(57)【要約】  動物組織材料の前処理および予備洗浄、ウイルスの不活化、脱細胞、塩化ナトリウム処理、成形、包装および滅菌の操作ステップを含む、動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法であって、当該方法により調製された動物由来の脱細胞ＥＣＭ材料は、動物由来細胞成分およびＤＮＡ成分が完全に除去されているとともに、天然ＥＣＭの成分、三次元構造、および組織再生を誘導・促進できる活性成長因子が完全に保持されており、内毒素、有機溶剤および有毒溶剤の残留がなく、様々な適応症に応じて、様々なサイズ、厚さ、および力学的強度を有する製品を形成することができる。
2016521592.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法において、
（１）動物組織材料の前処理である分離および予備洗浄のために、新鮮な動物組織を取り、注射用水を用いて３回洗い流すステップ、
（２）低濃度過酢酸−エタノール溶液法によりウイルスを不活化させるステップであって、洗浄槽式の振盪可能な恒温超音波洗浄器内で行われ、過酢酸の体積百分率を０．０５〜０．２％、不活化時間を１〜２時間、温度範囲を４〜４０℃とし、次に、リン酸塩緩衝液中で毎回１５分ずつ２〜５回洗浄して、洗浄後のリン酸塩緩衝液のｐＨ値を測定し、ｐＨが６．５〜７．５になったら、注射用水を流して材料を洗浄し、導電率が１．５μｍ／ｓ以下となったことが測定されたら終了するステップ、
（３）脱細胞のために、洗浄槽式の振盪可能な恒温超音波洗浄器内で行われ、まず、材料を洗浄槽内に入れ、濃度が５〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を洗浄槽内に注入し、洗浄器をオンにして、洗浄時間を５〜３０分とし、次に、洗浄器をオフにして、水酸化ナトリウム溶液を注ぎ出してリン酸塩緩衝液を注入し、洗浄器をオンにして、洗浄時間を５〜２０分とし、リン酸塩緩衝液で２〜５回繰り返し洗浄して、洗浄後のリン酸塩緩衝液のｐＨ値を測定し、ｐＨが６．５〜７．５になったら、注射用水を流して材料を洗浄し、導電率が１．５μｍ／ｓ以下となったことが測定されたら終了するステップ、
（４）塩化ナトリウム処理のためのステップであって、洗浄槽式の振盪可能な恒温超音波洗浄器内で行われ、濃度が０．０１５ｍｏｌ／Ｌまたは２ｍｏｌ／Ｌで、ｐＨ値が７．８を超えない塩化ナトリウム溶液を洗浄槽内に注入し、洗浄器をオンにして、洗浄時間を５〜３０分とし、次に、注射用水を流して材料を洗浄し、導電率が１．５μｍ／ｓ以下となったことが測定されたら終了するステップ、
（５）成形のためのステップであって、治具による固定、凍結乾燥、およびレーザマイクロドリルの３段階を含み、様々な製品の要求に基づいて、適応するサイズと形状の治具を設計し、材料を治具に固定して、注射用水できれいに洗浄済の、治具に固定された材料を凍結乾燥機に入れて、予め設計された凍結乾燥プロセス、つまり、２５〜５０℃に予備凍結して、０．５〜４時間保持し、１５℃に昇温して、４〜１２時間保持し、１５℃に昇温して、０．５〜４時間保持し、２５℃に昇温して、４時間保持するという凍結乾燥プロセスによって凍結乾燥を行い、凍結乾燥の完了後に、レーザマイクロドリルを用いて、孔径範囲が０．０５〜１ｍｍで、孔間隔が０．１〜２ｃｍである孔を開けるステップ、並びに
（６）包装および滅菌のためのステップであって、無菌の状態で包装し、一層にはタイベックを、他層にはポリエチレンプラスチックを使用し、包装の完了後にエチレンオキシドを用いて滅菌するステップを含むことを特徴とする、動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項２】
前記ステップ（１）において、動物にはブタ、ウシ、ウマが含まれることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項３】
前記ステップ（１）において、組織には小腸粘膜下層、真皮、心膜が含まれることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項４】
前記ステップ（２）において、過酢酸の体積百分率は０．１％であることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項５】
前記ステップ（２）において、不活化時間は１時間であることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項６】
前記ステップ（２）、（３）、（４）において、洗浄槽の振盪数は１００〜３００ｒｐｍであることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項７】
前記ステップ（２）、（３）、（４）において、洗浄槽の振盪数は２００ｒｐｍであることを特徴とする、請求項６に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項８】
前記ステップ（２）、（３）、（４）において、超音波周波数は２０〜８０ＫＨｚであることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項９】
前記ステップ（２）、（３）、（４）において、超音波周波数は４５ＫＨｚであることを特徴とする、請求項８に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項１０】
前記ステップ（３）において、水酸化ナトリウム溶液を用いて材料を洗浄する洗浄時間は２０分であることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項１１】
前記ステップ（３）において、水酸化ナトリウム溶液の濃度は５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項１２】
前記ステップ（３）において、水酸化ナトリウム溶液の濃度は１０ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする、請求項１１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項１３】
前記ステップ（３）において、リン酸塩緩衝液を用いて材料を洗浄する洗浄時間は１５分であることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項１４】
前記ステップ（４）において、塩化ナトリウム溶液の洗浄時間は２０分であることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項１５】
前記ステップ（４）において、塩化ナトリウム溶液の濃度は０．０１５ｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項１６】
前記ステップ（５）において、治具はステンレススチール治具であることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項１７】
前記ステップ（５）において、予め設計された凍結乾燥プロセスは、２５℃に予備凍結して、２時間保持し、１５℃に昇温して、８時間保持し、１５℃に昇温して、２時間保持し、２５℃に昇温して、４時間保持する凍結乾燥プロセスであることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項１８】
前記ステップ（５）において、レーザマイクロドリルで開けた孔の孔径範囲は０．２〜０．５ｍｍであることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項１９】
前記ステップ（５）において、レーザマイクロドリルで開けた孔の孔間隔は０．５〜１ｃｍであることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項２０】
脱細胞小腸粘膜下層マトリックス材料、脱細胞真皮マトリックス材料、脱細胞心膜マトリックス材料の調製に用いることを含むことを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法の応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療用生体材料の技術分野に関し、具体的には、動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な疾病や創傷によってもたらされる生体の一部の組織または器官の欠損、および機能の一部もしくはすべての喪失は、人類の健康が直面する主な危害の一つである。組織修復のための理想的な材料の研究開発は、一貫して医学、生物科学、および材料科学等の分野における重要な課題となっている。現在、幅広く臨床応用されている組織修復用の医学生体材料は、主に、高分子材料（例えば、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、シリカゲル等）、金属材料（例えば、ステンレススチール、チタン金属、およびその合金等）、無機材料（例えば、生体活性セラミックス、ヒドロキシアパタイト等）、および複合材料（炭素繊維／ポリマー、ガラス繊維／ポリマー等）を含む、非吸収性人工材料である。上述した材料の構造および組成はいずれも人体組織と大きく異なっており、短期間においてのみ代替・支持作用を発揮でき、組織再生を促進して組織機能を果たすことはできない。また、植込み後は分解されず、手術によって取り出さない限り永久に体内に残り、その安定性、組織毒性反応、および発癌性等はいずれも制御することが難しい。  
【０００３】
欧米などの先進国において、植込み型医療用生体材料は重大な産業革命期に入っている。すなわち、従来の非吸収性材料から、分解性で、組織再生を主導的に誘導可能な新規な生体材料へ変化しつつある。そして、発展の主な方向としては、組織工学の原理に基づく、動物組織を原料とする細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ，ＥＣＭ）材料が挙げられる。ＥＣＭとは、コラーゲン、非コラーゲン糖タンパク質、アミノグリカン、プロテオグリカン、エラスチン等の成分のような様々な巨大分子物質により、一定の割合および構造で構成された複雑な有機的三次元総体であり、各種細胞の生存および活動のために適した場所および微環境を提供し、各種細胞の成長、形状、代謝、移動、増殖、および分化を調節でき、さらには組織と器官の機能を調節制御する。組織欠損の深刻な結果の一つは、「土壌」としてのＥＣＭの喪失であり、これは生体が自ら組織の修復および再生を実現できない原因ともなっている。天然のＥＣＭは組織再生の「土壌」とすることができ、理想的な組織修復材料である。動物組織の細胞成分を除去すれば、ほとんどの免疫原性を除去することができ、またＥＣＭの成分を保持して理想的な組織修復材料を開発することができる。
【０００４】
海外では、すでにブタ、ウマ、ウシ等の動物の真皮、心膜、小腸等の組織に由来する動物由来脱細胞ＥＣＭ材料製品が臨床応用段階に入っている。そのうち、の脱細胞小腸粘膜下層（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｕｂｍｕｃｏｓａ，ＳＩＳ）マトリックス材料は、学界で公認された最も理想的な軟組織修復材料である。脱細胞ＳＩＳマトリックス材料の優位性には、１）免疫原性が低く、組織適合性が高いこと、２）特有の構造および組成が、様々な組織の再生を主導的に誘導する生物学的基礎を備えていること、３）応用分野が広範であり、生体の様々な軟組織の修復に適用可能であること、４）抗微生物活性を有すること、が含まれる。米国Ｃｏｏｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ社の脱細胞ＳＩＳマトリックス材料は、腹壁の修復、火傷、痔瘻、難治性創傷、整形手術、骨盤底の修復、腱の修復、泌尿生殖路の修復、神経の修復等の分野において、すでに大量の臨床応用例を有している。
【０００５】
国内外の特許および文献中には、脱細胞ＳＩＳマトリックス材料の調製方法に関する報告が数多く存在するが、これまでのところ、脱細胞ＳＩＳマトリックス材料の臨床応用段階に入っているのはＣｏｏｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ社ただ一社である。
【０００６】
脱細胞工程およびウイルスの不活化工程は、脱細胞ＳＩＳマトリックス材料の調製における主要な工程であるとともに技術的な難点であり、小腸粘膜下組織のウイルス、細胞成分、および動物由来のＤＮＡ成分を完全に除去するとともに、天然ＥＣＭの成分および三次元構造、特に組織再生を促進する成長因子（例えば塩基性成長因子、トランスフォーミング成長因子等）を完全に保持することが求められる。これまでに報告された脱細胞およびウイルスの不活化方法には多様な種類があるが、そのほとんどはすべての動物由来のＤＮＡ成分を完全に除去することができず、またほとんどは時間が非常に多くかかり、種々の有機溶剤および高強度酸塩溶剤を使用する必要があり、脱細胞ＳＩＳマトリックス材料における活性細胞外マトリックス成分の破壊をもたらし、有害な溶剤の残留は細胞毒性をもたらし、これにより組織修復の効果に影響を及ぼす。なお、ほとんどの脱細胞工程には、内毒素の残留を制御するための有効な手段が存在しない。成形工程は脱細胞ＳＩＳマトリックス材料の調製におけるもう一つの技術的な難点である。小腸の断面直径は６〜８ｃｍにすぎず、小腸粘膜下層の厚みは０．１ｍｍ未満であるため、様々なサイズ、厚さ、および様々な力学的強度の要求に適応する組織修復製品の調製は困難である。Ｃｏｏｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ社は、真空プレス法を用いて成形しているが、このような方法は脱細胞ＳＩＳマトリックス材料の空間構造を圧縮させ、天然ＥＣＭの三次元構造を破壊し、材料の空隙率に影響を及ぼす可能性がある。
【０００７】
臨床研究に示されるように、Ｃｏｏｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ社の脱細胞ＳＩＳマトリックス材料製品（ｓｕｒｇｉｓｉｓ  ＢＩＯＤＥＳＩＧＮ（登録商標）等）は、臨床応用において、漿液腫、感染、免疫拒絶反応、組織癒合不良等の合併症が生じており、その中では漿液腫の発生率が最も高い。合併症は疾病の再発をもたらす可能性があり、深刻な場合には植込まれた脱細胞ＳＩＳマトリックス材料を再手術によって除去しなければならない。漿液腫はＴｈ２炎症性細胞因子の反応により引き起こされるものであり、当該反応は製品の動物由来ＤＮＡの残留と密接に関連しているということが研究によって確認されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする技術的課題は、動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法を提供することであり、当該方法により調製された動物由来の脱細胞ＥＣＭ材料は、動物由来の細胞成分とＤＮＡ成分が完全に除去されているとともに、天然ＥＣＭの成分、三次元構造、および組織再生を誘導・促進できる活性成長因子が完全に保持されており、内毒素、有機溶剤、および有毒溶剤の残留がなく、様々な適応症に応じて、様々なサイズ、厚さ、および力学的強度を有する製品を形成することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明において用いられる技術的解決手段は、以下の通りである。
動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法であって、以下の操作ステップを含む。
【００１０】
１．動物組織材料の前処理である分離および予備洗浄
新鮮な動物組織を取り、注射用水を用いて３回洗い流す。ここで言う動物とは、理論上はすべての動物を含むが、好ましくはブタ、ウシ、ウマであり、より好ましくはブタである。前記組織には小腸粘膜下層、真皮、心膜が含まれる。  
【００１１】
２．ウイルスの不活化
低濃度過酢酸−エタノール溶液法によりウイルスを不活化させる。当該ステップは、洗浄槽が振盪可能な恒温超音波洗浄器内で行われ、過酢酸の体積百分率を０．０５〜０．２％（好ましくは０．１％）、不活化時間を１〜２時間（好ましくは１時間）、洗浄槽の振盪回転数を３０〜６００ｒｐｍ（好ましくは１００〜３００ｒｐｍ、より好ましくは２００ｒｐｍ）、超音波周波数を２０〜８０ＫＨｚ（好ましくは２０〜５０ＫＨｚ、より好ましくは３５〜５０ＫＨｚ、最も好ましくは４５ＫＨｚ）、温度範囲を４〜４０℃とし、次に、リン酸塩緩衝液中で毎回１５分ずつ２〜５回洗浄して、洗浄後のリン酸塩緩衝液のｐＨ値を測定し、ｐＨが６．５〜７．５になったら、注射用水を流して材料を洗浄し、導電率が１．５μｍ／ｓ以下となったことが測定されたら終了する。当該ステップにおいて、リン酸塩緩衝液の配合方法は、７．９ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌ、０．２４ｇのＫＨ２ＰＯ４、１．８ｇのＫ２ＨＰＯ４を秤量し、８００ｍｌの蒸留水中に溶解し、溶液のｐＨ値が７．４になるまでＨＣｌを用いて調節した後に、蒸留水を加えて１Ｌまで定容するという方法である。  
【００１２】
３．脱細胞
当該ステップは、洗浄槽が振盪可能な恒温超音波洗浄器内で行われ、まず、材料を洗浄槽内に入れ、濃度が５〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ（好ましくは５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ）の水酸化ナトリウム溶液を洗浄槽内に注入し、洗浄器をオンにして、洗浄時間を５〜３０分（好ましくは２０分）とし、次に、洗浄器をオフにして、水酸化ナトリウム溶液を注ぎ出してリン酸塩緩衝液を注入し、洗浄器をオンにして、洗浄時間を５〜２０分（好ましくは１５分）とし、リン酸塩緩衝液で２〜５回繰り返し洗浄して、洗浄後のリン酸塩緩衝液のｐＨ値を測定し、ｐＨが６．５〜７．５になったら、注射用水を流して材料を洗浄し、導電率が１．５μｍ／ｓ以下となったことが測定されたら終了する。当該ステップにおいて、洗浄槽の振盪回転数は１００〜３００ｒｐｍ（好ましくは２００ｒｐｍ）であり、超音波周波数は２０〜８０ＫＨｚ（好ましくは２０〜５０ＫＨｚ、より好ましくは３５〜５０ＫＨｚ、最も好ましくは４５ＫＨｚ）である。当該ステップにおけるリン酸塩緩衝液の配合方法はステップ２と同様とする。
【００１３】
４．塩化ナトリウム処理
当該ステップは、洗浄槽が振盪可能な恒温超音波洗浄器内で行われ、濃度が０．０１５ｍｏｌ／Ｌまたは２ｍｏｌ／Ｌ（好ましくは０．０１５ｍｏｌ／Ｌ）で、ｐＨ値が７．８を超えない塩化ナトリウム溶液を洗浄槽内に注入し、洗浄器をオンにして、洗浄時間を５〜３０分（好ましくは２０分）とし、次に、注射用水を流して材料を洗浄し、導電率が１．５μｍ／ｓ以下となったことが測定されたら終了する。当該ステップにおいて、洗浄槽の振盪回転数は１００〜３００ｒｐｍ（より好ましくは２００ｒｐｍ）であり、超音波周波数は２０〜８０ＫＨｚ（好ましくは２０〜５０ＫＨｚ、より好ましくは３５〜５０ＫＨｚ、最も好ましくは４５ＫＨｚ）である。
【００１４】
５．成形
当該ステップは、治具による固定、凍結乾燥、およびレーザマイクロドリルの３段階を含む。様々な製品の要求に基づいて、適応するサイズと形状の治具（好ましくはステンレススチール治具）を設計し、材料を治具に固定して、様々な製品の要求に応じて複数の層を重ね合わせることができ、注射用水できれいに洗浄済の、治具に固定された材料を凍結乾燥機に入れて、予め設計された凍結乾燥プロセス、つまり、２５〜５０℃（好ましくは２５℃）に予備凍結し、０．５〜４時間（好ましくは２時間）保持し、１５℃に昇温して、４〜１２時間（好ましくは８時間）保持し、１５℃昇温して、０．５〜４時間（好ましくは２時間）保持し、２５℃になるまで昇温して、４時間保持するという凍結乾燥プロセスによって、凍結乾燥を行う。凍結乾燥の完了後に、レーザマイクロドリルを用いて、孔径範囲が０．０５〜１ｍｍ（好ましくは０．２〜０．５ｍｍ）、孔間隔が０．１〜２ｃｍ（好ましくは０．５〜１ｃｍ）である孔を開ける。ここでいうレーザマイクロドリルとは、レーザ技術によって材料にマイクロメートルレベルの小孔を開けることができるものを指し、レーザマイクロドリルを用いて孔を開ける目的は、組織修復に有利になるように、材料の表面に孔隙を形成することである。
【００１５】
６．包装および滅菌
無菌の状態で包装し、一層にはタイベックを、他層にはポリエチレンプラスチックを使用し、包装の完了後にエチレンオキシドを用いて滅菌する。  
本発明において、注射用水の使用基準は中国薬局方の規定に準じる。
本発明に記載の、洗浄槽が振盪可能な超音波洗浄器は、従来の超音波洗浄器の洗浄槽と機械的振盪器とを組み合わせて、洗浄槽が超音波洗浄と同時に機械的振盪を行えるようにし、機械的振盪と超音波洗浄が同時に連携して作用できるようにしている。
【００１６】
本発明に係る動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法は、脱細胞小腸粘膜下層マトリックス材料、脱細胞真皮マトリックス材料、脱細胞心膜マトリックス材料の調製に用いることができる。
【発明の効果】
【００１７】
従来の技術に比べ、本発明は以下の顕著な長所と有益な効果を有している。本発明は洗浄槽が振盪可能な超音波洗浄器を使用し、機械的振盪と超音波洗浄が同時に連携して作用できるようにして、動物由来の脱細胞ＥＣＭ材料の調製におけるウイルスの不活化工程、脱細胞工程、および動物由来ＤＮＡの除去工程の効率を向上させ、工程にかかる時間を大幅に低減し、工程のフローを単純化している。調製過程全体において過酢酸−エタノール、水酸化ナトリウム、塩化ナトリウムという３種類の溶液しか使用しておらず、かついずれの濃度も従来の調製技術より大幅に低く、調製された材料から免疫原性が完全に除去され、天然ＥＣＭの構造と成長因子等の有効成分が完全に保持されている。また、成形工程においては、凍結乾燥技術とレーザマイクロドリル技術の効率的な結合が独創的に行われ、天然ＥＣＭの三次元構造を破壊しないことを前提として、様々な適応症に応じて、様々な形状、サイズ、厚さ、および力学的強度を有する製品を形成する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の実施例２における試料の切断模式図を示す。
【図２】本発明の実施例２における光学顕微鏡図を示す。
【図３】本発明の実施例２における電子顕微鏡下の超微細構造図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下では、実施例を参照しながら本発明についてさらに具体的に説明するが、これに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
脱細胞ブタ小腸粘膜下層マトリックス材料の調製
１．動物組織材料の前処理である分離および予備洗浄
屠殺されたばかりのブタの新鮮な小腸組織を取ってきれいに洗浄し、小腸粘膜下層を分離し、注射用水を用いて３回洗い流した。
【００２１】
２．ウイルスの不活化
低濃度過酢酸−エタノール溶液法によりウイルスを不活化させた。当該ステップは、洗浄槽が振盪可能な恒温超音波洗浄器内で行われ、過酢酸の体積百分率を０．０５〜０．２％（好ましくは０．１％）、不活化時間を１〜２時間（好ましくは１時間）、洗浄槽の振盪回転数を３０〜６００ｒｐｍ（好ましくは１００〜３００ｒｐｍ、より好ましくは２００ｒｐｍ）、超音波周波数を２０〜８０ＫＨｚ（好ましくは２０〜５０ＫＨｚ、より好ましくは３５〜５０ＫＨｚ、最も好ましくは４５ＫＨｚ）、温度範囲を４〜４０℃として、次に、リン酸塩緩衝液中で毎回１５分ずつ２〜５回洗浄して、洗浄後のリン酸塩緩衝液のｐＨ値を測定し、ｐＨが６．５〜７．５になったら、注射用水を流して材料を洗浄し、導電率が１．５μｍ／ｓ以下となったことが測定されたら終了した。当該ステップにおいて、リン酸塩緩衝液の配合方法は、７．９ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌ、０．２４ｇのＫＨ２ＰＯ４、１．８ｇのＫ２ＨＰＯ４を秤量し、８００ｍｌの蒸留水中に溶解し、溶液のｐＨ値が７．４になるまでＨＣｌを用いて調節した後に、蒸留水を加えて１Ｌまで定容するという方法である。
【００２２】
３．脱細胞
当該ステップは、洗浄槽が振盪可能な恒温超音波洗浄器内で行われ、まず、材料を洗浄槽内に入れ、濃度が５〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ（好ましくは５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ）の水酸化ナトリウム溶液を洗浄槽内に注入し、洗浄器をオンにして、洗浄時間を５〜３０分（好ましくは２０分）とし、次に、洗浄器をオフにして、水酸化ナトリウム溶液を注ぎ出してリン酸塩緩衝液を注入し、洗浄器をオンにして、洗浄時間を５〜２０分（好ましくは１５分）とし、リン酸塩緩衝液で２〜５回繰り返し洗浄して、洗浄後のリン酸塩緩衝液のｐＨ値を測定し、ｐＨが６．５〜７．５になったら、注射用水を流して材料を洗浄し、導電率が１．５μｍ／ｓ以下となったことが測定されたら終了した。当該ステップにおいて、洗浄槽の振盪回転数は１００〜３００ｒｐｍ（好ましくは２００ｒｐｍ）であり、超音波周波数は２０〜８０ＫＨｚ（好ましくは２０〜５０ＫＨｚ、より好ましくは３５〜５０ＫＨｚ、最も好ましくは４５ＫＨｚ）であった。当該ステップにおけるリン酸塩緩衝液の配合方法はステップ２と同様とした。
【００２３】
４．塩化ナトリウム処理
当該ステップは、洗浄槽が振盪可能な恒温超音波洗浄器内で行われ、濃度が０．０１５ｍｏｌ／Ｌまたは２ｍｏｌ／Ｌ（好ましくは０．０１５ｍｏｌ／Ｌ）で、ｐＨ値が７．８を超えない塩化ナトリウム溶液を洗浄槽内に注入し、洗浄器をオンにして、洗浄時間を５〜３０分（好ましくは２０分）とし、次に、注射用水を流して材料を洗浄し、導電率が１．５μｍ／ｓ以下となったことが測定されたら終了した。当該ステップにおいて、洗浄槽の振盪回転数は１００〜３００ｒｐｍ（好ましくは２００ｒｐｍ）であり、超音波周波数は２０〜８０ＫＨｚ（好ましくは２０〜５０ＫＨｚ、より好ましくは３５〜５０ＫＨｚ、最も好ましくは４５ＫＨｚ）であった。
【００２４】
５．成形
様々な製品の要求に基づいて、適応するサイズと形状のスチレンススチール治具を設計し、材料をスチレンススチール治具に固定して、様々な製品の要求に応じて複数の層を重ね合わせることができ、注射用水できれいに洗浄済の、治具に固定された材料を凍結乾燥機に入れて、予め設計された凍結乾燥プロセス、つまり、２５〜５０℃（好ましくは２５℃）に予備凍結して、０．５〜４時間（好ましくは２時間）保持し、１５℃に昇温して、４〜１２時間（好ましくは８時間）保持し、１５℃昇温して、０．５〜４時間（好ましくは２時間）保持し、２５℃に昇温して、４時間保持するという凍結乾燥プロセスによって、凍結乾燥を行った。凍結乾燥の完了後に、レーザマイクロドリルを用いて、孔径範囲が０．０５〜１ｍｍ（好ましくは０．２〜０．５ｍｍ）、孔間隔が０．１〜２ｃｍ（好ましくは０．５〜１ｃｍ）である孔を開けた。
【００２５】
６．包装および滅菌
無菌の状態で包装し、一層にはタイベックを、他層にはポリエチレンプラスチックを使用し、包装の完了後にエチレンオキシドを用いて滅菌した。
【実施例２】
【００２６】
実施例１で調製された脱細胞ブタ小腸粘膜下層マトリックス材料の理化学的性質、組織学、成長因子、および生物学性能の検出
１．調製された８層の材料に対する物理性能の検出を行った。検出項目には、縫合保持力、引張強度、破断強度、および空隙率が含まれていた。
【００２７】
１）縫合保持力の検出
以下の方法で行った。２−０の外科用縫合糸または同径のステンレススチール線材で８層の材料の一端縁部の内側２ミリメートルの箇所を縫合し、縫合糸またはステンレススチール線材と８層の材料の他端を引張強度試験機に固定し、縫合箇所が引き裂かれるまで２０ｍｍ／分の速度で引っ張って、縫合箇所が引き裂かれた時点の引張力を記録した。上記の方法により３回分のサンプルに対する検出を行った。その結果、縫合引張強度は５±０．５Ｎ以上であった。
【００２８】
２）引張強度の検出
以下の方法で行った。引張（圧縮）試験機を用いて、図１に示すように、８層の材料を試片に切断し、切断後に、相対湿度４０％〜６０％、温度２２℃±２℃の条件下で２時間放置した後、直ちに試験を行った。試片の両端を引張試験機のクランプヘッドに固定し、１００ｍｍ／分の速度で試片が破断するまで順次外向きに引っ張り、試片の縦方向および横方向に対してそれぞれ試験を行った。試片の破断時の力を単位Ｎで記録した。上記の方法により３回分のサンプルに対して検出を行った。その結果、縦方向：１５Ｎ、横方向：８Ｎであった。
【００２９】
３）破断強度の検出
以下の方法により行った。引張（圧縮）試験機を用いて、８層の材料を２３×２３ｍｍの正方形の試片に切断して準備し、相対湿度４０％〜６０％、温度２４℃±２℃の条件下で２時間放置した後、直ちに試験を行った。環状治具で試片を引張強度試験機の作業台に固定し、球状プローブが７５０ｍｍ／分の速度で試片を貫通するようにして、試片を貫通するプローブの力を記録した。上記の方法により３回分のサンプルについて検出を行った。その結果、破断強度は１２０Ｎを超えた。
【００３０】
４）空隙率の測定
水銀圧入法を用いて材料の空隙率を測定した。その結果、空隙率は８５％以上であった。
【００３１】
２．調製された８層の材料に対して化学性能の検出を行った。検出項目には、ウイルス、ｐＨ値、内毒素、およびＤＮＡ残留量が含まれていた。
【００３２】
１）試液の調製
サンプルの厚さが均一な部分を取って、１ｃｍ２の細片に切断し、水で洗浄し、乾燥した後にガラス容器に入れ、サンプルの内外総表面積（ｃｍ２）と水（ｍＬ）との比が５：１の割合となるように水を加え、蓋をした後に高圧蒸気滅菌器内に置き、１２１℃±１℃で３０分加熱し、加熱終了後にサンプルと液体とを分離し、室温に冷却して試液とした。同じ容積の水を秤取してガラス容器内に置いて、同様の方法によりブランク溶液を調製した。
【００３３】
２）ウイルスの検出
以下の方法により行った。指示ウイルスとして仮性狂犬病ウイルスを選び、リアルタイム定量的ＰＣＲ法によりウイルスＤＮＡコピー数を検出し、３回分のサンプルに対して検出を行った。その結果、ウイルスＤＮＡコピー数は０であった。
【００３４】
３）ｐＨ値の検出
ＧＢ／Ｔ１４２３３．１（『医療用輸液、輸血、注射器具の検査方法  第１部：化学分析方法』）の５．４．１に定められた方法で試験を行った。その結果、試液とブランク溶液とのｐＨ値の差は１．５を超えなかった。
【００３５】
４）内毒素の検出
６ｃｍ２のサンプルに１ｍｌの抽出媒体を加えるという割合で、３７±１℃、７２±２時間で試液を調製した。抽出媒体は生理食塩水とした。ＧＢ／Ｔ１４２３３．２−２００５（『医療用輸液、輸血、注射器具の検査方法  第２部：生物学試験方法』）に定められた方法で行い、３回分のサンプルに対して検出を行った。その結果、内毒素の含有量は５ＥＵ／ｇ未満であった。
【００３６】
５）ＤＮＡ残留量の検出
生物剤のＤＮＡ残留検出方法（『中国薬局方』２０１０、附録ＩＸ−Ｂ  外因性ＤＮＡ残留量の測定法）により、実施例１により提供されたサンプルのＤＮＡ残留量を蛍光染色法を用いて検出した。その結果、材料のＤＮＡ残留量は１５０ｐｇ／ｇを超えなかった。
【００３７】
３．組織学的検出
１）光学顕微鏡による観察
以下の方法により行った。パラフィンコーティングされた材料に対してヘマトキシリン−エオシン染色を行い、倒立型位相差顕微鏡で観察した。その結果、図２に示すように、細胞や細胞破片の残留はなく、コラーゲン繊維は破断せず連続していた。
【００３８】
２）超微細構造の観察  観察の結果、図３に示すように、材料は多孔質構造を呈し、繊維は破断せず、孔径は均一で、平均孔径サイズは２００μｍであり、空隙率は８５％を超えていた。
【００３９】
４．成長因子の検出
６ｃｍ２のサンプルに１ｍｌの抽出媒体を加えるという割合で、３７±１℃、７２±２時間で試液を調製した。抽出媒体は生理食塩水とした。ＥＬＩＳＡ法により抽出溶液における塩基性成長因子（ｂＦＧＦ）および血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）の含有量を検出した。結果として、ｂＦＧＦの含有量は１２１．８±２．６８３ｎｇ／Ｌであり、ＶＥＧＦの含有量は９３．８±３．０３３ｎｇ／Ｌであった。
【００４０】
５．生物学的性能検出において、検出項目には、細胞毒性、遅延型過敏反応、皮内反応が含まれていた。
【００４１】
１）細胞毒性の検出
以下の方法により行った。６ｃｍ２のサンプルに１ｍｌの抽出媒体を加えるという割合で、３７±１℃、２４±２時間で試液を調製した。抽出媒体は血清を含有するＭＥＭ培地とした。試液を取り、ＧＢ／Ｔ１６８８６．５−２００３（『医療機器の生物学的評価  第５部：体外細胞の毒性試験』）に定められた試験方法で試験を行った。その結果、細胞毒性反応は１級以下であった。
【００４２】
２）遅延型過敏反応の検出
以下の方法により行った。６ｃｍ２のサンプルに１ｍｌの抽出媒体を加えるという割合で、３７±１℃、７２±２時間で試液を調製した。抽出媒体は生理食塩水と綿実油とした。ＧＢ／Ｔ１６８８６．１０−２００５（『医療機器の生物学的評価  第１０部：刺激および遅延型過敏反応の試験』）の試験方法の規定に従って試験を行った。その結果、遅延型過敏反応はなかった。
【００４３】
３）皮内反応の検出
６ｃｍ２のサンプルに１ｍｌの抽出媒体を加えるという割合で、３７±１℃、７２±２時間で試液を調製した。抽出媒体は生理食塩水と綿実油とした。ＧＢ／Ｔ１６８８６．１０−２００５（『医療機器の生物学的評価  第１０部：刺激および遅延型過敏反応の試験』）の試験方法の規定に従って試験を行った。その結果、試験サンプルと溶剤のコントロールとの平均得点差は１．０未満であった。
【実施例３】
【００４４】
脱細胞ブタ真皮マトリックス材料の調製
屠殺されたばかりのブタの新鮮な真皮組織を原材料として取り、調製方法は実施例１と同様とした。
【実施例４】
【００４５】
実施例３により調製された脱細胞ブタ真皮マトリックス材料の理化学的性質、組織学、成長因子、および生物学的性能の検出
実施例２に記載の方法により検出を行った。
【００４６】
結果に示すように、実施例３により調製された脱細胞ブタ真皮マトリックス材料の縫合引張強度は５Ｎより大きく、横方向および縦方向の引張強度はいずれも２０Ｎより大きく、破断強度は１２０Ｎより大きく、空隙率は８０％より大きく、ウイルスＤＮＡコピー数は０であり、内毒素の含有量は５ＥＵ／ｇ未満であり、ＤＮＡ残留量は１５０ｐｇ／ｇを超えず、遅延型過敏反応はなく、皮内反応はなかった。
【実施例５】
【００４７】
脱細胞ブタ心膜マトリックス材料の調製
屠殺されたばかりのブタの新鮮な心膜組織を原材料として取り、調製方法は実施例１と同様とした。
【実施例６】
【００４８】
実施例５により調製された脱細胞ブタ心膜マトリックス材料の理化学的性質、組織学、成長因子、および生物学的性能の検出
実施例２に記載の方法により検出を行った。
【００４９】
結果に示すように、実施例５により調製された脱細胞ブタ心膜マトリックス材料の縫合引張強度は５Ｎより大きく、横方向および縦方向の引張強度はいずれも２０Ｎより大きく、破断強度は１２０Ｎより大きく、空隙率は８５％より大きく、ウイルスＤＮＡコピー数は０であり、内毒素の含有量は５ＥＵ／ｇ未満であり、ＤＮＡ残留量は１５０ｐｇ／ｇを越えず、遅延型過敏反応はなく、皮内反応はなかった。
【００５０】
本発明における上述の実施例は、本発明について説明をするためのものであって、本発明を限定するために用いることはできない。本発明の請求の範囲に相当する意味と範囲内にあるいかなる変更も、「請求の範囲」の範囲内に含まれるとみなされるべきである。
【図１】
2016521592.tif 000003
【図２】
2016521592.tif 000004
【図３】
2016521592.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成28年2月2日(2016.2.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法において、
（１）動物組織材料の前処理である分離および予備洗浄のために、新鮮な動物組織を取り、注射用水を用いて３回洗い流すステップ、
（２）低濃度過酢酸−エタノール溶液法によりウイルスを不活化させるステップであって、洗浄槽式の振盪可能な恒温超音波洗浄器内で行われ、過酢酸の体積百分率を０．０５〜０．２％、不活化時間を１〜２時間、温度範囲を４〜４０℃とし、次に、リン酸塩緩衝液中で毎回１５分ずつ２〜５回洗浄して、洗浄後のリン酸塩緩衝液のｐＨ値を測定し、ｐＨが６．５〜７．５になったら、注射用水を流して材料を洗浄し、導電率が１．５μｍ／ｓ以下となったことが測定されたら終了するステップ、
（３）脱細胞のために、洗浄槽式の振盪可能な恒温超音波洗浄器内で行われ、まず、材料を洗浄槽内に入れ、濃度が５〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を洗浄槽内に注入し、洗浄器をオンにして、洗浄時間を５〜３０分とし、次に、洗浄器をオフにして、水酸化ナトリウム溶液を注ぎ出してリン酸塩緩衝液を注入し、洗浄器をオンにして、洗浄時間を５〜２０分とし、リン酸塩緩衝液で２〜５回繰り返し洗浄して、洗浄後のリン酸塩緩衝液のｐＨ値を測定し、ｐＨが６．５〜７．５になったら、注射用水を流して材料を洗浄し、導電率が１．５μｍ／ｓ以下となったことが測定されたら終了するステップ、
（４）塩化ナトリウム処理のためのステップであって、洗浄槽式の振盪可能な恒温超音波洗浄器内で行われ、濃度が０．０１５ｍｏｌ／Ｌまたは２ｍｏｌ／Ｌで、ｐＨ値が７．８を超えない塩化ナトリウム溶液を洗浄槽内に注入し、洗浄器をオンにして、洗浄時間を５〜３０分とし、次に、注射用水を流して材料を洗浄し、導電率が１．５μｍ／ｓ以下となったことが測定されたら終了するステップ、
（５）成形のためのステップであって、治具による固定、凍結乾燥、およびレーザマイクロドリルの３段階を含み、様々な製品の要求に基づいて、適応するサイズと形状の治具を設計し、材料を治具に固定して、注射用水できれいに洗浄済の、治具に固定された材料を凍結乾燥機に入れて、予め設計された凍結乾燥プロセス、つまり、−２５〜−５０℃に予備凍結して、０．５〜４時間保持し、そこから１５℃昇温して、４〜１２時間保持し、更に１５℃昇温して、０．５〜４時間保持し、２５℃になるまで昇温して、４時間保持するという凍結乾燥プロセスによって凍結乾燥を行い、凍結乾燥の完了後に、レーザマイクロドリルを用いて、孔径範囲が０．０５〜１ｍｍで、孔間隔が０．１〜２ｃｍである孔を開けるステップ、並びに
（６）包装および滅菌のためのステップであって、無菌の状態で包装し、一層にはタイベックを、他層にはポリエチレンプラスチックを使用し、包装の完了後にエチレンオキシドを用いて滅菌するステップを含むことを特徴とする、動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項２】
前記ステップ（１）において、動物にはブタ、ウシ、ウマが含まれることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項３】
前記ステップ（１）において、組織には小腸粘膜下層、真皮、心膜が含まれることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項４】
前記ステップ（２）において、過酢酸の体積百分率は０．１％であることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項５】
前記ステップ（２）において、不活化時間は１時間であることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項６】
前記ステップ（２）、（３）、（４）において、洗浄槽の振盪数は１００〜３００ｒｐｍであることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項７】
前記ステップ（２）、（３）、（４）において、洗浄槽の振盪数は２００ｒｐｍであることを特徴とする、請求項６に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項８】
前記ステップ（２）、（３）、（４）において、超音波周波数は２０〜８０ＫＨｚであることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項９】
前記ステップ（２）、（３）、（４）において、超音波周波数は４５ＫＨｚであることを特徴とする、請求項８に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項１０】
前記ステップ（３）において、水酸化ナトリウム溶液を用いて材料を洗浄する洗浄時間は２０分であることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項１１】
前記ステップ（３）において、水酸化ナトリウム溶液の濃度は５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項１２】
前記ステップ（３）において、水酸化ナトリウム溶液の濃度は１０ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする、請求項１１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項１３】
前記ステップ（３）において、リン酸塩緩衝液を用いて材料を洗浄する洗浄時間は１５分であることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項１４】
前記ステップ（４）において、塩化ナトリウム溶液の洗浄時間は２０分であることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項１５】
前記ステップ（４）において、塩化ナトリウム溶液の濃度は０．０１５ｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項１６】
前記ステップ（５）において、治具はステンレススチール治具であることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項１７】
前記ステップ（５）において、予め設計された凍結乾燥プロセスは、−２５℃に予備凍結して、２時間保持し、そこから１５℃昇温して、８時間保持し、更に１５℃昇温して、２時間保持し、２５℃になるまで昇温して、４時間保持する凍結乾燥プロセスであることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項１８】
前記ステップ（５）において、レーザマイクロドリルで開けた孔の孔径範囲は０．２〜０．５ｍｍであることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項１９】
前記ステップ（５）において、レーザマイクロドリルで開けた孔の孔間隔は０．５〜１ｃｍであることを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
【請求項２０】
脱細胞小腸粘膜下層マトリックス材料、脱細胞真皮マトリックス材料、脱細胞心膜マトリックス材料の調製に用いることを含むことを特徴とする、請求項１に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法の応用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
５．成形
当該ステップは、治具による固定、凍結乾燥、およびレーザマイクロドリルの３段階を含む。様々な製品の要求に基づいて、適応するサイズと形状の治具（好ましくはステンレススチール治具）を設計し、材料を治具に固定して、様々な製品の要求に応じて複数の層を重ね合わせることができ、注射用水できれいに洗浄済の、治具に固定された材料を凍結乾燥機に入れて、予め設計された凍結乾燥プロセス、つまり、−２５〜−５０℃（好ましくは−２５℃）に予備凍結し、０．５〜４時間（好ましくは２時間）保持し、そこから１５℃昇温して、４〜１２時間（好ましくは８時間）保持し、更に１５℃昇温して、０．５〜４時間（好ましくは２時間）保持し、２５℃になるまで昇温して、４時間保持するという凍結乾燥プロセスによって、凍結乾燥を行う。凍結乾燥の完了後に、レーザマイクロドリルを用いて、孔径範囲が０．０５〜１ｍｍ（好ましくは０．２〜０．５ｍｍ）、孔間隔が０．１〜２ｃｍ（好ましくは０．５〜１ｃｍ）である孔を開ける。ここでいうレーザマイクロドリルとは、レーザ技術によって材料にマイクロメートルレベルの小孔を開けることができるものを指し、レーザマイクロドリルを用いて孔を開ける目的は、組織修復に有利になるように、材料の表面に孔隙を形成することである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
５．成形
様々な製品の要求に基づいて、適応するサイズと形状のスチレンススチール治具を設計し、材料をスチレンススチール治具に固定して、様々な製品の要求に応じて複数の層を重ね合わせることができ、注射用水できれいに洗浄済の、治具に固定された材料を凍結乾燥機に入れて、予め設計された凍結乾燥プロセス、つまり、−２５〜−５０℃（好ましくは−２５℃）に予備凍結して、０．５〜４時間（好ましくは２時間）保持し、そこから１５℃昇温して、４〜１２時間（好ましくは８時間）保持し、更に１５℃昇温して、０．５〜４時間（好ましくは２時間）保持し、２５℃になるまで昇温して、４時間保持するという凍結乾燥プロセスによって、凍結乾燥を行った。凍結乾燥の完了後に、レーザマイクロドリルを用いて、孔径範囲が０．０５〜１ｍｍ（好ましくは０．２〜０．５ｍｍ）、孔間隔が０．１〜２ｃｍ（好ましくは０．５〜１ｃｍ）である孔を開けた。
【国際調査報告】
2016521592.tif 000006
2016521592.tif 000007
2016521592.tif 000008
2016521592.tif 000009