(57)【要約】【解決手段】本発明は、標的の存在下で少なくとも１つの架橋剤と少なくとも１つのモノマーを重合することによって得られ、標的の形状を有する少なくとも１つの空洞と、重合可能な形態または重合可能でない形態のいずれかを取る少なくとも１つのレドックスプローブとをその構造内に含む非導電性インプリントポリマーに関する。本発明はまた、インプリントポリマーの調製方法、このようなポリマーを実施する標的の検出方法、ならびにセンサ、より具体的にはインプリントセンサとしての、電気化学（バイオ）センサを製造するための活性インターフェースとしてのこのようなポリマーの使用、または固相抽出基質を製造するための活性インターフェースとしてのこのようなポリマーの使用にも関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的（インプリント実体）の存在下で少なくとも１つの架橋剤と少なくとも１つのモノマーを重合することによって得られ、前記標的の形状を有する少なくとも１つの空洞をその構造内に呈する非導電性インプリントポリマーであって、
重合可能な形態または重合可能でない形態のいずれかで提供される少なくとも１つのレドックスプローブをその構造内に含む、非導電性インプリントポリマー。
【請求項２】
前記レドックスプローブが少なくとも１つの重合可能部位を呈し、この場合のモノマーが前記レドックスプローブである、請求項１に記載のインプリントポリマー。
【請求項３】
前記モノマーが、重合可能部位を有するフェロセン型の少なくとも１つの官能基を担持するレドックスモノマーであり、前記重合可能部位が、好ましくはビニル部位、（メタ）アクリル酸部位またはアリル部位から選択される、請求項２に記載のインプリントポリマー。
【請求項４】
前記レドックスモノマーがビニルフェロセンである、請求項３に記載のインプリントポリマー。
【請求項５】
前記レドックスプローブが、少なくとも２つの重合可能部位を呈し、かつ、架橋剤として作用する、請求項１に記載のインプリントポリマー。
【請求項６】
前記架橋剤が、二官能基、三官能基または四官能基から選択される（メタ）アクリル酸モノマー、ビニルモノマー、スチレンモノマーまたはアリルモノマーである、請求項５に記載のインプリントポリマー。
【請求項７】
前記レドックスプローブが、標的の形状を有する前記空洞に近接して位置している、請求項１〜６の一項に記載のインプリントポリマー。
【請求項８】
前記標的が分子またはイオンである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のインプリントポリマー。
【請求項９】
前記標的が、多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）、ステロイド、活性成分、殺虫剤、除草剤、界面活性剤、食用色素または生物活性分子から選択される分子である、請求項８に記載のインプリントポリマー。
【請求項１０】
前記標的がイオンであり、前記ポリマーが重合可能な形態または重合可能でない形態のいずれかで提供される少なくとも１つのリガンドもその構造内に含むことができる、請求項８に記載のインプリントポリマー。
【請求項１１】
前記レドックスプローブと標的の形状を有する前記空洞との最小距離が、前記レドックスプローブが前記標的と相互作用しかつ検出信号を発する距離である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のインプリントポリマー。
【請求項１２】
前記レドックスプローブが、標的の形状を有する前記空洞内に位置している、請求項１１に記載のインプリントポリマー。
【請求項１３】
請求項１〜１２の一項に記載のインプリントポリマーの調製方法であって、
（ｉ）標的と、重合可能な形態または重合可能でない形態のいずれかで提供されるレドックスプローブとの存在下で、架橋剤とモノマーを重合する工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）の終わりに得られたポリマー内に存在する前記標的を除去する工程と
を含む方法。
【請求項１４】
前記レドックスプローブが少なくとも１つの重合可能部位を呈し、この場合のモノマーがレドックスプローブである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記レドックスプローブが少なくとも２つの重合可能部位を呈し、この場合の架橋剤が前記レドックスプローブである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記工程（ｉ）が蒸留−沈殿によって行われる、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
標的の検出方法であって、
（ｉ’）標的を含むサンプルを請求項１〜１２のいずれか一項に記載のインプリントポリマーと接触させる工程と、
（ｉｉ’）該標的を検出する工程と
を少なくとも含む方法。
【請求項１８】
前記検出工程（ｉｉ’）が、電気的測定または電気化学方法、例えばクロノポテンショメトリ、クロノアンペロメトリもしくはボルタンメトリによって行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のインプリントポリマーの、センサとしての使用。
【請求項２０】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のインプリントポリマーの、（バイオ）センサまたは固相抽出支持体を製造するための活性インターフェースとしての使用。
【請求項２１】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のインプリントポリマーを少なくとも１つ包含する装置。
【請求項２２】
前記装置が電気化学センサまたは抽出カラムである、請求項２１に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つの架橋剤と少なくとも１つのモノマーを重合することによって得られ、標的（ｔａｒｇｅｔ）の形状を有する少なくとも１つの空洞をその構造内に呈する非導電性インプリントポリマーに関する。本発明はまた、インプリントポリマー（ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ）の調製方法、このようなポリマーを使用する標的の検出方法、および電気化学センサを製造するための活性インターフェース（ａｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）としてのこのようなポリマーの使用、又は、固相抽出支持体を製造するための活性インターフェースとしてのこのようなポリマーの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
微小汚染物質（ｍｉｃｒｏｐｏｌｌｕｔａｎｔ）は、所与の媒体において微量濃度で毒性作用を有することができる天然または人類起源の有機またはイオン性化学物質であるものと定義される。水中で、これらの汚染物質は非常に多岐にわたり、殺虫剤、ステロイド、多環芳香族炭化水素（ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ  ａｒｏｍａｔｉｃ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ，ＰＡＨ）、活性成分、界面活性剤、化粧品、金属イオン、微小毒素（ｍｉｃｒｏｔｏｘｉｎｓ）、細菌性毒素などが挙げられる。これらの汚染物質は、特に人間が消費することを目的とした水中での綿密なモニタリングの主題である（非特許文献１）。
【０００３】
しかしながら、微量の微小汚染物質の分析は、問題が多いものであることが判明しつつあり、あらかじめ、事前処理を導入してから、蛍光、可視紫外分光法（ＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）もしくは質量分析法による検出と組み合わせた液体クロマトグラフィー、または質量分析法と組み合わせたガスクロマトグラフィーなどの検出技術を使用することが必要となる（非特許文献２）。しかしながら、これらの技術は非常に有効ではあるが、研究室でしか使用することができない。更に、それらは、時に非常に長い期間を必要とし、汚染事象中の迅速な介入の可能性を制限するという欠点を呈する。故に、これら毒物のリアルタイムでの現場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）モニタリングには、小型化、速度、低費用および使いやすさを組み合わせたセンサの開発が必要とされる。
【０００４】
異なる変換モードを有するセンサの主なカテゴリーは３つあり、光学センサ、圧電センサまたは電気化学センサが挙げられる。
−光学ソリューション（ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、概して非常に高感度であり、ノイズ／信号比（ｎｏｉｓｅ／ｓｉｇｎａｌ  ｒａｔｉｏ）が大きいために小型化するのが困難である（非特許文献３、４）。
−圧電手段は、液状媒体中で分析を行う場合に使用するには依然として問題が多い（非特許文献５）。
−電気化学センサは、それらに関する限り、ノイズ／信号比が小さいために感度の損失なく小型化が可能であるという利点を呈する。更に、製造コストが低い。しかしながら、複雑なマトリクスの場合、それらを分析し得るには、検体を認識するための特定部位を電気化学センサに導入してその検出および／または定量を向上させる必要があり、これに関連して、分子インプリント電気化学センサ（非特許文献６）およびイオンインプリント電気化学センサ（非特許文献７）が開発されている。
【０００５】
プリントセンサ（ｐｒｉｎｔｅｄ  ｓｅｎｓｏｒ）の原理は、分子インプリントポリマー（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ  ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ，ＭＩＰ）またはイオンインプリントポリマー（ｉｏｎ  ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ，ＩＩＰ）の使用をベースとしている。
【０００６】
インプリントポリマーは、標的分子または標的イオンの存在下で調製される三次元ポリマー網状体であり、架橋剤の存在下での標的（ｔａｒｇｅｔ）と機能性モノマーとの特異的な相互作用によりポリマー網状体がその周りに構築される。インプリント分子またはインプリントイオンの放出は、当該分子またはイオンに相補的な官能基を包含する空洞を生成する（図１）。従って、これらの物質は高い分子認識力またはイオン認識力を呈し、それらの活性は抗体型の生物学的受容体のそれを制限し（非特許文献８）、ＭＩＰまたはＩＩＰは抗体よりも安定で、容易かつ安価に製造でき、使用前に非常に長期間保存することができる（非特許文献９）。
【０００７】
分子またはイオンインプリント電気化学センサを調製するための２つの合成手段が想定される。
−第一手段では、架橋剤を含まない導電性ポリマー内にインプリントが生成される。導電性ポリマーは認識とトランスデューサ（ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）の２つの役割を有しており、認識の現象は測定可能な電気信号に変換される。この手段は多数の利点、とりわけ、使用しやすさ、電界生成フィルムの厚さ制御および所与の表面上に検出系を精密に被着させる可能性、を呈する（非特許文献１０）。にもかかわらず、それらの使用には電気化学的測定の適用が含まれ、その結果として、例えば、導電性ポリマー内での対イオンの進入／退去が起こり得る。特にポリマー網状体が架橋していない結果として、これらの測定は、インプリントに、そして最終的には、標的を特異的に追跡するセンサの能力に、有害な影響を及ぼす。
−第二手段では、ＭＩＰおよびトランスデューサは別個の要素である。この手段は、導電性ポリマーであり得る導電相（非特許文献１１）または炭素ペーストをベースとする電極（非特許文献１２）内に、事前に調製および架橋されたＭＩＰまたはＩＩＰ粒子を配合することからなる。この場合、インプリントを変性させる危険性は低下するが、標的を追跡したＭＩＰまたはＩＩＰと、電極の導電相との間の情報の伝達がより困難になるという不利な点がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ９８／８３／ＣＥ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  ３  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １９９８，Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ
【非特許文献２】Ｐ．Ｐｌａｚａ−Ｂｏｌａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｔｒｅｎｄｓ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ａ．，１２１７（２０１０），６３０３−６３２６
【非特許文献３】Ｘ．−Ａ．Ｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃ．，３６（２０１２），２２−２８
【非特許文献４】Ｐ．Ｔｕｒｋｅｗｉｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，７０，２０２５−２０３０
【非特許文献５】Ｃ．−Ｙ．Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，２００３，９，５１０７−５１１０
【非特許文献６】Ｖ．Ｓｕｒｙａｎａｒａｙａｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．，２２（２０１０），１７９５−１８１１
【非特許文献７】Ｔ．Ｐｒａｓａｄａ  Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，５７８（２００６），１０５−１１６
【非特許文献８】Ｋ．Ｈａｕｐｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１００  （２０００），２４９５−２５０４
【非特許文献９】Ｖ．Ｐｉｃｈｏｎ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ａ．，１１５２（２００７），４１−５３
【非特許文献１０】Ｔ．Ｌ．Ｐａｎａｓｙｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７１（１９９９），４６０９−４６１３
【非特許文献１１】Ｋ．Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，５４２（２００５），９０−９６
【非特許文献１２】Ｎ．Ｋｉｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｔ．，１２６（２００１），１９３６−１９４１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、この最新技術に関してまだ解決されていない技術的課題は、認識現象を測定可能な電気信号または電気化学信号として効果的に伝達することを可能にする架橋インプリントポリマーを開発することからなる。
【００１０】
本発明の技術的課題は、より特定的には、更なる伝達手段（電気化学、蛍光など）を使用する必要なく、認識現象を測定可能な電気信号または電気化学信号として直接伝達することにより標的を直接検出することを可能にすることによって、インプリントセンサの役割を満たすインプリントポリマーを開発することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らが提供する解決手段は、信号伝達手段としてレドックスプローブ（ｒｅｄｏｘ  ｐｒｏｂｅ）をその構造内に包含する新規なインプリントポリマーであり、本発明者らは、認識部位に近いレドックスプローブの存在がその検出感度を著しく改善することを観察した。本発明者らによって開発されたインプリントポリマーはまた、高い安定性と使用前の長い保存期間を呈する。更に、このポリマーは、経済的に有利なプロセスにより簡便に製造可能である。
【００１２】
本発明のインプリントポリマーはまた、標的が必ずしもレドックス特性を示さずとも、あらゆるタイプの標的と共に使用可能であるという利点を呈し、標的の検出はレドックスプローブを介して行われる。
【００１３】
よって、本発明は、標的の存在下で少なくとも１つの架橋剤と少なくとも１つのモノマーを重合することによって得られる非導電性インプリントポリマーであって、前記標的の形状を有する少なくとも１つの空洞をその構造内に呈し、かつ、重合可能な形態または重合可能でない形態のいずれかで提供される少なくとも１つのレドックスプローブをその構造内に含む、非導電性インプリントポリマーに関する。
【００１４】
本発明の意味において、レドックスプローブは、酸化および／または還元可能な化合物を意味するものと理解される。
【００１５】
好ましくは、レドックスプローブは、標的の形状を有する空洞に近接して位置している。「近接」は、レドックスプローブが、標的と相互作用して検出信号の形態で電気化学的応答を提供することができる最小距離を意味する。電気化学的応答を得ることにより、レドックスプローブを、標的の形状を有する空洞に近接してまたはその近辺にあるものとみなすことができる。換言すると、レドックスプローブは、本発明のインプリントポリマー内に位置しているので、標的と相互作用して検出信号の形態で電気化学的応答を提供することができる。有利には、レドックスプローブは、標的の形状を有する空洞内に位置し、この空洞の一部を形成する。
【００１６】
有利な実施形態によれば、本発明のインプリントポリマーは、ポリマー構造内に存在するレドックスプローブ以外の伝達手段（電気化学、蛍光など）を含まない。
【００１７】
本発明の意味において、標的は、空洞（インプリント）を形成するのに使用でき、かつ、後にこの空洞と特定の方法で相互作用し得る実体を意味するものと理解され、この標的は分子またはイオンのいずれかであることができる。よって、空洞は標的のための認識部位として作用する。よって、この空洞は、形状および／または官能性の点で標的と相補的である。従って、本発明のインプリントポリマーは、分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）またはイオンインプリントポリマー（ＩＩＰ）のいずれかであり得る。
【００１８】
標的が分子である場合、この分子は、多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）、ステロイド、活性成分、殺虫剤、除草剤、界面活性剤、食用色素（カロテノイド、リボフラビン、タルトラジンまたはアマランスなど）、染料（アゾ染料、ポリメチン染料またはフタロシアニンなど）または生物活性分子（ポリペプチド、タンパク質、酵素、ホルモンまたはサイトカインなど）から選択することができる。
【００１９】
標的がＰＡＨである場合、前記ＰＡＨは、アセナフテン、アセナフチレン、アントラセン、ベンズ［ａ］アントラセン、ベンゾ［ａ］ピレン、ベンゾ［ｅ］ピレン、ベンゾ［ｂ］フルオランテン、ベンゾ［ｅ］ピレン、ベンゾ［ｇ，ｈ，ｉ］ピレン、ベンゾ［ｊ］フルオランテン、ベンゾ［ｆ］フルオランテン、ベンゾ［ｋ］フルオランテン、クリセン、コロネン、コランヌレン（ｃｏｒａｎｎｕｌｅｎｅ）、シクロペンタ［ｃ，ｄ］ピレン、ジベンゾ［ａ，ｅ］ピレン、ジベンズ［ａ，ｃ］アントラセン、ジベンズ［ａ，ｈ］アントラセン、ジベンゾ［ａ，ｈ］ピレン、ジベンゾ［ａ，ｉ］ピレン、ジベンゾ［ａ，ｌ］ピレン、フルオランテン、フルオレン、インデノ［１，２，３−ｃｄ］ピレン、オバレン、ペンタセン、ペリレン、フェナントレン、ピレン、テトラセン、トリフェニレンまたはゼトレンであり得る。
【００２０】
標的が殺虫剤である場合、前記殺虫剤は、ダニ駆除剤、殺菌剤、殺鳥剤（ｃｏｒｖｉｃｉｄｅ）もしくはカラス忌避剤、防カビ剤、防虫剤、軟体動物駆除剤、殺線虫剤、殺寄生虫剤、殺鼠剤、または殺モグラ剤であり得る。
【００２１】
標的が除草剤である場合、前記除草剤は、シアン化カルシウム（Ｃａ（ＣＮ）２）、硫化鉄（ＦｅＳＯ４）もしくは塩素酸カルシウム（ＮａＣｌＯ３）から選択される無機除草剤、またはグリホセート、ジニトロアニリン（トルイジン、ベンフルラリン、ブトラリン、フルクロラリン、ニトラリン、オリザリン、ペンジメタリン、トリフルラリン）、置換尿素（クロロトルロン（ｃｈｌｏｒｏｔｏｌｕｒｏｎ）、クロロクスロン、シクルロン、ジウロン、エチジムロン、フェヌロン、イソプロチュロン、リヌロン、モノリヌロン、メタベンズチアズロン、メトブロムロン、メトクスロン、モヌロン、チアザフルロン、テブチウロン、チアザフルロン、シデュロン、ネブロン）、トリアジン（アトラジン、シアナジン、メトプロトリン（ｍｅｔｈｏｐｒｏｔｒｙｎｅ）、プロパジン、ターブチラジン、シマジン、シメトリン（ｓｉｍｅｔｒｙｎ）、セクブメトン、ターブメトン、アメトリン、デスメトリン、プロメトリン、ターブトリン）、イミダゾリノン（イマザメタベンズ、イマザピル）、スルホニル尿素（アミドスルフロン、アジムスルフロン、クロルスルフロンなど）、ジフェニルエーテル（アシフルオルフェン−ナトリウム、アクロニフェン、ビフェノックス、ボロモフェンオキシム、クロメトキシフェン、ジクロホップ−メチル、フルオロジフェン、ホメサフェン、ラクトフェン、ニトロフェン、オキシフルオルフェン）、合成植物ホルモン（２，４−Ｄ、２，４−ＭＣＰＡ、トリクロピル、ジクロルプロップ、ＭＣＰＰ（メコプロップ）、２，３，６−ＴＢＡ（２，３，６−トリクロロ安息香酸）、ジカンバ、ピクロラム、クロピラリド、フルレノ−ル）、ニトロ染料（ＤＮＢＰ（ジノセブ）、ＤＮＯＣ（ジニトロ−オルト−クレゾール）、ジノターブ）、ＰＣＰ（ペンタクロロフェノール）、カルバメート（アシュラム、バルバン、クロルブファム、クロルプロファム、プロファム、カルベタミド）、チオカルバメート（ブチレート、シクロエート、ジ−アレート（ｄｉ−ａｌｌａｔｅ）、トリアレート（ｔｒｉ−ａｌｌａｔｅ）、Ｓ−エチル−Ｎ，Ｎ−ジプロピルチオカルバメート、モリネート（ｍｏｌｉｎａｔｅ）、プロスルホカルブ、ベルノレート（ｖｅｒｎｏｌａｔｅ）、ペブレート（ｐｅｂｕｌａｔｅ）、チオベンカルブ（ｔｈｉｏｂｅｎｃａｒｂ））、ジチオカルバメート（ナトリウムメチルアミノメタンジチオエート、ナバム）、ビスカルバメート（デスメジファム、フェンメジファム、カルブチラート）、四級アンモニウム（ジコート（ｄｉｑｕａｔ）、パラコート、ジフェンゾコート）、ホップ／ジム（ｆｏｐ／ｄｉｍ）およびピノキサデン（アロキシジムナトリウム、クロジナホップ−プロパルギル（ｃｌｏｄｉｎａｆｏｐ−ｐｒｏｐａｒｇｙｌ））から選択される有機除草剤であり得る。
【００２２】
レドックスプローブが重合可能でない形態で提供される場合、レドックスプローブは、重合に関与することなく、出発混合物中に配合され得る。「捕捉（ｔｒａｐｐｉｎｇ）」について言及すると、この場合のレドックスプローブは、ポリマー網状体に共有結合していない。
【００２３】
レドックスプローブが重合可能な形態で提供される場合、レドックスプローブは少なくとも１つの重合可能部位を有し、本発明のモノマーはレドックスプローブであり得る。その場合、レドックスモノマー（レドックスプローブ）は三次元網状体の実際の構成に関与するモノマーの形態で導入される（図２）。
【００２４】
レドックス系が２つ以上の重合可能部位を呈する場合、架橋剤はレドックスプローブであり得る。その際、レドックスプローブは三次元網状体の実際の構成に関与するモノマーの形態で導入される（図２）。
【００２５】
その際、レドックスプローブは、
０個の重合部位を有する場合、重合可能でない形態で存在し、
１つの重合部位を有する場合、重合可能な形態で存在し、モノマーとして作用し、または、
少なくとも２つの重合部位を有する場合、重合可能な形態で存在し、架橋剤として作用する、
化学的実体であり得る。
【００２６】
レドックスプローブは、例えば、メタロセン（フェロセン、ルテノセンもしくはコバルトセン）、テトラチアフルバレンおよびその誘導体、またはアントラキノンおよびその誘導体から選択可能である。有利には、レドックスプローブは、例えば、メタロセン（フェロセンおよびコバルトセン）、またはテトラチアフルバレンおよびその誘導体から選択可能である。
【００２７】
有利な実施形態によれば、レドックスプローブは、好ましくは、三次元網状体の実際の構成に関与するレドックスモノマーである。前記レドックスモノマーは、好ましくは、重合可能部位を有するフェロセン型の少なくとも１つの官能基を担持するレドックスモノマーであり、前記重合可能部位は、好ましくはビニル、（メタ）アクリル酸またはアリル部位から選択される。本発明の重合可能部位は、有利にはビニルフェロセン（ＶＦｃ）である。
【００２８】
架橋剤は、好ましくは二（ｄｉ）官能基、三（ｔｒｉ）官能基または四（ｔｅｔｒａ）官能基から選択される（メタ）アクリル酸、ビニル、スチレンまたはアリルモノマーであるのが有利である。本発明の好ましい実施形態によれば、架橋剤は、アルキルジ−（ａｌｋｙｌ  ｄｉ−）、トリ（ｔｒｉ−）またはテトラ（ｔｅｔｒａ−）（メタ）アクリレート、アリルジ−、トリまたはテトラ（メタ）アクリレート、アリールジ−、トリまたはテトラ（メタ）アクリレート、アルキレングリコールジ−、トリまたはテトラ（メタ）アクリレート、およびより好ましくは、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート（ＥＤ（Ｍ）Ａ）、テトラメチレンジ（メタ）アクリレート、ビスフェノールＡジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ペンタエリトリトールトリアクリレート（ＰＥＴＲＡ）およびテトラアクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、３−（アクリロイルオキシ）−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、ジアリルジグリコールジカーボネート、ジアリルマレエート、ジアリルフマレート、ジアリルイタコネート、ジアリルスクシネート、ジアリルフタレート、トリアリルイソシアヌレート、トリアリルメラミン、ジビニルベンゼン、ジビニルオキサレート、ジビニルマロネート、ジビニルエーテル、ジビニルスルホン、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡ）およびそれらの混合物である。
【００２９】
本発明の意味において、
−アルキルは、少なくとも１つの炭素原子、好ましくは１〜３０の炭素原子を有する飽和した直鎖または分岐鎖脂肪族炭化水素基を意味するものと理解される。有利には、用語「アルキル」は、１〜１２の炭素原子、好ましくは１〜６の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖脂肪族炭化水素基を示す。用語「分岐鎖」は、少なくとも１つの低級アルキル基、例えばメチルまたはエチルが線状アルキル鎖によって担持されることを意味する。アルキル基として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチルおよびｎ−ペンチル基などが挙げられる。
−アリールは、少なくとも１つの芳香環に由来する官能基または置換基を意味するものと理解される。芳香環は、非局在化π系を含む平坦な単環または多環基に相当し、ここで当該環の各原子はｐ軌道を含み、ｐ軌道は互いに重なり合っている。
【００３０】
標的がイオンである場合、前記イオンは、好ましくは以下の元素のうちの１つのイオンであり、Ｎｉ（ニッケル）、Ｐｂ（鉛）、Ｃｕ（銅）、Ｃｄ（カドミウム）、Ｃｏ（コバルト）、Ｚｎ（亜鉛）、Ｆｅ（鉄）、Ａｇ（銀）、Ｈｇ（水銀）、Ａｓ（ヒ素）、Ｐｄ（パラジウム）、Ｍｎ（マンガン）、Ｒｈ（ロジウム）、Ａｌ（アルミニウム）、Ｓｍ（サマリウム）、Ｚｒ（ジルコニウム）、Ｔｈ（トリウム）、Ｎｄ（ネオジム）、Ｅｕ（ユウロピウム）、Ｄｙ（ジスプロシウム）、Ｃｒ（クロム）、Ｉ（ヨウ素）、Ｙｔ（イットリウム）、Ｔｌ（タリウム）またはＰｔ（白金）が挙げられる。
【００３１】
標的がイオンである場合、本発明のインプリントポリマーは、重合可能な形態または重合可能でない形態のいずれかで提供される少なくとも１つのリガンドもその構造内に含むことができる。
【００３２】
リガンドが重合可能でない形態で提供される場合、以下の化合物から選択可能であり、４−ビニルピリジン、２−ビニルピリジン、１−ビニルイミダゾール、アクリルアミド、（メタ）クリル酸、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、２−（ジエチルアミノ）メチルメタクリレート、スチレン、１，４−ジヒドロキシアントラキノン、ジチゾン、ジメチルグリオキシム、５−ドデシルサリチルアルドキシム、８−ヒドロキシキノリン、８−アミノキノリン、８−メルカプトキノリン、アセチルアセトン、アセトアルデヒドチオセミカルバゾン、ベンズアルデヒドチオセミカルバゾン、バニリンベンジジン、１，５−ジフェニルカルバゾン、アンモニウムピロリジンジチオカルバメート、Ｎ，Ｎ’−ジエチルチオ尿素、５，７−ジクロロキノリン−８−オール、４−（２−ピリジルアゾ）レゾルシノール、４−（２−チアゾリルアゾ）レゾルシノール、１−（２−ピラジルアゾ）−２−ナフトール、１−（２−チアゾリルアゾ）−２−ナフトール、サレン、８−ヒドロキシキノリン−５−スルホン酸、ピロリジン−１−ジチオカルボン酸、１−（２−チアゾリルアゾ）−２−ナフトール、３，４−ジヒドロキシ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンスルホン酸（アリザリンレッドＳ）のナトリウム塩、２−エチルヘキシルベンズイミダゾリルスルフィド、オクチルベンゾチアゾリルスルフィド、ヂアゾアミノベンゼン、キナルジン酸、６−［（ヒドロキシアミノ）メチリデン］シクロヘキサ−２，４−ジエン−１−オン（サリチルアルドキシム）、５−（４−カルボキシフェニルアゾ）−８−ヒドロキシキノリン、ホルムアミドオキシムまたはネオクプロインが挙げられる。
【００３３】
リガンドが重合可能な形態で提供される場合、以下の化合物から選択可能であり、Ｎ−（４−ビニルベンジル）イミノ二酢酸、１−ヒドロキシ−４−（プロップ−２’−エニロキシ）−９．１０−アントラキノン、１−ヒドロキシ−２−（プロップ−２’−エニル）−９，１０−アントラキノン、５−ビニル−８−ヒドロキシキノリン、Ｎ−（６，７，９，１０，１２，１３，１５，１６−オクタヒドロ−５，８，１１，１４，１７−ペンタオキサベンゾシクロペンタデセン−２−イル）アクリルアミド（ベンゾ−１５−クラウン−５−アクリルアミド）、４−［（Ｅ）−２−（４’−メチル−２，２’−ビピリジン−４−イル）ビニル］フェニルメタクリレート、４−ビニルフェニルアゾ−２−ナフトール、Ｎ−メタクリロイル−Ｌ−ヒスチジン、Ｎ−メタクリロイル−Ｌ−システイン、Ｎ−メタクリロイル−Ｌ−システインメチルエステル、Ｎ−メタクリロイル−（Ｌ）−グルタミン酸、Ｎ−メタクリロイル−２−メルカプトエチルアミン、６−（４−ビニルフェニルカルバモイル）ピリジン−２−カルボン酸、ピリジン−２，６−ジカルボン酸ビス（４−ビニルフェニル）アミド、サレンまたは（４−エテニルフェニル）−４−ホルメート−６−フェニル−２，２’−ビピリジンが挙げられる。
【００３４】
好ましい実施形態によれば、本発明のインプリントポリマーは、０．６μｍから６μｍまでの間で様々であり得るサイズの架橋微粒子の形態で提供される。
【００３５】
本発明の別の主題は、インプリントポリマーの調製方法であって、
（ｉ）標的および重合可能な形態または重合可能でない形態のいずれかで提供されるレドックスプローブの存在下で架橋剤とモノマーを重合する工程であって、前記レドックスプローブが重合可能な形態で存在するときには前記モノマーが前記レドックスプローブであることができ、レドックスプローブが２つ以上の重合可能部位を呈するときには前記架橋剤が前記レドックスプローブであることができる、工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）の終わりに得られたポリマー内に存在する該標的を除去する工程と
を含む方法である。
【００３６】
有利な実施形態によれば、重合工程は、ラジカル重合、重縮合またはゾルーゲル手段によって行われる。重合工程はまた、イオン重合によって行われる。次のような重合技術、バルク、懸濁、分散、乳化および沈殿重合を使用することができる。好ましくは、溶媒の蒸留が重合反応と同時に生じる蒸留−沈殿重合を使用することができる。
【００３７】
蒸留−沈殿重合の場合、工程（ｉ）は、アセトニトリル、トルエン、アセトン、エタノール、メタノール、ｎ−ヘキサン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、エチルメチル、シクロヘキサン、２−メトキシエタノール、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、ジクロロメタン、シクロヘキサノール、ベンジルアルコールまたは酢酸エチルから選択される溶媒中で行われる。
【００３８】
溶媒は、ポリマー粒子のサイズおよびそれらの多孔率を調整することを可能にする。好ましい実施形態によれば、本発明の溶媒は、極性溶媒または極性溶媒／非極性溶媒混合物（９５／５〜７０／３０の比）である。好ましくは、本発明の溶媒は、アセトニトリルまたはアセトニトリル／トルエン混合物（任意には９５／５〜８０／２０の割合であり、好ましくは８０／２０の比である）である。
【００３９】
有利には、工程（ｉ）は、反応媒体を６０℃〜１００℃の第一温度で加熱し、次いで、好ましくは１００℃〜１５０℃の温度でそれを還流に付して蒸留を行うことによる蒸留−沈殿重合によって行われる。
【００４０】
重合段階は、熱またはＵＶラジカル開始剤の存在下で行うことができる。熱またはＵＶ開始剤の例としては、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、ベンゾイルペルオキシド、アセチルペルオキシド、ラウロイルペルオキシド、アゾビスイソブチロニトリル、ｔ−ブチルペルアセテート、クミルペルオキシド、ｔ−ブチルペルオキシド、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド、２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン、フェノチアジン、１，１’−アゾビス（シクロヘキサンカーボニトリル）、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）ジヒドロクロリド、２，２’−（２−メチルプロピオニトリル）、過硫酸カリウムまたはＨ２Ｏ２／ＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレンジアミン）混合物および好ましくはアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）が挙げられる。
【００４１】
有利な実施形態によれば、標的を除去する工程（ｉｉ）は、ジクロロメタン、アセトン、イソプロパノール、メタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、クロロホルム、トルエン、エタノール、２−メトキシエタノール、１，２−ジクロロエタン、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含む酸性溶液（ＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、ＨＮＯ３）または塩基性溶液（ＮａＯＨ、ＫＯＨ）、またはそれらの混合物から選択される洗浄溶液を用いて、工程（ｉ）の終わりに得られたポリマーを洗浄することによって行われる。洗浄は、１〜４８時間、好ましくは２４時間の期間行うことができ、２〜４回、好ましくは３回反復することができる。
【００４２】
好ましくは、工程（ｉｉ）は、撹拌しながら行われる。
【００４３】
標的の検出方法は、本発明の一部を形成し、
（ｉ’）標的を含むサンプルを本発明に従って規定されるようなインプリントポリマーと接触させる工程と、
（ｉｉ’）好ましくは電気的測定（導電性、インピーダンス）によってまたは電気化学的方法（クロノポテンショメトリ（ｃｈｒｏｎｏｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｙ）、クロノアンペロメトリもしくはボルタンメトリ（ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ））によって、該標的を検出する工程と
を少なくとも含む。
【００４４】
インプリントポリマーの構造内に存在する空洞は、標的のためのハウジングとして機能し、より一般的には（標的の）認識部位と称され、レドックスプローブは、標的と相互作用して検出信号の形態で電気化学的応答を提供することができるように配置される。レドックスプローブは、典型的には、前記空洞に近接して、またはその内部に位置し、それにより標的の検出を可能にする。
【００４５】
本発明のインプリントポリマーは、（生物）医学、食品加工および環境分野における検出、固相抽出、分子、精製および分子やイオンの放出制御に用途を有する。
【００４６】
本発明のインプリントポリマーは、特に、
センサとして、好ましくはインプリントセンサとして、より具体的には分子および／またはイオンの検出分野におけるセンサ内の認識領域として、
（バイオ）センサを製造するための活性インターフェースとして、
分子およびイオンの固相抽出用カラムを製造するための固相抽出支持体として、
クロマトグラフィーのために、
疑似免疫測定（ｐｓｅｕｄｏ−ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）のために、
人工抗体を製造するために、
エナンチオマーを分離するために、
有機合成のために、
触媒作用のために、
使用可能である。
【００４７】
特に好ましい実施形態によれば、本発明のインプリントポリマーは、センサとして、およびより具体的にはセンサ内の認識領域として使用される。その際、使用される用語は、インプリントセンサである。
【００４８】
別の主題は、本発明に従って規定されるような少なくとも１つのインプリントポリマーを包含する装置であって、電気化学的（バイオ）センサまたは抽出カラムである装置である。
【００４９】
先の規定に加え、本発明はまた、本発明のインプリントポリマーを製造するための方法の非限定例について、このようなポリマーの評価について、および添付の図面について言及する以下の詳細な説明から生じる他の規定も含む。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ＭＩＰを調製するための原理の概略図である。
【図２】ＭＩＰ内へのレドックスプローブの導入を示す。
【図３】ポリＥＤＭＡ、フェロセン、ＭＩＰ６およびＮＩＰ６のＦＴＩＲスペクトルを示す。
【図４】ＭＩＰ５およびＮＩＰ５ポリマー粒子のＳＥＭ画像を示す。
【図５】ＭＩＰ６およびＮＩＰ６ポリマー粒子のＳＥＭ画像を示す。
【図６】トルエン中での、本発明のＭＩＰ５ポリマーおよび対応する非インプリントポリマーＮＩＰ５の吸着等温線を示す。
【図７】水／アセトニトリル（９９／１、ｖ／ｖ）混合物中での、本発明のＭＩＰ５ポリマーおよび対応するＮＩＰ５ポリマーの吸着等温線を示す。
【図８】ＢａＰ標的添加前後に、ＮＩＰ５ポリマーを用いた示差パルスボルタンメトリ（ＤＰＶ）において観察された信号を示す。
【図９】ＢａＰ標的添加前後に、ＭＩＰ５ポリマーを用いた示差パルスボルタンメトリ（ＤＰＶ）において観察された信号を示す。
【図１０】ＭＩＰ６ポリマーへのＢａＰの吸着動態を時間の関数として示す。
【図１１】様々なポリマーの吸着能力（Ｑ）をＢａＰ溶液の初期濃度の関数として示す。
【図１２】接触から４時間後の、ＢａＰの不在下（上の曲線）および存在下（下の曲線）でのＮＩＰ６のＳＷＶボルタモグラムを示す。
【図１３】接触から４時間後の、ＢａＰの不在下（上の曲線）および存在下（底部曲線）でのＭＩＰ６のＳＷＶボルタモグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
液状媒体中での、多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）、ベンゾ［ａ］ピレン（ＢａＰ）のファミリーから選択される標的の検出に関する応用例に関連して、本発明を以下に説明する。しかしながら、本発明は、レドックスプローブが標的と反応して検出信号を与え得るものであれば、標的（分子またはイオン）の性質および／または媒体の性質がいかなるものであっても、より一般的に適用される。
【００５２】
［Ｉ．  インプリントポリマーの調製］
本発明の分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）は、多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）、ベンゾ［ａ］ピレン（ＢａＰ）のファミリーから選択される標的の存在下、ビニルフェロセン（ＶＦｃ）（レドックスモノマー）とエチレングリコールジメタクリレート（ＥＤＭＡ）（架橋剤）から調製される（スキーム１）。
【００５３】
［スキーム１：本発明のインプリントポリマーの合成］
【化１】
2016501958.tif 000003
【００５４】
［Ｉ−１．  インプリントポリマーの合成方法］
本発明のインプリントポリマーは、蒸留−沈殿重合によって調製される（Ｆ．Ｂａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００４，Ｖｏｌ．３７，９７４６−９７５２）。
【００５５】
装置は、１００ｍＬ丸底フラスコ、ディーン・スターク装置（合成用に使用する溶媒と同じものまたは溶媒混合物を充填）および還流冷却器からなる。ビニルフェロセン（ＶＦｃ）、エチレングリコールジメタクリレート（ＥＤＭＡ）、および、標的であるベンゾ［ａ］ピレン（ＢａＰ）を、マグネティックスターラを備えた丸底フラスコに導入する。
【００５６】
その後、溶媒を添加し（異なる溶媒混合物を試験した。表１参照）、丸底フラスコを超音波に供して固体を溶解する。
【００５７】
１００μＬの溶液を可視紫外分光分析（ＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）のために取り出す（導入された正確な量を定量）。溶液を１０分間ガス抜きする。
【００５８】
開始剤アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を溶液に加え、次いで溶媒を５分間ガス抜きする。
【００５９】
１００ｒｐｍの速度で撹拌を一定に保ちつつ、溶液を８０℃の温度で３０分間加熱し、次いで、温度をおよそ１１５℃まで上げる。蒸留をこの温度で３０分間行い、ディーン・スターク装置を空にし、合成溶媒の容量の半分に等しい量を留去する。
【００６０】
【表１】
2016501958.tif 000004
【００６１】
その後、本発明のインプリントポリマーを洗浄して、重合中にインプリント調製に使用した標的を取り除く。
【００６２】
ＢａＰ標的の放出は、１０ｍＬのジクロロメタンとポリマーを撹拌しながら２４時間接触させることによって行う。この操作を３回反復（２４時間を３サイクル）すると、効率は９３％である。
【００６３】
並行して、非インプリントポリマー（ＮＩＰ）を、標的の存在を除き本発明のＭＩＰと同条件下で調製した。結果として、これらのポリマーは標的の形状を有する空洞を有していない。
【００６４】
［Ｉ−２．  インプリントポリマーの特性決定］
［（１）．  赤外線分析］
分子インプリントポリマーＭＩＰ６および非インプリントポリマーＮＩＰ６を赤外線（Ｎｅｘｕｓ−ＴｈｅｒｍｏＮｉｃｏｌｅｔ装置）で特性決定する。サンプルをＫＢｒペレットの形態で調製する。ＭＩＰ６およびＮＩＰ６のＦＴＩＲスペクトルをポリＥＤＭＡおよびフェロセンのＦＴＩＲスペクトルと比較することにより、ＥＤＭＡをベースとするポリマーマトリクス中にＶＦｃレドックスプローブが正しく配合されたことを実証することができる。ＥＤＭＡおよびフェロセンのピーク特性はＭＩＰ６およびＮＩＰ６の両方にみられる（図３）。
【００６５】
［（２）．  走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）による分析］
ＭＩＰ５／ＮＩＰ５およびＭＩＰ６／ＮＩＰ６ポリマーの粒子を走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）（Ｇｅｍｉｎｉ（登録商標）Ｓｕｐｒａ  ４０ＶＰ装置）によって観察する。図４は、左側にＭＩＰ５ポリマー粒子（平均サイズ：２．４５μｍ；変動係数：２５％）を、右側にＮＩＰ５ポリマー粒子（平均サイズ：１．７μｍ；変動係数：３９％）を示す。図５は、左側にＭＩＰ６ポリマー粒子（平均サイズ：１．５μｍ；変動係数：２６％）を、右側にＮＩＰ６ポリマー粒子（平均サイズ：１．８μｍ；変動係数：４５％）を示す。変動係数（ＣＶ）は、粒子サイズ分布に関する情報を与えるものであり、
すなわち、
ＣＶ（％）＝（標準偏差×１００）／平均サイズ（１００個を超える粒子）
である。
【００６６】
ＭＩＰポリマー粒子の方がＮＩＰポリマーよりもより球状かつ均質である。よって、ＢａＰ標的は、媒体の溶解度パラメータに作用することによってポリマー鎖の沈殿を促進する。非極性溶媒（トルエン）の量の増加もまた、粒子表面の形態を改変する。
【００６７】
［ＩＩ．  インプリントポリマーの特性評価］
［ＩＩ−１．  ＭＩＰの吸着特性：吸着等温線］
原理：
インプリントポリマーの標的分子（ＢａＰ）に関する吸着能力は、吸着等温線によって評価される。この方法は、既知量のポリマーを、標的分子を含む溶液と接触させ、ポリマーにより吸着される量を測定することからなる。吸着能力（結合能力、Ｑと表す）は、ポリマーにより吸着される標的分子の最大量（標的のｍｇ（ミリグラム）／ポリマー樹脂のｇ（グラム）、または標的のμ（マイクロ）ｍｏｌ（モル）／ポリマー樹脂のｇ（グラム）で表す）である。この値は、インプリント効果を決定するべく非インプリントポリマーに関して得られる値と比較されるものである。
【００６８】
インプリント係数（ｉｍｐｒｉｎｔ  ｆａｃｔｏｒ）は、非インプリントポリマーの最大吸着能力に対するインプリントポリマーの最大吸着能力の比である。
【００６９】
実験部分：
１０ｍｇのポリマーを３０ｍＬのガラスフラスコに導入する。その後、０．１ｍｇ．Ｌ−１から２０．０ｍｇ．Ｌ−１までの間で様々である濃度を有する１０ｍＬのＢａＰ溶液を加える。接触操作を２４時間２００ｒｐｍの速度でオービタルスターラを用いて行う。上澄みを０．４５μｍＰＴＦＥフィルターでろ過し、ＵＶ可視分光法によって分析して、ポリマーにより吸着されるＢａＰ量を測定する。吸着量／ポリマーのｇ（グラム）を平衡濃度（上澄みの濃度）の関数としてプロットする。
【００７０】
結果：
［（１）．  トルエン中での吸着（Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）等温線（図６）］
合成されたＭＩＰ５ポリマーおよび対応するＮＩＰ５ポリマーのトルエン中での吸着等温曲線を図６に示す。図中、Ｃｅは平衡でのＢａＰ濃度を表す。
【００７１】
以下の事項が明白である。
（一）  吸着能力は低ＢａＰ濃度で大幅に増大し、平衡濃度がＢａＰのおよそ５ｍｇ．Ｌ−１に達するとその最大値に到達すること。
（二）  ＭＩＰ５ポリマーの最大吸着能力は０．３１±０．０１ｍｇ．Ｌ−１であり、ＮＩＰ５ポリマーの最大吸着能力は０．０８±０．１ｍｇ．Ｌ−１であり、よって、本発明のインプリントポリマーは非インプリントポリマーよりも吸着能力が高いこと。
（三）  ＭＩＰ５／ＮＩＰ５インプリント係数は３．９であり、よってＭＩＰ５ポリマーはＮＩＰ５ポリマーよりも３．９倍多くＢａＰを吸着すること。
【００７２】
［（２）．  ９９／１（ｖ／ｖ）水／アセトニトリル混合物中での吸着等温線（図７）］
本発明のインプリントポリマーの性能を、適用媒体と同様の媒体、すなわち水中で評価した。ＢａＰはそれほど水に可溶性ではないため、試験は９９／１（ｖ／ｖ）水／アセトニトリル混合物中で行う。
【００７３】
結果を図７に示す。図中、Ｃｅは平衡でのＢａＰ濃度を表す。
【００７４】
本発明のＭＩＰ５ポリマーに関し、吸着は、低ＢａＰ濃度で非常に迅速に増大し、およそ１ｍｇ．Ｌ−１の濃度でプラトーに達する。最大能力は６．５ｍｇ．Ｌ−１である。ＮＩＰ５ポリマーの場合、プラトーには３ｍｇ．Ｌ−１で到達し、能力は３．２ｍｇ．Ｌ−１である。よって、インプリント係数は２．０５である。
【００７５】
水性媒体中での最大吸着能力は、結果として、有機媒体中の吸着能力よりも２０倍大きい。
【００７６】
［ＩＩ−２．  従来技術に記載されるインプリントポリマーと本発明のインプリントポリマーとの性能比較］
文献に提示された結果と本発明のＭＩＰ５ポリマーによって得られた結果を以下の表２において比較する。
【００７７】
標的を定量するための技術、実験が行われる媒体、使用するモノマーおよび重合手段の関数としての、吸着能力（Ｑ）及びインプリント係数値を表２において比較する。
【００７８】
【表２】
2016501958.tif 000005
【００７９】
本発明のＭＩＰ５ポリマーのインプリント効果は、文献に報告されるものと同じ程度である。よって、レドックスモノマーの存在はＭＩＰ粒子の特異的認識を妨げるものではない。
【００８０】
［ＩＩ−３．  電気化学特性］
［（１）．  示差パルスボルタンメトリ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐｕｌｓｅ  ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ，ＤＰＶ）による電気化学的試験］
原理：
示差パルスボルタンメトリ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐｕｌｓｅ  ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ，ＤＰＶ）において、低振幅の線状電位勾配を、典型的には５０ｍｓ（ミリ秒）の短期間、毎１５０〜２００ｍｓ印加する。各パルスの印加直前および短期間（１０〜２０ｍｓ）の各パルスの直後に電流を測定する。記録された信号は、電位Ｅの関数としての、これら２つの測定間の電流差であり、結果として、ピークの出現を有する微分曲線が得られる。この技術により、ファラデー電流／容量性電流比が増大し得、故に感度が増大し得る。
【００８１】
獲得パラメータ
初期電位      −０．１００Ｖ
頂点電位      ０．０００Ｖ
最終電位      １．０００Ｖ
パルス振幅    ０．０５Ｖ
パルス期間    ５０ｍｓ
高さ          １ｍＶ
期間          １００ｍｓ
走査速度      ０．０１ｍＶ／秒
点の数        およそ２１００
【００８２】
［（２）．  作用電極の調製］
炭素ペーストを、ＭＩＰ５ポリマーまたはＮＩＰ５ポリマーと、４：１の重量比で混合する。混合物を少量の溶媒（ジクロロメタン）で均質化する。混合物がかなり流動性である場合、中空の作用電極（メトローム電極）内に入れ、真空で乾燥させる。余剰分を、電極表面を研磨することによって取り除く。
【００８３】
［（３）．  測定に使用する電極］
作用電極    表面積０．０７０ｃｍ２の固体電極（炭素ペースト＋ポリマー比４／１ｗ／ｗ電極）
参照電極    飽和塩化第一水銀電極（ＫＣｌ：０．２４２Ｖ）
対電極      白金電極（直径１ｃｍ）
【００８４】
［（４）．  実施する実験］
炭素ペースト／ＭＩＰ５ポリマー（またはＮＩＰ５ポリマー）混合物を含む電極を、５ｍＬの電界液（アセトニトリル中０．１ｍｇ．Ｌ−１のテトラブチルアンモニウムヘキサフルオロホスフェート）を含有する電気化学セル内に置く。フェロセンのレドックス信号を、両タイプの作用電極（ＭＩＰ５ポリマーおよびＮＩＰ５ポリマー）について、およそ０．４３Ｖで観察する（図８および図９）。この信号の安定化を得るには、４時間３０分という正常な期間が必要である（作用電極と溶液との平衡のための時間）。４時間３０分後、ＢａＰ標的を溶液に直接加え、次いで規則的な間隔で測定を行う。
【００８５】
［（４）−１．  炭素ペースト／ＮＩＰ５ポリマー電極（図８）］
「ＮＩＰのみ」は、４時間３０分の安定化後の炭素ペースト中のＮＩＰ５ポリマーのボルタモグラムを表す。
「添加直後ＮＩＰ＋ＢａＰ」は、ＢａＰ標的添加直後に記録されたボルタモグラムを表す。
「０．５時間後ＮＩＰ＋ＢａＰ」は、ＢａＰ標的添加から３０分後に記録されたボルタモグラムを表す。
【００８６】
第一曲線は、ＢａＰ標的添加からおよそ３０秒後に記録され（添加直後ＮＩＰ＋ＢａＰ曲線）、その後８時間まで規則的な間隔で記録される（３０分後に記録された０．５時間後ＮＩＰ＋ＢａＰ曲線）。ＮＩＰポリマーとＢａＰ標的を一緒にした際のＮＩＰポリマー中のフェロセンのボルタモグラムの外観の変更はみられない。
【００８７】
［（４）−２．  炭素ペースト／ＭＩＰ５ポリマー電極（図９）］
炭素ペーストと混合したＭＩＰ５ポリマーを電極中に導入することによって同じ実験を行う。フェロセンのレドックス信号はおよそ０．４３Ｖで観察される。
【００８８】
「ＭＩＰ５のみ」曲線は、４時間３０分の安定化後の、炭素ペースト中のＭＩＰ５ポリマーのボルタモグラムを表す。
【００８９】
「添加直後ＭＩＰ＋ＢａＰ」曲線は、ＢａＰ標的添加直後に記録されたボルタモグラムを表す。
【００９０】
「１．５時間後ＭＩＰ＋ＢａＰ」曲線から「８時間後ＭＩＰ＋ＢａＰ」曲線までは、規則的な間隔で記録されたボルタモグラムを表す。
【００９１】
ＢａＰの存在下での電気化学的応答の即座の変動が観察され、これは３０秒から生じる。ＢａＰ標的添加後のＭＩＰ５およびＮＩＰ５ポリマー間に見られるボルタモグラムの変動は、ＢａＰ標的添加前後に電極、接続またはポテンショスタットに関する干渉がなく、実験が同じプロトコールに従って行われる限り、インプリント効果に関連するものである。
【００９２】
［ＩＩ−４．  ＨＰＬＣ−ＵＶによるＭＩＰ５／ＮＩＰ５およびＭＩＰ６／ＮＩＰ６ポリマーの特性についての比較試験］
２つの特性、干渉分子の存在下での標的分子の吸着および感度を比較する。
【００９３】
［（１）．  吸着特性］
吸着は、既知量のポリマーと既知濃度の標的の溶液とを接触させることによって行われる（吸着試験の場合にはＢａＰのみ、感度試験の場合にはＢａＰ＋別のＰＡＨ）。混合物を２５０ｒｐｍの速度でオービタルスターラにより撹拌する。５時間の接触時間の後、上澄みをＨＰＬＣ−ＵＶによって分析して、残存する各実体の量と吸着量を測定する。本試験で使用される８種のＰＡＨをスキーム２に示す。
【００９４】
［スキーム２  感度試験で使用するＰＡＨ］
【化２】
2016501958.tif 000006
【００９５】
ＢａＰのみが存在する場合には定組成溶離（１００％アセトニトリル、分析時間：１５分）を使用する。選択性試験に使用される溶離勾配は、分析時間を１時間として表３に提示される。
【００９６】
【表３】
2016501958.tif 000007
【００９７】
［（２）．  ＨＰＬＣ−ＵＶ分析条件］
カラム        Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ（登録商標）ＰＡＨ（５μｍ）（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）
検出器        Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｌ−２４５５  ＤＡＤ
オーブン温度  ３０℃
射出容量      ５０μＬ
流速          ０．５ｍｌ／分
【００９８】
８種のＰＡＨを９９／１（ｖ／ｖ）水／アセトニトリル混合物に導入する。
【００９９】
［（３）．  吸着動態］
ＭＩＰ６ポリマーを、１．２５ｍｇ．Ｌ−１（すなわち、５μｍｏｌ．Ｌ−１）に等しい濃度のＢａＰ溶液と接触させる。接触時間の間、上澄みを分析する。およそ４時間（参照時間）の接触時間の後、吸着は最大かつ一定である（図１０）。
【０１００】
［（４）．  吸着等温線］
ＢａＰ濃度の関数としての吸着の増大、次いでプラトー（ｐｌａｔｅａｕ）が観察され、このプラトーは吸着能力（Ｑ）に相当する（図１１）。インプリント係数（非インプリントポリマーの吸着能力に対するインプリントポリマーの吸着能力の比）も測定する。ＭＩＰ５、ＭＩＰ６、ＮＩＰ５およびＮＩＰ６ポリマーに関して得られる結果を表４に要約する。
【０１０１】
【表４】
2016501958.tif 000008
【０１０２】
従来技術から知られている吸着能力（Ｑ）の値は５．８μｇ．ｇ−１〜７ｍｇ．ｇ−１である（Ｒ．Ｊ．Ｋｒｕｐａｄａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ，２００７，Ｖｏｌ．２６，ｐｐ４４４−４５１；Ｆ．Ｌ．Ｄｉｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，Ｖｏｌ．７１，ｐｐ４５５９−４５６３；Ｌ．Ｈ．Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｐａｒｔ．Ａ，２０１０，Ｖｏｌ．４５，ｐｐ２１１−２２３；Ｊ．Ｐ．Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，２００４，Ｖｏｌ．５２２，Ｎｏ．２，１３７−１４４；Ｒ．Ｊ．Ｋｒｕｐａｄａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗａｔｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，Ｖｏｌ．４４，Ｎｏ．３，６８１−６８８）。吸着能力の比較は、本発明のＭＩＰが良好なＢａＰ認識特性を呈することを示す。
【０１０３】
［（５）．  吸着等温線のモデル］
上記で生成された等温線をモデル化して吸着現象を解釈することができる（Ｅ．Ｃｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＮｏｎＣｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  Ｓｏｌｉｄｓ，２００７，Ｖｏｌ．３５３，Ｎｏ．８−１０，ｐｐ９７４−９８０；Ｇ．Ｌｉｍｏｕｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．２，ｐｐ２４９−２７５）。均一な吸着の場合、吸着パラメータを直接評価することができる。均一でない吸着の場合、評価は、低濃度での高アフィニティの吸着の寄与と高濃度での低アフィニティの吸着の寄与とを一般化することに基づく。最初の工程では、２つのモデル、単純なラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）およびフロイントリッヒ（Ｆｒｅｕｎｄｌｉｃｈ）、を試験する。
【０１０４】
［（５）−１．  単純なラングミュアモデル］
このモデルは以下の５つの仮定に基づく。
仮定１：  吸着能力が最大値（Ｑｍａｘ）を有し得ること。
仮定２：  全ての部位が等価であること。
仮定３：  各部位が１つの分子だけに占有されること。
仮定４：  エネルギーと立体障害が吸着量に依存しないこと。
仮定５：  表面活性係数が１に等しい（均一な吸着である）こと。
【０１０５】
線形化の後、Ｑ＝吸着量（または吸着能力）およびＣ＝遊離量（または平衡濃度）であることを考慮すると、次式が成り立つ。ここで、Ｋ０＝吸着アフィニティ係数、Ｑｅ＝平衡吸着能力である。
【数１】
2016501958.tif 000009
【０１０６】
［（５）−２．  フロイントリッヒモデル］
このモデルは、不均一な表面上での非理想的多層吸着に関する経験的関数、すなわち、
【数２】
2016501958.tif 000010
【数３】
2016501958.tif 000011
に基づくものであり、ここで、ａ＝フロイントリッヒ吸着係数、ｍ＝不均一性指数（０＜ｍ＜１）である。
【０１０７】
２つのモデルを得られた実験値に適用した後、相関係数および平衡定数を決定し、表５に要約する。
【０１０８】
【表５】
2016501958.tif 000012
【０１０９】
ＭＩＰ５を除き、ポリマーはラングミュアモデルに近い吸着挙動を呈する。しかしながら、Ｑｅ値は実験値から離れており、よって、より良好に実験値にアプローチするには（より良好な相関係数を得るには）他のモデル（例えば、ラングミュア−フロイントリッヒ）を適用する必要がある。
【０１１０】
［（６）．  選択性］
およそ０．４５μｍｏｌ．Ｌ−１の各実体の濃度でＢａＰおよび他のＰＡＨを含む溶液とポリマーを接触させることによって、選択性の測定を行い、吸着能力を測定する。
【０１１１】
各実体に関する吸着結果から様々な係数を測定する。結果を表６および表７に要約する。
【０１１２】
分布係数（Ｋｄ）は、平衡濃度での吸着能力の、この平衡濃度（Ｃｅ）に対する比である。
【数４】
2016501958.tif 000013
【０１１３】
選択性係数（ｋ）は、干渉分子の分布係数に対する標的の分布係数の比である。
【数５】
2016501958.tif 000014
【０１１４】
相対選択性係数ｋ’は、ＮＩＰのｋに対するＭＩＰのｋの比である：
【数６】
2016501958.tif 000015
【０１１５】
【表６】
2016501958.tif 000016
【０１１６】
【表７】
2016501958.tif 000017
【０１１７】
一般的に、インプリント係数は１より大きい。これは、ＭＩＰがＰＡＨに関してより良好な吸着能力を有していることを示す。対選択性係数（ｋ’）は１に近い。
【０１１８】
［（７）．  電気化学特性］
インプリントポリマーの電気化学特性を評価するために、ＭＩＰ６およびＮＩＰ６ポリマーの粒子を導電性マトリクス（炭素ペースト）と混合し、次いでこの混合物を直径５ｍｍの中空作用電極内に載置する。使用する技術は矩形波ボルタンメトリ（ｓｑｕａｒｅ  ｗａｖｅ  ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ，ＳＷＶ）である。
【０１１９】
まず初めに、電極を真空下で乾燥し、次いで有機媒体（０．１Ｍ  テトラブチルアンモニウムヘキサフルオロホスフェート、またはＴＢＡＰＦ６／アセトニトリル）中で分析を行う。信号が安定するまで、ボルタモグラムを２時間規則的に記録し、次にＢａＰ溶液を加えてポリマーを飽和させる。記録は２２時間行う。マグネティックバーで溶液を撹拌し続ける。各測定の１分３０秒前に撹拌を一時停止する。ＭＩＰ６およびＮＩＰ６ポリマーに関して得られる結果を図１２および図１３に提示する。
【０１２０】
［（８）．  機器］
ポテンショスタット：  ポテンショスタット／ガルバノスタットモデル２７３Ａ（ＥＧ＆Ｇ  Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）
【０１２１】
［（９）．  実験パラメータ］
３０秒間０．０００Ｖで平衡
初期電位      ０．０００Ｖ
頂点電位      １．０００Ｖ
パルス振幅    ０．１５Ｖ
パルス期間    ５０ｍｓ
高さ          ２ｍＶ
期間          １００ｍｓ
走査速度      ２０ｍＶ／秒
【０１２２】
ＮＩＰ６の場合、ＢａＰ添加から２２時間後、強度に僅かな低下がみられるが、効果はＭＩＰよりも小さい。ＭＩＰについては、ＢａＰ添加から４時間後に酸化電位のシフトおよび強度の低下がみられる。
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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