(57)【要約】毒素系治療用ペプチドを含む医薬組成物を投与することにより、ドライアイ及びブドウ膜炎等の眼科的状態を治療する方法を本明細書に開示する。ペプチドは、酸又はアミドをＣ末端に含むことが可能であり、アニオン電荷を有する有機又は無機化学物質に付着させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする対象者において炎症性の眼科的状態を治療する方法であって、式ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１７を有するＳｈＫ系ペプチドを含む医薬組成物の治療有効量を前記対象者に投与することを含む方法。
【請求項２】
必要とする対象者において炎症性の眼科的状態を治療する方法であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１７、及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１８に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有するＳｈＫ系ペプチドを含む医薬組成物の治療有効量を前記対象者に投与することを含む方法。
【請求項３】
前記ＳｈＫ系ペプチドは、天然又は合成ペプチドである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記ＳｈＫ系ペプチドは、アニオン電荷を有する有機又は無機化学物質に付着している、請求項１乃至３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
前記ＳｈＫ系ペプチドのＣ末端は、酸又はアミドである、請求項１乃至３の何れかに記載の方法。
【請求項６】
前記投与は、局所的に眼に対して行われる、請求項１乃至３の何れかに記載の方法。
【請求項７】
前記投与は、非経口及び／又は経腸投与である請求項１乃至３の何れかに記載の方法。
【請求項８】
前記投与は、局所的に眼に対して行われると共に、非経口及び／又は経腸経路で行われる、請求項１乃至３の何れかに記載の方法。
【請求項９】
前記投与は、硝子体内注射によるものである、請求項１乃至３の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
前記投与は、１日６回、１日５回、１日４回、１日３回、１日２回、１日１回、１週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、又は６ヶ月に１回である、請求項１乃至３の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
前記炎症性の眼科的状態は、ドライアイ、ブドウ膜炎  小児ブドウ膜炎、及び／又はシェーグレン症候群である、請求項１乃至３の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
前記対象者は、人間の子供、若年者、又は成人である、請求項１乃至３の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
前記医薬組成物は、更に、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．８ｗ／ｖ％ＮａＣｌと共に、ポリソルベート２０を０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、１、２、３、又は４ｗ／ｖ％含み、前記組成物のｐＨは、５．０、５．５、６．０、６．５、７、７．５、又は８である請求項１乃至３の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
前記医薬組成物は、ポリソルベート２０を０．０５ｗ／ｖ％含み、前記組成物のｐＨは、６．０である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記医薬組成物は、更に、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．８ｗ／ｖ％ＮａＣｌと共に、ポリソルベート８０を０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、１、２、３、又は４ｗ／ｖ％含み、前記組成物のｐＨは、５．０、５．５、６．０、６．５、７、７．５、又は８である、請求項１乃至３の何れかに記載の方法。
【請求項１６】
前記医薬組成物は、ポリソルベート８０を０．０５ｗ／ｖ％含み、前記組成物のｐＨは、６．０である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
請求項１乃至１６の何れかに記載の方法による治療から恩恵を受け得る対象者をスクリーニングする方法であって、前記対象者の生体試料からのＴ細胞のＫｖ１．３チャネル発現レベルを測定することと、前記対象者のＫｖ１．３チャネル発現レベルを、炎症性の眼科的状態を有していない集団からのデータセットより得た基準レベルと比較することと、前記対象者におけるＫｖ１．３チャネル発現のレベルが前記基準レベルと比較して増加している場合、前記対象者が請求項１乃至１６の何れかに記載の方法による治療から恩恵を受けると判断することと、を含む方法。
【請求項１８】
毒素系治療用ペプチドによる治療の結果を予測するために対象者を評価する方法であって、前記対象者の生体試料からのＴ細胞のＫｖ１．３チャネル発現レベルを分析することを含み、炎症性の眼科的状態を有していない集団からのデータセットより得た基準レベルに対して増加したＫｖ１．３チャネルの発現レベルは、毒素系治療用ペプチドの治療有効量の送達から恩恵を受ける対象者を示す方法。
【請求項１９】
前記毒素系治療用ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れか１つに対して、少なくとも８０％の配列同一性を有するＳｈＫ系ペプチドである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
更に、ＳｈＫ系ペプチドの存在下で、炎症誘発性免疫刺激剤又はＴ細胞活性化剤により前記Ｔ細胞にチャレンジすることを含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
更に、前記Ｔ細胞による炎症誘発性サイトカイン生成を測定することを含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
前記測定されるサイトカインは、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、インターロイキン（ＩＬ）−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、顆粒球マクロファージコロニ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）３、及びＭＭＰ９のうち１種類以上である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
更に、ＳｈＫ系ペプチドの存在下又は不在下で、眼の抗原により前記Ｔ細胞にチャレンジすることを含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
前記ＳｈＫ系ペプチドは、前記式ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１７を有する、請求項１９記載の方法。
【請求項２５】
前記ＳｈＫ系ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１９記載の方法。
【請求項２６】
前記ＳｈＫ系ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１９記載の方法。
【請求項２７】
前記ＳｈＫ系ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１７、及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１８に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部とする２０１３年７月２２日出願の米国仮特許出願第６１／８５７，１５７号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
本明細書に開示する方法は、多数の用途のうち特に、ドライアイ及びブドウ膜炎を含む眼科的状態を治療する毒素系治療ペプチドの使用に関する。毒素系治療ペプチドには、ＳｈＫ系ペプチドを含めることができる。毒素系治療ペプチドを含む医薬組成物を更に開示する。
【背景技術】
【０００３】
眼による涙液分泌は、角膜、角膜縁、結膜、血管、及び眼瞼を含む眼表面組織を保護及び維持する。涙液分泌は、感染性因子及び環境損傷から眼を保護する上で極めて重要である。涙液により形成される液膜も、滑らかな光学面をもたらし、細胞の健康を維持する上で不可欠である。
【０００４】
最も一般的な眼科的状態の１つは、ドライアイ症候群である（乾性角結膜炎及び「ドライアイ」としても知られる）。ドライアイは、眼の炎症及び損傷につながる恐れのある涙液の不足または欠如として定義される。
【０００５】
ドライアイは、様々な原因で生じる可能性がある。例えば、一時的な形態のドライアイは、眼の外傷または感染に対する炎症反応が引き金となり得る。一時的なドライアイの中には、例えば、局所的な眼の自己免疫状態が発生した際に慢性となるものもある。
【０００６】
ドライアイは、全身状態が引き起こす場合もある。例えば、シェーグレン症候群は、ドライアイ及び口渇という２つの最も一般的症状により特定される自己免疫障害である。シェーグレン症候群は、眼及び口の粘膜及び水分分泌腺に対して免疫系の損傷をもたらす。細胞及び組織の損傷により、涙液及び唾液の生産が減少する。シェーグレン症候群は、リューマチ性関節炎及びエリテマトーデス等、他の免疫系障害を伴うことが多い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
シェーグレン症候群により生じたドライアイの現行の治療には、ピロカルピン、シクロスポリン又はセビメリン等の薬剤が含まれ、これらは何れも経口使用時に主に唾液生産を増加させる。ピロカルピンは、点眼薬として投与することが可能だが、瞳孔の収縮、及びてんかん型の影響のリスクを考慮する必要がある。
【０００８】
シェーグレン症候群は、許容できない副作用の無い有効な治療が存在しないドライアイにつながる状態の一例に過ぎない。他の例として、ブドウ膜炎は、ブドウ膜（ｕｖｅａ）の炎症であり、米国における視力障害の約１０％を占める。ブドウ膜（ｕｖｅａｌ  ｔｒａｃｔ）は、虹彩、毛様体、及び脈絡膜を含む。ブドウ膜炎は、解剖学上、前部、中間部、後部、又はびまん性に分類するのが最も一般的である。前部ブドウ膜炎は、主に眼の前眼部に局在し、虹彩炎及び虹彩毛様体炎を含む。中間部ブドウ膜炎は、周辺部ブドウ膜炎とも呼ばれ、毛様体及び毛様体扁平部の領域内の虹彩及び水晶体の直下の範囲に集中しているため、代替の用語として「毛様体炎」及び「毛様体扁平部炎」も用いられる。後部ブドウ膜炎は、ブドウ膜炎の多数の形態を表し、網膜炎、脈絡膜炎、及び視神経炎を含む。びまん性ブドウ膜炎は、前部、中間部、及び後部構造を含む眼の全ての部位の炎症を意味する。ブドウ膜炎に対する現在の治療には、主に局所的に施される及び／又は全身に対するステロイド療法が含まれる。
【０００９】
米国におけるブドウ膜炎の症例の略６％は、小児で発生しており、世界の人口におけるブドウ膜炎の症例の２．２乃至３３．１％は、小児及び若年者に発生している。小児ブドウ膜炎の主要原因の１つは、若年性特発性関節炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、小児サルコイドーシス、及び川崎病を含む自己免疫障害に関連する。小児ブドウ膜炎は、小児における大きな健康問題であり、合併症には帯状角膜変性、緑内障、肺結核、白内障形成、黄斑浮腫、及び視神経変性が含まれる。慢性ブドウ膜炎は、病的状態及び失明をもたらす場合もある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、ドライアイ、ブドウ膜炎、強膜炎、及び他の眼の炎症状態を含む眼科的状態を治療する方法を提供する。本開示は、更に、上強膜炎、角膜炎、網膜血管炎、又は角膜、網膜、強膜、及び／又は眼窩の炎症を伴う他の疾患等、全身性自己免疫疾患の眼における徴候を治療する方法を提供する。方法では、治療有効量の毒素系治療用ペプチドを含む医薬組成物を投与することにより、眼科的状態を治療する。更に、記載した治療から恩恵を受ける被験者を特定する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、タプシガルジンにより刺激したヒト全血における炎症性サイトカイン濃度に対するＳｈＫ−１８６の効果を示す一連の４つのグラフである。ＳｈＫ−１８６は、炎症性サイトカイン、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、及びインターフェロン（ＩＦＮ）−γを用量依存的に抑制した。
【００１２】
【図２】図２は、タプシガルジンにより刺激したヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）における炎症性サイトカイン濃度に対するＳｈＫ−１８６の効果を示す一連の４つのグラフである。ＳｈＫ−１８６は、炎症性サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、及びＩＦＮ−γを用量依存的に抑制した。
【００１３】
【図３】図３Ａ乃至３Ｄは、ＳｈＫ−１８６又はＳｈＫ−１９８を、図示したように１日３回局所投与した後の局所（眼）及び全身（血漿）の流体におけるＳｈＫ−１８６及びＳｈＫ−１９８の定量を示す図である。図３Ａは、局所投与したＳｈＫ−１８６が、治療した右眼（ＲＥ）の前房水性流体において有意な濃度で確認されたが、左眼（ＬＥ）又は血漿（Ｐ）では確認されず、薬物の眼内送達が示唆されることを示す。図３Ｂは、未治療の左眼（ＬＥ）由来の試料において検出可能なＳｈＫ−１８６が存在せず、治療済みの右眼（ＲＥ）において有意な量の薬物が存在したことを示す。試料は、投薬の２１日後に採取した。図３Ｃは、０．１％ＳｈＫ−１８６又は１％ＳｈＫ−１８６の７日間の局所投与により、眼の前房内の薬物濃度に濃度依存性の増加が生じたことを示す。全身曝露は、検出レベルを下回った（図示せず）。１−１乃至１−４：生理食塩水溶媒による処置、３−１乃至３−３：Ｐ６Ｎ中の０．１％ＳｈＫ−１８６溶液、４−１乃至４−４：Ｐ６Ｎ中の１％ＳｈＫ−１８６溶液。前房水性流体は、２９ゲージ針により１９日目に回収し、希釈して、標準ＥＬＩＳＡ法により分析した。図３Ｄは、０．１％ＳｈＫ−１９８又は１％ＳｈＫ−１９８の１日３回７日間の局所投与により、眼内の薬物濃度に濃度依存性の増加が生じたことを示す。全身曝露は、検出レベルを下回った（図示せず）。２−１乃至２−４：Ｐ６Ｎ溶媒による処置、５−１乃至５−４：Ｐ６Ｎ中の０．１％ＳｈＫ−１９８溶液、６−１乃至６−４：Ｐ６Ｎ中の１％ＳｈＫ−１９８溶液。水性流体は、２９ゲージ針により１９日目に回収し、希釈して、標準ＥＬＩＳＡ法により分析した。
【００１４】
【図４】図４Ａ乃至４Ｄは、実験的前部ブドウ膜炎モデルにおけるＳｈＫ−１８６の局所投与の治療有効性を示す。図４Ａ：ＳｈＫ−１８６の局所投与は、実験的自己免疫性前部ブドウ膜炎（ＥＡＡＵ）のラットモデルにおける臨床スコアを低下させる。アジュバントメラニン関連抗原（ＭＡＡ）エマルションを用いた免疫化によるＥＡＡＵの誘導後１１、１３、１５、及び１８日目に  スリットランプを用いて各動物の臨床的観察を行った。眼には、瞳孔機能（縮瞳）、虹彩構造、前房内での細胞の有無、前房内でのタンパク質（フレア）の有無に基づいて個別のスコアを与えた。スコアは、その後、それぞれの日について複合臨床スコアに変換した。０乃至８日目は０．１％、９乃至１８日目は１％のＳｈＫ−１８６により１日３回、眼に局所的な治療を施した動物の複合スコアは、溶媒により処置したものよりも有意に低いことが分かった。Ｎ＝８ラット／１６眼。図４Ｂ：  ＳｈＫ−１８６の局所投与は、実験的自己免疫性ブドウ膜炎のラットモデルにおける肉眼病変を減少させた。左図：動物に溶媒（Ｐ６Ｎ）を１日３回投与した。免疫化後１８日目、動物３−２の観察では、複合臨床スコアが１３となる：縮小瞳孔にタンパク質が充満（スコア＝４）、何らかの損傷を有する充血した虹彩血管（スコア＝３）、前房内の多数の浸潤性細胞（スコア＝４、図示せず）、及び僅かなフレア（スコア＝２、図示せず）。右図：ＥＡＡＵ誘導のための免疫化後、０日目から８日目までを含めて０．１％ＳｈＫ１８６を与え、９日目から１８日目までを含めて１％ＳｈＫ−１８６を与えた動物。免疫化後１８日目、動物４−８の観察では、複合臨床スコアが０となる：正常な瞳孔（スコア＝０）、正常な虹彩血管及び構造（スコア＝０）、前房内で視認される細胞又はタンパク質の不在（それぞれについてスコア＝０、図示せず）。図４Ｃ：ＳｈＫ−１８６の局所投与は、ＥＡＡＵにおける病理組織を減少させる。アジュバントＭＡＡによる免疫化後１９日目に１０％ホルマリン中に採取した眼を切片化してヘマトキシリン及びエオシンにより染色した。眼の切片は、虹彩及び毛様体構造と、虹彩及び／又は毛様体及び前房の間質への炎症細胞の浸潤の度合い（Kim et al., Korean J. Ophthalmol. 12, 14-18, (1998)に記載のパラメータに基づく）とについて、独立した獣医病理学者が観察及び採点した。（１．）対照の健康な眼（１０×）。（２．）及び（４．）溶媒により処置した動物由来の眼では、病理組織スコアが２となった（１０×、４０×）。（３．）及び（５．）０．１％ＳｈＫ−１８６により９日間、その後１％ＳｈＫ−１８６により１０日間、１日３回治療した動物由来の眼では、病理組織スコアが０となった（１０×、４０×）。（６．）溶媒処置群（Ｐ６Ｎ）又は上述したＳｈＫ−１８６治療群（１％ＳｈＫ−１８６）由来の４個の眼の病理組織学的分析に基づく複合臨床スコア。図４Ｄ：ＳｈＫ−１９８の局所投与は、ＥＡＡＵのラットモデルにおける臨床スコアを低下させる。アジュバントＭＡＡエマルションを用いた免疫化によるＥＡＡＵの誘導後１３日目に、スリットランプを用いて各動物の臨床的観察を行った。眼には、前房内での細胞の有無（上図）、及び前房内でのタンパク質又はフレアの有無（下図）に基づいて���個別のスコアを与えた。ラットには、１日３回、Ｐ６Ｎ溶媒又は１％ＳｈＫ−１９８による眼に対する局所的処置を施した。Ｎ＝１０ラット／２０眼。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
涙液分泌は、物理的、環境的、微生物的、及び感情的刺激に対する迅速な涙液分泌反応が示すように、密な神経連絡を有する複雑系により調整される。涙液分泌組織は、涙腺、マイボーム腺、結膜杯細胞、及び上皮細胞を含む。涙液形成系の全体的又は部分的な破壊は、涙液生産の不足、即ち、ドライアイとして知られる状態につながる恐れがある。
【００１６】
ドライアイは、局所状態又は全身状態により発生する場合がある。例えば、局所状態としてのドライアイは、眼表面に対するストレスにより生じ得る。こうした眼のストレスは、サイトカイン及びケモカインといった炎症性因子の感染及び／又は調整の乱れにより発生する場合がある。こうした状態は、一時的な場合がある。しかしながら、他の例では、眼表面破損中に、抗原提示細胞（ＡＰＣ）が活性化され、自己抗原を内在化し、これが処理及び提示されて自己免疫反応を促進する場合がある。結果的に生じた組織損傷は、持続的な自己免疫反応を発生させ、結果的に、角膜、杯細胞、及び上皮細胞を含む眼組織を破壊する。この破壊は、最終的には、持続性のドライアイ及び他の炎症性眼疾患の徴候につながる。
【００１７】
ドライアイは、シェーグレン症候群、眼部瘢痕性類天疱瘡、及びスティーブンス・ジョンソン症候群を含む全身性自己免疫疾患により発生する場合もある。ドライアイをもたらす全身的自己免疫は、幹細胞移植における同種移植により生じ、移植片対宿主病として現れる場合もある。
【００１８】
ドライアイにつながる局所性及び全身性自己免疫反応は、自己反応性Ｔ及び／又はＢ細胞が活性化する点で共通している。一般にドライアイでは、シェーグレン症候群において特に、眼表面組織に対する自己反応性Ｔ細胞の活性化、分化、及びホーミングは、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ及びインターロイキン（ＩＬ）−１７を含むサイトカインの増加に関連する。ＩＦＮ−γは、角膜上皮細胞上のムチンを変化させ、組織損傷及び杯細胞密度低下につながる。
【００１９】
ドライアイのマウスモデルによる実験も、状態の発生及び病理におけるＴ細胞の役割を裏付けている。Ｓｔｅｒｎら（Int. Rev. Immunol. 32:19-41, 2013）は、乾燥ストレスを引き起こす条件に晒すことにより、マウスにおいてドライアイを誘導した。数日後、マウスは、Ｔ細胞浸潤及びサイトカイン濃度の増加を示した（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、及びＩＬ−１７）。眼表面は、アポトーシス及び細胞死を示し、涙液の生産が減少した。
【００２０】
これらのドライアイマウス（ドナーマウス）のリンパ節及び脾臓由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を取り出し、Ｔ細胞欠損マウス（レシピエントマウス）に注入した。レシピエントマウスでは、ドナーマウスのものと同様のドライアイ状態が発生し、これには眼表面組織に対するＴ細胞のホーミング、サイトカイン濃度の上昇、杯細胞密度の低下、涙液の生産低下、及び涙液の代謝回転の低下が含まれた。Ｓｔｅｒｎらは、ドナーマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞がレシピエントマウスにおけるドライアイを誘導するのに十分であると結論付けた。この結論は、ドライアイ患者の眼表面組織内に局在する活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の観察と一致する。
【００２１】
Ｔ細胞の浸潤及び活性化に関連する炎症性の眼の疾患又は状態には、アカントアメーバ感染症、急性網膜色素上皮炎、アレルギ、関節炎、細菌感染症、ベーチェット病、ベーチェット病関連網膜炎、眼瞼炎、化学暴露、脈絡膜炎、脈絡網膜炎、クローン病、結膜炎、糖尿病性網膜症、ドライアイ、上強膜炎、眼部打撲、眼部外傷、食物アレルギ、異物暴露、真菌感染症、蕁麻疹、虹彩毛様体炎、虹彩炎、若年性特発性関節炎、角膜炎、狼瘡、マイコバクテリア感染症、視神経網膜炎、寄生虫感染症、手術後の状態、後部毛様体炎、網膜血管炎、網膜炎、リューマチ性関節炎、サルコイドーシス、サルコイドーシス関連網膜炎、季節性アレルギ、強膜炎、スピロヘータ感染症、毒素暴露、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、及びウイルス感染症が含まれる。
【００２２】
多くの免疫関連疾患及び代謝障害は、Ｔ細胞介在性の眼科的状態を含め、少なくとも部分的には、メモリＴ細胞の作用に起因する。２種類のメモリＴ細胞として、セントラルメモリＴ細胞（ＴＣＭ）及びエフェクタメモリＴ細胞（ＴＥＭ）が知られている。
【００２３】
ＴＥＭの細胞数増加は、免疫関連障害を有する患者において一般に観察され、一部の症例において、これは、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に影響を与える障害の結果である。Ｔｒｅｇは、ＴＥＭを含む他の細胞の免疫応答を抑制するＴ細胞の一種である。正常レベルのＴｒｅｇが不在である場合、身体の免疫応答は制御されなくなり、健康な組織や器官を攻撃する。Ｔｒｅｇ機能の途絶は、眼科疾患を含む様々な自己免疫障害につながる。
【００２４】
活性化すると、ＴＥＭは、そのＫｖ１．３  Ｋ＋イオンチャネルの発現を上方制御する。有害な自己免疫プロセスを始動すると共に、これに寄与するＴＥＭは、こうしたＫｖ１．３チャネルに強く依存して、活性化、増殖、及びサイトカイン生成に必要な細胞内のカルシウムレベルを維持する。そのため、ＴＥＭの増殖は、Ｋｖ１．３  Ｋ＋チャネルブロッカに敏感である。Wulff et al., J. Clin. Invest., 111, 1703-1713 (2003)。他の細胞型で、Ｋｖ１．３チャネルを発現するもの及び炎症にとって重要なものには、マクロファージ、樹状細胞、クラススイッチしたメモリＢ細胞、及び小膠細胞が含まれる。
【００２５】
理論に拘束されるものではないが、本明細書に開示した毒素系治療ペプチドは、ドライアイ及び他の炎症性の眼科的状態を、上方制御されたＴＥＭに関連するものも含め、Ｋｖ１．３  Ｋ＋チャネルを遮断することにより、効果的に治療すると考えられる。したがって、本開示は、毒素系治療ペプチドを用いて、ドライアイ及びブドウ膜炎といった免疫介在性の眼科的状態を治療する方法を提供する。毒素系治療ペプチドがもたらす免疫介在性の眼科的状態に対する新たな治療選択肢は、自己免疫に関連する眼の損傷及びドライアイを低減可能であると共に、既存の療法よりも良好な安全プロフィールを有する。
【００２６】
毒素系治療ペプチド
【００２７】
本明細書に開示した方法において用いる毒素系治療ペプチドの特定の例は、電位依存性チャネルに結合する。電位依存性チャネルの例には、Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．２、Ｋｖ１．３、Ｋｖ１．４、Ｋｖ１．５、Ｋｖ１．６、Ｋｖ１．７、Ｋｖ２．１、Ｋｖ３．１、Ｋｖ３．２、Ｋｖ１１．１、Ｋｃ１．１、Ｋｃ２．１、Ｋｃ３．１、Ｎａｖ１．２、Ｎａｖ１．４、及びＣａｖ１．２が含まれる。
【００２８】
毒素ペプチドは、様々な生物により生成され、イオンチャネル及びレセプタに結合するように進化してきた。ヘビ、サソリ、クモ、ハチ、カタツムリ、及びイソギンチャク由来の天然の毒素ペプチドは、一般にアミノ酸１０乃至８０個の長さを有し、コンパクトな分子構造を形成する２乃至５個のジスルフィド架橋を含む。これらのペプチドは、少数の構造フレームワークから進化したと思われる。ペプチドは、システイン／ジスルフィドループ構造により保存された折り畳みパターンの系統群を形成し、効力、安定性、及び選択性に寄与する３次元構造を維持する（Pennington, et al., Biochemistry, 38, 14549-14558 (1999); Tudor, et al., Eur. J. Biochem., 251, 133-141 (1998)、及びJaravine et al., Biochemistry, 36, 1223-1232, (1997)）。
【００２９】
本明細書において、「毒素系治療ペプチド」には、表１の毒素系ペプチド（又はその変異体、Ｄ置換類似体、カルボキシ末端アミド、修飾体、誘導体、又は医薬的に許容可能な塩）又は表２のＳｈｋ系ペプチド（又はその変異体、Ｄ置換類似体、カルボキシ末端アミド、修飾体、誘導体、又は医薬的に許容可能な塩）が含まれる。毒素系治療ペプチドは、合成又は天然ペプチドにすることができる。
【００３０】
「毒素系ペプチド」には、任意の合成又は天然で既知の毒素ペプチド及び表１に記載のペプチド、並びにその変異体、Ｄ置換類似体、カルボキシ末端アミド、修飾体、誘導体、及び医薬的に許容可能な塩が含まれる。本明細書に開示した方法において用いられる毒素系治療ペプチドの特定の例には、表１に記載した、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６として配列表に示した毒素系ペプチドが含まれる。様々な実施形態において、眼科的状態を治療する方法は、表１の毒素系ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６）を含む毒素系治療用ペプチドを投与することを含む。様々な実施形態において、表１の毒素系ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６）は、眼科的状態を治療する医薬組成物（又は薬剤）の生産に使用することができる。
【００３１】
【表１】
2016527250.tif 000002
【００３２】
「ＳｈＫ」ペプチドは、本明細書に記載の方法及び医薬組成物において使用可能な毒素ペプチドのサブタイプである。ＳｈＫペプチドは、カリブのイソギンチャクであるＳｔｉｃｈｏｄａｃｔｙｌａ  ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓから最初に単離された。ＳｈＫペプチドは、Ｋｖ１．３チャネルの阻害剤の役割を果たす。Ｋｖ１．３チャネルを阻害することにより、ＳｈＫは、特定の実施形態においてはピコモル濃度で、ＴＥＭの、又はＴＥＭによる、活性化、増殖、及び／又はサイトカイン生成を抑制することができる。
【００３３】
本明細書において、「阻害剤」とは、生合成及び／又は触媒活性、受容体又はシグナル伝達経路活性、遺伝子転写又は翻訳、細胞タンパク質輸送等を含め、通常は化合物の受容体との相互作用に基づいて生じる生物活性を、低減又は除去する任意の毒素系治療用ペプチドである。
【００３４】
天然ＳｈＫペプチドについては、例えば、Pennington, et al., Int. J. Pept. Protein Res., 46, 354-358 (1995)に記載されている。本開示の範囲に含まれるＳｈＫ構造の例は、Beeton, et al., Mol. Pharmacol., 67, 1369-1381 (2005)、米国公開番号第２００８／０２２１０２４号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２０１２／１７０３９２、及び米国特許番号第８，０８０，５２３号及び第８，４４０，６２１号においても公開されている。
【００３５】
「ＳｈＫ系ペプチド」には、任意の合成又は天然で既知のＳｈＫペプチドと、その変異体、Ｄ置換類似体、カルボキシ末端アミド、修飾体、誘導体、及び医薬的に許容可能な塩とが含まれる。
【００３６】
本明細書に開示した方法及び医薬組成物に用いられるＳｈＫ系ペプチドの特定の例には、表２に記載した、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４として配列表に示したものを含めることができる。様々な実施形態において、眼科的状態を治療する方法は、表２のＳｈＫ系ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４）の治療有効量を投与することを含む。様々な実施形態において、表２のＳｈＫ系ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４）は、眼科的状態を治療する医薬組成物（又は薬剤）の生産に使用することができる。本明細書に開示した特定の実施形態において利用したＳｈＫ系ペプチドには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１７、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２１のものが含まれる。
【００３７】
【表２−１】
2016527250.tif 000003
【表２−２】
2016527250.tif 000004
【表２−３】
2016527250.tif 000005
【表２−４】
2016527250.tif 000006
【表２−５】
2016527250.tif 000007
【００３８】
アラニンスキャニング、既知の配列を用いたアラインメントによる変異誘発に基づく合理的設計、及び／又は分子モデリング等、特性を強化した毒素系治療ペプチドを設計する手法は、当業者に知られている。例えば、毒素系治療ペプチドは、プロテアーゼ切断部位（例えば、Ｋ又はＲ残基のトリプシン切断部位及び／又はＦ、Ｙ、又はＷ残基のキモトリプシン切断部位）を除去するように設計することができる。非加水分解性のリン酸置換も、リン酸基に安定効果を与えると共に、ホスファターゼ酵素に対する安定性を与える。非加水分解性リン酸基には、ホスホチロシンのホスホナート類似体、例えば４−ホスホノメチルフェニルアラニン（Ｐｍｐ）４−ホスホノジフルオロメチルフェニルアラニン（Ｆ２Ｐｍｐ）、パラホスホノフェニルアラニン、モノフルオロホスホノメチルフェニルアラニン、スルホノ（ジフルオロメチル）フェニルアラニン（Ｆ２Ｓｍｐ）、及びヒドロキシルホスホノメチルフェニルアラニンが含まれる。他の実施形態では、例えば  ＯＭＴ、ＦＯＭＴ、及びカルボン酸基を利用する他の類似体等のホスホチロシン模倣物を用いて、Burke and Lee, Acc. Chem. Res., 36, 426-433 (2003)に記載のようにリン酸の機能性を複製し得る。更に他の実施形態において、非加水分解性類似体には、メチル−、アリールオキシ−及びチオ−エチルホスホン酸が含まれる。更に他の実施形態において、非加水分解性リン酸誘導体には、ジフルオロメチレンホスホン酸及びジフルオロメチレンスルホン酸が含まれる。
【００３９】
毒素系治療ペプチド構造の薬物動態及び薬力学的（ＰＫ／ＰＤ）特性を改善するために、分解特性に対する感受性を有する残基を置換、交換、又は修飾することができる。Ｃ末端の酸の機能のアミドによる修飾も、安定性を与える。こうした毒素系治療ペプチドの一次構造の変更により、Ｎ末端の陰イオン部分と組み合わせて、安定した選択的なＫｖ１．３ブロッカを生成することができる。生体内での半減期の長い毒素系治療用ペプチドを生成するために、主要なタンパク質分解部位を置換してプロテアーゼ感受性を低減したペプチドの変異体又は修飾体を調製することができる。これには、保存的な等価の交換（例えば、ＬｙｓとＬｙｓ（アセチル）又はＧｌｎ）及び／又は中性の交換（Ａｌａ）による非必須残基の置換が含まれる。
【００４０】
本明細書に開示した毒素系治療ペプチドの「変異体」には、本明細書に開示した毒素系又はＳｈＫ系ペプチドと比較して、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、停止位置、又は置換を有するペプチドが含まれる。
【００４１】
アミノ酸置換は、保存的又は非保存的置換にすることができる。本明細書に開示した毒素系治療ペプチドの変異体には、１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するものを含めることができる。本明細書において、「保存的置換」は、以下の保存的置換群の１つにおいて見られる置換を含む：グループ１：アラニン（Ａｌａ、Ａ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）；グループ２：アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グループ３：アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グループ４：アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、グループ５：イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、及びグループ６：フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）。
【００４２】
更に、アミノ酸は、同様の機能、化学構造、又は組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、含硫）により保存的置換群にグループ化することができる。例えば、脂肪族のグループは、置換の目的で、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅを含み得る。互いに対して保存的置換となると考えられるアミノ酸の他のグループには、以下が含まれる：  含硫：Ｍｅｔ及びＣｙｓ；酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、及びＧｌｎ、小脂肪族非極性又は微極性残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、及びＧｌｙ、極性負電荷残基及びそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、及びＧｌｎ、極性正電荷残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、及びＬｙｓ、大脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、及びＣｙｓ、大芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐ。追加情報は、Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company に記載されている。
【００４３】
本明細書に開示した毒素系治療ペプチドの変異体には、更に、本明細書に開示したペプチド配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するペプチドが含まれる。
【００４４】
毒素系ペプチドに基づく本明細書に開示した方法に用いる毒素系治療ペプチドの変異体には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかと７０％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかと７５％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかと８０％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかと８１％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかと８２％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかと８３％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかと８４％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかと８５％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかと８６％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかと８７％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかと８８％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかと８９％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかと９０％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかと９１％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかと９２％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかと９３％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかと９４％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかと９５％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかと９６％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかと９７％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかと９８％の配列同一性、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかと９９％の配列同一性を共有するペプチドが含まれる。
【００４５】
ＳｈＫ系ペプチドに基づく本明細書に開示した方法に用いる毒素系治療ペプチドの変異体には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れかと８０％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れかと８１％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れかと８２％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れかと８３％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れかと８４％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れかと８５％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れかと８６％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れかと８７％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れかと８８％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れかと８９％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れかと９０％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れかと９１％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れかと９２％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れかと９３％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れかと９４％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れかと９５％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れかと９６％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れかと９７％の配列同一性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れかと９８％の配列同一性、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れかと９９％の配列同一性を共有するペプチドが含まれる。
【００４６】
特定の実施形態例には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０８の式と８０％の配列同一性、８５％の配列同一性、８６％の配列同一性、８７％の配列同一性、８８％の配列同一性、８９％の配列同一性、９０％の配列同一性、９１％の配列同一性、９２％の配列同一性、９３％の配列同一性、９４％の配列同一性、９５％の配列同一性、９６％の配列同一性、９７％の配列同一性、９８％の配列同一性、又は９９％の配列同一性を共有する毒素系治療ペプチドが含まれる。他の実施形態において、本明細書に開示した方法に用いる変異体には、  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０９の式と８０％の配列同一性、８５％の配列同一性、８６％の配列同一性、８７％の配列同一性、８８％の配列同一性、８９％の配列同一性、９０％の配列同一性、９１％の配列同一性、９２％の配列同一性、９３％の配列同一性、９４％の配列同一性、９５％の配列同一性、９６％の配列同一性、９７％の配列同一性、９８％の配列同一性、又は９９％の配列同一性を共有するペプチドが含まれる。他の実施形態において、本明細書に開示した方法に用いる変異体には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１７の式と８０％の配列同一性、８５％の配列同一性、８６％の配列同一性、８７％の配列同一性、８８％の配列同一性、８９％の配列同一性、９０％の配列同一性、９１％の配列同一性、９２％の配列同一性、９３％の配列同一性、９４％の配列同一性、９５％の配列同一性、９６％の配列同一性、９７％の配列同一性、９８％の配列同一性、又は９９％の配列同一性を共有するペプチドが含まれる。他の実施形態において、本明細書に開示した方法に用いる変異体には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１０の式と８０％の配列同一性、８５％の配列同一性、８６％の配列同一性、８７％の配列同一性、８８％の配列同一性、８９％の配列同一性、９０％の配列同一性、９１％の配列同一性、９２％の配列同一性、９３％の配列同一性、９４％の配列同一性、９５％の配列同一性、９６％の配列同一性、９７％の配列同一性、９８％の配列同一性、又は９９％の配列同一性を共有するペプチドが含まれる。他の実施形態において、本明細書に開示した方法に用いる変異体には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１８の式と８０％の配列同一性、８５％の配列同一性、８６％の配列同一性、８７％の配列同一性、８８％の配列同一性、８９％の配列同一性、９０％の配列同一性、９１％の配列同一性、９２％の配列同一性、９３％の配列同一性、９４％の配列同一性、９５％の配列同一性、９６％の配列同一性、９７％の配列同一性、９８％の配列同一性、又は９９％の配列同一性を共有するペプチドが含まれる。
【００４７】
「％の配列同一性」とは、配列を比較することにより決定されるような、２つ以上の配列の関係を示す。当該技術分野において、「同一性」とは、更に、こうした配列の文字列間の一致により決定されるような、ペプチド配列間の配列関連性の度合いを意味する。「同一性」（「類似性」と呼ばれる場合が多い）は、以下に記載されているものを含め、既知の方法により容易に計算することができる：Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988)、Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1994)、Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994)、Sequence Analysis in Molecular Biology (Von Heijne, G., ed.) Academic Press (1987)、及びSequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Oxford University Press, NY (1992)。配列同一性を決定する好適な方法は、試験する配列間での最善の一致を達成するように設計される。配列同一性及び類似性を決定する方法は、一般に公開されたコンピュータプログラムにおいて体系化されている。配列アラインメント及び同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用いて実施し得る（ＤＮＡＳＴＡＲ社、ウィスコンシン州マディソン）。配列の多重アラインメントも、Ｃｌｕｓｔａｌアラインメント法（Higgins and Sharp CABIOS, 5, 151-153 (1989)）を用いて、デフォルトパラメータ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）により実施することができる。関連プログラムには、ＧＣＧプログラムスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、ウィスコンシン州マディソン）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)）、ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ社、ウィスコンシン州マディソン）、及びＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを取り入れたＦＡＳＴＡプログラム（Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(s): Suhai, Sandor. Publisher: Plenum, New York, N.Y.）が含まれる。本開示の文脈において、配列解析ソフトウェアを解析に用いる場合、解析結果は、言及したプログラムの「デフォルト値」に基づく。本明細書において、「デフォルト値」は、初めての初期化の際にソフトウェアに最初にロードされる任意の組の値又はパラメータを意味する。
【００４８】
「Ｄ置換類似体」には、１個以上のＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸により置換した、本明細書に開示した毒素系治療ペプチドが含まれる。Ｄ−アミノ酸は、ペプチド配列内に見られるものと同じアミノ酸系にすること又は異なるアミノ酸にすることができる。したがって、Ｄ−類似体も変異体となる。
【００４９】
「修飾体」には、本明細書に開示した毒素系治療ペプチドで、１個以上のアミノ酸を非アミノ酸成分に置き換えたもの、又はアミノ酸が官能基に結合されたもの、若しくは官能基をアミノ酸又はペプチドに他の形で関連させたものが含まれる。修飾アミノ酸は、例えば、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に結合したアミノ酸、ヒト血清アルブミンに結合したアミノ酸、又は有機誘導化剤に結合したアミノ酸が含まれる。修飾アミノ酸の存在は、例えば、（ａ）ペプチドの血清半減期及び／又は生体内機能半減期を長くする、（ｂ）ペプチドの抗原性を低下させる、（ｃ）ペプチドの貯蔵安定性を高める、（ｄ）ペプチドの溶解性を高める、（ｅ）循環時間を長くする、及び／又は（ｆ）バイオアベイラビリティを高める、例えば、曲線下面積（ＡＵＣｓｃ）を増加させる上で有利となり得る。アミノ酸（群）は、例えば、組み換え生産中に翻訳と同時に又は翻訳後に修飾可能であり（例えば、哺乳動物細胞における発現中のＮ−Ｘ−Ｓ／ＴモチーフでのＮ結合グリコシル化）又は合成手段により修飾可能である。修飾アミノ酸は、配列内又は配列の末端に存在することができる。修飾体は、本明細書の他の箇所に記載の誘導体を含むことができる。
【００５０】
Ｃ末端は、毒素系治療ペプチド毎に、カルボン酸又はアミド基、好ましくはカルボン酸基となり得る。本開示は、更に、（ｉ）Ｃ末端に対して行われたＴｙｒ、ヨード−Ｔｙｒ、蛍光タグ等の付加、又は（ｉｉ）Ｎ末端に対して行われたＴｙｒ、ヨード−Ｔｙｒ、ピログルタミン酸、又は蛍光タグ等の付加により修飾された毒素系治療ペプチドに関する。
【００５１】
加えて、安定性を高めることが当業者に知られている残基又は残基群を、Ｃ末端及び／又はＮ末端に付加することができる。更に、経口アベイラビリティを高めることが当業者に知られている残基又は残基群を、Ｃ末端及び／又はＮ末端に付加することができる。
【００５２】
特定の実施形態において、Ｃ末端は、酸（例えば、ＣＯＯＨ）又はアミド（例えば、ＣＯＮＨ２）である。「アミド」とは、ＮＨ２による酸のＣ末端ヒドロキシル基（ＯＨ）の置換を示す。こうした置換は、本明細書において「アミド」という用語を用いて、或いは「−Ｃｙｓ−ＮＨ２」のようにＣ末端のアミノ酸−ＮＨ２として指定される。
【００５３】
様々な治療ペプチドの安全性、有効性、及び特異性が調査されてきており、アニオン電荷を有する有機又は無機化学物質にペプチドを付加することで、医薬組成物における使用に対する適合性を高まることが明らかとなっている。付加する部位は、Ｎ末端にすることが可能だが、修飾は、この部位での付加に限定されない。
【００５４】
適切な化学物質の例には、Ｌ−Ｐｍｐ（ＯＨ２）、Ｄ−Ｐｍｐ（ＯＨ２）、Ｄ−Ｐｍｐ（ＯＨＥｔ）、Ｐｍｐ（Ｅｔ２）、Ｄ−Ｐｍｐ（Ｅｔ２）、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）（ｐ−ホスホ−チロシン）、Ｌ−Ｐｈｅ（ｐ−ＮＨ２）、Ｌ−Ｐｈｅ（ｐ−ＣＯ２Ｈ）、Ｌ−アスパルタート、Ｄ−アスパルタート、Ｌ−グルタマート、及びＤ−グルタマートが含まれる。使用した略語は次のように定義される：Ｐｍｐ（ｐ−ホスホノメチル−フェニルアラニン）、及びＰｐａ（ｐ−ホスファチチル−フェニルアラニン）。ＰｍＰ及びＰｐａの代替には、Ｐｆｐ（ｐ−ホスホノ（ジフルオロ−メチル）−フェニルアラニン）及びＰｋｐ  （ｐ−ホスホノ−メチルケト−フェニルアラニン）が含まれる。
【００５５】
化学物質の例は、アミノエチルオキシエチルオキシ−アセチルリンカ（ここではＡＥＥＡｃと記載する）等のリンカにより、或いは他の任意の適切な手段により付着させることができる。化学物質／リンカの組み合わせの例には、ＡＥＥＡｃ−Ｌ−Ｐｍｐ（ＯＨ２）、ＡＥＥＡｃ−Ｄ−Ｐｍｐ（ＯＨ２）、ＡＥＥＡｃ−Ｄ−Ｐｍｐ（ＯＨＥｔ）、ＡＥＥＡｃ−Ｌ−Ｐｍｐ（Ｅｔ２）、ＡＥＥＡｃ−Ｄ−Ｐｍｐ（Ｅｔ２）、ＡＥＥＡｃ−Ｌ−Ｔｙｒ、ＡＥＥＡｃ−Ｌ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）、ＡＥＥＡｃ−Ｌ−Ｐｈｅ（ｐ−ＮＨ２）、ＡＥＥＡｃ−Ｌ−Ｐｈｅ（ｐ−ＣＯ２Ｈ）、ＡＥＥＡｃ−Ｌ−アスパルタート、ＡＥＥＡｃ−Ｄ−アスパルタート、ＡＥＥＡｃ−Ｌ−グルタマート、及びＡＥＥＡｃ−Ｄ−グルタマートが含まれる。化学物質においては一般に、アミノ酸残基がキラル中心を有する場合、アミノ酸残基のＤ及び／又はＬ鏡像体を用いることができる。
【００５６】
本明細書に開示した全ての毒素系治療ペプチドは、アミノエチルオキシエチルオキシ酢酸のＮ末端付着、及び／又はＣ末端でのアミドの付着により修飾することができる（例えば、ＳｈＫ−１８６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１７）。ＡＥＥＡｃは、形成プロセス中のリンカを表すために用いられる場合、相互に交換可能にアミノエチルオキシエチルオキシ酢酸及びＦｍｏｃ−アミノエチルオキシエチルオキシ酢酸を示す。最終状態にある特異的ペプチド内のリンカを示すために用いられる場合、この用語は、アミノエチルオキシエチルオキシ酢酸を示す。
【００５７】
本明細書に開示した全ての毒素系治療ペプチドは、ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン、抗体、脂肪酸、Ｆａｂ及びＦｃ領域を含む抗体断片、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン、オリゴ糖、ポリシアル酸、ヒアルロン酸、デキストリン、ポリ（２−エチル２−オキサゾロン）、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＰＭＡ）、特にアミノ酸Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、及びＴｈｒを含むアミノ酸の不定形親水性配列、及びSchmidt, S.R. (ed), Fusion Protein Targeting for Biopharmaceuticals: Applications and Challenges, John Wiley and Sons: Hoboken New Jersey, 2013に記載の他の多数のリンカ及び付加物を加えることにより修飾することができる。ＰＥＧ基は、リジンのεアミノ基に以下を用いて付着させることができる：（ａ）ＰＥＧスクシンイミジルカルボナート、（ｂ）ＰＥＧベンゾトリアゾールカルボナート、（ｃ）ＰＥＧジクロルトリアジン、（ｄ）ＰＥＧトレシラート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、（ｅ）ＰＥＧ  ｐ−ニトロフェニルカルボナート、（ｆ）ＰＥＧトリクロロフェニルカルボナート、（ｇ）ＰＥＧカルボニルイミダゾール、及び（ｈ）ＰＥＧスクシンイミジルスクシナート。ＰＥＧ基は、ベンジルウレタンのパラ又はオルトジスルフィドを含む分解性リンカにより、システインに付着させることができる。ＰＥＧの部位特異的導入は、ＰＥＧ−アルデヒドによる還元的アルキル化、又はシアノ水素化ホウ素ナトリウム存在下でのアルファアミノ基のグリセルアルデヒド修飾により達成することができる。ＰＥＧ化の化学反応については、Robert, et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 459-476 (2002)を含む多数の刊行物において説明されている。オリゴ糖は、Ｎ結合型又はＯ結合型にすることができる。ポリシアル酸を含むＮ結合型オリゴ糖は、生産細胞株によって、Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒのコンセンサス配列に対する付着により付加され、ここで、Ｘｘｘは、プロリン以外である。Ｏ結合型オリゴ糖は、Ｓｅｒ又はＴｈｒに付着させる。
【００５８】
特定の実施形態は、アニオン電荷を有する有機又は無機化学物質がアミノエチルオキシエチルオキシ−アセチルリンカ（ＡＥＥＡｃと表記）を介して付着したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の毒素系治療ペプチドを含む。
【００５９】
毒素系治療用ペプチドの他の例は、ＳｈＫ−１８６のＳｈＫ系ＤＯＴＡ−コンジュゲートである（ＳｈＫ−２２１と表記）。「ＤＯＴＡ」は、本明細書に開示した治療ペプチドのＮ末端にアミノヘキサン酸を介して付着させることが可能な１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸を示す。ＤＯＴＡの結合は、インジウム又はガドリニウム等のキレート金属原子用の部位を提供する。本明細書に開示した治療ペプチドと結合可能な他の分子には、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２−ニス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−三酢酸（ＮＯＴＡ）、及び関連する分子が含まれる。
【００６０】
本開示は、更に、開示した毒素系治療ペプチドの誘導体を対象とする。誘導体には、環状順列変異体が天然ＳｈＫペプチドの天然架橋パターンを保持する非環状順列変異を有する毒素系治療ペプチドが含まれる。一実施形態において、環化毒素系治療用ペプチドは、直鎖毒素系治療用ペプチド及びペプチドリンカを含み、ここで直鎖毒素系治療用ペプチドのＮ及びＣ末端は、ペプチドリンカを介して結合され、アミド環化ペプチド骨格を形成する。一部の実施形態において、ペプチドリンカには、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びその組み合わせから選択されたアミノ酸が含まれる。
【００６１】
様々な環化方法を、本明細書に記載の毒素系治療ペプチドに応用することができる。本明細書に記載の毒素系治療ペプチドは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、又はＡｌａ／Ｇｌｙ架橋、及びその組み合わせ、又はSchnolzer et al., Int J Pept Protein Res., 40, 180-193 (1992)に記載の他の残基を導入するＢＯＣ化学反応を用いて容易に環化させることができる。毒素系治療ペプチドを環化させることにより、特定の標的に対する毒素系治療ペプチドの親和性に影響を与えることなく、安定性、経口アベイラビリティを高め、タンパク質分解に対する感受性を低減することができる。
【００６２】
本明細書に開示した各毒素系治療用ペプチドは、更に、付加、欠失、停止位置、置換、交換、結合、関連付け、又は順列変異を、本明細書に開示した毒素系治療用ペプチド配列の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、又は６０を含む任意の位置に含み得る。したがって、特定の実施形態において、各毒素系治療用ペプチドの各アミノ酸位置は、Ｘａａ位置とすることが可能であり、ここでＸａａは、特定の位置でのアミノ酸の付加、欠失、停止位置、置換、交換、結合、関連付け、又は順列変異を示す。特定の実施形態において、各毒素系治療用ペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、又は６０個のＸａａ位置を、位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、又は６０の１つ以上において有する。
【００６３】
毒素系治療用ペプチドは、２つ以上の変化（付加、欠失、停止位置、置換、交換、結合、関連付け、又は順列変異）を有し、変異体、Ｄ置換類似体、カルボキシ末端アミド、修飾体、及び／又は誘導体の１つ以上となることができる。即ち、変異体、Ｄ置換類似体、カルボキシ末端アミド、修飾体、及び／又は誘導体のうち１分類を含むことは、他の分類を含むことを排除するものではなく、全てが集合的に本明細書において「毒素系治療ペプチド」と呼ばれる。一例には、位置２１のアミノ酸がノルロイシンであり、及び／又は、位置２２のアミノ酸がジアミノプロピオン酸に置き換わった、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１が含まれる。
【００６４】
位置２１がＭｅｔであるペプチドの何れかにおいては、Ｍｅｔを置換して、酸化に対する安定効果を与えることができる。一実施形態において、位置２１のＭｅｔは、Ｎｌｅに置換される。位置２１にＭｅｔを有する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２５６の何れかにおいて、このＭｅｔは、Ｎｌｅにより置換することができる。位置２２にＬｙｓを有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２５６の何れかにおいて、このＬｙｓは、ジアミノプロピオン酸により置換することができる。したがって、本明細書に開示した一実施形態には、位置２１のＭｅｔがＮｌｅに置換され、アミドがＣ末端に存在し、及び／又は陰イオン部分がＮ末端に存在するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１が含まれる。
【００６５】
「非機能性アミノ酸残基」は、酸性基、塩基性基、又は芳香族基が欠如した側鎖を有するＤ型又はＬ型のアミノ酸残基を示す。非機能性アミノ酸残基の例には、Ｍ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、及びＮｌｅが含まれる。
【００６６】
医薬組成物
【００６７】
開示した方法で使用するために、毒素系治療ペプチドは、医薬組成物内に提供することができる。毒素系治療ペプチドのプロドラッグも使用可能であり、親油性を高めるためにエステル基を添加することで作成することができ、これにより、一部の実施形態では、角膜を介した送達を促進することができる。合成若しくは天然毒素系治療ペプチド、又は天然及び合成毒素系治療ペプチドの混合物を使用することができる。
【００６８】
医薬組成物は、毒素系治療用ペプチドと、少なくとも１種類の医薬的に許容可能な担体とを含む。医薬的に許容可能な担体には、研究、予防、及び／又は治療的処置用であるかを問わず、投与の恩恵を上回る著しい副作用、アレルギ反応、又は他の有害反応を発生させないものが含まれる。医薬的に許容可能な担体及び関連する剤形の例は、Troy, D.B. and Beringer, P. (eds) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott; Philadelphia, 2006. 21st Edition に開示されている。医薬組成物は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の生物学的基準室（Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）及び／又は他の関連する他国の規制機関が求める滅菌、発熱性、及び／又は一般的安全性及び純度の基準を満たすように調製される。
【００６９】
一般に、毒素系治療用ペプチドは、  選択された投与方法に対して選ばれた１種類以上の医薬的に許容可能な担体と混合される。送達方法の例については、米国特許第５，８４４，０７７号を参照されたい。
【００７０】
一般に用いられる医薬的に許容可能な担体の例には、吸収遅延剤、抗酸化剤、結合剤、緩衝剤、増量剤、キレート剤、共溶媒、コーティング、着色剤、崩壊剤、分散媒、乳化剤、充填剤、香味料、ゲル、等張剤、潤滑剤、芳香剤、保存料、放出剤、塩、溶剤、安定剤、甘味料、界面活性剤、湿潤剤等の何れか及び全てが含まれる。
【００７１】
緩衝剤の例には、クエン酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、酒石酸緩衝剤、フマル酸緩衝剤、グルコン酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、乳酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、及びトリメチルアミン塩が含まれる。
【００７２】
保存料の例には、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、ハロゲン化ベンザルコニウム、塩化ヘキサメトニウム、アルキルパラベン、メチルパラベン、プロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、及び３−ペンタノールが含まれる。
【００７３】
点眼液用の保存料の更に特定の例には、塩化ベンザルコニウム（≦０．０２５％）、ソルビン酸、塩化ベンゼトニウム（≦０．０１％）、クロロブタノール（≦０．５％）、酢酸フェニル水銀（≦０．００４％）、硝酸フェニル水銀（≦０．００４％）、チメロサール  （≦０．０１％）、メチルパラベン（０．１乃至０．２％）、及びプロピルパラベン（≦０．０４％）が含まれる。他の保存料には、角膜上皮の疎水性バリアの破壊により透過促進剤としても機能するため、眼用医薬組成物において二重の役割を果たすものがある。使用可能な他の保存料には、水銀誘導体、アルコール、パラベン、四級アンモニウム化合物、ポリクオタニウム化合物、クロルヘキシジン、ＰＵＲＩＴＥ（登録商標）（Ａｌｌｅｒｇａｎ社、カリフォルニア州アーバイン）、及びＳＯＦＺＩＡ（登録商標）（Ａｌｃｏｎ社、スイス、ヒューネンベルク）防腐システムが含まれる。保存料を含むことは、医薬組成物をマルチドーズ型容器にパッケージされた点眼液として調製する際に、汚染（例えば、細菌汚染）を防止する上で特に有益である。
【００７４】
等張剤の例には、多価糖アルコール、三価糖アルコール、又は高級糖アルコール、例えばグリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトールが含まれる。
【００７５】
安定剤の例には、有機砂糖、多価糖アルコール、ポリエチレングリコール、含硫還元剤、アミノ酸、低分子量ポリペプチド、タンパク質、イムノグロブリン、親水性ポリマ、及び多糖類が含まれる。
【００７６】
抗酸化剤の例には、α−トコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、クエン酸、塩酸システイン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、レシチン、金属キレート剤、メチオニン、油溶性抗酸化剤、リン酸、没食子酸プロピル、亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ソルビトール、酒石酸、及びビタミンＥが含まれる。抗酸化剤の更に特定の例／量には、エチレンジアミン四酢酸（≦０．１％）、亜硫酸水素ナトリウム（≦０．１％）、ピロ亜硫酸ナトリウム（≦０．１％）、及びチオ尿素（≦０．１％）が含まれる。
【００７７】
潤滑剤の例には、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムが含まれる。
【００７８】
医薬的に許容可能な塩の例には、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、イセチオン酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、硝酸塩、リン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、テオフィリン酢酸塩、及びトリフルオロ酢酸塩等の無機及び有機付加塩が含まれる。低級アルキル四級アンモニウム塩も使用することができる。
【００７９】
特定の実施形態では、増粘剤を医薬組成物に添加して、医薬組成物を眼内により長く残留させ、眼組織との接触時間を増やし、浸透を増加させることができる。様々な実施形態において、点眼液に望ましい粘度は、２５乃至５０センチポアズである。増粘剤の例には、カルボキシメチルセルロース（≦１％）、ヒドロキシエチルセルロース（≦０．８％）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（≦１％）、メチルセルロース（≦２％）、ポリビニルアルコール（≦１．４％）、ポリカルボフィル、ゲランガム、キサンタンガム、カーボポール、ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）スルホン酸、及びポリビニルピロリジン（≦１．７％）が含まれる。
【００８０】
本明細書に記載の毒素系治療ペプチドに用いる透過促進剤には、Tommaso et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 53( 4), 2292-2299 (April 2012)に記載の方法により構築可能なメトキシポリエチレングリコール−ヘキシル置換ポリ乳酸（ＭＰＥＧ−ｈｅｘＰＬＡ）に基づくミセル製剤が含まれる。ジエチレングリコールモノエチルエーテル（Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ  Ｐ）も透過促進剤として用いることができる。
【００８１】
医薬組成物においては、可溶化剤を使用可能であり、ポロキサマ４０７、プルロニックＦ６８、プルロニックＦ１２７、ポリソルベート、ポリエチレン−３５−ヒマシ油、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、ｎ−オクテニルコハク酸デンプン、他のシクロデキストリン、チロキサポール、α−トコフェロールポリエチレングリコールコハク酸塩、中鎖トリグリセリド、ゴマ油、ラッカセイ油、ベニバナ油、カラシ油、ダイズ油、ヒマワリ油、他の油、リン脂質、界面活性剤、Ｒｏｆａｍ、及び水中油型エマルション含有可溶化剤が含まれる。
【００８２】
ナノ粒子及びナノエマルションに基づくシステムは、毒素系治療ペプチドの送達用に使用可能であり、ポリεカプロラクトン、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ビニルピロリドン、アクリル酸、オイドラギットＲＳ１００、オイドラギットＲＬ１００、ポリ乳酸グリコール酸、及びＮｏｖａｓｏｒｂＴＭが含まれる。ポリ−Ｌ−リジン、アルギン酸塩、又はキトサンによりコーティングしたカチオン性ナノエマルションは、ナノエマルションを安定化させ、角膜との相互作用を促進する。毒素系治療用ペプチドナノエマルションに適した他のカチオン性脂質及び賦形剤には、ステアリルアミン、オレイルアミン、ポリエチレンイミン、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎトリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、セトリミド、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セタルコニウム、塩化ベンゾドデシニウム、及びセチルピリジニウムが含まれる。医薬組成物に使用可能な他のナノエマルション又はマイクロエマルション成分には、浸透圧剤（マンニトール、グリセロール、ソルビトール、プロピレングリコール、デキストロース）、油（中鎖トリグリセリド、トリアセチン、鉱油、及び植物油）、及び界面活性剤（ポリソルベート、クレモフォール、ポロキサマ、チロキサポール、ビタミン−Ｅ−ＴＰＧＳ）が含まれる。
【００８３】
毒素系治療ペプチドの前角膜滞留時間は、ゲランガム又はポリアクリル酸ポリマに基づくイオン活性化生体内ゲル化系の使用により増加させることができる。毒素系治療ペプチドの眼表面への露出は、カーボポールゲル、セルロース誘導体、トレハロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポロキサマ４０７、ポリソルベート８０、プロピレングリコール、ポリビニルアルコール、及びポリビニルピロリドンを医薬組成物の成分として用いることで更に増加させることができる。
【００８４】
多分散性担体溶液は、医薬組成物に使用可能であり、ＳｏｐｈｉｓｅｎＴＭ、３Ａ  ＯｆｔｅｎｏＴＭ、及びＭｏｄｕｓｉｋ−Ａ  ＯｆｔｅｎｏＴＭが含まれる。
【００８５】
カチオン性リポソームを含むリポソーム製剤は、毒素系治療ペプチド用の担体として使用可能であり、ｌ−α−ジミリストイルホスファチジルグリセロール、リン脂質、コレステロール、スパン４０、ステアリルアミン、及びデオキシコール酸が含まれる。
【００８６】
毒素系治療ペプチドは、デポ製剤の剤形とすることができる。デポ製剤は、適切なポリマ又は疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションとして）又はイオン交換樹脂を配合すること、又は難溶性誘導体、例えば、難溶性塩として処方することができる。こうした長時間作用型医薬組成物は、任意の適切な形で投与することができる。
【００８７】
毒素系治療ペプチドを点眼するための医薬組成物には、更に、薬物の眼表面での接触及び吸収を促進する軟膏が含まれる。眼軟膏は、香油、白色ワセリン、又はラノリンを含有することが可能であり、体温に近い融解温度を有することができる。
【００８８】
生分解性ポリマは、毒素系治療ペプチドの徐放のために使用することができる。例には、ゼラチン、アルブミン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリビニルアルコール、ポリエステル、Ｄ−、Ｌ−及びＤＬ−乳酸の重合体、及び乳酸及びグリコール酸の共重合体が含まれる。こうした重合体は、結膜下及び眼内インプラントに用いることができる。
【００８９】
加えて、毒素系治療ペプチドは、固体ポリマの半透性マトリクスを利用した徐放システムとして処方することができる。様々な徐放性材料が確立されており、当業者に周知である。徐放性システムは、その化学的性質に応じて、投与後数週間、最大で１００日以上に亘り、毒素系治療ペプチドを放出する。
【００９０】
本明細書に開示した医薬組成物は、マイクロカプセル化（例えば、米国特許第４，３５２，８８３号、第４，３５３，８８８号、及び第５，０８４，３５０号参照）、持続放出ポリマインプラント（例えば、米国特許第４，８８３，６６６号参照）、及びマクロカプセル化（例えば、米国特許第５，２８４，７６１号、第５，１５８，８８１号、第４，９７６，８５９号、及び第４，９６８，７３３号及び公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ９２／１９１９５、ＷＯ９５／０５４５２）を利用することもできる。
【００９１】
特定の実施形態において、医薬組成物は、点眼剤、結膜下インプラント、眼内インプラント、眼内注射液、硝子体内注射液、硝子体内インプラント、テノン嚢下カプセル注入剤、及び涙点プラグとして調製することができる。
【００９２】
点眼に適した医薬組成物には、溶液及び懸濁液が含まれる。溶液は、無菌であり、微粒子を含まない。懸濁液は、固体粒子を含む水性製剤である。粒子は、炎症を防止するため、一般に、１０ミクロン未満の大きさであり、例えば、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１ミクロン、又は１ミクロン未満である。様々な実施形態において、粒子は、１０ミクロンを超える大きさである。一実施形態において、粒子の大きさは均一である。多の実施形態において、全ての粒子は、平均粒子サイズ１ミクロン以内である。他の実施形態において、全ての粒子は、平均粒子サイズ２ミクロン以内である。眼へ直接投与するために、医薬組成物は、点眼剤にすることができる。
【００９３】
注射用医薬組成物は、単位剤形、例えば、ガラスアンプルにおいて、又はマルチドーズ型容器、例えば、ガラスバイアルにおいて提供することができる。注射用医薬組成物は、油性又は水性溶媒中の懸濁液、溶液、又はエマルションのような形態にすることが可能であり、懸濁剤、安定化剤、保存料、及び／又は分散剤等の製剤用物質を含有することができる。
【００９４】
毒素系治療ペプチド及び／又は医薬組成物は、送達時に再構成するために粉末状にすることができる。他の実施形態において、毒素系治療用ペプチドの単位剤形は、無菌密封アンプル又は無菌注射器内の適切な希釈剤中の毒素系治療用ペプチド溶液にすることができる。
【００９５】
他の実施形態において、凍結乾燥した医薬組成物は、含水率５％未満である。他の実施形態において、凍結乾燥した医薬組成物は、含水率４．０％未満である。他の実施形態において、凍結乾燥した医薬組成物は、含水率２％未満である。一実施形態において、凍結乾燥した医薬組成物は、８乃至１２重量％の酢酸塩含有率を有する。他の実施形態において、凍結乾燥した医薬組成物は、１０乃至１１重量％の酢酸塩含有率を有する。
【００９６】
非経口投与用に、毒素系治療ペプチドは、医薬的に許容可能な担体に溶解して、溶液又は懸濁液として投与し得る。医薬的に許容可能な担体の例には、水、生理食塩水、デキストロース溶液、フルクトース溶液、エタノール、又は動物、植物、若しくは合成起源の油が含まれる。担体は、他の成分、例えば、保存料、懸濁化剤、可溶化剤、緩衝剤等を含んでもよい。
【００９７】
経口投与用に、毒素系治療ペプチドは、カプセル、丸剤、錠剤、トローチ、果粒、融解物、粉末、懸濁液、又はエマルション等の固体又は液体製剤として処方可能である。経口用剤形の組成物の調製では、通常の医薬的に許容可能な担体の何れか、例えば、経口固体製剤（例えば、粉末、カプセル、及び錠剤）の場合、デンプン、砂糖、希釈剤（スクロース、ラクトース、又はデンプン等）、造粒剤、潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム等）、結合剤、崩壊剤、緩衝剤等、又は経口液体製剤（例えば、エマルション、シロップ、懸濁液、エリキシル剤、液剤）の場合、水、グリコール、油、アルコール、保存料、着色剤、懸濁化剤等を利用し得る。こうした組成物には、更に、湿潤剤、甘味料、香味料、及び芳香剤等のアジュバントを含めることができる。投与が容易であることから、錠剤及びカプセル  は、有利な経口単位剤形であり、この場合、当然ながら、固体の医薬担体が利用される。望ましい場合、錠剤は、標準的な手法により、糖衣錠又は腸溶錠にし得る。
【００９８】
経口投与用の調製物は、毒素系治療ペプチドの制御放出を行うために適切に処方することができる。例えば、毒素系治療ペプチドは、消化管を安定的に通過すると同時に、特定の実施形態において、血液脳関門を通過可能となるように、カプセル化することができる。例えば、ＷＯ９６／１１６９８を参照されたい。
【００９９】
口腔内投与用に、組成物は、従来の形で処方された錠剤又はトローチの形態にすることができる。
【０１００】
経鼻投与若しくは経肺投与、又は吸入による他の任意の投与用に、毒素系治療ペプチド  は、加圧パック又はネブライザ用に提供されるエアゾールスプレの形態で、適切な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の適切な気体又は気体混合物を用いて、従来の形で送達することができる。
【０１０１】
毒素系治療ペプチドを髄腔内に投与する場合には、脳脊髄液に溶解してもよい。ＣＮＳに対する裸細胞又は非カプセル化細胞グラフトを用いることもできる。例えば、米国特許第５，０８２，６７０号及び第５，６１８，５３１号を参照されたい。
【０１０２】
ｐＨ、オスモル濃度、及び粘度等の医薬組成物の特質は、毒素系治療ペプチドを安定化し、眼及びその構造に対する効率的な送達をもたらし、対象者の快適さを高めるように調節することができる。緩衝剤を医薬組成物に添加して、ｐＨを４．５乃至１１．５の範囲、一般には６．５乃至８．５の範囲に調節することができる。
【０１０３】
点眼液中に毒素系治療用ペプチドを含む医薬組成物の例は、リン酸塩を緩衝剤として含有し、ｐＨは６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、又は６．５に調節される。点眼液のオスモル濃度は、０．９％の塩化ナトリウムの添加により、涙液と等浸透圧又は等張  にすることが可能であり、許容される塩化ナトリウム濃度範囲は、０．６乃至１．８％となる。
【０１０４】
「単位剤形の医薬組成物」とは、医療用投与に適した、物理的に個別の一貫した単位を意味し、それぞれが毒素系治療用ペプチドの治療有効量、又は治療有効量の倍数（最大４倍）又は約数（４０分の１まで）を医薬的に許容可能な担体と共に含有する。医薬組成物が１日用量を含むか、又は例えば、１日用量の半分、３分の１、若しくは４分の１を含むかは、医薬組成物が１日１回投与されるか、又は、例えば、それぞれ、２回、３回、若しくは４回投与されるかにより決まる。
【０１０５】
医薬組成物中の毒素系治療用ペプチドの量及び濃度は、臨床的に関連する要因、毒素系治療用ペプチドの担体における溶解度、毒素系治療用ペプチドの有効性及び活性、及び医薬組成物の投与の形態に基づいて選択される。毒素系治療用ペプチドが治療有効量を構成すること、即ち、適切な有効薬量が、単一又は複数の単位用量に利用される剤形と一致することのみが必要となる。
【０１０６】
医薬組成物は、一般に０．０００１乃至９９重量％、好ましくは０．００１乃至５０重量％、更に好ましくは０．０１乃至１０重量％の毒素系治療用ペプチドを全組成の重量に対して含む。
【０１０７】
様々な実施形態において、毒素系治療用ペプチドは、０．００１ｍｇ／ｍｌ乃至５００ｍｇ／ｍｌの量で存在し得る。付加的な実施形態において、毒素系治療用ペプチドは、０．００１、０．０１、０．１、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００ｍｇ／ｍｌの量で提供することができる。
【０１０８】
本明細書に開示した方法での使用に最適な安定性及び溶解性を有する医薬組成物の一例には、表３に示した成分が含まれる。
【表３】
2016527250.tif 000008
【０１０９】
他の毒素系治療ペプチドは、同一の又は類似する処方で使用することができる。
【０１１０】
毒素系治療用ペプチドに加えて、医薬組成物は、他の薬剤（群）又は生物活性剤（群）を含有することができる。他の薬剤又は生物活性剤の例には、鎮痛剤、サイトカイン、及び臨床医学の全主要分野における治療剤が含まれる。カクテルは、何れか１種類の毒素系治療ペプチドと他の薬剤又は生物活性剤との混合物である。本実施形態において、一般的な投与媒体（例えば、丸剤、錠剤、インプラント、ポンプ、注射液）は、毒素系治療ペプチドを他の薬剤又は生物活性剤（群）と組み合わせて共に含有し得る。
【０１１１】
使用方法
【０１１２】
本開示の医薬組成物は、眼科的状態を治療する方法において有用である。こうした方法には、毒素系治療用ペプチドを含む医薬組成物の治療有効量を、必要とする対象者に投与することが含まれる。特定の実施形態において、医薬的に許容可能な塩は、酢酸カリウム又は酢酸ナトリウム等の酢酸塩にすることが可能であり、医薬組成物は、水性担体中に提供される。
【０１１３】
本明細書に開示した方法により治療可能な眼科的状態には、ドライアイ、ブドウ膜炎、強膜炎、及び他の眼の炎症状態、例えば、眼内炎、瘢痕性類天疱瘡、モーレン潰瘍、サイトメガロウイルス媒介性網膜炎、及び他のウイルス媒介性炎症性眼疾患が含まれる。本開示は、更に、上強膜炎、角膜炎、網膜血管炎、又は角膜、網膜、強膜、及び眼窩の炎症を伴う他の疾患等、全身性自己免疫疾患の眼における徴候を治療する方法を提供する。眼における徴候を有する全身性自己免疫疾患の例には、全身性エリテマトーデス、顕微鏡的多発血管炎、結節性多発動脈炎、ウェゲナ肉芽腫症（多発血管炎性肉芽腫症）、サルコイドーシス、ベーチェット症候群、フォークト・小柳・原田症候群、高安動脈炎、リューマチ性関節炎、シェーグレン症候群、再発性多発性軟骨炎、強直性脊椎炎、乾癬、及びチャーグ・ストラウス症候群が含まれる。治療されるドライアイは、局所又は全身性免疫反応の結果である場合、或いは他の原因を有する場合がある。
【０１１４】
前記に限定されることなく、本明細書に開示した方法により治療可能な炎症性の眼科的状態には、Ｔ細胞の浸潤及び活性化に関連する眼の疾患又は眼の状態が含まれ、更に局所及び／又は全身性自己免疫疾患に関連する眼の状態が含まれる。炎症性の眼科的状態は、眼科的状態の一部である。炎症性の眼科的状態の例に含まれるもの及び／又は関連するもの（例えば、原因となるもの）は、アカントアメーバ感染症、急性網膜色素上皮炎、アレルギ、移植片対宿主病として現れる幹細胞移植における同種移植、強直性脊椎炎、関節炎、細菌感染症、ベーチェット病、ベーチェット病関連網膜炎、眼瞼炎、瘢痕性類天疱瘡，化学暴露、脈絡膜炎、脈絡網膜炎、チャーグ・ストラウス症候群、クローン病、結膜炎、サイトメガロウイルス媒介性網膜炎、糖尿病性網膜症、ドライアイ、眼内炎、上強膜炎、眼部打撲、眼部外傷、食物アレルギ、異物暴露、真菌感染症、蕁麻疹、虹彩毛様体炎、虹彩炎、若年性特発性関節炎、川崎病、角膜炎、乾性角結膜炎、狼瘡、顕微鏡的多発血管炎、モーレン潰瘍、マイコバクテリア感染症、視神経網膜炎、寄生虫感染症、小児ブドウ膜炎、結節性多発動脈炎、手術後の状態、後部毛様体炎、乾癬、反応性関節炎、再発性多発性軟骨炎、網膜血管炎、網膜炎、リューマチ性関節炎、サルコイドーシス、サルコイドーシス関連網膜炎、季節性アレルギ、強膜炎、シェーグレン症候群、スピロヘータ感染症、スティーブンス・ジョンソン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、毒素暴露、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウイルス感染症、フォークト・小柳・原田症候群、及びウェゲナ肉芽腫症（多発血管炎性肉芽腫症）である。
【０１１５】
本明細書に開示した方法は、対象者（ヒト、獣医学的動物（イヌ、ネコ、爬虫類、鳥類等）、家畜（ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、ニワトリ等）、及び研究動物（サル、ラット、マウス、魚類等）を本明細書に開示した医薬組成物により治療することを含む。対象者を治療することには、治療有効量の医薬組成物を送達することが含まれる。治療有効量には、有効量、予防的処置、及び／又は治療的処置を提供するものが含まれる。
【０１１６】
「有効量」は、対象者において所望の生理学的変化をもたらすために必要な医薬組成物の量である。有効量は、研究の目的で投与される場合も多い。本明細書に開示した有効量は、眼科的状態の治療における医薬組成物の有効性を研究することを意図した研究用アッセイにおいて所望の生理学的変化をもたらす。有効量は、ＴＥＭの細胞数を減少させ（即ち、増殖を減少させ）、サイトカイン生成（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、及びＩＬ−２１）及び／又はパーフォリン生成により測定されるようなＴＥＭの活性化を減少させ、及び／又はＫｖ１．３チャネルの発現を減少させ得る。減少は、同一対象者での以前の測定からの基準レベルとの比較に基づいて、又は母集団からのデータセットより得た基準レベルと比較して、確認することができる。
【０１１７】
「予防的処置」は、眼科的状態（群）の徴候又は症状を示さない対象者、又は眼科的状態（群）の初期徴候又は症状のみを示す対象者に対して、眼科的状態（群）を更に発生させるリスクを縮小、予防、又は低減する目的で施される処置を含む。従って、予防的処置は、眼科的状態（群）に対する予防的処置として機能する。一例として、ドライアイ等の炎症性の眼科的状態に対する予防的処置は、当業者に理解されるように、眼の刺痛又は灼熱感、眼に何かが入っているようなザラザラする又はゴロゴロする感覚、眼が非常に乾燥した時期に続く一過性の過剰な涙液、眼からの粘質排出物、眼の痛み及び発赤、一過性のかすみ目、及び／又は重い目蓋等、ドライアイの診断につながる恐れのある症状を発生させるリスクを縮小、予防、又は低減することができる。対象者は、季節的変化、自己免疫障害の発生又は再発、ウイルスへの暴露又は感染、花粉又は季節性アレルギにつながる他の刺激物への暴露等、ドライアイにつながる条件に晒される可能性が高い場合に、ドライアイの診断につながる恐れのある症状を発生させるリスクがある。他の例として、ブドウ膜炎等の炎症性の眼科的状態に対する予防的処置は、当業者に理解されるように、眼の充血、眼の痛み、光過敏性、かすみ目、視界内の暗く浮遊する点（飛蚊症）、視力低下、及び／又は眼の有色領域（虹彩）下部前方における眼内の白色領域（前房蓄膿）等、ブドウ膜炎の診断につながる恐れのある症状を発生するリスクを縮小、予防、又は低減することができる。当業者に理解されるように、これらの説明したパラメータは、それぞれ周知の客観的及び／又は主観的尺度により評価することができる。
【０１１８】
「治療的処置」は、眼科的状態（群）の徴候又は症状を示す対象者に対する施される処置を含み、こうした眼科的状態（群）の徴候又は症状を縮小又は除去する目的で対象者に施される。治療的処置は、眼科的状態（群）の存在又は活性を低減、制御、又は除去すること、及び／又は眼科的状態（群）の副作用を低減、制御、又は除去することができる。一例として、ドライアイ等の炎症性の眼科的状態に対する治療的処置は、当業者に理解されるように、眼の刺痛又は灼熱痛、眼に何かが入っているようなザラザラする又はゴロゴロする感覚、眼が非常に乾燥した時期に続く一過性の過剰な涙液、眼からの粘質排出物、眼の痛み及び発赤、一過性のかすみ目、及び／又は重い眼瞼等、ドライアイの診断につながる恐れのある症状を低減、制御、又は除去することができる。他の例として、ブドウ膜炎等の炎症性の眼科的状態に対する治療的処置は、当業者に理解されるように、眼の充血、眼の痛み、光感受性、かすみ目、飛蚊症、視力低下、及び／又は虹彩下部前方における眼内の前房蓄膿等、ブドウ膜炎の診断につながる恐れのある症状を低減、制御、又は除去することができる。当業者に理解されるように、これらの説明したパラメータは、それぞれ周知の客観的及び／又は主観的尺度により評価することができる。
【０１１９】
投与のために、有効量及び治療有効量（ここでは用量とも呼ぶ）は、インビトロアッセイ及び／又は動物モデルの研究の結果に基づいて最初に推定することができる。例えば、用量は、ＴＥＭによる活性化、増殖、サイトカイン生成、及び／又はパーフォリン生成に対して、細胞培養において判定されるＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて処方することができる。こうした情報を用いて、関係する対象者において有用な用量を、より正確に決定することができる。
【０１２０】
特定の対象者に治療有効量として実際に投与される量は、医師、獣医師、又は研究者が、標的、体重、状態の重篤度、眼科的状態の種類、過去又は現在の治療的介入、対象者の特発性、及び投与経路を含む物理的及び生理学的要因等のパラメータを考慮して決定することができる。
【０１２１】
投与量は、所望の毒素系治療用ペプチドレベルを、局所的又は全身的に達成するために、適切に調製し得る。通常、本開示の毒素系治療ペプチドは、０．００１ｍｇ／ｋｇ乃至２５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ乃至１００ｍｇ／ｋｇの毒素系治療用ペプチド、より好ましくは０．０５ｍｇ／ｋｇ乃至７５ｍｇ／ｋｇの投与量範囲で、その効果を示す。適切な用量は、１日に複数回の分割用量で投与することができる。通常、用量又は分割用量は、単位剤形当たり０．１ｍｇ乃至５００ｍｇの毒素系治療用ペプチドを含み得る。更に好適な投与量は、単位剤形当たり０．５ｍｇ乃至１００ｍｇの毒素系治療用ペプチドを含む。
【０１２２】
他の有用な用量は、体質量１キログラム（ｋｇ）当たり毒素系治療用ペプチド０．００１乃至１０，０００マイクログラム（μｇ）の範囲、１乃至５，０００μｇ／体質量ｋｇの範囲内、１乃至１，０００μｇ／体質量ｋｇの範囲内、又は１乃至１００μｇ／体質量ｋｇとなる場合が多い。多くの場合、用量は、０．１乃至５μｇ／ｋｇ又は０．５乃至１μｇ／ｋｇの範囲となる。他の例において、用量は、１μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、３５μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、４５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、５５μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、６５μｇ／ｋｇ、７０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、８０μｇ／ｋｇ、８５μｇ／ｋｇ、９０μｇ／ｋｇ、９５μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、５５０μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、６５０μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、８５０μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、９５０μｇ／ｋｇ、１，０００μｇ／ｋｇ、１，５００μｇ／ｋｇ、２，０００μｇ／ｋｇ、２，５００μｇ／ｋｇ、３，０００μｇ／ｋｇ、３，５００μｇ／ｋｇ、４，０００μｇ／ｋｇ、５，０００μｇ／ｋｇ、６，０００μｇ／ｋｇ、７，０００μｇ／ｋｇ、８，０００μｇ／ｋｇ、９，０００μｇ／ｋｇ、１０，０００μｇ／ｋｇ、０．１乃至５ｍｇ／ｋｇ、又は０．５乃至１ｍｇ／ｋｇを含むことができる。他の例において、用量は、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、又は５０ｍｇ／ｋｇを含むことができる。
【０１２３】
カクテルを用いる場合、共通の投与媒体（例えば、丸剤、錠剤、インプラント、ポンプ、注射液）に、毒素系治療ペプチドを他の薬物又は作用物質と組み合わせて共に含有させることができる。カクテルの個別成分は、それぞれ治療有効量で投与することが可能であり、又は組み合わせた投与により、治療有効量を形成することができる。
【０１２４】
特定の実施形態において、投与量は、当初は低いレベルから開始し、所望の効果が達成されるまで増加させることができる。こうした用量において対象者の反応が不十分である場合、更に高い用量（又はより局所化された異なる送達経路による有効な高用量）を、対象者の耐性が許す範囲で利用し得る。例えば、２４時間を超える継続投薬又は１日複数回の投薬により、毒素系治療用ペプチドの適切な全身的又は組織特異的レベルが達成されると考えられる。
【０１２５】
治療有効量は、治療レジメンの過程で単一又は複数の用量を投与することにより達成することができる（例えば、毎日、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、１日８回、１日９回、１日１０回、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、毎週、２週間毎、３週間毎、１ヶ月毎、２ヶ月毎、３ヶ月毎、４ヶ月毎、５ヶ月毎、６ヶ月毎、７ヶ月毎、８ヶ月毎、９ヶ月毎、１０ヶ月毎、１１ヶ月毎、又は毎年）。
【０１２６】
医薬組成物は、人工涙液、抗生物質、シクロスポリン、又はコルチコステロイド等、眼科的状態の症状を緩和する１つ以上の全身用又は局所用製品と併せて投与し得る。
【０１２７】
様々な投与経路を利用することができる。選択される特定の方式は、送達される特定の医薬組成物、治療する眼科的状態の重篤度、及び治療有効量を提供するために必要な投与量に応じて決まる。医学的に許容される任意の投与方式、即ち、健全な医学的判断による投与の恩恵を上回る、臨床的に許容されない副作用を引き起こすことなく、毒素系治療用ペプチドの治療有効量を提供する任意の方式を用いることができる。投与経路の例には、  動脈内、皮内、病巣内、リンパ内、筋肉内、鼻腔内、結節内、眼内、内部非経口、腹腔内、前立腺内、直腸内、髄腔内、腫瘍内、膣内、静脈内、小胞内、硝子体内、経口、皮下、舌下、及び／又は局所投与、更に具体的には、動脈内、皮内、病巣内、リンパ内、筋肉内、鼻腔内、結節内、眼内、内部非経口、腹腔内、前立腺内、直腸内、髄腔内、腫瘍内、膣内、静脈内、小胞内、硝子体内、経口、皮下、及び／又は舌下注射を含む。
【０１２８】
医薬組成物は、点眼剤、結膜下インプラント、眼内インプラント、眼内注射、硝子体内注射、硝子体内インプラント、テノン嚢下カプセル注入剤として、更に涙点プラグにおいて、眼及び付属器へ局所的に送達することができる。医薬組成物の送達は、超音波又はイオン泳動により促進することもできる。
【０１２９】
医薬組成物の投与に適切な経路は、注射である。医師は、対象者と、皮下、静脈内等の注射の種類とに応じた注射による投与方法に精通している。米国特許第７，９１８，８２４号では、対象者による使用に適した注射器を開示している。
【０１３０】
毒素系治療ペプチドの投与は、ポンプを用いて行うこともできる（例えば、Luer et al., The Annals of Pharmacotherapy, 27, 912 (1993)、Zimm et al., Cancer Research, 44, 1698 (1984)、及びEttinger et al., Cancer, 41, 1270 (1978)参照）。
【０１３１】
或いは、ターゲティング療法を用いて、毒素系治療用ペプチドを特定の種類の細胞に対して、抗体又は細胞特異的リガンド等のターゲティングシステムにより、更に特異的に送達してもよい。
【０１３２】
医薬組成物は、対象者の体内、例えば、眼内での移植用に設計された細胞内に、毒素系治療用ペプチドをコードするヌクレオチド配列を導入した、細胞に基づく送達システムにおいて投与することもできる。他の実施形態において、ヌクレオチド配列は、対象者の細胞に投与及びトランスフェクトすることができる。
【０１３３】
適切なヌクレオチド配列は、開示された配列及び既知の遺伝コードに基づいて、毒素系治療用ペプチド毎に、合成的に調製することができる。簡単に言えば、「遺伝子」という用語は、毒素系治療用ペプチドをコードする核酸配列を示す。この定義には、コードされた毒素系治療用ペプチドの機能に影響を与えない場合、様々な配列多型、突然変異、及び／又は配列変動といった変化が含まれる。「遺伝子」という用語は、コード配列だけでなく、プロモータ、エンハンサ、及び終端領域等の調節領域も含む。この用語は、更に、全てのイントロン、及びｍＲＮＡ転写物からスプライスされた他のＤＮＡ配列を、選択的スプライシング部位から生じた変異体と共に含むことができる。毒素系治療用ペプチドをコードする核酸配列は、毒素系治療用ペプチドの発現を指示するＤＮＡ又はＲＮＡにすることができる。こうした核酸配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖配列、又はタンパク質に翻訳されるＲＮＡ配列であってよい。核酸配列には、全長核酸配列と、全長タンパク質由来の非全長配列との両方が含まれる。配列は、更に、天然配列の縮重コドン、又は特定の細胞型においてコドン選択を提供するために導入し得る配列を含むことができる。本明細書に開示した毒素系治療用ペプチドをコードする遺伝子配列は、公開されているデータベース及び刊行物において入手することができる。
【０１３４】
一部の実施形態において、ポリヌクレオチドには、例えば、毒素系治療用ペプチドを発現する配列（例えば、遺伝子）を含むことが可能なプラスミド、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡが含まれる。適切なプラスミドには、細胞への遺伝子導入に使用可能な標準的なプラスミドベクタ及びミニサークルプラスミドが含まれる。ポリヌクレオチド（例えば、ミニサークルプラスミド）は、更に、遺伝子材料（例えば、毒素系治療用ペプチドをコードする配列）の導入を促進する任意の追加配列情報を含むことができる。例えば、ポリヌクレオチドは、一般的なプロモータ、組織特異的プロモータ、細胞特異的プロモータ、及び／又は核又は細胞質に対して特異的なプロモータ等のプロモータを含むことができる。プロモータ及びプラスミド（例えば、ミニサークルプラスミド）は、当該技術分野において一般的に周知であり、従来の手法を用いて調製することができる。本明細書で更に説明するように、ポリヌクレオチドは、細胞をトランスフェクトするために用いることができる。特に指定しない限り、トランスフェクト、トランスフェクトされた、又はトランスフェクトするという用語は、外因性のポリヌクレオチド、又はそれらから発現したペプチドが、細胞内に存在することを示すために用いることができる。当該技術分野において公知であるように、多数のベクタが、遺伝子の細胞への導入を仲介可能であることが知られている。
【０１３５】
特定の実施形態において、この送達方法は、脊髄領域において用いることができる。適切な送達システムは、米国特許第５，５５０，０５０号及び公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ９２／１９１９５、ＷＯ９４／２５５０３、ＷＯ９５／０１２０３、ＷＯ９５／０５４５２、ＷＯ９６／０２２８６、ＷＯ９６／０２６４６、ＷＯ９６／４０８７１、ＷＯ９６／４０９５９、及びＷＯ９７／１２６３５に記載されている。
【０１３６】
本開示は、更に、ドライアイ又は他の眼科的状態を有する対象者をスクリーニングし、スクリーニングした対象者における本明細書に開示した方法の潜在的治療効果を評価する方法を提供する。一実施形態では、対象者のＴ細胞集団におけるＫｖ１．３チャネルの発現レベルを、このチャネルの表面発現を検出する抗体を用いて評価する。こうした方法を実施するための抗カリウムチャネルＫｖ１．３（細胞外）抗体は、Ａｌｏｍｏｎｅ（イスラエル）から入手可能であり、抗体は、更に、ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（米国ワシントン州シアトル）から入手することができる。Ｋｖ１．３チャネルのレベルは、本明細書に開示した毒素系治療ペプチドにより効果的に治療可能な眼科的状態を示すことができる。
【０１３７】
本明細書に開示した方法から恩恵を受ける対象者を特定するために、対象者のＫｖ１．３チャネルのレベルを、データセットから求めた基準レベルと比較する。データセットからの基準レベルは、同一対象者での以前の測定から導出することが可能であり、又は母集団から導出することができる。「母集団」は、同様の指定された特性を有する被験者の任意のグループである。グループ分けは、例えば、臨床パラメータ、臨床評価、治療レジメン、疾病状態（健康又は本明細書に開示した眼科的状態を有する）、眼科的状態の重篤度等に応じて行うことができる。
【０１３８】
本明細書における「データセット」は、所望の条件下でのサンプル（サンプル集団）の評価により生じた数値のセットである。データセットの値は、サンプルから測定値を実験的に取得し、これらの測定値からデータセットを構築することにより得られる。当業者に理解されるように、基準レベルは、例えば、個別のデータ点、例えば、平均値、中央値、平均値の中央値等の集合から意味のある集計基準レベルに到達するのに有用で、当該技術分野において既知である、任意の数学的又は統計学的な式に基づいたものにすることができる。或いは、基準レベル又は基準レベルを形成するデータセットは、研究所等のサービス提供業者から、又はデータセットが格納されたデータベース若しくはサーバから得ることができる。
【０１３９】
特定の実施形態において、本明細書に開示した治療から恩恵を受ける者としての対象者の選択は、開示された治療から以前に恩恵を受けた集団からの基準レベルと統計的に有意に異なっていないＫｖ１．３チャネルレベルに基づいて行うことができる。付加的な実施形態において、本明細書に開示した治療から恩恵を受ける者としての対象者の選択は、本明細書に開示した眼科的状態を有する集団からの基準レベルと統計的に有意に異なっていないＫｖ１．３チャネルレベルに基づいて行うことができる。他の特定の実施形態において、本明細書に開示した治療から恩恵を受ける者としての対象者の選択は、健康な集団からの基準レベルに対して統計的に有意に高いＫｖ１．３チャネルレベルに基づいて行うことができる。
【０１４０】
Ｋｖ１．３チャネルレベルは、偶然にのみ基づいて発生が予想されるレベル内の差異である場合は、有意に異なっていない。一方、統計的に有意な差異又は増加は、偶然にのみ基づいて発生が予想されるものより大きなものである。統計的有意性又はその欠如は、当該技術分野において周知の様々な方法の何れかにより決定することができる。一般に用いられる統計的優位性の尺度の例は、ｐ値である。ｐ値は、特定のデータ点と同等である所定の結果が得られる確率を表し、ここでデータ点は、偶然のみの結果である。結果は、０．０５以下のｐ値において、有意（偶然ではない）と見做される場合が多い。
【０１４１】
説明したスクリーニング方法は、対象者の治療を監督するために用いることができる。例えば、対象者のＫｖ１．３チャネルレベルにより、対象者が本明細書に開示した方法から恩恵を受ける者であると特定された場合、対象者には、本明細書に開示した医薬組成物の治療有効量を処方又は投与することができる。スクリーニング方法の結果は、例えば、介入又は治療を延期するか、予防のための検査をリスクのある患者に勧めるか、訪問頻度を増やすことを勧めるか、検査を増やすことを勧めるか、及び／又は介入を勧めるかの判断等、臨床的決定の支援を提供するために用いることもできる。方法の結果は、治療上の選択、治療に対する反応の判断、治療の調節及び投薬量の決定、継続的な治療効率の監視、及び治療レジメンの変更の示唆にも有用となり得る。
【０１４２】
製造方法
【０１４３】
毒素系治療ペプチドは、組み換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる。毒素系治療ペプチドは、メリフィールド固相合成法を用いても調製し得るが、当該技術分野において既知の他の同等の化学合成を用いることもできる。固相合成法は、保護α−アミノ酸を適切な樹脂に結合させることにより、毒素系治療用ペプチドのＣ末端から開始される。こうした出発物質は、α−アミノ保護アミノ酸を、エステル結合によりクロロメチル化樹脂又はヒドロキシメチル樹脂に、又はアミド結合によりベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂又はパラ−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂に付着させることにより調製することができる。ヒドロキシメチル樹脂の調製については、Bodansky et al., Chem. Ind. (London) 38, 1597 (1966)に記載されている。クロロメチル化樹脂は、Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（カリフォルニア州リッチモンド）及びＬａｂ．Ｓｙｓｔｅｍｓ社から市販されている。こうした樹脂の調製については、Stewart & Young, Solid phase peptide synthesis. W.H. Freeman, Kent, England (1969)に記載されている。ＢＨＡ及びＭＢＨＡ樹脂担体は、市販されており、一般に、合成中の所望の毒素系治療用ペプチドが非置換アミドをＣ末端に有する場合に用いられる。したがって、固体樹脂担体は、式−Ｏ−ＣＨ２−の樹脂担体、−ＮＨ  ＢＨＡ樹脂担体、又は−ＮＨ−ＭＢＨＡ樹脂担体を有するもの等、当該技術分野で既知のものの何れかにしてよい。非置換アミドが望ましい場合、ＢＨＡ又はＭＢＨＡ樹脂の使用は、切断により直接アミドが得られるため有利となり得る。Ｎ−メチルアミドが望ましい場合には、Ｎ−メチルＢＨＡ樹脂から生成することができる。他の置換アミドが望ましい場合は、米国特許第４，５６９，９６７号の内容を用いることが可能であり、或いは、更に遊離酸以外の基がＣ末端において望ましい場合には、Houben & Weyl, Methoden der organischen Chemie, Georg Theime, Stuttgart (1974)に記載されるような古典的な方法を用いて、毒素系治療用ペプチドを合成することが好ましいことがある。
【０１４４】
Ｃ末端アミノ酸で、適切である場合には、Ｂｏｃ又はＦｍｏｃ及び側鎖保護基により保護されたものは、遊離酸をＣ末端に有する毒素系治療用ペプチドを合成する場合、Horiki et al., Chem. Lett., 165-168, (1978)に記載の手順により、約６０℃で２４時間、攪拌しながらジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中でＫＦを用いて、最初にクロロメチル化樹脂に結合させる。ＢＯＣ保護アミノ酸の樹脂担体への結合に続いて、α−アミノ保護基は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を塩化メチレン中で用いて、又はＴＦＡを単独で用いて、取り除くことができる。脱保護は、０℃乃至室温の温度で実施することができる。ジオキサン中のＨＣｌ等、他の標準切断試薬、及び特異的α−アミノ保護基を除去するための条件は、Schroeder & Lubke, The Peptides, Academic Press: New York (1965)に記載の通りに使用し得る。
【０１４５】
α−アミノ保護基の除去後、残存するα−アミノ及び側鎖保護アミノ酸は、段階的に所望の順序で結合させ、中間化合物を得ることが可能であり、或いは、合成において各アミノ酸を別個に付加する代わりに、それらの一部を、固相リアクタに付加する前に互いに結合させてもよい。適切な結合試薬の選択は、当業者の技能範囲内である。結合試薬の例には、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＨｏＢｔ又はＨｏＡｔ存在下でのＤＣＣ、ＤＩＣ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＴＢＴＵ）が含まれる。
【０１４６】
毒素系治療ペプチドを含むペプチドの固相合成に用いる活性化試薬は、当該技術分野において周知である。適切な活性化試薬の例には、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド及びＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド等のカルボジイミドが含まれる。他の活性化試薬及びそのペプチドカップリングにおける使用は、Schroeder & Lubke, The Peptides, Academic Press: New York (1965) and Kapoor, J. Pharm. Sci., 59(1),1-27 (1970)に記載されている。
【０１４７】
各保護アミノ酸又はアミノ酸配列は、２倍以上過剰に固相リアクタに導入することが可能であり、結合は、ＤＭＦ：ＣＨ２Ｃｌ２（１：１）の培地、又はＤＭＦ又はＣＨ２Ｃｌ２のみにおいて実施し得る。中間結合が発生する場合は、α−アミノ保護基の除去前に、次のアミノ酸の結合に先行して、結合手順を反復することができる。合成の各段階での結合反応の成功は、手動で行う場合、Kaiser et al., Anal. Biochem. Vol 34(2), 595-8 (1970)に記載されるように、ニンヒドリン反応によりモニタすることができる。
【０１４８】
結合反応は、Ｂｅｃｋｍａｎ９９０自動合成機上において、Rivier et al., Biopolymers, 17(8), 1927-1938 (1978)に記載のもの等のプログラムを用いて自動的に行うことができる。
【０１４９】
所望のアミノ酸配列の完成後には、ペプチドを樹脂から切断するだけでなく、全ての残存側鎖保護基と、更には、ペプチドを遊離酸の形態で得るために以前に除去されていない場合は、Ｎ末端のα−アミノ保護基とを除去するフッ化水素又はＴＦＡ（Ｆｍｏｃ化学反応を用いる場合）等の試薬での処理により、中間ペプチドを樹脂担体から除去することができる。Ｍｅｔが配列に存在する場合、ＴＦＡ／エタンジチオールを用いてＢｏｃ保護基を最初に除去した後、ＨＦによりペプチドを樹脂から切断して、Ｓ−アルキル化の可能性を取り除く。フッ化水素又はＴＦＡを切断に用いる場合、アニソール、クレゾール、ジメチルスルフィド、及びメチルエチルスルフィド等の１種類以上のスカベンジャを、反応槽に含めることができる。
【０１５０】
ペプチド−樹脂の一部である際に毒素系治療用ペプチドを環化する場合とは対照的に、直鎖毒素系治療用ペプチドの環化に影響を与えて、Ｃｙｓ残基間を結合させることができる。こうしたジスルフィド環化結合を達成するために、完全に保護された毒素系治療用ペプチドを、当該技術分野において周知であるアンモノリシスにより、ヒドロキシメチル化樹脂又はクロロメチル化樹脂担体から切断し、完全に保護されたアミド中間体を生成することが可能であり、その後、これを適切に環化及び脱保護する。或いは、脱保護と、毒素系治療用ペプチドの上記樹脂又はベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂又はメチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）からの切断は、０℃でフッ化水素酸（ＨＦ）又はＴＦＡにより行い、その後、上述したように酸化することができる。
【０１５１】
毒素系治療ペプチドは、自動合成機を用いて合成することもできる。こうした実施形態において、アミノ酸は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ  ３５７自動ペプチド合成機を用いて、ＭＢＨＡ  Ｒｉｎｋ樹脂（一般に樹脂１００ｍｇ）にＣ末端から連続して結合させることができる。結合は、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）中の１，３−ジイソプロピルカルボジイミドを用いて、又は２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）及びジエチルイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）により実施することができる。Ｆｍｏｃ保護基は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％ピペリジン溶液での処理により取り除くことができる。その後、樹脂をＤＭＦにより（２回）洗浄し、続いてエタノール及びＮＭＰにより洗浄する。
実施形態例
１．必要とする対象者において眼科的状態を治療する方法であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２５６の何れかに対して、少なくとも８０％の配列同一性を有する毒素系治療用ペプチドを含む医薬組成物の治療有効量を、前記対象者に投与することを含む方法。
２．前記毒素系治療用ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２５６の何れかに対して、少なくとも８５％の配列同一性を有する、実施形態１記載の方法。
３．前記毒素系治療用ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２５６の何れかに対して、少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態１又は２記載の方法。
４．前記毒素系治療用ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２５６の何れかに対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態１乃至３の何れかに記載の方法。
５．前記毒素系治療用ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２５６の何れかに対して、少なくとも９６％の配列同一性を有する、実施形態１乃至４の何れかに記載の方法。
６．前記毒素系治療用ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２５６の何れかに対して、少なくとも９７％の配列同一性を有する、実施形態１乃至５の何れかに記載の方法。
７．前記毒素系治療用ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２５６の何れかに対して、少なくとも９８％の配列同一性を有する、実施形態１乃至６の何れかに記載の方法。
８．前記毒素系治療用ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２５６の何れかに対して少なくとも９９％の配列同一性を有する、実施形態１乃至７の何れかに記載の方法。
９．前記毒素系治療用ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかに対して、少なくとも８０％の配列同一性を有する毒素系ペプチドである、実施形態１記載の方法。
１０．前記毒素系ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかに対して、少なくとも８５％の配列同一性を有する、実施形態９記載の方法。
１１．前記毒素系ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかに対して、少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態９又は１０記載の方法。
１２．前記毒素系ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかに対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態９乃至１１の何れかに記載の方法。
１３．前記毒素系ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかに対して、少なくとも９６％の配列同一性を有する、実施形態９乃至１２の何れかに記載の方法。
１４．前記毒素系ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかに対して、少なくとも９７％の配列同一性を有する、実施形態９乃至１３の何れかに記載の方法。
１５．前記毒素系ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかに対して、少なくとも９８％の配列同一性を有する、実施形態９乃至１４の何れかに記載の方法。
１６．前記毒素系ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５乃至２５６の何れかに対して、少なくとも９９％の配列同一性を有する、実施形態９乃至１５の何れかに記載の方法。
１７．前記毒素系治療用ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れかに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＳｈＫ系ペプチドである、実施形態１記載の方法。
１８．前記ＳｈＫ系ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れか１つに対して、少なくとも８５％の配列同一性を有する、実施形態１７記載の方法。
１９．前記ＳｈＫ系ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れか１つに対して、少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態１７又は１８記載の方法。
２０．前記ＳｈＫ系ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れか１つに対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態１７乃至１９の何れかに記載の方法。
２１．前記ＳｈＫ系ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れか１つに対して、少なくとも９６％の配列同一性を有する実施形態１７乃至２０の何れかに記載の方法。
２２．前記ＳｈＫ系ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れか１つに対して、少なくとも９７％の配列同一性を有する、実施形態１７乃至２１の何れかに記載の方法。
２３．前記ＳｈＫ系ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れか１つに対して、少なくとも９８％の配列同一性を有する、実施形態１７乃至２２の何れかに記載の方法。
２４．前記ＳｈＫ系ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れか１つに対して、少なくとも９９％の配列同一性を有する、実施形態１７乃至２３の何れかに記載の方法。
２５．前記ＳｈＫ系ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態１及び１７乃至２０の何れかに記載の方法。
２６．前記ＳｈＫ系ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態１及び１７乃至２０の何れかに記載の方法
２７．前記ＳｈＫ系ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１７、及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１８に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態１及び１７乃至２０の何れかに記載の方法。
２８．前記ＳｈＫ系ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１７、及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１８に対して、少なくとも９６％の配列同一性を有する、実施形態１、１７乃至２０、及び２７の何れかに記載の方法。
２９．前記ＳｈＫ系ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１７、及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１８に対して、少なくとも９７％の配列同一性を有する、実施形態１、１７乃至２０、２７、及び２８の何れかに記載の方法。
３０．前記ＳｈＫ系ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１７、及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１８に対して、少なくとも９８％の配列同一性を有する、実施形態１、１７乃至２０、及び２７乃至２９の何れかに記載の方法。
３１．前記ＳｈＫ系ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１７、及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１８に対して、少なくとも９９％の配列同一性を有する、実施形態１、１７乃至２０、及び２７乃至３０の何れかに記載の方法。
３２．前記毒素系治療用ペプチドは、天然又は合成物である、実施形態１乃至３１の何れかに記載の方法。
３３．前記毒素系治療用ペプチドは、アニオン電荷を有する有機又は無機化学物質に付着させる、実施形態１乃至３２の何れかに記載の方法。
３４．前記毒素系治療用ペプチドのＣ末端は、酸又はアミドである、実施形態１乃至３３の何れかに記載の方法。
３５．前記医薬組成物は、局所的に眼に対して投与される、実施形態１乃至３４の何れかに記載の方法。
３６．前記医薬組成物は、非経口及び／又は経腸経路により投与される、実施形態１乃至３５の何れかに記載の方法
３７．前記医薬組成物は、局所的に投与されると共に、非経口及び／又は経腸経路により投与される、実施形態１乃至３６の何れかに記載の方法。
３８．前記医薬組成物は、硝子体内注射により投与される、実施形態１乃至３７の何れかに記載の方法。
３９．前記医薬組成物は、１日６回、１日５回、１日４回、１日３回、１日２回、１日１回、１週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、又は６ヶ月に１回投与される、実施形態１乃至３８の何れかに記載の方法。
４０．前記眼科的状態は、ドライアイ、ブドウ膜炎、小児ブドウ膜炎、乾性角結膜炎、上強膜炎、角膜炎、網膜血管炎、強膜炎、眼内炎、瘢痕性類天疱瘡、モーレン潰瘍、及び／又はサイトメガロウイルス媒介性網膜炎である、実施形態１乃至３９の何れかに記載の方法。
４１．前記眼科的状態は、全身性エリテマトーデス、顕微鏡的多発血管炎、結節性多発動脈炎、ウェゲナ肉芽腫症（多発血管炎性肉芽腫症）、サルコイドーシス、ベーチェット症候群、フォークト・小柳・原田症候群、高安動脈炎、リューマチ性関節炎、シェーグレン症候群、再発性多発性軟骨炎、強直性脊椎炎、乾癬、及び／又はチャーグ・ストラウス症候群により発生する、実施形態１乃至４０の何れかに記載の方法。
４２．前記対象者は、成人、小児、又は若年者である実施形態１乃至４１の何れかに記載の方法。
４３．前記医薬組成物は、保存料を含む、実施形態１乃至４２の何れかに記載の方法。
４４．前記保存料は、ベンザルコニウムクロリド（≦０．０２５％）、ソルビン酸、塩化ベンゼトニウム（≦０．０１％）、クロロブタノール（≦０．５％）、酢酸フェニル水銀（≦０．００４％）、硝酸フェニル水銀（≦０．００４％）、チメロサール（≦０．０１％）、メチルパラベン（０．１乃至０．２％）、及び／又はプロピルパラベン（≦０．０４％）である、実施形態４３記載の方法。
４５．前記医薬組成物は、増粘剤を含む、実施形態１乃至４４の何れかに記載の方法。
４６．前記増粘剤は、カルボキシメチルセルロース（≦１％）、ヒドロキシエチルセルロース（≦０．８％）、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース（≦１％）、メチルセルロース（≦２％）、ポリビニルアルコール（≦１．４％）、ポリカルボフィル、ゲランガム、キサンタンガム、カーボポール、ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）スルホン酸、及び／又はポリビニルピロリジン（≦１．７％）である、実施形態４５記載の方法。
４７．前記医薬組成物は、抗酸化剤を含む、実施形態１乃至４６の何れかに記載の方法。
４８．前記抗酸化剤は、エチレンジアミン四酢酸（≦０．１％）、亜硫酸水素ナトリウム（≦０．１％）、ピロ亜硫酸ナトリウム（≦０．１％）、及び／又はチオ尿素（≦０．１％）である、実施形態４７記載の方法。
４９．前記医薬組成物は、緩衝剤、浸透圧調節剤、及び界面活性剤を含む、実施形態１乃至４８の何れかに記載の方法。
５０．前記医薬組成物は、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．８ｗ／ｖ％ＮａＣｌと共に、ポリソルベート２０を０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、１、２、３、又は４ｗ／ｖ％含み、前記組成物のｐＨは、５．０、５．５、６．０、６．５、７、７．５、又は８である、実施形態１乃至４９の何れかに記載の方法。
５１．前記医薬組成物は、ポリソルベート２０を０．０５ｗ／ｖ％含み、前記組成物のｐＨは、６．０である、実施形態１乃至５０の何れかに記載の方法。
５２．前記医薬組成物は、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．８ｗ／ｖ％ＮａＣｌと共に、ポリソルベート８０を０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、１、２、３、又は４ｗ／ｖ％含み、前記組成物のｐＨは、５．０、５．５、６．０、６．５、７、７．５、又は８である、実施形態１乃至４９の何れかに記載の方法。
５３．前記医薬組成物は、ポリソルベート８０を０．０５ｗ／ｖ％含み、前記組成物のｐＨは、６．０である、実施形態１乃至４９又は５２の何れかに記載の方法。
５４．前記治療有効量は、涙液形成を増加させ、眼の刺すような又は焼けるような感覚を減少させ、眼からの粘質排出物を減少させ、眼の痛みを減少させ、眼の発赤を減少させ、かすみ目の頻度及び／又は期間を減少させ、光過敏性を減少させ、対象者の視界内の一過性の暗く浮遊する点の頻度及び／又は期間を減少させ、対象者の視力を高め、眼のゴロゴロした感じを減少させ、眼瞼が重い感覚を減少させ、眼が非常に乾燥した時期に続く一過性の過剰な涙液を減少させ、及び／又は虹彩前方における眼内の白色領域（群）を減少させる、実施形態１乃至５３の何れかに記載の方法。
５５．実施形態１乃至５４の何れかに記載の方法による治療の結果を予測するために対象者を評価する方法であって、前記対象者の生体試料からのＴ細胞のＫｖ１．３チャネル発現レベルを分析することを含み、健康な対照又は基準集団と相対的なＫｖ１．３チャネルの発現レベルの増加は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２２４の何れか１つに対して、少なくとも８０％の配列同一性を有するＳｈＫ系ペプチドによる治療を受容可能な患者を示す方法。
５６．実施形態１乃至５４の何れかに記載の方法による治療から恩恵を受け得る対象者をスクリーニングする方法であって、前記対象者の生体試料からのＴ細胞及び／又はマクロファージのＫｖ１．３チャネル発現レベルを測定することと、前記対象者のＫｖ１．３チャネル発現レベルを、健康な対照又は基準集団のものと比較することと、前記対象者におけるＫｖ１．３チャネルの発現レベルが健康な対照又は基準集団と比較して増加している場合、前記対象者が実施形態１乃至５４の何れかに記載の方法による治療から恩恵を受けると判断することと、を含む方法。
５７．臨床試験の対象者を選択する方法であって、前記対象者の生体試料からのＴ細胞及び／又はマクロファージのＫｖ１．３チャネル発現レベルを測定することと、前記対象者のＫｖ１．３チャネル発現レベルを、健康な対照又は基準集団のものと比較することと、前記対象者のＫｖ１．３チャネル発現レベルが健康な対照又は基準集団と比較して増加している場合、前記対象者を臨床試験のために選択すること、又は前記対象者のＫｖ１．３チャネル発現レベルが健康な対照又は基準集団と比較して減少している又は変わらない場合、前記対象者を臨床試験から除外することと、を含む方法。
５８．対象者における眼科的状態に対して可能な治療をスクリーニングする方法であって、前記対象者の生体試料からのＴ細胞及び／又はマクロファージのＫｖ１．３チャネル発現レベルを測定することと、前記対象者のＫｖ１．３チャネル発現レベルを、健康な対照又は基準集団のものと比較することと、対象者のＫｖ１．３チャネル発現レベルが健康な対照又は基準集団と比較して増加している場合、実施形態１乃至５４の方法の何れかを、前記対象者に対する治療として特定することと、を含む方法。
５９．前記Ｋｖ１．３チャネル発現レベルは、アッセイを用いて測定される、実施形態５６乃至５８の何れかに記載の方法。
６０．前記Ｋｖ１．３チャネル発現レベルは、アッセイを用いて分析される、実施形態５５記載の方法。
６１．更に、毒素系治療用ペプチドの存在下で炎症誘発性免疫刺激剤又はＴ細胞活性化剤により前記Ｔ細胞にチャレンジすることを含む、実施形態５５乃至６０の何れかに記載の方法。
６２．前記毒素系治療用ペプチドは、ＳｈＫ系ペプチドである、実施形態６１記載の方法。
６３．前記ＳｈＫ系ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１７、及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態６２記載の方法。
６４．更に、炎症誘発性サイトカイン生成を測定することを含む、実施形態５５乃至６３の何れかに記載の方法。
６５．前記測定されるサイトカインは、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、インターロイキン（ＩＬ）−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、顆粒球マクロファージコロニ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）３、及び／又はＭＭＰ９である、実施形態６４記載の方法。
６６．更に、毒素系治療用ペプチドの存在下又は不在下で、眼の抗原により前記Ｔ細胞にチャレンジすることを含む、実施形態５５乃至６５の何れかに記載の方法。
６７．前記毒素系治療用ペプチドは、ＳｈＫ系ペプチドである、実施形態６６記載の方法。
６８．前記ＳｈＫ系ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１７、及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態６７記載の方法。
６９．前記ＳｈＫ系ペプチドは、前記式ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１７を有する、実施形態６８記載の方法。
７０．前記眼科的状態は、炎症性の眼科的状態である、実施形態１乃至６９の何れかに記載の実施形態例。
【０１５２】
以下の実施例では、本明細書に開示した方法の最適化について説明する。これらの実施例は、本開示の特定の実施形態を実証するために含めている。当業者は、本開示を踏まえて、本明細書に開示した特定の実施形態に多数の変更を加えても、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、同様又は類似の結果を得ることが可能であることを認識するであろう。
【実施例】
【０１５３】
実施例１．毒素系治療ペプチドによる炎症性サイトカイン生成の抑制。本実施例では、本明細書に開示した毒素系治療用ペプチドによる、眼科的状態に関連する組織損傷及び炎症に寄与するサイトカインのレベルの調節の評価について説明する。
【０１５４】
サイトカインＩＬ−１７−Ａ、Ｆ、Ａ／Ｆ、ＩＬ−２１、及びＩＬ２２を生成するＴｈ１７細胞と、ＩＬ−１７−Ａ、Ｆ、Ａ／Ｆ、及びＩＦＮ−γを生成するＴｈ１／Ｔｈ１７細胞は、様々な形態のブドウ膜炎及びドライアイ疾患といった、眼に影響する自己免疫障害を含む様々な自己免疫障害の原因とされることが多くなっている。ＩＦＮ−γと同様に、ケモカイン生成を増加させることにより、ＩＬ−１７は、炎症部位への単球／マクロファージ及び好中球の動員につながる。ＩＬ−１７の初期発生源には、眼表面組織に存在するγδ  Ｔ細胞と、乾燥ストレス誘発性ドライアイの初期段階において、結膜等の眼表面組織内に蓄積するナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞が含まれる。ＮＫ  Ｔ細胞は、肺細胞密度の低下、角膜上皮ムチンの変化、及び角膜上皮性関門の機能不全に関連するＩＦＮ−γの初期発生源でもある。
【０１５５】
ＣＤ４＋  Ｔｈ１、Ｔｈ１７、及びＴｈ１／Ｔｈ１７  Ｔ細胞は、抗原特異的なドライアイ及び他の眼科的状態の慢性期の組織損傷において主要な役割を果たす。活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ドライアイ患者の眼表面上に局在し、疾患の進行の要因となる。併せて、Ｔｈ１及びＴｈ１７由来のサイトカインは、ドライアイ及び他の眼科的状態における組織損傷の多くの要因となり、ヒトにおけるこうした状態の症状及び基礎となる病理過程の治療にとって適切な標的となる。これには、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７が共に炎症の増加及び腺の機能不全に関連する若年性特発性関節炎、シェーグレン症候群、及びベーチェット症候群において見られるような慢性ブドウ膜炎を含め、様々な形態のブドウ膜炎が含まれる。したがって、ドライアイ及びブドウ膜炎の局所的及び全身的原因における共通のメカニズムを、本明細書に開示した方法及び医薬組成物を用いた治療の標的とすることができる。
【０１５６】
本実施例では、タプシガルジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）により引き起こした炎症誘発性サイトカインの分泌を減少させる、本明細書に開示した毒素系治療ペプチドを含む医薬組成物の能力を調査する。タプシガルジンは、ミクロソームの筋小胞体及び小胞体内の細胞内膜のＣａ２＋イオンポンプタンパク質を阻害することにより、炎症誘発性サイトカインの放出を刺激する。この阻害は、貯蔵Ｃａ２＋の急速な放出と、その後の細胞膜カルシウムチャネルの活性化とをもたらす。
【０１５７】
一次血液細胞の調製。全血及び末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いて、ドライアイを含む眼科的状態を有する対象者の治療に対する、本明細書に開示したＳｈＫ系治療用ペプチドの適合性を試験した。全血は、追加処理を施すことなく、実験的アッセイ用の細胞培養に直接分注した。
【０１５８】
ＰＢＭＣは、次のように、密度勾配遠心分離によりドナー血液から単離した。血液は、抗凝血剤としてのヘパリンナトリウムと、ポリエステルゲル及び密度勾配液（ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＣＰＴ）を含む細胞分離媒体とを含む採取管に採取した。試料は、１５００ＲＣＦで、２０分間、室温で遠心分離した。単核細胞及び血小板を含む細胞層は、血漿層の直下に位置しており、パスツールピペットを用いて別個の１５ｍＬ円錐管に採取した。細胞をＰＢＳにより２回洗浄し、遠心分離により上清を除去して、ペレットとした。精製したＰＢＭＣは、コンプリートＲＰＭＩ（ｃＲＰＭＩ）細胞培養培地に再懸濁し、アッセイに適した濃度で平板培養した。
【０１５９】
サイトカイン分泌が測定可能な他の細胞には、ヒトマクロファージ／単球、ラット血液細胞、リンパ節、及び脾細胞が含まれる。
【０１６０】
一次血液細胞の処理。ＳｈＫ−１８６をｃＲＰＭＩにおいて段階希釈し、４×最終濃度  の作業用ストックとした。５０μＬの作業用ストックを、９６ウェル細胞培養プレートに対して、ＳｈＫ系ペプチドの濃度毎に６ウェルに添加した。ＳｈＫ系ペプチドを含まない５０μＬのｃＲＰＭＩを対照処理として、陽性対照ウェル（ＳｈＫ系ペプチド無し、タプシガルジン刺激有り）及び陰性対照ウェル（ＳｈＫ系ペプチド有り、タプシガルジン刺激無し）において使用した。１００μＬの全血又はコンプリートＲＰＭＩ中の２００，０００個のＰＢＭＣを、９６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに添加した。細胞とＳｈＫ系ペプチド又は対照培地とを、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。１時間後、５０μＬの４０ｕＭタプシガルジン刺激を、陰性対照ウェルを除く全てのウェルに追加し、陰性対照ウェルには、５０μＬの０．４％ＤＭＳＯを加え、最終濃度０．１％とした。細胞は、４８時間インキュベートした。
【０１６１】
ＳｈＫ系ペプチド処理及びタプシガルジン刺激を行った細胞の分析。タプシガルジンによる刺激の４８時間後、９６ウェルプレートを２０００ＲＰＭで５分間遠心分離した。上清を、試料分析用の無菌９６ウェルプレートに慎重に移した。サイトカインは、磁気ビーズに結合させた特異抗体と、ストレプトアビジン／フィコエリトリンと反応して蛍光信号を生成する二次抗体とを用いて検出した。結合したビーズは、Ｍａｇｐｉｘ装置（Ｌｕｍｉｎｅｘ社、米国テキサス州オースチン）を用いて検出及び定量化したが、例えば、ＥＬＩＳＡ等の当該技術分野において既知である同様の手法を用いて、蛍光及び比色法を含む検出の方法によりタンパク質生成を測定してもよい。
【０１６２】
上述した方法を用いて、ＳｈＫ−１８６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１７）が、ＩＬ−１７及びＩＦＮ−γを含む、ドライアイに寄与することが明らかとなっている炎症性サイトカインを抑制することが実証された。ＳｈＫ−１８６は、炎症性サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、及びＩＦＮ−γのレベルを、タプシガルジンによる刺激の前にＳｈＫ−１８６により処理した全血において抑制した。ＩＣ５０値は、図１に示したように、ピコモルの範囲となった。
【０１６３】
ＳｈＫ−１８６は、更に、炎症性サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、及びＩＦＮ−γのレベルを、タプシガルジンによる刺激の前にＳｈＫ−１８６により処理したＰＢＭＣにおいて抑制した。ＩＣ５０値は、図２に示したように、ピコモルの範囲となった。
【０１６４】
これらの結果は、本明細書に開示したＳｈＫ系治療ペプチドを含む医薬組成物が、ブドウ膜炎及びドライアイを含む自己免疫性眼疾患等の眼科的状態に関連する炎症誘発性サイトカインの分泌を低減可能であることを実証している。
【０１６５】
実施例２．ドライアイ及び対照患者におけるＴＥＭによるＫｖ１．３チャネルの発現。本実施例では、健康な患者対照からのものと比較した、ドライアイ患者で確認されたＴＥＭによるＫｖ１．３チャネルの発現の評価について説明し、ＳｈＫ−１８６等の本開示の毒素系治療用ペプチドによる処理に対するドライアイ患者試料の反応性を特徴付ける。
【０１６６】
機能アッセイを行うために、ＰＢＭＣを、ブドウ膜炎又はドライアイ患者及び健康な対照から単離する。実施例の第１の段階において、細胞は、生体外刺激無しで、活性化直後に試験するか、或いは、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体又はマイトジェンにより生体外で活性化した後、免疫染色及びマルチカラーフローサイトメトリを行い、ＣＤ４及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット内のＴＥＭ表面上でのＫｖ１．３チャネルの発現レベルを研究する。患者から単離した細胞は、生体外での刺激無しでも、高いＫｖ１．３発現を有すると予想されるが、この発現は、生体外での活性化により増加させることができる。Ｋｖ１．３を治療標的として検証するために、ドライアイ又はブドウ膜炎患者からの結膜の生検標本に対して、抗ＣＤ３＋、抗ＣＤ４＋、及び抗Ｋｖ１．３抗体により染色することで、免疫組織化学的検査を施し、Ｋｖ１．３レベルの上昇を示すＣＤ３＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞集団を特定する。同様に、ＣＤ４０、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ｉＮＯＳ等に対する抗体を抗Ｋｖ１．３抗体と組み合わせて、活性化マクロファージを特定することができる。ドライアイ又は慢性ブドウ膜炎等の他の自己免疫性眼疾患の患者からの試料は、活性化マーカ、及びＫｖ１．３の高いＴ細胞及びマクロファージについて陽性であると予想される。第３の段階では、適合する細胞アリコートを用いて、ＳｈＫ系ペプチドがドライアイ患者又はブドウ膜炎患者からのＴＥＭの炎症誘発性及び増殖ポテンシャルを遮断する能力を対照と比較して研究する。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、及びＩＬ−２２を含むサイトカイン、パーフォリン、及びグランザイムＢを、毒素系治療用ペプチドの存在下又は不在下で、休止又は活性化細胞における細胞内染色及びフローサイトメトリにより検出する。加えて、これらは、採取した上清のマルチプレックスＥＬＩＳＡ等のアッセイにより定量化することができる。これらの実験において、ＳｈＫ−１８６の生体外添加は、非刺激又は活性化Ｔ細胞又はマクロファージの両方において説明した１つ以上の方法により決定される、上記サイトカインの発現を有意に減少させる。ＳｈＫ−１８６の添加は、同様に、生体外活性化中のＴ細胞又はマクロファージの生体外増殖を有意に減少させる。この減少は、標準的な免疫学的方法のうち特に、［３Ｈ］チミジン取込の定量化又は蛍光色素ＣＦＳＥにより測定することができる。
【０１６７】
実施例３。局所投与による毒素系治療ペプチドの局所送達。本実施例では、ＳｈＫ−１８６又はＳｈＫ−１９８等の本開示の毒素系治療用ペプチドの投与後の局所及び全身薬物濃度の評価について説明する。
【０１６８】
６乃至８週齢のメスのスプラーグドーリーラット３匹（米国インディアナ州インディアナポリス）に対して、１０μＬのＰ６Ｎ（リン酸ナトリウム（１０ｍＭ）、塩化ナトリウム（０．８％）、及びポリソルベート２０（０．０５％）をｐＨ６．０で左眼（ＬＥ）において、Ｐ６Ｎ中の１０μＬの０．５％ＳｈＫ−１８６を右眼（ＲＥ）において、１日３回２１日間に亘り局所投与した。３、７、１２、１４、１７、及び２１日目に血液を採取及び処理して血漿を得た。２１日目には、血漿に加え、それぞれの眼から硝子体液を採取した。採取した試料におけるＳｈＫ−１８６レベルは、標準的な直接ＥＬＩＳＡ法により測定した。
【０１６９】
図３Ａ及び３Ｂは、溶媒と共に行った右眼（ＲＥ）へのＳｈＫ−１８６の局所投与後２１日目に採取した局所水性流体（図３Ａ及び図３Ｂ）及び血漿（図３Ａ）試料におけるＳｈＫ−１８６の定量を、左眼（ＬＥ）と比較して示している。局所投与したＳｈＫ−１８６は、ＲＥの水性流体において有意な濃度で確認され、薬物の眼内送達を示している（図３Ａ、３Ｂ）。未処理のＬＥからの試料、又は血漿中において、検出可能なＳｈＫ−１８６は存在せず、薬物に対する全身曝露が最小限であることを示している（図３Ａ及び３Ｂ）。
【０１７０】
加えて、８乃至１４週齢のメスのＬＥＷＩＳラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）に、  生理食塩水、又は０．１％（動物３−１乃至３−３）又は１％（動物４−１乃至４−４）のＳｈＫ−１８６を、１日３回（１０μＬ）局所投与した（図３Ｃ）。ＳｈＫ−１９８は、０．１％（動物５−１乃至５−４）又は１％で図３Ｄに示すように与え、動物２−１乃至２−４には、溶媒Ｐ６Ｎを与えた（図３Ｄ）。図３Ｃは、ＳｈＫ−１８６の局所投与後７日目に採取した局所水性流体中のＳｈＫ−１８６の定量を示している。局所投与したＳｈＫ−１８６は、前房水性流体において有意な濃度で確認され、薬物の眼内送達を示している。血漿試料において、検出可能なＳｈＫ−１８６は存在せず、薬物に対する全身曝露が最小限であることを示している（図示せず）。図３Ｄは、ＳｈＫ−１９８の局所投与後７日目に採取した前房水性流体又は血漿中のＳｈＫ−１９８の定量を示している。局所投与したＳｈＫ−１９８は、水性流体において有意な濃度で確認され、薬物の眼内送達を示している。血漿試料において、検出可能なＳｈＫ−１９８は存在せず、薬物に対する全身曝露が最小限であることを示している（図示せず）。
【０１７１】
実施例４．自己免疫性眼疾患におけるＳｈＫ−１８６及びＳｈＫ−１９８の治療的効果の評価。本実施例では、ＳｈＫ−１８６等の本開示の毒素系治療用ペプチドの局所送達の治療的効果の評価について説明する。
【０１７２】
ブドウ膜炎等の自己免疫性眼疾患におけるＳｈＫ−１８６の治療能力を評価するために用いた１モデルは、メラニン関連抗原（ＭＡＡ）誘導実験的自己免疫性前部ブドウ膜炎（ＥＡＡＵ）である。このモデルでは、５乃至１０週齢のオスのＬｅｗｉｓラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中で乳化したＭＡＡの皮下投与により免役し、百日咳毒素の腹腔内注射（０．２乃至１ｍｃｇ／匹）を一回行う。疾患の症状は、免疫後１０日目に現れ、１８日目にピークとなる。ラットは、一般に２５日で回復する。
【０１７３】
ＭＡＡの調製。ＭＡＡは、Simpsom et al., Eye 11, 206-208, (1997)に記載の手順を幾分集成したものにしたがって調製した。虹彩及び毛様体構造を、２５個の新鮮な色素沈着したウシの眼から切り出した。組織を小片に切り分け、低温のＰＢＳ中で均質化した。ホモジネートを４０００ｇで１０分間回転させ、ＰＢＳにより３回洗浄した後、２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００による界面活性剤抽出を行い、室温で３時間回転させた。結果的に生じた材料を、再度回転させ、ＰＢＳにより３回洗浄し、今回は２％ＳＤＳにより更に界面活性剤抽出を施し、３時間３７℃で回転させた。この材料を、ＰＢＳにより３回洗浄した後、Ｈ２Ｏにより３回洗浄し、最後に７０％エタノールにより洗浄した。ＭＡＡペレットを真空下に略１５分間置き、得られた乾燥抗原材料を−２０℃で冷凍保存した。
【０１７４】
ＭＡＡ：ＣＦＡエマルションの調製。図４に示した結果が得られた実験に用いたエマルションのために、５０ミリグラムのＭＡＡを３．８ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、懸濁液を短時間ボルテックスした後、３０秒間の超音波処理を３回行い、その合間に氷上で３０秒間のインキュベートを行った。このスラリを、１００μｍのセルストレーナに通し、厚みのある材料は、注射器プランジャを用いて押して通過させた。懸濁液のタンパク質含有量は、市販のＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ２３２２５）を用いて３．２７ｍｇ／ｍｌと判定され、−２０℃で使用まで冷凍保存した。免疫化の日（０日目）、ストックＭＡＡを室温で解凍し、短時間ボルテックスした後、作業用希釈物を６００μｇ／ｍＬ作成した。次に、この溶液を滴下して、ボルテックスしながらＣＦＡと１：１で混合し、最終抗原濃度を３００μｇ／ｍＬ（又は１匹当たり３０μｇ）とした。エマルションを更に５分間ボルテックスした後、注射器に詰め、１８Ｇ乳化ブリッジを通過させて非常に濃厚にした。エマルションは、同じ日に、各足蹠に５０μＬ、１匹当たり合計１００μＬをグループに応じて皮下投与した。図４Ａ乃至４Ｄは、この疾患モデルに関連する病状と、疾患の発生及び重篤度に対するＳｈＫ−１８６の局所投与の効果とを示す。
【０１７５】
図４Ａは、ＥＡＡＵ誘導後１１、１３、１５、及び１８日目にスリットランプを用いて各動物に行った臨床的観察のデータを示す。眼には、瞳孔機能（縮瞳）、虹彩構造、前房内での細胞の有無、前房内でのタンパク質（フレア）の有無に基づいて個別のスコアを与えた。スコアは、その後、それぞれの日について複合臨床スコアに変換した。０乃至８日目は０．１％、９乃至１８日目は１％のＳｈＫ−１８６により１日３回、眼に局所的な治療を施した動物の複合スコアは、溶媒により処置したものよりも有意に低いことが分かった。
【０１７６】
図４Ｂに見られるように、ＳｈＫ−１８６の局所投与は、このモデルにおける肉眼病変を減少させた。（左図（３−２ＲＥ））動物に溶媒（Ｐ６Ｎ）を１日３回投与した。免疫化後１８日目、動物３−２の観察では、複合臨床スコアが１３となる：縮小瞳孔にタンパク質が充満（スコア＝４）、何らかの損傷を有する充血した虹彩血管（スコア＝３）、前房内の多数の浸潤性細胞（スコア＝４、図示せず）、及び僅かなフレア（スコア＝２、図示せず）。（右図、４−８ＲＥ）に示す動物には、ＥＡＡＵ誘導のための免疫化後、９日間０．１％ＳｈＫ−１８６を与え、更に１０日間１％ＳｈＫ−１８６を与えた。免疫化後１８日目、動物４−８の観察では、複合臨床スコアが０となる：正常な瞳孔（スコア＝０）、正常な虹彩血管及び構造（スコア＝０）、前房内で視認される細胞又はタンパク質の不在（それぞれについてスコア＝０、図示せず）。
【０１７７】
肉眼病変の観察から予想されるように、ＳｈＫ−１８６の局所投与は、図４Ｃに示したように、病理組織も減少させる。この分析では、１０％ホルマリン中に固定済みの眼の切片を、虹彩及び毛様体構造と、虹彩及び／又は毛様体及び前房の間質への炎症細胞の浸潤の度合いとを、Kim et al., supra (1997)に記載の疾患パラメータにしたがって採点しており、これは独立した獣医病理学者により行われた。図４Ｃの（１．）は、対照の健康な眼（１０×）を示しており、（２．）及び（４．）において、溶媒により処置した動物由来の眼では、病理組織スコアが２となり（１０×、４０×）、（３．）及び（５．）において、０．１％ＳｈＫ−１８６により８日間、その後１％ＳｈＫ−１８６により１０日間、１日３回治療した動物由来の眼では、病理組織スコアが０となった（１０×、４０×）。図４Ｃの（６．）は、溶媒処置群（Ｐ６Ｎ）又は上述したＳｈＫ−１８６治療群（１％ＳｈＫ−１８６）由来の４個の眼の病理組織学的分析に基づく複合臨床スコアを示している。
【０１７８】
図４Ｄは、ＳｈＫ−１９８の局所投与が、ＥＡＡＵのラットモデルにおける臨床スコアを低下させることを示す。アジュバントＭＡＡエマルションを用いた免疫化によるＥＡＡＵの誘導後１３日目に、スリットランプを用いて各動物の臨床的観察を行った。アジュバントＭＡＡエマルションを用いた免疫化によるＥＡＡＵの誘導後１３日目に、スリットランプを用いて各動物の臨床的観察を行った。眼には、前房内での細胞の有無（上図）、及び前房内でのタンパク質又はフレアの有無（下図）に基づいて、個別のスコアを与えた。ラットには、１日３回、Ｐ６Ｎ溶媒又は１％ＳｈＫ−１９８による眼に対する局所的処置を施した。Ｎ＝１０ラット／２０眼。
【０１７９】
ＳｈＫ−１８６、ＳｈＫ−１９８、又は関連ペプチドのブドウ膜炎疾患に対する予防及び治療能力を評価するために用いる他のモデルには、網膜抗原により誘導するものが含まれる。これらの実験的自己免疫性ブドウ膜炎又は網膜ブドウ膜炎モデル（ＥＡＵ）も、エフェクタメモリＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞、一般にはＴｈ１（ＩＦＮ−γ生成）、Ｔｈ１７（ＩＬ−１７生成）、又はＴｈ１／Ｔｈ１７（ＩＦＮ−γ／ＩＬ−１７）併産細胞が発病において主要な役割を果たすと考えられる、臓器特異的なＴ細胞媒介障害である。これらのモデルでは、ウシ、齧歯類、又はヒトの光受容体タンパク質由来の網膜可溶性抗原（Ｓ−Ａｇ、アレスチンとしても知られる）又は光受容体間レチノイド結合タンパク質由来の抗原で、このタンパク質からのＲ１４及びＲ１６ペプチドを含み、ビタミンＡ誘導体の輸送に関与する光受容体間マトリクスに見られるものを、ＣＦＡ中で乳化する。エマルションは、マウス（Ｂ１０．ＲＩＩＩ、Ｃ５７．ＢＬ／６）、ラット（Ｌｅｗｉｓ、Ｆ３４４、ＣＡＲ、ＢＮ、ＰＶＧ）、又はモルモットの感受性株を免疫化するために、同時投与される精製百日咳毒素を加えて又は加えずに用いる。使用可能な抗原の他の供給源には、ロドプシン、レコベリン、及びホスデューシンが含まれる（Agarwal et al., (2012); Andras Perl (ed.), Autoimmunity: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 900. Springer Science+Business Media New Yorkにおいてレビューされている）。
【０１８０】
実施例５．ドライアイ疾患モデルにおけるＳｈＫ−１８６及びＳｈＫ類似体の治療的効果の評価。本開示のＳｈＫ−１８６及び他のペプチドの予防的及び治療的効果の評価は、乾性角結膜炎（ＫＣＳ）の分析により実施することができる。ＫＣＳは、眼窩涙腺及び瞬膜腺の除去後の動物において両側で誘導することができる（Moore et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 42(3), 653-659 (2001)）。涙腺の除去により、ラット、ウサギ、及びイヌを含む動物に疾患が導入され、手術後約２乃至３週間後にシルマ涙液試験（ＳＴＴ）値の有意な低下により判定される。細胞内のムチンの貯蔵も定量化され、疾患を有する宇動物からの結膜試料では低下している。ＫＣＳの導入後、ＳｈＫ−１８６、ＳｈＫ−１９８、又は表１及び２にそれぞれ列挙した毒素系又はＳｈＫ系ペプチドの何れかを、Ｐ６Ｎ又は他の溶媒中で０．０５乃至５％の濃度で、１日１回、２回、３回、又は更に多く適用することができる。腹側円蓋結膜の切開生検標本を、腺除去前（基準値）及び導入後２、４、及び６週目に採取することができる。各採取時間に、眼を撮影し、その後、結膜炎の度合い及び眼漏の特徴について、色の評価を行った。
【０１８１】
ＳｈＫ−１８６及び本開示の他のペプチドの予防的及び治療的効果の評価は、シェーグレン症候群の実験的自己免疫性ドライアイ疾患モデルにおいて行うことができる。こうしたモデルの１つは、Jiang et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 50, 2245-2254 (2009)の中に記載されている。このモデルでは、Ｌｅｗｉｓラットの皮下免疫を、５００μｇの涙腺及び唾液腺抽出物又は２００μｇの組み換えマウスＫｌｋ１ｂ２２及び５００μｇの結核菌Ｈ３７Ｒａ（Ｄｉｆｃｏ、ミシガン州デトロイト）を不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）中に含有する０．２ｍＬのエマルションにより、尾の付け根及び脇腹の４箇所に分散させて行う。２００、５００、７５０、又は１０００ナノグラムの百日咳毒素を１回、抗原エマルションとして同じ日に腹腔内注射する。
【０１８２】
ＳｈＫ−１８６の効能を評価するために用いる他のモデルは、抗原特異的Ｔ細胞養子移入モデルである。このモデルでは、精製Ｔ細胞を、免疫済みのラットの排出リンパ節又は脾臓から調製する。次に、これらの細胞を、涙腺抽出物（又は抽出物から精製したフラクションＶＩＩ、又はＫｌｋ１ｂ２２）に混合し、共に培養する。２、３、４、５、又は７日後、Ｔ細胞を、未処理のＬｅｗｉｓレシピエントに、０．５ｍＬのＰＢＳにより腹腔内注射する（５百万個／ラット）。
【０１８３】
実験的ドライアイ疾患の他のモデルには、保存料の塩化ベンザルコニウムの局所投与が含まれる（Xiong et al., Invest Ophthalmol Vis Sci, 49, 1850-1856 (2008)）。
【０１８４】
上述したモデルにおいて、ＳｈＫ−１８６等の毒素系治療ペプチド又は溶媒による処置は、ペプチドの予防的又は治療的効果を評価するために、免疫化又はＴ細胞移入前後の異なる時点で開始することができる。
【０１８５】
本開示の実施では、特に明示しない限り、当業者の技能範囲内である化学、分子生物学、微生物学、組換ＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養、及びトランスジェニック生物学の従来の手法を利用する。例えば、以下を参照されたい：Maniatis et al., Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1982)、Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)、Sambrook and Russell, Molecular Cloning, 3rd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001)、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, updated through 2005)、Glover, DNA Cloning (IRL Press, Oxford, 1985)、Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992)、Guthrie and Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press, New York, 1991)、Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1998)、Jakoby and Pastan, 1979、Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)、Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)、Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987)、Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986)、B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)、the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory)、Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987)、Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986)、Riott, Essential Immunology, 6th Edition, (Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988)、Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)、Westerfield, M., The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), 4th Ed., (Univ. of Oregon Press, Eugene, Oregon, 2000)。
【０１８６】
当業者に理解されるように、本明細書に開示した各実施形態は、上述した特定の要素、ステップ、材料、又は成分を含むか、本質的にそれらから成るか、或いはそれらから成る。したがって、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」又は「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「含む、成る、又は本質的に成る」を示すものと解釈されるべきである。本明細書において、移行語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、不特定の要素、ステップ、材料、又は成分の包含を、その量が大きい場合でも、意味し、限定では無く含み、許容する。移行句「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、不特定の要素、ステップ、材料、又は成分を全て除外する。移行句「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、実施形態の範囲を、特定された要素、ステップ、材料、又は成分と、実施形態に実質的に影響を与えないものとに限定する。本明細書において、実質的な影響は、本明細書に開示した毒素系治療用ペプチドが炎症性の眼科的状態を治療する能力において、統計的に有意な減少を引き起こす場合がある。
【０１８７】
特に明示しない限り、明細書及び特許請求の範囲おいて用いられた全ての数は、あらゆる場合において、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語により修飾されているものと理解するべきである。したがって、反対の明示が無い限り、本明細書及び添付特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、本発明により得ることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。最低限でも、特許請求の範囲に対する均等論の適用を限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、少なくとも、報告された有効数字の桁数を考慮し、通常の端数処理手法を適用して解釈するべきである。更に明確性が求められる場合、「約」という用語は、記載の数値又は範囲と共に用いられる際に当業者が妥当とみなす意味を有し、即ち、記載した値又は範囲より幾分上又は幾分下を、記載値の±２０％、記載値の±１９％、記載値の±１８％、記載値の±１７％、記載値の±１６％、記載値の±１５％、記載値の±１４％、記載値の±１３％、記載値の±１２％、記載値の±１１％、記載値の±１０％、記載値の±９％、記載値の±８％、記載値の±７％、記載値の±６％、記載値の±５％、記載値の±４％、記載値の±３％、記載値の±２％、又は記載値の±１％の範囲内で示す。
【０１８８】
本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータが近似値であるにもかかわらず、特定の例に記載した数値は、可能な限り正確に報告されている。しかしながら、全ての数値は、それぞれの試験計測において見られる標準誤差により必然的に生じる特定の誤差を本質的に含む。
【０１８９】
「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」という用語と、本発明を説明する文脈（特に以下の特許請求の範囲の文脈）で用いられる同様の指示対象とは、本明細書に特に明示されない限り、又は文脈との明確な矛盾が無い限り、単数及び複数の両方を含むと解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、範囲に含まれる個々の各値を個別に示す簡潔な方法の役割を果たすものに過ぎない。特に明示されない限り、個別の各値は、本明細書において個別に記載されたものとして、明細書に組み込まれる。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書に特に明示されない限り、又は文脈との明確な矛盾が無い限り、任意の適切な順序で実行することができる。全ての例又は例示的な語句（例えば、「等（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の本明細書での使用は、単に、本発明をより明確にするためのものであり、他の形で請求された本発明の範囲を限定しない。本明細書内の如何なる語句も、本発明の実施に不可欠な非請求要素を示唆するものとして解釈されるべきではない。
【０１９０】
本明細書に開示される本発明の代替要素又は実施形態のグループ化は、限定として解釈するべきではない。グループの各要素は、個別に、又はグループの他の要素又は本明細書に記載の他の要素との任意の組み合わせにおいて、参照及び請求され得る。グループの１つ以上の要素は、便宜上及び／又は特許性上、グループに含まれ得る、又はグループから削除され得ることが想定される。こうした任意の包含又は削除が生じた場合、本明細書は修正された群を含み、したがって、添付の特許請求の範囲において使用される全てのマーカッシュ群の記載を満たすと見做される。
【０１９１】
本発明の特定の実施形態は、発明者らに知られている本発明を実施するための最良の形態を含んで、本明細書に記載されている。当然ながら、これらの記載された実施形態の変形例は、上記の説明を読むことで、当業者には明らかとなろう。本発明者は、こうした変形例を当業者が適宜利用することを予期しており、本発明者らは、本明細書に具体的に記載された以外の形で本発明が実施されるものと考えている。したがって、本発明は、準拠法で認められているように、本明細書に添付の特許請求の範囲に列挙した内容のあらゆる変形例及び等価物を含む。更に、可能な全ての変形例における上述した要素の任意の組み合わせは、本明細書に特に明示されない限り、又は文脈との明確な矛盾が無い限り、本発明に包含される。
【０１９２】
更に、多数の刊行物、特許、及び特許出願（集合的に「参考文献」）が本明細書全体で参照されている。引用した参考文献のそれぞれは、その特定の引用内容の出典を明記することにより個別に本願明細書の一部とする。
【０１９３】
最後に、本明細書に開示された本発明の実施形態は、本発明の原理を例示するものであることを理解されたい。採用し得る他の変形例は、本発明の範囲に含まれる。したがって限定ではなく一例として、本発明の代替構成を、本明細書の内容に従って利用し得る。そのため、本発明の実施形態は、図示及び記載された通りのものに限定されない。
【０１９４】
本明細書に示した詳細は、一例であり、本発明の好適な実施形態の例示的考察の目的のみを有しており、本発明の様々な実施形態の原理及び概念的態様の最も有用且つ容易に理解される説明と考えられるものを提供するために提示されている。この点において、本発明の基本的理解、図面に伴う説明、及び／又は本発明の幾つかの形態をどのようにして実現し得るかを当業者に対して明らかにする例として必要なもの以上に、本発明の構造的詳細を示す試みは為されていない。
【０１９５】
本開示に用いられた定義及び説明は、実施例において明瞭且つ明確に変形されていない限り、或いは意味を適用することで解釈が無意味又は本質的に無意味になる場合を除き、将来における任意の解釈を制御するものとなることが意図されている。用語の解釈により無意味又は本質的に無意味になる場合、定義は、Webster's Dictionary, 3rd Edition又は当業者に知られている辞書、例えばthe Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology (Ed. Anthony Smith, Oxford University Press, Oxford, 2004)から得るべきである。
【図１】
2016527250.tif 000009
【図２】
2016527250.tif 000010
【図３−１】
2016527250.tif 000011
【図３−２】
2016527250.tif 000012
【図４−１】
2016527250.tif 000013
【図４−２】
2016527250.tif 000014
【図４−３】
2016527250.tif 000015
【配列表】
2016527250000001.app
【国際調査報告】
2016527250.tif 000016
2016527250.tif 000017
2016527250.tif 000018
2016527250.tif 000019
2016527250.tif 000020