(57)【要約】本発明は、式Ｉの化合物2016501844.tif 000088（式中、Ｒ１、ＬおよびＡは、本明細書に述べる通りである）またはその薬学的な塩、化合物を調製するためのプロセス、および化合物を用いて高トリグリセリド血症などの病態を治療する方法を提供する。
2016501844.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式の化合物：
【化１】
2016501844.tif 000072
（式中、
Ｌは、−ＣＨ２−および−ＣＨ２ＣＨ２−から選択され、
Ｒ１は、−ＣＨ３および−ＣＦ３から選択され、
Ａは、
【化２】
2016501844.tif 000073
から選択され、
（式中、
Ｔは、ＣＨ２、ＮＨおよびＯから選択され、
Ｕは、ＣＨ２、ＮＨおよびＯから選択され、
Ｖは、ＣＨ２、Ｃ＝Ｏ、ＮＨ、Ｎ−ＣＨ３およびＯから選択され、
但しＴ、ＵおよびＶの少なくとも１つはＣＨ２であるが全部ではなく、かつＵがＯである場合はＴおよびＶのそれぞれはＯまたはＮ以外であり、
Ｗは、ＣＨ２およびＯから選択され、
Ｘは、ＣＨおよびＮから選択され、但しＷがＣＨ２の場合、ＸはＮであり、ＷがＯの場合、ＸはＣＨであり、
Ｙは、ＣＨ２、Ｎ−Ｃ６Ｈ５およびＯから選択され、
Ｚは、ＣＨ２およびＯから選択され、
Ｒ２は、Ｈおよびハロゲンから選択され、
Ｒ３は、Ｈ、シクロプロピルおよびフェニルから選択され、
Ｒ４は、Ｈおよびフェニルから選択され、
【化３】
2016501844.tif 000074
は、ＡからＬに付着する化学結合を示す））
およびその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
【化４】
2016501844.tif 000075
である、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項３】
Ｌは−ＣＨ２−である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１は−ＣＨ３である、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１は−ＣＦ３である、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
Ａは
【化５】
2016501844.tif 000076
から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項７】
Ａは
【化６】
2016501844.tif 000077
である、請求項１から６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
ＴはＯまたはＮであり、
ＵはＣＨ２であり、かつ
ＶはＯまたはＮである、
請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
ＴおよびＶは共にＯである、請求項１から８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
ＴはＯかつＶはＮである、請求項１から８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
ＴおよびＶは共にＣＨ２でありかつＵはＯである、請求項１から７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ２はＨである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
Ａは
【化７】
2016501844.tif 000078
から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１４】
Ａは
【化８】
2016501844.tif 000079
から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１５】
Ａは
【化９】
2016501844.tif 000080
から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１６】
Ａは
【化１０】
2016501844.tif 000081
から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１７】
Ａは
【化１１】
2016501844.tif 000082
から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１８】
Ａは
【化１２】
2016501844.tif 000083
から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１９】
下式の化合物：
【化１３】
2016501844.tif 000084
（式中、
Ｌは、−ＣＨ２−および−ＣＨ２ＣＨ２−から選択され、
Ｒ１は、−ＣＨ３および−ＣＦ３から選択され、
Ａは、
【化１４】
2016501844.tif 000085
から選択される）
またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２０】
Ａは
【化１５】
2016501844.tif 000086
から選択される、請求項１９に記載の化合物、またはその薬学的な塩。
【請求項２１】
【化１６】
2016501844.tif 000087
である、請求項１９または２０に記載の化合物あるいはその薬学的な塩。
【請求項２２】
請求項１から２１のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩および薬学的に許容可能な担体、希釈剤もしくは賦形剤のうちの少なくとも１種を含む、医薬組成物。
【請求項２３】
高トリグリセリド血症の治療を必要とする患者を治療する方法であって、有効量の請求項１から２１のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を患者に投与するステップを含む、方法。
【請求項２４】
療法における使用のための、請求項１から２１のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２５】
高トリグリセリド血症の治療における使用のための、請求項１から２１のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２６】
高トリグリセリド血症を治療する薬品の製造における、請求項１から２１のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭｏＧＡＴ−２阻害剤として有用な新規のベンジルスルホンアミド化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
過剰な食物脂肪の摂取は、食餌誘発性の肥満の主要原因であり、人々の健康に重度の有害な影響を有し得る。ヒトのための食物脂肪の９０％より多くは、小腸によってほぼ完全に吸収される、トリアシルグリセロール（またはトリグリセリド）である。酵素アシルＣｏＡ：モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−２（ｍｏｎｏａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ  ａｃｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−２）（ＭｏＧＡＴ−２）は、小腸での食物脂肪の吸収において重要な役割を果たすと考えられている。ＭｏＧＡＴ−２欠損マウスは、高脂肪の食餌を与えられた場合に肥満、グルコース不耐性、高コレステロール血症を発症することおよび脂肪肝を発症することを防ぐことが実証されている。さらに、ＭｏＧＡＴ−２欠損マウスは、食物オリーブ油負荷後に低い血漿トリアシルグリセロール濃度を示すことも示されている（Ｙｅｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００９年、１５（４）、４４２〜４４６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｙｅｎら著、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００９年、１５（４）、４４２〜４４６頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
高トリグリセリド血症の治療のためのさらなる薬剤の必要性がある。ＭｏＧＡＴ−２受容体の新規の阻害剤も必要性がある。本発明は、高トリグリセリド血症治療のために適し得る代替の化合物および治療方法を提供することにより１つまたは複数のこれらの必要性に対処する。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
本発明は、下式Ｉの化合物を提供する：
【化１】
2016501844.tif 000003
（式中、Ｌは、−ＣＨ２−および−ＣＨ２ＣＨ２−から選択され、Ｒ１は、−ＣＨ３および−ＣＦ３から選択され、かつＡは、
【化２】
2016501844.tif 000004
から選択される
（Ａの式中、Ｔは、ＣＨ２、ＮＨおよびＯから選択され；Ｕは、ＣＨ２、ＮＨおよびＯから選択され；Ｖは、ＣＨ２、Ｃ＝Ｏ、ＮＨ、Ｎ−ＣＨ３およびＯから選択され、ただしＴ、ＵおよびＶの少なくとも１つはＣＨ２であるが全てではなく、かつＵがＯの場合は、それぞれのＴおよびＶはＯまたはＮ以外であるとし；Ｗは、ＣＨ２およびＯから選択され；Ｘは、ＣＨおよびＮから選択され；ただしＷがＣＨ２の場合は、ＸはＮであり、ＷがＯの場合は、ＸはＣＨであるとし；Ｙは、ＣＨ２、Ｎ−Ｃ６Ｈ５およびＯから選択され；Ｚは、ＣＨ２およびＯから選択され；Ｒ２は、Ｈおよびハロゲンから選択され；Ｒ３は、Ｈ、シクロプロピルおよびフェニルから選択され；Ｒ４は、Ｈおよびフェニルから選択される
（式中、
【化３】
2016501844.tif 000005
は、ＡからＬに付着する化学結合を示す）））。本発明は、式Ｉの化合物の薬学的に許容可能な塩を提供する。
【０００６】
一実施形態において式Ｉの化合物は、下記に例示される立体化学を有する：
【化４】
2016501844.tif 000006
（式中、Ｒ１、Ｌ、Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、上で述べた通りおよびその薬学的に許容可能な塩である）。
【０００７】
本発明は、Ｌは好ましくは−ＣＨ２−である、式Ｉの化合物およびその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【０００８】
一実施形態において式Ｉの化合物のＲ１は−ＣＨ３であり、別の実施形態においてＲ１は−ＣＦ３である。本発明は、両方の実施形態の薬学的に許容可能な塩を提供する。
【０００９】
本発明は、Ａが好ましくは
【化５】
2016501844.tif 000007
から選択される、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００１０】
本発明は、Ａが
【化６】
2016501844.tif 000008
である、式Ｉの化合物を提供する。
【００１１】
好ましくはＴは、ＯまたはＮ；Ｕは、ＣＨ２；Ｖは、ＯまたはＮである。
【００１２】
一実施形態においてＴおよびＶは、共にＯである。
【００１３】
別の実施形態において、Ｔは、ＯかつＶは、Ｎである。
【００１４】
別の実施形態においてＴおよびＶは、共にＣＨ２、かつＵは、Ｏである。
【００１５】
本発明は、Ｒ２は好ましくはＨおよびＦから選択され；より好ましくはＲ２はＨである、式Ｉの化合物を提供する。
【００１６】
本発明は、Ａが
【化７】
2016501844.tif 000009
から選択される、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００１７】
本発明は、Ａが
【化８】
2016501844.tif 000010
から選択される、式Ｉの化合物またはその薬学的な塩を提供する。
【００１８】
本発明は、Ａが
【化９】
2016501844.tif 000011
から選択される、式Ｉの化合物またはその薬学的な塩を提供する。
【００１９】
本発明は、Ａが
【化１０】
2016501844.tif 000012
から選択される、式Ｉの化合物またはその薬学的な塩を提供する。
【００２０】
本発明は、Ａが
【化１１】
2016501844.tif 000013
から選択される、式Ｉの化合物またはその薬学的な塩を提供する。
【００２１】
本発明は、Ａが
【化１２】
2016501844.tif 000014
から選択される、式Ｉの化合物またはその薬学的な塩を提供する。
【００２２】
本発明は、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供する：
【化１３】
2016501844.tif 000015
（式中、Ｌは、−ＣＨ２−および−ＣＨ２ＣＨ２−から選択され；Ｒ１は−ＣＨ３および−ＣＦ３から選択され；Ａは
【化１４】
2016501844.tif 000016
から選択される）。
【００２３】
本発明は、Ａが
【化１５】
2016501844.tif 000017
またはその薬学的な塩である、式Ｉの化合物を提供する。
【００２４】
本発明は、
【化１６】
2016501844.tif 000018
またはその薬学的な塩である、化合物を提供する。
【００２５】
本発明は、
【化１７】
2016501844.tif 000019
またはその薬学的な塩である、化合物を提供する。
【００２６】
本発明は、上式Ｉによる化合物またはその薬学的に許容可能な塩および薬学的に許容可能な担体、希釈剤もしくは賦形剤のうちの少なくとも１種を含む医薬組成物を提供する。
【００２７】
本発明は、高トリグリセリド血症の治療の必要がある患者を治療する方法を提供する。この方法は、有効量の上式Ｉによる化合物またはその薬学的に許容可能な塩を患者に投与するステップを含む。
【００２８】
本発明は、高トリグリセリド血症の治療を必要とする患者を治療する方法を提供する。この方法は、上式Ｉによる化合物またはその薬学的に許容可能な塩および薬学的に許容可能な担体、希釈剤もしくは賦形剤のうちの少なくとも１種を含む有効量の医薬組成物を患者に投与するステップを含む。
【００２９】
本発明は、療法における使用のための、式Ｉによる化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００３０】
本発明は、高トリグリセリド血症の治療における使用のための、式Ｉによる化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００３１】
本発明は、高トリグリセリド血症を治療する薬品の製造のための、式Ｉによる化合物またはその薬学的に許容可能な塩の使用を提供する。
【００３２】
「薬学的に許容可能な塩」と言う語は、臨床および／または獣医用途のために許容可能であると考えられる本発明の化合物の塩を指す。薬学的に許容可能な塩およびそれらを調製するための一般的方法論は、当技術分野において既知である。例えば、Ｐ．  Ｓｔａｈｌら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ、（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００２）、Ｓ．Ｍ．  Ｂｅｒｇｅら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｖｏｌ．６６、Ｎｏ．１、１９７７年１月を参照されたい。
【００３３】
本明細書で使用する場合治療を必要とする患者は、哺乳動物、好ましくはヒト、イヌやネコなどのコンパニオンアニマルまたは家禽を指す。
【００３４】
本発明の医薬製剤は、担体、希釈剤および／または賦形剤を含めた既知の原料を用いて当技術分野における既知の手順によって調製してよい。本明細書で使用する場合「薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤」と言う語は、製剤の他の原料と適合し、患者に対して有害ではない１種または複数の担体、希釈剤および賦形剤を指す。それらの調製のための医薬組成物およびプロセスは、当技術分野において既知であり、例はレミントン、「Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら版  第１９版  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）の中で見つけることができる。デンプン、ショ糖、マンニトールおよびシリカ誘導体、カルボキシメチルセルロースおよび他のセルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチンならびにポリビニル−ピロリドンなどの結合剤を含めた薬学的に許容可能な担体、賦形剤および希釈剤の非限定的な例は、こうした処方に適する。
【００３５】
それとは反対の注記がない限り、本明細書に例示される化合物は、ＡＣＤＬＡＢＳまたはＳｙｍｙｘ  Ｄｒａｗ  ３．２のいずれかを用いて命名および番号付けされる。
【００３６】
一般化学
本明細書で使用する場合、以下の語は示される意味を有する：「ＡＣＮ」はアセトニトリルを指し、「ＤＣＭ」はジクロロメタンを指し、「ＤＥＡ」はジエチルアミンを指し、「ＤＭＥＡ」はジメチルエチルアミンを指し、「ＤＭＦ」はジメチルホルムアミドを指し、「ｅｅ」は鏡像体過剰率を指し、「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルを指し、「ＥｔＯＨ」はエタノールを指し、「ＩＰＡ」はイソプロピルアルコールを指し、「ＩＰＡ」はイソプロピルアミンを指し、「異性体１」は本明細書で除外した条件下での第１の溶出異性体を指し、「異性体２」は本明細書で除外した条件下での第２の溶出異性体を指し、「ＬＣ／ＭＳ」は液体クロマトグラフィーとそれに続く質量分析を指し、「ＭｅＯＨ」はメタノールを指し、「ＭＳ」は質量分析を指し、「ＮＭＲ」は核磁気共鳴を指し、「Ｐｒｅｐ」は調製を指し、「ＳＦＣ」は超臨界流体クロマトグラフィーを指し、「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを指す。
【００３７】
スキーム１は、式Ｉの化合物の一般的合成を例示する。
【化１８】
2016501844.tif 000020
【００３８】
市販されているまたは既知の文献の方法によって合成される置換アミン化合物１を、還元的アミノ化条件下でこれも当業者に一般に既知であるアルデヒド化合物２と反応させて式３の化合物を提供する（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ：  ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、第２版、８３５〜８４６頁、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、（１９９９）を参照のこと）。より具体的には、置換アミン化合物１を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中でトリアセトキシ水素化ホウ素などの還元剤および酢酸などの酸の存在下でアルデヒド化合物２と反応させて式３の化合物を提供する。式３の化合物は、塩に変換してもよく、例えば塩酸で、塩酸塩を形成する。特定の鏡像異性体またはジアステレオマー（ｄｉａｓｔｅｒｉｏｍｅｒ）は、所望に応じてＲまたはＳ構造のいずれかを有するキラルアルデヒド２で開始することにより調製してよい。
【００３９】
調製１
（Ｎ−Ｚ）−Ｎ−［（４−ブロモフェニル）メチレン］−（Ｒ）−２−メチル−プロパン−２−スルフィンアミド
【化１９】
2016501844.tif 000021
【００４０】
（Ｒ）−２−メチルプロパン−２−スルフィンアミド（４０．５ｇ、０．３３ｍｏｌ）を、トルエン（２８３ｍＬ）中の４−ブロモベンズアルデヒド（６５．５７ｇ、０．３５ｍｏｌ）の溶液に一部ずつ（ｐｏｒｔｉｏｎ−ｗｉｓｅ）加える。混合物を周囲温度で１５分間撹拌し、次いで水酸化ナトリウム（１．３４ｇ、０．３３ｍｏｌ）を加える。懸濁液を周囲温度で１２時間撹拌する。硫酸ナトリウム（１６ｇ）およびＣｅｌｉｔｅ（登録商標）（１６ｇ）を加えて、懸濁液を１５分間撹拌する。ろ過して、ろ液を減圧下で濃縮する。ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（ヘキサン１００％〜７０％）で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、標記化合物を白色固体として与える（８５．５ｇ、収率８８％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２８８（Ｍ＋１）。
【００４１】
調製２
Ｎ−［（１Ｓ）−１−（４−ブロモフェニル）−２，２，２−トリフルオロ−エチル］−（Ｒ）−２−メチル−プロパン−２−スルフィンアミド
【化２０】
2016501844.tif 000022
【００４２】
生の（トリフルオロメチル）トリメチルシラン（１０９ｍＬ、０．７４ｍｏｌ）を、撹拌した酢酸テトラブチルアンモニウム（８８ｇ、０．２９ｍｏｌ）および（Ｎ−Ｚ）−Ｎ−［（４−ブロモフェニル）メチレン］−（Ｒ）−２−メチル−プロパン−２−スルフィンアミド（８５ｇ、０．２９ｍｏｌ）のＤＭＦ（１．２Ｌ）溶液に０℃で加える。混合物を０〜５℃で９０分間撹拌する。塩化アンモニウムの飽和水溶液（１．２Ｌ）を加えて、ＥｔＯＡｃ（４ｘ４００ｍＬ）で抽出する。有機抽出物を混ぜ合わせ、抽出物を連続的に水、次いで塩水で洗い（２ｘ１Ｌ）、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮する。残留物をヘキサン（２００ｍＬ）で１０分間粉砕し、ろ過し、減圧下で乾燥して、標記化合物を黄色個体として与える（８１ｇ、収率７６％、＞９８ｄｅ）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３５８（Ｍ＋１）。
【００４３】
調製３
（１Ｓ）−１−（４−ブロモフェニル）−２，２，２−トリフルオロエタンアミン
【化２１】
2016501844.tif 000023
【００４４】
ＨＣｌ（ジオキサン中４Ｍ、２２６ｍＬ、０．９ｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（６７０ｍＬ）中のＮ−［（１Ｓ）−１−（４−ブロモフェニル）−２，２，２−トリフルオロ−エチル］−（Ｒ）−２−メチル−プロパン−２−スルフィンアミド（８１ｇ、０．２３ｍｏｌ）の懸濁液に加える。周囲温度で１時間撹拌する。溶媒を減圧下で除去し、残留物をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２００ｍＬ）で１０分間粉砕して、標記化合物のＨＣｌ塩を褐色固体として提供する。塩を水に溶解して、混合物のｐＨが１０になるまで２Ｎ  ＮａＯＨ溶液を加える。混合物をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（３ｘ５００ｍＬ）で抽出する。混ぜ合わせた有機抽出物を水で、次いで塩水（それぞれ５００ｍＬ）洗い、ＭｇＳＯ４上で乾燥、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮して標記化合物を黄色個体として提供する（４６ｇ、収率８０％、ｅｅ９８％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３５８（Ｍ＋１）。
【００４５】
調製４
Ｎ−［（１Ｓ）−１−（４−ブロモフェニル）−２，２，２−トリフルオロ−エチル］メタンスルホンアミド
【化２２】
2016501844.tif 000024
【００４６】
塩化メタンスルホニル（１６．４２ｍＬ、０．２１ｍｏｌ）を、ＤＣＭ（２５０ｍＬ）中の（１Ｓ）−１−（４−ブロモフェニル）−２，２，２−トリフルオロエタンアミン（４９ｇ、０．１９ｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（１．１８ｇ、９．０ｍｍｏｌ）、２，６−ルチジン（６７ｍＬ、０．５７ｍｏｌ）の混合物に０℃で滴下して加える。混合物を周囲温度に温めて、その温度で２０時間混合物を撹拌する。反応混合物をＤＣＭ（３００ｍＬ）で希釈して、それをＨＣｌ水溶液（２Ｍ、２ｘ２００ｍＬ）、水（２５０ｍＬ）、次いで塩水（２５０ｍＬ）で連続的に洗う。有機相を回収し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過して、ろ液を減圧下で濃縮する。残留物をヘキサン（２００ｍＬ）で１０分間粉砕し、ろ過し、固体を減圧下で乾燥して、標記化合物を薄褐色固体として提供する（６０ｇ、収率９３％、ｅｅ９８％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３３２（Ｍ＋１）。
【００４７】
調製５
Ｎ−［（１Ｓ）−２，２，２−トリフルオロ−１−（４−ホルミルフェニル）エチル］メタンスルホンアミド
【化２３】
2016501844.tif 000025
【００４８】
Ｎ−［（１Ｓ）−１−（４−ブロモフェニル）−２，２，２−トリフルオロ−エチル］メタンスルホンアミド（３０ｇ、９０ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（ＩＩ）（０．８１ｇ、３．６ｍｍｏｌ）、ブチルジ−１−アダマンチルホスフィン（３．８９ｇ、１０．８４ｍｍｏｌ）およびテトラメチルエチレンジアミン（１０．５０ｇ、９０ｍｍｏｌ）ならびにトルエン（１．５ｍＬ）を、２ＬのＰＡＲＲ反応器内で混ぜ合わせる。反応器を合成ガス（７５ｐｓｉで１：１のＣＯ／Ｈ２）で充填し、次いでそれを密封する。反応混合物を９５℃に加熱して１６時間撹拌する。混合物を冷却し、排気し、次いで反応器を開放する。混合物を、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）を通してろ過し、ろ液を減圧下で濃縮する。ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（８：２から１：１）で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、標記化合物を与える（２２．８ｇ、９０％、ｅｅ８０％）。キラルカラム（Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＳ−Ｈ（２．１ｘ２５ｃｍ、５ｕＭ）ＣＯ２／ＥｔＯＨ（９：１））を用いることによりキラル純度を高めて標記化合物を提供する（１９ｇ、収率７５％、ｅｅ９８％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２８２（Ｍ＋１）。
【００４９】
調製６
Ｎ−［（１Ｒ）−１−（４−ブロモフェニル）エチル］メタンスルホンアミド
【化２４】
2016501844.tif 000026
【００５０】
塩化メタンスルホニル（１３．４４ｍＬ、０．１７ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（２５０ｍＬ）中の（１Ｒ）−１−（４−ブロモフェニル）エタンアミン（２５ｇ、０．１２ｍｏｌ）およびトリエチルアミン（５１ｍＬ、０．３６ｍｏｌ）の混合物に０℃で加える。周囲温度に温めて２．５時間撹拌する。反応混合物を、ＨＣｌ水溶液（２Ｍ、１００ｍＬ）で洗う。有機相を、水、次いで塩水で連続的に洗う（２ｘ１００ｍＬ）。有機相を、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮して残留物を提供する。残留物をヘキサン（１５０ｍＬ）で粉砕し、ろ過し、減圧下で乾燥して標記化合物を黄色個体として与える（３３．２４ｇ、９６％、ｅｅ＞９８％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２７８（Ｍ＋１）。
【００５１】
調製７
Ｎ−［（１Ｒ）−１−（４−ホルミルフェニル）エチル］メタンスルホンアミド
【化２５】
2016501844.tif 000027
【００５２】
Ｎ−［（１Ｒ）−１−（４−ブロモフェニル）エチル］−メタンスルホンアミド（１０ｇ、３５ｍｍｏｌ）、（１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）−フェロセン）パラジウム（ＩＩ）塩化物（７３３ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（３．８１ｇ、３５ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（５０ｍＬ）を、３００ｍＬのＰＡＲＲ反応器内で混ぜ合わせる。トリエチルシラン（１１．６ｍＬ、０．７２ｍｍｏｌ）を加えて、反応器を一酸化炭素で３回パージする。反応器に一酸化炭素を充填し（５０ｐｓｉ）、密封して、混合物を９０℃で１５時間撹拌する。反応器を周囲温度に冷却し、得られる混合物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）パッド上でろ過し、パッドをＤＣＭ（１５０ｍＬ）で洗う。ろ液を回収し、ろ液を水に次いで塩水で連続的に洗う（２ｘ８０ｍＬ）。有機ろ液を減圧下で濃縮して残留物を橙色油として得る。ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（０から３０％のＥｔＯＡｃ）で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、標記化合物を提供する（５．６ｇ、７０％、ｅｅ＞９８％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２２８（Ｍ＋１）。
【００５３】
調製８
２−クロロ−３−［［（２Ｓ）−オキシラン−２−イル］メトキシ］ピリジン
【化２６】
2016501844.tif 000028
【００５４】
（Ｒ）−オキシランメタノール（３２．８５ｇ、４４３．５ｍｍｏｌ）を、２−クロロ−３−ヒドロキシピリジン（５２．２３ｇ、４０３．１８ｍｍｏｌ）とＴＨＦ（１．３４Ｌ）中で混ぜ合わせる。混合物を、固体が溶解するまで撹拌する。これを０℃まで冷却して、トリフェニルホスフィン（１１６．３３ｇ、４４３．５ｍｍｏｌ）をゆっくり加える。全ての固体が溶解した後、アゾジカルボン酸ジイソプロピル（８７．９２ｍＬ、４４３．５ｍｍｏｌ）を、反応の内部温度を１０℃未満に維持するのに十分な遅い速度で２５分掛けて滴下して加える。混合物を３０分間冷却しながら撹拌し、次いで混合物を周囲温度まで温めて、撹拌を一晩継続する。ＥｔＯＡｃを加えて、ＮａＯＨ（２ｘ１．０Ｎ）で洗う。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過して、ろ液を減圧下で濃縮する。残留物を２：１のＥｔ２Ｏ：ヘキサンの混合物で粉砕して、５分間撹拌する。ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮して残留物を提供する。残留物を、０〜６６％ＴＨＦ／ヘキサンのグラジエントで溶出するフラッシュカラムクロマトグラフィー（２ｘ３３０ｇのＳｉＯ２）によって精製する。所望の画分を混ぜ合わせ、減圧下で濃縮して標記化合物を白色固体として提供する（３２．６ｇ、４３．６％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１８６（Ｍ＋１）。
【００５５】
調製９
（２Ｓ）−１−アジド−３−［（２−クロロ−３−ピリジル）オキシ］プロパン−２−オール
【化２７】
2016501844.tif 000029
【００５６】
アジ化ナトリウム（２２．８４ｇ、３５１．３ｍｍｏｌ）を、水（１９５ｍＬ）に溶解する。別個に、２−クロロ−３−［［（２Ｓ）−オキシラン−２−イル］メトキシ］ピリジン（３２．６ｇ、１７５．６ｍｍｏｌ）を、１，４−ジオキサン（８００ｍＬ）に溶解する。水／アジ化ナトリウム溶液をジオキサン溶液にゆっくり加え、９０℃に加熱して、１時間撹拌する。混合物を冷却して、減圧下でそれを濃縮する。水を加え、ＥｔＯＡｃ（２Ｘ）で抽出し、抽出物を混ぜ合わせ、混ぜ合わせた抽出物をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過して、ろ液を回収する。減圧下で溶媒を除去して標記化合物を赤みを帯びた白色固体として提供する（４０．２８ｇ、９２．８％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２２９（Ｍ＋１）。
【００５７】
調製１０
（３Ｓ）−３−（アジドメチル）−２，３−ジヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｂ］ピリジン
【化２８】
2016501844.tif 000030
【００５８】
（２Ｓ）−１−アジド−３−［（２−クロロ−３−ピリジル）オキシ］プロパン−２−オール（４０．２８ｇ、１７６．１７ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（８８０ｍＬ）に溶解して、水素化ナトリウムをゆっくり加える（鉱油中６０％分散液、１４．０９ｇ、３５２．３５ｍｍｏｌ）。混合物を９０℃に加熱して、その温度で２時間撹拌する。混合物を１リットルのパックされた氷にゆっくり注いで反応を失活させる。減圧下でジオキサンを除去して、得られる混合物をＥｔＯＡｃ（３ｘ）で抽出する。混ぜ合わせた抽出物をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過して、ろ液を減圧下で濃縮する。２ｘ３３０ｇのシリカゲルを用いて、ヘキサン中０〜７５％のＥｔ２Ｏのグラジエントで溶出するフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製する。生成物画分を混ぜ合わせ、溶媒を減圧下で除去して標記化合物を黄色個体として提供する（７．５ｇ、２２．１５％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１９３（Ｍ＋１）。
【００５９】
調製１１
［（３Ｓ）−２，３−ジヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］メタンアミン。
【化２９】
2016501844.tif 000031
【００６０】
（３Ｓ）−３−（アジドメチル）−２，３−ジヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｂ］ピリジン（７．５ｇ、３９．０３ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（３９０ｍＬ）に溶解する。混合物を、減圧に掛けることにより脱気し、次いで窒素で充填して戻し（３Ｘ）、１０％のＰｄ／Ｃ（２．０８ｇ、１．９５ｍｍｏｌ）を加え、再び混合物を脱気する。得られる脱気混合物を、周囲温度で水素雰囲気下で１７時間撹拌する。得られる混合物を、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）を通してろ過し、ろ液の溶媒を減圧下で除去して標記化合物を油として提供する（６．５ｇ、１００％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１６７（Ｍ＋１）。
【００６１】
調製１２
３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，４−ベンゾオキサジン−２−カルボニトリル
【化３０】
2016501844.tif 000032
【００６２】
２−クロロ−２−プロペンニトリル（３．０ｇ、３４．３ｍｍｏｌ）、２−アミノフェノール（３．２７ｇ、２９．９６ｍｍｏｌ）、アセトン（５０ｍＬ）および塩化カリウム（５ｇ、３６．１８ｍｍｏｌ）を混ぜ合わせる。混合物を、周囲温度で１６時間撹拌する。混合物をろ過して、ろ過ケークをＥｔＯＡｃで洗う。ろ液を減圧下で濃縮して残留物を与える。石油エーテル中１〜５０％のＥｔＯＡｃのグラジエントを用いて溶出するフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製する。生成物画分を混ぜ合わせ、溶媒を減圧下で除去して標記化合物を提供する（１．５ｇ、２１．６％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１６１（Ｍ＋１）。
【００６３】
調製１３
３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，４−ベンゾオキサジン−２−イルメタンアミン
【化３１】
2016501844.tif 000033
【００６４】
３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，４−ベンゾオキサジン−２−カルボニトリル（６００ｍｇ、３．７５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）に加え、次いで水素化アルミニウムリチウム（ＴＨＦ中１．０Ｍ、１ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）をゆっくり加える。混合物を周囲温度で３０分間撹拌する。Ｈ２Ｏ（１ｍＬ）加えて反応を失活させ、ろ過し、ろ過ケークをＥｔＯＡｃで洗う。ろ液を、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮して残留物を与える。得られる化合物を、ＤＣＭ中２０〜５０％のＭｅＯＨのグラジエントを用いるフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製する。所望の画分を混ぜ合わせ、溶媒を減圧下で除去して標記化合物を白色固体として提供する（３９０ｍｇ、６３．１％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１６５（Ｍ＋１）。
【００６５】
調製１４
４−（２，２−ジエトキシエチル）−１，４−ベンゾオキサジン−３−オン
【化３２】
2016501844.tif 000034
【００６６】
Ｈ−１，４−ベンゾオキサジン−３（４Ｈ）−オン（１．０ｇ、６．６４ｍｍｏｌ）を、ジメチルアセトアミド（５ｍＬ）に溶解し、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１．５４ｇ、１３．２８ｍｍｏｌ）を加えて、周囲温度で５分間撹拌する。２−ブロモ−１，１−ジエトキシエタン（１０．１ｍＬ、６６．４ｍｍｏｌ）およびテトラ−Ｎ−ブチルアンモニウムヨウ化物（２．４９ｇ、６．６４ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を８０℃に加熱して、２時間撹拌する。その後反応を周囲温度まで冷却させる。反応混合物をＥｔ２Ｏおよび水で希釈し、層を分離して、追加のＥｔ２Ｏで水層を抽出する。有機抽出物を混ぜ合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過して、ろ液を減圧下で濃縮する。ヘキサン中０％、１０％、２０％および３０％のＥｔＯＡｃのステップグラジエントを用いるフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製する。所望の画分を濃縮して標記化合物をワックス状固体として与える（１．６５ｇ、９３．７％）。１Ｈ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．３６−７．３２（ｍ，１Ｈ）、７．０３−６．９７（ｍ，３Ｈ）、４．７８（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ）、４．５９（ｓ，２Ｈ）、４．０２（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ）、３．８１−３．７０（ｍ，２Ｈ）、３．５８−３．４８（ｍ，２Ｈ）、１．１６（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，６Ｈ）。
【００６７】
調製１５
２−（３−オキソ−１，４−ベンゾオキサジン−４−イル）アセトアルデヒド
【化３３】
2016501844.tif 000035
【００６８】
４−（２，２−ジエトキシエチル）−１，４−ベンゾオキサジン−３−オン（７１０ｍｇ、２．６８ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（５．３５ｍＬ）に溶解して、ＨＣｌ水溶液（３Ｍ、３．５７ｍＬ、１０．７ｍｍｏｌ）を加える。周囲温度で７時間撹拌する。窒素ガス流を用いて有機溶媒を除去し、水性残留物をＥｔＯＡｃで抽出する。有機抽出物を混ぜ合わせ、水およびＮａＨＣＯ３飽和水溶液で洗い、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥する。ろ過し、減圧下でろ液から溶媒を除去して標記化合物を白色固体として提供する（４９０ｍｇ、８９．０７％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１９２（Ｍ＋１）。
【００６９】
調製１６
４−（２−アミノエチル）−１，４−ベンゾオキサジン−３−オン
【化３４】
2016501844.tif 000036
【００７０】
酢酸アンモニウム（１．３ｇ、１６．１９ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＨ（１５．６９ｍＬ）に溶解し、２−（３−オキソ−１，４−ベンゾオキサジン−４−イル）アセトアルデヒド（１５０ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（１５５．７ｍｇ、２．３５ｍｍｏｌ）およびアンモニア水（３２％、５．６４ｇ、１０５．９１ｍｍｏｌ）を加える。密閉可能なチューブを混合物で充填して、チューブを密封する。８０℃に加熱して、一晩撹拌する。その後混合物を周囲温度まで冷却させ、減圧下で溶媒を除去する。ＥｔＯＡｃを加え、塩水、ＮａＨＣＯ３（飽和、水性）で洗い、乾燥し、ろ過して、ろ液を減圧下で濃縮する。ＤＣＭ中５％、１０％および２０％のＭｅＯＨのステップグラジエントで溶出するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製する。所望の画分を混ぜ合わせ、溶媒を減圧下で除去して標記化合物を提供する（１７０ｍｇ、８０％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１９３（Ｍ＋１）。
【００７１】
調製１７
３−（１−オキソ−３，４−ジヒドロイソキノリン−２（１Ｈ）−イル）プロパン酸メチル
【化３５】
2016501844.tif 000037
【００７２】
３，４−ジヒドロイソキノリン−１（２Ｈ）−オン（５００ｍｇ、３．４０ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解し、水酸化ナトリウム（２７４．５ｍｇ、６．７９ｍｍｏｌ）を加え続いてＴＨＦ（１ｍＬ）中のアクリル酸メチル（４３８．７ｍｇ、５．１０ｍｍｏｌ）を加える。混合物を、周囲温度で３時間撹拌し、水（２０ｍＬ）で失活させ、次いでＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈する。得られる混合物を塩水で洗い、有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮して標記化合物を黄色油として提供する（５３０ｍｇ、６６．９％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２３４（Ｍ＋１）。
【００７３】
調製１８
３−（１−オキソ−３，４−ジヒドロイソキノリン−２（１Ｈ）−イル）プロパン酸
【化３６】
2016501844.tif 000038
【００７４】
３−（１−オキソ−３，４−ジヒドロイソキノリン−２（１Ｈ）−イル）プロパン酸メチル（０．３ｇ、１．２９ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１２ｍＬ）およびＭｅＯＨ（４ｍＬ）に溶解する。水酸化リチウム（４ｍＬのＨ２Ｏ中、０．２ｇ、８．２３ｍｍｏｌ）を加える。周囲温度で２時間撹拌する。反応混合物から溶媒を減圧下で蒸発させる。２Ｎ  ＨＣｌでｐＨを５に調整する。ＥｔＯＡｃ（６０ｍＬ）を加え、塩水で洗い、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮して標記化合物を提供する（無色油、０．２７ｇ、９５．８％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２２０（Ｍ＋１）。
【００７５】
調製１９
カルバミン酸２−（１−オキソ−３，４−ジヒドロイソキノリン−２（１Ｈ）−イル）エチルｔｅｒｔ−ブチル
【化３７】
2016501844.tif 000039
【００７６】
３−（１−オキソ−３，４−ジヒドロイソキノリン−２（１Ｈ）−イル）プロパン酸（１５０ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）、ジフェニルホスホン酸アジド（４８９．５５ｍｇ、１．７８ｍｍｏｌ）、ｔ−ブチルアルコール（１０ｍＬ）およびトリエチルアミン（２０７．７ｍｇ、２．０５ｍｍｏｌ）を混ぜ合わせる。混合物を加熱して還流させ、一晩撹拌する。減圧下で濃縮し、１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭを用いるｐｒｅｐ−ＴＬＣによって残留物を精製して標記化合物を無色油として溶出する（２７０ｍｇ、６８．０％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２３５（Ｍ−ｔＢｕ＋１）。
【００７７】
調製２０
（１−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−イル）メチルメタンスルホナート
【化３８】
2016501844.tif 000040
【００７８】
３−（ヒドロキシメチル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−オン（６．０ｇ、３３．８６ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（６０ｍＬ）に溶解して、トリエチルアミン（７．２５ｇ、６７．７２ｍｍｏｌ）を加える。０℃に冷却して、塩化メタンスルホニル（４．６５ｇ、４０．６３ｍｍｏｌ）を滴下で加える。１時間撹拌し、ＤＣＭで希釈し、水、次いで塩水で洗う。減圧下で溶媒を除去して標記化合物を与える（８．０ｇ、９２％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２５６（Ｍ＋１）。
【００７９】
調製２１
３−（アジドメチル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−オン
【化３９】
2016501844.tif 000041
【００８０】
（１−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−イル）メチルメタンスルホナート（３ｇ、１１．７ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解する。ＮａＮ３を加え、７０℃に加熱して、一晩撹拌する。減圧下で濃縮し、水を加えて、ＥｔＯＡｃで抽出する。抽出物を混ぜ合わせ、溶媒を減圧下で除去して標記化合物を提供する（１．７ｇ、７１．５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．１（ｓ，１Ｈ）、７．６（ｍ，１Ｈ）、７．５（ｍ，１Ｈ）、７．０（ｓ，１Ｈ）、３．９（ｍ，１Ｈ）、３．５（ｍ，２Ｈ）、３．０（ｍ，２Ｈ）。
【００８１】
調製２２
３−（アミノメチル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−オン
【化４０】
2016501844.tif 000042
【００８２】
３−（アジドメチル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−オン（１．８ｇ、８．９ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ）に溶解する。窒素雰囲気下で１０％のＰｄ／Ｃ（０．２ｇ）を加え次いで水素雰囲気下で一晩撹拌する。Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）を通して反応混合物をろ過し、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）をＥｔＯＡｃで洗う。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１７７（Ｍ＋１）。
【００８３】
調製２３
３−（アミノメチル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−オン、異性体１
【化４１】
2016501844.tif 000043
【００８４】
３−（アミノメチル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−オン（３６０ｍｇ、１．７０ｍｍｏｌ）の鏡像異性体を、キラルクロマトグラフィー条件Ｌ（下記参照）を用いて分離し、第１の溶出異性体を回収して標記化合物を提供する（１４０ｍｇ、４７％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１７７（Ｍ＋１）。
【００８５】
調製２４
Ｎ−［２−（２−オキソ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イル）エチル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化４２】
2016501844.tif 000044
【００８６】
２−（３Ｈ）−ベンゾオキサゾロン（０．４ｇ、２．９ｍｍｏｌ）、２−ブロモエチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（７１５．１４ｍｇ、３．１９ｍｍｏｌ）、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（５０８．７ｍｇ、４．３５ｍｍｏｌ）、ヨウ化カリウム（０．１ｇ、０．６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（６ｍＬ）中で混ぜ合わせる。８０℃に加熱して、混合物を一晩撹拌する。ろ過し、ろ液を回収し、ＨＰＬＣ条件Ｍ（下記参照）によって精製して標記化合物を油状固体として提供する（０．５３ｇ、６５．６％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２２３（Ｍ−ｔＢｕ＋１）。
【００８７】
調製２５
１−シクロプロピル−２−（（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メトキシ）エタノン
【化４３】
2016501844.tif 000045
【００８８】
フラスコを（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メタノール（１０ｇ、７５．７ｍｍｏｌ）で充填し、８５℃に加熱して、新しく切断したナトリウム（４６５ｍｇ、２０．２３ｍｍｏｌ）を加える。８５℃に加熱して、１時間撹拌する。２−ブロモ−１−シクロプロピルエタノン（３．０ｇ、１８．４ｍｍｏｌ）を加え温度を８５℃に維持して、３０分間撹拌する。ろ過して、固体をＡＣＮ（２０ｍＬ）で洗う。ろ液を回収して、減圧下で濃縮する。ＨＰＬＣ条件Ｚによって精製して標記化合物を無色油として与える。（６５０ｍｇ、１６．５％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２１５（Ｍ＋１）。
【００８９】
調製２６
１−シクロプロピル−２−（（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メトキシ）エタノール
【化４４】
2016501844.tif 000046
【００９０】
１−シクロプロピル−２−（（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メトキシ）エタノン（１．２ｇ、５．６ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）およびテトラヒドロホウ酸ナトリウム（３１０ｍｇ、８．１９ｍｍｏｌ）を溶解する。周囲温度で１時間撹拌する。減圧下で濃縮する。水（３０ｍＬ）を加えて、ＥｔＯＡｃ（３ｘ）で抽出する。抽出物を混ぜ合わせ、塩水で洗い、ＭｇＳＯ４上で乾燥する。ろ過し、ろ液を回収し、溶媒を減圧下で除去して標記化合物を無色油として与える（１．２ｇ、９９％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１９９（Ｍ−Ｈ２Ｏ＋１）。
【００９１】
調製２７
３−（２−シクロプロピル−２−ヒドロキシエトキシ）プロパン−１，２−ジオール
【化４５】
2016501844.tif 000047
【００９２】
１−シクロプロピル−２−（（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メトキシ）エタノール（１．１ｇ、５．０９ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（２０ｍＬ）に溶解し、ＨＣｌ（Ｅｔ２Ｏ中１Ｍ、１８ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）を加える。周囲温度で３時間撹拌する。減圧下で濃縮して標記生成物を無色油として提供する（８８０ｍｇ、９８．２％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１９９（Ｍ＋２３）。
【００９３】
調製２８
２−（アリルオキシ）−２−フェニル酢酸
【化４６】
2016501844.tif 000048
【００９４】
２−ヒドロキシ−２−フェニル酢酸メチル（１．５ｇ、９．０３ｍｍｏｌ）および３−ブロモプロパ−１−エン（１．６ｇ、１３．２３ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１５ｍＬ）に溶解する。酸化銀（４．１５ｇ、１７．９１ｍｍｏｌ）を加え、マイクロ波照射で８０℃に２時間加熱する。材料をろ過して、固体をＴＨＦ（３０ｍＬ）ですすぎ、ろ液を減圧下で濃縮する。ＤＣＭおよび石油エーテルの溶液（１：１）を用いるフラッシュクロマトグラフィーによって精製して標記化合物を無色油として提供する（６００ｍｇ、３２．２％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２０７（Ｍ＋１）。
【００９５】
調製２９
２−（アリルオキシ）−２−フェニル酢酸
【化４７】
2016501844.tif 000049
【００９６】
２−（アリルオキシ）−２−フェニル酢酸（１．２ｇ、５．８２ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（４０ｍＬ）に溶解し、水素化アルミニウムリチウム（ＴＨＦ中１Ｍ、６．４０ｍＬ、６．４ｍｍｏｌ）を注射器で加える。２時間撹拌し、氷水（６５０ｍｇ）を加えて反応を失活させ、さらに２０分間撹拌する。ろ過して、固体をＴＨＦ（２０ｍＬ）で洗う。ろ液を減圧下で濃縮して標記化合物を無色油として与える（８５０ｍｇ、８１．９７％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１９５（Ｍ＋１８）。
【００９７】
調製３０
２−（オキシラン−２−イルメトキシ）−２−フェニルエタノール
【化４８】
2016501844.tif 000050
【００９８】
２−（アリルオキシ）−２−フェニル酢酸（８５０ｍｇ、４．７７ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（４０ｍＬ）に溶解し、ｍ−クロロペルオキシ安息香酸（１．５ｇ、８．６９ｍｍｏｌ）を一度に（ｉｎ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｏｒｔｉｏｎ）加える。周囲温度で一晩撹拌する。減圧下で濃縮し、ＤＣＭ中１０％のＭｅＯＨを用いて溶出するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製する。減圧下で溶媒を除去して生成物を無色油として与える（９００ｍｇ、９７．２％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１９５（Ｍ＋１）。
【００９９】
調製３１
２−（オキシラン−２−イルメトキシ）−１−フェニルエタノール
【化４９】
2016501844.tif 000051
【０１００】
本質的に調製３０の方法によって２−（オキシラン−２−イルメトキシ）−１−フェニルエタノールを調製する。ＭＳ（ｍ／ｚ  ２１２（Ｍ＋１８）。
【０１０１】
調製３２
ｔｒａｎｓ−（５−フェニル−１，４−ジオキサン−２−イル）メタノール
【化５０】
2016501844.tif 000052
【０１０２】
ｔｒａｎｓ−２−（オキシラン−２−イルメトキシ）−２−フェニルエタノール（８００ｍｇ、４．１２ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのＤＣＭに溶解し、（１Ｓ）−（＋）−１０−カンファースルホン酸（９５ｍｇ、０．４０９ｍｍｏｌ）を加える。混合物を加熱して還流させ、一晩撹拌する。減圧下で濃縮し、クロマトグラフィー条件Ｒ（下記参照）により精製して標記化合物を提供する（３３０ｍｇ、４１．２５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．３２（ｍ，５Ｈ）、４．５５（ｍ，１Ｈ）、３．９６（ｍ，２Ｈ）、３．７９−３．５２（ｍ，５Ｈ）。
【０１０３】
表１における以下の化合物は、本質的に調製３２の方法によって調製される。
【表１】
2016501844.tif 000053
【０１０４】
調製３５
ｔｒａｎｓ５−フェニル−１，４−ジオキサン−２−イル）メチルベンゼンスルホナート
【化５１】
2016501844.tif 000054
【０１０５】
ｔｒａｎｓ−５−フェニル−１，４−ジオキサン−２−イル）メタノール（３１１ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）、塩化ｐ−トルエンスルホニル（３３６ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルピリジンアミン（１９５ｍｇ、１．５７ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．３５ｍＬ、２．５１ｍｍｏｌ）およびＤＣＭ（２０ｍＬ）を混ぜ合わせる。反応を、周囲温度で一晩撹拌する。減圧下で濃縮して残留物を提供する。ＤＣＭで溶出するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製する。所望の画分を混ぜ合わせ、溶媒を減圧下で除去して標記化合物を白色固体として提供する（５１０ｍｇ、９１．４％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３４９（Ｍ＋１）。
【０１０６】
表２における以下の化合物は、本質的に調製３５の方法によって調製される。
【表２】
2016501844.tif 000055
【０１０７】
調製３８
ｔｒａｎｓ−２−アジドメチル−５−フェニル−１，４−ジオキサン
【化５２】
2016501844.tif 000056
【０１０８】
ｔｒａｎｓ−５−フェニル−１，４−ジオキサン−２−イル）メチルベンゼンスルホナート（５１０ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解する。アジ化ナトリウム（１５２ｍｇ、２．３４ｍｍｏｌ）を一度にＤＭＦ溶液に加える。混合物を１０５℃に加熱して、２時間撹拌する。Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ）で失活させて、ＥｔＯＡｃ（３ｘ２０ｍＬ）で抽出する。有機抽出物を塩水で洗い、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、ろ液を濃縮して標記化合物を無色油として提供する。（３１９ｍｇ、９９．４％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２４２（Ｍ＋２３）。
【０１０９】
表３における以下の化合物は、本質的に調製３８の方法によって調製される。
【表３】
2016501844.tif 000057
【０１１０】
調製４１
（ｔｒａｎｓ−５−フェニル−１，４−ジオキサン−２−イル）メタンアミン
【化５３】
2016501844.tif 000058
【０１１１】
ｔｒａｎｓ−２−アジドメチル−５−フェニル−１，４−ジオキサン（３１９ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（７６５ｍｇ、２．９２ｍｍｏｌ）ならびにＴＨＦ（２０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（５ｍＬ）を混ぜ合わせる。反応混合物を、室温で一晩撹拌する。反応にＤｏｗｅｘ  ＡＧ  ５０Ｗ−Ｘ８陽イオン交換樹脂（アンモニウム型、２００〜４００メッシュ、１ｇ）を加え、周囲温度で２０分間撹拌する。ろ過し、樹脂をＴＨＦ（１０ｍＬ）、次いでＨ２Ｏ（１０ｍＬ）で連続的に洗う。ＳＣＸ樹脂をＭｅＯＨ中のＮＨ３（１２０ｍＬ  ７Ｎ）ですすぐことにより溶出させ、ろ液を減圧下で濃縮して標記化合物を無色油として提供する（２８０ｍｇ、９９．６％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１９４（Ｍ＋１）。
【０１１２】
表４における以下の化合物は、本質的に調製４１の方法によって調製される。
【表４】
2016501844.tif 000059
【実施例】
【０１１３】
実施例１
Ｎ−｛（１Ｓ）−１−［４−（｛［（３Ｓ）−２，３−ジヒドロ［１，４］ジオキシノ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イルメチル］アミノ｝メチル）フェニル］−２，２，２−トリフルオロエチル｝メタンスルホンアミド塩酸塩
【化５４】
2016501844.tif 000060
【０１１４】
［（３Ｓ）−２，３−ジヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］メタンアミン（９．７１ｇ、５８．４ｍｍｏｌ）、Ｎ−［（１Ｓ）−２，２，２−トリフルオロ−１−（４−ホルミルフェニル）−エチル］−メタンスルホンアミド（１６．４３ｇ、５８．４ｍｍｏｌ）およびＭｅＯＨ（２９２ｍＬ）を混ぜ合わせる。４Å分子篩（３０ｍＬ）を加え、混合物を周囲温度で窒素雰囲気下で１時間撹拌する。水素化ホウ素ナトリウム（８．８４ｇ、２３３．７ｍｍｏｌ）を一部ずつ加え、周囲温度で１０分間撹拌し、反応をＭＳおよび１Ｈ  ＮＭＲによって観察する。Ｈ２Ｏをゆっくり加えて反応を失活させ、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）を通してろ過する。ろ液を回収し、溶媒を減圧下で除去し、（５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）中０〜１００％の（ＤＣＭ中５％（２Ｎ  ＮＨ３／ＭｅＯＨ））のグラジエントを用いて生成物を溶出するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製する。生成物画分を混ぜ合わせ、溶媒を減圧下で除去して残留物として遊離塩基を与える。残留物を、ＤＣＭに溶解し、撹拌しながらＨＣｌ（Ｅｔ２Ｏ中１Ｎ、８７．７ｍＬ、８７．７ｍｍｏｌ）を加える。追加の完了後に１０分間撹拌し、次いで溶媒を減圧下で除去して標記生成物を白色固体として提供する（１２．９ｇ、４７．３％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４３２（Ｍ−Ｃｌ）。
【０１１５】
表５における以下の実施例は、本質的に実施例１の方法によって調製してよい。表５における以下の実施例は全て、キラル出発原料から開始することによりならびに／またはクロマトグラフのカラムおよび下記に特定される条件を用いることにより単一の異性体として単離された。
【表５−１】
2016501844.tif 000061
【表５−２】
2016501844.tif 000062
【表５−３】
2016501844.tif 000063
【表５−４】
2016501844.tif 000064
【表５−５】
2016501844.tif 000065
【表５−６】
2016501844.tif 000066
【０１１６】
実施例３１
Ｎ−｛（１Ｓ）−２，２，２−トリフルオロ−１−［４−（｛［２−（１−オキソ−３，４−ジヒドロイソキノリン−２（１Ｈ）−イル）エチル］アミノ｝メチル）フェニル］エチル｝メタンスルホンアミド塩酸塩
【化５５】
2016501844.tif 000067
【０１１７】
２−（１−オキソ−３，４−ジヒドロイソキノリン−２（１Ｈ）−イル）エチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２２０ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（３ｍＬ）に溶解して、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ、１３．２３ｍｍｏｌ）を加える。周囲温度で３０分間撹拌する。混合物を減圧下で濃縮し、次いで１，２−ジクロロエタン（２０ｍＬ）に溶解する。Ｎ−［（１Ｓ）−２，２，２−トリフルオロ−１−（４−ホルミルフェニル）−エチル］−メタンスルホンアミド（１５０ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）、酢酸（０．０５ｍＬ、０．８７ｍｍｏｌ）およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（６４２．３ｍｇ、３．０３ｍｍｏｌ）を加える。混合物を、周囲温度で一晩撹拌する。減圧下で濃縮して残留物を与え、残留物をＭｅＯＨ（２ｍＬ）で希釈する。残留物を、ＤＣＭ中１０％のＭｅＯＨを用いる分取（ｐｒｅｐａｒａｔｏｒｙ）ＴＬＣにより精製して無色油を与える。油をＭｅＯＨ（３ｍＬ）に溶解して、ＨＣｌ（ジエチルエーテル中１Ｍ、０．５ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）を加え、３０分間撹拌する。減圧下で濃縮して標記化合物を白色固体として与える（１０ｍｇ、３．７％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４５６（Ｍ−Ｃｌ）。
【０１１８】
実施例３２
Ｎ−｛（１Ｓ）−２，２，２−トリフルオロ−１−［４−（｛［２−（２−オキソ−１，３−ベンゾオキサゾール−３（２ｈ）−イル）エチル］アミノ｝メチル）フェニル］エチル｝メタンスルホンアミド塩酸塩
【化５６】
2016501844.tif 000068
【０１１９】
Ｎ−｛（１Ｓ）−２，２，２−トリフルオロ−１−［４−（｛［２−（２−オキソ−１，３−ベンゾオキサゾール−３（２ｈ）−イル）エチル］アミノ｝メチル）フェニル］エチル｝メタンスルホンアミド塩酸塩を、本質的に実施例３１のための調製の方法により調製する。ＭＳ（ｍ／ｚ）４４４（Ｍ−Ｃｌ）。
【０１２０】
表６は、上記の実施例と異なるクロマトグラフィー条件を提供する。
【表６−１】
2016501844.tif 000069
【表６−２】
2016501844.tif 000070
【０１２１】
ＭＯＧＡＴ−２阻害性アッセイ
本アッセイにおいてヒトＭｏＧＡＴ−２に対する化合物のインビトロでの阻害活性を評価する。ＭｏＧＡＴ−２は、腸管トリグリセリド再合成経路においてオレオイル基をオレオイル−ＣｏＡからモノオレオイル−グリセロール（「ＭＡＧ」）に転移してジオレオイル−グリセロール（「ＤＡＧ」）を形成する。本アッセイは、疎水性分子を親水性分子よりも選択的に抽出して１４Ｃ−オレオイル−ＣｏＡを１４Ｃ−ＤＡＧから分離する、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ  Ｅ抽出を利用する。
【０１２２】
遺伝子操作された昆虫のＳＦ９細胞は、ヒトＭｏＧＡＴ−２を発現する。プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅカタログ＃１１８７３５８０００１）で２０ｍＭのＮａＣｌ中の細胞溶解物を調製する。ヒトＭｏＧＡＴ−２を発現しているＳＦ９細胞を、１５，０００ｒｐｍで２０ｘ２秒間ホモジナイズする（ＰＴ−３１００  Ｐｏｌｙｔｒｏｎｅ）。ホモジネートを、１０００ｇで１０分間４℃で遠心分離機にかける。上澄み液を、タンパク質定量および活性試験のために別個のチューブに回収する。モノオレイン酸グリセロール基質（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ＣＡＳ＃２５４９６−７２−４）を、クロマトグラフィー的に精製する。リン脂質小胞（ジオレオイルホスファチジルコリン「ＤＯＰＣ」）中のモノアシルグリエロール（ｍｏｎｏａｃｙｌｇｌｙｅｒｏｌ）（ＭＡＧ）基質を調製する。ＭＡＧ／ＤＯＰＣ小胞を、総脂質（ＭＡＧおよびＤＯＰＣ）の２０ｍＭの濃度で調製する。化合物スクリーニング（８．９％）または化合物速度論研究（２．６〜４０％）のいずれかのために総脂質に対して異なるモル比のＭＡＧを調製する。適量の精製したＭＡＧおよびＤＯＰＣ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ＃８５０３７５Ｃ）をガラス管内のクロロホルム中で混合する。続いて、Ｎ２ガスの蒸気下でクロロホルムを蒸発させ、次いで減圧下で３０分間乾燥する。所望の総脂質濃度のために乾燥したＭＡＧ／ＤＯＰＣ混合物に適量の緩衝液（Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．４、２５０ｍＭのスクロース、１ｍＭのＥＤＴＡ）を加える。ＭＡＧ／ＤＯＰＣ溶液を、溶液が透き通るまで超音波処理する。動的光散乱を用いて小胞サイズを測定して均一性を確認する。
【０１２３】
アッセイ緩衝液は、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １５５６７−０２２）、１１％のＤＭＳＯ、２５０ｍＭのスクロース（Ｓｉｇｍａ  Ｓ−０３８９）、１ｍＭのＥＤＴＡおよびコンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  １２４５４８００）からなる。試験化合物を、基質および酵素と一緒に緩衝液に加える。反応のための最終濃度は、ＳＦ９細胞抽出物０．０１６ｍｇ／ｍＬ、オレオイル−ＣｏＡ（３．５μＭの１４Ｃ−オレオイル−ＣｏＡ）２０μＭ、８．９：９１．１（モル比）のＭＡＧ：ＤＯＰＣから構成される、超音波処理した小胞の形態の総脂質１．２６ｍＭである。室温での保温の９０分後にＡＥＳＳＭ（容量で、１００％中１２．５％の変性ＥｔＯＨ、１１％のＤＩ  Ｈ２Ｏ、２．５％の１．０Ｎ  ＮａＯＨ、５９％のイソプロパノール（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  ３０３１−０８）、１５％のヘプタン（Ｏｍｎｉ  Ｓｏｌｖ  ＨＸ００７８））を加えることにより反応を停止する。Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ  Ｅを加え、次いでプレートを密封して、室温での平衡の少なくとも４時間後にシンチレーションカウンター上で計数する。Ｅｘｃｅｌ  Ｆｉｔソフトウェア（バージョン４、４−パラメータ非線形ロジスティック方程式（ＡＢａｓｅ  Ｅｑｕａｔｉｏｎ  ２０５）を用いるデータ分析）を使用して濃度対相対的ＭｏＧＡＴ−２活性をプロットすることによりＩＣ５０（半数阻害に達する濃度）を計算する。
【０１２４】
本明細書に例示される全ての化合物は、１００ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。実施例１は、２．２８ｎＭのＩＣ５０を示す。この結果は、例示された化合物が本アッセイのＭｏＧＡＴ−２の阻害剤であることを実証する。
【０１２５】
ＭＯＧＡＴ−２細胞アッセイにおける阻害活性
本アッセイにおいて細胞環境におけるヒトＭｏＧＡＴ−２に対する化合物の阻害活性を評価する。Ｃａｃｏ−２は、ヒト結腸がん細胞株であり、腸上皮細胞のためのモデルとしてしばしば用いられる。Ｃａｃｏ−２は、ＭｏＧＡＴ−２を発現せず、したがって、ヒトＭｏＧＡＴ−２は、安定的なトランスフェクションによって細胞株内に組み込まれる。ＭＡＧ類似体である、２−Ｏ−ヘキサデシルグリセロール（ＨＤＧ）は、ＨＤＧが加水分解されず、得られる生成物は質量分析法によって容易に観察できるので、細胞のＭｏＧＡＴ−２活性を検出するために利用される。基質は、超音波処理した小胞の形態のＤＯＰＣとの混合物として用いて細胞に送達される。
【０１２６】
完全培地（３／１  ＤＭＥＭ：Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ＋２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋ゲンタマイシン）中で２４時間後に８０％集密となる１００ｍｍ皿上にＣａｃｏ２細胞を播種する。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｈＭｏＧＡＴ−２プラスミド（ＭＯＧＡＴ−２−ｐＣＤＮＡ３．１−Ｈｙｇｒｏ）で細胞をトランスフェクトする。トランスフェクション混合物への暴露の６時間後、ＰＢＳ中で細胞を３回洗い、次いで培地を加える。さらに１８時間の培養のために細胞を保温し、細胞をトリプシン処理して、それらを１００ｍｍ皿内へ連続的に希釈する。完全培地＋４００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを加えて、クローンが出現するまで保温する。クローンを単離し２４ウェル皿に移して、培養密度に生育する。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙキットを用いてこれらのクローンからＲＮＡを調製する。７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）上のＡＢＩ在庫（ｉｎｖｅｎｔｏｒｉｅｄ）アッセイ（ＨＳ００２２８２６２）を用いてＴａｑｍａｎ分析を行う。ヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＳＣ−３２３９２）を用いてウエスタンブロット分析によりこれらのクローンから溶解物を分析してＭｏＧＡＴ−２に対応する３８ｋＤタンパク質のヒトＭｏＧＡＴ−２発現を確認する。
【０１２７】
ガラス管内のクロロホルム中で２−Ｏ−ヘキサデシルグリセロール（「ＨＤＧ」、Ｂｉｏｓｙｎｔｈ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ、＃Ｈ−１８０６、２０ｍｇ／ｍｌのうち５６２．７μｌ）とＤＯＰＣ（２０ｍｇ／ｍｌのうち１４．３ｍＬ）とを混合して、はじめにＮ２ガス下で乾燥し、次いで減圧下でさらに３０分間乾燥する。溶液が透き通るまで超音波処理しながら乾燥したＨＤＧ／ＤＯＰＣ混合物に２０ｍＬの緩衝液（１５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．４、２５０ｍＭのスクロース、１ｍＭのＥＤＴＡ）を加える。Ｃａｃｏ２細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で一晩ポリ−Ｄ−リジンでコートした９６−ウェルプレート内に平板培養する（「細胞板」）。増殖培地を除去し、２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＤＭＥＭＦ１２（３：１）培地（ＧＩＢＣＯ  ９３−０１５２ＤＫ）中で試験化合物で細胞を３０分間前処理する。細胞を、４０μＭのオレイン酸および８００μＭの８．９：９１．９（モル比）のＨＤＧ／ＤＯＰＣを含有する２％ＢＳＡ  ＤＭＥＭＦ１２（３：１）培地中で１つの試験化合物で４時間処理する。細胞を、５０μｌのトリプシン溶液でトリプシン処理して、５０μｌのＰＢＳを加える。ＬＣ−ＭＳ分析のためにすぐに細胞をドライアイス上で冷凍して、−２０℃で保管する。以下のようにクロロホルム／メタノールで細胞を抽出する：細胞を２ｍＬプレートに移し、細胞板を２００μＬメタノールで洗い、次いでメタノール洗液を２ｍＬプレートに移し、再び細胞板を２００μＬのＰＢＳで洗い、ＰＢＳ洗液を２ｍＬプレートに移す。クロロホルム（４００μＬ）を、内部標準（１９．５２ｎｇ／ｍＬ）ＤＡＧ（１５：０、１５：０（Ｓｉｇｍａ））、Ｄ５−ＴＡＧ（３９．０３ｎｇ／ｍＬ）ＣＤＮ（１６、１６、１６）と共に２ｍＬプレートに加える。密封した２ｍＬプレートを上下に返し（１０ｘ）、次いでボルテックスしてスピンする。２ｍＬプレートから４００μＬの下層を取り出し、別のプレート「最終プレート」のウェルに加える。ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（４００μＬ  ２：１）を、２ｍＬプレートに加える。再び密封した２ｍＬプレートを上下に返し（１０ｘ）、ボルテックスしてスピンする。２ｍＬプレートから２２０μＬの下層を取り出し、最終プレートに加える。最終プレートを乾燥して、５００ｍＬのＩＰＡで復元する。最終プレートを密封して、５分間振る。最終プレートから１０μｌの試料を、１０μＬループを備え、Ｓｈｉｍａｄｚｕ溶媒デリバリーシステムに連結されたＬｅａｐ自動サンプラーを用いて６０℃に維持したＨａｌｏ  Ｃ８カラム（２．１ｘ５０、２．７μＬ粒径）上に注入する。Ｄ５  Ｃ１６  ＴＡＧ内部標準と同時にエーテルＴＡＧならびにＣ５２およびＣ５４天然ＴＡＧのデータを収集するために経路を観察する。溶媒Ａは、２０μＭの酢酸アンモニウムを含む８０／２０のＨ２Ｏ／メタノールである。溶媒Ｂは、２０μＭの酢酸アンモニウムを含む５０／５０のＩＰＡ／ＴＨＦである。流速は、０．４ｍＬ／分である。洗浄溶媒は、Ｈ２Ｏ／ＭｅＯＨおよびＤＣＭである。Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェアを用いて対象のピークの面積を抽出し、以下の式を使用するＥｘｃｅｌにデータをエクスポートする：（エーテルＴＡＧの面積／Ｃ５４天然ＴＡＧの面積）／ＩＳの面積。この比率は、それぞれのウェルにおける細胞数の分散について効果的に説明している。
【０１２８】
アッセイに基づくこのＭＯＧＡＴ−２細胞の結果は、下表７において提供され、表７に列挙される実施例が細胞環境においてヒトＭｏＧＡＴ−２を阻害することを実証している。
【表７】
2016501844.tif 000071
【０１２９】
イヌ油ボーラスモデルの薬理効果
小腸で見つかるＭｏＧＡＴ−２を阻害することは、過度の脂肪摂取量に起因する高トリグリセリド血症を治療するために有用であり得る。ＭｏＧＡＴ−２の阻害は、トリグリセリドの再合成を妨害し、これは腸からのトリグリセリドの分泌を減少させる。したがって、ＭｏＧＡＴ−２阻害は、身体を通る最終的な循環のための腸へのトリグリセリドの分泌に至る特異的なプロセスを妨げる。血液系において測定されるようなＭｏＧＡＴ−２によって誘発される腸へのＴＡＧ分泌を阻害する１種または複数の例示された化合物の能力を評価するために、以下の手順に従ってもよい：
【０１３０】
それぞれのイヌは９〜１３ｋｇの間の体重を有するように選択される、２１匹の雄のビーグルをそれぞれの調査のために登録する。イヌを、標準的な光サイクル（１２時間明るく１２時間暗い）で、室温（７２±８°Ｆ）かつ相対湿度３０％〜７０％の檻に収容する。調査の開始に先立ってイヌを１６時間絶食させ、次いで絶食したイヌにベヒクル（１％ＨＥＣ、０．２５％、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ａｎｔｉｆｏａｍ）またはそのベヒクル中の試験化合物の１つを投与する。時間０試料のために投薬の１時間後にイヌから血液を採る（頸静脈から０．５ｍＬ）。時間０試料の回収後すぐにイヌにオリーブ油（Ｓｉｇｍａ  カタログ＃：Ｏ−１５１４、５ｍＬ／ｋｇ）を投与する。化合物／ベヒクル投与後１．５、２、３、５、７および９時間に試料を氷上のＥＤＴＡチューブ内に回収する。試料を、９０００ｃｐｍで１５分間遠心分離機にかけ、Ｒｏｃｈｅ  Ｈｉｔａｃｈｉ  ９１７を用いて血漿総トリグリセリドを分析する（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１８７７７７１）。血漿ＴＡＧ１８．１＿１８．１＿１８．１測定のために、試料を抽出して、１０μＬの血漿を用いてＭｏＧＡＴ−２細胞アッセイにおいて前述したものと同様のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行う。
【０１３１】
検体は、ＴＡＧ  １８：１  １８：１  １８：１の［Ｍ＋ＮＨ４］＋イオンであり、これは９０２．８ｍ／ｚの質量を有し、内部標準は、Ｄ５  ＴＡＧ  １６：０  １６：０  １６：０であり、これは８２９．８ｍ／ｚの質量を有する。ＴＡＧ  １８：１  １８：１  １８：１の相対量において９０２．８ｍ／ｚ（ＴＡＧ  １８：１  １８：１  １８：１）の６０３．５ｍ／ｚ娘イオンおよび８２９．８ｍ／ｚ（Ｄ５  ＴＡＧ  １６：０  １６：０  １６：０内部標準）の５５６．５ｍ／ｚ娘イオンの比率が変化したことを報告する。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ４を用いて総ＴＡＧ  ＡＵＣ引く基準値ＴＡＧ  ＡＵＣから正味の血漿ＴＡＧ  ＡＵＣを計算する：（正味ＡＵＣＴＡＧ＝油ボーラス後ＡＵＣＴＡＧ−０時間におけるＡＵＣＴＡＧ）。血漿トリグリセリドの阻害百分率は、以下のように計算される：（正味ＴＡＧ  ＡＵＣの油ボーラスグループ平均値−化合物治療を行った正味ＴＡＧ  ＡＵＣの油ボーラスグループ平均値／正味ＴＡＧ  ＡＵＣの油ボーラスグループ平均値）＊１００。最終的な統計分析は、対照との比較のために一元配置分散分析（Ｏｎｅ  ｗａｙ  Ａｎｏｖａ）のダネットの方法を用いる。全ての正味ＴＡＧ  ＡＵＣ値を、調査内の変動を制限するための比較のために順位付けされた平均ＡＵＣに変換する。本発明の例示される化合物のインビボでＭｏＧＡＴ−２活性を阻害し、ＴＡＧ吸収を低減する能力は、本アッセイに従ってさらに評価され得る。
【０１３２】
実施例２は、本モデルにおいて１０ｍｇ／ｋｇの投与で評価した。統計的に有意な（ｐ＜０．０５）減少は、循環における油ボーラス誘発型のトリグリセリドの偏位を評価するために用いられる両方のパラメータについて観察された。結果は以下の通りであった：総トリグリセリドにおいて７７％の減少およびＴＡＧ  １８．１＿１８．１＿１８．１において６７％の減少。
【０１３３】
本発明の例示される化合物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．  Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．１９９０年において見つかるものなどの慣例に従って医薬組成物内に容易に処方され得る。
【０１３４】
治療する医師または他の医療専門家は、治療の必要がある人のために、具体的には高トリグリセリド血症の治療のために化合物の有効量を決定することができるであろう。好ましい医薬組成物は、経口投与のための錠剤またはカプセルとして処方してよい。錠剤またはカプセルには、治療の必要がある患者を治療するための有効量の本発明の化合物が含まれていてよい。
【国際調査報告】
2016501844.tif 000089
2016501844.tif 000090