(57)【要約】  半減期が著しく延長したペプチドベースのプロドラッグを本明細書に開示する。
2016521253.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造を含むプロドラッグ。
Ａ−Ｂ−Ｑ
（式中、Ｑは、グルカゴンスーパーファミリーペプチドであり、
Ａは、Ｃ16−Ｃ30アシル基又はＣ16−Ｃ30アルキル基に共有結合により連結しているアミノ酸であり、
Ｂは、Ａ−Ｂと（Ｃ1−Ｃ8アルキル）ＮＨ2側鎖を含むＱの残基との間のアミド結合を介してＱに連結しているＮ−アルキル化アミノ酸である）
【請求項２】
生理学的条件下の血清中、Ａ−ＢのＱからの切断半減期が約３日〜約１０日である、請求項１に記載のプロドラッグ。
【請求項３】
（Ｃ1−Ｃ8アルキル）ＮＨ2側鎖を含むＱの残基が、天然グルカゴン（配列番号７０１）の１、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２８、若しくは２９位に対応する位置に、又はＱのＣ末端の最後の５個のアミノ酸の１つに位置する、請求項１又は２に記載のプロドラッグ。
【請求項４】
Ａ−Ｂが以下の構造を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【化１】
2016521253.tif 000074
Ｉ
（式中、
Ｒ1及びＲ2は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ18アルキル、Ｃ2−Ｃ18アルケニル、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＯＲ9、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＳＲ9、（Ｃ2−Ｃ3アルキル）ＳＣＨ3、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＮＨＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ2+）ＮＨ2、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ2−Ｃ5複素環）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ9ヘテロアリール）、及びＣ1−Ｃ12アルキル（Ｗ1）Ｃ1−Ｃ12アルキルからなる群から独立に選択され、Ｗ1は、Ｎ、Ｓ及びＯからなる群から選択されるヘテロ原子であり、又はＲ1及びＲ2は、これらが結合している原子と一緒になってＣ3−Ｃ12シクロアルキル若しくはアリールを形成しており、
Ｒ4及びＲ8は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ18アルキル、Ｃ2−Ｃ18アルケニル、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＯＨ、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＳＨ、（Ｃ2−Ｃ3アルキル）ＳＣＨ3、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ2+）ＮＨ2、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ2−Ｃ5複素環）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ9ヘテロアリール）、及びＣ1−Ｃ12アルキル（Ｗ1）Ｃ1−Ｃ12アルキルからなる群から独立に選択され、Ｗ1は、Ｎ、Ｓ及びＯからなる群から選択されるヘテロ原子であり、又はＲ4及びＲ8は、これらが結合している原子と一緒になってＣ3−Ｃ6シクロアルキルを形成しており、
Ｒ3はＣ1−Ｃ18アルキルであり、又はＲ4及びＲ3は、これらが結合している原子と一緒になって４、５、若しくは６員の複素環を形成しており、
Ｒ5は、ＮＨＲ6又はＮＨＲ9であり、
Ｒ6はＨ、Ｃ1−Ｃ8アルキルであり、又はＲ6及びＲ2は、これらが結合している原子と一緒になって４、５、若しくは６員の複素環を形成しており、
Ｒ7は、Ｈ、ＯＲ9、Ｃ1−Ｃ18アルキル、Ｃ2−Ｃ18アルケニル、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＣＯＮＨＲ9、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＲ9、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＮＨＲ9、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＯＲ9、及びハロからなる群から選択され、且つ
Ｒ9は、Ｈ、Ｃ16−Ｃ30アシル、及びＣ16−Ｃ30アルキルからなる群から選択される）
【請求項５】
Ｒ1及びＲ8が独立にＨ又はＣ1−Ｃ8アルキルである、請求項４に記載のプロドラッグ。
【請求項６】
Ｒ4が、Ｈ、Ｃ1−Ｃ8アルキル、Ｃ2−Ｃ8アルケニル、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＯＨ、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＳＨ、（Ｃ2−Ｃ3アルキル）ＳＣＨ3、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ2+）ＮＨ2、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ2−Ｃ5複素環）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ9ヘテロアリール）、及びＣ1−Ｃ12アルキル（Ｗ1）Ｃ1−Ｃ12アルキルからなる群から選択され、Ｗ1が、Ｎ、Ｓ及びＯからなる群から選択されるヘテロ原子であり、又はＲ4及びＲ8が、これらが結合している原子と一緒になってＣ3−Ｃ6シクロアルキルを形成している、請求項４又は５に記載のプロドラッグ。
【請求項７】
Ｒ3がＣ1−Ｃ8アルキルであり、又はＲ4及びＲ3が、これらが結合している原子と一緒になって４、５、若しくは６員の複素環を形成している、請求項４〜６のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項８】
Ｒ3がＣ1−Ｃ8アルキルである、請求項４〜７のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項９】
Ｒ2が、Ｈ、Ｃ1−Ｃ8アルキル、Ｃ2−Ｃ8アルケニル、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＯＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＳＲ9、（Ｃ2−Ｃ3アルキル）ＳＣＨ3、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＮＨＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ2+）ＮＨ2、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ2−Ｃ5複素環）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ9ヘテロアリール）、及びＣ1−Ｃ12アルキル（Ｗ1）Ｃ1−Ｃ12アルキルからなる群から選択され、Ｗ1が、Ｎ、Ｓ及びＯからなる群から選択されるヘテロ原子であり、又はＲ1及びＲ2が、これらが結合している原子と一緒になってＣ3−Ｃ12シクロアルキル若しくはアリールを形成している、
請求項４〜８のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項１０】
Ｒ2が、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＯＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＳＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＮＨＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＲ9、及び（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7からなる群から選択され、
Ｒ7が、ＯＲ9、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＣＯＮＨＲ9、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＲ9、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＮＨＲ9、及び（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＯＲ9からなる群から選択される、
請求項４〜９のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項１１】
Ｒ5がＮＨＲ6である、請求項４〜１０のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項１２】
Ｒ1、Ｒ4、及びＲ8が、Ｈ及びＣ1−Ｃ18アルキルからなる群から独立に選択され、又はＲ4及びＲ8が、これらが結合している原子と一緒になってＣ3−Ｃ6シクロアルキルを形成しており、
Ｒ2が、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＯＲ9、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＳＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＮＨＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＲ9、及び（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7からなる群から選択され、
Ｒ6がＨ又はＣ1−Ｃ8アルキルであり、且つ
Ｒ7が、ＯＲ9、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＣＯＮＨＲ9、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＲ9、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＮＨＲ9、及び（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＯＲ9からなる群から選択される、
請求項４に記載のプロドラッグ。
【請求項１３】
Ｒ1、Ｒ4、及びＲ8が、Ｈ及びＣ1−Ｃ8アルキルからなる群から独立に選択され、又はＲ4及びＲ8が、これらが結合している原子と一緒になってＣ3−Ｃ6シクロアルキルを形成しており、
Ｒ2が、（Ｃ1−Ｃ8アルキル）ＯＲ9、（Ｃ1−Ｃ8アルキル）ＳＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＮＨＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＲ9、及び（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7からなる群から選択され、且つ
Ｒ3がＣ1−Ｃ8アルキルであり、又はＲ4及びＲ3が、これらが結合している原子と一緒になって、４、５、若しくは６員の複素環を形成している、
請求項１２に記載のプロドラッグ。
【請求項１４】
Ｒ2が、（Ｃ1−Ｃ8アルキル）ＯＲ9、（Ｃ1−Ｃ8アルキル）ＳＲ9、及び（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＲ9からなる群から選択され、且つ
Ｒ3がＣ1−Ｃ8アルキルであり、又はＲ4及びＲ3が、これらが結合している原子と一緒になって４、５、若しくは６員の複素環を形成している、
請求項１２又は１３に記載のプロドラッグ。
【請求項１５】
Ｒ2が（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＲ9であり、且つ
Ｒ3がＣ1−Ｃ8アルキルであり、又はＲ4及びＲ3が、これらが結合している原子と一緒になって４、５、若しくは６員の複素環を形成している、
請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項１６】
Ｒ1、Ｒ4、及びＲ8がＨであり、且つ
Ｒ3がＣ1−Ｃ8アルキルである、
請求項１２〜１５のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項１７】
Ｒ5がＮＨＲ6であり、且つ
Ｒ9が、Ｃ16−Ｃ30アシル及びＣ16−Ｃ30アルキルからなる群から選択される、
請求項１２〜１６のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項１８】
Ｒ1、Ｒ4、及びＲ8がＨであり、
Ｒ2が（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＲ9であり、
Ｒ3がＣ1−Ｃ8アルキルであり、
Ｒ5がＮＨＲ6であり、
Ｒ6がＨ又はＣ1−Ｃ8アルキルであり、且つ
Ｒ9がＣ16−Ｃ30及びＣ16−Ｃ30アルキルからなる群から選択される、
請求項４に記載のプロドラッグ。
【請求項１９】
Ｒ9が、Ｃ20−Ｃ28アシル及びＣ20−Ｃ28アルキルからなる群から選択される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項２０】
Ｒ2が（ＣＨ2）4ＮＨＲ9であり、
Ｒ3がＣＨ3であり、
Ｒ5がＮＨ2であり、且つ
Ｒ9がＣ20−Ｃ28アシルである、
請求項１８に記載のプロドラッグ。
【請求項２１】
Ｒ2が、（ＣＨ2）4ＮＨＣＯ（ＣＨ2）16ＣＨ3及び（ＣＨ2）4ＮＨＣＯ（ＣＨ2）20ＣＨ3からなる群から選択される、請求項１８又は２０に記載のプロドラッグ。
【請求項２２】
Ａ−Ｂが、（Ｃ2−Ｃ4アルキル）ＮＨ2側鎖を含むＱの残基に連結している、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項２３】
Ａ−Ｂが、リシン残基であるＱの残基に連結している、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項２４】
ＡがＤアミノ酸である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項２５】
グルカゴンスーパーファミリーペプチドがグルカゴン関連ペプチドである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項２６】
Ｑが、配列番号７０１のアミノ酸１２〜２９に対応するアミノ酸のアルファヘリックス立体配置を保持する天然グルカゴン（配列番号７０１）と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項２７】
Ｑが、１〜３個のアミノ酸改変を有するアミノ酸配列：
Ｘ１−Ｘ２−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｚ（配列番号８３９）
を含み、
Ｘ１及び／又はＸ２が、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する、非天然（配列番号７０１に対する）アミノ酸であり、
Ｚが、−ＣＯＯＨ、−Ａｓｎ−ＣＯＯＨ、Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨ、及びＹ−ＣＯＯＨからなる群から選択され、Ｙが、１〜２個のアミノ酸であり、
（１）ラクタム架橋が、ｉ位のアミノ酸とｉ＋４位のアミノ酸の側鎖を接続し、ｉが、１２、１６、２０、若しくは２４であり、又は（２）グルカゴンペプチドの１６、２０、２１、及び２４位のアミノ酸のうちの１、２、３個、又は全部が、α，α−二置換アミノ酸で置換されており、且つ
Ｑがグルカゴンアゴニスト活性を示す、
請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項２８】
Ｑが配列番号７０１のアミノ酸配列を含み、且つ、以下、
２８位のＡｓｎの、荷電アミノ酸との置換、
２８位のＡｓｎの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、及びホモシステイン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸との置換、
２８位での、Ａｓｎ、Ａｓｐ、又はＧｌｕとの置換、
２８位での、Ａｓｐとの置換、
２８位での、Ｇｌｕとの置換、
２９位のＴｈｒの、荷電アミノ酸との置換、
２９位のＴｈｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、及びホモシステイン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸との置換、
２９位での、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、又はＬｙｓとの置換、
２９位での、Ｇｌｕとの置換、
２９位の後への、１〜３個の荷電アミノ酸の挿入、
２９位の後への、Ｇｌｕ又はＬｙｓの挿入、
２９位の後への、Ｇｌｙ−Ｌｙｓ若しくはＬｙｓ−Ｌｙｓの挿入；又は
これらの組合せ
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸改変、並びに
グループＡ若しくはグループＢ、又はこれらの組合せから選択される少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、
グループＡは、１５位のＡｓｐの、Ｇｌｕとの置換、及び１６位のＳｅｒの、Ｔｈｒ又はＡＩＢとの置換からなる群から選択されるアミノ酸改変であり、
グループＢは、以下、
１位のＨｉｓの、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する非天然アミノ酸との置換、
２位のＳｅｒの、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する非天然アミノ酸との置換、
１０位のＴｙｒの、Ｐｈｅ又はＶａｌとの置換、
１２位のＬｙｓの、Ａｒｇとの置換、
２０位のＧｌｎの、Ａｌａ又はＡＩＢとの置換、
２１位のＡｓｐの、Ｇｌｕとの置換、
２４位のＧｌｎの、Ａｌａ又はＡＩＢとの置換、
２７位のＭｅｔの、Ｌｅｕ又はＮｌｅとの置換、
２７〜２９位のアミノ酸の欠失、
２８〜２９位のアミノ酸の欠失、
２９位のアミノ酸の欠失、又は
これらの組合せ
からなる群から選択されるアミノ酸改変であり、且つ
Ｑがグルカゴンアゴニスト活性を示す、
請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項２９】
Ｑが、以下の改変を有する配列番号７０１のグルカゴン関連ペプチドを含み、
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する、１位のアミノ酸改変、
（ｂ）（１）ｉ位とｉ＋４位のアミノ酸側鎖間の、若しくはｊ位とｊ＋３位のアミノ酸側鎖間のラクタム架橋（ここで、ｉは、１２、１３、１６、１７、２０、若しくは２４であり、ｊは、１７である）、又は（２）類似体の１６、２０、２１、及び２４位のアミノ酸のうちの１、２、３個、若しくは全部が、α，α−二置換アミノ酸と置換されており、
（ｃ）２７、２８、及び２９位のうちの１、２個、又は全部のアミノ酸改変、並びに
（ｄ）１〜６個のさらなるアミノ酸改変
ＧＩＰ受容体活性化に関する類似体のＥＣ５０が約１０ｎＭ以下である、
請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項３０】
Ｑが配列番号５５の配列又は配列番号５５の類似体を含み、前記類似体が、１、２、３、５、７、１０、１１、１３、１４、１７、１８、１９、２１、２４、２７、２８、及び２９位から選択される１〜３個のアミノ酸改変により配列番号５５と異なっており、前記グルカゴンペプチドが、ＧＬＰ−１受容体において天然ＧＬＰ−１の少なくとも２０％の活性を示す、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項３１】
Ｑが、１６、２０、２１、及び／又は２４位での、ＡＩＢとの１つ以上のアミノ酸置換を含む１０個以下のアミノ酸改変並びにジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性の低減をもたらす１位及び／又は２位でのアミノ酸改変により配列番号７０１と異なっているアミノ酸を含み、前記グルカゴンペプチドが、ＧＬＰ−１受容体において天然ＧＬＰ−１の少なくとも２０％の活性を示す、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項３２】
Ｑが配列番号１３４２の配列又はそのオキシ誘導体を含み、Ｑがグルカゴンアンタゴニスト活性を示す、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項３３】
Ｑが、配列番号７０１のＮ末端からの２〜５個のアミノ酸残基の欠失、及び配列番号７０１の９位のアスパラギン酸残基の、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、システインのスルホン酸誘導体、又は以下の構造を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体との置換により改変されている天然グルカゴンのアミノ酸配列を含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【化２】
2016521253.tif 000075
（式中、
Ｘ5は、Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ2−Ｃ4アルケニル、又はＣ2−Ｃ4アルキニルであり、Ｑはグルカゴンアンタゴニスト活性を示す）
【請求項３４】
ＱがＡ−Ｂ−Ｃの一般構造を含み、式中、Ａは以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群から選択され、
（ｉ）フェニル酪酸（ＰＬＡ）、
（ｉｉ）ＰＬＡのオキシ誘導体、
（ｉｉｉ）ぺプチドの連続する２つのアミノ酸がエステル結合又はエーテル結合により連結されている、２〜６個のアミノ酸のペプチド、
Ｂは、配列番号７０１のアミノ酸ｉ〜２６を表し、ｉは３、４、５、６、又は７であり、任意に以下の（ｉｖ）〜（ｉｘ）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸改変を含んでもよく、
（ｉｖ）９位（配列番号７０１のアミノ酸ナンバリングによる）のＡｓｐが、Ｇｌｕ、Ｃｙｓのスルホン酸誘導体、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、又は以下の構造を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体と置換されている、
【化３】
2016521253.tif 000076
（式中、Ｘ5は、Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ2−Ｃ4アルケニル、又はＣ2−Ｃ4アルキニルである）
（ｖ）１０、２０、及び２４位（配列番号７０１のアミノ酸ナンバリングによる）の１つ又は２つのアミノ酸の、エステル、エーテル、チオエーテル、アミド、又はアルキルアミン連結によりアシル基又はアルキル基に共有結合しているアミノ酸との置換、
（ｖｉ）１６、１７、２０、２１、及び２４位（配列番号７０１のアミノ酸ナンバリングによる）の１つ又は２つのアミノ酸の、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン、ホモシステイン、及びアセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）からなる群から選択されるアミノ酸であって、前記群のアミノ酸が親水性部分に共有結合しているアミノ酸との置換、
（ｖｉｉ）１５位（配列番号７０１のナンバリングによる）のＡｓｐが、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、及びホモシステイン酸と置換されている、
（ｖｉｉｉ）１６位（配列番号７０１のナンバリングによる）のＳｅｒが、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、及びホモシステイン酸と置換されている、
（ｉｘ）配列番号７０１のアミノ酸ナンバリングによる１６、２０、２１、及び２４位のうちの１つ以上での、ＡＩＢとの置換、
Ｃは、以下の（ｘ）〜（ｘｉｖ）からなる群から選択され、
（ｘ）Ｘ、
（ｘｉ）Ｘ−Ｙ、
（ｘｉｉ）Ｘ−Ｙ−Ｚ、及び
（ｘｉｉｉ）Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１０
（式中、ＸはＭｅｔ、Ｌｅｕ、又はＮｌｅであり、ＹはＡｓｎ又は荷電アミノ酸であり、ＺはＴｈｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）、ホモシステイン、アセチルフェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）、又は荷電アミノ酸であり、Ｒ１０は、配列番号１３１９〜１３２１及び１３５３からなる群から選択される）、並びに
（ｘｉｖ）Ｃ末端カルボキシレートがアミドで置き換えられている（ｘ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれか
Ｑがグルカゴンアンタゴニスト活性を示す、
請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項３５】
Ｑが、配列番号１４５１の配列、又はオキシ誘導体を含み、配列番号１４５１の４位及び７位、７位及び１１位、１１位及び１５位、１５位及び１９位、又は１９位及び２３位のアミノ酸が、ラクタム架橋により連結され、Ｑが、グルカゴンアンタゴニスト活性及びＧＬＰ−１アゴニスト活性を示す、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項３６】
Ｑが、（１）分子間架橋、若しくはアルファ，アルファ−二置換アミノ酸、若しくは１６位（配列番号７０１のナンバリングによる）の酸性アミノ酸、又はこれらの組合せ、（２）Ｃ末端カルボキシレートの代わりにＣ末端アミド又はエステル、及び（３）Ａ−Ｂ−Ｃの一般構造を含むペプチドを含み、
Ａは、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群から選択され、
（ｉ）ＰＬＡ、
（ｉｉ）ＰＬＡのオキシ誘導体、及び
（ｉｉｉ）ペプチドの連続する２つのアミノ酸がエステル結合又はエーテル結合により連結されている２〜６個のアミノ酸のペプチド
Ｂは、配列番号７０１のアミノ酸ｐ〜２６を表し、ｐは、３、４、５、６、又は７であり、任意に以下の（ｉｖ）〜（ｘ）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸改変を含んでもよく、
（ｉｖ）９位（配列番号７０１のアミノ酸ナンバリングによる）のＡｓｐが、Ｇｌｕ、Ｃｙｓのスルホン酸誘導体、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、又は以下の構造を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体と置換されており、
【化４】
2016521253.tif 000077
（式中、
Ｘ5は、Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ2−Ｃ4アルケニル、又はＣ2−Ｃ4アルキニルである）
（ｖ）１０、２０、及び２４位（配列番号７０１のアミノ酸ナンバリングによる）の１又は２個のアミノ酸の、エステル、エーテル、チオエーテル、アミド、又はアルキルアミン連結によりアシル基又はアルキル基に共有結合しているアミノ酸との置換、
（ｖｉ）１６、１７、２０、２１、及び２４位（配列番号７０１のアミノ酸ナンバリングによる）の１又は２個のアミノ酸の、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン、ホモシステイン、及びアセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）からなる群から選択されるアミノ酸であって、前記群のアミノ酸が親水性部分に共有結合しているアミノ酸との置換、
（ｖｉｉ）１５位（配列番号７０１のナンバリングによる）のＡｓｐが、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸と置換されている、
（ｖｉｉｉ）１６位（配列番号７０１のナンバリングによる）のＳｅｒが、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、及びホモシステイン酸と置換されている、
（ｉｘ）１７位のＡｒｇがＧｌｎで置き換えられ、１８位のＡｒｇがＡｌａで置き換えられ、２１位のＡｓｐがＧｌｕで置き換えられ、２３位のＶａｌがＩｌｅで置き換えられ、且つ２４位のＧｌｎがＡｌａで置き換えられている（配列番号７０１のアミノ酸ナンバリングによる）、
（ｘ）１６位のＳｅｒがＧｌｕで置き換えられ、２０位のＧｌｎがＧｌｕで置き換えられ、又は２４位のＧｌｎがＧｌｕで置き換えられている（配列番号７０１のアミノ酸ナンバリングによる）、
Ｃは、以下の（ｖｉｉ）〜（ｘ）からなる群から選択され、
（ｖｉｉ）Ｘ、
（ｖｉｉｉ）Ｘ−Ｙ、
（ｉｘ）Ｘ−Ｙ−Ｚ、
（ｘ）Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１０、
Ｘは、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、又はＮｌｅであり、Ｙは、Ａｓｎ、又は荷電アミノ酸であり、Ｚは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）、ホモシステイン、アセチルフェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）、又は荷電アミノ酸であり、Ｒ１０は、配列番号１４２１、１４２６、１４２７、及び１４５０からなる群から選択され、
Ｑが、グルカゴンアンタゴニスト活性、及びＧＬＰ−１アゴニスト活性を示す、
請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項３７】
Ｑが、配列番号１〜５６４、５６６〜５７０、５７３〜５７５、５７７、５７９〜５８０、５８５〜６１２、６１６、６１８〜６３２、６３４〜６４２、６４７、６５７〜６８４、７０１〜７３２、８０１〜８７８、８８３〜９１９、１００１〜１２６２、１３０１〜１３７１、１４０１〜１５１８、１７０１〜１７０８、１７１０、１７１１、１７３１〜１７３４、１７３８、１７４０、１７４１、１７４５、１７４７〜１７７６、及び３３２５〜３３２８からなる群から選択される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項３８】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載のプロドラッグ、及び薬学的に許容される担体を含む、無菌の医薬組成物。
【請求項３９】
有効量の請求項３８に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、高血糖又は糖尿病を処置する方法。
【請求項４０】
有効量の請求項３８に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、食欲を抑制し、体重増加を低減し、又は体重減少を誘発する方法。
【請求項４１】
第２の治療薬を投与する工程をさらに含む、請求項３９〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
第２の治療薬が、グルカゴン関連ペプチド又は第２のプロドラッグである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
第２の治療薬が、インスリン、レプチン、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、膵臓ペプチド（ＰＰ）、繊維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）、Ｙ２Ｙ４受容体アゴニスト、スルホニル尿素、トルブタミド（Ｏｒｉｎａｓｅ）、アセトヘキサミド（Ｄｙｍｅｌｏｒ）、トラザミド（Ｔｏｌｉｎａｓｅ）、クロルプロパミド（Ｄｉａｂｉｎｅｓｅ）、グリピジド（Ｇｌｕｃｏｔｒｏｌ）、グリブリド（Ｄｉａｂｅｔａ、Ｍｉｃｒｏｎａｓｅ、Ｇｌｙｎａｓｅ）、グリメピリド（Ａｍａｒｙｌ）、グリクラジド（Ｄｉａｍｉｃｒｏｎ）、メグリチニド、レパグリニド（Ｐｒａｎｄｉｎ）、ナテグリニド（Ｓｔａｒｌｉｘ）、ビグアナイド、メトホルミン（Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ）、フェンホルミン、チアゾリジンジオン、ロシグリタゾン（Ａｖａｎｄｉａ）、ピオグリタゾン（Ａｃｔｏｓ）、トログリタゾン（Ｒｅｚｕｌｉｎ）、ＰＰＡＲγインヒビター、炭水化物の消化を阻害するアルファグルコシダーゼインヒビター、ミグリトール（Ｇｌｙｓｅｔ）、アカルボース（Ｐｒｅｃｏｓｅ／Ｇｌｕｃｏｂａｙ）、エクセナチド（Ｂｙｅｔｔａ）、プラムリンチド、ジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）インヒビター、ビルダグリプチン、シタグリプチン、ＳＧＬＴ（ナトリウム依存性グルコース輸送体１）インヒビター、グルコキナーゼアクチベーター（ＧＫＡ）、グルカゴン受容体アンタゴニスト（ＧＲＡ）、又はＦＢＰアーゼ（フルクトース１，６−ビスホスファターゼ）インヒビターである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
第２の治療薬が、フェンテルミン、ジエチルプロピオン（Ｔｅｎｕａｔｅ（登録商標））、フェンジメトラジン（Ｐｒｅｌｕ−２（登録商標）、Ｂｏｎｔｒｉｌ（登録商標））、ベンズフェタミン（Ｄｉｄｒｅｘ（登録商標））、シブトラミン（Ｍｅｒｉｄｉａ（登録商標）、Ｒｅｄｕｃｔｉｌ（登録商標））、リモナバント（Ａｃｏｍｐｌｉａ（登録商標））、オキシントモジュリン、フルオキセチン塩酸塩（Ｐｒｏｚａｃ）、Ｑｎｅｘａ（トピラメート及びフェンテルミン）、Ｅｘｃａｌｉａ（ブプロピオン及びゾニサミド）、Ｃｏｎｔｒａｖｅ（ブプロピオン及びナルトレキソン）、ＸＥＮＩＣＡＬ（オーリスタット）、セチリスタット、又はＧＴ３８９−２５５である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
配列番号３２７２〜３２９２、３２９８〜３３００、３３０５〜３３１６、及び３３２９〜３３３７のいずれか１つを含むペプチドプロドラッグ。
【請求項４６】
配列番号３２７２〜３２９２、３２９８〜３３００、３３０５〜３３１６、及び３３２９〜３３３７のいずれか１つからなる、請求項４５に記載のペプチドプロドラッグ。
【請求項４７】
高血糖又は糖尿病の処置において使用するための、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項４８】
高血糖又は糖尿病を処置するための医薬を製造するための、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のプロドラッグの使用。
【請求項４９】
食欲の抑制、体重増加の低減、又は体重減少の誘発において使用するための、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項５０】
食欲の抑制、体重増加の低減、又は体重減少の誘発のための医薬を製造するための、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のプロドラッグの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全文が参照によって援用される、２０１３年３月１５日出願の米国仮特許出願第６１／７９２，４５９号の優先権を主張するものである。
電子的に提出された資料の参照による援用
本明細書と同時に提出し、以下の通り識別される、コンピュータ可読のヌクレオチド／アミノ酸の配列リストの全文が参照によって援用される：２０１４年３月１４日作成のファイル名「２２９１９９＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ，」の１６９０５４１バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル１個。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドベースの薬物は、作用の持続時間が比較的短く、治療指数が可変である、極めて有効な医薬である。本開示は、プロドラッグ誘導体が持続性作用を表す、ペプチドベースのプロドラッグに対するものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
親ペプチドまたはポリペプチドに比べて、血清中長時間の半減期を表し、ｉｎ  ｖｉｖｏで持続性作用を表す、生理活性ペプチド（またはポリペプチド）のプロドラッグ誘導体を提供する。一部の実施形態では、ペプチドは、グルカゴン、エキセンジン−４、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、ＧＩＰ、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド２７（ＰＡＣＡＰ−２７）、ペプチドヒスチジンメチオニン（ＰＨＭ）、オキシントモジュリン、セクレチン、オステオカルシン、成長ホルモン放出ホルモン、ならびに類似体、誘導体、およびコンジュゲートからなる群から選択される。プロドラッグ誘導体は、（ａ）アミド連結によって生理活性ポリペプチドに共有結合により連結している、自己切断型ジペプチドプロドラッグエレメント、および（ｂ）好ましくは炭素の長さが少なくとも１６、１８、または２０個であり、ジペプチドプロドラッグエレメントに連結している、脂肪酸、コール酸、または胆汁酸のステロイド部分を含む、アシル基またはアルキル基を含む。ジペプチドは、生理活性ポリペプチドが対応する受容体または補助因子と相互作用をする能力を妨害する位置で、生理活性ポリペプチドに共有結合しているのが好ましい。生理学的条件下、および酵素活性の非存在下で引き続きジペプチドを自己切断および除去することにより、ポリペプチドに完全な活性が回復する。
本開示は、以下の構造を含むプロドラッグを提供する。
Ａ−Ｂ−Ｑ
［式中、Ｑは、グルカゴンスーパーファミリーペプチド、または他の生理活性ペプチドもしくはポリペプチドであり、
Ａは、炭素の長さが少なくとも１６個の（例えば、少なくともＣ１６、Ｃ１８、もしくはＣ２０、またはＣ１６−Ｃ３０、もしくはＣ２０−Ｃ２８の長さの範囲）、アシル基またはアルキル基（脂肪酸、コール酸、もしくは胆汁酸のステロイド部分を含む）に共有結合により連結している、アミノ酸であり、Ｄアミノ酸であってもよい、
Ｂは、Ａ−Ｂと（Ｃ1−Ｃ8アルキル）ＮＨ2側鎖を含むＱの残基との間のアミド結合の形成を介してＱに連結しているＮ−アルキル化アミノ酸である］
【０００４】
一部の実施形態では、アミノ酸ＢのＮアルキル化基はＣ1−Ｃ18アルキルであり、一部の実施形態では、Ｃ1−Ｃ6アルキルである。
この構造のプロドラッグは、生理学的条件下、リン酸緩衝食塩水中または血清中のいずれかで、ＱからのＡ−Ｂの、少なくとも約３日、少なくとも約５日、または３〜１０日、または５〜１０日、または３〜７日、または５〜８日の長時間の切断半減期を表し得る。本明細書のデータは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのこの長時間の半減期は、ｉｎ  ｖｉｖｏの長時間の半減期に相関することを示すものである。
【０００５】
よって、本開示は、例えば、１週間に２回、または好ましくは毎週１回、または２週ごとに１回の投与を伴う、本開示のプロドラッグを投与する方法も提供する。このようなプロドラッグは、非経口的に、例えば、静脈内、皮下、皮内、または肺内に投与するのが好ましい。
【０００６】
本開示の一態様では、以下の構造を含むプロドラッグを提供する。
Ａ−Ｂ−Ｑ
［式中、Ｑは、グルカゴンスーパーファミリーペプチドであり、
Ａは、Ｃ16−Ｃ30アシル基またはＣ16−Ｃ30アルキル基に共有結合により連結しているアミノ酸であり、Ｄアミノ酸であってもよい、
Ｂは、Ａ−Ｂと（Ｃ1−Ｃ8アルキル）ＮＨ2側鎖を含むＱの残基との間のアミド結合を介してＱに連結しているＮ−アルキル化アミノ酸である］
【０００７】
一部の、またはあらゆる実施形態では、生理学的条件下、血清中ＱからＡ−Ｂの切断半減期は、少なくとも約３日、少なくとも約５日、または約３日から約１０日、または約５日から約１０日、または約３日から約７日、または約５日から約８日である。
一部の、またはあらゆる実施形態では、（Ｃ1−Ｃ8アルキル）ＮＨ2側鎖を含むＱの残基は、天然グルカゴン（配列番号７０１）の１、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２８、もしくは２９位に対応する位置に、またはＱのＣ末端の最後の５個のアミノ酸の１つに位置する。
【０００８】
一部の、またはあらゆる実施形態では、Ａ−Ｂは以下の構造を含む。
【化１】
2016521253.tif 000003
Ｉ
（式中、
Ｒ1およびＲ2は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ18アルキル、Ｃ2−Ｃ18アルケニル、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＯＲ9、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＳＲ9、（Ｃ2−Ｃ3アルキル）ＳＣＨ3、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＮＨＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ2+）ＮＨ2、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ2−Ｃ5複素環）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ9ヘテロアリール）、およびＣ1−Ｃ12アルキル（Ｗ1）Ｃ1−Ｃ12アルキルからなる群から独立に選択され、Ｗ1は、Ｎ、ＳおよびＯからなる群から選択されるヘテロ原子であり、またはＲ1およびＲ2は、これらが結合している原子と一緒になってＣ3−Ｃ12シクロアルキルもしくはアリールを形成し、
Ｒ4およびＲ8は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ18アルキル、Ｃ2−Ｃ18アルケニル、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＯＨ、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＳＨ、（Ｃ2−Ｃ3アルキル）ＳＣＨ3、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ2+）ＮＨ2、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ2−Ｃ5複素環）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ9ヘテロアリール）、およびＣ1−Ｃ12アルキル（Ｗ1）Ｃ1−Ｃ12アルキルからなる群から独立に選択され、Ｗ1は、Ｎ、ＳおよびＯからなる群から選択されるヘテロ原子であり、またはＲ4およびＲ8は、これらが結合している原子と一緒になってＣ3−Ｃ6シクロアルキルを形成し、
Ｒ3はＣ1−Ｃ18アルキルであり、またはＲ4およびＲ3は、これらが結合している原子と一緒になって４、５、もしくは６員の複素環を形成し、
Ｒ5は、ＮＨＲ6またはＮＨＲ9であり、
Ｒ6はＨ、Ｃ1−Ｃ8アルキルであり、またはＲ6およびＲ2は、これらが結合している原子と一緒になって４、５、もしくは６員の複素環を形成し、
Ｒ7は、Ｈ、ＯＲ9、Ｃ1−Ｃ18アルキル、Ｃ2−Ｃ18アルケニル、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＣＯＮＨＲ9、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＲ9、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＮＨＲ9、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＯＲ9、およびハロからなる群から選択され、
Ｒ9は、Ｈ、Ｃ16−Ｃ30アシル、およびＣ16−Ｃ30アルキルからなる群から選択される）
【０００９】
一部の、またはあらゆる実施形態では、Ｒ1およびＲ8は独立にＨまたはＣ1−Ｃ8アルキルである。
一部の、またはあらゆる実施形態では、Ｒ4は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ8アルキル、Ｃ2−Ｃ8アルケニル、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＯＨ、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＳＨ、（Ｃ2−Ｃ3アルキル）ＳＣＨ3、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ2+）ＮＨ2、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ2−Ｃ5複素環）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ9ヘテロアリール）、およびＣ1−Ｃ12アルキル（Ｗ1）Ｃ1−Ｃ12アルキルからなる群から選択され、Ｗ1は、Ｎ、ＳおよびＯからなる群から選択されるヘテロ原子であり、またはＲ4およびＲ8は、これらが結合している原子と一緒になってＣ3−Ｃ6シクロアルキルを形成する。
一部の、またはあらゆる実施形態では、Ｒ3はＣ1−Ｃ8アルキルであり、またはＲ4およびＲ3は、これらが結合している原子と一緒になって４、５、もしくは６員の複素環を形成する。
一部の、またはあらゆる実施形態では、Ｒ3はＣ1−Ｃ8アルキルである。
【００１０】
一部の、またはあらゆる実施形態では、Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ8アルキル、Ｃ2−Ｃ8アルケニル、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＯＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＳＲ9、（Ｃ2−Ｃ3アルキル）ＳＣＨ3、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＮＨＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ2+）ＮＨ2、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ2−Ｃ5複素環）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ9ヘテロアリール）、およびＣ1−Ｃ12アルキル（Ｗ1）Ｃ1−Ｃ12アルキルからなる群から選択され、Ｗ1が、Ｎ、ＳおよびＯからなる群から選択されるヘテロ原子であり、またはＲ1およびＲ2は、これらが結合している原子と一緒になってＣ3−Ｃ12シクロアルキルもしくはアリールを形成する。
【００１１】
一部の、またはあらゆる実施形態では、Ｒ2は、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＯＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＳＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＮＨＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＲ9、および（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7からなる群から選択され、Ｒ7は、ＯＲ9、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＣＯＮＨＲ9、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＲ9、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＮＨＲ9、および（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＯＲ9からなる群から選択される。
【００１２】
一部の、またはあらゆる実施形態では、Ｒ5はＮＨＲ6である。
一部の、またはあらゆる実施形態では、Ｒ1、Ｒ4、およびＲ8は、ＨおよびＣ1−Ｃ18アルキルからなる群から独立に選択され、またはＲ4およびＲ8は、これらが結合している原子と一緒になってＣ3−Ｃ6シクロアルキルを形成し、Ｒ2は、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＯＲ9、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＳＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＮＨＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＲ9、および（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7からなる群から選択され、Ｒ6はＨまたはＣ1−Ｃ8アルキルであり、Ｒ7は、ＯＲ9、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＣＯＮＨＲ9、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＲ9、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＮＨＲ9、および（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＯＲ9からなる群から選択される。
【００１３】
一部の、またはあらゆる実施形態では、Ｒ1、Ｒ4、およびＲ8は、ＨおよびＣ1−Ｃ8アルキルからなる群から独立に選択され、またはＲ4およびＲ8は、これらが結合している原子と一緒になってＣ3−Ｃ6シクロアルキルを形成し、Ｒ2は、（Ｃ1−Ｃ8アルキル）ＯＲ9、（Ｃ1−Ｃ8アルキル）ＳＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＮＨＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＲ9、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＲ9、および（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7からなる群から選択され、Ｒ3はＣ1−Ｃ8アルキルであり、またはＲ4およびＲ3は、これらが結合している原子と一緒になって、４、５、もしくは６員の複素環を形成する。
【００１４】
一部の、またはあらゆる実施形態では、Ｒ2は、（Ｃ1−Ｃ8アルキル）ＯＲ9、（Ｃ1−Ｃ8アルキル）ＳＲ9、および（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＲ9からなる群から選択され、Ｒ3はＣ1−Ｃ8アルキルであり、またはＲ4およびＲ3は、これらが結合している原子と一緒になって４、５、もしくは６員の複素環を形成する。
一部の、またはあらゆる実施形態では、Ｒ2は（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＲ9であり、Ｒ3はＣ1−Ｃ8アルキルであり、またはＲ4およびＲ3は、これらが結合している原子と一緒になって４、５、もしくは６員の複素環を形成する。
一部の、またはあらゆる実施形態では、Ｒ1、Ｒ4、およびＲ8はＨであり、Ｒ3はＣ1−Ｃ8アルキルである。
一部の、またはあらゆる実施形態では、Ｒ5はＮＨＲ6であり、Ｒ9は、Ｃ16−Ｃ30アシルおよびＣ16−Ｃ30アルキルからなる群から選択される。
一部の、またはあらゆる実施形態では、Ｒ1、Ｒ4、およびＲ8はＨであり、Ｒ2は（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＲ9であり、Ｒ3はＣ1−Ｃ8アルキルであり、Ｒ5はＮＨＲ6であり、Ｒ6はＨまたはＣ1−Ｃ8アルキルであり、Ｒ9はＣ16−Ｃ30アシルおよびＣ16−Ｃ30アルキルからなる群から選択される。
【００１５】
一部の、またはあらゆる実施形態では、Ｒ9は、Ｃ20−Ｃ28アシルおよびＣ20−Ｃ28アルキルからなる群から選択される。
一部の、またはあらゆる実施形態では、Ｒ2は（ＣＨ2）4ＮＨＲ9であり、Ｒ3はＣＨ3であり、Ｒ5はＮＨ2であり、Ｒ9はＣ20−Ｃ28アシルである。
一部の、またはあらゆる実施形態では、Ｒ2は、（ＣＨ2）4ＮＨＣＯ（ＣＨ2）16ＣＨ3および（ＣＨ2）4ＮＨＣＯ（ＣＨ2）20ＣＨ3からなる群から選択される。
一部の、またはあらゆる実施形態では、Ａ−Ｂは、（Ｃ2−Ｃ4アルキル）ＮＨ2側鎖を含むＱの残基に連結している。
一部の、またはあらゆる実施形態では、Ａ−Ｂは、リジン残基であるＱの残基に連結している。
一部の、またはあらゆる実施形態では、ＡはＤアミノ酸である。
【００１６】
一部の、またはあらゆる実施形態では、Ｑはグルカゴンスーパーファミリーペプチドである。例えば、Ｑは、グルカゴン関連ペプチド、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ、配列番号７１９）、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ、配列番号７２０）、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド２７（ＰＡＣＡＰ−２７、配列番号７２１）、ペプチドヒスチジンメチオニン（ＰＨＭ、配列番号７２２）、もしくはセクレチン（配列番号７２３）、ならびに／またはこれらの類似体、誘導体、およびコンジュゲートである。一部の実施形態では、類似体は、天然のペプチドの対応する配列と少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｑはグルカゴン関連ペプチドとして、天然のペプチドの長さにわたって（またはグルカゴンに対応する位置にわたって、例えば、図１０を参照されたい）、天然のグルカゴン、天然のオキシントモジュリン、天然のエキセンジン−４、天然の（７〜３７）ＧＬＰ−１、天然のＧＬＰ−２、または天然のＧＩＰの対応する配列と少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、グルカゴンスーパーファミリーペプチド（Ｑ）は、アミノ酸改変を最高１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個有する、天然のグルカゴン、天然のエキセンジン−４、天然の（７〜３７）ＧＬＰ−１、天然のＧＬＰ−２、天然のＧＨＲＨ、天然のＶＩＰ、天然のＰＡＣＡＰ−２７、天然のＰＨＭ、天然のオキシントモジュリン、天然のセクレチン、または天然のＧＩＰのアミノ酸配列を含む。なおさらなる実施形態では、Ｑは、２つ以上の天然グルカゴン関連ペプチド配列のキメラであるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｑは、配列番号７０１のアミノ酸１２〜２９に対応するアミノ酸のアルファヘリックス立体配置を保持する天然グルカゴン（配列番号７０１）に少なくとも約５０％同一のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
グルカゴンスーパーファミリーペプチドは、それだけには限定されないが、Ｎ末端アミノ酸内のホモロジーおよび／またはＣ末端部分内のアルファヘリックス構造を含めた、共通の構造上の特徴を有し得る。Ｃ末端は概ね受容体の結合において機能し、Ｎ末端は概ね受容体のシグナリングにおいて機能すると考えられている。Ｈｉｓ１、Ｇｌｙ４、Ｐｈｅ６、Ｐｈｅ２２、Ｖａｌ２３、Ｔｒｐ２５、およびＬｅｕ２６など、Ｎ末端部分およびＣ末端部分における数個のアミノ酸はグルカゴンスーパーファミリーのメンバーの中でも高度に保存されており、これらの位置のアミノ酸は、アミノ酸側鎖において同一性、保存的置換、または類似性を示す。
【００１８】
Ｑは、当技術分野で知られているあらゆるグルカゴン関連ペプチドなどを含めた、当技術分野で知られているグルカゴンスーパーファミリーペプチドのいずれかであってよく、そのいくつかは非限定的な例によって本明細書に開示するものである。多様なＧＬＰ−１類似体が、当技術分野では知られており、本発明によるグルカゴン関連ペプチドであり、例えば、ＧＬＰ−１類似体または誘導体の配列または式の開示の各々に対してその全文が参照によって本明細書に援用される、ＷＯ２００８０２３０５０、ＷＯ２００７０３０５１９、ＷＯ２００５０５８９５４、ＷＯ２００３０１１８９２、ＷＯ２００７０４６８３４、ＷＯ２００６１３４３４０、ＷＯ２００６１２４５２９、ＷＯ２００４０２２００４、ＷＯ２００３０１８５１６、ＷＯ２００７１２４４６１を参照されたい。一部の、またはあらゆる実施形態では、Ｑは、本明細書に詳述するクラス１、２、３、４、５、または６グルカゴン関連ペプチドである。本明細書に記載するあらゆる実施形態では、Ｑは、配列番号１〜６８４、７０１〜７４２、８０１〜９１９、１００１〜１２６２、１３０１〜１３７１、１４０１〜１５１８、１７０１〜１７７６、１８０１〜１９０８、２００１〜２５６５、および３００１〜３２６２、３３２５〜３３２８のいずれか、またはこれらの配列番号のいずれか１つに対してアミノ酸改変を最高１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個有するこれらの類似体である。
【００１９】
Ａ−Ｂなどのジペプチドプロドラッグは、Ｑの活性を妨害するあらゆる位置でＱに連結していてよいが、本明細書に開示する実施形態は、Ａ−Ｂの連結に適する位置の例を説明する。本明細書において、天然グルカゴン配列（配列番号７０１）における位置に言及することにより、位置番号に命名する場合、グルカゴン類似体における、または他のグルカゴンスーパーファミリーペプチドにおける対応する位置は、アラインメントにより決定することができる。例えば、ある種のグルカゴンスーパーファミリーペプチドのアラインメントを示す図６を参照されたい。例えば、天然グルカゴンに基づく２４位は、（７〜３７）ＧＬＰ−１の２４位に相当する。
【００２０】
ある特定の実施形態では、グルカゴンスーパーファミリーペプチドは、それだけには限定されないが、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ2、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号７１０）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＣＯＮＨ2（配列番号７１１）、オキシントモジュリンカルボキシ末端伸長、ＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号７１４）、またはＫＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴＱ（配列番号７１３）を含めた、Ｃ末端またはＣ末端アミノ酸配列を含んでいてよい。グルカゴンスーパーファミリーペプチドに対する、さらなるＣ末端アミノ酸配列を、以下にさらに詳述する。
【００２１】
他の態様では、Ｑは、オステオカルシン（配列番号７０９）、または天然のオステオカルシンに天然のペプチドの長さにわたって少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるアミノ酸配列を含む。Ｑは、天然のオステオカルシンに対して最高１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸改変を有するオステオカルシンの類似体を含んでいてよい。さらに他の態様では、Ｑは、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）（配列番号７１９）、または天然のＧＨＲＨに天然のペプチドの長さにわたって少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるアミノ酸配列を含む。Ｑは、天然のＧＨＲＨに対して最高１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸改変を有するＧＨＲＨの類似体を含んでいてよい。一部の実施形態では、Ｑは、当技術分野において知られているオステオカルシンまたはＧＨＲＨのあらゆる類似体であってよい。
【００２２】
一部の実施形態では、たった１個のプロドラッグ部分がＱに連結している。例えば、このような実施形態では、プロドラッグ部分（Ａ−Ｂ）がＮ末端でＱに連結している場合、Ｑの配列における内部のアミノ酸残基に連結しているプロドラッグ部分（Ａ−Ｂ）は存在せず、逆も同じである。一部の実施形態では、２個または３個のプロドラッグ部分が、例えば、Ｎ末端で、および１つまたは複数の内部の部分で、Ｑに連結している。
本開示は、配列番号３２７２〜３２７５、３２８８〜３２９１、３３０５〜３３１６、３３２９、３３３３、３３３５、３３３６、または３３３７のいずれかを含み、またはこれらからなるペプチドプロドラッグも提供する。本開示は、保存的なアミノ酸置換などのアミノ酸置換を１、２、もしくは３個、アミノ酸欠失を１、２、もしくは３個、ペプチドに対して内部のアミノ酸挿入を１、２、もしくは３個、および／またはＮ末端もしくはＣ末端に対する１〜２１個のアミノ酸付加、好ましくは総合して、親の配列に対して合計最高３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸改変を有する、配列番号３２７２〜３２７５、３２８８〜３２９１、３３０５〜３３１６、３３２９、３３３３、３３３５、３３３６、または３３３７のいずれかの類似体も提供する。
本開示は、配列番号３２７２〜３２９２、３２９８〜３３００、３３０５〜３３１６、３３２９〜３３３７のいずれかを含み、もしくはこれらからなるペプチドプロドラッグ、または親の配列に対して、最高３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の改変を有する、これらの類似体をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明のペプチドの合成を示すスキームである。試薬：（ａ）サルコシン（ｓａｃｒｏｓｉｎｅ）、ＤＥＰＢＴ、ＤＩＥＡ（５ｅｑｕｉｖ）、ＤＭＦ、ｒ．ｔ．、１時間、（ｂ）ＴＦＡ、ｒ．ｔ．、１分、（ｃ）Ｂｏｃ−ｄＬｙｓ（Ｆｍｏｃ）、ＤＥＰＢＴ、ＤＩＥＡ（５ｅｑｕｉｖ）、ＤＭＦ、ｒ．ｔ．、一晩、（ｄ）２０％ピペリジン／ＤＭＦ、ｒ．ｔ．、３０分、（ｅ）ステアリン酸、ＤＥＰＢＴ、ＤＩＥＡ５（ｅｑｕｉｖ）、５０％ＤＭＦ／ＤＣＭ、ｒ．ｔ．、一晩、（ｆ）ＴＦＡ、ｒ．ｔ．、１分、（ｇ）５％アニソール／ＨＦ、０℃、１時間。プロドラッグは、ＰＡＭ樹脂を使用することにより、Ｂｏｃ固相ペプチド方策を用いて合成した。サルコシンを樹脂と結合したペプチド１とカップリングして樹脂と結合した化合物２を作製し、次いで、ＴＦＡで処理し、Ｂｏｃ−ｄＬｙｓ（Ｆｍｏｃ）とカップリングさせて、樹脂と結合した化合物３を得た。最後に、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンで処理し、脂肪酸とカップリングさせて、最終の樹脂と結合したプロドラッグ４を得た。４をＴＦＡで処置してＮ末端のｔ−Ｂｏｃ基を除去した。最後に、樹脂と結合した化合物４を、フッ化水素酸（ＨＦ）により支持体からプロドラッグ５に切断した。
【図２】ペプチドＦ、ペプチドＤ、Ｃ18アシル化ジペプチドプロドラッグ部分を有するペプチドＤ、および１０位にて４−アミノフェニルアラニンと直接連結しているＣ18アシル化リシン残基を有するペプチドＤの１０または５０ｎｍｏｌ／ｋｇの単回用量を腹腔内注射した食餌誘導肥満（ＤＩＯ）マウスにおける体重の変化を示すグラフである。
【図３】図３Ａは、ペプチドＤ、Ｃ18アシル化ジペプチドプロドラッグ部分を有するペプチドＤ、１０位にて４−アミノフェニルアラニンと直接連結しているＣ18アシル化リシン残基を有するペプチドＤ、Ｃ20アシル化ジペプチドプロドラッグ部分を有するペプチドＤ、１０位にて４−アミノフェニルアラニンと直接連結しているＣ20アシル化リシン残基を有するペプチドＤ、Ｃ22アシル化ジペプチドプロドラッグ部分を有するペプチドＤ、および１０位にて４−アミノフェニルアラニンと直接連結しているＣ22アシル化リシン残基を有するペプチドＤの１０ｎｍｏｌ／ｋｇの単回用量を腹腔内注射した食餌誘導肥満（ＤＩＯ）マウスにおける体重の変化を示すグラフである。図３Ｂは、図３Ａのマウスの体重のパーセント変化の合計を示すグラフである。
【図４】図４Ａは、ペプチドＤ、Ｃ22アシル化ジペプチドプロドラッグ部分を有するペプチドＤ、および１０位にて４−アミノフェニルアラニンと直接連結しているＣ22アシル化リシン残基を有するペプチドＤの３または１０ｎｍｏｌ／ｋｇの単回用量を毎日、５日間にわたって腹腔内注射した食餌誘導肥満（ＤＩＯ）マウスにおける体重の変化を示すグラフである。図４Ｂは、図４Ａのマウスの体重のパーセント変化の合計を示すグラフである。
【図５】第０日に４０ｎｍｏｌ／ｋｇの単回用量、第０日および第２日に２０ｎｍｏｌ／ｋｇの単回用量、または第０、１、２および３日に１０ｎｍｏｌ／ｋｇの単回用量のペプチドＤまたはＣ22アシル化ジペプチドプロドラッグ部分を有するペプチドＤを腹腔内注射した食餌誘導肥満（ＤＩＯ）マウスにおける体重の変化を示すグラフである。
【図６】グルカゴンスーパーファミリーペプチドのアラインメントである。本明細書において、位置の番号が天然グルカゴン配列（配列番号７０１）中の位置を参照することにより命名されている場合、グルカゴン類似体または他のグルカゴンスーパーファミリーペプチド中の対応する位置は、アラインメントにより決定できる。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義
本発明を記載し、請求する上で、以下の用語を、以下に記載する定義に従って使用する。
【００２５】
本明細書で使用する「プロドラッグ」の語は、化学的改変を受けた後に完全な薬理学的効果を表すあらゆる化合物と規定する。
【００２６】
本明細書で使用する「アミノ酸」の語は、アミノ官能基およびカルボキシル官能基の両方を含むあらゆる分子を包含し、アミノ基およびカルボキシレート基は同じ炭素（アルファ炭素）に結合している。アルファ炭素は、１または２個のさらなる有機置換基を有してもよい。アミノ酸は、３文字コード、１文字コード、または場合によってはその側鎖の名称によって呼ぶことができる。例えば、アルファ炭素に結合しているシクロヘキサン基を含む非天然のアミノ酸は、「シクロヘキサン」または「シクロヘキシル」と呼ばれる。本開示の目的では、立体化学を特定しないアミノ酸の呼称は、アミノ酸のＬ体もしくはＤ体のいずれか、またはラセミ混合物を包含するものとされる。しかし、アミノ酸をその３文字コードによって呼び、上付き数字を含む場合（すなわち、Ｌｙｓ-1）、このような呼称は天然のＬ体のアミノ酸を特定するものとされ、Ｄ体は３文字コードおよび上付き数字の前に小文字のｄを含めることにより特定される（すなわち、ｄＬｙｓ-1）。
【００２７】
本明細書で使用する「ヒドロキシル酸」の語は、アルファ炭素のアミノ基をヒドロキシル基で置き換えるように改変されているアミノ酸を意味する。
本明細書で使用する「非コードアミノ酸」の語は、以下の２０個のアミノ酸：Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、ＴｙｒのいずれかのＬ−異性体ではない、あらゆるアミノ酸を包含する。
「ジペプチド」は、α−アミノ酸またはα−ヒドロキシル酸の、別のアミノ酸に対する、ペプチド結合を介した連結の結果である。
本明細書で使用する、いかなるさらなる呼称のない「化学的切断」の語は、共有結合による化学結合の破損をもたらす非酵素反応を包含する。
【００２８】
「生理活性ポリペプチド」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで生物学的効果を発揮することができるポリペプチドを意味する。
本明細書で使用する「アシル化されている」アミノ酸は、それを生成する手段に関係なく、天然に存在するアミノ酸に対して非天然であるアシル基を含むアミノ酸である。アシル化されているアミノ酸およびアシル化されているペプチドを生成する例示的な方法は、当技術分野では知られており、アミノ酸をアシル化した後、ペプチドに含め、またはペプチド合成後にペプチドを化学的にアシル化することを含む。
本明細書で使用する「アルキル化されている」アミノ酸は、それを生成する手段に関係なく、天然に存在するアミノ酸に対して非天然であるアルキル基を含むアミノ酸である。アルキル化されているアミノ酸およびアルキル化されているペプチドを生成する例示的な方法は、当技術分野では知られており、アミノ酸をアルキル化した後、ペプチドに含め、またはペプチド合成後にペプチドを化学的にアルキル化することを含む。
【００２９】
本明細書で使用する、ペプチドに対する一般参照（ｇｅｎｅｒａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）は、改変されているアミノ末端およびカルボキシ末端を有するペプチドを包含するものとされる。例えば、標準のアミノ酸を指定するアミノ酸配列は、Ｎ末端およびＣ末端の標準のアミノ酸、ならびにＮ末端の対応するヒドロキシル酸、および／または末端のカルボン酸の代わりにアミド基を含むように改変されているＣ末端の対応するアミノ酸を包含するものとされる。
本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」の語には、リン酸緩衝食塩水溶液、水、油／水もしくは水／油などのエマルジョン、および様々なタイプの湿潤剤など、標準的な製薬上の担体のいずれかが含まれる。この語はまた、米国連邦政府の監督官庁により認可されている、または米国薬局方においてヒトを含めた動物において使用するために列挙されている薬剤のいずれかも包含する。
【００３０】
本明細書で使用する「薬学的に許容される塩」の語は、親化合物の生物学的活性を保持し、生物学的に、または別の方法で望ましくないわけではない化合物の塩を意味する。本明細書に開示する化合物の多くは、アミノ基および／もしくはカルボキシル基、またはこれらに類似する基の存在によって、酸塩および／または塩基塩を形成することができる。
薬学的に許容される塩基付加塩は、無機塩基および有機塩基から調製することができる。無機塩基に由来する塩には、例示のみにより、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、およびマグネシウム塩が含まれる。有機塩基に由来する塩には、それだけには限定されないが、１級、２級、および３級アミンの塩が含まれる。
【００３１】
薬学的に許容される酸付加塩は、無機酸および有機酸から調製することができる。無機酸に由来する塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが含まれる。有機酸に由来する塩には、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などが含まれる。
本明細書で使用する「処置する」の語には、特定の障害もしくは状態の予防、または特定の障害もしくは状態に付随する症状の緩和、および／または前記症状の防止もしくは除去が含まれる。例えば、本明細書で使用する「糖尿病を処置する」の語は、全般的に、血中グルコースレベルを正常レベル付近に維持することを意味し、所与の状況に応じて血中グルコースレベルの上昇または低下を含むことができる。
本明細書で使用する、プロドラッグの「有効」量または「治療有効量」は、非毒性であるが、所望の効果を提供するのに十分なプロドラッグの量を意味する。例えば、所望の一効果は、高血糖の防止または処置である。「有効」である量は、対象ごとに、個体の年齢および全身状態、投与様式などに応じて変動する。よって、正確な「有効量」を特定するのが常に可能とは限らない。しかし、あらゆる個々の症例における適切な「有効」量は、当業者により、ルーチンの実験を使用して決定され得る。
【００３２】
「非経口」の語は、消化管を介さず、皮下、筋肉内、脊髄内、または静脈内など、何らかの他の経路によるものを意味する。
本明細書で使用する「同一性」の語は、２つ以上の配列間の類似性に関する。同一性は、同一の残基の数を、残基の合計数によって除し、成績に１００を乗じてパーセント値を実現することにより測定する。よって、正確に同じ配列の２コピーは同一性１００％であるが、相互に関してアミノ酸の欠失、付加、または置換を有する２つの配列は同一性の度合いが低い。当業者であれば、ＢＬＡＳＴ（ベーシックローカルアラインメント検索ツール、Altschul et al. (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410）などのアルゴリズムを使用するものなどの、いくつかのコンピュータプログラムが、配列同一性の決定に入手可能であることを認識されよう。
【００３３】
「グルカゴン関連ペプチド」の語は、グルカゴン、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、およびＧＩＰ受容体のいずれか１つまたは複数で生物学的活性（アゴニストもしくはアンタゴニストとして）を有し、天然のグルカゴン、天然のオキシントモジュリン、天然のエキセンジン−４、天然のＧＬＰ−１、天然のＧＬＰ−２、または天然のＧＩＰの少なくとも１つと、少なくとも４０％（例えば、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％）の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むペプチドを意味する。別段の記載がなければ、グルカゴン関連ペプチドにおけるアミノ酸位置（例えば、プロドラッグ部分、コンジュゲート部分、親水性ポリマー、アシル化、またはアルキル化の連結に対する）に対するあらゆる言及は、天然グルカゴンのアミノ酸配列（配列番号７０１）に対する位置を意味する。
【００３４】
「グルカゴンスーパーファミリーペプチド」の語は、これらのＮ末端およびＣ末端領域における構造に関連する一群のペプチドを意味する（例えば、Sherwood et al., Endocrine Reviews 21: 619-670 (2000)を参照されたい）。この群のメンバーには、全てのグルカゴン関連ペプチド、および成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ、配列番号７１９）、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ、配列番号７２０）、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド２７（ＰＡＣＡＰ−２７、配列番号７２１）、ペプチドヒスチジンイソロイシン（ＰＨＩ）、ペプチドヒスチジンメチオニン（ＰＨＭ、配列番号７２２）、セクレチン（配列番号７２３）、および天然のペプチドに対して最高１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸改変を有する類似体、誘導体、またはコンジュゲートが含まれる。これらのペプチドは、グルカゴン受容体スーパーファミリーの受容体と相互作用する能力を保持しているの（アゴニストまたはアンタゴニスト）が好ましい。別段の記載がなければ、グルカゴンスーパーファミリーペプチドにおけるアミノ酸位置のあらゆる言及（例えば、プロドラッグ部分、コンジュゲート部分、親水性ポリマー、アシル化、またはアルキル化の連結に対して）は、天然グルカゴンアミノ酸配列（配列番号７０１）に対する位置を意味し、代表的なグルカゴンスーパーファミリーペプチドのアラインメントについては、図１０を参照されたい。
【００３５】
「ＧＬＰ−１アゴニスト」の語は、その開示が参照によって本出願に特に援用される、公開されている２００７年５月１８日公開の国際出願第ＷＯ２００７／０５６３６２号の例１３に記載されているものなどの、確証されているｉｎ  ｖｉｔｒｏのモデルアッセイを使用してｃＡＭＰ生成によって測定して、ＧＬＰ−１受容体活性を刺激する化合物を意味する。
本明細書で使用する「天然のＧＬＰ−１」の語は、ＧＬＰ−１（７〜３６）アミド（配列番号７０４の配列からなる）、ＧＬＰ−１（７〜３７）酸（配列番号７０３の配列からなる）、またはこれら２つの化合物の混合物を指す総称である。本明細書で使用する、いかなるさらなる呼称のない「ＧＬＰ−１」に対する一般参照は、天然のＧＬＰ−１を意味するものとされる。
【００３６】
本明細書で使用する「グルカゴンペプチド」の語は、配列番号７０１の天然のグルカゴンペプチド、および天然のグルカゴン配列に対して１つまたは複数のアミノ酸改変を有する改変されている誘導体を指す総称であり、それだけには限定されないが、アミノ酸１、２、５、７、８、１０、１２、１３、１４、１６、１７、１８、２４、２８、および２９位の置換を含んでもよい。全般的に、数による特定のアミノ酸位置の言及（例えば、２８位）は全て、天然のグルカゴン（配列番号７０１）における位置、またはそのあらゆる類似体における対応するアミノ酸位置のアミノ酸を意味する。例えば、「２８位」と言及すれば、配列番号７０１の最初のアミノ酸が欠失しているグルカゴン類似体に対して対応する２７位を意味する。同様に、「２８位」と言及すれば、配列番号７０１のＮ末端の前にアミノ酸が１つ付加されているグルカゴン類似体に対して対応する２９位を意味する。
【００３７】
本明細書で使用する「ＧＬＰ−１ペプチド」の語は、天然のＧＬＰ−１、および天然のＧＬＰ−１配列に対してアミノ酸改変を１つまたは複数有する改変されている誘導体を指す総称である。
本明細書で使用する、アミノ酸の「改変」は、アミノ酸の置換、付加、または欠失を意味し、ヒトのタンパク質中に共通して見出される２０個のアミノ酸のいずれか、および普通ではない、または天然に存在しないアミノ酸での置換、またはこれらアミノ酸の付加を含む。普通ではないアミノ酸の市販の供給源には、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、ＣｈｅｍＰｅｐ  Ｉｎｃ．（Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）、およびＧｅｎｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）が含まれる。普通ではないアミノ酸は、市販の供給業者から購入し、初めから合成し、または天然に存在するアミノ酸を化学的に改変し、もしくは誘導体化してもよい。アミノ酸の改変には、アミノ酸の、親水性ポリマーなどのコンジュゲート部分への連結、アシル化、アルキル化、および／またはアミノ酸の他の化学的誘導体化が含まれる。
【００３８】
本明細書で使用する、アミノ酸の「置換」は、一アミノ酸残基の異なるアミノ酸残基による置き換えを意味する。
本明細書で使用する「保存的なアミノ酸置換」の語は、本明細書において一アミノ酸の、サイズ、電荷、疎水性、親水性、および／または芳香族性など、同様の性質を有する別の一アミノ酸での置換と規定され、以下の５つの群のうち１つ以内の交換が含まれる：
Ｉ．小型の脂肪族の無極性またはわずかに極性の残基：
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、
ＩＩ．極性の負に荷電している残基、ならびにこれらのアミドおよびエステル：
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ，システイン酸、およびホモシステイン酸：
ＩＩＩ．極性の正に荷電している残基：
Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）
ＩＶ．大型の脂肪族の無極性残基：
Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモシステイン
Ｖ．大型の芳香族残基：
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、アセチルフェニルアラニン
【００３９】
本明細書で使用する「キメラ２」の語は、天然グルカゴンのアミノ酸配列（配列番号７０１）が以下の改変：１７位のＧｌｎ、１８位のＡｌａ、２０位のＬｙｓ、２１位のＧｌｕ、２３位のＩｌｅ、および２４位のＡｌａ、ならびにＣ末端のアミドを含む、グルカゴンペプチドを意味する。
本明細書で使用する「ポリエチレングリコール鎖」または「ＰＥＧ鎖」の総称は、一般式Ｈ（ＯＣＨ2ＣＨ2）kＯＨによって表される分枝鎖または直鎖における、エチレンオキシドおよび水の縮合重合体の混合物を意味し、式中、ｋは少なくとも９である。いかなるさらなるキャラクタリゼーションがない場合、この語は、平均合計分子量が５００〜８００００ダルトンの範囲から選択されるエチレングリコールのポリマーを含むものとされる。「ポリエチレングリコール鎖」または「ＰＥＧ鎖」は、数字の接尾辞と組み合わせて使用して、およその平均分子量を示す。例えば、ＰＥＧ−５０００（５ｋＰＥＧ）は、合計分子量の平均が約５０００ダルトンであるポリエチレングリコール鎖を意味する。
【００４０】
本明細書で使用する「ペグ化」の語および同様の語は、ポリエチレングリコール鎖を化合物に連結することにより、その天然の状態から改変されている化合物を意味する。「ペグ化ポリペプチド」は、ポリペプチドに共有結合しているＰＥＧ鎖を有するポリペプチドである。
本明細書で使用する「リンカー」は、２つの別々の実体を相互に結合する、結合、分子、または分子の群である。リンカーは、２つの実体の最適な間隔を提供し得、または２つの実体が相互に離れているようにする不安定な連結をさらに供給し得る。柔軟な連結には、光切断性基、酸に不安定な部分、塩基に不安定な部分、および酵素切断性基が含まれる。
本明細書で使用する「ダイマー」は、リンカーによって相互に共有結合している２つのサブユニットを含む複合体である。ダイマーの語は、いかなる限定語の存在なしで使用する場合、ホモダイマーおよびヘテロダイマーの両方を包含する。ホモダイマーは同一のサブユニットを２つ含み、ヘテロダイマーは異なるサブユニットを２つ含むが、２つのサブユニットは相互に実質的に類似する。
【００４１】
本明細書で使用する、ｎが１〜６であってよい「Ｃ1−Ｃnアルキル」の語は、１から特定する数までの炭素原子を有する分枝または直鎖のアルキル基を意味する。典型的なＣ1−Ｃ6アルキル基には、それだけには限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが含まれる。
【００４２】
本明細書で使用する、ｎが２〜６であってよい「Ｃ2−Ｃnアルケニル」の語は、２から特定する数までの炭素原子および少なくとも１つの二重結合を有する、オレフィン性に（ｏｌｅｆｉｎｉｃａｌｌｙ）不飽和の分枝または直鎖の基を表す。このような基の例には、それだけには限定されないが、１−プロペニル、２−プロペニル（−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ2）、１，３−ブタジエニル（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨ2）、１−ブテニル（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ3）、ヘキセニル、ペンテニルなどが含まれる。
【００４３】
ｎが２〜６であってよい「Ｃ2−Ｃnアルキニル」の語は、２からｎ個までの炭素原子および少なくとも１つの三重結合を有する、不飽和の分枝または直鎖の基を表す。このような基の例には、それだけには限定されないが、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニルなどが含まれる。
本明細書で使用する「アリール」の語は、芳香環を１または２個有する単環式または二環式炭素環系を意味し、それだけには限定されないが、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、インデニルなどが含まれる。アリール環のサイズ、および置換基または連結基の存在は、存在する炭素の数を指摘することにより示される。例えば、「（Ｃ1−Ｃ3アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）」の語は、１〜３員のアルキル鎖によって親部分に結合している６〜１０員のアリールを意味する。
本明細書で使用する「ヘテロアリール」の語は、芳香環を１または２個含み、芳香環に窒素、酸素、またはイオウの原子を少なくとも１個含む、単環式または二環式環系を意味する。ヘテロアリール環のサイズ、および置換基または連結基の存在は、存在する炭素の数を指摘することにより示される。例えば、「（Ｃ1−Ｃnアルキル）（Ｃ5−Ｃ6ヘテロアリール）」の語は、親部分に１員から「ｎ」員のアルキル鎖によって結合している５または６員のヘテロアリールを意味する。
【００４４】
本明細書で使用する「ヘテロアルキル」の語は、指摘する数の炭素原子および少なくとも１個のヘテロ原子を構造のバックボーンに含む、直鎖または分枝の炭化水素を意味する。本明細書の目的に適するヘテロ原子には、それだけには限定されないが、Ｎ、Ｓ、およびＯが含まれる。
本明細書で使用する「ハロ」の語は、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群の１つまたは複数のメンバーを意味する。
本明細書で使用する「荷電アミノ酸」の語は、生理学的ｐＨの水溶液中で負に荷電している（すなわち、脱プロトン化されている）、または正に荷電している（すなわち、プロトン化されている）側鎖を含むアミノ酸を意味する。例えば、負に荷電しているアミノ酸には、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸、およびホモグルタミン酸が含まれ、正に荷電しているアミノ酸には、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが含まれる。荷電アミノ酸には、ヒトのタンパク質に共通して見出される２０個のアミノ酸の中の荷電アミノ酸、および非典型的な、または天然に存在しないアミノ酸が含まれる。
【００４５】
本明細書で使用する「酸性アミノ酸」の語は、カルボン酸基またはスルホン酸基などを含めた、第２の酸性部分（すなわち、全てのアミノ酸が有するα−カルボキシル基以外）を含むアミノ酸を意味する。
本明細書で使用する、さらなる呼称のない「患者」の語は、飼育されているあらゆる温血脊椎動物（例えば、それだけには限定されないが、家畜、ウマ、ネコ、イヌ、および他のペットを含む）、哺乳動物、およびヒトを包含するものとされる。
【００４６】
実施形態
本開示は、糖尿病、肥満などの疾患を処置するのに有用な生理活性ポリペプチドのプロドラッグ誘導体の製剤を記載するものである。より詳しくは、本明細書に開示するプロドラッグは、親の生理活性ペプチドまたはタンパク質の半減期を増強し、一方で非酵素的分解のメカニズムによってプロドラッグを引き続き活性化するように製剤化される。理想的なプロドラッグは、生理学的条件（例えば、ｐＨ７．２および３７℃）の水に可溶でなければならず、長期貯蔵の間、粉末形態において安定でなければならない。これはまた、親の薬物に対して免疫学的にサイレントでなければならず、低活性を表さなければならない。一部の実施形態では、プロドラッグは、親の薬物の活性の１０％以下を表す。一部の実施形態では、プロドラッグは、親の薬物に対して約１０％未満、約５％未満、約１％、または約１％未満の活性を表す。さらに、プロドラッグは体内に注射した場合、規定された時間内に有効薬物に定量的に変換されなければならない。
【００４７】
本明細書において、生理学的条件下、ＰＢＳ中または血清中の「非酵素的活性化半減期」（切断半減期）の、少なくとも５日〜約１週間の著しい延長を一緒にもたらす、選り抜きの構造的特徴を有する、知られている生理活性ポリペプチドのプロドラッグの例を開示する。少なくとも３日、例えば１０日まで半減期が延長された類似のペプチドなども調製することができる。
ＰＢＳ中または血清中の半減期に関して、本明細書に開示する生理学的条件は、温度約３５〜４０℃、およびｐＨ約７．０〜約７．４、より典型的にはｐＨ７．２〜７．４および温度３６〜３８℃を含むものとされる。本明細書に開示する例は、ＰＢＳ中または血清中の切断半減期の延長は、ｉｎ  ｖｉｖｏの長時間の作用に相関することを示す。
本発明の理論に拘泥するものではないが、プロドラッグの活性化は、ジケトピペラジンまたはジケトモルホリンが形成し、アミド結合連結したアシル化／アルキル化されたジペプチドが自己切断し、活性なポリペプチド薬物が放出された後に生じる。よって、ジペプチドプロドラッグエレメントは、さらなる化学的な添加剤または酵素に依存しない分子内化学反応に基づいて切断するようにデザインされている。ジペプチド構造が、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）などを含めた、哺乳動物の血清中に存在するペプチダーゼによる切断に抵抗するように選択されるのが好ましい。
【００４８】
一部の実施形態によれば、開示するプロドラッグは、プロドラッグの活性化を遅らせる手段として、特異的なＤＰＰ−ＩＶインヒビター（例えば、Ｊａｎｕｖｉａ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ，Ｉｎｃ）を含めたプロテアーゼインヒビターと同時投与することができる。この実施形態では、プロドラッグエレメントのアミノ酸は、ジペプチドがＤＰＰ−ＩＶ切断に対する許容される基質であるように選択される。プロテアーゼインヒビターは、単一の組成物で、または別々の組成物で投与してもよい。別々の組成物として投与する場合、プロテアーゼインヒビターは、プロドラッグを投与し、１〜５時間、１〜２時間、３０分、または１０分以内に投与するのが典型的である。一部の実施形態では、２つの別々の組成物を次々に直ちに投与する。
【００４９】
一部の実施形態によれば、ジペプチドプロドラッグエレメントを、親水性部分を含むようにさらに改変してもよい。一部の実施形態では、親水性部分はポリエチレングリコール鎖である。一部の実施形態によれば、４０ｋ以上のポリエチレングリコール鎖は、ジペプチドプロドラッグエレメントのＡまたはＢアミノ酸の側鎖に共有結合している。
Ａ−Ｂのアシル基またはアルキル基に対する連結
一部の、またはあらゆる態様では、アシル基またはアルキル基は、ジペプチド部分Ａ−Ｂによって、グルカゴンスーパーファミリーペプチドの１位（Ｎ末端）、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３７、３８、３９、４０、４１、４２、または４３位（またはＣ末端の５個のアミノ酸内）のいずれかに位置するアミノ酸に連結している。例示的な態様では、ペプチドのアミノ酸は、グルカゴンスーパーファミリーペプチドの９、１０、１２、１６、２０、または４０位のいずれかに位置し、グルカゴンスーパーファミリーペプチドの１０、１３、１４、１６、１７、または４０位のいずれかに位置する。
【００５０】
Ａ−Ｂの結合
一部の実施形態では、Ａ−Ｂは式Ｉのアミノ酸に連結している。
【化２】
2016521253.tif 000004
（式中、ｎ＝１〜８、１〜６、１〜４、または２〜４である）
［式Ｉ］
一部の実施形態では、式Ｉのアミノ酸は、ｎが４であるアミノ酸（Ｌｙｓ）またはｎが３であるアミノ酸（Ｏｒｎ）である。
【００５１】
アシル基またはアルキル基の結合
一部の実施形態では、アシル基が、ジペプチドＡ−Ｂのアミノ酸に、エステル、チオエステル、もしくはアミド連結により連結しており、またはアルキル基が、ジペプチドＡ−Ｂのアミノ酸に、エーテル、チオエーテル、もしくはアミン連結により連結している。
例えば、連結は、ジペプチドＡ−Ｂのアミノ酸Ａの側鎖アミン、ヒドロキシル、またはチオールがアシル化されると生じ得る。
【００５２】
あるいは、アルキル基の連結は、ジペプチドＡ−Ｂのアミノ酸Ａの側鎖アミン、ヒドロキシル、またはチオールがアルキル化されると生じ得る。一部の、またはあらゆる実施形態では、アルキル基は、アミン、ヒドロキシル、またはチオールを活性化アルキル基と反応させることにより連結される。アルキル基は、一部の態様では、ハロゲン、スルホネートエステル、ピリジルチオール、アンモニウム塩、またはフェノキシルなどの脱離基で活性化される。
【００５３】
Ａ−Ｂと、アシル基またはアルキル基との間の連結も、スペーサーによって生じ得る。一部の実施形態では、スペーサーは親水性の二官能性スペーサー、小型ＰＥＧ部分、または疎水性の二官能性スペーサーである。例示的な実施形態では、親水性の二官能性スペーサーは、２つ以上の反応基、例えば、アミン基、ヒドロキシル基、チオール基、およびカルボキシル基、またはこれらのあらゆる組合せを含む。例示的な実施形態では、親水性の二官能性スペーサーはヒドロキシル基およびカルボキシレートを含む。他の実施形態では、親水性の二官能性スペーサーは、アミン基およびカルボキシレートを含む。他の実施形態では、親水性の二官能性スペーサーは、チオール基およびカルボキシレートを含む。具体的な一実施形態では、スペーサーは、アミノポリ（アルキルオキシ）カルボキシレートを含む。これに関して、スペーサーは、例えば、ＮＨ2（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n（ＣＨ2）mＣＯＯＨを含むことができ、式中、ｍは１〜６のあらゆる整数であり、ｎは２〜１２のあらゆる整数であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ＫＹ）から市販されている、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸などである。
【００５４】
例示的な実施形態では、スペーサーは、［−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−］nの構造を含む小型のポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を含み、式中、ｎは、２〜１６の間の整数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６）である。このような小型のＰＥＧを、本明細書では「ミニＰＥＧ」と呼ぶ。例示的な態様では、ミニＰＥＧは、１つまたは複数の官能基を含む、官能基化されているミニＰＥＧである。適切な官能基には、それだけには限定されないが、アミン基、ヒドロキシル基、チオール基、およびカルボキシル基、またはこれらのあらゆる組合せが含まれる。例示的な態様では、ミニＰＥＧは、｛［−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−］n−ＣＯＯ−｝の構造を含むミニＰＥＧであり、式中、ｎは先に規定した通りである。例示的な態様では、ミニＰＥＧは、｛−Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−［−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−］n｝の構造を含むアミドミニＰＥＧであり、式中、ｎは先に規定した通りである。例示的な態様では、ミニＰＥＧは、｛−Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−［−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−］n−ＣＯＯ−｝の構造を含むアミドミニＰＥＧ酸であり、式中、ｎは先に規定した通りである。アミノ酸をミニＰＥＧでアシル化する上で使用するのに適する試薬は、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ＫＹ）などの業者から市販されている。また、アミノ酸をミニＰＥＧでアシル化するのに適する技術は本明細書に記載するものである（例１を参照されたい）。
【００５５】
一部の実施形態では、スペーサーは疎水性の二官能性スペーサーである。疎水性の二官能性スペーサーは、当技術分野では知られている。例えば、その全文が参照によって援用される、Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996)を参照されたい。例示的な態様では、疎水性の二官能性スペーサーは、アミン基、ヒドロキシル基、チオール基、およびカルボキシル基、またはこれらのあらゆる組合せなどの２つ以上の反応基を含む。例示的な態様では、疎水性の二官能性スペーサーは、ヒドロキシル基およびカルボキシレートを含む。他の実施形態では、疎水性の二官能性スペーサーは、アミン基およびカルボキシレートを含む。他の実施形態では、疎水性の二官能性スペーサーは、チオール基およびカルボキシレートを含む。カルボキシレートおよびヒドロキシル基またはチオール基を含む、適切な疎水性の二官能性スペーサーは当技術分野では知られており、８−ヒドロキシオクタン酸および８−メルカプトオクタン酸などを含む。
【００５６】
一部の、または前述の実施形態のいずれかによれば、二官能性スペーサーは、長さ３〜１０原子であるアミノ酸のバックボーン（例えば、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、および８−アミノオクタン酸）を含む、合成の、または天然に存在するアミノ酸（それだけには限定されないが、本明細書に記載するいずれかを含む）であってよい。あるいは、スペーサーは、長さ３〜１０原子（例えば、６〜１０原子）であるペプチドのバックボーンを有する、ジペプチドまたはトリペプチドのスペーサーであってよい。ジペプチドまたはトリペプチドのスペーサーの各アミノ酸は、ジペプチドまたはトリペプチドの他のアミノ酸（複数可）と同じでも、または異なっていてもよく、天然に存在する、またはコードされている、および／もしくは非コードの、または天然に存在しないアミノ酸、例えば、天然に存在するアミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）のＤもしくはＬ異性体のいずれか、あるいはβ−アラニン（β−Ａｌａ）、Ｎ−α−メチル−アラニン（Ｍｅ−Ａｌａ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、γ−アミノ酪酸（γ−Ａｂｕ）、アミノヘキサン酸（ε−Ａｈｘ）、アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、アミノメチルピロールカルボン酸、アミノピペリジンカルボン酸、アミノセリン（Ａｍｓ）、アミノテトラヒドロピラン−４−カルボン酸、アルギニンＮ−メトキシ−Ｎ−メチルアミド、β−アスパラギン酸（β−Ａｓｐ）、アゼチジンカルボン酸、３−（２−ベンゾチアゾリル）アラニン、α−ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、２−アミノ−５−ウレイド−ｎ−吉草酸（シトルリン、Ｃｉｔ）、β−シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、アセトアミドメチル−システイン、ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）、ジメチルチアゾリジン（ＤＭＴＡ）、γ−グルタミン酸（γ−Ｇｌｕ）、ホモセリン（Ｈｓｅ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、イソロイシンＮ−メトキシ−Ｎ−メチルアミド、メチル−イソロイシン（ＭｅＩｌｅ）、イソニペコチン酸（Ｉｓｎ）、メチル−ロイシン（ＭｅＬｅｕ）、メチル−リシン、ジメチル−リシン、トリメチル−リシン、メタノプロリン、メチオニン−スルホキシド（Ｍｅｔ（Ｏ））、メチオニン−スルホン（Ｍｅｔ（Ｏ）2）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、メチル−ノルロイシン（Ｍｅ−Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、パラ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、ペニシラミン（Ｐｅｎ）、メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｃｌ））、４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））、４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−ＮＯ2））、４−シアノフェニルアラニン（（Ｐｈｅ（４−ＣＮ））、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、ピペリジニルアラニン、ピペリジニルグリシン、３，４−デヒドロプロリン、ピロリジニルアラニン、サルコシン（Ｓａｒ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ）、Ｏ−ベンジル−ホスホセリン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸（Ｓｔａ）、���−アミノ−５−シクロヘキシル−３−ヒドロキシペンタン酸（ＡＣＨＰＡ）、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸（ＡＨＰＰＡ）、１，２，３，４，−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）、テトラヒドロピラングリシン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒａｎｇｌｙｃｉｎｅ）、チエニルアラニン（Ｔｈｉ）、Ｏ−ベンジル−ホスホチロシン、Ｏ−ホスホチロシン、メトキシチロシン、エトキシチロシン、Ｏ−（ｂｉｓ−ジメチルアミノ−ホスホノ）−チロシン、硫酸化チロシンテトラブチルアミン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｔｅｔｒａｂｕｔｙｌａｍｉｎｅ）、メチル−バリン（ＭｅＶａｌ）、およびアルキル化３−メルカプトプロピオン酸からなる群から選択される、天然に存在しないもしくは非コードのアミノ酸のあらゆるＤもしくはＬ異性体からなる群から独立に選択され得る。例示的な態様では、スペーサーは、Ｃｙｓ残基またはＬｙｓ残基である。
一部の実施形態では、スペーサーは、全体的に負の電荷を含み、例えば、負に荷電したアミノ酸を１または２個含む。
【００５７】
アシル基
アシル化アミノ酸のアシル基はＣ１６またはそれより長いのが好ましい。例えば、アシル基は、Ｃ１６脂肪酸、Ｃ１８脂肪酸、Ｃ２０脂肪酸、Ｃ２２脂肪酸、Ｃ２４脂肪酸、Ｃ２６脂肪酸、Ｃ２８脂肪酸、またはＣ３０脂肪酸のいずれかであってよい。一部の実施形態では、アシル基は、Ｃ１６−Ｃ３０脂肪酸またはＣ２０−Ｃ２８脂肪酸である。
【００５８】
代替の一実施形態では、アシル基は胆汁酸である。胆汁酸は、それだけには限定されないが、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、およびコレステロール酸を含めたあらゆる適切な胆汁酸であってよい。
【００５９】
例示的な実施形態では、アシル基は、コハク酸またはコハク酸誘導体である。本明細書で使用する「コハク酸誘導体」は、置換されているコハク酸、または置換されている環状コハク酸（すなわち、無水コハク酸）、または置換されている拡張環（ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｒｉｎｇ）無水コハク酸（すなわち、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−部分および３〜５個のさらなる炭素を含む６〜８員環）を含む化合物を意味し、置換されているコハク酸、置換されている環状コハク酸（すなわち、無水コハク酸）、または置換されている拡張環無水コハク酸は、１つもしくは複数のアルキル鎖または１つもしくは複数の官能基化されている炭素鎖で置換されている。
【００６０】
例示的な態様では、コハク酸誘導体は、式Ｖの構造を含み、
【化３】
2016521253.tif 000005
［式Ｖ］
式中、ＲおよびＲ’の各々は独立に、Ｈ、直鎖もしくは分枝のＣ１６−Ｃ３０炭素鎖、または直鎖もしくは分枝の官能基化されているＣ１６−Ｃ３０炭素鎖である。例示的な実施形態では、Ｒおよび／またはＲ’は、Ｃ１６−Ｃ３０アルキル鎖、例えば、Ｃ１６アルキル、Ｃ１８アルキル、Ｃ２０アルキル、Ｃ２２アルキル、Ｃ２４アルキル、Ｃ２６アルキル、Ｃ２８アルキル、またはＣ３０アルキルを含む炭素鎖である。例示的な態様では、官能基化されている炭素鎖は、それだけには限定されないが、カルボキシル、スルフヒドリル、アミン、ケチル、スルホキシル、またはアミドを含めた官能基を含む。
【００６１】
例示的な態様では、コハク酸誘導体は、式ＶＩの構造を含む無水コハク酸を含み、
【化４】
2016521253.tif 000006
［式ＶＩ］
式中、ＲおよびＲ’の各々は独立に、Ｈ、直鎖もしくは分枝のＣ１６−Ｃ３０炭素鎖、または直鎖もしくは分枝の官能基化されているＣ１６−Ｃ３０炭素鎖である。例示的な実施形態では、Ｒおよび／またはＲ’は、Ｃ１６−Ｃ３０アルキル鎖を含む炭素鎖である。例えば、アルキル基は、Ｃ１６アルキル、Ｃ１８アルキル、Ｃ２０アルキル、Ｃ２２アルキル、Ｃ２４アルキル、Ｃ２６アルキル、Ｃ２８アルキル、またはＣ３０アルキルのいずれかであってよい。例示的な態様では、官能基化されている炭素鎖は、それだけには限定されないが、カルボキシル、スルフヒドリル、アミン、ケチル、スルホキシル、またはアミドを含めた官能基を含む。
【００６２】
例示的な態様では、コハク酸誘導体は、式ＶＩＩのものを含む無水コハク酸誘導体であり、
【化５】
2016521253.tif 000007
［式ＶＩＩ］
式中、ｎは１〜４であり、
ＲおよびＲ’の各々は独立に、Ｈ、直鎖もしくは分枝のＣ１６−Ｃ３０炭素鎖、または直鎖もしくは分枝の官能基化されているＣ１６−Ｃ３０炭素鎖である。例示的な実施形態では、Ｒおよび／またはＲ’は、Ｃ１６−Ｃ３０アルキル鎖を含む炭素鎖である。例えば、アルキル基は、Ｃ１６アルキル、Ｃ１８アルキル、Ｃ２０アルキル、Ｃ２２アルキル、Ｃ２４アルキル、Ｃ２６アルキル、Ｃ２８アルキル、またはＣ３０アルキルのいずれかであってよい。例示的な態様では、官能基化されている炭素鎖は、それだけには限定されないが、カルボキシル、スルフヒドリル、アミン、ケチル、スルホキシル、またはアミドを含めた官能基を含む。
【００６３】
式Ｖ〜ＶＩのＲおよびＲ’の１つだけがＨである場合、アシル化されているアミノ酸は「Ｃｘスクシノイル」と呼ばれる。本明細書で使用する、ｘが整数である「Ｃｘスクシノイル」の語は、Ｒが炭素ｙ個のアルキル鎖であり、ｙ＝ｘ−１であり、ｙがスクシノイル部分の炭素を含まない構造を意味する。例えば、ＲがＣ１５アルキル基であり、Ｒ’がＨである、式ＶＩの構造は、Ｃ１６スクシノイルと呼ばれる。式Ｖ〜ＶＩのＲもＲ’もＨではない場合、アシル化されているアミノ酸は「Ｃｘ，Ｃｘ’スクシノイル」と呼ばれる。本明細書で使用する、ｘおよびｘ’が整数である「Ｃｘ，Ｃｘ’スクシノイル」の語は、Ｒが炭素ｙ個のアルキル鎖であり、Ｒ’が炭素ｙ’個のアルキル鎖であり、ｙ’＝ｘ’−１である構造を意味する。例えば、ＲがＣ１５アルキル基であり、Ｒ’がＣ１３アルキル基である式ＶＩの構造は、Ｃ１６，Ｃ１４スクシノイルと呼ばれる。コハク酸誘導体が、置換されている拡張環無水コハク酸であり、式ＶＩＩのＲもＲ’もＨではない場合、アシル化されているアミノ酸は「Ｃｘ，Ｃｘ’−ｎ−スクシノイル」と呼ばれる。本明細書で使用する、ｘ、ｘ’、およびｎが整数である「Ｃｘ，Ｃｘ’−ｎ−スクシノイル」は、Ｒが炭素ｙ個のアルキル鎖であり、Ｒ’が炭素ｙ’個のアルキル鎖であり、無水コハク酸の環はｎ個の炭素によって伸長している構造を意味する。例えば、ＲおよびＲ’がＣ１５アルキル基であり、ｎ＝２である式ＶＩＩの構造は、Ｃ１６，Ｃ１６−２−スクシノイルと呼ばれる。
【００６４】
例示的な実施形態では、アシル基はマレイン酸またはマレイン酸誘導体である。本明細書で使用する「マレイン酸誘導体」は、置換されているマレイン酸、または置換されている環状マレイン酸（すなわち、無水マレイン酸）、または置換されている拡張環無水マレイン酸（すなわち、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−部分および３〜５個のさらなる炭素を含む６〜８員環）を含む化合物を意味し、置換されているマレイン酸、または置換されている環状マレイン酸（すなわち、無水マレイン酸）、または置換されている拡張環無水マレイン酸は、１つもしくは複数のアルキル鎖または１つもしくは複数の官能基化されている炭素鎖で置換されている。
【００６５】
例示的な態様では、マレイン酸誘導体は、式ＶＩＩＩの構造を含み、
【化６】
2016521253.tif 000008
［式ＶＩＩＩ］
式中、ＲおよびＲ’の各々は独立に、Ｈ、直鎖もしくは分枝のＣ１６−Ｃ３０炭素鎖、または直鎖もしくは分枝の官能基化されているＣ１６−Ｃ３０炭素鎖である。例示的な実施形態では、Ｒおよび／またはＲ’は、Ｃ１６−Ｃ３０アルキル鎖を含む炭素鎖である。例えば、アルキル基は、Ｃ１６アルキル、Ｃ１８アルキル、Ｃ２０アルキル、Ｃ２２アルキル、Ｃ２４アルキル、Ｃ２６アルキル、Ｃ２８アルキル、またはＣ３０アルキルのいずれかであってよい。例示的な態様では、官能基化されている炭素鎖は、それだけには限定されないが、カルボキシル、スルフヒドリル、アミン、ケチル、スルホキシル、またはアミドを含めた官能基を含む。
【００６６】
例示的な態様では、マレイン酸誘導体は、式ＩＸの構造を含み、
【化７】
2016521253.tif 000009
［式ＩＸ］
式中、ＲおよびＲ’の各々は独立に、Ｈ、直鎖もしくは分枝のＣ１６−Ｃ３０炭素鎖、または直鎖もしくは分枝の官能基化されているＣ１６−Ｃ３０炭素鎖である。例示的な実施形態では、Ｒおよび／またはＲ’は、Ｃ１６−Ｃ３０アルキル鎖を含む炭素鎖である。例えば、アルキル基は、Ｃ１６アルキル、Ｃ１８アルキル、Ｃ２０アルキル、Ｃ２２アルキル、Ｃ２４アルキル、Ｃ２６アルキル、Ｃ２８アルキル、またはＣ３０アルキルのいずれかであってよい。例示的な態様では、官能基化されている炭素鎖は、それだけには限定されないが、カルボキシル、スルフヒドリル、アミン、ケチル、スルホキシル、またはアミドを含めた官能基を含む。
【００６７】
例示的な態様では、マレイン酸誘導体は、式Ｘのものを含む無水マレイン酸誘導体であり、
【化８】
2016521253.tif 000010
［式Ｘ］
式中、ｎは１〜４であり、２個の非カルボニル炭素間に少なくとも１つのＣ＝Ｃ二重結合が存在し、
ＲおよびＲ’の各々は独立に、Ｈ、直鎖もしくは分枝のＣ１６−Ｃ３０炭素鎖、または直鎖もしくは分枝の官能基化されているＣ１６−Ｃ３０炭素鎖である。例示的な実施形態では、Ｒおよび／またはＲ’は、Ｃ１６−Ｃ３０アルキル鎖を含む炭素鎖である。例えば、アルキル基は、Ｃ１６アルキル、Ｃ１８アルキル、Ｃ２０アルキル、Ｃ２２アルキル、Ｃ２４アルキル、Ｃ２６アルキル、Ｃ２８アルキル、またはＣ３０アルキルのいずれかであってよい。例示的な態様では、官能基化されている炭素鎖は、それだけには限定されないが、カルボキシル、スルフヒドリル、アミン、ケチル、スルホキシル、またはアミドを含めた官能基を含む。
【００６８】
式ＶＩＩＩ〜ＩＸのＲおよびＲ’の１つだけがＨである場合、アシル化されているアミノ酸は「Ｃｘマレオイル」と呼ばれる。本明細書で使用する、ｘが整数である「Ｃｘマレオイル」の語は、Ｒが炭素ｙ個のアルキル鎖であり、ｙ＝ｘ−１であり、ｙがマレオイル部分の炭素を含まない構造を意味する。例えば、ＲがＣ１５アルキル基であり、Ｒ’がＨである式ＩＸの構造は、Ｃ１６マレオイルと呼ばれる。式ＶＩＩＩ〜ＩＸのＲもＲ’もＨではない場合、アシル化されているアミノ酸は「Ｃｘ，Ｃｘ’マレオイル」と呼ばれる。本明細書で使用する、ｘおよびｘ’が整数である「Ｃｘ，Ｃｘマレオイル」の語は、Ｒが炭素ｙ個のアルキル鎖であり、Ｒ’が炭素ｙ’個のアルキル鎖であり、ｙ’＝ｘ’−１である構造を意味する。例えば、ＲがＣ１５アルキル基であり、Ｒ’がＣ１３アルキル基である式ＩＸの構造は、Ｃ１６，Ｃ１４マレオイルと呼ばれる。マレイン酸誘導体が、置換されている拡張環無水マレイン酸であり、式ＸのＲもＲ’もＨではない場合、アシル化されているアミノ酸は「Ｃｘ，Ｃｘ’−ｎ−マレオイル」と呼ばれる。本明細書で使用する、ｘ、ｘ’、およびｎが整数である「Ｃｘ，Ｃｘ’−ｎ−マレオイル」の語は、Ｒが炭素ｙ個のアルキル鎖であり、Ｒ’が炭素ｙ’個のアルキル鎖であり、無水マレイン酸環がｎ個の炭素により伸長している構造を意味する。例えば、ＲおよびＲ’がＣ１５アルキル基であり、ｎ＝２である式Ｘの構造は、Ｃ１６，Ｃ１６−２−マレオイルと呼ばれる。
【００６９】
アルキル基
アルキル化アミノ酸の非天然のアルキル基は、あらゆる長さの炭素鎖など、あらゆるサイズであってよく、直鎖でも、または分枝でもよい。いくつかの具体的な実施形態では、アルキル基はＣ１６−Ｃ３０アルキルである。例えば、アルキル基は、Ｃ１６アルキル、Ｃ１８アルキル、Ｃ２０アルキル、Ｃ２２アルキル、Ｃ２４アルキル、Ｃ２６アルキル、Ｃ２８アルキル、またはＣ３０アルキルのいずれかであってよい。
例示的な実施形態では、アルキル化アミノ酸の非天然のアルキル基は、それだけには限定されないが、カルボキシル、スルフヒドリル、アミン、ケチル、スルホキシル、またはアミドを含めた官能基を含む。
【００７０】
例示的な実施形態では、非天然のアルキル基は、−Ｃｘ−ＣＯＯＨの構造のカルボキシ官能基化されている炭素鎖であり、式中、ｘは、整数であり、４〜３０の間の整数（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０）であってもよく、カルボキシ炭素はアルファ炭素であり、Ｃｘの各炭素はベータ、ガンマ、デルタ、イプシロンなどと呼ばれ、ベータ炭素はアルファ炭素に結合している。例えば、ｘが４である場合、非天然のアルキル基は以下の通りに呼ばれる：Ｃε−Ｃδ−Ｃγ−Ｃβ−ＣαＯＯＨ。例示的な実施形態では、カルボキシ官能基化されている炭素鎖は、カルボキシ炭素以外の炭素、すなわちＣｘの炭素の１つによって結合している。例示的な態様では、カルボキシ官能基化されている炭素鎖は、カルボキシ官能基化されている炭素鎖のベータ、ガンマ、デルタ、またはイプシロン炭素によって、アルキル化されているアミノ酸の側鎖に結合している。代替的な実施形態では、カルボキシ官能基化されている炭素鎖は、カルボキシ官能基化されている炭素鎖のベータ、ガンマ、デルタ、またはイプシロン炭素によって、スペーサーの側鎖に結合し、このスペーサーはアルキル化されているアミノ酸に結合している。例示的な態様では、カルボキシ官能基化されている炭素鎖は、カルボキシ官能基化されている炭素鎖のベータ炭素によって、アルキル化されているアミノ酸の側鎖に結合している。代替の実施形態では、カルボキシ官能基化されている炭素鎖は、カルボキシ官能基化されている炭素鎖のベータ炭素によって、スペーサーの側鎖に結合し、このスペーサーはアルキル化されているアミノ酸に結合している。
【００７１】
アシル基を結合させる方法
アシル基を、ペプチドのアミン、ヒドロキシル、およびチオールによってペプチドに結合させる適切な方法は、当技術分野において知られている。例えば、例１（アミンを介したアシル化の方法に対して）、Miller, Biochem Biophys Res Commun 218: 377-382 (1996)、Shimohigashi and Stammer, Int J Pept Protein Res 19: 54-62 (1982)、およびPreviero et al., Biochim Biophys Acta 263: 7-13 (1972)（ヒドロキシルを介したアシル化の方法に対して）、ならびにSan and Silvius, J Pept Res 66: 169-180 (2005)（チオールを介したアシル化の方法に対して）、Bioconjugate Chem. "Chemical Modifications of Proteins: History and Applications" pages 1, 2-12 (1990)、Hashimoto et al., Pharmacuetical Res. "Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity" Vol. 6, No: 2 pp.171-176 (1989)を参照されたい。
【００７２】
一部の実施形態では、アシル化は、Ａ−Ｂジペプチドによる長鎖アルカンのアシル化によって生じる。具体的な態様では、長鎖アルカンは、Ａ−Ｂペプチドのカルボキシル基、またはその活性型と反応する、アミン、ヒドロキシル、またはチオール基（例えば、オクタデシルアミン、テトラデカノール、およびヘキサデカンチオール）を含む。カルボキシル基、またはその活性型は、アミノ酸Ａの側鎖の一部であってよい。
【００７３】
例示的な実施形態では、グルカゴンスーパーファミリーペプチドは、Ａ−Ｂジペプチドに結合しているスペーサーによる長鎖アルカンのアシル化によるアシル基を含む。具体的な態様では、長鎖アルカンは、スペーサーの、カルボキシル基、またはその活性型と反応する、アミン、ヒドロキシル、またはチオール基を含む。カルボキシル基、またはその活性型を含む適切なスペーサーは本明細書に記載するものであり、例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性の二官能性スペーサー、および疎水性の二官能性スペーサーなどの二官能性スペーサーを含む。
【００７４】
本明細書で使用する「活性型のカルボキシル基」の語は、一般式Ｒ（Ｃ＝Ｏ）Ｘを有するカルボキシル基を意味し、式中、Ｘは脱離基であり、Ｒはグルカゴン類似体またはスペーサーである。例えば、活性型のカルボキシル基には、それだけには限定されないが、塩化アシル、無水物、およびエステルが含まれ得る。一部の実施形態では、活性化されているカルボキシル基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）脱離基とのエステルである。
【００７５】
一部の実施形態では、Ａ−Ｂジペプチドのアミン基、ヒドロキシル基、またはチオール基は、コレステロール酸でアシル化されている。具体的な一実施形態では、Ａ−Ｂジペプチドは、アルキル化されているｄｅｓ−アミノＣｙｓスペーサー、すなわちアルキル化されている３−メルカプトプロピオン酸スペーサーを介してコレステロール酸に連結している。
アシル基がコハク酸、コハク酸誘導体、マレイン酸、またはマレイン酸誘導体である場合、ペプチドは、ＧＩＰアゴニストペプチドまたはスペーサーのアミン基、ヒドロキシル、またはチオール基の、式Ｖ、式ＶＩ、式ＶＩＩ、式ＶＩＩＩ、式ＩＸ、または式Ｘのコハク酸、コハク酸誘導体、マレイン酸、またはマレイン酸誘導体との反応により、スクシノイル化（ｓｕｃｃｉｎｏｙｌａｔｅｄ）／マレオイル化（ｍａｌｅｏｙｌａｔｅｄ）されている。スクシノイル化の方法は本明細書に記載するものである。
【００７６】
アルキル基を結合させる方法
アルキル基をアミノ酸に結合させる方法は、当技術分野において知られている。例えば、脱離基で活性化されているアルキル基は、アミン、ヒドロキシル、またはチオールを含む側鎖などの求核性の側鎖を含むアミノ酸と反応し得る。例示的な態様における脱離基は、ハロゲン、スルホネートエステル、ピリジルチオール、アンモニウム塩、またはフェノキシルである。
【００７７】
例示的な実施形態では、アルキル基に結合させようとするアミノ酸はＣｙｓ残基であり、イオウ原子は「Ｓ−アルキル化」など、アルキル化されている。例示的な実施形態では、Ｃｙｓのイオウは、−Ｃｘ−ＣＯＯＨの構造のカルボキシ官能基化されている炭素鎖を含むアルキル基の脱離基と反応し、式中、ｘは、整数であり、４〜３０の間の整数（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０）であってもよく、カルボキシ炭素はアルファ炭素であり、Ｃｘの各炭素はベータ、ガンマ、デルタ、イプシロンなどと呼ばれ、ベータ炭素はアルファ炭素に結合している。例えば、ｘが４である場合、非天然のアルキル基は以下の通りに呼ばれる：Ｃε−Ｃδ−Ｃγ−Ｃβ−ＣαＯＯＨ。例示的な実施形態では、カルボキシ官能基化されている炭素鎖は、カルボキシ炭素以外の炭素、すなわちＣｘの炭素の１つによって結合している。例示的な態様では、カルボキシ官能基化されている炭素鎖は、カルボキシ官能基化されている炭素鎖のベータ、ガンマ、デルタ、またはイプシロン炭素によって、アルキル化されているアミノ酸の側鎖に結合している。代替的な実施形態では、カルボキシ官能基化されている炭素鎖は、カルボキシ官能基化されている炭素鎖のベータ、ガンマ、デルタ、またはイプシロン炭素によって、スペーサーの側鎖に結合し、このスペーサーはアルキル化されているアミノ酸に結合している。例示的な態様では、カルボキシ官能基化されている炭素鎖は、カルボキシ官能基化されている炭素鎖のベータ炭素によって、アルキル化されているアミノ酸の側鎖に結合している。代替の実施形態では、カルボキシ官能基化されている炭素鎖は、カルボキシ官能基化されている炭素鎖のベータ炭素によって、スペーサーの側鎖に結合し、このスペーサーはアルキル化されているアミノ酸に結合している。
【００７８】
例示的な態様では、脱離基は、ヨウ素、臭素、塩素、もしくはフッ素などのハロゲン、トシレート、トリフレート、もしくはフルオロスルホネートなどのスルホン酸エステル、ピリジルチオール、アンモニウム塩、ジアゾニウム塩、ニトレート、ホスフェート、またはフェノキシルである。
具体的な態様では、アルキル基はヨウ素脱離基を含み、カルボキシ官能基化されている炭素鎖は合計１６個の炭素（カルボキシレートの炭素を含む）を含む。このようなヨウ素−カルボン酸でのアルキル化は、「Ｓ−パルミチルアルキル化」と呼ばれ、これは「Ｓ−パルミテートアルキル化（Ｓ−ｐａｌｍｉｎａｔｅ  ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ）」と同義である。Ｓ−パルミチルアルキル化のさらなる例示を、本明細書の例１および２０に提供する。
【００７９】
グルカゴン関連ペプチド
ある特定の態様では、本開示は、グルカゴン関連ペプチド（指定する「Ｑ」基の一部として）に関する。グルカゴン関連ペプチドの語は、グルカゴン、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、およびＧＩＰ受容体のいずれか１つまたは複数で生物学的活性（アゴニストもしくはアンタゴニストとして）を有し、天然のグルカゴン、天然のオキシントモジュリン、天然のエキセンジン−４、天然のＧＬＰ−１、天然のＧＬＰ−２、または天然のＧＩＰの少なくとも１つと、少なくとも４０％（例えば、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％）の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むペプチドを意味する。列挙する天然の各ペプチドに対して配列同一性の可能な全てのサブセットと一緒に、グルカゴンまたはＧＬＰ−１またはＧＩＰの受容体のいずれか１つまたは複数で生物学的活性（アゴニストもしくはアンタゴニストとして）を有するペプチド、例えば、天然グルカゴンの長さにわたって天然グルカゴンと、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むものなど、グルカゴン関連ペプチドの可能な全ての活性のサブセットが企図されることが理解される。本発明の一部の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体アゴニスト活性、ＧＩＰ受容体アゴニスト活性、グルカゴン受容体／ＧＬＰ−１受容体共アゴニスト活性、グルカゴン受容体アンタゴニスト活性、またはグルカゴン受容体アンタゴニストおよびＧＬＰ−１受容体活性を有するペプチドである。一部の実施形態では、ペプチドは、分子のＣ末端半分にアルファヘリックス立体配置を保持している。一部の実施形態では、ペプチドは、グルカゴンの３位、または（１〜３７）ＧＬＰ−１の７、１０、１２、１３、１５、もしくは１７位など、受容体の相互作用またはシグナリングに関与する位置を保持している。したがってグルカゴン関連ペプチドは、クラス１、クラス２、クラス３、クラス４、クラス５、および／またはクラス６のペプチドであってよく、これらは各々本明細書にさらに記載するものである。
【００８０】
一部の実施形態によれば、ジペプチドプロドラッグエレメント（ジペプチドプロドラッグエレメントに連結しているアシル基またはアルキル基を含む）は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８６０８（２００８年１月３日出願）、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５３８５７（２００８年２月１３日出願）、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４７４３７（２００９年６月１６日出願）、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４７４３８（２００９年６月１６日出願）、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４７４４７（２００９年６月１６日出願）、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０９７３（２００８年１０月２３日出願）、およびＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１３３３（２００８年１０月２７日出願）、２００９年６月１６日出願のＰＣＴ／ＵＳ０９／４７４３７、２００９年６月１６日出願のＰＣＴ／ＵＳ０９／４７４３８、０９年６月１６日出願のＰＣＴ／ＵＳ０９／４７４４７、２０１０年６月１６日出願のＰＣＴ／ＵＳ１０／３８８２５、２０１０年１２月９日出願のＰＣＴ／ＵＳ１０／５９７２４、２０１１年１月２６日出願のＰＣＴ／ＵＳ１１／２２６０８、２０１１年５月１０日出願のＰＣＴ／ＵＳ１１／３５９１２、２０１１年５月１０日出願のＰＣＴ／ＵＳ１１／３５９１３、２０１１年６月２３日出願のＰＣＴ／ＵＳ１１／４１６２３、２０１１年１２月２０日出願のＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４、２０１１年１２月２２日出願のＰＣＴ／ＵＳ１１／６６７３９、２０１２年６月１２日出願のＰＣＴ／ＵＳ１２／４２０８５、および２０１２年１１月１６日出願のＰＣＴ／ＵＳ１２／６５４９２に以前に開示されている生理活性化合物のいずれかに、アミド連結によって結合していてよく、各配列を含むこれらの開示は本出願に参照によって特に援用される。本明細書に開示するジペプチドプロドラッグエレメント（ジペプチドプロドラッグエレメントに連結しているアシル基またはアルキル基を含む）は、一部の例示的な実施形態では、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８６０８、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５３８５７、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４７４３７、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４７４３８、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４７４４７、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０９７、およびＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１３３３に開示される生理活性ペプチド、または先のＰＣＴ出願に開示されているいずれかに連結していてよい。
【００８１】
一部の実施形態では、Ｑは、２０１２年６月１２日出願のＰＣＴ／ＵＳ１２／４２０８４に開示されているペプチドであってよく、一部の実施形態では、ＱはＰＣＴ／ＵＳ１２／４２０８４に開示されているペプチドのいずれかではない。
【００８２】
改変
グルカゴン関連ペプチドは、改変のある天然グルカゴンのアミノ酸配列（配列番号７０１）を含むことができる。例示的な実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、天然グルカゴン配列に対して、保存的または非保存的な置換など、合計１個、最高２個、最高３個、最高４個、最高５個、最高６個、最高７個、最高８個、最高９個、または最高１０個のアミノ酸改変を含み得る。本明細書に記載する改変および置換は、ある特定の態様では、グルカゴン関連ペプチド内の特定の位置でなされ、位置のナンバリングは、グルカゴン（配列番号７０１）のナンバリングに対応する。一部の実施形態では、１、２、３、４、または５個の非保存的な置換が、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、または２９位のいずれかで行われ、最高５個のさらなる保存的置換がこれらの位置のいずれかで行われる。一部の実施形態では、１、２、または３つのアミノ酸改変が１〜１６位のアミノ酸内で行われ、１、２、または３つのアミノ酸改変が１７〜２６位のアミノ酸内で行われる。一部の実施形態では、このようなグルカゴン関連ペプチドは、天然に存在するアミノ酸を少なくとも２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８個、天然グルカゴンにおける対応する位置に保持している（例えば、天然に存在するグルカゴンに対して１〜７、１〜５、または１〜３個の改変を有する）。
【００８３】
ＤＰＰ−ＩＶ抵抗性
一部の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、１位または２位に、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性を低減する改変を含む。より詳しくは、一部の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドの１位（例えば、図１０におけるものから選択される）は、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、およびホモ−ヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。より詳しくは、一部の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドの２位は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、およびアミノイソ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドの２位はＤ−セリンではない。
【００８４】
親水性部分
一部の実施形態では、グルカゴン関連ペプチド（例えば、クラス１グルカゴン関連ペプチド、クラス２グルカゴン関連ペプチド、クラス３グルカゴン関連ペプチド、クラス４グルカゴン関連ペプチド、またはクラス５グルカゴン関連ペプチド、またはクラス６グルカゴン関連ペプチド）は、親水性部分に結合（共有結合）している。親水性部分は、タンパク質を活性化ポリマー分子と反応させるのに使用するあらゆる適切な条件下で、グルカゴン関連ペプチドに結合していてよい。ＰＥＧ部分上の反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミド、またはヒドラジノ基）を介した、標的化合物上の反応基（例えば、アルデヒド基、アミノ基、エステル基、チオール基、α−ハロアセチル基、マレイミド基、またはヒドラジノ基）への、アシル化、還元的アルキル化、マイケル付加、チオールアルキル化、または他の化学選択的なコンジュゲーション／ライゲーション方法を含めた、当技術分野では知られているあらゆる手段を使用することができる。水溶性ポリマーを１つまたは複数のタンパク質に連結するのに使用することができる活性化基には、制限なく、スルホン、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフレート、トレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、アジジリン（ａｚｉｄｉｒｉｎｅ）、オキシラン、および５−ピリジルが含まれる。還元的アルキル化によりペプチドに結合させる場合、選択されるポリマーには、重合度を制御するように、単一の反応性アルデヒドがなければならない。例えば、Kinstler et al., Adv. Drug. Delivery Rev. 54: 477-485 (2002)、Roberts et al., Adv. Drug Delivery Rev. 54: 459-476 (2002)、およびZalipsky et al., Adv. Drug Delivery Rev. 16: 157-182 (1995)を参照されたい。
【００８５】
クラス１から３のグルカゴン関連ペプチドに関して、水溶性ポリマーを１つまたは複数のタンパク質に連結するのに使用することができるさらなる活性化基には、アルファ−ハロゲン化アシル基（例えば、アルファ−ヨード酢酸、アルファ−ブロモ酢酸、アルファ−クロロ酢酸）が含まれる。グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである一部の実施形態では、チオールを含むアミノ酸を、マイケル付加反応においてマレイミド活性化ＰＥＧで改変して、以下に示すチオエーテル連結を含むＰＥＧ化ペプチドを得る。
【００８６】
【化９】
2016521253.tif 000011
【００８７】
他の実施形態では、クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドのアミノ酸のチオールを、求核置換反応においてハロアセチル活性化ＰＥＧで改変して、以下に示すチオエーテル連結を含むＰＥＧ化ペプチドを得る。
【化１０】
2016521253.tif 000012
【００８８】
適切な親水性部分には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール（例えば、ＰＯＧ）、ポリオキシエチレン化ソルビトール、ポリオキシエチレン化グルコース、ポリオキシエチレン化グリセロール（ＰＯＧ）、ポリオキシアルキレン、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリアセタール、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリ（β−アミノ酸）（ホモポリマーもしくはランダム共重合体のいずれか）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー（ＰＰＧ）、および他のポリアルキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、コラン酸（ｃｏｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）または他の多糖ポリマー、Ｆｉｃｏｌｌまたはデキストランおよびこれらの混合物が含まれる。デキストランは、グルコースサブユニットが、優先的にα１−６連結によって連結されている多糖ポリマーである。約１ｋＤ〜約１００ｋＤ、または約５、１０、１５、もしくは２０ｋＤから約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、もしくは９０ｋＤなどの多くの分子量範囲のデキストランが入手可能である。
【００８９】
一部の実施形態では、親水性部分は、前記グルカゴン関連ペプチドの、１６、１７、２１、２４、２９、４０位のうちの１つもしくは複数で、Ｃ末端伸長内で、またはＣ末端アミノ酸で、アミノ酸残基の側鎖に共有結合により連結しているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖または他の水溶性ポリマーである。一部の実施形態では、この位置の天然のアミノ酸は、親水性部分の、ペプチドに対する連結を促進するために、親水性部分との架橋連結に適する側鎖を有するアミノ酸で置換されている。例示的なアミノ酸には、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ、またはアセチルフェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）が含まれる。他の実施形態では、親水性基を含むように改変されているアミノ酸が、ペプチドにＣ末端で付加している。
【００９０】
ポリエチレングリコールなどの親水性部分は、一部の実施形態によれば、約５００〜約４００００ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。一部の実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の分子量は、約５００〜約５０００ダルトン、または約１０００〜約５０００ダルトンの範囲から選択される。別の実施形態では、ポリエチレングリコール鎖などの親水性部分の分子量は、約１００００〜約２００００ダルトンである。さらに他の例示的な実施形態では、ポリエチレングリコール鎖などの親水性部分の分子量は、約２００００〜約４００００ダルトンである。
【００９１】
直鎖または分枝の親水性ポリマーが企図される。結果として生じるコンジュゲートの調製物は、本質的に単分散または多分散であってよく、ペプチド１個あたりポリマー部分を約０．５、０．７、１、１．２、１．５、または２個有していてよい。
【００９２】
アシル化
一部の実施形態では、グルカゴン関連ペプチド（例えば、クラス１グルカゴン関連ペプチド、クラス２グルカゴン関連ペプチド、クラス３グルカゴン関連ペプチド、クラス４グルカゴン関連ペプチド（単数もしくは複数）、クラス５グルカゴン関連ペプチド、またはクラス６グルカゴン関連ペプチド）は、アシル基を含むように改変されている。例えば、グルカゴン関連ペプチドは、クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のうちの１つであってよく、天然に存在するアミノ酸に非天然であるアシル基を含むことができる。アシル化は、非アシル化のグルカゴン関連ペプチドによって表される活性がアシル化時に保持されるのであれば、１〜２９位のいずれか、Ｃ末端伸長内の位置、またはＣ末端アミノ酸を含めた、グルカゴン関連ペプチドのあらゆる位置で行われてよい。例えば、非アシル化ペプチドにグルカゴンアゴニスト活性があれば、アシル化ペプチドはグルカゴンアゴニスト活性を保持している。また、例えば、非アシル化ペプチドにグルカゴンアンタゴニスト活性があれば、アシル化ペプチドはグルカゴンアンタゴニスト活性を保持している。例えば、非アシル化ペプチドにＧＬＰ−１アゴニスト活性があれば、アシル化ペプチドはＧＬＰ−１アゴニスト活性を保持している。非限定的な例として、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、または２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）のアシル化が含まれる。クラス１、クラス２、クラス６、およびクラス３のグルカゴン関連ペプチドに関して、アシル化は、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、２９、３０、３７、３８、３９、４０、４１、４２、または４３位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）のいずれかで生じ得る。アシル基は、グルカゴン関連ペプチドのアミノ酸に直接、またはグルカゴン関連ペプチドのアミノ酸にスペーサーによって間接的に、共有結合により連結していてよく、スペーサーはグルカゴン関連ペプチドのアミノ酸とアシル基との間に位置付けられる。グルカゴン関連ペプチドは、親水性部分が連結している同じアミノ酸位置でアシル化されても、または異なるアミノ酸位置でアシル化されてもよい。非限定的な例には、１０位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）のアシル化、およびグルカゴンペプチドのＣ末端部分における、例えば、２４、２８、もしくは２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）の１つもしくは複数の位置の、Ｃ末端伸長内の、またはＣ末端（例えば、Ｃ末端のＣｙｓの付加を介して）の、ペグ化が含まれる。
【００９３】
本発明の具体的な一態様では、グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン関連ペプチドのアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル、またはチオールの直接的なアシル化により、アシル基を含むように改変される。一部の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、アミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル、またはチオールを介して直接アシル化される。一部の実施形態では、アシル化は１０、２０、２４、または２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）である。これに関して、アシル化されているグルカゴン関連ペプチドは、配列番号７０１のアミノ酸配列、または本明細書に記載するアミノ酸改変を１つまたは複数含む改変されているアミノ酸配列を含むことができ、１０、２０、２４、および２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）のうち少なくとも１つのアミノ酸が、側鎖アミン、ヒドロキシル、またはチオールを含むあらゆるアミノ酸に対して改変されている。本発明の一部の具体的な実施形態では、グルカゴン関連ペプチドの直接的なアシル化は、１０位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）のアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル、またはチオールを介して生じる。
【００９４】
一部の実施形態では、側鎖アミンを含むアミノ酸は、式Ｉのアミノ酸である。
【化１１】
2016521253.tif 000013
（式中、ｎ＝１〜４である）
［式Ｉ］
【００９５】
一部の例示的な実施形態では、式Ｉのアミノ酸は、ｎが４であるアミノ酸（Ｌｙｓ）、またはｎが３であるアミノ酸（Ｏｒｎ）である。
【００９６】
他の実施形態では、側鎖ヒドロキシルを含むアミノ酸は、式ＩＩのアミノ酸である。
【化１２】
2016521253.tif 000014
（式中、ｎ＝１〜４である）
［式ＩＩ］
【００９７】
一部の例示的な実施形態では、式ＩＩのアミノ酸は、ｎが１であるアミノ酸（Ｓｅｒ）である。
さらに他の実施形態では、側鎖チオールを含むアミノ酸は、式ＩＩＩのアミノ酸である。
【化１３】
2016521253.tif 000015
（式中、ｎ＝１〜４である）
［式ＩＩＩ］
【００９８】
一部の例示的な実施形態では、式ＩＩＩのアミノ酸は、ｎが１であるアミノ酸（Ｃｙｓ）である。
グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドであるさらに他の実施形態では、側鎖アミン、ヒドロキシル、またはチオールを含むアミノ酸は、式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩのアミノ酸のアルファ炭素に結合している水素が第２の側鎖で置き換えられている以外は、式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩの同じ構造を含む二置換されているアミノ酸である。
【００９９】
本発明の一部の実施形態では、アシル化されているグルカゴン関連ペプチドは、ペプチドとアシル基との間にスペーサーを含む。一部の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドはスペーサーに共有結合しており、スペーサーはアシル基に共有結合している。一部の例示的な実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、スペーサーのアミン、ヒドロキシル、またはチオールのアシル化によるアシル基を含むように改変されており、このスペーサーは１０、２０、２４、もしくは２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）で、またはグルカゴン関連ペプチドのＣ末端アミノ酸で、アミノ酸の側鎖に結合している。スペーサーが結合するアミノ酸は、スペーサーに対する連結を可能にする部分を含むあらゆるアミノ酸であってよい。例えば、側鎖−ＮＨ2、−ＯＨ、または−ＣＯＯＨを含むアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、もしくはＧｌｕ）が適切である。また、クラス１、クラス２、クラス６、およびクラス３のグルカゴン関連ペプチドに関して、側鎖−ＮＨ2、−ＯＨ、または−ＣＯＯＨを含むアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、もしくはＧｌｕ）（例えば、単一の、もしくは二重にα−置換されているアミノ酸）が適切である。これに関して、アシル化されているグルカゴン関連ペプチドは、配列番号７０１のアミノ酸配列、または本明細書に記載するアミノ酸改変を１つもしくは複数含む、改変されているアミノ酸配列を含むことができ、１０、２０、２４、および２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）のうち少なくとも１つのアミノ酸が、側鎖アミン、ヒドロキシル、またはカルボキシレートを含むあらゆるアミノ酸に対して改変されている。
【０１００】
一部の実施形態では、スペーサーは、側鎖アミン、ヒドロキシル、もしくはチオールを含むアミノ酸、または側鎖アミン、ヒドロキシル、もしくはチオールを含むアミノ酸を含むジペプチドもしくはトリペプチドである。一部の実施形態では、アミノ酸スペーサーは、γ−Ｇｌｕではない。一部の実施形態では、ジペプチドスペーサーは、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕではない。
【０１０１】
スペーサーのアミノ酸のアミン基を介してアシル化が生じる場合、アシル化は、アミノ酸のアルファアミンまたは側鎖アミンを介して生じ得る。アルファアミンがアシル化されている場合、スペーサーのアミノ酸はあらゆるアミノ酸であってよい。例えば、スペーサーのアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒなどの疎水性のアミノ酸であってよい。グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである一部の実施形態では、スペーサーのアミノ酸は、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸などの疎水性アミノ酸であってよい。あるいは、スペーサーのアミノ酸は、ＡｓｐおよびＧｌｕなどの酸性残基であってよい。スペーサーのアミノ酸の側鎖アミンがアシル化されている場合、スペーサーのアミノ酸は、式Ｉのアミノ酸（例えば、ＬｙｓまたはＯｒｎ）など、側鎖アミンを含むアミノ酸である。この場合、アルファアミンおよびスペーサーのアミノ酸の側鎖アミンの両方がアシル化され、その結果グルカゴンペプチドがジアシル化されることが可能である。本発明の実施形態はこのようなジアシル化されている分子を含む。
【０１０２】
アシル化が、スペーサーのアミノ酸のヒドロキシル基を介して生じる場合、アミノ酸、またはジペプチドもしくはトリペプチドのアミノ酸の１つは、式ＩＩのアミノ酸であってよい。具体的な例示的な一実施形態では、アミノ酸はＳｅｒである。
アシル化が、スペーサーのアミノ酸のチオール基を介して生じる場合、アミノ酸、またはジペプチドもしくはトリペプチドのアミノ酸の１つは、式ＩＩＩのアミノ酸であってよい。具体的な例示的な一実施形態では、アミノ酸はＣｙｓである。
一部の実施形態では、スペーサーは、親水性の二官能性スペーサーを含む。具体的な一実施形態では、スペーサーは、アミノポリ（アルキルオキシ）カルボキシレートを含む。これに関して、スペーサーは、例えば、ＮＨ2（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n（ＣＨ2）mＣＯＯＨを含むことができ、式中、ｍは１〜６のあらゆる整数であり、ｎは２〜１２のあらゆる整数であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ＫＹ）から市販されている、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸などである。
【０１０３】
一部の実施形態では、クラス１、クラス２、クラス６、およびクラス３のグルカゴン関連ペプチドのみに関して、スペーサーは、親水性の二官能性スペーサーを含む。ある特定の実施形態では、クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合している親水性の二官能性スペーサーは、アミン、ヒドロキシル、チオール、およびカルボキシル基、またはこれらのあらゆる組合せなどの２つ以上の反応基を含む。ある特定の実施形態では、クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合している親水性の二官能性スペーサーは、ヒドロキシル基およびカルボキシレートを含む。他の実施形態では、クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合している親水性の二官能性スペーサーは、アミン基およびカルボキシレートを含む。他の実施形態では、クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合している親水性の二官能性スペーサーは、チオール基およびカルボキシレートを含む。
【０１０４】
グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである一部の実施形態では、スペーサーは疎水性の二官能性スペーサーである。疎水性の二官能性スペーサーは、当技術分野では知られている。例えば、その全文が参照によって本明細書に援用される、Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996)を参照されたい。ある特定の実施形態では、クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合している疎水性の二官能性スペーサーは、アミン、ヒドロキシル、チオール、およびカルボキシル基、またはこれらのあらゆる組合せなどの２つ以上の反応基を含む。ある特定の実施形態では、クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合している疎水性の二官能性スペーサーは、ヒドロキシル基およびカルボキシレートを含む。他の実施形態では、クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合している疎水性の二官能性スペーサーは、アミン基およびカルボキシレートを含む。他の実施形態では、クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合している疎水性の二官能性スペーサーは、チオール基およびカルボキシレートを含む。カルボキシレートおよびヒドロキシル基またはチオール基を含む、適切な疎水性の二官能性スペーサーは当技術分野では知られており、８−ヒドロキシオクタン酸および８−メルカプトオクタン酸などを含む。
【０１０５】
一部の実施形態では、クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合している二官能性スペーサーは、非分枝の、カルボキシレート基の間に炭素原子１〜７個のメチレンを含むジカルボン酸ではない。一部の実施形態では、クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合している二官能性スペーサーは、非分枝の、カルボキシレート基の間に炭素原子１〜７個のメチレンを含むジカルボン酸である。
【０１０６】
スペーサー（例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性の二官能性スペーサー、または疎水性の二官能性スペーサー）は、グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである具体的な実施形態では、長さ３〜１０原子（例えば、６〜１０原子（例えば、６、７、８、９、または１０原子））である。グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドであるより詳しい実施形態では、スペーサーは、長さ約３〜１０原子（例えば、６〜１０原子）であり、アシル基は、Ｃ１４脂肪アシル基、Ｃ１６脂肪アシル基などのＣ１２−Ｃ１８脂肪アシル基であり、したがってスペーサーおよびアシル基の全長は１４〜２８原子、例えば、約１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８原子である。グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである一部の実施形態では、スペーサーおよびアシル基の長さは１７〜２８（例えば、１９〜２６、１９〜２１）原子である。
【０１０７】
グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドであるある特定の実施形態によれば、二官能性スペーサーは、長さ３〜１０原子であるアミノ酸のバックボーン（例えば、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、および８−アミノオクタン酸）を含む、合成の、または天然に存在するアミノ酸（それだけには限定されないが本明細書に記載するいずれかを含む）であってよい。あるいは、クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合しているスペーサーは、長さ３〜１０原子（例えば、６〜１０原子）であるペプチドバックボーンを有するジペプチドまたはトリペプチドのスペーサーであってよい。クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合しているジペプチドまたはトリペプチドのスペーサーの各アミノ酸は、ジペプチドまたはトリペプチドの他のアミノ酸（複数可）と同じでも、または異なっていてもよく、天然に存在する、および／または天然に存在しないアミノ酸、例えば、天然に存在するアミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）のＤもしくはＬ異性体のいずれか、または、β−アラニン（β−Ａｌａ）、Ｎ−α−メチル−アラニン（Ｍｅ−Ａｌａ）アミノ酪酸（Ａｂｕ）、γ−アミノ酪酸（γ−Ａｂｕ）、アミノヘキサン酸（ε−Ａｈｘ）、アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、アミノメチルピロールカルボン酸、アミノピペリジンカルボン酸、アミノセリン（Ａｍｓ）、アミノテトラヒドロピラン−４−カルボン酸、アルギニンＮ−メトキシ−Ｎ−メチルアミド、β−アスパラギン酸（β−Ａｓｐ）、アゼチジンカルボン酸、３−（２−ベンゾチアゾリル）アラニン、α−ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、２−アミノ−５−ウレイド−ｎ−吉草酸（シトルリン、Ｃｉｔ）、β−シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、アセトアミドメチル−システイン、ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）、ジメチルチアゾリジン（ＤＭＴＡ）、γ−グルタミン酸（γ−Ｇｌｕ）、ホモセリン（Ｈｓｅ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、イソロイシンＮ−メトキシ−Ｎ−メチルアミド、メチル−イソロイシン（ＭｅＩｌｅ）、イソニペコチン酸（Ｉｓｎ）、メチル−ロイシン（ＭｅＬｅｕ）、メチル−リシン、ジメチル−リシン、トリメチル−リシン、メタノプロリン、メチオニン−スルホキシド（Ｍｅｔ（Ｏ））、メチオニン−スルホン（Ｍｅｔ（Ｏ2））、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、メチル−ノルロイシン（Ｍｅ−Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、パラ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、ペニシラミン（Ｐｅｎ）、メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｃｌ））、４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））、４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−ＮＯ2））、４−シアノフェニルアラニン（（Ｐｈｅ（４−ＣＮ））、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、ピペリジニルアラニン、ピペリジニルグリシ���、３，４−デヒドロプロリン、ピロリジニルアラニン、サルコシン（Ｓａｒ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ）、Ｏ−ベンジル−ホスホセリン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸（Ｓｔａ）、４−アミノ−５−シクロヘキシル−３−ヒドロキシペンタン酸（ＡＣＨＰＡ）、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸（ＡＨＰＰＡ）、１，２，３，４，−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）、テトラヒドロピラングリシン、チエニルアラニン（Ｔｈｉ）、Ｏ−ベンジル−ホスホチロシン、Ｏ−ホスホチロシン、メトキシチロシン、エトキシチロシン、Ｏ−（ｂｉｓ−ジメチルアミノ−ホスホノ）−チロシン、チロシン硫酸テトラブチルアミン、メチル−バリン（ＭｅＶａｌ）、およびアルキル化３−メルカプトプロピオン酸からなる群から選択される天然に存在しないアミノ酸のあらゆるＤまたはＬ異性体からなる群から独立に選択することができる。
【０１０８】
グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである一部の実施形態では、スペーサーは、全体的に負の電荷を含み、例えば、１または２個の負に荷電アミノ酸を含む。グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである一部の実施形態では、ジペプチドは一般構造Ａ−Ｂのジペプチドのいずれかではなく、式中、Ａは、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、およびＰｒｏからなる群から選択され、Ｂは、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐからなる群から選択される。グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである一部の実施形態では、ジペプチドスペーサーは、Ａｌａ−Ａｌａ、β−Ａｌａ−β−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、γ−アミノ酪酸−γ−アミノ酪酸、およびγ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕからなる群から選択される。
【０１０９】
グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである一部の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン関連ペプチドによる長鎖アルカンのアシル化によるアシル基を含むように改変される。グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである具体的な態様では、長鎖アルカンは、グルカゴン関連ペプチドのカルボキシル基、またはその活性型と反応する、アミン、ヒドロキシル、またはチオール基（例えば、オクタデシルアミン、テトラデカノール、およびヘキサデカンチオール）を含む。クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドのカルボキシル基またはその活性型は、グルカゴン関連ペプチドのアミノ酸（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）の側鎖の一部であってもよく、またはペプチドバックボーンの一部であってもよい。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴンペプチドに結合しているスペーサーによる長鎖アルカンのアシル化によりアシル基を含むように改変される。具体的な態様では、長鎖アルカンは、スペーサーの、カルボキシル基またはその活性型と反応するアミン、ヒドロキシル、またはチオール基を含む。カルボキシル基またはその活性型を含む適切なスペーサーは、本明細書に記載するものであり、例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性の二官能性スペーサーなどの二官能性スペーサー、および疎水性の二官能性スペーサーを含む。
本明細書で使用する「活性型のカルボキシル基」の語は、一般式Ｒ（Ｃ＝Ｏ）Ｘを有するカルボキシル基を意味し、式中、Ｘは脱離基であり、Ｒはグルカゴン関連ペプチドまたはスペーサーである。例えば、活性型のカルボキシル基には、それだけには限定されないが、塩化アシル、無水物、およびエステルが含まれ得る。一部の実施形態では、活性化されているカルボキシル基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）脱離基とのエステルである。
【０１１１】
長鎖アルカンがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドまたはスペーサーによってアシル化されている本発明のこれらの態様に関して、長鎖アルカンはあらゆるサイズであってよく、あらゆる長さの炭素鎖を含むことができる。長鎖アルカンは直鎖でも、または分枝でもよい。グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドであるある特定の態様では、長鎖アルカンはＣ４〜Ｃ３０アルカンである。例えば、長鎖アルカンは、Ｃ４アルカン、Ｃ６アルカン、Ｃ８アルカン、Ｃ１０アルカン、Ｃ１２アルカン、Ｃ１４アルカン、Ｃ１６アルカン、Ｃ１８アルカン、Ｃ２０アルカン、Ｃ２２アルカン、Ｃ２４アルカン、Ｃ２６アルカン、Ｃ２８アルカン、またはＣ３０アルカンのいずれかであってよい。グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである一部の実施形態では、長鎖アルカンは、Ｃ８〜Ｃ２０アルカン、例えば、Ｃ１４アルカン、Ｃ１６アルカン、またはＣ１８アルカンを含む。
【０１１２】
また、グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである一部の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドのアミン、ヒドロキル、またはチオール基は、コレステロール酸でアシル化されている。特定の実施形態では、クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、アルキル化されているｄｅｓ−アミノＣｙｓスペーサー、すなわちアルキル化されている３−メルカプトプロピオン酸スペーサーを介してコレステロール酸に連結している。
【０１１３】
アミン、ヒドロキシル、およびチオールによるペプチドのアシル化の適切な方法は当技術分野では知られている。例えば、Miller, Biochem Biophys Res Commun 218: 377-382 (1996)、Shimohigashi and Stammer, Int J Pept Protein Res 19: 54-62 (1982)、およびPreviero et al., Biochim Biophys Acta 263: 7-13 (1972)（ヒドロキシルを介するアシル化の方法に対して）、およびSan and Silvius, J Pept Res 66: 169-180 (2005)（チオールを介するアシル化の方法に対して）、Bioconjugate Chem. "Chemical Modifications of Proteins: History and Applications" pages 1, 2-12 (1990)、Hashimoto et al., Pharmacuetical Res. "Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity" Vol. 6, No: 2 pp.171-176 (1989)を参照されたい。
【０１１４】
アシル化されているグルカゴン関連ペプチドのアシル基は、あらゆる長さの炭素鎖など、あらゆるサイズであってよく、直鎖でも、または分枝でもよい。本発明の一部の具体的な実施形態では、アシル基はＣ４〜Ｃ３０脂肪酸である。例えば、アシル基は、Ｃ４脂肪酸、Ｃ６脂肪酸、Ｃ８脂肪酸、Ｃ１０脂肪酸、Ｃ１２脂肪酸、Ｃ１４脂肪酸、Ｃ１６脂肪酸、Ｃ１８脂肪酸、Ｃ２０脂肪酸、Ｃ２２脂肪酸、Ｃ２４脂肪酸、Ｃ２６脂肪酸、Ｃ２８脂肪酸、またはＣ３０脂肪酸のいずれかであってよい。一部の実施形態では、アシル基はＣ８〜Ｃ２０脂肪酸、例えば、Ｃ１４脂肪酸またはＣ１６脂肪酸である。
代替の一実施形態では、アシル基は胆汁酸である。胆汁酸は、それだけには限定されないが、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、およびコレステロール酸を含めたあらゆる適切な胆汁酸であってよい。
【０１１５】
本明細書に記載する、アシル化されているグルカゴン関連ペプチドは、親水性部分を含むようにさらに改変することができる。一部の具体的な実施形態では、親水性部分はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含むことができる。親水性部分の組入れは、本明細書に記載する方法のいずれかなど、あらゆる適切な手段によって遂行することができる。これに関して、アシル化されているグルカゴン関連ペプチドは、本明細書に記載する改変のいずれかを含めた配列番号７０１を含むことができ、この配列番号７０１では、１０、２０、２４、および２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）のうち少なくとも１つのアミノ酸がアシル基を含み、１６、１７、２１、２４、または２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）、Ｃ末端伸長内の位置、またはＣ末端アミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸がＣｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ、またはＡｃ−Ｐｈｅに対して改変され、アミノ酸の側鎖が親水性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合している。一部の実施形態では、アシル基は、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ、またはＡｃ−Ｐｈｅを含むスペーサーを介してもよく、１０位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）に結合しており、親水性部分は２４位のＣｙｓ残基で組み入れられる。
あるいは、アシル化されているグルカゴン関連ペプチドはスペーサーを含むことができ、スペーサーは、親水性部分を含むようにアシル化および改変の両方がなされている。適切なスペーサーの非限定的な例には、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ、およびＡｃ−Ｐｈｅからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸を含むスペーサーが含まれる。
【０１１６】
アルキル化
一部の実施形態によれば、クラス１グルカゴン関連ペプチド、クラス２グルカゴン関連ペプチド、クラス３グルカゴン関連ペプチド、クラス４グルカゴン関連ペプチド、クラス５グルカゴン関連ペプチド、またはクラス６グルカゴン関連ペプチドなどのグルカゴン関連ペプチドは、循環半減期を延ばし、および／または発症を遅らせ、および／または作用の持続時間を延長し、および／またはＤＰＰ−ＩＶなどのプロテアーゼに対する抵抗性を改善する目的で、グルカゴン関連ペプチドにエーテル、チオエーテル、またはアミノ連結によって結合しているアルキル基を含むように改変される。グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３グルカゴン関連ペプチドである例示的な実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、天然に存在するアミノ酸に非天然であるアルキル基を含む。
【０１１７】
アルキル化は、グルカゴン、ＧＬＰ−１、または他のグルカゴン関連ペプチドの受容体に関して、グルカゴン関連ペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト活性が保持されるのであれば、１〜２９位のいずれか、Ｃ末端伸長内の位置、またはＣ末端アミノ酸を含めた、グルカゴン関連ペプチド内のあらゆる位置で行われてよい。一部の実施形態では、非アルキル化ペプチドにグルカゴンアゴニスト活性があれば、アルキル化ペプチドはグルカゴンアゴニスト活性を保持している。他の実施形態では、非アルキル化ペプチドにグルカゴンアンタゴニスト活性があれば、アルキル化ペプチドはグルカゴンアンタゴニスト活性を保持している。一部の実施形態では、非アルキル化ペプチドにＧＬＰ−１アゴニスト活性があれば、アルキル化ペプチドはＧＬＰ−１アゴニスト活性を保持している。非限定的な例として、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、または２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）のアルキル化が含まれる。クラス１、クラス２、クラス６、およびクラス３のグルカゴン関連ペプチドに関して、アルキル化は、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、２９、３０、３７、３８、３９、４０、４１、４２、または４３位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）に生じ得る。アルキル基は、グルカゴン関連ペプチドのアミノ酸に直接、またはグルカゴン関連ペプチドのアミノ酸にスペーサーによって間接的に、共有結合により連結していてよく、スペーサーはグルカゴン関連ペプチドのアミノ酸とアルキル基との間に位置付けられる。グルカゴン関連ペプチドは、親水性部分が連結している同じアミノ酸位置でアルキル化されても、または異なるアミノ酸位置でアルキル化されてもよい。非限定的な例には、１０位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）のアルキル化、およびグルカゴン関連ペプチドのＣ末端部分における、例えば、２４、２８、または２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）の、Ｃ末端伸長内の、またはＣ末端（例えば、Ｃ末端のＣｙｓの付加を介して）における１つまたは複数の位置のペグ化が含まれる。
【０１１８】
本発明の具体的な一態様では、グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン関連ペプチドのアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル、またはチオールの直接的なアルキル化によりアルキル基を含むように改変される。一部の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、アミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル、またはチオールを介して直接アルキル化される。一部の実施形態では、アルキル化は、１０、２０、２４、または２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）である。これに関して、アルキル化されているグルカゴン関連ペプチドは、配列番号７０１のアミノ酸配列、または本明細書に記載する１つまたは複数のアミノ酸改変を含む改変されているアミノ酸配列を含むことができ、１０、２０、２４、および２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）のうち少なくとも１つのアミノ酸は、側鎖アミン、ヒドロキシル、またはチオールを含むあらゆるアミノ酸に対して改変されている。本発明の一部の具体的な実施形態では、グルカゴン関連ペプチドの直接的なアルキル化は、１０位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）のアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル、またはチオールを介して生じる。
【０１１９】
一部の実施形態では、側鎖アミンを含むアミノ酸は式Ｉのアミノ酸である。一部の例示的な実施形態では、式Ｉのアミノ酸は、ｎが４であるアミノ酸（Ｌｙｓ）、またはｎが３であるアミノ酸（Ｏｒｎ）である。
他の実施形態では、側鎖ヒドロキシルを含むアミノ酸は式ＩＩのアミノ酸である。一部の例示的な実施形態では、式ＩＩのアミノ酸は、ｎが１であるアミノ酸（Ｓｅｒ）である。
さらに他の実施形態では、側鎖チオールを含むアミノ酸は式ＩＩＩのアミノ酸である。一部の例示的な実施形態では、式ＩＩのアミノ酸は、ｎが１であるアミノ酸（Ｃｙｓ）である。
【０１２０】
グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドであるさらに他の実施形態では、側鎖アミン、ヒドロキシル、またはチオールを含むアミノ酸は、式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩのアミノ酸のアルファ炭素に結合している水素が第２の側鎖で置き換えられている以外は、式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩの同じ構造を含む二置換されているアミノ酸である。
【０１２１】
本発明の一部の実施形態では、アルキル化されているグルカゴン関連ペプチドは、ペプチドとアルキル基との間にスペーサーを含む。一部の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドはスペーサーに共有結合しており、スペーサーはアルキル基に共有結合している。一部の例示的な実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、スペーサーのアミン、ヒドロキシル、またはチオールのアルキル化によるアルキル基を含むように改変され、スペーサーは、グルカゴン関連ペプチドの１０、２０、２４、または２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）でアミノ酸の側鎖に結合している。スペーサーが結合しているアミノ酸は、スペーサーに対する連結を可能にする部分を含むあらゆるアミノ酸であってよい。クラス１、クラス２、クラス６、およびクラス３のグルカゴン関連ペプチドに関して、スペーサーが結合しているアミノ酸は、スペーサーに対する連結を可能にする部分を含むあらゆるアミノ酸（例えば、単一のα−置換アミノ酸、またはα，α−二置換アミノ酸）であってよい。例えば、側鎖−ＮＨ2、−ＯＨ、または−ＣＯＯＨを含むアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、もしくはＧｌｕ）が適切である。これに関して、アルキル化されているグルカゴン関連ペプチドは、配列番号７０１のアミノ酸配列、または本明細書に記載するアミノ酸改変を１つもしくは複数含む改変されているアミノ酸配列を含むことができ、１０、２０、２４、および２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）のうち少なくとも１つのアミノ酸が、側鎖アミン、ヒドロキシル、またはカルボキシレートを含むあらゆるアミノ酸に対して改変されている。
一部の実施形態では、スペーサーは、側鎖アミン、ヒドロキシル、もしくはチオールを含むアミノ酸、または側鎖アミン、ヒドロキシル、もしくはチオールを含むアミノ酸を含むジペプチドもしくはトリペプチドである。一部の実施形態では、アミノ酸スペーサーは、γ−Ｇｌｕではない。一部の実施形態では、ジペプチドスペーサーはγ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕではない。
【０１２２】
アルキル化が、スペーサーのアミノ酸のアミン基を介して生じる場合、アルキル化は、アミノ酸のアルファアミンまたは側鎖アミンを介して生じ得る。アルファアミンがアルキル化されている場合、スペーサーのアミノ酸はあらゆるアミノ酸であってよい。例えば、スペーサーのアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒなどの疎水性アミノ酸であってよい。あるいは、スペーサーのアミノ酸は、ＡｓｐおよびＧｌｕなどの酸性残基であってよい。グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである例示的な実施形態では、スペーサーのアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸などの疎水性アミノ酸であってよい。あるいは、アルキル化が酸性残基のアルファアミン上で生じるのであれば、クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合しているスペーサーのアミノ酸は、ＡｓｐおよびＧｌｕなどの酸性残基であってよい。スペーサーのアミノ酸の側鎖アミンがアルキル化されている場合、スペーサーのアミノ酸は、式Ｉのアミノ酸など、側鎖アミンを含むアミノ酸である（例えば、ＬｙｓまたはＯｒｎ）。この場合、アルファアミンおよびスペーサーのアミノ酸の側鎖アミンの両方がアルキル化され、したがってグルカゴンペプチドがジアルキル化されているのが可能である。本発明の実施形態は、このようなジアルキル化分子を含む。
【０１２３】
アルキル化が、スペーサーのアミノ酸のヒドロキシル基を介して生じる場合、アミノ酸またはスペーサーの１つのアミノ酸は式ＩＩのアミノ酸であってよい。具体的な例示的な一実施形態では、アミノ酸はＳｅｒである。
【０１２４】
アルキル化が、スペーサーのアミノ酸のチオール基を介して生じる場合、アミノ酸またはスペーサーの１つのアミノ酸は式ＩＩＩのアミノ酸であってよい。具体的な例示的な一実施形態では、アミノ酸はＣｙｓである。
一部の実施形態では、スペーサーは、親水性の二官能性スペーサーを含む。具体的な一実施形態では、スペーサーは、アミノポリ（アルキルオキシ）カルボキシレートを含む。これに関して、スペーサーは、例えば、ＮＨ2（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n（ＣＨ2）mＣＯＯＨを含むことができ、式中、ｍは１〜６のあらゆる整数であり、ｎは２〜１２のあらゆる整数であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ＫＹ）から市販されている、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸などである。
【０１２５】
グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである一部の実施形態では、スペーサーは親水性の二官能性スペーサーである。ある特定の実施形態では、クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合している親水性の二官能性スペーサーは、アミン、ヒドロキシル、チオール、およびカルボキシル基、またはこれらのあらゆる組合せなどの２つ以上の反応基を含む。ある特定の実施形態では、クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合している親水性の二官能性スペーサーは、ヒドロキシル基およびカルボキシレートを含む。他の実施形態では、クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合している親水性の二官能性スペーサーは、アミン基およびカルボキシレートを含む。他の実施形態では、クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合している親水性の二官能性スペーサーは、チオール基およびカルボキシレートを含む。
【０１２６】
一部の実施形態では、クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合しているスペーサーは、疎水性の二官能性スペーサーである。ある特定の実施形態では、クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合している疎水性の二官能性スペーサーは、アミン、ヒドロキシル、チオール、およびカルボキシル基、またはこれらのあらゆる組合せなどの２つ以上の反応基を含む。ある特定の実施形態では、クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合している疎水性の二官能性スペーサーは、ヒドロキシル基およびカルボキシレートを含む。他の実施形態では、クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合している疎水性の二官能性スペーサーは、アミン基およびカルボキシレートを含む。他の実施形態では、クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合している疎水性の二官能性スペーサーは、チオール基およびカルボキシレートを含む。カルボキシレートおよびヒドロキシル基またはチオール基を含む、適切な疎水性の二官能性スペーサーは当技術分野では知られており、８−ヒドロキシオクタン酸および８−メルカプトオクタン酸などを含む。
【０１２７】
グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである具体的な実施形態におけるスペーサー（例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性の二官能性スペーサー、または疎水性の二官能性スペーサー）は、長さ３〜１０原子（例えば、６〜１０原子（例えば、６、７、８、９、または１０原子））である。より具体的な実施形態では、クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合しているスペーサーは、長さ約３〜１０原子（例えば、６〜１０原子）であり、アルキルはＣ１４アルキル基、Ｃ１６アルキル基などのＣ１２−Ｃ１８アルキル基であり、したがってスペーサーおよびアルキル基の合計の長さは１４〜２８原子、例えば、約１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８原子である。グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである一部の実施形態では、スペーサーおよびアルキルの長さは１７〜２８（例えば、１９〜２６、１９〜２１）原子である。
【０１２８】
グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである前述のある特定の実施形態によれば、二官能性スペーサーは、長さ３〜１０原子であるアミノ酸のバックボーンを含む、合成の、または天然に存在しないアミノ酸（例えば、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、および８−アミノオクタン酸）であってよい。あるいは、クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合しているスペーサーは、長さ３〜１０原子（例えば、６〜１０原子）であるペプチドのバックボーンを有するジペプチドまたはトリペプチドのスペーサーであってよい。クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合しているジペプチドまたはトリペプチドのスペーサーは、例えば、本明細書に教示するアミノ酸のいずれかを含めた、天然に存在するアミノ酸、および／または天然に存在しないアミノ酸からなっていてよい。グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである一部の実施形態では、スペーサーは全体的に負の電荷を含み、例えば、１または２個の負に荷電しているアミノ酸を含む。グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである一部の実施形態では、ジペプチドスペーサーは、Ａｌａ−Ａｌａ、β−Ａｌａ−β−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、γ−アミノ酪酸−γ−アミノ酪酸、およびγ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕからなる群から選択される。一部の実施形態では、ジペプチドスペーサーは、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕではない。
【０１２９】
アミン、ヒドロキシル、およびチオールによるペプチドのアルキル化の適切な方法は、当技術分野では知られている。例えば、ウィリアムソンエーテル合成を使用して、グルカゴン関連ペプチドとアルキル基との間にエーテル連結を形成してもよい。また、ペプチドのハロゲン化アルキルとの求核置換反応により、エーテル、チオエーテル、またはアミン連結のいずれかが生じ得る。
アルキル化されているグルカゴン関連ペプチドのアルキル基はあらゆるサイズ、例えば、あらゆる長さの炭素鎖であってよく、直鎖でも、または分枝でもよい。本発明の一部の実施形態では、アルキル基はＣ４〜Ｃ３０アルキルである。例えば、アルキル基は、Ｃ４アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ８アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ１２アルキル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１６アルキル、Ｃ１８アルキル、Ｃ２０アルキル、Ｃ２２アルキル、Ｃ２４アルキル、Ｃ２６アルキル、Ｃ２８アルキル、またはＣ３０アルキルのいずれかであってよい。一部の実施形態では、アルキル基は、Ｃ８−Ｃ２０アルキル、例えば、Ｃ１４アルキルまたはＣ１６アルキルである。
【０１３０】
一部の具体的な実施形態では、アルキル基は、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、およびコレステロール酸などの胆汁酸のステロイド部分を含む。
【０１３１】
グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである本発明の一部の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、求核性の長鎖アルカンをグルカゴン関連ペプチドと反応させることによりアルキル基を含むように改変され、グルカゴン関連ペプチドは求核性置換に適する脱離基を含む。グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである具体的な実施形態では、長鎖アルカンの求核性の基は、アミン、ヒドロキシル、またはチオール基を含む（例えば、オクタデシルアミン、テトラデカノール、およびヘキサデカンチオール）。クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドの脱離基は、アミノ酸の側鎖の一部であってもよく、またはペプチドバックボーンの一部であってもよい。適切な脱離基には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ハロゲン、およびスルホネートエステルなどが含まれる。
【０１３２】
ある特定の実施形態では、クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、求核性の長鎖アルカンを、グルカゴン関連ペプチドに結合しているスペーサーと反応させることによりアルキル基を含むように改変され、スペーサーは脱離基を含む。グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである具体的な態様では、長鎖アルカンは、アミン、ヒドロキシル、またはチオール基を含む。グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドであるある特定の実施形態では、脱離基を含むスペーサーは、本明細書で論じるあらゆるスペーサー、例えば、適切な脱離基をさらに含む、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性の二官能性スペーサー、および疎水性の二官能性スペーサーであってよい。
【０１３３】
グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドであり、長鎖アルカンがグルカゴン関連ペプチドまたはスペーサーによってアルキル化されている本発明のこれらの態様に関して、長鎖アルカンは、あらゆるサイズであってよく、あらゆる長さの炭素鎖を含むことができる。長鎖アルカンは、直鎖でも、または分枝でもよい。ある特定の態様では、長鎖アルカンは、Ｃ４〜Ｃ３０アルカンである。例えば、長鎖アルカンは、Ｃ４アルカン、Ｃ６アルカン、Ｃ８アルカン、Ｃ１０アルカン、Ｃ１２アルカン、Ｃ１４アルカン、Ｃ１６アルカン、Ｃ１８アルカン、Ｃ２０アルカン、Ｃ２２アルカン、Ｃ２４アルカン、Ｃ２６アルカン、Ｃ２８アルカン、またはＣ３０アルカンのいずれかであってよい。グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである一部の実施形態では、長鎖アルカンは、Ｃ８−Ｃ２０アルカン、例えば、Ｃ１４アルカン、Ｃ１６アルカン、またはＣ１８アルカンを含む。
また、グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである一部の実施形態では、アルキル化は、グルカゴン関連ペプチドとコレステロール部分との間に生じ得る。例えば、コレステロールのヒドロキシル基は、長鎖アルカン上の脱離基の位置を変えて、コレステロール−グルカゴンペプチド生成物を形成することができる。
【０１３４】
本明細書に記載するアルキル化されているグルカゴン関連ペプチドを、親水性部分を含むようにさらに改変してもよい。一部の具体的な実施形態では、親水性部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含むことができる。親水性部分の組入れは、本明細書に記載する方法のいずれかなど、あらゆる適切な手段によって遂行することができる。これに関して、アルキル化されているグルカゴン関連ペプチドは、配列番号７０１、または本明細書に記載する１つもしくは複数のアミノ酸改変を含むその改変されているアミノ酸配列を含むことができ、１０、２０、２４、および２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）のアミノ酸のうち少なくとも１つはアルキル基を含み、１６、１７、２１、２４、および２９位のアミノ酸、Ｃ末端伸長内の位置、またはＣ末端アミノ酸のうちの少なくとも１つは、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ、またはＡｃ−Ｐｈｅに対して改変され、アミノ酸の側鎖は親水性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合している。一部の実施形態では、アルキル基は、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ、またはＡｃ−Ｐｈｅを含むスペーサーを介してもよく、１０位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）に結合しており、親水性部分は２４位のＣｙｓ残基で組み入れられる。
【０１３５】
あるいは、アルキル化されているグルカゴン関連ペプチドはスペーサーを含むことができ、スペーサーは、親水性部分を含むようにアルキル化および改変の両方がなされている。適切なスペーサーの非限定的な例には、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ、およびＡｃ−Ｐｈｅからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸を含むスペーサーが含まれる。
【０１３６】
アルファヘリックス構造の安定化
一部の実施形態では、２つのアミノ酸側鎖間に分子内架橋が形成して、グルカゴン関連ペプチドのカルボキシル末端部分（例えば、アミノ酸１２〜２９（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる））の３次元構造を安定化する。２つのアミノ酸側鎖は、塩橋の形成など、水素結合、イオン性相互作用を介して、または共有結合により、相互に連結され得る。
一部の実施形態では、野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる、ｉが１２〜２５の間のあらゆる整数である（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、および２５）アミノ酸３個離れている２つのアミノ酸の、例えば、ｉ位とｉ＋４位のアミノ酸の間に、分子内架橋が形成される。より詳しくは、野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる、１２と１６と、１６と２０と、２０と２４と、または２４と２８とのアミノ酸対（ｉ＝１２、１６、２０、または２４であるアミノ酸対）の側鎖が相互に連結され、よってグルカゴンのアルファヘリックスを安定化する。あるいは、ｉは１７であってよい。
ｉ位とｉ＋４位のアミノ酸が分子内架橋によって接続される一部の具体的な実施形態では、リンカーのサイズは約８原子、または約７〜９原子である。
【０１３７】
他の実施形態では、分子内架橋は、ｊ位とｊ＋３位のアミノ酸など、アミノ酸２個離れている２つのアミノ酸間に形成し、ｊは、野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる、１２〜２６の間のあらゆる整数（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、および２６）である。一部の具体的な実施形態では、ｊは１７である。
ｊ位とｊ＋３位のアミノ酸が分子内架橋によって接続される一部の具体的な実施形態では、リンカーのサイズは、約６原子、または約５〜７原子である。
さらに他の実施形態では、分子内架橋は、ｋ位とｋ＋７位のアミノ酸など、アミノ酸６個離れている２つのアミノ酸間に形成し、ｋは、野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる、１２〜２２の間のあらゆる整数（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、および２２）である。一部の具体的な実施形態では、ｋは、１２、１３、または１７である。例示的な一実施形態では、ｋは１７である。
【０１３８】
共有結合して６原子連結性の架橋を形成することができるアミノ酸対の例には、ＯｒｎとＡｓｐと、Ｇｌｕと式Ｉのアミノ酸とが含まれ、ｎは２であり、ホモグルタミン酸と式Ｉのアミノ酸とが含まれ、ｎは１であり、式Ｉは、以下である。
【化１４】
2016521253.tif 000016
（式中、ｎ＝１〜４である）
［式Ｉ］
【０１３９】
共有結合して７原子連結性の可溶を形成することができるアミノ酸対の例には、Ｏｒｎ−Ｇｌｕ（ラクタム環）、Ｌｙｓ−Ａｓｐ（ラクタム）、またはホモｓｅｒ−ホモｇｌｕ（ラクトン）が含まれる。８原子リンカーを形成し得るアミノ酸対の例には、Ｌｙｓ−Ｇｌｕ（ラクタム）、ホモｌｙｓ−Ａｓｐ（ラクタム）、Ｏｒｎ−ホモｇｌｕ（ラクタム）、４−アミノＰｈｅ−Ａｓｐ（ラクタム）、またはＴｙｒ−Ａｓｐ（ラクトン）が含まれる。９原子リンカーを形成し得るアミノ酸対の例には、ホモｌｙｓ−Ｇｌｕ（ラクタム）、Ｌｙｓ−ホモｇｌｕ（ラクタム）、４−アミノＰｈｅ−Ｇｌｕ（ラクタム）、またはＴｙｒ−Ｇｌｕ（ラクトン）が含まれる。これらのアミノ酸上の側鎖のいずれかは、アルファヘリックスの３次元構造が乱されない限り、さらなる化学基でさらに置換されていてよい。当業者であれば、同様のサイズおよび所望の効果の安定化構造を作り出す、化学的に改変されている誘導体を含めた、代替的な対形成または代替的なアミノ酸類似体を想定することができる。例えば、ホモシステイン−ホモシステインジスルフィド架橋は長さ６原子であり、所望の効果をもたらすようにさらに改変することができる。共有結合による連結がなくても、上記に記載したアミノ酸対形成、または当業者には想定することができる同様の対形成は、塩橋の形成または水素結合性の相互作用などを介して、非共有結合を介してアルファヘリックスに安定性の付加ももたらし得る。
【０１４０】
ラクタム環のサイズは、アミノ酸側鎖の長さに応じて変動し得、一部の実施形態では、ラクタムは、リシンアミノ酸の側鎖をグルタミン酸の側鎖に連結することにより形成される。さらなる例示的な実施形態には（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）、ラクタム架橋であってもよい、以下の対形成が含まれる：１２位のＧｌｕと１６位のＬｙｓと、１２位の天然のＬｙｓと１６位のＧｌｕと、１６位のＧｌｕと２０位のＬｙｓと、１６位のＬｙｓと２０位のＧｌｕと、２０位のＧｌｕと２４位のＬｙｓと、２０位のＬｙｓと２４位のＧｌｕと、２４位のＧｌｕと２８位のＬｙｓと、２４位のＬｙｓと２８位のＧｌｕと。あるいは、ラクタム環におけるアミド結合の順序は逆転してもよい（例えば、ラクタム環はＬｙｓ１２とＧｌｕ１６との側鎖間に、または代替的にＧｌｕ１２とＬｙｓ１６との側鎖間に形成し得る）。
【０１４１】
ラクタム架橋以外の分子内架橋を使用して、グルカゴン関連ペプチドのアルファヘリックスを安定化してもよい。一部の実施形態では、分子内架橋は疎水性架橋である。この場合、分子内架橋は、グルカゴン関連ペプチドのアルファヘリックスの疎水性面の一部である２つのアミノ酸の側鎖間であってもよい。例えば、疎水性架橋によって接続されるアミノ酸の１つは、１０、１４、および１８位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）のアミノ酸であってよい。
【０１４２】
具体的な一態様では、全炭化水素架橋系を使用して、グルカゴン関連ペプチドのアルファヘリックスの１つまたは２つのターンを架橋するのに、オレフィンメタセシスを使用する。この場合のグルカゴン関連ペプチドは、様々な長さの、ｉ位およびｉ＋４位またはｉ＋７位のＲまたはＳいずれかの立体化学で形成されたオレフィン側鎖を有する、α−メチル化アミノ酸を含むことができる。例えば、オレフィン側は（ＣＨ2）ｎを含むことができ、式中、ｎは１〜６の間のあらゆる整数である。一部の実施形態では、８原子の長さの架橋に対してｎは３である。このような分子内架橋を形成する適切な方法は、当技術分野では記載されている。例えば、Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122: 5891-5892 (2000)およびWalensky et al., Science 305: 1466-1470 (2004)を参照されたい。あるいは、グルカゴンペプチドは、ルテニウムが触媒する閉環メタセシスによって一緒に架橋される、隣接するヘリックスターン上に位置するＯ−アリルＳｅｒ残基を含んでいてよい。このような架橋の手順は、Blackwell et al., Angew, Chem., Int. Ed. 37: 3281-3284 (1998)などに記載されている。
別の具体的な一態様では、アルファヘリックスの１つのターンを架橋するのに、シスチンのペプチドミメチックとして広く適用されている、非天然のチオ−ジアラニンアミノ酸であるランチオニンを使用する。ランチオニンベースの環化の適切な方法は、当技術分野では知られている。例えば、Matteucci et al., Tetrahedron Letters 45: 1399-1401 (2004)、Mayer et al., J. Peptide Res. 51: 432-436 (1998)、Polinsky et al., J. Med. Chem. 35: 4185-4194 (1992)、Osapay et al., J. Med. Chem. 40: 2241-2251 (1997)、Fukase et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 65: 2227-2240 (1992)、Harpp et al., J. Org. Chem. 36: 73-80 (1971)、Goodman and Shao, Pure Appl. Chem. 68: 1303-1308 (1996)、およびOsapay and Goodman, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1599-1600 (1993)を参照されたい。
【０１４３】
一部の実施形態では、ｉ位とｉ＋７位の２つのＧｌｕ残基間のα，ω−ジアミノアルカン繋留（例えば、１，４−ジアミノプロパンおよび１，５−ジアミノペンタン）を使用して、グルカゴンペプチドのアルファヘリックスを安定化する。このような繋留により、ジアミノアルカン繋留の長さに応じて、長さ９原子以上の架橋の形成がもたらされる。このような繋留でペプチドの架橋を生成する適切な方法が、当技術分野では記載されている。例えば、Phelan et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 455-460 (1997)を参照されたい。
【０１４４】
本発明のさらに別の実施形態では、ジスルフィド架橋を使用して、グルカゴン関連ペプチドのアルファヘリックスの１つまたは２つのターンを架橋連結する。あるいは、１つまたは両方のイオウ原子がメチレン基によって置き換えられ、等比体積の大環状化を生じる、改変されているジスルフィド架橋を使用して、グルカゴン関連ペプチドのアルファヘリックスを安定化する。ペプチドをジスルフィド架橋で改変する適切な方法またはイオウベースの環化は、例えば、Jackson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 9391-9392 (1991)およびRudinger and Jost, Experientia 20: 570-571 (1964)に記載されている。
さらに別の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドのアルファヘリックスを、ｉとｉ＋４に位置する２つのＨｉｓ残基またはＨｉｓとＣｙｓとの対による金属原子の結合により安定化する。金属原子は、Ｒｕ（ＩＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、またはＣｄ（ＩＩ）などであってよい。金属結合ベースのアルファヘリックス安定化のこのような方法は、当技術分野では知られている。例えば、Andrews and Tabor, Tetrahedron 55: 11711-11743 (1999)、Ghadiri et al., J. Am. Chem. Soc. 112: 1630-1632 (1990)、およびGhadiri et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 9063-9064 (1997)を参照されたい。
【０１４５】
グルカゴン関連ペプチドのアルファヘリックスは、代替的にペプチド環化の他の手段によって安定化してもよく、この手段は、Davies, J. Peptide. Sci. 9: 471-501 (2003)に再考されている。アルファヘリックスは、アミド架橋、チオエーテル架橋、チオエステル架橋、ウレア架橋、カーバメート架橋、スルホンアミド架橋などの形成により安定化することができる。例えば、チオエステル架橋は、Ｃ末端とＣｙｓ残基の側鎖との間に形成され得る。あるいは、チオエステルは、チオールを有するアミノ酸（Ｃｙｓ）の側鎖とカルボン酸を有するアミノ酸（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）の側鎖とにより形成され得る。別の方法では、ジカルボン酸などの架橋連結剤、例えばスベリン酸（オクタン二酸）などが、遊離のアミノ、ヒドロキシル、チオール基、およびこれらの組合せなどのアミノ酸側鎖の２つの官能基間に連結を導入することができる。
【０１４６】
一部の実施形態によれば、グルカゴン関連ペプチドのアルファヘリックスは、ｉ位およびｉ＋４位に疎水性アミノ酸を組み入れることにより安定化される。例えば、ｉはＴｙｒであってよく、ｉ＋４はＶａｌもしくはＬｅｕのいずれかであってよく、ｉはＰｈｅであってよく、ｉ＋４はＣｙｓまたはＭｅｔであってよく、ＩはＣｙｓであってよく、ｉ＋４はＭｅｔであってよく、またはｉはＰｈｅであってよく、ｉ＋４はＩｌｅであってよい。本明細書の目的では、上記のアミノ酸対形成は逆転してもよく、したがってｉ位の指摘されるアミノ酸は代替的にｉ＋４に位置してもよく、ｉ＋４のアミノ酸はｉ位に位置してもよいことを理解されたい。
【０１４７】
グルカゴン関連ペプチドが、グルカゴンアゴニスト活性、ＧＩＰアゴニスト活性、グルカゴンアンタゴニスト、およびＧＬＰ−１活性を有するペプチドである、本発明の他の実施形態によれば、アルファヘリックスは、グルカゴン関連ペプチドのＣ末端部分に（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる１２〜２９のアミノ酸周辺に）１つまたは複数のアルファヘリックスを安定化するアミノ酸を組み入れる（アミノ酸置換または挿入のいずれかにより）ことにより安定化される。具体的な一実施形態では、アルファヘリックスを安定化するアミノ酸は、それだけには限定されないが、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）；メチル、エチル、プロピル、およびｎ−ブチルから選択される同じまたは異なる基で、またはシクロオクタンもしくはシクロヘプタンで置換されているアミノ酸（例えば、１−アミノシクロオクタン−１−カルボン酸）のいずれかを含めた、α，α−二置換アミノ酸である。一部の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドの１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、または２９位のうち１、２、３、４つ、またはそれを超えて、α，α−二置換アミノ酸で置換されている。具体的な一実施形態では、１６、２０、２１、および２４位のうち１、２、３つ、または全てが、ＡＩＢで置換されている。
【０１４８】
コンジュゲート
本開示は、グルカゴン関連ペプチド（例えば、クラス１グルカゴン関連ペプチド、クラス２グルカゴン関連ペプチド、クラス３グルカゴン関連ペプチド、クラス４グルカゴン関連ペプチド、クラス５グルカゴン関連ペプチド、またはクラス６グルカゴン関連ペプチド）が、共有結合を介してもよく、リンカーを介してもよく、リンカーに連結してコンジュゲート部分に連結しているコンジュゲートも包含する。連結は、共有結合による化学結合、静電気などの物理的力、水素、イオン性、ファンデルワールス、または疎水性もしくは親水性の相互作用によって遂行することができる。ビオチン−アビジン、リガンド／受容体、酵素／基質、核酸／核酸結合タンパク質、脂質／脂質結合タンパク質、細胞接着分子パートナー；または相互に親和性を有するあらゆる結合パートナーまたはそのフラグメントを含めた、多様な非共有結合による連結系を使用してもよい。
【０１４９】
グルカゴン関連ペプチドは、ペプチドの標的化されるアミノ酸残基を、これら標的化されるアミノ酸の選択される側鎖またはＮ末端もしくはＣ末端の残基との反応を可能にする有機誘導体化剤と反応させることによる、直接的な共有結合による連結により、コンジュゲート部分に連結してもよい。ペプチドまたはコンジュゲート部分上の反応基には、例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミド、またはヒドラジノ基が含まれる。誘導体化剤には、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介したコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介した）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、または当技術分野において知られている他の薬剤が含まれる。あるいは、コンジュゲート部分はペプチドに、多糖またはポリペプチドの担体などの中間体の担体を介して間接的に連結してもよい。多糖の担体の例には、アミノデキストランが含まれる。適切なポリペプチドの担体の例には、得られる充填される担体上に所望の溶解性の性質を付与する、ポリリシン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、これらの共重合体、およびこれらのアミノ酸とセリンなどの他者との混合ポリマーが含まれる。
【０１５０】
システイニル残基は、最も一般的に、クロロ酢酸またはクロルアセトアミドなどのα−ハロアセテート（および対応するアミン）と反応して、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、アルファ−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ第二水銀安息香酸、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応により誘導体化される。
【０１５１】
ヒスチジル残基は、ヒスチジル側鎖に比較的特異的であるため、ｐＨ５．５〜７．０でジエチルピロカーボネートと反応することにより誘導体化される。パラ−ブロモフェナシルブロミドも有用であり、反応はｐＨ６．０の０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で行うのが好ましい。
リシニル（ｌｙｓｉｎｙｌ）残基およびアミノ末端残基は、無水コハク酸または他の無水カルボン酸と反応する。これらの薬剤での誘導体化には、リシニル残基の電荷を逆転する効果がある。アルファ−アミノ含有残基を誘導体化するのに適する他の試薬には、メチルピコリンイミデートなどのイミドエステル、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン、およびトランスアミナーゼが触媒するグリオキシレートとの反応が含まれる。
【０１５２】
アルギニル残基は、１つまたは数個の慣例的な試薬との反応により改変され、その中にはフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンがある。グアニジン官能基のｐＫaは高いため、アルギニン残基の誘導体化は、反応をアルカリ条件中で行うことを必要とする。さらに、これらの試薬は、リシンの基、およびアルギニンのイプシロン−アミノ基と反応し得る。
チロシル残基の特異的な改変は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によって、スペクトル標識（ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｌａｂｅｌ）のチロシル残基中への導入において行ってもよいのは特に興味深い。Ｎ−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成するのが最も一般的である。
【０１５３】
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応により選択的に改変され、式中、ＲおよびＲ’は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどの異なるアルキル基である。さらに、アスパルチル残基およびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換される。
他の改変には、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリル残基およびスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化（T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)）、アスパラギンもしくはグルタミンの脱アミド、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに／またはＣ末端カルボキシル酸基のアミド化もしくはエステル化が含まれる。
別のタイプの共有結合による改変は、グリコシドをペプチドに化学的または酵素的にカップリングすることを伴う。糖（複数可）は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離のカルボキシル基、（ｃ）遊離のスルフヒドリル基、例えばシステインのスルフヒドリル基、（ｄ）遊離のヒドロキシル基、例えばセリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのヒドロキシル基、（ｅ）芳香性残基、例えばチロシンもしくはトリプトファンの芳香性残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合していてよい。これらの方法は、１９８７年９月１１日公開のＷＯ８７／０５３３０、およびAplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
【０１５４】
本明細書に記載するグルカゴン関連ペプチドのいずれかに連結することができる例示的なコンジュゲート部分には、それだけには限定されないが、異種性のペプチドもしくはポリペプチド（例えば、血漿タンパク質を含む）、標的化剤、免疫グロブリンもしくはその部分（例えば、可変領域、ＣＤＲ、もしくはＦｃ領域）、診断用標識、例えば、放射性同位元素、フルオロフォア、もしくは酵素の標識、水溶性ポリマーを含むポリマー、または他の治療用もしくは診断用の薬剤が含まれる。一部の実施形態では、本発明のグルカゴン関連ペプチドおよび血漿タンパク質を含むコンジュゲートが提供され、血漿タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、フィブリノーゲン、およびグロブリンからなる群から選択される。一部の実施形態では、コンジュゲートの血漿タンパク質部分はアルブミンまたはトランスフェリンである。一部の実施形態では、リンカーは、長さ原子１〜約６０原子、または１〜３０原子もしくはそれを超える、２〜５原子、２〜１０原子、５〜１０原子、または１０〜２０原子の鎖を含む。一部の実施形態では、鎖の原子は全て炭素原子である。一部の実施形態では、リンカーのバックボーンにおける鎖の原子は、Ｃ、Ｏ、Ｎ、およびＳからなる群から選択される。鎖の原子およびリンカーは、より溶解性のコンジュゲートを提供するように、これらに予想される溶解性（親水性）に従って選択され得る。一部の実施形態では、リンカーは、標的の組織または器官または細胞中に見出される、酵素または他の触媒または加水分解の条件により切断を受ける官能基を提供する。一部の実施形態では、リンカーの長さは、立体障害の可能性を低減するのに十分長い。リンカーが共有結合またはペプチド結合であり、コンジュゲートがポリペプチドである場合、全体のコンジュゲートは融合タンパク質であり得る。このようなペプチジルリンカーはあらゆる長さであってよい。例示的なリンカーは、アミノ酸の長さが約１〜５０個、５〜５０個、３〜５個、５〜１０個、５〜１５個、または１０〜３０個のアミノ酸の長さである。このような融合タンパク質は、当業者には知られている組換えの遺伝子操作方法によって、代替的に生成され得る。
【０１５５】
上記に記載した通り、一部の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、免疫グロブリンまたはその部分（例えば、可変領域、ＣＤＲ、もしくはＦｃ領域）に、コンジュゲート、例えば、融合している。免疫グロブリン（Ｉｇ）の知られているタイプには、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭが含まれる。Ｆｃ領域はＩｇ重鎖のＣ末端領域であり、これは再利用（長時間の半減期をもたらす）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などの活動を行う、Ｆｃ受容体に対する結合を担う。
【０１５６】
例えば、いくつかの定義によれば、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、重鎖のＣｙｓ２２６からＣ末端まで伸びている。「ヒンジ領域」は、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０まで伸長するのが一般的である（他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、システイン結合に関与するシステインを整列させることによりＩｇＧ１配列と整列し得る）。ＩｇＧのＦｃ領域には、ＣＨ２およびＣＨ３の２つの定常ドメインが含まれる。ヒトＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインは通常、アミノ酸２３１からアミノ酸３４１まで伸長する。ヒトＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ３ドメインは通常、アミノ酸３４２から４４７まで伸長する。免疫グロブリンまたは免疫グロブリンのフラグメント、または領域のアミノ酸ナンバリングに対して行う言及は、全てKabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Mdに基づくものである。関連の一実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧおよびＩｇＡのＣＨ２およびＣＨ３領域、またはＩｇＥのＣＨ３およびＣＨ４領域などの、ＣＨ１以外の、免疫グロブリン重鎖からの天然のまたは改変されている定常領域の１つまたは複数を含むことができる。
【０１５７】
適切なコンジュゲート部分には、ＦｃＲｎ結合部位を含む免疫グロブリン配列の部分が含まれる。代理の受容体であるＦｃＲｎは、免疫グロブリンの再利用、および免疫グロブリンの血液中の循環への返却を担う。ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域は、Ｘ線結晶学に基づいて記載されている（Burmeister et al. 1994, Nature 372:379）。ＦｃのＦｃＲｎとの主な接触エリアは、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの接合部付近である。Ｆｃ−ＦｃＲｎの接触は全て、単一のＩｇ重鎖内である。主な接触部位には、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２４８、２５０〜２５７、２７２、２８５、２８８、２９０〜２９１、３０８〜３１１、および３１４、ならびにＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５〜３８７、４２８、および４３３〜４３６が含まれる。
【０１５８】
いくつかのコンジュゲート部分は、ＦｃγＲ結合部位（複数可）を含んでも、または含まなくてもよい。ＦｃγＲはＡＤＣＣおよびＣＤＣを担う。ＦｃγＲと直接接触するＦｃ領域内の位置の例には、アミノ酸２３４〜２３９（低ヒンジ領域）、アミノ酸２６５〜２６９（Ｂ／Ｃループ）、アミノ酸２９７〜２９９（Ｃ’／Ｅループ）、およびアミノ酸３２７〜３３２（Ｆ／Ｇ）ループがある（Sondermann et al., Nature 406: 267-273, 2000）。ＩｇＥの低ヒンジ領域は、ＦｃＲＩ結合にも関係している（Henry, et al., Biochemistry 36, 15568-15578, 1997）。ＩｇＡ受容体結合に関与する残基は、Lewis et al., （J Immunol. 175:6694-701, 2005）に記載されている。ＩｇＥ受容体結合に関与するアミノ酸残基は、Sayers et al. （J Biol Chem. 279(34):35320-5, 2004）に記載されている。
【０１５９】
アミノ酸改変は、免疫グロブリンのＦｃ領域に対して行ってもよい。このようなバリアントのＦｃ領域は、Ｆｃ領域（残基３４２〜４４７）のＣＨ３ドメインに少なくとも１つのアミノ酸改変、および／またはＦｃ領域（残基２３１〜３４１）のＣＨ２ドメインに少なくとも１つのアミノ酸改変を含む。ＦｃＲｎに対する親和性の増大を授与すると考えられている変異には、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、およびＮ４３４Ａが含まれる（Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591）。他の変異は、ＦｃＲｎの親和性を著しく低減せずに、Ｆｃ領域の、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、および／またはＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合を低減し得る。例えば、Ｆｃ領域の２９７位のＡｓｎの、Ａｌａまたは別のアミノ酸での置換により、高度に保存されているＮグリコシル化部位が除去され、免疫原性の低減をもたらし得、それに伴いＦｃ領域の半減期は長時間になり、ＦｃγＲに対する結合は低減する（Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847、Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632、Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591）。ＦｃγＲに対する結合を低減する、ＩｇＧ１の２３３〜２３６位のアミノ酸改変がなされている（Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77およびArmour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613）。いくつかの例示的なアミノ酸置換は、各々その全文が本明細書に参照によって援用される、米国特許第７，３５５，００８号および第７，３８１，４０８号に記載されている。
【０１６０】
ｒＰＥＧ
一部の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、国際特許出願公開第ＷＯ２００９／０２３２７０号および米国特許出願公開第ＵＳ２００８／０２８６８０８号に記載されているものなど、化学的なＰＥＧ（例えば、組換えＰＥＧ（ｒＰＥＧ）分子）に類似の、延長した立体配置を形成することができる付属のペプチドに融合している、グルカゴン関連ペプチド、オステオカルシン、ならびに前述の類似体、誘導体、およびコンジュゲートを含めた、グルカゴン関連ペプチドを含む。ｒＰＥＧ分子はポリエチレングリコールではない。ｒＰＥＧ分子は、一部の態様では、グリシン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、またはプロリンの１つまたは複数を含むポリペプチドである。一部の態様では、ｒＰＥＧは、ポリ−グリシン、ポリ−セリン、ポリ−グルタミン酸、ポリ−アスパラギン酸、ポリ−アラニン、またはポリ−プロリンなどのホモポリマーである。他の実施形態では、ｒＰＥＧは、ポリ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｓｐ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）、ポリ（Ｓｅｒ−Ｇｌｕ）など、２タイプのアミノ酸の反復を含む。一部の態様では、ｒＰＥＧは、ポリ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ）など、３つの異なるタイプのアミノ酸を含む。一部の態様では、ｒＰＥＧは、グルカゴンスーパーファミリーペプチドまたはオステオカルシンの半減期を増大する。一部の態様では、ｒＰＥＧは、正味の正の電荷または正味の負の電荷を含む。ｒＰＥＧは、一部の態様では、二次構造を欠く。一部の実施形態では、ｒＰＥＧはアミノ酸１０個以上の長さであり、一部の実施形態では、アミノ酸約４０〜約５０個の長さである。付属のペプチドは、一部の態様では、本発明のペプチドのＮ末端またはＣ末端に、ペプチド結合もしくはプロテイナーゼ切断部位を介して融合しており、または本発明のペプチドのループ中に挿入されている。ｒＰＥＧは、一部の態様では、アフィニティタグを含み、または５ｋＤａを超えるＰＥＧに連結している。一部の実施形態では、ｒＰＥＧは、本発明のペプチドに、流体力学半径、血清半減期、プロテアーゼ抵抗性、または溶解性の増大を授与し、一部の態様では、ペプチドに免疫原性の低減を授与する。
【０１６１】
融合ペプチド−Ｃ末端の伸長
ある特定の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、Ｃ末端、またはそれだけには限定されないが、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ2、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号７１０）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＣＯＮＨ2（配列番号７１１）、オキシントモジュリンカルボキシ末端伸長、ＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号７１４）またはＫＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴＱ（配列番号７１３）を含めたＣ末端アミノ酸配列を含むことができる。例えば、エキセンジン−４の末端の１０個のアミノ酸（すなわち、配列番号７１０の配列（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ））は、本開示のクラス１グルカゴン関連ペプチド、クラス２グルカゴン関連ペプチド、クラス３グルカゴン関連ペプチド、クラス４グルカゴン関連ペプチド、クラス５グルカゴン関連ペプチド、またはクラス６グルカゴン関連ペプチドのカルボキシ末端に連結している。
【０１６２】
体重減少を誘発する別の化合物は、小腸に見出される天然に存在する消化ホルモンである、オキシントモジュリンである（Diabetes 2005; 54:2390-2395を参照されたい）。オキシントモジュリンは、グルカゴンのアミノ酸２９個の配列に、配列番号７１４（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）のアミノ酸８個のカルボキシ末端伸長が続く、アミノ酸３７個のペプチド（配列番号７０６）である。したがって、一部の実施形態では、配列番号７１４の配列のカルボキシ末端伸長、またはＫＲＮＲの配列を有するアミノ酸４個の伸長をさらに含む、グルカゴン関連ペプチドのプロドラッグ誘導体を提供する。
【０１６３】
３位でのグルカゴン改変
本明細書に記載するクラス１から３のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体の活性を維持または増大するように、３位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）を改変してもよい。
【０１６４】
グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである一部の実施形態では、グルカゴン受容体での活性の維持または増強は、３位のＧｌｎをグルタミン類似体で改変することにより実現してもよい。例えば、３位にグルタミン類似体を含むクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体での天然グルカゴン（配列番号７０１）の活性の約５％、約１０％、約２０％、約５０％、または約８５％、またはそれを超えて表し得る。一部の実施形態では、３位にグルタミン類似体を含むクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体の３位アミノ酸が改変されている以外はグルタミン類似体を含むペプチドと同じアミノ酸配列を有する対応するグルカゴンペプチドの活性の、約２０％、約５０％、約７５％、約１００％、約２００％、または約５００％、またはそれを超えて表し得る。一部の実施形態では、３位にグルタミン類似体を含むクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体での活性の増強を表すが、活性の増強は、天然グルカゴンの、または３位のアミノ酸が改変されている以外はグルタミン類似体を含むペプチドと同じアミノ酸配列を有する対応するグルカゴン関連ペプチドの活性の、１０００％、１００００％、１０００００％、または１００００００％以下である。
【０１６５】
一部の実施形態では、グルタミン類似体は、構造Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩの側鎖を含む、天然に存在する、または天然に存在しないアミノ酸であり、
【化１５】
2016521253.tif 000017
構造Ｉ
【化１６】
2016521253.tif 000018
構造ＩＩ
【化１７】
2016521253.tif 000019
構造ＩＩＩ
式中、Ｒ1はＣ0-3アルキルまたはＣ0-3ヘテロアルキルであり、Ｒ2はＮＨＲ4またはＣ1-3アルキルであり、Ｒ3はＣ1-3アルキルであり、Ｒ4はＨまたはＣ1-3アルキルであり、ＸはＮＨ、Ｏ、またはＳであり、ＹはＮＨＲ4、ＳＲ3、またはＯＲ3である。一部の実施形態では、ＸはＮＨであり、またはＹはＮＨＲ4である。一部の実施形態では、Ｒ1はＣ0-2アルキルまたはＣ1ヘテロアルキルである。一部の実施形態では、Ｒ2はＮＨＲ4またはＣ1アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ4はＨまたはＣ1アルキルである。グルカゴン関連ペプチドがクラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである例示的な実施形態では、Ｒ1はＣＨ2−Ｓであり、ＸはＮＨであり、Ｒ2はＣＨ3であり（アセトアミドメチル−システイン、Ｃ（Ａｃｍ））；Ｒ1はＣＨ2であり、ＸはＮＨであり、Ｒ2はＣＨ3であり（アセチルジアミノブタン酸、Ｄａｂ（Ａｃ））；Ｒ1はＣ0アルキルであり、ＸはＮＨであり、Ｒ2はＮＨＲ4であり、Ｒ4はＨであり（カルバモイルジアミノプロパン酸、Ｄａｐ（ｕｒｅａ））；またはＲ1はＣＨ2−ＣＨ2であり、ＸはＮＨであり、Ｒ2はＣＨ3である（アセチルオルニチン、Ｏｒｎ（Ａｃ））、構造Ｉの側鎖を含むアミノ酸を提供する。例示的な実施形態では、Ｒ1はＣＨ2であり、ＹはＮＨＲ4であり、Ｒ4はＣＨ3である（メチルグルタミン、Ｑ（Ｍｅ））、構造ＩＩの側鎖を含むアミノ酸を提供する。例示的な実施形態では、Ｒ1はＣＨ2であり、Ｒ4はＨである（メチオニン−スルホキシド、Ｍ（Ｏ））、構造ＩＩＩＩの側鎖を含むアミノ酸を提供する。具体的な実施形態では、３位のアミノ酸はＤａｂ（Ａｃ）で置換されている。
【０１６６】
ダイマー
クラス１、クラス２、クラス６、またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに関して、グルカゴン関連ペプチドは、リンカーによって結合している少なくとも２つ、３つ、またはそれを超えるペプチドを含むダイマー、トリマー、または高次のマルチマーの一部であってよく、少なくとも１つまたは両方のペプチドはグルカゴン関連ペプチドである。ダイマーは、ホモダイマーでも、またはヘテロダイマーでもよい。一部の実施形態では、リンカーは、二官能性のチオール架橋剤、および二官能性のアミン架橋剤からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、リンカーは、５ｋＤａのＰＥＧ、２０ｋＤａのＰＥＧなどのＰＥＧである。一部の実施形態では、リンカーはジスルフィド結合である。例えば、ダイマーの各モノマーはＣｙｓ残基（例えば、末端の、または内部に位置するＣｙｓ）を含み得、各Ｃｙｓ残基のイオウ原子はジスルフィド結合の形成に加担する。本発明の一部の態様では、モノマーは、末端のアミノ酸（例えば、Ｎ末端もしくはＣ末端）によって、内部のアミノ酸によって、または少なくとも１つのモノマーの末端のアミノ酸によって、および少なくとも１つの他のモノマーの内部のアミノ酸によって接続されている。具体的な態様では、モノマーはＮ末端のアミノ酸によって接続されていない。一部の態様では、マルチマーのモノマーは、各モノマーのＣ末端アミノ酸が一緒に結合している「テイルトゥーテイル」の配向において一緒に結合している。コンジュゲート部分は、ダイマー、トリマー、または高次のマルチマーを含めた、本明細書に記載するグルカゴン関連ペプチドのいずれかに共有結合により連結していてよい。
【０１６７】
グルカゴン関連ペプチドを作成するための方法
本明細書に開示するグルカゴン関連ペプチド（およびプロドラッグ）は、標準の合成方法、組換えＤＮＡ法、またはペプチドおよび融合タンパク質を調製するあらゆる他の方法によって調製することができる。ある種の非天然のアミノ酸は、標準の組換えＤＮＡ法によって発現させることができないが、これらを調製する技術は当技術分野では知られている。非ペプチド部分を包含する本発明の化合物は、適用可能な場合は標準のペプチド化学反応に加えて、標準の有機化学反応によって合成してもよい。
グルカゴン関連ペプチドのクラスを以下に詳しく記載する。クラス１、２、３、４、５、および／または６に関する開示の各セクションに関して、グルカゴン関連ペプチドの改変を、上記に詳述したプロドラッグ化合物のグルカゴン関連ペプチド部分（Ｑ）に関して記載する。よって、グルカゴン関連ペプチドのクラスに関して記載する構造エレメントは、Ｑの構造エレメントであり、次いで、この構造エレメントをさらに改変して上記に詳述したプロドラッグ化合物を産生する。
【０１６８】
クラス１グルカゴン関連ペプチド
ある特定の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、本明細書、ならびにその内容の全文が参照によって援用される、国際特許出願第ＰＣＴ  ＵＳ２００９／４７４３７号（２００９年６月１６日出願）、２００８年７月１７日公開の国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０８６０８６号、および米国仮出願第６１／０９０，４１５号、ならびにその内容の全文が参照によって援用される、２０１１年６月２３日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／４１６２３号および米国仮出願第６１／３５８，７１０号に記載される、クラス１のグルカゴン関連ペプチドである。
クラス１グルカゴン関連ペプチドに関して以下のセクションにおいて参照する生物学的配列（配列番号８０１〜９１５）は、国際特許出願第ＰＣＴ  ＵＳ２００９／４７４３７号における配列番号１〜１１５に対応する。
【０１６９】
活性
クラス１グルカゴンペプチドは、天然グルカゴンペプチド（配列番号８０１）に対してグルカゴン受容体活性を保持している。例えば、グルカゴンペプチドは、天然グルカゴンの、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％の活性、８０％の活性、８５％の活性、または９０％の活性を保持し得る（グルカゴンペプチド対グルカゴンに対するＥＣ５０の逆比として計算、例えば、例において全般的に記載するアッセイを使用したｃＡＭＰ生成によって測定して）。一部の実施形態では、クラス１グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴンと同じまたはグルカゴンを超える活性（本明細書において「作用強度」の語と同義に使用される）を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載するグルカゴンペプチドは、天然グルカゴンペプチドの約１００％、１０００％、１００００％、１０００００％、または１００００００％以下の活性を表す。
【０１７０】
本明細書に記載するクラス１グルカゴン関連ペプチドのいずれかは、例５のアッセイを使用してなど、グルカゴン受容体を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞におけるｃＡＭＰ誘導に対して試験した場合、ヒトグルカゴン受容体で、約１００ｎＭ、７５ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、またはそれ未満のＥＣ５０を表し得る。典型的に、ペグ化されているペプチドは、非ペグ化のペプチドに比べてより高いＥＣ５０を表す。例えば、本明細書に記載するクラス１グルカゴン関連ペプチドは、非ペグ化の場合、グルカゴン受容体で、天然グルカゴン（配列番号８０１）の活性の、少なくとも２０％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、１００％、１５０％、２００％、４００％、５００％、またはそれを超える）であるグルカゴン受容体での活性を表し得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載するクラス１グルカゴン関連ペプチドは、親水性部分を欠く場合、グルカゴン受容体で天然グルカゴンの指摘される％活性を表すが、親水性部分を含む場合は、グルカゴン受容体で天然グルカゴンの％活性の低減を表す。例えば、本明細書に記載するクラス１グルカゴン関連ペプチドは、ペグ化されている場合、グルカゴン受容体で、天然グルカゴンの少なくとも２％（例えば、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、または少なくとも１０％）である活性を表し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載するクラス１グルカゴン関連ペプチドは、上記に指摘する活性のいずれかを表し得るが、グルカゴン受容体で、天然グルカゴンの活性の１０００％、１００００％、１０００００％、または１００００００％以下を表し得る。
【０１７１】
一部の実施形態では、クラス１グルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に比べて、ＧＬＰ−１受容体での天然のＧＬＰ−１の約５％、４％、３％、２％、もしくは１％未満の活性、および／またはグルカゴン受容体に対する約５倍、１０倍、もしくは１５倍を超える選択性を表す。例えば、一部の実施形態では、クラス１グルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体で、天然のＧＬＰ−１の活性の５％未満を表し、ＧＬＰ−１受容体に比べてグルカゴン受容体に対する５倍を超える選択性を表す。
【０１７２】
溶解性の改善
天然グルカゴンは、特に生理学的ｐＨの水溶液中で難溶性（ｐｏｏｒ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）を表し、経時的に凝集および沈澱する傾向がある。対照的に、クラス１グルカゴン関連ペプチドは、一部の実施形態では、６〜８の間、または６〜９の間のｐＨで、例えば、ｐＨ７、２５℃で２４時間後に、天然グルカゴンに比べて少なくとも２倍、５倍、またはさらに高い溶解性を表す。
したがって、一部の実施形態では、クラス１グルカゴン関連ペプチドは、Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ（配列番号８０１）の野生型ペプチドに対して、特に約５．５〜約８．０の範囲のｐＨの水溶液中のペプチドの溶解性を改善し、一方で天然のペプチドの生物学的活性を保持するように改変されている。
【０１７３】
例えば、本明細書に記載するクラス１グルカゴン関連ペプチドのいずれかの溶解性は、親水性部分をペプチドに結合させることによりさらに改善することができる。このような基の導入は、循環中の長時間の半減期などによって測定して、作用の持続時間も増大する。親水性部分は本明細書にさらに記載するものである。
【０１７４】
荷電している残基での改変
一部の実施形態では、天然の非荷電アミノ酸を、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸で置換することにより、または荷電アミノ酸をペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端に加えることにより、クラス１グルカゴン関連ペプチドに電荷を加えることによって溶解性を改善する。
一部の実施形態によれば、クラス１グルカゴン関連ペプチドは、荷電アミノ酸をペプチドのＣ末端部分に、および一部の実施形態では、配列番号８０１のＣ末端から２７位の位置に導入する、アミノ酸の置換および／または付加によってペプチドが改変されている事実により、溶解性が改善されている。荷電アミノ酸１、２、または３個をＣ末端部分内に導入してもよく、一部の実施形態では、Ｃ末端から２７位に導入してもよい。一部の実施形態によれば、２８位および／もしくは２９位の天然のアミノ酸（複数可）を荷電アミノ酸で置換し、ならびに／または、１〜３個の荷電アミノ酸をペプチドのＣ末端、例えば、２７、２８、もしくは２９位の後に付加する。例示的な実施形態では、１、２、３個、または全ての荷電アミノ酸は負に荷電している。他の実施形態では、１、２、３個、または全ての荷電アミノ酸は正に荷電している。
【０１７５】
具体的な例示的な実施形態では、クラス１グルカゴン関連ペプチドは、以下の改変：Ｎ２８のＥでの置換、Ｎ２８のＤでの置換、Ｔ２９のＤでの置換、Ｔ２９のＥでの置換、２７、２８、または２９位の後へのＥの挿入、２７、２８、または２９位の後へのＤの挿入、例えば、Ｄ２８Ｅ２９、Ｅ２８Ｅ２９、Ｅ２９Ｅ３０、Ｅ２８Ｅ３０、Ｄ２８Ｅ３０のいずれか１つまたは２つを含んでいてよい。
例示的な一実施形態によれば、クラス１グルカゴン関連ペプチドは、配列番号８１１のアミノ酸配列、または天然のグルカゴンに対して１〜３個のさらなるアミノ酸改変（グルカゴンアゴニストに関して本明細書に記載する）を含むその類似体、またはそのグルカゴンアゴニスト類似体を含む。配列番号８１１は改変されているクラス１グルカゴン関連ペプチドを表し、天然のタンパク質の２８位のアスパラギン残基はアスパラギン酸で置換されている。別の例示的な実施形態では、クラス１グルカゴン関連ペプチドは配列番号８３８のアミノ酸配列を含み、天然のタンパク質の２８位のアスパラギン残基はグルタミン酸で置換されている。他の例示的な実施形態は、配列番号８２４、８２５、８２６、８３３、８３５、８３６、および８３７のクラス１グルカゴン関連ペプチドを含む。
【０１７６】
２８位および／もしくは２９位の正常に生じるアミノ酸の、荷電アミノ酸での置換、ならびに／またはクラス１グルカゴン関連ペプチドのカルボキシ末端の１〜２個の荷電アミノ酸の付加により、生理的に関連のあるｐＨ（すなわち、ｐＨ約６．５〜約７．５）の水溶液中のグルカゴンペプチドの溶解性および安定性が、少なくとも５倍、および３０倍ほど増強される。したがって、一部の実施形態のクラス１グルカゴン関連ペプチドはグルカゴン活性を保持し、２５℃で２４時間後に測定した場合、ｐＨ７など、約５．５〜８の間の所与のｐＨでの天然のグルカゴンに比べて、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２５倍、３０倍、またはそれを超える溶解性を表す。
グルカゴン活性を依然として保持させる、保存的置換などのさらなる改変を、クラス１グルカゴン関連ペプチドに行ってもよく、この改変は本明細書にさらに記載するものである。
【０１７７】
安定性の改善
クラス１グルカゴン関連ペプチドのいずれかは、２５℃で２４時間後にオリジナルのペプチドの少なくとも９５％を保持するなど、安定性の改善および／または分解の低減をさらに表し得る。本明細書に開示するクラス１グルカゴン関連ペプチドのいずれかは、２５℃で２４時間後にオリジナルのペプチドの少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を保持するなど、ｐＨ５．５〜８の範囲内での安定性の改善をさらに表し得る。一部の実施形態では、本発明のクラス１グルカゴン関連ペプチドは安定性の改善を表し、少なくとも７５％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９５％を超える、最高１００％）の濃度のペプチド、または２５％未満（例えば、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％、４％、３％、２％、１％未満から０％まで）の分解されたペプチドが、少なくとも２０℃（例えば、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、少なくとも２７．５℃、少なくとも３０℃、少なくとも３５℃、少なくとも４０℃、少なくとも５０℃）、および１００℃未満、８５℃未満、７５℃未満、または７０℃未満の温度の溶液中、約１週間以上（例えば、約２週間、約４週間、約１か月、約２か月、約４か月、約６か月、約８か月、約１０か月、約１２か月）後に紫外線（ＵＶ）検出器により２８０ｎｍで検出可能である。クラス１グルカゴン関連ペプチドは、作用強度の増大、循環中の長時間の半減期、有効期間の増大、沈殿もしくは凝集の低減、および／または分解の低減、例えば、貯蔵後の切断もしくは化学改変の出現の低減など、薬学上の性質を変更するさらなる改変を含むことができる。
【０１７８】
またさらなる例示的な実施形態では、前述のクラス１グルカゴン関連ペプチドのいずれかは、特に酸性またはアルカリ性バッファー中、経時的なペプチドの分解を低減するために配列番号８０１の１５位のアミノ酸を改変することにより、安定性を改善するようにさらに改変することができる。例示的な実施形態では、１５位のＡｓｐをＧｌｕ、ホモ−Ｇｌｕ、システイン酸、またはホモ−システイン酸で置換する。
あるいは、本明細書に記載するクラス１グルカゴン関連ペプチドのいずれかは、配列番号８０１の１６位のアミノ酸を改変することにより、安定性を改善するようにさらに改変することができる。例示的な実施形態では、１６位のＳｅｒをＴｈｒもしくはＡＩＢで置換し、またはグルカゴン受容体の作用強度を増強するクラス１グルカゴン関連ペプチドに関して本明細書に記載するアミノ酸置換のいずれかで置換する。このような改変により、Ａｓｐ１５−Ｓｅｒ１６間のペプチド結合の切断は低減する。
【０１７９】
一部の実施形態では、本明細書に記載するクラス１グルカゴン関連ペプチドのいずれかは、２０、２１、２４、または２７位のうちのあらゆる１、２、３、または４つ全てを改変することにより、様々なアミノ酸位置での分解を低減するようにさらに改変することができる。例示的な実施形態には、２０位のＧｌｎのＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＡＩＢでの置換、２１位のＡｓｐのＧｌｕでの置換、２４位のＧｌｎのＡｌａまたはＡＩＢでの置換、２７位のＭｅｔのＬｅｕまたはＮｌｅでの置換が含まれる。メチオニンの除去または置換により、メチオニンの酸化による分解は低減する。ＧｌｎまたはＡｓｎの除去または置換により、ＧｌｎまたはＡｓｎの脱アミドによる分解は低減する。Ａｓｐの除去または置換により、環状スクシンイミド中間体を形成するＡｓｐの脱水および後続のイソ−アスパルテートへの異性体化により生じる分解は減少する。
【０１８０】
作用強度の増強
別の実施形態によれば、グルカゴン受容体での作用強度が増強しているクラス１グルカゴン関連ペプチドを提供し、ペプチドは天然グルカゴン（配列番号８０１）の１６位のアミノ酸改変を含む。非限定的な例により、このような作用強度の増強は、１６位の天然に存在するセリンをグルタミン酸で、もしくは長さ４原子の側鎖を有する負に荷電している別のアミノ酸で、または代替的にグルタミン、ホモグルタミン酸、もしくはホモシステイン酸のいずれか１つで、もしくは少なくとも１つのヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ）を含む側鎖を有する荷電アミノ酸で、および約４（または３〜５）原子の長さの側鎖で、置換することによりもたらされ得る。１６位のセリンのグルタミン酸での置換は、グルカゴン受容体でのグルカゴン活性を少なくとも２倍、４倍、５倍、および最高１０倍大きく増強する。一部の実施形態では、クラス１グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体に対する選択性を、ＧＬＰ−１受容体に対して、例えば少なくとも５倍、１０倍、または１５倍の選択性を保持している。
【０１８１】
ＤＰＰ−ＩＶ抵抗性
一部の実施形態では、本明細書に開示するクラス１グルカゴンペプチドは、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性を低減するために、１位または２位がさらに改変されている。より詳しくは、一部の実施形態では、クラス１グルカゴン関連ペプチドの１位および／または２位を、本明細書に記載するＤＰＰ−ＩＶ抵抗性アミノ酸（複数可）で置換する。一部の実施形態では、類似体ペプチドの２位を、アミノイソ酪酸で置換する。一部の実施形態では、類似体ペプチドの２位を、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、およびε−アミノ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換する。別の実施形態では、クラス１グルカゴン関連ペプチドの２位を、Ｄ−セリン、グリシン、およびアミノイソ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換する。一部の実施形態では、２位のアミノ酸はＤ−セリンではない。
【０１８２】
グルカゴンペプチドの１位および／または２位のアミノ酸を改変した時のグルカゴン活性の低減は、グルカゴンペプチドのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９周辺）におけるアルファヘリックス構造を安定化することにより回復することができる。アルファヘリックス構造は、本明細書にさらに記載する通り、例えば、共有結合または非共有結合による分子内架橋の形成（例えば、ｉが１２〜２５の整数である、「ｉ」位と「ｉ＋４」位のアミノ酸の側鎖間のラクタム架橋）、１２〜２９位周辺のアミノ酸の、アルファヘリックスを安定化するアミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸）での置換および／または挿入により安定化することができる。
【０１８３】
３位の改変
グルカゴン受容体活性は、３位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）のアミノ酸改変、例えば、３位の天然に存在するグルタミンの、酸性、塩基性、または疎水性のアミノ酸での置換により低減することができる。例えば、３位の、グルタミン酸、オルニチン、またはノルロイシンでの置換は、グルカゴン受容体活性を実質的に低減または破壊する。
グルカゴン受容体の活性の維持または増強を、３位のＧｌｎを、本明細書に記載するグルタミン類似体で改変することにより実現してもよい。例えば、グルカゴンアゴニストは、配列番号８６３、配列番号８６９、配列番号８７０、配列番号８７１、配列番号８７２、配列番号８７３、および配列番号８７４のアミノ酸配列を含むことができる。
【０１８４】
ＧＬＰ−１活性のＣ末端アミドおよびエステルでの増強
ＧＬＰ−１受容体の活性の増強は、Ｃ末端アミノ酸のカルボン酸を、アミドまたはエステルなどの電荷的中性の基で置き換えることによりもたらされる。逆に、ペプチドのＣ末端の天然のカルボン酸を保持することで、グルカゴン受容体対ＧＬＰ−１受容体に対するクラス１グルカゴン関連ペプチドの比較的高い選択性が維持される（例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０倍を超える）。
【０１８５】
さらなる改変および組合せ
クラス１グルカゴン関連ペプチドに対して、溶解性および／または安定性および／またはグルカゴン活性をさらに増大し得るさらなる改変を行ってもよい。クラス１グルカゴン関連ペプチドは、溶解性または安定性に実質的に影響を及ぼさず、グルカゴン活性を実質的に低減しない他の改変を、代替的に含むことができる。例示的な実施形態では、クラス１グルカゴン関連ペプチドは、天然のグルカゴン配列に対して、合計最高１１、または最高１２、または最高１３、または最高１４個のアミノ酸改変を含むことができる。例えば、保存的な、または非保存的な置換、付加、または欠失を、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、または２９位のいずれかで行ってもよい。
クラス１グルカゴン関連ペプチドの例示的な改変には、それだけには限定されないが、
（ａ）少なくとも部分的なグルカゴンアゴニスト活性を保持し、一方で非保存的な置換、保存的な置換、付加、または欠失、例えば、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、または２９位の１つまたは複数の保存的置換、１０位のＴｙｒのＶａｌまたはＰｈｅでの置換、１２位のＬｙｓのＡｒｇでの置換、これらの１つまたは複数の位置のＡｌａでの置換、
（ｂ）少なくとも部分的にグルカゴンアゴニスト活性を保持し、一方で２９位および／または２８位の、および２７位でもよいアミノ酸の欠失、
（ｃ）分解を低減し得る、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸、もしくはホモシステイン酸での置換などによる、１５位のアスパラギン酸の改変；あるいはトレオニン、ＡＩＢ、グルタミン酸、もしくは長さ４原子の側鎖を有する負に荷電している別のアミノ酸などによる、または代替的に、Ａｓｐ１５−Ｓｅｒ１６結合の切断による分解を同様に低減し得る、グルタミン、ホモグルタミン酸、またはホモシステイン酸のいずれか１つでの、１６位のセリンの改変、
（ｄ）溶解性および／または半減期を増大し得る、１６、１７、２０、２１、２４、２９、４０位、またはＣ末端アミノ酸などの、本明細書に記載する、水溶性ポリマーのポリエチレングリコールなどの親水性部分の付加、
（ｅ）酸化的分解を低減するための、ロイシンまたはノルロイシンでの置換などによる、２７位のメチオニンの改変、
【０１８６】
（ｆ）Ｇｌｎの脱アミドによって生じる分解を低減するための、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＡＩＢでの置換などによる、２０位または２４位のＧｌｎの改変、
（ｇ）環状スクシンイミド中間体を形成するためのＡｓｐの脱水および後続のイソ−アスパルテートへの異性体化によって生じる分解を低減するための、Ｇｌｎでの置換などによる、２１位のＡｓｐの改変、
（ｈ）ＤＰＰ−ＩＶ切断に対する抵抗性を改善する、「ｉ」位と「ｉ＋４」位の間のラクタム架橋などの分子内架橋と組み合わせてもよい、本明細書に記載する１位または２位の改変（ｉは１２、１６、２０、２４などの１２〜１５までの整数である）、
（ｉ）親水性部分の付加と組み合わせてもよい、さらにまたはあるいは、ＧＬＰ−１ペプチドの活性を選択的に低減する改変と組み合わせてもよい、グルカゴン受容体および／もしくはＧＬＰ−１受容体での活性を増大し得、循環中の半減期を増大し得、ならびに／または作用の持続時間を延長し得、ならびに／または作用の開始を遅らせ得る、本明細書に記載するグルカゴンペプチドのアシル化またはアルキル化；例えば、７位のＴｈｒの改変、例えば、７位のＴｈｒの、ＡｂｕまたはＩｌｅなどのヒドロキシル基を欠くアミノ酸での置換；Ｃ末端アミノ酸から２７位のアミノ酸の欠失（例えば、２８位および２９位のアミノ酸の１つまたは両方の欠失、アミノ酸の長さ２７または２８個のペプチドが得られる）、
（ｊ）本明細書に記載するＣ末端伸長、
（ｋ）本明細書に記載するホモ二量体化またはヘテロ二量体化；および（ａ）から（ｋ）までの組合せ
が含まれる。
【０１８７】
一部の実施形態では、クラス１グルカゴン関連ペプチドの例示的な改変には、グループＡから選択される少なくとも１つのアミノ酸改変、ならびにグループＢおよび／またはグループＣから選択される少なくとも１つまたは複数のアミノ酸改変が含まれ、
グループＡは、
２８位のＡｓｎの、荷電アミノ酸での置換、
２８位のＡｓｎの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、およびホモシステイン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸での置換、
２８位の、Ａｓｎ、Ａｓｐ、もしくはＧｌｕでの置換、
２８位の、Ａｓｐでの置換、
２８位の、Ｇｌｕでの置換、
２９位のＴｈｒの、荷電アミノ酸での置換、
２９位のＴｈｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、およびホモシステイン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸での置換、
２９位の、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、もしくはＬｙｓでの置換、
２９位の、Ｇｌｕでの置換、
２９位の後への、１〜３個の荷電アミノ酸の挿入、
２９位の後への、ＧｌｕもしくはＬｙｓの挿入、
２９位の後への、Ｇｌｙ−ＬｙｓもしくはＬｙｓ−Ｌｙｓの挿入；またはこれらの組合せであり、
グループＢは、
１５位のＡｓｐの、Ｇｌｕでの置換、
１６位のＳｅｒの、ＴｈｒまたはＡＩＢでの置換であり、
グループＣは、
１位のＨｉｓの、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する非天然アミノ酸での置換、
２位のＳｅｒの、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する非天然アミノ酸での置換、
１２位のＬｙｓの、Ａｒｇでの置換、
２０位のＧｌｎの、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＡＩＢでの置換、
２１位のＡｓｐの、Ｇｌｕでの置換、
２４位のＧｌｎの、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＡＩＢでの置換、
２７位のＭｅｔの、ＬｅｕまたはＮｌｅでの置換、
２７〜２９位のアミノ酸の欠失、
２８〜２９位のアミノ酸の欠失、
２９位のアミノ酸の欠失、
またはこれらの組合せである。
【０１８８】
例示的な実施形態では、１２位のＬｙｓはＡｒｇで置換されている。他の例示的な実施形態では、２９位および／または２８位のアミノ酸は欠失し、２７位のアミノ酸は欠失してもよい。
【０１８９】
いくつかの具体的な実施形態では、グルカゴンペプチドは、（ａ）ＤＰＰ−ＩＶ抵抗性を付与する１位および／または２位のアミノ酸改変、例えば、１位のＤＭＩＡでの、または２位のＡＩＢでの置換、（ｂ）１２〜２９位内の分子内架橋、例えば、１６位および２０位、または１６、２０、２１、および２４位のアミノ酸のα，α二置換アミノ酸での１つまたは複数の置換を含み、（ｃ）ＰＥＧなどの親水性部分に対する、例えば、２４、２９位のＣｙｓを介して、またはＣ末端アミノ酸での連結、（ｄ）ＭｅｔをＮｌｅなどで置換する２７位のアミノ酸改変、（ｅ）分解を低減する、２０、２１、および２４位のアミノ酸改変、ならびに（ｆ）配列番号８２０に対する連結を含んでもよい。グルカゴンペプチドが配列番号８２０に連結している場合、２９位のアミノ酸は、ある特定の実施形態では、ＴｈｒまたはＧｌｙである。他の具体的な実施形態では、グルカゴンペプチドは、（ａ）Ａｓｐ２８Ｇｌｕ２９、またはＧｌｕ２８Ｇｌｕ２９、またはＧｌｕ２９Ｇｌｕ３０、またはＧｌｕ２８Ｇｌｕ３０、またはＡｓｐ２８Ｇｌｕ３０を含み、（ｂ）Ｓｅｒを、ＴｈｒまたはＡＩＢなどで置換する１６位のアミノ酸改変、および（ｃ）Ｍｅｔを、Ｎｌｅなどで置換する２７位のアミノ酸改変、および（ｄ）分解を低減する、２０、２１、および２４位のアミノ酸改変を含んでもよい。具体的な一実施形態では、グルカゴンペプチドは、Ｔ１６、Ａ２０、Ｅ２１、Ａ２４、Ｎｌｅ２７、Ｄ２８、Ｅ２９である。
【０１９０】
いくつかの特定の実施形態では、クラス１グルカゴン関連ペプチドは、アミノ酸改変を１から３個有する、以下のアミノ酸配列を含む。
Ｘ１−Ｘ２−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｚ（配列番号８３９）
［配列中、Ｘ１および／またはＸ２は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減（または抵抗性を増大）する、非天然のアミノ酸であり、
Ｚは、−ＣＯＯＨ（天然に存在するＣ末端のカルボキシレート）、−Ａｓｎ−ＣＯＯＨ、Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨ、およびＹ−ＣＯＯＨからなる群から選択され、Ｙは、アミノ酸１〜２個であり、
分子内架橋は、好ましくは共有結合であり、ｉ位のアミノ酸とｉ＋４位のアミノ酸の側鎖を接続し、ｉは１２、１６、２０、または２４である］
【０１９１】
一部の実施形態では、分子内架橋はラクタム架橋である。一部の実施形態では、配列番号８３９のｉ位およびｉ＋４位のアミノ酸はＬｙｓおよびＧｌｕであり、例えば、Ｇｌｕ１６およびＬｙｓ２０である。一部の実施形態では、Ｘ１は、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｎ−メチル−Ｈｉｓ、アルファ−メチル−Ｈｉｓ、イミダゾール酢酸、ｄｅｓ−アミノ−Ｈｉｓ、ヒドロキシル−Ｈｉｓ、アセチル−Ｈｉｓ、ホモ−Ｈｉｓ、およびアルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）からなる群から選択される。他の実施形態では、Ｘ２は、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、Ｖａｌ、およびアルファ，アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群から選択される。一部の実施形態では、グルカゴンペプチドは、１６、１７、２０、２１、２４、２９、４０位のアミノ酸のいずれかで、Ｃ末端伸長内、またはＣ末端アミノ酸で、親水性部分に共有結合により連結している。例示的な実施形態では、この親水性部分は、これらの位置のいずれかで、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン、またはアセチルフェニルアラニン残基に共有結合により連結している。例示的な親水性部分は、分子量約１０００ダルトン〜約４００００ダルトン、または約２００００ダルトン〜約４００００ダルトンなどのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【０１９２】
他の実施形態では、クラス１グルカゴン関連ペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む。
Ｘ１−Ｘ２−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｚ（配列番号８３９）
［配列中、Ｘ１および／またはＸ２は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減（または抵抗性を増大）する、非天然のアミノ酸であり、
グルカゴンペプチドの１６、２０、２１、および２４位のうちの１、２、３、４つ、またはそれを超えてα，α−二置換アミノ酸で置換されており、
Ｚは、−ＣＯＯＨ（天然に存在するＣ末端カルボキシレート）、−Ａｓｎ−ＣＯＯＨ、Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨ、およびＹ−ＣＯＯＨからなる群から選択され、Ｙは、１〜２個のアミノ酸である］
【０１９３】
前述のクラス１グルカゴン関連ペプチドもしくは類似体に対する例示的なさらなるアミノ酸改変には、アシル基またはアルキル基に（スペーサーを介してもよい）共有結合により結合している側鎖を含むアミノ酸の置換もしくは付加と組み合わせてもよい、７位のＴｈｒの、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、Ｉｌｅなどのヒドロキシル基を欠くアミノ酸での置換が含まれ、このアシル基もしくはアルキル基は、天然に存在するアミノ酸に非天然であり、１２位のＬｙｓのＡｒｇでの置換、１５位のＡｓｐのＧｌｕでの置換、１６位のＳｅｒのＴｈｒもしくはＡＩＢでの置換、２０位のＧｌｎのＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、もしくはＡＩＢでの置換、２１位のＡｓｐのＧｌｕでの置換、２４位のＧｌｎのＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、もしくはＡＩＢでの置換、２７位のＭｅｔのＬｅｕもしくはＮｌｅでの置換、２８位のＡｓｎの荷電アミノ酸での置換、２８位のＡｓｎのＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、およびホモシステイン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸での置換、２８位のＡｓｎ、Ａｓｐ、もしくはＧｌｕでの置換、２８位のＡｓｐでの置換、２８位のＧｌｕでの置換、２９位のＴｈｒの荷電アミノ酸での置換、２９位のＴｈｒのＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、およびホモシステイン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸での置換、２９位のＡｓｐ、Ｇｌｕ、もしくはＬｙｓでの置換、２９位のＧｌｕでの置換、２９位の後への荷電アミノ酸１〜３個の挿入、３０位（すなわち２９位の後）のＧｌｕもしくはＬｙｓの挿入を有し、３１のＬｙｓの挿入を有してもよい、配列番号８２０のＣ末端への付加（２９位のアミノ酸はＴｈｒもしくはＧｌｙであってもよい）、親水性部分に共有結合により結合しているアミノ酸の置換もしくは付加、またはこれらの組合せである。
【０１９４】
グルカゴン受容体活性を増大し、部分的なグルカゴン受容体活性を保持し、溶解性を増大し、安定性を増大し、または分解を低減する、クラス１グルカゴンアゴニストに関して上記に記載した改変のいずれかは、個々に、または組み合わせて、クラス１グルカゴンペプチドに適用することができる。よって、グルカゴン受容体での天然のグルカゴンの活性の少なくとも２０％を保持し、ｐＨ６〜８の間、または６〜９の間（例えば、ｐＨ７）で少なくとも１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解性であり、２５℃で２４時間後にオリジナルのペプチドの少なくとも９５％を保持してもよい（例えば、オリジナルのペプチドの５％以下が分解または切断される）、クラス１グルカゴン関連ペプチドを調製することができる。あるいは、グルカゴン受容体での天然のグルカゴンの活性の少なくとも約１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０倍以上を表し、ｐＨ６〜８の間、または６〜９の間（例えば、ｐＨ７）で少なくとも１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解性であってもよく、２５℃で２４時間後にオリジナルのペプチドの少なくとも９５％を保持してもよい（例えば、オリジナルのペプチドの５％以下が分解または切断される）高作用強度のクラス１グルカゴンペプチドを調製することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載するクラス１グルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体で、上記に指摘した相対的なレベルの活性の少なくともいずれかを表し得るが、グルカゴン受容体で、天然のグルカゴンの活性の１００００％、１０００００％、または１００００００％以下を表し得る。
【０１９５】
クラス１グルカゴン関連ペプチドの実施形態の例
一部の実施形態によれば、２８位および／または２９位の天然のアミノ酸を、負に荷電しているアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）で置換し、負に荷電しているアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）をペプチドのカルボキシ末端に付加してもよいことにより、配列番号８０１の天然のグルカゴンペプチドを改変する。代替的な一実施形態では、２９位の天然のアミノ酸を、正に荷電しているアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、またはヒスチジン）で置換し、１または２個の正に荷電しているアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、またはヒスチジン）をペプチドのカルボキシ末端上に付加してもよいことにより、配列番号８０１の天然のグルカゴンペプチドを改変する。一部の実施形態によれば、２８位もしくは２９位の少なくとも１つのアミノ酸が酸性アミノ酸で置換されており、および／またはさらなる酸性アミノ酸が配列番号８３４のカルボキシ末端に付加されているという前提で、溶解性および安定性が改善されているグルカゴン類似体を提供し、類似体は配列番号８３４のアミノ酸配列を含んでいる。一部の実施形態では、酸性アミノ酸は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、およびホモシステイン酸からなる群から独立に選択される。
【０１９６】
一部の実施形態によれば、溶解性および安定性が改善されているグルカゴンアゴニストを提供し、アゴニストは配列番号８３３のアミノ酸配列を含み、２７、２８、または２９位の少なくとも１つのアミノ酸は、非天然のアミノ酸残基で置換されている（すなわち、類似体の２７、２８、または２９位に存在する少なくとも１つのアミノ酸は、配列番号８０１における対応する位置に存在するアミノ酸と異なる酸性アミノ酸である）。一部の実施形態によれば、２８位のアミノ酸がアスパラギンであり、２９位のアミノ酸がトレオニンである場合、ペプチドは、グルカゴンペプチドのカルボキシ末端に付加されたＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、またはＧｌｕからなる群から独立に選択されるアミノ酸を１から２つさらに含むという前提で、配列番号８３３の配列を含むグルカゴンアゴニストを提供する。
【０１９７】
親ペプチドの活性の少なくともいくらかは保持し、一方で天然のグルカゴンペプチドのある位置を改変することができることが報告されている。したがって、出願人らは、配列番号８１１のペプチドの２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、または２９位に位置する１つまたは複数のアミノ酸は、天然のグルカゴンペプチドに存在するアミノ酸と異なるアミノ酸で置換することができ、親のグルカゴンペプチドの作用強度の増強、生理学的ｐＨの安定性、および生物学的活性を依然として保持することを予測している。例えば、一部の実施形態によれば、天然のペプチドの２７位に存在するメチオニン残基を、ロイシンまたはノルロイシンに変更して、ペプチドの酸化的分解を防ぐ。
【０１９８】
一部の実施形態では、配列番号８３３のグルカゴン類似体を提供し、類似体の１、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２４位から選択される１〜６個のアミノ酸は配列番号８０１の対応するアミノ酸と異なる。別の実施形態によれば、配列番号８３３のグルカゴン類似体を提供し、類似体の１、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２４位から選択される１〜３個のアミノ酸は配列番号８０１の対応するアミノ酸と異なる。別の実施形態では、配列番号８０７、配列番号８０８、または配列番号８３４のグルカゴン類似体を提供し、類似体の１、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２４位から選択される１〜２個のアミノ酸は配列番号８０１の対応するアミノ酸と異なり、さらなる一実施形態では、これら１〜２個の異なるアミノ酸は、天然の配列（配列番号８０１）に存在するアミノ酸に対する保存的なアミノ酸置換を表す。一部の実施形態では、配列番号８１１または配列番号８１３のグルカゴンペプチドを提供し、グルカゴンペプチドは、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、または２９位から選択される位置にアミノ酸置換を１、２、または３個さらに含む。一部の実施形態では、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２７、または２９位の置換は保存的なアミノ酸置換である。
【０１９９】
一部の実施形態では、配列番号８０１の類似体ペプチドを含むグルカゴンアゴニストを提供し、類似体は、２位にセリン以外のアミノ酸を有し、２８位もしくは２９位の天然のアミノ酸に対して酸性アミノ酸が置換しており、または配列番号８０１のペプチドのカルボキシ末端に酸性アミノ酸が付加されていることが配列番号８０１と異なる。一部の実施形態では、酸性アミノ酸はアスパラギン酸またはグルタミン酸である。一部の実施形態では、配列番号８０９、配列番号８１２、配列番号８１３、または配列番号８３２のグルカゴン類似体を提供し、類似体は親分子と２位の置換が異なる。より詳しくは、類似体ペプチドの２位は、Ｄ−セリン、アラニン、Ｄ−アラニン、グリシン、ｎ−メチルセリン、およびアミノイソ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。
【０２００】
別の実施形態では、配列番号８０１の類似体ペプチドを含むグルカゴンアゴニストを提供し、類似体は、１位にヒスチジン以外のアミノ酸を有し、２８位もしくは２９位の天然のアミノ酸に対して酸性アミノ酸が置換しており、または酸性アミノ酸が配列番号８０１のペプチドのカルボキシ末端に付加されていることが配列番号８０１と異なる。一部の実施形態では、酸性アミノ酸はアスパラギン酸またはグルタミン酸である。一部の実施形態では、配列番号８０９、配列番号８１２、配列番号８１３、または配列番号８３２のグルカゴン類似体を提供し、類似体は親分子と１位の置換が異なる。より詳しくは、類似体ペプチドの１位は、ＤＭＩＡ、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、およびホモ−ヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。
【０２０１】
一部の実施形態によれば、改変されているグルカゴンペプチドは、配列番号８０９、配列番号８１２、配列番号８１３、および配列番号８３２からなる群から選択される配列を含む。さらなる一実施形態では、配列番号８０９、配列番号８１２、配列番号８１３、または配列番号８３２のＣ末端に付加されているアミノ酸を１または２つさらに含む、配列番号８０９、配列番号８１２、配列番号８１３、または配列番号８３２の配列を含むグルカゴンペプチドを提供し、さらなるアミノ酸は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、またはホモシステイン酸からなる群から独立に選択される。一部の実施形態では、カルボキシ末端に付加されているさらなるアミノ酸は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、もしくはＧｌｕからなる群から選択され、またはさらなる一実施形態では、さらなるアミノ酸はＡｓｐもしくはＧｌｕである。
【０２０２】
別の実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号７の配列またはそのグルカゴンアゴニスト類似体を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号８０８、配列番号８１０、配列番号８１１、配列番号８１２、および配列番号８１３からなる群から選択される配列を含む。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号８０８、配列番号８１０、および配列番号８１１からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドのＣ末端に付加された、ＡｓｐおよびＧｌｕからなる群から選択される、さらなるアミノ酸をさらに含む、配列番号８０８、配列番号８１０、および配列番号８１１の配列を含む。一部の実施形態では、グルカゴンペプチドは配列番号８１１または配列番号８１３の配列を含み、さらなる一実施形態では、グルカゴンペプチドは配列番号８１１の配列を含む。
【０２０３】
一部の実施形態によれば、以下からなる群から選択される改変されているグルカゴンペプチドを含む、グルカゴンアゴニストを提供し、
ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号８３４）、
ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｒ（配列番号８１１）および
ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｒ（配列番号８１３）
式中、１５位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸、またはホモシステイン酸であり、酸性残基が２８、２９、または３０位のうちの１つに存在するという前提で、２８位のＸａａはＡｓｎまたは酸性アミノ酸であり、２９位のＸａａはＴｈｒまたは酸性アミノ酸であり、Ｒは酸性アミノ酸、ＣＯＯＨ、またはＣＯＮＨ2である。一部の実施形態では、ＲはＣＯＯＨであり、別の実施形態では、ＲはＣＯＮＨ2である。
【０２０４】
本開示はグルカゴン融合ペプチドも包含し、第２のペプチドがグルカゴンペプチドのＣ末端に融合してグルカゴンペプチドの安定性および溶解性を増強する。より詳しくは、融合グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号８３４）を含むグルカゴンアゴニスト類似体を含むことができ、Ｒは、酸性アミノ酸、または結合、およびグルカゴンペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸に連結している、配列番号８２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号８２１（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、または配列番号８２２（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列である。一部の実施形態では、グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸に連結している、配列番号８２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号８２１（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、または配列番号８２２（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列をさらに含む、配列番号８３３、配列番号８０７、または配列番号８０８からなる群から選択される。一部の実施形態では、グルカゴン融合ペプチドは、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９に連結している、配列番号８２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号８２１（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、または配列番号８２２（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列をさらに含む、配列番号８０２、配列番号８０３、配列番号８０４、配列番号８０５、および配列番号８０６またはそのグルカゴンアゴニスト類似体を含む。一部の実施形態によれば、融合ペプチドは、１６、１７、２１、２４、２９位のアミノ酸に、Ｃ末端伸長内、またはＣ末端アミノ酸で連結しているＰＥＧ鎖をさらに含み、ＰＥＧ鎖は５００〜４００００ダルトンの範囲から選択される。一部の実施形態では、配列番号８２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号８２１（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、または配列番号８２２（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列は、ペプチド結合を介してグルカゴンペプチドのアミノ酸２９に結合している。一部の実施形態では、グルカゴン融合ペプチドのグルカゴンペプチド部分は、配列番号８１０、配列番号８１１、および配列番号８１３からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、グルカゴン融合ペプチドのグルカゴンペプチド部分は、配列番号８１１または配列番号８１３の配列を含み、ＰＥＧ鎖はそれぞれ、２１、２４、２９位で、Ｃ末端伸長内、またはＣ末端アミノ酸で連結している。
【０２０５】
別の実施形態では、融合ペプチドのグルカゴンペプチド配列は、配列番号８１１の配列を含み、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９に連結している配列番号８２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号８２１（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、または配列番号８２２（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、グルカゴン融合ペプチドは、配列番号８２４、配列番号８２５、および配列番号８２６からなる群から選択される配列を含む。本発明の融合ペプチドが、標準のカルボン酸基を有するＣ末端アミノ酸を有するのが典型的である。しかし、Ｃ末端アミノ酸がカルボキシル酸に対して置換されているアミドを有するこれらの配列の類似体も、実施形態として包含される。一部の実施形態によれば、融合グルカゴンペプチドは、配列番号８１０、配列番号８１１、および配列番号８１３からなる群から選択されるグルカゴンアゴニスト類似体を含み、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９に連結している配列番号８２３（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＣＯＮＨ2）のアミノ酸配列をさらに含む。
【０２０６】
本発明のグルカゴンアゴニストは、グルカゴンペプチドの生物学的活性を保持し、一方で水溶液中のペプチドの溶解性および安定性を改善するようにさらに改変することができる。一部の実施形態によれば、配列番号８１１のペプチドまたはそのグルカゴンアゴニスト類似体の１６、１７、２０、２１、２４、および２９位から選択される１つまたは複数の位置に親水性基を導入すると、ｐＨを安定化するグルカゴン類似体の溶解性および安定性が改善されると予測される。より詳しくは、一部の実施形態では、配列番号８１０、配列番号８１１、配列番号８１３、または配列番号８３２のグルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドの２１位および２４位に存在するアミノ酸の側鎖に共有結合により連結している親水性基を１つまたは複数含むように改変される。
【０２０７】
一部の実施形態によれば、配列番号８１１のグルカゴンペプチドは、１６、１７、２０、２１、２４、および／または２９位のアミノ酸置換を１つまたは複数含むように改変され、天然のアミノ酸は、ＰＥＧなどを含めた親水性部分と架橋連結するのに適する側鎖を有するアミノ酸で置換されている。天然ペプチドは、天然に存在するアミノ酸または合成（天然に存在しない）アミノ酸で置換できる。合成または天然に存在しないアミノ酸とは、ｉｎ  ｖｉｖｏで天然に存在しないが、それにもかわらず、本明細書に記載するペプチド構造に組み込むことができるアミノ酸のことをいう。
【０２０８】
一部の実施形態では、配列番号８１０、配列番号８１１、または配列番号８１３のグルカゴンアゴニストを提供し、天然のグルカゴンペプチドの配列は、天然の配列の１６、１７、２１、２４、２９位のうちの少なくとも１つに、Ｃ末端伸長内、またはＣ末端アミノ酸で、天然に存在するアミノ酸または合成のアミノ酸を含むように改変され、アミノ酸置換は親水性部分をさらに含む。一部の実施形態では、置換は２１位または２４位であり、さらなる一実施形態では、親水性部分はＰＥＧ鎖である。一部の実施形態では、配列番号８１１のグルカゴンペプチドは少なくとも１つのシステイン残基で置換され、システイン残基の側鎖は、マレイミド、ビニルスルホン、２−ピリジルチオ、ハロアルキル、およびハロアシルなどを含めたチオール反応性試薬でさらに改変される。これらのチオール反応性試薬は、カルボキシ、ケト、ヒドロキシル、およびエーテル基、ならびに他の親水性部分、例えば、ポリエチレングリコール単位を含んでいてよい。代替的な一実施形態では、天然のグルカゴンペプチドはリシンで置換され、置換性のリシン残基の側鎖は、カルボン酸の活性のエステル（スクシンイミド、無水物など）、またはポリエチレングリコールなどの親水性部分のアルデヒドなどのアミン反応性試薬を使用してさらに改変される。一部の実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号８１４、配列番号８１５、配列番号８１６、配列番号８１７、配列番号８１８、および配列番号８１９からなる群から選択される。
【０２０９】
一部の実施形態によれば、ペグ化グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドに共有結合している２つ以上のポリエチレングリコール鎖を含み、グルカゴン鎖の合計分子量は約１０００〜約５０００ダルトンである。一部の実施形態では、ペグ化グルカゴンアゴニストは配列番号８０６のペプチドを含み、ＰＥＧ鎖は２１位および２４位のアミノ酸残基に共有結合により連結しており、２本のＰＥＧ鎖を合わせた分子量は約１０００〜約５０００ダルトンである。別の実施形態では、ペグ化グルカゴンアゴニストは配列番号８０６のペプチドを含み、ＰＥＧ鎖は２１位および２４位のアミノ酸残基に共有結合により連結しており、２本のＰＥＧ鎖を合わせた分子量は約５０００〜約２００００ダルトンである。
ポリエチレングリコール鎖は、直鎖の形態であってよく、または分枝でもよい。一部の実施形態によれば、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約４００００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。一部の実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約５０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。別の実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、約２００００〜約４００００ダルトンの分子量を有する。
【０２１０】
上記に記載したグルカゴンペプチドのいずれかは、グルカゴンペプチドのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９位）内に、共有結合もしくは非共有結合による分子内架橋、またはアルファヘリックスを安定化するアミノ酸を含むようにさらに改変することができる。一部の実施形態によれば、グルカゴンペプチドは、ＡＩＢなどのα，α−二置換アミノ酸での１６、２０、２１、または２４位（またはこれらの組合せ）のアミノ酸置換に加えて、上記に論じたあらゆる１つまたは複数の改変を含む。別の実施形態によれば、グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドの１６位と２０位とのアミノ酸の側鎖の間に、ラクタムなどの分子内架橋に加えて、上記に論じたあらゆる１つまたは複数の改変を含む。
【０２１１】
一部の実施形態によれば、グルカゴンペプチドは、配列番号８７７のアミノ酸配列を含み、３位のＸａａは、構造Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩの側鎖を含むアミノ酸であり、
【化１８】
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構造Ｉ
【化１９】
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構造ＩＩ
【化２０】
2016521253.tif 000022
構造ＩＩＩ
式中、Ｒ1はＣ0-3アルキルまたはＣ0-3ヘテロアルキルであり、Ｒ2はＮＨＲ4またはＣ1-3アルキルであり、Ｒ3はＣ1-3アルキルであり、Ｒ4はＨまたはＣ1-3アルキルであり、ＸはＮＨ、Ｏ、またはＳであり、ＹはＮＨＲ4、ＳＲ3、またはＯＲ3である。一部の実施形態では、ＸはＮＨであり、またはＹはＮＨＲ4である。一部の実施形態では、Ｒ1はＣ0-2アルキルであり、またはＣ1ヘテロアルキルである。一部の実施形態では、Ｒ2はＮＨＲ4またはＣ1アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ4はＨまたはＣ1アルキルである。例示的な実施形態では、構造Ｉの側鎖を含むアミノ酸を提供し、Ｒ1はＣＨ2−Ｓであり、ＸはＮＨであり、Ｒ2はＣＨ3であり（アセトアミドエチル−システイン、Ｃ（Ａｃｍ））、Ｒ1はＣＨ2であり、ＸはＮＨであり、Ｒ2はＣＨ3であり（アセチルジアミノブタン酸、Ｄａｂ（Ａｃ））、Ｒ1はＣ0アルキルであり、ＸはＮＨであり、Ｒ2はＮＨＲ4であり、Ｒ4はＨであり（カルバモイルジアミノプロパン酸、Ｄａｐ（尿素））、またはＲ1はＣＨ2−ＣＨ2であり、ＸはＮＨであり、Ｒ2はＣＨ3である（アセチルオルニチン、Ｏｒｎ（Ａｃ））。例示的な実施形態では、構造ＩＩの側鎖を含むアミノ酸を提供し、Ｒ1はＣＨ2であり、ＹはＮＨＲ4であり、Ｒ4はＣＨ3である（メチルグルタミン、Ｑ（Ｍｅ））。例示的な実施形態では、構造ＩＩＩの側鎖を含むアミノ酸を提供し、Ｒ1はＣＨ2であり、Ｒ4はＨである（メチオニン−スルホキシド、Ｍ（Ｏ））。特定の実施形態では、３位のアミノ酸はＤａｂ（Ａｃ）で置換されている。例えば、グルカゴンアゴニストは、配列番号８６３、配列番号８６９、配列番号８７１、配列番号８７２、配列番号８７３、および配列番号８７４のアミノ酸配列を含むことができる。
【０２１２】
ある特定の実施形態では、グルカゴンペプチドは配列番号８７７のグルカゴンペプチドの類似体である。具体的な態様では、類似体は、それだけには限定されないが、２８位のＡｓｎの荷電アミノ酸での置換、２８位のＡｓｎの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、およびホモシステイン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸での置換、２８位のＡｓｎ、Ａｓｐ、またはＧｌｕでの置換、２８位のＡｓｐでの置換、２８位のＧｌｕでの置換、２９位のＴｈｒの荷電アミノ酸での置換、２９位のＴｈｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、およびホモシステイン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸での置換、２９位のＡｓｐ、Ｇｌｕ、またはＬｙｓでの置換、２９位のＧｌｕでの置換、２９位の後への荷電アミノ酸１〜３個の挿入、２９位の後へのＧｌｕまたはＬｙｓの挿入、２９位の後へのＧｌｙ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−Ｌｙｓの挿入、ならびにこれらの組合せを含めた、本明細書に記載するアミノ酸改変のいずれかを含む。
【０２１３】
ある特定の実施形態では、配列番号８７７のグルカゴンペプチドの類似体は、１６、２０、２１、および２４位のうちの１、２、３つ、または全てに、ＡＩＢなどのα，α−二置換アミノ酸を含む。
ある特定の実施形態では、配列番号８７７のグルカゴンペプチドの類似体は、１位のＨｉｓの、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する非天然のアミノ酸での置換、２位のＳｅｒの、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する非天然のアミノ酸での置換、７位のＴｈｒの、ＡｂｕまたはＩｌｅなどのヒドロキシル基を欠くアミノ酸での置換、１０位のＴｙｒのＰｈｅまたはＶａｌでの置換、１２位のＬｙｓのＡｒｇでの置換、１５位のＡｓｐのＧｌｕでの置換、１６位のＳｅｒのＴｈｒまたはＡＩＢでの置換、２０位のＧｌｎのＡｌａまたはＡＩＢでの置換、２１位のＡｓｐのＧｌｕでの置換、２４位のＧｌｎのＡｌａまたはＡＩＢでの置換、２７位のＭｅｔのＬｅｕまたはＮｌｅでの置換、２７〜２９位のアミノ酸の欠失、２８〜２９位のアミノ酸の欠失、２９位のアミノ酸の欠失、２９位のアミノ酸がＴｈｒまたはＧｌｙである、配列番号８２０のアミノ酸配列のＣ末端への付加、またはこれらの組合せの１つまたは複数を含む。
【０２１４】
具体的な実施形態によれば、グルカゴンペプチドは、配列番号８６２〜８６７および８６９〜８７４のいずれかのアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、配列番号８７７を含むグルカゴンペプチドの類似体は、１６、１７、２０、２１、２４、または２９位のいずれかのアミノ酸に、またはＣ末端アミノ酸で共有結合により連結している、ＰＥＧなどの親水性部分を含む。
ある特定の実施形態では、配列番号８７７を含むグルカゴンペプチドの類似体は、スペーサーを介してもよい、アシル基またはアルキル基に共有結合により結合している側鎖を含むアミノ酸を含み、このアシル基またはアルキル基は、天然に存在するアミノ酸に非天然である。アシル基は、一部の実施形態では、Ｃ４〜Ｃ３０脂肪アシル基である。他の実施形態では、アルキル基はＣ４〜Ｃ３０アルキルである。具体的な態様では、アシル基またはアルキル基は、１０位のアミノ酸の側鎖に共有結合により結合している。一部の実施形態では、７位のアミノ酸はＩｌｅまたはＡｂｕである。
【０２１５】
グルカゴンアゴニストは、最高１、２、３、４、または５個のグルカゴンアゴニスト活性を保持するさらなる改変を有してもよい、配列番号８０１〜９１９のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドであってよい。ある特定の実施形態では、グルカゴンアゴニストは、配列番号８５９〜９１９のいずれかのアミノ酸を含む。
【０２１６】
クラス２グルカゴン関連ペプチド
ある特定の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、本明細書に、ならびにその内容が全文において参照によって援用される、国際特許出願第ＰＣＴ  ＵＳ２００９／４７４４７号（２００９年６月１６日出願）、米国仮出願第６１／０９０，４４８号、および米国出願第６１／１５１，３４９号に記載される、ならびにその内容が全文において参照によって援用される、２０１０年６月１６日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／３８８２５号、および米国仮出願第６１／１８７５７８号のクラス２グルカゴン関連ペプチドである。クラス２グルカゴン関連ペプチドには、クラス６グルカゴン関連ペプチド内のペプチドが含まれ、よって、クラス２グルカゴン関連ペプチドに関する類似体、誘導体、コンジュゲート、改変などに対する本明細書の言及は全て、クラス６グルカゴン関連ペプチドにも適用される。
クラス２グルカゴン関連ペプチドに関して以下のセクションにおいて言及する生物学的配列（配列番号１００１〜１２６２）は、国際特許出願第ＰＣＴ  ＵＳ２００９／４７４４７号における配列番号１〜２６２に対応する。
【０２１７】
活性
天然のグルカゴンは、ＧＩＰ受容体を活性化せず、通常ＧＬＰ−１受容体での天然のＧＬＰ−１の活性の約１％を有する。本明細書に記載する天然のグルカゴン配列に対する改変により、天然のグルカゴン（配列番号１００１）の活性と等価な、もしくはそれより優れた強力なグルカゴン活性、天然のＧＩＰ（配列番号１００４）の活性と等価な、もしくはそれより優れた強力なＧＩＰ活性、および／または天然のＧＬＰ−１の活性と等価な、もしくはそれより優れた強力なＧＬＰ−１活性を表し得るクラス２グルカゴン関連ペプチドが生成される。これに関して、クラス２グルカゴン関連ペプチドは、本明細書にさらに記載する通り、グルカゴン／ＧＩＰ共アゴニスト、グルカゴン／ＧＩＰ／ＧＬＰ−１トリアゴニスト、ＧＩＰ／ＧＬＰ−１共アゴニスト、またはＧＩＰアゴニストグルカゴンペプチドの１つであってよい。
【０２１８】
一部の実施形態では、本明細書に記載するクラス２グルカゴン関連ペプチドは、約１００ｎＭ以下、または約７５、５０、２５、１０、８、６、５、４、３、２、もしくは１ｎＭ、もしくはそれ未満の、ＧＩＰ受容体活性化活性に対するＥＣ５０を表す。一部の実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドは、約１００ｎＭ以下、または約７５、５０、２５、１０、８、６、５、４、３、２、もしくは１ｎＭ、もしくはそれ未満の、グルカゴン受容体活性化に対するＥＣ５０を表す。一部の実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドは、約１００ｎＭ以下、または約７５、５０、２５、１０、８、６、５、４、３、２、もしくは１ｎＭ、もしくはそれ未満の、ＧＬＰ−１受容体活性化に対するＥＣ５０を表す。受容体活性化は、受容体を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞におけるｃＡＭＰ誘導を測定するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって、例えば、例に記載する通り、受容体をコードするＤＮＡ、およびｃＡＭＰ応答性エレメントに連結しているルシフェラーゼ遺伝子を同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３をアッセイすることによって測定することができる。
【０２１９】
一部の実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドは、ＧＩＰ受容体で、天然のＧＩＰに対して、少なくとも約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％，１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、または２００％、またはそれを超える活性（ＧＩＰ作用強度）を表す。一部の実施形態では、本明細書に記載するグルカゴンペプチドは、ＧＩＰ受容体で、天然のＧＩＰに対して、１０００％、１００００％、１０００００％、または１００００００％以下の活性を表す。一部の実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体で、天然のグルカゴンに対して、少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、または５００％、またはそれを超える活性（グルカゴン作用強度）を表す。一部の実施形態では、本明細書に記載するグルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体で、天然のグルカゴンに対して、１０００％、１００００％、１０００００％、または１００００００％以下の活性を表す。一部の実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体で、天然のＧＬＰ−１に対して、少なくとも約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、または２００％、またはそれを超える活性（ＧＬＰ−１作用強度）を表す。一部の実施形態では、本明細書に記載するグルカゴンペプチドは、ＧＬＰ−１受容体で、天然のＧＬＰ−１に対して１０００％、１００００％、１０００００％、または１００００００％以下の活性を表す。受容体の天然のリガンドに対する、受容体でのクラス２グルカゴン関連ペプチドの活性は、クラス２グルカゴン関連ペプチド対天然のリガンドに対するＥＣ５０の逆比として計算する。
【０２２０】
一部の実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体およびＧＩＰ受容体の両方で活性を表す（「グルカゴン／ＧＩＰ共アゴニスト」）。これらのクラス２グルカゴン関連ペプチドは、ＧＩＰ受容体に比べて、グルカゴン受容体に対する天然のグルカゴンの選択性を失っている。一部の実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドのＧＩＰ受容体でのＥＣ５０は、グルカゴン受容体でのＥＣ５０と、約５０倍、４０倍、３０倍、または２０倍未満異なる（高いまたは低い）。一部の実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドのＧＩＰ作用強度は、グルカゴン作用強度と約５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、７５、５０、２５、２０、１５、１０、または５倍未満異なる（高いまたは低い）。一部の実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドのＧＩＰ受容体でのＥＣ５０を、クラス２グルカゴン関連ペプチドのグルカゴン受容体でのＥＣ５０によって除した比は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、または５未満である。一部の実施形態では、ＧＩＰ受容体でのＥＣ５０を、グルカゴン受容体でのＥＣ５０によって除した比は、約１、または約１未満（例えば、約０．０１、０．０１３、０．０１６７、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０５、０．０６７、０．１、０．２）である。一部の実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドのＧＩＰ作用強度を、クラス２グルカゴン関連ペプチドのグルカゴン作用強度と比べた比は、約５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、または５未満である。一部の実施形態では、ＧＩＰ受容体での作用強度を、グルカゴン受容体での作用強度によって除した比は、約１または約１未満（例えば、約０．０１、０．０１３、０．０１６７、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０５、０．０６７、０．１、０．２）である。一部の実施形態では、ＧＬＰ−１活性は、７位のアミノ酸改変、２７−もしくは２８−アミノ酸ペプチドを生じる２７位もしくは２８位のアミノ酸に対するアミノ酸（複数可）Ｃ末端の欠失、またはこれらの組合せなどによって、著しく低減または破壊されている。
【０２２１】
別の一態様では、クラス２グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン、ＧＩＰ、およびＧＬＰ−１受容体で活性を表す（「グルカゴン／ＧＩＰ／ＧＬＰ−１トリアゴニスト」）。これらのクラス２グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体に対する天然のグルカゴンの選択性を、ＧＬＰ−１受容体およびＧＩＰ受容体の両方に比べて失っている。一部の実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドのＧＩＰ受容体でのＥＣ５０は、グルカゴン受容体およびＧＬＰ−１受容体でのそれぞれのＥＣ５０と、約５０倍、４０倍、３０倍、または２０倍未満異なる（高いまたは低い）。一部の実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドのＧＩＰ作用強度は、グルカゴンおよびＧＬＰ−１の作用強度と、約５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、７５、５０、２５、２０、１５、１０、または５倍未満異なる（高いまたは低い）。一部の実施形態では、ＧＩＰ受容体でのトリアゴニストのＥＣ５０を、ＧＬＰ−１受容体でのトリアゴニストのＥＣ５０によって除した比は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、または５未満である。一部の実施形態では、ＧＩＰ受容体でのＥＣ５０を、ＧＬＰ−１受容体でのＥＣ５０によって除した比は、約１または約１未満（例えば、約０．０１、０．０１３、０．０１６７、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０５、０．０６７、０．１、０．２）である。一部の実施形態では、トリアゴニストのＧＩＰ作用強度を、トリアゴニストのＧＬＰ−１作用強度と比べた比は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、または５未満である。一部の実施形態では、ＧＩＰ受容体での作用強度を、ＧＬＰ−１受容体での作用強度によって除した比は、約１または約１未満（例えば、約０．０１、０．０１３、０．０１６７、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０５、０．０６７、０．１、０．２）である。関連の実施形態では、ＧＩＰ受容体でのトリアゴニストのＥＣ５０を、グルカゴン受容体でのトリアゴニストのＥＣ５０によって除した比は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、または５未満である。一部の実施形態では、ＧＩＰ受容体でのＥＣ５０を、グルカゴン受容体でのＥＣ５０によって除した比は、約１または約１未満（例えば、約０．０１、０．０１３、０．０１６７、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０５、０．０６７、０．１、０．２）である。一部の実施形態では、トリアゴニストのグルカゴン作用強度に比べた、トリアゴニストのＧＩＰ作用強度の比は、約５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、または５未満である。一部の実施形態では、ＧＩＰ受容体での作用強度を、グルカゴン受容体での作用強度によって除した比は、約１または約１未満（例えば、約０．０１、０．０１３、０．０１６７、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０５、０．０６７、０．１、０．２）である。一部の実施形態では、トリアゴニストのＧＬＰ−１受容体でのＥＣ５０を、トリアゴニストのグルカゴン受容体でのＥＣ５０によって除した比は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、または５未満である。一部の実施形態では、ＧＬＰ−１受容体でのＥＣ５０を、グルカゴン受容体でのＥＣ５０によって除した比は、約１または約１未満（例えば、約０．０１、０．０１３、０．０１６７、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０５、０．０６７、０．１、０．２）である。一部の実施形態では、トリアゴニストのグルカゴン作用強度に比べた、トリアゴニストのＧＬＰ−１作用強度の比は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、または５未満である。一部の実施形態では、ＧＬＰ−１受容体での作用強度を、グルカゴン受容体での作用強度によって除した比は、約１または約１未満（例えば、約０．０１、０．０１３、０．０１６７、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０５、０．０６７、０．１、０．２）である。
【０２２２】
さらに別の態様では、クラス２グルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１およびＧＩＰ受容体で活性を表すが、この場合、３位のアミノ酸改変などによって、グルカゴン活性は著しく低減または破壊されている（「ＧＩＰ／ＧＬＰ−１共アゴニスト」）。例えば、この位置の、酸性、塩基性、または疎水性のアミノ酸（グルタミン酸、オルニチン、ノルロイシン）での置換により、グルカゴン活性は低減する。一部の実施形態では、ＧＩＰ受容体でのグルカゴンペプチドのＥＣ５０は、ＧＬＰ−１受容体でのＥＣ５０と、約５０倍、４０倍、３０倍、または２０倍未満異なる（高いまたは低い）。一部の実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドのＧＩＰ作用強度は、そのＧＬＰ−１作用強度と約２５、２０、１５、１０、または５倍未満異なる（高いまたは低い）。一部の実施形態では、これらのクラス２グルカゴン関連ペプチドの、グルカゴン受容体での天然グルカゴンの活性は、約１０％以下、例えば、約１〜１０％、または約０．１〜１０％、または約０．１％を超えるが約１０％未満である。一部の実施形態では、ＧＩＰ受容体でのクラス２グルカゴン関連ペプチドのＥＣ５０を、ＧＬＰ−１受容体でのクラス２グルカゴン関連ペプチドのＥＣ５０によって除した比は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、または５未満、および１以上（ｎｏ  ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ）である。一部の実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドのＧＩＰ作用強度を、クラス２グルカゴン関連ペプチドのＧＬＰ−１作用強度と比べた比は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、または５未満、および１以上である。
【０２２３】
さらなる一態様では、クラス２グルカゴン関連ペプチドはＧＩＰ受容体で活性を表し、この場合、グルカゴンおよびＧＬＰ−１活性は、３位のＧｌｕの、および７位のＩｌｅのアミノ酸改変などによって、著しく低減または破壊されている（「ＧＩＰアゴニストグルカゴンペプチド」）。一部の実施形態では、これらのクラス２グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体での、天然のグルカゴンの活性の、約１０％以下、例えば、約１〜１０％、または約０．１〜１０％、または約０．１％、０．５％、もしくは１％を超え、しかし約１％、５％、もしくは１０％未満を有する。一部の実施形態では、これらのクラス２グルカゴン関連ペプチドはまた、ＧＬＰ−１受容体での、天然のＧＬＰ−１の活性の、約１０％以下、例えば、約１〜１０％、または約０．１〜１０％、または約０．１％、０．５％、もしくは１％を超え、しかし約１％、５％、もしくは１０％未満を有する。
【０２２４】
一部の実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドがペグ化されていない場合、ＧＩＰ受容体に対するクラス２グルカゴン関連ペプチドのＥＣ５０は約４、２、１ｎＭ、もしくはそれ未満であり、または類似体は、ＧＩＰ受容体で天然のＧＩＰの活性の少なくとも約１％、２％、３％、４％、もしくは５％を有する。関連の実施形態では、ＧＬＰ−１受容体活性化に対する非ペグ化のクラス２グルカゴン関連ペプチドのＥＣ５０は、約４、２、１ｎＭ、もしくはそれ未満であり、またはＧＬＰ−１受容体での天然のＧＬＰ−１の活性の少なくとも約１％、２％、３％、４％、もしくは５％を有する。さらに他の関連の実施形態では、グルカゴン受容体活性化に対する非ペグ化のクラス２グルカゴン関連ペプチドのＥＣ５０は、約４、２、１ｎＭ、もしくはそれ未満であり、またはグルカゴン受容体での天然グルカゴンの活性の少なくとも約５％、１０％、１５％、もしくは２０％を有する。一部の実施形態では、非ペグ化のクラス２グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体での天然のグルカゴンの活性の約１％未満を有する。他の実施形態では、非ペグ化のクラス２グルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体での天然のＧＬＰ−１の活性の約１０％、５％、または１％未満を有する。
【０２２５】
クラス２グルカゴン関連ペプチドがＰＥＧなどの親水性部分に連結している実施形態では、１つまたは複数の受容体での相対的なＥＣ５０は高くてよく、例えば約１０倍高い。例えば、ＧＩＰ受容体活性化に関するペグ化されている類似体のＥＣ５０は約１０ｎＭ以下であり、またはクラス２グルカゴン関連ペプチドは、ＧＩＰ受容体で天然のＧＩＰの活性の少なくとも約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、もしくは０．５％を有する。関連の実施形態では、ＧＬＰ−１受容体活性化に関するペグ化されているクラス２グルカゴン関連ペプチドのＥＣ５０は、約１０ｎＭ以下であり、またはＧＬＰ−１受容体で天然のＧＬＰ−１の活性の少なくとも約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、または０．５％を有する。さらに他の関連の実施形態では、グルカゴン受容体活性化に関するペグ化されているクラス２グルカゴン関連ペプチドのＥＣ５０は約１０ｎＭ以下であり、またはグルカゴン受容体での天然のグルカゴンの活性の少なくとも約０．５％、１％、１．５％、もしくは２％である。一部の実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体での天然グルカゴンの活性の約１％未満を有する。他の実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体での天然ＧＬＰ−１の活性の約１０％、５％、または１％未満を有する。
【０２２６】
改変
クラス２グルカゴン関連ペプチドに関して本明細書に開示する改変により、ＧＩＰ活性、グルカゴン活性、および／またはＧＬＰ−１活性の増大を表すグルカゴンペプチドを作り出すための、グルカゴン（配列番号１００１）の操作が可能になる。クラス２グルカゴン関連ペプチドに関して本明細書に開示する他の改変は、結果として生じるペプチドの半減期を延ばし、溶解性を増大し、または安定性を増大する。クラス２グルカゴン関連ペプチドに関して本明細書に開示するさらに他の改変は、活性に対して効果がなく、または所望の活性（単数もしくは複数）を壊さずに作成することができる。同じ目的を供する（例えば、ＧＩＰ活性を増大する）クラス２グルカゴン関連ペプチドに関する組合せのいずれかを、個々に、または組み合わせて適用することができる。性質の増強を付与するクラス２グルカゴン関連ペプチドに関する単一の、またはセットの組合せのいずれかを、個々に、または組み合わせて適用することができ、例えば、ＧＩＰおよび／またはＧＬＰ−１活性の増大を、半減期の増大と組み合わせることができる。関連の実施形態では、１、２、３、４、５、６個、またはそれを超えるアミノ酸改変は、非保存的な置換、付加、または欠失であってよい。一部の実施形態では、１、２、３、４、５、６個、またはそれを超えるアミノ酸改変は、保存的な置換であってよい。
【０２２７】
ＧＩＰ活性に影響を及ぼす改変
ＧＩＰ受容体での活性の増強は、１位のアミノ酸改変によってもたらされる。例えば、１位のＨｉｓを大型の芳香族アミノ酸で置換し、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、アミノ−Ｐｈｅ、ニトロ−Ｐｈｅ、クロロ−Ｐｈｅ、スルホ−Ｐｈｅ、４−ピリジル−Ａｌａ、メチル−Ｔｙｒ、または３−アミノＴｙｒで置換してもよい。１位のＴｙｒを、アミノ酸１２〜２９に対応する領域内のアルファヘリックスの安定化と組み合わせることで、ＧＩＰ受容体およびＧＬＰ−１受容体およびグルカゴン受容体を活性化するクラス２グルカゴン関連ペプチドがもたらされる。アルファヘリックス構造は、共有結合もしくは非共有結合による分子内架橋の形成などにより、または１２〜２９位周辺のアミノ酸の、アルファヘリックスを安定化するアミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸）での置換および／もしくは挿入により安定化することができる。
【０２２８】
ＧＩＰ受容体での活性の増強は、２７位および／または２８位の、ならびに２９位でもよいアミノ酸改変によってももたらされる。例えば、２７位のＭｅｔを大型の脂肪族アミノ酸で置換し、Ｌｅｕで置換してもよく、２８位のＡｓｎを、小型の脂肪族アミノ酸で置換し、Ａｌａで置換してもよく、２９位のＴｈｒを小型の脂肪族アミノ酸で置換し、Ｇｌｙで置換してもよい。２７〜２９位のＬＡＧでの置換により、これらの位置の天然のＭＮＴ配列に比べてＧＩＰ活性の増大がもたらされる。
ＧＩＰ受容体での活性の増強は、１２位のアミノ酸改変によってももたらされる。例えば、１２位を、大型の脂肪族無極性アミノ酸で置換し、Ｉｌｅで置換してもよい。
ＧＩＰ受容体での活性の増強は、１７位および／または１８位のアミノ酸改変によってももたらされる。例えば、１７位を極性の残基で置換し、Ｇｌｎで置換してもよく、１８位を、小型の脂肪族アミノ酸で置換し、Ａｌａで置換してもよい。１７位および１８位のＱＡでの置換により、これらの位置の天然のＲＲ配列に比べて、ＧＩＰ活性の増大がもたらされる。
ＧＩＰ受容体での活性の増強は、１２位から２９位までのアミノ酸側鎖の間の分子内架橋の形成を可能にする改変によってももたらされる。例えば、分子内架橋は、ｉ位とｉ＋４位の２つのアミノ酸の側鎖間の、またはｊ位とｊ＋３位の間の、またはｋ位とｋ＋７位の間の共有結合によって形成され得る。例示的な実施形態では、架橋は１２位と１６位と、１６位と２０位と、２０位と２４位と、２４位と２８位と、または１７位と２０位との間である。他の実施形態では、塩橋などの非共有結合による相互作用が、これらの位置の正に荷電しているアミノ酸と負に荷電アミノ酸との間に形成し得る。
ＧＩＰ受容体活性を増大する、上記に記載した改変のいずれかを、個々に、または組み合わせて適用することができる。ＧＩＰ受容体活性を増大する改変の組合せは、単独で採用したこのような改変のいずれかよりも高いＧＩＰ活性をもたらすのが一般的である。
【０２２９】
グルカゴン活性に影響を及ぼす改変
一部の実施形態では、グルカゴン作用強度の増強が、天然のグルカゴン（配列番号１００１）の１６位のアミノ酸改変によってももたらされる。非限定的な例により、このような作用強度の増強は、１６位の天然に存在するセリンをグルタミン酸で、もしくは長さ４原子の側鎖を有する負に荷電している別のアミノ酸で、または代替的にグルタミン、ホモグルタミン酸、もしくはホモシステイン酸のいずれか１つで、もしくは少なくとも１つのヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ）を含む側鎖を有する荷電アミノ酸で、および約４（または３〜５）原子の長さの側鎖で、置換することによりもたらされ得る。一部の実施形態では、グルカゴンペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対して、グルカゴン受容体に対するオリジナルの選択性を保持する。
【０２３０】
グルカゴン受容体活性は、３位のアミノ酸改変、例えば、天然に存在する３位のグルタミンの、酸性、塩基性、または疎水性のアミノ酸での置換により、低減することができる。例えば、３位の、グルタミン酸、オルニチン、またはノルロイシンでの置換により、グルカゴン受容体活性は実質的に低減または破壊される。
グルカゴン受容体での活性の維持または増強は、本明細書に記載する通り、３位のＧｌｎをグルタミン類似体で改変することにより実現され得る。例えば、グルカゴンアゴニストは、配列番号１２４３〜１２４８、１２５０、１２５１、および１２５３〜１２５６のいずれかのアミノ酸配列を含むことができる。
【０２３１】
１位および２位のアミノ酸改変により低減されたグルカゴン活性の回復は、グルカゴンペプチドまたはその類似体のＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９）のアルファヘリックス構造を安定化する改変によりもたらされる。例えば、ｉ位とｉ＋４位の２つのアミノ酸の側鎖間の、またはｊ位とｊ＋３位の間の、またはｋ位とｋ＋７位の間の共有結合により、分子内形成を形成することができる。他の実施形態では、塩橋などの非共有結合による相互作用が、これらの位置で正に荷電しているアミノ酸と負に荷電アミノ酸との間に形成され得る。さらに他の実施形態では、１つまたは複数のα，α−二置換アミノ酸が、所望の活性を保持する位置で、このＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９）に挿入され、または置換される。例えば、１６、２０、２１、または２４位のうちの１、２、３つ、または全てが、ＡＩＢなどのα，α−二置換アミノ酸で置換される。
【０２３２】
ＧＬＰ−１活性に影響を及ぼす改変
ＧＬＰ−１受容体での活性の増強は、Ｃ末端アミノ酸のカルボン酸を、アミドまたはエステルなどの電荷的中性の基で置き換えることによりもたらされる。
ＧＬＰ−１受容体の活性の増強は、本明細書にさらに記載する通り、グルカゴンのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９周辺）におけるアルファヘリックス構造を、２つのアミノ酸の側鎖間の分子内架橋の形成、または１２〜２９位周辺のアミノ酸の、アルファヘリックス構造を安定化するアミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸）での置換および／もしくは挿入などにより、安定化することによってももたらされる。例示的な実施形態では、１２と１６と、１３と１７と、１６と２０と、１７と２１と、２０と２４と、または２４と２８とのアミノ酸対の側鎖（ｉ＝１２、１６、２０、または２４であるアミノ酸対）が相互に連結しており、よってグルカゴンのアルファヘリックスを安定化する。一部の実施形態では、特に架橋がｉ位とｉ＋４位の間である場合、架橋またはリンカーの長さは約８（または約７〜９）原子である。一部の実施形態では、特に架橋がｊ位とｊ＋３位の間である場合、架橋またはリンカーの長さは約６（または約５〜７）原子である。
【０２３３】
一部の実施形態では、分子内架橋は、（ａ）１６位の天然に存在するセリンを、グルタミン酸で、または長さ４原子の側鎖を有する負に荷電している別のアミノ酸で、または代替的にグルタミン、ホモグルタミン酸、もしくはホモシステイン酸のいずれか１つで、または少なくとも１つのヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ）を含む側鎖を有し、長さ約４（または３〜５）原子の側鎖を有する荷電アミノ酸で置換し、（ｂ）２０位の天然に存在するグルタミンを、荷電している、または水素結合する能力を有するいずれかの側鎖、および長さ少なくとも約５（または約４〜６）原子である側鎖を有する別の親水性アミノ酸、例えば、リシン、シトルリン、アルギニン、もしくはオルニチンで置換することにより形成される。１６位および２０位のこのようなアミノ酸の側鎖は、塩橋を形成することができ、または共有結合により連結することができる。一部の実施形態では、２つのアミノ酸は相互に結合してラクタム環を形成する。
【０２３４】
一部の実施形態では、グルカゴンペプチドのＣ末端部分におけるアルファヘリックス構造の安定化は、ラクタム架橋以外の分子内架橋の形成により実現される。例えば、適切な共有結合形成法は、オレフィンメタセシス、ランチオニンベースの環化、ジスルフィド架橋または改変硫黄含有架橋形成、α，ω−ジアミノアルカンテザーの使用、金属−原子架橋の形成のいずれか１つまたは複数を含み、ペプチド環化の他の手段を、アルファへリックスを安定化するために用いる。
さらに他の実施形態では、１つまたは複数のα，α−二置換アミノ酸が、所望の活性を保持する位置で、このＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９）に挿入され、または置換される。例えば、１６、２０、２１、または２４位のうちの１、２、３つ、または全てが、ＡＩＢなどのα，α−二置換アミノ酸で置換される。
【０２３５】
ＧＬＰ−１受容体の活性の増大は、本明細書に記載する２０位のアミノ酸改変によりもたらされる。
ＧＬＰ−１受容体での活性の増大は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１０９５）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１０９６）をＣ末端に付加することによりもたらされる。このような類似体におけるＧＬＰ−１活性は、本明細書に記載する通り、１８、２８、もしくは２９位のアミノ酸、または１８および２９位のアミノ酸を改変することによりさらに増大することができる。
ＧＬＰ−１作用強度のさらなる適度な増大は、１０位のアミノ酸を、大型の芳香族アミノ酸残基であり、Ｔｒｐであってもよいように改変することによりもたらされる。
ＧＬＰ−１受容体での活性の低減は、本明細書に記載する通り、７位のアミノ酸改変などによりもたらされる。
【０２３６】
ＧＬＰ−１受容体での作用強度は、１８位の天然のアルギニンに対してアラニンを置換することにより、さらに増強することができる。
ＧＬＰ−１受容体活性を増大する、クラス２グルカゴン関連ペプチドに関して上記に記載した改変のいずれかを、個々に、または組み合わせて適用することができる。ＧＬＰ−１受容体の活性を増大する改変の組合せは、一般的に、単独で採用したこのような改変のいずれかよりも高いＧＬＰ−１活性をもたらす。例えば、本発明は、１６位と２０位とのアミノ酸間に共有結合を有してもよい、１６位、２０位、およびＣ末端のカルボン酸基の改変を含むグルカゴンペプチド；１６位およびＣ末端にカルボン酸基の改変を含むグルカゴンペプチド；１６位と２０位とのアミノ酸間に共有結合を有してもよい、１６位および２０位の改変を含むグルカゴンペプチド；ならびに２０位およびＣ末端のカルボン酸基に改変を含むグルカゴンペプチドを提供する。
【０２３７】
ＤＰＰ−ＩＶ抵抗性を改善する改変
１位および／または２位の改変は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ  ＩＶ）の切断に対するペプチドの抵抗性を増大し得る。例えば、１位および／または２位を、本明細書に記載するＤＰＰ−ＩＶ抵抗性のアミノ酸で置換してもよい。一部の実施形態では、２位のアミノ酸をＮ−メチルアミンで置換する。
２位の改変（例えば、２位のＡＩＢ）および場合により１位の改変（例えば、１位のＤＭＩＡ）は、時には著しく、グルカゴン活性を低減し得、驚くべきことに、グルカゴン活性におけるこの低減は、グルカゴンのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９周辺）におけるアルファヘリックス構造を、本明細書に記載する通り、２つのアミノ酸側鎖間に共有結合を形成することなどにより、安定化することにより回復することができる。一部の実施形態では、共有結合は、「ｉ」位と「ｉ＋４」位、または「ｊ」位と「ｊ＋３」位のアミノ酸間、例えば、１２位と１６位と、１６位と２０位と、２０位と２４位と、２４位と２８位と、または１７位と２０位との間である。例示的な実施形態では、この共有結合は、１６位のグルタミン酸と２０位のリシンとの間のラクタム架橋である。一部の実施形態では、この共有結合は、本明細書に記載する通り、ラクタム架橋以外の分子内架橋である。
【０２３８】
分解を低減する改変
またさらなる例示的な実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドのいずれかは、特に酸性またはアルカリ性バッファー中、配列番号１００１の１５位および／または１６位のアミノ酸を改変して経時的なペプチドの分解を低減することにより、安定性を改善するようにさらに改変することができる。このような改変により、Ａｓｐ１５−Ｓｅｒ１６のペプチド結合の切断が低減する。例示的な実施形態では、１５位のアミノ酸改変は、Ａｓｐの、欠失、またはグルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸、もしくはホモシステイン酸での置換である。他の例示的な実施形態では、１６位のアミノ酸改変は、Ｓｅｒの欠失、またはＴｈｒもしくはＡＩＢでの置換である。他の例示的な実施形態では、１６位のＳｅｒを、グルタミン酸で、もしくは長さ４原子の側鎖を有する負に荷電している別のアミノ酸で、または代替的にグルタミン、ホモグルタミン酸、もしくはホモシステイン酸のいずれか１つで置換する。
【０２３９】
一部の実施形態では、天然ペプチドの２７位に存在するメチオニン残基を、欠失または置換などにより改変する。このような改変により、ペプチドの酸化的分解を防ぐことができる。一部の実施形態では、２７位のＭｅｔを、ロイシン、イソロイシン、またはノルロイシンで置換する。一部の具体的な実施形態では、２７位のＭｅｔをロイシンまたはノルロイシンで置換する。
一部の実施形態では、２０位および／または２４位のＧｌｎを、欠失または置換などにより改変する。このような改変により、Ｇｌｎの脱アミドによって生じる分解は低減し得る。一部の実施形態では、２０位および／または２４位のＧｌｎを、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＡＩＢで置換する。一部の実施形態では、２０位および／または２４位のＧｌｎを、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、またはシトルリンで置換する。
一部の実施形態では、２１位のＡｓｐを、欠失または置換などにより改変する。このような改変により、Ａｓｐの脱水によって生じる分解を低減して環状スクシンイミド中間体を形成させ、引き続きイソアスパルテートに異性体化してもよい。一部の実施形態では、２１位をＧｌｕ、ホモグルタミン酸、またはホモシステイン酸で置換する。一部の具体的な実施形態では、２１位をＧｌｕで置換する。
【０２４０】
アルファヘリックス構造の安定化
クラス２グルカゴン関連ペプチドのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９周辺）におけるアルファヘリックス構造の安定化により、ＧＬＰ−１および／またはＧＩＰ活性の増強がもたらされ、１位および／または２位のアミノ酸改変によって低減したグルカゴン活性が回復する。アルファヘリックス構造は、共有結合もしくは非共有結合による分子内架橋の形成、または１２〜２９位周辺のアミノ酸の、アルファヘリックスを安定化するアミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸）での置換および／もしくは挿入などにより安定化することができる。ＧＩＰアゴニストのαへリックス構造の安定化は、本明細書に記載する通りに遂行することができる。
【０２４１】
アシル化およびアルキル化
一部の実施形態によれば、本明細書に開示するグルカゴンペプチドを、本明細書に記載する天然に存在するアミノ酸に非天然であるアシル基またはアルキル基など、アシル基またはアルキル基を含むように改変する。アシル化またはアルキル化により、循環中のグルカゴンペプチドの半減期は増大し得る。アシル化またはアルキル化が、グルカゴン受容体および／もしくはＧＬＰ−１受容体で作用の開始を遅らせ得、ならびに／または作用の持続時間を延長し得、ならびに／またはＤＰＰなどのプロテアーゼに対する抵抗性を改善し得、ならびに／または溶解性を改善し得るのが有利である。グルカゴンペプチドのグルカゴンおよび／またはＧＬＰ−１および／またはＧＩＰ受容体での活性は、アシル化後も維持され得る。一部の実施形態では、アシル化されたグルカゴンペプチドの作用強度は、グルカゴンペプチドの非アシル化のバージョンに匹敵する。クラス２グルカゴン関連ペプチドは、本明細書に記載する通り、親水性部分が連結しているのと同じアミノ酸の位置で、または異なるアミノ酸位置で、アシル化もしくはアルキル化され得る。
【０２４２】
一部の実施形態では、本発明は、グルカゴンペプチドの１０位のアミノ酸に共有結合により連結しているアシル基またはアルキル基を含むように改変されているグルカゴンペプチドを提供する。グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドの１０位のアミノ酸と、アシル基またはアルキル基との間にスペーサーをさらに含むことができる。一部の実施形態では、アシル基は脂肪酸もしくは胆汁酸、またはこれらの塩、例えば、Ｃ４〜Ｃ３０脂肪酸、Ｃ８〜Ｃ２４脂肪酸、コール酸、Ｃ４〜Ｃ３０アルキル、Ｃ８〜Ｃ２４アルキル、または胆汁酸のステロイド部分を含むアルキルである。スペーサーは、アシル基またはアルキル基に結合するのに適する反応基を有するあらゆる部分である。例示的な実施形態では、スペーサーは、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性の二官能性、または疎水性の二官能性のスペーサーを含む。一部の実施形態では、スペーサーは、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、およびＮＨ2（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ（ＣＨ2）ｍＣＯＯＨを含むスペーサーからなる群から選択され、ｍは１〜６のあらゆる整数であり、ｎは２〜１２のあらゆる整数である。このようなアシル化またはアルキル化されたグルカゴンペプチドは、親水性部分をさらに含むことができ、ポリエチレングリコールをさらに含んでもよい。前述のグルカゴンペプチドのいずれかは、アシル基２個もしくはアルキル基２個、またはこれらの組合せを含むことができる。
【０２４３】
コンジュゲートおよび融合
ＧＩＰアゴニストは、共有結合によってもよく、リンカーによってもよく、本明細書に記載するコンジュゲート部分に連結していてよい。
他の実施形態では、第２のペプチドはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１０９６）であり、式中、Ｘは、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはグリシンなどの２０個の通常のアミノ酸のうちの１つから選択される。一部の実施形態では、Ｘは、そのアミノ酸の側鎖に共有結合により連結している親水性部分をさらに含む、Ｃｙｓなどのアミノ酸を表す。このようなＣ末端伸長により溶解性は改善し、ＧＩＰまたはＧＬＰ−１活性も改善し得る。グルカゴンペプチドがカルボキシ末端伸長をさらに含む一部の実施形態では、伸長のカルボキシ末端のアミノ酸は、カルボン酸ではなく、アミド基またはエステル基で終わる。
【０２４４】
一部の実施形態では、Ｃ末端伸長を含むグルカゴンペプチドなどでは、天然のグルカゴンペプチドの２９位のトレオニンは、グリシンで置き換えられている。例えば、２９位のトレオニンに対するグリシン置換を有し、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１０９５）のＣ末端伸長を含むグルカゴンペプチドは、ＧＬＰ−１受容体で、同じＣ末端伸長を含むように改変されている天然のグルカゴンの４倍強力である。このＴ２９Ｇ置換を、本明細書に開示する他の改変と組み合わせて使用して、ＧＬＰ−１受容体に対するグルカゴンペプチドの親和性を増強することができる。例えば、Ｔ２９Ｇ置換を、Ｓ１６ＥおよびＮ２０Ｋアミノ酸置換と組み合わせることができ、アミノ酸１６と２０との間のラクタム架橋と組み合わせてもよく、本明細書に記載するＰＥＧ鎖の付加と組み合わせてもよい。
一部の実施形態では、アミノ酸をＣ末端に付加し、さらなるアミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびグリシンからなる群から選択される。
【０２４５】
溶解性を増強する改変
別の実施形態では、グルカゴンペプチドのいずれかの溶解性は、荷電アミノ酸をペプチドのＣ末端部分中に、好ましくは配列番号１００１のＣ末端から２７位の位置に導入する、アミノ酸の置換および／または付加により改善することができる。１、２、または３個の荷電アミノ酸を、Ｃ末端部分内に、好ましくはＣ末端から２７位に導入してもよい。一部の実施形態では、２８位および／もしくは２９位の天然のアミノ酸（複数可）を、１もしくは２個の荷電アミノ酸で置換し、ならびに／またはさらなる実施形態では、１〜３個の荷電アミノ酸もペプチドのＣ末端に付加する。例示的な実施形態では、１、２個、または全ての荷電アミノ酸は負に荷電している。一部の実施形態では、負に荷電している（酸性アミノ酸）は、アスパラギン酸またはグルタミン酸である。
グルカゴンペプチドがＧＩＰ活性を保持できる（ＧＬＰ−１活性および／またはグルカゴン活性を保持できてもよい）ようにする、保存的置換などのさらなる改変をグルカゴンペプチドに行ってもよい。
【０２４６】
他の改変
ＧＩＰ活性を増大または低減し、グルカゴン受容体活性を増大または低減し、ＧＬＰ−１受容体活性を増大する、クラス２ペプチドに関して上記に記載した他の改変のいずれかを、個々に、または組み合わせて適用することができる。クラス２グルカゴン関連ペプチドに関して本明細書に記載する通り、クラス２グルカゴン関連ペプチドに関して上記に記載した改変のいずれかを、溶解性および／または安定性および／または作用の持続時間の増大など、他の所望の性質を付与する他の改変と組み合わせてもよい。あるいは、クラス２グルカゴン関連ペプチドに関して上記に記載した改変のいずれかを、溶解性または安定性または活性に実質的に影響を及ぼさないクラス２グルカゴン関連ペプチドに関して本明細書に記載する他の改変と組み合わせてもよい。例示的な改変には、それだけには限定されないが、以下が含まれる：
【０２４７】
（Ａ）１、２、３個、またはそれを超える荷電アミノ酸（複数可）を天然のグルカゴンのＣ末端部分に、好ましくはＣ末端から２７位の位置に導入するなどによる溶解性の改善。このような荷電アミノ酸は、２８位もしくは２９位などの天然のアミノ酸を荷電アミノ酸で置換することにより、または代替的に２７、２８、もしくは２９位の後などに荷電アミノ酸を付加することにより、導入することができる。例示的な実施形態では、１、２、３個、または全ての荷電アミノ酸は負に荷電している。他の実施形態では、１、２、３個、または全ての荷電アミノ酸は正に荷電している。このような改変により溶解性は増大し、例えば、２５℃で２４時間後に測定した場合、ｐＨ７など、約５．５〜８の間の所与のｐＨで、天然のグルカゴンに対して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２５倍、３０倍、またはそれを超える溶解性がもたらされる。
（Ｂ）Ｃ末端伸長内の１６、１７、２０、２１、２４、もしくは２９位に、またはペプチドのＣ末端アミノ酸などに、本明細書に記載する通り、ポリエチレングリコール鎖などの親水性部分を付加することによる、溶解性および作用の持続時間または循環中の半減期の増大。
（Ｃ）本明細書に記載する通り、グルカゴンペプチドのアシル化またはアルキル化による、溶解性および／もしくは作用の持続時間もしくは循環中の半減期の増大、ならびに／または作用の開始の遅延。
（Ｄ）本明細書に記載する通り、１位または２位のアミノ酸の改変により、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ  ＩＶ）の切断に対する抵抗性の導入による、作用の持続時間または循環中の半減期の増大。
【０２４８】
（Ｅ）欠失、またはグルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸、もしくはホモシステイン酸での置換などによる、１５位のＡｓｐの改変による安定性の増大。このような改変により、２５℃で２４時間後にオリジナルのペプチドの少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、最高１００％を保持するなど、５．５〜８の範囲内のｐＨでの分解または切断を低減することができる。このような改変により、Ａｓｐ１５−Ｓｅｒ１６間のペプチド結合の切断が低減する。
（Ｆ）ＴｈｒまたはＡＩＢでの置換などによる、１６位のＳｅｒの改変による安定性の増大。このような改変により、Ａｓｐ１５−Ｓｅｒ１６間のペプチド結合の切断がやはり低減する。
（Ｇ）ロイシンまたはノルロイシンでの置換など、２７位のメチオニンの改変による安定性の増大。このような改変により、酸化的分解が低減し得る。安定性は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＡＩＢでの置換など、２０位または２４位のＧｌｎの改変によっても増大し得る。このような改変により、Ｇｌｎの脱アミドによって生じる分解が減少し得る。安定性は、Ｇｌｕでの置換によるなど、２１位のＡｓｐの改変により増大し得る。このような改変により、Ａｓｐの脱水によって生じる分解が減少して環状スクシンイミド中間体が形成され、引き続きイソアスパルテートに異性体化され得る。
（Ｈ）２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、もしくは２９位のうちの１つもしくは複数の保存的置換；これらの位置のうちの１つもしくは複数のＡｌａでの置換；２７、２８、もしくは２９位のうちの１つもしくは複数のアミノ酸の欠失；またはＣ末端のカルボン酸基の代わりにＣ末端のアミドもしくはエステルと組み合わせてもよい、２９のアミノ酸の欠失；１２位のＬｙｓのＡｒｇでの置換；１０位のＴｙｒのＶａｌもしくはＰｈｅでの置換など、活性に実質的に影響を及ぼさない、非保存的または保存的な置換、付加、または欠失。
【０２４９】
ペグ化後の活性の保存は、Ｃ末端にＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１０９５）を付加することによりもたらされる。
親ペプチドの活性の少なくともいくつかを保持し、一方で天然のグルカゴンペプチドのいくつかの位置を改変することができる。したがって、本出願人らは、２、５、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、または２９位に位置するアミノ酸のうちの１つまたは複数を、天然のグルカゴンペプチドに存在するものと異なるアミノ酸で置換し、依然としてグルカゴン受容体での活性を保持することができると予測する。
【０２５０】
一部の実施形態では、１８位を、Ａｌａ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸で置換する。一部の実施形態では、２０位のアミノ酸を、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、シトルリン、またはＡＩＢで置換する。一部の実施形態では、２１位を、Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸、またはホモシステイン酸で置換する。一部の実施形態では、グルカゴンペプチドは１６、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２７、２８、および２９位から選択されるアミノ酸改変を１〜１０個含む。例示的な実施形態では、改変は、Ｇｌｎ１７、Ａｌａ１８、Ｇｌｕ２１、Ｉｌｅ２３、Ａｌａ２４、Ｖａｌ２７、およびＧｌｙ２９からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換である。一部の実施形態では、１７〜２６位から選択される１〜２個のアミノ酸は親ペプチドと異なる。他の実施形態では、１７〜２２位から選択される１〜２個のアミノ酸は親ペプチドと異なる。さらに他の実施形態では、改変は、Ｇｌｎ１７、Ａｌａ１８、Ｇｌｕ２１、Ｉｌｅ２３、およびＡｌａ２４である。
【０２５１】
一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸を、グルカゴンペプチドのカルボキシ末端に付加する。アミノ酸は、２０個の通常のアミノ酸のうちの１つから選択するのが典型的であり、一部の実施形態では、アミノ酸は、天然のアミノ酸のカルボン酸の代わりにアミド基を有する。例示的な実施形態では、付加するアミノ酸は、グルタミン酸、およびアスパラギン酸、およびグリシンからなる群から選択される。
活性を破壊しない他の改変にはＷ１０またはＲ２０が含まれる。
一部の実施形態では、本明細書に開示するクラス２グルカゴン関連ペプチドは、１〜２個のアミノ酸残基によりＣ末端の切り捨て（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）によって改変するが、グルカゴン、ＧＬＰ−１、および／またはＧＩＰ受容体に同様の活性および作用強度を保持している。これに関して、２９位および／または２８位のアミノ酸は欠失してもよい。
【０２５２】
例示的な実施形態
本発明の一部の実施形態によれば、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴンの類似体（配列番号１００１）は、（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する１位のアミノ酸改変、（ｂ）類似体のＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９）のアルファヘリックス構造を安定化する改変を有し、（ｃ）１〜１０個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個）のさらなるアミノ酸改変を有してもよい、配列番号１００１を含む。一部の実施形態では、類似体は、ＧＩＰ受容体での天然のＧＩＰの少なくとも約１％の活性、または本明細書に記載するＧＩＰ受容体でのあらゆる他の活性レベルを表す。
ある特定の実施形態では、アルファヘリックス構造を安定化する改変は、本明細書に記載するいずれかなど、共有結合による分子内架橋などを含めた、分子内架橋を提供または導入するものである。共有結合による分子内架橋は、一部の実施形態では、ラクタム架橋である。これらの実施形態の類似体のラクタム架橋は、本明細書に記載するラクタム架橋であってよい。例えば、「アルファヘリックス構造の安定化」のセクションの下のラクタム架橋の教示を参照されたい。例えば、ラクタム架橋はｉ位とｉ＋４位のアミノ酸の側鎖間、またはｊ位とｊ＋３位のアミノ酸の側鎖間の架橋であってよく、式中、ｉは１２、１３、１６、１７、２０、または２４であり、ｊは１７である。ある特定の実施形態では、ラクタム架橋は、１６位と２０位のアミノ酸の間であってよく、この場合、１６位および２０位のアミノ酸の一方がＧｌｕで置換されており、１６位および２０位のアミノ酸の他方がＬｙｓで置換されている。
【０２５３】
代替的な実施形態では、アルファヘリックス構造を安定化する改変は、類似体の１６、２０、２１、および２４位（複数可）のうちの１、２、３、または４個のα，α−二置換アミノ酸の導入である。一部の実施形態では、α，α−二置換アミノ酸はＡＩＢである。ある特定の態様では、α，α−二置換アミノ酸（例えば、ＡＩＢ）は２０位にあり、１６位のアミノ酸は、例えば本明細書に記載する式ＩＶのアミノ酸などの、正に荷電しているアミノ酸で置換されている。式ＩＶのアミノ酸は、ホモＬｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、または２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）であってよい。
【０２５４】
本発明の具体的な態様では、１位のアミノ酸改変は、Ｈｉｓの、大型の芳香族アミノ酸（例えば、Ｔｙｒ）などのイミダゾール側鎖を欠くアミノ酸での置換である。
ある特定の態様では、グルカゴンの類似体は、２７、２８、および２９位のうちの１、２つ、または全てのアミノ酸改変を含む。例えば、２７位のＭｅｔは、大型の脂肪族アミノ酸で置換され、Ｌｅｕで置換されていてもよく、２８位のＡｓｎは、小型の脂肪族アミノ酸で置換され、Ａｌａで置換されていてもよく、２９位のＴｈｒは、小型の脂肪族アミノ酸で置換され、Ｇｌｙで置換されていてもよく、または前述の２つもしくは３つの組合せであってもよい。具体的な実施形態では、グルカゴンの類似体は、２７位のＬｅｕ、２８位のＡｌａ、および２９位のＧｌｙまたはＴｈｒを含む。
【０２５５】
本発明のある特定の実施形態では、グルカゴンの類似体は、Ｃ末端から２９位のアミノ酸の１〜２１個のアミノ酸の伸長を含む。延長は、例えば、配列番号１０９５または１０９６のアミノ酸配列を含むことができる。さらに、またはあるいは、グルカゴンの類似体は、延長の１〜６個のアミノ酸が正に荷電しているアミノ酸である延長を含むことができる。正に荷電しているアミノ酸は、それだけには限定されないが、Ｌｙｓ、ホモＬｙｓ、Ｏｒｎ、およびＤａｂを含めた式ＩＶのアミノ酸であってよい。
【０２５６】
グルカゴンの類似体は、一部の実施形態では、本明細書に記載する通り、アシル化またはアルキル化されている。例えば、アシル基またはアルキル基は、本明細書にさらに記載する通り、スペーサーありまたはなしで、類似体の１０位または４０位で、グルカゴンの類似体に結合していてよい。類似体は、さらにまたはあるいは、本明細書にさらに記載する通り、親水性部分を含むように改変されていてよい。さらに、一部の実施形態では、類似体は、以下の改変：
Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌ、またはα−アミノ−Ｎ−酪酸で置換されている２位のＳｅｒ、
Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌで置換されている１０位のＴｙｒ、
１０位のＬｙｓに対するアシル基の連結、
ＡｒｇまたはＩｌｅで置換されている１２位のＬｙｓ、
Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＡＩＢで置換されている１６位のＳｅｒ、
Ｇｌｎで置換されている１７位のＡｒｇ、
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＧＬｙで置換されている１８位のＡｒｇ、
Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、シトルリン、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、またはＡＩＢで置換されている２０位のＧｌｎ、
Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換されている２１位のＡｓｐ、
Ｉｌｅで置換されている２３位のＶａｌ、
Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＡＩＢで置換されている２４位のＧｌｎ、
ならびに２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、および２９位のいずれかの保存的置換
のあらゆる１つまたは組合せを含む。
【０２５７】
例示的な実施形態では、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴンの類似体（配列番号１００１）は、以下の改変：
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する１位のアミノ酸改変、
（ｂ）ｉ位とｉ＋４位のアミノ酸の側鎖間の、またはｊ位とｊ＋３位のアミノ酸の側鎖間のラクタム架橋（ｉは１２、１３、１６、１７、２０、または２４であり、ｊは１７である）、
（ｃ）２７、２８、および２９位の１、２つ、または全てのアミノ酸改変、例えば、２７位および／または２８位のアミノ酸改変、ならびに
（ｄ）１〜９個または１〜６個のさらなるアミノ酸改変、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のさらなるアミノ酸改変、
を含み、ＧＩＰ受容体活性化に関する類似体のＥＣ５０は約１０ｎＭ以下である。
【０２５８】
これらの実施形態の類似体のラクタム架橋は、本明細書に記載するラクタム架橋であってよい。例えば、「アルファヘリックス構造の安定化」のセクションの下のラクタム架橋の教示を参照されたい。例えば、ラクタム架橋は１６位と２０位とのアミノ酸の間であってよく、この場合、１６位および２０位のアミノ酸の一方がＧｌｕで置換されており、１６位および２０位のアミノ酸の他方がＬｙｓで置換されている。
これらの実施形態によれば、類似体は、例えば、配列番号１００５〜１０９４のいずれかのアミノ酸配列を含むことができる。
【０２５９】
他の例示的な実施形態では、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴンの類似体（配列番号１００１）は、以下の改変：
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する１位のアミノ酸改変、
（ｂ）類似体の１６、２０、２１、および２４位のアミノ酸のうちの１、２、３つ、または全てがα，α−二置換アミノ酸で置換されている、
（ｃ）２７、２８、および２９位のうちの１、２つ、または全てのアミノ酸改変、例えば、２７位および／または２８位のアミノ酸改変、ならびに
（ｄ）１〜９個または１〜６個のさらなるアミノ酸改変、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のさらなるアミノ酸改変
を含み、ＧＩＰ受容体活性化に関する類似体のＥＣ５０は約１０ｎＭ以下である。
【０２６０】
これらの実施形態の類似体のα，α−二置換アミノ酸は、それだけには限定されないが、アミノイソ−酪酸（ＡＩＢ）；メチル、エチル、プロピル、およびｎ−ブチルから選択される同じもしくは異なる基で、またはシクロオクタンもしくはシクロヘプタンで二置換されているアミノ酸（例えば、１−アミノシクロオクタン−１−カルボン酸）を含めた、あらゆるα，α−二置換アミノ酸であってよい。ある特定の実施形態では、α，α−二置換アミノ酸はＡＩＢである。ある特定の実施形態では、２０位のアミノ酸は、ＡＩＢなどのα，α−二置換アミノ酸で置換されている。
【０２６１】
これらの実施形態によれば、類似体は、例えば、配列番号１０９９〜１１４１、１１４４〜１１６４、１１６６〜１１６９、および１１７３〜１１７８のいずれかのアミノ酸配列を含んでいてよい。
さらに他の例示的な実施形態では、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴンの類似体（配列番号１００１）は以下の改変：
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する１位のアミノ酸改変、
（ｂ）１６位のＳｅｒの、式ＩＶのアミノ酸でのアミノ酸置換：
【０２６２】
【化２１】
2016521253.tif 000023
［式ＩＶ］
（式中、ｎは、１〜１６、または１〜１０、または１〜７、または１〜６、または２〜６であり、Ｒ1およびＲ2の各々は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ18アルキル、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＯＨ、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＳＨ、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ6）シクロアルキル、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ2−Ｃ5複素環）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7、および（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ9ヘテロアリール）からなる群から独立に選択され、Ｒ7はＨまたはＯＨであり、式ＩＶのアミノ酸の側鎖は遊離のアミノ基を含む）
（ｃ）２０位のＧｌｎの、アルファ，アルファ−二置換アミノ酸でのアミノ酸置換、
（ｄ）２７、２８、および２９位のうちの１、２つ、または全てのアミノ酸改変、例えば、２７位および／または２８位のアミノ酸改変、ならびに
（ｅ）１〜９個または１〜６個のさらなるアミノ酸改変、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のさらなるアミノ酸改変
を含み、ＧＩＰ受容体活性化に関する類似体のＥＣ５０は約１０ｎＭ以下である。
【０２６３】
これらの実施形態の類似体の式ＩＶのアミノ酸は、ｎが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６である、式ＩＶのアミノ酸などのあらゆるアミノ酸であってよい。ある特定の実施形態では、ｎは２、３、４、または５であり、この場合、アミノ酸はそれぞれＤａｂ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ、またはホモＬｙｓである。
これらの実施形態の類似体のアルファ，アルファ−二置換アミノ酸は、それだけには限定されないが、アミノイソ−酪酸（ＡＩＢ）；メチル、エチル、プロピル、およびｎ−ブチルから選択される同じもしくは異なる基で、またはシクロオクタンもしくはシクロヘプタンで二置換されているアミノ酸（例えば、１−アミノシクロオクタン−１−カルボン酸）を含めたあらゆるアルファ，アルファ−二置換アミノ酸であってよい。ある特定の実施形態では、アルファ，アルファ−二置換アミノ酸はＡＩＢである。
【０２６４】
これらの実施形態によれば、類似体は、例えば、配列番号１０９９〜１１６５のいずれかのアミノ酸配列を含むことができる
さらに他の例示的な実施形態では、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴンの類似体（配列番号１００１）は、
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する１位のアミノ酸改変、
（ｂ）伸長の少なくとも１つのアミノ酸がアシル化またはアルキル化されている、Ｃ末端から２９位のアミノ酸の約１〜約２１個のアミノ酸の伸長
を含み、ＧＩＰ受容体活性化に関する類似体のＥＣ５０は約１０ｎＭ以下である。
【０２６５】
一部の実施形態では、アシル化またはアルキル化されているアミノ酸は、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのアミノ酸である。より具体的な実施形態では、式Ｉのアミノ酸はＤａｂ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ、またはホモＬｙｓである。また、一部の実施形態では、約１〜約２１個のアミノ酸の伸長は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１０９５）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１０９６）のアミノ酸配列を含み、Ｘは、あらゆるアミノ酸、またはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（配列番号１１７０）もしくはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（配列番号１１７１）もしくはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ（配列番号１１７２）であり、ＸはＧｌｙ、または小型の脂肪族もしくは無極性もしくはわずかに極性のアミノ酸である。一部の実施形態では、約１〜約２１個のアミノ酸は、配列番号１０９５、１０９６、１１７０、１１７１、または１１７２に対して１つまたは複数の保存的置換を含む配列を含んでいてよい。一部の実施形態では、アシル化またはアルキル化されているアミノ酸は、Ｃ末端が伸長されている類似体の３７、３８、３９、４０、４１、４２、または４３位に位置する。ある特定の実施形態では、アシル化またはアルキル化されているアミノ酸は、Ｃ末端が伸長されている類似体の４０位に位置する。
一部の実施形態では、ＧＩＰアゴニスト活性を有する類似体は、２７、２８、および２９位のうちの１、２つ、または全てにアミノ酸改変をさらに含み、例えば、２７位および／または２８位にアミノ酸改変を含む。
【０２６６】
上記の例示的な実施形態のいずれかでは、ＧＩＰアゴニスト活性を付与する１位のアミノ酸改変は、Ｈｉｓの、イミダゾール側鎖を欠くアミノ酸での置換であってよい。例えば、１位のアミノ酸改変は、Ｈｉｓの、大型の芳香族アミノ酸での置換であってよい。一部の実施形態では、大型の芳香族アミノ酸は、Ｔｙｒなどを含めた、本明細書に記載するアミノ酸のいずれかである。
【０２６７】
また、上記の例示的な実施形態に関して、２７、２８、および２９位のうちの１、２つ、または全てのアミノ酸改変は、本明細書に記載するこれらの位置の改変のいずれかであってよい。例えば、２７位のＭｅｔは、大型の脂肪族アミノ酸で置換され、Ｌｅｕで置換されていてもよく、２８位のＡｓｎは、小型の脂肪族アミノ酸で置換され、Ａｌａで置換されていてもよく、および／または２９位のＴｈｒは小型の脂肪族アミノ酸で置換され、Ｇｌｙで置換されていてもよい。あるいは、類似体は、２７位および／または２８位にこのようなアミノ酸改変を含むことができる。
【０２６８】
上記の例示的な実施形態の類似体は、１〜９個または１〜６個のさらなる、付加的なアミノ酸改変、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のさらなるアミノ酸改変、例えば、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１、およびグルカゴン受容体のいずれかでの活性を増大または低減し、溶解性を改善し、作用の持続時間もしくは循環中の半減期を改善し、作用の開始を遅らせ、または安定性を増大する、本明細書に記載する改変のいずれかをさらに含むことができる。類似体はさらに、例えば、１２位のアミノ酸改変を含み、Ｉｌｅでの置換を含んでもよく、ならびに／または１７位および１８位のアミノ酸改変を含み、１７位のＱおよび１８位のＡでの置換を含んでもよく、ならびに／またはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１０９５）もしくはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１０９６）、または配列番号１０９５もしくは１０９６に対する１つもしくは複数の保存的置換を含む配列のＣ末端への付加を含むことができる。類似体は、以下の改変：
Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌ、またはα−アミノ−Ｎ−酪酸で置換されている２位のＳｅｒ、
Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌで置換されている、１０位のＴｙｒ、
１０位のＬｙｓへのアシル基の連結、
Ａｒｇで置換されている１２位のＬｙｓ、
Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＡＩＢで置換されている１６位のＳｅｒ、
Ｇｌｎで置換されている１７位のＡｒｇ、
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＧｌｙで置換されている１８位のＡｒｇ、
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、シトルリン、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、またはＡＩＢで置換されている２０位のＧｌｎ、
Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換されている２１位のＡｓｐ、
Ｉｌｅで置換されている２３位のＶａｌ、
Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＡＩＢで置換されている２４位のＧｌｎ、ならびに
２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、および２９位のいずれかの保存的置換
の１つまたは複数を含むことができる。
【０２６９】
一部の実施形態では、類似体は、（ｉ）から（ｘｉｉ）までの改変の組合せを含む。あるいは、またはさらに、類似体は、３位のアミノ酸改変（例えば、ＧｌｎのＧｌｕでのアミノ酸置換）を含むことができ、類似体はグルカゴン受容体でのグルカゴンの活性の約１％未満を有する。あるいは、またはさらに、類似体は、７位のアミノ酸改変（例えば、Ｔｈｒの、ＡｂｕもしくはＩｌｅなどのヒドロキシル基を欠くアミノ酸でのアミノ酸置換）、またはこれらの組合せを含むことができ、類似体は、ＧＬＰ−１受容体でのＧＬＰ−１の活性の約１０％未満を有する。
【０２７０】
例示的な実施形態に関して、類似体は親水性部分に共有結合により連結していてよい。一部の実施形態では、類似体は、１６、１７、２０、２１、２４、２９、４０位、またはＣ末端アミノ酸のいずれかで親水性部分に共有結合により連結している。ある特定の実施形態では、類似体は、Ｃ末端の伸長（例えば、配列番号１０９５のアミノ酸配列）、および親水性部分を含むアミノ酸の付加を含み、その結果親水性部分は４０位で類似体に共有結合により連結している。
【０２７１】
一部の実施形態では、親水性部分は、類似体のＬｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン、またはアセチル−フェニルアラニンに共有結合により連結している。Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン、またはアセチル−フェニルアラニンは、グルカゴン配列（配列番号１００１）に天然であるアミノ酸であってよく、または配列番号１００１の天然のアミノ酸を置き換えるアミノ酸であってよい。親水性部分がＣｙｓに結合している一部の実施形態では、親水性部分に対する連結は以下の構造を含むことができる。
【０２７２】
【化２２】
2016521253.tif 000024
【０２７３】
親水性部分を含む類似体に関して、親水性部分は、本明細書に記載する親水性部分のいずれかであってよい。例えば、「親水性部分の連結」のセクションの下の教示を参照されたい。一部の実施形態では、親水性部分はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、ある特定の実施形態では、約１０００ダルトン〜約４００００ダルトン、例えば、約２００００ダルトン〜約４００００ダルトンの分子量を有する。
【０２７４】
例示的な実施形態に関して、類似体は、側鎖がアシル基またはアルキル基（例えば、天然に存在するアミノ酸に非天然であるアシル基またはアルキル基）に共有結合により連結している、改変されているアミノ酸を含むことができる。アシル化またはアルキル化されている類似体は、「アシル化およびアルキル化」のセクションに記載したアシル化またはアルキル化されているペプチドによるものであってよい。一部の実施形態では、アシル基はＣ４〜Ｃ３０脂肪アシル基、例えば、Ｃ１０脂肪アシル基またはアルキル基、Ｃ１２脂肪アシル基またはアルキル基、Ｃ１４脂肪アシル基またはアルキル基、Ｃ１６脂肪アシル基またはアルキル基、Ｃ１８脂肪アシル基またはアルキル基、Ｃ２０アシル基またはアルキル基、またはＣ２２アシル基またはアルキル基である。アシル基またはアルキル基は、それだけには限定されないが、１０位または４０位のアミノ酸、またはＣ末端アミノ酸を含めた、類似体のあらゆるアミノ酸に共有結合により結合していてよい。ある特定の実施形態では、類似体は、Ｃ末端伸長（例えば、配列番号１０９５のアミノ酸配列）、およびアシル基またはアルキル基を含むアミノ酸の付加を含み、その結果アシル基またはアルキル基は４０位で類似体に共有結合により連結している。一部の実施形態では、アシル基またはアルキル基は、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのアミノ酸の側鎖、例えばＬｙｓ残基に共有結合により連結している。アシル基またはアルキル基は、グルカゴン配列（配列番号１００１）に天然であるアミノ酸に共有結合により連結していてもよく、または配列番号１００１の配列に、もしくは配列番号１０９５が続く配列番号１００１の配列に（Ｎ末端もしくはＣ末端で）付加されているアミノ酸に連結していてもよく、または配列番号１００１の１０位のＴｙｒなど、天然のアミノ酸を置き換えるアミノ酸に連結していてもよい。
【０２７５】
類似体がアシル基またはアルキル基を含む上記の例示的な実施形態では、類似体は、本明細書に記載する通り、アシル基またはアルキル基にスペーサーによって結合していてよい。スペーサーは、例えば、長さ３〜１０原子であってよく、例えば、アミノ酸（例えば、６−アミノヘキサン酸、本明細書に記載するあらゆるアミノ酸）、ジペプチド（例えば、Ａｌａ−Ａｌａ、βＡｌａ−βＡｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、γＧｌｕ−γＧｌｕ）、トリペプチド、または親水性もしくは疎水性の二官能性スペーサーであってよい。ある特定の態様では、スペーサーおよびアシル基またはアルキル基の全長は約１４〜約２８原子である。一部の実施形態では、アミノ酸スペーサーはγ−Ｇｌｕではない。一部の実施形態では、ジペプチドスペーサーはγ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕではない。
【０２７６】
なおさらなる例示的な実施形態では、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴンの類似体は、以下の改変：
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する１位のアミノ酸改変をさらに含んでもよく、
（ｂ）伸長のアミノ酸の少なくとも１つがアシル化またはアルキル化されている、Ｃ末端から２９位のアミノ酸の約１〜約２１個のアミノ酸伸長、ならびに
（ｄ）最高６個のさらなるアミノ酸改変
をさらに含む、配列番号１２２７、１２２８、１２２９、または１２３０のいずれか１つによるアミノ酸配列を含み、ＧＩＰ受容体活性化に関する類似体のＥＣ５０は約１０ｎＭ以下である。
【０２７７】
一部の態様では、アシル化またはアルキル化されているアミノ酸は、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのアミノ酸である。より具体的な実施形態では、式Ｉのアミノ酸は、Ｄａｂ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ、またはホモＬｙｓである。また、一部の実施形態では、約１〜約２１個のアミノ酸は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１０９５）もしくはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１０９６）のアミノ酸配列を含み、Ｘはあらゆるアミノ酸であり、またはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（配列番号１１７０）もしくはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（配列番号１１７１）もしくはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ（配列番号１１７２）を含み、ＸはＧｌｙまたは小型の脂肪族もしくは無極性もしくはわずかに極性のアミノ酸である。一部の実施形態では、約１〜約２１個のアミノ酸は、配列番号１０９５、１０９６、１１７０、１１７１、または１１７２に対して１つまたは複数の保存的置換を含む配列を含んでいてよい。一部の実施形態では、アシル化またはアルキル化されているアミノ酸は、Ｃ末端が伸長されている類似体の３７、３８、３９、４０、４１、４２、または４３位に位置する。ある特定の実施形態では、アシル化またはアルキル化されているアミノ酸は、Ｃ末端が伸長されている類似体の４０位に位置する。
【０２７８】
上記の例示的な実施形態のいずれかでは、ＧＩＰアゴニスト活性を付与する１位のアミノ酸は、イミダゾール側鎖を欠くアミノ酸であってよい。１位のアミノ酸は、例えば、大型の芳香族アミノ酸であってよい。一部の実施形態では、大型の芳香族アミノ酸は、Ｔｙｒなどを含めた、本明細書に記載するいずれかである。
上記の例示的な実施形態の類似体は、１〜６個のさらなる、付加的なアミノ酸改変、例えば、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１、およびグルカゴン受容体のいずれかでの活性を増大または低減し、溶解性を改善し、作用の持続時間もしくは循環中の半減期を改善し、作用の開始を遅らせ、または安定性を増大する、本明細書に記載する改変のいずれかをさらに含むことができる。
【０２７９】
ある特定の態様では、上記の例示的な実施形態に記載したグルカゴン類似体は、２７、２８、および２９位のうちの１、２つ、または全てにさらなるアミノ酸改変を含む。これらの位置での改変は、これらの位置に対して本明細書に記載する改変のいずれかであってよい。例えば、配列番号１２２７、１２２８、１２２９、または１２３０に対して、２７位を大型の脂肪族アミノ酸（例えば、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、もしくはノルロイシン）、またはＭｅｔで置換してもよく、２８位を別の小型脂肪族アミノ酸（例えば、ＧｌｙもしくはＡｌａ）またはＡｓｎで置換してもよく、ならびに／あるいは２９位を別の小型脂肪族アミノ酸（例えば、ＡｌａもしくはＧｌｙ）またはＴｈｒで置換してもよい。あるいは、類似体は、２７位および／または２８位にこのようなアミノ酸改変を含むことができる。
【０２８０】
類似体は、以下のさらなる改変：
２位のアミノ酸が、Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌ、またはα−アミノ−Ｎ−酪酸のいずれか１つであり、
１０位のアミノ酸がＴｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌであり、
１０位のＬｙｓに対するアシル基の連結、
１２位のアミノ酸がＩｌｅ、Ｌｙｓ、またはＡｒｇであり、
１６位のアミノ酸が、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＡＩＢのいずれか１つであり、
１７位のアミノ酸が、ＧｌｎまたはＡｒｇであり、
１８位のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＧｌｙのいずれか１つであり、
２０位のアミノ酸が、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、シトルリン、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、もしくはＡＩＢ、または別のアルファ，アルファ−二置換アミノ酸のいずれか１つであり、
２１位のアミノ酸が、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸のいずれか１つであり、
２３位のアミノ酸が、ＶａｌまたはＩｌｅであり、
２４位のアミノ酸が、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＡＩＢのいずれか１つであり、
２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、および２９位のいずれかの１つまたは複数の保存的置換
の１つまたは複数をさらに含むことができる。
【０２８１】
一部の実施形態では、類似体は、（ｉ）から（ｘｉｉ）までの改変の組合せを含む。あるいは、またはさらに、類似体は、３位のアミノ酸改変（例えば、ＧｌｎのＧｌｕでのアミノ酸置換）を含むことができ、類似体はグルカゴン受容体でのグルカゴンの活性の約１％未満を有する。あるいは、またはさらに、類似体は、７位のアミノ酸改変（例えば、Ｔｈｒの、ＡｂｕもしくはＩｌｅなどのヒドロキシル基を欠くアミノ酸でのアミノ酸置換）、またはこれらの組合せを含むことができ、類似体は、ＧＬＰ−１受容体でのＧＬＰ−１の活性の約１０％未満を有する。
【０２８２】
例示的な実施形態に関して、類似体は親水性部分に共有結合により連結していてよい。一部の実施形態では、類似体は、１６、１７、２０、２１、２４、２９、４０位、またはＣ末端アミノ酸のいずれかで親水性部分に共有結合により連結している。ある特定の実施形態では、類似体は、２４位で類似体に共有結合により連結している親水性部分を含む。
【０２８３】
一部の実施形態では、親水性部分は、類似体のＬｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン、またはアセチル−フェニルアラニンに共有結合により連結している。Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン、またはアセチル−フェニルアラニンは、配列番号１００１、１２２７、１２２８、１２２９または１２３０に天然であるアミノ酸であってよく、または置換されたアミノ酸であってよい。親水性部分がＣｙｓに連結している一部の実施形態では、連結は以下の構造を含んでもよい。
【０２８４】
【化２３】
2016521253.tif 000025
親水性部分を含む類似体に関して、親水性部分は、本明細書に記載する親水性部分のいずれかであってよい。例えば、「親水性部分の連結」のセクションの下の教示を参照されたい。一部の実施形態では、親水性部分はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、ある特定の実施形態では、約１０００ダルトン〜約４００００ダルトン、例えば、約２００００ダルトン〜約４００００ダルトンの分子量を有する。
【０２８５】
例示的な実施形態に関して、類似体は、Ｃ末端伸長内に改変されているアミノ酸を含むことができ、Ｃ末端伸長では、側鎖がアシル基またはアルキル基に共有結合により連結している。アシル化またはアルキル化されている類似体は、「アシル化およびアルキル化」のセクションに記載したアシル化またはアルキル化されているペプチドによるものであってよい。一部の実施形態では、アシル基はＣ４−Ｃ３０脂肪アシル基、例えば、Ｃ１０脂肪アシル基またはアルキル基、Ｃ１２脂肪アシル基またはアルキル基、Ｃ１４脂肪アシル基またはアルキル基、Ｃ１６脂肪アシル基またはアルキル基、Ｃ１８脂肪アシル基またはアルキル基、Ｃ２０アシル基またはアルキル基、またはＣ２２アシル基またはアルキル基である。アシル基またはアルキル基は、それだけには限定されないが、１０位または４０位のアミノ酸、またはＣ末端アミノ酸を含めた、類似体のあらゆるアミノ酸に共有結合により結合していてよい。一部の実施形態では、アシル基またはアルキル基は、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのアミノ酸の側鎖、例えばＬｙｓ残基に共有結合により連結している。アシル基またはアルキル基は、配列番号１００１、１２２７、１２２８、１２２９、もしくは１２３０に天然であるアミノ酸に共有結合により連結しており、または置換されているアミノ酸に連結していてよい。アシル基またはアルキル基は、配列番号１０９５、１０９６、１１７１、もしくは１１７２に天然であるアミノ酸に共有結合により連結していてよく、または置換されているアミノ酸に連結していてよい。
【０２８６】
類似体がアシル基またはアルキル基を含む上記の例示的な実施形態では、類似体は、本明細書に記載する通り、アシル基またはアルキル基にスペーサーによって結合していてよい。スペーサーは、例えば、長さ３〜１０原子であってよく、例えば、アミノ酸（例えば、６−アミノヘキサン酸、本明細書に記載するあらゆるアミノ酸）、ジペプチド（例えば、Ａｌａ−Ａｌａ、βＡｌａ−βＡｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、γＧｌｕ−γＧｌｕ）、トリペプチド、または親水性もしくは疎水性の二官能性スペーサーであってよい。ある特定の態様では、スペーサーおよびアシル基またはアルキル基の全長は約１４〜約２８原子である。一部の実施形態では、アミノ酸スペーサーはγ−Ｇｌｕではない。一部の実施形態では、ジペプチドスペーサーはγ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕではない。
【０２８７】
いくつかの非常に具体的な実施形態では、本発明の類似体は、配列番号１０９９〜１１４１、１１４４〜１１６４、１１６６、１１９２〜１２０７、１２０９〜１２２１、および１２２３からなる群から選択される、または配列番号１１６７〜１１６９、１１７３〜１１７８、および１２２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
さらに、本発明の類似体の具体的な例には、それだけには限定されないが、表１〜３において参照するもののいずれかが含まれる。
【０２８８】
なおさらなる例示的な実施形態では、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴンの類似体は、アシル基またはアルキル基（例えば、天然に存在するアミノ酸に非天然であるアシル基またはアルキル基）を含み、アシル基またはアルキル基はスペーサーに結合しており、（ｉ）スペーサーは類似体の１０位のアミノ酸の側鎖に結合しており、または（ｉｉ）類似体はＣ末端から２９位のアミノ酸の１〜２１個のアミノ酸の伸長を含み、スペーサーは、配列番号１００１に対して３７〜４３位の１つに対応するアミノ酸の側鎖に結合しており、ＧＩＰ受容体活性化に関する類似体のＥＣ５０は約１０ｎＭ以下である。
このような実施形態では、類似体は、（ｉ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する１位のアミノ酸改変、（ｉｉ）２７、２８、および２９位のうちの１、２つ、または全てのアミノ酸改変、（ｉｉｉ）以下の少なくとも１つ：
（Ａ）類似体は、ｉ位とｉ＋４位のアミノ酸の側鎖間に、またはｊ位とｊ＋３位のアミノ酸の側鎖間にラクタム架橋を含み、ｉは１２、１３、１６、１７、２０、または２４であり、ｊは１７であり、
（Ｂ）類似体の１６、２０、２１、および２４位のアミノ酸のうちの１、２、３つ、または全てがα，α−二置換アミノ酸で置換されており、あるいは
（Ｃ）類似体は、（ｉ）１６位のＳｅｒの式ＩＶのアミノ酸でのアミノ酸置換：
【０２８９】
【化２４】
2016521253.tif 000026
［式ＩＶ］
（式中、
ｎは１から７であり、Ｒ１およびＲ２の各々は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ18アルキル、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＯＨ、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＳＨ、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ6）シクロアルキル、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ2−Ｃ5複素環）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7、および（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ9ヘテロアリール）からなる群から独立に選択され、Ｒ7はＨまたはＯＨであり、式ＩＶのアミノ酸の側鎖は遊離のアミノ基を含む）
および（ｉｉ）２０位のＧｌｎの、アルファ，アルファ−二置換アミノ酸でのアミノ酸置換を含み、
ならびに（ｉｖ）最高６個のさらなるアミノ酸改変
を有する配列番号１００１のアミノ酸配列を含むことができる。
【０２９０】
これらの実施形態の類似体のアルファ，アルファ−二置換アミノ酸は、それだけには限定されないが、アミノイソ−酪酸（ＡＩＢ）；メチル、エチル、プロピル、およびｎ−ブチルから選択される同じもしくは異なる基で、またはシクロオクタンもしくはシクロヘプタンで二置換されているアミノ酸（例えば、１−アミノシクロオクタン−１−カルボン酸）を含めた、あらゆるアルファ，アルファ−二置換アミノ酸であってよい。ある特定の実施形態では、アルファ，アルファ−二置換アミノ酸はＡＩＢである。
これらの実施形態の類似体の式ＩＶのアミノ酸は、ｎが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６である、式ＩＶのアミノ酸などのあらゆるアミノ酸であってよい。ある特定の実施形態では、ｎは２、３、４、または５であり、この場合、アミノ酸はそれぞれＤａｂ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ、またはホモＬｙｓである。
上記の例示的な実施形態のいずれかでは、ＧＩＰアゴニスト活性を付与する１位のアミノ酸改変は、Ｈｉｓの、イミダゾール側鎖を欠くアミノ酸での置換であってよい。例えば、１位のアミノ酸改変は、Ｈｉｓの、大型の芳香族アミノ酸での置換であってよい。一部の実施形態では、大型の芳香族アミノ酸は、Ｔｙｒなどを含めた、本明細書に記載するアミノ酸のいずれかである。
【０２９１】
また、上記の例示的な実施形態に関して、２７、２８、および２９位のうちの１、２つ、または全てのアミノ酸改変は、本明細書に記載するこれらの位置の改変のいずれかであってもよい。例えば、２７位のＭｅｔは、大型の脂肪族アミノ酸で置換され、Ｌｅｕで置換されていてもよく、２８位のＡｓｎは、小型の脂肪族アミノ酸で置換され、Ａｌａで置換されていてもよく、および／または２９位のＴｈｒは小型の脂肪族アミノ酸で置換され、Ｇｌｙで置換されていてもよい。あるいは、類似体は、２７位および／または２８位にこのようなアミノ酸改変を含むことができる。
【０２９２】
上記の例示的な実施形態の類似体は、１〜９個または１〜６個のさらなる、付加的なアミノ酸改変、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のさらなるアミノ酸改変、例えば、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１、およびグルカゴン受容体のいずれかでの活性を増大または低減し、溶解性を改善し、作用の持続時間もしくは循環中の半減期を改善し、作用の開始を遅らせ、または安定性を増大する、本明細書に記載する改変のいずれかをさらに含むことができる。類似体はさらに、例えば、１２位のアミノ酸改変を含み、Ｉｌｅでの置換を含んでもよく、ならびに／または１７位および１８位のアミノ酸改変を含み、１７位のＱおよび１８位のＡでの置換を含んでもよく、ならびに／またはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１０９５）もしくはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１０９６）、または配列番号１０９５もしくは１０９６に対する１つもしくは複数の保存的置換を含む配列のＣ末端への付加を含むことができる。類似体は、以下の改変：
Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌ、またはα−アミノ−Ｎ−酪酸で置換されている２位のＳｅｒ、
Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌで置換されている、１０位のＴｙｒ、
１０位のＬｙｓへのアシル基の連結、
Ａｒｇで置換されている１２位のＬｙｓ、
Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、またはＡＩＢで置換されている１６位のＳｅｒ、
Ｇｌｎで置換されている１７位のＡｒｇ、
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＧｌｙで置換されている１８位のＡｒｇ、
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、シトルリン、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、またはＡＩＢで置換されている２０位のＧｌｎ、
Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換されている２１位のＡｓｐ、
Ｉｌｅで置換されている２３位のＶａｌ、
Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＡＩＢで置換されている２４位のＧｌｎ、ならびに
２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、および２９位のいずれかの保存的置換
の１つまたは複数を含むことができる。
【０２９３】
一部の実施形態では、類似体は、（ｉ）から（ｘｉｉ）までの改変の組合せを含む。あるいは、またはさらに、類似体は、３位のアミノ酸改変（例えば、ＧｌｎのＧｌｕでのアミノ酸置換）を含むことができ、類似体はグルカゴン受容体でのグルカゴンの活性の約１％未満を有する。あるいは、またはさらに、類似体は、７位のアミノ酸改変（例えば、Ｔｈｒの、ＡｂｕもしくはＩｌｅなどのヒドロキシル基を欠くアミノ酸でのアミノ酸置換）、２７−もしくは２８−アミノ酸ペプチドを生じる、Ｃ末端から２７位または２８位のアミノ酸のアミノ酸（複数可）の欠失、またはこれらの組合せを含むことができ、類似体は、ＧＬＰ−１受容体でのＧＬＰ−１の活性の約１０％未満を有する。
【０２９４】
例示的な実施形態に関して、類似体は親水性部分に共有結合により連結していてよい。一部の実施形態では、類似体は、１６、１７、２０、２１、２４、２９、４０位、またはＣ末端アミノ酸のいずれかで親水性部分に共有結合により連結している。ある特定の実施形態では、類似体は、Ｃ末端の伸長（例えば、配列番号１０９５のアミノ酸配列）、および親水性部分を含むアミノ酸の付加を含み、その結果親水性部分は４０位で類似体に共有結合により連結している。
一部の実施形態では、親水性部分は、類似体のＬｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン、またはアセチル−フェニルアラニンに共有結合により連結している。Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン、またはアセチル−フェニルアラニンは、グルカゴン配列（配列番号１００１）に天然であるアミノ酸であってよく、または配列番号１００１の天然のアミノ酸を置き換えるアミノ酸であってよい。親水性部分がＣｙｓに結合している一部の実施形態では、親水性部分に対する連結は以下の構造を含むことができる。
【０２９５】
【化２５】
2016521253.tif 000027
【０２９６】
親水性部分を含む類似体に関して、親水性部分は、本明細書に記載する親水性部分のいずれかであってよい。例えば、「親水性部分の連結」のセクションの下の教示を参照されたい。一部の実施形態では、親水性部分はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、ある特定の実施形態では、約１０００ダルトン〜約４００００ダルトン、例えば、約２００００ダルトン〜約４００００ダルトンの分子量を有する。
類似体がスペーサーによって類似体に結合しているアシル基またはアルキル基を含む、例示的な実施形態では、スペーサーは本明細書に記載するあらゆるスペーサーであってよい。スペーサーは、例えば、長さ３〜１０原子であってよく、例えば、アミノ酸（例えば、６−アミノヘキサン酸、本明細書に記載するあらゆるアミノ酸）、ジペプチド（例えば、Ａｌａ−Ａｌａ、βＡｌａ−βＡｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、γＧｌｕ−γＧｌｕ）、トリペプチド、または親水性もしくは疎水性の二官能性スペーサーであってよい。ある特定の態様では、スペーサーおよびアシル基またはアルキル基の全長は約１４〜約２８原子である。一部の実施形態では、アミノ酸スペーサーはγ−Ｇｌｕではない。一部の実施形態では、ジペプチドスペーサーはγ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕではない。
【０２９７】
アシル基またはアルキル基は、天然に存在するアミノ酸に非天然であるアシル基またはアルキル基など、本明細書に記載するあらゆるアシル基またはアルキル基である。アシル基またはアルキル基は、一部の実施形態では、Ｃ４−Ｃ３０脂肪アシル基、例えば、Ｃ１０脂肪アシル基またはアルキル基、Ｃ１２脂肪アシル基またはアルキル基、Ｃ１４脂肪アシル基またはアルキル基、Ｃ１６脂肪アシル基またはアルキル基、Ｃ１８脂肪アシル基またはアルキル基、Ｃ２０アシル基またはアルキル基、またはＣ２２アシル基またはアルキル基、またはＣ４−Ｃ３０アルキル基である。具体的な実施形態では、アシル基はＣ１２−Ｃ１８脂肪アシル基（例えば、Ｃ１４またはＣ１６脂肪アシル基）である。
【０２９８】
一部の実施形態では、類似体のＣ末端から２９位のアミノ酸の約１〜約２１個のアミノ酸の伸長は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１０９５）もしくはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１０９６）のアミノ酸配列を含み、Ｘはあらゆるアミノ酸であり、またはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（配列番号１１７０）もしくはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（配列番号１１７１）もしくはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ（配列番号１１７２）を含み、ＸはＧｌｙもしくは小型の脂肪族もしくは無極性もしくはわずかに極性のアミノ酸である。一部の実施形態では、約１〜約２１個のアミノ酸は、配列番号１０９５、１０９６、１１７０、１１７１、または１１７２に対して１つまたは複数の保存的置換を含む配列を含んでいてよい。一部の実施形態では、アシル化またはアルキル化されているアミノ酸は、Ｃ末端が伸長されている類似体の３７、３８、３９、４０、４１、４２、または４３位に位置する。ある特定の実施形態では、アシル化またはアルキル化されているアミノ酸は、Ｃ末端が伸長されている類似体の４０位に位置する。
【０２９９】
ＧＩＰアゴニストは、ＧＩＰアゴニスト活性を保持する最高１、２、３、４、または５個のさらなる改変を有してもよい、配列番号１００５〜１０９４などのアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドであってよい。ある特定の実施形態では、ＧＩＰアゴニストは、配列番号１０９９〜１２６２のいずれかのアミノ酸を含む。
【０３００】
さらなる例示的な実施形態
本発明の一部の態様では、ＧＩＰ受容体でのアゴニスト活性を表す類似体は、少なくとも１つのアミノ酸改変、および類似体のＣ末端から２９位のアミノ酸の１〜２１個のアミノ酸（例えば、アミノ酸５〜１８、７〜１５、９〜１２個）の伸長を有する配列番号１００１（天然のグルカゴン）を含む。
ある特定の態様では、類似体は、少なくとも１個のアミノ酸改変、および最高１５個のアミノ酸改変（例えば、１５個以下のアミノ酸改変、１０個以下のアミノ酸改変）を含む。例えば、類似体は、アミノ酸改変を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個有する配列番号１００１を含むことができる。ある特定の実施形態では、類似体は、少なくとも１つのアミノ酸改変および最高１０個のアミノ酸改変、ならびにさらなる保存的なアミノ酸改変を含む。さらなる態様では、少なくとも１個のアミノ酸改変により、類似体のＣ末端部分におけるアルファヘリックス構造の安定化が付与される。アルファヘリックス構造の安定化を実現する改変は、本明細書に記載するものである。例えば、「アルファヘリックス構造の安定化」のタイトルのセクションの下の教示を参照されたい。
【０３０１】
アシル化またはアルキル化されている（アミノ酸１〜２１個の）Ｃ末端伸長を含む類似体は、意外にも、ＧＩＰ受容体でのアゴニスト活性の増大を表した。よって、ある特定の態様では、３７〜４３位（配列番号１００１のナンバリングによる）のいずれかに位置する伸長の少なくとも１つのアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸に非天然であるアシル基またはアルキル基を含み、すなわち、伸長はアシル化またはアルキル化されている。一部の実施形態では、アシル基またはアルキル基は、アミノ酸の側鎖などによって、アミノ酸に直接結合している。他の実施形態では、アシル基またはアルキル基は、アミノ酸に、スペーサー（例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性の二官能性スペーサー、疎水性の二官能性スペーサー）によって結合している。アシル基またはアルキル基を含む適切なアミノ酸、ならびに適切なアシル基およびアルキル基は、本明細書に記載するものである。例えば、「アシル化およびまたはアルキル化」、および「Ａ−Ｂのアシル基またはアルキル基への連結」の表題のセクションの下の教示を参照されたい。
【０３０２】
他の実施形態では、Ｃ末端伸長のアミノ酸１〜６個（例えば、アミノ酸１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個）は、正に荷電しているアミノ酸、例えば、Ｌｙｓなどの式ＩＶのアミノ酸である。本明細書で使用する「正に荷電しているアミノ酸」の語は、生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ６．８〜８．０、ｐＨ７．０〜７．７）で、その側鎖の原子上に正の電荷を含む、天然に存在し、または天然に存在しない、あらゆるアミノ酸を意味する。ある特定の態様では、正に荷電しているアミノ酸は、３７、３８、３９、４０、４１、４２、および４３位のいずれかに位置する。具体的な実施形態では、正に荷電しているアミノ酸は、４０位に位置する。
【０３０３】
他の場合では、伸長は、本明細書に記載するようにアシル化またはアルキル化され、本明細書に記載するように１〜６個の正荷電アミノ酸を含む。
さらに他の実施形態では、ＧＩＰ受容体にてアゴニスト活性を示す類似体は、（ｉ）少なくとも１個のアミノ酸改変を有する配列番号１００１と、（ｉｉ）類似体の２９位のアミノ酸に対してＣ末端に１〜２１アミノ酸（例えば５〜１８、７〜１５、９〜１２アミノ酸）の伸長と、（ｉｉｉ）Ｃ末端伸長の外側（例えば１〜２９位のいずれか）にある、天然に存在するアミノ酸に対して非天然であるアシルまたはアルキル基を含むアミノ酸とを含む。一部の実施形態では、類似体は、１０位にアシル化またはアルキル化アミノ酸を含む。特定の態様では、アシルまたはアルキル基は、Ｃ４−Ｃ３０脂肪酸アシルまたはＣ４−Ｃ３０アルキル基である。一部の実施形態では、アシルまたはアルキル基は、スペーサー、例えばアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能性スペーサー、疎水性二官能性スペーサーを介して結合している。ある特定の態様では、類似体は、１６位のＧｌｕと２０位のＬｙｓの間の塩橋、または１６位、２０位、２１位および２４位の任意の１、２、３個以上のアルファ，アルファ二置換されているアミノ酸のようなアルファへリックスを安定化するアミノ酸改変を含む。具体的な態様では、類似体は、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ耐性を与えるアミノ酸改変をさらに含む。さらなるアミノ酸改変を含む類似体は、本明細書に包含される。
【０３０４】
ある特定の実施形態では、ＧＩＰ受容体活性を有する類似体は、ＧＩＰ受容体で天然ＧＩＰの少なくとも０．１％（例えば少なくとも０．５％、１％、２％、５％、１０％、１５％または２０％）の活性を示す。一部の実施形態では、類似体は、ＧＩＰ受容体で、天然のＧＩＰの活性の２０％超（例えば、５０％超、７５％超、１００％超、２００％超、３００％超、５００％超）の活性を示す。一部の実施形態では、類似体は、ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体の一方または両方にて、認識できるアゴニスト活性を示す。一部の態様では、これらの受容体（ＧＩＰ受容体およびＧＬＰ−１受容体ならびに／またはグルカゴン受容体）についての選択性は、１００倍以内である。例えば、ＧＩＰ受容体活性を有する類似体の、ＧＬＰ−１受容体についての選択性は、１００倍未満、５０倍以内、２５倍以内、１５倍以内、１０倍以内、ＧＩＰ受容体および／またはグルカゴン受容体についての選択性であり得る。
【０３０５】
ＧＬＰ−１活性は、（ｉ）Ｃ末端のアルファカルボキシレート基、（ｉｉ）７位のＴｈｒの、ＡｂｕもしくはＩｌｅなどのヒドロキシル基を欠くアミノ酸での置換、（ｉｉｉ）アミノ酸の長さ２７もしくは２８個のペプチドを得るための、２７位もしくは２８位のアミノ酸のＣ末端アミノ酸（複数可）の欠失（例えば、２８位のアミノ酸の欠失、２８位および２９位のアミノ酸の欠失）、または（ｉｖ）これらの組合せを含めることにより低減してもよい。
本発明の一部の実施形態では、ＧＩＰ受容体でのアゴニスト活性を表す、グルカゴンペプチドの類似体を提供する。ある特定の実施形態では、類似体は、少なくとも１つのアミノ酸改変（アミノ酸改変最高１５個であってもよい）を有する配列番号１００１のアミノ酸配列、および類似体のＣ末端から２９位のアミノ酸のアミノ酸１〜２１個の伸長を含む。
【０３０６】
ある特定の態様では、類似体は、少なくとも１個のアミノ酸改変であって１５個までのアミノ酸改変（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個のアミノ酸改変、１０個までのアミノ酸改変）を含む。ある特定の実施形態では、類似体は、１０個までのアミノ酸改変にて少なくとも１個のアミノ酸改変と、さらなる保存的アミノ酸改変とを含む。保存的アミノ酸改変は、本明細書に記載する。
一部の態様では、アミノ酸改変の少なくとも１個は、類似体のＣ末端部分において安定化されたアルファへリックス構造を与える。安定化されたアルファへリックス構造を達成する改変は、本明細書に記載する。例えば、「アルファへリックス構造の安定化」との表題の項目の下の教示を参照されたい。一部の態様では、類似体は、類似体の２個のアミノ酸の側鎖の間に分子内架橋（例えば共有的分子内架橋、非共有的分子内架橋）を含む。ある特定の態様では、分子内架橋は、ｉ位およびｉ＋４位（ここで、ｉは、１２、１３、１６、１７、２０または２４である）のアミノ酸の側鎖を連結する。他の態様では、分子内架橋は、ｊ位およびｊ＋３位（ここで、ｊは、１７である）、またはｋ位およびｋ＋７位（ここで、ｋは、１２から２２の間の任意の整数である）のアミノ酸の側鎖を接続する。ある特定の実施形態では、分子内架橋は、共有的分子内架橋、例えばラクタム架橋である。具体的な態様では、ラクタム架橋は、１６位および２０位のアミノ酸の側鎖を接続する。特定の態様では、１６位および２０位のうちの一方のアミノ酸は、正荷電アミノ酸であり、他方は、負荷電アミノ酸である。例えば、類似体は、１６位のＧｌｕおよび２０位のＬｙｓの側鎖を接続するラクタム架橋を含むことができる。他の態様では、負荷電アミノ酸および正荷電アミノ酸は、塩橋を形成する。この場合、分子内架橋は、非共有的分子内架橋である。
【０３０７】
特定の態様では、安定化されたアルファへリックスを与えるアミノ酸改変は、配列番号１００１のアミノ酸への、α，α−二置換されているアミノ酸の挿入または置換である。アルファへリックスを安定化する目的のための適切なα，α−二置換されているアミノ酸は、本明細書に記載し、例えばＡＩＢを含む。一部の態様では、配列番号１００１の１６位、２０位、２１位および２４位のアミノ酸の１、２、３個以上は、α，α−二置換されているアミノ酸、例えばＡＩＢで置換されている。特定の実施形態では、１６位のアミノ酸は、ＡＩＢである。
【０３０８】
ＧＩＰ受容体にてアゴニスト活性を示す類似体は、本明細書に記載するもののいずれかのようなさらなる改変を含むことができる。例えば、アミノ酸改変は、ＧＬＰ−１受容体およびグルカゴン受容体の一方または両方での活性を増加または減少してよい。アミノ酸改変は、ペプチドの安定性を増加してよく、例えばＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ分解に対する耐性を増加し、アミノ酸１５と１６の間の結合を安定化してよい。アミノ酸改変は、ペプチドの溶解性を増加し、かつ／またはＧＩＰ、グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体のいずれかでの類似体の作用の時間を変更してよい。これらのタイプの改変のいずれかの組合せは、ＧＩＰ受容体にてアゴニスト活性を示す類似体に存在してよい。
【０３０９】
したがって、一部の態様では、類似体は、１７位のＧｌｎ、１８位のＡｌａ、２１位のＧｌｕ、２３位のＩｌｅおよび２４位のＡｌａ、ＡｓｎもしくはＣｙｓまたはそれらの保存的アミノ酸置換の１または複数を有する配列番号１００１のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、類似体は、Ｃ末端アルファカルボキシレートの代わりにＣ末端アミドを含む。ある特定の実施形態では、類似体は、１位、２位または１位および２位のアミノ酸置換を含み、該置換は、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ耐性を達成する。適切なアミノ酸置換は、本明細書に記載する。例えば、１位のＤＭＩＡおよび／または２位のｄ−ＳｅｒもしくはＡＩＢである。
【０３１０】
一部の実施形態では、類似体は、２７位および／または２８位が改変され、２９位が改変されていてもよい。例えば、２７位のＭｅｔは、大型の脂肪族アミノ酸で置換され、Ｌｅｕで置換されていてもよく、２８位のＡｓｎは、小型の脂肪族アミノ酸で置換され、Ａｌａで置換されていてもよく、２９位のＴｈｒは小型の脂肪族アミノ酸で置換され、Ｇｌｙで置換されていてもよい。あらゆる特定の理論に拘泥するものではないが、２７〜２９位のＬＡＧでの置換により、これらの位置での配列番号１００１の天然のＭＮＴ配列に対するＧＩＰ活性の増大がもたらされると考えられる。一部の態様では、１位のアミノ酸は、Ｈｉｓ、Ｈｉｓの類似体などのイミダゾール環を含むアミノ酸であり、類似体は、本明細書に記載する通り、２７位および／または２８位が改変され、２９位が改変されていてもよい。
【０３１１】
さらに、またはあるいは、類似体は、（ａ）Ａｌａで置換されている２位のＳｅｒ、（ｂ）Ｇｌｕまたはグルタミン類似体で置換されている３位のＧｌｎ、（３）Ｉｌｅで置換されている７位のＴｈｒ、（ｄ）Ｔｒｐ、または天然に存在するアミノ酸に非天然であるアシル基もしくはアルキル基を含むアミノ酸で置換されている１０位のＴｙｒ、（ｅ）Ｉｌｅで置換されている１２位のＬｙｓ、（ｆ）Ｇｌｕで置換されている１５位のＡｓｐ、（ｇ）Ｇｌｕで置換されている１６位のＳｅｒ、（ｈ）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＡＩＢで置換されている２０位のＧｌｎ、（ｉ）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＡＩＢで置換されている２４位のＧｌｎ、（ｊ）ＬｅｕまたはＮｌｅで置換されている２７位のＭｅｔ、（ｋ）荷電アミノ酸で置換され、ＡｓｐまたはＧｌｕで置換されていてもよい２９位のＡｓｎ、および（ｌ）Ｇｌｙまたは荷電アミノ酸で置換され、ＡｓｐまたはＧｌｕで置換されていてもよい２９位のＴｈｒの１つまたは組み合わせを含むことができる。
【０３１２】
ある特定の態様では、類似体は、ＧＩＰアゴニスト活性を付与する１位のアミノ酸改変を含まない。一部の態様では、１位のアミノ酸は、Ｔｙｒなどの大型の芳香族アミノ酸ではない。一部の実施形態では、１位のアミノ酸は、Ｈｉｓ、Ｈｉｓの類似体などのイミダゾール環を含むアミノ酸である。ある特定の実施形態では、類似体は、米国特許出願第６１／１５１，３４９号に開示されている化合物のいずれかではない。ある特定の態様では、類似体は、配列番号６５７〜６６９のいずれかのアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、類似体は、１２位のアミノ酸がＩｌｅであり、および／または２７位のアミノ酸がＬｅｕであり、および／または２８位のアミノ酸がＡｌａである、配列番号６５７〜６６９のいずれかの改変されているアミノ酸を含む。一部の態様では、類似体は、配列番号６７６、６７７、６７９、６８０のいずれかのアミノ酸配列を含む。
【０３１３】
ＧＩＰ受容体にてアゴニスト活性を示す類似体に関して、類似体は、１〜２１アミノ酸（例えば５〜１９、７〜１５、９〜１２アミノ酸）の伸長を含む。類似体の伸長は、伸長が１〜２１アミノ酸であれば、任意のアミノ酸配列を含んでよい。一部の態様では、伸長は、７〜１５アミノ酸であり、他の態様では、伸長は、９〜１２アミノ酸である。一部の実施形態では、伸長は、（ｉ）配列番号２６もしくは６７４のアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号２６もしくは６７４のアミノ酸配列と高い配列同一性（例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％）を有するアミノ酸配列、または（ｉｉｉ）１もしくは複数の保存的アミノ酸改変を有する（ｉ）もしくは（ｉｉ）のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、伸長のアミノ酸の少なくとも１つは、アシル化またはアルキル化されている。アシルまたはアルキル基を含むアミノ酸は、類似体の伸長のいずれの位置にあってもよい。ある特定の実施形態では、伸長のアシル化またはアルキル化アミノ酸は、類似体の３７位、３８位、３９位、４０位、４１位または４２位（配列番号１００１のナンバリングによる）の１つにある。ある特定の実施形態では、アシル化またはアルキル化アミノ酸は、類似体の４０位にある。
【０３１４】
例示的な実施形態では、アシルまたはアルキル基は、天然に存在するアミノ酸に対して非天然であるアシルまたはアルキル基である。例えば、アシルまたはアルキル基は、Ｃ４−Ｃ３０（例えばＣ１２−Ｃ１８）脂肪酸アシル基またはＣ４−Ｃ３０（例えばＣ１２−Ｃ１８）アルキルであってよい。アシルまたはアルキル基は、本明細書で論じるもののいずれかであってよい。
一部の実施形態では、アシルまたはアルキル基は、アミノ酸に直接、例えばアミノ酸の側鎖を介して結合する。他の実施形態では、アシルまたはアルキル基は、スペーサー（例えばアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能性スペーサー、疎水性二官能性スペーサー）を介してアミノ酸に結合する。ある特定の態様では、スペーサーは、３〜１０原子の長さである。一部の実施形態では、スペーサーは、６−アミノヘキサン酸、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、ベータ−Ａｌａ、ガンマ−Ｇｌｕ（例えば、ガンマ−Ｇｌｕ−ガンマ−Ｇｌｕ）の１または２つを含むアミノ酸またはジペプチドである。特定の態様では、スペーサーの全長は１４〜２８原子である。
【０３１５】
また、例示的な実施形態では、アシル基またはアルキル基が結合しているアミノ酸は、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのアミノ酸などを含めた、本明細書に記載するもののいずれかであってよい。アシル化またはアルキル化されているアミノ酸は、Ｌｙｓなどであってよい。アシル基またはアルキル基を含む適切なアミノ酸、ならびに適切なアシル基、アルキル基、およびスペーサーは本明細書に記載するものである。例えば、「アシル化および／またはアルキル化」、ならびに「Ａ−Ｂのアシル基またはアルキル基への連結」の表題のセクションの下の教示を参照されたい。
【０３１６】
他の実施形態では、伸長のアミノ酸１〜６個（例えば、アミノ酸１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個）は、正に荷電しているアミノ酸、例えばＬｙｓなどの式ＩＶのアミノ酸である。本明細書で使用する「正に荷電しているアミノ酸」の語は、生理学的ｐＨでその側鎖の原子上に正の電荷を含む、天然に存在し、または天然に存在しない、あらゆるアミノ酸を意味する。ある特定の態様では、正に荷電しているアミノ酸は、３７、３８、３９、４０、４１、４２、および４３位のいずれかに位置する。特定の実施形態では、正に荷電しているアミノ酸は４０位に位置する。
他の場合では、伸長は、本明細書に記載するようにアシル化またはアルキル化され、本明細書に記載するように１〜６個の正荷電アミノ酸を含む。
【０３１７】
さらに他の実施形態では、ＧＩＰ受容体にてアゴニスト活性を示す類似体は、（ｉ）少なくとも１個のアミノ酸改変を有する配列番号１００１と、（ｉｉ）類似体の２９位のアミノ酸に対してＣ末端に１〜２１アミノ酸（例えば５〜１８、７〜１５、９〜１２アミノ酸）の伸長と、（ｉｉｉ）Ｃ末端伸長の外側（例えば１〜２９位のいずれか）にある、天然に存在するアミノ酸に対して非天然であるアシルまたはアルキル基を含むアミノ酸とを含む。一部の実施形態では、類似体は、１０位にアシル化またはアルキル化アミノ酸を含む。特定の態様では、アシルまたはアルキル基は、Ｃ４−Ｃ３０脂肪酸アシルまたはＣ４−Ｃ３０アルキル基である。一部の実施形態では、アシルまたはアルキル基は、スペーサー、例えばアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能性スペーサー、疎水性二官能性スペーサーを介して結合している。ある特定の態様では、類似体は、１６位のＧｌｕと２０位のＬｙｓの間の塩橋、または１６位、２０位、２１位および２４位の任意の１、２、３個以上のアルファ，アルファ二置換されているアミノ酸のようなアルファへリックスを安定化するアミノ酸改変を含む。具体的な態様では、類似体は、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ耐性を与えるアミノ酸改変、例えば１位にてＤＭＩＡ、２位にてＡＩＢをさらに含む。さらなるアミノ酸改変を含む類似体は、本明細書に包含される。
【０３１８】
ある特定の実施形態では、ＧＩＰ受容体活性を有する類似体は、類似体がＰＥＧなどの親水性部分を欠く場合、ＧＩＰ受容体で天然のＧＩＰの活性の少なくとも０．１％（例えば、少なくとも０．５％、１％、２％、５％、１０％、１５％、または２０％）の活性を示す。一部の実施形態では、類似体は、ＧＩＰ受容体で天然のＧＩＰの活性の１０％超（例えば、２０％超、５０％超、７５％超、１００％超、２００％超、３００％超、５００％超）の活性を示す。一部の実施形態では、類似体は、ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体の一方または両方で、かなりのアゴニスト活性を表す。一部の態様では、これらの受容体（ＧＩＰ受容体およびＧＬＰ−１受容体および／またはグルカゴン受容体）に対する作用強度および／または選択性は、１０００倍、７５０倍、５００倍、２５０倍、または１００倍以内（高いまたは低い）である。例えば、ＧＩＰ受容体活性を有する類似体の、ＧＬＰ−１受容体に対する選択性は、ＧＩＰ受容体および／またはグルカゴン受容体に対する選択性の１０００倍未満、５００倍、１００倍、５０倍以内、２５倍以内、１５倍以内、１０倍以内）（高いまたは低い）であってよい。
【０３１９】
本明細書にはＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴンペプチドの類似体をさらに提供し、類似体は、
（ｉ）少なくとも１つのアミノ酸改変により、類似体のＣ末端部分におけるアルファヘリックス構造の安定化が付与される、少なくとも１つおよび最高１０個のアミノ酸改変を有する天然のグルカゴンの配列（配列番号１００１）
（ｉｉ）Ｃ末端から２９位のアミノ酸のアミノ酸１〜２１個の伸長、ならびに
（ｉｉｉ）以下の少なくとも１つ：
（ａ）３７〜４３位（配列番号１００１のナンバリングによる）のいずれかに位置する伸長のアミノ酸の少なくとも１つが、天然に存在するアミノ酸に非天然であるアシル基またはアルキル基を含み、
（ｂ）類似体が、類似体の１０位に、天然に存在するアミノ酸に非天然であるアシル基またはアルキル基を含むアミノ酸を含み、または
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の組合せ
を含み、類似体が親水性部分を欠く場合、類似体は、ＧＩＰ受容体で天然のＧＩＰの少なくとも０．１％の活性を表す。好ましくは、非天然のアシル基またはアルキル基を含む（に連結している）アミノ酸は、Ｌｙｓなどの、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのアミノ酸である。非天然のアシル基またはアルキル基を含むアミノ酸が、類似体の３７、３８、３９、４０、４１、４２、または４３位のいずれかに位置するのが好ましい。
【０３２０】
先の類似体のいずれかは、（ｉ）ｉが１２、１３、１６、１７、２０、２４であり、ｊが１７である、ｉ位のアミノ酸とｉ＋４位のアミノ酸の側鎖間、もしくはｊ位とｊ＋３位のアミノ酸の側鎖間の分子内架橋、または（ｉｉ）類似体の１６、２０、２１、もしくは２４位のうちの１、２、３つ、もしくはそれを超えてα，α−二置換アミノ酸で置換されており、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方をさらに含むことができる。このような類似体は、１位に、大型の芳香族アミノ酸（例えば、Ｔｙｒ）ではないアミノ酸を有していてよい。例えば、１位のアミノ酸は、イミダゾール環を含むアミノ酸であり、Ｈｉｓであってよい。
一部の、またはあらゆる実施形態では、類似体は、１６位にＧｌｕおよび２０位にＬｙｓを含み、ラクタム架橋はＧｌｕとＬｙｓとを連結してもよく、１７位のＧｌｎ、１８位のＡｌａ、２１位のＧｌｕ、２３位のＩｌｅ、および２４位のＡｌａもしくはＣｙｓ、または１つもしくは複数のこれらの保存的なアミノ酸置換の１つまたは複数をさらに含んでもよい。
【０３２１】
一部の、またはあらゆる実施形態では、このような類似体は、（ａ）Ｃ末端のアミド、および／または（ｂ）１位、２位、もしくは１および２位にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換（複数可）によりＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ抵抗性が実現する。一部の実施形態では、１位のＨｉｓは、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシルヒスチジン、アセチルヒスチジン、およびホモヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、２位のＳｅｒは、Ｄ−セリン、アラニン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン、およびアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。
【０３２２】
先の類似体のいずれかは、２７、２８、および２９位のうちの１、２つ、または全てにさらなるアミノ酸改変を含んでいてよい。例えば、（ａ）２７位のＭｅｔは大型の脂肪族アミノ酸で置換され、Ｌｅｕで置換されていてもよく、（ｂ）２８位のＡｓｎは小型の脂肪族アミノ酸で置換され、Ａｌａで置換されていてもよく、（ｃ）２９位のＴｈｒは小型の脂肪族アミノ酸で置換され、Ｇｌｙで置換されていてもよく、または（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の２つもしくは全ての組合せである。具体的な例示的な実施形態では、このような改変は、２７位のＬｅｕ、２８位のＡｌａ、および２９位のＧｌｙまたはＴｈｒである。
【０３２３】
先の類似体のいずれかは、１つまたは複数の以下の改変を含んでいてよい：
ａ．Ａｌａで置換されている２位のＳｅｒ、
ｂ．Ｇｌｕまたはグルタミン類似体で置換されている３位のＧｌｎ、
ｃ．Ｉｌｅで置換されている７位のＴｈｒ、
ｄ．Ｔｒｐ、または天然に存在するアミノ酸に非天然であるアシル基もしくはアルキル基を含むアミノ酸で置換されている１０位のＴｙｒ、
ｅ．Ｉｌｅで置換されている１２位のＬｙｓ、
ｆ．Ｇｌｕで置換されている１５位のＡｓｐ、
ｇ．Ｇｌｕで置換されている１６位のＳｅｒ、
ｈ．Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＡＩＢで置換されている２０位のＧｌｎ、
ｉ．Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＡＩＢで置換されている２４位のＧｌｎ、
ｊ．ＬｅｕまたはＮｌｅで置換されている２７位のＭｅｔ、
ｋ．荷電アミノ酸で置換され、ＡｓｐまたはＧｌｕで置換されていてもいよい２９位のＡｓｎ、
ｌ．Ｇｌｙまたは荷電アミノ酸で置換され、ＡｓｐまたはＧｌｕで置換されていてもいよい２９位のＴｈｒ。
【０３２４】
先の類似体のいずれかは、一部の、またはあらゆる実施形態では、（ｉ）Ｘがあらゆるアミノ酸である、アミノ酸配列ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号２６）もしくはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号６７４）、（ｉｉ）配列番号２６もしくは配列番号６７４に少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または（ｉｉｉ）１つもしくは複数の保存的なアミノ酸置換を有する（ｉ）もしくは（ｉｉ）のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は類似体のＣ末端から２９位のアミノ酸である。
【０３２５】
これらの実施形態のいずれかでは、アシル基はＣ４−Ｃ３０脂肪アシル基、またはＣ１２−Ｃ１８脂肪アシル基、またはＣ１４−Ｃ１６脂肪アシル基、または胆汁酸もしくは塩、またはステロイドもしくはコレステロール群である。アシル基またはアルキル基は、アミノ酸の側鎖に、アミノ酸、またはジペプチド、６−アミノヘキサン酸；Ａｌａ−Ａｌａ、β−Ａｌａ−β−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、もしくはＰｒｏ−Ｐｒｏからなる群から選択されるジペプチドなどのスペーサーにより、共有結合により結合していてよい。一部の実施形態では、スペーサーは長さ３〜１０原子であり、またはスペーサーおよびアシル基の全長は、長さ約１４〜約２８原子である。
【０３２６】
一部の実施形態では、先の類似体のいずれかは、３７、３８、３９、４０、４１、４２、および４３位のいずれかに（配列番号１００１のナンバリングによる）、またはＣ末端に、正に荷電しているアミノ酸を１〜６個含んでいてよい。このような正に荷電しているアミノ酸は、式ＩＶの構造を含み、
【化２６】
2016521253.tif 000028
［式ＩＶ］
式中、ｎは、１〜１６、または１〜１０、または１〜７、または１〜６、または２〜６、または２もしくは３もしくは４もしくは５であり、Ｒ1およびＲ2は各々、Ｈ、Ｃ1−Ｃ18アルキル、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＯＨ、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＳＨ、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ6）シクロアルキル、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ2−Ｃ5複素環）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7、および（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ9ヘテロアリール）からなる群から独立に選択され、Ｒ7はＨまたはＯＨであり、式ＩＶのアミノ酸の側鎖は遊離のアミノ基を含む。例えば、式ＩＶのアミノ酸は、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｌｙｓ、またはホモＬｙｓである。
【０３２７】
先の類似体のいずれかは、１９、２０、２３、２４、２７、３２、４０、４３位のアミノ酸のいずれかで、またはＣ末端で、親水性部分に共有結合により連結していてよい。親水性部分は、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン、またはアセチル−フェニルアラニンを含めたその位置で、あらゆる適切なアミノ酸に共有結合により連結していてよい。親水性部分の例には、分子量約１０００ダルトン〜約４００００ダルトンなどの、または約２００００ダルトン〜約４００００ダルトンなどの、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。
一部の実施形態では、ＧＩＰ受容体活性化に関する類似体のＥＣ５０は、親水性部分に連結していない場合、約１０ｎＭ以下である。ＧＬＰ−１受容体での類似体のＥＣ５０の、ＧＩＰ受容体での類似体のＥＣ５０に対する比は、約０．０１未満であってよい。
【０３２８】
クラス３グルカゴン関連ペプチド
ある特定の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、本明細書、ならびに国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４７４３８（２００９年６月１６日に出願）、２００８年８月２１日に公開された国際特許出願公開第２００８／１０１０１７号ならびに米国仮特許出願第６１／０９０，４１２号および米国特許出願第６１／１７７，４７６号（これらの内容はそれらの全体が参照により組み込まれている）、ならびに２０１０年１２月０９日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１０／５９７２４および米国仮特許出願第６１／２８８，２４８号（これらの内容はそれらの全体が参照により組み込まれている）、ならびに２０１２年６月１２日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１２／４２０８５および米国仮特許出願第６１／５００，０２５号（これらの内容はそれらの全体が参照により組み込まれている）に記載されるクラス３グルカゴン関連ペプチドである。
【０３２９】
クラス３グルカゴン関連ペプチドに関連して以下の項目で参照する生物学的配列（配列番号１−６５６）のうちいくつかは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４７４３８号における配列番号１〜６５６に相当する。
【０３３０】
活性
クラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体にて活性の増加を示し、さらなる実施形態では、生物物理学的安定性および／または水溶性の増進を示すペプチドであり得る。さらに、一部の実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体よりも、グルカゴン受容体についての天然グルカゴンの選択性を喪失しており、よって、これらの２つの受容体の共同アゴニストを表す。クラス３グルカゴン関連ペプチド内の選択されたアミノ酸改変は、グルカゴン受容体よりも、ＧＬＰ−１受容体にてペプチドの相対的活性を制御できる。よって、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体よりも、グルカゴン受容体にてより高い活性を有するグルカゴン／ＧＬＰ−１共同アゴニスト、両方の受容体にてほぼ等しい活性を有するグルカゴン／ＧＬＰ−１共同アゴニスト、またはグルカゴン受容体よりも、ＧＬＰ−１受容体にてより高い活性を有するグルカゴン／ＧＬＰ−１共同アゴニストであり得る。共同アゴニストの後者のカテゴリーは、グルカゴン受容体にてほとんどまたは全く活性を示さないが、天然ＧＬＰ−１と同じまたはよりよい有効性でＧＬＰ−１受容体を活性化する能力をまだ保持するように操作できる。これらの共同アゴニストのいずれも、生物物理学的安定性および／または水溶性の増進を与える改変も含んでよい。
【０３３１】
クラス３グルカゴン関連ペプチドの改変を作製して、天然ＧＬＰ−１と比べてＧＬＰ−１受容体にて少なくとも約１％（少なくとも約１．５％、２％、５％、７％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％を含む）〜約２００％以上のいずれかの活性を有し、天然グルカゴンと比べてグルカゴン受容体にて少なくとも約１％（約１．５％、２％、５％、７％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％を含む）〜約５００％以上のいずれかの活性を有するグルカゴンペプチドを生成できる。天然グルカゴンのアミノ酸配列は配列番号１であり、ＧＬＰ−１（７−３６）アミドのアミノ酸配列は配列番号５２であり、ＧＬＰ−１（７−３７）酸のアミノ酸配列は配列番号５０である。例示的な実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体にて天然グルカゴンの活性の少なくとも１０％およびＧＬＰ−１受容体にて天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも５０％、またはグルカゴン受容体にて天然グルカゴンの活性の少なくとも４０％およびＧＬＰ−１受容体にて天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも４０％、またはグルカゴン受容体にて天然グルカゴンの活性の少なくとも６０％およびＧＬＰ−１受容体にて天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも６０を示してよい。
【０３３２】
グルカゴン受容体対ＧＬＰ−１受容体についてのクラス３グルカゴン関連ペプチドの選択性は、グルカゴン／ＧＬＰ−１活性の相対比（天然グルカゴンと比べてのグルカゴン受容体でのペプチドの活性を、天然ＧＬＰ−１と比べてのＧＬＰ−１受容体でのペプチドの活性で除したもの）として示すことができる。例えば、グルカゴン受容体にて天然グルカゴンの活性の６０％およびＧＬＰ−１受容体にて天然ＧＬＰ−１の活性の６０％を示すクラス３グルカゴン関連ペプチドは、１：１のグルカゴン／ＧＬＰ−１活性の比を有する。グルカゴン／ＧＬＰ−１活性の例示的な比は、約１：１、１．５：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１もしくは１０：１、または約１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２もしくは１：１．５を含む。例として、１０：１のグルカゴン／ＧＬＰ−１活性の比は、ＧＬＰ−１受容体よりも、グルカゴン受容体について１０倍の選択性を示す。同様に、１０：１のＧＬＰ−１／グルカゴン活性の比は、グルカゴン受容体よりも、ＧＬＰ−１受容体について１０倍の選択性を示す。
【０３３３】
一部の実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体にて天然グルカゴンの活性の約１０％以下、例えば約１〜１０％もしくは約０．１〜１０％、または約０．１％より大きいが約１０％未満を有するが、ＧＬＰ−１受容体にてＧＬＰ−１の活性の少なくとも２０％を示す。例えば、本明細書に記載する例示的なクラス３グルカゴン関連ペプチドは、天然グルカゴンの活性の約０．５％、約１％または約７％を有するが、ＧＬＰ−１受容体にてＧＬＰ−１の活性の少なくとも２０％を示す。
【０３３４】
クラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体もしくはＧＬＰ−１受容体または両方にて活性が増加または減少したグルカゴンペプチドであり得る。クラス３グルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体よりも、グルカゴン受容体についての選択性が変更されたグルカゴンペプチドであり得る。
【０３３５】
よって、本明細書に開示するように、改善された溶解性および／または安定性も示す、高い有効性のクラス３グルカゴン関連ペプチドが提供される。例示的な高い有効性のクラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体にて天然グルカゴンの活性の少なくとも約２００％を示し、６から８の間または６から９の間または７から９の間のｐＨ（例えばｐＨ７）にて少なくとも１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解してもよく、２５℃にて２４時間後に元のペプチドの少なくとも９５％（例えば元のペプチドの５％以下が分解または切断される）を保持してもよい。別の例として、例示的なクラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体の両方にて約４０％より大きい、または約６０％より大きい活性（約１：３から３：１の間または約１：２から２：１の間の比）を示し、６から８の間または６から９の間または７から９の間のｐＨ（例えばｐＨ７）にて少なくとも１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解してもよく、２５℃にて２４時間後に元のペプチドの少なくとも９５％を保持してもよい。別の例示的なクラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体にて天然グルカゴンの活性の約１７５％以上およびＧＬＰ−１受容体にて天然ＧＬＰ−１の活性の約２０％以下を示し、６から８の間または６から９の間または７から９の間のｐＨ（例えばｐＨ７）にて少なくとも１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解してもよく、２５℃にて２４時間後に元のペプチドの少なくとも９５％を保持してもよい。さらに別の例示的なクラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体にて天然グルカゴンの活性の約１０％以下およびＧＬＰ−１受容体にて天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも約２０％を示し、６から８の間または６から９の間または７から９の間のｐＨ（例えばｐＨ７）にて少なくとも１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解してもよく、２５℃にて２４時間後に元のペプチドの少なくとも９５％を保持してもよい。さらに別の例示的なクラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体にて天然グルカゴンの活性の約１０％以下であるが０．１％、０．５％または１％を超える活性およびＧＬＰ−１受容体にて天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％以上を示し、６から８の間または６から９の間または７から９の間のｐＨ（例えばｐＨ７）にて少なくとも１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解してもよく、２５℃にて２４時間後に元のペプチドの少なくとも９５％を保持してもよい。一部の実施形態では、このようなクラス３グルカゴン関連ペプチドは、天然グルカゴン中の対応する位置にて少なくとも２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８の天然に存在するアミノ酸を保持する（例えば、天然に存在するグルカゴンと比べて１〜７、１〜５または１〜３の改変を有する）。
【０３３６】
グルカゴン活性に影響する改変
グルカゴン受容体での活性の増加は、天然グルカゴン（配列番号１）の１６位のアミノ酸改変によりもたらされる。一部の実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体でのペプチドの有効性を増進するようにＨｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ（配列番号１）の野生型ペプチドに比べて改変されたグルカゴンアゴニストである。天然グルカゴン（配列番号１）の１６位に通常存在するセリンは、検証されたｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル（例５を参照されたい）におけるｃＡＭＰ合成を刺激するその能力の点でグルカゴンの有効性を増進するように選択酸性アミノ酸で置換できる。より具体的には、この置換は、類似体の有効性をグルカゴン受容体にて少なくとも２倍、４倍、５倍および１０倍までより大きく増進する。この置換は、ＧＬＰ−１受容体での類似体の活性も、天然グルカゴンと比べて少なくとも５倍、１０倍または１５倍増進するが、グルカゴン受容体についての選択性は、ＧＬＰ−１受容体を超えて維持される。
【０３３７】
非限定的な例により、このような作用強度の増強は、１６位の天然に存在するセリンをグルタミン酸で、もしくは長さ４原子の側鎖を有する負に荷電している別のアミノ酸で、または代替的にグルタミン、ホモグルタミン酸、もしくはホモシステイン酸のいずれか１つで、もしくは少なくとも１つのヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ）を含む側鎖を有する荷電アミノ酸で、および約４（または３〜５）原子の長さの側鎖で、置換することによりもたらされ得る。一部の実施形態によると、天然グルカゴンの１６位のセリン残基は、グルタミン酸、グルタミン、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、トレオニン、またはグリシンからなる群から選択されるアミノ酸で置換される。一部の実施形態によると、天然グルカゴンの１６位のセリン残基は、グルタミン酸、グルタミン、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換され、一部の実施形態では、セリン残基は、グルタミン酸で置換される。
【０３３８】
一部の実施形態では、有効性が増進されたクラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７のペプチドまたは配列番号５のグルカゴンアゴニスト類似体を含む。一部の実施形態によると、野生型グルカゴンと比べてグルカゴン受容体にて有効性が増進されたクラス３グルカゴン関連ペプチドであって、ペプチドが、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０の配列を含み、グルカゴンペプチドが、ＧＬＰ−１受容体と比べてグルカゴン受容体についてのその選択性を保持するクラス３グルカゴン関連ペプチドが提供される。一部の実施形態では、グルカゴン受容体についての選択性が増進されたクラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０のペプチドまたはそのグルカゴンアゴニスト類似体を含み、ここで、カルボキシ末端アミノ酸は、その天然カルボン酸基を保持する。一部の実施形態によると、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨ（配列番号１０）の配列を含み、ここで、ペプチドは、例５のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃＡＭＰアッセイにより測定して、天然グルカゴンと比べて、グルカゴン受容体にておよそ５倍の有効性の増進を示す。
【０３３９】
グルカゴン受容体活性は、３位のアミノ酸改変、例えば３位の天然に存在するグルタミンの置換により、低減、維持または増進できる。一部の実施形態では、３位のアミノ酸の酸性、塩基性または疎水性アミノ酸（グルタミン酸、オルニチン、ノルロイシン）での置換がグルカゴン受容体活性を実質的に低減または破壊することが示されている。例えばグルタミン酸、オルニチンまたはノルロイシンで置換された類似体は、グルカゴン受容体にて天然グルカゴンの活性の約１０％以下、例えば約１〜１０％もしくは約０．１〜１０％、または約０．１％より大きいが約１０％未満を示すが、ＧＬＰ−１受容体にてＧＬＰ−１の活性の少なくとも２０％を示す。例えば、本明細書に記載する例示的な類似体は、天然グルカゴンの活性の約０．５％、約１％または約７％を有するが、ＧＬＰ−１受容体にてＧＬＰ−１の活性の少なくとも２０％を示す。特に、グルカゴン類似体、グルカゴンアゴニスト類似体、グルカゴン共同アゴニストおよびグルカゴン／ＧＬＰ−１共同アゴニスト分子を含む、本明細書に記載するクラス３グルカゴン関連ペプチドのいずれも、３位の改変、例えばＧｌｕで置換されたＧｌｎを有して、グルカゴン受容体についての選択性と比較して、ＧＬＰ−１受容体について高い選択性、例えば１０倍の選択性を有するペプチドを生成するように改変してよい。
【０３４０】
別の実施形態では、任意のクラス３グルカゴンペプチドの３位の天然に存在するグルタミンは、グルカゴン受容体での活性を実質的に喪失することなく、そして一部の場合では、本明細書に記載するように、グルカゴン受容体活性を増進して、グルタミン類似体で置換できる。具体的な実施形態では、３位のアミノ酸は、Ｄａｂ（Ａｃ）で置換される。例えば、グルカゴンアゴニストは、配列番号５９５、配列番号６０１、配列番号６０３、配列番号６０４、配列番号６０５および配列番号６０６のアミノ酸配列を含むことができる。
【０３４１】
２位の改変（例えば２位のＡＩＢ）および一部の場合では１位の改変がグルカゴン活性を低減し得ることが観察された。グルカゴン活性のこの低減は、例えば本明細書に記載する手段により、例えば「ｉ」位および「ｉ＋４」位、例えば１２位および１６位、１６位および２０位または２０位および２４位のアミノ酸の側鎖の間の共有結合により、グルカゴンのＣ末端部分のアルファへリックスを安定化することにより回復できる。一部の実施形態では、この共有結合は、１６位のグルタミン酸と２０位のリシンとの間のラクタム架橋である。一部の実施形態では、この共有結合は、ラクタム架橋以外の分子内架橋である。例えば、適切な共有結合形成法は、オレフィンメタセシス、ランチオニンベースの環化、ジスルフィド架橋または改変硫黄含有架橋形成、α，ω−ジアミノアルカンテザーの使用、金属−原子架橋の形成およびペプチド環化の他の手段の任意の１または複数を含む。
【０３４２】
ＧＬＰ−１活性に影響する改変
ＧＬＰ−１受容体での活性の増進は、Ｃ末端アミノ酸のカルボン酸を、アミドまたはエステルのような電荷中性の基で置き換えることによりもたらされる。一部の実施形態では、これらのクラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号２０の配列を含み、ここで、カルボキシ末端アミノ酸は、天然アミノ酸で見出されるカルボン酸基の代わりにアミド基を有する。これらのクラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体の両方で強い活性を有し、よって、両方の受容体で共同アゴニストとして働く。一部の実施形態によると、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体共同アゴニストであり、ここで、ペプチドは、配列番号２０の配列を含み、２８位のアミノ酸は、ＡｓｎまたはＬｙｓであり、２９位のアミノ酸は、Ｔｈｒ−アミドである。
ＧＬＰ−１受容体での活性の増加は、グルカゴンのＣ末端部分（例えば残基１２〜２９のあたり）でアルファへリックスを安定化する改変によりもたらされる。
【０３４３】
一部の実施形態では、このような改変は、３個の介在アミノ酸（すなわち「ｉ」位のアミノ酸と「ｉ＋４」位のアミノ酸との間（ここで、ｉは、１２から２５の間の任意の整数である））により分けられた２つのアミノ酸、２つの介在アミノ酸により分けられた２つのアミノ酸、すなわち「ｊ」位のアミノ酸と「ｊ＋３」位のアミノ酸（ここで、ｊは、１２から２７の間の任意の整数である）または６つの介在アミノ酸により分けられた２つのアミノ酸、すなわち「ｋ」位のアミノ酸と「ｋ＋７」位のアミノ酸（ここで、ｋは、１２から２２の間の任意の整数である）の側鎖の間の分子内架橋の形成を許容する。例示的な実施形態では、架橋またはリンカーは、約８（または約７〜９）原子の長さであり、１２位および１６位、または１６位および２０位、または２０位および２４位、または２４位および２８位のアミノ酸の側鎖の間で形成される。２つのアミノ酸側鎖は、非共有結合、例えば水素結合、塩橋の形成のようなイオン相互作用により、または共有結合により互いに連結できる。
一部の実施形態によると、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニスト活性を示し、配列番号１１、４７、４８および４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、側鎖は、互いに共有結合し、一部の実施形態では、２つのアミノ酸は、互いに結合して、ラクタム環を形成する。
【０３４４】
一部の実施形態によると、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号４５を含み、ここで、少なくとも１つのラクタム環が、１２および１６、１６および２０、２０および２４または２４および２８のアミノ酸の対からなる群から選択されるアミノ酸の対の側鎖の間に形成される。一部の実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号２０のグルカゴンペプチド類似体を含み、ここで、ペプチドは、１２位および１６位のアミノ酸の間、または１６位および２０位のアミノ酸の間に形成された分子内ラクタム架橋を含む。一部の実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号２０の配列を含み、ここで、分子内ラクタム架橋が、１２位および１６位のアミノ酸の間、１６位および２０位のアミノ酸の間または２０位および２４位のアミノ酸の間に形成され、２９位のアミノ酸が、グリシンであり、配列番号２９の配列が、配列番号２０のＣ末端アミノ酸と連結している。さらなる実施形態では、２８位のアミノ酸は、アスパラギン酸である。
【０３４５】
一部の具体的な実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドのＣ末端部分におけるアルファへリックス構造の安定化は、ラクタム架橋以外の分子内架橋の形成により達成される。例えば、適切な共有結合形成法は、オレフィンメタセシス、ランチオニンベースの環化、ジスルフィド架橋または改変硫黄含有架橋形成、α，ω−ジアミノアルカンテザーの使用、金属−原子架橋の形成の任意の１または複数を含み、ペプチド環化の他の手段を、アルファへリックスを安定化するために用いる。
さらに、ＧＬＰ−１受容体での活性の増進は、所望の活性を保持する位置に１または複数のα，α二置換されているアミノ酸を意図的に導入することにより、グルカゴンペプチドのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９のあたり）のアルファへリックスを安定化することにより達成してよい。このようなペプチドは、本明細書において、分子内架橋を欠くペプチドと考えてよい。一部の態様では、アルファへリックスの安定化は、塩橋または共有結合のような分子内架橋を導入することなく、この様式で達成される。一部の実施形態では、グルカゴンペプチドの１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２４位または２９位の１、２、３、４つ以上が、α，α二置換されているアミノ酸で置換される。例えば、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）でのクラス３グルカゴン関連ペプチドの１６位の置換は、塩橋またはラクタムの非存在下でＧＬＰ−１活性を増進する。一部の実施形態では、１６位、２０位、２１位または２４位の１、２、３つ以上がＡＩＢで置換される。
【０３４６】
ＧＬＰ−１受容体での活性の増進は、２０位のアミノ酸改変により達成してよい。一部の実施形態では、２０位のグルタミンは、荷電されているかまたは水素結合する能力を有し、少なくとも約５（または約４〜６）原子の長さである別の親水性アミノ酸、例えばリシン、シトルリン、アルギニンまたはオルニチンで置き換えられる。
ＧＬＰ−１受容体での活性の増加は、配列番号２６のＣ末端の伸長を含むクラス３グルカゴン関連ペプチドにおいて証明される。配列番号２６を含むこのようなクラス３グルカゴン関連ペプチドにおけるＧＬＰ−１活性は、本明細書に記載するように、１８位、２８位もしくは２９位、または１８位および２９位のアミノ酸を改変することによりさらに増加できる。
ＧＬＰ−１有効性のさらなる適度な増加は、１０位のアミノ酸をＴｒｐに改変することにより達成してよい。
ＧＬＰ−１受容体活性を増加する改変の組合せは、単独で生じるこのような改変のいずれよりも高いＧＬＰ−１活性をもたらし得る。例えば、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、１６位、２０位およびＣ末端カルボン酸基に改変を含むことができ、１６位および２０位のアミノ酸の間に共有結合を有してもよいか；１６位およびＣ末端カルボン酸基に改変を含むことができるか、１６位および２０位に改変を含むことができるか；１６位および２０位に改変を含むことができ、１６位および２０位のアミノ酸の間に共有結合を有してもよいか；または２０位およびＣ末端カルボン酸基に改変を含むことができ；ただし、１２位のアミノ酸がＡｒｇではなくてもよいか；もしくはただし、９位のアミノ酸がＧｌｕではなくてもよい。
【０３４７】
溶解性に影響する改変
親水性部分の付加
クラス３グルカゴン関連ペプチドは、天然グルカゴンと比べて高い生物活性を保持しながら、生理的ｐＨの水溶液中のペプチドの溶解性および安定性を改善するように、さらに改変できる。本明細書で論じる親水性部分は、本明細書でさらに論じるようにしてクラス３グルカゴン関連ペプチドに結合できる。
【０３４８】
一部の実施形態によると、配列番号９または配列番号１０を含むクラス３グルカゴン関連ペプチドの１７位、２１位および２４位での親水性基の導入は、生理的ｐＨの溶液中の高い有効性のグルカゴン類似体の溶解性および安定性を改善することが予想される。このような基の導入は、例えば循環中の半減期の延長により測定されるように、作用の期間も増加する。
一部の実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９からなる群から選択される配列を含み、ここで、前記クラス３グルカゴン関連ペプチドの１６位、１７位、２１位または２４位のうちの１つのアミノ酸残基の側鎖は、約５００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有するポリエチレングリコール鎖をさらに含む。一部の実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。別の実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、約１０，０００〜約２０，０００ダルトンの分子量を有する。さらに他の例示的な実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、約２０，０００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する。
【０３４９】
適切な親水性部分は、本明細書に記載する親水性部分、ＰＥＧのホモまたはコポリマー、およびＰＥＧのモノメチル置換ポリマー（ｍＰＥＧ）を含む、当該技術で知られる任意の水溶性ポリマーを含む。一部の実施形態によると、親水性基は、ポリエチレン（ＰＥＧ）鎖を含む。より具体的には、一部の実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号６または配列番号７の配列を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、クラス３グルカゴン関連ペプチドの２１位および２４位に存在するアミノ酸の側鎖と共有的に連結し、クラス３グルカゴン関連ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸は、カルボン酸基を有する。一部の実施形態によると、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約１０，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。
【０３５０】
一部の実施形態によると、ｐｅｇ化クラス３グルカゴン関連ペプチドは、クラス３グルカゴン関連ペプチドと共有結合した２つ以上のポリエチレングリコール鎖を含み、ここで、グルカゴン鎖の全分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。一部の実施形態では、ｐｅｇ化グルカゴンアゴニストは、配列番号５からなるペプチドまたは配列番号５のグルカゴンアゴニスト類似体を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、２１位および２４位にてアミノ酸残基と共有的に連結し、２つのＰＥＧ鎖の組合わせた分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。
【０３５１】
荷電Ｃ末端
配列番号２０を含むクラス３グルカゴン関連ペプチドの溶解性は、例えば、配列番号２０のグルカゴンペプチドのＣ末端部分、好ましくは２７位に対してＣ末端の位置に１、２、３個以上の荷電アミノ酸を導入することによりさらに改善できる。このような荷電アミノ酸は、例えば２８位もしくは２９位にて天然アミノ酸を荷電アミノ酸で置換することにより、または例えば２７位、２８位もしくは２９位の後へ荷電アミノ酸を付加することにより導入できる。例示的な実施形態では、荷電アミノ酸の１、２、３個または全てが負に荷電されている。グルカゴン活性をまだ保持できるようなさらなる改変、例えば保存的置換をクラス３グルカゴン関連ペプチドに作製してよい。一部の実施形態では、配列番号２０のクラス３グルカゴン関連ペプチドの類似体であって、１７位〜２６位の１〜２アミノ酸置換が配列番号２０と異なり、一部の実施形態では、２０位のアミノ酸置換が配列番号２０のペプチドと異なる類似体が提供される。
【０３５２】
アシル化／アルキル化
一部の実施形態によると、グルカゴンペプチドは、アシルまたはアルキル基、例えばＣ４−Ｃ３０アシルまたはアルキル基を含むように改変される。一部の態様では、アシル基またはアルキル基は、アミノ酸に天然に存在しない。具体的な態様では、アシルまたはアルキル基は、任意の天然に存在するアミノ酸に対して非天然である。アシル化またはアルキル化は、循環における半減期を増加し、かつ／または作用の開始を遅延し、かつ／または作用の期間を延長し、かつ／またはＤＰＰ−ＩＶのようなプロテアーゼに対する耐性を改善することができる。クラス３グルカゴン関連ペプチドのグルカゴン受容体およびＧＬＰ−１受容体での活性は、アシル化の後に実質的に増進されないならば、維持される。さらに、アシル化類似体の有効性は、実質的に増進されないならば、クラス３グルカゴン関連ペプチドの非アシル化バージョンに匹敵する。
【０３５３】
一部の実施形態では、本発明は、グルカゴンペプチドの１０位のアミノ酸と共有的に連結したアシル基またはアルキル基を含むように改変されたクラス３グルカゴン関連ペプチドを提供する。グルカゴンペプチドは、クラス３グルカゴン関連ペプチドの１０位のアミノ酸とアシル基またはアルキル基との間にスペーサーをさらに含んでよい。上記のクラス３グルカゴン関連ペプチドのいずれも、２個のアシル基もしくは２個のアルキル基またはそれらの組合せを含んでよい。
本発明の具体的な態様では、アシル化クラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号５３４〜５４４および５４６〜５４９のいずれかのアミノ酸配列を含む。
【０３５４】
Ｃ末端短縮
一部の実施形態では、本明細書に記載するクラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体での活性および／または有効性に影響することなく、グルカゴンペプチドのＣ末端（すなわち２９位および／または２８位）の１または２個のアミノ酸の短縮または欠失によりさらに改変される。この点で、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、本明細書に記載する１または複数の改変を含んでいてもよい、天然グルカゴンペプチド（配列番号１）のアミノ酸１〜２７または１〜２８を含むことができる。
一部の実施形態では、短縮されたクラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号５５０または配列番号５５１を含む。別の実施形態では、短縮されたグルカゴンアゴニストペプチドは、配列番号５５２または配列番号５５３を含む。
【０３５５】
Ｃ末端伸長
一部の実施形態によると、本明細書に開示するクラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴンペプチドのカルボキシ末端に第２のペプチド、例えば配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８を付加することにより改変される。一部の実施形態では、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８および配列番号６９からなる群から選択される配列を有するクラス３グルカゴン関連ペプチドは、第２のペプチドと結合したペプチドに共有結合し、ここで、第２のペプチドは、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群から選択される配列を含む。さらなる実施形態では、Ｃ末端伸長を含むクラス３グルカゴン関連ペプチドにおいて、天然グルカゴンペプチドの２９位のトレオニンは、グリシンで置き換えられている。２９位のトレオニンについてグリシン置換を有し、配列番号２６のカルボキシ末端伸長を有するクラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号２６のカルボキシ末端伸長を含むように改変された天然グルカゴンよりもＧＬＰ−１受容体にて４倍有効である。ＧＬＰ−１受容体での有効性は、１８位の天然アルギニンについてのアラニン置換によりさらに増進できる。
【０３５６】
したがって、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）または配列番号２８のカルボキシ末端伸長を有することができる。一部の実施形態によると、配列番号３３または配列番号２０を含むクラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９と連結した配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）または配列番号２８のアミノ酸配列をさらに含む。より具体的には、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９と連結した配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）または配列番号２８のアミノ酸配列をさらに含む、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群から選択される配列を含む。より具体的には、グルカゴンペプチドは、クラス３グルカゴン関連ペプチドのアミノ酸２９と連結した配列番号２６（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）または配列番号２９のアミノ酸配列をさらに含む、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号５５および配列番号５６からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号６４の配列を含む。
【０３５７】
他の改変
グルカゴン受容体活性を増加または減少し、ＧＬＰ−１受容体活性を増加するクラス３グルカゴン関連ペプチドに関して上記するいずれの改変も、個別にまたは組合せで用いることができる。ＧＬＰ−１受容体活性を増加する改変の組合せは、単独で行われるそのような改変のいずれよりも高いＧＬＰ−１活性を一般的にもたらす。上記の改変のいずれも、溶解性および／または安定性および／または作用の期間の増加のような他の所望の特性を与えるクラス３グルカゴン関連ペプチドに関して本明細書に記載する他の改変と組み合わせることができる。あるいは、上記の改変のいずれも、溶解性または安定性または活性に実質的に影響しないクラス３グルカゴン関連ペプチドに関して本明細書に記載する他の改変と組み合わせることができる。例示的な改変は、それらに限定されないが、以下を含む。
（Ａ）例えば天然グルカゴンのＣ末端部分、好ましくは２７位に対してＣ末端の位置に１、２、３個以上の荷電アミノ酸を導入することによる、溶解性の改善。このような荷電アミノ酸は、例えば２８位もしくは２９位にて天然アミノ酸を荷電アミノ酸で置換することにより、または２７位、２８位もしくは２９位の後へ荷電アミノ酸を付加することにより導入できる。例示的な実施形態では、荷電アミノ酸の１、２、３個または全ては、負に荷電されている。他の実施形態では、荷電アミノ酸の１、２、３個または全ては、正に荷電されている。このような改変は、溶解性を増加し、例えば、約５．５から８の間の与えられたｐＨ、例えばｐＨ７にて、２５℃にて２４時間後に測定した場合に、天然グルカゴンと比べて少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２５倍、３０倍以上大きい溶解性をもたらす。
（Ｂ）本明細書に記載するように、ポリエチレングリコール鎖のような親水性部分を例えばペプチドの１６位、１７位、２０位、２１位、２４位もしくは２９位またはＣ末端アミノ酸に付加することによる、溶解性および作用の期間または循環中の半減期の増加。
（Ｃ）例えば欠失、またはグルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸もしくはホモシステイン酸での置換による１５位のアスパラギン酸の改変による、安定性の増加。このような改変は、５．５〜８の範囲内のｐＨにて、特に酸性またはアルカリ性の緩衝液中での分解または切断を低減でき、例えば、２５℃にて２４時間後に元のペプチドの少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を保持する。
（Ｄ）例えばロイシンまたはノルロイシンでの置換による２７位のメチオニンの改変による、安定性の増加。このような改変は、酸化分解を低減できる。安定性は、２０位または２４位のＧｌｎの改変により、例えばＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＡＩＢでの置換により増加することもできる。このような改変は、Ｇｌｎの脱アミドにより生じる分解を低減できる。安定性は、２１位のＡｓｐの改変により、例えばＧｌｕでの置換により増加できる。このような改変は、Ａｓｐが脱水して環状スクシンイミド中間体を形成した後にイソアスパルテートに異性化することにより生じる分解を低減できる。
（Ｅ）２位のアミノ酸の、Ｎ−メチル−アラニンでの改変を含む、１位または２位のアミノ酸の、本明細書に記載するＤＰＰ−ＩＶ耐性アミノ酸での改変による、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ  ＩＶ）切断に対する耐性の増加。
（Ｆ）活性に影響しない保存的もしくは非保存的置換、付加または欠失、例えば２位、５位、７位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２４位、２７位、２８位もしくは２９位の１もしくは複数での保存的置換、２７位、２８位もしくは２９位の１もしくは複数での欠失、またはＣ末端カルボン酸基の代わりのＣ末端アミドもしくはエステルと組み合わせてもよい、アミノ酸２９の欠失。
（Ｇ）本明細書に記載するようなＣ末端伸長の付加。
（Ｈ）例えば本明細書に記載するようなグルカゴンペプチドのアシル化またはアルキル化による、循環中の半減期の増加および／または作用の期間の延長および／または作用の開始の遅延。
（Ｉ）本明細書に記載するようなホモ二量体化またはヘテロ二量体化。
【０３５８】
他の改変は、１位のＨｉｓの、大きい芳香族アミノ酸（例えばＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐまたはアミノ−Ｐｈｅ）での置換、２位のＳｅｒのＡｌａでの置換、１０位のＴｙｒの、ＶａｌまたはＰｈｅでの置換、１２位のＬｙｓのＡｒｇでの置換、１５位のＡｓｐのＧｌｕでの置換、１６位のＳｅｒのＴｈｒまたはＡＩＢでの置換を含む。
１位のＨｉｓの、大きい芳香族アミノ酸（例えばＴｙｒ）での非保存的置換を含む、ＧＬＰ−１活性を有するクラス３グルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１活性を保持でき、ただし、アルファへリックスは分子内架橋、例えば本明細書に記載するものにより安定化される。
【０３５９】
コンジュゲートおよび融合体
クラス３グルカゴン関連ペプチドは、コンジュゲート部分と連結でき、共有結合またはリンカーを用いてもよい。
【０３６０】
クラス３グルカゴン関連ペプチドは、融合ペプチドまたはタンパク質の一部分であることができ、ここで、第２のペプチドまたはポリペプチドは、クラス３グルカゴン関連ペプチドの末端、例えばカルボキシ末端に融合されている。
【０３６１】
より具体的には、融合クラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９と連結した配列番号２６（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）または配列番号２８（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列をさらに含む、配列番号５５、配列番号９または配列番号１０のグルカゴンアゴニストを含んでよい。一部の実施形態では、配列番号２６（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）または配列番号２８（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列は、ペプチド結合によりクラス３グルカゴン関連ペプチドのアミノ酸２９と結合する。出願人らは、エキセンジン−４のＣ末端伸長ペプチド（例えば配列番号２６または配列番号２９）を含むクラス３グルカゴン関連ペプチド融合ペプチドにおいて、２９位での天然トレオニン残基のグリシンでの置換がＧＬＰ−１受容体活性を劇的に増加することを発見した。このアミノ酸置換は、ＧＬＰ−１受容体についてのグルカゴン類似体の親和性を増進するためのクラス３グルカゴン関連ペプチドに関して本明細書に開示する他の改変と共に用いることができる。例えば、Ｔ２９Ｇ置換は、Ｓ１６ＥおよびＮ２０Ｋアミノ酸置換と組み合わせることができ、アミノ酸１６と２０の間のラクタム架橋と組み合わせてもよく、本明細書に記載するようなＰＥＧ鎖の付加と組み合わせてもよい。一部の実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号６４の配列を含む。一部の実施形態では、グルカゴン融合ペプチドのクラス３グルカゴン関連ペプチド部分は、配列番号５５、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群から選択され、ここで、ＰＥＧ鎖は、１７位、２１位、２４位もしくはＣ末端アミノ酸、または２１位および２４位の両方に存在する場合、５００〜４０，０００ダルトンの範囲から選択される。より具体的には、一部の実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドセグメントは、配列番号７、配列番号８および配列番号６３からなる群から選択され、ここで、ＰＥＧ鎖は、５００〜５，０００の範囲から選択される。一部の実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号５５および配列番号６５の配列を含む融合ペプチドであり、ここで、配列番号６５のペプチドは、配列番号５５のカルボキシ末端と連結している。
【０３６２】
一部の実施形態によると、配列番号１０のクラス３グルカゴン関連ペプチドのさらなる化学改変は、グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体での相対活性が本質的に等しくなる点までのＧＬＰ−１受容体の有効性の増加を授ける。したがって、一部の実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、天然アミノ酸に存在するカルボン酸基の代わりにアミド基を含む末端アミノ酸を含む。グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体それぞれでのクラス３グルカゴン関連ペプチドの相対活性は、グルカゴン受容体にて天然グルカゴンの活性の約４０％〜約５００％以上およびＧＬＰ−１受容体にて天然ＧＬＰ−１の活性の約２０％〜約２００％以上、例えばＧＬＰ−１受容体でのグルカゴンの通常の活性と比べて５０倍、１００倍以上の増加を示す類似体を生成するようなクラス３グルカゴン関連ペプチドに対するさらなる改変により調整できる。一部の実施形態では、本明細書に記載するグルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体にて天然グルカゴンの活性の約１００％、１０００％、１０，０００％、１００，０００％または１，０００，０００％までを示す。一部の実施形態では、本明細書に記載するグルカゴンペプチドは、ＧＬＰ−１受容体にて天然ＧＬＰ−１の活性の約１００％、１０００％、１０，０００％、１００，０００％または１，０００，０００％までを示す。
【０３６３】
例示的な実施形態
一部の実施形態によると、配列番号５５の配列を含むグルカゴン類似体であって、前記類似体が、１位、２位、３位、５位、７位、１０位、１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、１９位、２１位、２４位、２７位、２８位および２９位から選択される１〜３アミノ酸が配列番号５５と異なり、前記グルカゴンペプチドが、ＧＬＰ−１受容体にて天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも２０％を示すグルカゴン類似体が提供される。
【０３６４】
一部の実施形態によると、配列：
ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号３３）（ここで、１５位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、１６位のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、２０位のＸａａは、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、２４位のＸａａは、ＧｌｎまたはＧｌｕであり、２８位のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｙｓまたは酸性アミノ酸であり、２９位のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙまたは酸性アミノ酸であり、Ｒは、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ2であるが、但し、１６位がセリンである場合、２０位はＬｙｓであるか、または１６位がセリンである場合、２４位はＧｌｕであり、２０位または２８位のいずれかは、Ｌｙｓである）を含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストが提供される。一部の実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストは、配列番号３３の配列を含み、ここで、２８位のアミノ酸は、アスパラギン酸であり、２９位のアミノ酸は、グルタミン酸である。別の実施形態では、２８位のアミノ酸は、天然アスパラギンであり、２９位のアミノ酸は、グリシンであり、配列番号２９または配列番号６５のアミノ酸配列は、配列番号３３のカルボキシ末端と共有的に連結している。
【０３６５】
一部の実施形態では、配列番号３３の配列を含む共同アゴニストであって、さらなる酸性アミノ酸がペプチドのカルボキシ末端に付加されている共同アゴニストが提供される。さらなる実施形態では、グルカゴン類似体のカルボキシ末端アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボン酸基の代わりにアミドを有する。一部の実施形態では、グルカゴン類似体は、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３および配列番号４４からなる群から選択される配列を含む。
【０３６６】
一部の実施形態によると、配列番号３３のグルカゴンペプチド類似体であって、１位、２位、３位、５位、７位、１０位、１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、１９位、２１位および２７位から選択される１〜３アミノ酸が配列番号３３と異なるが、但し、１６位のアミノ酸がセリンである場合、２０位がリシンであるかまたはラクタム架橋が２４位のアミノ酸と２０位または２８位のいずれかのアミノ酸との間に形成されるグルカゴンペプチド類似体が提供される。一部の実施形態によると、類似体は、１位、２位、３位、２１位および２７位から選択される１〜３アミノ酸が配列番号３３と異なる。一部の実施形態では、配列番号３３のグルカゴンペプチド類似体は、１位、２位、３位、５位、７位、１０位、１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、１９位、２１位および２７位から選択される１〜２アミノ酸が、または一部の実施形態では、単一アミノ酸が該配列と異なるが、但し、１６位のアミノ酸がセリンである場合、２０位がリシンであるかまたはラクタム架橋が２４位のアミノ酸と２０位または２８位のいずれかのアミノ酸との間に形成される。
【０３６７】
別の実施形態によると、配列ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号５３）（ここで、３位のＸａａは、Ｇｌｕ、ＯｒｎまたはＮｌｅからなるアミノ酸の群から選択され、１５位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、１６位のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、２０位のＸａａは、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、２４位のＸａａは、ＧｌｎまたはＧｌｕであり、２８位のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｙｓまたは酸性アミノ酸であり、２９位のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙまたは酸性アミノ酸であり、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ2、配列番号２６または配列番号２９であるが、但し、１６位がセリンである場合、２０位はＬｙｓであるか、または１６位がセリンである場合、２４位はＧｌｕであり、２０位もしくは２８位のいずれかはＬｙｓである）を含む比較的選択的なＧＬＰ−１受容体アゴニストが提供される。一部の実施形態では、３位のアミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、２８位および／または２９位で置換する酸性アミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸である。一部の実施形態では、共同アゴニストペプチドを含むグルカゴンペプチドは、ペプチドのカルボキシ末端に付加されたさらなる酸性アミノ酸をさらに含む配列番号３３の配列を含む。さらなる実施形態では、グルカゴン類似体のカルボキシ末端アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボン酸基の代わりにアミドを有する。
【０３６８】
一部の実施形態によると：
ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号３４）（ここで、１５位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、１６位のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、２０位のＸａａは、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、２４位のＸａａは、ＧｌｎまたはＧｌｕであり、２８位のＸａａは、Ａｓｎ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり、Ｒは、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ2であり、２９位のＸａａは、ＴｈｒまたはＧｌｙであり、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ2、配列番号２６または配列番号２９であるが、但し、１６位がセリンである場合、２０位はＬｙｓであるか、または１６位がセリンである場合、２４位はＧｌｕであり、２０位もしくは２８位のいずれかはＬｙｓである）からなる群から選択される改変グルカゴンペプチドを含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストが提供される。一部の実施形態では、Ｒは、ＣＯＮＨ2であり、１５位のＸａａは、Ａｓｐであり、１６位のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、２０位および２４位のＸａａは、それぞれＧｌｎであり、２８位のＸａａは、ＡｓｎまたはＡｓｐであり、２９位のＸａａは、Ｔｈｒである。一部の実施形態では、１５位および１６位のＸａａは、それぞれＧｌｕであり、２０位および２４位のＸａａは、それぞれＧｌｎであり、２８位のＸａａは、ＡｓｎまたはＡｓｐであり、２９位のＸａａは、Ｔｈｒであり、Ｒは、ＣＯＮＨ2である。
【０３６９】
天然グルカゴンペプチドのある特定の位置は、親のペプチドの活性の少なくともいくらかを保持したまま改変できることが報告されている。したがって、出願人らは、配列番号１１のペプチドの２位、５位、７位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２４位、２７位、２８位または２９位に位置するアミノ酸の１または複数を、天然グルカゴンペプチドに存在するものとは異なるアミノ酸で置換して、グルカゴン受容体での活性をまだ保持できると予想する。一部の実施形態では、天然ペプチドの２７位に存在するメチオニン残基をロイシンまたはノルロイシンに変更して、ペプチドの酸化分解を妨げる。別の実施形態では、２０位のアミノ酸をＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎもしくはシトルリン（Ｃｉｔｒｕｌｌｅｎｅ）で置換し、かつ／または２１位をＧｌｕ、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸で置換する。
【０３７０】
一部の実施形態では、類似体の１位、２位、５位、７位、１０位、１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、１９位、２１位、２７位、２８位または２９位から選択される１〜６アミノ酸が配列番号１の対応するアミノ酸と異なるが、但し、１６位のアミノ酸がセリンである場合、２０位はＬｙｓであるか、または１６位がセリンである場合、２４位はＧｌｕであり、２０位もしくは２８位のいずれかはＬｙｓである配列番号２０のグルカゴン類似体が提供される。別の実施形態によると、類似体の１位、２位、５位、７位、１０位、１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２７位、２８位または２９位から選択される１〜３アミノ酸が配列番号１の対応するアミノ酸と異なる配列番号２０のグルカゴン類似体が提供される。別の実施形態では、類似体の１位、２位、５位、７位、１０位、１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、１９位、２０位または２１位から選択される１〜２アミノ酸が配列番号１の対応するアミノ酸と異なり、さらなる実施形態では、１〜２の異なるアミノ酸が、天然グルカゴン配列（配列番号１）に存在するアミノ酸と比べて保存的アミノ酸置換を示す、配列番号８、配列番号９または配列番号１１のグルカゴン類似体が提供される。一部の実施形態では、２位、５位、７位、１０位、１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２７位または２９位から選択される位置に１、２または３個のアミノ酸置換をさらに含む配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５のグルカゴンペプチドが提供される。一部の実施形態では、２位、５位、７位、１０位、１１位、１３位、１４位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２７位または２９位の置換は、保存的アミノ酸置換である。
【０３７１】
一部の実施形態によると、配列番号３３の配列のバリアントを含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストであって、バリアントのそれぞれ１６位、１７位、１８位、２０位、２１位、２３位、２４位、２７位、２８位および２９位から選択される１〜１０アミノ酸が配列番号１の対応するアミノ酸と異なるグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストが提供される。一部の実施形態によると、Ｇｌｎ１７、Ａｌａ１８、Ｇｌｕ２１、Ｉｌｅ２３、Ａｌａ２４、Ｖａｌ２７およびＧｌｙ２９からなる群から選択される１または複数のアミノ酸置換が配列番号３３と異なる配列番号３３の配列のバリアントが提供される。一部の実施形態によると、配列番号３３の配列のバリアントを含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストであって、バリアントの１７〜２６位から選択される１〜２アミノ酸が配列番号１の対応するアミノ酸と異なるグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストが提供される。一部の実施形態によると、Ｇｌｎ１７、Ａｌａ１８、Ｇｌｕ２１、Ｉｌｅ２３およびＡｌａ２４からなる群から選択されるアミノ酸置換が配列番号３３と異なる配列番号３３の配列のバリアントが提供される。一部の実施形態によると、１８位のアミノ酸置換が配列番号３３と異なり、置換アミノ酸が、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＧｌｙからなる群から選択される、配列番号３３の配列のバリアントが提供される。一部の実施形態によると、１８位のＡｌａのアミノ酸置換が配列番号３３と異なる配列番号３３の配列のバリアントが提供される。このような変動は、配列番号５５に包含される。別の実施形態では、配列番号３３の配列のバリアントを含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストであって、バリアントの１７〜２２位から選択される１〜２アミノ酸が配列番号１の対応するアミノ酸と異なるグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストが提供され、さらなる実施形態では、２０位および２１位の１または２のアミノ酸置換が配列番号３３と異なる配列番号３３のバリアントが提供される。一部の実施形態によると、配列：
【０３７２】
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号５１）（ここで、
１５位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸であり、
１６位のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸であり、
２０位のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎまたはシトルリンであり、２１位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸であり、２４位のＸａａは、ＧｌｎまたはＧｌｕであり、２８位のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｙｓまたは酸性アミノ酸であり、２９位のＸａａは、Ｔｈｒまたは酸性アミノ酸であり、Ｒは、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ2である）を含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストが提供される。一部の実施形態では、Ｒは、ＣＯＮＨ2である。一部の実施形態によると、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号４７、配列番号４８または配列番号４９のバリアントを含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストであって、バリアントが、２０位のアミノ酸置換が前記配列と異なるグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストが提供される。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、２０位についてＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎまたはシトルリンからなる群から選択される。
【０３７３】
一部の実施形態では、配列番号３４の類似体ペプチドを含むグルカゴンアゴニストであって、類似体が、２位にセリン以外のアミノ酸を有することが配列番号３４と異なるグルカゴンアゴニストが提供される。一部の実施形態では、セリン残基は、アミノイソ酪酸、Ｄ−アラニンで置換され、一部の実施形態では、セリン残基は、アミノイソ酪酸で置換される。このような改変は、親の化合物の固有の有効性を保持しながら（例えば親の化合物の有効性の少なくとも７５、８０、８５、９０、９５％以上）ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断を抑制する。一部の実施形態では、天然グルカゴンのＣ末端部分、好ましくは２７位に対してＣ末端の位置に１、２、３個以上の荷電アミノ酸を導入することにより、類似体の溶解性が増加する。例示的な実施形態では、荷電アミノ酸の１、２、３個または全ては、負に荷電されている。別の実施形態では、類似体は、２８位もしくは２９位の天然アミノ酸を置換する酸性アミノ酸、または配列番号３４のペプチドのカルボキシ末端に付加された酸性アミノ酸をさらに含む。
【０３７４】
一部の実施形態では、本明細書に開示するグルカゴン類似体は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性を低減するために、１位または２位にてさらに改変される。一部の実施形態では、２位の置換が親の分子と異なり、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性（すなわち耐性）の低減を示す配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５のグルカゴン類似体が提供される。より具体的には、一部の実施形態では、類似体ペプチドの２位は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、アミノｎ−酪酸、グリシン、Ｎ−メチルセリンおよびアミノイソ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換される。一部の実施形態では、類似体ペプチドの２位は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、グリシン、Ｎ−メチルセリンおよびアミノイソ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換される。別の実施形態では、類似体ペプチドの２位は、Ｄ−セリン、グリシン、Ｎ−メチルセリンおよびアミノイソ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換される。一部の実施形態では、２位のアミノ酸は、Ｄ−セリンでない。一部の実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号２１または配列番号２２の配列を含む。
【０３７５】
一部の実施形態では、１位の置換が親の分子と異なり、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性（すなわち耐性）の低減を示す配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５のグルカゴン類似体が提供される。より具体的には、類似体ペプチドの１位は、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デサミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジンおよびホモヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸で置換される。別の実施形態では、配列番号３４の類似体ペプチドを含むグルカゴンアゴニストであって、類似体が、１位にヒスチジン以外のアミノ酸を有することが配列番号３４と異なるグルカゴンアゴニストが提供される。一部の実施形態では、天然グルカゴンのＣ末端部分、好ましくは２７位に対してＣ末端の位置に１、２、３個以上の荷電アミノ酸を導入することにより、類似体の溶解性が増加する。例示的な実施形態では、荷電アミノ酸の１、２、３個または全ては、負に荷電されている。別の実施形態では、類似体は、２８位もしくは２９位の天然アミノ酸を置換する酸性アミノ酸、または配列番号３４のペプチドのカルボキシ末端に付加された酸性アミノ酸をさらに含む。一部の実施形態では、酸性アミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸である。
【０３７６】
一部の実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストは、１アミノ酸、または配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群から選択されるペプチドのさらなるカルボキシ末端伸長をさらに含む配列番号２０の配列を含む。単一アミノ酸が配列番号２０のカルボキシ末端に付加される実施形態では、アミノ酸は、２０個の一般的なアミノ酸の１個から典型的に選択され、一部の実施形態では、さらなるカルボキシ末端アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボン酸の代わりにアミド基を有する。一部の実施形態では、さらなるアミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸およびグリシンからなる群から選択される。
【０３７７】
代替の実施形態では、ペプチドが、グルタミン酸残基およびリシン残基の側鎖の間に形成された少なくとも１つのラクタム環を含み、グルタミン酸残基とリシン残基とが、３アミノ酸離れている、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストが提供される。一部の実施形態では、ラクタム保有グルカゴンペプチドのカルボキシ末端アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボン酸の代わりにアミド基を有する。より具体的には、一部の実施形態では、
ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号６６）
ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号６７）
ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号６８）
ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号６９）
ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ（配列番号１６）
ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｒ（配列番号１７）
ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｒ（配列番号１８）
【０３７８】
（ここで、２８位のＸａａ＝ＡｓｐまたはＡｓｎ、２９位のＸａａは、ＴｈｒまたはＧｌｙであり、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ2、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群から選択され、ラクタム架橋は、配列番号６６について１２位のＬｙｓと１６位のＧｌｕの間、配列番号６７について１６位のＧｌｕと２０位のＬｙｓの間、配列番号６８について２０位のＬｙｓと２４位のＧｌｕの間、配列番号６９について２４位のＧｌｕと２８位のＬｙｓの間、配列番号１６について１２位のＬｙｓと１６位のＧｌｕの間および２０位のＬｙｓと２４位のＧｌｕの間、配列番号１７について１２位のＬｙｓと１６位のＧｌｕの間および２４位のＧｌｕと２８位のＬｙｓの間、ならびに配列番号１８について１６位のＧｌｕと２０位のＬｙｓの間および２４位のＧｌｕと２８位のＬｙｓの間に形成される）からなる群から選択される改変グルカゴンペプチドを含むグルカゴンおよびＧＬＰ−１共同アゴニストが提供される。一部の実施形態では、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ2、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシンからなる群から選択され、２８位のアミノ酸は、Ａｓｎであり、２９位のアミノ酸は、トレオニンである。一部の実施形態では、Ｒは、ＣＯＮＨ2であり、２８位のアミノ酸は、Ａｓｎであり、２９位のアミノ酸は、トレオニンである。別の実施形態では、Ｒは、配列番号２６、配列番号２９および配列番号６５からなる群から選択され、２９位のアミノ酸は、グリシンである。
【０３７９】
さらなる実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８からなる群から選択され、ここで、ペプチドは、１アミノ酸、または配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群から選択されるペプチドのさらなるカルボキシ末端伸長をさらに含む。一部の実施形態では、末端伸長は、配列番号２６、配列番号２９または配列番号６５の配列を含み、グルカゴンペプチドは、配列番号５５の配列を含む。一部の実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストは、配列番号３３の配列を含み、ここで、１６位のアミノ酸は、グルタミン酸であり、２０位のアミノ酸は、リシンであり、２８位のアミノ酸は、アスパラギンであり、配列番号２６または配列番号２９のアミノ酸配列は、配列番号３３のカルボキシ末端と連結されている。
【０３８０】
単一アミノ酸が配列番号２０のカルボキシ末端に付加される実施形態では、アミノ酸は、２０個の一般的なアミノ酸の１個から典型的に選択され、一部の実施形態では、アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボン酸の代わりにアミド基を有する。一部の実施形態では、さらなるアミノ酸は、グルタミン酸およびアスパラギン酸およびグリシンからなる群から選択される。グルカゴンアゴニスト類似体がカルボキシ末端伸長をさらに含む実施形態では、伸長のカルボキシ末端アミノ酸は、一部の実施形態では、カルボン酸ではなくアミド基またはエステル基で終結する。
【０３８１】
別の実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストは、配列：ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｘａａ−ＣＯＮＨ2（配列番号１９）（ここで、３０位のＸａａは、任意のアミノ酸を表す）を含む。一部の実施形態では、Ｘａａは、２０個の一般的なアミノ酸の１個から選択され、一部の実施形態では、アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸またはグリシンである。このペプチドの溶解性は、配列番号１９の１７位、２１位、２４位または３０位のアミノ酸の側鎖にＰＥＧ鎖を共有的に連結することにより、さらに改善できる。さらなる実施形態では、ペプチドは、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群から選択されるペプチドのさらなるカルボキシ末端伸長を含む。一部の実施形態によると、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストは、配列番号３０、配列番号３１および配列番号３２の配列を含む。
【０３８２】
配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号６４のグルカゴンの内部のさらなる部位特異的改変を行って、様々な程度のＧＬＰ−１アゴニズムを有する一連のグルカゴンアゴニストを得ることができる。したがって、各受容体にて本質的に同一のｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性を有するペプチドを調製して、特徴決定した。同様に、２つの受容体のそれぞれで１０倍選択的に有効性が増進したペプチドを同定して、特徴決定した。上記のように、１６位のセリン残基のグルタミン酸への置換は、グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体の両方での天然グルカゴンの有効性を増進するが、グルカゴン受容体についておよそ１０倍の選択性を維持する。さらに、３位の天然グルタミンのグルタミン酸（配列番号２２）への置換により、ＧＬＰ−１受容体についておよそ１０倍の選択性を示すグルカゴン類似体が得られる。
【０３８３】
グルカゴン／ＧＬＰ−１共同アゴニストペプチドの溶解性は、ペプチドの１６位、１７位、２１位および２４位での親水性基の導入により、またはグルカゴン／ＧＬＰ−１共同アゴニストペプチドのカルボキシ末端での単一改変アミノ酸（すなわち親水性基を含むように改変されたアミノ酸）の付加により、天然グルカゴンと比べて高い生物活性を保持しながら、生理的ｐＨの水溶液中でさらに増進できる。一部の実施形態によると、親水性基は、ポリエチレン（ＰＥＧ）鎖を含む。より具体的には、一部の実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８の配列を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、グルカゴンペプチドの１６位、１７位、２１位、２４位、２９位のアミノ酸の側鎖またはＣ末端アミノ酸と共有的に連結しているが、但し、ペプチドが配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３を含む場合、ポリエチレングリコール鎖は、１７位、２１位または２４位のアミノ酸残基と共有結合し、ペプチドが配列番号１４または配列番号１５を含む場合、ポリエチレングリコール鎖は、１６位、１７位または２１位のアミノ酸残基と共有結合し、ペプチドが配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８を含む場合、ポリエチレングリコール鎖は、１７位または２１位のアミノ酸残基と共有結合する。
【０３８４】
一部の実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３の配列を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、グルカゴンペプチドの１７位、２１位、２４位のアミノ酸の側鎖またはＣ末端アミノ酸と共有的に連結し、ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボン酸基の代わりにアミド基を有する。一部の実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストペプチドは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９からなる群から選択される配列を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、グルカゴンペプチドの配列番号１２、配列番号１３および配列番号１９の１７位、２１位もしくは２４位、または配列番号１４および配列番号１５の１６位、１７位もしくは２１位、または配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８の１７位もしくは２１位のアミノ酸の側鎖と共有的に連結している。別の実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストペプチドは、配列番号１１または配列番号１９の配列を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、グルカゴンペプチドの１７位、２１位もしくは２４位のアミノ酸の側鎖またはＣ末端アミノ酸と共有的に連結している。
【０３８５】
一部の実施形態によると、そして先行する段落に記載した制限の但し書きに従って、１６位、１７位、２１位、２４位もしくは２９位またはＣ末端アミノ酸に１または複数のアミノ酸置換を含むようにグルカゴン共同アゴニストペプチドを改変し、ここで、天然アミノ酸は、例えばＰＥＧを含む親水性部分との架橋のために適切な側鎖を有するアミノ酸で置換される。天然ペプチドは、天然に存在するアミノ酸または合成（天然に存在しない）アミノ酸で置換できる。合成または天然に存在しないアミノ酸とは、ｉｎ  ｖｉｖｏで天然に存在しないが、それにもかかわらず、本明細書に記載するペプチド構造に組み込むことができるアミノ酸のことをいう。あるいは、例えばＰＥＧを含む親水性部分との架橋のために適切な側鎖を有するアミノ酸を、本明細書に開示するグルカゴン類似体のいずれかのカルボキシ末端に付加できる。一部の実施形態によると、アミノ酸置換を、１６、１７、２１、２４または２９からなる群から選択される位置でグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストペプチド中に作製して、天然アミノ酸を、リシン、システイン、オルニチン、ホモシステインおよびアセチルフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸で置き換え、ここで、置換するアミノ酸は、アミノ酸の側鎖と共有結合したＰＥＧ鎖をさらに含む。一部の実施形態では、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９からなる群から選択されるグルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドの１７位または２１位のアミノ酸の側鎖と共有的に連結したＰＥＧ鎖を含むようにさらに改変される。一部の実施形態では、ｐｅｇ化グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストは、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２９の配列をさらに含む。
【０３８６】
別の実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号５５または配列番号５６のＣ末端アミノ酸と連結した配列番号２６、配列番号２９または配列番号６５のＣ末端伸長をさらに含み、ペプチドの１７位、１８位、２１位、２４位もしくは２９位のアミノ酸の側鎖またはＣ末端アミノ酸と共有的に連結したＰＥＧ鎖をさらに含んでもよい配列番号５５または配列番号５６の配列を含む。別の実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号５５または配列番号５６の配列を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、グルカゴンペプチドの２１位または２４位のアミノ酸の側鎖と共有的に連結し、ペプチドは、配列番号２６または配列番号２９のＣ末端伸長をさらに含む。
【０３８７】
別の実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号５５または配列番号３３または配列番号３４の配列を含み、ここで、さらなるアミノ酸は、配列番号３３または配列番号３４のカルボキシ末端に付加され、ＰＥＧ鎖は、付加されたアミノ酸の側鎖と共有的に連結している。さらなる実施形態では、ｐｅｇ化グルカゴン類似体は、配列番号３３または配列番号３４のＣ末端アミノ酸と連結した配列番号２６または配列番号２９のＣ末端伸長をさらに含む。別の実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号１９の配列を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、グルカゴンペプチドの３０位のアミノ酸の側鎖と共有的に連結し、ペプチドは、配列番号１９のＣ末端アミノ酸と連結した配列番号２６または配列番号２９のＣ末端伸長をさらに含む。
【０３８８】
ポリエチレングリコール鎖は、直鎖の形であってよいか、または分岐状であってよい。一部の実施形態によると、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約１０，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。一部の実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、約１，０００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。代替の実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、約１０，０００〜約２０，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。一部の実施形態によると、ｐｅｇ化グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドと共有的に結合した２個以上のポリエチレングリコール鎖を含み、ここで、グルカゴン鎖の全分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。一部の実施形態では、ｐｅｇ化グルカゴンアゴニストは、配列番号５からなるペプチドまたは配列番号５のグルカゴンアゴニスト類似体を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、２１位および２４位にてアミノ酸残基と共有的に連結し、２つのＰＥＧ鎖の組合わせた分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。
【０３８９】
ある特定の例示的な実施形態では、グルカゴンペプチドは、１０個までのアミノ酸改変を有する配列番号１のアミノ酸配列を含み、アシル化またはアルキル化されたアミノ酸を１０位に含む。一部の実施形態では、１０位のアミノ酸は、Ｃ４−Ｃ３０脂肪酸でアシル化またはアルキル化されている。ある特定の態様では、１０位のアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸に対して非天然であるアシル基またはアルキル基を含む。
ある特定の実施形態では、アシル化またはアルキル化されたアミノ酸を１０位に含むグルカゴンペプチドは、安定化されたアルファへリックスを含む。したがって、ある特定の態様では、グルカゴンペプチドは、本明細書に記載するアシルまたはアルキル基と、ｉ位のアミノ酸およびｉ＋４位のアミノ酸（ここで、ｉは、１２、１６、２０または２４である）の側鎖の間に分子内架橋、例えば共有的分子内架橋（例えばラクタム架橋）とを含む。あるいはまたはさらに、グルカゴンペプチドは、本明細書に記載するアシルまたはアルキル基を含み、グルカゴンペプチドの１６位、２０位、２１位および／または２４位の１、２、３個以上は、α，α二置換されているアミノ酸、例えばＡＩＢで置換されている。一部の場合では、非天然グルカゴンペプチドは、１６位にてＧｌｕおよび２０位にてＬｙｓを含み、ラクタム架橋が、ＧｌｕとＬｙｓを連結してもよく、グルカゴンペプチドが、１７位のＧｌｎ、１８位のＡｌａ、２１位のＧｌｕ、２３位のＩｌｅおよび２４位のＡｌａからなる群から選択される１または複数の改変をさらに含んでもよい。
また、グルカゴンペプチドがアシル化またはアルキル化されたアミノ酸を１０位に含む任意の実施形態では、グルカゴンペプチドは、Ｃ末端アルファカルボキシレートの代わりにＣ末端アミドをさらに含むことができる。
【０３９０】
一部の実施形態では、本明細書に記載するアシルまたはアルキル基を含むグルカゴンペプチドは、１位、２位または１位および２位にアミノ酸置換をさらに含み、ここで、アミノ酸置換は、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ耐性を達成する。例えば、１位のＨｉｓは、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デサミノヒスチジン、ヒドロキシルヒスチジン、アセチルヒスチジンおよびホモヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸で置換してよい。あるいはまたはさらに、２位のＳｅｒは、Ｄ−セリン、アラニン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニンおよびアミノイソ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換してよい。一部の実施形態では、２位のアミノ酸は、Ｄ−セリンでない。
【０３９１】
本明細書に記載するようにアシル化またはアルキル化されたアミノ酸を１０位に含むグルカゴンペプチドは、配列番号１と実質的に関連する任意のアミノ酸配列を含むことができる。例えば、グルカゴンペプチドは、１０個までのアミノ酸改変（例えば０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の改変）を有する配列番号１を含む。ある特定の実施形態では、アシル化またはアルキル化グルカゴンペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１と２５％を超えて同一（例えば配列番号１と３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超えて、または１００％近く同一）である。ある特定の具体的な実施形態では、グルカゴンペプチドは、本明細書に記載するように１０位のアミノ酸がアシル化またはアルキル化された配列番号５５を含むものである。グルカゴンペプチドは、配列番号５５、１〜２個のアミノ酸改変を有する５５、２〜４、９〜１８、２０、２３〜２５、３３、４０〜４４、５３、５６、６１、６２、６４、６６〜５１４および５３４のいずれかであり得る。
【０３９２】
これらの実施形態のアシルまたはアルキル基は、本明細書に記載する任意のアシルまたはアルキル基であってよい。例えば、アシル基は、Ｃ４−Ｃ３０（例えばＣ８−Ｃ２４）脂肪酸アシル基であってよく、アルキル基は、Ｃ４−Ｃ３０（例えばＣ８−Ｃ２４）アルキル基であってよい。
アシルまたはアルキル基と結合したアミノ酸は、本明細書に記載する任意のアミノ酸、例えば式Ｉ（例えばＬｙｓ）、式ＩＩおよび式ＩＩＩのいずれかのアミノ酸であってよい。
一部の実施形態では、アシル基またはアルキル基は、１０位のアミノ酸に直接結合する。一部の実施形態では、アシルまたはアルキル基は、スペーサー、例えば３〜１０原子の長さであるスペーサー、例えばアミノ酸またはジペプチドを介して１０位のアミノ酸に結合する。アシルまたはアルキル基の結合の目的のために適切なスペーサーは、本明細書に記載する。
【０３９３】
一部の実施形態によると、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、本明細書に記載する上記のクラス３グルカゴン関連ペプチドのいずれかの類似体であってよく、この類似体は、ＧＩＰ受容体にてアゴニスト活性を示す。グルカゴン受容体、ＧＬＰ−１受容体およびＧＩＰ受容体での類似体の活性レベル、これらの受容体のそれぞれでの有効性、ならびにこれらの受容体のそれぞれについての選択性は、本明細書に記載するクラス２グルカゴン関連ペプチドの教示に従ってよい。クラス２グルカゴン関連ペプチドの項目の「活性」との表題の小項目の下の教示を参照されたい。
本発明の一部の実施形態では、ＧＩＰ受容体にてアゴニスト活性を示す、グルカゴンペプチドの類似体が提供される。類似体は、ある特定の実施形態では、少なくとも１個のアミノ酸改変（１５個までのアミノ酸改変であってもよい）と、類似体の２９位のアミノ酸に対してＣ末端に１〜２１アミノ酸の伸長とを有する配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【０３９４】
ある特定の態様では、類似体は、少なくとも１個のアミノ酸改変であって１５個までのアミノ酸改変（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個のアミノ酸改変、１０個までのアミノ酸改変）を含む。ある特定の実施形態では、類似体は、１０個までのアミノ酸改変にて少なくとも１個のアミノ酸改変と、さらなる保存的アミノ酸改変とを含む。保存的アミノ酸改変は、本明細書に記載する。
【０３９５】
一部の態様では、アミノ酸改変の少なくとも１個は、類似体のＣ末端部分において安定化されたアルファへリックス構造を与える。安定化されたアルファへリックス構造を達成する改変は、本明細書に記載する。例えば、「アルファへリックス／分子内架橋の安定化」との表題の項目の下の教示を参照されたい。一部の態様では、類似体は、類似体の２個のアミノ酸の側鎖の間に分子内架橋（例えば共有的分子内架橋、非共有的分子内架橋）を含む。ある特定の態様では、分子内架橋は、ｉ位およびｉ＋４位（ここで、ｉは、１２、１３、１６、１７、２０または２４である）のアミノ酸の側鎖を連結する。他の態様では、分子内架橋は、ｊ位およびｊ＋３位（ここで、ｊは、１７である）、またはｋ位およびｋ＋７位（ここで、ｋは、１２から２２の間の任意の整数である）のアミノ酸の側鎖を接続する。ある特定の実施形態では、分子内架橋は、共有的分子内架橋、例えばラクタム架橋である。具体的な態様では、ラクタム架橋は、１６位および２０位のアミノ酸の側鎖を接続する。特定の態様では、１６位および２０位のうちの一方のアミノ酸は、正荷電アミノ酸であり、他方は、負荷電アミノ酸である。例えば、類似体は、１６位のＧｌｕおよび２０位のＬｙｓの側鎖を接続するラクタム架橋を含むことができる。他の態様では、負荷電アミノ酸および正荷電アミノ酸は、塩橋を形成する。この場合、分子内架橋は、非共有的分子内架橋である。
【０３９６】
特定の態様では、安定化されたアルファへリックスを与えるアミノ酸改変は、配列番号１のアミノ酸への、α，α二置換されているアミノ酸の挿入または置換である。アルファへリックスを安定化する目的のための適切なα，α二置換されているアミノ酸は、本明細書に記載し、例えばＡＩＢを含む。一部の態様では、配列番号１の１６位、２０位、２１位および２４位のアミノ酸の１、２、３個以上は、α，α二置換されているアミノ酸、例えばＡＩＢで置換されている。特定の実施形態では、１６位のアミノ酸は、ＡＩＢである。
ＧＩＰ受容体にてアゴニスト活性を示す類似体は、本明細書に記載するもののいずれかのようなさらなる改変を含むことができる。例えば、アミノ酸改変は、ＧＬＰ−１受容体およびグルカゴン受容体の一方または両方での活性を増加または減少してよい。アミノ酸改変は、ペプチドの安定性を増加してよく、例えばＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ分解に対する耐性を増加し、アミノ酸１５と１６の間の結合を安定化してよい。アミノ酸改変は、ペプチドの溶解性を増加し、かつ／またはＧＩＰ、グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体のいずれかでの類似体の作用の時間を変更してよい。これらのタイプの改変のいずれかの組合せは、ＧＩＰ受容体にてアゴニスト活性を示す類似体に存在してよい。
【０３９７】
したがって、一部の態様では、類似体は、１７位のＧｌｎ、１８位のＡｌａ、２１位のＧｌｕ、２３位のＩｌｅおよび２４位のＡｌａもしくはＣｙｓまたはそれらの保存的アミノ酸置換の１または複数を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、類似体は、Ｃ末端アルファカルボキシレートの代わりにＣ末端アミドを含む。ある特定の実施形態では、類似体は、１位、２位または１位および２位のアミノ酸置換を含み、該置換は、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ耐性を達成する。適切なアミノ酸置換は、本明細書に記載する。例えば、１位のＤＭＩＡおよび／または２位のｄ−ＳｅｒもしくはＡＩＢである。一部の実施形態では、２位のアミノ酸は、Ｄ−セリンでない。
【０３９８】
さらに、またはあるいは、類似体は、（ａ）Ａｌａで置換されている２位のＳｅｒ、（ｂ）Ｇｌｕまたはグルタミン類似体で置換されている３位のＧｌｎ、（３）Ｉｌｅで置換されている７位のＴｈｒ、（ｄ）Ｔｒｐ、または天然に存在するアミノ酸に非天然であるアシル基もしくはアルキル基を含むアミノ酸で置換されている１０位のＴｙｒ、（ｅ）Ｉｌｅで置換されている１２位のＬｙｓ、（ｆ）Ｇｌｕで置換されている１５位のＡｓｐ、（ｇ）Ｇｌｕで置換されている１６位のＳｅｒ、（ｈ）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＡＩＢで置換されている２０位のＧｌｎ、（ｉ）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＡＩＢで置換されている２４位のＧｌｎ、（ｊ）ＬｅｕまたはＮｌｅで置換されている２７位のＭｅｔ、（ｋ）荷電アミノ酸で置換され、ＡｓｐまたはＧｌｕで置換されていてもよい２９位のＡｓｎ、および（ｌ）Ｇｌｙまたは荷電アミノ酸で置換され、ＡｓｐまたはＧｌｕで置換されていてもよい２９位のＴｈｒの１つまたは組み合わせを含むことができる。
【０３９９】
ある特定の態様では、類似体は、ＧＩＰアゴニスト活性を付与する１位のアミノ酸改変を含まない。一部の態様では、１位のアミノ酸は、Ｔｙｒなどの大型の芳香族アミノ酸ではない。一部の実施形態では、１位のアミノ酸は、Ｈｉｓ、Ｈｉｓの類似体などのイミダゾール環を含むアミノ酸である。ある特定の実施形態では、類似体は、米国特許出願第６１／１５１，３４９号に開示されている化合物のいずれかではない。ある特定の態様では、類似体は、配列番号６５７〜６６９のいずれかのアミノ酸配列を含む。
ＧＩＰ受容体にてアゴニスト活性を示す類似体に関して、類似体は、１〜２１アミノ酸（例えば５〜１９、７〜１５、９〜１２アミノ酸）の伸長を含む。類似体の伸長は、伸長が１〜２１アミノ酸であれば、任意のアミノ酸配列を含んでよい。一部の態様では、伸長は、７〜１５アミノ酸であり、他の態様では、伸長は、９〜１２アミノ酸である。一部の実施形態では、伸長は、（ｉ）配列番号２６もしくは６７４のアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号２６もしくは６７４のアミノ酸配列と高い配列同一性（例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％）を有するアミノ酸配列、または（ｉｉｉ）１もしくは複数の保存的アミノ酸改変を有する（ｉ）もしくは（ｉｉ）のアミノ酸配列を含む。
【０４００】
一部の実施形態では、伸長のアミノ酸の少なくとも１つは、アシル化またはアルキル化されている。アシルまたはアルキル基を含むアミノ酸は、類似体の伸長のいずれの位置にあってもよい。ある特定の実施形態では、伸長のアシル化またはアルキル化アミノ酸は、類似体の３７位、３８位、３９位、４０位、４１位または４２位（配列番号１のナンバリングによる）の１つにある。ある特定の実施形態では、アシル化またはアルキル化アミノ酸は、類似体の４０位にある。
例示的な実施形態では、アシルまたはアルキル基は、天然に存在するアミノ酸に対して非天然であるアシルまたはアルキル基である。例えば、アシルまたはアルキル基は、Ｃ４−Ｃ３０（例えばＣ１２−Ｃ１８）脂肪酸アシル基またはＣ４−Ｃ３０（例えばＣ１２−Ｃ１８）アルキルであってよい。アシルまたはアルキル基は、本明細書で論じるもののいずれかであってよい。
一部の実施形態では、アシルまたはアルキル基は、アミノ酸に直接、例えばアミノ酸の側鎖を介して結合する。他の実施形態では、アシルまたはアルキル基は、スペーサー（例えばアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能性スペーサー、疎水性二官能性スペーサー）を介してアミノ酸に結合する。ある特定の態様では、スペーサーは、３〜１０原子の長さである。一部の実施形態では、アミノ酸スペーサーは、γ−Ｇｌｕでない。一部の実施形態では、ジペプチドスペーサーは、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕでない。
【０４０１】
また、例示的な実施形態では、アシル基またはアルキル基が結合しているアミノ酸は、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのアミノ酸などを含めた、本明細書に記載するもののいずれかであってよい。アシル化またはアルキル化されているアミノ酸は、Ｌｙｓなどであってよい。アシル基またはアルキル基を含む適切なアミノ酸、ならびに適切なアシル基、およびアルキル基は本明細書に記載するものである。例えば、「アシル化およびアルキル化」の表題のセクションの下の教示を参照されたい。
【０４０２】
他の実施形態では、伸長のアミノ酸１〜６個（例えば、アミノ酸１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個）は、正に荷電しているアミノ酸、例えばＬｙｓなどの式ＩＶのアミノ酸である。本明細書で使用する「正に荷電しているアミノ酸」の語は、生理学的ｐＨでその側鎖の原子上に正の電荷を含む、天然に存在し、または天然に存在しない、あらゆるアミノ酸を意味する。ある特定の態様では、正に荷電しているアミノ酸は、３７、３８、３９、４０、４１、４２、および４３位のいずれかに位置する。特定の実施形態では、正に荷電しているアミノ酸は４０位に位置する。
【０４０３】
他の場合では、伸長は、本明細書に記載するようにアシル化またはアルキル化され、本明細書に記載するように１〜６個の正荷電アミノ酸を含む。
さらに他の実施形態では、ＧＩＰ受容体にてアゴニスト活性を示す類似体は、（ｉ）少なくとも１個のアミノ酸改変を有する配列番号１と、（ｉｉ）類似体の２９位のアミノ酸に対してＣ末端に１〜２１アミノ酸（例えば５〜１８、７〜１５、９〜１２アミノ酸）の伸長と、（ｉｉｉ）Ｃ末端伸長の外側（例えば１〜２９位のいずれか）にある、天然に存在するアミノ酸に対して非天然であるアシルまたはアルキル基を含むアミノ酸とを含む。一部の実施形態では、類似体は、１０位にアシル化またはアルキル化アミノ酸を含む。特定の態様では、アシルまたはアルキル基は、Ｃ４−Ｃ３０脂肪酸アシルまたはＣ４−Ｃ３０アルキル基である。一部の実施形態では、アシルまたはアルキル基は、スペーサー、例えばアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能性スペーサー、疎水性二官能性スペーサーを介して結合している。ある特定の態様では、類似体は、１６位のＧｌｕと２０位のＬｙｓの間の塩橋、または１６位、２０位、２１位および２４位の任意の１、２、３個以上のアルファ，アルファ二置換されているアミノ酸のようなアルファへリックスを安定化するアミノ酸改変を含む。具体的な態様では、類似体は、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ耐性を与えるアミノ酸改変、例えば１位にてＤＭＩＡ、２位にてＡＩＢをさらに含む。さらなるアミノ酸改変を含む類似体は、本明細書に包含される。
【０４０４】
ある特定の実施形態では、ＧＩＰ受容体活性を有する類似体は、ＧＩＰ受容体にて天然ＧＩＰの少なくとも０．１％（例えば少なくとも０．５％、１％、２％、５％、１０％、１５％または２０％）の活性を示す。一部の実施形態では、類似体は、ＧＩＰ受容体にて天然ＧＩＰの２０％より大きい（例えば５０％より大きい、７５％より大きい、１００％より大きい、２００％より大きい、３００％より大きい、５００％より大きい）活性を示す。一部の実施形態では、類似体は、ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体の一方または両方にて、認識できるアゴニスト活性を示す。一部の態様では、これらの受容体（ＧＩＰ受容体およびＧＬＰ−１受容体ならびに／またはグルカゴン受容体）についての選択性は、１０００倍以内である。例えば、ＧＩＰ受容体活性を有する類似体の、ＧＬＰ−１受容体についての選択性は、５００倍未満、１００倍、５０倍以内、２５倍以内、１５倍以内、１０倍以内、ＧＩＰ受容体および／またはグルカゴン受容体についての選択性であり得る。
特定の態様では、類似体は、配列番号６５７〜６６９のいずれかの構造を含む。
【０４０５】
一部の実施形態によると、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、以下の改変：２位のＡＩＢ、３位のＧｌｕ、１０位のＬｙｓ、１６位のＧｌｕ、１７位のＧｌｎ、１８位のＡｌａ、２０位のＬｙｓ、２１位のＧｌｕ、２３位のＩｌｅ、２４位のＡｌａを含む天然グルカゴンのアミノ酸配列（配列番号１）を含み、ここで、１０位のＬｙｓは、Ｃ１４またはＣ１６脂肪酸でアシル化され、Ｃ末端カルボキシレートは、アミドで置き換えられている。具体的な実施形態では、このクラス３グルカゴン関連ペプチドは、そのＮ末端アミノ酸を介してジペプチドＤ−Ｌｙｓ−サルコシンに結合する。
【０４０６】
一部の実施形態によると、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１アゴニストおよび／またはグルカゴンアゴニスト活性を保持する１、２、３、４または５個までのさらなる改変を有してもよい配列番号７０〜５１４、５１７〜５３４または５５４のいずれかのアミノ酸配列を含むか、該アミノ酸配列から本質的になるか、または該アミノ酸配列からなる。ある特定の実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号５６２〜６８４および１７０１〜１７７６のいずれかのアミノ酸を含む。一部の実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号１８０１〜１９０８のいずれかのアミノ酸配列を含む。
【０４０７】
クラス４グルカゴン関連ペプチド
ある特定の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドはクラス４グルカゴン関連ペプチドである（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願（ＰＣＴ）第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０９７３号を参照されたい）。
下記の項において言及するすべての生物学的配列（配列番号１３０１〜１３７１）は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０９７３号の配列番号１〜７１に対応する。
【０４０８】
活性
一部の実施形態に従って、クラス４グルカゴン関連ペプチドが提供される（これ以降「クラス４ペプチド」と称される）。ある特定の態様では、グルカゴンアンタゴニスト活性を有するクラス４ペプチドが提供される。グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴンアゴニズムの抑制が望まれる任意の設定に使用される。最も直接的で明らかな使用は、高血糖症の前臨床モデルにおいてグルカゴンアンタゴニズムが実証され、血糖の降下をもたらす、糖尿病の処置における使用である。グルカゴンアンタゴニストをさらに改変して、親化合物のアンタゴニスト活性を維持しながら、化合物の生物物理学的安定性および／または水溶解度を改良することができる。ある特定の態様では、クラス４ペプチドは、純粋グルカゴンアンタゴニストとして定義される。
【０４０９】
「グルカゴンアンタゴニスト」という用語は、グルカゴン活性を相殺する、またはグルカゴン機能を防止する化合物を指す。例えば、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体においてグルカゴンにより達成される最大応答の少なくとも６０％の阻害（例えば、少なくとも７０％の阻害）を示し、好ましくは少なくとも８０％の阻害を示す。一部の実施形態では、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体においてグルカゴンにより達成される最大応答の少なくとも９０％の阻害を示す。特定の実施形態では、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体においてグルカゴンにより達成される最大応答の１００％の阻害を示す。さらに、グルカゴンアンタゴニストは、約１μＭの濃度において、グルカゴン受容体においてグルカゴンにより達成される最大アゴニスト活性の約２０％未満を示す。一部の実施形態では、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体においてグルカゴンにより達成される最大アゴニスト活性の約１０％未満を示す。特定の実施形態では、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体においてグルカゴンにより達成される最大アゴニスト活性の約５％未満を示す。さらに別の特定の実施形態では、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体においてグルカゴンにより達成される最大アゴニスト活性の０％を示す。
【０４１０】
「純粋グルカゴンアンタゴニスト」は、検証されたｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルアッセイを使用してｃＡＭＰ産生により測定された、グルカゴンまたはＧＬＰ−１受容体活性の刺激が何も検出されないグルカゴンアンタゴニストである（例えば、第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０９７３号を参照されたい）。例えば、純粋グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体においてグルカゴンにより達成される最大アゴニスト活性の約５％未満、（例えば、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０％）を示し、ＧＬＰ−１受容体においてＧＬＰ−１により達成される最大アゴニスト活性の約５％未満（例えば、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満および約０％）を示す。
したがって、一部の態様では、純粋なグルカゴンアンタゴニスト活性を示すクラス４ペプチドが提供される。一部の態様によれば、グルカゴン受容体を、０．８ｎＭのグルカゴンとグルカゴンアンタゴニストとに同時接触させる場合、グルカゴンアンタゴニストは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてｃＡＭＰ産生により測定されるグルカゴン受容体のグルカゴン誘導性ｃＡＭＰ産生を、最大の少なくとも５０％低減させる活性を示す。一部の実施形態では、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体のグルカゴン誘導性ｃＡＭＰ産生を、最大量の少なくとも８０％低減させる。
【０４１１】
クラス４ペプチドは、グルカゴンアンタゴニストに関して以前に記載されたいずれの使用に対しても適切であると考えられる。したがって本明細書に記載のクラス４ペプチドは、高血糖症の処置、またはグルカゴンの高血中レベルまたは高血糖レベルによりもたらされる他の代謝性疾患の処置に使用することができる。一部の実施形態によれば、本明細書に開示のクラス４ペプチドを使用して処置される患者は、飼い慣らされた動物であり、別の実施形態では、処置される患者はヒトである。研究により、糖尿病患者におけるグルカゴン抑制の欠落は、グリコーゲン分解の加速により、一部食後高血糖に寄与することが示唆される。経口ブドウ糖負荷試験（Ｏｒａｌ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  Ｔｅｓｔ）（ＯＧＴＴ）の際の血糖の分析により、ソマトスタチン誘導性グルカゴン抑制の存在下または不在下で、高グルカゴンレベルを有する対象におけるグルコースの有意な増加が示されている。したがって、本発明のクラス４ペプチドは、高血糖症の処置に使用することができ、インスリン依存性または非インスリン依存性のいずれであっても、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病または妊娠糖尿病を含むさまざまな型の糖尿病の処置に有用であり、腎障害、網膜障害および血管系疾患を含む糖尿病の合併症を低減させることが期待される。
【０４１２】
一部の実施形態では、エキセンジン−４の末端の１０個のアミノ酸（すなわち、配列番号１３１９の配列（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ））が、クラス４ペプチドのカルボキシ末端に連結される。これらの融合タンパク質は、食欲を抑制し、体重減少／体重維持を誘発するための薬理活性を有することが予想される。一部の実施形態によれば、本明細書に開示のクラス４ペプチドを、配列番号１３４２のクラス４ペプチドのアミノ酸２４に連結された配列番号１３１９のアミノ酸配列（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）を含むようにさらに改変することができ、体重減少を誘導または体重維持を支援するために個体に投与される。より詳細には、クラス４ペプチドは、配列番号１３０２、配列番号１３０３、配列番号１３０４配列番号１３０５、配列番号１３０６、配列番号１３０７、配列番号１３０８、配列番号１３３６、配列番号１３３９、配列番号１３４０配列番号１３４１、配列番号１３４２、配列番号１３４３および配列番号１３４４からなる群から選択される配列を含み、クラス４ペプチドのアミノ酸２４に連結された配列番号１３１９（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）のアミノ酸配列をさらに含み、食欲を抑制し、体重減少／体重維持を誘発するために使用される。一部の実施形態では、投与されるクラス４ペプチドは、配列番号１３４６または配列番号１３４７の配列を含む。
【０４１３】
食欲を低下させるか、または体重減少を促進するためのそのような方法は、体重の低下、体重増加の防止、または薬物誘導性肥満など様々な原因の肥満の処置、ならびに血管疾患（冠動脈疾患、脳卒中、末梢血管疾患、虚血再かん流など）、高血圧、ＩＩ型糖尿病の開始、高脂血症および骨格筋疾患などの肥満と関連する合併症の減少において有用であると期待される。
【０４１４】
本発明のクラス４ペプチドは、単独で、または他の抗糖尿病薬もしくは抗肥満薬と組み合わせて投与することができる。当分野において公知の、または治験中の抗糖尿病薬としては、インスリン、スルホニル尿素、例えば、トルブタミド（Ｏｒｉｎａｓｅ）、アセトヘキサミド（Ｄｙｍｅｌｏｒ）、トラザミド（Ｔｏｌｉｎａｓｅ）、クロルプロパミド（Ｄｉａｂｉｎｅｓｅ）、グリピジド（Ｇｌｕｃｏｔｒｏｌ）、グリブリド（Ｄｉａｂｅｔａ、Ｍｉｃｒｏｎａｓｅ、Ｇｌｙｎａｓｅ）、グリメピリド（Ａｍａｒｙｌ）またはグリクラジド（Ｄｉａｍｉｃｒｏｎ）；メグリチニド、例えば、レパグリニド（Ｐｒａｎｄｉｎ）またはナテグリニド（Ｓｔａｒｌｉｘ）；ビグアナイド、例えば、メトホルミン（Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ）またはフェンホルミン；チアゾリジンジオン、例えば、ロシグリタゾン（Ａｖａｎｄｉａ）、ピオグリタゾン（Ａｃｔｏｓ）もしくはトログリタゾン（Ｒｅｚｕｌｉｎ）または他のＰＰＡＲγインヒビター；炭水化物の消化を阻害するアルファグルコシダーゼインヒビター、例えば、ミグリトール（Ｇｌｙｓｅｔ）、アカルボース（Ｐｒｅｃｏｓｅ／Ｇｌｕｃｏｂａｙ）、エクセナチド（Ｂｙｅｔｔａ）またはプラムリンチド；ジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）インヒビター、例えば、ビルダグリプチン、シタグリプチン；ＳＧＬＴ（ナトリウム依存性グルコース輸送体１）インヒビター；またはＦＢＰアーゼ（フルクトース１，６−ビスホスファターゼ）インヒビターが挙げられる。
【０４１５】
当業界で公知の、または調査中の抗肥満剤としては、フェネチルアミン型刺激剤、フェンテルミン（フェンフルラミンもしくはデクスフェンフルラミンを含んでもよい）、ジエチルプロピオン（Ｔｅｎｕａｔｅ（登録商標））、フェンジメトラジン（Ｐｒｅｌｕ−２（登録商標）、Ｂｏｎｔｒｉｌ（登録商標））、ベンズフェタミン（Ｄｉｄｒｅｘ（登録商標））、シブトラミン（Ｍｅｒｉｄｉａ（登録商標）、Ｒｅｄｕｃｔｉｌ（登録商標））；リモナバント（Ａｃｏｍｐｌｉａ（登録商標））、他のカンナビノイド受容体アンタゴニスト；オキシントモジュリン；塩酸フルオキセチン（Ｐｒｏｚａｃ）；Ｑｎｅｘａ（トピラメートおよびフェンテルミン）、Ｅｘｃａｌｉａ（ブプロピオンおよびゾニサミド）もしくはＣｏｎｔｒａｖｅ（ブプロピオンおよびナルトレキソン）；またはゼニカル（Ｏｒｌｉｓｔａｔ）もしくはＣｅｔｌｉｓｔａｔ（ＡＴＬ−９６２としても知られる）、もしくはＧＴ３８９−２５５と同様のリパーゼ阻害剤などの食欲抑制剤が挙げられる。
【０４１６】
本発明のクラス４ペプチドは、異化亢進（ｃａｔａｂｏｌｉｃ  ｗａｓｔｉｎｇ）を患う患者に投与することもできる。半分を超えるがん患者が、意図せず、進行性の体重減少、衰弱、および低体脂肪および筋力低下を特徴とする異化亢進を経験すると見積もられている。この症候群は、ＡＩＤＳ患者において同頻度で見られ、細菌および寄生虫疾患、関節リウマチ、ならびに腸、肝臓、肺、および心臓の慢性疾患においても存在し得る。それは通常、食欲不振と関連し、加齢における状態として、または物理的外傷の結果として生じ得る。異化亢進は、生活の質を低下させ、基礎となる状態を悪化させる症状であり、主な死因である。出願人は、本明細書に開示のクラス４ペプチドが、異化亢進を処置するために患者に投与可能であることを予想する。
【０４１７】
本明細書に開示のクラス４ペプチドを含む医薬組成物は、標準的な薬学的に（ｐｈａｒｍａｅｕｃｔｉｃａｌｌｙ）許容される担体および当業者に公知の投与経路を使用して製剤化でき、患者に投与することができる。したがって、本開示は、本明細書に開示のクラス４ペプチドの１つまたは複数と、薬学的に許容される担体とを組み合わせて含む医薬組成物もまた包含する。医薬組成物は、クラス４ペプチドを単独の薬学的活性成分として含んでもよく、またはクラス４ペプチドを、１つまたは複数の追加の活性薬剤と組み合わせてもよい。一部の実施形態によれば、本発明のクラス４ペプチドおよびＧＬＰ−１受容体（例えば、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１類似体、エキセンジン−４類似体またはこれらの誘導体）を活性化する化合物を含む組成物が提供される。一部の実施形態によれば、本発明のクラス４ペプチドおよびインスリンまたはインスリン類似体を含む組成物が提供される。または、配列番号１３４２のアミノ酸２４に連結された配列番号１３１９（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）のアミノ酸配列および抗肥満ペプチドをさらに含む配列番号１３４２の配列を含む、体重減少を誘発する、または体重増加を防止するための組成物が提供され得る。適切な抗肥満ペプチドとしては、米国特許第５，６９１，３０９号、第６，４３６，４３５号または米国特許出願第２００５０１７６６４３号に開示のものが挙げられ、限定するものではないが、ＧＬＰ−１、ＧＩＰ（消化管抑制ポリペプチド）、ＭＰ１、ＰＹＹ、ＭＣ−４、レプチンを含む。
【０４１８】
クラス４ペプチドの構造
一部の実施形態では、（グルカゴン、配列番号１３０１の）９位に正常に存在するアスパラギン酸が、グルタミン酸またはシステイン酸系誘導体で置換されているクラス４グルカゴン関連ペプチドが提供される。より詳細には、第１のアミノ酸の欠失（ｄｅｓ−Ｈｉｓ）および９位のアスパラギン酸のグルタミン酸との置換が、一部の態様では、クラス４ペプチドを作り出す。グルカゴンの９位のアミノ酸において置換されたスルホン酸置換基を有するクラス４グルカゴン関連ペプチドは、カルボン酸系アミノ酸と同様に機能するが、溶解度などの物理的特性に関していくつかの重要な違いを有する。ホモシステイン酸（ｈＣｙｓＳＯ3）が、通常のｄｅｓ−Ｈｉｓ，Ｇ１ｕ９  クラス４ペプチドの９位において等配電子のグルタミン酸と置換された場合、部分的アンタゴニストおよび弱いアゴニストを保有する。
一部の実施形態では、最初の２から５個のアミノ酸が除去され、９位（配列番号１３０１のナンバリングによる）が、ｈＣｙｓ（ＳＯ3）、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸または以下の構造を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体で置き換えられたクラス４ペプチドが提供され、高度に特異的で強力な、アゴニスト特性が混入していない、ホルモン性アンタゴニストとして機能する化合物が提供される。
【０４１９】
【化２７】
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（式中、Ｘ5は、Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ2−Ｃ4アルケニルまたはＣ2−Ｃ4アルキニルである）
一部の実施形態によれば、Ｎ末端からアミノ酸残基２から５個の欠失および天然タンパク質の９位のアスパラギン酸残基の、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、システインのスルホン酸誘導体または以下の構造を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体での置換により、配列番号１３０１の野生型配列と比較して改変されたグルカゴンペプチドを含むクラス４ペプチドが提供される。
【０４２０】
【化２８】
2016521253.tif 000030
（式中、Ｘ5は、Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ2−Ｃ4アルケニルまたはＣ2−Ｃ4アルキニルである）
【０４２１】
特定の一実施形態において、天然グルカゴンのＮ末端からアミノ酸残基２から５個の欠失および９位のＡｓｐの置換を含むクラス４ペプチドが、３個までのアミノ酸改変によりさらに改変される。例えば、クラス４ペプチドは、１、２または３個の保存的アミノ酸改変を含み得る。またはクラス４ペプチドは、
Ａ．クラス４ペプチドの１０、２０および２４位（配列番号１３０１のアミノ酸ナンバリングによる）またはＮ末端もしくはＣ末端のアミノ酸の１つまたは２つのアミノ酸の、エステル、エーテル、チオエーテル、アミド、またはアルキルアミン連結によりアシル基またはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸での置換、
Ｂ．クラス４ペプチドの１６、１７、２０、２１、および２４位（配列番号１３０１のアミノ酸ナンバリングによる）またはＮ末端もしくはＣ末端の１つまたは２つのアミノ酸の、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン、ホモシステイン、およびアセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）からなる群から選択されるアミノ酸であって、前記群のアミノ酸が親水性部分に共有結合により結合しているアミノ酸での置換、
Ｃ．親水性部分に共有結合しているアミノ酸の、クラス４ペプチドのＮ末端またはＣ末端への付加、
Ｄ．１５位（配列番号１３０１のナンバリングによる）のＡｓｐの、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸での置換、
Ｅ．１６位（配列番号１３０１のナンバリングによる）のＳｅｒの、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸での置換、
Ｆ．配列番号１３０１のアミノ酸ナンバリングによる１６、２０、２１および２４位の１つまたは複数におけるＡＩＢでの置換、
Ｇ．配列番号１３０１のナンバリングによる２９位のアミノ酸または２８位および２９位のアミノ酸の欠失、
Ｈ．２８位のＡｓｎおよび２９位のＴｈｒ（配列番号１３０１のアミノ酸ナンバリングによる）のそれぞれまたは両方の、荷電アミノ酸での置換、および／または配列番号１３０１のＣ末端の１個または２個の荷電アミノ酸の付加、
Ｉ．２７位（配列番号１３０１のナンバリングによる）のＭｅｔの、Ｌｅｕまたはノルロイシンでの置換、
Ｊ．配列番号１９−２１および５３のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドの、２９位（配列番号１３０１のナンバリングによる）のＴｈｒがＴｈｒまたはＧｌｙである、配列番号１３０１のＣ末端への付加、ならびに
Ｋ．Ｃ末端カルボキシレートの、アミドまたはエステルでの置き換え、
からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸改変を含み得る。
【０４２２】
特定の実施形態では、クラス４ペプチドは、上記のＡ、ＢもしくはＣのアミノ酸改変またはこれらの組合せを含む。さらに別の特定の実施形態では、クラス４ペプチドは、上記のＤからＫのいずれかのアミノ酸改変またはこれらの組合せを、Ａ、Ｂおよび／またはＣのアミノ酸改変（複数可）に加えてさらに含む。
【０４２３】
一部の実施形態では、クラス４ペプチドは、最初の５個のアミノ酸がＮ末端から除去されており、残りのＮ末端アミノ基が、ヒドロキシル基で置き換えられており（「ＰＬＡ６類似体」）、配列番号１３３９のペプチドが生み出されたグルカゴンペプチドを含む。出願人らは、最初の５個のアミノ酸の欠失および９位のグルタミン酸の置換（天然グルカゴンと比較して）を有するクラス４ペプチド類似体における、フェニル乳酸のフェニルアラニンへの置換が、クラス４ペプチド類似体の効力をさらに強化することを発見していた。
【０４２４】
一部の実施形態では、配列番号１３３９のクラス４ペプチドのペプチドが、４位（天然グルカゴンの９位）のアスパラギン酸残基を、以下の一般構造のアミノ酸で置換することによって、さらに改変され、
【化２９】
2016521253.tif 000031
式中、Ｘ6は、Ｃ1−Ｃ3アルキル、Ｃ2−Ｃ3アルケンまたはＣ2−Ｃ3アルキニルであり、一部の実施形態では、Ｘ6はＣ1−Ｃ3アルキルであり、別の実施形態では、Ｘ6はＣ2アルキルである。一部の実施形態では、クラス４ペプチドは、Ｎ末端から最初の５個のアミノ酸が除去され、４位（天然グルカゴンの９位）のアスパラギン酸残基が、システイン酸またはホモシステイン酸で置換されているグルカゴンペプチドを含む。一部の実施形態では、クラス４ペプチドは、配列番号１３３９、配列番号１３０７および配列番号１３０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むグルカゴンペプチドを含む。一部の実施形態では、クラス４ペプチドは、４位のアミノ酸がホモシステイン酸である配列番号１３０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０４２５】
別の実施形態では、配列番号１３３９のクラス４ペプチドは、４位（天然グルカゴンの９位）のアスパラギン酸残基を、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸または以下の構造を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体で置換することによって、さらに改変され、
【０４２６】
【化３０】
2016521253.tif 000032
式中、Ｘ5は、Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ2−Ｃ4アルケニルまたはＣ2−Ｃ4アルキニルである。特定の実施形態では、Ｘ5はＣ1またはＣ2アルキルである。
【０４２７】
しかし、出願人らは、ｄｅｓ１−５グルカゴン類似体（すなわち、最初の５個のアミノ酸が欠失されたグルカゴン類似体）におけるＮ末端フェニルアラニンのＰＬＡでの置換により、４位（天然グルカゴンの９位）の天然アスパラギン酸残基のさらなる置換が、純粋なアンタゴニズムを示す類似体を作り出すために必要ではないことを発見している。この結果は、グルカゴン（２−２９）類似体の高い親和性および効力のアンタゴニストを作り出すためには、４位の天然アスパラギン酸残基を置換しなければならないという先行技術の教示と照らし合わせると、驚くべきである。ＰＬＡ置換の使用は、Ａｓｐ９類似体の相対効力を、Ｇｌｕ９およびｈＣｙｓ（ＳＯ3Ｈ）９類似体の相対効力に匹敵する点まで改善する。
【０４２８】
フェニルアラニン残基の、３，４−２Ｆ−フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌｎｉｎｅ）（３，４−２Ｆ−Ｐｈｅ）、２−ナフチルアラニン（ｎａｐｈｔｈｙａｌａｎｉｎｅ）（２−Ｎａｌ）、Ｎ−アシル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）、アルファ−メチルヒドロケイ皮酸（ＭＣＡ）およびベンジルマロン酸（ＢＭＡ）を含む他のフェニルアラニン類似体での置換は、ＰＬＡ置換ほど強力に機能しなかった。
４位および５位を含む、６位（天然グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）以外の部位におけるＰＬＡ置換により、ＰＬＡ６類似体が、わずかに伸長されたＮ末端を有するグルカゴン類似体よりかなり強力なアンタゴニストであることが明らかにされる。本発明は、Ｎ末端アミノ基が、アシル化およびアルキル化「Ｏ末端」ペプチドで置換される類似体もまた含む。
【０４２９】
さらに、ＰＬＡ６置換は、アンタゴニストの効力を増加させるだけでなく、ペグ化においても重要な役割を果たす。ＰＬＡ６類似体は、グルカゴンアゴニズムの復元をせずに選択的にペグ化することができる。ＰＬＡ置換の不在下で、驚くべきことに、類似体のペグ化はグルカゴンアゴニズムを誘導する。このグルカゴンアゴニズムは、ペグ化されたＰＬＡ６類似体では見られない。３、６および１９位（天然グルカゴンの８、１１および１９位）を含むいくつかの部位およびＮ末端アミノ酸残基においてペグ化のための調査をした。一部の実施形態では、ペグ化は、１９位（天然グルカゴンの２４位）が最も強力で選択的なグルカゴンアンタゴニズムを示すので、この部位において行われる。
【０４３０】
一部の実施形態では、クラス４ペプチドは、Ａ−Ｂ−Ｃの一般構造を含み、
Ａは、
（ｉ）フェニル乳酸（ＰＬＡ）、
（ｉｉ）ＰＬＡのオキシ誘導体、
（ｉｉｉ）ペプチドの連続する２つのアミノ酸がエステル結合またはエーテル結合により連結されている、アミノ酸２から６個のペプチド
からなる群から選択され、
Ｂは、配列番号１３０１のアミノ酸ｉから２６を表し、ｉは３、４、５、６、または７であり、
（ｉｖ）９位（配列番号１３０１のアミノ酸ナンバリングによる）のＡｓｐは、Ｇｌｕ、Ｃｙｓのスルホン酸誘導体、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、または以下の構造を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体で置換されており、
【０４３１】
【化３１】
2016521253.tif 000033
（式中、Ｘ5は、Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ2−Ｃ4アルケニルまたはＣ2−Ｃ4アルキニルである）
（ｖ）１０、２０および２４位（配列番号１３０１のアミノ酸ナンバリングによる）の１つまたは２つのアミノ酸の、エステル、エーテル、チオエーテル、アミド、またはアルキルアミン連結によりアシル基またはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸での置換、
（ｖｉ）１６、１７、２０、２１および２４位（配列番号１３０１のアミノ酸ナンバリングによる）の１つまたは２つのアミノ酸の、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン、ホモシステイン、およびアセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）からなる群から選択されるアミノ酸であって、前記群のアミノ酸が親水性部分に共有結合により結合しているアミノ酸での置換、
（ｖｉｉ）１５位（配列番号１３０１のナンバリングによる）のＡｓｐが、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸で置換されている、
（ｖｉｉｉ）１６位（配列番号１３０１のナンバリングによる）のＳｅｒが、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸で置換されている、
（ｉｘ）配列番号１３０１のアミノ酸ナンバリングによる１６、２０、２１および２４位のうちの１つまたは複数の、ＡＩＢでの置換
からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸改変を含んでもよく、ならびに
Ｃは、
（ｘ）Ｘ、
（ｘｉ）Ｘ−Ｙ、
（ｘｉｉ）Ｘ−Ｙ−Ｚ、および
（ｘｉｉｉ）Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１０
（式中、ＸはＭｅｔ、Ｌｅｕ、またはＮｌｅであり、ＹはＡｓｎまたは荷電アミノ酸であり、ＺはＴｈｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）、ホモシステイン、アセチルフェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）、または荷電アミノ酸であり、Ｒ１０は、配列番号１３１９〜１３２１および１３５３からなる群から選択される）、ならびに
（ｘｉｖ）Ｃ末端カルボキシレートがアミドで置き換えられている（ｘ）から（ｘｉｉｉ）のいずれか
からなる群から選択される。
【０４３２】
特定の態様では、クラス４ペプチドは、ＰＬＡのオキシ誘導体を含む。本明細書において使用する場合、「ＰＬＡのオキシ誘導体」は、ヒドロキシル基がＯ−Ｒ11で置き換えられており、Ｒ11が化学部分である、ＰＬＡの改変された構造を含む化合物を指す。この点から考えて、ＰＬＡのオキシ誘導体は、例えば、ＰＬＡのエステルまたはＰＬＡのエーテルであってよい。
【０４３３】
ＰＬＡのオキシ誘導体を作る方法は、当分野において公知である。例えば、オキシ誘導体がＰＬＡのエステルである場合、エステルは、ＰＬＡのヒドロキシルと、求核試薬を有するカルボニルとの反応により形成することができる。該求核試薬は、限定するものではないが、アミンまたはヒドロキシルを含む任意の適切な求核試薬であってよい。したがって、ＰＬＡのエステルは、式ＩＶの構造を含むことができる。
【０４３４】
【化３２】
2016521253.tif 000034
式ＩＶ
（式中、Ｒ７は、ＰＬＡのヒドロキシルと求核試薬を有するカルボニルとの反応により形成されるエステルである）
【０４３５】
求核試薬を有するカルボニル（ＰＬＡのヒドロキシルと反応して、エステルを形成する）は、例えば、カルボン酸、カルボン酸誘導体、またはカルボン酸の活性化エステルであってよい。カルボン酸誘導体は、限定するものではないが、塩化アシル、酸無水物、アミド、エステルまたはニトリルであってよい。カルボン酸の活性化エステルは、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、トシレート（Ｔｏｓ）、カルボジイミドまたはヘキサフルオロホスフェートであってよい。一部の実施形態では、カルボジイミドは、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）または１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣＤ）である。一部の実施形態では、ヘキサフルオロホスフェートは、ヘキサフルオロホスフェートベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）およびｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−ホスフェート（ＨＢＴＵ）からなる群から選択される。
【０４３６】
ヒドロキシル基（例えば、ＰＬＡのヒドロキシル）との反応からエーテルを作る方法もまた、当分野において公知である。例えば、ＰＬＡのヒドロキシル基は、ハロゲン化アルキルまたはトシル化アルキルアルコールと反応させて、エーテル結合を形成することができる。
全体として、Ｒ11の化学部分は、クラス４ペプチドの活性を減少させない化学部分である。一部の実施形態では、化学部分は、クラス４ペプチドの活性、安定性および／または溶解度を強化する。
特定の実施形態では、酸素含有結合により（例えば、エステルまたはエーテル結合により）ＰＬＡと結合された化学部分は、ポリマー（例えば、ポリアルキレングリコール）、炭水化物、アミノ酸、ペプチドまたは脂質、例えば脂肪酸またはステロイドである。
【０４３７】
特定の実施形態では、化学部分は、式ＩＶがデプシペプチドであるようなペプチドの一部であってもよいアミノ酸である。この点から考えて、ＰＬＡは、クラス４ペプチドが、ＰＬＡ残基へと続く１つまたは複数の（例えば、１、２、３、４、５、６またはそれ以上）のアミノ酸Ｎ末端を含むように、クラス４ペプチドのＮ末端アミノ酸残基以外の位置にあり得る。例えば、クラス４ペプチドは、クラス４ペプチドのｎ位にＰＬＡを含むことができ、ｎは２、３、４、５または６である。
【０４３８】
ＰＬＡ残基に続くアミノ酸Ｎ末端は、合成であっても、または天然に存在してもよい。特定の実施形態では、ＰＬＡへと続くＮ末端のアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸である。一部の実施形態では、ＰＬＡへと続くＮ末端アミノ酸は、天然グルカゴンのＮ末端アミノ酸である。例えば、クラス４ペプチドは、配列番号１３５４〜１３５８のいずれかのアミノ酸配列をＮ末端に含んでよく、ＰＬＡはエステル結合によりトレオニンに連結される：
配列番号１３５４  Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号１３５５  Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号１３５６  Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号１３５７  Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号１３５８  Ｔｈｒ−ＰＬＡ
【０４３９】
代替の実施形態では、１つまたは複数のＮ末端アミノ酸は、天然グルカゴンのアミノ酸以外のアミノ酸で置換することができる。例えば、クラス４ペプチドが、ＰＬＡを５または６位のアミノ酸として含む場合、１位および／または２位のアミノ酸は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性を低減させるアミノ酸であり得る。より詳細には、一部の実施形態では、クラス４ペプチドの１位は、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール（ｉｍｉｄｉａｚｏｌｅ）酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジンおよびホモ−ヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸である。より詳細には、一部の実施形態では、アンタゴニストペプチドの２位は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニンおよびアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群から選択されるアミノ酸である。さらに、例えば、クラス４ペプチドが、ＰＬＡをアミノ酸として４、５または６位に含む場合、クラス４ペプチドの３位のアミノ酸は、天然グルカゴンの天然グルタミン残基に相対するグルタミン酸であってよい。本発明の例示的一実施形態では、クラス４ペプチドは、配列番号１３５９〜１３６１のいずれかのアミノ酸配列をＮ末端に含む。
【０４４０】
式ＩＶの化合物を含むクラス４ペプチドに関して、ポリマーは、ＰＬＡのヒドロキシル基と反応可能であることを条件として、任意のポリマーであってよい。ポリマーは、天然または正常に求核試薬を有するカルボニルを含むポリマーであってよい。または、ポリマーは、該カルボニルを有するカルボニルを含むように誘導体化されたポリマーであってよい。ポリマーは、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレンおよび以下を含むこれらの誘導体：ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）およびポリ（オクタデシルアクリレート）を含むアクリル酸およびメタクリル酸エステルのポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリ（ビニルアセテート）およびポリビニルピロリドンを含むポリビニルポリマー、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびこれらのコポリマー、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシ−プロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシルエチルセルロース、セルローストリアセテートおよびセルローススルフェートナトリウム塩を含むセルロース、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（エチレンテレフタレート）を含むポリエチレンならびにポリスチレン、のいずれかの誘導体化ポリマーであってよい。
【０４４１】
ポリマーは、合成生分解性ポリマー（例えば、乳酸およびグリコール酸のポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）（ｐｏｌｙ（ｂｕｔｉｃ  ａｃｉｄ））、ポリ（吉草酸）およびポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクタン））ならびに天然生分解性ポリマー（例えば、アルギネートおよびデキストランおよびセルロースを含む他の多糖、コラーゲン、これらの化学誘導体（化学基、例えば、アルキル、アルキレンの置換、付加、ヒドロキシル化、酸化および当業者により日常的に行われる他の改変）、アルブミンおよび他の親水性タンパク質（例えば、ゼインおよび他のプロラミンならびに疎水性タンパク質））ならびにこれらの任意のコポリマーまたは混合物を含む、生分解性ポリマーであってよい。概して、これらの材料は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて酵素的加水分解または表面または全体の侵食（ｂｕｌｋ  ｅｒｏｓｉｏｎ）による水への曝露のいずれかにより分解する。
【０４４２】
ポリマーは、生体結合性ポリマー、例えば、その教示が本明細書に組み込まれるH. S. Sawhney, C. P. PathakおよびJ. A. Hubbellにより、Macromolecules, 1993, 26, 581-587に記載された生体侵食性ヒドロゲル、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギネート、キトサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）およびポリ（オクタデシルアクリレート）であってよい。
【０４４３】
一部の実施形態では、ポリマーは水溶性ポリマーである。適切な水溶性ポリマーは当分野において公知であり、例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ；Ｋｌｕｃｅｌ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ；Ｍｅｔｈｏｃｅｌ）、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルブチルセルロース、ヒドロキシプロピルペンチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース（Ｅｔｈｏｃｅｌ）、ヒドロキシエチルセルロース、さまざまなアルキルセルロースおよびヒドロキシアルキルセルロース、さまざまなセルロースエーテル、セルロースアセテート、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ビニルアセテート／クロトン酸コポリマー、ポリ−ヒドロキシアルキルメタクリレート、ヒドロキシメチルメタクリレート、メタクリル酸コポリマー、ポリメタクリル酸、ポリメチルメタクリレート、無水マレイン酸／メチルビニルエーテルコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウムおよびポリアクリル酸カルシウム、ポリアクリル酸、酸性カルボキシポリマー、カルボキシポリメチレン、カルボキシビニルポリマー、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー、ポリメチルビニルエーテルｃｏ−無水マレイン酸、カルボキシメチルアミド、カリウムメタクリレートジビニルベンゼンコポリマー、ポリオキシエチレングリコール、ポリエチレンオキシドならびにこれらの誘導体、塩および組合せが挙げられる。
【０４４４】
特定の実施形態では、ポリマーは、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むポリアルキレングリコールである。
炭水化物は、アルファ脱離基を有するカルボニルを含むか、またはこれを含むように作られたことを条件として、任意の炭水化物であってよい。炭水化物は、例えば、アルファ脱離基を有するカルボニルを含むように誘導体化されている炭水化物であってよい。この点から考えて、炭水化物は、単糖（例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース）、二糖（例えば、スクロース、ラクトース、マルトース）、オリゴ糖（例えば、ラフィノース、スタキオース）、多糖（デンプン、アミラーゼ、アミロペクチン、セルロース、キチン、カロース、ラミナリン、キシラン、マンナン、フコイダン、ガラクトマンナンの誘導体化形態であってよい。
【０４４５】
式ＩＶの化合物を含むクラス４ペプチドに関して、脂質は、アルファ脱離基を有するカルボニルを含む任意の脂質であってよい。脂質は、例えば、カルボニルを含むように誘導体化された脂質であってよい。この点から考えて、脂質は、脂肪酸（例えば、Ｃ４−Ｃ３０脂肪酸、エイコサノイド、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン、Ｎ−アシルエタノールアミン）、グリセロ脂質（例えば、モノ−、ジ−、トリ−置換グリセロール）、グリセロリン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン）、スフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴシン、セラミド）、ステロール脂質（例えば、ステロイド、コレステロール）、プレノール脂質（ｐｒｅｎｏｌ  ｌｉｐｉｄ）、糖脂質（ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄ）、またはポリケチドの誘導体であってよい。
【０４４６】
油、ワックス、コレステロール、ステロール、脂溶性ビタミン、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質。
一部の実施形態では、Ｒ７は、約１００ｋＤａ以下、例えば、約９０ｋＤａ以下、約８０ｋＤａ以下、約７０ｋＤａ以下、約６０ｋＤａ以下、約５０ｋＤａ以下、約４０ｋＤａ以下の分子量を有する。したがって、Ｒ７は、約３５ｋＤａ以下、約３０ｋＤａ以下、約２５ｋＤａ以下、約２０ｋＤａ以下、約１５ｋＤａ以下、約１０ｋＤａ以下、約５ｋＤａ以下または約１ｋＤａ以下の分子量を有してもよい。
代替の実施形態では、クラス４ペプチドは、ペプチドの連続する２つのアミノ酸がエステル結合またはエーテル結合により連結されているアミノ酸２から６個のペプチドをＡとして含む。エステル結合またはエーテル結合は、アミノ酸２と３、３と４、４と５または５と６との間であってよい。該ペプチドは、ポリマー（例えば、親水性ポリマー）との連結、アルキル化またはアシル化を含む、別の化学部分との共有結合により、さらに改変されてもよい。
【０４４７】
一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むクラス４ペプチドに関して、Ｂは、例えば、配列番号１３０１の天然グルカゴンのアミノ酸ｉから２６を表し、ｉは３、４、５、６、または７であり、１つまたは複数のアミノ酸改変を含んでもよい。特定の実施形態では、Ｂは、配列番号１３０１のアミノ酸７から２６を表し、さらに改変されてもよい。
一部の実施形態では、Ｂは、３つまでのアミノ酸改変により改変されている。例えば、配列番号１３０１の天然アミノ酸配列を表すＢは、１つまたは複数の保存的アミノ酸改変により改変されている。
別の実施形態では、Ｂは、本明細書に記載の（ｉｖ）から（ｉｘ）からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸改変を含む。特定の実施形態では、Ｂは、アミノ酸改変（ｖ）および（ｖｉ）の一方または両方を含む。さらなる特定の実施形態では、Ｂは、（ｖ）および（ｖｉ）に加えて、（ｉｖ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）および（ｉｘ）からなる群から選択されるアミノ酸改変の１つまたは組合せを含む。
【０４４８】
別の特定の実施形態では、クラス４ペプチドは、１つまたは複数の荷電アミノ酸をＣ末端に含む。例えば、Ｙおよび／またはＺは、荷電アミノ酸、例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＡｓｐおよびＧｌｕであってよい。さらに別の実施形態では、クラス４ペプチドは、Ｚに続いて１から２個のＣ末端荷電アミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＡｓｐおよびＧｌｕ）を含む。特定の態様では、その後に１から２個の荷電アミノ酸が続くＺは、Ｒ１０を含まない。
【０４４９】
一部の実施形態では、クラス４ペプチドは本明細書に記載のクラス４ペプチドのアミノ酸残基に共有結合された親水性部分を含む。例えば、クラス４ペプチドは、配列番号１３０１のナンバリングによる１、１６、２０、２１または２４位のアミノ酸に共有結合により結合している親水性部分を含むことができる。別の実施形態では、親水性部分は、クラス４ペプチドのＣ末端アミノ酸に結合しており、ある場合において、Ｚに続く１または１１個のアミノ酸Ｃ末端である。さらに別の実施形態では、ＡがＰＬＡ、ＰＬＡ−ＰｈｅまたはＰＬＡ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅである場合、親水性部分はＰＬＡに結合しており、ＰＬＡは、親水性部分を含むように改変される。別の実施形態では、親水性部分を含むアミノ酸が、クラス４ペプチドのＮまたはＣ末端に付加される。別の実施形態では、クラス４ペプチドは、本明細書に記載のアシル基またはアルキル基を含む。例えば、アシル化またはアルキル化は、配列番号１３０１のナンバリングによる１０、２０または２４位のアミノ酸の側鎖から離れて起り得る。代替の実施形態では、アシル化またはアルキル化は、クラス４ペプチドのＣ末端アミノ酸の側鎖から離れて起こり、ある場合において、これは、Ｚに続く１または１１個のアミノ酸Ｃ末端である。さらに別の実施形態では、ＡがＰＬＡ、ＰＬＡ−ＰｈｅまたはＰＬＡ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅである場合、ＰＬＡは、アシル基またはアルキル基を含むように改変される。
【０４５０】
例示的実施形態
クラス４ペプチドは、ペプチドの連続する少なくとも２つのアミノ酸がエステル結合またはエーテル結合により連結されていることを条件として、合成または天然に存在する任意のアミノ酸を含み得る。特定の実施形態では、ペプチドは、天然グルカゴンのアミノ酸を含む。例えば、ペプチドは、天然グルカゴン（配列番号１３０１）のｊから６を含んでよく、ｊは１、２、３、４または５である。または、ペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸改変を有する配列番号１３０１のＮ末端に基づくアミノ酸配列を含み得る。１位および／または２位のアミノ酸は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性を低減させるアミノ酸であり得る。例えば、ペプチドは、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール（ｉｍｉｄｉａｚｏｌｅ）酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、ｄｅｓアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジンおよびホモ−ヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸を、クラス４ペプチドの１位に含み得る。より詳細には、一部の実施形態では、アンタゴニストペプチドの２位は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニンおよびアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群から選択されるアミノ酸である。さらに、例えば、クラス４ペプチドの３位のアミノ酸は、天然グルカゴンの天然グルタミン残基に相対するグルタミン酸であってよい。したがって、クラス４ペプチドは、以下のアミノ酸配列を含み得る
Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号１３６８）、
Ｘａａ2−Ｘａａ3−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号１３６９）、または
Ｘａａ3−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号１３７０）
（式中、Ｘａａ1は、Ｈｉｓ、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール（ｉｍｉｄｉａｚｏｌｅ）酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、ｄｅｓアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジンおよびホモ−ヒスチジンからなる群から選択され、Ｘａａ2は、Ｓｅｒ、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニンおよびアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群から選択され、Ｘａａ3はＧｌｎまたはＧｌｕである）
【０４５１】
本発明はまた、クラス４ペプチドのＣ末端アミノ酸が、天然アミノ酸に存在するカルボン酸基を置換したアミド基を有する実施形態を包含する。
【０４５２】
クラス４ペプチドがＰＥＧ化された一部の実施形態では、クラス４ペプチドは、短縮されたグルカゴンペプチド、特に「Ｎ末端」アミノ酸がＰＬＡ（フェニル乳酸）である６〜２９を含む。このようなグルカゴン誘導体は、特有の効能を示す。これらは、天然のＮ末端フェニルアラニンを有するグルカゴン誘導体より強力なペプチドであり、これらは、ペグ化によりもたらされるどのようなグルカゴンアゴニズムをも抑制し、天然のフェニルアラニンでは見られないものである。最終的に、現在の文献は９位の天然アスパラギン酸の置換が、アンタゴニスト活性には必要であることを確立しているが、出願人らは、このような置換が、ＰＬＡ6−（６〜２９）グルカゴン類似体においてはもはや必要ないという驚くべき結果を発見した。
【０４５３】
一部の実施形態では、クラス４ペプチドのアミノ酸は、少なくとも１つのシステイン残基で置換され、システイン残基の側鎖は、例えば、マレイミド、ビニルスルホン、２−ピリジルチオ、ハロアルキルおよびハロアシルを含む、チオール反応試薬によりさらに改変される。これらのチオール反応試薬は、カルボキシ、ケト、ヒドロキシルおよびエーテル基ならびに他の親水性部分、例えば、ポリエチレングリコール単位を含有し得る。代替の実施形態では、クラス４ペプチドのアミノ酸はリシンで置換され、置換するリシン残基の側鎖は、アミン反応試薬、例えば、カルボン酸の活性エステル（スクシンイミド、無水物など）または親水性部分、例えば、ポリエチレングリコールのアルデヒドを使用してさらに改変される。一部の実施形態によれば、天然ペプチドの１２位に対応するリシン残基はアルギニンで置換され、単一のリシン置換が、天然ペプチドの１、１６、１７、２０、２１、２４または２９位に対応するアミノ酸の１つに挿入されるか、またはリシンがクラス４ペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加される。
【０４５４】
別の実施形態では、天然ペプチドの２７位に対応するメチオニン残基がロイシンまたはノルロイシンに変更され、ペプチドの酸化分解が防止される。
【０４５５】
一部の実施形態では、本明細書に記載のクラス４ペプチドは、グルカゴン受容体における活性および／または効力に影響を与えることなく、グルカゴンペプチドのＣ末端の１個または２個のアミノ酸の平滑化または欠失（すなわち、天然グルカゴンの２９位または２８および２９位のアミノ酸の平滑化）によりさらに改変される。この点から考えて、本明細書に記載のクラス４ペプチドは、例えば、天然グルカゴンペプチド（配列番号１３０１）のアミノ酸１〜２７、１〜２８、２〜２７、２〜２８、３〜２７、３〜２８、４〜２７、４〜２８、５〜２７、５〜２８、６〜２７または６〜２８から本質的になる、またはこれらからなり得、１つまたは複数の改変が本明細書に記載のクラス４ペプチドの活性をもたらす。
【０４５６】
現在開示されたクラス４ペプチドはまた、グルカゴンペプチドの機能にとって重要でないことが知られているアミノ酸置換を包含する。一部の実施形態では、置換は、配列番号１３３９の２、５、６、７、８、９、１２、１３、１４、１５、１６、１９、２２、２３または２４からなる群から選択される、１、２または３つの位置における保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態では、クラス４ペプチドは、グルカゴンペプチドが、２、５、６、８、９、１２、１３および１４位から選択される１から３つのアミノ酸位において、配列番号１３４２に対するさらなるアミノ酸置換を含む、配列番号１３４２の誘導体ペプチドを含む。一部の実施形態では、配列番号１３４２の２、５、６、８、９、１２、１３および１４位における置換は、保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態では、天然ペプチドの１６、１７、２０、２１、２４または２９位、およびより詳細には、２１および／または２４位に対応するアミノ酸は、システインまたはリシンで置換され、ＰＥＧ鎖は、置換されたシステインまたはリシン残基に共有結合により結合している。
一部の実施形態によれば、改変されたクラス４ペプチドは、ペプチドに共有結合している２以上のポリエチレングリコール鎖を含み、グルカゴン鎖の全分子量は、約１，０００から約５，０００ダルトンである。一部の実施形態では、ペグ化クラス４ペプチドは、配列番号１３１２および配列番号１３２２からなる群から選択されるペプチドを含み、前記ペプチドは、１１および１９位のアミノ酸と連結されたポリエチレングリコールを含み、２つのＰＥＧ鎖の統合分子量は約１，０００から約５，０００ダルトンである。
【０４５７】
一部の実施形態によれば、以下からなる群から選択される改変グルカゴンペプチドを含むクラス４ペプチドが提供され、
Ｒ1−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ2（配列番号１３０９）、
Ｒ1−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ2（配列番号１３１０）、
Ｒ1−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ2（配列番号１３１１）および
Ｒ1−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ2（配列番号１３１２）、
式中、４位のＸａａ＝アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸またはホモシステイン酸、７位のＸａａ＝ＬｙｓまたはＡｒｇ、１０位のＸａａはアスパラギン酸、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸であり、１１位のＸａａはＳｅｒ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはアセチルフェニルアラニンであり、１６位のＸａａはＡｓｐ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはアセチルフェニルアラニンであり、ならびに１９位のＸａａはＧｌｎ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインおよびアセチルフェニルアラニンであり、２２位のＸａａ＝Ｍｅｔ、ＬｅｕまたはＮｌｅ、Ｒ1はＯＨまたはＮＨ2であり、Ｒ2はＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ2であり、ペプチドは、配列番号１３０９の１１位、配列番号１３１０の１６位、配列番号１３１１の１９位および配列番号１３１２の１６および１９位においてペグ化されており、ただし、４位のＸａａ＝アスパラギン酸の場合は、Ｒ1がＯＨである。一部の実施形態によれば、このペプチドは、配列番号１３０９、配列番号１３１０または配列番号１３１１の配列を含み、Ｒ1はＯＨであり、Ｒ2はＣＯＮＨ2である。一部の実施形態では、ペプチドは、Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＣＯＮＨ2であり、４位のアミノ酸がアスパラギン酸である配列番号１３０９、配列番号１３１０または配列番号１３１１の配列を含み、さらなる実施形態では、このようなペプチドは、配列番号１３１９の配列を含むカルボキシ末端の伸長を含む。
【０４５８】
一部の実施形態によれば、ペプチドは、配列番号１３０９、配列番号１３１０、配列番号１３１３、配列番号１３１４、および配列番号１３１６からなる群から選択される配列を含み、ペプチドは、配列番号１３０９および配列番号１３１３の１１位においてペグ化され、配列番号１３１０の１６位においてペグ化され、ならびに配列番号１３１０および配列番号１３１４の１９位においてペグ化されている。一部の実施形態では、グルカゴンアゴニストは、配列番号１３１３または配列番号１３１４のペプチドを含む。一部の実施形態では、本明細書に開示のクラス４ペプチドのＣ末端アミノ酸は、天然アミノ酸に存在するカルボン酸基の代わりにアミド基を有する。一部の実施形態によれば、クラス４ペプチドは、配列番号１３１８の配列を有する。
【０４５９】
一部の実施形態によれば、血漿タンパク質が、ペプチドのアミノ酸側鎖に共有結合により連結されて、グルカゴンペプチドの溶解度、安定性および／または薬物動態が改善されたクラス４ペプチドが提供される。例えば、血清アルブミンを、本明細書において提示されるクラス４ペプチドに共有結合させることができる。一部の実施形態では、血漿タンパク質は、天然グルカゴンペプチドの１６、１７、２０、２１、２４または２９位に対応するアミノ酸に共有結合される。より詳細には、一部の実施形態では、血漿タンパク質は、天然グルカゴンペプチドの１６または２４位に対応するアミノ酸に結合され、該クラス４ペプチドは、配列番号１３０３、配列番号１３０４、配列番号１３０５、配列番号１３０６、配列番号１３０７、配列番号１３０８、配列番号１３０９、配列番号１３１１、配列番号１３１２、配列番号１３２２、配列番号１３２３、配列番号１３２４、配列番号１３２５、配列番号１３２６、配列番号１３２７、配列番号１３２８、配列番号１３３６および配列番号１３３９の配列を含む。一部の実施形態では、クラス４ペプチドは、配列番号１３０９、配列番号１３１０、配列番号１３１１および配列番号１３１２からなる群から選択されるペプチドを含む。
【０４６０】
一部の実施形態によれば、免疫グロブリン分子のＦｃ部分を表す線形アミノ酸配列が、本明細書に開示のクラス４ペプチドのアミノ酸側鎖に共有結合により連結され、グルカゴンペプチドの溶解度、安定性および／または薬物動態が改善されたクラス４ペプチドが提供される。例えば、免疫グロブリン分子のＦｃ部分を表すアミノ酸配列は、配列番号１３０７、配列番号１３３９のグルカゴンペプチドまたはこれらのグルカゴン類似体の１１、１２、１５、１６、１９、２１または２４位に共有結合させることができる。一部の実施形態では、Ｆｃペプチドは配列番号１３０６、配列番号１３０７、配列番号１３０８または配列番号１３３６のクラス４ペプチドの１１または１９位に共有結合される。Ｆｃ部分は、普通ＩｇＧから単離されるが、いずれの免疫グロブリン由来のＦｃペプチド断片も、同等に機能しなければならない。一部の実施形態では、グルカゴンペプチドは、番号１３０３、配列番号１３０４、配列番号１３０５、配列番号１３０７配列番号１３０８および配列番号１３３９からなる群から選択される配列であり、Ｆｃ部分は、天然グルカゴンペプチドの１６、１７、２０、２１、２４または２９の対応する位置に連結される。一部の実施形態では、クラス４ペプチドは、配列番号１３０９、配列番号１３１０、配列番号１３１１および配列番号１３１２からなる群から選択されるグルカゴンペプチドを含み、Ｆｃペプチドは、それぞれ配列番号１３０９、配列番号１３１０、配列番号１３１１の１１、１６または１９位、ならびに配列番号１３１２の１１および１９位の両方に位置するアミノ酸の側鎖に結合される。
本発明のある特定の実施形態において、クラス４ペプチドは、配列番号１３６２、１３６４〜１３６７および１３７１のいずれかのアミノ酸配列を含む。
【０４６１】
溶解度を改善するための改変
クラス４ペプチドは、一部の態様では、グルカゴンアンタゴニスト活性を保有しながら、生理的ｐＨの水溶液中でのペプチドの溶解度を改善するためにさらに改変することができる。天然ペプチドの１、１６、１７、２０、２１、２４および２９位に対応する位置またはＣ末端における親水性基の導入は、親化合物のアンタゴニスト活性を保有しながら、生理的ｐＨを有する溶液中のクラス４ペプチドの得られた溶解度を改善することができる。したがって、一部の実施形態では、現在開示されているクラス４ペプチドは、天然グルカゴンペプチドの１、１６、１７、２０、２１、２４および２９位のアミノ酸に対応するアミノ酸またはＮ末端もしくはＣ末端アミノ酸の側鎖に共有結合により連結された１つまたは複数の親水性基を含むように、さらに改変される。さらなる実施形態では、天然グルカゴンペプチドの１６および２４位のアミノ酸に対応するアミノ酸の側鎖は、親水性基に共有結合され、一部の実施形態では、親水性基はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【０４６２】
出願人らは、天然グルカゴンが、そのカルボキシ末端に電荷を導入することにより改変され、ペプチドのアゴニスト特性を保有しながら、ペプチドの溶解度を強化し得ることもまた発見している。溶解度の強化は、中性に近いｐＨにおいてグルカゴン溶液の調製および保存を可能にする。相対的中性ｐＨ（例えば、約６．０から約８．０のｐＨ）におけるグルカゴン溶液の製剤化は、クラス４ペプチドの長期保存安定性を改善する。
【０４６３】
再び、出願人らは、本明細書に開示のクラス４ペプチドを同様に改変して、親タンパク質のアンタゴニスト特性を保有しながら、相対的中性ｐＨ（例えば、約６．０から約８．０のｐＨ）における水溶液中のこれらの溶解度を改変することができると予想する。したがって、本発明の一部の実施形態は、野生型グルカゴン（配列番号１３０１）の６〜２９位に存在する天然アミノ酸をさらに改変して、天然の非荷電アミノ酸を荷電アミノ酸に置換する、または荷電アミノ酸をカルボキシ末端に付加することによって、ペプチドに電荷を加えている配列番号１３３９のクラス４ペプチドを対象とする。一部の実施形態によれば、配列番号１３３９のクラス４ペプチドの１つから３つの非荷電天然アミノ酸が、荷電アミノ酸で置き換えられる。一部の実施形態では、荷電アミノ酸は、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択される。より詳細には、出願人らは、天然グルカゴンの２８および／または２９位に対応する、正常に存在するアミノ酸の荷電アミノ酸での置換、および／またはクラス４ペプチドのカルボキシ末端における１つまたは２つの荷電アミノ酸の付加が、生理学的に適切なｐＨ（すなわち、約６．５から約７．５のｐＨ）の水溶液中でのクラス４ペプチドの溶解度および安定性を強化することを発見している。したがって、本明細書に開示のクラス４ペプチドのこのような改変は、親ペプチドの生物活性を保有しながら、特に約５．５から約８．０の範囲のｐＨの水溶液中での溶解度に対して同様の効果を有することが予想される。
【０４６４】
一部の実施形態によれば、配列番号１３３９のクラス４ペプチドは、天然グルカゴンの２８および／または２９位に対応する天然アミノ酸の、負に荷電したアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）での置換により改変され、ペプチドのカルボキシ末端への負に荷電したアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）の付加により改変されてもよい。代替の実施形態では、配列番号１３３９のクラス４ペプチドは、天然グルカゴンの２９位に対応する天然アミノ酸の、１つまたは２つの正に荷電したアミノ酸（例えば、リシン、アルギニンまたはヒスチジン）での置換により改変され、ペプチドのカルボキシ末端への正に荷電したアミノ酸（例えば、リシン、アルギニンまたはヒスチジン）の付加により改変されてもよい。一部の実施形態によれば、溶解度および安定性が改善されたクラス４ペプチドが提供され、該ペプチドは、配列番号１３４１の２３または２４位の少なくとも１つのアミノ酸が、酸性アミノ酸で置換される、および／またはさらなる酸性アミノ酸が、配列番号１３４１のカルボキシ末端に付加されることを条件として、配列番号１３４１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、酸性アミノ酸は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸およびホモシステイン酸からなる群から独立して選択される。
【０４６５】
一部の実施形態によれば、溶解度および安定性が改変されたクラス４ペプチドが提供され、該アンタゴニストは、配列番号１３４１、配列番号１３４２、配列番号１３４３または配列番号１３４４のアミノ酸配列を含み、２３または２４位のアミノ酸の少なくとも１つが、非天然アミノ酸残基で置換される（すなわち、類似体の２３または２４位に存在する少なくとも１つのアミノ酸は、配列番号１３０７の対応する位置に存在するアミノ酸とは異なる酸性アミノ酸である）。一部の実施形態によれば、２３位のアミノ酸がアスパラギンであり、２４位のアミノ酸がトレオニンである場合、該ペプチドが、クラス４ペプチドのカルボキシ末端に加えて、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕからなる群から独立して選択される１つから２つのアミノ酸をさらに含むことを条件として、配列番号１３４１または１３４２の配列を含むグルカゴンアゴニストが提供される。
【０４６６】
別の実施形態では、配列番号１３４２のクラス４ペプチドの溶解度は、親水性部分を１１、１２、１５、１６、１９または２４位のアミノ酸残基と共有結合により連結することによって改善でき、一部の実施形態では、親水性部分は、１１、１６または１９位のアミノ酸と連結され、さらなる実施形態では、親水性部分は、１９位のアミノ酸と連結される。一部の実施形態では、親水性部分は、血漿タンパク質または免疫グロブリンのＦｃ部分であり、代替の実施形態では、親水性部分は親水性炭化水素鎖である。一部の実施形態では、親水性部分は、約１，０００から約５，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有するポリエチレングリコールである。別の実施形態では、親水性部分は、少なくとも約２０，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールである。一部の実施形態では、ポリエチレンにより改変されたクラス４ペプチドは、配列番号１３０９、配列番号１３１０、配列番号１３１１、配列番号１３１２、配列番号１３４３、配列番号１３４４または配列番号１３４５のアミノ酸配列を含む。
【０４６７】
安定性を改善するための改変
天然グルカゴンの１５−１６位のＡｓｐ−Ｓｅｒ配列は、水性バッファー中で天然ホルモンの中途の化学的切断をもたらす独特な不安定ジペプチドとして同定されている。例えば、０．０１Ｎ  ＨＣｌに３７℃において２週間維持した場合、天然グルカゴンの５０％より多くが断片に切断される恐れがある。２つの遊離された切断ペプチド１〜１５と１６〜２９とは、グルカゴン様生物活性が欠けており、したがってグルカゴンおよびその関連類似体の水性の予備製剤化の制限を意味する。天然グルカゴンペプチドの１５位のＡｓｐのＧｌｕによる選択的化学置換が、１５〜１６のペプチド結合の化学切断を実質的に除去することが観察されている。
【０４６８】
したがって、本発明のクラス４ペプチドが、水性バッファーにおける中途の化学切断に対するこれらの感受性を低減するように同様に改変され得ることが期待される。一部の実施形態によれば、本明細書に記載のクラス４ペプチドは、天然グルカゴンペプチドの１５位に位置する天然アスパラギンアミノ酸を、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなる群から選択されるアミノ酸で置き換えることによって、水溶液中でのこれらの安定性を強化するようにさらに改変することができる。一部の実施形態によれば、配列番号１３３９のクラス４ペプチドの１０位のアスパラギン酸残基は、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換することができ、一部の実施形態では、配列番号１３３９の１０位の天然アスパラギン酸はグルタミン酸で置き換えられる。一部の実施形態によれば、水溶液中での安定性が改善されたクラス４ペプチドが提供され、該アンタゴニストは、配列番号１３３６、配列番号１３４０および配列番号１３４２からなる群から選択される配列を含む。さらなる実施形態では、クラス４ペプチドはアミド化される。
【０４６９】
一部の実施形態によれば、本明細書に記載のクラス４ペプチドの分解を低減することによる安定性の増加は、１６位（天然グルカゴンのナンバリングによる）のセリンの、グルタミン酸、システイン酸、ホモ−グルタミン酸，またはホモ−システイン酸での置換によって達成することもできる。特定の実施形態では、１６位（天然グルカゴンの配列ナンバリングによる）のセリンは、グルタミン酸で置き換えられる。より詳細な態様では、このような改変を含むクラス４ペプチドは、Ｃ末端カルボキシレートを含み、アミド化されない。
【０４７０】
一部の実施形態によれば、天然グルカゴンペプチドの１１、１２、１５、１６、１９および／または２４位に対応する位置における１つまたは２つのさらなるアミノ酸置換によりさらに改変された、配列番号１３０７、配列番号１３３６、配列番号１３３９、配列番号１３４０、配列番号１３４１、配列番号１３４２、配列番号１３４３および配列番号１３４４からなる群から選択されるグルカゴンペプチドを含むクラス４ペプチドが提供され、アミノ酸置換は、例えばＰＥＧを含む親水性部分との架橋に適切な側鎖を有するアミノ酸との置換を含む。該ペプチドは、天然に存在するアミノ酸または合成（非天然存在）アミノ酸で置換することができる。合成または非天然存在アミノ酸は、ｉｎ  ｖｉｖｏに天然に存在しないが、それにもかかわらず、本明細書に記載のペプチド構造に組み込むことができるアミノ酸を指す。一部の実施形態では、ペプチドが、配列番号１３０７、配列番号１３３６、配列番号１３３９、配列番号１３４０、配列番号１３４１、配列番号１３４２、配列番号１３４３および配列番号１３４４の配列を含み、天然グルカゴンペプチドの２１または２４位に対応する位置に結合されたポリエチレングリコール鎖をさらに含む、クラス４ペプチドが提供される。さらなる実施形態では、クラス４ペプチドのＣ末端は、カルボン酸基がアミド基で置き換えられるように改変される。
【０４７１】
融合ペプチドおよびコンジュゲート
本開示は、クラス４ペプチド融合ペプチドをさらに包含し、第２のペプチドは、クラス４ペプチドのＣ末端に融合されている。より詳細には、融合ペプチドは、クラス４ペプチドのＣ末端アミノ酸に連結された配列番号１３１９（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号１３２０（Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ａｌａ）または配列番号１３２１（Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｒｇ）のアミノ酸配列をさらに含む、配列番号１３４４のクラス４ペプチドペプチドを含み得る。一部の実施形態では、配列番号１３１９（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）のアミノ酸配列は、配列番号１３４２のクラス４ペプチドアミノ酸２４にペプチド結合を介して結合される。別の実施形態では、融合ペプチドは、クラス４ペプチドのアミノ酸２４に連結された配列番号１３１９（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）のアミノ酸配列をさらに含む、配列番号１３０７、配列番号１３３６、配列番号１３３９、配列番号１３４０、配列番号１３４１または配列番号１３４３のクラス４ペプチドペプチドを含む。別の実施形態では、融合ペプチドは、クラス４ペプチドのアミノ酸２４に連結された配列番号１３２０、配列番号１３２１または配列番号１３５３のアミノ酸配列をさらに含む、配列番号１３０７、配列番号１３３６、配列番号１３３７、配列番号１３３８、配列番号１３３９、配列番号１３４１または配列番号１３４３のクラス４ペプチドペプチドを含む。一部の実施形態では、クラス４ペプチド融合ペプチドは、配列番号１３４６および配列番号１３４７からなる群から選択される配列を含む。さらなる実施形態では、融合ペプチドのＣ末端は、カルボン酸基をアミド基で置き換えるように改変される。
【０４７２】
一部の実施形態では、クラス４ペプチド融合ペプチドが提供され、融合ペプチドのクラス４ペプチド部分は、配列番号１３０３、配列番号１３０４、配列番号１３０５、配列番号１３０６、配列番号１３０７、配列番号１３０８、配列番号１３０９、配列番号１３１１、配列番号１３１２、配列番号１３１３、配列番号１３１４、配列番号１３１５、配列番号１３１０、配列番号１３１６、配列番号１３１７、配列番号１３１８および配列番号１３３９からなる群から選択され、配列番号１３１９の配列は、クラス４ペプチド部分のカルボキシ末端に融合され、存在する場合、ＰＥＧ鎖は５００から４０，０００ダルトンの範囲から選択される。より詳細には、一部の実施形態では、クラス４ペプチドセグメントは、配列番号１３１３、配列番号１３１４、配列番号１３１５、配列番号１３１６、配列番号１３４６および配列番号１３４７からなる群から選択され、ＰＥＧ鎖は、約５００から約５，０００ダルトンの範囲から選択され、より詳細には、一部の実施形態では、ＰＥＧ鎖は約１，０００ダルトンである。さらなる実施形態では、Ｃ末端は、カルボン酸基をアミド基で置き換えるように改変される。
【０４７３】
クラス４ペプチドは、カルボキシ末端に付加された１つから２つの荷電アミノ酸をさらに含んでよい。１つまたは２つの荷電アミノ酸が、配列番号１３４４のカルボキシ末端に付加される一部の実施形態では、アミノ酸は負に荷電したアミノ酸であり、例えば、グルタミン酸およびアスパラギン酸を含む。一部の実施形態では、クラス４ペプチドは、配列番号１３４２の配列を含み、天然グルカゴンペプチドの２７および２８位に対応する少なくとも１つは、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸を含み、配列番号１３４２は、カルボキシ末端に付加された１つから２つの負に荷電したアミノ酸を含むように改変されてもよい。一部の実施形態では、負に荷電したアミノ酸はグルタミン酸またはアスパラギン酸である。
【０４７４】
本明細書に開示のクラス４ペプチドは、過剰なグルカゴン活性により特徴付けられる疾患または状態を処置するために、例えばインスリンを含む他の活性剤と組み合わせることができる。一部の実施形態では、１０，０００ダルトンを超える分子量を有するＰＥＧ鎖に共有結合されるように改変されているクラス４ペプチドは、糖尿病において安定した血糖レベルの維持を助けるために、インスリンと併せて投与することができる。本開示のクラス４ペプチドは、単一組成物としてインスリンと同時投与されても、別々の溶液として同時に投与されてもよく、またはインスリンおよびクラス４ペプチドは、互いに異なる時間に投与されてもよい。一部の実施形態では、インスリンを含む組成物およびクラス４ペプチドを含む組成物は、互いに１２時間以内に投与される。クラス４ペプチドと、投与されるインスリンとの正確な比率は、患者のグルカゴンレベルの決定に一部依存し、日常の実験を介して決定することができる。
【０４７５】
二量体ペプチド
本開示はまた、本明細書に開示の改変クラス４ペプチドの多量体もまた包含する。２以上の改変クラス４ペプチドを、当業者に公知の標準的な連結剤および手順を使用して一緒に連結することができる。例えば、二量体は、特に、（例えば、１１、１６または１９位において）システイン、リシン  オルニチン、ホモシステインまたはアセチルフェニルアラニン残基で置換されたクラス４ペプチド（例えば、配列番号１３０９、配列番号１３１０、配列番号１３１１および配列番号１３１２）に対して、二官能性チオール架橋剤および二官能性アミン架橋剤の使用を介して２つの改変クラス４ペプチドの間に形成され得る。二量体は、ホモ二量体であってもよく、またはヘテロ二量体であってもよい。一部の実施形態では、二量体は、配列番号１３０８、配列番号１３０９、配列番号１３１０、配列番号１３１１、配列番号１３１２、配列番号１３４５、配列番号１３４６または配列番号１３４７からなる群から独立して選択される２つのクラス４ペプチドの間に形成され、２つのペプチドは、各ペプチドの１１位、各ペプチドの１６位もしくは各ペプチドの１９位またはこれらの任意の組合せに結合するリンカーを介して互いに連結される。一部の実施形態では、連結は、それぞれのクラス４ペプチドペプチドのＣｙｓ１１とＣｙｓ１１またはＣｙｓ１９とＣｙｓ１９またはＣｙｓ１１とＣｙｓ１９残基との間のジスルフィド連結である。
【０４７６】
同様に、二量体は、配列番号１３０３、配列番号１３０４、配列番号１３０５、配列番号１３０６、配列番号１３０７、配列番号１３０８、配列番号１３０９、配列番号１３１０、配列番号１３１１、配列番号１３１２、配列番号１３３６、配列番号１３３７、配列番号１３３８、配列番号１３３９および配列番号１３４２からなる群から独立して選択される２つのクラス４ペプチドペプチドの間に形成することができ、連結は、天然グルカゴンペプチドに関する１６、２１および２４位から独立して選択されるアミノ酸位の間に連結される。
一部の実施形態によれば、２つのクラス４ペプチドを含み、それぞれが１３４６の配列を含み、２つのアンタゴニストが、アミノ酸位２５を介してジスルフィド結合により互いに連結されるクラス４ペプチド二量体が提供される。別の実施形態では、２つのクラス４ペプチドを含み、それぞれが１３４７の配列を含み、２つのアンタゴニストが、アミノ酸位３５を介してジスルフィド結合により互いに連結されるクラス４ペプチド二量体が提供される。一部の実施形態では、二量体は、配列番号１３４６および配列番号１３４７のクラス４ペプチドから形成され、１０位のアミノ酸がグルタミン酸である。
【０４７７】
一部の実施形態では、二量体は、配列番号１３０７、配列番号１３０８、配列番号１３３６、配列番号１３３７、配列番号１３４０、配列番号１３３９、番号１３４０、配列番号１３４１、配列番号１３４２および前記クラス４ペプチドの薬学的に許容される塩からなる群から選択されるクラス４ペプチド融合ペプチドのホモ二量体を含む。一部の実施形態によれば、第１のクラス４ペプチドがリンカーを介して第２のクラス４ペプチドと結合した二量体が提供され、二量体の第１および第２のペプチドが、配列番号１３０７、配列番号１３０８、配列番号１３３６、配列番号１３３７、配列番号１３３９、配列番号１３４０、配列番号１３４１および配列番号１３４２ならびに前記グルカゴンポリペプチドの薬学的に許容される塩からなる群から独立して選択される。別の実施形態では、二量体の１および第２のクラス４ペプチドは、配列番号１３０７、配列番号１３０８、配列番号１３３６および配列番号１３３９からなる群から独立して選択される。
【０４７８】
別の実施形態では、二量体は、配列番号１３２３、配列番号１３２４、配列番号１３２５、配列番号１３２６、配列番号１３２７、配列番号１３２８、配列番号１３２９、配列番号１３３０、配列番号１３３１からなる群から選択されるクラス４ペプチドのホモ二量体を含む。別の実施形態では、二量体の第１および第２のペプチドが、配列番号１３２３、配列番号１３２４、配列番号１３２５、配列番号１３２６、配列番号１３２７および配列番号１３２８からなる群から独立して選択されるアミノ酸配列を含むクラス４ペプチド二量体が提供される。別の実施形態では、二量体は、配列番号１３０９、配列番号１３１１および配列番号１３１２からなる群から選択されるクラス４ペプチドのホモ二量体を含み、該ペプチドは、グルカゴンペプチドの１１または１９位に共有結合されたポリエチレングリコール鎖をさらに含む。
クラス４グルカゴン関連ペプチドは、配列番号１３０１〜１３７１のいずれかのアミノ酸配列を含むことができ、グルカゴンアンタゴニスト活性を保有する、１、２、３、４または５つまでのさらなる改変を含んでもよい。
【０４７９】
クラス５グルカゴン関連ペプチド
ある特定の実施形態において、グルカゴン関連ペプチドは、クラス５グルカゴン関連ペプチドである（例えば国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１３３３を参照のこと、その全体を参照により本明細書に組み込む）。
以下の項（配列番号１４０１〜１５１８）で参照されるすべての生物学的配列は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１３３３の配列番号１〜１１８に対応する。
【０４８０】
活性
ある特定の態様において、クラス５グルカゴン関連ペプチド（この後、「クラス５ペプチド」と称する）は、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストであることができる。グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、グルカゴン作動性の抑制が求められ、同時にＧＬＰ−１活性の同時刺激も求められる任意の設定に利用される。例えば、高血糖の前臨床モデルにおいてグルカゴン拮抗作用が、血糖の低下をもたらすことが実証されたＧＬＰ−１刺激と連動するグルカゴンアンタゴニスト活性は、糖尿病の治療に使用することができ、ＧＬＰ−１活性はインスリン産生と関連している。ＧＬＰ−１活性を実証する化合物が、肥満を治療し、体重増加を予防するのに有用であることも公知であった。
【０４８１】
ある特定の態様において、クラス５ペプチドは、他のグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストについてこれまでに記載されてきた任意の使用に適合していると考えられる。これらの２つの活性は、メタボリックシンドローム、特に糖尿病および肥満の治療にとって非常に望ましい特性であることが別々に示された。グルカゴンアンタゴニスト活性は、グルカゴン作動性の抑制が求められる任意の設定において有用である。ＧＬＰ−１作動性が存在することにより、膵臓からのグルカゴンの内在的分泌がさらに抑制され、一方でインスリンの合成および分泌が刺激される。２つの薬理作用は、相乗的な様式で機能して、代謝異常を正常化する。したがって、クラス５ペプチドを使用して高血糖を治療する、またはグルカゴンの高い血中レベルもしくは高血糖レベルに起因する他の代謝疾患を治療することができる。一部の実施形態によると、本明細書に開示するクラス５ペプチドなどグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストを使用して治療すべき患者は、家畜であり、別の実施形態において、治療すべき患者はヒトである。研究から、糖尿病患者におけるグルカゴン抑制の欠如が、一部には、グリコーゲン分解の加速による食後の高血糖を助長することが示唆されている。経口的ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）における、およびソマトスタチン誘導グルカゴン抑制の有無での血糖分析は、高グルカゴンレベルの対象におけるグルコースの有意な増加を示した。したがって、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストもしくは本明細書に記載されるクラス５ペプチドを使用して高血糖を治療することができ、Ｉ型真性糖尿病、ＩＩ型真性糖尿病または妊娠糖尿病を含めた様々な型のインスリン依存性もしくはインスリン非依存性のいずれかの糖尿病を治療し、腎症、網膜症および血管系疾患を含めた糖尿病の合併症を減少させるのに有用であると期待される。
【０４８２】
食欲を低下させるか、または体重減少を促進するためのそのような方法は、体重の低下、体重増加の防止、または薬物誘導性肥満など様々な原因の肥満の処置、ならびに血管疾患（冠動脈疾患、脳卒中、末梢血管疾患、虚血再かん流など）、高血圧、ＩＩ型糖尿病の開始、高脂血症および骨格筋疾患などの肥満と関連する合併症の減少において有用であると期待される。
クラス５ペプチドを含む医薬組成物は、当業者に公知の標準的な薬学的に許容される担体および投与経路を使用して製剤化され、患者に投与できる。したがって、本開示は、本明細書に開示する１つまたは複数のクラス５ペプチドを薬学的に許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物も包含する。医薬組成物は、唯一の薬学的活性成分としてクラス５ペプチドを含むことができ、またはクラス５ペプチドは１つまたは複数の追加の活性薬剤と併用することができる。一部の実施形態によると、クラス５ペプチドおよびインスリンまたはインスリン類似体を含む組成物が提供される。別法として、体重減少を誘導するまたは体重増加を予防するための組成物が提供され、配列番号１４１５もしくは配列番号１４５１の配列を含み、配列番号１４１５もしくは配列番号１４５１のアミノ酸２４に連結された配列番号１４２１（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）もしくは配列番号１４５０のアミノ酸配列、および抗肥満ペプチドをさらに含む組成物が提供され得る。適切な抗肥満ペプチドは、米国特許第５，６９１，３０９号、第６，４３６，４３５号または米国特許出願第２００５０１７６６４３号に開示される抗肥満ペプチドを含む。
【０４８３】
クラス５ペプチド構造
一部の実施形態によると、Ｎ末端から最初の１〜５個のアミノ酸残基（例えば、最初の１個のアミノ酸、最初の２個のアミノ酸、最初の３個のアミノ酸、最初の４個のアミノ酸、最初の５個のアミノ酸）の欠失、ならびに化合物のＣ末端部分にあるアルファヘリックス構造（野生型グルカゴン、配列番号１４０１のアミノ酸ナンバリングによっておよそアミノ酸１２〜２９位）の安定化によって、例えば、水素結合もしくは塩橋の形成などイオン相互作用によって、または共有結合による１２位と１６位、１６位と２０位、２０位と２４位および２４位と２８位（天然グルカゴンペプチド配列と比較して）から選択されるアミノ酸対の側鎖の互いの結合によって修飾されたグルカゴンペプチドを含むクラス５ペプチドが提供される。別法として、残基およそ１２〜２９のアルファヘリックスの安定化は、所望の活性を保持する位置での１つまたは複数のアルファ，アルファ二置換アミノ酸の導入によって実現される。一部の実施形態において、クラス５ペプチドまたはその類似体の１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４もしくは２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）のうち１、２、３、４個もしくはより多くは、アルファ，アルファ二置換アミノ酸で置換される。例えば、クラス５ペプチドまたはその類似体の１６位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）のアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）での置換は、塩橋もしくはラクタムの非存在下で安定化されたアルファヘリックスをもたらす。一部の実施形態において、１６、２０、２１または２４位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）のうち１、２、３つもしくはより多くが、ＡＩＢで置換される。
【０４８４】
一部の実施形態によると、クラス５ペプチドが提供され、ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対して天然ＧＬＰ−１により達成される最大作動性の少なくとも８０％を呈し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおけるｃＡＭＰ産生によって測定するグルカゴン受容体に対する最大のグルカゴン誘導ｃＡＭＰ産生を少なくとも約５０％まで減少させるグルカゴンアンタゴニスト活性を呈する。一部の実施形態において、クラス５ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも９０％を呈し、グルカゴン受容体に対する最大のグルカゴン誘導ｃＡＭＰ産生を少なくとも約８０％まで減少させるグルカゴンアンタゴニスト活性を呈する。
【０４８５】
一部の実施形態によると、クラス５ペプチドは、配列番号１４０２の誘導体ペプチドを含み、ペプチドは、１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１９、２２および２４位から選択される１〜３つのアミノ酸位置で配列番号１４０２と比較してさらなるアミノ酸置換を含み、ＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも９０％を呈し、グルカゴン受容体に対する最大のグルカゴン誘導ｃＡＭＰ産生を少なくとも約８０％まで減少させるグルカゴンアンタゴニスト活性を呈する。
【０４８６】
一部の実施形態において、クラス５ペプチドのＣ末端部分にあるアルファヘリックス構造（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによっておよそアミノ酸１２〜２９）は、例えば共有結合もしくは非共有結合による分子内架橋の形成、またはアルファヘリックス安定化アミノ酸（例えば、アルファ，アルファ二置換アミノ酸）でのおよそアミノ酸１２〜２９位の置換および／もしくは挿入によって安定化される。一部の実施形態において、クラス５ペプチドもしくはその類似体の１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４または２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）のうち１、２、３、４つまたはより多くは、アルファ，アルファ二置換アミノ酸、例えば、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）で置換される。例えば、クラス５ペプチドまたはその類似体の１６位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）のアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）での置換は、塩橋もしくはラクタムの非存在下で安定化されたアルファヘリックスをもたらす。
【０４８７】
一部の実施形態において、クラス５ペプチドは、配列番号１４１５または配列番号１４５１、より具体的には、配列番号１４０５、配列番号１４０６、配列番号１４０７、配列番号１４０８、配列番号１４０９、配列番号１４１６、配列番号１４１７、配列番号１４１８、配列番号１４１９、配列番号１４２２、配列番号１４２３、配列番号１４２４および配列番号１４２５からなる群から選択される配列を含む。さらなる実施形態において、クラス５ペプチドは、配列番号１４１５または配列番号１４５１の誘導体ペプチドを含み、ペプチドは、１、２、５、６、８、９、１２、１３および１４位から選択される１〜３つのアミノ酸位置で配列番号１４１５または配列番号１４５１と比較してさらなるアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、１、２、５、６、８、９、１２、１３および１４位における置換は、保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態において、配列番号１４０５または配列番号１４０６の２４位のトレオニンは、グリシンで置換される。
【０４８８】
一部の実施形態によると、クラス５ペプチドは、ペプチドのさらなる改変を表し、Ｎ末端欠失に加えて、天然グルカゴンペプチドの６位のフェニルアラニンが修飾されて、例えば、Ｎ末端アミノ基の代わりに水酸基を含む。さらなる実施形態において、Ｃ末端アミノ酸の天然のカルボン酸は、アミドまたはエステルなど電荷中性基で置き換えられる。
一部の実施形態によると、クラス５ペプチドが調製され、天然グルカゴンの最初の３〜５個のアミノ酸が欠失され、天然グルカゴンペプチドと比較して９位のアミノ酸が、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、システインのスルホン酸誘導体、または以下の構造を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体
【０４８９】
【化３３】
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（式中、Ｘ5はＣ1−Ｃ4アルキル、Ｃ2−Ｃ4アルケニル、またはＣ2−Ｃ4アルキニルである）からなる群から選択されるアミノ酸で置換され、グルカゴンのＣ末端部分におけるアルファヘリックス構造（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによっておよそアミノ酸１２〜２９）は、例えば、天然グルカゴンペプチドと比較してアミノ酸１２と１６またはアミノ酸１６と２０の側鎖間でラクタム架橋が形成されることにより安定化される。共有結合して原子７個の連結架橋を形成することができるアミノ酸対の例が、この開示の全体を通じて詳述される。一部の実施形態において、システインのスルホン酸誘導体は、システイン酸またはホモシステイン酸である。
【０４９０】
一部の実施形態において、配列番号１４０５、配列番号１４０６、配列番号１４０７および配列番号１４０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むクラス５が提供され、前記ペプチドは、配列番号１４０５のアミノ酸７と１１、配列番号１４０６の１１と１５、配列番号１４０７の１５位と１９位、および配列番号１４０８の１９位と２４位の側鎖間で形成されるラクタム環を含み、前記配列のそれぞれはさらに修飾されて、ペプチドに共有結合した親水性部分を含む。より具体的には、一部の実施形態において、クラス５ペプチドを有するラクタムのそれぞれは、ポリエチレングリコール鎖の共有結合によって修飾される。例えば、配列番号１４０５を含むクラス５ペプチドの場合、ペプチドは、１２、１５、１６、１９および２４からなる群から選択される位置でペグ化され；配列番号１４０６を含むクラス５ペプチドの場合、ペプチドは、１２、１６、１９および２４からなる群から選択される位置でペグ化され；配列番号１４０７を含むクラス５ペプチドの場合、ペプチドは、１１、１２、１６および２４からなる群から選択される位置でペグ化され；配列番号１４０８を含むクラス５ペプチドの場合、ペプチドは、１１、１２、１５および１６からなる群から選択される位置でペグ化される。一部の実施形態によると、配列番号１４４７または配列番号１４４８を含むクラス５ペプチドが提供され、ペプチドは、配列番号１４４７もしくは配列番号１４４８配列と比較して１２、１６、１９および２４からなる群から選択される位置でペグ化される。さらなる実施形態において、配列番号１４４７または配列番号１４４８のペプチドは、ペプチドのカルボキシ末端への配列番号１４２１の配列の付加によりさらに修飾される。
【０４９１】
ある特定の態様において上で詳述するように、クラス５ペプチドが提供され、天然グルカゴンの最初の５つのアミノ酸が欠失しており、Ｎ末端アミノ酸（フェニルアラニン）のアミノ基が水酸基で置き換えられており（すなわち、第１のアミノ酸は、フェニル乳酸である）、１２と１６、１６と２０、２０と２４および２４と２８位から選択される１つまたは複数のアミノ酸対の側鎖が互いに連結され、したがってクラス５ペプチドアルファヘリックスが安定化される。
【０４９２】
一部の実施形態によると、配列番号１４０２の１１位（天然グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによって１６位）のセリン残基の、グルタミン酸、グルタミン、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、トレオニンまたはグリシンからなる群から選択されるアミノ酸での置換によって修飾される配列番号１４０２の配列を含むクラス５ペプチドが提供される。一部の実施形態によると、配列番号１４０２の１１位のセリン残基は、グルタミン酸、グルタミン、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換され、一部の実施形態においてセリン残基はグルタミン酸で置換される。一部の実施形態によると、クラス５ペプチドは、配列番号１４３８の配列を含む。
【０４９３】
一部の実施形態において、クラス５ペプチドが提供され、２つのアミノ酸側鎖間で分子内架橋が形成されて、配列番号１４０２のペプチドのカルボキシ末端の三次元構造が安定化される。より具体的には、配列番号１４０２のアミノ酸対７と１１、１１と１５、１５と１９または１９と２３から選択される１つまたは複数のアミノ酸の側鎖が互いに連結され、したがってＣ末端部分にあるアルファヘリックスが安定化される。２つの側鎖は、水素結合、イオン相互作用（塩橋の形成など）によって、または共有結合によって互いに連結できる。一部の実施形態によると、リンカーのサイズは、原子７〜９個であり、一部の実施形態において、リンカーのサイズは原子８個である。一部の実施形態において、クラス５ペプチドは、配列番号１４０５、配列番号１４０６、配列番号１４０７および配列番号１４０８からなる群から選択される。一部の実施形態において、クラス５ペプチドのＣ末端アミノ酸は、天然アミノ酸に存在するカルボン酸基と置換したアミド基を有する。
【０４９４】
一部の実施形態によると、クラス５ペプチドが提供され、類似体は配列番号１４０９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ペプチドの側鎖間の共有結合の形成によって、配列番号１４０９のペプチドのカルボキシ末端の三次元構造が安定化される。一部の実施形態において、２つのアミノ酸側鎖が互いに結合されて、ラクタム環を形成する。ラクタム環のサイズは、アミノ酸側鎖の長さに応じて変化し得、一部の実施形態において、ラクタムは、リシンアミノ酸の側鎖をグルタミン酸側鎖に連結することによって形成される。一部の実施形態において、クラス５ペプチドのＣ末端アミノ酸は、天然アミノ酸に存在するカルボン酸基と置換したアミド基を有する。
【０４９５】
ラクタム環におけるアミド結合の順序は、逆転することができる（例えば、ラクタム環は、Ｌｙｓ１２とＧｌｕ１６または別法としてＧｌｕ１２とＬｙｓ１６の側鎖間で形成することができる）。一部の実施形態によると、配列番号１４０９のグルカゴン類似体が提供され、少なくとも１つのラクタム環が、配列番号１４０９のアミノ酸対７と１１、１１と１５、１５と１９または１９と２３からなる群から選択されるアミノ酸対の側鎖間で形成される。一部の実施形態において、クラス５ペプチドが提供され、ペプチドは、配列番号１４１０の配列を含み、前記配列は、配列番号１４１０のアミノ酸７位と１１位の間、またはアミノ酸１１位と１５位の間、またはアミノ酸１５位と１９位の間で形成される分子内ラクタム架橋をさらに含む。一部の実施形態において、クラス５ペプチドが提供され、ペプチドは、配列番号１４１１の配列を含み、前記配列は、配列番号１４１１のアミノ酸７位と１１位の間、またはアミノ酸１１位と１５位の間で形成される分子内ラクタム架橋をさらに含む。一部の実施形態において、クラス５ペプチドは、配列番号１４１７の配列を含む。
【０４９６】
配列番号１４０５の誘導体を含む追加のクラス５ペプチドが提供され、配列番号１４０５の１０位（天然グルカゴンの１５位）のアスパラギン酸は、グルタミン酸、以下の一般構造のアミノ酸：
【０４９７】
【化３４】
2016521253.tif 000036
（式中、Ｘ6はＣ1−Ｃ3アルキル、Ｃ2−Ｃ3アルケンまたはＣ2−Ｃ3アルキニルであり、一部の実施形態においてＸ6はＣ1−Ｃ3アルキルであり、別の実施形態においてＸ6はＣ2アルキルである）により置換されている。一部の実施形態において、配列番号１４０９のクラス５ペプチド誘導体が提供され、配列番号１４０９の１０位（天然グルカゴンの１５位）は、グルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸およびホモグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。さらなる実施形態において、配列番号１４０９の１０位は、システイン酸またはホモシステイン酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。一部の実施形態において、配列番号１４０６、配列番号１４０７または配列番号１４０８のクラス５ペプチド誘導体が提供され、配列番号１４０６、配列番号１４０７または配列番号１４０８の１０位は、グルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸およびホモグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。一部の実施形態において、クラス５ペプチドのＣ末端アミノ酸は、天然アミノ酸に存在するカルボン酸基と置換したアミド基を有する。
【０４９８】
一部の実施形態では、クラス５ペプチドのアミノ酸は、少なくとも１つのシステイン残基で置換され、システイン残基の側鎖は、例えば、マレイミド、ビニルスルホン、２−ピリジルチオ、ハロアルキルおよびハロアシルを含む、チオール反応試薬によりさらに改変される。これらのチオール反応試薬は、カルボキシ、ケト、ヒドロキシルおよびエーテル基ならびに他の親水性部分、例えば、ポリエチレングリコール単位を含有し得る。代替の実施形態では、クラス５ペプチドのアミノ酸はリシンで置換され、置換するリシン残基の側鎖は、アミン反応試薬、例えば、カルボン酸の活性エステル（スクシンイミド、無水物など）または親水性部分、例えば、ポリエチレングリコールのアルデヒドを使用してさらに改変される。一部の実施形態によれば、配列番号１４０５のペプチドの７位に対応するリシン残基はアルギニンで置換され、単一のリシン置換が、配列番号１４０５のペプチドの１２、１５、１６、１９および２４位に対応するアミノ酸の１つに挿入される。
【０４９９】
別の実施形態において、本明細書に開示するクラス５ペプチドの２２位に対応するメチオニン残基は、ペプチドの酸化分解を防ぐためにロイシンまたはノルロイシンに交換される。
【０５００】
一部の態様において、さらにクラス５ペプチドは、グルカゴン類似体の機能に重要でないことが公知である位置でのアミノ酸置換も包含する。一部の実施形態において、置換は、２、５、６、７、８、９、１２、１３、１４、１５、１６、１９、２２、２３または２４からなる群から選択される１、２もしくは３つの位置での保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態において、天然グルカゴンペプチドの１６、１７、２０、２１、２４または２９位に対応するアミノ酸、より具体的には天然グルカゴンと比較して２１および／もしくは２４位は、システインもしくはリシンで置換され、ＰＥＧ鎖が、置換されたシステインもしくリシン残基に共有結合により結合している。
【０５０１】
一部の実施形態によると、配列番号１４０９からなる配列を含むクラス５ペプチドが提供され、ペプチドの１１、１２、１５、１６、１９および／または２４位に対応する位置で１つもしくは複数の追加のアミノ酸置換（例えばシステインによる置換を含む）によりさらに修飾され、アミノ酸置換は、例えば、ＰＥＧを含めた親水性部分との架橋に適した側鎖を有するアミノ酸を含む。天然グルカゴンは、天然に存在するアミノ酸または合成（天然に存在しない）アミノ酸で置換することができる。合成または天然に存在しないアミノ酸とは、ｉｎ  ｖｉｖｏで天然に存在しないにもかかわらず、本明細書に記載されるペプチド構造に組み込むことができるアミノ酸のことを指す。一部の実施形態において、クラス５ペプチドが提供され、ペプチドは、配列番号１４０９の配列を含み、ペプチドの１６または１９位に結合したポリエチレングリコール鎖をさらに含む。さらなる実施形態において、グルカゴン類似体のＣ末端が修飾されて、カルボン酸基がアミド基で置き換えられる。
【０５０２】
一部の実施形態によると、
Ｒ1−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ2（配列番号１４３９）
Ｒ1−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ2（配列番号１４１３）、
Ｒ1−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ2（配列番号１４１４）および
Ｒ1−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ2（配列番号１４１２）
からなる群から選択されるグルカゴン類似体を含むクラス５ペプチドが提供され、４位のＸａａ=アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸またはホモシステイン酸、１０位のＸａａ=Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸、１６位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはアセチルフェニルアラニンであり、１９位のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインおよびアセチルフェニルアラニンであり、２２位のＸａａ=Ｍｅｔ、ＬｅｕまたはＮｌｅであり、Ｒ1は、ＯＨまたはＮＨ2であり、Ｒ2は、Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ（配列番号１４２１）、Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｘａａ［配列番号１４５０；ＸａａはＣｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはアセチルフェニルアラニン（ｐｈｅｎｙａｌａｎｉｎｅ）である］、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ2であり、ペプチドは、配列番号１４１３の１６位、配列番号１４１４の１９位ならびに配列番号１４１２の１６と１９位でペグ化されていてもいよい。一部の実施形態において、配列番号１４１２〜１４１４および１４３９の２４位のＴｈｒは、Ｇｌｙで置換されている。一部の実施形態によると、ペプチドは、配列番号１３または配列番号１４１４の配列を含み、Ｒ1は、ＯＨである。一部の実施形態によると、ペプチドは、配列番号１４１３または配列番号１４１４の配列を含み、Ｒ1はＯＨであり、Ｒ2はＣＯＮＨ2である。一部の実施形態によると、ペプチドは、配列番号１４１３または配列番号１４１４の配列を含み、Ｒ1はＯＨであり、Ｒ2はＣＯＮＨ2であり、２４位のトレオニンはグリシンで置換されている。
【０５０３】
一部の実施形態において、クラス５ペプチドはさらに修飾されて、対応するアミノ酸位置にある天然グルカゴン残基の置換により、天然ＧＬＰ−１のアミノ酸を１つまたは複数含む。例えば、クラス５ペプチドは、２、３、１７、１８、２１、２３および２４位（天然グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）のいずれかにアミノ酸置換を１つまたは複数含むことができる。特定の実施形態において、クラス５ペプチドは、以下のアミノ酸置換の１つまたは複数により改変される：Ｓｅｒ２はＡｌａで置き換えられ、Ｇｌｎ３はＧｌｕで置き換えられ、Ａｒｇ１７はＧｌｎで置き換えられ、１８位のＡｒｇはＡｌａで置き換えられ、２１位のＡｓｐはＧｌｕで置き換えられ、２３位のＶａｌはＩｌｅで置き換えられ、２４位のＧｌｎはＡｌａで置き換えられる（アミノ酸位置は、天然グルカゴン配列による）。特定の実施形態において、クラス５ペプチドは、Ｓｅｒ２をＡｌａでおよびＧｌｎ３をＧｌｕで置き換えることによって修飾される（天然グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）。別の特定の実施形態において、クラス５ペプチドは、以下のアミノ酸置換の全部で改変される：Ａｒｇ１７はＧｌｎで置き換えられ、１８位のＡｒｇはＡｌａで置き換えられ、２１位のＡｓｐはＧｌｕで置き換えられ、２３位のＶａｌはＩｌｅで置き換えられ、２４位のＧｌｎはＡｌａで置き換えられる（天然グルカゴンによるアミノ酸ナンバリング）。さらに別の特定の実施形態において、クラス５ペプチドは修飾されて、２１位にＧｌｕだけを含む（配列番号１４０１のナンバリングによる）。したがって、クラス５ペプチドは、配列番号１４６０〜１４７０、１４７３〜１４７８、１４８０〜１４８８、１４９０〜１４９６、１５０３、１５０４、１５０６、および１５１４〜１５１８のいずれかのアミノ酸配列を含むことができる。
【０５０４】
（１）本明細書に記載される手段によって安定化されたアルファヘリックス［例えば、分子内架橋、もしくはアルファ，アルファ二置換アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸１６位（配列番号１４０１のナンバリングによる）の１つもしくは複数の組み込み、またはその組合せによる］、（２）Ｃ末端カルボキシレートの代わりにＣ末端アミドまたはエステル、および（３）Ａ−Ｂ−Ｃの一般構造
［式中、Ａは、
（ｉ）フェニル乳酸（ＰＬＡ）、
（ｉｉ）ＰＬＡの酸素誘導体、および
（ｉｉｉ）ペプチドの連続する２つのアミノ酸がエステルまたはエーテル結合により連結されているアミノ酸２〜６個のペプチド
からなる群から選択され、
式中、Ｂは、配列番号１４０１のアミノ酸ｐ〜２６を表し、ｐは、３、４、５、６または７であり、本明細書に記載の通り、例えば、クラス５ペプチドについて記載されている修飾のいずれかを含めた１つまたは複数のアミノ酸改変を含んでもよい］
を含むクラス５ペプチドまたはそのコンジュゲートも本明細書に提供される。例えば、この１つまたは複数の修飾は、
（ｉｖ）９位（配列番号１４０１のアミノ酸ナンバリングによる）のＡｓｐは、Ｇｌｕ、Ｃｙｓのスルホン酸誘導体、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、または以下の構造を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体で置換されている、
【０５０５】
【化３５】
2016521253.tif 000037
（式中、Ｘ5はＣ1−Ｃ4アルキル、Ｃ2−Ｃ4アルケニル、またはＣ2−Ｃ4アルキニルである）
（ｖ）１０、２０および２４位（配列番号１４０１のアミノ酸ナンバリングによる）の１つもしくは２つのアミノ酸の、エステル、エーテル、チオエーテル、アミドまたはアルキルアミン結合によるアシルもしくはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸での置換、
（ｖｉ）１６、１７、２０、２１および２４位（配列番号１４０１のアミノ酸ナンバリングによる）の１つまたは２つのアミノ酸の、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン、ホモシステインおよびアセチルフェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）からなる群から選択されるアミノ酸であって、群のアミノ酸が親水性部分に共有結合により結合しているアミノ酸での置換、
（ｖｉｉ）１５位（配列番号１４０１のナンバリングによる）のＡｓｐが、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、およびホモシステイン酸で置換されている、
（ｖｉｉｉ）１６位（配列番号１４０１のナンバリングによる）のＳｅｒが、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、およびホモシステイン酸で置換されている、
（ｉｘ）１７位のＡｒｇがＧｌｎで置き換えられ、１８位のＡｒｇがＡｌａで置き換えられ、２１位のＡｓｐがＧｌｕで置き換えられ、２３位のＶａｌがＩｌｅで置き換えられ、２４位のＧｌｎがＡｌａで置き換えられる（配列番号１４０１のアミノ酸ナンバリングによる）、
（ｘ）１６位のＳｅｒがＧｌｕで置き換えられ、２０位のＧｌｎがＧｌｕで置き換えられる、または２４位のＧｌｎがＧｌｕで置き換えられる（配列番号１４０１のアミノ酸ナンバリングによる）
からなる群から選択することができ、
（一般構造Ａ−Ｂ−Ｃの）Ｃは、
（ｖｉｉ）Ｘ、
（ｖｉｉｉ）Ｘ−Ｙ、
（ｉｘ）Ｘ−Ｙ−Ｚ、
（ｘ）Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１０、
ＸはＭｅｔ、ＬｅｕまたはＮｌｅであり、ＹはＡｓｎまたは荷電アミノ酸であり、ＺはＴｈｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）、ホモシステイン、アセチルフェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）、または荷電アミノ酸であり、Ｒ１０は、配列番号１４２１、１４２６、１４２７および１４５０からなる群から選択される）からなる群から選択される。
【０５０６】
特定の態様では、ペプチドは、ＰＬＡのオキシ誘導体を含む。本明細書において使用する場合、「ＰＬＡのオキシ誘導体」は、ヒドロキシル基がＯ−Ｒ11で置き換えられており、Ｒ11が化学部分である、ＰＬＡの改変された構造を含む化合物を指す。この点から考えて、ＰＬＡのオキシ誘導体は、例えば、ＰＬＡのエステルまたはＰＬＡのエーテルであってよい。
【０５０７】
ＰＬＡのオキシ誘導体を作る方法は、当分野において公知である。例えば、オキシ誘導体がＰＬＡのエステルである場合、エステルは、ＰＬＡのヒドロキシルと、求核試薬を有するカルボニルとの反応により形成することができる。該求核試薬は、限定するものではないが、アミンまたはヒドロキシルを含む任意の適切な求核試薬であってよい。したがって、ＰＬＡのエステルは、式ＩＶの構造を含むことができる。
【０５０８】
【化３６】
2016521253.tif 000038
式ＩＶ
（式中、Ｒ７は、ＰＬＡのヒドロキシルと求核試薬を有するカルボニルとの反応により形成されるエステルである）
【０５０９】
求核試薬を有するカルボニル（ＰＬＡのヒドロキシルと反応して、エステルを形成する）は、例えば、カルボン酸、カルボン酸誘導体、またはカルボン酸の活性化エステルであってよい。カルボン酸誘導体は、限定するものではないが、塩化アシル、酸無水物、アミド、エステルまたはニトリルであってよい。カルボン酸の活性化エステルは、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、トシレート（Ｔｏｓ）、カルボジイミドまたはヘキサフルオロホスフェートであってよい。一部の実施形態では、カルボジイミドは、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）または１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣＤ）である。一部の実施形態では、ヘキサフルオロホスフェートは、ヘキサフルオロホスフェートベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）およびｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−ホスフェート（ＨＢＴＵ）からなる群から選択される。
ヒドロキシル基（例えば、ＰＬＡのヒドロキシル）との反応からエーテルを作る方法もまた、当分野において公知である。例えば、ＰＬＡのヒドロキシル基は、ハロゲン化アルキルまたはトシル化アルキルアルコールと反応させて、エーテル結合を形成することができる。
特定の実施形態では、酸素含有結合により（例えば、エステルまたはエーテル結合により）ＰＬＡと結合された化学部分は、ポリマー（例えば、ポリアルキレングリコール）、炭水化物、アミノ酸、ペプチドまたは脂質、例えば脂肪酸またはステロイドである。
【０５１０】
特定の実施形態では、化学部分は、式ＩＶがデプシペプチドであるようなペプチドの一部であってもよいアミノ酸である。この点から考えて、ＰＬＡは、ペプチドが、ＰＬＡ残基へと続く１つまたは複数の（例えば、１、２、３、４、５、６またはそれ以上）のアミノ酸Ｎ末端を含むように、ペプチドのＮ末端アミノ酸残基以外の位置にあり得る。例えば、ペプチドは、ペプチドのｎ位にＰＬＡを含むことができ、ｎは２、３、４、５または６である。
【０５１１】
ＰＬＡ残基に続くアミノ酸Ｎ末端は、合成であっても、または天然に存在してもよい。特定の実施形態では、ＰＬＡへと続くＮ末端のアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸である。一部の実施形態では、ＰＬＡへと続くＮ末端アミノ酸は、天然グルカゴンのＮ末端アミノ酸である。例えば、ペプチドは、配列番号１４５２〜１４５６のいずれかのアミノ酸配列をＮ末端に含んでよく、ＰＬＡはエステル結合によりトレオニンに連結される：
配列番号１４５２    Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号１４５３    Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号１４５４    Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号１４５５    Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号１４５６    Ｔｈｒ−ＰＬＡ
【０５１２】
代替の実施形態では、１つまたは複数のＮ末端アミノ酸は、天然グルカゴンのアミノ酸以外のアミノ酸で置換することができる。例えば、ペプチドが、ＰＬＡを５または６位のアミノ酸として含む場合、１位および／または２位のアミノ酸は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性を低減させるアミノ酸であり得る。より詳細には、一部の実施形態では、ペプチドの１位は、Ｄ−ヒスチジン、アルファ,アルファ−ジメチルイミダゾール（ｉｍｉｄｉａｚｏｌｅ）酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジンおよびホモ−ヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸である。より詳細には、一部の実施形態では、アンタゴニスト／アゴニストペプチドの２位は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニンおよびアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群から選択されるアミノ酸である。さらに、例えば、ペプチドが、ＰＬＡをアミノ酸として４、５または６位に含む場合、ペプチドの３位のアミノ酸は、天然グルカゴンの天然グルタミン残基に相対するグルタミン酸であってよい。本発明の例示的一実施形態では、ペプチドは、配列番号１４５７〜１４５９のいずれかのアミノ酸配列をＮ末端に含む。
【０５１３】
式ＩＶの化合物を含むペプチドに関して、ポリマーは、ＰＬＡのヒドロキシル基と反応可能であることを条件として、任意のポリマーであってよい。ポリマーは、天然または正常に求核試薬を有するカルボニルを含むポリマーであってよい。または、ポリマーは、該カルボニルを有するカルボニルを含むように誘導体化されたポリマーであってよい。ポリマーは、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレンおよび以下を含むこれらの誘導体：ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）およびポリ（オクタデシルアクリレート）を含むアクリル酸およびメタクリル酸エステルのポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリ（ビニルアセテート）およびポリビニルピロリドンを含むポリビニルポリマー、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびこれらのコポリマー、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシ−プロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシルエチルセルロース、セルローストリアセテートおよびセルローススルフェートナトリウム塩を含むセルロース、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（エチレンテレフタレート）を含むポリエチレンならびにポリスチレン、のいずれかの誘導体化ポリマーであってよい。
【０５１４】
ポリマーは、合成生分解性ポリマー（例えば、乳酸およびグリコール酸のポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）（ｐｏｌｙ（ｂｕｔｉｃ  ａｃｉｄ））、ポリ（吉草酸）およびポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクタン））ならびに天然生分解性ポリマー（例えば、アルギネートおよびデキストランおよびセルロースを含む他の多糖、コラーゲン、これらの化学誘導体（化学基、例えば、アルキル、アルキレンの置換、付加、ヒドロキシル化、酸化および当業者により日常的に行われる他の改変）、アルブミンおよび他の親水性タンパク質（例えば、ゼインおよび他のプロラミンならびに疎水性タンパク質））ならびにこれらの任意のコポリマーまたは混合物を含む、生分解性ポリマーであってよい。概して、これらの材料は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて酵素的加水分解または表面または全体の侵食による水への曝露のいずれかにより分解する。
【０５１５】
ポリマーは、生体結合性ポリマー、例えば、その教示が本明細書に組み込まれるH. S. Sawhney, C. P. PathakおよびJ. A. Hubbell により、Macromolecules, 1993, 26, 581-587に記載された生体侵食性ヒドロゲル、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギネート、キトサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）およびポリ（オクタデシルアクリレート）であってよい。
【０５１６】
一部の実施形態では、ポリマーは水溶性ポリマーである。適切な水溶性ポリマーは当分野において公知であり、例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ；Ｋｌｕｃｅｌ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ；Ｍｅｔｈｏｃｅｌ）、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルブチルセルロース、ヒドロキシプロピルペンチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース（Ｅｔｈｏｃｅｌ）、ヒドロキシエチルセルロース、さまざまなアルキルセルロースおよびヒドロキシアルキルセルロース、さまざまなセルロースエーテル、セルロースアセテート、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ビニルアセテート／クロトン酸コポリマー、ポリ−ヒドロキシアルキルメタクリレート、ヒドロキシメチルメタクリレート、メタクリル酸コポリマー、ポリメタクリル酸、ポリメチルメタクリレート、無水マレイン酸／メチルビニルエーテルコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウムおよびポリアクリル酸カルシウム、ポリアクリル酸、酸性カルボキシポリマー、カルボキシポリメチレン、カルボキシビニルポリマー、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー、ポリメチルビニルエーテルｃｏ−無水マレイン酸、カルボキシメチルアミド、カリウムメタクリレートジビニルベンゼンコポリマー、ポリオキシエチレングリコール、ポリエチレンオキシドならびにこれらの誘導体、塩および組合せが挙げられる。
【０５１７】
特定の実施形態では、ポリマーは、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むポリアルキレングリコールである。
炭水化物は、アルファ脱離基を有するカルボニルを含むか、またはこれを含むように作られたことを条件として、任意の炭水化物であってよい。炭水化物は、例えば、アルファ脱離基を有するカルボニルを含むように誘導体化されている炭水化物であってよい。この点から考えて、炭水化物は、単糖（例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース）、二糖（例えば、スクロース、ラクトース、マルトース）、オリゴ糖（例えば、ラフィノース、スタキオース）、多糖（デンプン、アミラーゼ、アミロペクチン、セルロース、キチン、カロース、ラミナリン、キシラン、マンナン、フコイダン、ガラクトマンナンの誘導体化形態であってよい。
【０５１８】
脂質は、アルファ脱離基を有するカルボニルを含む任意の脂質であってよい。脂質は、例えば、カルボニルを含むように誘導体化された脂質であってよい。この点から考えて、脂質は、脂肪酸（例えば、Ｃ４−Ｃ３０脂肪酸、エイコサノイド、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン、Ｎ−アシルエタノールアミン）、グリセロ脂質（例えば、モノ−、ジ−、トリ−置換グリセロール）、グリセロリン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン）、スフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴシン、セラミド）、ステロール脂質（例えば、ステロイド、コレステロール）、プレノール脂質、糖脂質、またはポリケチドの誘導体であってよい。
油、ワックス、コレステロール、ステロール、脂溶性ビタミン、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質。
【０５１９】
一部の実施形態では、Ｒ７は、約１００ｋＤａ以下、例えば、約９０ｋＤａ以下、約８０ｋＤａ以下、約７０ｋＤａ以下、約６０ｋＤａ以下、約５０ｋＤａ以下、約４０ｋＤａ以下の分子量を有する。したがって、Ｒ７は、約３５ｋＤａ以下、約３０ｋＤａ以下、約２５ｋＤａ以下、約２０ｋＤａ以下、約１５ｋＤａ以下、約１０ｋＤａ以下、約５ｋＤａ以下または約１ｋＤａ以下の分子量を有してもよい。
代わりの実施形態において、Ａ−Ｂ−Ｃの一般構造を含むペプチドは、Ａとして、Ａのペプチドの連続する２つのアミノ酸がエステルまたはエーテル結合により連結されているアミノ酸２〜６個のペプチドを含む。エステルまたはエーテル結合は、例えば、アミノ酸２と３、３と４、４と５または５と６の間であることができる。Ａのペプチドは、ポリマー（例えば親水性ポリマー）との結合を含めた別の化学的部分との共有結合、アルキル化またはアシル化によってさらに修飾されていてもよい。
特定の実施形態において、ＰＬＡを含む上記のクラス５ペプチドは修飾されて、例えば、ＰＬＡのエステルまたはＰＬＡのエーテルなどＰＬＡの酸素誘導体を含む。例えば、クラス５ペプチドは、配列番号１４０２、１４０５〜１４２０、１４２２〜１４２５、１４３２〜１４３６、１４３８、１４３９、１４４５、１４４６、および１４５１のいずれかのアミノ酸配列を含むことができ、ＰＬＡは、エステルもしくはエーテル結合によりアミノ酸、ペプチド、ポリマー、アシル基またはアルキル基に連結される。アミノ酸、ペプチド、ポリマー、アシル基またはアルキル基は、本明細書に記載されるいずれかであることができる。ＰＬＡが、エステル結合によりアミノ酸またはペプチドに連結されている場合、クラス５ペプチドは、デプシペプチドと考えることができる。
【０５２０】
また、別の特定の実施形態において、ＰＬＡを欠く上記のクラス５ペプチドは修飾されて、７位のアミノ酸に対してＮ末端側にある連続する２つのアミノ酸の間に少なくとも１つのエステル結合またはエーテル結合を含む（天然グルカゴンのナンバリングによる）。特定の実施形態において、クラス５ペプチドは、連続する２つのアミノ酸の間に少なくとも１つのエステルまたはエーテル結合を含む。より特定の実施形態において、クラス５ペプチドは、配列番号１４０１のＮ末端の６個のアミノ酸を含み、Ｎ末端の６個のアミノ酸のうち連続する２つのアミノ酸は、エステルまたはエーテル結合により連結されている。
【０５２１】
連続する少なくとも２つのアミノ酸がエステルもしくはエーテル結合により連結されるならば、Ａのペプチドは、合成または天然に存在する任意のアミノ酸を含むことができる。特定の実施形態において、Ａのペプチドは、天然グルカゴンのアミノ酸を含む。１位および／または２位のアミノ酸は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性を減少させるアミノ酸であることができる。例えば、Ａのペプチドは、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファジメチルイミダゾール（ｉｍｉｄｉａｚｏｌｅ）酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファメチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシルヒスチジン、アセチルヒスチジンおよびホモヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸を１位に含むことができる。より具体的には、一部の実施形態において、Ａのペプチドの２位は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニンおよびアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群から選択されるアミノ酸である。また、例えば、Ａのペプチドの３位のアミノ酸は、天然グルカゴンの天然のグルタミン残基とは対照的にグルタミン酸であることができる。
したがって、Ａ−Ｂ−Ｃの一般構造のペプチドは、
Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号１５０７）、
Ｘａａ2−Ｘａａ3−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号１５０８）、または
Ｘａａ3−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号１５０９）、
のアミノ酸配列を含むことができ、
Ｘａａ1は、Ｈｉｓ、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファジメチルイミダゾール（ｉｍｉｄｉａｚｏｌｅ）酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファメチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシルヒスチジン、アセチルヒスチジンおよびホモヒスチジンからなる群から選択され、Ｘａａ2はＳｅｒ、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン、およびアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群から選択され、Ｘａａ3はＧｌｎまたはＧｌｕである。
【０５２２】
一部の実施形態において、Ｂは３つ以下のアミノ酸改変によって修飾される。例えば、配列番号１４０１の天然アミノ酸配列を表すＢは、１つまたは複数の保存的アミノ酸改変によって修飾される。
別の実施形態において、本明細書に記載の通り、Ｂは、（ｉｖ）〜（ｘ）からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸改変を含む。特定の実施形態において、Ｂは、アミノ酸改変（ｖ）および（ｖｉ）の一方または両方を含む。さらなる特定の実施形態において、Ｂは、（ｖ）および（ｖｉ）に加えて、（ｉｖ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）ならびに（ｘ）からなる群から選択されるアミノ酸改変のうち１つまたはその組合せを含む。
【０５２３】
本明細書に記載の通り、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドは、Ｃ末端に１つまたは複数の荷電アミノ酸を、本明細書に記載の通り、例えばＹおよび／またはＺとして含むことができる。あるいはまたはさらに、ＣがＸ−Ｙ−Ｚを含む場合、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドは、Ｃ末端〜Ｚに１〜２個の荷電アミノ酸をさらに含むことができる。荷電アミノ酸は、例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＡｓｐおよびＧｌｕのうちの１つであることができる。特定の実施形態において、ＹはＡｓｐである。
【０５２４】
一部の実施形態において、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドは、１、１６、２０、２１もしくは２４位（配列番号１４０１のアミノ酸ナンバリングによる）で、または一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドのＮもしくはＣ末端残基でアミノ酸残基に共有結合している親水性部分を含む。特定の実施形態において、親水性部分は、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドのＣｙｓ残基に結合している。これに関連して、天然グルカゴン（配列番号１４０１）の１６、２１、２４または２９位のアミノ酸は、Ｃｙｓ残基で置換されてもよい。別法として、例えば、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドが、Ｃ末端伸長（配列番号１４０１のアミノ酸ナンバリングによる位置）を含む場合、親水性部分を含むＣｙｓ残基は、３０位としてまたは４０位として一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドのＣ末端に付加できる。別法として、親水性部分は、ＰＬＡのヒドロキシル部分により、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドのＰＬＡに結合させることができる。親水性部分は、例えば、ポリエチレングリコールを含めた本明細書に記載されるいずれかであり得る。
【０５２５】
特定の態様において、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドは、分子内架橋の組み込みにより安定化されたアルファヘリックスを含む。一部の実施形態において、分子内架橋は、ラクタム架橋である。ラクタム架橋は、９位と１２位のアミノ酸、１２位と１６位のアミノ酸、１６位と２０位のアミノ酸、２０位と２４位のアミノ酸または２４位と２８位のアミノ酸の間にあることができる（配列番号１４０１のアミノ酸ナンバリングによる）。特定の実施形態において、１２位と１６位または１６位と２０位（配列番号１４０１のアミノ酸ナンバリングによる）のアミノ酸は、ラクタム架橋により連結されている。他の位置のラクタム架橋も考えられる。
加えてまたは別法として、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドは、例えば、１６、２０、２１もしくは２４位（配列番号１４０１のアミノ酸ナンバリングによる）のいずれかにアルファ，アルファ二置換アミノ酸を含むことができる。一部の実施形態において、アルファ，アルファ二置換アミノ酸はＡＩＢである。特定の態様において、ＡＩＢは１６位（配列番号１４０１のナンバリングによる）に位置する。
あるいはまたはさらに、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドは修飾されて、１６位（配列番号１４０１のナンバリングによる）に酸性アミノ酸を含むことができ、その修飾は、アルファヘリックスの安定性を増強する。一部の実施形態において、酸性アミノ酸は、側鎖スルホン酸または側鎖カルボン酸を含むアミノ酸である。さらに特定の実施形態において、酸性アミノ酸は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ホモグルタミン酸、Ｃｙｓのスルホン酸誘導体、システイン酸、ホモシステイン酸、Ａｓｐ、および以下の構造を有するＣｙｓのアルキル化誘導体
【０５２６】
【化３７】
2016521253.tif 000039
（式中、Ｘ5はＣ1−Ｃ4アルキル、Ｃ2−Ｃ4アルケニル、またはＣ2−Ｃ4アルキニルである）からなる群から選択される。
【０５２７】
特定の実施形態において、クラス５ペプチドは配列番号１４６０〜１４７０、１４７３〜１４７８、１４８０〜１４８８、１４９０〜１４９６、１５０３、１５０４、１５０６、および１５１４〜１５１８のいずれかのアミノ酸配列を含むことができ、表１のペプチド２〜６、表２のペプチド１〜８、ならびに表３のペプチド２〜６、８、および９のいずれかのアミノ酸配列を含むことができる。
【０５２８】
【表１】
2016521253.tif 000040
【表２】
2016521253.tif 000041
【表３】
2016521253.tif 000042
【０５２９】
一部の実施形態において、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドは、クラス５ペプチドである。特定の実施形態において、ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対して天然ＧＬＰ−１により達成される最大作動性の少なくとも約５０％およびグルカゴン受容体に対して天然グルカゴンにより達成される最大反応の少なくとも約５０％の阻害を呈する。別の特定の実施形態において、ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対して天然ＧＬＰ−１により達成される最大作動性の少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または約１００％を呈する。あるいはまたはさらに、ペプチドは、グルカゴン受容体に対して天然グルカゴンにより達成される最大反応の少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または約１００％の阻害を呈することができる。
【０５３０】
一部の実施形態において、
（１）
（ａ）野生型グルカゴンのＮ末端から１〜５個のアミノ酸の欠失を有してもよい、６位のＰｈｅの、ＰＬＡでの置換（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）または
（ｂ）野生型グルカゴンの９位のＡｓｐの、グルタミン酸、ホモグルタミン酸もしくはシステインのスルホン酸誘導体での置換を有してもよい、野生型グルカゴンのＮ末端から２〜５個のアミノ酸の欠失（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）
を含むがこれに限定されないグルカゴンアンタゴニスト活性を付与する修飾、
【０５３１】
（２）
（ａ）野生型グルカゴンのアミノ酸１２〜２９、例えば１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４もしくは２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）のうち１、２、３、４つもしくはより多くにおけるアルファ，アルファ二置換アミノ酸の挿入もしくは置換、または
（ｂ）野生型グルカゴンのアミノ酸１２〜２９における分子内架橋の導入、例えば塩橋もしくはラクタム架橋もしくは別の型の共有結合、または
（ｃ）２、３、１７、１８、２１、２３もしくは２４位（天然グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）のうち１つもしくは複数のアミノ酸の、ＧＬＰ−１の対応するアミノ酸での置換、例えば、Ｓｅｒ２はＡｌａで置き換えられ、Ｇｌｎ３はＧｌｕで置き換えられ、Ａｒｇ１７はＧｌｎで置き換えられ、１８位のＡｒｇはＡｌａで置き換えられ、２１位のＡｓｐはＧｌｕで置き換えられ、２３位のＶａｌはＩｌｅで置き換えられ、および／もしくは２４位のＧｌｎはＡｌａで置き換えられる、または
（ｄ）野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによっておよそアミノ酸１２〜２９位のアルファヘリックス構造を安定化する他の修飾
を含むがこれに限定されないＧＬＰ−１アゴニスト活性を付与する修飾、
（３）ＧＬＰ−１アゴニスト活性を増強する他の修飾、例えば、
（ａ）Ｃ末端カルボキシレートの代わりにＣ末端アミドまたはエステル
のうち１つまたは複数を含み、
（４）以下の修飾の１つもしくは複数：
（ａ）例えばＮ末端、もしくは６、１６、１７、２０、２１、２４、２９、４０位もしくはＣ末端アミノ酸での、ポリエチレングリコールなど親水性部分への共有結合、および／または
（ｂ）アシル化またはアルキル化
を含んでもよく、
【０５３２】
（５）以下の追加の修飾：
（ａ）えば本明細書に記載の通り、ＤＰＰ−ＩＶ切断に対する抵抗性を改善する１もしくは２位の修飾を有してもよい、Ｎ末端への、例えばＮ末端への１〜５個のアミノ酸、エステル結合を介してもよい６位（野生型グルカゴンのナンバリングによる）のＰＬＡへのアミノ酸の共有結合、
（ｂ）２９および／もしくは２８位の、および２７位でもよい（野生型グルカゴンのナンバリングによる）アミノ酸の欠失、
（ｃ）Ｃ末端へのアミノ酸の共有結合、
（ｄ）所望の活性を保持しながらの、非保存的置換、保存的置換、付加もしくは欠失、例えば、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８もしくは２９位のうち１つまたは複数の保存的置換、１０位のＴｙｒの、ＶａｌもしくはＰｈｅでの置換、１２位のＬｙｓの、Ａｒｇでの置換、これら位置のうち１つもしくは複数の、Ａｌａでの置換、
（ｅ）分解を減少させ得る、例えば、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸もしくはホモシステイン酸での置換による１５位のアスパラギン酸の修飾、または、例えば、トレオニン、ＡＩＢ、グルタミン酸での、もしくは長さ４原子の側鎖を有する別の負に荷電したアミノ酸での、もしくは別法としてＡｓｐ１５−Ｓｅｒ１６結合の切断による分解を同様に減少させ得るグルタミン、ホモグルタミン酸もしくはホモシステイン酸のいずれか１つでの置換による１６位のセリンの修飾、
（ｆ）酸化分解を減少させるための、例えば、ロイシンまたはノルロイシンでの置換による２７位のメチオニンの修飾、
（ｇ）Ｇｌｎの脱アミドによって起こる分解を減少させるための、例えばＡｌａもしくはＡＩＢでの置換による２０もしくは２４位のＧｌｎの修飾、
（ｈ）Ａｓｐが脱水して、環状スクシンイミド中間体を形成し、その後イソアスパラギン酸に異性化することによって起こる分解を減少させるための、例えばＧｌｕでの置換による２１位のＡｓｐの修飾、
（ｊ）本明細書に記載のホモ二量体化もしくはヘテロ二量体化、
（ｋ）上記の組合せ
を含んでもよいクラス５ペプチドまたはそのコンジュゲートを有するペプチドが提供される。
【０５３３】
同じクラス内の修飾のいずれかを一緒に組み合わせることができおよび／または異なるクラスの修飾が組み合わせるものと理解される。例えば、（１）（ａ）の修飾は、（２）（ａ）および（３）と組み合わせることができ；（１）（ａ）は、（２）（ｂ）と、例えばラクタム架橋または塩橋、および（３）と組み合わせることができ；（１）（ａ）は、（２）（ｃ）および（３）と組み合わせることができ；（１）（ｂ）は、（２）（ａ）および（３）と組み合わせることができ；（１）（ｂ）は、（２）（ｂ）と、例えばラクタム架橋または塩橋、および（３）と組み合わせることができ；（１）（ｂ）は、（２）（ｃ）および（３）と組み合わせることができ；前述のいずれかは、（４）（ａ）および／または（４）（ｂ）と組み合わせることができ；前述のいずれかは、（５）（ａ）〜（５）（ｋ）のいずれかと組み合わせることができる。
例示的な実施形態において、アルファ，アルファ二置換アミノ酸であるＡＩＢは、１６、２０、２１または２４位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）のうち１、２、３つもしくは全部で置換される。
例示的な実施形態において、分子内架橋は、塩橋である。
【０５３４】
他の例示的な実施形態において、分子内架橋は、共有結合、例えばラクタム架橋である。一部の実施形態において、ラクタム架橋は、９位と１２位のアミノ酸、１２位と１６位のアミノ酸、１６位と２０位のアミノ酸、２０位と２４位のアミノ酸、または２４位と２８位のアミノ酸の間にある（配列番号１４０１のアミノ酸ナンバリングによる）。
例示的な実施形態において、アシル化またはアルキル化は、６、１０、２０もしくは２４位またはＮ末端もしくはＣ末端にある（野生型グルカゴン、配列番号１４０１のアミノ酸ナンバリングによる）。
【０５３５】
例示的な実施形態において、修飾には、
（ｉ）１５位のＡｓｐ（配列番号１４０１のナンバリングによる）の、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸での置換、
（ｉｉ）１６位のＳｅｒ（配列番号１４０１のナンバリングによる）の、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸での置換、
（ｉｉｉ）２８位のＡｓｎの、荷電アミノ酸での置換、
（ｉｖ）２８位のＡｓｎの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸およびホモシステイン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸での置換、
（ｖ）２８位の、Ａｓｎ、ＡｓｐもしくはＧｌｕでの置換、
（ｖｉ）２８位の、Ａｓｐでの置換、
（ｖｉｉ）２８位の、Ｇｌｕでの置換、
（ｖｉｉｉ）２９位のＴｈｒの、荷電アミノ酸での置換、
（ｉｘ）２９位のＴｈｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸およびホモシステイン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸での置換、
（ｘ）２９位の、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＬｙｓでの置換、
（ｘｉ）２９位の、Ｇｌｕでの置換、
（ｘｉｉ）２９位の後への１〜３個の荷電アミノ酸の挿入、
（ｘｉｉｉ）２９位の後へのＧｌｕまたはＬｙｓの挿入、
（ｘｉｖ）２９位の後へのＧｌｙ−ＬｙｓもしくはＬｙｓ−Ｌｙｓの挿入
またはその組合せがある。
ＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性、グルカゴン受容体アンタゴニスト活性、ペプチド可溶性および／またはペプチド安定性を高める上述の修飾のいずれかは、個々にもしくは組み合わせて適用することができる。
【０５３６】
安定性を増強するための修飾
一部の実施形態によると、本明細書に開示するクラス５ペプチドはさらに修飾されて、クラス５ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸（２４位）に連結された配列番号１４２１（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）もしくは配列番号１４５０のアミノ酸配列を含むことができ、個体に投与して体重減少を誘導するまたは体重維持を支援することができる。より具体的には、クラス５ペプチドは、配列番号１４０５、配列番号１４０６、配列番号１４０７、配列番号１４０８、配列番号１４０９、配列番号１４１２、配列番号１４１３、配列番号１４１４、配列番号１４１６、配列番号１４１７、配列番号１４１８、配列番号１４１９、配列番号１４２２、配列番号１４２３、配列番号１４２４および配列番号１４２５からなる群から選択される配列を含み、ペプチドまたはクラス５ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸（２４位）に連結された配列番号１４２１（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）もしくは配列番号１４５０のアミノ酸配列をさらに含み、これらを使用して食欲を抑制し、体重減少／体重維持を誘導する。一部の実施形態において、投与されたペプチドまたはクラス５ペプチドは、配列番号１４１６、配列番号１４１７、配列番号１４１８および配列番号１４１９からなる群から選択される配列を含み、クラス５ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸（２４位）に連結された配列番号１４２１（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）のアミノ酸配列をさらに含む。一部の実施形態において、本方法は、配列番号１４４５または配列番号１４４６の配列を含むペプチドもしくはクラス５ペプチドを投与するステップを含む。
【０５３７】
したがって、本明細書に開示するクラス５ペプチドを同様に修飾して、水性緩衝液中での未成熟化学切断に対する感受性を低下させ得ると期待される。一部の実施形態によると、本明細書に記載されるクラス５ペプチドをさらに修飾して、天然グルカゴンの１５位に対応して位置する天然アスパラギン酸アミノ酸をシステイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなる群から選択されるアミノ酸で置き換えることによって水溶液中のその安定性を増強することができる。一部の実施形態によると、配列番号１４０５、配列番号１４０６、配列番号１４０７または配列番号１４０８のクラス５ペプチドの１０位のアスパラギン酸残基は、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換でき、一部の実施形態において、配列番号１４０５、配列番号１４０６、配列番号１４０７または配列番号１４０８の１０位の天然アスパラギン酸は、グルタミン酸で置き換えられる。一部の実施形態によると、水溶液中での安定性を改善したクラス５ペプチドが提供され、アンタゴニストは、配列番号１４０９の修飾された配列を含み、修飾は、配列番号１４０９の１０位のＡｓｐの、Ｇｌｕでの置換を含む。一部の実施形態において、配列番号１４２２、配列番号１４２３、配列番号１４２４および配列番号１４２５からなる群から選択される配列を含むクラス５ペプチドが提供される。一部の実施形態において、クラス５ペプチドはアミド化されている。
【０５３８】
天然グルカゴンの１５−１６位のＡｓｐ−Ｓｅｒ配列は、水性バッファー中で天然ホルモンの中途の化学的切断をもたらす独特な不安定ジペプチドとして同定されている。例えば、０．０１Ｎ  ＨＣｌに３７℃において２週間維持した場合、天然グルカゴンの５０％より多くが断片に切断される恐れがある。２つの遊離された切断ペプチド１〜１５と１６〜２９とは、グルカゴン様生物活性が欠けており、したがってグルカゴンおよびその関連類似体の水性の予備製剤化の制限を意味する。天然グルカゴンの１５位のＡｓｐのＧｌｕによる選択的化学置換が、１５〜１６のペプチド結合の化学切断を実質的に除去することが観察されている。
【０５３９】
さらに他の例示的な実施形態において、前述の化合物のいずれかをさらに修飾して、天然グルカゴンの１５または１６位に対応するアミノ酸を修飾することにより安定性を改善し、それにより特に酸性またはアルカリ性緩衝液中でのペプチドの経時的分解を減少させることができる。
【０５４０】
可溶性を増強するための修飾
ある特定の態様において、クラス５ペプチドはさらに修飾されて、グルカゴンアンタゴニストおよびＧＬＰ−１アゴニスト活性を保持しながら生理的ｐＨの水溶液中でのペプチドの可溶性を改善することができる。配列番号１４０５のペプチドの１２、１５、１６、１９および２４位、または配列番号１４０６のペプチドの１２、１６、１９もしくは２４位に対応する位置での親水性基の導入により、親化合物のグルカゴンアンタゴニストならびにＧＬＰアゴニスト活性を保持しながら、生理的ｐＨを有する溶液中での得られたペプチドの可溶性を改善することができる。したがって、一部の実施形態において、ここに開示するクラス５ペプチドはさらに修飾されて、配列番号１４０５もしくは配列番号１４０６のペプチドのアミノ酸１２、１５、１６、１９および２４位に対応するアミノ酸の側鎖に共有結合した親水性基を１つまたは複数含む。さらなる実施形態において、配列番号１４０５または配列番号１４０６のアミノ酸１６および１９位に対応するアミノ酸の側鎖は、親水性基に共有結合しており、一部の実施形態において、親水性基はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【０５４１】
クラス５グルカゴン関連ペプチドは、カルボキシ末端に電荷を導入することによって修飾して、ペプチドのアゴニスト特性を保持しながらペプチドの可溶性を増強することができる。可溶性を増強することにより、中性に近いｐＨでのグルカゴン溶液の調製および貯蔵が可能になる。比較的中性のｐＨ（例えばｐＨ約６．０〜約８．０）でグルカゴン溶液を製剤化することにより、クラス５ペプチドの長期安定性が改善される。
【０５４２】
出願人は、本明細書に開示するクラス５ペプチドを同様に修飾して、場合によっては、グルカゴンアンタゴニストおよびＧＬＰ−１活性を保持しながら比較的中性のｐＨ（例えばｐＨ約６．０〜約８．０）の水溶液中での可溶性を増強することができると予想する。したがって、一部の実施形態は、野生型グルカゴン（配列番号１４０１）の６〜２９位に存在する天然アミノ酸と比較してさらに修飾されて、天然の非荷電アミノ酸の、荷電アミノ酸での置換もしくはカルボキシ末端への荷電アミノ酸の付加によりペプチドに電荷を付加された配列番号１４０５、配列番号１４０６、配列番号１４０７または配列番号１４０８のグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１を対象とする。一部の実施形態によると、本明細書に開示するクラス５ペプチドの非荷電天然アミノ酸の１〜３個は、荷電アミノ酸で置き換えられる。一部の実施形態において、荷電アミノ酸は、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択される。より具体的には、出願人は、２８および／もしくは２９位（天然グルカゴンと比較して）に対応する本来存在しているアミノ酸の、荷電アミノ酸での置換、ならびに／またはペプチドのカルボキシ末端における１〜２個の荷電アミノ酸の付加により、生理的に妥当なｐＨ（すなわち、ｐＨ約６．５〜約７．５）の水溶液中でのクラス５ペプチドの可溶性および安定性が増強されることを発見した。したがって、クラス５ペプチドのそのような修飾は、元のペプチドの生物活性を保持しながら、水溶液、特にｐＨ約５．５〜約８．０での可溶性に同様の効果を有すると予想される。
【０５４３】
一部の実施形態によると、配列番号１４０５、配列番号１４０６、配列番号１４０７または配列番号１４０８のクラス５ペプチドは、それらの配列の２３および／もしくは２４位の天然アミノ酸の、負に荷電したアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）での置換によって修飾され、ペプチドのカルボキシ末端への負に荷電したアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）の付加によって修飾されてもよい。代わりの実施形態において、配列番号１４０５、配列番号１４０６、配列番号１４０７または配列番号１４０８を含むクラス５ペプチドは、配列番号１４０５、配列番号１４０６、配列番号１４０７もしくは配列番号１４０８の２４位の天然アミノ酸の、正に荷電したアミノ酸（例えば、リシン、アルギニンまたはヒスチジン）での置換によって修飾され、ペプチドのカルボキシ末端における１もしくは２個の、正に荷電したアミノ酸（例えば、リシン、アルギニンまたはヒスチジン）の付加によって修飾されてもよい。一部の実施形態によると、可溶性および安定性を改善したクラス５ペプチドが提供され、類似体は、配列番号１４１５もしくは配列番号１４５１のアミノ酸配列を含み、ただし配列番号１４１５もしくは配列番号１４５１の２３もしくは２４位の少なくとも１つのアミノ酸は酸性アミノ酸で置換され、ならびに／または配列番号１４１５もしくは配列番号１４５１のカルボキシ末端に追加の酸性アミノ酸が付加される。一部の実施形態において、酸性アミノ酸は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸およびホモシステイン酸からなる群からそれぞれ独立に選択される。
【０５４４】
一部の実施形態によると、可溶性および安定性を改善したクラス５ペプチドが提供され、アンタゴニストは、配列番号１４１６、配列番号１４１７、配列番号１４１８または配列番号１４１９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態によると、配列番号１４１６または配列番号１４１７の配列を含むグルカゴンアゴニストが提供される。一部の実施形態において、クラス５ペプチドは、配列番号１４２０の配列を含む。
【０５４５】
一部の実施形態によると、配列番号１４１５または配列番号１４５１の配列を含むクラス５ペプチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号１４１５または配列番号１４５１の４位は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸もしくはホモシステイン酸であり、一部の実施形態において、４位はアスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸もしくはホモシステイン酸であり、さらなる実施形態において、配列番号１４１５または配列番号１４５１の４位は、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸であり、一部の実施形態において、配列番号１４１５または配列番号１４５１の４位は、アスパラギン酸である。一部の実施形態によると、配列番号１４１５または配列番号１４５１の配列を含むクラス５ペプチドが提供され、配列番号１４１５の４位はアスパラギン酸であり、配列番号１４１５の１０位はグルタミン酸である。さらなる実施形態において、配列番号１４１５または配列番号１４５１のＣ末端アミノ酸は修飾されて、天然のカルボン酸基は、アミドもしくはエステルなどの電荷中性基で置き換えられる。
【０５４６】
クラス５ペプチド融合体
さらなる実施形態において、本明細書に記載されるクラス５ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸は、配列番号１４２１、１４２６、１４２７および１４５０からなる群から選択される配列を含む第２のペプチドに共有結合している。例えば、一部の実施形態において、配列番号１４１５、配列番号１４５１、配列番号１４０５、配列番号１４０６、配列番号１４０７、配列番号１４０８、配列番号１４１２、配列番号１４１３、配列番号１４１４、配列番号１４１６、配列番号１４１７、配列番号１４１８、配列番号１４１９、配列番号１４２２、配列番号１４２３、配列番号１４２４ならびに配列番号１４２５のクラス５ペプチドは、配列番号１４２１（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号１４２６（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、配列番号１４２７（ＫＲＮＲ）および配列番号１４５０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＸ）からなる群から選択される配列を含む第２のペプチドに共有結合している。
【０５４７】
一部の実施形態において、配列番号１４０５、配列番号１４０６、配列番号１４０７、配列番号１４０８、配列番号１４０９、配列番号１４２２、配列番号１４２３、配列番号１４２４および配列番号１４２５からなる群からそれぞれ独立に選択される２つの配列を含み、クラス５ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸に連結された配列番号１４２１（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）のアミノ酸配列をさらに含むクラス５ペプチド二量体が提供される。
一部の実施形態において、クラス５ペプチドは、ペプチドのＣ末端の１もしくは２個のアミノ酸の切断または欠失によってさらに修飾される（すなわち、天然グルカゴンの２９位、または２８と２９位のアミノ酸の切断）。好ましくは、切断は、クラス５ペプチドの活性（例えば、グルカゴン拮抗作用／ＧＬＰ−１作動性）に影響を与えない。
クラス５ペプチドコンジュゲート
【０５４８】
クラス５ペプチドのコンジュゲートも提供され、グルカゴンペプチドは、共有結合を介してもよく、リンカーを介してもよくコンジュゲート部分に連結される。
クラス５ペプチドがポリエチレングリコール鎖を含む実施形態において、ポリエチレングリコール鎖は直鎖形態であってもよく、または分岐していてもよい。一部の実施形態によると、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約１００００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。一部の実施形態において、ポリエチレングリコール鎖は、約１０００〜約５０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。一部の実施形態において、ポリエチレングリコール鎖は、約１０００〜約５０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。一部の実施形態において、ポリエチレングリコール鎖は、約１０００〜約２０００ダルトンから選択される平均分子量を有する。一部の実施形態において、ポリエチレングリコール鎖は、約１０００ダルトンの平均分子量を有する。
【０５４９】
一部の実施形態において、ペグ化したクラス５ペプチドは、配列番号１４１５または配列番号１４５１の配列からなるペプチドを含み、ポリエチレングリコール鎖は、配列番号１４１５または配列番号１４５１の１１、１２、１５、１６、１９および２４位から選択されるアミノ酸に連結され、ＰＥＧ鎖の分子量は、約１０００〜約５０００ダルトンである。一部の実施形態において、ペグ化したクラス５ペプチドは、配列番号１４１５または配列番号１４５１の配列からなるペプチドを含み、ポリエチレングリコール鎖は、配列番号１４１５または配列番号１４５１の１６もしくは１９位でアミノ酸に連結され、ＰＥＧ鎖の分子量は、約１０００〜約５０００ダルトンである。さらなる実施形態において、修飾されたクラス５ペプチドは、ペプチドに共有結合したポリエチレングリコール鎖を２つ以上含み、グルカゴン鎖の総分子量は、約１０００〜約５０００ダルトンである。一部の実施形態によると、クラス５ペプチドは、配列番号１４１５または配列番号１４５１の配列を含み、ポリエチレングリコール鎖は、配列番号１４１５または配列番号１４５１の１６および１９位でアミノ酸に連結され、２つのＰＥＧ鎖の合わせた分子量は、約１０００〜約５０００ダルトンである。
クラス５グルカゴン関連ペプチドは、配列番号１４０１〜１５１８のいずれかのアミノ酸配列を含むことができ、グルカゴンアンタゴニストおよびＧＬＰ−１アゴニスト活性を保持する１、２、３、４または５つ以下のさらなる修飾を有していてもよい。
【０５５０】
クラス６グルカゴン関連ペプチド
例えば糖尿病および肥満を患う、それを必要とする対象の治療に使用することを意図するＧＩＰアゴニストペプチドであるペプチドが、本明細書に提供される。以下に記す「クラス６グルカゴン関連ペプチド」と称されるそのようなペプチドは、クラス２グルカゴン関連ペプチドに類似しており、クラス２グルカゴン関連ペプチドに記載される修飾、類似体、バリアント、誘導体、多量体、融合体およびコンジュゲートの全てが、クラス６グルカゴン関連ペプチドに等しく適用される。Ｑは、これらクラス６グルカゴンペプチドのいずれかであることができる。
【０５５１】
配列番号２００１〜２５６５は、２０１２年１０月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／７１６８７８号の配列番号１〜５６５に対応し、その全体を参照により組み込む。配列番号３００１〜３２６２は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４の配列番号１〜２６２に対応し、その全体を参照により本明細書に組み込む。したがって、一部の実施形態において、Ｑは、配列番号２００１〜２５６５および３００１〜３２６２のいずれかである。
天然グルカゴンはＧＩＰ受容体を活性化せず、通常ＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の約１％を有する。一部の実施形態において、ペプチドは、天然のヒトグルカゴン（配列番号１）のアミノ酸配列に基づく構造を含むグルカゴン類似体であるが、配列番号１と比較して１つもしくは複数の位置で異なり、差異または修飾は、ＧＩＰ受容体に対する類似体のアゴニスト活性を増強する。そのようなグルカゴン類似体は、ＧＩＰ受容体に対して天然グルカゴンより大きいアゴニスト活性を有し、一部の態様において天然ＧＩＰより大きくなる。一部のまたは任意の実施形態において、ＧＩＰアゴニストは、少なくとも０．１％のＧＩＰパーセンテージ効力を有する。本開示の一部のまたは任意の態様において、グルカゴンの類似体は、グルカゴン受容体とＧＬＰ−１受容体の一方もしくは両方に対するアゴニスト活性をさらに呈する。したがって、ＧＩＰアゴニスト、ＧＩＰ−ＧＬＰ−１共アゴニスト、ＧＩＰ−グルカゴン共アゴニスト、およびＧＩＰ−ＧＬＰ−１−グルカゴントリアゴニスト（ｔｒｉａｇｏｎｉｓｔｓ）が本明細書に提供される。
【０５５２】
例示的な実施形態において、ヒトＧＬＰ−１受容体に対する本開示のＧＩＰアゴニストペプチドの選択性は、ＧＩＰ受容体と対比して１００倍未満である。一部のまたは任意の実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、グルカゴンパーセンテージ効力および／もしくはＧＬＰ−１パーセンテージ効力と２０倍もしくは１０倍の範囲で異なる（高いまたは低い）ＧＩＰパーセンテージ効力を有する。
本開示の一部の実施形態において、グルカゴン類似体は、（ｉ）１位にイミダゾール側鎖を含むアミノ酸、（ｉｉ）２位にＤＰＰ−ＩＶ保護アミノ酸、（ｉｉｉ）非天然のアシルもしくはアルキル基を、任意選択で９、１０、１２、１６、２０または３７〜４３位のいずれかに含み、非天然のアシルもしくはアルキル基がスペーサーによりそのようなアミノ酸に連結されていてもよいアミノ酸；（ｉｖ）１６、１７、１８、１９、２０または２１位のうち１つもしくは複数にアルファヘリックス安定化アミノ酸、ならびに（ｖ）配列番号１と比較して１０個以下（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９個以下）の追加のアミノ酸改変を含む。
【０５５３】
例示的な実施形態において、グルカゴン類似体は、（ｉ）１位にイミダゾール側鎖を含むアミノ酸（例えば、Ｈｉｓ）、（ｉｉ）２位にＤＰＰ−ＩＶ保護アミノ酸、任意選択で、アミノイソ酪酸、（ｉｉｉ）非天然のアシルもしくはアルキル基を、９、１０、１２、１６、２０または３７〜４３位のいずれかに含み、非天然のアシルもしくはアルキル基がスペーサーによりそのようなアミノ酸に連結されていてもよいアミノ酸；（ｉｖ）２０位にアルファ，アルファ二置換アミノ酸もしくはイミダゾール側鎖を含むアミノ酸、および（ｖ）配列番号１と比較して１０個以下（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９個以下）の追加のアミノ酸改変を含む。
【０５５４】
例示的な実施形態において、グルカゴン類似体は、（ｉ）１位にイミダゾール側鎖を含むアミノ酸、（ｉｉ）２位にＤＰＰ−ＩＶ保護アミノ酸、任意選択で、アミノイソ酪酸、（ｉｉｉ）非天然のアシルもしくはアルキル基を、任意選択で９、１０、１２、１６、２０または３７〜４３位のいずれかに含み、非天然のアシルもしくはアルキル基がスペーサーによりそのようなアミノ酸に連結されていてもよいアミノ酸；（ｉｖ）１６〜２１位の１つまたは複数、任意選択で１６位のアルファヘリックス安定化アミノ酸、ただし類似体は２０位にアルファヘリックス安定化アミノ酸を含まない、および（ｖ）配列番号１と比較して１０個以下（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９個以下）の追加のアミノ酸改変を含む。代わりの例示的な実施形態において、グルカゴン類似体は、（ｉ）類似体の３位にＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ノルバリン、ホモセリン、Ｍｅｔおよびメチオニンスルホンからなる群から選択されるアミノ酸；（ｉｉ）非天然のアシルもしくはアルキル基を、任意選択で９、１０、１２、１６、２０または３７〜４３位のいずれかに含み、非天然のアシルもしくはアルキル基がスペーサーによりそのようなアミノ酸に連結されていてもよいアミノ酸；（ｉｉｉ）１６〜２１位の１つまたは複数にアルファヘリックス安定化アミノ酸、ならびに（ｉｖ）配列番号１と比較して１０個以下（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９個以下）の追加のアミノ酸改変を含む。
【０５５５】
例示的な実施形態において、グルカゴン類似体が親水性部分を欠いている場合、グルカゴン類似体は、少なくとも０．１％（例えば、少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２０％）のＧＩＰパーセンテージ効力を呈する。例示的な実施形態において、グルカゴン類似体は、ＧＩＰ受容体と対比してヒトＧＬＰ−１受容体に対して１００倍未満（例えば、５０倍未満、２５倍未満、１０倍未満）の選択性を有する。例示的な実施形態において、グルカゴン類似体は、ＧＩＰ受容体に対するＥＣ５０の１００倍以内（例えば、５０倍以内、２５倍以内、１０倍以内）のＧＬＰ−１受容体に対するＥＣ５０を呈する。
【０５５６】
数字による特定のアミノ酸位置（例えば、２８位）への言及はすべて、天然グルカゴン（配列番号１）にあるその位置のアミノ酸またはその任意の類似体もしくは関連ペプチドにある対応するアミノ酸位置のことを指す。例えば、本明細書において「２８位」への言及は、配列番号１の第１のアミノ酸が欠失したグルカゴン類似体の対応する２７位を意味することになる。同様に、本明細書において「２８位」への言及は、配列番号１のＮ末端の前に１つのアミノ酸が付加されたグルカゴン類似体の対応する２９位を意味することになる。
【０５５７】
一部の実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、配列番号２７〜３３、３５〜４１、４３〜４６、７６〜８０、８３〜８７、８９、および９０のいずれか、または配列番号４８、５２、５３、および７４のいずれか、または配列番号５０、５１、５４、５６、５８〜６０、６２〜６６、６８〜７０、７２、７３、７５、８１、８２、８８、および９２のいずれかのアミノ酸配列を含み、すべての配列番号は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４を参照し、その全体を参照により本明細書に組み込む。一部の実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、配列番号２７〜３３、３５〜４１、４３〜４６、７６〜８０、８３〜８７、８９、および９０のいずれか、または配列番号４８、５２、５３、および７４のいずれか、または配列番号５０、５１、５４、５６、５８〜６０、６２〜６６、６８〜７０、７２、７３、７５、８１、８２、８８、および９２のいずれかを含む元の配列に基づく構造を含むが、本明細書にさらに記載されるように、１つもしくは複数の位置で元の配列と異なり、すべての配列番号は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４を参照し、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【０５５８】
したがって、本発明は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）にある配列番号２８の配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるペプチドを提供する。国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）にある配列番号３７の配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるペプチドも提供する。本発明は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）にある配列番号８９の配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるペプチドをさらに提供する。本発明は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）にある配列番号１８０の配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるペプチドをさらに提供する。本発明は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）にある配列番号３１の配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるペプチドをさらに提供する。
【０５５９】
本発明は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）にある配列番号１８４の配列
ＨＸ2Ｘ3ＧＴＦＴＳＤＸ10ＳＫＹＬＤＸ16ＲＸ18ＡＸ20Ｘ21ＦＶＱＷＬＸ27Ｘ28Ｘ29ＧＰＳＳＧＸ35ＰＰＰＳ（配列番号１８４）
［式中、
Ｘ2は、ＡＩＢであり、
Ｘ3は、ＧｌｎまたはＧｌｎ類似体であり、
Ｘ10は、ＴｙｒまたはＣ１２−Ｃ１８アシルもしくはアルキル基に共有結合しているアミノ酸であり、
Ｘ16は、任意のアミノ酸であり、Ｇｌｙ、ＰｒｏおよびＳｅｒ以外の任意のアミノ酸であってもよく、
Ｘ18は、ＡｒｇまたはＡｌａであり、
Ｘ20は、負荷電アミノ酸もしくは電荷中性アミノ酸であり、ＡＩＢまたはＧｌｎであってもよく、
Ｘ21は、酸性アミノ酸であり、ＡｓｐまたはＧｌｕであってもよく、
Ｘ27は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、ＮｌｅまたはＭｅｔであり、
Ｘ28は、Ａｌａまたは酸性アミノ酸であり（ＡｓｐまたはＧｌｕであってもよい）、
Ｘ29は、ＡｌａまたはＧｌｙであり、
Ｘ35は、Ａｌａまたは塩基性アミノ酸であり（ＡｒｇまたはＬｙｓであってもよい）、
Ｘ28が酸性アミノ酸である場合、Ｘ35は、塩基性アミノ酸であり、
Ｘ10がＴｙｒである場合、ペプチドは、４０位にＣ１２−Ｃ１８アシルまたはアルキル基に共有結合しているアミノ酸を含み、ペプチドは、４１位にＧｌｙを含んでもよく、
ペプチドのＣ末端アミノ酸は、アミド化されている］
を含むペプチドを提供する。
【０５６０】
本発明は、配列番号１８４と比較して３つ以下のアミノ酸改変を有する配列番号１８４の配列を含むペプチドも提供し、類似体は、ヒトＧＩＰ受容体、ヒトＧＬＰ−１受容体およびヒトグルカゴン受容体のそれぞれに対してアゴニスト活性を呈する。
【０５６１】
本発明は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）にある配列番号１８５の配列
ＨＸ2ＱＧＴＦＴＳＤＸ10ＳＫＹＬＤＸ16ＲＸ18ＡＸ20Ｘ21ＦＶＱＷＬＸ27Ｘ28Ｘ29ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１８５）
（式中、
Ｘ2は、ＡＩＢであり、
Ｘ10は、ＴｙｒまたはＣ１２−Ｃ１８アシルもしくはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸であり、
Ｘ16は、Ｇｌｕ、アルファ，アルファ二置換アミノ酸、またはＬｙｓであり、
Ｘ18は、ＡｒｇまたはＡｌａであり、
Ｘ20は、ＡＩＢまたはＧｌｎであり、
Ｘ21は、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、
Ｘ27は、Ｌｅｕ、ＮｌｅまたはＭｅｔであり、
Ｘ28は、Ａｌａ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、
Ｘ29は、ＴｈｒまたはＧｌｙであり、
Ｘ10がＴｙｒである場合、ペプチドは、４０位にＣ１２−Ｃ１８アシルまたはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸を含み、ペプチドは、４１位にＧｌｙを含んでもよく、
ペプチドのＣ末端アミノ酸は、アミド化されている）
を含むペプチドをさらに提供する。
【０５６２】
本発明は、配列番号１８５と比較して３つ以下のアミノ酸改変を持つ配列番号１８５の配列を含むペプチドをさらに提供し、類似体は、ヒトＧＩＰ受容体、ヒトＧＬＰ−１受容体およびヒトグルカゴン受容体のそれぞれに対してアゴニスト活性を呈する。
【０５６３】
さらに、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）にある配列番号１８６の配列：
ＨＸ2Ｘ3ＧＴＦＴＳＤＸ10ＳＫＹＬＤＸ16ＲＸ18ＡＸ20Ｘ21ＦＶＱＷＬＸ27Ｘ28Ｘ29（配列番号１８６）
［式中、
Ｘ2は、ＡＩＢであり、
Ｘ3は、ＧｌｎまたはＧｌｎ類似体であり、
Ｘ10は、ＴｙｒまたはＣ１０−Ｃ２６アシルもしくはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸であり、
Ｘ16は、任意のアミノ酸であり、Ｇｌｙ、ＰｒｏおよびＳｅｒ以外の任意のアミノ酸であってもよく、
Ｘ18は、ＡｒｇまたはＡｌａであり、
Ｘ20は、負荷電アミノ酸もしくは電荷中性アミノ酸であり、ＡＩＢまたはＧｌｎであってもよく、
Ｘ21は、酸性アミノ酸であり、ＡｓｐまたはＧｌｕであってもよく、
Ｘ27は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、ＮｌｅまたはＭｅｔであり、
Ｘ28は、Ａｌａまたは酸性アミノ酸であり（ＡｓｐまたはＧｌｕであってもよい）、
Ｘ29は、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり、
ペプチドは、１０位にＣ１０−Ｃ２６アシルまたはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸を含んでもよく、ペプチドのＣ末端アミノ酸は、アミド化されている］
を含むペプチドが提供される。
【０５６４】
さらに、配列番号１８６と比較して３つ以下のアミノ酸改変を有する配列番号１８６の配列を含むペプチドが提供され、類似体は、ヒトＧＩＰ受容体、ヒトＧＬＰ−１受容体およびヒトグルカゴン受容体のそれぞれに対してアゴニスト活性を呈する。
【０５６５】
本発明は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）にある配列番号１８７の配列：
ＨＸ2ＱＧＴＦＴＳＤＸ10ＳＫＹＬＤＸ16ＲＸ18ＡＸ20Ｘ21ＦＶＱＷＬＸ27Ｘ28Ｘ29（配列番号１８７）
（式中、
Ｘ2は、ＡＩＢであり、
Ｘ10は、ＴｙｒまたはＣ１０−Ｃ２６アシルもしくはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸であり、
Ｘ16は、Ｇｌｕ、アルファ，アルファ二置換アミノ酸、またはＬｙｓであり、
Ｘ18は、ＡｒｇまたはＡｌａであり、
Ｘ20は、負荷電アミノ酸もしくは電荷中性アミノ酸であり、ＡＩＢまたはＧｌｎであってもよく、
Ｘ21は、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、
Ｘ27は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、ＮｌｅまたはＭｅｔであり、
Ｘ28は、Ａｌａ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、
Ｘ29は、ＧｌｙまたはＴｈｒであり、
ペプチドは、１０位にＣ１２−Ｃ１８アシルまたはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸を含んでもよく、ペプチドのＣ末端アミノ酸は、アミド化されている）
を含むペプチドを提供する。
【０５６６】
本発明は、配列番号１８７と比較して３つ以下のアミノ酸改変を有する配列番号１８７も提供し、類似体は、ヒトＧＩＰ受容体、ヒトＧＬＰ−１受容体およびヒトグルカゴン受容体のそれぞれに対してアゴニスト活性を呈する。
本発明は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）に記載の通り、配列番号１８４、１８５、１８６、および１８７のいずれか１つの類似体をさらに提供するが、Ｘ3もしくは３位のアミノ酸は、ＧｌｎもしくＧｌｎ類似体または本明細書に記載されるものを含めたグルカゴン活性を減少させるアミノ酸である。例示的な実施形態において、グルカゴン活性を減少させるアミノ酸は、酸性、塩基性または疎水性アミノ酸（例えば、Ｇｌｕ、ＯｒｎまたはＮｌｅ）である。３位のアミノ酸は、Ｇｌｕであってもよい。
【０５６７】
さらに、
（ａ）１位にイミダゾール側鎖を含むアミノ酸、
（ｂ）１６位に式ＩＶのアミノ酸：
【０５６８】
【化３８】
2016521253.tif 000043
［式ＩＶ］
［式中、ｎは１〜７であり、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１８アルキル、（Ｃ１−Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ１８アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ０−Ｃ４アルキル）（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０−Ｃ４アルキル）（Ｃ２−Ｃ５複素環）、（Ｃ０−Ｃ４アルキル）（Ｃ６−Ｃ１０アリール）Ｒ７、ならびに（Ｃ１−Ｃ４アルキル）（Ｃ３−Ｃ９ヘテロアリール）からなる群からそれぞれ独立に選択され、Ｒ７はＨまたはＯＨであり、式ＩＶのアミノ酸の側鎖は遊離アミノ基を含んでもよい］
（ｃ）２０位にアルファ，アルファ二置換アミノ酸、
（ｄ）配列番号１と比較して１０個以下の追加のアミノ酸改変、
を含むＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴン（配列番号１）の類似体が本明細書に提供され、類似体が親水性部分を欠いている場合、グルカゴン類似体は、ＧＩＰ受容体に対して天然ＧＩＰの少なくとも０．１％の活性を呈し、グルカゴン類似体は、ＧＩＰ受容体と対比してヒトＧＬＰ−１受容体に対して１００倍未満の選択性を有する。
【０５６９】
本発明は、
（ａ）ＨＸ2Ｘ3ＧＴＦＴＳＤＸ10ＳＫＹＬＸ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18Ｘ19Ｘ20Ｘ21ＦＶＱＷＬＸ27Ｘ28Ｘ29Ｘ30ＰＳＳＧＸ35ＰＰＰＳ
（２０１２年１０月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／７１６８７８号にある配列番号６６、その全体を参照により本明細書に組み込む）
【０５７０】
［式中、
Ｘ2は、ＡＩＢであり、
Ｘ3は、Ｇｌｎまたは本明細書に記載の通り構造Ｉ、ＩＩもしくはＩＩＩの側鎖構造を含むアミノ酸であり、
Ｘ10は、ＴｙｒまたはＣ１２−Ｃ１８アシルもしくはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸であり、
Ｘ15は、酸性アミノ酸であり、ＧｌｕまたはＡｓｐであってもよく、
Ｘ16は、任意のアミノ酸であり、Ｇｌｙ、ＰｒｏおよびＳｅｒ以外の任意のアミノ酸であってもよく、
例えば、Ｇｌｕ、Ａｌａ、アルファ，アルファ二置換アミノ酸（例えば、ＡＩＢ）、Ｈｉｓ、Ｌｙｓであり、
Ｘ17は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎであり、
Ｘ18は、ＡｒｇまたはＡｌａであり、
Ｘ19は、Ａｌａまたはアルファ，アルファ二置換アミノ酸であり、
Ｘ20は、アルファ，アルファ二置換アミノ酸（例えば、ＡＩＢ）もしくはＧｌｎまたはＨｉｓ、ＬｙｓもしくはＡｌａからなる群から選択され、
Ｘ21は、酸性アミノ酸であり、ＡｓｐまたはＧｌｕであってもよく、
Ｘ27は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、ＮｌｅまたはＭｅｔであり、
Ｘ28は、Ａｌａまたは酸性アミノ酸であり（ＡｓｐまたはＧｌｕであってもよい）であり、
Ｘ29は、脂肪族、例えば、ＡｌａもしくはＧｌｙまたはＡＩＢもしくはＶａｌであり、
Ｘ30は、小型脂肪族アミノ酸、例えばＡｌａまたはＧｌｙであり、
Ｘ35は、Ａｌａまたは塩基性アミノ酸であり（ＡｒｇまたはＬｙｓであってもよい）であり、
Ｘ28が酸性アミノ酸である場合、Ｘ35は、塩基性アミノ酸であり、Ｘ28がＡｓｐである場合、Ｘ29はＧｌｙではなくてもよく、
Ｘ10がＴｙｒである場合、ペプチドは、４０位にＣ１２−Ｃ１８アシルまたはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸を含み、ペプチドは、４１位にＧｌｙを含んでもよく、
ペプチドのＣ末端アミノ酸は、アミド化されている］
の配列または
（ｂ）配列番号６６と比較して３つ以下のアミノ酸改変を有する配列番号６６であり、ペプチドが、ヒトＧＩＰ受容体、ならびにヒトＧＬＰ−１受容体および／またはヒトグルカゴン受容体に対してアゴニスト活性を呈する配列、
を含むペプチドも提供する。
【０５７１】
本開示は、
（ａ）Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＧＴＦＴＳＤＸ10ＳＫＹＬＸ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18Ｘ19Ｘ20Ｘ21ＦＶＱＷＬＸ27Ｘ28Ｘ29Ｘ30ＰＳＳＧＸ35ＰＰＰＳ
（２０１２年１０月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／７１６８７８号にある配列番号６７、その全体を参照により本明細書に組み込む）
［式中、
Ｘ1は、側鎖イミダゾールであり、ＨｉｓまたはＨｉｓ誘導体を含むアミノ酸であってもよく、
Ｘ2は、ＤＰＰ−ＩＶ保護アミノ酸であり、アルファ，アルファ二置換アミノ酸（例えばＡＩＢ）であってもよく、
Ｘ3は、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、Ｖａｌ、ＮｏｒＶａｌ、ホモセリン、Ｍｅｔ、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、アセチルＯｒｎ、アセチルジアミノブタン酸、アセチルＬｙｓからなる群から選択され、
Ｘ10は、Ｃ１２−Ｃ１８アシルまたはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸であり、
Ｘ15は、酸性アミノ酸であり、ＧｌｕまたはＡｓｐであってもよく、
Ｘ16は、任意のアミノ酸であり、Ｇｌｙ、ＰｒｏおよびＳｅｒ以外の任意のアミノ酸であってもよく、
｛例えば、Ｇｌｕ、Ａｌａ、アルファ，アルファ二置換アミノ酸（例えば、ＡＩＢ）、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ｝
Ｘ17は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎであり、
Ｘ18は、ＡｒｇまたはＡｌａであり、
Ｘ19は、Ａｌａまたはアルファ，アルファ二置換アミノ酸であり、
Ｘ20は、アルファ，アルファ二置換アミノ酸（例えば、ＡＩＢ）もしくはＧｌｎまたはＨｉｓ、ＬｙｓもしくはＡｌａからなる群から選択され、
Ｘ21は、酸性アミノ酸、ＡｓｐまたはＧｌｕであってもよく、
Ｘ27は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、ＮｌｅまたはＭｅｔであり、
Ｘ28は、Ａｌａまたは酸性アミノ酸であり（ＡｓｐまたはＧｌｕであってもよい）、
Ｘ29は、脂肪族、例えば、ＡｌａもしくはＧｌｙまたはＡＩＢもしくはＶａｌであり、
Ｘ30は、小型脂肪族アミノ酸、例えばＡｌａまたはＧｌｙであり、
Ｘ35は、Ａｌａまたは塩基性アミノ酸であり（ＡｒｇまたはＬｙｓであってもよい）、
Ｘ28が酸性アミノ酸である場合、Ｘ35は、塩基性アミノ酸であり、
Ｘ28がＡｓｐである場合、Ｘ29はＧｌｙではなくてもよく、
Ｘ10がＴｙｒである場合、ペプチドは、４０位にＣ１２−Ｃ１８アシルまたはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸を含み、ペプチドは、４１位にＧｌｙを含んでもよい、
ペプチドのＣ末端アミノ酸は、アミド化されている）
の配列または
（ｂ）配列番号６７と比較して３つ以下のアミノ酸改変を有する配列番号６７であり、ペプチドが、ヒトＧＩＰ受容体、ならびにヒトＧＬＰ−１受容体および／またはヒトグルカゴン受容体に対してアゴニスト活性を呈する配列、
を含むペプチドも提供する。
【０５７２】
例示的な実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、配列番号１９、２１〜２６、２８、２８７、２８９〜２９４、２９６、５２０、５２２〜５２７、および５２９のいずれか、または配列番号３０、３１、３２、３３、３５、３７、３８、および４１のいずれかのアミノ酸配列を含み、すべての配列番号は、２０１２年１０月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／７１６８７８号を参照し、その全体を参照により本明細書に組み込む。一部の実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、配列番号３０、３１、３２、３３、３５、３７、３８、４１、２９８、２９９、３００、３０１、３０３、３０５、３０６、３０９、５３１、５３２、５３３、５３４、５３６、５３８、５３９、および５４２のいずれかを含む元の配列に基づく構造を含むが、本明細書にさらに記載されるように、１つまたは複数の位置で元の配列と異なり、すべての配列番号は、２０１２年１０月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／７１６８７８号を参照し、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【０５７３】
したがって、本発明は、２０１２年１０月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／７１６８７８号（その全体を参照により本明細書に組み込む）にある配列番号１８の配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるペプチドを提供する。２０１２年１０月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／７１６８７８号（その全体を参照により本明細書に組み込む）にある配列番号４３の配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるペプチドも提供される。
【０５７４】
本発明は、２０１２年１０月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／７１６８７８号（その全体を参照により本明細書に組み込む）にある配列番号１００〜２８２、配列番号３３３〜５１５のいずれか１つを含む、それから本質的になる、またはそれからなるペプチドも提供する。
本発明は、２０１２年１０月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／７１６８７８号（その全体を参照により本明細書に組み込む）にある配列番号１５〜２８、３４、３６、３９、４２、４３、４４、５２、５３、６３〜６５、２８３〜２９６、３０２、３０４、３０７、３１０、３１１、３１２、３２０、３２１、３３０〜３３２、５１６〜５２９、５３５、５３７、５４０、５４３、５４４、５４５、５５３、５５４、および５６３〜５６５のいずれか１つを含む、それから本質的になる、またはそれからなるペプチドも提供する。
【０５７５】
本発明は、２０１２年１０月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／７１６８７８号（その全体を参照により本明細書に組み込む）にある配列番号２９〜４２、２９７〜３１０、および５３０〜５４３のいずれか１つを含む、それから本質的になる、またはそれからなるペプチドも提供する。
【０５７６】
例示的な実施形態
例示的な実施形態において、本開示のクラス６ペプチドは、（ｉ）１位にイミダゾール側鎖を含むアミノ酸、（ｉｉ）２位にＤＰＰ−ＩＶ保護アミノ酸、（ｉｉｉ）任意選択で９、１０、１２、１６、２０もしくは３７〜４３位のいずれかで、アシルもしくはアルキル基がスペーサーによりアミノ酸に連結されていてもよいアシル化アミノ酸またはアルキル化アミノ酸、（ｉｖ）１６〜２１位の１つまたは複数にアルファヘリックス安定化アミノ酸、および（ｖ）配列番号１と比較して１０個以下の追加のアミノ酸改変、を含むグルカゴン（配列番号１）の類似体であり、グルカゴン類似体が異種性部分、例えば親水性部分（例えばＰＥＧ）にコンジュゲートされていない場合、グルカゴン類似体は、ＧＩＰ受容体に対して天然ＧＩＰの少なくともまたは約０．１％（例えば、少なくともまたは約１％、少なくともまたは約１０％、少なくともまたは約５０％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約１００％、少なくともまたは約５００％）の活性を呈する。
【０５７７】
ここで記載されるクラス６グルカゴン類似体は、本明細書に記載される任意の活性プロファイルを含むことができる。例示的な態様において、クラス６グルカゴン類似体は、少なくとももしくは約１％、少なくとももしくは約１０％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約１００％、少なくとももしくは約３００％、または少なくとももしくは約５００％のＧＩＰパーセンテージ効力を呈する。一部の態様において、クラス６グルカゴン類似体は、少なくとももしくは約１％、少なくとももしくは約１０％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約１００％、少なくとももしくは約３００％、または少なくとももしくは約５００％のＧＬＰ−１パーセンテージ効力も呈する。代わりのまたは追加の態様において、クラス６グルカゴン類似体は、少なくとももしくは約１％、少なくとももしくは約１０％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約９０％、または少なくとももしくは約１００％のグルカゴンパーセンテージ効力を呈する。したがって、クラス６グルカゴン類似体は、ＧＩＰアゴニストペプチドと考えることができるが、一部の態様において、クラス６グルカゴン類似体は、ＧＩＰ−ＧＬＰ−１共アゴニスト、ＧＩＰ−グルカゴン共アゴニスト、またはＧＩＰ−ＧＬＰ−１−グルカゴン（ｇｌｕｃｇａｏｎ）トリアゴニストとさらに考えることができる。例えば、ペプチドは、ヒトＧＩＰ受容体、ヒトＧＬＰ−１受容体およびヒトグルカゴン受容体のそれぞれに対してアゴニスト活性を呈することができ、ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対するＥＣ５０の１００倍以内（例えば、５０倍、４０倍、３０倍、２０倍、１５倍、１０倍またはより少ない）、およびグルカゴン受容体に対するＥＣ５０の１００倍以内（例えば、５０倍、４０倍、３０倍、２０倍、１５倍、１０倍またはより少ない）のＧＩＰ受容体に対するＥＣ５０を呈する。
【０５７８】
例示的な実施形態において、クラス６グルカゴン類似体は、１位にイミダゾール側鎖を含むアミノ酸を含む。例示的な態様において、１位のアミノ酸は、式Ａの構造
【化３９】
2016521253.tif 000044
［式Ａ］
［式中、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、Ｈ、（Ｃ１−６）アルキル、Ｏ（Ｃ１−６）アルキル、（Ｃ１−６）アルキル−ＯＨ、Ｆ、および少なくとも１つのＨがＦによって置き換えられている（Ｃ１−Ｃ６）アルキルからなる群からそれぞれ独立に選択される］
を含む。
【０５７９】
例示的な態様において、１位のアミノ酸は、グルカゴン（配列番号１）の天然の残基Ｌ−ヒスチジン（Ｈｉｓ）であり、またはＨｉｓの誘導体（Ｈｉｓ誘導体）、例えば、アルファ原子が修飾されているＨｉｓの誘導体である。本明細書では、用語「Ｈｉｓ誘導体」とは、少なくとも１つの炭素原子に結合している、例えば、式Ａの構造を含むイミダゾール、または置換されたイミダゾールを含む化学的部分のことを指す。例示的な実施形態において、Ｈｉｓ誘導体は、ヒスチジンの構造と類似の構造を含むが、アルファアミン、アルファ炭素、またはアルファカルボキシレートが別の化学的部分で置き換えられている。例示的な実施形態において、Ｈｉｓ誘導体は、アルファ炭素に連結された水素原子が別の化学的部分、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ヒドロキシル、メトキシ、エトキシ等で置換されているアルファ置換されたヒスチジンである。一部の態様において、Ｈｉｓ誘導体は、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシルヒスチジン、アセチルヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファメチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、またはアルファ，アルファジメチルイミダゾール（ｉｍｉｄｉａｚｏｌｅ）酢酸（ＤＭＩＡ）である。
【０５８０】
一部の態様において、２位のＤＰＰ−ＩＶ保護アミノ酸は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン、またはアルファ、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）のうちの１つである。一部の態様において、ＤＰＰ−ＩＶ保護アミノ酸は、Ｄ−Ｓｅｒ、もしくはその保存的アミノ酸置換、またはα，α−二置換アミノ酸である。一部の態様において、α，α−二置換アミノ酸は、Ｒ１およびＲ２を含み、そのそれぞれは、アルファ炭素に結合しており、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、Ｃ１−Ｃ４アルキルからなる群からそれぞれ独立に選択され、ヒドロキシル、アミド、チオール、ハロで置換されていてもよい、またはＲ１およびＲ２は、それらが結合しているアルファ炭素と共に環を形成する。一部の態様において、α，α−二置換アミノ酸はＡＩＢである。例示的な態様において、ＤＰＰ−ＩＶ保護アミノ酸がＤ−Ｓｅｒである場合、ＧＩＰアゴニストペプチドは、異種性部分、例えば、親水性部分（例えば、ＰＥＧ）にコンジュゲートされない。本開示の他の態様において、ＤＰＰ−ＩＶ保護アミノ酸は、Ｄ−セリンでない。
【０５８１】
一部の態様において、クラス６グルカゴン類似体は、１６、１７、１８、１９、２０、または２１位のいずれかにアルファヘリックス安定化アミノ酸を含む。一部の態様において、グルカゴン類似体は、１６、１７、１８、１９、２０もしくは２１位のうち１、２、３、４、５つまたは全部でアルファヘリックス安定化アミノ酸を含む。例示的な態様において、クラス６グルカゴン類似体は、１６、１７、２０および２１位にアルファヘリックス安定化アミノ酸を含む。一部の態様において、クラス６グルカゴン類似体は、１６および２０位にアルファヘリックス安定化アミノ酸を含む。代わりのまたは追加の態様において、クラス６グルカゴン類似体は、１７および２１位にアルファヘリックス安定化アミノ酸を含む。
【０５８２】
一部の態様において、クラス６グルカゴン類似体が、２０位にアルファヘリックス安定化アミノ酸を含む場合、２０位のアミノ酸は、アルファ，アルファ二置換アミノ酸である。例示的な態様において、アルファ，アルファ二置換アミノ酸は、Ｒ１およびＲ２を含み、そのそれぞれは、アルファ炭素に結合しており、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、Ｃ１−Ｃ４アルキルからなる群からそれぞれ独立に選択され、ヒドロキシル、アミド、チオール、ハロで置換されていてもよい、またはＲ１およびＲ２は、それらが結合しているアルファ炭素と共に環を形成する。一部の実施形態において、アルファ，アルファ二置換アミノ酸は、１−アミノシクロプロパン−１−カルボキシレート（ＡＣＰＣ）である。一部の態様において、２０位のアルファ，アルファ二置換は、ＡＩＢである。一部の実施形態において、２０位のアミノ酸が、アルファ，アルファ二置換アミノ酸である場合、１６位のアミノ酸は、ＡＩＢ以外のアルファヘリックス安定化アミノ酸であってもよい。例示的な実施形態において、１６位のアミノ酸は、荷電アミノ酸、例えば、正荷電アミノ酸、負荷電アミノ酸である。一部の態様において、２０位のアミノ酸が、アルファ，アルファ二置換アミノ酸である場合、１６位のアミノ酸は、式ＩＶの正荷電アミノ酸、例えば、Ｌｙｓであり、または負荷電アミノ酸、例えば、Ｇｌｕである。一部の態様において、２０位のアミノ酸が、アルファ，アルファ二置換アミノ酸である場合、１６位のアミノ酸は、電荷中性アミノ酸、例えば、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙである。
【０５８３】
したがって、例示的な実施形態において、クラス６グルカゴン類似体は、（ｉ）１位にイミダゾール側鎖を含むアミノ酸、（ｉｉ）２位にＤＰＰ−ＩＶ保護アミノ酸、任意選択で、アミノイソ酪酸、（ｉｉｉ）非天然のアシルもしくはアルキル基を、任意選択で９、１０、１２、１６、２０または３７〜４３位のいずれかに含み、非天然のアシルもしくはアルキル基がスペーサーによりそのようなアミノ酸に連結されていてもよいアミノ酸、（ｉｖ）２０位にアルファ，アルファ二置換アミノ酸、（ｖ）配列番号１と比較して１０個以下（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９個以下）の追加のアミノ酸改変を含む。
【０５８４】
例示的な実施形態において、クラス６グルカゴンの類似体が、２０位にアルファ，アルファ二置換アミノ酸を含む場合、クラス６グルカゴン類似体が親水性部分を欠いている場合、グルカゴン類似体は、少なくとも０．１％（例えば、少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２０％）のＧＩＰパーセンテージ効力を呈する。例示的な実施形態において、クラス６グルカゴン類似体は、ＧＩＰ受容体と対比してヒトＧＬＰ−１受容体に対して１００倍未満（例えば、約９０倍またはそれ未満、約８０倍またはそれ未満、約７０倍またはそれ未満、約６０倍またはそれ未満、約５０倍またはそれ未満、約４０倍またはそれ未満、約３０倍またはそれ未満、約２０倍またはそれ未満、約１５倍またはそれ未満、約１０倍またはそれ未満、約５倍またはそれ未満）の選択性を有する。例示的な態様において、ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対するＥＣ５０より１００倍未満（例えば、約９０倍またはそれ未満、約８０倍またはそれ未満、約７０倍またはそれ未満、約６０倍またはそれ未満、約５０倍またはそれ未満、約４０倍またはそれ未満、約３０倍またはそれ未満、約２０倍またはそれ未満、約１５倍またはそれ未満、約１０倍またはそれ未満、約５倍またはそれ未満）異なり、グルカゴン受容体に対するＥＣ５０と１００倍未満（例えば、約９０倍またはそれ未満、約８０倍またはそれ未満、約７０倍またはそれ未満、約６０倍またはそれ未満、約５０倍またはそれ未満、約４０倍またはそれ未満、約３０倍またはそれ未満、約２０倍またはそれ未満、約１５倍またはそれ未満、約１０倍またはそれ未満、約５倍またはそれ未満）異なってもよいＧＩＰ受容体に対するＥＣ５０を有する。
【０５８５】
例示的な実施形態において、クラス６グルカゴンの類似体が、２０位にアルファ，アルファ二置換アミノ酸を含む場合、アルファ，アルファ二置換アミノ酸は、Ｒ１およびＲ２を含み、そのそれぞれは、アルファ炭素に結合しており、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、Ｃ１−Ｃ４アルキルからなる群からそれぞれ独立に選択され、ヒドロキシル、アミド、チオール、ハロで置換されていてもよい、またはＲ１およびＲ２は、それらが結合しているアルファ炭素と共に環を形成する。例示的な実施形態において、２０位のアルファ，アルファ二置換アミノ酸はＡＩＢである。また、例示的な実施形態において、グルカゴン類似体が、２０位にアルファ，アルファ二置換アミノ酸を含む場合、１６位のアミノ酸はＡＩＢ以外のアルファヘリックス安定化アミノ酸である。例示的な態様において、１６位のアミノ酸は、荷電アミノ酸であり、負荷電アミノ酸（例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐ）または正荷電アミノ酸（例えば、ＬｙｓまたはＯｒｎ）であってもよい。
【０５８６】
代わりの実施形態において、クラス６グルカゴン類似体は、２０位にアルファヘリックス安定化アミノ酸を含まず、１６、１７、１８、１９または２１位の１つもしくは複数は、アルファヘリックス安定化アミノ酸である。一部の態様において、アルファヘリックス安定化アミノ酸は１６位に位置する。一部の実施形態において、アルファヘリックス安定化アミノ酸は、負荷電アミノ酸（例えば、Ｇｌｕ）、正荷電アミノ酸［例えば、式ＩＶの構造を含む（例えば、Ｌｙｓ）］、またはアルファ，アルファ二置換アミノ酸である。一部の態様において、アルファ，アルファ二置換アミノ酸は、Ｒ１およびＲ２を含み、そのそれぞれは、アルファ炭素に結合しており、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、Ｃ１−Ｃ４アルキルからなる群からそれぞれ独立に選択され、ヒドロキシル、アミド、チオール、ハロで置換されていてもよい、またはＲ１およびＲ２は、それらが結合しているアルファ炭素と共に環を形成する。特定の態様において、１６位のアルファ，アルファ二置換アミノ酸はＡＩＢである。
【０５８７】
追加の実施形態において、クラス６グルカゴン類似体が、２０位にアルファヘリックス安定化アミノ酸を含まず、１６、１７、１８、１９もしくは２１位の１つまたは複数が、アルファヘリックス安定化アミノ酸である場合、グルカゴン類似体は、（ｉ）ペプチド類似体の２９位のアミノ酸のＣ末端に１〜２１個のアミノ酸の伸長または（ｉｉ）１０、１２もしくは１６位に位置するアシル化アミノ酸もしくはアルキル化アミノ酸を含む。一部の態様において、グルカゴン類似体は、ペプチド類似体の２９位のアミノ酸のＣ末端に１〜２１個のアミノ酸の伸長を含み、２９位のアミノ酸はＧｌｙであってもよい。一部の態様において、１〜２１個のアミノ酸の伸長は、本明細書に記載されるいずれかである。一部の態様において、伸長は、Ｔｒｐケージ構造を形成するアミノ酸配列を含み、例えば、伸長はＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号５）のアミノ酸配列、またはその保存的に置換された配列を含む。代わりの態様において、１〜２１個のアミノ酸の伸長は、少なくとも１つの荷電アミノ酸を含む。例示的な態様において、伸長は、Ｘ１−Ｘ２のアミノ酸配列を含み、Ｘ１は、荷電アミノ酸であり、Ｘ２は小型脂肪族アミノ酸である。一部の態様において、Ｘ１は正荷電アミノ酸、例えば、Ａｒｇである。一部の態様において、伸長はＡｒｇ−Ｇｌｙを含む。
【０５８８】
したがって、代わりの例示的な実施形態において、クラス６グルカゴン類似体は、（ｉ）１位にイミダゾール側鎖を含むアミノ酸、（ｉｉ）２位にＤＰＰ−ＩＶ保護アミノ酸、任意選択で、アミノイソ酪酸、（ｉｉｉ）非天然のアシルもしくはアルキル基を、任意選択で９、１０、１２、１６、２０または３７〜４３位のいずれかに含み、非天然のアシルもしくはアルキル基がスペーサーによりそのようなアミノ酸に連結されていてもよいアミノ酸、（ｉｖ）１６〜２１位の１つまたは複数、任意選択で１６位にアルファヘリックス安定化アミノ酸、ただし類似体は２０位にアルファヘリックス安定化アミノ酸を含まない、（ｖ）配列番号１と比較して１０個以下（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９個以下）の追加のアミノ酸改変を含む。例示的な態様において、類似体は、２０位にアルファ，アルファ二置換アミノ酸、任意選択で、ＡＩＢまたはＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＬｙｓおよびＡｒｇからなる群から選択されるアルファヘリックス安定化アミノ酸を含まない。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、配列番号１と比較して２０位で修飾されず、したがって、この位置でグルカゴンの天然アミノ酸であるＧｌｎ残基を有する。
【０５８９】
例示的な実施形態において、クラス６グルカゴン類似体が、１６〜２１位、任意選択で１６位の１つまたは複数にアルファヘリックス安定化アミノ酸を含む場合、類似体は２０位にアルファヘリックス安定化アミノ酸を含まず、グルカゴン類似体が親水性部分を欠いている場合、グルカゴン類似体は、少なくとも０．１％（例えば、少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２０％）のＧＩＰパーセンテージ効力を呈する。例示的な実施形態において、グルカゴン類似体は、ＧＩＰ受容体と対比してヒトＧＬＰ−１受容体に対して１００倍未満（例えば、約９０倍またはそれ未満、約８０倍またはそれ未満、約７０倍またはそれ未満、約６０倍またはそれ未満、約５０倍またはそれ未満、約４０倍またはそれ未満、約３０倍またはそれ未満、約２０倍またはそれ未満、約１５倍またはそれ未満、約１０倍またはそれ未満、約５倍またはそれ未満）の選択性を有する。例示的な態様において、ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対するＥＣ５０より１００倍未満（例えば、約９０倍またはそれ未満、約８０倍またはそれ未満、約７０倍またはそれ未満、約６０倍またはそれ未満、約５０倍またはそれ未満、約４０倍またはそれ未満、約３０倍またはそれ未満、約２０倍またはそれ未満、約１５倍またはそれ未満、約１０倍またはそれ未満、約５倍またはそれ未満）異なり、グルカゴン受容体に対するＥＣ５０と１００倍未満（例えば、約９０倍またはそれ未満、約８０倍またはそれ未満、約７０倍またはそれ未満、約６０倍またはそれ未満、約５０倍またはそれ未満、約４０倍またはそれ未満、約３０倍またはそれ未満、約２０倍またはそれ未満、約１５倍またはそれ未満、約１０倍またはそれ未満、約５倍またはそれ未満）異なってもよいＧＩＰ受容体に対するＥＣ５０を有する。
【０５９０】
例示的な態様において、クラス６グルカゴン類似体が、１６〜２１位の１つまたは複数にアルファヘリックス安定化アミノ酸を含む場合、類似体は２０位にアルファヘリックス安定化アミノ酸を含まず、グルカゴンの類似体は、１６位にアルファヘリックス安定化アミノ酸を含み、アルファヘリックス安定化アミノ酸は、負荷電アミノ酸（例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐ）またはアルファ，アルファ二置換アミノ酸であってもよい。１６位のアルファ，アルファ二置換アミノ酸は、Ｒ１およびＲ２を含んでもよく、そのそれぞれは、アルファ炭素に結合しており、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、Ｃ１−Ｃ４アルキルからなる群からそれぞれ独立に選択され、ヒドロキシル、アミド、チオール、ハロで置換されていてもよい、またはＲ１およびＲ２は、それらが結合しているアルファ炭素と共に環を形成する。例示的な態様において、１６位のアミノ酸はＡＩＢである。例示的な態様において、クラス６グルカゴン類似体は、１８位に小型脂肪族アミノ酸を含み、Ａｌａを含んでもよく、および１７位にＡｒｇを含む。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、１６〜２０位として配列ＥＲＡＡＱ（国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４の配列番号２００、その全体を参照により本明細書に組み込む）または１６〜２１位としてＥＲＡＡＱＤ（国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４の配列番号２０１、その全体を参照により本明細書に組み込む）を含む。
【０５９１】
例示的な態様において、クラス６グルカゴン類似体は、９、１０、１２、１６、２０位のいずれか１つに非天然のアシルまたはアルキル基を含むアミノ酸を含む。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、９、１０、１２、１３、１４、１６、１７および２０位のいずれか１つまたは複数にＣ１２−Ｃ１８アシル基もしくはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸を含む。例示的な態様において、クラス６グルカゴン類似体は、１０、１４位のいずれか１つまたは複数に１２−Ｃ１８アシル基もしくはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸を含む。一部の態様において、グルカゴン類似体は、１０、１２または１６位にアシル化アミノ酸もしくはアルキル化アミノ酸を含む。例示的な態様において、アシル化アミノ酸またはアルキル化アミノ酸は、１４位にある。一部の態様において、グルカゴン類似体は、２９位のアミノ酸のＣ末端に１〜２１個のアミノ酸の伸長を含み、３７〜４３位（例えば、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３）のいずれかに非天然のアシルまたはアルキル基を含むアミノ酸を含む。一部の態様において、非天然のアシルまたはアルキル基を含むアミノ酸は、４０位である。
【０５９２】
例示的な態様において、クラス６グルカゴン類似体は、２９位のアミノ酸のＣ末端に１〜２１個のアミノ酸の伸長を含み、一部の態様において、伸長はＴｒｐケージとして当技術分野において公知の構造を形成する。一部の態様において、伸長は、アミノ酸配列ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号５）もしくはＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号６）もしくはＧＰＳＳＧＲＰＰＰＳ（配列番号１８３）、または１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換を有する前述の配列のうちの１つを含み、すべての配列番号は、その全体を参照により本明細書に組み込む国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４のものである。代わりの態様において、伸長は、少なくとも１つの荷電アミノ酸を含み、例えば伸長はＸ１−Ｘ２のアミノ酸配列を含み、Ｘ１は荷電アミノ酸［例えば、正荷電アミノ酸（例えば、Ａｒｇ）］であり、Ｘ２は小型脂肪族アミノ酸である。一部の態様において、伸長はＡｒｇ−Ｇｌｙを含む。
【０５９３】
例示的な態様において、アシル化アミノ酸またはアルキル化アミノ酸は、式Ｉ（Ｌｙｓであってもよい）、式ＩＩ（Ｃｙｓであってもよい）もしくは式ＩＩＩ（Ｓｅｒであってもよい）の構造を含む。一部の態様において、アシル化アミノ酸またはアルキル化アミノ酸は、式Ｉ（例えば、Ｌｙｓ）の構造を含んでもよい。
一部の実施形態において、アシル化またはアルキル化アミノ酸は、側鎖アミンを含む芳香族アミノ酸である。例示的な態様において、側鎖アミンを含む芳香族アミノ酸は、４−アミノフェニルアラニン（４−アミノＰｈｅ）、ｐ−アミノフェニルグリシン、ｐ−アミノホモフェニルアラニン、または３−アミノチロシンである。例示的な態様において、側鎖アミンを含む芳香族アミノ酸は、４−アミノ−Ｐｈｅである。例示的な態様において、アシル化またはアルキル化アミノ酸は、式ＩＩのアミノ酸であり、ｎは２（ホモセリン）である。例示的な態様において、アシル化またはアルキル化アミノ酸は、Ｔｈｒもしくはホモトレオニンである。例示的な実施形態において、アシル化またはアルキル化アミノ酸は、チロシン、ホモチロシン、メチルチロシン、もしくは３−アミノチロシンを含むがこれに限定されない側鎖ヒドロキシルを含む芳香族アミノ酸である。
【０５９４】
例示的な態様において、クラス６グルカゴン類似体は、Ｃｘ−スクシノイルに共有結合により結合しているアミノ酸を含み、ｘは、１０〜２６であり、１２〜１８の整数であってもよい。例示的な態様において、Ｃｘ−スクシノイルは、スペーサーによりペプチドまたはクラス６グルカゴン類似体に結合されている。スペーサーは、本明細書に記載されるそれらのいずれか１つであることができる。
【０５９５】
一部の態様において、アシル化アミノ酸またはアルキル化アミノ酸は、スペーサーによりアシル基もしくはアルキル基に連結される。一部の態様において、スペーサーは、原子３〜１０個の長さである。一部の態様において、スペーサーは、アミノ酸１個またはジペプチドであり、一部の態様において、スペーサーは、１もしくは２個の酸性アミノ酸残基、例えばＧｌｕを含む。一部の態様において、アシルまたはアルキル基は、によりアミノ酸に連結されており、スペーサーの全長およびアシル基は原子約１４〜約２８個の長さである。一部の態様において、スペーサーはＣｙｓを含む。一部の態様において、スペーサーは１または２個のガンマＧｌｕを含む。一部の態様において、スペーサーはＬｙｓを含む。一部の態様において、スペーサーはＣｙｓ、ガンマＧｌｕおよびＬｙｓのうち２つの組合せ、または２つのガンマＧｌｕ残基を含む。
【０５９６】
特定の態様において、スペーサーはＣｙｓ残基であり、Ｃｙｓ残基はアルキル基、例えば、非官能性または官能性炭素鎖に共有結合により結合している。例示的な態様において、Ｃｙｓ残基は、Ｓ−パルミチルアルキル化（すなわち、Ｓ−パルミレートアルキル化）されており、Ｃｙｓ残基は、ペプチド骨格の一部であるＬｙｓ残基に結合していてもよい。代わりの実施形態において、スペーサーは、Ｃｙｓ残基を含むジペプチドであり、アルキル基に共有結合により結合している。例示的な態様において、ＣｙｓはＳ−パルミチルアルキル化されており、Ｃｙｓはスペーサーの別のアミノ酸に結合しており、例えば、ペプチド骨格の一部であるＬｙｓ残基に結合している。
例示的な態様において、スペーサーは、構造［−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2］nを含む小さなポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を含み、ｎは２〜１６の整数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６）である。
【０５９７】
アシル化アミノ酸に関しては、一部の態様において、アシル基は、Ｃ１２−Ｃ１８（例えば、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８）脂肪酸アシル基である。一部の態様において、アシル基は、Ｃ１４またはＣ１６脂肪酸アシル基である。代わりの態様において、アシル基は、コハク酸またはコハク酸誘導体（例えば、式Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩのコハク酸誘導体）である。代わりの態様において、アシル基は、マレイン酸またはマレイン酸誘導体（例えば、式ＶＩＩＩ、ＩＸまたはＸのマレイン酸誘導体）である。
【０５９８】
アルキル化アミノ酸に関しては、一部の態様において、非天然のアルキル基は、構造−Ｃｘ−ＣＯＯＨのカルボキシ官能基化されている炭素鎖であり、ｘは、整数であり、４〜３０の整数（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０）であってもよい。
例示的な態様において、クラス６ペプチドまたはクラス６グルカゴン類似体は、アシルもしくはアルキル基を２つ以上含む。この点において、ペプチドまたはグルカゴン類似体は、ジアシル化もしくは二重アシル化ペプチドであることができる。２つ以上のアシルまたはアルキル基は、直鎖構成に配置され、介在スペーサーを有してもよい。本明細書に記載の通り、２つ以上のアシルまたはアルキル基は、分枝構成に配置できる。例示的な態様において、２つのアシルまたはアルキル基は、Ｌｙｓスペーサー残基に結合している。
本開示の一部の態様において、クラス６グルカゴン類似体は、２７位のアミノ酸のＣ末端に少なくとも１つ荷電アミノ酸を含む。例えば、一部の態様において、クラス６グルカゴン類似体は、２８位に荷電アミノ酸（例えば、負荷電アミノ酸）を含む。一部の態様において、負荷電アミノ酸は、Ａｓｐである。代わりの態様において、２８位のアミノ酸は、正荷電アミノ酸であり、例えば正荷電アミノ酸は、式Ｉのアミノ酸、例えばＬｙｓである。
【０５９９】
代わりのまたは追加の態様において、クラス６グルカゴン類似体は、２７位、２９位、もしくは２７位と２９位の両方にアミノ酸改変を含む。例えば、一部の態様において、２７位のアミノ酸はＬｅｕ、Ｎｌｅ、ＶａｌもしくはＬｙｓであり、および／または一部の態様において２９位のアミノ酸はＧｌｙもしくはＴｈｒである。
【０６００】
本明細書にさらに述べられるように、本明細書に記載されるクラス６グルカゴン類似体は、配列番号１と比較して追加のアミノ酸改変、例えば、１０個以下（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個）の追加のアミノ酸改変を含むことができる。例示的な態様において、クラス６グルカゴン類似体は、
ａ）ペプチド類似体の１位のＤＰＰ−ＩＶ保護アミノ酸、
ｂ）３位の酸性アミノ酸、任意選択で、Ｇｌｕ、
ｃ）７位のＩｌｅ、
ｄ）１２位のＩｌｅまたはＡｒｇ、
ｅ）１５位の酸性アミノ酸、任意選択で、Ｇｌｕ、
ｆ）１８位の脂肪族アミノ酸、任意選択で、Ａｌａ、
ｇ）２１位の酸性アミノ酸、任意選択で、Ｇｌｕ、
ｈ）２４位のＡｓｎ、ＡｌａまたはＡＩＢ、
ｉ）２７位の脂肪族アミノ酸、任意選択で、ＡｌａもしくはＬｅｕ、またはＮｌｅ、
ｊ）２８位の酸性アミノ酸、任意選択で、Ｇｌｕまたは脂肪族アミノ酸、任意選択で、Ａｌａ、
ｋ）２９位の脂肪族アミノ酸、任意選択で、Ａｌａ、
ｌ）Ｃ末端のアミド化、
のうち１つまたは複数を含む。
【０６０１】
前述によると、例示的な態様におけるクラス６グルカゴン類似体は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号２７〜３３、３５〜４１、４３〜４６、７６〜８０、８３〜８７、８９、および９０のいずれか、または配列番号９４〜１００、１０２〜１１２、１２０〜１２４、１２７〜１３１のいずれかのアミノ酸配列を含む。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号９４〜１００、１０２〜１１２、１２０〜１２４、１２７〜１３１のいずれかを含む、またはそれからなる。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号２８、２９、３１、３７〜４１、４３〜４６、７６〜８０、８３〜８７、８９、および９０のいずれかを含む、またはそれからなる。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号２８、２９、３１、３７〜４１、７９、８０、８９、９０、９５、１３０、１４５〜１５２、１５５〜１６７、１７１、１７６、１７７、１８０、２０３〜２０７、２１２、および２３０のいずれかを含む、またはそれからなる。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号２７を含む、またはそれからなる。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号３０を含む、またはそれからなる。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号３２を含む、またはそれからなる。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号３３を含む、またはそれからなる。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号３５を含む、またはそれからなる。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号３６を含む、またはそれからなる。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号２８を含む、またはそれからなる。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号３７を含む、またはそれからなる。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号８９を含む、またはそれからなる。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号３１を含む、またはそれからなる。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号１８０を含む、またはそれからなる。
【０６０２】
本発明は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号２８の配列を含むペプチドをさらに提供する。例示的な態様において、ペプチドは配列番号２８からなる。
本発明により、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号３１の配列を含むペプチドも提供される。例示的な態様において、ペプチドは配列番号３１からなる。
本発明は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号３７の配列を含むペプチドをさらに提供する。例示的な態様において、ペプチドは配列番号３７からなる。
【０６０３】
本発明は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号８９の配列を含むペプチドをさらに提供する。例示的な態様において、ペプチドは配列番号８９からなる。
本発明は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号９５の配列を含むペプチドをさらに提供する。例示的な態様において、ペプチドは配列番号９５からなる。
本発明は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号１３０の配列を含むペプチドをさらに提供する。例示的な態様において、ペプチドは配列番号１３０からなる。
【０６０４】
さらに、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号３１の配列を含むペプチドが本明細書に提供される。例示的な態様において、ペプチドは配列番号１７１からなる。
本発明により、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号１８０の配列を含むペプチドも提供される。例示的な態様において、ペプチドは配列番号１８０からなる。
【０６０５】
本発明は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号１８４の配列
ＨＸ2Ｘ3ＧＴＦＴＳＤＸ10ＳＫＹＬＤＸ16ＲＸ18ＡＸ20Ｘ21ＦＶＱＷＬＸ27Ｘ28Ｘ29ＧＰＳＳＧＸ35ＰＰＰＳ（配列番号１８４）
［式中、
Ｘ2は、ＡＩＢであり、
Ｘ3は、ＧｌｎまたはＧｌｎ類似体であり、
Ｘ10は、ＴｙｒまたはＣ１２−Ｃ１８アシルもしくはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸であり、
Ｘ16は、任意のアミノ酸であり、Ｇｌｙ、ＰｒｏおよびＳｅｒ以外の任意のアミノ酸であってもよく、
Ｘ18は、ＡｒｇまたはＡｌａであり、
Ｘ20は、負荷電アミノ酸もしくは電荷中性アミノ酸であり、ＡＩＢまたはＧｌｎであってもよく、
Ｘ21は、酸性アミノ酸であり、ＡｓｐまたはＧｌｕであってもよく、
Ｘ27は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、ＮｌｅまたはＭｅｔであり、
Ｘ28は、Ａｌａまたは酸性アミノ酸であり（ＡｓｐまたはＧｌｕであってもよい）、
Ｘ29は、ＡｌａまたはＧｌｙであり、
Ｘ35は、Ａｌａまたは塩基性アミノ酸であり（ＡｒｇまたはＬｙｓであってもよい）、
Ｘ28が酸性アミノ酸である場合、Ｘ35は、塩基性アミノ酸であり、
Ｘ10がＴｙｒである場合、ペプチドは、４０位にＣ１２−Ｃ１８アシルまたはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸を含み、ペプチドは、４１位にＧｌｙを含んでもよく、
ペプチドのＣ末端アミノ酸は、アミド化されている］
を含むペプチドを提供する。
【０６０６】
例示的な態様において、配列番号１８４のＸ１０は、Ｔｙｒであり、ペプチドは、４０位にＣ１２−Ｃ１８アシルまたはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸を含み、ペプチドは、４１位にＧｌｙを含んでもよい。例示的な態様において、配列番号１８４のＸ１０は、Ｃ１２−Ｃ１８アシルまたはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸である。
例示的な態様において、配列番号１８４のＸ２０は、Ｇｌｎであり、１６位のアミノ酸は、負荷電アミノ酸（例えば、Ｇｌｕ）であってもよい。例示的な態様において、配列番号１８４のＸ１８は、Ａｌａであり、ペプチドは、Ｅ１６、Ｒ１７、Ａ１８、Ａ１９およびＱ２０を含む。
代わりの例示的な態様において、配列番号１８４のＸ２０は、ＡＩＢである。配列番号１８４のＸ１６は、ＡＩＢ以外の任意のアミノ酸であってもよい。
【０６０７】
また、例示的な態様において、（ｉ）配列番号１８４のＸ２８は、酸性アミノ酸であり、ＡｓｐまたはＧｌｕであってもよく、配列番号１８４のＸ３５は、塩基性アミノ酸であり、ＡｒｇまたはＬｙｓであってもよく、（ｉｉ）配列番号１８４のＸ２７、Ｘ２８およびＸ２９のうち１つだけが、Ａｌａであり、（ｉｉｉ）ペプチドは、Ｃ末端にアミド化されたＧｌｙを含む。
【０６０８】
本発明は、配列番号１８４と比較して３つ以下のアミノ酸改変（例えば、保存的置換）を持つ配列番号１８４の配列を含むペプチドも提供し、類似体は、ヒトＧＩＰ受容体、ヒトＧＬＰ−１受容体およびヒトグルカゴン受容体のそれぞれに対してアゴニスト活性を呈する。例示的な実施形態において、グルカゴン類似体のヒトＧＩＰ受容体、ヒトＧＬＰ−１受容体およびヒトグルカゴン受容体のそれぞれに対する活性（例えば、ＥＣ５０）は、互いの１００倍以内（例えば、５０倍以内、２５倍以内、１０倍以内）である。
【０６０９】
本発明は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号１８５の配列
ＨＸ2ＱＧＴＦＴＳＤＸ10ＳＫＹＬＤＸ16ＲＸ18ＡＸ20Ｘ21ＦＶＱＷＬＸ27Ｘ28Ｘ29ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１８５）
（式中：
Ｘ2は、ＡＩＢであり、
Ｘ10は、ＴｙｒまたはＣ１２−Ｃ１８アシルもしくはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸であり、
Ｘ16は、Ｇｌｕ、アルファ，アルファ二置換アミノ酸、またはＬｙｓであり、
Ｘ18は、ＡｒｇまたはＡｌａであり、
Ｘ20は、ＡＩＢまたはＧｌｎであり、
Ｘ21は、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、
Ｘ27は、Ｌｅｕ、ＮｌｅまたはＭｅｔであり、
Ｘ28は、Ａｌａ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、
Ｘ29は、ＧｌｙまたはＴｈｒであり、
Ｘ10がＴｙｒである場合、ペプチドは、４０位にＣ１２−Ｃ１８アシルまたはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸を含み、ペプチドは、４１位にＧｌｙを含んでもよく、
ペプチドのＣ末端アミノ酸は、アミド化されている）
を含むペプチドをさらに提供する。
【０６１０】
本発明は、配列番号１８５と比較して３つ以下のアミノ酸改変（例えば、保存的置換）を持つ配列番号１８５の配列を含むペプチドを提供し、類似体は、ヒトＧＩＰ受容体、ヒトＧＬＰ−１受容体およびヒトグルカゴン受容体のそれぞれに対してアゴニスト活性を呈する。例示的な実施形態において、グルカゴン類似体のヒトＧＩＰ受容体、ヒトＧＬＰ−１受容体およびヒトグルカゴン受容体のそれぞれに対する活性（例えば、ＥＣ５０）は、互いの１００倍以内（例えば、５０倍以内、２５倍以内、１０倍以内）である。
【０６１１】
本発明は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）にある配列番号１９６の配列、
ＨＸ2Ｘ3ＧＴＦＴＳＤＸ10ＳＫＹＬＤＸ16ＲＸ18ＡＸ20Ｘ21ＦＶＱＷＬＸ27Ｘ28Ｘ29ＧＰＳＳＧＸ35ＰＰＰＳ（配列番号１９６）
［式中、
Ｘ2は、ＡＩＢであり、
Ｘ3は、ＧｌｎもしくはＧｌｎ類似体またはグルカゴン活性を減少させるアミノ酸（Ｇｌｕであってもよい）であり、
Ｘ10は、ＴｙｒまたはＣ１２−Ｃ１８アシルもしくはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸であり、
Ｘ16は、任意のアミノ酸であり、Ｇｌｙ、ＰｒｏおよびＳｅｒ以外の任意のアミノ酸であってもよく、
Ｘ18は、ＡｒｇまたはＡｌａであり、
Ｘ20は、負荷電アミノ酸もしくは電荷中性アミノ酸であり、ＡＩＢまたはＧｌｎであってもよく、
Ｘ21は、酸性アミノ酸であり、ＡｓｐまたはＧｌｕであってもよく、
Ｘ27は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、ＮｌｅまたはＭｅｔであり、
Ｘ28は、Ａｌａまたは酸性アミノ酸であり（ＡｓｐまたはＧｌｕであってもよい）、
Ｘ29は、ＡｌａまたはＧｌｙであり、
Ｘ35は、Ａｌａまたは塩基性アミノ酸であり（ＡｒｇまたはＬｙｓであってもよい）、
Ｘ28が酸性アミノ酸である場合、Ｘ35は、塩基性アミノ酸であり、
Ｘ10がＴｙｒである場合、ペプチドは、４０位にＣ１２−Ｃ１８アシルまたはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸を含み、ペプチドは、４１位にＧｌｙを含んでもよく、ペプチドのＣ末端アミノ酸は、アミド化されている］
を含むペプチドも提供する。
【０６１２】
グルカゴン活性を減少させる追加のアミノ酸が、本明細書に記載される。例示的な態様において、Ｘ３は酸性、塩基性または疎水性アミノ酸（例えば、グルタミン酸、オルニチン、ノルロイシン）である。例示的な態様において、Ｘ３はＧｌｕである。
【０６１３】
さらに、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号１８６の配列：
ＨＸ2Ｘ3ＧＴＦＴＳＤＸ10ＳＫＹＬＤＸ16ＲＸ18ＡＸ20Ｘ21ＦＶＱＷＬＸ27Ｘ28Ｘ29（配列番号１８６）
［式中、
Ｘ2は、ＡＩＢであり、
Ｘ3は、ＧｌｎまたはＧｌｎ類似体であり、
Ｘ10は、ＴｙｒまたはＣ１０−Ｃ２６アシルもしくはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸であり、
Ｘ16は、任意のアミノ酸であり、Ｇｌｙ、ＰｒｏおよびＳｅｒ以外の任意のアミノ酸であってもよく、
Ｘ18は、ＡｒｇまたはＡｌａであり、
Ｘ20は、負荷電アミノ酸もしくは電荷中性アミノ酸であり、ＡＩＢまたはＧｌｎであってもよく、
Ｘ21は、酸性アミノ酸であり、ＡｓｐまたはＧｌｕであってもよく、
Ｘ27は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、ＮｌｅまたはＭｅｔであり、
Ｘ28は、Ａｌａまたは酸性アミノ酸であり（ＡｓｐまたはＧｌｕであってもよい）、
Ｘ29は、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり、
ペプチドは、１０位にＣ１０−Ｃ２６アシルまたはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸を含んでもよく、ペプチドのＣ末端アミノ酸は、アミド化されている］
を含むペプチドが提供される。
【０６１４】
例示的な態様において、配列番号１８６のＸ２０は、ＡＩＢである。例示的な態様において、Ｘ２９は、Ｔｈｒであり、ペプチドは、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号５）を含まない。一部の態様において、配列番号１８６のＸ２０は、ＡＩＢであり、Ｘ１６は、ＡＩＢ以外のアミノ酸である。
例示的な態様において、Ｘ２０は、Ｇｌｎである。一部の態様において、Ｘ１６は、負荷電アミノ酸であり、Ｇｌｕであってもよい。例示的な態様において、Ｘ１８は、Ａｌａであり、ペプチドは、Ｅ１６、Ｒ１７、Ａ１８、Ａ１９およびＱ２０を含んでもよい。
【０６１５】
一部の態様において、配列番号１８６のペプチドは、２９位のアミノ酸のＣ末端に１〜２１個のアミノ酸の伸長を含み、２９位のアミノ酸はＧｌｙであってもよい。例示的な態様において、伸長は、アミノ酸配列ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号５）、もしくはその保存的に置換された配列を含み、または伸長は、配列Ｘ１−Ｘ２を含み、Ｘ１は、荷電アミノ酸であり、Ｘ２は、小型脂肪族アミノ酸であり、Ｘ１は正荷電アミノ酸であってもよい。一部の態様において、正荷電アミノ酸はＡｒｇであり、ペプチドはＡｒｇ−Ｇｌｙを含んでもよく、またはそれからなってもよい。ある特定の態様において、伸長は、アミノ酸配列ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号５）それに続くＬｙｓまたはＬｙｓ−Ｇｌｙを含み、ＬｙｓはＣ１０−Ｃ２６アシル基に共有結合により結合している。
【０６１６】
例示的な態様において、ペプチドは、配列番号１８６を含み、Ｘ２は、ＡＩＢであり、Ｘ３は、Ｇｌｎであり、Ｘ１０は、Ｃ１０−Ｃ２６アシルまたはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸であり、Ｘ１８は、ＡｒｇまたはＡｌａであり、Ｘ２０は、ＡＩＢまたはＧｌｎであり、Ｘ２１は、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘ２９は、Ｇｌｙであり、Ｃ末端アミノ酸は、アミド化されており、２９位のＧｌｙは、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳに融合されてその後ＬｙｓまたはＬｙｓ−Ｇｌｙが続き、Ｌｙｓは、Ｃ１０−Ｃ２６アシル基に共有結合により結合している。
【０６１７】
本発明は、配列番号１８６と比較して３つ以下のアミノ酸改変（例えば、保存的置換）を持つ配列番号１８６の配列を含むペプチドも提供し、類似体は、ヒトＧＩＰ受容体、ヒトＧＬＰ−１受容体およびヒトグルカゴン受容体のそれぞれに対してアゴニスト活性を呈する。例示的な実施形態において、グルカゴン類似体のヒトＧＩＰ受容体、ヒトＧＬＰ−１受容体およびヒトグルカゴン受容体のそれぞれに対する活性（例えば、ＥＣ５０）は、互いの１００倍以内（例えば、５０倍以内、２５倍以内、１０倍以内）である。
【０６１８】
本発明は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号１８７の配列：
ＨＸ2ＱＧＴＦＴＳＤＸ10ＳＫＹＬＤＸ16ＲＸ18ＡＸ20Ｘ21ＦＶＱＷＬＸ27Ｘ28Ｘ29（配列番号１８７）
（式中：
Ｘ2は、ＡＩＢであり、
Ｘ10は、ＴｙｒまたはＣ１０−Ｃ２６アシルもしくはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸であり、
Ｘ16は、Ｇｌｕ、アルファ，アルファ二置換アミノ酸、またはＬｙｓであり、
Ｘ18は、ＡｒｇまたはＡｌａであり、
Ｘ20は、負荷電アミノ酸もしくは電荷中性アミノ酸であり、ＡＩＢまたはＧｌｎであってもよく、
Ｘ21は、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、
Ｘ27は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、ＮｌｅまたはＭｅｔであり、
Ｘ28は、Ａｌａ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、
Ｘ29は、ＧｌｙまたはＴｈｒであり、
ペプチドは、１０位にＣ１２−Ｃ１８アシルまたはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸を含んでもよく、ペプチドのＣ末端アミノ酸は、アミド化されている）
を含むペプチドを提供する。
【０６１９】
本発明は、配列番号１８７と比較して３つ以下のアミノ酸改変（例えば、保存的置換）を有する配列番号１８７の配列を含むペプチドも提供し、類似体は、ヒトＧＩＰ受容体、ヒトＧＬＰ−１受容体およびヒトグルカゴン受容体のそれぞれに対してアゴニスト活性を呈する。例示的な実施形態において、グルカゴン類似体のヒトＧＩＰ受容体、ヒトＧＬＰ−１受容体およびヒトグルカゴン受容体のそれぞれに対する活性（例えば、ＥＣ５０）は、互いの１００倍以内（例えば、５０倍以内、２５倍以内、１０倍以内）である。
【０６２０】
本発明は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号１９８の配列：
ＨＸ2Ｘ3ＧＴＦＴＳＤＸ10ＳＫＹＬＤＸ16ＲＸ18ＡＸ20Ｘ21ＦＶＱＷＬＸ27Ｘ28Ｘ29（配列番号１９８）
［式中、
Ｘ2は、ＡＩＢであり、
Ｘ3は、ＧｌｎもしくはＧｌｎ類似体またはグルカゴン活性を減少させるアミノ酸（例えば、Ｇｌｕ）であり、
Ｘ10は、ＴｙｒまたはＣ１０−Ｃ２６アシルもしくはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸であり、
Ｘ16は、任意のアミノ酸であり、Ｇｌｙ、ＰｒｏおよびＳｅｒ以外の任意のアミノ酸であってもよく、
Ｘ18は、ＡｒｇまたはＡｌａであり、
Ｘ20は、負荷電アミノ酸もしくは電荷中性アミノ酸であり、ＡＩＢまたはＧｌｎであってもよく、
Ｘ21は、酸性アミノ酸であり、ＡｓｐまたはＧｌｕであってもよく、
Ｘ27は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、ＮｌｅまたはＭｅｔであり、
Ｘ28は、Ａｌａまたは酸性アミノ酸であり（ＡｓｐまたはＧｌｕであってもよい）、
Ｘ29は、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり、
ペプチドは、１０位にＣ１０−Ｃ２６アシルまたはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸を含んでもよく、ペプチドのＣ末端アミノ酸は、アミド化されている］、
を含むペプチドを提供する。
【０６２１】
グルカゴン活性を減少させる追加のアミノ酸が、本明細書に記載される。例示的な態様において、Ｘ３は酸性、塩基性または疎水性アミノ酸（例えば、グルタミン酸、オルニチン、ノルロイシン）である。例示的な態様において、Ｘ３はＧｌｕである。
【０６２２】
本発明は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号１８４を含むペプチドを提供する。本発明は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号１８５の配列を含むペプチドを提供する。本発明は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号１９６の配列を含むペプチドを提供する。本発明は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号１８６の配列を含むペプチドを提供する。本発明は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号１８７の配列を含むペプチドを提供する。本発明は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号１９８の配列を含むペプチドを提供する。
【０６２３】
さらに、
（ａ）１位にイミダゾール側鎖を含むアミノ酸、
（ｂ）１６位に式ＩＶのアミノ酸：
【化４０】
2016521253.tif 000045
［式ＩＶ］
（式中、ｎは１〜７であり、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１８アルキル、（Ｃ１−Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ１８アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ０−Ｃ４アルキル）（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０−Ｃ４アルキル）（Ｃ２−Ｃ５複素環）、（Ｃ０−Ｃ４アルキル）（Ｃ６−Ｃ１０アリール）Ｒ７、および（Ｃ１−Ｃ４アルキル）（Ｃ３−Ｃ９ヘテロアリール）からなる群からそれぞれ独立に選択され、Ｒ７はＨまたはＯＨであり、式ＩＶのアミノ酸の側鎖は遊離アミノ基を含んでもよい）
（ｃ）２０位にアルファ，アルファ二置換アミノ酸、
（ｄ）配列番号１と比較して１０個以下の追加のアミノ酸改変、
を含む、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴン（配列番号１）の類似体が本明細書に提供され、類似体が親水性部分を欠いている場合、グルカゴン類似体は、ＧＩＰ受容体に対して天然ＧＩＰの少なくとも０．１％の活性を呈し、グルカゴン類似体は、ＧＩＰ受容体と対比してヒトＧＬＰ−１受容体に対して１００倍未満の選択性を有する。
【０６２４】
例示的な実施形態において、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴン（配列番号１）の類似体は、
（ａ）１位にイミダゾール側鎖を含むアミノ酸、
（ｂ）１６位に式ＩＶのアミノ酸：
【化４１】
2016521253.tif 000046
［式ＩＶ］
（式中、ｎは１〜７であり、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、Ｈ、Ｃ1−Ｃ18アルキル、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＯＨ、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＳＨ、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ6）シクロアルキル、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ2−Ｃ5複素環）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7、および（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ9ヘテロアリール）からなる群からそれぞれ独立に選択され、Ｒ７はＨまたはＯＨであり、式ＩＶのアミノ酸の側鎖は遊離アミノ基を含んでもよい）
（ｃ）２０位にアルファ，アルファ二置換アミノ酸、
（ｄ）配列番号１と比較して１０個以下の追加のアミノ酸改変、
のうち１つまたは複数含み、類似体が異種性部分、例えば親水性部分（例えば、ＰＥＧ）を欠いている場合、グルカゴン類似体は、ＧＩＰ受容体に対して天然ＧＩＰの少なくともまたは約０．１％（例えば、少なくともまたは約１％、少なくともまたは約１０％、少なくともまたは約５０％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約１００％、少なくともまたは約５００％）の活性を呈する。例示的な態様において、ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対するＥＣ５０より１００倍未満（例えば、約９０倍またはそれ未満、約８０倍またはそれ未満、約７０倍またはそれ未満、約６０倍またはそれ未満、約５０倍またはそれ未満、約４０倍またはそれ未満、約３０倍またはそれ未満、約２０倍またはそれ未満、約１５倍またはそれ未満、約１０倍またはそれ未満、約５倍またはそれ未満）異なり、グルカゴン受容体に対するＥＣ５０と１００倍未満（例えば、約９０倍またはそれ未満、約８０倍またはそれ未満、約７０倍またはそれ未満、約６０倍またはそれ未満、約５０倍またはそれ未満、約４０倍またはそれ未満、約３０倍またはそれ未満、約２０倍またはそれ未満、約１５倍またはそれ未満、約１０倍またはそれ未満、約５倍またはそれ未満）異なってもよいＧＩＰ受容体に対するＥＣ５０を有する。
【０６２５】
例示的な実施形態において、グルカゴン類似体は、１位に式Ａの構造
【化４２】
2016521253.tif 000047
［式Ａ］
［式中、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、Ｈ、（Ｃ１−６）アルキル、Ｏ（Ｃ１−６）アルキル、（Ｃ１−６）アルキル−ＯＨ、Ｆ、および少なくとも１つのＨがＦによって置き換えられている（Ｃ１−Ｃ６）アルキルからなる群からそれぞれ独立に選択される］
を含むアミノ酸を含む。
【０６２６】
例示的な態様において、１位のアミノ酸は、グルカゴン（配列番号１）の天然の残基Ｌ−ヒスチジン（Ｈｉｓ）であり、またはＨｉｓの誘導体（Ｈｉｓ誘導体）、例えば、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシルヒスチジン、アセチルヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファメチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、またはアルファ，アルファジメチルイミダゾール（ｉｍｉｄｉａｚｏｌｅ）酢酸（ＤＭＩＡ）である。
【０６２７】
例示的な態様において、グルカゴン類似体は、（ｂ）の１６位に式ＩＶのアミノ酸を含み、ホモＬｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎまたは２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）である。
例示的な態様において、２０位のアミノ酸、例えばアルファ，アルファ二置換アミノ酸は、Ｒ１およびＲ２を含み、そのそれぞれは、アルファ炭素に結合しており、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、Ｃ１−Ｃ４アルキルからなる群からそれぞれ独立に選択され、ヒドロキシル、アミド、チオール、ハロで置換されていてもよい、またはＲ１およびＲ２は、それらが結合しているアルファ炭素と共に環を形成する。例示的な態様において、２０位のアルファ，アルファ二置換は、ＡＩＢである。他の例示的な態様において、２０位のアルファ，アルファ二置換はＡＣＰＣである。
【０６２８】
例示的な態様において、グルカゴン類似体は、配列番号１と比較して１０個以下の追加の修飾を含む。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、配列番号１と比較して２、１２、１７、１８、２１、２４、２７、２８および２９位の１つまたは複数にアミノ酸置換を含む。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、
ｉ．２位のＤＰＰ−ＩＶ保護アミノ酸、任意選択でＡＩＢまたはＤ−Ｓｅｒ、
ｉｉ．１２位の大型脂肪族、無極性アミノ酸、任意選択でＩｌｅ、
ｉｉｉ．１７位のＡｒｇ以外のアミノ酸、任意選択でＧｌｎ、
ｉｖ．１８位の小型脂肪族アミノ酸、任意選択でＡｌａ、
ｖ．２１位のＡｓｐ以外のアミノ酸、任意選択でＧｌｕ、
ｖｉ．２４位のＧｌｎ以外のアミノ酸、任意選択でＡｓｎまたはＡｌａ、
ｖｉｉ．２７位のＭｅｔ以外のアミノ酸、任意選択でＬｅｕ、
ｖｉｉｉ．２８位のＡｓｎ以外のアミノ酸、任意選択でＡｌａ、
ｉｘ．２９位のＴｈｒ以外のアミノ酸、任意選択でＧｌｙ、および
ｘ．２９位のアミノ酸に１〜２１個のアミノ酸Ｃ末端伸長
のうち１つまたは複数を含む。
【０６２９】
例示的な態様において、グルカゴン類似体は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳまたはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＣの伸長を含む。
例示的な態様において、１位にＨｉｓ、１６位にＬｙｓおよび２０位にＡＩＢを含むグルカゴン類似体は、１７〜１８位にＧｌｎ−Ａｌａを含まない。
他の例示的な実施形態において、グルカゴン類似体は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号４８、５２、５３、および７４のいずれかのアミノ酸配列を含む。そのようなグルカゴン類似体は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号２７〜３３、３５〜４１、４３〜４６、７６〜８０、８３〜８７、８９、および９０の構造に類似しているが、前述のグルカゴン類似体（配列番号４８、５２、５３、および７４）は、アシル化アミノ酸またはアルキル化アミノ酸を含まない。
さらに他の例示的な実施形態において、グルカゴン類似体は、配列番号５０、５１、５４、５６、５８〜６０、６２〜６６、６８〜７０、７２、７３、７５、８１、８２、８８、および９２のいずれか、または配列番号１１４〜１１９、１２５、１２６、および１３３のいずれか、または配列番号１３９〜１４４、１５０〜１５３、２０８、２１０、および２１１のいずれかのアミノ酸配列を含み、すべての配列番号は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４を参照し、その全体を参照により本明細書に組み込む。そのようなグルカゴン類似体は、１位に大きい、芳香族アミノ酸、例えばＴｙｒを含む。
【０６３０】
一部の実施形態において、グルカゴンスーパーファミリーペプチドは、配列番号２７〜３３、３５〜４１、４３〜４６、７６〜８０、８３〜８７、８９、９０、９４〜１００、１０２〜１１２、１２０〜１２４、および１２７〜１３１のいずれか、または配列番号４８、５２、５３、および７４のいずれか、または配列番号５０、５１、５４、５６、５８〜６０、６２〜６６、６８〜７０、７２、７３、７５、８１、８２、８８、９２、１１４〜１１９、１２５、１２６、および１３３のいずれかのアミノ酸配列を含み、すべての配列番号は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４を参照し、その全体を参照により本明細書に組み込む。一部の実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４の配列番号２８、２９、３１、３７〜４１、７９、８０、８９、９０、９５、１３０、１４５〜１５２、１５５〜１６７、１７１、１７６、１７７、１８０、２０３〜２０７、２１２、および２３０のいずれかのアミノ酸配列を含み、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【０６３１】
一部の実施形態において、グルカゴンスーパーファミリーペプチドは、配列番号２７〜３３、３５〜４１、４３〜４６、７６〜８０、８３〜８７、８９、９０、９４〜１００、１０２〜１１２、１２０〜１２４、および１２７〜１３１のいずれか、または配列番号４８、５２、５３、および７４のいずれか、または配列番号５０、５１、５４、５６、５８〜６０、６２〜６６、６８〜７０、７２、７３、７５、８１、８２、８８、９２、１１４〜１１９、１２５、１２６、および１３３のいずれか、または配列番号２８、２９、３１、３７〜４１、７９、８０、８９、９０、９５、１３０、１４５〜１５２、１５５〜１６７、１７１、１７６、１７７、１８０、２０３〜２０７、２１２、および２３０のいずれかを含む元の配列に基づく構造を含むが、１つもしくは複数の位置で元の配列と異なり、すべての配列番号は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４を参照し、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【０６３２】
一部のまたは任意の実施形態において、本開示のペプチドは、配列番号２７〜３３、３５〜４１、４３〜４６、７６〜８０、８３〜８７、８９、９０、９４〜１００、１０２〜１１２、１２０〜１２４、および１２７〜１３１のいずれか、または配列番号４８、５２、５３、および７４のいずれか、または配列番号５０、５１、５４、５６、５８〜６０、６２〜６６、６８〜７０、７２、７３、７５、８１、８２、８８、９２、１１４〜１１９、１２５、１２６、および１３３のいずれか、または配列番号２８、２９、３１、３７〜４１、７９、８０、８９、９０、９５、１３０、１４５〜１５２、１５５〜１６７、１７１、１７６、１７７、１８０、２０３〜２０７、２１２、および２３０のいずれかを含む元の配列の類似体であり、類似体のアミノ酸配列は、１つもしくは複数［例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、場合によっては１６個またはより多く（例えば、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個など）］の指定されたもしくは任意のアミノ酸改変を含むので、元の配列のアミノ酸配列に基づくが元の配列と異なるアミノ酸配列を含み、すべての配列番号は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４を参照し、その全体を参照により本明細書に組み込む。一部のまたは任意の実施形態において、本開示のペプチドは、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号２７〜３３、３５〜４１、４３〜４６、７６〜８０、８３〜８７、８９、９０、９４〜１００、１０２〜１１２、１２０〜１２４、および１２７〜１３１のいずれか、または配列番号４８、５２、５３、および７４のいずれか、または配列番号５０、５１、５４、５６、５８〜６０、６２〜６６、６８〜７０、７２、７３、７５、８１、８２、８８、９２、１１４〜１１９、１２５、１２６、および１３３のいずれか、または配列番号２８、２９、３１、３７〜４１、７９、８０、８９、９０、９５、１３０、１４５〜１５２、１５５〜１６７、１７１、１７６、１７７、１８０、２０３〜２０７、２１２、および２３０のいずれかを含む元の配列と比較して合計１つ、２つ以下、３つ以下、４つ以下、５つ以下、６つ以下、７つ以下、８つ以下、９つ以下、または１０個以下の追加のアミノ酸改変を含む。一部のまたは任意の実施形態において、修飾は、グルカゴン類似体に関して本明細書に記載される修飾、例えば、アシル化、アルキル化、ペグ化、Ｃ末端での切断、１、２、３、７、１０、１２、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２４、２７、２８、および２９位のうち１つもしくは複数のアミノ酸の置換、のいずれかである。
【０６３３】
一部のまたは任意の実施形態において、修飾は、アミノ酸置換もしくは置き換え、例えば、保存的アミノ酸置換である。一部の態様において、保存的置換は、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８または２９位のうち１つもしくは複数のアミノ酸の置き換えである。代わりの実施形態において、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換ではなく、例えば、非保存的アミノ酸置換である。
【０６３４】
一部の実施形態において、本開示のペプチドは、配列番号２７〜３３、３５〜４１、４３〜４６、７６〜８０、８３〜８７、８９、９０、９４〜１００、１０２〜１１２、１２０〜１２４、および１２７〜１３１のいずれか、または配列番号４８、５２、５３、および７４のいずれか、または配列番号５０、５１、５４、５６、５８〜６０、６２〜６６、６８〜７０、７２、７３、７５、８１、８２、８８、９２、１１４〜１１９、１２５、１２６、および１３３のいずれか、または配列番号２８、２９、３１、３７〜４１、７９、８０、８９、９０、９５、１３０、１４５〜１５２、１５５〜１６７、１７１、１７６、１７７、１８０、２０３〜２０７、２１２、および２３０のいずれかを含む元の配列のアミノ酸配列に対して少なくとも２５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、すべての配列番号は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４を参照し、その全体を参照により本明細書に組み込む。一部の実施形態において、本開示のペプチドは、元の配列に対して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％の配列同一性がある、または９０％より大きい配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、上述した％配列同一性を有するここに開示するペプチドのアミノ酸配列は、ここに開示するペプチドの全長アミノ酸配列である。一部の実施形態において、上述した％配列同一性を有する本開示のペプチドのアミノ酸配列は、ここに開示するペプチドのアミノ酸配列の一部しかない。一部の実施形態において、ここに開示するペプチドは、元の配列のうち連続する少なくとも５個のアミノ酸（例えば、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個のアミノ酸）の参照アミノ酸配列に対して約Ａ％またはより大きな配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照アミノ酸配列は、配列番号１のＣ位のアミノ酸から始まり配列番号１のＤ位のアミノ酸で終わり、Ａは、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９であり；Ｃは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８であり、Ｄは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９である。前述のパラメーターの考え得る全部の組合せが想像され、例えば、Ａが９０％であり、ＣおよびＤが、１および２７、または６および２７、または８および２７、または１０および２７、または１２および２７、または１６および２７を含むがこれに限定されない。
【０６３５】
配列番号２７〜３３、３５〜４１、４３〜４６、７６〜８０、８３〜８７、８９、および９０のいずれか、または配列番号４８、５２、５３、および７４のいずれか、または配列番号５０、５１、５４、５６、５８〜６０、６２〜６６、６８〜７０、７２、７３、７５、８１、８２、８８、および９２のいずれかを含む、または配列番号２８、２９、３１、３７〜４１、７９、８０、８９、９０、９５、１３０、１４５〜１５２、１５５〜１６７、１７１、１７６、１７７、１８０、２０３〜２０７、２１２、および２３０のいずれかを含むいずれかの元の配列の類似体は、本明細書に記載の通り、任意のアミノ酸数のペプチド骨格を含むことができる、すなわち、任意のペプチド長であることができ、すべての配列番号は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４を参照し、その全体を参照により本明細書に組み込み、一部の実施形態において、本明細書に記載されるペプチドは、配列番号１と同じ長さ、すなわち、アミノ酸２９個の長さである。一部の実施形態において、ここに開示するペプチドは、アミノ酸２９個の長さより長く、例えば本明細書にさらに記載されるように、ここに開示するペプチドは、アミノ酸１〜２１個のＣ末端伸長を含む。したがって、一部の実施形態において、本開示のペプチドは、アミノ酸３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個の長さである。一部の実施形態において、ここに開示するペプチドは、アミノ酸５０個の長さ以下である。一部の実施形態において、ここに開示するペプチドは、別のペプチドと融合することにより、アミノ酸２９個の長さより長い［例えば、アミノ酸５０個より長い（例えば、アミノ酸少なくともまたは約６０、少なくともまたは約７０、少なくともまたは約８０、少なくともまたは約９０、少なくともまたは約１００、少なくともまたは約１５０、少なくともまたは約２００、少なくともまたは約２５０、少なくともまたは約３００、少なくともまたは約３５０、少なくともまたは約４００、少なくともまたは約４５０、少なくともまたは約５００個のアミノ酸の長さ）］。他の実施形態において、ここに開示するペプチドは、アミノ酸２９個未満の長さ、例えば、アミノ酸２８、２７、２６、２５、２４、２３個である。
【０６３６】
前述によると、一部の態様において、本開示のペプチドは、配列番号２７〜３３、３５〜４１、４３〜４６、７６〜８０、８３〜８７、８９、９０、９４〜１００、１０２〜１１２、１２０〜１２４、および１２７〜１３１のいずれか、または配列番号４８、５２、５３、および７４のいずれか、または配列番号５０、５１、５４、５６、５８〜６０、６２〜６６、６８〜７０、７２、７３、７５、８１、８２、８８、９２、１１４〜１１９、１２５、１２６、および１３３のいずれか、または配列番号２８、２９、３１、３７〜４１、７９、８０、８９、９０、９５、１３０、１４５〜１５２、１５５〜１６７、１７１、１７６、１７７、１８０、２０３〜２０７、２１２、および２３０のいずれかを含む元の配列の類似体であり、類似体の配列は、ＧＩＰ活性、グルカゴン活性および／もしくはＧＬＰ−１活性に影響を及ぼす、例えばペプチドの分解を減少させることにより（例えば、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼに対する抵抗性を改善することにより）安定性を増強する、可溶性を増強する、半減期を増加させる、作用の発現を遅延させる、ＧＩＰ、グルカゴンもしくはＧＬＰ−１受容体に対する作用持続時間を延長する、または前述のいずれかの組合せである１つもしくは複数のアミノ酸改変を含み、すべての配列番号は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／６６１６４を参照し、その全体を参照により本明細書に組み込む。他の修飾に加えて、そのようなアミノ酸改変が、グルカゴン類似体に関して本明細書においてさらに記載され、これらの修飾のいずれかは、個々にまたは組み合せて適用することができる。
【０６３７】
さらなる例示的な実施形態
例示的な実施形態において、本開示のペプチドは、（ｉ）１位にイミダゾール側鎖を含むアミノ酸、（ｉｉ）２位にＤＰＰ−ＩＶ保護アミノ酸、（ｉｉｉ）アシルもしくはアルキル基がスペーサーによりアミノ酸に連結されていてもよい、９、１０、１２、１６、２０または３７〜４３位のいずれかにアシル化アミノ酸もしくはアルキル化アミノ酸；（ｉｖ）２０位に、（ｉ）アルファ，アルファ二置換アミノ酸；および（ｉｉ）イミダゾール側鎖を含むアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸；ならびに（ｖ）配列番号１と比較して１０個以下の追加のアミノ酸改変、を含むグルカゴン（配列番号１）の類似体であり、グルカゴン類似体が異種性部分、例えば親水性部分（例えばＰＥＧ）にコンジュゲートされていない場合、グルカゴン類似体は、ＧＩＰ受容体に対して天然ＧＩＰの少なくともまたは約０．１％（例えば、少なくともまたは約１％、少なくともまたは約１０％、少なくともまたは約５０％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約１００％、少なくともまたは約５００％）の活性を呈する。
【０６３８】
ここで記載されるグルカゴン類似体は、本明細書に記載される任意の活性プロファイルを含むことができる。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、少なくとももしくは約１％、少なくとももしくは約１０％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約１００％、少なくとももしくは約３００％、または少なくとももしくは約５００％のＧＩＰパーセンテージ効力を呈する。一部の態様において、グルカゴン類似体は、少なくとももしくは約１％、少なくとももしくは約１０％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約１００％、少なくとももしくは約３００％、または少なくとももしくは約５００％のＧＬＰ−１パーセンテージ効力も呈する。代わりのまたは追加の態様において、グルカゴン類似体は、少なくとももしくは約１％、少なくとももしくは約１０％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約９０％、または少なくとももしくは約１００％のグルカゴンパーセンテージ効力を呈する。したがって、グルカゴン類似体は、ＧＩＰアゴニストペプチドと考えることができるが、一部の態様において、グルカゴン類似体は、ＧＩＰ−ＧＬＰ−１共アゴニスト、ＧＩＰ−グルカゴン共アゴニスト、またはＧＩＰ−ＧＬＰ−１−グルカゴン（ｇｌｕｃｇａｏｎ）トリアゴニストとさらに考えることができる。例えば、ペプチドは、ヒトＧＩＰ受容体、ヒトＧＬＰ−１受容体および任意選択でヒトグルカゴン受容体のそれぞれに対してアゴニスト活性を呈することができ、ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対するＥＣ５０の１００倍以内（例えば、５０倍、４０倍、３０倍、２０倍、１５倍、１０倍またはより少ない）の、およびグルカゴン受容体に対するＥＣ５０の１００倍以内（例えば、５０倍、４０倍、３０倍、２０倍、１５倍、１０倍またはより少ない）でもよい、ＧＩＰ受容体に対するＥＣ５０を呈する。
【０６３９】
例示的な実施形態において、グルカゴン類似体は、１位にイミダゾール側鎖を含むアミノ酸を含む。例示的な態様において、１位のアミノ酸は、式Ａの構造、
【化４３】
2016521253.tif 000048
［式Ａ］
［式中：Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、Ｈ、（Ｃ１−６）アルキル、Ｏ（Ｃ１−６）アルキル、（Ｃ１−６）アルキル−ＯＨ、Ｆ、および少なくとも１つのＨがＦによって置き換えられている（Ｃ１−Ｃ６）アルキルからなる群からそれぞれ独立に選択される］
を含む。例示的な態様において、１位のアミノ酸は、式Ａの類似体構造を含み、一方または両方の環窒素が、Ｃ１−Ｃ３アルキルに結合している。
【０６４０】
例示的な態様において、１位のアミノ酸は、グルカゴン（配列番号１）の天然の残基Ｌ−ヒスチジン（Ｈｉｓ）であり、またはＨｉｓの誘導体（Ｈｉｓ誘導体）、例えば、アルファ原子が修飾されているＨｉｓの誘導体である。本明細書では、用語「Ｈｉｓ誘導体」とは、少なくとも１つの炭素原子に結合している、例えば、式Ａの構造を含むイミダゾール、または置換されたイミダゾールを含む化学的部分のことを指す。例示的な実施形態において、Ｈｉｓ誘導体は、ヒスチジンの構造と類似の構造を含むが、アルファアミン、アルファ炭素、またはアルファカルボキシレートは別の化学的部分で置き換えられている。例示的な実施形態において、Ｈｉｓ誘導体は、アルファ炭素に連結された水素原子が別の化学的部分、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ヒドロキシル、メトキシ、エトキシ等で置換されているアルファ置換されたヒスチジンである。一部の態様において、Ｈｉｓ誘導体は、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、ホモ−ヒスチジン、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、またはアルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール（ｉｍｉｄｉａｚｏｌｅ）酢酸（ＤＭＩＡ）である。
【０６４１】
一部の態様において、２位のＤＰＰ−ＩＶ保護アミノ酸は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン、またはアルファアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）のうちの１つである。一部の態様において、ＤＰＰ−ＩＶ保護アミノ酸は、Ｄ−Ｓｅｒ、もしくはその保存的アミノ酸置換、またはα，α二置換アミノ酸である。一部の態様において、α，α二置換アミノ酸は、Ｒ１およびＲ２を含み、そのそれぞれは、アルファ炭素に結合しており、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、Ｃ１−Ｃ４アルキルからなる群からそれぞれ独立に選択され、ヒドロキシル、アミド、チオール、ハロで置換されていてもよい、またはＲ１およびＲ２は、それらが結合しているアルファ炭素と共に環を形成する。一部の態様において、α，α二置換アミノ酸はＡＩＢである。例示的な態様において、ＤＰＰ−ＩＶ保護アミノ酸がＤ−Ｓｅｒである場合、ＧＩＰアゴニストペプチドは、異種性部分、例えば、親水性部分（例えば、ＰＥＧ）にコンジュゲートされない。本開示の他の態様において、ＤＰＰ−ＩＶ保護アミノ酸は、Ｄ−セリンでない。
【０６４２】
例示的な態様において、本開示のグルカゴン（配列番号１）の類似体は、２０位にα，α二置換アミノ酸を含む。例示的な態様において、α，α−二置換アミノ酸は、Ｒ１およびＲ２を含み、そのそれぞれは、アルファ炭素に結合しており、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、Ｃ１−Ｃ４アルキルからなる群からそれぞれ独立に選択され、ヒドロキシル、アミド、チオール、ハロで置換されていてもよい、またはＲ１およびＲ２は、それらが結合しているアルファ炭素と共に環を形成する。一部の実施形態において、α，α−二置換アミノ酸は、１−アミノシクロプロパン−１−カルボキシレート（ＡＣＰＣ）である。一部の態様において、２０位のα，α−二置換は、ＡＩＢである。例示的な実施形態において、１６位のアミノ酸は、荷電アミノ酸、例えば、正荷電アミノ酸、負荷電アミノ酸である。一部の態様において、２０位のアミノ酸が、アルファ，アルファ二置換アミノ酸である場合、１６位のアミノ酸は、式ＩＶの正荷電アミノ酸、例えば、Ｌｙｓであり、または負荷電アミノ酸、例えば、Ｇｌｕである。一部の態様において、２０位のアミノ酸が、アルファ，アルファ二置換アミノ酸である場合、１６位のアミノ酸は、電荷中性アミノ酸、例えば、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙである。例示的な態様において、１６位のアミノ酸は、小型脂肪族アミノ酸（例えば、Ａｌａ）、α，α二置換アミノ酸、（例えば、ＡＩＢ）、またはイミダゾール側鎖を含むアミノ酸（例えば、Ｈｉｓ）である。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、グルカゴン類似体の１７位にＡｒｇ、Ｇｌｎ、またはイミダゾール側鎖を含むアミノ酸を含み、Ｈｉｓを含んでもよい。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、１８位にＡｌａおよび１９位にＡｌａを含む。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、２１位にＧｌｕを含む。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、２７位にＬｅｕまたはＮｌｅ、２８位にＡｓｐまたはＧｌｕ、および２９位にＧｌｙを含む。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、２９位のアミノ酸のＣ末端に１〜２１個のアミノ酸のＣ末端伸長を含む。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、Ｃ末端残基のアルファカルボキシレートの代わりにＣ末端アミドを含む。
【０６４３】
例示的な態様において、本開示のグルカゴン（配列番号１）の類似体は、２０位にイミダゾール側鎖を含むアミノ酸を含む。例示的な態様において、イミダゾール側鎖を含むアミノ酸は、式Ａの構造：
【０６４４】
【化４４】
2016521253.tif 000049
［式Ａ］
［式中、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、Ｈ、（Ｃ１−６）アルキル、Ｏ（Ｃ１−６）アルキル、（Ｃ１−６）アルキル−ＯＨ、Ｆ、および少なくとも１つのＨがＦによって置き換えられている（Ｃ１−Ｃ６）アルキルからなる群からそれぞれ独立に選択される］
を含む。イミダゾール側鎖を含む適切なアミノ酸が、本明細書に記載される。例示的な態様において、２０位のアミノ酸は、式Ａの類似体構造を含み、一方または両方の環窒素が、Ｃ１−Ｃ３アルキルに結合している。一部の態様において、２０位のアミノ酸は、ＨｉｓまたはＨｉｓ誘導体である。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、１６位に負荷電アミノ酸、例えば、Ｇｌｕを含む。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、グルカゴン類似体の１７位にＡｒｇ、Ｇｌｎ、またはイミダゾール側鎖を含むアミノ酸を含み、Ｈｉｓを含んでもよい。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、１８位にＡｌａおよび１９位にＡｌａを含む。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、２７位にＬｅｕまたはＮｌｅ、２８位にＡｓｐまたはＧｌｕ、および２９位にＧｌｙを含む。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、２９位のアミノ酸のＣ末端に１〜２１個のアミノ酸のＣ末端伸長を含む。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、Ｃ末端残基のアルファカルボキシレートの代わりにＣ末端アミドを含む。
【０６４５】
例示的な実施形態において、本開示のペプチドは、（ｉ）３位にＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ノルバリン、ホモセリン、Ｍｅｔおよびメチオニンスルホンからなる群から選択されるアミノ酸；（ｉｉ）９、１０、１２、１６、２０もしくは３７〜４３位のいずれかでアシルもしくはアルキル基がスペーサーによりアミノ酸に連結されていてもよいアシル化アミノ酸またはアルキル化アミノ酸；（ｉｉｉ）１６〜２１位の１つまたは複数にアルファヘリックス安定化アミノ酸、および（ｖ）配列番号１と比較して１０個以下の追加のアミノ酸改変、を含むグルカゴン（配列番号１）の類似体であり、グルカゴン類似体が異種性部分、例えば親水性部分（例えばＰＥＧ）にコンジュゲートされていない場合、グルカゴン類似体は、ＧＩＰ受容体に対して天然ＧＩＰの少なくともまたは約０．１％（例えば、少なくともまたは約１％、少なくともまたは約１０％、少なくともまたは約５０％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約１００％、少なくともまたは約５００％）の活性を呈する。
【０６４６】
グルカゴン受容体に対する活性の減少を付与するアミノ酸改変を含むグルカゴン類似体は、本明細書に記載される任意の活性プロファイルを含むことができる。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、少なくとももしくは約１％、少なくとももしくは約１０％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約１００％、少なくとももしくは約３００％、または少なくとももしくは約５００％のＧＩＰパーセンテージ効力を呈する。一部の態様において、グルカゴン類似体は、少なくとももしくは約１％、少なくとももしくは約１０％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約１００％、少なくとももしくは約３００％、または少なくとももしくは約５００％のＧＬＰ−１パーセンテージ効力も呈する。したがって、グルカゴン類似体は、ＧＩＰアゴニストペプチドと考えることができるが、一部の態様において、グルカゴン類似体はＧＩＰ−ＧＬＰ−１共アゴニストとさらに考えることができる。例えば、ペプチドは、ヒトＧＩＰ受容体およびヒトＧＬＰ−１受容体に対してアゴニスト活性を呈することができ、ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対するＥＣ５０の１００倍以内（例えば、５０倍、４０倍、３０倍、２０倍、１５倍、１０倍またはより少ない）の、ＧＩＰ受容体に対するＥＣ５０を呈する。
【０６４７】
例示的な実施形態において、グルカゴン類似体は、１位にイミダゾール側鎖を含むアミノ酸を含む。例示的な態様において、１位のアミノ酸は、式Ａの構造、
【化４５】
2016521253.tif 000050
［式Ａ］
［式中、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、Ｈ、（Ｃ１−６）アルキル、Ｏ（Ｃ１−６）アルキル、（Ｃ１−６）アルキル−ＯＨ、Ｆ、および少なくとも１つのＨがＦによって置き換えられている（Ｃ１−Ｃ６）アルキルからなる群からそれぞれ独立に選択される］
を含む。例示的な態様において、１位のアミノ酸は、式Ａの類似体構造を含み、一方または両方の環窒素が、Ｃ１−Ｃ３アルキルに結合している。
【０６４８】
例示的な態様において、１位のアミノ酸は、グルカゴン（配列番号１）の天然の残基Ｌ−ヒスチジン（Ｈｉｓ）であり、またはＨｉｓの誘導体（Ｈｉｓ誘導体）、例えば、アルファ原子が修飾されているＨｉｓの誘導体である。本明細書では、用語「Ｈｉｓ誘導体」とは、少なくとも１つの炭素原子に結合している、例えば、式Ａの構造を含むイミダゾール、または置換されたイミダゾールを含む化学的部分のことを指す。例示的な実施形態において、Ｈｉｓ誘導体は、ヒスチジンの構造と類似の構造を含むが、アルファアミン、アルファ炭素、またはアルファカルボキシレートは別の化学的部分で置き換えられている。例示的な実施形態において、Ｈｉｓ誘導体は、アルファ炭素に連結された水素原子が別の化学的部分、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ヒドロキシル、メトキシ、エトキシ等で置換されているアルファ置換されたヒスチジンである。一部の態様において、Ｈｉｓ誘導体は、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシルヒスチジン、アセチルヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファメチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、またはアルファ，アルファジメチルイミダゾール（ｉｍｉｄｉａｚｏｌｅ）酢酸（ＤＭＩＡ）である。
【０６４９】
一部の態様において、グルカゴン類似体は、２位にＤＰＰ−ＩＶ保護アミノ酸を含む。例示的な態様において、ＤＰＰ−ＩＶ保護アミノ酸は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン、またはアルファアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）のうちの１つである。一部の態様において、ＤＰＰ−ＩＶ保護アミノ酸は、Ｄ−Ｓｅｒ、もしくはその保存的アミノ酸置換、またはアルファ，アルファ二置換アミノ酸である。一部の態様において、アルファ，アルファ二置換アミノ酸は、Ｒ１およびＲ２を含み、そのそれぞれは、アルファ炭素に結合しており、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、Ｃ１−Ｃ４アルキルからなる群からそれぞれ独立に選択され、ヒドロキシル、アミド、チオール、ハロで置換されていてもよい、またはＲ１およびＲ２は、それらが結合しているアルファ炭素と共に環を形成する。一部の態様において、アルファ，アルファ二置換アミノ酸はＡＩＢである。例示的な態様において、ＤＰＰ−ＩＶ保護アミノ酸がＤ−Ｓｅｒである場合、ＧＩＰアゴニストペプチドは、異種性部分、例えば、親水性部分（例えば、ＰＥＧ）にコンジュゲートされない。本開示の他の態様において、ＤＰＰ−ＩＶ保護アミノ酸は、Ｄ−セリンでない。
【０６５０】
例示的な態様において、グルカゴン類似体は、１６〜２１位の１つまたは複数にアルファヘリックス安定化アミノ酸を含む。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、１６位にアルファヘリックス安定化アミノ酸を含み、負荷電アミノ酸（例えば、Ｇｌｕ）またはアルファ，アルファ二置換アミノ酸を含んでもよい。例示的な態様において、アルファ，アルファ二置換アミノ酸は、Ｒ１およびＲ２を含み、そのそれぞれは、アルファ炭素に結合しており、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、Ｃ１−Ｃ４アルキルからなる群からそれぞれ独立に選択され、ヒドロキシル、アミド、チオール、ハロで置換されていてもよい、またはＲ１およびＲ２は、それらが結合しているアルファ炭素と共に環を形成する。例示的な態様において、アルファ，アルファ二置換アミノ酸はＡＩＢである。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、１７位にＡｒｇを、１８位に小型脂肪族アミノ酸を含み、Ａｌａを含んでもよい。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、配列番号１と比較して２０位で修飾されておらず、２０位のアミノ酸は、Ｇｌｎである。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、１６位にＧｌｕ、１７位にＡｒｇ、１８位にＡｌａ、１９位にＡｌａ、および２０位にＧｌｎを含む。
【０６５１】
前述の例示的な態様において、グルカゴン類似体は、９、１０、１２、１６、２０位のいずれか１つにアシル化またはアルキル化アミノ酸を含む。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、９、１０、１２、１３、１４、１６、１７および２０位のいずれか１つまたは複数にＣ１２−Ｃ１８アシル基もしくはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸を含む。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、１０位にアシル化またはアルキル化アミノ酸を含む。一部の態様において、グルカゴン類似体は、２９位のアミノ酸のＣ末端に１〜２１個のアミノ酸の伸長を含み、３７〜４３位（例えば、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３）のいずれかにアシル化またはアルキル化アミノ酸を含む。一部の態様において、非天然のアシルまたはアルキル基を含むアミノ酸は、４０位である。
【０６５２】
前述の例示的な態様において、グルカゴン類似体は、２９位のアミノ酸のＣ末端に１〜２１個のアミノ酸の伸長を含み、一部の態様において、伸長はＴｒｐケージとして当技術分野において公知の構造を形成する。一部の態様において、伸長は、２０１２年１０月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／７１６８７８号（その全体を参照により本明細書に組み込む）のアミノ酸配列ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号５）もしくはＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号６）もしくはＧＰＳＳＧＲＰＰＰＳ（配列番号６８）、または１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換を有する前述の配列のうちの１つを含む。例示的な態様において、グルカゴン類似体が１〜２１個のアミノ酸の伸長を含む場合、グルカゴン類似体は２９位にＧｌｙを含む。
例示的な態様において、アシル化アミノ酸またはアルキル化アミノ酸は、式Ｉ（Ｌｙｓであってもよい）、式ＩＩ（Ｃｙｓであってもよい）もしくは式ＩＩＩ（Ｓｅｒであってもよい）の構造を含む。一部の態様において、アシル化アミノ酸またはアルキル化アミノ酸は、式Ｉ（例えば、Ｌｙｓ）の構造を含んでもよい。
【０６５３】
一部の態様において、アシル化アミノ酸またはアルキル化アミノ酸は、スペーサーによりアシル基もしくはアルキル基に連結される。一部の態様において、スペーサーは、原子３〜１０個の長さである。一部の態様において、スペーサーは、アミノ酸１個またはジペプチドであり、一部の態様において、スペーサーは、１もしくは２個の酸性アミノ酸残基、例えばＧｌｕを含む。一部の態様において、アシルまたはアルキル基は、によりアミノ酸に連結されており、スペーサーの全長およびアシル基は原子約１４〜約２８個の長さである。一部の態様において、スペーサーは１または２個のガンマＧｌｕを含む。
【０６５４】
アシル化アミノ酸に関しては、一部の態様において、アシル基は、Ｃ１２−Ｃ１８（例えば、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８）脂肪酸アシル基である。一部の態様において、アシル基は、Ｃ１４またはＣ１６脂肪酸アシル基である。
前述の実施形態の例示的な態様において、グルカゴン類似体は、１５位、２１位もしくは２８位、または１５位と２１位、１５位と２８位、または２１位と２８位、または１５位と２１位と２８位にＧｌｕを含む。
【０６５５】
本開示の一部の態様において、グルカゴン類似体は、２７位のアミノ酸のＣ末端に少なくとも１つ荷電アミノ酸を含む。例えば、一部の態様において、グルカゴン類似体は、２８位に荷電アミノ酸（例えば、負荷電アミノ酸）を含む。一部の態様において、負荷電アミノ酸は、ＡｓｐまたはＧｌｕである。負荷電アミノ酸は、一部の態様において、Ｇｌｕである。代わりの態様において、２８位のアミノ酸は、正荷電アミノ酸であり、例えば正荷電アミノ酸は、式Ｉのアミノ酸、例えばＬｙｓである。
代わりのまたは追加の態様において、グルカゴン類似体は、２７位、２９位、もしくは２７位と２９位の両方にアミノ酸改変を含む。例えば、一部の態様において、２７位のアミノ酸はＬｅｕ、Ｎｌｅ、ＶａｌもしくはＬｙｓであり、および／または一部の態様において２９位のアミノ酸はＧｌｙもしくはＴｈｒである。
一部の態様において、２８位のアミノ酸はＡｓｐであり、２９位のアミノ酸はＧｌｙ以外のアミノ酸、例えば、Ｖａｌ、ＡｌａまたはＡＩＢであってもよい。
【０６５６】
本明細書にさらに述べられるように、本明細書に記載されるグルカゴン類似体は、配列番号１と比較して追加のアミノ酸改変、例えば、１０個以下（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個）の追加のアミノ酸改変を含むことができる。例示的な態様において、グルカゴン類似体は、
ｉ．７位のＩｌｅ、
ｉｉ．１２位のＩｌｅまたはＡｒｇ、
ｉｉｉ．１８位の脂肪族アミノ酸、任意選択で、Ａｌａ、
ｉｖ．２１位の酸性アミノ酸、任意選択で、Ｇｌｕ、
ｖ．２４位のＡｓｎ、ＡｌａまたはＡＩＢ、
ｖｉ．２７位の脂肪族アミノ酸、任意選択で、ＡｌａまたはＬｅｕ、またはＮｌｅ、
ｖｉｉ．２８位の酸性アミノ酸、任意選択で、Ｇｌｕ、または脂肪族アミノ酸、任意選択で、Ａｌａ、
ｖｉｉｉ．２９位の脂肪族アミノ酸、任意選択で、Ａｌａ、
ｉｘ．Ｃ末端のアミド化
のうち１つまたは複数を含む。
【０６５７】
前述によると、例示的な態様におけるグルカゴン類似体は、配列番号１９、２１〜２６、２８、２８７、２８９〜２９４、２９６、５２０、５２２〜５２７、および５２９のいずれか、または配列番号３０、３１、３２、３３、３５、３７、３８、４１、２９８、２９９、３００、３０１、３０３、３０５、３０６、３０９、５３１、５３２、５３３、５３４、５３６、５３８、５３９、および５４２のいずれかのアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなり、すべての配列番号は、２０１２年１０月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／７１６８７８号を参照し、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【０６５８】
本発明は、２０１２年１０月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／７１６８７８号（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号６６の配列
ＨＸ2Ｘ3ＧＴＦＴＳＤＸ10ＳＫＹＬＸ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18Ｘ19Ｘ20Ｘ21ＦＶＱＷＬＸ27Ｘ28Ｘ29Ｘ30ＰＳＳＧＸ35ＰＰＰＳ（配列番号６６）
［式中、
Ｘ2は、ＡＩＢであり、
Ｘ3は、Ｇｌｎまたは構造Ｉ、ＩＩもしくはＩＩＩの側鎖構造を含むアミノ酸であり、
Ｘ10は、ＴｙｒまたはＣ１２−Ｃ１８アシルもしくはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸であり、
Ｘ15は、酸性アミノ酸であり、ＧｌｕまたはＡｓｐであってもよく、
Ｘ16は、任意のアミノ酸であり、Ｇｌｙ、ＰｒｏおよびＳｅｒ以外の任意のアミノ酸ってもよく、
例えば、Ｇｌｕ、Ａｌａ、アルファ，アルファ二置換アミノ酸（例えば、ＡＩＢ）、Ｈｉｓ、Ｌｙｓであり、
Ｘ17は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎであり、
Ｘ18は、ＡｒｇまたはＡｌａであり、
Ｘ19は、Ａｌａまたはアルファ，アルファ二置換アミノ酸（例えば、ＡＩＢ）であり、
Ｘ20は、アルファ，アルファ二置換アミノ酸（例えば、ＡＩＢ）もしくはＧｌｎまたはＨｉｓ、Ｌｙｓ、もしくはＡｌａからなる群から選択され、
Ｘ21は、酸性アミノ酸であり、ＡｓｐまたはＧｌｕであってもよく、
Ｘ27は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、ＮｌｅまたはＭｅｔであり、
Ｘ28は、Ａｌａまたは酸性アミノ酸であり（ＡｓｐまたはＧｌｕってもよい）、
Ｘ29は、脂肪族、例えば、ＡｌａもしくはＧｌｙまたはＡＩＢもしくはＶａｌであり、
Ｘ30は、小型脂肪族アミノ酸、例えばＡｌａまたはＧｌｙであり、
Ｘ35は、Ａｌａまたは塩基性アミノ酸であり（ＡｒｇまたはＬｙｓってもよい）、
Ｘ28が酸性アミノ酸である場合、Ｘ35は、塩基性アミノ酸であり、
Ｘ28がＡｓｐである場合、次いでＸ29はＧｌｙではなくてもよく、
Ｘ10がＴｙｒである場合、ペプチドは、４０位にＣ１２−Ｃ１８アシルまたはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸を含み、ペプチドは、４１位にＧｌｙを含んでもよく、
ペプチドのＣ末端アミノ酸は、アミド化されている］
を含むペプチドを提供する。
【０６５９】
配列番号６６のペプチドの例示的な態様において、Ｘ10は、Ｃ１２−Ｃ１８アシルまたはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸である。例示的な態様において、Ｘ28はＧｌｕであり、Ｘ15がＧｌｕおよび／またはＸ21がＧｌｕであってもよい。例示的な態様において、１５、２１および２８位のそれぞれ。例示的な態様において、Ｘ18は、Ａｌａであり、Ｘ19は、Ａｌａであり、Ｘ20は、アルファ，アルファ二置換アミノ酸、例えば、ＡＩＢであってもよい。例示的な態様において、Ｘ16は、Ｇｌｕ、Ａｌａ、ＡＩＢ、ＨｉｓまたはＬｙｓであり；Ｘ17は、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＧｌｎであり、Ｘ21は、Ｇｌｕである。代わりの例示的な態様において、Ｘ20は、ＬｙｓまたはＨｉｓであり、Ｘ16は、Ｇｌｕであり、Ｘ17は、Ａｒｇであり、Ｘ21は、Ａｓｐであってもよい。代わりの態様において、Ｘ18は、Ａｌａであり、Ｘ19は、アルファ，アルファ二置換アミノ酸（例えば、ＡＩＢ）であり、Ｘ16は、Ｇｌｕであり、Ｘ17は、Ａｒｇであり、Ｘ21は、Ｇｌｕであってもよい。また、例示的な態様において、Ｘ20は、ＡｌａまたはＬｙｓである。配列番号６６のペプチドの例示的な態様において、Ｘ29は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、またはアルファ，アルファ二置換アミノ酸であり、ＡＩＢであってもよい。
【０６６０】
配列番号６６のペプチドの例示的な態様において、Ｘ10は、Ｔｙｒであり、Ｃ１２−Ｃ１８アシルもしくはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸は、４０位に位置する。例示的な態様において、ペプチドは、４１位にＧｌｙを含む。例示的な態様において、Ｘ9またはＸ15は、Ｇｌｕである。
【０６６１】
配列番号６６のペプチドの例示的な態様において、アシルまたはアルキル基は、式Ｉ、式ＩＩもしくは式ＩＩＩの構造を含むアミノ酸に結合している。例示的な態様において、式Ｉのアミノ酸は、Ｌｙｓである。また、例示的な態様において、アシルまたはアルキル基は、スペーサーによりペプチドのアミノ酸に結合しており、スペーサーは、ジペプチドのアミノ酸であってもよい。例示的な態様において、スペーサーは１または２個の酸性アミノ酸残基である。
【０６６２】
配列番号６６のペプチドの例示的な態様において、Ｘ3は、Ｇｌｎまたはアセチルジアミノブタン酸もしくはアセチルＬｙｓもしくはアセチルオルニチンもしくはメチルスルフォキシドである。例示的な態様において、ペプチドは、２７位にＬｅｕ、２９位にＧｌｙおよび２９位のＧｌｙにＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ  Ｃ末端を含む。
【０６６３】
例示的な態様において、ペプチドは、２０１２年１０月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／７１６８７８号の配列番号１５〜２８、３４、３６、３９、４２、４３、４４、５２、５３、６３〜６５、２８３〜２９６、３０２、３０４、３０７、３１０、３１１、３１２、３２０、３２１、３３０〜３３２、５１６〜５２９、５３５、５３７、５４０、５４３、５４４、５４５、５５３、５５４、および５６３〜５６５のいずれか１つの配列を含み、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【０６６４】
さらに、本発明は、配列番号６６と比較して３つ以下のアミノ酸改変を有する配列番号６６の配列を含むペプチドを提供し、ペプチドは、ヒトＧＩＰ受容体、ならびにヒトＧＬＰ−１受容体および／またはヒトグルカゴン受容体に対してアゴニスト活性を呈する。アミノ酸改変は、本明細書に記載されるそれのいずれかであり得る。
【０６６５】
本発明は、
（ａ）Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＧＴＦＴＳＤＸ10ＳＫＹＬＸ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18Ｘ19Ｘ20Ｘ21ＦＶＱＷＬＸ27Ｘ28Ｘ29Ｘ30ＰＳＳＧＸ35ＰＰＰＳ
の配列（２０１２年１０月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／７１６８７８号の配列番号６７、その全体を参照により本明細書に組み込む）
［式中、
Ｘ1は、側鎖イミダゾールであり、ＨｉｓまたはＨｉｓ誘導体を含むアミノ酸であってもよく、
Ｘ2は、ＤＰＰ−ＩＶ保護アミノ酸であり、アルファ，アルファ二置換アミノ酸（例えばＡＩＢ）であってもよく、
Ｘ3は、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、Ｖａｌ、ＮｏｒＶａｌ、ホモセリン、Ｍｅｔ、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、アセチルＯｒｎ、アセチルジアミノブタン酸、アセチルＬｙｓからなる群から選択され、
Ｘ10は、Ｃ１２−Ｃ１８アシルまたはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸であり、
Ｘ15は、酸性アミノ酸であり、ＧｌｕまたはＡｓｐであってもよく、
Ｘ16は、任意のアミノ酸であり、Ｇｌｙ、ＰｒｏおよびＳｅｒ以外の任意のアミノ酸であってもよく、
｛例えば、Ｇｌｕ、Ａｌａ、アルファ，アルファ二置換アミノ酸（例えば、ＡＩＢ）、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ｝、
Ｘ17は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎであり、
Ｘ18は、ＡｒｇまたはＡｌａであり、
Ｘ19は、Ａｌａまたはアルファ，アルファ二置換アミノ酸であり、
Ｘ20は、アルファ，アルファ二置換アミノ酸（例えば、ＡＩＢ）もしくはＧｌｎまたはＨｉｓ、ＬｙｓもしくはＡｌａからなる群から選択され、
Ｘ21は、酸性アミノ酸であり、ＡｓｐまたはＧｌｕであってもよく、
Ｘ27は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、ＮｌｅまたはＭｅｔであり、
Ｘ28は、Ａｌａまたは酸性アミノ酸であり（ＡｓｐまたはＧｌｕであってもよい）、
Ｘ29は、脂肪族、例えば、ＡｌａもしくはＧｌｙまたはＡＩＢもしくはＶａｌであり、
Ｘ30は、小型脂肪族アミノ酸、例えばＡｌａまたはＧｌｙであり、
Ｘ35は、Ａｌａまたは塩基性アミノ酸であり（ＡｒｇまたはＬｙｓであってもよい）、
Ｘ28が酸性アミノ酸である場合、Ｘ35は、塩基性アミノ酸であり、
Ｘ28がＡｓｐである場合、Ｘ29はＧｌｙではなくてもよく、
Ｘ10が、Ｔｙｒである場合、ペプチドは、４０位にＣ１２−Ｃ１８アシルまたはアルキル基に共有結合により結合しているアミノ酸を含み、ペプチドは、４１位にＧｌｙを含んでもよく、
ペプチドのＣ末端アミノ酸は、アミド化されている］
を含むペプチドも提供する。
【０６６６】
配列番号６７を含むペプチドの例示的な態様において、ペプチドは、Ｘ1は、Ｈｉｓであり；Ｘ2は、ＡＩＢであり；Ｘ16は、Ｇｌｕであり；Ｘ17は、Ａｒｇであり；Ｘ18は、Ａｌａであり；Ｘ19は、Ａｌａであり；Ｘ20は、Ｇｌｎであり；Ｘ27は、Ｌｅｕであり；Ｘ29は、Ｇｌｙであり；Ｘ30は、Ｇｌｙであり；Ｘ35は、Ａｌａである；またはその組合せを含む。例示的な態様において、ペプチドは、２０１２年１０月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／７１６８７８号の配列番号２９〜４２、２９７〜３１０、および５３０〜５４３の配列を含み、その全体を参照により本明細書に組み込む。
さらに、本発明は、配列番号６７と比較して３つ以下のアミノ酸改変を持つ配列番号６７の配列を含むペプチドを提供し、ペプチドは、ヒトＧＩＰ受容体、ならびにヒトＧＬＰ−１受容体および／またはヒトグルカゴン受容体に対してアゴニスト活性を呈する。アミノ酸改変は、本明細書に記載されるそれのいずれかであり得る。
【０６６７】
本発明は、２０１２年１０月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／７１６８７８号（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号１８の配列を含むペプチドをさらに提供する。例示的な態様において、ペプチドは、配列番号１８から本質的になる、またはからなる。
本発明により、２０１２年１０月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／７１６８７８号（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号４３の配列を含むペプチドも提供される。例示的な態様において、ペプチドは、配列番号４３から本質的になる、またはからなる。
配列番号１８と比較して３つ以下のアミノ酸改変を有する配列番号１８の配列または配列番号４３と比較して３つ以下のアミノ酸改変を有する配列番号４３の配列を含むペプチドも本明細書に提供され、ペプチドは、ヒトＧＩＰ受容体およびヒトＧＬＰ−１受容体に対してアゴニスト活性を呈する。
【０６６８】
本発明は、２０１２年１０月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／７１６８７８号（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号１００〜２８２；または配列番号３３３〜５１５のいずれか１つの配列を含むペプチドも提供する。２０１２年１０月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／７１６８７８号（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号４３と比較して３つ以下のアミノ酸改変を有する、２０１２年１０月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／７１６８７８号（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号１００〜２８２；配列番号３３３〜５１５のいずれか１つの配列を含むペプチドも提供され、ペプチドは、ヒトＧＩＰ受容体およびヒトＧＬＰ−１受容体に対してアゴニスト活性を呈する。
【０６６９】
一部の実施形態において、グルカゴン類似体は、配列番号１５〜４２、４３、４４、５２、５３、６３〜６５、１００〜３１２、３２０、３２１、３３０〜５４３、５４４、５４５、５５３、５５４、および５６３〜５６５のいずれか１つを含む元の配列に基づく構造を含むが、１つまたは複数の位置で元の配列と異なり、各配列番号は、２０１２年１０月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／７１６８７８号を参照し、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【０６７０】
一部のまたは任意の実施形態において、本開示のペプチドは、配列番号１５〜４２、４３、４４、５２、５３、６３〜６５、１００〜３１２、３２０、３２１、３３０〜５４３、５４４、５４５、５５３、５５４、および５６３〜５６５（各配列番号は、２０１２年１０月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／７１６８７８号を参照し、その全体を参照により本明細書に組み込む）のいずれかを含む元の配列の類似体であり、類似体のアミノ酸配列は、１つまたは複数［例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、場合によっては、１６個またはより多く（例えば、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個など）］の指定されたもしくは任意のアミノ酸改変を含むので、元の配列のアミノ酸配列に基づくが元の配列と異なるアミノ酸配列を含み、一部のまたは任意の実施形態において、本開示のペプチドは、配列番号１５〜４２、４３、４４、５２、５３、６３〜６５、１００〜３１２、３２０、３２１、３３０〜５４３、５４４、５４５、５５３、５５４、および５６３〜５６５のいずれかを含む元の配列と比較して合計１つ、２つ以下、３つ以下、４つ以下、５つ以下、６つ以下、７つ以下、８つ以下、９つ以下または、１０個以下の追加のアミノ酸改変を含む。一部のまたは任意の実施形態において、修飾は、グルカゴン類似体に関して本明細書に記載される修飾、例えば、アシル化、アルキル化、ペグ化、Ｃ末端での切断、１、２、３、７、１０、１２、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２４、２７、２８、および２９位のうち１つもしくは複数のアミノ酸の置換、のいずれかである。
【０６７１】
一部のまたは任意の実施形態において、修飾は、アミノ酸置換もしくは置き換え、例えば、保存的アミノ酸置換である。一部の態様において、保存的置換は、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８または２９位のうち１つもしくは複数のアミノ酸の置き換えである。代わりの実施形態において、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換ではなく、例えば、非保存的アミノ酸置換である。
【０６７２】
一部の実施形態において、本開示のペプチドは、２０１２年１０月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／７１６８７８号（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号１５〜４２、４３、４４、５２、５３、６３〜６５、１００〜３１２、３２０、３２１、３３０〜５４３、５４４、５４５、５５３、５５４、および５６３〜５６５のいずれかを含む元の配列のアミノ酸配列に対して少なくとも２５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、本開示のペプチドは、元の配列に対して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％の配列同一性がある、または９０％より大きい配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、上述した％配列同一性を有するここに開示するペプチドのアミノ酸配列は、ここに開示するペプチドの全長アミノ酸配列である。一部の実施形態において、上述した％配列同一性を有する本開示のペプチドのアミノ酸配列は、ここに開示するペプチドのアミノ酸配列の一部しかない。一部の実施形態において、ここに開示するペプチドは、元の配列のうち連続する少なくとも５個のアミノ酸（例えば、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個のアミノ酸）の参照アミノ酸配列に対して約Ａ％またはより大きな配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照アミノ酸配列は、配列番号１のＣ位のアミノ酸から始まり配列番号１のＤ位のアミノ酸で終わり、Ａは、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９であり；Ｃは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８であり、Ｄは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９である。前述のパラメーターの考え得る全部の組合せが想像され、例えば、Ａが９０％であり、ＣおよびＤが、１および２７、または６および２７、または８および２７、または１０および２７、または１２および２７、または１６および２７を含むがこれに限定されない。
【０６７３】
２０１２年１０月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／７１６８７８号（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号１５〜４２、４３、４４、５２、５３、６３〜６５、１００〜３１２、３２０、３２１、３３０〜５４３、５４４、５４５、５５３、５５４、および５６３〜５６５のいずれかを含む元の配列の類似体は、本明細書に記載の通り、任意のアミノ酸数のペプチド骨格を含むことができ、すなわち、任意のペプチド長であることができる。一部の実施形態において、本明細書に記載されるペプチドは、配列番号１と同じ長さ、すなわち、アミノ酸２９個の長さである。一部の実施形態において、ここに開示するペプチドは、アミノ酸２９個の長さより長く、例えば本明細書にさらに記載されるように、ここに開示するペプチドは、アミノ酸１〜２１個のＣ末端伸長を含む。したがって、一部の実施形態において、本開示のペプチドは、アミノ酸３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個の長さである。一部の実施形態において、ここに開示するペプチドは、アミノ酸５０個の長さ以下である。一部の実施形態において、ここに開示するペプチドは、別のペプチドと融合することにより、アミノ酸２９個の長さより長い［例えば、アミノ酸５０個より長い（例えば、アミノ酸少なくともまたは約６０、少なくともまたは約７０、少なくともまたは約８０、少なくともまたは約９０、少なくともまたは約１００、少なくともまたは約１５０、少なくともまたは約２００、少なくともまたは約２５０、少なくともまたは約３００、少なくともまたは約３５０、少なくともまたは約４００、少なくともまたは約４５０、少なくともまたは約５００個の長さ）］。他の実施形態において、ここに開示するペプチドは、アミノ酸２９個未満の長さ、例えば、アミノ酸２８、２７、２６、２５、２４、２３個である。
【０６７４】
前述によると、一部の態様において、本開示のペプチドは、２０１２年１０月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／７１６８７８号（その全体を参照により本明細書に組み込む）の配列番号１５〜４２、４３、４４、５２、５３、６３〜６５、１００〜３１２、３２０、３２１、３３０〜５４３、５４４、５４５、５５３、５５４、および５６３〜５６５のいずれかを含む元の配列の類似体であり、類似体の配列は、ＧＩＰ活性、グルカゴン活性および／もしくはＧＬＰ−１活性に影響を及ぼす、例えばペプチドの分解を減少させることにより（例えば、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼに対する抵抗性を改善することにより）安定性を増強する、可溶性を増強する、半減期を増加させる、作用の発現を遅延させる、ＧＩＰ、グルカゴンもしくはＧＬＰ−１受容体に対する作用持続時間を延長する、または前述のいずれかの組合せである１つもしくは複数のアミノ酸改変を含む。他の修飾に加えて、そのようなアミノ酸改変が、グルカゴン類似体に関して本明細書においてさらに記載され、これらの修飾のいずれかは、個々にまたは組み合わせて適用することができる。
【０６７５】
本開示の２つ以上のＧＩＰアゴニストペプチド（例えばクラス２および／またはクラス６グルカゴン関連ペプチド）を含む二量体および多量体も、本明細書に提供される。本開示のＧＩＰアゴニストペプチドを含むコンジュゲートおよびコンジュゲート部分が、本明細書にさらに提供される。一部の態様において、コンジュゲートは、異種性ペプチドに融合された、本開示のＧＩＰアゴニストペプチドを含む融合ポリペプチドである。本開示は、本開示のＧＩＰアゴニストペプチド、二量体、多量体、またはコンジュゲート（またはその組合せ）を含むキットも提供する。
【０６７６】
本開示のＧＩＰアゴニストペプチド、二量体、多量体、もしくはコンジュゲート（例えばクラス２および／またはクラス６グルカゴン関連ペプチド）のいずれかまたはその組合せ、および薬学的に許容される担体、希釈剤、もしくは賦形剤を含む医薬組成物が、本開示によってさらに提供される。医薬組成物は、好ましくは無菌であり、非経口投与に適している。医薬組成物は、糖尿病もしくは肥満、または糖尿病もしくは肥満と関連する病状を治療もしくは予防する方法用と考えられる。したがって、例示的な実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるような薬剤を含む他の任意の抗糖尿もしくは抗肥満薬と組み合わせてもよい、ＧＩＰアゴニストペプチド（例えばクラス２および／またはクラス６グルカゴン関連ペプチド）を投与することにより、体重増加を減少させるもしくは体重減少を誘導する方法および／または糖尿病もしくは肥満を治療もしくは予防する方法を提供する。
【０６７７】
当技術分野において公知のまたは研究中の糖尿病治療薬には、インスリン、レプチン、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、膵臓ペプチド（ＰＰ）、線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）、Ｙ２Ｙ４受容体アゴニスト、トルブタミド（オリナーゼ）、アセトヘキサミド［ダイメロール（Ｄｙｍｅｌｏｒ）］、トラザミド（トリナーゼ）、クロルプロパミド（ジアビネース）、グリピジド（グルコトロール）、グリブリド（ダイアベータ、ミクロナーゼ、グリナーゼ）、グリメピリド（アマリール）もしくはグリクラジド（ダイミクロン）などのスルホニル尿素；レパグリニド［プランディン（Ｐｒａｎｄｉｎ）］もしくはナテグリニド（スターリックス）などのメグリチニド；メトホルミン（グルコファージ）もしくはフェンホルミンなどのビグアナイド；ロシグリタゾン（アバンディア）、ピオグリタゾン（アクトス）もしくはトログリタゾン（レズリン）などのチアゾリジンジオン、または他のＰＰＡＲγインヒビター；ミグリトール［グリセット（Ｇｌｙｓｅｔ）］、アカルボース（プレコース／グルコバイ）などの炭水化物の消化を阻害するアルファグルコシダーゼインヒビター；エキセナチド（バイエッタ）またはプラムリンチド；ビルダグリプチンもしくはシタグリプチンなどのジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）インヒビター；ＳＧＬＴ（ナトリウム依存性グルコース輸送体１）インヒビター；グルコキナーゼアクチベーター（ＧＫＡ）；グルカゴン受容体アンタゴニスト（ＧＲＡ）；または、ＦＢＰアーゼ（フルクトース１，６−ビスホスファターゼ）インヒビターがある。
当業界で公知の、または調査中の抗肥満剤としては、フェネチルアミン型刺激剤、フェンテルミン（フェンフルラミンもしくはデクスフェンフルラミンを含んでもよい）、ジエチルプロピオン（Ｔｅｎｕａｔｅ（登録商標））、フェンジメトラジン（Ｐｒｅｌｕ−２（登録商標）、Ｂｏｎｔｒｉｌ（登録商標））、ベンズフェタミン（Ｄｉｄｒｅｘ（登録商標））、シブトラミン（Ｍｅｒｉｄｉａ（登録商標）、Ｒｅｄｕｃｔｉｌ（登録商標））；リモナバント（Ａｃｏｍｐｌｉａ（登録商標））、他のカンナビノイド受容体アンタゴニスト；オキシントモジュリン；塩酸フルオキセチン（Ｐｒｏｚａｃ）；Ｑｎｅｘａ（トピラメートおよびフェンテルミン）、Ｅｘｃａｌｉａ（ブプロピオンおよびゾニサミド）もしくはＣｏｎｔｒａｖｅ（ブプロピオンおよびナルトレキソン）；またはゼニカル（Ｏｒｌｉｓｔａｔ）もしくはＣｅｔｌｉｓｔａｔ（ＡＴＬ−９６２としても知られる）、もしくはＧＴ３８９−２５５と同様のリパーゼ阻害剤などの食欲抑制剤が挙げられる。
【０６７８】
一部の実施形態において、本明細書に記載されるペプチドは、非アルコール性脂肪肝疾患またはＮＡＳＨの治療用の薬剤と同時投与される。非アルコール性脂肪肝疾患を治療するために使用される薬剤には、ウルソデオキシコール酸（ａ．ｋ．ａ．アクティゴール、ＵＲＳＯおよびウルソジオール）、メトホルミン（グルコファージ）、ロシグリタゾン（アバンディア）、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、ポリミキシンＢ（Ｐｏｌｙｍｉｘｉｎ  Ｂ）およびベタインがある。
【０６７９】
切断速度に対するジペプチドプロドラッグエレメント構造の効果
本明細書の以前に記載のように、グルカゴンスーパーファミリーペプチドからのジペプチドプロドラッグエレメントＡ−Ｂの切断の速度、およびかくして、プロドラッグの活性化は、構造（Ｎ−アルキル化、置換基の数、長さまたは嵩高さなど）、およびジペプチドプロドラッグエレメントのアミノ酸の立体化学に依存する。グルカゴンスーパーファミリーペプチドからのジペプチドプロドラッグエレメントＡ−Ｂの切断の速度は、ジケトピペラジン形成中のＱの脱離基の立体障害、求核性、安定性にも依存する。これらの構造特性のいくつかは、本発明の一部を形成する、以下のカテゴリーＩ、カテゴリーＩＩ、およびカテゴリーＩＩＩに記載される。
【０６８０】
カテゴリーＩ：ジペプチドプロドラッグエレメントのアミノ酸Ｂの組成
いくつかの実施形態においては、生理的条件下、ＰＢＳ中で少なくとも約１時間〜約１週間のプロドラッグの半減期、例えば、ＱからＡ−Ｂの化学的切断半減期（ｔ1/2）は、Ｂアミノ酸上のＮ−アルキル置換基の存在および長さに依存する。例えば、Ｂアミノ酸上により短いＮ−アルキル置換基（例えば、Ｇｌｙ（Ｎ−メチル））を有するプロドラッグは、Ｂアミノ酸上により長いＮ−アルキル置換基（例えば、Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル））を有するプロドラッグよりも、遅い速度のＡ−Ｂの切断を受け、長い半減期を有する。
【０６８１】
いくつかの実施形態においては、プロドラッグの半減期は、ジペプチドプロドラッグエレメントのＢアミノ酸のベータ位での置換度に依存する。例えば、ベータ位で二置換されたＢアミノ酸（例えば、Ｎ−アルキル化イソロイシン）を有するプロドラッグは、ベータ位で一置換されたＢアミノ酸（例えば、Ｎ−アルキル化ロイシン）を有するプロドラッグよりも、遅いＡ−Ｂの切断を受け、長い半減期を有する。さらに、ベータ位で一置換されたＢアミノ酸（例えば、Ｎ−アルキル化ロイシン）を有するプロドラッグは、ベータ位で置換されていないＢアミノ酸（例えば、Ｎ−アルキル化アラニン）を有するプロドラッグよりも、遅いＡ−Ｂの切断を受け、長い半減期を有する。さらに、ベータ位に炭素を有するＢアミノ酸（例えば、Ｎ−アルキル化アラニン）を有するプロドラッグは、Ｂアミノ酸としてグリシンを有するプロドラッグよりも、遅いＡ−Ｂの切断を受け、長い半減期を有する。
いくつかの実施形態においては、プロドラッグの半減期は、Ｂアミノ酸の側鎖の嵩高さに依存する。例えば、Ｂアミノ酸上により嵩高い側鎖（例えば、Ｎ−アルキル化フェニルアラニン）を有するプロドラッグは、Ｂアミノ酸上に嵩が低い側鎖（例えば、Ｎ−アルキル化アラニン）を有するプロドラッグよりも、遅いＡ−Ｂの切断を受け、長い半減期を有する。
【０６８２】
ジペプチドプロドラッグエレメントのＢアミノ酸の組成を、以下のサブカテゴリーＩＡ、ＩＢおよびＩＣに分類することができる。一般に、サブカテゴリーＩＡ中のジペプチドプロドラッグエレメントは、最も速い切断を受け、サブカテゴリーＩＣ中のジペプチドプロドラッグエレメントは最も遅い切断を受ける。
【０６８３】
サブカテゴリーＩＡ：Ｎ−アルキル化グリシンであるジペプチドプロドラッグエレメントのアミノ酸Ｂ
いくつかの実施形態においては、プロドラッグは、以下の構造を含む。
Ａ−Ｂ−Ｑ
［式中、Ｑはグルカゴンスーパーファミリーペプチドであり、
Ａ−Ｂは以下の構造を含む
【化４６】
2016521253.tif 000051
Ｉ
（式中、
Ｒ1およびＲ2は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ18アルキル、Ｃ2−Ｃ18アルケニル、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＯＨ、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＳＨ、（Ｃ2−Ｃ3アルキル）ＳＣＨ3、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ2+）ＮＨ2、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ2−Ｃ5複素環）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ9ヘテロアリール）、およびＣ1−Ｃ12アルキル（Ｗ1）Ｃ1−Ｃ12アルキルからなる群から独立に選択され、Ｗ1は、Ｎ、ＳおよびＯからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、またはＲ1およびＲ2は、それらが結合する原子と一緒になって、Ｃ3−Ｃ12シクロアルキルを形成し、
Ｒ3は、Ｃ1−Ｃ18アルキルであり、
Ｒ4およびＲ8は、それぞれＨであり、
Ｒ5はＮＨＲ6であり、
Ｒ6は、ＨもしくはＣ1−Ｃ4アルキルであるか、またはＲ5およびＲ2はそれらが結合する原子と一緒になって、４、５もしくは６員の複素環を形成し、ならびに
Ｒ7は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、（Ｃ1−Ｃ7アルキル）、（Ｃ2−Ｃ7アルケニル）、ＯＣＦ3、ＮＯ2、ＣＮ、ＮＣ、Ｏ（Ｃ1−Ｃ7アルキル）、ＣＯ2Ｈ、ＣＯ2（Ｃ1−Ｃ7アルキル）、ＮＨＲ6、アリール、およびヘテロアリールからなる群から選択される）］
【０６８４】
いくつかの実施形態においては、Ｂアミノ酸は、グリシン（Ｎ−メチル）、グリシン（Ｎ−エチル）、グリシン（Ｎ−プロピル）、グリシン（Ｎ−ブチル）、グリシン（Ｎ−ペンチル）、グリシン（Ｎ−ヘキシル）、グリシン（Ｎ−ヘプチル）、およびグリシン（Ｎ−オクチル）からなる群から選択される。例えば、Ｂアミノ酸は、グリシン（Ｎ−メチル）またはグリシン（Ｎ−ヘキシル）であってもよい。
いくつかの実施形態においては、Ｒ1およびＲ2が両方とも水素である場合、Ｒ3はＣ1−Ｃ4アルキルであり、例えば、Ａ−Ｂは脂肪族アミンにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態においては、Ｒ1およびＲ2が両方とも水素である場合、Ｒ3はＣ5−Ｃ8アルキルであり、例えば、Ａ−Ｂは脂肪族アミンにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態においては、Ｒ1またはＲ2の少なくとも一方が水素ではない場合、Ｒ3はＣ1−Ｃ4アルキルであり、例えば、Ａ−Ｂは脂肪族アミンにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態においては、Ｒ1またはＲ2の少なくとも一方が水素ではない場合、Ｒ3はＣ5−Ｃ8アルキルであり、例えば、Ａ−Ｂは脂肪族アミンにコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態においては、Ｒ1およびＲ2が両方とも水素であり、Ｒ3がメチルである場合、Ａ−ＢはＦ7ＧＬＰ−１（８−３７）のアルファアミノ基にコンジュゲートされない。
【０６８５】
サブカテゴリーＩＢ：ベータ位で非置換または一置換であるジペプチドプロドラッグエレメントのアミノ酸Ｂ
いくつかの実施形態においては、プロドラッグは、構造：
Ａ−Ｂ−Ｑ
［式中、Ｑはグルカゴンスーパーファミリーペプチドであり、
Ａ−Ｂは、構造：
【０６８６】
【化４７】
2016521253.tif 000052
Ｉ
（式中、
Ｒ1およびＲ2は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ18アルキル、Ｃ2−Ｃ18アルケニル、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＯＨ、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＳＨ、（Ｃ2−Ｃ3アルキル）ＳＣＨ3、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ2+）ＮＨ2、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ2−Ｃ5複素環）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ9ヘテロアリール）、およびＣ1−Ｃ12アルキル（Ｗ1）Ｃ1−Ｃ12アルキルからなる群から独立に選択され、Ｗ1はＮ、ＳおよびＯからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、またはＲ1およびＲ2はそれらが結合する原子と一緒になって、Ｃ3−Ｃ12シクロアルキルを形成し、
Ｒ3は、Ｃ1−Ｃ18アルキルであり、
Ｒ4は、ＣＨ3、ＣＨ2（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、ＣＨ2（Ｃ2−Ｃ10アルケニル）、ＣＨ2（Ｃ0−Ｃ10アルキル）ＯＨ、ＣＨ2（Ｃ0−Ｃ10アルキル）ＳＨ、ＣＨ2（Ｃ0−Ｃ3アルキル）ＳＣＨ3、ＣＨ2（Ｃ0−Ｃ3アルキル）ＣＯＮＨ2、ＣＨ2（Ｃ0−Ｃ3アルキル）ＣＯＯＨ、ＣＨ2（Ｃ0−Ｃ3アルキル）ＮＨ2、ＣＨ2（Ｃ0−Ｃ3アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ2+）ＮＨ2、ＣＨ2（Ｃ0−Ｃ3アルキル）（Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル）、ＣＨ2（Ｃ0−Ｃ3アルキル）（Ｃ2−Ｃ5複素環）、ＣＨ2（Ｃ0−Ｃ3アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7、ＣＨ2（Ｃ1−Ｃ3アルキル）（Ｃ3−Ｃ9ヘテロアリール）、およびＣＨ2（Ｃ0−Ｃ12アルキル）（Ｗ1）Ｃ1−Ｃ12アルキルからなる群から選択され、Ｗ1はＮ、ＳおよびＯからなる群から選択されるヘテロ原子であるか；またはＲ4およびＲ3は、それらが結合する原子と一緒になって、４、５もしくは６員の複素環を形成し、
Ｒ8は、Ｈであり、
Ｒ5は、ＮＨＲ6であるか、またはＲ5およびＲ2はそれらが結合する原子と一緒になって、４、５もしくは６員の複素環を形成し、
Ｒ6は、ＨまたはＣ1−Ｃ4アルキルであり、
Ｒ7は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、（Ｃ1−Ｃ7アルキル）、（Ｃ2−Ｃ7アルケニル）、ＯＣＦ3、ＮＯ2、ＣＮ、ＮＣ、Ｏ（Ｃ1−Ｃ7アルキル）、ＣＯ2Ｈ、ＣＯ2（Ｃ1−Ｃ7アルキル）、ＮＨＲ6、アリール、およびヘテロアリールからなる群から選択される）
を含む］
を含む。
【０６８７】
いくつかの実施形態においては、Ｒ4は、ＣＨ3、ＣＨ2（Ｃ1−Ｃ4アルキル）、ＣＨ2（Ｃ1−Ｃ4）アルケニル、ＣＨ2（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＯＨ、ＣＨ2（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＳＨ、ＣＨ2（Ｃ0−Ｃ3アルキル）ＳＣＨ3、ＣＨ2（Ｃ0−Ｃ3アルキル）ＣＯＮＨ2、ＣＨ2（Ｃ0−Ｃ3アルキル）ＣＯＯＨ、ＣＨ2（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＮＨ2、およびＣＨ2（Ｃ0−Ｃ3アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ2+）ＮＨ2からなる群から選択される。
【０６８８】
これらの実施形態におけるＢアミノ酸の非限定例としては、アラニン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ10アルキル）、ロイシン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ10アルキル）、メチオニン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ10アルキル）、アスパラギン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ10アルキル）、グルタミン酸（Ｎ−Ｃ1−Ｃ10アルキル）、アスパラギン酸（Ｎ−Ｃ1−Ｃ10アルキル）、グルタミン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ10アルキル）、ヒスチジン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ10アルキル）、リシン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ10アルキル）、アルギニン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ10アルキル）、セリン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ10アルキル）、およびシステイン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ10アルキル）が挙げられる。
【０６８９】
いくつかの実施形態においては、Ｂアミノ酸は、アラニン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ6アルキル）、ロイシン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ6アルキル）、メチオニン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ6アルキル）、アスパラギン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ6アルキル）、グルタミン酸（Ｎ−Ｃ1−Ｃ6アルキル）、アスパラギン酸（Ｎ−Ｃ1−Ｃ6アルキル）、グルタミン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ6アルキル）、ヒスチジン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ6アルキル）、リシン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ6アルキル）、アルギニン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ6アルキル）、セリン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ6アルキル）、およびシステイン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ6アルキル）からなる群から選択される。
【０６９０】
例えば、Ｂアミノ酸は、アラニン（Ｎ−メチル）、ロイシン（Ｎ−メチル）、メチオニン（Ｎ−メチル）、アスパラギン（Ｎ−メチル）、グルタミン酸（Ｎ−メチル）、アスパラギン酸（Ｎ−メチル）、グルタミン（Ｎ−メチル）、ヒスチジン（Ｎ−メチル）、リシン（Ｎ−メチル）、アルギニン（Ｎ−メチル）、セリン（Ｎ−メチル）、およびシステイン（Ｎ−メチル）を含んでもよい。
いくつかの実施形態においては、Ｒ4は、ＣＨ2（Ｃ0−Ｃ3アルキル）（Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル）、ＣＨ2（Ｃ0−Ｃ3アルキル）（Ｃ2−Ｃ5ヘテロ環）、ＣＨ2（Ｃ0−Ｃ3アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7、ＣＨ2（Ｃ1−Ｃ3アルキル）（Ｃ3−Ｃ9ヘテロアリール）、およびＣＨ2（Ｃ0−Ｃ12アルキル）（Ｗ1）Ｃ1−Ｃ12アルキルからなる群から選択され、Ｗ1はＮ、ＳおよびＯからなる群から選択されるヘテロ原子であり、Ｒ7はＨおよびＯＨからなる群から選択される。
【０６９１】
これらの実施形態におけるＢアミノ酸の非限定例としては、フェニルアラニン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ10アルキル）、チロシン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ10アルキル）、およびトリプトファン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ10アルキル）が挙げられる。いくつかの実施形態においては、Ｂアミノ酸は、フェニルアラニン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ6アルキル）、チロシン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ6アルキル）、およびトリプトファン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ6アルキル）からなる群から選択される。例えば、Ｂアミノ酸は、フェニルアラニン（Ｎ−メチル）、チロシン（Ｎ−メチル）、およびトリプトファン（Ｎ−メチル）を含んでもよい。
いくつかの実施形態においては、Ｂアミノ酸は、プロリンである。いくつかの実施形態においては、プロリンは、サブカテゴリーＩＢから排除される。
【０６９２】
サブカテゴリーＩＣ：ベータ位で二置換されたジペプチドプロドラッグエレメントのアミノ酸Ｂ
いくつかの実施形態においては、プロドラッグは、構造：
Ａ−Ｂ−Ｑ
［式中、Ｑはグルカゴンスーパーファミリーペプチドであり、
Ａ−Ｂは、構造：
【化４８】
2016521253.tif 000053
Ｉ
（式中、
Ｒ1およびＲ2は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ18アルキル、Ｃ2−Ｃ18アルケニル、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＯＨ、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＳＨ、（Ｃ2−Ｃ3アルキル）ＳＣＨ3、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ2+）ＮＨ2、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ2−Ｃ5複素環）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ9ヘテロアリール）、およびＣ1−Ｃ12アルキル（Ｗ1）Ｃ1−Ｃ12アルキルからなる群から独立に選択され、Ｗ1はＮ、ＳおよびＯからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、またはＲ1およびＲ2は、それらが結合する原子と一緒になって、Ｃ3−Ｃ12シクロアルキルを形成する；またはＲ1およびＲ2は、それらが結合する原子と一緒になって、Ｃ3−Ｃ12シクロアルキルを形成し、
Ｒ3は、Ｃ1−Ｃ18アルキルであり、
Ｒ4は、ＣＨ（Ｃ1−Ｃ8アルキル）2、ＣＨ（Ｃ2−Ｃ8アルケニル）2、ＣＨ（Ｃ1−Ｃ8アルキル）（ＯＨ）、ＣＨ（Ｃ1−Ｃ8アルキル）（（Ｃ1−Ｃ8アルキル）ＳＨ）、ＣＨ（Ｃ1−Ｃ3アルキル）（（Ｃ1−Ｃ8アルキル）（ＮＨ2)）からなる群から独立に選択され、
Ｒ8は、Ｈであり、
Ｒ5は、ＮＨＲ6であるか、またはＲ5およびＲ2は、それらが結合する原子と一緒になって、４、５もしくは６員の複素環を形成し、
Ｒ6は、ＨまたはＣ1−Ｃ4アルキルであり、
Ｒ7は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、（Ｃ1−Ｃ7アルキル）、（Ｃ2−Ｃ7アルケニル）、ＯＣＦ3、ＮＯ2、ＣＮ、ＮＣ、Ｏ（Ｃ1−Ｃ7アルキル）、ＣＯ2Ｈ、ＣＯ2（Ｃ1−Ｃ7アルキル）、ＮＨＲ6、アリール、およびヘテロアリールからなる群から選択される）
を含む］
を含む。
【０６９３】
いくつかの実施形態においては、Ｒ4は、ＣＨ（Ｃ1−Ｃ8アルキル）2またはＣＨ（Ｃ1−Ｃ8アルキル）ＯＨである。Ｂアミノ酸の非限定例としては、イソロイシン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ10アルキル）、バリン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ10アルキル）、およびトレオニン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ10アルキル）が挙げられる。いくつかの実施形態においては、Ｂアミノ酸は、イソロイシン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ6アルキル）、バリン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ6アルキル）、およびトレオニン（Ｎ−Ｃ1−Ｃ6アルキル）からなる群から選択される。例えば、Ｂアミノ酸は、イソロイシン（Ｎ−メチル）、バリン（Ｎ−メチル）、およびトレオニン（Ｎ−メチル）を含んでもよい。
【０６９４】
カテゴリーＩＩ：ジペプチドプロドラッグエレメントのアミノ酸Ａの組成
いくつかの実施形態においては、プロドラッグの半減期は、Ａアミノ酸のアルファ位での置換基の数に依存する。例えば、α−一置換アミノ酸であるＡアミノ酸（例えば、Ａｌａ）を含むプロドラッグは、α，α−二置換アミノ酸であるＡアミノ酸（例えば、Ａｉｂ）を含むプロドラッグよりも、遅い切断を受け、長い半減期を有する。
いくつかの実施形態においては、プロドラッグの半減期は、Ａアミノ酸のアルファアミノ基上のアルキル化の程度に依存する。一般に、アルキル化の程度が高くなるほど、プロドラッグの切断の速度は遅くなり、半減期は長くなる。例えば、Ｎ−アルキル化されたＡｌａを有するジペプチドプロドラッグエレメントは、Ａｌａよりも、遅い速度で切断し、長い半減期を有する。
【０６９５】
ジペプチドプロドラッグエレメントのＡアミノ酸の組成を、以下のサブカテゴリーＩＩＡおよびＩＩＢに分類することができる。一般に、サブカテゴリーＩＩＡ中のジペプチドプロドラッグエレメントは、サブカテゴリーＩＩＢ中のジペプチドプロドラッグエレメントよりも速く切断する。
【０６９６】
サブカテゴリーＩＩＡ：アルファ位で二置換であるジペプチドプロドラッグエレメントのアミノ酸Ａ
いくつかの実施形態においては、ジペプチドプロドラッグエレメントのＡアミノ酸は、アルファ位で二置換される。これらの実施形態においては、サブカテゴリーＩＡ、ＩＢおよびＩＣに記載された構造のＲ1およびＲ2は、Ｃ1−Ｃ10アルキル、Ｃ2−Ｃ10アルケニル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）ＯＨ、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）ＳＨ、（Ｃ2−Ｃ3アルキル）ＳＣＨ3、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ2+）ＮＨ2、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ2−Ｃ5複素環）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ9ヘテロアリール）、およびＣ1−Ｃ12アルキル（Ｗ1）Ｃ1−Ｃ12アルキルからなる群から独立に選択され、Ｗ1はＮ、ＳおよびＯからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、またはＲ1およびＲ2は、それらが結合する原子と一緒になって、Ｃ3−Ｃ12シクロアルキルを形成し、Ｒ7は、ＨおよびＯＨからなる群から選択される。
例えば、Ａアミノ酸は、アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）を含んでもよい。
【０６９７】
サブカテゴリーＩＩＢ：アルファ位で非置換または一置換であるジペプチドプロドラッグエレメントのアミノ酸Ａ
いくつかの実施形態においては、ジペプチドプロドラッグエレメントのＡアミノ酸は、アルファ位で非置換または一置換である。これらの実施形態においては、サブカテゴリーＩＡ、ＩＢおよびＩＣに記載された構造のＲ1はＨであり、サブカテゴリーＩＡ、ＩＢおよびＩＣに記載された構造のＲ2は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ10アルキル、Ｃ2−Ｃ10アルケニル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）ＯＨ、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）ＳＨ、（Ｃ2−Ｃ3アルキル）ＳＣＨ3、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ2+）ＮＨ2、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ2−Ｃ5複素環）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ9ヘテロアリール）、およびＣ1−Ｃ12アルキル（Ｗ1）Ｃ1−Ｃ12アルキルからなる群から選択され、Ｒ7はＨおよびＯＨからなる群から選択され、Ｗ1はＮ、ＳおよびＯからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、またはＲ1およびＲ2は、それらが結合する原子と一緒になって、Ｃ3−Ｃ12シクロアルキルを形成するか、またはＲ2およびＲ5は、それらが結合する原子と一緒になって、４、５もしくは６員の複素環を形成する。
【０６９８】
いくつかの実施形態においては、ジペプチドプロドラッグエレメントのＡアミノ酸は、「ｄ」立体化学を有する。これらの実施形態におけるＡアミノ酸の非限定例としては、リシン、システイン、およびアラニンが挙げられる。例えば、ｄ−リシン、ｄ−システイン、およびｄ−アラニンである。いくつかの実施形態においては、ｄ−立体化学は、プロドラッグペプチドのタンパク質溶解的分解の低下によって半減期を増強してもよい。
【０６９９】
いくつかの実施形態においては、Ａアミノ酸は、Ａｌａ（Ｎ−Ｃ1−Ｃ4アルキル）、Ｌｙｓ（Ｎ−Ｃ1−Ｃ4アルキル）、およびＣｙｓ（Ｎ−Ｃ1−Ｃ4アルキル）などの１〜４個の炭素原子を有する基でＮ−アルキル化される。例えば、Ａアミノ酸は、Ａｌａ（Ｎ−メチル）、Ｌｙｓ（Ｎ−メチル）、およびＣｙｓ（Ｎ−メチル）であってもよい。Ａアミノ酸のＮ−アルキル化は、Ｑからのジペプチドプロドラッグエレメントの切断の速度を低下させ、より長い半減期を提供する。
【０７００】
カテゴリーＩＩＩ：グルカゴンスーパーファミリーペプチド（Ｑ）へのジペプチドプロドラッグエレメント（Ａ−Ｂ）のコンジュゲーション部位
いくつかの実施形態においては、プロドラッグの半減期は、ジケトピペラジン形成中のＱ上の脱離基の立体障害、求核性、および安定性に依存する。立体障害される脱離基が少ないほど、脱離基の求核性は低くなるか、または切断後の脱離基の安定性が高いほど、プロドラッグの半減期は短くなる。Ｑ上の脱離基の種類は、以下のサブカテゴリーＩＩＩＡおよびＩＩＩＢに記載されるように、Ａ−ＢとＱのアミノ基との間の結合の種類によって決定することができる。一般に、サブカテゴリーＩＩＩＡ中のジペプチドプロドラッグエレメントは、サブカテゴリーＩＩＩＢ中のジペプチドプロドラッグエレメントよりも、Ｑから遅く切断し、長い半減期を有する。
【０７０１】
サブカテゴリーＩＩＩＡ：Ｑの脂肪族アミノ基に結合したＡ−Ｂ
いくつかの実施形態においては、Ａ−Ｂは、Ａ−Ｂと、Ｑの脂肪族アミノ基との間のアミド結合によりＱに連結され、本明細書の以前に記載されたように、生理的条件下で、ＰＢＳ中、少なくとも約１時間〜約１週間の、ＱからのＡ−Ｂの化学的切断半減期（ｔ1/2）を有するプロドラッグが得られる。
いくつかの実施形態においては、Ａ−Ｂは、Ａ−Ｂと、ＱのＮ末端アミノ酸のアルファアミノ基との間のアミド結合によりＱに連結される。例えば、サブカテゴリーＩＡ、ＩＢおよびＩＣのいずれかに由来するＢアミノ酸と、サブカテゴリーＩＩＡおよびＩＩＢのいずれかに由来するＡアミノ酸とを有するジペプチドプロドラッグエレメントを、ＱのＮ末端アミノ酸に連結して、生理的条件下、ＰＢＳ中で少なくとも約１時間〜約１週間のＱからのＡ−Ｂの化学的切断半減期（ｔ1/2）を有するプロドラッグを得ることができる。
いくつかの実施形態においては、Ａ−Ｂは、Ａ−Ｂと、Ｑのアミノ酸の側鎖上の脂肪族アミノ基との間のアミド結合によりＱに連結される。例えば、サブカテゴリーＩＡ、ＩＢおよびＩＣのいずれかに由来するＢアミノ酸と、サブカテゴリーＩＩＡおよびＩＩＢのいずれかに由来するＡアミノ酸とを有するジペプチドプロドラッグエレメントを、Ｑのアミノ酸の側鎖上の脂肪族アミノ基に連結して、生理的条件下、ＰＢＳ中で少なくとも約１時間〜約１週間のＱからのＡ−Ｂの化学的切断半減期（ｔ1/2）を有するプロドラッグを得ることができる。
【０７０２】
いくつかの実施形態においては、Ａ−Ｂが、Ａ−Ｂと、Ｑの脂肪族アミノ基との間のアミド結合によりＱに連結される場合、Ａはα，α−二置換アミノ酸（サブカテゴリーＩＩＡ）であるか、またはＢはＮ−アルキル化である（サブカテゴリーＩＡ、ＩＢもしくはＩＣのいずれか）か、またはその両方であるべきである。例えば、Ａがα−一置換アミノ酸（例えば、Ａｌａ）である場合、ＢはＮ−アルキル化ではなく、Ａ−ＢがＱの脂肪族アミノ基によりＱに結合される場合、Ａ−Ｂの有意な切断はない。
他の実施形態においては、Ａ−ＢがＦ7ＧＬＰ−１（８−３７）のアルファアミノ基に連結される場合、Ａ−ＢはＧｌｙ−Ｇｌｙ（Ｎ−Ｍｅ）ではない。
他の任意の実施形態において、Ａ−Ｂが、Ａ−Ｂと、Ｑの脂肪族アミノ基との間のアミド結合によりＱに連結され、Ａがアルファ位で非置換であるアミノ酸（例えば、グリシン）であり、ＢがサブカテゴリーＩＡに由来するアミノ酸（Ｎ−アルキル化グリシン）である場合、Ｂアミノ酸のＮ−アルキル置換基は、少なくとも５個の炭素原子の長さを有する（例えば、Ｎ−Ｃ5−Ｃ8アルキル）。
【０７０３】
さらに他の実施形態においては、Ａ−ＢがＡ−Ｂと、Ｑの脂肪族アミノ基との間のアミド結合によりＱに連結され、Ａアミノ酸がアルファ位で非置換または一置換である場合（サブカテゴリーＩＩＢ）、Ｂアミノ酸はプロリンではない。いくつかの実施形態においては、Ａ−ＢがＡ−Ｂと、Ｑの脂肪族アミノ基との間のアミド結合によりＱに連結される場合、Ａ−ＢはＧｌｙ−Ｐｒｏではない。いくつかの実施形態においては、Ｂアミノ酸がプロリンである場合、Ａアミノ酸はサブカテゴリーＩＩＡに由来する。
【０７０４】
サブカテゴリーＩＩＩＢ：Ｑの芳香族アミノ基に連結されたＡ−Ｂ
いくつかの実施形態においては、Ａ−Ｂは、Ａ−Ｂと、Ｑのアミノ酸の側鎖の芳香族アミノ基との間のアミド結合によりＱに連結され、本明細書の以前に記載されたように、生理的条件下、ＰＢＳ中で少なくとも約１時間〜約１週間のＱからのＡ−Ｂの化学的切断半減期（ｔ1/2）を有するプロドラッグが得られる。例えば、サブカテゴリーＩＡ、ＩＢおよびＩＣのいずれかに由来するＢアミノ酸と、サブカテゴリーＩＩＡおよびＩＩＢのいずれかに由来するＡアミノ酸とを有するジペプチドプロドラッグエレメントを、Ｑのアミノ酸の側鎖の芳香族アミノ基に連結して、生理的条件下、ＰＢＳ中で少なくとも約１時間〜約１週間のＱからのＡ−Ｂの化学的切断半減期（ｔ1/2）を有するプロドラッグが得られる。
【０７０５】
カテゴリーＩにより定義される任意のＢアミノ酸を、カテゴリーＩＩにより定義される任意のＡアミノ酸と組み合わせて、ジペプチドプロドラッグエレメントを形成させることができる。このジペプチドプロドラッグエレメントを、カテゴリーＩＩＩに記載の任意の位置に連結することができる。プロドラッグの半減期を、
（ｉ）Ａアミノ酸のアルファ位上の置換基の数、
（ｉｉ）ＡおよびＢアミノ酸のＮ−アルキル化の程度、
（ｉｉｉ）Ｂアミノ酸のベータ位上の置換基の数、
（ｉｖ）Ｂアミノ酸の側鎖の嵩高さ、ならびに
（ｉｉｉ）ジケトピペラジン形成中のＱ上の脱離基の立体障害、求核性、および安定性
の選択により調整することができる。
【０７０６】
ジペプチドプロドラッグエレメントＡ−Ｂの改変
上記のジペプチドプロドラッグエレメントを、本明細書の以前に記載のように、親水性部分、アシル基、またはアルキル基を含むようにさらに改変することができる。いくつかの実施形態においては、ジペプチドプロドラッグエレメントは、その側鎖アミノ基によりアシル基またはアルキル基にコンジュゲートされたリシンを含む。いくつかの実施形態においては、ジペプチドプロドラッグエレメントは、側鎖スルフヒドリル基により親水性部分（例えば、４０ｋＤのＰＥＧ）にコンジュゲートされたシステインを含む。親水性部分、アシル基、またはアルキル基を、ジペプチドプロドラッグエレメントに直接、またはスペーサーを介してコンジュゲートすることができる。いくつかの例示的な実施形態においては、親水性基、アルキル基、および／またはアシル基を、ジペプチドプロドラッグエレメントのＡアミノ酸にコンジュゲートする。
いくつかの実施形態においては、以下のジペプチドプロドラッグエレメントは、ＰＥＧ化される：ｄＣｙｓ−Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）ｄＣｙｓ−Ｇｌｙ（Ｎ−メチル）、およびｄＣｙｓ−Ｐｈｅ（Ｎ−メチル）。いくつかの実施形態においては、以下のジペプチドプロドラッグエレメントは、アシル基を含む：ｄＬｙｓ−Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）、ｄＬｙｓ−Ｇｌｙ（Ｎ−メチル）、およびｄＬｙｓ−Ｐｈｅ（Ｎ−メチル）。いくつかの実施形態においては、以下のジペプチドプロドラッグエレメントは、アルキル基を含む：ｄＬｙｓ−Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）、ｄＬｙｓ−Ｇｌｙ（Ｎ−メチル）、およびｄＬｙｓ−Ｐｈｅ（Ｎ−メチル）。
【０７０７】
例示的実施形態
本発明のジペプチドプロドラッグエレメントは、カテゴリーＩに由来する任意のＢアミノ酸と、カテゴリーＩＩに由来する任意のＡアミノ酸との組合せを含んでもよい。ジペプチドプロドラッグエレメントのＡアミノ酸およびＢアミノ酸にとって好適なアミノ酸の非限定例を、以下の表に列挙する。
【０７０８】
【表４】
2016521253.tif 000054
2016521253.tif 000055
2016521253.tif 000056
【０７０９】
いくつかの実施形態においては、ジペプチドプロドラッグエレメントは、Ａ１〜Ａ７７のいずれか１つと、Ｂ１〜Ｂ１１３のいずれか１つとの組合せを含む。例えば、ジペプチドプロドラッグエレメントのＡアミノ酸とＢアミノ酸の組合せは、Ａ１−Ｂ１；Ａ１−Ｂ２；Ａ１−Ｂ３；Ａ１−Ｂ４；Ａ１−Ｂ５；Ａ１−Ｂ６；Ａ１−Ｂ７；Ａ１−Ｂ８；Ａ１−Ｂ９；Ａ１−Ｂ１０；Ａ１−Ｂ１１；Ａ１−Ｂ１２；Ａ１−Ｂ１３；Ａ１−Ｂ１４；Ａ１−Ｂ１５；Ａ１−Ｂ１６；Ａ１−Ｂ１７；Ａ１−Ｂ１８；Ａ１−Ｂ１９；Ａ１−Ｂ２０；Ａ１−Ｂ２１；Ａ１−Ｂ２２；Ａ１−Ｂ２３；Ａ１−Ｂ２４；Ａ１−Ｂ２５；Ａ１−Ｂ２６；Ａ１−Ｂ２７；Ａ１−Ｂ２８；Ａ１−Ｂ２９；Ａ１−Ｂ３０；Ａ１−Ｂ３１；Ａ１−Ｂ３２；Ａ１−Ｂ３３；Ａ１−Ｂ３４；Ａ１−Ｂ３５；Ａ１−Ｂ３６；Ａ１−Ｂ３７；Ａ１−Ｂ３８；Ａ１−Ｂ３９；Ａ１−Ｂ４０；Ａ１−Ｂ４１；Ａ１−Ｂ４２；Ａ１−Ｂ４３；Ａ１−Ｂ４４；Ａ１−Ｂ４５；Ａ１−Ｂ４６；Ａ１−Ｂ４７；Ａ１−Ｂ４８；Ａ１−Ｂ４９；Ａ１−Ｂ５０；Ａ１−Ｂ５１；Ａ１−Ｂ５２；Ａ１−Ｂ５３；Ａ１−Ｂ５４；Ａ１−Ｂ５５；Ａ１−Ｂ５６；Ａ１−Ｂ５７；Ａ１−Ｂ５８；Ａ１−Ｂ５９；Ａ１−Ｂ６０；Ａ１−Ｂ６１；Ａ１−Ｂ６２；Ａ１−Ｂ６３；Ａ１−Ｂ６４；Ａ１−Ｂ６５；Ａ１−Ｂ６６；Ａ１−Ｂ６７；Ａ１−Ｂ６８；Ａ１−Ｂ６９；Ａ１−Ｂ７０；Ａ１−Ｂ７１；Ａ１−Ｂ７２；Ａ１−Ｂ７３；Ａ１−Ｂ７４；Ａ１−Ｂ７５；Ａ１−Ｂ７６；Ａ１−Ｂ７７；Ａ１−Ｂ７８；Ａ１−Ｂ７９；Ａ１−Ｂ８０；Ａ１−Ｂ８１；Ａ１−Ｂ８２；Ａ１−Ｂ８３；Ａ１−Ｂ８４；Ａ１−Ｂ８５；Ａ１−Ｂ８６；Ａ１−Ｂ８７；Ａ１−Ｂ８８；Ａ１−Ｂ８９；Ａ１−Ｂ９０；Ａ１−Ｂ９１；Ａ１−Ｂ９２；Ａ１−Ｂ９３；Ａ１−Ｂ９４；Ａ１−Ｂ９５；Ａ１−Ｂ９６；Ａ１−Ｂ９７；Ａ１−Ｂ９８；Ａ１−Ｂ９９；Ａ１−Ｂ１００；Ａ１−Ｂ１０１；Ａ１−Ｂ１０２；Ａ１−Ｂ１０３；Ａ１−Ｂ１０４；Ａ１−Ｂ１０５；Ａ１−Ｂ１０６；Ａ１−Ｂ１０７；Ａ１−Ｂ１０８；Ａ１−Ｂ１０９；Ａ１−Ｂ１１０；Ａ１−Ｂ１１１；Ａ１−Ｂ１１２；Ａ１−Ｂ１１３；
【０７１０】
Ａ２−Ｂ１；Ａ２−Ｂ２；Ａ２−Ｂ３；Ａ２−Ｂ４；Ａ２−Ｂ５；Ａ２−Ｂ６；Ａ２−Ｂ７；Ａ２−Ｂ８；Ａ２−Ｂ９；Ａ２−Ｂ１０；Ａ２−Ｂ１１；Ａ２−Ｂ１２；Ａ２−Ｂ１３；Ａ２−Ｂ１４；Ａ２−Ｂ１５；Ａ２−Ｂ１６；Ａ２−Ｂ１７；Ａ２−Ｂ１８；Ａ２−Ｂ１９；Ａ２−Ｂ２０；Ａ２−Ｂ２１；Ａ２−Ｂ２２；Ａ２−Ｂ２３；Ａ２−Ｂ２４；Ａ２−Ｂ２５；Ａ２−Ｂ２６；Ａ２−Ｂ２７；Ａ２−Ｂ２８；Ａ２−Ｂ２９；Ａ２−Ｂ３０；Ａ２−Ｂ３１；Ａ２−Ｂ３２；Ａ２−Ｂ３３；Ａ２−Ｂ３４；Ａ２−Ｂ３５；Ａ２−Ｂ３６；Ａ２−Ｂ３７；Ａ２−Ｂ３８；Ａ２−Ｂ３９；Ａ２−Ｂ４０；Ａ２−Ｂ４１；Ａ２−Ｂ４２；Ａ２−Ｂ４３；Ａ２−Ｂ４４；Ａ２−Ｂ４５；Ａ２−Ｂ４６；Ａ２−Ｂ４７；Ａ２−Ｂ４８；Ａ２−Ｂ４９；Ａ２−Ｂ５０；Ａ２−Ｂ５１；Ａ２−Ｂ５２；Ａ２−Ｂ５３；Ａ２−Ｂ５４；Ａ２−Ｂ５５；Ａ２−Ｂ５６；Ａ２−Ｂ５７；Ａ２−Ｂ５８；Ａ２−Ｂ５９；Ａ２−Ｂ６０；Ａ２−Ｂ６１；Ａ２−Ｂ６２；Ａ２−Ｂ６３；Ａ２−Ｂ６４；Ａ２−Ｂ６５；Ａ２−Ｂ６６；Ａ２−Ｂ６７；Ａ２−Ｂ６８；Ａ２−Ｂ６９；Ａ２−Ｂ７０；Ａ２−Ｂ７１；Ａ２−Ｂ７２；Ａ２−Ｂ７３；Ａ２−Ｂ７４；Ａ２−Ｂ７５；Ａ２−Ｂ７６；Ａ２−Ｂ７７；Ａ２−Ｂ７８；Ａ２−Ｂ７９；Ａ２−Ｂ８０；Ａ２−Ｂ８１；Ａ２−Ｂ８２；Ａ２−Ｂ８３；Ａ２−Ｂ８４；Ａ２−Ｂ８５；Ａ２−Ｂ８６；Ａ２−Ｂ８７；Ａ２−Ｂ８８；Ａ２−Ｂ８９；Ａ２−Ｂ９０；Ａ２−Ｂ９１；Ａ２−Ｂ９２；Ａ２−Ｂ９３；Ａ２−Ｂ９４；Ａ２−Ｂ９５；Ａ２−Ｂ９６；Ａ２−Ｂ９７；Ａ２−Ｂ９８；Ａ２−Ｂ９９；Ａ２−Ｂ１００；Ａ２−Ｂ１０１；Ａ２−Ｂ１０２；Ａ２−Ｂ１０３；Ａ２−Ｂ１０４；Ａ２−Ｂ１０５；Ａ２−Ｂ１０６；Ａ２−Ｂ１０７；Ａ２−Ｂ１０８；Ａ２−Ｂ１０９；Ａ２−Ｂ１１０；Ａ２−Ｂ１１１；Ａ２−Ｂ１１２；Ａ２−Ｂ１１３；
【０７１１】
Ａ３−Ｂ１；Ａ３−Ｂ２；Ａ３−Ｂ３；Ａ３−Ｂ４；Ａ３−Ｂ５；Ａ３−Ｂ６；Ａ３−Ｂ７；Ａ３−Ｂ８；Ａ３−Ｂ９；Ａ３−Ｂ１０；Ａ３−Ｂ１１；Ａ３−Ｂ１２；Ａ３−Ｂ１３；Ａ３−Ｂ１４；Ａ３−Ｂ１５；Ａ３−Ｂ１６；Ａ３−Ｂ１７；Ａ３−Ｂ１８；Ａ３−Ｂ１９；Ａ３−Ｂ２０；Ａ３−Ｂ２１；Ａ３−Ｂ２２；Ａ３−Ｂ２３；Ａ３−Ｂ２４；Ａ３−Ｂ２５；Ａ３−Ｂ２６；Ａ３−Ｂ２７；Ａ３−Ｂ２８；Ａ３−Ｂ２９；Ａ３−Ｂ３０；Ａ３−Ｂ３１；Ａ３−Ｂ３２；Ａ３−Ｂ３３；Ａ３−Ｂ３４；Ａ３−Ｂ３５；Ａ３−Ｂ３６；Ａ３−Ｂ３７；Ａ３−Ｂ３８；Ａ３−Ｂ３９；Ａ３−Ｂ４０；Ａ３−Ｂ４１；Ａ３−Ｂ４２；Ａ３−Ｂ４３；Ａ３−Ｂ４４；Ａ３−Ｂ４５；Ａ３−Ｂ４６；Ａ３−Ｂ４７；Ａ３−Ｂ４８；Ａ３−Ｂ４９；Ａ３−Ｂ５０；Ａ３−Ｂ５１；Ａ３−Ｂ５２；Ａ３−Ｂ５３；Ａ３−Ｂ５４；Ａ３−Ｂ５５；Ａ３−Ｂ５６；Ａ３−Ｂ５７；Ａ３−Ｂ５８；Ａ３−Ｂ５９；Ａ３−Ｂ６０；Ａ３−Ｂ６１；Ａ３−Ｂ６２；Ａ３−Ｂ６３；Ａ３−Ｂ６４；Ａ３−Ｂ６５；Ａ３−Ｂ６６；Ａ３−Ｂ６７；Ａ３−Ｂ６８；Ａ３−Ｂ６９；Ａ３−Ｂ７０；Ａ３−Ｂ７１；Ａ３−Ｂ７２；Ａ３−Ｂ７３；Ａ３−Ｂ７４；Ａ３−Ｂ７５；Ａ３−Ｂ７６；Ａ３−Ｂ７７；Ａ３−Ｂ７８；Ａ３−Ｂ７９；Ａ３−Ｂ８０；Ａ３−Ｂ８１；Ａ３−Ｂ８２；Ａ３−Ｂ８３；Ａ３−Ｂ８４；Ａ３−Ｂ８５；Ａ３−Ｂ８６；Ａ３−Ｂ８７；Ａ３−Ｂ８８；Ａ３−Ｂ８９；Ａ３−Ｂ９０；Ａ３−Ｂ９１；Ａ３−Ｂ９２；Ａ３−Ｂ９３；Ａ３−Ｂ９４；Ａ３−Ｂ９５；Ａ３−Ｂ９６；Ａ３−Ｂ９７；Ａ３−Ｂ９８；Ａ３−Ｂ９９；Ａ３−Ｂ１００；Ａ３−Ｂ１０１；Ａ３−Ｂ１０２；Ａ３−Ｂ１０３；Ａ３−Ｂ１０４；Ａ３−Ｂ１０５；Ａ３−Ｂ１０６；Ａ３−Ｂ１０７；Ａ３−Ｂ１０８；Ａ３−Ｂ１０９；Ａ３−Ｂ１１０；Ａ３−Ｂ１１１；Ａ３−Ｂ１１２；Ａ３−Ｂ１１３；
【０７１２】
Ａ４−Ｂ１；Ａ４−Ｂ２；Ａ４−Ｂ３；Ａ４−Ｂ４；Ａ４−Ｂ５；Ａ４−Ｂ６；Ａ４−Ｂ７；Ａ４−Ｂ８；Ａ４−Ｂ９；Ａ４−Ｂ１０；Ａ４−Ｂ１１；Ａ４−Ｂ１２；Ａ４−Ｂ１３；Ａ４−Ｂ１４；Ａ４−Ｂ１５；Ａ４−Ｂ１６；Ａ４−Ｂ１７；Ａ４−Ｂ１８；Ａ４−Ｂ１９；Ａ４−Ｂ２０；Ａ４−Ｂ２１；Ａ４−Ｂ２２；Ａ４−Ｂ２３；Ａ４−Ｂ２４；Ａ４−Ｂ２５；Ａ４−Ｂ２６；Ａ４−Ｂ２７；Ａ４−Ｂ２８；Ａ４−Ｂ２９；Ａ４−Ｂ３０；Ａ４−Ｂ３１；Ａ４−Ｂ３２；Ａ４−Ｂ３３；Ａ４−Ｂ３４；Ａ４−Ｂ３５；Ａ４−Ｂ３６；Ａ４−Ｂ３７；Ａ４−Ｂ３８；Ａ４−Ｂ３９；Ａ４−Ｂ４０；Ａ４−Ｂ４１；Ａ４−Ｂ４２；Ａ４−Ｂ４３；Ａ４−Ｂ４４；Ａ４−Ｂ４５；Ａ４−Ｂ４６；Ａ４−Ｂ４７；Ａ４−Ｂ４８；Ａ４−Ｂ４９；Ａ４−Ｂ５０；Ａ４−Ｂ５１；Ａ４−Ｂ５２；Ａ４−Ｂ５３；Ａ４−Ｂ５４；Ａ４−Ｂ５５；Ａ４−Ｂ５６；Ａ４−Ｂ５７；Ａ４−Ｂ５８；Ａ４−Ｂ５９；Ａ４−Ｂ６０；Ａ４−Ｂ６１；Ａ４−Ｂ６２；Ａ４−Ｂ６３；Ａ４−Ｂ６４；Ａ４−Ｂ６５；Ａ４−Ｂ６６；Ａ４−Ｂ６７；Ａ４−Ｂ６８；Ａ４−Ｂ６９；Ａ４−Ｂ７０；Ａ４−Ｂ７１；Ａ４−Ｂ７２；Ａ４−Ｂ７３；Ａ４−Ｂ７４；Ａ４−Ｂ７５；Ａ４−Ｂ７６；Ａ４−Ｂ７７；Ａ４−Ｂ７８；Ａ４−Ｂ７９；Ａ４−Ｂ８０；Ａ４−Ｂ８１；Ａ４−Ｂ８２；Ａ４−Ｂ８３；Ａ４−Ｂ８４；Ａ４−Ｂ８５；Ａ４−Ｂ８６；Ａ４−Ｂ８７；Ａ４−Ｂ８８；Ａ４−Ｂ８９；Ａ４−Ｂ９０；Ａ４−Ｂ９１；Ａ４−Ｂ９２；Ａ４−Ｂ９３；Ａ４−Ｂ９４；Ａ４−Ｂ９５；Ａ４−Ｂ９６；Ａ４−Ｂ９７；Ａ４−Ｂ９８；Ａ４−Ｂ９９；Ａ４−Ｂ１００；Ａ４−Ｂ１０１；Ａ４−Ｂ１０２；Ａ４−Ｂ１０３；Ａ４−Ｂ１０４；Ａ４−Ｂ１０５；Ａ４−Ｂ１０６；Ａ４−Ｂ１０７；Ａ４−Ｂ１０８；Ａ４−Ｂ１０９；Ａ４−Ｂ１１０；Ａ４−Ｂ１１１；Ａ４−Ｂ１１２；Ａ４−Ｂ１１３；
【０７１３】
Ａ５−Ｂ１；Ａ５−Ｂ２；Ａ５−Ｂ３；Ａ５−Ｂ４；Ａ５−Ｂ５；Ａ５−Ｂ６；Ａ５−Ｂ７；Ａ５−Ｂ８；Ａ５−Ｂ９；Ａ５−Ｂ１０；Ａ５−Ｂ１１；Ａ５−Ｂ１２；Ａ５−Ｂ１３；Ａ５−Ｂ１４；Ａ５−Ｂ１５；Ａ５−Ｂ１６；Ａ５−Ｂ１７；Ａ５−Ｂ１８；Ａ５−Ｂ１９；Ａ５−Ｂ２０；Ａ５−Ｂ２１；Ａ５−Ｂ２２；Ａ５−Ｂ２３；Ａ５−Ｂ２４；Ａ５−Ｂ２５；Ａ５−Ｂ２６；Ａ５−Ｂ２７；Ａ５−Ｂ２８；Ａ５−Ｂ２９；Ａ５−Ｂ３０；Ａ５−Ｂ３１；Ａ５−Ｂ３２；Ａ５−Ｂ３３；Ａ５−Ｂ３４；Ａ５−Ｂ３５；Ａ５−Ｂ３６；Ａ５−Ｂ３７；Ａ５−Ｂ３８；Ａ５−Ｂ３９；Ａ５−Ｂ４０；Ａ５−Ｂ４１；Ａ５−Ｂ４２；Ａ５−Ｂ４３；Ａ５−Ｂ４４；Ａ５−Ｂ４５；Ａ５−Ｂ４６；Ａ５−Ｂ４７；Ａ５−Ｂ４８；Ａ５−Ｂ４９；Ａ５−Ｂ５０；Ａ５−Ｂ５１；Ａ５−Ｂ５２；Ａ５−Ｂ５３；Ａ５−Ｂ５４；Ａ５−Ｂ５５；Ａ５−Ｂ５６；Ａ５−Ｂ５７；Ａ５−Ｂ５８；Ａ５−Ｂ５９；Ａ５−Ｂ６０；Ａ５−Ｂ６１；Ａ５−Ｂ６２；Ａ５−Ｂ６３；Ａ５−Ｂ６４；Ａ５−Ｂ６５；Ａ５−Ｂ６６；Ａ５−Ｂ６７；Ａ５−Ｂ６８；Ａ５−Ｂ６９；Ａ５−Ｂ７０；Ａ５−Ｂ７１；Ａ５−Ｂ７２；Ａ５−Ｂ７３；Ａ５−Ｂ７４；Ａ５−Ｂ７５；Ａ５−Ｂ７６；Ａ５−Ｂ７７；Ａ５−Ｂ７８；Ａ５−Ｂ７９；Ａ５−Ｂ８０；Ａ５−Ｂ８１；Ａ５−Ｂ８２；Ａ５−Ｂ８３；Ａ５−Ｂ８４；Ａ５−Ｂ８５；Ａ５−Ｂ８６；Ａ５−Ｂ８７；Ａ５−Ｂ８８；Ａ５−Ｂ８９；Ａ５−Ｂ９０；Ａ５−Ｂ９１；Ａ５−Ｂ９２；Ａ５−Ｂ９３；Ａ５−Ｂ９４；Ａ５−Ｂ９５；Ａ５−Ｂ９６；Ａ５−Ｂ９７；Ａ５−Ｂ９８；Ａ５−Ｂ９９；Ａ５−Ｂ１００；Ａ５−Ｂ１０１；Ａ５−Ｂ１０２；Ａ５−Ｂ１０３；Ａ５−Ｂ１０４；Ａ５−Ｂ１０５；Ａ５−Ｂ１０６；Ａ５−Ｂ１０７；Ａ５−Ｂ１０８；Ａ５−Ｂ１０９；Ａ５−Ｂ１１０；Ａ５−Ｂ１１１；Ａ５−Ｂ１１２；Ａ５−Ｂ１１３；
【０７１４】
Ａ６−Ｂ１；Ａ６−Ｂ２；Ａ６−Ｂ３；Ａ６−Ｂ４；Ａ６−Ｂ５；Ａ６−Ｂ６；Ａ６−Ｂ７；Ａ６−Ｂ８；Ａ６−Ｂ９；Ａ６−Ｂ１０；Ａ６−Ｂ１１；Ａ６−Ｂ１２；Ａ６−Ｂ１３；Ａ６−Ｂ１４；Ａ６−Ｂ１５；Ａ６−Ｂ１６；Ａ６−Ｂ１７；Ａ６−Ｂ１８；Ａ６−Ｂ１９；Ａ６−Ｂ２０；Ａ６−Ｂ２１；Ａ６−Ｂ２２；Ａ６−Ｂ２３；Ａ６−Ｂ２４；Ａ６−Ｂ２５；Ａ６−Ｂ２６；Ａ６−Ｂ２７；Ａ６−Ｂ２８；Ａ６−Ｂ２９；Ａ６−Ｂ３０；Ａ６−Ｂ３１；Ａ６−Ｂ３２；Ａ６−Ｂ３３；Ａ６−Ｂ３４；Ａ６−Ｂ３５；Ａ６−Ｂ３６；Ａ６−Ｂ３７；Ａ６−Ｂ３８；Ａ６−Ｂ３９；Ａ６−Ｂ４０；Ａ６−Ｂ４１；Ａ６−Ｂ４２；Ａ６−Ｂ４３；Ａ６−Ｂ４４；Ａ６−Ｂ４５；Ａ６−Ｂ４６；Ａ６−Ｂ４７；Ａ６−Ｂ４８；Ａ６−Ｂ４９；Ａ６−Ｂ５０；Ａ６−Ｂ５１；Ａ６−Ｂ５２；Ａ６−Ｂ５３；Ａ６−Ｂ５４；Ａ６−Ｂ５５；Ａ６−Ｂ５６；Ａ６−Ｂ５７；Ａ６−Ｂ５８；Ａ６−Ｂ５９；Ａ６−Ｂ６０；Ａ６−Ｂ６１；Ａ６−Ｂ６２；Ａ６−Ｂ６３；Ａ６−Ｂ６４；Ａ６−Ｂ６５；Ａ６−Ｂ６６；Ａ６−Ｂ６７；Ａ６−Ｂ６８；Ａ６−Ｂ６９；Ａ６−Ｂ７０；Ａ６−Ｂ７１；Ａ６−Ｂ７２；Ａ６−Ｂ７３；Ａ６−Ｂ７４；Ａ６−Ｂ７５；Ａ６−Ｂ７６；Ａ６−Ｂ７７；Ａ６−Ｂ７８；Ａ６−Ｂ７９；Ａ６−Ｂ８０；Ａ６−Ｂ８１；Ａ６−Ｂ８２；Ａ６−Ｂ８３；Ａ６−Ｂ８４；Ａ６−Ｂ８５；Ａ６−Ｂ８６；Ａ６−Ｂ８７；Ａ６−Ｂ８８；Ａ６−Ｂ８９；Ａ６−Ｂ９０；Ａ６−Ｂ９１；Ａ６−Ｂ９２；Ａ６−Ｂ９３；Ａ６−Ｂ９４；Ａ６−Ｂ９５；Ａ６−Ｂ９６；Ａ６−Ｂ９７；Ａ６−Ｂ９８；Ａ６−Ｂ９９；Ａ６−Ｂ１００；Ａ６−Ｂ１０１；Ａ６−Ｂ１０２；Ａ６−Ｂ１０３；Ａ６−Ｂ１０４；Ａ６−Ｂ１０５；Ａ６−Ｂ１０６；Ａ６−Ｂ１０７；Ａ６−Ｂ１０８；Ａ６−Ｂ１０９；Ａ６−Ｂ１１０；Ａ６−Ｂ１１１；Ａ６−Ｂ１１２；Ａ６−Ｂ１１３；
【０７１５】
Ａ７−Ｂ１；Ａ７−Ｂ２；Ａ７−Ｂ３；Ａ７−Ｂ４；Ａ７−Ｂ５；Ａ７−Ｂ６；Ａ７−Ｂ７；Ａ７−Ｂ８；Ａ７−Ｂ９；Ａ７−Ｂ１０；Ａ７−Ｂ１１；Ａ７−Ｂ１２；Ａ７−Ｂ１３；Ａ７−Ｂ１４；Ａ７−Ｂ１５；Ａ７−Ｂ１６；Ａ７−Ｂ１７；Ａ７−Ｂ１８；Ａ７−Ｂ１９；Ａ７−Ｂ２０；Ａ７−Ｂ２１；Ａ７−Ｂ２２；Ａ７−Ｂ２３；Ａ７−Ｂ２４；Ａ７−Ｂ２５；Ａ７−Ｂ２６；Ａ７−Ｂ２７；Ａ７−Ｂ２８；Ａ７−Ｂ２９；Ａ７−Ｂ３０；Ａ７−Ｂ３１；Ａ７−Ｂ３２；Ａ７−Ｂ３３；Ａ７−Ｂ３４；Ａ７−Ｂ３５；Ａ７−Ｂ３６；Ａ７−Ｂ３７；Ａ７−Ｂ３８；Ａ７−Ｂ３９；Ａ７−Ｂ４０；Ａ７−Ｂ４１；Ａ７−Ｂ４２；Ａ７−Ｂ４３；Ａ７−Ｂ４４；Ａ７−Ｂ４５；Ａ７−Ｂ４６；Ａ７−Ｂ４７；Ａ７−Ｂ４８；Ａ７−Ｂ４９；Ａ７−Ｂ５０；Ａ７−Ｂ５１；Ａ７−Ｂ５２；Ａ７−Ｂ５３；Ａ７−Ｂ５４；Ａ７−Ｂ５５；Ａ７−Ｂ５６；Ａ７−Ｂ５７；Ａ７−Ｂ５８；Ａ７−Ｂ５９；Ａ７−Ｂ６０；Ａ７−Ｂ６１；Ａ７−Ｂ６２；Ａ７−Ｂ６３；Ａ７−Ｂ６４；Ａ７−Ｂ６５；Ａ７−Ｂ６６；Ａ７−Ｂ６７；Ａ７−Ｂ６８；Ａ７−Ｂ６９；Ａ７−Ｂ７０；Ａ７−Ｂ７１；Ａ７−Ｂ７２；Ａ７−Ｂ７３；Ａ７−Ｂ７４；Ａ７−Ｂ７５；Ａ７−Ｂ７６；Ａ７−Ｂ７７；Ａ７−Ｂ７８；Ａ７−Ｂ７９；Ａ７−Ｂ８０；Ａ７−Ｂ８１；Ａ７−Ｂ８２；Ａ７−Ｂ８３；Ａ７−Ｂ８４；Ａ７−Ｂ８５；Ａ７−Ｂ８６；Ａ７−Ｂ８７；Ａ７−Ｂ８８；Ａ７−Ｂ８９；Ａ７−Ｂ９０；Ａ７−Ｂ９１；Ａ７−Ｂ９２；Ａ７−Ｂ９３；Ａ７−Ｂ９４；Ａ７−Ｂ９５；Ａ７−Ｂ９６；Ａ７−Ｂ９７；Ａ７−Ｂ９８；Ａ７−Ｂ９９；Ａ７−Ｂ１００；Ａ７−Ｂ１０１；Ａ７−Ｂ１０２；Ａ７−Ｂ１０３；Ａ７−Ｂ１０４；Ａ７−Ｂ１０５；Ａ７−Ｂ１０６；Ａ７−Ｂ１０７；Ａ７−Ｂ１０８；Ａ７−Ｂ１０９；Ａ７−Ｂ１１０；Ａ７−Ｂ１１１；Ａ７−Ｂ１１２；Ａ７−Ｂ１１３；
【０７１６】
Ａ８−Ｂ１；Ａ８−Ｂ２；Ａ８−Ｂ３；Ａ８−Ｂ４；Ａ８−Ｂ５；Ａ８−Ｂ６；Ａ８−Ｂ７；Ａ８−Ｂ８；Ａ８−Ｂ９；Ａ８−Ｂ１０；Ａ８−Ｂ１１；Ａ８−Ｂ１２；Ａ８−Ｂ１３；Ａ８−Ｂ１４；Ａ８−Ｂ１５；Ａ８−Ｂ１６；Ａ８−Ｂ１７；Ａ８−Ｂ１８；Ａ８−Ｂ１９；Ａ８−Ｂ２０；Ａ８−Ｂ２１；Ａ８−Ｂ２２；Ａ８−Ｂ２３；Ａ８−Ｂ２４；Ａ８−Ｂ２５；Ａ８−Ｂ２６；Ａ８−Ｂ２７；Ａ８−Ｂ２８；Ａ８−Ｂ２９；Ａ８−Ｂ３０；Ａ８−Ｂ３１；Ａ８−Ｂ３２；Ａ８−Ｂ３３；Ａ８−Ｂ３４；Ａ８−Ｂ３５；Ａ８−Ｂ３６；Ａ８−Ｂ３７；Ａ８−Ｂ３８；Ａ８−Ｂ３９；Ａ８−Ｂ４０；Ａ８−Ｂ４１；Ａ８−Ｂ４２；Ａ８−Ｂ４３；Ａ８−Ｂ４４；Ａ８−Ｂ４５；Ａ８−Ｂ４６；Ａ８−Ｂ４７；Ａ８−Ｂ４８；Ａ８−Ｂ４９；Ａ８−Ｂ５０；Ａ８−Ｂ５１；Ａ８−Ｂ５２；Ａ８−Ｂ５３；Ａ８−Ｂ５４；Ａ８−Ｂ５５；Ａ８−Ｂ５６；Ａ８−Ｂ５７；Ａ８−Ｂ５８；Ａ８−Ｂ５９；Ａ８−Ｂ６０；Ａ８−Ｂ６１；Ａ８−Ｂ６２；Ａ８−Ｂ６３；Ａ８−Ｂ６４；Ａ８−Ｂ６５；Ａ８−Ｂ６６；Ａ８−Ｂ６７；Ａ８−Ｂ６８；Ａ８−Ｂ６９；Ａ８−Ｂ７０；Ａ８−Ｂ７１；Ａ８−Ｂ７２；Ａ８−Ｂ７３；Ａ８−Ｂ７４；Ａ８−Ｂ７５；Ａ８−Ｂ７６；Ａ８−Ｂ７７；Ａ８−Ｂ７８；Ａ８−Ｂ７９；Ａ８−Ｂ８０；Ａ８−Ｂ８１；Ａ８−Ｂ８２；Ａ８−Ｂ８３；Ａ８−Ｂ８４；Ａ８−Ｂ８５；Ａ８−Ｂ８６；Ａ８−Ｂ８７；Ａ８−Ｂ８８；Ａ８−Ｂ８９；Ａ８−Ｂ９０；Ａ８−Ｂ９１；Ａ８−Ｂ９２；Ａ８−Ｂ９３；Ａ８−Ｂ９４；Ａ８−Ｂ９５；Ａ８−Ｂ９６；Ａ８−Ｂ９７；Ａ８−Ｂ９８；Ａ８−Ｂ９９；Ａ８−Ｂ１００；Ａ８−Ｂ１０１；Ａ８−Ｂ１０２；Ａ８−Ｂ１０３；Ａ８−Ｂ１０４；Ａ８−Ｂ１０５；Ａ８−Ｂ１０６；Ａ８−Ｂ１０７；Ａ８−Ｂ１０８；Ａ８−Ｂ１０９；Ａ８−Ｂ１１０；Ａ８−Ｂ１１１；Ａ８−Ｂ１１２；Ａ８−Ｂ１１３；
【０７１７】
Ａ９−Ｂ１；Ａ９−Ｂ２；Ａ９−Ｂ３；Ａ９−Ｂ４；Ａ９−Ｂ５；Ａ９−Ｂ６；Ａ９−Ｂ７；Ａ９−Ｂ８；Ａ９−Ｂ９；Ａ９−Ｂ１０；Ａ９−Ｂ１１；Ａ９−Ｂ１２；Ａ９−Ｂ１３；Ａ９−Ｂ１４；Ａ９−Ｂ１５；Ａ９−Ｂ１６；Ａ９−Ｂ１７；Ａ９−Ｂ１８；Ａ９−Ｂ１９；Ａ９−Ｂ２０；Ａ９−Ｂ２１；Ａ９−Ｂ２２；Ａ９−Ｂ２３；Ａ９−Ｂ２４；Ａ９−Ｂ２５；Ａ９−Ｂ２６；Ａ９−Ｂ２７；Ａ９−Ｂ２８；Ａ９−Ｂ２９；Ａ９−Ｂ３０；Ａ９−Ｂ３１；Ａ９−Ｂ３２；Ａ９−Ｂ３３；Ａ９−Ｂ３４；Ａ９−Ｂ３５；Ａ９−Ｂ３６；Ａ９−Ｂ３７；Ａ９−Ｂ３８；Ａ９−Ｂ３９；Ａ９−Ｂ４０；Ａ９−Ｂ４１；Ａ９−Ｂ４２；Ａ９−Ｂ４３；Ａ９−Ｂ４４；Ａ９−Ｂ４５；Ａ９−Ｂ４６；Ａ９−Ｂ４７；Ａ９−Ｂ４８；Ａ９−Ｂ４９；Ａ９−Ｂ５０；Ａ９−Ｂ５１；Ａ９−Ｂ５２；Ａ９−Ｂ５３；Ａ９−Ｂ５４；Ａ９−Ｂ５５；Ａ９−Ｂ５６；Ａ９−Ｂ５７；Ａ９−Ｂ５８；Ａ９−Ｂ５９；Ａ９−Ｂ６０；Ａ９−Ｂ６１；Ａ９−Ｂ６２；Ａ９−Ｂ６３；Ａ９−Ｂ６４；Ａ９−Ｂ６５；Ａ９−Ｂ６６；Ａ９−Ｂ６７；Ａ９−Ｂ６８；Ａ９−Ｂ６９；Ａ９−Ｂ７０；Ａ９−Ｂ７１；Ａ９−Ｂ７２；Ａ９−Ｂ７３；Ａ９−Ｂ７４；Ａ９−Ｂ７５；Ａ９−Ｂ７６；Ａ９−Ｂ７７；Ａ９−Ｂ７８；Ａ９−Ｂ７９；Ａ９−Ｂ８０；Ａ９−Ｂ８１；Ａ９−Ｂ８２；Ａ９−Ｂ８３；Ａ９−Ｂ８４；Ａ９−Ｂ８５；Ａ９−Ｂ８６；Ａ９−Ｂ８７；Ａ９−Ｂ８８；Ａ９−Ｂ８９；Ａ９−Ｂ９０；Ａ９−Ｂ９１；Ａ９−Ｂ９２；Ａ９−Ｂ９３；Ａ９−Ｂ９４；Ａ９−Ｂ９５；Ａ９−Ｂ９６；Ａ９−Ｂ９７；Ａ９−Ｂ９８；Ａ９−Ｂ９９；Ａ９−Ｂ１００；Ａ９−Ｂ１０１；Ａ９−Ｂ１０２；Ａ９−Ｂ１０３；Ａ９−Ｂ１０４；Ａ９−Ｂ１０５；Ａ９−Ｂ１０６；Ａ９−Ｂ１０７；Ａ９−Ｂ１０８；Ａ９−Ｂ１０９；Ａ９−Ｂ１１０；Ａ９−Ｂ１１１；Ａ９−Ｂ１１２；Ａ９−Ｂ１１３；
【０７１８】
Ａ１０−Ｂ１；Ａ１０−Ｂ２；Ａ１０−Ｂ３；Ａ１０−Ｂ４；Ａ１０−Ｂ５；Ａ１０−Ｂ６；Ａ１０−Ｂ７；Ａ１０−Ｂ８；Ａ１０−Ｂ９；Ａ１０−Ｂ１０；Ａ１０−Ｂ１１；Ａ１０−Ｂ１２；Ａ１０−Ｂ１３；Ａ１０−Ｂ１４；Ａ１０−Ｂ１５；Ａ１０−Ｂ１６；Ａ１０−Ｂ１７；Ａ１０−Ｂ１８；Ａ１０−Ｂ１９；Ａ１０−Ｂ２０；Ａ１０−Ｂ２１；Ａ１０−Ｂ２２；Ａ１０−Ｂ２３；Ａ１０−Ｂ２４；Ａ１０−Ｂ２５；Ａ１０−Ｂ２６；Ａ１０−Ｂ２７；Ａ１０−Ｂ２８；Ａ１０−Ｂ２９；Ａ１０−Ｂ３０；Ａ１０−Ｂ３１；Ａ１０−Ｂ３２；Ａ１０−Ｂ３３；Ａ１０−Ｂ３４；Ａ１０−Ｂ３５；Ａ１０−Ｂ３６；Ａ１０−Ｂ３７；Ａ１０−Ｂ３８；Ａ１０−Ｂ３９；Ａ１０−Ｂ４０；Ａ１０−Ｂ４１；Ａ１０−Ｂ４２；Ａ１０−Ｂ４３；Ａ１０−Ｂ４４；Ａ１０−Ｂ４５；Ａ１０−Ｂ４６；Ａ１０−Ｂ４７；Ａ１０−Ｂ４８；Ａ１０−Ｂ４９；Ａ１０−Ｂ５０；Ａ１０−Ｂ５１；Ａ１０−Ｂ５２；Ａ１０−Ｂ５３；Ａ１０−Ｂ５４；Ａ１０−Ｂ５５；Ａ１０−Ｂ５６；Ａ１０−Ｂ５７；Ａ１０−Ｂ５８；Ａ１０−Ｂ５９；Ａ１０−Ｂ６０；Ａ１０−Ｂ６１；Ａ１０−Ｂ６２；Ａ１０−Ｂ６３；Ａ１０−Ｂ６４；Ａ１０−Ｂ６５；Ａ１０−Ｂ６６；Ａ１０−Ｂ６７；Ａ１０−Ｂ６８；Ａ１０−Ｂ６９；Ａ１０−Ｂ７０；Ａ１０−Ｂ７１；Ａ１０−Ｂ７２；Ａ１０−Ｂ７３；Ａ１０−Ｂ７４；Ａ１０−Ｂ７５；Ａ１０−Ｂ７６；Ａ１０−Ｂ７７；Ａ１０−Ｂ７８；Ａ１０−Ｂ７９；Ａ１０−Ｂ８０；Ａ１０−Ｂ８１；Ａ１０−Ｂ８２；Ａ１０−Ｂ８３；Ａ１０−Ｂ８４；Ａ１０−Ｂ８５；Ａ１０−Ｂ８６；Ａ１０−Ｂ８７；Ａ１０−Ｂ８８；Ａ１０−Ｂ８９；Ａ１０−Ｂ９０；Ａ１０−Ｂ９１；Ａ１０−Ｂ９２；Ａ１０−Ｂ９３；Ａ１０−Ｂ９４；Ａ１０−Ｂ９５；Ａ１０−Ｂ９６；Ａ１０−Ｂ９７；Ａ１０−Ｂ９８；Ａ１０−Ｂ９９；Ａ１０−Ｂ１００；Ａ１０−Ｂ１０１；Ａ１０−Ｂ１０２；Ａ１０−Ｂ１０３；Ａ１０−Ｂ１０４；Ａ１０−Ｂ１０５；Ａ１０−Ｂ１０６；Ａ１０−Ｂ１０７；Ａ１０−Ｂ１０８；Ａ１０−Ｂ１０９；Ａ１０−Ｂ１１０；Ａ１０−Ｂ１１１；Ａ１０−Ｂ１１２；Ａ１０−Ｂ１１３；
【０７１９】
Ａ１１−Ｂ１；Ａ１１−Ｂ２；Ａ１１−Ｂ３；Ａ１１−Ｂ４；Ａ１１−Ｂ５；Ａ１１−Ｂ６；Ａ１１−Ｂ７；Ａ１１−Ｂ８；Ａ１１−Ｂ９；Ａ１１−Ｂ１０；Ａ１１−Ｂ１１；Ａ１１−Ｂ１２；Ａ１１−Ｂ１３；Ａ１１−Ｂ１４；Ａ１１−Ｂ１５；Ａ１１−Ｂ１６；Ａ１１−Ｂ１７；Ａ１１−Ｂ１８；Ａ１１−Ｂ１９；Ａ１１−Ｂ２０；Ａ１１−Ｂ２１；Ａ１１−Ｂ２２；Ａ１１−Ｂ２３；Ａ１１−Ｂ２４；Ａ１１−Ｂ２５；Ａ１１−Ｂ２６；Ａ１１−Ｂ２７；Ａ１１−Ｂ２８；Ａ１１−Ｂ２９；Ａ１１−Ｂ３０；Ａ１１−Ｂ３１；Ａ１１−Ｂ３２；Ａ１１−Ｂ３３；Ａ１１−Ｂ３４；Ａ１１−Ｂ３５；Ａ１１−Ｂ３６；Ａ１１−Ｂ３７；Ａ１１−Ｂ３８；Ａ１１−Ｂ３９；Ａ１１−Ｂ４０；Ａ１１−Ｂ４１；Ａ１１−Ｂ４２；Ａ１１−Ｂ４３；Ａ１１−Ｂ４４；Ａ１１−Ｂ４５；Ａ１１−Ｂ４６；Ａ１１−Ｂ４７；Ａ１１−Ｂ４８；Ａ１１−Ｂ４９；Ａ１１−Ｂ５０；Ａ１１−Ｂ５１；Ａ１１−Ｂ５２；Ａ１１−Ｂ５３；Ａ１１−Ｂ５４；Ａ１１−Ｂ５５；Ａ１１−Ｂ５６；Ａ１１−Ｂ５７；Ａ１１−Ｂ５８；Ａ１１−Ｂ５９；Ａ１１−Ｂ６０；Ａ１１−Ｂ６１；Ａ１１−Ｂ６２；Ａ１１−Ｂ６３；Ａ１１−Ｂ６４；Ａ１１−Ｂ６５；Ａ１１−Ｂ６６；Ａ１１−Ｂ６７；Ａ１１−Ｂ６８；Ａ１１−Ｂ６９；Ａ１１−Ｂ７０；Ａ１１−Ｂ７１；Ａ１１−Ｂ７２；Ａ１１−Ｂ７３；Ａ１１−Ｂ７４；Ａ１１−Ｂ７５；Ａ１１−Ｂ７６；Ａ１１−Ｂ７７；Ａ１１−Ｂ７８；Ａ１１−Ｂ７９；Ａ１１−Ｂ８０；Ａ１１−Ｂ８１；Ａ１１−Ｂ８２；Ａ１１−Ｂ８３；Ａ１１−Ｂ８４；Ａ１１−Ｂ８５；Ａ１１−Ｂ８６；Ａ１１−Ｂ８７；Ａ１１−Ｂ８８；Ａ１１−Ｂ８９；Ａ１１−Ｂ９０；Ａ１１−Ｂ９１；Ａ１１−Ｂ９２；Ａ１１−Ｂ９３；Ａ１１−Ｂ９４；Ａ１１−Ｂ９５；Ａ１１−Ｂ９６；Ａ１１−Ｂ９７；Ａ１１−Ｂ９８；Ａ１１−Ｂ９９；Ａ１１−Ｂ１００；Ａ１１−Ｂ１０１；Ａ１１−Ｂ１０２；Ａ１１−Ｂ１０３；Ａ１１−Ｂ１０４；Ａ１１−Ｂ１０５；Ａ１１−Ｂ１０６；Ａ１１−Ｂ１０７；Ａ１１−Ｂ１０８；Ａ１１−Ｂ１０９；Ａ１１−Ｂ１１０；Ａ１１−Ｂ１１１；Ａ１１−Ｂ１１２；Ａ１１−Ｂ１１３；
【０７２０】
Ａ１２−Ｂ１；Ａ１２−Ｂ２；Ａ１２−Ｂ３；Ａ１２−Ｂ４；Ａ１２−Ｂ５；Ａ１２−Ｂ６；Ａ１２−Ｂ７；Ａ１２−Ｂ８；Ａ１２−Ｂ９；Ａ１２−Ｂ１０；Ａ１２−Ｂ１１；Ａ１２−Ｂ１２；Ａ１２−Ｂ１３；Ａ１２−Ｂ１４；Ａ１２−Ｂ１５；Ａ１２−Ｂ１６；Ａ１２−Ｂ１７；Ａ１２−Ｂ１８；Ａ１２−Ｂ１９；Ａ１２−Ｂ２０；Ａ１２−Ｂ２１；Ａ１２−Ｂ２２；Ａ１２−Ｂ２３；Ａ１２−Ｂ２４；Ａ１２−Ｂ２５；Ａ１２−Ｂ２６；Ａ１２−Ｂ２７；Ａ１２−Ｂ２８；Ａ１２−Ｂ２９；Ａ１２−Ｂ３０；Ａ１２−Ｂ３１；Ａ１２−Ｂ３２；Ａ１２−Ｂ３３；Ａ１２−Ｂ３４；Ａ１２−Ｂ３５；Ａ１２−Ｂ３６；Ａ１２−Ｂ３７；Ａ１２−Ｂ３８；Ａ１２−Ｂ３９；Ａ１２−Ｂ４０；Ａ１２−Ｂ４１；Ａ１２−Ｂ４２；Ａ１２−Ｂ４３；Ａ１２−Ｂ４４；Ａ１２−Ｂ４５；Ａ１２−Ｂ４６；Ａ１２−Ｂ４７；Ａ１２−Ｂ４８；Ａ１２−Ｂ４９；Ａ１２−Ｂ５０；Ａ１２−Ｂ５１；Ａ１２−Ｂ５２；Ａ１２−Ｂ５３；Ａ１２−Ｂ５４；Ａ１２−Ｂ５５；Ａ１２−Ｂ５６；Ａ１２−Ｂ５７；Ａ１２−Ｂ５８；Ａ１２−Ｂ５９；Ａ１２−Ｂ６０；Ａ１２−Ｂ６１；Ａ１２−Ｂ６２；Ａ１２−Ｂ６３；Ａ１２−Ｂ６４；Ａ１２−Ｂ６５；Ａ１２−Ｂ６６；Ａ１２−Ｂ６７；Ａ１２−Ｂ６８；Ａ１２−Ｂ６９；Ａ１２−Ｂ７０；Ａ１２−Ｂ７１；Ａ１２−Ｂ７２；Ａ１２−Ｂ７３；Ａ１２−Ｂ７４；Ａ１２−Ｂ７５；Ａ１２−Ｂ７６；Ａ１２−Ｂ７７；Ａ１２−Ｂ７８；Ａ１２−Ｂ７９；Ａ１２−Ｂ８０；Ａ１２−Ｂ８１；Ａ１２−Ｂ８２；Ａ１２−Ｂ８３；Ａ１２−Ｂ８４；Ａ１２−Ｂ８５；Ａ１２−Ｂ８６；Ａ１２−Ｂ８７；Ａ１２−Ｂ８８；Ａ１２−Ｂ８９；Ａ１２−Ｂ９０；Ａ１２−Ｂ９１；Ａ１２−Ｂ９２；Ａ１２−Ｂ９３；Ａ１２−Ｂ９４；Ａ１２−Ｂ９５；Ａ１２−Ｂ９６；Ａ１２−Ｂ９７；Ａ１２−Ｂ９８；Ａ１２−Ｂ９９；Ａ１２−Ｂ１００；Ａ１２−Ｂ１０１；Ａ１２−Ｂ１０２；Ａ１２−Ｂ１０３；Ａ１２−Ｂ１０４；Ａ１２−Ｂ１０５；Ａ１２−Ｂ１０６；Ａ１２−Ｂ１０７；Ａ１２−Ｂ１０８；Ａ１２−Ｂ１０９；Ａ１２−Ｂ１１０；Ａ１２−Ｂ１１１；Ａ１２−Ｂ１１２；Ａ１２−Ｂ１１３；
【０７２１】
Ａ１３−Ｂ１；Ａ１３−Ｂ２；Ａ１３−Ｂ３；Ａ１３−Ｂ４；Ａ１３−Ｂ５；Ａ１３−Ｂ６；Ａ１３−Ｂ７；Ａ１３−Ｂ８；Ａ１３−Ｂ９；Ａ１３−Ｂ１０；Ａ１３−Ｂ１１；Ａ１３−Ｂ１２；Ａ１３−Ｂ１３；Ａ１３−Ｂ１４；Ａ１３−Ｂ１５；Ａ１３−Ｂ１６；Ａ１３−Ｂ１７；Ａ１３−Ｂ１８；Ａ１３−Ｂ１９；Ａ１３−Ｂ２０；Ａ１３−Ｂ２１；Ａ１３−Ｂ２２；Ａ１３−Ｂ２３；Ａ１３−Ｂ２４；Ａ１３−Ｂ２５；Ａ１３−Ｂ２６；Ａ１３−Ｂ２７；Ａ１３−Ｂ２８；Ａ１３−Ｂ２９；Ａ１３−Ｂ３０；Ａ１３−Ｂ３１；Ａ１３−Ｂ３２；Ａ１３−Ｂ３３；Ａ１３−Ｂ３４；Ａ１３−Ｂ３５；Ａ１３−Ｂ３６；Ａ１３−Ｂ３７；Ａ１３−Ｂ３８；Ａ１３−Ｂ３９；Ａ１３−Ｂ４０；Ａ１３−Ｂ４１；Ａ１３−Ｂ４２；Ａ１３−Ｂ４３；Ａ１３−Ｂ４４；Ａ１３−Ｂ４５；Ａ１３−Ｂ４６；Ａ１３−Ｂ４７；Ａ１３−Ｂ４８；Ａ１３−Ｂ４９；Ａ１３−Ｂ５０；Ａ１３−Ｂ５１；Ａ１３−Ｂ５２；Ａ１３−Ｂ５３；Ａ１３−Ｂ５４；Ａ１３−Ｂ５５；Ａ１３−Ｂ５６；Ａ１３−Ｂ５７；Ａ１３−Ｂ５８；Ａ１３−Ｂ５９；Ａ１３−Ｂ６０；Ａ１３−Ｂ６１；Ａ１３−Ｂ６２；Ａ１３−Ｂ６３；Ａ１３−Ｂ６４；Ａ１３−Ｂ６５；Ａ１３−Ｂ６６；Ａ１３−Ｂ６７；Ａ１３−Ｂ６８；Ａ１３−Ｂ６９；Ａ１３−Ｂ７０；Ａ１３−Ｂ７１；Ａ１３−Ｂ７２；Ａ１３−Ｂ７３；Ａ１３−Ｂ７４；Ａ１３−Ｂ７５；Ａ１３−Ｂ７６；Ａ１３−Ｂ７７；Ａ１３−Ｂ７８；Ａ１３−Ｂ７９；Ａ１３−Ｂ８０；Ａ１３−Ｂ８１；Ａ１３−Ｂ８２；Ａ１３−Ｂ８３；Ａ１３−Ｂ８４；Ａ１３−Ｂ８５；Ａ１３−Ｂ８６；Ａ１３−Ｂ８７；Ａ１３−Ｂ８８；Ａ１３−Ｂ８９；Ａ１３−Ｂ９０；Ａ１３−Ｂ９１；Ａ１３−Ｂ９２；Ａ１３−Ｂ９３；Ａ１３−Ｂ９４；Ａ１３−Ｂ９５；Ａ１３−Ｂ９６；Ａ１３−Ｂ９７；Ａ１３−Ｂ９８；Ａ１３−Ｂ９９；Ａ１３−Ｂ１００；Ａ１３−Ｂ１０１；Ａ１３−Ｂ１０２；Ａ１３−Ｂ１０３；Ａ１３−Ｂ１０４；Ａ１３−Ｂ１０５；Ａ１３−Ｂ１０６；Ａ１３−Ｂ１０７；Ａ１３−Ｂ１０８；Ａ１３−Ｂ１０９；Ａ１３−Ｂ１１０；Ａ１３−Ｂ１１１；Ａ１３−Ｂ１１２；Ａ１３−Ｂ１１３；
【０７２２】
Ａ１４−Ｂ１；Ａ１４−Ｂ２；Ａ１４−Ｂ３；Ａ１４−Ｂ４；Ａ１４−Ｂ５；Ａ１４−Ｂ６；Ａ１４−Ｂ７；Ａ１４−Ｂ８；Ａ１４−Ｂ９；Ａ１４−Ｂ１０；Ａ１４−Ｂ１１；Ａ１４−Ｂ１２；Ａ１４−Ｂ１３；Ａ１４−Ｂ１４；Ａ１４−Ｂ１５；Ａ１４−Ｂ１６；Ａ１４−Ｂ１７；Ａ１４−Ｂ１８；Ａ１４−Ｂ１９；Ａ１４−Ｂ２０；Ａ１４−Ｂ２１；Ａ１４−Ｂ２２；Ａ１４−Ｂ２３；Ａ１４−Ｂ２４；Ａ１４−Ｂ２５；Ａ１４−Ｂ２６；Ａ１４−Ｂ２７；Ａ１４−Ｂ２８；Ａ１４−Ｂ２９；Ａ１４−Ｂ３０；Ａ１４−Ｂ３１；Ａ１４−Ｂ３２；Ａ１４−Ｂ３３；Ａ１４−Ｂ３４；Ａ１４−Ｂ３５；Ａ１４−Ｂ３６；Ａ１４−Ｂ３７；Ａ１４−Ｂ３８；Ａ１４−Ｂ３９；Ａ１４−Ｂ４０；Ａ１４−Ｂ４１；Ａ１４−Ｂ４２；Ａ１４−Ｂ４３；Ａ１４−Ｂ４４；Ａ１４−Ｂ４５；Ａ１４−Ｂ４６；Ａ１４−Ｂ４７；Ａ１４−Ｂ４８；Ａ１４−Ｂ４９；Ａ１４−Ｂ５０；Ａ１４−Ｂ５１；Ａ１４−Ｂ５２；Ａ１４−Ｂ５３；Ａ１４−Ｂ５４；Ａ１４−Ｂ５５；Ａ１４−Ｂ５６；Ａ１４−Ｂ５７；Ａ１４−Ｂ５８；Ａ１４−Ｂ５９；Ａ１４−Ｂ６０；Ａ１４−Ｂ６１；Ａ１４−Ｂ６２；Ａ１４−Ｂ６３；Ａ１４−Ｂ６４；Ａ１４−Ｂ６５；Ａ１４−Ｂ６６；Ａ１４−Ｂ６７；Ａ１４−Ｂ６８；Ａ１４−Ｂ６９；Ａ１４−Ｂ７０；Ａ１４−Ｂ７１；Ａ１４−Ｂ７２；Ａ１４−Ｂ７３；Ａ１４−Ｂ７４；Ａ１４−Ｂ７５；Ａ１４−Ｂ７６；Ａ１４−Ｂ７７；Ａ１４−Ｂ７８；Ａ１４−Ｂ７９；Ａ１４−Ｂ８０；Ａ１４−Ｂ８１；Ａ１４−Ｂ８２；Ａ１４−Ｂ８３；Ａ１４−Ｂ８４；Ａ１４−Ｂ８５；Ａ１４−Ｂ８６；Ａ１４−Ｂ８７；Ａ１４−Ｂ８８；Ａ１４−Ｂ８９；Ａ１４−Ｂ９０；Ａ１４−Ｂ９１；Ａ１４−Ｂ９２；Ａ１４−Ｂ９３；Ａ１４−Ｂ９４；Ａ１４−Ｂ９５；Ａ１４−Ｂ９６；Ａ１４−Ｂ９７；Ａ１４−Ｂ９８；Ａ１４−Ｂ９９；Ａ１４−Ｂ１００；Ａ１４−Ｂ１０１；Ａ１４−Ｂ１０２；Ａ１４−Ｂ１０３；Ａ１４−Ｂ１０４；Ａ１４−Ｂ１０５；Ａ１４−Ｂ１０６；Ａ１４−Ｂ１０７；Ａ１４−Ｂ１０８；Ａ１４−Ｂ１０９；Ａ１４−Ｂ１１０；Ａ１４−Ｂ１１１；Ａ１４−Ｂ１１２；Ａ１４−Ｂ１１３；
【０７２３】
Ａ１５−Ｂ１；Ａ１５−Ｂ２；Ａ１５−Ｂ３；Ａ１５−Ｂ４；Ａ１５−Ｂ５；Ａ１５−Ｂ６；Ａ１５−Ｂ７；Ａ１５−Ｂ８；Ａ１５−Ｂ９；Ａ１５−Ｂ１０；Ａ１５−Ｂ１１；Ａ１５−Ｂ１２；Ａ１５−Ｂ１３；Ａ１５−Ｂ１４；Ａ１５−Ｂ１５；Ａ１５−Ｂ１６；Ａ１５−Ｂ１７；Ａ１５−Ｂ１８；Ａ１５−Ｂ１９；Ａ１５−Ｂ２０；Ａ１５−Ｂ２１；Ａ１５−Ｂ２２；Ａ１５−Ｂ２３；Ａ１５−Ｂ２４；Ａ１５−Ｂ２５；Ａ１５−Ｂ２６；Ａ１５−Ｂ２７；Ａ１５−Ｂ２８；Ａ１５−Ｂ２９；Ａ１５−Ｂ３０；Ａ１５−Ｂ３１；Ａ１５−Ｂ３２；Ａ１５−Ｂ３３；Ａ１５−Ｂ３４；Ａ１５−Ｂ３５；Ａ１５−Ｂ３６；Ａ１５−Ｂ３７；Ａ１５−Ｂ３８；Ａ１５−Ｂ３９；Ａ１５−Ｂ４０；Ａ１５−Ｂ４１；Ａ１５−Ｂ４２；Ａ１５−Ｂ４３；Ａ１５−Ｂ４４；Ａ１５−Ｂ４５；Ａ１５−Ｂ４６；Ａ１５−Ｂ４７；Ａ１５−Ｂ４８；Ａ１５−Ｂ４９；Ａ１５−Ｂ５０；Ａ１５−Ｂ５１；Ａ１５−Ｂ５２；Ａ１５−Ｂ５３；Ａ１５−Ｂ５４；Ａ１５−Ｂ５５；Ａ１５−Ｂ５６；Ａ１５−Ｂ５７；Ａ１５−Ｂ５８；Ａ１５−Ｂ５９；Ａ１５−Ｂ６０；Ａ１５−Ｂ６１；Ａ１５−Ｂ６２；Ａ１５−Ｂ６３；Ａ１５−Ｂ６４；Ａ１５−Ｂ６５；Ａ１５−Ｂ６６；Ａ１５−Ｂ６７；Ａ１５−Ｂ６８；Ａ１５−Ｂ６９；Ａ１５−Ｂ７０；Ａ１５−Ｂ７１；Ａ１５−Ｂ７２；Ａ１５−Ｂ７３；Ａ１５−Ｂ７４；Ａ１５−Ｂ７５；Ａ１５−Ｂ７６；Ａ１５−Ｂ７７；Ａ１５−Ｂ７８；Ａ１５−Ｂ７９；Ａ１５−Ｂ８０；Ａ１５−Ｂ８１；Ａ１５−Ｂ８２；Ａ１５−Ｂ８３；Ａ１５−Ｂ８４；Ａ１５−Ｂ８５；Ａ１５−Ｂ８６；Ａ１５−Ｂ８７；Ａ１５−Ｂ８８；Ａ１５−Ｂ８９；Ａ１５−Ｂ９０；Ａ１５−Ｂ９１；Ａ１５−Ｂ９２；Ａ１５−Ｂ９３；Ａ１５−Ｂ９４；Ａ１５−Ｂ９５；Ａ１５−Ｂ９６；Ａ１５−Ｂ９７；Ａ１５−Ｂ９８；Ａ１５−Ｂ９９；Ａ１５−Ｂ１００；Ａ１５−Ｂ１０１；Ａ１５−Ｂ１０２；Ａ１５−Ｂ１０３；Ａ１５−Ｂ１０４；Ａ１５−Ｂ１０５；Ａ１５−Ｂ１０６；Ａ１５−Ｂ１０７；Ａ１５−Ｂ１０８；Ａ１５−Ｂ１０９；Ａ１５−Ｂ１１０；Ａ１５−Ｂ１１１；Ａ１５−Ｂ１１２；Ａ１５−Ｂ１１３；
【０７２４】
Ａ１６−Ｂ１；Ａ１６−Ｂ２；Ａ１６−Ｂ３；Ａ１６−Ｂ４；Ａ１６−Ｂ５；Ａ１６−Ｂ６；Ａ１６−Ｂ７；Ａ１６−Ｂ８；Ａ１６−Ｂ９；Ａ１６−Ｂ１０；Ａ１６−Ｂ１１；Ａ１６−Ｂ１２；Ａ１６−Ｂ１３；Ａ１６−Ｂ１４；Ａ１６−Ｂ１５；Ａ１６−Ｂ１６；Ａ１６−Ｂ１７；Ａ１６−Ｂ１８；Ａ１６−Ｂ１９；Ａ１６−Ｂ２０；Ａ１６−Ｂ２１；Ａ１６−Ｂ２２；Ａ１６−Ｂ２３；Ａ１６−Ｂ２４；Ａ１６−Ｂ２５；Ａ１６−Ｂ２６；Ａ１６−Ｂ２７；Ａ１６−Ｂ２８；Ａ１６−Ｂ２９；Ａ１６−Ｂ３０；Ａ１６−Ｂ３１；Ａ１６−Ｂ３２；Ａ１６−Ｂ３３；Ａ１６−Ｂ３４；Ａ１６−Ｂ３５；Ａ１６−Ｂ３６；Ａ１６−Ｂ３７；Ａ１６−Ｂ３８；Ａ１６−Ｂ３９；Ａ１６−Ｂ４０；Ａ１６−Ｂ４１；Ａ１６−Ｂ４２；Ａ１６−Ｂ４３；Ａ１６−Ｂ４４；Ａ１６−Ｂ４５；Ａ１６−Ｂ４６；Ａ１６−Ｂ４７；Ａ１６−Ｂ４８；Ａ１６−Ｂ４９；Ａ１６−Ｂ５０；Ａ１６−Ｂ５１；Ａ１６−Ｂ５２；Ａ１６−Ｂ５３；Ａ１６−Ｂ５４；Ａ１６−Ｂ５５；Ａ１６−Ｂ５６；Ａ１６−Ｂ５７；Ａ１６−Ｂ５８；Ａ１６−Ｂ５９；Ａ１６−Ｂ６０；Ａ１６−Ｂ６１；Ａ１６−Ｂ６２；Ａ１６−Ｂ６３；Ａ１６−Ｂ６４；Ａ１６−Ｂ６５；Ａ１６−Ｂ６６；Ａ１６−Ｂ６７；Ａ１６−Ｂ６８；Ａ１６−Ｂ６９；Ａ１６−Ｂ７０；Ａ１６−Ｂ７１；Ａ１６−Ｂ７２；Ａ１６−Ｂ７３；Ａ１６−Ｂ７４；Ａ１６−Ｂ７５；Ａ１６−Ｂ７６；Ａ１６−Ｂ７７；Ａ１６−Ｂ７８；Ａ１６−Ｂ７９；Ａ１６−Ｂ８０；Ａ１６−Ｂ８１；Ａ１６−Ｂ８２；Ａ１６−Ｂ８３；Ａ１６−Ｂ８４；Ａ１６−Ｂ８５；Ａ１６−Ｂ８６；Ａ１６−Ｂ８７；Ａ１６−Ｂ８８；Ａ１６−Ｂ８９；Ａ１６−Ｂ９０；Ａ１６−Ｂ９１；Ａ１６−Ｂ９２；Ａ１６−Ｂ９３；Ａ１６−Ｂ９４；Ａ１６−Ｂ９５；Ａ１６−Ｂ９６；Ａ１６−Ｂ９７；Ａ１６−Ｂ９８；Ａ１６−Ｂ９９；Ａ１６−Ｂ１００；Ａ１６−Ｂ１０１；Ａ１６−Ｂ１０２；Ａ１６−Ｂ１０３；Ａ１６−Ｂ１０４；Ａ１６−Ｂ１０５；Ａ１６−Ｂ１０６；Ａ１６−Ｂ１０７；Ａ１６−Ｂ１０８；Ａ１６−Ｂ１０９；Ａ１６−Ｂ１１０；Ａ１６−Ｂ１１１；Ａ１６−Ｂ１１２；Ａ１６−Ｂ１１３；
【０７２５】
Ａ１７−Ｂ１；Ａ１７−Ｂ２；Ａ１７−Ｂ３；Ａ１７−Ｂ４；Ａ１７−Ｂ５；Ａ１７−Ｂ６；Ａ１７−Ｂ７；Ａ１７−Ｂ８；Ａ１７−Ｂ９；Ａ１７−Ｂ１０；Ａ１７−Ｂ１１；Ａ１７−Ｂ１２；Ａ１７−Ｂ１３；Ａ１７−Ｂ１４；Ａ１７−Ｂ１５；Ａ１７−Ｂ１６；Ａ１７−Ｂ１７；Ａ１７−Ｂ１８；Ａ１７−Ｂ１９；Ａ１７−Ｂ２０；Ａ１７−Ｂ２１；Ａ１７−Ｂ２２；Ａ１７−Ｂ２３；Ａ１７−Ｂ２４；Ａ１７−Ｂ２５；Ａ１７−Ｂ２６；Ａ１７−Ｂ２７；Ａ１７−Ｂ２８；Ａ１７−Ｂ２９；Ａ１７−Ｂ３０；Ａ１７−Ｂ３１；Ａ１７−Ｂ３２；Ａ１７−Ｂ３３；Ａ１７−Ｂ３４；Ａ１７−Ｂ３５；Ａ１７−Ｂ３６；Ａ１７−Ｂ３７；Ａ１７−Ｂ３８；Ａ１７−Ｂ３９；Ａ１７−Ｂ４０；Ａ１７−Ｂ４１；Ａ１７−Ｂ４２；Ａ１７−Ｂ４３；Ａ１７−Ｂ４４；Ａ１７−Ｂ４５；Ａ１７−Ｂ４６；Ａ１７−Ｂ４７；Ａ１７−Ｂ４８；Ａ１７−Ｂ４９；Ａ１７−Ｂ５０；Ａ１７−Ｂ５１；Ａ１７−Ｂ５２；Ａ１７−Ｂ５３；Ａ１７−Ｂ５４；Ａ１７−Ｂ５５；Ａ１７−Ｂ５６；Ａ１７−Ｂ５７；Ａ１７−Ｂ５８；Ａ１７−Ｂ５９；Ａ１７−Ｂ６０；Ａ１７−Ｂ６１；Ａ１７−Ｂ６２；Ａ１７−Ｂ６３；Ａ１７−Ｂ６４；Ａ１７−Ｂ６５；Ａ１７−Ｂ６６；Ａ１７−Ｂ６７；Ａ１７−Ｂ６８；Ａ１７−Ｂ６９；Ａ１７−Ｂ７０；Ａ１７−Ｂ７１；Ａ１７−Ｂ７２；Ａ１７−Ｂ７３；Ａ１７−Ｂ７４；Ａ１７−Ｂ７５；Ａ１７−Ｂ７６；Ａ１７−Ｂ７７；Ａ１７−Ｂ７８；Ａ１７−Ｂ７９；Ａ１７−Ｂ８０；Ａ１７−Ｂ８１；Ａ１７−Ｂ８２；Ａ１７−Ｂ８３；Ａ１７−Ｂ８４；Ａ１７−Ｂ８５；Ａ１７−Ｂ８６；Ａ１７−Ｂ８７；Ａ１７−Ｂ８８；Ａ１７−Ｂ８９；Ａ１７−Ｂ９０；Ａ１７−Ｂ９１；Ａ１７−Ｂ９２；Ａ１７−Ｂ９３；Ａ１７−Ｂ９４；Ａ１７−Ｂ９５；Ａ１７−Ｂ９６；Ａ１７−Ｂ９７；Ａ１７−Ｂ９８；Ａ１７−Ｂ９９；Ａ１７−Ｂ１００；Ａ１７−Ｂ１０１；Ａ１７−Ｂ１０２；Ａ１７−Ｂ１０３；Ａ１７−Ｂ１０４；Ａ１７−Ｂ１０５；Ａ１７−Ｂ１０６；Ａ１７−Ｂ１０７；Ａ１７−Ｂ１０８；Ａ１７−Ｂ１０９；Ａ１７−Ｂ１１０；Ａ１７−Ｂ１１１；Ａ１７−Ｂ１１２；Ａ１７−Ｂ１１３；
【０７２６】
Ａ１８−Ｂ１；Ａ１８−Ｂ２；Ａ１８−Ｂ３；Ａ１８−Ｂ４；Ａ１８−Ｂ５；Ａ１８−Ｂ６；Ａ１８−Ｂ７；Ａ１８−Ｂ８；Ａ１８−Ｂ９；Ａ１８−Ｂ１０；Ａ１８−Ｂ１１；Ａ１８−Ｂ１２；Ａ１８−Ｂ１３；Ａ１８−Ｂ１４；Ａ１８−Ｂ１５；Ａ１８−Ｂ１６；Ａ１８−Ｂ１７；Ａ１８−Ｂ１８；Ａ１８−Ｂ１９；Ａ１８−Ｂ２０；Ａ１８−Ｂ２１；Ａ１８−Ｂ２２；Ａ１８−Ｂ２３；Ａ１８−Ｂ２４；Ａ１８−Ｂ２５；Ａ１８−Ｂ２６；Ａ１８−Ｂ２７；Ａ１８−Ｂ２８；Ａ１８−Ｂ２９；Ａ１８−Ｂ３０；Ａ１８−Ｂ３１；Ａ１８−Ｂ３２；Ａ１８−Ｂ３３；Ａ１８−Ｂ３４；Ａ１８−Ｂ３５；Ａ１８−Ｂ３６；Ａ１８−Ｂ３７；Ａ１８−Ｂ３８；Ａ１８−Ｂ３９；Ａ１８−Ｂ４０；Ａ１８−Ｂ４１；Ａ１８−Ｂ４２；Ａ１８−Ｂ４３；Ａ１８−Ｂ４４；Ａ１８−Ｂ４５；Ａ１８−Ｂ４６；Ａ１８−Ｂ４７；Ａ１８−Ｂ４８；Ａ１８−Ｂ４９；Ａ１８−Ｂ５０；Ａ１８−Ｂ５１；Ａ１８−Ｂ５２；Ａ１８−Ｂ５３；Ａ１８−Ｂ５４；Ａ１８−Ｂ５５；Ａ１８−Ｂ５６；Ａ１８−Ｂ５７；Ａ１８−Ｂ５８；Ａ１８−Ｂ５９；Ａ１８−Ｂ６０；Ａ１８−Ｂ６１；Ａ１８−Ｂ６２；Ａ１８−Ｂ６３；Ａ１８−Ｂ６４；Ａ１８−Ｂ６５；Ａ１８−Ｂ６６；Ａ１８−Ｂ６７；Ａ１８−Ｂ６８；Ａ１８−Ｂ６９；Ａ１８−Ｂ７０；Ａ１８−Ｂ７１；Ａ１８−Ｂ７２；Ａ１８−Ｂ７３；Ａ１８−Ｂ７４；Ａ１８−Ｂ７５；Ａ１８−Ｂ７６；Ａ１８−Ｂ７７；Ａ１８−Ｂ７８；Ａ１８−Ｂ７９；Ａ１８−Ｂ８０；Ａ１８−Ｂ８１；Ａ１８−Ｂ８２；Ａ１８−Ｂ８３；Ａ１８−Ｂ８４；Ａ１８−Ｂ８５；Ａ１８−Ｂ８６；Ａ１８−Ｂ８７；Ａ１８−Ｂ８８；Ａ１８−Ｂ８９；Ａ１８−Ｂ９０；Ａ１８−Ｂ９１；Ａ１８−Ｂ９２；Ａ１８−Ｂ９３；Ａ１８−Ｂ９４；Ａ１８−Ｂ９５；Ａ１８−Ｂ９６；Ａ１８−Ｂ９７；Ａ１８−Ｂ９８；Ａ１８−Ｂ９９；Ａ１８−Ｂ１００；Ａ１８−Ｂ１０１；Ａ１８−Ｂ１０２；Ａ１８−Ｂ１０３；Ａ１８−Ｂ１０４；Ａ１８−Ｂ１０５；Ａ１８−Ｂ１０６；Ａ１８−Ｂ１０７；Ａ１８−Ｂ１０８；Ａ１８−Ｂ１０９；Ａ１８−Ｂ１１０；Ａ１８−Ｂ１１１；Ａ１８−Ｂ１１２；Ａ１８−Ｂ１１３；
【０７２７】
Ａ１９−Ｂ１；Ａ１９−Ｂ２；Ａ１９−Ｂ３；Ａ１９−Ｂ４；Ａ１９−Ｂ５；Ａ１９−Ｂ６；Ａ１９−Ｂ７；Ａ１９−Ｂ８；Ａ１９−Ｂ９；Ａ１９−Ｂ１０；Ａ１９−Ｂ１１；Ａ１９−Ｂ１２；Ａ１９−Ｂ１３；Ａ１９−Ｂ１４；Ａ１９−Ｂ１５；Ａ１９−Ｂ１６；Ａ１９−Ｂ１７；Ａ１９−Ｂ１８；Ａ１９−Ｂ１９；Ａ１９−Ｂ２０；Ａ１９−Ｂ２１；Ａ１９−Ｂ２２；Ａ１９−Ｂ２３；Ａ１９−Ｂ２４；Ａ１９−Ｂ２５；Ａ１９−Ｂ２６；Ａ１９−Ｂ２７；Ａ１９−Ｂ２８；Ａ１９−Ｂ２９；Ａ１９−Ｂ３０；Ａ１９−Ｂ３１；Ａ１９−Ｂ３２；Ａ１９−Ｂ３３；Ａ１９−Ｂ３４；Ａ１９−Ｂ３５；Ａ１９−Ｂ３６；Ａ１９−Ｂ３７；Ａ１９−Ｂ３８；Ａ１９−Ｂ３９；Ａ１９−Ｂ４０；Ａ１９−Ｂ４１；Ａ１９−Ｂ４２；Ａ１９−Ｂ４３；Ａ１９−Ｂ４４；Ａ１９−Ｂ４５；Ａ１９−Ｂ４６；Ａ１９−Ｂ４７；Ａ１９−Ｂ４８；Ａ１９−Ｂ４９；Ａ１９−Ｂ５０；Ａ１９−Ｂ５１；Ａ１９−Ｂ５２；Ａ１９−Ｂ５３；Ａ１９−Ｂ５４；Ａ１９−Ｂ５５；Ａ１９−Ｂ５６；Ａ１９−Ｂ５７；Ａ１９−Ｂ５８；Ａ１９−Ｂ５９；Ａ１９−Ｂ６０；Ａ１９−Ｂ６１；Ａ１９−Ｂ６２；Ａ１９−Ｂ６３；Ａ１９−Ｂ６４；Ａ１９−Ｂ６５；Ａ１９−Ｂ６６；Ａ１９−Ｂ６７；Ａ１９−Ｂ６８；Ａ１９−Ｂ６９；Ａ１９−Ｂ７０；Ａ１９−Ｂ７１；Ａ１９−Ｂ７２；Ａ１９−Ｂ７３；Ａ１９−Ｂ７４；Ａ１９−Ｂ７５；Ａ１９−Ｂ７６；Ａ１９−Ｂ７７；Ａ１９−Ｂ７８；Ａ１９−Ｂ７９；Ａ１９−Ｂ８０；Ａ１９−Ｂ８１；Ａ１９−Ｂ８２；Ａ１９−Ｂ８３；Ａ１９−Ｂ８４；Ａ１９−Ｂ８５；Ａ１９−Ｂ８６；Ａ１９−Ｂ８７；Ａ１９−Ｂ８８；Ａ１９−Ｂ８９；Ａ１９−Ｂ９０；Ａ１９−Ｂ９１；Ａ１９−Ｂ９２；Ａ１９−Ｂ９３；Ａ１９−Ｂ９４；Ａ１９−Ｂ９５；Ａ１９−Ｂ９６；Ａ１９−Ｂ９７；Ａ１９−Ｂ９８；Ａ１９−Ｂ９９；Ａ１９−Ｂ１００；Ａ１９−Ｂ１０１；Ａ１９−Ｂ１０２；Ａ１９−Ｂ１０３；Ａ１９−Ｂ１０４；Ａ１９−Ｂ１０５；Ａ１９−Ｂ１０６；Ａ１９−Ｂ１０７；Ａ１９−Ｂ１０８；Ａ１９−Ｂ１０９；Ａ１９−Ｂ１１０；Ａ１９−Ｂ１１１；Ａ１９−Ｂ１１２；Ａ１９−Ｂ１１３；
【０７２８】
Ａ２０−Ｂ１；Ａ２０−Ｂ２；Ａ２０−Ｂ３；Ａ２０−Ｂ４；Ａ２０−Ｂ５；Ａ２０−Ｂ６；Ａ２０−Ｂ７；Ａ２０−Ｂ８；Ａ２０−Ｂ９；Ａ２０−Ｂ１０；Ａ２０−Ｂ１１；Ａ２０−Ｂ１２；Ａ２０−Ｂ１３；Ａ２０−Ｂ１４；Ａ２０−Ｂ１５；Ａ２０−Ｂ１６；Ａ２０−Ｂ１７；Ａ２０−Ｂ１８；Ａ２０−Ｂ１９；Ａ２０−Ｂ２０；Ａ２０−Ｂ２１；Ａ２０−Ｂ２２；Ａ２０−Ｂ２３；Ａ２０−Ｂ２４；Ａ２０−Ｂ２５；Ａ２０−Ｂ２６；Ａ２０−Ｂ２７；Ａ２０−Ｂ２８；Ａ２０−Ｂ２９；Ａ２０−Ｂ３０；Ａ２０−Ｂ３１；Ａ２０−Ｂ３２；Ａ２０−Ｂ３３；Ａ２０−Ｂ３４；Ａ２０−Ｂ３５；Ａ２０−Ｂ３６；Ａ２０−Ｂ３７；Ａ２０−Ｂ３８；Ａ２０−Ｂ３９；Ａ２０−Ｂ４０；Ａ２０−Ｂ４１；Ａ２０−Ｂ４２；Ａ２０−Ｂ４３；Ａ２０−Ｂ４４；Ａ２０−Ｂ４５；Ａ２０−Ｂ４６；Ａ２０−Ｂ４７；Ａ２０−Ｂ４８；Ａ２０−Ｂ４９；Ａ２０−Ｂ５０；Ａ２０−Ｂ５１；Ａ２０−Ｂ５２；Ａ２０−Ｂ５３；Ａ２０−Ｂ５４；Ａ２０−Ｂ５５；Ａ２０−Ｂ５６；Ａ２０−Ｂ５７；Ａ２０−Ｂ５８；Ａ２０−Ｂ５９；Ａ２０−Ｂ６０；Ａ２０−Ｂ６１；Ａ２０−Ｂ６２；Ａ２０−Ｂ６３；Ａ２０−Ｂ６４；Ａ２０−Ｂ６５；Ａ２０−Ｂ６６；Ａ２０−Ｂ６７；Ａ２０−Ｂ６８；Ａ２０−Ｂ６９；Ａ２０−Ｂ７０；Ａ２０−Ｂ７１；Ａ２０−Ｂ７２；Ａ２０−Ｂ７３；Ａ２０−Ｂ７４；Ａ２０−Ｂ７５；Ａ２０−Ｂ７６；Ａ２０−Ｂ７７；Ａ２０−Ｂ７８；Ａ２０−Ｂ７９；Ａ２０−Ｂ８０；Ａ２０−Ｂ８１；Ａ２０−Ｂ８２；Ａ２０−Ｂ８３；Ａ２０−Ｂ８４；Ａ２０−Ｂ８５；Ａ２０−Ｂ８６；Ａ２０−Ｂ８７；Ａ２０−Ｂ８８；Ａ２０−Ｂ８９；Ａ２０−Ｂ９０；Ａ２０−Ｂ９１；Ａ２０−Ｂ９２；Ａ２０−Ｂ９３；Ａ２０−Ｂ９４；Ａ２０−Ｂ９５；Ａ２０−Ｂ９６；Ａ２０−Ｂ９７；Ａ２０−Ｂ９８；Ａ２０−Ｂ９９；Ａ２０−Ｂ１００；Ａ２０−Ｂ１０１；Ａ２０−Ｂ１０２；Ａ２０−Ｂ１０３；Ａ２０−Ｂ１０４；Ａ２０−Ｂ１０５；Ａ２０−Ｂ１０６；Ａ２０−Ｂ１０７；Ａ２０−Ｂ１０８；Ａ２０−Ｂ１０９；Ａ２０−Ｂ１１０；Ａ２０−Ｂ１１１；Ａ２０−Ｂ１１２；Ａ２０−Ｂ１１３；
【０７２９】
Ａ２１−Ｂ１；Ａ２１−Ｂ２；Ａ２１−Ｂ３；Ａ２１−Ｂ４；Ａ２１−Ｂ５；Ａ２１−Ｂ６；Ａ２１−Ｂ７；Ａ２１−Ｂ８；Ａ２１−Ｂ９；Ａ２１−Ｂ１０；Ａ２１−Ｂ１１；Ａ２１−Ｂ１２；Ａ２１−Ｂ１３；Ａ２１−Ｂ１４；Ａ２１−Ｂ１５；Ａ２１−Ｂ１６；Ａ２１−Ｂ１７；Ａ２１−Ｂ１８；Ａ２１−Ｂ１９；Ａ２１−Ｂ２０；Ａ２１−Ｂ２１；Ａ２１−Ｂ２２；Ａ２１−Ｂ２３；Ａ２１−Ｂ２４；Ａ２１−Ｂ２５；Ａ２１−Ｂ２６；Ａ２１−Ｂ２７；Ａ２１−Ｂ２８；Ａ２１−Ｂ２９；Ａ２１−Ｂ３０；Ａ２１−Ｂ３１；Ａ２１−Ｂ３２；Ａ２１−Ｂ３３；Ａ２１−Ｂ３４；Ａ２１−Ｂ３５；Ａ２１−Ｂ３６；Ａ２１−Ｂ３７；Ａ２１−Ｂ３８；Ａ２１−Ｂ３９；Ａ２１−Ｂ４０；Ａ２１−Ｂ４１；Ａ２１−Ｂ４２；Ａ２１−Ｂ４３；Ａ２１−Ｂ４４；Ａ２１−Ｂ４５；Ａ２１−Ｂ４６；Ａ２１−Ｂ４７；Ａ２１−Ｂ４８；Ａ２１−Ｂ４９；Ａ２１−Ｂ５０；Ａ２１−Ｂ５１；Ａ２１−Ｂ５２；Ａ２１−Ｂ５３；Ａ２１−Ｂ５４；Ａ２１−Ｂ５５；Ａ２１−Ｂ５６；Ａ２１−Ｂ５７；Ａ２１−Ｂ５８；Ａ２１−Ｂ５９；Ａ２１−Ｂ６０；Ａ２１−Ｂ６１；Ａ２１−Ｂ６２；Ａ２１−Ｂ６３；Ａ２１−Ｂ６４；Ａ２１−Ｂ６５；Ａ２１−Ｂ６６；Ａ２１−Ｂ６７；Ａ２１−Ｂ６８；Ａ２１−Ｂ６９；Ａ２１−Ｂ７０；Ａ２１−Ｂ７１；Ａ２１−Ｂ７２；Ａ２１−Ｂ７３；Ａ２１−Ｂ７４；Ａ２１−Ｂ７５；Ａ２１−Ｂ７６；Ａ２１−Ｂ７７；Ａ２１−Ｂ７８；Ａ２１−Ｂ７９；Ａ２１−Ｂ８０；Ａ２１−Ｂ８１；Ａ２１−Ｂ８２；Ａ２１−Ｂ８３；Ａ２１−Ｂ８４；Ａ２１−Ｂ８５；Ａ２１−Ｂ８６；Ａ２１−Ｂ８７；Ａ２１−Ｂ８８；Ａ２１−Ｂ８９；Ａ２１−Ｂ９０；Ａ２１−Ｂ９１；Ａ２１−Ｂ９２；Ａ２１−Ｂ９３；Ａ２１−Ｂ９４；Ａ２１−Ｂ９５；Ａ２１−Ｂ９６；Ａ２１−Ｂ９７；Ａ２１−Ｂ９８；Ａ２１−Ｂ９９；Ａ２１−Ｂ１００；Ａ２１−Ｂ１０１；Ａ２１−Ｂ１０２；Ａ２１−Ｂ１０３；Ａ２１−Ｂ１０４；Ａ２１−Ｂ１０５；Ａ２１−Ｂ１０６；Ａ２１−Ｂ１０７；Ａ２１−Ｂ１０８；Ａ２１−Ｂ１０９；Ａ２１−Ｂ１１０；Ａ２１−Ｂ１１１；Ａ２１−Ｂ１１２；Ａ２１−Ｂ１１３；
【０７３０】
Ａ２２−Ｂ１；Ａ２２−Ｂ２；Ａ２２−Ｂ３；Ａ２２−Ｂ４；Ａ２２−Ｂ５；Ａ２２−Ｂ６；Ａ２２−Ｂ７；Ａ２２−Ｂ８；Ａ２２−Ｂ９；Ａ２２−Ｂ１０；Ａ２２−Ｂ１１；Ａ２２−Ｂ１２；Ａ２２−Ｂ１３；Ａ２２−Ｂ１４；Ａ２２−Ｂ１５；Ａ２２−Ｂ１６；Ａ２２−Ｂ１７；Ａ２２−Ｂ１８；Ａ２２−Ｂ１９；Ａ２２−Ｂ２０；Ａ２２−Ｂ２１；Ａ２２−Ｂ２２；Ａ２２−Ｂ２３；Ａ２２−Ｂ２４；Ａ２２−Ｂ２５；Ａ２２−Ｂ２６；Ａ２２−Ｂ２７；Ａ２２−Ｂ２８；Ａ２２−Ｂ２９；Ａ２２−Ｂ３０；Ａ２２−Ｂ３１；Ａ２２−Ｂ３２；Ａ２２−Ｂ３３；Ａ２２−Ｂ３４；Ａ２２−Ｂ３５；Ａ２２−Ｂ３６；Ａ２２−Ｂ３７；Ａ２２−Ｂ３８；Ａ２２−Ｂ３９；Ａ２２−Ｂ４０；Ａ２２−Ｂ４１；Ａ２２−Ｂ４２；Ａ２２−Ｂ４３；Ａ２２−Ｂ４４；Ａ２２−Ｂ４５；Ａ２２−Ｂ４６；Ａ２２−Ｂ４７；Ａ２２−Ｂ４８；Ａ２２−Ｂ４９；Ａ２２−Ｂ５０；Ａ２２−Ｂ５１；Ａ２２−Ｂ５２；Ａ２２−Ｂ５３；Ａ２２−Ｂ５４；Ａ２２−Ｂ５５；Ａ２２−Ｂ５６；Ａ２２−Ｂ５７；Ａ２２−Ｂ５８；Ａ２２−Ｂ５９；Ａ２２−Ｂ６０；Ａ２２−Ｂ６１；Ａ２２−Ｂ６２；Ａ２２−Ｂ６３；Ａ２２−Ｂ６４；Ａ２２−Ｂ６５；Ａ２２−Ｂ６６；Ａ２２−Ｂ６７；Ａ２２−Ｂ６８；Ａ２２−Ｂ６９；Ａ２２−Ｂ７０；Ａ２２−Ｂ７１；Ａ２２−Ｂ７２；Ａ２２−Ｂ７３；Ａ２２−Ｂ７４；Ａ２２−Ｂ７５；Ａ２２−Ｂ７６；Ａ２２−Ｂ７７；Ａ２２−Ｂ７８；Ａ２２−Ｂ７９；Ａ２２−Ｂ８０；Ａ２２−Ｂ８１；Ａ２２−Ｂ８２；Ａ２２−Ｂ８３；Ａ２２−Ｂ８４；Ａ２２−Ｂ８５；Ａ２２−Ｂ８６；Ａ２２−Ｂ８７；Ａ２２−Ｂ８８；Ａ２２−Ｂ８９；Ａ２２−Ｂ９０；Ａ２２−Ｂ９１；Ａ２２−Ｂ９２；Ａ２２−Ｂ９３；Ａ２２−Ｂ９４；Ａ２２−Ｂ９５；Ａ２２−Ｂ９６；Ａ２２−Ｂ９７；Ａ２２−Ｂ９８；Ａ２２−Ｂ９９；Ａ２２−Ｂ１００；Ａ２２−Ｂ１０１；Ａ２２−Ｂ１０２；Ａ２２−Ｂ１０３；Ａ２２−Ｂ１０４；Ａ２２−Ｂ１０５；Ａ２２−Ｂ１０６；Ａ２２−Ｂ１０７；Ａ２２−Ｂ１０８；Ａ２２−Ｂ１０９；Ａ２２−Ｂ１１０；Ａ２２−Ｂ１１１；Ａ２２−Ｂ１１２；Ａ２２−Ｂ１１３；
【０７３１】
Ａ２３−Ｂ１；Ａ２３−Ｂ２；Ａ２３−Ｂ３；Ａ２３−Ｂ４；Ａ２３−Ｂ５；Ａ２３−Ｂ６；Ａ２３−Ｂ７；Ａ２３−Ｂ８；Ａ２３−Ｂ９；Ａ２３−Ｂ１０；Ａ２３−Ｂ１１；Ａ２３−Ｂ１２；Ａ２３−Ｂ１３；Ａ２３−Ｂ１４；Ａ２３−Ｂ１５；Ａ２３−Ｂ１６；Ａ２３−Ｂ１７；Ａ２３−Ｂ１８；Ａ２３−Ｂ１９；Ａ２３−Ｂ２０；Ａ２３−Ｂ２１；Ａ２３−Ｂ２２；Ａ２３−Ｂ２３；Ａ２３−Ｂ２４；Ａ２３−Ｂ２５；Ａ２３−Ｂ２６；Ａ２３−Ｂ２７；Ａ２３−Ｂ２８；Ａ２３−Ｂ２９；Ａ２３−Ｂ３０；Ａ２３−Ｂ３１；Ａ２３−Ｂ３２；Ａ２３−Ｂ３３；Ａ２３−Ｂ３４；Ａ２３−Ｂ３５；Ａ２３−Ｂ３６；Ａ２３−Ｂ３７；Ａ２３−Ｂ３８；Ａ２３−Ｂ３９；Ａ２３−Ｂ４０；Ａ２３−Ｂ４１；Ａ２３−Ｂ４２；Ａ２３−Ｂ４３；Ａ２３−Ｂ４４；Ａ２３−Ｂ４５；Ａ２３−Ｂ４６；Ａ２３−Ｂ４７；Ａ２３−Ｂ４８；Ａ２３−Ｂ４９；Ａ２３−Ｂ５０；Ａ２３−Ｂ５１；Ａ２３−Ｂ５２；Ａ２３−Ｂ５３；Ａ２３−Ｂ５４；Ａ２３−Ｂ５５；Ａ２３−Ｂ５６；Ａ２３−Ｂ５７；Ａ２３−Ｂ５８；Ａ２３−Ｂ５９；Ａ２３−Ｂ６０；Ａ２３−Ｂ６１；Ａ２３−Ｂ６２；Ａ２３−Ｂ６３；Ａ２３−Ｂ６４；Ａ２３−Ｂ６５；Ａ２３−Ｂ６６；Ａ２３−Ｂ６７；Ａ２３−Ｂ６８；Ａ２３−Ｂ６９；Ａ２３−Ｂ７０；Ａ２３−Ｂ７１；Ａ２３−Ｂ７２；Ａ２３−Ｂ７３；Ａ２３−Ｂ７４；Ａ２３−Ｂ７５；Ａ２３−Ｂ７６；Ａ２３−Ｂ７７；Ａ２３−Ｂ７８；Ａ２３−Ｂ７９；Ａ２３−Ｂ８０；Ａ２３−Ｂ８１；Ａ２３−Ｂ８２；Ａ２３−Ｂ８３；Ａ２３−Ｂ８４；Ａ２３−Ｂ８５；Ａ２３−Ｂ８６；Ａ２３−Ｂ８７；Ａ２３−Ｂ８８；Ａ２３−Ｂ８９；Ａ２３−Ｂ９０；Ａ２３−Ｂ９１；Ａ２３−Ｂ９２；Ａ２３−Ｂ９３；Ａ２３−Ｂ９４；Ａ２３−Ｂ９５；Ａ２３−Ｂ９６；Ａ２３−Ｂ９７；Ａ２３−Ｂ９８；Ａ２３−Ｂ９９；Ａ２３−Ｂ１００；Ａ２３−Ｂ１０１；Ａ２３−Ｂ１０２；Ａ２３−Ｂ１０３；Ａ２３−Ｂ１０４；Ａ２３−Ｂ１０５；Ａ２３−Ｂ１０６；Ａ２３−Ｂ１０７；Ａ２３−Ｂ１０８；Ａ２３−Ｂ１０９；Ａ２３−Ｂ１１０；Ａ２３−Ｂ１１１；Ａ２３−Ｂ１１２；Ａ２３−Ｂ１１３；
【０７３２】
Ａ２４−Ｂ１；Ａ２４−Ｂ２；Ａ２４−Ｂ３；Ａ２４−Ｂ４；Ａ２４−Ｂ５；Ａ２４−Ｂ６；Ａ２４−Ｂ７；Ａ２４−Ｂ８；Ａ２４−Ｂ９；Ａ２４−Ｂ１０；Ａ２４−Ｂ１１；Ａ２４−Ｂ１２；Ａ２４−Ｂ１３；Ａ２４−Ｂ１４；Ａ２４−Ｂ１５；Ａ２４−Ｂ１６；Ａ２４−Ｂ１７；Ａ２４−Ｂ１８；Ａ２４−Ｂ１９；Ａ２４−Ｂ２０；Ａ２４−Ｂ２１；Ａ２４−Ｂ２２；Ａ２４−Ｂ２３；Ａ２４−Ｂ２４；Ａ２４−Ｂ２５；Ａ２４−Ｂ２６；Ａ２４−Ｂ２７；Ａ２４−Ｂ２８；Ａ２４−Ｂ２９；Ａ２４−Ｂ３０；Ａ２４−Ｂ３１；Ａ２４−Ｂ３２；Ａ２４−Ｂ３３；Ａ２４−Ｂ３４；Ａ２４−Ｂ３５；Ａ２４−Ｂ３６；Ａ２４−Ｂ３７；Ａ２４−Ｂ３８；Ａ２４−Ｂ３９；Ａ２４−Ｂ４０；Ａ２４−Ｂ４１；Ａ２４−Ｂ４２；Ａ２４−Ｂ４３；Ａ２４−Ｂ４４；Ａ２４−Ｂ４５；Ａ２４−Ｂ４６；Ａ２４−Ｂ４７；Ａ２４−Ｂ４８；Ａ２４−Ｂ４９；Ａ２４−Ｂ５０；Ａ２４−Ｂ５１；Ａ２４−Ｂ５２；Ａ２４−Ｂ５３；Ａ２４−Ｂ５４；Ａ２４−Ｂ５５；Ａ２４−Ｂ５６；Ａ２４−Ｂ５７；Ａ２４−Ｂ５８；Ａ２４−Ｂ５９；Ａ２４−Ｂ６０；Ａ２４−Ｂ６１；Ａ２４−Ｂ６２；Ａ２４−Ｂ６３；Ａ２４−Ｂ６４；Ａ２４−Ｂ６５；Ａ２４−Ｂ６６；Ａ２４−Ｂ６７；Ａ２４−Ｂ６８；Ａ２４−Ｂ６９；Ａ２４−Ｂ７０；Ａ２４−Ｂ７１；Ａ２４−Ｂ７２；Ａ２４−Ｂ７３；Ａ２４−Ｂ７４；Ａ２４−Ｂ７５；Ａ２４−Ｂ７６；Ａ２４−Ｂ７７；Ａ２４−Ｂ７８；Ａ２４−Ｂ７９；Ａ２４−Ｂ８０；Ａ２４−Ｂ８１；Ａ２４−Ｂ８２；Ａ２４−Ｂ８３；Ａ２４−Ｂ８４；Ａ２４−Ｂ８５；Ａ２４−Ｂ８６；Ａ２４−Ｂ８７；Ａ２４−Ｂ８８；Ａ２４−Ｂ８９；Ａ２４−Ｂ９０；Ａ２４−Ｂ９１；Ａ２４−Ｂ９２；Ａ２４−Ｂ９３；Ａ２４−Ｂ９４；Ａ２４−Ｂ９５；Ａ２４−Ｂ９６；Ａ２４−Ｂ９７；Ａ２４−Ｂ９８；Ａ２４−Ｂ９９；Ａ２４−Ｂ１００；Ａ２４−Ｂ１０１；Ａ２４−Ｂ１０２；Ａ２４−Ｂ１０３；Ａ２４−Ｂ１０４；Ａ２４−Ｂ１０５；Ａ２４−Ｂ１０６；Ａ２４−Ｂ１０７；Ａ２４−Ｂ１０８；Ａ２４−Ｂ１０９；Ａ２４−Ｂ１１０；Ａ２４−Ｂ１１１；Ａ２４−Ｂ１１２；Ａ２４−Ｂ１１３；
【０７３３】
Ａ２５−Ｂ１；Ａ２５−Ｂ２；Ａ２５−Ｂ３；Ａ２５−Ｂ４；Ａ２５−Ｂ５；Ａ２５−Ｂ６；Ａ２５−Ｂ７；Ａ２５−Ｂ８；Ａ２５−Ｂ９；Ａ２５−Ｂ１０；Ａ２５−Ｂ１１；Ａ２５−Ｂ１２；Ａ２５−Ｂ１３；Ａ２５−Ｂ１４；Ａ２５−Ｂ１５；Ａ２５−Ｂ１６；Ａ２５−Ｂ１７；Ａ２５−Ｂ１８；Ａ２５−Ｂ１９；Ａ２５−Ｂ２０；Ａ２５−Ｂ２１；Ａ２５−Ｂ２２；Ａ２５−Ｂ２３；Ａ２５−Ｂ２４；Ａ２５−Ｂ２５；Ａ２５−Ｂ２６；Ａ２５−Ｂ２７；Ａ２５−Ｂ２８；Ａ２５−Ｂ２９；Ａ２５−Ｂ３０；Ａ２５−Ｂ３１；Ａ２５−Ｂ３２；Ａ２５−Ｂ３３；Ａ２５−Ｂ３４；Ａ２５−Ｂ３５；Ａ２５−Ｂ３６；Ａ２５−Ｂ３７；Ａ２５−Ｂ３８；Ａ２５−Ｂ３９；Ａ２５−Ｂ４０；Ａ２５−Ｂ４１；Ａ２５−Ｂ４２；Ａ２５−Ｂ４３；Ａ２５−Ｂ４４；Ａ２５−Ｂ４５；Ａ２５−Ｂ４６；Ａ２５−Ｂ４７；Ａ２５−Ｂ４８；Ａ２５−Ｂ４９；Ａ２５−Ｂ５０；Ａ２５−Ｂ５１；Ａ２５−Ｂ５２；Ａ２５−Ｂ５３；Ａ２５−Ｂ５４；Ａ２５−Ｂ５５；Ａ２５−Ｂ５６；Ａ２５−Ｂ５７；Ａ２５−Ｂ５８；Ａ２５−Ｂ５９；Ａ２５−Ｂ６０；Ａ２５−Ｂ６１；Ａ２５−Ｂ６２；Ａ２５−Ｂ６３；Ａ２５−Ｂ６４；Ａ２５−Ｂ６５；Ａ２５−Ｂ６６；Ａ２５−Ｂ６７；Ａ２５−Ｂ６８；Ａ２５−Ｂ６９；Ａ２５−Ｂ７０；Ａ２５−Ｂ７１；Ａ２５−Ｂ７２；Ａ２５−Ｂ７３；Ａ２５−Ｂ７４；Ａ２５−Ｂ７５；Ａ２５−Ｂ７６；Ａ２５−Ｂ７７；Ａ２５−Ｂ７８；Ａ２５−Ｂ７９；Ａ２５−Ｂ８０；Ａ２５−Ｂ８１；Ａ２５−Ｂ８２；Ａ２５−Ｂ８３；Ａ２５−Ｂ８４；Ａ２５−Ｂ８５；Ａ２５−Ｂ８６；Ａ２５−Ｂ８７；Ａ２５−Ｂ８８；Ａ２５−Ｂ８９；Ａ２５−Ｂ９０；Ａ２５−Ｂ９１；Ａ２５−Ｂ９２；Ａ２５−Ｂ９３；Ａ２５−Ｂ９４；Ａ２５−Ｂ９５；Ａ２５−Ｂ９６；Ａ２５−Ｂ９７；Ａ２５−Ｂ９８；Ａ２５−Ｂ９９；Ａ２５−Ｂ１００；Ａ２５−Ｂ１０１；Ａ２５−Ｂ１０２；Ａ２５−Ｂ１０３；Ａ２５−Ｂ１０４；Ａ２５−Ｂ１０５；Ａ２５−Ｂ１０６；Ａ２５−Ｂ１０７；Ａ２５−Ｂ１０８；Ａ２５−Ｂ１０９；Ａ２５−Ｂ１１０；Ａ２５−Ｂ１１１；Ａ２５−Ｂ１１２；Ａ２５−Ｂ１１３；
【０７３４】
Ａ２６−Ｂ１；Ａ２６−Ｂ２；Ａ２６−Ｂ３；Ａ２６−Ｂ４；Ａ２６−Ｂ５；Ａ２６−Ｂ６；Ａ２６−Ｂ７；Ａ２６−Ｂ８；Ａ２６−Ｂ９；Ａ２６−Ｂ１０；Ａ２６−Ｂ１１；Ａ２６−Ｂ１２；Ａ２６−Ｂ１３；Ａ２６−Ｂ１４；Ａ２６−Ｂ１５；Ａ２６−Ｂ１６；Ａ２６−Ｂ１７；Ａ２６−Ｂ１８；Ａ２６−Ｂ１９；Ａ２６−Ｂ２０；Ａ２６−Ｂ２１；Ａ２６−Ｂ２２；Ａ２６−Ｂ２３；Ａ２６−Ｂ２４；Ａ２６−Ｂ２５；Ａ２６−Ｂ２６；Ａ２６−Ｂ２７；Ａ２６−Ｂ２８；Ａ２６−Ｂ２９；Ａ２６−Ｂ３０；Ａ２６−Ｂ３１；Ａ２６−Ｂ３２；Ａ２６−Ｂ３３；Ａ２６−Ｂ３４；Ａ２６−Ｂ３５；Ａ２６−Ｂ３６；Ａ２６−Ｂ３７；Ａ２６−Ｂ３８；Ａ２６−Ｂ３９；Ａ２６−Ｂ４０；Ａ２６−Ｂ４１；Ａ２６−Ｂ４２；Ａ２６−Ｂ４３；Ａ２６−Ｂ４４；Ａ２６−Ｂ４５；Ａ２６−Ｂ４６；Ａ２６−Ｂ４７；Ａ２６−Ｂ４８；Ａ２６−Ｂ４９；Ａ２６−Ｂ５０；Ａ２６−Ｂ５１；Ａ２６−Ｂ５２；Ａ２６−Ｂ５３；Ａ２６−Ｂ５４；Ａ２６−Ｂ５５；Ａ２６−Ｂ５６；Ａ２６−Ｂ５７；Ａ２６−Ｂ５８；Ａ２６−Ｂ５９；Ａ２６−Ｂ６０；Ａ２６−Ｂ６１；Ａ２６−Ｂ６２；Ａ２６−Ｂ６３；Ａ２６−Ｂ６４；Ａ２６−Ｂ６５；Ａ２６−Ｂ６６；Ａ２６−Ｂ６７；Ａ２６−Ｂ６８；Ａ２６−Ｂ６９；Ａ２６−Ｂ７０；Ａ２６−Ｂ７１；Ａ２６−Ｂ７２；Ａ２６−Ｂ７３；Ａ２６−Ｂ７４；Ａ２６−Ｂ７５；Ａ２６−Ｂ７６；Ａ２６−Ｂ７７；Ａ２６−Ｂ７８；Ａ２６−Ｂ７９；Ａ２６−Ｂ８０；Ａ２６−Ｂ８１；Ａ２６−Ｂ８２；Ａ２６−Ｂ８３；Ａ２６−Ｂ８４；Ａ２６−Ｂ８５；Ａ２６−Ｂ８６；Ａ２６−Ｂ８７；Ａ２６−Ｂ８８；Ａ２６−Ｂ８９；Ａ２６−Ｂ９０；Ａ２６−Ｂ９１；Ａ２６−Ｂ９２；Ａ２６−Ｂ９３；Ａ２６−Ｂ９４；Ａ２６−Ｂ９５；Ａ２６−Ｂ９６；Ａ２６−Ｂ９７；Ａ２６−Ｂ９８；Ａ２６−Ｂ９９；Ａ２６−Ｂ１００；Ａ２６−Ｂ１０１；Ａ２６−Ｂ１０２；Ａ２６−Ｂ１０３；Ａ２６−Ｂ１０４；Ａ２６−Ｂ１０５；Ａ２６−Ｂ１０６；Ａ２６−Ｂ１０７；Ａ２６−Ｂ１０８；Ａ２６−Ｂ１０９；Ａ２６−Ｂ１１０；Ａ２６−Ｂ１１１；Ａ２６−Ｂ１１２；Ａ２６−Ｂ１１３；
【０７３５】
Ａ２７−Ｂ１；Ａ２７−Ｂ２；Ａ２７−Ｂ３；Ａ２７−Ｂ４；Ａ２７−Ｂ５；Ａ２７−Ｂ６；Ａ２７−Ｂ７；Ａ２７−Ｂ８；Ａ２７−Ｂ９；Ａ２７−Ｂ１０；Ａ２７−Ｂ１１；Ａ２７−Ｂ１２；Ａ２７−Ｂ１３；Ａ２７−Ｂ１４；Ａ２７−Ｂ１５；Ａ２７−Ｂ１６；Ａ２７−Ｂ１７；Ａ２７−Ｂ１８；Ａ２７−Ｂ１９；Ａ２７−Ｂ２０；Ａ２７−Ｂ２１；Ａ２７−Ｂ２２；Ａ２７−Ｂ２３；Ａ２７−Ｂ２４；Ａ２７−Ｂ２５；Ａ２７−Ｂ２６；Ａ２７−Ｂ２７；Ａ２７−Ｂ２８；Ａ２７−Ｂ２９；Ａ２７−Ｂ３０；Ａ２７−Ｂ３１；Ａ２７−Ｂ３２；Ａ２７−Ｂ３３；Ａ２７−Ｂ３４；Ａ２７−Ｂ３５；Ａ２７−Ｂ３６；Ａ２７−Ｂ３７；Ａ２７−Ｂ３８；Ａ２７−Ｂ３９；Ａ２７−Ｂ４０；Ａ２７−Ｂ４１；Ａ２７−Ｂ４２；Ａ２７−Ｂ４３；Ａ２７−Ｂ４４；Ａ２７−Ｂ４５；Ａ２７−Ｂ４６；Ａ２７−Ｂ４７；Ａ２７−Ｂ４８；Ａ２７−Ｂ４９；Ａ２７−Ｂ５０；Ａ２７−Ｂ５１；Ａ２７−Ｂ５２；Ａ２７−Ｂ５３；Ａ２７−Ｂ５４；Ａ２７−Ｂ５５；Ａ２７−Ｂ５６；Ａ２７−Ｂ５７；Ａ２７−Ｂ５８；Ａ２７−Ｂ５９；Ａ２７−Ｂ６０；Ａ２７−Ｂ６１；Ａ２７−Ｂ６２；Ａ２７−Ｂ６３；Ａ２７−Ｂ６４；Ａ２７−Ｂ６５；Ａ２７−Ｂ６６；Ａ２７−Ｂ６７；Ａ２７−Ｂ６８；Ａ２７−Ｂ６９；Ａ２７−Ｂ７０；Ａ２７−Ｂ７１；Ａ２７−Ｂ７２；Ａ２７−Ｂ７３；Ａ２７−Ｂ７４；Ａ２７−Ｂ７５；Ａ２７−Ｂ７６；Ａ２７−Ｂ７７；Ａ２７−Ｂ７８；Ａ２７−Ｂ７９；Ａ２７−Ｂ８０；Ａ２７−Ｂ８１；Ａ２７−Ｂ８２；Ａ２７−Ｂ８３；Ａ２７−Ｂ８４；Ａ２７−Ｂ８５；Ａ２７−Ｂ８６；Ａ２７−Ｂ８７；Ａ２７−Ｂ８８；Ａ２７−Ｂ８９；Ａ２７−Ｂ９０；Ａ２７−Ｂ９１；Ａ２７−Ｂ９２；Ａ２７−Ｂ９３；Ａ２７−Ｂ９４；Ａ２７−Ｂ９５；Ａ２７−Ｂ９６；Ａ２７−Ｂ９７；Ａ２７−Ｂ９８；Ａ２７−Ｂ９９；Ａ２７−Ｂ１００；Ａ２７−Ｂ１０１；Ａ２７−Ｂ１０２；Ａ２７−Ｂ１０３；Ａ２７−Ｂ１０４；Ａ２７−Ｂ１０５；Ａ２７−Ｂ１０６；Ａ２７−Ｂ１０７；Ａ２７−Ｂ１０８；Ａ２７−Ｂ１０９；Ａ２７−Ｂ１１０；Ａ２７−Ｂ１１１；Ａ２７−Ｂ１１２；Ａ２７−Ｂ１１３；
【０７３６】
Ａ２８−Ｂ１；Ａ２８−Ｂ２；Ａ２８−Ｂ３；Ａ２８−Ｂ４；Ａ２８−Ｂ５；Ａ２８−Ｂ６；Ａ２８−Ｂ７；Ａ２８−Ｂ８；Ａ２８−Ｂ９；Ａ２８−Ｂ１０；Ａ２８−Ｂ１１；Ａ２８−Ｂ１２；Ａ２８−Ｂ１３；Ａ２８−Ｂ１４；Ａ２８−Ｂ１５；Ａ２８−Ｂ１６；Ａ２８−Ｂ１７；Ａ２８−Ｂ１８；Ａ２８−Ｂ１９；Ａ２８−Ｂ２０；Ａ２８−Ｂ２１；Ａ２８−Ｂ２２；Ａ２８−Ｂ２３；Ａ２８−Ｂ２４；Ａ２８−Ｂ２５；Ａ２８−Ｂ２６；Ａ２８−Ｂ２７；Ａ２８−Ｂ２８；Ａ２８−Ｂ２９；Ａ２８−Ｂ３０；Ａ２８−Ｂ３１；Ａ２８−Ｂ３２；Ａ２８−Ｂ３３；Ａ２８−Ｂ３４；Ａ２８−Ｂ３５；Ａ２８−Ｂ３６；Ａ２８−Ｂ３７；Ａ２８−Ｂ３８；Ａ２８−Ｂ３９；Ａ２８−Ｂ４０；Ａ２８−Ｂ４１；Ａ２８−Ｂ４２；Ａ２８−Ｂ４３；Ａ２８−Ｂ４４；Ａ２８−Ｂ４５；Ａ２８−Ｂ４６；Ａ２８−Ｂ４７；Ａ２８−Ｂ４８；Ａ２８−Ｂ４９；Ａ２８−Ｂ５０；Ａ２８−Ｂ５１；Ａ２８−Ｂ５２；Ａ２８−Ｂ５３；Ａ２８−Ｂ５４；Ａ２８−Ｂ５５；Ａ２８−Ｂ５６；Ａ２８−Ｂ５７；Ａ２８−Ｂ５８；Ａ２８−Ｂ５９；Ａ２８−Ｂ６０；Ａ２８−Ｂ６１；Ａ２８−Ｂ６２；Ａ２８−Ｂ６３；Ａ２８−Ｂ６４；Ａ２８−Ｂ６５；Ａ２８−Ｂ６６；Ａ２８−Ｂ６７；Ａ２８−Ｂ６８；Ａ２８−Ｂ６９；Ａ２８−Ｂ７０；Ａ２８−Ｂ７１；Ａ２８−Ｂ７２；Ａ２８−Ｂ７３；Ａ２８−Ｂ７４；Ａ２８−Ｂ７５；Ａ２８−Ｂ７６；Ａ２８−Ｂ７７；Ａ２８−Ｂ７８；Ａ２８−Ｂ７９；Ａ２８−Ｂ８０；Ａ２８−Ｂ８１；Ａ２８−Ｂ８２；Ａ２８−Ｂ８３；Ａ２８−Ｂ８４；Ａ２８−Ｂ８５；Ａ２８−Ｂ８６；Ａ２８−Ｂ８７；Ａ２８−Ｂ８８；Ａ２８−Ｂ８９；Ａ２８−Ｂ９０；Ａ２８−Ｂ９１；Ａ２８−Ｂ９２；Ａ２８−Ｂ９３；Ａ２８−Ｂ９４；Ａ２８−Ｂ９５；Ａ２８−Ｂ９６；Ａ２８−Ｂ９７；Ａ２８−Ｂ９８；Ａ２８−Ｂ９９；Ａ２８−Ｂ１００；Ａ２８−Ｂ１０１；Ａ２８−Ｂ１０２；Ａ２８−Ｂ１０３；Ａ２８−Ｂ１０４；Ａ２８−Ｂ１０５；Ａ２８−Ｂ１０６；Ａ２８−Ｂ１０７；Ａ２８−Ｂ１０８；Ａ２８−Ｂ１０９；Ａ２８−Ｂ１１０；Ａ２８−Ｂ１１１；Ａ２８−Ｂ１１２；Ａ２８−Ｂ１１３；
【０７３７】
Ａ２９−Ｂ１；Ａ２９−Ｂ２；Ａ２９−Ｂ３；Ａ２９−Ｂ４；Ａ２９−Ｂ５；Ａ２９−Ｂ６；Ａ２９−Ｂ７；Ａ２９−Ｂ８；Ａ２９−Ｂ９；Ａ２９−Ｂ１０；Ａ２９−Ｂ１１；Ａ２９−Ｂ１２；Ａ２９−Ｂ１３；Ａ２９−Ｂ１４；Ａ２９−Ｂ１５；Ａ２９−Ｂ１６；Ａ２９−Ｂ１７；Ａ２９−Ｂ１８；Ａ２９−Ｂ１９；Ａ２９−Ｂ２０；Ａ２９−Ｂ２１；Ａ２９−Ｂ２２；Ａ２９−Ｂ２３；Ａ２９−Ｂ２４；Ａ２９−Ｂ２５；Ａ２９−Ｂ２６；Ａ２９−Ｂ２７；Ａ２９−Ｂ２８；Ａ２９−Ｂ２９；Ａ２９−Ｂ３０；Ａ２９−Ｂ３１；Ａ２９−Ｂ３２；Ａ２９−Ｂ３３；Ａ２９−Ｂ３４；Ａ２９−Ｂ３５；Ａ２９−Ｂ３６；Ａ２９−Ｂ３７；Ａ２９−Ｂ３８；Ａ２９−Ｂ３９；Ａ２９−Ｂ４０；Ａ２９−Ｂ４１；Ａ２９−Ｂ４２；Ａ２９−Ｂ４３；Ａ２９−Ｂ４４；Ａ２９−Ｂ４５；Ａ２９−Ｂ４６；Ａ２９−Ｂ４７；Ａ２９−Ｂ４８；Ａ２９−Ｂ４９；Ａ２９−Ｂ５０；Ａ２９−Ｂ５１；Ａ２９−Ｂ５２；Ａ２９−Ｂ５３；Ａ２９−Ｂ５４；Ａ２９−Ｂ５５；Ａ２９−Ｂ５６；Ａ２９−Ｂ５７；Ａ２９−Ｂ５８；Ａ２９−Ｂ５９；Ａ２９−Ｂ６０；Ａ２９−Ｂ６１；Ａ２９−Ｂ６２；Ａ２９−Ｂ６３；Ａ２９−Ｂ６４；Ａ２９−Ｂ６５；Ａ２９−Ｂ６６；Ａ２９−Ｂ６７；Ａ２９−Ｂ６８；Ａ２９−Ｂ６９；Ａ２９−Ｂ７０；Ａ２９−Ｂ７１；Ａ２９−Ｂ７２；Ａ２９−Ｂ７３；Ａ２９−Ｂ７４；Ａ２９−Ｂ７５；Ａ２９−Ｂ７６；Ａ２９−Ｂ７７；Ａ２９−Ｂ７８；Ａ２９−Ｂ７９；Ａ２９−Ｂ８０；Ａ２９−Ｂ８１；Ａ２９−Ｂ８２；Ａ２９−Ｂ８３；Ａ２９−Ｂ８４；Ａ２９−Ｂ８５；Ａ２９−Ｂ８６；Ａ２９−Ｂ８７；Ａ２９−Ｂ８８；Ａ２９−Ｂ８９；Ａ２９−Ｂ９０；Ａ２９−Ｂ９１；Ａ２９−Ｂ９２；Ａ２９−Ｂ９３；Ａ２９−Ｂ９４；Ａ２９−Ｂ９５；Ａ２９−Ｂ９６；Ａ２９−Ｂ９７；Ａ２９−Ｂ９８；Ａ２９−Ｂ９９；Ａ２９−Ｂ１００；Ａ２９−Ｂ１０１；Ａ２９−Ｂ１０２；Ａ２９−Ｂ１０３；Ａ２９−Ｂ１０４；Ａ２９−Ｂ１０５；Ａ２９−Ｂ１０６；Ａ２９−Ｂ１０７；Ａ２９−Ｂ１０８；Ａ２９−Ｂ１０９；Ａ２９−Ｂ１１０；Ａ２９−Ｂ１１１；Ａ２９−Ｂ１１２；Ａ２９−Ｂ１１３；
【０７３８】
Ａ３０−Ｂ１；Ａ３０−Ｂ２；Ａ３０−Ｂ３；Ａ３０−Ｂ４；Ａ３０−Ｂ５；Ａ３０−Ｂ６；Ａ３０−Ｂ７；Ａ３０−Ｂ８；Ａ３０−Ｂ９；Ａ３０−Ｂ１０；Ａ３０−Ｂ１１；Ａ３０−Ｂ１２；Ａ３０−Ｂ１３；Ａ３０−Ｂ１４；Ａ３０−Ｂ１５；Ａ３０−Ｂ１６；Ａ３０−Ｂ１７；Ａ３０−Ｂ１８；Ａ３０−Ｂ１９；Ａ３０−Ｂ２０；Ａ３０−Ｂ２１；Ａ３０−Ｂ２２；Ａ３０−Ｂ２３；Ａ３０−Ｂ２４；Ａ３０−Ｂ２５；Ａ３０−Ｂ２６；Ａ３０−Ｂ２７；Ａ３０−Ｂ２８；Ａ３０−Ｂ２９；Ａ３０−Ｂ３０；Ａ３０−Ｂ３１；Ａ３０−Ｂ３２；Ａ３０−Ｂ３３；Ａ３０−Ｂ３４；Ａ３０−Ｂ３５；Ａ３０−Ｂ３６；Ａ３０−Ｂ３７；Ａ３０−Ｂ３８；Ａ３０−Ｂ３９；Ａ３０−Ｂ４０；Ａ３０−Ｂ４１；Ａ３０−Ｂ４２；Ａ３０−Ｂ４３；Ａ３０−Ｂ４４；Ａ３０−Ｂ４５；Ａ３０−Ｂ４６；Ａ３０−Ｂ４７；Ａ３０−Ｂ４８；Ａ３０−Ｂ４９；Ａ３０−Ｂ５０；Ａ３０−Ｂ５１；Ａ３０−Ｂ５２；Ａ３０−Ｂ５３；Ａ３０−Ｂ５４；Ａ３０−Ｂ５５；Ａ３０−Ｂ５６；Ａ３０−Ｂ５７；Ａ３０−Ｂ５８；Ａ３０−Ｂ５９；Ａ３０−Ｂ６０；Ａ３０−Ｂ６１；Ａ３０−Ｂ６２；Ａ３０−Ｂ６３；Ａ３０−Ｂ６４；Ａ３０−Ｂ６５；Ａ３０−Ｂ６６；Ａ３０−Ｂ６７；Ａ３０−Ｂ６８；Ａ３０−Ｂ６９；Ａ３０−Ｂ７０；Ａ３０−Ｂ７１；Ａ３０−Ｂ７２；Ａ３０−Ｂ７３；Ａ３０−Ｂ７４；Ａ３０−Ｂ７５；Ａ３０−Ｂ７６；Ａ３０−Ｂ７７；Ａ３０−Ｂ７８；Ａ３０−Ｂ７９；Ａ３０−Ｂ８０；Ａ３０−Ｂ８１；Ａ３０−Ｂ８２；Ａ３０−Ｂ８３；Ａ３０−Ｂ８４；Ａ３０−Ｂ８５；Ａ３０−Ｂ８６；Ａ３０−Ｂ８７；Ａ３０−Ｂ８８；Ａ３０−Ｂ８９；Ａ３０−Ｂ９０；Ａ３０−Ｂ９１；Ａ３０−Ｂ９２；Ａ３０−Ｂ９３；Ａ３０−Ｂ９４；Ａ３０−Ｂ９５；Ａ３０−Ｂ９６；Ａ３０−Ｂ９７；Ａ３０−Ｂ９８；Ａ３０−Ｂ９９；Ａ３０−Ｂ１００；Ａ３０−Ｂ１０１；Ａ３０−Ｂ１０２；Ａ３０−Ｂ１０３；Ａ３０−Ｂ１０４；Ａ３０−Ｂ１０５；Ａ３０−Ｂ１０６；Ａ３０−Ｂ１０７；Ａ３０−Ｂ１０８；Ａ３０−Ｂ１０９；Ａ３０−Ｂ１１０；Ａ３０−Ｂ１１１；Ａ３０−Ｂ１１２；Ａ３０−Ｂ１１３；
【０７３９】
Ａ３１−Ｂ１；Ａ３１−Ｂ２；Ａ３１−Ｂ３；Ａ３１−Ｂ４；Ａ３１−Ｂ５；Ａ３１−Ｂ６；Ａ３１−Ｂ７；Ａ３１−Ｂ８；Ａ３１−Ｂ９；Ａ３１−Ｂ１０；Ａ３１−Ｂ１１；Ａ３１−Ｂ１２；Ａ３１−Ｂ１３；Ａ３１−Ｂ１４；Ａ３１−Ｂ１５；Ａ３１−Ｂ１６；Ａ３１−Ｂ１７；Ａ３１−Ｂ１８；Ａ３１−Ｂ１９；Ａ３１−Ｂ２０；Ａ３１−Ｂ２１；Ａ３１−Ｂ２２；Ａ３１−Ｂ２３；Ａ３１−Ｂ２４；Ａ３１−Ｂ２５；Ａ３１−Ｂ２６；Ａ３１−Ｂ２７；Ａ３１−Ｂ２８；Ａ３１−Ｂ２９；Ａ３１−Ｂ３０；Ａ３１−Ｂ３１；Ａ３１−Ｂ３２；Ａ３１−Ｂ３３；Ａ３１−Ｂ３４；Ａ３１−Ｂ３５；Ａ３１−Ｂ３６；Ａ３１−Ｂ３７；Ａ３１−Ｂ３８；Ａ３１−Ｂ３９；Ａ３１−Ｂ４０；Ａ３１−Ｂ４１；Ａ３１−Ｂ４２；Ａ３１−Ｂ４３；Ａ３１−Ｂ４４；Ａ３１−Ｂ４５；Ａ３１−Ｂ４６；Ａ３１−Ｂ４７；Ａ３１−Ｂ４８；Ａ３１−Ｂ４９；Ａ３１−Ｂ５０；Ａ３１−Ｂ５１；Ａ３１−Ｂ５２；Ａ３１−Ｂ５３；Ａ３１−Ｂ５４；Ａ３１−Ｂ５５；Ａ３１−Ｂ５６；Ａ３１−Ｂ５７；Ａ３１−Ｂ５８；Ａ３１−Ｂ５９；Ａ３１−Ｂ６０；Ａ３１−Ｂ６１；Ａ３１−Ｂ６２；Ａ３１−Ｂ６３；Ａ３１−Ｂ６４；Ａ３１−Ｂ６５；Ａ３１−Ｂ６６；Ａ３１−Ｂ６７；Ａ３１−Ｂ６８；Ａ３１−Ｂ６９；Ａ３１−Ｂ７０；Ａ３１−Ｂ７１；Ａ３１−Ｂ７２；Ａ３１−Ｂ７３；Ａ３１−Ｂ７４；Ａ３１−Ｂ７５；Ａ３１−Ｂ７６；Ａ３１−Ｂ７７；Ａ３１−Ｂ７８；Ａ３１−Ｂ７９；Ａ３１−Ｂ８０；Ａ３１−Ｂ８１；Ａ３１−Ｂ８２；Ａ３１−Ｂ８３；Ａ３１−Ｂ８４；Ａ３１−Ｂ８５；Ａ３１−Ｂ８６；Ａ３１−Ｂ８７；Ａ３１−Ｂ８８；Ａ３１−Ｂ８９；Ａ３１−Ｂ９０；Ａ３１−Ｂ９１；Ａ３１−Ｂ９２；Ａ３１−Ｂ９３；Ａ３１−Ｂ９４；Ａ３１−Ｂ９５；Ａ３１−Ｂ９６；Ａ３１−Ｂ９７；Ａ３１−Ｂ９８；Ａ３１−Ｂ９９；Ａ３１−Ｂ１００；Ａ３１−Ｂ１０１；Ａ３１−Ｂ１０２；Ａ３１−Ｂ１０３；Ａ３１−Ｂ１０４；Ａ３１−Ｂ１０５；Ａ３１−Ｂ１０６；Ａ３１−Ｂ１０７；Ａ３１−Ｂ１０８；Ａ３１−Ｂ１０９；Ａ３１−Ｂ１１０；Ａ３１−Ｂ１１１；Ａ３１−Ｂ１１２；Ａ３１−Ｂ１１３；
【０７４０】
Ａ３２−Ｂ１；Ａ３２−Ｂ２；Ａ３２−Ｂ３；Ａ３２−Ｂ４；Ａ３２−Ｂ５；Ａ３２−Ｂ６；Ａ３２−Ｂ７；Ａ３２−Ｂ８；Ａ３２−Ｂ９；Ａ３２−Ｂ１０；Ａ３２−Ｂ１１；Ａ３２−Ｂ１２；Ａ３２−Ｂ１３；Ａ３２−Ｂ１４；Ａ３２−Ｂ１５；Ａ３２−Ｂ１６；Ａ３２−Ｂ１７；Ａ３２−Ｂ１８；Ａ３２−Ｂ１９；Ａ３２−Ｂ２０；Ａ３２−Ｂ２１；Ａ３２−Ｂ２２；Ａ３２−Ｂ２３；Ａ３２−Ｂ２４；Ａ３２−Ｂ２５；Ａ３２−Ｂ２６；Ａ３２−Ｂ２７；Ａ３２−Ｂ２８；Ａ３２−Ｂ２９；Ａ３２−Ｂ３０；Ａ３２−Ｂ３１；Ａ３２−Ｂ３２；Ａ３２−Ｂ３３；Ａ３２−Ｂ３４；Ａ３２−Ｂ３５；Ａ３２−Ｂ３６；Ａ３２−Ｂ３７；Ａ３２−Ｂ３８；Ａ３２−Ｂ３９；Ａ３２−Ｂ４０；Ａ３２−Ｂ４１；Ａ３２−Ｂ４２；Ａ３２−Ｂ４３；Ａ３２−Ｂ４４；Ａ３２−Ｂ４５；Ａ３２−Ｂ４６；Ａ３２−Ｂ４７；Ａ３２−Ｂ４８；Ａ３２−Ｂ４９；Ａ３２−Ｂ５０；Ａ３２−Ｂ５１；Ａ３２−Ｂ５２；Ａ３２−Ｂ５３；Ａ３２−Ｂ５４；Ａ３２−Ｂ５５；Ａ３２−Ｂ５６；Ａ３２−Ｂ５７；Ａ３２−Ｂ５８；Ａ３２−Ｂ５９；Ａ３２−Ｂ６０；Ａ３２−Ｂ６１；Ａ３２−Ｂ６２；Ａ３２−Ｂ６３；Ａ３２−Ｂ６４；Ａ３２−Ｂ６５；Ａ３２−Ｂ６６；Ａ３２−Ｂ６７；Ａ３２−Ｂ６８；Ａ３２−Ｂ６９；Ａ３２−Ｂ７０；Ａ３２−Ｂ７１；Ａ３２−Ｂ７２；Ａ３２−Ｂ７３；Ａ３２−Ｂ７４；Ａ３２−Ｂ７５；Ａ３２−Ｂ７６；Ａ３２−Ｂ７７；Ａ３２−Ｂ７８；Ａ３２−Ｂ７９；Ａ３２−Ｂ８０；Ａ３２−Ｂ８１；Ａ３２−Ｂ８２；Ａ３２−Ｂ８３；Ａ３２−Ｂ８４；Ａ３２−Ｂ８５；Ａ３２−Ｂ８６；Ａ３２−Ｂ８７；Ａ３２−Ｂ８８；Ａ３２−Ｂ８９；Ａ３２−Ｂ９０；Ａ３２−Ｂ９１；Ａ３２−Ｂ９２；Ａ３２−Ｂ９３；Ａ３２−Ｂ９４；Ａ３２−Ｂ９５；Ａ３２−Ｂ９６；Ａ３２−Ｂ９７；Ａ３２−Ｂ９８；Ａ３２−Ｂ９９；Ａ３２−Ｂ１００；Ａ３２−Ｂ１０１；Ａ３２−Ｂ１０２；Ａ３２−Ｂ１０３；Ａ３２−Ｂ１０４；Ａ３２−Ｂ１０５；Ａ３２−Ｂ１０６；Ａ３２−Ｂ１０７；Ａ３２−Ｂ１０８；Ａ３２−Ｂ１０９；Ａ３２−Ｂ１１０；Ａ３２−Ｂ１１１；Ａ３２−Ｂ１１２；Ａ３２−Ｂ１１３；
【０７４１】
Ａ３３−Ｂ１；Ａ３３−Ｂ２；Ａ３３−Ｂ３；Ａ３３−Ｂ４；Ａ３３−Ｂ５；Ａ３３−Ｂ６；Ａ３３−Ｂ７；Ａ３３−Ｂ８；Ａ３３−Ｂ９；Ａ３３−Ｂ１０；Ａ３３−Ｂ１１；Ａ３３−Ｂ１２；Ａ３３−Ｂ１３；Ａ３３−Ｂ１４；Ａ３３−Ｂ１５；Ａ３３−Ｂ１６；Ａ３３−Ｂ１７；Ａ３３−Ｂ１８；Ａ３３−Ｂ１９；Ａ３３−Ｂ２０；Ａ３３−Ｂ２１；Ａ３３−Ｂ２２；Ａ３３−Ｂ２３；Ａ３３−Ｂ２４；Ａ３３−Ｂ２５；Ａ３３−Ｂ２６；Ａ３３−Ｂ２７；Ａ３３−Ｂ２８；Ａ３３−Ｂ２９；Ａ３３−Ｂ３０；Ａ３３−Ｂ３１；Ａ３３−Ｂ３２；Ａ３３−Ｂ３３；Ａ３３−Ｂ３４；Ａ３３−Ｂ３５；Ａ３３−Ｂ３６；Ａ３３−Ｂ３７；Ａ３３−Ｂ３８；Ａ３３−Ｂ３９；Ａ３３−Ｂ４０；Ａ３３−Ｂ４１；Ａ３３−Ｂ４２；Ａ３３−Ｂ４３；Ａ３３−Ｂ４４；Ａ３３−Ｂ４５；Ａ３３−Ｂ４６；Ａ３３−Ｂ４７；Ａ３３−Ｂ４８；Ａ３３−Ｂ４９；Ａ３３−Ｂ５０；Ａ３３−Ｂ５１；Ａ３３−Ｂ５２；Ａ３３−Ｂ５３；Ａ３３−Ｂ５４；Ａ３３−Ｂ５５；Ａ３３−Ｂ５６；Ａ３３−Ｂ５７；Ａ３３−Ｂ５８；Ａ３３−Ｂ５９；Ａ３３−Ｂ６０；Ａ３３−Ｂ６１；Ａ３３−Ｂ６２；Ａ３３−Ｂ６３；Ａ３３−Ｂ６４；Ａ３３−Ｂ６５；Ａ３３−Ｂ６６；Ａ３３−Ｂ６７；Ａ３３−Ｂ６８；Ａ３３−Ｂ６９；Ａ３３−Ｂ７０；Ａ３３−Ｂ７１；Ａ３３−Ｂ７２；Ａ３３−Ｂ７３；Ａ３３−Ｂ７４；Ａ３３−Ｂ７５；Ａ３３−Ｂ７６；Ａ３３−Ｂ７７；Ａ３３−Ｂ７８；Ａ３３−Ｂ７９；Ａ３３−Ｂ８０；Ａ３３−Ｂ８１；Ａ３３−Ｂ８２；Ａ３３−Ｂ８３；Ａ３３−Ｂ８４；Ａ３３−Ｂ８５；Ａ３３−Ｂ８６；Ａ３３−Ｂ８７；Ａ３３−Ｂ８８；Ａ３３−Ｂ８９；Ａ３３−Ｂ９０；Ａ３３−Ｂ９１；Ａ３３−Ｂ９２；Ａ３３−Ｂ９３；Ａ３３−Ｂ９４；Ａ３３−Ｂ９５；Ａ３３−Ｂ９６；Ａ３３−Ｂ９７；Ａ３３−Ｂ９８；Ａ３３−Ｂ９９；Ａ３３−Ｂ１００；Ａ３３−Ｂ１０１；Ａ３３−Ｂ１０２；Ａ３３−Ｂ１０３；Ａ３３−Ｂ１０４；Ａ３３−Ｂ１０５；Ａ３３−Ｂ１０６；Ａ３３−Ｂ１０７；Ａ３３−Ｂ１０８；Ａ３３−Ｂ１０９；Ａ３３−Ｂ１１０；Ａ３３−Ｂ１１１；Ａ３３−Ｂ１１２；Ａ３３−Ｂ１１３；
【０７４２】
Ａ３４−Ｂ１；Ａ３４−Ｂ２；Ａ３４−Ｂ３；Ａ３４−Ｂ４；Ａ３４−Ｂ５；Ａ３４−Ｂ６；Ａ３４−Ｂ７；Ａ３４−Ｂ８；Ａ３４−Ｂ９；Ａ３４−Ｂ１０；Ａ３４−Ｂ１１；Ａ３４−Ｂ１２；Ａ３４−Ｂ１３；Ａ３４−Ｂ１４；Ａ３４−Ｂ１５；Ａ３４−Ｂ１６；Ａ３４−Ｂ１７；Ａ３４−Ｂ１８；Ａ３４−Ｂ１９；Ａ３４−Ｂ２０；Ａ３４−Ｂ２１；Ａ３４−Ｂ２２；Ａ３４−Ｂ２３；Ａ３４−Ｂ２４；Ａ３４−Ｂ２５；Ａ３４−Ｂ２６；Ａ３４−Ｂ２７；Ａ３４−Ｂ２８；Ａ３４−Ｂ２９；Ａ３４−Ｂ３０；Ａ３４−Ｂ３１；Ａ３４−Ｂ３２；Ａ３４−Ｂ３３；Ａ３４−Ｂ３４；Ａ３４−Ｂ３５；Ａ３４−Ｂ３６；Ａ３４−Ｂ３７；Ａ３４−Ｂ３８；Ａ３４−Ｂ３９；Ａ３４−Ｂ４０；Ａ３４−Ｂ４１；Ａ３４−Ｂ４２；Ａ３４−Ｂ４３；Ａ３４−Ｂ４４；Ａ３４−Ｂ４５；Ａ３４−Ｂ４６；Ａ３４−Ｂ４７；Ａ３４−Ｂ４８；Ａ３４−Ｂ４９；Ａ３４−Ｂ５０；Ａ３４−Ｂ５１；Ａ３４−Ｂ５２；Ａ３４−Ｂ５３；Ａ３４−Ｂ５４；Ａ３４−Ｂ５５；Ａ３４−Ｂ５６；Ａ３４−Ｂ５７；Ａ３４−Ｂ５８；Ａ３４−Ｂ５９；Ａ３４−Ｂ６０；Ａ３４−Ｂ６１；Ａ３４−Ｂ６２；Ａ３４−Ｂ６３；Ａ３４−Ｂ６４；Ａ３４−Ｂ６５；Ａ３４−Ｂ６６；Ａ３４−Ｂ６７；Ａ３４−Ｂ６８；Ａ３４−Ｂ６９；Ａ３４−Ｂ７０；Ａ３４−Ｂ７１；Ａ３４−Ｂ７２；Ａ３４−Ｂ７３；Ａ３４−Ｂ７４；Ａ３４−Ｂ７５；Ａ３４−Ｂ７６；Ａ３４−Ｂ７７；Ａ３４−Ｂ７８；Ａ３４−Ｂ７９；Ａ３４−Ｂ８０；Ａ３４−Ｂ８１；Ａ３４−Ｂ８２；Ａ３４−Ｂ８３；Ａ３４−Ｂ８４；Ａ３４−Ｂ８５；Ａ３４−Ｂ８６；Ａ３４−Ｂ８７；Ａ３４−Ｂ８８；Ａ３４−Ｂ８９；Ａ３４−Ｂ９０；Ａ３４−Ｂ９１；Ａ３４−Ｂ９２；Ａ３４−Ｂ９３；Ａ３４−Ｂ９４；Ａ３４−Ｂ９５；Ａ３４−Ｂ９６；Ａ３４−Ｂ９７；Ａ３４−Ｂ９８；Ａ３４−Ｂ９９；Ａ３４−Ｂ１００；Ａ３４−Ｂ１０１；Ａ３４−Ｂ１０２；Ａ３４−Ｂ１０３；Ａ３４−Ｂ１０４；Ａ３４−Ｂ１０５；Ａ３４−Ｂ１０６；Ａ３４−Ｂ１０７；Ａ３４−Ｂ１０８；Ａ３４−Ｂ１０９；Ａ３４−Ｂ１１０；Ａ３４−Ｂ１１１；Ａ３４−Ｂ１１２；Ａ３４−Ｂ１１３；
【０７４３】
Ａ３５−Ｂ１；Ａ３５−Ｂ２；Ａ３５−Ｂ３；Ａ３５−Ｂ４；Ａ３５−Ｂ５；Ａ３５−Ｂ６；Ａ３５−Ｂ７；Ａ３５−Ｂ８；Ａ３５−Ｂ９；Ａ３５−Ｂ１０；Ａ３５−Ｂ１１；Ａ３５−Ｂ１２；Ａ３５−Ｂ１３；Ａ３５−Ｂ１４；Ａ３５−Ｂ１５；Ａ３５−Ｂ１６；Ａ３５−Ｂ１７；Ａ３５−Ｂ１８；Ａ３５−Ｂ１９；Ａ３５−Ｂ２０；Ａ３５−Ｂ２１；Ａ３５−Ｂ２２；Ａ３５−Ｂ２３；Ａ３５−Ｂ２４；Ａ３５−Ｂ２５；Ａ３５−Ｂ２６；Ａ３５−Ｂ２７；Ａ３５−Ｂ２８；Ａ３５−Ｂ２９；Ａ３５−Ｂ３０；Ａ３５−Ｂ３１；Ａ３５−Ｂ３２；Ａ３５−Ｂ３３；Ａ３５−Ｂ３４；Ａ３５−Ｂ３５；Ａ３５−Ｂ３６；Ａ３５−Ｂ３７；Ａ３５−Ｂ３８；Ａ３５−Ｂ３９；Ａ３５−Ｂ４０；Ａ３５−Ｂ４１；Ａ３５−Ｂ４２；Ａ３５−Ｂ４３；Ａ３５−Ｂ４４；Ａ３５−Ｂ４５；Ａ３５−Ｂ４６；Ａ３５−Ｂ４７；Ａ３５−Ｂ４８；Ａ３５−Ｂ４９；Ａ３５−Ｂ５０；Ａ３５−Ｂ５１；Ａ３５−Ｂ５２；Ａ３５−Ｂ５３；Ａ３５−Ｂ５４；Ａ３５−Ｂ５５；Ａ３５−Ｂ５６；Ａ３５−Ｂ５７；Ａ３５−Ｂ５８；Ａ３５−Ｂ５９；Ａ３５−Ｂ６０；Ａ３５−Ｂ６１；Ａ３５−Ｂ６２；Ａ３５−Ｂ６３；Ａ３５−Ｂ６４；Ａ３５−Ｂ６５；Ａ３５−Ｂ６６；Ａ３５−Ｂ６７；Ａ３５−Ｂ６８；Ａ３５−Ｂ６９；Ａ３５−Ｂ７０；Ａ３５−Ｂ７１；Ａ３５−Ｂ７２；Ａ３５−Ｂ７３；Ａ３５−Ｂ７４；Ａ３５−Ｂ７５；Ａ３５−Ｂ７６；Ａ３５−Ｂ７７；Ａ３５−Ｂ７８；Ａ３５−Ｂ７９；Ａ３５−Ｂ８０；Ａ３５−Ｂ８１；Ａ３５−Ｂ８２；Ａ３５−Ｂ８３；Ａ３５−Ｂ８４；Ａ３５−Ｂ８５；Ａ３５−Ｂ８６；Ａ３５−Ｂ８７；Ａ３５−Ｂ８８；Ａ３５−Ｂ８９；Ａ３５−Ｂ９０；Ａ３５−Ｂ９１；Ａ３５−Ｂ９２；Ａ３５−Ｂ９３；Ａ３５−Ｂ９４；Ａ３５−Ｂ９５；Ａ３５−Ｂ９６；Ａ３５−Ｂ９７；Ａ３５−Ｂ９８；Ａ３５−Ｂ９９；Ａ３５−Ｂ１００；Ａ３５−Ｂ１０１；Ａ３５−Ｂ１０２；Ａ３５−Ｂ１０３；Ａ３５−Ｂ１０４；Ａ３５−Ｂ１０５；Ａ３５−Ｂ１０６；Ａ３５−Ｂ１０７；Ａ３５−Ｂ１０８；Ａ３５−Ｂ１０９；Ａ３５−Ｂ１１０；Ａ３５−Ｂ１１１；Ａ３５−Ｂ１１２；Ａ３５−Ｂ１１３；
【０７４４】
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【０７４５】
Ａ３７−Ｂ１；Ａ３７−Ｂ２；Ａ３７−Ｂ３；Ａ３７−Ｂ４；Ａ３７−Ｂ５；Ａ３７−Ｂ６；Ａ３７−Ｂ７；Ａ３７−Ｂ８；Ａ３７−Ｂ９；Ａ３７−Ｂ１０；Ａ３７−Ｂ１１；Ａ３７−Ｂ１２；Ａ３７−Ｂ１３；Ａ３７−Ｂ１４；Ａ３７−Ｂ１５；Ａ３７−Ｂ１６；Ａ３７−Ｂ１７；Ａ３７−Ｂ１８；Ａ３７−Ｂ１９；Ａ３７−Ｂ２０；Ａ３７−Ｂ２１；Ａ３７−Ｂ２２；Ａ３７−Ｂ２３；Ａ３７−Ｂ２４；Ａ３７−Ｂ２５；Ａ３７−Ｂ２６；Ａ３７−Ｂ２７；Ａ３７−Ｂ２８；Ａ３７−Ｂ２９；Ａ３７−Ｂ３０；Ａ３７−Ｂ３１；Ａ３７−Ｂ３２；Ａ３７−Ｂ３３；Ａ３７−Ｂ３４；Ａ３７−Ｂ３５；Ａ３７−Ｂ３６；Ａ３７−Ｂ３７；Ａ３７−Ｂ３８；Ａ３７−Ｂ３９；Ａ３７−Ｂ４０；Ａ３７−Ｂ４１；Ａ３７−Ｂ４２；Ａ３７−Ｂ４３；Ａ３７−Ｂ４４；Ａ３７−Ｂ４５；Ａ３７−Ｂ４６；Ａ３７−Ｂ４７；Ａ３７−Ｂ４８；Ａ３７−Ｂ４９；Ａ３７−Ｂ５０；Ａ３７−Ｂ５１；Ａ３７−Ｂ５２；Ａ３７−Ｂ５３；Ａ３７−Ｂ５４；Ａ３７−Ｂ５５；Ａ３７−Ｂ５６；Ａ３７−Ｂ５７；Ａ３７−Ｂ５８；Ａ３７−Ｂ５９；Ａ３７−Ｂ６０；Ａ３７−Ｂ６１；Ａ３７−Ｂ６２；Ａ３７−Ｂ６３；Ａ３７−Ｂ６４；Ａ３７−Ｂ６５；Ａ３７−Ｂ６６；Ａ３７−Ｂ６７；Ａ３７−Ｂ６８；Ａ３７−Ｂ６９；Ａ３７−Ｂ７０；Ａ３７−Ｂ７１；Ａ３７−Ｂ７２；Ａ３７−Ｂ７３；Ａ３７−Ｂ７４；Ａ３７−Ｂ７５；Ａ３７−Ｂ７６；Ａ３７−Ｂ７７；Ａ３７−Ｂ７８；Ａ３７−Ｂ７９；Ａ３７−Ｂ８０；Ａ３７−Ｂ８１；Ａ３７−Ｂ８２；Ａ３７−Ｂ８３；Ａ３７−Ｂ８４；Ａ３７−Ｂ８５；Ａ３７−Ｂ８６；Ａ３７−Ｂ８７；Ａ３７−Ｂ８８；Ａ３７−Ｂ８９；Ａ３７−Ｂ９０；Ａ３７−Ｂ９１；Ａ３７−Ｂ９２；Ａ３７−Ｂ９３；Ａ３７−Ｂ９４；Ａ３７−Ｂ９５；Ａ３７−Ｂ９６；Ａ３７−Ｂ９７；Ａ３７−Ｂ９８；Ａ３７−Ｂ９９；Ａ３７−Ｂ１００；Ａ３７−Ｂ１０１；Ａ３７−Ｂ１０２；Ａ３７−Ｂ１０３；Ａ３７−Ｂ１０４；Ａ３７−Ｂ１０５；Ａ３７−Ｂ１０６；Ａ３７−Ｂ１０７；Ａ３７−Ｂ１０８；Ａ３７−Ｂ１０９；Ａ３７−Ｂ１１０；Ａ３７−Ｂ１１１；Ａ３７−Ｂ１１２；Ａ３７−Ｂ１１３；
【０７４６】
Ａ３８−Ｂ１；Ａ３８−Ｂ２；Ａ３８−Ｂ３；Ａ３８−Ｂ４；Ａ３８−Ｂ５；Ａ３８−Ｂ６；Ａ３８−Ｂ７；Ａ３８−Ｂ８；Ａ３８−Ｂ９；Ａ３８−Ｂ１０；Ａ３８−Ｂ１１；Ａ３８−Ｂ１２；Ａ３８−Ｂ１３；Ａ３８−Ｂ１４；Ａ３８−Ｂ１５；Ａ３８−Ｂ１６；Ａ３８−Ｂ１７；Ａ３８−Ｂ１８；Ａ３８−Ｂ１９；Ａ３８−Ｂ２０；Ａ３８−Ｂ２１；Ａ３８−Ｂ２２；Ａ３８−Ｂ２３；Ａ３８−Ｂ２４；Ａ３８−Ｂ２５；Ａ３８−Ｂ２６；Ａ３８−Ｂ２７；Ａ３８−Ｂ２８；Ａ３８−Ｂ２９；Ａ３８−Ｂ３０；Ａ３８−Ｂ３１；Ａ３８−Ｂ３２；Ａ３８−Ｂ３３；Ａ３８−Ｂ３４；Ａ３８−Ｂ３５；Ａ３８−Ｂ３６；Ａ３８−Ｂ３７；Ａ３８−Ｂ３８；Ａ３８−Ｂ３９；Ａ３８−Ｂ４０；Ａ３８−Ｂ４１；Ａ３８−Ｂ４２；Ａ３８−Ｂ４３；Ａ３８−Ｂ４４；Ａ３８−Ｂ４５；Ａ３８−Ｂ４６；Ａ３８−Ｂ４７；Ａ３８−Ｂ４８；Ａ３８−Ｂ４９；Ａ３８−Ｂ５０；Ａ３８−Ｂ５１；Ａ３８−Ｂ５２；Ａ３８−Ｂ５３；Ａ３８−Ｂ５４；Ａ３８−Ｂ５５；Ａ３８−Ｂ５６；Ａ３８−Ｂ５７；Ａ３８−Ｂ５８；Ａ３８−Ｂ５９；Ａ３８−Ｂ６０；Ａ３８−Ｂ６１；Ａ３８−Ｂ６２；Ａ３８−Ｂ６３；Ａ３８−Ｂ６４；Ａ３８−Ｂ６５；Ａ３８−Ｂ６６；Ａ３８−Ｂ６７；Ａ３８−Ｂ６８；Ａ３８−Ｂ６９；Ａ３８−Ｂ７０；Ａ３８−Ｂ７１；Ａ３８−Ｂ７２；Ａ３８−Ｂ７３；Ａ３８−Ｂ７４；Ａ３８−Ｂ７５；Ａ３８−Ｂ７６；Ａ３８−Ｂ７７；Ａ３８−Ｂ７８；Ａ３８−Ｂ７９；Ａ３８−Ｂ８０；Ａ３８−Ｂ８１；Ａ３８−Ｂ８２；Ａ３８−Ｂ８３；Ａ３８−Ｂ８４；Ａ３８−Ｂ８５；Ａ３８−Ｂ８６；Ａ３８−Ｂ８７；Ａ３８−Ｂ８８；Ａ３８−Ｂ８９；Ａ３８−Ｂ９０；Ａ３８−Ｂ９１；Ａ３８−Ｂ９２；Ａ３８−Ｂ９３；Ａ３８−Ｂ９４；Ａ３８−Ｂ９５；Ａ３８−Ｂ９６；Ａ３８−Ｂ９７；Ａ３８−Ｂ９８；Ａ３８−Ｂ９９；Ａ３８−Ｂ１００；Ａ３８−Ｂ１０１；Ａ３８−Ｂ１０２；Ａ３８−Ｂ１０３；Ａ３８−Ｂ１０４；Ａ３８−Ｂ１０５；Ａ３８−Ｂ１０６；Ａ３８−Ｂ１０７；Ａ３８−Ｂ１０８；Ａ３８−Ｂ１０９；Ａ３８−Ｂ１１０；Ａ３８−Ｂ１１１；Ａ３８−Ｂ１１２；Ａ３８−Ｂ１１３；
【０７４７】
Ａ３９−Ｂ１；Ａ３９−Ｂ２；Ａ３９−Ｂ３；Ａ３９−Ｂ４；Ａ３９−Ｂ５；Ａ３９−Ｂ６；Ａ３９−Ｂ７；Ａ３９−Ｂ８；Ａ３９−Ｂ９；Ａ３９−Ｂ１０；Ａ３９−Ｂ１１；Ａ３９−Ｂ１２；Ａ３９−Ｂ１３；Ａ３９−Ｂ１４；Ａ３９−Ｂ１５；Ａ３９−Ｂ１６；Ａ３９−Ｂ１７；Ａ３９−Ｂ１８；Ａ３９−Ｂ１９；Ａ３９−Ｂ２０；Ａ３９−Ｂ２１；Ａ３９−Ｂ２２；Ａ３９−Ｂ２３；Ａ３９−Ｂ２４；Ａ３９−Ｂ２５；Ａ３９−Ｂ２６；Ａ３９−Ｂ２７；Ａ３９−Ｂ２８；Ａ３９−Ｂ２９；Ａ３９−Ｂ３０；Ａ３９−Ｂ３１；Ａ３９−Ｂ３２；Ａ３９−Ｂ３３；Ａ３９−Ｂ３４；Ａ３９−Ｂ３５；Ａ３９−Ｂ３６；Ａ３９−Ｂ３７；Ａ３９−Ｂ３８；Ａ３９−Ｂ３９；Ａ３９−Ｂ４０；Ａ３９−Ｂ４１；Ａ３９−Ｂ４２；Ａ３９−Ｂ４３；Ａ３９−Ｂ４４；Ａ３９−Ｂ４５；Ａ３９−Ｂ４６；Ａ３９−Ｂ４７；Ａ３９−Ｂ４８；Ａ３９−Ｂ４９；Ａ３９−Ｂ５０；Ａ３９−Ｂ５１；Ａ３９−Ｂ５２；Ａ３９−Ｂ５３；Ａ３９−Ｂ５４；Ａ３９−Ｂ５５；Ａ３９−Ｂ５６；Ａ３９−Ｂ５７；Ａ３９−Ｂ５８；Ａ３９−Ｂ５９；Ａ３９−Ｂ６０；Ａ３９−Ｂ６１；Ａ３９−Ｂ６２；Ａ３９−Ｂ６３；Ａ３９−Ｂ６４；Ａ３９−Ｂ６５；Ａ３９−Ｂ６６；Ａ３９−Ｂ６７；Ａ３９−Ｂ６８；Ａ３９−Ｂ６９；Ａ３９−Ｂ７０；Ａ３９−Ｂ７１；Ａ３９−Ｂ７２；Ａ３９−Ｂ７３；Ａ３９−Ｂ７４；Ａ３９−Ｂ７５；Ａ３９−Ｂ７６；Ａ３９−Ｂ７７；Ａ３９−Ｂ７８；Ａ３９−Ｂ７９；Ａ３９−Ｂ８０；Ａ３９−Ｂ８１；Ａ３９−Ｂ８２；Ａ３９−Ｂ８３；Ａ３９−Ｂ８４；Ａ３９−Ｂ８５；Ａ３９−Ｂ８６；Ａ３９−Ｂ８７；Ａ３９−Ｂ８８；Ａ３９−Ｂ８９；Ａ３９−Ｂ９０；Ａ３９−Ｂ９１；Ａ３９−Ｂ９２；Ａ３９−Ｂ９３；Ａ３９−Ｂ９４；Ａ３９−Ｂ９５；Ａ３９−Ｂ９６；Ａ３９−Ｂ９７；Ａ３９−Ｂ９８；Ａ３９−Ｂ９９；Ａ３９−Ｂ１００；Ａ３９−Ｂ１０１；Ａ３９−Ｂ１０２；Ａ３９−Ｂ１０３；Ａ３９−Ｂ１０４；Ａ３９−Ｂ１０５；Ａ３９−Ｂ１０６；Ａ３９−Ｂ１０７；Ａ３９−Ｂ１０８；Ａ３９−Ｂ１０９；Ａ３９−Ｂ１１０；Ａ３９−Ｂ１１１；Ａ３９−Ｂ１１２；Ａ３９−Ｂ１１３；
【０７４８】
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【０７４９】
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【０７５０】
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Ａ４４−Ｂ１；Ａ４４−Ｂ２；Ａ４４−Ｂ３；Ａ４４−Ｂ４；Ａ４４−Ｂ５；Ａ４４−Ｂ６；Ａ４４−Ｂ７；Ａ４４−Ｂ８；Ａ４４−Ｂ９；Ａ４４−Ｂ１０；Ａ４４−Ｂ１１；Ａ４４−Ｂ１２；Ａ４４−Ｂ１３；Ａ４４−Ｂ１４；Ａ４４−Ｂ１５；Ａ４４−Ｂ１６；Ａ４４−Ｂ１７；Ａ４４−Ｂ１８；Ａ４４−Ｂ１９；Ａ４４−Ｂ２０；Ａ４４−Ｂ２１；Ａ４４−Ｂ２２；Ａ４４−Ｂ２３；Ａ４４−Ｂ２４；Ａ４４−Ｂ２５；Ａ４４−Ｂ２６；Ａ４４−Ｂ２７；Ａ４４−Ｂ２８；Ａ４４−Ｂ２９；Ａ４４−Ｂ３０；Ａ４４−Ｂ３１；Ａ４４−Ｂ３２；Ａ４４−Ｂ３３；Ａ４４−Ｂ３４；Ａ４４−Ｂ３５；Ａ４４−Ｂ３６；Ａ４４−Ｂ３７；Ａ４４−Ｂ３８；Ａ４４−Ｂ３９；Ａ４４−Ｂ４０；Ａ４４−Ｂ４１；Ａ４４−Ｂ４２；Ａ４４−Ｂ４３；Ａ４４−Ｂ４４；Ａ４４−Ｂ４５；Ａ４４−Ｂ４６；Ａ４４−Ｂ４７；Ａ４４−Ｂ４８；Ａ４４−Ｂ４９；Ａ４４−Ｂ５０；Ａ４４−Ｂ５１；Ａ４４−Ｂ５２；Ａ４４−Ｂ５３；Ａ４４−Ｂ５４；Ａ４４−Ｂ５５；Ａ４４−Ｂ５６；Ａ４４−Ｂ５７；Ａ４４−Ｂ５８；Ａ４４−Ｂ５９；Ａ４４−Ｂ６０；Ａ４４−Ｂ６１；Ａ４４−Ｂ６２；Ａ４４−Ｂ６３；Ａ４４−Ｂ６４；Ａ４４−Ｂ６５；Ａ４４−Ｂ６６；Ａ４４−Ｂ６７；Ａ４４−Ｂ６８；Ａ４４−Ｂ６９；Ａ４４−Ｂ７０；Ａ４４−Ｂ７１；Ａ４４−Ｂ７２；Ａ４４−Ｂ７３；Ａ４４−Ｂ７４；Ａ４４−Ｂ７５；Ａ４４−Ｂ７６；Ａ４４−Ｂ７７；Ａ４４−Ｂ７８；Ａ４４−Ｂ７９；Ａ４４−Ｂ８０；Ａ４４−Ｂ８１；Ａ４４−Ｂ８２；Ａ４４−Ｂ８３；Ａ４４−Ｂ８４；Ａ４４−Ｂ８５；Ａ４４−Ｂ８６；Ａ４４−Ｂ８７；Ａ４４−Ｂ８８；Ａ４４−Ｂ８９；Ａ４４−Ｂ９０；Ａ４４−Ｂ９１；Ａ４４−Ｂ９２；Ａ４４−Ｂ９３；Ａ４４−Ｂ９４；Ａ４４−Ｂ９５；Ａ４４−Ｂ９６；Ａ４４−Ｂ９７；Ａ４４−Ｂ９８；Ａ４４−Ｂ９９；Ａ４４−Ｂ１００；Ａ４４−Ｂ１０１；Ａ４４−Ｂ１０２；Ａ４４−Ｂ１０３；Ａ４４−Ｂ１０４；Ａ４４−Ｂ１０５；Ａ４４−Ｂ１０６；Ａ４４−Ｂ１０７；Ａ４４−Ｂ１０８；Ａ４４−Ｂ１０９；Ａ４４−Ｂ１１０；Ａ４４−Ｂ１１１；Ａ４４−Ｂ１１２；Ａ４４−Ｂ１１３；
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Ａ４８−Ｂ１；Ａ４８−Ｂ２；Ａ４８−Ｂ３；Ａ４８−Ｂ４；Ａ４볯銈볯閼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯鮼볯钼볯銈볯鞼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯鮼볯钼볯銈볯馼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯邼볯鮼볯钼볯銈볯醼볯醼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯邼볯鮼볯钼볯銈볯醼볯鎼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯邼볯鮼볯钼볯銈볯醼볯閼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯邼볯鮼볯钼볯銈볯醼볯鞼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯邼볯鮼볯钼볯銈볯醼볯馼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯醼볯鮼볯钼볯銈볯醼볯醼볯ꆼ볯颼裢ꊼ볯醼볯鮼볯钼볯銈볯醼볯鎼볯છ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†볯钼볯銈볯醼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯鮼볯钼볯銈볯鎼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯鮼볯钼볯銈볯閼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯鮼볯钼볯銈볯鞼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯鮼볯钼볯銈볯馼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯邼볯鮼볯钼볯銈볯醼볯醼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯邼볯鮼볯钼볯銈볯醼볯鎼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯邼볯鮼볯钼볯銈볯醼볯閼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯邼볯鮼볯钼볯銈볯醼볯鞼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯邼볯鮼볯钼볯銈볯醼볯馼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯醼볯鮼볯钼볯銈볯醼볯醼볯ꆼ볯馼裢ꊼ볯醼볯鮼볯钼볯銈볯醼볯鎼볯છ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†볯閼볯銈볯醼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯鮼볯閼볯銈볯鎼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯鮼볯閼볯銈볯閼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯鮼볯閼볯銈볯鞼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯鮼볯閼볯銈볯馼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯邼볯鮼볯閼볯銈볯醼볯醼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯邼볯鮼볯閼볯銈볯醼볯鎼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯邼볯鮼볯閼볯銈볯醼볯閼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯邼볯鮼볯閼볯銈볯醼볯鞼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯邼볯鮼볯閼볯銈볯醼볯馼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯醼볯鮼볯閼볯銈볯醼볯醼볯ꆼ볯邼裢ꊼ볯醼볯鮼볯閼볯銈볯醼볯鎼볯છ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯鞼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†볯閼볯銈볯醼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯鮼볯閼볯銈볯鎼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯鮼볯閼볯銈볯閼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯鮼볯閼볯銈볯鞼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯鮼볯閼볯銈볯馼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯鎼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯钼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯閼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯隼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯鞼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯颼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯馼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯邼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯醼볯ꆼ볯醼裢ꊼ볯銼볯ꆼ볯醼裢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