(57)【要約】海馬の可塑性ならびに海馬介在性学習及び記憶を向上させるための方法、及び／またはニューロンのシナプス成熟を向上させるための方法、及び／またはニューロンのシナプス伝達を最適化もしくは向上させるための方法、及び／または細胞内の酸素送達もしくは利用を向上させるための方法、及び／またはＡＴＰ合成を向上させるための方法であって、それを必要とする対象に（例えば、正常な対象、神経的外傷（例えば、脳への事故または損傷、卒中、酸素欠乏、溺水、及び窒息）から回復中の対象、ならびに学習障害（例えば、読字障害、計算障害、書字障害、統合運動障害（感覚統合障害）など）を有する対象から選択されるがこれらに限定されない、少なくとも１つの対象群において）、十分な時間にわたって十分な量の、１００ｎｍ未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ構造体（例えば、ナノ気泡）のイオン性水溶液の投与を含む、方法が提供される。【選択図】図８Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
海馬介在性学習及び記憶の向上を必要とする対象に、前記対象の海馬介在性学習及び記憶を向上させるために１００ナノメートル未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ構造体の治療上有効な量のイオン性水溶液を投与することを含む、海馬介在性学習及び記憶を向上させるための方法。
【請求項２】
前記イオン性水溶液が、大気圧及び周囲温度で少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、及び少なくとも６０ｐｐｍの酸素の群から選択される量の溶解酸素を含む、請求項１に記載の前記方法。
【請求項３】
前記電荷安定化酸素含有ナノ構造体として前記溶液中に存在する溶解酸素分子の百分率が、大気圧及び周囲温度で０．０１％超、０．１％超、１％超、５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、及び９５％超からなる群から選択される百分率である、請求項１に記載の前記方法。
【請求項４】
電荷安定化酸素含有ナノ構造体中に存在する溶解酸素の量が、大気圧及び周囲温度で少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、及び少なくとも６０ｐｐｍの酸素からなる群から選択される量である、請求項３に記載の前記方法。
【請求項５】
前記溶解酸素の過半量が、前記電荷安定化酸素含有ナノ構造体中に存在する、請求項３に記載の前記方法。
【請求項６】
前記電荷安定化酸素含有ナノ構造体が、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１０ｎｍ、及び５ｎｍ未満からなる群から選択される大きさ未満の平均直径を有する、請求項１に記載の前記方法。
【請求項７】
前記イオン性水溶液（ｉｏｎｉｃ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が、水溶液（ｗａｔｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）または食塩水溶液（ｓａｌｉｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を含む、請求項１に記載の前記方法。
【請求項８】
前記溶液が超酸素化される、請求項１に記載の前記方法。
【請求項９】
前記電荷安定化酸素含有ナノ構造体が、１００ナノメートル未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ気泡を含む、請求項請求項１〜８のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１０】
前記対象の海馬細胞の細胞膜電位及び細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を含む、請求項１に記載の前記方法。
【請求項１１】
学習及び／または記憶を向上させることが、正常な対象、神経的外傷から回復中の対象、及び学習障害を有する対象からなる群から選択される少なくとも１つの群において学習及び／または記憶を向上させることを含む、請求項１に記載の前記方法。
【請求項１２】
前記学習障害が、読字障害、計算障害、書字障害、統合運動障害（感覚統合障害）、言語障害／失語症、聴覚処理障害、非言語性学習障害、視覚処理障害、及び注意欠陥障害（ＡＤＤ）からなる群から選択される１つを含む、請求項１１に記載の前記方法。
【請求項１３】
神経的外傷が、脳への事故または損傷、卒中、酸素欠乏、溺水、及び窒息のうちの少なくとも１つを含む、請求項１１に記載の前記方法。
【請求項１４】
投与が、海馬ニューロンにおいて、ＮＲ２Ａ及び／もしくはＮＲ２ＢサブユニットＮＭＤＡ受容体、ＡＭＰＡ受容体のＧｌｕＲ１（ｇｌｕｒ１）サブユニット、Ａｒｃ（ａｒｃ）、ＰＳＤ９５、ＣＲＥＢ（ｃｒｅｂ）：ａｒｃ、ｚｉｆ−２６８、及びｃ−ｆｏｓを含むＩＥＧ；ｎｒ１、ｎｒ２ａ、ｎｒ２ｂ、及びｎｒ２ｃを含むＮＭＤＡ受容体サブユニット；ＡＭＰＡ受容体サブユニットｇｌｕｒ１；ｂｄｎｆ、ｎｔ３、ｎｔ５、及びｎｔｒｋ２を含む神経栄養因子ならびにそれらの受容体；アデニル酸シクラーゼ（ａｄｃｙ１及びａｄｃｙ８）；ｃａｍｋ２ａ、ａｋｔ１；ＡＤＡＭ−１０、Ｓｙｎｐｏ、及びｈｏｍｅｒ−１からなる群から選択される少なくとも１つの神経可塑性タンパク質の発現、量、または活性レベルの調節（例えば、上方制御を促進する、請求項１に記載の前記方法。
【請求項１５】
投与が、長期抑圧を支持することが知られる遺伝子によってコード化されるタンパク質であるＧｒｉａ２、Ｐｐｐ１ｃａ、Ｐｐｐ２ｃａ、及びＰｐｐ３ｃａからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の発現、量、または活性レベルの調節（例えば、下方制御を促進する、請求項１に記載の前記方法。
【請求項１６】
少なくとも１つの追加の治療薬が前記患者に投与される、併用療法を含む、請求項１に記載の前記方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの追加の治療薬が、酢酸グラチラマー、インターフェロン−β、ミトキサントロン、ナタリズマブ、ＭＭＰ−９及びＭＭＰ−２の阻害剤を含むＭＭＰの阻害剤、短時間作用型β２作動薬、長時間作用型β２作動薬、抗コリン薬、副腎皮質ステロイド、全身性副腎皮質ステロイド、マスト細胞安定剤、ロイコトリエン変性剤、メチルキサンチン、β２作動薬、アルブテロール、レブアルブテロール、ピルブテロール、アルトホルモテロール（ａｒｔｆｏｒｍｏｔｅｒｏｌ）、ホルモテロール、サルメテロール、イプラトロピウム及びチオトロピウムを含む抗コリン薬；ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾン、モメタゾン、トリアムシノロン、メチプレドニゾロン（ｍｅｔｈｙｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、プレドニゾロン、プレドニゾンを含む副腎皮質ステロイド；モンテルカスト、ザフィルルカスト、及びジロートンを含むロイコトリエン変性剤；クロモリン及びネドクロミルを含むマスト細胞安定剤；テオフィリンを含むメチルキサンチン；イプラトロピウム及びアルブテロール、フルチカゾン及びサルメテロール、ブデソニド及びホルモテロールを含む配合薬；ヒドロキシジン、ジフェンヒドラミン、ロラタジン、セチリジン、及びヒドロコルチゾンを含む抗ヒスタミン薬；タクロリムス及びピメクロリムスを含む免疫系調節薬；シクロスポリン；アザチオプリン；ミコフェノール酸モフェチル；ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１６に記載の前記方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの追加の治療薬が、抗炎症剤である、請求項１６に記載の前記方法。
【請求項１９】
細胞膜電位及び細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節が、膜結合タンパク質の量、立体構造、活性、リガンド結合活性、及び／または触媒活性のうちの少なくとも１つの調節を含む、細胞膜構造または機能のうちの少なくとも１つを調節することを含む、請求項１０に記載の前記方法。
【請求項２０】
前記膜結合タンパク質が、受容体、イオンチャネルタンパク質、細胞内付着タンパク質、細胞接着タンパク質、及びインテグリンからなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１９に記載の前記方法。
【請求項２１】
前記受容体が、膜貫通受容体を含む、請求項２０に記載の前記方法。
【請求項２２】
細胞膜伝導性を調節することが、全細胞コンダクタンスを調節することを含む、請求項１０に記載の前記方法。
【請求項２３】
全細胞コンダクタンスを調節することが、前記全細胞コンダクタンスの少なくとも１つの電位依存性寄与を調節することを含む、請求項２２に記載の前記方法。
【請求項２４】
細胞膜電位及び細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節が、カルシウム依存性細胞メッセージ経路または系を調節することを含む、請求項１０に記載の前記方法。
【請求項２５】
イオンチャネル型グルタミン酸受容体を介してカルシウム流入を調節することを含む、請求項２４に記載の前記方法。
【請求項２６】
前記イオンチャネル型グルタミン酸受容体が、少なくとも１つのＮＭＤＡ及び／またはＡＭＰＡ受容体を含む、請求項２５に記載の前記方法。
【請求項２７】
細胞膜電位及び細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節が、ホスホリパーゼＣ活性の調節を含む細胞内シグナル伝達を調節することを含む、請求項１０に記載の前記方法。
【請求項２８】
細胞膜電位及び細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節が、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）活性の調節を含む細胞内シグナル伝達を調節することを含む、請求項１０に記載の前記方法。
【請求項２９】
細胞ネットワークまたは層への投与を含み、その中の細胞間結合部の調節をさらに含む、請求項１に記載の前記方法。
【請求項３０】
細胞膜電位及び細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つを調節する流体の能力が、密閉された気密容器内で少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも４カ月、少なくとも５カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月、またはそれより長い期間にわたって持続する、請求項１０に記載の前記方法。
【請求項３１】
治療することが、局所、吸入、鼻腔内、経口、静脈内（ＩＶ）、及び腹腔内（ＩＰ）のうちの少なくとも１つによる投与を含む、請求項１に記載の前記方法。
【請求項３２】
前記電荷安定化酸素含有ナノ構造体が、本明細書に開示される表１及び２の少なくとも１つの塩またはイオンを含む溶液中で形成される、請求項１に記載の前記方法。
【請求項３３】
前記対象が哺乳動物、好ましくはヒトである、請求項１に記載の前記方法。
【請求項３４】
樹状突起棘の密度及び大きさを充実させることによってニューロンのシナプス成熟を向上させることをさらに含む、請求項１に記載の前記方法。
【請求項３５】
少なくとも１つのシナプス前応答及び／またはシナプス後応答を調節することをさらに含み、ニューロンのシナプス伝達の最適化または向上が得られる、請求項１に記載の前記方法。
【請求項３６】
細胞内の酸素送達または利用を向上させることをさらに含む、請求項３５に記載の前記方法。
【請求項３７】
ＡＴＰ合成の増加をさらに含む、請求項３５に記載の前記方法。
【請求項３８】
ニューロンのシナプス成熟の向上を必要とするニューロンまたは対象に、樹状突起棘の密度及び大きさを充実させることによってニューロンのシナプス成熟を向上させるのに十分な、１００ナノメートル未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ構造体の治療上有効な量のイオン性水溶液を投与することを含む、樹状突起棘の密度及び大きさを充実させることによってニューロンのシナプス成熟を向上させるための方法。
【請求項３９】
主軸索の長さ、側枝の数、または三次分枝の数のうちの少なくとも１つを向上させることを含む、請求項３８に記載の前記方法。
【請求項４０】
前記イオン性水溶液が、大気圧及び周囲温度で少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、及び少なくとも６０ｐｐｍの酸素からなる群から選択される量の溶解酸素を含む、請求項３８に記載の前記方法。
【請求項４１】
前記電荷安定化酸素含有ナノ構造体として前記溶液中に存在する溶解酸素分子の百分率が、大気圧及び周囲温度で０．０１％超、０．１％超、１％超、５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、及び９５％超からなる群から選択される百分率である、請求項３８に記載の前記方法。
【請求項４２】
電荷安定化酸素含有ナノ構造体中に存在する溶解酸素の量が、大気圧及び周囲温度で少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、及び少なくとも６０ｐｐｍの酸素からなる群から選択される量である、請求項３８に記載の前記方法。
【請求項４３】
前記溶解酸素の過半量が、前記電荷安定化酸素含有ナノ構造体中に存在する、請求項３８に記載の前記方法。
【請求項４４】
前記電荷安定化酸素含有ナノ構造体が、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１０ｎｍ、及び５ｎｍ未満からなる群から選択される大きさ未満の平均直径を有する、請求項３８に記載の前記方法。
【請求項４５】
前記イオン性水溶液（ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が、水溶液（ｗａｔｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）または食塩水溶液を含む、請求項３８に記載の前記方法。
【請求項４６】
前記溶液が超酸素化される、請求項３８に記載の前記方法。
【請求項４７】
前記電荷安定化酸素含有ナノ構造体が、１００ナノメートル未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ気泡を含む、請求項請求項３８〜４６のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項４８】
前記ニューロンが海馬ニューロンである、請求項３８に記載の前記方法。
【請求項４９】
少なくとも１つのシナプス前応答及び／またはシナプス後応答を調節することをさらに含み、ニューロンのシナプス伝達の最適化または向上が得られる、請求項３８に記載の前記方法。
【請求項５０】
ニューロンのシナプス成熟の維持、増大、または向上を必要とするニューロンに、培養ニューロンのシナプス成熟を維持、増大、または向上させるのに十分な、１００ナノメートル未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ構造体の有効な量のイオン性水溶液を投与することを含む、培養ニューロンのシナプス成熟を維持、増大、または向上させるための方法。
【請求項５１】
前記ニューロンが海馬ニューロンである、請求項５０に記載の前記方法。
【請求項５２】
樹状突起棘の密度及び大きさを充実させることをさらに含む、請求項５０に記載の前記方法。
【請求項５３】
少なくとも１つのシナプス前応答及び／またはシナプス後応答を調節することをさらに含み、ニューロンのシナプス伝達の最適化または向上が得られる、請求項５０に記載の前記方法。
【請求項５４】
神経伝達を最適化または向上させるための方法であって、１００ｎｍ未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ構造体を含む電気運動的に変化させられたイオン性水溶液を、少なくとも１つのシナプス前応答及び／またはシナプス後応答を調節するのに十分な量で、かつ十分な期間にわたって、ニューロンと接触させること、またはニューロンを有する対象に投与することを含み、ニューロンのシナプス伝達を最適化または向上させるための方法が得られる、前記方法。
【請求項５５】
少なくとも１つのシナプス前応答及び／またはシナプス後応答を調節することが、自発性伝達物質放出の増加を含む、請求項５４に記載の前記方法。
【請求項５６】
少なくとも１つのシナプス前応答及び／またはシナプス後応答を調節することが、雑音動態の改変を含む、請求項５４に記載の前記方法。
【請求項５７】
少なくとも１つのシナプス前応答及び／またはシナプス後応答を調節することが、シナプス後応答の増加を含む、請求項５４に記載の前記方法。
【請求項５８】
シナプス前ＩＣａ＋＋振幅の増加を伴わない前記シナプス後応答の増加を含む、請求項５７に記載の前記方法。
【請求項５９】
少なくとも１つのシナプス前応答及び／またはシナプス後応答を調節することが、活性帯におけるシナプス小胞密度及び／または数の減少を含む、請求項５４に記載の前記方法。
【請求項６０】
クラスリン被覆小胞、及び結合部位近傍の大型エンドソーム様小胞の数の増加をさらに含む、請求項５９に記載の前記方法。
【請求項６１】
少なくとも１つのシナプス前応答及び／またはシナプス後応答を調節することが、シナプス伝達最適化をもたらすＡＴＰ合成の顕著な増加を含む、請求項５４に記載の前記方法。
【請求項６２】
少なくとも１つのシナプス前応答及び／またはシナプス後応答を調節することが、シナプス後スパイク生成の回復の向上またはより活発な回復を含む、請求項５４に記載の前記方法。
【請求項６３】
少なくとも１つのシナプス前応答及び／またはシナプス後応答を調節することが、シナプス前及びシナプス後終末におけるＡＴＰ合成の増加を含む、請求項５４に記載の前記方法。
【請求項６４】
細胞内の酸素送達または利用を向上させることをさらに含む、請求項５４に記載の前記方法。
【請求項６５】
前記１００ｎｍ未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ構造体が、１００ｎｍ未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ気泡を含む、請求項５４〜６４のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項６６】
神経伝達を最適化または向上させるための方法であって、１００ｎｍ未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ構造体を含む電気運動的に変化させられたイオン性水溶液を、細胞内の酸素送達または利用を向上させるのに十分な量で、かつ十分な期間にわたって、ニューロンと接触させること、またはニューロンを有する対象に投与することを含み、ニューロンのシナプス伝達を最適化または向上させるための方法が得られる、前記方法。
【請求項６７】
ニューロンのシナプス伝達を最適化または向上させることが、自発性伝達物質放出の増加を含む、請求項６６に記載の前記方法。
【請求項６８】
ニューロンのシナプス伝達を最適化または向上させることが、雑音動態の改変を含む、請求項６６に記載の前記方法。
【請求項６９】
ニューロンのシナプス伝達を最適化または向上させることが、シナプス後応答の増加を含む、請求項６６に記載の前記方法。
【請求項７０】
シナプス前ＩＣａ＋＋振幅の増加を伴わない前記シナプス後応答の増加を含む、請求項６９に記載の前記方法。
【請求項７１】
ニューロンのシナプス伝達を最適化または向上させることが、活性帯におけるシナプス小胞密度及び／または数の減少を含む、請求項６６に記載の前記方法。
【請求項７２】
クラスリン被覆小胞、及び結合部位近傍の大型エンドソーム様小胞の数の増加をさらに含む、請求項７１に記載の前記方法。
【請求項７３】
ニューロンのシナプス伝達を最適化または向上させることが、ＡＴＰ合成の顕著な増加を含む、請求項６６に記載の前記方法。
【請求項７４】
ニューロンのシナプス伝達を最適化または向上させることが、シナプス後スパイク生成の回復の向上またはより活発な回復を含む、請求項６６に記載の前記方法。
【請求項７５】
ニューロンのシナプス伝達を最適化または向上させることが、シナプス前及びシナプス後終末におけるＡＴＰ合成の増加を含む、請求項６６に記載の前記方法。
【請求項７６】
前記１００ｎｍ未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ構造体が、１００ｎｍ未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ気泡を含む、請求項６６〜７５のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項７７】
細胞内の酸素送達または利用を向上させるための方法であって、１００ｎｍ未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ構造体を含む電気運動的に変化させられたイオン性水溶液を、細胞内で細胞内の酸素送達または利用を向上させるのに十分な量で、かつ十分な期間にわたって、前記細胞と接触させること、または細胞を有する対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項７８】
前記細胞が神経細胞である、請求項７７に記載の前記方法。
【請求項７９】
細胞内の酸素送達または利用を向上させることが、ニューロンのシナプス伝達の最適化または向上をもたらす、請求項７８に記載の前記方法。
【請求項８０】
ニューロンのシナプス伝達を最適化または向上させることが、自発性伝達物質放出の増加を含む、請求項７９に記載の前記方法。
【請求項８１】
ニューロンのシナプス伝達を最適化または向上させることが、雑音動態の改変を含む、請求項７９に記載の前記方法。
【請求項８２】
ニューロンのシナプス伝達を最適化または向上させることが、シナプス後応答の増加を含む、請求項７９に記載の前記方法。
【請求項８３】
シナプス前ＩＣａ＋＋振幅の増加を伴わない前記シナプス後応答の増加を含む、請求項８２に記載の前記方法。
【請求項８４】
ニューロンのシナプス伝達を最適化または向上させることが、活性帯におけるシナプス小胞密度及び／または数の減少を含む、請求項７９に記載の前記方法。
【請求項８５】
クラスリン被覆小胞、及び結合部位近傍の大型エンドソーム様小胞の数の増加をさらに含む、請求項８４に記載の前記方法。
【請求項８６】
ニューロンのシナプス伝達を最適化または向上させることが、ＡＴＰ合成の増加を含む、請求項７９に記載の前記方法。
【請求項８７】
ニューロンのシナプス伝達を最適化または向上させることが、シナプス後スパイク生成の回復の向上またはより活発な回復を含む、請求項７９に記載の前記方法。
【請求項８８】
ニューロンのシナプス伝達を最適化または向上させることが、シナプス前及びシナプス後終末におけるＡＴＰ合成の増加を含む、請求項７９に記載の前記方法。
【請求項８９】
前記１００ｎｍ未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ構造体が、１００ｎｍ未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ気泡を含む、請求項７７〜８８のいずれか１項に記載の前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年７月２３日出願で「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＵＰＲＥＧＵＬＡＴＩＮＧ  ＨＩＰＰＯＣＡＭＰＡＬ  ＰＬＡＳＴＩＣＩＴＹ  ＡＮＤ  ＨＩＰＰＯＣＡＭＰＵＳ−ＤＥＰＥＮＤＥＮＴ  ＬＥＡＲＮＩＮＧ  ＡＮＤ  ＭＥＭＯＲＹ」と題する同時係属の米国仮特許出願第６１／８５７，３０６号、２０１３年１０月８日出願で「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＵＰＲＥＧＵＬＡＴＩＮＧ  ＨＩＰＰＯＣＡＭＰＡＬ  ＰＬＡＳＴＩＣＩＴＹ  ＡＮＤ  ＨＩＰＰＯＣＡＭＰＵＳ−ＤＥＰＥＮＤＥＮＴ  ＬＥＡＲＮＩＮＧ  ＡＮＤ  ＭＥＭＯＲＹ」と題する米国仮特許出願第６１／８８８，４２０号、及び２０１４年１月２２日出願で「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＯＰＴＩＭＩＺＩＮＧ  ＮＥＵＲＯＮＡＬ  ＳＹＮＡＰＴＩＣ  ＴＲＡＮＳＭＩＳＳＩＯＮ」と題する米国仮特許出願第６１／９３０，３８８号の利益を主張するものであり、これらのすべては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（技術分野）
具体的な態様は、概して海馬依存性学習及び記憶に関し、より具体的な態様では、本明細書に開示されるように、電荷安定化酸素含有ナノ構造体を含む気体富化された（例えば、酸素富化された）電気運動的に生成される流体を含む治療組成物を投与することによって、対象における海馬の可塑性ならびに海馬依存性学習及び記憶を上方制御するための組成物及び方法に関する。追加の態様は、（例えば、主軸索の長さ、側枝の数、または三次分枝の数のうちの少なくとも１つを向上させることを含む）樹状突起棘の密度及び大きさを充実させることによってニューロンのシナプス成熟を向上させるための方法に関する。追加の態様は、概してニューロン及びニューロンのシナプス伝達に関し、より具体的には、ニューロンのシナプス伝達を最適化または向上させるための組成物及び方法に関する。さらなる態様は、（具体的にはニューロン内で）細胞内の酸素送達または利用を向上させるための方法、及び（例えば、シナプス前及び／またはシナプス後終末において）ＡＴＰ合成を向上させるための方法に関する。追加の態様は併用療法に関する。
【背景技術】
【０００３】
イオンチャネル型グルタミン酸受容体を介するカルシウム流入の増加、及び海馬ニューロン内の可塑性関連分子の上方制御は、海馬依存性空間学習及び記憶の過程における２つの重要な事象である。
【０００４】
さらに、イオンチャネル型グルタミン酸受容体を介する樹状突起棘の密度の増加及びシナプス伝達の向上は、シナプス可塑性の、そして最終的には海馬依存性空間学習及び記憶の過程における、重要な事象である。
【０００５】
海馬ニューロン機能はまた、神経変性疾患に関係する。例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶及び認知の機能障害を特徴とする老齢集団において最も一般的な神経変性障害である。海馬ニューロンの大量の損失（１）が、この疾患の特徴である。海馬ニューロンの死は、多くの場合、イオンコンダクタンス（３、４）、シナプス形成（５）、樹状分枝（６）、長期増強（７、８）、及び長期抑圧（８、９）に関与する多くの機能遺伝子の強力な下方制御（２）に関連する。ＮＭＤＡ及びＡＭＰＡ受容体を含むイオンチャネル型グルタミン酸受容体を介するカルシウム流入の機能障害は、海馬学習及び記憶の損失に直接関係する（１０）。死後のＡＤ脳の分析は、ＮＲ１、ＮＲ２Ａ、及びＮＲ２Ｂを含むＮＭＤＡサブユニットの発現が、海馬を含む感受性脳領域において変化させられたことを示した（１１）。ａｒｃ、ｚｉｆ−２６８、ｈｏｍｅｒ−１、ｃ−ｆｏｓを含む前初期遺伝子（ＩＥＧ）の下方制御（１２）、及びｐｓｄ−９５、ｓｙｎｐｏ、ａｄａｍ−１０を含むシナプス遺伝子の阻害（１３〜１５）も、ＡＤ脳内で下方制御されると報告された。加えて、異なる海馬タンパク質中の酸化的損傷（１６）及びニトロシル化的（ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｖｅ）損傷（１７、１８）も、海馬ニューロンの機能の損失そして最終的にはその死に関係付けられている。コリンエステラーゼ阻害剤及びメマンチンを含む多くの薬理学的化合物が、これらの進行性神経変性疾患の治療において試験されているが、それらのほとんどは、おそらく高齢者集団のより低い代謝活性のためか、またはおそらくそれらの代謝に起因する毒性のために、いくつかの副作用を生み出す。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，Ｐ．Ｊ．，Ｐｒｉｃｅ，Ｄ．Ｌ．，Ｓｔｒｕｂｌｅ，Ｒ．Ｇ．，Ｃｌａｒｋ，Ａ．Ｗ．，Ｃｏｙｌｅ，Ｊ．Ｔ．，ａｎｄ  Ｄｅｌｏｎ，Ｍ．Ｒ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８２）２１５，１２３７〜１２３９
【非特許文献２】Ｃｏｌａｎｇｅｌｏ，Ｖ．，Ｓｃｈｕｒｒ，Ｊ．，Ｂａｌｌ，Ｍ．Ｊ．，Ｐｅｌａｅｚ，Ｒ．Ｐ．，Ｂａｚａｎ，Ｎ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｌｕｋｉｗ，Ｗ．Ｊ．、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ（２００２）７０，４６２〜４７３
【非特許文献３】Ｊａｃｏｂ，Ｃ．Ｐ．，Ｋｏｕｔｓｉｌｉｅｒｉ，Ｅ．，Ｂａｒｔｌ，Ｊ．，Ｎｅｕｅｎ−Ｊａｃｏｂ，Ｅ．，Ａｒｚｂｅｒｇｅｒ，Ｔ．，Ｚａｎｄｅｒ，Ｎ．，Ｒａｖｉｄ，Ｒ．，Ｒｏｇｇｅｎｄｏｒｆ，Ｗ．，Ｒｉｅｄｅｒｅｒ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｇｒｕｎｂｌａｔｔ，Ｅ．、Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ（２００７）１１，９７〜１１６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、神経変性疾患の治療の他に、（神経変性疾患との関連で神経可塑性及び学習を向上させることに加えて）一般集団の神経可塑性及び学習を向上させるための組成物及び方法が、当該技術分野において明白に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
特定の態様によると、開示される電気運動的に変化させられた流体（例えば、ＲＮＳ６０）は、ＮＭＤＡ感受性及びＡＭＰＡ感受性のイオンチャネル型グルタミン酸受容体を介してカルシウム流入を誘導することによって、海馬ニューロンのシナプス可塑性を制御または調節する（例えば、増加または向上させる）。ＲＮＳ６０は、Ａｒｃ、ＰＳＤ９５、及びＣＲＥＢを含む他の可塑性関連分子とともにＮＲ２Ａ、ＮＲ２ＢサブユニットＮＭＤＡ、及びＡＭＰＡ受容体のＧｌｕＲ１サブユニットの発現を刺激するが、ＮＳまたはＰＮＳのいずれもそれらの発現を刺激しない。
【０００９】
したがって、特定の態様は、海馬の可塑性ならびに海馬依存性学習及び／または記憶の向上を必要とする対象に、主に約１００ナノメートル未満の平均直径を有し、かつイオン性水性流体中に安定して構成されている電荷安定化酸素含有ナノ構造体（例えば、ナノ気泡）のイオン性水溶液を含む、治療上有効な量の電気運動的に変化させられた水性流体を、対象の海馬の可塑性ならびに海馬依存性学習及び／または記憶を向上させるのに十分な量で投与することを含む、海馬の可塑性ならびに海馬依存性学習及び／または記憶を向上させるための方法を提供する。
【００１０】
したがって、特定の態様は、海馬介在性学習及び記憶の向上を必要とする対象に、該対象の海馬介在性学習及び記憶を向上させるために１００ナノメートル未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ構造体の治療上有効な量のイオン性水溶液を投与することを含む、海馬介在性学習及び記憶を向上させるための方法を提供する。
【００１１】
本方法の特定の態様では、イオン性水溶液は、大気圧で少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素の量の溶解酸素を含む。本方法の特定の態様では、電荷安定化酸素含有ナノ構造体として溶液中に存在する溶解酸素分子の百分率は、０．０１％超、０．１％超、１％超、５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、及び９５％超からなる群から選択される百分率である。本方法の特定の態様では、電荷安定化酸素含有ナノ構造体中に存在する溶解酸素の量は、大気圧で少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素である。本方法の特定の態様では、溶解酸素の過半量は、電荷安定化酸素含有ナノ構造体中に存在する。本方法の特定の態様では、電荷安定化酸素含有ナノ構造体は、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１０ｎｍ、及び５ｎｍ未満からなる群から選択される大きさ未満の平均直径を有する。本方法の特定の態様では、イオン性水溶液は、食塩水溶液を含む。本方法の特定の態様では、該溶液は超酸素化される。
【００１２】
本方法の特定の態様では、電荷安定化酸素含有ナノ構造体は、１００ナノメートル未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ気泡を含む。
【００１３】
本方法の特定の態様では、対象の海馬細胞の細胞膜電位及び細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つを調節することを含む。
【００１４】
本方法の特定の態様では、学習及び／または記憶を向上させることは、正常な対象、神経的外傷から回復中の対象、及び学習障害を有する対象からなる群から選択される少なくとも１つの群において学習及び／または記憶を向上させることを含む。本方法の特定の態様では、学習障害は、読字障害、計算障害、書字障害、統合運動障害（感覚統合障害）、言語障害／失語症、聴覚処理障害、非言語性学習障害、視覚処理障害、及び注意欠陥障害（ＡＤＤ）からなる群から選択される１つを含む。本方法の特定の態様では、神経的外傷は、脳への事故または損傷、卒中、酸素欠乏、溺水、及び窒息のうちの少なくとも１つを含む。
【００１５】
本方法の特定の態様では、投与は、海馬ニューロンにおいて、ＮＲ２Ａ及び／もしくはＮＲ２ＢサブユニットＮＭＤＡ受容体、ＡＭＰＡ受容体のＧｌｕＲ１（ｇｌｕｒ１）サブユニット、Ａｒｃ（ａｒｃ）、ＰＳＤ９５、ＣＲＥＢ（ｃｒｅｂ）：ａｒｃ、ｚｉｆ−２６８、及びｃ−ｆｏｓを含むＩＥＧ；ｎｒ１、ｎｒ２ａ、ｎｒ２ｂ、及びｎｒ２ｃを含むＮＭＤＡ受容体サブユニット；ＡＭＰＡ受容体サブユニットｇｌｕｒ１；ｂｄｎｆ、ｎｔ３、ｎｔ５、及びｎｔｒｋ２を含む神経栄養因子ならびにそれらの受容体；アデニル酸シクラーゼ（ａｄｃｙ１及びａｄｃｙ８）；ｃａｍｋ２ａ、ａｋｔ１；ＡＤＡＭ−１０、Ｓｙｎｐｏ、及びｈｏｍｅｒ−１からなる群から選択される少なくとも１つの神経可塑性タンパク質の発現、量、または活性レベルの調節（例えば、上方制御を促進する。
【００１６】
本方法の特定の態様では、投与は、長期抑圧を支持することが知られる遺伝子によってコード化されるタンパク質であるＧｒｉａ２、Ｐｐｐ１ｃａ、Ｐｐｐ２ｃａ、及びＰｐｐ３ｃａからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の発現、量、または活性レベルの調節（例えば、下方制御を促進する。
【００１７】
本方法の特定の態様は、少なくとも１つの追加の治療薬が患者に投与される、併用療法を含む。本方法の特定の態様では、少なくとも１つの追加の治療薬は、酢酸グラチラマー、インターフェロン−β、ミトキサントロン、ナタリズマブ、ＭＭＰ−９及びＭＭＰ−２の阻害剤を含むＭＭＰの阻害剤、短時間作用型β２作動薬、長時間作用型β２作動薬、抗コリン薬、副腎皮質ステロイド、全身性副腎皮質ステロイド、マスト細胞安定剤、ロイコトリエン変性剤、メチルキサンチン、β２作動薬、アルブテロール、レブアルブテロール、ピルブテロール、アルトホルモテロール（ａｒｔｆｏｒｍｏｔｅｒｏｌ）、ホルモテロール、サルメテロール、イプラトロピウム及びチオトロピウムを含む抗コリン薬；ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾン、モメタゾン、トリアムシノロン、メチプレドニゾロン（ｍｅｔｈｙｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、プレドニゾロン、プレドニゾンを含む副腎皮質ステロイド；モンテルカスト、ザフィルルカスト、及びジロートンを含むロイコトリエン変性剤；クロモリン及びネドクロミルを含むマスト細胞安定剤；テオフィリンを含むメチルキサンチン；イプラトロピウム及びアルブテロール、フルチカゾン及びサルメテロール、ブデソニド及びホルモテロールを含む配合薬；ヒドロキシジン、ジフェンヒドラミン、ロラタジン、セチリジン、及びヒドロコルチゾンを含む抗ヒスタミン薬；タクロリムス及びピメクロリムスを含む免疫系調節薬；シクロスポリン；アザチオプリン；ミコフェノール酸モフェチル；ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される。本方法の特定の態様では、少なくとも１つの追加の治療薬は、抗炎症剤である。
【００１８】
本方法の特定の態様では、細胞膜電位及び細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、膜結合タンパク質の量、立体構造、活性、リガンド結合活性、及び／または触媒活性のうちの少なくとも１つの調節を含む、細胞膜構造または機能のうちの少なくとも１つを調節することを含む。本方法の特定の態様では、膜結合タンパク質は、受容体、イオンチャネルタンパク質、細胞内付着タンパク質、細胞接着タンパク質、及びインテグリンからなる群から選択される少なくとも１つを含む。本方法の特定の態様では、受容体は、膜貫通受容体を含む。本方法の特定の態様では、細胞膜伝導性を調節することは、全細胞コンダクタンスを調節することを含む。本方法の特定の態様では、全細胞コンダクタンスを調節することは、該全細胞コンダクタンスの少なくとも１つの電位依存性寄与を調節することを含む。
【００１９】
本方法の特定の態様では、細胞膜電位及び細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、カルシウム依存性細胞メッセージ経路または系を調節することを含む。本方法の特定の態様は、イオンチャネル型グルタミン酸受容体（例えば、少なくとも１つのＮＭＤＡ及び／またはＡＭＰＡ受容体を含む）を介してカルシウム流入を調節することを含む。
【００２０】
本方法の特定の態様では、細胞膜電位及び細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、ホスホリパーゼＣ活性の調節を含む細胞内シグナル伝達を調節することを含む。
【００２１】
本方法の特定の態様では、細胞膜電位及び細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）活性の調節を含む細胞内シグナル伝達を調節することを含む。
【００２２】
本方法の特定の態様は、細胞ネットワークまたは層への投与を含み、その中の細胞間結合部の調節をさらに含む。
【００２３】
本方法の特定の態様では、該溶液は、溶媒和電子、及び電気運動的に変更または荷電された酸素種の形態のうちの少なくとも１つを含む。本方法の特定の態様では、溶媒和電子または電気運動的に変更もしくは荷電された酸素種の形態は、少なくとも０．０１ｐｐｍ、少なくとも０．１ｐｐｍ、少なくとも０．５ｐｐｍ、少なくとも１ｐｐｍ、少なくとも３ｐｐｍ、少なくとも５ｐｐｍ、少なくとも７ｐｐｍ、少なくとも１０ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、または少なくとも２０ｐｐｍの量で存在する。本方法の特定の態様では、電気運動的に変化させられた酸素化水性流体は、分子酸素によって少なくとも部分的に安定化された溶媒和電子を含む。
【００２４】
本方法の特定の態様では、細胞膜電位及び細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つを調節する溶液の能力は、密閉された気密容器内で少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも４カ月、少なくとも５カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月、またはそれより長い期間にわたって持続する。
【００２５】
本方法の特定の態様では、治療／投与することは、局所、吸入、鼻腔内、経口、静脈内（ＩＶ）、及び腹腔内（ＩＰ）のうちの少なくとも１つによる投与を含む。
【００２６】
本方法の特定の態様では、電荷安定化酸素含有ナノ構造体は、本明細書に開示される表１及び２の少なくとも１つの塩またはイオンを含む溶液中で形成される。
【００２７】
本方法の特定の態様では、対象は哺乳動物、好ましくはヒトである。
【００２８】
追加の態様は、ニューロンのシナプス成熟の向上を必要とするニューロンまたは対象に、樹状突起棘の密度及び大きさを充実させることによってニューロンのシナプス成熟を向上させるのに十分な、１００ナノメートル未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ構造体の治療上有効な量のイオン性水溶液を投与することを含む、樹状突起棘の密度及び大きさを充実させることによってニューロンのシナプス成熟を向上させるための方法を提供する。特定の実施形態は、主軸索の長さ、側枝の数、または三次分枝の数のうちの少なくとも１つを向上させることを含む。ある特定の態様では、イオン性水溶液は、大気圧で少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素の量の溶解酸素を含む。ある特定の態様では、電荷安定化酸素含有ナノ構造体として溶液中に存在する溶解酸素分子の百分率は、０．０１％超、０．１％超、１％超、５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、及び９５％超からなる群から選択される百分率である。ある特定の態様では、電荷安定化酸素含有ナノ構造体中に存在する溶解酸素の量は、大気圧で少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素である。ある特定の態様では、溶解酸素の過半量は、電荷安定化酸素含有ナノ構造体中に存在する。ある特定の態様では、電荷安定化酸素含有ナノ構造体は、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１０ｎｍ、及び５ｎｍ未満からなる群から選択される大きさ未満の平均直径を有する。ある特定の態様では、イオン性水溶液は、食塩水溶液を含む。ある特定の態様では、該溶液は超酸素化される。ある特定の態様では、ニューロンは海馬ニューロンである。ある特定の態様は、ニューロンへのエクスビボ、インビボ、またはインビトロの投与を含む。
【００２９】
ある特定の態様では、電荷安定化酸素含有ナノ構造体は、１００ナノメートル未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ気泡を含む。
【００３０】
さらなる態様は、培養ニューロンのシナプス成熟を維持、増大、または向上させるための方法を含む。
【００３１】
またさらなる態様は、ニューロンのシナプス伝達を最適化もしくは向上させること、及び／または（具体的にはニューロン内で）細胞内の酸素送達もしくは利用を向上させるため、ならびに（例えば、シナプス前及び／またはシナプス後終末において）ＡＴＰ合成を向上させるための方法に関する。
【００３２】
神経細胞間、または神経終末と筋系もしくは腺組織との間の電気的及び化学シナプス伝達の両方を制御する生物学的変数の決定は、数十年間にわたって非常に重要な生理学的調査の分野である。化学シナプス伝達は、事象の伝達利得、ならびに結合部の興奮性または阻害性の性質、及びその活性依存性増強または抑圧の両方に対処するという追加の魅力を有している。
【００３３】
神経伝達（ニューロンのシナプス伝達）を最適化または向上させるための方法であって、１００ｎｍ未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ構造体（例えば、酸素含有ナノ気泡）を含む電気運動的に変化させられたイオン性水溶液を、少なくとも１つのシナプス前応答及び／またはシナプス後応答を調節するのに十分な量で、かつ十分な期間にわたって投与することを含む、方法が提供される。
【００３４】
追加の態様は、神経伝達を最適化または向上させるための方法であって、１００ｎｍ未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ構造体を含む電気運動的に変化させられたイオン性水溶液を、細胞内の酸素送達または利用を向上させるのに十分な量で、かつ十分な期間にわたって、ニューロンと接触させること、またはニューロンを有する対象に投与することを含み、ニューロンのシナプス伝達を最適化するための方法が得られる、方法を提供する。
【００３５】
さらなる態様は、細胞内の酸素送達または利用を向上させるための方法であって、１００ｎｍ未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ構造体を含む電気運動的に変化させられたイオン性水溶液を、細胞内で細胞内の酸素送達または利用を向上させるのに十分な量で、かつ十分な期間にわたって、細胞と接触させること、または細胞を有する対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００３６】
神経伝達を最適化または向上させるための上記の方法に関して、代表的なシナプス前応答及び／またはシナプス後応答としては、例えば、自発性伝達物質放出の増加、雑音動態の改変、シナプス後応答の増加（例えば、シナプス前ＩＣａ＋＋振幅の不在増加）、活性帯におけるシナプス小胞密度及び／もしくは数の減少、クラスリン被覆小胞、及び／もしくは結合部位近くの大型エンドソーム様小胞の数の増加、（例えば、シナプス前及びシナプス後終末における）ＡＴＰ合成の増加、またはシナプス後スパイク生成の回復の向上のうちの少なくとも１つが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
特定の態様では、電気運動的に変化させられたイオン性水溶液は、過度に異常な過剰放出作用を引き起こすことなくシナプス伝達を最適化する。
【００３８】
特定の態様では、電荷安定化酸素含有ナノ気泡を含むように電気運動的に変化させられている、物理的に変更された等張食塩水である、ＲＮＳ６０に基づく人工海水（ＡＳＷ）の作用は、神経伝達を向上させ、かつ／または最適化することが示されている。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｈは、培養マウス海馬ニューロン内のＮＭＤＡ及びＡＭＰＡ依存性カルシウム流入に対するＲＮＳ６０、ＰＮＳ６０、及びＮＳの作用を示す。
【図１−２】図１Ａ〜１Ｈは、培養マウス海馬ニューロン内のＮＭＤＡ及びＡＭＰＡ依存性カルシウム流入に対するＲＮＳ６０、ＰＮＳ６０、及びＮＳの作用を示す。
【図１−３】図１Ａ〜１Ｈは、培養マウス海馬ニューロン内のＮＭＤＡ及びＡＭＰＡ依存性カルシウム流入に対するＲＮＳ６０、ＰＮＳ６０、及びＮＳの作用を示す。
【図２−１】図２Ａ〜２Ｋは、マウス海馬ニューロン内の可塑性関連タンパク質の発現におけるＲＮＳ６０の作用を示す。
【図２−２】図２Ａ〜２Ｋは、マウス海馬ニューロン内の可塑性関連タンパク質の発現におけるＲＮＳ６０の作用を示す。
【図２−３】図２Ａ〜２Ｋは、マウス海馬ニューロン内の可塑性関連タンパク質の発現におけるＲＮＳ６０の作用を示す。
【図２−４】図２Ａ〜２Ｋは、マウス海馬ニューロン内の可塑性関連タンパク質の発現におけるＲＮＳ６０の作用を示す。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｄｖｉｉｉは、培養マウス海馬ニューロン内の可塑性関連遺伝子の発現に対するＲＮＳ６０の作用を示す。
【図３−２】図３Ａ〜３Ｄｖｉｉｉは、培養マウス海馬ニューロン内の可塑性関連遺伝子の発現に対するＲＮＳ６０の作用を示す。
【図３−３】図３Ａ〜３Ｄｖｉｉｉは、培養マウス海馬ニューロン内の可塑性関連遺伝子の発現に対するＲＮＳ６０の作用を示す。
【図４−１】図４Ａ〜４Ｄは、マウス海馬ニューロン内の可塑性関連遺伝子のＲＮＳ６０介在性上方制御におけるＰＩ３Ｋ経路の役割を示す。
【図４−２】図４Ａ〜４Ｄは、マウス海馬ニューロン内の可塑性関連遺伝子のＲＮＳ６０介在性上方制御におけるＰＩ３Ｋ経路の役割を示す。
【図５−１】図５Ａ〜５Ｄは、ＰＩ３Ｋの活性化が、ＲＮＳ６０処置マウス海馬ニューロン内のＮＭＤＡ感受性及びＡＭＰＡ感受性の両方のカルシウム流入を制御することを示す。
【図５−２】図５Ａ〜５Ｄは、ＰＩ３Ｋの活性化が、ＲＮＳ６０処置マウス海馬ニューロン内のＮＭＤＡ感受性及びＡＭＰＡ感受性の両方のカルシウム流入を制御することを示す。
【図６−１】図６Ａ〜６Ｊは、５ＸＦＡＤトランスジェニック動物の海馬におけるインビボの可塑性関連分子の発現に対するＲＮＳ６０の作用を示す。
【図６−２】図６Ａ〜６Ｊは、５ＸＦＡＤトランスジェニック動物の海馬におけるインビボの可塑性関連分子の発現に対するＲＮＳ６０の作用を示す。
【図６−３】図６Ａ〜６Ｊは、５ＸＦＡＤトランスジェニック動物の海馬におけるインビボの可塑性関連分子の発現に対するＲＮＳ６０の作用を示す。
【図６−４】図６Ａ〜６Ｊは、５ＸＦＡＤトランスジェニック動物の海馬におけるインビボの可塑性関連分子の発現に対するＲＮＳ６０の作用を示す。
【図６−５】図６Ａ〜６Ｊは、５ＸＦＡＤトランスジェニック動物の海馬におけるインビボの可塑性関連分子の発現に対するＲＮＳ６０の作用を示す。
【図７−１】図７Ａ〜７Ｋは、海馬ニューロン内の樹状突起棘の数、大きさ、及び成熟に対するＲＮＳ６０、ＮＳ、ＰＮＳ６０、及びＲＮＳ１０．３の作用を示す。
【図７−２】図７Ａ〜７Ｋは、海馬ニューロン内の樹状突起棘の数、大きさ、及び成熟に対するＲＮＳ６０、ＮＳ、ＰＮＳ６０、及びＲＮＳ１０．３の作用を示す。
【図７−３】図７Ａ〜７Ｋは、海馬ニューロン内の樹状突起棘の数、大きさ、及び成熟に対するＲＮＳ６０、ＮＳ、ＰＮＳ６０、及びＲＮＳ１０．３の作用を示す。
【図７−４】図７Ａ〜７Ｋは、海馬ニューロン内の樹状突起棘の数、大きさ、及び成熟に対するＲＮＳ６０、ＮＳ、ＰＮＳ６０、及びＲＮＳ１０．３の作用を示す。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｆは、ＲＮＳ６０が、培養海馬ニューロン内の主軸索の全長及び側枝を刺激することを示す。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｆは、ＲＮＳ６０が、培養海馬ニューロン内の主軸索の全長及び側枝を刺激することを示す。
【図８Ｃ】図８Ａ〜８Ｆは、ＲＮＳ６０が、培養海馬ニューロン内の主軸索の全長及び側枝を刺激することを示す。
【図８Ｄ】図８Ａ〜８Ｆは、ＲＮＳ６０が、培養海馬ニューロン内の主軸索の全長及び側枝を刺激することを示す。
【図８Ｅ】図８Ａ〜８Ｆは、ＲＮＳ６０が、培養海馬ニューロン内の主軸索の全長及び側枝を刺激することを示す。
【図８Ｆ】図８Ａ〜８Ｆは、ＲＮＳ６０が、培養海馬ニューロン内の主軸索の全長及び側枝を刺激することを示す。
【図９−１】図９Ａ、９Ｂ（ｉ）〜９Ｂ（ｉｉｉ）、及び９Ｃ〜９Ｅは、ＰＩ３Ｋの活性化が、ＲＮＳ６０処置マウス海馬ニューロン内の形態的可塑性を制御することを示す。
【図９−２】図９Ａ、９Ｂ（ｉ）〜９Ｂ（ｉｉｉ）、及び９Ｃ〜９Ｅは、ＰＩ３Ｋの活性化が、ＲＮＳ６０処置マウス海馬ニューロン内の形態的可塑性を制御することを示す。
【図９−３】図９Ａ、９Ｂ（ｉ）〜９Ｂ（ｉｉｉ）、及び９Ｃ〜９Ｅは、ＰＩ３Ｋの活性化が、ＲＮＳ６０処置マウス海馬ニューロン内の形態的可塑性を制御することを示す。
【図１０】図１０は、特定の例示的な態様による、シナプス前終末の電気刺激後の低酸素シナプスにおける誘発された伝達物質放出の増加の一例を示す。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｅは、特定の例示的な態様による、対照及びＲＮＳ６０  ＡＳＷにおける高周波刺激を示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｃは、特定の例示的な態様による、対照ＡＳＷ及びＲＮＳ６０  ＡＳＷ中で記録されたシナプス雑音を示す。
【図１３−１】図１３Ａ〜１３Ｅは、特定の例示的な態様による、ＲＮＳ６０がカルシウム電流または伝達物質放出とのその関係を改変することなく伝達物質放出を増加させることを示す電位固定研究を示す。
【図１３−２】図１３Ａ〜１３Ｅは、特定の例示的な態様による、ＲＮＳ６０がカルシウム電流または伝達物質放出とのその関係を改変することなく伝達物質放出を増加させることを示す電位固定研究を示す。
【図１４−１】図１４Ａ〜１４Ｆは、特定の例示的な態様による、ルシフェリン／ルシフェラーゼ発光を使用するシナプス前及びシナプス後終末におけるＡＴＰ合成の増加の直接的決定を示す。
【図１４−２】図１４Ａ〜１４Ｆは、特定の例示的な態様による、ルシフェリン／ルシフェラーゼ発光を使用するシナプス前及びシナプス後終末におけるＡＴＰ合成の増加の直接的決定を示す。
【図１５】図１５は、特定の例示的な態様による、オリゴマイシン投与後の自発性シナプス放出の低減を示す。周波数の関数としての雑音振幅のプロット（注、二重対数座標）。赤は対照ＡＳＷであり、緑はオリゴマイシンの添加７分後であり、青はオリゴマイシン投与の２２分後かつ灌流をＲＮＳ６０  ＡＳＷに変更した１２分後である。黒は細胞外記録である。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｃは、特定の例示的な態様による、ＲＮＳ６０  ＡＳＷ灌流後のシナプス結合部の電子顕微鏡写真を示す。
【図１７】図１７Ａ及び１７Ｂは、特定の例示的な態様による、ＲＮＳ６０  ＡＳＷで灌流されたシナプス内のシナプス小胞数の統計的測定を示す。図８Ａは、大きさの関数としてのＣＣＶの数のプロットを示す。図８Ｂは、大きさの関数としての大型小胞の数を示す。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｃは、特定の例示的な態様による、オリゴマイシン注入後のヤリイカ巨大シナプス活性帯の超微細構造を示す。
【図１９−１】図１９Ａ〜１９Ｃは、特定の例示的な態様による、シナプス小胞数に対するＲＮＳ６０及びオリゴマイシン（ｏｌｙｇｏｍｙｃｉｎ）の作用を示す。
【図１９−２】図１９Ａ〜１９Ｃは、特定の例示的な態様による、シナプス小胞数に対するＲＮＳ６０及びオリゴマイシン（ｏｌｙｇｏｍｙｃｉｎ）の作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
海馬の可塑性ならびに海馬依存性学習及び記憶の上方制御／向上
本明細書に開示されるある特定の実施形態は、海馬の可塑性ならびに海馬依存性学習及び記憶の上方制御を必要とする対象（例えば、哺乳動物またはヒト）に、電気運動的に変化させられ、気体富化された（例えば、酸素富化された）水性流体を含む治療組成物を投与することを含む、海馬の可塑性ならびに海馬依存性学習及び記憶を上方制御するための組成物及び方法を提供することに関する。
【００４１】
特定の態様は、対象の海馬の可塑性ならびに海馬依存性学習及び記憶を向上させるための方法を提供するように、海馬の可塑性ならびに海馬依存性学習及び記憶の向上を必要とする対象に、約１００ナノメートル未満の平均直径を有し、かつイオン性水性流体中に安定して構成されている電荷安定化酸素含有ナノ構造体のイオン性水溶液を含む、治療上有効な量の電気運動的に変化させられた水性流体を、海馬の可塑性ならびに海馬依存性学習及び記憶を向上させるのに十分な量で投与することを含む、海馬の可塑性ならびに海馬依存性学習及び記憶を向上させるための方法を提供する。
【００４２】
イオンチャネル型グルタミン酸受容体を介するカルシウム流入の増加、及び海馬ニューロン内の可塑性関連分子の上方制御は、海馬依存性空間学習及び記憶の過程における２つの重要な事象である。ここで我々は、海馬の可塑性を上方制御する発明的取り組みを試みた。例えば、出願者のＲＮＳ６０流体は、生理食塩水を高酸素圧力下で特許取得型のＴａｙｌｏｒ−Ｃｏｕｅｔｔｅ−Ｐｏｉｓｅｕｉｌｌｅ（ＴＣＰ）フローに晒すことによって生成される等張食塩水溶液である（例えば、すべて参照によりそれぞれの全体が本明細書に組み込まれる、出願者の交付済み米国特許第７，８３２，９２０号、同第７，９１９，５３４号、同第８，４１０，１８２号、同第８，４４５，５４６号、同第８，４４９，１７２号、及び同第８，４７０，８９３号を参照されたい）。
【００４３】
ＲＮＳ６０は、培養海馬ニューロン内のＮＭＤＡ感受性及びＡＭＰＡ感受性のカルシウム流入を刺激するが、ＮＳ（生理食塩水）またはＰＮＳ６０（ＴＣＰ変性を伴わない過剰な酸素を含有する食塩水）のいずれもそれを刺激しない。ｍＲＮＡベースの標的化遺伝子アレイ、実時間ＰＣＲ、ならびに免疫ブロット及び免疫蛍光分析を使用して、我々は、ＲＮＳ６０が培養海馬ニューロン内の多くの可塑性関連タンパク質の上方制御を刺激することをさらに実証する。最後に、ＲＮＳ６０処置は、アルツハイマー病（ＡＤ）の５ＸＦＡＤトランスジェニックマウスモデルの海馬内の可塑性関連タンパク質及びカルシウム流入を増加させた。これらの結果は、ＡＤ及び他の認知症の治療の助けとなり得る、海馬の可塑性の刺激におけるＲＮＳ６０の新規の性質を説明する。
【００４４】
特定の態様によると、開示される電気運動的に変化させられた流体（例えば、ＲＮＳ６０）は、ＮＭＤＡ感受性及びＡＭＰＡ感受性のイオンチャネル型グルタミン酸受容体を介してカルシウム流入を誘導することによって、海馬ニューロンのシナプス可塑性を制御または調節する（例えば、増加または向上させる）。ＲＮＳ６０は、Ａｒｃ、ＰＳＤ９５、及びＣＲＥＢを含む他の可塑性関連分子とともにＮＲ２Ａ、ＮＲ２ＢサブユニットＮＭＤＡ、及びＡＭＰＡ受容体のＧｌｕＲ１サブユニットの発現を刺激するが、ＮＳまたはＰＮＳのいずれもそれらの発現を刺激しない。
【００４５】
可塑性は、老齢及びＡＤを有する患者におけるものを含むがこれらに限定されない、様々な病状において減少すると考えられる。したがって、学習障害の病状及びＡＤまたは加齢を含む場合において可塑性を全体的に引き上げる方法の探索は、重要な研究分野である。脳機能を改善するための薬物及び取り組みは他にあるが、ここでは我々は、可塑性を増補するための簡素な食塩水ベースの薬剤を導入する。生理食塩水を高酸素圧力の存在下でＴａｙｌｏｒ−Ｃｏｕｅｔｔｅ−Ｐｏｉｓｅｕｉｌｌｅ（ＴＣＰ）乱流に晒すことにより、Ｒｅｖａｌｅｓｉｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔａｃｏｍａ，ＷＡ）は、いかなる活性薬学的成分をも含有しないＲＮＳ６０を生成した（１９、２０）。ＴＣＰ乱流に起因して、ＲＮＳ６０は、例えば、液体／気体界面における電気二重層によって包囲された酸素ナノ気泡コアからなる電荷安定化ナノ構造体を含有する（１９、２０）。
【００４６】
ここで我々は、ＴＣＰ乱流に起因して生成されるイオン性流体または食塩水が、培養海馬ニューロン内及びインビボで（例えば、５ＸＦＡＤトランスジェニックマウスの海馬内で）可塑性を改善することができるという第１の根拠を詳述する。
【００４７】
我々の結論は以下に基づく。
【００４８】
第１に、実施例７に示されるように、我々は、ＲＮＳ６０が培養海馬ニューロン内の樹状突起棘の数、大きさ、及び成熟を誘導したことを観察し、これはニューロンのシナプス効力の制御におけるＲＮＳ６０の有益な役割を示す。
【００４９】
第２に、実施例７に示されるように、ＲＮＳ６０は、ニューロン内の軸索長及び側枝を増加させ、ニューロンの形態的可塑性の刺激におけるＲＮＳ６０の役割をさらに裏付けた。
【００５０】
第３に、作業実施例（ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｅｘａｍｐｌｅ）３に示されるように、ＲＮＳ６０は、海馬ニューロンのカルシウム依存性興奮性を変更しなかったが、むしろイオンチャネル型グルタミン酸受容体を介してこれらのニューロン内の流入するカルシウム電流を刺激した。これは、ＲＮＳ６０が可塑性関連活性を調節することを示す。
【００５１】
第４に、作業実施例４に示されるように、ＲＮＳ６０は、海馬ニューロン内の可塑性関連分子の広域スペクトルの発現を誘導した。
【００５２】
第５に、作業実施例４に示されるように、ＲＮＳ６０は、タンパク質が可塑性の主要制御因子であるＣＲＥＢの活性化のためのシグナル伝達経路（アデニル酸シクラーゼ、ＣＡＭキナーゼＩＩ、及びＡｋｔ）を刺激するいくつかの遺伝子のレベルを増補した。
【００５３】
第６に、作業実施例４に示されるように、Ｇｒｉａ２、Ｐｐｐ１ｃａ、Ｐｐｐ２ｃａ、及びＰｐｐ３ｃａなどのいくつかの遺伝子によってコード化されるタンパク質は、長期抑圧を支持することが知られる（３５）。ＲＮＳ６０が、海馬ニューロン内でＧｒｉａ２、Ｐｐｐ１ｃａ、Ｐｐｐ２ｃａ、及びＰｐｐ３ｃａの発現を下方制御したことは興味深い。
【００５４】
第７に、作業実施例６に示されるように、ＲＮＳ６０処置は、５ＸＦＡＤトランスジェニックマウスの海馬内で、可塑性関連分子の発現を増加させ、インビボのカルシウム流入を増補した。これらの結果は、ＲＮＳ６０が、学習及び／または記憶障害を有する対象、ニューロン損傷を有する対象、ならびにＡＤ及び他の認知症を有するものを含む、可塑性の引き上げを必要とする患者において、可塑性を引き上げるに当たっての治療薬として提供することを示す。
【００５５】
相次ぐ根拠は、シナプス後ニューロン内のグルタミン酸作動性ＮＭＤＡ受容体の過剰な発現が、ＡＤにおける進行性ニューロン損失の主要因であることを示唆する（２８）。異なる非競合的及び不競合的なＮＭＤＡ受容体遮断剤がＡＤの治療に使用されている（３６）。しかしながら、これらの薬物の長期使用は、これらのニューロンの生存能に必須である、これらの受容体の正常な興奮性を最終的に破壊する。さらに、ＮＭＤＡ受容体のこれらの特異的阻害剤は、より高齢の集団におけるそれらの乏しい代謝クリアランスのために、胸痛、悪心、心拍数増加、呼吸困難、排尿低下、及び異なる消化障害を含む広範な副作用を生み出す（３７、３８）。対照的に、例えばＲＮＳ６０は、追加の酸素を含む等張食塩水と化学的に同一であるため、副作用をほとんど生み出さない。
【００５６】
作業実施例２〜６において本明細書に開示されるように、ＲＮＳ６０処置は、細胞培養実験及びインビボ実験の両方で高振幅ＮＭＤＡ依存性カルシウム振動を発生させた。高振幅カルシウム波はイオンチャネル型受容体の興奮性に対応するため、ＲＮＳ６０はＮＭＤＡ受容体の正常な興奮性を変更しないという結果になる。さらに、ＲＮＳ６０は、ニューロンの生存に必要とされるＣＲＥＢ、ＢＤＮＦ、及びＮＴＲを含む多くの成長支持分子；シナプス構造の維持に必要とされるＰＳＤ９５、ＡＤＡＭ−１０、及びＳｙｎｐｏを含むシナプスタンパク質；シナプス後ニューロンのカルシウム興奮性に必要とされるＮＲ２Ａ、ＧｌｕＲ１、及びＮＲ２Ｂを含む受容体タンパク質；ならびに記憶の固定をもたらす神経可塑性に必須なｃ−ＦＯＳ、Ａｒｃ、Ｈｏｍｅｒ１、及びＺｉｆ−２６８などのＩＥＧの発現を誘導した（３９〜４１）。
【００５７】
可塑性をもたらすシグナル伝達機構は明らかになってきている。主要制御因子ｃＡＭＰ応答配列結合（ＣＲＥＢ）が可塑性において重要な役割を果たし、異なる可塑性関連遺伝子のプロモーターが複数のｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）を内包することが分かっている（４２〜４５）。出願者は、ＲＮＳ６０が、ミクログリア細胞内のＩＡ型ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）によって、ミクログリア細胞内でＣＲＥＢの活性化を誘導することを実証した。ＰＩ３Ｋは、細胞生存を含む多岐にわたる生物学的応答の制御に関係する重要なシグナル伝達分子である（３４）。クラスＩＡのＰＩ３Ｋでは、ｐ８５制御性サブユニットが、そのＳＨ２ドメインを通してＩＲＳ−１と相互作用することによって界面として作用し、それにより細胞膜にｐ１１０触媒的サブユニット（ｐ１１０α／β）を動員し、これが次にＡｋｔ／タンパク質キナーゼＢ及びｐ７０リボソームＳ６キナーゼのような下流シグナル伝達分子を活性化させる（３４）。それに対して、クラスＩＢのＰＩ３Ｋでは、ｐ１１０γが、Ｇタンパク質共役受容体の会合によって活性化される。次にｐ１１０γは、反応を触媒して、基質としてホスファチジルイノシトール（４，５）−ビスホスフェートを使用してホスファチジルイノシトール（３，４，５）−トリホスフェートを二次メッセンジャーとして放出し、下流シグナル伝達分子を活性化させる（３３）。
【００５８】
本明細書において我々は、作業実施例５において、ＲＮＳ６０が一次海馬ニューロン内でＩＢ型のＰＩ−３Ｋ  ｐ１１０γを調節せずにＩＡ型のＰＩ−３Ｋのサブユニットの両方（ｐ１１０α及びｐ１１０β）の活性化を誘導すること（これはニューロン内のＩＡ型のｐ１１０α／β  ＰＩ３Ｋの特異的活性化を示す）を実証する。さらに、ＰＩ３Ｋの阻害剤による、海馬ニューロン内のＲＮＳ６０介在性のＮＲ２Ａ及びＧｌｕＲ１の上方制御ならびにカルシウム流入の刺激の抑止は、ＲＮＳ６０がＰＩ３Ｋを介してＮＭＤＡ感受性及びＡＭＰＡ感受性のカルシウム電流を増加させることを示す。
【００５９】
特定の態様によると、出願者は、ＲＮＳ６０処置が、培養海馬ニューロン内及びインビボで（例えば、５ＸＦＡＤマウスの海馬内で）可塑性関連分子及びカルシウム流入を上方制御することを、本明細書において初めて実証する。これらの結果は、出願者の流体（例えば、ＲＮＳ６０）の新たな海馬ニューロン可塑性引き上げ特性を実証及び確証し、本明細書に開示されるすべての種類の対象においてシナプス可塑性を刺激するための、出願者の変更食塩水の新たな用途を提供する。
【００６０】
ニューロンのシナプス伝達の最適化
特定の例示的な態様によると、電荷安定化酸素含有ナノ構造体（例えば、電荷安定化酸素含有ナノ気泡）を含有する物理的に変更された食塩水であるＲＮＳ６０は、ニューロンのシナプス伝達を最適化するための有意な機能最適化特性を有する。
【００６１】
特定の態様によると、ＲＮＳ６０は、（１００ｎｍ未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ構造体、例えば、電荷安定化酸素含有ナノ気泡の形態の）水の物理的構造及び酸素看護能力の増加に関連するある種の生物活性剤となり、追加の化学的分子を有しないが、グリア細胞への直接作用ならびにＴ細胞サブセットの調節を通じて神経変性の異なるモデルにおいて細胞保護及び抗炎症作用を証明している（Ｋｈａｓｎａｖｉｓ  Ｓ．２０１２、Ｍｏｎｄａｌ，Ｓ，２０１２）。機構に束縛されることなく、そして本明細書に記載される結果と合わせて、これは、ＲＮＳ６０が特異的受容体との相互作用に基づかない多面的作用を及ぼすことを示唆するが、むしろこのＲＮＳ６０は、異なる名称を必要とする生理機能の促進因子である。機能的には、本明細書に示されるように、ＲＮＳ６０は、（有害な作用が見られていないヒト用途を含む他系における以前の研究によって実証されているように）正常機能に影響することなく、かつあらゆる有害な副作用を伴わずにシナプス伝達を最適化することができる。
【００６２】
好ましい実施形態。特定の態様は、神経伝達を最適化するための方法であって、１００ｎｍ未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ構造体を含む電気運動的に変化させられたイオン性水溶液を、少なくとも１つのシナプス前応答及び／またはシナプス後応答を調節するのに十分な量で、かつ十分な期間にわたって、ニューロンと接触させること、またはニューロンを有する対象に投与することを含み、ニューロンのシナプス伝達を最適化するための方法が得られる、方法を提供する。ある特定の態様では、少なくとも１つのシナプス前応答及び／またはシナプス後応答を調節することは、自発性伝達物質放出の増加を含む。ある特定の態様では、少なくとも１つのシナプス前応答及び／またはシナプス後応答を調節することは、雑音動態の改変を含む。ある特定の態様では、少なくとも１つのシナプス前応答及び／またはシナプス後応答を調節することは、（例えば、シナプス前ＩＣａ＋＋振幅の増加を伴わない）シナプス後応答の増加を含む。ある特定の態様では、少なくとも１つのシナプス前応答及び／またはシナプス後応答を調節することは、活性帯におけるシナプス小胞密度及び／または数の減少を含み、クラスリン被覆小胞、及び結合部位近傍の大型エンドソーム様小胞の数の増加をさらに含み得る。ある特定の態様では、少なくとも１つのシナプス前応答及び／またはシナプス後応答を調節することは、シナプス伝達最適化をもたらすＡＴＰ合成の顕著な増加を含む。ある特定の態様では、少なくとも１つのシナプス前応答及び／またはシナプス後応答を調節することは、シナプス後スパイク生成の回復の向上またはより活発な回復を含む。ある特定の態様では、少なくとも１つのシナプス前応答及び／またはシナプス後応答を調節することは、シナプス前及びシナプス後終末におけるＡＴＰ合成の増加を含む。特定の実施形態では、１００ｎｍ未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ構造体は、１００ｎｍ未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ気泡を含む。
【００６３】
追加の態様は、神経伝達を最適化するための方法であって、１００ｎｍ未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ構造体を含む電気運動的に変化させられたイオン性水溶液を、細胞内の酸素送達または利用を向上させるのに十分な量で、かつ十分な期間にわたって、ニューロンと接触させること、またはニューロンを有する対象に投与することを含み、ニューロンのシナプス伝達を最適化するための方法が得られる、方法を提供する。ある特定の態様では、ニューロンのシナプス伝達を最適化することは、自発性伝達物質放出の増加を含む。ある特定の態様では、ニューロンのシナプス伝達を最適化することは、雑音動態の改変を含む。ある特定の態様では、ニューロンのシナプス伝達を最適化することは、（例えば、シナプス前ＩＣａ＋＋振幅の増加を伴わない）シナプス後応答の増加を含む。ある特定の態様では、ニューロンのシナプス伝達を最適化することは、活性帯におけるシナプス小胞密度及び／または数の減少を含み、クラスリン被覆小胞、及び結合部位近傍の大型エンドソーム様小胞の数の増加をさらに含み得る。ある特定の態様では、ニューロンのシナプス伝達を最適化することは、ＡＴＰ合成の顕著な増加を含む。ある特定の態様では、ニューロンのシナプス伝達を最適化することは、シナプス後スパイク生成の回復の向上またはより活発な回復を含む。ある特定の態様では、ニューロンのシナプス伝達を最適化することは、シナプス前及びシナプス後終末におけるＡＴＰ合成の増加を含む。特定の実施形態では、１００ｎｍ未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ構造体は、１００ｎｍ未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ気泡を含む。
【００６４】
さらなる態様は、細胞内の酸素送達または利用を向上させるための方法であって、１００ｎｍ未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ構造体を含む電気運動的に変化させられたイオン性水溶液を、細胞内で細胞内の酸素送達または利用を向上させるのに十分な量で、かつ十分な期間にわたって、細胞と接触させること、または細胞を有する対象に投与することを含む、方法を提供する。特定の態様では、該細胞は神経細胞（例えば、哺乳動物、ヒト、またはその他のもの；ニューロン及びニューロンの伝達を含むあらゆる生物または動物）である。特定の態様では、細胞内の酸素送達または利用を向上させることは、ニューロンのシナプス伝達の最適化をもたらす。特定の態様では、ニューロンのシナプス伝達を最適化することは、自発性伝達物質放出の増加を含む。特定の態様では、ニューロンのシナプス伝達を最適化することは、雑音動態の改変を含む。特定の態様では、ニューロンのシナプス伝達を最適化することは、（例えば、シナプス前ＩＣａ＋＋振幅の増加を伴わない）シナプス後応答の増加を含む。特定の態様では、ニューロンのシナプス伝達を最適化することは、活性帯におけるシナプス小胞密度及び／または数の減少を含む。特定の態様は、クラスリン被覆小胞、及び結合部位近傍の大型エンドソーム様小胞の数の増加をさらに含み得る。特定の態様では、ニューロンのシナプス伝達を最適化することは、ＡＴＰ合成の顕著な増加を含む。特定の態様では、ニューロンのシナプス伝達を最適化することは、シナプス後スパイク生成の回復の向上またはより活発な回復を含む。特定の態様では、ニューロンのシナプス伝達を最適化することは、シナプス前及びシナプス後終末におけるＡＴＰ合成の増加を含む。特定の実施形態では、１００ｎｍ未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ構造体は、１００ｎｍ未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ気泡を含む。
【００６５】
上記と一致して、単一スパイクシナプス伝達（図１０、作業実施例９）ならびに反復性のシナプス前終末の活性化に対する応答（図１１、作業実施例１０）に関して開示される結果は、正常なパラメータ内にシナプス伝達を維持及び最適化するＲＮＳ６０の能力が異常応答を伴わず、過剰投与または副作用の不在を示すことを示す。この結論は、ＲＮＳ６０の単回の灌流後に最大レベルに達し、３０分間にわたって維持され対照ＡＳＷを用いる灌流後に緩徐に減衰する、自発性放出の増加によっても支持される（図１２、作業実施例１１）。自発性伝達物質放出の増加で同様の結果が見出された（図１２、作業実施例１１）。
【００６６】
特許請求される方法におけるＲＮＳ６０の作用の機構に関して、それがチャネル動態、そして特にカルシウム電流を改変し得るという可能性は、シナプスの最適化が時間経過または伝達物質放出の原因となる内向きカルシウム電流の振幅のいかなる変化とも相関しないことを示す電位固定結果によって、あり得そうにないと見なされた（図１３、作業実施例１２）。
【００６７】
機構に束縛されることなく、ＲＮＳ６０はＡＴＰ増加を介して利用可能なエネルギーレベルを変化させる可能性があり、そのような事象はシナプス伝達有効性の上昇を伴う（図１４、作業実施例１３）。追加の予想外の所見は、ＲＮＳ６０の存在下での雑音周波数変化に関するものであった（図１２Ｃ、作業実施例１１）。自発性放出のレベルにおいて、高周波雑音の低減及び低周波雑音の増加（図１２Ｃ、作業実施例１１）として見られる雑音プロファイルの明らかな変化があるという事実は、シナプス小胞の大きさの分布の変化と相関するように思われる（図１７、作業実施例１５）。機構に束縛されることなく、伝達物質送達動態は、正常な小胞のプロファイルと、より大型のエンドソーム関連小胞のものとの間で異なる場合がある。後者は、付随する雑音レベル振幅の増加とともにより低い周波数に向かう雑音周波数の変化を説明し得るより緩徐な放出動態を有し得る。
【００６８】
形態的観点から、脳胞モノアミン輸送体ＶＭＡＴ２の発現の増加が、小胞表現型及び素量サイズを制御することが知られている（Ｐｏｔｈｏｓ  ＦＮ  ｅｔ．ａｌ，２０００）。ＲＮＳ６０灌流終末に示されるように（図１６Ａ、作業実施例１５）、分析された終末内に異なる形状及び大きさを有する大型小胞が観察される。これらの構造は、電流制御シナプス（図１５Ｂ、作業実施例１４）または以前の実験で研究された終末には決して観察されない（Ｈｅｕｓｅｒ，Ｊ．Ｅ．＆  Ｒｅｅｓｅ，Ｔ．Ｓ．，１９７３）。
【００６９】
神経伝達物質放出は、シナプス小胞の開口分泌及び飲食作用に関する周知の工程一式を必要とする（Ｈｅｕｓｅｒ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ  Ｒｅｅｓｅ  Ｔ．Ｓ．，１９７３）。先行研究において、ダイナミン（ｄｉｎａｍｉｎ）／シナプトフィジン複合体破壊が、シナプス小胞再循環の枯渇に起因する伝達物質放出の減少をもたらすことが示されている（Ｄａｌｙ  Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．２０００）。これらの条件下でＣＣＶの数が実際は増加することも観察されており、従来のクラスリン経路より早い時間経過を有する別の小胞飲食作用機構の存在を示唆している（Ｄａｌｙ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。この所見は、多機能的様式でヤリイカシナプス前終末内の飲食作用経路の膜の分布に影響する、ラブフィリン（Ｒａｂｆｉｌｉｎ）３Ａ及び／またはその断片のうちの１つの注入によってさらに裏付けられた（Ｂｕｒｎｓ  ＭＥ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。これは、シナプス小胞タンパク質であるシナプトタグミンの異なるドメイン操作後の以前の観察と一致する（Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．１９９５、Ｆｕｋｕｄａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ，１９９５）。
【００７０】
本明細書においてＲＮＳ６０投与後に示されるシナプスの機能亢進は活性帯におけるシナプス小胞数の有意な減少を伴うが、活性帯近傍のシナプス前終末領域は多数のＣＣＶを示し、ＣＣＶによって回収される膜の量は、本明細書に記載されるシナプス放出の増補の間に観察される大量の伝達物質放出を維持するのに十分ではない場合がある。しかしながら、活性帯のすぐ近傍で画像化された多数のエンドソーム小胞（最大３００ｎｍの直径）は、これらの条件下で観察された向上したシナプス伝達物質の放出の一部であり得る。これは、通常のシナプス小胞プロファイルに混じった活性帯におけるそのような「より大型の小胞」の存在に支持された（図１７、作業実施例１５）。そのような小胞は活性帯近傍全体に現れるため、これは、それらの存在の原因となる飲食作用機構がクラスリンまたはカベオリン経路から独立している場合があることを示唆する（Ｍａｙｏｒ  Ｓ．ａｎｄ  Ｐａｇａｎｏ  Ｒ．Ｅ．２００７によってレビュー）。
【００７１】
誘発されるシナプス電位の自発性放出レベルならびに振幅の両方が有意に増加するという事実は、通常の大きさの小胞の放出の確率がわずかに減少し得る一方で、より大型の小胞構成要素の放出が実際は増加し得ることを示す。より小型のクラスリン関連小胞よりも、より大型のエンドソーム小胞プロファイルに有利に働く、小胞の大きさの分布のそのような変化は、高レベルのシナプス活性化後の小胞の大きさの分布の同様の形態的分析を確証する（Ｈａｙａｓｈｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ  ２００８、Ｓａｈｅｋｉ，Ｙ  ａｎｄ  Ｄｅ  Ｃａｍｉｌｉ  Ｐ．２０１２によってレビュー）。
【００７２】
小胞の大きさの分布におけるこの変化は、図１２に示されるように、そしてシナプス雑音ならびにシナプス微小電位の時間経過及び小胞の大きさとのその関係についての説明に記載されるように、自発性シナプス雑音の性質がＲＮＳ  ６０投与後に改変されたという事実に関する、考えられる説明を提供し得る（作業実施例１１）。
【００７３】
ミトコンドリアは、化学シナプスが際立って豊富なエネルギー供給小器官である（Ｐａｌａｙ，ＳＩ  １９５６、Ｔａｌｂｏｔ  Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ヤリイカでは、シナプス前終末ミトコンドリアは、シナプス前カルシウムチャネルの近くに並んで存在する（Ｐｉｖｏｖａｒｏｖａ  ＮＢ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。酸素及びグルコースならびにその最終生成物であるミトコンドリア生成ＡＴＰの形態でのニューロンへのエネルギー供給は、シナプス電位及び活動電位の基礎をなすイオン流入を逆転させるために広く使用される（Ａｔｔｗｅｌｌ  Ｄ．ａｎｄ  Ｌａｕｇｈｌｉｎ  ＳＢ．２００１）。ここで出願者は、オリゴマイシンを用いたミトコンドリアＡＴＰの阻害が、シナプス伝達に対するＲＮＳ６０の作用を改変したかを試験した。
【００７４】
ミトコンドリアは、オリゴマイシンなどのミトコンドリア膜電位（Ψｍ）を変更しない薬物、または脱分極性Ψｍ阻害剤を用いて遮断され得る。いくつかの終末ではＲｕ３６０が形質膜全体でＣａ２＋流入を阻害するように思われるため（Ｄａｖｉｄ  Ｇ．１９９９）、ミトコンドリア単輸送体の阻害剤であるＲｕ３６０は使用されなかった。ＣＣＣＰまたはアンチマイシンＡ１もΨｍ脱分極剤であり、そしてこれらの薬剤はミトコンドリアのカルシウム取り込みを遮断するため、これら両方がシナプス前終末からの伝達物質放出に潜在的に影響し得るため、これらの使用も避けられた。
【００７５】
ＲＮＳ６０及び複合体Ｖミトコンドリア遮断剤オリゴマイシン（ｏｌｙｇｏｍｉｃｉｎ）の同時適用は、シナプス雑音パワースペクトル分析によって判定されたときに、自発性放出の増大を誘導できなかった（図１５、作業実施例１４）。これらの実験は、ＲＮＳ６０の作用機構が、潜在的に、より効率的に酸素を提供すること、または酸素の提供を促進することによって、ミトコンドリアＡＴＰ産生に依存することを示唆する。
【００７６】
ＲＮＳ６０の作用機構に関して、ミトコンドリアＡＴＰ合成の遮断がシナプス伝達に対するＲＮＳ６０作用の不活性化をもたらすことが有意である場合がある。これらの所見は、ＡＴＰ合成の低減が、ＲＮＳ６０によるシナプス放出機構の応答の欠如を伴うことをさらに示す。これらの所見は、ＲＮＳ６０が、直接的ではなく、むしろミトコンドリア系によるＡＴＰの合成の増加を介して間接的に小胞の放出機構に作動する可能性があることを示す。これは、小胞小器官の利用能、及びシナプス結合部領域内のシナプス前区画における活性帯へのそれらの移動の両方に対して、有意な作用を有することが示されている（Ｉｖａｎｉｋｏｖ  ＭＶ．ｅｔ  ａｌ．２０１０）。
【００７７】
したがって特定の態様によると、神経伝達を最適化することに関して、ＲＮＳ６０は、細胞内フリーラジカルレベルの最小限の上昇を伴う、ミトコンドリア系への酸素輸送の促進によるＡＴＰ合成の最適化因子である。
【００７８】
電気運動的に生成される流体：
本明細書において使用される場合、「電気運動的に生成される流体」は、出願者の交付済み特許に詳述される例示的な混合装置によって本明細書における作業実施例の目的のために生成される、出願者の発明の電気運動的に生成される流体を指す（例えば、すべて参照によりそれぞれの全体が本明細書に組み込まれる、出願者の交付済み米国特許第７，８３２，９２０号、同第７，９１９，５３４号、同第８，４１０，１８２号、同第８，４４５，５４６号、同第８，４４９，１７２号、及び同第８，４７０，８９３号を参照されたい）。本明細書に開示及び提示されるデータによって実証されるように、この電気運動的流体は、先行技術の非電気運動的流体（先行技術の酸素化された非電気運動的流体（例えば、圧力ポット酸素化流体など）を含む）に対して、新規かつ本質的に異なる流体となる。本明細書の様々な態様に開示されるように、電気運動的に生成される流体は、以下を含むがこれらに限定されない、特有かつ新規の物理特性及び生物学的特性を有する。
【００７９】
特定の態様では、電気運動的に変化させられた水性流体は、約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有し、かつイオン性水性流体中に安定して構成されている電荷安定化酸素含有ナノ構造体のイオン性水溶液を、該流体が生細胞に接触すると細胞膜電位及び細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節をもたらすのに十分な量で含む。
【００８０】
好ましい態様では、ＲＮＳ６０は、高酸素圧力下で制御された乱流及びＴａｙｌｏｒ−Ｃｏｕｅｔｔｅ−Ｐｏｉｓｅｕｉｌｌｅ（ＴＣＰ）フローを組み込む回転子／固定子装置を使用することによって生成される、物理的に変更された生理食塩水（０．９％）溶液である（出願者の装置、該流体を作製するための方法、及び該流体自体を包含する教示に関して、すべて参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、出願者の米国特許第７，８３２，９２０号、同第７，９１９，５３４号、同第８，４１０，１８２号、同第８，４４５，５４６号、同第８，４４９，１７２号、及び同第８，４７０，８９３号を参照されたい）。
【００８１】
特定の態様では、電気運動的に生成される流体は、本明細書に記載される装置特徴局在性作用などの、水力学的に誘導される局在性（例えば、全体の流体体積に対して非均一な）電気運動作用（例えば、電位／電流パルス）の存在下で生成される流体を指す。特定の態様では、該水力学的に誘導される局在性電気運動作用は、本明細書に開示及び記載されるように、表面に関連する二重層及び／または荷電電流作用と組み合わされる。
【００８２】
特定の態様では、投与される発明の電気運動的に変化させられた流体は、細胞膜電位及び細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節をもたらすのに十分な量の電荷安定化酸素含有ナノ構造体を含む。ある特定の実施形態では、電気運動的に変化させられた流体は超酸素化される（例えば、ＲＮＳ−２０、ＲＮＳ−４０、及びＲＮＳ−６０は、標準的な食塩水中にそれぞれ２０ｐｐｍ、４０ｐｐｍ、及び６０ｐｐｍの溶解酸素を含む）。特定の実施形態では、電気運動的に変化させられた流体は超酸素化されない（例えば、ＲＮＳ−１０またはＳｏｌａｓは、１０ｐｐｍ（例えば、標準的な食塩水中におよそ周囲レベルの溶解酸素）を含む）。ある特定の態様では、本発明の電気運動的に変化させられた流体の塩分、無菌性、ｐＨなどは、該流体の電気運動的生成時に確立され、無菌流体は適切な経路で投与される。あるいは、該流体の塩分、無菌性、ｐＨなどのうちの少なくとも１つは、（例えば、無菌食塩水または適切な希釈剤を使用して）投与の経路と生理的に適合性があるように該流体の投与の前に適切に調整される。好ましくは、該流体の塩分、無菌性、ｐＨなどのうちの少なくとも１つを調整するために使用される希釈剤及び／または食塩水溶液及び／または緩衝剤組成物も電気運動的流体であるか、または別様に相溶性である。
【００８３】
特定の態様では、本発明の電気運動的に変化させられた流体は、食塩水（例えば、１つ以上の溶解塩（複数可）；例えば、アルカリ金属系塩（Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋など）、アルカリ土類系塩（例えば、Ｍｇ＋＋、Ｃａ＋＋）など、または遷移金属系陽イオン（例えば、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎなど）を、各事例においてＦ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、ＰＯ４−、ＳＯ４−、及び窒素系アニオンを含むがこれらに限定されない任意の好適なアニオン構成成分とともに含む。特定の態様は、混合塩ベースの電気運動的流体（例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋、遷移金属イオン（複数可）など）を、様々な組み合わせ及び濃度で、そして任意に対イオンの混合物とともに含む。特定の態様では、本発明の電気運動的に変化させられた流体は、標準的な食塩水（例えば、およそ０．９％のＮａＣｌ、または約０．１５ＭのＮａＣｌ）を含む。特定の態様では、本発明の電気運動的に変化させられた流体は、食塩水を少なくとも０．０００２Ｍ、少なくとも０．０００３Ｍ、少なくとも０．００１Ｍ、少なくとも０．００５Ｍ、少なくとも０．０１Ｍ、少なくとも０．０１５Ｍ、少なくとも０．１Ｍ、少なくとも０．１５Ｍ、または少なくとも０．２Ｍの濃度で含む。特定の態様では、本発明の電気運動的に変化させられた流体の伝導性は、少なくとも１０μＳ／ｃｍ、少なくとも４０μＳ／ｃｍ、少なくとも８０μＳ／ｃｍ、少なくとも１００μＳ／ｃｍ、少なくとも１５０μＳ／ｃｍ、少なくとも２００μＳ／ｃｍ、少なくとも３００μＳ／ｃｍ、または少なくとも５００μＳ／ｃｍ、少なくとも１ｍＳ／ｃｍ、少なくとも５、ｍＳ／ｃｍ、１０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも４０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも８０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも１００ｍＳ／ｃｍ、少なくとも１５０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも２００ｍＳ／ｃｍ、少なくとも３００ｍＳ／ｃｍ、または少なくとも５００ｍＳ／ｃｍである。特定の態様では、本発明の電気運動的に変化させられた流体の調製において任意の塩が使用され得るが、但し、それらが本明細書に開示される生物学的に活性な塩安定化ナノ構造体（例えば、塩安定化酸素含有ナノ構造体）の形成を可能にすることを条件とする。
【００８４】
特定の態様によると、電荷安定化気体含有ナノ構造体を含む本発明の流体組成物の生物学的作用は、流体のイオン構成成分を変更することによって、かつ／または流体の気体構成成分を変更することによって、調節され得る（例えば、増加、減少、調整など）。
【００８５】
特定の態様によると、電荷安定化気体含有ナノ構造体を含む本発明の流体組成物の生物学的作用は、流体の気体構成成分を変更することによって調節され得る（例えば、増加、減少、調整など）。好ましい態様では、本発明の電気運動的流体の調製において酸素が使用される。追加の態様では、窒素、酸素、アルゴン、二酸化炭素、ネオン、ヘリウム、クリプトン、水素、及びキセノンから選択される少なくとも１つの他の気体と合わせた酸素の混合物。上記のように、イオンは、様々な気体構成物（複数可）とともに変動することを含むように、変動してもよい。
【００８６】
本明細書に開示される教示及びアッセイ系（例えば、細胞ベースのサイトカインアッセイ、パッチクランプアッセイなど）を所与として、当業者であれば、本明細書に開示される生物活性を達成するように適切な塩及びその濃度を容易に選択することができるであろう。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【００８７】
本開示は、糖尿病または糖尿病関連障害の治療に有用な、気体富化イオン性水溶液、水性食塩水溶液（例えば、標準的な水性食塩水溶液、及び、生理的に適合性があるあらゆる食塩水溶液を含む、本明細書に記載され、かつ当該技術分野において認識されるであろう他の食塩水溶液）、細胞培養培地（例えば、最少培地、及び他の培養培地）を含むがこれらに限定されない、新規の気体富化流体を記載する。培地（単数または複数）は、成長に必須な栄養分のみを含有する場合に「最少」と呼ばれる。原核生物の宿主細胞については、最少培地は典型的に、炭素、窒素、リン、マグネシウムの供給源、及び微量の鉄及びカルシウムを含む。（Ｇｕｎｓａｌｕｓ  ａｎｄ  Ｓｔａｎｔｅｒ，Ｔｈｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｖ．１，Ｃｈ．１  Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（１９６０））。ほとんどの最少培地は、グルコースを炭素供給源として、アンモニアを窒素供給源として、そして正リン酸（例えば、ＰＯ４）をリン供給源として使用する。培地構成成分は、標的タンパク質の産生を阻害することなく最適な成長を促すために、生育される特異的な原核生物または真核生物（複数可）に従って変更または補充されてよい。（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇ．２７：８１８−８２４（１９８５））。
【００８８】
特定の態様では、電気運動的に変化させられた水性流体は、その中に溶解されるレポーター溶質（例えば、トレへロース（Ｔｒｅｈｅｌｏｓｅ））の１３Ｃ−ＮＭＲ線幅を調節するのに好適である。ＮＭＲ線幅作用は、例えば、本明細書の特定の作業実施例に記載される試験流体における溶質「タンブリング」を測定する間接的な方法におけるものである。
【００８９】
特定の態様では、電気運動的に変化させられた水性流体は、−０．１４Ｖ、−０．４７Ｖ、−１．０２Ｖ、及び−１．３６Ｖのうちのいずれか１つにおける独特の方形波ボルタンメトリーピーク差異；−０．９ボルトにおけるポーラログラフピーク；ならびに−０．１９及び−０．３ボルトにおけるポーラログラフピークの非存在のうちの少なくとも１つを特徴とし、これらは本明細書の特定の作業実施例に開示される電気運動的に生成される流体に特有のものである。
【００９０】
特定の態様では、電気運動的に変化させられた水性流体は、細胞膜伝導性（例えば、本明細書に開示されるパッチクランプ研究で測定される全細胞コンダクタンスの電位依存性寄与）を変更するのに好適である。
【００９１】
特定の態様では、電気運動的に変化させられた水性流体は酸素化され、該流体中の酸素は、大気圧で少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの溶解酸素の量で存在する。特定の態様では、電気運動的に変化させられた水性流体は、大気圧またはおよそ周囲酸素レベルで、１５ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満の溶解酸素を有する。
【００９２】
特定の態様では、電気運動的に変化させられた水性流体は酸素化され、該流体中の酸素は、およそ８ｐｐｍ〜およそ１５ｐｐｍの量で存在し、この場合、本明細書において「Ｓｏｌａｓ」と称されることがある。
【００９３】
特定の態様では、電気運動的に変化させられた水性流体は、（例えば、分子酸素によって安定化された）溶媒和電子、ならびに電気運動的に変更及び／または荷電された酸素種のうちの少なくとも１つを含み、ある特定の実施形態では、溶媒和電子ならびに／または電気運動的に変更もしくは荷電された酸素種は、少なくとも０．０１ｐｐｍ、少なくとも０．１ｐｐｍ、少なくとも０．５ｐｐｍ、少なくとも１ｐｐｍ、少なくとも３ｐｐｍ、少なくとも５ｐｐｍ、少なくとも７ｐｐｍ、少なくとも１０ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、または少なくとも２０ｐｐｍの量で存在する。
【００９４】
特定の態様では、電気運動的に変化させられた水性流体は、対照である非電気運動的に変化させられた流体に対して差次的な（例えば、上昇または減少した）誘電率を特徴とする。好ましい態様では、電気運動的に変化させられた水性流体は、対照である非電気運動的に変化させられた流体に対して差次的な、上昇した誘電率を特徴とする。誘電率（ε）（ファラド毎メートル）は、電場によって極性化され、それによって材料内の全体の電場を低減させる材料の能力の尺度である。したがって、誘電率は、電場を伝達（または「許容」）する材料の能力に関する。密接に関わる特性である静電容量（Ｃ）（ファラド；クーロン毎ボルト）は、電位が全体に適用される場合に電荷を保持する材料の能力の尺度である（例えば、２枚の平行な伝導性プレート間にはさまれた誘電性層によって最良にモデル化される）。電位Ｖが静電容量Ｃのコンデンサ全体に適用される場合、それが保持し得る電荷Ｑは、適用される電位Ｖに正比例し、静電容量Ｃは比例定数である。したがって、Ｑ＝ＣＶ、またはＣ＝Ｑ／Ｖである。コンデンサの静電容量は、誘電性層の誘電率ε、ならびにコンデンサの面積Ａ、及び２枚の伝導性プレート間の分離距離ｄに依存する。誘電率及び静電容量は、次のように数学的に関連している：Ｃ＝ε（Ａ／ｄ）。使用される誘電体が真空である場合、静電容量Ｃｏ＝εｏ（Ａ／ｄ）であり、式中、εｏは真空の誘電率である（８．８５×１０−１２Ｆ／ｍ）。絶縁定数（ｋ）、すなわち材料の比誘電率は、その誘電率εと真空の誘電率εｏとの比であり、ｋ＝ε／εｏである（真空の絶縁定数は１である）。Ｌｏｗ−ｋ誘電体は、低い誘電率、すなわち極性化し電荷を保持する低い能力を有する誘電体である。それに対してＨｉｇｈ−ｋ誘電体は、高い誘電率を有する。Ｈｉｇｈ−ｋ誘電体は電荷を保持するのに優れているため、コンデンサに好ましい誘電体である。Ｈｉｇｈ−ｋ誘電体は、電荷の形態でデジタルデータを保存するメモリセルにも使用される。
【００９５】
特定の態様では、電気運動的に変化させられた水性流体は、細胞内シグナル伝達の調節をもたらすのに十分に細胞膜構造または機能を変更するのに（例えば、膜結合タンパク質の立体構造、リガンド結合活性、または触媒活性の変更に）好適であり、特定の態様では、膜結合タンパク質は、受容体、膜貫通受容体（例えば、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、ＴＳＬＰ受容体、β２アドレナリン作動性受容体、ブラジキニン受容体など）、イオンチャネルタンパク質、細胞内付着タンパク質、細胞接着タンパク質、及びインテグリンからなる群から選択される少なくとも１つを含む。ある特定の態様では、もたらされるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、Ｇタンパク質αサブユニット（例えば、Ｇαｓ、Ｇαｉ、Ｇαｑ、及びＧα１２）と相互作用する。
【００９６】
特定の態様では、電気運動的に変化させられた水性流体は、カルシウム依存性細胞メッセージ経路または系の調節を含む、細胞内シグナル伝達の調節（例えば、ホスホリパーゼＣ活性の調節、またはアデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）活性の調節）に好適である。
【００９７】
特定の態様では、電気運動的に変化させられた水性流体は、本明細書の作業実施例及びその他の箇所に記載される様々な生物活性（例えば、サイトカイン、受容体、酵素、ならびに他のタンパク質及び細胞内シグナル伝達経路の制御）を特徴とする。
【００９８】
特定の態様では、電気運動的に変化させられた水性流体は、酢酸グラチラマーインターフェロン−β、ミトキサントロン、及び／またはナタリズマブとの相乗作用を示す。特定の態様では、電気運動的に変化させられた水性流体は、気管支上皮細胞（ＢＥＣ）内のＤＥＰ誘導性のＴＳＬＰ受容体発現を低減させる。
【００９９】
特定の態様では、電気運動的に変化させられた水性流体は、気管支上皮細胞（ＢＥＣ）内のＤＥＰ誘導性の細胞表面結合ＭＭＰ９レベルを阻害する。
【０１００】
特定の態様では、電気運動的に変化させられた水性流体の生物学的作用は、ジフテリア毒素によって阻害され、ベータ遮断、ＧＰＣＲ遮断、及びＣａチャネル遮断が、電気運動的に変化させられた水性流体の活性に（例えば、制御性Ｔ細胞機能に対して）影響することを示す。
【０１０１】
特定の態様では、電気運動的に変化させられた水性流体の物理的及び生物学的作用（例えば、細胞内シグナル伝達の調節をもたらすのに十分に細胞膜構造または機能を変更する能力）は、密閉された容器（例えば、大気圧かつ好ましくは４℃において密閉された気密容器）内で少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも４カ月、少なくとも５カ月、少なくとも６カ月、またはそれより長い期間にわたって持続する。
【０１０２】
特定の態様によると、電気運動的に変化させられた水性流体の１００ｎｍ未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ構造体（ナノ気泡）は、密閉された容器（例えば、大気圧かつ好ましくは４℃において密閉された気密容器）内で少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも４カ月、少なくとも５カ月、少なくとも６カ月、またはそれより長い期間にわたって持続し、これは該流体の生物活性の安定性の主要因であり、それと相関する。
【０１０３】
したがって、さらなる態様は、該電気運動的に生成された溶液、ならびに、電気運動的に変化させられた酸素化水性流体または溶液を生成する方法であって、相対運動において離間し、かつその間の混合容積を画定する２つの表面間に、流体材料の流れを提供することであって、混合容積内及びそれを通って流動する流体材料の単一の通過の滞留時間が０．０６秒超または０．１秒超である、提供することと、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素を材料内に溶解させ、かつ流体または溶液を電気運動的に変化させるのに好適な条件下で、混合容積内の流動する流体材料内に酸素（Ｏ２）を導入することと、を含む、方法を提供する。ある特定の態様では、酸素は、１００ミリ秒未満、２００ミリ秒未満、３００ミリ秒未満、または４００ミリ秒未満で材料内に注入される。特定の実施形態では、表面積対容積の比は、少なくとも１２、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０である。
【０１０４】
またさらなる態様は、電気運動的に変化させられた酸素化水性流体または溶液を生成する方法であって、その間の混合容積を画定する２つの離間した表面間に流体材料の流れを提供することと、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素を、１００ミリ秒未満、２００ミリ秒未満、３００ミリ秒未満、または４００ミリ秒未満で材料内に注入するのに好適な条件下で、混合容積内の流動する材料に酸素を導入することと、を含む、方法を提供する。ある特定の態様では、混合容積内の流動する材料の滞留時間は、０．０６秒超または０．１秒超である。特定の実施形態では、表面積対容積の比は、少なくとも１２、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０である。
【０１０５】
追加の実施形態は、第１の材料と第２の材料とを混合することによって産出混合物を生成するための混合装置の使用を含む、電気運動的に変化させられた酸素化水性流体または溶液を生成する方法を提供し、該装置は、第１の材料の供給源から第１の材料を受けるように構成された第１のチャンバと、固定子と、回転軸を有する回転子であって、固定子の内部に配設され、かつその中の回転軸上を回転するように構成され、回転子及び固定子のうちの少なくとも１つが複数の貫通孔を有する、回転子と、回転子と固定子との間に画定される混合チャンバであって、第１のチャンバと流体連通し、かつそこから第１の材料を受けるように構成され、第２の材料が、回転子及び固定子のうちの１つに形成された複数の貫通孔を介して混合チャンバに提供される、混合チャンバと、混合チャンバと流体連通し、かつそこから産出材料を受けるように構成された第２のチャンバと、第１のチャンバの内部に収容された第１の内部ポンプであって、第１のチャンバから混合チャンバ内に第１の材料をポンピングするように構成される、第１の内部ポンプと、を備える。ある特定の態様では、第１の内部ポンプは、第１の材料が混合チャンバに入る前に第１の材料に周速度を付与するように構成される。
【０１０６】
さらなる実施形態は、第１の材料と第２の材料とを混合することによって産出混合物を生成するための混合装置の使用を含む、電気運動的に変化させられた酸素化水性流体または溶液を生成する方法を提供し、該装置は、固定子と、回転軸を有する回転子であって、固定子の内部に配設され、かつその中の回転軸上を回転するように構成された、回転子と、回転子と固定子との間に画定される混合チャンバであって、それを通って第１の材料が混合チャンバに入る第１の開口端、及びそれを通って産出材料が混合チャンバを出る第２の開口端を有し、第２の材料が、回転子及び固定子のうちの少なくとも１つを通って混合チャンバに入る、混合チャンバと、混合チャンバの第１の開口端の少なくとも大部分と連通する第１のチャンバと、混合チャンバの第２の開口端と連通する第２のチャンバと、を備える。
【０１０７】
追加の態様は、上記の方法のいずれかに従って作製される電気運動的に変化させられた酸素化水性流体または溶液を提供する。特定の態様では、投与される発明の電気運動的に変化させられた流体は、細胞膜電位及び細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節をもたらすのに十分な量の電荷安定化酸素含有ナノ構造体を含む。ある特定の実施形態では、電気運動的に変化させられた流体は超酸素化される（例えば、ＲＮＳ−２０、ＲＮＳ−４０、及びＲＮＳ−６０は、標準的な食塩水中にそれぞれ２０ｐｐｍ、４０ｐｐｍ、及び６０ｐｐｍの溶解酸素を含む）。特定の実施形態では、電気運動的に変化させられた流体は超酸素化されない（例えば、ＲＮＳ−１０またはＳｏｌａｓは、１０ｐｐｍ（例えば、標準的な食塩水中におよそ周囲レベルの溶解酸素を含む）。ある特定の態様では、本発明の電気運動的に変化させられた流体の塩分、無菌性、ｐＨなどは、該流体の電気運動的生成時に確立され、無菌流体は適切な経路で投与される。あるいは、該流体の塩分、無菌性、ｐＨなどのうちの少なくとも１つは、（例えば、無菌食塩水または適切な希釈剤を使用して）投与の経路と生理的に適合性があるように該流体の投与の前に適切に調整される。好ましくは、該流体の塩分、無菌性、ｐＨなどのうちの少なくとも１つを調整するために使用される希釈剤及び／または食塩水溶液及び／または緩衝剤組成物も、電気運動的流体であるか、または別様にそれと相溶性である。
【０１０８】
本開示は、気体富化イオン性水溶液、水性食塩水溶液（例えば、標準的な水性食塩水溶液、及び、生理的に適合性があるあらゆる食塩水溶液を含む、本明細書に記載され、かつ当該技術分野において認識されるであろう他の食塩水溶液）、細胞培養培地（例えば、最少培地、及び他の培養培地）を含むがこれらに限定されない、新規の気体富化流体を記載する。
【０１０９】
本方法の特定の態様及び上記の流体によると、電荷安定化酸素含有ナノ構造体は、主に１００ｎｍ未満の平均直径を有する電荷安定化酸素含有ナノ気泡を含む。特定の態様によると、電荷安定化酸素含有ナノ気泡は、大気圧において密閉された容器内で少なくとも数ヶ月にわたって溶液中で持続するよう安定している。
【０１１０】
治療の方法
「治療すること」または「投与すること」という用語は、本明細書において定義される場合、疾患、障害、もしくは病状、またはそれらの１つ以上の症状を逆転させること、緩和すること、その進行を阻害すること、または予防することを指し、かつそれらを含み、「治療」及び「治療上」は、治療する行為を指す。
【０１１１】
「治療上有効な量」は、本明細書に提供される本発明を実施する過程で用いられる化合物のうちのいずれかの、疾患、障害、もしくは病状、またはそれらの１つ以上の症状を逆転させる、緩和する、その進行を阻害する、または予防するのに十分な任意の量である。
【０１１２】
本明細書におけるある特定の実施形態は、本明細書に開示されるように、海馬の可塑性ならびに海馬介在性学習及び記憶を向上させることによる、対象のための治療組成物及び治療の方法に関する。
【０１１３】
併用療法：
追加の態様は、少なくとも１つの追加の治療薬が患者に投与される、併用療法をさらに含む、本明細書に開示される発明の方法を提供する。ある特定の態様では、少なくとも１つの追加の治療薬は、本明細書に開示されるように、抗炎症剤である。
【０１１４】
例示的な関連する分子間相互作用：
我々の日常生活の巨視的世界がニュートンの運動の法則に従って挙動するという点で古典的と称される一方で、従来、量子的特性は１０−１０メートル未満の素粒子に属すると考えられる。
【０１１５】
近年、分子は、希釈とともに大きさが増加するクラスターを形成するものとして説明されている。これらのクラスターは、直径が数マイクロメートルの寸法であり、希釈とともに大きさが非線形に増加すると報告されている。直径が１００ナノメートルの寸法である量子干渉性ドメインは純水中で生じると仮定されており、干渉性ドメイン内の水分子の集団振動は、最終的に電磁場のゆらぎに位相固定され、水中で安定した振動をもたらし、水の集合構造を変化させる水中に溶解された物質に特異的な持続性の干渉性振動の励起の形態における「記憶」の形態をもたらし得、これが次に、発生する特異的な干渉性振動を決定し得る。これらの振動が磁場相結合によって安定化すると、水は、希釈しても、「種」干渉性振動を依然として保有し得る。分子のクラスターの大きさが増加するにつれて、その電磁気特性図がそれに対応して増幅し、水が保有する干渉性振動を強化する。
【０１１６】
水の溶解分子のクラスターの大きさ及び詳細な顕微鏡的構造の多様性にかかわらず、干渉性振動の特異性がなお存在する場合がある。水の特性の変化を考慮するための１つのモデルは、結晶化に関わる考慮に基づく。
【０１１７】
プロトン化された水クラスターは典型的に、Ｈ＋（Ｈ２Ｏ）ｎの形態をとる。いくつかのプロトン化された水クラスターは、イオン圏におけるように自然発生する。いかなる特定の理論にも束縛されることなく、かつ特定の態様によると、酸素（そして場合により本発明の産出材料に付与される安定化された電子）を含むナノ構造体を含む、他の種類の水クラスターまたは構造体（ナノクラスター、ナノケージ、ナノ気泡）が可能である。得られる構造体内に酸素原子が捕捉されてもよい。準結合（ｓｅｍｉ−ｂｏｕｎｄ）ナノケージまたはナノ気泡の化学的性質は、酸素及び／または安定化された電子が長期間にわたって溶解されたままであることを可能にする。薬用化合物などの他の原子または分子を徐放目的で組み合わせてもよい。溶液材料及び溶解化合物の特異的な化学的性質は、これらの材料の相互作用に依存する。
【０１１８】
出願者の国際公開第２００９／０５５７２９号の「二重層作用（Ｄｏｕｂｌｅ  Ｌａｙｅｒ  Ｅｆｆｅｃｔ）」、「滞留時間（Ｄｗｅｌｌ  Ｔｉｍｅ）」、「注入速度（Ｒａｔｅ  ｏｆ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）」、及び「気泡サイズ測定（Ｂｕｂｂｌｅ  ｓｉｚｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）」に以前に記載されたように、電気運動混合装置は、本明細書に記載される新規の治療効果をもたらす、複雑な混合をもたらす有効に巨大な表面積（装置のもの及び非常に小さな気泡；１００ｎｍ未満のナノ気泡のものを含む）と接触している複雑な動的乱流を用いて、第１の材料と第２の材料との特有の非線形流体動的相互作用を、ほんの数ミリ秒で生み出す。さらに、特徴局在性の電気運動作用（電位／電流）が、絶縁された回転子及び固定子特徴を備える特別に設計された混合装置を使用して実証された（例えば、すべて参照によりそれぞれの全体が本明細書に組み込まれる、出願者の交付済み米国特許第７，８３２，９２０号、同第７，９１９，５３４号、同第８，４１０，１８２号、同第８，４４５，５４６号、同第８，４４９，１７２号、及び同第８，４７０，８９３号も参照されたい）。
【０１１９】
当該技術分野において十分に認識されているように、電荷再分配及び／または溶媒和電子は、水溶液中で高度に不安定であることが知られている。特定の態様によると、出願者の電気運動作用（例えば、特定の態様では溶媒和電子を含む、電荷再分配）は、産出材料（例えば、食塩水溶液、イオン性溶液）内で驚くほど安定している。実際に、本明細書に記載されるように、本発明の電気運動的流体（例えば、ＲＮＳ−６０またはＳｏｌａｓ（装置を通して処理されるが追加の酸素を含まない）の特性及び生物活性の安定性は、気密容器内で数カ月にわたって維持され得、本発明の溶液の特性及び活性の生成、及び／または維持、及び／または媒介を援助するに当たっての溶解された気体（例えば、酸素）の関与を示している。有意に、電荷再分配及び／または溶媒和電子は、流体が生細胞（例えば、哺乳動物細胞）に接触すると細胞膜電位及び細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節をもたらすのに十分な量で、本発明の電気運動的イオン性水性流体中に安定して構成される（例えば、国際公開第２００９／０５５７２９号の細胞パッチクランプ作業実施例２３及び本明細書に開示されるものを参照されたい）。
【０１２０】
本明細書の「分子間相互作用」に記載されるように、本発明の電気運動的流体（例えば、電気運動的な食塩水溶液）の安定性及び生体適合性を説明するために、出願者は、水分子と水中に溶解された物質（例えば、酸素）の分子との間の相互作用が、水の集合構造を変化させ、酸素及び／または本発明の産出材料に付与される安定化された電子を含むナノ構造体（例えば、ナノ気泡）を含む、ナノスケール構造体（例えば、ナノ気泡）をもたらすことを提唱している。機構に束縛されることなく、特定の態様におけるナノ構造体（例えば、ナノ気泡）の構成は、それらが、（少なくとも形成及び／または安定性及び／または生物活性のために）溶解された気体（例えば、酸素）を含み、細胞膜またはその関連する構成物と接触すると、電気運動的流体（例えば、ＲＮＳ−６０またはＳｏｌａｓ食塩水流体）が電荷及び／または荷電効果を調節（例えば、付与または受容）することを可能にし、かつ特定の態様では、生物学的に関連した形態の溶媒和電子の安定化（例えば、保有、内包、捕捉）をもたらすようなものである。
【０１２１】
特定の態様によると、そして本開示に支持されるように、イオン性溶液または食塩水（例えば、標準的な食塩水、ＮａＣｌ）溶液中で、本発明のナノ構造体は、電荷安定化水和殻内に少なくとも１つの溶解された気体分子（例えば、酸素）を含み得る電荷安定化ナノ構造体（例えば、ナノ気泡）（例えば、１００ｎｍ未満の平均直径）を含む。追加の態様によると、電荷安定化水和殻は、少なくとも１つの溶解された気体分子（例えば、酸素）を内包するケージまたは空隙を備え得る。さらなる態様によると、好適な電荷安定化水和殻の提供によって、電荷安定化ナノ構造体及び／または電荷安定化酸素含有ナノ構造体は、溶媒和電子（例えば、安定化された溶媒和電子）をさらに含み得る。
【０１２２】
本発明の特定の態様によると、出願者の新規の電気運動的流体は、新規の生物学的に活性な形態の電荷安定化酸素含有ナノ構造体（例えば、ナノ気泡）を含み、そのような構造体の（例えば、そのようなナノ気泡の）新規のアレイ、クラスター、及び会合をさらに含み得る。
【０１２３】
電荷安定化マイクロ気泡モデルによると、水構造の短距離分子秩序は、気体分子の存在によって破壊され（例えば、初めは非吸着性イオンと複合されていた溶解された気体分子が短距離秩序の欠損をもたらし）、イオン液滴の凝縮をもたらし、この欠損は、水分子の第１及び第２の配位圏に包囲され、これらは、配位圏においてそれぞれ６個及び１２個の空孔を占める、吸着性イオン（例えば、電気二重層を形成するためのＮａ＋イオンの「スクリーニングシェル（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｓｈｅｌｌ）の捕捉）及び非吸着性イオン（例えば、第２の配位圏を占めるＣｌ−イオン）によって交互に充填される。不飽和のイオン性溶液（例えば、不飽和の食塩水溶液）中、この水和された「核」は、第１及び第２の圏がそれぞれ６個の吸着性イオン及び５個の非吸着性イオンによって充填されるまで安定したままであり、次に、気体分子を含有する内部空隙を生み出すクーロン爆発を受け、吸着性イオン（例えば、Ｎａ＋イオン）は、得られる空隙の表面に吸着され、一方で非吸着性イオン（またはその一部）は、溶液中に拡散する（Ｂｕｎｋｉｎら、上記）。このモデルでは、ナノ構造体内の空隙は、その表面に吸着されるイオン（例えば、Ｎａ＋イオン）間のクーロン反発によって崩壊が妨げられる。空隙を含むナノ構造体の安定性は、空隙／気泡表面上への同じ電荷を有する溶解されたイオンの選択的吸着、及び溶解された気体と気泡内の気体との間の拡散平衡に起因すると仮定され、得られる電気二重層が及ぼす陰圧（外向きの静電圧は、表面張力の安定した補正をもたらし、気泡内の気体圧力は、周囲圧力によって平衡される。このモデルによると、そのようなマイクロ気泡の形成はイオン構成成分を必要とし、ある特定の態様では、粒子間の衝突介在性会合が、より大きな秩序クラスター（アレイ）の形成をもたらし得る（Ｉｄ）。
【０１２４】
電荷安定化マイクロ気泡モデルは、粒子が気体マイクロ気泡であり得ることを示唆するが、周囲空気と平衡状態にあるイオン性溶液中のそのような構造体の自発性形成のみを企図し、酸素がそのような構造体を形成することができるかに関して特定及び言及されておらず、同様に、溶媒和電子がそのような構造体に会合し、かつ／またはそれによって安定化され得るかに関して言及されていない。
【０１２５】
特定の態様によると、電荷安定化ナノ構造体及び／または電荷安定化酸素含有ナノ構造体を含む本発明の電気運動的流体は、新規であり、マイクロ気泡モデルに従う仮定の非電気運動的な大気の電荷安定化マイクロ気泡構造体とは本質的に異なる。有意に、この結論は、対照の食塩水溶液が本明細書に開示される生物学的特性を有しないのに対して、出願者の電荷安定化ナノ構造体は、新規の生物学的に活性な形態の電荷安定化酸素含有ナノ構造体をもたらすという事実に少なくとも部分的に由来して、不可避である。
【０１２６】
本発明の特定の態様によると、出願者の新規の電気運動的装置及び方法は、空気と平衡状態にあるイオン性流体中または任意の非電気運動的に生成される流体中で自発的に発生する場合も発生しない場合もあるあらゆる量を超える有意量の電荷安定化ナノ構造体を含む、新規の電気運動的に変化させられた流体をもたらす。特定の態様では、電荷安定化ナノ構造体は、電荷安定化酸素含有ナノ構造体を含む。追加の態様では、電荷安定化ナノ構造体は、すべて、もしくは実質的にすべて電荷安定化酸素含有ナノ構造体であるか、または電荷安定化酸素含有ナノ構造体は、電気運動的流体中の主要な電荷安定化気体含有ナノ構造体種である。
【０１２７】
またさらなる態様によると、電荷安定化ナノ構造体及び／または電荷安定化酸素含有ナノ構造体は、溶媒和電子を含むかまたは内包し、それによって新規の安定化された溶媒和電子担体をもたらし得る。特定の態様では、電荷安定化ナノ構造体及び／または電荷安定化酸素含有ナノ構造体は、新規の種類の電子化物（または反転した電子化物（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｉｄｅ））をもたらし、これは、単一の有機配位カチオンを有する従来の溶質電子化物とは対照的に、むしろ、空隙または酸素原子を含有する空隙の周りに安定して配列された複数のカチオンを有し、配列されたナトリウムイオンは、有機分子ではなくむしろ水の水和殻によって配位される。特定の態様によると、溶媒和電子は、水分子の水和殻に収容されるか、または好ましくは、すべてのカチオンにわたって分布するナノ構造体の空隙内に収容され得る。ある特定の態様では、本発明のナノ構造体は、複数の配列されたナトリウムカチオン全体にわたる溶媒和電子の分布／安定化をもたらすことだけではなく、空隙内でケージ化された酸素分子（複数可）と溶媒和電子との会合または部分的会合をもたらす（溶媒和電子がナトリウム原子及び少なくとも１個の酸素原子のアレイ全体にわたって分布する）ことにもよって、溶液中の新規の「超電子化物（ｓｕｐｅｒ  ｅｌｅｃｔｒｉｄｅ）」構造体をもたらす。したがって、特定の態様によると、本発明の電気運動的流体に関連して本明細書に開示される「溶媒和電子」は、水分子による直接水和を含む従来のモデルで溶媒和されない場合がある。あるいは、乾燥した電子化物塩を用いる限定例において、本発明の電気運動的流体中の溶媒和電子は、水溶液中のより高度な秩序アレイを安定化させるための「格子接着（ｌａｔｔｉｃｅ  ｇｌｕｅ）」をもたらすように、複数の電荷安定化ナノ構造体にわたって分布してよい。
【０１２８】
特定の態様では、本発明の電荷安定化ナノ構造体及び／または電荷安定化酸素含有ナノ構造体は、細胞膜もしくはその構成物、またはタンパク質などと相互作用して、生物活性を媒介することができる。特定の態様では、溶媒和電子を内包する本発明の電荷安定化ナノ構造体及び／または電荷安定化酸素含有ナノ構造体は、細胞膜もしくはその構成物、またはタンパク質などと相互作用して、生物活性を媒介することができる。
【０１２９】
特定の態様では、本発明の電荷安定化ナノ構造体及び／または電荷安定化酸素含有ナノ構造体は、電荷及び／もしくは荷電効果供与体（送達）として、かつ／または電荷及び／もしくは荷電効果受容体として、細胞膜もしくはその構成物、またはタンパク質などと相互作用して、生物活性を媒介する。特定の態様では、溶媒和電子を内包する本発明の電荷安定化ナノ構造体及び／または電荷安定化酸素含有ナノ構造体は、電荷及び／もしくは荷電効果供与体として、かつ／または電荷及び／もしくは荷電効果受容体として、細胞膜と相互作用して、生物活性を媒介する。
【０１３０】
特定の態様では、本発明の電荷安定化ナノ構造体及び／または電荷安定化酸素含有ナノ構造体は、本発明の電気運動的流体の観察される安定性及び生物学的特性と一致し、かつその主要因である。
【０１３１】
特定の態様では、電荷安定化酸素含有ナノ構造体は、電荷安定化酸素含有ナノ気泡を実質的に含むか、その形態をとるか、またはそれを生じさせる。特定の態様では、電荷安定化酸素含有クラスターは、電荷安定化酸素含有ナノ構造体の相対的により大きなアレイ、及び／または電荷安定化酸素含有ナノ気泡もしくはそのアレイの形成をもたらす。特定の態様では、電荷安定化酸素含有ナノ構造体は、疎水性表面と接触すると疎水性ナノ気泡の形成をもたらし得る。
【０１３２】
特定の態様では、電荷安定化酸素含有ナノ構造体は、少なくとも１個の酸素分子を実質的に含む。ある特定の態様では、電荷安定化酸素含有ナノ構造体は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、またはそれより多い酸素分子を実質的に含む。特定の態様では、電荷安定化酸素含有ナノ構造体は、約２０ｎｍ×１．５ｎｍのナノ気泡（例えば、疎水性ナノ気泡）を含むか、またはそれを生じさせ、約１２個の酸素分子を含む（例えば、酸素分子の大きさ（およそ０．３ｎｍ×０．４ｎｍ）に基づいて、理想的な気体の想定及びｎの適用はＰＶ／ＲＴであり、ここで、Ｐ＝１ａｔｍであり、Ｒ＝０．０８２０５７ｌ．ａｔｍ／ｍｏｌ．Ｋであり、Ｔ＝２９５Ｋであり、Ｖ＝ｐｒ２ｈ＝４．７×１０−２２Ｌであり、ここで、ｒ＝１０×１０−９ｍであり、ｈ＝１．５×１０−９ｍであり、ｎ＝１．９５×１０−２２モルである）。
【０１３３】
ある特定の態様では、イオン性水性流体中の電荷安定化構成を有するそのようなナノ構造体またはそのアレイ内にある、流体中に存在する酸素分子の百分率は、０．１％超、１％超、２％超、５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、及び９５％超からなる群から選択される百分率量である。好ましくは、この百分率は、約５％超、約１０％超、約１５％超、または約２０％超である。追加の態様では、イオン性水性流体中の電荷安定化構成を有する電荷安定化酸素含有ナノ構造体またはそのアレイの実質的な大きさは、１００ｎｍ未満、９０ｎｍ未満、８０ｎｍ未満、７０ｎｍ未満、６０ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、４０ｎｍ未満、３０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満、１０ｎｍ未満、５ｎｍ未満、４ｎｍ未満、３ｎｍ未満、２ｎｍ未満、及び１ｎｍ未満からなる群から選択される大きさである。好ましくは、この大きさは、約５０ｎｍ未満、約４０ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、約２０ｎｍ未満、または約１０ｎｍ未満である。
【０１３４】
ある特定の態様では、本発明の電気運動的流体は、溶媒和電子を含む。さらなる態様では、本発明の電気運動的流体は、溶媒和電子（複数可）及び特有の電荷分布（極性、対称性、非対称性の電荷分布）のうちの少なくとも１つを含む、電荷安定化ナノ構造体及び／もしくは電荷安定化酸素含有ナノ構造体、ならびに／またはそれらのアレイを含む。ある特定の態様では、電荷安定化ナノ構造体及び／もしくは電荷安定化酸素含有ナノ構造体、ならびに／またはそれらのアレイは、常磁性を有する。
【０１３５】
対照的に、本発明の電気運動的流体に対して、対照の圧力ポット酸素化流体（非電気運動的流体）などは、細胞膜電位及び細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節が可能な、そのような電気運動的に生成される電荷安定化された生物学的に活性なナノ構造体、及び／もしくは生物学的に活性な電荷安定化酸素含有ナノ構造体、ならびに／またはそれらのアレイを含まない。
【０１３６】
投与の経路及び形態
特定の例示的な実施形態では、本発明の気体富化流体は、治療組成物が海馬の可塑性ならびに海馬介在性学習及び記憶を向上させるように、単独または別の治療薬との組み合わせで治療組成物として機能し得る。本発明の治療組成物は、それを必要とする対象に投与されることができる組成物を含む。ある特定の実施形態では、治療組成物製剤は、担体、アジュバント、乳化剤、懸濁剤、甘味剤、香味剤、香料、及び結合剤からなる群から選択される少なくとも１つの追加の薬剤を含んでもよい。
【０１３７】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」及び「担体」は、概して、任意の種類の、無毒性の不活性固体、半固体、または液体の充填剤、希釈剤、カプセル封入材料、または製剤化助剤を指す。薬学的に許容される担体として機能し得る材料のいくつかの非限定的な例は、ラクトース、グルコース、及びスクロースなどの糖類；トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン類；ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、及び酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体；トラガント末；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバター及び坐薬ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、及び大豆油などの油類；プロピレングリコールなどのグリコール類；オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル類；アガー；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール、及びリン酸緩衝液であり、同様に、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムなどの他の無毒性相溶性潤滑剤、ならびに着色剤、剥離剤、被覆剤、甘味剤、香味剤、及び芳香剤、防腐剤、及び抗酸化剤も、調合者の判断によって本組成物中に存在し得る。特定の態様では、そのような担体及び賦形剤は、本発明の気体富化流体または溶液であり得る。
【０１３８】
本明細書に記載される薬学的に許容される担体、例えば、溶剤、アジュバント、賦形剤、または希釈剤は、当業者に周知である。典型的に、薬学的に許容される担体は、治療薬に対して化学的に不活性であり、使用条件下で有害な副作用または毒性を有しない。薬学的に許容される担体としては、ポリマー及びポリマーマトリクス、ナノ粒子、マイクロ気泡などを挙げることができる。
【０１３９】
本発明の治療用の気体富化流体に加えて、治療組成物は、不活性希釈剤、例えば追加の非気体富化水または他の溶媒など、可溶化剤及び乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油類（特に、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、及びソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物などをさらに含み得る。当業者によって理解されるように、特定の治療組成物の新規かつ改善された製剤、新規の気体富化治療用流体、及び新規の気体富化治療用流体を送達する新規の方法は、１つ以上の不活性希釈剤を、同一の、同様の、または異なる組成の気体富化流体で置換えることによって得ることができる。例えば、従来の水は、気体富化流体を提供するように水または脱イオン水中に酸素を混合することによって生成された気体富化流体で置換または補充され得る。
【０１４０】
ある特定の実施形態では、本発明の気体富化流体は、１つ以上の治療薬と組み合わされ、かつ／または単独で使用され得る。特定の実施形態では、気体富化流体の組み込みは、当該技術分野で既知の１つ以上の溶液、例えば脱イオン水、食塩水溶液などを、１つ以上の気体富化流体で置換え、それによって対象への送達のための改善された治療組成物を提供することを含み得る。
【０１４１】
ある特定の実施形態は、本発明の気体富化流体、薬学的組成物もしくは治療薬、またはそれらの薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物、及び少なくとも１つの薬学的担体または希釈剤を含む、治療組成物を提供する。これらの薬学的組成物は、前述の疾患または病状の予防及び治療、ならびに上述の療法において使用され得る。好ましくは、担体は、薬学的に許容されるべきであり、組成物中の他の成分と適合性がある、すなわち、それに対する有害作用を有しないべきである。担体は、固体または液体であり得、好ましくは、単位用量製剤、例えば、０．０５〜９５重量％の活性成分を含有し得る錠剤として製剤化される。
【０１４２】
考えられる投与経路としては、経口、舌下、口腔、非経口（例えば皮下、筋肉内、動脈内、腹腔内、大槽内、膀胱内、髄腔内、または静脈内）、直腸、経皮、膣内、眼内、耳内（ｉｎｔｒａｏｔｉｃａｌ）、鼻腔内、吸入、及び植え込み式装置または材料の注入もしくは挿入を含む局所経路が挙げられる。
【０１４３】
投与経路
特定の対象に最も好適な投与の手段は、治療されている疾患もしくは病状の性質及び重症度、または使用されている療法の性質、ならびに治療組成物もしくは追加の治療薬の性質に依存する。ある特定の実施形態では、経口または局所投与が好ましい。
【０１４４】
経口投与に好適な製剤は、それぞれが規定量の活性化合物を含有する錠剤、カプセル、カシェ剤、シロップ、エリキシル剤、チューインガム、「ロリポップ」製剤、ミクロ乳濁液、溶液、懸濁液、ロゼンジ、もしくはゲル被覆アンプルなどの別個の単位として、粉末もしくは顆粒として、水性液もしくは非水性液中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油乳濁液もしくは油中水乳濁液として提供され得る。
【０１４５】
経口投与に好適な追加の製剤は、様々な種類の加圧式定用量エアロゾル、アトマイザ、ネブライザ、またはガス注入器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）の手段によって生成され得る微細粒子の塵または霧を含むように提供される。具体的には、治療薬の粉末または他の化合物は、本発明の気体富化流体中に溶解または懸濁され得る。
【０１４６】
舌下または口腔投与によるものなどの経粘膜的方法に好適な製剤としては、活性化合物、及び典型的に風味付き基剤、例えば糖及びアカシアまたはトラガントを含むロゼンジパッチ、錠剤など、ならびにゼラチン及びグリセリンまたはスクロースアカシアなどの不活性基剤中に活性化合物を含む香錠が挙げられる。
【０１４７】
非経口投与に好適な製剤は典型的に、規定濃度の活性気体富化流体、そして場合により別の治療薬を含有する無菌水溶液を含み、この溶液は好ましくは、意図される受給者の血液と等張性である。非経口投与に好適な追加の製剤としては、生理的に好適な共溶媒ならびに／または界面活性剤及びシクロデキストリンなどの錯化剤を含有する製剤が挙げられる。水中油乳濁液も、気体富化流体の非経口投与のための製剤に好適であり得る。そのような溶液は好ましくは静脈内投与されるが、皮下または筋肉内注入によって投与されてもよい。
【０１４８】
尿道、直腸、または膣内投与に好適な製剤としては、ゲル、クリーム、ローション、水性または油性懸濁液、分散性粉末または顆粒、乳濁液、分解可能な固形材料、潅注液などが挙げられる。この製剤は、好ましくは、坐薬基剤、例えば、カカオバターを形成する１つ以上の固形担体中に活性成分を含む単位用量坐薬として提供される。あるいは、本発明の気体富化流体を含む結腸洗浄液が、結腸または直腸投与のために製剤化されてもよい。
【０１４９】
局所、眼内、耳内（ｉｎｔｒａｏｔｉｃ）、または鼻腔内適用に好適な製剤としては、軟膏、クリーム、ペースト、ローション、ペースト、ゲル（ヒドロゲルなど）、スプレー、分散性粉末及び顆粒、乳濁液、流動噴霧剤を使用するスプレーまたはエアロゾル（リポソームスプレー、点鼻薬、経鼻スプレーなど）、ならびに油類が挙げられる。そのような製剤に好適な担体としては、石油ゼリー、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール類、及びこれらの組み合わせが挙げられる。経鼻または鼻腔内送達は、定用量のこれらの製剤またはその他のいずれかを含み得る。同様に、耳内または眼内は、点滴薬、軟膏、刺激流体などを含み得る。
【０１５０】
本発明の製剤は、任意の好適な方法によって、典型的には、任意に活性化合物を含む気体富化流体と、液体もしくは細かく分割された固形担体またはその両方とを、必要な割合で均一かつ緊密に混和し、次に必要に応じて得られる混合物を所望の形状に成形することによって、調製され得る。
【０１５１】
例えば、錠剤は、活性成分の粉末もしくは顆粒と、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、もしくは界面活性分散剤などの１つ以上の任意の成分とを含む、緊密な混合物を圧縮することによって、または粉末状活性成分と本発明の気体富化流体との緊密な混合物を成形することによって、調製され得る。
【０１５２】
吸入による投与に好適な製剤としては、様々な種類の加圧式定用量エアロゾル、アトマイザ、ネブライザ、またはガス注入器の手段によって生成され得る微細粒子の塵または霧が挙げられる。具体的には、治療薬の粉末または他の化合物は、本発明の気体富化流体中に溶解または懸濁され得る。
【０１５３】
口を介する肺内投与の場合、粉末または液滴の粒径は典型的に、気管支樹への送達を確かにするために、０．５〜１０μＭ、好ましくは１〜５μＭの範囲内である。経鼻投与の場合、１０〜５００μＭの範囲内の粒径が、鼻腔内での保持を確かにするために好ましい。
【０１５４】
定用量吸入器は、典型的に液化噴霧剤中に治療薬の懸濁液または溶液製剤を含有する、加圧式エアロゾル分注器である。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるように、本発明の気体富化流体は、標準的な液化噴霧剤に加えて、またはその代わりに使用され得る。使用中、これらの装置は、計量された体積、典型的には１０〜１５０μＬを送達するように適合された弁を通して製剤を放出して、治療薬及び気体富化流体を含有する微細粒子スプレーを生成する。好適な噴霧剤としては、ある特定のクロロフルオロカーボン化合物、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、及びこれらの混合物が挙げられる。
【０１５５】
製剤は、１つ以上の共溶媒、例えば、オレイン酸またはトリオレイン酸ソルビタンなどのエタノール界面活性剤、抗酸化剤、及び好適な香味剤をさらに含有してもよい。ネブライザは、狭いベンチュリ開口部を通る圧縮された気体（典型的には空気または酸素）の加速の手段、または超音波撹拌の手段のいずれかによって、活性成分の溶液または懸濁液を治療用エアロゾルの霧に変換する市販の装置である。ネブライザでの使用に好適な製剤は、気体富化流体中にあり製剤の最大４０％（ｗ／ｗ）、好ましくは２０％（ｗ／ｗ）未満を構成する、別の治療薬からなる。加えて、好ましくは塩化ナトリウムなどの塩の添加によって体液と等張性にされた、蒸留水、滅菌水、または希釈アルコール水溶液などの他の担体が用いられ得る。任意の添加剤は、特に製剤が無菌に調製されていない場合、防腐剤を含み、ヒドロキシ安息香酸メチル、抗酸化剤、香味剤、揮発油、緩衝剤、及び界面活性剤を含み得る。
【０１５６】
ガス注入による投与に好適な製剤としては、ガス注入器の手段によって送達されるか、または鼻吸入の様式で鼻腔内に取り込まれ得る、細かく粉砕された粉末が挙げられる。ガス注入器では、粉末は、典型的にゼラチンまたはプラスチックで作製されるカプセルまたはカートリッジ内に収容され、これが原位置で穿孔または開放され、吸入に際し、または手動操作されるポンプの手段により、装置に引き込まれる空気によって粉末が送達される。ガス注入器内で用いられる粉末は、活性成分のみからなるか、または活性成分、ラクトースなどの好適な粉末希釈剤、及び任意の界面活性剤を含む粉末ブレンドからなるかのいずれかである。活性成分は典型的に製剤の０．１〜１００ｗ／ｗを構成する。
【０１５７】
上に具体的に記載された成分に加えて、本発明の製剤は、問題の製剤の種類に鑑みて当業者に既知の他の薬剤を含んでもよい。例えば、経口投与に好適な製剤は香味剤を含み得、鼻腔内投与に好適な製剤は香料を含み得る。
【０１５８】
本発明の治療組成物は、個別の治療薬として、または治療薬の組み合わせのいずれかで、医薬品との併用に利用可能な任意の従来の方法によって投与され得る。
【０１５９】
投与される薬用量は、当然ながら、特定の薬剤の薬力学的特性ならびにその投与の様態及び経路、受給者の年齢、健康、及び体重、症状の性質及び程度、併用治療の種類、治療の頻度、ならびに所望の効果などの、既知の要因によって変動する。活性成分の１日の薬用量は、約０．００１〜１０００ミリグラム（ｍｇ）／体重１キログラム（ｋｇ）と予想され得、好ましい用量は０．１〜約３０ｍｇ／ｋｇである。ある特定の態様によると、活性成分の１日の薬用量は、．００１リットル〜１０リットルであり得、好ましい用量は約．０１リットル〜１リットルである。
【０１６０】
剤形（投与に好適な組成物）は、単位当たり約１ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分を含有する。これらの薬学的組成物では、活性成分は通常、組成物の総重量に基づいて約０．５〜９５重量％の量で存在する。
【０１６１】
軟膏、ペースト、発泡体、オクルージョン、クリーム、及びゲルも、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、シリコーン、ベントナイト、シリカ酸、及びタルクなどの賦形剤、またはこれらの混合物を含有し得る。粉末及びスプレーも、ラクトース、タルク、シリカ酸、水酸化アルミニウム、及びケイ酸カルシウムなどの賦形剤、またはこれらの物質の混合物を含有し得る。ナノ結晶性抗菌金属の溶液も、エアロゾル製薬の作製に日常的に使用される既知の手段のいずれかによって、エアロゾルまたはスプレーに変換され得る。一般的に、そのような方法は、通常は不活性担体ガスを用いて溶液の容器を加圧すること、または加圧のための手段を提供すること、及び加圧された気体を小さな開口部に通すことを含む。スプレーは、慣例の噴霧剤、例えば窒素、二酸化炭素、及び他の不活性気体などをさらに含有し得る。加えて、小球体またはナノ粒子が、治療化合物を対象に投与するのに必要な経路のいずれかにおいて、本発明の気体富化された治療組成物または流体とともに用いられ得る。
【０１６２】
注入用製剤は、アンプルまたはバイアルなどの単位用量または複数用量の密封容器内で提示され得、使用直前に無菌の液体賦形剤、または気体富化流体の添加のみを必要とするフリーズドライの（凍結乾燥した）条件で保管され得る。即時の注入溶液及び懸濁液が、無菌の粉末、顆粒、及び錠剤から調製され得る。注入可能な組成物のための有効な薬学的担体の必要条件は、当業者に周知である。例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ，Ｅｄｓ．，２３８−２５０（１９８２）及びＡＳＨＰ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，４ｔｈ  ｅｄ．，６２２−６３０（１９８６）を参照されたい。
【０１６３】
局所投与に好適な製剤としては、本発明の気体富化流体、そして任意に追加の治療薬及び香味剤（通常はスクロース及びアカシアまたはトラガント）を含むロゼンジ；ゼラチン及びグリセリンまたはスクロース及びアカシアなどの不活性基剤中に気体富化流体及び任意の追加の治療薬を含む香錠；ならびに好適な液体担体中に気体富化流体及び任意の追加の治療薬を含む洗口剤またはうがい剤；ならびにクリーム、乳濁液、ゲルなどが挙げられる。
【０１６４】
さらに、直腸投与に好適な製剤は、乳化基剤または水溶性基剤などの様々な基剤と混合することによって坐薬として提示され得る。膣内投与に好適な製剤は、活性成分に加えて、適切であることが当該技術分野において既知であるような担体を含有する、膣坐薬、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、発泡体、またはスプレーフォーミュラとして提示され得る。
【０１６５】
好適な薬学的担体は、当該技術分野で標準的な参考書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている。
【０１６６】
対象、特に動物、具体的にはヒトに投与される用量は、本発明の範囲では、合理的な時間枠にわたって動物における治療反応をもたらすのに十分である必要がある。当業者であれば、薬用量が、動物の状態、動物の体重、ならびに処置されている病状を含む、様々な要因に依存するということを認識するであろう。好適な用量は、対象において所望の反応に影響することが知られる治療組成物の濃度をもたらすものである。
【０１６７】
用量の大きさはまた、投与の経路、タイミング、及び頻度、ならびに治療組成物の投与及び所望の生理作用に付随し得る有害な副作用の存在、性質、及び程度によって決定される。
【０１６８】
（１）共製剤（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）中の化合物の配合によって同時に、または（２）交替によって、すなわち、別々の薬学的製剤で化合物を順次、連続的に、並行して、または同時に送達することによって、配合物の化合物が投与され得ることが理解されるであろう。交替療法（ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）では、第２の活性成分の、そして任意に第３の活性成分の投与の遅れは、活性成分の組み合わせの相乗的な治療効果の利益を失うようなものであってはならない。投与方法（１）または（２）のいずれかによるある特定の実施形態によると、理想的には、配合物は、最も効果のある結果を達成するように投与されるべきである。投与方法（１）または（２）のいずれかによるある特定の実施形態では、理想的には、配合物は、活性成分のそれぞれのピーク血漿濃度を達成するように投与されるべきである。配合共製剤の投与による１日１回１錠の投与計画は、炎症性神経変性疾患を患う一部の患者にとってふさわしい場合がある。ある特定の実施形態によると、配合物の活性成分の有効なピーク血漿濃度は、およそ０．００１〜１００μＭの範囲内となる。最適なピーク血漿濃度は、特定の患者に処方される製剤及び投薬計画によって達成され得る。本発明の流体、ならびに酢酸グラチラマー、インターフェロン−β、ミトキサントロン、及び／もしくはナタリズマブ、またはこれらいずれかの生理的に機能的な誘導体が、同時または連続的に提示されるかを問わず、個別に、倍数単位で、またはこれらの任意の組み合わせで投与され得ることも、理解されるであろう。一般的に、交替療法（２）の間、各化合物の有効な薬用量が順次投与され、共製剤療法（１）では、２つ以上の化合物の有効な薬用量が一緒に投与される。
【０１６９】
本発明の配合物は、簡便に、単一剤形中の薬学的製剤として提示されてよい。簡便な単一の投与製剤は、各１ｍｇ〜１ｇ、例えば１０ｍｇ〜３００ｍｇの任意の量の活性成分を含有するが、これに限定されない。酢酸グラチラマー、インターフェロン−β、ミトキサントロン、及び／またはナタリズマブと組み合わされた本発明の流体の相乗的作用は、例えば１：５０〜５０：１（発明の流体：酢酸グラチラマー、インターフェロン−β、ミトキサントロン、及び／またはナタリズマブ）の広範な比率で実現され得る。一実施形態では、この比は、約１：１０〜１０：１の範囲であり得る。別の実施形態では、共製剤化配合物の剤形（例えば、丸薬、錠剤、カプレット、またはカプセルなど）中の発明の流体と、酢酸グラチラマー、インターフェロン−β、ミトキサントロン、及び／またはナタリズマブとの重量／重量比は、約１、すなわち、発明の流体と酢酸グラチラマー、インターフェロン−β、ミトキサントロン、及び／またはナタリズマブとがおよそ等量となる。他の例示的な共製剤では、より多いかまたはより少ない発明の流体と、酢酸グラチラマー、インターフェロン−β、ミトキサントロン、及び／またはナタリズマブとが存在してよい。一実施形態では、各化合物は、単独で使用されると抗炎症活性を示す量の配合物中に用いられる。他の比率及び量の該配合物の化合物が、本発明の範囲内に企図される。
【０１７０】
単一剤形は、発明の流体と、酢酸グラチラマー、インターフェロン−β、ミトキサントロン、及び／もしくはナタリズマブ、またはこれらいずれかの生理的に機能的な誘導体と、薬学的に許容される担体と、をさらに含み得る。
【０１７１】
治療での使用に必要な本発明の配合物中の活性成分の量が、治療されている病状の性質ならびに患者の年齢及び状態を含む様々な要因によって変動し、最終的には主治医または医療実践者の自由裁量によるものであるということを、当業者であれば理解するであろう。考慮されるべき要因としては、投与の経路及び製剤の性質、動物の体重、年齢、及び全身状態、ならびに治療される疾患の性質及び重症度が挙げられる。
【０１７２】
同時または連続的な投与のための単一剤形中の活性成分のうちのいずれか２つを、第３の活性成分と組み合わせることも可能である。３部配合物は、同時または連続的に投与されてよい。連続的に投与される場合、配合物は、２回または３回の投与で投与されてよい。ある特定の実施形態によると、発明の流体、ならびに酢酸グラチラマー、インターフェロン−β、ミトキサントロン、及び／またはナタリズマブの３部配合物は、いかなる順序で投与されてもよい。
【０１７３】
以下の実施例は単なる例示であり、決して限定的でないことが意図される。
【実施例】
【０１７４】
実施例１
（電気運動的に変化させられた流体溶液は、１００ナノメートル未満の平均直径を有するナノ気泡を含むことが判定された）
気体マイクロ気泡の大きさ制限を判定するために本発明の拡散器を使用して、気体富化流体を用いる実験を実施した。気体富化流体を０．２２及び０．１ミクロンのフィルタに通すことによって、マイクロ気泡の大きさ制限を確立した。これらの試験の実施に当たり、ある体積の流体が本発明の拡散器を通過し、気体富化流体を生成した。６０ミリリットルのこの流体を６０ｍｌのシリンジ内に流した。次に、シリンジ内の流体の溶解酸素レベルをウィンクラー滴定によって測定した。シリンジ内の流体を、０．２２ミクロンのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＰ５０フィルタを通して５０ｍｌのビーカー内に注入した。次に、５０ｍｌのビーカー内の材料の溶解酸素率を測定した。この実験を３回実施して、以下の表３に示される結果を得た。
【表３】
2016532683.tif 000008
【０１７５】
ここから分かるように、シリンジ内で測定された溶解酸素レベル及び５０ｍｌのビーカー内の溶解酸素レベルは、拡散材料を０．２２ミクロンフィルタに通すことによって有意に変化せず、これは流体中に溶解された気体のマイクロ気泡が０．２２ミクロンより大きくないことを暗示する。
【０１７６】
食塩水溶液のバッチを本発明の拡散器で富化し、産出溶液の試料を無濾過状態で採取する、第２の試験を実施した。無濾過試料の溶解酸素レベルは４４．７ｐｐｍであった。０．１ミクロンフィルタを使用して本発明の拡散器からの酸素富化溶液を濾過し、追加の２つの試料を採取した。第１の試料では、溶解酸素レベルは４３．４ｐｐｍであった。第２の試料では、溶解酸素レベルは４１．４ｐｐｍであった。最後に、フィルタを取り外し、最終試料を無濾過溶液から採取した。この場合では、最終試料は４５．４ｐｐｍの溶解酸素レベルを有した。これらの結果は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ０．２２ミクロンフィルタを使用した場合のものと一致していた。したがって、食塩水溶液中の気泡またはマイクロ気泡の過半量は、０．１ミクロン未満の大きさである（すなわち、直径１００ナノメートル未満、つまり、気泡の過半量が１００ナノメートル未満の平均直径を有するナノ気泡である）。
【０１７７】
これらの結果はイオン性水溶液（例えば、水）または食塩水溶液に適用可能であることが見出され、追加の方法（例えば、ＡＦＭ、ナノピペットベースの実験）で確証されている。
【０１７８】
実施例２
（材料及び方法）
試薬：Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地及びＢ２７サプリメントをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。他の細胞培養材料（ハンクス平衡塩類溶液、０．０５％のトリプシン、及び抗真菌性抗生物質）をＭｅｄｉａｔｅｃｈ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）から購入した。５ＸＦＡＤトランスジェニックマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、遺伝子型を同定し、我々の動物管理施設で飼養した。マウス可塑性遺伝子を分析するためのスーパーアレイキットをＳＡｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。使用した一次抗体、それらの供給源、及び濃度を表４に列記する。免疫染色に使用したＡｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ抗体はＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから取得し、免疫ブロッティングに使用したＩＲ染料標識化試薬はＬｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから取得した。
【表４】
2016532683.tif 000009
【０１７９】
動物：Ｂ６ＳＪＬ−Ｔｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ，ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｊトランスジェニック（５ＸＦＡＤ）マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した。雄の５ＸＦＡＤ及び非トランスジェニックマウスを実験に使用した。動物を飼養し、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈの指針に従って実験を行い、Ｒｕｓｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。ＮＲ２Ａ（４２０５番）、ＧｌｕＲ１（８８５０番）、及びＣＲＥＢ（９１９７番）に対する抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから購入し、Ａｒｇ３．１抗体はＡｂｃａｍから購入した（ａｂ２３３８２）。マウス可塑性遺伝子を分析するためのスーパーアレイキットをＳＡｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した（ＰＡＭＭ−１２６Ｚ）。
【０１８０】
ＲＮＳ６０の調製：以前に記載したように（１９、２０）、Ｒｅｖａｌｅｓｉｏ（Ｔａｃｏｍａ，ＷＡ）においてＴａｙｌｏｒ−Ｃｏｕｅｔｔｅ−Ｐｏｉｓｅｕｉｌｌｅ（ＴＣＰ）フローを使用してＲＮＳ６０を生成した。簡潔に言うと、灌注のための塩化ナトリウム（０．９％）、ＵＳＰ  ｐＨ５．６（４．５〜７．０、Ｈｏｓｐｉｒａ）を、３，４５０ｒｐｍの回転子速度を維持しながら、４℃及び１ａｔｍの酸素背圧下で３２ｍＬ／ｓの流速（気体流速７．８ｍＬ／ｓ）で処理した。化学的には、ＲＮＳ６０は、水、塩化ナトリウム、５０〜６０百万分率の酸素を含有するが、追加の活性薬学的成分は含有しない。
【０１８１】
以下のＲＮＳ６０の対照も本研究で使用した：ａ）ＮＳ（同じ製造バッチからの食塩水。この食塩水はＲＮＳ６０と同じ装置表面に接触し、同じ方法で瓶詰めした）、及びｂ）ＰＮＳ６０（同じ装置内部で調製されたがＴＣＰフローで処理されなかった、同じ酸素含量（５５±５ｐｐｍ）を有する食塩水）。注意深い分析は、３つの流体すべてが化学的に同一であることを実証した（１９）。液体クロマトグラフィー四重極型飛行時間型質量分析も、ＲＮＳ６０と他の対照溶液との間の差を示さなかった（１９）。それに対して、原子間力顕微鏡法を使用して、我々は、ＲＮＳ６０及び他の食塩水溶液中のナノ気泡核形成を研究し、ＲＮＳ６０が対照の食塩水溶液のものに対して特有の表面ナノ気泡核形成プロファイルを示すことを観察した（１９）。これと同じ核形成ナノ気泡の数及び大きさの相対的パターンが、同じ対照溶液を含むＡＦＭ表面に陽電位が適用されたときに観察され、ＲＮＳ６０中のナノ気泡の安定化における電荷の関与を示唆している（図１Ａ）。
【０１８２】
マウス海馬ニューロンの単離及び維持：我々が記載したように、妊娠中の雌Ｐｐａｒａ欠損マウス及び同系統の野生型同腹仔マウスの胎仔（Ｅ１８）から、海馬ニューロンを単離した（２１、２２）。簡潔に言うと、氷冷スクロース緩衝液（スクロース０．３２Ｍ、トリス０．０２５Ｍ、ｐＨ７．４）中で解剖及び単離手技を実施した。皮膚及び頭蓋をハサミで脳から慎重に除去し、続いて一対の細いピンセットで髄膜を剥離した。ウィリス動脈輪周囲の中心線に細い切り込みを入れ、内側側頭葉を開いた。内側側頭葉の皮層の縁近くに位置する組織の薄切片として海馬を単離した。全胎仔（ｎ＞１０）から単離した海馬組織を一緒に合わせ、１ｍｌのトリプシンを用いて３７℃で５分間ホモジナイズし、続いてトリプシンを中和した（２１、２２）。ポリ−Ｄ−リジンで予め被覆された７５ｍｍフラスコ内に、海馬組織の単細胞懸濁液をプレーティングした。プレーティングの５分後、上清を慎重に除去し、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌの完全培地と交換した。翌日、１０μＭのＡｒａＣを添加して、ニューロン培養物内のグリアの混入を除去した。処置前の９〜１０日間にわたって海馬ニューロンの純培養物を完全に分化させた（図１Ｂ）。
【０１８３】
突起棘の密度及び大きさの測定：突起棘密度の計数のため、ＭＡＰ２と一緒にＡｌｅｘａ−６４７共役ファロイジン（カタログ番号Ａ２２２８７）でＥ１８海馬ニューロンを染色した。密に染色されたニューロンのみを計数のために選択した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ−５１蛍光顕微鏡を使用して４００倍の倍率で各細胞を拡大し、樹状突起の全長を測定した。全樹状突起上の突起棘の数は、油浸下で計数した。突起棘のうちのいくつかは樹状突起の下に隠れていたため、樹状突起の軸から透明なニューロピルの周辺領域まで側方に突出した突起棘のみを計数のために選択した。ニューロン上の突起棘の総数をその樹状突起の全長で除すことによって錐体ニューロンの突起棘密度を算出し、１０μＭの樹状突起当たりの突起棘の数として表した。突起棘の頭部の平均蛍光強度（ＭＦＩ）と樹状突起軸のＭＦＩとの比を算出することによって、樹状突起棘の大きさを測定した。
【０１８４】
軸索長及び側枝の数の測定：ＩＮＫＳＣＡＰＥ（商標）ソフトウェアトレーシングツールにおけるＭＡＰ−２染色ニューロンのトレーシングによって、主軸索の長さ及び軸索の側枝の数を測定した。同じ色強度下で全画像を基準化した。側枝の数の算出のために、画像を１００倍の倍率で拡大し、次に長さ１００μＭの軸索それぞれについて側枝の数を測定した。
【０１８５】
一次マウス海馬ニューロンにおけるカルシウム流入アッセイ：培養海馬ニューロンをＦｌｕｏ４−蛍光共役カルシウム緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｆ１０４７１、Ｆ１０４７２、Ｆ１０４７３）で満たし、製造者のプロトコルに従って３７℃で６０分間インキュベートした。その後、蛍光励起及び発光スペクトルを、５０μＭのＮＭＤＡ及び５０μＭのＡＭＰＡ溶液の存在下で、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｖｉｃｔｒｏｒ  Ｘ２ルミネセンス分光計に記録した。０．１ミリ秒間隔で３００回の反復を用いて記録を実施した。
【０１８６】
マウス海馬切片におけるカルシウム流入アッセイ：雄のＣ５７ＢＬ／６動物（ｎ＝５）を麻酔し、氷冷無菌ＰＢＳで急速に灌流し、断頭し、最後に頭蓋から全脳を慎重に取り出した。ＴＰＩ  ＰＥＬＣＯ  １０１ビブラトームシリーズ１０００半自動式組織薄片化システムで、１００ミクロンの厚さの海馬の背腹側切片を作製した。ビブラトーム機の切片チャンバに切断溶液（５００ｍＬの蒸留水中スクロース２４．５６ｇ、デキストロース０．９００８ｇ、アスコベート０．０８８１ｇ、ピルビン酸ナトリウム０．１６５０ｇ、及びミオイノシトール０．２７０３ｇ）を充填し、５％のＣＯ２と９５％のＯ２との気体混合物を連続的に通気した。切片化期間中、チャンバ全体を氷冷に保った。次に、Ｆｌｕｏ−４染料を含有する反応緩衝液に切片を慎重に移動させた。脳切片を作製する前に、１瓶のＦｌｕｏ−４染料（カタログ番号Ｆ１０４７１）に添加した１０ｍＬの人工ＣＳＦ（１１９ｍＭのＮａＣｌ、２６．２ｍＭのＮａＨＣＯ３、２．５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１．３ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのグルコース、５％のＣＯ２及び９５％のＯ２を通気、続いて２．５ｍＭのＣａＣｌ２を添加）、及び２５０ｍＭのプロベネシドを使用して、反応緩衝液を作成した。切片を移動させる前に、平底９６ウェルプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ、カタログ番号３２３５１９）をウェル１つ当たり５０μＬの反応緩衝液で満たし、アルミニウム箔で覆い、暗所に置いた。個別の切片それぞれを、反応緩衝液で満たされた各ウェルに入れた。切片を移動させた後、プレート全体をアルミニウム箔で再度包み、３７℃のインキュベーターに２０分間置き、続いて上述のようにＶｉｃｔｏｒ  Ｘ２計器でカルシウムアッセイを行った。
【０１８７】
免疫蛍光分析：前述のように免疫蛍光分析を実施した（２３、２４）。簡潔に言うと、８ウェルチャンバスライド（Ｌａｂ−Ｔｅｋ  ＩＩ）内で培養した細胞を４％のパラホルムアルデヒドで２０分間固定し、続いて冷エタノール（−２０℃）で５分間処置し、ＰＢＳ中で２回すすいだ。試料をＰＢＳＴ中３％のＢＳＡで３０分間ブロッキングし、１％のＢＳＡ、ならびにウサギ抗ＮＲ２Ａ（１：１００）、抗ＧｌｕＲ１（１：１００）、抗ＰＳＤ９５（１：１００）、及び抗ＣＲＥＢ（１：１００）を含有するＰＢＳＴ中でインキュベートした。ＰＢＳＴ中の３回の洗浄（各回１５分）後、ｃｙ２共役及びｃｙ５共役二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）とともにスライドをさらにインキュベートした。陰性対照では、一次抗体を用いない同様の条件下で一式の培養スライドをインキュベートした。試料をＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８１蛍光顕微鏡下に乗せ、観察した。組織染色のために、４％のパラホルムアルデヒド中に保持された脳を、クライオスタット機において３０μｍの厚さで薄片化し、続いて前述のように免疫染色を行った（２５）。
【０１８８】
細胞膜抽出：ニューロン膜を単離して、様々な膜結合タンパク質の膜への動員を判定した。細胞をＰＢＳで洗浄し、フェノールレッドフリーＨＢＳＳ中で５ｍＬの超遠心分離管に掻き入れた。次にこの溶液を１００ｍＭの炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１．５）で希釈し、超遠心分離機内で４℃で１時間にわたり４０，０００ｒｐｍで回転させた。得られた上清を吸引し、二重蒸留したＨ２Ｏ及びＳＤＳ中にペレットを浸漬し、−８０℃で一晩保管した。翌日、繰り返しの研磨及び煮沸によってペレットを再懸濁した。
【０１８９】
免疫ブロット分析：前述のように免疫ブロット分析を実施した（２６）。簡潔に言うと、ニューロン細胞ホモジネートを電気泳動させ、タンパク質をニトロセルロース膜上に移動させ、一次抗体、続いて赤外フルオロフォアタグ付き二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）での免疫標識化の後にＯｄｙｓｓｅｙ赤外線スキャナでタンパク質帯を視覚化した。
【０１９０】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ：製造者のプロトコルに従ってウルトラスペックＩＩ  ＲＮＡ試薬（Ｂｉｏｔｅｃｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用してマウス一次海馬ニューロンから全ＲＮＡを単離した。混入するいかなるゲノムＤＮＡをも除去するために、全ＲＮＡをＤＮアーゼで消化した。ＣｌｏｎｔｅｃｈによるＲＴ−ＰＣＲキットを使用して、前述のように半定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した（２７）。簡潔に言うと、２０μｌの反応混合物中で、プライマーとしてのオリゴ（ｄＴ）１２−１８及びＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、１μｇの全ＲＮＡを逆転写した。得られたｃＤＮＡを適切に希釈し、希釈されたｃＤＮＡを以下のプライマーを使用して増幅した：
ｎｒ−２ａ（マウス）：センス：５’−ＧＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＴＧＧＡＴＴ−３’（配列番号：１）、
アンチセンス：５’−ＧＧＣＣＣＧＧＣＴＴＧＡＧＧＴ  ＴＴＣＡＧＡＡＡＴ  Ｇ−３’（配列番号：２）、
ｇｌｕｒ１（マウス）：センス：５’−ＡＡＴＧＧＴＧＧＴＡＣＧＡＣＡＡＧＧＧＣ−３’（配列番号：３）、及び
アンチセンス：５’−ＧＧＡＴＴＧＣＡＴＧＧＡＣＴＴＧＧＧＧＡ−３’（配列番号：４）。
増幅された生成物を１．８％のアガロースゲル上で電気泳動させ、臭化エチジウム染色によって視覚化した。
【０１９１】
実時間ＰＣＲ分析：前述のように、プライマー及びＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓによるＦＡＭ標識化プローブを使用するＡＢＩ−Ｐｒｉｓｍ７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した（２５、２６）。それぞれの遺伝子のｍＲＮＡ発現を、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのレベルに正規化した。データをＡＢＩ配列検出システム１．６ソフトウェアによって処理し、分散分析によって分析した。
【０１９２】
可塑性関連遺伝子のＰＣＲスーパーアレイ分析：マウスシナプス可塑性ＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標）ＰＣＲアレイ（ＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＰＡＭＭ−１２６Ｚ）は、学習及び記憶中のシナプス変性の中核をなす８４個の鍵遺伝子の発現をプロファイリングする。簡潔に言うと、以前に記載されたように、マウス海馬ニューロンを１０％（ｖ／ｖ）のＲＮＳ６０及びＮＳで２４時間処置し、続いて、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡ単離キットを使用する全ＲＮＳの単離、及びｃＤＮＡの合成を行った（２５、２６）。次に、ｃＤＮＡ試料を１００倍に希釈し、次に２μｌの希釈されたｃＣＮＡを９６ウェルアレイプレートの各ウェルに加え、続いてＡＢＩ−Ｐｒｉｓｍ７７００（商標）配列検出システム内のＳＹＢＲグリーン技術を使用してｃＤＮＡを増幅した。得られたＣｔ値をハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨで正規化し、次にヒートマップエクスプローラソフトウェアでプロットした。
【０１９３】
実施例３
（ＲＮＳ６０は、ＮＭＤＡまたはＡＭＰＡの存在下で培養海馬ニューロン内の内向きカルシウム電流を刺激したが、ＮＳまたはＰＮＳ６０のいずれもそれを刺激しなかった）
ＮＭＤＡ及びＡＭＰＡ受容体を介して流入するカルシウム電流は、海馬ニューロンの可塑性に関連することが当該技術分野において示されている。本実施例では、培養マウス海馬ニューロン内のカルシウム流入に対する、出願者の電気運動的に変化させられた流体（例えば、ＲＮＳ６０）の作用を判定した。
【０１９４】
イオンチャネル型グルタミン酸受容体の活性化は非常に急速かつ一過性の過程であるため、短期間のＲＮＳ６０インキュベーション中のカルシウム流入をまず測定した。興味深いことに、すべての事例でＲＮＳ６０はイオンチャネル型グルタミン酸受容体の興奮性が変更されなかったことを示す高振幅の振動を示したにもかかわらず、ＲＮＳ６０を用いたインキュベーションの５分後、１５分後、及び３０分後、ＮＭＤＡ依存性（図１Ｃ）またはＡＭＰＡ依存性（図１Ｄ）のカルシウム流入のいずれにおいても、強力な誘導は観察されなかった。
【０１９５】
次に、ＮＭＤＡ及びＡＭＰＡ依存性カルシウム流入に対するＲＮＳ６０の作用を、インキュベーションの２４時間後の培養海馬ニューロン内で調査した。興味深いことに、ＲＮＳ６０は、ＮＭＤＡ（図１Ｅ）またはＡＭＰＡ（図１Ｆ）の存在下でカルシウム流入を有意に刺激したが、ＮＳまたはＰＮＳ６０のいずれもそれを刺激しなかった。さらに、ＲＮＳ６０を用いた海馬ニューロンの長期のインキュベーションは、ＮＭＤＡ（図１Ｇ）またはＡＭＰＡ（図１Ｈ）の存在下での高周波カルシウム流入をもたらし、これは特定の態様では、ＮＳではなくＲＮＳ６０が、最終的には海馬ニューロン内のＬＴＰの形成をもたらす（２０）シナプス後膜脱分極を誘導する非常に強力な薬剤であることを示す。
【０１９６】
具体的には、図１Ａ〜１Ｈは、培養マウス海馬ニューロン内のＮＭＤＡ及びＡＭＰＡ依存性カルシウム流入に対するＲＮＳ６０、ＰＮＳ６０、及びＮＳの作用を示す。
【０１９７】
血清を含まない条件下で５分間、１５分間、及び３０分間、１０％（ｖ／ｖ）のＲＮＳ６０でマウス海馬ニューロンを処置し、続いて、材料方法の項に記載したように５０μＭのＮＭＤＡ及びＡＭＰＡで処置した。培養海馬ニューロン内で９０秒間にわたり３００回の反復について監視された（Ａ）ＮＭＤＡ依存性及び（Ｂ）ＡＭＰＡ依存性のカルシウム流入の正規化された蛍光値。次に、ＲＮＳ６０、ＮＳ、及びＰＮＳ６０処置の２４時間後の一次ニューロン内のＮＭＤＡ依存性（Ｃ）及びＡＭＰＡ依存性（Ｄ）のカルシウム流入を分析した。その結果は３つの独立した実験の平均である。ＲＮＳ６０及びＮＳ処置された一次ニューロン培養液中の（Ｅ）ＮＭＤＡ駆動性及び（Ｆ）ＡＭＰＡ駆動性のカルシウム電流のオシログラム。結果は３つの独立した実験の平均±ＳＤである。
【０１９８】
実施例４
（ＲＮＳ６０は、海馬ニューロン内の可塑性関連分子の発現に対する作用を有することが示された）
ＲＮＳ６０が短期インキュベーション後のニューロン内でイオンチャネル型カルシウムチャネルの活性化を誘導できなかったため、これはＮＭＤＡ及びＡＭＰＡ受容体サブユニットの一過性のリン酸化に関与しないと想定される。それに対して、インキュベーションの２４時間後、ＲＮＳ６０は、ＮＭＤＡ及びＡＭＰＡ依存性カルシウム流入を誘導した。したがって、培養海馬ニューロン内の可塑性関連遺伝子の発現に対するＲＮＳ６０の作用を調査した。時間依存性ｍＲＮＡ分析は、ＲＮＳ６０が、インキュベーションの２時間以内にＮＲ２Ａ及びＧｌｕＲ１を増加させることができたことを示す（図２Ａ〜Ｂ）。しかしながら、ＮＲ２Ａ及びＧｌｕＲ１両方の上方制御のレベルが、研究の期間（２４時間）までに経時的に上昇した（図２Ａ〜Ｂ）。これらのｍＲＮＡ発現研究は、海馬ニューロン内のＮＲ２Ａ、ＧｌｕＲ１、ＰＳＤ９５、及びＣＲＥＢのタンパク質発現分析でさらに裏付けられた。
【０１９９】
具体的には、図２Ａ〜２Ｋは、マウス海馬ニューロン内の可塑性関連タンパク質の発現におけるＲＮＳ６０の作用を示す。ＮＲ２Ａ及びＧｌｕＲ１遺伝子の（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲならびに（Ｂ）実時間ＰＣＲ分析を、マウス一次海馬ニューロン内で、ＲＮＳ６０（１０％：ｖ／ｖ）処置の０時間、２時間、６時間、１２時間、及び２４時間時点で実施した。（Ｃ）材料及び方法の項に記載したＲＮＳ６０及びＮＳ処置の２４時間後のマウス海馬ニューロン内のＰＳＤ９５の免疫蛍光分析。右パネルは、点線のボックス内に示される左パネル写真の拡大図である。（Ｄ）ＲＮＳ６０及びＮＳで２４時間処置されたマウス一次ニューロン内のＧｌｕＲ１（赤）及びβチューブリン（緑）の二重免疫蛍光分析。（Ｅ）ＧｌｕＲ１免疫反応性の突起棘の数を、対照、ＮＳ処置、及びＲＮＳ６０処置の海馬ニューロンの５０ミクロン長の神経炎において計数し、次に対照と比較したパーセント基準でプロットした。結果は３つの独立した結果の平均±ＳＤである。＃ｐ＜０．０１対対照。（Ｆ）ＲＮＳ６０及びＮＳで２４時間処置されたマウス海馬ニューロン内のＮＲ２Ａ（赤）及びβチューブリン（緑）の二重標識化。（Ｇ）ＮＲ２Ａ免疫反応性の突起棘の数を、対照、ＮＳ処置、及びＲＮＳ６０処置のニューロンにおける対象に対するパーセントとしてプロットした。結果は３つの独立した結果の平均±ＳＤであり、＃＃ｐ＜０．００１対対照である。マウス一次ニューロンをＲＮＳ６０及びＮＳで２４時間処置し、続いてＮＲ２Ａ及びＧｌｕＲ１（Ｈ）；ＣＲＥＢ及びＰＳＤ−９５（Ｉ）の免疫ブロット分析を行った。（Ｊ及びＫ）代表的なヒストグラムは、それぞれの免疫ブロット分析の相対的濃度測定プロットである。ａｐ＜０．０１対対照ＮＲ２Ａ、ｂｐ＜０．００１対対照ＧｌｕＲ１、ｃｐ＜０．０１対対照ＣＲＥＢ、及びｄｐ＜０．０１対対照ＰＳＤ９５。結果は３つの独立した実験の平均±ＳＤである。
【０２００】
まず、ＰＳＤ９５（図３Ｃ）、ＧｌｕＲ１（図３Ｄ〜Ｅ）、及びＮＲ２Ａ（図３Ｆ〜Ｇ）の免疫蛍光分析を実施した。ＲＮＳ６０は、海馬ニューロンの投射においてＰＳＤ９５、ＮＲ２Ａ、及びＧｌｕＲ１のタンパク質発現を強力に上方制御した（図３Ｃ〜Ｇ）。ＣＲＥＢ及びＰＳＤ９５（図３Ｊ〜Ｋ）と合わせたＮＲ２Ａ及びＧｌｕＲ１（図３Ｈ〜Ｉ）の免疫ブロット分析は、ＲＮＳ６０が海馬ニューロン内の可塑性関連タンパク質の発現を有意に刺激したことをさらに確証した。ＮＳはこれらの可塑性関連タンパク質の発現に対する効果を有しなかったため、これらの結果は特異的であった。
【０２０１】
可塑性は複数のタンパク質によって制御される。したがって、ＲＮＳ６０がＮＲ２Ａ及びＧｌｕＲ１のみを制御したか、または他の可塑性関連海馬分子もＲＮＳ６０によって制御されるかという疑問を調査した。ＲＮＳ６０処置及びＮＳ処置の両方の培養海馬ニューロン内で可塑性関連遺伝子のｍＲＮＡベースのスーパーアレイ分析を実施し、結果をヒートマップ表現で要約した（図３Ａ〜Ｂ）。際立って、ＮＳ処置と比較して、ＲＮＳ６０処置された海馬ニューロンにおいて、分析された遺伝子８４個中６２個が上方制御され、９個の遺伝子が下方制御され、１３個の遺伝子が未変性のままであった（図３Ｃ）。上方制御が観察された遺伝子には、ａｒｃ、ｚｉｆ−２６８、及びｃ−ｆｏｓを含むＩＥＧ；ｓｙｎｐｏ、ａｄａｍ−１０、及びｐｓｄ−９５を含むシナプス関連遺伝子；ならびに、最も興味深いことに、ｎｒ１、ｎｒ２ａ、ｎｒ２ｂ、及びｎｒ２ｃを含むＮＭＤＡ受容体サブユニットをコード化する遺伝子；ＡＭＰＡ受容体サブユニットｇｌｕｒ１の遺伝子；ならびに、ｂｄｎｆ、ｎｔ３、ｎｔ５、及びｎｔｒｋ２を含む神経栄養因子及びそれらの受容体のための遺伝子があった。さらに、ＣＲＥＢは様々な可塑性関連分子の転写を制御するため、可塑性に重要な分子である（２９、３０）。ＲＮＳ６０が、ＣＲＥＢならびにＣＲＥＢの活性化に関与する異なるシグナル伝達分子を上方制御することは興味深い。例えば、アデニル酸シクラーゼ経路は、ｃＡＭＰ−タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）経路を介してＣＲＥＢを活性化させることが知られている（３１）。ＲＮＳ６０処置は、ＮＳ処置と比較して、マウス海馬ニューロン内で異なるアデニル酸シクラーゼをコード化する遺伝子（ａｄｃｙ１及びａｄｃｙ８）の発現を増加させる（図３Ａ〜Ｂ）。ＣＲＥＢもＣａ２＋／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ（ＣＡＭキナーゼＩＩ）及びＡｋｔによって活性化される（３１、３２）。したがって、ＲＮＳ６０もｃａｍｋ２ａ及びａｋｔ１の発現を上方制御した（図３Ａ〜Ｂ）。可塑性関連分子の上方制御とは対照的に、ＲＮＳ６０処置は、長期抑圧を支持することが知られる遺伝子によってコード化されるタンパク質であるＧｒｉａ２、Ｐｐｐ１ｃａ、Ｐｐｐ２ｃａ、及びＰｐｐ３ｃａの発現を下方制御した（図３Ａ〜Ｃ）。
【０２０２】
アレイベースのｍＲＮＡ結果のいくつかを検証するため、一覧表から無作為に選択した８個の遺伝子の定量的実時間ＰＣＲ分析を実施し、ＲＮＳ６０が実際に、ｎｒ２ａ（図３Ｄｉ）、ｎｒ２ｂ（図３Ｄｉｉ）、ｇｌｕｒ１（図３Ｄｉｉｉ）、ａｒｃ（図３Ｄｉｖ）、ｈｏｍｅｒ−１（図３Ｄｖ）、ｃｒｅｂ（図３Ｄｖｉ）、ｂｄｎｆ（図３Ｄｖｉｉ）、及びｚｉｆ−２６８（図３Ｄｖｉｉｉ）のｍＲＮＡ発現を、無処置ニューロンと比較して海馬ニューロン内で数倍上方制御したことを確証した。ＮＳ処置はこれらの遺伝子の発現を上方制御しなかったため、これらの結果はＲＮＳ６０特異性であった（図３Ｄ）。
【０２０３】
具体的には、図３Ａ〜３Ｄｖｉｉｉは、培養マウス海馬ニューロン内の可塑性関連遺伝子の発現に対するＲＮＳ６０の作用を示す。マウス一次ニューロンを１０％のＲＮＳ６０及びＮＳで２４時間処置し、続いてｍＲＮＡベースのスーパーアレイ技術によって全ｍＲＮＡからの可塑性関連遺伝子の発現の分析を行った。（Ａ）ｍＲＮＡベースアッセイから導かれた８４個の可塑性関連遺伝子のヒートマップ発現プロファイル。赤は発現の最小レベルを表し、青は最大レベルを表す。（Ｂ）ヒートマップに示される代表的な遺伝子すべての発現のヒストグラム概要。（Ｃ）ベン図は、ＲＮＳ処置水中で上方制御された遺伝子、下方制御された遺伝子、及び未変性の遺伝子の一覧表を要約する。（Ｄ）同様の条件下のＲＮＳ及びＮＳ処置マウス海馬ニューロン内のＮＲ２Ａ（ｉ）、ＮＲ２Ｂ（ｉｉ）、ＧｌｕＲ１（ｉｉｉ）、Ａｒｃ（ｉｖ）、Ｈｏｍｅｒ１（ｖ）、ＣＲＥＢ（ｖｉ）、ＢＤＮＦ（ｖｉｉ）、及びＺｉｆ−２６８（ｖｉｉｉ）を含む無作為に選択された８個の異なる遺伝子の実時間ｍＲＮＡ分析。結果は３つの独立した実験の平均±ＳＤである。ａｐ＜０．００１対対照。
【０２０４】
したがって本発明の特定の態様によると、これらの結果は、まとめると、ＲＮＳ６０が海馬ニューロン培養物内の可塑性関連タンパク質の発現を刺激するということを示し、確証する。
【０２０５】
実施例５
（ＲＮＳ６０は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）によって、一次マウス海馬ニューロン内の可塑性関連分子を上方制御し、カルシウム流入を刺激した）
本実施例では、ＲＮＳ６０が培養海馬ニューロン内の可塑性を上昇させる機構を調査した。
【０２０６】
出願者は、ＲＮＳ６０がミクログリア細胞内でＰＩ３Ｋを活性化させることを観察した（１９）。ＰＩ３Ｋは多様な群の細胞機能に関係するため、本実施例では、ＰＩ３Ｋが海馬ニューロン内の可塑性のＲＮＳ６０介在性刺激に関与したかという疑問を調査した。まず、海馬ニューロン内のＰＩ３Ｋ活性化に対するＲＮＳ６０の作用を試験した。受容体チロシンキナーゼによって制御されるクラスＩＡのＰＩ３Ｋは、制御性８５−ｋＤａサブユニットと触媒的１１０−ｋＤａサブユニットのヘテロダイマー（ｐ８５：ｐ１１０α／β／δ）からなる。それに対してクラスＩＢのＰＩ３Ｋは、１０１−ｋＤａ制御性サブユニットとｐ１１０γ触媒的サブユニットのダイマー（ｐ１０１／ｐ１１０γ）からなる。静止状態では、ＰＩ３Ｋのサブユニットは主に細胞質中に位置し、活性化すると、これらは形質膜に転位置する（３３、３４）。したがって、形質膜へのｐ１１０α、ｐ１１０β、及びｐ１１０γの動員によるクラスＩＡ及びＩＢのＰＩ３Ｋの活性化を調査した。
【０２０７】
結果。ｐ１１０サブユニットに関する膜断片のウェスタンブロッティングは、ＲＮＳ６０が、ｐ１１０γではなくｐ１１０α及びｐ１１０βの形質膜への動員を特異的に誘導することを示唆する（図４Ａ）。ＲＮＳ６０刺激の異なる時間点におけるｐ１１０α及びｐ１１０βの濃度測定分析は、１０分及び１５分におけるＰＩ３Ｋの有意な活性化を示す（図４Ｂ）。それに対して、ＲＮＳ６０刺激の５分時点でｐ１１０α及びｐ１１０β  ＰＩ３Ｋの活性化は観察されなかった（図４Ａ〜Ｂ）。ここでも、ＮＳはＲＮＳ６０刺激の１０分または１５分のいずれの時点でもｐ１１０α及びｐ１１０β  ＰＩ３Ｋを活性化することができないままであったため、これらの結果は特異的であった。合わせて、これらの結果は、ＲＮＳ６０が、海馬ニューロン内でＩＢ型ＰＩ３Ｋ  ｐ１１０γではなくＩＡ型ＰＩ３Ｋ  ｐ１１０α及びｐ１１０βを活性化させることを示唆する。
【０２０８】
次に、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路の調節がＲＮＳ６０誘導性の神経可塑性に関与するかを理解するために、一次マウス海馬ニューロンを２μＭのＰＩ３Ｋ阻害剤（ＬＹ２９４００２）で１５分間前処置し、続いて１０％のＲＮＳ６０またはＮＳで刺激した。刺激の３時間後、ＮＲ２Ａ及びＧｌｕＲ１のｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲ及び実時間ＰＣＲによって監視した。この事例においても、ＲＮＳ６０処置はＮＲ２Ａ及びＧｌｕＲ１の発現を増加させた（図４Ｃ〜Ｄ）。しかしながら、ＬＹ２９４００２は、海馬ニューロン内のＮＲ２Ａ及びＧｌｕＲ１発現のＲＮＳ６０介在性増加を抑止した（図４Ｃ〜Ｄ）。
【０２０９】
具体的には、図４Ａ〜４Ｄは、マウス海馬ニューロン内の可塑性関連遺伝子のＲＮＳ６０介在性上方制御におけるＰＩ３Ｋ経路の役割を示す。（Ａ）血清を含まない条件下で５分間、１０分間、１５分間、及び３０分間、ＲＮＳ６０及びＮＳでマウス海馬ニューロンを刺激し、続いて、膜断片内のｐ１１０α、β、及びγの免疫ブロット分析を行った。（Ｂ）同じ処置条件でのｐ１１０α及びβの免疫ブロットの相対的濃度測定分析。結果は３つの独立した実験の平均±ＳＤである。ａｐ＜０．００１対対照−ｐ１１０、ｂｐ＜０．００１対対照−ｐ１１０。２μＭのＬＹ２９４００２で１５分間前処置された細胞を、１０％のＲＮＳ６０で刺激した。刺激の３時間後、ＮＲ２Ａ及びＧｌｕＲ１のｍＲＮＡ発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｃ）及び実時間ＰＣＲ（Ｄ）によって分析した。結果は３つの独立した実験の平均±ＳＤである。ａｐ＜０．００１対対照、ｂｐ＜０．００１対ＲＮＳ６０。
【０２１０】
しかしながら、ＬＹ２９４０２は、クラス１Ａ及び１Ｂ両方のＰＩ３Ｋの活性化を阻害する。したがって、我々の次の狙いは、海馬ニューロン内のＮＲ２Ａ及びＧｌｕＲ１のＲＮＳ６０介在性上方制御に関与したＰＩ３Ｋの特異的クラスを同定することであった。我々は、３つの異なるＰＩ３Ｋ阻害剤：ＧＤＣ−０９４１（ｐ１１０αの阻害剤）、ＴＧＸ−２２１（ｐ１１０βの阻害剤）、及びＡＳ−６０５２４０（ｐ１１０γの阻害剤）を使用した。興味深いことに、α及びβの前処置は、培養海馬ニューロン内のＮＲ２Ａ及びＧｌｕＲ１のＲＮＳ６０刺激性発現を抑制し、これは、クラス１Ｂではなくクラス１ＡのＰＩ３Ｋが、ＲＮＳ６０刺激ニューロン内の可塑性関連遺伝子の上方制御に関与することを示す。
【０２１１】
ＮＲ２Ａ及びＧｌｕＲ１の発現の低減はニューロンの突起棘密度及び軸索の成熟の低下に関係するため、培養海馬ニューロン内の突起棘密度及び軸索の形態のＲＮＳ６０介在性増加におけるＰＩ３Ｋ経路の役割を研究した。出願者は、ＲＮＳ６０処置前の２μＭのＬＹ２９４０２を用いた１５分の前処置が、ＮＳ処置ではなくＲＮＳ６０処置された海馬ニューロン内の突起棘密度を有意に減少させたことを観察した（図９Ａ）。突起密度を計数することによって、この作用をさらに数量化した（図９Ｃ）。次に、ＲＮＳ６０処置ニューロン内の軸索長及び側枝の数に対するＬＹ２９４０２の作用を調査した。興味深いことに、ＬＹ２９４０２は、ＲＮＳ６０処置ニューロン内の主軸索の長さ及び側枝の数を有意に減衰させ（図９Ｂｉ〜ｉｉｉ）、これを図９Ｄ〜Ｅに示されるようにさらに数量化した。
【０２１２】
具体的には、図９Ａ、９Ｂ（ｉ）〜９Ｂ（ｉｉｉ）、及び９Ｃ〜９Ｅは、ＰＩ３Ｋの活性化が、ＲＮＳ６０処置マウス海馬ニューロン内の形態的可塑性を制御することを示す。（Ａ）ＬＹ２９４００２前処置マウス海馬ニューロンをＲＮＳ６０及びＮＳで４８時間刺激し、続いてＭＡＰ２（緑）及びファロイジン（赤）を用いた二重免疫染色を行い、突起棘密度を示した。（Ｂ）ＲＮＳ及びＮＳを用いた処置の４８時間後、Ｉｎｋｓｃａｐｅソフトウェアによってニューロンをトレースした。（Ｃ）突起棘密度、軸索長、及び樹状分枝を、各処置群の１０個の異なるニューロンから測定した。＊ｐ＜０．０５対対照、及び＊＊ｐ＜０．０１（ＲＮＳ６０処置ニューロンの突起棘密度に対して）。
【０２１３】
長期増強の誘導をもたらす重大事象は、シナプス後突起棘へのカルシウムイオンの流入であるように思われる。したがって、ＲＮＳ６０誘導性カルシウム流入に対するＬＹ２９４００２の作用を次に調査した。上に示したように、ＲＮＳ６０処置は、ＮＭＤＡ（図５Ａ〜Ｂ）またはＡＭＰＡ（図５Ｃ〜Ｄ）のいずれかの存在下でカルシウム流入を刺激した。しかしながら、ＬＹ２９４００２は、ＮＭＤＡ誘導性（図５Ａ〜Ｂ）及びＡＭＰＡ誘導性（図５Ｃ〜Ｄ）のカルシウム流入に対するＲＮＳ６０の刺激作用を弱めた。
【０２１４】
具体的には、図５Ａ〜５Ｄは、ＰＩ３Ｋの活性化が、ＲＮＳ６０処置マウス海馬ニューロン内のＮＭＤＡ感受性及びＡＭＰＡ感受性の両方のカルシウム流入を制御することを示す。２μＭのＬＹ２９４００２で１５分間前処置したマウス海馬ニューロンを、血清を含まない条件下で２４時間、１０％（ｖ／ｖ）のＲＮＳ６０とともにインキュベートし、続いて５０μＭのＮＭＤＡ（Ａ）及びＡＭＰＡ（Ｂ）の存在下のカルシウム流入を測定した。代表的な画像は、対照、ＲＮＳ６０処置、（ＲＮＳ６０＋ＬＹ）処置、及びＬＹ処置された一次海馬ニューロン内のカルシウム流入の、（Ｃ）ＮＭＤＡ介在性及び（Ｄ）ＡＭＰＡ介在性のオシログラムである。結果は３つの独立した実験の平均である。
【０２１５】
したがって本発明の特定の態様によると、これらの結果は、まとめると、ＲＮＳ６０がＰＩ３Ｋ経路の活性化によって海馬ニューロン内の可塑性を刺激するということを示し、確証する。
【０２１６】
実施例６
（ＲＮＳ６０処置は、５ＸＦＡＤトランスジェニックマウスの海馬内でインビボの可塑性関連タンパク質の発現を増加させた）
本実施例では、ＡＤの加速モデルである５ＸＦＡＤマウスにおける、これらの海馬タンパク質の発現に対するＲＮＳ６０処置の作用を調査した。
【０２１７】
海馬ニューロン内のＮＭＤＡ及びＡＭＰＡ受容体タンパク質の強力な下方制御、ならびにカルシウム興奮性の損失は、多くの場合、ＡＤ脳で観察される。特定の態様に従って、出願者は、これらの細胞的事象の逆転が、海馬の可塑性ならびに海馬依存性学習及び記憶との関連を有し得ると考えた。したがって、ＡＤの加速モデルである５ＸＦＡＤマウスにおける、これらの海馬タンパク質の発現に対するＲＮＳ６０処置の作用を調査した。
【０２１８】
５ＸＦＡＤトランスジェニックマウス（ＴＲ）及び同齢の非トランスジェニックマウス（ＮＴＲ）、ならびにＲＮＳ６０（ＴＲ＋ＲＮＳ６０）またはＮＳ（ＴＲ＋ＮＳ）で処置されたトランスジェニック動物における、異なる海馬タンパク質の免疫ブロット分析をまず実施した。免疫ブロット分析は、ＮＴＲマウスと比較してＴＲマウスの海馬内で、ＮＲ２Ａ及びＧｌｕＲ１（図６Ａ〜Ｂ）を含むイオンチャネル型グルタミン酸受容体サブユニット、ならびにＰＳＤ−９５及びＣＲＥＢ（図６Ｃ〜Ｄ）を含む他の可塑性関連タンパク質の強力な下方制御を明らかにした。この欠陥はＲＮＳ６０を用いた処置によってほぼ完全に修復されたが、ＮＳは無効性のままであった。一貫して、免疫蛍光分析は、ＲＮＳ６０処置がＴＲ動物の海馬内のＰＳＤ９５（図６Ｅ）及びＮＲ２Ａ（図６Ｆｉ〜ｉｖ）の発現を有意に上方制御したことを示した。なお、ＲＮＳ６０処置ＴＲマウスの代表的な３Ｄ強度プロットにおけるシグナルホットスポットの数は、ＮＴＲマウスのものと同様であった（図６Ｇｉ〜ｉｖ）。
【０２１９】
培養ニューロンと同様である場合、成体マウスの海馬切片内のカルシウム流入が記録され得るかという疑問。ＮＴＲマウスと比較したときのＴＲマウスの海馬内の可塑性関連分子の発現の減少と一致して、ＡＭＰＡ依存性（図６Ｈ）及びＮＭＤＡ依存性（図６Ｉ）のカルシウム流入は、ＮＴＲマウスと比較してＴＲマウスの海馬切片内でより少なかった。しかしながら、ＡＭＰＡ依存性及びＮＭＤＡ依存性のカルシウム流入は、ＲＮＳ６０処置後のＴＲマウスの海馬切片内で増加した（図６Ｈ〜Ｉ）。興味深いことに、（ＴＲ＋ＲＮＳ）群の海馬切片内のカルシウム流入のレベルは、ＮＴＲ群の海馬切片内で観察されたものと非常に類似していた。図６Ｊから明らかなように、ＲＮＳ６０処置は、無処置ＮＴＲマウスと同様のレベルまで、ＴＲマウスの海馬内の振動性の振幅を誘発した。
【０２２０】
具体的には、図６Ａ〜５Ｊは、５ＸＦＡＤトランスジェニック動物の海馬におけるインビボの可塑性関連分子の発現に対するＲＮＳ６０の作用を示す。５月齢のトランスジェニックマウス（１群当たりｎ＝５）に、６０日間にわたってＲＮＳ６０及びＮＳ（３００μＬ／マウス／２日）を腹腔内注入した。その後、動物を屠殺し、その海馬を異なる可塑性関連タンパク質の発現について分析した。ＮＴＲ（非トランスジェニック）、ＴＲ（トランスジェニック）、ＴＲ＋ＲＮＳ、及びＴＲ＋ＮＳ動物の海馬抽出物中の、ＮＲ２Ａ及びＧｌｕＲ１（Ａ）；ＰＳＤ−９５及びＣＲＥＢ（Ｃ）の免疫ブロット分析。ＧｌｕＲ１及びＮＲ２Ａ（Ｂ）ならびにＰＳＤ９５及びＣＲＥＢ（Ｄ）の相対的濃度測定分析。結果は１群当たり５匹のマウスの平均±ＳＥＭである。ａｐ＜０．００１対対照−ＧｌｕＲ１、ｂｐ＜０．００５対対照−ＮＲ２Ａ、ｃｐ＜０．００１対ＴＲ−ＧｌｕＲ１。ｄｐ＜０．００５対ＴＲ−ＮＲ２Ａ、ｅｐ＜０．００５対対照−ＰＳＤ９５、ｆｐ＜０．００１対対照−ＣＲＥＢ、ｇｐ＜０．００１対ＴＲ−ＰＳＤ９５、ｈｐ＜０．００５対ＴＲ−ＣＲＥＢ。（Ｅ）ＲＮＳ６０及びＮＳを与えられたＮＴＲ及びＴＲ動物の海馬を、ＰＳＤ９５（赤）及びβチューブリン（緑）で染色した。代表的な画像は、ＣＡ１核のシナプス前分枝内のＰＳＤ９５の分布を示した。右側パネルは、白点線で囲まれた左側の画像の拡大図である。（Ｆ）ＲＮＳ６０−（ｉｉｉ）及びＮＳ−（ｉｖ）を与えられたＮＴＲ動物（ｉ）及びＴＲ動物（ｉｉ）のＣＡ−１海馬内のＮＲ２Ａ（赤）及びβチューブリン（緑）の二重標識化。下パネルは、点線の四角で強調された上パネル画像の拡大図である。（Ｇｉ〜ｉｖ）ＣＡ−１核内のＮＲ２Ａの分布を、Ｉｍａｇｅ  Ｄｉｇソフトウェアでシグナルホットスポットとして３Ｄ輪郭図中に示した。赤色、黄色、緑色、及び青色はそれぞれ、低度、中度、高度、及び非常に高度のＮＲ２Ａ受容体の分布を有する領域を示す。（Ｈ）ＡＭＰＡ依存性及び（Ｉ）ＮＭＤＡ依存性のカルシウム電流を、材料及び方法に記載したようにＮＴＲ、ＴＲ、（ＴＲ＋ＲＮＳ６０）、及び（ＴＲ＋ＮＳ）動物の海馬切片内で測定した。（Ｊ）ＮＴＲ及び（ＴＲ＋ＲＮＳ６０）を与えられた海馬切片内のカルシウム電流の代表的なオシログラム。
【０２２１】
実施例７
（ＲＮＳ６０は、培養海馬ニューロン内の形態的可塑性を誘導したが、ＮＳ、ＰＮＳ６０、またはＲＮＳ１０．３のいずれもそれを誘導しなかった）
樹状突起棘の形成及び成熟は、学習及び記憶の形成の基礎をなす海馬ニューロンのシナプス効力の長期向上に直接寄与するため、樹状突起棘の数、大きさ、及び成熟に対するＲＮＳ６０の作用を研究した。まず、突起棘密度に対する２％、５％、及び１０％（ｖ／ｖ）のＲＮＳ６０の作用を分析した。興味深いことに、ＲＮＳ６０は、培養海馬ニューロン内の樹状突起棘の密度を用量依存的に増加させた（図７Ｃ〜Ｄ）。詳細な形態的分析は、ＮＳ、ＰＮＳ、及びＲＮＳ１０．３（Ｓｏｌａｓ）などの他の食塩水ではなく、ＲＮＳ６０が、海馬ニューロン内の樹状突起棘の数（図７Ｅ〜Ｆ）、大きさ（図７Ｇ〜Ｈ）、及び成熟（図７Ｊ〜Ｋ）を刺激したことをさらに明らかにし、これは、ＲＮＳ６０が、樹状突起棘の密度及び大きさを充実させることによって海馬ニューロンのシナプス成熟を向上させたことを示す。
【０２２２】
具体的には、図７Ａ〜７Ｋは、海馬ニューロン内の樹状突起棘の数、大きさ、及び成熟に対するＲＮＳ６０、ＮＳ、ＰＮＳ６０、及びＲＮＳ１０．３の作用を示す。Ａ）ＲＮＳ６０の概略図。３週齢の海馬ニューロン培養物（Ｂ）を、２％、５％、及び１０％のＲＮＳ６０で２日間処置し、続いて、神経マーカーＭＡＰ２（緑）及びＡｌｅｘａ−６４７共役ファロイジン（赤）を用いた突起棘（Ｃ）の免疫染色を行った。異なる用量のＲＮＳ６０によるニューロン内の突起棘密度を数量化するための箱ひげ図分析（Ｄ）。対照、ＲＮＳ６０処置、ＮＳ処置、ＰＮＳ６０処置、及びＲＮＳ１０．３処置ニューロンを、インキュベーションの４８時間後にＭＡＰ２及びファロイジンで二重染色した（Ｅ）。左側の画像は、樹状突起のより大きな図であり、１群当たり３枚の右側の画像は、各群の３枚の別々の画像から収集した樹状突起の突起棘密度を示す。突起棘密度（Ｆ）をファロイジン染色ニューロンから測定し、長さ１０μｍの樹状突起（Ｇ）の関数としてプロットした。誇張画は、突起棘の大きさを測定するために適用した方法を示す。（Ｈ）したがって、樹状突起の２０枚の画像から突起棘の大きさを算出した。（Ｉ）０．６の頭部と首部との比を有する突起棘を成熟した突起棘と見なし、それらの数を計数及びプロットした。キノコ状突起棘（Ｊ）及び短く太い突起棘（Ｋ）の数を１０枚の異なる画像から計数し、対照、ＲＮＳ６０処置、ＮＳ処置、ＲＮＳ１０．３処置、及びＰＮＳ６０処置の海馬ニューロンについてプロットした。
【０２２３】
主軸索の長さ、側枝の数、及び三次分枝の数を含む、シナプス前ニューロンの軸索の異なる形態的変化も、長期のシナプス性促進と関連する（Ｈａｔａｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２０，ＲＣ８２）。
【０２２４】
したがって、主軸索の拡大、新たな側枝の形成、及び三次分枝を有するニューロンの数に対する、ＲＮＳ６０の作用を分析した。興味深いことに、トレーシング分析（１群当たりｎ＝１０）は、ＮＳではなくＲＮＳ６０が、主軸索の伸長（図８Ａ及び８Ｃ）、側枝の数（図８Ｂ及び８Ｄ）、ならびに三次分枝を有するニューロンの数（図８Ｅ〜Ｆ）を有意に刺激したことを明らかに示し、ＲＮＳ６０が軸索の成長を刺激する（これは次にシナプス活性の増加に関連する）ことを実証した。
【０２２５】
具体的には、図８Ａ〜８Ｆは、ＲＮＳ６０が、培養海馬ニューロン内の主軸索の全長及び側枝を刺激することを示す。（Ａ）海馬ニューロン培養物を１０％のＲＮＳ６０及びＮＳで２日間処置し、続いて、神経マーカーＭＡＰ２を用いた免疫染色を行った。その後、主軸索のみ（Ａ）及び詳細な分枝（Ｂ）について、スケーラブルベクターグラフィックス（ＳＶＧ）ソフトウェアであるＩＮＫＳＣＡＰＥ（商標）でニューロンをトレースした。（Ｃ）主軸索の長さ、（Ｄ）軸索１００μｍ当たりの側枝の数、（Ｅ）分枝点の数、及び（Ｆ）（ＲＮＳ６０に対するパーセント基準でプロットした）三次分枝の数を、各処置群の２０枚の画像から算出した。ａｐ＜０．０１対対照。
【０２２６】
したがって本発明の特定の態様によると、これらの結果は、まとめると、ＲＮＳ６０が、インビボの海馬ニューロン内の可塑性を刺激し、樹状突起棘の密度及び大きさを充実させることによって海馬ニューロンのシナプス成熟を向上させ、主軸索の長さ、側枝の数、及び三次分枝の数を向上させることを示し、確証する。
【０２２７】
実施例８
（ヤリイカ巨大シナプス標本、溶液、及び方法）
Ｗｏｏｄｓ  Ｈｏｌｅ，ＭＡ（ＭＢＬ）のＭａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおいて、すべての実験を実施した。この結合部に関する以前の研究のように（Ｋａｔｚ  ａｎｄ  Ｍｉｌｅｄｉ  １９６７，７１、Ｌｌｉｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９７６，１９８１、Ａｕｇｕｓｔｉｎｅ  ａｎｄ  Ｃｈａｒｌｔｏｎ，１９８６）、断頭後に１つのヤリイカ（Ｌｏｌｉｇｏ  ｐａｅｌｌｉ）の星状神経節を外套から急速に除去し、流水下で外套の内表面から星状神経節を切断した。単離後、神経節を記録チャンバ内に入れ、人工海水（ＡＳＷ）に浸した。シナプス前終末及びシナプス後終末の両方が微小電極浸透について直接視覚化され得るように、神経節をチャンバ内に配置した。合計７０個のシナプスを研究し、解剖した標本の数は１５０個近くであった（明らかな解剖学的かつ最適な透明度が実験実装の安定性に必要とされるため、解剖したシナプスのいくつかは使用不可能であった）。
【０２２８】
ＲＮＳ６０。ＲＮＳ６０は、高酸素圧力下で制御された乱流及びＴａｙｌｏｒ−Ｃｏｕｅｔｔｅ−Ｐｏｉｓｅｕｉｌｌｅ（ＴＣＰ）フローを組み込む回転子／固定子装置を使用することによって生成される、物理的に変更された生理食塩水（０．９％）溶液である（出願者の装置、該流体を作製するための方法、及び該流体自体を包含する教示に関して、すべて参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、出願者の米国特許第７，８３２，９２０号、同第７，９１９，５３４号、同第８，４１０，１８２号、同第８，４４５，５４６号、同第８，４４９，１７２号、及び同第８，４７０，８９３号を参照されたい）。簡潔に言うと、本明細書に開示される作業実施例で使用したＲＮＳ６０を生成するために、塩化ナトリウム（０．９％）、ＵＳＰ  ｐＨ５．６（４．５〜７．０、Ｈｏｓｐｉｒａ）を、３，４５０ｒｐｍの回転子速度を維持しながら、４℃において１ａｔｍの酸素背圧下で３２ｍＬ／ｓの流速（気体流速７．８ｍＬ／ｓ）で、出願者の特許取得型装置を使用して処理する。これらの条件は、回転子の空洞近くの蒸気相と液体相との間の界面において強力な剪断層を生成し、これは、空洞化、剪断、及び他の力による小さな気泡の生成と相関する。得られる流体をガラス瓶（ＫＧ−３３ホウケイ酸ガラス、Ｋｉｍｂｌｅ−Ｃｈａｓｅ）に直ちに入れ、灰色のクロロブチルゴム栓（ＵＳＰクラス６、Ｗｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を使用して密封して、圧力を維持し、浸出物（ｌｅａｃｈａｂｌｅｓ）を最小限に抑える。２４時間後に試験した際、酸素含量は５５±５ｐｐｍ（周囲温度及び圧力）であった。化学的には、ＲＮＳ６０は、水、塩化ナトリウム、５０〜６０百万分率の酸素を含有するが、活性薬学的成分は含有しない。流体の構造及び活性は、大気圧において密閉された容器内で４℃で少なくとも数ヶ月または少なくとも数年にわたって安定している。
【０２２９】
灌流溶液。２つの標準的な人工海水（ＡＳＷ）溶液、及び１つの物理的に変更された人工海水溶液を、これらの実験に使用した。最終的な塩の組成及びｐＨがすべての事例において同一になるように、１リットルの蒸留水または４０ｍｌ瓶の物理的に変更された水に塩を添加した（４２３ｍＭのＮａＣｌ、８．２７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、５０ｍＭのＭｇＣｌ２、ＨＥＰＥＳで７．２に緩衝、塩分３．１２１％）。蒸留水または物理的に変更された食塩水で作製されたＡＳＷは毎日調製し、実験の開始まで４°に保つ。実験の開始時に、対照ＡＳＷ、及び１本の４０ｍｌ瓶のＲＮＳ６０  ＡＳＷを冷蔵庫から取り出し、室温にし、酸素含量を測定した。毎日いくつかのシナプス（５〜１５）を解剖し、研究した。我々の標準的技法であるように、室温（１５〜１８℃）ですべての実験を実施した。
【０２３０】
物理的に変更された食塩水は、ＴＣＰフローを用いて調製した酸素化ナノ気泡を含有するＲＮＳ６０を使用して作製されたＲＮＳ６０  ＡＳＷであった。標準ＡＳＷは、１）空気拡散酸素化（通気なし）を用いて蒸留したＨ２Ｏを使用して作製された対照ＡＳＷ、及び２）ＲＮＳ６０を作製するために使用したものと同じ原料溶液から未処理の生理食塩水を使用して作製されたＮＳ３０６１２  ＡＳＷであった。ＲＮＳ６０及びＮＳ３０６１２は、Ｒｅｖａｌｅｓｉｏからの寄贈品であった。流水下でヤリイカからのシナプスの除去を行った。記録セッション開始前のすべての手技、微細解剖及びシナプス刺入は、大体積のＡＳＷが必要とされるため、標準ＡＳＷを使用して実施した。我々の最初の実験において、ＮＳ３０６１２におけるシナプス伝達は、我々の標準対照ＡＳＷ（図示せず）で記録されたものと区別不可能であることが分かった（ＡＳＷはすべての実験で初期工程として使用した）。
【０２３１】
酸素含量測定。各超灌流液（ｓｕｐｅｒｐｅｒｆｕｓａｔｅ）の酸素測定値を、温度及び塩分について補正されたＵｎｉｓｅｎｓｅ  ＭｉｃｒｏＯｐｔｏｄｅ近赤外線（ＮＩＲ、７６０〜７９０ｎｍ）感知プローブ（４００μｍ）を使用して決定した。１０分間にわたって測定されたＡＳＷのそれぞれの酸素含量の平均及び平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）は、１）対照ＡＳＷ  ２６８±０．２６μモル／ｌ（８．５７ｐｐｍ）、２）ＲＮＳ６０  ＡＳＷ  ８７８±０．８μモル／ｌ（２８．１ｐｐｍ）、３）生理食塩水（ＮＳ）２６６±０．１８μモル／ｌ（８．５ｐｐｍ）であった。ＲＮＳ６０  ＡＳＷの酸素含量はかなり安定している。典型的な実験の期間である約３０分間にわたって、ＲＮＳ６０  ＡＳＷの酸素含量は約８．７％減少した。
【０２３２】
全体的な電気生理学。安定したシナプス前及びシナプス後の微小電極刺入、ならびにシナプス前電気刺激後のシナプス伝達の実証の後、実験手技を開始した。シナプス後電極に斜角をつけてそれらの抵抗を低減させ（１ＭΩ未満）、それによりシグナル／雑音比を改善した。シナプス後膜のＲＣ特性の変化を評価するため、減衰指数関数のための内蔵の曲線適合機能（ｅｘｐ  Ｘｏｆｆｓｅｔ、Ｉｇｏｒ  Ｐｒｏ、Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ，Ｉｎｃ）を使用してＥＰＳＰの下降相の減衰定数を推定した。
【０２３３】
誘発されたシナプス伝達。最大の（最遠位の）シナプス前終末及び対応するシナプス後軸索に、単一のガラス微小電極を挿入した。誘発されたシナプス前及びシナプス後活動電位を、以下の標準プロトコル（Ｌｌｉｎａｓ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ  １９８１）を使用して記録した。絶縁銀線の電極対を介するシナプス前軸索の細胞外電気刺激、または細胞内電極を通してシナプス前終末を直接脱分極することのいずれかによって、シナプスを活性化させた。神経刺激は、単一の刺激またはトレイン（１Ｈｚで送達される２００Ｈｚにおいて２５０ミリ秒）として送達した。
【０２３４】
シナプス後雑音レベルのフーリエ解析によって判定された自発性放出。シナプス結合部におけるシナプス後膜電位の雑音ゆらぎ（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）として自発性伝達物質放出をシナプス後性に記録した。シナプス雑音測定は、シナプス生存能を査定するための第２の方法、及び自発性のシナプス小胞の放出動態に対するＲＮＳ６０の考えられる作用を理解するためのプローブを提供した。電気生理学的分析及び超微細構造的分析を組み合わせることによって、我々は、シナプスの小胞再循環特性をさらに査定した。オリゴマイシンなどのミトコンドリア阻害剤の使用と合わせて、この組み合わせにより、我々は、ＡＴＰ合成に対するＲＮＳ６０作用の機構（Ｌａｒｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９５８）を研究することができた。
【０２３５】
Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈフィルタ（０．１〜１ｋＨｚ）とともにＮｅｕｒｏｄａｔａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ増幅器（ＥＲ−９１）を使用してシナプス雑音を記録した。雑音分析は、２つの指数関数によるシナプス後自発性単一波形の決定法（Ｖｅｒｖｅｅｎ  ａｎｄ  ＤｅＦｅｌｉｃｅ，１９７４）、Ｆ（ｔ）＝ａ［／［ｅ−ｔ／τｄ＿ｅ−ｔ／τｒ］に基づき、式中、ａは、振幅基準化因子であり、τｄ及びτｒはそれぞれ、減衰定数及び立上がり時間定数である。
【０２３６】
単一電位から導かれるパワースペクトルは、Ｓ（ｆ）＝２ｎａ２（τｄ−τｒ）２／［１＋４π２ｆ２τ２ｄ）（１＋４π２ｆ２τ２ｒ）］であり、式中、ｎは、単一放出ｆの速度であり、ａ、τｄ、及びτｒは、上記と同じである。２０〜２００Ｈｚの雑音周波数内の雑音振幅を平均することによって、自発性放出の変化を数量化した。
【０２３７】
雑音モデル。ＲＮＳ６０ベースのＡＳＷの後に観察された雑音ゆらぎ変化に対処するため、我々は雑音プロファイルの数値解法（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）を実行した。以前の研究（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９０）のように、微小電位の立上がり時間の時定数を０．２ミリ秒を有するものとして、そして立下がり時間を１．５ミリ秒として決定した。ＲＮＳ６０後の雑音結果は、０．２ミリ秒の立上がり時間及び２．５ミリ秒の立下がり時間を有することが分かった。ＲＮＳ６０雑音プロファイルのパラメータは、適合度（ｇｏｏｄｎｅｓｓ  ｏｆ  ｆｉｔ）によって選択した。
【０２３８】
電位固定。電位固定実験は標準プロトコル（Ｌｌｉｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８１）に従った。簡潔に言うと、２つのガラス微量ピペット電極をシナプス結合部位における最大の（最遠位の）シナプス前終末の指状部（ｄｉｇｉｔ）に挿入し、第３の微量ピペットは、結合部位におけるシナプス後軸索に刺入した（Ｌｌｉｎａｓ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ  １９８１）。シナプス前電極のうちの１つを、電位固定電流帰還を支持する微量注入に使用し、一方で第２のものは膜電位を監視した。ＦＥＴ入力演算増幅器（Ａｎａｌｏｇ  Ｄｅｖｉｃｅｓモデル５１５、Ａｎａｌｏｇ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｗｏｏｄ，Ｍａｓｓ）を使用して、シナプス前電位を測定した。高速高電位増幅器（Ｂｕｒｒ−Ｂｒｏｗｎ  Ｃｏｒｐ，３５８４ＪＭ）の手段によって電流を注入した。仮想接地回路（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  Ｐｈｉｌｂｒｉｃｋ  １４３９、Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  Ｐｈｉｌｂｒｉｃｋ，Ｄｅｄｈａｍ，Ｍａｓｓ．）の手段によって全電流を測定した。不関電極は、チャンバの底全体に配置された大きな銀−塩化銀プレートからなった。分極化の人為的結果を排除するため、シナプスに隣接する浴内に置かれたＡｇ−ＡｇＣｌアガー仮想接地電極を使用して電流を測定した。ほとんどの事例で、電位微小電極シグナルのプラトーまでの時間は、５０〜１５０μｓの範囲であった。
【０２３９】
ＡＴＰ合成。ルシフェリン／ルシフェラーゼ発光測定（ＭｃＥｌｒｏｙ  Ｗ．Ｄ．１９４７）を使用してＡＴＰ合成を判定した。シナプス前終末またはシナプス後終末のいずれかにルシフェラーゼを圧力注入した。ルシフェリンを灌流液に添加した。単一光子計数ビデオカメラ（Ａｒｇｏｓ−１００  Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｘ）を使用して発光を監視及び画像化した。１５秒の時間積分期間を使用して光の規模を判定した。５０〜１００ミリ秒の圧力パルスを使用してオリゴマイシン（０．２５ｍｇ／ｍｌ）をシナプス前性に注入し、光子計数カメラを使用して直接視覚化した。注入した体積は、ＡＴＰ合成を遮断するように２５．０μｇ／ｍｌの最終濃度になるように、０．５〜１ｐｌ、すなわち、シナプス前終末体積の約５〜１０％（Ｌｌｉｎａｓ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．１９９１）の範囲内であった。
【０２４０】
オリゴマイシンを用いたＡＴＰ合成の遮断。５０〜１００ミリ秒の圧力パルスを使用してオリゴマイシン（０．２５ｍｇ／ｍｌ）をシナプス前性に注入し、光子計数カメラを使用して直接視覚化した。注入した体積は、ＡＴＰ合成を遮断するように２５．０μｇ／ｍｌの最終濃度になるように、０．５〜１ｐｌ、すなわち、シナプス前終末体積の約５〜１０％（Ｌｌｉｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）の範囲内であった。
【０２４１】
超微細構造研究。電気生理学的記録の終わりに、記録チャンバから星状神経節を直ちに取り出し、グルタルアルデヒドへの浸漬によって固定した。完全な保存を示すシナプスのみを分析に承認した。したがって、表１に要約されるように、８個のシナプス終末からの２４０個の活性帯（ＡＺ）に対して超微細構造的分析を実施した。組織を四酸化オスミウムで後固定（ｐｏｓｔｆｉｘ）し、酢酸ウランでブロック染色し、脱水し、樹脂（Ｅｍｂｅｄ  ８１２、ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に埋め込んだ。Ｐｉｏｌｏｆｏｒｍ（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，Ｒｅｄｄｉｎｇ，ＣＡ）及び炭素で被覆された単一スロットグリッド上に超薄切片を採取し、酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で対照した。Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（ＮＩＨ，ＥＵＡ）を用いてシナプス小胞の形態計測及び定量的分析を実施した。２０または３０Ｋの初期倍率で電子顕微鏡写真を撮った。これらを、シナプス小胞の計数のために５０Ｋの倍率に、そしてクラスリン被覆小胞（ＣＣＶ）の計数のために７５Ｋの倍率に、コンピュータスクリーン上で拡大した。シナプス活性帯におけるシナプス小胞密度及びＣＣＶの数を、１μｍ２当たりの小胞の数として決定した。
【０２４２】
統計；形態学。一元配置分散分析検定（パラメトリック検定）、続いてテューキー（Ｔｕｋｅｙ）の検定によってシナプス小胞密度を分析し、マン−ホイットニーのＵ検定（ノンパラメトリック検定）によってＣＣＶ密度を分析した。両方の分析は、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍソフトウェア１０．０（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，ＥＵＡ）で実現した。データは、平均±標準誤差）として提示される。
【０２４３】
電気生理学。電気生理学的データの分析は、ＳＰＳＳ環境（ＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，ＩＢＭ）で実施した。各実験につき各パラメータのいくつかの測定を行った。各シナプスの平均の総平均で統計分析を実施した。ｔ検定または独立した試料の分散分析、続いてテューキー事後検定を使用して、有意性を判定した。３つの統計的閾値を、Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．００１とマークする。
【０２４４】
データベース。本研究のためのデータは、表１に要約されるように、８５個の実験をもたらした合計７５個のヤリイカシナプスから得た。シナプスは、安定したシナプス前及びシナプス後の静止電位を有した場合、かつシナプス前及びシナプス後の活動電位が制御条件下で劣化の兆候を示さなかった場合にのみ、分析に含まれた。
【表５】
2016532683.tif 000010
【０２４５】
実施例９
（電気生理学的研究が実施され、ＲＮＳ６０  ＡＳＷが低酸素遮断からシナプス伝達を救助したことを示した）
最初の実験は、対照ＡＳＷに対して物理的に変更されたＡＳＷ（ＲＮＳ６０  ＡＳＷ）の存在下でシナプス後応答を生み出すシナプス前活性化の能力を試験した（Ｈａｇｉｗａｒａ  Ｓ．ａｎｄ  Ｔａｓａｋｉ，Ｉ，１９５８、Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ａ．ａｎｄ  Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｎ．１９６２、及びＫｕｓａｎｏ  Ｋ．１９６８）。研究されたシナプスのすべてにおいて、ＲＮＳ６０  ＡＳＷを用いた灌流はシナプス伝達を向上させた。ＲＮＳ６０  ＡＳＷは、シナプス前膜の静止膜電位を改変しなかった（表３）。これは、シナプス前終末へのルシフェラーゼの細胞内注入の後の場合であった。ＲＮＳ６０  ＡＳＷは、シナプス後静止電位を過分極させた。これは、ＲＮＳ６０の存在下で上昇したＡＰＴ利用能に起因するＮａ−Ｋ  ＡＴＰアーゼの活性の上昇が原因であった可能性が最も高い。ルシフェラーゼがシナプス後終末に注入された際、膜の過分極は見られなかった（表３）。
【０２４６】
ＲＮＳ６０  ＡＳＷは、低酸素遮断からシナプス伝達を救助した。Ｂｒｙａｎｔ  ＳＨ．（１９５８）及びＣｏｌｔｏｎ  ＣＡ．ら（１９９２）によって最初に実証されたように、シナプスが適切に酸素化されない場合、シナプス伝達は３０分以内に機能しなくなる。これは、低酸素症に伴う伝達物質の枯渇が原因である（Ｃｏｌｔｏｎ  ＣＡ．ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。したがって、ＲＮＳ６０が低酸素シナプス内で正常な伝達を修復し得るかを判定するように、最初の一式の実験を設計した。
対照の低酸素ＡＳＷに対してシナプス伝達を修復するＲＮＳ６０の能力の簡素な直接試験を提供する最初の実験は、閾値未満のわずかなシナプス後シナプス電位のみが誘発され得るように（図１０、下の矢印）、シナプス後振幅を減退させることからなった。低酸素シナプスをＲＮＳ６０（ＲＮＳ６０  ＡＳＷ）で灌流すると、シナプス後スパイクが各シナプス前刺激によって容易に誘発され得る時点まで、シナプス後電位の振幅が急速に増加する。図１０の活動電位は、ＲＮＳ６０（ＲＮＳ６０  ＡＳＷ）に変更した３分後に記録された。そのような記録は、最大数時間のＲＮＳ６０（ＲＮＳ６０  ＡＳＷ）の長期灌流を用いて行なわれ得る。これは、ＲＮＳ６０（ＲＮＳ６０  ＡＳＷ）が、低酸素性不全後の伝達を急速かつ有効に修復することができ、それ自体が、酸素化されたＡＳＷで見られるような伝達事象に対する有害作用を有しないことを実証する（Ｃｏｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。
【０２４７】
図１０は、特定の例示的な態様による、シナプス前終末の電気刺激後の低酸素シナプスにおける誘発された伝達物質放出の増加の一例を示す。低酸素症の３０分後の閾値未満のわずかなシナプス電位、及びＲＮＳ６０  ＡＳＷを用いた灌流の３分後に誘発された活動電位に留意されたい。挿入図は、放出潜伏期の変化を伴わない振幅の変化を示すＥＰＳＰ開始の詳細を示す振幅の拡大（３倍）である。時間、振幅、及びシナプス後繊維の静止電位は図示の通りである。
【０２４８】
実施例１０
（ＲＮＳ６０  ＡＳＷは、高周波刺激によるシナプスの疲労から伝達を救助した）
ＲＮＳ６０  ＡＳＷを用いた超灌流（ｓｕｐｅｒｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）とともに長期の変化が生じないことを実証した後、反復性刺激後の伝達物質枯渇の研究を実施した。ヤリイカ巨大シナプスの高周波刺激は、シナプス小胞の低減、及び静止期間後に修復され得るシナプス後スパイク生成の不全をもたらす（Ｋｕｓａｎｏ  Ｋ．ａｎｄ  Ｌａｎｄａｕ  Ｅ．Ｍ．，１９７５、Ｗｅｉｇｈｔ  ＦＦ．ａｎｄ  Ｅｒｕｌｋａｒ  Ｓ．Ｄ．，１９７６、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ  Ｉ．Ｊ．，１９７９）。
【０２４９】
ＲＮＳ６０がそのようなシナプスの疲労からの回復の時間経過を変更し得るかを判定するように、一式の実験を設計した。５０回の高頻度反復刺激のトレイン（２００Ｈｚにおける）を、シナプス不全（シナプス後スパイクがない状態）が生じるまで毎秒適用した。次にシナプスを静止させ、刺激トレインを再度適用した。各トレインの間に誘発されたスパイクの数を、シナプス不全または回復の指標（後者は細胞内伝達物質の補充の定量的尺度を提供する）として使用した。図１１に図示した実施例に示されるように、対照ＡＳＷ及びＲＮＳ６０  ＡＳＷにおいてこのプロトコルに従った。
【０２５０】
図１１Ａ〜１１Ｅは、特定の例示的な態様による、対照及びＲＮＳ６０  ＡＳＷにおける高周波刺激を示す。図１１Ａは、２００Ｈｚにおける反復性のシナプス前電気刺激によって生成されたシナプス前（赤）及びシナプス後（黒）スパイクを示す（最後の刺激がシナプス後スパイクを生成できないことに留意されたい）。図１１Ｂは、対照ＡＳＷにおいて１Ｈｚで繰り返された１００回の連続的なトレインの後の、すべてのシナプス後スパイク生成の不全を示す。図１１Ｃは、Ｂと同じであるが、ＲＮＳ６０  ＡＳＷで記録されたものを示す。図１１Ｄは、対照ＡＳＷにおける３０秒の静止期間後のシナプス後スパイク生成の部分的回復を示す。図１１Ｅは、ＲＮＳ６０  ＡＳＷにおける静止期間後の部分的回復を示す。Ｄ及びＥにおいて、ＲＮＳ６０  ＡＳＷの存在下で、同様の３０秒の静止期間後に、対照ＡＳＷ中よりも活発なシナプス後スパイク生成の回復があったことに留意されたい。同じ刺激パラダイムを用いる４個の他のシナプス内で同様の結果が得られた。
【０２５１】
対照ＡＳＷ中では、ヤリイカ巨大シナプスは、２００Ｈｚの刺激速度の伝達を追うことができる。図１１Ａに示されるように、２００Ｈｚの刺激トレインは、５０回中最初の４９回の刺激でシナプス前活動電位（黒）及びシナプス後活動電位（赤）を誘発した。しかしながら、そのようなトレインが１Ｈｚで送達されたとき、対照ＡＳＷ（図１１Ｂ）及びＲＮＳ６０  ＡＳＷ（図１１Ｃ）において伝達は機能しなかった。対照及びＲＮＳ６０  ＡＳＷ中で、回復の時間経過に差が見られた。図１１の実施例において、対照ＡＳＷ中では、３０秒の静止期間後、トレインの最初の１２回の刺激がシナプス後スパイクを誘発し、その後、閾値未満のＥＰＳＰのみが誘発された（図２１１）。しかしながら、ＲＮＳ６０  ＡＳＷの後、最初の２２回の刺激はシナプス後スパイクを誘発した（図１１Ｅ）。
【０２５２】
この簡素な試験が、低酸素症からの回復を試験する第１の近似方法論を可能にしたため、２種類の実験：１）非人工的に酸素化された（対照）ＡＳＷにおける反復性刺激からの回復、または２）ＲＮＳ６０  ＡＳＷの存在下での回復を実行した。対照ＡＳＷ中の平均回復は１４±２．５％（ｎ＝４）であり、ＲＮＳ６０  ＡＳＷ中のものは６８±６．２％（ｎ＝９）であった。統計分析は、ＡＳＷの種類が回復に対して有意な作用を有したことを明らかにした（Ｔ（１，１２）＝６．２６、ｐ＜０．０００１）。
【０２５３】
これらの所見は、ＲＮＳ６０  ＡＳＷ灌流の間に、（ＥＰＳＰ振幅の増加によって示される）伝達物質の量の増加に加えて、伝達物質の利用能も上昇したことを示す。これは、小胞再循環が改変され、小胞の急速な代謝回転及び伝達物質の利用能の上昇を可能にすることを示唆する。
【０２５４】
実施例１１
（ＲＮＳ６０  ＡＳＷは自発性伝達物質放出を増加させた）
伝達物質の利用能及び放出動態に関連する一式の測定値は、ヤリイカシナプス内の自発性伝達物質放出の規模を判定することによって得ることができる（Ｍｉｌｅｄｉ  Ｒ．，１９６６、Ｋｕｓａｎｏ  Ｋ．ａｎｄ  Ｌａｎｄａｕ  Ｅ．Ｍ．，１９７５、Ｍａｎｎ  Ｄ．Ｗ．ａｎｄ  Ｊｏｙｎｅｒ  Ｒ．Ｗ．，１９７８、Ｌｉｎ  Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ，１９９０）。この測定は多くの場合、所定の結合部における小胞利用能の尺度として用いられている（Ｌｉｎ  Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。
【０２５５】
ＲＮＳ６０がそのような自発性放出を改変し得るかを判定するために、対照ＡＳＷ中で、そして灌流後にＲＮＳ６０  ＡＳＷを用いて、シナプス雑音を測定した（図１２）。図１２Ａは、ＲＮＳ６０  ＡＳＷを用いた灌流の５分後（図１２Ａ、赤いトレース）及び１０分後（図１２Ａ、青いトレース）に記録されたシナプス雑音が、対照ＡＳＷ中で記録されたもの（図１２Ａ、緑のトレース）よりも大きかったことを示す。シナプス雑音の高速フーリエ変換（ＦＦＴ）分析は、２００Ｈｚを超える周波数で自発性放出の増加が生じたことを示した（図１２Ｂ）。これは、モデルによって予測された関数（図１２Ｂ、挿入図）と一致する。
【０２５６】
図１２Ａ〜１２Ｃは、特定の例示的な態様による、対照ＡＳＷ及びＲＮＳ６０  ＡＳＷ中で記録されたシナプス雑音を示す。図１２Ａは、対照ＡＳＷ（緑）で灌流されたシナプス後膜全体のシナプス雑音、ならびにＲＮＳ６０  ＡＳＷを用いた灌流の５分後（赤）及び１０分後（青）の雑音振幅の増加、ならびに浴から直接記録された細胞外の背景雑音（黒）を示す記録を示す。図１２Ｂは、ＲＮＳ６０  ＡＳＷを用いた灌流後の時間の関数としての雑音振幅の変化のプロットを示す。図１２Ｃは、対照ＡＳＷ中（赤）及びＲＮＳ６０  ＡＳＷを用いた灌流の１０分後（黒）の周波数の関数としての雑音振幅のプロット（注、対数スケール）を示す。挿入図は、雑音プロッティングの変化が、シナプスの微小雑音の時間経過及び振幅の変化として解釈され得ることを示す、モデル結果を示す。（例えば、詳細はＬｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０を参照されたい。）
【０２５７】
これらの結果は、対照からＲＮＳ６０  ＡＳＷに変更した約１０分後に最適化した、２０％〜８０％の範囲の自発性伝達物質放出の有意な増加を示す。これは、ＲＮＳ６０  ＡＳＷに変更した後の時間の関数としてシナプス雑音がプロットされている図１２Ｃにおける４個のシナプスに関して示されている。自発性伝達物質放出のこの増加レベルは、図１２及び１１に示される所見と一致して、実験期間、最大２５分にわたって維持された。
【０２５８】
実施例１２
（シナプス前カルシウム電流の調節は、伝達物質放出の増加を媒介しないことが示された）
上述の結果は、ＲＮＳ６０  ＡＳＷを用いた灌流が、誘発された伝達物質放出、及び、場合により伝達物質の利用能に関連する自発性伝達物質放出の両方の増加をもたらすことを示す。重要なことに、これは、この増加が、最適な機能的レベルを超えて伝達物質放出を上昇させないことも示唆する。
【０２５９】
そのような所見は、放出過程の多くの構成要素のうちのいずれの結果でもあり得るが、考えられる候補の１つは、ＲＮＳ６０  ＡＳＷ灌流後のシナプス前イオン性チャネル動態の変化である。これらのうち最も可能性のあるものは、シナプス前電位開口型カルシウム電流（ＩＣａ＋＋）の調節であろう。このパラメータの上昇は、これまで記載した結果の多くを説明し得る。実際に、ＩＣａ＋＋の増加は、シナプス前終末における小胞融合の確率の上昇、ならびに自発性伝達物質放出の増加によって、伝達物質放出の度合に影響するであろう。シナプス前電位固定パラダイムを実行する可能性を所与として（Ｌｌｉｎａｓ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９７６、１９８１、Ａｕｇｕｓｔｉｎｅ  ＧＪ．ｅｔ  ａｌ．，１９８６）、このシナプスは、シナプス前カルシウム電流の変化に対処する研究ツールとして最適である。
【０２６０】
一式の電位固定実験を実行して、上に見られる伝達物質放出のＲＮＳ６０調節が、シナプス前カルシウム電流の増加によって媒介されるかを判定した。考慮すべき第２の問題は、ＩＣａ＋＋と伝達物質放出との間の関係（Ｌｌｉｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１）が、ＲＮＳ６０の存在によって維持ないしは改変されたかであった。
【０２６１】
電位開口型ナトリウム及びカリウムコンダクタンスの薬理学的遮断後に、段階的な脱分極性階段状パルスによってシナプス前カルシウム電流を誘発した（Ｌｌｉｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９７６、１９８１ａ、Ａｕｇｕｓｔｉｎｅ  ａｎｄ  Ｃｈａｒｌｔｏｎ，１９８６）。図１３Ａは、対照（上のトレース、緑）及びＲＮＳ６０（下のトレース、赤）ＡＳＷ中の、シナプス前脱分極の３つのレベルにおけるシナプス前カルシウム電流（前ＩＣａ）、シナプス後ＥＰＳＰ、及びシナプス前電位パルス（前Ｖ）を示す。カルシウム電流及びＥＰＳＰトレースは、図１３Ｂで重ね合わせられている。シナプス後応答振幅が対照（緑）ＡＳＷ中よりもＲＮＳ６０（赤）中で大きく、かつシナプス前内向きカルシウム電流がＲＮＳ６０によって有意に改変されなかったことは、直ちに明らかである。最大のシナプス前脱分極についての対照とＲＮＳ６０  ＥＰＳＰとの間の差が、中間の脱分極についてのもの未満であることに留意されたい。これは、シナプス前膜がカルシウムの平衡電位に近く、ＩＣａ＋＋及びＥＰＳＰ振幅を減少させるためである（Ｌｌｉｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１ａ）。５個のシナプスのＥＰＳＰ振幅を、シナプス前電位固定脱分極の関数として図１３Ｃにプロットする。各シナプスは異なるマーカーを有し、対照ＡＳＷ（緑）ＲＮＳ６０  ＡＳＷ（赤）中で記録されたＥＰＳＰを各シナプスについて比較することができる。伝達物質放出の変化はシナプス間で変動したが、すべての事例においてＲＮＳ６０  ＡＳＷ中よりも大きく、最大値に達したことに留意されたい。この値に達したら、長引く灌流によるさらなる増加は観察されず、これは、向上した伝達物質放出のための条件に達したことを示唆する。対照及びＲＮＳ６０  ＡＳＷ中のシナプス後応答の平均振幅を比較すると、脱分極の３つのレベルにおいて有意差が見られた。図１３Ｄに見ることができるように、脱分極パルスは、シナプス全体でまったく同じ振幅ではなかった。平均ＥＰＳＰ振幅を算出するため、シナプス前脱分極によって４つの群のうちの１つに応答を割り当てた（２つの脱分極値、１６．５ｍＶ及び２５ｍＶは、群に含まれなかった）。３つのシナプス前脱分極群において、対照及びＲＳＮ６０  ＡＳＷ中で記録されたＥＰＳＰに有意差があった：３８ｍＶ、（Ｔ（１，８）＝４．２７、ｐ＜．０１）；４３ｍＶ、（Ｔ（１，８）＝５．１、ｐ＜．００１）、４８ｍＶ、（Ｔ（１，８）＝３．５４、ｐ＜．０１）。ＲＮＳ６０は、ＥＰＳＰの減衰定数を変化させなかった。これは、シナプス後膜の受動的特性（抵抗または静電容量）に有意な変化がなかったことを示唆する（τ、対照２．９９±０．７ミリ秒；ＲＮＳ６０  ２．３６±０．３ミリ秒、ｎ＝９）。
【０２６２】
したがって、５つの電位固定実験からの結果は、伝達物質放出の増加が、カルシウム電流の動態または規模の改変を伴わなかったことを明らかに示す。この時点で、ＲＮＳ６０の作用が小胞利用能及び関連する細胞内小胞動力学のいくつかの態様に関連し得るという可能性を考慮した。
【０２６３】
ここで、酸素化された海水を用いて実施された過去の実験（Ｌｌｉｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１）の同様の電位固定結果と比較したとき（図１３Ｄ及びＥ、黒）、これらの結果が我々の本対照と重なり合ったという事実も有意である。これは、ＲＮＳ６０ベースのＡＳＷの後の伝達物質放出の増加が、通常酸素化された海水から予想されるものを超えて伝達物質放出を増加させることを示す。
【０２６４】
図１３Ａ〜１３Ｅは、特定の例示的な態様による、ＲＮＳ６０がカルシウム電流または伝達物質放出とのその関係を改変することなく伝達物質放出を増加させることを示す電位固定研究を示す。図１３Ａは、シナプス前カルシウム電流（黒）の振幅及び時間経過を示す、対照ＡＳＷ中で記録された一式のトレースを示し、シナプス後応答（緑）の振幅及び時間経過は、第３のトレース（前脱分極、黒）に示される急速な電位固定工程によって誘発された。図１３Ｂは、対照集合と同じ振幅脱分極パルスを用いてＲＮＳ６０  ＡＳＷ中で記録された一式のトレースを示し、ＥＰＳＰは赤である。図１３Ｃは、対照（緑）に関するパネルＡ及びＲＮＳ６０（赤）ＡＳＷに関するパネルＢからのカルシウム電流（上のトレース）及びＥＰＳＰ（下のトレース）の重複像を示し、シナプス前カルシウム電流の時間経過または振幅に変化はなかったが、対照ＡＳＷと比較してＲＮＳ６０においてＥＰＳＰ振幅の明らかな変化があったことを実証する。図１３Ｄは、５個のシナプスに関するシナプス前脱分極工程の関数としてのＥＰＳＰ振幅のプロットを示す（各シナプスからの一式の記録は同じマーカーを使用する）。図１３Ｅは、パネルＤのシナプスに関する平均ＥＰＳＰ平均及び標準誤差のプロットを示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、ｔ検定）。
【０２６５】
実施例１３
（シナプス前及びシナプス後終末におけるＡＴＰ合成のＲＮＳ６０介在性増加を、ルシフェリン／ルシフェラーゼ発光を使用して判定した）
灌流液を対照からＲＮＳ６０  ＡＳＷに変更したときのＡＴＰレベルのいかなる変化の時間経過及び規模をも判定するように、一式の実験を設計した。発光とＡＴＰレベルとの間に直接相関があるルシフェリン／ルシフェラーゼプロトコル（Ｓｐｉｅｌｍａｎｎ，Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１）を使用して、ＡＴＰレベルを測定した。シナプスのシナプス前要素及びシナプス後要素の両方において光の測定を行った。
【０２６６】
図１４Ａ〜１４Ｆは、特定の例示的な態様による、ルシフェリン／ルシフェラーゼ発光を使用するシナプス前及びシナプス後終末におけるＡＴＰ合成の増加の直接的決定を示す。図１４Ａは、対照（対照）ならびにＲＮＳ６０灌流の３分後及び６分後におけるルシフェリン／ルシフェラーゼ発光のレベルを示す。図１４Ｂ、１４Ｃ、及び１４Ｄ中、シナプス後軸索において記録された振幅及び静止電位が増加し、ＲＮＳ６０  ＡＳＷの後にシナプス前終末において測定されたＡＴＰのレベルの上昇と同時性であるシナプス後軸索の生存能の最適化を示していることに留意されたい。図１４Ｅ及び１４Ｆに示されるように、同様の条件下のシナプス後軸索においても、ＡＴＰレベルの同様の上昇を観察することができた。図１４Ｅ中、シナプス前（緑）及びシナプス後（赤）要素が描かれている。シナプス後終末におけるルシフェラーゼ注入部位は、白でマークされている。図１４Ｆ中、ＲＮＳ６０灌流の２分後及び５分後の発光が示されている。
【０２６７】
より具体的には、灌流液が対照からＲＮＳ６０  ＡＳＷに変更された３分後及び６分後に記録された発光の増加によって示されるように、対照レベル（図１４Ａ、対照）からのＡＴＰレベルの明らかな上昇があった（図１４Ａ）。これと同じ期間中、シナプス前終末の静止電位にわずかな減少があったが、活動電位振幅には変化がなかった（図１４Ｂ〜Ｄ）。ＲＮＳ６０灌流を開始した３〜６分後、シナプス後軸索における静止電位にわずかな増加があった。シナプス前要素とは異なり、シナプス後活動電位の振幅の増加があった（図１４Ｂ〜Ｄ）。この結果は、ＲＮＳ６０超灌流後のシナプス伝達の増加が、シナプス前及びシナプス後終末の両方におけるＡＴＰレベルの上昇を伴うことを示す。
【０２６８】
実施例１４
（ＡＴＰ合成遮断剤であるオリゴマイシンは、シナプス前及びシナプス後終末におけるＡＴＰ合成のＲＮＳ６０介在性増加を遮断した）
検討されるべき１つの明らかな可能性は、ＲＮＳ６０の特性が細胞内区画への酸素のアクセスを溶解酸素よりも効率的に促進したかである。もしそうである場合、目下の可能性の１つは、ＲＮＳ６０  ＡＳＷが拡散酸素化されたＡＳＷよりも効率的にＡＴＰ合成を支持し得、ひいてはクラスリン活性を増加させること（Ａｕｇｕｓｔｉｎｅ  ＧＪ．ｅｔ  ａｌ  ２００６）または非クラスリン依存性小胞飲食作用（Ｄａｌｙ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ  １９９２）のいずれかによって、小胞利用能を上昇させることであった。この可能性を所与として、低酸素症によって誘導されるミトコンドリア機能に干渉することによるＡＴＰ合成の遮断（Ｊｏｎａｓ  ＥＡ，２００４、Ｊｏｎａｓ  ＥＡ，ｅｔ  ａｌ．，２００５））が、図１〜５に見られるＲＮＳ６０によるシナプス性伝達物質放出の改変を妨げるかを試験するように、一式の実験を設計した。
【０２６９】
シナプス小胞の可動化及び再循環の多くの態様がミトコンドリアＡＴＰ依存性である（Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０においてレビュー）ため、ＡＴＰの低減は、伝達物質放出を減少させると予想される。シナプス伝達に対するミトコンドリア遮断の作用のうちのいくつかは細胞外カルシウム濃度に関連するが（Ｔａｌｂｏｔ  ２００３）。
【０２７０】
ミトコンドリアは、ミトコンドリア膜電位（Ψｍ）を変性しない薬物、または脱分極性Ψｍ阻害剤を用いて遮断され得る。ミトコンドリア脱分極剤は、ＡＴＰ産生及びミトコンドリアのカルシウム取り込みの両方に影響する。シナプス伝達に観察される脱分極性Ψｍ阻害剤による作用のほとんどは、シナプス前終末におけるカルシウム動態の変化に関連すると提唱されている（Ｂｉｌｌｕｐｓ  ａｎｄ  Ｆｏｒｓｙｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｔａｌｂｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。オリゴマイシンは、ＡＴＰシンターゼを阻害するがミトコンドリアを脱分極させず、かつ、いくつかの調製物ではサイトゾルまたはミトコンドリアのカルシウム動態のいずれに対する作用も有しないが、複合体Ｖを遮断することによって作用すると報告されているため（Ｄａｖｉｄ  １９９９、Ｔａｌｂｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、本研究での使用のために選択された。
【０２７１】
小胞の代謝回転及び全体的な放出器官の最も高感度な尺度は、その活性化において最も少ない数の工程を伴うため、自発性伝達物質放出である。これを考慮して、一式の実験を実行して、自発性伝達物質放出に対するＡＴＰ合成の遮断の作用を判定した。
【０２７２】
図１５は、特定の例示的な態様による、オリゴマイシン投与後の自発性シナプス放出の低減、周波数の関数としての雑音振幅のプロット（注、二重対数座標）を示す。赤は対照ＡＳＷであり、緑はオリゴマイシンの添加７分後であり、青はオリゴマイシン投与の２２分後かつ灌流をＲＮＳ６０  ＡＳＷに変更した１２分後である。黒は細胞外記録である。
【０２７３】
具体的には、対照ＡＳＷ灌流中のシナプス前細胞内オリゴマイシン注入（０．２５ｍｇ／ｍｌ）は、自発性放出を対照レベルから顕著に減少させた（図１５、赤及び緑を比較されたい）。これは、すべての実験で急速に生じた。１桁を超える低減が、シナプス前終末へのオリゴマイシン注入後の最初の７分以内に生じた。オリゴマイシンの注入の２２分後に灌流をＲＮＳ６０  ＡＳＷに変更すると、自発性伝達物質放出は増加しなかった（図１５、青）。図１５の青い曲線は、ＲＮＳ６０  ＡＳＷ灌流の開始の１２分後に記録された。同様の所見が５つの実験で見られた。したがって、ＲＮＳ６０  ＡＳＷは、ＡＴＰ枯渇に起因する低減からシナプス伝達を救助できなかった。
【０２７４】
図１９Ａ〜１９Ｃは、特定の例示的な態様による、シナプス小胞数に対するＲＮＳ６０及びオリゴマイシン（ｏｌｙｇｏｍｙｃｉｎ）の作用を示す。図１９Ａは、対照（緑）、ＲＮＳ６０（赤）、ならびにＲＮＳ６０及びオリゴマイシンのシナプス前注入（青）を用いた灌流後の、透明で小型のシナプス小胞の数を示す。図１９Ｂは、パネルＡと同じ３つの条件下の大型で不規則な小胞の数を示す。図１９Ｃは、パネルＡと同じ３つの条件下のクラセリン（ｃｌａｔｈｅｒｉｎ）被覆小胞の数。＊＜０．０５、マン−ホイットニー。
【０２７５】
対照終末（図１９Ａ、緑）と比較して、ＲＮＳ６０  ＡＳＷで灌流された終末（図１９Ａ、赤）におけるＳＳＶ数に統計的に有意な減少があった（Ｆ（１．１１４）＝５．９７、ｐ＜０．０５）。対照的に、ＣＣＶの数は、対照シナプス（図１９Ｃ、緑）よりもＲＮＳ６０シナプス（図１９Ｃ、赤）内で高かったが、この差は有意に達しなかった。加えて、大型小胞の数の増加は、シナプス前終末におけるＡＴＰレベルの上昇から予想されるように、小胞の代謝回転の増加を示唆する。これらの結果は、ミトコンドリアと小胞の形成及び利用能との間の関係に関する研究（Ｉｖａｎｉｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）と一致する。
【０２７６】
実施例１５
（正常な形態との３つの主な差異：１）クラスリン被覆小胞（ＣＣＶ）の数の増加、２）大直径小胞の数の増加、及び３）活性帯における通常の大きさのシナプス小胞の数の低減が、ＲＮＳ６０投与後のシナプス活性帯において認められ、これは放出動態の増加を示唆する）
ＲＮＳ６０処置シナプスの超微細構造的分析。シナプス前及びシナプス後形態の電子顕微鏡分析は、ＲＮＳ６０  ＡＳＷ投与後の、非常に良好に保存された超微細構造変化を明らかにした。大まかに言えば、超微細構造は、良好に保存されたサイトゾル特性ならびにミトコンドリアプロファイルを示した（図１６及び１８）。１μｍ２の各活性帯においてシナプス小胞及びＣＣＶの数を分析した。２個の対照シナプス及び３個のＲＮＳ６０  ＡＳＷシナプス内の２０〜２５個の活性帯で数量化を実施した。
【０２７７】
シナプス形態に関して、正常な形態との３つの主な差異：１）クラスリン被覆小胞（ＣＣＶ）の数の増加、２）大直径小胞（ＬＥＶ）の数の増加、及び３）活性帯における通常の大きさの透明なシナプス小胞（ＳＳＶ）の数の低減が、ＲＮＳ６０投与後のシナプス活性帯において認められ、これは放出動態の増加を示唆する。
【０２７８】
対照終末と比較して、ＲＮＳ６０  ＡＳＷで灌流された終末におけるＳＳＶ数に統計的に有意な減少があった（図１６Ａ、赤及び緑）。対照的に、ＣＣＶの数は、対照シナプスよりもＲＮＳ６０シナプス内で高かったが（図１６Ｂ、赤及び緑）、この差は有意に達しなかった。加えて、大型小胞（図１６Ｃ、赤及び緑）の数の大きな増加は、シナプス前終末におけるＡＴＰレベルの上昇から予想されるように、小胞の代謝回転の増加を示唆する。これらの結果は、ミトコンドリアと小胞の形成及び利用能との間の関係に関する研究（Ｉｖａｎｎｉｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）と一致する。
【０２７９】
具体的には、図１６Ａ〜１６Ｃは、特定の例示的な態様による、ＲＮＳ６０  ＡＳＷ灌流後のシナプス結合部の電子顕微鏡写真を示す。図１６Ａは、不規則な形状及び大きさの小胞が終末内に存在することを示す。青い点は大型シナプス様小胞を意味し、赤い点はクラスリン被覆小胞のマークを意味する。図１６Ｂは、より低い倍率のシナプス前及びシナプス後画像を示し、シナプス前終末（黄色の点）とともに活性帯を形成するいくつかの接点を作るシナプス後の指状部を示している。図１６Ｃは、大型小胞（図１６Ｃ、赤及び緑）の数の大きな増加を示す。
【０２８０】
図８Ａ及び８Ｂは、特定の例示的な態様による、ＲＮＳ６０  ＡＳＷで灌流されたシナプス内のシナプス小胞数の統計的測定を示す。図１７Ａは、大きさの関数としてのＣＣＶの数のプロットを示す。図１７Ｂは、大きさの関数としての大型小胞の数を示す。
【０２８１】
興味深いのは、ＲＳＮ６０の存在下及び非存在下の７０を超える異なる活性帯の研究における放出部位の超微細構造の直接比較が、ＲＮＳ６０  ＡＳＷの存在下で正常なシナプス小胞の数が有意に減少すると明らかにしたという事実である。加えて、大型小胞の数は、シナプス前終末におけるＡＴＰレベルの上昇から予想されるように、小胞の代謝回転の増加を示唆する。これらの結果は、ミトコンドリアと小胞の形成及び利用能との間の関係に関する研究（Ｉｖａｎｉｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）と一致する。
【０２８２】
オリオグマイシン（ｏｌｉｏｇｍｙｃｉｎ）を用いたＡＴＰ合成の遮断は、ＲＮＳ６０の作用を妨げる。オリゴマイシンで処置されたシナプスにおいて、超微細構造的分析からの結果は、すべてのシナプス小胞の種類における顕著な低減を示す。実際に、そのようなシナプスの画像（図１８）は、超微細構造は著しく変更されないが、活性帯近傍のすべての種類の小胞の数が大いに減少することを示す。
【０２８３】
図１８Ａ〜１８Ｃは、特定の例示的な態様による、オリゴマイシン注入後のヤリイカ巨大シナプス活性帯の超微細構造を示す。図１８Ａ〜１８Ｃ中、黒い矢印は、あるとしても少ないシナプス小胞を示す活性帯を示す。ＲＮＳ６０  ＡＳＷで灌流されたシナプスの存在下で通常見出されるＣＣＶ及び大型小胞プロファイルの欠如にも留意されたい。活性帯から離れて散乱する少ない小胞の存在にも留意されたい（赤い矢印）。
【０２８４】
小胞の実際の数を４個のシナプスから数量化し、異なる１８０個の活性帯の合計を調査した。
【０２８５】
向上したシナプス伝達態様の要約において。神経細胞間、または神経終末と筋系もしくは腺組織との間の電気的及び化学シナプス伝達の両方を制御する生物学的変数の決定は、数十年間にわたって非常に重要な生理学的調査の分野である。化学シナプス伝達は、事象の伝達利得、ならびに結合部の興奮性または阻害性の性質、及びその活性依存性増強または抑圧の両方に対処するという追加の魅力を有している。
【０２８６】
特定の態様によると、電荷安定化酸素含有ナノ構造体（例えば、酸素ナノ気泡）を含む電気運動的に変化させられたイオン性水溶液（例えば、出願者の米国特許第７，８３２，９２０号、同第７，９１９，５３４号、同第８，４１０，１８２号、同第８，４４５，５４６号、同第８，４４９，１７２号、及び同第８，４７０，８９３号に従って調製された、物理的に変更された等張食塩水であるＲＮＳ６０）へのニューロンの曝露は、例えば、（酸素ナノ気泡を含む等張食塩水（ＲＮＳ６０  ＡＳＷ）に基づく人工海水（ＡＳＷ）で灌流された）ヤリイカ巨大シナプスにおけるシナプス伝達によって例示されるように、ニューロン内のシナプス伝達の最適化をもたらす。これは、単一及び反復性のシナプス前スパイク活性化に対するシナプス後応答、自発性伝達物質放出、ならびにシナプス前電位固定研究を調査することによって決定された。このシナプス伝達の最適化は、ＲＮＳ６０ベースのＡＳＷを用いた灌流後の５〜１０分以内に安定した最大値に達した。
【０２８７】
ＲＮＳ６０  ＡＳＷ灌流中のシナプス後軸索におけるシナプス雑音の分析は、雑音動態の改変とともに自発性伝達物質放出の増加を明らかにした。この増加は、記録時間の期間、通常１時間にわたって維持された。シナプス放出は、単一事象として、または２００Ｈｚの反復性シナプス前刺激後のいずれかで、シナプス前活動電位の電気的活性化によって査定された。シナプス前終末の電位固定は、ＲＮＳ６０  ＡＳＷ灌流中のシナプス前ＩＣａ＋＋振幅の増加を伴わないシナプス後応答の増加を実証した。電子顕微鏡に基づく形態計測は、クラスリン被覆小胞、及び結合部位近傍の大型エンドソーム様小胞の数の増加とともに、活性帯におけるシナプス小胞密度及び数の減少を示した。最後に、オリゴマイシンのシナプス前注入によるミトコンドリアＡＴＰ合成の遮断は、自発性放出を顕著に減少させ、ＲＮＳ６０  ＡＳＷに見られるシナプス雑音増加を妨げた。超微細構造レベルでは、シナプス前結合部における活性帯における小胞の大きな低減、ならびに大型小胞の増加を伴うクラスリン被覆小胞の数の低減があった。ＲＮＳ６０  ＡＳＷがミトコンドリアＡＴＰ合成を増加させることによって作用するという可能性を、シナプス前及びシナプス後構造の両方におけるＡＴＰレベルの直接的決定によって試験した。ルシフェリン／ルシフェラーゼ光子放出を使用してこれを実行し、これはＲＮＳ６０投与後のＡＴＰ合成の顕著な増加を実証した。機構に束縛されることなく、ＲＮＳ６０は、シナプス伝達最適化をもたらすＡＴＰ合成の上方制御によって、シナプス伝達を陽性に調節する可能性がある。
【０２８８】
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９．Ｃｏｌｌｉｎｇｒｉｄｇｅ，Ｇ．Ｌ．，Ｐｅｉｎｅａｕ，Ｓ．，Ｈｏｗｌａｎｄ，Ｊ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｔ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １１，４５９−４７３
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１１．Ｍｉｓｈｉｚｅｎ−Ｅｂｅｒｚ，Ａ．Ｊ．，Ｒｉｓｓｍａｎ，Ｒ．Ａ．，Ｃａｒｔｅｒ，Ｔ．Ｌ．，Ｉｋｏｎｏｍｏｖｉｃ，Ｍ．Ｄ．，Ｗｏｌｆｅ，Ｂ．Ｂ．，ａｎｄ  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｄ．Ｍ．（２００４）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ  １５，８０−９２
１２．Ｄｅｓｊａｒｄｉｎｓ，Ｓ．，Ｍａｙｏ，Ｗ．，Ｖａｌｌｅｅ，Ｍ．，Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｄ．，Ｌｅ  Ｍｏａｌ，Ｍ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｈ．，ａｎｄ  Ａｂｒｏｕｓ，Ｄ．Ｎ．（１９９７）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ  １８，３７−４４
１３．Ｐｒｏｃｔｏｒ，Ｄ．Ｔ．，Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｄｏｄｄ，Ｐ．Ｒ．Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ  ２１，７９５−８１１
１４．Ｒｅｄｄｙ，Ｐ．Ｈ．，Ｍａｎｉ，Ｇ．，Ｐａｒｋ，Ｂ．Ｓ．，Ｊａｃｑｕｅｓ，Ｊ．，Ｍｕｒｄｏｃｈ，Ｇ．，Ｗｈｅｔｓｅｌｌ，Ｗ．，Ｊｒ．，Ｋａｙｅ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｍａｎｃｚａｋ，Ｍ．（２００５）Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ  ７，１０３−１１７；  ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  １７３−１８０
１５．Ｂｅｌｌ，Ｋ．Ｆ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｌ．，Ｆａｈｒｅｎｈｏｌｚ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ａ．Ｃ．（２００８）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ  ２９，５５４−５６５
１６．Ｇｏｏｄ，Ｐ．Ｆ．，Ｗｅｒｎｅｒ，Ｐ．，Ｈｓｕ，Ａ．，Ｏｌａｎｏｗ，Ｃ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｐｅｒｌ，Ｄ．Ｐ．（１９９６）Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １４９，２１−２８
１７．Ｌｉｐｔｏｎ，Ｓ．Ａ．，Ｃｈｏｉ，Ｙ．Ｂ．，Ｐａｎ，Ｚ．Ｈ．，Ｌｅｉ，Ｓ．Ｚ．，Ｃｈｅｎ，Ｈ．Ｓ．，Ｓｕｃｈｅｒ，Ｎ．Ｊ．，Ｌｏｓｃａｌｚｏ，Ｊ．，Ｓｉｎｇｅｌ，Ｄ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｓｔａｍｌｅｒ，Ｊ．Ｓ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４，６２６−６３２
１８．Ｓｅｌｖａｋｕｍａｒ，Ｂ．，Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｍ．Ａ．，Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｎ．Ｋ．，Ｈｕｇａｎｉｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｔｒａｙｎｅｌｉｓ，Ｓ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｓｎｙｄｅｒ，Ｓ．Ｈ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １１０，１０７７−１０８２
１９．Ｋｈａｓｎａｖｉｓ，Ｓ．，Ｊａｎａ，Ａ．，Ｒｏｙ，Ａ．，Ｍａｚｕｍｄｅｒ，Ｍ．，Ｂｈｕｓｈａｎ，Ｂ．，Ｗｏｏｄ，Ｔ．，Ｇｈｏｓｈ，Ｓ．，Ｗａｔｓｏｎ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｐａｈａｎ，Ｋ．（２０１２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８７，２９５２９−２９５４２
２０．Ｍｏｎｄａｌ，Ｓ．，Ｍａｒｔｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，Ｇｈｏｓｈ，Ｓ．，Ｗａｔｓｏｎ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｐａｈａｎ，Ｋ．（２０１２）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７，ｅ５１８６９
２１．Ｊａｎａ，Ｍ．，Ｊａｎａ，Ａ．，Ｐａｌ，Ｕ．，ａｎｄ  Ｐａｈａｎ，Ｋ．（２００７）Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２，２０１５−２０２２
２２．Ｓａｈａ，Ｒ．Ｎ．，Ｇｈｏｓｈ，Ａ．，Ｐａｌｅｎｃｉａ，Ｃ．Ａ．，Ｆｕｎｇ，Ｙ．Ｋ．，Ｄｕｄｅｋ，Ｓ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｐａｈａｎ，Ｋ．（２００９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８３，２０６８−２０７８
２３．Ｒｏｙ，Ａ．，Ｊａｎａ，Ａ．，Ｙａｔｉｓｈ，Ｋ．，Ｆｒｅｉｄｔ，Ｍ．Ｂ．，Ｆｕｎｇ，Ｙ．Ｋ．，Ｍａｒｔｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ  Ｐａｈａｎ，Ｋ．（２００８）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ４５，６８６−６９９
２４．Ｍｏｎｄａｌ，Ｓ．，Ｒｏｙ，Ａ．，Ｊａｎａ，Ａ．，Ｇｈｏｓｈ，Ｓ．，Ｋｏｒｄｏｗｅｒ，Ｊ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｐａｈａｎ，Ｋ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７，５４４−５５６
２５．Ｇｈｏｓｈ，Ａ．，Ｒｏｙ，Ａ．，Ｌｉｕ，Ｘ．，Ｋｏｒｄｏｗｅｒ，Ｊ．Ｈ．，Ｍｕｆｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．，Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．，Ｇｈｏｓｈ，Ｓ．，Ｍｏｓｌｅｙ，Ｒ．Ｌ．，Ｇｅｎｄｅｌｍａｎ，Ｈ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｐａｈａｎ，Ｋ．（２００７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０４，１８７５４−１８７５９
２６．Ｒｏｙ，Ａ．，Ｇｈｏｓｈ，Ａ．，Ｊａｎａ，Ａ．，Ｌｉｕ，Ｘ．，Ｂｒａｈｍａｃｈａｒｉ，Ｓ．，Ｇｅｎｄｅｌｍａｎ，Ｈ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｐａｈａｎ，Ｋ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７，ｅ３８１１３
２７．Ｒｏｙ，Ａ．，Ｆｕｎｇ，Ｙ．Ｋ．，Ｌｉｕ，Ｘ．，ａｎｄ  Ｐａｈａｎ，Ｋ．（２００６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１，１４９７１−１４９８０
２８．Ｌｉ，Ｌ．，Ｓｔｅｆａｎ，Ｍ．Ｉ．，ａｎｄ  Ｌｅ  Ｎｏｖｅｒｅ，Ｎ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７，ｅ４３８１０
２９．Ｉｍｐｅｙ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｒ．Ｈ．（２００１）Ｓｃｉ  ＳＴＫＥ  ２００１，ｐｅ１
３０．Ｂｉｔｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｔａｋｅｍｏｔｏ−Ｋｉｍｕｒａ，Ｓ．（２００３）Ｃｅｌｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ  ３４，４２５−４３０
３１．Ｘｉａ，Ｚ．，ａｎｄ  Ｓｔｏｒｍ，Ｄ．Ｒ．Ｌｅａｒｎ  Ｍｅｍ  １９，３６９−３７４
３２．Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇ，Ｔ．Ｒ．（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ２４，２３２−２３６
３３．Ｆｒａｎｋｅ，Ｔ．Ｆ．，Ｋａｐｌａｎ，Ｄ．Ｒ．，Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｌ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｔｏｋｅｒ，Ａ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５，６６５−６６８
３４．Ｋｏｙａｓｕ，Ｓ．（２００３）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４，３１３−３１９
３５．Ｉｓａａｃ，Ｊ．（２００１）Ｎｅｕｒｏｎ  ３２，９６３−９６６
３６．Ｄａｎｙｓｚ，Ｗ．，ａｎｄ  Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｃ．Ｇ．（２００３）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｇｅｒｉａｔｒ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １８，Ｓ２３−３２
３７．Ｇｅｅｒｔｓ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇ，Ｇ．Ｔ．（２００６）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４６，８Ｓ−１６Ｓ
３８．Ｒｏｓｓｏｍ，Ｒ．，Ａｄｉｔｙａｎｊｅｅ，ａｎｄ  Ｄｙｓｋｅｎ，Ｍ．（２００４）Ａｍ  Ｊ  Ｇｅｒｉａｔｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ  ２，３０３−３１２
３９．Ｇｒｉｎｅｖｉｃｈ，Ｖ．，Ｓｅｅｂｕｒｇ，Ｐ．Ｈ．，Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｍ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｊｅｚｏｖａ，Ｄ．Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｇｕｌ  ４６，１５３−１５９
４０．ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｆ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｍ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｂｅａｚｅｌｙ，Ｍ．Ａ．（２００６）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  １８，７１−８４
４１．Ｍｅｄｉｎａ，Ａ．Ｅ．，Ｌｉａｏ，Ｄ．Ｓ．，Ｍｏｗｅｒ，Ａ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｒａｍｏａ，Ａ．Ｓ．（２００１）Ｎｅｕｒｏｎ  ３２，５５３−５５５
４２．Ｙｉｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｄｅｌ  Ｖｅｃｃｈｉｏ，Ｍ．，Ｚｈｏｕ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｔｕｌｌｙ，Ｔ．（１９９５）Ｃｅｌｌ  ８１，１０７−１１５
４３．Ｌｅｅ，Ｈ．Ｋ．，Ｔａｋａｍｉｙａ，Ｋ．，Ｈａｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｍａｎ，Ｈ．，Ｋｉｍ，Ｃ．Ｈ．，Ｒｕｍｂａｕｇｈ，Ｇ．，Ｙｕ，Ｓ．，Ｄｉｎｇ，Ｌ．，Ｈｅ，Ｃ．，Ｐｅｔｒａｌｉａ，Ｒ．Ｓ．，Ｗｅｎｔｈｏｌｄ，Ｒ．Ｊ．，Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｈｕｇａｎｉｒ，Ｒ．Ｌ．（２００３）Ｃｅｌｌ  １１２，６３１−６４３
４４．Ｇｕｚｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｆ．，ａｎｄ  ＭｃＧａｕｇｈ，Ｊ．Ｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９４，２６９３−２６９８
４５．Ｉｍｐｅｙ，Ｓ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｍ．，Ｏｂｒｉｅｔａｎ，Ｋ．，Ｄｏｎａｈｕｅ，Ｒ．，Ｗａｄｅ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｓｔｏｒｍ，Ｄ．Ｒ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １，５９５−６０１
Ａｔｔｗｅｌｌ，Ｄ．，Ｌａｎｇｌｉｎ，Ｓ．Ｂ．，Ａｎ  ｅｎｅｒｇｙ  ｂｕｄｇｅｔ  ｆｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｒｅｙ  ｍａｔｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ．，Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．，２００１，２１（１０），１１３３−１１４５．
Ａｕｇｕｓｔｉｎｅ，Ｇ．Ｊ．ａｎｄ  Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍ．Ｐ．，Ｃａｌｃｉｕｍ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｏｓｔ−ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｔ  ｔｈｅ  ｓｑｕｉｄ  ｇｉａｎｔ  ｓｙｎａｐｓｅ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９８６．３８１：ｐ．６１９−６４０．
Ａｕｇｕｓｔｉｎｅ，Ｇ．Ｊ．，Ｍｏｒｇａｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｖｉｌｌａｌｂａ−Ｇａｌｅａ，Ｃ．Ａ．，Ｊｉｎ，Ｓ．，Ｐｒａｓａｄ，Ｋ．，Ｌａｆｅｒ，Ｅ．Ｍ．，Ｃｌａｔｈｒｉｎ  ａｎｄ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ：ｓｔｕｄｉｅｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｓｑｕｉｄ  ｇｉａｎｔ  ｓｙｎａｐｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，２００６．３４（Ｐｔ  １）：ｐ．６８−７２．
Ｂｉｌｌｕｐｓ，Ｂ．，Ｆｏｒｓｙｔｈｅ，Ｉ．Ｄ．，Ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｏｒｉａｌ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ａｔ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｓｙｎａｐｓｅｓ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００２，２２（１４），８４０−８４７．
Ｂｕｒｎｓ，Ｍ．Ｅ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．，Ｔａｋａｉ，Ｙ．，Ａｕｇｕｓｔｉｎｅ，Ｇ．Ｊ．，Ｒａｂｐｈｉｌｉｎ−３Ａ：Ａ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｔｒａｆｆｉｃ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９８，１１１（２），２４３−２５５．
Ｃｏｌｔｏｎ，Ｃ．，Ｙａｏ，Ｊ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｙ．，Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｘａｎｔｈｉｎｅ／ｘａｎｔｈｉｎｅ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｎ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ．Ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９１．１４（５−６）：ｐ．３８５−３９３．
Ｃｏｌｔｏｎ，Ｃ．Ａ．，Ｊ．Ｓ．Ｃｏｌｔｏｎ，ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｄ．Ｌ．，Ｏｘｙｇｅｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ  ｏｆ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  ｓｑｕｉｄ  Ｌｏｌｉｇｏ  ｐｅａｌｅｉ  ｇｉａｎｔ  ｓｙｎａｐｓｅ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９９２．１０２（２）：ｐ．２７９−２８３．
Ｄａｌｙ，Ｃ．，Ｓｕｇｉｍｏｒｉ，Ｍ．，Ｍｏｒｅｉｒａ，Ｊ．Ｅ．，Ｚｉｆｆ，Ｅ．Ｂ．，Ｌｌｉｎａｓ，Ｒ．，Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ．ＰＮＡＳ，２０００．９７（１１）：ｐ．６１２０−６１２５．
Ｄａｖｉｄ  Ｇ．，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  Ｃａ２＋  ｉｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｌｉｚａｒｄ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｒｖｅ  ｔｅｒｍｉｎａｌｓ  ｐｒｏｃｅｅｄｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｅｌｅｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｍａｔｒｉｘ  ［Ｃａ２＋］  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９９；１９：７４９５−７５０６．
Ｆｒｏｅｓｃｈ，Ｄ．ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，Ｒ．，Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｑｕｉｄ  ｇｉａｎｔ  ｆｉｂｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｒａｉｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９７２．４３（２）：ｐ．５７３−５７９．
Ｆｕｋｕｄａ  Ｍ．，Ｍｏｒｅｉｒａ，Ｊ．Ｅ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｆ．Ｍ．，Ｓｕｇｉｍｏｒｉ，Ｍ．，Ｎｉｉｎｏｂｅ，Ｍ．Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，Ｋ．，Ｌｌｉｎａｓ，Ｒ．，Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃ２Ｂ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｎｄ  ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ  ａｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｑｕｉｄ  ｇｉａｎｔ  ｓｙｎａｐｓｅ  ｐｒｅｔｉｅｒｍｉｎａｌ．，ＰＮＡＳ，１９９５，９２（２３），１０７０８−１０７１２．
Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，Ｊ．Ｉ．，Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｑｕｉｄ  ｇｉａｎｔ  ｓｙｎａｐｓｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｌｏｎｄｏｎ．Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ，Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐａｐｅｒｓ  ｏｆ  ａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ．Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９７９．２０６（１１６４）：ｐ．２９３−３０６．
Ｈａｇｉｗａｒａ，Ｓ．ａｎｄ  Ｔａｓａｋｉ，Ｉ．，Ａ  ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｉｍｐｕｌｓｅ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｇｉａｎｔ  ｓｙｎａｐｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｑｕｉｄ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９５８．１４３（１）：ｐ．１１４−３７．
Ｈａｙａｓｈｉ  Ｍ．，Ｒａｉｍｏｎｄｉ  Ａ．Ｏ’Ｔｏｏｌｅ  Ｅ．，Ｐａｒａｄｉｓｅ  Ｓ．，Ｃｏｌｌｅｓｉ  Ｃ．Ｃｒｅｍｏｎａ  Ｏ．Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｓ．Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅ  Ｃａｍｉｌｉ  Ｐ．Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｓｔｉｍｕｌｕｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｄｙｎａｍｉｎ  １−ｎｕｌｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ．ＰＮＡＳ  １０５：２１７５−２１８０，２００８．
Ｈｅｕｓｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｒｏｏｓｅ，Ｔ．Ｓ．，Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ  ｏｆ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｔ  ｔｈｅ  ｆｒｏｇ  ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｌａｒ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１９７３，５７（２），３１７−３３１．
Ｉｖａｎｎｉｋｏｖ，Ｍ．Ｖ．，Ｓｕｇｉｍｏｒｉ，Ｍ．ａｎｄ  Ｒ．Ｒ．Ｌｌｉｎａｓ．Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｎｅｒｇｙ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ｎｅｕｒｏｎｓ，Ｃｅｌｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ  ２０１０，４７：ｐ．５０７−５１３．
Ｊｏｎａｓ，Ｅ．Ａ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，２００４．３６（４）：ｐ．３５７−３６１．
Ｊｏｎａｓ，Ｅ．Ａ．，Ｈｉｃｋｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｈａｒｄｗｉｃｋ，Ｊ．Ｍ．，Ｋａｃｚｍａｒｅｋ，Ｌ．Ｋ．，Ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ｈｙｐｏｘｉａ  ｒａｐｉｄｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｃｈａｎｎｅｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｗｉｔｈｉｎ  ａ  ｌｉｖｉｎｇ  ｓｙｎａｐｓｅ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５．２８０（６）：ｐ．４４９１−４４９７．
Ｋａｔｚ，Ｂ．ａｎｄＭｉｌｅｄｉ，Ｒ．，Ａ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｎｅｒｖｅ  ｉｍｐｕｌｓｅｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９６７．１９２（２）：ｐ．４０７−４３６．
Ｋａｔｚ，Ｂ．ａｎｄ  Ｍｉｌｅｄｉ，Ｒ．，Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｇａｎｇｌｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｑｕｉｄ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９７１．２１６（２）：ｐ．５０３−５１２．
Ｋｈａｓｎａｖｉｓ，Ｓ．，Ｊａｎａ，Ａ，Ｒｏｙ，Ａ．，Ｍａｚｕｍｄｅｒ，Ｍ．，Ｂｈｕｓｈａｎ，Ｂ．，Ｗｏｏｄ，Ｔ．，Ｇｈｏｓｈ，Ｓ．，Ｗａｔｓｏｎ，Ｒ．，Ｐａｈａｎ，Ｋ．，Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−κＢ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａ  ｂｙ  ｐｈｙｄｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓａｌｉｎｅ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１２，２８７（３５），２９５２９−２９５４２．
Ｋｕｓａｎｏ，Ｋ．，Ｆｕｒｔｈｅｒ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｒｅ−  ａｎｄ  ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｑｕｉｄ  ｇｉａｎｔ  ｓｙｎａｐｓｅ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９６８．５２（２）：ｐ．３２６−４５．
Ｋｕｓａｎｏ，Ｋ．ａｎｄ  Ｌａｎｄａｕ，Ｅ．Ｍ．，Ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  ｓｑｕｉｄ  ｇｉａｎｔ  ｓｙｎａｐｓｅ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９７５．２４５（１）：ｐ．１３−３２．
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Ｌｌｉｎａｓ，Ｒ．，Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｉ．Ｚ．，ａｎｄ  Ｗａｌｔｏｎ，Ｋ．，Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎ  ｓｑｕｉｄ  ｇｉａｎｔ  ｓｙｎａｐｓｅ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ，１９８１．３３（３）：ｐ．３２３−３５１．
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Ｌｌｉｎａｓ，Ｒ．，Ｓｕｇｉｍｏｒｉ，Ｍ．，Ｌｉｎ，Ｊ．Ｗ．，Ｌｅｏｐｏｌｄ，Ｐ．ａｎｄ  Ｂｒａｄｙ，Ｓ．ＡＴＰ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｍｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒａｔ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｏｆ  ｓｑｕｉｄ  ｇｉａｎｔ  ｓｙｎａｐｓｅ．ＰＮＡＳ，１９８９，Ｖｏｌ．８６，ｐ  ５６５６−５６６０．
Ｍａｎｎ，Ｄ．Ｗ．ａｎｄ  Ｊｏｙｎｅｒ，Ｒ．Ｗ．，Ｍｉｎｉａｔｕｒｅ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｓｑｕｉｄ  ｇｉａｎｔ  ｓｙｎａｐｓｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９７８．９（４）：ｐ．３２９−３３５．
Ｍａｙｏｒ，Ｓ．，Ｐａｇａｎｏ，Ｒ．Ｅ．，Ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２００７，８（８），６０３−６１２．
ＭｃＥｌｒｏｙ，Ｗ．Ｄ．，Ｔｈｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ．ＰＮＡＳ  １９４７．ｖｏｌ．３３，ｐ３４２−３４５．
Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，Ｋ．，Ｆｕｋｕｄａ，Ｍ．，Ｍｏｒｉｅｒａ，Ｊ．Ｅ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｆ．Ｍ．，Ｓｕｇｉｍｏｒｉ，Ｍ．，Ｎｉｉｎｏｂｅ，Ｍ．，Ｌｌｉｎａｓ，Ｒ．，Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｃ２Ａ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｓｑｕｉｄ  ｇｉａｎｔ  ｓｙｎａｐｓｅ  ｐｒｅｔｅｒｍｉｎａｌ．，ＰＮＡＳ，１９９５，９２（２３），１０７０３−１０７０７．
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Ｍｏｎｄａｌ，Ｓ．，Ｍａｒｔｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，Ｇｈｏｓｈ，Ｓ．，Ｗａｔｓｏｎ，Ｒ．，Ｐａｈａｎ，Ｋ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒｅｇｓ，ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈ１  ａｎｄ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｂｙ  ｐｈｙｓｉｃａｌｌｙ  −  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓａｌｉｎｅ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１２，７（１２）ｅ５１８６９．
Ｍｏｒｇａｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｐｒａｓａｄ，Ｋ．，Ｈａｏ，Ｗ．，Ａｕｇｕｓｔｉｎｅ，Ｇ．Ｊ．，Ｌａｆｅｒ，Ｅ．Ｍ．，Ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｃｌａｔｈｒｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｍｏｔｉｆ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ：ｔｈｅ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０００．２０（２３）：ｐ．８６６７−８６７６．
Ｐａｌａｙ，Ｓ．Ｌ．，Ｓｙｎａｐｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．，Ｊ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｌ．，１９５６，２  （４  Ｓｕｐｐｌ），１９３−２０２．
Ｐｉｖｏｖａｒｏｖａ，Ｎ．Ｂ．，Ｈｏｇｐａｉｓａｎ，Ｊ．，Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｓ．Ｂ．，Ｆｒｉｅｌ，Ｄ．Ｄ．，Ｄｅｐｏｌｉｚａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｃａ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｎｓ：Ｓｐａｔｉａｌ  ａｎｄ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９９９，１９（１５），６３７２−６３８４．
Ｐｏｔｈｏｓ，Ｅ．Ｎ．，Ｌａｒｓｅｎ，Ｋ．Ｅ．，Ｋｒａｎｔｚ，Ｄ．Ｅ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｈａｙｃｏｃｋ，Ｊ．Ｗ．，Ｓｅｔｌｉｋ，Ｗ．，Ｇｅｒｓｈｏｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｒ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｓｕｌｚｅｒ  Ｄ．，Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｖｅｓｉｃｌｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｖｅｓｉｃｌｅ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  Ｑｕａｎｔａｌ  Ｓｉｚｅ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２０（１９）：７２９７−７３０６．
Ｓａｈｅｈｉ  Ｙ  ａｎｄ  Ｄｅ  Ｃａｍｉｌｉ  Ｐ  Ｓｙｎａｐｉｃ  Ｖｅｓｉｃｌｅ  Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １−３０  ２０１２．
Ｔａｌｂｏｔ，Ｊ．Ｄ．，Ｄａｖｉｄ，Ｇ．，Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｅ．Ｆ．，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｃａ２＋  ｕｐｔａｋｅ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｐｈａｓｉｃ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｍｏｔｏｒ  ｔｅｒｍｉｎａｌｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ  ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ  ｏｎ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  Ｃａ２＋  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．２００３．９０：４９１−５０２．
Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ａ．ａｎｄ  Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｎ．Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｐｒｅ  ａｎｄ  ｐ１ｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  ａｘｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｉａｎｔ  ｓｙｎａｐｓｅ  ｏｆ  Ｌｏｌｉｇｏ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９６２，４５：１１８１−１１９３．
Ｖｅｒｖｅｅｎ，Ａ．Ａ．ａｎｄ  Ｄｅ  Ｆｅｌｉｃｅ，Ｌ．Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｎｏｉｓｅ．Ｐｒｏｇ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９７４，２８：１８９−２６５．
Ｖｅｒｓｔｒｅｋｅｎ，Ｐ．，Ｌｙ，Ｃ．Ｖ．，Ｖｅｎｋｅｎ，Ｋ．Ｊ．，Ｋｏｈ，Ｔ．Ｗ．Ｚｈｏｕ，Ｙ．，Ｂｅｌｌｅｎ，Ｈ．Ｊ．，Ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ａｒｅ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｅｒｖｅ  ｐｏｏｌ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ａｔ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｌａｒ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ．，Ｎｅｕｒｏｎ，２００５，４７（３），３６５−３７８．
Ｖｏｓ，Ｍ．，Ｌａｕｗｅｒｓ，Ｅ．，Ｖｅｒｓｔｒｅｋｅｎ，Ｐ．，Ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ｉｎ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｅｒｓｉｃｌｅ  ｐｏｏｌｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｆｒｏｎｔ．Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｎｅｕｒｏｓｉ．，２０１０，２：１３９．
Ｗｅｉｇｈｔ，Ｆ．Ｆ．ａｎｄ  Ｅｒｕｌｋａｒ，Ｓ．Ｄ．，Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｂｙ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  ａｃｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７６．１９３（４２５７）：ｐ．１０２３−１０２５．
参照による援用。上記の米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、及び本明細書において言及され、かつ／または出願データシートに列記される非特許公開物のすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２８９】
図面及び本明細書における詳細説明は、制限的ではなくむしろ例示的に考慮されるべきであり、開示される特定の形態及び実施例に本発明を限定するよう意図するものではないことを理解されたい。対照的に、本発明は、以下の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、当業者にとって明らかなあらゆるさらなる改変、変更、再配置、置換、代替物、設計の選択、及び実施形態を含む。したがって、以下の特許請求の範囲は、そのようなさらなる改変、変更、再配置、置換、代替物、設計の選択、及び実施形態をすべて包括するものとして解釈されることが意図される。
【０２９０】
前述の記載された実施形態は、異なる他の構成要素の中に含まれるか、またはそれに接続する、異なる構成要素を表す。表されたそのような構成は単なる例示であり、実際は同じ機能性を達成する多くの他の構成が実施され得ることを理解されたい。概念的な意味では、同じ機能性を達成する構成要素のあらゆる配置が、所望の機能性が達成されるように有効に「関連している」。したがって、本明細書において特定の機能性を達成するように組み合わされるいかなる２つの構成要素も、構成または中間の構成要素を問わず、所望の機能性が達成されるように互いと「関連している」ものとして見なされることができる。同様に、そのように関連するいかなる２つの構成要素も、所望の機能性を達成するために互いと「操作可能に接続している」または「操作可能に結合している」ものとして見なされてもよい。
【０２９１】
本発明の特定の実施形態を示し記載したが、本明細書における教示に基づいて、本発明及びそのより広範な態様から逸脱することなく変更及び改変がなされ得、ひいては添付の特許請求の範囲が、本発明の真の趣旨及び範囲の範囲内であるようにそのような変更及び改変すべてをその範囲内に包含することは、当業者にとって明らかであろう。さらに、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ定義されるものと理解されたい。概して、本明細書、特に添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求の範囲の本文）において使用される用語は、概して「非限定的な（ｏｐｅｎ）」用語として意図される（例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「〜を含むがこれらに限定されない」として解釈されるべきであり、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、「少なくとも〜を有する」として解釈されるべきであり、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語は、「〜を含むがこれらに限定されない」などとして解釈されるべきである）ことを、当業者であれば理解するであろう。さらに、当業者であれば、導入された請求項の特定の番号の記載が意図される場合、そのような意図は特許請求の範囲に明確に記載され、そのような記載が存在しない場合はそのような意図が存在しないことを理解するであろう。例えば、理解を助けるものとして、以下の添付の特許請求の範囲は、請求項の記載を導入するために「少なくとも１つ」及び「１つ以上」という導入表現の使用を含む場合がある。しかしながら、そのような表現の使用は、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という不定冠詞による請求項の記載の導入が、同一の請求項が「１つ以上」または「少なくとも１つ」という導入表現、及び「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」などの不定冠詞を含む場合であっても、そのような導入された請求項の記載を含むあらゆる特定の請求項を、そのような記載１つのみを含む発明に限定することを暗示するものとして解釈されるべきではなく（例えば、「１つの（ａ）」及び／または「１つの（ａｎ）は典型的に、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味するものと解釈されるべきであり）、請求項の記載を導入するために使用される定冠詞の使用についても同じことが言える。加えて、導入された請求項の特定の番号の記載が明確に記載される場合であっても、当業者であれば、そのような記載が典型的に少なくとも記載される番号を意味するよう解釈されるべきである（例えば、他の修飾語句を伴わない「２つの記載」という単なる記載は典型的に、少なくとも２つの記載、または２つ以上の記載を意味する）ことを認識するであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によるものを除いて限定されない。
【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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