(57)【要約】本発明の態様は、ＦＯＸＰ３の発現を活性化又は増強するための一本鎖オリゴヌクレオチドを提供する。別の態様は、ＦＯＸＰ３の発現を活性化又は増強するための一本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物及びキットを提供する。一本鎖オリゴヌクレオチドを用いて、ＦＯＸＰ３の発現を調節する方法も提供される。本発明の別の態様は、ＦＯＸＰ３の発現を活性化又は増強するための候補オリゴヌクレオチドを選択する方法を提供する。一局面において、配列５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ（Ｘは、任意のヌクレオチドであり、Ｙは、ヒトミクロＲＮＡのシード配列ではない、長さ６ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Ｚは、長さ１〜２３ヌクレオチドのヌクレオチド配列である）を有する一本鎖オリゴヌクレオチドが提供され、上記一本鎖オリゴヌクレオチドが、ＦＯＸＰ３遺伝子のＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的である。
2016521556.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ（Ｘは、任意のヌクレオチドであり、Ｙは、ヒトミクロＲＮＡのシード配列ではない、長さ６ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Ｚは、長さ１〜２３ヌクレオチドのヌクレオチド配列である）を有する一本鎖オリゴヌクレオチドであって、前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、ＦＯＸＰ３遺伝子のＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的である一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドが、３個以上の連続したグアノシンヌクレオチドを含まない、請求項１に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが、４個以上の連続したグアノシンヌクレオチドを含まない、請求項１又は２に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドが、８〜３０ヌクレオチドの長さである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドが、８〜１０ヌクレオチドの長さであり、かつ前記ＰＲＣ２関連領域の相補的配列の１、２、若しくは３個を除く全てが、シトシン又はグアノシンヌクレオチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオチドが、ヌクレオチド類似体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記少なくとも１個のヌクレオチド類似体が、前記少なくとも１個のヌクレオチド類似体を有していないオリゴヌクレオチドと比較して、１〜５℃の範囲で前記オリゴヌクレオチドのＴｍの増加をもたらす、請求項６に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオチドが、２’Ｏ−メチルを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドが、２’Ｏ−メチルを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１個のリボヌクレオチド、少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチド、又は少なくとも１個の架橋ヌクレオチドを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記架橋ヌクレオチドが、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド又はＥＮＡ修飾ヌクレオチドである、請求項１０に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドが、ＬＮＡヌクレオチドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド及び２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドを交互に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを交互に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド及びＥＮＡヌクレオチド類似体を交互に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド及びＬＮＡヌクレオチドを交互に含む、請求項１〜Ａ７のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドである、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが、ＬＮＡヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを交互に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
前記オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドが、ＬＮＡヌクレオチドである、請求項１８に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドを含み、これらは、前記デオキシリボヌクレオチドの５’及び３’末端の各々で少なくとも１つのＬＮＡヌクレオチドによりフランキングされている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
少なくとも２つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
全てのヌクレオチドの間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに含む、請求項２１に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチドの３’位置の前記ヌクレオチドが、３’ヒドロキシル基を有する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
前記オリゴヌクレオチドの３’位置の前記ヌクレオチドが、３’チオホスフェートを有する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
５’ヌクレオチドに結合したビオチン部分をさらに含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
第１染色体において、ＦＯＸＰ３遺伝子のＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的である相補性の領域を含む一本鎖オリゴヌクレオチドであって、ここで、前記オリゴヌクレオチドが、以下：
ａ）５’−Ｘ−Ｙ−Ｚである配列（Ｘは、任意のヌクレオチドであり、Ｘは、オリゴヌクレオチドの５’末端に固定されており、Ｙは、ミクロＲＮＡのヒトシード配列ではない、長さ６ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Ｚは、長さ１〜２３ヌクレオチドのヌクレオチド配列である）；
ｂ）３個以上の連続したグアノシンヌクレオチドを含まない配列；
ｃ）ヌクレオチドの全ての配列に対し閾値レベルに満たない配列同一性を有し、オフターゲット遺伝子の５’末端の上流５０キロベースから前記オフターゲット遺伝子の３’末端の下流５０キロベースの間にある、第２ヌクレオチド配列と同等長さの配列；
ｄ）少なくとも２つの一本鎖ループを含む二次構造を形成するＲＮＡをコードするＰＲＣ２関連領域と相補的な配列；並びに／又は
ｅ）６０％を超えるＧ−Ｃ含有率を有する配列
の少なくとも１つを有する、一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
前記オリゴヌクレオチドが、配列５’−Ｘ−Ｙ−Ｚを有し、前記オリゴヌクレオチドが、８〜５０ヌクレオチドの長さである、請求項２６の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、細胞に送達されると、前記細胞におけるＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、及び／又はＩＬ−１０発現のレベルを増大することができる、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
前記細胞がＴ細胞である、請求項２８に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、Ｔ細胞の集団に送達されると、前記Ｔ細胞の集団中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞の数を増加させることができる、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドと、担体とを含む組成物。
【請求項３２】
緩衝液中に、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物。
【請求項３３】
前記オリゴヌクレオチドが、担体に結合される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記担体が、ペプチドである、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記担体が、ステロイドである、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３６】
請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の組成物と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項３７】
請求項３１〜３６のいずれか１項に記載の組成物を収納する容器を含むキット。
【請求項３８】
細胞におけるＦＯＸＰ３の発現を増大する方法であって、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドを前記細胞に送達することを含む方法。
【請求項３９】
前記細胞への前記一本鎖オリゴヌクレオチドの送達によって、前記一本鎖オリゴヌクレオチドを含まない対照細胞中のＦＯＸＰ３の発現のレベルより少なくとも５０％高いＦＯＸＰ３の発現のレベルがもたらされる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞への前記一本鎖オリゴヌクレオチドの送達によって、前記一本鎖オリゴヌクレオチドを含まない適切な対照細胞と比較して、増加したレベルのＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、及び／又はＩＬ−１０発現がもたらされる、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞への前記一本鎖オリゴヌクレオチドの送達によって、前記一本鎖オリゴヌクレオチドを含まない対照細胞におけるＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、及び／又はＩＬ−１０発現のレベルより少なくとも３０％高いＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、及び／又はＩＬ−１０の発現のレベルがもたらされる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞が、Ｔ細胞である、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
被験者におけるＦＯＸＰ３の発現を増大する方法であって、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドを前記被験者に投与することを含む方法。
【請求項４４】
前記被験者への前記一本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、前記一本鎖オリゴヌクレオチドを投与していない適切な対照被験者と比較して、前記被験者において増加したレベルのＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、及び／又はＩＬ−１０発現がもたらされる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記被験者への前記一本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、前記一本鎖オリゴヌクレオチドを投与していない適切な対照被験者におけるＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、及び／又はＩＬ−１０発現のレベルより少なくとも３０％高いＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、及び／又はＩＬ−１０の発現のレベルがもたらされる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記被験者への前記一本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、前記一本鎖オリゴヌクレオチドを投与していない対照被験者のＴ細胞と比較して、前記被験者のＴ細胞において増加したレベルのＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、及び／又はＩＬ−１０発現がもたらされる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記被験者への前記一本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、前記一本鎖オリゴヌクレオチドが投与されていない前記対照被験者のＴ細胞におけるＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、及び／又はＩＬ−１０発現のレベルより少なくとも３０％高いＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、及び／又はＩＬ−１０の発現のレベルが、前記被験者のＴ細胞にもたらされる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記被験者への前記一本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、前記一本鎖オリゴヌクレオチドを投与していない対照被験者と比較して、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞の数の増加が、前記被験者にもたらされる、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記被験者への前記一本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、前記一本鎖オリゴヌクレオチドが投与されていない前記対照被験者におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞の数より少なくとも３０％多いＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞の数が、前記被験者にもたらされる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
被験者におけるＦＯＸＰ３のレベル低下に関連する状態又は疾患を治療する方法であって、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドを前記被験者に投与することを含む方法。
【請求項５１】
前記病状又は疾患が、異常な免疫細胞活性化に関連する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
細胞においてＦＯＸＰ３の発現を増大する方法であって、前記細胞へのＥＺＨ１  ｍＲＮＡ若しくはＥＺＨ２  ｍＲＮＡの少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的な相補性の領域を有するオリゴヌクレオチドを前記細胞に送達することを含む方法。
【請求項５３】
前記オリゴヌクレオチドが、８〜３０ヌクレオチドの長さである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオチドが、ヌクレオチド類似体である、請求項５２又は５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記オリゴヌクレオチドが、ギャップマーを含む、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ギャップマーが、少なくとも２個のヌクレオチド類似体により両側がフランキングされた少なくとも４個のＤＮＡヌクレオチドから成る中央領域を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
少なくとも２個のヌクレオチド類似体が、少なくとも１個のＬＮＡ又は少なくとも１個の２’−Ｏ修飾リボヌクレオチドである、請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に従い、２０１３年６月７日に提出された「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧ  ＦＯＸＰ３  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」と題する米国仮特許出願第６１／８３２，６７７号明細書の利益を主張する。尚、これら文献の各々の内容は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、オリゴヌクレオチドベースの組成物、並びに疾患を治療する目的でオリゴヌクレオチドベースの組成物を使用する方法に関する。
【０００３】
ＦＯＸタンパク質ファミリーのメンバーである、ＦＯＸＰ３（フォークヘッドボックスタンパク質Ｐ３）は、免疫抑制調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の分化及び活性を駆動する主要制御転写因子である。Ｔｒｅｇは、免疫抑制活性を有し、免疫寛容誘導性応答を確立することができるＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔリンパ球である。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の投与により、１型糖尿病、多発性硬化症、喘息、炎症性腸疾患、及び甲状腺炎の動物モデルにおいて、免疫／自己免疫疾患の重症度が顕著な軽減がもたらされることがこれまでに判明している。ＦＯＸＰ３の発現は、エフェクターＴ細胞増殖及び活性を低減させる。さらに、Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞は、Ｔｈ１応答、Ｔｈ１７応答を制御して、抗体産生、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞活性、及び抗原提示を抑制することができる。
【０００４】
Ｆｏｘｐ３を発現するものなど、Ｔｒｅｇの数又は機能の改変は、いくつかの病態と関連している。例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のような自己免疫疾患を有する患者は、Ｔｒｅｇの欠損調節機能を有することが判明している。ＦＯＸＰ３遺伝子はまた、ＩＰＥＸ（免疫調節異常、多発性内分泌障害、及び腸疾患、Ｘ関連）症候群を有する患者において突然変異することも明らかにされている。ＩＰＥＸ症候群は、罹患した患者における、腸疾患、皮膚炎、及び１型糖尿病などのいくつかの自己免疫疾患の発生を特徴とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書に開示する本発明の態様は、細胞のＦＯＸＰ３を上方制御するのに有用な方法及び組成物を提供する。ある実施形態では、ＦＯＸＰ３遺伝子（例えば、ヒトＦＯＸＰ３）のＰＲＣ２関連領域をターゲティングし、これにより遺伝子の上方制御をもたらす一本鎖オリゴヌクレオチドが提供される。ある実施形態では、ＦＯＸＰ３をコード化する遺伝子のＰＲＣ２関連領域をターゲティングする一本鎖オリゴヌクレオチドが提供される。ある実施形態では、これらの一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＦＯＸＰ３のＰＲＣ２媒介抑制を軽減又は予防することにより、ＦＯＸＰ３の発現を活性化又は増強する。本明細書に開示する本発明の態様は、異常免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）活性化に関連する疾患若しくは障害、例えば、自己免疫若しくは炎症性疾患又は障害の治療及び／又は予防のためのＦＯＸＰ３の上方制御に有用な方法及び組成物を提供する。
【０００６】
本発明のさらに別の態様は、ＦＯＸＰ３の発現を活性化若しくは増大するためのオリゴヌクレオチドを選択する方法を提供する。ある実施形態では、ＦＯＸＰ３の発現を活性化若しくは増大するための候補が豊富な（例えば、オリゴヌクレオチドのランダム選択と比較して）オリゴヌクレオチドのセットを選択する方法が提供される。従って、これらの方法は、ＦＯＸＰ３の発現を活性化又は増強するオリゴヌクレオチドが豊富な臨床的候補のセットを立証するための用いることができる。例えば、このようなライブラリーを使用して、ＦＯＸＰ３を治療するために治療薬を開発するためのリードオリゴヌクレオチドを同定することができる。さらに、ある実施形態では、ＦＯＸＰ３の発現を活性化するための一本鎖オリゴヌクレオチドの薬物動態学、生体分布、生物学的利用能及び／又は効力を制御するのに有用なオリゴヌクレオチド化学が提供される。
【０００７】
本発明のある態様によれば、ＦＯＸＰ３遺伝子のＰＲＣ２関連領域、例えば、配列番号１、２、５、６、７、４６、若しくは４７に記載のヌクレオチド配列のＰＲＣ２関連領域（例えば、その少なくとも８つの連続ヌクレオチド）と相補的である相補性の領域を有する一本鎖オリゴヌクレオチドが提供される。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、以下の特徴の少なくとも１つを有する：ａ）５’Ｘ−Ｙ−Ｚである配列（Ｘは、任意のヌクレオチドであり、ここで、Ｘは、このオリゴヌクレオチドの５’末端に位置し、Ｙは、ミクロＲＮＡのヒトシード配列ではない、長さ６ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Ｚは、長さ１〜２３ヌクレオチドのヌクレオチド配列である）；ｂ）３個以上の連続したグアノシンヌクレオチドを含まない配列；ｃ）ヌクレオチドの全ての配列に対し閾値レベルに満たない配列同一性を有し、オフターゲット遺伝子の５’末端の上流５０キロベースからオフターゲット遺伝子の３’末端の下流５０キロベースとの間の、第２ヌクレオチド配列と同等長さの配列；ｄ）少なくとも２つの一本鎖ループを含む二次構造を形成するＲＮＡをコード化するＰＲＣ２関連領域と相補的な配列；並びにｅ）６０％超のＧ−Ｃ含有率を有する配列。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの各々は、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、及びｅ）の少なくとも２つを有し、これらは各々独立に選択される。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの各々は、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、及びｅ）の少なくとも３つを有し、これらは各々独立に選択される。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの各々は、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、及びｅ）の少なくとも４つを有し、これらは各々独立に選択される。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの各々は、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、及びｅ）の各々を有する。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの各々は、このオリゴヌクレオチドが８〜５０ヌクレオチドの長さである配列５’Ｘ−Ｙ−Ｚを有する。
【０００８】
本発明の一部の実施形態によれば、配列Ｘ−Ｙ−Ｚ（Ｘは、任意のヌクレオチドであり、Ｙは、ミクロＲＮＡのヒトシード配列ではない、長さ６ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Ｚは、長さ１〜２３ヌクレオチドのヌクレオチド配列である）を有する一本鎖オリゴヌクレオチドが提供され、ここで、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＦＯＸＰ３遺伝子のＰＲＣ２関連領域、例えば、配列番号１、２、５、６、７、４６、若しくは４７に記載のヌクレオチド配列のＰＲＣ２関連領域と相補的である。一部の態様では、配列５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ（Ｘは、任意のヌクレオチドであり、Ｙは、ヒトミクロＲＮＡのシード配列ではない、長さ６ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Ｚは、長さ１〜２３ヌクレオチドのヌクレオチド配列である）を有する一本鎖オリゴヌクレオチドが提供され、ここで、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＦＯＸＰ３遺伝子のＰＲＣ２関連領域、例えば、配列番号１、２、５、６、７、４６、若しくは４７に記載のヌクレオチド配列のＰＲＣ２関連領域と相補的である。ある実施形態では、Ｙは、表１から選択される配列である。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、配列番号８〜４５又は４８〜５９のいずれか１つに記載される配列である。
【０００９】
ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号６０〜４５７１３のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列、又は少なくとも８ヌクレオチドであるその断片を含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号６０〜４５７１３のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列を含み、ここで、記載されるヌクレオチド配列の５’末端は、オリゴヌクレオチドの５’末端である。ある実施形態では、相補性の領域（例えば、少なくとも８個の連続したヌクレオチド）は、配列番号３又は４に記載されるヌクレオチド配列内にも存在する。
【００１０】
ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、配列番号８〜４５のいずれか１つに記載される配列である。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号１６４２６〜４５７１３のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列、又は少なくとも８ヌクレオチドであるその断片を含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号１６４２６〜４５７１３のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列を含み、ここで、配列番号１６４２６〜４５７１３のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列の５’末端は、前記オリゴヌクレオチドの５’末端である。ある実施形態では、少なくとも８個の連続したヌクレオチドは、配列番号４に記載されるヌクレオチド配列内にも存在する。
【００１１】
ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、配列番号４８〜５９のいずれか１つに記載される配列である。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号６０〜１６４６１のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列、又は少なくとも８ヌクレオチドであるその断片を含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号６０〜１６４６１のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列を含み、ここで、配列番号６０〜１６４６１のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列の５’末端は、前記オリゴヌクレオチドの５’末端である。ある実施形態では、少なくとも８個の連続したヌクレオチドは、配列番号３に記載されるヌクレオチド配列内にも存在する。
【００１２】
ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号６０〜１６４６１のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが最大５０ヌクレオチドである。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号６０〜１６４６１のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列の少なくとも８ヌクレオチドの断片を含む。
【００１３】
ある実施形態では、表４に記載されるヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、表４に記載されるヌクレオチド配列の少なくとも８ヌクレオチドの断片を含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、表４に記載されるヌクレオチド配列から成る。
【００１４】
ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、細胞に送達されると、この細胞におけるＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、及び／又はＩＬ−１０発現のレベルを増大することができる（例えば、対照細胞におけるＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、及び／又はＩＬ−１０発現のレベルより、少なくとも３０％高いＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、及び／又はＩＬ−１０発現のレベルをもたらす）。ある実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、Ｔ細胞の集団に送達されると、Ｔ細胞の集団中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞の数を増加させることができる（例えば、この集団において、対照集団におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞の数より、少なくとも３０％高いＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞の数をもたらす）。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、３個以上の連続したグアノシンヌクレオチドを含まない。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、４個以上の連続したグアノシンヌクレオチドを含まない。
【００１５】
ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、長さが８〜３０ヌクレオチドである。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、長さが最大５０ヌクレオチドである。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、長さが８〜１０ヌクレオチドであり、かつＰＲＣ２関連領域の相補的配列の１、２、若しくは３個を除く全てが、シトシン又はグアノシンヌクレオチドである。
【００１６】
ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＦＯＸＰ３遺伝子のＰＲＣ２関連領域、例えば、配列番号１、２、５、６、７、４６、若しくは４７に記載のヌクレオチド配列のＰＲＣ２関連領域と相補的であり、前記一本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、以下のものからなる群から選択される１つ又は複数のヌクレオチド配列を含む：
（ａ）（Ｘ）Ｘｘｘｘｘｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘｘｘ、（Ｘ）ｘｘＸｘｘｘ、（Ｘ）ｘｘｘＸｘｘ、（Ｘ）ｘｘｘｘＸｘ及び（Ｘ）ｘｘｘｘｘＸ、
（ｂ）（Ｘ）ＸＸｘｘｘｘ、（Ｘ）ＸｘＸｘｘｘ、（Ｘ）ＸｘｘＸｘｘ、（Ｘ）ＸｘｘｘＸｘ、（Ｘ）ＸｘｘｘｘＸ、（Ｘ）ｘＸＸｘｘｘ、（Ｘ）ｘＸｘＸｘｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘＸｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘｘＸ、（Ｘ）ｘｘＸＸｘｘ、（Ｘ）ｘｘＸｘＸｘ、（Ｘ）ｘｘＸｘｘＸ、（Ｘ）ｘｘｘＸＸｘ、（Ｘ）ｘｘｘＸｘＸ及び（Ｘ）ｘｘｘｘＸＸ、
（ｃ）（Ｘ）ＸＸＸｘｘｘ、（Ｘ）ｘＸＸＸｘｘ、（Ｘ）ｘｘＸＸＸｘ、（Ｘ）ｘｘｘＸＸＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸｘｘ、（Ｘ）ＸＸｘｘＸｘ、（Ｘ）ＸＸｘｘｘＸ、（Ｘ）ｘＸＸｘＸｘ、（Ｘ）ｘＸＸｘｘＸ、（Ｘ）ｘｘＸＸｘＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸｘｘ、（Ｘ）ＸｘｘＸＸｘ、（Ｘ）ＸｘｘｘＸＸ、（Ｘ）ｘＸｘＸＸｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘＸＸ、（Ｘ）ｘｘＸｘＸＸ、（Ｘ）ｘＸｘＸｘＸ及び（Ｘ）ＸｘＸｘＸｘ、
（ｄ）（Ｘ）ｘｘＸＸＸ、（Ｘ）ｘＸｘＸＸＸ、（Ｘ）ｘＸＸｘＸＸ、（Ｘ）ｘＸＸＸｘＸ、（Ｘ）ｘＸＸＸＸｘ、（Ｘ）ＸｘｘＸＸＸＸ、（Ｘ）ＸｘＸｘＸＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸｘＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸｘ、（Ｘ）ＸＸｘｘＸＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸｘＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸＸｘ、（Ｘ）ＸＸＸｘｘＸ、（Ｘ）ＸＸＸｘＸｘ、及び（Ｘ）ＸＸＸＸｘｘ、
（ｅ）（Ｘ）ｘＸＸＸＸＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸＸＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸＸＸ、（Ｘ）ＸＸＸｘＸＸ、（Ｘ）ＸＸＸＸｘＸ及び（Ｘ）ＸＸＸＸＸｘ、並びに
（ｆ）ＸＸＸＸＸＸ、ＸｘＸＸＸＸＸ、ＸＸｘＸＸＸＸ、ＸＸＸｘＸＸＸ、ＸＸＸＸｘＸＸ、ＸＸＸＸＸｘＸ及びＸＸＸＸＸＸｘ
から選択される１つ又は複数のヌクレオチド配列を含み、ここで、「Ｘ」は、ヌクレオチド類似体を示し、（Ｘ）は、任意選択のヌクレオチド類似体を示し、「ｘ」は、ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオチド単位を示す。
【００１７】
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体である。ある実施形態では、少なくとも１個のヌクレオチド類似体は、少なくとも１個のヌクレオチド類似体を有していないオリゴヌクレオチドと比較して、１〜５℃の範囲でオリゴヌクレオチドのＴｍの増加をもたらす。
【００１８】
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオチドは、２’Ｏ−メチルを含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドは、２’Ｏ−メチルを含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個のリボヌクレオチド、少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチド、又は少なくとも１個の架橋ヌクレオチドを含む。ある実施形態では、架橋ヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド又はＥＮＡ修飾ヌクレオチドである。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドである。
【００１９】
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド及び２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドを交互に含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを交互に含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド及びＥＮＡヌクレオチド類似体を交互に含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド及びＬＮＡヌクレオチドを交互に含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを交互に含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドである。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドの５’及び３’末端の各々で、少なくとも１個のＬＮＡヌクレオチドによりフランキングされているデオキシリボヌクレオチドを含む。
【００２０】
ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個以上のヌクレオチド同士の間に修飾されたヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合又は他の結合）を含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、全ヌクレオチド同士の間に修飾されたヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合又は他の結合）を含む。
【００２１】
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの３’位のヌクレオチドは、３’ヒドロキシル基を有する。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの３’位のヌクレオチドは、３’チオリン酸塩を有する。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、その５’若しくは３’ヌクレオチドに結合したビオチン部分又は他の部分を有する。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、その５’若しくは３’末端に、コレステロール、ビタミンＡ、葉酸塩、シグマ受容体リガンド、アプタマー、ＣＰＰなどのペプチド、脂質などの疎水性分子、ＡＳＧＰＲ又は動的ポリ抱合体、並びにそれらの変異体を有する。
【００２２】
本発明のある態様によれば、本明細書に開示するオリゴヌクレオチドのいずれか、及び担体を含む組成物が提供される。ある実施形態では、緩衝液中にオリゴヌクレオチドのいずれかを含む組成物が提供される。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、前記担体に結合されている。ある実施形態では、担体は、ペプチドである。ある実施形態では、担体は、ステロイドである。本発明のいくつかの態様によれば、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドのいずれか、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
【００２３】
本発明の他の態様によれば、本明細書に開示する組成物のいずれかを収納する容器を含むキットも提供される。
【００２４】
本発明のいくつかの態様によれば、細胞におけるＦＯＸＰ３の発現を増大する方法が提供される。ある実施形態では、これらの方法は、本明細書に開示する一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれか１つ又は複数を細胞に送達するステップを含む。ある実施形態では、細胞への一本鎖オリゴヌクレオチドの送達によって、一本鎖オリゴヌクレオチドを含まない対照細胞中のＦＯＸＰ３の発現のレベルより高い（例えば、少なくとも５０％高い）ＦＯＸＰ３の発現のレベルがもたらされる。ある実施形態では、細胞への一本鎖オリゴヌクレオチドの送達によって、一本鎖オリゴヌクレオチドを含まない適切な対照細胞と比較して、増加したレベルのＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、及び／又はＩＬ−１０発現がもたらされる。ある実施形態では、細胞への一本鎖オリゴヌクレオチドの送達によって、一本鎖オリゴヌクレオチドを含まない対照細胞中のＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、及び／又はＩＬ−１０の発現レベルより高い（例えば、少なくとも３０％高い）ＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、及び／又はＩＬ−１０の発現レベルがもたらされる。ある実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。
【００２５】
本発明のいくつかの態様によれば、被験者においてＦＯＸＰ３のレベルを増加する方法が提供される。本発明のいくつかの態様によれば、被験者におけるＦＯＸＰ３のレベル低下に関連する病状又は疾患（例えば、自己免疫若しくは炎症性疾患若しくは障害などの異常な免疫細胞活性化に関連する疾患若しくは障害）を治療する方法が提供される。ある実施形態では、方法は、本明細書に開示する一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれか１つ又は複数を被験者に投与するステップを含む。ある実施形態では、被験者への一本鎖オリゴヌクレオチドの投与により、一本鎖オリゴヌクレオチドを投与していない適切な対照被験者と比較して、被験者において増加したレベルのＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、及び／又はＩＬ−１０発現がもたらされる。ある実施形態では、被験者への一本鎖オリゴヌクレオチドの投与により、一本鎖オリゴヌクレオチドを投与していない適切な対照被験者と比較して、高い（例えば、少なくとも３０％高い）レベルのＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、及び／又はＩＬ−１０の発現がもたらされる。ある実施形態では、被験者への一本鎖オリゴヌクレオチドの投与により、一本鎖オリゴヌクレオチドを投与していない対照被験者におけるＴ細胞と比較して、前記被験者のＴ細胞において増加したレベルのＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、及び／又はＩＬ−１０がもたらされる。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドを投与していない対照被験者におけるＴ細胞中のＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、及び／又はＩＬ−１０のレベルより高い（例えば、少なくとも３０％高い）、被験者のＴ細胞中のＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、及び／又はＩＬ−１０の発現レベルがもたらされる。ある実施形態では、被験者への一本鎖オリゴヌクレオチドの投与により、一本鎖オリゴヌクレオチドを投与していない対照被験者と比較して、被験者におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞の数の増加がもたらされる。ある実施形態では、被験者への一本鎖オリゴヌクレオチドの投与により、一本鎖オリゴヌクレオチドを投与していない対照被験者でのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞の数より多い（例えば、少なくとも３０％多い）、被験者におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞の数がもたらされる。
【００２６】
本発明の他の態様は、ＥＺＨ１及び／若しくはＥＺＨ２又はＰＲＣ２の別の成分、例えば、Ｓｕｚ１２、ＥＥＤ１、若しくはＲｂＡｐ４８の発現を阻害又は低減することにより、細胞中のＦＯＸＰ３の発現を増大する、Ｔ細胞を活性化する、並びに／又は、ＦＯＸＰ３のレベル低下に関連する病状若しくは疾患（例えば、自己免疫若しくは炎症性疾患若しくは障害などの異常な免疫細胞活性化に関連する疾患若しくは障害）を治療する方法に関する。ある実施形態では、本方法は、ＥＺＨ１ｍＲＮＡ又はＥＺＨ２ｍＲＮＡの少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的な相補性の領域を有するオリゴヌクレオチドを細胞に送達するステップを含む。ある実施形態では、方法は、ＥＺＨ１ｍＲＮＡの少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的な相補性の領域を有する第１オリゴヌクレオチドと、ＥＺＨ２ｍＲＮＡの少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的な相補性の領域を有する第２オリゴヌクレオチドとを細胞に送達するステップを含む。
【００２７】
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが８〜３０ヌクレオチドである。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体である。
【００２８】
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）を含む。ある実施形態では、ギャップマーは、少なくとも２つのヌクレオチド類似体により両側がフランキングされた少なくとも４個のＤＮＡヌクレオチドから成る中央領域を含む。ある実施形態では、少なくとも２個のヌクレオチド類似体は、少なくとも１個のＬＮＡ又は少なくとも１個の２’−Ｏ修飾リボヌクレオチドを含む。
【００２９】
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、表８に記載するヌクレオチド配列の少なくとも８個のヌクレオチドを含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、表８に記載するヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、表８に記載するヌクレオチド配列から構成されている。ある実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖オリゴヌクレオチド）は、配列番号４５７１４〜４５７１７のいずれか１つに記載の配列又はそれらのいずれか１つの補体を含む。
【００３０】
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオチドは、２’Ｏ−メチルを含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドは、２’Ｏ−メチルを含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個のリボヌクレオチド、少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチド、又は少なくとも１個の架橋ヌクレオチドを含む。ある実施形態では、架橋ヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド又はＥＮＡヌクレオチドである。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドである。
【００３１】
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド及び２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドを交互に含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを交互に含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド及びＥＮＡヌクレオチド類似体を交互に含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド及びＬＮＡヌクレオチドを交互に含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、ＬＮＡリボヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを交互に含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドである。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドの５’及び３’末端の各々で、少なくとも１個のＬＮＡヌクレオチドがフランキングしたデオキシリボヌクレオチドを含む。
【００３２】
ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個以上のヌクレオチド同士の間に、修飾されたヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合又は他の結合）を含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、全ヌクレオチド同士の間に、修飾されたヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合又は他の結合）を含む。
【００３３】
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの３’位のヌクレオチドは、３’ヒドロキシル基を有する。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの３’位のヌクレオチドは、３’チオホスフェートを有する。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、その５’及び３’ヌクレオチドに結合したビオチン部分又は他の部分を有する。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、その５’若しくは３’末端に、コレステロール、ビタミンＡ、葉酸塩、シグマ受容体リガンド、アプタマー、ＣＰＰなどのペプチド、脂質などの疎水性分子、ＡＳＧＰＲ又は動的ポリ抱合体、並びにそれらの変異体を有する。
【００３４】
本発明の他の態様は、ＥＺＨ１ｍＲＮＡ又はＥＺＨ２ｍＲＮＡの少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的な相補性の領域を有する一本鎖オリゴヌクレオチドに関する。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、表８に記載するヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、表８に記載するヌクレオチド配列の少なくとも８個のヌクレオチドから成る断片を含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、表８に記載するヌクレオチド配列から構成される。
【００３５】
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが８〜３０ヌクレオチドである。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体である。
【００３６】
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ギャップマーを含む。ある実施形態では、ギャップマーは、少なくとも２つのヌクレオチド類似体により両側がフランキングされた少なくとも４個のＤＮＡヌクレオチドから成る中央領域を含む。ある実施形態では、少なくとも２個のヌクレオチド類似体は、少なくとも１個のＬＮＡ又は少なくとも１個の２’−Ｏ修飾リボヌクレオチドを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＰＭＡ及びイオノマイシンで活性化したヒトＴ細胞におけるＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤＫＮ１Ａ、及びＩＬ−２ＲＡ発現のレベルを示す４つのグラフのシリーズである。
【図２】表４に記載のＦＯＸＰ３オリゴが結合するヒトＦＯＸＰ３遺伝子に沿う位置を示す図である。
【図３】ＤＭＳＯで処理した、又は非処理のＴ細胞と比較して、異なる濃度のＰＭＡ及びイオノマイシン（１×若しくは２×）で活性化したヒトＴ細胞のＣＤ６２Ｌ及びＣＤ６９ｍＲＮＡのレベルを示す２つのグラフのセットである。
【図４】２：１のビーズ：細胞比（左のバー）又は１：１のビーズ：細胞比（右のバー）のダイナビーズで活性化した細胞におけるＣＤ６２Ｌ及びＣＤ２５ｍＲＮＡのレベルを示す２つのグラフのシリーズである。
【図５】活性化ヒトＴ細胞に裸で送達された濃度：０、０．０３２、０．１６、０．８、及び２０ｕＭのＧＡＰＤＨギャップマーによるＧＡＰＤＨｍＲＮＡの下方制御を示すグラフである。
【図６】１０ｕＭのＦＯＸＰ３オリゴで処理したＰＭＡ／イオノマイシン活性化ヒトＴ細胞における４８時間時点でのＦＯＸＰ３ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。星印付きのバーは、安定したハウスキーパー遺伝子Ｃｔ値が観測されたオリゴ処理を示す。
【図７】１０ｕＭのＦＯＸＰ３オリゴで処理したダイナビーズ活性化ヒトＴ細胞における９６時間時点でのＦＯＸＰ３ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。
【図８】ＦＯＸＰ３オリゴで処理したダイナビーズ活性化ヒトＴ細胞における９６時間時点でのＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルを示すグラフである。黒いバーは、ハウスキーパー遺伝子と陰性対照との差が、１．５Ｃｔを超えるオリゴを示す。
【図９】ＦＯＸＰ３オリゴで処理したダイナビーズ活性化ヒトＴ細胞における９６時間時点でのＣＴＬＡ４ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。
【図１０】ＦＯＸＰ３オリゴで処理したダイナビーズ活性化ヒトＴ細胞における９６時間時点でのＧＩＴＲｍＲＮＡレベルを示すグラフである。
【図１１】ＦＯＸＰ３オリゴで処理したダイナビーズ活性化ヒトＴ細胞における９６時間時点でのＦＯＸＰ３ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。
【図１２】ＦＯＸＰ３オリゴで処理したダイナビーズ活性化ヒトＴ細胞における９６時間時点でのＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルを示すグラフである。黒いバーは、ハウスキーパー遺伝子と陰性対照との差が、１．５Ｃｔを超えるオリゴを示す。
【図１３】ＦＯＸＰ３オリゴで処理した、ダイナビーズ活性化ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋ヒトＴ細胞における９６時間時点でのＦｏｘＰ３蛍光強度を示すグラフである。
【図１４−１】陰性対照オリゴ（２９３）及び例示的ＦＯＸＰ３オリゴ（ＦＯＸＰ３−３５）で処理した活性化ヒトＴ細胞におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。
【図１４−２】陰性対照オリゴ（２９３）及び例示的ＦＯＸＰ３オリゴ（ＦＯＸＰ３−３５）で処理した活性化ヒトＴ細胞におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。
【図１５】ＦＯＸＰ３オリゴで処理した、ダイナビーズ活性化ヒトＴ細胞における９６時間時点でのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞のパーセンテージを示すグラフである。
【図１６】ＦＯＸＰ３オリゴで処理した、ダイナビーズ活性化ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋ヒトＴ細胞における９６時間時点でのＩＬ−１０タンパク質レベルを示すグラフである。
【図１７】ＭＡＬＡＴ−１ギャップマーオリゴで処理したマウスから採取した全血から選別されたＣＤ４＋細胞におけるＭＡＬＡＴ−１ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。
【図１８】ＭＡＬＡＴ−１ギャップマーオリゴで処理したマウスから採取した肝臓中のＭＡＬＡＴ−１ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。
【図１９】ＥＺＨ１ギャップマー、ＥＺＨ２ギャップマー、又はＥＺＨ１及びＥＺＨ２ギャップマーの組み合わせで処理した活性化ヒトＴ細胞における３又は５日時点でのＥＺＨ１ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。各ペアの左のバーは、３日時点である。各ペアの右のバーは、５日時点である。
【図２０】ＥＺＨ１ギャップマー、ＥＺＨ２ギャップマー、又はＥＺＨ１及びＥＺＨ２ギャップマーの組み合わせで処理した活性化ヒトＴ細胞における３又は５日時点でのＥＺＨ２ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。各バーペアの左のバーは、３日時点である。各バーペアの右のバーは、５日時点である。
【図２１】ＥＺＨ１ギャップマー、ＥＺＨ２ギャップマー、又はＥＺＨ１及びＥＺＨ２ギャップマーの組み合わせで処理した活性化ヒトＴ細胞における３又は５日時点でのＦＯＸＰ３ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。各バーペアの左のバーは、３日時点である。各バーペアの右のバーは、５日時点である。
【図２２】ＥＺＨ１／２ノックダウン後のＴ細胞遺伝子のｍＲＮＡ発現を示すヒートマップである。
【図２３】ＥＺＨ１ギャップマー、ＥＺＨ２ギャップマー、又はＥＺＨ１及びＥＺＨ２ギャップマーの組み合わせで処理した活性化ヒトＴ細胞におけるＦＯＸＰ３タンパク質のフローサイトメトリーデータを示すグラフのシリーズである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
いくつかの表の簡単な説明
表１：ヒトｍｉＲＮＡのシード配列ではない六量体
【００３９】
表２：一本鎖オリゴヌクレオチドの実験による評価。配列番号（カラム１）は、オリゴヌクレオチドの塩基配列に対応する配列番号を指す。各オリゴヌクレオチドのフォーマット化配列（あらゆる修飾を含む）を表４に記載する。オリゴ名（カラム２）は、所与のオリゴヌクレオチドの名称を指し、また、表４では同じフォーマット化オリゴヌクレオチドを指す。ＲＱ（カラム３）及びＡＶＧ  ＲＱ  ＳＤ（カラム４）は、対照ウェル（担体のみ又はユニバーサル陰性対照オリゴ２９３）に対する、オリゴ含有のウェルにおける「プローブ」遺伝子の発現レベル、並びに実験の３重反復についての標準偏差を示す。標的（カラム５）は、オリゴヌクレオチドによってターゲティングされる遺伝子を指す。プローブ（カラム６）は、発現が、所与のアッセイで測定された遺伝子を指す。例えば、標的ＦＯＸＰ３及びプローブＧＩＴＲは、ＦＯＸＰ３をターゲティングするオリゴをウェルに添加し、ＧＩＴＲのレベルをｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した実験を指す。この実験のためのＲＱ及びＡＶＧ  ＲＱ  ＳＤは、ＧＩＴＲのＲＱ及びＡＶＧ  ＲＱ  ＳＤであろう。［オリゴ］は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験ではナノモル単位で示し、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験では体重１キログラム当たりのミリグラム単位で示す。
【００４０】
表３：オリゴヌクレオチド修飾の一覧表
【００４１】
表４：ヌクレオチド修飾を示す試験のために作成されるフォーマット化オリゴヌクレオチド。表は、修飾したヌクレオチドの配列を示し、ここで、ｌｎａＸは、３’ホスホロチオエート結合を有するＬＮＡヌクレオチドを表し、ｏｍｅＸは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり、ｄＸは、デオキシヌクレオチドである。ヌクレオチドコード末端のｓは、ヌクレオチドが、３’ホスホロチオエート結合を有することを示している。配列末端の「−Ｓｕｐ」は、３’末端が、３’結合上にホスフェート又はチオホスフェートのいずれかを欠失していることを表す。フォーマット化配列カラムは、表２で試験したオリゴヌクレオチドについて、修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの配列を示す。
（発明を実施するための形態）
【００４２】
本明細書に記載する本発明の態様は、ポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ）−相互反応ＲＮＡの発見に関する。ポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ）は、ヒストンメチルトランスフェラーゼであり、ヒストンＨ３のメチル化によってゲノム領域のサイレンシングに関与する既知のエピジェネティック制御因子である。他の機能の中でも、ＰＲＣ２は、ＲｅｐＡ、Ｘｉｓｔ、及びＴｓｉｘなどの長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）と相互反応して、ヒストンＨ３−リシン２７のトリメチル化を触媒する。ＰＲＣ２は、４つのサブユニット、Ｅｅｄ、Ｓｕｚ１２、ＲｂＡｐ４８、及びＥｚｈ２を含む。
【００４３】
本発明の態様は、ＦＯＸＰ３遺伝子を包含するか、又はこの遺伝子と機能的近位にあるゲノム領域内から発現されるＲＮＡ（例えば、ｌｎｃＲＮＡ）のＰＲＣ２関連領域に結合する一本鎖オリゴヌクレオチドが、ＦＯＸＰ３の発現を誘導若しくは増強することができるという認識に関する。ある実施形態では、この上方制御は、ＦＯＸＰ３のＰＲＣ２媒介抑制の阻害によって起こると考えられる。ＦＯＸＰ３は、Ｔ細胞分化及びＴ調節細胞（Ｔｒｅｇ）の活性を駆動する主要制御転写因子である。Ｔｒｅｇは、免疫抑制活性を有し、免疫寛容誘導性応答の促進を補助することができる。Ｔｒｅｇは、免疫反応の終了に向かうＴ細胞媒介免疫のシャットダウン、並びに胸腺における負の選択のプロセスから免れた自己反応性Ｔ細胞の抑制に有用であることが判明している。活性化Ｔ細胞は、病原体及び腫瘍細胞からの宿主の免疫防御にとって重要である。しかし、不適切に活性化した、又は自己反応性のＴ細胞は、例えば、非制御免疫応答又は自己ターゲティング自己免疫応答を引き起こすことによって、有害な作用を及ぼし得る。本明細書では、Ｔ調節状態へのＴ細胞分化及び／又は活性を駆動するために、ＦＯＸＰ３の上方制御を用いることが考慮される。これは、例えば、活性化Ｔ細胞を駆動してＴｒｅｇに分化させるか、又は活性化Ｔ細胞活性を抑制する上で有用となり得る。従って、本発明のいくつかの態様は、ＦＯＸＰ３を上方制御するための組成物及び方法に関する。
【００４４】
本明細書で用いる「ＰＲＣ２関連領域」という用語は、ＰＲＣ２の成分と直接又は間接的に相互作用するヌクレオチドの配列を含むか、又はこれをコードする核酸の領域を指す。ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２と相互作用するＲＮＡ（例えば、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ））内に存在し得る。ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２と相互作用するＲＮＡをコードするＤＮＡ内に存在し得る。ある形態では、ＰＲＣ２関連領域は、「ＰＲＣ２相互作用領域内で」と等価に呼ばれることもある。
【００４５】
ある実施形態において、ＰＲＣ２関連領域は、ＲＮＡを発現する細胞のｉｎ  ｓｉｔｕ紫外線照射に応答してＰＲＣ２の成分に架橋するＲＮＡの領域、又はこのＲＮＡ領域をコードするゲノムＤＮＡの領域である。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２の成分をターゲティングする抗体と免疫沈降するＲＮＡの領域、又はこのＲＮＡ領域をコードするゲノムＤＮＡの領域である。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＳＵＺ１２、ＥＥＤ、ＥＺＨ２又はＲＢＢＰ４（上記のとおりＰＲＣ２の成分である）をと特異的に結合する抗体と共に免疫沈降するＲＮＡの領域、又はこのＲＮＡ領域をコードするゲノムＤＮＡの領域である。
【００４６】
ある実施形態において、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２の成分をターゲティングする抗体を用いたＲＮＡ免疫沈降アッセイにおいてヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ）から保護されるＲＮＡの領域、又はこの保護されたＲＮＡ領域をコードするゲノムＤＮＡの領域である。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＳＵＺ１２、ＥＥＤ、ＥＺＨ２又はＲＢＢＰ４をターゲティングする抗体を用いたＲＮＡ免疫沈降アッセイにおいてヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ）から保護されるＲＮＡの領域、又はこの保護されたＲＮＡ領域をコードするゲノムＤＮＡの領域である。
【００４７】
ある実施形態において、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２の成分をターゲティングする抗体を用いたＲＮＡ免疫沈降アッセイの産物のシークエンシング反応において、比較的高い頻度の配列リード数をもたらすＲＮＡの領域、又はこのＲＮＡ領域をコードするゲノムＤＮＡの領域である。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＳＵＺ１２、ＥＥＤ、ＥＺＨ２又はＲＢＢＰ４と特異的に結合する抗体を用いたＲＮＡ免疫沈降アッセイの産物のシークエンシング反応において、比較的高い頻度の配列リード数をもたらすＲＮＡの領域、又はこの保護されたＲＮＡ領域をコードするゲノムＤＮＡの領域である。このような実施形態において、ＰＲＣ２関連領域は、「ピーク」と呼ばれることもある。
【００４８】
ある実施形態において、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２複合体と相互作用する４０〜６０ヌクレオチドの配列を含む。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２と相互作用するＲＮＡをコードする４０〜６０ヌクレオチドの配列を含む。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２と相互作用する（例えば、４０〜６０ヌクレオチドの）配列を含む、長さ５ｋｂ以下の配列を含む。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２と相互作用することがわかっている（例えば、４０〜６０ヌクレオチドの）配列を有する、長さ５ｋｂ以下の配列を含み、この配列内にＲＮＡがコードされている。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２と相互作用する（例えば、４０〜６０ヌクレオチドの）配列を含む、長さ約４ｋｂの配列を含む。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２と相互作用することがわかっている（例えば、４０〜６０ヌクレオチドの）配列を有する、長さ約４ｋｂの配列を含み、この配列内にＲＮＡがコードされている。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、配列番号９〜２９のいずれか１つに記載されている配列を有する。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、配列番号２４〜２９のいずれか１つに記載されている配列を有する。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、配列番号８〜４５又は４８〜５９のいずれか１つに記載される配列を有する。
【００４９】
ある実施形態では、ＦＯＸＰ３遺伝子を包含するか、又はこの遺伝子と近位にあるゲノム領域内のＰＲＣ２関連領域に特異的に結合するか、又はこれと相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドが提供される。ある実施形態では、配列番号８〜４５又は４８〜５９のいずれか１つに記載される配列を有するＰＲＣ２関連領域に特異的に結合するか、又はこれと相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドが提供される。ある実施形態では、これらの配列番号がマップする（例えば、ヒトゲノムにおいて）対応ゲノム領域からのフランキング配列の最大２ｋｂ、最大５ｋｂ、又は最大１０ｋｂと結合させた、配列番号８〜４５又は４８〜５９のいずれか１つに記載される配列を有するＰＲＣ２関連領域に特異的に結合するか、又はこれと相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドが提供される。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号６０〜４５７１３のいずれか１つに記載の配列を有する。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、表４に記載の配列を有する。
【００５０】
本発明の理論に拘束されるわけではないが、これらのオリゴヌクレオチドは、特定の染色体座へのＰＲＣ２の動員（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）を阻止することにより、ＰＲＣ２の結合及び機能を妨害することができる。例えば、ＰＲＣ２関連領域ｌｎｃＲＮＡに特異的に結合するように設計された一本鎖オリゴヌクレオチドは、ｌｎｃＲＮＡだけではなく、ｌｎｃＲＮＡに結合するＰＲＣ２も、結合クロマチンから安定して置換することができることを示す。置換後、ＰＲＣ２の完全な補体は、２４時間後まで回復されない。さらに、ｌｎｃＲＮＡは、シス（ｃｉｓ）様式でＰＲＣ２を動員して、ｌｎｃＲＮＡが転写された特定の染色体座又はその付近での遺伝子発現を抑制することができる。
【００５１】
ある実施形態では、遺伝子発現を調節する方法が提供され、これらの方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、又はｉｎ  ｖｉｖｏのいずれで実施してもよい。本明細書全体を通して、化合物の使用について述べるときはいずれも、ＦＯＸＰ３のレベル又は活性の低下に関連する病状若しくは疾患の治療（例えば、自己免疫若しくは炎症性疾患又は障害などの異常な免疫細胞活性化に関連する疾患又は障害）に用いるための医薬組成物若しくは薬剤の調製における化合物の使用を考慮することが理解される。従って、非制限的一例として、本発明のこの態様は、疾患の治療に用いるための薬剤の調製におけるこうした一本鎖オリゴヌクレオチドの使用を含み、ここで、治療は、ＦＯＸＰ３の発現を上方制御することを含む。
【００５２】
本発明の別の態様において、ＦＯＸＰ３の発現を活性化するための候補オリゴヌクレオチドを選択する方法が提供される。本方法は、一般に、候補オリゴヌクレオチドとして、ＰＲＣ２関連領域（例えば、配列番号８〜４５又は４８〜５９に記載のヌクレオチド配列）に相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドを選択することを含む。ある実施形態では、ＦＯＸＰ３の発現を活性化するオリゴヌクレオチドが豊富な（例えば、オリゴヌクレオチドの無作為選択と比較して）オリゴヌクレオチドのセットを選択することができる。
【００５３】
ＦＯＸＰ３の発現を調節するための一本鎖オリゴヌクレオチド
本発明の一形態において、細胞でのＦＯＸＰ３の発現を調節するためのＰＲＣ２関連領域と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドが提供される。ある実施形態では、ＦＯＸＰ３の発現が上方制御又は増大される。ある実施形態では、これらのＰＲＣ２関連領域に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドが、長いＲＮＡ転写物とＰＲＣ２との相互作用を阻害することにより、遺伝子発現が上方制御又は増大される。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドが、ＰＲＣ２と長いＲＮＡ転写物との相互作用を阻害し、その結果、ヒストンＨ３のメチル化の低減及び遺伝子不活性化の低減が起こることにより、遺伝子発現が上方制御又は増大される。ある実施形態では、上記の相互作用は、長いＲＮＡの構造の変化によって、ＰＲＣ２との結合が阻止又は低減されるために、破壊又は阻害され得る。ＦＯＸＰ３の発現を活性化するための候補オリゴヌクレオチドを選択するための本明細書に開示する方法のいずれかを用いて、オリゴヌクレオチドを選択することができる。
【００５４】
一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜７、４６、又は４７のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列のＰＲＣ２関連領域と相補的な相補性の領域を含み得る。一本鎖オリゴヌクレオチドの相補性の領域は、ＰＲＣ２関連領域の少なくとも６、例えば、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５個以上の連続したヌクレオチドと相補的であってよい。
【００５５】
ＦＯＸＰ３遺伝子のＰＲＣ２関連領域は、ＦＯＸＰ３遺伝子の５’末端の上流５０キロベースからＦＯＸＰ３遺伝子の３’末端の下流５０キロベースまでの染色体における一位置にマップし得る。例えば、ＦＯＸＰ３遺伝子のＰＲＣ２関連領域は、２００９年２月ＵＣＳＣゲノムアセンブリ（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）に基づき、座標ｃｈｒＸ：４９，０５７，７９５−４９，１６４，９６２内のヒトゲノムの座標Ｘにおける一位置にマップする配列を有し得る。ＰＲＣ２関連領域は、ＦＯＸＰ３遺伝子の５’末端の上流２５キロベースからＦＯＸＰ３遺伝子の３’末端の下流２５キロベースまでの染色体における一位置にマップし得る。ＰＲＣ２関連領域は、ＦＯＸＰ３遺伝子の５’末端の上流１２キロベースからＦＯＸＰ３遺伝子の３’末端の下流１２キロベースまでの染色体における一位置にマップし得る。ＰＲＣ２関連領域は、ＦＯＸＰ３遺伝子の５’末端の上流５キロベースからＦＯＸＰ３遺伝子の３’末端の下流５キロベースまでの染色体における一位置にマップし得る。
【００５６】
ＦＯＸＰ３遺伝子に関して選択されたＰＲＣ２関連領域のゲノム位置は、変動し得る。例えば、ＰＲＣ２関連領域は、ＦＯＸＰ３遺伝子の５’末端の上流であってもよい。ＰＲＣ２関連領域は、ＦＯＸＰ３遺伝子の３’末端の下流であってもよい。ＰＲＣ２関連領域は、ＦＯＸＰ３遺伝子のイントロン内であってもよい。ＰＲＣ２関連領域は、ＦＯＸＰ３遺伝子のエキソン内であってもよい。ＰＲＣ２関連領域は、ＦＯＸＰ３遺伝子のイントロン−エキソン接合部、５’ＵＴＲ−エキソン接合部又は３’ＵＴＲ−エキソン接合部を横断してもよい。
【００５７】
一本鎖オリゴヌクレオチドは、式：Ｘ−Ｙ−Ｚ（Ｘは、任意のヌクレオチドであり、Ｙは、ミクロＲＮＡのヒトシード配列ではない、長さ６ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Ｚは、可変長さのヌクレオチド配列である）を有する配列を含んでもよい。ある実施形態では、Ｘは、オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドである。ある実施形態では、Ｘがオリゴヌクレオチドの５’末端に固定されている場合、オリゴヌクレオチドは、Ｘに５’側で連結されたヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を一切有していない。ある実施形態では、ペプチド又はステロールなどの他の化合物は、これらがヌクレオチド又はヌクレオチド類似体ではない限り、この実施形態において５’末端で連結されていてもよい。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列：５’Ｘ−Ｙ−Ｚを有し、長さが８〜５０ヌクレオチドである。これらの配列特性を有するオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ経路を回避すると予想される。従って、ある実施形態では、これらの配列特性を有するオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ分子として細胞内で機能するという意図しない結果をもたらす可能性が低い。Ｙ配列は、表１に記載する長さ６ヌクレオチドのヌクレオチド配列であってよい。
【００５８】
一本鎖オリゴヌクレオチドは、グアノシンヌクレオチド区間（例えば、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上の連続したグアノシンヌクレオチド）を含まない配列を有してもよい。ある実施形態では、グアノシンヌクレオチド区間を有するオリゴヌクレオチドは、グアノシンヌクレオチド区間のないオリゴヌクレオチドと比較して、増大した非特異的結合及び／又はオフターゲット効果を有する。
【００５９】
一本鎖オリゴヌクレオチドは、オフターゲット遺伝子を包含するか、又はその近位のゲノム位置にマップする、同等の長さの全てのヌクレオチド配列に対して、閾値レベルに満たない配列同一性を有する配列を有してもよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、ＦＯＸＰ３以外のあらゆる既知の遺伝子（例えば、あらゆる既知のタンパク質コード遺伝子）を包含するか、又はその近位のゲノム位置にマップする配列を含まないことを確実にするように設計してもよい。類似の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、いずれか他の既知のＰＲＣ２関連領域、特に、いずれか他の既知の遺伝子（例えば、いずれか他の既知のタンパク質コード遺伝子）に機能的に関連するＰＲＣ２関連領域にマップする配列を含まないことを確実にするように設計してもよい。どちらの場合にも、オリゴヌクレオチドは、オフターゲット効果を有する低い尤度を有すると予想される。配列同一性の閾値レベルは、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％配列同一性であってよい。
【００６０】
一本鎖オリゴヌクレオチドは、それが、少なくとも２つの一本鎖ループを含む二次構造を形成するＲＮＡをコードするＰＲＣ２関連領域と相補的な配列を有してもよい。ある実施形態では、１つ又は複数の一本鎖ループ（例えば、少なくとも２つの一本鎖ループ）を含む二次構造を形成するＲＮＡをコードするＰＲＣ２関連領域と相補的なオリゴヌクレオチドは、無作為に選択したオリゴヌクレオチドと比較して、活性である（例えば、標的遺伝子の発現を活性化又は増強することができる）高い尤度を有することが見出されている。ある形態では、二次構造は、少なくとも２つの一本鎖ループの間に二本鎖ステムを含んでもよい。従って、オリゴヌクレオチドとＰＲＣ２関連領域との間の相補性の領域は、少なくとも１つのループの少なくとも一部をコードするＰＲＣ２関連領域の位置にあってもよい。ある形態では、オリゴヌクレオチドとＰＲＣ２関連領域との間の相補性の領域は、少なくとも２つのループの少なくとも一部をコードするＰＲＣ２関連領域の位置にあってもよい。ある形態では、オリゴヌクレオチドとＰＲＣ２関連領域との間の相補性の領域は、二本鎖ステムの少なくとも一部をコードするＰＲＣ２関連領域の位置にあってもよい。ある実施形態では、（例えば、ｌｎｃＲＮＡの）ＰＲＣ２関連領域を（例えば、ＲＩＰ−Ｓｅｑ方法又はそれから得られる情報を用いて［例えば、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｏｍｂ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＲＮＡｓ  ｂｙ  ＲＩＰ−ｓｅｑ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２０１０  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２２；４０（６）：９３９−９５３を参照］）同定する。ある実施形態では、ＲＮＡ二次構造予測アルゴリズム、例えば、ＲＮＡｆｏｌｄ、ｍｆｏｌｄを用いて、ＰＲＣ２関連領域を含む予測二次構造ＲＮＡ（例えば、ｌｎｃＲＮＡ）を決定する。ある実施形態では、少なくとも２つの一本鎖ループの間に二本鎖ステムを含み得る１つ又は複数の一本鎖ループ（例えば、少なくとも２つの一本鎖ループ）を含む二次構造を形成するＲＮＡの領域をターゲティングするように、オリゴヌクレオチドを設計する。
【００６１】
一本鎖オリゴヌクレオチドは、それが、３０％超のＧ−Ｃ含有率、４０％超のＧ−Ｃ含有率、５０％超のＧ−Ｃ含有率、６０％超のＧ−Ｃ含有率、７０％超のＧ−Ｃ含有率、又は８０％超のＧ−Ｃ含有率を有する配列を有してもよい。一本鎖オリゴヌクレオチドは、最大１００％Ｇ−Ｃ含有率、最大９５％Ｇ−Ｃ含有率、最大９０％Ｇ−Ｃ含有率、又は最大８０％Ｇ−Ｃ含有率を有する配列を有してもよい。オリゴヌクレオチドが、長さ８〜１０ヌクレオチドであるいくつかの実施形態では、ＰＲＣ２関連領域の相補的配列のヌクレオチドの１、２、３、４、若しくは５個を除く全てが、シトシン又はグアノシンヌクレオチドである。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドが相補的であるＰＲＣ２関連領域は、アデニン及びウラシルから選択される３個以下のヌクレオチドを含む。
【００６２】
一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＦＯＸＰ３のその種の相同体を包含する位置、又はその近位の位置で、様々な種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、サルなど）の染色体と相補的であってもよい。一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＦＯＸＰ３遺伝子を含むか、又はその近位のヒトゲノム領域と相同的であってもよいし、また、ＦＯＸＰ３のマウス相同体を包含する、又はその近位のマウスゲノム領域と相同的であってもよい。例えば、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＦＯＸＰ３遺伝子を含む又はその近位のヒトゲノム領域である配列番号１、２、５、６、７、４６、若しくは４７に記載の配列と相同的であってもよいし、また、ＦＯＸＰ３遺伝子のマウス相同体を包含する、又はその近位のマウスゲノム領域である配列番号３若しくは４に記載の配列と相同的であってもよい。これらの特徴を有するオリゴヌクレオチドは、複数の種（例えば、ヒト及びマウス）における効力についてｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験することができる。このアプローチはまた、対象の疾患について適切な動物が存在する種を選択することにより、ヒトの疾患を治療するための臨床候補薬の開発も促進する。
【００６３】
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドの相補性の領域は、ＰＲＣ２関連領域の少なくとも８〜１５、８〜３０、８〜４０、又は１０〜５０、又は５〜５０、又は５〜４０塩基、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、若しくは５０個の連続したヌクレオチドと相補的である。ある実施形態では、相補性の領域は、ＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的である。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドの配列は、ＰＲＣ２に結合するＲＮＡ配列、又はその一部分に基づいており、前記部分は、５〜４０の連続した塩基対、又は約８〜４０、又は約５〜１５、又は約５〜３０、又は約５〜４０、又は約５〜５０塩基の長さを有する。
【００６４】
相補的とは、この用語が当分野で用いられているように、２つのヌクレオチド同士の正確な対合の能力を指す。例えば、オリゴヌクレオチドの特定の位置にあるヌクレオチドが、ＰＲＣ２関連領域の同じ位置のヌクレオチドと水素結合することができれば、その一本鎖オリゴヌクレオチドとＰＲＣ２関連領域は、その位置で互いに相補的であるとみなされる。一本鎖ヌクレオチドとＰＲＣ２関連領域は、各分子内の十分な数の対応位置が、それらの塩基同士が互いに水素結合することができるヌクレオチドにより占められている場合、互いに相補的である。従って、「相補的」とは、こうした安定かつ特異的な結合が、一本鎖ヌクレオチドとＰＲＣ２関連領域との間に起こるのに十分な程度の相補性又は正確な対合を示すために用いられる用語である。例えば、一本鎖ヌクレオチドの一位置にある塩基が、ＰＲＣ２関連領域の対応位置にある塩基と水素結合することができれば、これらの塩基は、その位置で互いに相補的であるとみなされる。１００％の相補性は要求されない。
【００６５】
一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＰＲＣ２関連領域の連続ヌクレオチドと、少なくとも８０％（任意選択で、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）相補的であってよい。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＰＲＣ２関連領域の連続ヌクレオチドの部分と比較して、１、２若しくは３つの塩基ミスマッチを含んでいてもよい。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、１５塩基に対して３つ以下の塩基ミスマッチ、又は１０塩基に対して２つ以下の塩基ミスマッチを有していてもよい。
【００６６】
相補的ヌクレオチド配列が、特異的にハイブリダイズすることが可能なその標的の配列と１００％相補的である必要がないことは当業者には理解されよう。ある実施形態では、本開示が目的とする相補的核酸配列は、この配列と標的分子（例えば、ｌｎｃＲＮＡ）の結合が、標的（例えば、ｌｎｃＲＮＡ）の正常な機能を妨害して、活性の消失（例えば、遺伝子発現の結果として起こる上方制御によるＰＲＣ２関連抑制の阻害）を引き起こし、非特異的結合の回避が要望される条件下で、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ又は治療的処置の場合には、生理学的条件下で、また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ場合には、好適な緊縮条件でアッセイが行われる条件下で、配列と非標的配列との非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性があるとき、特異的にハイブリダイズすることが可能である。
【００６７】
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、長さ７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド又はそれ以上である。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さ８〜３０ヌクレオチドである。
【００６８】
ある実施形態において、ＰＲＣ２関連領域は、遺伝子配列と同じＤＮＡ鎖上に存在する（センス）。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、遺伝子配列と逆のＤＮＡ鎖上に存在する（アンチセンス）。ＰＲＣ２関連領域と相補的なオリゴヌクレオチドは、センス又はアンチセンス配列のいずれかと結合することができる。塩基対合は、正統なワトソン−クリック塩基対合及び非ワトソン−クリック塩基対合（例えば、ゆらぎ（Ｗｏｂｂｌｅ）塩基対合及びフーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）塩基対合）の両方を含んでよい。相補的塩基対合について、アデノシン型塩基（Ａ）は、チミジン型塩基（Ｔ）又はウラシル型塩基（Ｕ）と相補的であり、シトシン型塩基（Ｃ）は、グアノシン型塩基（Ｇ）と相補的であり、また、３−ニトロピロール又は５−ニトロインドールなどのユニバーサル塩基は、Ａ、Ｃ、Ｕ、若しくはＴのいずれともハイブリダイズすることができるため、これらと相補的であるとみなされることは理解されよう。イノシン（Ｉ）も、当分野ではユニバーサル塩基と考えられており、Ａ、Ｃ、Ｕ、若しくはＴのいずれとも相補的であるとみなされる。
【００６９】
ある実施形態において、配列表に示す配列を含む本明細書に記載の配列におけるいずれか１つ又は複数のチミジン（Ｔ）ヌクレオチド（若しくはその修飾ヌクレオチド）又はウリジン（Ｕ）ヌクレオチド（若しくはその修飾ヌクレオチド）を、アデノシンヌクレオチドとの塩基対合（例えば、ワトソン−クリック塩基対による）に好適ないずれか他のヌクレオチドで置換してもよい。ある実施形態では、配列表に示す配列を含む本明細書に記載の配列におけるいずれか１つ又は複数のチミジン（Ｔ）ヌクレオチド（若しくはその修飾ヌクレオチド）又はウリジン（Ｕ）ヌクレオチド（若しくはその修飾ヌクレオチド）を、異なるピリミジンヌクレオチドで好適に置換してもよいし、その逆も可能である。ある実施形態では、配列表に示す配列を含む本明細書に記載の配列におけるいずれか１つ又は複数のチミジン（Ｔ）ヌクレオチド（若しくはその修飾ヌクレオチド）をウリジン（Ｕ）ヌクレオチド（若しくはその修飾ヌクレオチド）で好適に置換してもよいし、その逆も可能である。
【００７０】
ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドのＧＣ含有率は、約３０〜６０％であり得る。実施形態によっては、３つ以上のＧ又はＣが連続して出現するのは好ましくない場合もある。従って、ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、３つ以上のグアノシンヌクレオチドの区間を含まない。
【００７１】
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、単一の連続した転写物（例えば、非スプライスＲＮＡ）としてゲノム（例えば、ヒトゲノム）内でコードされるＲＮＡに特異的に結合するか、又はこれに対して相補的である。ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ゲノム（例えば、ヒトゲノム）内でコードされるＲＮＡに特異的に結合するか、又はこれに対して相補的であり、ここで、上記ゲノムにおいて、ＲＮＡのコード領域の５’末端と、ＲＮＡのコード領域の３’末端との間の距離は、１ｋｂ未満、２ｋｂ未満、３ｋｂ未満、４ｋｂ未満、５ｋｂ未満、７ｋｂ未満、８ｋｂ未満、９ｋｂ未満、１０ｋｂ未満、又は２０ｋｂ未満である。
【００７２】
本明細書に記載するいずれのオリゴヌクレオチドも除外することができることは理解すべきである。
【００７３】
ある実施形態において、本明細書に開示する一本鎖オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現を少なくとも約５０％（すなわち、通常の１５０％、若しくは１．５倍）、又は約２倍〜約５倍増大し得ることが判明している。ある実施形態では、発現は、少なくとも約１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍若しくは１００倍、又はこれら数値のいずれかの間の範囲で増大され得る。増大したｍＲＮＡ発現が、増大したタンパク質発現と相関することも明らかにされている。
【００７４】
ある実施形態において、本明細書に開示する一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、及び／又はＩＬ−１０に対応するｍＲＮＡ若しくはタンパク質の発現を少なくとも約３０％（すなわち、通常の１３０％、若しくは１．３倍）、又は約１．５倍、若しくは約２倍〜約５倍増大し得ることが判明している。ある実施形態では、発現は、少なくとも約５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍若しくは１００倍、又はこれら数値のいずれかの間の範囲で増大され得る。例えば、ＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、及び／又はＩＬ−１０に対応するｍＲＮＡ若しくはタンパク質の発現は、１．３倍〜２倍、１．３倍〜５倍、１．３倍〜１０倍、１．３倍〜２０倍、１．３倍〜５０倍、１．３倍〜１００倍、２倍〜５倍、２倍〜１０倍、２倍〜２０倍、２倍〜１０倍、２倍〜２０倍、２倍〜５０倍、又は２倍〜１００倍の範囲の量で増大され得る。ＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、及び／又はＩＬ−１０についてのヒトｍＲＮＡ及びタンパク質配列識別子の例を以下に記載する。これらの識別子は、本出願の提出日現在、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ検索を用いて、ＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、及び／又はＩＬ−１０の例示的ｍＲＮＡ及びタンパク質配列を同定するのに使用することができる。
【００７５】
ＣＴＬＡ４：ＮＭ＿００１０３７６３１．２、ＮＭ＿００５２１４．４、ＮＰ＿００１０３２７２０．１、ＮＰ＿００５２０５．２
ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８とも呼ばれる）：ＮＭ＿００４１９５．２、ＮＭ＿１４８９０１．１、ＮＭ＿１４８９０２．１、ＮＰ＿００４１８６．１、ＮＰ＿６８３６９９．１、ＮＰ＿６８３７００．１
ＩＬ−１０：ＮＭ＿０００５７２．２、ＮＰ＿０００５６３．１
【００７６】
ある実施形態において、本明細書に開示する一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞の数を少なくとも約３０％（すなわち、通常の１３０％、若しくは１．３倍）、又は約１．５倍、若しくは約２倍〜約５倍増加し得ることが判明している。ある実施形態では、数は、少なくとも約５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍若しくは１００倍、又はこれら数値のいずれかの間の範囲で増加され得る。例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞の数は、１．３倍〜２倍、１．３倍〜５倍、１．３倍〜１０倍、１．３倍〜２０倍、１．３倍〜５０倍、１．３倍〜１００倍、２倍〜５倍、２倍〜１０倍、２倍〜２０倍、２倍〜１０倍、２倍〜２０倍、２倍〜５０倍、２倍〜１００倍の範囲の量で増加され得る。
【００７７】
本明細書に記載するオリゴヌクレオチド、又はそれらを設計若しくは合成する方法の実施形態のいくつか若しくはいずれかにおいて、オリゴヌクレオチドは、遺伝子発現を上方制御し、タンパク質コード標準遺伝子と同じ鎖から転写されるＰＲＣ２結合ＲＮＡと特異的に結合するか、又は特異的にハイブリダイズするか、又はそれと相補的であるかのいずれであってもよい。オリゴヌクレオチドは、標準遺伝子（ｒｅｆＧｅｎｅ）のタンパク質コードセンス鎖のイントロン、エキソン、イントロン−エキソン接合部、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、翻訳開始領域、又は翻訳終結領域内で始まるか、又はこれと重複するＰＲＣ２結合ＲＮＡの領域に結合してもよい。
【００７８】
本明細書に記載するオリゴヌクレオチド、又はそれらを設計若しくは合成する方法の実施形態のいくつか若しくはいずれかにおいて、オリゴヌクレオチドは、遺伝子発現を上方制御し、タンパク質コード標準遺伝子と逆の鎖（アンチセンス鎖）から転写されるＰＲＣ２結合ＲＮＡと特異的に結合するか、又は特異的にハイブリダイズするか、又はそれと相補的であるかのいずれであってもよい。オリゴヌクレオチドは、標準遺伝子のタンパク質コードアンチセンス鎖のイントロン、エキソン、イントロン−エキソン接合部、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、翻訳開始領域、又は翻訳終結領域内で始まるか、又はこれと重複するＰＲＣ２結合ＲＮＡの領域に結合してもよい。
【００７９】
本明細書に記載するオリゴヌクレオチドは、修飾されていてもよく、例えば、修飾された糖部分、修飾されたヌクレオシド間結合、修飾されたヌクレオチド及び／又はこれらの組合せを含んでもよい。さらに、オリゴヌクレオチドは、以下に挙げる特性の１つ又は複数を呈示するものであってよい：標的ＲＮＡの実質的な切断又は分解を誘導しない；標的ＲＮＡの実質的に完全な切断又は分解を引き起こさない；ＲＮＡｓｅ  Ｈ経路を活性化しない；ＲＩＳＣを活性化しない；アルゴノート（Ａｒｇｏｎａｕｔｅ）ファミリータンパク質を一切動員しない；ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）により切断されない；選択的スプライシングを媒介しない；免疫刺激賦活性ではない；ヌクレアーゼ耐性である；非修飾オリゴヌクレオチドと比較して向上した細胞取込みを有する；細胞又は哺乳動物に対して毒性ではない；エンドソーム離脱の向上をもたらし得る；ｌｎｃＲＮＡと、ＰＲＣ２、好ましくはＥｚｈ２サブユニット、また任意選択ではあるが、Ｓｕｚ１２、Ｅｅｄ、ＲｂＡｐ４６／４８サブユニット若しくはＪａｒｉｄ２などの副因子との相互作用を妨害する；ヒストンＨ３リシン２７メチル化を低減する、及び／又は遺伝子発現を上方制御する。
【００８０】
ＲＮＡと相互作用して、遺伝子発現を調節するように設計されたオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ標的に結合するように設計されたものとは別個の塩基配列のサブセットである（例えば、ＲＮＡが転写される基礎ゲノムＤＮＡ配列と相補的である）。
【００８１】
本明細書に開示するオリゴヌクレオチドのいずれも、リンカー、例えば、切断可能なリンカーによって、本明細書に開示する１つ又は複数の他のオリゴヌクレオチドと連結してもよい。
【００８２】
ＦＯＸＰ３の発現を活性化するための候補オリゴヌクレオチドを選択する方法
ＦＯＸＰ３の発現を活性化又は増強するための候補オリゴヌクレオチドを選択する方法が本明細書において提供される。標的選択方法は、概して、本明細書に開示する構造的及び機能的特徴のいずれかを有する一本鎖オリゴヌクレオチドを選択するステップを含み得る。典型的に、本方法は、ＦＯＸＰ３と機能的に関連するＰＲＣ２関連領域、例えば、ＦＯＸＰ３遺伝子に対するＰＲＣ２の動員を促進する（例えば、シス（ｃｉｓ）調節様式で）ことにより、ＦＯＸＰ３の発現を調節するｌｎｃＲＮＡのＰＲＣ２関連領域をターゲティングするオリゴヌクレオチドを同定することを目標とする１つ又は複数のステップを含む。このようなオリゴヌクレオチドは、核酸（例えば、ｌｎｃＲＮＡ）のＰＲＣ２関連領域とハイブリダイズするそれらの能力のために、ＦＯＸＰ３の発現を活性化する候補であると予想される。ある実施形態では、このハイブリダイゼーションイベントは、ＰＲＣ２と核酸（例えば、ｌｎｃＲＮＡ）との相互作用を破壊し、これにより、ＦＯＸＰ３遺伝子座に対するＰＲＣ２及びその関連共抑制因子（例えば、クロマチン再構成因子）の動員を破壊すると理解されている。
【００８３】
候補オリゴヌクレオチドを選択する方法は、ＦＯＸＰ３遺伝子を含むか、又はその近位の染色体位置（例えば、配列番号１〜７、４６、若しくは４７のいずれか１つに記載の配列を有する染色体位置）にマップするＰＲＣ２関連領域（例えば、配列番号８〜４５又は４８〜５９のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列）を選択するステップを含み得る。ＰＲＣ２関連領域は、ＦＯＸＰ３遺伝子のセンス鎖を含む染色体の鎖に位置していてもよく、この場合、候補オリゴヌクレオチドは、ＦＯＸＰ３遺伝子のセンス鎖と相補的である（すなわち、ＦＯＸＰ３遺伝子に対してアンチセンスである）。あるいは、ＰＲＣ２関連領域は、ＦＯＸＰ３遺伝子のアンチセンス鎖を含む第１染色体の鎖に位置していてもよく、この場合、オリゴヌクレオチドは、ＦＯＸＰ３遺伝子のアンチセンス鎖（鋳型鎖）と相補的である（すなわち、ＦＯＸＰ３遺伝子に対してセンスである）。
【００８４】
ＦＯＸＰ３の発現を活性化するオリゴヌクレオチドが豊富な候補オリゴヌクレオチドのセットを選択する方法は、ＦＯＸＰ３遺伝子を包含するか、又はその近傍にある染色体位置に位置する１つ又は複数のＰＲＣ２関連領域を選択すること及びオリゴヌクレオチドのセットを選択することを含んでもよく、ここで、上記セットにおける各オリゴヌクレオチドは、１つ又は複数のＰＲＣ２関連領域と相補的なヌクレオチド配列を含む。本明細書で用いる「発現を活性化するオリゴヌクレオチドが豊富なオリゴヌクレオチドのセット」というフレーズは、上記の豊富なセットと同じ物理化学的特性（例えば、同じＧＣ含有率、Ｔｍ、長さなど）のオリゴヌクレオチドの無作為選択と比較して、標的遺伝子（例えば、ＦＯＸＰ３）の発現を活性化するオリゴヌクレオチドの数をより多く有するオリゴヌクレオチドのセットを指す。
【００８５】
一本鎖オリゴヌクレオチドの設計及び／又は合成が、このような配列情報により記載される核酸又はＰＲＣ２関連領域と相補的な配列の設計及び／又は合成を含む場合、当業者は、例えば、当分野における一般的知識の一部を成すワトソン−クリック塩基対合の理解により、相補的配列を容易に決定することができる。
【００８６】
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドの設計及び／又は合成は、当業者には公知の技術により出発材料からオリゴヌクレオチドを製造することを含み、その際、合成は、ＰＲＣ２関連領域の配列、又はその一部に基づいて実施してよい。
【００８７】
一本鎖オリゴヌクレオチドの設計及び／又は合成の方法は、以下：
ＰＲＣ２関連領域を同定する、及び／又は選択するステップ；
ＰＲＣ２関連領域若しくはその一部に対し、要望される程度の配列同一性又は相補性を有する核酸配列を設計するステップ；
一本鎖オリゴヌクレオチドを、設計した配列に合成するステップ；
合成した一本鎖オリゴヌクレオチドを精製するステップ；並びに
任意選択で、合成した一本鎖オリゴヌクレオチドを少なくとも１種の薬学的に許容される希釈剤、担体若しくは賦形剤と混合することにより、医薬組成物又は薬剤を形成するステップ
のうち１つ又は複数を含み得る。
【００８８】
このように設計及び／又は合成した一本鎖オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載するように、遺伝子発現を調節する方法に有用となり得る。
【００８９】
好ましくは、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、化学的に合成される。本発明を実施するのに用いられるオリゴヌクレオチドは、公知の化学的合成技術により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成することができる。
【００９０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾、例えば、ヌクレオチド修飾などにより、核酸分解に対して安定化することができる。例えば、本発明の核酸配列は、ヌクレオチド配列の５’又は３’末端にホスホロチオエートの、少なくとも第１、第２、若しくは第３ヌクレオチド間結合を含む。別の例として、核酸配列は、２’−修飾ヌクレオチド、例えば、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、又は２’−Ｏ−−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−−ＮＭＡ）を含んでよい。別の例として、核酸配列は、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル−修飾ヌクレオチドを含んでよく、ある実施形態では、ヌクレオチドの全てが、２’−Ｏ−メチル−修飾を含む。ある実施形態では、核酸は、「ロック」されている、すなわち、２’−Ｏ原子と４’−Ｃ原子とをつなぐメチレン架橋により、リボース環が「ロック」されている核酸類似体を含む。
【００９１】
本明細書に記載する一本鎖オリゴヌクレオチドの修飾された化学又はフォーマットのいずれかを互いに組み合わせることができること、並びに、同じ分子内に１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つ以上の異なるタイプの修飾を含有させてもよいことは理解されよう。
【００９２】
ある実施形態において、本方法は、合成された一本鎖オリゴヌクレオチドを増幅するステップ、及び／又は一本鎖オリゴヌクレオチド（若しくは増幅された一本鎖オリゴヌクレオチド）を精製するステップ、並びに／又はこのようにして得られた一本鎖オリゴヌクレオチドを配列決定するステップをさらに含んでもよい。
【００９３】
従って、一本鎖オリゴヌクレオチドを調製する方法は、疾患の治療に用いるための医薬組成物又は薬剤の製造に使用される方法であってもよく、任意選択で、上記治療は、ＰＲＣ２関連領域に関連する遺伝子の発現を調節することを含む。
【００９４】
前述した方法において、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２に結合するＲＮＡを同定することを含む方法により、同定若しくは取得することができ、あるいは、同定若しくは取得されている。
【００９５】
このような方法は、以下のステップを含む：核リボ核酸を含有するサンプルを用意するステップ、このサンプルを、ＰＲＣ２又はそのサブユニットと特異的に結合する物質と接触させるステップ、上記物質とサンプル中のタンパク質同士で複合体を形成させるステップ、複合体を分配するステップ、複合体中に存在する核酸と相補的な核酸を合成するステップ。
【００９６】
一本鎖オリゴヌクレオチドが、ＰＲＣ２関連領域、又はこのような配列の一部に基づいている場合、これは、その配列に関する情報、例えば、文書又は電子形態で入手可能な配列情報を基にしてよく、こうした情報は、一般に入手可能な科学出版物又は配列データベースに含まれる配列情報を含み得る。
【００９７】
ヌクレオチド類似体
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個のリボヌクレオチド、少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチド、及び／又は少なくとも１個の架橋ヌクレオチドを含んでもよい。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ｂａｓｅｓ）（（ＬＮＡ）ヌクレオチド、拘束エチル（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｅｔｈｙｌ）（ｃＥｔ）ヌクレオチド、又はエチレン架橋型拡散（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ＥＮＡ）ヌクレオチドなどの架橋ヌクレオチドを含んでもよい。このようなヌクレオチドの例は本発明に開示しており、当分野でも公知である。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、以下の米国特許又は米国特許出願：米国特許第７，３９９，８４５号明細書、米国特許７，７４１，４５７号明細書、米国特許８，０２２，１９３号明細書、米国特許７，５６９，６８６号明細書、米国特許７，３３５，７６５号明細書、米国特許第７，３１４，９２３号明細書、米国特許第７，３３５，７６５号明細書、米国特許第７，８１６，３３３号明細書、米国特許第２０１１０００９４７１号明細書の１つに開示されているヌクレオチド類似体を含み、これら文献の各々の全内容は、あらゆる目的のために本明細書に参照により組み込む。オリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の２’Ｏ−メチルヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、２’Ｏ−メチルヌクレオチドから完全に構成されていてもよい。
【００９８】
多くの場合、一本鎖オリゴヌクレオチドは、１つ又は複数のヌクレオチド類似体を有する。例えば、一本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含まないオリゴヌクレオチドと比較して、１℃、２℃、３℃、４℃、又は５℃の範囲でオリゴヌクレオチドのＴｍに上昇をもたらす少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含んでもよい。一本鎖オリゴヌクレオチドは、複数のヌクレオチド類似体を含んでもよく、これにより、ヌクレオチド類似体を含まないオリゴヌクレオチドと比較して、合計で２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃又はそれ以上の範囲でオリゴヌクレオチドのＴｍに上昇をもたらす。
【００９９】
オリゴヌクレオチドは、長さ５０ヌクレオチド以下であってよく、ここで、オリゴヌクレオチドの２〜１０、２〜１５、２〜１６、２〜１７、２〜１８、２〜１９、２〜２０、２〜２５、２〜３０、２〜４０、２〜４５、又はそれ以上の個数のヌクレオチドがヌクレオチド類似体である。オリゴヌクレオチドは、長さ８〜３０ヌクレオチドであってよく、ここで、オリゴヌクレオチドの２〜１０、２〜１５、２〜１６、２〜１７、２〜１８、２〜１９、２〜２０、２〜２５、２〜３０のヌクレオチドがヌクレオチド類似体である。オリゴヌクレオチドは、長さ８〜１５ヌクレオチドであってよく、ここで、オリゴヌクレオチドの２〜４、２〜５、２〜６、２〜７、２〜８、２〜９、２〜１０、２〜１１、２〜１２、２〜１３、２〜１４のヌクレオチドがヌクレオチド類似体である。任意選択で、オリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個の修飾ヌクレオチドを除いて、全てのヌクレオチドを有してもよい。
【０１００】
オリゴヌクレオチドは、架橋ヌクレオチド（例えば、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド）から完全に構成されていてもよい。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドを交互に含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを交互に含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドとＥＮＡヌクレオチドを交互に含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドとＬＮＡヌクレオチドを交互に含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを交互に含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、架橋ヌクレオチド（例えば、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド）である５’ヌクレオチドを有していてもよい。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである５’ヌクレオチドを有していてもよい。
【０１０１】
オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドの５’及び３’末端の各々で、少なくとも１つの架橋ヌクレオチド（例えば、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド）によりフランキングされるデオキシリボヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドの５’及び３’末端の各々で、１、２、３、４、５、６、７、８又はそれ以上の架橋ヌクレオチド（例えば、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド）によってフランキングされているデオキシリボヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドの３’位は、３’ヒドロキシル基を有してもよい。オリゴヌクレオチドの３’位は、３’チオリン酸塩を有してもよい。
【０１０２】
オリゴヌクレオチドは、標識と結合させてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、その５’又は３’末端で、ビオチン部分、コレステロール、ビタミンＡ、葉酸塩、シグマ受容体リガンド、アプタマー、ＣＰＰなどのペプチド、脂質などの疎水性分子、ＡＳＧＰＲ又は動的ポリ抱合体並びにそれらの変異体と結合させてもよい。
【０１０３】
好ましくは、一本鎖オリゴヌクレオチドは、以下：修飾された糖部分、及び／又は修飾されたヌクレオチド間結合、及び／又は修飾されたヌクレオチド及び／又はそれらの組合せを含む１つ又は複数の修飾を含む。所与のオリゴヌクレオチドにおける全ての位置が均一に修飾されている必要はなく、実際には、本明細書に記載する修飾の２つ以上を単一のオリゴヌクレオチド内に、又は１オリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオチドに組み込んでもよい。
【０１０４】
ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、各々が少なくとも１個のヌクレオチドから構成される２つ以上の化学的に別個の領域を含むキメラオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的に、１つ又は複数の有益な特性（例えば、ヌクレアーゼ耐性の増大、細胞内への取込みの増大、標的に対する結合親和性の増大）を賦与する修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つの領域と、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素の基質である１領域を含む。本発明のキメラ一本鎖オリゴヌクレオチドは、前述したように、２つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド及び／又はオリゴヌクレオチド模倣物の複合構造体として形成してもよい。このような化合物は、当分野では、ハイブリッド又はギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）とも呼ばれている。こうしたハイブリッド構造体の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定しないが、以下のものがある：米国特許第５，０１３，８３０号明細書；第５，１４９，７９７号明細書；第５，２２０，００７号明細書；第５，２５６，７７５号明細書；第５，３６６，８７８号明細書；第５，４０３，７１１号明細書；第５，４９１，１３３号明細書；第５，５６５，３５０号明細書；第５，６２３，０６５号明細書；第５，６５２，３５５号明細書；第５，６５２，３５６号明細書；及び第５，７００，９２２号明細書。尚、これら文献の各々は、本明細書に参照により組み込むものとする。
【０１０５】
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、糖の２’位で修飾された少なくとも１個のヌクレオチド、最も好ましくは２’−Ｏ−アルキル−、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル又は２’−フルオロ−修飾ヌクレオチドを含む。別の好ましい実施形態では、ＲＮＡ修飾は、ピリミジンのリボース上に２’−フルオロ、２’−アミノ及び２’−Ｏ−メチル−修飾ヌクレオチド、ＲＮＡの３’末端に脱塩基残基若しくは逆方法塩基を含む。こうした修飾は、常用の方法でオリゴヌクレオチドに組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対して、２’−デオキシオリゴヌクレオチドより高いＴｍ（すなわち、より高い標的結合親和性）を有することがわかっている。
【０１０６】
いくつかのヌクレオチド及びヌクレオシド修飾が、それらを組み込んだオリゴヌクレオチドを、ネイティブオリゴデオキシヌクレオチドより、ヌクレアーゼ消化に対して耐性にすることが明らかにされており；これらの修飾されたオリゴは、非修飾オリゴヌクレオチドより長時間にわたってインタクトのまま生存する。最も好ましい修飾オリゴヌクレオチドは、修飾された骨格を含むものがあり、例えば、ホスホロチオエート、リン酸トリエステル、メチルホスホネート、単鎖アルキル若しくはシクロアルキル糖間結合又は単鎖ヘテロ原子又は複素環式糖間結合が挙げられる。例としては、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド及びヘテロ原子骨格を有するものであり、特に、以下のものである：ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ、〜Ｎ（ＣＨ３）〜Ｏ〜ＣＨ２（メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られる）、ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２及びＯ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２骨格（ここで、ネイティブリン酸ジエステル骨格は、Ｏ−Ｐ−−Ｏ−ＣＨのように表される）；アミド骨格（Ｄｅ  Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｃｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９５，２８：３６６−３７４を参照）；モルホリノ骨格構造（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ及びＷｅｌｌｅｒ、米国特許第５，０３４，５０６号明細書を参照）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（ここで、オリゴヌクレオチドのリン酸ジエステル骨格は、ポリアミド骨格で置換されており、ヌクレオチドは、ポリアミド骨格のアザ窒素原子と直接又は間接的に結合している；Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１，２５４，１４９７を参照）。リン含有結合としては、限定しないが、ホスホロチオエート、キメラホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、３’アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートなどのメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィン酸塩、３’−アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートなどのホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルリン酸トリエステル、並びに通常の３’−５’結合を有するボラノリン酸塩、これらの２’−５’結合類似体、並びに逆転極性を有するもの（ここで、ヌクレオシド単位の隣接する対は、３’−５’から５’−３’に、又は２’−５’から５’−２’に連結される）を含む；米国特許第３，６８７，８０８号明細書；同第４，４６９，８６３号明細書；同第４，４７６，３０１号明細書；同第５，０２３，２４３号明細書；同第５，１７７，１９６号明細書；同第５，１８８，８９７号明細書；同第５，２６４，４２３号明細書；同第５，２７６，０１９号明細書；同第５，２７８，３０２号明細書；同第５，２８６，７１７号明細書；同第５，３２１，１３１号明細書；同第５，３９９，６７６号明細書；同第５，４０５，９３９号明細書；同第５，４５３，４９６号明細書；同第５，４５５，２３３号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７６，９２５号明細書；同第５，５１９，１２６号明細書；同第５，５３６，８２１号明細書；同第５，５４１，３０６号明細書；同第５，５５０，１１１号明細書；同第５，５６３，２５３号明細書；同第５，５７１，７９９号明細書；同第５，５８７，３６１号明細書；同第５，６２５，０５０号明細書を参照。
【０１０７】
モルホリノベースのオリゴマー化合物は、以下：Ｄｗａｉｎｅ  Ａ．Ｂｒａａｓｃｈ及びＤａｖｉｄ  Ｒ．Ｃｏｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１（１４），４５０３−４５１０）；Ｇｅｎｅｓｉｓ，ｖｏｌｕｍｅ  ３０，ｉｓｓｕｅ  ３，２００１；Ｈｅａｓｍａｎ，Ｊ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２００２，２４３，２０９−２１４；Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０００，２６，２１６−２２０；Ｌａｃｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２０００，９７，９５９１−９５９６；並びに１９９１年７月２３日に発行された米国特許第５，０３４，５０６号明細書に記載されている。ある実施形態では、モルホリノベースのオリゴマー化合物は、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）である（例えば、Ｉｖｅｒｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，３：２３５−２３８，２００１；及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．，１２：３５４−３６４，２０１０に記載されている通り；これらの開示内容は、本明細書に参照により全体を組み込むものとする）。
【０１０８】
シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣物は、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０００，１２２，８５９５−８６０２に記載されている。
【０１０９】
リン原子を内部に含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１つ又は複数の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合（一部がヌクレオシドの糖部分から形成される）；シクロサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びフルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファミメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；並びにＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分の混合部分を有する他の骨格であり；以下を参照されたい：米国特許第５，０３４，５０６号明細書；同第５，１６６，３１５号明細書；同第５，１８５，４４４号明細書；同第５，２１４，１３４号明細書；同第５，２１６，１４１号明細書；同第５，２３５，０３３号明細書；同第５，２６４，５６２号明細書；同第５，２６４，５６４号明細書；同第５，４０５，９３８号明細書；同第５，４３４，２５７号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７０，９６７号明細書；同第５，４８９，６７７号明細書；同第５，５４１，３０７号明細書；同第５，５６１，２２５号明細書；同第５，５９６，０８６号明細書；同第５，６０２，２４０号明細書；同第５，６１０，２８９号明細書；同第５，６０２，２４０号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第５，６１０，２８９号明細書；同第５，６１８，７０４号明細書；同第５，６２３，０７０号明細書；同第５，６６３，３１２号明細書；同第５，６３３，３６０号明細書；同第５，６７７，４３７号明細書；及び同第５，６７７，４３９号明細書。尚、これらの文献は各々、本明細書に参照により組み込む。
【０１１０】
また、アラビノヌクレオチド又は修飾されたアラビノヌクレオチド残基に基づく、又はそれらから構築されるオリゴヌクレオチドを含む修飾オリゴヌクレオチドも知られている。アラビノヌクレオチドは、リボヌクレオシドの立体異性体であり、糖環の２’位の立体配置だけが異なる。ある実施形態では、２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆアラビノである。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、２’−フルオロ−Ｄ−アラビノ核酸（ＦＡＮＡ）である（例えば、Ｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４１：３４５７−３４６７，２００２及びＭｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１２：２６５１−２６５４，２００２；に記載されている通り；これらの開示内容は、本明細書に参照により全体を組み込むものとする）。また、同様の修飾を糖の他の位置、特に３’末端ヌクレオシド上又は２’−５’結合オリゴヌクレオチド内の糖の３’位、及び５’末端ヌクレオチドの５’位に実施することもできる。
【０１１１】
ＰＣＴ公開番号：国際公開第９９／６７３７８号パンフレットは、相補的メッセンジャーＲＮＡとの結合による遺伝子発現の配列特異的阻害向上を目的とするアラビノ核酸（ＡＮＡ）オリゴマー及びその類似体を開示している。
【０１１２】
他の好ましい修飾としては、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）がある（例えば、国際公開第２００５／０４２７７７号パンフレット、Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，Ｓｕｐｐｌ  １：２４１−２４２，２００１；Ｓｕｒｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１５：７４９−７５７，２００４；Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，８：１４４−１４９，２００６及びＨｏｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ（Ｏｘｆ），４９：１７１−１７２，２００５；これらの開示内容は、本明細書に参照により全体を組み込むものとする）。好ましいＥＮＡとしては、限定しないが、２’−Ｏ、４’−Ｃ−エチレン架橋核酸が挙げられる。
【０１１３】
ＬＮＡの例は、国際公開第２００８／０４３７５３号パンフレットに記載されており、下記の一般式：
【化１】
2016521556.tif 000003
の組成物を含み、
式中、Ｘ及びＹは、独立に、基−Ｏ−、
−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）−、Ｎ（Ｒ）−、−ＣＨ２−又は−ＣＨ−（二重結合の一部である場合）、
−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−又は−ＣＨ２−ＣＨ−（二重結合の一部である場合）、
−ＣＨ＝ＣＨ−
の群から選択され、ここで、Ｒは、水素及びＣ１〜４−アルキルから選択され；Ｚ及びＺ＊は、独立に、ヌクレオシド間結合、末端基又は保護基から選択され；Ｂは、天然若しくは非天然ヌクレオチド塩基部分を構成し；いずれかの配向に非対称基が存在してもよい。
【０１１４】
好ましくは、本発明に記載されるオリゴヌクレオチドオリゴマーに用いられるＬＮＡは、下記式：
【化２】
2016521556.tif 000004
のいずれかに従う少なくとも１つのＬＮＡ単位を含み、
式中、Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、若しくはＮ（ＲＨ）−であり；Ｚ及びＺ＊は、独立に、ヌクレオシド間結合、末端基又は保護基から選択され；Ｂは、天然若しくは非天然ヌクレオチド塩基部分を構成し；ＲＨは、水素及びＣ１〜４−アルキルから選択される。
【０１１５】
ある実施形態において、本発明に記載されるオリゴヌクレオチドにおいて使用されるロックド核酸（ＬＮＡ）は、ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２のスキーム２に示される式のいずれかに従う少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）単位を含む。
【０１１６】
ある実施形態において、本発明のオリゴマーに用いられるＬＮＡは、以下：−０−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−０−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−０−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（ＲＨ）−Ｏ−、Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＲＨ）−Ｏ−、−０−ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−から選択されるヌクレオシド間結合を含み、ここで、ＲＨは、水素及びＣ１〜４−アルキルから選択される。
【０１１７】
特に好ましいＬＮＡ単位を以下のスキーム２に示す。
【化３】
2016521556.tif 000005
【０１１８】
「チオ−ＬＮＡ」という用語は、前記一般式におけるＸ又はＹの少なくとも１つが、Ｓ又は−ＣＨ２−Ｓ−から選択される、ロックドヌクレオチドを含む。チオ−ＬＮＡは、β−Ｄ及びα−Ｌ−立体配置のいずれであってもよい。
【０１１９】
「アミノ−ＬＮＡ」という用語は、前記一般式におけるＸ又はＹの少なくとも１つが、−Ｎ（Ｈ）−、Ｎ（Ｒ）−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−、及び−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−（Ｒは、水素及びＣ１〜４−アルキルから選択される）から選択される、ロックドヌクレオチドを含む。アミノ−ＬＮＡは、β−Ｄ及びα−Ｌ−立体配置のいずれであってもよい。
【０１２０】
「オキシ−ＬＮＡ」という用語は、前記一般式におけるＸ又はＹの少なくとも１つが、−Ｏ−又は−ＣＨ２−Ｏ−を示す、ロックドヌクレオチドを含む。オキシ−ＬＮＡは、β−Ｄ及びα−Ｌ−立体配置のいずれであってもよい。
【０１２１】
「エナ−ＬＮＡ」という用語は、前記一般式におけるＹが、−ＣＨ２−Ｏ−である（−ＣＨ２−Ｏ−の酸素原子は、塩基Ｂに対して２’−位置に結合している）ロックドヌクレオチドを含む。
【０１２２】
ＬＮＡは、本明細書でさらに詳しく説明する。
【０１２３】
また、１つ又は複数の置換された糖部分を含んでもよく、例えば、２’位置にある以下のものの１つが挙げられる：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３ＯＣＨ３、ＯＣＨ３Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２又はＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ｎは、１〜約１０である）；Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換された低級アルキル、アルカリル若しくはアルキリル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ−、Ｓ−、若しくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、若しくはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換されたシリル；ＲＮＡ切断性基（ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）；リポータ基；インターカレータ；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を向上させるための基；又はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を向上させるための基並びに同様の特性を有する他の置換基。好ましい修飾には、２’−メトキシエトキシ［２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、また、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）としても知られる］がある（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ，ＨｅＩｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６）。他の好ましい修飾としては、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−プロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。また、類似の修飾をオリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位及び５’末端ヌクレオチドの５’位に実施してもよい。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル基に代わりシクロブチルなどの糖模倣物を有していてもよい。
【０１２４】
一本鎖オリゴヌクレオチドはまた、上記に加え、又は代わって、核酸塩基（一般に、当分野では単純に「塩基」と呼ぶ）修飾又は置換を含んでもよい。本明細書で用いる「非修飾」又は「天然の」ヌクレアーゼは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾された核酸塩基は、天然の核酸に稀に又は一時的にしか認められない核酸塩基、例えば、以下を含む：ヒポキサチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン、特に、５−メチルシトシン（５−メチル−２’−デオキシシトシンとも呼ばれ、当分野では５−Ｍｅ−Ｃと呼ばれることが多い）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ及びゲントビオシルＨＭＣ、イソシトシン、プソイドイソシトシン、並びに合成の核酸塩基、例えば、２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾリルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ）アデニン、又は他のヘテロ置換されたアルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−プロピルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン、６−アミノプリン、２−アミノプリン、２−クロロ−６−アミノプリン及び２，６−ジアミノプリン又は他のジアミノプリン。例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，“ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８０，ｐｐ７５−７７；Ｇｅｂｅｙｅｈｕ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５：４５１３（１９８７））を参照。例えば、イノシンなどの当技術分野において周知の「ユニバーサル」塩基も含んでよい。５−Ｍｅ−Ｃ置換は、核酸二重らせんの安定性を０．６〜１．２℃増大することが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｃｒｏｏｋｅ，及びＬｅｂｌｅｕ，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｃｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、これを塩基置換として用いてよい。
【０１２５】
所与のオリゴヌクレオチドにおける全ての位置が均一に修飾されている必要はなく、実際には、本明細書に記載する修飾の２つ以上を単一のオリゴヌクレオチド内に、あるいは、１オリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオチドに組み込んでもよい。
【０１２６】
ある実施形態において、糖及びヌクレオシド間結合の両方、すなわちヌクレオチド単位の骨格を新しい基で置換する。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持する。こうしたオリゴマー化合物の１つ、すなわち優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、例えば、アミノエチルグリシン骨格で置換されている。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子と直接又は間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的米国特許としては、限定しないが、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；同第５，７１４，３３１号明細書；及び同第５，７１９，２６２号明細書が挙げられ、これらは各々、参照により本明細書に組み込む。ＰＮＡ化合物についての別の教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００に見出すことができる。
【０１２７】
一本鎖オリゴヌクレオチドはまた、１つ又は複数の核酸塩基（多くの場合、当分野では単に「塩基」と呼ばれる）修飾又は置換を含んでもよい。本明細書で用いる「非修飾」又は「天然の」核酸塩基は、プリン塩基のアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾された核酸塩基は、他の合成及び天然核酸塩基、例えば、以下を含む：５−メチルシトシン（５−Ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイド−ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、並びに他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、とりわけ５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニン。
【０１２８】
さらに、核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されているもの、“Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，８５８〜８５９頁，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの；Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｌｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１，３０，６１３頁により開示されているもの、並びにＳａｎｇｈｖｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，２８９〜３０２頁，Ｃｒｏｏｋｅ，及びＬｅｂｌｅｕ，ｅｄｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３によって開示されているものを含む。これら核酸塩基のいくつかは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増大するのにとりわけ有用である。このようなものとして、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、並びにＮ−２、Ｎ−６及び０−６置換プリンが挙げられ、これらは、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、並びに５−プロピニルシトシンを含む。５−メチルシトシン置換は、核酸二重らせんの安定性を０．６〜１．２℃増大することが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、これらは好ましい塩基置換を示しており、特に、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組合せた場合、さらに好ましい塩基置換である。修飾された核酸塩基は、以下：米国特許第３，６８７，８０８号明細書、並びに同第４，８４５，２０５号明細書；同第５，１３０，３０２号明細書；同第５，１３４，０６６号明細書；同第５，１７５，２７３号明細書；同第５，３６７，０６６号明細書；同第５，４３２，２７２号明細書；同第５，４５７，１８７号明細書；同第５，４５９，２５５号明細書；同第５，４８４，９０８号明細書；同第５，５０２，１７７号明細書；同第５，５２５，７１１号明細書；同第５，５５２，５４０号明細書；同第５，５８７，４６９号明細書；同第５，５９６，０９１号明細書；同第５，６１４，６１７号明細書；同第５，７５０，６９２号明細書、及び同第５，６８１，９４１号明細書に記載されており、これらは各々、参照により本明細書に組み込む。
【０１２９】
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、又は細胞の取込みを増強する、１つ又は複数の部分若しくはコンジュゲートに化学的に連結させる。例えば、同じ、若しくは異なるタイプの１つ又は複数の一本鎖オリゴヌクレオチドを互いに結合させることができ；又は一本鎖オリゴヌクレオチドを１細胞型若しくは組織型に対して増強された特異性を有するターゲティング部分と結合させることができる。このような部分としては、限定しないが、以下のものが挙げられる：コレステロール部分などの脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４；Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９０，１８，３７７７−３７８３）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｃｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５，１４，９６９−９７３）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９９５，１２６４、２２９−２３７）、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ−カルボニル−ｔオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３−９３７）。また、以下：米国特許第４，８２８，９７９号明細書；同第４，９４８，８８２号明細書；同第５，２１８，１０５号明細書；同第５，５２５，４６５号明細書；同第５，５４１，３１３号明細書；同第５，５４５，７３０号明細書；同第５，５５２，５３８号明細書；同第５，５７８，７１７号明細書；同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５９１，５８４号明細書；同第５，１０９，１２４号明細書；同第５，１１８，８０２号明細書；同���５，１３８，０４５号明細書；同第５，４１４，０７７号明細書；同第５，４８６，６０３号明細書；同第５，５１２，４３９号明細書；同第５，５７８，７１８号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第４，５８７，０４４号明細書；同第４，６０５，７３５号明細書；同第４，６６７，０２５号明細書；同第４，７６２，７７９号明細書；同第４，７８９，７３７号明細書；同第４，８２４，９４１号明細書；同第４，８３５，２６３号明細書；同第４，８７６，３３５号明細書；同第４，９０４，５８２号明細書；同第４，９５８，０１３号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，２４５，０２２号明細書；同第５，２５４，４６９号明細書；同第５，２５８，５０６号明細書；同第５，２６２，５３６号明細書；同第５，２７２，２５０号明細書；同第５，２９２，８７３号明細書；同第５，３１７，０９８号明細書；同第５，３７１，２４１号明細書；同第５，３９１，７２３号明細書；同第５，４１６，２０３号明細書；同第５，４５１，４６３号明細書；同第５，５１０，４７５号明細書；同第５，５１２，６６７号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５６５，５５２号明細書；同第５，５６７，８１０号明細書；同第５，５７４，１４２号明細書；同第５，５８５，４８１号明細書；同第５，５８７，３７１号明細書；同第５，５９５，７２６号明細書；同第５，５９７，６９６号明細書；同第５，５９９，９２３号明細書；同第５，５９９，９２８号明細書、及び同第５，６８８，９４１号明細書を参照されたい。尚、これらは各々、参照により本明細書に組み込むものとする。
【０１３０】
これらの部分又はコンジュゲートは、一次又は二次ヒドロキシル基などの官能基に共有結合したコンジュゲート基を含んでもよい。本発明のコンジュゲート基としては、インターカレータ、リポータ分子、ポリイミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増強するための基；又はオリゴマーの薬物動態学的特性を増強するための基が挙げられる。典型的なコンジュゲート基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クーマリン、及び色素が挙げられる。本発明に関して、薬力学的特性を増強する基には、取込みを向上させ、分解に対する耐性を増強し、及び／又は標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が含まれる。本発明に関して、薬物動態学的特性を増強する基には、本発明の化合物の取込み、分布、代謝又は排出を向上させる基が含まれる。代表的コンジュゲート基は、１９９２年１０月２３日に提出された国際特許出願番号：ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号パンフレット、及び米国特許第６，２８７，８６０号明細書に開示されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。コンジュゲート部分は、限定しないが、コレステロール部分などの脂質部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル−５−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖、又はアダマンタン酢酸、パルミチル部分、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分を含む。例えば、以下の文献を参照されたい：米国特許第４，８２８，９７９号明細書；同第４，９４８，８８２号明細書；同第５，２１８，１０５号明細書；同第５，５２５，４６５号明細書；同第５，５４１，３１３号明細書；同第５，５４５，７３０号明細書；同第５，５５２，５３８号明細書；同第５，５７８，７１７号明細書；同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５９１，５８４号明細書；同第５，１０９，１２４号明細書；同第５，１１８，８０２号明細書；同第５，１３８，０４５号明細書；同第５，４１４，０７７号明細書；同第５，４８６，６０３号明細書；同第５，５１２，４３９号明細書；同第５，５７８，７１８号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第４，５８７，０４４号明細書；同第４，６０５，７３５号明細書；同第４，６６７，０２５号明細書；同第４，７６２，７７９号明細書；同第４，７８９，７３７号明細書；同第４，８２４，９４１号明細書；同第４，８３５，２６３号明細書；同第４，８７６，３３５号明細書；同第４，９０４，５８２号明細書；同第４，９５８，０１３号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，２４５，０２２号明細書；同第５，２５４，４６９号明細書；同第５，２５８，５０６号明細書；同第５，２６２，５３６号明細書；同第５，２７２，２５０号明細書；同第５，２９２，８７３号明細書；同第５，３１７，０９８号明細書；同第５，３７１，２４１号明細書；同第５，３９１，７２３号明細書；同第５，４１６，２０３号明細書；同第５，４５１，４６３号明細書；同第５，５１０，４７５号明細書；同第５，５１２，６６７号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５６５，５５２号明細書；同第５，５６７，８１０号明細書；同第５，５７４，１４２号明細書；同第５，５８５，４８１号明細書；同第５，５８７，３７１号明細書；同第５，５９５，７２６号明細書；同第５，５９７，６９６号明細書；同第５，５９９，９２３号明細書；同第５，５９９，９２８号明細書、及び同第５，６８８，９４１号明細書。
【０１３１】
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチド修飾は、オリゴヌクレオチドの５’又は３’末端の修飾を含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの３’末端は、ヒドロキシル基又はチオホスフェートを含む。別の分子（例えば、ビオチン部分又は発蛍光団）を一本鎖オリゴヌクレオチドの５’又は３’末端に結合することができることは理解すべきである。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、５’ヌクレオチドに結合したビオチン部分を含む。
【０１３２】
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ＥＮＡ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、又は２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドを含む。ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドを交互に含む。ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを交互に含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドとＥＮＡ修飾ヌクレオチドを交互に含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドとロックド核酸ヌクレオチドを交互に含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ロックド核酸ヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを交互に含む。
【０１３３】
ある実施形態において、オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドは、ロックド核酸ヌクレオチドである。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドの５’及び３’末端の各々で少なくとも１個のロックド核酸ヌクレオチドによりフランキングされているデオキシリボヌクレオチドを含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの３’位のヌクレオチドは、３’ヒドロキシル基又は３’チオホスフェートを有する。
【０１３４】
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも２個のヌクレオチドの間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、全てのヌクレオチドの間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
【０１３５】
一本鎖オリゴヌクレオチドが、本明細書に記載する修飾の任意の組合せを有してもよいことは理解すべきである。
【０１３６】
オリゴヌクレオチドは、以下の修飾パターンの１つ又は複数を有するヌクレオチド配列を含んでもよい。
（ａ）（Ｘ）Ｘｘｘｘｘｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘｘｘ、（Ｘ）ｘｘＸｘｘｘ、（Ｘ）ｘｘｘＸｘｘ、（Ｘ）ｘｘｘｘＸｘ及び（Ｘ）ｘｘｘｘｘＸ、
（ｂ）（Ｘ）ＸＸｘｘｘｘ、（Ｘ）ＸｘＸｘｘｘ、（Ｘ）ＸｘｘＸｘｘ、（Ｘ）ＸｘｘｘＸｘ、（Ｘ）ＸｘｘｘｘＸ、（Ｘ）ｘＸＸｘｘｘ、（Ｘ）ｘＸｘＸｘｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘＸｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘｘＸ、（Ｘ）ｘｘＸＸｘｘ、（Ｘ）ｘｘＸｘＸｘ、（Ｘ）ｘｘＸｘｘＸ、（Ｘ）ｘｘｘＸＸｘ、（Ｘ）ｘｘｘＸｘＸ及び（Ｘ）ｘｘｘｘＸＸ、
（ｃ）（Ｘ）ＸＸＸｘｘｘ、（Ｘ）ｘＸＸＸｘｘ、（Ｘ）ｘｘＸＸＸｘ、（Ｘ）ｘｘｘＸＸＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸｘｘ、（Ｘ）ＸＸｘｘＸｘ、（Ｘ）ＸＸｘｘｘＸ、（Ｘ）ｘＸＸｘＸｘ、（Ｘ）ｘＸＸｘｘＸ、（Ｘ）ｘｘＸＸｘＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸｘｘ、（Ｘ）ＸｘｘＸＸｘ、（Ｘ）ＸｘｘｘＸＸ、（Ｘ）ｘＸｘＸＸｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘＸＸ、（Ｘ）ｘｘＸｘＸＸ、（Ｘ）ｘＸｘＸｘＸ及び（Ｘ）ＸｘＸｘＸｘ、
（ｄ）（Ｘ）ｘｘＸＸＸ、（Ｘ）ｘＸｘＸＸＸ、（Ｘ）ｘＸＸｘＸＸ、（Ｘ）ｘＸＸＸｘＸ、（Ｘ）ｘＸＸＸＸｘ、（Ｘ）ＸｘｘＸＸＸＸ、（Ｘ）ＸｘＸｘＸＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸｘＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸｘ、（Ｘ）ＸＸｘｘＸＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸｘＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸＸｘ、（Ｘ）ＸＸＸｘｘＸ、（Ｘ）ＸＸＸｘＸｘ、及び（Ｘ）ＸＸＸＸｘｘ、
（ｅ）（Ｘ）ｘＸＸＸＸＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸＸＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸＸＸ、（Ｘ）ＸＸＸｘＸＸ、（Ｘ）ＸＸＸＸｘＸ及び（Ｘ）ＸＸＸＸＸｘ、並びに
（ｆ）ＸＸＸＸＸＸ、ＸｘＸＸＸＸＸ、ＸＸｘＸＸＸＸ、ＸＸＸｘＸＸＸ、ＸＸＸＸｘＸＸ、ＸＸＸＸＸｘＸ及びＸＸＸＸＸＸｘ、
ここで、「Ｘ」は、ヌクレオチド類似体を示し、（Ｘ）は、任意のヌクレオチド類似体を示し、「ｘ」は、ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオチド単位を示す。上に挙げたパターンの各々は、単独、又は開示された他の修飾パターンのいずれかとの組み合わせでオリゴヌクレオチド内に１回又は複数回出現し得る。
【０１３７】
本開示の態様は、ＦＯＸＰ３の発現を誘導する、Ｔ細胞を活性化する、及び／又はＦＯＸＰ３のレベル低下に関連する病状若しくは疾患（例えば、自己免疫若しくは炎症性疾患又は障害などの異常な免疫細胞活性化に関連する疾患又は障害）を治療する方法に関し、これは、ＥＺＨ１及び／若しくはＥＺＨ２、又はＰＲＣ２の別の成分、例えば、Ｓｕｚ１２、ＥＥＤ１若しくはＲｂＡｐ４８の発現若しくは活性を阻害するステップを含む。例えば、ＥＺＨ１及び／若しくはＥＺＨ２の発現は、本明細書に開示するオリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖オリゴヌクレオチド）のいずれかを用いることによって阻害することができる。ある実施形態では、発現又は活性は、ギャップマー、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又は標的ｍＲＮＡの発現を阻害する他のオリゴヌクレオチドの使用によって阻害することができる。
【０１３８】
ＥＺＨ１、ＥＺＨ２、Ｓｕｚ１２、ＥＥＤ１及びＲｂＡｐ４８についてのヒトｍＲＮＡ及びタンパク質配列識別子の例を以下に記載する。これらの識別子は、本出願の提出日現在、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ検索を用いて、ｍＲＮＡ及びタンパク質配列を同定するのに使用することができる。
ＥＺＨ１：ＮＭ＿００１９９１．３、ＮＰ＿００１９８２．２
ＥＺＨ２：ＮＭ＿００１２０３２４７．１、ＮＭ＿００１２０３２４８．１、ＮＭ＿００１２０３２４９．１、ＮＭ＿００４４５６．４、ＮＰ＿００４４４７．２、ＮＭ＿１５２９９８．２、ＮＰ＿００１１９０１７７．１、ＮＰ＿００１１９０１７６．１、ＮＰ＿００１１９０１７８．１、ＮＰ＿６９４５４３．１
Ｓｕｚ１２：ＮＭ＿０１５３５５．２、ＮＰ＿０５６１７０．２
ＥＥＤ１：ＮＭ＿００３７９７．３、ＮＭ＿１５２９９１．２、ＮＰ＿００３７８８．２、ＮＰ＿６９４５３６．１
ＲｂＡｐ４８：ＮＭ＿００１１３５２５５．１、ＮＭ＿００１１３５２５６．１、ＮＭ＿００５６１０．２、ＮＰ＿００１１２８７２７．１、ＮＰ＿００１１２８７２８．１、ＮＰ＿００５６０１．１
【０１３９】
従って、ある実施形態では、ギャップマーオリゴヌクレオチドが本明細書に提供される。ある実施形態では、ギャップマーオリゴヌクレオチドは、式５’Ｘ−Ｙ−Ｚ−３’を有し、ここで、Ｘ及びＺは、ギャップ領域Ｙ周辺のフランキング領域として存在する。ある実施形態では、Ｙ領域は、ヌクレオチドの連続的区間、例えば、少なくとも６個のＤＮＡヌクレオチドの領域であり、これらは、ＲＮＡｓｅＨなどのＲＮＡｓｅを動員することができる。特定の理論に拘束されるわけではないが、ギャップマーは、標的核酸に結合し、この地点で、ＲＮＡｓｅが動員された後、標的核酸を切断することができると考えられる。ある実施形態では、Ｙ領域は、高親和性修飾ヌクレオチド、例えば、１〜６修飾ヌクレオチドを含む領域Ｘ及びＺにより、５’及び３’の両方でフランキングしている。修飾オリゴヌクレオチドの例としては、限定はしないが、２’ＭＯＥ又は２’ＯＭｅ又はロックド核酸（ＬＮＡ）が挙げられる。フランクＸ及びＺは、長さ１〜２０ヌクレオチド、好ましくは１〜８ヌクレオチド及びより好ましくは１〜５ヌクレオチドであってよい。フランクＸ及びＺは、同様の長さ又は異なる長さのいずれであってもよい。ギャップ−セグメントＹは、長さ５〜２０ヌクレオチド、好ましくは６〜１２ヌクレオチド及びより好ましくは６〜１０ヌクレオチドのヌクレオチド配列であってよい。ある態様では、本発明のギャップマーのギャップ領域は、Ｃ４’−置換ヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、及びアラビノ（ａｒａｂｉｎｏ）配置のヌクレオチドなどのＤＮＡヌクレオチドに加えて、効率的なＲＮａｓｅ  Ｈ作用を許容可能であることがわかっている修飾ヌクレオチドを含有してもよい。ある実施形態では、ギャップ領域は、１つ又は複数の非修飾ヌクレオシド間結合を含む。ある実施形態では、一方若しくは両方のフランキング領域は、各々独立に、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個又はそれ以上のヌクレオチド同士の間に、１つ又は複数のホスホロチオエートヌクレオシド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合若しくは他の結合）を含む。ある実施形態では、ギャップ領域と２つのフランキング領域は、各々独立に、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個若しくはそれ以上のヌクレオチド同士の間に、１つ又は複数のホスホロチオエートヌクレオシド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合若しくは他の結合）を含む。
【０１４０】
ある実施形態では、本明細書に記載するオリゴヌクレオチドは、低分子干渉（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の態様であってもよく、これは、低分子干渉（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡ又はサイレンシングＲＮＡとも呼ばれる。ｓｉＲＮＡは、典型的に、長さが約１８〜２３若しくは２０〜２５塩基対の二本鎖ＲＮＡ分子のクラスであり、細胞におけるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を通して、分解するための核酸（例えば、ｍＲＮＡ）をターゲティングする。ｓｉＲＮＡ分子の特異性は、この分子のアンチセンス鎖とその標的ＲＮＡとの結合によって決定することができる。有効なｓｉＲＮＡ分子は、インタフェロン応答を介して細胞内の非特異的ＲＮＡ干渉経路のトリガーを阻止するために、一般に、３０〜３５塩基対を下回る長さであるが、これより長いｓｉＲＮＡが有効となる場合もある。ｓｉＲＮＡ分子は、二本鎖（すなわち、アンチセンス鎖及び相補的センス鎖を含むｄｓＲＮＡ分子）又は一本鎖（すなわち、アンチセンス鎖のみを含むｓｓＲＮＡ）であってもよい。ｓｉＲＮＡ分子は、自己相補的センス及びアンチセンス鎖を有する二重螺旋、非対称二重螺旋、ヘアピン又は非対称ヘアピン二次構造を有していてもよい。
【０１４１】
二本鎖ｓｉＲＮＡは、同じ長さ又は異なる長さのＲＮＡを含んでもよい。二本鎖ｓｉＲＮＡ分子はまた、ステムループ構造の単一オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ分子の自己相補的センス及びアンチセンス領域は、核酸ベースの、又は非核酸ベースのリンカーにより連結されている）、並びに２つ以上のループ構造と、自己相補的センス及びアンチセンス鎖を含むステムとを有する環状一本鎖ＲＮＡ（環状ＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかでプロセシングして、ＲＮＡｉを媒介する能力を有する活性ｓｉＲＮＡ分子を生成することができる）から構築することもできる。従って、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子も本発明において考慮される。これらの分子は、逆相補鎖（センス）配列に加えて、特異的アンチセンス配列を含み、これらは、典型的に、スペーサ又はループ配列により隔てられている。スペーサ又はループの切断により、一本鎖ＲＮＡ分子とその逆相補鎖が得られ、これによって、これらは、アニーリングして、ｄｓＲＮＡを形成し得る（任意選択で、いずれか若しくは両方の鎖の３’末端及び／又は５’末端からの１個、２個、３個若しくはそれ以上のヌクレオチドの添加又は除去をもたらし得るプロセシングステップを追加する）。スペーサは、スペーサの切断（並びに、任意選択で、いずれか若しくは両方の鎖の３’末端及び／又は５’末端からの１個、２個、３個、４個、若しくはそれ以上のヌクレオチドの添加又は除去をもたらし得る次のプロセシングステップ）の前に、アンチセンス及びセンス配列が、アニーリングして、二本鎖構造（又はステム）を形成することができるように、十分な長さのものであってよい。スペーサ配列は、非関連ヌクレオチド配列であってもよく、これは、アニーリングされて二本鎖核酸になると、ｓｈＲＮＡを含む２つの相補的ヌクレオチド配列領域の間に位置する。
【０１４２】
ｓｉＲＮＡ分子の全長は、設計しようとするｓｉＲＮＡ分子のタイプに応じて、約１４〜約２００ヌクレオチド、例えば、約１４〜１００、１４〜５０、１４〜３０又は１８〜２３ヌクレオチドの範囲で変動し得る。一般に、これらのヌクレオチドのうち約１４〜約５０個が、ＲＮＡ標的配列と相補的である、すなわち、ｓｉＲＮＡ分子の特定のアンチセンス配列を構成する。例えば、ｓｉＲＮＡが、二本鎖若しくは一本鎖ｓｉＲＮＡである場合、長さは、約１４〜約５０ヌクレオチドの範囲で変動し得るが、ｓｉＲＮＡが、ｓｈＲＮＡ又は環状分子である場合には、長さは、約４０〜約２００ヌクレオチドの範囲で変動し得る。
【０１４３】
ｓｉＲＮＡ分子は、この分子の一端に３’突出部を含んでもよい。他端は、平滑末端であってもよいし、又はやはり突出部（５’若しくは３’）を有してもよい。ｓｉＲＮＡ分子がこの分子の両端に突出部を含む場合、突出部の長さは、同じでも異なっていてもよい。一実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、この分子の両端に約１〜約３ヌクレオチドの３’突出部を含む。
【０１４４】
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であってもよい。ミクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」と呼ばれる）は、低分子ノンコーディングＲＮＡであり、これは、標的ＲＮＡ転写物上の相補的部位に結合することによって遺伝子発現を制御する、植物及び動物にみいだされる調節分子のクラスに属する。ｍｉＲＮＡは、約７０ヌクレオチドのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡに核内でプロセシングされる高分子ＲＮＡ前駆体（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡと称する）から生成され、これは、不完全なステムループ構造に折り畳まれる（Ｌｅｅ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００３）４２５（６９５６）：４１５−９）。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、細胞質内で追加プロセシングステップを経るが、そこで、長さが１８〜２５ヌクレオチドの成熟型ｍｉＲＮＡは、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ酵素であるダイサー（Ｄｉｃｅｒ）によって、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの一端から切除される（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１）１２：１２及びＧｒｉｓｈｏｋ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２００１）１０６（１）：２３−３４）。
【０１４５】
本明細書で用いられる場合、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、成熟型ｍｉＲＮＡ又は、成熟型ｍｉＲＮＡの生物活性を保持するその変異体の断片を含むｍｉＲＮＡ。ある実施形態では、ｍｉＲＮＡのサイズの範囲は、２１ヌクレオチド〜１７０ヌクレオチドであってよいが、最大２０００ヌクレオチドのｍｉＲＮＡを使用することもできる。好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡのサイズの範囲は、長さ７０ヌクレオチド〜１７０ヌクレオチドである。別の好ましい実施形態では、長さ２１ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドの成熟型ｍｉＲＮＡを用いることができる。
【０１４６】
ある実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３０前駆体であってもよい。本明細書で用いる場合、「ｍｉＲ−３０前駆体」（ｍｉＲ−３０ヘアピンとも呼ばれる）は、文字通り、ヒトミクロＲＮＡ  ｍｉＲ−３０の前駆体であり（例えば、Ｚｅｎｇ及びＣｕｌｌｅｎ，２００３；Ｚｅｎｇ及びＣｕｌｌｅｎ，２００５；Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；米国特許出願公開第２００４／００５３４１号明細書）、前駆体は、上記文献に記載若しくは示される任意の方法で、ｍｉＲＮＡにプロセシングされる能力を保持しながら、野生型ｍｉＲ−３０前駆体から修飾することができる。ある実施形態では、ｍｉＲ−３０前駆体は、長さ少なくとも８０ヌクレオチドであり、ステムループ構造を含む。ある実施形態では、ｍｉＲ−３０前駆体は、第１標的配列の一部（例えば、本明細書に開示する標的遺伝子の真正染色質領域内の配列）と相補的なステムループ構造のステム上に２０〜２２ヌクレオチドの第１ｍｉＲＮＡ配列をさらに含む。
【０１４７】
ｍｉＲＮＡは、様々な供給源から単離するか、又は当分野では公知の方法に従って合成することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｏｎｌｉｎｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ；米国特許第８３５４３８４号明細書；及びＷａｈｉｄ  ｅｔ  ａｌ．ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｒｅｃｅｎｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２０１０；１８０３（１１）：１２３１−４３を参照）。ある実施形態では、ｍｉＲＮＡは、当分野において公知であるか、又は本明細書に記載されるベクターから発現される。ある実施形態では、ベクターは、成熟型ｍｉＲＮＡをコードする配列を含んでもよい。ある実施形態では、ベクターは、細胞においてｐｒｅ−ｍｉＲＮＡが発現されて、成熟型ｍｉＲＮＡにプロセシングされるように、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡをコードする配列を含んでもよい。ある実施形態では、ベクターは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡをコードする配列を含んでもよい。この実施形態では、一次転写物が初めにプロセシングされて、ステムループ前駆体ｍｉＲＮＡ分子を生成する。次に、ステムループ前駆体がプロセシングされて、成熟型ミクロＲＮＡを生成する。
【０１４８】
遺伝子発現を調節する方法
一形態において、本発明は、研究目的で（例えば、細胞中の遺伝子の機能を研究するために）、細胞（例えば、ＦＯＸＰ３レベルが低下している細胞）における遺伝子発現を調節する方法に関する。別の態様では、本発明は、遺伝子又はエピジェネティック療法のために、細胞（例えば、ＦＯＸＰ３レベルが低下している細胞）における遺伝子発現を調節する方法に関する。細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、ＦＯＸＰ３の発現又は活性低下に起因する疾患又は病状を有する被験者において）であってよい。ある実施形態では、細胞における遺伝子発現を調節する方法は、本明細書に記載する一本鎖オリゴヌクレオチドを送達することを含む。ある実施形態では、細胞への一本鎖オリゴヌクレオチドの送達によって、一本鎖オリゴヌクレオチドが送達されていない対照細胞における遺伝子の発現レベルに比べ、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％又はそれ以上高い遺伝子の発現レベルがもたらされる。特定の実施形態では、細胞への一本鎖オリゴヌクレオチドの送達によって、一本鎖オリゴヌクレオチドが送達されていない対照細胞における遺伝子の発現レベルに比べ、少なくとも５０％高い遺伝子の発現レベルがもたらされる。
【０１４９】
本発明の別の態様において、方法は、本明細書に記載する一本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物を被験者（例えば、ヒト）に投与して、被験者におけるタンパク質レベルを増大することを含む。ある実施形態では、タンパク質レベルの増大は、投与前の被験者におけるタンパク質の量に比べ、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、又はそれ以上高い。
【０１５０】
別の例として、細胞中のＦＯＸＰ３の発現を増大するために、本方法は、ＦＯＸＰ３遺伝子を包含するか、又はその近傍にあるゲノム位置に位置する（例えば、長い非コードＲＮＡの）ＰＲＣ２関連領域と十分相補的である一本鎖オリゴヌクレオチド配列を細胞に導入することを含む。
【０１５１】
別の態様において、本発明は、被験者におけるＦＯＸＰ３の発現のレベル低下に関連する状態（例えば、自己免疫疾患又は障害などの異常な免疫細胞活性化に関連する疾患又は障害）を治療する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載する一本鎖オリゴヌクレオチドを投与することを含む。
【０１５２】
被験者は、非ヒト哺乳動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ウシ、又はウマを含み得る。好ましい実施形態において、被験者は、ヒトである。一本鎖オリゴヌクレオチドは、ヒトを含む動物における病態の治療薬中の治療部分として使用されてきた。一本鎖オリゴヌクレオチドは、細胞、組織及び動物、特にヒトの治療のための治療計画に有用となるように設計することができる治療法である。
【０１５３】
治療薬の場合、自己免疫疾患又は障害などの異常な免疫細胞活性化に関連する疾患又は障害を有することが疑われる動物、好ましくはヒトを、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドを投与することにより疾患又は障害を治療する。例えば、非制限的な一実施形態では、本方法は、治療が必要な動物に、本明細書に記載する治療有効量の一本鎖オリゴヌクレオチドを投与するステップを含む。
【０１５４】
本明細書に開示する方法に従って治療することができる自己免疫疾患及び障害の例としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経失調、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂質血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索性及びニューロン性ニューロパシー、バロー（Ｂａｌｏ）病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋疾患、キャッスルマン病、セリアック（Ｃｅｌｉａｃ）病、シャガス（Ｃｈａｇａｓ）病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多巣性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス（Ｃｈｕｒｇ−Ｓｔｒａｕｓ）症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、炎症性腸疾患（例えば、クローン（Ｃｒｏｈｎ’ｓ）病若しくは潰瘍性大腸炎）、コーガン（Ｃｏｇａｎｓ）症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクッサキー（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ）心筋炎、ＣＲＥＳＴ症候群、本態性混合性クリオグロブリン血症（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｉｘｅｄ  ｃｒｙｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）、脱髄性ニューロパシー、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デヴィック（Ｄｅｖｉｃ’ｓ）病（視神経脊髄炎）、円板状エリテマトーデス、ドレスラー（Ｄｒｅｓｓｌｅｒ’ｓ）症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エバンス（Ｅｖａｎｓ）症候群、線維性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー（Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ’ｓ）症候群、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）（以前は、ウェゲナー肉芽腫症（Ｗｅｇｅｎｅｒ’ｓ  Ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｓｉｓ）と呼ばれていた）、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本脳症、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホシェーンライン（Ｈｅｎｏｃｈ−Ｓｃｈｏｎｌｅｉｎ）紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、間質性膀胱炎、ＩＰＥＸ（Ｘ連鎖免疫調節異常、多発性内分泌障害、及び腸疾患）症候群、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎、川崎症候群、ランバート・イートン（Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｅａｔｏｎ）症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック病（Ｄｅｖｉｃ’ｓ））、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（小児自己免疫性溶連菌感染関連性精神神経障害）、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルク（Ｐａｒｒｙ  Ｒｏｍｂｅｒｇ）症候群、パーソネージ・ターナー（Ｐａｒｓｏｎｎａｇｅ−Ｔｕｒｎｅｒ）症候群、毛様体輪炎（周辺ぶどう膜炎（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｕｖｅｉｔｉｓ））、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲性脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型多腺性自己免疫症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開術後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣自己免疫（Ｓｐｅｒｍ  ＆  ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ）、スティッフパーソン症候群（Ｓｔｉｆｆ  ｐｅｒｓｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント（Ｔｏｌｏｓａ−Ｈｕｎｔ）症候群、横断性脊髄炎、１型糖尿病、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ぶどう膜炎、血管炎、小水疱性皮膚病、白斑、及びウェゲナー肉芽腫症（多発血管性肉芽腫症（ＧＰＡ）とも呼ばれる）。ある実施形態では、自己免疫疾患又は障害は、炎症性腸疾患（例えば、クローン病若しくは潰瘍性大腸炎）、ＩＰＥＸ症候群、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、ＳＬＥ又は１型糖尿病である。
【０１５５】
本明細書に開示する方法に従って治療することができる炎症性疾患及び障害の例としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：尋常性座瘡、虫垂炎、関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化、アレルギー（１型過敏症）、滑液包炎、大腸炎、慢性前立腺炎、膀胱炎、皮膚炎、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、炎症性筋疾患（例えば、多発性筋疾患、皮膚筋炎、若しくは封入体筋炎）、炎症性肺疾患、間質性膀胱炎、髄膜炎、骨盤内炎症性疾患、静脈炎、乾癬、再潅流障害、関節リウマチ、類肉腫症、腱炎、扁桃炎、移植片拒絶反応、及び脈管炎。ある実施形態では、炎症性疾患又は障害は、喘息である。
【０１５６】
製剤化、送達、及び用量決定
本明細書に記載するオリゴヌクレオチドは、ＦＯＸＰ３のレベル低下と関連する病状（例えば、自己免疫若しくは炎症性疾患などの異常な免疫細胞活性化に関連する疾患又は障害）の治療を目的として、被験者への投与のために製剤化することができる。本明細書に開示するオリゴヌクレオチドのどれを用いても、製剤、組成物及び方法を実施できることは理解すべきである。
【０１５７】
製剤は、好都合には単位剤形で提供することができ、製薬の分野で公知のいずれかの方法により調製してもよい。単一剤形を製造するのに担体物質と組み合わせることができる活性成分（例えば、本発明のオリゴヌクレオチド又は化合物）の量は、治療しようとする宿主、具体的投与方式、例えば、皮内若しくは吸入などに応じて変動する。単一剤形を製造するのに担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果、例えば、腫瘍退縮をもたらす化合物の量である。
【０１５８】
本発明の医薬製剤は、製剤の製造に関する分野で公知のいずれかの方法に従い調製することができる。このような製剤は、甘味料、香味料、着色剤及び防腐剤を含有してよい。製剤は、製造に好適であり、非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合してもよい。製剤は、１種以上の希釈剤、乳化剤、防腐剤、緩衝剤、賦形剤などを含んでもよく、液体、粉末、エマルション、凍結乾燥した粉末、スプレー、クリーム、ローション、徐放剤、錠剤、丸薬、ゲル、パッチ、インプラントなどの形態で提供することができる。
【０１５９】
製剤化した一本鎖オリゴヌクレオチド組成物は、多様な状態を呈するものであってよい。ある例では、組成物は、少なくとも部分的に結晶性、均質に結晶性、及び／又は無水性（例えば、含水率が８０％、５０％、３０％、２０％、若しくは１０％未満）である。別の例では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、水相、例えば、水を含む溶液状である。水相又は結晶性組成物は、例えば、送達ビヒクル、例えば、リポソーム（特に、水相の場合）又は粒子（例えば、結晶性組成物に好適となり得るようなミクロ粒子）に組み込むことができる。一般に、意図する投与方法と適合性である方法で、一本鎖オリゴヌクレオチド組成物を製剤化する。
【０１６０】
ある実施形態において、組成物は、以下の方法の少なくとも１つにより調製する：噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、蒸発、流動層乾燥、若しくはこれらの技術の組合せ；又は脂質を用いた超音波処理、フリーズドライ、縮合及びその他の自己組織化。
【０１６１】
一本鎖オリゴヌクレオチド調製物は、別の薬剤、例えば、別の治療薬又は一本鎖オリゴヌクレオチドを安定化する物質、例えば、一本鎖オリゴヌクレオチドと複合体化するタンパク質と組み合わせて製剤化又は投与する（一緒に、若しくは個別に）ことができる。別の薬剤は、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ（例えば、Ｍｇ２＋などの二価カチオンを除去するため）、塩、ＲＮＡｓｅ阻害剤（例えば、ＲＮＡｓｉｎなどの広特異性ＲＮＡｓｅ阻害剤）などを含む。
【０１６２】
一実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチド調製物は、別の一本鎖オリゴヌクレオチド、例えば、第２遺伝子の発現を調節する第２一本鎖オリゴヌクレオチド又は第１遺伝子の発現を調節する第２一本鎖オリゴヌクレオチドを含む。さらに別の調製物は、少なくとも３、５、１０、２０、５０、又は１００以上の異なる一本鎖オリゴヌクレオチド種を含んでもよい。こうした一本鎖オリゴヌクレオチドは、同様の数の異なる遺伝子に関して、遺伝子発現を媒介することができる。一実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチド調製物は、少なくとも１種の第２治療薬（例えば、オリゴヌクレオチド以外の薬剤）を含む。
【０１６３】
送達経路
一本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物は、様々な経路で被験者に送達することができる。経路の例として、静脈内、皮内、局所、直腸、非経口、肛門、膣内、鼻内、肺、眼、皮下、筋内、腹腔内、及び関節内（例：例えば、関節リウマチの場合には関節への注射）投与が挙げられる。「治療に有効な量」という用語は、予測される生理学的応答を賦与するために、治療対象の被験者において要望されるレベルのＦＯＸＰ３発現をもたらすのに必要な、組成物中に存在するオリゴヌクレオチドの量である。「生理学的に有効な量」という用語は、要望される苦痛緩和又は治癒効果を賦与するために、被験者に送達される量である。「薬学的に許容される担体」という用語は、被験者に対する有意な有害な毒物学的作用を伴うことなく、担体を被験者に投与することができることを意味する。
【０１６４】
本発明の一本鎖オリゴヌクレオチド分子は、投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。こうした組成物は、典型的に、１種又は複数種の一本鎖オリゴヌクレオチドと、薬学的に許容される担体を含む。本明細書で用いる「薬学的に許容される担体」という表現は、製剤投与に適合性のあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含むことを意図する。薬学的に活性の物質のためのこのような媒質及び薬剤の使用は、当分野では公知である。従来の媒質又は薬剤が活性化合物と非適合性である場合を除いて、組成物におけるその使用が考慮される。また、追加の活性化合物を組成物に組み込むこともできる。
【０１６５】
本発明の医薬組成物は、局所又は全身治療のいずれが要望されるか、また治療しようとする部位に応じていくつかの方法で投与することができる。投与は、局所（眼、膣、直腸、鼻内、経皮など）、経口又は非経口であってよい。非経口投与には、静脈内持続注入法、皮下、腹腔内若しくは筋内注射、又はクモ膜下腔内若しくは脳室内投与が含まれる。
【０１６６】
投与の経路及び部位は、ターゲティングを増強するように選択してよい。例えば、筋肉細胞をターゲティングするためには、対象の筋肉への筋内注射が、理にかなった選択であろう。肺細胞は、エアロゾル形態の一本鎖オリゴヌクレオチドを投与することにより、ターゲティングすることができる。血管内皮細胞は、バルーンカテーテルを一本鎖オリゴヌクレオチドでコーティングして、オリゴヌクレオチドを機械的に導入することによりターゲティングすることができる。
【０１６７】
ある実施形態では、Ｔ細胞又はＴ細胞の集団は、被験者、例えば、ヒト被験者から取得して、本明細書に記載する一本鎖オリゴヌクレオチドと接触させてもよい。ある実施形態では、本明細書に記載する一本鎖オリゴヌクレオチドと接触させたＴ細胞又はＴ細胞の集団は、前記被験者に再投与してもよい。ある実施形態では、本明細書に記載する一本鎖オリゴヌクレオチドと接触させたＴ細胞又はＴ細胞の集団は、被験者に投与する前に、所定期間（例えば、１時間、２時間、３時間、４時間、若しくはそれ以上；１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、若しくはそれ以上）にわたり培養する。
【０１６８】
局所投与とは、製剤を被験者の表面に直接接触させることによる、被験者への送達を指す。局所投与の最も一般的形態は、皮膚に対するものであるが、本明細書に開示する組成物は、身体の他の表面、例えば、眼、粘膜、体腔の表面又は内面にも直接適用することができる。前述したように、最も一般的な局所送達は、皮膚に対するものである。この用語は、限定しないが、局所及び経皮を含む複数の投与経路を包含する。これらの投与方式は、典型的に、皮膚の透過障壁の浸透及び標的組織又は層への有効な送達を含む。局所投与は、表皮及び真皮に浸透して、最終的に組成物の全身送達を達成する手段として用いることができる。局所投与は、被験者の表皮若しくは真皮、又はその特定の層、又は下層組織にオリゴヌクレオチドを選択的に投与する手段として用いることができる。
【０１６９】
局所投与のための製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、点滴薬、座薬、スプレー、液剤及び粉末剤が挙げられる。従来の製剤用担体、水性、粉末若しくは油性基剤、増粘剤などが必要であるか、又は望ましい場合もある。また、コーティングされたコンドーム、手袋などが有用な場合もある。
【０１７０】
経皮送達は、脂溶性治療薬の投与のための貴重な経路である。真皮は、表皮より透過性であるため、擦りむいた、熱傷を受けた、又はむき出しの皮膚からの吸収は、はるかに高速である。炎症及び皮膚への血流を増加する他の生理学的状態もまた、経皮吸収を増強する。この経路を介した吸収は、油性ビヒクルの使用（塗擦）又は１種以上の浸透促進剤の使用により、増強され得る。経皮経路により本明細書に開示する組成物を送達する他の有効な方法としては、皮膚の水和、及び徐放性局所パッチの使用がある。経皮経路は、全身及び／又は局所療法のために本明細書に開示する組成物を送達する潜在的に有効な手段を提供する。加えて、イオン導入法（電界の影響下での生体膜を介したイオン性溶質の輸送）、音波泳動又は超音波泳動（生体膜、特に皮膚及び角質を通した各種治療薬の吸収を増強するための超音波の使用）、並びに投与位置及び投与部位での貯留に関するビヒクル特性の最適化も、皮膚及び粘膜部位を介した局所適用組成物の輸送を増強する上で有用な方法である。
【０１７１】
経口及び鼻粘膜は、他の投与経路に比して利点を提供する。例えば、これらの膜を介して投与されたオリゴヌクレオチドは、作用の迅速な開始を有し、治療血漿レベルをもたらし、肝代謝の初回通過効果を回避し、有害な胃腸（ＧＩ）環境へのオリゴヌクレオチドの暴露を回避する。さらに別の利点は、オリゴヌクレオチドを容易に適用、局在化及び除去することができるような膜部位に対する容易な接近を含む。
【０１７２】
経口送達の場合、組成物は、口腔の表面、例えば、舌下面及び口腔底の粘膜又は頬の内側表面を構成する頬粘膜にターゲティングすることができる。舌下粘膜は、比較的透過性であるため、多くの薬剤の迅速な吸収及び許容可能な生体利用可能性をもたらす。さらに、舌下粘膜は、好都合で、許容可能かつ容易に接触可能である。
【０１７３】
一本鎖オリゴヌクレオチドの医薬組成物は、計量噴霧ディスペンサーから、前述したような混合ミセル医薬製剤及び噴霧剤を、吸入せずに、口腔に噴霧することによりヒトの口腔に投与することもできる。一実施形態では、ディスペンサーをまず振盪した後、医薬組成物及び噴霧剤を口腔に噴霧する。
【０１７４】
経口投与のための組成物としては、粉末若しくは顆粒、水中の懸濁液若しくは溶液、シロップ、エマルション、エリキシール又は非水性媒体、錠剤、カプセル、ロゼンジ、又はトローチが挙げられる。錠剤の場合、用いることができる担体としては、ラクトース、クエン酸ナトリウム、及びリン酸の塩がある。デンプンなどの各種崩壊剤、並びにステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルクなどの潤滑剤が一般に錠剤に用いられている。カプセル形態への経口投与の場合、有用な希釈剤は、ラクトース及び高分子量ポリエチレングリコールである。経口用途に水性懸濁液が必要な場合、核酸組成物は、乳化及び懸濁剤と組み合わせることができる。要望される場合には、特定の甘味料及び／又は香味料を添加してもよい。
【０１７５】
非経口投与には、静脈内持続注入法、皮下、腹腔内又は筋内注射、クモ膜下腔内又は脳室内投与が含まれる。ある実施形態において、非経口投与は、疾患の部位への直接の投与（例えば、腫瘍への注射）を含む。
【０１７６】
非経口投与のための製剤は、滅菌水溶液を含んでもよく、こうした水溶液は、緩衝剤、希釈剤及びその他の好適な添加剤をさらに含有してもよい。脳室内投与は、例えば、レザバーに取り付けられた脳室内カテーテルによって促進してもよい。静脈内での使用の場合、溶質の合計濃度を制御して、製剤を等張性にしなければならない。
【０１７７】
本明細書に記載する一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれも眼組織に投与することができる。例えば、組成物は、眼の表面又は周辺組織、例えば、瞼の内部に適用することができる。眼への投与の場合、軟膏又は点滴可能な液体を、アプリケータ又は点眼器などの当分野では公知の眼投与装置により投与してよい。このような組成物は、ヒアルロン酸、硫酸コンドロイチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はポリ（ビニルアルコール）などのムコミメティック剤（ｍｕｃｏｉｍｉｍｅｔｉｃｓ）、ソルビン酸、ＥＤＴＡ若しくは塩化ベンジルクロニウムなどの防腐剤、並びに通常量の希釈剤及び／又は担体を含んでもよい。一本鎖オリゴヌクレオチドはまた、眼の内部に投与することもでき、これを選択した部位又は構造体に導入することができる針若しくは他の送達装置により導入することができる。
【０１７８】
肺送達組成物は、患者が分散液を吸入することにより送達することができ、これによって、分散液内の組成物、好ましくは一本鎖オリゴヌクレオチドが、肺に到達し、そこで、組成物が肺胞領域を通して直接血液循環中に容易に吸収されるようにすることができる。肺送達は、肺の疾患を治療するための全身送達及び局在化送達の両方に有効となり得る。
【０１７９】
肺送達
肺送達は、噴霧化、エアロゾル化、ミセル及び乾燥粉末ベースの製剤の使用など、様々なアプローチにより達成することができる。送達は、液体ネブライザー、エアロゾルベースの吸入器、及び乾燥粉末分散器を用いて、達成することができる。定量装置が好ましい。噴霧器又は吸入器を用いる利点の１つは、装置が自蔵式であるため、汚染の可能性が最小限に抑えられることである。例えば、乾燥粉末分散器は、乾燥粉末として容易に製剤化することができる薬剤を送達する。一本鎖オリゴヌクレオチド組成物は、単独で、又は好適な粉末担体と組み合わせて、凍結乾燥又は噴霧乾燥粉末として安定して貯蔵することができる。吸入用組成物の送達は、タイマー、ドーズカウンター、時間計測装置を含み得る投与タイミング要素、又は時間表示器を用いて実施することができ、これらが装置に内蔵されていれば、エアロゾル薬剤の投与の際の用量追跡、適合性モニタリング、及び／又は患者への用量トリガーが可能になる。
【０１８０】
「粉末」という用語は、流動性であって、吸入装置に容易に分散させることができ、被験者によって吸入されて、粒子が肺に到達し、肺胞への浸透を可能にするような微細に分散した固体粒子から構成される組成物を意味する。従って、こうした粉末は、「呼吸用（ｒｅｓｐｉｒａｂｌｅ）」と言われる。好ましくは、平均粒度は、粒径約１０μｍ未満であり、好ましくは比較的均一の球状形の分布をしている。より好ましくは、粒径は、約７．５μｍ未満であり、極めて好ましくは約５．０μｍ未満である。通常、粒度分布は、直径約０．１μｍ〜約５μｍ、特に約０．３μｍ〜約５μｍである。
【０１８１】
「乾燥（した）」という用語は、組成物が、約１０重量％（％ｗ）未満の水、通常約５％ｗ未満、好ましくは約３％ｗ未満の含水率を有することを意味する。乾燥組成物は、粒子が、エアロゾルを形成するように、吸入装置中に容易に分散可能であるものでよい。
【０１８２】
担体として有用な様々なタイプの医薬用賦形剤としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの安定剤、炭水化物、アミノ酸及びポリペプチドなどの充填剤；ｐＨ調節剤若しくは緩衝剤；塩化ナトリウムなどの塩等がある。これらの担体は、結晶性又は非晶性形態のいずれであってもよいし、両者の混合物であってもよい。
【０１８３】
好適なｐＨ調節剤又は緩衝剤としては、有機酸と塩基から調製される有機塩、例えば、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウムなどがあり、クエン酸ナトリウムが好ましい。ミセル状一本鎖オリゴヌクレオチド製剤の肺投与は、テトラフルオロエタン、ヘプタフルオロエタン、ジメチルフルオロプロパン、テトラフルオロプロパン、ブタン、イソブタン、ジメチルエーテル及びその他の非ＣＦＣ及びＣＦＣ噴霧剤などの噴霧剤を含む定量噴霧装置を用いて達成することができる。
【０１８４】
例示的装置としては、血管系に導入される装置、例えば、血管組織の管腔に挿入される装置、又は装置自体が血管系の一部を形成するもの、例えば、ステント、カテーテル、心臓弁、及びその他の血管装置が挙げられる。これらの装置、例えば、カテーテル又はステントは、肺、心臓、又は脚の血管系に配置することができる。
【０１８５】
他の装置としては、非血管装置、例えば、腹腔内、臓器若しくは腺組織に移植される装置、例えば、人工臓器がある。こうした装置は、一本鎖オリゴヌクレオチドに加えて治療物質を放出することができる。例えば、ある装置は、インスリンを放出することができる。
【０１８６】
一実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物の単位用量又は計測用量は、埋め込みデバイスによって投与される。デバイスは、被験者内のパラメータを監視するセンサーを含んでもよい。例えば、デバイスは、例えば、ポンプ、並びに任意選択で付属の電子部品を含んでもよい。
【０１８７】
組織、例えば、細胞又は臓器を一本鎖オリゴヌクレオチドによりｅｘ  ｖｉｖｏで処置した後、被験者に投与又は移植することができる。組織は、オートロガス、同種異系、又は異種間組織であってよい。例えば、組織を処置して、移植片対宿主病を軽減することができる。他の実施形態では、組織は、同種異系であり、組織を処置して、その組織における不要な遺伝子発現を特徴とする障害を治療することができる。例えば、組織、例えば、造血細胞、例えば、骨髄造血細胞を処置して、不要な細胞増殖を阻害することができる。オートロガス又は移植片のいずれであっても、処置した組織の導入と、他の療法を組み合せることができる。ある実施において、一本鎖オリゴヌクレオチドで処置した細胞を、例えば、半透性多孔質隔膜により、他の細胞から遮断するが、この隔膜は、細胞がインプラントから流出するのを阻止するが、身体からの分子は細胞に到達させると共に、これら細胞が生成する分子が身体に進入することを可能にする。一実施形態では、多孔質隔膜は、アルギニン酸塩から形成される。
【０１８８】
一実施形態において、避妊用具を一本鎖オリゴヌクレオチドでコーティング又は包含する。例示的避妊用具としては、コンドーム、ペッサリー、ＩＵＤ（子宮内避妊用具、スポンジ、膣内シース、及び避妊用具がある。
【０１８９】
投薬
一態様において、本発明は、一本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、化合物として、又は組成物の１成分として）を被験者（例えば、ヒト被験者）に投与する方法を特徴とする。一実施形態では、単位用量は、体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇ〜２５ｍｇである。一実施形態では、単位用量は、体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜約１００ｍｇである。一実施形態では、単位用量は、体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇである。ある実施形態では、単位用量は、体重１ｋｇ当たり０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、５、１０、２５、５０又は１００ｍｇ超である。
【０１９０】
規定量は、疾患又は障害、例えば、ＦＯＸＰ３に関連する疾患又は障害を治療又は予防するのに有効な量であってよい。単位用量は、例えば、注射（例えば、静脈内若しくは筋内）、吸入投与、又は局所適用によって投与することができる。
【０１９１】
ある実施形態において、単位用量は、毎日投与する。ある実施形態では、１日１回より頻度は少なく、例えば、２日、４日、８日若しくは３０日毎に１回投与する。別の実施形態では、単位用量をある頻度で（例えば、規則的な頻度で）投与しない。例えば、単位用量を単一回投与してよい。ある実施形態では、単位用量を１日１回より多く、例えば、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間毎等に１回投与する。
【０１９２】
一実施形態において、被験者に、初期用量及び１回又は複数回の維持用量の一本鎖オリゴヌクレオチドを投与する。維持用量は、一般に初期用量より少なく、例えば、初期用量の半分である。維持計画は、１日につき０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲、例えば、１日につき体重１ｋｇ当たり１００、１０、１、０．１、０．０１、０．００１、又は０．０００１ｍｇの用量又は複数回用量で被験者を治療することを含む。維持用量は、１日、５日、１０日、又は３０日毎に１回以下投与してもよい。さらに、治療計画は、一定期間継続してよいが、これは、特定の疾患の性質、その重症度及び患者の全身状態に応じて変動する。ある実施形態では、投薬は、１日に１回以下、例えば、２４、３６、４８、又はそれ以上の時間毎に１回以下、例えば、５又は８日毎に１回以下送達してもよい。治療後に、その状態の変化及び病態の症状の改善について患者をモニターする。オリゴヌクレオチドの用量は、患者が現状の投薬レベルに有意に応答しない場合には、増加してもよいし、あるいは、病態の症状の改善が認められる、病態が除去されるか、又は望ましくない副作用が認められる場合には、用量を減らしてもよい。
【０１９３】
有効量は、特定の状況下で必要に応じて、又は適切と考えられれば、単一用量又は２回以上の用量で投与することができる。反復又は頻繁な注入を促進することが要望される場合には、送達装置、例えば、ポンプ、半永久的ステント（例えば、静脈内、腹腔内、大槽内若しくは嚢内）、又はレザバーの埋め込みが妥当であろう。
【０１９４】
ある実施形態において、オリゴヌクレオチド医薬組成物は、複数の一本鎖オリゴヌクレオチド種を含む。別の実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチド種は、天然に存在する標的配列（例えば、ＰＲＣ２関連領域）に関して、別の種と重複せず、かつ隣接していない配列を有する。別の実施形態では、複数の一本鎖オリゴヌクレオチド種が、異なるＰＲＣ２関連領域に対して特異的である。別の実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、対立遺伝子特異的である。
【０１９５】
ある形態では、別の治療法と共に、一本鎖オリゴヌクレオチドで患者を治療する。
【０１９６】
治療が成功したら、患者は、病態の再発を防ぐために維持療法を受けることが望ましい場合もあり、この場合、本発明の化合物を、体重１ｋｇ当たり０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲の維持用量で投与する。
【０１９７】
一本鎖オリゴヌクレオチド組成物の濃度は、障害を治療若しくは予防する上で、又はヒトにおける生理学的条件を調節する上で十分な量である。投与される一本鎖オリゴヌクレオチドの濃度又は量は、薬剤について決定されたパラメータ、並びに投与方法、例えば、経鼻、口腔内、肺などに応じて変動する。例えば、経鼻製剤は、鼻腔の刺激又は炎症を防ぐために、成分によっては、はるかに低濃度が要求される傾向があると考えられる。時には、好適な経鼻製剤を提供するために、経口製剤を１０〜１００倍希釈するのが望ましい場合もある。
【０１９８】
いくつかの要因が、被験者を有効に治療するのに要求される用量に影響を与え得るが、このような要因として、限定しないが、障害の重症度、治療歴、被験者の全般的健康状態及び／又は年齢、並びに存在する他の疾患などがある。さらに、治療有効量の一本鎖オリゴヌクレオチドによる被験者の治療は、単一療法を含んでもよいし、又は、好ましくは、一連の療法を含んでもよい。また、治療に用いる一本鎖オリゴヌクレオチドの有効量が、特定の治療の過程で増減し得ることは理解されよう。例えば、一本鎖オリゴヌクレオチド組成物を投与した後、被験者をモニターすることができる。モニタリングから得た情報に基づき、追加量の一本鎖オリゴヌクレオチド組成物を投与することができる。
【０１９９】
投薬は、治療しようとする疾患状態の重症度及び応答性に左右され、治療コースは、数日から数ヵ月、あるいは、治癒が達成されるか、又は疾患状態の軽減が達成されるまで継続する。最適な投薬スケジュールは、患者の身体におけるＦＯＸＰ３発現レベルの測定値から計算することができる。通常の当業者であれば、最適な投薬量、投与方法及び反復速度を容易に決定することができる。最適な投薬量は、個々の化合物の相対的効能に応じて変動し得るが、一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルで有効であると認められるＥＣ５０に基づいて推定することができる。ある実施形態では、動物モデルは、ヒトＦＯＸＰ３を発現するトランスジェニック動物を含む。別の実施形態では、試験のための組成物は、動物モデルにおけるＦＯＸＰ３とヒトにおけるＦＯＸＰ３との間で保存されている配列に対して、少なくとも内部領域内で、相補的である一本鎖オリゴヌクレオチドを含む。
【０２００】
一実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチド組成物の投与は、非経口、例えば、静脈内（例えば、ボーラス又は拡散性注入）、内皮、腹腔内、筋内、クモ膜下腔内、脳室内、頭蓋内、皮下、経粘膜、口腔、舌下、内視鏡、直腸、経口、膣、局所、肺、鼻内、尿道又は眼などの経路によるものである。投与は、被験者又は例えば、医療供給者などの別の人によって実施することができる。組成物は、計測された用量で、又は定用量を送達するディスペンサーにより提供することができる。選択される送達方法については以下に、より詳しく述べる。
【０２０１】
キット
本発明の特定の態様において、一本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物を収納する容器を含むキットが提供される。ある実施形態では、組成物は、一本鎖オリゴヌクレオチドと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。ある実施形態では、医薬組成物の個々の成分を１つの容器内に提供してもよい。あるいは、医薬組成物の成分を２つ以上の容器、例えば、一本鎖オリゴヌクレオチド用の１つの容器と、担体化合物用の少なくとも１つの別の容器に個別に提供するのが望ましい場合もある。キットは、例えば、単一ボックス内の１つ又は複数の容器のようにいくつかの異なる構成でパッケージしてもよい。例えば、キットに備えられた指示書に従い、様々な成分を組み合わせることができる。例えば、医薬組成物を調製及び投与するために、本明細書に記載の方法に従い、上記成分を組み合わせることができる。キットは、さらに送達装置を含んでもよい。
【０２０２】
本発明を以下の実施例によりさらに詳しく説明するが、これらは限定するものとして何ら解釈すべきではない。本明細書を通じて引用した参照物（参照文献、発行された特許、公開特許出願、及び係属特許出願など）は全て、本明細書に参照によって明示的に組み込まれるものとする。
【実施例】
【０２０３】
本発明を以下の実施例においてさらに詳しく説明するが、これらは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【０２０４】
実施例１
材料及び方法：
リアルタイム（定量）ＰＣＲ
以下に記載するように、ＲＮＡを細胞から採取して、ｃＤＮＡに変換した。最終容量２０ｕｌ／ウェルの９６ウェルフォーマット中でリアルタイムＰＣＲ（本明細書ではＰＣＲ又はｑＰＣＲ又はｑＲＴＰＣＲとも呼ばれる）を実施した。各ウェルは、２．５ｕｌのｃＤＮＡ、５．５ｕｌの水、１ｕｌの標的遺伝子プローブ、１ｕｌのハウスキーパープローブ及び１０ｕｌのＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含んだ。
【０２０５】
ヒト特異的ＦｏｘＰ３、ＩＬ２ＲＡ、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１８（ＧＩＴＲ）及びＢ−Ａｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の検出のためのｑＰＣＲ用の標的遺伝子プローブを用いて、ｍＲＮＡレベルを検出した。標的遺伝子プローブをＦａｒｍ（商標）で標識し、ハウスキーパープローブをＶＩＣ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。
【０２０６】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）ＳｔｅｐＯｎｅ（商標）Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ装置を用いて、サンプルを読み取り、ｍＲＮＡのレベルを決定した。下記のサイクルプログラムを使用した：
ステップ１：９５℃で２０秒間を１サイクル
ステップ２：９５℃で３秒間を４０サイクル
ステップ３：６０℃で２０秒間を４０サイクル
【０２０７】
各標的遺伝子のｍＲＮＡ発現のベースラインを決定した。構成的に発現される様々なハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡについてもベースラインレベルを決定した。標的遺伝子とほぼ同レベルのベースライン発現を有する「対照」ハウスキーピング遺伝子を、比較のために選択した。表２に記載する定量ＰＣＲは、ＲＱ（相対定量）として表示される：標的ｄＣＴ＝標的Ｃｔ−ハウスキーパーＣｔ；ｄｄＣＴ＝標的ｄＣＴ−負の対照ｄＣＴ（ｕｎｃ−２９３ｍ０１、これは、ユニバーサル陰性対照オリゴヌクレオチドである）；ＲＱ＝Ｌｏｇ２−ｄｄＣＴ。
【０２０８】
オリゴヌクレオチド設計
ＦＯＸＰ３を上方制御するために、ＰＲＣ２相互作用領域内でオリゴヌクレオチドを設計した（例えば、図２を参照）。各オリゴヌクレオチドの配列及び構造を表４に示す。表３に、表２又は表４で試験及び記載される特定のオリゴヌクレオチドについて用いるヌクレオチド類似体、修飾及びヌクレオチド間結合の記述を示す。
【０２０９】
Ｔ細胞単離及び培養
ヒトＴ細胞を一人の健常な男性及び一人の健常な女性ドナーから取得した。いずれのドナーも同様の年齢及び健康状態であった。各実験のために、Ｔ細胞をドナーから新しく単離し、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて、ＣＤ４−陽性について選別した。ヒトＴ細胞（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＡｎｔｉ−Ａｎｔｉ（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下でＰＲＭＩ１６４０／１０％ウシ胎仔血清中で培養した。細胞を解凍してから、刺激前に１日かけて培養した。
【０２１０】
Ｔ細胞刺激
Ｔ細胞刺激は、５ｎｇ／ｍｌのホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（ＰＭＡ）及び１ｕＭのイオノマイシン（Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）（Ｓｉｇｍａ）を用いて、５時間にわたり実施した。２×濃度の場合、ＰＭＡ及びイオノマイシンの用量は２倍であった。初期Ｔ細胞刺激条件は、健常な男性ドナー由来のＴ細胞を用いて決定した。健常な女性ドナー由来のＴ細胞（表２ではｈｕＴ細胞＋と称する）を用いて、オリゴヌクレオチドのスクリーニング（以下に記載する）を実施した。
【０２１１】
オリゴヌクレオチドでの細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション
前述のように、Ｔ細胞をＰＭＡ／イオノマイシンにより５時間刺激した。刺激後、約１００，０００細胞／ウェルの９６ウェルＶ字底プレートフォーマットに細胞を塗布した。各ウェルは、最終濃度１０ｕＭのオリゴヌクレオチドを生成するのに適したオリゴヌクレオチド量を含んだ。ウェル当たりの最終容量は、１００ｕｌであった。用量応答実験のために同じ方法を用いた。オリゴヌクレオチドは、裸で（ｇｙｍｎｏｔｉｃａｌｌｙ）送達した。送達に関して、裸の（ｇｙｍｎｏｔｉｃ）（又は裸で（ｇｙｍｎｏｔｉｃａｌｌｙ））という用語は、トランスフェクション試薬不使用の細胞への薬剤の自然取り込み、又はトランスフェクション試薬不使用の被験者への送達を指す。４８時間後、細胞を２０００ＲＰＭ、４℃で、５分間スピンし、氷冷ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１回洗浄した後、Ｃｅｌｌ−ｔｏ−Ｃｔキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて細胞溶解物を生成した。使用したバッファーの量は、３５ｕｌ／ウェルであった。合計５０ｕｌの反応容量に対して１５ｕｌの溶解物を用いて、ｃＤＮＡを作製した。続いて、上に概説したように、定量ＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【０２１２】
結果：
（ａ）５ｎｇ／ｍｌＰＭＡ及び１ｕＭイオノマイシン、（ｂ）１０ｎｇ／ｍｌＰＭＡ及び２ｕＭイオノマイシン、（ｃ）ＤＭＳＯのみ、又は（ｄ）処理なしのいずれかで、Ｔ細胞を刺激した。Ｔ細胞の活性化及び増殖のためのバイオマーカを評価して、ＰＭＡ及びイオノマイシン処理がＴ細胞を好適に刺激したかどうかを決定した。ＣＤＫＮ１Ａは、活性細胞増殖時又はその最中に上方制御されるハウスキーパー遺伝子である。ＣＤ６９及びＩＬ−２ＲＡは、活性化Ｔ細胞において上方制御されることがわかっている。ＣＤ６９、ＣＤＫＮ１Ａ、及びＩＬ−２ＲＡは、ＰＭＡ及びイオノマイシンでの刺激時に上方制御されることが判明した（図１）。ナイーブＴ細胞のバイオマーカであるＣＤ６２Ｌは、ＰＭＡ及びイオノマイシンでの刺激時に下方制御されることが判明した（図１）。これらの結果は、ＰＭＡ及びイオノマイシンが、Ｔ細胞を刺激することができたことを立証するものである。
【０２１３】
一本鎖オリゴヌクレオチド上方制御ＦＯＸＰ３発現のｉｎ  ｖｉｔｒｏ送達
ＦＯＸＰ３を上方制御するための候補としてオリゴヌクレオチドを設計した。配列番号１〜７、４６、又は４７に記載する配列内のＰＲＣ２相互作用領域と相補的であるように、一本鎖オリゴヌクレオチドを設計した。複数のオリゴヌクレオチドを少なくとも２回反復して試験した。オリゴヌクレオチドの配列及び構造特徴を表４に記載する。手短には、前述のようにＴ細胞を刺激した後、前述のように、オリゴヌクレオチドの各々を用いて、裸でｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクトした。ｕｎｃ−２９３ｍ０１オリゴは、ユニバーサル陰性対照オリゴである。「Ｃｎｔｌ  ｕｎ」は、オリゴヌクレオチドを含有しなかったウェルを指し、これも陰性対照として用いた。処理後の刺激Ｔ細胞におけるＦＯＸＰ３発現をｑＲＴ−ＰＣＲにより評価した。ＦＯＸＰ３発現を上方制御したオリゴヌクレオチドを同定した。ＦＯＸＰ３を上方制御したオリゴヌクレオチドのサブセットを、２つのＴ細胞バイオマーカ、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８とも呼ばれる）及びＩＬ２ＲＡの発現についてさらに試験した。これら２つのバイオマーカのレベルをｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。ＧＩＴＲは、Ｔｒｅｇのバイオマーカであるため、このバイオマーカの発現増大は、活性化Ｔ細胞が、Ｔ調節状態にスイッチしていることを示すと考えられる。ＩＬ２ＲＡは、活性化Ｔ細胞のバイオマーカであるため、ＩＬ２ＲＡの減少は、Ｔ細胞活性化状態（例えば、Ｔ調節状態へのスイッチング）の低減を示すと考えられる。ＦＯＸＰ３及びＴ細胞バイオマーカ発現に関するさらなる詳細を表２に概説する。
【０２１４】
実施例２
方法：
ＰＭＡ／イオノマイシンによるＴ細胞活性化
２つの異なる濃度のＰＭＡ／イオノマイシン（１×及び２×）と一緒に、細胞を５時間インキュベートした。１×及び２×濃度のＰＭＡ／イオノマイシンは、実施例１に定義したものと同じである。ナイーブＴ細胞を対照（非処理）として用いた。ＣＤ６２Ｌ（ナイーブ細胞マーカ）及びＣＤ６９（活性化細胞マーカ）ｍＲＮＡレベルを測定した（図３）。
【０２１５】
ＤｙｎａｂｅａｄｓによるＴ細胞活性化
異なる比のＤｙｎａｂｅａｄｓ（２：１又は１：１のビーズ／細胞比）と一緒にヒトＴ細胞を２、５、２４及び４８時間インキュベートした。ナイーブＴ細胞を対照として用いた（非処理）。ＣＤ６２Ｌ（ナイーブＴ細胞マーカ）及びＣＤ２５（活性化Ｔ細胞マーカ）ｍＲＮＡレベルを測定して、Ｔ細胞活性化を試験した（図４）。
【０２１６】
スクリーニング
オリゴを添加する前に、ＰＭＡ／イオノマイシン又はＤｙｎａｂｅａｄｓ（抗ＣＤ３／ＣＤ２８）で５時間活性化した。ＧＡＰＤＨギャップマーを用いて、最適化トランスフェクション方法を決定した。次に、表４に記載するＦＯＸＰ３オリゴを、１０μＭで２４、４８及び９６時間かけて細胞への裸の送達（トランスフェクション試薬不使用のオリゴヌクレオチドの自然取り込み）によってスクリーニングした。２つの個別の実験は、各々２回の生物学的反復で実施した。Ｆｏｘｐ３ｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲにより測定し、Ｆｏｘｐ３タンパク質レベルをフローサイトメトリーにより測定した。ＧＩＴＲ及びＣＴＬＡ４（Ｔｒｅｇバイオマーカ）ｍＲＮＡレベルは、Ｆｏｘｐ３オリゴ処理後にも測定した。三重陽性細胞：Ｆｏｘｐ３＋、ＣＴＬＡ４及びＧＩＴＲ＋由来の細胞上清において、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０を測定した。表からのいくつかのＦＯＸＰ３オリゴを、次の基準により要望の特性を有するものとして選択した：Ｆｏｘｐ３ｍＲＮＡ及びタンパク質レベル、Ｔｒｅｇバイオマーカの存在。
【０２１７】
結果：
ＰＭＡ／イオノマイシンを用いて、ヒトＴ細胞を活性化した。ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ６９ｍＲＮＡレベルを測定することにより、Ｔ細胞の活性化を確認した（図３）。オリゴを活性化ヒトＴ細胞に送達することができることを立証するためにＧＡＰＤＨギャップマーオリゴを用いた。ＧＡＰＤＨギャップマーは、オリゴ処理の４８時間後に４及び２０μＭでＰＭＡ／Ｉｏｎｏ活性化Ｔ細胞の最大７０％ｍＲＮＡノックダウンを示した（図５）。
【０２１８】
次に、ＰＭＡ／イオノマイシン又はダイナビーズを用いて、ヒトＴ細胞を活性化した。ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ６９又はＣＤ６９Ｌ及びＣＤ２５ｍＲＮＡレベルを測定することにより、Ｔ細胞の活性化を確認した（図３及び４）。表４からのＦＯＸＰ３オリゴ（ＦＯＸＰ３−０１〜ＦＯＸＰ３−６０）を１０μＭで、活性化Ｔ細胞に裸で送達した。ＦＯＸＰ３オリゴは、ＰＭＡ／イオノマイシン活性化細胞中の陰性対照オリゴ（２９３）と比較して、２〜６倍のＦｏｘｐ３ｍＲＮＡ上方制御を示した（図６）。ＦＯＸＰ３オリゴは、ダイナビーズ活性化Ｔ細胞における陰性対照オリゴ（２９３）と比較して、２〜８倍のＦｏｘｐ３ｍＲＮＡ上方制御を示した（図７）。ダイナビーズ活性化Ｔ細胞において、ハウスキーパー遺伝子（ＧＡＰＤＨ）Ｃｔレベルは、処置同士の間で極めて一致していた（図８）。
【０２１９】
いずれもＴｒｅｇバイオマーカであるＣＴＬＡ４ｍＲＮＡ及びＧＩＴＲｍＲＮＡのレベルは、ダイナビーズ活性化Ｔ細胞へのＦＯＸＰ３オリゴの送達後にも測定した。ＦＯＸＰ３オリゴは、一般に、９６時間の処理後、ＣＴＬＡ４ｍＲＮＡレベルを上方制御することが判明した（図９）。ＦＯＸＰ３オリゴは、一般に、９６時間の処理後、ＧＩＴＲｍＲＮＡレベルを上方制御することが判明し、２０を超えるオリゴが、上方制御を示している（図１０）。
【０２２０】
ＦＯＸＰ３オリゴが、ダイナビーズ活性化Ｔ細胞のＦＯＸＰ３ｍＲＮＡレベルを上方制御することを確認するために、第２の実験を実施した。一般に、ＦＯＸＰ３オリゴは、活性化Ｔ細胞において、ＦＯＸＰ３ｍＲＮＡレベルを２〜１０倍上方制御した（図１１）。１．５Ｃｔを超えるハウスキーパー遺伝子の変化を引き起こしたＦＯＸＰ３オリゴは、陽性とみなさなかった（図１２）。
【０２２１】
次に、フローサイトメトリーを用いて、オリゴ処理した活性化ヒトＴ細胞中のＦｏｘｐ３タンパク質のレベルを検出した。Ｆｏｘｐ３タンパク質のレベルは、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、及びＦｏｘＰ３＋である細胞で測定した。一般に、ＦＯＸＰ３オリゴ（例えば、ＦＯＸＰ３−２〜ＦＯＸＰ３−６０）が、三重陽性ヒトＴ細胞のＦｏｘｐ３タンパク質のレベルを増加させることが判明した（図１３）。例示的オリゴであるＦＯＸＰ３−３５からの生フローサイトメトリーデータを図１４に示すが、これは、陰性対照オリゴ（２９３）で処理した細胞と比較したＦＯＸＰ３発現の差を明らかにしている。
【０２２２】
続いて、全細胞集団と比較した、三重陽性Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）のパーセンテージを調べた。複数のオリゴ（例えば、ＦＯＸＰ３−３、ＦＯＸＰ３−５〜ＦＯＸＰ３−４４、ＦＯＸＰ３−４６〜ＦＯＸＰ３−５０、ＦＯＸＰ３−５２−６０）が、オリゴ対照と比較して、２倍超Ｔｒｅｇ細胞集団を増加したことがわかった。
【０２２３】
ある実施形態では、下記の基準に従って、考えられるリード分子として、いくつかのＦＯＸＰ３オリゴを選択した：ＦｏｘＰ３ｍＲＮＡ及びタンパク質レベル、全細胞集団内のＴｒｅｇのパーセント及びＣＴＬＡ４／ＧＩＴＲｍＲＮＡ発現。２つの実験のオリゴから得られた結果の概要を表５及び６に記載する。いずれの実験においても、オリゴＦＯＸＰ３−２８、ＦＯＸＰ３−２９、ＦＯＸＰ３−３０及びＦＯＸＰ３−５７は、陽性バイオマーカ発現を示した（すなわち、基準を満たした）。
【０２２４】
【表１】
2016521556.tif 000006
【０２２５】
【表２】
2016521556.tif 000007
【０２２６】
三重陽性マーカ（ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋）に基づき選択したオリゴは、ＩＬ−１０タンパク質、すなわち免疫抑制サイトカインを上方制御した（図１６）。要約すると、この実験の結果は、ＦＯＸＰ３オリゴが、ＦＯＸＰ３、並びにいくつかのＴｒｅｇバイオマーカ及びＩＬ−１０を上方制御することができることを立証するものである。
【０２２７】
実施例３
方法：
ＭＡＬＡＴ−１をターゲティングする単一用量２５ｍｇ／ｋｇのギャップマーで、マウス（ｎ＝４）を処理した。投与から１、５及び７日後に血液及び肝臓を採取した。ＣＤ４＋細胞を血液から選別し、ｑＰＣＲによりＭＡＬＡＴ−１ｍＲＮＡを測定した。
【０２２８】
結果：
オリゴをＴ細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで送達することができることを立証するために、ＭＡＬＡＴ−１ギャップマーを使用した。単一用量のＭＡＬＡＴ−１ギャップマーオリゴヌクレオチドが、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び肝臓において、ＭＡＬＡＴ−１ｍＲＮＡのレベルを低減することができることが判明した（図１７及び１８）。これらの結果は、オリゴをＴ細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで好適に送達することができることを立証するものである。
【０２２９】
実施例４
実施例２で同定したリードオリゴ候補は、マウスＦｏｘＰ３遺伝子と１又は０のミスマッチを有するように設計された（以下の表７を参照）ため、これらのオリゴをマウスモデルにおいて試験する。マウスモデルの例として、ＧＦＰ／ＲＦＰＴｒｅｇリポータマウス、ＥＡＥ（多発性硬化症）及びＮＯＤ（１型糖尿病）マウスモデル、マウス炎症性疾患モデル、及びヒト化マウスモデルが挙げられる。炎症性疾患モデルの例として、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）モデル、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）モデル、例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎、関節リウマチモデル並びに乾癬モデルが挙げられる。ＧｖＨＤモデルとしては、ＭＨＣミスマッチ若しくはｍｉＨＡミスマッチ宿主へのドナー細胞若しくは組織の導入、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２ｄ）レシピエント株へのＣ５７／Ｂ１６（Ｈ２ｂ）ドナー株脾細胞若しくはＴ細胞の導入、又はＢＡＬＢ．Ｋ（Ｈ２ｋ）レシピエント株へのＢ１０．Ｂｒ（Ｈ２ｋ）ドナー株骨髄細胞若しくはＴ細胞の導入を含む複数のモデルがある（例えば、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｍｅｃｈ．Ｍａｙ  ２０１１；４（３）：３１８−３３３を参照）。ＩＢＤモデルとしては、遺伝子モデルＩＬ−１０Ｒ２−／−×優性陰性ＴＧＦβＲＩＩマウス、ＳＡＭＰ１／Ｙｉｔ、Ｍｄｒ１ａ−／−、ＩＫＫγ−／−、並びに化学薬剤モデル：デキストラン硫酸ナトリウム、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸、及びオキサゾロンが挙げられる（例えば、Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ．Ｐｒｏｇ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｓｃｉ．２０１２；１０５：２６３−３２０を参照）。関節リウマチモデルとしては、コラーゲン誘導性関節炎、コラーゲン−抗体誘導性関節炎、抗原（例えば、完全フロイントアジュバント中のメチル化ＢＳＡ）に感作された炎症性関節炎、ＴＮＦ−ａトランスジェニックマウス、ＳＫＧマウス、ＳＣＩＤマウス、ＤＲ４−ＣＤ４マウス、及びＤＮａｓｅＩＩ−／−ＩＦＮ−ＩＲ−／−マウスが挙げられる（例えば、Ａｓｑｕｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９．３９：１９９１−２０５８を参照）。乾癬モデルとしては、Ｔｔｃ７ｆｓｎ／Ｔｔｃ７ｆｓｎマウス、Ｋ５−Ｓｔａｔ３Ｃマウス、Ｋ１４−ＩＬ−２０マウス、Ｋ１４−ＩＬ−６マウス、Ｋ５−潜在型ＴＧＦβ１マウス、Ｋ１０−ＢＭＰ−６マウス、Ｋ１４−ＩＬ１αマウス、Ｋ１４−ＶＥＧＦマウス、ＩＬ１−ｒａノックアウトマウス、ＩＲＦ−２ノックアウトマウス、及びＩＫＫ２ノックアウトマウスがある（例えば、Ｇｕｄｊｏｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２００７  Ｊｕｎ；１２７（６）：１２９２−３０８を参照）。また、適切なマウスモデルは、例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）又は別の商業的供給源から入手することも可能である。
【０２３０】
【表３】
2016521556.tif 000008
【０２３１】
実施例５
ヒトＥＺＨ１及びＥＺＨ２ｍＲＮＡをターゲティングし、分解するようにギャップマーを設計した。ギャップマーを用いて、ＦＯＸＰ３発現がＥＺＨ１及び／又はＥＺＨ２により調節される程度を評価した。
【０２３２】
【表４】
2016521556.tif 000009
【０２３３】
ＥＺＨ１をターゲティングするギャップマーは、陰性対照（２９３）と比較して、１０μＭで５日後に（自然取り込み）、ヒトＴ細胞中のＥＺＨ１ｍＲＮＡレベルを９０〜９５％低下した（図１９）。５μＭ（組み合わせオリゴ）では、ＥＺＨ１のレベルは、ギャップマー及び時間に応じて６０〜９０％低下した（図１９）。ＥＺＨ２ギャップマーは、陰性対照（２９３）と比較して、１０μＭで５日後に、ＥＺＨ２ｍＲＮＡレベルを最大で９９％低下した（図２０）。ギャップマー組み合わせは、ＥＺＨ２ｍＲＮＡレベルを７５％低下した（図２０）。
【０２３４】
ＥＺＨ１ギャップマーは、陰性対照と比較して、ＦｏｘＰ３ｍＲＮＡレベルを約２倍増加した（図２１）。ＦｏｘＰ３ｍＲＮＡレベルは、ＥＺＨ２ギャップマー＃９により最大１０倍増加した。ＦｏｘＰ３ｍＲＮＡレベルに対するＥＺＨ１及びＥＺＨ２ギャップマーの組み合わせ（例えば、２８−９、２９−９、２８−３８、及び２９−３８）の作用は、いずれか単独よりはるかに高く、相乗的であると思われる（図２１）。
【０２３５】
いくつかのＴ細胞関連遺伝子をＥＺＨ１／２ギャップマー処理後の遺伝子発現レベルについて試験した。Ｆｏｘｐ３は、ＥＺＨ１／２ＫＤ後のｍＲＮＡレベルに、より高い増加を示した。ここでも、ＥＺＨ１及びＥＺＨ２ギャップマーを組み合わせると、相乗的と考えられる効果が観測された（図２２）。ＥＺＨ１及びＥＺＨ２ギャップマーによる処理はまた、Ｆｏｘｐ３及びＣＤ３ｚについて二重陽性（＋＋）細胞のパーセントも高めた（図２３）。
【０２３６】
表
表１：ヒトｍｉＲＮＡのシード配列ではない六量体
【化４】
2016521556.tif 000010
【化５】
2016521556.tif 000011
【化６】
2016521556.tif 000012
【化７】
2016521556.tif 000013
【化８】
2016521556.tif 000014
【化９】
2016521556.tif 000015
【化１０】
2016521556.tif 000016
【化１１】
2016521556.tif 000017
【０２３７】
【表５】
2016521556.tif 000018
【０２３８】
【表６】
2016521556.tif 000019
【０２３９】
【表７】
2016521556.tif 000020
【０２４０】
【表８】
2016521556.tif 000021
【０２４１】
【表９】
2016521556.tif 000022
【０２４２】
【表１０】
2016521556.tif 000023
【０２４３】
【表１１】
2016521556.tif 000024
【０２４４】
【表１２】
2016521556.tif 000025
【０２４５】
【表１３】
2016521556.tif 000026
【０２４６】
【表１４】
2016521556.tif 000027
【０２４７】
【表１５】
2016521556.tif 000028
【０２４８】
【表１６】
2016521556.tif 000029
【０２４９】
【表１７】
2016521556.tif 000030
【０２５０】
【表１８】
2016521556.tif 000031
【０２５１】
【表１９】
2016521556.tif 000032
【０２５２】
【表２０】
2016521556.tif 000033
【０２５３】
【表２１】
2016521556.tif 000034
【０２５４】
【表２２】
2016521556.tif 000035
【０２５５】
【表２３】
2016521556.tif 000036
【０２５６】
一本鎖オリゴヌクレオチド（標的遺伝子のアンチセンス鎖）
配列番号の範囲：６０〜１６４６１
Ｇランを含まない配列番号：
【化１２】
2016521556.tif 000037
ｍｉＲシードを含まない配列番号：
【化１３】
2016521556.tif 000038
【化１４】
2016521556.tif 000039
【化１５】
2016521556.tif 000040
【化１６】
2016521556.tif 000041
【化１７】
2016521556.tif 000042
【化１８】
2016521556.tif 000043
【化１９】
2016521556.tif 000044
【化２０】
2016521556.tif 000045
【化２１】
2016521556.tif 000046
【化２２】
2016521556.tif 000047
【化２３】
2016521556.tif 000048
一本鎖オリゴヌクレオチド（標的遺伝子のセンス鎖）
配列番号の範囲：１６４２６〜４５７１３
Ｇランを含まない配列番号：
【化２４】
2016521556.tif 000049
【化２５】
2016521556.tif 000050
ｍｉＲシードを含まない配列番号：
【化２６】
2016521556.tif 000051
【化２７】
2016521556.tif 000052
【化２８】
2016521556.tif 000053
【化２９】
2016521556.tif 000054
【化３０】
2016521556.tif 000055
【化３１】
2016521556.tif 000056
【化３２】
2016521556.tif 000057
【化３３】
2016521556.tif 000058
【化３４】
2016521556.tif 000059
【化３５】
2016521556.tif 000060
【化３６】
2016521556.tif 000061
【化３７】
2016521556.tif 000062
【化３８】
2016521556.tif 000063
【化３９】
2016521556.tif 000064
【化４０】
2016521556.tif 000065
【化４１】
2016521556.tif 000066
【化４２】
2016521556.tif 000067
【化４３】
2016521556.tif 000068
【化４４】
2016521556.tif 000069
【化４５】
2016521556.tif 000070
【化４６】
2016521556.tif 000071
【０２５７】
以上記載した明細書は、当業者が本発明を実施する上で十分であると考えられる。本発明は、記載した例によって範囲を限定されることはない。何故なら、これらの例は本発明の一態様の単なる例示として意図されるに過ぎず、他の機能的に同等の実施形態が、本発明の範囲に含まれるからである。本明細書に示し、説明したもの以外の本発明の様々な変更は、以上の説明から当業者には明らかになることであり、これらは、添付した特許請求の範囲に含まれる。本発明の利点及び目的は、本発明の各実施形態により必ずしも包含されているわけではない。
【図１】
2016521556.tif 000072
【図２】
2016521556.tif 000073
【図３】
2016521556.tif 000074
【図４】
2016521556.tif 000075
【図５】
2016521556.tif 000076
【図６】
2016521556.tif 000077
【図７】
2016521556.tif 000078
【図８】
2016521556.tif 000079
【図９】
2016521556.tif 000080
【図１０】
2016521556.tif 000081
【図１１】
2016521556.tif 000082
【図１２】
2016521556.tif 000083
【図１３】
2016521556.tif 000084
【図１４−１】
2016521556.tif 000085
【図１４−２】
2016521556.tif 000086
【図１５】
2016521556.tif 000087
【図１６】
2016521556.tif 000088
【図１７】
2016521556.tif 000089
【図１８】
2016521556.tif 000090
【図１９】
2016521556.tif 000091
【図２０】
2016521556.tif 000092
【図２１】
2016521556.tif 000093
【図２２】
2016521556.tif 000094
【図２３】
2016521556.tif 000095
【配列表】
2016521556000001.app
【国際調査報告】
2016521556.tif 000096
2016521556.tif 000097
2016521556.tif 000098
2016521556.tif 000099
2016521556.tif 000100