(57)【要約】  本発明は、とりわけ、新規のＮ−フェニル置換ピロール誘導体、および療法、特に細菌（例えば肺炎球菌）感染症の処置におけるその使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化１】
2016521702.tif 000023
から選択される化合物、ならびにその医薬的に許容される塩および溶媒和物。
【請求項２】
２−（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（２−メチルプロパノエート）、
２−（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（２−メチルプロパノエート）塩酸塩、
２−（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（２，２−ジメチルプロパノエート）、
２−（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（２，２−ジメチルプロパノエート）塩酸塩、
２，５−ビス（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（３−（（ホスホノオキシ）メチル）ベンゾエート）、
（（（（２，５−ビス（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイル）ビス（オキシ））ビス（カルボニル））ビス（３，１−フェニレン））ビス（メチレン）ビス（リン酸水素）ナトリウム、
２−（ジメチルカルバモイル）−５−（エトキシカルボニル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（４−（（ホスホノオキシ）メチル）ベンゾエート）、および
（（（（２−（ジメチルカルバモイル）−５−（エトキシカルボニル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイル）ビス（オキシ））ビス（カルボニル））ビス（４，１−フェニレン））ビス（メチレン）ビス（リン酸水素）ナトリウムから選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
場合により１つまたは複数の医薬的に許容される希釈剤または担体と組み合わされる、請求項１または２に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項４】
他の１つまたは複数の治療活性成分を含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
医薬として使用するための、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項６】
他の１つまたは複数の治療活性成分と組み合わせて使用するための、請求項１または５に記載の化合物。
【請求項７】
孔形成毒素、例えばコレステロール依存性細胞溶解素を産生する細菌によって引き起こされる細菌感染症の処置に使用するための、請求項１、２、５または６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
前記細菌感染症がストレプトコッカス属種（Streptococcus spp.）（例えば肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、Ａ群連鎖球菌（Group A Streptococci）または豚連鎖球菌（Streptococcus suis））、クロストリジウム属種（Clostridium spp.）（例えばウェルシュ菌（Clostridium perfringens））、リステリア属種（Listeria spp.）（例えばリステリア・モノシトゲネス（Listeria monocytogene））またはバチルス属種（Bacillus spp.）（例えば炭疽菌（Bacillus anthracis））によって引き起こされる、請求項７に記載の使用のための化合物。
【請求項９】
肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）によって引き起こされる細菌感染症の処置のための、請求項８に記載の使用のための化合物。
【請求項１０】
肺炎球菌性肺炎、肺炎球菌性髄膜炎、肺炎球菌性敗血症／菌血症、肺炎球菌性角膜炎または肺炎球菌性中耳炎の処置のための、請求項９に記載の使用のための化合物。
【請求項１１】
肺炎球菌以外の細菌によって引き起こされるガス壊疽、胃腸炭疽、吸入炭疽、豚髄膜炎、脳炎、敗血症／菌血症および肺炎から選択される症状の処置のための、請求項７に記載の使用のための化合物。
【請求項１２】
他の１つまたは複数の治療活性成分（例えば１つまたは複数の抗微生物剤または免疫調節剤）と組み合わせて投与される、請求項５から１１のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１３】
孔形成毒素、例えばコレステロール依存性細胞溶解素を産生する細菌によって引き起こされる細菌感染症の処置方法であって、請求項１、２、５または６のいずれか一項に記載の化合物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項１４】
式（Ｉ）
【化２】
2016521702.tif 000024
（式中、ＲａおよびＲｂは請求項１の化合物における２位および５位の置換基に相当する）の化合物を、
ａ）３−（（ホスホノオキシ）メチル）安息香酸）、またはその保護誘導体、例えばそのジ−ｔｅｒｔ−ブチル保護誘導体と反応させ、続いて必要であれば脱保護する、または
ｂ）式ＬＧ−Ｃ（Ｏ）−Ｒｃの化合物（式中、ＬＧは脱離基、例えばクロロであり、Ｒｃは−Ｃ（ＣＨ３）３または−ＣＨ（ＣＨ３）２である）と反応させるステップ、
および場合によりその塩または溶媒和物を形成するステップ
を含む、請求項１に記載の化合物の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞溶解素阻害剤のプロドラッグである化合物、および特に細菌感染、例えば肺炎球菌感染の処置における、医薬組合せを含む、療法における該化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）（肺炎球菌）は、最も強力なヒト病原体の１つであり、世界中で１，０００万人を超えるあらゆる年齢層の人々、特に幼児、高齢者および免疫不全者に影響を及ぼしている。それは肺炎、菌血症および髄膜炎など、重篤な、多くの場合致死的な疾患の主導的原因因子である。また、中耳炎や角膜炎など、他のさほど重篤ではないが、それでもなお身体を衰弱させる疾患の原因でもある。
【０００３】
抗生物質や抗生物質補助剤としてのステロイドを数十年間にわたり使用した後でさえ、肺炎球菌性疾患に起因する死亡率および罹患率は依然、先進国世界で非常に高く、また発展途上世界では憂慮すべきほど高い。今なお、入院患者の２０％近くが、抗生物質による肺炎球菌の死滅にもかかわらず死亡し、その一方で肺炎球菌性髄膜炎からの生存者の多くが、認知障害、失明および難聴を含む重度の神経学的障害に苦しみ、その結果、患者とその家族に対する甚大な苦痛や、医療制度に対する非常に多大な費用負担をもたらしている。現在、肺炎球菌感染は全世界的に依然として、この分野における指導者やＷＨＯを含む保健機関から幅広く認識されている主要な公衆衛生問題である。
【０００４】
現在の標準的療法では対処されない、この一貫して高い死亡率と罹患率の主因の１つは、有毒な肺炎球菌産物の放出に起因する毒血症であり、中でも最も重要な産物は肺炎球菌毒素の１つである肺炎球菌溶血素である。この毒素は肺炎球菌の病原性に多大な役割を果たし、毒血症の主な直接および間接の原因である。
【０００５】
肺炎球菌溶血素はコレステロール依存性細胞溶解素（ＣＤＣ）の族に属するが、ＣＤＣはコレステロール含有膜に結合して、罹患細胞に致死的および準致死的影響を及ぼす大きな孔を生じる。この細菌において、毒素肺炎球菌溶血素は細胞質性であり、主に肺炎球菌から、その溶解後に放出される。結果的に、溶解性抗生物質の影響下において、大量の毒素が一気に放出され、毒血症を悪化させる。したがって、抗生物質での処置により患者からの細菌排出に成功したとしても、その後の毒素放出は有害であり、また致死的となるか、または長期間に及ぶ障害の原因となり得る。
【０００６】
この毒血症は、国際的に認識されているが未だ満たされていない、医学的対処が大いに必要とされる要素である。現在、副腎皮質ステロイド、主にデキサメタゾンが、肺炎球菌性髄膜炎向けの抗生物質療法の補助薬として使用されている。しかし、デキサメタゾンを使用する場合であっても、有意な死亡率および罹患率が見られ、またデキサメタゾンの幅広い使用は依然、その非特異的効果、限られた臨床的影響、そして場合によっては髄膜炎における神経細胞アポトーシスの増大という有害影響を背景に、議論の的である［Lancet (2002) 360 211-218］。したがって、現在の技術水準は、侵襲性肺炎球菌性疾患の効率的処置に十分な水準に達していない。
【０００７】
治療標的としての肺炎球菌溶血素の妥当性を裏付ける、注目に値する証拠が存在する。本発明者らの研究室において、マウス肺炎モデルを使用して、肺炎球菌溶血素を産生しない肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）の突然変異株（ＰＬＮ−Ａ）はもはや致死的でなく、菌血症を引き起こす度合いが大幅に低く、また肺炎症の重症度の有意な低減を示すことが実証済みである。ラット髄膜炎モデルで得られた他の証拠は、肺炎球菌溶血素陰性突然変異体の感染が、野生型肺炎球菌感染よりも重症度が際立って低く、脳の線毛上皮の損傷が全く観察されず、線毛上皮周囲細胞のアポトーシスも生じないことを示している［J. Infect, (2007) 55 394-399］。モルモットの肺炎球菌性髄膜炎では、野生型肺炎球菌が重度の蝸牛管障害および難聴を誘発した一方、ＰＬＮ−Ａ感染の場合はコルチ器官が無傷のままであった［Infect. Immun. (1997) 65 4411-4418］。培養線毛脳上皮細胞を使用するエクスビボモデルにより、脳室の内側を覆う細胞が肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）に曝露されるインビボ状況の再現が可能になった。無傷の野生型肺炎球菌および抗生物質によって死滅させられた野生型肺炎球菌はいずれも、培養下の上皮細胞の損傷を誘発し、線毛の脈動を有意に低下させた。この効果はＰＬＮ−Ａの場合には見られなかった［Infect. Immun. (2000) 68 1557-1562］。抗生物質により溶解した肺炎球菌が培養上衣細胞に及ぼすこの損傷効果は明らかに、抗生物質により溶解した細菌から放出される毒素肺炎球菌溶血素によって引き起こされるが、この損傷は抗肺炎球菌溶血素抗体の存在下だと消失したからである［Infect. Immun. (2004) 72 6694-6698］。この所見は、抗生物質誘発性毒血症を抗肺炎球菌溶血素剤との組合せによって予防するという戦略を裏付けるものである。
【０００８】
肺炎球菌感染における肺炎球菌溶血素の有意な関与および肺炎球菌溶血素が存在しない状況での疾患予後の大幅な改善に関する証拠から、肺炎球菌溶血素は肺炎球菌性疾患の新たな処置の開発に向けた潜在的治療標的に相当する、という結論に結び付いた。従前の研究では、肺炎球菌溶血素を阻害するコレステロールの能力を示している［Biochem. J. (1974) 140 95-98］が、この阻害は、コレステロールが、標的細胞膜における孔形成に必要な肺炎球菌溶血素の天然の細胞受容体であるという事実を背景としているにすぎない。ウサギの角膜に対するコレステロールの局所適用により、肺炎球菌性角膜炎におけるプラスの治療効果が実証された［Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. (2007) 48 2661-2666］。これは、肺炎球菌性角膜炎における肺炎球菌溶血素の関与と、これを阻害した後に得られる治療的便益を示唆するものである。しかし、コレステロールは肺炎球菌性疾患の処置のための治療剤として捉えられておらず、また患者へ臨床的に使用されてきたわけでもない。別の肺炎球菌溶血素阻害剤であるアリシンは、ニンニク抽出物の一成分であるが、これは既に、肺炎球菌溶血素の溶血活性を阻害することがインビトロで認められている［Toxicon (2011) 57 540-545］。この化合物は、毒素の反応性チオール基に不可逆的に結合するシステイン阻害剤である。そのような特性を示す化合物は、体内における他のシステイン含有タンパク質へ非特異的に結合する潜在性があることから、薬物候補としては好ましくない。
【０００９】
細菌感染処置での使用に適する、肺炎球菌溶血素など細胞溶解素の阻害剤を提供する必要性が依然として残っている。
【００１０】
本出願の優先日より後に公表され、全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３０２２では、個々の宿主の病原性に基軸的役割を果たす肺炎球菌溶血素および他のコレステロール依存性細胞溶解素の直接の毒性効果を特異的に阻害する、細胞溶解素阻害剤としてのＮ−フェニル置換ピロール誘導体を開示している。本発明の化合物はアリシンとの構造的類似性を全く有さず、また毒素の反応性チオール基へ共有結合するものでもない。
【００１１】
本発明は、肺炎球菌溶血素によって誘発される、また想定され得る他のコレステロール依存性細胞溶解素によって誘発される宿主由来毒性効果の刺激を予防する、Ｎ−フェニル置換ピロール細胞溶解素阻害剤の新規プロドラッグを提供する。これらの化合物は、良好な水溶性および水溶液中での良好な化学的安定性も実証すると見られる。したがって、該化合物は、肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）などに起因する感染の過程で見られる肺炎球菌溶血素誘発性毒性およびその抗宿主効果の予防または弱毒化を目的に、単剤として、または抗生物質補助薬として使用することができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明によれば、
【００１３】
【化１】
2016521702.tif 000002
から選択される化合物、ならびに医薬的に許容されるその塩および溶媒和物が提供される。
【００１４】
さらなる態様において、本発明は、医薬として使用するための、上記にて定義のとおりの化合物（以下、「本発明の化合物」という）を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ａ５４９ヒト肺上皮細胞を使用した化合物ＵＬ１−００５による、肺炎球菌溶血素誘発性ＬＤＨ放出のインビトロ阻害を示す図である。
【図２】エクスビボ髄膜炎効力アッセイにおいて、肺炎球菌溶血素による上衣細胞線毛機能の損傷を化合物ＵＬ１−００５が阻害する効果を示す図である。
【図３】本発明の化合物を使用するインビボマウス肺炎モデル効力アッセイの実験設計を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の化合物は、対応する３，４−ジヒドロキシピロール誘導体のプロドラッグ誘導体である。本発明の化合物は、対象へ投与された後、分解して活性３，４−ジヒドロキシ化合物（本明細書で「親活性化合物」と呼ばれることもある）をインビボで形成する。
【００１７】
本発明の化合物の塩の例として、医薬的に許容される非毒性の塩基または酸から調製されるすべての医薬的に許容される塩が挙げられる。塩基から誘導される塩の例として、例えばカリウム塩およびナトリウム塩などが挙げられる。酸から誘導される塩の例として、例えば塩酸、メタンスルホン酸、硫酸およびｐ−トルエンスルホン酸などの無機酸および有機酸から誘導されるものが挙げられる。
【００１８】
本発明の化合物の溶媒和物の例として、水和物が挙げられる。
【００１９】
本発明は、塩の溶媒和物（水和物を含む）を含む。
【００２０】
言及され得る本発明の化合物の具体例として以下が挙げられる：
２−（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（２−メチルプロパノエート）、
２−（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（２−メチルプロパノエート）塩酸塩、
２−（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（２，２−ジメチルプロパノエート）、
２−（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（２，２−ジメチルプロパノエート）塩酸塩、
２，５−ビス（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（３−（（ホスホノオキシ）メチル）ベンゾエート）、
（（（（２，５−ビス（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイル）ビス（オキシ））ビス（カルボニル））ビス（３，１−フェニレン））ビス（メチレン）ビス（リン酸水素）ナトリウム、
２−（ジメチルカルバモイル）−５−（エトキシカルボニル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（４−（（ホスホノオキシ）メチル）ベンゾエート）、および
（（（（２−（ジメチルカルバモイル）−５−（エトキシカルボニル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイル）ビス（オキシ））ビス（カルボニル））ビス（４，１−フェニレン））ビス（メチレン）ビス（リン酸水素）ナトリウム。
【００２１】
本発明は、本発明の化合物のすべての多型形態にまでも及ぶ。
【００２２】
本発明は、１個または複数の原子が、天然に最もよく見出される原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子に置き換えられている同位体標識化された本発明の化合物にまでも及ぶ。本発明の化合物に組み込むことができる同位体の例として、水素、炭素、窒素、およびリンの同位体、例えば２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、３２Ｐおよび３３Ｐが挙げられる。同位体標識化された本発明の化合物は、下記の合成方法を実行することおよび同位体標識化された試薬または中間体を同位体標識化されていない試薬または中間体の代わりに使用することによって調製することができる。
【００２３】
本発明の化合物は、実施例に記載のとおり調製することができる。
【００２４】
したがって、本発明のさらなる態様によれば、式（Ｉ）
【００２５】
【化２】
2016521702.tif 000003
（式中、ＲａおよびＲｂは本発明の化合物における２位および５位の置換基に相当する）の化合物を、
ａ）３−（（ホスホノオキシ）メチル）安息香酸）、またはその保護誘導体、例えばそのジ−ｔｅｒｔ−ブチル保護誘導体と反応させ、続いて必要であれば脱保護する、または
ｂ）式ＬＧ−Ｃ（Ｏ）−Ｒｃの化合物（式中、ＬＧは脱離基、例えばクロロであり、Ｒｃは−Ｃ（ＣＨ３）３または−ＣＨ（ＣＨ３）２である）と反応させるステップ、
および場合によりその塩または溶媒和物を形成するステップ
を含む、本発明の化合物の製造方法が提供される。
【００２６】
任意の新規の中間体が本発明の化合物の合成において有用であり得、したがって、これらもまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００２７】
保護基は、プロセスが効率的であることを確保するよう、本発明の化合物の合成過程で化学的感受性基を保護する必要が生じ得る。したがって、望ましい場合または必要な場合、中間体化合物を従来型の保護基の使用によって保護することができる。保護基およびその除去手段については、“Protective Groups in Organic Synthesis”, by Theodora W. Greene and Peter G.M. Wuts, published by John Wiley & Sons Inc; 4th Rev Ed., 2006, ISBN-10: 0471697540に記載されている。
【００２８】
前述のとおり、本発明の化合物は、孔形成毒素、例えばコレステロール依存性細胞溶解素を産生する細菌によって引き起こされる細菌感染症の処置に有用である。
【００２９】
特に、本発明の化合物は、細菌感染症に関連する毒血症の処置に有用である。
【００３０】
そのような用途の場合、本発明の化合物は一般的に医薬組成物の形態で投与される。
【００３１】
さらに、本発明は、場合により１つまたは複数の医薬的に許容される希釈剤または担体と組み合わされた本発明の化合物を含む、医薬組成物を提供する。
【００３２】
希釈剤および担体の例として、非経口、経口、局所、粘膜および直腸での投与に適するものが挙げられる。
【００３３】
前述のとおり、そのような組成物は、例えば、特に、液体の溶液または懸濁剤の形態で、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内または関節周囲での投与向けに、また特に錠剤またはカプセル剤の形態での経口投与向けに、また特に点眼薬、粉末剤、点鼻薬またはエアロゾルの形態での局所投与（例えば硝子体内、肺または鼻腔内投与）および経皮投与向けに、また粘膜投与（例えば口腔粘膜、舌下粘膜または膣粘膜への粘膜投与）、および直腸投与（例えば坐剤の形態）向けに調製することができる。
【００３４】
組成物は、単位剤形で便利に投与することができ、また例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA., (1985)に記載のような、医薬分野で周知の任意の方法によって調製することができる。非経口投与用製剤は、賦形剤として、滅菌水または生理食塩水、アルキレングリコール（例えばプロピレングリコール）、ポリアルキレングリコール（例えばポリエチレングリコール）、植物由来の油、水素化ナフタレンなどを含有していてもよい。非経口投与用製剤は、凍結乾燥組成物など固体形態で提供されてもよく、凍結乾燥組成物は再構成することができ、その場合、好ましくは投与直前がよい。再構成は、水中または何か他の医薬的に許容される溶媒（例えば生理食塩水、医薬的に許容されるアルコール（例えばエタノール）、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（例えばポリエチレングルコール３００）など）中、もしくは何か他の滅菌注射物質中での凍結乾燥組成物の溶解が関係し得る。
【００３５】
経鼻投与用製剤は固体であってもよく、また例えばラクトースまたはデキストランなど賦形剤を含有するか、もしくは点鼻薬または定量スプレーの形態で使用するための水性または油性の溶液であってもよい。口腔投与向けの典型的な賦形剤の例として糖類、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ゼラチン化デンプンなどが挙げられる。
【００３６】
経口投与に適する組成物は、１つまたは複数の生理的に適合性のある担体および／または賦形剤を含んでいてもよく、また固体または液体の形態であってもよい。錠剤およびカプセル剤は、結合剤（例えばシロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカントまたはポリビニルピロリドン）、増量剤（例えばラクトース、スクロース、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトール、またはグリシン）、滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、またはシリカ）、および界面活性剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）と併せて調製することができる。液体組成物は、従来型の添加剤、例えば懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、メチルセルロース、糖シロップ、ゼラチン、カルボキシメチルセルロース、または食用脂）、乳化剤（例えばレシチン、またはアカシア）、植物油（例えばアーモンド油、ココナッツ油、タラ肝油、またはピーナッツ油）、防腐剤（例えばブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）およびブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ））を含有し得る。液体組成物は、例えばゼラチンに封入して、単位剤形を提供する形態としてもよい。
【００３７】
固体経口剤形の例として、錠剤、２ピース型硬質シェルカプセル剤および軟質弾性ゼラチン（ＳＥＧ）カプセル剤が挙げられる。
【００３８】
乾燥シェル製剤は典型的に、約４０％〜６０％の濃度のゼラチン、約２０％〜３０％の濃度の可塑剤（例えばグリセリン、ソルビトールまたはプロピレングリコール）および約３０％〜４０％の濃度の水を含む。他の材料、例えば防腐剤、色素、乳白剤および香味料なども存在し得る。液体充填材料は、（蜜ろう、水素化ヒマシ油、またはポリエチレングリコール４０００などの懸濁化剤を使用して）溶解、可溶化、または分散された状態の固体薬物、もしくは鉱油、植物油、トリグリセリド、グリコール、ポリオール、および界面活性剤などのビヒクル中またはビヒクルの組合せ中の液体薬物を含む。
【００３９】
本発明の医薬組成物は、場合により１つまたは複数の抗酸化剤（例えばアスコルビン酸またはメタ重亜硫酸塩およびその塩）を含み得る。
【００４０】
本発明による特定の、言及され得る医薬組成物の例として以下が挙げられる：
−  非経口（例えば静脈内）投与用医薬組成物
−  経口投与用医薬組成物
−  単位剤形の非経口（例えば静脈内）投与用または経口投与用医薬組成物
−  投与前に液体を使用して再構成する固体形態の、非経口（例えば静脈内）投与用医薬組成物
−  液体形態（例えば溶液）の、非経口（例えば静脈内）投与用医薬組成物。
【００４１】
本発明の化合物は、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）という細菌によって産生されるコレステロール依存性細胞溶解素である肺炎球菌溶血素の阻害剤である。該化合物はＡ群連鎖球菌（Group A Streptococci）によって産生されるストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）およびウェルシュ菌（Clostridium perfringens）によって産生されるパーフリンゴリジンＯ（ＰＦＯ）をも阻害する。該化合物は、密接に関連するコレステロール依存性細胞溶解素に属する他のメンバーも阻害すると期待され、例としてリステリア・モノシトゲネス（Listeria monocytogenes）によって産生されるリステリオリジンＯ（ＬＬＯ）、炭疽菌（Bacillus anthracis）によって産生されるアントロリジンＯ（ＡＬＯ）および豚連鎖球菌（Streptococcus suis）によって産生されるスイリジン（ＳＬＹ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
本発明の化合物は、肺炎球菌毒素が、引き起こされる疾患において基軸的役割を果たすことが示されている関連毒血症を含む、肺炎球菌感染症など細菌感染症の処置に有用である。そのような疾患の例として、肺炎球菌性肺炎、肺炎球菌性髄膜炎、肺炎球菌性敗血症／菌血症、肺炎球菌性角膜炎および肺炎球菌性中耳炎が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の化合物は、他の症状を伴う肺炎球菌感染症の処置にも有用である。そのような症状の例として（制限なく）嚢胞性線維症および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）が挙げられる。例えば、肺炎球菌（S pneumoniae）はＣＯＰＤ患者から単離されており、この疾患の憎悪因子であると考えられている。
【００４３】
本発明の化合物は、Ａ群連鎖球菌（Group A Streptococci）（ＧＡＳ）によって引き起こされる感染症の処置に有用であり、係る感染症の例として侵襲性Ａ群連鎖球菌性（Group A Streptococcal）疾患が挙げられるが、これらに限定されず、これらの疾患について、毒素ストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）が全身性ＧＡＳ疾患の発症に極めて重要な役割を果たすことが既に実証されている。
【００４４】
本発明の化合物は、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）によって引き起こされる感染症の処置に有用であり、係る感染症の例として、筋壊死、敗血症性ショックおよび死亡を特徴とするガス壊疽が挙げられるが、これらに限定されず、これらの疾患において、毒素パーフリンゴリジンＯが発症における主要な病原性因子であることが既に実証されている。
【００４５】
本発明の化合物は、炭疽菌（Bacillus anthracis）によって引き起こされる感染症の処置に有用であり、係る感染症において、コレステロール依存性細胞溶解素であるアントロリジンＯ（ＡＬＯ）が胃腸（ＧＩ）炭疽に不可欠な役割を果たし、また吸入性炭疽の発症にも寄与する。
【００４６】
本発明の化合物は、コレステロール依存性細胞溶解素を産生するグラム陽性細菌によって引き起こされる他の疾患の処置にも有用であり、係る疾患の例として以下が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
豚連鎖球菌（Streptococcus suis）による疾患の発症に関与するコレステロール依存性細胞溶解素、スイリジンを産生する、豚連鎖球菌（Streptococcus suis）によって引き起こされる豚髄膜炎、敗血症／菌血症および敗血症性ショック。
【００４８】
リステリア・モノシトゲネス（Listeria monocytogenes）によって引き起こされる脳炎、腸炎、髄膜炎、敗血症／菌血症および肺炎（これらの疾患において、コレステロール依存性細胞溶解素であるリステリオロジンＯ（ＬＬＯ）が上記の疾患の発症に重要な役割を果たす）。
【００４９】
本発明の化合物は、ＲＴＸ族の毒素など、宿主の病原性において不可欠である他の細菌孔形成毒素の阻害にも十分に有用となり得る。例として、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（孔形成性毒素であるブドウ球菌によるα溶血を生じる）によって引き起こされる肺炎および敗血症／菌血症や、孔形成毒素であるαヘモリジンを産生する病原性大腸菌（Escherichia coli）によって引き起こされる腹膜炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
したがって、本発明は以下を提供する：
−  孔形成毒素を産生する細菌によって引き起こされる細菌感染症の処置に使用するための本発明の化合物であって、細菌感染症が、ストレプトコッカス属種（Streptococcus spp.）（例えば肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、Ａ群連鎖球菌（Group A Streptococci）または豚連鎖球菌（Streptococcus suis））、クロストリジウム属種（Clostridium spp.）（例えばウェルシュ菌（Clostridium perfringens））、リステリア属種（Listeria spp.)（例えばリステリア・モノシトゲネス（Listeria monocytogene））またはバチルス属種（Bacillus spp.）（例えば炭疽菌（Bacillus anthracis））によって引き起こされる、化合物、
−  肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）によって引き起こされる細菌感染症の処置のための本発明の化合物、
−  肺炎球菌性肺炎、肺炎球菌性髄膜炎、肺炎球菌性敗血症／菌血症、肺炎球菌性角膜炎、または肺炎球菌性中耳炎の処置に使用するための本発明の化合物、ならびに
−  肺炎球菌以外の細菌によって引き起こされるガス壊疽、胃腸炭疽、吸入炭疽、豚髄膜炎、脳炎、敗血症／菌血症および肺炎から選択される症状の処置のための本発明の化合物。
【００５１】
本発明の化合物は、ヒトまたは動物、例えば、家畜、例えばブタ、ウシ、ヒツジ、ウマなどの処置に使用することができ、また医薬組成物に言及する場合、ヒトまたは動物への使用に適する組成物が対象であると解釈されるべきである。
【００５２】
したがって、さらなる態様において、本発明は、前述の症状の処置に使用するための、本発明の化合物を提供する。
【００５３】
さらなる態様において、本発明は、前述の症状の処置のための医薬を製造するための、本発明の化合物を提供する。
【００５４】
さらなる態様において、本発明は、前述の症状の処置方法であって、本発明の化合物またはその医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００５５】
「処置」という単語は、治療的処置のほか、予防も包含するものと意図される。
【００５６】
本発明の化合物は、単独で、またはさらなる治療活性成分と組み合わせて使用することができる。したがって、本発明の化合物は、さらなる治療活性成分と同時に、順次、または別々に、同じ製剤中で一緒に、または別の製剤中で、および同じ投与経路または異なる投与経路で投与することができる。したがって、本発明の化合物は、前述の症状の処置に適する他の１つまたは複数の活性成分と組み合わせて投与することができる。例えば、処置用として可能な組合せの例として、天然、合成、および半合成の抗微生物剤を含む、抗微生物剤、例えば抗生物質剤との組合せが挙げられる。抗生物質剤の例として、βラクタム（ペニシリン、ベンジルペニシリン、アモキシシリンおよびこれらの全世代を含むがこれらに限定されない）、βラクタムとβラクタマーゼ阻害剤（クラブラン酸およびスルバクタムを含むがこれらに限定されない）の組合せ、セファロスポリン（セフロキシム、セフォタキシムおよびセフトリアキソンを含むがこれらに限定されない）、フルオロキノロン（レボフロキサシンおよびモキシフロキサシンを含むがこれらに限定されない）、テトラサイクリン（ドキシサイクリンを含むがこれに限定されない）、マクロライド（エリスロマイシンおよびクラリスロマイシンを含むがこれらに限定されない）、リポペプチド抗生物質（ダプトマイシンを含むがこれに限定されない）、アミノグリコシド（カナマイシンおよびゲンタマイシンを含むがこれらに限定されない）、糖ペプチド抗生物質（バンコマイシンを含むがこれに限定されない）、リンコサミド（クリンダマイシンおよびリンコマイシンを含むがこれらに限定されない）、リファマイシン（リファンピシンを含むがこれに限定されない）、ならびにクロラムフェニコールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
さらなる組合せの例として、抗炎症剤など免疫調節剤との組合せが挙げられる。
【００５８】
免疫調節剤の例として、例えば、免疫系の細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、または抗原提示細胞の細胞活性を刺激するか、もしくは抑制することによって、あるいは免疫系の外側の成分に作用し、それがさらに、免疫系を刺激、抑制、または調節することによって、直接または間接的に免疫系に作用する薬剤、例えばホルモン剤、受容体作動薬または拮抗薬、および神経伝達物質が挙げられ、他の免疫調節剤の例として、免疫抑制剤または免疫賦活剤が挙げられる。抗炎症剤の例として、例えば、炎症応答、負傷に対する組織反応を処置する薬剤、免疫系、血管系、またはリンパ系を処置する薬剤、もしくはこれらの組合せが挙げられる。抗炎症剤および免疫調節剤の例として、インターフェロン誘導体（例えばベータセロン）、βインターフェロン、プロスタン誘導体（例えばイロプロストおよびシカプロスト）、副腎皮質ステロイド（例えばプレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾンおよびフルチカゾン）、ＣＯＸ２阻害剤、免疫抑制剤（例えばシクロスポリンＡ、ＦＫ−５０６、メトキサレン、サリドマイド、スルファサラジン、アザチオプリンおよびメトトレキセート）、リポキシゲナーゼ阻害剤、ロイコトリエン拮抗薬、ペプチド誘導体（例えばＡＣＴＨおよび類似体）、可溶性ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）受容体、ＴＮＦ抗体、インターロイキン、他のサイトカイン、およびＴ細胞タンパク質の可溶性受容体、インターロイキン、他のサイトカインおよびＴ細胞タンパク質の受容体に対する抗体が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる抗炎症剤の例として、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が挙げられる。ＮＳＡＩＤの例として、ナトリウムクロモグリケート、ナトリウムネドクロミル、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤（例えばテオフィリン、ＰＤＥ４阻害剤または混合型ＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤）、ロイコトリエン拮抗薬、ロイコトリエン合成の阻害剤（例えばモンテルカスト、ｉＮＯＳ阻害剤、トリプターゼ阻害剤およびエラスターゼ阻害剤）、β−２インテグリン拮抗薬およびアデノシン受容体作動薬または拮抗薬（例えばアデノシン２ａ作動薬）、サイトカイン拮抗薬（例えばＣＣＲ３拮抗薬などケモカイン拮抗薬）、またはサイトカイン合成の阻害剤、ならびに５−リポキシゲナーゼ阻害剤が挙げられる。
【００５９】
したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数のさらなる活性成分、例えば前述の活性成分のうち１つまたは複数と組み合わせた、本発明の化合物を提供する。
【００６０】
本発明の別の態様は、場合により１つまたは複数の医薬的に許容される補助剤、希釈剤または担体と組み合わされた本発明の化合物を含み、１つまたは複数の治療活性成分を含む、医薬組成物を提供する。
【００６１】
同様に、本発明の別の態様は、
（Ａ）本発明の化合物と、
（Ｂ）別の治療剤
とを含み、成分（Ａ）および（Ｂ）がそれぞれ、医薬的に許容される補助剤、希釈剤または担体との混合物として配合される、組合せ製品を提供する。
【００６２】
本発明のこの態様において、組合せ製品は、単一の（組合せ）医薬製剤またはキットオブパーツ（kit of parts）のいずれかの形態で提供され得る。
【００６３】
したがって、本発明のこの態様は、医薬的に許容される補助剤、希釈剤または担体との混合物としての、本発明の化合物および別の治療剤を含む医薬製剤を包含する（以下、この製剤を「複合型調製物」という）。
【００６４】
本発明のこの態様は、
（ｉ）医薬的に許容される補助剤、希釈剤または担体との混合物としての、本発明の化合物を含む医薬製剤、および
（ｉｉ）医薬的に許容される補助剤、希釈剤または担体との混合物としての、別の治療剤を含む医薬製剤の成分を含むキットオブパーツをも包含し、成分（ｉ）と（ｉｉ）はそれぞれ、他方との併用投与に適する形態で提供される。
【００６５】
したがって、キットオブパーツの成分（ｉ）は、医薬的に許容される補助剤、希釈剤または担体との混合物としての、上記成分（Ａ）である。同様に、成分（ｉｉ）は、医薬的に許容される補助剤、希釈剤または担体との混合物としての、上記成分（Ｂ）である。
【００６６】
他方の治療剤（すなわち上記成分（Ｂ））は、例えば、前述の抗微生物剤または免疫調節剤などの薬剤のうちいずれかであってもよい。
【００６７】
本発明のこの態様の組合せ製品（複合型調製物またはキットオブパーツのいずれか）は、前述の症状のいずれかの処置または予防に使用され得る。
【００６８】
本発明の化合物は、１つまたは複数のさらなる活性成分と組み合わせて使用する場合、例えば使用説明書と一緒に提供される場合もある。
【００６９】
したがって、本発明のさらなる態様は、１つまたは複数のさらなる活性成分、例えば前述の活性成分のうち１つまたは複数と組み合わせた、式（Ｉ）の化合物を提供する。
【００７０】
本発明のこの態様で使用するための本発明の化合物は、前述の症状のいずれかの処置または予防に使用され得る。
【００７１】
次に、本発明について、例示目的である以下の実施例を参考に記述するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００７２】
略語
ＡｃＯＨ：氷酢酸
ａｑ．：水性
Ｂｎ：ベンジル
ｂｒ：ブロード
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ＣＯＰＤ：慢性閉塞性肺疾患
ｄ：二重項
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル
ｈ：時間
ＨＡＴＵ：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（７−アザベンゾチアゾール−１−イル）ウロニウムＰＦ６
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ｍ：多重項
ＭｅＣＮ：アセトニトリル
ＭｅＯＨ：メタノール
ｍｉｎ：分
ＮＭＲ：核磁気共鳴
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ｑｕｉｎ．：五重項
ＲＴ：室温
ｓ：一重項
ｓａｔ．：飽和
ＳＡＸ：固体担持強陽イオン交換樹脂
ｓｅｐｔ．：七重項
ｓｅｘｔ．：六重項
ｔ：三重項
ＴＦＡＡ：無水トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＵＶ：紫外線
【００７３】
一般的手順
開始材料および溶媒はすべて、市販供給源から入手したか、または文献に記載の条件に従って調製した。
【００７４】
水素化はＴｈｌａｅｓ製Ｈ−ｃｕｂｅ流動反応装置上で、または水素のバルーン下で触媒の懸濁物を使用して実施した。
【００７５】
カラムクロマトグラフィーを、充填済みシリカ（２３０〜４００メッシュ、４０〜６３μＭ）カートリッジ上で実施した。
【００７６】
溶解性試験および安定性試験向けのＰＢＳ溶液を、Ｏｘｏｉｄ（商標）錠剤１個（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより入手）を脱イオン水（１００ｍＬ）に溶解することにより調製した。
【００７７】
１〜２ｍｇの化合物をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解した後、結果として得られた溶液０．４ｍＬを、３７．５℃で撹拌したＰＢＳ溶液（９．６ｍＬ）へ添加することによって、安定性試験を実施した。試料（約０．５ｍＬ）を即座に、ＨＰＬＣ分析用として採取した。その後の様々な時点での分析用として、追加試料を採取した。時間の経過に伴う化合物の濃度低下から、半減期を判定した。
【００７８】
分析方法
分析ＨＰＬＣを、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｘｔｅｎｄ  Ｃ１８、高速分解ＨＴの、０．１％の水性ギ酸中のＭｅＣＮにおける０．１％のギ酸の５〜９５％の勾配、または５０ｍＭの水性酢酸アンモニウム中のＭｅＣＮの５〜９５％の勾配で溶出する１．８μｍのカラムを使用して実施した。あるいは、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｓｅｌｅｃｔ  ＣＳＨ  Ｃ１８の、０．１％の水性ギ酸中のＭｅＣＮにおける０．１％のギ酸の５〜９５％の勾配で溶出する３．５μｍで実施した。溶出ピークのＵＶスペクトルを、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００システム上のダイオードアレイまたは可変波長検出装置いずれかを使用して測定した。
【００７９】
分析ＬＣＭＳを、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｘｔｅｎｄ  Ｃ１８、高速分解ＨＴの、０．１％の水性ギ酸中のＭｅＣＮにおける０．１％のギ酸の５〜９５％の勾配、または５０ｍＭの水性酢酸アンモニウム中のＭｅＣＮの５〜９５％の勾配で溶出する１．８μｍのカラムを使用して実施した。あるいは、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｓｅｌｅｃｔ  ＣＳＨ  Ｃ１８の、０．１％の水性ギ酸中のＭｅＣＮにおける０．１％のギ酸の５〜９５％の勾配で溶出する３．５μｍで実施した。溶出ピークのＵＶスペクトルおよび質量スペクトルを、陽／陰イオンエレクトロスプレーを有する６１２０四重極質量分析計を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００またはＡｇｉｌｅｎｔ  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  １２６０  ＬＣいずれかに装着された可変波長検出装置を使用して測定した。
【００８０】
分取ＨＰＬＣを、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ−Ｃ１８の５μｍの分取用カートリッジを使用して、０．１％の水性ギ酸中のＭｅＣＮにおける０．１％のギ酸の勾配、または１０ｍＭの重炭酸アンモニウム中のＭｅＣＮの勾配いずれかを用いて実施した。あるいは、０．１％の水性ギ酸中の０．１％のＭｅＣＮの勾配を用いる、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｓｅｌｅｃｔ  ＣＳＨ  Ｃ１８の５μｍのカラムで実施した。２５４ｎｍでのＵＶによる検出に従って、留分を採取した。
【００８１】
１Ｈ  ＮＭＲ分光法
ＮＭＲスペクトルを、残留非重水素化溶媒またはテトラ−メチルシランいずれかを参照として用いる、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩＩ  ４００  ＭＨｚ装置を使用して記録した。
【００８２】
化学合成
本発明の化合物、対応する親化合物および対比化合物を、以下の一般的方法を用いて調製した。
（実施例Ａ１）
【００８３】
３，４−ジヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−Ｎ２，Ｎ２，Ｎ５，Ｎ５−テトラメチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジカルボキサミド（ＵＬ１−００５）
【００８４】
【化３】
2016521702.tif 000004
【００８５】
ステップ（ｉ）：ジエチル２，２’−（（４−メトキシフェニル）アザンジイル）二酢酸（１）
エチル２−ブロモ酢酸（１４６ｍＬ、１．３０ｍｏｌ）を、ＭｅＣＮ中の４−メトキシアニリン（７５．０ｇ、０．６１０ｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２６５ｍＬ、１．５０ｍｏｌ）の撹拌溶液（３００ｍＬ）へ滴下により添加した。反応混合物を６０℃で１６時間撹拌した後、２ＭのＨＣｌ水溶液（５００ｍＬ）とＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）との間で分割し、水相をＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を２ＭのＨＣｌ水溶液（２×３００ｍＬ）、水（５００ｍＬ）および塩水（５００ｍＬ）で連続洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を真空中で除去して、ジエチル２，２’−（（４−メトキシフェニル）アザンジイル）二酢酸（１）（１８０ｇ、１００％）を紫色の油として得た：ｍ／ｚ  ２９６（Ｍ＋Ｈ）＋（ＥＳ＋）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.82-6.78 (m, 2H), 6.64-6.59 (m, 2H), 4.19 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 4.10 (s, 4H), 3.74 (s, 3H), 1.27 (t, J =7.1 Hz, 6H).
【００８６】
ステップ（ｉｉ）：ジエチル３，４−ジヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジカルボキシレート（２）
シュウ酸ジエチル（８３．０ｍＬ、０．６１０ｍｏｌ）を、ＮａＯＥｔ（ＥｔＯＨ中の２１重量％）中のジエチル２，２’−（（４−メトキシフェニル）アザンジイル）二酢酸（１）（１８０ｇ、０．６１０ｍｏｌ）の撹拌溶液（５０６ｍＬ、１．３０ｍｏｌ）へ滴下により添加し、混合物を１００℃で１時間撹拌した。反応物を酢酸（２１０ｍＬ、３．７０ｍｏｌ）で急冷し、結果として生じた懸濁物を氷水（１Ｌ）へ注入した結果、灰色がかった白色の固体を真空濾過により採取した。粗生成物を高温ＥｔＯＨ（３．５０Ｌ）から再結晶化した結果、ジエチル３，４−ジヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジカルボキシレート（２）（１５２ｇ、７１％）を白色の固体として得た：ｍ／ｚ  ３５０（Ｍ＋Ｈ）＋（ＥＳ＋）、３４８（Ｍ−Ｈ）−（ＥＳ−）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.64 (s, 2H), 7.13-7.01 (m, 2H), 6.92-6.81 (m, 2H), 3.99 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 3.78 (s, 3H), 0.99 (t, J =7.1 Hz, 6H).
【００８７】
ステップ（ｉｉｉ）：ジエチル３，４−ビス（ベンジルオキシ）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジカルボキシレート（３）
臭化ベンジル（４２．６ｍＬ、３５８ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１Ｌ）中の３，４−ジヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジカルボキシレート（２）（５０．０ｇ、１４３ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（４９．５ｇ、３５８ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁物へ滴下により添加し、反応混合物を６０℃で４時間撹拌した。室温まで冷却した後、反応混合物をエーテル（５００ｍＬ）へ注入し、塩水（３×２５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空中で濃縮した結果、明るい黄色の固体を得た。粗生成物をイソヘキサンで磨砕した結果、ジエチル３，４−ビス（ベンジルオキシ）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジカルボキシレート（３）（６４．８ｇ、８５％）を白色の固体として得た：ｍ／ｚ  ５３０（Ｍ＋Ｈ）＋（ＥＳ＋）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.48-7.29 (m, 10H), 7.17-7.09 (m, 2H), 6.95-6.87 (m, 2H), 5.09 (s, 4H), 3.99 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 3.80 (s, 3H), 0.99 (t, J =7.1 Hz, 6H).
【００８８】
ステップ（ｉｖ）：３，４−ビス（ベンジルオキシ）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジカルボン酸（４）
エタノール（１２ｍＬ）およびＴＨＦ（２０ｍＬ）中のジエチル３，４−ビス（ベンジルオキシ）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジカルボキシレート（３）（２．８０ｇ、５．２９ｍｍｏｌ）、２ＭのＮａＯＨ水溶液（２６．４ｍＬ、５２．９ｍｍｏｌ）の混合物を、６０℃で７２時間撹拌した。室温まで冷却した後、混合物を６ＭのＨＣｌ水溶液で酸性化し、結果として生じた沈殿物を濾過により採取し、水（５ｍＬ）とＥｔ２Ｏ（５．００ｍＬ）で洗浄した結果、４−ビス（ベンジルオキシ）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジカルボン酸（４）（１．９４ｇ、６７％）を灰色がかった白色の固体として得た：ｍ／ｚ  ４７４（Ｍ＋Ｈ）＋（ＥＳ＋）、４７２（Ｍ−Ｈ）−（ＥＳ−）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.61 (s, 2H), 7.46-7.40 (m, 4H), 7.39-7.29 (m, 6H), 7.16-7.07 (m, 2H), 6.92-6.84 (m, 2H), 5.07 (s, 4H), 3.78 (s, 3H).
【００８９】
ステップ（ｖ）：３，４−ビス（ベンジルオキシ）−Ｎ２，Ｎ２，Ｎ５，Ｎ５−テトラメチル−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジカルボキサミド（５）
ＤＭＦ中の３，４−ビス（ベンジルオキシ）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジカルボン酸（４）（１１０ｍｇ、０．２３２ｍｍｏｌ）および塩酸ジメチルアミン（５６．８ｍｇ、０．６９７ｍｍｏｌ）の（２ｍＬ、０℃）へＤＩＰＥＡ（２４３μＬ、１．３９ｍｍｏｌ）を添加した後、即座にＨＡＴＵ（２６５ｍｇ、０．６９７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を３０分間撹拌した。反応混合物を水で急冷した後、飽和水性塩化アンモニウム（２０ｍＬ）とエーテル（３０ｍＬ）との間で分割した。エーテル層を採取して、さらなる飽和塩化アンモニウム水溶液（１５ｍＬ）、飽和水性重炭酸ナトリウム（２×１５ｍＬ）、塩水（１５ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空中で濃縮した結果、３，４−ビス（ベンジルオキシ）−１−（４−メトキシフェニル）−Ｎ２，Ｎ２，Ｎ５，Ｎ５−テトラメチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジカルボキサミド（５）（１２４ｍｇ、１００％）を得た：ｍ／ｚ  ５２８．３（Ｍ＋Ｈ）＋（ＥＳ＋）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.37-7.25 (m, 10H), 7.11-7.06 (m, 2H), 6.82-6.77 (m, 2H), 5.06 (s, 4H), 3.76 (s, 3H), 2.79 (s, 6H), 2.63 (s, 6H).
【００９０】
ステップ（ｖｉ）：３，４−ジヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−Ｎ２，Ｎ２，Ｎ５，Ｎ５−テトラメチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジカルボキサミド（ＵＬ１−００５）
３，４−ビス（ベンジルオキシ）−１−（４−メトキシフェニル）−Ｎ２，Ｎ２，Ｎ５，Ｎ５−テトラメチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジカルボキサミド（５）（５．００ｇ、９．４８ｍｍｏｌ）をメタノール（１５０ｍＬ）に溶解し、溶液をＨ−ｃｕｂｅ内で水素化（１０％のＰｄ／Ｃ、７０×４ｍｍ、完全水素、４０℃、１ｍＬ／分）した後、真空下で濃縮した。結果として生じた残留物をイソプロパノール（１００ｍＬ）から再結晶化し、乾燥装置内で乾燥させた結果、３，４−ジヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−Ｎ２，Ｎ２，Ｎ５，Ｎ５−テトラメチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジカルボキサミド（ＵＬ１−００５）（２．７０ｇ、７８％）を白色の結晶質固体として得た：ｍ／ｚ  ３４８．１（Ｍ＋Ｈ）＋（ＥＳ＋）、３４６．０（Ｍ−Ｈ）−（ＥＳ−）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.38 (s, 2H), 6.94-6.89 (m, 2H), 6.86-6.81 (m, 2H), 3.73 (s, 3H), 2.88 (s, 12H).
（実施例Ａ２）
【００９１】
別の潜在的な、３，４−ジヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−Ｎ２，Ｎ２，Ｎ５，Ｎ５−テトラメチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジカルボキサミド（ＵＬ１−００５）の合成
【００９２】
【化４】
2016521702.tif 000005
（実施例Ｂ）
【００９３】
エチル５−（ジメチルカルバモイル）−３，４−ジヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキシレート（ＵＬ１−０１２）
【００９４】
【化５】
2016521702.tif 000006
【００９５】
ステップ（ｉ）：トリエチルアンモニウム３，４−ビス（ベンジルオキシ）−５−（エトキシカルボニル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキシレート（６）
ＴＨＦ／ＥｔＯＨ（３００／５０ｍＬ）中のジエチル３，４−ビス（ベンジルオキシ）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジカルボキシレート（３）（３９．６ｇ、７４．８ｍｍｏｌ）の溶液へ、ＮａＯＨ（３．０７ｇ、７７ｍｍｏｌ）を水溶液（２０ｍＬ）として添加した。反応物を５０℃で１６時間撹拌した。トリエチルアミン（３０ｍＬ、２１５ｍｍｏｌ）を添加し、揮発物を真空中で除去した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（５０％のイソヘキサン：ＤＣＭ（＋２％のＥｔ３Ｎ）、次いで２０％のＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ（＋２％のＥｔ３Ｎ））により精製した結果、トリエチルアンモニウム３，４−ビス（ベンジルオキシ）−５−（エトキシカルボニル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキシレート（６）（３９．３ｇ、８３％）を黄色の油として得た：ｍ／ｚ  ５０２（Ｍ＋Ｈ）＋（ＥＳ＋）、５００（Ｍ−Ｈ）−（ＥＳ−）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.51-7.26 (m, 10H), 7.11-7.05 (m, 2H), 6.92-6.83 (m, 2H), 5.09 (s, 2H), 5.06 (s, 2H), 3.95 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.79 (s, 3H), 2.85-2.62 (m, 6H), 1.08-0.92 (m, 12H).
【００９６】
ステップ（ｉｉ）：エチル３，４−ビス（ベンジルオキシ）−５−（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキシレート（７）
ＤＭＦ中のトリエチルアンモニウム３，４−ビス（ベンジルオキシ）−５−（エトキシカルボニル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキシレート（６）（１０．８４ｇ、１７．９９ｍｍｏｌ）の溶液（１５０ｍＬ、０℃）へ、ＨＡＴＵ（１０．２６ｇ、２７．０ｍｍｏｌ）、塩酸ジメチルアミン（２．９３ｇ、３６．０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１８．８ｍＬ、１０８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１６時間撹拌し、ＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）と１ＭのＨＣｌ水溶液（２５０ｍＬ）との間で分割した。有機相を１ＭのＨＣｌ水溶液（２５０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×２５０ｍＬ）、および塩水（２×２５０ｍＬ）で連続洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空中で濃縮した結果、エチル３，４−ビス（ベンジルオキシ）−５−（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキシレート（７）（７．６２ｇ、７９％）を淡黄色の油として得、これが時間の経過と共に固化した：ｍ／ｚ  ５２９（Ｍ＋Ｈ）＋（ＥＳ＋）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.51-7.21 (m, 10H), 7.14-7.03 (m, 2H), 6.94-6.84 (m, 2H), 5.12 (s, 2H), 4.96 (s, 2H), 4.00 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.77 (s, 3H), 2.70 (s, 6H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H).
【００９７】
ステップ（ｉｉｉ）：エチル５−（ジメチルカルバモイル）−３，４−ジヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキシレート（ＵＬ１−０１２）
エチル３，４−ビス（ベンジルオキシ）−５−（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキシレート（７）（１．０３ｇ、１．９４ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨに溶解し、次いで１０％のＰｄ／Ｃ（３７ｍｇ）で処理した。反応混合物をＮ２で５分間パージし、次いで室温で１．５時間撹拌しながら、混合物に水素ガスの気泡を通した。混合物をＣｅｌｉｔｅで濾過し、真空中で濃縮した。残った黄色の固体をＥｔ２Ｏで磨砕した結果、エチル５−（ジメチルカルバモイル）−３，４−ジヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキシレート（ＵＬ１−０１２）（６０２ｍｇ、８９％）を白色の固体として得た：ｍ／ｚ  ３４９（Ｍ＋Ｈ）＋（ＥＳ＋）、３４７（Ｍ−Ｈ）−（ＥＳ−）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.60 (s, 1H), 8.46 (s, 1H), 7.08-7.01 (m, 2H), 6.90-6.82 (m, 2H), 4.00 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.76 (s, 3H), 2.83 (br s, 6H), 0.99 (t, J = 7.1 Hz, 6H).
（実施例Ｃ）
【００９８】
３，４−ジヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド（ＵＬ１−０２７）
【００９９】
【化６】
2016521702.tif 000007
【０１００】
ステップ（ｉ）：３，４−ビス（ベンジルオキシ）−１−（４−メトキシフェニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド（８）
ＴＨＦ中のエチル３，４−ビス（ベンジルオキシ）−５−（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキシレート（７）（６．６２ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）および１−メチルピペラジン（３．１８ｍＬ、２５．１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液（１００ｍＬ、０℃）へ、塩化イソプロピルマグネシウム（１５．７ｍＬ、３１．３ｍｍｏｌ）を滴下により添加した。反応混合物を室温に達するまで放置し、１時間撹拌した。反応物を塩化アンモニウム水溶液（２０ｍＬ）で急冷し、塩水（２００ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（２×２００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空中で濃縮した。残留物をジエチルエーテル（１００ｍＬ）で磨砕し、固体を濾過により単離し、ジエチルエーテルで洗い流した結果、３，４−ビス（ベンジルオキシ）−１−（４−メトキシフェニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド（８）（５．７６ｇ、７９％）を白色の固体として得た：ｍ／ｚ  ５８３（Ｍ＋Ｈ）＋（ＥＳ＋）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.40-7.30 (m, 10H), 7.03-6.98 (m, 2H), 6.95-6.90 (m, 2H), 5.00 (s, 4H), 3.76 (s, 3H), 3.41-3.30 (br m, 2H), 3.19-3.08 (br m, 2H), 2.74 (s, 3H), 2.72 (s, 3H), 2.14-2.00 (br m, 5H), 1.98-1.87 (br m, 2H).
【０１０１】
ステップ（ｉｉ）：３，４−ジヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド（ＵＬ１−０２７）
メタノール中の３，４−ビス（ベンジルオキシ）−１−（４−メトキシフェニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド（８）（２．００ｇ、３．４３ｍｍｏｌ）の溶液（２０ｍＬ）を、Ｈ−ｃｕｂｅ内で水素化（１０％のＰｄ／Ｃ、５５×４ｍｍ、完全水素、４０℃、１ｍＬ／分）した後、反応混合物を真空下で濃縮した。残留物をジエチルエーテル（１０ｍＬ）で磨砕し、固体を濾過により単離し、ジエチルエーテルで洗い流した結果、３，４−ジヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド（ＵＬ１−０２７）（１．１０ｇ、２．６８ｍｍｏｌ、収率７８％）を灰色がかった白色の固体として得た：ｍ／ｚ  ４０３（Ｍ＋Ｈ）＋（ＥＳ＋）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.43 (br s, 2H), 6.95-6.90 (m, 2H), 6.88-6.83 (m, 2H), 3.74 (s, 3H), 3.44-3.36 (br m, 4H), 2.87 (s, 6H), 2.24-2.12 (br m, 7H).
（実施例Ｄ）
【０１０２】
２，５−ビス（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（２−プロパン酸メチル）（ＵＬ１−１１４）
【０１０３】
【化７】
2016521702.tif 000008
【０１０４】
ステップ（ｉ）：２，５−ビス（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（２−プロパン酸メチル）（ＵＬ１−１１４）
アセトニトリル中の３，４−ジヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−Ｎ２，Ｎ２，Ｎ５，Ｎ５−テトラメチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジカルボキシレート（ＵＬ１−００５）（０．０６５ｇ、０．１８７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液（４ｍＬ、０℃）へ、塩化イソブチリル（０．０４３ｍＬ、０．４１２ｍｍｏｌ）を、続いてＤＩＰＥＡ（０．０７２ｍＬ、０．４１２ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温に達するまで放置し、３時間撹拌した。その後、反応混合物をＤＣＭ（５０ｍＬ）で希釈し、水（５０ｍＬ）で洗浄した後、塩水（２×５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空中で濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（４０ｇ、０〜４％のＤＣＭ中メタノール）により精製した結果、淡黄色の油を得た。生成物をさらに分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ、Ａｃｉｄｉｃ（０．１％のギ酸）、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘ−Ｓｅｌｅｃｔ  Ｐｒｅｐ−Ｃ１８、５μｍ、１９×５０ｍｍのカラム、３０〜５０％の水中ＭｅＣＮ）により精製した結果、２，５−ビス（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（２−プロパン酸メチル）（ＵＬ１−１１４）（０．０２ｇ、２２％）を白色の固体として得た：ｍ／ｚ  ４８８（Ｍ＋Ｈ）＋（ＥＳ＋）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.12-7.08 (m, 2H), 6.97-6.93 (m, 2H), 3.77 (s, 3H), 2.85 (br s, 6H), 2.79-2.72 (m, 8H), 1.15 (d, J = 7.0 Hz, 12 H).
（実施例Ｅ）
【０１０５】
２−（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（２−プロパン酸メチル）塩酸塩（ＵＬ６−００２）
【０１０６】
【化８】
2016521702.tif 000009
【０１０７】
ステップ（ｉ）：２−（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（２−プロパン酸メチル）（ＵＬ６−００１）
ＤＣＭ中の２−ｔｅｒｔ−ブチルイミノ−２−ジエチルアミノ−１，３−ジメチルペルヒドロ−１，３，２−ジアザホスホリン（ポリマー結合、２．２ｍｍｏｌ／ｇ）（１．１０ｇ、２．４３ｍｍｏｌ）および３，４−ジヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド（ＵＬ１−０２７）（３２６ｍｇ、０．８１０ｍｍｏｌ）の懸濁物（５ｍＬ、０℃）へ、塩化イソブチリル（１８０μＬ、１．７０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を周囲温度に達するまで放置し、３０分間振った。この時間の後、混合物を濾過し、溶媒を減圧条件下で除去し、結果として生じた黄色の油をシリカゲルクロマトグラフィー（４０ｇ、０〜５％のＤＣＭ中ＭｅＯＨ）により精製した結果、２−（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（２−プロパン酸メチル）（ＵＬ６−００１）（１７６ｍｇ、３８％）を黄色の油として得た：ｍ／ｚ  ５４３（Ｍ＋Ｈ）＋（ＥＳ＋）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.13-7.08 (m, 2H), 7.00-6.95 (m, 2H), 3.78 (s, 3H), 3.40-3.17 (m, 4H), 2.87-2.71 (m, 8H), 2.21-1.96 (m, 7H), 1.17 (d, J = 2.5 Hz, 6H), 1.15 (d, J = 2.5 Hz, 6H).
【０１０８】
ステップ（ｉｉ）：２−（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（２−プロパン酸メチル）塩酸塩（ＵＬ６−００２）
エーテル中の２−（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（２−プロパン酸メチル）（ＵＬ６−００１）（８８ｍｇ、０．１５４ｍｍｏｌ）の溶液（５ｍＬ）へ、ジオキサン中の４ＭのＨＣｌの溶液（３８．５μＬ、０．１５４ｍｍｏｌ）を添加した結果、黄色の沈殿物が形成された。イソヘキサン（２ｍＬ）を添加してさらなる沈殿を補助し、結果として生じた混合物をＧｅｎｅｖａｃ（真空なし）内で沈降させ、上澄みをピペットで除去した。エーテル（５ｍＬ）をさらに添加し、沈降と上澄み除去を繰り返し、残留溶媒を減圧条件下で除去した結果、２−（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（２−プロパン酸メチル）塩酸塩（ＵＬ６−００２）（９２ｍｇ、９８％）を黄色の粉末として得た：ｍ／ｚ  ５４３（Ｍ＋Ｈ）＋（ＥＳ＋）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 10.61 (br s, 1H), 7.13-7.09 (m, 2H), 7.00-6.95 (m, 2H), 4.50-4.08 (br m, 2H) 3.78 (s, 3H), 3.50-3.19 (m, 3H), 2.87-2.54 (m, 14H), 1.17 (d, J=2.5 Hz, 6H), 1.15 (d, J = 2.5 Hz, 6H).
（実施例Ｆ）
【０１０９】
２−（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（２，２−プロパン酸ジメチル）塩酸塩（ＵＬ６−００４）
【０１１０】
【化９】
2016521702.tif 000010
【０１１１】
ステップ（ｉ）：２−（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（２，２−プロパン酸ジメチル）（ＵＬ６−００３）
ＤＣＭ中の３，４−ジヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド（ＵＬ１−１２７）（１．０７ｇ、２．６５ｍｍｏｌ）および２−ｔｅｒｔ−ブチルイミノ−２−ジエチルアミノ−１，３−ジメチルペルヒドロ−１，３，２−ジアザホスホリン（ポリマー結合、２．２ｍｍｏｌ／ｇ）（３．６２ｇ、７．９６ｍｍｏｌ）の溶液／懸濁物（２０ｍＬ、０℃）へ、塩化ピバロイル（０．６９２ｍＬ、５．８４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温に達するまで放置し、１時間振った。次いで混合物を濾過し、真空中で濃縮した。残留物をジエチルエーテル（２０ｍＬ）で磨砕し、結果として生じた固体を濾過により単離し、エーテルで洗い流した結果、２−（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（２，２−プロパン酸ジメチル）（ＵＬ６−００３）（１．０１ｇ、６５％）を灰色がかった白色の固体として得た：ｍ／ｚ  ５７１（Ｍ＋Ｈ）＋（ＥＳ＋）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.14-7.09 (m, 2H), 7.01-6.96 (m, 2H), 3.78 (s, 3H), 3.45-3.10 (br m, 4H), 2.86 (s, 3H), 2.76 (s, 3H), 2.32-1.87 (br m, 7H), 1.23 (s, 9H), 1.22 (s, 9H).
【０１１２】
ステップ（ｉｉ）：２−（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（２，２−プロパン酸ジメチル）塩酸塩（ＵＬ６−００４）
ＤＣＭ中の２−（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（２，２−プロパン酸ジメチル）（ＵＬ６−００３）（５００ｍｇ、０．８７６ｍｍｏｌ）の溶液（１０ｍＬ、０℃）へ、ジオキサン中の４ＭのＨＣｌの溶液（０．２３０ｍＬ、０．９２０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温に達するまで放置した後、真空中で濃縮した。残留物を酢酸エチル（１０ｍＬ）で磨砕し、固体を濾過により単離し、酢酸エチルで洗い流した結果、２−（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（２，２−プロパン酸ジメチル）塩酸塩（ＵＬ６−００４）（０．４３６ｇ、８２％）を灰色がかった白色の固体として得た：ｍ／ｚ  ５７１（Ｍ＋Ｈ）＋（ＥＳ＋）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 10.94 (br s, 1H), 7.20-7.14 (m, 2H), 7.02-6.96 (m, 2H), 4.45-3.95 (br m, 2H), 3.79 (s, 3H), 3.52-3.28 (br m, 3H), 3.15-2.53 (m, 12H), 1.25 (s, 9H), 1.23 (s, 9H).
（実施例Ｇ）
【０１１３】
（（（（２，５−ビス（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイル）ビス（オキシ））ビス（カルボニル））ビス（３，１−フェニレン））ビス（メチレン）ビス（リン酸水素）ナトリウム（ＵＬ６−００６）
【０１１４】
【化１０】
2016521702.tif 000011
【０１１５】
ステップ（ｉ）：メチル３−（（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）メチル）ベンゾエート（９）
ＴＨＦ中のメチル３−（ヒドロキシメチル）ベンゾエート（３．００ｇ、１８．１ｍｍｏｌ）およびジ−ｔｅｒｔ−ブチルジエチルホスホロアミダイト（６．７５ｇ、２７．１ｍｍｏｌ）の溶液（１００ｍＬ）へ、５−メチル−１Ｈ−テトラゾール（３．０４ｇ、３６．１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で４時間３０分間撹拌し、次いで１０分間にわたり−７８℃まで冷却した後、３−クロロベンゾペルオキシ酸（７．２８ｇ、３２．５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温まで加温し、室温で１時間撹拌した後、亜硫酸水素ナトリウム水溶液（約４０％、５０ｍＬ）の添加により急冷した。揮発物を真空中で除去し、水性残留物を酢酸エチル（２００ｍＬ）と水（１００ｍＬ）との間で分割した。水相を、追加分の酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を炭酸水素ナトリウム水溶液（３×１５０ｍＬ）および塩水（１００ｍＬ）で順次洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空中で濃縮した結果、淡黄色の油を得た。この油を酢酸エチル（２００ｍＬ）に溶解し、炭酸水素ナトリウム水溶液（４×１５０ｍＬ）および塩水（１００ｍＬ）で順次洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空中で濃縮した結果、淡黄色の油を得た。粗原料をシリカゲルクロマトグラフィー（１２０ｇ、０〜１００％のイソヘキサン中酢酸エチル）により精製した結果、メチル３−（（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）メチル）ベンゾエート（９）（５．５８ｇ、８１％）を得た：ｍ／ｚ  ３８１（Ｍ＋Ｎａ）＋（ＥＳ＋）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.01 (td, J = 1.7, 0.7 Hz, 1H), 7.92 (dt, J = 7.8, 1.5 Hz, 1H), 7.66 (ddd, J = 7.7, 1.9, 1.1 Hz, 1H), 7.55 (dd, J = 8.0, 7.4 Hz, 1H), 5.01 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 3.86 (s, 3H), 1.44 - 1.36 (m, 18H).
【０１１６】
ステップ（ｉｉ）：３−（（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）メチル）安息香酸（１０）
メチル３−（（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）メチル）ベンゾエート（９）（３．００ｇ、８．３７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶解した。水酸化ナトリウム（０．６７０ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）を水（３ｍＬ）に溶解し、この溶液を反応混合物へ添加し、続いてエタノール（３ｍＬ）を添加した。反応混合物を室温で１８時間撹拌した後、溶媒を真空中で除去した。水（２０ｍＬ）を残留物へ添加して溶液を取得し、これを１Ｍのリン酸の滴下添加によって酸性化した。沈殿溶液を酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空中で濃縮した結果、３−（（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）メチル）安息香酸（１０）（２．３８ｇ、７５％）を灰色がかった白色の固体として得た：ｍ／ｚ  ３４３（Ｍ−Ｈ）−（ＥＳ−）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 13.01 (s, 1H), 8.00 - 7.97 (m, 1H), 7.90 (dt, J = 7.8, 1.5 Hz, 1H), 7.65 - 7.59 (m, 1H), 7.52 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 5.00 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 1.45 - 1.33 (m, 18H).
【０１１７】
ステップ（ｉｉｉ）：２，５−ビス（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（３−（（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）メチル）ベンゾエート）（１１）
ＴＨＦ中の３，４−ジヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−Ｎ２，Ｎ２，Ｎ５，Ｎ５−テトラメチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジカルボキシレート（ＵＬ１−００５）（８５７ｍｇ、２．４７ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルピリジン−４−アミン（１２１ｍｇ、０．９８７ｍｍｏｌ）および３−（（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）メチル）安息香酸（１０）（２．３８ｇ、６．９１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液（４０ｍＬ）へ、Ｎ１−（（エチルイミノ）メチレン）−Ｎ３，Ｎ３−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン（１．２２ｍＬ、６．９１ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で２時間撹拌した。混合物を飽和炭酸アンモニウム溶液（５０ｍＬ）へ注入し、酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出し、続いてＤＣＭ（２×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を脱水（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空中で濃縮した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（８０ｇ、１０％のＤＣＭ中ＴＨＦ）により精製した結果、２，５−ビス（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（３−（（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）メチル）ベンゾエート）（１１）（０．６４５ｇ、２６％）を淡黄色の固体として得た：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.03 (s, 2H), 7.95 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.71 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.57 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 7.22-7.17 (m, 2H), 7.02-6.97 (m, 2H), 4.99 (d, J = 8.6 Hz, 4H), 3.80 (s, 3H), 2.88 (s, 6H), 2.73 (s, 6H), 1.35 (s 36H).
【０１１８】
ステップ（ｉｖ）：２，５−ビス（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（３−（（ホスホノオキシ）メチル）ベンゾエート）（ＵＬ６−００５）
ＤＣＭ中の２，５−ビス（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（３−（（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）メチル）ベンゾエート）（１１）（６４２ｍｇ、０．６４２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液（２５ｍＬ）へ、ＴＦＡ（２．５ｍＬ、３２．４ｍｍｏｌ）を添加した。３０分後、反応混合物を真空中で濃縮し、ジエチルエーテル（２０ｍＬ）で磨砕した。固体を濾過により単離し、真空中で乾燥させた結果、２，５−ビス（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（３−（（ホスホノオキシ）メチル）ベンゾエート）（ＵＬ６−００５）（２８８ｍｇ、５７％）を白色の固体として得た：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.00 (s, 2H), 7.93 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.71 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.56 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 7.22-7.18 (m, 2H), 7.02-6.98 (m, 2H), 4.95 (d, J = 7.5 Hz, 4H), 3.80 (s, 3H), 2.89 (s, 6H), 2.75 (s, 6H).
【０１１９】
ステップ（ｖ）：（（（（２，５−ビス（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイル）ビス（オキシ））ビス（カルボニル））ビス（３，１−フェニレン））ビス（メチレン）ビス（リン酸水素）ナトリウム（ＵＬ６−００６）
アセトニトリル中の２，５−ビス（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（３−（（ホスホノオキシ）メチル）ベンゾエート）（ＵＬ６−００５）（２７７ｍｇ、０．３５７ｍｍｏｌ）の懸濁物（２ｍＬ）へ、０．１Ｍの重炭酸ナトリウム（７．１４ｍＬ、０．７１４ｍｍｏｌ）を添加した。結果として生じた溶液を１時間放置した後、アセトニトリルを真空中で除去した。結果として生じた水溶液を凍結乾燥した結果、（（（（２，５−ビス（ジメチルカルバモイル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイル）ビス（オキシ））ビス（カルボニル））ビス（３，１−フェニレン））ビス（メチレン）ビス（リン酸水素）ナトリウム（ＵＬ６−００６）（２８０ｍｇ、９５％）を白色の粉末として得た：ｍ／ｚ  ７７６．０（Ｍ＋３Ｈ）＋（ＥＳ＋）。1H NMR (400 MHz, D2O) δ: 8.13 (s, 2H), 8.07 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.80 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.58 (t,2H) 7.34-7.30 (m, 2H), 7.14-7.10 (m, 2H), 4.96 (d, J = 7.1 Hz, 4H), 3.91 (s, 3H), 3.11 (s, 6H), 2.90 (s, 6H).
（実施例Ｈ）
【０１２０】
（（（（２−ジメチルカルバモイル）−５−（エトキシカルボニル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイル）ビス（オキシ））ビス（カルボニル））ビス（４，１−フェニレン））ビス（メチレン）ビス（リン酸水素）ナトリウム（ＵＬ６−００８）
【０１２１】
【化１１】
2016521702.tif 000012
【０１２２】
ステップ（ｉ）：メチル４−（（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）メチル）ベンゾエート（１２）
ＴＨＦ中のメチル４−（ヒドロキシメチル）ベンゾエート（５．００ｇ、３０．１ｍｍｏｌ）およびジ−ｔｅｒｔ−ブチルジエチルホスホロアミダイト（１２．５６ｍＬ、４５．１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液（１５０ｍＬ）へ、５−メチル−１Ｈ−テトラゾール（２．５３ｇ、３０．１ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で撹拌した。４時間後、反応混合物を−７８℃まで冷却し、３−クロロベンゾペルオキシ酸（１２．１ｇ、５４．２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温に達するまで放置し、１６時間撹拌した。反応混合物を飽和亜硫酸水素ナトリウム溶液（１００ｍＬ）で急冷し、酢酸エチル（２×２００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（５００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空中で濃縮した。粗原料をシリカゲルクロマトグラフィー（３３０ｇ、０〜１００％のヘキサン中酢酸エチル）により精製した結果、メチル４−（（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）メチル）ベンゾエート（１２）（９．３２ｇ、８６％）を白色の固体として得た：ｍ／ｚ  ３８１．０（Ｍ＋Ｎａ）＋（ＥＳ＋）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.99-7.97 (m, 2H), 7.54-7.51 (m, 2H), 5.01 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 3.85 (s, 3H), 1.44-1.37 (m, 18H).
【０１２３】
ステップ（ｉｉ）：４−（（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）メチル）安息香酸（１３）
ＴＨＦ中のメチル４−（（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）メチル）ベンゾエート（１２）（１．６３ｇ、４．５５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液（２０ｍＬ）へ、水酸化ナトリウム（３６４ｍｇ、９．１０ｍｍｏｌ）水溶液（４ｍＬ）を添加し、続いてエタノール（４ｍＬ）を添加した。反応混合物を室温で１６時間撹拌した。次いで有機溶媒を真空中で除去し、結果として生じた水溶液を１Ｍのリン酸の滴下添加により約ｐＨ６にまで酸性化させた。次いでこの溶液をＤＣＭ（２×１０．０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空中で濃縮した。結果として生じた残留物を酢酸エチル（１０ｍＬ）で磨砕し、濾過により単離した結果、４−（（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）メチル）安息香酸（１３）（１．０１ｇ、６１％）を白色の固体として得た：ｍ／ｚ  ３６７．０（Ｍ＋Ｎａ）＋（ＥＳ＋）、３４３．０（Ｍ−Ｈ）−（ＥＳ−）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.99 (s, 1H), 7.98-7.94 (m, 2H), 7.51-7.47 (m, 2H), 5.00 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 1.41 (s, 18H).
【０１２４】
ステップ（ｉｉｉ）：２−（ジメチルカルバモイル）−５−（エトキシカルボニル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（４−（（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）メチル）ベンゾエート）（１４）
ＴＨＦ中の４−（（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）メチル）安息香酸（１３）（２．５３ｇ、７．３５ｍｍｏｌ）、エチル５−（ジメチルカルバモイル）−３，４−ジヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキシレート（ＵＬ１−０１２）（９１４ｍｇ、２．６３ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチルピリジン−４−アミン（１２８ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液（６０ｍＬ）へ、Ｎ１−（（エチルイミノ）メチレン）−Ｎ３，Ｎ３−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン（１．３０ｍＬ、７．３５ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で２４時間撹拌した。反応混合物を飽和塩化アンモニウム水溶液（１００ｍＬ）へ注入し、酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出し、続いてＤＣＭ（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空中で濃縮した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（１２０ｇ、酢酸エチル）により精製した結果、２−（ジメチルカルバモイル）−５−（エトキシカルボニル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（４−（（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）メチル）−ベンゾエート）（１４）（１．１９ｇ、４３％）を白色の固体として得た：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.07-8.00 (m, 4H), 7.55 (dd, J = 8.5, 3.5 Hz, 4H), 7.32-7.27 (m, 2H), 7.01-6.96 (m, 2H), 5.02 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 5.01 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 3.93 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.81 (s, 3H), 2.89 (s, 3H), 2.69 (s, 3H), 1.38 (s, 36H), 0.81 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
【０１２５】
ステップ（ｉｖ）：２−（ジメチルカルバモイル）−５−（エトキシカルボニル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（４−（（ホスホノオキシ）メチル）ベンゾエート）（ＵＬ６−００７）
ＤＣＭ中の２−（ジメチルカルバモイル）−５−（エトキシカルボニル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（４−（（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）メチル）ベンゾエート）（１４）（１．１５ｇ、１．１４９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液（５０ｍＬ）へ、トリフルオロ酢酸（２．５ｍＬ、３２．４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮した。残留物を酢酸（２０ｍＬ）で磨砕し、結果として生じた固体を濾過し、酢酸およびジエチルエーテルで洗い流し、凍結乾燥させた結果、２−（ジメチルカルバモイル）−５−（エトキシカルボニル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（４−（（ホスホノオキシ）メチル）ベンゾエート）（ＵＬ６−００７）（０．５１６ｇ、５７％）を白色の固体として得た：ｍ／ｚ  ７７７（Ｍ＋Ｈ）＋（ＥＳ＋）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.06-7.99 (m, 4H), 7.57-7.51 (m, 4H), 7.32-7.27 (m, 2H), 7.01-6.96 (m, 2H), 4.98 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 4.97 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 3.94 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.81 (s, 3H), 2.89 (s, 3H), 2.70 (s, 3H), 0.82 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
【０１２６】
ステップ（ｖ）：（（（（２−ジメチルカルバモイル）−５−（エトキシカルボニル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイル）ビス（オキシ））ビス（カルボニル））ビス（４，１−フェニレン））ビス（メチレン）ビス（リン酸水素）ナトリウム（ＵＬ６−００８）
水（１０ｍＬ）およびアセトニトリル（１０ｍＬ）中の２−（ジメチルカルバモイル）−５−（エトキシカルボニル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイルビス（４−（（ホスホノオキシ）メチル）ベンゾエート）（ＵＬ６−００７）（０．５１６ｇ、０．６６４ｍｍｏｌ）の溶液へ、０．１Ｍの重炭酸ナトリウム水溶液（１３．３ｍＬ、１．３３ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液を２０分間放置した後、アセトニトリルを真空中で除去した。結果として生じた水溶液を凍結乾燥した結果、（（（（２−ジメチルカルバモイル）−５−（エトキシカルボニル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−３，４−ジイル）ビス（オキシ））ビス（カルボニル））ビス（４，１−フェニレン））ビス（メチレン）ビス（リン酸水素）ナトリウム（ＵＬ６−００８）（０．５３７ｇ、９８％）を白色の粉末として得た：ｍ／ｚ  ７７７（Ｍ＋３Ｈ）＋（ＥＳ＋）。1H NMR (400 MHz, DMSO-D2O) δ: 8.14-8.09 (m, 4H), 7.57 (d, J = 8.2 Hz, 4H), 7.44-7.39 (m, 2H), 7.15 (m, 2H), 5.02-4.96 (m, 4H), 4.02 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.93 (s, 3H), 3.10 (s, 3H), 2.83 (s, 3H), 0.82 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
【０１２７】
下記の表１に記載の実施例を、上記の方法を用いて調製した。
【０１２８】
エントリー１〜４は比較目的での記載であり、本発明の一態様として請求範囲に含まれるものではない。
【０１２９】
【表１−１】
2016521702.tif 000013
【０１３０】
【表１−２】
2016521702.tif 000014
【０１３１】
【表１−３】
2016521702.tif 000015
【０１３２】
【表１−４】
2016521702.tif 000016
【０１３３】
生物学的試験
以下、本発明の化合物すべてを使用して実施した生物学的アッセイ、ならびに化合物ＵＬ１−００５およびＵＬ１−０１２、ＵＬ１−０２７およびＵＬ１−１１４を対比化合物として使用して実施した追加アッセイの要約を記載する。
【０１３４】
Ａ．一次インビトロアッセイ：肺炎球菌溶血素の溶血作用の阻害
論拠
このアッセイの基礎は、肺炎球菌溶血素は赤血球細胞に添加された場合、赤血球の溶解を誘発し、ヘモグロビン放出に繋がるという点にある。阻害性化合物が存在すると、肺炎球菌溶血素誘発性溶解が阻止され、赤血球はマイクロタイタープレートウェルの底部に良好に沈殿し、上澄みは透明である。しかし、化合物が阻害性でなければ、赤血球は溶解し、ヘモグロビンが上澄みへ放出される。
【０１３５】
実験手順
試験化合物溶液（典型的にＤＭＳＯ中５ｍＭ）を、１００％のＤＭＳＯ中で１：１の比率で希釈した。次いで化合物を９６ウェル型丸底マイクロタイタープレートの１１個のウェルを使用して、１００％のＤＭＳＯ中で連続的に２倍に希釈した。次いでＰＢＳをすべてのウェルへ添加して、ＰＢＳ中で１：１０の化合物希釈を達成した。次いで肺炎球菌溶血素を、そのＬＤ１００に相当する濃度で添加した。次いでプレートを３７℃にて３０〜４０分間培養した。培養期間終了後、４％（ｖ／ｖ）の等容積のヒツジ赤血球懸濁物を各ウェルへ添加し、プレートを再び３７℃で少なくとも３０分間培養した。ＰＢＳに赤血球のみ入れた対照（溶解が生じない対照）または赤血球に肺炎球菌溶血素を加えたもの（溶解が生じる対照）を、同じ手順に従って調製した。赤血球と併せた培養の後、各ウェルの５９５ｎｍでの吸収度を測定し、データを各試験化合物についてのＩＣ５０の決定に使用した。ＩＣ５０の値を、非線形回帰曲線適合を使用して決定した。これを目的に、試験化合物の濃度の対数を、Ａ５９５の値から推定される阻害率と対比する形でプロット化し、続いて勾配をデータに適合させた。
【０１３６】
結果
このアッセイは主に、親活性化合物ＵＬ１−００５、ＵＬ１−０１２およびＵＬ１−０２７の阻害活性の決定に関連する。一般的に、プロドラッグの場合、阻害活性はインビトロでは存在しないと予想されるが、これはプロドラッグの場合、プロドラッグ成分を加水分解し、親活性化合物の形成を可能にするために血漿酵素の存在が必要であるためである。しかし、我々の一次インビトロアッセイでは、血液がアッセイ対象化合物であり、肺炎球菌溶血素によって誘発される溶血の阻害を評価するために使用される。したがって、我々は、親活性化合物の放出に繋がる、血液中での４０分間の培養過程で発生するプロドラッグ成分の酵素的切断を背景に、本発明のプロドラッグの存在下での阻害活性を観察する。要約すると、このアッセイでは親活性化合物ＵＬ１−００５、ＵＬ１−０１２およびＵＬ１−０２７のインビトロ活性を実証し、そしてプロドラッグＵＬ１−１１４、ＵＬ６−００２、ＵＬ６−００４、ＵＬ６−００６およびＵＬ６−００８が、血液の存在下で親活性化合物へと変換することを示す。この親活性化合物への変換は、セクションＦでさらに実証される。ＩＣ５０の値は下記の表２に記載のとおりである。
【０１３７】
【表２】
2016521702.tif 000017
【０１３８】
Ｂ．二次インビトロアッセイ：肺炎球菌溶血素誘発性乳酸塩脱水素酵素放出の阻害
論拠
肺炎球菌溶血素は、ヒトの単球および肺上皮細胞からの乳酸塩脱水素酵素（ＬＤＨ）放出を誘発し、この現象は、血漿膜の損傷または破壊を示唆するものである［Infect. Immun. (2002) 70 1017-1022］。培養下のヒト肺上皮細胞に対する肺炎球菌溶血素の細胞毒性効果を本開示の化合物が阻害する能力を実証するため、ＬＤＨアッセイを応用した。このアッセイの使用により、（１）活性（阻害性化合物の存在下で肺炎球菌溶血素に曝露された細胞からのＬＤＨ放出の阻害を、肺炎球菌溶血素だけに曝露された細胞からのＬＤＨ放出と対比して実証する）、（２）化合物毒性（対照ウェルにおいて、化合物だけに曝露された細胞からのＬＤＨ放出を試験できるよう、アッセイ形式を設計した）、これら２項目の主要情報がもたらされる。
【０１３９】
実験手順
ヒト肺上皮細胞（Ａ５４９）を平底９６ウェル型組織培養プレートに播種し、グルタミンを補給されたＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃、５％のＣＯ２の条件で２４時間培養した。使用に先立ち、細胞をＰＢＳで洗浄した。セクションＡに記載のとおり、試験化合物希釈物を肺炎球菌溶血素と併せて培養し、その後、ヒト肺上皮細胞を含有するウェルへ移し、プレートを３７℃、５％のＣＯ２の条件で３０分間培養した。以下に挙げる対照をプレートに含めた：（１）培養下での細胞からのＬＤＨの自然放出を測定するための陰性対照（低対照と呼ばれる（ＰＢＳのみ））、（２）細胞からのＬＤＨの最大放出を測定するための陽性対照（ＰＢＳ中の１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ）、（３）肺炎球菌溶血素誘発性ＬＤＨ放出のみ測定するための肺炎球菌溶血素溶液、（４）化合物単独での毒性を評価するための試験化合物溶液。培養後、上澄みを、製造者からの指示に従って調製した乳酸塩脱水素酵素アッセイ混合物（ＴＯＸ７、Ｓｉｇｍａ）を２倍の量含有する、丸底９６ウェル型マイクロタイタープレートのウェルへ移した。遮光チャンバー内で室温にて５〜１０分間培養した後、１ＮのＨＣｌをすべてのウェルへ添加した。その後、４９０ｎｍおよび６５５ｎｍでの吸収度を測定した。試験化合物が存在する条件と存在しない条件での、肺炎球菌溶血素によって誘発されるＬＤＨ放出率を、試験化合物の濃度の対数と対比する形でプロット化し、そしてＩＣ５０を、セクションＡで溶血アッセイの阻害について前述のとおり決定した。
【０１４０】
結果
プロドラッグＵＬ６−００５およびＵＬ６−００６の親活性化合物であるＵＬ１−００５について、６２．５μＭ〜０．４９μＭの濃度範囲にわたり、三重のＬＤＨアッセイで試験を行った。得られた結果が図１に示されている。
【０１４１】
図１において、（１）１００％での横方向の点線、ＰＬＹ対照（−−）は、肺炎球菌溶血素の影響を受けた細胞からのＬＤＨの最大放出を示す一方、０％での横方向の実線（低対照）は、アッセイ用緩衝剤だけに曝露された細胞の上澄みに相当し、これはアッセイ条件下での自然なＬＤＨ放出を示す。（２）灰色の実線（△）は、肺炎球菌溶血素に曝露された細胞からのＬＤＨ放出が、ＵＬ１−００５が存在する場合、ＰＬＹ対照に比べ、用量応答の形で有意に減少したことを示す。これはＵＬ１−００５が、培養下のヒト肺上皮細胞に対する肺炎球菌溶血素による損傷を防ぎ、ＩＣ５０が０．４９μＭ未満であることを実証するものである。（３）黒い実線（−×−）は、治療的ＩＣ５０値の最大約１５０倍までの試験濃度において、ＵＬ１−００５が細胞毒性を呈しないことを示す。
【０１４２】
結論
ＵＬ１−００５は、培養下のヒト肺上皮細胞に対する肺炎球菌溶血素の損傷作用を阻害する。ＵＬ１−００５は、治療的ＩＣ５０値の１５０倍でも、ヒト肺上皮細胞に対して細胞毒性効果を呈さなかった。
【０１４３】
Ｃ．エクスビボアッセイ：培養上衣細胞の線毛機能に対する肺炎球菌溶血素の効果の阻害
論拠
上衣線毛細胞は、脳の脳室および脊髄の中心管の内側を覆い、また中枢神経系の周囲における脳脊髄液（ＣＳＦ）の循環を受け持つ線毛に覆われている。この層は脳脊髄液の往来における選択的な脳のバリアの役割を果たし、またＣＳＦ容積を制御する役割も果たす。肺炎球菌溶血素が上衣層に対して引き起こす損傷を阻害剤が防ぐかどうか調査するため、ラットの髄膜炎のエクスビボモデルを使用した。このモデルは、脳室の内側を覆う細胞が肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）およびその有毒生成物に曝露されるという、インビボ状況を再現する、新生ラットの脳からの線毛上衣細胞の培養と分化に基づく。
【０１４４】
髄膜炎のエクスビボモデルの使用は、化合物が肺炎球菌溶血素による損傷をインビボで防ぐ能力を予測するための、強力な手段に相当する。
【０１４５】
実験手順
上衣細胞培養物を、従前の文献に記載の方法により調製した［Microb. Pathog. (1999) 27 303-309］。組織培養トレーをウシフィブロネクチンで被覆し、使用前に３７℃、５％（ｖ／ｖ）のＣＯ２の条件で２時間培養した。成長培地は最小必須培地（ＭＥＭ）にペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、ファンギゾン（２．５μｇ／ｍＬ）、ＢＳＡ（５μｇ／ｍＬ）、インスリン（５μｇ／ｍＬ）、トランスフェリン（１０μｇ／ｍＬ）およびセレン（５μｇ／ｍＬ）を添加したものであった。新生（生後０〜１日）ラットを頸椎脱臼により死なせ、脳を取り出した。左右の半球皮質および前頭皮質の端部領域と一緒に、小脳を取り出した。残った脳領域を、４ｍＬの成長培地中で機械的に解離させた。１つまたは２つの脳からの解離組織を、成長培地を２．５ｍＬずつ含有する組織培養トレーのウェル（１ウェル当たり５００μＬ）へ添加した。次いで細胞を３７℃、５％（ｖ／ｖ）のＣＯ２の条件で培養した。３日後に培地を交換し、その後２日おきに上衣細胞へ、トロンビンを補充した新しい成長培地を２ｍＬずつ供給した。
【０１４６】
約２週間後、細胞に線毛が生え揃い、実験準備が整った。実験を実施するに当たり、成長培地を、２５ｍＭ、ｐＨ７．４のＨＥＰＥＳを含有する１ｍＬの培地ＭＥＭと交換した。倒立光学顕微鏡のステージを包囲するサーモスタット制御型培養チャンバーの内側に、組織培養トレーを配置した。細胞培養物を、アッセイ培地が３７℃に達するまで平衡化させた。この時点で、１ｍＬの培地ＭＥＭ中で３７℃にて４０分間事前培養した、組み換え精製肺炎球菌溶血素に試験化合物を加えたものと加えないものを、線毛細胞を含有するウェルへ添加した。対照細胞へ、１ｍＬのＭＥＭ培地を添加した。曝露の前後３０分間にわたり、秒間５００フレームに設定したデジタル高速ビデオカメラを使用して、線毛の脈動を記録した。記録したビデオシーケンスを、フレームレートを落として再生し、線毛脈動周波数（ＣＢＦ）を以下の方程式により決定した。
【０１４７】
【数１】
2016521702.tif 000018
【０１４８】
結果
測定したパラメーターは、線毛脈動周波数（ＣＢＦ）であった。培養下の線毛細胞へ添加された肺炎球菌溶血素は、重度または完全な線毛脈動損失を誘発する。プロドラッグＵＬ５−００１の親活性化合物であるＵＬ５−００１は、培養下の上衣細胞の線毛機能に対して肺炎球菌溶血素が誘発する損傷効果を阻害した（図２）。
【０１４９】
図２において、各時点は、３回の独立的実験における、各ウェルからの個別の１０本の線毛の線毛脈動周波数（ＣＢＦ）測定結果の正規化平均±標準偏差を表す。（１）対照１、アッセイ培地のみ：記号（−｜−）は正常な線毛脈動の参照として使用されたアッセイ培地におけるＣＢＦ測定結果を表す。記録全体を通じて、ＣＢＦに対する損傷効果は全く見られなかった。（２）対照２、肺炎球菌溶血素のみ：記号（●）は肺炎球菌溶血素を添加したウェルにおけるＣＢＦ測定結果を表す。細胞毒素曝露後５分以内に、ＣＢＦが元来の周波数の０％にまで下がる有意な低下が観察された。（３）ＵＬ１−００５での処理：記号（▽）は肺炎球菌溶血素とＵＬ１−００５（１．５６μＭ）が存在する条件でのＣＢＦ測定結果を表す。有意なＣＢＦ損失が見られなかったことから、ＵＬ１−００５は脳上衣細胞の線毛脈動周波数に対する肺炎球菌溶血素誘発性損傷を阻害することが分かる。対照１（培地のみ）のＣＢＦと処置を施した状況でのＣＢＦ（▽）との間に統計的差異がなかったことから、肺炎球菌溶血素の損傷効果に対するＵＬ１−００５による阻害が、対照培地のみの場合に匹敵する度合いで達成されたことが窺える。
【０１５０】
結論
ＵＬ１−００５は、培養下の上衣線毛細胞に対して肺炎球菌溶血素が誘発する損傷効果を阻害する。これを基に、プロドラッグＵＬ６−００５およびＵＬ６−００６がインビボで親活性化合物ＵＬ１−００５へと変換される場合、後者は肺炎球菌溶血素がインビボで損傷を引き起こすことを防ぐことになると予測される。
【０１５１】
Ｄ．静脈内投与に適する製剤を決定するための溶解性および化学的安定性の試験
論拠
非経口送達は、本発明の化合物の好適な一投与経路である。したがって、製剤の水溶性および化学的安定性は、本発明の化合物の医薬的有用性を示す重要なパラメーターである。本発明のプロドラッグは、親活性化合物の溶液の溶解性および化学的安定性を改善するよう設計され、またベッドの側で、静脈内投与に適合するｐＨにて安全な生理食塩水中で高濃度で再構成できる、溶解性の高い安定した製剤を達成すべく、最適化された。製剤が静脈内投与されると、プロドラッグは循環過程で酵素的に切断され、親活性化合物を放出することになる。血液の存在下において、該当する親活性化合物へ至るプロドラッグの切断は、セクションＦで実証される。
【０１５２】
製剤における溶解性および化学的安定性の改善に関する実施例を、以下、プロドラッグＵＬ６−００６とＵＬ６−００８、ならびにそれぞれの該当する親活性化合物であるＵＬ１−００５とＵＬ１−０１２について記載する。
【０１５３】
実験手順
−  溶解性試験
溶解性試験を、バイアルに５〜１０ｍｇの化合物を充填し、続いてＰＢＳ溶液または０．９％の生理食塩水を添加して１００ｍｇ／ｍＬの濃度を達成することによって実施した。溶解性が観察されなかった場合、溶液を５０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬおよび４ｍｇ／ｍＬの濃度へと連続的に、完全な溶解性が観察されるまで希釈した。
【０１５４】
−  化学的安定性評価
１〜２ｍｇの化合物をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解した後、結果として得られた溶液０．４ｍＬを、３７．５℃で撹拌したＰＢＳ溶液（９．６ｍＬ）へ添加することによって、安定性試験を実施した。試料（約０．５ｍＬ）を即座に、ＨＰＬＣ分析用として採取した。その後の様々な時点での分析用として、追加試料を採取した。時間の経過に伴う化合物の濃度低下から、半減期を決定した。
【０１５５】
結果
プロドラッグＵＬ６−００６とＵＬ６−００８ならびにそれぞれの該当する親活性化合物を使用して得られた製剤が表３に示されている。プロドラッグＵＬ６−００６およびＵＬ６−００８を使用した場合、それぞれの該当する親活性化合物ＵＬ１−００５およびＵＬ１−０１２に比べ、溶解性の向上と化学的安定性の増進が得られた。したがって、これらのプロドラッグは、高い濃度と静脈内投与に適合するｐＨの条件で溶解性が高く化学的安定性が増進した安全な製剤を提供することによる、その医薬的有用性を理由に選択される。
【０１５６】
【表３】
2016521702.tif 000019
【０１５７】
Ｅ．マウス肺炎モデルを使用してのインビボ抗力アッセイ
論拠
このモデルは本発明者らの実験室で十分に立証済みであり、またこの分野に取り組む他の研究グループも適応するようになってきた。このモデルを使用して、肺炎球菌溶血素は肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）の発症およびインビボでの生存に不可欠であることが示された。この疾患モデルにおいて、肺炎球菌溶血素が欠落している肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）突然変異株（ＰＬＮ−Ａ）に感染したマウスは、（１）有意な生存率上昇、（２）疾患兆候の有意な遅延および減退、そして（３）肺炎症の大幅な減少および菌血症（肺から血液循環への細菌侵入）の低減を示した。したがって、このインビボ疾患モデルは、野生型肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）に感染し、肺炎球菌溶血素阻害剤での処置を施されたマウスの疾患進行を研究するための、強力なツールに相当する。この研究のエンドポイントパラメーターとして、生存率を使用した。
【０１５８】
実験手順：感染、処置および疾患兆候評定
非近交系ＭＦ１、生後８週以上、体重２５〜３０ｇの雌マウスを使用することができる。マウスは温度、湿度および日長を制御された条件下で飼育される。水道水とペレットを自由に摂取することができる。インビボ実験を、対照１（感染および非処置）、対照２（非感染および処置）の２つの対照群と、１つの処置群（感染および処置）を使用して実施する。対照群１と処置群のマウスを肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）株Ｄ３９に経鼻感染させる（手順については後述）。感染完了後、与えた用量について生菌数を決定する（後述するとおり）。その後、６時間おきに、処置群と対照群２のマウスに試験化合物を静脈内投与する一方、対照群１には賦形剤のみ投与する。疾患兆候の進行（表４）を、Ｍｏｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓのスキームに基づき、６時間おきに評価する［Veterinary Record. (1985) 111, 431-436］。２＋の昏睡状態に陥ったらマウスを死なせ、時刻を記録した。対照群と試験群の生存率を、対数順位検定と比較する。
【０１５９】
【表４】
2016521702.tif 000020
【０１６０】
実験設計が図３に示されている。肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）感染、処置剤の送達および前述の細菌生存数決定に用いる手順の詳細は以下のとおりである。
【０１６１】
−  経鼻点滴による感染
１分当たり酸素量１．６〜１．８Ｌの条件で２．５％（ｖ／ｖ）のイソフルランを使用して、マウスに軽く麻酔をかける。麻酔が効いた状態の確認は、足反射の有無の観察によって行う。首筋を垂直方向の位置にして鼻を上に向けた状態で、マウスを保持する。次いで感染用量を滅菌ＰＢＳに混ぜ、鼻孔へ１滴ずつ、滴下の間にマウスが吸入できるような要領で落とす。感染用量の投与が済んだら、マウスをケージへ戻し、麻酔の効果から回復するよう仰向けに寝かせる。
【０１６２】
−  処置剤の静脈内投与
マウスを３７℃のインキュベータ内に１０分間入れておくことにより、静脈を拡張させる。次いで各マウスを個別に拘束装置内に置き、尾が露出した状態にする。抗菌性拭き取り用具で尾を消毒する。本発明の化合物を使用する処置剤を、尾の側部静脈のうち１本へ慎重に差し込まれた０．５ｍＬのインスリン注射器を使用して、６時間おきに静脈内投与する。用量を新たに調製し、マウスへ静脈内投与する。
【０１６３】
−  感染用量の生菌数の決定
Ｍｉｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｉｓｒａの方法により、生菌数決定を行う［J. Hyg. (1938) 38 732-749］。２０μＬの試料を、丸底の９６ウェル型マイクロタイタープレート内で１８０μＬのＰＢＳに入れ、最大１０６の希釈に至るまで連続的に希釈する。血液寒天培地プレートを６つのセクターに分け、個々のセクターに希釈物を６０μＬずつ入れる。プレートをＣＯ２ガス容器内で終夜、３７℃で培養する。翌日、３０〜３００のコロニーが見えるセクター内のコロニーを数える。１ミリリットル当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）濃度を、下記の方程式を使用して決定する。
【０１６４】
【数２】
2016521702.tif 000021
【０１６５】
Ｆ．マウス、ラットまたはヒトの血漿中におけるプロドラッグ誘導体から活性阻害剤への変換
論拠
プロドラッグ誘導体が血漿酵素の存在下で親活性化合物へ変換されることを実証するため、プロドラッグ誘導体をマウス、ラットまたはヒトの血漿を使用して、３７℃にて、２時間の期間にわたり５通りの時点で培養した。次いで試料をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析し、時間の経過に伴って出現した親活性化合物と残存プロドラッグ誘導体の量を求めた。
【０１６６】
実験手順
プロドラッグ誘導体を、マウス、ラットまたはヒトの血漿安定性アッセイにおいて、１０μＭの濃度で評価した。試験化合物をＤＭＳＯで希釈して、最終ストック濃度を１０ｍＭとした。アッセイの目的上、調製したストックをさらにＤＭＳＯで希釈して濃度を４００μＭとし、そして１９５μＬのマウス、ラットまたはヒトの血漿（ｐＨ７．４）へ５μＬを添加した後、３７℃で培養した。プレート内のＤＭＳＯの最終濃度は２．５％（ｖ／ｖ）であった。０．５５μＭのメトプロロールと１％（ｖ／ｖ）のギ酸を含有する４００μＬのアセトニトリルの添加により、培養後０分、１５分、３０分、６０分および１２０分経過時点で反応を終了させた。次いでプレートを３０００ｒｐｍ、４℃にて４５分間、遠心分離した。８０μＬの上澄みを、円錐底の９６ウェル型ガラスコートプレートへ移した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるプロドラッグ誘導体および活性種の分析の前に、４０μＬの水を添加した。このアッセイは、本発明者らからの依頼により、契約研究機関である英国のＣｙｐｒｏｔｅｘ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄがライセスターにて実施した。
【０１６７】
結果
残存プロドラッグ誘導体と出現した親活性化合物の定量化を、以下の要領で実施した。
【０１６８】
（１）親活性化合物を、マウス、ラットまたはヒトの不活性化血漿中で作成された６ポイント較正曲線を使用して定量化した。（２）０分の試料を基準に、各時点でのプロドラッグ化合物の残存率を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳピーク領域比（化合物のピーク領域／内部標準ピーク領域）を基に計算した。その後、この残存率を使用して、０分時点での開始濃度（１０μＭ）を基準に、各時点でのプロドラッグ化合物濃度を決定した。
【０１６９】
プロドラッグＵＬ６−００２、ＵＬ６−００４、ＵＬ６−００６およびＵＬ６−００８からそれぞれの親活性化合物であるＵＬ１−００５、ＵＬ１−０１２およびＵＬ１−０２７への変換の要約が、表５に示されている。
【０１７０】
結論
表５に記載の結果は明らかに、本発明のプロドラッグにおける、血漿中での親活性化合物への変換によって実証される治療的便益を示唆するものである。加えて、プロドラッグＵＬ６−００２、ＵＬ６−００６およびＵＬ６−００８の物理化学的特性は、非経口送達に適する製剤の調製に有利である。
【０１７１】
【表５】
2016521702.tif 000022
【０１７２】
結論
表５に記載の結果は明らかに、本発明のプロドラッグにおける、血漿中での親活性化合物への変換によって実証される治療的便益を示唆するものである。その治療的便益の実証に加え、本発明の化合物の物理化学的特性は製剤の調製に有利であり、特に、非経口送達に適する。
【０１７３】
本明細書および下記の特許請求の範囲の全体を通じ、別段に文脈から必要となる場合を除き、「含む」という言葉は、言明される整数またはステップもしくは複数の整数またはステップから成る群の包含を意味するものであり、他の整数またはステップもしくは複数の整数またはステップから成る群の除外を意味するものではないという点が理解されることになる。
【０１７４】
本明細書にて言及の特許および特許出願はすべて、その全体が、参照により組み込まれる。
【図１】
2016521702.tif 000025
【図２】
2016521702.tif 000026
【図３】
2016521702.tif 000027
【国際調査報告】
2016521702.tif 000028
2016521702.tif 000029
2016521702.tif 000030