(57)【要約】  本発明は、(a)懸濁細胞培養において栄養培地中で、タプシア属の植物細胞を培養する工程、ここで該細胞は、タプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンを産生する；および(b) (a)で産生されたタプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンを回収する工程を含む、タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンを産生する方法に関する。本発明はさらに、タプシア属の植物細胞を含む懸濁細胞培養であって、該植物細胞が、タプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンを産生し得る、懸濁細胞培養、および前記懸濁細胞培養から得られたタプシア属の植物細胞を含む植物細胞バイオマスに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)懸濁細胞培養において栄養培地中で、タプシア属の植物細胞を培養する工程、ここで該細胞は、タプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンを産生する；および
(b) (a)で産生されたタプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンを回収する工程
を含む、タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンを作製する方法。
【請求項２】
工程(b)で回収されたタプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンが、2β,3α,7β,8α,10β,11α-六酸化-6β,12-グアヤノリド核(guaianolide nucleus)を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンがタプシガルギンである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
工程(b)で回収されたタプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンが3α,7β,8α,10β,11α-五酸化-6β,12-グアヤノリド核を含む、請求項１〜３いずれか記載の方法。
【請求項５】
該植物細胞が、タプシアガルガニカ(Thapsia garganica)細胞、タプシアギムネシカ(Thapsia gymnesica)細胞およびタプシアビローサ(Thapsia villosa)細胞からなる群より選択される、請求項１〜４いずれか記載の方法。
【請求項６】
該植物細胞が、非胚発生細胞である、請求項１〜５いずれか記載の方法。
【請求項７】
工程(a)の前に、
(a-0)培地上で、タプシア植物外植片を培養し、それにより脆いカルス材料を得るさらなる工程
をさらに含む、請求項１〜６いずれか記載の方法。
【請求項８】
工程(a)における栄養培地が、1週間に少なくとも50%の増殖の増加を誘導し得る増殖培地である、請求項１〜７いずれか記載の方法。
【請求項９】
該栄養培地が、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸を含まない、請求項１〜８いずれか記載の方法。
【請求項１０】
タプシア属の植物細胞を含む、懸濁細胞培養であって、該植物細胞が、タプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンを産生し得る、懸濁細胞培養。
【請求項１１】
請求項１０記載の懸濁細胞培養から得られるタプシア属の植物細胞を含む、植物細胞バイオマス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、(a)懸濁細胞培養において栄養培地中で、タプシア属(genus Thapsia)の植物細胞を培養する工程、ここで該細胞は、タプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンを産生する；および(b) (a)で産生されたタプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンを回収する工程を含む、タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンを産生する方法に関する。さらに、本発明は、タプシア属の植物細胞を含む懸濁細胞培養であって、該植物細胞が、タプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンを産生し得る懸濁細胞培養、および前記懸濁細胞培養から得られたタプシア属の植物細胞を含む植物細胞バイオマスに関する。
【０００２】
本明細書において、特許出願および製造業者のマニュアルを含むいくつかの書類が引用される。これらの書類の開示は、この発明の特許性に関連があるものとは考えられないが、それらの全体において参照により本明細書に援用される。より具体的に、全ての参照される書類は、それぞれ個々の書類が具体的および個々に参照により援用されることが指示されるかのように、同じ程度に参照により援用される。
【背景技術】
【０００３】
背景
植物は、医薬品を含む広い範囲の化合物を含む。多くの場合、かかる二次代謝産物は、薬学的活性について調査されている。最も顕著な例は、イチイ属のメンバーにより発現される抗癌化合物パクリタキセルである。何年も前から、医薬有効成分としてパクリタキセルを含む製品が市販されている。パクリタキセルは、高度に増殖するヒト細胞(早い細胞増殖は多くの腫瘍の特徴である)を効率的に殺傷することが示されている。
【０００４】
セスキテルペンラクトンの化学クラスに属する天然に存在するタプシガルギンは、それらの細胞死誘導活性について調べられている。セスキテルペンラクトンのタプシガルギンファミリーのメンバーは、増殖とは独立した様式のアポトーシス誘導因子として作用することが見出された。タプシガルギンファミリーの1つの異なるメンバーであるタプシガルギン(図1)は、筋小胞体カルシウム輸送ATPアーゼ(SERCA)ファミリーの特異的な阻害剤であることが発見され、癌との戦いにおける有力な使用が示唆されている。例えば前立腺癌細胞などの癌細胞に対してタプシガルギンを標的化するために、タプシガルギンを、例えば前立腺特異的抗原(PSA)などの癌細胞特異的タンパク質分解酵素のための選択基質として作用するペプチドにコンジュゲートし得る[SB Christensen et al. 2009, Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry; 9: 276-294]。細胞傷害性化合物としてタプシガルギンを含むこのようないわゆるプロドラッグは、現在臨床開発中である。
【０００５】
タプシガルギンファミリーメンバーは、通常、例えばタプシアガルガニカ(Thapsia garganica)、タプシアトランスタガナ(Thapsia transtagana)およびタプシアビローサ(Thapsia villosa)などのタプシア属の植物、または表2に参照される任意のタプシア植物から単離される。タプシア属の異なるメンバーにおけるタプシガルギンの分布は異なり得る。最も顕著な化合物タプシガルギンは、タプシアガルガニカから最初に単離されたが、タプシア属の他のメンバーにおいても同定されている。
【０００６】
現在、タプシアガルガニカ植物は、化合物タプシガルギンの複雑な化学構造のために経済的に妥当な価格で化学的に合成することができないため、化合物タプシガルギンについての唯一の市販される妥当な供給源である。価値のある植物由来の二次代謝産物の産生のためのインビトロ培養は、代替的な供給源として長く認識されている。インビトロ培養の拡張性(scalability)は、持続可能な様式で天然の環境から独立して、大量の所定の化合物の商業的な供給を可能にする。
【０００７】
Jaegerら[Jaeger et al. 1993; Plant Cell Reports: 12, 517-520]は、タプシガルギンの産生のための代替的な供給源としてインビトロで成長させたタプシア種を調べた。Jaegerらは、固形培地上で成長させたインビトロで分化した植物材料、すなわち緑色子葉(green cotyledonary)胚、苗条および根を調べた際に、前記植物材料中で、五酸化タプシガルギンノルトリロボリド(nortrilobolid)およびトリロボリドを同定した。しかしながら、六酸化タプシガルギンは同定されなかった。Smitt et al. 1996 [Smitt, UW, Jaeger, AK, and Nyman, U; XXIV Thapsia garganica L.: In vitro culture, somatic embryogenesis, and the production of Thapsigargins; In: Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol 37; Medicinal and Aromatic Plants IX (By YPS Bajaj編); Springer-Verlag Berlin Heidelberg 1996]も参照。
【０００８】
さらに、固形培地または懸濁培養のいずれかで成長させたカルス、前胚培養物または球状期(globular stage)の胚などの他のインビトロ材料を使用した場合、これらの著者らによりタプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンは全く同定されなかった。
【０００９】
したがって、タプシガルギンの産生のための植物細胞培養を確立する方法について多くの努力が費やされたという事実に関わらず、植物細胞培養物、特に大規模アプローチに適した培養物からのこれらの化合物の経済的で簡便な産生を可能にする方法は、これまでには存在しない。よって、依然として、かかる方法およびかかる細胞培養を提供するための必要性がある。
【００１０】
この必要性は、特許請求の範囲に特徴付けられる態様の要件により解決される。
【発明の概要】
【００１１】
発明の概要
本発明は、植物細胞培養から、タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンを産生する種々の方法を提供する。該発明の1つの目的は、懸濁培養物から商業的に有意な量の最終生成物を得ることである。
【００１２】
したがって、該発明は、栄養培地中でタプシア属の植物細胞を培養して、1つ以上のタプシガルギンを産生する細胞培養物を形成すること、および1つ以上のタプシガルギンを回収することにより、懸濁細胞培養からタプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンを産生する方法を提供する。
【００１３】
好ましくは、植物細胞はタプシア細胞である。より好ましくは、植物細胞は、タプシアガルガニカ、タプシアビローサ、タプシアトランスタガナ、タプシアギムネシカ(Thapsia gymnesica)、タプシアマキシマ(Thapsia maxima)、タプシアデクサーテ(Thapsia decussate)、タプシアラシニアータ(Thapsia laciniata)、例えば亜種/品種、タプシアガルガニカdecussata亜種、angusta品種、タプシアビローサdissecta品種、タプシアビローサmicrocarpa品種およびタプシアビローサstenoptera品種由来の細胞からなる群より選択される。さらに好ましくは、該細胞は、未分化の細胞、脱分化した細胞もしくは分裂組織細胞またはそれらの混合物であるが、胚性細胞ではない。
【００１４】
植物細胞を増殖培地中で培養することがさらに好ましい。より好ましくは、該増殖培地は、1週間に少なくとも50%の増殖増加を誘導し得る。代替的に、または追加的に、該植物細胞は産生培地中で培養される。さらに好ましくは、該植物細胞は増殖培地中で培養され、次いで産生培地中で増殖される。好ましくは、増殖培地と産生培地は異なる。増殖培地は、植物増殖制御因子2,4-Dを含まないこと、および/または産生培地は、植物増殖制御因子2,4-Dを含まないことがさらに好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
図面は以下を示す：
【図１】図1：タプシガルギンファミリーの五酸化セスキテルペンラクトンの一般的な中心構造、置換基R1およびR2の詳細な概要については表1参照。
【図２】図2：タプシガルギンの分子構造。
【図３】図3：UPLC/MSにより分析された非胚性懸濁細胞培養由来のタプシアガルガニカバイオマス試料およびタプシガルギン標準のUPLC-MS/MS-スペクトル。タプシガルギン(m/z = 668; M+NH4+)の母イオンから得られた2つの娘イオン(第1(標準)および第3(試料)、グラフm/z = 491、ならびに第2(標準)および第4(試料)、グラフm/z = 551)は、非胚性懸濁細胞培養物由来の試料における雑音レベルを超えて検出された。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、(a)懸濁細胞培養において栄養培地中でタプシア属の植物細胞を培養する工程、ここで該細胞は、タプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンを産生する；および(b) (a)で産生されたタプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンを回収する工程を含む、タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンを産生する方法に関する。
【００１７】
本明細書において用語「タプシガルギン」と交換可能に使用される用語「タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトン」は、2β,3α,7β,8α,10β,11α-六酸化-6β,12-グアヤノリド核(guaianolide nucleus)、すなわち六酸化タプシガルギン(図1)、または3α,7β,8α,10β,11α-五酸化-6β,12-グアヤノリド核、すなわち五酸化タプシガルギンを含む、グアヤノリドのスーパーファミリーの任意のメンバーをいう。タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンの特徴は、ラクトン環のトランスアネレーション(trans-annelation)を生じる7β-ヒドロキシ基である。タプシガルギンファミリーの非限定的なメンバーは、O(2)およびO(8)に結合するアシル基の構造が異なる、タプシガルギン (図2)、タプシガルギシン(thapsigargicin)、タプシトランスタギン(thapsitranstagin)、タプシビロシン(thapsivillosin)A、タプシビロシンB、タプシビロシンC、タプシビロシンD、タプシビロシンE、タプシビロシンG、タプシビロシンH、タプシビロシンI、タプシビロシンJおよびタプシビロシンKなどの六酸化タプシガルギン、ならびにO(8)に結合するアシル基の構造が異なる、トリロボリド、ノルトリロボリドおよびタプシビロシンFなどの五酸化タプシガルギンである[Christensen et al. 1997; 129-167; in Progress in the Chemistry of Organic Natural Compounds; Ed. Herz, Kirby, Moore, Steglich and Tamm; Springer-Verlag Wien; ISBN 3-211-82850-8]。
【００１８】
【表１】
2016538887.tif 000002
【００１９】
好ましくは、タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンは、タプシア細胞から産生され得るタプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンである。さらに好ましくは、タプシア細胞から産生され得るタプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンは、化合物タプシガルギンである。
【００２０】
タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンが治療活性を有すること、またはタプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンを修飾して、生体活性化合物を生じ得ることも好ましい。生体活性化合物は、例えば[US 7,468,345]に記載されるような、標的化ペプチドに融合された、治療活性を有するタプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンを含むことを特徴とする。好ましい態様において、タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンは、それ自身で治療活性を有し、ヒトまたは動物の身体における特定の環境について、前記ヒトおよび動物の身体における環境で、例えば限定されないがプロテアーゼにより特異的に切断される標的化ペプチドに融合されることにより、標的化され得る。
【００２１】
本明細書で使用する場合、用語、含む(comprising)は、具体的に記載される工程および/または成分に加えて、さらなる工程および/または成分が含まれ得ることを記す。しかしながら、この用語は、特許請求される主題が、正確に、記載される工程および/または成分からなることも包含する。
【００２２】
本発明によると、先に定義されるように、タプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンを産生するために、タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンを産生する細胞を培養する。用語「タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンを産生する細胞」は、少なくとも1つの培養条件の設定下でタプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンを産生し得る任意の細胞をいう。本発明によると、「タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンを産生する細胞」は、該発明の方法において定義される培養条件下で検出可能な量でタプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンを産生する細胞である。
【００２３】
該発明の方法によると、該細胞培養物は、タプシア属の細胞を含む。タプシア属の植物としては、限定されないが、以下の表2に示されるように、タプシアガルガニカ、タプシアビローサ、タプシアトランスタガナ、タプシアギムネシカ、タプシアマキシマ、タプシアデクサーテ、タプシアラシニアータ、例えば亜種/品種、タプシアガルガニカdecussata亜種、angusta品種、タプシアビローサdissecta品種、タプシアビローサmicrocarpa品種およびタプシアビローサstenoptera品種が挙げられる。該発明の方法の好ましい態様において、該培養物の植物細胞は、タプシアガルガニカ細胞、タプシアギムネシカ細胞およびタプシアビロ細胞からなる群より選択される。該発明の方法のより好ましい態様において、該細胞培養物は、タプシアガルガニカ細胞を含む。
【００２４】
【表２】
2016538887.tif 000003
【００２５】
例えば、1つおよび同じ懸濁細胞培養における細胞は、1つ以上の種、亜種、品種または系統由来であり得る。好ましくは、該細胞は、1つの種、より好ましくは1つの亜種、さらに好ましくは1つの品種、最も好ましくは1つの系統由来である。
【００２６】
懸濁細胞培養を開始するために使用される植物組織は、任意の植物組織、好ましくは、例えばタプシガルギンファミリーの1つ以上の特定のセスキテルペンラクトンの産生に有利な能力に基づいて選択される組織であり得る。懸濁培養の開始における使用のための組織の非限定的な例は、例えば根、葉、茎、分裂組織または前もって形成されるカルス、好ましくは脆いカルス材料から得られる細胞などの植物器官から得られる細胞である。植物細胞は、植物または凍結保存された細胞から直接得られる細胞であり得る。
【００２７】
該方法は、栄養培地中で懸濁培養物を培養する工程を含む。該方法はまた、栄養培地中で懸濁培養物を培養する1つより多くの工程を含み得る。
【００２８】
本発明によると、栄養培地が使用される。本明細書で使用する場合、用語「栄養培地」は、植物細胞カルス(calli)の培養および/または懸濁培養に適した培地をいう。用語「栄養培地」は、「増殖培地」と「産生培地」の両方を包含する。用語「増殖培地」は、培養される細胞の増殖に有利である栄養培地をいう。好ましい態様において、増殖培地は、1週間に少なくとも50%の増殖増加を提供する。排他的ではなく好ましくは、増殖増加は、乾燥重量に基づいて決定される。より好ましくは、増殖増加は、生の(fresh)重量に対して決定される。本発明によると、「産生培地」は、タプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンの産生に有利な栄養培地である。増殖は産生培地中でも起こり得ること、および産生は増殖培地中で起こり得ることが理解されるので、増殖培地および産生培地は同一であってもよい。しかしながら、より好ましくは、産生培地は、使用される増殖培地よりも高い程度までの標的化合物の産生に有利であるものが選択される。
【００２９】
当該技術分野において、細胞増殖は一般に、バランスがとれているかまたは比較的低い炭素 対 窒素およびリンなどの無機成分の割合で有利であり、細胞増殖は、比較的高い炭素 対 無機成分の割合により制限されることが周知である。したがって、産生培地は、細胞増殖とは反対に、タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトン産生を促進するように、増殖が限定された条件、例えば高い割合の炭素 対 無機成分を利用し得る[例えば、Majerus F. & Pareilleux A., “Alkaloid accumulation in Ca-alginate entrapped cells of Catharanthus roseus: Using a limiting growth medium”, Plant Cell Reports (1986) 5: 302-305参照]。
【００３０】
栄養培地は当該技術分野で良く確立されており、例えばMurashige and Skoog Basal Salts (MS)、Schenk and Hildebrandt Basal Salts (SH)またはGamborgに従った化合物組成(B5)に基づき得る。
【００３１】
例示的な産生培地(PM)としては、限定されないが、塩ベース(例えばMSまたはSH)に、多量要素、微量栄養素、ビタミンおよび炭素供給源、好ましくはスクロースを追加したものを含む培地が挙げられる。
【００３２】
使用されるスクロースの好ましい量は、0.01%〜10%、より好ましくは0.05〜8.%、より好ましくは0.5〜6%、例えば1%〜4%であり、最も好ましくは該量は、約3%である。スクロースは、例えばSigma Aldrich、Carl Rothおよび/またはVWRから入手され得る。使用される窒素の好ましい量は、0.1%〜10%、より好ましくは0.5%〜5%、例えば1%〜3%、最も好ましくは2.63%である。窒素は、硝酸、アンモニアおよびアミノ酸から入手され得る。
【００３３】
例示的な増殖培地としては、限定されないが、炭素供給源、好ましくはスクロースを追加した塩ベース(例えばMSまたはSHまたはB5)を含む培地が挙げられる。
【００３４】
使用されるスクロースの好ましい量は、0.01%〜6%、より好ましくは0.1〜5%、例えば1%〜3%であり、最も好ましくは、該量は、約2%である。スクロースは、例えばSigma Aldrich、Carl RothおよびまたはVWRから入手され得る。使用される窒素の好ましい量は、0.1%〜10%、より好ましくは0.5%〜5%、例えば1%〜3%、最も好ましくは2.63%である。窒素は、硝酸、アンモニアおよびアミノ酸から入手され得る。
【００３５】
従って、好ましい増殖培地は、塩ベース(例えばMSまたはSHまたはB5)を含み、2%スクロースが追加される。
【００３６】
タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンを産生する懸濁培養物は、適切な栄養および反応条件を使用する場合、速い増殖速度および高い細胞密度が可能である。当業者は、最適な性能を達成するために、本明細書に提供され、当該技術分野から利用可能なガイダンスに鑑みて、細胞株の間で変化し得る培地条件を、容易に一体化、改変および操作し得る。
【００３７】
植物懸濁培養における二次代謝産物の産生は、植物増殖制御因子により影響を受けることが知られており、同様に、タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトン産生のための培養培地中で、植物増殖制御因子物質を除去またはその含有量を低減することにより産生を向上し得る。選択された植物増殖制御因子によるタプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトン産生の向上は、さらなる苦労なく当業者により実験的に確認され得る。
【００３８】
タプシガルギンの産生の速度は、単一の速度制限工程によっては決定されず、複数の限定要因の間の複雑な相互作用により決定される。限定要因のいずれか1つを軽減することで、タプシガルギンの産生が高められるが、向上の規模は、特定の限定が軽減されると、タプシガルギンの産生における他の工程の相対的な限定効果を決定する、特定の培養条件に依存する。種々の限定要因の間の相互作用に影響する培養条件としては、細胞の遺伝子構成、培養培地の組成および温度が挙げられる。
【００３９】
植物増殖制御因子としては、一般的な植物の文献から容易に知られる種々の物質が挙げられる。これらの中で、タプシア懸濁培養に特に適切な増殖制御因子としては、限定されないが、オーキシンおよび/またはサイトカイン様化合物、例えばインドール酢酸、インドール酪酸、ナフタレン酢酸(NAA)、ピクロラム、ジカンバ、ベンジルアミノプリン、カイネチン、ゼアチン、チジアズロンおよびインドール酢酸が挙げられる。アミノ酸としては、グルタミン、グルタミン酸およびアスパラギン酸などの、細胞に利用される、任意の天然のアミノ酸または合成アミノ酸が挙げられる。これらは単一で使用され得るかまたは任意の組合せで使用され得る。好ましくは、添付の実施例に示されるように、ジカンバ、ベンジルアミノプリンおよびチジアズロンの組合せが使用される。
【００４０】
植物増殖制御因子2,4-ジクロロフェノキシ酢酸は、タプシア懸濁培養において胚発生の開始に対するその影響が公知であるので、植物細胞を非胚性状態に維持するために、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸を含まない栄養培地が最も好ましい。
【００４１】
細胞培養において酸化褐変(oxidative browning)を低減または回避することも望ましい。したがって、フェノール性滲出物の酸化を阻害するために抗褐変剤を添加し得る。好ましくは、懸濁培養物は、褐変に対して胚性細胞よりも感受性が低い未分化な細胞である。
【００４２】
これらの培地成分について示唆される濃度範囲は以下に示されるが、常套的な最適化により、特定の細胞株および/または特定の培養条件についてのこれらの範囲以外の好ましい条件が示され得る。全ての濃度は、添加後の細胞外培地における平均開始値をいう。給餌溶液(feed solution)中の濃度、したがって細胞と接触する局所的な濃度は、示されるものよりも高いものであり得る。細胞材料を含む製剤は、製剤の特定の構成要素の濃度に基づいて添加され得るか、または培養物体積のいくつかの画分として添加され得る。
【００４３】
植物増殖制御因子は、約0.001μmol/L〜約2mmol/L、好ましくは約0.01μmol/L〜約1mmol/Lの濃度で使用され得る。
【００４４】
アミノ酸は、約1μmol/L〜約20mmol/L、好ましくは約10μmol/L〜約10mmol/Lの濃度で使用され得る。
【００４５】
ガイドとしてこれらの示唆される濃度を使用して、常套的な最適化により、どの成分または成分の組合せ、および上述の示唆を超える濃度を含むどの濃度が、タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトン産生を最大限にするのに有用であるかが識別され得る。
【００４６】
好ましい態様において、細胞は第1に、増殖培地において培養され、次いで細胞は、増殖培地とは異なる産生培地において培養される。増殖培地はまた、無機窒素またはアミノ酸などの有機窒素の供給源を含む。増殖培地から産生培地に細胞を移す場合、産生培地は、好ましくは、高いレベルの炭素供給源および/またはC:N比、例えばより高い濃度の糖類を有する。産生培地はまた、好ましくは無機窒素またはアミノ酸などの有機窒素の供給源を含む。栄養培地の他の構成要素は、細胞と培地を最初に接触させた後に、培養物に導入し得る。一態様において、さらなる糖類などのこれらの成分は、必要に応じて、間欠的または継続的に給餌流(feed stream)に供給される。
【００４７】
該発明の方法は、増殖培地中で細胞を培養する1つ以上の工程および/または産生培地中で細胞を培養する1つ以上の工程を含み得ることが理解される。
【００４８】
一般的な細胞培養条件は当該技術分野で周知であり、所望の効果、例えば増殖または産生は、1つ以上の栄養または他の薬剤の濃度を追加、除去または変更して、上述の培地条件を操作することにより達成され得ることが知られている。培地成分の変更に加えて、他の反応条件を変更して、例えば温度およびpHを含むが限定されない条件を操作、またはこれらの条件の任意の組合せを操作することによっても、所望の結果を得ることができる。
【００４９】
例えば、温度範囲を調整し得る。好ましい温度としては、約0℃〜約40℃、より好ましくは約15℃〜約35℃、さらに好ましくは約20℃〜約30℃が挙げられる。さらに好ましくは、細胞培養条件は、暗所、約23℃〜27℃、好ましくは約25℃の温度で、好ましくは約40rpm〜約350rpm、より好ましくは約80rpm〜約200rpm、例えば約100rpm〜約150rpm、さらに好ましくは約130rpmでの振盪の条件を含み、最も好ましくは振盪回数は、130rpmである。さらに、細胞培養物は、14日毎に継代培養することが好ましい。
【００５０】
本明細書で使用する場合、用語「約」は、明確に記載される値およびその値からの小さな偏差を包含する。すなわち、「約130rpm」の振盪速度は、厳密に130rpmの記載される量である必要はなく、数rpm異なり得、そのため、例えば131rpm、132rpm、129rpmまたは128rpmを含む。当業者は、かかる値は、記載される値に概ね対応する限りは、完全な正確性を必要としない相対的な値であることを理解する。よって、記載された値から、例えば15%、より好ましくは10%、最も好ましくは5%の偏差が、用語「約」に包含される。
【００５１】
上述に加えて、一般的な処理操作は、当業者によるさらなる苦労なしで、調整され得る。植物細胞培養処理についての作動モードは、栄養、細胞および生成物を、時間に関して追加または除去する方法をいう[Payne, G., et al., 1991; “Plant Cell and Tissue Culture in Liquid System”, 62-66 & 298-297 (Hanser Publishers]。細胞に提供される成分は、いくつかの異なる方法で提供され得る。成分は、遅延(lag)、指数関数的または静止などの増殖の特定の成長段階で追加され得る。全ての成分は、一度に提供され得、次いで適切な時間の後、生成物を回収し得る。他の状況において、全ての成分が一度に提供され得るわけではない。むしろ、1つ以上の成分が、培養中の異なる時点で提供され得る。さらに、最初の接触の時間について、追加は不連続であり得るかまたは時間をずらして行われ得、かかる提供の持続時間は、異なる成分について異なり得る。成分は、複数の部分において提供され得る。1つ以上の成分は、細胞培養物と別々に接触された溶液またはその一部の部分として供給され得る。任意の時点または定期的に懸濁培養物の一部は除去され得、低温保存、さらなる細胞増殖、産生および/または回収のために使用され得る。かかる細胞含有部分は、所望の場合、栄養または他の成分にさらに曝露され得る。例示的な継代培養手順を本明細書に記載する。
【００５２】
一態様において、栄養または他の成分を含む培地は、除去された体積の一部または全てを補充するために添加され得る。かかる除去された材料の一部は、元の培養物に戻して追加され得、例えば細胞および培地が除去され得、細胞または培地の一部が生成物回収のために使用され得、残りの細胞または培地が戻され得る。培養物への成分の供給速度または培養物中の種々の成分のレベルは、生成物を有利に産生および回収するように調節され得る。培養物の別の部分は、前述のモードのいずれかにおいて成分に曝露され得、次いで、産生について有利であるように決定された割合で合わされ得る。培養物の細胞含有量も、生成物を有利に生じるかまたは細胞を有利に増殖させるように調整され得る。細胞含有量の調整は、栄養または他の成分との接触のための戦略と、有利に組み合され得る。
【００５３】
活性な生合成が行われている細胞に新鮮な培地を補充することはまた、枯渇した必須の栄養を提供することにより、産生を高め得る。例えば、Miyasakaらは、培地にスクロースを添加することにより、タンジン(Salvia miltiorhiza)の静止相の細胞を刺激して、ジテルペン代謝産物クリプトタンシノンおよびフェルギノールを簡単に産生させ得た[Miyasaka et al., “Regulation of Ferruginol and Cryptotanshinone Biosynthesis in Cell Suspension Cultures of Salvia miltiorrhiza,” Phytochemistry 25: 637-640 (1986)]。おそらく、生合成は、静止相における炭素制限のために停止した。
【００５４】
本発明の培養法のために定期的な培地交換プロトコルを使用することで、同様の利益をもたらし得る。
【００５５】
交換される培地の量、交換の頻度および補充されている培地の組成は、該発明の種々の態様に従って変化し得ることが構想される。培地の交換により生合成を刺激する能力は、連続的、半連続的、またはフィードバッチ(fed-batch)形式での効率的な商業的方法の設計および操作に重要な関係を有する。「フィードバッチ」操作において、栄養素などの特定の培地成分は、定期的または連続的のいずれかで供給される。好ましい態様において、バッチ培養内容物の全てではないが実質的な部分は、連続した細胞増殖および産生のために、新しい培地と交換され、この処理モードは、「反復吸出しおよび充填」操作と類似しており、「半連続法」と称される。代替的な好ましい態様において、該方法は「連続的」であり、すなわち新鮮な培地を連続的に供給し、廃棄物培地を連続的または反復的に除去する。
【００５６】
本明細書で使用する場合、用語「懸濁培養」は、細胞、好ましくは液体栄養培地中で分散された、構造的に未分化な細胞の培養をいう。この培養技術のために、細胞は固相支持体または培養容器に接触しない。懸濁培養は、集合の種々の段階の細胞を含むことが容易に理解される。集合サイズの範囲は、直径数十ミクロン(単一細胞またはいくつかの集合した細胞)から、数千の細胞からなる直径数ミリメートルの集合の範囲のサイズを有する懸濁物中にある(encounter)。かかる集合を含む懸濁培養は、本発明の方法に包含される。
【００５７】
細胞を懸濁培養に移すために、例えば細胞をカルスから除去して、栄養培地を含む滅菌培養容器に移す。例えば、懸濁培養は、好ましくはゲル化剤なしで、例えば脆いカルス培養の以前の世代において成功裡であった栄養培地を使用して開始され得る。しかしながら、懸濁培養のための最適な培地は、同じ細胞株のカルスのために最適なものとは異なることが認識される。当業者は、さらなる苦労なしで、適切な培地を決定し得る。
【００５８】
代替的または追加的に、植物細胞培養物は、低温保存された細胞の回収物由来でもあり得る。
【００５９】
一旦開始すると、懸濁培養は、(i)培地から細胞を(典型的には濾過により)実質的に分離して、次いで栄養を含む培地に一部を再度導入することによるか、または(ii)ある体積の培養培地(細胞および培地)を、栄養を含む培地に移すことによるか、または(iii)細胞を沈降させ、次いで既に存在する培地の任意の部分を除去し、栄養含有培地を再度導入することによるかのいずれかで、さらに培養され得る。細胞および培地を体積測定的に移した場合、移された体積と最終的な体積の割合は、好ましくは約1%〜該体積の実質的に全て、より好ましくは約5%〜約50%、さらに好ましくは10%〜約20%であり得る。体積の全てを移す場合、新鮮な栄養を濃縮した形態で供給して、わずかに少量な体積の増加のみをもたらし得る。したがって、培養物は部分に分割され得、該部分は個々に、細胞のさらなる増殖、タプシガルギンの産生またはその両方のいずれかのためにさらに使用され得る。必要ではないが、それぞれの部分は、互いに同じ条件または元の培養と同じ条件下で培養され得る。増殖の持続時間は、部分的に枯渇した培地に栄養を補充することにより延長され得る。
【００６０】
本発明の方法に従って増殖された細胞は、先に規定されるように、タプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンを産生する。
【００６１】
本明細書で使用する場合、例えば用語「タプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトン」における用語「1つ以上」は、正確に1つをいうが、例えば2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つなどの1つより多くもいう。さらに、用語「1つ以上」は、存在する1つの種類の分子の実際の数を規定せずに、記載されるクラスの区別できる分子の数をいう。例えば、用語「タプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトン」は、例えば好ましくはセスキテルペンラクトンタプシガルギンなどの正確に1つのセスキテルペンラクトンをいうが、例えば2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つなどの1つより多くの前記ファミリーの異なるセスキテルペンラクトンもいう。
【００６２】
本発明の方法の第2の工程において、培養された細胞により産生されたタプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトン(1つまたは複数)が回収される。タプシガルギンは、全体の培養物または培養物の任意の部分から回収され得、タプシガルギンは、培養中、または培養期間の完了後の任意の時点で回収され得る。産生されるタプシガルギンの全てが回収され得ること、または好ましくは、例えば六酸化タプシガルギンのみ、五酸化タプシガルギンのみ、またはさらには単一化合物タプシガルギンのみなどの目的の1つ以上の特定のタプシガルギンが回収されることが理解される。
【００６３】
抽出手順に先立って、細胞材料を凍結乾燥し得る。適切な抽出方法のための細胞材料または懸濁材料を調製するために、当該技術分野で公知の他の方法を使用し得る。タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンは、非水性極性溶媒を使用した抽出、酸性培地を使用した抽出、塩基性培地を使用した抽出、培養容器の内側か外側のいずれかに樹脂がある樹脂吸着物による回収を含むが限定されない、当該技術分野で公知の任意の方法により回収し得る。
【００６４】
産生された分子を単離する方法は当該技術分野で周知であり、方法は限定されないが、例えば酢酸エチル、アセトンもしくはトルエンなどの有機溶媒を使用した凍結乾燥された細胞または水性細胞懸濁液の抽出、その後例えば液体クロマトグラフィー(LC)、逆相LCもしくは液体/液体クロマトグラフィーを使用したその後のクロマトグラフィー分離などの工程を含む。回収される唯一のセスキテルペンラクトンが化合物タプシガルギンである場合、該化合物は、例えばOllivier A et al. 2013 [Ollivier, A. 2013; J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.; 926: 6-20]またはRasmussen et al. 1978 [Rasmussen U. et al. 1978;. Acta Pharm Suec.; 15(2);133-40]に記載されるような精製シークエンスを使用して回収されることが好ましい。
【００６５】
好ましくは、回収することは、添付の実施例に記載されるように、すなわち、Ollivier A et al. 2013 [Ollivier, A. 2013; J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.; 926: 6-20]に記載されるように、細胞培養中で得られたバイオマスを凍結乾燥し、凍結乾燥されたバイオマスをビーズミル中溶媒で均質化し、その後遠心分離して粗製の抽出物を得て該粗製抽出物の成分を精製することにより実施される。
【００６６】
本発明によると、タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンの産生のための新規の方法が提供される。懸濁培養中で増殖させた細胞を使用して、現在、例えば半連続的または連続的細胞培養技術により、タプシガルギンの大量産生が可能である。発明者の最良の知識について、タプシガルギンの大量産生のためのかかる植物細胞培養アプローチは、現在利用可能ではない。かかる方法の欠如のために、近年、大量のタプシガルギンの単離のための現在唯一実行可能な供給源であるタプシア属の植物の存在についての脅威が存在する[SB Christensen et al. 2009, Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry; 9: 276-294]。これは、合成には少なくとも42の工程が必要であるので、これらの化合物を産生する合成方法が、経済的な観点から利用可能ではないためである。
【００６７】
該発明の方法の好ましい態様において、工程(b)で回収されるタプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンは、2β,3α,7β,8α,10β,11α-六酸化-6β,12-グアヤノリド核を含む。
【００６８】
先に詳述されるように、それぞれの植物細胞により産生されるセスキテルペンラクトンは、同一であり得、すなわちセスキテルペンラクトンのわずかに1分子の種類を示すか、またはセスキテルペンラクトンの異なる種類の分子の混合物であり得る。同様に先に詳述されるように、タプシガルギンファミリーのこれらの産生されたセスキテルペンラクトンの全ては、回収され得るか、またはこの群由来の好ましい化合物のみである。
【００６９】
したがって、この好ましい態様によると、(i)該発明の方法に従って工程(b)で回収されたタプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンの1つは、2β,3α,7β,8α,10β,11α-六酸化-6β,12-グアヤノリド核を含むか、(ii)該発明の方法に従って工程(b)で回収されたタプシガルギンファミリーの全てではないが複数のセスキテルペンラクトンは、2β,3α,7β,8α,10β,11α-六酸化-6β,12-グアヤノリド核を含むか、または(iii)該発明の方法に従って工程(b)で回収されたタプシガルギンファミリーの全てのセスキテルペンラクトンは、2β,3α,7β,8α,10β,11α-六酸化-6β,12-グアヤノリド核を含むことが包含される。
【００７０】
該発明の方法のより好ましい態様において、2β,3α,7β,8α,10β,11α-六酸化-6β,12-グアヤノリド核を含むタプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンはタプシガルギンである。
【００７１】
タプシガルギンは、最も一般的に使用されるタプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンであり、その構造を図1に示す。好ましくは、タプシガルギンは、該発明の方法に従って植物細胞から回収されるタプシガルギンファミリーの唯一のセスキテルペンラクトンである。
【００７２】
該発明の方法の別の好ましい態様において、工程(b)で回収されるタプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンは、3α,7β,8α,10β,11α-五酸化-6β,12-グアヤノリド核を含む。
【００７３】
六酸化タプシガルギンに関する同様の考察は、五酸化タプシガルギンにも適用され、すなわち、好ましい態様によると、(i)該発明の方法に従って工程(b)で回収されたタプシガルギンファミリーの1つのセスキテルペンラクトンが3α,7β,8α,10β,11α-五酸化-6β,12-グアヤノリド核を含むか、(ii)該発明の方法に従って工程(b)で回収されたタプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンの全てではないが複数が3α,7β,8α,10β,11α-五酸化-6β,12-グアヤノリド核を含むか、または(iii)該発明の方法に従って工程(b)で回収されたタプシガルギンファミリーの全てのセスキテルペンラクトンが3α,7β,8α,10β,11α-五酸化-6β,12-グアヤノリド核を含むことが包含される。
【００７４】
上述のことから、六酸化タプシガルギンおよび五酸化タプシガルギンの混合物も回収され得ることが明らかである。
【００７５】
該発明の方法の別の好ましい態様において、植物細胞は、非胚性細胞である。
【００７６】
本発明によると、用語「非胚性細胞」は、未分化の細胞、脱分化した細胞および分裂組織細胞をいう。非胚性細胞は、(1つまたは複数の)液胞が存在することで胚性細胞とは区別可能であり、胚性細胞は、高度に細胞質性であり、液胞を含まない。
【００７７】
該発明の方法における使用のための非胚性細胞を得るための手段および方法は、当該技術分野で周知である。非胚性細胞を得るための非限定的な例としては、例えば脆いカルス由来のそれらの誘導体が挙げられる。例を提供するために、約0.01〜約10g/25mlのかかる脆いカルス由来の移植片を使用して、本発明による方法における使用のための非胚性懸濁培養物を調製し得る。本発明によると、植物細胞は、懸濁培養の間、非胚性のままである。
【００７８】
用語「脆いカルス材料」は、固形化された培地上で培養された実質的に未分化の細胞塊をいう。脆いカルス材料の形成およびカルス増殖のための方法は、一般的に当該技術分野で公知である。カルスを得るための非限定的な方法は、例えば、次亜塩素酸塩などの消毒薬を使用して、TweenもしくはTritonなどの湿潤剤を使用して、抗生物質を使用して、および/または抗菌剤を使用して、きれいな水で完全に洗浄することにより、例えば植物供給原材料を表面滅菌することを含む。カルス形成は、植物の任意の生存部分(本明細書において「植物外植片」ともいう)から、好ましくは植物の根の組織から開始され得る。該植物供給原材料は、植物の完全な部分またはその一部であり得る。典型的に、該植物供給原材料は、固形化された培地の表面上に置かれ、滅菌環境下で、未分化の細胞の塊(脆いカルス材料)が植物供給原材料の近位に成長するまで約1〜12週間インキュベートされる。脆いカルス材料を確立した後、該発明の方法に従って、細胞を栄養培地中で培養する。
【００７９】
培地成分、pH範囲、炭素供給源、窒素供給源、マクロ塩およびミクロ塩、ビタミン、ならびに増殖制御因子を含む脆いカルス増殖のための培養条件は、当該技術分野で周知であり、例えば、その全体において参照により本明細書に援用されるWO 97/44476に記載されている。好ましい態様において、脆いカルス増殖は、ゲル化剤を使用することを含む。ゲル化剤としては、例えば寒天、ヒドロゲル、ゼラチンおよびGelrite(登録商標)が挙げられる。老廃物および望ましくない有機化合物を除去するために木炭を使用し得る。別の好ましい態様において、脆いカルス増殖は、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸を含まない培地上での脆いカルス材料の開始を含む。さらに好ましい態様において、脆いカルス増殖は、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸を含まない培地上での脆いカルスの培養を含む。本発明の全ての態様のための脆いカルスの開始および増殖のための培地は、例えば固形培地または半固形培地であり得る。好ましくは、本発明の全ての態様のための脆いカルスの開始および増殖のための培地は、固形培地である。
【００８０】
当該技術分野で公知の継代培養技術は、脆いカルスの一部の、栄養物の新鮮な供給源への定期的な連続輸送のために使用され得る。好ましくは、カルス(calli)の輸送の頻度は、4〜6週間である。
【００８１】
本明細書において上述されるように、本発明は、タプシガルギンの大量産生に適した懸濁細胞培養を初めて提供する。細胞培養からタプシガルギンを産生することを試みる先行技術が記載されるが(Jaeger et al. 1993上記参照)、先行技術では、懸濁培養からのタプシガルギン産生の有利な形式は提供されていなかった。理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、先行技術において、前記植物材料から得られる細胞によるタプシガルギンの産生に負の影響を有し得る植物材料の胚発生を生じる様式で誘導された、カルスから得られた細胞を使用することを順守する。
【００８２】
上述によると、さらに好ましい態様において、該方法はさらに、工程(a)の前に、さらなる工程(a-0)を実行することを含み、該工程は、タプシア植物外植片を培地上で培養し、それにより脆いカルス材料を得ることを含む。本発明の全ての態様のための脆いカルスの開始のための培地は、例えば固形培地または半固形培地であり得る。好ましくは、本発明の全ての態様のための脆いカルスの開始のための培地は固形培地である。
【００８３】
本明細書に上述される定義および好ましい態様を準用する。
【００８４】
特に好ましい態様において、本発明は、
(a)  懸濁細胞培養において栄養培地中でタプシア属の植物細胞を培養する工程、ここで該細胞は、タプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンを産生し、該細胞培養条件は、暗所中約23℃〜27℃、好ましくは25℃の温度で好ましくは130rpmの振盪の条件を含み、該細胞培養物は、定期的な間隔、好ましくは14日毎に継代培養される；および
(b)  (a)で産生されたタプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンを回収する工程
を含む、タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンを産生する方法を提供する。
【００８５】
該発明の方法の別の好ましい態様において、該栄養培地は2,4-ジクロロフェノキシ酢酸を含まない。
【００８６】
2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(本明細書において2,4-Dとも称される)は、合成オーキシン、すなわち植物細胞培養培地の補充物として植物の研究において一般的に使用される植物ホルモンであり、例えばカルス材料の誘導および維持のためならびにそれらが胚性になるまでの懸濁物の培養のための増殖制御因子として使用される。
【００８７】
そのため、胚発生を回避するために、この好ましい態様に従って、懸濁培養物は、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸を含まない栄養培地中で増殖される。別の好ましい態様において、懸濁培養物は、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸を含まない栄養培地中で維持される。本発明によると、懸濁培養物の維持は、細胞は生存しているが、有意には増殖しないことを特徴とする。さらに好ましい態様において、懸濁培養物は、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸を含まない栄養培地中で増殖される。
【００８８】
本明細書に上述されるように、細胞培養物からタプシガルギンを産生することを試みる先行技術が記載されているが(Jaeger et al. 1993上記参照)、懸濁培養からのタプシガルギンの産生は何ら示さなかった。再度、理論に拘束されることは望まないが、本発明者らは、先行技術において、前記植物材料から得られた細胞によるタプシガルギンの産生に負の影響を有し得る、植物材料の胚発生を生じる植物ホルモン2,4-Dを使用した培養技術により得られた細胞を使用することを順守する。胚発生の開始に対する2,4-Dの正の影響は議論されており認められている。培養培地への2,4-Dの添加およびそのために開始される胚発生は、なぜ、これらの著者が、五酸化タプシガルギンのみを同定し、さらに分化した胚段階、すなわち子葉段階のみにおいて、固形培地上で苗条および根が成長したかを説明し得る。
【００８９】
よって、特定の好ましい態様において、本発明は、
(a)  懸濁細胞培養において2,4-ジクロロフェノキシ酢酸を含まない栄養培地中でタプシア属の非胚性の植物細胞を培養する工程、ここで該細胞は、タプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンを産生する；および
(b)  (a)で産生されたタプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンを回収する工程
を含む、タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンを産生する方法を提供する。
【００９０】
最も好ましい態様において、本発明は、
(a)  懸濁細胞培養において2,4-ジクロロフェノキシ酢酸を含まない栄養培地中でタプシア属の植物細胞を培養する工程、ここで該細胞は、タプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンを産生し、該細胞培養条件は、暗所中、約23℃〜27℃、好ましくは約25℃の温度で、好ましくは130rpmの振盪の条件を含み、該細胞培養物は、定期的な間隔で、好ましくは14日毎に継代培養される；および
(b)  (a)で産生されたタプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンを回収する工程
を含む、タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンを産生する方法を提供する。
【００９１】
別の特に好ましい態様において、本発明は、
(a-0)  培地上でタプシア植物外植片を培養して、それにより脆いカルス材料を得る工程
(a)  懸濁細胞培養において2,4-ジクロロフェノキシ酢酸を含まない栄養培地中、工程(a-0)で得られたタプシア属の植物細胞を培養する工程、ここで該細胞は、タプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンを産生する；および
(b)  (a)で産生されたタプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンを回収する工程
を含む、タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンを産生する方法を提供する。
【００９２】
さらに好ましい態様において、本発明は、
(a-0)  2,4-ジクロロフェノキシ酢酸を含まない培地上でタプシア植物外植片を培養して、それにより脆いカルス材料を得る工程
(a)  懸濁細胞培養において栄養培地中で、工程(a-0)で得られたタプシア属の植物細胞を培養する工程、ここで該細胞は、タプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンを産生する；および
(b)  (a)で産生されたタプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンを回収する工程
を含む、タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンを産生する方法を提供する。
【００９３】
さらに好ましい態様において、本発明は、
(a-0)  2,4-ジクロロフェノキシ酢酸を含まない培地上でタプシア植物外植片を培養して、それにより脆いカルス材料を得る工程、
(a)  懸濁細胞培養において2,4-ジクロロフェノキシ酢酸を含まない栄養培地中で、工程(a-0)で得られたタプシア属の植物細胞を培養する工程、ここで該細胞は、タプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンを産生する；および
(b)  (a)で産生されたタプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンを回収する工程
を含む、タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンを産生する方法を提供する。
【００９４】
最も好ましい態様において、本発明は、
(a-0)  2,4-ジクロロフェノキシ酢酸を含まない培地上でタプシア植物外植片を培養して、それにより脆いカルス材料を得る工程、
(a)  懸濁細胞培養において2,4-ジクロロフェノキシ酢酸を含まない栄養培地中で、工程(a-0)で得られたタプシア属の植物細胞を培養する工程、ここで該細胞は、タプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンを産生し、該細胞培養条件は、暗所中、約23℃〜27℃、好ましくは約25℃の温度で、好ましくは130rpmの振盪の条件を含み、該細胞培養物は、定期的な間隔で、好ましくは14日毎に継代培養される；および
(b)  (a)で産生されたタプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンを回収する工程
を含む、タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンを産生する方法を提供する。
【００９５】
本発明はまた、タプシア属の植物細胞を含む懸濁細胞培養物に関し、該植物細胞は、タプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンを産生し得る。好ましくは、これらの懸濁細胞培養物は、本明細書に上述される態様のいずれかに従って、培養され/産生され/産生可能であり/提供される。
【００９６】
該発明の方法に関して本明細書に上述される定義および好ましい態様は、本発明のこの懸濁細胞培養にも準用される。
【００９７】
発明者らが最大限知る限り、当該技術分野において、タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンを産生し得る、利用可能なタプシア属の植物細胞の懸濁細胞培養はない。本発明の方法に基づいて、かかる懸濁細胞培養は、初めて提供され得、1つ以上のタプシガルギンの大量産生に適している。
【００９８】
本発明はさらに、該発明の懸濁細胞培養から得られるかまたは入手可能であるタプシア属の植物細胞を含む、植物細胞バイオマスに関する。
【００９９】
再度、該発明の方法に関して本明細書に上述される全ての定義および好ましい態様は、本発明のこの植物細胞バイオマスにも準用される。
【０１００】
本明細書で使用する場合、用語「バイオマス」は、懸濁培養物の細胞塊を作製する生物学的材料をいう。すなわち、懸濁細胞培養の細胞を液体培地から分離すると、該バイオマスが得られる。好ましくは、該発明に従って使用する場合、該バイオマスは、タプシガルギンファミリーからの1つ以上のセスキテルペンラクトンを含む。
【０１０１】
本発明のバイオマスは、タプシガルギンの価値のある供給源である。該バイオマスは、新たに得られるバイオマスであり得るか、または貯蔵された、例えば凍結試料もしくは凍結乾燥粉末の形態のバイオマスであり得る。
【０１０２】
本明細書に記載される全ての方法工程は、記載される順序で行われる、すなわち工程(b)の前に工程(a)が行われることが理解される。さらなる工程(a-0)が含まれる場合、この工程は、工程(a)の前に、最初に行われる。すなわち、特許請求される方法は、第1の工程(a)およびその後の工程(b)、または代替的に第1の工程(a-0)、その後の工程(a)および工程(a)の後に第3の工程(b)を含む(またはからなる)。
【０１０３】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての科学技術的用語は、この発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む特許明細書が優勢である。
【０１０４】
本明細書中、特に特許請求の範囲中で特徴付けられる態様に関して、従属項に記載されるそれぞれの態様は、前記従属項が従属する(独立するかまたは従属する)それぞれの請求項のそれぞれの態様と組み合わされることが意図される。例えば、3つの選択肢A、BおよびCを記載する独立項1、3つの選択肢D、EおよびFを記載する従属項2、ならびに請求項1および2に従属して、3つの選択肢G、HおよびIを記載する請求項3の場合、具体的にそうではないと記載されなければ、明細書には、組合せA、D、G；A、D、H；A、D、I；A、E、G；A、E、H；A、E、I；A、F、G；A、F、H；A、F、I；B、D、G；B、D、H；B、D、I；B、E、G；B、E、H；B、E、I；B、F、G；B、F、H；B、F、I；C、D、G；C、D、H；C、D、I；C、E、G；C、E、H；C、E、I；C、F、G；C、F、H；C、F、Iに対応する態様が明白に開示されることが理解される。
【０１０５】
同様に、独立項および/または従属項が選択肢を記載しない場合においても、従属項が複数の先行する請求項を引用する場合は、それによってカバーされる主題の任意の組合せが明確に開示されるものと考えられることが理解される。例えば、独立項1、請求項1を引用する従属項2、および請求項2および1を引用する従属項3の場合は、請求項3および1の主題の組合せは、請求項3、2および1の主題の組合せと同様に、明確かつ明白に開示されるということになる。請求項1〜3のいずれか1つを引用するさらなる従属項4が存在する場合は、請求項4および1、請求項4、2および1、請求項4、3および1、ならびに請求項4、3、2および1の主題の組合せが明確かつ明白に開示されるということになる。
【０１０６】
上述の考えは、添付される全ての特許請求の範囲に準用される。非限定的な例を示すために、請求項の構造の観点から、請求項9、8および1の組合せが明確かつ明白に構想される。例えば請求項9、8、7および1の組合せ等にも同様に適用される。
【０１０７】
先の詳細な説明には、具体的な例示態様に関する発明が記載される。しかしながら、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更および変化がなされ得ることが理解される。詳細な説明および添付の図面は、限定ではなく単なる例示としてみなされるべきであり、もしあるならば、全てのかかる変更または変化は、本明細書に説明および記載されるように、本発明の範囲に該当するものと意図される。
【０１０８】
より具体的に、本発明の説明の例示的な態様が本明細書に記載されているが、本発明はこれらの態様に限定されるものではなく、前述の詳細な説明に基づいて当業者が理解するように変更、省略、 (例えば種々の態様を通しての局面の) 組合せ、適合および/または改変を有する任意および全ての態様が本発明に含まれる。特許請求の範囲の限定は、特許請求の範囲に使用される言語に基づいて広範に解釈されるべきであり、前述の詳細な説明に記載される例に限定されないか、または出願手続の際に、かかる例は排他的ではないものと解釈されるべきである。
【実施例】
【０１０９】
実施例により該発明を説明する：
【０１１０】
実施例1：完全植物材料の表面滅菌
タプシアガルガニカの根を水道水で完全に洗浄した。根を、約3x3cmの小さな立方体(植物外植片)に切断した。植物外植片を界面活性剤中および流しっぱなしの水で、約10〜15分間完全に洗浄した。外植片の表面滅菌は、外植片を、2〜3滴のTween 20を含む70%イソプロピルアルコール(IPA)(v/v)溶液中に1分間(この間に緩やかに撹拌)浸漬して無菌的に行った。その後、植物外植片をNaOCl溶液(2.8g/100ml次亜塩素酸ナトリウム)中で15〜30分処理した。続いて、外植片を滅菌蒸留水で3〜4回簡単にすすぎ、滅菌剤の残りの全てを除去した。表面殺菌の後、脱水を回避する処理を準備するまで、外植片は、層流キャビネット内で、カバーされたペトリ皿中に維持した。外植片を固形培養培地上に配置する前に、外植片の切断末端を、滅菌したメスで除去し、外植片を、適切なサイズ(0.5〜1cm)の小片に切断した。
【０１１１】
実施例2：2,4-Dを含む固形培地上での胚性カルスの誘導
植物外植片を、MusharigeおよびSkoog(半分の強度のMS基底塩、3%スクロース、0.5mg/l BAPおよび0.5mg/l 2,4-D)の固形の改変基底培地上に置いた。次いで培養物を、暗所の25±2℃に維持したインキュベーター内でインキュベートした。6〜8週間後、一次カルス材料を得た。2,4-Dを補充したMS培地上で培養した外植片は胚性カルスになり、培養時間を増やすにつれて、体細胞胚の異なる段階にさらに成長した。胚性カルスの移行の頻度は増殖速度に依存し、4〜8週の範囲であった。
【０１１２】
実施例3：2,4-Dを含まない固形培地上での脆いカルスの誘導
植物外植片を、Gamborg(完全強度のB5基底塩、2%スクロース、5mMピクロラムおよび0.01mM BAPまたは1mg/l ジカンバおよび0.22mg/l TDZ)の2種類の異なる固形の改変基底培地上に置いた。次いで、培養物を、暗所の25±2℃に維持したインキュベーター中でインキュベートした。6〜8週間後、一次カルス材料を得た。4〜6週間後、2,4-Dなしの両方の改変B5培地上で培養した外植片から脆いカルス材料を確立した。脆いカルスの移行の頻度は増殖速度に依存し、4〜6週間の範囲であった。
【０１１３】
実施例4：タプシアガルガニカの懸濁培養の開始
懸濁培養の開始のために、脆いカルス材料(約40〜60g/l)を、上述の2,4-Dを含まない改変液体B5培地に移した。懸濁培養物はより大きな細胞集団に成長し、これを、暗所で130rpmでの回転振盪器上、250ml三角フラスコ中50mlの培養培地中で培養した。培養温度は25±2℃であった。より高い開始スクロース濃度またはより高い硝酸塩 対 アンモニアの割合などのさらなる培地の改変を適用して、より優れた懸濁細胞株を得ることができる。
【０１１４】
実施例5：タプシアガルガニカの懸濁培養物の維持
懸濁物の維持のために、真空濾過したバイオマス(40〜60g/l)を、上述の、2,4-Dを含まない50mlの新たな改変液体B5培地に移した。培養物を、暗所で130rpmでの回転振盪器上、250mlの三角フラスコ中で維持して、14日毎に継代培養した。培養温度は、25±2℃であった、全ての確立された培養物は少なくとも3か月間維持した。
【０１１５】
実施例6：タプシアガルガニカのバイオマスの抽出
タプシアガルガニカのバイオマス(懸濁液由来のカルス材料または真空濾過バイオマスのいずれか)を、サンプリングの後、液体窒素に直接移し、細胞内の細胞代謝を回避した。抽出物を作製するために、凍結乾燥バイオマス試料の重量を測り、15倍の量の溶媒を添加した。溶媒として、EtOAc、アセトンまたはエタノールを使用した。ビーズミルで90秒かけて細胞を均質化し、続いてこの混合物を10分間遠心分離し(14,000rpm)、粗製の抽出物を得て、これをさらなる分析に使用した。
【０１１６】
実施例7：懸濁物の抽出
タプシアガルガニカの懸濁培養の試料を凍結乾燥して、続いて重量を測った。凍結乾燥物を、15倍体積の溶媒に再懸濁した。溶媒として、EtOAc、アセトンまたはエタノールを使用した。ビーズミルで90秒かけてこの混合物を均質化し、続いて10分間遠心分離し(14,000rpm)、粗製の抽出物を得て、これをさらなる分析に使用した。
【０１１７】
実施例8：タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンの分析
タプシガルギンファミリーのセスキテルペンラクトンの検出のための以下の方法を使用した：
カラム：C18、例えばWaters Acquity UPLC BEH C18、2.1x50mm；1,7μ
クロマトグラフ：UPLC、例えば二対のポンプを有するWaters Acquity UPLC
溶媒：  A：10mmol酢酸アンモニアバッファ+0.1%蟻酸
B:アセトニトリル+0.1%蟻酸
【表３】
2016538887.tif 000004
作動時間：5.00分
注入体積：4μL
保持時間：約1.18分(タプシガルギン)
検出器：質量分析器、例えばWaters Quattro Premier
検出：ESI+
同定  タプシガルギン m/z = 668,4 (M+NH4)+/ 551,4 (M - OAng)+ / 491,4 (M - HOAc - OAng)+
条件：キャピラリー電圧(Capillary Voltage)：2,5kV
コーン電圧(Cone Voltage)：18V
供給源温度：150℃
脱溶媒和化温度：400℃
【０１１８】
例えば実施例7に記載される細胞抽出にこれらの条件を適用して、参照材料(図3、標準参照)との比較により試料(図3、試料参照)中でタプシガルギンを明確に同定した。標準および試料について、m/z = 668 (M+NH4)+での母イオンの、m/z = 491(標準および試料における上のグラフ)での娘イオンおよびm/z = 551 (標準および試料における下のグラフ)での娘イオンへの断片化を明確に観察した。
【０１１９】
実施例9：タプシガルギンの単離およびタプシガルギンファミリーの他のセスキテルペンラクトンの単離
当該技術分野において公知の典型的な方法を使用して、PCF細胞懸濁物からタプシガルギンを単離し得る。酢酸エチル、アセトンまたはトルエン等の有機溶媒を使用して凍結乾燥細胞または水性細胞懸濁液を最初に抽出し、その後、例えば正常静止相または逆相静止相を使用したクロマトグラフィー分離を続ける。有力な精製順序の例については、Ollivier A, Grougnet R, Cachet X, Meriane D, Ardisson J, Boutefnouchet S, Deguin B. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2013; 926; 16-20またはRasmussen U, Broogger Christensen S, Sandberg F. Acta Pharm Suec. 1978; 15(2);133-40参照。
【図１】
2016538887.tif 000005
【図２】
2016538887.tif 000006
【図３】
2016538887.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成28年9月23日(2016.9.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１０】
タプシア属の植物細胞を含む、懸濁細胞培養物であって、該植物細胞が、タプシガルギンファミリーの1つ以上のセスキテルペンラクトンを産生し得る、懸濁細胞培養物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１１】
請求項１０記載の懸濁細胞培養物から得られるタプシア属の植物細胞を含む、植物細胞バイオマス。
【国際調査報告】
2016538887.tif 000008
2016538887.tif 000009