置したマウスにおける体重減少に寄与するメカニズムを調べるために、ＨＦＤを与えたマウスを１２日間処置してから群内において任意の体重変化が明らかになる前（溶媒：２９．４±０．５８ｇに対してＬＰ５３３４０１：２８．９±０．６３ｇ）に代謝ケージに収容した。ＬＰ５３３４０１での処置により、活動レベル（図７ａ〜ｂ）または食物摂取量（溶媒＝１３．０±０．６５ｇに対して阻害剤＝１３．７±０．４５ｇ、Ｐ＞０．０５、ｎ＝８）を変化させることなく、暗サイクル中及び明サイクル中の両方において酸素消費量が増加した。その後、１８ＦＤＧ−ＰＥＴ／ＣＴ解析がおこなわれ、ＬＰ５３３４０１での処置により、ＵＣＰ１の発現亢進及び脂質沈着の減少（図７ｄ）と合致してＢＡＴにおけるＦＤＧの取り込みが増加したこと（図７ｃ）が見出された。これらのデータは、化学的なＴｐｈ１阻害により、Ｔｐｈ１−／−マウスにおいて観察された結果と類似してエネルギー消費及びＢＡＴの活性が増加することを示す。
【００６５】
Ｔｐｈ１阻害の臨床的利点（体重減少及びインスリン感受性の向上）がＵＣＰ１によって媒介される熱産生の増加に由来するものかどうかを立証するために、ＨＦＤを与えて熱中性条件（３０℃）下で飼育したＵＣＰ１欠損（Ｕｃｐ１−／−）及び野生型同腹仔（Ｕｃｐ１＋／＋）を用いて毎日ＬＰ５３３４０１の注入を実施した。驚くべきことに、Ｕｃｐ１＋／＋マウスではＬＰ５３３４０１での処置に起因して体重増加が鈍化したが、Ｕｃｐ１−／−マウスでは鈍化しなかった（図８ａ）。さらに、ＬＰ５３３４０１によって誘発される耐糖能の向上はＵＣＰ１の発現に完全に依存していた（図８ｂ）。さらに、ＣＬ−３１６，２４３でチャレンジした場合、ＬＰ５３３４０１で処置したＵｃｐ１＋／＋マウスのみが、酸素摂取量及び熱産生の増加を示した（図８ｃ〜ｄ）。従って、Ｔｐｈ１阻害の臨床的利点は、ＵＣＰ１が媒介する熱産生を必要とする。
【００６６】
それによってセロトニンが褐色脂肪組織の活性を調節する可能性があるメカニズムを調べるために、尿中のカテコールアミン（エピネフリン、ノルエピネフリン、及びドーパミン）を調べたところ、驚くべきことに、Ｔｐｈ１−／−マウスにおいて交感神経の緊張がより低かったことが見出され、代わりにセロトニンがＢＡＴのカテコールアミンに対する感受性を変化させている可能性があることが示唆された（表２）。
【表２】
2016509017.tif 000007
データは平均値±ＳＥＭ、ｎ＝６〜１０、＊：ＴＰＨ１＋／＋に対してＰ＜０．０５
【００６７】
ＵＣＰ１の発現及びＢＡＴの活性はｃＡＭＰの変化に大きく依存しているため、ｃＡＭＰレベルを測定したところ、ＨＦＤを与えたＴｐｈ１−／−マウスにおいてｃＡＭＰがより多いことが見出された（図９ａ）。セロトニンが細胞自律的な様式でｃＡＭＰ及び熱産生プログラムの誘導を変化させることができるかどうか調べるために、イソプロテレノール（ｃＡＭＰアゴニスト）で刺激する前にＢＡＴ細胞を、ＨＦＤを与えたＴｐｈ１＋／＋マウスのＢＡＴにおいて観察される濃度のセロトニンで処置した（図９ｂ）。セロトニンでの処置は、イソプロテレノールによって刺激されるｃＡＭＰならびにホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ  Ｓ６６０−図９ｃ）などのプロテインキナーゼＡの基質のリン酸化を減衰させ、重要なことに、熱産生遺伝子プログラム（ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｉｃ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｇｒａｍ）の誘導も鈍化させた（図９ｄ〜ｆ）。従って、セロトニンは、ＢＡＴ、ｃＡＭＰ及び熱産生プログラムを直接阻害する。これは、Ｔｐｈ１の阻害に加えて、セロトニン受容体に対する拮抗作用が、ＢＡＴの熱産生を増加させるのに有効である可能性があることを示唆する。
【００６８】
最後に、白色脂肪細胞のベージュまたはブライト細胞への褐色化がエネルギー消費の調節、そして恐らくは体重の調節において重要な役割を担うことが最近になって示唆されているため、Ｔｐｈ１−／−マウス及びＴｐｈ１阻害剤で処置したマウスにおけるこれらの特徴を評価した。遺伝学的または化学的にＴｐｈ１を阻害したマウスにおいて内臓のＷＡＴのＦＤＧの取り込みが増加していたことがＰＥＴスキャンにより見出された（図１０ａ）。内臓の白色脂肪組織の代謝活性におけるこれらの変化と合致して、Ｕｃｐ１、Ｃｉｄｅａ及びＰｇｃ１ａの発現もｅＷＡＴ及び鼠蹊部のＷＡＴの貯蔵部（depots）において増加していたことから、ベージュまたはブライト細胞のマーカーが観察されたことが見出された（図１０ｂ〜ｃ）。また、ｅＷＡＴの褐色化の増加もＴｐｈ１阻害剤で処置したマウスにおいて巨視的に明らかであり（図１０ｄ）、免疫染色によって評価されるようにＵＣＰ１の顕著な発現と関連していた（図１０ｅ）。これらのデータは、Ｔｐｈ１阻害剤が、ＢＡＴ活性を増加させることに加えて、白色脂肪組織の褐色化も促進することを示す。肥満のヒトに存在する大量の白色脂肪組織、ならびに、ヒトにおける褐色脂肪はげっ歯類のベージュまたはブライト脂肪細胞と密接に関連する可能性があるという示唆を考慮すると、この発見はヒトの肥満の治療において臨床的に重要である。
【００６９】
考察
Ｔｐｈ１−／−マウス、ならびに、野生型マウスにおけるＴｐｈ１の薬理学的阻害を利用して、エネルギー恒常性及び肥満の進展に対する末梢セロトニンの役割を調べた。ＨＦＤ誘発性肥満は、Ｔｐｈ１の発現に依存した脂肪組織のセロトニンレベルの上昇を引き起こし、これは、セロトニン生産が栄養の制御下にあることを示す。Ｃ  ｅｌｅｇａｎｓにおける以前の研究では、セロトニンが脂肪酸酸化をアップレギュレートすることによってエネルギー消費を増加させることが示されていたが、今回の発見は、哺乳動物においてはその逆が正しいことを示す。
【００７０】
Ｔｐｈ１の遺伝学的または化学的阻害は、ＵＣＰ１が媒介する熱産生を増加させることによって、ＨＦＤ誘発性肥満及びｄｙｓｇｌｙｃｅｍｉａの進展を防ぐか、または改善させた。これらのデータは、脂肪組織のエネルギー代謝の制御における末梢セロトニンの役割についての初めての証拠を提供する。この発見は、門全体にわたってエネルギー平衡の調節に不可欠である古典的分子を哺乳動物における褐色脂肪組織の制御に結び付ける。肥満においてＢＡＴ活性は低下しているため、Ｔｐｈ１、セロトニンまたはセロトニン受容体の阻害が肥満及び関連する障害を改善させるのに有効であることが本明細書において示される。
【００７１】
実施例２−セロトニン受容体の阻害の効果
方法
細胞培養：（Ｕｌｄｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，３（２００６）３３３−３４１に記載される）マウス胎児褐色脂肪由来の不死化褐色脂肪細胞（ＢＡ）細胞株を、以前にＭｏｔｔｉｌｌｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８７（２０１２）２５０３８−２５０４８に記載された通りに培養し、分化させた。要するに、コンフルエント細胞を誘導培地（０．５ｍＭ  ＩＢＭＸ；０．２ｍＭ  インドメタシン；２μｇ／ｍｌデキサメタゾン；１ｎＭ  Ｔ３、２０ｎＭインスリン）中に２日間配置し、その後、分化培地（１ｎＭ  Ｔ３、２０ｎＭインスリン）で維持した。実験は全て、誘導から６〜８日後の培養物でおこなった。特に明記しない限り、細胞をＰＢＳですすぎ、培地をＨＥＰＥＳ緩衝クレブスリンガーバッファ（ＨＫＲＢ）＋１％ＢＳＡに交換した。明記される場合には、ＢＡをセロトニン（１００μＭ；Ｓｉｇｍａ）で３０分間処理し、その後、イソプロテレノール（１ｎＭ、Ｓｉｇｍａ）で４時間処理した。上述のセロトニンでの処理の４５分前に、セロトニン受容体アンタゴニストであるメチセルジド（３μＭ）を使用した。
【００７２】
ｃＡＭＰの測定：イソプロテレノール（１ｎＭ）で１０分間刺激したＢＡにおいてｃＡＭＰレベルを測定した。０．１Ｍ  ＨＣｌ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で細胞を２０分間溶解し、酸性化された細胞溶解物を回収してＮａＯＨで中和し、５０００×ｇで５分間遠心分離して上清を回収した。以前（Ｍｏｔｔｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  Ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，３０１（２０１１）Ｅ１２２−Ｅ１３１）に記載された通りに、ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）によってｃＡＭＰレベルを定量化した。
【００７３】
ＦＦＡの定量：ＮＥＦＡ−ＨＲ（２）キット（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＵＳＡ）を製造業者の提示する通りに用いて、イソプロテレノールで１時間刺激した後に培地中に放出されたＦＦＡを定量化した。
【００７４】
ＲＮＡ抽出及び遺伝子発現解析：Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＲＮＡ  ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いて、ＢＡ由来のＲＮＡを単離した。以前（Ｍｏｔｔｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２９３（２００７）Ｅ１１８８−１１９７）に記載された通りに、様々な遺伝子の発現パターンをｑＲＴ−ＰＣＲ解析によって定量化した。要するに、製造業者の推奨する通りにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びランダムヘキサマープライマーを用いてＲＮＡ（１〜２μｇ）をｃＤＮＡに逆転写した。以前に記載された通りに、１０μｌの定量的ＰＣＲ反応（Ａｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄ）中で２５ｎｇのｃＤＮＡを解析した。デルタ−デルタＣＴ法（２−ΔΔＣＴ）（Ｌｉｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２５（２００１）４０２−４０８）を用いて発現データをハウスキーピング遺伝子であるＲＮＡポリメラーゼＩＩＡ（Ｐｏｌｒ２Ａ）に対して標準化した。
【００７５】
タンパク質の単離及びウェスタンブロット解析：プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）及びホスファターゼ阻害剤（１００μＭ  ＮａＦ、２ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム）を含む細胞溶解バッファ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１％ＮＰ−４０、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中でタンパク質を抽出した。溶解物を４℃にて１５分間可溶化し、１６，０００×ｇで１０分間遠心分離して溶解物を清澄化した。抽出物を回収し、ビシンコニン酸法（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質を定量化した。還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥをおこない、分離したタンパク質をＰＶＤＦに転写した。メンブレンを５％脱脂粉乳中で室温にて１時間免疫ブロッキング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｃｋ）し、リン酸化−ＨＳＬ  Ｓ６６０及び総ＨＳＬに対する抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ）で一晩プローブ化した。次に、ブロットを洗浄し、１：１０，０００で希釈した二次ヤギ抗ウサギＨＲＰ（ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＨＲＰ）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ）と共にインキュベートして、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）で可視化した。
【００７６】
結果
本結果は、図１１に示されるように、イソプレナリンによって誘発される脂肪分解（ｃＡＭＰの間接的な機能尺度）の増加をセロトニン（１００ｎｇ／ｍｌの５−ＨＴ）が鈍化させること、ならびに、５−ＨＴ受容体アンタゴニストであるメチセルジドと共に処理することによってこの効果が遮断されることを示す。データは、不死化ＢＡＴ細胞由来のｎ＝２に基づく。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【国際調査報告】
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