(57)【要約】  【課題】本発明は膜透過のための化合物投与前駆体、及び該前駆体に基づく薬物担体製剤を提供する。本発明は調製した化合物投与前駆体および薬物担体製剤が、膜透過することが困難である化合物の膜透過性を効果的に向上させることができ、臨床投薬に対して新しい選択を提供する。  【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物投与前駆体であって、前記投与前駆体の構造式は
2016523836.tif 000008
であり、
ただし、Ｘは細胞膜を透過することの困難な化合物であり、ｌｉｎｋｅｒはＸとＤＮＡ又はＲＮＡとの間の連結基であることを特徴とする化合物投与前駆体。
【請求項２】
前記ＤＮＡ又はＲＮＡは一本鎖又は二本鎖であることを特徴とする請求項１に記載の化合物投与前駆体。
【請求項３】
前記ＤＮＡ又はＲＮＡの一本鎖又は二本鎖の長さは５個以上塩基対又は塩基であることを特徴とする請求項２に記載の化合物投与前駆体。
【請求項４】
前記ＤＮＡ又はＲＮＡは定義される長さ範囲における任意の配列であることを特徴とする請求項３に記載の化合物投与前駆体。
【請求項５】
前記ＤＮＡ又はＲＮＡは１つの共有結合するための官能基を有することを特徴とする請求項１に記載の化合物投与前駆体。
【請求項６】
前記ＤＮＡ又はＲＮＡ標識はビオチン、蛍光、同位素又はその他のトレースするための標識を含むことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の化合物投与前駆体。
【請求項７】
前記Ｘの分子量が１００〜４０００Ｄａであることを特徴とする請求項１に記載の化合物投与前駆体。
【請求項８】
前記Ｘは細胞膜を透過することが困難である非ペプチド系化合物又はペプチド系化合物であることを特徴とする請求項７に記載の化合物投与前駆体。
【請求項９】
前記ｌｉｎｋｅｒの化合物Ｘにおける接続部位はＸの生物活性を影響しないことを特徴とする請求項１に記載の化合物投与前駆体。
【請求項１０】
前記ｌｉｎｋｅｒは化合物ＸとＤＮＡ又はＲＮＡとが接続反応する両方に適合する任意の共有結合であることを特徴とする請求項１に記載の化合物投与前駆体。
【請求項１１】
前記ｌｉｎｋｅｒは化合物Ｘと直接的に共有結合し、或いは予め修飾された化合物Ｘで接続されることを特徴とする請求項１０に記載の化合物投与前駆体。
【請求項１２】
(１)化合物Ｘ及び１つの反応官能基を有するＤＮＡ又はＲＮＡを取る原料取得のステップと、
(２)化合物Ｘが選択的に二官能基試薬の１つの官能基と反応して、化合物Ｘ１が得られる、化合物Ｘ共有結合準備のステップと、
(３)１つの反応官能基を有するＤＮＡ又はＲＮＡに対して二官能基試薬で修飾され、ステップ(２)における化合物Ｘの共有結合に合わせた修飾ＤＮＡ又はＲＮＡが得られる、ＤＮＡ又はＲＮＡ共有結合準備のステップと、
(４)化合物Ｘ１とそれに合わせた修飾ＤＮＡ又はＲＮＡとを共有結合させ、分離・純化して化合物投与前駆体が得られる；或いは化合物Ｘ１とステップ（１)において１つの反応官能基を有するＤＮＡ又はＲＮＡとを共有結合させ、分離・純化して化合物投与前駆体が得られる；或いは化合物Ｘとステップ（３)における修飾ＤＮＡ又はＲＮＡとを共有結合させ、分離・純化して化合物投与前駆体が得られる共有結合ステップと、を含むことを特徴とする請求項１に記載の化合物投与前駆体の調製方法。
【請求項１３】
それは請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の化合物投与前駆体に担体を加入して調製してなることを特徴とする化合物投与前駆体に基づく薬物担体製剤。
【請求項１４】
前記担体はＤＮＡ又はＲＮＡトランスファー生物材料であることを特徴とする請求項１３に記載の化合物投与前駆体に基づく薬物担体製剤。
【請求項１５】
(１)１:１０−１００(Ｗ／Ｖ)の割合で化合物投与前駆体及び薬物担体を取る原料取得のステップと、
(２)化合物投与前駆体を取り、バッファーと均一に混合して溶液Ａが得られ、薬物担体を取り、バッファーを加入して均一に混合して溶液Ｂが得られ、溶液Ａと溶液Ｂとを混合させ、チップでピペットされ、室温にてインキュベーションされ、薬物担体製剤が得られるインキュベーションのステップと、を含むことを特徴とする請求項１３に記載の化合物投与前駆体に基づく薬物担体製剤の調製方法。
【請求項１６】
ステップ（２)において、室温にてインキュベーションする時間が２０ｍｉｎであることを特徴とする請求項１５に記載の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は化合物投与前駆体及び薬物担体製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物の有效性及び安全性はその体内薬物動態学特徴（例えば、薬物の体内の運送、活性又は毒性の発現、代謝など）に緊密に関連したが、こられの特徴は薬物の体内の膜貫通トランスファー過程に大いに依存するので、大部分の研究者は膜透過性が薬物の安全性および有效性を決める重要な要素の１つであることが考えられる[１]。組み合わせ化学、遺伝子技術、ハイスループットスクリーニング技術などの薬物研究開発に広く応用させると共に、大量の活性を有する候補薬物が発見されたが、薬物の膜透過性が悪い欠陥なので、多くの候補薬物が細胞に進入することができず、その相応の作用を発揮することができない。実際的には、多くの膜透過性が悪い候補薬物は強い生物活性を有し、腫瘍、糖尿病、心血管疾患などの治療分野においてよい効果を有する。そのため、どのように薬物の膜透過効率を向上させるのは、新薬研究のホットスポットと困難点になり、新しい技術を至急必要としてこの問題を解決する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は膜透過のための化合物投与前駆体、及び該前駆体に基づく薬物担体製剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は化合物投与前駆体を提供し、前記投与前駆体の構造式は、
2016523836.tif 000002
ただし、Ｘは細胞膜を透過することができない化合物であり、ｌｉｎｋｅｒはＸとＤＮＡ又はＲＮＡとの間の連結基である。
【０００５】
本発明において、Ｘは細胞膜を透過することができない化合物から選択し、該化合物が通常の使用時に細胞膜を透過することができず、研究開発過程において廃棄される可能性があり、或いは使用過程において最適な活性を発揮することができず、この化合物は本発明の実施例に使用した具体的な化合物に限定されない。本発明の研究によれば、該化合物はｌｉｎｋｅｒとＤＮＡ又はＲＮＡとが接続した後に、細胞膜を透過する条件を有することができ、遺伝子トランスファー方法によって、化合物Ｘの膜透過トランスファーを実現することができる。
【０００６】
前記「遺伝子トランスファー」とは、物理、化学又は生物方法を使用して核酸を細胞に転移する過程を意味する。本発明の前記遺伝子トランスファー方法は、明らかな細胞損傷を引き起こさないすべてのトランスファー方法であり、既知の陽イオン性脂質媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、ナノ粒子トランスフェクション、電気穿孔トランスフェクション及びその他の核酸物質を細胞内にトランスファーすることができる生物学方法のうちの１種又は複数種の方法の組合せを使用することができる。
【０００７】
さらに、前記ＤＮＡ又はＲＮＡは一本鎖又は二本鎖である。
【０００８】
さらに、前記ＤＮＡ又はＲＮＡの一本鎖又は二本鎖の長さは５個以上塩基対又は塩基以上である。
【０００９】
さらに、前記ＤＮＡ又はＲＮＡは定義された長さ範囲における任意の配列である。例えば、長さ５〜３８個塩基対又は塩基の一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡである。
【００１０】
一つの具体的な実施形態において、ＤＮＡ又はＲＮＡは、５ｂｐのｐｏｌｙＡ、１９ｂｐのｐｏｌｙＡ、３８ｂｐのｐｏｌｙＡ、１９ｂｐの一本鎖ランダム配列又は１９ｂｐの二本鎖ランダム配列であっでもよい。さらに、前記ＤＮＡ又はＲＮＡは１つの共有結合するための官能基を有する。
【００１１】
さらに、前記Ｘの分子量が１００〜４０００Ｄａである。
【００１２】
さらに、前記Ｘは細胞膜を透過することが困難である非ペプチド系化合物又はペプチド系化合物である。
【００１３】
さらに、前記ｌｉｎｋｅｒは化合物Ｘにおける接続部位がＸの生物活性を影響しない。
【００１４】
さらに、前記ｌｉｎｋｅｒは「化合物ＸがＤＮＡ又はＲＮＡと接続反応することに適合する任意の共有結合」であり、或いは「化合物とＤＮＡ／ＮＡとを接続することができる任意の飽和及び不飽和の共有結合基。」であっでもよい。
【００１５】
具体的な実施形態において、Ｌｉｎｋｅｒの接続方式は化合物Ｘと直接的に共有結合し、或いは予め修飾された化合物Ｘによって接続される。
【００１６】
一つの具体的な実施形態において、本発明は調製した化合物投与前駆体の構造式は以下の通りである。
2016523836.tif 000003
【００１７】
本発明は化合物投与前駆体の調製方法をさらに提供し、それは、
(１)化合物Ｘ及び１つの反応官能基を有するＤＮＡ又はＲＮＡを取る原料取得のステップと、
(２)化合物Ｘが二官能基試薬の１つの官能基と選択的に反応し、化合物Ｘ１が得られる化合物Ｘの共有結合準備のステップと、
(３)１つの反応官能基を有するＤＮＡ又はＲＮＡに対して二官能基試薬で修飾され、前記化合物Ｘの共有結合に合わせた修飾ＤＮＡ又はＲＮＡが得られるＤＮＡ又はＲＮＡの共有結合準備のステップと、
(４)化合物Ｘ１とそれに合わせた修飾ＤＮＡ又はＲＮＡとを共有結合させ、分離・純化して化合物投与前駆体が得られ、或いは化合物Ｘ１とステップ（１)において１つの反応官能基を有するＤＮＡ又はＲＮＡとを共有結合させ、分離・純化して化合物投与前駆体が得えられ、或いは化合物Ｘとステップ（３)における修飾ＤＮＡ又はＲＮＡとを共有結合させ、分離・純化して化合物投与前駆体が得られる共有結合のステップと、を含む。
【００１８】
前記「反応官能基」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡに適合する、例えば、アミン、メルカプト、カルボキシ、アジドなどのその他の試薬と反応することができる基である。前記「二官能基試薬」とは、１つの試薬が２つの化学反応に用いられる官能基を含有し、例えば、４−アジド−安息香酸活性化エステルであり、アミン反応の先にあってもよく、さらにアルキンとクリック反応（Ｃｌｉｃｋ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ)を行う。
【００１９】
上記ステップ（２)において前記「選択的に......反応する」とは、化合物Ｘと反応した後に、化合物Ｘにおける接続部位がＸの生物活性を影響しない。
【００２０】
本発明は上記化合物投与前駆体に基づく薬物担体製剤をさらに提供し、それは上記化合物投与前駆体に担体を加入して調製してなる。
【００２１】
さらに、前記担体はＤＮＡ又はＲＮＡトランスファー生物材料である。前記ＤＮＡ又はＲＮＡトランスファー生物材料は、ＤＮＡ又はＲＮＡのトランスフェクション試薬であり、「トランスフェクション」は真核細胞が外因性ＤＮＡ又はＲＮＡの混入なので獲得した新たな遺伝子マーカーを獲得する過程である。
【００２２】
本発明は上記化合物投与前駆体に基づく薬物担体製剤の調製方法をさらに提供し、それは、
(１)１:１０−１００(Ｗ／Ｖ)の割合で化合物投与前駆体及び薬物担体を取る原料取得のステップと、
(２)化合物投与前駆体を取り、バッファーと均一に混合して溶液Ａが得られ、薬物担体を取り、バッファーを加入して均一に混合して溶液Ｂが得られ、溶液Ａと溶液Ｂとを混合させ、チップでピペットし、室温にてインキュベーションし、薬物担体製剤が得られるインキュベーションのステップと、を含む。
【００２３】
室温インキュベーション時間は膜貫通効果に応じて簡単的に選択することができ、膜貫通トランスファーのインキュベーション時間に達すれば本発明に適合することができる。本発明の一実施例において、採用した室温インキュベーション時間が２０ｍｉｎである。
【００２４】
２５ｎＭ化合物投与前駆体をトランスファーする薬物担体の調製を例とし、１つの１．５ｍＬ無菌遠心分離管（管Ａ)を取り、０．１２５μｇ化合物投与前駆体を加入し、相応体積のバッファーと均一に混合し、総体積が１００μＬになるように調整する。２．５μＬトランスファー担体を取って他管（管Ｂ)における９７．５μＬバッファーと混合され、総体積が１００μＬになるように調整される。Ａ管とＢ管とを混合し、チップでゆっくりピペットし、室温にてインキュベーションし、２５ｎＭ化合物投与前駆体に基づく薬物担体が得られる。
【００２５】
膜透過性は薬物が体内に薬理作用を発揮することを前提とし、本発明は調製した投与前駆体及び薬物担体製剤は、膜透過することが困難である化合物の膜透過性を効果的に向上させることができ、膜透過することができず、或いは膜透性が悪い薬物を細胞にトランスファーし、新薬の研究開発及び臨床投薬に対して新しい選択を提供する。
【００２６】
１つの具体的な実施方案において、本発明は調製した投与前駆体又は薬物担体製剤を使用して、膜透過することが困難である薬物を細胞膜にトランスファーし、従って薬効活性を発揮し、或いは増加する。
【００２７】
別の具体的な実施方案において、本発明は調製した投与前駆体又は薬物担体製剤を使用し、膜透過することが困難である薬物を細胞膜にトランスファーすることができ、薬物と細胞内の標的とを結合させることで、関連薬物と標的タンパク質との結合部位及び結合方式をスクリーニングし、該方法は細胞完全を十分に保証する情況で関連薬物のターゲッティング研究を行うことができるだけでなく、かつ、関連薬物の研究結果が膜透過率の影響を受けないことを保証することもでき、潜在の活性成分を除外することを回避する。
【００２８】
明らかに、本発明の上記内容に基づいて、本分野の通常の技術知識及び慣用手段に従って、本発明の上記基本技術思想を逸脱しない前提で、そのほかの複数種の改正、置換、又は変更を行うことができる。
【００２９】
以下、実施例形式の具体的な実施形態によって、本発明の上記内容をさらに詳しく説明する。本発明の上記保護主題の範囲は以下の実施例に限定されることがしない。本発明の上記内容に基づいて実現した技術はいずれも本発明の範囲に属する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は化合物２の１Ｈ核磁気共鳴スペクトルである。
【図２】図２は化合物３の１Ｈ核磁気共鳴スペクトルである。
【図３】図３は化合物５のＨＰＬＣ検出スペクトルである。
【図４】図４は化合物５の質量スペクトルである。
【図５】図５はＰＴＰ１Ｂ抑制剤及び修飾された後の化合物２のＩＣ５０測定である。
【図６】図６は化合物５の濃度の測定である。
【図７】図７は化合物５のＰＴＰ１Ｂに対するＩＣ５０測定である。
【図８】図８は化合物５の膜透過実験のレーザー共焦点顕微位置決めである(青色が細胞核を示し、緑色がＦＩＴＣ標識の化合物５を示す)。
【図９】図９は化合物５のトランスファー効率である。Ａ）位相差顕微鏡で観察した細胞総数。Ｂ)蛍光顕微鏡で観察した投与前駆体１がトランスファーされた細胞である。Ｃ)トランスファー効率。
【図１０】図１０はＰＴＰ１Ｂ抑制剤に基づく投与前駆体及び薬物担体製剤の細胞リン酸化レベルに対する影響である。
【図１１】図１１は異なる長さ及び一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ、異なる化合物及び異なる接続アームの投与前駆体の膜透過実験のレーザー共焦点顕微位置決めである（青色が細胞核を示し、緑色がＦＩＴＣ標識の一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを示す。)
【発明を実施するための形態】
【００３１】
実施例１  本発明の化合物投与前駆体１の合成
【００３２】
１、材料及び試薬
化合物１は参考文献の方法（Ｄ．Ｐ．Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００７，５０，４６８１−４６９８)に従って本会社で合成する。５'−アミノ、３'−フルオレセイン修飾のポリアデニル酸(５'−(ＣＨ２)１２−Ａ１９−３'−ＦＩＴＣ)は英い捷基(上海)貿易有限会社(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｔｒａｄｉｎｇ  Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ)で受託合成され、その他の化学合成は使用した試薬がそれぞれＡｌｄｒｉｃｈ又はＴＣＩから購入する。
【００３３】
２、合成方法
ＰＴＰ１Ｂ抑制剤の投与前駆体の合成は以下の経路で合成する。
2016523836.tif 000004
【００３４】
化合物２:  ４−ブロム−３−オキソ酢酸−５−(３−(((１−フェニルカルバモイルピペリジン)−４−メチル)−Ｎ−プロパルギルアミン)フェニル)チオフェン−２−カルボン酸
４−ブロム−３−オキソ酢酸ｔｅｒｔ‐ブチル−５−(３−((１−フェニルカルバモイルピペリジン)−４−メチル)フェニル)チオフェン−２−カルボン酸メチルエステル（１)(２５０ｍｇ，０．４ｍｍｏｌ)、臭化プロパルギル(７０ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ)及びΝ，Ν−ジイソプロピルエチルアミン(１．５ｍＬ)を２０ｍＬのΝ，Ν−ジメチルホルムアミドに溶解し、かつ９０°Ｃにて５時間攪拌し、室温まで冷却して減圧して蒸留して粗生成物が得られ、カラムクロマトグラフィーによって４−ブロム−３−オキソ酢酸ｔｅｒｔ‐ブチル−５−(３−（（（１−フェニルカルバモイルピペリジン)−４−メチル)−Ｎ−プロパルギルアミン)フェニル)チオフェン−２−カルボン酸メチルエステル（白色固体，１３０ｍｇ，４９％収率）が得られる。ＭＳ ｍ／ｚ(ＥＳＩ):６６８，６７０(Ｍ＋Ｈ)＋;６９０，６９２(Ｍ＋Ｎａ)＋。水酸化リチウム(２００ｍｇ，２．３８ｍｍｏｌ)を４−ブロム−３−オキソ酢酸ｔｅｒｔ‐ブチル−５−(３−(((１−フェニルカルバモイルピペリジン)−４−メチル:)−Ｎ−プロパルギルアミン)フェニル)チオフェン−２−カルボン酸メチルエステル(１００ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ)の５ｍＬテトラヒドロフランと５ｍＬ水溶液に加入し、室温にて終夜攪拌する。反応液に２Ｎ塩酸を加入してかつｐＨ２に酸性化され、濃縮して粗生成物が得られる。粗生成物がＨＰＬＣによって調製した後に４−ブロム−３−オキソ酢酸−５−(３−(((１−フェニルカルバモイルピペリジン)−４−メチル)−Ｎ−プロパルギルアミン)フェニル)チオフェン−２−カルボン酸（２)(白色固体，４０ｍｇ，４２％収率）が得られる。ＭＳ  ｍ／ｚ(ＥＳＩ):６２６，６２８(Ｍ＋Ｈ)＋;１Ｈ  ＮＭＲ(ＣＤＣ１３):δ８．４５(ｓ，１Ｈ)，７．４３(ｍ，２Ｈ)，７．３３(ｔ，Ｊ＝７．６Ηｚ，１Η)，７．２１(ｍ，２Ｈ)，７．０３(ｓ，１Ｈ)，６．９２(ｍ，３Ｈ)，４．８８(ｓ，２Ｈ)，４．１５(ｍ，４Ｈ)，３．２８(ｍ，２Ｈ)，３．２０(ｍ，１Ｈ)，２．７０(ｍ，２Ｈ)，１．８２(ｍ，１Ｈ)，１．７３(ｍ，２Ｈ)，１．２４(ｍ，３Ｈ)．
【００３５】
化合物３:４−アジド安息香酸スクシンイミドエステル
氷浴で、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣＩ，５７０ｍｇ，３．７ｍｍｏｌ)を４−アジド安息香酸(５００ｍｇ，３．０６ｍｍｏｌ)を含有した１０ｍＬ  Ν，Ν−ジメチルホルムアミドに加入し、その後にΝ−ヒドロキシこはく酸イミド（４４０ｍｇ，３．７ｍｍｏｌ）を加入する。反応が遮光及び窒素雰囲気で１時間反応し、その後に室温まで加温して終夜遮光攪拌する。減圧して蒸留してΝ，Ν−ジメチルホルムアミドが除去され、その後に残部が酢酸エチルに溶解され、水で３回洗浄し、有機相が無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、粗生成物が得られる。カラムクロマトグラフィーによって生成物である４−アジド安息香酸スクシンイミドエステル（５)(白色固体，７８０ｍｇ，９７．５％収率)が得られる。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６):δ８．１１(ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ)，７．３７(ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ)，７．３７(ｓ，４Ｈ)。
【００３６】
化合物４: ４−アジドベンズアミド１２−アルキル１９ポリアデニル化フルオレセイン
５'−アミノ、３'−フルオレセイン修飾のポリアデニル酸(５'−ＣＨ２)１２−Ａ１９−３'−ＦＩＴＣ）（５０ｎｍｏｌ)及び４−アジド安息香酸スクシンイミドエステル（３)(５μｍｏｌ，１００ｅｑ．)の５００μＬ  ０．５Μ炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９)と５００μＬジメチル・スルホキシド混合溶液を室温にて低速に終夜振動する。その後、反応系は直接的に逆相ＨＰＬＣカラムで分離され、凍結乾燥して４−アジドベンズアミド１２−アルキル１９ポリアデニル化フルオレセイン（４)(淡黄色固体、９０％収率以上）が得られる。
【００３７】
化合物５:  ４−ブロム−３−オキソ酢酸−５−(３−(((１−(４−(フルオレセイン１９ポリアデニル酸）１２−アルキルイソアミドフェニル)−１Η−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル)((１−フェニルカルバモイルピペリジン)−４−メチル)アミノ)フェニル)チオフェン−２−カルボン酸（すなわち、本発明の投与前駆体１)
３０μの溶液Α(硫酸銅とトリス[(１−ベンジル−１Η−１，２，３−トリアゾール−４−イル)メチル]アミンがモル比１:２で体積比４:３:１の水／ジメチル・スルホキシド／ｔｅｒｔ−ブタノールの溶液に溶解し、濃度が１０ｍＭである)を溶液Ｂ(４−アジドベンズアミド１２−アルキル１９ポリアデニル化フルオレセイン（４)(１５ｎｍｏｌ)の２００μＬ水溶液と４−ブロム−３−オキソ酢酸−５−(３−(((１−フェニルカルバモイルピペリジン)−４−メチル)−Ν−プロパルギルアミン)フェニル)チオフェン−２−カルボン酸（２)(９６０ｎｍｏｌ)の５μＬ  ＤＭＳＯ溶液）に加入し、ボルテックスして遠心分離された後に、６μＬの調製したばかりのアスコルビン酸ナトリウム(６００ｎｍｏｌ)水溶液を上記反応系に加入し、室温にて低速に終夜振動する。その後に、反応液は直接的に逆相ＨＰＬＣカラムで分離・純化して生成物である４−ブロム−３−オキソ酢酸−５−(３−（（(１−(４−(フルオレセイン１９ポリアデニル酸）１２−アルキルイソアミドフェニル)−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル)((１−フェニルカルバモイルピペリジン)−４−メチル)アミノ)フェニル)チオフェン−２−カルボン酸（５)(淡黄色固体，約８０％収率，純度が約９７％、ＨＰＬＣスペクトル３ 参照)が得られる。質量スペクトルが図４参照する。
ただし、ＦＩＴＣが蛍光標識物であり、本発明においてＦＩＴＣを加入する目的はただ実験において化合物投与前駆体を観察することであり、この標識物は本発明の化合物投与前駆体の必要である構成ではない。以下でも同様である。
【００３８】
実施例２  化合物２と化合物投与前駆体１(化合物５)との直接的なＰＴＰ１Ｂに対する抑制性試験
【００３９】
１、材料及び試薬
ヒト完全長ＰＴＰ１Ｂタンパク質はＳｉｇｍａ会社（Ｃａｔ#ＳＲＰ０２１５，Ｌｏｔ#３０００９２０３２２)から購入し、基質（４−ニトロフェニルりん酸二ナトリウム（六水和物））はＳｉｇｍａ会社(Ｃａｔ#７１７６８)から購入し、ＤＮＡ−ＦＩＴＣ標準品（５'−アミノ、３'−フルオレセイン修飾のポリアデニル酸(５'−(ＣＨ２)１２−Ａ１９−３'−ＦＩＴＯ)は英い捷基(上海)貿易有限会社(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｔｒａｄｉｎｇ  Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ)で受託合成され、実験用の緩衝液などはＳｉｇｍａから購入する。
【００４０】
２、化合物２のＰＴＰ１Ｂに対するＩＣ５０測定
化学修飾の有効成分の活性に対する影響を追跡するために、本発明は化合物２のＰＴＰ１Ｂに対する活性を試験する。１０μＬ化合物を９０μＬの基質含有の、ＰＴＰ１Ｂの反応系に加入し、終濃度がそれぞれ１０、３、１、０．３、０．１、０．０３、０．０１、０．００３、０．００１、０．０００３、０μΜであり、室温にて１５ｍｉｎ反応し、６０ｓごとに４０５ｎｍ箇所にその吸収値を測定する。化合物を含有しない反応レート（吸光値増加量／反応時間）１００％で、各濃度点の反応レートの相対パーセントを計算する。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ作図ソフトウェアを採用してｓｉｇｍｏｉｄａｌ  ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ(ｖａｒｉａｂｌｅ  ｓｌｏｐｅ) モデルで曲線適合を行い、検出待ち化合物のＩＣ５０値を計算する。（化合物２のＩＣ５０曲線が図５に参照する)。
【００４１】
３、化合物５含有量の測定
ＤＮＡ−ＦＩＴＣ標準品（１００μΜ)を為２０，１０，５，２．５，１．２５，０．６２５，０．３１２５μΜに希釈し、ＴＥＣＡＮマイクロプレートリーダーにおいてＯＤ２６０吸光度値を検出し、測定値を縦軸とし、標準品濃度を横軸として標準曲線を描出する。サンプル測定値を標準曲線に代入して濃度を求める（図６)。
【００４２】
４、化合物５のＰＴＰ１Ｂに対するＩＣ５０測定
１０μＬ化合物を９０μＬの基質含有の、ＰＴＰ１Ｂの反応系に加入し、終濃度はそれぞれ１０、３、１、０．３、０．１、０．０３、０．０１、０．００３、０．００１、０．０００３、０μΜであり、室温にて１５ｍｉｎ反応し、６０ｓごとに４０５ｎｍ箇所にその吸収値を測定する。化合物を含有しない反応レート（吸光値増加量／反応時間）１００％で、各濃度点の反応レートの相対パーセントを計算する。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ作図ソフトウェアを採用してｓｉｇｍｏｉｄａｌ  ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ(ｖａｒｉａｂｌｅ  ｓｌｏｐｅ) モデルで曲線適合を行い、検出待ちＩＣ５０値を計算する（図７)。
【００４３】
本実験において、細胞外プロテアーゼを採用して活性測定を行い、そのうちに化合物の膜透過作用に関しないので、それぞれの試験された成分はいずれも膜透過率を考慮する必要がない。上記実験結果を比較すると、修飾された化合物は体外において修飾前に類似した活性を有する。この結果は、本発明が調製した化合物投与前駆体が原化合物の生理活性を低下させることがしないことを示す。
【００４４】
実施例３  化合物投与前駆体に基づく薬物担体の調製
【００４５】
１、材料及び試薬
ＨｅｐＧ２細胞株は中国科学院上海生命科学研究院から購入し、ＲＰＭＩ−１６４０培地はＨｙｃｌｏｎｅから購入し、ウシ胎仔血清は天津こう洋生物製品科技有限会社から購入し、トリプシンとＯｐｔｉ−ＭＥＭとはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬はＲｏｃｈｅから購入し、そのほかの細胞インキュベーションディッシュなどの用品はいずれもＣｏｍｉｎｇから購入する。
【００４６】
２、化合物投与前駆体に基づく薬物担体の調製
(１)原料取得：１:１０−１００(Ｗ／Ｖ)の割合で化合物投与前駆体及び薬物担体を取る。
(２)インキュベーション：２５ｎＭ化合物投与前駆体をトランスファーする薬物担体の調製を例とし、一つの１．５ｍＬ無菌遠心分離管（管Ａ)を取り、０．１２５μｇ化合物投与前駆体を加入し、相応体積のＯｐｔｉ−ＭＥＭと均一に混合し、総体積が１００μＬになるように調整する。Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥｓｉＲＮＡ試薬をゆっくりと均一に揺動し、２．５μＬＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥｓｉＮＡ試薬を取って他管（管Ｂ)における９７．５μＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭと混合し、総体積が１００μＬになるように調整する。Ａ管とＢ管とを混合させ、チップでゆっくりピペットし、室温にて２０ｍｉｎインキュベーションする。２５ｎＭ化合物投与前駆体に基づく薬物担体が得られる。
【００４７】
実施例４  化合物投与前駆体の膜貫通トランスファー効率に対する影響
【００４８】
１、材料及び試薬
ＨｅｐＧ２細胞株は中国科学院上海生命科学研究院から購入し、ＲＰＭＩ−１６４０培地は上海前塵生物科技有限会社（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｓｈａｎｇｈａｉ)から購入し、ウシ胎仔血清は天津こう洋生物製品科技有限会社から購入し、トリプシンとＯｐｔｉ−ΜΕΜとは上海英駿生物技術有限会社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｈａｎｇｈａｉ)から購入し、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬は羅氏中国会社(Ｒｏｃｈｅ)から購入し、そのほかの細胞インキュベーションディッシュなどの用品はいずれも康寧中国会社（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｈｉｎａ)から購入し、化合物５は実施例１に提供される。
【００４９】
２、異なる配列の一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡのトランスファー前の準備
トランスファー前の２４ｈに、トリプシンで対数期成長期のＨｅｐＧ２細胞を消化し、１０％血清を含有した培地で細胞密度が１．０×１０７細胞／２０ｍＬになるように調整し、新たに１５ｃｍ細胞インキュベーションディッシュに接種し、３７°Ｃで、５％ＣＯ２インキュベーション箱でインキュベーションする。２４ｈに細胞密度が６０％−７０％に達すると実験に用いられる。
【００５０】
３、トランスファー
１つの１５ｍＬ無菌遠心分離管（管Ａ)を取り、４ｎｍｏｌの化合物５を加入し、相応体積のＯｐｔｉ−ＭＥＭと均一に混合し、総体積が２ｍＬになるように調整する。Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥｓｉＲＮＡ試薬をゆっくりと均一に揺動し、１６０μＬ  Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥｓｉＮＡ試薬を取って他管（管Ｂ)における１．８４ｍＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭと混合する。Ａ管とＢ管とを混合させ、チップでゆっくりピペットし、室温にて２０ｍｉｎインキュベーションする。
【００５１】
６ｍＬ無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地を混合物に加入し、均一に混合する。ＨｅｐＧ２細胞インキュベーションディッシュにおける過去の培地を廃棄し、かつ無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地でゆっくりと一回ピペットし、その後に上記混合物をＨｅｐＧ２−ＰＴ細胞インキュベーションディッシュに転移し、３７°Ｃにて、５％のＣＯ２インキュベーション箱でインキュベーションする。６ｈ後、レーザー共焦点顕微鏡で化合物の細胞内の位置決め情況を観察する。
【００５２】
４、実験結果
結果は図８に示すように、原化合物２が蛍光標識に接続した後に細胞内に進入することができず（図８Ａ)、投与前駆体化合物５がＸ−ｔｒｅｍｅｓｉＲＮＡに細胞にトランスファーされることができ、大部分の化合物５が細胞質にあり、少数の化合物５が細胞核に進入し（図８Ｂ)、かつ、トランスファー効率は８０％以上に達することができる(図９)。
【００５３】
実施例５  化合物投与前駆体に基づく薬物担体の細胞トランスファーとリン酸化レベルの変化
【００５４】
１、材料及び試薬
ＨｅｐＧ２細胞株は中国科学院上海生命科学研究院から購入し、ＲＰＭＩ−１６４０培地はＨｙｃｌｏｎｅから購入し、ウシ胎仔血清は天津こう洋生物製品科技有限会社から購入し、トリプシンはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、細胞溶解液とプロテアーゼ抑制剤とはＰｉｅｒｃｅから購入し、Ｐ−ＩＲＳ−１ＥＬＳＡキットはｂｉｏ−ｓｗａｍｐから購入し、そのほかの細胞インキュベーションディッシュなどの用品はいずれもＣｏｒｎｉｎｇから購入する。
【００５５】
２、化合物投与前駆体に基づく薬物担体の化合物膜透過トランスファーの影響の研究
タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ(ＰＴＰ１Ｂ)はタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰｓ)族に属し、膜貫通受容体様タンパク質と細胞内酵素という２種の形式で存在し、タンパク質のリン酸化チロシン残基の脱リン酸化反応を触媒し、哺乳動物体内の最も早く同定され、純化されるＰＴＰｓ[２，３]である。ＰＴＰ１Ｂはインスリン受容体（ＩＲ）、インスリン受容体基質１、２（ＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２）、成長因子受容体結合タンパク質２（Ｇｒｂ２）、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ−３Ｋ）などのインスリン信号変換に関するタンパク質に作用し、それらのリン酸化チロシン残基を脱リン酸化させ、インスリン信号変換を減衰させ、従って受容体後のインスリン抵抗性を発生する[４]。そのため、本発明は薬物がトランスファーされた後に細胞内のＩＲＳ−１リン酸化レベルの変化を測定することで、薬物が細胞に進入した後に細胞内のインスリン信号チャネル機能に対する影響を評価する。試験方法は以下の通りである。
【００５６】
２．１  トランスファー前の２４ｈに、トリプシンで対数期成長期のＨｅｐＧ２細胞を消化し、１０％血清を含有した培地で細胞密度が０．５×１０６細胞／ｍＬになるように調整し、新たに６ウェルプレートに接種し、３７°Ｃにて、５％ＣＯ２インキュベーション箱で２４ｈインキュベーションした後に細胞密度が６０％−７０％に達すると実験に用いられる。
【００５７】
２．２  ２つの１．５ｍＬ無菌遠心分離管（管Ａ１、Ａ２)を取り、それぞれ０．０２５μＬと０．０７５μＬ化合物投与前駆体を加入し、相応体積のＯｐｔｉ−ＭＥＭと均一に混合し、総体積が１００μＬになるように調整し、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥｓｉＲＮＡ試薬をゆっくりと均一に揺動し、２．５μＬ  Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥｓｉＮＡ試薬を取って別の２つの対応した遠心分離管（管Ｂ１、Ｂ２)における９７．５μＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭと混合し、総体積が１００μＬになるように調整する。対応するＡ管とＢ管とを混合させ、チップでゆっくりとピペットし、室温にて２０ｍｉｎインキュベーションし，化合物投与前駆体の薬物担体が得られる。以上の類似操作のように、化合物を添加せず、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥｓｉＲＮＡを添加せず、及び両者が添加されず、それぞれ２つの対照と１つの空白とする。
【００５８】
２．３  それぞれ８００μＬ無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地を混合物に加入し、均一に混合する。ＨｅｐＧ２細胞インキュベーションディッシュにおける過去の培地を廃棄し、かつ無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地でゆっくりと一回洗浄し、その後に空白制御、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬、化合物投与前駆体および化合物投与前駆体の薬物担体をＨｅｐＧ２細胞インキュベーションディッシュに転移し、３７°Ｃにて、５％ＣＯ２インキュベーション箱で５時間インキュベーションする。１μｇ／ｍＬインスリンと５ｍＭグルコースを加入して３０分間誘導される。
【００５９】
２．４  細胞は氷ＰＢＳで３回洗浄した後に、各孔に５０μＬ細胞溶解液を加入し氷で１時間分解され、遠心分離して上澄みを取り、ＢＣＡキットでタンパク質定量を行う。等量の総タンパク質をＥＬＩＳＡ板に加入し、ＥＬＩＳＡキットでＩＲＳ−１のリン酸化レベルを測定する。毎回実験において４つの平行孔を設定し、データが３回の独立の実験から由来する。
【００６０】
試験結果は図１０に示す。
図１０に示すように、異なる濃度の薬物がＨｅｐＧ２細胞にトランスファーされた後に、薬物が添加されない空白制御と比べて、細胞内のＩＲＳ−１のリン酸化レベルが向上し、それは、本発明は投与前駆体と薬物担体の方式で細胞膜を透過することが困難である薬物を細胞にトランスファーさせ、かつ原薬は細胞内に作用を発揮することを保証することができることを示す。
【００６１】
実施例６  本発明の投与前駆体２の合成経路
【００６２】
膜貫通トランスファーのための投与前駆体２の合成経路は以下の通りである。
2016523836.tif 000005
【００６３】
化合物２−２:  １４−アジド−３，６，９，１２−テトラオキサＮ−テトラデシル−１−カルボキシレートｔｅｒｔ−ブタノール：
カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド(３３６ｍｇ，３ｍｍｏｌ)を１５ｍＬ化合物（２−１)(３７２ｍｇ，２ｍｍｏｌ)のｔｅｒｔ−ブタノール溶液に加入し、３０度で１５分間攪拌する。その後にt− ブチルブロモ酢酸（７８０ｍｇ、４ｍｍｏｌ)を以上の体系に加入し、３０度で終夜攪拌する。減圧して蒸留して粗生成物が得られる。３０ｍＬのジクロロメタンに溶解し、順次に水で３回洗浄し、飽和塩水で３回洗浄し、有機相が無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、化合物（２−２)(無色油状液体，４６６ｍｇ，７０％収率)が得られる。ＭＳ  ｍ／ｚ(ＥＳＩ):２５０(Ｍ−ｔＢｕ−Ｎ２＋Ｈ)＋;２７８(Ｍ−ｔＢｕ＋Ｈ)＋
【００６４】
化合物２−３:  １４−アジド−３，６，９，１２−テトラオキサＮ−テトラデシル−１−カルボン酸
トリフルオロ酢酸(１ｍＬ)を化合物(２−２)(４６６ｍｇ，１．４ｍｍｏｌ)の５ｍＬジクロロメタン溶液に加入し、室温にて２時間攪拌する。濃縮して粗生成物である化合物（２−３)(無色油状，３７０ｍｇ，９５％収率）が得られる。ＭＳ  ｍ／ｚ(ＥＳＩ):２５０(Ｍ−Ｎ２＋Ｈ)＋;２７８(Ｍ＋Ｈ)＋。
【００６５】
化合物２−４:  １４−アジド−３，６，９，１２−テトラオキサＮ−テトラデシル−１−ホルミル−ｎ−ドデシル１９ポリアデニル化フルオレセイン
５'−アミノ、３'−フルオレセイン修飾のポリアデニル酸（５'−(ＣＨ２)１２−Ａ１９−３'−ＦＩＴＣ)(８０ｎｍｏｌ)、化合物(２−３)(１．６μｍｏｌ、２００ｅｑ．)、４−(４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル)−４−メチルモルホリン塩酸塩(ＤＭＴ−ＭＭ，１.６μｍｏｌ，２００ｅｑ．)の８０μＬ  ０．５Μ炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）、１６μＬ脱イオン水及び１６μＬジメチル・スルホキシド混合溶液を室温にて低速に終夜振動する。その後に、反応系は直接的に逆相ＨＰＬＣカラムで分離され、凍結乾燥して化合物（２−４)(白色固体）が得られる。ＭＳ  ｍ／ｚ(ＴＯＦ):６８９６
【００６６】
投与前駆体２:
６μＬの溶液Ａ(硫酸銅とトリス[(１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル)メチル]アミンがモル比１:２で体積比４:３:１の水／ジメチル・スルホキシド／ｔｅｒｔ−ブタノールの溶液に溶解し、濃度が１０ｍＭである)を溶液Ｂ(化合物（２４)(５０ｎｍｏｌ)の４００μＬ水溶液と４−ブロム−３−オキソ酢酸−５−(３−(((１−フェニルカルバモイルピペリジン)−４−メチル)−Ν−プロパルギルアミン)フェニル)チオフェン−２−カルボン酸（１−３)(３ｕｍｏｌ)の１００μＬ  ＤＭＳＯ溶液）に加入し、ボルテックスして遠心分離された後に、１２０μＬの調製したばかりのアスコルビン酸ナトリウム(１２００ｎｍｏｌ)水溶液を上記反応系に加入し、室温にて低速に終夜振動する。その後に、反応液は直接的に逆相ＨＰＬＣカラムで分離・純化して生成物（投与前駆体２)(淡黄色固体）が得られる。ＭＳ  ｍ／ｚ(ＴＯＦ):７５２１
【００６７】
実施例７  本発明の投与前駆体３の合成経路
【００６８】
膜貫通トランスファーのための投与前駆体３の合成経路は以下の通りである。
2016523836.tif 000006
【００６９】
化合物３−２:
５'−アミノ、３'−フルオレセイン修飾のポリアデニル酸（５'−(ＣＨ２)１２−Ａ１９−３'−ＦＩＴＣ)(８０ｎｍｏｌ)、アジド酢酸(３−１)(１．６μｍｏｌ、２００ｅｑ．)、４−(４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル)−４−メチルモルホリン塩酸塩(ＤＭＴ−ＭＭ，１．６μｍｏｌ，２００ｅｑ．)の８０μＬ  ０．５Ｍ炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム緩衝液ｐＨ９)、１６０μＬ脱イオン水及び１６０μＬジメチル・スルホキシド混合溶液を室温にて低速に終夜振動する。その後に、反応系は直接的に逆相ＨＰＬＣカラムで分離され、凍結乾燥して化合物(４)(白色固体）が得られる。ＭＳ  ｍ／ｚ(ＴＯＦ):６７２０
【００７０】
投与前駆体３:
６０μＬの溶液Α(硫酸銅とトリス[(１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル)メチル]アミンがモル比１:２で体積比４:３:１の水／ジメチル・スルホキシド／ｔｅｒｔ−ブタノールの溶液に溶解され、濃度が１０ｍＭである)を溶液Ｂ(化合物(３−２)(５０ｎｍｏｌ)の４００μＬ水溶液と４−ブロム−３−オキソ酢酸−５−(３−(((１−フェニルカルバモイルピペリジン)−４−メチル)−Ν−プロパルギルアミン)フェニル)チオフェン−２−カルボン酸（１−３)(３ｕｍｏｌ)の１００μＬ  ＤＭＳＯ溶液）に加入し、ボルテックスして遠心分離された後に、１２０μＬの調製したばかりのアスコルビン酸ナトリウム(１２００ｎｍｏｌ)水溶液を上記反応系に加入し、室温にて低速に終夜振動する。その後に、反応液は直接的に逆相ＨＰＬＣカラムで分離・純化して生成物（投与前駆体３)(淡黄色固体）が得られる。ＭＳ  ｍ／ｚ(ＴＯＦ):７３４５
【００７１】
実施例８  発明の投与前駆体４の合成経路
2016523836.tif 000007
【００７２】
化合物４−２の合成
化合物（４−１)(４４１ｍｇ，１ｍｍｏｌ)、臭化プロパルギル(９５ｍｇ，０．８ｍｍｏｌ)、炭酸カリウム（１３８ｍｇ，１ｍｍｏｌ)を２０ｍＬのΝ，Ν−ジメチルホルムアミドに溶解し、室温にて終夜攪拌する。減圧して蒸留して粗生成物が得られる。５０ｍＬのジクロロメタンに溶解し、順次に水で３回洗浄し、飽和塩水で３回洗浄し、有機相が無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、化合物（４−２)(黄色固体，２８７ｍｇ，６０％収率）が得られる。ＭＳ ｍ／ｚ(ＥＳＩ):４２４(Ｍ−ｔＢｕ＋Ｈ)＋;４８０(Ｍ＋Ｈ)＋。
【００７３】
化合物４−３の合成
化合物（４−２)(８７ｍｇ，０．６ｍｍｏｌ)、水酸化リチウム一水化合物(１２６ｍｇ，３ｍｍｏｌ)を５ｍＬのメタノールと５ｍＬの水に溶解し、回流して終夜攪拌する。蒸留してアルコールが除去される。２０ｍＬの水で希釈し、１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ２．０程度に酸性化され、凍結乾燥して粗生成物が得られ、直接的に逆相高速液体分離で(４−３)(黄色固体，２１６ｍｇ，８０％収率)が得られる。ＭＳｍ／ｚ(ＥＳＩ):４１０(Ｍ＋Ｈ)＋。
【００７４】
投与前駆体４の合成
６０μの溶液Α(硫酸銅とトリス[(１−ベンジル−１Η−１，２，３−トリアゾール−４−イル)メチル]アミンがモル比１:２で体積比４:３:１の水／ジメチル・スルホキシド／ｔｅｒｔ−ブタノールの溶液に溶解し、濃度が１０ｍＭである)を溶液Ｂ(化合物（４−４)(５０ｎｍｏｌ)の４００μＬ水溶液と化合物（４−３)(３ｕｍｏｌ)の１００μＬ  ＤＭＳＯ溶液）に加入し、ボルテックスして遠心分離された後に、１２０μＬの調製したばかりのアスコルビン酸ナトリウム(１２００ｎｍｏｌ)水溶液を上記反応系に加入し、室温にて低速に終夜振動する。その後に、反応液は直接的に逆相ＨＰＬＣカラムで分離・純化して生成物（投与前駆体４)(淡黄色固体）が得られる。ＭＳ  ｍ／ｚ(ＴＯＦ):７１９１
【００７５】
実施例９  一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ、及び異なる化合物及び異なる接続アームの投与前駆体の膜貫通トランスファーの効率評価
【００７６】
１、材料及び試薬
ＨｅｐＧ２細胞株は中国科学院上海生命科学研究院から購入し、ＲＰＭＩ−１６４０培地は上海前塵生物科技有限会社（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｓｈａｎｇｈａｉ)から購入し、ウシ胎仔血清は天津こう洋生物製品科技有限会社から購入し、トリプシンとΟｐｔｉ−ΜΕΜは上海英駿生物技術有限会社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｈａｎｇｈａｉ)から購入し、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬は羅氏中国会社(Ｒｏｃｈｅ)から購入し、そのほかの細胞インキュベーションディッシュなどの用品はいずれも康寧中国会社（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｈｉｎａ)から購入し、５ｂｐのｐｏｌｙＡ  ５'−ＮＨ２−(ＣＨ２)１２−ＰＯ４−Ａ５−３'-ＦＩＴＣ、１９ｂｐのｐｏｌｙＡ  ５'−ＮＨ２−(ＣＨ２)１２−ＰＯ４−Ａ１９−３'−ＦＩＴＣ、３８ｂｐのｐｏｌｙＡ５'−ＮＨ２−(ＣＨ２)１２−ＰＯ４−Ａ３８−３'一ＦＩＴＣ、ランダム１９ｂｐ一本鎖５'−ＮＨ２−(ＣＨ２)１２−ＰＯ４−ＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧ−３'−ＦＩＴＣとランダム１９ｂｐ二本鎖(５'−ＮＨ２−(ＣＨ２)１２−ＰＯ４−ＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧ−３'−ＦＩＴＣ:
５'−ＣＡＧＣＡＧＴＴＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡ−３')はいずれも英い捷基（上海）貿易有限会社で合成し、投与前駆体２〜４は実施例６〜８で調製してなる。
【００７７】
２、トランスファー前準備
トランスファー前の２４ｈに、トリプシンで対数期成長期のＨｅｐＧ２細胞を消化し、１０％血清を含有した培地で細胞密度が０．５×１０６細胞／ｍＬになるように調整し、新たに１５ｃｍ細胞インキュベーションディッシュに接種し、３７°Ｃにて、５％ＣＯ２インキュベーション箱でインキュベーションする。２４ｈに細胞密度が６０％−７０％に達すると実験に用いられる。
【００７８】
３、トランスファー
１つの１５ｍＬ無菌遠心分離管（管Ａ)を取り、それぞれ４ｎｍｏｌ以上の異なる配列の一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ／ＮＡフラグメント及び異なる投与前駆体を取り、相応体積のＯｐｔｉ−ＭＥＭと均一に混合し、総体積が２ｍＬになるように調整する。Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥｓｉＲＮＡ試薬をゆっくりと均一に揺動し、１６０μＬ  Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥｓｉＲＮＡ試薬を取って他管（管Ｂ)における１．８４ｍＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭと混合する。Ａ管とＢ管とを混合させ、チップでゆっくりとピペットし、室温にて２０ｍｉｎインキュベーションする。
【００７９】
６ｍＬ無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地を混合物に加入し、均一に混合される。ＨｅｐＧ２細胞インキュベーションディッシュにおける過去の培地を廃棄し、かつ無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地でゆっくりと一回ピペットし、その後に上記混合物をＨｅｐＧ２−ＰＴ細胞インキュベーションディッシュに転移し、３７°Ｃにて、５％ＣＯ２インキュベーション箱でインキュベーションする。６ｈ後に、レーザー共焦点顕微鏡で化合物の細胞内の位置決め情況を観察する。
【００８０】
４、実験結果
結果は図１１に示すように、５ｂｐ以上の一本鎖、二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡランダム又はｐｏｌｙＡフラグメント（例えば５ｂｐのｐｏｌｙＡ、１９ｂｐのｐｏｌｙＡ、３８ｂｐのｐｏｌｙＡ、１９ｂｐの一本鎖ランダム配列又は１９ｂｐの二本鎖ランダム配列フラグメント）、及び本発明は調製した各種の投与前駆体は、Ｘ−ｔｒｅｍｅｓｉＲＮＡに細胞にトランスファーされることができ、大部分が細胞質にあり、少数が細胞核に進入する。
【００８１】
以上のように、本発明は調製した投与前駆体および薬物担体製剤は、膜透過することが困難である化合物の膜透過性を効果的に向上させることができ、臨床投薬及び新薬の研究開発に対して新しい選択を提供する。
【００８２】
参考文献：
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【図１】
2016523836.tif 000009
【図２】
2016523836.tif 000010
【図３】
2016523836.tif 000011
【図４】
2016523836.tif 000012
【図５】
2016523836.tif 000013
【図６】
2016523836.tif 000014
【図７】
2016523836.tif 000015
【図８】
2016523836.tif 000016
【図９】
2016523836.tif 000017
【図１０】
2016523836.tif 000018
【図１１】
2016523836.tif 000019
【配列表】
2016523836000001.app
【国際調査報告】
2016523836.tif 000020
2016523836.tif 000021
2016523836.tif 000022
2016523836.tif 000023