(57)【要約】  本発明は、ＣＳＦ−１融合タンパク質を含む組成物および損傷肝の再生の向上または機能の回復においてそれを使用する方法を提供する。組成物は、肝障害の治療において、例えば、肝疾患の予防および／または治療において、および肝手術後のアウトカムを改善するために有用である。
2016510977.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝再生の向上および／または肝機能の回復および／または肝恒常性の調節において使用されるＣＳＦ−１タンパク質またはその相同体もしくは変異体もしくは誘導体の生物学的活性断片。
【請求項２】
請求項１に記載のＣＳＦ−１タンパク質またはその相同体もしくは変異体もしくは誘導体の生物学的活性断片をコードする核酸。
【請求項３】
（ｉ）ＣＳＦ−１またはその相同体もしくは変異体もしくは誘導体の生物学的活性断片；および
（ｉｉ）生物学的活性抗体断片
を含む融合タンパク質。
【請求項４】
ＣＳＦ−１タンパク質の前記生物学的活性断片が、ヒトＣＳＦ−１の残基３３〜１８２もしくはその生物学的活性部分、または任意の哺乳動物種からのＣＳＦ−１の生物学的に等価な断片である、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
ＣＳＦ−１タンパク質またはその相同体もしくは変異体もしくは誘導体の前記生物学的活性断片が、天然物／天然存在であり、または組換え体のいずれかである、請求項３または４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記抗体が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含む群から選択される免疫グロブリンである、請求項３〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記免疫グロブリンが、ＩｇＧである、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記抗体断片が、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＦｃおよびｒＩｇＧを含む群から選択される、請求項３〜７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記断片が、ＦＣ断片である、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記融合タンパク質のＣＳＦ−１またはその相同体もしくは変異体もしくは誘導体の前記生物学的活性断片および前記生物学的活性抗体断片が、直接またはリンカー部分を介して共有結合している、請求項３〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項３〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする単離核酸。
【請求項１２】
請求項１１に記載の単離核酸を含むベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
本発明の第１の態様の融合タンパク質を作製する方法であって、
（ｉ）請求項１３に記載の宿主細胞を培養すること；および
（ｉｉ）前記培養物から融合タンパク質を回収すること
を含む方法。
【請求項１５】
（ａ）（ｉ）ＣＳＦ−１またはその相同体もしくは変異体もしくは誘導体の生物学的活性断片；および（ｉｉ）生物学的活性抗体断片を含む少なくとも１つの融合タンパク質；ならびに
（ｂ）薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤
を含む組成物。
【請求項１６】
請求項４〜１０に記載の特徴部のいずれか１つ以上をさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１１に記載の核酸または請求項１２に記載のベクターのいずれか、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤を含む組成物。
【請求項１８】
肝再生を向上させ、および／または肝機能を回復させ、および／または肝恒常性を調節するための、
（ｉ）ＣＳＦ−１またはその相同体もしくは変異体もしくは誘導体の生物学的活性断片；および
（ｉｉ）生物学的活性抗体断片
を含む融合タンパク質の使用。
【請求項１９】
肝再生を向上させ、および／または肝機能を回復させ、および／または肝恒常性を調節するための医薬品の製造のための、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項１１に記載の核酸または請求項１２に記載のベクターの使用。
【請求項２０】
肝癌を罹患し、手術を受ける予定の個体を治療する方法であって、術前、術中または術後に請求項３〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項１１に記載の核酸または請求項１２に記載のベクターを投与することを含む方法。
【請求項２１】
本発明のいっそうさらなる態様によれば、肝移植術を受ける予定の個体を治療する方法であって、術前、術中または術後に請求項３〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項１１に記載の核酸または請求項１２に記載のベクターを投与することを含む方法が提供される。
【請求項２２】
有効量の本発明の融合タンパク質または核酸またはベクターを含む医薬投与量単位を有する１つ以上の容器を含むキットであって、前記容器が、任意選択のその使用説明書とともに包装されているキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組成物および損傷肝の再生の向上または機能の回復においてそれを使用する方法に関する。組成物は、肝障害の治療において、例えば、急性もしくは慢性肝疾患の予防および／もしくは治療において、または肝切除もしくは肝移植後のアウトカムを改善するための支持療法として有用である。
【背景技術】
【０００２】
肝疾患は、世界中で疾病および死亡の主な原因であるが、これにもかかわらず、疾患または損傷肝の再生を向上させるための有効な治療法は現在のところ存在しない。肝臓の再生を向上させるための治療法は、一連の医学および手術状況にわたり、適応症、例として、急性、急性増悪または慢性肝不全に適用することができる。医療現場において、急性肝不全は、一連の病因から生じ得るが、ほとんどは一般に感染（ウイルス性肝炎）、アルコール摂取、または毒物過剰摂取（Ｐａｒａｃｅｔａｍｏｌ（登録商標）過剰摂取）に起因する。急性肝不全において、急死をもたらし得る肝組織の広範な壊死が起こり得る。急性肝不全は、既存の肝疾患（ウイルス性肝炎、アルコール、非アルコール性脂肪肝疾患および他の原因に起因）が肝臓の再生能をさらに害する慢性肺疾患（急性増悪）のバックグラウンドに基づき生じ得る。慢性肝不全は、肝臓が恒常性を維持し得なくなる時点までの肝機能の緩やかな悪化（上記の原因）から生じ得る。致死的な肝不全において、唯一の任意選択は肝移植であるが、潜在的なドナーおよびレシピエント間の不足により、多くの患者が肝移植を待ち望みながら死亡することになる。
【０００３】
肝再生は、多くの成長因子、サイトカインおよび細胞タイプが関与する複雑なプロセスである。肝マクロファージは、一連の生体恒常性の役割を遂行し、有効な肝再生に重要である。コロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）とも称され、それと互換的に使用されるマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）は、肝臓中で発現され、単球／マクロファージ系統の細胞、例として、肝マクロファージの産生および維持を担う基本因子である。マクロファージの枯渇およびＣＳＦ１の欠損は、部分肝切除後に肝再生の損害をもたらす。部分肝切除後のＭ−ＣＳＦヌルマウスモデルにおける先行技術から、クッパー細胞により誘導されるＭ−ＣＳＦが肝再生において重要な役割を果たすことが公知である（Ａｍｅｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．１６５，５９−６７，２０１１）。しかしながら、肝再生を向上させるためのＣＳＦ１補給の潜在性は、これまで考慮されてこなかった。
【０００４】
肝臓の再生を向上させ、および／またはその機能を回復させるための治療法は、一連の医学および手術状況にわたり、適応症、例として、急性、急性増悪または慢性肝不全に適用することができ、患者、臨床医および医療従事者などに直接の利益を提供する。
【０００５】
肝臓の再生を向上させるための治療法は、移植後の再生を容易にするための救急療法として、もしくは重篤な不全の状況において適用し、または慢性肝疾患の悪化を予防するために使用することができ、患者、臨床医および医療従事者などに直接の利益を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の態様によれば、肝再生の向上および／または肝機能の回復および／または肝恒常性の調節において使用されるＣＳＦ１タンパク質またはその相同体もしくは変異体もしくは誘導体の生物学的活性断片が提供される。
【０００７】
ＣＳＦ１タンパク質またはその相同体もしくは変異体もしくは誘導体の生物学的活性断片をコードする核酸も含まれる。
【０００８】
驚くべきことに、本発明者らは、正常ＣＳＦ−１レベルを有する対象への追加または余分または補給ＣＳＦ−１の投与が、健常動物において肝臓のサイズを増加させ、種々の原因からの機能損失後に肝臓を修復する能力を改善することを見出した。個体において既に機能しているＣＳＦ−１へのＣＳＦ−１の補給が肝再生または機能を改善することは、予期されない知見であった。肝臓は、極めて厳密な恒常性のもとにあり、これまで、臨床現場において肝恒常性を良好に調節し、肝臓のサイズを総体重に対する標準値を超えて増加させ得る薬剤は同定されていない。しかしながら、本発明は、哺乳動物種における適切な肝栄養剤および恒常性維持剤としてのＣＳＦ−１の使用のための証拠を提供する。さらに、本発明は、ＣＳＦ−１が肝臓の食作用能を回復させ得る観察に基づき、したがって、この肝機能面の回復のためのＣＳＦ−１タンパク質の使用は、本発明において特に興味深いものである。
【０００９】
本発明のさらなる態様によれば、
（ｉ）ＣＳＦ−１またはその相同体もしくは変異体もしくは誘導体の生物学的活性断片；および
（ｉｉ）生物学的活性抗体断片
を含む融合タンパク質が提供される。
【００１０】
好ましくは、ヒト治療法の目的のため、ＣＳＦ−１の生物学的活性断片は、ヒトＣＳＦ−１の残基３３〜１８２（配列番号５）もしくはその生物学的活性部分、または任意の哺乳動物種からのＣＳＦ−１の生物学的に等価な断片である。
【００１１】
ＣＳＦ−１の生物学的活性断片は、天然物であり得、またはそれは組換え体であり得る。
【００１２】
好ましくは、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含む群から選択される免疫グロブリンであり、より好ましくは、抗体は、ＩｇＧである。
【００１３】
好ましくは、抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＦｃおよびｒＩｇＧを含む群から選択され、より好ましくは、抗体断片は、ＦＣ断片である。
【００１４】
好ましくは、融合タンパク質のＣＳＦ−１またはその相同体もしくは変異体もしくは誘導体の生物学的活性断片および生物学的活性抗体断片は、直接またはリンカー部分を介して共有結合している。
【００１５】
本発明のさらなる態様によれば、融合タンパク質をコードする核酸が提供される。
【００１６】
本発明のいっそうさらなる態様によれば、本発明の単離核酸を含むベクターが提供される。
【００１７】
本発明のいっそうさらなる態様によれば、本発明のベクターを含む宿主細胞が提供される。
【００１８】
本発明のいっそうさらなる態様によれば、本発明の第１の態様の融合タンパク質を作製する方法であって、
（ｉ）本発明の宿主細胞を培養すること；および
（ｉｉ）前記培養物から融合タンパク質を回収すること
を含む方法が提供される。
【００１９】
本発明のいっそうさらなる態様によれば、
（ａ）（ｉ）ＣＳＦ−１またはその相同体もしくは変異体もしくは誘導体の生物学的活性断片；および（ｉｉ）生物学的活性抗体断片を含む少なくとも１つの融合タンパク質；ならびに
（ｂ）薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤
を含む組成物が提供される。
【００２０】
代替的な実施形態において、組成物は、本発明の核酸またはベクターを含み得る。
【００２１】
本発明のさらなる態様によれば、肝再生を向上させ、および／または肝機能を回復させ、および／または肝恒常性を調節するための、
（ｉ）ＣＳＦ−１またはその相同体もしくは変異体もしくは誘導体の生物学的活性断片；および
（ｉｉ）生物学的活性抗体断片
を含む融合タンパク質の使用が提供される。
【００２２】
手術現場において、肝癌を含有する肝臓の領域の外科的切除が治癒管理の中心である。これは、特に患者が慢性肝疾患のバックグラウンドを有する場合、術後肝不全のリスクを負い得る。肝移植に関して、移植臓器がレシピエントの要求に十分に合致しない場合に肝不全が起こり得る。再生を向上させるための治療法による治療は、術前、術中または術後に適用することができる。
【００２３】
本発明のさらなる態様によれば、肝再生を向上させ、および／または肝機能を回復させ、および／または肝恒常性を調節するための医薬品の製造のための、本発明の融合タンパク質または核酸またはベクターの使用が提供される。
【００２４】
本発明のいっそうさらなる態様によれば、肝癌を罹患し、手術を受ける予定の個体を治療する方法であって、術前、術中または術後に本発明の融合タンパク質または核酸またはベクターを投与することを含む方法が提供される。
【００２５】
本発明のいっそうさらなる態様によれば、肝移植術を受ける個体を治療する方法であって、術前、術中または術後に本発明の融合タンパク質または核酸またはベクターを投与することを含む方法が提供される。
【００２６】
本発明のいっそうさらなる態様によれば、有効量の本発明の融合タンパク質または核酸またはベクターを含む医薬投与量単位を有する１つ以上の容器を含むキットであって、容器が、任意選択のその使用説明書とともに包装されているキットが提供される。
【００２７】
本発明の種々の態様は、ヒトおよび他の哺乳動物腫において損傷肝の再生を向上させ、機能を回復させる組成物および方法を提供する。
【００２８】
本発明の任意の態様に属する特性は、変更すべき箇所は変更して本発明の全ての他の態様に適用可能である。
【００２９】
本発明の実施形態を、非限定的な例として、付属の図面を参照して以下にさらに記載する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
［図１］３つの損傷モデルにおける生存率のカプラン・マイヤーを示し、チャートは、介入および処置後の重量変化の割合を示す。＊＊＊ｐ＜０．００１  マン・ホイットニーＵ検定［実線＝ｆｃ−ＣＳＦ１による処置；破線＝ＰＢＳ対照］
［図２］割合として表現される肝重量／体重比および高倍率の１視野当たりのＫｉ６７陽性肝細胞として表現される肝細胞増殖を示す棒チャートである。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１  マン・ホイットニーＵ検定［処置＝ｆｃ−ＣＳＦ１；対照＝ＰＢＳ］
［図３］体重に対する、上記のとおり投与されたＣＳＦ−１の効果を示す。図３Ａは、ＣＳＦ−１（１ｍｇ／ｋｇ）とＦｃ−ＣＳＦ−１（１ｍｇ／ｋｇ）とを比較する。非改変タンパク質は、この用量において効果を有さず、Ｆｃ−ＣＳＦ−１は総体重を明らかに増加させた。図３Ｂは、０．１ｍｇ／ｋｇのＦｃ−ＣＳＦ−１における検出可能な活性を実証する用量応答曲線を示す。図３Ｃは、１ｍｇ／ｋｇ用量の効果がより大きい実験系列で確認されることを示す。この系列における動物を後続のスライドにおいてさらに分析する。
［図４］図４Ａは、マウス脾重量に対するＣＳＦ−１（１ｍｇ／ｋｇ）およびＦｃ−ＣＳＦ−１（１ｍｇ／ｋｇ）の効果を示し、図４Ｂは、マウス肝重量に対するＣＳＦ−１（１ｍｇ／ｋｇ）およびＦｃ−ＣＳＦ−１（１ｍｇ／ｋｇ）の効果を示す。
［図５］ｃｓｆ１ｒ−ＥＧＦＰレポーターにより検出される脾臓中のマクロファージの数に対するＦｃ−ＣＳＦ−１の効果を示し、図５Ａは対照であり、図５Ｂは処置試料を示す。
［図６］図６Ａは、図５Ａおよび５Ｂについての用量応答曲線を示し、図６Ａは、マクロファージ特異的Ｆ４／８０抗原の免疫組織化学局在化に基づく用量応答曲線を示す。
［図７］マウスにおけるマクロファージ特異的Ｆ４／８０抗原についての免疫染色を示す。図７Ａは、ＰＢＳ処置対照肝臓を示し；図７Ｂは、Ｆｃ−ＣＳＦ−１により処置されたマウスの肝臓を示し、図７Ｃは、ＰＢＳ処置対照脾臓を示し、図７Ｄは、Ｆｃ−ＣＳＦ−１により処置されたマウスの脾臓を示す。
［図８］図８Ａは、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）について免疫染色したＰＢＳ処置対照マウス肝を示し、図８Ｂは、Ｆｃ−ＣＳＦ−１による処置後のマウス肝を示す。
［図９］離乳期ブタに投与されたＣＳＦ−１の薬物動態の影響を示す。図９Ａは、非改変ＣＳＦ−１のクリアランスを示し、図９Ｂおよび９Ｃは、それぞれ静脈内および皮下投与された場合の１．２ｍｇ／ｋｇのＦｃ−ＣＳＦ−１のクリアランスを示す。
［図１０］０．５ｍｇ／Ｋｇを６回投与された離乳期ブタにおける血液効果を示し；図１０Ａは総白血球数を示し、図１０Ｂは単球数を示し、図１０Ｃはリンパ球数を示し、図１０Ｄは好中球（ｎｅｕｔｏｐｈｉｌ）数を示す。
［図１１］０．５ｍｇ／Ｋｇを６回投与された離乳期ブタにおける血液効果の用量応答曲線；図１１Ａは総白血球数を示し、図１１Ｂは単球数を示し、図１１Ｃはリンパ球数を示し、図１１Ｄは好中球数を示す。
［図１２］０．１２ｍｇ／Ｋｇを３回投与された離乳期ブタにおける臓器重量に対する効果を示す。図１２Ａは肝重量に対する効果を示し、図１２Ｂは脾重量に対する効果を示し、図１１Ｃは肺重量に対する効果を示し、図１１Ｄは腎重量に対する効果を示す。
［図１３］図１３Ａは、パラセタモール誘導肝不全を有する生存または死亡した／肝移植を受けた患者における入院時の患者における血清ＣＳＦ１レベルを示す。図１３Ｂは、続いて死亡または生存した患者の下位群の血清レベルを示す。図１３Ｃは、パラセタモール過剰摂取後の移植なしの生存についてのバイオマーカーとして機能する入院時ＣＳＦ１の潜在性を評価する受信者動作特性曲線分析を示す。
［図１４］図１４Ａは、パラセタモール中毒後の肝ＣＳＦ１遺伝子発現および血清ＣＳＦ１レベルを示す。図１４Ｂは、パラセタモール中毒後３日目における肝臓体重比およびＫｉ６７免疫組織化学検査により評価された肝細胞増殖を示す。図１４Ｃは、対照およびＣＳＦ１受容体阻害を比較するパラセタモール中毒後３日目における血清分析を示す。
［図１５］図１５Ａは、ＣＳＦ１−Ｆｃ（実線）または対照（点線）投与を比較するパラセタモール中毒後のマウスにおける平均肝重量体重比および肝細胞増殖（ｋｉ６７免疫組織化学検査）を示す。図１５Ｂは、パラセタモール中毒後の血清パラメータを示す（ｎ＝８／群）。
［図１６］図１６Ａは、２／３部分肝切除後の肝ＣＳＦ１遺伝子発現および血清ＣＳＦ１レベルを示す。図１６Ｂは、２／３部分肝切除後２日目における肝臓と体重との比およびＫｉ６７免疫組織化学検査により評価された肝細胞増殖を、ＣＳＦ１受容体阻害（ＧＷ２５８０）または対照とともに示す。図１６Ｃは、対照およびＧＷ２５８０によるＣＳＦ１受容体阻害を比較するパラセタモール中毒後２日目における血清分析を示す（１群当たりｎ＝８）。
［図１７］図１７Ａは、ＣＳＦ１−Ｆｃ（実線）または対照（点線）投与を比較する２／３部分肝切除後のマウスにおける平均肝重量体重比および肝細胞増殖（ｋｉ６７免疫組織化学検査）を示す。図１７Ｂは、パラセタモール中毒後の血清パラメータを示す（ｎ＝８／群）。図１７Ｃは、再生促進サイトカインＩｌ６およびオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）ならびにさらには成長因子アクチベーターのウロキナーゼ受容体（ＵＲ）の相対遺伝子発現を、対照に対するＣＳＦ１受容体の遮断（ＧＷ２５８０）およびＣＳＦ１−Ｆｃの投与とともに示す。
［図１８］図１８Ａは、慢性的に損傷した肝臓における部分肝切除後のＣＳＦ１−Ｆｃ処置による術後の生存傾向（ｐ＝０．０７）および体重増加を示すカプラン・マイヤープロットを示す（実線＝ＣＳＦ１−Ｆｃ、点線＝対照；４日目および７日目におけるｎ＝８／群）。図１８Ｂは、平均肝重量体重比、肝細胞増殖（ｋｉ６７免疫組織化学検査）およびシリウスレッド定量を介する線維症の定量を示す。図１８Ｃは、血清パラメータを示す。
［図１９］Ａ）対照群（ＭＡＲＣＯ：コラーゲン構造を有するマクロファージ受容体；ＭＳＲ１：マクロファージスカベンジャー受容体１）の平均に対する遺伝子発現（白色＝対照；陰影＝ＣＳＦ１−Ｆｃ）；Ｂ）血管内注射から１〜１５分後に蛍光ビーズ上でゲート化されたフロープロットオーバーレイを示すビーズクリアランスアッセイ（点線＝対照；実線＝ＣＳＦ１−Ｆｃ；灰色線＝未損傷未処置マウス）；Ｃ）蛍光ビーズの血管内注射から１５分後のエクスビボ蛍光臓器（１群当たりｎ＝６）を示す。
［図２０］Ａ）（ＭＡＲＣＯ：コラーゲン構造を有するマクロファージ受容体；ＭＳＲ１：マクロファージスカベンジャー受容体１）の平均に対する遺伝子発現［白色＝対照；陰影＝ＣＳＦ１−Ｆｃ］；Ｂ）ビーズクリアランスアッセイ；Ｃ）蛍光ビーズの血管内注射から１５分後のエクスビボ蛍光臓器を示す。
［図２１］Ａ）術前ならびに術後１日目および術後３日目における、部分肝切除を受けた５５人の患者の血清ＣＳＦ１レベルを示す。Ｂ）肝切除の程度に従って分類されたコホート。３つ未満の区域を切除された患者と比較した５つを超える区域を切除された患者におけるＣＳＦ１レベルの有意な増加を示す事後分析を伴う二元ＡＮＯＶＡ。Ｃ）コホートの残りと比較して点線で示される術後肝不全を発症した患者（中央値および範囲）。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
用語「Ｍ−ＣＳＦ」、「マクロファージコロニー刺激因子」、「ＣＳＦ−１」、「ＣＳＦ１」、「コロニー刺激因子１」および「コロニー刺激因子−１」は、本明細書において互換的に使用される。
【００３２】
用語「補給」、「補給する」または「補給すること」は、機能ＣＳＦ−１の個体が既に有するレベルを超える追加または余分量でＣＳＦ−１を個体に投与するものとする。
【００３３】
用語「治療する」、「治療すること」または「の治療」は、治療の不存在化で生じるものと比較して障害の重症度もしくは障害の症状を軽減し、または障害を部分的もしくは完全に撲滅するものとする。治療は、障害の完治の達成を要求しない。
【００３４】
用語「回復させる」、「回復させること」または「の回復」は、治療の不存在化で生じるものと比較して障害の重症度もしくは障害の症状を軽減させ、または障害を部分的もしくは完全に撲滅するものとする。治療は、障害の完治の達成を要求しない。
【００３５】
「治療有効」または「有効」量は、臨床試験および評価、患者観察などを介して認められる疾患または障害の症状の緩和を引き起こす用量を示すものとする。「有効量」または「有効」は、生物学的または化学的活性の検出可能な変化を引き起こす用量をさらに示し得る。検出可能な変化は、その関連機序またはプロセスについての当業者により検出することができ、および／またはさらに定量することができる。さらに、「有効量」または「有効」は、所望の生理学的状態を維持し、すなわち、目的病態の顕著な悪化を軽減または予防し、および／またはその改善を促進する量を示し得る。当分野において一般に理解されるとおり、投与量は、投与経路、症状および患者の体重に応じて変動するが、投与される化合物にも応じて変動する。
【００３６】
本発明において治療することができる病態としては、物理的外傷、医薬もしくは毒性化学物質の副作用、感染、自己免疫、虚血、アルコール誘導性肝障害の結果としての肝障害もしくは肝炎、または任意の他の原因の肝障害が挙げられる。肝損傷は、一般に、物理的外傷、例えば、交通事故、落下、暴行などにより引き起こされる。パラセタモール（アセトアミノフェン）過剰摂取は、医薬誘導性肝障害の比較的一般的な原因であるが、肝障害は、多くの他の医薬、例えば、メトトレキサート、スタチン、ナイアシン、アミオダロン、化学療法剤、および一部の抗生物質によっても引き起こされ得る。アルコール誘導性肝疾患は、肝障害の極めて広い原因である。肝障害を引き起こす感染としては、とりわけ、Ａ、ＢまたはＣ型肝炎ウイルス感染が挙げられる。ＣＳＦ１治療が肝障害の全ての症例において適切であるわけでないと考えられる一方、多くの症例においてそれは有益な効果を有し得る。
【００３７】
用語「Ｆｃ」は、細胞、例えば、マクロファージおよびマスト細胞の表面上の抗体受容体に、ならびに補体タンパク質に結合する抗体分子の領域を指すものとする。Ｆｃ（５０，０００ダルトン）断片は、１つ以上のジスルフィドおよび非共有結合相互作用により一緒に保持されるＣＨ２およびＣＨ３領域ならびにヒンジ領域の一部を含有する。ＦｃおよびＦｃ５μ断片は、それぞれＩｇＧまたはＩｇＭの断片化により産生される。用語Ｆｃは、結晶化するそれらの抗体断片の能力に由来する。Ｆｃ断片は、免疫グロブリンの重鎖定常領域から全体として生成される。Ｆｃ断片は、抗原に結合し得ないが、抗体のエフェクター機能、例えば、補体結合を担う。
【００３８】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して結合しているアミノ酸のポリマー（ジペプチド以上）を指す。したがって、用語「ポリペプチド」は、タンパク質、オリゴペプチド、タンパク質断片、タンパク質アナログなどを含む。用語「ポリペプチド」は、ポリペプチド」は、核酸によりコードされ、組換え産生され、適切な資源から単離され、または合成される上記定義のポリペプチドを企図する。
【００３９】
本明細書において使用される「機能」ポリペプチドは、そのポリペプチドに通常伴う少なくとも１つの生物学的活性を保持するものである。好ましくは、「機能」ポリペプチドは、非改変ペプチドにより所有される活性の全てを保持する。生物学的活性を「保持する」は、ポリペプチドが天然ポリペプチドの生物学的活性の少なくとも約５０％、６０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれより多くを保持することを意味する（天然ポリペプチドよりも高いレベルの活性さえ有し得る）。「非機能」ポリペプチドは、そのポリペプチドに通常伴う本質的に検出可能でない生物学的活性を示すものである（例えば、多くとも、わずかな量のみ、例えば、約１０％またはさらには５％未満）。
【００４０】
本明細書において使用される「融合タンパク質」は、２つ（以上）の異なるポリペプチド、またはその断片をコードする２つの異種ヌクレオチド配列またはその断片を、正確な翻訳リーディングフレーム中で一緒に融合される場合に産生されるタンパク質を指す。２つ以上の異なるポリペプチド、またはその断片としては、天然に一緒に融合して見出されないものが挙げられ、および／または天然存在の突然変異体が挙げられる。
【００４１】
本明細書において使用される「断片」は、そのタンパク質またはポリペプチドに通常伴う少なくとも１つの生物学的活性を実質的に保持するものである。特定の実施形態において、「断片」は、非改変タンパク質により所有される活性の全てを実質的に保持する。生物学的活性を「実質的に保持する」は、タンパク質が天然タンパク質の生物学的活性の少なくとも約５０％、６０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれより多くを保持することを意味する（天然ポリペプチドよりも高いレベルの活性さえ有し得る）。
【００４２】
「組換えポリペプチド」は、組換え核酸から産生されるものである。
【００４３】
「単離」ポリペプチドは、天然存在の生物もしくはウイルスの他の構成成分、例えば、細胞もしくはウイルス構造構成成分またはそのポリペプチドに一般に伴って見出される他のポリペプチドもしくは核酸の少なくとも一部から分離され、またはそれを実質的に含まないポリペプチドを意味する。本明細書において使用される「単離」ポリペプチドは、少なくとも約２５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い純度である（ｗ／ｗ）。
【００４４】
用語「誘導体」は、ＣＳＦ−１に由来（実質的に由来）し、またはそれから得られる（実質的に得られる）が、ＣＳＦ−１の生物学的機能の類似性または実質的な類似性を保持する任意の分子を指すと理解すべきである。ある態様において、生物学的機能は、肝臓の臓器発生を促進する能力である。誘導体は、例えば、生物学的活性断片を産生するためのＣＳＦ−１の開裂、環化、例えば、溶解度、安定性もしくは生物学的半減期を改善し、または後続の検出のための標識として作用する１つ以上の追加の部分とのバイオコンジュゲーションおよび／またはカップリングなどの結果として提供することができる。誘導体は、翻訳後もしくは合成後修飾、例えば、炭水化物部分の付着、または構造修飾、例えば、アミノ酸のアルキル化もしくはアセチル化もしくは化学結合の形成が関与する他の変化をもたらす化学反応からも生じ得る。本発明における使用に好適な誘導体の特に好ましい実施形態において、誘導体は、ＣＳＦ−１の成熟ドメインである。本明細書に開示の方法における使用に好適な誘導体の別の好ましい実施形態において、誘導体は、ＣＳＦ−１の生物学的活性Ｃ末端断片（例えば、５３６アミノ酸タンパク質のＣ末端アミノ酸１から１５０を含むＣＳＦ−１断片）である。ＣＳＦ−１の誘導体のさらなる実施形態としては、化学修飾側鎖（例えば、リジルε−アミノ基のペグ化）、Ｃおよび／もしくはＮ末端（例えば、無水酢酸によるＮ末端のアシル化）を含み、または種々の担体（例えば、ヒト血清アルブミンまたはヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグ）に結合しているＣＳＦ−１が挙げられる。
【００４５】
本明細書において一般に使用される「相同体」は、場合に応じて、限定可能なヌクレオチドまたはアミノ酸配列関係を別の核酸またはポリペプチドと共有する。「タンパク質相同体」は、好ましくは、本明細書に記載のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％または８０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも８５％、９０％、さらにより好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有する。ＣＳＦの相同体も本明細書に従って使用することができる。このようなＣＳＦ相同体は、好ましくは、高度または実質的な生物学的活性を有するＣＳＦタンパク質とほぼ同一またはそれより高い生物学的活性を特徴とする。
【００４６】
本明細書において使用される「変異体」タンパク質は、１つ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸により置き換えられたタンパク質である。天然または野生型ＣＳＦの生物学的活性を保持するＣＳＦのタンパク質変異体を、本明細書に従って使用することができる。一部のアミノ酸を、ポリペプチドの活性の性質を変化させずに広く類似の特性を有する他のものに変化させることができることが、当分野において十分に理解される（保存的置換）。一般に、ポリペプチド特性の最大変化を産生する可能性が高い置換は、（ａ）親水性残基（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）が疎水性残基（例えば、Ｌｅｕ、ｌｉｅ、ＰｈｅまたはＶａｌ）に代えて、もしくはそれにより置換されるもの；（ｂ）システインもしくはプロリンが任意の他の残基に代えて、もしくはそれにより置換されるもの；（ｃ）電気陽性側鎖を有する残基（例えば、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓ）が電気陰性残基（例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐ）に代えて、もしくはそれにより置換されるもの、または（ｄ）かさ高い側鎖を有する残基（例えば、ＰｈｅまたはＴｒｐ）がより小さい側鎖を有するもの（例えば、Ａｌａ、Ｓｅｒ）もしくは側鎖を有さないもの（例えば、Ｇｌｙ）に代えて、もしくはそれにより置換されるものである。
【００４７】
本発明の実施形態は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする単離核酸（例えば、「単離ＤＮＡ」または「単離ベクターゲノム」）をさらに提供する。核酸は、天然存在の生物もしくはウイルスの他の構成成分、例えば、細胞もしくはウイルス構造構成成分など、またはその核酸に一般に伴って見出される他のポリペプチドもしくは核酸の少なくとも一部から分離され、またはそれを実質的に含まない。本発明の活性薬剤を構成するポリペプチドのためのコード配列は、転写され、場合により翻訳される。本発明の実施形態によれば、コード配列の転写および翻訳は、記載の融合タンパク質の産生をもたらす。
【００４８】
遺伝子コードの縮重に起因して本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸の変動性が存在し得ることが当業者により認識される。核酸配列のさらなる変動は、非翻訳配列、例えば、イントロン配列ならびに５’および３’非翻訳配列の存在（または不存在）により導入され得る。さらに、本発明の単離核酸は、本明細書に具体的に開示されるポリペプチド配列と、または本発明の態様に含まれるタンパク質に対応する公知の配列（またはその断片）に対して少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％またはそれより高いアミノ酸配列類似性を有する融合タンパク質をコードする核酸を包含し、本明細書に定義の機能融合タンパク質をさらにコードする。
【００４９】
本発明の単離核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）およびそれらのキメラを含む。単離核酸は、改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログをさらに含み得る。
【００５０】
本発明のポリペプチドをコードする単離核酸は、適切な発現制御配列、例えば、転写／翻訳制御シグナルおよびポリアデニル化シグナルと会合していてよい。
【００５１】
種々のプロモーター／エンハンサーエレメントを、所望されるレベルおよび組織特異的発現に応じて使用することができることが認識される。プロモーターは、所望される発現のパターンに応じて構成性または誘導性（例えば、メタロチオネインプロモーターまたはホルモン誘導性プロモーター）であり得る。プロモーターは、天然または外来であり得、天然または合成配列であり得る。外来とは、転写開始領域が、転写開始領域が導入される野生型宿主中に見出されないものとする。プロモーターは、それが目的標的細胞中で機能するように選択される。
【００５２】
本発明は、本明細書に記載の融合タンパク質を作製する方法をさらに提供する。融合タンパク質を作製する方法は、当分野において十分理解される。このような方法は、融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターを含む宿主細胞を、発現に適切な条件下で増殖させ、続いて融合タンパク質を単離することを含む。したがって、本発明の融合タンパク質を構成するポリペプチドをコードする単離核酸は、例えば、クローニングまたは他の実験室操作、組換えタンパク質産生、または遺伝子送達の目的のためにベクター中に取り込むことができる。例示的なベクターとしては、細菌人工染色体、コスミド、酵母人工染色体、ファージ、プラスミド、脂質ベクターおよびウイルスベクターが挙げられる（以下のより詳細に記載）。
【００５３】
特定の実施形態において、単離核酸は、発現ベクターに取り込まれる。本発明のさらなる実施形態において、本明細書に記載の単離核酸を含むベクターは、宿主細胞中に含まれる。種々の宿主細胞と適合性の発現ベクターは当分野において周知であり、核酸の転写および翻訳に好適なエレメントを含有する。典型的には、発現ベクターは、５’から３’方向でプロモーター、プロモーターに作動可能と会合している本発明のポリペプチドまたはその活性断片をコードするコード配列、ならびに場合によりＲＮＡポリメラーゼのための停止シグナルおよびポリアデニラーゼのためのポリアデニル化シグナルを含む終結配列を含む「発現カセット」を含有する。
【００５４】
上記の調節制御配列に加え、組換え発現ベクターは、追加のヌクレオチド配列を含有し得る。例えば、組換え発現ベクターは、ベクターを取り込んでおり、および／または別の目的異種配列を含み得る宿主細胞を同定するための選択マーカー遺伝子をコードし得る。
【００５５】
ベクターは、原核または真核細胞中に慣用の形質転換または形質移入技術を介して導入することができる。本明細書において使用される用語「形質転換」および「形質移入」は、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞中に導入するための種々の当分野において認識される技術、例として、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介形質移入、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ＤＮＡロードリポソーム、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−ＤＮＡ複合体、細胞音波処理、高速マイクロプロジェクティル（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｓ）を使用する遺伝子ボンバードメント、およびウイルス媒介形質移入を指す。
【００５６】
投与に関して、任意の所与の症例における最も好適な経路は、治療される肝病態の性質および重症度に、ならびに投与される融合タンパク質、ウイルスベクター、核酸または医薬配合物に依存する。
【００５７】
本発明の融合タンパク質、ウイルスベクターおよび核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）は、公知の技術に従って医薬担体中での投与のために配合することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（９ｔｈ  Ｅｄ．１９９５）参照。本発明による医薬配合物の製造において、融合タンパク質、ウイルスベクターまたは核酸は、典型的には、とりわけ、許容可能な担体と混合される。担体は、固体もしくは液体、またはその両方であり得、場合により、製薬の周知技術のいずれかにより調製することができる単位用量配合物として配合される。
【００５８】
このような医薬組成物に使用される担体および添加剤は、予測される投与方式に応じて種々の形態をとり得る。したがって、経口投与のための組成物は、例えば、固体製剤、例えば、錠剤、糖衣錠、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤などであり得、好適な担体および添加剤は、デンプン、糖、結合剤、希釈剤、顆粒化剤、滑沢剤、崩壊剤などである。これらの使用の容易性およびより高度な患者コンプライアンスのため、錠剤およびカプセル剤が多くの病状のための最も有利な経口剤形となる。
【００５９】
同様に、液体製剤のための組成物としては、液剤、エマルション、分散液、懸濁液、シロップ剤、エリキシル剤などが挙げられ、好適な担体および添加剤は、水、アルコール、油、グリコール、保存剤、着香剤、着色剤、懸濁化剤などである。
【００６０】
液剤の例において、それは、散剤に凍結乾燥させ、次いで使用直前に再構成させることができる。分散液および懸濁液について、適切な担体および添加剤としては、水性ガム、セルロース、ケイ酸塩または油が挙げられる。
【００６１】
注射液について、担体は、典型的には、液体、例えば、無菌パイロジェンフリー水、パイロジェンフリーリン酸緩衝生理食塩水、静菌水、またはＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、非経口的に許容可能な油、例として、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、レシチン、ラッカセイ油またはゴマ油であり、溶解度または保存補助のための他の添加剤を含めることもできる。他の投与方法について、担体は固体または液体であり得る。
【００６２】
経口投与について、融合タンパク質、ウイルスベクターまたは核酸は、固体剤形、例えば、カプセル剤、錠剤、および散剤で、または液体剤形、例えば、エリキシル剤、シロップ剤、および懸濁液で投与することができる。融合タンパク質、ウイルスベクターまたは核酸は、ゼラチンカプセル中で不活性成分および粉末化担体、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、タルク、炭酸マグネシウムなどと一緒にカプセル化することができる。所望の色、風味、安定性、緩衝能、分散または他の公知の所望の特性を提供するために添加することができる追加の不活性成分の例は、赤色酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、食用白色インクなどである。類似の希釈剤を使用して圧縮錠を作製することができる。錠剤およびカプセル剤は両方とも、数時間にわたる医薬品の連続放出を提供するための徐放生成物として製造することができる。圧縮錠は、いかなる不快な風味もマスクし、錠剤を大気から保護するための糖衣もしくはフィルムコーティング錠、または胃腸管中での選択的崩壊のための腸溶性錠剤であり得る。経口投与のための液体剤形は、患者許容性を増加させるための着色剤および着香剤を含有し得る。
【００６３】
非経口投与に好適な本発明の配合物としては、融合タンパク質、ウイルスベクターまたは核酸の無菌水性および非水性注射液を挙げることができ、これらの製剤は一般に、対象とするレシピエントの血液と等張性である。これらの製剤は、配合物を対象とするレシピエントの血液と等張性にする酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤および溶質を含有し得る。水性および非水性無菌懸濁液は、懸濁化剤および増粘剤を含み得る。配合物は、単位用量または多用量容器、例えば、密封アンプルおよびバイアル中で提供することができ、使用直前に無菌液体担体、例えば、生理食塩水または注射水の添加のみを要求するフリーズドライ（凍結乾燥）条件で貯蔵することができる。
【００６４】
用時調製注射液および懸濁液は、無菌の散剤、顆粒剤および錠剤から調製することができる。例えば、本発明の一態様において、密封容器中の単位剤形の本発明の融合タンパク質、ウイルスベクターまたは核酸を含む注射可能な、安定な、無菌組成物が提供される。場合により、組成物は、対象中へのその注射に好適な液体組成物を形成するために好適な薬学的に許容可能な担体により再構成され得る凍結乾燥物の形態で提供される。
【００６５】
本発明の特定の実施形態において、投与は、皮下または皮内投与によるものである。皮下および皮内投与は、当分野において公知の任意の方法、例として、限定されるものではないが、注射、遺伝子銃、パウダージェクト（ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ）装置、バイオジェクト（ｂｉｏｊｅｃｔ）装置、マイクロエンハンサー（ｍｉｃｒｏｅｎｈａｎｃｅｒ）アレイ、マイクロニードル、およびスカリフィケーション（すなわち、表面を薄く削り、次いで融合タンパク質、ウイルスベクターまたは核酸を含む液剤を適用する）によるものであり得る。
【００６６】
他の実施形態において、融合タンパク質、ウイルスベクターまたは核酸は、例えば、筋肉内注射により筋肉内投与され、または局所投与により投与される。
【００６７】
核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）は、リポソーム、例えば、レシチンリポソームまたは当分野において公知の他のリポソーム（例えば、国際公開第９３／２４６４０号パンフレットに記載）と会合させて送達することもでき、さらに助剤と会合させることができる。カチオン脂質を含むリポソームはポリアニオン、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡと自然におよび急速に相互作用し、最大１００％のポリヌクレオチドを捕捉するリポソーム／核酸複合体をもたらす。さらに、ポリカチオン複合体は、細胞膜と融合し、リソソームコンパートメントの分解酵素を回避するポリヌクレオチドの細胞内送達をもたらす。ＰＣＴ国際公開第９４／２７４３５号パンフレットは、カチオン脂質およびポリヌクレオチドを含む遺伝子免疫法のための組成物を記載する。核酸の細胞取り込みを支援する薬剤、例えば、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質および他の形質移入促進剤を含めることができる。
【００６８】
本発明によれば、本発明の方法は、有効量の上記の本発明の組成物を対象に投与することを含む。使用が本発明の範囲内である有効量の組成物は、対象ごとにいくらか変動し、対象の年齢および病態ならびに送達経路などの因子に依存する。このような投与量は、当業者に公知の定型的な薬理学的手順に従って決定することができる。例えば、本発明の活性薬剤は、組成物の約０．０１、０．０５、０．１０、０．５０、１．０、５．０、または１０重量％の下限から、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００重量％の範囲の上限の範囲の量で対象に投与することができる。一部の実施形態において、活性薬剤は、組成物の約０．０５から約９５重量％を構成する。他の実施形態において、活性薬剤は、組成物の約０．０５から約６０重量％を構成する。さらに他の実施形態において、活性薬剤は、組成物の約０．０５から約１０重量％を構成する。
【００６９】
ブタＦｃ融合物のクローニングおよび発現
ブタＣＳＦ−１の活性断片に対応する配列
【化１】
2016510977.tif 000003
を、ブタＩｇＧ１ａ配列のヒンジ−ＣＨ３領域
【化２】
2016510977.tif 000004
に結合させた。この全領域を、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）により哺乳動物発現についてコドン最適化し、発現プラスミドｐＳ００５２４中に、５’および３’末端中にそれぞれエンジニアリングされたＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ制限部位を使用してクローニングした。得られたプラスミドをシーケンシングしてＯＲＦ統合性を確認し、タンパク質を形質移入ＨＥＫ２９３ＦまたはＣＨＯ細胞から発現させた。
【００７０】
ブタＣＳＦ−１：Ｆｃ融合物の単離
プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを使用してブタＣＳＦ−１Ｆｃ融合タンパク質を単離した。手短に述べると、細胞培養物からの馴化培地を澄明化し、ＰＢＳにより平衡化されたＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上にロードした。ロード後、カラムを２ＢＶのＰＢＳおよび２ＢＶの３５ｍＭの酢酸Ｎａ  ｐＨ５．５により洗浄した。８０％のＢ緩衝液（３５ｍＭの酢酸、ｐＨ調整なし）、８５％のＢ緩衝液および１００％のＢ緩衝液の段階勾配を使用してタンパク質を溶出させた。８０および８５％のＢ分画を凝集タンパク質の欠如に基づきプールし（分析ＳＥＣ）、１００％のＢ分画を含めなかった。プールされたタンパク質をｐＨ７．２に調整し、ＰＢＳに対して透析した。
【００７１】
ＥＬＩＳＡによる血漿中でのブタＣＳＦ−１Ｆｃ融合物の定量
市販の抗体を利用する社内開発の慣用のサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、ブタＣＳＦ−１Ｆｃ融合血漿レベルを検出した。捕捉抗体はＡｂｃａｍ  ａｂ９６９３（０．３μｇ／ｍＬ）であり、検出抗体はウサギ抗ブタＩｇＧ（Ｆｃ）ビオチン化Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ９０４４０（１：５０００希釈）であった。標準タンパク質を社内で生成および精製した（ロット２／２４／１１  ＪＡＳ）。標準をそれぞれのプレートに試料とともに添加し、２７００ｎｇ／ｍＬから０．０４６ｐｇ／ｍＬの１１点の標準範囲をもたらした。このことは、アッセイプレートごとに対する標準曲線に対するそれぞれの試料の定量を可能とした。アッセイ検出は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（１：１０，０００希釈）およびＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ溶液（ＫＰＬ）を使用して行った。
【００７２】
ブタＰＫ
離乳齢の去勢ブタ（＜１４ｋｇ）を、下記のとおり単回静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）投与を受ける３つの処置群に割り当てた。３匹のブタは、０．５ｍｇ／ｋｇのＣＳＦ−１の非注入ＳＣ投与を受けた。２匹のブタは、１．２ｍｇ／ｋｇのＣＳＦ−１：Ｆｃの注入ＩＶ投与を受けた。２匹のブタは、１．２ｍｇ／ｋｇのＣＳＦ−１：ＦｃのＳＣ投与を受けた。１ｍｌの血漿試料をＥＤＴＡ抗凝固チューブ中で頸静脈を介して得、遠心分離するまで氷上に置いた。血漿を無菌チューブに移し、分析まで≦−１０℃において貯蔵した。連続血漿試料をそれぞれの動物から、投与前ならびに投与５分後、３０分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、２４時間後、４８時間後、および７２時間後に得た。ＣＳＦ−１およびＣＳＦ−１：Ｆｃ融合タンパク質レベルを、血漿中でＥＬＩＳＡアッセイを使用して定量した。
【００７３】
ＭＴＴ細胞生存アッセイ
ブタＣＳＦ−１Ｒを発現する安定なＢａ／Ｆ３細胞を、ＭＴＴアッセイ前に１０４ユニット／ｍｌのｒｈ−ＣＳＦ−１または１０％のＩＬ−３馴化培地のいずれかが補給された完全ＲＰＭＩを有する培地中で維持した。９６ウェルプレートの２×１０４個の細胞／ウェル（Ｂａ／Ｆ３細胞およびＢａ／Ｆ３形質移入体）、または５×１０４個の細胞／ウェル（ブタＢＭＭ）を、三重または四重および適切な処置でプレーティングした（ｒｈ−ＣＳＦ−１またはブタＦｃＣＳＦ−１の段階希釈物を添加して１ウェル当たり１００μｌの総容量とした。細胞を３７℃において５％のＣＯ２を用いて４８時間インキュベートした。Ｂａ／Ｆ３細胞について、１０μｌのＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｍ５６５５）原液（５ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれのウェルに直接添加して０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度を達成し、一晩可溶化前に３７℃において３時間インキュベートした。接着マウスＢＭＭ細胞について、培養培地を５０μｌの１ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ溶液により置き換え、３７℃において１時間インキュベートした。ＭＴＴ溶液を除去し、テトラゾリウム塩を１００μｌの可溶化剤（０．１ＭのＨＣＬ、１０％のＴｒｉｔｏｎ  ｘ−１００およびイソプロパノール）により可溶化し、次いで３７℃において５％のＣＯ２を用いて１０分間インキュベートした。プレートを５７０ｎｍにおいて読取り、参照波長は４０５ｎｍであった。
【００７４】
マウス試験
１０〜１２週齢の４８匹の雌Ｃ５７Ｂｌ６マウスが、２／３部分肝切除、パラセタモール中毒または慢性肝損傷および２／３部分肝切除のいずれかを受けた。２／３部分肝切除は、左葉ならびに左および右中葉を結紮することにより実施した。パラセタモール中毒は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で溶解した３５０ｍｇ／ｋｇのパラセタモールの腹腔内投与により実施した。慢性肝損傷および２／３部分肝切除は、８週間の腹腔内の四塩化炭素投与（週２回１ｍｃｌ／ｇ、オリーブ油中に溶解）と、それに続く上記の２／３部分肝切除により実施した。処置群（１損傷モデル当たりｎ＝８）は、部分肝切除またはパラセタモール中毒のいずれかの直後に皮下投与される０．７５ｍｃｇ／ｇのＦＣ−ＣＳＦ１および続いて２４時間ごとの３回のさらなる投与を受けた。対照マウス（１損傷モデル当たりｎ＝８）は、適切な容量の皮下ＰＢＳを受けた。全てのマウスを損傷（部分肝切除またはパラセタモール中毒）後４日目に屠殺した。
【００７５】
正中線開腹術後、肝臓を摘出および秤量した。肝重量体重比を算出し、割合として表現した。肝臓を４％のホルマリン中で一晩固定し、次いで７０％のエタノールに移した。次いで、肝臓をパラフィンブロック中に包埋し、４μｍの切片に切り出した。Ｋｉ６７（細胞周期全体にわたり発現される細胞増殖のマーカー）の免疫組織化学検査を、ｐＨ９におけるＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ溶液中での熱媒介抗原回復後に実施した。１動物当たり２０の高倍率視野（４００倍）中でｋｉ６７陽性肝細胞をカウントすることにより、肝細胞増殖を定量し、平均を算出した。
【実施例】
【００７６】
実施例１
急性肝損傷（部分肝切除；パラセタモール中毒）および急性増悪肝損傷（慢性肝損傷および部分肝切除）のネズミモデルにおける肝再生に対するＦｃ−ＣＳＦ１の効果は、試験Ｄであった。処置群（１損傷モデル当たりｎ＝８）は、部分肝切除またはパラセタモール中毒のいずれかの直後に皮下投与される０．５ｍｃｇ／ｇのＦｃ−ＣＳＦ１および続いて２４時間ごとの３回のさらなる投与を受けた。対照マウス（１損傷モデル当たりｎ＝８）は、適切な容量の皮下ＰＢＳを受けた。介入および処置は十分に忍容された。最も重度の損傷モデル（慢性肝損傷と２／３部分肝切除）において、マウス重量の有意な増加（４日目においてｐ＜０．００１）および生存改善の傾向（ｐ＝０．０８）が存在した（図１）。他の知見は、損傷モデルにわたり肝重量および肝細胞増殖の両方の再生パラメータの向上を含んだ（図２）。これらの試験の結果は、Ｆｃ−ＣＳＦ１の投与が一連の肝損傷モデルにわたり再生応答を向上させ得ることを実証する。最も重度の肝損傷（慢性肝損傷および部分肝切除）のモデルにおいて、生存改善の傾向および有意な体重増加が存在し、このことは術後経過の改善を示した。Ｆｃ−ＣＳＦ１は、全ての損傷モデルにおいて肝重量および肝細胞増殖に対する増殖促進効果を有することが見出された。有効な肝再生をもたらす経路の多くにおいて冗長性が存在する一方、ＣＳＦ１は最適な回復を達成するために重要であると考えられ、本試験は、この因子の補給が再生をさらに増強し得ることを示した。これらの知見は、臨床現場における肝不全の管理におけるアウトカムの改善に変わることが想定される。
【００７７】
実施例２
マウスに４日間のそれぞれでＦｃ−ＣＳＦ−１を皮下注射し、５日目に安楽死させた。マウスは、Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンドのｃｓｆ１ｒ−ＥＧＦＰ（ＭａｃＧｒｅｅｎ）マウスであった。組織加工および免疫組織化学検査を、（Ａｌｉｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ  Ａｍ  Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７９，１２４３−１２５６，２０１１およびＭａｃｄｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｌｏｏｄ．１１６，３９５５−３９６３，２０１０）に記載のとおり実施した。Ｇｏｗ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ．６０，７９３−８０５，２０１２）に記載のアッセイを使用するマウス骨髄細胞またはＢａ／Ｆ３ＣＳ１Ｒレポーター細胞系の増殖に対する組換えブタＣＳＦ−１またはＦｃ−ＣＳＦ−１の効果の比較は、生物学的活性の差異は存在しないことを示し（データ示さず）、このことはＣＳＦ−１のＣ末端へのＦｃ構成成分の付加が受容体への結合を干渉しないことを実証した。
【００７８】
実施例３
体重に対する、投与されたＣＳＦ−１の効果を評価した。図３Ａは、ＣＳＦ−１（１ｍｇ／ｋｇ）とＦｃ−ＣＳＦ−１（１ｍｇ／ｋｇ）とを比較する。非改変タンパク質は、この用量において効果を有さず、Ｆｃ−ＣＳＦ−１は、総体重を明らかに増加させる。図３Ｂは、０．１ｍｇ／ｋｇのＦｃ−ＣＳＦ−１の検出可能な活性を実証する応答用量曲線を示す。図３Ｃは、１ｍｇ／ｋｇ用量の効果がより大きい実験系列において確認されることを示す。この系列における動物を後続の試験においてさらに分析する。臓器重量試験は、１ｍｇ／ｋｇにおけるＦｃ−ＣＳＦ−１処置が脾臓の重量のほぼ２倍であり、総肝重量を有意に増加させることを示した一方；重量または肺または腎臓に対するＦｃ−ＣＳＦ−１の効果は、群全体についても雄または雌に分けても観察されなかった。
【００７９】
血液に対する、マウスに投与されたＦｃ−ＣＳＦ−１の効果を評価した。結果は、Ｆｃ−ＣＳＦ−１が白血球数および総血中単球数を上昇させることを示した。雄マウスと雌マウスとの間で多少の変動が存在し、雄は雌よりも高い平均数を有するが、効果は両方の性において見られることが留意された。そのＦｃ−ＣＳＦ−１が分葉核好中球数を増加させることも観察された。この場合も、雄は雌と区別することができる。結果的に、Ｆｃ−ＣＳＦ−１は総リンパ球に対する効果を有さなかった。
【００８０】
ｃｓｆ１ｒ−ＥＧＦＰレポーターにより検出される脾臓中のマクロファージの数に対する、マウスに投与されたＦｃ−ＣＳＦ−１の効果も評価した。処置された図５Ｂにおいて顕著に増加した蛍光に留意されたい。これを図６Ａにおいて用量応答曲線中で定量する。図６Ｂにおいて、同一の結果がマクロファージ特異的Ｆ４／８０抗原の免疫組織化学局在化に基づき実証される。
【００８１】
骨中の骨吸収破骨細胞に対する、マウスに投与されたＦｃ−ＣＳＦ−１の効果を評価した。結果は、成長板、吸収帯および骨幹の、破骨細胞の処置群における増加を示した（データ示さず）。
【００８２】
実施例４
図７Ｂは、Ｆｃ−ＣＳＦ−１により処置されたマウスの肝臓中のマクロファージ特異的Ｆ４／８０抗原についての免疫染色を示し、対照の図７Ａに対するマクロファージ数の大きな増加を実証する。図７Ｄは、Ｆｃ−ＣＳＦ−１により処置されたマウスの脾臓中のマクロファージ特異的Ｆ４／８０抗原についての免疫染色を示し、対照の図７Ｃに対するマクロファージ数およびさらにはＦ４／８０の強度の大きな増加を実証する。図８Ｂは、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）についての免疫染色を示す。染色は、対照マウス肝の図８Ａでは観察されない。図８Ｂは、Ｆｃ−ＣＳＦ−１が広範囲の細胞増殖を引き起こすことを示す。サイズおよび核形態に基づき、増殖細胞を肝細胞として同定する。組織化学染色に加え、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ上での遺伝子発現プロファイリングを使用して対照およびＦｃ−ＣＳＦ−１処置マウスの肝臓を試験した。データは、既知マクロファージ特異的遺伝子（ｃｓｆ１ｒ、ｅｍｒ１（Ｆ４／８０）の吸光度の４〜８倍の増加、および細胞周期関連遺伝子の検出のさらに大きい増加が存在することを裏付けた。重要なことに、古典的な炎症遺伝子、例えば、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−６またはＩＬ−１の誘導の証拠は存在しなかった。
【００８３】
実施例５
図９は、離乳期ブタに投与されたＣＳＦ−１の薬物動態の影響を実証する。図９Ａは、非改変ＣＳＦ−１のクリアランスを示す。得られたピーク血漿レベルが、約１００ｎｇ／ｍｌにすぎず、それは２０時間後には完全にクリアランスされることに留意されたい。対照的に、Ｆｃ−ＣＳＦ−１（図９ＢおよびＣ）は、１００倍高い血漿濃度を保持し、最大７２時間の上昇を保った。離乳期ブタに対する予備実験は、隔日の０．４ｍｇ／ｋｇのＦｃ−ＣＳＦ−１による３回の処置が循環単球数の２〜３倍の増加をもたらすことを決定した。
【００８４】
さらなる試験を実施して新生児ブタにおけるＦｃ−ＣＳＦ−１効力／安全性処置試験を評価した。２つの試験用量（０．１２ｍｇ／Ｋｇを３回および０．５ｍｇ／Ｋｇを６回）において、Ｆｃ−ＣＳＦ−１処置は、いかなる時点においても体重増量に対してほとんど効果を有さなかった。増量の微落がより高い容量において観察された（データ示さず）。図１０Ａ〜Ｄおよび１１Ａ〜Ｄは、処置の効力を実証する。対照動物において、総血球数、単球数および顆粒球数はブタにおいて生後の最初の２週間で降下することが留意された。Ｆｃ−ＣＳＦ−１は、単球、リンパ球および顆粒球数の全てを有意に増加させた。図１２Ａ〜Ｄは、この用量およびタイミングにおいて、Ｆｃ−ＣＳＦ−１は、実験終期において肝臓、脾臓、肺または腎臓のそれぞれの臓器重量寸法を変化させなかったことを示す。ＰＣＮＡ染色は、対照群においてブタ肝の広範囲の増殖が存在することを明らかにし、このことはこの週齢においていかなる効果も制限し得る。病変報告は、肝臓中の組織球数の増加の存在を記載した。
【００８５】
実施例６
パラセタモール過剰摂取により誘導された急性肝不全を呈する７８人の患者のコホートにおけるＭＳＤ（登録商標）電気化学発光プラットフォームを使用して、血清マクロファージコロニー刺激（ＣＳＦ１）を評価した。生存した患者は、死亡した者または肝移植を要求した者よりも有意に高い血清ＣＳＦ１レベルを示した（図１３Ａ）。連続試料を患者の下位群（７人の生存者、７人の死亡／肝移植者）から分析し、生存した患者における血清ＣＳＦ１レベルの増加を実証し、死亡した者は、ＣＳＦ１レベルの低減を示した（図１３Ｂ）。入院時のＣＳＦ１レベルは、生存についての有意な予測値を実証した（ＲＯＣ−ＡＵＣ  ０．８４）（図１３Ｃ）。
【００８６】
肝ＣＳＦ１遺伝子発現を、パラセタモール中毒（一晩絶食後の３５０ｍｇ／ｋｇのパラセタモールＩＰ）後のマウスにおいて４日間までの時点において評価し、２日目にピークＣＳＦ１遺伝子発現を示した（図１４Ａ）。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘアッセイを介して評価された血清ＣＳＦ１レベルは、パラセタモール中毒後１日目にピークレベルを示した（図１４Ａ）。パラセタモール中毒についてのＣＳＦ１受容体の遮断（ＧＷ２５８０  １８０ｍｇ／ｋｇ、強制経口投与を介する、ＬＣ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、損傷後３日後における肝重量体重比の低減および肝細胞増殖の損害により実証される肝再生の損害をもたらした（図１４Ｂ）。血清分析を図１４Ｃに示し、損傷後３日目におけるＣＳＦ１受容体遮断についてのＡＬＴ（肝損傷のマーカー）の上昇を実証する。
【００８７】
ＣＳＦ１−Ｆｃまたは対照をマウスにパラセタモール中毒から１２時間後に投与し、パラセタモール中毒後４日目における肝重量体重比が有意に増加し、肝細胞増殖が増加し（図１５Ａ）、血清分析を図１５Ｂに示す。
【００８８】
結果は、より高いレベルの血清ＣＳＦ１がパラセタモール中毒により誘導される急性肝不全後のヒトの生存と関連し、それを予測することを実証する。パラセタモール中毒のマウスモデルにおいて、肝ＣＳＦ１遺伝子発現は部分肝切除後に増加する。ＣＳＦ１受容体の遮断は、肝再生を害し、マウスにおけるパラセタモール中毒から１２時間後のＣＳＦ１−Ｆｃの投与は、再生パラメータを向上させ得る。
【００８９】
実証例７
肝ＣＳＦ１遺伝子発現をマウスにおいて、２／３部分肝切除後に術後７日間までの時点において評価した。１日目に肝ＣＳＦ１遺伝子発現の早期低減が存在した（図１６Ａ）。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘアッセイを介して評価された血清ＣＳＦ１レベルは、このマウスモデルにおいて検出不能であった（図１６Ａ）。しかしながら、２／３部分肝切除についてのＣＳＦ１受容体の遮断（ＧＷ２５８０  １８０ｍｇ／ｋｇ、強制経口投与を介する、ＬＣ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、３日目における肝細胞増殖の顕著な損害により実証される肝再生の損害をもたらした（図１６Ｂ）。血清分析を図１６Ｃに示し、ＣＳＦ１受容体遮断についてのＡＬＴ（肝損傷のマーカー）の上昇を実証する。
【００９０】
ＣＳＦ１−Ｆｃまたは対照をマウスに２／３部分肝切除直後に投与し、肝重量体重比が有意に増加し、肝細胞増殖が増加した（図１７Ａ）。血清分析を図１７Ｂに示す。ＣＳＦ１−Ｆｃ投与は、再生促進サイトカインＩｌ６およびオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）の遺伝子発現を有意に向上させた一方、ＧＷ２５８０によるＣＳＦ１受容体阻害は、部分肝切除後２日目にそれらの発現の有意な低減をもたらした。成長因子活性化に関与するウロキナーゼ受容体（ＵＲ）は、ＣＳＦ１−Ｆｃ投与により有意に上昇し、ＣＳＦ１受容体遮断（ＧＷ２５８０）によりウロキナーゼ受容体発現は低減した（図１７Ｃ）。
【００９１】
ＣＳＦ１−Ｆｃまたは対照をマウスに、８週間の四塩化炭素により誘導された慢性肝損傷（１ｍｃｌ／ｇの四塩化炭素／マウス、２回／週）のバックグラウンドの２／３部分肝切除直後に投与した。ＣＳＦ１−Ｆｃ処置による生存改善の傾向および体重の有意増加が存在した（図１８Ａ）。肝重量体重比および増殖肝細胞の数は有意に増加し、シリウスレッド定量により評価される線維症の低減の傾向が存在した（図１８５Ｂ）。血清パラメータを図１８Ｃに示し、これはＣＳＦ１−Ｆｃ処置についての肝切除後４日目におけるビリルビンおよびＡＬＴの有意な低減を実証する。
【００９２】
パラセタモール中毒の状況とは対照的に、ＣＳＦ１遺伝子発現および血清レベルは部分肝切除後に上昇しないことが見出された。しかしながら、ＣＳＦ１受容体の遮断は、肝再生を有意に害した。ＣＳＦ１−Ｆｃの投与は、正常および慢性損傷マウス肝における部分肝切除のモデルにおいて再生のマーカーを有意に向上させた。
【００９３】
実施例８
ＣＳＦ１−Ｆｃは、損傷後の肝食作用能を向上させる
背景
肝臓は、腸管の下流に位置するため、病原物質に常に曝露され、この状況において恒常性の維持に重要な解毒および自然免疫機能を遂行する。肝マクロファージは、病原性および他の不溶性物質の食作用における主要な役割を担う、直接循環接触するマクロファージの最大集団となる。肝損傷は、肝臓に対して実質的な再生を要求し、食作用能および免疫機能を大幅に低減させる［１、２］。現在、肝食作用能を向上させるための利用可能な治療法は存在しない。
【００９４】
方法
Ｃ５７Ｂｌ６雄マウス（８〜１０週齢）は、部分肝切除（２／３切除）またはパラセタモール中毒（一晩絶食後の３５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）のいずれかを受けた。ＣＳＦ１−Ｆｃを、上記のとおり投与した（０．７５ｍｇ／ｋｇ）。Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒｓ（ＭＳＲ１およびＭＡＲＣＯ）を使用して遺伝子分析を実施し、それぞれの試料についてＧＡＰＤＨレベルに関連づけた。食作用アッセイのため、マウスを２％のイソルフルオラン（ｉｓｏｌｆｌｕｏｒａｎｅ）により麻酔し、下大静脈にカニューレを挿入した。０．１ｍｌの５０００ＩＵ／ｍｌのヘパリン溶液を注入してカテーテルの遮断を防止した。１００μｌの赤色蛍光ビーズ溶液（１：５のラテックスビーズ１．０μｍ、蛍光レッド、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（登録商標））を、カニューレを介して注入した（パラセタモール損傷後のアッセイのための１：２の溶液）。２０ｍｃｌの血液をカニューレから注射の１分後から開始して２分ごとに、１５分間取り出した。血液を、３００μｌのＦＡＣＳ−Ｌｙｓｉｎｇ溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅｓ）により直ちに固定した。１５分後、流出のために門脈を分流した後にマウスを１５ｍｌの０．９％生理食塩水によりＩＶＣカニューレを介してかん流させた。次いで、臓器を摘出し（肝臓、脾臓、肺、腎臓、脳）、Ｋｏｄａｋ  Ｉｎ−Ｖｉｖｏ  Ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｔｒａｌ  ＦＸイメージステーション（励起：５５０ｎｍ；発光：６００ｎｍ；露光１秒；ｆストップ２．８）によりイメージングした。続いて、ＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して血液試料を分析し、蛍光ビーズを青色チャネル（Ｂ６９５／４０）上で低流速設定で１分間の試料回収を単位として検出した。
【００９５】
知見
ＣＳＦ１−Ｆｃおよび部分肝切除
全肝の遺伝子分析は、ＣＳＦ１−Ｆｃ処置についての部分肝切除後２日目における食作用と関連する遺伝子、ＭＳＲ１（マクロファージスカベンジャー受容体１）およびＭＡＲＣＯ（コラーゲン構造を有するマクロファージ受容体）の上方調節を明らかにした。ＣＳＦ１受容体遮断は、これらの遺伝子の発現の相反減少をもたらした。
【００９６】
部分肝切除後のＣＳＦ１−Ｆｃによる処置は、蛍光ラテックスマイクロビーズの循環からのクリアランスにより評価されるとおり肝臓の食作用能を大幅に向上させた（図Ｂ）。全肝の蛍光イメージングは、肝臓の蛍光強度の増加が食作用の向上の存在と一致することを明らかにした（図Ｃ）。他の臓器の蛍光イメージングは、肝臓がビーズ取り込みの優勢部位であることを明らかにした。
【００９７】
ＣＳＦ１−Ｆｃおよびパラセタモール中毒
全肝の遺伝子分析は、パラセタモール中毒後２日目における食作用と関連する遺伝子、ＭＳＲ１（マクロファージスカベンジャー受容体１）およびＭＡＲＣＯ（コラーゲン構造を有するマクロファージ受容体）の上方調節を明らかにした。
【００９８】
肝組織の損失は、部分肝切除と比較してパラセタモール中毒モデルにおいてそれほど重症でなく、これに伴って本発明者らはパラセタモールモデルにおける循環からのラテックスマイクロビーズのクリアランスの向上に留意しなかった。しかしながら、本発明者らは、エクスビボイメージング後の肝蛍光の有意な増加を確認し、このことは食作用能の増加を示唆した。
【００９９】
結論
これらの知見は、肝損傷後に肝臓の食作用能をＣＳＦ１−Ｆｃによる処置により向上させることができることを実証する。
【０１００】
実施例９
ヒトにおける部分肝切除および血清ＣＳＦ１レベルの効果を以下のとおり評価した。
【０１０１】
方法
部分肝切除を受けた５５人の患者のコホートにおけるＭＳＤ（登録商標）電気化学発光プラットフォームを使用して、血清マクロファージコロニー刺激（ＣＳＦ１）を評価した。血清試料を術前ならびに術後１日目および３日目に採取した。
【０１０２】
知見
部分肝切除後のヒトにおいて、血清ＣＳＦ１レベルの有意な減少が１日目に見られ、続いて３日目にＣＳＦ１レベルが増加した（図２１Ａ）。最大増加は、最大数の区域が切除された患者に見られた（３つ未満の区域と比較して５つを超える区域）（図２１Ｂ）。コホート全体のうち、２人の患者が術後肝不全を発症した。これらの患者のＣＳＦ１レベルは、最低四分位であった（図２１Ｃ）。
【０１０３】
本明細書の詳細な説明および特許請求の範囲の全体にわたり、語「含む」および「含有する」ならびにそれらの変形は、「例として、限定されるものではないが」を意味し、それらは、他の部分、付加物、構成要素、整数またはステップを排除するものではない（排除しない）。本明細書の詳細な説明および特許請求の範囲の全体にわたり、単数形は、文脈が特に要求しない限り複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、本明細書は、文脈が特に要求しない限り、単数形だけでなく複数形を企図するものとして理解すべきである。
【０１０４】
本発明の特定の態様、実施形態または実施例と関連して記載される特性、整数、特徴、化合物、化学部分または基は、特に不適合でない限り、本明細書に記載の任意の他の態様、実施形態または実施例に適用可能であると理解すべきである。本明細書（任意の付属の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）に開示の特性の全て、および／またはそのように開示される任意の方法もしくはプロセスのステップの全ては、そのような特性および／またはステップの少なくとも一部が相互に排他的である組合せを除き、任意の組合せで組み合わせることができる。本発明は、いかなる上記実施形態の詳細にも限定されるものではない。本発明は、本明細書（任意の付属の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）に開示の特性の任意の新規のもの、もしくは任意の新規組合せに拡大し、またはそのように開示される任意の方法もしくはプロセスのステップの任意の新規のもの、もしくは任意の新規組合せに拡大する。
【０１０５】
読者の注意は、本願に関し、本明細書と同時にまたはそれよりも前に提出され、本明細書を使用して調査を行う公衆に公開されている全ての論文および文献に向けられ、全てのそのような論文および文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０６】
参考文献
１．Ｃａｎａｌｅｓｅ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｆｕｌｍｉｎａｎｔ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｆａｉｌｕｒｅ．Ｇｕｔ，１９８２．２３（４）：ｐ．２６５−９．
２．Ｓｃｈｉｎｄｌ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｍａｊｏｒ  ｌｉｖｅｒ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ，２００６．２４３（４）：ｐ．５０７−１４．
【０１０７】
ヒトＣＳＦ−１配列
全長（残基１〜５５４）：
【化３】
2016510977.tif 000005
シグナルペプチドが除去された配列（残基３３〜５５４）：
【化４】
2016510977.tif 000006
活性断片、すなわち残基３３〜１８２：
【化５】
2016510977.tif 000007
【図１】
2016510977.tif 000008
【図２】
2016510977.tif 000009
【図３Ａ】
2016510977.tif 000010
【図３Ｂ】
2016510977.tif 000011
【図３Ｃ】
2016510977.tif 000012
【図４Ａ】
2016510977.tif 000013
【図４Ｂ】
2016510977.tif 000014
【図５Ａ】
2016510977.tif 000015
【図５Ｂ】
2016510977.tif 000016
【図６Ａ】
2016510977.tif 000017
【図６Ｂ】
2016510977.tif 000018
【図７Ａ】
2016510977.tif 000019
【図７Ｂ】
2016510977.tif 000020
【図７Ｃ】
2016510977.tif 000021
【図７Ｄ】
2016510977.tif 000022
【図８Ａ】
2016510977.tif 000023
【図８Ｂ】
2016510977.tif 000024
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
2016510977.tif 000026
【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
2016510977.tif 000039
【図１３Ａ】
2016510977.tif 000040
【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
2016510977.tif 000042
【図１４Ａ】
2016510977.tif 000043
【図１４Ｂ】
2016510977.tif 000044
【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
2016510977.tif 000049
【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
2016510977.tif 000055
【図１８Ｃ】
2016510977.tif 000056
【図１９Ａ】
2016510977.tif 000057
【図１９Ｂ】
2016510977.tif 000058
【図１９Ｃ】
2016510977.tif 000059
【図２０Ａ】
2016510977.tif 000060
【図２０Ｂ】
2016510977.tif 000061
【図２０Ｃ】
2016510977.tif 000062
【図２１Ａ】
2016510977.tif 000063
【図２１Ｂ】
2016510977.tif 000064
【図２１Ｃ】
2016510977.tif 000065
【配列表】
2016510977000001.app
【国際調査報告】
2016510977.tif 000066
2016510977.tif 000067
2016510977.tif 000068