(57)【要約】本発明は、抗体に基づくデュアルターゲティング分子と、ライブラリーに基づく手法を含む、そのようなデュアルターゲティング分子を生成するための方法とに関する。2016500367.tif 000005
2016500367.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（A）（i）請求項10〜19のいずれか一項に記載の抗体もしくはその機能的フラグメントのコレクションと、または（ii）抗体もしくはその機能的フラグメントのコレクションであって、該コレクションは抗体可変ドメイン配列の多様なコレクションを含み、該抗体可変ドメイン配列はVLドメインとVHドメインとの組み合わせを含み、
a．該VLドメインは、SEQ-ID NO: 1、3、5、および7より選択されるフレームワークに基づき、該VLドメインは、SEQ-ID NO: 8、12、18、19、27、もしくは28のいずれか1つ、とくにSEQ-ID NO: 8、12、18、もしくは19のいずれか1つ、またはSEQ-ID NO: 27もしくは28のいずれか1つに示される多様化スキームに従って多様化されており、かつ
b．該VHドメインは、SEQ-ID NO: 2、4、および6より選択されるフレームワークに基づき、該VHドメインは、SEQ-ID NO: 9、13、20、もしくは21のいずれか1つに示される多様化スキームに従って多様化されている、コレクション、
とくに、以下のコレクション：Lib3-L、Lib4-L、Lib4-LE、およびLib5-Lのいずれか1つより選択される、抗体もしくはその機能的フラグメントのコレクションと、
第1の関心対象標的とを接触させる工程と、第1の関心対象標的に対する結合特異性を備えた抗体またはその機能的フラグメントについてスクリーニングするまたは選択する工程とを含む、第1の関心対象標的に対する結合特異性を備えた抗体またはその機能的フラグメントを同定する工程；ならびに
（B）（i）請求項2〜9のいずれか一項に記載の抗体もしくはその機能的フラグメントのコレクションと、または（ii）抗体もしくはその機能的フラグメントのコレクションであって、該コレクションは抗体可変ドメイン配列の多様なコレクションを含み、該抗体可変ドメイン配列はVLドメインとVHドメインとの組み合わせを含み、
a．該VLドメインは、SEQ-ID NO: 1、3、5、および7より選択されるフレームワークに基づき、該VLドメインは、SEQ-ID NO: 10、14、16、22、23、もしくは29のいずれか1つ、とくにSEQ-ID NO: 10、14、16、22、もしくは23のいずれか1つ、またはSEQ-ID NO: 29に示される多様化スキームに従って多様化されており、かつ
b．該VHドメインは、SEQ-ID NO: 2、4、および6より選択されるフレームワークに基づき、該VHドメインは、SEQ-ID NO: 11、15、17、24、25、もしくは26のいずれか1つに示される多様化スキームに従って多様化されている、コレクション、
とくに、以下のコレクション：Lib3-H、Lib4-H、Lib4-HE_ini、およびLib4-HEのいずれか1つより選択される、抗体もしくはその機能的フラグメントのコレクションと、
第2の関心対象標的とを接触させる工程と、第2の関心対象標的に対する結合特異性を備えた抗体またはその機能的フラグメントについてスクリーニングするまたは選択する工程とを含む、第1の関心対象標的に対する結合特異性を備えた抗体またはその機能的フラグメントを同定する工程；ならびに
（C）工程（A）で同定された抗体のうちの1つの第1の標的上のエピトープに特異的なパラトープと、工程（B）で同定された抗体のうちの1つの第2の標的上のエピトープに特異的なパラトープとを組み合わせる工程であるが、
ただし、請求項20c.に記載のコレクションからの抗体またはその機能的フラグメントに由来するパラトープと、請求項22c.に記載のコレクションからの抗体またはその機能的フラグメントに由来するパラトープとの組み合わせが除外されることを条件とする、工程
を含む、二重特異性抗体またはその機能的二重特異性フラグメントを生成するための方法。
【請求項２】
抗体またはその機能的フラグメントのコレクションであって、該コレクションは、少なくともVκ VLドメインおよびVHドメインを含む抗体可変ドメイン配列の多様なコレクションを含み、
ここで、
（ia）位置Vκ54およびVκ60の少なくとも1つが多様化されており、かつ/または
（ib）位置VH1およびVH27の少なくとも1つが欠失しており、かつ
（ii）図1Aに従ったLib2位置より選択される少なくとも3個のさらなるCDR残基が多様化されており、
ただし、少なくとも1個の多様化された残基がVHドメイン内に位置し、かつ少なくとも1つの多様化された位置がVLドメイン内に位置していることを条件とし、かつ
ここで、図1Aに従ったLib1_A位置由来の残基、とくにLib1位置由来の残基は多様化されていない、コレクション。
【請求項３】
（i）において、位置Vκ60は多様化されているが、位置Vκ54は多様化されていない、請求項2に記載のコレクション。
【請求項４】
（i）において、位置Vκ54は多様化されているが、位置Vκ60は多様化されていない、請求項2に記載のコレクション。
【請求項５】
（i）において、位置Vκ54およびVκ54の両方が多様化されている、請求項2に記載のコレクション。
【請求項６】
VHドメインのCDR1およびCDR3ならびにVLドメインのCDR2のそれぞれの少なくとも1個の残基が多様化されている、請求項2または3に記載のコレクション。
【請求項７】
図1Bに従ったLib2E_A位置の少なくとも1個の残基、とくにLib2E位置由来の少なくとも1個の残基が、可変結合ドメインにおいてさらに多様化されている、請求項2〜4のいずれか一項に記載のコレクション。
【請求項８】
VLおよびVHにおいて少なくとも14個の残基が多様化されている、とくにVL CDR2において少なくとも4個の残基が多様化されており、かつVH CDR1およびVH CDR3において少なくとも10個の残基が多様化されている、請求項2〜5のいずれか一項に記載のコレクション。
【請求項９】
15、16、17、18、19、または20個の残基が多様化されている、請求項6に記載のコレクション。
【請求項１０】
抗体またはその機能的フラグメントのコレクションであって、該コレクションは、少なくともVκ VLドメインおよびVHドメインを含む抗体可変ドメイン配列の多様なコレクションを含み、
ここで、
（ia）位置Vκ4、Vκ92、およびVκ97の少なくとも1つが多様化されており、かつ/または
（ib）位置Vκ1が欠失しており、かつ
（ii）図1Aに従ったLib1_A位置より選択される少なくとも3個のさらなるCDR残基が多様化されており、
ただし、少なくとも1個の多様化された残基がVHドメイン内に位置し、かつ少なくとも1つの多様化された位置がVLドメイン内に位置していることを条件とし、かつ
ここで、図1Aに従ったLib2由来の残基は多様化されていない、コレクション。
【請求項１１】
（i）において、位置Vκ4は多様化されているが、位置Vκ92または位置Vκ97は多様化されていない、請求項10に記載のコレクション。
【請求項１２】
（i）において、位置Vκ92は多様化されているが、位置Vκ4または位置Vκ97は多様化されていない、請求項10に記載のコレクション。
【請求項１３】
（i）において、位置Vκ97は多様化されているが、位置Vκ4または位置Vκ92は多様化されていない、請求項10に記載のコレクション。
【請求項１４】
（i）において、Vκ4、Vκ92、およびVκ92より選択される2つの位置が多様化されている、請求項10に記載のコレクション。
【請求項１５】
（i）において、Vκ4、Vκ92、およびVκ92の3つの位置すべてが多様化されている、請求項10に記載のコレクション。
【請求項１６】
VLドメインのCDR1およびCDR3ならびにVHドメインのCDR2のそれぞれの少なくとも1個の残基が多様化されている、請求項10〜15のいずれか一項に記載のコレクション。
【請求項１７】
図1Bに従ったLib1E_A位置の少なくとも1個の残基が、可変結合ドメインにおいてさらに多様化されている、請求項10〜16のいずれか一項に記載のコレクション。
【請求項１８】
VLおよびVHにおいて少なくとも14個の残基が多様化されている、とくにVH CDR2において少なくとも4個の残基が多様化されており、かつVL CDR1およびVL CDR3において少なくとも10個の残基が多様化されている、請求項10〜17のいずれか一項に記載のコレクション。
【請求項１９】
15、16、17、18、19、または20個の残基が多様化されている、請求項18に記載のコレクション。
【請求項２０】
抗体またはその機能的フラグメントのコレクションであって、該コレクションは抗体可変ドメイン配列の多様なコレクションを含み、該抗体可変ドメイン配列はVLドメインとVHドメインとの組み合わせを含み、
a．該VLドメインは、SEQ-ID NO: 1、3、5、および7より選択されるフレームワークに基づき、該VLドメインは、SEQ-ID NO: 8、12、18、19、27、もしくは28のいずれか1つ、とくにSEQ-ID NO: 8、12、18、もしくは19のいずれか1つ、またはSEQ-ID NO: 27もしくは28のいずれか1つに示される多様化スキームに従って多様化されており；かつ
b．該VHドメインは、SEQ-ID NO: 2、4、および6より選択されるフレームワークに基づき、該VHドメインは、SEQ-ID NO: 9、13、20、もしくは21のいずれか1つに示される多様化スキームに従って多様化されており；
c．ただし、SEQ-ID NO: 18もしくは19に示される多様化スキームに従って多様化されている、SEQ-ID NO: 1に基づくVLドメインと、SEQ-ID NO: 20もしくは21に示される多様化スキームに従って多様化されている、SEQ-ID NO: 2に基づくVHドメインとの組み合わせが除外されることを条件とする、
コレクション。
【請求項２１】
以下のコレクション：Lib3-L、Lib4-L、Lib4-LE、およびLib5-Lのいずれか1つより選択される、請求項20に記載のコレクション。
【請求項２２】
抗体またはその機能的フラグメントのコレクションであって、該コレクションは抗体可変ドメイン配列の多様なコレクションを含み、該抗体可変ドメイン配列はVLドメインとVHドメインとの組み合わせを含み、
a．該VLドメインは、SEQ-ID NO: 1、3、5、および7より選択されるフレームワークに基づき、該VLドメインは、SEQ-ID NO: 10、14、16、22、23、もしくは29のいずれか1つ、とくにSEQ-ID NO: 10、14、16、22、もしくは23のいずれか1つ、またはSEQ-ID NO: 29に示される多様化スキームに従って多様化されており；かつ
b．該VHドメインは、SEQ-ID NO: 2、4、および6より選択されるフレームワークに基づき、該VHドメインは、SEQ-ID NO: 11、15、17、24、25、もしくは26のいずれか1つに示される多様化スキームに従って多様化されており；
c．ただし、SEQ-ID NO: 22もしくは23に示される多様化スキームに従って多様化されている、SEQ-ID NO: 1に基づくVLドメインと、SEQ-ID NO: 24、25、もしくは26に示される多様化スキームに従って多様化されている、SEQ-ID NO: 2に基づくVHドメインとの組み合わせが除外されることを条件とする、
コレクション。
【請求項２３】
以下のコレクション：Lib3-H、Lib4-H、Lib4-HE_ini、およびLib4-HEのいずれか1つより選択される、請求項22に記載のコレクション。
【請求項２４】
請求項2〜23のいずれか一項に記載のライブラリーをコードする核酸配列のコレクション。
【請求項２５】
請求項24に記載の核酸配列のコレクションを含むベクター、とくに発現ベクターのコレクション。
【請求項２６】
ベクターがファージディスプレイベクターである、請求項25に記載のコレクション。
【請求項２７】
請求項24に記載の核酸配列のコレクションまたは請求項25もしくは26に記載のベクターのコレクションを含む、宿主細胞のコレクション。
【請求項２８】
（i）請求項24に記載の核酸配列を発現させる工程、（ii）請求項25もしくは26に記載のベクターから核酸配列を発現させる工程、および/または（iii）該核酸配列の発現を引き起こすもしくは可能にする条件下で、請求項27に記載の宿主細胞のコレクションを培養する工程を含む、請求項2〜23のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的フラグメントのコレクションを産生するための方法。
【請求項２９】
請求項2〜23のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的フラグメントのコレクションと関心対象標的とを接触させる工程、および該関心対象標的に対する結合特異性を備えた抗体またはその機能的フラグメントについてスクリーニングするまたは選択する工程を含む、関心対象標的に対する結合特異性を備えた抗体またはその機能的フラグメントを同定するための方法。
【請求項３０】
スクリーニングするまたは選択する工程が、ファージディスプレイを用いるものである、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
請求項29または30に記載の方法によって得ることができる、抗体または機能的フラグメント。
【請求項３２】
請求項1に記載の方法によって得ることができる、二重特異性抗体またはその機能的二重特異性フラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、抗体に基づくデュアルターゲティング分子と、ライブラリーに基づく手法を含む、そのようなデュアルターゲティング分子を生成するための方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本発明は、二重特異性抗体またはその機能的フラグメントについての新規な設計に関する。
【０００３】
文献において、二重特異性抗体分子を生成する様々な手法が報告されている。これらの手法は、2つのカテゴリー：1）2種の標的または2種のエピトープを認識する2種のパラトープが、両方とも、1つの相補性VH-VLペアによって形成される1つのヘテロ二量体抗体可変領域内にあり、かつ両方とも、この相補性VH-VLペアに属するCDR残基を含む、二重特異性抗体形態を生成するもの；および2）2種の標的またはエピトープを認識する2種のパラトープが、両方ともが、1つの相補性VH-VLペアによって形成される1つのヘテロ二量体抗体可変領域内にあることはなく、かつ両方ともが、同じ相補性VH-VLペアに属するCDR残基を含むことはない、他の二重特異性抗体形態を生成するもの、に分けられ得る。
【０００４】
第1のカテゴリーの手法の中では、二重特異性抗体分子を予測どおりに操作する2つの方法のみが文献に記載されており、これらは下記[0014]〜[0015]の項で詳細に記述される。しかしながら、本研究を関連付けて文脈の筋道を通すために、まず第2のカテゴリーの手法を概説する。
【０００５】
この第2のカテゴリーの手法（2種の標的またはエピトープを認識する2種のパラトープが、両方ともが、1つの相補性VH-VLペアによって形成される1つのヘテロ二量体抗体可変領域内にあることはなく、かつ両方ともが、同じ相補性VH-VLペアに属するCDR残基を含むことはない）は、様々な先行研究者による研究の非常に多数を占め、かつそのような二重特異性抗体の多種多様な例が記載されている。
【０００６】
第2のカテゴリーの手法に属する第1の群の例では、異なる特異性の2種以上の抗体フラグメント（Fabフラグメント、一本鎖Fv、または単一ドメイン抗体を含む）が、化学結合によってまたは1種もしくは複数種のペプチドリンカーを介した遺伝子融合によって組み合わされている。この群の例における公表された二重特異性抗体形態には、以下のものが含まれる。
a．ダイアボディ（Perisic et al., Structure. 1994 Dec 15;2(12):1217-26；Kontermann, Acta Pharmacol Sin. 2005 Jan;26(1):1-9；Kontermann, Curr Opin Mol Ther. 2010 Apr;12(2):176-83.）
b．TandAb等（Cochlovius et al., Cancer Res. 2000 Aug 15;60(16):4336-41.）
c．ペプチドリンカーによって遺伝子融合された、異なる標的に特異的な単一ドメイン（例えば、Domantis：WO2008/096158；Ablynx：WO2007/112940）
d．その他（総説に関して、Enever et al., Curr Opin Biotechnol. 2009 Aug;20(4):405-11. Epub 2009 Aug 24.；Carter, Nat. Rev. Immunol. 6, 343 (2006)；P. Kufer et al., Trends Biotechnol. 22, 238 (2004)を参照されたい）。
【０００７】
医学的適用におけるそれらの潜在的有用性を改善するために、以下のものを含む様々な技術を用いて、上記の二重特異性抗体形態のインビボ血清中半減期を延長することができる。
a．血清アルブミンまたは血清アルブミン結合実体の付加
b．PEG化
c．HAP化（Schlapschy et al., Protein Eng Des Sel. 2007 Jun;20(6):273-84. Epub 2007 Jun 26）またはXTEN（Schellenberger, Nat. Biotechnology 12 (2009) 1186）など、遺伝子融合によるタンパク質ポリマーの付加。
【０００８】
この群の例では、抗体フラグメントから構成される二重特異性抗体は、Fc領域を欠き、したがって一般的に、胎児性Fc受容体FcRnへの天然結合を示さず、完全IgG抗体の天然エフェクター機能（ADCCおよびCDC、参照）を呈さず、かつIgG抗体と同一の様式で、Fc領域に特異的なプロテインA樹脂などの超抗原由来親和性樹脂を介して精製されることは通常あり得ない。Fc領域の欠如のこれらの結果により、達成可能な血清中半減期、活性薬物成分としての実行可能な適用、およびそのような二重特異性抗体の経済的製造は制限され得る。
【０００９】
第2のカテゴリーの手法に属する第2の群の例では、二重特異性抗体は、IgG様分子および1つまたはいくつかのさらなる追加の結合ドメインまたは実体を含む。そのような抗体には、一本鎖Fvが重鎖または軽鎖の末端の一方に融合されているIgG-scFv融合タンパク質（カリフォルニア大学、Biogen Idec、CAT/MedImmune）、ならびにさらなるVHドメインおよびリンカーが重鎖のN末端に融合され、かつさらなるVLドメインおよびリンカーが軽鎖のN末端に融合されているデュアル可変ドメイン（dvd-IgG）分子（Abbott）が含まれる。一般的に、これらの手法は、構築物の製造、利用可能性、および安定性という点で欠点を抱えている。
【００１０】
第2のカテゴリーの手法に属する第3の群の例では、二重特異性抗体は、さらなる結合ドメインまたは実体の付加なしでそれらが2つの特異性を呈するような手段で生成されているまたは改変されているIgG様抗体を含む。そのような抗体には、例えば操作された（engineered）隆起形成（protuberation）（Ridgway et al., Protein Eng. 1996 Jul;9(7):617-21）を用いて、鎖交換（Davis et al., Protein Eng Des Sel. 2010 Apr;23(4):195-202. Epub 2010 Feb 4）を用いて、または操作された反対電荷（Novo Nordisk）を用いて、天然ではホモ二量体であるCH3ドメインがヘテロ二量体になるように改変されているIgG分子が含まれ、それによって、IgG様分子の2つの半分体は、Fc領域に付加された結合実体、通常はN末端のFab領域を介して2種の異なる標的に結合することが潜在的に可能となっている。この第3の群の例における抗体には、例えばFc領域における点変異（例えば、Xencor社の、FcgRIIbへのFc結合）によって、または構造ループの多様化（例えば、f-star社の、多様化CH3ドメインを有するMab2）によって、天然では抗原接触に関与しないいくつかの構造ループが、天然では可変領域CDRループを介して結合しているものに加えてさらなる標的に結合するように改変されているIgG分子も含まれる。これらの手法は、安定性、製造、結合価、および限定された親和性/適用という点で欠点を抱えている。
【００１１】
第2のカテゴリーにおける二重特異性抗体の上記の例のすべてとは対照的に、第1のカテゴリーにおける二重特異性抗体は、2種の標的に特異的な2種のパラトープを有し、この両方とも、同じヘテロ二量体VH-VL抗体可変領域内に位置するCDR残基を含む。当技術分野において、この第1のカテゴリーに帰属し得る4種のタイプの抗体分子のみが記載されている。刊行物によれば、これら4種のタイプのうち、第1のタイプの抗体は、それは2種の無関係な標的を特異的には認識し得ないため正確には二重特異性でなく；第2のタイプの抗体は、天然に存在するが、そのような研究の例が公表されていないため、それが予測どおりに操作され得るかどうかは知られておらず；そして第3および第4のタイプの抗体のみが、2種の無関係な標的に対する特異性を備えて操作され得る。第1のカテゴリーに帰属し得る4種のタイプの抗体分子は、以下のものである。
【００１２】
構造上関係する2種以上の抗原またはエピトープに対応する単一の広い特異性を有する、交差反応性抗体。そのような抗体に関して、2種の抗原は配列および構造において関係している。例えば、抗体は、ニワトリ卵白リゾチームおよび七面鳥リゾチーム（WO 92/01047）など、異なる種由来の関係する標的と交差反応し得、またはハプテンおよび担体とコンジュゲートしたハプテン（Griffiths AD et al. EMBO J 1994 13:14 3245-60）など、異なる状態または形態にある同じ標的と交差反応し得る。交差反応性のために、抗体を意図的に操作することが可能である。例えば、抗体は、異なる種由来の2種の関係する抗原を認識するように操作されている（例えば、Genentech：アカゲザルLFA1にも結合するように操作された、ヒトLFA1に結合する抗体は、薬物Raptiva/エファリズマブの成功をもたらしている）。同様に、WO 02/02773は、「デュアル特異性」を備えた抗体分子を記載している。言及される抗体分子は、構造上関係する2種以上の標的に適合し得る単一の結合特異性を備えた、構造上関係する複数の抗原に対して作られたまたは選択された抗体である。しかしながら、上述のように、これらすべての交差反応性抗体は、正確には二重特異性でなく、かつ2種の無関係な標的を特異的に認識するようには操作されていない。
【００１３】
さらに、天然に存在する多反応性（polyreactive）自己抗体がある（Casali & Notkins, Ann. Rev. Immunol. 7, 515-531）。これらの多反応性抗体は、構造上関係しない少なくとも2種（通常、それを上回る）の異なる抗原またはエピトープを認識し得る能力を有する。モノクローナル抗体に対するファージディスプレイ技術を用いたランダムペプチドレパートリーの選択により、抗原結合部位に合致する種々のペプチド配列が同定されることも示されている。配列のいくつかは高度に関係し、コンセンサス配列に合致しており、一方で他のものは非常に異なり、ミモトープと称されている（Lane & Stephen, Current Opinion in Immunology, 1993, 5, 268-271）。したがって、いくつかのヘテロ二量体VH-VL抗体の結合部位が、異なるかつときには無関係な抗原に結合する潜在力を有することは明らかである。しかしながら、上述のように、そのような多反応性抗体は見出され得るが、当技術分野において記載される予測可能な方法を用いて意図的に操作されていない。
【００１４】
二重特異性抗体の意図的操作により、2種のパラトープ（両方とも、1つの相補性ヘテロ二量体VH-VLペア内にあり、かつ両方とも、この相補性VH-VLペアに属するCDR残基を含む）を介して、2種の構造上無関係な標的に結合し得るのを可能にする、当技術分野において記載される1つの方法は、「2イン1（two-in-one）」抗体に関する。これらの「2イン1」抗体は、先の交差反応性操作方法とはいくらか違う方法を用いて、2種の重複するパラトープを含むように操作される。この研究は、WO 2008/027236においておよびBostromら（Bostrom et al., Science. 2009 Mar 20;323(5921):1610-4）によって記載されている。公表された例では、1種の標的（HER2）に特異的なヘテロ二量体VH-VL抗体可変領域が単離され、その後に軽鎖が再多様化されて、第2の標的（VEGFまたはデス受容体5）に対するさらなる特異性を達成した。結果として生じる抗体の1つに関して、結合は構造分解能（structure resolution）を特徴とし、1つの抗体-抗原複合体内でHER2と接触している13個のVHおよびVL CDR残基のうちの11個は、別の抗体-抗原複合体内でVEGFとも接触することが見出された。公表された「2イン1」抗体は、HER2に対するナノモルの親和性を保持したものの、Bostromら（2009）によって公表されたクローンのうちの1つのみが、さらなる標的のVEGFに対して300nMというナノモルの親和性を有し、一方で他の4つのクローンは、さらなる標的に対してマイクロモルの親和性を有した。この手法は、2種の構造上無関係な標的への結合を達成しているものの、2種の重複するパラトープの特異性を可能にするために、2種の標的間の表面適合性の程度が必要とされることは明らかである。そのような「2イン1」抗体が2種の標的のみに対してどのくらい高度に特異的であるか、および2種のパラトープの重複部分に位置する側鎖のいくらかの立体構造的柔軟性の必要性によって潜在的に引き起こされる、そのような抗体のいくらかの全体的な非特異的結合または「粘着性」が観察され得るかどうかも、詳細には記載されていない。
【００１５】
二重特異性抗体の意図的操作により、2種のパラトープ（両方とも、1つの相補性ヘテロ二量体VH-VLペア内にあり、かつ両方とも、この相補性VH-VLペアに属するCDR残基を含む）を介して、2種の構造上無関係な標的に結合し得るのを可能にする、当技術分野において記載される第2の方法は、単一ドメイン抗体の相補性ペアを含む抗体に関する。WO 2003/002609およびUS 2007/026482は、重鎖可変ドメインが1種の標的を認識しかつ軽鎖可変ドメインが第2の構造上無関係な標的を認識し、かつ異なる特異性を備えた2つの単一ドメインが1つの連結ヘテロ二量体VH-VL可変領域へと組み合わされている、ヘテロ二量体VH-VL抗体を記載している。そのような抗体の公表された例では、まず、単一ドメインが、2種の無関係な標的に結合する不対VHドメインとしてまたは不対VLドメインとして別々に選択され、その後、両標的に特異的な連結ヘテロ二量体VH-VL可変領域へと組み合わされた。
【００１６】
第1のカテゴリーの二重特異性抗体に属する（2種のパラトープ（両方とも、1つの相補性ヘテロ二量体VH-VLペア内にあり、かつ両方とも、この相補性VH-VLペアに属するCDR残基を含む）を介して、2種の標的に結合し得る）すべての分子に関しては、さらなるドメインまたは実体がIgG分子に融合される必要はなく、IgG分子の構造ループが多様化される必要はなく、かつデュアル特異性を達成するために限定的ヘテロ二重特異性Fc領域が利用される必要はない。このことは、いくつかの潜在的有益性を有する。
【００１７】
構造ループが多様化される必要がなく、かつ定常ドメイン界面が改変される必要がないため、タンパク質安定性を低下させる危険性が低下し、抗体の生物物理学的特性の潜在的に大幅な改善をもたらす。
【００１８】
潜在的に容易にタンパク質分解される（proteolysed）または潜在的に免疫原性であるリンカーが要求されず、活性薬物成分としての抗体の開発可能性の改善をもたらす。
【００１９】
1つの固有のVH領域および1つの固有のVL領域のみが要求されるため、VHおよびVLドメインの望ましくない対合が生じ得ず、発現の間の、誤対合ヘテロ二量体VH-VL可変領域を含む潜在的副産物を回避する。
【００２０】
従来の単一特異性抗体と比較してさらなるジスルフィド結合が要求されないため、異常な共有結合性凝集体の発現または形成の低下は予想されない。
【００２１】
1つの相補性ヘテロ二量体VH-VLペア内に2種のパラトープを含む二重特異性ヘテロ二量体可変領域は、Fc領域を含む、異なる定常ドメインと組み合わされ得る。このことは、いくつかの利点を供与する。
a．十分に確立された方法、例えば従来の単一特異性IgGの製造において用いられたものと同一の方法を用いた、製造の潜在的な改善。
b．患者および動物モデルにおけるFcRn介在性血清中半減期の調節。
c．非細胞毒性で本質的に不活性の挙動（例えば、受容体遮断のために設計された抗体における）から侵攻性の細胞毒性挙動（例えば、腫瘍細胞を殺傷するように設計された抗体における）に及ぶ、異なるアイソタイプと関連したエフェクター機能の自由選出。
【００２２】
交差反応性工学に関係する方法によって得られた「2イン1」抗体についての上記の第3の例は、CDRループ内の重複する少なくとも部分的に共有された結合残基に対する、2種の無関係な標的の競合によって、その医学的適用性において潜在的に大幅に制限される。さらに、まず1種の標的に対して達成された特異性を備え、その後に再多様化、次いでさらなる標的に特異的なクローンの発見が続く、「2イン1」抗体の本来逐次的な選択過程は、第1の標的に特異的な限定された数のみの抗体が、選択可能なライブラリーへと再多様化され得るが、第1の特異的クローンのどれがさらなる所望の特異性の操作に最も適しているかは未知であるため、時間がかかりかつ予測不能である。最後に、「2イン1」抗体の単離および親和性成熟は、一方の標的への結合を増加させる可変ドメイン配列の任意の改善が、他方の標的に対する親和性の低下を潜在的に引き起こし得るという事実によって著しく複雑である。
【００２３】
軽鎖CDRループ残基を介した一方の標的への結合および重鎖CDRループ残基を介したもう一方の標的への結合についての上記の第4の例は、第1の標的への結合に関わる潜在的に重要な軽鎖CDR残基のいくつかが、最終的なパッキングされた二重特異性ヘテロ二量体抗体可変領域において、第2の標的への結合に関わる潜在的に重要な重鎖CDR残基のいくつかに直接隣接しているという事実によって著しく複雑である。このことは、その結合状態において、そのような抗体によって認識される第1の標的は、立体障害により、そのような抗体によって認識される第2の標的と潜在的に競合し得、それによって、そのような抗体の医学的適用性を潜在的に制限する。さらに、そのような抗体の軽鎖および重鎖が、US2007026482（Abbott Laboratories）の歴史的な例において記載された選択およびスクリーニング法によって独立して単離された場合、それらを二重特異性抗体へと組み合わせることは、重鎖および軽鎖の対合にあたって潜在的に生じ得る、CDRにおける立体構造変化により、組み合わされた二重特異性分子における個々の標的に対するもともとは独立しているドメインの親和性に潜在的に影響を及ぼし得る。最後に、多様なCDRループを有するあらかじめ単離されたVHおよびVL可変ドメインを組み合わせることは、WornおよびPluckthun（1998）ならびにRothlisbergerら（2005）によって、抗体重鎖および軽鎖の重要な相互作用および相互安定化は、VHドメインとVLドメインとの間で生じると記載されているように、予測不能な抗体安定性をもたらす可能性がある。
【００２４】
逆に、1つの相補性ヘテロ二量体VH-VLペア内に2種のパラトープを含む二重特異性ヘテロ二量体可変領域は、Fabフラグメントまたは一本鎖Fvなどの抗体フラグメントとして用いられ得、かつそれらのデュアル特異性を達成するためにFc領域の存在を要求することはないと考えられ、哺乳類のN-グリコシル化メカニズムの非存在下での微生物による製造の選択肢を可能にし、かつ低分子量または短い血清中半減期が望ましい治療的または診断的適用におけるそれらの使用を可能にする。
【００２５】
ゆえに、1つの相補性ヘテロ二量体VH-VLペア内に2種のパラトープを有するという手法はそのように多くの利点を供与するものの、上記で記載されている現在までに遂行された試みは、成功が限定的であった。
【００２６】
ゆえに、1つの相補性ヘテロ二量体VH-VLペア内に2種のパラトープを有することの利点を組み入れ、一方で先行技術による構築物に関して観察される問題を回避する、二重特異性抗体に対して改善された形態を提供するという、依然として満たされていない大きな必要性が存在する。
【００２７】
本発明によって提供されているこの問題に対する解決策、すなわち、各相補性ヘテロ二量体VH-VLペアについての2種のパラトープ（各パラトープは、VHおよびVLドメインの両方からのCDR領域に由来する残基を用いる）の設計は、現在までのところ先行技術によって達成されていないまたは示唆されていない。
【発明の概要】
【００２８】
本発明は、各相補性ヘテロ二量体VH-VLペアについて2種のパラトープ（各パラトープは、VHおよびVLドメインの両方からのCDR領域に由来する残基を用いる）を有することを特徴とする新規な二重特異性抗体に関する。
【００２９】
ゆえに、第1の局面において、本発明は、
（A）（i）本発明の第3の局面に従った、抗体もしくはその機能的フラグメントのコレクションと、または（ii）抗体もしくはその機能的フラグメントのコレクションであって、該コレクションは抗体可変ドメイン配列の多様なコレクションを含み、該抗体可変ドメイン配列はVLドメインとVHドメインとの組み合わせを含み、
a．該VLドメインは、SEQ-ID NO: 1、3、5、および7より選択されるフレームワークに基づき、該VLドメインは、SEQ-ID NO: 8、12、18、19、27、もしくは28のいずれか1つ、とくにSEQ-ID NO: 8、12、18、もしくは19のいずれか1つ、またはSEQ-ID NO: 27もしくは28のいずれか1つに示される多様化スキームに従って多様化されており、かつ
b．該VHドメインは、SEQ-ID NO: 2、4、および6より選択されるフレームワークに基づき、該VHドメインは、SEQ-ID NO: 9、13、20、もしくは21のいずれか1つに示される多様化スキームに従って多様化されている、コレクション、
とくに、以下のコレクション：Lib3-L、Lib4-L、Lib4-LE、およびLib5-Lのいずれか1つより選択される、抗体もしくはその機能的フラグメントのコレクションと、
第1の関心対象標的とを接触させる工程と、第1の関心対象標的に対する結合特異性を備えた抗体またはその機能的フラグメントについてスクリーニングするまたは選択する工程とを含む、第1の関心対象標的に対する結合特異性を備えた抗体またはその機能的フラグメントを同定する工程；ならびに
（B）（i）本発明の第2の局面に従った、抗体もしくはその機能的フラグメントのコレクションと、または（ii）抗体もしくはその機能的フラグメントのコレクションであって、該コレクションは抗体可変ドメイン配列の多様なコレクションを含み、該抗体可変ドメイン配列はVLドメインとVHドメインとの組み合わせを含み、
a．該VLドメインは、SEQ-ID NO: 1、3、5、および7より選択されるフレームワークに基づき、該VLドメインは、SEQ-ID NO: 10、14、16、22、23、もしくは29のいずれか1つ、とくにSEQ-ID NO: 10、14、16、22、もしくは23のいずれか1つ、またはSEQ-ID NO: 29に示される多様化スキームに従って多様化されており、かつ
b．該VHドメインは、SEQ-ID NO: 2、4、および6より選択されるフレームワークに基づき、該VHドメインは、SEQ-ID NO: 11、15、17、24、25、もしくは26のいずれか1つに示される多様化スキームに従って多様化されている、コレクション、
とくに、以下のコレクション：Lib3-H、Lib4-H、Lib4-HE_ini、およびLib4-HEのいずれか1つより選択される、抗体もしくはその機能的フラグメントのコレクションと、
第2の関心対象標的とを接触させる工程と、第2の関心対象標的に対する結合特異性を備えた抗体またはその機能的フラグメントについてスクリーニングするまたは選択する工程とを含む、第1の関心対象標的に対する結合特異性を備えた抗体またはその機能的フラグメントを同定する工程；ならびに
（C）工程（A）で同定された抗体のうちの1つの第1の標的上のエピトープに特異的なパラトープと、工程（B）で同定された抗体のうちの1つの第2の標的上のエピトープに特異的なパラトープとを組み合わせる工程であるが、
ただし、本発明の第4の局面の特質c.に従ったコレクションからの抗体またはその機能的フラグメントに由来するパラトープと、本発明の第5の局面の特質c.に従ったコレクションからの抗体またはその機能的フラグメントに由来するパラトープとの組み合わせが除外されることを条件とする、工程
を含む、二重特異性抗体またはその機能的二重特異性フラグメントを生成するための方法に関する。
【００３０】
第2の局面において、本発明は、抗体またはその機能的フラグメントのコレクションに関し、該コレクションは、少なくともVκ VLドメインおよびVHドメインを含む抗体可変ドメイン配列の多様なコレクションを含み、
ここで、
（ia）位置Vκ54およびVκ60の少なくとも1つが多様化されており、かつ/または
（ib）位置VH1およびVH27の少なくとも1つが欠失しており、かつ
（ii）図1Aに従ったLib2位置より選択される少なくとも3個のさらなるCDR残基が多様化されており、
ただし、少なくとも1個の多様化された残基がVHドメイン内に位置し、かつ少なくとも1つの多様化された位置がVLドメイン内に位置していることを条件とし、かつ
ここで、図1Aに従ったLib1_A位置由来の残基、とくにLib1位置由来の残基は多様化されていない。
【００３１】
第3の局面において、本発明は、抗体またはその機能的フラグメントのコレクションに関し、該コレクションは、少なくともVκ VLドメインおよびVHドメインを含む抗体可変ドメイン配列の多様なコレクションを含み、
ここで、
（ia）位置Vκ4、Vκ92、およびVκ97の少なくとも1つが多様化されており、かつ/または
（ib）位置Vκ1が欠失しており、かつ
（ii）図1Aに従ったLib1_A位置より選択される少なくとも3個のさらなるCDR残基が多様化されており、
ただし、少なくとも1個の多様化された残基がVHドメイン内に位置し、かつ少なくとも1つの多様化された位置がVLドメイン内に位置していることを条件とし、かつ
ここで、図1Aに従ったLib2由来の残基は多様化されていない。
【００３２】
第4の局面において、本発明は、抗体またはその機能的フラグメントのコレクションに関し、該コレクションは抗体可変ドメイン配列の多様なコレクションを含み、該抗体可変ドメイン配列はVLドメインとVHドメインとの組み合わせを含み、
a．該VLドメインは、SEQ-ID NO: 1、3、5、および7より選択されるフレームワークに基づき、該VLドメインは、SEQ-ID NO: 8、12、18、19、27、もしくは28のいずれか1つ、とくにSEQ-ID NO: 8、12、18、もしくは19のいずれか1つ、またはSEQ-ID NO: 27もしくは28のいずれか1つに示される多様化スキームに従って多様化されており；かつ
b．該VHドメインは、SEQ-ID NO: 2、4、および6より選択されるフレームワークに基づき、該VHドメインは、SEQ-ID NO: 9、13、20、もしくは21のいずれか1つに示される多様化スキームに従って多様化されており；
a．ただし、SEQ-ID NO: 18もしくは19に示される多様化スキームに従って多様化されている、SEQ-ID NO: 1に基づくVLドメインと、SEQ-ID NO: 20もしくは21に示される多様化スキームに従って多様化されている、SEQ-ID NO: 2に基づくVHドメインとの組み合わせが除外されることを条件とする。
【００３３】
第5の局面において、本発明は、抗体またはその機能的フラグメントのコレクションに関し、該コレクションは抗体可変ドメイン配列の多様なコレクションを含み、該抗体可変ドメイン配列はVLドメインとVHドメインとの組み合わせを含み、
a．該VLドメインは、SEQ-ID NO: 1、3、5、および7より選択されるフレームワークに基づき、該VLドメインは、SEQ-ID NO: 10、14、16、22、23、もしくは29のいずれか1つ、とくにSEQ-ID NO: 10、14、16、22、もしくは23のいずれか1つ、またはSEQ-ID NO: 29に示される多様化スキームに従って多様化されており；かつ
b．該VHドメインは、SEQ-ID NO: 2、4、および6より選択されるフレームワークに基づき、該VHドメインは、SEQ-ID NO: 11、15、17、24、25、もしくは26のいずれか1つに示される多様化スキームに従って多様化されており；
ただし、SEQ-ID NO: 22もしくは23に示される多様化スキームに従って多様化されている、SEQ-ID NO: 1に基づくVLドメインと、SEQ-ID NO: 24、25、もしくは26に示される多様化スキームに従って多様化されている、SEQ-ID NO: 2に基づくVHドメインとの組み合わせが除外されることを条件とする。
【００３４】
第6の局面において、本発明は、本発明に従ったライブラリーをコードする核酸配列のコレクションに関する。
【００３５】
第7の局面において、本発明は、本発明の核酸配列のコレクションを含むベクター、とくに発現ベクターのコレクションに関する。
【００３６】
第8の局面において、本発明は、本発明の核酸配列のコレクションまたは本発明に従ったベクターのコレクションを含む、宿主細胞のコレクションに関する。
【００３７】
第9の局面において、本発明は、（i）本発明の核酸配列を発現させる工程、（ii）本発明のベクターから核酸配列を発現させる工程、および/または（iii）該核酸配列の発現を引き起こすもしくは可能にする条件下で、本発明に従った宿主細胞のコレクションを培養する工程を含む、本発明のいずれか1つに従った、抗体またはその機能的フラグメントのコレクションを産生するための方法に関する。
【００３８】
第10の局面において、本発明は、本発明のいずれか1つに従った、抗体またはその機能的フラグメントのコレクションと関心対象標的とを接触させる工程、および該関心対象標的に対する結合特異性を備えた抗体またはその機能的フラグメントについてスクリーニングするまたは選択する工程を含む、関心対象標的に対する結合特異性を備えた抗体またはその機能的フラグメントを同定するための方法に関する。
【００３９】
第11の局面において、本発明は、本発明の方法によって得ることができる抗体または機能的フラグメントに関する。
【００４０】
第12の第11の局面において、本発明は、本発明の方法によって得ることができる二重特異性抗体またはその機能的二重特異性フラグメントに関する。
【００４１】
最後の局面において、本発明は、本発明の抗体分子もしくはその機能的フラグメント、または二重特異性抗体もしくはその二重特異性機能的フラグメント、ならびに任意で薬学的に許容される担体および/もしくは賦形剤を含む、薬学的組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
（図１）図1は、本発明者らの本発明のいくつかの態様における抗体ライブラリーにおいて、すべてまたは一部分が多様化されているべき好ましいCDR位置のリスト（A）、本発明のいくつかの態様における抗体ライブラリーにおいて、多様化されていてもよい、フレームワーク領域における好ましい任意の増強位置のリスト（B）、ならびに本発明のすべてのライブラリーにおいて、すなわちLib1またはLib1_A残基が多様化されているライブラリーおよびLib2残基が多様化されているライブラリーの両方において、すべてまたは一部分が好ましくは不変のままであるCDR位置のリスト（C）を示している。
（図２）図2は、どのように、ヘテロ二量体VH-VL抗体スキャフォールドが、まず、Lib1またはLib1_AおよびLib2 CDR残基を表す2つの領域で別々に多様化され；これにより2種のライブラリーが産出され、それは2種の抗体クローンを得るように別々に選択され、一方のクローンは第1のパラトープを介して第1の標的またはエピトープに結合し、かつ第2のクローンは第2のパラトープを介して第2の標的またはエピトープに結合し；次いで、これらのクローンが、第1の抗体クローンにおけるLib1もしくはLib1_A位置において選択された標的特異的残基を第2の抗体クローン内へと導入することによって、または第2の抗体クローンにおけるLib2位置において選択された標的特異的残基を第1の抗体クローン内へと導入することによって、本発明に従った二重特異性抗体へと組み合わされるのかを示す上面図（空中の）全体像を用いて、新規な二重特異性抗体の発見過程を概略的手段で解説している。図2は、上面図（空中の）全体像から目に見える、フレームワーク領域における本発明に従ったそれらの潜在的増強残基の場所も概略的手段で解説している。
（図３）図3は、本発明者らが試験した、4種の初回ライブラリー設計（Lib D1L1、Lib D1L2、Lib D1H1、およびLib D1H2ライブラリー）を示している。本発明者らは、ヘテロ二量体VH-VLスキャフォールドとしての示されているVH3-VK1対合を有するヒトFabフラグメントをコードする合成遺伝子のプールとして、これら4種のライブラリーのそれぞれを産生した。各ライブラリーにおける合成遺伝子は、特異的アミノ酸が一文字記号で提示されている位置において一定であり、「X」によって印付けられた位置で多様化されていた。4種のライブラリーは、当技術分野において公知の標準的方法を用いて、ファージディスプレイライブラリーとしてそれぞれ産生され、かついくつかの抗原に対して選別された。これら4種のライブラリーからの選択された抗体クローンは、図4において詳述される二重特異性抗体へと組み合わされた。図3は、さらなる3種の好ましいライブラリー設計（Lib D1H3、Lib D2L1、およびLib D2H1）をさらに示している。
（図４）図4は、本発明に従って生成された二重特異性抗体の配列の例を与えている。
（図５）図5は、抗MBP抗GSTデュアルターゲティングクローンHM2LG1についてのELISA解析によって実証された、図4において開示される抗体の特異性を示している。
（図６）図6は、本発明に従った二重特異性構築物の高い特異性を例証するBiacore（商標）データを示している。
（図７）図7は、VEGFおよびIL6に対する、親抗体および二重特異性抗体についてのBiacore（商標）解析を示している。
（図８）図8は、本発明に従った二重特異性構築物への2種の標的の独立した共結合を例証するBiacore（商標）データを示している：A：GMCSF＋抗体＋IL6の共結合；B：抗LC＋抗体＋IL6の共結合。
（図９）図9は、本発明に従って用いられているライブラリーフレームワーク（またはスキャフォールド）の概観を示している。
（図１０）図10は、本発明に従って用いられた多様化ストラテジーの概観を示している。「X」という残基は、多様化されている残基である。取り消し線および太字で
2016500367.tif 000003
を示している残基は、ライブラリーのいくつかのクローンにおいて欠失しており、ゆえに長さの多様性を創出する。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
発明の詳細な説明
二重特異性抗体の構築のための以前の手法と比較した本発明の特色は、各相補性ヘテロ二量体VH-VLペアについて2種のパラトープ（各パラトープは、VHおよびVLドメインの両方からのCDR領域に由来する残基を用いる）を有するという、現在までのところ知られていない実現性である。
【００４４】
ゆえに、本出願は、重鎖可変（VH）ドメインおよび軽鎖可変（VL）ドメインからなる少なくとも1つの可変結合ドメインを含む抗体またはその機能的フラグメントに関し、該結合ドメインは2種の無関係なエピトープに対する2種のパラトープを含み、（i）各パラトープのそのエピトープへの結合は、他方のパラトープのその各々のエピトープへの同時結合を妨げず、かつ（ii）両パラトープは、少なくとも1つのVH CDR由来の少なくとも1個の残基および少なくとも1つのVL CDR由来の少なくとも1個の残基を含む。
【００４５】
ゆえに、第1の局面において、本発明は、
（A）（i）本発明の第3の局面に従った、抗体もしくはその機能的フラグメントのコレクションと、または（ii）抗体もしくはその機能的フラグメントのコレクションであって、該コレクションは抗体可変ドメイン配列の多様なコレクションを含み、該抗体可変ドメイン配列はVLドメインとVHドメインとの組み合わせを含み、
c．該VLドメインは、SEQ-ID NO: 1、3、5、および7より選択されるフレームワークに基づき、該VLドメインは、SEQ-ID NO: 8、12、18、19、27、もしくは28のいずれか1つ、とくにSEQ-ID NO: 8、12、18、もしくは19のいずれか1つ、またはSEQ-ID NO: 27もしくは28のいずれか1つに示される多様化スキームに従って多様化されており、かつ
d．該VHドメインは、SEQ-ID NO: 2、4、および6より選択されるフレームワークに基づき、該VHドメインは、SEQ-ID NO: 9、13、20、もしくは21のいずれか1つに示される多様化スキームに従って多様化されている、コレクション、
とくに、以下のコレクション：Lib3-L、Lib4-L、Lib4-LE、およびLib5-Lのいずれか1つより選択される、抗体もしくはその機能的フラグメントのコレクションと、
第1の関心対象標的とを接触させる工程と、第1の関心対象標的に対する結合特異性を備えた抗体またはその機能的フラグメントについてスクリーニングするまたは選択する工程とを含む、第1の関心対象標的に対する結合特異性を備えた抗体またはその機能的フラグメントを同定する工程；ならびに
（B）（i）本発明の第2の局面に従った、抗体もしくはその機能的フラグメントのコレクションと、または（ii）抗体もしくはその機能的フラグメントのコレクションであって、該コレクションは抗体可変ドメイン配列の多様なコレクションを含み、該抗体可変ドメイン配列はVLドメインとVHドメインとの組み合わせを含み、
c．該VLドメインは、SEQ-ID NO: 1、3、5、および7より選択されるフレームワークに基づき、該VLドメインは、SEQ-ID NO: 10、14、16、22、23、もしくは29のいずれか1つ、とくにSEQ-ID NO: 10、14、16、22、もしくは23のいずれか1つ、またはSEQ-ID NO: 29に示される多様化スキームに従って多様化されており、かつ
d．該VHドメインは、SEQ-ID NO: 2、4、および6より選択されるフレームワークに基づき、該VHドメインは、SEQ-ID NO: 11、15、17、24、25、もしくは26のいずれか1つに示される多様化スキームに従って多様化されている、コレクション、
とくに、以下のコレクション：Lib3-H、Lib4-H、Lib4-HE_ini、およびLib4-HEのいずれか1つより選択される、抗体もしくはその機能的フラグメントのコレクションと、
第2の関心対象標的とを接触させる工程と、第2の関心対象標的に対する結合特異性を備えた抗体またはその機能的フラグメントについてスクリーニングするまたは選択する工程とを含む、第1の関心対象標的に対する結合特異性を備えた抗体またはその機能的フラグメントを同定する工程；ならびに
（C）工程（A）で同定された抗体のうちの1つの第1の標的上のエピトープに特異的なパラトープと、工程（B）で同定された抗体のうちの1つの第2の標的上のエピトープに特異的なパラトープとを組み合わせる工程であるが、
ただし、本発明の第4の局面の特質c.に従ったコレクションからの抗体またはその機能的フラグメントに由来するパラトープと、本発明の第5の局面の特質c.に従ったコレクションからの抗体またはその機能的フラグメントに由来するパラトープとの組み合わせが除外されることを条件とする、工程
を含む、二重特異性抗体またはその機能的二重特異性フラグメントを生成するための方法に関する。
【００４６】
第1の局面のある特定の態様において、本発明は、
（D）工程（A）〜（C）で生成された二重特異性抗体もしくはその機能的二重特異性フラグメントをコードする核酸配列を宿主細胞内で発現させる工程、または該核酸を、二重特異性抗体もしくはその機能的二重特異性フラグメントを表すタンパク質に翻訳する工程
をさらに含む方法に関する。
【００４７】
第2の局面において、本発明は、抗体またはその機能的フラグメントのコレクションに関し、該コレクションは、少なくともVκ VLドメインおよびVHドメインを含む抗体可変ドメイン配列の多様なコレクションを含み、
ここで、
（ia）位置Vκ54およびVκ60の少なくとも1つが多様化されており、かつ/または
（ib）位置VH1およびVH27の少なくとも1つが欠失しており、かつ
（ii）図1Aに従ったLib2位置より選択される少なくとも3個のさらなるCDR残基が多様化されており、
ただし、少なくとも1個の多様化された残基がVHドメイン内に位置し、かつ少なくとも1つの多様化された位置がVLドメイン内に位置していることを条件とし、かつ
ここで、図1Aに従ったLib1_A位置由来の残基、とくにLib1位置由来の残基は多様化されていない。
【００４８】
第2の局面の特定の態様において、本発明は、（i）において、位置Vκ60は多様化されているが、位置Vκ54は多様化されていないコレクションに関する。
【００４９】
第2の局面の特定の態様において、本発明は、（i）において、位置Vκ60は多様化されているが、位置Vκ54は多様化されていないコレクションに関する。
【００５０】
第2の局面の特定の態様において、本発明は、（i）において、位置Vκ54は多様化されているが、位置Vκ60は多様化されていないコレクションに関する。
【００５１】
第2の局面の特定の態様において、本発明は、（i）において、位置Vκ54およびVκ54の両方が多様化されているコレクションに関する。
【００５２】
第2の局面の特定の態様において、本発明は、VHドメインのCDR1およびCDR3ならびにVLドメインのCDR2のそれぞれの少なくとも1個の残基が多様化されているコレクションに関する。
【００５３】
第2の局面の特定の態様において、本発明は、図1Bに従ったLib2E_A位置の少なくとも1個の残基、とくにLib2E位置由来の少なくとも1個の残基が、可変結合ドメインにおいてさらに多様化されているコレクションに関する。
【００５４】
第2の局面の特定の態様において、本発明は、VLおよびVHにおいて少なくとも14個の残基が多様化されている、とくにVL CDR2において少なくとも4個の残基が多様化されており、かつVH CDR1およびVH CDR3において少なくとも10個の残基が多様化されているコレクションに関する。
【００５５】
第2の局面の特定の態様において、本発明は、15、16、17、18、19、または20個の残基が多様化されているコレクションに関する。
【００５６】
第3の局面において、本発明は、抗体またはその機能的フラグメントのコレクションに関し、該コレクションは、少なくともVκ VLドメインおよびVHドメインを含む抗体可変ドメイン配列の多様なコレクションを含み、
ここで、
（ia）位置Vκ4、Vκ92、およびVκ97の少なくとも1つが多様化されており、かつ/または
（ib）位置Vκ1が欠失しており、かつ
（ii）図1Aに従ったLib1_A位置より選択される少なくとも3個のさらなるCDR残基が多様化されており、
ただし、少なくとも1個の多様化された残基がVHドメイン内に位置し、かつ少なくとも1つの多様化された位置がVLドメイン内に位置していることを条件とし、かつ
ここで、図1Aに従ったLib2由来の残基は多様化されていない。
【００５７】
第3の局面の特定の態様において、本発明は、（i）において、位置Vκ4は多様化されているが、位置Vκ92または位置Vκ97は多様化されていないコレクションに関する。
【００５８】
第3の局面の特定の態様において、本発明は、（i）において、位置Vκ92は多様化されているが、位置Vκ4または位置Vκ97は多様化されていないコレクションに関する。
【００５９】
第3の局面の特定の態様において、本発明は、（i）において、位置Vκ97は多様化されているが、位置Vκ4または位置Vκ92は多様化されていないコレクションに関する。
【００６０】
第3の局面の特定の態様において、本発明は、（i）において、Vκ4、Vκ92、およびVκ92より選択される2つの位置が多様化されているコレクションに関する。
【００６１】
第3の局面の特定の態様において、本発明は、（i）において、Vκ4、Vκ92、およびVκ92の3つの位置すべてが多様化されているコレクションに関する。
【００６２】
第3の局面の特定の態様において、本発明は、VLドメインのCDR1およびCDR3ならびにVHドメインのCDR2のそれぞれの少なくとも1個の残基が多様化されているコレクションに関する。
【００６３】
第3の局面の特定の態様において、本発明は、図1Bに従ったLib1E_A位置の少なくとも1個の残基が、可変結合ドメインにおいてさらに多様化されているコレクションに関する。
【００６４】
第3の局面の特定の態様において、本発明は、VLおよびVHにおいて少なくとも14個の残基が多様化されている、とくにVH CDR2において少なくとも4個の残基が多様化されており、かつVL CDR1およびVL CDR3において少なくとも10個の残基が多様化されているコレクションに関する。
【００６５】
第3の局面の特定の態様において、本発明は、15、16、17、18、19、または20個の残基が多様化されているコレクションに関する。
【００６６】
第4の局面において、本発明は、抗体またはその機能的フラグメントのコレクションに関し、該コレクションは抗体可変ドメイン配列の多様なコレクションを含み、該抗体可変ドメイン配列はVLドメインとVHドメインとの組み合わせを含み、
a．該VLドメインは、SEQ-ID NO: 1、3、5、および7より選択されるフレームワークに基づき、該VLドメインは、SEQ-ID NO: 8、12、18、19、27、もしくは28のいずれか1つ、とくにSEQ-ID NO: 8、12、18、もしくは19のいずれか1つ、またはSEQ-ID NO: 27もしくは28のいずれか1つに示される多様化スキームに従って多様化されており；かつ
b．該VHドメインは、SEQ-ID NO: 2、4、および6より選択されるフレームワークに基づき、該VHドメインは、SEQ-ID NO: 9、13、20、もしくは21のいずれか1つに示される多様化スキームに従って多様化されており；
ただし、SEQ-ID NO: 18もしくは19に示される多様化スキームに従って多様化されている、SEQ-ID NO: 1に基づくVLドメインと、SEQ-ID NO: 20もしくは21に示される多様化スキームに従って多様化されている、SEQ-ID NO: 2に基づくVHドメインとの組み合わせが除外されることを条件とする。
【００６７】
第4の局面の特定の態様において、本発明は、以下のコレクション：Lib3-L、Lib4-L、Lib4-LE、およびLib5-Lのいずれか1つより選択されるコレクションに関する。
【００６８】
第5の局面において、本発明は、抗体またはその機能的フラグメントのコレクションに関し、該コレクションは抗体可変ドメイン配列の多様なコレクションを含み、該抗体可変ドメイン配列はVLドメインとVHドメインとの組み合わせを含み、
c．該VLドメインは、SEQ-ID NO: 1、3、5、および7より選択されるフレームワークに基づき、該VLドメインは、SEQ-ID NO: 10、14、16、22、23、もしくは29のいずれか1つ、とくにSEQ-ID NO: 10、14、16、22、もしくは23のいずれか1つ、またはSEQ-ID NO: 29に示される多様化スキームに従って多様化されており；かつ
d．該VHドメインは、SEQ-ID NO: 2、4、および6より選択されるフレームワークに基づき、該VHドメインは、SEQ-ID NO: 11、15、17、24、25、もしくは26のいずれか1つに示される多様化スキームに従って多様化されており；
ただし、SEQ-ID NO: 22もしくは23に示される多様化スキームに従って多様化されている、SEQ-ID NO: 1に基づくVLドメインと、SEQ-ID NO: 24、25、もしくは26に示される多様化スキームに従って多様化されている、SEQ-ID NO: 2に基づくVHドメインとの組み合わせが除外されることを条件とする。
【００６９】
第5の局面の特定の態様において、本発明は、以下のコレクション：Lib3-H、Lib4-H、Lib4-HE_ini、およびLib4-HEのいずれか1つより選択されるコレクションに関する。
【００７０】
第6の局面において、本発明は、本発明に従ったライブラリーをコードする核酸配列のコレクションに関する。
【００７１】
第7の局面において、本発明は、本発明の核酸配列のコレクションを含むベクター、とくに発現ベクターのコレクションに関する。
【００７２】
特定の態様において、ベクターはファージディスプレイベクターである。
【００７３】
第8の局面において、本発明は、本発明の核酸配列のコレクションまたは本発明に従ったベクターのコレクションを含む、宿主細胞のコレクションに関する。
【００７４】
第9の局面において、本発明は、（i）本発明の核酸配列を発現させる工程、（ii）本発明のベクターから核酸配列を発現させる工程、および/または（iii）該核酸配列の発現を引き起こすもしくは可能にする条件下で、本発明に従った宿主細胞のコレクションを培養する工程を含む、本発明のいずれか1つに従った、抗体またはその機能的フラグメントのコレクションを産生するための方法に関する。
【００７５】
第10の局面において、本発明は、本発明のいずれか1つに従った、抗体またはその機能的フラグメントのコレクションと関心対象標的とを接触させる工程、および該関心対象標的に対する結合特異性を備えた抗体またはその機能的フラグメントについてスクリーニングするまたは選択する工程を含む、関心対象標的に対する結合特異性を備えた抗体またはその機能的フラグメントを同定するための方法に関する。
【００７６】
特定の態様において、スクリーニングするまたは選択する工程は、ファージディスプレイを用いるものである。
【００７７】
第10の局面のある特定の態様において、本発明は、関心対象標的に対する結合特異性を備えた抗体もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸配列を宿主細胞内で発現させる工程、または該核酸を、関心対象標的に対する結合特異性を備えた抗体もしくはその機能的フラグメントを表すタンパク質に翻訳する工程をさらに含む方法に関する。
【００７８】
第11の局面において、本発明は、本発明の方法によって得ることができる抗体または機能的フラグメントに関する。
【００７９】
第12の局面において、本発明は、本発明の方法によって得ることができる二重特異性抗体またはその機能的二重特異性フラグメントに関する。
【００８０】
最後の局面において、本発明は、本発明の抗体分子もしくはその機能的フラグメント、または二重特異性抗体もしくはその二重特異性機能的フラグメント、ならびに任意で薬学的に許容される担体および/もしくは賦形剤を含む、薬学的組成物に関する。
【００８１】
本明細書において使用するとき、「抗体」という用語は、IgG、IgM、IgE、IgA、またはIgDクラス（またはその任意のサブクラス）に属するタンパク質として定義される免疫グロブリン（Ig）分子を指し、それには、すべての従来公知の抗体およびその機能的フラグメントが含まれる。抗体/免疫グロブリン分子の「機能的フラグメント」とは、本明細書によって、抗原結合領域を保持する、抗体/免疫グロブリン分子のフラグメント（例えば、IgGの可変領域）として定義される。抗体の「抗原結合領域」は、典型的に、抗体分子の1つまたは複数の超可変領域（または相補性決定領域、「CDR」）、すなわちCDR-1、-2、および/または-3領域において見出されるが、しかしながら、可変「フレームワーク」領域も、CDRにスキャフォールドを提供するなどによって、抗原結合において重要な役割を果たし得る。好ましくは、「抗原結合領域」は、少なくとも可変軽（VL）鎖のアミノ酸残基4〜103および可変重（VH）鎖の5〜109、より好ましくはVLのアミノ酸残基3〜107およびVHの4〜111を含み、とくに好ましいのは完全なVHおよびVL鎖である（VLのアミノ酸位置1〜109およびVHの1〜113；WO 97/08320に従った番号付け）。本発明における使用のための、抗体分子の好ましいクラスはIgGである。
【００８２】
本発明の「機能的フラグメント」には、F(ab')2フラグメント、Fabフラグメント、scFv、または単一免疫グロブリン可変ドメインもしくは単一ドメイン抗体ポリペプチド、例えば単一重鎖可変ドメインもしくは単一軽鎖可変ドメインを含む構築物が含まれる。F(ab')2またはFabは、CH1ドメインとCLドメインとの間で生じる分子間ジスルフィド相互作用を最小限に抑えるまたは完全に除去するように操作されてもよい。
【００８３】
抗体は、動物を免疫することから、またはインシリコで設計されたアミノ酸配列および合成的に創出されている核酸によってコードされたアミノ酸配列に基づく抗体ライブラリーを含む、組換え抗体ライブラリーから得られ得る。抗体配列のインシリコ設計は、例えば、ヒト配列のデータベースを解析し、かつそこから取得されたデータを利用してポリペプチド配列を考案することによって達成される。インシリコで創出された配列を設計するおよび取得するための方法は、例えばKnappik et al., J. Mol. Biol. (2000) 296:57；Krebs et al., J. Immunol. Methods. (2001) 254:67；およびKnappik らに発行された米国特許第6,300,064号に記載されている。
【００８４】
本発明の文脈において、「二重特異性抗体分子」という用語は、2種の異なる標的生体分子に対する、または1つの標的生体分子上に存在しているか、もしくは該標的生体分子および第2の生体分子上などの2つの異なる分子上に存在している2種の異なるエピトープに対する特異的結合部位を含む、抗体分子の機能的フラグメントを含めた、抗体分子を指す。
【００８５】
本明細書において使用するとき、結合分子は、そのような結合分子がそのような標的生体分子と1種または複数種の参照分子とを区別し得る場合、標的生体分子（またはそのような生体分子のエピトープ）などの標的「に/に対して特異的である」、「を特異的に認識する」、または「に特異的に結合する」。というのは、結合特異性とは絶対的特性ではなく相対的特性であるからである。その最も一般的な形態において（および規定の参照が述べられていない場合）、「特異的結合」とは、例えば当技術分野において公知の特異性アッセイ法に従って判定される、関心対象の標的生体分子と無関係な生体分子とを区別し得る結合分子の能力を指す。そのような方法には、ウェスタンブロット、ELISA、RIA、ECL、IRMAテスト、およびペプチドスキャンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。例えば、標準的なELISAアッセイが実施され得る。採点は、標準的な発色（例えば、ホースラディッシュペルオキシドを有する二次抗体、および過酸化水素とともにテトラメチルベンジジン）によって実施され得る。ある特定のウェル中の反応は、例えば450nmでの光学密度によって採点される。典型的なバックグランド（＝陰性反応）は約0.1 ODであり得、典型的な陽性反応は約1 ODであり得る。このことは、陽性スコアと陰性スコアとの間の比が10倍またはそれよりも高くあり得ることを意味する。典型的に、結合特異性の判定は、単一の参照生体分子ではなく、粉ミルク、BSA、トランスフェリンなど、約3〜5種の無関係な生体分子のセットを用いることによって行われる。
【００８６】
本発明の文脈において、「約」または「およそ」という用語は、所与の値または範囲の90％〜110％を意味する。
【００８７】
しかしながら、「特異的結合」は、標的生体分子と、参照点として用いられる1種または複数種の密接に関係した生体分子とを区別し得る結合分子の能力も指し得る。加えて、「特異的結合」は、その標的抗原の異なる部分、例えば標的生体分子の異なるドメイン、領域、もしくはエピトープを区別し得る、または標的生体分子のアミノ酸残基の1個もしくは複数個の主要なアミノ酸残基もしくは区間を区別し得る結合分子の能力に関し得る。
【００８８】
本発明の文脈において、「パラトープ」という用語は、標的と抗体分子との間の特異的結合に要求される、所与の抗体分子の部分を指す。パラトープは連続的であり得、すなわち抗体分子内に存在している隣接アミノ酸残基によって形成されていてよく、または断続的であり得、すなわちアミノ酸残基のCDRのアミノ酸配列においてなど、アミノ酸残基の一次配列において異なる位置にあるが、抗体分子が取る三次元構造において近くに接近しているアミノ酸残基によって形成されていてよい。
【００８９】
本発明の文脈において、「エピトープ」という用語は、標的と抗体との間の特異的結合に要求される、所与の標的の部分を指す。エピトープは連続的であり得、すなわち標的内に存在している隣接した構造エレメントによって形成されていてよく、または断続的であり得、すなわち標的としてのタンパク質のアミノ酸配列においてなど、標的の一次配列において異なる位置にあるが、体液中などの自然環境で標的が取る三次元構造において近くに接近している構造エレメントによって形成されていてよい。
【００９０】
一態様において、抗体またはその機能的フラグメントは二重特異性抗体である。
【００９１】
本発明の抗体または機能的フラグメントのさらなる態様において、両エピトープの同時存在下における各パラトープのその各々のエピトープへの結合の量は、その他の点では同一な条件下で他方のエピトープの非存在下において達成される結合の量の少なくとも25％である。
【００９２】
本発明の抗体または機能的フラグメントのさらなる態様において、結合の量は、少なくとも50％、とくに少なくとも75％、よりとくに少なくとも90％である。
【００９３】
本発明の抗体または機能的フラグメントのさらなる態様において、第1のパラトープは、VLドメインのCDR1およびCDR3ならびにVHドメインのCDR2に由来する残基を含み、かつ第2のパラトープは、VHドメインのCDR1およびCDR3ならびにVLドメインのCDR2に由来する残基を含む。
【００９４】
特定の態様において、抗体またはその機能的フラグメントは、ヒト抗体またはその機能的フラグメントである。
【００９５】
さらなる態様において、本発明の抗体または機能的フラグメントは、ヒトVH3ファミリー重鎖配列およびヒトVκ1ファミリー軽鎖配列に基づく。
【００９６】
さらなる態様において、本発明の抗体または機能的フラグメントは、ヒトVH3ファミリー重鎖配列およびヒトVλ1ファミリー軽鎖に基づく。
【００９７】
さらなる態様において、本発明の抗体または機能的フラグメントは、一本鎖Fvフラグメント、Fabフラグメント、およびIgGより選択される。
【００９８】
本発明の抗体またはその機能的フラグメントのさらなる態様において、一方のエピトープへの結合は、（i）Lib1もしくはLib1_A位置の1つ、または（ii）Lib2位置の1つ、のいずれかを変異させることによってノックアウトされ得、一方で他方のエピトープへの結合は無傷に保たれる。
【００９９】
この文脈において、「結合は・・・ノックアウトされる」という語句は、エピトープへの親和性が少なくとも10倍（例えば、1nMから10nMへ）低下する状況を指し、「・・・結合は無傷に保たれる」という語句は、エピトープへの親和性が最大で3倍（例えば、1nMから3nMへ）低下する状況を指す。
【０１００】
特定のそのような態様において、一方のエピトープへの結合は、VL位置27もしくはVH位置61の位置の1つを変異させることによって、またはLib2位置のVL位置56もしくはVH位置28の1つを変異させることによってノックアウトされ得る。
【０１０１】
特定のそのような態様において、一方のエピトープへの結合は、[0110]の項で列挙される残基の1つを、該残基がD、N、E、およびQより選択される場合、Rに変異させることによって、またはそのような残基を、該残基がD、N、E、もしくはQとは異なる場合、Dに変異させることによってノックアウトされ得る。
【０１０２】
ゆえに、本発明は、1本の可変軽鎖および1本の可変重鎖を含む少なくとも1つの抗体可変ドメインを含む結合分子に関し、該抗体可変ドメインは少なくとも第1および第2の標的に結合しており、該抗体可変ドメインの該第1の標的への結合は、該抗体可変ドメインの該第2の標的への結合とは独立しており、逆もまた同様であり、かつ該第1および第2の標的は、抗イディオタイプ抗体でも、エピトープマッピングに用いられるペプチドなどの非生理学的ペプチドでもない。
【０１０３】
本発明の文脈において、両標的の同時存在下における第1のパラトープのその各々のエピトープ（第1の標的）への結合の量が、その他の点では同一な条件下で他方の標的の非存在下において達成される結合の量の少なくとも25％である場合、一方の標的への抗体可変ドメインの結合は、他方の標的への結合とは「独立」している。とくに、結合の量は、少なくとも50％、とくに少なくとも75％、よりとくに少なくとも90％である。
【０１０４】
特定の態様において、第1および第2の標的は、癌に関係する抗原、細胞表面受容体、サイトカイン、および/または他のシグナル伝達分子など、疾患に関係する標的を含めた、両方ともに生理学的に関連する標的および/またはそのエピトープである。
【０１０５】
別の局面において、本発明は、本発明に従った抗体またはその機能的フラグメントをコードする核酸配列に関する。
【０１０６】
別の局面において、本発明は、本発明に従った核酸配列を含むベクターに関する。
【０１０７】
別の局面において、本発明は、本発明に従った核酸配列または本発明に従ったベクターを含む宿主細胞に関する。
【０１０８】
別の局面において、本発明は、インビトロで、または本発明に従った宿主細胞を含む適切な宿主細胞から、本発明に従った核酸配列または本発明に従ったベクターを発現させる工程を含む、本発明に従った抗体またはその機能的フラグメントを生成するための方法に関する。
【０１０９】
ある特定のそのような態様において、抗体分子またはその機能的フラグメントは、一本鎖Fvフラグメント、Fabフラグメント、およびIgGより選択される。
【０１１０】
最後の局面において、本発明は、本発明の抗体分子もしくはその機能的フラグメント、または二重特異性抗体もしくはその二重特異性機能的フラグメント、ならびに任意で薬学的に許容される担体および/もしくは賦形剤を含む、薬学的組成物に関する。組成物は、例えば1日1回の投薬、1日2回の投薬、または1日3回の投薬用に製剤化され得る。
【０１１１】
本発明の組成物に関連して用いられる「薬学的に許容される」という語句は、哺乳類（例えば、ヒト）に投与された場合に、生理学的に忍容されかつ典型的に有害反応をもたらさない、そのような組成物の分子実体および他の成分を指す。「薬学的に許容される」という用語は、哺乳類での、よりとくにヒトでの使用のために、連邦もしくは州政府の規制機関によって認可されていること、または米国薬局方もしくは他の一般的に認められている薬局方に列挙されていることも意味し得る。
【０１１２】
本発明の文脈において、「約」または「およそ」という用語は、所与の値または範囲の90％〜110％を意味する。特定の態様において、該用語は、所与の値または範囲の95％〜105％を意味する。特定の態様において、該用語は、所与の値または範囲の100％を意味する。
【０１１３】
本発明の薬学的組成物に適用される「担体」という用語は、活性化合物（例えば、二重特異性抗体フラグメント）とともに投与される希釈剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような薬学的担体は、水、生理食塩溶液、水性デキストロース溶液、水性グリセロール溶液、およびピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など、石油、動物、植物、または合成起源のものを含めた油などの無菌の液体であり得る。適切な薬学的担体は、A.R. Gennaro による「Remington's Pharmaceutical Sciences」、第20版に記載されている。
【０１１４】
本発明の組成物の活性成分（例えば、二重特異性抗体フラグメント）は、少なくとも1つの疾患または障害の治療に用いられ得、該治療は、本明細書において開示される特異的投与に（例えば、1日1回、1日2回、または1日3回の投与に）適応しているまたはそのために適切に準備される。この目的のために、パッケージ小冊子および/または患者情報は、対応する情報を含有する。
【０１１５】
本発明の組成物の活性成分（例えば、二重特異性抗体分子またはその二重特異性フラグメント）は、少なくとも1つの疾患または障害の治療のための医薬の製造に用いられ得、該医薬は、本明細書において開示される特異的投与に（例えば、1日1回、1日2回、または1日3回の投与に）適応しているまたはそのために適切に調製される。この目的のために、パッケージ小冊子および/または患者情報は、対応する情報を含有する。
【実施例】
【０１１６】
以下の実施例は、本発明を、その範囲を限定することなく例証する。
【０１１７】
上記で記載される二重特異性抗体分子の第1のカテゴリー（2種の標的に特異的な2種のパラトープ（両方とも、同じヘテロ二量体VH-VL抗体可変領域内に位置するCDR残基を含む）を有する）は、上記で記載される種々の潜在的有益性を供与する一方で、本発明者らは、抗体分子のこの第1のカテゴリーに属するが、文献で報告されている上述の4つの例とは全く異なる、全く新規なクラスの抗体分子を創出し得るという仮説を立てた。本発明者らは、全く新規な手法を追求することによって、上述の例と比較して、この第1のカテゴリーに属する抗体の意図的操作においてある劇的な改善を達成することが可能であり得るという仮説を立てた。この仮説は、上述される歴史的方法が、活性薬物成分としての抗体の開発においてある重大な潜在的制限を有するという事実を考慮に入れた。
【０１１８】
本発明に従って、本発明者らは、これらの課題に対処し、そして予想外のかつ劇的な利点を有する、全く新規なクラスの二重特異性抗体を記載する。本発明者らは、それぞれが、重鎖および軽鎖の両方に由来するCDR残基を含むが、重複していない、好ましくは互いに直に隣接していない、ヘテロ二量体抗体のVH-VL可変領域内の2種の別個のパラトープを操作して、他方の結合部位における変異の結果としての一方の結合部位の立体構造変化を回避すること、および（その結合状態において、2種の標的間の考え得る立体障害を最小限に抑えることによって）抗体への結合における2種の標的間の競合の可能性を低下させることが可能であり得ると推測した。本発明者らは、それぞれが、パッキングされたヘテロ二量体VH-VLペアの背景にあり、その一方において、第1のセット（Lib1またはLib1_A）の重鎖および軽鎖CDR位置が多様化され得、かつその他方のものにおいて、異なる重複しないセット（Lib2）の重鎖および軽鎖CDR位置が多様化され得る、2種の合成抗体ライブラリーをまず創出することによって、この新規なクラスの抗体分子を操作し得るとさらに推測した。本発明者らは、そのようなライブラリーが創出され得、かつ2種の無関係な標的に対して並行して上手く選択され得た場合には、第1の標的に対する選択の間にLib1位置において選択された特異的残基を、第2の標的に対する選択の間にLib2位置において選択された特異的残基を有する抗体クローン内へと導入することによって、二重特異性抗体を潜在的に迅速に創出し得ると結論付けた。逆もまた同様であり、本発明者らは、そのようなライブラリーが創出され得、かつ2種の別個の標的に対して上手く選択され得た場合には、第2の標的に対する選択の間にLib2位置において選択された残基を、第1の標的に対する選択の間にLib1またはLib1_A位置において選択された特異的残基を有する抗体クローン内へと導入することによって、二重特異性抗体を潜在的に創出し得るとも結論付けた。本発明者らは、第1の特異性を規定する、第1の抗体由来の残基のセットを、第2の特異性についての第2の抗体内へと導入するこのストラテジーは、パッキングされたVH-VLペアを規定する同一のまたは高度に類似したスキャフォールド内に両ライブラリーを創出することによって大幅に助けられ得ると推測した。
【０１１９】
本出願において、本発明者らは、本発明者らが、2種の完全に無関係な標的に対して、いくつかの二重特異性ヘテロ二量体VH-VL抗体を創出して、本発明を上手く実践したことを実証する。重要なことには、抗体は迅速に創出され、かつ2種の標的のみに高度に特異的であり、さらなる無関係な標的への結合を示さなかった。驚くべきことには、創出された二重特異性抗体は、（軽鎖CDRループ残基を介して一方の標的に、かつ重鎖CDRループ残基を介してもう一方の標的に結合する抗体については実証されていない）高い生物物理学的安定性を示しただけでなく、「2イン1」抗体の創出において用いられたスキャフォールドと比較してさえ、かつ市販薬物において活性成分として用いられる確立された単一特異性抗体クローンと比較して、極めて高い生物物理学的安定性を示した。最後にかつ驚くべきことにも、GM-CSFおよびTNF-αに対する二重特異性抗体の例を用いて、本発明者らは、TNF-α結合に関与する推定パラトープを提供する、Lib1またはLib1_A結合領域内のCDR位置における単一の保存的点変異が、TNF-αへの結合を本質的に消失させ、一方でGM-CSFへの結合を無傷のままにしたこと、およびGM-CSF結合に関与する推定パラトープを提供する、Lib2結合領域内のCDR位置における異なる単一の保存的点変異が、GM-CSFへの結合を完全に消失させ、一方でTNF-αへの結合を無傷のままにしたことを実証することができた。このことは、本発明者らの本発明の抗体は、一般的な「粘着性」を介してよりもむしろ、高度に特異的な様式で2種の無関係な標的に実際に結合し得ること、および当技術分野において公知の上記の二重特異性抗体とは対照的に、重複しないパラトープとして設計される2つの結合部位は、両方とも、1つのヘテロ二量体VH-VL可変領域に位置するものの、かつ両方とも、同じヘテロ二量体可変領域に属するCDR残基を含むものの、本質的に独立して挙動することを実証している。したがって、本発明の抗体は、先行の二重特異性抗体と比べて重大な利点を有する。
【０１２０】
本発明の好ましい態様において、好ましい発見過程は、（1）第1および第2のライブラリーにおける異なるCDR位置の多様化によって、同じまたは高度に類似したヘテロ二量体VH-VL抗体スキャフォールドに基づくライブラリーのペアを生成する工程、（2）2種のライブラリーより選択されるクローンの結合特性を潜在的に増強する、2種のライブラリーの一方または両方のVH-VLスキャフォールドにおける、選択されたフレームワーク位置の多様化も任意で含む工程、（3）2種の標的分子またはエピトープに対して両ライブラリーを独立して選択し、かつ結合物を特徴付けして、所望の特性を備えた標的特異的またはエピトープ特異的な抗体クローンを同定する工程、（4）一方のライブラリーより選択されかつ第1の標的またはエピトープに特異的である抗体クローンにおける多様化された位置において選択された残基のすべてまたは残基の一部分（好ましくは残基の大部分であるが、残基の3個以上）を、他方のライブラリーより選択されかつ第2の標的またはエピトープに特異的である標的特異的抗体クローン内へと導入する工程を含む。この発見過程が最適に働くために、主要な残基のいくつかの群が重要な役割を果たす。
【０１２１】
ヘテロ二量体VH-VL抗体の分子モデルをインシリコで検証することによって、かつ特異性を備えていない非選択ヘテロ二量体VH-VL抗体「ダミー」の突然変異誘発を行うことによって（データ示さず）、本発明者らは、潜在的に多様化されて、第1の標的に対する第1の潜在的結合部位を形成し得るCDR残基のリスト（Lib1またはLib1_A残基）、および潜在的に多様化されて、第2の標的に対する第2の潜在的結合部位を形成し得るCDR残基のリスト（Lib2残基）を得た。本発明者らは、折り畳まれた抗体分子において、Lib1、Lib1_A、またはLib2 CDR残基に対して近くに接近している、かつ潜在的に多様化されて、Lib1またはLib1_A CDR残基を含む第1のパラトープの特性を改変し得、かつ第1の標的（Lib1EまたはLib1E_A増強残基）へのその結合、およびLib2 CDR残基を含む第2のパラトープの第2の標的（Lib2EまたはLib2E_A増強残基）への結合を増強し得る、抗体フレームワーク領域における潜在的増強残基のリストも得た。最後に、本発明者らは、両ライブラリーにおける抗体分子の中心コア領域、それは、その後、標的1に特異的なLib1またはLib1_Aおよび任意でLib1EまたはLib1E_A残基のセット、ならびに標的2に特異的なLib2および任意でLib2EまたはLib2E_A残基のセットを含むすべての組み合わせた二重特異性抗体クローン内にも存在していると考えられる、の不変パッキングを維持するために、好ましくは両ライブラリーにおいて同一なまたは非常に類似したままであろうCDR残基のリストを得た。本発明者らは、この不変のパッキングされたコア領域により、2つの結合部位は互いから保護され、第1の標的に対する第1のパラトープは、第2の標的に対する第2のパラトープの変化により生じる有害な立体構造の影響に対していくらか免疫があるようになると結論付けた。実際に、本発明者らは、親抗体クローンの親和性および結合反応速度が、親クローンに由来する組み合わされた二重特異性抗体クローンによって通常厳密に一致していることを実証することができた。実施例8は、例示的な抗原VEGFおよびIL6を用いてこのことを例証しており、38nMの親和性を有する親抗体IL6Pと11nMの親和性を有する親抗体VEGFPとを組み合わせて、IL6に対して40nMかつVEGFに対して7.8nMの親和性を有する二重特異性抗体VH6Lを産出した。2つの結合部位のこの驚くべき高いレベルの独立性は、「2イン1」抗体（上記の第3の歴史的な例）または二重特異性の対合した単一ドメインヘテロ二量体（上記の第4の歴史的な例）には可能でない手段で、それらを親和性成熟にしかつ並行させることを可能にする。本発明者らは、不変コア領域が、2つの結合部位間の間隔作りを達成し得、重複するパラトープによって引き起こされる、または各標的分子の性質および分子サイズに依存する、第1の結合している標的と第2の結合していない標的との間の立体障害によって引き起こされる競合なしで、それらが独立して2種の標的に結合するのを潜在的に可能にするとも結論付けた。実際に、例示的な抗原GMCSFおよびIL6を用いて、本発明者らは、組み合わされたクローンのいくつかに関して、単一VH-VL可変領域への両抗原の共結合が可能であることを、本発明に従った新規なクラスの二重特異性抗体分子に関して実証することができた。さらに、実施例9は、可変領域への第2の抗原の共結合の親和性は、第1の標的が存在しているま��は存在していないかどうかとは独立してあり得ることを例証している。同じVH-VL可変領域へのそのような共結合を達成する可能性、および共結合親和性の考え得る独立性は、他のタイプの歴史的な二重特異性抗体に関しては実証されておらず、本発明に従った新規な抗体の固有の利点を表す。新規な二重特異性抗体のいくつかにおいて、独立した結合挙動は、実施例10に列挙されているもののような変異によってさらに実証され得る。そのような抗体において、Lib1またはLib1_A位置において点変異を作製することによって、第1の標的に対する親和性をノックアウトしまたは大幅に低下させ、一方で第2の標的に対する親和性を無傷のままにすることが可能であり、逆もまた同様であり、Lib2位置において点変異を作製することによって、第2の標的に対する親和性をノックアウトしまたは大幅に低下させ、一方で第1の標的に対する親和性を無傷のままにすることが可能である。
【０１２２】
実施例1：ライブラリーの構築
Lib D1L1およびLib D1H1ライブラリーに対する合成遺伝子プールをGeneArtから購入し、一方でD1L2およびD1H2ライブラリーに対する合成遺伝子プールをSloning Biotechnologyから購入した。4種すべてのライブラリーを、M13起点；抗体重鎖および軽鎖の発現を推進する2つの合成リボソーム結合部位；ならびに大腸菌（E. coli）周辺質への抗体ポリペプチドの分泌を推進する2種のシグナルペプチド、ヒトCH1およびCK定常ドメイン、ならびにヒトCH1定常ドメインのC末端に融合したM13タンパク質IIIの切断C末端部分をコードする合成遺伝子の付加によって、本発明者らがpUC19骨格（NEBから購入した）から作り上げた新たに構築されたファージディスプレイベクター内にクローニングした。ライブラリーをTG1大腸菌細胞内に形質転換して、それぞれ109個の形質転換された多様性を備えた4種のライブラリーを産出した。形質転換されたTG1大腸菌細胞から、（Barbas et al., Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1st ed., 2001；Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 3rd ed., 2001）によって記載されるM13KO7ヘルパーファージおよび標準的な分子生物学の方法を用いて、4種のライブラリーを、多様化されたFabフラグメントを提示するファージのライブラリーとして産生した。
【０１２３】
実施例2：パニング
標準的なパニング手順（Barbas et al., Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1st ed., 2001；Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 3rd ed., 2001）に従って、固定化した標的MBPおよびGSTに対する、Fabをのせたファージ粒子（Fab-on-phage particle）のライブラリーからの結合物を選択することができる。
【０１２４】
実施例3：スクリーニング
実施例2において選択されたファージ粒子を、細菌宿主細胞に感染させることによって救出することができる（Barbas et al., Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1st ed., 2001；Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 3rd ed., 2001）。Fabタンパク質を個々のクローンから発現させ、かつ標的MPBおよびGSTに対する特異的結合について試験する。陽性にヒットしたものを次の工程で用いて、二重特異性構築物をクローニングする。
【０１２５】
実施例4：二重特異性抗体のクローニング
抗体遺伝子を所望のアミノ酸配列に基づいて設計し、かつ合成遺伝子または合成遺伝子フラグメントとしてGeneArtまたはDNA2.0から購入した。Rocheから購入したポリメラーゼPwo Master、およびThermo Fisher Scientificから購入した、所望の点変異をコードする合成オリゴヌクレオチドを用いて、メーカーの指示に従って、点変異を有する抗体変種をコードする遺伝子をPCRまたはオーバーラップPCRによって生成した。New England Biolabsから購入したプラスミドpUC19の改変によって、大腸菌Fab発現ベクターを生成した。抗体重鎖および軽鎖の発現を推進する2つの合成リボソーム結合部位、大腸菌周辺質への抗体鎖の分泌を推進する2種の合成シグナルペプチド配列、および一本鎖産生を潜在的に可能にする1つのM13ファージ起点の付加によって、pUC19骨格を改変した。合成抗体遺伝子、抗体遺伝子の合成フラグメント、および点変異をコードする抗体遺伝子のPCRにより生成された変種を、Rocheから購入した制限エンドヌクレアーゼを用いた制限消化、それに続く、Promegaから購入したLigaFastを用いたライゲーションによって、メーカーの指示に従って、この大腸菌Fab発現ベクター内にクローニングした。ライゲーション反応物を、StratageneまたはZymoresearchから購入したコンピテントTG1大腸菌細胞内に形質転換した。
【０１２６】
実施例5：抗体の発現および精製
Fab発現構築物を担持するTG1大腸菌クローンを、VWRから購入したカルベニシリンおよびグルコースを補給された、Carl Rothから購入したLBおよびTBの固体および液体培地中で増殖させた。液体培養下での抗体発現を、振とうインキュベーター内でErlenmeyerフラスコで一晩行い、かつCarl Rothから購入したイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）の増殖培地への添加によって誘導した。分泌されたFabフラグメントを含有する培養上清を、発現培養物の遠心分離によって清澄化した。清澄化された培養上清に、PAA Laboratoriesから購入した、1％容量のストレプトマイシン/ペニシリン溶液、VWRから購入した、2％容量の1M Tris pH8.0、およびGE Healthcareから購入した、0.4％容量のSTREAMLINE rProtein A樹脂を補給した。補給された培養上清を回転式インキュベーターで3時間または一晩インキュベートして、プロテインA樹脂へのFabフラグメントの結合を達成した。次いで、樹脂を重力流カラムに移し、Invitrogenから購入した、30ベッド容量の2×PBS pH7.4を用いて一度洗浄し、VWRから購入した、5ベッド容量の、10mM Tris pH6.8および100mM NaClを含有するバッファーを用いて一度洗浄し、かつVWRから購入した、10mMクエン酸pH3および100mM NaClを含有するバッファーを用いて溶出した。溶出されたFabフラグメントを、8％容量の1M Tris pH8.0を添加することによって中和した。中和された精製Fabフラグメントを、GE Healthcare製のillustra NAP-5脱塩カラムを用いて、メーカーの指示に従って、純粋な1×PBS pH7.4（1.06mM KH2PO4、2.97mM Na2HP04-7H20、155.17mM NaClを含有し、他の補給物を含有しない；Invitrogenカタログ番号10010056）にバッファー交換した。
【０１２７】
実施例6：抗体安定性の測定
精製されバッファー交換されたFabフラグメントの生物物理学的安定性を、示差走査熱量測定法（DSC）を用いて、1×PBS pH7.4（Invitrogenカタログ番号10010056）中で判定した。すべての測定に対して、オートサンプラーを装備しかつMicroCal製のVPViewer2000 CapDSCソフトウェアによって制御されたキャピラリーセル微量熱量計を用いた。すべてのFabフラグメントを、抗体を含有しない純粋なバッファー（1×PBS pH7.4；Invitrogenカタログ番号10010056）に対して走査した。走査パラメーターを設定して、2分間の走査前サーモスタット、0分間の走査後サーモスタット、および増大なしに関して、32℃から105℃〜115℃までの温度ウィンドウを解析した。走査速度を、スクリーニング適用に対して1時間あたり250℃に、および最も安定な組み合わせ変異体の再解析に対して1時間あたり60℃に設定した。スクリーニングモード（1時間あたり250℃の走査速度）において判定されたFabフラグメントの絶対融解温度は、再解析モード（1時間あたり60℃の走査速度）においてより3.7℃〜4.5℃高かったが、クローンの序列は両モードにおいて同じであった。MicroCal製のOrigin 7.0ソフトウェアを用いて、PBS参照を差し引いた後に、Fabフラグメントの融解温度を判定した。
【０１２８】
実施例7：抗体特異性の測定
1種の標的に対する、Lib1およびLib2ライブラリーより選択された抗体の特異性、ならびに両標的に結合するように設計された二重特異性抗体の特異性を試験するために、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を標準的方法を用いて行った。簡潔には、Nunc Maxisorpプレートを、1×PBS中に溶解したストレプトアビジンでコーティングし、PBS-T（0.3％ Tween-20が1×PBS中に溶解されている）中20nMのビオチン化標的（GST、MBP、HEL、またはVEGF）を結合させ、かつPBS-T中5％スキムミルク粉末でブロッキングすることによって調製した。その後、マイクロタイタープレート内で、可溶性Fabフラグメントとして抗体クローンを発現する大腸菌TG1培養上清の50μlを添加し、その後に、ヤギ抗ヒトκ軽鎖ポリクローナル抗体（Sigma）、または可溶性Fab発現構築物における重鎖のC末端に融合させたStrep-IIタグに特異的なマウス抗Strepタグ抗体（IBA）を用いた、結合しているFabフラグメントの検出が続いた。HRP標識した三次抗体を用いて二次抗体を検出し、TMB基質（KPL）を用いてELISAを発色させ、かつ450nmに設定されたPerkinElmer製のVictorプレートリーダーを用いてシグナルを定量化した。大腸菌培養上清中に分泌されたダミー1 Fabは4種の標的のいずれとも結合せず、Fab LG1（Lib D1L1ライブラリーより選択された）はGSTにのみ結合し、Fab HM2（Lib D1H1ライブラリーより選択された）はMBPにのみ結合し、かつFab DT3（Fab LG1およびHM2において見出されるすべての標的特異的残基を組み合わせた）はGSTおよびMBPにのみ結合することが見出された。クローンのいずれも、対照標的のHELまたはVEGFには結合しなかった（図5）。各Fabに対して2つの独立したクローンを用いて、実験を二つ組で行った。
【０１２９】
実施例8：親抗体および二重特異性抗体の親和性
ヒトVEGF（Peprotechカタログ番号100-20）およびヒトIL6（Peprotechカタログ番号200-06）に対して、抗体ライブラリーを選択した。単離された親抗体クローンのうち、IL6PおよびVEGFPを、二重特異性抗体クローンVH6Lへと組み合わせた。VH6Lの配列は図4に示されており、それは軽鎖のアミノ酸4においてさらなる点変異を示す。親抗体および二重特異性抗体の親和性を査定するために、Biacore（商標）解析を行って、IL6P、VH6L、およびVEGFPの結合挙動を解析した。このために、抗軽鎖捕捉抗体を、アミンカップリングを用いてCM5チップ上に固定化し、12000 RUがもたらされた。Fabフラグメントを400〜500RUのレベルまで捕捉させ、かつ0〜450nMに及ぶ濃度系列のIL6およびVEGFをチップ上を通過させた。図7に描写されるように、クローンIL6PはIL6に結合するがVEGFには結合せず、クローンVEGFPはVEGFに結合するがIL6には結合せず、組み合わされたクローンVH6LはIL6およびVEGFの両方に結合する。表1に示されるように、標的に対する親和性は、親抗体および二重特異性抗体に関して同程度である。解離定数KDは、IL6PおよびVH6Lに関して各々38nMおよび40nMであり、かつVEGFPおよびVH6Lに関して各々11nMおよび7.8nMである。
【０１３０】
（表１）親和性測定
2016500367.tif 000004
【０１３１】
実施例9：同じVH-VL可変領域への2種の抗原の共結合
本発明に従った二重特異性抗体が、同じVH-VL可変領域を介して2種の異なる抗原に同時に結合し得ることを実証するために、ヒトGMCSFおよびヒトIL6に特異的な二重特異性抗体クローンGH6Lを用いたBiacore（商標）実験を行った。GH6Lの配列は図4に示されており、それは軽鎖のアミノ酸4においてさらなる点変異を示す。GH6L重鎖および軽鎖ならびにシグナルペプチドcDNAを担持する標準的な哺乳類発現ベクターを用いて、HEK293-6E細胞の一過性トランスフェクションにより、抗体をヒトIgG1形態で発現させた。発現したIgGを、プロテインA樹脂を用いて親和性精製した。Biacore（商標）解析のために、GMCSF（Peprotechカタログ番号300-03）または抗軽鎖捕捉抗体を、アミンカップリングを用いてCM5チップ上に固定化し、各々4000RUおよび12000RUの固定化されたGMCSFおよび抗軽鎖捕捉抗体がもたらされた。
【０１３２】
調製された表面上にGH6Lを捕捉させ、かつそれぞれの場合において、IL6（Peprotechカタログ番号200-06）の濃度系列を流し、かつBIAevaluationソフトウェアを用いてデータを解析した。図8Aに見られ得るように、GMCSF上に捕捉されたGH6Lは、IL6に結合し得る。GMCSFをインジェクションする対照実験はシグナルを生じさせず、IL6結合シグナルが、チップ表面上のGMCSFと相互作用しないGH6Lの「フリーアーム」の結合ではなくむしろ、同じVH-VL可変領域における同時結合によるものであることを示した。図8Bでは、GH6Lを包括的な抗軽鎖捕捉抗体によって捕捉して、GMCSFの存在なしで、GH6LのIL6結合親和性を測定している。図8Aと8Bとを比較すると、GH6LがGMSCFに結合しているか否かにかかわらず、GH6Lは同程度の親和性でIL6に結合することが分かる。
【０１３３】
実施例10：独立した結合挙動
本発明に従ったいくつかの二重特異性抗体に関して、Lib1またはLib1E_AまたはLib2結合領域内に位置する単一残基の部位指向性突然変異誘発を用いて、2つの結合部位の独立した挙動を示すことができた。一例において、標的Aおよび標的Bに対して向けられた二重特異性抗体クローンを変異させた。
【０１３４】
標的A結合に関与する推定パラトープを提供するLib1またはLib1E_A結合領域内に単一の保存的LCDR3点変異H93Yを組み入れることによって、標的Aに対する親和性は大きく消失し、一方で標的Bに対する親和性は無傷のままであった。
【０１３５】
他方で、標的B結合に関与する推定パラトープを提供する、その抗体クローンのLib2結合領域内に単一の保存的LCDR2点変異W56Yを組み入れることによって、標的Bに対する親和性は完全に消失し、一方で標的Aに対する親和性は無傷のままであった。
【０１３６】
別の例において、標的Cおよび標的Dに対して向けられた二重特異性抗体クローンを変異させた。標的C結合に関与する推定パラトープを提供するLib1またはLib1E_A結合領域内に単一の保存的LCDR1点変異N27Dを組み入れることによって、標的Cに対する親和性は大きく消失し、一方で標的Dに対する親和性は無傷のままであった。
【０１３７】
他方で、標的D結合に関与する推定パラトープを提供する、この第2の抗体クローンのLib2結合領域内に単一のHCDR1点変異L28Dまたは単一のLCDR2点変異Y56Dを組み入れることによって、標的Dに対する親和性は消失し、一方で標的Cに対する親和性は無傷のままであった。
【０１３８】
本発明は、本明細書において記載される具体的態様によって範囲が限定されるべきではない。実際に、本明細書において記載されるものに加えた本発明の様々な改変は、前述の記載から当業者に明白となるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲内にあると意図される。
【０１３９】
各々の特許法の下で可能な程度まで、本明細書において引用されるすべての特許、出願、刊行物、試験方法、文献、および他の材料は、参照により本明細書によって組み入れられる。
【図１】
2016500367.tif 000006
【図２】
2016500367.tif 000007
【図３−１】
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【図３−２】
2016500367.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【図６−１】
2016500367.tif 000012
【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
2016500367.tif 000015
【図７−３】
2016500367.tif 000016
【図８−１】
2016500367.tif 000017
【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
2016500367.tif 000020
【図９−１】
2016500367.tif 000021
【図９−２】
2016500367.tif 000022
【図１０−１】
2016500367.tif 000023
【図１０−２】
2016500367.tif 000024
【図１０−３】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年8月5日(2015.8.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2016500367000001.app
【国際調査報告】
2016500367.tif 000026
2016500367.tif 000027
2016500367.tif 000028