(57)【要約】本明細書において、患者からの癌試料、例えば前立腺腫瘍試料の評価の方法、例えば、コンピュータ実装方法または自動化方法を提供する。また、前立腺癌の予後診断のためのバイオマーカーパネルを提供する。また、侵攻性前立腺癌または致死性転帰を有し得る前立腺癌を同定することによる前立腺癌の処置方法を提供する。該方法は、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２およびＨＳＰＡ９（腫瘍マーカーセット）のうちの１、２、３、４、５、６、７もしくは８種類の腫瘍マーカーまたは前記腫瘍マーカーのＤＮＡもしくはｍＲＮＡ（１種類もしくはそれ以上）のレベル、例えば量または発現レベルを同定し、それにより前記腫瘍試料を評価することを含むものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者からの癌試料、例えば前立腺腫瘍試料の評価の方法、例えば、コンピュータ実装方法または自動化方法であって、
ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２およびＨＳＰＡ９（腫瘍マーカーセット）のうちの１、２、３、４、５、６、７もしくは８種類の腫瘍マーカーまたは前記腫瘍マーカーのＤＮＡもしくはｍＲＮＡのレベル、例えば量または発現レベルを同定すること、
それにより前記腫瘍試料を評価すること
を含む、方法。
【請求項２】
腫瘍マーカーのシグナルを例えば直接または間接的に取得することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記シグナルを直接取得することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料を直接または間接的に取得することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
癌試料；ならびに
ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２およびＨＳＰＡ９（腫瘍マーカーセット）のうちの１、２、３、４、５、６、７もしくは８種類の腫瘍マーカーまたは前記腫瘍マーカーのＤＮＡもしくはｍＲＮＡの検出試薬
を含む反応混合物。
【請求項６】
前記癌試料が複数の一部分、例えばスライスまたはアリコートを含むものである、請求項５に記載の反応混合物。
【請求項７】
前記癌試料の第１の一部分が、前記マーカーのすべてではない第１のマーカーの検出試薬を含むものであり、前記癌試料の第２の一部分が、前記第１のマーカーの検出試薬を含まない前記マーカーのうちの１つの検出マーカーの検出試薬を含むものである、請求項５に記載の反応混合物。
【請求項８】
患者からの試料、例えば組織試料、例えば癌試料、例えば前立腺腫瘍試料の評価の方法、例えば、コンピュータ実装方法または自動化方法であって、
（ａ）前記試料から、関心領域（ＲＯＩ）において、第１の領域の表現型マーカー、例えば第１の腫瘍マーカーのレベルを同定すること、
それにより前記試料を評価すること
を含む、方法。
【請求項９】
前記試料が癌試料である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料が固形腫瘍由来の細胞を含むものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料が液性腫瘍由来の細胞を含むものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＲＯＩが形態学的特徴によって画定または選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＲＯＩが手作業または自動化手段および他の細胞もしくは物質からのＲＯＩの物理的分離によって、例えば、他の組織、例えば非癌性細胞からのＲＯＩ、例えば癌性領域の切開によって画定または選択される、請求項８に記載の方法。。
【請求項１４】
前記ＲＯＩが非形態学的特徴、例えばＲＯＩマーカーによって画定または選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＲＯＩが、ＲＯＩマーカーを含めることによってセルソーティングにより同定または選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＲＯＩが形態学的選択と非形態学的選択の組合せによって同定または選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
第１の領域の表現型マーカー、例えば第１の腫瘍マーカーのレベルが第１のＲＯＩ、例えば第１の癌性領域において同定され、第２の領域の表現型マーカー、例えば第２の腫瘍マーカーのレベルが第２のＲＯＩ、例えば第２の癌性領域において同定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
第１の領域の表現型マーカーレベルと第２の領域の表現型マーカーレベル、例えば腫瘍マーカーレベルが同じＲＯＩ、例えば同じ癌性領域において同定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１９】
さらに：
（ｂ）ＲＯＩ、例えば癌性領域に対応するＲＯＩを同定すること；
を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）が（ｂ）の前に行なわれる、請求項８に記載の方法。
【請求項２１】
（ｂ）が（ａ）の前に行なわれる、請求項８に記載の方法。
【請求項２２】
第１の領域の表現型マーカー、例えば第１の腫瘍マーカーのレベルの同定が、前記第１の領域の表現型マーカー、例えば第１の腫瘍マーカーに対する検出試薬の結合に関連している、例えば比例しているシグナルを例えば直接または間接的に取得することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２３】
前記試料を、第１の領域の表現型マーカー、例えば第１の腫瘍マーカーの検出試薬と接触させることを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２４】
前記試料を、ＲＯＩマーカー、例えば上皮マーカーの検出試薬と接触させることを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２５】
さらに、前記試料の画像を取得すること、および前記画像を解析することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２６】
前記画像から前記患者のリスクスコアを計算することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記試料を、前記第１の領域の表現型マーカー、例えば腫瘍マーカーの検出試薬と接触させること、および前記検出試薬の結合の値を取得することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２８】
前記値から前記患者のリスクスコアを計算することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
さらに：
（ｂ）試料をＲＯＩマーカーの検出試薬と接触させること
を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項３０】
さらに：
（ｃ）ＲＯＩを画定すること
を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
さらに：
（ｄ）領域−表現型マーカー、例えば腫瘍マーカーのレベルを前記ＲＯＩにおいて同定すること
を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
さらに：
（ｅ）前記レベルを解析してリスクスコアを得ること
を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
さらに、工程（ａ）〜（ｄ）を反復することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
さらに：
前記試料を物理的調製工程に供すること、例えば、
前記試料を解離させること、例えばトリプシン処理すること、前記試料を切開すること、もしくは前記試料をＲＯＩマーカーの検出試薬と接触させること；
前記ＲＯＩを検出試薬と接触させること；または
前記ＲＯＩからのシグナルを検出すること
を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項３５】
患者の腫瘍試料、例えば前立腺腫瘍試料の評価の方法、例えば、コンピュータ実装方法または自動化方法であって、
（ａ）ＲＯＩ、例えば癌性ＲＯＩにおいて、第１の領域−表現型マーカー、例えば第１の腫瘍マーカーまたは前記第１の腫瘍マーカーのＤＮＡもしくはｍＲＮＡのレベル、例えば量を同定することであって、例えば、ここで前記第１の腫瘍マーカーは、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２およびＨＳＰＡ９（腫瘍マーカーセット）から選択される、同定すること、
それにより前記腫瘍試料を評価すること
を含む、方法。
【請求項３６】
第１の領域−表現型マーカー、例えば前記腫瘍マーカーセットからの第１の腫瘍マーカーのレベルが第１のＲＯＩ、例えば癌性ＲＯＩにおいて同定され、第２の領域−表現型マーカー、例えば前記腫瘍マーカーセットからの第２の腫瘍マーカーのレベルが第２のＲＯＩ、例えば第２の癌性ＲＯＩにおいて同定される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１のＲＯＩ、例えば癌性ＲＯＩと前記ＲＯＩ、例えば第２の癌性ＲＯＩが同じ方法または基準によって同定または選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
第１の領域−表現型マーカーのレベルと第２の領域−表現型マーカーのレベル、例えば、ともに前記腫瘍マーカーセットからの第１および第２の腫瘍マーカーのレベルが同じＲＯＩ内、例えば、同じ癌性ＲＯＩ内で同定される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
さらに：
（ｂ）ＲＯＩ、例えば、腫瘍上皮に対応する前記腫瘍試料のＲＯＩを同定すること
を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
（ａ）が（ｂ）の前に行なわれる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
（ｂ）が（ａ）の前に行なわれる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
第１の領域−表現型マーカー、例えば第１の腫瘍マーカーのレベルの同定が、前記第１の領域−表現型マーカー、例えば第１の腫瘍マーカーに対する検出試薬の結合に関連している、例えば比例しているシグナルを例えば直接または間接的に取得することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
前記腫瘍マーカーが、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２またはＨＳＰＡ９ＨＳＰＡ９をコードしているＤＮＡである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
前記腫瘍マーカーが、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２またはＨＳＰＡ９をコードしているｍＲＮＡである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
前記腫瘍マーカーが、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２またはＨＳＰＡ９から選択されるタンパク質である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
前記試料を、腫瘍マーカーセットの中のマーカーの検出試薬と接触させること、前記試料の画像を直接または間接的に取得すること、および前記画像を解析することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４７】
前記画像から前記患者のリスクスコアを計算することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４８】
前記試料を、腫瘍マーカーセットの前記第１のマーカーの検出試薬と接触させること、前記検出試薬の結合の値を直接または間接的に取得することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４９】
前記値から前記患者のリスクスコアを計算することを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
さらに、
ＲＯＩ（例えば、同じまたは異なるＲＯＩ）、例えば腫瘍上皮に対応するＲＯＩにおいて、前記腫瘍マーカーセットから選択される第２の腫瘍マーカーまたは前記第２の腫瘍マーカーのＤＮＡもしくはｍＲＮＡのレベルを同定すること
を含む、請求項１〜４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記第２の腫瘍マーカーが前記腫瘍マーカーセットのタンパク質である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
さらに、
ＲＯＩ（例えば、同じまたは異なるＲＯＩ）、例えば腫瘍上皮に対応するＲＯＩにおいて、前記腫瘍マーカーセットから選択される第３の腫瘍マーカーまたは前記第３の腫瘍マーカーのＤＮＡもしくはｍＲＮＡのレベルを同定すること
を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
さらに、
ＲＯＩ（例えば、同じまたは異なるＲＯＩ）、例えば腫瘍上皮に対応するＲＯＩにおいて、前記腫瘍マーカーセットから選択される第４の腫瘍マーカーまたは前記第４の腫瘍マーカーのＤＮＡもしくはｍＲＮＡのレベルを同定すること
を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
さらに、
ＲＯＩ（例えば、同じまたは異なるＲＯＩ）、例えば腫瘍上皮に対応するＲＯＩにおいて、前記腫瘍マーカーセットから選択される第５の腫瘍マーカーまたは前記第５の腫瘍マーカーのＤＮＡもしくはｍＲＮＡのレベルを同定すること
を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
さらに、
ＲＯＩ（例えば、同じまたは異なるＲＯＩ）、例えば腫瘍上皮に対応するＲＯＩにおいて、前記腫瘍マーカーセットから選択される第６の腫瘍マーカーまたは前記第６の腫瘍マーカーのＤＮＡもしくはｍＲＮＡのレベルを同定すること
を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
さらに、
ＲＯＩ（例えば、同じまたは異なるＲＯＩ）、例えば腫瘍上皮に対応するＲＯＩにおいて、前記腫瘍マーカーセットから選択される第７の腫瘍マーカーまたは前記第７の腫瘍マーカーのＤＮＡもしくはｍＲＮＡのレベルを同定すること
を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
さらに、
ＲＯＩ（例えば、同じまたは異なるＲＯＩ）、例えば腫瘍上皮に対応するＲＯＩにおいて、前記腫瘍マーカーセットから選択される第８の腫瘍マーカーまたは前記第８の腫瘍マーカーのＤＮＡもしくはｍＲＮＡのレベルを同定すること
を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
さらに、前記腫瘍マーカーセットのマーカー以外の本明細書に開示するさらなるマーカーのレベルを同定することを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記さらなるマーカーのレベルが癌性ＲＯＩにおいて同定される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記さらなるマーカーのレベルが良性ＲＯＩにおいて同定される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
さらに、前記腫瘍試料を準備することを含む、請求項１〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
さらに、前記腫瘍試料を別の実体、例えば病院、検査室または診療所から受領することを含む、請求項１〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記腫瘍試料が前立腺組織の切片またはスライスを含むものである、請求項１〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記腫瘍試料が複数の一部分、例えば、複数の前立腺組織の切片またはスライスを含むものである、請求項１〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記腫瘍試料が固定されている、例えばホルマリン固定されている、請求項１〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記腫瘍試料がマトリックス中に包埋されている、請求項１〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記腫瘍試料がパラフィン包埋されている、請求項１〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記腫瘍試料が脱パラフィンされている、請求項１〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記腫瘍試料がホルマリン固定パラフィン包埋された試料またはその等価物である、請求項１〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
腫瘍試料の調製、例えば脱パラフィンが自動化されている、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
検出試薬と前記腫瘍試料との接触が自動化されている、請求項１〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記腫瘍試料が自動化スキャナー内に配置される、請求項１〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記腫瘍試料、例えば前立腺組織の一部分、例えば切片またはスライスを、基材上に、例えば固相または硬質の基材、例えばガラスまたはプラスチックの基材、例えばガラススライド上に載せる、請求項１〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記腫瘍試料の第１の一部分、例えば切片またはスライスを、第１の基材、例えば固相または硬質の基材、例えばガラスまたはプラスチックの基材、例えばガラススライド上に載せる、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
さらに：
前記腫瘍試料の第２の一部分、例えば切片またはスライスを、第２の基材、例えば固相または硬質の基材、例えばガラスまたはプラスチックの基材、例えばガラススライド上に載せること
を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
さらに：
前記腫瘍試料の第３の一部分、例えば切片またはスライスを、第３の基材、例えば固相または硬質の基材、例えばガラスまたはプラスチックの基材、例えばガラススライド上に載せること
を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
さらに：
前記腫瘍試料の第４の一部分、例えば切片またはスライスを、第４の基材、例えば固相または硬質の基材、例えばガラスまたはプラスチックの基材、例えばガラススライド上に載せること
を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記第１および第２の一部分が同時に解析される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
前記第１および第２の一部分が逐次解析される、請求項７５に記載の方法。
【請求項８０】
前記検出試薬が腫瘍マーカー抗体、例えば腫瘍マーカーモノクローナル抗体、例えば、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２またはＨＳＰＡ９に対する腫瘍マーカー抗体を含む、請求項１〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記腫瘍マーカー抗体が標識、例えば蛍光性部分、例えば蛍光色素にコンジュゲートされている、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記検出試薬が、前記腫瘍マーカー抗体に対する抗体、例えばモノクローナル抗体である第２の抗体を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記検出試薬が、前記第２の抗体に対する抗体、例えばモノクローナル抗体である第３の抗体を含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記第２の抗体が標識、例えば蛍光性部分、例えば蛍光色素にコンジュゲートされている、請求項８１に記載の方法。
【請求項８５】
前記第３の抗体が標識、例えば蛍光性部分、例えば蛍光色素にコンジュゲートされている、請求項８２に記載の方法。
【請求項８６】
前記腫瘍試料を：
第１の発光プロフィール、例えば第１のピーク発光を有するか、または第１のチャネル内で測定される第１のＲＯＩマーカー検出試薬、例えば全上皮検出試薬、例えば、本明細書に記載のもの；
第２の発光プロフィール、例えば第２のピーク発光を有するか、または第２のチャネル内で測定される第２のＲＯＩマーカー検出試薬、例えば基底上皮検出試薬、例えば、本明細書に記載のもの；
第３の発光プロフィール、例えば第３のピーク発光を有するか、または第３のチャネル内で測定される領域−表現型マーカー、例えば腫瘍マーカー検出試薬、例えば、本明細書に記載のもの
と接触させる、請求項１〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記腫瘍試料をさらに：
第４の発光プロフィール、例えば第４のピーク発光を有するか、または第４のチャネル内で測定される核検出試薬
と接触させる、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記腫瘍試料をさらに：
第５の発光プロフィール、例えば第５のピーク発光を有するか、または第５のチャネル内で測定される第２の領域−表現型マーカー、例えば第２の腫瘍マーカー検出試薬、例えば、本明細書に記載のもの
と接触させる、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記腫瘍試料をさらに：
第６の発光プロフィール、例えば第６のピーク発光を有するか、または第６のチャネル内で測定される第３の領域−表現型マーカー、例えば第３の腫瘍マーカー検出試薬、例えば、本明細書に記載のもの
と接触させる、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
ＲＯＩ、例えば癌性ＲＯＩの同定が、基底細胞の外層がない上皮構造を有する領域を同定することを含む、請求項１〜８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
上皮構造が、第１のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば第１の全上皮特異的検出試薬、例えば抗体、例えばモノクローナル抗体、例えば抗ＣＫ８または抗ＣＫ１８抗体、例えばモノクローナル抗体で検出される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
上皮構造が、前記第１のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば前記第１の全上皮特異的検出試薬と第２のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば第２の全上皮特異的検出試薬で検出される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記第１のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば前記第１の全上皮特異的検出試薬と前記第２のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば前記第２の全上皮特異的検出試薬の一方がＣＫ８検出試薬、例えば抗ＣＫ８抗体、例えばモノクローナル抗体であり、他方がＣＫ１８結合試薬、例えば抗ＣＫ１８抗体、例えばモノクローナル抗体である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記第１のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば前記第１の全上皮検出試薬の結合のシグナルが、第１のチャネルを介して例えば第１の波長で検出される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記第１のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば前記第１の全上皮検出試薬の結合のシグナルと前記第２のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば前記第２の全上皮検出試薬のシグナルが前記第１のチャネルを介して例えば第１の波長で検出される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記第１（および存在する場合は、必要に応じて前記第２）のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば前記全上皮検出試薬が、マーカー抗体、例えばマーカーモノクローナル抗体を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９７】
前記第１（および存在する場合は、必要に応じて前記第２）のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば前記全上皮検出試薬が標識、例えば蛍光性部分、例えば蛍光色素にコンジュゲートされている、請求項９１に記載の方法。
【請求項９８】
前記第１（および存在する場合は、必要に応じて前記第２）のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば前記全上皮結合剤が、前記マーカー抗体に対する抗体、例えばモノクローナル抗体である第２の抗体を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９９】
前記第１（および存在する場合は、必要に応じて前記第２）のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば前記全上皮結合剤が、前記第２の抗体に対する抗体、例えばモノクローナル抗体である第３の抗体を含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記第２の抗体が標識、例えば蛍光性部分、例えば蛍光色素にコンジュゲートされている、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記第３の抗体が標識、例えば蛍光性部分、例えば蛍光色素にコンジュゲートされている、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０２】
基底細胞の存在または非存在が、ＲＯＩ特異的検出試薬、例えば基底上皮検出試薬、例えば本明細書に記載の基底上皮検出試薬で検出される、請求項９０から１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０３】
さらに、前記腫瘍試料の良性ＲＯＩに対応するＲＯＩ、例えば第２のＲＯＩ同定することを含む、請求項１〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
良性ＲＯＩの同定が、基底細胞の外層によって囲まれた上皮構造を有する領域を同定することを含む、請求項１０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０５】
基底細胞が、基底上皮のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば抗体、例えばモノクローナル抗体、例えば抗ＣＫ５抗体、例えばモノクローナル抗体または抗ＴＲＩＭ２９抗体、例えばモノクローナル抗体で検出される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
基底細胞が、基底上皮の前記ＲＯＩ特異的検出試薬と基底上皮の第２のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば抗体、例えばモノクローナル抗体、例えば抗ＣＫ５抗体、例えばモノクローナル抗体または抗ＴＲＩＭ２９抗体、例えばモノクローナル抗体で検出される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
基底上皮の前記第１のＲＯＩ特異的検出試薬と基底上皮の前記ＲＯＩ特異的検出試薬の一方がＣＫ５検出試薬、例えば抗ＣＫ５抗体、例えばモノクローナル抗体であり、他方がＴＲＩＭ２９検出試薬、例えば抗ＴＲＩＭ２９抗体、例えばモノクローナル抗体である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
基底上皮の前記第１のＲＯＩ特異的検出試薬の結合のシグナルが第１のチャネルを介して例えば第１の波長で検出される、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
基底上皮の前記第１のＲＯＩ特異的検出試薬の結合のシグナルと基底上皮の前記第２のＲＯＩ特異的検出試薬のシグナルが前記第１のチャネルを介して例えば第１の波長で検出される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
基底上皮の前記第１（および存在する場合は、必要に応じて前記第２）のＲＯＩ特異的検出試薬が、マーカー抗体、例えばマーカーモノクローナル抗体を含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１１】
基底上皮の前記第１（および存在する場合は、必要に応じて前記第２）のＲＯＩ特異的検出試薬が標識、例えば蛍光性部分、例えば蛍光色素にコンジュゲートされている、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１２】
基底上皮の前記第１（および存在する場合は、必要に応じて前記第２）のＲＯＩ特異的検出試薬が、前記マーカー抗体に対する第２の抗体、例えばモノクローナル抗体を含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１３】
基底上皮の前記第１（および存在する場合は、必要に応じて前記第２）のＲＯＩ特異的検出試薬が前記第２の抗体に対する抗体、例えばモノクローナル抗体である第３の抗体を含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１４】
前記第２の抗体が標識、例えば蛍光性部分、例えば蛍光色素にコンジュゲートされている、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記第３の抗体が標識、例えば蛍光性部分、例えば蛍光色素にコンジュゲートされている、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
さらに、前記腫瘍試料のＲＯＩを間質として同定することを含む、請求項１〜１１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１７】
（ｉ．ａ）全上皮特異的マーカー、例えばＣＫ８のシグナルを直接または間接的に取得すること；
（ｉｉ．ａ）基底上皮特異的マーカー、例えばＣＫ５のシグナルを直接または間接的に取得すること
を含む、請求項１〜１１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１８】
さらに：
（ｉ．ｂ）第２の全上皮特異的マーカー、例えばＣＫ１８のシグナルを直接または間接的に取得すること；
（ｉｉ．ｂ）第２の基底上皮特異的マーカー、例えばＴＲＩＭ２９のシグナルを直接または間接的に取得すること
を含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
さらに：
（ｉｉｉ）核マーカーのシグナルを直接または間接的に取得すること
を含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
さらに；
（ｉｖ）前記腫瘍マーカーセットの第２の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得すること
を含む、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
さらに；
（ｖ）前記腫瘍マーカーセットの第３の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得すること
を含む  、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
さらに；
（ｖｉ）前記腫瘍マーカーセットの第４の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得すること
を含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２３】
さらに；
（ｖｉｉ）前記腫瘍マーカーセットの第５の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得すること
を含む、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
さらに；
（ｖｉｉｉ）前記腫瘍マーカーセットの第６の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得すること
を含む、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
さらに；
（ｉｘ）前記腫瘍マーカーセットの第７の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得すること
を含む、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
さらに；
（ｘ）前記腫瘍マーカーセットの第８の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得すること
を含む、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
（ｉ．ａ）および（ｉ．ｂ）の前記シグナルが同じピーク発光を有するか、または同じチャネル内で収集される、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２８】
（ｉｉ．ａ）および（ｉｉ．ｂ）の前記シグナルが同じピーク発光を有するか、または同じチャネル内で収集される、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２９】
（ｉ．ａ）全上皮特異的マーカー、例えばＣＫ８のシグナルを直接または間接的に取得すること；
（ｉ．ｂ）第２の全上皮特異的マーカー、例えばＣＫ１８のシグナルを直接または間接的に取得すること；
（ｉｉ．ａ）基底上皮特異的マーカー、例えばＣＫ５のシグナルを直接または間接的に取得すること；
（ｉｉ．ｂ）第２の基底上皮特異的マーカー、例えばＴＲＩＭ２９のシグナルを直接または間接的に取得すること；
（ｉｉｉ）核マーカーのシグナルを直接または間接的に取得すること；
（ｉｖ）第１の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得すること；
（ｖ）第２の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得すること；あるいは
（ｖｉ）第３の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得すること
を含む、請求項１〜１１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３０】
（ｉ．ａ）、（ｉｉ．ａ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含む、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
（ｉ．ａ）、（ｉ．ｂ）、（ｉｉ．ａ）、（ｉｉ．ｂ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含む、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３２】
（ｉ．ａ）〜（ｖ）の全部を含む、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３３】
（ｉ．ａ）〜（ｖｉ）の全部を含む、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３４】
さらに、例えば第２のＲＯＩ内、例えば良性ＲＯＩ内の品質管理マーカーレベルを同定することを含む、請求項１〜１３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３５】
さらに、前記品質管理マーカーが腫瘍マーカーセットから選択される、例えばＤＥＲＬ１である、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
さらに、前記試料を前記品質管理マーカーの検出試薬と接触させることを含む、請求項１３４または１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
さらに、例えば第２のＲＯＩ内、例えば良性ＲＯＩ内の前記第１の品質管理マーカーに対する前記検出試薬の結合に関連している、例えば比例しているシグナルを、例えば直接または間接的に取得すること含む、請求項１３３〜１３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３８】
さらに、例えば第２のＲＯＩ内、例えば良性ＲＯＩ内の第２の品質管理マーカーレベルを同定することを含む、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
前記第２の品質管理マーカーが前記腫瘍マーカーセットのマーカー以外のものである、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
前記第２の品質管理マーカーが腫瘍の致死性または侵攻性と関連している、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記第２の品質管理マーカーが、前記腫瘍マーカーセットのマーカー以外の本明細書に記載のマーカー、例えば腫瘍マーカーである、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４２】
前記第２の品質管理マーカーが、ＡＣＴＮおよびＶＤＡＣ１から選択される、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
さらに、例えば第２のＲＯＩ内、例えば良性ＲＯＩ内の第３の品質管理マーカーのレベルを同定することを含む、請求項１３７から１４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記第３の品質管理マーカーが前記腫瘍マーカーセットのマーカー以外のものである、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
前記第３の品質管理マーカーが、前記腫瘍マーカーセットのマーカー以外の本明細書に記載のマーカー、例えば腫瘍マーカーである、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記第３の品質管理マーカーが、ＡＣＴＮおよびＶＤＡＣ１から選択される、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４７】
さらに：
第２のＲＯＩ内、例えば良性ＲＯＩ内の第１の品質管理マーカー、例えばＤＥＲＬ１のレベル、例えば量を同定すること；および
第２のＲＯＩ内、例えば良性ＲＯＩ内の第２の品質管理マーカー、例えばＡＣＴＮとＶＤＡＣのうちの一方のレベルを同定すること
を含む、請求項１から１４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４８】
さらに：
第２のＲＯＩ内、例えば良性ＲＯＩ内の第３の品質管理マーカー、例えばＡＣＴＮとＶＤＡＣのうちの一方のレベルを同定すること
を含む、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
前記第１の、第２のおよび第３の品質管理マーカーのレベルが、同じ第２のＲＯＩ、例えば良性ＲＯＩにおいて同定される、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１５０】
前記第１の、第２のおよび第３の品質管理マーカーのレベルが、異なる第２のＲＯＩ、例えば異なる良性ＲＯＩにおいて同定される、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１５１】
さらに：
第２のＲＯＩ内、例えば良性ＲＯＩ内の第１の品質管理マーカー、例えばＤＥＲＬ１のレベルを同定すること；
第２のＲＯＩ内、例えば良性ＲＯＩ内の第２の品質管理マーカー、例えばＡＣＴＮとＶＤＡＣのうちの一方のレベルを同定すること；および
第２のＲＯＩ内、例えば良性ＲＯＩ内の第３の品質管理マーカー、例えばＡＣＴＮとＶＤＡＣのうちの一方のレベルを同定すること
ここで、前記レベルに応じて、前記試料を例えば合格または合格でないと分類すること
を含む、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１５２】
前記品質管理マーカーのうちの１つのレベルのシグナルを検出することを含む、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
検出された前記シグナルの第１の値が第１の品質レベル、例えば合格品質を示し、検出されたシグナルの第２の値が第２の品質レベル、例えば不合格品質を示す、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
前記値に応じて、前記試料が加工される、もしくは加工されない、例えば廃棄される、または解析のパラメータが変更される、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
前記試料からマルチスペクトル画像を取得すること、および前記マルチスペクトル画像を以下のチャネル：
第１のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば上皮特異的マーカーのチャネル；
第２のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば基底上皮特異的マーカーのチャネル；
核特異的シグナル、例えばＤＡＰＩシグナルのチャネル；および
第１の集団表現型マーカー、例えば第１の腫瘍マーカーのチャネル
内にアンミキシングすること
を含む、請求項１〜１５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５６】
第１のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば全上皮マーカーのシグナルを収集するための第１のチャネルの使用；
第２のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば基底上皮マーカーのシグナルを収集するための第２のチャネルの使用；
核領域のシグナルを収集するための第３のチャネルの使用；
第１の集団表現型マーカー、例えばＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２およびＨＳＰＡ９から選択される第１の腫瘍マーカーのシグナルを収集するための第４のチャネルの使用
を含む、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
さらに：
第２の集団表現型マーカー、例えばＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２およびＨＳＰＡ９から選択される第２の腫瘍マーカーのシグナルを収集するための第５のチャネルの使用
を含む、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
さらに：
第３の集団表現型マーカー、例えばＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２およびＨＳＰＡ９から選択される第３の腫瘍マーカーのシグナルを収集するための第６のチャネルの使用
を含む、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
前記試料の解析される領域の画像を、例えばＤＡＰＩフィルタリング画像として取得することを含む、請求項１〜１５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６０】
例えば前記試料から収集された画像に組織検索アルゴリズムを適用することにより、組織の位置特定を行なうこと
を含む、請求項１〜１５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６１】
ＤＡＰＩおよびＦＩＴＣモノクロームフィルターを用いて画像を再度取得すること
を含む、請求項１〜１６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６２】
さらに、例えば充分な組織を含む予め選択した視野数の画像が取得されることが確実になるように、組織検索アルゴリズムを適用すること
を含む、請求項１〜１６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６３】
さらに、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣおよびＣｙ５フィルターの連続露光量を直接または間接的に取得することを含む、請求項１〜１６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６４】
試料の解析される領域のマルチスペクトル画像を取得することを含む、請求項１〜１６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６５】
前記試料領域を上皮細胞、基底細胞および間質にセグメント化することを含む、請求項１〜１６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６６】
さらに、前記試料領域の細胞質領域と核領域を同定することを含む、請求項１〜１６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６７】
癌性ＲＯＩの細胞質、核および／または全細胞における集団表現型マーカー、例えば腫瘍マーカーの値を例えば直接または間接的に取得することを含む、請求項１〜１６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６８】
良性ＲＯＩの細胞質、核および／または全細胞における集団表現型マーカー、例えば腫瘍マーカーの値を例えば直接または間接的に取得することを含む、請求項１〜１６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６９】
前記腫瘍試料が複数の一部分、例えば複数の切片またはスライスを含むものである、請求項１〜１６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７０】
本明細書に記載の工程を行なうこと、例えば、第１の一部分、例えば切片またはスライスから、第１の集団表現型マーカー、例えば第１の腫瘍マーカーのシグナルを収集もしくは取得すること、または画像を形成すること、例えばレベルを同定すること；および
本明細書に記載の工程を行なうこと、例えば、第２の一部分、例えば第２の切片またはスライスから、第２の集団表現型マーカー、例えば第２の腫瘍マーカーのシグナルを収集もしくは取得すること、または画像を形成すること、例えばレベルを同定すること
を含む、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７１】
前記第２の腫瘍マーカーが、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２およびＨＳＰＡ９から選択される、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
さらに：
前記腫瘍試料の第２の一部分、例えば第２の切片またはスライスにおいて、腫瘍上皮に対応するＲＯＩを同定すること；
腫瘍上皮に対応する前記ＲＯＩから、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２およびＨＳＰＡ９から選択される第２の腫瘍マーカーのシグナルを例えば直接または間接的に取得すること
を含む、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７３】
前記腫瘍試料の前記第２の一部分、例えば第２の切片またはスライスの
（ｉ．ａ）上皮特異的マーカー、例えばＣＫ８のシグナルを取得すること；
（ｉｉ．ａ）基底上皮特異的マーカー、例えばＣＫ５のシグナルを取得すること
を含む、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７４】
さらに、前記腫瘍試料の前記第２の一部分、例えば第２の切片またはスライスの：
（ｉ．ｂ）第２の上皮特異的マーカー、例えばＣＫ１８のシグナルを取得すること；
（ｉｉ．ｂ）第２の基底上皮特異的マーカー、例えばＴＲＩＭ２９のシグナルを取得すること
を含む、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７５】
さらに、前記腫瘍試料の前記第２の一部分、例えば第２の切片またはスライスの：
（ｉｉｉ）核マーカーのシグナルを取得すること
を含む、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７６】
さらに、前記腫瘍試料の前記第２の一部分、例えば第２の切片またはスライスの；
（ｉｖ）請求項１に記載の第２の腫瘍マーカーのシグナルを取得すること
を含む、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７７】
さらに、前記腫瘍試料の前記第２の一部分、例えば第２の切片またはスライスの；
（ｖ）前記腫瘍マーカーセットの第２の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得すること
を含む、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７８】
さらに、前記腫瘍試料の前記第２の一部分、例えば第２の切片またはスライスの
（ｖｉ）前記腫瘍マーカーセットの第３の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得すること
を含む、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１７９】
さらに、前記腫瘍試料の前記第２の一部分、例えば第２の切片またはスライスの；
（ｖｉｉ）前記腫瘍マーカーセットの第４の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得すること
を含む、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８０】
さらに、前記腫瘍試料の前記第２の一部分、例えば第２の切片またはスライスの；
（ｖｉｉｉ）前記腫瘍マーカーセットの第５の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得すること
を含む、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８１】
さらに、前記腫瘍試料の前記第２の一部分、例えば第２の切片またはスライスの；
（ｉｘ）前記腫瘍マーカーセットの第６の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得すること
を含む、請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８２】
さらに、前記腫瘍試料の前記第２の一部分、例えば第２の切片またはスライスの；
（ｘ）前記腫瘍マーカーセットの第７の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得すること
を含む、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８３】
さらに、前記腫瘍試料の前記第２の一部分、例えば第２の切片またはスライスの；
（ｘｉ）前記腫瘍マーカーセットの第８の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得すること
を含む、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８４】
（ｉ．ａ）および（ｉ．ｂ）の前記シグナルが同じピーク発光を有するか、または同じチャネル内で収集される、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１８５】
（ｉｉ．ａ）および（ｉｉ．ｂ）の前記シグナルが同じピーク発光を有するか、または同じチャネル内で収集される、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１８６】
さらに：
前記腫瘍試料の第３の一部分、例えば第３の切片またはスライスにおいて、腫瘍上皮に対応するＲＯＩを同定すること；
腫瘍上皮に対応する前記ＲＯＩから、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２およびＨＳＰＡ９から選択される第３の腫瘍マーカーのシグナルを例えば直接または間接的に取得すること
を含む、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１８７】
前記腫瘍試料の第３の一部分、例えば第３の切片またはスライスの：
（ｉ．ａ）上皮特異的マーカー、例えばＣＫ８のシグナルを取得すること；
（ｉｉ．ａ）基底上皮特異的マーカー、例えばＣＫ５のシグナルを取得すること
を含む、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１８８】
さらに、前記腫瘍試料の前記第３の一部分、例えば第３の切片またはスライスの：
（ｉ．ｂ）第２の上皮特異的マーカー、例えばＣＫ１８のシグナルを取得すること；
（ｉｉ．ｂ）第２の基底上皮特異的マーカー、例えばＴＲＩＭ２９のシグナルを取得すること
を含む、請求項１８７に記載の方法。
【請求項１８９】
さらに、前記腫瘍試料の前記第３の一部分、例えば第３の切片またはスライスの：
（ｉｉｉ）核マーカーのシグナルを取得すること
を含む、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９０】
さらに、前記腫瘍試料の前記第３の一部分、例えば第３の切片またはスライスの：
（ｉｖ）請求項１に記載の第２の腫瘍マーカーのシグナルを取得すること
を含む、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９１】
（ｉ．ａ）および（ｉ．ｂ）の前記シグナルが同じピーク発光を有するか、または同じチャネル内で収集される、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９２】
（ｉｉ．ａ）および（ｉｉ．ｂ）の前記シグナルが同じピーク発光を有するか、または同じチャネル内で収集される、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９３】
第１の腫瘍試料の一部分、例えば第１の切片またはスライスを第１の基材上に載せる、請求項１〜１９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９４】
第２の腫瘍試料の一部分、例えば第２の切片またはスライスを第２の基材上に載せる、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９５】
第３の腫瘍試料の一部分、例えば第３の切片またはスライスを第３の基材上に載せる、請求項１９４に記載の方法。
【請求項１９６】
第４の腫瘍試料の一部分、例えば第４の切片またはスライスを第４の基材上に載せる、請求項１９５に記載の方法。
【請求項１９７】
第１の腫瘍試料の一部分、例えば第１の切片またはスライスと第２の腫瘍試料の一部分、例えば第２の切片またはスライスを同じ基材上に載せる、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１９８】
さらに、本明細書に記載の方法のいずれかの工程で前記試料から取得したシグナル、値または画像に対応する値を、デジタルまたは電子媒体に、例えばコンピュータのデータベースに保存または格納することを含む、請求項１〜１９７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９９】
前記腫瘍試料からのシグナルの捕捉により得られた値または画像をソフトウェアに、例えばパターン認識または物体認識ソフトウェアにエクスポートし、核領域を同定することを含む、請求項１〜１９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２００】
前記腫瘍試料からのシグナルの捕捉により得られた値または画像をソフトウェアに、例えばパターン認識または物体認識ソフトウェアにエクスポートし、細胞質領域を同定することを含む、請求項１〜１９９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０１】
前記腫瘍試料からのシグナルの捕捉により得られた値または画像をソフトウェアに、例えばパターン認識または物体認識ソフトウェアにエクスポートし、癌性ＲＯＩを同定することを含む、請求項１〜２００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０２】
前記腫瘍試料からのシグナルの捕捉により得られた値または画像をソフトウェアに、例えばパターン認識または物体認識ソフトウェアにエクスポートし、良性ＲＯＩを同定することを含む、請求項１〜２０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０３】
前記腫瘍試料からのシグナルの捕捉により得られた値または画像をソフトウェアに、例えばパターン認識または物体認識ソフトウェアにエクスポートし、癌性ＲＯＩ内の前記腫瘍マーカーのレベルの値を得ることを含む、請求項１〜２０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０４】
前記腫瘍試料からのシグナルの捕捉により得られた値または画像をソフトウェアに、例えばパターン認識または物体認識ソフトウェアにエクスポートし、良性ＲＯＩ内の前記腫瘍マーカーのレベルの値を得ることを含む、請求項１〜２０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０５】
領域の表現型マーカー、例えば腫瘍マーカーのシグナル、第１のＲＯＩマーカー、例えば全上皮特異的マーカーのシグナルおよび第２のＲＯＩマーカー、例えば基底上皮特異的マーカーのシグナルに応じて、癌性ＲＯＩ内の領域の表現型マーカー、例えば腫瘍マーカーのレベルの値を得ること
を含む、請求項１〜２０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０６】
領域の表現型マーカー、例えば腫瘍マーカーのシグナル、第１のＲＯＩマーカー、例えば全上皮特異的マーカーのシグナルおよび第２のＲＯＩマーカー、例えば基底上皮特異的マーカーのシグナルに応じて、良性ＲＯＩ内の腫瘍マーカーのレベルの値を得ることを含む、請求項１〜２０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０７】
領域の表現型マーカー、例えば腫瘍マーカーのシグナル、第１のＲＯＩマーカー、例えば全上皮特異的マーカーのシグナルおよび第２のＲＯＩマーカー、例えば基底上皮特異的マーカーのシグナルおよび第３のＲＯＩマーカー、例えば核特異的マーカーのシグナルに応じて、癌性ＲＯＩ内の腫瘍マーカーの細胞質内レベルの値を得ることを含む、請求項１〜２０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０８】
領域の表現型マーカー、例えば腫瘍マーカーのシグナル、第１のＲＯＩマーカー、例えば全上皮特異的マーカーのシグナルおよび第２のＲＯＩマーカー、例えば基底上皮特異的マーカーのシグナルおよび第３のＲＯＩマーカー、例えば核特異的マーカーのシグナルに応じて、良性ＲＯＩ内の腫瘍マーカーの核内レベルの値を得ることを含む、請求項１〜２０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０９】
前記患者のリスクスコアを計算することを含む、請求項２０５に記載の方法。
【請求項２１０】
前記値に応じて前記患者のリスクスコアを計算することを含む、請求項２０５に記載の方法。
【請求項２１１】
請求項１９８〜２０８に記載の前記値のうちの１つまたはそれより多くに応じて、前記患者のリスクスコアを計算することを含む、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１２】
前記患者のリスクスコアを計算することを含み、前記リスクスコアが前立腺外拡張または転移の可能性と相関している、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１３】
前記リスクスコアに応じて、前記患者の予後診断を行なうこと、前記患者を分類すること、前記患者に対して処置過程を選択すること、または選択された処置過程を前記患者に施すことを含む、請求項２１２に記載の方法。
【請求項２１４】
前記リスクスコアが「予後良好」症例（例えば、外科的グリーソン３＋３または３に最低４、器官限局性（≦Ｔ２）腫瘍を伴う）に対応する、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１５】
前記リスクスコアが「予後不良」症例（例えば、被膜浸透（Ｔ３ａ）、精嚢浸潤（Ｔ３ｂ）、リンパ節転移または４もしくはそれより高い優位なグリーソンパターン）に対応する、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１６】
前記リスクスコアにより「予後良好」症例（例えば、外科的グリーソン３＋３または３に最低４、器官限局性（≦Ｔ２）腫瘍を伴う）と「予後不良」症例（例えば、被膜浸透（Ｔ３ａ）、精嚢浸潤（Ｔ３ｂ）、リンパ節転移または４もしくはそれより高い優位なグリーソンパターン）間の識別が可能である、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１７】
前記リスクスコアが：
外科的グリーソン３＋３もしくは局在性疾患（≦Ｔ３ａ）（「低リスク」と規定する）；
外科的グリーソン≧３＋４もしくは非局在性疾患（Ｔ３ｂ、ＮあるいはＭ）（「中〜高リスク」と規定する）；
外科的グリーソン≦３＋４および器官限局疾患（≦Ｔ２）（「予後良好」と規定する）；または
外科的グリーソン≧４＋３もしくは器官非限局疾患（Ｔ３ａ、Ｔ３ｂ、ＮあるいはＭ）（「予後不良」）
に対応する、または予測するものである、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１８】
さらに、前記リスクスコアに応じて、前記患者を、侵攻性癌を有する、またはリスクの増大もしくは癌関連致死性転帰を有すると同定することを含む、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１９】
補助療法について前記患者を選択すること、または前記患者に補助療法を施すことを含む、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２２０】
腫瘍マーカーＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２またはＨＳＰＡ９のうちの１、２、３、４、５、６、７または全部の検出試薬を含むキット。
【請求項２２１】
さらに、全上皮マーカーおよび基底上皮マーカーの検出試薬を含む、請求項２２０に記載のキット。
【請求項２２２】
癌試料、例えば前立腺腫瘍試料の上にに：
全上皮マーカーの検出試薬；
基底上皮マーカーの検出試薬；
ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２またはＨＳＰＡ９から選択される腫瘍マーカーの検出試薬
が配置された癌試料、例えば前立腺腫瘍試料。
【請求項２２３】
前記試料が複数の一部分、例えばスライスを含むものである、請求項２２２に記載の前立腺腫瘍試料。
【請求項２２４】
癌試料、例えば前立腺腫瘍試料の上にさらに、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２またはＨＳＰＡ９から選択される第２の腫瘍マーカーの検出試薬が配置された癌試料、例えば前立腺腫瘍試料。
【請求項２２５】
患者の前立腺腫瘍試料の評価のコンピュータ実装方法であって、
（ｉ）腫瘍上皮に対応する前記腫瘍試料のＲＯＩ（癌性ＲＯＩ）を同定すること；
（ｉｉ）癌性ＲＯＩ内の以下の腫瘍マーカー、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２およびＨＳＰＡ９（腫瘍マーカーセット）の各々のレベル、例えば量を同定することであって、ここで、腫瘍マーカーレベルの同定は、前記腫瘍マーカーに対する抗体の結合に関連している、例えば比例しているシグナルを例えば直接または間接的に取得することを含む、同定すること；
（ｉｉｉ）癌性ＲＯＩ内の前記腫瘍マーカーの各々のレベルの値を得ること；ならびに
（ｉｖ）例えばアルゴリズムによって前記レベルを併せることにより前記患者にリスクスコアを割り当てることを含む、前記値に応じて前記腫瘍試料を評価すること
それにより前立腺腫瘍試料を評価すること
を含む、方法。
【請求項２２６】
全上皮マーカーのシグナルを収集するための第１のチャネルの使用；
基底上皮マーカーのシグナルを収集するための第２のチャネルの使用；
核領域のシグナルを収集するための第３のチャネルの使用；
ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２およびＨＳＰＡ９から選択される腫瘍マーカーのシグナルを収集するための第４のチャネルの使用
を含む、請求項２２５に記載の方法。
【請求項２２７】
前記腫瘍マーカーセットの第１の腫瘍マーカーのレベルが第１の癌性ＲＯＩにおいて同定され、前記腫瘍マーカーセットの第２の腫瘍マーカーのレベルが第２の癌性ＲＯＩにおいて同定される、請求項２２５〜２２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２２８】
ともに前記腫瘍マーカーセットからの第１の腫瘍マーカーのレベルおよび第２の腫瘍マーカーのレベルが同じ癌性ＲＯＩにおいて同定される、請求項２２５〜２２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２２９】
さらに：
第２のＲＯＩ内、例えば良性ＲＯＩ内の第１の品質管理マーカー、例えばＤＥＲＬ１のレベルを同定すること；
第２のＲＯＩ内、例えば良性ＲＯＩ内の第２の品質管理マーカー、例えばＡＣＴＮとＶＤＡＣのうちの一方のレベルを同定すること；および
第２のＲＯＩ内、例えば良性ＲＯＩ内の第３の品質管理マーカー、例えばＡＣＴＮとＶＤＡＣのうちの一方のレベルを同定すること
ここで、前記レベルに応じて、前記試料を例えば合格または合格でないと分類すること
を含む、請求項２２５〜２２８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／７９２，００３号の利益を請求し、その全内容はその全体が参照によって本明細書により援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、癌患者の予後を予測するためのバイオマーカーパネルの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
前立腺癌（ＰＣＡ）は、男性の最も一般的な癌である。ほとんどの高齢男性は前立腺内新形成を有するが、その圧倒的多数の症例は局所性および緩慢性のままであり、治療介入の必要性がない。しかし、侵攻性の悪性腫瘍が“変化しにくい”である初期段階のＰＣＡのサブセットが存在し、未処置のまま放置すると前立腺外に広がり、転移性疾患および最終的には死へと容赦なく進行する。現在、緩慢性疾患と侵攻性疾患を正確に識別できないことにより、緩慢性の可能性がある疾患を有する多くの男性が、高い不健全率を伴う不必要な根治的治療介入、例えば前立腺摘除および放射線を受けている。米国単独において、前立腺癌の過剰処置と関連しているコストは、年間２０億ドルを超えると推定されている。また、これは、治療処置による生活の質への影響を含んでいない。一方で、侵攻性の可能性があるＰＣＡを有する一部の患者は処置不充分であり、疾患進行のために死亡している。
【０００４】
前立腺癌の転帰を予測するために現在使用されている階層化方法は、グリーソン分類、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）レベルおよび腫瘍進行度分類などの臨床的要素に基づいている。しかしながら、これらの要素では転帰は充分にな予測されず、最も重要な臨床的エンドポイントである転移性リスクおよびＰＣＡ特異的死亡とも確実には関連していない。まだ対処されていないこの医学的必要性により、進行リスクを割り当てることができ、被標化介入治療の機会をもたらすバイオマーカーを同定することことを目的として、ＰＣＡ進行の遺伝的および生物学的根拠を規定するための取組みが活気づいている。ヒトＰＣＡの遺伝子研究により、いくつかの指標事象、例えばＰＴＥＮ腫瘍抑制因子の不活化およびＥＴＳファミリー転座および調節異常ならびに他の遺伝子改変もしくは後成的改変、例えばＮｋｘ３．１、ｃ−ＭｙｃおよびＳＰＩＮＫが同定されている。また、全体的分子解析によっても一連の潜在的再発／転移バイオマーカー、例えばＥＣＡＤ、ＡＩＰＣ、Ｐｉｍ−１  Ｋｉｎａｓｅ、ｈｅｐｓｉｎ、ＡＭＡＣＲおよびＥＺＨ２が同定されている。しかしながら、ヒトＰＣＡの極めて強い異質性によって臨床的場面における単独バイオマーカーの使用が制限されており、したがって、予後診断用多重遺伝子バイオマーカーパネルまたは指標を規定するための、より包括的な転写プロファイリング試験が鼓舞されている。このようなパネルまたは指標はよりロバストであるように思われるが、その臨床使用は、固有のノイズおよび転写ネットワークの状況特異的性質ならびに有意な疾患異質性をもたらす無数のバイスタンダー遺伝的および後成的事象を伴う癌ゲノムの極端な不安定性のため不確実なままである。したがって、特に初期段階における癌の存在および挙動を予測するために使用され得、したがって前立腺癌患者に対する適切な処置のガイドに有用な、初期段階腫瘍におけるより正確な予後診断試験の必要性が存在している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
一態様では、本明細書において、患者からの癌試料、例えば前立腺腫瘍試料の評価の方法、例えば、コンピュータ実装方法または自動化方法を提供する。該方法は、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２およびＨＳＰＡ９（腫瘍マーカーセット）のうちの１、２、３、４、５、６、７もしくは８種類の腫瘍マーカーまたは前記腫瘍マーカーのＤＮＡもしくはｍＲＮＡ（１種類もしくはそれ以上）のレベル、例えば量または発現レベルを同定し、それにより前記腫瘍試料を評価することを含むものである。
【０００６】
諸実施形態では、該方法は、腫瘍マーカーのシグナルを例えば直接または間接的に取得することを含む。諸実施形態では、該方法は、該シグナルを直接取得することを含む。
【０００７】
諸実施形態では、該方法は、癌試料を直接または間接的に取得することを含む。
【０００８】
また、本明細書において、（ａ）癌試料；ならびに（ｂ）ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２およびＨＳＰＡ９（腫瘍マーカーセット）のうちの１、２、３、４、５、６、７もしくは８種類の腫瘍マーカーまたは前記腫瘍マーカーのＤＮＡもしくはｍＲＮＡの検出試薬を含む反応混合物を提供する。該反応混合物の一部の実施形態では、癌試料が複数の一部分、例えばスライスまたはアリコートを含むものである。該反応混合物の一部の実施形態では、癌試料の第１の一部分が、前記マーカーのすべてではない第１のマーカーの検出試薬を含むものであり、癌試料の第２の一部分が、第１のマーカーの検出試薬を含まない該マーカーのうちの１つの検出マーカーの検出試薬を含むものである。
【０００９】
また、本明細書において、患者試料、例えば組織試料、例えば癌試料、例えば前立腺腫瘍試料の評価の方法、例えば、コンピュータ実装方法または自動化方法を提供する。該方法は：（ａ）前記試料から、関心領域（ＲＯＩ）において、第１の領域の表現型マーカー、例えば第１の腫瘍マーカーのレベルを同定すること、それにより前記試料を評価することを含むものである。
【００１０】
諸実施形態では、試料が癌試料である。諸実施形態では、試料が固形腫瘍由来の細胞を含むものである。諸実施形態では、試料が液性腫瘍由来の細胞を含むものである。諸実施形態では、ＲＯＩが形態学的特徴によって画定または選択される。
【００１１】
諸実施形態では、ＲＯＩが手作業または自動化手段および他の細胞もしくは物質からのＲＯＩの物理的分離によって、例えば、他の組織、例えば非癌性細胞からのＲＯＩ、例えば癌性領域の切開によって画定または選択される。諸実施形態では、ＲＯＩが非形態学的特徴、例えばＲＯＩマーカーによって画定または選択される。諸実施形態では、ＲＯＩが、ＲＯＩマーカーを含めることによってセルソーティングにより同定または選択される。諸実施形態では、ＲＯＩが形態学的選択と非形態学的選択の組合せによってに同定または選択される。
【００１２】
諸実施形態では、第１の領域の表現型マーカー、例えば第１の腫瘍マーカーのレベルが第１のＲＯＩ、例えば第１の癌性領域において同定され、第２の領域の表現型マーカー、例えば第２の腫瘍マーカーのレベルが第２のＲＯＩ、例えば第２の癌性領域において同定される。
【００１３】
諸実施形態では、第１の領域の表現型マーカーレベルと第２の領域の表現型マーカーレベル、例えば腫瘍マーカーレベルが同じＲＯＩ、例えば同じ癌性領域において同定される。
【００１４】
諸実施形態では、該方法は、さらに：（ｂ）ＲＯＩ、例えば癌性領域に対応するＲＯＩを同定することを含む。
【００１５】
一部の実施形態では、（ａ）が（ｂ）の前に行なわれる。
【００１６】
他の実施形態では（ｂ）が（ａ）の前に行なわれる。
【００１７】
諸実施形態では、第１の領域の表現型マーカー、例えば第１の腫瘍マーカーのレベルの同定が、前記第１の領域の表現型マーカー、例えば第１の腫瘍マーカーに対する検出試薬の結合に関連している、例えば比例しているシグナルを例えば直接または間接的に取得することを含む。
【００１８】
諸実施形態では、該方法は、試料を、第１の領域の表現型マーカー、例えば第１の腫瘍マーカーの検出試薬と接触させることを含む。
【００１９】
諸実施形態では、該方法は、試料を、ＲＯＩマーカー、例えば上皮マーカーの検出試薬と接触させることを含む。
【００２０】
諸実施形態では、該方法はさらに、試料の画像を取得すること、および該画像を解析することを含む。一部のかかる実施形態では、該方法は、前記画像から前記患者のリスクスコアを計算することを含む。
【００２１】
諸実施形態では、該方法は、試料を、第１の領域の表現型マーカー、例えば腫瘍マーカーの検出試薬と接触させること、および検出試薬の結合の値を取得することを含む。一部のかかる実施形態では、該方法は、該値から前記患者のリスクスコアを計算することを含む。
【００２２】
諸実施形態では、該方法はさらに（ｂ）試料をＲＯＩマーカーの検出試薬と接触させることを含む。諸実施形態では、該方法はさらに（ｃ）ＲＯＩを画定することを含む。諸実施形態では、該方法はさらに（ｄ）領域−表現型マーカー、例えば腫瘍マーカーのレベルを前記ＲＯＩにおいて同定することを含む。諸実施形態では、該方法はさらに（ｅ）前記レベルを解析してリスクスコアを得ることを含む。諸実施形態では、該方法はさらに工程（ａ）〜（ｄ）を反復することを含む。
【００２３】
諸実施形態では、該方法はさらに（ｉ）前記試料を試料の１つまたはそれより多くの物理的調製工程に供すること、例えば前記試料を解離させること、例えばトリプシン処理すること、前記試料を切開すること、もしくは前記試料をＲＯＩマーカーの検出試薬と接触させること；（ｉｉ）前記ＲＯＩを検出試薬と接触させること；および／または（ｉｉｉ）前記ＲＯＩからのシグナルを検出することを含む。
【００２４】
また、本発明は、患者の腫瘍試料、例えば前立腺腫瘍試料の評価の方法、例えば、コンピュータ実装方法または自動化方法であって：
【００２５】
（ａ）ＲＯＩ、例えば癌性ＲＯＩにおいて、第１の領域−表現型マーカー、例えば第１の腫瘍マーカー（例えば、ここで前記第１の腫瘍マーカーは、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２およびＨＳＰＡ９（腫瘍マーカーセット）から選択される）または前記第１の腫瘍マーカーのＤＮＡもしくはｍＲＮＡのレベル、例えば量を同定すること、それにより前記腫瘍試料を評価することを含む方法を特徴とするものである。
【００２６】
諸実施形態では、第１の領域−表現型マーカー、例えば前記腫瘍マーカーセットからの第１の腫瘍マーカーのレベルが第１のＲＯＩ、例えば癌性ＲＯＩにおいて同定され、第２の領域−表現型マーカー、例えば前記腫瘍マーカーセットからの第２の腫瘍マーカーのレベルが第２のＲＯＩ、例えば第２の癌性ＲＯＩにおいて同定される。諸実施形態では、前記第１のＲＯＩ、例えば癌性ＲＯＩと前記ＲＯＩ、例えば第２の癌性ＲＯＩが同じ方法または基準によって同定または選択される。諸実施形態では、第１の領域−表現型マーカーのレベルと第２の領域−表現型マーカーのレベル（例えば、ともに前記腫瘍マーカーセットからの第１および第２の腫瘍マーカー）が同じＲＯＩ内、例えば、同じ癌性ＲＯＩ内で同定される。
【００２７】
諸実施形態では、該方法はさらに：（ｂ）ＲＯＩ、例えば、腫瘍上皮に対応する前記腫瘍試料のＲＯＩを同定することを含む。該方法の一部の実施形態では、（ａ）が（ｂ）の前に行なわれる。該方法の一部の実施形態では、（ｂ）が（ａ）の前に行なわれる。
【００２８】
諸実施形態では、第１の領域−表現型マーカー、例えば第１の腫瘍マーカーのレベルの同定が、前記第１の領域−表現型マーカー、例えば第１の腫瘍マーカーに対する検出試薬の結合に関連している、例えば比例しているシグナルを例えば直接または間接的に取得することを含む。諸実施形態では、腫瘍マーカーが、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２またはＨＳＰＡ９ＨＳＰＡ９をコードしているＤＮＡである。諸実施形態では、腫瘍マーカーが、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２またはＨＳＰＡ９をコードしているｍＲＮＡである。諸実施形態では、腫瘍マーカーが、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２またはＨＳＰＡ９から選択されるタンパク質である。
【００２９】
諸実施形態では、該方法は、試料を、腫瘍マーカーセットの中のマーカーの検出試薬と接触させること、試料の画像を直接または間接的に取得すること、該画像を解析することを含む。諸実施形態では、該方法は、該画像から患者のリスクスコアを計算することを含む。
【００３０】
諸実施形態では、該方法は、試料を、腫瘍マーカーセットの第１のマーカーの検出試薬と接触させること、検出試薬の結合の値を直接または間接的に取得することを含む。諸実施形態では、該方法は、前記値から前記患者のリスクスコアを計算することを含む。
【００３１】
前述の方法のいずれか（ａｎｙ  ｏｆ  ａｎｙ  ｏｆ）１つの諸実施形態では、該方法はさらに、ＲＯＩ（例えば、同じまたは異なるＲＯＩ）、例えば腫瘍上皮に対応するＲＯＩにおいて、前記腫瘍マーカーセットから選択される第２の腫瘍マーカーまたは前記第２の腫瘍マーカーのＤＮＡもしくはｍＲＮＡのレベルを同定することを含む。
【００３２】
諸実施形態では、前記第２の腫瘍マーカーが前記腫瘍マーカーセットのタンパク質である。
【００３３】
諸実施形態では、該方法はさらに、ＲＯＩ（例えば、同じまたは異なるＲＯＩ）、例えば腫瘍上皮に対応するＲＯＩにおいて、前記腫瘍マーカーセットから選択される第３の腫瘍マーカーまたは前記第３の腫瘍マーカーのＤＮＡもしくはｍＲＮＡのレベルを同定することを含む。
【００３４】
諸実施形態では、該方法はさらに、ＲＯＩ（例えば、同じまたは異なるＲＯＩ）、例えば腫瘍上皮に対応するＲＯＩにおいて、前記腫瘍マーカーセットから選択される第４の腫瘍マーカーまたは前記第４の腫瘍マーカーのＤＮＡもしくはｍＲＮＡのレベルを同定することを含む。
【００３５】
諸実施形態では、該方法はさらに、ＲＯＩ（例えば、同じまたは異なるＲＯＩ）、例えば腫瘍上皮に対応するＲＯＩにおいて、前記腫瘍マーカーセットから選択される第５の腫瘍マーカーまたは前記第５の腫瘍マーカーのＤＮＡもしくはｍＲＮＡのレベルを同定することを含む。
【００３６】
諸実施形態では、該方法はさらに、ＲＯＩ（例えば、同じまたは異なるＲＯＩ）、例えば腫瘍上皮に対応するＲＯＩにおいて、前記腫瘍マーカーセットから選択される第６の腫瘍マーカーまたは前記第６の腫瘍マーカーのＤＮＡもしくはｍＲＮＡのレベルを同定することを含む。
【００３７】
諸実施形態では、該方法はさらに、ＲＯＩ（例えば、同じまたは異なるＲＯＩ）、例えば腫瘍上皮に対応するＲＯＩにおいて、前記腫瘍マーカーセットから選択される第７の腫瘍マーカーまたは前記第７の腫瘍マーカーのＤＮＡもしくはｍＲＮＡのレベルを同定することを含む。
【００３８】
諸実施形態では、該方法はさらに、ＲＯＩ（例えば、同じまたは異なるＲＯＩ）、例えば腫瘍上皮に対応するＲＯＩにおいて、前記腫瘍マーカーセットから選択される第８の腫瘍マーカーまたは前記第８の腫瘍マーカーのＤＮＡもしくはｍＲＮＡのレベルを同定することを含む。
【００３９】
諸実施形態では、該方法はさらに、前記腫瘍マーカーセットのマーカー以外の本明細書に開示するさらなるマーカーのレベルを同定することを含む。
【００４０】
諸実施形態では、前記さらなるマーカーのレベルが癌性ＲＯＩにおいて同定される。
【００４１】
諸実施形態では、前記さらなるマーカーのレベルが良性ＲＯＩにおいて同定される。
【００４２】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法はさらに、前記腫瘍試料または前記癌試料を準備することを含む。（本明細書で用いる場合、本文中にそうでないことが示されていない限り、用語「癌試料」および「腫瘍試料」は互換的である。）
【００４３】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法はさらに、別の実体、例えば病院、検査室または診療所からの前記腫瘍試料を含む。
【００４４】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、前記癌試料または前記腫瘍試料が前立腺組織の切片またはスライスを含むものである。
【００４５】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、前記癌試料または前記腫瘍試料が複数の一部分、例えば、複数の前立腺組織の切片またはスライスを含むものである。
【００４６】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、前記癌試料または前記腫瘍試料が固定されている、例えばホルマリン固定されている。
【００４７】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、前記癌試料または前記腫瘍試料がマトリックス中に包埋されている。
【００４８】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、前記癌試料または前記腫瘍試料がパラフィン包埋されている。
【００４９】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、前記癌試料または前記腫瘍試料が脱パラフィンされている。
【００５０】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、前記癌試料または前記腫瘍試料がホルマリン固定パラフィン包埋された試料またはその等価物である。
【００５１】
諸実施形態では、癌試料または腫瘍試料の調製（例えば、脱パラフィン）が自動化されている。
【００５２】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、検出試薬と前記癌試料または腫瘍試料との接触が自動化されている。
【００５３】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、癌試料または腫瘍試料が自動化スキャナー内に配置される。
【００５４】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、癌試料または腫瘍試料、例えば前立腺組織の一部分、例えば切片またはスライスを、基材上に、例えば固相または硬質の基材、例えばガラスまたはプラスチックの基材、例えばガラススライド上に載せる。一部のかかる実施形態では、前記腫瘍試料の第１の一部分、例えば切片またはスライスを、第１の基材、例えば固相または硬質の基材、例えばガラスまたはプラスチックの基材、例えばガラススライド上に載せる。諸実施形態では、前記腫瘍試料の第２の一部分、例えば切片またはスライスを、第２の基材、例えば固相または硬質の基材、例えばガラスまたはプラスチックの基材、例えばガラススライド上に載せる。諸実施形態では、前記腫瘍試料の第３の一部分、例えば切片またはスライスを、第３の基材、例えば固相または硬質の基材、例えばガラスまたはプラスチックの基材、例えばガラススライド上に載せる。諸実施形態では、前記腫瘍試料の第４の一部分、例えば切片またはスライスを、第４の基材、例えば固相または硬質の基材、例えばガラスまたはプラスチックの基材、例えばガラススライド上に載せる。
【００５５】
諸実施形態では、前記第１および第２の一部分が同時に解析される。諸実施形態では、前記第１および第２の一部分が逐次解析される。
【００５６】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、前記検出試薬が腫瘍マーカー抗体、例えば腫瘍マーカーモノクローナル抗体、例えば、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２またはＨＳＰＡ９に対する腫瘍マーカー抗体を含む。諸実施形態では、前記腫瘍マーカー抗体が標識、例えば蛍光性部分、例えば蛍光色素にコンジュゲートされている。
【００５７】
諸実施形態では、前記検出試薬が、前記腫瘍マーカー抗体に対する抗体、例えばモノクローナル抗体である第２の抗体を含む。
【００５８】
諸実施形態では、前記検出試薬が、前記第２の抗体に対する抗体、例えばモノクローナル抗体である第３の抗体を含む。
【００５９】
諸実施形態では、前記第２の抗体が標識、例えば蛍光性部分、例えば蛍光色素にコンジュゲートされている。
【００６０】
諸実施形態では、前記第３の抗体が標識、例えば蛍光性部分、例えば蛍光色素にコンジュゲートされている。
【００６１】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、癌または腫瘍の試料を：
第１の発光プロフィール、例えば第１のピーク発光を有するか、または第１のチャネル内で測定される第１のＲＯＩマーカー検出試薬、例えば全上皮検出試薬（例えば、本明細書に記載のもの）；
第２の発光プロフィール、例えば第２のピーク発光を有するか、または第２のチャネル内で測定される第２のＲＯＩマーカー検出試薬、例えば基底上皮検出試薬（例えば、本明細書に記載のもの）；
第３の発光プロフィール、例えば第３のピーク発光を有するか、または第３のチャネル内で測定される領域−表現型マーカー、例えば腫瘍マーカー検出試薬（例えば、本明細書に記載のもの）
と接触させる。
【００６２】
諸実施形態では、癌または腫瘍の試料をさらに、第４の発光プロフィール、例えば第４のピーク発光を有するか、または第４のチャネル内で測定される核検出試薬と接触させる。
【００６３】
諸実施形態では、癌または腫瘍の試料をさらに、第５の発光プロフィール、例えば第５のピーク発光を有するか、または第５のチャネル内で測定される第２の領域−表現型マーカー、例えば第２の腫瘍マーカー検出試薬（例えば、本明細書に記載のもの）と接触させる。
【００６４】
諸実施形態では、癌または腫瘍の試料をさらに、第６の発光プロフィール、例えば第６のピーク発光を有するか、または第６のチャネル内で測定される第３の領域−表現型マーカー、例えば第３の腫瘍マーカー検出試薬（例えば、本明細書に記載のもの）と接触させる。
【００６５】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、ＲＯＩ、例えば癌性ＲＯＩの同定が、基底細胞の外層がない上皮構造を有する領域を同定することを含む。
【００６６】
諸実施形態では、該上皮構造が、第１のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば第１の全上皮特異的検出試薬、例えば抗体、例えばモノクローナル抗体、例えば抗ＣＫ８または抗ＣＫ１８抗体、例えばモノクローナル抗体で検出される。
【００６７】
諸実施形態では、該上皮構造が、前記第１のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば前記第１の全上皮特異的検出試薬と第２のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば第２の全上皮特異的検出試薬で検出される。
【００６８】
諸実施形態では、前記第１のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば前記第１の全上皮特異的検出試薬と前記第２のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば前記第２の全上皮特異的検出試薬の一方がＣＫ８検出試薬、例えば抗ＣＫ８抗体、例えばモノクローナル抗体であり、他方がＣＫ１８結合試薬、例えば抗ＣＫ１８抗体、例えばモノクローナル抗体である。
【００６９】
諸実施形態では、前記第１のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば前記第１の全上皮検出試薬の結合のシグナルが、第１のチャネルを介して例えば第１の波長で検出される。
【００７０】
諸実施形態では、前記第１のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば前記第１の全上皮検出試薬の結合のシグナルと前記第２のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば前記第２の全上皮検出試薬のシグナルが前記第１のチャネルを介して例えば第１の波長で検出される。
【００７１】
諸実施形態では、前記第１（および存在する場合は、必要に応じて前記第２）のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば前記全上皮検出試薬が、マーカー抗体、例えばマーカーモノクローナル抗体を含む。
【００７２】
諸実施形態では、前記第１（および存在する場合は、必要に応じて前記第２）のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば前記全上皮検出試薬が標識、例えば蛍光性部分、例えば蛍光色素にコンジュゲートされている。
【００７３】
諸実施形態では、前記第１（および存在する場合は、必要に応じて前記第２）のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば前記全上皮結合剤が、前記マーカー抗体に対する抗体、例えばモノクローナル抗体である第２の抗体を含む。
【００７４】
諸実施形態では、前記第１（および存在する場合は、必要に応じて前記第２）のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば前記全上皮結合剤が、前記第２の抗体に対する抗体、例えばモノクローナル抗体である第３の抗体を含む。
【００７５】
諸実施形態では、前記第２の抗体が標識、例えば蛍光性部分、例えば蛍光色素にコンジュゲートされている。
【００７６】
諸実施形態では、前記第３の抗体が標識、例えば蛍光性部分、例えば蛍光色素にコンジュゲートされている。
【００７７】
諸実施形態では、基底細胞の存在または非存在が、ＲＯＩ特異的検出試薬、例えば基底上皮検出試薬、例えば本明細書に記載の基底上皮検出試薬で検出される。
【００７８】
諸実施形態では、方法がさらに、前記腫瘍試料の良性ＲＯＩに対応するＲＯＩ、例えば第２のＲＯＩ同定することを含む。
【００７９】
諸実施形態では、良性ＲＯＩの同定が、基底細胞の外層によって囲まれた上皮構造を有する領域を同定することを含む。
【００８０】
諸実施形態では、基底細胞が、基底上皮のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば抗体、例えばモノクローナル抗体、例えば抗ＣＫ５抗体、例えばモノクローナル抗体または抗ＴＲＩＭ２９抗体、例えばモノクローナル抗体で検出される。
【００８１】
諸実施形態では、基底細胞が、基底上皮の前記ＲＯＩ特異的検出試薬と基底上皮の第２のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば抗体、例えばモノクローナル抗体、例えば抗ＣＫ５抗体、例えばモノクローナル抗体または抗ＴＲＩＭ２９抗体、例えばモノクローナル抗体で検出される。
【００８２】
諸実施形態では、基底上皮の前記第１のＲＯＩ特異的検出試薬と基底上皮の前記ＲＯＩ特異的検出試薬の一方がＣＫ５検出試薬、例えば抗ＣＫ５抗体、例えばモノクローナル抗体であり、他方がＴＲＩＭ２９検出試薬、例えば抗ＴＲＩＭ２９抗体、例えばモノクローナル抗体である。
【００８３】
諸実施形態では、基底上皮の前記第１のＲＯＩ特異的検出試薬の結合のシグナルが第１のチャネルを介して例えば第１の波長で検出される。
【００８４】
諸実施形態では、基底上皮の前記第１のＲＯＩ特異的検出試薬の結合のシグナルと基底上皮の前記第２のＲＯＩ特異的検出試薬のシグナルが前記第１のチャネルを介して例えば第１の波長で検出される。
【００８５】
諸実施形態では、基底上皮の前記第１（および存在する場合は、必要に応じて前記第２）のＲＯＩ特異的検出試薬が、マーカー抗体、例えばマーカーモノクローナル抗体を含む。
【００８６】
諸実施形態では、基底上皮の前記第１（および存在する場合は、必要に応じて前記第２）のＲＯＩ特異的検出試薬が標識、例えば蛍光性部分、例えば蛍光色素にコンジュゲートされている。
【００８７】
諸実施形態では、基底上皮の前記第１（および存在する場合は、必要に応じて前記第２）のＲＯＩ特異的検出試薬が、前記マーカー抗体に対する第２の抗体、例えばモノクローナル抗体を含む。
【００８８】
諸実施形態では、基底上皮の前記第１（および存在する場合は、必要に応じて前記第２）のＲＯＩ特異的検出試薬が前記第２の抗体に対する抗体、例えばモノクローナル抗体である第３の抗体を含む。
【００８９】
諸実施形態では、前記第２の抗体が標識、例えば蛍光性部分、例えば蛍光色素にコンジュゲートされている。
【００９０】
諸実施形態では、前記第３の抗体が標識、例えば蛍光性部分、例えば蛍光色素にコンジュゲートされている。
【００９１】
諸実施形態では、該方法がさらに、前記腫瘍試料のＲＯＩを間質として同定することを含む。
【００９２】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法は（ｉ．ａ）全上皮特異的マーカー、例えばＣＫ８のシグナルを直接または間接的に取得すること；（ｉｉ．ａ）基底上皮特異的マーカー、例えばＣＫ５のシグナルを直接または間接的に取得することを含む。
【００９３】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法は、さらに：（ｉ．ｂ）第２の全上皮特異的マーカー、例えばＣＫ１８のシグナルを直接または間接的に取得すること；（ｉｉ．ｂ）第２の基底上皮特異的マーカー、例えばＴＲＩＭ２９のシグナルを直接または間接的に取得することを含む。諸実施形態では、該方法はさらに（ｉｉｉ）核マーカーのシグナルを直接または間接的に取得することを含む。諸実施形態では、該方法はさらに（ｉｖ）前記腫瘍マーカーセットの第２の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得することを含む。諸実施形態では、該方法はさらに（ｖ）前記腫瘍マーカーセットの第３の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得することを含む。諸実施形態では、該方法はさらに
（ｖｉ）前記腫瘍マーカーセットの第４の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得することを含む。諸実施形態では、該方法はさらに（ｖｉｉ）前記腫瘍マーカーセットの第５の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得することを含む。諸実施形態では、該方法はさらに（ｖｉｉｉ）前記腫瘍マーカーセットの第６の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得することを含む。諸実施形態では、該方法はさらに（ｉｘ）前記腫瘍マーカーセットの第７の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得することを含む。諸実施形態では、該方法はさらに（ｘ）前記腫瘍マーカーセットの第８の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得することを含む。
【００９４】
諸実施形態では、（ｉ．ａ）および（ｉ．ｂ）の前記シグナルが同じピーク発光を有するか、または同じチャネル内で収集される。
【００９５】
諸実施形態では、（ｉｉ．ａ）および（ｉｉ．ｂ）の前記シグナルが同じピーク発光を有するか、または同じチャネル内で収集される。
【００９６】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法は：（ｉ．ａ）全上皮特異的マーカー、例えばＣＫ８のシグナルを直接または間接的に取得すること；（ｉ．ｂ）第２の全上皮特異的マーカー、例えばＣＫ１８のシグナルを直接または間接的に取得すること；（ｉｉ．ａ）基底上皮特異的マーカー、例えばＣＫ５のシグナルを直接または間接的に取得すること；（ｉｉ．ｂ）第２の基底上皮特異的マーカー、例えばＴＲＩＭ２９のシグナルを直接または間接的に取得すること；（ｉｉｉ）核マーカーのシグナルを直接または間接的に取得すること；（ｉｖ）第１の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得すること；（ｖ）第２の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得すること；あるいは（ｖｉ）第３の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得することを含む。諸実施形態では、該方法は（ｉ．ａ）、（ｉｉ．ａ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含む。諸実施形態では、該方法は（ｉ．ａ）、（ｉ．ｂ）、（ｉｉ．ａ）、（ｉｉ．ｂ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含む。諸実施形態では、該方法は（ｉ．ａ）〜（ｖ）の全部を含む。諸実施形態では、該方法は（ｉ．ａ）〜（ｖｉ）の全部を含む。
【００９７】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法はさらに、例えば第２のＲＯＩ内、例えば良性ＲＯＩ内の品質管理マーカーのレベルを同定することを含む。諸実施形態では、前記品質管理マーカーが該腫瘍マーカーセットから選択される、例えばＤＥＲＬ１である。
【００９８】
諸実施形態では、該方法はさらに、前記試料を、前記品質管理マーカーの検出試薬と接触させることを含む。
【００９９】
諸実施形態では、該方法はさらに、例えば第２のＲＯＩ内、例えば良性ＲＯＩ内の前記第１の品質管理マーカーに対する前記検出試薬の結合に関連している、例えば比例しているシグナルを例えば直接または間接的に取得することを含む。
【０１００】
諸実施形態では、該方法はさらに、例えば第２のＲＯＩ内、例えば良性ＲＯＩ内の第２の品質管理マーカーのレベルを同定することを含む。諸実施形態では、前記第２の品質管理マーカーが前記腫瘍マーカーセットのマーカー以外のものである。諸実施形態では、前記第２の品質管理マーカーが腫瘍の致死性または侵攻性と関連している。諸実施形態では、前記第２の品質管理マーカーが、前記腫瘍マーカーセットのマーカー以外の本明細書に記載のマーカー、例えば腫瘍マーカーである。諸実施形態では、前記第２の品質管理マーカーが、ＡＣＴＮおよびＶＤＡＣ１から選択される。
【０１０１】
諸実施形態では、該方法はさらに、例えば第２のＲＯＩ内、例えば良性ＲＯＩ内の第３の品質管理マーカーのレベルを同定することを含む。諸実施形態では、前記第３の品質管理マーカーが前記腫瘍マーカーセットのマーカー以外のものである。諸実施形態では、前記第３の品質管理マーカーが、前記腫瘍マーカーセットのマーカー以外の本明細書に記載のマーカー、例えば腫瘍マーカーである。諸実施形態では、前記第３の品質管理マーカーが、ＡＣＴＮおよびＶＤＡＣ１から選択される。
【０１０２】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法はさらに、第２のＲＯＩ内、例えば良性ＲＯＩ内の第１の品質管理マーカー、例えばＤＥＲＬ１のレベル、例えば量を同定すること；および第２のＲＯＩ内、例えば良性ＲＯＩ内の第２の品質管理マーカー、例えばＡＣＴＮとＶＤＡＣのうちの一方のレベルを同定することを含む。
【０１０３】
諸実施形態では、該方法はさらに、第２のＲＯＩ内、例えば良性ＲＯＩ内の第３の品質管理マーカー、例えばＡＣＴＮとＶＤＡＣのうちの一方のレベルを同定することを含む。諸実施形態では、第１の、第２のおよび第３の品質管理マーカーのレベルが、同じ第２のＲＯＩ、例えば良性ＲＯＩにおいて同定される。諸実施形態では、第１の、第２のおよび第３の品質管理マーカーのレベルが、異なる第２のＲＯＩ、例えば異なる良性ＲＯＩにおいて同定される。
【０１０４】
諸実施形態では、該方法はさらに、第２のＲＯＩ内、例えば良性ＲＯＩ内の第１の品質管理マーカー、例えばＤＥＲＬ１のレベルを同定すること；第２のＲＯＩ内、例えば良性ＲＯＩ内の第２の品質管理マーカー、例えばＡＣＴＮとＶＤＡＣのうちの一方のレベルを同定すること；および第２のＲＯＩ内、例えば良性ＲＯＩ内の第３の品質管理マーカー、例えばＡＣＴＮとＶＤＡＣのうちの一方のレベルを同定すること、ここで、前記レベルに応じて、試料を例えば合格または合格でないと分類することを含む。
【０１０５】
諸実施形態では、該方法は、前記品質管理マーカーのうちの１つのレベルのシグナルを検出することを含む。諸実施形態では、検出されたシグナルの第１の値が第１の品質レベル、例えば合格品質を示し、検出されたシグナルの第２の値が第２の品質レベル、例えば不合格品質を示す。諸実施形態では、前記値に応じて、試料が加工される、もしくは加工されない、例えば廃棄される、または解析のパラメータが変更される。
【０１０６】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法は、前記試料からマルチスペクトル画像を取得すること、および前記マルチスペクトル画像を以下のチャネル：第１のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば上皮特異的マーカーのチャネル；第２のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば基底上皮特異的マーカーのチャネル；核特異的シグナル、例えばＤＡＰＩシグナルのチャネル；および第１の集団表現型マーカー、例えば第１の腫瘍マーカーのチャネル内にアンミキシングすることを含む。諸実施形態では、該方法は：第１のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば全上皮マーカーのシグナルを収集するための第１のチャネルの使用；第２のＲＯＩ特異的検出試薬、例えば基底上皮マーカーのシグナルを収集するための第２のチャネルの使用；核領域のシグナルを収集するための第３のチャネルの使用；第１の集団表現型マーカー、例えばＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２およびＨＳＰＡ９から選択される第１の腫瘍マーカーのシグナルを収集するための第４のチャネルの使用を含む。諸実施形態では、該方法はさらに：第２の集団表現型マーカー、例えばＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２およびＨＳＰＡ９から選択される第２の腫瘍マーカーのシグナルを収集するための第５のチャネルの使用を含む。諸実施形態では、該方法はさらに：第３の集団表現型マーカー、例えばＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２およびＨＳＰＡ９から選択される第３の腫瘍マーカーのシグナルを収集するための第６のチャネルの使用を含む。
【０１０７】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法は、試料の解析される領域の画像を、例えばＤＡＰＩフィルタリング画像として取得することを含む。
【０１０８】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法は、例えば前記試料から収集された画像に組織検索アルゴリズムを適用することにより、組織の位置特定を行なうことを含む。
【０１０９】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法は、ＤＡＰＩおよびＦＩＴＣモノクロームフィルターを用いて画像を再度取得することを含む。
【０１１０】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法は、例えば充分な組織を含む予め選択した視野数の画像が取得されることが確実になるように、組織検索アルゴリズムを適用することを含む。
【０１１１】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法は、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣおよびＣｙ５フィルターの連続露光量を直接または間接的に取得することを含む。
【０１１２】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法は、試料の解析される領域のマルチスペクトル画像を取得することを含む。
【０１１３】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法は、前記試料領域を上皮細胞、基底細胞および間質にセグメント化することを含む。
【０１１４】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法はさらに、前記試料領域の細胞質領域と核領域を同定することを含む。
【０１１５】
癌性ＲＯＩの細胞質、核および／または全細胞における集団表現型マーカー、例えば腫瘍マーカーの値を例えば直接または間接的に取得することを含む、請求項１〜１６６のいずれか１項に記載の方法。
【０１１６】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法は、良性ＲＯＩの細胞質、核および／または全細胞における集団表現型マーカー、例えば腫瘍マーカーの値を例えば直接または間接的に取得することを含む。
【０１１７】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、前記癌または腫瘍の試料が複数の一部分、例えば複数の切片またはスライスを含むものである。
【０１１８】
諸実施形態では、該方法は、第１の一部分、例えば切片またはスライスで第１の集団表現型マーカー、例えば第１の腫瘍マーカーの本明細書に記載の工程を行なうこと、例えばシグナルを収集もしくは取得すること、または画像を形成すること、例えばレベルを同定すること；および第２の一部分、例えば第２の切片またはスライスで第２の集団表現型マーカー、例えば第２の腫瘍マーカーの本明細書に記載の工程を行なうこと、例えばシグナルを収集もしくは取得すること、または画像を形成すること、例えばレベルを同定することを含む。諸実施形態では、前記第２の腫瘍マーカーが、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２およびＨＳＰＡ９から選択される。諸実施形態では、該方法はさらに：前記腫瘍試料の第２の一部分、例えば第２の切片またはスライスにおいて、腫瘍上皮に対応するＲＯＩを同定すること；腫瘍上皮に対応する前記ＲＯＩから、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２およびＨＳＰＡ９から選択される第２の腫瘍マーカーのシグナルを例えば直接または間接的に取得することを含む。
【０１１９】
諸実施形態では、該方法は、前記腫瘍試料の前記第２の一部分、例えば第２の切片またはスライスの（ｉ．ａ）上皮特異的マーカー、例えばＣＫ８のシグナルを取得すること；
（ｉｉ．ａ）基底上皮特異的マーカー、例えばＣＫ５のシグナルを取得すること
を含む。
【０１２０】
諸実施形態では、該方法はさらに、前記腫瘍試料の前記第２の一部分、例えば第２の切片またはスライスの：（ｉ．ｂ）第２の上皮特異的マーカー、例えばＣＫ１８のシグナルを取得すること；（ｉｉ．ｂ）第２の基底上皮特異的マーカー、例えばＴＲＩＭ２９のシグナルを取得することを含む。
【０１２１】
諸実施形態では、該方法はさらに、前記腫瘍試料の前記第２の一部分、例えば第２の切片またはスライスの：（ｉｉｉ）核マーカーのシグナルを取得することを含む。
【０１２２】
諸実施形態では、該方法はさらに、前記腫瘍試料の前記第２の一部分、例えば第２の切片またはスライスの；（ｉｖ）請求項１に記載の第２の腫瘍マーカーのシグナルを取得することを含む。諸実施形態では、該方法はさらに、前記腫瘍試料の前記第２の一部分、例えば第２の切片またはスライスの；（ｖ）前記腫瘍マーカーセットの第２の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得することを含む。諸実施形態では、該方法はさらに、前記腫瘍試料の前記第２の一部分、例えば第２の切片またはスライスの（ｖｉ）前記腫瘍マーカーセットの第３の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得することを含む。諸実施形態では、該方法はさらに、前記腫瘍試料の前記第２の一部分、例えば第２の切片またはスライスの；（ｖｉｉ）前記腫瘍マーカーセットの第４の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得することを含む。諸実施形態では、該方法はさらに、前記腫瘍試料の前記第２の一部分、例えば第２の切片またはスライスの；（ｖｉｉｉ）前記腫瘍マーカーセットの第５の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得することを含む。諸実施形態では、該方法はさらに、前記腫瘍試料の前記第２の一部分、例えば第２の切片またはスライスの；（ｉｘ）前記腫瘍マーカーセットの第６の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得することを含む。諸実施形態では、該方法はさらに、前記腫瘍試料の前記第２の一部分、例えば第２の切片またはスライスの；（ｘ）前記腫瘍マーカーセットの第７の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得することを含む。諸実施形態では、該方法はさらに、前記腫瘍試料の前記第２の一部分、例えば第２の切片またはスライスの；（ｘｉ）前記腫瘍マーカーセットの第８の腫瘍マーカーのシグナルを直接または間接的に取得することを含む。
【０１２３】
諸実施形態では、（ｉ．ａ）および（ｉ．ｂ）の前記シグナルが同じピーク発光を有するか、または同じチャネル内で収集される。
【０１２４】
諸実施形態では、（ｉｉ．ａ）および（ｉｉ．ｂ）の前記シグナルが同じピーク発光を有するか、または同じチャネル内で収集される。
【０１２５】
諸実施形態では、該方法はさらに、前記腫瘍試料の第３の一部分、例えば第３の切片またはスライスにおいて、腫瘍上皮に対応するＲＯＩを同定すること；腫瘍上皮に対応する前記ＲＯＩから、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２およびＨＳＰＡ９から選択される第３の腫瘍マーカーのシグナルを例えば直接または間接的に取得することを含む。
【０１２６】
諸実施形態では、該方法は、前記腫瘍試料の第３の一部分、例えば第３の切片またはスライスの：（ｉ．ａ）上皮特異的マーカー、例えばＣＫ８のシグナルを取得すること；（ｉｉ．ａ）基底上皮特異的マーカー、例えばＣＫ５のシグナルを取得することを含む。諸実施形態では、該方法はさらに、前記腫瘍試料の前記第３の一部分、例えば第３の切片またはスライスの：（ｉ．ｂ）第２の上皮特異的マーカー、例えばＣＫ１８のシグナルを取得すること；（ｉｉ．ｂ）第２の基底上皮特異的マーカー、例えばＴＲＩＭ２９のシグナルを取得することを含む。諸実施形態では、該方法はさらに、前記腫瘍試料の前記第３の一部分、例えば第３の切片またはスライスの：（ｉｉｉ）核マーカーのシグナルを取得することを含む。諸実施形態では、該方法はさらに、前記腫瘍試料の前記第３の一部分、例えば第３の切片またはスライスの：（ｉｖ）請求項１に記載の第２の腫瘍マーカーのシグナルを取得することを含む。諸実施形態では、（ｉ．ａ）および（ｉ．ｂ）の前記シグナルが同じピーク発光を有するか、または同じチャネル内で収集される。諸実施形態では、（ｉｉ．ａ）および（ｉｉ．ｂ）の前記シグナルが同じピーク発光を有するか、または同じチャネル内で収集される。
【０１２７】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、第１の腫瘍試料の一部分、例えば第１の切片またはスライスを第１の基材上に載せる。諸実施形態では、第２の腫瘍試料の一部分、例えば第２の切片またはスライスを第２の基材上に載せる。諸実施形態では、第３の腫瘍試料の一部分、例えば第３の切片またはスライスを第３の基材上に載せる。諸実施形態では、第４の（ｆｏｒｔｈ）腫瘍試料の一部分、例えば第４の切片またはスライスを第４の基材上に載せる。
【０１２８】
諸実施形態では、第１の腫瘍試料の一部分、例えば第１の切片またはスライスと第２の腫瘍試料の一部分、例えば第２の切片またはスライスを同じ基材上に載せる。
【０１２９】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法はさらに、本明細書に記載の方法のいずれかの工程で前記試料から取得したシグナル、値または画像に対応する値を、デジタルまたは電子媒体に、例えばコンピュータのデータベースに保存または格納することを含む。
【０１３０】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法は、前記腫瘍試料からのシグナルの捕捉により得られた値または画像をソフトウェアに、例えばパターン認識または物体認識ソフトウェアにエクスポートし、核領域を同定することを含む。
【０１３１】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法は、前記腫瘍試料からのシグナルの捕捉により得られた値または画像をソフトウェアに、例えばパターン認識または物体認識ソフトウェアにエクスポートし、細胞質領域を同定することを含む。
【０１３２】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法は、前記腫瘍試料からのシグナルの捕捉により得られた値または画像をソフトウェアに、例えばパターン認識または物体認識ソフトウェアにエクスポートし、癌性ＲＯＩを同定することを含む。
【０１３３】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法は、前記腫瘍試料からのシグナルの捕捉により得られた値または画像をソフトウェアに、例えばパターン認識または物体認識ソフトウェアにエクスポートし、良性ＲＯＩを同定することを含む。
【０１３４】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法は、前記腫瘍試料からのシグナルの捕捉により得られた値または画像をソフトウェアに、例えばパターン認識または物体認識ソフトウェアにエクスポートし、癌性ＲＯＩ内の前記腫瘍マーカーのレベルの値を得ることを含む。
【０１３５】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法は、前記腫瘍試料からのシグナルの捕捉により得られた値または画像をソフトウェアに、例えばパターン認識または物体認識ソフトウェアにエクスポートし、良性ＲＯＩ内の前記腫瘍マーカーのレベルの値を得ることを含む。
【０１３６】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法は、領域の表現型マーカー、例えば腫瘍マーカーのシグナル、第１のＲＯＩマーカー、例えば全上皮特異的マーカーのシグナルおよび第２のＲＯＩマーカー、例えば基底上皮特異的マーカーのシグナルに応じて、癌性ＲＯＩ内の領域の表現型マーカー、例えば腫瘍マーカーのレベルの値を得ることを含む。諸実施形態では、該方法は、前記患者のリスクスコアを計算することを含む。諸実施形態では、該方法は、前記値に応じて前記患者のリスクスコアを計算することを含む。
【０１３７】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法は、領域の表現型マーカー、例えば腫瘍マーカーのシグナル、第１のＲＯＩマーカー、例えば全上皮特異的マーカーのシグナルおよび第２のＲＯＩマーカー、例えば基底上皮特異的マーカーのシグナルに応じて、良性ＲＯＩ内の腫瘍マーカーのレベルの値を得ることを含む。
【０１３８】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法は、領域の表現型マーカー、例えば腫瘍マーカーのシグナル、第１のＲＯＩマーカー、例えば全上皮特異的マーカーのシグナルおよび第２のＲＯＩマーカー、例えば基底上皮特異的マーカーのシグナルおよび第３のＲＯＩマーカー、例えば核特異的マーカーのシグナルに応じて、癌性ＲＯＩ内の腫瘍マーカーの細胞質内レベルの値を得ることを含む。
【０１３９】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法は、領域の表現型マーカー、例えば腫瘍マーカーのシグナル、第１のＲＯＩマーカー、例えば全上皮特異的マーカーのシグナルおよび第２のＲＯＩマーカー、例えば基底上皮特異的マーカーのシグナルおよび第３のＲＯＩマーカー、例えば核特異的マーカーのシグナルに応じて、良性ＲＯＩ内の腫瘍マーカーの核内レベルの値を得ることを含む。
【０１４０】
前述の方法のいずれか１つの諸実施形態では、該方法は、前記値のうちの１つまたはそれより多くに応じて、前記患者のリスクスコアを計算することを含む。
【０１４１】
諸実施形態では、該方法は、前記患者のリスクスコアを計算することを含み、前記リスクスコアが前立腺外拡張または転移の可能性と相関している。
【０１４２】
諸実施形態では、該方法は、前記リスクスコアに応じて、前記患者の予後診断を行なうこと、患者を分類すること、前記患者に対して処置過程を選択すること、または選択された処置過程を前記患者に施すことを含む。
【０１４３】
諸実施形態では、前記リスクスコアが「予後良好」症例（例えば、外科的グリーソン３＋３または３に最低４、器官限局性（≦Ｔ２）腫瘍を伴う）に対応する。
【０１４４】
諸実施形態では、前記リスクスコアが「予後不良」症例（例えば、被膜浸透（Ｔ３ａ）、精嚢浸潤（Ｔ３ｂ）、リンパ節転移または４もしくはそれより高い優位なグリーソンパターン）に対応する。
【０１４５】
諸実施形態では、前記リスクスコアにより「予後良好」症例（例えば、外科的グリーソン３＋３または３に最低４、器官限局性（≦Ｔ２）腫瘍を伴う）と「予後不良」症例（例えば、被膜浸透（Ｔ３ａ）、精嚢浸潤（Ｔ３ｂ）、リンパ節転移または４もしくはそれより高い優位なグリーソンパターン）間の識別が可能である。
【０１４６】
諸実施形態では、前記リスクスコアが：外科的グリーソン３＋３もしくは局在性疾患（≦Ｔ３ａ）（「低リスク」と規定する）；外科的グリーソン≧３＋４もしくは非局在性疾患（Ｔ３ｂ、ＮあるいはＭ）（「中〜高リスク」と規定する）；外科的グリーソン≦３＋４および器官限局疾患（≦Ｔ２）（「予後良好」と規定する）；または外科的グリーソン≧４＋３もしくは器官非限局疾患（Ｔ３ａ、Ｔ３ｂ、ＮあるいはＭ）（「予後不良」）に対応する、または予測するものである。
【０１４７】
リスクスコアが計算される諸実施形態では、該方法はさらに、前記リスクスコアに応じて、前記患者を、侵攻性癌を有する、またはリスクの増大もしくは癌関連致死性転帰を有すると同定することを含む。
【０１４８】
リスクスコアが計算される諸実施形態では、該方法はさらに（例えば、前記リスクスコアに応じて）前記患者に補助療法を選択すること、または前記患者に補助療法を施すことを含む。
【０１４９】
また、本明細書において、腫瘍マーカーＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２またはＨＳＰＡ９のうちの１、２、３、４、５、６、７または全部の検出試薬を含むキットを提供する。諸実施形態では、キットはさらに、全上皮マーカーおよび基底上皮マーカーの検出試薬を含む。
【０１５０】
また、本明細書において、癌試料、例えば前立腺腫瘍試料の上にに：全上皮マーカーの検出試薬；基底上皮マーカーの検出試薬；ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２またはＨＳＰＡ９から選択される腫瘍マーカーの検出試薬が配置された癌試料、例えば前立腺腫瘍試料を提供する。諸実施形態では、癌試料、例えば前立腺腫瘍試料が複数の一部分、例えばスライスを含むものである。
【０１５１】
諸実施形態では、癌試料、例えば前立腺腫瘍試料の上にさらに、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２またはＨＳＰＡ９から選択される第２の腫瘍マーカーの検出試薬が配置されている。
【０１５２】
また、本発明は、（ｉ）腫瘍上皮に対応する前記腫瘍試料のＲＯＩ（癌性ＲＯＩ）を同定すること；（ｉｉ）癌性ＲＯＩ内の以下の腫瘍マーカーＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２およびＨＳＰＡ９（腫瘍マーカーセット）の各々のレベル、例えば量を同定すること、ここで、該腫瘍マーカーレベルの同定は、前記腫瘍マーカーに対する抗体の結合に関連している、例えば比例しているシグナルを例えば直接または間接的に取得することを含む；（ｉｉｉ）癌性ＲＯＩ内の該腫瘍マーカーの各々のレベルの値を得ること；ならびに（ｉｖ）例えばアルゴリズムによって前記レベルを併せることにより前記患者にリスクスコアを割り当てることを含む、前記値に応じて前記腫瘍試料を評価すること、それにより前立腺腫瘍試料を評価することを含む、患者の前立腺腫瘍試料の評価のコンピュータ実装方法を特徴とするものである。
【０１５３】
諸実施形態では、該方法は：全上皮マーカーのシグナルを収集するための第１のチャネルの使用；基底上皮マーカーのシグナルを収集するための第２のチャネルの使用；核領域のシグナルを収集するための第３のチャネルの使用；ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２およびＨＳＰＡ９から選択される腫瘍マーカーのシグナルを収集するための第４のチャネルの使用を含む。
【０１５４】
諸実施形態では、前記腫瘍マーカーセットの第１の腫瘍マーカーのレベルが第１の癌性ＲＯＩにおいて同定され、前記腫瘍マーカーセットの第２の腫瘍マーカーのレベルが第２の癌性ＲＯＩにおいて同定される。
【０１５５】
諸実施形態では、ともに前記腫瘍マーカーセットからの第１の腫瘍マーカーのレベルおよび第２の腫瘍マーカーのレベルが同じ癌性ＲＯＩにおいて同定される。
【０１５６】
諸実施形態では、該方法はさらに：第２のＲＯＩ内、例えば良性ＲＯＩ内の第１の品質管理マーカー、例えばＤＥＲＬ１のレベルを同定すること；第２のＲＯＩ内、例えば良性ＲＯＩ内の第２の品質管理マーカー、例えばＡＣＴＮとＶＤＡＣのうちの一方のレベルを同定すること；および第２のＲＯＩ内、例えば良性ＲＯＩ内の第３の品質管理マーカー、例えばＡＣＴＮとＶＤＡＣのうちの一方のレベルを同定すること、ここで、前記レベルに応じて、試料を例えば合格または合格でないと分類することを含む。
【０１５７】
本発明により、患者（例えばヒト患者）における癌（例えば、前立腺癌）の予後を予測するための方法を提供する。この方法により、患者が侵攻性形態の癌を有するかどうか、もしくは侵攻性形態の癌を有するリスクがあるかどうかに関する、および／または患者に癌関連致死性転帰を有するリスクがあるかどうかに関する信頼性のある予測が得られる。
【０１５８】
一部の実施形態では、本発明の予後診断方法は、患者から得た試料において、ＡＣＴＮ１、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１およびＹＢＸ１からなる群より選択される２つまたはそれより多くの予後決定因子（ＰＤ）のレベル測定することを含み、この場合、レベル測定値は癌患者の予後を示す。
【０１５９】
一部の実施形態では、本発明の予後診断方法は、患者から採取した試料中において：
（１）少なくとも１種類の細胞骨格遺伝子またはタンパク質（例えば、α−アクチニン、例えばα−アクチニン１、２、３および４）；
（２）少なくとも１種類のユビキチン化遺伝子またはタンパク質（例えば、ＣＵＬ１、ＣＵＬ２、ＣＵＬ３、ＣＵＬ４Ａ、ＣＵＬ４Ｂ、ＣＵＬ５、ＣＵＬ７、ＤＥＲＬ１、ＤＥＲＬ２およびＤＥＲＬ３）；
（３）少なくとも１種類の依存性受容体遺伝子またはタンパク質（例えば、ＤＣＣ、ネオゲニン、ｐ７５ＮＴＲ、ＲＥＴ、ＴｒｋＣ、Ｐｔｃ、ＥｐｈＡ４、ＡＬＫおよびＭＥＴ）；
（４）少なくとも１種類のＤＮＡ修復遺伝子またはタンパク質（例えば、ＦＵＳ、ＥＷＳ、ＴＡＦ１５、ＳＡＲＦおよびＴＬＳ）；
（５）少なくとも１種類のテルペノイド骨格生合成遺伝子またはタンパク質（例えば、ＰＤＳＳ１およびＰＤＳＳ２）；
（６）少なくとも１種類のＰＩ３Ｋ経路遺伝子またはタンパク質（例えば、ＲｐＳ６およびＰＬＡＧ１）；
（７）少なくとも１種類のＴＦＧ−β経路遺伝子またはタンパク質（例えば、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５およびＳＭＡＤ９）；
（８）少なくとも１種類の電位依存性アニオンチャネル遺伝子またはタンパク質（例えば、ＶＤＡＣ１、ＶＤＡＣ２、ＶＤＡＣ３、ＴＯＭＭ４０およびＴＯＭＭ４０Ｌ）；および／または
（９）少なくとも１種類のＲＮＡスプライシング遺伝子またはタンパク質（例えば、Ｕ２ＡＦまたはＹＢＸ１）
から選択される２つまたはそれより多くのＰＤレベルを測定することを含み；
この場合、レベル測定値は癌患者の予後を示す。
【０１６０】
該方法は、患者から試料（例えば癌性組織試料）を採取するさらなる工程を含んでいてもよい。試料は固形組織試料、例えば腫瘍試料であり得る。固形組織試料はホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料、スナップ凍結組織試料、エタノール固定組織試料、有機溶媒で固定された組織試料、プラスチックもしくはエポキシで固定された組織試料、架橋固定組織試料、手術によって除去された腫瘍組織、または生検材料試料、例えばコア生検材料、切除組織生検材料、または切開組織生検材料であり得る。他の実施形態では、試料は液状試料、例えば血液試料および循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）試料であってもよい。さらなる一実施形態では、組織試料は前立腺組織試料、例えばＦＦＰＥ前立腺腫瘍試料である。
【０１６１】
一部の実施形態では、本発明の予後診断方法において：少なくともＡＣＴＮ１、ＹＢＸ１、ＳＭＡＤ２およびＦＵＳ；少なくともＡＣＴＮ１、ＹＢＸ１およびＳＭＡＤ２；少なくともＡＣＴＮ１、ＹＢＸ１およびＦＵＳ；少なくともＡＣＴＮ１、ＳＭＡＤ２およびＦＵＳ；または少なくともＹＢＸ１、ＳＭＡＤ２およびＦＵＳを含む２つまたはそれより多くのＰＤのＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルを測定する。
【０１６２】
一部の実施形態では、本発明の方法において、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２種類のＰＤを測定する。さらなる実施形態では、該方法において、３種類のＰＤ（すなわち、ＰＤ１〜３）、４種類のＰＤ（すなわち、ＰＤ１〜４）、５種類のＰＤ（すなわち、ＰＤ１〜５）、６種類のＰＤ（すなわち、ＰＤ１〜６）、７種類のＰＤ（すなわち、ＰＤ１〜７）、８種類のＰＤ（すなわち、ＰＤ１〜８）、９種類のＰＤ（すなわち、ＰＤ１〜９）、１０種類のＰＤ（すなわち、ＰＤ１〜１０）、１１種類のＰＤ（すなわち、ＰＤ１〜１１）または１２種類のＰＤ（すなわち、ＰＤ１〜１２）を測定し、このとき、ＰＤはすべて互いに異なっており、独立して、ＡＣＴＮ１、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１およびＹＢＸ１からなる群より選択される。
【０１６３】
一部の実施形態では、本発明の予後診断方法において、侵攻性形態の癌または致死性転帰のリスクが高い癌において参照値と比べてレベルが上方調節されている１つまたはそれより多くのＰＤを測定する。かかるＰＤは、例えばＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＳＭＡＤ２およびＶＤＡＣ１であり得る。方法において、侵攻性形態の癌または致死性転帰のリスクが高い癌において参照値と比べてレベルが下方調節されている１つまたはそれより多くのＰＤを測定してもよい。かかるＰＤは、例えばＡＣＴＮ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ４およびＹＢＸ１であり得る。
【０１６４】
さらなる実施形態では、本発明の方法において、前述の１２種類のバイオマーカー群から選択されるＰＤに加えて、ＨＯＸＢ１３、ＦＡＫ１、ＣＯＸ６Ｃ、ＦＫＢＰ５、ＰＸＮ、ＡＫＡＰ８、ＤＩＡＢＬＯ、ＣＤ７５、ＬＡＴＳ２、ＤＥＣ１、ＬＭＯ７、ＥＩＦ３Ｈ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＭＴＤＨ２、ＭＡＯＡ、ＣＣＮＤ１、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＭＡＰ３Ｋ５およびｐＰＲＡＳ４０からなる群より選択される１つまたはそれより多くのＰＤを測定する。
【０１６５】
本発明の予後診断方法は選択されたＰＤの発現レベルを、例えば、抗体またはその抗原結合断片によって測定するものであってもよい。発現レベルまたはタンパク質レベルは免疫組織化学または免疫蛍光によって測定され得る。例えば、ＰＤに指向される抗体または抗原結合断片は各々、異なるフルオロフォアで標識され得るか、または異なるフルオロフォアと結合され得、フルオロフォアからのシグナルは別々に、または並行して（マルチプレックス）自動イメージング装置によって検出され得る。一部の実施形態では、組織試料はＤＡＰＩで染色され得る。一部の実施形態では、該方法は、細胞成分区画における、例えば核、細胞質または細胞膜における選択されたＰＤタンパク質レベルを測定するものであり得る。あるいはまた、測定を全細胞において行なってもよい。
【０１６６】
測定は、組織試料の画定関心領域内で、例えば非癌性細胞を排除した腫瘍領域内で行なわれ得る。例えば、非癌性細胞は、抗サイトケラチン５抗体および／または抗ＴＲＩＭ２９抗体に対する結合によって（例えば、染色によって）、および／または抗サイトケラチン８抗体もしくは抗サイトケラチン１８抗体に対する特異的結合の欠如（バックグラウンドノイズレベルより有意に高くない）によって同定され得る。他方で、癌性細胞は、抗サイトケラチン８抗体および／または抗サイトケラチン１８抗体に対する結合によって（例えば、染色によって）、および／または抗サイトケラチン５抗体および抗ＴＲＩＭ２９抗体に対する特異的結合の欠如によって同定され得る。特定の一実施形態では、該方法は、ＦＦＰＥ前立腺腫瘍試料の断面を抗サイトケラチン８抗体、抗サイトケラチン１８抗体、抗サイトケラチン５抗体および抗ＴＲＩＭ２９抗体と接触させることを含み、ここで、該測定工程は、該断面内の、抗サイトケラチン８抗体と抗サイトケラチン１８抗体によって境界が示され、抗サイトケラチン５抗体および抗ＴＲＩＭ２９抗体では境界が示されない領域で行なわれる。
【０１６７】
一部の実施形態では、本発明のバイオマーカーの測定に加えて、対象の癌と関連している少なくとも１つの標準的なパラメータ、例えばグリーソンスコア、腫瘍進行度分類、腫瘍悪性度、腫瘍サイズ、腫瘍見た目の特徴、腫瘍の位置、腫瘍の増殖、リンパ節の状態、腫瘍の厚さ（ブレスロースコア）、潰瘍形成、発症年齢、ＰＳＡレベルおよびＰＳＡ速度論を評価することが所望される場合があり得る。
【０１６８】
本発明の予後診断方法は臨床的には、癌の処置の有効性を改善するため、および不必要な処置を回避するために有用である。例えば、本発明のバイオマーカーおよび診断方法は補助療法を必要とする癌患者を同定するために使用され得、患者から組織試料を採取すること；該試料中において本明細書に記載のバイオマーカーのレベルを測定することを含み、次いで、侵攻性癌の予後を有する患者または癌関連致死性転帰のリスクの増大を有する患者が補助療法で処置され得る。したがって、本発明はまた、本発明の予後診断方法によって調べたとき予後不良である患者を同定または選択し、予後不良を有する患者のみ補助療法で処置することによる癌患者の処置方法を提供する。補助療法は、標準的なケア治療、例えば手術、放射線、化学療法またはアンドロゲン除去を受けたことがある患者に施してもよい。補助療法の例としては、限定されないが、放射線療法、化学療法、免疫療法、ホルモン療法および標的療法が挙げられる。標的療法は、選択されたＰＤのうちの１つまたはそれより多くが一成分であるシグナル伝達経路の一成分を標的化するものであり得、ここで、被標的化成分は選択されたＰＤと同じであるか、または異なっている。
【０１６９】
また、本発明により、ＡＣＴＮ１、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１およびＹＢＸ１からなる群より選択される２つまたはそれより多くのＰＤのレベルを測定するための診断用キットであって、選択されたＰＤのレベルを特異的に測定するための試薬を含む診断用キットを提供する。試薬は、１種類またはそれより多く抗体またはその抗原結合断片、オリゴヌクレオチドまたはアプタマーを含むものであり得る。試薬は、例えば選択されたＰＤのＲＮＡ転写物レベルまたはタンパク質レベルを測定するものであり得る。
【０１７０】
また、本発明により：（ａ）ＡＣＴＮ１、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１およびＹＢＸ１からなる群より選択されるＰＤを発現する細胞を準備すること；（ｂ）該細胞を候補化合物と接触させること；ならびに（ｃ）該候補化合物が選択されたＰＤの発現または活性を改変させるかどうかを調べることを含み；ここで、該化合物の存在下で観察された改変は、該化合物が癌進行のリスクを低減し得る、または癌進行の遅延もしくは遅滞させ得ることを示す、癌進行のリスクを低減し得る、または癌進行の遅延もしくは遅滞させ得る化合物を同定する方法を提供する。そのようにして同定される化合物は、本発明の癌の処置方法に使用され得る。
【０１７１】
また、本明細書において以下の実施形態を説明する：
【０１７２】
実施形態１．患者から採取した試料中において、ＡＣＴＮ１、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１およびＹＢＸ１からなる群より選択される２つまたはそれより多くの予後決定因子（ＰＤ）のレベルを測定することを含み、
この場合、レベル測定値は癌患者の予後を示す、
癌患者の予後を予測するための方法。
【０１７３】
実施形態２．患者から採取した試料中において、少なくとも１種類の細胞骨格遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のユビキチン化遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類の依存性受容体遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＤＮＡ修復遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のテルペノイド骨格生合成遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＰＩ３Ｋ経路遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＴＦＧ−β経路遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類の電位依存性アニオンチャネル遺伝子またはタンパク質；ｏｒ  少なくとも１種類のＲＮＡスプライシング遺伝子またはタンパク質から選択される２つまたはそれより多くのＰＤレベル測定することを含み；
この場合、レベル測定値は癌患者の予後を示す、
癌患者の予後を予測するための方法。
【０１７４】
実施形態３．該少なくとも１種類の細胞骨格遺伝子またはタンパク質がα−アクチニン１、α−アクチニン２、α−アクチニン３またはα−アクチニン４である；該少なくとも１種類のユビキチン化遺伝子またはタンパク質がＣＵＬ１、ＣＵＬ２、ＣＵＬ３、ＣＵＬ４Ａ、ＣＵＬ４Ｂ、ＣＵＬ５、ＣＵＬ７、ＤＥＲＬ１、ＤＥＲＬ２またはＤＥＲＬ３である；該少なくとも１種類の依存性受容体遺伝子またはタンパク質がＤＣＣ、ネオゲニン、ｐ７５ＮＴＲ、ＲＥＴ、ＴｒｋＣ、Ｐｔｃ、ＥｐｈＡ４、ＡＬＫまたはＭＥＴである；該少なくとも１種類のＤＮＡ修復遺伝子またはタンパク質がＦＵＳ、ＥＷＳ、ＴＡＦ１５、ＳＡＲＦまたはＴＬＳである；該少なくとも１種類のテルペノイド骨格生合成遺伝子またはタンパク質がＰＤＳＳ１またはＰＤＳＳ２である；該少なくとも１種類のＰＩ３Ｋ経路遺伝子またはタンパク質がＲｐＳ６またはＰＬＡＧ１である；該少なくとも１種類のＴＦＧ−β経路遺伝子またはタンパク質がＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５またはＳＭＡＤ９である；該少なくとも１種類の電位依存性アニオンチャネル遺伝子またはタンパク質がＶＤＡＣ１、ＶＤＡＣ２、ＶＤＡＣ３、ＴＯＭＭ４０またはＴＯＭＭ４０Ｌである；あるいは該少なくとも１種類のＲＮＡスプライシング遺伝子またはタンパク質がＵ２ＡＦまたはＹＢＸ１である、実施形態２の方法。
【０１７５】
実施形態４．さらに、患者から試料を採取する工程を含む、実施形態１〜３のいずれか１つの方法。
【０１７６】
実施形態５．予後が癌が侵攻性形態の癌であるというものである、実施形態１〜４のいずれか１つの方法。
【０１７７】
実施形態６．予後が患者に侵攻性形態の癌を有するリスクがあるというものである、実施形態１〜４のいずれか１つの方法。
【０１７８】
実施形態７．予後が患者に癌関連致死性転帰を有するリスクがあるというものである、実施形態１〜４のいずれか１つの方法。
【０１７９】
実施形態８．患者から組織試料を採取すること；ならびに
該試料中において、ＡＣＴＮ１、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１およびＹＢＸ１からなる群より選択される２つまたはそれより多くのＰＤのレベルを測定することを含み、
この場合、レベル測定値は、該患者が補助療法を必要とすることを示す、
補助療法を必要とする癌患者を同定するための方法。
【０１８０】
実施形態９．患者から組織試料を採取すること；ならびに
該試料中において、少なくとも１種類の細胞骨格遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のユビキチン化遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類の依存性受容体遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＤＮＡ修復遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のテルペノイド骨格生合成遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＰＩ３Ｋ経路遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＴＦＧ−β経路遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類の電位依存性アニオンチャネル遺伝子またはタンパク質；あるいは少なくとも１種類のＲＮＡスプライシング遺伝子またはタンパク質から選択される２つまたはそれより多くのＰＤレベルを測定することを含み；
この場合、レベル測定値は、該患者が補助療法を必要とすることを示す、
補助療法を必要とする癌患者を同定するための方法。
【０１８１】
実施形態１０．ＡＣＴＮ１、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１およびＹＢＸ１からなる群より選択される２つまたはそれより多くのＰＤのレベルを測定すること；ならびに
レベル測定値よって患者が侵攻性形態の癌を有するか、または癌関連致死性転帰を有するリスクがあることが示された場合、該患者を補助療法で処置すること
を含む、癌患者の処置方法。
【０１８２】
実施形態１１．少なくとも２種類のＰＤのレベルの変化を有する患者を同定すること、ここで、該レベルの変化は、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＳＭＡＤ２およびＶＤＡＣ１のうちの１つまたはそれより多くの上方調節ならびにＡＣＴＮ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ４およびＹＢＸ１のうちの１つまたはそれより多くの下方調節からなる群より選択される；ならびに
該患者を補助療法で処置すること
を含む、癌患者の処置方法。
【０１８３】
実施形態１２．少なくとも１種類の細胞骨格遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のユビキチン化遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類の依存性受容体遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＤＮＡ修復遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のテルペノイド骨格生合成遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＰＩ３Ｋ経路遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＴＦＧ−β経路遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類の電位依存性アニオンチャネル遺伝子またはタンパク質；あるいは少なくとも１種類のＲＮＡスプライシング遺伝子またはタンパク質からなる群より選択される２つまたはそれより多くのＰＤのレベルを測定すること；および
レベル測定値よって患者が侵攻性形態の癌を有するか、または癌関連致死性転帰を有するリスクがあることが示された場合、該患者を補助療法で処置すること
を含む、癌患者の処置方法。
【０１８４】
実施形態１３．補助療法が、放射線療法、化学療法、免疫療法、ホルモン療法および標的療法からなる群より選択される、実施形態８〜１２のいずれか１つの方法。
【０１８５】
実施形態１４．標的療法が、選択されたＰＤのうちの１つまたはそれより多くが一成分であるシグナル伝達経路の一成分を標的化するものであり、この場合、被標的化成分は選択されたＰＤとは異なる、実施形態１３の方法。
【０１８６】
実施形態１５．標的療法が、選択されたＰＤのうちの１つまたはそれより多くを標的化するものである、実施形態１３の方法。
【０１８７】
実施形態１６．患者が標準的なケア治療に供されたことがある、実施形態８〜１２のいずれか１つの方法。
【０１８８】
実施形態１７．標準的なケア治療が手術、放射線、化学療法またはアンドロゲン除去である、実施形態１６の方法。
【０１８９】
実施形態１８．患者が前立腺癌を有する患者である、実施形態１〜１７のいずれか１つの方法。
【０１９０】
実施形態１９．該２つまたはそれより多くのＰＤが：
Ａ）少なくともＡＣＴＮ１、ＹＢＸ１、ＳＭＡＤ２およびＦＵＳ；
Ｂ）少なくともＡＣＴＮ１、ＹＢＸ１およびＳＭＡＤ２；
Ｃ）少なくともＡＣＴＮ１、ＹＢＸ１およびＦＵＳ；
Ｄ）少なくともＡＣＴＮ１、ＳＭＡＤ２およびＦＵＳ；または
Ｅ）少なくともＹＢＸ１、ＳＭＡＤ２およびＦＵＳ
を含む、
実施形態１〜１８のいずれか１つの方法。
【０１９１】
実施形態２０．少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２種類のＰＤが選択される、実施形態１〜１９のいずれか１つの方法。
【０１９２】
実施形態２１．ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５およびＰＤ６からなる６種類のＰＤが選択され、該ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５およびＰＤ６は異なるものであり、独立して、ＡＣＴＮ１、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１およびＹＢＸ１からなる群より選択される、実施形態１、４〜８、９、１０および１２〜１９のいずれか１つの方法。
【０１９３】
実施形態２２．ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６およびＰＤ７からなる７種類のＰＤが選択され、該ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６およびＰＤ７は異なるものであり、独立して、ＡＣＴＮ１、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１およびＹＢＸ１からなる群より選択される、実施形態１、４〜８、９、１０および１２〜１９のいずれか１つの方法。
【０１９４】
実施形態２３．さらに、ＨＯＸＢ１３、ＦＡＫ１、ＣＯＸ６Ｃ、ＦＫＢＰ５、ＰＸＮ、ＡＫＡＰ８、ＤＩＡＢＬＯ、ＣＤ７５、ＬＡＴＳ２、ＤＥＣ１、ＬＭＯ７、ＥＩＦ３Ｈ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＭＴＤＨ２、ＭＡＯＡ、ＣＣＮＤ１、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＭＡＰ３Ｋ５およびｐＰＲＡＳ４０からなる群より選択される１つまたはそれより多くのＰＤのレベルを測定することを含む、実施形態１、５〜８、１０および１３〜２２のいずれか１つの方法。
【０１９５】
実施形態２４．選択された該２つまたはそれより多くのＰＤのうちの少なくとも１つのレベル測定値が参照値と比べて上方調節されている、実施形態１〜２３のいずれか１つの方法。
【０１９６】
実施形態２５．選択された該２つまたはそれより多くのＰＤのうちの少なくとも１つのレベル測定値が参照値と比べて下方調節されている、実施形態１〜２４のいずれか１つの方法。
【０１９７】
実施形態２６．選択された該２つまたはそれより多くのＰＤのうちの少なくとも１つのレベル測定値が参照値と比べて上方調節されており、選択された該２つまたはそれより多くのＰＤのうちの少なくとも１つが参照値と比べて下方調節されている、実施形態１〜２５のいずれか１つの方法。
【０１９８】
実施形態２７．選択されたＰＤが、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＳＭＡＤ２およびＶＤＡＣ１からなる群より選択される１つまたはそれより多くのＰＤを含む、実施形態２４の方法。
【０１９９】
実施形態２８．選択されたＰＤが、ＡＣＴＮ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ４およびＹＢＸ１からなる群より選択される１つまたはそれより多くのＰＤを含む、実施形態２５の方法。
【０２００】
実施形態２９．該測定工程が、選択されたＰＤのタンパク質レベルを測定することを含む、実施形態１〜２８のいずれか１つの方法。
【０２０１】
実施形態３０．該タンパク質レベルが抗体またはその断片によって測定される、実施形態２９の方法。
【０２０２】
実施形態３１．該タンパク質レベルが免疫組織化学または免疫蛍光によって測定される、実施形態３０の方法。
【０２０３】
実施形態３２．抗体またはその断片が各々、異なるフルオロフォアで標識されるか、または異なるフルオロフォアと結合され、フルオロフォアからのシグナルが並行して自動イメージング装置によって検出される、実施形態３０の方法。
【０２０４】
実施形態３３．組織試料がＤＡＰＩで染色される、実施形態３２の方法。
【０２０５】
実施形態３４．該測定工程が、細胞成分区画内の選択されたＰＤのタンパク質レベルを測定することを含む、実施形態２９の方法。
【０２０６】
実施形態３５．該測定工程が、核内、細胞質内または細胞膜上の選択されたＰＤのタンパク質レベルを測定することを含む、実施形態２９の方法。
【０２０７】
実施形態３６．ＰＤのレベルが、画定された関心領域で測定される、上記の実施形態のいずれか１つの方法。
【０２０８】
実施形態３７．非癌性細胞が関心領域から除外される、実施形態３６の方法。
【０２０９】
実施形態３８．非癌性細胞が抗サイトケラチン５抗体および抗ＴＲＩＭ２９抗体によって境界が示される、実施形態３７の方法。
【０２１０】
実施形態３９．非癌性細胞が抗サイトケラチン８抗体および抗サイトケラチン１８抗体では境界が示されない、実施形態３８の方法。
【０２１１】
実施形態４０．癌性細胞が関心領域に含まれる実施形態３６〜３９のいずれか１つの方法。
【０２１２】
実施形態４１．癌性細胞が抗サイトケラチン８抗体および抗サイトケラチン１８抗体によって境界が示される、実施形態４３の方法。
【０２１３】
実施形態４２．癌性細胞が抗サイトケラチン５抗体および抗ＴＲＩＭ２９抗体では境界が示されない、実施形態４１の方法。
【０２１４】
実施形態４３．該測定工程が、選択されたＰＤのレベルを別々に測定することを含む、上記の実施形態のいずれか１つの方法。
【０２１５】
実施形態４４．該測定工程が、選択されたＰＤのレベルをマルチプレックス反応において測定することを含む、上記の実施形態のいずれか１つの方法。
【０２１６】
実施形態４５．試料が固形組織試料である、上記の実施形態のいずれか１つの方法。
【０２１７】
実施形態４６．固形組織試料がホルマリン固定パラフィン包埋組織試料、スナップ凍結組織試料、エタノール固定組織試料、有機溶媒で固定された組織試料、プラスチックもしくはエポキシで固定された組織試料、架橋固定組織試料、手術によって除去された腫瘍組織または生検材料試料である、実施形態４５の方法。
【０２１８】
実施形態４７．前記生検試料がコア生検材料、切除組織生検材料または切開組織生検材料である、実施形態４６の方法。
【０２１９】
実施形態４８．組織試料は癌性組織試料である、上記の実施形態のいずれか１つの方法。
【０２２０】
実施形態４９．組織試料が前立腺組織試料である、上記の実施形態のいずれか１つの方法。
【０２２１】
実施形態５０．前立腺組織試料がホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）前立腺腫瘍試料である、実施形態４９の方法。
【０２２２】
実施形態５１．さらに、ＦＦＰＥ前立腺腫瘍試料の断面を抗サイトケラチン８抗体、抗サイトケラチン１８抗体、抗サイトケラチン５抗体および抗ＴＲＩＭ２９抗体と接触させることを含み、ここで、該測定工程は、該断面内の、抗サイトケラチン８抗体と抗サイトケラチン１８抗体によって境界が示され、抗サイトケラチン５抗体および抗ＴＲＩＭ２９抗体では境界が示されない領域で行なわれる、実施形態５０の方法。
【０２２３】
実施形態５２．さらに、前記癌と関連している少なくとも１つの標準的なパラメータを測定することを含む、上記の実施形態のいずれか１つの方法。
【０２２４】
実施形態５３．該少なくとも１つの標準的なパラメータが、グリーソンスコア、腫瘍進行度分類、腫瘍悪性度、腫瘍サイズ、腫瘍見た目の特徴、腫瘍の位置、腫瘍の増殖、リンパ節の状態、腫瘍の厚さ（ブレスロースコア）、潰瘍形成、発症年齢、ＰＳＡレベルおよびＰＳＡ速度論からなる群より選択される、実施形態５２の方法。
【０２２５】
実施形態５４．ＡＣＴＮ１、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１およびＹＢＸ１からなる群より選択される２つまたはそれより多くのＰＤのレベルを測定するためのキットであって、選択されたＰＤのレベルを特異的に測定するための試薬を含むキット。
【０２２６】
実施形態５５．試薬が、１種類またはそれより多く抗体またはその断片、オリゴヌクレオチドまたはアプタマーを含む、実施形態５４のキット。
【０２２７】
実施形態５６．試薬が、ＲＮＡ転写物レベルまたは選択されたＰＤのタンパク質レベルを測定するものである、実施形態５４のキット。
【０２２８】
実施形態５７．（ａ）ＡＣＴＮ１、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１およびＹＢＸ１からなる群より選択されるＰＤを発現する細胞を準備すること；
（ｂ）該細胞を候補化合物と接触させること；ならびに
（ｃ）該候補化合物が選択されたＰＤの発現または活性を改変させるかどうかを調べること
を含み；
ここで、該化合物の存在下で観察された改変は、該化合物が癌進行のリスクを低減し得る、または癌進行の遅延もしくは遅滞させ得ることを示す、
癌進行のリスクを低減し得る、または癌進行の遅延もしくは遅滞させ得る化合物の同定方法。
【０２２９】
実施形態５８．ＡＣＴＮ１、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１およびＹＢＸ１からなる群より選択されるＰＤのレベルを測定すること；ならびに
選択されたＰＤのレベルをモジュレートする薬剤を投与すること
を含む、癌患者の処置方法。
【０２３０】
実施形態５９．少なくとも１種類の細胞骨格遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のユビキチン化遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類の依存性受容体遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＤＮＡ修復遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のテルペノイド骨格生合成遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＰＩ３Ｋ経路遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＴＦＧ−β経路遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類の電位依存性アニオンチャネル遺伝子またはタンパク質；あるいは少なくとも１種類のＲＮＡスプライシング遺伝子またはタンパク質からなる群より選択される２つまたはそれより多くのＰＤのレベルを測定すること；および
選択されたＰＤのレベルをモジュレートする薬剤を投与すること
を含む、癌患者の処置方法。
【０２３１】
実施形態６０．少なくとも２種類のＰＤのレベルの変化を有する患者を同定すること、ここで、該レベルの変化は、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＳＭＡＤ２およびＶＤＡＣ１のうちの１つまたはそれより多くの上方調節ならびにＡＣＴＮ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ４およびＹＢＸ１のうちの１つまたはそれより多くの下方調節からなる群より選択される；ならびに
該ＰＤのうちの少なくとも１つのレベルをモジュレートする薬剤を投与すること
を含む、癌患者の処置方法。
【０２３２】
実施形態６１．組織試料を、関心領域を特異的に同定するための１種類またはそれより多くの第１の試薬と接触させることを含む、組織試料において関心領域を画定するための方法。
【０２３３】
実施形態６２．関心領域が癌性細胞を含む、実施形態６１の方法。
【０２３４】
実施形態６３．該１種類またはそれより多くの第１の試薬が抗サイトケラチン８抗体および抗サイトケラチン１８抗体を含む、実施形態６２の方法。
【０２３５】
実施形態６４．さらに、組織試料を、除外すべき領域に特異的に同定するための１種類またはそれより多くの第２の試薬と接触させることにより、関心領域から除外すべき組織試料領域を画定することを含む、実施形態６１〜６３のいずれか１つの方法。
【０２３６】
実施形態６５．除外すべき領域が非癌性細胞を含む、実施形態６４の方法。
【０２３７】
実施形態６６．該１種類またはそれより多くの第２の試薬が抗サイトケラチン５抗体および抗ＴＲＩＭ２９抗体を含む、実施形態６５の方法。
【０２３８】
また、諸態様および諸実施形態は、例えば、リスクスコアを患者に割り当てるための腫瘍試料の評価のコンピュータ実装方法または自動化方法に関する。
【０２３９】
また、諸態様および諸実施形態は、メモリ、および例えばリスクスコアを患者に割り当てるための腫瘍試料の評価に機能的な処理装置を含むシステムに関する。
【０２４０】
また、諸態様および諸実施形態は、メモリ、および例えば完全な腫瘍試料からのシグナルを解析するため、または患者にリスクスコアを割り当てるための腫瘍試料の評価に機能的な処理装置を含むシステムに関する。
【０２４１】
また、諸態様および諸実施形態は、コンピュータのプロセッサで実行されると、例えば完全な腫瘍試料からのシグナルを解析するため、または患者にリスクスコアを割り当てるために腫瘍試料の評価方法が実施されるコンピュータ実行可能な命令を含むコンピュータ可読媒体に関する。
【図面の簡単な説明】
【０２４２】
本出願が優先権を主張する米国特許仮出願第６１／７９２，００３号は、カラーで作製された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（１つまたは複数）を含む米国特許仮出願第６１／７９２，００３号の複写は、請求し、必要な費用を支払うと米国特許庁から提供される。
【０２４３】
【図１】図１は、外科的に取り出した前立腺腫瘍のヘマトキシリンおよびエオシン染色切片を示す。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ認定の解剖病理医が切片をアノテーションし、グリーソンスコアパターンが最高測定値の４つの領域および最低測定値の２つの領域を同定した。高測定値コアの１つを高測定値組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）への組み入れのために腫瘍試料から抽出し、低測定値コアの１つを低測定値ＴＭＡへの組み入れのために腫瘍試料から抽出した。
【０２４４】
【図２】図２は、任意の疾患または病状に対するバイオマーカーを同定するために使用され得るバイオマーカー選択および検証用エンジンを示す。エンジンは３つのフェーズ：生物学的フェーズ、技術的フェーズおよびパフォーマンスフェーズを有する。ＭｏＡｂ−モノクローナル抗体；ＤＡＢ−３，３’−ジアミノベンジジン；ＩＦ−免疫蛍光；およびＴＭＡ−組織マイクロアレイ。
【０２４５】
【図３】図３は、前立腺癌特異的バイオマーカー選択および検証用エンジンを示す。このエンジンは３つのフェーズ：生物学的フェーズ、技術的フェーズおよびパフォーマンスフェーズを有する。最初に１６０種類の潜在的バイオマーカーを同定した。このバイオマーカー選択および検証用エンジンを使用し、１２種類のマーカーを腫瘍侵攻と相関しているものとして同定した。ＭｏＡｂ−モノクローナル抗体；ＤＡＢ−３，３’−ジアミノベンジジン；ＩＦ−免疫蛍光；およびＴＭＡ−組織マイクロアレイ。
【０２４６】
【図４】図４は、対照細胞株ＴＭＡ（ＣＴＭＡ）において定量的マルチプレックス免疫蛍光を用いた切片間再現性を示す。ＣＴＭＡの切片２７および４１を、ＦＵＳ−ＮおよびＤＥＲＬ１に対する免疫蛍光抗体で染色した。ＣＴＭＡにおける各細胞株の蛍光強度を切片２７および４１間で比較し、結果を、表示のとおりにグラフにした。２つの細胞株における免疫蛍光の量の線形の関係および高いＲ２値は実験間の定量免疫蛍光アッセイの再現性を示す。
【０２４７】
【図５】図５は、腫瘍侵攻および致死性転帰に関して低測定値ＴＭＡに含めた試料のコホートの詳細を示す。腫瘍侵攻試験に含めた２９７例の患者のうち、外科的グリーソンスコアに基づいて、１１０例の患者は緩慢性腫瘍を有し、１２２例の患者は中等度腫瘍を有し、６７例の患者は侵攻性腫瘍を有した。致死性転帰試験に含めた３１７例の患者のうち、２７５例の患者は緩慢性腫瘍を有し（前立腺癌で死亡しなかった）、４２例の患者は侵攻性腫瘍を有した（前立腺癌または遠隔転移で死亡した）。最初の５つの列は臨床データを示すが、後の４つの列は３、６、９または１２種類のマーカーを用いてモデルを訓練した場合に有用であろう試料の数の推定値を示す。
【０２４８】
【図６】図６は、２つのＶｅｃｔｒａ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｌｉｄｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓのシステム間再現性を示す。ＣＴＭＡを異なる２つのシステムにおいて二連で、Ａｌｅｘａ−５６８、Ａｌｅｘａ−６３３およびＡｌｅｘａ−６４７検出について評価した。この２つのシステムは、Ａｌｅｘａ−５６８検出において約７％、Ａｌｅｘａ−６３３検出において約２０％およびＡｌｅｘａ−６４７検出において約２％異なった。抗ＶＤＡＣ１、ＦＵＳおよびＳＭＡＤ４抗体を、それぞれＡｌｅｘａ−５６８、６３３および６４７チャネルに対して使用した。
【０２４９】
【図７】図７は、自動画像取得およびＶｅｃｔｒａ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｌｉｄｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍによる処理、およびＤｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  ＸＤＴＭによる自動画像解析を示す。自動解析によって得られたバイオマーカー強度スコアは、次いで、バイオインフォマティクスによってバイオマーカー相関を調べるため、またはＨａｒｖｅｓｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩＳ）を用いて臨床試料を評価するために使用され得る。
【０２５０】
【図８】図８は、自動画像解析に組み込まれる品質管理フィーチャーを示し、ここで、各画像を各蛍光層から解析し、過飽和、異常テクスチャまたは組織の欠如を検出する。「アーティファクト」と表示した領域は、過飽和領域が画像の解析から除外されるような過飽和の検出を示す。
【０２５１】
【図９】図９Ａ〜図９Ｆは、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  ＸＤＴＭを用いた関心領域（ＲＯＩ）の自動同定を示す。図９Ａは、蛍光の多数のチャネルを含むシステムにインポートした未処理画像を示す。図９Ｂは、腫瘍上皮構造が抗サイトケラチン８および抗サイトケラチン１８染色に基づいて同定されることを示す。図９Ｃは、核をオーバーレイすると、腫瘍上皮領域内のどこに細胞が局在しているかが同定されることを示す。図９Ｄは、細胞が、基底細胞マーカーサイトケラチン５およびＴＲＩＭ２９の存在に基づいて良性または悪性として規定されることを示す。図９Ｅは、良性腫瘍および悪性腫瘍の領域が画定されることを示す。図９Ｆは、関心領域が良性腫瘍および悪性腫瘍の位置に基づいて画定されることを示す。
【０２５２】
【図１０】図１０は、関心領域内のバイオマーカー（ＰＤ）免疫蛍光の定量を示す。２種類のバイオマーカー（ＤＥＲＬ１（ＰＤ１）およびＦＵＳ（ＰＤ２））が、良性腫瘍領域よりも悪性腫瘍領域の方が低いレベルで発現されていることに注目のこと。
【０２５３】
【図１１】図１１は、低コアを用いたＨＬＴＭＡ試験における腫瘍侵攻および致死性転帰の予測に対して単変量パフォーマンスを示した１７種類のバイオマーカーを示す。コアグリーソンスコアは測定値グリーソンスコアである。中等度腫瘍（外科的グリーソンスコアに基づいて）からのコアを除外した場合、最も信頼性のある結果が得られた。中等度腫瘍からのコアを緩慢性または侵攻性と規定することにより、バイオマーカーと腫瘍侵攻間の相関が緩慢性または侵攻性アソシエーションの方に歪曲し得る。
【０２５４】
【図１２】図１２は、ＨＬＴＭＡ試験のデータのバイオインフォマティクス解析を示す。
【０２５５】
【図１３】図１３は、腫瘍侵攻との相関についてＡＩＣでソートされた組合せの上位１％にどのバイオマーカーが現れるかの頻度を示す。頻度は、最大３種類のバイオマーカー、最大４種類のバイオマーカー、最大５種類のバイオマーカー、最大６種類のバイオマーカー、最大８種類のバイオマーカーおよび最大１０種類のバイオマーカーの組合せについて示している。試験したバイオマーカーは、ミニＴＭＡアッセイおよびＨＬＴＭＡにおける単変量パフォーマンスに関して予備選択した１７種類のバイオマーカーのプールから選択した。
【０２５６】
【図１４】図１４は、腫瘍侵攻との相関についてＡＩＣでソートされた組合せの上位５％にどのバイオマーカーが現れるかの頻度を示す。頻度は、最大３種類のバイオマーカー、最大４種類のバイオマーカー、最大５種類のバイオマーカー、最大６種類のバイオマーカー、最大８種類のバイオマーカーおよび最大１０種類のバイオマーカーの組合せについて示している。試験したバイオマーカーは、ミニＴＭＡアッセイおよびＨＬＴＭＡにおける単変量パフォーマンスに関して予備選択した１７種類のバイオマーカーのプールから選択した。
【０２５７】
【図１５】図１５は、腫瘍侵攻との相関についてＡＩＣおよびテストデータでソートされた最大７メンバーの組合せの上位１％および上位５％にどのバイオマーカーが現れるかの頻度を示す。試験したバイオマーカーは、低コアを用いたミニＴＭＡアッセイおよびＨＬＴＭＡにおける単変量パフォーマンスに関して予備選択した１７種類のバイオマーカーのプールから選択した。
【０２５８】
【図１６】図１６は、腫瘍侵攻との相関についてＡＩＣおよびテストデータでソートされた最大５メンバーの組合せの上位１％にどのバイオマーカーが現れるかの頻度を示す。試験したバイオマーカーは、ＨＬＴＭＡにおける単変量パフォーマンスについて予備選択しなかった３１種類のバイオマーカーのプールから選択した。
【０２５９】
【図１７】図１７は、腫瘍侵攻との相関についてＡＩＣおよびテストデータでソートされた最大５メンバーの組合せの上位５％にどのバイオマーカーが現れるかの頻度を示す。試験したバイオマーカーは、ＨＬＴＭＡにおける単変量パフォーマンスについて予備選択しなかった３１種類のバイオマーカーのプールから選択した。
【０２６０】
【図１８】図１８は、各型の解析のための上位１２種類のマーカーおよび種々の解析のための上位マーカー間のコンコーダンスを示す。７バイオマーカーのコアを、解析の７５％または１００％で上位１２種類のマーカーリストに現れると同定した。また、７バイオマーカーの二次セットを解析の５０％で上位１２種類のマーカーリスト現れると同定した。
【０２６１】
【図１９】図１９は、致死性転帰との相関についてＡＩＣでソートされた組合せの上位１％にどのバイオマーカーが現れるかの頻度を示す。頻度は、最大３種類のバイオマーカー、最大４種類のバイオマーカー、最大５種類のバイオマーカー、最大６種類のバイオマーカー、最大８種類のバイオマーカーおよび最大１０種類のバイオマーカーの組合せについて示している。試験したバイオマーカーは、ＨＬＴＭＡにおける単変量パフォーマンスに関して予備選択した１７種類のバイオマーカーのプールから選択した。
【０２６２】
【図２０】図２０は、致死性転帰との相関についてＡＩＣでソートされた組合せの上位５％にどのバイオマーカーが現れるかの頻度を示す。頻度は、最大３種類のバイオマーカー、最大４種類のバイオマーカー、最大５種類のバイオマーカー、最大６種類のバイオマーカー、最大８種類のバイオマーカーおよび最大１０種類のバイオマーカーの組合せについて示している。試験したバイオマーカーは、ＨＬＴＭＡにおける単変量パフォーマンスに関して予備選択した１７種類のバイオマーカーのプールから選択した。
【０２６３】
【図２１】図２１は、致死性転帰との相関についてＡＩＣおよびテストデータでソートされた最大７メンバーの組合せの上位１％および上位５％にどのバイオマーカーが現れるかの頻度を示す。試験したバイオマーカーは、ＨＬＴＭＡにおける単変量パフォーマンスに関して予備選択した１７種類のバイオマーカーのプールから選択した。
【０２６４】
【図２２】図２２は、腫瘍侵攻および致死性転帰との相関において一部重複しているマーカーが、両方のエンドポイントを単一のアッセイで評価するために潜在的に使用され得ることを示す。例えば、図１１、１３および１９に示すように、ＡＣＴＮ１およびＹＢＸ１は、腫瘍侵攻および致死性転帰の両方との高度の相関を示す。
【０２６５】
【図２３】図２３は、腫瘍マスクマーカーおよび単一のスライド上での核染色に加えて、３種類のバイオマーカー（ＰＤ）を評価するために使用され得る三重（トリプレックス）解析を示す。第１のバイオマーカーＰＤ１は、ＦＩＴＣ−コンジュゲート一次抗体および抗ＦＩＴＣ−Ａｌｅｘａ  ５６８二次抗体を用いて検出され得る。第２のバイオマーカーＰＤ２は、ウサギ一次抗体、ビオチンコンジュゲート抗ウサギ二次抗体およびＡｌｅｘａ  ６３３にコンジュゲートさせたストレプトアビジンを用いて検出され得る。第３のバイオマーカーＰＤ３は、マウス一次抗体、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗マウス二次抗体および抗ＨＲＰ−Ａｌｅｘａ  ６４７三次抗体を用いて検出され得る。腫瘍マスクには、抗ＣＫ８−Ａｌｅｘａ  ４８８および抗ＣＫ１８−Ａｌｅｘａ  ４８８が腫瘍上皮構造を同定するために使用され得、抗ＣＫ５−Ａｌｅｘａ  ５５５および抗ＴＲＩＭ２９−Ａｌｅｘａ  ５５５が基底細胞マーカーを同定するために使用され得る。腫瘍切片の品質は、一般的な自家蛍光（ＡＦＬ）ならびに赤血球および明顆粒（ＢＡＦＬ）からの自家蛍光によって評価され得る。任意の３種類のバイオマーカー（ＰＤ）が三重染色に使用され得るが（ただし、正しい抗体の組合せが入手可能であるものとする）、この図では、ＰＤ１がＨＳＤ１７Ｂ４であり、ＰＤ２がＦＵＳであり、ＰＤ３がＬＡＴＳ２である。
【０２６６】
【図２４】図２４は、三重解析のための組み合わせることができるバイオマーカー抗体の組合せを示す。このような組合せを使用し、１２種類のバイオマーカーが腫瘍試料からの４つの切片において評価され得る。
【０２６７】
【図２５】図２５は、多バイオマーカー（ＳＭＡＤ（ＰＤ１）およびＲｐＳ６（ＰＤ２））のための抗体を同じアッセイで使用すると、観察される干渉が最小限であることを示す。２つのアッセイにおける免疫蛍光の量の線形の関係および高いＲ２値は、第２の抗体による第１のものに対する干渉が最小限であることを示す。
【０２６８】
【図２６】図２６は、本発明の実施形態の種々の態様が実装され得る例示的なコンピュータシステムを示す。
【０２６９】
【図２７−１】図２７Ａ〜Ｆは、自動定量的マルチプレックス免疫蛍光実験アプローチおよび前立腺摘除組織の画定された関心領域内におけるバイオマーカー測定の概略を示す。
【図２７−２】図２７Ａ〜Ｆは、自動定量的マルチプレックス免疫蛍光実験アプローチおよび前立腺摘除組織の画定された関心領域内におけるバイオマーカー測定の概略を示す。
【図２７−３】図２７Ａ〜Ｆは、自動定量的マルチプレックス免疫蛍光実験アプローチおよび前立腺摘除組織の画定された関心領域内におけるバイオマーカー測定の概略を示す。
【０２７０】
図２７Ａは、アッセイに使用したスペクトルライブラリー内の各フルオロフォアのスペクトルプロフィールならびにそれぞれ、組織自家蛍光シグナル（ＡＦＬ）および明自家蛍光（ＢＡＦＬ）シグナルのプロフィールを示す。
【０２７１】
図２７Ｂは、組織関心領域における定量的マルチプレックス免疫蛍光バイオマーカー測定のための染色手順の一般的な概略を示す。ＳＰＰ１およびＳＭＡＤ４を一例として使用した。関心領域マーカー抗体（全上皮に対するＣＫ８およびＣＫ１８ならびに基底上皮に対するＣＫ５およびＴＲＩＭ２９）を、それぞれＡｌｅｘａ４８８およびＡｌｅｘａ  ５５５に直接コンジュゲートさせた。バイオマーカー抗体は、記載の二次抗体および三次抗体配列を用いて検出した。表内の色は、表示したＡｌｅｘａ  フルオフォア（ｆｌｕｏｐｈｏｒｅ）色素の発光ピークの特殊スペクトルの位置を示す。
【０２７２】
図２７Ｃは、複合マルチスペクトル画像（ｉ）が表示したとおり（ｉｉ）の自家蛍光（ＡＦＬ）および明自家蛍光（ＢＡＦＬ）、関心領域マーカーならびにバイオマーカーに対応する個別のチャネルにアンミキシングされることを示す。
【０２７３】
図２７Ｄは、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  ｓｃｒｉｐｔ系組織のセグメント化およびバイオマーカー定量を示す。パート１〜６を合成画像（１）から移動させると、まず全上皮領域が同定され（２）、続いて核領域が同定される（３）。上皮領域を腫瘍（これは赤色で可視化した）、良性（これは緑色で可視化した）、不明瞭（これは黄色で可視化した）（４）にさらにセグメント化した。グレイカラーは非上皮領域、例えば間質および血管を示した（４）。最後に、バイオマーカーを腫瘍上皮領域のみ（これは赤色の輪郭であった）からを定量した（５および６）。
【０２７４】
図２７Ｅは、組織アノテーションおよび品質管理手順を示す。左：専門の病理医によってアノテーションされたそれぞれ、最高および最低グリーソンパターン領域上に配置された４つの（青）および２つの（緑）の１ｍｍ直径の円を示すヒト前立腺摘除試料の代表的なヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色切片。２つのコア（各々、１ｍｍ直径）を４つの青色領域から２つを採取し、ＴＭＡブロックを作製した。右：同じ前立腺摘除試料の連続切片をＤＡＰＩおよびＣＫ８／ＣＫ１８−Ａｌｅｘａ４８８で染色した。ＣＫ８／１８  サイトケラチン抗体による前立腺上皮の明染色を有する領域を良好品質領域とみなし、一方、染色がほとんどまたは全くない（黄色の斑点領域表示したとおり）領域を低品質とみなし、ＴＭＡ構築に適するとみなさなかった。
【０２７５】
図２７Ｆは、実験内再現性を示す。前立腺腫瘍試験ＴＭＡからの２つの連続切片を同じ実験で染色した。Ｖｅｃｔｒａシステムを用いて画像を取得し、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  ｓｃｒｉｐｔを用いて処理した。散乱プロットで連続ＴＭＡ切片の同じコアでのＣＫ８／１８、ＰＴＥＮおよびＳＭＡＤ４の染色強度の平均値を比較する。線形回帰曲線、方程式およびＲ２値はＥｘｃｅｌソフトウェアを用いて作成した。
【０２７６】
【図２８】図２８Ａ〜Ｃは、コホートの説明および致死性転帰の単変量解析を示す。図２８Ａは、本試験に使用した致死性転帰アノテーション付き前立腺摘除コホートの組成およびＤｉｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１１，４７０：２６９−２７３のＰＨＳコホートとの比較を示す。図２８Ｂは、試験コホートにおける単一バイオマーカータンパク質発現の関数としての生存のカプラン−マイヤー曲線を示す。リスクスコアの上位３分の１の値を有する集団を下位３分の２のリスクスコアを有する集団と分けた。Ｐ値（Ｐ）およびハザード比（ＨＲ）をアノテーションする。
【０２７７】
【図２９】図２９Ａ〜Ｃは、多変量モデルの開発およびカプラン−マイヤー生存プロットを示す。図２９Ａは、本試験コホートでの生存予測の多変量Ｃｏｘ回帰およびロジスティック回帰分析を示す。マーカーの組合せを使用し、全コホートでの訓練およびテストに基づいてモデルを開発した。４種類のマーカー：ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、ＣＣＮＤ１、ＳＰＰ１．３種類のマーカー：ＳＭＡＤ４、ＣＣＮＤ１、ＳＰＰ１．図２９Ｂは、全コホートにおいて４種類のマーカーまたは［３種類のマーカー＋ｐＳ６＋ｐＰＲＡＳ４０］を用いて訓練したＣｏｘモデルによって作成したリスクスコアの関数としての生存のカプラン−マイヤー曲線を示す。リスクスコアの最低３分の２を集団分割の閾値として使用した。図２９Ｃは、この試験とＤｉｎｇら間の４種類のマーカー（ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、ＣＣＮＤ１、ＳＰＰ１）の致死性転帰−予測パフォーマンス比較を示す。
【０２７８】
【図３０】図３０Ａ〜Ｅは、ＰＴＥＮ、ＣＣＮＤ１、ＳＭＡＤ４、ＳＰＰ１、Ｐ−Ｓ６およびＰ−ＰＲＡＳ４０抗体特異性の検証を示す。ドキシサイクリン誘導性ｓｈＲＮＡノックダウン細胞株をＰＴＥＮ（図３０Ａ）、ＣＣＮＤ１（図３０Ｂ）およびＳＭＡＤ４（図３０Ｃ）について確立した。ドキシサイクリン処理により、すべての場合においてウエスタンブロッティング（ＷＢ）によって評価したとき、豊富な標的タンパク質が低減された。また、ｏｆ  ＰＴＥＮ（図３０Ａ）、ＣＣＮＤ１（図３０Ｂ）およびＳＭＡＤ４（図３０Ｃ）の高いまたは低い／陰性レベルの発現を有する細胞株もＷＢおよび免疫組織化学（ＩＨＣ）によって調べ、抗体の特異性をさらに検証した。ＳＰＰ１（図３０Ｄ）抗体によりＳＰＰ１特異的バンドおよび低分子量のさらなるバンド（ＰＣ３細胞においてＷＢによって評価時）を検出し、一方、上側のＳＰＰ１特異的バンドは低ＳＰＰ１発現ＢｘＰＣ３細胞において有意に減少した。ＩＨＣによるＰＣ３およびＢｘＰＣ３細胞におけるＳＰＰ１抗体の染色強度は、ＷＢによって検出されたＳＰＰ１特異的バンドの相対強度と充分に相関していた。Ｐ−Ｓ６およびＰ−ＰＲＡＳ４０抗体（図３０Ｅ）の特異性をＤＵ１４５細胞において検証した。ＬＹ２９４００２処理により、それぞれＷＢおよびＩＨＣによって示されるようにＳ６およびＰＲＡＳ４０のリン酸化が有意に低減された。
【０２７９】
【図３１】図３１は、統計学的解析フローの概略を示す。各患者について、最高グリーソンスコアを有する領域からの２つの組織コアをＴＭＡブロック内に配置した。各ＴＭＡコアの腫瘍上皮領域内のバイオマーカー発現の平均値を解析に使用し、患者１人あたり２つのバイオマーカー値を得た。ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４およびｐＳ６では、２つのコアでの最低値を解析に使用した。ＣＣＮＤ１、ＳＰＰ１、ｐ９０ＲＳＫ、ｐＰＲＡＳ４０およびＦｏｘｏ３ａでは、２つのコアからの最高値を使用した。このような値を使用し、１０，０００ブートストラップ訓練サンプルを作成し、多変量Ｃｏｘおよびロジスティック回帰モデルの両方を各訓練サンプルで訓練した。各試験は、コンプリメントセット（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｓｅｔ）で行なった。コホートに打ち切りデータを含めたことを考慮し、本発明者らは、コンコーダンスインデックス（ＣＩ）と「曲線下面積」（ＡＵＣ）の両方を用いてモデルパフォーマンスを推定した。モデルにおいて試験したマーカーの組合せは以下のとおりとした：４種類のマーカー（ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、ＣＣＮＤ１、ＳＰＰ１）、３種類のマーカー（ＳＭＡＤ４、ＣＣＮＤ１、ＳＰＰ１）、および３種類のマーカーと以下のホスホマーカー：ｐＳ６、ｐＰＲＡＳ４０および［ｐＳ６＋ｐＰＲＡＳ４０］の各組合せ。
【０２８０】
【図３２】図３２は、生検シミュレーション組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）の作出を示す。前立腺摘除試料からの組織ブロックを、視認可能なすべてのグリーソンパターンをアノテーションした（上）。図示した例は、全体グリーソンスコア（ＧＳ）４＋３＝７を有する患者由来のものである。より高倍率の図（中央）に示すように、同じブロック内のパターンは、非常に多様であり得る。２つの１ｍｍコアを各組織ブロックから採取した。一方は、最高ＧＳ（４＋４＝８）を有する領域から採取し、アガロース／パラフィン中に他のブロックからの高スコアリングコアとともに包埋し、Ｈ  ＴＭＡを作出した（左下）。他方は最低ＧＳ（３＋３＝６）を有する領域から採取し、アガロース／パラフィン中に他のブロックからの低スコアリングコアとともに包埋し、Ｌ  ＴＭＡを作出した（右下）。
【０２８１】
【図３３】図３３は、バイオマーカー選択ストラテジーを示す。３つの型の基準（生物学的、技術的およびパフォーマンスベース）を使用し、１２種類の最終バイオマーカーを選択した。（ＤＡＢ：ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）での色素生成組織染色に基づいて評価したＡｂ特異性；ＩＦ：免疫蛍光組織染色に基づいたＡｂ特異性およびパフォーマンス）。
【０２８２】
【図３４】図３４Ａおよび図３４Ｂは、低（Ｌ  ＴＭＡ；黒バー）および高（Ｈ  ＴＭＡ；茶色のバー）グリーソン領域の両方において測定した疾患の侵攻性および疾患特異的死亡に対する３９種類のバイオマーカーの単変量パフォーマンスを示す。図３４Ａは、各マーカーについて計算した重症疾患病態（侵攻性）を予測するためのオッズ比（ＯＲ）を示す。垂直線の左側のＯＲを有するマーカーは病態によって評価される疾患の重症度と負に相関している。この線の右側のものは正に相関している。マーカーを、Ｌ  ＴＭＡにおいて測定したときＯＲに基づいてランク付けした。図３４Ｂは、各マーカーについて計算され、図３４Ａに記載のようにしてプロットされた疾患による死亡（致死性）のハザード比を示す。図３４Ａおよび図３４Ｂにおいて、２つのアスタリスク（＊＊）を有するバイオマーカーはＬ  ＴＭＡおよびＨ  ＴＭＡの両方における０．１レベルでの統計学的有意性を示す。１つのアスタリスク（＊）を有するバイオマーカーは、Ｈ  ＴＭＡのみにおける統計学的有意性を示し、Ｌ  ＴＭＡに有意性はない。侵攻性疾患および疾患による死亡の両方で、バイオマーカーと統計学的に有意な単変量パフォーマンスとの大きな重複に注目のこと。
【０２８３】
【図３５−１】図３５Ａおよび図３５Ｂは、疾患の侵攻性に対するパフォーマンスベースバイオマーカー選択プロセスを示す。図３５Ａは、バイオインフォマティクスワークフローにより３１種類の組からの５種類までのマーカーのすべての組合せから最も高頻度で使用されるバイオマーカーが選択されたことを示す。図３５Ｂは、上位ランクの５マーカーモデルのパフォーマンスの一例を示し、Ｌ  ＴＭＡにおいて訓練し、次いでＬ  ＴＭＡおよびＨ  ＴＭＡからの独立した試料においてテストすることとの比較を含む。Ｌ  ＴＭＡおよびＨ  ＴＭＡにおけるテストパフォーマンスは実質的な信頼区間の重複と整合していることに注目のこと。図３５Ｃは、最大３、４または５種類のバイオマーカーを可能にする組合せを作成したことを示す。この図は、５バイオマーカーモデルを使用してテストによってランク付けされた侵攻性疾患を予測するとき最も高頻度で含まれるタンパク質を示す。
【図３５−２】図３５Ａおよび図３５Ｂは、疾患の侵攻性に対するパフォーマンスベースバイオマーカー選択プロセスを示す。図３５Ａは、バイオインフォマティクスワークフローにより３１種類の組からの５種類までのマーカーのすべての組合せから最も高頻度で使用されるバイオマーカーが選択されたことを示す。図３５Ｂは、上位ランクの５マーカーモデルのパフォーマンスの一例を示し、Ｌ  ＴＭＡにおいて訓練し、次いでＬ  ＴＭＡおよびＨ  ＴＭＡからの独立した試料においてテストすることとの比較を含む。Ｌ  ＴＭＡおよびＨ  ＴＭＡにおけるテストパフォーマンスは実質的な信頼区間の重複と整合していることに注目のこと。図３５Ｃは、最大３、４または５種類のバイオマーカーを可能にする組合せを作成したことを示す。この図は、５バイオマーカーモデルを使用してテストによってランク付けされた侵攻性疾患を予測するとき最も高頻度で含まれるタンパク質を示す。
【０２８４】
【図３６−１】図３６Ａおよび図３６Ｂは、最終バイオマーカーセットおよび選択基準を示す。図３６Ａは、侵攻性に対する単変量パフォーマンス（左側のＯＲで示す）ならびに疾患の侵攻性または致死性転帰に対する多変量モデルにおける致死性および出現頻度（表の右側）に基づいて選択した１２種類のバイオマーカーを示す。図３６Ｂに、バイオマーカーの名称および生物学的重要性をまとめる。このバイオマーカーセットは、細胞の増殖、細胞の生存および代謝の調節において機能することが知られているタンパク質を含む。図３６Ｃは、疾患の侵攻性に対する多変量１２マーカーモデルがロジスティック回帰に基づいて開発されたことを示す。得られたＡＵＣおよびＯＲを示す。続いて、全患者に対する侵攻性モデルによって作成されたリスクスコアを致死性転帰と相関させた。得られたＡＵＣおよびＨＲを示す。
【図３６−２】図３６Ａおよび図３６Ｂは、最終バイオマーカーセットおよび選択基準を示す。図３６Ａは、侵攻性に対する単変量パフォーマンス（左側のＯＲで示す）ならびに疾患の侵攻性または致死性転帰に対する多変量モデルにおける致死性および出現頻度（表の右側）に基づいて選択した１２種類のバイオマーカーを示す。図３６Ｂに、バイオマーカーの名称および生物学的重要性をまとめる。このバイオマーカーセットは、細胞の増殖、細胞の生存および代謝の調節において機能することが知られているタンパク質を含む。図３６Ｃは、疾患の侵攻性に対する多変量１２マーカーモデルがロジスティック回帰に基づいて開発されたことを示す。得られたＡＵＣおよびＯＲを示す。続いて、全患者に対する侵攻性モデルによって作成されたリスクスコアを致死性転帰と相関させた。得られたＡＵＣおよびＨＲを示す。
【０２８５】
【図３７】図３７Ａ〜Ｌは、抗体の特異性を示す。ＡＣＴＮ１（図３７Ａ）、ＣＵＬ２（図３７Ｂ）、デルリン１（図３７Ｃ）、ＦＵＳ（図３７Ｄ）、ＰＤＳＳ２（図３７Ｅ）、ＳＭＡＤ２（図３７Ｆ）、ＶＤＡＣ１（図３７Ｇ）およびＹＢＸ１（図３７Ｈ）抗体の特異性を、ｓｉＲＮＡ処理細胞および対照細胞のウエスタンブロッティング（ＷＢ）および免疫組織化学（ＩＨＣ）によって検証した。マーカー特異的ｓｉＲＮＡ処理によりＷＢ上のバンドの強度が有意に低減され、細胞内の特異的ＩＨＣ染色により抗体の特異性を確認した。ＳＭＡＤ４抗体（図３７Ｉ）の特異性をＳＭＡＤ４陽性対照細胞株ＰＣ３およびＳＭＡＤ４陰性対照細胞株ＢｘＰＣ３のＷＢおよびＩＨＣによって検証した。ｐＳ６抗体（図３７Ｊ）の特異性を未処理のＤＵ１４５細胞およびＰＩ３Ｋ阻害薬ＬＹ２９４００２で処理したＤＵ１４５細胞のＷＢおよびＩＨＣによって検証した。ＬＹ２９４００２処理により、ＷＢおよびＩＨＣによって示されるようにＳ６のリン酸化が有意に低減された。Ｌｅｉｃａ抗ＤＣＣ抗体（図３７Ｋ）によりＷＢ上にバンドが検出され、これはＤＣＣタンパク質（Ｋの表示「Ｘ」）について予測されたサイズとマッチしなかった；また、ＩＨＣ染色はＤＣＣ  ｓｉＲＮＡ処理細胞において低減されなかった（図３７Ｋの左パネル）。Ｌｅｉｃａ抗ＤＣＣ抗体は、ＨＳＰＡ９  ｓｉＲＮＡ処理細胞および対照細胞のＷＢおよびＩＨＣによって示されるようにＨＳＰＡ９タンパク質を認識するようであった（図３７Ｋの右パネル）。β−アクチンをＷＢ負荷対照として使用した。
【０２８６】
【図３８】図３８Ａ〜Ｇは、前立腺癌の予後バイオマーカーとしてＤＣＣではなくＨＳＰＡ９の同定を示す。Ｌｅｉｃａ抗ＤＣＣ抗体は、ＷＢおよびＩＨＣによりＤＣＣ  ｓｉＲＮＡノックダウン細胞によって検証しなかった（図３８Ａ）。それは、ＷＢ上で抗体によって検出されたバンドのサイズがＤＣＣタンパク質について予測していたものよりもずっと小さく（１５８ｋＤａに対して７５ｋＤａ）、ＩＨＣ染色強度がＤＣＣ  ｓｉＲＮＡ処理細胞において低減されなかったからであった。質量分析により、ＷＢ上でＬｅｉｃａ抗ＤＣＣ抗体によって認識されたタンパク質がＨＳＰＡ９であると同定した。Ｌｅｉｃａ抗ＤＣＣ抗体が実際に抗ＨＳＰＡ９抗体であることを確認するため、これをＨＳＰＡ９  ｓｉＲＮＡ処理細胞および対照細胞においてＷＢおよびＩＨＣによって試験した；ＷＢバンドおよびＬｅｉｃａ抗ＤＣＣ抗体によって検出されるＩＨＣ染色はどちらもＨＳＰＡ９  ｓｉＲＮＡ処理細胞において有意に低減された（図３８Ｂ）。ＨＳＰＡ９  ｓｉＲＮＡ処理細胞におけるＬｅｉｃａ抗ＤＣＣ抗体のＷＢおよびＩＨＣパターンは、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ抗ＨＳＰＡ９抗体によって検出されるものと同様であった（図３８Ｃ）。ｓｉＲＮＡによるＨＳＰＡ９のサイレンヂングはＨｅＬａ細胞の増殖を減少させるようであり（図３８Ｄ）、クローン原性アッセイにおけるＨｅＬａ細胞コロニー形成を低減させ（図３８Ｅ）、細胞死（図３８Ｆ）およびカスパーゼ活性（図３８Ｇ）の増大を引き起こした。
【０２８７】
【図３９】図３９Ａ〜Ｃは、８−マーカー指標アッセイのためのモデル設計を示す。図３９Ａは、個々のバイオマーカーのオッズ比（９５％信頼区間で）を示す。定量的バイオマーカー測定はエンドポイントとしての前立腺癌の病態と相関していた。有効サイズは正規化してあることに注意のこと。図３９Ｂは、多変量モデルの上位１０％におけるバイオマーカー使用頻度を示す。多くのモデルがブートストラップテストＡＵＣにおいて同様のパフォーマンスを有することを考慮すると、網羅的上位マーカーモデル検索における存在頻度は、診断試験のための最終マーカーを選択するためのさらなる基準として使用される。この図は、ブートストラップテストＡＵＣ中央値でソートした場合、上位８位のマーカーが８マーカーモデルの上位１０％にどれだけ多くの場合で存在するかを示す。図３９Ｃは、リスクスコアの計算のためにロジスティック回帰モデルにおいて使用した、０から１の間で連続する目盛りで示される最終マーカーモデル係数を示す。負の符号は保護マーカーを示すことに注意のこと。この係数の単位はアッセイと関連している蛍光強度スケールである。
【０２８８】
図４０Ａ〜Ｆは、予後良好病態の予測のための臨床的検証試験およびそのパフォーマンスを示す。感度および特異度の曲線（それぞれ、図４０Ａおよび図４０Ｂ）を使用し、適切なリスク分類群が同定され得る。ＮＣＣＮリスク分類群（図４０Ｃおよび図４０Ｄ）ならびにＤ’Ａｍｉｃｏリスク分類群（図４０Ｅおよび図４０Ｆ）に相対するリスクスコア分布は、バイオマーカー指標アッセイによって各ＮＣＣＮまたはＤ’Ａｍｉｃｏレベル内において有意なさらなるリスク情報が付加されることを示す。
【０２８９】
【図４０Ａ】図４０Ａは、感度および関連する医学的決断レベル間の関係が、低リスク分類群を同定するために使用され得ることを示す。例えば予後良好分類は、０〜０．３３の区間のリスクスコアを有する患者と同定され得、この区間は９０％（９５％ＣＩ，８２％〜９４％）の感度（Ｐ［リスクスコア＞０．３３｜予後不良病態］）に対応する。この場合、予後不良病態を有する患者は間違って予後良好分類を受ける１０％（９５％ＣＩ，６％〜１８％）の偶然性を有し得る。この偽陰性は処置不充分に至り得る。
【０２９０】
【図４０Ｂ】図４０Ｂは、特異度と関連する医学的決断レベル間の関係が、予後不良分類群を同定するためにも同様に使用され得ることを示す。例えば予後不良分類は、区間（０．８〜１）のリスクスコアを有する患者と同定され得、この区間は、９５％（９５％ＣＩ，９０％〜９８％）の特異度（Ｐ［リスクスコア≦０．８０｜予後良好病態］）に対応する。この場合、予後良好病態を有する患者は間違って予後不良分類を受ける５％（９５％ＣＩ，２％〜１０％）偶然性を有し得る。この偽陽性は過剰処置に至り得る。
【０２９１】
【図４０Ｃ】図４０Ｃは、各ＮＣＣＮリスクレベル（非常に低、低、中間、高）バイオマーカー指標アッセイを用いて誘導されるリスクスコア中央値が０．３３〜０．８のリスクスコアカットオフレベルに含まれ、予後良好（外科的グリーソン３＋３または３＋４および≦Ｔ２）病態に対する予測値（＋ＰＶ）がリスクスコアカットオフ＜０．３３で８５％にみられたことを示す。予後不良病態に対する予測値（−ＰＶ）はリスクスコアカットオフ＞０．９では１００％リスクスコア＞０．８では７６．９％であった。リスクスコア＜０．３３では、「非常に低い」ＮＣＣＮ分類を有する患者の９５％が予後良好病態を有したが「非常に低い」ＮＣＣＮ分類単独による予後良好症例の頻度測定値は８０．３％であった。「低」ＮＣＣＮカテゴリーにおいて、リスクスコア＜０．３３では、患者の８１．５％が予後良好病態を有したが、「低」ＮＣＣＮ基準による予後良好病態の頻度測定値は６３．８％であった。逆に、リスクスコア＞０．８では、「非常に低い」ＮＣＣＮカテゴリーの患者の７５％が予後不良病態を有し、リスクスコアが＞０．８である場合、全患者の７６．９％が予後不良病態を有した。
【０２９２】
【図４０Ｄ】図４０Ｄは、リスクスコア四分位の関数としての予後良好症例の頻度測定値ことを示す。リスクスコア四分位の増大は、各ＮＣＣＮカテゴリーにおいて観察される予後良好症例頻度の減少と大きく相関していた。さらに、テスト対ＮＣＣＮ階層化単独によって同定される予後良好病態を有する患者の頻度測定値は８１％の信頼度レベルで０％から２３．８％まで増大した。
【０２９３】
【図４０Ｅ】図４０Ｅは、各Ｄ’Ａｍｉｃｏリスクレベル（低、中間、高）におけるバイオマーカー指標アッセイを用いて誘導されるリスクスコア中央値が０．３３〜０．８のリスクスコアカットオフレベルに含まれたことを示す。予後良好病態に対する予測値（＋ＰＶ）はリスクスコアカットオフ＜０．３３で８５％である。予後不良不良に対する予測値（−ＰＶ）はリスクスコアカットオフ＞０．９で１００％、リスクスコア＞０．８で７６．９％である。リスクスコア＜０．３３では、「低」Ｄ’Ａｍｉｃｏ分類を有する患者の８７．２％が予後良好病態を有するが、「低」Ｄ’Ａｍｉｃｏ群内の予後良好症例の頻度測定値は７０．６％である。「中間」Ｄ’Ａｍｉｃｏカテゴリーにおいて、リスクスコア＜０．３３では、患者の７５％が予後良好予後良好を有するが、「中間」Ｄ’Ａｍｉｃｏ群内の予後良好病態を有する全患者の頻度測定値は４１．２％である。逆に、リスクスコア＞０．８では、「低」Ｄ’Ａｍｉｃｏカテゴリー内の患者の５９．３％が予後不良病態を有し、リスクスコアが＞０．８である場合、全患者の７６．９％が予後不良病態を有する。
【０２９４】
【図４０Ｆ】図４０Ｆは、リスクスコア四分位の関数としての予後良好症例の頻度測定値を示す。リスクスコア四分位の増大は各Ｄ’Ａｍｉｃｏカテゴリーにおける予後良好症例頻度測定値の減少と大きく相関していた。さらに、テスト対Ｄ’Ａｍｉｃｏ階層化単独によって同定される予後良好病態を有する患者の頻度測定値は８１％の信頼度レベルで０％から２３．８％まで増大した。
【０２９５】
【図４１】図４１Ａ〜Ｄは、臨床的検証試験、全コホート：「ＧＳ６」病態（外科的グリーソン＝３＋３および局所性の≦Ｔ３ａ、Ｎ＝２５６）に対するパフォーマンスの結果の結果を示す。図４１Ａは、医学的決断レベルの関数としての試験の感度（Ｐ［リスクスコア＞閾値｜「非ＧＳ６」病態］）を示す。図４１Ｂは、「非ＧＳ６」カテゴリーを同定するためにリスクスコアの特異度（Ｐ［リスクスコア＜閾値｜「ＧＳ６」病態］）を示す。図４１Ｃおよび図４１Ｄは、「ＧＳ６」および「非ＧＳ６」病態に対するリスクスコアの分布を示す。図４１Ｅは、このモデルの受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）＝０．６５（９５％信頼区間［ＣＩ］，０．５８〜０．７２），Ｐ＜０．００１、および最高対最低四分位オッズ比（ＯＲ）＝４．２（９５％ＣＩ，１．９〜９．３）。定量的リスクスコアのＯＲは１２．５９（９５％ＣＩ，３．５〜４７．２）／単位変化であった。
【０２９６】
【図４２】図４２Ａ〜Ｃは、臨床的検証試験、全コホート：予後良好病態（外科的グリーソン≦３＋４および器官限局性≦Ｔ２、Ｎ＝２７４）の予測に対するパフォーマンスの結果を示す。図４２Ａは、予後良好病態に対するリスクスコアの分布を示す。図４２Ｂは、予後不良病態に対するリスクスコアの分布を示す。図４２Ｃは、このモデルのＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣ＝０．６８（９５％ＣＩ，０．６１〜０．７４），Ｐ＜０．０００１、および最高対最低四分位ＯＲ＝３．３（９５％ＣＩ，１．８〜６．１）。定量的リスクスコアのＯＲは２０．９（９５％ＣＩ，６．４〜６８．２）／単位変化であった。
【０２９７】
【図４３】図４３Ａ〜Ｃは、臨床的検証試験、全米総合癌センターネットワーク（ＮＣＣＮ）およびＤ’Ａｍｉｃｏ基準を有するコホート：予後良好病態（外科的グリーソン≦３＋４および器官限局性≦Ｔ２、Ｎ＝２５６）に対するパフォーマンスの結果を示す。図４３Ａは、予後良好疾患に対するリスクスコアの分布を示す。図４３Ｂは、予後不良疾患に対するリスクスコアの分布を示す。図４３Ｃは、このモデルのＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣ＝０．６９（９５％ＣＩ，０．６３〜０．７３），Ｐ＜０．０００１、および最高対最低四分位ＯＲ＝５．５（９５％ＣＩ，２．５〜１２．１）。定量的リスクスコアのＯＲは２６．２（９５％ＣＩ，７．６〜９０．１）／単位変化であった。
【０２９８】
【図４４−１】図４４Ａ〜Ｂは、純再分類改善度解析がどのように予後良好（リスクスコア≦０．３３）および予後不良（リスクスコア＞０．８）の分子指標カテゴリーＮＣＣＮ（図４４Ａ）およびＤ’Ａｍｉｃｏ（図４４Ｂ）ＳＯＣリスク分類システムを補足し得るを示すことを示す。ＮＣＣＮ低、中間および高またはＤ’Ａｍｉｃｏ中間および高カテゴリーにおいて分子リスクスコア≦０．３３を有する患者はＳＯＣカテゴリー単独で示されるものより侵攻性疾患が低リスクとみなされ得る。ＮＣＣＮ非常に低、低および中間ならびにＤ’Ａｍｉｃｏ低および中間カテゴリーにおける分子リスクスコア＞０．８を有する患者はＳＯＣカテゴリー単独で示されるものより侵攻性疾患が高リスクとみなされ得る。カテゴリーＮＣＣＮ非常に低およびＤ’Ａｍｉｃｏ低に対する分子リスクスコア≦０．３３は確証的とみなされ得る。同様に、カテゴリーＮＣＣＮ高およびＤ’Ａｍｉｃｏ高対する分子リスクスコア＞０．８は確証的とみなされ得る。左の四角内の予後良好患者および右の四角内の予後不良患者は正しいリスク調整を反映していることに注意のこと。予後良好病態を有する患者のうち、ＮＣＣＮおよびＤ’Ａｍｉｃｏのそれぞれ７８％および５３％は正しく調整されている。予後不良病態を有する患者のうち、ＮＣＣＮおよびＤ’Ａｍｉｃｏのそれぞれ７６％および８８％は正しく調整されている。また、分子リスクスコア≦０．３３でカテゴリーＮＣＣＮ非常に低およびＤ’Ａｍｉｃｏ低の患者は、リスク群全体と比べて予後良好患者が有意に多いことにも注意のこと。Ｒ．Ｓ．＝分子リスクスコア。
【図４４−２】図４４Ａ〜Ｂは、純再分類改善度解析がどのように予後良好（リスクスコア≦０．３３）および予後不良（リスクスコア＞０．８）の分子指標カテゴリーＮＣＣＮ（図４４Ａ）およびＤ’Ａｍｉｃｏ（図４４Ｂ）ＳＯＣリスク分類システムを補足し得るを示すことを示す。ＮＣＣＮ低、中間および高またはＤ’Ａｍｉｃｏ中間および高カテゴリーにおいて分子リスクスコア≦０．３３を有する患者はＳＯＣカテゴリー単独で示されるものより侵攻性疾患が低リスクとみなされ得る。ＮＣＣＮ非常に低、低および中間ならびにＤ’Ａｍｉｃｏ低および中間カテゴリーにおける分子リスクスコア＞０．８を有する患者はＳＯＣカテゴリー単独で示されるものより侵攻性疾患が高リスクとみなされ得る。カテゴリーＮＣＣＮ非常に低およびＤ’Ａｍｉｃｏ低に対する分子リスクスコア≦０．３３は確証的とみなされ得る。同様に、カテゴリーＮＣＣＮ高およびＤ’Ａｍｉｃｏ高対する分子リスクスコア＞０．８は確証的とみなされ得る。左の四角内の予後良好患者および右の四角内の予後不良患者は正しいリスク調整を反映していることに注意のこと。予後良好病態を有する患者のうち、ＮＣＣＮおよびＤ’Ａｍｉｃｏのそれぞれ７８％および５３％は正しく調整されている。予後不良病態を有する患者のうち、ＮＣＣＮおよびＤ’Ａｍｉｃｏのそれぞれ７６％および８８％は正しく調整されている。また、分子リスクスコア≦０．３３でカテゴリーＮＣＣＮ非常に低およびＤ’Ａｍｉｃｏ低の患者は、リスク群全体と比べて予後良好患者が有意に多いことにも注意のこと。Ｒ．Ｓ．＝分子リスクスコア。
【０２９９】
【図４５】図４５Ａは、１２種類のマーカーの染色のための４つのすべての定量的マルチプレックス免疫蛍光トリプレックスアッセイ形式（ＰＢＸＡ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）の概略を示す。関心領域マーカー抗体をＡｌｅｘａ色素と直接コンジュゲートさせ、一方、チャネル５６８内のバイオマーカー抗体はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）とコンジュゲートさせた。すべてのバイオマーカー（一次抗体）はｐＳ６およびＰＤＳＳ２以外（これはＦＩＴＣと直接コンジュゲートさせた）二次抗体および三次抗体の配列で検出した。各色は特異的チャネルに対応する。アスタリスク（＊）を有するバイオマーカーを内部組織の品質管理の目的で使用し、この場合、ＡＣＴＮ１、ＤＥＲＬ１またはＶＤＡＣについて所定のシグナル強度より低いものは自動的に除外された。腫瘍上皮内での定量測定が予測アルゴリズムに使用される８種類のバイオマーカーをイタリック体で示す。  図４５Ｂは、画像取得プロセス中、スライド全体の画像が最初に４×モノクローム４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）フィルタリング画像のモザイクで取得されることを示す。組織検索アルゴリズムを用いて組織の位置を決定し、この場合、画像の再度取得を、４×ＤＡＰＩと４×ＦＩＴＣ  モノクロームフィルターの両方を用いて行ない、後で別の組織検索アルゴリズム用いてすべてが充分な量の組織を含む２０倍視野の画像をＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）およびＣｙ５フィルターの連続露光を用いて取得した。画像キューブを、個々のチャネルへの自動アンミキシングおよびＤｅｆｉｎｉｅｎｓソフトウェアによるさらなる処理のために格納した。  図４５Ｃは、全定量的マルチプレックス免疫蛍光アッセイ手順の種々の工程を示す。未加工スライドをまず蛍光顕微鏡で染色および色素の存在について目視検査した。認識可能な量の蛍光色素の存在はスライドをさらなる解析から除外した。最初の品質管理に合格した組織をマルチプレックス染色手順に供し、続いて画像取得、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ解析およびバイオインフォマティクス解析を行なった。画像取得プロセスを図４５Ｂについて上記のようにして行なった。画像キューブをサーバー内に格納し、個々のチャネルにアンミキシングし、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓソフトウェアによって処理した。データを各特異的関心領域（ＲＯＩ）の腫瘍領域および良性領域からＲＯＩバイオマーカーを用いてＤｅｆｉｎｉｅｎｓソフトウェアによって収集した。バイオインフォマティクス解析アルゴリズムにより、ＡＣＴＮ１、ＤＥＲＬ１またはＶＤＡＣ  １について所定のシグナル強度よりも低い場合は、データをさらに解析する前に除外された。
【発明を実施するための形態】
【０３００】
発明の詳細な説明
本発明は、ＡＣＴＮ１、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１およびＹＢＸ１（「予後決定因子」または「ＰＤ」；表１）からなる群より選択される２つまたはそれより多くのメンバーを含むバイオマーカーパネルが、癌患者に関する分子的エビデンス系の信頼性のある予後を得ることにおいて有用であるという知見に基づいている。患者由来の癌性組織試料における発現（例えば、タンパク質発現）またはバイオマーカーの活性レベルを測定することにより、癌患者における腫瘍の侵攻性、例えば腫瘍が周囲組織への浸潤する能力または進行リスクが高信頼度で予測され得る。癌進行は、例えば、癌の転移または再発）によって示される。また、レベルは、従来の確立されたリスク評価手順とは独立して、または該評価手順に加えて癌の致死性転帰または癌治療（例えば、手術、放射線療法もしくは化学療法）の有効性を予測するためにも使用され得る。また、レベルが、侵攻性癌治療（例えば補助療法、例えば外科処置に加えて施される化学療法）を必要とする患者を同定するため、またはさらなる診断試験をガイドするために使用され得る。経路状況遺伝子またはタンパク質の状況において使用される場合、該レベルはまた、保健医療提供者に癌患者に最も有益であり得る治療の型に関する情報を与えるため、および臨床研究への組み入れのために患者を階層化するためにも使用され得る。また、レベルは、癌治療（例えば、手術、放射線療法、化学療法、標的療法もしくは補助療法）が有益でない患者および／または必要がない患者を同定するために使用され得る。換言すると、本発明のバイオマーカーパネルにより医師が癌患者を最適にマネージメントすることが可能である。
【０３０１】
一部の実施形態では、本発明のマルチプレックスまたは多変量診断方法の一次臨床的適応は、ＰＣＡが「侵攻性」であるかどうかを正確に予測すること（例えば、診断時に前立腺腫瘍が活発に進行している（すなわち、「活発侵攻性疾患」；または後のある時点で進行する（すなわち、「進行リスク」））、または「緩慢性」もしくは「休眠状態」である確率を予測することである。該方法の別の臨床的適応は、患者がＰＣＡで死亡する確率（すなわち、「致死性転帰」／「疾患特異的死亡」）を正確に予測することであり得る。精度はＣ統計量に換算して測定され得る。リスクスコアを試料に割り当てるモデルでは、Ｃ統計量は１つの侵攻性試料および１つの緩慢性試料の試料のペアの数の比であり、このとき、侵攻性試料は、かかる試料のペアの総数において緩慢性試料よりも高いリスクスコアを有する。
【０３０２】
定義
「取得する」または「取得すること」は、該用語を本明細書で用いる場合、物理的実体（例えば試料）または値、例えば数値または画像の所有を、該物理的実体または値を「直接取得すること」または「間接的に取得すること」により得ることをいう。「直接取得すること」とは、プロセスを行ない（例えば、合成方法もしくは解析方法行なう、試料を検出試薬と接触させる、または試料からのシグナルを捕捉する）、物理的実体または値を得ることを意味する。「間接的に取得すること」とは、別の相手または供給源から物理的実体または値を受け取ることをいう（例えば該物理的実体または値を直接取得した第三者の検査室から）。物理的実体を直接取得することとしては、物理的物質の物理変化を含むプロセスを行なうことが挙げられる。例示的な変化としては、２種類またはそれより多くの出発物質から物理的実体を作製すること、物質を剪断または断片化すること、物質を分離または精製すること、２つまたはそれより多くの別々の実体を混合物に合わせること、非共有結合または非共有結合の破壊または形成を含む化学反応を行なうことが挙げられる。値を直接取得することとしては、試料または別の物質における物理変化を含むプロセスを行なうこと、例えば、物質、例えば試料、被検物または試薬における物理変化を含む解析プロセス（場合によっては本明細書において「物理的解析」と称する）を行なうこと、解析方法、例えば、以下：物質、例えば被検物またはその断片もしくは他の誘導体を別の物質から分離または精製すること；被検物またはその断片もしくは他の誘導体を別の物質と、例えばバッファー、溶媒または反応体と合わせること；あるいは被検物またはその断片もしくは他の誘導体の構造を、例えば、被検物の第１の原子と第２の原子間に共有結合または非共有結合を破壊または形成することにより；シグナル、例えば光系シグナル、例えば蛍光シグナルを誘導または収集することにより、または試薬またはその断片もしくは他の誘導体の構造を変化させることにより（例えば、試薬の第１の原子と第２の原子間に共有結合または非共有結合を破壊または形成することにより）変化させることのうちの１つまたはそれより多くを含む方法を行なうことが挙げられる。値を直接取得することは、例えば光子の検出器への衝突に応答した電子状態の変化がある場合にコンピュータまたは検出デバイス、例えばスキャナーが使用される方法を包含している。値を直接取得することは試料からのシグナルの捕捉を包含している。
【０３０３】
検出試薬は、本明細書で用いる場合、その意図される標的に対して充分な特異性を有し、該標的を本明細書において論考している他のものと識別するために使用され得る試薬、典型的には結合試薬である。諸実施形態では、検出試薬は、当該方法を実施している条件下で他の（非標的）種に対する結合を有しない、または実質的に有しないものである。
【０３０４】
関心領域（ＲＯＩ）は、該用語を本明細書で用いる場合、１つまたはそれより多くの実体、例えば、単細胞実体（例えば細胞成分成分（例えば、核または細胞質）、組織成分、単細胞結合組織マトリックス、単細胞膠質性物質、細胞外成分、例えば間質組織液）、またはその実体が領域−表現型マーカーを含む細胞であって、該領域−表現型マーカーがＲＯＩまたはこれを得た試料、組織もしくは患者の解析に使用される細胞をいう。一実施形態では、ＲＯＩの実体は細胞である。
【０３０５】
領域−表現型マーカーは、該用語を本明細書で用いる場合、事前に選択した表現型、例えば、癌、例えば癌のサブタイプまたは患者の転帰を反映、予測またはこれらと関連するものである。一実施形態では、領域−表現型マーカーは、炎症性障害（例えば、自己免疫障害）、神経系障害または感染性疾患を反映、予測またはこれらと関連するものである。一実施形態では、事前に選択した表現型は、ＲＯＩの実体または細胞に存在するもの、または影響するものである。一実施形態では、事前に選択した表現型は、ＲＯＩ、試料、組織が患者が解析される対象疾患、例えば癌の表現型である。
【０３０６】
一例として、ＲＯＩとしては癌細胞、例えば癌性前立腺細胞が挙げられ、事前に選択した表現型は癌性細胞の表現型であり、集団−表現型マーカーは癌マーカー、例えば前立腺癌の場合は、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ｐＳ６、ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２およびＨＳＰＡ９から選択される腫瘍マーカーである。
【０３０７】
本明細書で用いる場合、本文中にそうでないことが示されていない限り、ｐＳ６はリボソームタンパク質Ｓ６のリン酸化形態をいい、ＲｐＳ６遺伝子にコードされている。
【０３０８】
一実施形態では、第１のＲＯＩが癌性ＲＯＩであり、第２のＲＯＩが良性ＲＯＩである。
【０３０９】
一実施形態では、領域−表現型マーカーはＲＯＩの細胞内で発現されている。一実施形態では、領域−表現型マーカーはＲＯＩの細胞に存在しているが該細胞内で発現されないものであり、例えば一実施形態では、領域−表現型マーカーは間質にみられる分泌因子であり、したがって、この例では間質がＲＯＩである。
【０３１０】
ＲＯＩはさまざまな様式で得られ得る。一例として、ＲＯＩは：
形態学的特徴、例えば、第２の組織型もしくは細胞型と事前に選択した関係を有する、例えば第２の組織型もしくは細胞型によって囲まれた第１の組織型もしくは細胞型；
例えば、選択した分子、例えばタンパク質、ｍＲＮＡもしくはＤＮＡ（本明細書においてＲＯＩマーカーと称する）マーカーの所有による非形態学的特徴、例えば分子の特徴
の所有によって；または
形態学的特徴と非形態学的特徴の組合せによって
選択または同定され得る。
【０３１１】
一実施形態では、形態学的特徴による同定または選択としては、他の細胞または物質、例えば他の組織からのＲＯＩの、例えば非癌性細胞からのＲＯＩの、例えば癌性領域の切開による選択（例えば、手作業または自動化手段により）および物理的分離が挙げられる。形態学的選択の一実施形態、例えばマイクロダイセクションでは、ＲＯＩは本質的にインタクトな状態で周囲から取り出される。形態学的選択の一実施形態、例えばマイクロダイセクションでは、ＲＯＩが取り出されるが、形態学的構造は維持されない。
【０３１２】
非形態学的特徴による選択または同定の一実施形態では、ＲＯＩは、例えばＲＯＩの実体、例えば細胞において関連しているＲＯＩマーカー、例えば事前に選択した分子種を含めることによって同定または選択され得る。一例として、セルソーティング、例えばＦＡＣＳが、非形態学的特徴によってＲＯＩを得るために使用され得る。一実施形態では、ＦＡＣＳは、ＲＯＩマーカーを有する細胞を他の細胞から分離してＲＯＩを得るために使用される。
【０３１３】
形態学的選択と非形態学的選択の組合せによるＲＯＩの選択の一実施形態では、ＲＯＩマーカーの検出試薬に対して事前に選択した結合パターンを示す形態学的に同定可能な構造が、ＲＯＩを得るために使用される。
【０３１４】
ＲＯＩは、集団表現型マーカーがその機能を発揮する実体、典型的には細胞を含む。一実施形態では、ＲＯＩは、領域−表現型マーカーに関連している、例えば比例しているシグナルが抽出され得る実体の集合体、典型的には細胞の集合体である。ＲＯＩ内の領域−表現型マーカーのレベルにより試料の評価が可能である。例えば前立腺癌の場合、領域−表現型マーカー、例えば腫瘍マーカー、例えば本明細書に記載の腫瘍マーカーのうちの１つのレベルにより、試料の評価および試料を採取した患者の評価が可能である。一実施形態では、領域−表現型マーカーは、機能、例えば評価対象の障害に関連する機能を発揮することに基づいて選択され、ＲＯＩの実体または細胞において予後診断または診断される。ＲＯＩマーカーは、一部の実施形態ではＲＯＩを選択または画定するために使用される。
【０３１５】
一実施形態では、ＲＯＩは、例えば患者において（必ずしも試料中でないが）パターン、例えば相違する形態学的領域を形成する実体の集合体、典型的には細胞の集合体である。
【０３１６】
試料は、該用語を本明細書で用いる場合、患者由来の細胞成分または単細胞成分を含む組成物である。試料という用語は、患者由来の未加工の試料、例えば生検試料、加工済試料、例えば固定化した組織、組織由来画分または他の物質を包含している。ＲＯＩは試料であるとみなされる。
【０３１７】
予後決定因子
本発明の第１の態様では、癌の処置の決定における使用のためのを提供する。用語「予後決定因子」、「バイオマーカー」および「マーカー」は本明細書において互換的に用いており、生物学的プロセスのインジケータとして客観的に測定および評価され得る被検物（例えばペプチドまたはタンパク質）をいう。本発明者らは、このようなバイオマーカーの発現または活性のレベルが癌患者の予後、例えば腫瘍侵攻性または致死性転帰と高信頼度で相関していることを見出した。このようなバイオマーカーが癌の予後と相関し得る可能性は、これらを組み合わせて使用することにより増幅され得る。
【０３１８】
少なくとも１種類のバイオマーカーは細胞骨格遺伝子またはタンパク質であり得る。理論に拘束されないが、細胞骨格の遺伝子およびタンパク質は、悪性腫瘍が一部において隣接組織内への腫瘍の浸潤および遠位腫瘍への腫瘍の拡延によって特性評価されるため、癌の予後と相関し得る。かかる浸潤および拡延には、典型的には細胞骨格の再組織化が必要とされる。癌の予後のバイオマーカーとして有用な細胞骨格の遺伝子およびタンパク質の非限定的な例としては、αアクチン、βアクチン、γアクチン、α−アクチニン１、α−アクチニン２、α−アクチニン３、α−アクチニン４、ビンキュリン、Ｅ−カドヘリン、ビメンチン、ケラチン１、ケラチン２、ケラチン３、ケラチン４、ケラチン５、ケラチン６、ケラチン７、ケラチン８、ケラチン９、ケラチン１０、ケラチン１１、ケラチン１２、ケラチン１３、ケラチン１４、ケラチン１５、ケラチン１６、ケラチン１７、ケラチン１８、ケラチン１９、ケラチン２０、ラミンＡ、ラミンＢ１、ラムビン（ｌａｍｂｉｎ）Ｂ２、ラミンＣ、α−チューブリン、β−チューブリン、γ−チューブリン、δ−チューブリン、ε−チューブリン、ＬＭＯ７、ＬＡＴＳ１およびＬＡＴＳ２が挙げられる。好ましくは、細胞骨格遺伝子またはタンパク質はα−アクチニン１、α−アクチニン２、α−アクチニン３またはα−アクチニン４、特にα−アクチニン１である。α−アクチニン１は、ＣＤＫ５Ｒ１；ＣＤＫ５Ｒ２；コラーゲン，ＸＶＩＩ型、α１；ＧＩＰＣ１；ＰＤＬＩＭ１；タンパク質キナーゼＮ１；ＳＳＸ２ＩＰ；およびザイキシンと相互作用することが示されている。したがって、これらの遺伝子およびタンパク質は、本出願の解釈上の細胞骨格タンパク質とみなされる。
【０３１９】
少なくとも１種類のバイオマーカーはユビキチン化遺伝子またはタンパク質であり得る。理論に拘束されないが、ユビキチン化遺伝子およびタンパク質は、ユビキチンがタンパク質に結合して該タンパク質をプロテアソームに指向して破壊させ得るため、癌の予後と相関し得る。タンパク質合成の速度増大には、多くの場合、癌における形質転換事象を支持することが必要とされ、ユビキチン化などのタンパク質の制御プロセスが腫瘍の進行（ｐｒｏｇｅｓｓｉｏｎ）において極めて重要である。癌の予後のバイオマーカーとして有用なユビキチン化遺伝子およびタンパク質の非限定的な例としては、ユビキチン活性化酵素（例えば、ＵＢＡ１、ＵＢＡ２、ＵＢＡ３、ＵＢＡ５、ＵＢＡ６、ＵＢＡ７、ＡＴＧ７、ＮＡＥ１およびＳＡＥ１）、ユビキチン結合酵素（例えば、ＵＢＥ２Ａ、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＥ２Ｃ、ＵＢＥ２Ｄ１、ＵＢＥ２Ｄ２、ＵＢＥ２Ｄ３、ＵＢＥ２Ｅ１、ＵＢＥ２Ｅ２、ＵＢＥ２Ｅ３、ＵＢＥ２Ｇ１、ＵＢＥ２Ｇ２、ＵＢＥ２Ｈ、ＵＢＥ２Ｉ、ＵＢＥ２Ｊ１、ＵＢＥ２Ｌ３、ＵＢＥ２Ｌ６、ＵＢＥ２Ｍ、ＵＢＥ２Ｎ、ＵＢＥ２Ｏ、ＵＢＥ２Ｒ２、ＵＢＥ２Ｖ１、ＵＢＥ２Ｖ２およびＢＩＲＣ６）、ユビキチンリガーゼ（例えば、ＵＢＥ３Ａ、ＵＢＥ３Ｂ、ＵＢＥ３Ｃ、ＵＢＥ４Ａ、ＵＢＥ４Ｂ、ＵＢＯＸ５、ＵＢＲ５、ＷＷＰ１、ＷＷＰ２、ｍｄｍ２、ＡＰＣ、ＵＢＲ５、ＳＯＣＳ、ＣＢＬＬ１、ＨＥＲＣ１、ＨＥＲＣ２、ＨＵＷＥ１、ＮＥＤＤ４、ＮＥＤＤ４Ｌ、ＰＰＩＬ２、ＰＲＰＦ１９、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ２、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳ４、ＲＡＮＢＰ２、ＲＢＸ１、ＳＭＵＲＦ１、ＳＭＵＲＦ２、ＳＴＵＢ１、ＴＯＰＯＲＳおよびＴＲＩＰ１２）、Ｆ−ボックスタンパク質（例えば、ｃｄｃ４）、Ｓｋｐ１、クリン（ｃｕｌｌｉｎ）ファミリーメンバー（例えば、ＣＵＬ１、ＣＵＬ２、ＣＵＬ３、ＣＵＬ４Ａ、ＣＵＬ４Ｂ、ＣＵＬ５、ＣＵＬ７およびＡＮＡＰＣ２）、ＲＩＮＧタンパク質（例えば、ＲＢＸ１）、エロンギンＣならびに小胞体関連分解タンパク質（「ＥＲＡＤ」，例えば、ＤＥＲＬ１、ＤＥＲＬ２、ＤＥＲＬ３、Ｄｏａ１０、ＥＤＥＭ、ＥＲマンノシダーゼＩ、ＶＩＭＰ、ＳＥＬ１、ＨＲＤ１およびＨＥＲＰ）が挙げられる。好ましくは、ユビキチン化遺伝子またはタンパク質はクリン、特にＣＵＬ２またはＥＲＡＤ遺伝子またはタンパク質、特にＤＥＲＬ１である。ＣＵＬ２は、ＤＣＵＮ１Ｄ１、ＳＡＰ１３０、ＣＡＮＤ１、ＲＢＸ１、ＴＣＥＢ２およびフォン・ヒッペル・リンドウ腫瘍抑制因子と相互作用することが示されている。したがって、これらの遺伝子およびタンパク質は、本出願の解釈上のユビキチン化タンパク質とみなされる。
【０３２０】
少なくとも１種類のバイオマーカーは依存性受容体遺伝子またはタンパク質であり得る。理論に拘束されないが、依存性受容体遺伝子およびタンパク質は、２つの正反対のシグナル伝達経路：１）細胞の生存、遊走および分化；と２）アポトーシスを誘発するその能力のため、癌の予後と相関し得る。リガンドの存在下では、この受容体は、細胞の生存、遊走および分化に関与する古典的シグナル伝達経路を活性化させる。リガンドの非存在下では、不活性なままではない；そうではなく、アポトーシスシグナルを誘起する。細胞の生存、遊走およびアポトーシスはすべて癌に関与している。癌の予後のバイオマーカーとして有用な依存性受容体遺伝子およびタンパク質の非限定的な例としては、ＤＣＣ、ネオゲニン、ｐ７５ＮＴＲ、ＲＥＴ、ＴｒｋＣ、Ｐｔｃ、ＥｐｈＡ４、ＡＬＫ、ＭＥＴおよびインテグリンサブセットが挙げられる。好ましくは、依存性受容体遺伝子またはタンパク質はＤＣＣである。ＤＣＣは、ＰＴＫ２、ＡＰＰＬ１、ＭＡＺ、カスパーゼ３、ＮＴＮ１およびアンドロゲン受容体と相互作用することが示されている。したがって、これらの遺伝子およびタンパク質は、本出願の解釈上の依存性受容体タンパク質とみなされる。
【０３２１】
少なくとも１種類のバイオマーカーはＤＮＡ修復遺伝子またはタンパク質であり得る。理論に拘束されないが、ＤＮＡ修復遺伝子およびタンパク質は、大量のＤＮＡ損傷が蓄積された細胞またはＤＮＡに起こった損傷がもはや有効に修復されない細胞は無秩序な細胞分裂に入り得るため、癌の予後と相関し得る。癌の予後のバイオマーカーとして有用なＤＮＡ修復遺伝子およびタンパク質の非限定的な例としては、相同組換え修復遺伝子およびタンパク質（例えば、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＡＴＭ、ＭＲＥ１１、ＢＬＭ、ＷＲＮ、ＲＥＣＱ４、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤｌ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＮＣＩ、ＦＡＮＣＪ、ＦＡＮＣＬ、ＦＡＮＣＭおよびＦＡＮＣＮ）、ヌクレオチド除去修復遺伝子およびタンパク質（例えば、ＸＰＣ、ＸＰＥ（ＤＤＢ２）、ＸＰＡ、ＸＰＢ、ＸＰＤ、ＸＰＦおよびＸＰＧ）、非相同末端結合遺伝子およびタンパク質（例えば、ＮＢＳ、Ｒａｄ５０、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ、Ｋｕ７０およびＫｕ８０）、損傷乗り越え合成遺伝子およびタンパク質（例えば、ＸＰＶ（ＰＯＬＨ））、ミスマッチ修復遺伝子およびタンパク質（例えば、ｈＭＳＨ２、ｈＭＳＨ６、ｈＭＬＨ１、ｈＰＭＳ２）、アデニン塩基除去修復遺伝子およびタンパク質（例えば、ＭＵＴＹＨ）、細胞周期チェックポイント遺伝子およびタンパク質（例えば、ｐ５３、ｐ２１、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＢＲＣＡ１、ＭＤＣ１および５３ＢＰ１）ならびにＴＥＴファミリー遺伝子およびタンパク質（例えば、ＦＵＳ、ＥＷＳ、ＴＡＦ１５、ＳＡＲＦおよびＴＬＳ）が挙げられる。好ましくは、ＤＮＡ修復遺伝子またはタンパク質はＴＥＴファミリーメンバー、特にＦＵＳである。ＦＵＳは、ＦＵＳＩＰ１、ＩＬＦ３、ＰＲＭＴ１、ＲＥＬＡ、ＳＰＩ１およびＴＮＰＯ１と相互作用することが示されている。したがって、これらの遺伝子およびタンパク質は、本出願の解釈上のＤＮＡ修復タンパク質とみなされる。
【０３２２】
少なくとも１種類のバイオマーカーはテルペノイド骨格生合成遺伝子またはタンパク質であり得る。理論に拘束されないが、テルペノイド骨格生合成遺伝子およびタンパク質は、報告によるとＣｏＱ１０などの一部のテルペノイドの生合成が癌において低減しているため、癌の予後と相関し得る。癌の予後のバイオマーカーとして有用なテルペノイド骨格生合成遺伝子およびタンパク質の非限定的な例としては、ＡＣＡＴ１、ＡＣＡＴ２、ＨＭＧＣＳ１、ＨＭＧＣＳ２、ＨＭＧＣＲ、ＭＶＫ、ＰＭＶＫ、ＭＶＤ、ＩＤＩ１、ＩＤＩ２、ＦＤＰＳ、ＧＧＰＳ１、ＰＤＳＳ１、ＰＤＳＳ２、ＤＨＤＤＳ、ＦＮＴＡ、ＦＮＴＢ、ＲＣＥ１、ＺＭＰＳＴＥ２４、ＩＣＭＴおよびＰＣＹＯＸ１が挙げられる。好ましくは、テルペノイド骨格生合成遺伝子またはタンパク質はＰＤＳＳ２である。
【０３２３】
少なくとも１種類のバイオマーカーはホスファチジルイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路遺伝子またはタンパク質であり得る。理論に拘束されないが、ＰＩ３Ｋ遺伝子およびタンパク質は、該経路が一部においてアポトーシスを調節するため、癌の予後と相関し得る。ＰＩ３Ｋ経路の非限定的な例としては、リガンド（例えば、インスリン、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦおよびＶＥＧＦ）、受容体型チロシンキナーゼ（例えば、インスリン受容体、ＩＧＦ受容体、ＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体およびＶＥＧＦ受容体）、キナーゼ（例えば、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ＧＳＫ３−β、ＩＫＫ、ＰＤＫ１、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＦＡＫ１およびＳ６Ｋ）、ホスファターゼ（例えば、ＰＴＥＮおよびＰＨＬＰＰ）、リボソームタンパク質（例えば、リボソームタンパク質Ｓ６）、アダプタータンパク質（例えば、ＧＡＢ２、ＧＲＢ２、ＧＲＡＰ、ＧＲＡＰ２、ＰＩＫ３ＡＰ１、ＰＲＡＳ４０、ＰＸＮ、ＳＨＢ、ＳＨ２Ｂ１、ＳＨ２Ｂ２、ＳＨ２Ｂ３、ＳＨ２Ｄ３ＡおよびＳＨ２Ｄ３Ｃ）イムノフィリン（例えば、ＦＫＢＰ１２、ＦＫＢＰ５２およびＦＫＢＰ５）ならびに転写因子（例えば、ＦｏｘＯ１、Ｈｉｆ１−ａｌｐｈａ、ＤＥＣ１およびＰＬＡＧ１）が挙げられる。好ましくは、ＰＩ３Ｋ遺伝子またはタンパク質はリボソームタンパク質、例えばリボソームタンパク質Ｓ６、特にホスホ−ｒｐＳ６、あるいは転写因子遺伝子またはタンパク質、特にＰＬＡＧ１である。ＰＬＡＧ１は、ＩＧＦ−２ならびに他の標的遺伝子、例えばＣＲＬＦ１、ＣＲＡＢＰ２、ＣＲＩＰ２およびＰＩＧＦの転写を調節することが示されている。したがって、ＣＲＬＦ１、ＣＲＡＢＰ２、ＣＲＩＰ２およびＰＩＧＦは、本出願の解釈上のＰＩ３Ｋタンパク質とみなされる。
【０３２４】
少なくとも１種類のバイオマーカーはトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）経路遺伝子またはタンパク質であり得る。理論に拘束されないが、ＴＧＦ−β遺伝子およびタンパク質は、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路が細胞周期をＧ１期で停止させて増殖を停止させ、またアポトーシスを促進させるため、癌の予後と相関し得る。ＴＧＦ−βシグナル伝達の破壊により増殖が増大し、アポトーシスが低減される。ＴＧＦ−β経路のメンバーの非限定的な例としては、リガンド（例えば、アクチビンＡ、ＧＤＦ１、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３）、Ｉ型受容体（例えば、ＴＧＦ−βＲ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＢＭＰＲ１ＡおよびＢＭＰＲ１Ｂ）、ＩＩ型受容体（例えば、ＴＧＦ−βＲ２、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＢＭＰＲ２Ｂ）、ＳＡＲＡ、受容体制御型ＳＭＡＤ（例えば、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５およびＳＭＡＤ９）、ｃｏＳＭＡＤ（例えば、ＳＭＡＤ４）、アポトーシスタンパク質（例えば、ＤＡＸＸ）ならびに細胞周期タンパク質（例えば、ｐ１５、ｐ２１、Ｒｂおよびｃ−ｍｙｃ）が挙げられる。好ましくは、ＴＧＦ−β経路遺伝子またはタンパク質はＳＭＡＤ、特にＳＭＡＤ２またはＳＭＡＤ４である。
【０３２５】
少なくとも１種類のバイオマーカーは電位依存性アニオンチャネル遺伝子またはタンパク質であり得る。理論に拘束されないが、電位依存性アニオンチャネル遺伝子およびタンパク質は、アポトーシスの一因となっていることが示されているため、癌の予後と相関し得る。電位依存性アニオンチャネルの非限定的な例としては、ＶＤＡＣ１、ＶＤＡＣ２、ＶＤＡＣ３、ＴＯＭＭ４０およびＴＯＭＭ４０Ｌが挙げられる。好ましくは、電位依存性アニオンチャネルはＶＤＡＣ１である。ＶＤＡＣ１は、ゲルゾリン、ＢＣＬ２様１、ＰＲＫＣＥ、Ｂｃｌ−２結合Ｘタンパク質およびＤＹＮＬＴ３と相互作用することが示されている。したがって、これらの遺伝子およびタンパク質は、本出願の解釈上の電位開口型アニオンチャネルとみなされる。
【０３２６】
少なくとも１種類のバイオマーカーはＲＮＡスプライシング遺伝子またはタンパク質であり得る。理論に拘束されないが、ＲＮＡスプライシング遺伝子およびタンパク質は、異常スプライシングｍＲＮＡが高比率の癌性細胞においてもみられるため、癌の予後と相関し得る。ＲＮＡスプライシング遺伝子およびタンパク質の非限定的な例としては、ｓｎＲＮＰ（例えば、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ１１、Ｕ１２、Ｕ４ａｔａｃおよびＵ６ａｔａｃ）、Ｕ２ＡＦならびにＹＢＸ１が挙げられる。好ましくは、ＲＮＡスプライシング遺伝子またはタンパク質はＹＢＸ１である。ＹＢＸ１は、ＲＢＢＰ６、ＰＣＮＡ、ＡＮＫＲＤ２、ＳＦＲＳ９、ＣＴＣＦおよびＰ５３と相互作用することが示されている。したがって、これらの遺伝子およびタンパク質は、タンパク質  本出願の解釈上のＲＮＡスプライシングとみなされる。
【０３２７】
本発明の好ましい予後決定因子としては、ＡＣＴＮ１、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ２、ＨＯＸＢ１３、ＤＥＲＬ１、ｐＳ６、ＦＡＫ１、ＹＢＸ１、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１、ＣＯＸ６Ｃ、ＦＫＢＰ５、ＤＣＣ、ＣＵＬ２、ＰＬＡＧ１、ＰＤＳＳ２、ＰＸＮ、ＡＫＡＰ８、ＤＩＡＢＬＯ、ＣＤ７５、ＬＡＴＳ２、ＤＥＣ１、ＬＭＯ７、ＥＩＦ３Ｈ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＭＴＤＨ２、ＭＡＯＡ、ＣＣＮＤ１、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＭＡＰ３Ｋ５、ｐＰＲＡＳ４０が挙げられる。本発明のより好ましい予後決定因子としては、ＡＣＴＮ１、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ２、ＤＥＲＬ１、ｐＳ６、ＹＢＸ１、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１、ＤＣＣ、ＣＵＬ２、ＰＬＡＧ１およびＰＤＳＳ２が挙げられる。この１２種類のより好ましいバイオマーカーを以下の表１に、より詳細に示す。
【表１】
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【０３２８】
本明細書で用いる場合、用語「ＡＣＴＮ１」はアクチニン，α１をいう。また、ＡＣＴＮ１は、アクチニンα１、α−アクチニン細胞骨格アイソフォーム、非筋肉α−アクチニン−１、Ｆ−アクチン架橋タンパク質、アクチニン１平滑筋またはα−アクチニン−１として知られているものであり得る。これは、アクチンをさまざまな細胞内構造にアンカリングし得るＦ−アクチン架橋タンパク質である。例えば、ＡＣＴＮ１タンパク質配列は配列番号：１を含むものであり得、ＡＣＴＮ１  ｍＲＮＡ配列は配列番号：２を含むものであり得る。
【０３２９】
本明細書で用いる場合、用語「ＣＵＬ２」はクリン−２をいう。これは、マルチプルクリン−ＲＩＮＧ型Ｅ３ユビキチン−タンパク質リガーゼ複合体のコア成分である。例えば、ＣＵＬ２タンパク質配列は配列番号：３を含むものであり得、ＣＵＬ２  ｍＲＮＡ配列は配列番号：４を含むものであり得る。
【０３３０】
本明細書で用いる場合、用語「ＤＣＣ」はｄｅｌｅｔｅｄ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒをいう。また、ＤＣＣは、ＩＧＤＣＣ、直腸結腸腫瘍抑制因子、直腸結腸癌抑制因子、ｄｅｌｅｔｅｄ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒタンパク質、免疫グロブリンスーパーファミリーＤＣＣサブクラスメンバー１、免疫グロブリンスーパーファミリー，ＤＣＣサブクラス、メンバー１，腫瘍抑制因子タンパク質ＤＣＣ、ネトリン受容体ＤＣＣ２  ＣＲＣ１８、およびＣＲＣＲ１として知られているものであり得る。これは依存性受容体である。これは、ネトリンの存在下では軸索の伸長を促進させ、ネトリンが存在しない場合はアポトーシスを誘導する。例えば、ＤＣＣタンパク質配列は配列番号：５を含むものであり得、ＤＣＣ  ｍＲＮＡ配列は配列番号：６を含むものであり得る。
【０３３１】
本明細書で用いる場合、用語「ＤＥＲＬ１」はデルリン１をいう。また、ＤＥＲＬ１は、ＤＥＲ１、ＤＥＲ−１、ＤＥＲ１様ドメインファミリー，メンバー、小胞体関連分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）タンパク質１、ＤＥＲｔｒｉｎ−１、ＦＬＪ１３７８４、ＭＧＣ３０６７、ＰＲＯ２５７７、およびＤｅｒ１様タンパク質として知られているものであり得る。これは、ＥＲ関連分解に関与し、ミスフォールドまたはアンフォールドタンパク質をＥＲ内腔からサイトゾルに、プロテアソーム分解のために逆輸送する。例えば、ＤＥＲＬ１タンパク質配列は配列番号：７を含むものであり得、ＤＥＲＬ１  ｍＲＮＡ配列は配列番号：８を含むものであり得る。
【０３３２】
本明細書で用いる場合、用語「ＦＵＳ」はｆｕｓｅｄ  ｉｎ  ｓａｒｃｏｍａをいう。また、ＦＵＳは、ＴＬＳ、ＡＬＳ６、ＦＵＳ１、癌遺伝子ＦＵＳ、癌遺伝子ＴＬＳ、ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｄ  ｉｎ  ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａタンパク質，７５ｋＤａ  ＤＮＡ対合タンパク質、ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ６、ｈｎＲＮＰ−Ｐ２、ＥＴＭ４、ＨＮＲＮＰＰ２、ＰｏＭＰ７５、ｆｕｓ様タンパク質、粘液性脂肪肉腫における融合遺伝子、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ｐ２、ＲＮＡ結合タンパク質ＦＵＳ、およびＰＯＭｐ７５として知られているものであり得る。これは、遺伝子発現の調節、ゲノム完全性の維持およびｍＲＮＡ／マイクロＲＮＡのプロセッシングが挙げられる細胞内プロセスに関与しているＴＥＴタンパク質ファミリーのメンバーである。例えば、ＦＵＳタンパク質配列は配列番号：８を含むものであり得、ＦＵＳ  ｍＲＮＡ配列は配列番号：１０を含むものであり得る。
【０３３３】
本明細書で用いる場合、用語「ＰＤＳＳ２」はプレニル（デカプレニル）二リン酸シンターゼ，サブユニット２をいう。また、ＰＤＳＳ２は、ＤＬＰ１；ｈＤＬＰ１；ＣＯＱ１０Ｄ３；Ｃ６ｏｒｆ２１０；ｂＡ５９Ｉ９．３；デカプレニルピロリン酸シンテターゼサブユニット２；デカプレニル−二リン酸シンターゼサブユニット２；オール−トランス−デカプレニル−二リン酸シンターゼサブユニット２；デカプレニル二リン酸シンターゼのサブユニット２；デカプレニルピロリン酸シンターゼサブユニット２；ＥＣ  ２．５．１．９１；および第６染色体オープンリーディングフレーム２１０として知られているものであり得る。これは、呼吸鎖における重要な要素である補酵素Ｑまたはユビキノンのプレニル側鎖を合成する酵素である。例えば、ＰＤＳＳ２タンパク質配列は配列番号：１１を含むものであり得、ＰＤＳＳ２  ｍＲＮＡ配列は配列番号：１２を含むものであり得る。
【０３３４】
本明細書で用いる場合、用語「ＰＬＡＧ１」は多形腺腫遺伝子１をいう。また、ＰＬＡＧ１は、ＰＳＡ；ＳＧＰＡ；ＺＮＦ９１２；ＣＯＬ１Ａ２／ＰＬＡＧ１融合体；ジンクフィンガータンパク質ＰＬＡＧ１；および多形腺腫遺伝子１タンパク質として知られているものであり得る。これは、２つの推定核局在シグナルを有するジンクフィンガータンパク質である。例えば、ＰＬＡＧ１タンパク質配列は配列番号：１３を含むものであり得、ＰＬＡＧ１  ｍＲＮＡ配列は配列番号：１４を含むものであり得る。
【０３３５】
本明細書で用いる場合、用語「ＲｐＳ６」はリボソームタンパク質Ｓ６をいう。また、ＲｐＳ６は、Ｓ６；リンタンパク質ＮＰ３３；および４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ６として知られているものであり得る。これは、４０Ｓリボソームサブユニットの一成分である細胞質リボソームタンパク質である。例えば、ＲｐＳ６タンパク質配列は配列番号：１５を含むものであり得、ＲｐＳ６  ｍＲＮＡ配列は配列番号：１６を含むものであり得る。
【０３３６】
本明細書で用いる場合、用語「ＳＭＡＤ２」はＳＭＡＤファミリーメンバー２をいう。また、ＳＭＡＤ２は、ＪＶ１８；ＭＡＤＨ２；ＭＡＤＲ２；ＪＶ１８−１；ｈＭＡＤ−２；ｈＳＭＡＤ２；ＳＭＡＤファミリーメンバー２；ＳＭＡＤ，ｍｏｔｈｅｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＤＰＰホモログ２（ショウジョウバエ）；ｍｏｔｈｅｒ  ａｇａｉｎｓｔ  ＤＰＰホモログ２；ｍｏｔｈｅｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃホモログ２；Ｓｍａ−およびＭａｄ関連タンパク質２；ＭＡＤホモログ２；Ｍａｄ関連タンパク質２；ｍｏｔｈｅｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＤＰＰホモログ２；ならびにＭＡＤ，ｍｏｔｈｅｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃホモログ２（ショウジョウバエ）として知られているものであり得る。これは、多くのシグナル伝達経路、例えばＴＧＦ−β経路、細胞増殖プロセス、アポトーシスプロセスおよび分化プロセスを媒介するシグナル伝達因子および転写調節因子であるＳｍａｄファミリータンパク質のメンバーである。例えば、ＳＭＡＤ２タンパク質配列は配列番号：１７を含むものであり得、ＳＭＡＤ２  ｍＲＮＡ配列は配列番号：１８を含むものであり得る。
【０３３７】
本明細書で用いる場合、用語「ＳＭＡＤ４」はＳＭＡＤファミリーメンバー４をいう。また、ＳＭＡＤ４は、ＪＩＰ；ＤＰＣ４；ＭＡＤＨ４；ＭＹＨＲＳ；ｄｅｌｅｔｅｄ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｌｏｃｕｓ  ４；ｍｏｔｈｅｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃホモログ４；ｍｏｔｈｅｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ，ショウジョウバエ，ホモログ，４；ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ４；ＳＭＡＤ，ｍｏｔｈｅｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＤＰＰホモログ４；ＭＡＤホモログ４；ｈＳＭＡＤ４；ＭＡＤ，ｍｏｔｈｅｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃホモログ４（ショウジョウバエ）；ｍｏｔｈｅｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＤＰＰホモログ４；およびＳＭＡＤ，ｍｏｔｈｅｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＤＰＰホモログ４（ショウジョウバエ）として知られているものであり得る。これは、Ｓｍａｄファミリータンパク質のメンバーであり、他の活性型Ｓｍａｄタンパク質とホモメリック複合体およびヘテロメリック複合体を形成し得、次いで、これらは核内に蓄積して標的遺伝子の転写を調節する。例えば、ＳＭＡＤ４タンパク質配列は配列番号：１９を含むものであり得、ＳＭＡＤ４  ｍＲＮＡ配列は配列番号：２０を含むものであり得る。
【０３３８】
本明細書で用いる場合、用語「ＶＤＡＣ１」は電位依存性アニオンチャネル１をいう。また、ＶＤＡＣは、ＶＤＡＣ−１；ＰＯＲＩＮ；ＭＧＣ１１１０６４；ミトコンドリア外膜タンパク質ポリン１；電位依存性アニオン選択的チャネルタンパク質１；原形質ポリン；ＶＤＡＣ；ポリン３１ＨＬ；ｈＶＤＡＣ１；およびポリン３１ＨＭとして知られているものであり得る。これは、ミトコンドリア外膜の主成分である電位依存性アニオンチャネルタンパク質である。これによりミトコンドリア外膜を通した代謝産物およびイオンの交換が助長され得、ミトコンドリアの機能が調節され得る。例えば、ＶＤＡＣ１タンパク質配列は配列番号：２１を含むものであり得、ＶＤＡＣ１  ｍＲＮＡ配列は配列番号：２２を含むものであり得る。
【０３３９】
本明細書で用いる場合、用語「ＹＢＸ１」はＹボックス結合タンパク質１をいう。また、ＹＢＸ１は、ＹＢ１；ＢＰ−８；ＹＢ−１；ＣＳＤＡ２；ＮＳＥＰ１；ＭＤＲ−ＮＦ１；ＮＳＥＰ−１；ヌクレアーゼ感受性エレメント結合タンパク質１；ＤＢＰＢ；エンハンサー因子ＩサブユニットＡ；ＣＢＦ−Ａ３；ＥＦＩ−Ａ；ＣＣＡＡＴ結合転写因子ＩサブユニットＡ；ＤＮＡ結合タンパク質Ｂ；Ｙボックス転写因子；ＣＳＤＢ；Ｙボックス結合タンパク質１；主要組織適合遺伝子複合体，クラスＩＩ、Ｙボックス結合タンパク質Ｉ；およびヌクレアーゼ感受性エレメント結合タンパク質１として知られているものであり得る。これは、プレｍＲＮＡ選択的スプライシングの調節を媒介する。例えば、これは、プレｍＲＮＡ内のスプライス部位に結合してスプライス部位の選択を調節し得る。また、これは細胞質内ｍＲＮＡにも結合し、安定化させ得る。例えば、ＹＢＸ１タンパク質配列は配列番号：２３を含むものであり得、ＹＢＸ１  ｍＲＮＡ配列は配列番号：２４を含むものであり得る。
【０３４０】
本明細書において言及される別のバイオマーカーはＨＳＰＡ９である。本明細書で用いる場合、用語「ＨＳＰＡ９」は７０ｋＤａの熱ショックタンパク質９（モルタリン）をいう。また、ＨＳＰＡ９は、ＣＳＡ；ＭＯＴ；ＭＯＴ２；ＧＲＰ７５；ＰＢＰ７４；ＧＲＰ−７５；ＨＳＰＡ９Ｂ；ＭＴＨＳＰ７５；またはＨＥＬ−Ｓ−１２４ｍとして知られているものであり得る。ヒトＨＳＰＡ９のＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤは３３１３である。ヒトＨＳＰＡ９  ｍＲＮＡ配列はＮＭ＿００４１３４．６（配列番号：２６）に示されている。ヒトＨＳＰＡ９タンパク質配列はＮＰ＿００４１２５．３（配列番号：２５）に示されている。例えば、ＨＳＰＡ９タンパク質配列は配列番号：２５を含むものであり得る。例えば、ＨＳＰＡ９  ｍＲＮＡ配列は配列番号：２６を含むものであり得る。
【０３４１】
本明細書に示した配列は単なる例示である。本発明のバイオマーカーは、具体的に記載した任意のバイオマーカーのあらゆる形態およびバリアント、例えば限定されないが、完全集合体構造の構成サブユニットとして任意のバイオマーカーで構成された多型バリアントまたは対立遺伝子バリアント、アイソフォーム、変異型、誘導体、前駆体（例えば、核酸およびプロタンパク質）、切断生成物ならびに構造物を包含している。
【０３４２】
バイオマーカーパネルの構築
上記のように、ＰＤが癌の予後と相関し得る可能性は、これらを組み合わせて使用することにより増幅され得る。したがって、本発明のバイオマーカーパネルは、本明細書に記載のＰＤのうちの２つまたはそれより多くで構築されたものであり得る。本発明のバイオマーカーパネルの一例は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２種類のバイオマーカーを含み、該バイオマーカーの各々が独立して、少なくとも１種類の細胞骨格遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のユビキチン化遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類の依存性受容体遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＤＮＡ修復遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のテルペノイド骨格生合成遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＰＩ３Ｋ経路遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＴＦＧ−β経路遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類の電位依存性アニオンチャネル遺伝子またはタンパク質；および少なくとも１種類のＲＮＡスプライシング遺伝子またはタンパク質から選択されるものであり得る。好ましくは、バイオマーカーパネルは、６、７、８または９種類のバイオマーカー、最も好ましくは７種類のバイオマーカーを含むものである。
【０３４３】
本発明の好ましいバイオマーカーパネルの一例は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２種類のバイオマーカーを含み、該バイオマーカーの各々が独立して、ＡＣＴＮ１、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ２、ＨＯＸＢ１３、ＤＥＲＬ１、ｐＳ６、ＦＡＫ１、ＹＢＸ１、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１、ＣＯＸ６Ｃ、ＦＫＢＰ５、ＤＣＣ、ＣＵＬ２、ＰＬＡＧ１、ＰＤＳＳ２、ＰＸＮ、ＡＫＡＰ８、ＤＩＡＢＬＯ、ＣＤ７５、ＬＡＴＳ２、ＤＥＣ１、ＬＭＯ７、ＥＩＦ３Ｈ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＭＴＤＨ２、ＭＡＯＡ、ＣＣＮＤ１、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＭＡＰ３Ｋ５およびｐＰＲＡＳ４０から選択されるものであり得る。本発明の好ましいバイオマーカーパネルの一例は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２種類のバイオマーカーを含み、該バイオマーカーの各々が独立して、ＡＣＴＮ１、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ２、ＤＥＲＬ１、ｐＳ６、ＹＢＸ１、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１、ＤＣＣ、ＣＵＬ２、ＰＬＡＧ１およびＰＤＳＳ２から選択されるものであり得る。好ましくは、バイオマーカーパネルは、６、７、８または９種類のバイオマーカー、最も好ましくは７種類のバイオマーカーを含むものである。バイオマーカーの厳密な組合せおよび加重は、得ようとする予後診断情報に応じて異なり得る。
【０３４４】
以下のバイオマーカーの組合せが想定される：
１．ＰＤ１およびＰＤ２、ここで、ＰＤ１およびＰＤ２は異なるものである；
２．ＰＤ１、ＰＤ２およびＰＤ３、ここで、ＰＤ１、ＰＤ２およびＰＤ３は異なるものである；
３．ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３およびＰＤ４、ここで、ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３およびＰＤ４は異なるものである；
４．ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４およびＰＤ５、ここで、ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４およびＰＤ５は異なるものである；
５．ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５およびＰＤ６、ここで、ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５およびＰＤ６は異なるものである；
６．ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６およびＰＤ７、ここで、ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６およびＰＤ７は異なるものである；
７．ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６、ＰＤ７およびＰＤ８、ここで、ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６、ＰＤ７およびＰＤ８は異なるものである；
８．ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６、ＰＤ７、ＰＤ８およびＰＤ９、ここで、ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６、ＰＤ７、ＰＤ８およびＰＤ９は異なるものである；
９．ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６、ＰＤ７、ＰＤ８、ＰＤ９およびＰＤ１０、ここで、ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６、ＰＤ７、ＰＤ８、ＰＤ９およびＰＤ１０は異なるものである；
１０．ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６、ＰＤ７、ＰＤ８、ＰＤ９、ＰＤ１０およびＰＤ１１、ここで、ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６、ＰＤ７、ＰＤ８、ＰＤ９、ＰＤ１０およびＰＤ１１は異なるものである；
１１．ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６、ＰＤ７、ＰＤ８、ＰＤ９、ＰＤ１０、ＰＤ１１およびＰＤ１２、ここで、ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６、ＰＤ７、ＰＤ８、ＰＤ９、ＰＤ１０、ＰＤ１１およびＰＤ１２は異なるものである；
この場合、ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６、ＰＤ７、ＰＤ８、ＰＤ９、ＰＤ１０、ＰＤ１１およびＰＤ１２は各々、独立して、ＡＣＴＮ１、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ２、ＨＯＸＢ１３、ＤＥＲＬ１、ｐＳ６、ＦＡＫ１、ＹＢＸ１、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１、ＣＯＸ６Ｃ、ＦＫＢＰ５、ＤＣＣ、ＣＵＬ２、ＰＬＡＧ１、ＰＤＳＳ２、ＰＸＮ、ＡＫＡＰ８、ＤＩＡＢＬＯ、ＣＤ７５、ＬＡＴＳ２、ＤＥＣ１、ＬＭＯ７、ＥＩＦ３Ｈ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＭＴＤＨ２、ＭＡＯＡ、ＣＣＮＤ１、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＭＡＰ３Ｋ５およびｐＰＲＡＳ４０からなる群より選択される。
【０３４５】
以下のバイオマーカーの組合せが好ましい：
１．ＰＤ１およびＰＤ２、ここで、ＰＤ１およびＰＤ２は異なるものである；
２．ＰＤ１、ＰＤ２およびＰＤ３、ここで、ＰＤ１、ＰＤ２およびＰＤ３は異なるものである；
３．ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３およびＰＤ４、ここで、ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３およびＰＤ４は異なるものである；
４．ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４およびＰＤ５、ここで、ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４およびＰＤ５は異なるものである；
５．ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５およびＰＤ６、ここで、ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５およびＰＤ６は異なるものである；
６．ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６およびＰＤ７、ここで、ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６およびＰＤ７は異なるものである；
７．ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６、ＰＤ７およびＰＤ８、ここで、ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６、ＰＤ７およびＰＤ８は異なるものである；
８．ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６、ＰＤ７、ＰＤ８およびＰＤ９、ここで、ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６、ＰＤ７、ＰＤ８およびＰＤ９は異なるものである；
９．ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６、ＰＤ７、ＰＤ８、ＰＤ９およびＰＤ１０、ここで、ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６、ＰＤ７、ＰＤ８、ＰＤ９およびＰＤ１０は異なるものである；
１０．ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６、ＰＤ７、ＰＤ８、ＰＤ９、ＰＤ１０およびＰＤ１１、ここで、ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６、ＰＤ７、ＰＤ８、ＰＤ９、ＰＤ１０およびＰＤ１１は異なるものである；
１１．ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６、ＰＤ７、ＰＤ８、ＰＤ９、ＰＤ１０、ＰＤ１１およびＰＤ１２、ここで、ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６、ＰＤ７、ＰＤ８、ＰＤ９、ＰＤ１０、ＰＤ１１およびＰＤ１２は異なるものである；
この場合、ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６、ＰＤ７、ＰＤ８、ＰＤ９、ＰＤ１０、ＰＤ１１およびＰＤ１２は各々、独立して、ＡＣＴＮ１、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ２、ＤＥＲＬ１、ｐＳ６、ＹＢＸ１、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１、ＤＣＣ、ＣＵＬ２、ＰＬＡＧ１およびＰＤＳＳ２からなる群より選択される。
【０３４６】
必要に応じて、バイオマーカーの組合せは、少なくともＡＣＴＮ１、ＹＢＸ１、ＳＭＡＤ２およびＦＵＳを含むものである。あるいはまた、バイオマーカーの組合せは、（１）少なくともＡＣＴＮ１、ＹＢＸ１およびＳＭＡＤ２；（２）少なくともＡＣＴＮ１、ＹＢＸ１およびＦＵＳ；（３）少なくともＡＣＴＮ１、ＳＭＡＤ２およびＦＵＳ；または（４）少なくともＹＢＸ１、ＳＭＡＤ２およびＦＵＳを含むものである。バイオマーカーの好ましい組合せの一例は、米国特許仮出願第６１／７９２，００３号（２０１３年３月１５日出願，その全内容は引用により本明細書に組み込まれる）に開示した表６に示されたものである。
【０３４７】
組織試料
本発明の方法に使用される組織試料は、生検によって得られる腫瘍試料（例えば、前立腺腫瘍試料）であり得る。保険医療機関は、初期検査、例えば前立腺特異抗原（ＰＳＡ）血液検査または直腸指診（ＤＲＥ）の結果により前立腺癌が示唆される場合、生検（例えば前立腺生検）を指示することがあり得る。前立腺生検を得るため、保険医療機関では、微細針を用いていくつかの組織試料（「コア」サンプルとも称される）が前立腺の腺部分から採取され得る（後述の論考も参照されたい）。また、本発明の方法のための組織試料は、泌尿器科医または手術支援ロボットによって行なわれた手術（例えば、前立腺摘除）によって得られたものであってもよい。手術によって得る組織試料は、前立腺全体であっても前立腺の一部であってもよく、１つまたはそれより多くリンパ節を含むものであってもよい。一実施形態では、組織試料はブロック状のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）であり得る。次いでＦＦＰＥブロックから切片が切り出され、任意の適切な手段によってスライド上に配置され得る。多くの腫瘍または患者由来の試料を含むスライドを、加工のために組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）として１つのバッチにまとめてもよい。凍結組織も同様に使用され得る。適当な対照スライドまたは対照コア、例えば、ＡＣＴＮ１、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１およびＹＢＸ１の広範な発現を有する細胞株から調製したものをバッチに加えてもよい。
【０３４８】
各バイオマーカー（例えば、ＡＣＴＮ１、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１およびＹＢＸ１）について高レベル、中間レベルおよび低レベルの発現を示す一組の対照細胞株が選択され得る。これらの細胞株は、次いで、標準的な組織学手法を用いてホルマリンで固定され、加工され、パラフィンブロックに組み込まれ得る。細胞株対照ＴＭＡは、各細胞株パラフィンブロックのコアを新たなアクセプターブロックに配することにより確立され得る。この細胞株対照ＴＭＡは切片化され得、得られた切片は患者の組織試料とパラレルで染色され得る。細胞株が均一で再現可能なバイオマーカー発現の供給源となるため、かかる細胞株対照ＴＭＡは、患者の組織試料におけるバイオマーカー発現を測定する免疫染色定量アッセイの基準点として使用され得る。経時的に定量対照レベルと比較することによりユーザーが、機器が検量標準から外れている傾向にあるかかどうかを調べることが可能である。また、必要な場合はユーザーが、バッチ間の絶対定量のために対照値に対して患者試料を標準化してもよい。
【０３４９】
バイオマーカーの測定
本発明のバイオマーカーは種々の形態で測定され得る。例えば、バイオマーカーレベルは、ゲノムＤＮＡレベルで（例えば、コピー数、ヘテロ接合度、欠失、挿入もしくは点変異の測定）、ｍＲＮＡレベルで（例えば、転写物レベルもしくは転写物の位置の測定）、タンパク質レベル（例えば、タンパク質の発現レベル、翻訳後修飾の定量もしくは活性レベル）で、または代謝産物／被検物レベルで測定され得る。バイオマーカーレベルのゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質および代謝産物／被検物レベルでの測定方法は当該技術分野で知られている。好ましくは、バイオマーカーレベルは、全細胞および／または細胞成分区画（例えば、核、細胞質および細胞膜）におけるタンパク質レベルで測定される。タンパク質レベルでのレベルの測定のための例示的な方法としては、限定されないが、イムノアッセイ、例えば免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）、免疫蛍光アッセイ（ＩＦ）、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫放射定量アッセイ、および免疫酵素アッセイが挙げられる。イムノアッセイでは、例えば、バイオマーカーまたはその断片に結合する抗体が使用され得る。該抗体はモノクローナル、ポリクローナル、キメラまたはヒト化型であり得る。該抗体は二重特異性であってもよい。また、完全抗体の抗原結合断片、例えば、一本鎖抗体、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、二重特異性単鎖Ｆｖ二量体、ナノボディ、ダイアボディ、ドメイン欠失抗体、単一ドメイン抗体および／または２種類またはそれより多くの特異的モノクローナル抗体のオリゴクローナル混合物も使用され得る。
【０３５０】
例えば、組織試料、例えば上記の生検スライドは、適切なバイオマーカーのレベルを測定するために、例えば免疫組織化学的（ＩＨＣ）アッセイにおいてアッセイされ得る。ＩＨＣアッセイでは、種々のバイオマーカーに対して検出可能に標識された抗体が前立腺組織試料の染色のために使用され得、結合レベルが、例えば蛍光または発光によって表示され得る。比色色素（例えば、ＤＡＢ、Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ）も同様に使用され得る。一実施形態では、前立腺組織スライドは、それぞれＡＣＴＮ１、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１およびＹＢＸ１に結合する抗体のうちの１種類またはそれより多くを用いて染色される。本発明の方法に使用される抗体はモノクローナルであってもポリクローナルであってもよい。また、バイオマーカーに特異的に結合し得る完全抗体の抗原結合部分または任意の他の分子実体（例えば、ペプチド模倣物およびアプタマー）を使用してもよい。
【０３５１】
タンパク質レベルでバイオマーカーを測定するための他の方法としては、例えば、クロマトグラフィー、質量分析、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、マイクロ流体チップ系アッセイ、表面プラズモン共鳴、配列決定、ウエスタンブロット解析、アプタマー結合、分子インプリント法、ペプチド模倣、親和性に基づいたペプチド結合、親和性に基づいた化学結合、またはその組合せが挙げられる。また、バイオマーカーの全細胞内および／または細胞成分内レベルを測定するために、ＡＱＵＡ（登録商標）（例えば、米国特許７，２１９，０１６および同７，７０９，２２２；Ｃａｍｐら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，８（１１）：１３２３−２７（２００２）参照）ならびにＤｅｆｉｎｉｅｎｓ  ＴｉｓｓｕｅＳｔｕｄｉｏＴＭ（例えば、米国特許７，８７３，２２３、同７，８０１，３６１、同７，４６７，１５９および同７，１４６，３８０、ならびにＢａａｔｚら，Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ，１２（９）：９０８−１６（２００９）参照）などの方法も使用され得る。
【０３５２】
一部の実施形態では、測定されたバイオマーカーレベルは正規化用タンパク質、例えば、ハウスキーピング遺伝子の発現産物、例えばＧＡＰＤＨ、Ｃｙｎ１、ＺＮＦ５９２またはアクチンの発現産物に対して正規化され、変動源が除かれる。正規化の方法はよく当該技術分野で知られている。例えば、Ｐａｒｋら，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．４：３３（２００３）を参照のこと。
【０３５３】
関心領域の画定
アッセイの精度を改善するため、関心領域を画定し、該関心領域内だけでバイオマーカーを定量することが望ましい場合があり得る。関心領域は、「腫瘍マスク」を試料に適用して腫瘍領域内のバイオマーカーレベルのみが測定されるようにすることにより画定され得る。「腫瘍マスク」は、対象組織内の腫瘍領域の同定を可能にするバイオマーカーの組合せをいう。例えば、前立腺癌は典型的には、上皮マーカー、例えばサイトケラチン８（ＣＫ８またはＫＲＴ８）およびサイトケラチン１８（ＣＫ１８またはＫＲＴ１８）を発現しているが、前立腺基底マーカー、例えばサイトケラチン５（ＣＫ５またはＫＲＴ５）は発現していない癌である。したがって、前立腺癌での「腫瘍マスク」は、これらのマーカーに特異的に結合する抗体の混合物の使用を伴うものであり得る。また、本発明者らは驚くべきことに、一部の他の癌の腫瘍マーカーであるＴＲＩＭ２９が、前立腺組織においては腫瘍マーカーではなく基底マーカーであることを見出した；したがって、抗ＴＲＩＭ２９抗体もまた前立腺腫瘍マスクに使用され得る。例えば、本発明に有用な前立腺腫瘍マスクは、抗ＣＫ５、抗ＣＫ８、抗ＣＫ１８および抗ＴＲＩＭ２９抗体の混合物を含むものであり得、この場合、前立腺腫瘍領域は抗ＣＫ８と抗ＣＫ１８抗体によって境界が示される前立腺組織領域であって、抗ＣＫ５および抗ＴＲＩＭ２９抗体では境界が示されない前立腺組織領域として画定される。前立腺腫瘍領域は、抗ＣＫ８または抗ＣＫ１８抗体のいずれか、好ましくは両方によって境界が示される前立腺組織領域として画定され得る。同様に、前立腺腫瘍領域は、抗ＣＫ５抗体では境界が示されない、または抗ＴＲＩＭ２９抗体では境界が示されない前立腺組織領域として画定され得る。好ましくは、前立腺腫瘍領域は、抗ＣＫ５または抗ＴＲＩＭ２９抗体のいずれかでは境界が示されない。基底前立腺腫瘍領域は、抗ＣＫ５または抗ＴＲＩＭ２抗体のいずれか、好ましくは両方によって境界が示される前立腺組織領域として画定され得る。好ましくは、基底腫瘍領域は、抗ＣＫ８または抗ＣＫ１８抗体のいずれかでは境界が示されない。あるいはまた、上皮マーカーと基底マーカーの他の組合せ、例えば、上皮細胞のＥＳＡ抗体と基底細胞のｐ６３抗体が使用され得る。前立腺癌以外の癌では、腫瘍領域の同定を可能にする他のマーカーの組合せ、例えば、悪性黒色腫に特異的なＳ１００マーカーが使用され得る。
【０３５４】
したがって、本発明の一態様により、組織試料を、関心領域を特異的に同定するための１種類またはそれより多くの第１の試薬と接触させることを含む、組織試料において関心領域を画定するための方法を提供する。関心領域は、前立腺癌細胞などの癌細胞を含むものであり得る。前立腺癌細胞を同定するため、該１種類またはそれより多くの第１の試薬は、抗サイトケラチン８抗体、抗サイトケラチン１８抗体または両方を含むものであり得る。該方法に、さらに、関心領域から除外すべき組織試料領域、例えば非癌性細胞を、組織試料を、除外すべき領域に特異的に同定するための１種類またはそれより多くの第２の試薬と接触させることにより画定することを含めてもよい。例えば、非癌性前立腺基底細胞を除外するためには、該１種類またはそれより多くの第２の試薬は抗サイトケラチン５抗体、抗ＴＲＩＭ２９抗体または両方を含むものであり得る。
【０３５５】
細胞成分領域、例えば核、細胞質および細胞膜におけるバイオマーカーの測定を可能にするためには、該領域に対する特異的マーカーを使用することが必要である。上皮領域の同定に使用されるサイトケラチン８および１８は細胞質特異的および膜特異的な染色パターンをもたらし、したがって、この細胞成分内局在の画定に使用され得る。細胞の核領域を同定するためには、前立腺組織試料は核の特異的蛍光色素で、例えばＤＡＰＩまたはＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で染色され得る。
【０３５６】
適切な染色を行なった後、生検スライドは、例えば、スライド上に褪色防止試薬および／またはカバースリップを適用することにより、検出のためのシグナルが保存されるように処理され得る。次いで、スライドはイメージング装置に格納され、読み取りが行なわれ得る。そのようにして得られた画像は、次いで処理され、バイオマーカー発現が定量され得る。また、このプロセスは定量的マルチプレックス免疫蛍光収集（ＱＭＩＦ収集）とも称される。
【０３５７】
本発明のマルチプレックスインサイチュプロテオミクス技術により、タンパク質の発現／活性ではなく遺伝子発現が測定される慣用的な遺伝学プラットフォームと比べていくつかの利点がもたらされる。第１に、腫瘍マスクの使用により、正常組織による「希釈」のない腫瘍組織のみからのマーカー情報の入手が可能になり、したがって検査精度が向上する。また、本技術により、かなり不均一であることがわかっている腫瘍組織の種々の領域でのマーカーの定量が可能になる。腫瘍の最も侵攻性の領域からの読み出し情報により患者の臨床転帰に対するより正確な見通しが得られ、したがって、医師が患者に対する最良の処置過程を決定することの補助において、より有用となる。また、本発明の多変量診断方法は、より小さな代表腫瘍領域においてであっても転帰が予測されるように設計されており、ランダムサンプリング誤差によって引き起こされる問題が緩和される。さらに、活性化状態の抗体の使用およびマーカーの細胞成分内局在により、機能的に活性なマーカーの定量が可能になり、検査精度がさらに向上する。
【０３５８】
データ処理
腫瘍試料の免疫蛍光から得られた画像は、画像から収集されるデータの自動化定量解析に適したアルゴリズム（例えば、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  ＸＤＴＭを用いて開発されたアルゴリズムを使用するパターン認識ソフトウェアまたは他の画像解析ソフトウェア、例えばＩＮＦＯＲＭ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）にエクスポートされ得る。本発明の一部の実施形態では、かかるアルゴリズムは、ＡＣＴＮ１、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１およびＹＢＸ１のうちの１つまたはそれより多くに対する抗体染色の存在および／またはレベルを測定するものである。この測定をＣＫ８およびＣＫ１８染色の存在およびＣＫ５およびＴＲＩＭ２９染色の非存在によって画定される腫瘍領域に集中させるためのアルゴリズムを使用してもよい。一部の実施形態では、ＡＣＴＮ１、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１およびＹＢＸ１のうちの１つまたはそれより多くについての最高侵攻性領域のヒートマップを作成するためのアルゴリズムが使用される。また、腫瘍体積を測定するためのアルゴリズムを使用してもよい。
【０３５９】
組織試料の画像処理によって得られたデータはリスクスコアを計算するために使用される。リスクスコアにより腫瘍（例えば、前立腺腫瘍）の侵攻性が測量され得る。例えば、リスクスコアにより、腫瘍（例えば、前立腺腫瘍）が診断時に活発に進行している、または緩慢性／休眠状態である確率が予測され得る。また、リスクスコアにより、腫瘍（例えば、前立腺腫瘍）が診断時点の後、後のある時点で進行している確率も予測され得る。また、リスクスコアにより、癌（例えば、前立腺癌）の致死性転帰／疾患特異的死亡（ＤＳＤ）、すなわち、腫瘍を有する患者が癌で死亡する確率（例えば、予測生存年数）、または腫瘍（例えば前立腺腫瘍）が進行もしくは転移するリスクも予測され得る。これらの確率は、試料で測定されたマーカー値においてモデルを評価すること／このリスクの予測のために訓練された分類子により得られ得る。いくつかの確率二項分類子が使用され得、当業者に知られている（ランダムフォレストまたはロジスティック回帰など）。以下に示す実施例では、ロジスティック回帰を使用した。また、リスクスコアは、腫瘍組織試料中において転移の可能性を有する細胞を検出するためにも使用され得る。また、リスクスコアに他の診断結果または癌パラメータを、例えば直腸指診（ＤＲＥ）結果、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）レベル、ＰＳＡ速度論、グリーソンスコア、腫瘍進行度分類、腫瘍サイズ、発症年齢およびリンパ節の状態を組み込んでもよい。リスクスコアは保険医療機関および／または患者に連絡され、患者（例えば、手術）に対する処置レジメンを決定するために使用され得る。
【０３６０】
臨床応用
本発明の診断方法は、保険医療機関が癌患者（例えば、前立腺癌患者）に対する最も適切な処置を決定するのに有用である。保険医療機関が、病歴、ＤＲＥおよび／またはＰＳＡレベルに基づいて患者の癌（例えば、前立腺癌）を疑った場合、当該機関は生検（例えば前立腺生検）を指示することがあり得る。生検を行なうためには、一般開業医または泌尿器科医により、経直腸的超音波（ＴＲＵＳ）ガイドコア針を用いて多数（例えば、８〜１８例）のコア試料（各々、約１／２インチ長および１／１６インチ幅）が採取され得る。形態学的検査によって癌性細胞が見つかった場合、さらなる検査（例えば、イメージング検査、例えば骨スキャン、ＣＴスキャンおよびＭＲＩ  ＰｒｏｓｔａｓｔｉｎｔＴＭ  Ｓｃａｎ）が、癌の進行度分類を補助するために行なわれ得る。次いで、癌の侵攻性、進行リスクまたは転帰をさらに予測するために、本発明の診断方法が行なわれ得る。該方法によって１）腫瘍の活発な進行；２）高い進行リスク；または３）致死性転帰が予測される場合、保険医療機関では積極的処置の使用が判断され得る。例えば、前立腺摘除に加え、医師により、放射線療法（例えば、外部放射線、陽子線治療および近接照射療法）、ホルモン療法（例えば、精巣切開、ＬＨＲＨアゴニスト製剤またはアンタゴニスト製剤および抗アンドロゲン薬）、化学療法、ならびに他の適切な処置（例えば、Ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔ（ＰＲＯＶＥＮＧＥ（登録商標））療法、凍結手術および高強度レーザー療法）が使用され得る。しかしながら、患者が緩慢性ＰＣＡを有すると予後診断された場合は積極的監視と称され、反復生検に供され得、根治的処置の必要なない。
【０３６１】
したがって、本発明の一態様により癌患者の予後を予測するための方法を提供する。該方法は、測定すること、患者から採取した試料中において、少なくとも１種類の細胞骨格遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のユビキチン化遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類の依存性受容体遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＤＮＡ修復遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のテルペノイド骨格生合成遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＰＩ３Ｋ経路遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＴＦＧ−β経路遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類の電位依存性アニオンチャネル遺伝子またはタンパク質；および少なくとも１種類のＲＮＡスプライシング遺伝子またはタンパク質から選択される２つまたはそれより多くのＰＤレベルを含むものであり得；この場合、レベル測定値は癌患者の予後を示す。必要に応じて、該２つまたはそれより多くのＰＤは、ＡＣＴＮ１、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ２、ＨＯＸＢ１３、ＤＥＲＬ１、ＲｐＳ６、ＦＡＫ１、ＹＢＸ１、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１、ＣＯＸ６Ｃ、ＦＫＢＰ５、ＤＣＣ、ＣＵＬ２、ＰＬＡＧ１、ＰＤＳＳ２、ＰＸＮ、ＡＫＡＰ８、ＤＩＡＢＬＯ、ＣＤ７５、ＬＡＴＳ２、ＤＥＣ１、ＬＭＯ７、ＥＩＦ３Ｈ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＭＴＤＨ２、ＭＡＯＡ、ＣＣＮＤ１、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＭＡＰ３Ｋ５およびｐＰＲＡＳ４０からなる群より選択される。好ましくは、ｔｈｅ  ２つまたはそれより多くのＰＤは、ＡＣＴＮ１、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１およびＹＢＸ１からなる群より選出される。該方法に、さらに、患者から試料を採取する工程を含めてもよい。予後は、癌が侵攻性形態の癌である、患者に侵攻性形態の癌を有するリスクがある、または患者に癌関連致死性転帰を有するリスクがあるというものであり得る。癌は前立腺癌であり得る。
【０３６２】
本発明の別の態様により、患者から組織試料を採取すること；ならびに該試料中において、少なくとも１種類の細胞骨格遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のユビキチン化遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類の依存性受容体遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＤＮＡ修復遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のテルペノイド骨格生合成遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＰＩ３Ｋ経路遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＴＦＧ−β経路遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類の電位依存性アニオンチャネル遺伝子またはタンパク質；および少なくとも１種類のＲＮＡスプライシング遺伝子またはタンパク質から選択される２つまたはそれより多くのＰＤレベルを測定することを含み；この場合、レベル測定値は、該患者が補助療法を必要とすることを示す、補助療法を必要とする癌患者を同定するための方法を提供する。必要に応じて、該２つまたはそれより多くのＰＤは、ＡＣＴＮ１、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ２、ＨＯＸＢ１３、ＤＥＲＬ１、ＲｐＳ６、ＦＡＫ１、ＹＢＸ１、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１、ＣＯＸ６Ｃ、ＦＫＢＰ５、ＤＣＣ、ＣＵＬ２、ＰＬＡＧ１、ＰＤＳＳ２、ＰＸＮ、ＡＫＡＰ８、ＤＩＡＢＬＯ、ＣＤ７５、ＬＡＴＳ２、ＤＥＣ１、ＬＭＯ７、ＥＩＦ３Ｈ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＭＴＤＨ２、ＭＡＯＡ、ＣＣＮＤ１、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＭＡＰ３Ｋ５およびｐＰＲＡＳ４０からなる群より選択される。好ましくは、該２つまたはそれより多くのＰＤは、ＡＣＴＮ１、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１およびＹＢＸ１からなる群より選出される。
【０３６３】
本発明のさらなる一態様により、少なくとも１種類の細胞骨格遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のユビキチン化遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類の依存性受容体遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＤＮＡ修復遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のテルペノイド骨格生合成遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＰＩ３Ｋ経路遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＴＦＧ−β経路遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類の電位依存性アニオンチャネル遺伝子またはタンパク質；および少なくとも１種類のＲＮＡスプライシング遺伝子またはタンパク質からなる群より選択される２つまたはそれより多くのＰＤのレベルを測定すること；ならびにレベル測定値よって患者が活発に進行している癌または癌進行のリスクまたは癌関連致死性転帰を有するリスクを有することが示された場合、該患者を補助療法で処置することを含む、癌患者の処置方法を提供する。必要に応じて、該２つまたはそれより多くのＰＤは、ＡＣＴＮ１、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ２、ＨＯＸＢ１３、ＤＥＲＬ１、ＲｐＳ６、ＦＡＫ１、ＹＢＸ１、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１、ＣＯＸ６Ｃ、ＦＫＢＰ５、ＤＣＣ、ＣＵＬ２、ＰＬＡＧ１、ＰＤＳＳ２、ＰＸＮ、ＡＫＡＰ８、ＤＩＡＢＬＯ、ＣＤ７５、ＬＡＴＳ２、ＤＥＣ１、ＬＭＯ７、ＥＩＦ３Ｈ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＭＴＤＨ２、ＭＡＯＡ、ＣＣＮＤ１、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＭＡＰ３Ｋ５およびｐＰＲＡＳ４０からなる群より選択される。好ましくは、該２つまたはそれより多くのＰＤは、ＡＣＴＮ１、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１およびＹＢＸ１からなる群より選出される。あるいはまた、該方法は、少なくとも２種類のＰＤのレベルの変化を有する患者を同定すること（ここで、該レベルの変化は、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＳＭＡＤ２およびＶＤＡＣ１のうちの１つまたはそれより多くの上方調節ならびにＡＣＴＮ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ４およびＹＢＸ１のうちの１つまたはそれより多くの下方調節からなる群より選択される）；および該患者を補助療法で処置することを含む。患者は前立腺癌を有する患者であり得る。
【０３６４】
補助療法は、放射線療法、化学療法、免疫療法、ホルモン療法および標的療法からなる群より選択され得る。一部の実施形態では、標的療法は、選択されたＰＤのうちの１つまたはそれより多くが一成分であるシグナル伝達経路の一成分を標的化するものであり、この場合、被標的化成分は選択されたＰＤとは異なる。あるいはまた、標的療法は、選択されたＰＤのうちの１つまたはそれより多くを標的化するものである。患者は、標準的なケア治療、例えば手術、放射線、化学療法またはアンドロゲン除去に供されたことがある患者であってもよい。
【０３６５】
本発明のさらなる一態様では、ＡＣＴＮ１、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１およびＹＢＸ１からなる群より選択されるＰＤを発現する細胞を準備すること；該細胞を候補化合物と接触させることならびに該候補化合物が選択されたＰＤの発現または活性を改変させるかどうかを調べることを含み；ここで、該化合物の存在下で観察された改変は、該化合物が癌進行のリスクを低減し得る、または癌進行の遅延もしくは遅滞させ得ることを示す、癌進行のリスクを低減し得る、または癌進行の遅延もしくは遅滞させ得る化合物の同定方法を提供する。
【０３６６】
本発明の別の態様により、少なくとも１種類の細胞骨格遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のユビキチン化遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類の依存性受容体遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＤＮＡ修復遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のテルペノイド骨格生合成遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＰＩ３Ｋ経路遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＴＦＧ−β経路遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類の電位依存性アニオンチャネル遺伝子またはタンパク質；および少なくとも１種類のＲＮＡスプライシング遺伝子またはタンパク質からなる群より選択される２つまたはそれより多くのＰＤのレベルを測定すること；ならびに選択されたＰＤのレベルをモジュレートする薬剤を投与することを含む、癌患者の処置方法を提供する。必要に応じて、該２つまたはそれより多くのＰＤは、ＡＣＴＮ１、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ２、ＨＯＸＢ１３、ＤＥＲＬ１、ＲｐＳ６、ＦＡＫ１、ＹＢＸ１、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１、ＣＯＸ６Ｃ、ＦＫＢＰ５、ＤＣＣ、ＣＵＬ２、ＰＬＡＧ１、ＰＤＳＳ２、ＰＸＮ、ＡＫＡＰ８、ＤＩＡＢＬＯ、ＣＤ７５、ＬＡＴＳ２、ＤＥＣ１、ＬＭＯ７、ＥＩＦ３Ｈ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＭＴＤＨ２、ＭＡＯＡ、ＣＣＮＤ１、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＭＡＰ３Ｋ５およびｐＰＲＡＳ４０からなる群より選択される。好ましくは、該２つまたはそれより多くのＰＤは、ＡＣＴＮ１、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１およびＹＢＸ１からなる群より選出される。あるいはまた、該方法は、少なくとも２種類のＰＤのレベルの変化を有する患者を同定すること（ここで、該レベルの変化は、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＳＭＡＤ２およびＶＤＡＣ１のうちの１つまたはそれより多くの上方調節ならびにＡＣＴＮ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ４およびＹＢＸ１のうちの１つまたはそれより多くの下方調節からなる群より選択される）；ならびに該ＰＤのうちの少なくとも１つのレベルをモジュレートする薬剤を投与することを含む。
【０３６７】
上記の任意の方法において、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２種類のＰＤのレベルが測定され得る。必要に応じて、ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５およびＰＤ６からなる６種類のＰＤのレベルが測定され、ここで、ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５およびＰＤ６は異なるものであり、独立して、ＡＣＴＮ１、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ２、ＨＯＸＢ１３、ＤＥＲＬ１、ＲｐＳ６、ＦＡＫ１、ＹＢＸ１、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１、ＣＯＸ６Ｃ、ＦＫＢＰ５、ＤＣＣ、ＣＵＬ２、ＰＬＡＧ１、ＰＤＳＳ２、ＰＸＮ、ＡＫＡＰ８、ＤＩＡＢＬＯ、ＣＤ７５、ＬＡＴＳ２、ＤＥＣ１、ＬＭＯ７、ＥＩＦ３Ｈ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＭＴＤＨ２、ＭＡＯＡ、ＣＣＮＤ１、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＭＡＰ３Ｋ５およびｐＰＲＡＳ４０からなる群より選択される。好ましくは、ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５およびＰＤ６は異なるものであり、独立して、ＡＣＴＮ１、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１およびＹＢＸ１からなる群より選択される。
【０３６８】
必要に応じて、ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６およびＰＤ７からなる７種類のＰＤのレベルが測定され、ここで、ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６およびＰＤ７は異なるものであり、独立して、ＡＣＴＮ１、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ２、ＨＯＸＢ１３、ＤＥＲＬ１、ＲｐＳ６、ＦＡＫ１、ＹＢＸ１、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１、ＣＯＸ６Ｃ、ＦＫＢＰ５、ＤＣＣ、ＣＵＬ２、ＰＬＡＧ１、ＰＤＳＳ２、ＰＸＮ、ＡＫＡＰ８、ＤＩＡＢＬＯ、ＣＤ７５、ＬＡＴＳ２、ＤＥＣ１、ＬＭＯ７、ＥＩＦ３Ｈ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＭＴＤＨ２、ＭＡＯＡ、ＣＣＮＤ１、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＭＡＰ３Ｋ５およびｐＰＲＡＳ４０からなる群より選択される。好ましくは、ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ５、ＰＤ６およびＰＤ７は異なるものであり、独立して、ＡＣＴＮ１、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１およびＹＢＸ１からなる群より選択される。該方法に、さらに、ＨＯＸＢ１３、ＦＡＫ１、ＣＯＸ６Ｃ、ＦＫＢＰ５、ＰＸＮ、ＡＫＡＰ８、ＤＩＡＢＬＯ、ＣＤ７５、ＬＡＴＳ２、ＤＥＣ１、ＬＭＯ７、ＥＩＦ３Ｈ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＭＴＤＨ２、ＭＡＯＡ、ＣＣＮＤ１、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＭＡＰ３Ｋ５およびｐＰＲＡＳ４０からなる群より選択される１つまたはそれより多くのＰＤのレベルを測定することを含めてもよい。
【０３６９】
少なくとも１種類のＰＤのレベル測定値は参照値と比べて上方調節されたものであり得る。好ましくは、上方調節されたＰＤは、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＳＭＡＤ２およびＶＤＡＣ１からなる群より選択される。さらに、少なくとも１種類のＰＤのレベル測定値は参照値と比べて下方調節されたものであり得る。好ましくは、下方調節されたＰＤは、ＡＣＴＮ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ４およびＹＢＸ１からなる群より選択される。したがって、少なくとも１種類のＰＤのレベル測定値は参照値と比べて上方調節されたものであり得、少なくとも１種類のＰＤの測定値は参照値と比べて下方調節されたものであり得る。参照値は非癌性細胞におけるＰＤのレベル測定値であり得る。
【０３７０】
上記の任意の方法は、各ＰＤのゲノムＤＮＡレベル、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルを測定することを含む。例えば、該方法は、試料を各ＰＤに特異的なオリゴヌクレオチド、アプタマーまたは抗体と接触させることを含むものであり得る。ＰＤのレベルは別々に、または例えばマルチプレックス反応を用いて並行して測定され得る。好ましくは、各ＰＤのタンパク質レベルが測定される。例えば免疫組織化学または免疫蛍光によるタンパク質レベルの測定には抗体または抗体断片が使用され得る。１つより多くのＰＤが単一の試料で測定される場合、抗体またはその断片は各々、異なるフルオロフォアで標識され得るか、または異なるフルオロフォアと結合され得る。該異なるフルオロフォアからのシグナルは、自動イメージング装置によって並行して検出され得る。
【０３７１】
ＰＤのタンパク質レベルを特定の細胞成分区画内において測定してもよい。例えばＤＡＰＩ染色が各細胞の核を同定するために使用され得、したがって、核および／または細胞質内の各ＰＤの量が測定され得る。
【０３７２】
同様に、ＰＤのレベルを、画定された関心領域のみにおいて測定してもよい。癌では、例えば、癌細胞は関心領域に含まれ得、一方、非癌細胞は関心領域から除外され得る。前立腺では、癌細胞はサイトケラチン−８およびサイトケラチン−１８を発現しており、基底（非癌）細胞はサイトケラチン−５およびＴＲＩＭ２９を発現している。したがって、関心領域は、抗サイトケラチン８抗体および抗サイトケラチン１８抗体の染色によって画定され得、抗サイトケラチン５抗体および抗ＴＲＩＭ２９抗体の染色の欠如によってさらに画定され得る。除外領域は抗サイトケラチン５抗体および抗ＴＲＩＭ２９抗体の染色によって画定され得、抗サイトケラチン８抗体および抗サイトケラチン１８抗体の染色の欠如によってさらに画定され得る。
【０３７３】
上記の任意の方法において、試料は固形組織試料または血液試料、好ましくは固形組織試料である。固形組織試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料、スナップ凍結組織試料、エタノール固定組織試料、有機溶媒で固定された組織試料、プラスチックもしくはエポキシで固定された組織試料、架橋固定組織試料、手術によって除去された腫瘍組織または生検材料試料、例えばコア生検材料、および切除組織生検材料または切開組織生検材料であり得る。好ましくは、試料は癌性組織試料である。試料は前立腺組織試料、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）前立腺腫瘍試料であり得る。したがって、上記の方法は、さらに、ＦＦＰＥ前立腺腫瘍試料の断面を抗サイトケラチン８抗体、抗サイトケラチン１８抗体、抗サイトケラチン５抗体および抗ＴＲＩＭ２９抗体と接触させることを含み、ここで、該測定工程は、該断面内の、抗サイトケラチン８抗体と抗サイトケラチン１８抗体によって境界が示され、抗サイトケラチン５抗体および抗ＴＲＩＭ２９抗体では境界が示されない領域で行なわれるものであり得る。
【０３７４】
上記の任意の方法は、さらに、癌と関連している少なくとも１つの標準的なパラメータを測定することを含むものであり得る。標準的なパラメータとしては、限定されないが、グリーソンスコア、腫瘍進行度分類、腫瘍悪性度、腫瘍サイズ、腫瘍見た目の特徴、腫瘍の位置、腫瘍の増殖、リンパ節の状態、腫瘍の厚さ（ブレスロースコア）、潰瘍形成、発症年齢、ＰＳＡレベル、およびＰＳＡ速度論が挙げられる。
【０３７５】
さらなる予後因子
本発明のバイオマーカーパネルは、存在していることが知られているか、または対象の臨床転帰と関連しているさらなるバイオマーカー、臨床パラメータまたは従来の検査値リスクファクターとともに使用され得る。１つまたはそれより多くの臨床パラメータが本発明の実施において、配合に入れるバイオマーカーとして、または具体的なバイオマーカーパネルおよび配合を用いて測定される該当集団を規定する予備選択基準として使用され得る。また、１つまたはそれより多くの臨床パラメータは、バイオマーカーの正規化および前処理、またはバイオマーカーの選択、パネルの構築、配合の型の選択および、ならびに処理後の配合結果にも有用であり得る。従来の検査値リスクファクターを用いて同様のアプローチが行なわれ得る。臨床パラメータまたは従来の検査値リスクファクターは、典型的には臨床検査室において評価され、従来の包括的リスク評価アルゴリズムにおいて使用される臨床徴候である。腫瘍転移の臨床パラメータまたは従来の検査値リスクファクターとしては、例えば、腫瘍進行度分類、腫瘍悪性度、腫瘍サイズ、腫瘍見た目の特徴、腫瘍の位置、腫瘍の増殖、リンパ節の状態、組織学、腫瘍の厚さ（ブレスロースコア）、潰瘍形成、増殖指数、腫瘍浸潤リンパ球、発症年齢、ＰＳＡレベル、またはグリーソンスコアが挙げられ得る。腫瘍転移の他の従来の検査値リスクファクターは当業者に知られている。
【０３７６】
一部の実施形態では、本発明の方法によって得られるバイオマーカースコアは、より良好な予測結果を得るためにグリーソンスコアとともに使用され得る。グリーソンスコアは、前立腺組織の顕微鏡検査による外観に基づいて前立腺癌に付与され、ＰＣＡの予後を予測するために臨床使用されている。グリーソンスコアを得るため、前立腺組織試料はヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色され、顕微鏡下で病理医によって検査され得る。試料の前立腺腫瘍パターンは１〜５の段階で分類され、５が最も低分化型で浸潤性である。最も一般的なパターン（腫瘍の５０％より多く）の分類に２番目に一般的なパターン（５０％未満だが５％より多い）の分類を加算して腫瘍グリーソンスコアを構成する。スコア２〜６は低悪性度ＰＣＡを示し、再発リスクは低い。スコア７（３＋４または４＋３）は中悪性度ＰＣＡを示し、再発リスクは中程度であり、ここでスコア４＋３はスコア３＋４よりも悪い。スコア８〜１０は高悪性度ＰＣＡを示し、再発リスクが高い。本明細書に記載の方法によって求められるリスクスコアはグリーソンスコアと一緒に使用され得、グリーソンスコアの予測の可能性が改善され得る。例えば、中間のグリーソンスコア７（３＋４）では、患者のＰＣＡ再発リスクの良好な予測が得られない。しかし、本明細書に記載の方法によって計算されるリスクスコアを加味すると該中間のグリーソンスコアの予測力が改善される。
【０３７７】
バイオマーカーを検出するためのキット
本発明の別の態様は、少なくとも１種類の細胞骨格遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のユビキチン化遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類の依存性受容体遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＤＮＡ修復遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のテルペノイド骨格生合成遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＰＩ３Ｋ経路遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類のＴＦＧ−β経路遺伝子またはタンパク質；少なくとも１種類の電位依存性アニオンチャネル遺伝子またはタンパク質；および少なくとも１種類のＲＮＡスプライシング遺伝子またはタンパク質からなる群より選択される２つまたはそれより多くのＰＤのレベルを測定するためのキットであって、選択されたＰＤのレベルを特異的に測定するための試薬を含むキットを作製できることである。必要に応じて、該２つまたはそれより多くのＰＤは、ＡＣＴＮ１、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ２、ＨＯＸＢ１３、ＤＥＲＬ１、ＲｐＳ６、ＦＡＫ１、ＹＢＸ１、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１、ＣＯＸ６Ｃ、ＦＫＢＰ５、ＤＣＣ、ＣＵＬ２、ＰＬＡＧ１、ＰＤＳＳ２、ＰＸＮ、ＡＫＡＰ８、ＤＩＡＢＬＯ、ＣＤ７５、ＬＡＴＳ２、ＤＥＣ１、ＬＭＯ７、ＥＩＦ３Ｈ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＭＴＤＨ２、ＭＡＯＡ、ＣＣＮＤ１、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＭＡＰ３Ｋ５およびｐＰＲＡＳ４０からなる群より選択される。好ましくは、該２つまたはそれより多くのＰＤは、ＡＣＴＮ１、ＣＵＬ２、ＤＣＣ、ＤＥＲＬ１、ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＰＬＡＧ１、ＲｐＳ６、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１およびＹＢＸ１からなる群より選出される。
【０３７８】
該試薬は、選択されたＰＤのゲノムＤＮＡレベル、ｍＲＮＡ転写物レベルまたはタンパク質レベルを測定するものであり得る。好ましくは、試薬は、１種類またはそれより多く抗体またはその断片、オリゴヌクレオチドまたはアプタマーを含む。
【０３７９】
バイオマーカーの選択方法
本発明の別の態様は、生物学的工程；技術的工程；パフォーマンス工程；および検証工程を含む、対象疾患の予後決定因子の同定方法である。
【０３８０】
生物学的工程は、対象疾患についてコンパイルされた候補リストを公的に入手可能なデータ（例えば、科学文献、データベース、および会議でのプレゼンテーション）から作成すること；ならびに生物学的関連性、インシリコ解析、既知の発現情報および必要とされるモノクローナル抗体の市販による入手可能性に基づいて該候補リストの優先順位を決めることを含むものであり得る。
【０３８１】
技術的工程は、候補予後決定因子に対する抗体を得ること；該抗体を免疫組織化学アッセイにおいて３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）染色を用いて試験し、染色の特異性および強度を評価すること；ならびにＤＡＢでの充分な染色の特異性および強度を有する抗体を、免疫蛍光（ＩＦ）アッセイにおいて試験してＩＦ特異性、シグナル強度および動力学を調べ、技術的要件に合格である抗体を同定することを含むものであり得る。
【０３８２】
パフォーマンス工程は、ミニ組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を技術的要件に合格である該抗体と接触させること（ここで、該ミニＴＭＡは対象疾患の異なる進行度分類のいくつかの試料を含むものである）；各抗体の免疫蛍光強度を定量すること；各抗体の免疫蛍光強度を該ミニＴＭＡ内の各試料の予後と相関させること；および対象疾患の予後との相関のためにどの抗体がミニＴＭＡにおいて単変量パフォーマンスを示しているかを調べることを含むものであり得る。必要に応じて、パフォーマンス工程は、さらに、より大型のＴＭＡを技術的要件に合格である該抗体と接触させること（ここで、より大型の該ＴＭＡは対象疾患の異なる進行度分類のいくつかの試料を含むものである）；各抗体の免疫蛍光強度を定量すること；各抗体の免疫蛍光強度を、より大型の該ＴＭＡ内の各試料の予後と相関させること；および対象疾患の予後との相関のためにどの抗体が、より大型の該ＴＭＡにおいて単変量パフォーマンスを示しているかを調べることを含む。一部の実施形態では、パフォーマンス工程は、さらに、バイオインフォマティクス解析を行ない、対象疾患の予後と相関するＰＤに対する抗体の組合せを同定することを含む。
【０３８３】
検証工程は、対象疾患に苦しんでいる患者から組織試料を採取すること；該組織試料を対象疾患のＰＤに対する抗体またはＰＤに対する抗体の組合せと接触させること；各抗体または抗体の組合せの免疫蛍光強度を定量すること；および各抗体または抗体の組合せの免疫蛍光強度を対象疾患の被検体の予後と相関させることを含むものであり得る。
【０３８４】
コンピュータシステムの例
本開示による本明細書に記載の種々の態様および機能は、ハードウェア、ソフトウェアまたはハードウェアとソフトウェアの組合せとして、１つまたはそれより多くのコンピュータシステムに実装され得る。現在使用されているコンピュータシステムには多くの例がある。一例としては、とりわけ、ネットワークアプライアンス、パーソナルコンピュータ、ワークステーション、メインフレーム、ネットワーク化クライアント、サーバー、メディアサーバー、アプリケーションサーバー、データベースサーバー、ウェブサーバーおよびバーチャルサーバーが挙げられる。コンピュータシステムの他の例としては、モバイルコンピューティングデバイス、例えば携帯電話および携帯情報端末、ならびにネットワーク機器、例えば、ロードバランサ、ルータおよびスイッチが挙げられ得る。さらに、本開示による態様は単一のコンピュータシステムに配置してもよく、１つまたはそれより多くの通信ネットワークに接続された複数のコンピュータシステム間に分散してもよい。
【０３８５】
例えば、種々の態様および機能は、１つまたはそれより多くのクライアントコンピュータにサービスが提供されるように、またはタスク全体が分散システムの一部として行なわれるように構成された１つまたはそれより多くのコンピュータシステム間に分散され得る。さらに、諸態様は、種々の機能を行なう１つまたはそれより多くのサーバーシステム間に分散されたコンポーネントを含むクライアント−サーバーまたは多階層システムにおいて行なわれ得る。したがって、本開示は、なんら特定のシステムまたはシステム群での実行に限定されない。さらに、諸態様は、ソフトウェア、ハードウェアもしくはファームウェアまたはその任意の組合せに実装され得る。したがって、本開示による態様は、方法、行為、システム、プレースメントシステムおよびコンポーネント内に、さまざまなハードウェア構成およびソフトウェア構成を用いて実装され得るが、本開示は、なんら特定の分散型構造、ネットワークまたは通信プロトコルに限定されない。さらに、本開示による態様は、特別プログラムハードウェアおよび／またはソフトウェアとして実装され得る。
【０３８６】
図２６は、本開示による種々の態様および機能が実施され得る分散コンピュータシステム１００のブロック図を示す。分散コンピュータシステム１００は、もう１つコンピュータシステムを含むものであってもよい。例えば、図示のように、分散コンピュータシステム１００は３つのコンピュータシステム１０２、１０４および１０６を含む。図示のように、コンピュータシステム１０２、１０４および１０６は通信ネットワーク１０８によって相互接続されており、これを介してデータ交換され得る。ネットワーク１０８は、コンピュータシステムによってデータ交換され得る任意の通信ネットワークを含むものであり得る。ネットワーク１０８によってデータ交換するため、コンピュータシステム１０２、１０４および１０６ならびにネットワーク１０８には、種々の方法、プロトコルおよび規格、例えばとりわけ、トークンリング、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）、Ｗｉｒｅｌｅｓｓ  Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、ＴＣＰ／ＩＰ、ＵＤＰ、ＨＴＴＰ、ＦＴＰ、ＳＮＭＰ、ＳＭＳ、ＭＭＳ、ＳＳ７、ＪＳＯＮ、ＸＭＬ、ＲＥＳＴ、ＳＯＡＰ、ＣＯＲＢＡ  ＩＩＯＰ、ＲＭＩ、ＤＣＯＭおよびＷｅｂ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓが使用され得る。データ転送がセキュアであることを確実にするため、コンピュータシステム１０２、１０４および１０６はネットワーク１０８により、さまざまなセキュリティ手段を用いて、例えば数あるセキュリティ手法の中でもＴＳＬ、ＳＳＬまたはＶＰＮを用いてデータ送信され得る。分散コンピュータシステム１００には３つのネットワーク化コンピュータシステムを図示しているが、分散コンピュータシステム１００は、任意の媒体および通信プロトコルを用いてネットワーク化された任意の数のコンピュータシステムを含むものであり得る。
【０３８７】
本開示による種々の態様および機能は、１つまたはそれより多くのコンピュータシステム、例えば図１に示すコンピュータシステム１０２において実行される特化ハードウェアまたはソフトウェアとして実装され得る。図示のように、コンピュータシステム１０２はプロセッサ１１０、メモリ１１２、バス１１４、インタフェース１１６および格納システム１１８を含む。プロセッサ１１０は、１つまたはそれより多くのマイクロプロセッサまたは他の型のコントローラを含むものであってもよく、データを操作する一連の命令を実行し得る。プロセッサ１１０はよく知られた市販のプロセッサ、例えば、Ｉｎｔｅｌ  Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）、Ｉｎｔｅｌ  Ａｔｏｍ、ＡＲＭ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｍｏｔｏｒｏｌａ  ＰｏｗｅｒＰＣ、ＳＧＩ  ＭＩＰＳ、Ｓｕｎ  ＵｌｔｒａＳＰＡＲＣもしくはＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ＰＡ−ＲＩＳＣプロセッサであり得、または多くの他のプロセッサおよびコントローラが入手可能であるため、任意の他の型のプロセッサもしくはコントローラであってもよい。プロセッサ１１０はモバイルデバイスまたはスマートフォンプロセッサ、例えばＡＲＭ  Ｃｏｒｔｅｘプロセッサ、Ｑｕａｌｃｏｍｍ  ＳｎａｐｄｒａｇｏｎプロセッサまたはＡｐｐｌｅプロセッサであってもよい。図示のように、プロセッサ１１０は他のプレースメントシステムに、例えばメモリ１１２にバス１１４によって接続されている。
【０３８８】
メモリ１１２は、コンピュータシステム１０２の動作中、プログラムおよびデータを格納するために使用され得る。したがって、メモリ１１２は比較的高性能の揮発性ランダムアクセスメモリ、例えばダイナミックランダムアクセスメモリ（ＤＲＡＭ）またはスタティックメモリ（ＳＲＡＭ）であり得る。しかしながら、メモリ１１２は、データを格納するための任意のデバイス、例えばディスクドライブまたは他の不揮発性格納デバイス、例えばフラッシュメモリまたは相変化メモリ（ＰＣＭ）を含むものであってもよい。本開示による種々の実施形態では、本明細書に開示した態様および機能を実施するために、メモリ１１２が特殊な、一部の場合では独自の構造に組織化され得る。
【０３８９】
コンピュータシステム１０２のコンポーネントは、バス１１４などの相互接続エレメントによって連結され得る。バス１１４は１つまたはそれより多くの物理的バス（例えば、同じ機械内に一体化されたコンポーネント間のバス）を含むものであってもよく、プレースメントシステム間を連結する任意の通信、例えば特化または標準的コンピューティングバス技術、例えばＩＤＥ、ＳＣＳＩ、ＰＣＩおよびＩｎｆｉｎｉＢａｎｄを含むものであってもよい。したがって、バス１１４は、通信（例えば、データおよび命令）がコンピュータシステム１０２のシステムコンポーネント間で交換されることを可能にするものである。
【０３９０】
また、コンピュータシステム１０２は、１つまたはそれより多くのインタフェースデバイス１１６、例えば入力デバイス、出力デバイスおよび入力／出力統合デバイスを含む。インタフェースデバイス１１６は入力を受け付けるもの、出力をもたらすもの、または両方であり得る。例えば、出力デバイスは、外部提示のために情報をレンダリングするものであり得る。入力デバイスは、外部情報源からの情報を受け取るものであり得る。インタフェースデバイスの例としては、とりわけ、キーボード、マウスデバイス、トラックボール、マイクロフォン、タッチスクリーン、印刷デバイス、ディスプレイスクリーン、スピーカー、ネットワークインタフェースカードなどが挙げられる。インタフェースデバイス１１６は、コンピュータシステム１０２が外部実体と、例えばユーザーおよび他のシステムと情報を交換し、通信することを可能にするものである。
【０３９１】
格納システム１１８は、命令が格納され、プロセッサによって実行されるプログラムを定義するコンピュータ可読でコンピュータ書き込み可能な不揮発性格納媒体を含むものであり得る。また、格納システム１１８は、媒体上または媒体内に記録された情報を含むものであり得、この情報はプログラムによって加工され得る。より具体的には、情報は、格納領域が維持されるように、またはデータ交換の実行が増大するように特別に構成された１つまたはそれより多くのデータ構造内に格納され得る。命令はコードシグナルとして永続的に格納され得、命令によりプロセッサが本明細書に記載のいずれかの機能を実行し得る。種々の実施形態で使用され得る媒体としてはとりわけ、例えば光ディスク、磁気ディスクまたはフラッシュメモリが挙げられ得る。動作時、プロセッサ１１０またはなんらかの他のコントローラにより、データが不揮発性記録媒体から、格納システム１１８に含まれた格納媒体よりも高速なプロセッサ１１０による情報へのアクセスを可能にする別のメモリに、例えばメモリ１１２に読み込まれ得る。該メモリは格納システム１１８またはメモリ１１２に配置され得る。プロセッサ１１０ではメモリ１１２内のデータが操作され得、次いでこのデータは、処理終了後に、格納システム１１８と関連している媒体にコピーされ得る。さまざまなコンポーネントによって媒体とメモリ１１２間でのデータ移動が管理され得るが、本開示はこれらに限定されない。
【０３９２】
さらに、本開示は特定のメモリシステムまたは格納システムに限定されない。コンピュータシステム１０２は、例示の目的で、本開示による種々の態様および機能が実施され得る一例の型のコンピュータシステムを示しているが、本開示の諸態様は、図１に示すコンピュータシステムでの実装に限定されない。本開示による種々の態様および機能は、図１に示したものとは異なるアーキテクチャまたはコンポーネントを有する１つまたはそれより多くのコンピュータでも実施され得る。例えば、コンピュータシステム１０２は、特別にプログラムされた特殊用途のハードウェア、例えば、本明細書に開示した特定の動作が実行されるようにあつらえられたアプリケーション専用集積回路（ＡＳＩＣ）などを含むものであってもよい。別の実施形態では、同じ機能が、ＭＡＣ  ＯＳ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｘで実行され、Ｍｏｔｏｒｏｌａ  ＰｏｗｅｒＰＣプロセッサを有するいくつかの汎用コンピューティングデバイスと、プロプライエタリハードウェアおよびオペレーティングシステムで実行されるいくつかの特化コンピューティングデバイスを用いて実行され得る。
【０３９３】
コンピュータシステム１０２は、コンピュータシステム１０２内に含まれたハードウェアプレースメントの少なくとも一部分を管理するオペレーティングシステムを含むものであってもよい。プロセッサまたはコントローラ、例えばプロセッサ１１０は、とりわけ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）系オペレーティングシステム（例えば、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ＮＴ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ２０００／ＭＥ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ＸＰ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ７、もしくはＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  Ｖｉｓｔａ）（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）、ＭＡＣ  ＯＳ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｘオペレーティングシステム（Ａｐｐｌｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒから入手可能）、多くのＬｉｎｕｘ（登録商標）系オペレーティングシステムディストリビューションのうちの１つ（例えば、Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  Ｌｉｎｕｘ（登録商標）オペレーティングシステム（Ｒｅｄ  Ｈａｔ  Ｉｎｃ．から入手可能））、Ｓｏｌａｒｉｓオペレーティングシステム（Ｓｕｎ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能）、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム（種々の供給元から入手可能）であり得るオペレーティングシステムを実行するものであり得る。オペレーティングシステムはモバイルデバイスまたはスマートフォンオペレーティングシステム、例えばＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  Ｍｏｂｉｌｅ、ＡｎｄｒｏｉｄまたはｉＯＳであり得る。多くの他のオペレーティングシステムが使用され得、本実施形態は、なんら特定のオペレーティングシステムに限定されない。コンピュータシステム１０２は、仮想マシン（例えば疑似物理的マシン）内部のオペレーティングシステムのホストである仮想化フィーチャーを含むものであってもよい。システムアーキテクチャの種々のコンポーネントを別々の「仮想マシン」内部の個々の場合のオペレーティングシステムに存在させ得、したがって、互いにいくぶん隔離された状態で実行され得る。
【０３９４】
プロセッサとオペレーティングシステムは一体で、アプリケーションプログラムが高水準プログラミング言語で書き込まれ得るコンピューティングプラットフォームを画定する。このようなコンポーネントアプリケーションは、実行可能な中間コード（例えば、Ｃ＃またはＪＡＶＡ（登録商標）バイトコード）であってもよく、通信プロトコル（例えば、ＴＣＰ／ＩＰ）を用いて通信ネットワーク（例えば、インターネット）上で通信される解釈実行コードであってもよい。同様に、本開示の諸態様による機能は、オブジェクト指向プログラミング言語、例えばＳｍａｌｌＴａｌｋ、ＪＡＶＡ（登録商標）、Ｃ＋＋、Ａｄａ、またはＣ＃（Ｃ−Ｓｈａｒｐ）を用いて実装され得る。また、他のオブジェクト指向プログラミング言語も使用され得る。あるいはまた、手続き型、スクリプトまたは論理型プログラミング言語を使用してもよい。
【０３９５】
さらに、種々の本開示の諸態様による機能は、非プログラミング環境（例えば、ＨＴＭＬ、ＸＭＬまたはブラウザープログラムのウィンドウ内で見るとグラフィカルユーザインタフェースのアスペクトがレンダリングされるか、もしくは他の機能が実行される他の形式で作成されたドキュメント）に実装され得る。さらに、本開示の諸態様に従う種々の実施形態は、プログラムされた、もしくはプログラムされていないプレースメント、またはその任意の組合せとして実装され得る。例えばウェブページはＨＴＭＬを用いて実装され得るが、ウェブページ内からコールされたデータ対象はＣ＋＋で書き込まれ得る。したがって、本開示は、特定のプログラミング言語に限定されず、任意の適当なプログラミング言語もまた使用され得る。
【０３９６】
一実施形態に含められるコンピュータシステムでは本開示の範囲外で機能が実行され得る。例えば、該システムの諸態様は既存の製品を用いて、例えば、Ｇｏｏｇｌｅ検索エンジン、Ｙａｈｏｏ検索エンジン（Ｙａｈｏｏ！（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手可能）またはＢｉｎｇ検索エンジン（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）から入手可能）などを用いて実装され得る。システムのアスペクトはデータベース管理システムに、例えばＳＱＬ  Ｓｅｒｖｅｒ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）から入手可能）；Ｏｒａｃｌｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｏｒａｃｌｅ（Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｓｈｏｒｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）製）；およびＭｙＳＱＬ（Ｓｕｎ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）製）；または統合ソフトウェア，例えばＷｅｂＳｐｈｅｒｅミドルウェア（ＩＢＭ（Ａｒｍｏｎｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）製））に実装され得る。しかしながら、例えばＳＱＬ  Ｓｅｒｖｅｒを実行するコンピュータシステムでは、本開示による態様と本開示の範囲内ではない種々のアプリケーションのデータベースの両方がサポートされ得る。
【０３９７】
また、本明細書に記載の方法を他のハードウェアおよび／またはソフトウェア製品に、例えばウェブパブリッシング製品、ウェブブラウザー、またはインターネットマーケティングもしくは検索エンジン最適化ツールに組み込んでもよい。
【０３９８】
特に定義していない限り、本明細書で用いる科学技術用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。例示的な方法および材料を以下に説明するが、本明細書に記載のもの同様または同等の方法および材料もまた、本発明の実施または試験において使用され得る。本明細書で挙げた刊行物および他の参考文献はすべて、引用によりその全体が組み込まれる。矛盾する場合は、本明細書（定義を含む）に支配される。いくつかの文献を本明細書において列挙しているが、この列挙は、これらの文献のいずれかが当該技術分野の周知の一般知識の一部を構成するという是認を構成するものではない。本明細書および実施形態全体を通して、単語“ｃｏｍｐｒｉｓｅ（〜を含む）”または語尾変化形、例えば“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”または“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”は、記載の整数または整数群を包含しており、任意の他の整数または整数群を排除することを意味しているのではないことは理解されよう。材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定を意図するものではない。
【実施例】
【０３９９】
実施例
本発明のさらなる詳細を以下の非限定的な実施例に記載する。本実施例は、本発明の一部の好ましい実施形態を示しているが、例示の目的で示したものにすぎず、添付の実施形態または特許請求の範囲を限定するもと解釈されるべきでないことを理解されたい。本開示および本実施例から、当業者は本発明の一定の特徴を確認することができ、それを種々の使用および条件に適合させるために、本発明の精神および範囲から逸脱することなく本実施例の変更および修正を行なうことができよう。
【０４００】
実施例１：腫瘍マイクロアレイの作製
実施例２〜４に記載の実験では、４つの異なる腫瘍マイクロアレイ（ＴＭＡ）：細胞株対照ＴＭＡ、ミニＴＭＡ、高測定値グリーソンＴＭＡおよび低測定値グリーソンＴＭＡを使用した。
【０４０１】
Ａ．細胞株対照ＴＭＡの作製
一組の細胞株対照を選択し、マルチプレックス免疫蛍光アッセイの信頼性および再現性を調べた。これらの細胞株は、マルチプレックス免疫蛍光アッセイにおいて解析され得る腫瘍マーカーに対して一連の発現レベルを有するものであった。細胞株およびそのバイオマーカー発現レベルを以下の表２に示す。
【表２】
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【０４０２】
選択された細胞株を標準的な条件下で培養し、必要な場合はＰＩ３Ｋキナーゼ阻害薬（表２参照）で処理した。細胞をＰＢＳで洗浄し、プレート上に直接、１０％ホルマリンで５分間固定し、掻き取って固定剤中に収集し、固定を室温で合計１時間継続した。次いで細胞をスピンダウンし、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞ペレットを７０℃の温Ｈｉｓｔｏｇｅｌ中に再縣濁させ、速やかにエッペンドルフチューブ内にスピンダウンし、濃縮細胞−Ｈｉｓｔｏｇｅｌペレットを形成した。このペレットをパラフィン中に包埋して標準的なパラフィンブロックにし、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）構築のためのドナーブロックとして使用した。
【０４０３】
ＴＭＡブロックを、修正型アガロースブロック手順（Ｙａｎら，Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ５５（１）：２１−２４（２００７）を用いて作製した。簡単には、０．７％アガロースブロックをパラフィンブロック中に包埋し、ＴＭＡアクセプターブロックとして使用した。ＴＭＡ  ＭＡＳＴＥＲ（３ＤＨＩＳＴＥＣＨ）装置を使用し、アクセプターブロックに１ｍｍコア用の穿孔を事前に行なった。１ｍｍコアを細胞株対照のドナーブロックから取り出し、ＴＭＡアクセプターブロック内に配置して細胞株対照ＴＭＡを作出した。次いで、ＴＭＡブロックを表を下にしてガラススライド上に押し付け、パラフィンが溶融してブロック内のコアが完全に融合し得るようにブロックを６５℃のホットプレート上に１５分間置くことにより、コアを整列させた。ブロックを有するスライドを冷却し、ＴＭＡブロックをスライドから取り出し、トリミングし、５μｍの連続切片をＴＭＡブロックから切り出した。
【０４０４】
Ｂ．ミニＴＭＡの調製
ミニＴＭＡを作製するため、本発明者らは、根治的前立腺摘除術を受け、グリーソンスコアが判定された患者の注釈付きコホートのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）前立腺腫瘍試料ブロックを使用した。このコホートは、約４０例の緩慢性腫瘍（グリーソン≦３＋３）および約４０例の侵攻性腫瘍（グリーソン≧４＋３）からなるものであった。
【０４０５】
ＴＭＡブロックを、修正型アガロースブロック手順（Ｙａｎら，上掲）を用いて作製した。簡単には、０．７％アガロースブロックをパラフィンブロック中に包埋し、ＴＭＡアクセプターブロックとして使用した。ＴＭＡ  ＭＡＳＴＥＲ（３ＤＨＩＳＴＥＣＨ）装置を使用し、アクセプターブロックに１ｍｍコア用の穿孔を事前に行なった。１ｍｍコアを約８０例のコホートドナーブロックから取り出し、ＴＭＡアクセプターブロック内に配置してミニＴＭＡを作出した。細胞株対照をコホート試料とともに散在させ、スライド内またはコア間の染色再現性、スライド間の染色再現性および日ごとの染色再現性のための対照とした。次いで、ＴＭＡブロックを表を下にしてガラススライド上に押し付け、パラフィンが溶融してブロック内のコアが完全に融合し得るようにブロックを６５℃のホットプレート上に１５分間置くことにより、コアを整列させた。ブロックを有するスライドを冷却し、ＴＭＡブロックをスライドから取り出し、トリミングし、５μｍの連続切片をＴＭＡブロックから切り出した。
【０４０６】
Ｃ．高測定値グリーソンＴＭＡおよび低測定値グリーソンＴＭＡの調製
根治的前立腺摘除術を受けた患者の注釈付きコホートのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）前立腺腫瘍試料ブロックをＦｏｌｉｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｏｗｅｌｌ，ＯＨ）から入手した。
【０４０７】
一連の５μｍ切片を各ＦＦＰＥブロックから切り出し、この切片を組織の品質管理用加工およびその後のグリーソンスコアアノテーションに使用した。組織の品質がさらなる試験に適しているかどうかを調べるため、および組織がさらなる試験のために充分な腫瘍領域を含んでいることを確実にするため、一部の切片に免疫蛍光染色を行なった。簡単には、この対照ＦＦＰＥ切片を免疫蛍光染色のために加工し、抗ホスホＳＴＡＴ３−Ｔ７０５ウサギモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、抗ＳＴＡＴ３マウスｍＡｂ、Ａｌｅｘａ  ４８８−コンジュゲート抗サイトケラチン８マウスｍＡｂ、Ａｌｅｘａ  ４８８−コンジュゲート抗サイトケラチン１８マウスｍＡｂ、Ａｌｅｘａ  ５５５−コンジュゲート抗サイトケラチン５  ｍＡｂおよびＡｌｅｘａ  ５５５−コンジュゲート抗ＴＲＩＭ  ｍＡｂ（表１参照）で染色した。スライドを各抗体による染色について蛍光顕微鏡（Ｖｅｃｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）下で目視検査した。染色強度および自家蛍光に基づいて、切片およびその対応するＦＦＰＥブロックを、表２に示すような組織の品質を示す４つのカテゴリーに分類した。腫瘍領域は、基底細胞マーカーのない前立腺上皮構造と規定した。抗サイトケラチン８および抗サイトケラチン１８  ｍＡｂは、上皮特異的染色を示すために使用した。抗サイトケラチン５および抗ＴＲＩＭ２９  ｍＡｂは、基底細胞染色を示すために使用した。充分な量の腫瘍領域が含まれており、上位２つの品質カテゴリーに含まれるＦＦＰＥブロックのみをさらなる試験に使用した。
【０４０８】
各ＦＦＰＥブロックから切り出される最後の５μｍ切片をヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、Ａｐｅｒｉｏ  ＸＴシステム（Ａｐｅｒｉｏ，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）を用いてスキャンした。スキャンした画像をＳＰＥＣＴＲＵＭデータベース（Ａｐｅｒｉｏ，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）に保管した。Ｈ＆Ｅ染色切片の画像を遠隔観察し、グリーソンスコアを、盲検様式で、ブリガム・アンド・ウィメンズ病院（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）およびジョンズ・ホプキンス大学（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）の米国臨床病理医認定試験合格者の解剖病理医が、ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅソフトウェア（Ａｐｅｒｉｏ，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）によってアノテーションした。病理医は、各切片の画像のグリーソンスコアパターンが最高値の４つの領域および最低値の２つの領域に、１ｍｍコアに対応する注釈付きの丸印を付けた（例えば、図１参照）。最高値の１つのグリーソン切片および最低値の１つのグリーソン切片を、それぞれ高測定値グリーソンＴＭＡおよび低測定値グリーソンＴＭＡへの包含に選択した。腫瘍が比較的一様であった場合、高値および低値の切片はほぼ同一であった。
【０４０９】
ＴＭＡブロックを、修正型アガロースブロック手順（Ｙａｎら，上掲）を用いて作製した。簡単には、０．７％アガロースブロックをパラフィンブロック中に包埋し、ＴＭＡアクセプターブロックとして使用した。ＴＭＡ  Ｍａｓｔｅｒ（３ＤＨｉｓｔｅｃｈ）装置を使用し、アクセプターブロックに１ｍｍコア用の穿孔を事前に行なった。１ｍｍコアを細胞株対照のドナーブロック（上記）から取り出し、アクセプターブロックの３つの別々の領域：上側部分、中間部分および底面部分に配置した。この配列で、細胞株対照がスライド内またはコア間の染色再現性、スライド間の染色再現性、および日ごとの染色再現性のための対照となり得た。細胞株対照の重要な特徴の１つは、ＴＭＡブロックの離れた切片間に一貫性があることであった。組織試料はコアを切片に切り出すにつれて変化するが、細胞株対照はコアの深さ方向全体において細胞の一様な混合物であり、変化しない。
【０４１０】
品質管理に合格した前立腺腫瘍試料のＦＦＰＥブロックを患者試料ドナーブロックとして選択した。これらのドナーブロックのコアを、選択された高測定値および低測定値グリーソン切片に対応する領域内で病理医のアノテーションどおりに抜いた。アクセプターブロック内への患者試料の配置順は無作為抽出とした。各ドナーブロックから二連のコアを採取しており（すなわち、１つの高測定値グリーソンコアおよび１つの低測定値グリーソンコア）、別々の２つのアクセプターブロックのうちの一方に配置されているため、第２のコアを第１のコアの位置に対して無作為抽出した位置に配置した。換言すると、高測定値グリーソンＴＭＡは低測定値グリーソンＴＭＡとは別個に無作為抽出した。したがって、得られた２つの二連のＴＭＡブロックは患者試料組成物である点では同一であるが、その位置は無作為抽出されたものであった。次いで、ＴＭＡブロックを表を下にしてガラススライド上に押し付け、パラフィンが溶融してブロック内のコアが完全に融合し得るようにブロックを６５℃のホットプレート上に１５分間置くことにより、コアを整列させた。ブロックを有するスライドを冷却し、ＴＭＡブロックをスライドから取り出し、トリミングし、５μｍの連続切片をＴＭＡブロックから切り出した。次いで、前立腺腫瘍試料から得られた各コアを病理医がアノテーションし、グリーソンスコア測定値を得た（以前に得られた腫瘍全体の「実際の」グリーソンスコアとは別の、単離したコアのみに基づいて）。例えば、侵攻性腫瘍から選択され、ＬＴＭＡ上に配置されるコアは、腫瘍の「実際の」外科的グリーソンスコアが４＋３より大きい場合であっても、「測定値」グリーソンスコア３＋３を有するとアノテーションされたものであり得る。
【０４１１】
実施例２：バイオマーカー選択のためのエンジン
本発明者らは、任意の疾患または病状のバイオマーカーを同定するために使用され得るバイオマーカー選択および検証用エンジンを開発した（図２）。このエンジンは４つの主なステージ：生物学的ステージ、技術的ステージ、パフォーマンスステージおよび検証ステージを有する。
【０４１２】
生物学的ステージ、最初のバイオマーカー候補リストが対象疾患について公的に入手可能なデータから、例えば科学文献、データベースおよび会議でのプレゼンテーションからコンパイルされる。次いでバイオマーカーリストは、生物学的関連性、インシリコ解析、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｔｌａｓの検討および必要とされるモノクローナル抗体の市販による入手可能性に基づいて優先順位が決定される。生物学的関連性の検討は細胞内、特に疾患の細胞内での作用機序に基づいたものである。インシリコ解析は、これまでに知られた遺伝子の増幅、欠失および変異ならびにこのような遺伝子改変と疾患との間の単変量パフォーマンスまたは進行の相関に基づいたものである。Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｔｌａｓは、疾患状態の種々の組織におけるタンパク質の発現レベルを提供する。バイオマーカーは、健常状態および疾患状態において一連の発現レベルで発現されているか否かに基づいてランク付けされる。
【０４１３】
技術的ステージでは、市販の抗体を供給元から入手し、臨床試料からマーカーを検出する能力について試験する。まず、抗体を免疫組織化学アッセイにおいて、古典的な３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）染色を用いて試験し、染色の特異性および強度を評価する。ＤＡＢは免疫蛍光染色よりも感度が高いため、免疫蛍光によっても検出されるのに充分な強度でＤＡＢによって検出されるマーカーを同定することが重要である。ＤＡＢ基準を満たす抗体およびマーカーを、次いで免疫蛍光（ＩＦ）によって評価し、特異性、シグナル強度および動力学（すなわち、発現の範囲）を調べる。ＩＦ基準を満たす抗体およびマーカーをパフォーマンスステージに進める。
【０４１４】
パフォーマンスステージでは、抗体をミニＴＭＡで試験する。パフォーマンスは発現と疾患状態間の単変量相関について評価する。発現と疾患状態間の単変量相関を示す抗体およびマーカーを次いで、より大型のＴＭＡコホートにおいて、単変量相関および他のマーカーとの組合せでのパフォーマンスの両方について評価する。次いで主要なバイオマーカーの組合せを、臨床検証コホートを用いて検証する。
【０４１５】
実施例３：前立腺癌バイオマーカーの選択
実施例２に記載のバイオマーカー選択エンジンを使用し、緩慢性および侵攻性の前立腺癌の同定のためのバイオマーカーを図３に示すようにして試験し、選択した。
【０４１６】
Ａ．生物学的ステージ
最初の標的候補リストを、マウスモデルにおいて前立腺癌と関連しているマーカーを同定するための前立腺癌の文献の検討、グリーソン分類特異的発現、進行との相関、前立腺癌における生物学的役割および／または既知の前立腺癌マーカーに基づいてコンパイルした。同定されたマーカーのうちのいくつかは１つまたはそれより多くのシグナル伝達経路の一部であったため、該シグナル伝達経路の他のメンバーを初期候補リストに含めた。合計で、１６０種類の潜在的マーカーを初期候補標的リストに含めた。
【０４１７】
初期標的リストを、生物学的関連性、インシリコ解析、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｔｌａｓ（ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／において入手可能）および抗体の入手可能性に基づいて優先順位を決定した。生物学的関連性の評価において、癌遺伝子および腫瘍抑制因子遺伝子は、おそらく腫瘍悪性度との関連性が低いため予後に関してあまり重要とみなさなかった。同様に、インシリコ解析において単変量パフォーマンスおよび進行との相関を有すると同定された遺伝子の優先順位も決定した。しかしながら、前立腺癌では遺伝子とタンパク質発現間の相関は不充分である。したがって、前立腺癌マーカーのほとんどの優先順位決定は、４６種類の異なる正常ヒト組織および２０種類の異なる癌型ならびに４７種類の異なるヒト細胞株のタンパク質の空間的分布を示すＨｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｔｌａｓに基づくものとした。特に、発現レベルが種々の腫瘍においてさまざまであるタンパク質の優先順位を決定した。これは、その発現レベルがより密接に腫瘍進行度分類と相関している可能性があるからである。この解析後、約１２０種類の優先順位決定済み候補のリストを技術的検証ステージに進めた。
【０４１８】
Ｂ．技術的ステージ
１２０種類の優先順位決定済み候補に対する抗体を市販の供給元から入手し、免疫組織化学によって検証した。さまざまな良性および癌性前立腺ＦＦＰＥ組織試料の切片を候補抗体で、標準的なＤＡＢプロトコルを使用して、ユニバーサルポリマーＤＡＢ検出キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて染色した。試験抗体のほぼ半数が、高い強度で特異的染色パターンを示し、したがって免疫蛍光による評価に選択した。
【０４１９】
さまざまな良性および癌性前立腺ＦＦＰＥ組織試料の切片を候補抗体で、後述する免疫蛍光プロトコルを用いて対照細胞株ＴＭＡで染色した。特異的染色パターンを示す抗体をさらなる試験に選択した。
【０４２０】
前立腺癌は、典型的には、上皮マーカー、例えばサイトケラチン８（ＣＫ８またはＫＲＴ８）およびサイトケラチン１８（ＣＫ１８またはＫＲＴ１８）を発現しているが、前立腺基底マーカー、例えばサイトケラチン５（ＣＫ５またはＫＲＴ５）は発現していない癌である。また、本発明者らは驚くべきことに、いくつかの他の癌の腫瘍マーカーであるＴＲＩＭ２９は、前立腺組織では腫瘍マーカーではなく基底マーカーであることを見出した；したがって、抗ＴＲＩＭ２９抗体も前立腺腫瘍マスクにおいて使用され得る。本発明者らは腫瘍切片を、抗ＣＫ５、抗ＣＫ８、抗ＣＫ１８および抗ＴＲＩＭ２９抗体の混合物を用いて評価し、この場合、前立腺腫瘍領域は、抗ＣＫ８および抗ＣＫ１８抗体によって境界が示され、抗ＣＫ５および抗ＴＲＩＭ２９抗体では境界が示されない前立腺組織領域として画定される。
【０４２１】
５μｍ切片を細胞株対照ＴＭＡブロックから切り出し、ＨＩＳＴＯＧＲＩＰ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）コートスライド上に置いた。スライドを６５℃で３０分間焼成し、キシレン中での連続インキュベーションによって脱パラフィンし、一連の等級別アルコール中で再水和させた。抗原賦活をｐＨ７．４の  ０．０５％無水シトコラン酸溶液中で９５℃にて４０分間行なった。
【０４２２】
免疫蛍光染色をＬａｂＶｉｓｉｏｎ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒを用いて行ない、インキュベーションはすべて室温で、洗浄はすべてＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で行ない、抗体はすべてＴＢＳ−Ｔ＋０．１％ＢＳＡ溶液で希釈した。まず、スライドをＢｉｏｔｉｎ  Ｂｌｏｃｋ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）溶液Ａで２０分間ブロックし、洗浄し、次いで溶液Ｂで２０分間ブロックし、洗浄し、次いでＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｓｎｉｐｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）で２０分間ブロックし、再度洗浄した。マウスまたはウサギのいずれかの一次抗体を適用し、１時間インキュベートした。一部の場合では、第１のバイオマーカーに対してマウス一次抗体および第２のバイオマーカーに対してウサギ一次抗体をスライドに適用し、１時間インキュベートした。
【０４２３】
充分に洗浄後、ビオチン−コンジュゲート抗マウスＩｇＧまたはＦＩＴＣ−コンジュゲート抗ウサギＩｇＧのいずれかを４５分間適用した。２種類のバイオマーカーを同じスライド上で検出する場合は、ビオチン−コンジュゲート抗マウスＩｇＧとＦＩＴＣ−コンジュゲート抗ウサギＩｇＧの両方を４５分間適用した。充分に洗浄後、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  ６３３、抗ＦＩＴＣ  ｍＡｂ−Ａｌｅｘａ  ５６８およびＴｕｍｏｒ  Ｍａｓｋカクテル（抗サイトケラチン８  ｍＡｂ  Ａｌｅｘａ  ４８８、抗サイトケラチン１８  ｍＡｂ  Ａｌｅｘａ  ４８８、抗サイトケラチン５  ｍＡｂ  Ａｌｅｘａ  ５５５、抗ＴＲＩＭ２９  ｍＡｂ  Ａｌｅｘａ５５５）からなるＡｌｅｘａフルオロフォア−コンジュゲート試薬の混合物を適用した。
【０４２４】
前立腺癌腫瘍組織の自動画像解析を可能にするため、本発明者らは、前立腺上皮マーカーおよび基底マーカーに対する抗体（Ｔｕｍｏｒ  Ｍａｓｋ）と、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  ＸＤ（後述）に基づいた物体認識の組合せを使用した。腫瘍領域は基底マーカーのない前立腺上皮構造と規定した。Ａｌｅｘａ  ４８８−コンジュゲート抗サイトケラチン８および抗サイトケラチン１８特異的マウスｍＡｂカクテルを用いて上皮特異的染色を得た。基底細胞の染色はＡｌｅｘａ  ５５５−コンジュゲート抗サイトケラチン５および抗ＴＲＩＭ２９特異的ｍＡｂのカクテルに基づくものとした。スライドを、これらのＡｌｅｘａフルオロフォア−コンジュゲート試薬とともに１時間インキュベートした。充分に洗浄後、ＤＡＰＩ溶液（ＴＢＳ−Ｔ中１００ｎｇ／ｍｌのＤＡＰＩ）を３分間適用した。数回の洗浄後、スライドをＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ褪色防止試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に設置した。スライドを暗所で−２０℃にて一晩放置して「硬化」させ、褪色を最小限にするために暗所で−２０℃にて長期間保存した。各マーカーの免疫蛍光の量を評価した。例えば、図４は、対照細胞株ＴＭＡの２つの異なる切片（切片２７および４１）における２種類の異なるマーカー（ＦＵＳおよびＤＥＲＬ１）の定量的免疫蛍光を示す。切片２７の各細胞株で検出された免疫蛍光の量をｘ軸に示し、一方、切片４１の各細胞株で検出された免疫蛍光の量をｙ軸に示す。この２つの細胞株における免疫蛍光の量の線形の関係および高いＲ２値は実験間の定量免疫蛍光アッセイの再現性を示す。
【０４２５】
次に、本発明者らはマーカー発現の範囲を試験した。本発明者らの染色アッセイにおけるマーカー抗体の最適な希釈のため、および再現性のため、本発明者らは「滴定」ＴＭＡを作製した。本発明者らは、一連のグリーソンスコアを有する前立腺癌試料の４０個のＦＦＰＥブロックを選択した。次いで、「滴定」ＴＭＡを、上記の修正型アガロースブロック手順を使用し、各ドナー試料の二連のコアを用いて作製した。単一のマーカーならびに腫瘍領域認識抗サイトケラチン８、抗サイトケラチン１８、抗サイトケラチン５および抗ＴＲＩＭ２９抗体での免疫蛍光染色を行なった。上記に論考したように、マウスモノクローナル候補抗体の検出のため、本発明者らは、抗マウス−ビオチン二次およびストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  ６３３三次抗体を使用した。ウサギモノクローナル候補抗体には、抗ウサギ−ＦＩＴＣ二次抗体および抗ＦＩＴＣ  ｍＡｂ−Ａｌｅｘａ  ５６８三次抗体を使用した。後述するＶｅｃｔｒａシステムで画像を取得し、マーカー発現を、Ｉｎｆｏｒｍ  １．３ソフトウェアを用いて定量した。マーカーの特異性、シグナル強度およびマーカーのダイナミックレンジに基づき、検証した６２種類の候補をパフォーマンスステージに進めた。
【０４２６】
Ｃ．パフォーマンスステージ
ミニコホートスクリーニング
検証した６２種類の候補を、実施例１で上記のようにして作製したミニＴＭＡにおいて試験した。定量免疫蛍光アッセイは、技術的ステージで上記のマウスおよびウサギ一次抗体を用いて行なった。６２種類のバイオマーカーを定量し、約４０例の緩慢性腫瘍試料と約４０例の侵攻性腫瘍試料間の発現レベルの差を調べた。６２種類のマーカーのうち、３３種類が緩慢性または侵攻性腫瘍状態との相関に関して単変量パフォーマンスを示した。
【０４２７】
この３３種類の単変量パフォーマンスマーカーを、拡張型生検シミュレーション試験において、高測定値グリーソンＴＭＡおよび低測定値グリーソンＴＭＡ（ＨＬＴＭＡ）を用いて試験した。高ＴＭＡおよび低ＴＭＡの各コアで測定されるグリーソンスコアが、コアを得た腫瘍の実際のグリーソンスコア（外科的に取り出した腫瘍全体に基づいたもの）と異なる場合があるため、腫瘍内の試料の位置とは独立して真のグリーソンスコア、したがって侵攻性を予測するバイオマーカーを同定することが可能である。換言すると、本発明者らは、腫瘍内の異質性によって引き起こされるサンプリングの偏りが最小限となり得るバイオマーカーが同定されることを期待した。例えば、緩慢性、中間および侵攻性の腫瘍の各々を低測定値ＴＭＡに提示した（例えば、低測定値ＴＭＡのコアの実際のグリーソンスコアの概要については図５を参照のこと）。
【０４２８】
ミニＴＭＡ実験で単変量パフォーマンスを有するこの３３種類のバイオマーカーでは、定量免疫蛍光アッセイは、技術的ステージで上記のマウスおよびウサギ一次抗体を用いて行なった。マーカーのうち２種類は、ＨＬＴＭＡ免疫染色時および検出時の技術的困難性のため廃棄した。したがって、ミニＴＭＡ実験で単変量パフォーマンスを有する３１種類のバイオマーカーのデータを取得し、解析した。
【０４２９】
Ｄ．画像取得
２台のＶｅｃｔｒａ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｌｉｄｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を定量的マルチプレックス免疫蛍光（ＱＭＩＦ）画像取得に使用した。ＴＭＡ取得プロトコルは製造業者の使用説明書に従って（軽微な修正を伴った）実行した。すべてのスライドに対して同じ露光時間を使用した。ＴＭＡ間の差異を最小限にするため、同じ抗体の組合せで染色したＴＭＡスライドを同じＶｅｃｔｒａ顕微鏡上で加工した。
【０４３０】
ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣおよびＣｙ５ロングパス発光フィルターキューブをＳｅｍｒｏｃｋから取得した。ＴＲＩＴＣおよびＣｙ５フィルターキューブを、Ａｌｅｘａ  ５５５、Ａｌｅｘａ  ５６８およびＡｌｅｘａ  ６３３色素間の最大限のスペクトル分離を可能にするために最適化した。ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣおよびＣｙ５ロングパス発光フィルターキューブをＳｅｍｒｏｃｋから取得した。ＴＲＩＴＣおよびＣｙ５フィルターキューブを、Ａｌｅｘａ  ５５５、Ａｌｅｘａ  ５６８およびＡｌｅｘａ  ６３３色素間の最大限のスペクトル分離を可能にするために最適化した。
【０４３１】
ＤＡＰＩバンドの取得を２０ｎｍステップで行なった。ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣおよびＣｙ５バンドの取得は１０ｎｍステップで行なった。１つのコアあたり２つの２０×画像キューブを、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣおよびＣｙ５バンドの画像の順次コレクションで取得した。製造業者の使用説明書に従ってスペクトルライブラリーを作製し、Ｉｎｆｏｒｍ  １．４ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて画像キューブを、個々のフルオロフォアシグナルおよび自家蛍光シグナルを有するフローティングＴＩＦＦファイルにアンミキシングした。自家蛍光に対して２つのチャネルを作出し（１つは一般組織自家蛍光に対して、もう１つは赤血球に対して）、明顆粒を前立腺組織全体に散乱させた。画像のアンミキシング後、ＴＩＦＦファイルセットをＤｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒソフトウェアでさらに解析した。より小型の「滴定」ＴＭＡのデータの解析には、Ｉｎｆｏｒｍ  １．３ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて画像キューブをアンミキシングし、マーカー発現を定量した。
【０４３２】
２つのＶｅｃｔｒａ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｌｉｄｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）間に装置間差異（あれば）が存在するかどうかを調べるため、本発明者らは、ＣＴＭＡをこの２つの装置においてパラレルで、Ａｌｅｘａ−５６８、Ａｌｅｘａ−６３３およびＡｌｅｘａ−６４７の検出について解析した。図６に示すように、この２つのシステムは、Ａｌｅｘａ−６４７の検出では２％未満およびＡｌｅｘａ−５６８の検出では約７％の差があった。しかしながら、Ａｌｅｘａ−６３３の検出は２つの装置間で約２０％異なった。このデータを使用し、本発明者らは、各チャネルについて装置間変換計数を確立することができた。
【０４３３】
Ｅ．画像解析
腫瘍同定およびバイオマーカーの定量のための完全自動画像解析アルゴリズムを、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  ＸＤＴＭ（Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）を用いて作製した（例えば、図７参照）。各組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）コアに対して、２つの２０倍１．０ｍｍ画像フィールドを得た。Ｖｅｃｔｒａマルチスペクトル画像ファイルをまず、ｉｎＦｏｒｍを用いて多層ＴＩＦＦ形式に変換し、次いでＢｉｏＦｏｒｍａｔｓを用いて単層ＴＩＦＦファイルに変換した。単層ＴＩＦＦをＤｅｆｉｎｉｅｎｓワークスペースに、カスタマイズインポートアルゴリズムを用いてインポートした。各ＴＭＡコアについて、両方の画像フィールドＴＩＦＦファイルを「マップ」として単一の「シーン」内に、製造業者の使用説明書のとおりにロードした。
【０４３４】
内蔵自動適合二値化を使用し、本発明者らの画像解析アルゴリズムでの個々の各組織試料での組織のセグメント化のための蛍光カットオフを規定した。細胞株対照は、事前に画定されたコアの位置に基づいて自動的に同定された。組織試料を、蛍光の上皮マーカーおよび基底細胞マーカーを上皮細胞、基底細胞および間質への分類のためのＤＡＰＩとともにを用いてセグメント化し、さらに細胞質と核に区画化した。細胞株対照は、自家蛍光チャネルを用いてセグメント化した。アーティファクト染色、不充分な上皮組織およびピンぼけを有するフィールドは、厳密マルチパラメータ品質管理アルゴリズムによって除去した（例えば、図８参照）。組織試料中の個々の腺領域を、基底細胞と隣接上皮構造間の関連する特徴に基づいて対象物関連特徴、例えば腺の厚さと併用して、悪性または良性にさらに分類した（例えば、図９参照）。
【０４３５】
上皮マーカーおよびＤＡＰＩの強度を悪性および非悪性上皮領域において品質管理測定値として定量した。バイオマーカー値は悪性組織の細胞質、核または全細胞において独立して、所定の細胞成分内局在に基づいて測定した（例えば、図１０参照）。悪性区画における平均バイオマーカーピクセル強度を合格品質パラメータを有するマップにおいて平均し、各組織試料および細胞株対照コアについて単一の値を得た。
【０４３６】
Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ解析で得られたデータをバイオインフォマティクス解析またはＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  Ａｍｅｎｄｍｅｎｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩＳ）解析のためにエクスポートした。
【０４３７】
Ｆ．データ解析
ミニＴＭＡ実験で単変量パフォーマンスを有する３１種類のバイオマーカーについて得られた平均バイオマーカー値を、その腫瘍侵攻性および致死性との相関について調べた。上記に論考したように、緩慢性、中間および侵攻性の腫瘍を各々、高測定値ＴＭＡおよび低測定値ＴＭＡの両方に提示した（例えば、低測定値ＴＭＡに関する各カテゴリーの詳細については図５参照のこと）。侵攻性の試験では、本発明者らはバイオマーカー発現を侵攻性と、４つの異なる試料の組：（１）すべてグリーソンスコア測定値≦３＋３を有するコア；（２）すべてグリーソンスコア測定値≦３＋４を有するコア（この場合、中間の外科的グリーソンスコアを有するコアは除外する）；（３）すべてグリーソンスコア測定値≦３＋４を有するコア（この場合、中間の外科的グリーソンスコアを有するコアは侵攻性としてカウントする）；および（４）すべてグリーソンスコア測定値≦３＋４を有するコア（この場合、中間の外科的グリーソンスコアを有するコアは緩慢性としてカウントするにおいて相関させた（図１１）。致死性転帰の試験では、本発明者らはバイオマーカー発現を致死性侵攻と、２つの異なる試料の組：（１）すべてグリーソンスコア測定値≦３＋４を有するコア；および（２）すべてのコアにおいて相関させた（図１０）。バイオマーカー値は単変量ベースで、Ｔ検定、ウィルコクソン検定および並べかえ検定を用いて相関させた。試験した３１種類のバイオマーカーのうち、１７種類のバイオマーカーが侵攻性転帰の測定および致死性転帰の測定の両方において単変量パフォーマンスを示した（図１１）。
【０４３８】
次に、本発明者らは、バイオマーカーの組合せが腫瘍侵攻性を相関しているかどうかを、２つの異なるアプローチ：（１）侵攻性転帰の測定および致死性転帰の測定の両方において単変量パフォーマンスを示した１７種類のバイオマーカーの組合せにおいて調べる；および（２）ＨＬＴＭＡ解析で試験した３１種類すべてのバイオマーカーの組合せの不偏解析を用いて評価した（図１２）。１７種類の単変量パフォーマンスバイオマーカーから選択した３〜１０種類のバイオマーカーの組合せを解析し、３１種類のバイオマーカーの組から３〜５種類のバイオマーカーの組合せを解析した。各マーカーの組合せに対して５００の訓練事例集合をブートストラップ（すなわち、復元抽出）によって作成し、関連テスト事例集合を得た。訓練事例集合に対するロジスティック回帰によってモデルを誘導し、関連テスト事例集合において試験した。訓練およびテストのＣ統計量（すなわち、曲線下面積）ならびに訓練の赤池情報量規準（ＡＩＣ）を各回で得た。中央値および９５％信頼区間を３つのすべての統計量について得た。各解析方法で単変量パフォーマンスに関して事前に選択した組合せにおける腫瘍侵攻性の上位ランクのモデルを表３に示す。
【表３−１】
2016521966.tif 000004
【表３−２】
2016521966.tif 000005
【０４３９】
予測通り、データを訓練データまたはＡＩＣに基づいて格納すると、種々の組合せと侵攻性との相関は、組合せのサイズが大きくなるにつれて増大した。換言すると、１０メンバーの組合せは９メンバーの組合せよりも侵攻性の予測性が高い、などである。これは、組合せ内のさらなる各メンバーにより、さらなる自由度が訓練解析に付加されるため予測される。しかしながら、データをテストデータに基づいて格納した場合、７つメンバーまたは６つのメンバーの組合せの方が８、９および１０個のメンバーの組合せよりも相関性が高かった。これは、データがより大きな自由度で訓練されるにつれて、テストデータを一般化することがより困難になるためである。したがって、６種類または７種類のバイオマーカーの組合せが一部の場合では、臨床アッセイでの腫瘍の侵攻性の予測においてより有用であり得る。各ＡＩＣおよびテストデータについて各バイオマーカーのどれが上位組合せに現れるかの頻度を調べた。ＡＩＣに格納された３〜１０メンバーの組合せの上位１％の上位バイオマーカーについては図１３；ＡＩＣに格納された３〜１０メンバーの組合せの上位５％の上位バイオマーカーについては図１４；ならびにＡＩＣおよびテストＣ統計量データに格納された７メンバーの組合せの上位１％および上位５％の上位バイオマーカーについては図１５を参照のこと。テストデータに格納された７メンバーの組合せの上位５％は米国特許仮出願第６１／７９２，００３号（２０１３年３月１５日出願，その全内容は引用により本明細書に組み込まれる）に開示された表６に示されている。
【０４４０】
各解析方法で単変量パフォーマンスに関して事前に選択しなかった組合せにおける腫瘍侵攻性の上位ランクのモデルを表４に示す。各ＡＩＣおよびテストデータについて各バイオマーカーのどれが上位組合せに現れるかの頻度を調べた。ＡＩＣおよびテストデータに格納された５メンバーの組合せの上位１％にどのバイオマーカーが現れるかの頻度については図１６を参照のこと。ＡＩＣおよびテストデータに格納された５メンバーの組合せの上位５％にどのバイオマーカーが現れるかの頻度については図１７を参照のこと。図１６および１７のフラットテール（ｆｌａｔ  ｔａｉｌ）は、これらのバイオマーカーの多くが互換的であり、パフォーマンスの付加はほとんど示され得ないことを示唆する。
【表４】
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【０４４１】
上記のすべてのデータを合わせると、前立腺腫瘍侵攻性についてのすべての選択アプローチで一貫して現れる７種類のマーカー（すなわち、ＡＣＴＮ１、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ２、ＨＯＸＢ１３、ＤＥＲＬ１、ＲｐＳ６およびＣｏＸ６Ｃ）のコアセットが同定され得る（図１８の一番右の列の１００％または７５％を有するマーカー参照）。また、前立腺腫瘍侵攻性の７種類のマーカーの二次セット（すなわち、ＹＢＸ１、ＳＭＡＤ４、ＶＤＡＣ１、ＤＣＣ、ＣＵＬ２、ＰＬＡＧ１およびＰＤＳＳ２）も容易に同定され得る（図１８の一番右の列の５０％を有するマーカー参照）。
【０４４２】
また、本発明者らは、バイオマーカーの組合せが致死性転帰と相関しているかどうかも、侵攻性転帰の測定および致死性転帰の測定の両方において単変量パフォーマンスを示した１７種類のバイオマーカーの組合せを用いて評価した。１７種類の単変量パフォーマンスバイオマーカーから選択した３〜１０種類のバイオマーカーの組合せをロジスティック回帰によって解析した。ブートストラップ法（すなわち、復元抽出）および多数回の交差検証を用いた訓練／テストコホートをＣ統計量、ＡＩＣおよび９５％信頼区間によって解析した。各解析方法で単変量パフォーマンスに関して事前に選択した組合せにおける致死性転帰の上位ランクのモデルを表５に示す。
【表５−１】
2016521966.tif 000007
【表５−２】
2016521966.tif 000008
【０４４３】
上記の腫瘍侵攻性モデルと同様、６種類または７種類のバイオマーカーの組合せが臨床アッセイにおける致死性転帰の予測において最も有用であり得る。各ＡＩＣおよびテストデータについて各バイオマーカーのどれが上位組合せに現れるかの頻度を致死性転帰解析のために調べた。ＡＩＣに格納された３〜１０メンバーの組合せの上位１％の上位バイオマーカーについては図１９；ＡＩＣに格納された３〜１０メンバーの組合せの上位５％の上位バイオマーカーについては図２０；ならびにＡＩＣおよびテストデータに格納された７メンバーの組合せの上位１％および上位５％の上位バイオマーカーについては図２１を参照のこと。興味深いことに、図１５と２１を比較すると、８種類のバイオマーカーが、腫瘍侵攻および致死性転帰の両方で上位１２種類のバイオマーカー現れている。したがって、腫瘍侵攻および致死性転帰の予測の可能性において一部重複する一組のバイオマーカーを選択することが可能である（図２２）。
【０４４４】
実施例４：バイオマーカーの組合せの臨床的検証
上記の実施例３で同定された上位バイオマーカーの組合せを使用し、本発明者らは、臨床腫瘍試料を腫瘍侵攻について評価し、上記の本発明らのモデルの結果を検証するためのアッセイを設計した。画像取得ハードウェアは６つまでの異なる蛍光チャネルを検出することができる。したがって、３種類までのバイオマーカー（または予後決定因子「ＰＤ」）を２つの腫瘍マスクシグナルおよび核染色（例えば、ＤＡＰＩ）とともに検出すること、すなわち三重染色が可能である。例えば、図２３は、単一のスライドからの３種類のバイオマーカー（ＨＳＤ１７Ｂ４、ＦＵＳおよびＬＡＴＳ２）、２つの腫瘍マスクシグナル（ＣＫ８＋ＣＫ１８−Ａｌｅｘａ  ４８８およびＣＫ５＋ＴＲＩＭ２９−Ａｌｅｘａ  ５５５）ならびに核染色（ＤＡＰＩ）の６つの異なる蛍光シグナルの検出を示す。例えば、第１のチャネルは、第１のバイオマーカー（例えば、ＰＤ１）を検出するために使用され得る。このマーカーの一次抗体はＦＩＴＣ分子にコンジュゲートされ、抗ＦＩＴＣ−Ａｌｅｘａ−５６８によって検出され得る。第２のチャネルは、第２のバイオマーカー（例えば、ＰＤ２）を検出するために使用され得、このマーカーの一次抗体は、ビオチンにコンジュゲートさせた抗ウサギＦａｂとＡｌｅｘａ−６３３にコンジュゲートさせたストレプトアビジンを用いて検出され得るウサギ抗体である。第３のチャネルは、第３のバイオマーカー（例えば、ＰＤ３）を検出するために使用され得、このマーカーの一次抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートさせた抗マウスＦａｂとＡｌｅｘａ−６４７にコンジュゲートさせた抗ＨＲＰで検出され得るマウス抗体である。第４のチャネルは、癌の上皮マーカー、例えばサイトケラチン８（ＣＫ８またはＫＲＴ８）およびサイトケラチン１８（ＣＫ１８またはＫＲＴ１８）を検出するために使用され得る。例えば、抗ＣＫ８−Ａｌｅｘａ−４８８と抗ＣＫ１８−Ａｌｅｘａ−４８８の組合せは試料の腫瘍領域を画定するために使用され得る。第５のチャネルは、基底上皮マーカー、例えばサイトケラチン５（ＣＫ５またはＫＲＴ５）およびＴＲＩＭ２９を検出するために使用され得る。例えば、抗ＣＫ５−Ａｌｅｘａ−５５５と抗ＴＲＩＭ２９−Ａｌｅｘａ−５５５の組合せは試料の非腫瘍領域を画定するために使用され得る。第６のチャネルは、細胞構造を検出するため、例えばＤＡＰＩ染色された核を検出するために使用され得る。７種類のマーカーのコアセット７種類のマーカーの二次セットから、本発明者らは、４つ一組のスライドでの三重染色に適したこれらのマーカーに対する１２種類の市販の抗体を同定した（図２４参照）。
【０４４５】
三重染色における多種類の抗体での染色は該抗体の検出に影響を及ぼし得ないことを確認するため、本発明者らは、アッセイ単独または別のバイオマーカー（ＰＤ２）抗体の存在下でのバイオマーカー（ＰＤ１）に対する抗体からのシグナルを腫瘍マスクマーカーのバックグラウンドで比較した。図２５に示すように、第２のバイオマーカーに対する抗体の添加が有する第１のマーカーの検出に対する影響は最小限である。この解析を用いて、本発明者らは、図２４に示したマーカーの組合せが、各バイオマーカーの検出における支障が最小限で使用され得ることを確認した。
【０４４６】
次に、本発明者らは、２つの前立腺癌腫瘍試料コホート：クリーブランド・クリニックからの３５０例の腫瘍のコホートおよびハーバード公衆衛生大学院からの１８０例の腫瘍のコホートを得た。本発明者らは、５つの５μｍの連続切片をコホートの各腫瘍試料から単離した。切片のうち４つを図２４に示したようなバイオマーカー検出に使用した。第５の切片は、自家蛍光（ａｕｔｏｆｌｕｒｏｅｓｃｅｎｃｅ）を評価することにより腫瘍試料の品質を調べるために使用した。２つのチャネルを自家蛍光について評価し（１つは一般組織自家蛍光（ＡＦＬ）に対して、もう１つは赤血球に対して）、明顆粒（ＢＡＦＬ）前立腺組織全体に散乱させた．例えば、図２３を参照のこと。
【０４４７】
具体的には、５μｍ切片をパラフィン包埋腫瘍試料ブロックから切り出し、Ｈｉｓｔｏｇｒｉｐ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）コートスライド上に置いた。スライドを６５℃で３０分間焼成し、キシレン中の連続インキュベーションによって脱パラフィンし、一連の等級別アルコール中で再水和させた。抗原賦活をｐＨ７．４の０．０５％無水シトコラン酸溶液中で９５℃にて４０分間行なった。
【０４４８】
免疫蛍光染色をＬａｂＶｉｓｉｏｎ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒを用いて行ない、インキュベーションはすべて室温で、洗浄はすべてＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で行ない、抗体はすべてＴＢＳ−Ｔ＋０．１％ＢＳＡ溶液で希釈した。まず、スライドをＢｉｏｔｉｎ  Ｂｌｏｃｋ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）溶液Ａで２０分間ブロックし、洗浄し、次いで溶液Ｂで２０分間ブロックし、洗浄し、次いでＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｓｎｉｐｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）で２０分間ブロックし、再度洗浄した。ＦＩＴＣ−コンジュゲートマウス一次抗体およびウサギ一次抗体の混合物（図２３参照）を適用し、１時間インキュベートした。
【０４４９】
充分に洗浄後、ビオチン−コンジュゲート抗ウサギＩｇＧとＨＲＰ  コンジュゲート抗ウサギＩｇＧの混合物を４５分間適用した。充分に洗浄後、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  ６３３、抗ＦＩＴＣ  ｍＡｂ−Ａｌｅｘａ  ５６８、抗ＨＲＰ  ｍＡｂ−Ａｌｅｘａ  ６４７およびＴｕｍｏｒ  Ｍａｓｋカクテル（抗サイトケラチン８  ｍＡｂ  Ａｌｅｘａ  ４８８、抗サイトケラチン１８  ｍＡｂ  Ａｌｅｘａ  ４８８、抗サイトケラチン５  ｍＡｂ  Ａｌｅｘａ  ５５５、抗ＴＲＩＭ２９  ｍＡｂ  Ａｌｅｘａ５５５）からなるＡｌｅｘａフルオロフォア−コンジュゲート試薬の混合物を適用した。上記のように、本発明者らは、前立腺上皮マーカーおよび基底マーカー（Ｔｕｍｏｒ  Ｍａｓｋ）に対する抗体と、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  ＸＤに基づいた物体認識の組合せを使用し、前立腺癌腫瘍組織の自動画像解析を可能にした。腫瘍領域は、基底マーカーのない前立腺上皮構造と規定した。Ａｌｅｘａ  ４８８−コンジュゲート抗サイトケラチン８および抗サイトケラチン１８特異的マウスｍＡｂのカクテルを用いて上皮特異的染色を得た。基底細胞の染色はＡｌｅｘａ  ５５５−コンジュゲート抗サイトケラチン５および抗ＴＲＩＭ２９特異的ｍＡｂのカクテルに基づくものとした。スライドを、これらのＡｌｅｘａフルオロフォア−コンジュゲート試薬とともに１時間インキュベートした。充分に洗浄後、ＤＡＰＩ溶液（ＴＢＳ−Ｔ中１００ｎｇ／ｍｌのＤＡＰＩ）を３分間適用した。数回の洗浄後、スライドをＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ褪色防止試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に設置した。スライドを暗所で−２０℃にて一晩放置して「硬化」させ、褪色を最小限にするために暗所で−２０℃にて長期間保存した。画像を取得し、実施例３に記載のようにして解析した。
【０４５０】
実施例５：自動化定量的マルチプレックスプロテオミクスインサイチュイメージングプラットフォームの開発および前立腺癌致死性転帰の予測における応用
概要
癌の予後診断に対する遺伝子系アプローチ、高リスク患者に対する有望な早期介入および低リスク患者に対する過剰処置の回避においては大きな進歩がみられている。タンパク質レベルの乱れおよび翻訳後修飾は、より直接的に表現型と関連しているにもかかわらず、プロテオミクスアプローチにはあまり進歩がみられていない。現在使用されているほとんどの遺伝子発現系プラットフォームでは組織の溶解が必要とされ、構造的分子情報の損失がもたらされ、したがって腫瘍異質性および形態学的特徴の欠点がみえない。ここでは、対象のバイオマーカーがその表現型を発揮している規定のインタクトな組織領域においてタンパク質バイオマーカーレベルおよび活性状態定量的に測定する自動統合型マルチプレックスプロテオミクスインサイチュイメージングプラットフォームを提示する。概念実証として、４種類の既報の予後診断マーカーＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、ＣＣＮＤ１およびＳＰＰ１によってヒト前立腺癌の致死性転帰が予測され得ることを確認した。さらに、ＰＴＥＮが２つのＰＩ３Ｋ経路調節タンパク質活性で置き換えられ得ることを示すことにより、タンパク質発現の機構系パワーが示された。要約すると、該プラットフォームでは、インタクトな組織内で癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子の多種類の機能的活性を再現可能に同時に定量および評価することができる。該プラットフォームは広く適用可能であり、重要なシグナル伝達タンパク質レベルおよび活性が乱れる初期の進行度分類の疾患の予後診断に充分に適している。
【０４５１】
序論
再発検証遺伝子変異に関する試験は大きな予後診断面および予測面で重要性を有するが１〜５、このような変異は初期段階の癌では比較的稀である。多変量遺伝子系試験には、変動する比率の腫瘍組織および良性組織を有するホモジナイズされた組織が必要とされ、正確性に低いバイオマーカー測定値がもたらされる６，７。このような型の試験では、遺伝子パターンおよび変異パターンから表現型が推測されなければならない。対照的に、タンパク質レベルおよび翻訳後修飾の直接インサイチュ測定では、より直接的に癌遺伝子のシグナル伝達経路の状態が反映されるはずである。したがって、タンパク質系アプローチが予後診断に有益であると予測することは妥当である。
【０４５２】
他の問題も予後診断試験を複雑にしている。前立腺癌では、腫瘍異質性が顕著であり、サンプリング誤差が不正確な予測に寄与し得る。また、グリーソン分類および腫瘍進行度分類に従わない病理医によってもこの多病巣性疾患における予後診断が困難となっている。このような欠点に対処するため、本発明者らは、個々のスライドレベルでの規定の関連組織領域の形態学的物体認識および分子バイオマーカーの測定が統合されたインタクトな組織のための自動化定量的マルチプレックスプロテオミクスイメージングプラットフォームを開発した。このシステムを、根治的前立腺摘除組織から既報の４つのマーカーＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、ＣＣＮＤ１およびＳＰＰ１８を用いて致死性転帰を予測するために使用した。重要なことに、ここではまた、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴおよびＭＡＰＫシグナル伝達状態を反映するタンパク質の活性状態の定量測定が、それ自体がＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路シグナル伝達を調節する高度に検証された予後診断マーカーであるＰＴＥＮ９〜１３の代わりに代用され得ることも示される。これらのデータをまとめると、新規な致死性転帰予測指標：ＳＭＡＤ４、ＣＣＮＤ１、ＳＰＰ１、ホスホ−ＰＲＡＳ４０（ｐＰＲＡＳ４０）−Ｔ２４６およびホスホ−リボソームＳ６（ｐＳ６）−Ｓ２３５／２３６が同定された。
【０４５３】
材料および方法
試薬および抗体
この試験で使用した抗体および試薬はすべて、表７に記載した市販の供給元から取得した。抗ＦＩＴＣ  ＭＡｂ−Ａｌｅｘａ５６８、抗ＣＫ８−Ａｌｅｘａ４８８、抗ＣＫ１８−Ａｌｅｘａ４８８、抗ＣＫ５−Ａｌｅｘａ５５５および抗Ｔｒｉｍ２９−Ａｌｅｘａ５５５はＡｌｅｘａ色素と、自社で適切なタンパク質コンジュゲーションキットを製造業者の使用説明書（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）に従って用いてコンジュゲートさせた。
【表７】
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【０４５４】
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）前立腺癌組織ブロックの取得、加工および品質管理
【０４５５】
本発明者らは、臨床的アノテーションおよび長期の患者転帰情報を有するＦＦＰＥヒト前立腺癌組織ブロックのコホートをＦｏｌｉｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｏｗｅｌｌ，ＯＨ）から取得した。試料は適切なＩＲＢ承認を伴って収集されたものであり、患者の記録はすべて無名化した。本発明者らは、他の市販の供給元（ＢｉｏＯｐｔｉｏｎｓ，Ｂｒｅａ，ＣＡ；Ｃｕｒｅｌｉｎｅ，Ｓｏ．Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；ＩＬＳＢｉｏ，Ｃｈｅｓｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＤ；ＯｒｉＧｅｎｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）のいくつかのＦＦＰＥヒト前立腺癌組織ブロックも含めて、個々の抗体および組合せのマルチプレックス染色形式の染色強度を検証し、品質管理手順を開発し、実験内再現性試験を評価し、前立腺腫瘍組織における染色の特異性を確認した。
【０４５６】
１０〜１２枚の切片（５μｍカット）を各ＦＦＰＥブロックから作製した。最後の切片をヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、Ａｐｅｒｉｏ（Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）ＸＴシステムでスキャンした。Ｈ＆Ｅ染色画像を遠隔観察およびＩｍａｇｅＳｃｏｐｅソフトウェア（Ａｐｅｒｉｏ，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）を用いた専門の認定解剖病理医による盲検様式での集中グリーソンアノテーションのためにＳｐｅｃｔｒｕｍデータベース（Ａｐｅｒｉｏ，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）に保管した。各前立腺摘除試料のグリーソンパターンが最高の４つの領域および最低の２つの領域に、現行の基準１４を用いて、１ｍｍコアに対応する注釈付きの丸印を付けた。
【０４５７】
組織品質管理手順
各ＦＦＰＥブロックからの５μｍ切片を抗ホスホＳＴＡＴ３Ｔ７０５ウサギモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、抗ＳＴＡＴ３マウスｍＡｂおよび関心領域マーカーで、後述するようにして染色した。スライドを蛍光顕微鏡下で検査した。染色強度と自家蛍光に基づき、組織を、表８および図２７Ｅに示したような４つのカテゴリーに定性的に分類した。上位２つの品質カテゴリーに属するＦＦＰＥブロックを試験に含めた。
【表８】
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【０４５８】
定義：
高  −  明るい蛍光染色．ＣＫ８および１８では一様
低  −  かろうじて視認可能な染色，一部、バックグラウンドレベル
なし  −  染色は観察されず
【０４５９】
細胞株対照
陽性対照および陰性対照として使用するために選択した細胞株を標準的な条件下で培養し、薬物と阻害薬で処理した後、表示したとおり（表１０）に収集した。細胞をＰＢＳで洗浄し、プレート上に直接、１０％ホルマリンで５分間固定し、次いで、掻き取り、ＰＢＳ中に収集した。次に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、Ｈｉｓｔｏｇｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中に７０℃で再縣濁させ、５分間スピンし（１０，０００ｇ）、濃縮細胞−Ｈｉｓｔｏｇｅｌペレットを形成した。ペレットをパラフィン中に包埋して標準的なパラフィンブロックにし、ドナーブロックとして腫瘍マイクロアレイの構築に使用した。
【０４６０】
腫瘍マイクロアレイ（ＴＭＡ）ブロックの作製
ＴＭＡブロックを、修正型アガロースブロック手順１５を用いて作製した。簡単には、０．７％アガロースブロックをパラフィン中に包埋し、ＴＭＡアクセプターブロックとして使用した。ＴＭＡ  Ｍａｓｔｅｒ（３ＤＨｉｓｔｅｃｈ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ）装置を使用し、病理医のアノテーションによる最高グリーソンパターンに対応する領域からのドナーブロック内に２つの１ｍｍ直径コアを穿孔した。これらのコアのうちの一方を一方のアクセプターブロック内の無作為抽出した位置に配置し、一方、第２のアクセプターブロック内の他方のコアの位置を第１のコアに対して無作為抽出した。これを９１、１７０および１５７アノテーション付き前立腺腫瘍試料（表９）でも繰り返し、それぞれ、３対のＴＭＡブロック（ＭＰＴＭＡＦ１Ａおよび１Ｂ、２Ａおよび２Ｂ、３Ａおよび３Ｂ）を形成した。得られたペアのブロックは患者試料組成物である点では同一であるが、試料の位置に関しては無作為抽出されたものであった。細胞株対照コアをこれらのアクセプターブロックの上側部分、中間部分および底面部分に加えた。負荷したら、ＴＭＡブロックを表を下にしてガラススライド上に６５℃で１５分間押し付け、ホストパラフィン内へのＴＭＡコアの融合を可能にした。次いで、パラフィンブロックを５μｍの連続切片にカットした。より小型の試験ＴＭＡを、限られた（グリーソンスコア）アノテーションのみを有する市販のＦＦＰＥ前立腺腫瘍例から作製した。このＴＭＡを用いて、メインのコホート試験の前にＰＴＥＮ値をホスホマーカーを用いて比較し、再現性を確認した。再現性は、試験ＴＭＡの連続切片における個々のマーカーシグナルを比較することにより示された（表９および図２７Ｆ）。
【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【表９−４】
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【表９−５】
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【表９−６】
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【表９−７】
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【０４６１】
スライド加工および定量的マルチプレックス免疫蛍光（ＱＭＩＦ）染色プロトコル
５ｕｍ厚のＴＭＡ切片をカットし、Ｈｉｓｔｏｇｒｉｐ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）コートスライド上に置いた。スライドを６５℃で３０分間焼成し、キシレン中の連続インキュベーションによって脱パラフィンし、一連の等級別アルコール中で再水和させた。抗原賦活を０．０５％無水シトコラン酸溶液中で９５℃にて４５分間、ＰＴモジュール（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて行なった。染色には、Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒｓ  ３６０および７２０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用した。
【０４６２】
染色手順には、２つのブロッキング程の後、４つのインキュベーション工程（工程間に、適切な洗浄を伴う）を含めた。ブロッキングは、ビオチン工程の後、Ｓｎｉｐｅｒ試薬（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＣＡ）からなるものであった。第１のインキュベーション工程には、抗バイオマーカー１マウスｍＡｂおよび抗バイオマーカー２ウサギｍＡｂを含めた。第２の工程には、抗ウサギＩｇＧ  Ｆａｂ−ＦＩＴＣおよび抗マウスＩｇＧ  Ｆａｂ−ビオチンの後、第３の「可視化」工程を含め、この第３工程には、抗ＦＩＴＣ  ＭＡｂ−Ａｌｅｘａ５６８、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ６３３およびフルオロフォア−コンジュゲート関心領域抗体（抗ＣＫ８−Ａｌｅｘａ４８８、抗ＣＫ１８−Ａｌｅｘａ４８８、抗ＣＫ５−Ａｌｅｘａ５５５および抗Ｔｒｉｍ２９−Ａｌｅｘａ５５５）を含めた。最後に、核染色のために切片をＤＡＰＩとともにインキュベートした（染色形式の概略については、図２７Ｂを参照のこと）。スライドをＰｒｏｌｏｎｇＧｏｌｄ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）設置し、カバーガラスをのせた。スライドを−２０℃で一晩維持した後、イメージングし、長期保存した。種々の抗体の組合せに試験対象のすべてのバイオマーカーが包含されるように、フルセットの６つのＭＰＴＭＡＦスライドを１回の染色セッションで染色した。
【０４６３】
抗体の検証
ノックダウンの前および後でのウエスタンブロッティングによる試験：ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４およびＣＣＮＤ１に対するｍＡｂの特異性を試験するため、本発明者らは、対象タンパク質マーカーの誘導性ｓｈＲＮＡノックダウンを使用した。簡単には、誘導性ｓｈＲＮＡを有するＤＵ１４５細胞を、ｐＴＲＩＰＺ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を担持させたウイルスでナイーブＤＵ１４５細胞を形質導入することによって作製した。２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを用いて細胞を安定的に１週間選択した。続いて細胞を、０．１μｇ／ｍｌまたは２μｇ／ｍｌのいずれかのドキシサイクリンを用いて７２時間誘導した。細胞をトリプシン処理し、ＲＮＡ抽出または細胞溶解物の作製のいずれかのために加工した。各タンパク質マーカーに対する最良のｓｈＲＮＡは、まずＲＴ−ＰＣＲによって、次いでウエスタンブロットによって確認した。抗体は、ウエスタンブロットにおいてｓｈＲＮＡ誘導されると予測される分子バンドサイズが減少する場合、特異的であるとみなした。ＳＰＰ１に対するｍＡｂを試験するため、本発明者らは、高ＳＰＰ発現または低ＳＰＰ発現を有する細胞株を使用した。また、これらの細胞株（図３０に示すとおり）の溶解物もウエスタンブロッティングに使用した。ＡＫＴシグナル伝達経路のメンバーに対する抗ホスホ抗体を試験するため、ＤＵ１４５細胞を一晩、血清不足にし、１０μＭのＰＩ３Ｋ阻害薬ＬＹ２９４００２で２時間処理し、溶解させた。阻害薬で処理し細胞の溶解物をウエスタンブロットの陰性対照として使用し；標準的な条件中で培養した細胞の溶解物を陽性対照として使用した。
【０４６４】
２０μｇの細胞溶解物を４−１５％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸプレキャストゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上で泳動させた。その後、ゲルをニトロセルロース膜に、ｉＢｌｏｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いて転写した。製品データシートの推奨に従って一次抗体希釈物を使用した。膜を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて現像した。画像を、ＦｌｕｒｏＣｈｅｍ  Ｑシステム（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いて取得した。画像を、ＡｌｐｈａＶｉｅｗ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）ａｎｄ  ＩｍａｇｅＪ１６を用いて処理した。
【０４６５】
標的ノックダウンの前および後での免疫組織化学による試験：上記のようにして処理した細胞株のＦＦＰＥ細胞ペレットをひとまとめにしてＴＭＡブロックにした。５μｍ切片をカットし、６０℃で１時間乾燥させた後、キシレン（３回交換）中で脱パラフィンし、一連の漸減量のエタノール洗浄において再水和した。スライドを、抗原賦活のために０．０５％無水シトコラン酸（Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で９５℃にて４０分間加熱した。スライドを、Ｌａｂ  ＶｉｓｉｏｎＴＭ  ＵｌｔｒａＶｉｓｉｏｎＴＭ  ＬＰ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：ＨＲＰ  Ｐｏｌｙｍｅｒ／ＤＡＢ  Ｐｌｕｓ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を製造業者の使用説明書のとおりに用いて染色した。スライドをＡｐｅｒｉｏ  Ｓｃａｎｓｃｏｐｅ  ＡＴ  Ｔｕｒｂｏシステム（Ａｐｅｒｉｏ，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）でスキャンした。画像をＡｐｅｒｉｏ  ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅソフトウェア（Ａｐｅｒｉｏ，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）で解析した。
【０４６６】
画像取得
２つのＶｅｃｔｒａ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｌｉｄｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を自動画像取得に使用した。最大限のスペクトル解像を可能にし、フルオロフォア間の交差干渉が最小限になるようにＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣおよびＣｙ５ロングパスフィルターキューブを最適化した。スペクトルライブラリーの自動画像取得および現像には、それぞれＶｅｃｔｒａ  ２．０およびＮｕａｎｃｅ  ２．０ソフトウェアパッケージ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用した。
【０４６７】
ＴＭＡ取得プロトコルは自動モードで、製造業者の使用説明書（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に従って実行した。コア１つあたり２つの２０倍視野を、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣおよびＣｙ５フィルターを用いた連続露光を含むマルチスペクトル取得プロトコルを用いてイメージングした。バイオマーカー定量の再現性を確実にするため、各ＴＭＡスライドの画像取得の前に、光源強度をＸ−Ｃｉｔｅ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｐｏｗｅｒ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｕｍｅｎ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）で較正した。同じ抗体の組合せを含むスライドにはすべて、同一の露光時間を使用した。実験内差異を最小限にするため、同じ抗体の組合せで染色したＴＭＡスライドは同じＶｅｃｔｒａ  顕微鏡でイメージングした。
【０４６８】
各蛍光色素ならびにＦＦＰＥ前立腺組織自家蛍光のスペクトルプロフィールを作成した。興味深いことに、２つの型の自家蛍光がＦＦＰＥ前立腺組織において観察された。典型的な自家蛍光シグナルは良性組織と腫瘍組織の両方に共通してみられたが、典型的な「明」自家蛍光は、ほとんどが良性組織の上皮細胞に存在する明顆粒に特異的であった。この２つのスペクトルプロフィールの組合せを含むスペクトルライブラリーを使用し、自家蛍光バックグラウンドから個々の色素シグナルを分離または「アンミキシング」した（図２７Ａおよび図２７Ｃ）。
【０４６９】
画像解析
本発明者らは、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  ＸＤ（Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  ＡＧ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した腫瘍同定およびバイオマーカー定量のための自動画像解析アルゴリズムを開発した。各１．０ｍｍ  ＴＭＡコアに対して、２つの２０倍画像視野を取得した。Ｖｅｃｔｒａマルチスペクトル画像ファイルをまず、ｉｎＦｏｒｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて多層ＴＩＦＦ形式に変換し、次いで、カスタマイズスペクトルライブラリーを、ＢｉｏＦｏｒｍａｔｓ（ＯＭＥ１７）を用いて単層ＴＩＦＦファイルに変換した。単層ＴＩＦＦファイルをＤｅｆｉｎｉｅｎｓワークスペースにカスタマイズインポートアルゴリズムを用いてインポートし、各ＴＭＡコアについて、両方の画像視野ＴＩＦＦファイルが「マップ」として単一の「シーン」内にロードされ、解析されるようにした。
【０４７０】
自動適合二値化を用いて個々の各組織試料での組織のセグメント化に対する蛍光強度カットオフを規定した。組織試料を、上皮細胞、基底細胞および間質としての分類が可能になるようにＤＡＰＩを蛍光の上皮細胞マーカーおよび基底細胞マーカーとともに用いてセグメント化し、さらに細胞質と核に区画化した。良性の前立腺の腺部分には基底細胞と管腔細胞が含まれているが、前立腺癌の腺には基底細胞がなく、管腔プロフィールは少ない。したがって個々の腺領域を、基底細胞と隣接上皮構造間の関連する特徴と対象物関連特徴、例えば腺サイズの組合せに基づいて悪性または良性として分類した（図２７Ｄ参照）。アーティファクト染色を有する視野、不充分な上皮組織またはピンぼけ画像はスコアリングの前に除去した。
【０４７１】
上皮マーカーおよびＤＡＰＩの強度を、良性および悪性上皮領において域品質管理測定値として定量した。バイオマーカーの強度レベルを細胞質、核または癌細胞の全細胞において所定の細胞成分内局在基準に基づいて測定した。癌区画内の平均バイオマーカーピクセル強度を、合格品質パラメータを有するマップにおいて平均し、各組織試料および細胞株対照コアについて単一の値を得た。
【０４７２】
患者コホート組成
図２８Ａは、本試験に使用したＦＯＬＩＯコホート組成を示し、ＰＨＳコホート８との比較を含む。
【０４７３】
マーカー値の測定
各試料を２つのコアにしたため、本発明者らは、相関命令に基づいて各マーカーのアグリゲイトスコアを作成した。致死性と正に相関しているマーカーには、本発明者らは最高値を有するコアを使用し；負に相関しているマーカーには、本発明者らは最低値を有するコアを使用した。例えば、すべての染色切片に存在した腫瘍抑制因子ＳＭＡＤ４には、本発明者らは、最低コア値の３つのコアを使用した。
【０４７４】
単変量解析
単変量ｃｏｘモデルを各バイオマーカーについて訓練した。各マーカーについてハザード比とログランクｐ−値を計算し、正相関マーカーではリスクスコアの上位３分の１からなる集団と下位３分の２からなる集団、および負相関マーカーではリスクスコアの下位３分の１からなる集団と上位３分の２からなる集団を比較した（図２８ＢおよびＣ）。
【０４７５】
多変量解析
本発明者らは、マーカーセットで致死性転帰を予測できる可能性を調べるために多変量解析を使用した。本発明者らは、２つのモデル設計アプローチと２つのマトリックスを使用した。具体的には、１０，０００のブートストラップ訓練サンプルを作成し、多変量Ｃｏｘモデルとロジスティック回帰モデルの両方を各訓練サンプルで訓練した。各試験は、コンプリメントセットで行なった。コンコーダンスインデックス（ｃｏｎｃｏｒｄａｎｃｅ  ｉｎｄｅｘ）（ＣＩ）および曲線下面積（ＡＵＣ）を使用し、モデルパフォーマンスを推定した。カプラン・マイヤー曲線を作成し、下位３分の２のリスクスコアを有する集団を、上位３分の１のリスクスコアを有する集団と比較した。全コホートについて、ロジスティック回帰モデルによるリスクスコアに基づいて受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を作成した。本発明らのモデルで試験したマーカーの組合せは以下のとおり：１）ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、ＣＣＮＤ１およびＳＰＰ１、ならびに２）ＳＭＡＤ４、ＣＣＮＤ１、ＳＰＰ１ならびに以下のホスホマーカー：ｐＳ６、ｐＰＲＡＳ４０およびｐＳ６＋ｐＰＲＡＳ４０の組合せのうちの１つである。図３１は多変量解析アプローチの概略を示す。
【０４７６】
結果
プラットフォームの開発
自動化マルチプレックスプロテオミクスイメージングプラットフォームの開発には、いくつかの技術的要件：１）多種類のマーカーを画定された関心領域において（すなわち、腫瘍と周囲の良性組織（対比）において）を定量できる可能性、２）厳格な組織の品質管理、３）バランスのとれたマルチプレックスアッセイ染色形式、および４）実験の再現性を満たすことが必要とされた。
【０４７７】
第１のことに対処するため、本発明者らは、ロングパスＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣおよびＣｙ５フィルターセットを、充分な励起および発光バンドパスを有し、チャネル間干渉が最小限となるように最適化した。本発明者らは、さらに、バイオマーカーシグナルを内因性自家蛍光から、画像のスペクトルアンミキシングによって分離した（図２７Ａ；１８）。腫瘍上皮内のみのバイオマーカーを定量的に測定するため、本発明者らは「組織のセグメント化」を行ない、腫瘍領域を良性領域と区別する必要があった。セグメント化は、フィーチャー抽出とタンパク質共局在アルゴリズムの組合せを用いて行なった。全上皮をＡｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗ＣＫ８およびＣＫ１８抗体を用いて染色し、一方、Ａｌｅｘａ５５５コンジュゲート抗ＣＫ５およびＴｒｉｍ２９抗体で基底上皮を染色した１９，２０。自動Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ（Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）画像解析を使用し、基底細胞の外層を有する上皮構造を良性とみなし、一方、基底細胞のないものを癌２０とみなした。非上皮領域は間質とみなした。最終的に、定量バイオマーカー値を癌上皮（「関心領域」；図２７Ｂ〜Ｄ）のみから抽出した。
【０４７８】
試験に含めるための組織試料の品質を評価するため、本発明者らは、良性組織内のいくつかのタンパク質マーカーの染色強度を評価した。さまざまな品質の大量数の前立腺組織ブロックの検査により、それぞれ良性上皮領域および血管内皮において、サイトケラチン８および１８ならびにｐＳＴＡＴ３の強度が「高」から「低」または「非存在」までさまざまであることが明らかになった（データ示さず；Ｍａｓｓｉｍｏ  Ｌｏｄａ，個人通信機関）。これに基づき、本発明者らは、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）前立腺癌組織ブロックを４つの品質群にカテゴライズした（図２７Ｅおよび表８）。最良の２つの群のブロックのみを用いて腫瘍マイクロアレイブロック（ＴＭＡ）を作製し、それにより、予備分析のバリエーション２１〜２３による生体試料の分解および差異を制御した。合計で、本発明者らは、入手可能な致死性転帰アノテーション（Ｆｏｌｉｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｏｗｅｌｌ，ＯＨ）を有する５０８例の固有の前立腺摘除試料を入手し、試験した。これらのうち、４１８例が品質試験に合格し、本発明者らのＴＭＡに使用した（表１０）。
【表１０】
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【０４７９】
本発明者らのマルチプレックスアッセイ形式においてバイオマーカーシグナルレベルのバランスをとるため、サイトケラチンおよびＴｒｉｍ２９などの高発現レベルを有するタンパク質を直接コンジュゲート抗体で可視化したが、低発現レベルを有するバイオマーカーでは二次抗体および三次抗体の使用によるシグナル増幅が必要とされた。低悪性度および高悪性度の腫瘍材料を含む試験前立腺ＴＭＡを使用し、各抗体の希釈物を、バックグラウンドが最小限となって特異性が最大限になるように、および低シグナル値と高シグナル値の差が少なくとも３倍のダイナミックレンジが確実になるように最適化した（図２８Ｂ）。連続ＴＭＡ切片からのシグナルにより高い再現性が示され、典型的なＲ２相関値は０．９より上であり、絶対値の差は典型的には１０％未満であった（図２８Ｂ，データ示さず）。
【０４８０】
致死性転帰を予測できる可能性
本発明者らは該プラットフォームを、Ｄｉｎｇら８によって公表された最近の試験で報告された４タンパク質指標を用いて試験した。Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔｕｄｙ（ＰＨＳ）で得られた４０５例で構成されたＴＭＡを使用し、著者らは、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、ＣＣＮＤ１およびＳＰＰ１の半定量的病理医評価タンパク質レベルに基づいた多変量のモデルによって致死性転帰が予測され得ることを示した。本発明者らは、本発明者らが独立した前立腺摘除コホートにおいてタンパク質レベルを評価することにより致死性転帰を予測し得るかどうかを病理医にではなく本発明者らの自動プラットフォームを使用して尋ねた。本発明者らのＴＭＡ内の４１８の適格例のうち、３４０例が解析に有用であることがわかり、除外例は主に切片作製時のコアのずれによるためであった（コホートの説明およびＰＨＳコホートとの比較については図２８Ａ参照）。定量腫瘍上皮バイオマーカーレベルは各試料から抽出し、値を単変量解析に供した。ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４およびＣＣＮＤ１はすべて個々に致死性転帰が予測されることがわかり、ハザード比（ＨＲ）はそれぞれ、２．７４、２．４８および１．９９であったが、ＳＰＰ１有意な予測パフォーマンスを有しなかった（図２８Ｂ）。
【０４８１】
次に、多変量Ｃｏｘおよびロジスティック回帰分析を行なった。４マーカーモデルのパフォーマンスを曲線下面積（ＡＵＣ）およびコンコーダンスインデックス（ＣＩ）（それぞれ、図２９Ａおよび表１１）として調べた。ロジスティック回帰分析では、ケースを前立腺癌で死亡した患者と規定した。ＡＵＣは、訓練モードの４種類のマーカーではおよそ０．７５であり、それぞれロジスティック回帰およびＣｏｘ分析によるテストモードでは０．６９〜０．７０であった（図２９Ａ）。４種類のマーカーに基づいてリスクスコアの上位３分の１を下位３分の２と比較するカプラン−マイヤー曲線を、全コホートで訓練したＣｏｘモデルによって作成した。この曲線はリスク群間の生存の明白な差を示す（図２９Ｂ）。図２９Ｂは、本発明者らの結果とＰＨＳでの試験でのものとの比較を示す。本発明者らの平均ＡＵＣ  ０．７５［９５％信頼区間（０．６７，０．８３）］は、ＰＨＳの平均ＡＵＣ  ０．８３［９５％信頼区間（０．７６，０．９１）］のパフォーマンスと同等である。信頼区間における大きな重複に注目のこと。
【表１１】
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【０４８２】
多変量指標の一部としてのタンパク質の活性状態の組込み
【０４８３】
タンパク質の活性状態は腫瘍の侵攻性挙動と関連している機能事象を反映しているため、本発明者らは、本発明者らのプラットフォームによって単にタンパク質レベルではなく、翻訳後修飾または細胞成分内局在の改変によって反映されるタンパク質の活性状態が定量的に測定され得るかどうかを試験した。リン酸化は、特に充分に研究されている翻訳後修飾の例であり；特定の部位におけるタンパク質のリン酸化の化学量論は、親シグナル伝達経路２４、２５の活性状態の間接的尺度である。具体的には、本発明者らは、コアＰＴＥＮ調節シグナル伝達経路ＰＩ３Ｋ／ＡｋｔおよびＭＡＰＫ内の１種類またはそれより多くのシグナル伝達分子の活性状態が４マーカーモデル内のＰＴＥＮの代わりに代用され得るかかどうかを調べた。ＰＴＥＮタンパク質は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路とは対照的に、前立腺癌サブセットにおいて唯一改変されているため１１，２６、本発明者らの目的は、約ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の活性状態についてより広く参考になり得る置き換えホスホマーカーを同定することであった２６，２７、この目的のため、本発明者らは、重要なリンタンパク質に指向されるいくつかのリン酸化部位特異的モノクローナル抗体（Ｐ−ｍＡｂ）を入手し、これらを技術的好適性について試験した（表７）。試験には、細胞株におけるノックダウンによる特異性解析、ヒト前立腺癌組織におけるシグナル強度、および重要なことには、前立腺癌ＦＦＰＥ試料全体におけるシグナル保存に基づいたエピトープ安定性２３，２７を含めた（図３０，データ示さず）。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の活性は多くの場合、ＰＴＥＮタンパク質状態１２，１３とは独立しているため、本発明者らはホスホ−マーカーを含めた。このような基準に基づき、以下のリン酸化部位特異的抗体を選択し、単変量および多変量の致死性転帰予測パフォーマンス：ｐ９０ＲＳＫ−Ｔ３５９／Ｓ３６３、ｐＰＲＡＳ４０−Ｔ２４６、ｐＳ６−Ｓ２３５／２３６およびｐＧＳＫ３−Ｓ２１／９（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ；２７）について試験した。また、本発明者らは抗Ｆｏｘｏ３Ａ抗体も試験に選択した。これは、ＰＩ３Ｋ経路が活性化されると核から排除されるためである２８。マーカーをカプラン−マイヤープロットにおいて単変量解析に供した。ｐＰＲＡＳ４０およびｐＳ６は有意な単変量パフォーマンスを有し、上位３分の１のシグナル値を下位３分の２と比較するとＨＲは２前後であった（図２８Ｃ）。
【０４８４】
次いで、本発明者らは、ＰＴＥＮなしの４種類のオリジナルのマーカーのパフォーマンスを調べた（図２９Ａ）。ＡＵＣ（訓練）は０．７５から０．７２〜０．７３に減少した。ｐＳ６の添加（本質的に、ｐＳ６はＰＴＥＮの代わりに代用される）により、ＣＩおよびＡＵＣはそれぞれ、０．７５および０．７６まで増大したが、ｐＰＲＡＳ４０での置き換えではＡＵＣおよびＣＩの有意な増大はもたらされなかった（データ示さず）。最後に、ＰＴＥＮをｐＳ６とｐＰＲＡＳ４０の両方で置き換えるとＡＵＣ（訓練）値は約０．７６〜約０．７７まで増大した（図２９Ａ）。ｐＳ６＋ｐＰＲＡＳ４０と一緒にしたこの３種類のマーカーに対応するカプラン−マイヤー曲線を図２９Ｂに示す。このような結果は、本発明者らにより、致死性転帰を予測できる可能性は維持されたまま、既知の致死性転帰予測マーカーであるＰＴＥＮが２種類のホスホ−マーカーｐＳ６およびｐＰＲＡＳ４０で成功裡に置き換えることができることを示す。
【０４８５】
考察
この研究により、形態学的情報とプロテオミクス情報を正確に再現可能に統合する自動化イメージングプラットフォームが確立された。本発明者らはプラットフォームのパフォーマンスを、これまでの試験との直接比較により、致死性転帰が予測されることが報告された同じ４種類のマーカーを使用することによって評価した。２つの試験の単純なメタ解析により、有意でない平均ＡＵＣの差０．０８［９５％信頼区間（−０．０３、０．１９）］が推定された。パフォーマンスの差は２つの試験間の方法論の違いによるものであり得る。まず、本発明者らは、ウエスタンブロッティングおよび免疫組織化学においてｓｉＲＮＡオリゴ媒介性ノックダウンによって特異性を検証したモノクローナル抗体を使用した（図３０）が、ＰＨＳでの試験で使用された抗体のうち２種類はポリクローナルであり、したがって、継続される予想アプリケーションには理想的でない。さらに、この試験における定量測定は完全に自動化されていたが、彼らのものは病理医の解釈に依存したものであり、したがって、全体的には再現性が若干低いことが予測され得よう。最後に、本発明者らのコホートには、致死性転帰を予測することが高悪性度症例よりもよりも困難であり得、さらに致死性転帰の予測が、すべての死亡例を把握するには充分な長さでない１１．９２年間という追跡期間中央値によって制限されるグリーソン≦６の例を高比率で含めた。このような方法論の相違とＡＵＣの差の評価を考慮すると、本発明者らの結果は同等であり、ヒトによる解釈とは独立したこの完全自動プラットフォームおよび予後診断の有用性が示される。
【０４８６】
本明細書に特徴を示した諸実施形態では、ロバストな組織セグメント化アルゴリズムおよび定量バイオマーカー測定が、腫瘍上皮領域において、Ｖｅｃｔｒａマルチスペクトル画像分解をプログラマブルＤｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒと組み合わせることにより行なわれる。本明細書において提供する方法により、高感度であり、主観的介入なしで実行され、非常に少量の癌組織が成功裡に評価され得る自動化アプローチがもたらされる。
【０４８７】
本発明のプラットフォームの重要な応用の一例は、タンパク質の活性化状態をバイオマーカーとして組み込むことができることである。ここに、コアＰＩ３ＫおよびＭＡＰＫ経路内のシグナル伝達分子の活性状態を測定するｐ−ｍＡｂが、高度な転帰予測マーカーであるＰＴＥＮの代わりに代用され得ることを示す。腫瘍抑制因子ＰＴＥＮは１５〜２０％の初期段階前立腺癌でしか改変されていないが、多くの場合、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の活性の改変に反映され得るさまざまな他の機構によって機能的に不活化されている１２。理論に拘束されることを望まないが、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の活性状態の測定は初期の前立腺癌病変においてＰＴＥＮよりも参考になる場合があるかもしれない。本発明者らは、ここに、根治的前立腺摘除に関する新たな５マーカー指標：ＳＭＡＤ４、ＣＣＮＤ１、ＳＰＰ１、ｐＰＲＡＳ４０およびｐＳ６の致死性転帰予測パフォーマンスを示す。
【０４８８】
要約すると、本発明者らは、病理医の解釈とは独立した、前立腺摘除組織を用いて致死性転帰を予測することができる自動化された客観的バイオマーカー測定を伴うマルチプレックスプロテオミクスインサイチュイメージングプラットフォームを開発した。重要なことに、本発明者らは、翻訳後修飾に反映されるタンパク質の活性状態の定量測定を致死性転帰の多変量タンパク質予測因子に組み込むことができることを示した。このプラットフォームは、疾患状態全体において広く適用可能である。特に、本発明者らは既にこれを応用して、多くの場合で組織量が限定的である初期段階病変のための予後診断的前立腺癌生検試験を開発した。
【化１−１】
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【化１−２】
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【化１−３】
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【化１−４】
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【化１−５】
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【０４８９】
実施例６：生検サンプリング誤差にもかかわらず前立腺癌侵攻性が予測されるプロテオミクスバイオマーカーの同定および臨床評価
概要
この試験は、サンプリング誤差にもかかわらず前立腺癌の侵攻性および致死性転帰が予測されるインタクトな組織のタンパク質バイオマーカーの同定および臨床評価を示す。
【０４９０】
前立腺癌侵攻性の判定および適切な治療は、臨床的病理学的パラメータ、例えば生検材料のグリーソン分類および腫瘍の関与の程度、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）レベルならびに患者の年齢に基づいている。生検材料のグリーソン分類に基づいた腫瘍侵攻性の予測の重要な難点としては、前立腺癌の異質性、生検材料のサンプリング誤差および生検解釈のばらつきが挙げられる。得られたリスク評価の不確実性は有意な過剰処置をもたらし、コストと不健全率が付随する。本発明者らは、生検材料のサンプリングの差異にもかかわらず真の前立腺癌侵攻性がより正確に反映されるようにあつらえられたタンパク質バイオマーカーを同定するためのパフォーマンスベースストラテジーを開発した。長期追跡された大型患者コホートの病理学的および致死性転帰のアノテーションを有する前立腺摘除試料を、各患者の最高および最低グリーソン分類を有する組織領域を同定した専門の病理医が盲検的に評価した。生検材料のサンプリング誤差をシミュレーショするため、各患者試料の高グリーソン領域および低グリーソン領域由来のコアを用いて、それぞれ「高」および「低」腫瘍マイクロアレイを作製した。定量インサイチュプロテオミクスアプローチを使用し、本発明者らは１６０の候補から、ほとんどが新規な、前立腺癌侵攻性（外科的グリーソンスコアおよび病理学的ＴＮＭ進行度分類）ならびに致死性転帰を高グリーソン領域および低グリーソン領域の両方においてロバストに予測する１２種類のバイオマーカーを同定した。逆に、前立腺摘除組織に対する既報の致死性転帰予測マーカー指標では、最大サンプリング誤差の状況下において機能しなかった。本発明者らの研究により、一般的な、および臨床試験のための生検時に前立腺癌の病態が予測される、生検材料のサンプリング誤差に耐える癌バイオマーカーの発見がもたらされる。
【０４９１】
序論
前立腺癌は米国の男性で診断される癌発症例の２７％を占め、アメリカがん協会の推定によると、２０１４年に国内で新たに２３３，０００例の前立腺癌が診断されている（１）。前立腺癌による死亡リスクは、早期検出および処置選択肢の改善の結果、有意に低下しているが（１）、この一般的な癌には過剰診断および過剰処置の懸念が存在する（２，３）。新たに診断される症例のうち、前立腺癌の症例では、一生の間にわずか７人に約１人が転移性疾患に進行するが、新たに前立腺癌と診断された男性のおよそ半数は、進行のリスクが非常に低い局在性疾患を有する人である（１，４）。この低リスクにもかかわらず、米国では低リスクの前立腺癌と診断され男性のうち９０％もの多く男性が根治的処置、通常、根治的前立腺摘除または除去的放射線療法を受けている（５）。臨床的に明らかになりにくい疾患では、かかる処置は過度であり得、多くの場合、長期的な有害事象、例えば尿失禁および勃起性および腸機能障害がもたらされ得る（２，６，７）。
【０４９２】
前立腺癌の診断およびマネージメントのための現行の指針および認められた標準的医療では、臨床パラメータおよび病理学的パラメータを使用し、生検時に疾患悪性度および進行度分類を評価することが推奨されている（８，９）。針生検によって得られた組織の病理学的評価は、前立腺癌診断の確認および癌の悪性度分類の両方のために必須である。生検グリーソンスコア（ＧＳ）によって決定される悪性度は転帰の最も重要な予測因子であり、マネージメントの判断の指針として最も参考になるされている。すべての前立腺癌生検材料のおよそ８０〜８５％は、低度から中等度から高度までの進行リスクを有する一連の症例を表すＧＳ  ３＋３＝６または３＋４＝７を有する（１０）。緩慢性疾患を有するとされた患者は積極的監視の候補である（３，８，９）。しかしながら、現在の生検材料評価方法では、多くの場合、この範囲に従って個々の患者を正確に仕分けることはできない（５，１０）。
【０４９３】
生検系グリーソンスコアリングの精度に影響を及ぼすことが認識されている因子が２つある：１つはサンプリングの差異（すなわち、最高グリーソン分類を有する領域のサンプリングができない）であり、２つ目は、病理医のグリーソンスコアリングが一致しないことである（１０〜１２）。現在の標準的な実務がマルチコア生検材料サンプリングであるにもかかわらず、腫瘍の最も侵攻性の領域は高頻度で過少提示または過剰提示される（１１，１３）。実際、前立腺癌の症例の２５〜５０％は、前立腺摘除組織の解析および分類後、初期の生検スコアからより正確な外科的ＧＳに悪性度を上げる必要があるか、または悪性度を下げる必要があるかのいずれかである（１０，１４，１５）。グリーソン分類における病理医間の不一致は、特に少量の試料に適用されるグリーソンスコアリングシステムの主観的側面に由来する。かかる不一致は、一様で正確な予後診断を確実にすることを困難にし、３０％もの高率であり得る（１６，１７）。
【０４９４】
前立腺癌侵攻性の予測を改善するため、いくつかの臨床的および病理学的リスク階層化システム、例えば、Ｄ’Ａｍｉｃｏ分類システム、Ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｒｉｓｋ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ＣＡＰＲＡ）スコア、および全米総合癌センターネットワーク（ＮＣＣＮ）ガイドラインが開発されている。（９，１８〜２０）。かかるシステムはすべて、生検ＧＳがリスク評価において単独の最も有力で有益であると認めている。ＧＳは２つのグリーソンパターンで構成されており、より優位なパターンを最初に明示する。この２つを合計してグリーソンスコアが決定される。グリーソンスコアリングに関する２００５年のコンセンサスによると、３つのパターン（３、４および５）のみが典型的に生検において認められる（２１）。許容される予後診断カテゴリーのＧＳは３＋３＝６、３＋４＝７、４＋３＝７、８、および９〜１０である。重要なことは、３＋４＝７と４＋３＝７は同等のグリーソン合計を有するが、パターン４の量が多いことに基づいて後者の方が有意に不良な予後を有する（１６，２２）。重要なことに、臨床的マネージメントのガイドに使用されるリスク階層化システムはすべて、有効で一貫したグリーソンスコアリングに依存しており、したがって、サンプリングの差異および病理医によるスコアリングの不一致が生じやすい。
【０４９５】
サンプリングの差異および誤差を解決する手段の１つとして生検ストラテジーの増強が提案されている。これらの中でも、コア試料の数または密度を増大させると、より代表的な腫瘍組織の採取が確実となり得よう。しかしながら、収集する生検試料の数を現在推奨されている１２例より多くに増大させると、過剰サンプリングによる有害事象のリスクが増大し得、増大させることによって病理学的分類が改善されるという証拠はほとんどない（２３，２４）。また、画像ガイド式生検という新規な形態にも関心が集まっている。現在、ＭＲＩガイド式生検で侵攻性癌の検出に改善がみられるようであるが、ＭＲＩによって積極的監視（ＡＳ）に対する患者の選択が改善され得るかどうかを判定するには長期試験が必要であろう（２５）。
【０４９６】
インタクトな腫瘍上皮からの正確なバイオマーカー測定を可能にする定量的マルチプレックスプロテオミクスインサイチュイメージングシステム（２６）を使用し、本発明者らは、ここに、前立腺癌侵攻性（前立腺摘除（外科的）グリーソンスコアおよび病理学的ＴＮＭ進行度分類によって規定）ならびに致死性転帰を予測することができる１２種類のバイオマーカーの同定および評価を報告する。該マーカーは、サンプリング誤差に対してロバストであるように特異的に選択された。試験は前立腺摘除組織に対して行ない、各患者の高ＧＳおよび低ＧＳ領域からのコア採取に基づいた生検材料のサンプリングバイアス誤差のシミュレーションを含めた。このアプローチ使用し、高スコアグリーソン領域で測定したか低スコアグリーソン領域で測定したかに関係なく、前立腺摘除ＧＳおよび病理学的進行度分類によって調べたときの真の前立腺の病態を反映できる可能性に基づいてバイオマーカーを選択した。侵攻性病態の反映に加え、バイオマーカー候補を、不均一な癌の低悪性度領域および高悪性度領域において前立腺癌特異的死亡を予測できる可能性についても評価した。このパフォーマンスベースアプローチにより新規なバイオマーカーを同定し、前立腺癌の侵攻性および致死性転帰を予測する既知のバイオマーカーを確認した。
【０４９７】
結果
生検シミュレーション
臨床実務において観察される生検試料の多様性をシミュレーショし、誇張するための生検材料のサンプリングモデルを開発した。この目的のため、本発明者らは、アノテーション付き前立腺摘除組織由来のコアを組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）に包埋した。泌尿器科の専門病理医による集中グリーソン分類に基づき、各患者についてコアを最も低い侵攻性の腫瘍（低ＧＳ）を有する領域から採取し、低悪性度組織マイクロアレイ（Ｌ  ＴＭＡ）中に包埋し；並行して、グリーソン分類（高ＧＳ）に基づいて最も侵攻性の腫瘍を有する領域からコアを採取し、高悪性度組織マイクロアレイ（Ｈ  ＴＭＡ）中に包埋した（図３２）。したがって、本発明者らは、各患者の高侵攻性腫瘍領域と低侵攻性腫瘍領域の両方を表す二方向バイアス試料を有するペア型組織ＴＭＡを開発した。
【０４９８】
表１２ａは、ペア型ＴＭＡを作製した３８０例の患者の多施設コホートの臨床徴候を示す。表１２ｂは、Ｌ  ＴＭＡにおいてコアグリーソン３＋３または３＋４を有する３０１症例のサブセットとともに、その対応するＨ  ＴＭＡでのコアグリーソンおよびその外科的（前立腺摘除）グリーソンを示す。
【０４９９】
表１２ａおよび１２ｂは、ＬおよびＨ  ＴＭＡを作製するために使用したコホートの臨床徴候を示す。
【表１２ａ】
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【表１２ｂ】
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【０５００】
Ｌ  ＴＭＡのためのサンプリングは、疾患の重症度が過小評価されるように特異的に設計された。表１２ａおよび表１２ｂに示すように、Ｌ  ＴＭＡ試料のうち６４．７％が６またはそれより低いコアＧＳを有していたが、これらのＬ  ＴＭＡ試料のうち、６またはそれより低い外科的ＧＳを有する患者由来のものはわずか３０％であった。コアＧＳ≦３＋４から高い外科的ＧＳを有する症例由来のＬ  ＴＭＡの試料について、悪性度アップの確率（表１２ｂ）は０．６４（９５％Ｗｉｌｓｏｎ信頼区間［ＣＩ］：０．５９−０．６９）であった。悪性度アップのこの確率は、使用されるサンプリング方法および患者コホートから予測されるとおり、臨床実務でみられるもの（１２）よりも高い。したがって、臨床実務において予測される試料の多様性を誇張することにより、この生検シミュレーション手順によって、試料の多様性に関係なく前立腺癌侵攻性を高信頼度が予測されるバイオマーカーを同定するための有用なモデルが得られた。
【０５０１】
既知のバイオマーカーモデルパフォーマンスに対するサンプリング誤差の効果
予後診断マーカーパフォーマンスに対するサンプリングの差異の効果を評価するため、本発明者らは最初に、前立腺摘除組織に対して使用したとき致死性転帰が予後診断されると報告されている確立されたバイオマーカーの組合せを、生検シミュレーション組織に対して使用したときに致死性転帰および侵攻性疾患を予測できる可能性について試験した。以前の試験では、７またはそれより高い根治的前立腺摘除（ＲＰ）ＧＳおよび前立腺の腺部分を超えた前立腺癌の拡張が転移および前立腺癌特異的死亡の有意な予測因子ことが示されている（２７〜２９）。したがって、本発明者らは、「侵攻性疾患」を前立腺の病態に基づいて外科的ＧＳが少なくとも３＋４またはｐＴ３ｂ（精嚢浸潤）、Ｎ＋もしくはＭ＋と規定した。本発明者らは、Ｄｉｎｇら（３０）による既報の４バイオマーカーモデル（ＳＭＡＤ４、ＣＣＮＤ１、ＳＰＰ１、ＰＴＥＮ）を、本発明者らのサンプリングの差異があるＴＭＡコホートにおいて疾患特異的死および疾患の侵攻性の両方を予測できる可能性について試験した。ＬまたはＨ  ＴＭＡ内の患者のコアを独立した「訓練」データセットと「テスト」データセットに分け、ロジスティック回帰モデルを使用し、訓練データセットを用いてマーカー係数を推定した。本発明者らは、テストセットにおいて得られた受信者操作特性（ＲＯＣ）から曲線下面積（ＡＵＣ）を推定し、次いで、このプロセスをさらなるサンプリングで繰り返した。表１３に示すように、Ｈ  ＴＭＡで測定すると、この４マーカー指標で疾患特異的死亡を予測することができ、テストＡＵＣ中央値は０．６５であった（９５％ＣＩは０．５９〜０．７４）。しかしながら、外科的ＧＳのバイアス過小評価を表すＬ  ＴＭＡで測定すると、この４マーカーモデルで、有意でないテストＡＵＣ中央値０．４９が示された（９５％ＣＩは０．４２〜０．５８）。さらに、ＨまたはＬのいずれかのＴＭＡで測定したときのこの４マーカー指標で侵攻性疾患を予測できる可能性も有意に達しなかった（テストＡＵＣ中央値は、それぞれ０．５６［９５％ＣＩは０．４４〜０．６４］および０．５６［９５％ＣＩは０．４６〜０．６５］）。このような結果は、予後診断マーカーパフォーマンスに対するサンプリング誤差の影響およびかかるサンプリングの差異にもかかわらず転帰を正確に予測できる択一的なバイオマーカーの組合せが同定されることの重要性を示す。
【０５０２】
【表１３】
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【０５０３】
バイオマーカーの同定
【０５０４】
バイアス生検シミュレーションＴＭＡが実際に極端なサンプリング誤差シナリオを反映していること、およびかかるサンプリングの差異のため既知の予測マーカー指標が再現可能にパフォーマンスできないことを示した後、次に、本発明者らは、生検材料のサンプリングの差異に関係なくロバストに癌侵攻性が予測され得るバイオマーカーを同定するという主目的を追求した。長期追跡された患者の大型コホート由来の豊富な臨床的および病理学的アノテーションを有する前立腺摘除組織試料を利用することにより、本発明者らは、潜在的マーカーを選択するためのパフォーマンスベースストラテジーを確立した。段階的アプローチには：１）候補バイオマーカーの同定、２）その生物学的および技術的好適性の評価、ならびに３）ＨおよびＬ  ＴＭＡコホートにおけるパフォーマンスの解析を含めた（図３３）。
【０５０５】
このプロセスは、既刊文献および公衆に利用可能な遺伝子発現データセットの検索から始め、これにより、前立腺癌に対する生物学的関連性に基づいて１６０種類のバイオマーカー候補を同定した（３０〜４８）。本発明者らはさらに、適切なモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の入手可能性に基づいてこれらのうちの１２０種類の優先順位を決定した（包括的なバイオマーカー候補リストについては表１４参照）。候補には、前立腺癌侵攻性と関連している充分に特性評価されたマーカー、例えばＥＺＨ２、ＭＴＤＨ、ＦＯＸＡ１（４９〜５１）、ならびにマーカーＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１、ＳＰＰ１、ホスホ−ＰＲＡＳ４０−Ｔ２４６（ｐＰＲＡＳ４０）およびホスホ−Ｓ６−Ｓｅｒ２３５／２３６（ｐＳ６）（以前に前立腺摘除組織において致死性転帰を予測するものとして同定）（２６，３０）を含めた。
【０５０６】
【表１４−１】
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【表１４−２】
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【表１４−３】
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【表１４−４】
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【表１４−５】
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【表１４−６】
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【０５０７】
次に、本発明者らは、１２０種類の優先順位決定済み候補バイオマーカーに対するＭａｂを入手し、定量的マルチプレックス免疫蛍光（ＱＭＩＦ）アッセイに対する特異性および好適性を試験した。さらなる解析のための候補ＭＡｂを、別の箇所に記載のようにしてシグナル強度および特異的免疫蛍光（ＩＦ）染色パターンに基づいて選択した（２６）。本発明者らは、間質細胞よりも癌細胞を優先的に染色したＭＡｂの優先順位を決定した。大量数の染色試料に基づき、本発明者らは、上皮マーカーのＩＦ染色強度が、固定または保存が不良と思われる組織において低いことを観測した。候補バイオマーカー抗体を、上皮マーカーのものよりも安定であるシグナルに基づいて選択した。
【０５０８】
第３の工程において、本発明者らは、先の工程に合格した６２種類のＭＡｂを試験し、そのダイナミックレンジならびに予測パフォーマンスを調べた。高値の全体ＧＳおよび低値の全体ＧＳを有する前立腺腫瘍の最も低い侵攻性領域を表すように設計した小型の試験ＴＭＡを使用し、バイオマーカーをシグナル強度と外科的ＧＳとの相関に基づいて選択した。具体的には、本発明者らは、非侵攻性症例と侵攻性症例間でシグナル値の分布に差が示されることに加えて、最低発現値と最高発現値との間で３倍のシグナルの差を必要とした。この基準を満たす最終の３９種類の候補ＭＡｂを、上記のＨおよびＬ  ＴＭＡブロックで表される臨床コホートにおいて試験した。
【０５０９】
単変量解析
本発明者らの次の目的は候補バイオマーカーを、さらに、サンプリング誤差の状況下での単変量予後診断能および解析パフォーマンスに基づいて評価することであった。上記で同定された３９種類のバイオマーカーの各々を、低グリーソン領域および高グリーソン領域の両方において測定したときの疾患の侵攻性（外科的ＧＳ≧３＋４あるいは病理学的進行度分類ｐＴ３ｂおよび／またはＮ＋もしくはＭ＋）ならびに該疾患による死亡（生存率解析）を予測できる可能性について試験した。２つのアスタリスクを表示した個々のマーカーでは、低グリーソン領域で測定したか高グリーソン領域で測定したかに関係なく発現の増減に基づいて、侵攻性疾患または前立腺癌による死亡に対して予測値（Ｐ＜０．１）が示された（図３４）。この結果は、これらのマーカーが、さまざまな度合いのサンプリング誤差に耐久性であることを示唆する。高グリーソン領域だけで測定し、低グリーソン領域では測定しなかった場合、侵攻性を予測するマーカーは２種類、致死性転帰のマーカーは３種類あり、これらのマーカーがサンプリング誤差に対してロバストでないことが示された。逆に、本発明者らは、低グリーソン領域で測定し、高グリーソン領域では測定しなかった場合、予測パフォーマンスを有するマーカーを同定できなかった。注目すべきことに、侵攻性疾患と致死性転帰間の強い関連性は、侵攻性に対して有意な単変量パフォーマンスを有する１４種類のマーカーのうち１２種類は、致死性転帰に対して有意な単変量パフォーマンスも示すという所見によって明らかになった。パフォーマンスベースバイオマーカー選択アプローチのさらなる検証として、本発明者らは、致死性転帰と既報（４９〜５１）の３種類の既知の前立腺癌進行マーカーＥＺＨ２、ＨｏｘＢ１３およびＭＴＤＨ２の発現との間に強い相関を確認した。結論として、本発明者らは、侵攻性疾患と致死性転帰の両方に対して単変量パフォーマンスを有し、また、サンプリング誤差に耐久性でもあるいくつかのマーカー候補を同定した。さらに、本発明者らは、サンプリング誤差が最小限の状況においてのみ予測性である（Ｈ  ＴＭＡではパフォーマンスありだがＬ  ＴＭＡではなし）マーカーを同定した。
【０５１０】
多変量解析：腫瘍侵攻性を予測するバイオマーカー
疾患の侵攻性が予測される最良の多変量バイオマーカーの組合せを探索するため、本発明者らは、考えられ得るあらゆるモデルを、５種類（を含む）までのバイオマーカーの組合せを用いて徹底的に検索した（図３５Ａ）。多変量解析では、オリジナルの３９種類の組から技術的基準、例えばＭＡｂ検出シグナル強度、ダイナミックレンジおよび特異性に基づいて精選した３１種類のバイオマーカーに着目した（材料および方法参照）。最初に、「極端」モデルアプローチを多変量解析に使用し、これには、モデル構築および試験に中間試料（ＧＳ＝３＋４、≦Ｔ３ａおよびＮ０）を除外することを含めた。本発明者らは、Ｌ  ＴＭＡ内の患者コアを独立した訓練事例集合とテスト事例集合に分け、得られたモデルをＬ  ＴＭＡおよびＨ  ＴＭＡの両方で、サンプリングの差異下での多変量パフォーマンスについて試験した。この目的のため、本発明者らはロジスティック回帰モデルを使用し、訓練データセットを用いてバイオマーカー係数を推定し、テストセットで得られたＲＯＣからＡＵＣを推定し、次いで、このプロセスを別のサンプリングで繰り返した。
【０５１１】
各場合において、ＡＩＣ（赤池情報量規準）（５２）およびテストセットＡＵＣでソートされた、モデル内の上位５％または１％に最も高頻度で存在するバイオマーカーを調べた。テストによるランキング、ＡＩＣによるランキングおよび両方のランキングのために最終タリーを作成した（ＡＩＣおよびテストでランク付けされた５バイオマーカーモデルの代表例については図３５Ｂ参照）。本発明者らは、上位パフォーマンスバイオマーカーモデルにおいてバイオマーカー順位の高度な保存を観測した（図３５Ｃおよび表１５参照）。中でも、以下のバイオマーカー：ＡＣＴＮ１、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ２、ＤＥＲＬ１、ＹＢＸ１、ＤＥＣ１、ｐＳ６、ＨＳＰＡ９、ＨＯＸＢ１３、ＰＤＳＳ２、ＳＭＡＤ４、ＣＤ７５が、ランク付けしたリストの少なくとも５０％において上位マーカーのようであった。また、ＣＵＬ２が、いくつかの高ランキングモデルに存在した（ランキング結果のさらなる詳細については表１５参照）。
【表１５】
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【０５１２】
多変量解析：致死性転帰を予測するバイオマーカー
同様のモデル設計解析を致死性転帰について行なった（表１６）。中でも、ランク付けしたリストの少なくとも５０％において上位マーカーと思われるバイオマーカー：ＭＴＤＨ２、ＡＣＴＮ１、ＣＯＸ６Ｃ、ＹＢＸ１、ＳＭＡＤ２、ＤＥＲＬ１、ＣＤ７５、ＦＵＳ、ＬＭＯ７、ＰＤＳＳ２、ＦＡＫ１、ＳＭＡＤ４、ＤＥＣ１を含めた（ランキング結果のさらなる詳細については表１６参照）。
【表１６】
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【０５１３】
最終バイオマーカーセット
【０５１４】
本発明者らは、単変量パフォーマンスと多変量パフォーマンスの注意深い統合、および解析における考慮事項、例えばすべての抗体について腫瘍試料において最低３倍のシグナル強度ダイナミックレンジに基づいて、最終の１２種類のバイオマーカーの組を選択する。図３６Ａは、侵攻性の単変量予測についての、これらの１２種類のバイオマーカーと関連している推定オッズ比（ＯＲ）を示し、また、単変量解析および多変量解析の両方に基づいた各バイオマーカーの選択根拠をまとめている。図３６Ｂは、選択されたバイオマーカーの生物学的概要を示す。最終バイオマーカーセットは：ＦＵＳ、ＰＤＳＳ２、ＤＥＲＬ１、ＨＳＰＡ９、ＰＬＡＧ１、ＳＭＡＤ２、ＶＤＡＣ１、ＣＵＬ２、ＹＸＢ１、ｐＳ６、ＳＭＡＤ４、ＡＣＴＮ１で構成した。
【０５１５】
この１２種類のマーカー抗体の各々を標的特異的ノックダウンの前と後で、図３７に示すようにして、ウエスタンブロッティング（ＷＢ）および免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイを含む特異性解析によって厳格に検証した。興味深いことに、このプロセスによって、本発明者らは、ＤＣＣに特異的であるとして販売されているＭＡｂが、ＤＣＣではなくＨＳＰＡ９（モルタリンとしても知られている）を検出することを見出した（図３８）。ＤＣＣノックダウンによってＷＢ上の唯一のバンドの消失がもたらされなかったため、本発明者らは、質量分析での配列決定解析を行ない、このタンパク質をＨＳＰＡ９と同定した。このタンパク質が癌の進行および生存において充分に報告された役割を有する（５３）という事実により、パフォーマンスベースおよび機能ベースのバイオマーカー同定アプローチがさらに検証される。
【０５１６】
次に、本発明者らは先に記載のモデル設計アプローチを使用し、疾患の侵攻性および疾患特異的死亡の両方に対する最終の１２バイオマーカーセットの予測の潜在性を、いずれかの患者コホートで評価した。Ｌ  ＴＭＡおよびＨ  ＴＭＡのデータを無作為に訓練事例集合とテスト事例集合に分配し、Ｌ  ＴＭＡ訓練事例集合においてロジスティック回帰を行ない、パフォーマンスをＬ  ＴＭＡおよびＨ  ＴＭＡテスト事例集合において評価し、このプロセスを繰り返して疾患の侵攻性に対する１２マーカーモデルを開発した。図３６Ｃに示すように、これにより、Ｌ  ＴＭＡテストＡＵＣは０．７２（９５％ＣＩ：０．６４〜０．７９）および対応する侵攻性疾患のＯＲは２０／リスクスコアの変化単位（９５％ＣＩ：４．３〜２５７）がもたらされた。サンプリング誤差下で一般化できる可能性を確認するため、Ｌ  ＴＭＡ訓練事例集合から誘導されたモデルをＨ  ＴＭＡにおいても侵攻性疾患の予測について試験し、結果は一貫していた（図３６Ｃ）。この侵攻性モデルに対してなんらさらなる変更を加えずに、本発明者らは、その致死性転帰の予測に対するパフォーマンスを、侵攻性リスクスコアを疾患による死亡と相関させることによって調べた。注目すべきことに、本発明者らは、Ｌ  ＴＭＡおよびＨ  ＴＭＡの両方において致死性転帰のＡＵＣが侵攻性のものと同様であることを見出した（それぞれ、０．７２（９５％ＣＩ：０．６０〜０．８３）および０．７１（９５％ＣＩ：０．６１〜０．８１））。Ｌ  ＴＭＡおよびＨ  ＴＭＡにおける致死性転帰に対する対応ＨＲは、それぞれ６６／変化単位（９５％ＣＩ：５．１〜６７５６）および３６（９５％ＣＩ：３．３〜２８８９）であった。本発明者らは、この１２種類の同定されたバイオマーカーはサンプリング誤差に対してロバストであり、おそらく疾患の侵攻性および致死性転帰の両方が予測されると結論付ける。
【０５１７】
考察
前立腺癌侵攻性を、初期診断に時点で、ならびに患者の、例えば、積極的患者監視に割り当てられた患者およびこの疾患に対して積極的処置を受けている患者の継続中の追跡の一部として、より正確に評価することの臨床的必要性が継続的に存在している（４，２９，５４）。現在、初期疾患を有する男性において、生検ＧＳが３＋４＝７またはそれより大きい値は、積極的処置の必要性を示す有用な予後診断因子の１つである（９，５５）が、論考したとおり、腫瘍異質性およびグリーソンスコアリングの不一致に起因する生検材料のサンプリング誤差が癌進行、侵攻性および致死性の患者のリスクの評価の精度および信頼性に影響を及ぼし得る。この不確実性は、生検材料のグリーソン分類が３＋３または３＋４である患者の予後を正確に予測することが困難であるため、前立腺癌が有意に過剰処置されるという状況の一因となっている（２，５，１０，５４，５６，５７）。
【０５１８】
前立腺癌の侵攻性および致死性を予測するバイオマーカー
本明細書において、前立腺生検材料採取の際に典型的にみられる問題である極端なサンプリングの差異の状況下であっても、前立腺癌の侵攻性および致死性転帰が予測されるバイオマーカーを同定および評価するためのパフォーマンスベース方法の成功裡の開発を記載する。致死性転帰についての長期追跡を伴うアノテーション付き臨床前立腺摘除試料の大型コホート（Ｎ  ＝  ３８０）を使用し、各前立腺摘除組織上の最高ＧＳおよび最低ＧＳの領域に専門の病理医が盲検様式で印をつけた。このような各患者試料からの「高」領域および「低」領域のコア採取により、本発明者らは、全コホートを表すペア型ＴＭＡを作製し、それにより各患者に対するサンプリング誤差を伴う生検材料のシミュレーションを行なった。このようなペア型ＴＭＡを使用し、本発明者らは、大量数のバイオマーカー候補を、各患者の低悪性度癌領域または高悪性度癌領域のいずれかで測定したときの侵攻性の前立腺の病態および致死性転帰を予測できる可能性について評価した。具体的には、本発明者らは、まず、Ｌ  ＴＭＡ組織において測定したときに侵攻性および致死性転帰に対してパフォーマンスを有するバイオマーカーを選択し、極端なサンプリング誤差に対して最もロバストなものを同定した。この目的のため、本発明者らは、コアグリーソン≦３＋４を有するＬ  ＴＭＡ試料のみを臨床的に該当するとして含めた。それは、４＋３またはそれより高いＧＳを有する生検材料は不可避的に積極的治療候補となるからである。バイオマーカー候補を、自動化された客観的バイオマーカー測定をもたらす統合マルチプレックスプロテオミクスインサイチュイメージングプラットフォームを用いて定量した（２６）。単変量解析に基づくと、同定されたバイオマーカーのほとんどで、Ｌ  ＴＭＡ組織試料で測定したかＨ  ＴＭＡ組織試料で測定したかに関係なく、疾患の侵攻性および前立腺癌特異的死亡の両方が予測され、したがってサンプリングの差異に対してロバストであった（図３４）。さらに、進行リスクおよび致死性転帰を予測すると以前に報告されたいくつかの前立腺癌バイオマーカー、例えばＳＭＡＤ４、ＥＺＨ２、ＭＴＤＨ２、ＨｏｘＢ１３およびＰＴＥＮはすべて、致死性転帰に対して陽性であると確認され、本アプローチの検証をサポートする。
【０５１９】
本発明者らの抗体の特異性の検証の一部として、本発明者らは、標的ノックダウン解析および質量分析系タンパク質配列決定解析により、抗ＤＣＣとして販売されているＭＡｂが実際には無関連のタンパク質ＨＳＰＡ９またはモルタリンを認識していることを知った。本発明者らは、ＨＳＰＡ９が多変量モデルの一部として予測因子となり、したがって最終の１２種類のマーカーセットに含められることを見出した。機能解析に供したとき、本発明者らは、実際に、ＨＳＰＡ９がクローン原性細胞コロニーアッセイ構成および細胞増殖に関与していることを見出し、先の所見と整合した（図３８および（５３）参照）。これにより、さらに、不偏型パフォーマンスベースマーカー選択アプローチの検証がサポートされる。
【０５２０】
単変量パフォーマンスならびに疾患の侵攻性および致死性転帰の多変量モデルにおけるマーカー出現頻度に基づいて、１２種類のバイオマーカーを選択した（図３６Ａ）。これらの１２種類のマーカーに基づいた多変量モデルでは、組織サンプリングの差異下で侵攻性に対して同様の予測パフォーマンスが示された（図３６Ｃ）。興味深いことに、この１２マーカー侵攻性モデルに基づいて作成されたリスクスコアでは、組織サンプリングの差異下で致死性転帰の別々のエンドポイントが等しく予測された（図３６Ｃ）。また、前立腺グリーソン分類および進行度分類によって規定される前立腺癌侵攻性を予測するマーカーによって致死性転帰も予測されるという事実により、外科的病態における侵攻性の特徴と致死性とのリンクが強力にサポートされる。より重要なことは、本発明者らのバイオマーカーパネルの構築のための長期患者転帰に関連するものとしての本発明者らの病理学的エンドポイントの使用が検証される。この１２種類の同定されたバイオマーカーは腫瘍の挙動の予測に関連しており、前立腺癌侵攻性を評価するための臨床的エビデンスベースの多変量生検試験の基盤をもたらす。生検は初期診断時、および積極的監視を受けている患者の疾患状態のモニタリングにおいて重要な役割を果たす（８，９）。そのため、ここに記載の多変量生検試験により、前立腺癌を有する患者のマネージメントにおける早期決断工程の情報が得られ得る。
【０５２１】
サンプリング誤差に対してロバストなバイオマーカー
本発明の試験により、サンプリング誤差に対して高度にロバストなマーカーが同定され、選択された。生検材料のサンプリング誤差の主な理由の１つは前立腺癌の異質性である。腫瘍の最も侵攻性の部分から一貫した組織取得ができないことにより、高頻度で腫瘍侵攻性および進行リスクの過小評価がもたらされる。各患者の最高および最低グリーソン領域においてコア採取することにより、本発明者らは、各患者の２種類の生検材料（一方は「最大の」サンプリング誤差を有するもの（Ｌ  ＴＭＡ）、他方は最小のサンプリング誤差を有するもの（Ｈ  ＴＭＡ））がシミュレーショされるように設計された全コホート試験のペア型ＴＭＡを作成した。本発明者らは、コアグリーソン≦３＋４を有するＬ  ＴＭＡに着目した。それは、これが、標準的医療が正確な予後に不充分であるという臨床的に該当する場合を表すからである。本発明者らは、このようなＬ  ＴＭＡの場合のうち約５４％が、より高い外科的グリーソンスコア（これは臨床実務において観察されるものより高い）に悪性度アップされることを見出し（１２）、本発明者らのアプローチはバイアスサンプリング誤差モデルを提供するものであることを確認した（表１２ｂ）。
【０５２２】
サンプリング誤差に耐久性であるバイオマーカーの同定の必要性は、前立腺摘除コホートに基づいて致死性転帰を予測すると以前に報告されたサイクリンＤ１、ＳＭＡＤ４、ＰＴＥＮおよびＳＰＰ１に基づいた充分に確立された４マーカー指標を調べることにより強調された（３０）。このモデルは、最小のサンプリング誤差の状況を表すＨ  ＴＭＡでは致死性転帰の予測性を示したが、このモデルは、最大のサンプリング誤差を表す本発明者らのＬ  ＴＭＡ組織コアでは全く致死性転帰の予測性を示さなかった（表１３）。この所見は、この４マーカー指標では低グリーソンスコア前立腺腫瘍において致死性転帰を予測することができないという最近の報告と整合する（５８）。
【０５２３】
単変量マーカー解析に基づいて、本発明者らは、Ｌ  ＴＭＡおよびＨ  ＴＭＡ試料においてそれぞれ疾患の侵攻性および致死性転帰に対するサンプリング誤差にロバストなパフォーマンスを有する１４種類および１８種類のマーカーを同定した（図３４において＊＊を表示したマーカー）。これらの単変量選択マーカーのほとんどで、サンプリングの差異下において両方の適応症が予測され、この場合も、上記の多変量解析について上記で論考したような疾患の侵攻性と致死性転帰間の相関がサポートされる。興味深いことに、Ｌ  ＴＭＡにおいて疾患の侵攻性および致死性転帰に対して単変量パフォーマンスを示したマーカーはすべてＨ  ＴＭＡでも予測性を示したが、２種類のマーカー（ＰＸＮとＭＴＤＨ２）および３種類のマーカー（ＮＣＯＡ２、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）とＡＫＡＰ８）は、それぞれ、Ｈ  ＴＭＡで測定したときのみ侵攻性疾患および致死性転帰の予測性を示し、Ｌ  ＴＭＡでは示されなかった（図３４）。これは、これらのマーカーは主としてサンプリング誤差が最小限の状況において予測性を示すことを示す。実際、これらの５種類のマーカーはすべて、細胞の増殖、遊走および発癌の重要な調節因子であることが示されている（例えば（３０，５１，５９〜６１）参照）。サイクリンＤ１はＨ  ＴＭＡのみにおいて致死性転帰が予測され、Ｌ  ＴＭＡでは予測されないという観察結果は、Ｄｉｎｇらによって報告された４マーカー指標が本発明者らのＬ  ＴＭＡ組織ならびに低悪性度前立腺癌試料では致死性転帰の予測性を示さないという所見と整合する（５８）。Ｌ  ＴＭＡのみにおいて侵攻性疾患または致死性転帰が予測され、Ｈ  ＴＭＡでは予測されないというマーカーはないという事実は、本発明者らが主として、Ｌ  ＴＭＡにおいて侵攻性または致死性転帰のいずれかを予測することができ、最大のサンプリング誤差ロバストネスを反映するマーカーを選択したことを考慮すると興味深い。これは、同定されたマーカーがおそらくより多くの侵攻性腫瘍領域の場効果を反映していることを示し、そのＬ  ＴＭＡおよびＨ  ＴＭＡ組織における同様のパフォーマンスと整合する。
【０５２４】
遺伝学的およびプロテオミクスアプローチ
前立腺癌におけるより良好な新しいバイオマーカーを見出すための検索において、臨床的リスク予後診断の情報が得られ得る考えられ得る遺伝子マーカーの同定において、大きな重要性と進歩がみられている（３１，３２，３９，４８，６２，６３）。しかしながら、同定された遺伝子の多くでは、かかるマーカーの疾患予後診断における信頼性に関する結果に矛盾または不充分さがみられる。例えば、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ融合型遺伝子は高リスク腫瘍と関連していることが報告されているが、大型コホートを用いたごく最近の研究では、この融合型と患者転帰との間に強い相関はないと報告されている（６４）。多変量遺伝子発現系の試験では、最近、転移性疾患および致死性転帰が、ＵＫの保守的管理患者コホート（６５）ならびにＵＳにおいて積極的管理コホートにおける処置後の生化学的再発（６６，６７）に基づいて予測されることが報告されている。この試験に対するサンプリングの差異の影響はまだ確立されていない。
【０５２５】
本試験の結果により、インタクトな組織の腫瘍領域のみからタンパク質を測定するプロテオミクスアプローチを採用すると、生検時の進行度分類における正確なリスク分類が改善され得ることが示される。この考えの理論的根拠は二要素性である。まず、前立腺癌は不均一な多病巣性の疾患であり、生検材料は高頻度で、低悪性度成分のみを含むものであり、病理医によって低リスク癌と分類され得るためである。しかしながら、形態学的に反映されない高悪性度分子特質が癌全体に広がっていることが報告されており（６８，６９）、したがって、低悪性度を含むと思われる生検材料においても測定可能になっている。インタクトな組織の腫瘍領域のみからタンパク質を測定するプロテオミクスアプローチにより、良性成分に対してさまざまな量の腫瘍成分を有する組織試料中であっても、かかる高悪性度分子特質をインサイチュで正確に高感度で評価することが可能である。これは、組織ホモジネーションを必要し、混在している良性組織の量に応じて高悪性度分子特質がさまざまに希釈される遺伝子発現系技術と比べて利点である。第２に、生検に対するグリーソン分類が主観的であり、３０％にのぼる症例において専門の病理医の一致がみられない（１６，１７）。客観的に測定され得る分子特質によりリスク分類が改善される。
【０５２６】
本試験において同定された１２種類のバイオマーカーは、一連の機能、例えば転写、タンパク質合成、ならびに細胞増殖およびアポトーシスの調節ならびに細胞構造を有するタンパク質である（３０）。該バイオマーカーは生検材料のサンプリング誤差にもかかわらず機能を発揮できるという事実は、タンパク質系バイオマーカーは前立腺癌の処置の初期マネージメントをガイドする手段として、グリーソン系リスク分類をさらに改善し得ることを示す。
【０５２７】
結論
初期段階の癌と診断された患者生存転帰を予測する困難性およびその結果の過剰処置を考慮すると、前立腺癌を有する患者に対する信頼性のある正確な予後診断試験の緊急の必要性が存在している。また、本明細書に記載のタンパク質バイオマーカー同定ストラテジーは他の腫瘍型にも適用することができ、組織学的評価がリスク階層化および予後診断に枢要である他の腫瘍予後診断試験または予測試験を開発するために使用され得るバイオマーカーのパフォーマンスベース選択が可能である。
【０５２８】
材料および方法
試薬および抗体
この試験に使用した抗体および試薬はすべて、表１７に示した市販の供給元から入手した。抗フルオロセインチオイソシアネート（ｆｌｕｒｏｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｏｐｃｙａｎａｔｅ）（ＦＩＴＣ）ＭＡｂ−Ａｌｅｘａ  ５６８、抗ＣＫ８−Ａｌｅｘａ  ４８８、抗ＣＫ１８−Ａｌｅｘａ  ４８８、抗ＣＫ５−Ａｌｅｘａ  ５５５および抗Ｔｒｉｍ２９−Ａｌｅｘａ  ５５５はＡｌｅｘａ色素と、適切なタンパク質コンジュゲーションキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてコンジュゲートさせた。
【０５２９】
【表１７−１】
2016521966.tif 000036
【表１７−２】
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【０５３０】
スライドの加工および染色プロトコル
ＴＭＡブロックから、５μｍ切片をカットし、Ｈｉｓｔｏｇｒｉｐ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）−コートスライドに置き、先に記載のようにして（材料の補足）加工した。簡単には、脱パラフィン後、抗原賦活を、０．０５％シトコラン酸溶液中で９５℃にて４５分間、Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ  ＰＴモジュール（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を行なった。染色は手作業、またはＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  ３６０もしくは７２０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた自動化様式のいずれかで行なった。
【０５３１】
２種類の抗バイオマーカー抗体と関心領域  マーカーを併用したＱＭＩＦ染色手順を先に記載のようにして行なった（材料の補足および方法参照）。ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）系ＩＨＣ染色のため、組織を有するスライドを上記のようにして加工し、Ｓｎｉｐｅｒ  ｒｅａｇｅｎｔＴＭ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）でブロックし、一次抗体溶液とともにインキュベートした。ＵｌｔｒａＶｉｓｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を二次試薬として使用した。最後に、組織をヘマトキシリンで対比染色し、カバーガラスをのせた。
【０５３２】
ＦＦＰＥ前立腺癌組織ブロックの取得、加工、品質管理およびアノテーション
臨床的アノテーションおよび長期患者転帰情報を有する一組のＦＦＰＥヒト前立腺癌組織ブロックをＦｏｌｉｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから取得した。試料は適切な施設内倫理委員会承認を伴って収集されたものであり、患者の記録はすべて無名化した。候補バイオマーカー抗体の評価のため、臨床的アノテーションが限定的なＦＦＰＥヒト前立腺癌組織ブロックを他の市販の供給元から取得した。
【０５３３】
一連の５μｍ切片を各ＦＦＰＥブロックからカットした。アノテーションのため、各ＦＦＰＥブロックから切り出される最後の５μｍ切片をヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、ＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＸＴシステム（Ａｐｅｒｉｏ）を用いてスキャンした。スキャンした画像を遠隔観察し、ＧＳを、盲検様式で専門の有資格者の臨床解剖病理医がアノテーションした。グリーソンスコアパターンが最高値の４つの領域および最低値の２つの領域に、１ｍｍ直径コアに対応する注釈付きの丸印を付けた（図３２，上参照）。
【０５３４】
ＴＭＡブロックの作製
ＴＭＡブロックを修正型アガロースブロック手順（７０）を用いて作製した。試験ＴＭＡ（ＭＰＴＭＡ１０）を作製するため、本発明者らは、ＧＳおよび病理学的進行度分類に利用可能なアノテーションを有する前立腺摘除試料の７２個のＦＦＰＥ組織ブロックを選択し、これらのうち、３７例はＧＳ  ３＋３＝６とＴ２進行度分類を有していたが、３５例はＧＳ  ４＋３＝７または３＋３＝６もしくは３＋４＝７のいずれかのＧＳとＴ３ｂ進行度分類を有していた。患者試料１例あたり１つの１ｍｍコアを最低グリーソンパターン領域から採取し、アクセプターブロック内に配置した。
【０５３５】
Ｈ  ＴＭＡおよびＬ  ＴＭＡの構築のため、本発明者らは、臨床的アノテーションおよび長期患者転帰情報を有するＦＦＰＥヒト前立腺癌組織ブロックのコホートを使用した。各患者試料について、コアを最高グリーソンパターンを有する領域から採取し、Ｈアクセプターブロック内に保管した。次いで、第２のコアを最低グリーソンパターンを有する領域から採取し、Ｌアクセプターブロック内に入れた。Ｈブロック内への試料コアの配置順は無作為抽出し、Ｌブロック内のコアの位置はＨブロック内と同一にした。また、細胞株対照（表１８）のＦＦＰＥブロックのコアをすべてのＨ  ＴＭＡブロックおよびＬ  ＴＭＡブロックの上側部分と下側部分に配置した。終了したら、５μｍの連続切片を各ブロックから切り出し、代表的な切片をＨ＆Ｅで染色し、ＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＸＴシステムでスキャンした。次いで、Ｈ＆Ｅ染色コアの画像を観察されたグリーソンパターンについて有資格者の解剖病理医が盲検様式で独立してアノテーションした。
【表１８】
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【０５３６】
得られたＨ  ＴＭＡおよびＬ  ＴＭＡブロックは一組の患者試料に対して同一であったが、観察され得るグリーソンパターンは異なった（図３２，下）。この試験のため、２対のＴＭＡブロック（ＭＰＴＭＡＦ５Ｈと５Ｌ、６Ｈと６Ｌ）を、３８０例の患者試料由来のコアを用いて作製した。
【０５３７】
バイオマーカー選択
前立腺癌侵攻性に対するバイオマーカーを同定するため、本発明者らは、疾患および病状に広く適用可能であり得る選択／評価方法を開発した。図３３に示すこの方法は、生物学的ステージ、技術的ステージ、パフォーマンスステージおよび検証ステージを有するものとした。
【０５３８】
生物学的ステージでは、前立腺癌侵攻性に対する潜在的バイオマーカーの初期リストを公的に入手可能なデータからコンパイルした。次いで、このリストの優先順位を生物学的関連性、インシリコ解析、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｔｌａｓの検討（ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ）および必要とされるＭＡｂの市販による入手可能性に基づいて決定した。生物学的関連性の検討は細胞内の、特に疾患細胞内の作用機序に基づいた。インシリコ解析は、これまでに知られている遺伝子の増幅、欠失および変異、ならびにこのような遺伝子改変と疾患との間での単変量パフォーマンスまたは進行との相関に基づいた。Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｔｌａｓには疾患状態における種々の組織内のタンパク質発現レベルに関するデータが含まれている。
【０５３９】
技術的ステージでは、市販のＭＡｂを入手し、臨床試料由来のバイオマーカーを検出できる可能性について試験した。最初に、本発明者らは、悪性および良性前立腺組織の試料を、ＤＡＢ系ＩＨＣ染色手順を用いて染色し、良好な信号対ノイズ比を示し、上皮細胞染色に特異的な候補抗体選択した。本発明者らは、さらに、悪性および良性前立腺組織試料に対して好成績の候補を、ＩＦとともに記載（材料の補足および方法）の関心領域マーカーである上皮サイトケラチンＣＫ８およびＣＫ１８ならびに基底マーカーＣＫ５およびＴｒｉｍ２９を用いて試験した。ＩＦ基準を満たす抗体およびバイオマーカーをパフォーマンスステージへと進めた。
【０５４０】
パフォーマンスステージでは、ＭＡｂをＴＭＡにおいて試験した。パフォーマンスを、腫瘍上皮発現と疾患状態間の単変量相関について評価した。発現と疾患状態間の単変量相関を示すＭＡｂおよびバイオマーカーを次いで、大型Ｈ  ＴＭＡおよびＬ  ＴＭＡセットにおいて、単変量相関および他のマーカーとの組合せでのパフォーマンスの両方について評価した。
【０５４１】
画像取得
２つのＶｅｃｔｒａ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｌｉｄｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を自動画像取得に、記載のようにして（材料および方法の補足）使用した。マルチスペクトル画像を別々の各フルオロフォアシグナルのための画像に処理し、解析のためにＤｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  ｓｃｒｉｐｔ（Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  ＡＧ）で送った。
【０５４２】
Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ自動画像解析
本発明者らは、腫瘍同定およびバイオマーカー定量のための、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  ＸＤを用いた自動画像解析アルゴリズムを開発した。各１．０ｍｍ  ＴＭＡコアに対して、２つの２０倍画像視野を取得した。Ｖｅｃｔｒａマルチスペクトル画像ファイルをまず、ｉｎＦｏｒｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて多層ＴＩＦＦファイルに変換し、次いで、カスタマイズスペクトルライブラリーを、ＢｉｏＦｏｒｍａｔｓ（ＯＭＥ）を用いて単層ＴＩＦＦファイルに変換した。単層ＴＩＦＦファイルをＤｅｆｉｎｉｅｎｓワークスペースに、カスタマイズインポートアルゴリズムを用いてインポートし、各ＴＭＡコアについて、両方の画像視野ＴＩＦＦファイルが「マップ」として単一の「シーン」内にロードされ、解析されるようにした。
【０５４３】
自動適合二値化を使用し、本発明者らの画像解析アルゴリズムでの個々の各組織試料での組織のセグメント化に対する蛍光強度カットオフを規定した。ＴＭＡ内の細胞株対照コアは、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓアルゴリズムにおいて所定のコア座標に基づいて自動的に同定した。組織試料を、蛍光の上皮細胞マーカーおよび基底細胞マーカーを４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）とともに用いて上皮細胞、基底細胞および間質への分類のためにセグメント化し、さらに細胞質と核に区画化した。個々の腺領域を、基底細胞と隣接上皮構造間の関連する特徴に基づいて対象物関連特徴、例えば腺の厚さと併用して悪性または良性に分類した。すべての細胞株に上皮マーカーは存在せず、したがって、細胞株対照を組織対バックグラウンドに自家蛍光チャネルを用いてセグメント化した。アーティファクト染色、不充分な上皮組織またはピンぼけ画像を有する視野は、厳密マルチパラメータ品質管理アルゴリズムによって除去した。
【０５４４】
上皮マーカーおよびＤＡＰＩの強度を悪性および非悪性上皮領域において品質管理測定として定量した。バイオマーカーの強度レベルを悪性組織の細胞質、核または全細胞において所定の細胞成分内局在基準に基づいて測定した。悪性区画における平均バイオマーカーピクセル強度を、合格品質パラメータを有するマップにおいて平均し、各組織試料および細胞株対照コアについて単一の値を得た。
【０５４５】
データの階層化および解析におけるエンドポイント
３９種類のバイオマーカーの発現を腫瘍侵攻性および致死性との相関について、Ｈ  ＴＭＡおよびＬ  ＴＭＡを用いて調べた。疾患の侵攻性は前立腺の病態に基づいて規定した（侵攻性疾患＝外科的グリーソン≧３＋４またはＴ３ｂ、Ｎ＋、もしくはＭ＋）。侵攻性の解析では、本発明者らはマーカー相関を、コアグリーソン≦３＋４を有するＬ  ＴＭＡ試料および対応する適合Ｈ  ＴＭＡ試料の両方での測定に基づいて調べた。
【０５４６】
致死性転帰の解析では、本発明者らは、異なる２つの試料の組：（１）すべて測定値ＧＳ≦３＋４を有するコア；および（２）すべてのコアを作出した。
【０５４７】
コホート組成
表１２ａはコホート組成を示す。完全セットの臨床情報を有する試料のみを含めた。特定の組のバイオマーカーを用いて解析を行なう場合、マーカーに対する値を有する試料のみ考慮した。したがって、表内の数値は上限である。
【０５４８】
侵攻性および致死性の単変量解析
単変量解析の本発明者らの目的は：最終のマーカーセットに潜在的に含めるためのパフォーマンス評価として単変量挙動を特性評価すること、および網羅的多変量モデルの探索のための少数セットのマーカーを得ることの二要素性である。モデル設計はすべてＲ  ３．０において行ない、標準機能およびパッケージ、例えばｇｌｍ、ｓｕｒｖｉｖａｌ、ＫＭｓｕｒｖ、ｂｉｎｏｍおよびｐＲＯＣを使用した。バイオマーカーを２つの転帰：外科的ＧＳの予測および死亡の予測（致死性）に基づいて評価した。緩慢性またはより重症にカテゴライズされた外科的ＧＳの予測を、ＯＲ（ロジスティック回帰）およびバイオマーカー手段（線形回帰）の両方を用いてモデル設計した。致死性は、ＨＲ（従来のＣｏｘ比例ハザード）、ＯＲ（ロジスティック回帰）およびマーカー手段（線形回帰）を用いてモデル設計した。また、ノンパラメトリックでロバストな評価を得るため、Ｗｉｌｃｏｘｏｎおよび並べかえ検定を適用した。
【０５４９】
図３４Ａ〜Ｂはキーとなる結果を示す。また、単変量結果を、図３６Ａに示すように最終のマーカーセットの選択に直接考慮した。
【０５５０】
多マーカーモデルの徹底検索による侵攻性に対するバイオマーカーランキング
本発明者らはバイオマーカーを多マーカーモデルにおける重要性によってランキングした；技術的パフォーマンスをさらに改善するためにオリジナルの３９種類のセットから精選した３１種類のバイオマーカーを、さらに、徹底的なバイオマーカー検索に使用した。本発明者らは、Ｈ  ＴＭＡおよびＬ  ＴＭＡ解析においてＬ  ＴＭＡで試験した３１種類のバイオマーカーからの５種類までのバイオマーカーのすべての組合せを考慮した各バイオマーカーの組合せに対して、ブートストラップ法によって５００の訓練事例集合を作成し、関連する相補性テスト事例集合を得た。各訓練事例集合にロジスティック回帰モデルを適用し、次いで、各関連テスト事例集合で試験した。訓練およびテストのＡＵＣ（すなわち、統計量）ならびに訓練ＡＩＣを各回で得た。中央値および９５％ＣＩを３つのすべての統計量について得た。
【０５５１】
本発明者らは、次いで、モデル内のバイオマーカー選択頻度を考慮し、そのＡＩＣによって、および別々にそのテストＡＵＣによってソートした。モデルで得られた各ランキングについて、リストの上位１％および上位５％内のバイオマーカー利用頻度を調べた。次いで、モデルの少なくとも５０％内に含まれたバイオマーカーを同定した。
【０５５２】
表１５は、侵攻評価の予測におけるバイオマーカー頻度を示す。上位ランキングモデルのパフォーマンスは同様であった。さらに、上位ランキングモデル内のバイオマーカーの数はさまざまであった。モデルサイズに関連していると思われるこの問題を解決するため、本発明者らは、テストＡＵＣによってソートされたモデルの上位１％を考慮した。本発明者らは、いくつかの異なる集団仮定で得られた分布、例えば、中間コアＧＳを解析から除外した場合、または緩慢性スコアを含む場合、または高スコアを含む場合を検討した。最終の解析において、本発明者らは、８バイオマーカーモデルによってこの実験データセットにおけるパフォーマンスと複雑性間の最良のトレードオフが得られると結論付けた。
多マーカーモデルの徹底検索による致死性に対するバイオマーカーランキング
【０５５３】
致死性に対する予測のためのバイオマーカーランキングと同じモデル構築アプローチに従った。表１６は、致死性に対するバイオマーカー利用頻度（上位５％）を示す。
【０５５４】
最終バイオマーカーセットへの結果の統合
選択した最終の１２種類のバイオマーカーの組は、患者試料測定の単変量解析および多変量解析において評価されるその生物学的有意性を反映している必要があった。最終の選択を複雑にし、抑制するものは、試験に利用可能な特異的ＭＡｂの技術的制限を考慮であった。選択した最終バイオマーカーセットを図３６に示す。
【０５５５】
補足付録
結果
臨床的使用のためのロックダウン（ｌｏｃｋｅｄ  ｄｏｗｎ）モデルを開発するため、この試験で同定された１２種類のマーカーを前立腺癌ＦＦＰＥ生検試料の別の独立した試験に進めた（原稿は提出済）。この新しい試験において、本発明者らは、この１２種類のマーカーの最良のマーカーサブセットを同定し、以下のバイオマーカー：ＳＭＡＤ４、ＦＵＳ、ＣＵＬ２、ＹＢＸ１、ＤＥＲＬ１、ＰＤＳＳ２、ＨＳＰＡ９およびｐＳ６を含む得られた８−マーカーモデルをロックダウンした。完全性のため、本発明者らは、ＴＭＡコホートがマーカー選択プロセスの一助になるという理解の下、この試験において、このマーカーの組をＴＭＡ試料において解析した。本発明者らは、この場合も同じ患者パーティションを使用し、Ｌ  ＴＭＡにおいて訓練した後、Ｌ  ＴＭＡおよびＨ  ＴＭＡの両方試料でテストした。本発明者らは、４０例の疾患による死亡事象を含む２６８例の患者を解析した。侵攻性疾患の予測に対するＬ  ＴＭＡに基づいて得られたテストＡＵＣは０．６４（９５％ＣＩ：０．５６〜０．７１）であり、侵攻性疾患のテストオッズ比は１３／リスクスコアの変化単位（９５％ＣＩ：２．３〜３４１）であった。致死性転帰の予測のテストハザード比は１４／リスクスコアの変化単位（９５％ＣＩ：１．３〜３９３）であった。サンプリング誤差下において一般化できる可能性を確認するため、また、Ｌ  ＴＭＡ訓練から誘導したモデルもテストＨ  ＴＭＡにおいて試験し、結果は両方の適応症で一貫していた。Ｈ  ＴＭＡテストＡＵＣは０．７０（９５％ＣＩ：０．６２〜０．７８）であり、侵攻性疾患のオッズ比は４６／リスクスコアの変化単位（９５％ＣＩ：５．６〜１２９０）であった。致死性転帰の予測に対するＨ  ＴＭＡのテストハザード比は１９／リスクスコアの変化単位（９５％ＣＩ：１．４〜６２０）であった。
【０５５６】
材料および方法
定量的マルチプレックス免疫蛍光（ＱＭＩＦ）染色手順
ＱＭＩＦは、２回の初期ブロッキング工程、続く４回のＭＡｂインキュベーション工程（工程間に、適切な洗浄を伴う）で構成した。ブロッキングは、ビオチンブロッキング工程、続くＳｎｉｐｅｒ試薬（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）での処理（製造業者の使用説明書に従う）からなるものにした。第１のＭＡｂ  インキュベーション工程は抗バイオマーカー１マウスＭＡｂと抗バイオマーカー２ウサギＭＡｂの混合物、続いて抗マウスＩｇＧ  Ｆａｂ−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）と抗ウサギＩｇＧ  Ｆａｂ−ビオチンの混合物を含む第２の工程からなるものにした。第３の「可視化」工程は、抗ＦＩＴＣ  ＭＡｂ−Ａｌｅｘａ  ５６８、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  ６３３ならびにそれぞれ上皮に対するＭＡｂ（抗ＣＫ８−Ａｌｅｘａ  ４８８および抗ＣＫ１８−Ａｌｅｘａ  ４８８）および基底上皮に対するＭＡｂ（抗ＣＫ５−Ａｌｅｘａ  ５５５および抗Ｔｒｉｍ２９−Ａｌｅｘａ  ５５５）混合物を含むものにした。最終の第４の工程は、核染色のための４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）との短時間のインキュベーションを含むものにした。最後の洗浄後、スライドをＰｒｏｌｏｎｇ  ＧｏｌｄＴＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に設置した後、カバーガラスをのせた。スライドはイメージングの前後で不変的に−２０℃に維持した。
【０５５７】
ＦＦＰＥ組織ブロックの品質評価
各ＦＦＰＥブロックからの５μｍ切片を手作業にて、抗ホスホＳＴＡＴ３（Ｔ７０５）ウサギＭＡｂ、抗ＳＴＡＴ３マウスＭＡｂおよび関心領域マーカーで上記のようにして染色した。スライドを蛍光顕微鏡下で目視検査した。染色強度および自家蛍光に基づいて、切片およびその対応するＦＦＰＥブロックを４つの品質カテゴリーに分類した。
【０５５８】
画像取得
２つのＶｅｃｔｒａ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｌｉｄｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を、自動画像取得のために別の箇所に記載のようにして使用した。ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）およびＣｙ５ロングパスフィルターキューブを最大限のマルチプレックス能のために最適化した。Ｖｅｃｔｒａ  ２．０およびＮｕａｎｃｅ  ２．０ソフトウェアパッケージ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を、それぞれ自動画像取得およびスペクトルライブラリーの現像のために使用した。
【０５５９】
ＴＭＡ取得プロトコルを自動モードで製造業者の使用説明書（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に従って実行した。コア１つあたり２つの２０倍視野を、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣおよびＣｙ５フィルターを用いた連続露光を含むマルチスペクトル取得プロトコルを用いてイメージングした。最大限の再現性のため、Ｘ−Ｃｉｔｅ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｐｏｗｅｒ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｕｍｅｎ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）の補助を伴って光源強度を調整した後、各ＴＭＡスライドの画像を取得した。同じ抗体の組合せを含むスライドにはすべて、同一の露光時間を使用した。同じ抗体の組合せで染色した一組のＴＭＡスライドは同じＶｅｃｔｒａ顕微鏡でイメージングした。
【０５６０】
各蛍光色素ならびにＦＦＰＥ前立腺組織自家蛍光のスペクトルプロフィールを作成した。興味深いことに、２つの型の自家蛍光がＦＦＰＥ前立腺組織において観察された。典型的な自家蛍光シグナルは良性組織と腫瘍組織の両方に共通してみられたが、非定型の「明」の型の自家蛍光は、ほとんどが良性組織の上皮細胞に存在する明顆粒に特異的であった。この２つのスペクトルプロフィールの組合せを含むスペクトルライブラリーを使用し、自家蛍光バックグラウンドから個々の色素シグナルを分離または「アンミキシング」した。
【０５６１】
ＦＦＰＥ細胞株対照
選択した細胞株を標準的な条件で、表示したとおり（表１８）の収集前の処理をして、またはなしで培養した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、プレート上に直接、１０％ホルマリンで５分間固定し、次いで、掻き取り、ＰＢＳ中に収集し、固定を室温で１時間継続した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、Ｈｉｓｔｏｇｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に７０℃で再縣濁させ、１．５ｍｌ容微量遠心チューブ内で速やかにスピンダウンして濃縮細胞−Ｈｉｓｔｏｇｅｌペレットを形成した。このペレットを次いで、パラフィン中に包埋して標準的なパラフィンブロックにし、これをＴＭＡ構築のためのドナーブロックとして供した。ＣＣＮＤ１およびＳＭＡＤ４の誘導性ノックダウンを有するＤＵ１４５細胞を、「Ｔｅｔ−ｏｎｅ」システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を製造業者の使用説明書に従って用いて確立した。
【０５６２】
抗体の特異性アッセイ
抗ＡＣＴＮ１、抗ＣＵＬ２、抗デルリン１、抗ＦＵＳ、抗ＰＤＳＳ２、抗ＳＭＡＤ２、抗ＶＤＡＣ１、抗ＹＢＸ１および抗ＨＳＰＡ９を含むいくつかのＭＡｂを、標的特異的ノックダウン細胞および対照細胞のウエスタンブロッティング（ＷＢ）および免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイによって検証した（図３７）。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）配列および宿主細胞株の詳細を表１９に示す。細胞を１２ウェルプレート内に播種し、２５ｎＭのｓｉＲＮＡおよびＤｈａｒｍａＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）でトランスフェクトした；モックトランスフェクションにはトランスフェクション試薬のみを含めた。また、２種類の非標的化配列でトランスフェクトした細胞も対照として含めた。
【表１９−１】
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【表１９−２】
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【０５６３】
ＷＢアッセイでは、トランスフェクト細胞を７２時間目に収集し、Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害薬カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補給したＰｉｅｒｃｅ  ＲＩＰＡバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて溶解させた。タンパク質濃度をＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。試料を等しいタンパク質濃度に調整し、次いで試料バッファー（Ｂｏｓｔｏｎ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）と混合し、プレキャストＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  ４〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で泳動させた。試料をＰＶＤＦまたはニトロセルロース膜上に、ＩＢｌｏｔ装置（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて転写し、抗体を用いて４℃で一晩イムノブロッティングした後、二次マウスまたはウサギＭＡｂ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）とともにインキュベーションした。ブロットをＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて現像し、ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ  Ｑシステム（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ）での露光によって可視化した・
【０５６４】
ＩＨＣアッセイでは、１２ウェルプレート内でカバーガラス上にて培養した細胞を、トランスフェクション後７２時間目に氷上でメタノールにて２０分間固定した。この後、氷上で０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて透過処理を１０分間行なった。その後のＩＨＣアッセイには、ＵｌｔｒａＶｉｓｉｏｎ  ＬＰ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＨＲＰ  Ｐｏｌｙｍｅｒ／ＤＡＢ  Ｐｌｕｓ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の使用説明書に従って使用した。
【０５６５】
ＳＭＡＤ４抗体を、ＳＭＡＤ４陽性細胞株ＰＣ３とＳＭＡＤ４陰性細胞株ＢｘＰＣ３のＷＢおよびＩＨＣアッセイによって検証した。ホスホ−Ｓ６抗体は、未処理のＤＵ１４５細胞およびＬＹ２９４００２処理ＤＵ１４５細胞のＷＢおよびＩＨＣによって検証した。
【０５６６】
細胞増殖アッセイ
ＨｅＬａ細胞を２種類の非標的化ｓｉＲＮＡならびにＨＳＰＡ９に特異的なｓｉ９−１１で一価的にトランスフェクトした（ｓｉＲＮＡ配列の詳細については表１９参照）。トランスフェクションの４８時間後、細胞を９６ウェルプレート内に再度プレーティングし、３連で１０００細胞／ウェルにて播種した。細胞の増殖を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の使用説明書に従って用いて、再度プレーティング後の０、２４、７２および１２０時間目にモニタリングした。
【０５６７】
クローン原性アッセイ
トランスフェクション後４８時間目、ＨｅＬａ細胞を、２ｍｌの細胞培地を入れた６ウェルプレート内に５００細胞／ウェルで再度プレーティングした。プレーティング後、７日間目に細胞を、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｖｉｏｌｅｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ）を用いて固定した。各ウェルの画像を、ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ  Ｑシステム（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ）内のＡｌｐｈａＶｉｅｗソフトウェアを用いて取得し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて処理した。
【０５６８】
細胞生存性アッセイ
ＨｅＬａ細胞を、トランスフェクション後１２０時間目に収集した。細胞は、トリプシンを用いて収集した。１２ウェルプレートの各ウェルからの細胞ペレットを５００μの細胞培地中に縣濁させた。細胞縣濁液（９５μｌ）を５μのＳｏｌｕｔｉｏｎ  ５（ＶＢ−４８／ＰＩ／ＡＯ）と混合し、３０μの混合物をＮＣ−Ｓｌｉｄｅ  Ａ２に負荷した（ともにＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ製）。差細胞生存性を、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ−３０００ＴＭ（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ）によって製造業者の使用説明書に従って測定した。
【０５６９】
カスパーゼアッセイ
ＨｅＬａ細胞を、ｓｉＲＮＡ  トランスフェクション後１２０時間目にトリプシンを用いて収集した。細胞を２×１０６細胞／ｍｌで縣濁させた。細胞懸濁液の９３μアリコートを５μｌの希釈ＦＬＩＣＡ試薬（ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および２μのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と混合した。混合物を３７℃で１時間インキュベートした。ＨｅＬａ細胞を１×Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２回洗浄した。細胞ペレットを１００μｌの１×Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒおよび２μのプロピジウムイオダイド中に縣濁させた。混合物の３０μｌアリコートをＮＣ−Ｓｌｉｄｅ  Ａ２に負荷し、カスパーゼアッセイのためのＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ−３０００ソフトウェアを用いて読み取りを行なった。ＦＬＩＣＡ染色に対して陽性の細胞をアポトーシス細胞としてカウントした。
【０５７０】
ＨＳＰＡ９（モルタリン）の同定
Ｌｅｉｃａ「抗ＤＣＣ」抗体標的（図３７）の同定のため、分取用免疫沈降を行なった。１０枚分のｐ１００プレートのコンフルエントＡ５４９細胞を、プロテアーゼ阻害薬を加えた５ｍｌのＲＩＰＡバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて収集した。細胞溶解物を１４，０００ｒｐｍで５分間スピンダウンし；上清みを８０℃で５分間加熱し、次いで氷上で冷却し、１４，０００ｒｐｍで５分間、再度スピンダウンした。上清みを収集し、２μｇの「抗ＤＣＣ」抗体を事前に結合させた５０μのＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ／Ｇビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した後、振盪しながら４℃で２時間インキュベートした。ビーズをＴＢＳ＋１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００で３回洗浄し、３０μの１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ負荷バッファーとともに煮沸した。上清みを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に負荷し、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下で分離させた。このゲルを質量分析のための銀染色キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色し；特異的バンドを切り出し、トリプシンで消化し、Ｔａｐｌｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ハーバード大学医学大学院）でのＭＳ／ＭＳ配列決定質量分析に供した。同定されたペプチドをＨｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ参照データベースとアラインメントした。同定されたタンパク質ＨＳＰＡ９を、記載のようにしてさらに検証した。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【０５７１】
実施例７：前立腺癌の予後良好と予後不良の識別のためのプロテオミクスインサイチュ生検試験の臨床的検証
概要
前立腺癌の侵攻性および適切な治療は生検材料のサンプリングに従って決定される。現在使用されている臨床的および病理学的パラメータは正確なリスク予測には不充分であり、第１に過剰処置となるだけでなく、治癒的治療の機会を失うことにもなっている。
【０５７２】
前立腺の病態を予測するインタクトな組織の生検材料に対する８バイオマーカープロテオミクスアッセイをマッチ前立腺摘除被検試料を伴う３８１例の患者生検材料の試験において規定し、その後、２７６例の患者の症例の盲検において検証した。前立腺摘除に基づいて病理学的に「予後良好」と「予後不良」の疾患プロフィールを識別できる可能性を、リスク分類のための現行の標準医療（ＳＯＣ）と相対して調べた。
【０５７３】
検証試験は、２つの所定のエンドポイント予後良好病態を予後不良病態から分けることを満足するものであった（ＡＵＣ，０．６８，Ｐ＜０．０００１，オッズ比＝２０．９）。予後良好（リスクスコア≦０．３３）および予後不良（リスクスコア＞０．８０）の患者カテゴリーはそれぞれ、１０％および５％の「偽陰性」率および「偽陽性」率に基づいて規定した。リスクスコア≦０．３３では、非常に低リスクおよび低リスクＮＣＣＮならびに低リスクＤ’Ａｍｉｃｏ群における予後良好患者に対する予測値は、それぞれ９５％、８１．５％および８７．２％であり、ＳＯＣリスク群のもの（それぞれ、８０．３％、６３．８％および７０．６％）より高かった。予後不良患者に対する予測値は、全リスク群においてリスクスコア＞０．８で７６．９％であった。全リスク群において、高リスクスコアは予後良好症例の頻度の低下と相関していた。ＮＣＣＮでの純再分類改善度は０．３４（Ｐ＜０．００００１）であり、Ｄ’Ａｍｉｃｏでは０．２４（Ｐ＝０．０００１）であった。
【０５７４】
この８バイオマーカー試験により、ＳＯＣリスク階層化システムの情報に対して個別の独立した補完的な情報が得られ、生検時における臨床的決断が補助され得る。
【０５７５】
序論
２０１４年、米国では推定２３３，０００例が新たに前立腺癌と診断されている１。患者の大部分は初期段階の臨床的に局在性疾患を有する患者である１〜５。前立腺癌の著しい異質性およびその過剰処置に関する懸念を考慮すると６〜８、生検後および決定的処置の前に、良好な予後を有する緩慢性症例を生存率が不良のより侵攻性の症例と識別することは重要である９。針生検によって得られた組織の病理学的評価は、前立腺癌診断を確認するため、および患者のリスクカテゴリーを決定するための両方に必須である１０。利用可能な臨床的および病理学的パラメータを組み合わせるいくつかの分類システムが開発されている９，１１。しかしながら、すべての分類システムは完璧ではなく、いずれも個別のリスクスコアを確認するために設計されたものではない１２〜１４。
【０５７６】
診断時に低リスク疾患を有するとみなされた患者のおよそ２５〜３０％は、その後、腫瘍病態の悪性度がアップする１４〜１６。実際、有意な比率の患者が、根治的前立腺摘除組織の解析後、最初の「生検」グリーソンスコアからより正確な「外科的」または病理学的グリーソンスコアに悪性度アップまたは悪性度ダウンされる１６。このような修正は、初期の生検材料のサンプリング誤差１７または病理医の腫瘍分類における不一致１８を反映するものであり得、どちらも、疾患の過剰処置または処置不充分の一因となり得る７。特に、針生検試料におけるグリーソンパターン４の過大判定または過小判定の懸念があり１９ １６，２０，２１、癌が器官限局性であれ最終的に転移性の可能性を有する器官非限局性であれ、生検材料において患者を低悪性度から中等度悪性度の疾患を有すると判定できる必要性が継続的に存在している。
【０５７７】
臨床的リスク予後診断の情報を得る遺伝子マーカーの同定は進歩しており、その一例は、死亡リスクを予測するために使用される一組の細胞周期進行遺伝子の発現である２２〜２５。また、腫瘍異質性の状況下で、ごくわずかな癌細胞のものであっても最も侵攻性腫瘍領域で測定が可能なタンパク質バイオマーカーのインサイチュ同定も着目されている２６〜２８。定量的マルチプレックスプロテオミクスインサイチュイメージング（ＱＭＰＩ）アプローチを使用し、本発明者らは、独立した大規模臨床試験において、サンプリング誤差に耐久性となるようにあつらえられ、前立腺の侵攻性の病態および致死性転帰の両方を予測する１２種類の生検バイオマーカー候補を同定した（以下の実施例６および補足付録参照）。
【０５７８】
ここに、別々の２つの生検の臨床試験（各々、マッチしたアノテーション付き前立腺摘除被検試料を伴う）において、これらの１２種類のマーカーから誘導した８バイオマーカー指標のモデルの開発およびその後の盲検的検証を報告する。第１の試験は、バイオマーカー指標モデルおよびＱＭＰＩアッセイ（ＰｒｏＭａｒｋＴＭ）をロジスティック回帰（訓練−テスト）解析によって規定してロックダウンし、疾患の侵攻性の可能性に対するリスクスコアを得るために設計した。盲検的臨床的検証試験により、臨床的に関連する二分されるエンドポイントである予後良好病態と予後不良病態を前立腺摘除時に生検アッセイで予測できる可能性を評価した。アッセイとリスクスコアで得られる情報の違いを２つのリスク階層化システム、Ｄ’ＡｍｉｃｏシステムおよびＮＣＣＮガイドラインカテゴリー９，１１と比較し、決断における潜在的補助としての個々の患者の予後の予測におけるさらなる精度が得られる可能性を考慮した。
【０５７９】
方法
タンパク質のインサイチュ測定のためのＱＭＰＩアプローチは以下の補足付録に記載のとおりである。
【０５８０】
臨床モデル設計試験およびアッセイロックダウン
前立腺の侵攻性病態および致死性転帰の両方と相関していることが示された１２種類の以前に同定されたバイオマーカー候補から最良のマーカーサブセット指標を規定するため、生検のときの組織試料を用いた非介入的後ろ向き臨床モデルの開発研究を考案した。この研究の目的は、外科的グリーソン３＋３および≦Ｔ３ａ（「ＧＳ６」）を有する前立腺の病態と外科的グリーソン≧３＋４または非局所性の＞Ｔ３ａ、ＮもしくはＭ（「非ＧＳ６」）を有する前立腺の病態とを、前立腺摘除時に外科的グリーソン３＋３を有する腫瘍が転移しないことを示す試験に基づいて識別できるモデルを規定することであった２９，３０。本研究プロトコルは治験審査委員会（ＩＲＢ）によって承認されたものであり、患者の同意が得られたか、またはそれに応じて撤回された。
【０５８１】
ロバストなアッセイを開発するため、典型的な米国内患者コホートである他施設：Ｕｒｏｌｏｇｙ  Ａｕｓｔｉｎ、Ｃｈｅｓａｐｅａｋｅ  Ｕｒｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、クリーブランド・クリニック、Ｍｉｃｈｉｇａｎ  ＵｒｏｌｏｇｙおよびＦｏｌｉｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓで募集を行なった。生検材料試料の組み入れ／除外基準は、該アッセイの常套的臨床的使用の際に適切であろうものに適合していた（補足付録）。生検グリーソン≧４＋３を有する患者は、２名の専門の病理医による分類が３＋４および４＋３の両方と不一致であった限定数の生検材料を除き、除外した。生検の適合および前立腺摘除病態報告に関する情報を含むアノテーションを必要とした。試料はすべて検査室での処理時において盲検的であった。
【０５８２】
バイオマーカー指標を、独立した訓練セットおよびテストセットのブートストラップ解析によって決定される「非ＧＳ６」の確率を推定するためのロジスティック回帰モデルとして最適化した。モデルを受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）によって特性評価し、赤池情報量規準（ＡＩＣ）の値の増大３１、訓練事例集合でのＡＵＣの値の減少およびテストセットでのＡＵＣの値の減少によってソートした。次いで、マーカーの使用頻度を最も高ランキング１０％のモデルにおいて調べ、バイオマーカーセットを最終決定した。０から１の間で連続する数のリスクスコアをコンピュータ処理し、「非ＧＳ６」病態の尤度を推定した。規定されたロックダウンアッセイを確認するために感度解析を行なった。
【０５８３】
臨床的検証試験
非介入的盲検的で前向きに設計され後ろ向きに収集された臨床研究を行ない、前立腺の病態の予測における８バイオマーカー生検アッセイのパフォーマンスを単独で、および患者リスクカテゴリー化の現行の標準医療（ＳＯＣ）と比較して検証した。コホートは、モントリオール大学（カナダ）で管理された患者のマッチ前立腺摘除アノテーションを有する生検試料で構成した。同意の基準およびＩＲＢ承認措置は臨床開発研究の場合のようにした。組み入れ基準は、集中グリーソンスコア３＋３または３＋４生検材料（２名の専門の病理医による分類が３＋４および４＋３で不一致の生検材料も同様に含めた）、ならびに病理学的ＴＮＭ進行度分類、ＰＳＡレベルおよびグリーソンスコアマッチ前立腺摘除にした。アッセイのパフォーマンスを、診断のリスクスコアのＲＯＣおよび対応するＡＵＣを用いて評価した。
【０５８４】
前立腺の病態２つの共一次エンドポイントをＡＵＣによって評価される生検アッセイ誘導リスクスコアによって検証した：
１．「予後良好」病態−外科的グリーソン≦３＋４および器官限局性疾患（≦Ｔ２）に対して
「予後不良」病態  −外科的グリーソン≧４＋３または器官非限局疾患（Ｔ３ａ、Ｔ３ｂ、ＮもしくはＭ）
および
２．「ＧＳ６」病態−外科的グリーソン３＋３および局在性疾患（≦Ｔ３ａ）に対して
「非ＧＳ６」病態−外科的グリーソン≧３＋４または非局在性疾患（Ｔ３ｂ、ＮもしくはＭ）
【０５８５】
予後良好病態と予後不良病態（対比）を、最終患者カテゴリー化に対して検証試験によって選択した。これは、最小グリーソン４パターンを有する器官限局性疾患はおそらく無害のままであり、高悪性度（優位なグリーソン４パターン）または器官非限局疾患よりも有意に良好な長期予後を有するという認識の高まりを反映する３０，３２，３３。
【０５８６】
二次解析には、リスクスコアの最高四分位対最低四分位のオッズ比（ＯＲ）および連続ステップのＯＲ（点推定）を含めた。本発明者らは、本発明者らの診断試験のリスク転帰をＤ’ＡｍｉｃｏおよびＮＣＣＮによって規定されたＳＯＣリスク分類カテゴリー９，１１と、陽性的中率（ＰＰＶ）を用いて比較した。純再分類改善度（ＮＲＩ）の規定および統計学的解析はＰｅｎｃｉｎａ３４に記載のとおりに行なった
【０５８７】
両臨床研究の統計学的計画については補足付録を参照のこと。
【０５８８】
結果
臨床モデル設計試験およびアッセイロックダウン
モデル開発試験に含めた３８１例の患者の腫瘍の特徴を表２０に示す。図３９Ａ〜Ｃはモデル最適化プロセスを示す。図３９Ａは、評価したバイオマーカーと関連している単変量ＯＲを示す。モデルパフォーマンスを評価し、いくつかの高パフォーマンスモデル、例えばテストＡＵＣ０．７９（９５％信頼区間［ＣＩ］、０．７２〜０．８４）を同定した。図３９Ｂは、最大８種類のバイオマーカーを用いて全モデルで得られたバイオマーカー頻度を示す。得られたロックダウン指標を図３９Ｃに示す。
【表２０−１】
2016521966.tif 000050
【表２０−２】
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【０５８９】
臨床的検証試験
表２０に、臨床的検証試験の２７６例の試料の腫瘍特徴をまとめる。表２１に示すように、本試験では、２つの共一次エンドポイントが満たされ、アッセイを両方のエンドポイントについて検証した（予後良好病態：ＡＵＣ，０．６８［９５％ＣＩ，０．６１〜０．７４］；Ｐ＜０．０００１；リスクスコアのＯＲ，２０．９／変化単位；「ＧＳ６」病態：ＡＵＣ，０．６５［９５％ＣＩ，０．５８〜０．７２］；Ｐ＜０．０００１；リスクスコアのＯＲ，１２．６／変化単位）。さらなる詳細を図４１および４２に示す。
【表２１】
2016521966.tif 000052
【０５９０】
本発明者らは、２５６例をＮＣＣＮおよびＤ’Ａｍｉｃｏ基準に従って分類するのに充分なアノテーションを有した。予後良好病態に対するこのコホートでのバイオマーカー指標アッセイのパフォーマンスを図４３に示す。パフォーマンスは全コホートと同様であった（ＡＵＣ，０．６９［９５％ＣＩ，０．６３〜０．７６］；Ｐ＜０．０００１；リスクスコアのＯＲ，２６．２／変化単位）。
【０５９１】
図４０は、予後良好疾患／予後不良疾患に対する予後診断の補助としてのリスクスコアと関連している感度および特異度、ならびにＮＣＣＮおよびＤ’Ａｍｉｃｏカテゴリーにおけるリスクスコアの分布を示す。図４０Ａは、この試験集団で該分子指標に基づいて同定された予後良好カテゴリーの一例を示す。予後良好カテゴリーに対して０．３３の閾値により９０％（９５％ＣＩ，８２％〜９４％）の感度（Ｐ［リスクスコア＞０．３３｜予後不良病態］）が得られ、これは、予後不良病態を有する患者において偽陰性率を１０％（９５％ＣＩ，６％〜１８％）に抑える。同様に、図４０Ｂにおいて、９５％（９５％ＣＩ，９０％〜９８％）の特異度（Ｐ［リスクスコア≦０．８０｜予後良好病態］）を有する予後不良カテゴリーがこの試験集団において同定され得、これは、予後良好病態を有する患者において偽陽性率を５％（９５％ＣＩ，２％〜１０％）に抑える。
【０５９２】
本発明者らはリスクスコアの予測値を評価し、これをＮＣＣＮおよびＤ’Ａｍｉｃｏリスクカテゴリーのものと比較した（表２２）。≦０．３３のリスクスコアで予後良好疾患が同定されるＰＰＶは８３．６％（特異度，９０％）であった。逆に、＞０．８０のリスクスコアでは、２３．１％の患者が予後良好疾患を有した（すなわち、７６．９％が予後不良疾患を有した）。この試験集団に基づくと、これは≦０．３３または＞０．８のリスクスコアを有する患者の３９％に言い換えられ、そのうち８１％が正確に同定される。
【表２２−１】
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【表２２−２】
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【表２２−３】
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【０５９３】
本発明者らは、さらに、本発明者らのリスクスコアによる予後良好疾患を有する患者の各ＮＣＣＮカテゴリーにおける分布を調べた（図４０Ｃおよび表２２）。≦０．３３のリスクスコアを使用すると、予後良好疾患のＰＰＶはＮＣＣＮ中間リスクでは７５％、ＮＣＣＮ低リスクでは８１．５％、およびＮＣＣＮ非常に低リスクでは９５％であった（図４０Ｃおよび表２２）。これは、ＮＣＣＮリスクカテゴリー単独（中間リスクでは４０．９％、低リスクでは６３．８％および非常に低リスクでは８０．３％であった）で得られるＰＰＶと対照的である（表２２）。したがって、本リスクスコアによりＮＣＣＮリスクカテゴリーに対して個々の患者に関するさらなる情報が得られた。図４０Ｄに示すように、リスクスコアの増大は各ＮＣＣＮカテゴリーにおける予後良好症例頻度の減少と相関していた。Ｄ’Ａｍｉｃｏカテゴリーと比較すると同様の結果が得られた（図４０Ｅおよび図４０Ｆ）。
【０５９４】
ＳＯＣとの関連におけるリスクスコアの有益性を確認するため、本発明者らは、ＮＣＣＮおよびＤ’Ａｍｉｃｏと比較した予後良好カテゴリーおよび予後不良カテゴリーに対するＮＲＩ解析を行なった。表２２に示した基礎データを使用し、本発明者らは、ＮＣＣＮのＮＲＩは０．３４（Ｐ＜０．００００１；９５％ＣＩ，０．２０〜０．４８）、およびＤ’Ａｍｉｃｏでは０．２４（Ｐ＝０．０００１；９５％ＣＩ，０．１２〜０．３５；図４４参照）であることを見出した。これは、本試験により、ＳＯＣ分類システム単独によって示されるものにさらなる識別能が得られることを示す。
【０５９５】
考察
マッチ前立腺摘除被検試料を用いた前立腺癌生検試料において行なった２つの臨床的研究：開発研究および盲検的検証試験の結果をここに報告する。これらの研究は、前立腺内の高リスクフィーチャーの存在ならびに前立腺外拡張および転移の可能性を生検時に予測するために使用され得る新規なプロテオミクス多バイオマーカーアッセイの精度および妥当性を示す。本発明者らの第１のモデル構築試験では、最適な８バイオマーカー指標を、腫瘍侵攻性および致死性を予測することが以前に示された１２種類の候補バイオマーカーから決定した。本試験により８バイオマーカー指標ならびに得られた個別のリスクスコアを、「非ＧＳ６」前立腺の病態（外科的グリーソンスコア≧３＋４もしくは非局所性＞Ｔ３ａ、Ｎ、Ｍ）の予測のロジスティック回帰分析に基づいて規定した。
【０５９６】
第２に、盲検的臨床的検証試験は、以下のとおり：「ＧＳ６」病態（外科的グリーソン３＋３＝６および≦Ｔ３ａと規定）および「予後良好」病態（器官限局性前立腺の病態（外科的グリーソン３＋３または３＋４；≦Ｔ２と規定）の臨床的および病理学的パラメータの独立した前立腺の病態を予測するその２つの共一次臨床的エンドポイントを満たしていた。さらに、本発明者らのリスクスコアによりＳＯＣリスク階層化に対して識別的および補完的な個別化情報が付加される。
【０５９７】
最近の研究で、器官限局性グリーソン３＋４疾患を有する患者の長期生存は、器官非限局疾患を有する患者または優位なグリーソンパターン４もしくはそれより高いを有する腫瘍よりも有意に良好であること１９，３２，３３ならびに前者の群に対する据え置き治療によって長期転帰は有意に変わらないこと３５〜３７が示されている。現在、ほとんどのリスク階層化システムではグリーソン７生検材料間の識別がなされず、典型的には、積極的監視の候補とみなされた患者は、生検グリーソンスコア≦６のみを含む「非常に低リスク」または「低リスク」群に属する３，９。しかしながら、外科的グリーソンと比較すると、グリーソン分類３＋４生検材料のうち２５％前後は「悪性度ダウン」され、同様のパーセンテージのグリーソン分類３＋３生検材料が「悪性度アップ」され、これは、主に生検材料のサンプリング誤差および病理医の不一致のためである１６ ２０。これに基づくと、グリーソン分類３＋３および３＋４生検材料のための分子エビデンス系試験の必要性が高く２１、本発明者らは、この適応症のための本発明者らの試験を開発した。予後良好症例（外科的グリーソン３＋３または３＋４、器官限局性［≦Ｔ２］腫瘍）と予後不良不良（前立腺外拡張［Ｔ３ａ］、精嚢浸潤［Ｔ３ｂ］、リンパ節もしくは遠位転移または４もしくはそれより高い優位なグリーソンパターン）とを識別するための予後良好エンドポイントを開発した。
【０５９８】
本発明者らの研究は、テストリスクスコア≦０．３３では、非常に低リスクＮＣＣＮ  および低リスクＮＣＣＮならびに低リスクＤ’Ａｍｉｃｏ群において、予後良好病態を有する患者が同定される予測値は、それぞれ９５％、８１．５％および８７．２％であり、これらのリスク群単独で得られるものより高い値であることを示す。さらに、本試験は、おそらく間違いなく積極的監視に適さない予後不良病態を有する患者を、両方のリスク階層化システムで、全リスク群においてリスクスコア＞０．８で７６．９％の予測値を有する高い信頼度で同定することもできる。個々の患者に対する本試験に基づく患者の階層化の有意性は、全リスク階層化群においてテストリスクスコアの増大が観察される予後良好症例の頻度の減少と相関しているという事実によって示される。ＳＯＣと比べて該リスクスコアによって得られるさらなる情報の尺度をＮＲＩ解析によって得た。本発明者らは、ＮＣＣＮのＮＲＩは０．３４（Ｐ＜０．００００１；９５％ＣＩ，０．２０〜０．４８）、Ｄ’Ａｍｉｃｏでは０．２４（Ｐ＝０．０００１；９５％ＣＩ，０．１２〜０．３５）であることを見出した。予後良好病態および予後不良病態を有する患者のうち、それぞれ７８％および７６％がＮＣＣＮリスク群自体で明白なものより低いリスクおよび高いリスクに正しく調整された（図４４）。
【０５９９】
諸実施形態では、本発明者らのリスクスコアを、マルチプレックスプロテオミクスイメージングプラットフォーム（補足付録）を用いたインタクトな組織での８種類のバイオマーカーの定量測定に基づいて作成している。このアプローチは、解析前に組織をホモジナイズする遺伝子発現系試験と比べていくつかの潜在的利点を有する。第１に、本試験が腫瘍組織に対する良性組織の比率の多様性に対してロバストとなることである。これは、インタクトな癌細胞でのマーカー測定に支障をきたさないからである。さらに、本試験により、分子情報および形態学的情報の組込みが可能であり、わずかな癌細胞しか必要とされない。
【０６００】
本発明らのモデルにおける８種類のバイオマーカーは、組織サンプリング誤差にもかかわらず侵攻性および致死性転帰の両方を予測すると同定された１２種類のバイオマーカー候補のサブセットを構成するものである。これは、報告されているように、本試験に使用した病態エンドポイントが長期転帰にも関連していることを示す２９，３２，３３。
【０６０１】
結論として、本発明者らの結果により、前立腺癌の個別化予後診断に対するこの臨床的バイオマーカー生検試験の有用性およびその治療選択肢に対する影響が示される。予後診断能が現在では限定的であるＳＯＣと比べて異なる個々の患者の情報を改善できる可能性は臨床的決断における有用な補助となる。
【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【０６０２】
材料の補足
図４１Ａ〜Ｅ、図４２Ａ〜Ｃ、図４３Ａ〜Ｃ、図４４Ａ〜Ｂおよび図４５Ａ〜Ｃは、さらなる情報を示し、上記の図面の簡単な説明に記載したものである。
【０６０３】
定量的マルチプレックスプロテオミクスイメージング（ＱＭＰＩ）のための方法
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）前立腺癌生検組織スライドを、腫瘍上皮の形態学的物体認識と分子バイオマーカー測定が統合されたインタクトな組織のための定量的マルチプレックスプロテオミクスイメージング（ＱＭＰＩ）プラットフォームを用いて個々のスライドレベルで解析した。抗体の検証、染色プロトコル、画像取得、画像解析および実験間対照は後述する。
【０６０４】
アッセイの説明およびバイオマーカー−抗体の検証
アッセイは、図４５に図示した染色プロトコルに概略を示した４つのスライドを用いて実施した。
【０６０５】
３（トリプレックス）バイオマーカーの４つの組合せ、各々：Ａ）ＰＬＡＧ１、ＳＭＡＤ２、ＡＣＴＮ１；Ｂ）ＶＤＡＣ１、ＦＵＳ、ＳＭＡＤ４；Ｃ）ｐＳ６、ＹＢＸ１、ＤＥＲＬ１；Ｄ）ＰＤＳＳ２、ＣＵＬ２、ＤＣＣを使用した。使用した各一次抗体を特異性について検証し、ＰＬＡＧ１の特異性は不充分であることがわかった；したがって、これを潜在的指標から除外した。各トリプレックスアッセイは、初期ブロッキング工程、続いて５回の連続インキュベーション工程（工程間に、適切な洗浄を伴う）からなるものにした。
【０６０６】
１）抗バイオマーカー２（ウサギモノクローナル抗体［ＭＡｂ］）と抗バイオマーカー３（マウスＭＡｂ）の混合物とのインキュベーション
【０６０７】
２）Ｚｅｎｏｎ抗マウスＩｇＧ  Ｆａｂ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とＺｅｎｏｎ抗ウサギＩｇＧ  Ｆａｂ−ビオチンの混合物とのインキュベーション
【０６０８】
３）ＦＩＴＣにコンジュゲートさせた抗バイオマーカー１  ＭＡｂとのインキュベーション
【０６０９】
４）抗ＦＩＴＣ  ＭＡｂ−Ａｌｅｘａ  ５６８、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  ６３３、抗ＨＲＰ−Ａｌｅｘａ  ６４７、抗ＣＫ８−Ａｌｅｘａ  ４８８、抗ＣＫ１８−Ａｌｅｘａ  ４８８、抗ＣＫ５−Ａｌｅｘａ  ５５５および抗Ｔｒｉｍ２９−Ａｌｅｘａ  ５５５の混合物を用いた可視化工程
【０６１０】
５）核染色のためのＤＡＰＩとの短時間のインキュベーション
【０６１１】
最終の洗浄後、スライドをＰｒｏｌｏｎｇＧｏｌｄ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）設置し、カバーガラスをのせ、スライドを−２０℃で一晩保存した後、画像取得を行なった。
【０６１２】
スライド加工および染色プロトコル
スライド加工および染色工程の大部分は、最大限の再現性を確実にするために自動化した。切片をまず、キシレン／等級別アルコール中でＳｔａｉｎＭａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて脱パラフィンした。抗原賦活は、０．０５％無水シトコラン酸溶液を用いて９５℃で４５分間、Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ  ＰＴモジュール（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行なった。スライドはＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  ３６０または７２０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、上記のアッセイ形式を用いて染色した。生検材料の場合の試料は２５スライド／Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒのバッチ式で染色し、１つの細胞株組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）は各トリプレックスアッセイ形式の対照スライド（下記参照）にした。
【０６１３】
画像取得
各トリプレックスアッセイでは、１つの特定のＶｅｃｔｒａ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｌｉｄｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（２００−スライド容量）を定量的マルチプレックス免疫蛍光画像取得に使用し、最大限のスペクトル解像および最小限のフルオロフォア間ブリードスルーを可能にする最適化されたＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣおよびＣｙ５ロングパスフィルターキューブを使用した。差異を最小限にするため、Ｘ−Ｃｉｔｅ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｐｏｗｅｒ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｕｍｅｎ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いた各実行の前に各システムでの光強度を較正した。Ｖｅｃｔｒａ  ２．０、Ｉｎｆｏｒｍ  １．３およびＮｕａｎｃｅ  ２．０ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を、それぞれ画像取得、組織検索アルゴリズムの作成およびスペクトルライブラリーの開発に使用した。
【０６１４】
画像取得プロセスでは、まず、スライド全体の画像を４×モノクロームＤＡＰＩフィルタリング画像のモザイクで取得した。次いで、画像取得プロトコルに含めた初期組織検索アルゴリズムを用いて組織の位置を決定し、次いでこれを画像の再度取得に供し、このときは４×ＤＡＰＩおよび４×ＦＩＴＣの両方のモノクロームフィルターを使用した。次いで、本プロトコルに含めた最終組織検索アルゴリズムを適用し、すべての２０倍視野に充分な量の組織が含まれた画像が取得されることを確実にした（図４５Ｂ）。
【０６１５】
画像取得プロトコルに含めたアルゴリズムでは、データ収集が、充分な量の組織を含む２０倍視野に制限された。アッセイに使用したマルチスペクトル取得プロトコルはＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣおよびＣｙ５フィルターの連続露光を有した。画像取得が終了したら、画像キューブを、その後の個々のチャネルへの自動アンミキシングおよびＤｅｆｉｎｉｅｎｓソフトウェアにより処理のために自動でサーバーに格納した。
【０６１６】
画像解析およびリスクスコアモデルのための入力
本発明者らは、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  ＸＤ（Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  ＡＧ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、腫瘍同定およびバイオマーカー定量のための画像解析アルゴリズムを開発した。生検組織の悪性上皮領域および良性上皮領域の輪郭を描くためにソフトウェアを使用し、排他的に悪性領域でのマーカー強度の測定を可能にした。各生検試料に対して、ＣＲｉ  Ｖｅｃｔｒａ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いていくつかの２０倍画像視野をスキャンし、マルチスペクトル画像ファイルとして保存した。組織試料全体の画像を取得するために、所与のスライドに対して１４０もの多くの個々の視野をスキャンした。三連の１１種類の異なるＦＦＰＥ細胞株および二連の２種類の前立腺摘除組織試料を、別個の品質管理スライドアレイで対照として使用し、各１．０ｍｍ品質管理細胞株または組織コアについて、２つの２０倍画像視野をスキャンした（すなわち、合計で各細胞株対照では６つの画像および各組織対照では４つの画像）。Ｖｅｃｔｒａマルチスペクトル画像ファイルをまず、ｉｎＦｏｒｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）ａｎｄ  カスタマイズスペクトルライブラリーを用いて多層ＴＩＦ形式に変換し、次いでＢｉｏＦｏｒｍａｔｓ（ＯＭＥ）を用いて単層ＴＩＦＦファイルに変換した。単層ＴＩＦＦファイルをＤｅｆｉｎｉｅｎｓワークスペースに、各生検試料および各品質管理について、すべての画像視野ＴＩＦＦファイルが「マップ」として単一の「シーン」内に負荷され、解析されるようにカスタマイズインポートアルゴリズムを用いてインポートした。
【０６１７】
自動適合二値化用いて本発明者らの画像解析アルゴリズムでの個々の各組織試料での組織のセグメント化に対する蛍光強度カットオフを規定した。細胞株対照コアは前立腺摘除組織コアと、品質管理スライド上でＤｅｆｉｎｉｅｎｓアルゴリズムにおいて所定のコア座標に基づいて自動的に識別された。生検および組織コア試料を、蛍光の上皮細胞マーカーおよび基底細胞マーカーを上皮細胞、基底細胞および間質への分類のためのＤＡＰＩとともに用いてセグメント化し、さらに細胞質と核に区画化した。個々の腺領域を、基底細胞と隣接上皮構造間の関連する特徴に基づいて対象物関連特徴、例えば腺の厚さと併用して悪性または良性と分類した。すべての細胞株に上皮マーカーは存在せず、したがって、細胞株対照を組織対バックグラウンドに自家蛍光チャネルを用いてセグメント化した。アーティファクト染色、不充分な上皮組織およびピンぼけ画像を有する視野は、厳密マルチパラメータ品質管理アルゴリズムによって除去した。
【０６１８】
上皮マーカー、ＤＡＰＩ、ＡＣＴＮ、ＶＤＡＣおよびＤＥＲＬ１の強度を悪性および非悪性上皮領域において品質管理測定値として定量した。また、バイオマーカー値を悪性および非悪性上皮領域の細胞質、核および全細胞においても測定した。各細胞成分区画の平均バイオマーカーピクセル強度を合格品質パラメータを有する個々の各マップにおいて平均し、マップ特異的値をバイオインフォマティクス解析にエクスポートした。適当な値から加重平均を計算して組織試料における各マーカーに対する単一の強度を得た；スライドで４０位〜９０位パーセンタイルの平均強度値を有する２０倍視野または大きな腫瘍領域を含む２０倍視野を好適とみなした。これによりリスクスコアモデルのための入力が得られた。
【０６１９】
実験間対照：品質管理手順
細胞株対照をバッチ対照として使用した。受領した生検の場合の全試料も多工程品質管理手順に供し、臨床的研究に対する試料の組み入れまたは除外の手段として供した。切片を有する未加工されスライドを目視および蛍光顕微鏡で染色および色素の存在について検査した。生検組織内に著しい量の蛍光色素を有する試料は、さらなる解析から除外した。それは、臨床的病態検査実務におけるものであり得るためである。次に、各生検の場合の試料のスライドの１つを手作業で、ＡＣＴＮ１、ＣＫ８／１８−Ａｌｅｘａ  ４８８およびＣＫ５／Ｔｒｉｍ２９で染色した。染色されたスライドを手作業で検査した；組織が少量または断片化されているか、腫瘍組織がほとんどないか、または上記の３種類のマーカーのいずれかでの染色が不充分である場合、試料は品質管理不合格とした。
【０６２０】
マルチプレックス免疫蛍光染色後、２０倍画像すべてを手作業で検査し、疑似／非前立腺組織（例えば、腸組織）を含む視野をさらなる解析から除外した。画像解析で悪性組織と良性組織を分けたら、良性領域または腫瘍領域が不充分な場合を除外した。また、ＡＣＴＮ１、ＤＥＲＬ１またはＶＤＡＣレベルが所定の最低値未満の場合も除外した。
【０６２１】
染色対照開発および応用：細胞株対照
３０種類の細胞株を、本試験に使用した各マーカーで染色し、そのうち１１種類の細胞株を、範囲、シグナル強度および差異が最低限であることに基づいて対照の染色に選択した。
【０６２２】
細胞株を規定の培地中で７０％〜８０％コンフルエンスまで一様に培養し、ホルマリンを用いてプレート上で固定した。細胞を掻き取り、スピンダウンし、細胞ディスクを細胞ペレットの細胞／ヒストゲル懸濁液から調製し、これをパラフィン包埋した。このペレットを使用し、再現性試験における使用、マスターミックスの検証における使用および常套的な試料染色時の対照スライドとしての使用のためのＴＭＡブロックを作製した。
【０６２３】
細胞株ＴＭＡからの切片／スライドの１つを生検スライドの各バッチを用いて加工した。染色、画像取得およびデータ抽出および解析は、個々のトリプレックスアッセイ形式で先に記載のものと厳密に同じ様式で行なった。
【０６２４】
臨床試験：統計学的計画
統計学的解析計画（ＳＡＰ）をロックし、記録し、外部の生物統計専門部門と通信した後、臨床研究データが検証試験における解析に利用可能となった。ＳＡＰによれば、共一次転帰のＰ値はすべて、２を乗算してボンフェローニ相関を反映させた後に報告される。ＡＵＣ  ＣＩおよびＰ値は２項正確確率検定を用いて推定し、一方、ＡＵＣ標準誤差はＤｅＬｏｎｇら１９８８１に記載の方法を用いて測定した。ロジスティック回帰によるＯＲをＳＡＰならびに陽性的中率、感度および特異度に対する２項正確確率ＣＩを用いた標準的医療との比較に含めた。その他の場合でアッセイ開発に関与していない統計学担当者が統計学的解析を行なった。
参考文献
1．DeLong  ER，DeLong  DM，Clarke-Pearson  DL．Comparing  the  areas  under  two  or  more  correlated  receiver  operating  characteristic  curves:a  nonparametric  approach．Biometrics  1988;44：837-45.
【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【化２０】
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【化３０】
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【化３４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図２０】
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【図２４】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４０Ｄ】
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【図４０Ｅ】
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【図４０Ｆ】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４−１】
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【図４４−２】
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【図４５】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図３０】
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【図３７】
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【図３８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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