(57)【要約】ＡＲ関連の疾患、例えば、前立腺がんなどの前立腺疾患、乳がん、および他の多くの疾患などの診断、予後診断、および処置のための組成物および方法を提供する。特に、アンドロゲンレセプター（ＡＲ）の位置８７６における新規の臨床的に関連する変異が同定された。薬物感受性を予測することができ、この変異の存在もしくは不在に基づいて、治療レジメンを計画することができる。変異体ＡＲを含むポリペプチド、それに対する抗体、それをコードするポリヌクレオチドを使用して、新規の処置を同定することができる。位置７４１および８７７でのＡＲにおける二重変異も、患者の層別化にとって有用であることが示された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
位置８７６を含むかまたは位置８７６にまたがるアンドロゲンレセプターまたはその断片もしくはバリアントを含むポリペプチドを含む組成物であって、位置８７６のアミノ酸が、置換されているかまたは欠失しているかまたはフェニルアラニン（Ｆ）以外である（前記アミノ酸の位置は、配列番号５４の付番に従う）、組成物。
【請求項２】
前記位置８７６のアミノ酸が欠失している、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記位置８７６のアミノ酸がロイシン（Ｌ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
位置８７６を含むかまたは位置８７６にまたがるアンドロゲンレセプターまたはその断片もしくはバリアントを含むポリペプチドを含む組成物であって、位置８７６のアミノ酸が、置換されているかまたは欠失しているかまたはフェニルアラニン（Ｆ）以外であり（前記アミノ酸の位置は、配列番号５４の付番に従う）、
前記ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントが、任意により、他の位置の１つまたは複数の変異を含む、組成物。
【請求項５】
位置８７７のアミノ酸がトレオニン（Ｔ）ではなく、位置８７４のアミノ酸がヒスチジン（Ｈ）ではなく、位置７１５のアミノ酸がバリン（Ｖ）ではなく、かつ／または位置７４１のアミノ酸がトリプトファン（Ｗ）ではない、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記断片が、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７５、少なくとも１００、または少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも７００、少なくとも７５０、少なくとも８００、少なくとも８５０、および／または少なくとも９００のアミノ酸長である、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記断片またはバリアントが、Ｆ８７６の変異を欠く野生型ＡＲ、またはＦ８７６の少なくとも１つの活性を保持する、請求項１または４に記載の組成物。
【請求項８】
配列番号５４の残基の５０％以下での１つまたは複数のアミノ酸の欠失、付加、挿入、または置換において異なり、配列番号５４に記載される配列またはそのバリアントを有する、ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントを含む組成物であって、その結果、前記ポリペプチドが配列番号５４のポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持する、組成物。
【請求項９】
配列番号５４の残基の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０％以下での１つまたは複数のアミノ酸の欠失、付加、挿入、または置換において異なる、配列番号５４に記載される配列またはそのバリアントを有する、ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントを含む組成物であって、その結果、前記ポリペプチドが配列番号５４のポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持する、組成物。
【請求項１０】
前記断片が、配列番号５４の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記断片が、配列番号５４の少なくとも１５個の連続するアミノ酸を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントを含む組成物であって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号５４に示され、前記配列が、位置８７６のアミノ酸が置換されているかまたは欠失しているかまたはフェニルアラニン（Ｆ）ではないような、配列番号５４のアミノ酸位置８７６におけるもしくは位置８７６にまたがる変異を含有し、任意により、位置８７７のアミノ酸がトレオニン（Ｔ）ではなく、位置８７４のアミノ酸がヒスチジン（Ｈ）ではなく、位置７１５のアミノ酸がバリン（Ｖ）ではなく、かつ／または位置７４１のアミノ酸がトリプトファン（Ｗ）ではなく、前記断片の配列が、配列番号５４の少なくとも５個、１０個、または１５個の連続するアミノ酸を含み、かつ位置８７６を含む、組成物。
【請求項１３】
配列番号３から５３のいずれかを含む配列を含むポリペプチドを含む組成物。
【請求項１４】
患者からの試料におけるＡＲポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおける位置Ｆ８７６での変異を検出する方法であって、
（ａ）前記患者からＡＲを含む試料を得る工程；および
（ｂ）前記ＡＲが位置Ｆ８７６の変異を含むか否かを決定するために、前記ＡＲポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはその一部の配列を決定する工程
を含む、方法。
【請求項１５】
患者を診断、予後診断、および／または処置する方法であって、
（ａ）前記患者からＡＲを含む試料を得る工程；
（ｂ）前記ＡＲが位置Ｆ８７６の変異を含むか否かを決定するために、前記ＡＲポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはその一部の配列を決定する工程；および
（ｃ）ＡＲがＦ８７６の変異を含まない場合にＭＤＶ３１００を含む治療的組成物を投与する工程もしくはその投与を推奨する工程；または、ＡＲがＦ８７６の変異を含む場合にＭＤＶ３１００を含まない治療的組成物を投与する工程もしくはその投与を推奨する工程
を含む、方法。
【請求項１６】
ＭＤＶ３１００を含まない前記治療的組成物が、ビカルタミドまたはＬＥＥ０１１もしくはＰＤ０３３２９９１などのＣＤＫ４／６阻害剤、あるいは治療的核酸を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
患者を診断、予後診断、および／または処置する方法であって、
（ａ）患者におけるアンドロゲンレセプターまたはその断片の位置７４１および８７７のアミノ酸が、それぞれ、トリプトファン（Ｗ）およびトレオニン（Ｔ）であるか否かを決定する工程；
（ｂ）（１）前記位置７４１および８７７のアミノ酸が、それぞれ、トリプトファン（Ｗ）およびトレオニン（Ｔ）である場合にはビカルタミドもしくはＭＤＶ３１００；または（２）前記位置７４１および８７７のアミノ酸が、それぞれ、トリプトファン（Ｗ）およびトレオニン（Ｔ）でない場合にはビカルタミドもしくはＭＤＶ３１００以外の前立腺疾患処置の前記患者への投与を推奨する工程および／またはそれを前記患者に投与する工程
を含む、方法。
【請求項１８】
前記ビカルタミドまたはＭＤＶ３１００を含まない処置が、ＬＥＥ０１１もしくはＰＤ０３３２９９１などのＣＤＫ４／６阻害剤または治療的核酸を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１８】
位置８７６を含む配列番号５４の少なくとも５個の連続するアミノ酸をコードする第１の配列を有し、かつ／またはそれに対して相補的な配列を有する、０、１、２、または３つのミスマッチを含む少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドであって、位置８７６のアミノ酸が、置換されているかもしくは欠失しており、かつフェニルアラニン（Ｆ）以外のアミノ酸である、ポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記第１の配列が、配列番号２の少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個の連続するアミノ酸をコードし、前記少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個の連続するアミノ酸が、配列番号２の位置８７６を含むかもしくは位置８７６にまたがり、前記位置８７６のアミノ酸はフェニルアラニン（Ｆ）ではなく、任意により、位置８７７のアミノ酸はトレオニン（Ｔ）ではなく、８７４のアミノ酸はヒスチジン（Ｈ）ではなく、位置７１５のアミノ酸はバリン（Ｖ）ではなく、かつ／または位置７４１のアミノ酸はトリプトファン（Ｗ）ではない、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載のポリヌクレオチドを含む発現構築物またはベクター。
【請求項２１】
請求項２０に記載の発現構築物またはベクターを含む宿主細胞。
【請求項２２】
コードされた変異体アンドロゲンレセプタータンパク質が配列番号２の位置８７６にロイシン（Ｌ）を含有することを除いて、配列番号２のアミノ酸配列を含む前記変異体アンドロゲンレセプターをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２３】
プロモーター；および変異体アンドロゲンレセプターもしくはその断片をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む発現構築物またはベクターであって、前記アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列が配列番号２に示され、前記配列が、位置８７６のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｆ）ではないような、配列番号２のアミノ酸位置８７６における変異を含有し、任意により、位置８７７のアミノ酸がトレオニン（Ｔ）ではなく、８７４のアミノ酸がヒスチジン（Ｈ）ではなく、位置７１５のアミノ酸がバリン（Ｖ）ではなく、かつ／または位置７４１のアミノ酸がトリプトファン（Ｗ）ではなく、前記断片の配列が、配列番号２の少なくとも５個の連続するアミノ酸を含み、かつ位置８７６を含み、前記ポリヌクレオチドセグメントが、前記プロモーターの下流に位置し、前記ポリヌクレオチドセグメントの転写が前記プロモーターにおいて開始される、発現構築物またはベクター。
【請求項２４】
単離ポリヌクレオチドもしくはその相補体が、配列番号５４の少なくとも１０個、１５個、または２０個の連続するアミノ酸をコードし、前記少なくとも１０個の連続するアミノ酸が配列番号５４の位置８７６を含むかもしくは位置８７６にまたがり、位置８７６のアミノ酸が、置換されているかまたは欠失しているかまたはフェニルアラニン（Ｆ）ではない、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２５】
プロモーター、および請求項２２または２４に記載のポリヌクレオチドを含む構築物を含む宿主細胞。
【請求項２６】
ＭＤＶ３１００に対する細胞の感受性を決定する方法であって、
（ａ）もしあれば、前記細胞におけるアンドロゲンレセプターの位置８７６のアミノ酸を決定する工程であって、前記位置８７６が配列番号５４の付番に従って決定される、工程；
（ｂ）もしあれば、前記位置８７６のアミノ酸を、野生型アンドロゲンレセプターと比較する工程であって、アミノ酸の不在またはフェニルアラニン以外のアミノ酸の存在が、前記細胞がＭＤＶ３１００に対して感受性でないことを示す、工程
を含む、方法。
【請求項２７】
前記細胞が、前立腺がん細胞、乳がん細胞、または他のＡＲ関連疾患細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＡＲ関連疾患が、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、またはケネディ病である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＭＤＶ３１００による処置に対するＡＲ関連疾患の患者の感受性を予測する方法であって、
（ａ）もしあれば、前記患者におけるまたは前記患者から得られる試料におけるアンドロゲンレセプターの位置８７６のアミノ酸を決定する工程であって、前記位置８７６が配列番号５４の付番に従って決定される、工程；
（ｂ）もしあれば、前記位置８７６のアミノ酸を、野生型アンドロゲンレセプターと比較する工程であって、アミノ酸の不在またはフェニルアラニン以外のアミノ酸の存在が、前記患者がＭＤＶ３１００に対して感受性でないことを示す、工程
を含む、方法。
【請求項３０】
前記ＡＲ関連疾患が前立腺がんまたは乳がんである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＡＲ関連疾患が、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、またはケネディ病である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
ＡＲ関連疾患を有する患者を処置する方法であって、
（ａ）もしあれば、前記患者におけるまたは前記患者から得られる試料におけるアンドロゲンレセプターの位置８７６のアミノ酸を決定する工程であって、前記位置８７６が配列番号５４の付番に従って決定される、工程；
（ｂ）もしあれば、前記位置８７６のアミノ酸を、野生型アンドロゲンレセプターと比較する工程であって、アミノ酸の不在またはフェニルアラニン以外のアミノ酸の存在が、前記患者がＭＤＶ３１００に対して感受性でないことを示す、工程；
（ｃ）８７６の位置の前記アミノ酸がフェニルアラニンでない場合、ＭＤＶ３１００を含まない処置を投与する工程；または、前記位置８７６のアミノ酸がフェニルアラニンである場合、ＭＤＶ３１００を含む処置を投与する工程；ならびに
（ｄ）疾患の進行または緩和についてアッセイする工程
を含む、方法。
【請求項３３】
前記ＡＲ関連疾患が前立腺がんまたは乳がんである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＡＲ関連疾患が、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、またはケネディ病である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
ＭＤＶ３１００に対する細胞の感受性を決定する方法であって、
（ａ）もしあれば、前記細胞におけるアンドロゲンレセプターの位置７４１および８７７のアミノ酸を決定する工程であって、前記位置７４１および８７７が配列番号５４の付番に従って決定される、工程；
（ｂ）もしあれば、前記位置７４１および８７７のアミノ酸を、野生型アンドロゲンレセプターと比較する工程であって、位置７４１におけるアミノ酸の不在またはトリプトファン（Ｗ）以外のアミノ酸の存在および位置８７７におけるアミノ酸の不在またはトレオニン（Ｔ）以外のアミノ酸の存在が共に、前記細胞がＭＤＶ３１００に対して感受性でないことを示す、工程
を含む、方法。
【請求項３６】
前記細胞が、前立腺がん細胞、乳がん細胞、または他のＡＲ関連疾患細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＡＲ関連疾患が、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、またはケネディ病である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
ＭＤＶ３１００による処置に対するＡＲ関連疾患の患者の感受性を予測する方法であって、
（ａ）もしあれば、前記患者におけるまたは前記患者から得られる試料におけるアンドロゲンレセプターの位置７４１および８７７のアミノ酸を決定する工程であって、前記位置７４１および８７７が配列番号５４の付番に従って決定される、工程；
（ｂ）もしあれば、前記位置７４１および８７７のアミノ酸を、野生型アンドロゲンレセプターと比較する工程であって、位置７４１におけるアミノ酸の不在またはトリプトファン（Ｗ）以外のアミノ酸の存在および位置８７７におけるアミノ酸の不在またはトレオニン（Ｔ）以外のアミノ酸の存在が共に、前記患者がＭＤＶ３１００に対して感受性でないことを示す、工程
を含む、方法。
【請求項３９】
前記ＡＲ関連疾患が前立腺がんまたは乳がんである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＡＲ関連疾患が、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、またはケネディ病である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
ＡＲ関連疾患を有する患者を処置する方法であって、
（ａ）もしあれば、前記患者におけるまたは前記患者から得られる試料におけるアンドロゲンレセプターの位置７４１および８７７のアミノ酸を決定する工程であって、前記位置７４１および８７７が配列番号５４の付番に従って決定される、工程；
（ｂ）もしあれば、前記位置７４１および８７７のアミノ酸を、野生型アンドロゲンレセプターと比較する工程であって、位置７４１におけるアミノ酸の不在またはトリプトファン（Ｗ）以外のアミノ酸の存在および位置８７７におけるアミノ酸の不在またはトレオニン（Ｔ）以外のアミノ酸の存在が共に、前記患者がＭＤＶ３１００に対して感受性でないことを示す、工程；
（ｃ）８７６の位置の前記アミノ酸がフェニルアラニンでない場合、ＭＤＶ３１００を含まない処置を投与する工程；または、前記位置７４１および８７７のアミノ酸がフェニルアラニンである場合、ＭＤＶ３１００を含む処置を投与する工程；ならびに
（ｄ）疾患の進行または緩和についてアッセイする工程
を含む、方法。
【請求項４２】
前記ＡＲ関連疾患が前立腺がんまたは乳がんである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＡＲ関連疾患が、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、またはケネディ病である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
アンドロゲンレセプター（ＡＲ）関連疾患を有する患者を処置する方法であって、ＡＲの８７６の位置のアミノ酸が不在であるか、またはフェニルアラニンではなく、前記方法がＭＤＶ３１００を含まない治療的組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項４５】
前記ＭＤＶ３１００を含まない治療的組成物が、ビカルタミドまたはＬＥＥ０１１もしくはＰＤ０３３２９９１などのＣＤＫ４／６阻害剤、あるいは治療的核酸を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＡＲ関連疾患が前立腺がんまたは乳がんである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＡＲ関連疾患が、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、またはケネディ病である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
アンドロゲンレセプター（ＡＲ）関連疾患を有する患者を処置する方法であって、ＡＲの位置７４１および８７７のアミノ酸がフェニルアラニンであり、前記方法がＭＤＶ３１００を含む治療的組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項４９】
前記ＡＲ関連疾患が前立腺がんまたは乳がんである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＡＲ関連疾患が、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、またはケネディ病である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
アンドロゲンレセプター（ＡＲ）関連疾患を有する患者を処置する方法であって、ＡＲの８７６の位置のアミノ酸が不在であるか、またはフェニルアラニンではなく、前記方法がＣＤＫ４／６阻害剤を含む治療的組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項５２】
前記ＣＤＫ４／６阻害剤が、ＬＥＥ０１１またはＰＤ０３３２９９１である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＡＲ関連疾患が前立腺がんまたは乳がんである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＡＲ関連疾患が、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、またはケネディ病である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
アンドロゲンレセプター（ＡＲ）関連疾患を有する患者を処置する方法であって、前記ＡＲが野生型であるか、またはＡＲの８７６の位置のアミノ酸が不在であるかもしくはフェニルアラニンではなく、前記方法がＣＤＫ４／６阻害剤を含む治療的組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項５６】
前記ＣＤＫ４／６阻害剤が、ＬＥＥ０１１またはＰＤ０３３２９９１である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＡＲ関連疾患が前立腺がんまたは乳がんである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＡＲ関連疾患が、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、またはケネディ病である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＣＤＫ４／６阻害剤が、インビトロまたはインビボにおいて、アンドロゲンレセプターを発現する細胞株の成長を阻害し、前記アンドロゲンレセプターの８７６の位置のアミノ酸が不在であるかまたはフェニルアラニンではない、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
前記成長阻害が、増殖速度、コロニーアッセイ、顕微鏡アッセイ、および／または画像分析によって決定される、請求項５９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本開示は、概して、アンドロゲンレセプター（ＡＲ）に関連する状態、例えば、前立腺がん（ＰＣａ）などの前立腺疾患、乳がん、および他の様々な疾患などの処置にとって有用な組成物および方法に関する。本開示は、より詳細には、Ｆ８７６における新規の変異を有するアンドロゲンレセプターまたはそれらの断片もしくは変異体［ＡＲ（Ｆ８７６）］を含む組成物に関連する。この変異は、いくつかの治療法（ＭＤＶ３１００など）に対してＡＲ耐性にするが他の治療法（抗アンドロゲン剤のビカルタミド、またはＣＤＫ４／６阻害剤のＬＥＥ０１１およびＰＤ０３３２９９１）に対してはＡＲ耐性にしないので、患者の層別化、薬物感受性の予測、および治療レジメンの設計にとって有用である。このＦ８７６の変異は、ＭＤＶ３１００に対してアンタゴニストからアゴニストへの切り替えをも生じ得る。本開示は、変異ＡＲを含むポリペプチド、それに対する抗体、およびそれをコードするポリヌクレオチドにも関連し、それらの全てを使用して、ＡＲ関連疾患のための新規の処置を同定することができる。本開示は、ＭＤＶ３１００に対する耐性も付与する、位置Ｗ７４１およびＴ８７７におけるＡＲの二重変異にも関する。したがって、これらのＡＲの変異は、患者の層別化およびＡＲ関連疾患のための新規の治療法の開発にとって有用である。本開示は、ＡＲがＦ８７６またはＷ７４１／Ｔ８７７の変異を有する、ＡＲ関連疾患の処置方法にも関する。この開示は、療法の併用を伴う処置方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
アンドロゲンレセプター（ＡＲ）は、テストステロンおよびジヒドロテストステロンなどのリガンドに結合して細胞核へ移行するレセプターである。これは、そこでＤＮＡ結合転写因子として機能し、遺伝子発現および多くの他の機能を制御する。
【０００３】
ＡＲの過剰発現または変異は、前立腺がんなどのがんおよび他の多くの疾患を含む、様々な疾患に関係している。
【０００４】
前立腺がんは、世界で最も一般的に診断されるがんの１つである。Kawata et al. The Prostate 70, 745-754 (2010)；およびJemal et al. CA 58, 71-96 (2008)。局所腫瘍は、多くの場合、治癒的であるが、患者のかなりの割合において遠隔転移が生じる。Scher et al. Journal of clinical oncology 23, 8253-8261 (2005)；およびClegg et al. Cancer research 72, 1494-1503 (2012)。外科的もしくは化学的性腺摘除を含む、アンドロゲン枯渇療法は、初期には有効であるが、ほとんど常に、耐性が獲得され、結果として、去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）と呼ばれるはるかに攻撃的な形態の腫瘍を生じる。ＣＲＰＣは、アメリカ人男性におけるがん関連死の二番目に最も一般的な原因であり［Jemal et al. CA: a cancer journal for clinicians 60, 277-300 (2010)］、現在、不治である。ＣＲＰＣにおける保存される特徴は、ＡＲ遺伝子の過剰発現／増幅およびＡＲ遺伝子の変異を含む多くのメカニズムによる、ＡＲシグナリングの持続的活性である［Chen et al. Nature medicine 10, 33-39 (2004)］。Scher et al. Journal of clinical oncology 23, 8253-8261 (2005)。ＣＲＰＣにおけるＡＲシグナリングへの継続的な依拠は、ＡＲのリガンド結合ポケットへの結合に対してアンドロゲンと拮抗する拮抗阻害剤の開発につながった。ビカルタミドは、そのような抗アンドロゲン剤であり、アンドロゲンの作用を妨げるために、単独療法としてまたは性腺摘除との組み合わせにおいて、長年にわたって臨床的に使用されてきた。しかしながら、ＣＲＰＣの場合、ビカルタミドは、アンタゴニストからアゴニストへの切り替えを受け、逆に、ＡＲシグナリング活性を強めてしまう。Culig et al. British journal of cancer 81, 242-251 (1999)。
【０００５】
近年、より強力な抗アンドロゲン剤であるＭＤＶ３１００（エンザルタミド、Ａｓｔｅｌｌａｓ  Ｐｈａｒｍａ  ＵＳ，Ｉｎｃ．（ノースブルック、イリノイ州）およびＭｅｄｉｖａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．（サンフランシスコ、カリフォルニア）によってＸＴＡＮＤＩ（登録商標）として市販されている）は、アゴニスト活性を欠いていることが見出されている。Tran et al. Science 324, 787-790 (2009)。説得力のある臨床前および臨床データに基づき、ＭＤＶ３１００は、ドセタキセルによる処置の前の、転移性ＣＲＰＣを有する男性の処置のためにＦＤＡによって承認されている。継続中の臨床試験は、進行した前立腺がんを有するまだ性腺摘除されていない患者における単独療法として、ならびに前立腺がんと診断されたがまだ前立腺摘除を受けていない男性における術前補助療法として、ＭＤＶ３１００を試験している。
【０００６】
ＭＤＶ３１００は臨床試験において素晴らしい効力を示したが、初期において好ましく反応した人の多くは、後に、この第２世代抗アンドロゲン剤に対する耐性を発現した。Kim et al. Current treatment options in oncology 13, 189-200 (2012)。
【０００７】
したがって、患者の層別化ならびに前立腺がん、乳がん、および他のＡＲ関連疾患に対する処置の薬物感受性の予測のための新規の組成物および方法が必要とされている。さらに、ＡＲ関連疾患に対する新規の治療法も必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の要旨
本開示の目的は、アンドロゲンレセプター（ＡＲ）関連疾患、例えば、去勢抵抗性Ｐｃａ（ＣＲＰＣ）を含む、前立腺がん（ＰＣａ）などの前立腺疾患、および乳がんなど、ならびに他のＡＲ関連障害、例えば、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症（spinal and muscular atrophy）、ならびにケネディ病などの診断、予後診断、および処置のためのツールおよび方法を提供することである。本開示のこれらおよび他の目的は、下記において説明される１つまたは複数の実施形態によって提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
様々な態様において、本開示は、治療的ＭＤＶ３１００に対する耐性を付与し、さらにはこの薬物に対してアンタゴニストからアゴニストへの切り替え（antagonist-to-agonist switch）を引き起こす、ＡＲにおける新規の臨床的に関連する変異、すなわち、位置Ｆ８７６（配列番号１または５４の配列に従って付番される）における変異、に関する。本開示はさらに、ＡＲ関連疾患の患者の細胞もしくは組織試料においてこの変異の存在もしくは不在を検出する工程、ならびにそれに従った処置計画を予測および設計する工程を伴う、患者の層別化方法にも関する。本開示はさらに、アンドロゲンレセプター（ＡＲ）関連疾患を有する患者を処置する方法であって、ＡＲの８７６の位置のアミノ酸が不在であるかもしくはフェニルアラニンではなく、方法がＣＤＫ４／６阻害剤を含む治療的組成物を投与する工程を含む、方法にも関する。様々な実施形態において、当該ＣＤＫ４／６阻害剤は、ＬＥＥ０１１またはＰＤ０３３２９９１であり、これは、ＡＲ関連疾患のための治療法（therapeutic）として使用することができる。これは、ＡＲがＦ８７６の変異を含んでいるＡＲ関連疾患を含む。さらに、ＰＤ０３３２９９１、ＬＥＥ０１１、および他のＣＤＫ４／６阻害剤は、ＡＲが野生型であるＡＲ関連疾患に対する治療法として有用である。Ｆ８７６変異を有するＡＲポリペプチド、それらに対する抗体、およびそれらをコードするポリヌクレオチドも、新規の治療法のスクリーニングのために有用である。さらに、様々な態様において、本開示は、位置Ｗ７４１およびＴ８７７（配列番号１の配列に従って付番される）でのＡＲにおける二重変異に関し、本開示はさらに、ＭＤＶ３１００に対する耐性も付与することを示す。
【００１０】
変異アンドロゲンレセプター（ＡＲ）ポリペプチド
様々な態様において、本開示は、位置８７６を含むかまたは位置８７６にまたがるアンドロゲンレセプターまたはその断片もしくはバリアントを含むポリペプチドもしくは同様のものであるＡＲ（Ｆ８７６）であって、位置８７６のアミノ酸が、置換されているかまたは欠失しているかまたはフェニルアラニン（Ｆ）以外である（当該アミノ酸の位置は、配列番号５４の付番に従っている）、ＡＲ（Ｆ８７６）に関する。いくつかの態様において、位置８７６のアミノ酸は、置換されているかまたは欠失している。いくつかの態様において、位置８７６のアミノ酸は、ロイシン（Ｌ）である。様々な態様において、ＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチドまたはそれらの断片もしくはバリアントは、任意により、位置８７７のアミノ酸がトレオニン（Ｔ）ではなく、位置８７４のアミノ酸がヒスチジン（Ｈ）ではなく、位置７１５のアミノ酸がバリン（Ｖ）ではなく、かつ／または位置７４１のアミノ酸がトリプトファン（Ｗ）ではないような、他の位置における１つまたは複数の変異を含む。
【００１１】
様々な実施形態において、当該断片は、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７５、少なくとも１００、または少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも７００、少なくとも７５０、少なくとも８００、少なくとも８５０、および／または少なくとも９００のアミノ酸長である。様々な実施形態において、ＡＲ（Ｆ８７６）の断片もしくはバリアントは、Ｆ８７６の変異を欠く野生型（または「ＷＴ」）ＡＲあるいはＡＲ（Ｆ８７６）の少なくとも１つの活性を保持する。
【００１２】
一態様において、本開示は、配列番号５４の残基の５０％以下での１つまたは複数のアミノ酸の欠失、付加、挿入、もしくは置換において異なり、その結果、ＡＲ（Ｆ８７６）の少なくとも１つの活性を保持する、配列番号５４に記載される配列を有する単離ＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチドまたはそのバリアントを提供する。
【００１３】
一態様において、本開示は、配列番号５４の残基の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０％以下での１つまたは複数のアミノ酸の欠失、付加、挿入、もしくは置換において異なり、その結果、ＡＲ（Ｆ８７６）の少なくとも１つの活性を保持する、配列番号５４に記載される配列を有する単離ＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチドまたはそのバリアントを提供する。
【００１４】
本開示の別の実施形態は、断片が少なくとも１０個の配列番号５４における連続するアミノ酸を含む、上記において説明されるような単離ポリペプチドを提供する。
【００１５】
本開示の別の実施形態は、断片が少なくとも１５個の配列番号５４における連続するアミノ酸を含む、上記において説明されるような単離ポリペプチドを提供する。
【００１６】
本開示の別の実施形態は、変異体アンドロゲンレセプターもしくはその断片を含む単離ポリペプチドであって、変異体アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列が配列番号５４に示され、当該配列が、位置８７６のアミノ酸が置換されているかまたは欠失しているかまたはフェニルアラニン（Ｆ）ではないような、配列番号５４のアミノ酸位置８７６におけるもしくは位置８７６にまたがる変異を含有し、任意により、位置８７７のアミノ酸がトレオニン（Ｔ）ではなく、位置８７４のアミノ酸がヒスチジン（Ｈ）ではなく、位置７１５のアミノ酸がバリン（Ｖ）ではなく、かつ／または位置７４１のアミノ酸がトリプトファン（Ｗ）ではなく、断片の配列が、少なくとも５個の配列番号５４における連続するアミノ酸を含みかつ位置８７６を含む、ポリペプチドを提供する。
【００１７】
本開示の別の実施形態は、断片が少なくとも１０個の配列番号５４における連続するアミノ酸を含む、上記において説明されるような単離ポリペプチドを提供する。
【００１８】
本開示の別の実施形態は、断片が少なくとも１５個の配列番号５４における連続するアミノ酸を含む、上記において説明されるような単離ポリペプチドを提供する。
【００１９】
様々な態様において、本開示は、位置８７６を含むアンドロゲンレセプターまたはその断片を含むポリペプチドもしくは同様のものであるＡＲ（Ｆ８７６）であって、位置８７６のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｆ）以外のアミノ酸である、ＡＲ（Ｆ８７６）に関する。
【００２０】
したがって、様々な態様において、本開示は、位置Ｆ８７６での変異を有する（任意により他の位置の１つまたは複数の変異を有する）ＡＲまたは位置Ｆ８７６を含むかもしくは位置８７６にまたがるその断片もしくはバリアントを含む、様々なポリペプチドであって、当該ポリペプチド、断片、またはバリアントが、その位置に変異を有するＡＲの少なくとも１つの活性を保持する、ポリペプチドに関する。
【００２１】
ＡＲ（Ｆ８７６）を検出する方法および患者を層別化する方法
さらなる態様内において、本開示は、患者においてのもしくは患者からの試料において、ＡＲの位置Ｆ８７６における変異の存在または不在を検出する方法を提供する。ＡＲのＦ８７６における変異は、臨床的に関連しているので、そのような変異体ＡＲを示す患者は、ＭＤＶ３１００で処置すべきではく、むしろ、ＭＤＶ３１００を含まない処置（例えば、ビカルタミドまたはＬＥＥ０１１もしくはＰＤ０３３２９９１などのＣＤＫ４／６阻害剤）によって処置されるべきである。ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、ＬＥＥ０１１およびＰＤ０３３２９９１）は、ＡＲが野生型である場合のＡＲ関連疾患の処置方法においても有効であることも留意されたい。ＣＤＫ４／６阻害に対する反応は、アンドロゲン非依存性２２Ｒｖ１細胞のようなＦ８７６Ｌを保有する細胞に限定されない（ＷＴ  ＡＲを発現し、ＭＤＶ３１００処理条件下においてＡＲシグナリングならびにＤＨＦＲおよびＴＫ１の発現を維持することができるＰＣａ株は、ＣＤＫ４／６阻害に対しても強い感受性を示した）。これらのデータは、ＣＤＫ４／６機能の標的化が、一般的におそらくアンドロゲン非依存性である、ＭＤＶ３１００に対する耐性の複数のメカニズムの処置に対して効果的な戦略として役に立ち得ることを繰り返し示唆している。
【００２２】
試料内の細胞は異種であってもよい、すなわち、いくつかはＡＲ（Ｆ８７６）を発現し得る一方で、他のものはＷＴ（野生型）ＡＲおよび／または他の変異体ＡＲを発現し得ることに留意されたい。本明細書において説明される様々な態様において、本開示は、ＡＲ（Ｆ８７６）、ＷＴ  ＡＲ、および／または他の変異体ＡＲの混合物を含み得る試料のＡＲの位置Ｆ８７６における変異を検出する方法に関する。
【００２３】
様々な態様において、本開示は、患者からの試料におけるＡＲポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおける位置Ｆ８７６での変異を検出する方法であって、（ａ）患者からＡＲを含む試料を得る工程；および（ｂ）ＡＲが位置Ｆ８７６の変異を含むか否かを決定するために、ＡＲポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはその一部の配列を決定する工程を含む方法を提供する。当該方法は、任意により、患者の診断、予後診断、および／または処置に関し、ならびに任意によりさらに追加の工程：（ｃ）ＡＲがＦ８７６の変異を含まない場合にＭＤＶ３１００を含む治療的組成物を投与する工程もしくはその投与を推奨する工程；または、ＡＲがＦ８７６の変異を含む場合にＭＤＶ３１００を含まない治療的組成物を投与する工程もしくはその投与を推奨する工程を含む。様々な態様において、ＭＤＶ３１００を含まない治療的組成物は、ビカルタミドまたはＣＤＫ４／６阻害剤、例えば、ＬＥＥ０１１またはＰＤ０３３２９９１など、あるいは治療的核酸である。様々な態様において、試料が、ＡＲ（Ｆ８７６）、ＷＴ  ＡＲ、および／または他の変異体ＡＲを発現する細胞の混合物を含むと決定された場合、当該混合物内の異なるタイプの細胞を攻撃する（attack）ためにいくつかの工程が必要となり得る。さらに、ＷＴおよび様々な変異体ＡＲを示す細胞の比率は、細胞の分集団が、死滅するか、または場合によっては治療によって活性化されて、耐性クローンが生じた場合に変化し得る。したがって、工程（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）は繰り返され得る。
【００２４】
様々な態様において、ＡＲの位置８７６のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｆ）であるか否かを決定する方法としては、これらに限定されるわけではないが、とりわけ、核酸配列決定法の使用、またはＡＲ（Ｆ８７６）に対して特異的な抗体もしくは核酸の使用が挙げられる。
【００２５】
さらなる他の態様内において、本開示は、（ａ）試料を、ＡＲ（Ｆ８７６）に対して特異的な核酸またはその断片もしくはバリアントに、ある条件下および試料中の核酸と当該核酸とのハイブリダイゼーションを可能にする十分な時間において接触させる工程；および（ｂ）ハイブリダイゼーションのレベルを検出する工程を含む、試料におけるＡＲ（Ｆ８７６）発現を検出する方法を提供する。
【００２６】
細胞における増殖反応を調整する方法であって、ＡＲ（Ｆ８７６）活性を調整する薬剤に細胞を接触させる工程を含む方法も提供する。
【００２７】
さらなる態様内において、細胞の分化を調整するための方法であって、ＡＲ（Ｆ８７６）活性を調整する薬剤に細胞を接触させる工程を含む方法が提供される。
【００２８】
本開示はさらに、細胞生存を調整する方法であって、ＡＲ（Ｆ８７６）活性を調整する薬剤に細胞を接触させる工程を含む方法も提供する。
【００２９】
したがって、様々な態様において、本開示は、ＡＲ（Ｆ８７６）を検出する、またはこのポリペプチドを発現するもしくは発現しない患者を層別化する、様々な方法に関する。
【００３０】
一態様において、本開示は、ＭＤＶ３１００に対する細胞の感受性を決定する方法であって、（ａ）もしあれば、細胞におけるアンドロゲンレセプターの位置８７６のアミノ酸を決定する工程であって、位置８７６が配列番号５４の付番に従って決定される、工程；（ｂ）もしあれば、位置８７６のアミノ酸を、野生型アンドロゲンレセプターと比較する工程であって、アミノ酸の不在またはフェニルアラニン以外のアミノ酸の存在が、当該細胞がＭＤＶ３１００に対して感受性でないことを示す、工程を含む方法に関する。一態様において、当該細胞は、前立腺がん細胞、乳がん細胞、または他のＡＲ関連疾患細胞である。一態様において、当該ＡＲ関連疾患は、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、またはケネディ病である。
【００３１】
一態様において、本開示は、ＭＤＶ３１００による処置に対するＡＲ関連疾患の患者の感受性を予測する方法であって、（ａ）もしあれば、患者におけるまたは患者から得られる試料におけるアンドロゲンレセプターの位置８７６のアミノ酸を決定する工程であって、位置８７６が配列番号５４の付番に従って決定される、工程；（ｂ）もしあれば、位置８７６のアミノ酸を、野生型アンドロゲンレセプターと比較する工程であって、アミノ酸の不在またはフェニルアラニン以外のアミノ酸の存在が、当該患者がＭＤＶ３１００に対して感受性でないことを示す、工程を含む方法に関する。一態様において、ＡＲ関連疾患は、前立腺がんまたは乳がんである。一態様において、当該ＡＲ関連疾患は、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、またはケネディ病である。
【００３２】
一態様において、本開示は、ＡＲ関連疾患を有する患者を処置する方法であって、（ａ）もしあれば、患者におけるまたは患者から得られる試料におけるアンドロゲンレセプターの位置８７６のアミノ酸を決定する工程であって、位置８７６が配列番号５４の付番に従って決定される、工程；（ｂ）もしあれば、位置８７６のアミノ酸を、野生型アンドロゲンレセプターと比較する工程であって、アミノ酸の不在またはフェニルアラニン以外のアミノ酸の存在が、当該患者がＭＤＶ３１００に対して感受性でないことを示す、工程、（ｃ）８７６の位置のアミノ酸がフェニルアラニンでない場合に、ＭＤＶ３１００を含まない処置を投与する（施す（administering））工程；または、位置８７６のアミノ酸がフェニルアラニンの場合に、ＭＤＶ３１００を含む処置を投与する工程；ならびに（ｄ）疾患の進行または緩和（palliation）についてアッセイする工程を含む方法に関する。一態様において、ＡＲ関連疾患は、前立腺がんまたは乳がんである。一態様において、当該ＡＲ関連疾患は、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、またはケネディ病である。
【００３３】
ＡＲ（Ｗ７４１／Ｔ８７７）を検出する方法および患者を層別化する方法
さらなる態様内において、本開示はさらに、位置Ｗ７４１およびＴ８７７における二重変異；患者からの試料においてこの二重変異を検出する方法；ならびに、この二重変異を示す患者はＭＤＶ３１００またはビカルタミドで処置すべきではなく、むしろＭＤＶ３１００またはビカルタミドを含まない処置によって処置すべきであるように、患者を層別化する方法にも関する。
【００３４】
様々な態様において、本開示は、患者におけるＡＲ（Ｗ７４１／Ｔ８７７）発現を検出する方法であって、患者におけるアンドロゲンレセプターまたはその断片の位置７４１および８７７のアミノ酸が、それぞれ、トリプトファン（Ｗ）およびトレオニン（Ｔ）であるか否かを決定する工程を含む方法を提供する。様々な態様において、当該方法はさらに、（ａ）位置７４１および８７７のアミノ酸がそれぞれトリプトファン（Ｗ）およびトレオニン（Ｔ）である場合にはビカルタミドもしくはＭＤＶ３１００；または（ｂ）位置７４１および８７７のアミノ酸がそれぞれトリプトファン（Ｗ）およびトレオニン（Ｔ）でない場合にはビカルタミドもしくはＭＤＶ３１００以外の前立腺疾患処置、の患者への投与を推奨する工程および／またはそれを患者に投与する工程を含む。ビカルタミドまたはＭＤＶ３１００を含まない処置は、非限定例として、他の治療、例えば、ＬＥＥ０１１もしくはＰＤ０３３２９９１などのＣＤＫ４／６阻害剤、または治療的核酸を含み得る。
【００３５】
様々な態様において、本開示は、ＡＲ関連疾患を有するかまたは有すると疑われる患者を診断、予後診断、および／または処置する方法であって、アンドロゲンレセプターを発現する細胞を含む生体試料を患者から得る工程；アンドロゲンレセプターが、位置７４１のアミノ酸がトリプトファン（Ｗ）ではなくかつ位置８７７のアミノ酸がトレオニン（Ｔ）ではないように、位置７４１および８７７に二重変異を含むか否かを決定する工程、および以下いずれか；アンドロゲンレセプターがアミノ酸位置７４１にトリプトファン（Ｗ）を含みかつ位置８７７にトレオニン（Ｔ）を含む場合に、ビカルタミドまたはＭＤＶ３１００を含む処置によって患者を処置する工程、あるいは、アンドロゲンレセプターがアミノ酸位置７４１にトリプトファン（Ｗ）以外のアミノ酸を含みかつアミノ酸位置８７７にトレオニン（Ｔ）以外のアミノ酸を含む場合に、ビカルタミドまたはＭＤＶ３１００を含まない、前立腺疾患のための処置によって患者を処置する工程を含む方法を提供する。ビカルタミドまたはＭＤＶ３１００を含まない処置は、非限定例として、他の治療、例えば、ＬＥＥ０１１もしくはＰＤ０３３２９９１などのＣＤＫ４／６阻害剤、または治療的核酸を含み得る。本開示はさらに、ＣＤＫ４／６阻害剤が、ＡＲが野生型であるＡＲ関連疾患の処置方法においても使用することができることについても述べる。ＡＲ関連疾患の処置（例えば、ビカルタミドおよび／またはＬＥＥ０１１および／またはＰＤ０３３２９９１および／または当技術分野において既知の他の処置）において、複数の薬剤および／または治療法を含む併用療法（combination therapy）を使用することができることにも留意されたい。
【００３６】
一態様において、本開示は、ＭＤＶ３１００に対する細胞の感受性を決定する方法であって、（ａ）もしあれば、細胞におけるアンドロゲンレセプターの位置７４１および８７７のアミノ酸を決定する工程であって、位置７４１および８７７が配列番号５４の付番に従って決定される、工程；（ｂ）もしあれば、位置７４１および８７７のアミノ酸を、野生型アンドロゲンレセプターと比較する工程であって、位置７４１におけるアミノ酸の不在またはトリプトファン（Ｗ）以外のアミノ酸の存在および位置８７７におけるアミノ酸の不在またはトレオニン（Ｔ）以外のアミノ酸の存在が共に（together）、当該細胞がＭＤＶ３１００に対して感受性でないことを示す、工程を含む方法に関する。一態様において、当該細胞は、前立腺がん細胞、乳がん細胞、または他のＡＲ関連疾患細胞である。一態様において、当該ＡＲ関連疾患は、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、またはケネディ病である。
【００３７】
一態様において、本開示は、ＭＤＶ３１００による処置に対する、ＡＲ関連疾患の患者の感受性を予測する方法であって、（ａ）もしあれば、患者におけるまたは患者から得られる試料におけるアンドロゲンレセプターの位置７４１および８７７のアミノ酸を決定する工程であって、位置７４１および８７７が配列番号５４の付番に従って決定される、工程；（ｂ）もしあれば、位置７４１および８７７のアミノ酸を、野生型アンドロゲンレセプターと比較する工程であって、位置７４１におけるアミノ酸の不在またはトリプトファン（Ｗ）以外のアミノ酸の存在および位置８７７におけるアミノ酸の不在またはトレオニン（Ｔ）以外のアミノ酸の存在が共に、当該患者がＭＤＶ３１００に対して感受性でないことを示す、工程を含む方法に関する。一態様において、ＡＲ関連疾患は、前立腺がんまたは乳がんである。一態様において、当該ＡＲ関連疾患は、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、またはケネディ病である。
【００３８】
一態様において、本開示は、ＡＲ関連疾患を有する患者を処置する方法であって、（ａ）もしあれば、患者におけるまたは患者から得られる試料におけるアンドロゲンレセプターの位置７４１および８７７のアミノ酸を決定する工程であって、位置７４１および８７７が配列番号５４の付番に従って決定される、工程；（ｂ）もしあれば、位置７４１および８７７のアミノ酸を、野生型アンドロゲンレセプターと比較する工程であって、位置７４１におけるアミノ酸の不在またはトリプトファン（Ｗ）以外のアミノ酸の存在、および位置８７７におけるアミノ酸の不在またはトレオニン（Ｔ）以外のアミノ酸の存在が共に、当該患者がＭＤＶ３１００に対して感受性でないことを示す、工程、（ｃ）８７６の位置のアミノ酸がフェニルアラニンでない場合に、ＭＤＶ３１００を含まない処置を投与する工程；または、位置７４１および８７７のアミノ酸がフェニルアラニンの場合に、ＭＤＶ３１００を含む処置を投与する工程；ならびに（ｄ）疾患の進行または緩和についてアッセイする工程を含む方法に関する。一態様において、ＡＲ関連疾患は、前立腺がんまたは乳がんである。一態様において、当該ＡＲ関連疾患は、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、またはケネディ病である。
【００３９】
したがって、様々な態様において、本開示は、ＡＲ（Ｗ７４１／Ｔ８７７）を検出し、このポリペプチドを発現するもしくは発現しない患者を層別化する様々な方法に関する。
【００４０】
新規の治療法のスクリーニング
位置Ｆ８７６の変異は、ＡＲを、ＭＤＶ３１００に対して耐性を有するようにし、さらには、この薬物に対してアンタゴニストからアゴニストへの切り替えも引き起こす。したがって、ＡＲ（Ｆ８７６）と相互作用し、ＡＲのそのような変異を有するＡＲ関連疾患の患者の処置にとって有用である、新規の治療法が必要とされている。
【００４１】
本開示はさらに、他の態様内において、ＡＲ（Ｆ８７６）を相互作用する能力について分子（例えば、潜在的治療法）をスクリーニングする方法であって、（ａ）ある条件下において、候補の分子とＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチドとが相互作用することができる十分な時間において、当該候補の分子をポリペプチドと接触させる工程；ならびに（ｂ）候補の分子の、当該ポリペプチドへの結合の存在もしくは不在および／または当該ポリペプチドと相互作用する能力、またはポリペプチドの少なくとも１つの活性を減じる能力を検出する工程を含む方法を提供する。検出工程は、例えば、ＡＲ（Ｆ８７６）およびＡＲレポーター（例えば、ＡＲＥ［ＷＴまたはＡＴ（Ｆ８７６）が結合しているＤＮＡ配列］を含むポリヌクレオチドなど）、プロモーター、ならびにレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）の使用を含み得る。検出工程は、例えば、候補の分子が、ＡＲレポーターから発現を駆動するＡＲ（Ｆ８７６）の能力を妨げるかもしくは低下させるか否かを決定する工程を含み得る。検出工程は、例えば、アフィニティー精製工程、酵母ツーハイブリッドスクリーニング法、またはファージディスプレイライブラリーのスクリーニング法を含み得る。
【００４２】
いくつかの態様において、新規の治療法をスクリーニングする方法は、ＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチドまたは、位置８７６のアミノ酸を含むかまたは当該アミノ酸にまたがるその断片もしくはバリアントの使用を伴う。このポリペプチドは、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからの発現を含めた、当技術分野において既知の任意の方法において産生することができる。
【００４３】
本開示は、ＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチドを産生する方法も包含する。
【００４４】
本開示はさらに、他の態様内において、ＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチドを産生する方法であって、（ａ）上記において説明したような宿主細胞を、ＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチドの発現が可能な条件下において培養する工程；および（ｂ）宿主細胞培養物からＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチドを単離する工程を含む方法も提供する。
【００４５】
したがって、本開示は、様々な態様において、ＡＲ（Ｆ８７６）を含むポリペプチド、ＡＲ（Ｆ８７６）を含むポリペプチドに対する抗体、およびＡＲ（Ｆ８７６）をコードするポリヌクレオチドを含む、新規の治療法をスクリーニングおよび開発するための組成物および方法に関する。
【００４６】
処置方法
様々な実施形態において、本開示は、ＡＲ関連疾患の処置方法であって、ＡＲが本明細書において説明した変異を有する方法に関する。
【００４７】
一実施形態において、本開示は、アンドロゲンレセプター（ＡＲ）関連疾患を有する患者を処置する方法であって、ＡＲの８７６の位置のアミノ酸が不在であるか、またはフェニルアラニンではなく、方法がＭＤＶ３１００を含まない治療的組成物を投与する工程を含む、方法に関する。
【００４８】
様々な実施形態において、ＭＤＶ３１００を含まない治療的組成物は、ビカルタミドまたはＬＥＥ０１１もしくはＰＤ０３３２９９１などのＣＤＫ４／６阻害剤、あるいは治療的核酸を含む。
【００４９】
一実施形態において、本開示は、アンドロゲンレセプター（ＡＲ）関連疾患を有する患者を処置する方法であって、ＡＲの位置７４１および８７７のアミノ酸がフェニルアラニンであり、方法がＭＤＶ３１００を含む治療的組成物を投与する工程を含む、方法に関する。
【００５０】
一実施形態において、本開示は、アンドロゲンレセプター（ＡＲ）関連疾患を有する患者を処置する方法であって、ＡＲの８７６の位置のアミノ酸が不在であるかもしくはフェニルアラニンではなく、方法がＣＤＫ４／６阻害剤を含む治療的組成物を投与する工程を含む、方法にも関する。
【００５１】
様々な実施形態において、ＣＤＫ４／６阻害剤は、ＬＥＥ０１１またはＰＤ０３３２９９１である。
【００５２】
様々な実施形態において、ＡＲ関連疾患は、前立腺がんまたは乳がんである。様々な実施形態において、当該ＡＲ関連疾患は、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、またはケネディ病である。
【００５３】
ＡＲ（Ｆ８７６）ポリヌクレオチド
別の態様において、本開示は、配列番号５４の配列を有し、かつ／または位置８７６を含む、配列番号５４の少なくとも５個の連続するアミノ酸をコードする配列に対して検出可能にハイブリダイズすることができる、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド（０、１つ、２つ、または３つのミスマッチを含む）を含むポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドであって、位置８７６のアミノ酸が、置換されているかもしくは欠失しており、フェニルアラニン（Ｆ）以外のアミノ酸であり、ハイブリダイゼーションが洗浄を含む条件下において行われる、ポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドは、ＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチドをコード（例えば、発現）するために使用することができ、または治療的核酸（例えば、ＡＲ（Ｆ８７６）に対するｓｉＲＮＡなど）に組み入れることができる。
【００５４】
本開示の別の実施形態は、単離アンドロゲンレセプターポリヌクレオチドを提供し、この場合、当該単離ポリヌクレオチドもしくはその相補体は、配列番号２の少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個の連続するアミノ酸をコードし、当該少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個の連続するアミノ酸は、配列番号２の位置８７６を含むかもしくは位置８７６にまたがり、ならびに位置８７６のアミノ酸はフェニルアラニン（Ｆ）ではなく、任意により、位置８７７のアミノ酸はトレオニン（Ｔ）ではなく、８７４のアミノ酸はヒスチジン（Ｈ）ではなく、位置７１５のアミノ酸はバリン（Ｖ）ではなく、かつ／または位置７４１のアミノ酸はトリプトファン（Ｗ）ではない。
【００５５】
本開示の別の実施形態は、上記において説明したような単離アンドロゲンレセプターポリヌクレオチドを含む発現構築物（または発現ベクター）を提供する。
【００５６】
本開示の別の実施形態は、上記において説明したような単離アンドロゲンレセプターポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。
【００５７】
本開示の別の実施形態は、コードされた変異体アンドロゲンレセプタータンパク質が配列番号２の位置８７６にロイシン（Ｌ）を含有することを除いて配列番号２のアミノ酸配列を含む変異体アンドロゲンレセプターをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００５８】
本開示の別の実施形態は、プロモーター；および変異体アンドロゲンレセプターもしくはその断片をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む構築物であって、アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列が配列番号２に示され、当該配列が、位置８７６のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｆ）ではなく、任意により、位置８７７のアミノ酸がトレオニン（Ｔ）ではなく、８７４のアミノ酸がヒスチジン（Ｈ）ではなく、位置７１５のアミノ酸がバリン（Ｖ）ではなく、かつ／または位置７４１のアミノ酸がトリプトファン（Ｗ）ではないような、配列番号２のアミノ酸位置８７６における変異を含有し、当該断片の配列が、配列番号２の少なくとも５個の連続するアミノ酸を含み、ならびに位置８７６を含み、当該ポリヌクレオチドセグメントが、プロモーターの下流に位置し、ポリヌクレオチドセグメントの転写がプロモーターにおいて開始される、構築物を提供する。
【００５９】
本開示の別の実施形態は、単離ポリヌクレオチドを提供し、この場合、当該単離ポリヌクレオチドもしくはその相補体は、配列番号５４の少なくとも１０個、１５個、または２０個の連続するアミノ酸をコードし、当該少なくとも１０個の連続するアミノ酸が配列番号５４の位置８７６を含み、位置８７６のアミノ酸は、置換されているかまたは欠失しているかまたはフェニルアラニン（Ｆ）ではない。
【００６０】
本開示の別の実施形態は、プロモーター、および上記において説明されるような任意のポリヌクレオチドを含む構築物を含む宿主細胞を提供する。
【００６１】
したがって、様々な態様において、本開示は、ＡＲ（Ｆ８７６）またはその断片もしくはバリアントをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００６２】
本開示のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明および添付の図面の参照により、明らかとなるであろう。本明細書において開示される全ての参考文献は、あたかも各々が個々に組み入れられているかのように、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】ＬＮＣａＰ細胞に由来するＭＤＶ３１００耐性クローンの特徴付け。Ａ、１０％のＦＣＳ（左上）、１０％のＣＳＳ（右上）、１０％のＦＣＳ＋１μＭのＭＤＶ３１００（左下）、および１０％のＦＣＳ＋１μＭのＭＤＶ３１００＋１ｎＭのＲ１８８１（右下）を補ったＲＰＭＩ培地において培養したＬＮＣａＰ細胞のフェーズ対比画像。目盛り線は５０μＭである。Ｂ、適用される実験的パラダイムの概略図（詳細は本文を参照のこと）。Ｃ、ＭＤＶ３１００（上側）およびビカルタミド（下側）で処理した、３つの対照（茶線）および７つの耐性クローン（緑および赤）の個別（左）および平均（右）の成長抑制曲線。データは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイによって測定した場合の、ＤＭＳＯ処理条件に対するパーセント成長として提示したデータ。Ｄ、対照株および耐性株におけるＡＲ発現のウェスタンブロット分析。β−アクチンを負荷対照として使用した。Ｅ、ベースラインにおいて１０％のＦＣＳにおいて成長させた（続いて２週間の退薬）Ｃ１〜Ｃ３および７つの耐性クローンのＡＲ経路活性スコア（ベージュ線）。さらに、参照として１０μＭのＭＤＶ３１００で２４時間処理したＣ１〜Ｃ３について計算したスコア（緑色のバー）。分析のために、アンドロゲンによって上方制御された遺伝子を使用した。
【図２】耐性クローンは、ＭＤＶ３１００に対するＡＲ経路感受性に基づいて分離する。Ａ、左、１０μＭのＭＤＶ３１００で２４時間の処理における、対照（茶色のフォント）、弱耐性株（赤）、および強耐性株（緑）での遺伝子の発現の差を示すヒートマップ。少なくとも１つの試料セット（対照、弱耐性試料、および強耐性試料）に対する少なくとも２の平均倍率変化（ＭＤＶ対ＤＭＳＯ）のプローブセットが示されている。右に記載されたローマ数字は、示差的に発現した遺伝子の広いクラスを表している。中央、クラスＩＩＩの遺伝子のＧＯパスウェイ強化分析の結果を示す表。青い網掛けは、「ＡＲ活性化」遺伝子セットからの遺伝子の著しい強化を強調している。右、経路分析から有意スコアに加えられたＡＲ制御遺伝子（青い矢印）の相対位置を示すクラスＩＩＩの拡大図。全てのデータは、ＭＤＶ対ＤＭＳＯ処理のｌｏｇ２比として表されている。Ｂ、対照（左）、弱耐性株（中央）、および強耐性株（右）における１０μＭのＭＤＶ３１００で２４時間の処理についての上位の遺伝子との比較におけるＡＲ遺伝子シグネチャーの間の相関。緑線は、経路活性のレベルを表しており、黒い対角線からの偏位が大きい程、ＭＤＶ３１００処理による経路活性の抑制が大きいことを表している。Ｃ、ＤＭＳＯまたはＭＤＶ３１００で２４時間処理した１０種の株のカノニカルＡＲ標的遺伝子の発現のｑＰＣＲ分析。データは、ＤＭＳＯ（１００％での無作為に設定）に対するＭＤＶ３１００処理試料での発現のパーセンテージとして表されている。ＤはＤＭＳＯを表し；Ｍは１０μＭのＭＤＶ３１００を表す。発現を正規化するためにＴＢＰを使用した。データは平均±ＳＥＭ；ｎ＝３を表す。＊Ｐ＜０．０５（スチューデントｔ検定）。Ｄ、ＤＭＳＯ、１０μＭのＭＤＶ３１００（ＭＤＶ）、または０．１ｎＭのＲ１８８１（Ｒ１８８１）で２４時間処理した、対照（Ｃ１、茶色）および耐性クローン（＃１、緑色）における内因性ＡＲ発現の核−細胞質比の定量化。比率を決定するために、補足の図Ｓ３に提示されたウェスタンブロットデータをＩｍａｇｅＪによって分析した。
【図３】全トランスクリプトーム配列分析により、強い耐性株および異種移植腫瘍におけるＡＲの新規のＦ８７６Ｌ変異が同定される。Ａ、上側、対照（茶色のフォント）、弱耐性クローン（赤色のフォント）、および強耐性クローン（緑色のフォント）において検出された体細胞変異の無作為の階層クラスタリング。灰色の線は、変異の欠如を表しており；オレンジ色の線は単一の再発性異型接合変異を表しており；赤色の線は、再発性同型接合変異を表しており；緑色の線は、緑色の矢印によって示されるように、ＡＲにおける再発性変異を表している。下側、ヒトアンドロゲンレセプターの概略図。ＮＴＤはＮ末端ドメインを表し；ＤＢＤはＤＮＡ結合ドメインを表し；ＬＢＤはリガンド結合ドメインを表す。Ｆ８７６Ｌ変異の部位は、緑色の線と緑色のフォントで示されている。Ｂ、左側、強耐性クローンにおけるＡＲのエキソン８におけるＦ８７６Ｌ変異の異型接合特性を示すＩＧＶプロット（緑色の矢印）。Ｆ８７６Ｌ変異は、ＬＮＣａＰにおける既存の同型接合Ｔ８７７Ａ変異（オレンジ色の網掛け）に隣接している。右側、強耐性クローンにおける野生型（ＷＴ、赤色の網掛け）および変異体（Ｍｕｔ、緑色の網掛け）ＡＲ対立遺伝子の生のカウント。Ｃ、２つのビヒクル処理されたＬＮＣａＰ腫瘍（赤色の曲線）および４つのＭＤＶ３１００処理されたＬＮＣａＰ腫瘍（緑色の曲線）の腫瘍成長動態。Ｄ、ＭＤＶ３１００耐性腫瘍におけるＦ８７６Ｌを促進するヌクレオチド置換の相対位置および頻度を示すＩＧＶプロット。Ｃ１〜Ｃ２はビヒクル処理された腫瘍を表し；Ｒ１〜Ｒ４はＭＤＶ３１００耐性腫瘍を表す。Ｅ、ＩＧＶプロットからのデータを列挙する表。赤色の網掛けは、腫瘍を有するＷＴ  ＡＲであり、その一方で、緑色の網掛けは、腫瘍を有するＦ８７６Ｌ変異体ＡＲを強調する。Ｆ、ＬＮＣａＰ腫瘍におけるＡＲ標的遺伝子ＫＬＫ３およびＮＫＸ３−１の相対的発現を示す棒グラフ。赤色のバーはＡＲ−ＷＴを発現する腫瘍からの発現データを表し；緑色のバーはＡＲ−Ｆ８７６Ｌを含む腫瘍からの発現データを表す。
【図４】Ｆ８７６Ｌ変異は、機能上、アンタゴニストからアゴニストへの切り替えを付与する。Ａ、野生型（ＷＴ）ＡＲの不活性状態でのＭＤＶ３１００のドッキングモード（左側）と、変異体ＡＲの活性状態に結合したＭＤＶ３１００の推測モデル（右側）との比較。Ｂ、様々なＡＲ発現構築物（ＡＲＷＴ、ＡＲＴ８７７Ａ、ＡＲＦ８７６Ｌ、ＡＲＦ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ）による２９３Ｔ細胞（上）およびＶＣａＰ細胞（下）のトランスフェクションおよびその後のビヒクル（Ｖｅｈ）、０．１ｎＭのＲ１８８１（Ｒ）、１０μＭのＭＤＶ３１００（ＭＤＶ）、１０μＭビカルタミド（Ｂｉｃ）、１０μＭのＭＤＶ３１００＋０．１ｎＭのＲ１８８１（Ｍ／Ｒ）、または１０μＭビカルタミド＋０．１ｎＭのＲ１８８１（Ｂ／Ｒ）による２４時間の処理の後の正規化されたＡＲレポーター活性を示す棒グラフ。全てのデータは、ウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬＵＣ）発現に対して正規化されている。データは、平均±ＳＥＭ；ｎ＝３を表している。＊Ｐ＜０．００１（スチューデントｔ検定）。Ｃ、１０％のＣＳＳ中において、ビヒクル（Ｖ）、０．１ｎＭのＲ１８８１、０．１ｎＭのＲ１８８１＋１０μＭのＭＤＶ３１００（ＭＤＶ）、および０．１ｎＭのＲ１８８１＋１０μＭのビカルタミド（Ｂｉｃ）で２４時間処理した後の、対照株（Ｃ１）、弱耐性クローン（赤色のフォント）、および強耐性クローン（緑色のフォント）におけるＫＬＫ３発現のｑＰＣＲ分析。発現を正規化するためにＴＢＰを使用した。データは平均±ＳＥＭ；ｎ＝３を表している。＊Ｐ＜０．０５であり、＊＊Ｐ＜０．０１である（スチューデントｔ検定）。
【図５】ＡＲ−Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａを過剰発現するように遺伝子操作されたＰＣａ細胞は、遺伝的および表現型的にＭＤＶ３１００に対して耐性を有する。Ａ、遺伝子操作された様々な株（ベクター対照（Ｖｅｃ）；Ｔ８７７Ａ；Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ、Ｆ８７６Ｌ；Ｗ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａ、Ｗ７４１Ｃ）におけるＫＬＫ３（上）およびＮＫＸ３−１（下）発現のｑＰＣＲ分析。全ての株を、ビヒクル（−）またはドキシサイクリン（＋）で３日間前処理した後に、１０％のＦＣＳ中においてＤＭＳＯ（左）または１０μＭのＭＤＶ３１００（右）で２４時間処理した。発現を正規化するためにＴＢＰを使用した。データは平均±ＳＥＭ；ｎ＝３を表している。＊Ｐ＜０．０５であり、＊＊Ｐ＜０．０１である（スチューデントｔ検定）。Ｂ、１０％のＣＳＳを補った培地においてＤＭＳＯ（Ｄ）または１０μＭのＭＤＶ３１００（Ｍ）で処理した様々な遺伝子操作された株から単離した細胞質分画および細胞核分画における外因性ＡＲ（ＨＡ）発現のウェスタン分析。全ての株は、Ｄｏｘで３日間前処理した後に、ＤＭＳＯまたはＭＤＶ３１００で２４時間処理した。Ｆ８７６ＬはＦ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａを表し；Ｗ７４１ＣはＷ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａを表す。細胞質分画および細胞核分画の純度を確認するために、それぞれ、β−チューブリン（β−ｔｕｂ）およびヒストンＨ３（Ｈ３）を調べた。Ｃ、ＤＭＳＯ、１μＭのＭＤＶ３１００（ＭＤＶ）、または１μＭのビカルタミド（ＢＩＣ）で３〜４週間処理した、様々な遺伝子操作された株（Ｄｏｘ−／＋）のコロニー形成アッセイ。３つの非依存性実験からの代表的な実験が示されている。Ｄ、上、ＤＭＳＯ（左側のウェル）または１０μＭのＭＤＶ３１００（右側のウェル、ＭＤＶ）で約１４日間処理したＡＲ−Ｔ８７７Ａ（左）またはＡＲ−Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ（右）（Ｄｏｘ−／＋）を発現するように遺伝子操作されたＭｙｃ−ＣａＰ細胞のコロニー形成アッセイ。下側、ＩｍａｇｅＪによるコロニー形成データの定量化。Ｅ、ビヒクル（Ｖｅｈ）または３０ｍｇ／ｋｇのＭＤＶ３１００（ＭＤＶ）で処理した対照（Ｃ１、赤色）および耐性クローン＃１（＃１、緑色）腫瘍の腫瘍体積測定。実線の赤色および緑色の矢印は、それぞれ、対照（Ｃ１）マウスおよびクローン＃１（＃１）マウスにおいてＭＤＶ３１００の連日投与を開始した日を示している。点線の緑色の矢印は、クローン＃１（＃１、暗緑色）を注入した３０匹のうちの１５匹のマウスにおいての休薬日の前の、ＭＤＶ３１００による処理の連続する２日を強調している。＃１ｖｅｈ（ｎ＝２）を除いて、全ての群に対してｎ＝７〜８の腫瘍である。データは平均±ＳＥＭを表す。Ｆ、触知可能な腫瘍が成長するマウスのパーセンテージを示す棒グラフ（棒の上の数値は、腫瘍を示すマウスの数を表している）。Ｇ、ビヒクル（Ｖｅｈ）またはＭＤＶ３１００（ＭＤＶ）で処理した対照（Ｃ１）および耐性（＃１）腫瘍におけるＴＭＰＲＳＳ２およびＳＬＣ４５Ａ３発現のｑＰＣＲ分析。発現を正規化するためにＴＢＰを使用した。データは平均±ＳＥＭ；（ビヒクルで処理したＣ１がｎ＝２であることを除いて、全ての群において）ｎ＝３、を表す。＊Ｐ＜０．０５であり、＊＊Ｐ＜０．０１���ある（スチューデントｔ検定）。
【図６】ＣＤＫ４／６の標的化は、ＭＤＶ３１００耐性前立腺がん細胞株の増殖を減少させる。Ａ、ＤＭＳＯ（Ｄ）、１０μＭのＭＤＶ３１００（Ｍ）、１０μＭのＬＥＥ０１１（Ｌ）、または１０μＭのＭＤＶ３１００および１０μＭのＬＥＥ０１１（Ｍ＋Ｌ）による２４時間の処理における、Ｃ１およびクローン＃１株におけるＤＨＦＲおよびＴＫ１を標的とするＥ２Ｆ１のｑＰＣＲ分析。Ｂ、ＰＤ０３３２９９（上側）およびＬＥＥ０１１（下側）で処理した、３つの対照（茶線）および７つの耐性クローン（緑および赤）に対する平均成長阻害曲線。データは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイによって測定した場合の、ＤＭＳＯ処理条件に対する成長パーセントとして提示された。Ｃ、ＤＭＳＯ、１０μＭのＤＶ３１００（ＭＤＶ）、１０μＭのビカルタミド（Ｂｉｃ）、または１０μＭのＬＥＥ０１１（ＬＥＥ）で２８日間処理したＡＲ−Ｔ８７７ＡおよびＡＲ−Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ株のコロニー形成アッセイからのデータの相対定量化（Ｉｍａｇｅ  Ｊで定量化した）。Ｄ、ＤＭＳＯ、１０μＭのＭＤＶ３１００（ＭＤＶ）、１０μＭのＬＥＥ０１１（ＬＥＥ）、または１０μＭのＭＤＶ３１００および１０μＭのＬＥＥ０１１（ＭＤＶ＋ＬＥＥ）で４８時間処理したアンドロゲン非依存性２２Ｒｖ１株におけるＤＨＦＲおよびＴＫ１を標的とするＥ２Ｆ１のｑＰＣＲ分析。Ｅ、示された様々な化合物（ＤＭＳＯ、ビカルタミド（Ｂｉｃ）、ＭＤＶ３１００（ＭＤＶ）、またはＬＥＥ０１１（ＬＥＥ））で１４日間処理した２２Ｒｖ１細胞のコロニー形成アッセイ。
【図７】ＡＲ−Ｆ８７６Ｌを標的化するために適用することができる治療戦略の概略図。左、ＭＤＶ３１００（茶色の円）は、ＡＲ−ＷＴ（赤色の楕円）への結合の際のＥ２Ｆ１およびカノニカルＡＲ標的遺伝子の発現を抑制する。中央、ＡＲ−Ｆ８７６Ｌ（緑色の楕円）は、アゴニストとしてＭＤＶ３１００を用いることにより、Ｅ２Ｆ１およびカノニカルＡＲ標的遺伝子の発現を維持する。右、構造的に異なる抗アンドロゲンでのＣＤＫ４／６またはＡＲの標的化は、それぞれ、Ｅ２Ｆ１およびカノニカルＡＲ標的遺伝子を抑制することよって増殖を妨げる。灰色の矢印の長さは、経路活性の相対的レベルを表している。赤色および青色の円は、それぞれ、ＣＤＫ４／６阻害剤およびビカルタミドを表している。ＥＢＳはＥ２Ｆ１結合部位を表し；ＡＲＥはアンドロゲン反応エレメントを表す。
【図８】弱耐性クローンおよび強耐性クローンは、ＭＤＶ３１００に対する部分的耐性を示す。様々な濃度のＭＤＶ３１００（黄色のフォントで示される、μＭ）で処理した対照１（Ｃ１、左）、強耐性クローン＃１（中央）、および弱耐性クローン＃１４（右）の長期間コロニー形成アッセイ。
【図９】強耐性クローンは、ＭＤＶ３１００で処理された場合にＡＲ経路活性の調整を示さない。Ａ、アンドロゲン誘導遺伝子シグネチャーを使用して、対照（凝集塊）および耐性株に対してクラスタリング分析を実施した。アンドロゲン誘導遺伝子シグネチャーから遺伝子をマッチングする全てのプローブセットを使用した。全ての発現データは、ＭＤＶ３１００処理試料対ＤＭＳＯ処理試料での平均倍率変化として示される。Ｂ、１０μＭのＭＤＶ３１００で２４時間処理した場合の、対照（左）、弱い耐性株（中央）、および強い耐性株（右）でのＡＲ経路活性における変更を示すパスウェイ強化分析。対照（左）、弱い耐性株（中央）、および強い耐性株（右）における、１０μＭのＭＤＶ３１００による２４時間の処理についての上位遺伝子との比較におけるＡＲ遺伝子シグネチャーの間の相関。緑線は、経路活性のレベルを表しており、黒い対角線からの偏位が大きい程、ＭＤＶ３１００処理による経路活性の抑制が大きいことを表している。
【図１０】ＤＭＳＯ、０．１ｎＭのＲ１８８１、または１０μＭのＭＤＶ３１００（ＭＤＶ）で２４時間処理された対照（Ｃ１）および強耐性クローン（＃１）から単離された細胞質分画および細胞核分画におけるＡＲ発現のウェスタン分析。細胞質分画および細胞核分画の純度を確認するために、それぞれ、β−チューブリンおよびヒストンＨ３を調べた。両方とも、負荷対照としての役割も果たした。
【図１１】強耐性クローン（クローン＃１）および弱耐性クローン（クローン＃１０）から単離された遺伝子ＤＮＡのサンガー配列決定トレースプロット。矢印は、クローン＃１における２つのヌクレオチドの存在を示している。
【図１２】ＡＲにおけるＷ７４１ＣおよびＷ７４１Ｌ変異は、ビカルタミドに対して特異的な、アンタゴニストからアゴニストへの切り替えを付与する。Ａ、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における様々なＡＲ構築物の一過性トランスフェクションの後のＡＲの発現レベルを示すウェスタン分析。Ｂ、ＡＲなし（左）での、またはＷ７４１Ｌ（中央）もしくはＷ７４１Ｃ（右）変異体ＡＲによる、同時トランスフェクションの後のＡＲレポーター活性を示す棒グラフ。細胞を、ビヒクル（Ｖｅｈ）、０．１ｎＭのＲ１８８１、１０μＭのＭＤＶ３１００（ＭＤＶ）、１０μＭのビカルタミド（Ｂｉｃ）、１０μＭのＭＤＶ３１００＋０．１ｎＭのＲ１８８１（Ｍ／Ｒ）または１０μＭのＢｉｃ＋０．１ｎＭのＲ１８８１（Ｂ／Ｒ）で処理した。全てのデータは、ウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬＵＣ）発現に対して正規化されている。データは平均±ＳＥＭ；ｎ＝３を表している。＊＊Ｐ＜０．０１（スチューデントｔ検定）。
【図１３】Ｆ８７６Ｌ変異は、単独でもしくはＴ８７７Ａとの組み合わせにおいて、ＰＣ３細胞においてＭＤＶ３１００に特異的なアンタゴニストからアゴニストへの切り替えを付与する。ＰＣ３におけるＷＴ  ＡＲ（左）、Ｔ８７７Ａ（２番目）、Ｆ８７６Ｌ（３番目）、またはＦ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ（右）変異体ＡＲによる同時トランスフェクションの後のＡＲレポーター活性を示す棒グラフ。細胞を、ビヒクル（Ｖｅｈ）、０．１ｎＭのＲ１８８１、１０μＭのＭＤＶ３１００（ＭＤＶ）、１０μＭのビカルタミド（Ｂｉｃ）、１０μＭのＭＤＶ３１００＋０．１ｎＭのＲ１８８１（Ｍ／Ｒ）、または１０μＭのＢｉｃ＋０．１ｎＭのＲ１８８１（Ｂ／Ｒ）で処理した。全てのデータは、ウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬＵＣ）発現に対して正規化されている。データは平均±ＳＥＭ；ｎ＝３を表している。＊Ｐ＜０．０５（スチューデントｔ検定）。
【図１４】Ｔ８７７Ａ（赤色のバー）、Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ（緑色のバー）、またはＷ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａ（青色のバー）ＡＲを誘導的に発現するように遺伝子操作されたＬＮＣａＰは、ｑＰＣＲ（上側）分析およびウェスタン分析（下側）の両方によって評価した場合にわずかな過剰発現を示す。−／＋は、それぞれ、Ｄｏｘによる処理の有り無しを表す。ＴＢＰおよびβ−アクチンを、それぞれ、ｑＰＣＲ分析およびウェスタン分析のための負荷対照として使用した。データは平均±ＳＥＭを表す。
【図１５】Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ変異体ＡＲは、ＭＤＶ３１００の存在下においてＡＲシグナリングを効率的にレスキューすることができる。１０％のＦＣＳを補ったＲＰＭＩ１６４０中での、ＤＭＳＯ（Ｖｅｈ）、１０μＭのＭＤＶ３１００（ＭＤＶ）、１０μＭのビカルタミド（Ｂｉｃ）、または１０μＭのヒドロキシフルタミド（ＯＨ−Ｆ）による処理の後での、遺伝子操作された様々な株でのＫＬＫ３発現のｑＰＣＲ分析（ベクター：ベージュ色のバー；Ｔ８７７Ａ：赤色のバー；Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ：緑色のバー；Ｗ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａ：青色のバー）。−／＋は、それぞれ、Ｄｏｘによる処理の有り無しを表す。発現を正規化するためにＴＢＰを使用した。データは、平均±ＳＥＭ；ｎ＝３を表している。＊Ｐ＜０．０５であり、＊＊Ｐ＜０．０１である（スチューデントｔ検定）。
【図１６】Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ変異体ＡＲは、アンドロゲン枯渇培地においてアゴニストとしてＭＤＶ３１００を利用する。Ａ、１０％のＣＳＳ中での、ＤＭＳＯ（Ｖｅｈ）、０．１ｎＭのＲ１８８１（Ｒ１８８１）、または１０μＭのＭＤＶ３１００（ＭＤＶ）で処理した、遺伝子操作された様々な株でのＫＬＫ３およびＮＫＸ３−１発現のｑＰＣＲ分析（ベクター：ベージュ色のバー；Ｔ８７７Ａ：赤色のバー；Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ：緑色のバー；Ｗ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａ：青色のバー）。−／＋は、それぞれ、Ｄｏｘによる処理の有り無しを表す。発現を正規化するためにＴＢＰを使用した。データは平均±ＳＥＭ；ｎ＝３を表す。＊Ｐ＜０．０５であり、＊＊Ｐ＜０．０１である（スチューデントｔ検定）。Ｂ、ＤＭＳＯ（Ｖｅｈ）、０．１ｎＭのＲ１８８１（Ｒ１８８１）、または１０μＭのＭＤＶ３１００（ＭＤＶ）で２４時間処理した、遺伝子操作されたＴ８７７ＡおよびＦ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ株の細胞質分画および細胞核分画における外因性ＡＲ発現レベルのウェスタン分析（ＨＡで調べた）。分画の純度を検証するために、β−チューブリン（細胞質タンパク質）およびヒストンＨ３（細胞核タンパク質）を調べた。遺伝子操作された株を、処理前に、Ｄｏｘの存在下で３〜４日間、１０％のＣＳＳ中において培養した。
【図１７】ＡＲにおけるＦ８７６Ｌ変異は、ＭＤＶ３１００の存在下において核移行を促進する。Ａ、１０％のＦＣＳを補った培地においてＤＭＳＯ（Ｄ）または１０μＭのＭＤＶ３１００（Ｍ）で処理した様々な遺伝子操作された株から単離した細胞質分画および細胞核分画における外因性ＡＲ（ＨＡ）発現のウェスタン分析。全ての株は、Ｄｏｘで３日間前処理した後に、ＤＭＳＯまたはＭＤＶ３１００で２４時間処理した。Ｆ８７６ＬはＦ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａを表し；Ｗ７４１ＣはＷ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａを表す。細胞質分画の純度を確認するために、β−チューブリン（β−ｔｕｂ）を調べ、細胞核分画の純度を確認するために、ヒストンＨ３（Ｈ３）を調べた。Ｂ、ＤＭＳＯまたは１０μＭのＭＤＶ３１００（ＭＤＶ）で２４時間処理した、Ｔ８７７Ａ（赤色のバー）、Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ（緑色のバー）、およびＷ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａ（青色のバー）過剰発現株における外因性ＡＲ発現（ＨＡタグ付けＡＲ）の細胞核：細胞質比。細胞核：細胞質比を決定するために、図５ＢおよびパネルＡに提示されたウェスタンブロットデータを、ＩｍａｇｅＪによって分析した。示された培養条件（１０％のＦＣＳまたは１０％のＣＳＳ）でのＤＭＳＯまたはＭＤＶ３１００による処理の前に、細胞をドキシサイクリンで３日間処理した。
【図１８】Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７ＡおよびＷ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａ変異体ＡＲは、ＭＤＶ３１００に対する表現型耐性を付与する。Ａ、ＭＤＶ３１００の濃度を１０μＭまで増加させて処理した遺伝子操作された株に対して得られる成長阻害曲線。Ｄｏｘ−は赤色で表され；Ｄｏｘ＋は緑色で表される。データは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイによって測定した場合の、ＤＭＳＯ処理条件に対する成長パーセントとして提示した。Ｂ、１０日間の処理後のＡからの、ＭＤＶ３１００処理細胞のフェーズ対比画像。目盛り線は５０μｍである。
【図１９】ＬＮＣａＰ細胞におけるＡＲ−Ｆ８７６Ｌ過剰発現は、ＭＤＶ３１００に対する遺伝的および表現型的耐性を駆動するのに十分である。Ａ、ＤＭＳＯおよびＭＤＶ３１００処理条件下においてＬＮＣａＰ細胞を発現するＡＲ−ＷＴ（赤色のバー）およびＡＲ−Ｆ８７６Ｌ（緑色のバー）におけるＡＲ（ＫＬＫ３、ＮＫＸ３−１、ＳＬＣ４５Ａ３、ＴＭＰＲＳＳ２）の下流標的遺伝子の相対的発現を示すｑＰＣＲ分析。ＤＭＳＯまたはＭＤＶ３１００で２４時間処理する前に、細胞をＤｏｘ（＋）で２日間処理した。データは平均±ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５（スチューデントｔ検定）。Ｂ、様々なＭＤＶ３１００濃度（黒色のフォントで記述、μＭ）においてＡＲ−Ｆ８７６Ｌ（Ｄｏｘ＋）を発現するＬＮＣａＰ細胞の持続的成長を示すコロニー形成アッセイ。
【図２０】ＡＲでのＦ８７６Ｌ変異を安定して発現するＶＣａＰ細胞は、ＭＤＶ３１００に対して部分的耐性である。ＡＲ−Ｔ８７７Ａ発現性ＶＣａＰ細胞は、ＭＤＶ３１００（左）に対して感受性のままであるが、その一方で、ＡＲ−Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａの発現は、結果として、ＭＤＶ３１００処理条件下での部分的成長を生じる（右）。データは平均±ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５（スチューデントｔ検定）。
【図２１】ＡＲ−Ｆ８７６Ｌ変異体を含むクローンのＭＤＶ３１００処理は、インビトロにおいてアンドロゲン枯渇培地における細胞成長を促進することができない。１０％のＣＳＳを補ったＲＰＭＩ  １６４０において培養した細胞の細胞成長に対するＲ１８８１（赤）、ＭＤＶ３１００（緑）、およびビカルタミド（青）処理の濃度増加の影響を表している折れ線グラフ。適用した最大用量は、１０ｎＭのＲ１８８１ならびにＭＤＶ３１００およびビカルタミドについて１０μＭであった。データは、ＤＭＳＯ処理条件に対する細胞数の倍率変化として表した（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイによって測定）。分析前に細胞を１３日間処理した。
【図２２】対照１およびクローン＃１異種移植片の重量測定。Ａ：対照１およびＢ：クローン＃１異種移植片の重量を１週間に１度測定した。データは、平均±ＳＤとして表した。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
発明の詳細な説明
本開示は、アンドロゲンレセプター（ＡＲ）関連疾患に関する。本開示は、アンドロゲンレセプターの位置Ｆ８７６における新規の臨床的に関連する変異であって、薬物ＭＤＶ３１００に対する耐性を付与し、患者の層別化にとって有用な、変異に関する。この変異［ＡＲ（Ｆ８７６）］を含むアンドロゲンレセプターならびにその断片およびバリアントも、この変異体レセプターを標的とする新規の処置の考案にとって有用である。さらに、位置Ｗ７４１およびＴ８７７での二重変異体ＡＲならびにこの二重変異［ＡＲ（Ｗ７４１／Ｔ８７７）］を含むその断片およびバリアントも、ＭＤＶ３１００に対して耐性であり、ならびに患者の層別化にとって有用である。したがって、本開示は、ＡＲ関連疾患、例えば、去勢抵抗性Ｐｃａ（ＣＲＰＣ）を含む前立腺がん（ＰＣ）などの前立腺疾患、および乳がんなど、ならびに他のＡＲ関連障害、例えば、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、ならびにケネディ病などの予後診断、診断、および処置において有用性を有する。
【００６５】
前立腺がんは、世界で最も一般的に診断されるがんのうちの１つであるにもかかわらず、知識、リソース、および分析方法が不十分であることから、１）前立腺がんの信頼性高い診断、２）生死に関わる疾患と良性とを区別する能力、ならびに３）アンドロゲン枯渇療法で再発した患者を効率的に処理する能力、が妨げられることに科学者たちは悩まされている。化学的および外科的性腺摘除を含むアンドロゲン枯渇療法は、アンドロゲン依存ＰＣａの処置において、初期には有効である。しかしながら、ほとんどの腫瘍が、去勢抵抗性ＰＣａ（ＣＲＰＣ）とも呼ばれる、はるかに攻撃的で不治の形態のＰＣａとして再発する。ＣＲＰＣの極めて有害な性質から、ＣＲＰＣ患者の生存率を改善するための二次選択治療法として使用することができる、効果的な治療法の開発を促進させる積極的なキャンペーンが展開された。このために、ＣＲＰＣが生き残るためにＡＲシグナリングに頼り続けるという知識に基づいて、ＡＲへの結合に対してアンドロゲンと競合するアンタゴニストが開発された。ここでの成功は、１）化合物の力価の不足、および２）ＣＲＰＣが、当該化合物が、逆にＡＲシグナリングを強めるような、アンタゴニストからアゴニストへの切り替えを促進することによって適合してしまうことから、あまり芳しいものではなかった。これらの限界を回避するために、近年、以前にドセタキセルで処置されている転移性ＣＲＰＣを有する男性の処置のために、より強力なアンタゴニストであるＭＤＶ３１００（エンザルタミド）がＦＤＡによって承認された。場合によって、ＭＤＶ３１００は、去勢抵抗性前立腺がんに対しても、単独療法として使用することができる。当該化合物は、臨床試験において素晴らしい効力を示したが、初期に反応した患者の多くが、後に耐性を発症した。耐性の機構的理解が不足しているため、この演繹的知識は、代替の処置戦略の設計に対して批判的である。このために、本開示は、ＭＤＶ３１００に対する耐性を遺伝的および表現型的に付与する、ＡＲにおける新規の変異（ＭＤＶ３１００の直接標的）の同定および特徴付けを提示する。
【００６６】
耐性の機構を解明するために、本開示は、ＭＤＶ３１００に対して特異的な自然耐性モデルを確立するために、ＬＮＣａＰ（ビカルタミドに対する耐性を付与する臨床的に関連するＷ７４１Ｃ変異を同定するために以前に使用したモデル）を使用する。耐性クローンの２つの広いクラスが同定され、これらは、ＭＤＶ３１００処置に対してＡＲ経路調節に対して感受性または耐性のいずれかを示す。心躍ることに、ＲＮＡ−ｓｅｑ分析は、ＭＤＶ３１００による経路調節に対する耐性と関係のある、ＡＲにおける新規のＦ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ変異を同定した。遺伝子操作された株の分析と組み合わせたトランス活性化アッセイにより、変異がＭＤＶ３１００に対してアンタゴニストからアゴニストへの切り替えを促進する（最終的に表現型耐性へと翻訳される）ことが確認された。興味深いことに、本開示は、古い抗アンドロゲン剤であるビカルタミドによる処置がもう一度細胞を感応化するため、この変異が、ＭＤＶ３１００に対して非常に選択的であることを見出している。これらの研究結果は、１）薬物反応を予測するためのバイオマーカーとして変異を使用することができ、ならびに２）Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ変異を示す患者を、臨床的有益性を達成するために、ビカルタミドによって容易に処置することができることから著しい臨床的影響を有すると思われる。
【００６７】
予想外なことに、本開示によってさらに、以前に同定したＷ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａ変異（ビカルタミドに対する耐性を付与することが以前に示された）も、ＭＤＶ３１００に対する表現型耐性を部分的に付与することが見出された。いかなる特定の理論にも束縛されることを望まないが、本開示は、このことはおそらく二重変異体ＡＲが構成型活性機能を獲得する間接的影響であろうと推測する。いずれにせよ、この調査結果は、この変異を示す患者は、抗アンドロゲン療法から恩恵を受ける可能性が低いであろうという翻訳影響を有すると思われる。さらに、発明者らの研究は、ＭＤＶ３１００に対する耐性を付与する可能性を決定するために、前立腺がんにおいて他のよく特徴付けられた変異をスクリーニングすることの重要性を強調することであり、Ｈ８７４Ｙ、Ｖ７１５Ｍ、およびＬ７０１Ｈ／Ｔ８７７Ａなどの変異が、広範囲のリガンド応答性を有することが分かっており、ならびに以前から、ヒドロキシフルタミドがこれらの変異体に対するアゴニストとして機能することが分かっている。
【００６８】
本開示からの知見はおそらく、最終的に治療戦略の開発および実践に影響を及ぼすであろう様々な病理学的状態のためのドライバー変異の発見を速めるためのお膳立てをするであろう。本開示は、以下の貢献を為す：１）ハイスループットＲＮＡ−ｓｅｑ技術を自然耐性のモデルと組み合わせることによって、本開示は、ＭＤＶ３１００に対する耐性を遺伝的および表現型的に付与する（それにもかかわらず、ビカルタミドに対する感受性を維持する）、ＡＲにおける新規の変異を同定する。このことは、患者の層別化および代替の処置戦略の開発に役立つであろう。２）発明者らの自然細胞株は、少なくとも２つの耐性の非依存性モード（耐性メカニズムへのさらなる追求のためのＰＣａコミュニティにとって非常に有益であろうリソース）を表している。３）本開示は、ＡＲのリガンド結合ポケットにおける耐性変異の保存された特徴が、化合物の他のクラスとは異なって、アンタゴニストからアゴニストへの切り替えを付与することであるということを示す。ＡＲ（８７６）を含む組成物は、このポリペプチドに対する抗体を生じさせるためにも使用することができ、ならびに、このポリペプチドを標的とする新規の治療法を開発するためにも使用することができ、ならびに、アンドロゲンレセプター関連疾患、とりわけ前立腺がんおよび乳がんなどの処置において有用である。
【００６９】
ＭＤＶ３１００耐性を克服するための治療戦略としてのＣＤＫ４／６の標的化
次に、本発明者らは、インビトロおよびインビボにおいて様々な遺伝学的状況下でＡＲ−Ｆ８７６ＬがＭＤＶ３１００に対する耐性を促進することができることを確証することにより、変異体対立遺伝子と拮抗するための合理的な戦略を開発することを目的とした。ＡＲの高変異可能なリガンド結合ポケットを標的とし続ける新規の抗アンドロゲン剤の開発［Balbas et al. 2013 eLife 2:e00499］に対する代替策として、本発明者らは、診療所においてより持続可能であり得る治療戦略を同定することを目的とした。このために、本発明者らは、ＭＤＶ３１００で処理された強耐性クローンにおける「ＡＲ活性化」に加えて、「細胞周期」に属する遺伝子および「Ｅ２Ｆ１活性化」遺伝子セットに対するかなりの強化を観察し、これらのクローンが、Ｅ２Ｆ１標的遺伝子の継続的発現により、ＭＤＶ３１００処理条件下での増殖を潜在的に維持し得ることを提案した。アンドロゲンシグナリング（Ｇ１−Ｓ転移の重要なレギュレーター）が活性ＣＤＫ４／サイクリンＤ１アセンブリを、したがってＥ２Ｆ１機能の活性化を促進することが知られているため、上記は、魅力的な仮説である。Schiewer et al. 2012 End. Relat. Cancer 9: 1-12。この概念に一致して、本発明者らは、ＭＤＶ３１００処理が、対照株においてＥ２Ｆ１標的遺伝子ＤＨＦＲおよびＴＫ１の発現を抑制するのを観察し、Ｅ２Ｆ１機能のレギュレーターとしてのＡＲシグナリングを確認した。対照的に、Ｆ８７６Ｌを保有する細胞は、対照株と比べて、ＭＤＶ３１００処理条件下においてＤＨＦＲおよびＴＫ１のより高い発現を維持することが可能であった（図６Ａ）。これらのデータに基づいて、本発明者らは、Ｅ２Ｆ１活性は、ＡＲシグナリングの下流エフェクターとして機能し得、そのため、Ｅ２Ｆ１機能のレギュレーターは、ＡＲを対象とする療法が効果を失ったときに、重要な治療的ノードとして機能し得ると推論した。この仮説に従って、本発明者らは、強耐性クローン（図１４Ｂ）およびＡＲ−Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａを発現するように遺伝子操作されたＬＮＣａＰ株（図６Ｃ）の成長は、ビカルタミドと同程度に、ＣＤＫ４／６阻害剤ＬＥＥ０１１［Rader et al. 2013 CDK4/CDK6 inhibition is potently active in a definable subset of human neuroblastomas American Association for Cancer Research; Philadelphia, PA］およびＰＤ０３３２９９１に対して感受性であることを見出した。興味深いことに、アンドロゲン非依存性２２Ｒｖ１細胞（ＷＴ  ＡＲを発現し、ＭＤＶ３１００処理条件下においてＡＲシグナリングならびにＤＨＦＲおよびＴＫ１の発現を維持することができるＰＣａ株（図６Ｄ））も、ＣＤＫ４／６阻害に対して強い感受性を示した（図６Ｅ）ので、ＣＤＫ４／６阻害に対する反応は、Ｆ８７６Ｌを保有する細胞のみに限定されない。これらのデータは、ＣＤＫ４／６機能の標的化が、一般的におそらくアンドロゲン非依存性である、ＭＤＶ３１００に対する耐性の複数のメカニズムの処置に対して効果的な戦略として役に立ち得ることを繰り返し示唆している。
【００７０】
定義
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において使用されるある特定の用語および語句の意味を以下に提供する。本明細書の他の部分での用語の使用法と、このセクションにおいて提供されるその定義との間に明らかな相違が存在する場合、このセクションの定義が優先される。
【００７１】
アンドロゲンレセプター
「アンドロゲンレセプター」もしくは「ＡＲ」は、ＮＲ３Ｃ４（細胞核レセプターサブファミリー３、グループＣ、メンバー４）としても知られかつ符号ＡＲ；ＡＩＳ；ＤＨＴＲ；ＨＵＭＡＲＡ；ＨＹＳＰ１；ＫＤ；ＮＲ３Ｃ４；ＳＢＭＡ；ＳＭＡＸ１；およびＴＦＭならびに外部ＩＤ  ＯＭＩＭ：３１３７００  ＭＧＩ：８８０６４  ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：２８  ＩＵＰＨＡＲ：ＮＲ３Ｃ４  ＣｈＥＭＢＬ：１８７１によっても知られる、遺伝子もしくは遺伝子産生物（例えば、ポリペプチド）を意味する。例示的ＡＲのポリペプチドおよびヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号１および２に示されている。例示的ＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチド配列は、配列番号５４に示されている。
【００７２】
アンドロゲンレセプターは、細胞核レセプターの１種であり［Lu et al. 2006 Pharmacol. Rev. 58: 782-97］、細胞質中での男性ホルモンであるテストステロンまたはジヒドロテストステロンのいずれかとの結合およびその後の細胞核中への移行によって活性化される［Roy et al. Vitam. Horm. 55: 309-52］。当該アンドロゲンレセプターは、プロゲステロンレセプターに最も密接に関連しており、より多い用量でのプロゲスチンは、アンドロゲンレセプターを妨げ得る。Bardin et al. 1983 Pharm. Ther. 23: 443-59;および Raudrant et al. 2003 Drugs 63: 463-92。アンドロゲンレセプターの主な機能は、遺伝子発現を制御するＤＮＡ−結合転写因子としてであるが［Mooradian et al. 1987 Endocr. Rev. 8: 1-28］；ただし、アンドロゲンレセプターは、他の機能も有する［Heinlein et al. 2002. Mol. Endocrinol. 16: 2181-7］。アンドロゲン制御遺伝子は、雄の性表現型の発育および保守にとって重要である。
【００７３】
アンドロゲンレセプターへのアンドロゲンの結合は、当該レセプターに対して立体構造変化を誘発し、結果として、ヒートショックタンパク質の解離、二量化、およびサイトソルから細胞核への輸送を引き起こし、ここで、アンドロゲンレセプター二量体は、特定のＤＮＡ配列（ホルモン応答要素またはアンドロゲン応答要素（ＡＲＥ）とも呼ばれる）に結合する。他の細胞核タンパク質との相互作用に応じて、ＡＲは遺伝子発現を制御し、特定の遺伝子、例えば、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−１）などの転写を増加もしくは減少させる。
【００７４】
アンドロゲンレセプターはさらに、細胞質内のシグナル伝達タンパク質によって細胞質活性も有することができる。細胞質アンドロゲンレセプターへのアンドロゲンの結合は、遺伝子転写に関係のない細胞機能（例えば、イオン輸送など）ならびに、例えば他のシグナル伝達経路を媒介することによる、遺伝子転写の間接的影響において急速な変化を引き起こし得、結果として、他の転写因子の活性に影響を及ぼし得る。
【００７５】
アンドロゲンレセプター配列および変異
例示的ＡＲのアミノ酸配列を以下に示す。
【００７６】
【化１】
2016516005.tif 000002
【００７７】
注目すべきいくつかのアミノ酸には下線が引かれており：
Ｗ７４１：多くのビカルタミド耐性腫瘍においてＷ７４１Ｃ／Ｌへと変異する。
Ｈ８７４：多くの前立腺腫瘍においてＨ８７４Ｙへと変異する。
Ｆ８７６：本明細書において、例えばＦ８７６Ｌなどに変異することが示された。Ｆ８７６Ｌ単一変異体およびＦ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ二重変異体ＡＲは、ＭＤＶ３１００に対してかなりのトランス活性反応を有し、ＭＤＶ３１００に対して非常に特異的であるアンタゴニストからアゴニストへの切り替えを提示する。
Ｔ８７７：多くの後期およびフルタミド耐性腫瘍においてＴ８７７Ａに変異する。
【００７８】
ＡＲにおいて生じることが知られているさらなる変異は、Ｖ７１５および当技術分野における本明細書で説明された他のものを含む。
【００７９】
本研究は、Ｔ８７７Ａ変異に隣接するＦ８７６Ｌ変異を同定する。
本開示は、Ｗ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａ変異も試験し、このタンパク質の異所性発現が、ＭＤＶ３１００に対する非特異的耐性を付与することを見出した。
これらの変異は、本明細書において開示されるように、患者の層別化および新規の治療法の開発において有用である。
【００８０】
例示的ＡＲのヌクレオチド配列を以下に示す。
【００８１】
【化２】
2016516005.tif 000003
【００８２】
上記に列挙される注目すべきアミノ酸に対応するコドン（Ｗ７４１、Ｈ８７４、Ｆ８７６、およびＴ８７７）には下線が引かれている。
これらのうち、
ＴＴＣ：すべての本発明者らの耐性クローンにおいてＣＴＣに変異する。
ＡＣＴ：多くの後期およびフルタミド耐性腫瘍においてＧＣＴへと変異する。
【００８３】
ＡＲ変異
本開示は、Ｆ８７６における変異ならびに／あるいはＷ７４１およびＴ８７７における二重変異を含む全長アンドロゲンレセプターまたは断片もしくはバリアントであって、任意によりさらなる変異を含み得る、ＡＲまたは断片もしくはバリアントに関する。
【００８４】
本明細書において定義される場合、「変異」（例えば、ＡＲの）は、アミノ酸の欠失もしくは置換を含み得る。
【００８５】
本明細書において定義される場合、ＡＲの「断片」もしくは「バリアント」は、ＡＲまたはそれらの短縮形に由来するポリペプチドを包含する。「全長」ＡＲは、本明細書において定義される場合、ＡＲ配列全体、例えば、配列番号１または５４に示される配列全体、を含むポリペプチドを包含する。ＡＲ断片は、これらに限定されるわけではないが、全長未満の配列（例えば、配列番号１または５４に示されるものより短い）を含むがＡＲもしくはＡＲ変異体［例えばＡＲ（Ｆ８７６）など］によって媒介される少なくとも１つの活性を保持するＡＲが挙げられる。バリアントは、断片もしくは修飾されている全長ＡＲである。そのような修飾としては、これらに限定されるわけではないが、翻訳後修飾（ペグ化、グリコシル化、メチル化など）が挙げられる。ＡＲもしくは断片の修飾はさらに、共有結合性もしくは非共有結合性であり得る、ＡＲもしくは断片とさらなる成分との組み合わせも含む。そのような他の成分は、融合ポリペプチドまたは融合タンバク質を形成する融合パートナー（例えば、Ｆｃ、例えばＦｃＬＡＬＡなど）を含み得る。
【００８６】
ＡＲの断片およびバリアントは、ＡＲの様々なアイソフォームを含み得、および／またはＡＲのドメインのうちの１つまたは複数を含み得る。ＡＲは、２つのアイソフォーム：インビトロでのタンパク質分解の結果として、Ｎ末端が切断され、最初の１８７ａａ（アミノ酸）を欠くＡＲ−Ａ（８７ｋＤａ）、において存在することが知られている。アイソフォームＡＲ−Ｂは、１００ｋＤａおよび全長である。Wilson et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1234-8；およびGregory et al. 2001 2001. J. Mol. Endocrinol. 27: 309-19を参照されたい。
【００８７】
断片は、本明細書において説明されるように、Ｆ８７６位置に「またがる」ものも含み得る。
【００８８】
ＡＲの様々なドメインとしては、Ｎ末端調節ドメイン（活性化機能１：ＡＦ−１；活性化機能５：ＡＦ−５；および二量体表面を含む）、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、ヒンジ領域、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）、およびＣ末端ドメインが挙げられる。ＡＲ（Ｆ８７６）およびＡＲ（Ｗ７４１／Ｔ８７７）は、例えば、１つまたは複数のドメインを有することができるが、ただし、ＡＲ（Ｆ８７６）およびＡＲ（Ｗ７４１／Ｔ８７７）の配列が、それぞれ、位置Ｆ８７６、または７４１および８７７を包含する場合に限る。
【００８９】
アンドロゲンレセプター変異は、特定のアミノ酸の欠失および置換の両方を含むことにも留意されたい。したがって、ＡＲ（Ｆ８７６）は、Ｆ８７６において欠失を有する断片または全長ＡＲまたはバリアントであり；したがって、通常、Ｆ８７６に対応する位置にアミノ酸が存在しない（例えば、配列番号５４に示されるように）。したがって、ＡＲ（Ｆ８７６）は、Ｆ８７６を飛ばして、位置８７７に対応するアミノ酸に直接結合している位置８７５のアミノ酸を含み得る。位置８７５および８７７のアミノ酸は、様々な実施形態において、任意により、変異させることもできる。
【００９０】
したがって、用語「ＡＲ（Ｆ８７６）」および「ＡＲ（Ｗ７４１／Ｔ８７７）」は、ＡＲによって媒介される少なくとも１つの活性を維持し、かつ、それぞれ、Ｆ８７６における変異あるいはＷ７４１およびＴ８７７の両方における二重変異を含み、任意によりさらなる変異を含む、任意の全長、断片、バリアント、またはＡＲの他の形態を包含することが意図される。
【００９１】
本開示はさらに、ＡＲ（Ｆ８７６）およびＡＲ（Ｗ７４１／Ｔ８７７）「ポリペプチド」、「ポリペプチド部分」、「タンパク質」などを含む組成物にも関する。用語「ポリペプチド」、「ポリペプチド部分」、「タンパク質」などは、本明細書において、任意の長さのアミノ酸残基の任意のポリマーを意味するために、相互互換的に使用される。当該ポリマーは、直鎖状もしくは非直鎖状（例えば、分岐鎖状）であり得、修飾アミノ酸もしくはアミノ酸類似体を含んでもよく、アミノ酸以外の化学部分によって割り込まれていてもよい。当該用語はさらに、自然に、あるいは介入によって；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、あるいは他の操作もしくは修飾、例えば、標識化もしくは生理活性成分とのコンジュゲート化などによって、修飾されているアミノ酸ポリマーも包含する。
【００９２】
したがって、本開示は、Ｆ８７６における変異またはＷ７４１／Ｔ８７７における二重変異を含む（任意により、他の変異を含む）ＡＲまたはその断片もしくはバリアントであって、患者の層別化および／またはアンドロゲンレセプター関連疾患の処置における使用のための新規の治療法の創出において有用である、ＡＲまたはその断片もしくはバリアントに関する。
【００９３】
ＷＴまたは変異体ＡＲの活性
様々な態様において、ＡＲもしくは変異体ＡＲ（例えば、ＡＲ（Ｆ８７６）および／またはＡＲ（Ｗ７４１／Ｔ８７７など））の断片および／またはバリアントは、全長ＷＴもしくは変異体ポリペプチド（例えば、配列番号１または５４のポリペプチド）の少なくとも１つの活性を保持する。そのような活性としては、これらに限定されるわけではないが、アンドロゲン、テストステロン、および／またはジヒドロテストステロン；ＭＤＶ３１００を結合させる不能性；リガンドの結合の際の立体構造変化；ヒートショックタンパク質の解離；細胞質から細胞核への輸送；二量体化；ＤＮＡを結合させる能力；ＤＮＡにおけるＨＲＥ（ホルモン応答要素）配列への配列特異的結合；遺伝子転写の制御；他のレセプターのリン酸化における役割；細胞質におけるシグナル伝達タンパク質との相互作用；完全リガンド活性化転写活性に対する活性化機能１（ＡＦ−１）；アゴニスト誘導活性の原因となる、活性化機能２（ＡＦ−２）；および／または、ＡＫＴ１、ＢＡＧ１、β−カテニン、ＢＲＣＡ１、Ｃ−ｊｕｎ、カルモジュリン−１、カベオリン−１、ＣＤＫ９、ＣＯＸ５Ｂ、ＣＲＥＢ−結合タンパク質、サイクリンＤ１、サイクリン依存性キナーゼ７、細胞死関連タンパク質６、大腸がんにおける欠失、ＥＦＣＡＢ６、上皮成長因子レセプター、ＦＯＸＯ１、ＧＡＰＤＨ、ゲルゾリン、ＧＮＢ２Ｌ１、ＧＳＫ３Ｂ、ＨＤＡＣ１、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＨＴＡＴＩＰ、ＭＡＧＥＡ１１、ＭＥＤ１、ＭＹＳＴ２、ＮＣＯＡ１、ＮＣＯＡ２、ＮＣＯＡ３、ＮＣＯＡ４、ＮＣＯＡ６、ＮＣＯＲ２、ＮＯＮＯ、ＰＡ２Ｇ４、ＰＡＫ６、ＰＡＴＺ１、ＰＩＡＳ２、ＰＲＰＦ６、ＰＴＥＮ、ＲＡＤ９Ａ、ＲＡＮＢＰ９、ＲＣＨＹ１、網膜芽腫タンパク質、ＲＮＦ１４、ＲＮＦ４、ＳＡＲＴ３、ＳＭＡＤ３、小ヘテロ二量体パートナー、Ｓｒｃ、ＳＲＹ、ＳＴＡＴ３、ＳＶＩＬ、精巣レセプター２、精巣レセプター４、ＴＧＦＢ１Ｉ１、ＴＭＦ１、ＴＲＩＭ６８、ＵＢＥ２Ｉ、ＵＸＴ、および／またはＺＭＩＺ１、との相互作用、あるいは媒介性特異的免疫原性、［例えば、ＡＲ（Ｆ８７６）の断片は、免疫原生を模倣するのに十分な長さであるか、またはＡＲもしくはＡＲ（Ｆ８７６）の対応する断片もしくは配列に結合する抗体を産生もしくは誘発するために使用することができる、任意の断片であり得る］が挙げられる。したがって、例えば、ＡＲ（Ｆ８７６）断片は、全ＡＲ（Ｆ８７６）またはＡＲ（Ｆ８７６）にまたがるその断片の配列に特異的な免疫反応を誘発することができる活性を保持する任意の断片である。
【００９４】
ＡＲのそのような活性の少なくとも１つは、以下においてより詳細に説明される、ＡＲの変異体、断片、またはバリアント、例えば、ＡＲ（Ｆ８７６）またはＡＲ（Ｗ７４１／Ｔ８７７）などによって保持される。
【００９５】
ＡＲ（Ｆ８７６）
本明細書において説明されるように、ＡＲにおけるＦ８７６変異体の出現は、処理の際のＭＤＶ３１００に対する鈍化したＡＲ反応および持続する増殖と相関があった。ＡＲ遺伝子における再発性Ｆ８７６Ｌ変異は、全ての４つの強耐性クローン（本明細書において説明される）において保存されるが、弱耐性クローンまたは対照細胞株においては見出されなかった。Ｆ８７６変異は、ＡＲ（Ｆ８７６Ｌ）がアゴニストとしてＭＤＶ３１００を使用できるようにし、一貫して、これにより、Ｆ８７６Ｌを保持する細胞は、インビボにおいて成長のためにＭＤＶ３１００の存在を必要とした。
【００９６】
ＭＤＶ３１００がＡＲシグナリングを阻害するメカニズムは、ＡＲの核移行を妨げるその能力に部分的に起因すると考えられていた。Tran et al. 2009 Science 324: 787-90。Ｆ８７６変異は、ＡＲのリガンド結合ドメインに局在する。ＭＤＶ３１００反応に対するＦ８７６変異の潜在的影響を評価するために、発明者らは、野生型（ＷＴ）および変異体レセプターへのＭＤＶ３１００の結合をコンピュータ的にモデル化した。発明者らは、ＷＴ  ＡＲの拮抗状態のドッキングモードにおいて、ＭＤＶ３１００のみがＡＲ（Ｆ８７６）との弱い相互作用を示すことを見出した。しかしながら、Ｆ８７６変異の存在下において、ＭＤＶ３１００のベンズアミドモチーフは、より小さいロイシン残基によって作り出されるアクセスチャネル内へと延び得る。これは、当該化合物が、アゴニストモードでのＡＲリガンド結合ドメインのへリックス−１２と衝突するのを潜在的に防ぐであろう。したがって、コンピュータモデリングは、ＡＲにおけるＦ８７６Ｌ変異がＭＤＶ３１００のアンタゴニスト活性を無効にし得、ならびにアゴニスト活性を潜在的に可能にし得ることを示唆した。
【００９７】
「ＡＲ（Ｆ８７６）」または「ＡＲ−Ｆ８７６」は、本明細書において定義されるように、位置８７６を含むかもしくは位置８７６にまたがる、アンドロゲンレセプターまたはその断片もしくはバリアントを含むポリペプチドなどであり、この場合、位置８７６のアミノ酸は、置換されているかまたは欠失しているかまたはフェニルアラニン（Ｆ）以外である（この場合、アミノ酸の位置は、配列番号１または配列番号５４の付番に従う）。「ＡＲ（Ｆ８７６Ｌ）」または「ＡＲ−Ｆ８７６Ｌ」は、本明細書において定義されるように、位置８７６を含むかもしくは位置８７６にまたがる、アンドロゲンレセプターまたはその断片もしくはバリアントを含むポリペプチドなどであり、この場合、位置８７６のアミノ酸は、ロイシン（Ｌ）で置換されている（この場合、アミノ酸の位置は、配列番号１または配列番号５４の付番に従う）。
【００９８】
したがって、「ＡＲ（Ｆ８７６）」は、以下の配列番号５４（この配列は、Ｆ８７６が「Ｘ」によって示されることを除いて、配列番号１と同一であり、Ｆ以外の任意のアミノ酸がこの位置で置換され得ること、またはこのアミノ酸が欠失し得ることを意味する）の全体もしくは断片を含む。したがって、ＡＲ（Ｆ８７６）において、位置Ｘは、欠失し得るか、あるいはＦ以外の任意のアミノ酸であり得る。
【００９９】
ＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチド配列の非限定的例を以下に示す。
【０１００】
【化３】
2016516005.tif 000004
【０１０１】
したがって、例示的なＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントは、配列番号５４のサブセット、例えば、ＥＬＨＱＸＴＦＤＬＬ（配列番号２０）、ＬＨＱＸＴＦ（配列番号２１）、ＨＱＸＴＦＤ（配列番号２２）、ＱＸＴＦＤ（配列番号２３）などを含み得、この場合、Ｘは、欠失しているか、またはＦ以外の任意のアミノ酸である。ＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチドの他の非限定的な例としては、例えば、本明細書において示されるような、配列番号３〜５３のいずれかを含むものが挙げられる。様々な実施形態において、当該断片は、ＡＲの任意の活性を媒介することができる。
【０１０２】
用語「ＡＲ（Ｆ８７６）」は、位置Ｆ８７６に欠失を有するＡＲも明確に包含する。したがって、「にまたがる」は、変異体ＡＲが、位置Ｆ８７６のアミノ酸が欠失しているかまたは欠失されるような配列を含むことを意味する。例えば、Ｆ８７６「にまたがる」配列を含む変異体ＡＲは、とりわけ、位置８７５および８７７のアミノ酸を含むがＦ８７６のアミノ酸は含まないアミノ酸配列を含み得る。別の非限定的例において、Ｆ８７６「にまたがる」配列を含む変異体ＡＲは、Ｆ８７６を含む１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸のギャップを含み得；例えば、当該変異体ＡＲは、位置８７５および８７８のアミノ酸を含むか（８７６およびＦ８７７など、これらの間を欠く）、あるいは位置８７４および８７７のアミノ酸を含む（８７５および８７６など、これらの間を欠く）配列を有し得る。したがって、例示的なＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントは、例えば、ＥＬＨＱ＿Ｔ（配列番号２４）、ＬＨＱ＿ＴＦ（配列番号２５）、ＨＱ＿ＴＦＤ（配列番号２６）、またはＱ＿ＴＦＤＬ（配列番号２７）などを含み得、この場合「＿」は、位置Ｆ８７６でのアミノ酸の欠失を示している。
【０１０３】
ＡＲ（Ｆ８７６）は、例えば位置Ｔ８７７などにおいて、さらなる変異を含み得る。特異的ＡＲ（Ｆ８７６）は、指定されたもの、例えば、「Ｆ８７６Ｌ」（「Ｆ８７６Ｌ  ＡＲ」）または「Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ」（「Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ  ＡＲ」）などを含んでおり、それらが位置８７６においてＦからＬへの置換を有するか、または、位置８７６においてＦからＬへの置換および位置８７７においてＴからＡへの置換の両方を有することを示している。
【０１０４】
したがって、ＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチド、断片、もしくはバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列のサブセットを含み得、この場合、当該サブセットは、フェニルアラニン（Ｆ）以外の任意のアミノ酸が位置８７６にあることを示した「Ｘ」として表される位置８７６を含む。したがって、ＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチド、断片、またはバリアントは、これらに限定されるわけではないが、とりわけ、例えば、以下を含み得る。
【０１０５】
【化４】
2016516005.tif 000005
【０１０６】
したがって、二者択一的に、ＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチド、断片、またはバリアントは、位置８７６にまたがる配列を含み得、この場合、当該位置におけるアミノ酸は欠失しており、それは、以下において「＿」として表される。したがって、ＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチド、断片、またはバリアントは、これらに限定されるわけではないが、とりわけ、例えば以下のものを含み得る。
【０１０７】
【化５】
2016516005.tif 000006
【０１０８】
いくつかの実施形態において、ＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチド、断片、またはバリアントは、Ｆ８７６の変異に加えて、１つまたは複数の他の位置の変異を含み得る。
【０１０９】
したがって、いくつかの実施形態において、ＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチド、断片、またはバリアントは、以下のＦ８７６（配列「ＸＸ」の最初の「Ｘ」によって示される）およびＴ８７７（配列「ＸＸ」の２番目の「Ｘ」によって示される）の両方に変異を有し得る。したがって、ＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチド、断片、もしくはバリアントは、これらに限定されるわけではないが、とりわけ、例えば、以下を含み得る。
【０１１０】
【化６】
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【０１１１】
いくつかの実施形態において、ＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチド、断片、またはバリアントは、以下のＨ８７４（配列「ＸＱＸＸ」の「Ｘ」によって示される）；Ｆ８７６（配列「ＸＱＸＸ」の２番目の「Ｘ」によって示される）およびＴ８７７（配列「ＸＱＸＸ」の３番目の「Ｘ」によって示される）に変異を有し得る。したがって、ＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチド、断片、またはバリアントは、これらに限定されるわけではないが、とりわけ、例えば、以下を含み得る。
【０１１２】
【化７】
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【０１１３】
様々な他の実施形態において、ＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチド、断片、またはバリアントは、Ｆ８７６における置換もしくは欠失、ならびに１つまたは複数の他の変異、修飾などを含み得る。ＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチド、断片、またはバリアントは、混合された様々な置換変異および欠失変異を含み得る。
【０１１４】
他のＡＲ変異
他のＡＲ変異については前に説明した。
【０１１５】
Ｗ７４１変異、例えばＷ７４１Ｃ、は、多くのビカルタミド耐性腫瘍において生じる。Hara et al. Cancer Res. 63: 149-153 (2003) ; Taplin et al. J. Clin. Oncol. 21: 2673-2678 (2003); Haapala et al. Labor. Invest. 81: 1647-1651 (2001)。本開示は、この変異が、Ｔ８７７での変異との組み合わせにおいて、ＭＤＶ３１００に対する表現型耐性も部分的に付与し得ることを示す。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むわけではないが、本開示は、上記のことが、二重変異体ＡＲが構成型活性機能を獲得する際の間接的影響に起因し得ると推測する。
【０１１６】
Ｈ８７４ＹなどのＨ８７４変異は、多くの前立腺腫瘍において生じることが知られている。
【０１１７】
例えばＦ８７６ＬなどのＦ８７６変異は、ＭＤＶ３１００に対する耐性を生じさせることが本明細書に示されている。しかしながら、Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ変異を示す患者は、臨床的有益性を達成するために、ビカルタミドなどのＭＤＶ３１００を含まない処置によって容易に処置することができる。
【０１１８】
ただし、Ｗ７４１Ｃ／Ｌ単一変異体は、感受性であり（少なくとも、レポーターアッセイによって決定される場合）；しかしながら、Ｗ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａ  ＡＲは、構成的に活性であり、表現型耐性を示すということに留意されたい。
【０１１９】
例えばＴ８７７ＡなどのＴ８７７変異は、多くの後期のフルタミド耐性腫瘍を生じさせることが知られている。Fenton et al. Clin. Cancer Res. 3: 1383-1388 (1997); Taplin et al. Cancer Res. 59: 2511-2515 (1999)。本開示は、Ｗ７４１およびＴ８７７における二重変異もＭＤＶ３１００に対する耐性を生じさせることを示している。
【０１２０】
さらなるＡＲ変異としては、例えば、Ｌ７０１（例えば、Ｌ７０１Ｈ）、Ｖ７１５（例えば、Ｖ７１５Ｍ）、Ｑ９０２（例えば、Ｑ９０２Ｒ）、およびＡ７２１（例えば、Ａ７２１Ｔ）のものが挙げられる。Fenton et al. Clin. Cancer Res. 3: 1383-1388 (1997)。いくつかの変異部位は、臨床的に関連することが知られている。例えば、Ｈ８７４Ｙ、Ｖ７１５Ｍ、およびＬ７０１Ｈ／Ｔ８７７Ａは、幅広いリガンド応答性を有することが示されており、ヒドロキシフルタミドは、以前に、これらの変異体に対するアゴニストとして機能することが示されている。Fenton et al. Clin. Cancer Res. 3: 1383-1388 (1997); Hara et al. Cancer Res. 63: 149-153 (2003); Veldscholte et al. Biochem. 31: 2393-2399 (1992); Zhao et al. Nature Med. 6: 703-706 (2000)。Ｔ８７７Ａ、Ｔ８７７Ｓ、およびＨ８７４Ｙ変異体は、ＷＴ  ＡＲと比べて、エストラジオールおよびプロゲステロンの両方に対して増加した応答性を有することが知られている。Ｈ８７４ＹおよびＴ８７７Ｓ  ＡＲは、ニルタミドによって活性化することができる。Fenton et al. Clin. Cancer Res. 3: 1383-1388 (1997)およびそこに列記された参考文献を参照されたい。
【０１２１】
変異であることに影響されやすいことが知られている部位は、しばしば、「ホットスポット」と呼ばれている。
【０１２２】
患者の層別化および投薬レジメン設計においては、様々な既知のＡＲ変異の、既知の役割、薬物感受性、およびアンタゴニストからアゴニストへの切り替えを考慮しなければならない。
【０１２３】
いくつかの場合において、１つの置換のみが、特定の位置に対して説明されているが、本開示は、任意のアミノ酸が（または欠失の場合は何もない場所が）、変異のための部位であり得ることも想到する。したがって、本開示は、Ｆ以外の任意のアミノ酸（または何もない場所）が、ＡＲ（Ｆ８７６）における位置Ｆ８７６にあり得ることも想到する。好ましい置換は、ＭＤＶ３１００に対して耐性である能力（例えば、Ｆ８７６Ｌによって示される）を示すものである。同様に、特に二重変異（Ｗ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａと同様に）もＭＤＶ３１００に対する耐性を付与する場合、任意のアミノ酸が、Ｗ７４１／Ｔ８７７の二重変異において置換され得る（または欠失した位置であり得る）。
【０１２４】
ＡＲ（Ｆ８７６）変異およびＷ７４１／Ｔ８７７二重変異のさらなる記述および説明を以下に提示する。これらの本文において、本開示は、ＡＲ（Ｆ８７６）変異のＦ８７６Ｌの例が、既存であるかそれともＭＤＶ３１００に対応して獲得されるか；Ｗ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａ変異が、ＭＤＶ−３１００に対する耐性を間接的に付与すること；アンタゴニストからアゴニストへの切り替え；およびＭＤＶ３１００に対する耐性の代替のメカニズム、について説明する。
【０１２５】
Ｆ８７６Ｌ：ＭＤＶ３１００処置に対する応答におけるＡＲのホットスポット変異
インビトロでの選択の際のＦ８７６Ｌ変異の比較的速い出現（図３Ａ、３Ｂ）は、最初は、この変異がおそらく低い頻度の既存のものであろうことを示唆した。しかしながら、２つの独立したヌクレオチド置換がインビボでの選択の際にＦ８７６Ｌ変異を引き起こした（図３Ｄおよび３Ｅ）という事実は、当該変異が処置の際に獲得され得たことを暗に示している。ＬＮＣａＰ細胞は、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）メカニズムに欠陥を有しており、ＰＣａのサブセットにも欠陥が存在することが見出されたので［Chen et al. 2001 Cancer Res. 61: 4112-21］、それらが（ＭＤＶ３１００処理の有無のいずれかにおいて）この変異をより容易に獲得し得ることが想像できる。しかしながら、Ｂａｌｂａｓおよび同僚ら（２０１３）も、ＣＷＲ２２ＰＣ細胞の長期処理におけるＦ８７６Ｌの自然発生を報告しているように［Balbas et al. 2013 eLife 2:e00499］、完全なＭＭＲメカニズムを有すると信じられている細胞株は、Ｆ８７６Ｌが本当に、ＭＭＲの状態に関係なく前立腺腫瘍において耐性を付与する能力を有し得るホットスポット変異であり得ることを示唆している。
【０１２６】
Ｗ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａ変異はＭＤＶ３１００に対する耐性を間接的に付与する。
ＡＲ（Ｆ８７６）に加えて、二重変異ＡＲ（Ｗ７４１／Ｔ８７７）もＭＤＶ３１００に対する耐性を付与することを上記において述べた。
【０１２７】
予期していなかったが、本開示は、Ｗ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａ  ＡＲの発現が、Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ対立遺伝子よりもはるかに強い発現レベルにもかかわらず、ＭＤＶ３１００に対する表現型耐性を付与することを、一貫して見出した。この現象は、以前の報告を支持して、構成的活性特性を獲得するＷ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａ変異体ＡＲによる間接的影響であると思われる。Hara, T., et al.  Cancer research 63, 149-153 (2003)。遺伝子発現分析は、この変異がＭＤＶ３１００の存在下において、Ｔ８７７Ａ変異体ＡＲよりも効率的に、ＡＲ経路活性をレスキューできることを示唆しているが（図５ａ）、この対立遺伝子の異所性発現がベースラインでのＡＲシグナリングを著しく増強するので（図１５および１６ａ、データは示されていない）、これはＭＤＶ３１００に非依存性であると思われる。これを支持して、本開示は、アンドロゲン枯渇条件下において、Ｔ８７７Ａ  ＡＲに比べて、ベースラインでのＷ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａ変異体ＡＲの著しい細胞核局在性を観察する。細胞核局在性は、ＭＤＶ３１００に対して感受性のままであるが、処理によって局在性が著しく低下されるので、細胞核Ｗ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａタンパク質のレベルは、ＭＤＶ３１００処理後でもＴ８７７Ａ  ＡＲよりも高いままであり、より高い程度の耐性へと翻訳される。耐性のメカニズムは、上記において説明した理由から間接的であるように思われるが、ＭＤＶ３１００または他の抗アンドロゲン剤が完全に無効であると思われること、ならびに他のクラスのＡＲアンタゴニストを使用する「混合性アンドロゲン遮断」処置または、他のキーシグナリング経路も標的とする薬剤との併用療法が、Ｗ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａ変異を含む腫瘍の処置においてより効果的であり得ることを暗に意味するであろうために、それは依然として注目に値する観察結果である。
【０１２８】
Ｗ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａ対立遺伝子がＭＤＶ３１００に対する部分的耐性を付与できるという予期されない知見は、臨床前立腺がん試料において、他のよく記録されたＡＲの変異の機能をスクリーニングする必要性を暗に意味している。Taplin, M.E., et al.  The New England journal of medicine 332, 1393-1398 (1995); Marcelli, M., et al.  Cancer research 60, 944-949 (2000);およびCulig, Z., et al.  Molecular endocrinology 7, 1541-1550 (1993)。Ｈ８７４Ｙ、Ｖ７１５Ｍ、およびＬ７０１Ｈ／Ｔ８７７Ａなどのいくつかの変異は、幅広いリガンド応答性を有していることが示されており、ならびに、ヒドロキシフルタミドは、以前に、これらの変異体に対するアゴニストとして機能することが示されている。Fenton, M.A., et al.  Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 3, 1383-1388 (1997); Hara, T., et al.  Cancer research 63, 149-153 (2003); Veldscholte, J., et al. Biochemistry 31, 2393-2399 (1992);およびZhao, X.Y., et al. Nature medicine 6, 703-706 (2000)。したがって、以前に同定されたＡＲ変異のいずれもＭＤＶ３１００に対する耐性も付与することができるのか否か、できるのであれば、これらの変異とＦ８７６Ｌとを組み合わせることにより、臨床設定における薬物感受性を予測することができるか否かを試験することは、臨床的に重要であるだろう。
【０１２９】
したがって、ＡＲの位置８７６の変異（例えば、ＡＲ（Ｆ８７６））の存在または不在を試験する患者試料の分析は、任意により、位置７４１および８７７の二重変異（例えば、ＡＲ（Ｗ７４１／Ｔ８７７））の存在または不在を試験することができる。本明細書において説明されるように、これらの変異の存在または不在は、患者の層別化および投薬レジメンの設計に対して影響を有する。
【０１３０】
アンタゴニストからアゴニストへの切り替えおよび代替の治療戦略
本開示は、ＡＲ（Ｆ８７６）変異が、ＭＤＶ３１００に対する耐性を可能にするだけでなく、アンタゴニストからアゴニストへの切り替えも引き起こすことを示し、この場合、ＡＲ（Ｆ８７６）を発現する細胞は、ＭＤＶ３１００の存在下においてより良く成長するかまたは存在下においてのみ成長する。
【０１３１】
抗アンドロゲン剤に対する耐性の獲得において繰り返されるテーマは、小分子阻害剤をアゴニストとして最終的に用いることができる変異の出現である。Ｔ８７７Ａ／Ｓ、Ｗ７４１Ｃ／Ｌ、および（本明細書において示されるような）Ｆ８７６Ｌ（図１５）は、それぞれ、ヒドロキシフルタミド、ビカルタミド、およびＭＤＶ３１００に対してアンタゴニストからアゴニストへの切り替えを促進する。これは、他のクラスの阻害剤、例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬを標的とするものなど［Gorre, M.E., et al. Science 293, 876-880 (2001)］、において観察される耐性とは明確に異なっており、この場合、当該変異は、分子標的を治療法に対して無反応にする。この切り替えが抗アンドロゲン剤に対して非常に一般的な特徴であるという事実は、１）より良好な治療指数のより強力な化合物の開発、または２）代替の治療戦略の探求、のどちらかを示唆する。最初の点に対処するため、Ｓａｗｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｊｕｎｇは、近年、次世代の抗アンドロゲン剤であるＡＦＮ−５０９を開発し、これは、より強力であることが示され、より高い治療指数とより長い半減期を有し、その全てが、より少ない耐性へと翻訳されるはずである。Clegg et al. Cancer Res. 72: 1494-1503 (2012)。将来の研究によって、ＡＦＮ−５０９に特異的な、耐性を付与する変異が同定されるなら、高い治療指数にもかかわらず、おそらく、ＡＲを標的とする代替の戦略は、ＡＲにおける変異によって耐性の影響をほとんど受け得ない、探求された戦略であるはずである。まず１つ目に、そのような戦略は、２つの抗アンドロゲン剤を、両方に耐性を付与する変異の見込みが非常に低減されることを期待して、組み合わせること（組み合わせて、または連続的に）を含み得る。第二に、１）活性化機能２（ＡＦ２）機能を妨げるか［Gao, W. Current pharmaceutical design 16, 1106-1113 (2010)］、または２）Ｎ−末端ドメイン活性化レポーター遺伝子転写を阻害することが示されているＥＰＩ−００１と同様の方式においてＮ末端ドメインを標的とする、ＡＲ特異的ペプチドアンタゴニストの開発などの戦略が、実行可能な選択肢としての役割を果たし得る。Gao, W. Current pharmaceutical design 16, 1106-1113 (2010)；およびAndersen, R.J., et al. Cancer cell 17, 535-546 (2010)。あるいは、ＡＲにおける個々のドメインの機能について妥協するというよりむしろ、ＡＲを不安定化する／劣化させる化合物も考慮され得る。
【０１３２】
ＭＤＶ３１００が、Ｆ８７６Ｌ変異を含むクローンにおいてＡＲ経路のアゴニストとして機能し得ることが示されているので、次に、本開示は、このアゴニストの切り替えがアンドロゲン枯渇条件下において細胞成長を増強することができるか否かを取り上げた。興味深いことに、当該切り替えは、インビトロにおいてＦ８７６Ｌ保有クローンの増殖を駆動することができないが、本開示は、インビボにおいて、注目に値するＭＤＶ依存性成長を観察した。Ｃ１（対照１）腫瘍は、ＭＤＶ３１００処置において即座の停滞を示したのに対して、クローン＃１腫瘍［ＡＲ（Ｆ８７６）］の成長は、実際には、ＭＤＶ３１００によって刺激され、ビヒクル群での１５匹のうちの２匹と比べて、ＭＤＶで処置した１５匹のうちの１１匹のマウスが腫瘍を示した。その上、以前の観察結果に一致して、クローン＃１［ＡＲ（Ｆ８７６）］腫瘍は、ＭＤＶ３１００の存在下において成長し続けた。まとめると、これらのデータは、変異体ＡＲは、アゴニストとしてＭＤＶ３１００を利用できるようにすることによって、おそらく、ＭＤＶ３１００に対する遺伝子的耐性および表現型的耐性を媒介するであろうことを暗に意味している。本明細書において説明される様々な実施形態において、ビヒクルはＤＭＳＯである。
【０１３３】
加えて、本発明者らは以下において、Ｆ８７６Ｌ変異が、遺伝子操作されたＬＮＣａＰ細胞においてＭＤＶ３１００に対する遺伝的および表現型的耐性を誘発するのに十分であることを示す。
【０１３４】
耐性付与におけるＡＲ（Ｆ８７６）の役割は、いくつかの前立腺がん細胞株に広く適用可能である。ヒトＶＣａＰ株（ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ融合およびＡＲ増幅を含む）およびネズミＭｙｃ−ＣａＰ株（Ｍｙｃを過剰発現する）に、変異体ＡＲを安定に発現するように形質導入した。ＬＮＣａＰ細胞において観察される耐性の表現型と一致して、両方の株も、ＭＤＶ３１００に対する部分的耐性を提示した。
【０１３５】
さらに、本発明者らは、ＡＲ（Ｆ８７６）保有細胞がインビボでの性腺摘除設定においてＭＤＶ３１００に対して耐性であることを示す。本発明者らは、Ｆ８７６Ｌ保有細胞を性腺摘除された雄ネズミに移植した場合、インビボでの成長に対してＭＤＶ３１００に対する著しい依存性を観察した。
【０１３６】
本発明者らはさらに、ＣＤＫ４／６の標的化が、ＣＤＫ４／６阻害剤のＬＥＥ０１１およびＰＤ０３３２９９を使用したＭＤＶ３１００耐性を克服するための治療戦略であることも示す。
【０１３７】
本開示は、ＬＥＥ０１１およびＰＤ０３３２９９１がＡＲ関連疾患のための治療法として使用することができることを示す。これは、ＡＲがＦ８７６の変異を含む、ＡＲ関連疾患を含む。さらに、ＰＤ０３３２９９１、ＬＥＥ０１１、および他のＣＤＫ４／６阻害剤は、ＡＲが野生型であるＡＲ関連疾患に対する治療法として有用である。例えば、本明細書において示されるように、ＷＴ（野生型）ＡＲを発現しかつＭＤＶ３１００処置条件下においてＡＲシグナリングならびにＤＨＦｒおよびＴＫ１の発現を維持することができるＰＣａ株も、ＣＤＫ４／６抑制に対して強い感受性を示した。
【０１３８】
ＭＤＶ３１００に対する耐性の代替のメカニズム
耐性についての２つのメカニズムは、ＭＤＶ３１００に関与していた（構成型リガンド非依存性ＡＲ活性［Li, Y., et al. Cancer research 73, 483-489 (2013)］およびＰＩ３Ｋシグナリング経路の活性化を引き起こすスプライスバリアントの発現）。Mulholland, D.J., et al. Cancer cell 19, 792-804 (2011);およびCarver, B.S., et al. Cancer cell 19, 575-586 (2011)。しかしながら、本発明者らの研究において、弱耐性クローン（Ｆ８７６Ｌなし）は、トランケートされたＡＲアイソフォーム（データは示されず）を発現せず、ベースラインＰＩ３Ｋ活性（データは示されず）を継続的に示し、これらのクローンにおいてどちらも耐性の重要なメカニズムではないことを示唆している。これを支持して、ＬＮＣａＰ細胞におけるバリアントＶ７（ＣＲＰＣ患者において高度に発現されるＡＲの、臨床的に関連するアイソフォーム）の異所性発現は、ＡＲシグナリング（データは示されず）における強いレスキューにもかかわらず、ＭＤＶ３１００に対する表現型耐性を付与することができず、これは、以前の研究を支持している。Watson, P.A., et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107, 16759-16765 (2010)。本明細書において提示されたデータを考慮すると、いかなる特定の理論にも束縛されることを望むわけではないが、本開示は、Ｆ８７６Ｌ対立遺伝子を欠くクローンによって利用される耐性メカニズムが、おそらく、（ＭＤＶ３１００に対する特殊性の欠如に基づいて）抗アンドロゲン剤に対する一般的な耐性を駆動するという考えに一致する。これらのクローンに独特な変異、例えば、前立腺がんにおいて去勢抵抗性成長を駆動することが以前に示されたキナーゼ［Dai, B., et al. Cancer research 70, 5587-5596 (2010)］であるチロシンキナーゼＢＭＸにおける変異など、が、一般的な耐性のドライバーとして潜在的に機能し得ることは可能である。ＲＮＡ−ｓｅｑ分析によって同定されたさらなる変異の潜在的役割を調査する追跡調査が、現在も継続されている。
【０１３９】
まとめると、本開示は、ビカルタミドに対する感受性を維持するＭＤＶ３１００に対する遺伝的および表現型的耐性のドライバーとしてＦ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ対立遺伝子をしっかりと確立する。臨床的な意義は、広範囲に及び；１）変異は、患者における薬物感受性を予測するために使用されるバイオマーカーとして機能することができ、ならびに２）この変異を示す患者を、臨床的有益性を達成するために、代替的にビカルタミドで処置することができる（図７）。
【０１４０】
したがって、本開示は、ＡＲ（Ｆ８７６）変異およびＡＲ（Ｗ７４１／Ｔ８７７）二重変異の両方が臨床的に関連しており、ＭＤＶ３１００に対する耐性を付与し、ならびに、下記においてより詳細に説明されるように、様々なＡＲ関連疾患の処置の際の患者の層別化および投薬レジメンの設計にとって有用であることを示す。
【０１４１】
アンドロゲンレセプター関連疾患
アンドロゲンレセプターの過剰発現および／より多くの変異が、いくつかの疾患、例えば、前立腺がんおよび乳がんを含むがんなど、ならびに他の障害、例えば、ポリグルタミン酸病、脱毛症（例えば、アンドロゲン性脱毛症）、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、ならびにケネディ病などにおいて示されている。Sawaya et al. J. Cutaneous Med. Surg. 3: 9-15 (1998); Schmidt et al. Gyn. Obstet. Invest. 22: 206-211 (1986); Giovannucci et al. Prostate 39: 130-134 (1999); Amato et al. Neurology 43: 4791 (1993); Ferlini et al. Am. J. Med. Gen. 55: 105-111 (2005); Monks et al., PNAS November 2 2007; Hillmer Am. J. H. Genet. 77: 140-148 (2005);ＷＯ２０１２／０６５０５１およびＵＳ２０１０／００２２６３２、ならびにそれらにおいて引用されている参考文献を参照されたい。
【０１４２】
前立腺疾患および乳がんなどのＡＲ関連疾患について、以下においてより詳細に説明する。
【０１４３】
アンドロゲンレセプター関連疾患：前立腺疾患
「前立腺」は、膀胱の底部において男性の尿道を囲む筋肉性の腺器官を意味する。前立腺は非必須の器官である。前立腺は、精液の産生および貯蔵を助ける。成人男性において、典型的な前立腺は、長さ約３センチメートル、重さ約２０グラムである。骨盤において、膀胱の下かつ直腸の正面に位置している。前立腺は、排尿の際に膀胱から尿を、ならびに射精の際に精液を運ぶ管である尿道の一部を囲んでいる。前立腺は、精液を構成する体液の約２０パーセントを産生する多くの小さい腺を含んでいる。
【０１４４】
「前立腺疾患」は、前立腺に影響を及ぼす任意の疾患、例えば、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）、前立腺炎、および去勢抵抗性ＰＣａ（ＣＲＰＣ）を含む前立腺がん（ＰＣａ）などを意味する。前立腺疾患は、場合により、頻尿症、夜間多尿症（夜の排尿増加）、排尿の開始および尿の一定の流れの維持の困難さ、血尿（尿中の血液）、ならびに排尿障害（排尿痛）などの症状の原因となる。前立腺疾患の多くの犠牲者は症状を表さない。
【０１４５】
前立腺疾患は、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）を含むが、ＢＰＨにおけるＡＲの正確な役割は、不明のままである。Chatterjee Mol. Cell. Biochem. 253: 89-101 (2003);およびHo et al. Nat. Rev. Urol. 8: 29-41 (2011)、ならびにそれらにおいて引用された参考文献。ＢＰＨは、前立腺のサイズ増加であり、尿路閉塞症の原因となり、結果として尿失禁を引き起こす。８０歳までの男性のおよそ８０％に生じる。ＢＰＨは、多くの場合、前立腺の経尿道的切除（ＴＵＲＰ）によって外科的に処置される。この手段は、非常に一般的であり、米国において、毎年、５００，０００のＴＵＲＰが実施されており、ＢＰＨは、男性における外科手術の２番目に最も一般的な原因である。残念ながら、ＴＵＲＰの副作用は、陰茎の射精管および神経束の排除であり、結果として、患者の９０％が不能症を生じる。ＢＰＨの処置のための薬物療法は、現在、前立腺平滑筋の弛緩（α１遮断）および前立腺体積の減少（アンドロゲン抑制）を目的としている。ＢＰＨの処置のために、選択的α１遮断薬、抗アンドロゲン剤、５−αレダクターゼ阻害剤を評価するために、臨床試験が行われている。５−αレダクターゼ阻害剤であるフィナステリドは、大部分の患者において過形成性前立腺の改善を生じる能力を示している。Mocellini et. al. (1993) Prostate 22:291;およびMarberger (1998) Urology 51:677-86。
【０１４６】
別の前立腺疾患は前立腺炎である。前立腺炎は、前立腺の炎症である。前立腺炎という用語は、前立腺の組織における組織学的炎症を意味する。炎症の全ての形態と同様に、前立腺炎は、感染症に対する適切な身体の反応と関連付けることができるが、それは、感染症の不在下においても生じる。
【０１４７】
「前立腺がん」または「ＰＣａ」などは、前立腺において発症するがんのある種の形態を意味する。前立腺がんには、アンドロゲンレセプターが関係している。「がん」は、比較的自律的な成長を示す細胞の異常な存在を意味し、したがって、それらは、細胞増殖調節の重大な欠如によって特徴付けられる異常成長表現型を示す。ＰＣａのタイプの１つは、去勢抵抗性ＰＣａ（ＣＲＰＣ）である。
【０１４８】
本発明の一実施形態は、前立腺がんを処置する方法を含む。
【０１４９】
いくつかの事例では活動的であるが、ほとんどの前立腺がんは成長が遅い。当該がん細胞は、前立腺から身体の他の部位、例えば、骨またはリンパ節などに転移し得る。前立腺がんは、疼痛、排尿の困難、性交の際の問題、および／または勃起機能不全を引き起こし得る。
【０１５０】
前立腺がんの存在は、症状、身体的検査、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、または生体組織検査によって示され得る。
【０１５１】
アンドロゲンレセプター、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２、ＨＰＣ１、ビタミンＤレセプター、ならびにＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２−ＥＴＶ１／４などの多くの異なる遺伝子が、前立腺がんに関係している。関連する腫瘍抑制遺伝子としては、Ｐ５３、ＰＴＥＮ、およびＫＡＩ１、Ｅ−カドヘリン、およびＣＤ４４が挙げられる。
【０１５２】
前立腺がんは、アデノカルチノーマまたは腺がんであり、これは、正常な精液分泌前立腺腺細胞ががん細胞へと変異した場合に生じる。腺癌が最も一般的に見られる前立腺の領域は、辺縁帯である。最初に、がん細胞の小さな塊が、他の正常な前立腺に閉じ込められたままとなり、これは、上皮内癌または前立腺上皮細胞内新生物（ＰＩＮ）として知られている状態である。時間の経過と共に、これらのがん細胞は増殖し始め、周囲の前立腺組織（間質）へと広がって腫瘍を形成する。最終的に、当該腫瘍は、貯精嚢または直腸などの付近の器官に侵入するほど十分に大きく成長し得るか、または腫瘍細胞が、血液およびリンパ系において移動する能力を発現し得る。前立腺がんは、身体の他の部分に侵入することができる細胞の塊であるため、悪性腫瘍と見なされる。この器官への侵入は、転移と呼ばれる。最も一般的には、前立腺がんは、骨、リンパ節に転移し、ならびに直腸、膀胱、および尿管下部にも侵入し得る。
【０１５３】
アンドロゲンレセプターの過剰発現および／または変異は、乳がんを含むいくつかの他の疾患に関係している。
【０１５４】
アンドロゲンレセプター関連疾患：乳がん
アンドロゲンレセプターは、原発性乳房腫瘍において頻繁に発現され、発現は、乳がんの研究およびそのサブタイプに応じて、５０％から９０％までの間であると見積もられている。Birrell et al. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 52: 459-467 (1995); Moinfar et al. Cancer 98: 703-711 (2003); Buchanan et al. Cancer Res. 65: 8487-8496 (2005); Doane et al. Oncogene 25: 3994-4008 (2006);およびGonzalez-Angulo et al. Clin. Cancer Res. 15: 2472-2478 (2009)を参照されたい。しかしながら、ＡＲが腫瘍抑制因子または発癌遺伝子として機能したか否かは明らかではない。この多機能的役割は、ＡＲが関係していると報告されている多くの経路によって部分的に説明することができるが、アンドロゲンは、反対の機能を有し得る黄体ホルモンおよびエストロゲンの合成経路の間に位置しているので、代謝性の観点からも説明できる。Iacopetta et al. Drug Disc. Today: Disease Mech. (2012)。
【０１５５】
いくつかのシグナリングメカニズムが全て、乳がんにおけるＡＲ機能に寄与している。ＡＲは、以下の３つの方式：（ｉ）ＡＲが、ＤＮＡにおいてコードされる遺伝子の発現と相互作用し、ならびにそれを直接制御する、ゲノムシグナリング；（ｉｉ）細胞核レセプターが他のタンパク質との相互作用を介してシグナリングを行う非ゲノムシグナリング（２つのシグナリングメカニズムの間にクロストークが存在するがまだ完全には理解されていない）；ならびに（ｉｉｉ）成長因子およびサイトカインによるクロストークを介したシグナリングによって効果を発揮することが報告されている。Rahman et al. Trends Endocrin. Metab. 18: 371-378 (2007);および Iacopetta et al. Drug Disc. Today: Disease Mech. (2012)を参照されたい。
【０１５６】
ＡＲは、エストロゲンレセプター（ＥＲ）陽性腫瘍および陰性腫瘍の両方において潜在的な臨床的有益性を有する。ＥＲと比べて、ＡＲは、ヒト乳がんにおいて変化するその役割に関連する独特な機能性ドメインを有している。ＥＲ陽性腫瘍の大部分は、ＡＲを発現し、ＥＲ陰性腫瘍のかなりの割合が、ＡＲおよびＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２発癌遺伝子の混合性標的化から恩恵を受けるかもしれない。ＡＲのシグナリングの下流も、乳がんにおいて新たに注目された臨床的標的でもある、多くの臨床的に重要な経路に、影響を及ぼすかもしれない。ＡＲの発現も、転移性疾患への腫瘍の進行の際に、ある役割を果たすかもしれない。レビューでは、Iacopetta et al. 2012. Drug Disc. Today: Disease Mechを参照されたい。
【０１５７】
いくつかの研究において、アンドロゲンレセプターは、乳がんの６０％から８５％において発現し、いくつかの場合においては、エストロゲンレセプター（ＥＲ）またはプロゲステロンレセプター（ＰＲ）よりも高度に発現される。さらに、疫学的研究から、アンドロゲンの高血中濃度が、特に閉経後の女性において、乳がんを発症するリスクの増加に関連することが見出された。乳房細胞に対するアンドロゲンの影響が主に増殖性であるかそれとも反増殖性であるかが不明であるため、乳房におけるアンドロゲンの生物学的役割についての理解は不完全である。最近、乳がん細胞株に対するアンドロゲンの影響および乳がんにおけるアンドロゲンレセプター経路の潜在的役割が調査された。結果は、乳がんにおけるアンドロゲンレセプター刺激および経路活性化の反増殖性の効果の可能性を示唆している。
【０１５８】
最近、浸潤性乳がんの分子的に定義されたカテゴリでの（特に三種陰性（またはｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ群）群ならびにホルモンレセプター陰性であると考えられるＨＥＲ２群での）アンドロゲンレセプターの発現の評価に関心が持たれている。しかしながら、インサイチューでの、分子表現型との関連における、あるいは導管性癌を有する女性においての、アンドロゲンレセプターの発現を調査する大集団ベースの研究が欠けている。したがって、本開示の目的は、乳がんを有する女性の、よく特徴付けられた大集団を用いて、腫瘍の病期、病理学的特徴、および分子表現型との関連におけるアンドロゲンレセプターの発現を調べることである。Collins et al. 2011 Mod. Pathol. 24: 924-931およびそれらの中で引用された参考文献を参照されたい。
【０１５９】
Collins et al. 2011 Mod. Pathol. 24: 924-931も、全体で浸潤性乳癌の７７％がアンドロゲンレセプター陽性であることを見出した。２，１７１の浸潤性がんの内、６４％がｌｕｍｉｎａｌ  Ａ、１５％がｌｕｍｉｎａｌ  Ｂタイプ、６％がＨＥＲ２タイプ、ならびに１１％がｂａｓａｌ−ｌｉｋｅタイプであった。アンドロゲンレセプター発現の頻度は、分子表現型によって著しく変わった（ｐ＜０．０００１）。特に、アンドロゲンレセプターの発現は、ｌｕｍｉｎａｌ  Ａタイプのがん（９１％）およびｌｕｍｉｎａｌ  Ｂタイプのがん（６８％）において一般的に観察されるが、ＨＥＲ２タイプのがん（５９％）では、頻繁には見られない。エストロゲンおよびプロゲステロンレセプター発現の不在によって定義され、かつホルモン性無反応であると考えられているにもかかわらず、ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅタイプのがんの３２％は、アンドロゲンレセプターを発現した。インサイチューの腺管上皮内癌の２４６の症例の内、８６％がアンドロゲンレセプター陽性であったが、アンドロゲンレセプター発現の頻度は、分子表現型によって有意に異なり（ｐ＝０．００１）、高細胞核グレードの病変は、より低いグレードの病変と比較して、アンドロゲンレセプター陽性ではなさそうであった。
【０１６０】
ＭＤＶ３１００は、少なくともいくつかのタイプの乳がんに対する可能な処置として提案されてきた。Naderi et al. Breast Cancer Res. 13: R36 (2011)。したがって、ＡＲ（Ｆ８７６）またはＡＲ（Ｗ７４１／Ｔ８７７）の二重変異を発現する試料の乳がん患者は、ＭＤＶ３１００に対して耐性であるように思われるので、本開示は、上記のタイプのＡＲ関連疾患の処置においてこの薬物を使用する可能性に対する意義を有する。
【０１６１】
したがって、アンドロゲンレセプターの過剰発現および／より多くの変異が、いくつかの疾患（例えば、前立腺がんおよび乳がんなどのがん）ならびに他の障害（例えば、ポリグルタミン酸病、脱毛症（例えば、アンドロゲン性脱毛症）、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、ならびにケネディ病など）において示された。
【０１６２】
したがって、本開示は、Ｆ８７６における変異またはＷ７４１／Ｔ８７７における二重変異を含む（任意により、他の変異を含む）ＡＲまたはその断片もしくはバリアントであって、患者の層別化および／またはアンドロゲンレセプター関連疾患（例えば、上記において列挙されたものなど）の処置における使用のための新規の治療法の創出において有用である、ＡＲまたはその断片もしくはバリアントに関する。患者の層別化および処置におけるこれらの変異の可用性について、下記において詳細に述べる。
【０１６３】
アンドロゲンレセプター関連疾患の処置
本開示は、ＡＲ関連疾患の診断、予後診断、および処置にとって有用な、アンドロゲンレセプターにおける変異に関する。これらの変異の存在または不在は、様々な異なるタイプの疾患の処置の中から決定するために使用することができる。
【０１６４】
これらの処置は、細胞の増殖を抑制するため、および個体の疾患を緩和するために有用である。これらの処置は、有効量または治療量において提供されるであろう。
【０１６５】
本明細書において使用される場合、「処置」は、これに限定されるわけではないが、前立腺細胞の増殖の抑制などの有益なもしくは望ましい臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的にとって、有益なもしくは望ましい臨床結果としては、これらに限定されるわけではないが、検出可能であるかまたは検出不能にかかわらず、症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の状態の安定化（すなわち、非悪化）、疾患の広がり（すなわち、転移）の予防、疾患進行の遅延または鈍化、疾患状態の改善または緩和、人生の楽しみの質の向上、寛解（部分的または総合的にかかわらず）、が挙げられる。「処置」は、処置を受けなかった場合に予想される生存に比べてより長い生存も意味し得る。例えば、処置は、細胞の増殖を抑制することが可能であり得るか、または疾患を緩和することが可能であり得る。
【０１６６】
「細胞の増殖を抑制する」は、細胞の増殖、例えば、前立腺細胞、転移性腫瘍を含む前立腺由来腫瘍細胞、またはＰＳＡを発現する任意の細胞、あるいは乳房組織、特に乳がん細胞、の増殖が阻害されることを意味する。
【０１６７】
疾患の「緩和」は、本発明のポリアミン類似体コンジュゲートを投与しない場合と比べて、疾患の状態の程度および／または望ましくない臨床症状が和らぎ、かつ／または進行の時間経過が鈍化もしくは延長されることを意味する。
【０１６８】
本開示はさらに、処置の有効量もしくは治療量を使用した、個体の処置にも関する。
【０１６９】
「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳類としては、これらに限定されるわけではないが、家畜、スポーツ動物、齧歯動物、霊長動物、および愛玩動物が挙げられる。好ましくは、個体は、前立腺疾患、例えば、ＢＰＨ、前立腺炎、および／または前立腺がんなどを患っていることが知られているかまたは患っていることが疑われる。
【０１７０】
「有効量」または「治療量」は、有益なもしくは望ましい臨床結果を達成するのに十分な量である。有効量は、１回または複数回投与において投与することができる。本発明の目的のために、ポリアミン類似体コンジュゲートの有効量は、症状の進行を、緩和し、改善し、安定させ、回復させ、鈍化させ、または停滞させるのに十分な量である。本発明のポリアミン類似体コンジュゲートの治療量は、前立腺細胞の増殖を阻害するのに十分な量である。ポリアミン類似体コンジュゲートは、例えば、少なくとも１つのタイプの前立腺がん細胞株に対して有効な場合、たとえ異なる細胞株に対しては有効でなくても、前立腺疾患を処置するための有効な薬剤であると見なされる。
【０１７１】
アンドロゲンレセプター関連疾患の処置：様々な治療法および処置
様々な異なる処置がＡＲ関連疾患に対して使用されている。本開示は、患者の層別化および可能な疾患処置の決定において有用である、ＡＲにおける特定の変異に関する。
【０１７２】
例えば、患者がＡＲ（Ｆ８７６）を示す場合、ＭＤＶ３１００を含む処置は有用ではないであろうが、ＭＤＶ３１００を含まない処置（例えば、ビカルタミド、ＬＥＥ０１１、治療的核酸、または他の処置）は使用することができる。患者がＡＲ（Ｗ７４１／Ｔ８７７）を示す場合、ＭＤＶ３１００またはビカルタミドを含む処置は有用ではないであろうが、これらの成分のどちらも含まない処置（例えば、ＬＥＥ０１１もしくはＰＤ０３３２９９１などのＣＤＫ４／６阻害剤、治療的核酸、または他の処置）は使用することができる。
【０１７３】
ＭＤＶ３１００および／またはビカルタミドを含まない、ＡＲ関連疾患のための様々な他の処置が使用されてきた。これらは、外科手術（例えば、根治的前立腺切除術）、様々な形態の放射線治療（例えば、近接照射療法および外照射療法）、高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）、凍結外科手術、ならびにホルモン療法および／または化学療法薬を含む。ＡＲ関連疾患のためのさらなる治療法としては、これらに限定されるわけではないが、化学的および外科手術的性腺摘除を含むアンドロゲン枯渇療法、グリシルサイクリン、ベンジル性オキシインドールピリミジン、チエノピリジン誘導体、デスチアゾリルリトナビル、インドリン−２−オン、およびアザ−インドリン−２−オン、イソフラボン誘導体、ニトリル誘導体、ｓｔａｔ５阻害剤、プロトンポンプ阻害剤、シクロプロピルジカルボキシアミドおよび類似体、３−デスオキシ−２−メチレン−１９−ノル−ビタミン−Ｄ類似体、および核酸療法が挙げられる。ＵＳ２０１２／０３２９７６１；ＵＳ２０１２／０３２９７７１；ＵＳ２０１２／３２９７７４；ＵＳ２０１２／０３２９８４１；ＵＳ２０１２／０３２１６３９；ＵＳ２０１２／０３２２８２０；ＵＳ２０１２／０３２２８３４；ＵＳＰＮ８，３３８，４２２；ＵＳＰＮ８，３３８，６２４；ＵＳＰＮ８，３３８，４５４；ＷＯ２０１２／１７４０９５。アンドロゲンレセプター（ＡＲ）関連疾患、例えば、去勢抵抗性Ｐｃａ（ＣＲＰＣ）を含む前立腺がん（ＰＣ）などの前立腺疾患、および乳がん、ならびに他のＡＲ関連障害、例えば、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、ならびにケネディ病などを処置するためのさらなる治療法は、当技術分野において既知である。
【０１７４】
ＭＤＶ３１００、ビカルタミド、ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、ＬＥＥ０１１またはＰＤ０３３２９９１）、および治療的核酸による処置について、以下においてより詳細に説明する。
【０１７５】
アンドロゲンレセプター関連疾患の処置：ＭＤＶ３１００
「ＭＤＶ３１００」、「ＭＤＶ−３１００」、「エンザルタミド」、「ＸＴＡＮＤＩ」（登録商標）（商標）、「ＸＴＡＮＤＩ（登録商標）カプセル剤」などは、４−｛３−［４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニル］−５，５−ジメチル−４−オキソ−２−スルファニリデンイミダゾリジン−１−イル｝−２−フルオロ−Ｎ−メチルベンズアミドの化学名の、Ａｓｔｅｌｌａｓ  Ｐｈａｒｍａ  ＵＳ，  Ｉｎｃ．（ノースブルック、ＩＬ）およびＭｅｄｉｖａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．（サンフランシスコ、ＣＡ）によって市販されているアンドロゲンレセプター阻害剤を意味する。ＸＴＡＮＤＩ（登録商標）の活性成分はエンザルタミドであり、不活性成分は、カプリロカプロイルポリオキシルグリセリド、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、ゼラチン、ソルビトールソルビタン溶液、グリセリン、精製水、二酸化チタン、黒色酸化鉄である。ＭＤＶ３１００は、強力な抗アンドロゲン剤であり、アゴニスト活性を欠く。Tran et al. Science 324,787-790(2009)。ＭＤＶ３１００は、以前にドセタキセルの処置を受けたことがある去勢抵抗性の転移性前立腺がんを有する患者の処置に対して提示される。参考文献として、Scher et al. N. Engl. J. Med. 2012; 367:1187-1197;ならびに米国特許第７，７０９，５１７号および同第８，１８３，２７４号を参照されたい。
【０１７６】
ＭＤＶ３１００は、アンドロゲンレセプターの過剰発現を有する前立腺がんモデルにおける活性に基づいた臨床開発のために、Ａｓｔｅｌｌａｓ  ＰｈａｒｍａおよびＭｅｄｉｖａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．によって選択される。エンザルタミドは、アンドロゲンレセプターの核移行、ＤＮＡ結合、およびコアクチベータ漸増を阻害するという点において、現在利用可能な抗アンドロゲン剤とは異なっている。それは、当該レセプターに対してより強い親和性も有しており、（従来の薬剤は成長を遅らせるのみである）異種移植モデルにおいて腫瘍の縮小を誘導し、既知のアゴニスト活性を有さない。前臨床研究において、ＭＤＶ３１００は、細胞死を誘導し、増殖を低下させ、腫瘍体積を減少させるように、前立腺がん細胞内において作用する。ＭＤＶ３１００は、アンドロゲンレセプターへのアンドロゲンの結合を拮抗阻害し、アンドロゲンレセプターの核移行を阻害し、ＤＮＡとのアンドロゲンレセプターの相互作用を阻害し、ならびに細胞死を誘導し、前立腺がん細胞の増殖を低下させ、腫瘍体積を減少させる。
【０１７７】
ＭＤＶ３１００に対して、いくつかの禁止、警告、および注意が存在する。ＭＤＶ３１００は、妊婦に投与された場合、その作用メカニズムに基づいて、胎児への害の原因となり得る。女性での使用に対して、ＭＤＶ３１００は提示されない。妊婦もしくは妊婦になり得る女性に対してＭＤＶ３１００は禁止されている。
【０１７８】
無作為臨床試験において、ＸＴＡＮＤＩの患者の０．９％に痙攣が生じた。プラセボの患者は、痙攣を生じなかった。痙攣を起こした患者は、永久的に治療を中止した。全ての痙攣は解けた。痙攣閾値を下げることが知られている医薬を服薬している、痙攣の病歴を有する患者、または痙攣に対する他のリスク因子を有する患者は、臨床試験から除外した。ＸＴＡＮＤＩ使用に関連する痙攣のリスクから、患者は、突然の意識喪失が彼らもしくは他の人に重大な害を及ぼし得るような任意の活動に従事する場合の危険性について知らされるべきである。
【０１７９】
無作為臨床試験においてＸＴＡＮＤＩを受けた患者において報告されている最も一般的である有害薬物反応（≧５％）は、無力症／疲労、背痛、下痢症状、関節痛、顔面潮紅、末梢性浮腫、筋骨格痛、頭痛、上気道炎、筋力低下、眩暈、不眠、下気道感染、脊髄圧迫および馬尾症候群、血尿、知覚異常、不安症、および高血圧症であった。
【０１８０】
ＭＤＶ３１００の薬物相互作用。ＭＤＶ３１００は、ヒトにおいて強いＣＹＰ３Ａ４誘導物質ならびに中等度のＣＹＰ２Ｃ９およびＣＹＰ２Ｃ１９誘導物質である。強いＣＹＰ２Ｃ８誘導物質の投与は、ＭＤＶ３１００に対する血漿曝露を増加させ得る。ＭＤＶ３１００と強いＣＹＰ２Ｃ８誘導物質との併用投与は、可能であれば避けるべきである。ＭＤＶ３１００の併用投与が避けられない場合、ＭＤＶ３１００の適用量を減らさなければならない。ＭＤＶ３１００と強いもしくは中等度のＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ２Ｃ８誘導物質との併用投与は、ＭＤＶ３１００に対する血漿曝露を変え得るので、可能であれば避けるべきである。狭い治療指数のＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９、およびＣＹＰ２Ｃ１９基質では、ＭＤＶ３１００がこれらの薬物の血漿曝露を減少させ得るので、避けるべきである。ＭＤＶ３１００がワルファリン（ＣＹＰ２Ｃ９基質）と併用投与される場合、さらなるＩＮＲモニタリングを行うべきである。
【０１８１】
推奨されるエンザルタミドの適用量およびスケジュールは、経口による１６０ｍｇの１日１回投与である。
【０１８２】
ＭＤＶ３１００は、前立腺疾患の患者への使用が承認されているが、少なくともいくつかのタイプの乳がんに対する潜在的処置として位置付けられている。Naderi et al. Breast Cancer Res. 13: R36 (2011)。
【０１８３】
ＭＤＶ３１００は臨床試験において素晴らしい効力を示したが、初期において好ましく反応した人の多くは、後に、この第２世代抗アンドロゲン剤に対する耐性を発現した。Kim et al. Curr. Treat. Opt. Oncol. 13: 189-200 (2012)。本開示は、インビトロでのＭＤＶ３１００による長期間の処置後のＬＮＣａＰ細胞における自然耐性のモデルの世代を示す。これらの細胞株の実験から、ＭＤＶ３１００に対して高度に特異的なアンタゴニストからアゴニストへの切り替えを付与するＡＲのリガンド結合ポケットにおける高度に再発性のＦ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ変異が明らかとなった。この新規の変異は、ビカルタミドの細胞増殖抑制的な影響に対する感受性を維持しつつ、ＭＤＶ３１００に対して特異的な遺伝子的および表現型的耐性を駆動する。
【０１８４】
したがって、本開示は、ＡＲにおけるＦ８７６での変異またはＷ７４１／Ｔ８７７での二重変異が、ＭＤＶ３１００に対する耐性を生じさせることを示す。当該Ｆ８７６変異は、実際に、ＭＤＶ３１００に対するアンタゴニストからアゴニストへの切り替えを生じさせ得る。したがって、ＡＲ（Ｆ８７６）変異を示す細胞は、ＭＤＶ３１００で処置することができないが、ＭＤＶ３１００を含まない他の処置、例えば、ビカルタミドなどに対しては感受性のままである。
【０１８５】
アンドロゲンレセプター関連疾患の他の処置：ビカルタミド
「ビカルタミド」およびその商標「ＣＡＳＯＤＥＸ」、「ＳＡＮＤＯＺ  ＢＩＣＡＬＵＴＡＭＩＤＥ」、「ＣＯＳＵＤＥＸ」、「ＣＡＬＵＴＩＤＥ」、「ＫＡＬＵＭＩＤ」などは、Ｎ−［４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニル］−３−［（４−フルオロフェニル）スルホニル］−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドの化学名の非ステロイド性抗アンドロゲン剤を意味する。Furr. Eur. Urol. 29 Suppl 2: 83-95(1996); Furr. Urology 47 (1A Suppl): 13-25; discussion 29-32 (1996); Schellhammer et al. Urology 50 (3): 330-6 (1997); Waller et al. J. Mol. Endocrinol. 24 (3): 339-51 (2000); Muderris et al. Gynecol. Endocrinol. 16 (1): 63-6 (2002); Schellhammer. Expert Opin Pharmacother 3 (9): 1313-28 (2002);  Fradet et al. Expert Rev Anticancer Ther 4 (1): 37-48 (2004);  Chen et al. Mol. Interv. 5 (3): 173-88 (2005); Klotz Urol. Clin. North Am. 33 (2): 161-6, v-vi (2006); Journal of cancer research and clinical oncology 132 Suppl 1: S7-16 (2006);およびLevine et al. Cancer 110 (11): 2448-56 (2007)。
【０１８６】
ビカルタミドは、非ステロイド性抗アンドロゲン剤として知られる医薬の群に属する。他の非ステロイド性抗アンドロゲン剤はフルタミドである。ビカルタミドなどの非ステロイド性抗アンドロゲン剤は、身体において男性ホルモンテストステロンの効果を妨げる。
【０１８７】
ビカルタミドは、後期（転移性）前立腺がんの処置のために、（黄体形成ホルモン放出ホルモン類似体（ＬＨＲＨ）と呼ばれる医薬または睾丸を取り除く外科手術のいずれかを有する）身体中のテストステロンの量を減じる他の処置と組み合わせて使用される。ビカルタミドは、非ステロイド性抗アンドロゲン剤として知られている医薬の群に属する。
【０１８８】
他の非ステロイド性抗アンドロゲン剤はフルタミドである。ビカルタミドなどの非ステロイド性抗アンドロゲン剤は、身体において男性ホルモンテストステロンの効果を妨げる。
【０１８９】
ビカルタミドは、後期（転移性）前立腺がんの処置のために、（黄体形成ホルモン放出ホルモン類似体（ＬＨＲＨ）と呼ばれる医薬または睾丸を取り除く外科手術のいずれかを有する）身体中のテストステロンの量を減じる他の処置と組み合わせて使用される。
【０１９０】
ビカルタミドは、ホルモン感受性前立腺がんにおいてＡＲに対する阻害効果を有するが、がんがホルモン耐性になるとＡＲを抑制できない。現在の抗アンドロゲン剤の２つの弱点は、ホルモン感受性段階からホルモン耐性疾患への前立腺がんの進行を防ぐことができないこと、およびホルモン耐性前立腺がんを効率的に処置できないことの原因とされている。ホルモン耐性前立腺がんにおいてＡＲが過剰発現される場合、一方は、それらの弱いアンタゴニスト活性であり、他方は、それらの強いアゴニスト活性である。したがって、より強力なアンタゴニスト活性および最小のアゴニスト活性を有するより良好なＡＲ阻害剤が、疾患の進行を遅延させるため、ならびに致命的なホルモン耐性前立腺がんを処置するために必要である。
【０１９１】
ビカルタミドなどの非ステロイド性抗アンドロゲン剤は、より選択的でかつ副作用が少ないため、前立腺がんに対してステロイド系化合物よりも好ましかった。このクラスの化合物は、多くの特許、例えば、米国特許第４，０９７，５７８号、米国特許第５，４１１，９８１号、米国特許第５，７０５，６５４号、ＰＣＴ国際出願ＷＯ９７／０００７１およびＷＯ００／１７１６３、ならびに米国特許出願公開第２００４／０００９９６９号などに記載されており、なお、当該文献の全ては、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１９２】
ビカルタミドは、アンドロゲンの作用を妨げるために、単独療法としてまたは性腺摘除との組み合わせにおいて、長年にわたって臨床的に使用されてきた。しかしながら、ＣＲＰＣの場合、ビカルタミドは、アンタゴニストからアゴニストへの切り替えを受け、逆に、ＡＲシグナリング活性を強めてしまう。Culig. Et al. Brit. J. Cancer 81: 242-251 (1999)。
【０１９３】
ＡＲにおけるＷ７４１／Ｔ８７７二重変異が、細胞をビカルタミドに対して耐性にすることが知られている。本開示はさらに、この二重変異が細胞をＭＤＶ３１００に対して耐性にすることも示す。
【０１９４】
本開示はさらに、ＡＲにおけるＦ８７６変異が、細胞をＭＤＶ３１００に対して耐性にするが、ビカルタミドに対しては耐性にしないことも示す。したがって、ビカルタミドは、ＡＲ（Ｆ８７６）変異を有する細胞に対する治療法として使用することができる。
【０１９５】
ビカルタミドに加えて、アンドロゲンレセプター関連疾患のための、ＭＤＶ３１００を含まない他の治療法が存在し、それについては下記において説明する。
【０１９６】
アンドロゲンレセプター関連疾患のための他の治療法：ＬＥＥ０１１
ＬＥＥ０１１（Ｌｅｅ  ０１１、Ｌｅｅ０１１、ＬＥＥ−０１１、およびＬＥＥ  ０１１とも表される）（ＮｏｖａｒｔｉｓおよびＡｓｔｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、ＣＤＫ４／６の活性を阻害するように設計された新しい経口薬である。ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６９５９５；ＷＯ２０１０／０２０６７５；およびＷＯ２０１１／１３０２３２を参照されたい。
【０１９７】
ＬＥＥ０１１の化学名は、７−シクロペンチル−２−（５−ピペラジン−１−イル−ピリジン−２−イルアミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−カルボン酸ジメチルアミドである。ＬＥＥ０１１の構造は以下の通りである。
【０１９８】
【化８】
2016516005.tif 000009
【０１９９】
ＬＥＥ０１１は、がん細胞においてＲｂの完全な脱リン酸化およびＧ１停止を誘発する。ＣＤＫ４／６は、正常な細胞およびがん細胞の両方が分裂し増殖することを可能にするプロセスに関係している。がん細胞は、多くの場合、ＣＤＫ４の活性を増加させる異常によって、分裂し増殖するように駆動される。したがって、ＣＤＫ４の活性を妨げることによって、乳がんおよび前立腺がんを含むいくつかのがんの成長を鈍化させることができる望みがある。
【０２００】
本開示は、ＡＲにおけるＦ８７６変異が細胞をＭＤＶ３１００に対して耐性にすることを示す。Ｗ７４１／Ｔ８７７二重変異は、細胞をビカルタミドに対して耐性にすることが知られており、ここでは、細胞をＭＤＶ３１００に対して耐性にすることが示された。しかしながら、本明細書において示されるように、ＡＲにおけるＦ８７６変異またはＷ７４１／Ｔ８７７二重変異のどちらかを有する細胞は、関連のない細胞増殖抑制剤ＬＥＥ０１１に対して感受性のままである。
【０２０１】
さらに、ＬＥＥ０１１、ＰＤ０３３２９９１、および他のＣＤＫ４／６阻害剤は、ＡＲが野生型であるＡＲ関連疾患に対する治療法として有用である。例えば、本明細書において示されるように、ＷＴ（野生型）ＡＲを発現しかつＭＤＶ３１００処置条件下においてＡＲシグナリングならびにＤＨＦｒおよびＴＫ１の発現を維持することができるＰＣａ株も、ＣＤＫ４／６抑制に対して強い感受性を示した。
【０２０２】
ＬＥＥ０１１はさらに、ＡＲ関連疾患の処置方法において、１つまたは複数の他の治療法および／または処置との併用療法の一部としても使用することもできる。
【０２０３】
アンドロゲンレセプター関連疾患のための他の治療法：ＰＤ０３３２９９１
ＣＤＫ４／６阻害剤であるＰＤ−０３３２９９１［またはＰＤ０３３２９９１もしくはＰＤ０３３２９９］は、乳がんを含む多発性悪性腫瘍に対してフェーズＩＩ臨床試験にある、強力な細胞増殖抑制剤である。Finn et al. 2009 Breast Cancer Res. 11: R77; Thangavel et al. 2011 End. Relat. Cancer 18: 333-45; Dean et al. 2010 Oncogene 29: 4018-32; および Dean et al. 2012 Cell Cycle 11: 2756-2761。
【０２０４】
本開示は、ＰＤ０３３２９９１がＡＲ関連疾患のための治療法として使用することができることを示す。これは、ＡＲがＦ８７６の変異を含む、ＡＲ関連疾患を含む。さらに、ＰＤ０３３２９９１、ＬＥＥ０１１および他のＣＤＫ４／６阻害剤は、ＡＲが野生型であるＡＲ関連疾患に対する治療法として有用である。例えば、本明細書において示されるように、ＷＴ（野生型）ＡＲを発現しかつＭＤＶ３１００処置条件下においてＡＲシグナリングならびにＤＨＦｒおよびＴＫ１の発現を維持することができるＰＣａ株も、ＣＤＫ４／６抑制に対して強い感受性を示した。
【０２０５】
アンドロゲンレセプター関連疾患のための他の治療法：治療的核酸および誘導体
いくつかの群は、アンドロゲンレセプター関連疾患の処置にとって有用な治療的核酸を示した。これらは、アンチセンス核酸、モルフォリン、ｓｉＲＮＡなどを含む。
【０２０６】
Ｗ０９７／１  １  １７０では、良性前立腺過形成または前立腺がんを有するとして診断された患者を処置する方法であって、アンドロゲンレセプターｍＲＮＡに対して選択的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する工程を含む方法について報告されている。２７〜２９のヌクレオチドの間の３つのアンチセンスオリゴヌクレオチド配列が開示されている。ＵＳ６，７３３，７７６およびＥＰ０６９２９７２では、アンドロゲンレセプター遺伝子にハイブリダイズするアンチセンス核酸を含むリポソームを適用することによってアンドロゲン性脱毛症を処置する方法について報告されている。しかし、特異的な配列を有し、アンドロゲンレセプターを標的とする、アンチセンス分子は提供されていない。ＵＳ２００５／０１６４９７０では、アンドロゲンレセプターｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ複合体を使用した前立腺がんの処置方法について報告されている。ＷＯ２００５／０２７８３３では、１２〜４０の間のモルフォリノサブユニット長のモルフォリノオリゴヌクレオチドを患者に投与する工程を含む、前立腺がんを処置する方法について報告されている。ＷＯ２００３／０８３７４０では、ヒトアンドロゲンレセプターを標的とする、１８〜２０の間の連続するユニットの荷電されていないモルホリノ骨格を有するアンチセンス化合物について報告されている。モルフォリノアンチセンス化合物は、他の分子、例えば、ｍＲＮＡスプライシングまたは翻訳開始に関与する分子などによるｍＲＮＡへのアクセスを妨げるために核酸標的への結合を介して作用する。ＵＳ７，０６７，２５６では、おそらくアンドロゲンレセプターの不活性化を媒介すると思われるリボザイムについて報告されている。アンドロゲンレセプターｍＲＮＡの対応する領域に対する１９のヌクレオチドＲＮＡ分子アンチセンスが提供される。ＷＯ２０１２／０６５０５１では、アンドロゲンレセプターに対するｓｉＲＮＡについて記載されている。
【０２０７】
本開示は、ＡＲにおけるＦ８７６変異またはＷ７４１／８７７二重変異を有する細胞がＭＤＶ３１００に対して耐性であることを示す。しかしながら、いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、本開示は、治療を十分な量において細胞に提供することができる場合に限り、ＭＤＶ３１００を含まない治療法、例えば、治療的核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）など、が、これらの細胞に対して有効であると推測する。
【０２０８】
さらに、本発明者らは、本明細書において、ＣＤＫ４／６の標的化が、ＣＤＫ４／６阻害剤であるＬＥＥ０１１およびＰＤ０３３２９９を使用した、ＭＤＶ３１００耐性を克服するための治療戦略であることを示す。
【０２０９】
本発明者らはさらに、Ｆ８７６Ｌバリアントがビカルタミドに対する感受性を維持することも実証するが、アンドロゲン枯渇と一緒に同時もしくは順次のいずれかによる、構造的に異なる抗アンドロゲン剤との併用療法は、診療所においてＡＲ耐性メカニズムに抵抗するための魅力的な治療戦略を提供し得る。
【０２１０】
さらに、ＣＤＫ４／６阻害剤によるＣＤＫ４／６の標的化は、アンドロゲンレセプター関連疾患に対する有効な治療戦略であり、この場合、ＡＲはＷＴであるか、またはＦ８７６などの変異を有する。
【０２１１】
ＡＲ（Ｆ８７６）ポリヌクレオチド
別の態様において、本開示は、配列番号５４の配列を有し、かつ／または位置８７６を含む、配列番号５４の少なくとも５個の連続するアミノ酸をコードする配列に対して検出可能にハイブリダイズすることができる、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド（０、１つ、２つ、または３つのミスマッチを含む）を含むポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドであって、位置８７６のアミノ酸が、フェニルアラニン（Ｆ）以外のアミノ酸であり、ハイブリダイゼーションが、０．１×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳ中において５０℃で１５分間の洗浄を含む条件下である、ポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドを提供する。そのようなポリヌクレオチドは、細胞または組織または患者内のＡＲ（Ｆ８７６）ポリヌクレオチドの存在の検出にとって、あるいは、ＡＲ（Ｆ８７６）に対する治療的核酸の製造にとって、有用であり得る。様々な態様において、当該治療的核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ（様々な修飾および／またはエンドキャップの有無における、小さいもしくは短い干渉ＲＮＡ）、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ（ｄｓＲＮＡの一部がｄｓＤＮＡで置換されていることを除いて、ｓｉＲＮＡと同様である）、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＴＮＡ（トレオース核酸）、ＧＮＡ（グリコール核酸）、モルホリノ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｓｉｓｉＲＮＡ（小さい内部セグメント化されたＲＮＡ）、ａｉＲＮＡ（非対称干渉ＲＮＡ）、または上記のいずれかの組み合わせ（例えば、当該核酸の成分は、上記のものの１つまたは複数、例えば、ＲＮＡ、ＧＮＡ、ＬＮＡ、モルホリノなどで置換されたいくつかのヌクレオチドを有するＲＮＡなどを含む）などである。様々な実施形態において、当該ポリヌクレオチドおよび／またはアンチセンスポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり、ならびに／あるいは、例えば、２’−ＯＭｅ、２’−Ｆ、および／または２’−ＭＯＥによって、ならびに／あるいは、リン酸の修飾および／または置き換えによって（例えば、メチル化されたリン酸、ヒ素、セレンなどによって）、修飾される。さらに、上記のポリヌクレオチドのいずれかを含む発現ベクターならびにそのような発現ベクターによってトランスフォームもしくはトランスフェクトされた宿主細胞も提供される。
【０２１２】
したがって、手短に言えば、本開示は、ＡＲ関連疾患を有する患者の診断、予後診断、および処置（例えば、一連の処置の設計）において有用な、ＡＲにおける特定の変異に関する。
【０２１３】
下記において、特定のＡＲ変異の検出および患者の層別化の方法についてより詳細に説明する。
【０２１４】
患者の層別化の方法ならびにＡＲ（Ｆ８７６）の検出および患者の層別化の方法
さらなる態様内において、本開示は、患者（例えば、ＡＲ関連疾患で苦しめられているか、患っているか、または少なくとも１つの臨床兆候もしくは症状を示すか、発症のリスクがあるかもしくは発症する傾向にあるかもしくは有している疑いのある、患者）におけるもしくは患者からの試料（例えば、細胞もしくは組織試料）における、ＡＲの位置Ｆ８７６での変異の存在もしくは不在を検出する方法を提供する。ＡＲのＦ８７６における変異は、臨床的に関連しているので、そのような変異体ＡＲを示す患者は、ＭＤＶ３１００で処置すべきではなく、むしろ、ＭＤＶ３１００を含まない処置（例えば、ビカルタミドまたはＬＥＥ０１１もしくはＰＤ０３３２９９１などのＣＤＫ４／６阻害剤）によって処置されるべきである。
【０２１５】
試料内の細胞は異種であってもよいこと、すなわち、いくつかはＡＲ（Ｆ８７６）を発現し得る一方で、他のものはＷＴ（野生型）ＡＲおよび／または他の変異体ＡＲを発現し得ることに留意されたい。本明細書において説明される様々な態様において、本開示は、ＡＲ（Ｆ８７６）、ＷＴ  ＡＲ、および／または他の変異体ＡＲの混合物を含み得る試料のＡＲの位置Ｆ８７６における変異を検出する方法に関する。いくつかの態様において、当該方法は、ＡＲ（Ｆ８７６）、ＷＴ  ＡＲ、および／または他の変異体ＡＲの混合物の比率を決定することができる。いくつかの試料において、ＡＲ（Ｆ８７６）は、少数のＡＲ発現細胞にあってもよい。
【０２１６】
様々な態様において、本開示は、（例えば、患者からの）試料における、ＡＲポリヌクレオチドまたはポリペプチドの位置Ｆ８７６での変異を検出する方法であって、（ａ）患者からＡＲを含む試料（例えば、生体試料、組織試料、細胞試料など）を得る工程；および（ｂ）ＡＲが位置Ｆ８７６（アミノ酸の位置は、配列番号５４の付番に従う）に変異を含むか否かを決定するために、ＡＲポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列またはその一部を決定する工程を含む方法を提供する。様々な態様において、当該試料は、依然として患者内および／または患者の一部である。様々な態様において、患者は、ＡＲ関連疾患に苦しめられているか、患っているか、または少なくとも１つの臨床兆候もしくは症状を示すか、かつ／または発症のリスクにあるかもしくは発症する傾向にあるかもしくは有している疑いがある。当該方法は、任意により、患者の診断、予後診断、および／または処置に関し、ならびに任意によりさらに追加の工程：（ｃ）ＡＲがＦ８７６の変異を含まない場合にＭＤＶ３１００を含む治療的組成物を投与する工程もしくはその投与を推奨する工程；または、ＡＲがＦ８７６の変異を含む場合にＭＤＶ３１００を含まない治療的組成物を投与する工程もしくはその投与を推奨する工程を含む。様々な態様において、ＭＤＶ３１００を含まない治療的組成物は、ビカルタミドまたはＬＥＥ０１１もしくはＰＤ０３３２９９１などのＣＤＫ４／６阻害剤、あるいは治療用核酸である。様々な態様において、試料が、ＡＲ（Ｆ８７６）、ＷＴ  ＡＲ、および／または他の変異体ＡＲを発現する細胞の混合物を含むと決定された場合、当該混合物内の異なるタイプの細胞を攻撃するためにいくつかの工程が必要となり得る。
【０２１７】
さらに、ＷＴと様々な変異体ＡＲを示す細胞の比率は、細胞の部分集団が死滅するか、または場合によっては治療によって活性化されて、耐性クローンが生じた場合に変化し得る。したがって、工程（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）は繰り返され得る。
【０２１８】
例えば、ＡＲの位置８７６のアミノ酸がフェニルアラニンかどうかを決定し、患者を層別化する方法は、治療の１ラウンドまたは複数ラウンド後に実施することができる。腫瘍または他の病変組織は、複数のタイプのＡＲ［例えば、ＷＴ  ＡＲ、ならびに／あるいはＡＲ（Ｆ８７６）および／または他の変異体］を含む異種性であってもよい。細胞のこれらの部分集団の比率は、いくつかの細胞が治療によって死滅するかまたは活性化することにより変化し得る。本明細書において開示された実験は、ＭＤＶ３１００へのＬＮＣａＰ細胞の長期間の曝露が、ＭＤＶ３１００に対して耐性のクローンの集団をもたらしたことを示している。他の研究は、ＭＤＶ３１００または他の疾患処置に対する耐性の出現、または変異体である耐性細胞の富化を示していた。耐性が既存であるか（例えば、細胞の小規模の部分集団において）、それとも処置に反応して獲得されたものであるかは、不明瞭であり得ることに留意されたい。したがって、治療の１ラウンドまたは複数ラウンド後、工程（ａ）および（ｂ）を繰り返すことにより、残存する細胞の特徴を決定することができ、工程（ｃ）は、残存する細胞への攻撃のために適切な治療法を選択するために変更することができる。
【０２１９】
様々な態様において、ＡＲの位置８７６のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｆ）であるか否かを決定する方法としては、これらに限定されるわけではないが、とりわけ、核酸配列決定法（例えば、ＤＮＡ配列決定法、ＲＮＡ−ｓｅｑ、タンパク質配列決定法、全トランスクリプトーム配列決定法、または当技術分野において既知の他の方法）の使用、またはＡＲ（Ｆ８７６）に特異的な抗体もしくは核酸の使用が挙げられる。
【０２２０】
様々な態様において、核酸配列決定法は、位置Ｆ８７６を含むか位置Ｆ８７６にまたがるＡＲまたはその一部をコードすることができる核酸、またはＡＲまたはその一部をコードする核酸に対して相補的である核酸の配列決定法に関する。
【０２２１】
様々な態様において、ＡＲの位置８７６のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｆ）であるか否かを決定する方法としては、これらに限定されるわけではないが、とりわけ、ＡＲ（Ｆ８７６）に対して特異的な［例えば、ＡＲ（Ｆ８７６）に結合するかもしくは認識するが、ＷＴ  ＡＲに対してはしない］抗体またはその断片もしくはバリアントの使用が挙げられる。様々な態様において、本開示は、（例えば、患者からの）試料においてＡＲ（Ｆ８７６）発現を検出する方法であって、（ａ）抗体／ＡＲ（Ｆ８７６）複合体の形成を可能にする条件下およびそれに十分な時間において、試料を上記において説明したような抗体もしくはその抗原結合性断片に接触させる工程；および（ｂ）抗体／ＡＲ（Ｆ８７６）複合体のレベルを検出する工程を含む方法を提供する。
【０２２２】
様々な態様において、ＡＲの位置８７６のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｆ）であるか否かを決定する方法としては、これらに限定されるわけではないが、とりわけ、ＡＲ（Ｆ８７６）に対して特異的な［例えば、ＡＲ（Ｆ８７６）に結合するかもしくは認識するが、ＷＴ  ＡＲに対してはしない］核酸の使用が挙げられる。
【０２２３】
さらなる他の態様内において、本開示は、（ａ）試料を、ＡＲ（Ｆ８７６）に対して特異的な核酸またはその断片もしくはバリアントに、ある条件下および試料中の核酸と当該核酸とのハイブリダイゼーションを可能にする十分な時間において接触させる工程；および（ｂ）ハイブリダイゼーションのレベルを検出する工程を含む、試料においてＡＲ（Ｆ８７６）発現を検出する方法を提供する。
【０２２４】
ポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズする、試料中のＡＲ（Ｆ８７６）アンチセンスポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの量は、例えば、配列決定法、ポリメラーゼ連鎖反応、またはハイブリダイゼーションアッセイを使用して決定され得る。
【０２２５】
ＡＲ（Ｆ８７６）活性を調整する薬剤に細胞を接触させる工程を含む、細胞における増殖反応を調整する方法も提供する。
【０２２６】
さらなる態様内において、ＡＲ（Ｆ８７６）活性を調整する薬剤に細胞を接触させる工程を含む、細胞の分化を調整するための方法が提供される。
【０２２７】
本開示はさらに、ＡＲ（Ｆ８７６）活性を調整する薬剤に細胞を接触させる工程を含む、細胞生存を調整する方法も提供する。
【０２２８】
したがって、様々な態様において、本開示は、ＡＲ（Ｆ８７６）を検出する、およびこのポリペプチドを発現するもしくは発現しない患者を層別化する、様々な方法に関する。
【０２２９】
様々な態様において、ＡＲの位置８７６のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｆ）であるか否かを決定する方法としては、これらに限定されるわけではないが、とりわけ、核酸配列決定法（例えば、ＤＮＡ配列決定法、ＲＮＡ−ｓｅｑ、タンパク質配列決定法、全トランスクリプトーム配列決定法、または当技術分野において既知の他の方法）の使用、またはＡＲ（Ｆ８７６）に特異的な抗体もしくは核酸の使用が挙げられる。配列決定法に関連する様々な参考文献については、Morin et al. Nature 476: 298-303 (2011); Kridel et al. Blood 119: 1963-1971 (2012); Ren et al. Cell Res. 22: 806-821 (2012)、およびそれらの中で引用されている参考文献を参照されたい。
【０２３０】
簡潔に言えば、患者からの試料が特定の変異を有するＡＲを含むか否かを決定するために、様々な方法が利用可能である。これらの様々な変異は、患者の層別化にとって、ならびに処置レジメンの設計にとって有用である。
【０２３１】
新規の臨床的に関連するＦ８７６のＡＲ変異はさらに、この変異を含むＡＲポリペプチド、これらのポリペプチドに対する抗体、およびそれらをコードするポリヌクレオチドを使用して、新しい治療法を開発またはスクリーニングすることができるという点においても有用である。
【０２３２】
新規の治療法の開発およびスクリーニングするためのＡＲ（Ｆ８７６）の使用
位置Ｆ８７６の変異は、ＡＲを、ＭＤＶ３１００に対して耐性にし、さらには、この薬物に対してアンタゴニストからアゴニストへの切り替えも引き起こす。したがって、ＡＲ（Ｆ８７６）と相互作用し、ＡＲのそのような変異を有するＡＲ関連疾患の患者の処置にとって有用である、新規の治療法が必要とされている。
【０２３３】
本開示はさらに、他の態様内において、ＡＲ（Ｆ８７６）と相互作用する能力について分子（例えば、潜在的治療法）をスクリーニングする方法であって、（ａ）ある条件下において、候補の分子とＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチドとが相互作用することができる十分な時間において、当該候補の分子をポリペプチドと接触させる工程；ならびに（ｂ）候補の分子の、当該ポリペプチドへの結合の存在もしくは不在および／または当該ポリペプチドと相互作用する能力、またはポリペプチドの少なくとも１つの活性を減じる能力を検出する工程を含む方法を提供する。検出工程は、例えば、ＡＲ（Ｆ８７６）およびＡＲレポーター（例えば、ＡＲＥ［ＷＴまたはＡＴ（Ｆ８７６）が結合しているＤＮＡ配列］を含むポリヌクレオチドなど）、プロモーター、ならびにレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）の使用を含み得る。検出工程は、例えば、候補の分子が、ＡＲレポーターから発現を駆動するＡＲ（Ｆ８７６）の能力を妨げるかもしくは低下させるか否かを決定する工程を含み得る。検出工程は、例えば、アフィニティー精製工程、酵母ツーハイブリッドスクリーニング法、またはファージディスプレイライブラリーのスクリーニング法を含み得る。
【０２３４】
いくつかの態様において、新規の治療法をスクリーニングする方法は、ＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチドまたは、位置８７６のアミノ酸を含むかまたは当該アミノ酸にまたがるその断片もしくはバリアントの使用を伴う。このポリペプチドは、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからの発現を含めた、当技術分野において既知の任意の方法において産生することができる。
【０２３５】
本開示は、ＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチドを産生する方法も包含する。
【０２３６】
本開示はさらに、他の態様内において、ＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチドを産生する方法であって、（ａ）上記において説明したような宿主細胞を、ＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチドの発現が可能な条件下において培養する工程；および（ｂ）宿主細胞培養物からＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチドを単離する工程を含む方法も提供する。
【０２３７】
この変異体ＡＲに感作する薬物のスクリーニングにおいて変異体ＡＲ（Ｆ８７６）を使用するための多くの方法を、容易に考案することができる。
【０２３８】
本開示が適用した２つの方法は、１）トランス活性化、および２）ＡＲ経路を標的とする化合物が変異体ＡＲの機能の阻害剤として使用することができるかどうかを決定するための遺伝子発現分析、を含む。両方の方法は、方法のセクションにおいて明確に概説されている。一方の方法は、実施例７において詳述される。
【０２３９】
簡潔に言えば、対照溶媒（例えば、ＤＭＳＯなど）、関心対象のアゴニスト、または関心対象のアンタゴニストによる処置の前に、トランス活性化アッセイの場合、ＡＲレポーター、コントロールプラスミド、およびＷＴもしくは変異体ＡＲ（Ｆ８７６）プラスミドを同時トランスフェクトする。ＡＲレポーターは、例えば、ＡＲＥ（ＡＲが結合するアンドロゲン応答要素配列）、プロモーター、およびルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子を含む。処置後、レポーター遺伝子（例えば、バイオルミネセンス）の産生物を定量する。ＷＴ  ＡＲは、アゴニスト（例えば、Ｒ１８８１）の存在下においてＡＲレポーターを活性化し、シグナルは、アンタゴニスト、例えば、ＭＤＶ３１００などの存在下において十分に抑制されるはずであることが予想される。しかしながら、ＡＲ（Ｆ８７６）の場合、アゴニストおよびアンタゴニスト、例えば、ＭＤＶ３１００などの存在下でのＡＲレポーター活性が十分に活性化されることが予想される。理想的な新規のアンタゴニストは、ビカルタミドと同様の方式において、ＡＲ（Ｆ８７６）の機能を十分に妨げるであろう。
【０２４０】
トランス活性化アッセイに加えて、カノニカルＡＲ遺伝子、例えば、ＫＬＫ３、ＴＭＰＲＳＳ２、ＮＫＸ３−１、およびＳＬＣ４５Ａ３などの遺伝子発現分析もモニターすることができる。この実験は、ＭＤＶ３１００が新規の化合物で置き換えられ得ることを除いて、本明細書の他の場所で概説された実験と同じである。シグナリングをレスキューするアゴニストとしてＭＤＶ３１００を使用することができるが、新規の化合物は、Ｆ８７６Ｌ−ＡＲ保有細胞でのシグナリング活性の抑制を維持するために有効であり得ることが予想される。
【０２４１】
したがって、ＡＲ（Ｆ８７６）は、この変異体ＡＲに影響を及ぼす新規の薬物および治療法をスクリーニングするために使用されてきたし、使用することができる。
【０２４２】
ＡＲ（Ｆ８７６）に対する抗体
ＡＲ（Ｆ８７６）に対して特異的に結合するがＦ８７６に変異のないＡＲ（したがって、位置８７６にフェニルアラニンを有するＡＲ、断片、もしくはバリアント）には結合しない抗体を開発することができる。
【０２４３】
用語「抗体」は、少なくとも１種の免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質を意味する。例えば、抗体は、重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書ではＶＨとして省略される）と、軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書ではＶＬとして省略される）とを含み得る。別の実施例において、抗体は、２つの重（Ｈ）鎖可変領域と２つの軽（Ｌ）鎖可変領域とを含む。用語「抗体」は、抗体の抗原結合性断片（例えば、単鎖抗体、ＦａｂおよびｓＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、およびドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（de Wildt et al., Eur J. Immunol. 1996; 26 (3):629-39）、ならびに完全抗体を包含する。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（ならびにそれらのサブタイプ）の構造的特徴を有し得る。抗体は、任意の供給源由来であり得るが、霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類）抗体および霊長類化抗体が好ましい。
【０２４４】
ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）と呼ばれるより変異の少ない領域が散在する、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超変異性領域にさらに分けることができる。フレームワーク領域およびＣＤＲの程度は、正確に定義されている（Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242,およびChothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917、を参照されたく、さらにｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋも参照されたい）。本明細書ではＫａｂａｔの定義を使用する。各ＶＨおよびＶＬは、典型的には、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４、においてアミノ末端からカルボキシ末端まで整列された、３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成される。
【０２４５】
抗体のＶＨまたはＶＬ鎖はさらに、重鎖または軽鎖定常領域の全てもしくは一部を含み得、それにより、それぞれ、免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖を形成する。一実施形態において、当該抗体は、２つの免疫グロブリン重鎖と２つの免疫グロブリン軽鎖とによる四量体であり、この場合、当該免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖は、例えばジスルフィド結合などによって内部連結される。ＩｇＧにおいて、重鎖定常領域は、３つの免疫グロブリンドメインのＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。軽鎖定常領域はＣＬドメインを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、典型的には、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織もしくは宿主因子への抗体の結合を媒介する。免疫グロブリンの軽鎖は、タイプκまたはタイプλであり得る。一実施形態において、抗体はグリコシル化されている。抗体は、抗体依存性細胞毒性および／または補体媒介性細胞毒性に対して機能的であり得る。
【０２４６】
抗体の１つまたは複数の領域は、ヒト由来または実質的にヒト由来であり得る。例えば、可変領域の１つまたは複数は、ヒト由来または実質的にヒト由来であり得る。例えば、ＣＤＲの１つまたは複数は、ヒト由来、例えば、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、およびＬＣ  ＣＤＲ３など、であり得る。各軽鎖ＣＤＲは、ヒト由来であり得る。ＨＣ  ＣＤＲ３は、ヒト由来であり得る。フレームワーク領域の１つまたは複数は、ヒト由来、例えば、ＨＣまたはＬＣのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４など、であり得る。例えば、Ｆｃ領域は、ヒト由来であり得る。一実施形態において、すべてのフレームワーク領域は、ヒト由来、例えば、ヒト体細胞由来、例えば、免疫グロブリンを産生する造血細胞または非造血細胞など、であり得る。一実施形態において、ヒト配列は、例えば、生殖細胞系核酸によってコードされる、生殖細胞系配列である。一実施形態において、選択されたＦａｂのフレームワーク（ＦＲ）残基は、ほとんど同様の霊長類生殖細胞系遺伝子、特にヒト生殖細胞系遺伝子、において、アミノ酸タイプの対応する残基へと変換され得る。定常領域の１つまたは複数は、ヒト由来または実質的にヒト由来であり得る。例えば、免疫グロブリン可変ドメインの少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９８、または１００％、定常領域、定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＬ１）、または抗体全体は、ヒト由来、または実質的にヒト由来であり得る。
【０２４７】
抗体の全体もしくは一部は、免疫グロブリン遺伝子またはそのセグメントによってコードされ得る。例示的ヒト免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、γ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに、多くの免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５ＫＤａまたは約２１４のアミノ酸）は、ＮＨ２−末端における可変領域遺伝子（約１１０のアミノ酸）によって、およびＣＯＯＨ−末端におけるκもしくはλ定常領域遺伝子によってコードされる。全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０ＫＤａまたは約４４６のアミノ酸）は、同様に、可変領域遺伝子（約１１６のアミノ酸）によって、および他の前述の定常領域遺伝子、例えば、γ（約３３０のアミノ酸をコードする）によってコードされる。ＨＣ  ＣＤＲ３が約３つのアミノ酸残基から３５を超えるアミノ酸残基まで変わるため、ヒトＨＣの長さは少なからず変わる。
【０２４８】
したがって、抗体、小分子、ＡＲ（Ｆ８７６）を特異的に標的化するｓｉＲＮＡは、ＡＲ（Ｆ８７６）を使用して考案することができる。
【０２４９】
ＡＲ（Ｆ８７６）ポリヌクレオチド
本開示はさらに、ＡＲ（Ｆ８７６）ポリヌクレオチドにも関する。これらのポリヌクレオチドは、ＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチドをコード（例えば、発現）するために使用することができ、または治療的核酸（例えば、ＡＲ（Ｆ８７６）に対するｓｉＲＮＡなど）に組み入れることができる。
【０２５０】
一態様において、本開示は、配列番号５４の配列を有し、かつ／または位置８７６を含む、配列番号５４の少なくとも５個の連続するアミノ酸をコードする配列に対して検出可能にハイブリダイズすることができる、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド（０、１つ、２つ、または３つのミスマッチを含む）を含むポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドであって、位置８７６のアミノ酸が、フェニルアラニン（Ｆ）以外のアミノ酸であり、ハイブリダイゼーションが洗浄を含む条件下である、ポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドを提供する。そのようなポリヌクレオチドは、細胞または組織または患者内のＡＲ（Ｆ８７６）ポリヌクレオチドの存在を検出するために、あるいはＡＲ（Ｆ８７６）に対する治療的核酸を産生するために、有用であり得る。さらに、前述のポリヌクレオチドのいずれかを含む発現ベクターならびにそのような発現ベクターによってトランスフォームもしくはトランスフェクトされる宿主細胞も提供する。
【０２５１】
本開示の別の実施形態は、単離アンドロゲンレセプターポリヌクレオチドを提供し、この場合、当該単離ポリヌクレオチドもしくはその相補体は、配列番号２の少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個の連続するアミノ酸をコードし、当該少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個の連続するアミノ酸は、配列番号２の位置８７６を含むかもしくは位置８７６にまたがり、ならびに位置８７６のアミノ酸はフェニルアラニン（Ｆ）ではなく、任意により、位置８７７のアミノ酸はトレオニン（Ｔ）ではなく、８７４のアミノ酸はヒスチジン（Ｈ）ではなく、位置７１５のアミノ酸はバリン（Ｖ）ではなく、かつ／または位置７４１のアミノ酸はトリプトファン（Ｗ）ではない。
【０２５２】
本開示の別の実施形態は、上記において説明したような単離アンドロゲンレセプターポリヌクレオチドを含む発現構築物（または発現ベクター）を提供する。
【０２５３】
本開示の別の実施形態は、上記において説明したような単離アンドロゲンレセプターポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。
【０２５４】
本開示の別の実施形態は、プロモーター、および上記において説明されるような任意の単離アンドロゲンレセプターポリヌクレオチドを含む構築物を含む宿主細胞を提供する。
【０２５５】
本開示の別の実施形態は、コードされた変異体アンドロゲンレセプターが配列番号２の位置８７６にロイシン（Ｌ）を含有することを除いて配列番号２のアミノ酸配列を含む変異体アンドロゲンレセプターをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０２５６】
本開示の別の態様は、プロモーター；および変異体アンドロゲンレセプターまたはその断片をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む構築物であって、アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列が配列番号２に示され、当該配列が、位置８７６のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｆ）ではなく、任意により、位置８７７のアミノ酸がトレオニン（Ｔ）ではなく、８７４のアミノ酸がヒスチジン（Ｈ）ではなく、位置７１５のアミノ酸がバリン（Ｖ）ではなく、かつ／または位置７４１のアミノ酸がトリプトファン（Ｗ）ではないような、配列番号２のアミノ酸位置８７６における変異を含有し、当該断片の配列が、配列番号２の少なくとも５個の連続するアミノ酸を含みかつ位置８７６を含み、当該ポリヌクレオチドセグメントが、プロモーターの下流に位置し、ポリヌクレオチドセグメントの転写がプロモーターにおいて開始される、構築物を提供する。
【０２５７】
本開示の別の実施形態は、単離ポリヌクレオチドを提供し、この場合、当該単離ポリヌクレオチドもしくはその相補体は、配列番号５４の少なくとも１０個の連続するアミノ酸をコードし、当該少なくとも１０個の連続するアミノ酸が配列番号５４の位置８７６を含み、位置８７６のアミノ酸は、置換されているかまたは欠失しており、またはフェニルアラニン（Ｆ）ではない。
【０２５８】
本開示の別の実施形態は、単離ポリヌクレオチドを提供し、この場合、当該単離ポリヌクレオチドもしくはその相補体は、配列番号５４の少なくとも１５個の連続するアミノ酸をコードし、当該少なくとも１５個の連続するアミノ酸が配列番号５４の位置８７６を含み、位置８７６のアミノ酸は、置換されているかまたは欠失しており、またはフェニルアラニン（Ｆ）ではない。
【０２５９】
本開示の別の実施形態は、単離ポリヌクレオチドを提供し、この場合、当該単離ポリヌクレオチドもしくはその相補体は、配列番号５４の少なくとも２０個の連続するアミノ酸をコードし、当該少なくとも２０個の連続するアミノ酸が配列番号５４の位置８７６を含み、位置８７６のアミノ酸は、置換されているかまたは欠失しており、またはフェニルアラニン（Ｆ）ではない。
【０２６０】
本開示の別の実施形態は、上記において説明したような任意の単離ポリヌクレオチドを含む発現構築物を提供する。
【０２６１】
本開示の別の実施形態は、上記において説明されるような任意の単離ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。
【０２６２】
本開示の別の実施形態は、プロモーター、および上記において説明されるような任意のポリヌクレオチドを含む構築物を含む宿主細胞を提供する。
【０２６３】
本開示の別の実施形態は、変異体アンドロゲンレセプターポリペプチドまたはその断片をコードする単離ポリヌクレオチドであって、当該アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列が配列番号５４に示され、当該配列が、位置８７６におけるアミノ酸が置換されているかまたは欠失しているかまたはフェニルアラニン（Ｆ）ではないような、配列番号５４のアミノ酸位置８７６における変異を含有し、当該断片の配列が、配列番号５４の少なくとも５個の連続するアミノ酸を含みかつ位置８７６を含む、単離ポリヌクレオチドを提供する。
【０２６４】
本開示の別の実施形態は、コードされた変異体アンドロゲンレセプタータンパク質が配列番号５４の位置８７６にロイシン（Ｌ）を含有することを除いて配列番号５４のアミノ酸配列を含む変異体アンドロゲンレセプタータンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０２６５】
したがって、様々な態様において、本開示は、ＡＲ（Ｆ８７６）またはその断片もしくはバリアントをコードするポリヌクレオチドに関する。下記において、本開示は、この変異に関係するさらに詳細な実験データを提示する。
【０２６６】
Ｆ８７６変異を有するアンドロゲンレセプター
本開示の目的は、前立腺疾患（例えば、去勢抵抗性Ｐｃａ（ＣＲＰＣ）を含む前立腺がん（ＰＣａ）など）の診断、予後診断、および処置するためのツールおよび方法を提供することである。本開示のこれらおよび他の目的は、下記において説明される１つまたは複数の実施形態によって提供される。
【０２６７】
様々な態様において、本開示は、位置８７６を含むアンドロゲンレセプターまたはその断片を含むポリペプチドもしくは同様のものであるＡＲ（Ｆ８７６）であって、位置８７６のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｆ）以外のアミノ酸である、ＡＲ（Ｆ８７６）に関する。いくつかの態様において、位置８７６のアミノ酸は、ロイシン（Ｌ）である。様々な態様において、当該ＡＲ（Ｆ８７６）ポリペプチドは、任意により、位置８７７のアミノ酸がトレオニン（Ｔ）ではなく、８７４のアミノ酸がヒスチジン（Ｈ）ではなく、位置７１５のアミノ酸がバリン（Ｖ）ではなく、かつ／または位置７４１のアミノ酸がトリプトファン（Ｗ）ではないような、他の位置における変異を含む。さらなる態様において、本開示は、アンドロゲンレセプターあるいは位置７４１および８７７を含むその断片を含むポリペプチドもしくは同様のものであるＡＲ（Ｗ７４１／Ｔ８７７）であって、位置７４１のアミノ酸がトリプトファン（Ｗ）ではなく、位置８７７のアミノ酸がトレオニン（Ｔ）ではない、ＡＲ（Ｗ７４１／Ｔ８７７）に関する。
【０２６８】
様々な態様において、本開示は、患者におけるＡＲ（Ｗ７４１／Ｔ８７７）発現を検出する方法であって、患者におけるアンドロゲンレセプターまたはその断片の位置７４１および８７７のアミノ酸が、それぞれ、トリプトファン（Ｗ）およびトレオニン（Ｔ）であるか否かを決定する工程を含む方法を提供する。様々な態様において、当該方法はさらに、（ａ）位置７４１および８７７のアミノ酸がそれぞれトリプトファン（Ｗ）およびトレオニン（Ｔ）である場合にはビカルタミドもしくはＭＤＶ３１００；または（ｂ）位置７４１および８７７のアミノ酸がそれぞれトリプトファン（Ｗ）およびトレオニン（Ｔ）でない場合にビカルタミドもしくはＭＤＶ３１００以外の前立腺疾患処置の投与を推奨する工程および／またはそれを患者に投与する工程を含む。
【０２６９】
本開示は、ＭＤＶ３１００に対するアンタゴニストからアゴニストへの切り替えとしての、ＡＲにおけるＦ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ変異を同定するため、およびその役割を機能的に確認するために、ＬＮＣａＰモデル（ビカルタミドに対する耐性を付与する臨床的に関連するＷ７４１Ｃ変異を同定するために、以前に使用したモデル［Hara et al. Cancer Res. 63: 149-153 (2003)］）を利用する。遺伝子発現および表現型分析により、本開示は、ビカルタミドに対して感受性が維持されるので、ＡＲにおけるＦ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ変異体によって付与されるアゴニスト切り替えが、ＭＤＶ３１００に対して高度に選択的であることを示す。このことは、この変異（既存であるかまたは治療法に対する反応において獲得された）を示す患者は、ＭＤＶ３１００による処置の際は疾患の急速な臨床的進行を示すであろうが、ビカルタミドに対して有利に、または他のクラスの抗アンドロゲン剤に対しては潜在的に、反応し得ることを暗に意味するであろう。この変異を同定するために患者をスクリーニングすることは、治療前または耐性の発症後のいずれかにおいて、薬物の感受性の予測において役立ち、代替の臨床管理戦略を導くであろう。
【実施例】
【０２７０】
実施例１  材料および方法
方法
細胞培養
ＬＮＣａＰ−ＦＧＣおよびＰＣ３細胞を、示されたように１０％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）または１０％のＣＳＳ（Ｏｍｅｇａ、カタログ＃  ｆｂ−０４）を含むＲＰＭＩ  １６４０培地において継代させた。２２Ｒｖ１細胞を、１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １６４０培地において継代させた。ＶＣａＰ細胞を、１０％のＦＣＳまたは１０％のＣＳＳを含むＤＭＥＭ培地において継代させた。Ｍｙｃ−ＣａＰ細胞を、１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地において継代させた。２９３ＦＴ細胞を、１０％のＦＣＳおよび１×ＮＥＡＡを補ったＤＭＥＭにおいて継代させた。Ｍｙｃ−ＣａＰ細胞を除く全ての株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手し、細胞は、単一ヌクレオチド多型フィンガープリントによって試験され認証された。親切にも、Ｍｙｃ−ＣａＰ細胞は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｓａｗｙｅｒｓ博士によって提供され、さらなる試験もしくは認証は行っていない。
【０２７１】
インビトロでのＭＤＶ３１００自然耐性ＬＮＣａＰクローンの発生
２００万のＬＮＣａＰ細胞を、１０％のＦＣＳを補ったフェノールレッド不含のＲＰＭＩ  １６４０培地の４つの１５０ｃｍ２の組織培養皿に播種した。翌日、それぞれ、ＤＭＳＯおよびエタノール（対照１、Ｃ１）、ＤＭＳＯおよび１．０ｎＭのＲ１８８１（対照２、Ｃ２）、１μＭのＭＤＶ＋１．０ｎＭのＲ１８８１（対照３、Ｃ３）、および１μＭＭＤＶ３１００を、皿１から４にそれぞれ加えた。１週間に１度、適切な処理によって補った１５０ｃｍ２皿に細胞を再播種した。毎週、皿４に対して培地および化合物を取り替えた。耐性クローンが出現すると、皿４から培地を吸引した。トリプシンを含浸させた３ｍｍの無菌クローニングディスク（Ｓｃｉｅｎｃｅｗａｒｅ、カタログ＃  １７−２．Ｘ）を使用して、耐性クローンに重ね、１〜２分間のインキュベート後、クローニングディスクを、１０％のＦＣＳおよびＭＤＶ３１００を補ったフェノールレッド不含のＲＰＭＩ  １６４０培地を有する２４ウェルプレートに移した。耐性クローンが出現するまで継代した対照皿１〜３からの細胞を、対照細胞株および実験細胞株に対して一定の培養期間維持するために凍結保存した。
【０２７２】
安定した形質導入株の発生
ＷＴまたは変異体ＡＲをコードするコドン最適化ｃＤＮＡを合成し（ＤＮＡ２．０）、ｐＬＫＯ−ＴＲＥＸ−ＨＡ−Ｎｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。１：２．５：１．２５の比率のＶＳＶＧ：ｄｅｌｔａＲ８．９：ｃＤＮＡ構築物を２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトすることによってレンチウイルスを作成した。トランスフェクトの２〜３日後にウイルスを収穫し、ろ過して、８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下においてＬＮＣａＰ、ＭｙＣ−ＣａＰ、およびＶＣａＰ細胞培養物に感染させるために使用した。感染した細胞を、３週間ネオマイシンにおいて継代した。全例において、少なくとも１０００の非依存性クローンを、クローンバリエーションを避けて安定な細胞株を発生させるためにプールした。並行して、実験対照として使用するために、対照ベクターに感染させた安定な細胞株を発生させた。
【０２７３】
ミクロアレイ
３×１０５の細胞を６ウェルプレートに播種し、２〜３日後にＤＭＳＯまたは１０μＭのＭＤＶ３１００で２４時間処理した。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキットを使用して細胞から全ＲＮＡを単離した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）においてＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  ＬａｂＣｈｉｐシステムにより、ＲＮＡの完全性および純度を評価した。前に説明したような標準的プロトコルを使用して、標識化されたｃＤＮＡの発生およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．）へのハイブリダイゼーションを実施した（８）。
【０２７４】
発現分析
アフィメトリクス遺伝子発現データセットからのプローブセットを、１５０のトリミングした平均目標によりＭＡＳ５を使用して正規化し、Ｉｏｇ２−形質転換させた。次いで、様々な試料でのそれらの最大値が少なくとも５である場合に限り含ませるように、プローブセットをフィルターにかけた。共変量として０〜１のインジケーター変数を使用して最小２乗法を実施し；１つのインジケーターは、各クローンのベースライン（未処理試料）を表すために使用し、３つのインジケーター変数は、試料の各クラス（対照、弱耐性クローン、および強耐性クローン）に対するＭＤＶ３１００による処理を表した。この回帰を使用して、名目ｐ値および回帰係数（すなわち、倍率変化）を得た。個々のプローブセットは、それらの倍率変化が≧１．５の場合に、名目ｐ値≦０．０５において、有意差的に発現したと見なした。
【０２７５】
遺伝子セット強化の分析
ＡＲ遺伝子シグネチャーの間の相関（３０）を、ＭＤＶ−３１００による処理について上位の遺伝子と比較した。青色の線は、発現したプローブセットの位置を表しており、平均倍率変化によってランク付けし；少なくとも１つの試料において少なくとも３２のＭＡＳ５−１５０レベルで発現したプローブセットのみを含ませた。赤色の線は、ＡＲ遺伝子シグネチャーにおける遺伝子へのプローブセットのマッピングが、我々のデータセットに現れる場所を表し、灰色の線は、名目有意に達しないプローブセットを表し、より高い赤色の線は、少なくとも１．５の倍率変化および０．０５未満の名目ｐ値のプローブセットを表している。黒色の曲線は、ＡＲ遺伝子シグネチャーにおけるプローブセットの累積和を表し、点線は、強化されていない遺伝子の無作為リストに対する仮定的累積和を表す。
【０２７６】
パスウェイ強化のスコア
候補シグネチャー（３０）に対して、これらのシグネチャーで遺伝子を表すプローブセットが、発現はしたが示差的でなかったプローブセットと比べて、少なくとも１．５倍上方もしくは下方制御したプローブセットのセットに対して出現頻度が低いかまたは高いかを０．０５以下の名目ｐ値において決定するために両側フィッシャー直接検定を行った。バイアスのかからないアプローチの場合、ＧＯタームおよび転写因子ネットワークに由来するパスウェイを、アレイ上に表された全ての遺伝子と比べて０．０５以下の名目ｐ値において１．５倍以上変わる遺伝子を使用して、片側補間フィッシャー直接検定により過剰表現について分析し；次いで、これらのｐ値にＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ（ＢＨ）補正を適用した（８）。
【０２７７】
サンガー配列決定法
ゲノムＤＮＡは、Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＤＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ＃  ６９５８１）を使用して、製造元の指示に従って様々な１μＭのＭＤＶ耐性クローンおよび適切な対照株から単離した。プライマーを使用してエキソン８を増幅し（Ｆ８７６Ｌ変異の部位）（前方：５’−ＡＴＴＧＣＧＡＧＡＧＡＧＣＴＧＣＡＴＣＡ−３’（配列番号５５）；後方：５’ＴＴＣＴＣＧＴＣＡＣＴＡＴＴＧＧＣＣＴＣ−３’（配列番号５６））；増幅されたｃＤＮＡを、同じプライマーを使用してＧｅｎｅｗｉｚによって配列決定した。Ｆ８７６Ｌ変異の存在を確認するために、トレースファイルを分析した。
【０２７８】
定量的リアルタイムＰＣＲ
自然発生クローンについて：２００ｋの細胞を、１０％のＦＣＳを補ったＲＰＭＩ  １６４０に６ウェルプレートに播種し、その２日後に様々な化合物で２４時間処理した。あるいは、アンドロゲン枯渇に関連する実験のために、２００ｋの細胞を１０％のＦＣＳを補ったフェノール不含のＲＰＭＩ  １６４０において６ウェルプレートに播種し、２日間培養した。培地を吸引し、１０％のＣＳＳを補ったフェノールレッド不含のＲＰＭＩ  １６４０で交換し、３〜４日後に様々な化合物で２４時間処理した。十分なトランスジーン発現を可能にするために、様々な化合物で処理する少なくとも２日前に細胞をＤｏｘで前処理したことを除いて、同様のプロトコルを遺伝子組み換え株に適用した。ＲＮｅａｓｙプラスミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ＃  ７４１３６）を使用して、製造元の指示に従って全ＲＮＡを抽出した。高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃  ４３６８８１３）を使用したｃＤＮＡ合成のために、１〜２μｇの全ＲＭＡを使用した。各試料からのｃＤＮＡを、１５〜２０倍に希釈し、ＡＢＩ  ７９００ＨＴシリーズＰＣＲマシンにおいて、遺伝子特異的プライマーおよびＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｒｏｘ）（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、トリプリケートにおいてリアルタイムＰＣＲを実施した。発現レベルは、ＴＢＰ発現に対して正規化した。全ての分析は、ＳＤＳ２．３ソフトウェアを使用して実施した。以下の遺伝子特異的プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した：ＡＲ（Ｈｓ００１７１１７２＿ｍ１）、ＫＬＫ３（Ｈｓ０２５７６３４５＿ｍ１）、ＮＫＸ３−１（Ｈｓ００１７１８３４＿ｍ１）、ＴＭＰＲＳＳ２（Ｈｓ０１１２０９６５＿ｍ１）、ＳＬＣ４５Ａ３（Ｈｓ００２６３８３２＿ｍ１）、ＴＢＰ（Ｈｓ００４２７６２０＿ｍ１）、ＤＨＦＲ（Ｈｓ００７５８８２２＿ｓ１）、およびＴＫ１（Ｈｓ０１０６２１２５＿ｍ１）。
【０２７９】
インビボでの腫瘍形成アッセイ
マトリゲルと１：１混合した１０００万のＬＮＣａＰ細胞（Ｃ１、クローン＃１）を、性腺摘除後７〜８週間の雄のｎｕ／ｎｕマウスの横腹に皮下注入した。腫瘍保有マウス（腫瘍体積＝１５０〜３００ｍｍ３）を、ビヒクルまたは３０ｍｇ／ｋｇのＭＤＶ３１００で毎日処置した。キャリパーを使用して腫瘍を測定し、長さ×幅２／２により腫瘍体積を算出した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。全ての動物実験は、ノバルティスバイオメディカル研究所の動物実験委員会（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）のプロトコルおよび規定のガイドラインに従って実施した。
【０２８０】
統計分析
結果は、平均±ＳＥＭ（平均値の標準誤差）として報告した。遺伝子発現レベルおよびインビトロでのルシフェラーゼアッセイのエンドポイントを分析するために、等分散性の仮定のない両側独立スチューデントｔ検定を実施した。遺伝子セット強化の分析の場合、示されたｐ値は、全ての他のプローブセットの有意／無意に対して、有意性に合格する遺伝子シグネチャーにおけるプローブセットとそうでないものとを比較する両側フィッシャー直接検定に基づいている。動物実験の場合、各群において触知可能な腫瘍が成長したマウスのパーセンテージにおける有意性を決定するために、両側フィッシャー直接検定を実施した。
【０２８１】
受託番号
自然発生株および遺伝子操作された株でのＭＤＶ３１００対ＤＭＳＯでの処置における示差的遺伝子発現を分析するために使用した遺伝子発現マイクロアレイデータは、それぞれ、受託番号ＧＳＥ４４９２４およびＧＳＥ４４９２７において遺伝子発現情報データベース（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ）に蓄積した。
【０２８２】
さらなる実験手順は、方法に関する補足情報に列挙する。
【０２８３】
方法に関する補足情報
ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析
ＲＮＡ−ｓｅｑアライメントは、ｆａｓｔｑ前処理、アライメントするための共通ゲノム／トランスクリプトームｆａｓｔａファイルの生成、ならびにｂｏｗｔｉｅ２およびｔｏｐｈａｔ１．３の修正バージョンによるアライメントからなり、詳細については下記を参照されたい。
【０２８４】
ＦＡＳＴＱ前処理
３’末端ならびにアダプター配列における低品質塩基をトリミングするために、ペアにしたリードを前処理した。最初に、ＢＷＡアルゴリズムを使用して低品質塩基を３’末端から除去した（すなわち、ｐｈｒｅｄスケーリング品質スコアの合計から結果として得られるリード長の２０倍を差し引いたものを最大にするために、リードをトリミングする）。品質トリミング後にどちらかのリードが５０ｂｐ長未満であるリードペアを除去した。次に、リードペアを相補性についてチェックした。結果としてＩｌｌｕｍｉｎａアダプター配列の１つに一致する３’オーバーハングを生じる相補性は、トリミングされたオーバーハングを有していた。相補性が、６７ｂｐ未満の断片挿入サイズを示した場合、そのリードペアは除去した。
【０２８５】
結合ゲノム／トランスクリプトームファイルの生成
ゲノム（ＤＮＡ汚染、無作為転写、またはｍＲＮＡ前駆体に由来する）およびトランスクリプトームの両方に対してリードを競争的にアライメントするために、多数の統合されたＦＡＳＴＡファイルを作成した。さらに、ｐｈｉＸ、ｒＲＮＡ、１０００−ゲノム由来の「デコイ」配列、およびＲｅｆＳｅｑ（１）からのウイルス性（ＴａｘＩＤ  １０２３９）核酸配列を表す配列を、統合されたＦＡＳＴＡファイルに含めた。使用したゲノムは、ＮＣＢＩ  ＧＲＣｈ３７．５であったが、しかしながら、参照における全ての一塩基多型は、代替の対立遺伝子がｄｂＳＮＰ１３７による注釈付きの集団の少なくとも７５％においてより一般的である場合に、この対立遺伝子に交換した。トランスクリプトーム配列は、ＵＣＳＣ  ｋｎｏｗｎＧｅｎｅを使用して作成した。上記の配列に追加するために以下の３つのトランスクリプトームＦＡＳＴＡファイルを作成した。
【０２８６】
（１）使用される最も長いリード長は１０１のヌクレオチドであるので、各注釈付きの接合部に隣接する１００の塩基対が含まれており、この場合、当該隣接部は、１００ｂｐ長未満のエキソンの他の接合部に続いていた。したがって、Ｔｏｐｈａｔの第１ステップにおいて、シングルエンドアライメントを実施するバージョンを使用した。
【０２８７】
（２）典型的には、断片サイズの９９番目のパーセンタイルは、５００塩基対未満の長さであった。したがって、各注釈付きの接合部に隣接する５００塩基対の後に続くバージョンも作成し、この場合、隣接部は、関心対象の転写産物の他の注釈付きの接合部に続いていた。目標ＦＡＳＴＡアライメントファイルを最小化するために、オーバーラップする接合部を統合し；例えば、すべてのエキソンが＜５００ｂｐ長である１つのアイソフォームしか持たない遺伝子は、ｃＤＮＡ全体の配列を含む１つのＦＡＳＴＡレコードしか持たないであろう。一方が交互にスプライスされたエキソンを含む、２つのアイソフォームを有する遺伝子は、２つのＦＡＳＴＡレコードを有し；ｃＤＮＡ全体を有する一方は交互にスプライスされたエキソンを含み、１０００のヌクレオチド長であるもう一方は、当該エキソンをスプライスアウトした接合部に隣接する５００ｂｐを含む。このバージョンは、Ｂｏｗｔｉｅ  ２を使用して、ペア化したエンドアライメントに対して使用した。
【０２８８】
（３）より長い断片サイズを有する試料の場合、（２）と同じであるが、５００ｂｐの隣接部の代わりに１０００ｂｐの隣接部を使用する。各接合部に対する配列名は、ゲノム座標に容易にマッピングし戻すことができるように、参照ゲノムにおける含められたヌクレオチドの位置を示していた。これら３つのバージョンのそれぞれは、参照ゲノム＋上記に列挙される他の配列に連結され、Ｂｏｗｔｉｅ  ２．０．０−ｂｅｔａ７ならびにｂｏｗｔｉｅ  ０．１２．８を使用してインデックス化した。
【０２８９】
ＦＡＳＴＱファイルのアライメント：最初に、ＦＡＳＴＱファイルを、ｂｏｗｔｉｅ２．０．０−ｂｅｔａ７（２）を使用し、以下のパラメータ： 
ｂｏｗｔｉｅ２  −Ｄ  １８  −Ｒ  ０  −Ｌ  ２８  −Ｎ  １  −ｉ  Ｌ，０，．３２  −−ｍｐ  ４０，３０
−−ｓｃｏｒｅ−ｍｉｎ  Ｃ，−１３２，０  −−ｇｂａｒ  ３  −−ｒｄｇ  ８０，２  −−ｒｆｇ  ８０，５  −ｋ  １０  
−ｘ  ＧＲＣｈ３７ｃ＿ｋｎｏｗｎＧｅｎｅ＿ｐｅ５００．ｊｕｎｃｓ
−１  ｒｅａｄ１．ｆａｓｔｑ．ｔｒｉｍｍｅｄ．ｔｘｔ  −１  ｒｅａｄ２．ｆａｓｔｑ．ｔｒｉｍｍｅｄ．ｔｘｔ
−−ｎｏ−ｍｉｘｅｄ  −Ｘ  １０００  −ｐ  ４  −ｒｅｏｒｄｅｒ
ならびにｒｇ−ｉｄおよび様々なｒｇパラメータを使用してアライメントすることにより、試料を同定したが、この場合、ファイルＧＲＣｈ３７ｃ＿ｋｎｏｗｎＧｅｎｅ＿ｐｅ５００．ｊｕｎｃｓは、上記のゲノム／トランスクリプトーム接合ファイルにおける（２）を意味する。
【０２９０】
マッピングしなかったリード、非依存的に１０回（許容される最大値）マッピングしたリード、または最初もしくは最後の２ｂｐにミスマッチを有していたリードは、アライメントしていないと見なし、Ｔｏｐｈａｔを使用して再マッピングするためにＦＡＳＴＱファイルにリダイレクトした。全ての他のリードは、ゲノム座標を使用するために編集されたＢＡＭファイルを有しており、ならびに、統合されたゲノム／トランスクリプトームファイルの除去によって生じた冗長なマッピングを有していた。
【０２９１】
初期Ｂｏｗｔｉｅ２アライメントによってアライメントされていないリードは、Ｔｏｐｈａｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．３の修正バージョンによってアライメントした（３）。修正は、主に、示されたハイブリッドゲノム／トランスクリプトームｆａｓｔａファイル（上記からの（１））をトランスクリプトームマッピングされたリードの入力および変換として、ｔｏｐｈａｔ内のそれらのゲノム位置に戻せるようにする。可能な単一アライメントから最良のペア化したアライメントを選択するための決定ツリープロセスも、反復プロセスにおいて修正し、塩基ペアのミスマッチの数の低減を最適化した。マイナーな修正は、全長リードのセグメント化およびセグメントのマッピングのために使用される隣接配列の量に対する修正を含んでいた。Ｔｏｐｈａｔを、適切なリードグループパラメータと共に、以下の例示的引数：
ｔｏｐｈａｔ  −−ｎｕｍ−ｔｈｒｅａｄｓ＝４  −ｒ  −３４  −−ｍａｔｅ−ｓｔｄ−ｄｅｖ  １２６  −−ｂｗｔ−ｉｄｘ−ｐｒｅｆｉｘ＝ＧＲＣｈ３７ｃ
−−ｗｉｔｈ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ−ｐｒｅｆｉｘ＝ＧＲＣｈ３７ｃ＿ｋｎｏｗｎＧｅｎｅ＿ｓｅ．ｊｕｎｃｓ  
−Ｇ  ｋｎｏｗｎＧｅｎｅ．ｒｅｆＦｌａｔ．ｇｔｆ  −−ｌｉｂｒａｒｙ−ｔｙｐｅ  ｆｒ−ｕｎｓｔｒａｎｄｅｄ
−−ｓｅｇｍｅｎｔ−ｌｅｎｇｔｈ＝２５  −−ｍａｘ−ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ−ｌｅｎｇｔｈ  １０  −−ｍａｘ−ｄｅｌｅｔｉｏｎ−ｌｅｎｇｔｈ  １０  
−Ｆ  ０．０５  −ａ  １２  −−ｍｉｃｒｏｅｘｏｎ−ｓｅａｒｃｈ  −−ｎｏ−ｃｏｖｅｒａｇｅ−ｓｅａｒｃｈ  −−ｂｏｗｔｉｅ−ｅ  ４５
−−ｓｅｇｍｅｎｔ−ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ  ２  −−ｍａｘ−ｍｕｌｔｉｈｉｔｓ  ２５  
ｂｏｗｔｉｅ２＿ｕｎａｌｉｇｎｅｄ．１．ｆｑ．ｇｚ  ｂｏｗｔｉｅ２＿ｕｎａｌｉｇｎｅｄ．２．ｆｑ．ｇｚ
を使用して呼び出した。この場合、挿入サイズパラメータ（−ｒおよび−−ｍａｔｅ−ｓｔｄ−ｄｅｖ）は、結合ゲノム／トランスクリプトームへの初期ｂｏｗｔｉｅ２マッピングから経験的に推定される。修正されたｔｏｐｈａｔ内での初期シングルエンドｂｏｗｔｉｅマッピングは、以下：
ｂｏｗｔｉｅ  −ｑ  −ｅ  ４５  −−ｎｏｍａｑｒｏｕｎｄ  −−ｓａｍ  −−ｓａｍ−ｎｏｈｅａｄ  −ｐ  ４  −ｋ  ２５  −ｍ  ２５  
ＧＲＣｈ３７ｃ＿ｋｎｏｗｎＧｅｎｅ＿ｓｅ．ｊｕｎｃｓ  −  ＜  ｚｃａｔ  ｌｅｆｔ＿ｋｅｐｔ＿ｒｅａｄｓ．ｆｑ．ｇｚ
のように呼び出される。
【０２９２】
次いで、ｔｏｐｈａｔからのｂａｍアウトプット（ａｃｃｅｐｔｅｄ＿ｈｉｔｓ．ｂａｍ）を、元のｂｏｗｔｉｅ２アライメントからのアウトプットと統合して、単一のアライメントファイルを作成した。ヒトゲノム／トランスクリプトームに対して独特の最良のアライメントを有するリードペアのみを、最終アウトプットアライメントファイルに維持した（すなわち、マルチマッピングされたリード、ｒＲＮＡリード、およびウイルスリードを、後続の分析から排除した）。
【０２９３】
ＲＮＡ−Ｓｅｑ耐性関連の変異の発見
アライメントされたｂａｍファイルを、Ｐｉｃａｒｄから入手可能なＭａｒｋＤｕｐｌｉｃａｔｅｓツールを使用して、重複リードのためにマーキングした。次に、既知の部位としてのｄｂＳＮＰ１３７ならびに標準共分散およびオプションを使用して、塩基品質再較正のためにＧＡＴＫ  ｖ  １．５（４）を使用した。バリアントを、ＧＡＴＫ  ｖ１．５からＵｎｉｆｉｅｄＧｅｎｏｔｙｐｅｒを使用して呼び出し、標準クオリティメトリクス、ｄｂＳＮＰ１３７での存在、ＮＨＬＢＩエキソーム配列決定プロジェクト（ＥＳＰ６５００，  Ｅｘｏｍｅ  Ｖａｒｉａｎｔ  Ｓｅｒｖｅｒ，  ＮＨＬＢＩ  ＧＯ  Ｅｘｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  （ＥＳＰ）（シアトル、ＷＡ））、およびＣＯＳＭＩＣ  ｖ５８  （５）、ならびにＳｎｐＥＦＦ（６）およびＳｎｐＥＦＦから利用可能なアンサンブル転写データベースＧＲＣｈ３７．６８を使用する機能について注釈付けした。
【０２９４】
次いで、全ての試料において一貫していた変異を除去した。ＵｎｉｆｉｅｄＧｅｎｏｔｙｐｅｒからアウトプットされた事後尤度スコアを、各バリアントに対する各遺伝子型（ホモ接合型参照、ヘテロ接合型、およびホモ接合型代替）に対して、全ての試料について合計し；３つの合計スコアの最小値は、バリアントあたりのｐｈｒｅｄスケーリング不一致の限度を表しており；１００未満の不一致を有するバリアントは、ホモ接合性の試行において生じたバリアント、またはホモ接合型参照と呼ばれる試料の代替対立遺伝子の証拠（＞１０％）を示したバリアント、または平均して２０％未満の、ヘテロ接合型もしくはホモ接合型代替と呼ばれる試料の代替対立遺伝子からのリードを有したバリアントと同様に、さらなる分析から排除した。バリアントが結果としてタンパク質コーディング配列への予測された変化を生じなかった場合にも、そのバリアントを除去した。
【０２９５】
イムノブロット分析
全細胞溶解物：細胞を、Ｈａｌｔプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤混合物（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ＃  ７８４４０）を含有するＴＰＥＲ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ＃  ７８５１０）に溶解させ、その後、５分間沸騰させた。１レーンあたりおよそ２０μｇのタンパク質を装入し、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動によって分離させた。タンパク質をニトロセルロース膜に移して、５％の低脂肪乳中でブロックし、ＡＲ  Ｎ−２０に対する抗体（１：１０００希釈、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カタログ＃  Ｓｃ−８１６）、ヒストンＨ３（１：２０００希釈、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ＃  ９７１５ｓ）、β−チューブリン（１：１０００希釈、Ａｂｃａｍ、カタログ＃  ａｂ６０４６）、ＨＡ−ＨＲＰ（１：５００、Ｒｏｃｈｅ、カタログ＃  １２  ０１３  ８１９  ００１）、β−アクチン（１：３０００希釈、Ｓｉｇｍａ、カタログ＃  Ａ−２２２８）、およびｐ−ＡＫＴ（１：１０００希釈、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ＃  ４０６０）でプロ−ビングを実施した。膜を、ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合型抗マウス二次抗体（１：４０００希釈、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ＃  １２−３４８）または抗ウサギ二次抗体（１：４０００希釈、Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ＃  ３１４３０）で１時間インキュベートし、ＥＣＬ法（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてシグナルを発生させた。
【０２９６】
細胞核および細胞質のタンパク質分画：自然耐性クローンの場合、１００万のＣ１細胞およびクローン＃１細胞を、Ｔ７５フラスコにおいて、１０％のＦＣＳを補ったＲＰＭＩ  １６４０培地に播種し、２日間培養した後、ＤＭＳＯ、０．１ｎＭのＲ１８８１、または１０μＭのＭＤＶ３１００で２４時間処理した。遺伝子操作された株の場合、１００万のＬＮＣａＰ由来株を、Ｔ７５フラスコにおいて、１０％のＦＣＳおよび１００ｎｇ／ｍｌのＤｏｘ（Ｓｉｇｍａ、４４５７７−１Ｇ）を補ったＲＰＭＩ  １６４０培地に播種し、２日間放置した後、ＤＭＳＯ、０．１ｎＭのＲ１８８１、または１０μＭのＭＤＶ３１００で２４時間処理した。あるいは、培地を吸引し、１０％のＣＳＳおよび１００ｎｇ／ｍｌのＤｏｘを含有するフェノールレッド不含のＲＰＭＩ  １６４０培地と取り替えた。１０％のＣＳＳにおいて４日間培養した後、ＤＭＳＯまたは１０μＭのＭＤＶ３１００をフラスコに加えて一晩放置した。翌日、細胞をトリプシンで収穫し、５００ｘｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、１．５ｍｌのマイクロ遠心分離管に移し、５００ｘｇで２〜３分間遠心分離することによってペレット化した。製造元の取扱説明書（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ＃  ７８８３３）に従って、細胞質および細胞核タンパク質抽出を実施した。簡潔には、ペレットを５００μｌの氷冷Ｃｅｒ  Ｉ緩衝液中に再懸濁させ、氷上で１０分間インキュベートした。インキュベート後、２７．５μｌの氷冷Ｃｅｒ  ＩＩ緩衝液を加え、ボルテックスして、氷上で１分間インキュベートした。溶解物／Ｃｅｒ  Ｉ／ＩＩ混合物を再びボルテックスし、１４０００ｘｇで５分間遠心分離し、細胞質抽出物（上清）を予冷却した管に移した。細胞核を含む不溶性のペレットを、２５０μｌの氷冷ＮＥＲ緩衝液に再懸濁させ、ボルテックスし、氷上に置いた。試料を、４０分間にわたって１０分毎に１５秒間ボルテックスした。インキュベート後、試料を１４０００ｘｇで１０分間遠心分離した。細胞核抽出物を含む上清を、予冷却した管に移した。これらの試料を、上記において説明したようなイムノブロット分析のために処理した。
【０２９７】
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅによる変異誘発
ＰＣＲで増幅されたＡＲコード領域を、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターに挿入した。単一変異体Ｔ８７７Ａ、Ｗ７４１Ｃ、Ｗ７４１Ｌ、Ｆ８７６Ｌ、および二重変異体Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ発現プラスミドを、以下のプライマーセットにより、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ部位特異的変異誘発キット（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ）（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ＃  ２００５１７−５）を使用した部位特異的変異誘発によって産生した。
【０２９８】
【化９】
2016516005.tif 000010
【０２９９】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
以下のようにレポーターアッセイを実施した。３×１０５のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、６ウェルプレートにおいて、１０％のＦＣＳおよび１×ＮＥＡＡを補ったＤＭＥＭに播種し、２４時間後にトランスフェクトした。あるいは、１×１０６のＶＣａＰ細胞または３×１０５のＰＣ３細胞を、６ウェルプレートにおいて、１０％のＣＳＳを補った適切な培地に播種し、２４時間後にトランスフェクトした。翌日、４００ｎｇのＡＲホタルレポータープラスミド（４×ＡＲＥ−ルシフェラーゼ）、１００ｎｇのコントロールプラスミド（構成型ウミシイタケルシフェラーゼ発現プラスミド）、および上記において説明した２００ｎｇのＡＲ過剰発現ｐｃＤＮＡプラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃  １１６６８０２７）を使用して同時トランスフェクトした。トランスフェクトの６時間後に、培地を、ＤＭＳＯ、０．１ｎＭのＲ１８８１、１０μＭのＭＤＶ３１００、１０μＭのビカルタミド、１０μＭのＭＤＶ３１００＋０．１ｎＭのＲ１８８１、および１０μＭのビカルタミド＋０．１ｎＭのＲ１８８１を含む新鮮な培地と取り替えた。処理の約１６時間後に細胞を収集し、Ｇｌｏｍａｘ  ９６マイクロプレートルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してルシフェラーゼ活性についてアッセイした。ホタル活性は、Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ１９１０）を使用してウミシイタケに対して正規化した。全ての実験を少なくとも３回実施した。
【０３００】
細胞成長アッセイ
ＬＮＣａＰ細胞
短期間マイクロタイタープレートアッセイ：１０００の細胞（自然耐性株または遺伝子操作された株）を、１０％のＦＣＳを補った培地に播種した。自然耐性クローンの場合、播種の日に、漸増する濃度の化合物を加え、その一方で、遺伝子操作された株の場合、ドキシサイクリン処理の２日後に化合物を加えた。全ての場合において、化合物処理の７日後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ＃  Ｇ７５７３）を使用して、成長アッセイを実施した。
【０３０１】
長期間コロニー形成アッセイ：５０００〜７５００細胞（自然耐性株または遺伝子操作された株）を、６ウェルプレートにおいて、１０％のＦＣＳを補った培地に播種した。自然耐性クローンの場合、播種の日にＭＤＶ３１００をプレートに加え、培地／化合物を毎週取り替えた。遺伝子操作された株の場合、播種の日にドキシサイクリンを加え、２日後に、様々な濃度の化合物（ＭＤＶ３１００／ビカルタミド）を加えた。自然耐性株と同様に、培地／ｄｏｘ／化合物を毎週取り替えた。３〜４週間の培養後に、生存可能なコロニーを染色した。培地を吸引した後、０．５％のクリスタルバイオレットをウェルに加え、一晩放置した。翌朝、クリスタルバイオレット溶液を除去し、ウェルを注意深くｄｄＨ２Ｏで洗浄して、残留する染色溶液を除去した。プレートを一晩風乾した後、写真を撮影した。
【０３０２】
ＶＣａＰ細胞
ＡＲ−Ｔ８７７ＡまたはＡＲ−Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａのいずれかを発現するＶＣａＰ細胞を、６ウェルプレートにおいて、１０％のＦＣＳを補ったＤＭＥＭに５００，０００細胞／ウェルにおいて播種した。ドキシサイクリンを使用してＡＲプラスミドの発現を誘導し、２日後にＤＭＳＯまたは１０μＭのＭＤＶ３１００を加えた。化合物処理の８日後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ＃Ｇ７５７３）を使用して、成長アッセイを実施した。データを０日目（化合物を投与した日）と比較した。
【０３０３】
Ｍｙｃ−ＣａＰ細胞
ＡＲ−Ｔ８７７Ａまたは−Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａのいずれかを保有するＭｙｃ−ＣａＰ細胞を、６ウェルプレートにおいて、１０％のＦＣＳを補ったＤＭＥＭに１００細胞／ウェルにおいて播種した。０．２μｇ／ｍｌのドキシサイクリンを培地に加えて、ＡＲの発現を誘導した。コロニーが形成されるまで（約２週間）、３日毎に培地を交換した。０．１％のクリスタルバイオレットを使用してコロニーを染色した。
【０３０４】
２２ＲＶ１細胞
２２Ｒｖ１細胞を、６ウェルプレートにおいて、１０％のＦＣＳを補ったＤＭＥＭに５０００細胞／ウェルにおいて播種した。細胞を様々な化合物で処理し、１４日後に、０．１％のクリスタルバイオレットで染色した。
【０３０５】
ＭＤＶ３１００自然耐性ＬＮＣａＰ異種移植片の発生
１０×１０６のＬＮＣａＰ細胞を、性腺摘除した雄のマウスの横腹に皮下移植した。腫瘍が２００〜３００ｍｍ３に達したら、ビヒクルまたは３０ｍｇ／ｋｇのＭＤＶ３１００による処理を開始した。３〜４ヶ月にわたって毎日処理した後、いくつかの腫瘍は、自然発生的に、ＭＤＶ３１００の存在下において成長する能力を獲得した。これらの腫瘍が約１０００〜１５００ｍｍ３に達したとき、マウスを犠牲にして腫瘍を採取した。続いて、２種のＭＤＶ３１００耐性腫瘍からの腫瘍断片（マウス１からの１つの断片およびマウス２からの３つの断片）を、第２のレシピエントに再移植し、ＭＤＶ３１００による処置を再び開始した（Ｒ１〜Ｒ４）。さらに、マウス１および２の両方からの１つの腫瘍断片を、第２のレシピエントに移植して、ビヒクルで処理した（Ｃ１〜Ｃ２）。腫瘍が１０００〜１５０００ｍｍ３に達したら、全ての腫瘍からＲＮＡを採取し、前に説明したように、全トランスクリプトーム配列決定を実施した。
【０３０６】
参考文献
【化１０】
2016516005.tif 000011
【０３０７】
実施例２  ＭＤＶ３１００に対する自然耐性のモデルの発生および特徴付け
ＭＤＶ３１００に対する耐性の内因性メカニズムを解明するために、本開示は、ＬＮＣａＰ細胞における自然耐性のモデルについて説明する（図１ｂ）。ＭＤＶ３１００による短期間培養（＜１．５ヶ月）は、母集団全体の停滞を誘導し（図１ａ、ＦＣＳに対するＦＣＳ＋ＭＤＶ）、１μＭのＭＤＶ３１００による長期間培養に対して、いくつかの細胞が免れることができ、結果として、耐性クローンの出現が生じた（図１ｂ）。さらなる特徴付けのために、対照集団（Ｃ１〜Ｃ３、図１ｂ）と同様の成長特性を示した耐性クローンを選択する。短期間ＣＴＧベース（図１ｃ）および長期間コロニー形成アッセイにより、部分的耐性表現型を確認した。さらなる特徴付けにより、７つの耐性クローンのうちの４つ（クローン＃１、１５、１９、２４−強耐性、緑色の曲線およびフォント）は、ＭＤＶ３１００に対する著しく高い耐性を示すことが明らかとなった（残りの３つのクローン（クローン＃９、１０、および１４−弱耐性、赤色の曲線およびフォント）の＜１０μＭおよび対照の０．２μＭと比べて、凝集塊のＩＣ５０は＞１０μＭであった）（図１ｃ）。対照的に、弱耐性クローンは、ビカルタミドに対するより高い耐性を示し（強耐性の５μＭおよび対照の１μＭに対し、ＩＣ５０は＞１０μＭである）（図１ｃ）、クローンの両方のセットは、対照集団としての関係ない細胞増殖抑制剤Ｌｅｅ０１１に対して同様の感受性を示した（図６ｂ）。これらのデータは総合的に、単離した耐性クローンが、（ＭＤＶ３１００に対する耐性を特異的に促進するように微調整された強耐性クローンにおける耐性のメカニズムによって）抗アンドロゲン剤に対する耐性を優先的に示すことを示唆している。
【０３０８】
耐性のメカニズムを解明するために、最初に、ＡＲの発現レベルを分析し；ＡＲの過剰発現が、アンドロゲンおよび抗アンドロゲンビカルタミドの去勢抵抗性のレベルを促進することが前に示された。Chen et al. Nature Med. 10: 33-39 (2004);およびKawata et al. Prostate 70: 745-754 (2010)。予想外なことに、本開示は、ＲＮＡでのＡＲ発現（データは示されていない）およびタンパク質レベル（図１ｄ）において有意な変化を確認できなかった。さらに、ＡＲ経路活性のグローバル分析は、いくつかの下流の標的遺伝子を例外として、ベースラインにおいてほとんど変化を示さず（図１ｅ）、ベースラインでのＡＲ経路の有意な調整のないことを繰り返し示唆している。
【０３０９】
実施例３  強耐性クローンはＭＤＶ３１００によるＡＲ経路調整に対して回復的である
耐性を駆動する分子メカニズムをさらに探求するために、本開示は、ＤＭＳＯまたはＭＤＶ３１００で２４時間処理した３つの対照および７つの耐性クローンについて、アレイ分析を実施した。予想されるように、本開示は、ＭＤＶ３１００で処理した場合に３つの対照において独特に示差的に発現する多くの遺伝子（約１０１）（細胞周期およびＤＮＡ損傷修復に関連する機能を圧倒的に強化された遺伝子）を見出し、ＭＤＶ３１００の細胞増殖抑制性の影響に対するそれらの感受性を確認した。本開示はさらに、対照および弱耐性クローンにおいて有意な示差的発現のみを示した約１９１の遺伝子を明らかにした（下方制御された遺伝子が、細胞周期／ＤＮＡ損傷、ならびに、予想外なことにアンドロゲンレセプター細胞核シグナリング経路、に対して強化される（Ｐ＝２．０１ｅ−２））。この知見は、ＭＤＶ３１００によるアンドロゲン経路の示差的制御に対する最初の兆しを提供するものであり、この場合、強耐性クローンは、調節に対する耐性を明白に示した。これを支持して、クラスタリング（図６ａ）およびＧＳＥＡ分析（図２ｂおよび図９ｂ）の両方は、ＭＤＶ３１００による処理における、対照および弱耐性株でのＡＲ経路活性の低下を確証したが、強耐性クローンでは有意な変化は観察されなかった。これは、ｑＰＣＲ分析によって確証され、強耐性クローンにおいて特異的なＡＲ標的遺伝子ＫＬＫ３、ＮＫＸ３−１、およびＳＬＣ４５Ａ３の発現に対するＭＤＶ３１００の効果の鈍化も確認した（図２ｃ）。
【０３１０】
ＭＤＶ３１００に対する示差的経路反応が、様々なクローンでのＡＲの局在性における変化に対応するか否かを評価するために、本開示は、ＤＭＳＯまたはＭＤＶ３１００で処理した対照株（Ｃ１）および強耐性株（クローン＃１）から細胞質および細胞核タンパク質分画を単離した。細胞核のＡＲ局在性は、ＭＤＶ３１００で処理した対照株ではかなり損なわれるが、その一方で、強耐性クローンでは、ＡＲ局在性はほとんど変わらず、これは、強耐性株ではＡＲ経路活性が持続することの説明を提供する。凝集塊において、様々なクローンの分析により、２つのグループ（表現型的により感受性が高く、ＭＤＶ３１００処理においてＡＲ経路活性が著しく損なわれることを示す一方と、表現型的におよび遺伝的に、ＭＤＶ３１００に対してより回復的である他方）の間の明確な区別が明らかとなる。
【０３１１】
実施例４  ＲＮＡ−ｓｅｑ分析により、耐性と相関がある、ＡＲにおける高再発性変異を明らかにする
強耐性クローンではＡＲ経路活性がＭＤＶ３１００による調整に対して回復的であることは明らかであるが、１）どのようにしてこの経路がＭＤＶ３１００の存在下において活性のままであるか、および２）持続されるＡＲ経路活性が、強耐性クローンにおいて観察される耐性表現型の原因であるか否か、については不明である。アレイ分析では、持続するＡＲ経路活性を合理的に説明し得るような、関連する遺伝子／経路を同定することができないので、本開示は、いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、おそらく、ＡＲ経路の構成要素における変異が、強耐性クローンをＭＤＶ３１００に対して鈍化し得ると推論した。この可能性を探究するために、本開示は、上記において説明した株についてＲＮＡ−ｓｅｑ分析を実施し、１０μＭのＭＤＶ３１００での長期間の培養に対して自然耐性となったいくつかの株を含めた（これらのクローンは、弱耐性クローンと同様に、ＭＤＶ３１００に対する反応においてＡＲ経路調節を示し続けた）。興味深いことに、本開示は、対照集団では検出されずその逆も同様である、大部分の耐性クローンにおいて共通のいくつかの再発性変異を発見した。このデータは、親ＬＮＣａＰにおける少なくとも２つの集団（ＭＤＶ３１００に対して表現型的に高感受性である主要分画と、おそらく多世代前に分化し、多くの新規の変異を生じ、ＭＤＶ３１００に対して表現型的により耐性である少数の部分集団）の存在を暗に意味している。各クローンの変異プロファイルに基づく監督なしのクラスタリング分析は、結果として、２つのクラスター（３つの対照株および強耐性クローン＃１９を含む一方と、残りの全てのクローンをクラスタリングするもう一方）を生じた。実際に、大部分のクローンクラスターは一緒に、先験的知識がなく、ドライバー変異の同定を困難にしたが、しかしながら、強耐性クローンにおける鈍化したＡＲ経路調節についての知識が、これらのクローンに独特の変異に対する本発明者らの探求への集中を可能にした。興奮することに、本開示は、４つ全てに共通の単一の再発性変異を同定した（ＡＲにおける変異、ＭＤＶ３１００の直接標的化）。新規のＦ８７６Ｌ変異は、ＡＲのリガンド結合ドメインにあり、異型接合であり（図１１）、ならびにＬＮＣａＰ細胞における既存の同型接合Ｔ８７７Ａ変異（フルタミドに対する耐性を付与することが知られている変異）に隣接する（Fenton et al. 1997;および Hara et al. 2003）。野生型に対する変異体の対立遺伝子頻度は、最も低い２０％を示したクローン＃１５を除いて、およそ４０％である。ゲノムＤＮＡにおけるＦ８７６Ｌ変異の存在は、サンガー配列決定法によって確認される（図１１）。
【０３１２】
実施例５  アンタゴニストからアゴニストへの切り替えのコンピュータモデリングおよび実験検証
コンピュータモデリングによって得られる仮説を機能的に試験するために、本開示は、トランス活性化アッセイにおいて、野生型；単一の変異体Ｔ８７７Ａ、Ｗ７４１Ｃ、Ｗ７４１Ｌ、およびＦ８７６Ｌ；および二重変異体Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７６Ａ  ＡＲの、アゴニストおよび抗アンドロゲン剤のビカルタミドおよびＭＤＶ３１００、に対する転写反応を評価した。モデリングデータを支持して、本開示は、Ｆ８７６Ｌ単一変異体およびＦ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ  二重変異体ＡＲのみが、ＭＤＶ３１００に対するかなりのトランス活性化反応を有したことを見出し（０．１ｎＭのＲ１８８１に匹敵する）、これは、ＭＤＶ３１００に対して非常に特異的なアンタゴニストからアゴニストへの切り替えを示唆している。しかしながら、これらのデータは、ＭＤＶ３１００に対する反応において、強耐性クローンにおいて観察される経路調節の欠如に対して著しく対照的である（図２ｂ〜ｃ）。これらの明らかに矛盾する結果は、部分的には実験条件に起因し得、トランス活性実験は、ＡＲ非発現株における単一の対立遺伝子の影響をアッセイするのに対し、強耐性クローンは、異型接合方式においてＦ８７６Ｌ変異を含む。ＭＤＶ３１００に対するアンタゴニストからアゴニストへの切り替えが、強耐性クローンにおいても観察されるか否かを試験するために、本開示は、（基本ＡＲ経路活性を最小化し、ＭＤＶ３１００に対する内因性ＡＲの反応を減じる）内因性アンドロゲンを除いた培地での転写反応を評価する。レポーターベースのアッセイから為される観察と同じに、ＭＤＶ３１００処理は、単独でまたはアゴニストとの組み合わせにおいて、強耐性クローンでのＫＬＫ３発現を著しく高める。凝集塊でのこれらのデータは、Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ変異が、変異体ＡＲがＭＤＶ３１００をアゴニストとして利用することを可能にすることを暗に意味している（ビカルタミドに対する感度としてＭＤＶ３１００に特異的な切り替えが維持される）。
【０３１３】
実施例６  Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ変異体ＡＲは、遺伝子操作されたＬＮＣａＰにおいてＭＤＶ３１００に対する表現型耐性を付与する
Ｆ８７６ＬおよびＦ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ対立遺伝子は、ＭＤＶ３１００の存在下においてＡＲ経路を強力に再活性化するが、経路活性におけるこのレスキューが、（特に、いくつかの他の変異を含む強耐性クローンにおいて）表現型耐性へと十分に翻訳されるか否かについては依然として不明である。この問題に対して十分に対処するために、本開示は、Ｔ８７７Ａ、Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ、およびＷ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａ変異体ＡＲを誘導的に発現するようにＬＮＣａＰ細胞を遺伝子操作する。Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ  ＡＲの発現レベルは、ｑＰＣＲおよびウェスタン分析によって評価した場合に、Ｔ８７７ＡおよびＷ４１Ｃ／Ｔ８７７Ａ変異体ＡＲよりも著しく低い。以前の報告を支持して、全てのＴ８７７Ａ保有変異体対立遺伝子およびＷ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａ対立遺伝子の発現は、それぞれ、ヒドロキシフルタミド（Fenton et al. 1997;および Hara et al. 2003）；およびビカルタミド（Hara et al. 2003）に対して特異的な、アンタゴニストからアゴニストへの切り替えを促進した（図１５）。対照的に、Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ対立遺伝子の弱い発現にもかかわらず、ＡＲ経路活性の著しいレスキューが、ＭＤＶ３１００の存在下において特異的に観察され、これは、アンタゴニストからアゴニストへの切り替えを確認するものである（図５ａおよび図１５）。さらに、Ｔ８７７ＡおよびＷ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａ対立遺伝子の異所性発現は、ＭＤＶ３１００の存在下においてＡＲシグナリングを弱くしかレスキューせず、再び、新規のＦ８７６Ｌ変異の特異性および有効性を確認した（図５１および図１５）。遺伝子発現データと一致して、ＡＲの細胞核局在性は、Ｔ８７７Ａ発現株において著しく損なわれるが、その一方で、ＡＲの局在性は、ＭＤＶ３１００による処置に関して、Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ株において影響を受けず、Ｆ８７６Ｌ株でのＡＲ活性の持続を確認した（図５ｂ）。
【０３１４】
アゴニストとしてＭＤＶ３１００を利用する、Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ変異体ＡＲの最大の可能性は、同様の実験をアンドロゲン枯渇条件下において実施する場合に実現される。Ｔ８７７ＡおよびＷ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａ対立遺伝子の発現は、経路活性を最小限にしかレスキューしないが、その一方で、Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ対立遺伝子の発現は、ＭＤＶ処理条件下においてＫＬＫ３およびＮＫＸ３−１発現を３〜４倍に高める（図１６ａ）。興味深いことに、Ｗ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａ  ＡＲは、構成型活性機能を示し、ベースライン条件下においてＫＬＫ３およびＮＫＸ３−１の発現を駆動する（図１６）。上記において観察された発現レベルの変化は、ＡＲの局在性における変化に忠実に対応する（Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ  ＡＲは、次第に、ＭＤＶ３１００による処理後に局在化した細胞核となる（図１６ｂおよび５ｂ））。再び、Ｗ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａ  ＡＲは、高められた細胞核の局在性がベースラインにおいて観察されるような構成型活性を示した（図５ｂ）。
【０３１５】
Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ変異体対立遺伝子がアゴニストとしてＭＤＶ３１００を利用することができることをしっかりと確認したので、本開示は、次に、Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ  ＡＲの異所性発現が表現型耐性を付与することができるか否かについて試験した。Ｔ８７７Ａ対立遺伝子の発現は、成長をレスキューしなかったが、その一方で、Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ対立遺伝子の発現は、ＭＤＶ３１００条件下において成長をレスキューした（図５ｃおよび図１８ａ、ｂ）。以前の観察（図１５）に一致して、Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ過剰発現株は、ビカルタミドに対して感受性のままであった（図５ｃ）。興味深いことに、Ｗ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａの異所性発現は、ＭＤＶ３１００およびビカルタミド処理条件下においても成長を著しくレスキューした（ＭＤＶ３１００に対する耐性は、その構成活性に一部起因して、おそらく間接的である（図５ｂ、１６）。
【０３１６】
実施例７  変異体ＡＲに感作する薬物をスクリーニングするための変異体ＡＲ（Ｆ８７６）の使用
本開示が適用した２つの方法は、１）トランス活性化、および２）ＡＲ経路を標的とする化合物が変異体ＡＲの機能の阻害剤として使用することができるかどうかを決定するための遺伝子発現分析、を含む。両方の方法は、方法のセクションにおいて明確に概説されている。
【０３１７】
簡潔に言えば、トランス活性化アッセイの場合、ＤＭＳＯ、関心対象のアゴニストもしくはアンタゴニストによる処置の４時間前に、ＡＲレポーター、コントロールプラスミド、およびＷＴもしくは変異体ＡＲプラスミドを同時トランスフェクトする。ＡＲレポーターは、ＡＲＥ（ＡＲが結合するアンドロゲン応答要素配列）、プロモーター、およびレポーター遺伝子（この場合はルシフェラーゼ）を含む。処理の１６時間後、バイオルミネセンスを定量する。本開示は、ＷＴ  ＡＲが、Ｒ１８８１（アゴニスト）の存在下においてＡＲレポーターを活性化し、シグナルは、ＭＤＶ３１００または他のアンタゴニストの存在下において十分に抑制されるはずであると予想する。しかしながら、Ｆ８７６Ｌ  ＡＲの場合、本開示は、アゴニストおよびＭＤＶ３１００の存在下において、ＡＲレポーター活性が十分に活性化されると予想する。本発明者らは、新規のアンタゴニストが（ビカルタミドと同様の方式において）Ｆ８７６Ｌ  ＡＲ機能を十分に妨げることを期待する。
【０３１８】
トランス活性化アッセイに加えて、カノニカルＡＲ遺伝子、例えば、ＫＬＫ３、ＴＭＰＲＳＳ２、ＮＫＸ３−１、およびＳＬＣ４５Ａ３などの遺伝子発現分析もモニターすることができる。この実験は、ＭＤＶ３１００が新規の化合物で置き換えられ得ることを除いて、図５ｂにおいて概説された実験と同じである。本開示は、シグナリングをレスキューするアゴニストとしてＭＤＶ３１００を使用することができるが、新規の化合物は、Ｆ８７６Ｌ−ＡＲ保有細胞でのシグナリング活性の抑制を維持するために有効であり得ると予想する。
【０３１９】
実施例８  Ｆ８７６Ｌ変異は、遺伝子操作されたＬＮＣａＰにおいてＭＤＶ３１００に対する遺伝的および表現型的耐性を誘発するのに十分である
強耐性クローンが、Ｆ８７６Ｌ変異に加えて、いくつかの配列バリアントを含んでいるのであれば、本発明者らは、ＡＲ−Ｆ８７６Ｌバリアントが、ＭＤＶ３１００耐性成長表現型を促進するのに十分であるか否かを正式に試験したかった。このために、Ｔ８７７Ａ、Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ、およびＷ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａ変異体ＡＲを誘導的に発現するようにＬＮＣａＰ細胞を遺伝子操作した。前の報告を支持して、全てのＴ８７７Ａ保有変異体対立遺伝子およびＷ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａ対立遺伝子の発現は、ＡＲ標的遺伝子ＫＬＫ３（ＰＳＡ）の制御に基づいて、それぞれ、ヒドロキシフルタミド（Tan et al. 1997 Mol. Endocrin. 11:450-9; Fenton et al. 1997 Clin. Cancer Res. 3: 1383-8;およびVeldscholte et al. 1990 Biochem. Biophys. Res. Comm. 173: 534-40）およびビカルタミド（Hara et al. 2003 Cancer Res. 63: 149-53）に特異的なアンタゴニストからアゴニストへの切り替えを促進した。
【０３２０】
ＡＲ−Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａのわずかに低い発現にもかかわらず、ＡＲ経路活性の著しいレスキューが、１０％のＦＣＳ培養条件下において観察され、ならびに著しいアゴニスト効果が、１０％のＣＳＳ培養条件下において観察された。ＡＲ−Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａが、１０％のＦＣＳおよび１０％のＣＳＳの両方の培養条件下において、Ｔ８７７Ａ株と比べてより大きな核内流入を示す（ＭＤＶ３１００対ＤＭＳＯ）ので、経路活性に対するＡＲ−Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａの影響は、ＡＲの局在化の変化に密接に対応した。予想外なことに、本発明者らはさらに、以前に報告されたように（Hara et al. 2003 Cancer Res. 63: 149-53）、二重変異によって付与される構成型活性機能におそらく起因する、Ｗ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａ株における経路活性の著しいレスキューも観察した。ＡＲ−Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７ＡがアゴニストとしてＭＤＶ３１００を利用できることが確立されているので、本発明者らは、次に、ＡＲ−Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａの異所性発現が、表現型耐性を付与するのに十分であるか否かを試験した。短期間増殖アッセイでは、成長における中等度のレスキューのみが観察されたが、ＭＤＶ３１００に反応して、しかしビカルタミドには反応せず、頑健なレスキューが長期間コロニー形成アッセイにおいて観察された。とりわけ、Ｗ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａ株はさらに、以前に観察された経路活性のレスキューに一致して、ＭＤＶ３１００の存在下において著しい成長を示した。
【０３２１】
Ｔ８７７Ａ変異が耐性表現型にとって必要であるか否かを評価するために、単一の変異体ＡＲ−Ｆ８７６Ｌを安定して発現するようにＬＮＣａＰ細胞を遺伝子操作した。
【０３２２】
トランス活性データと一致して、ＡＲＦ８７６Ｌは、ＭＤＶ３１００に対する遺伝子的および表現型耐性を付与し、このことは、Ｆ８７６Ｌが（単独でまたはＴ８７７Ａとの併用において）、アゴニスト切り替えを付与することができることと等しいことを示唆している。
【０３２３】
実施例９  耐性付与におけるＡＲ−Ｆ８７６Ｌの役割はいくつかの前立腺がん株に広く適用可能である
ＡＲにおけるＦ８７６Ｌ変異がＰＴＥＮｎｕｌｌ  ＬＮＣａＰ細胞においてＭＤＶ３１００に対する耐性を促進することができると仮定して、本発明者らは、次に、この変異が、様々な遺伝的背景のＰＣａ株において広く耐性を付与するのに十分であるか否かについて検討した。このために、ヒトＶＣａＰ株（ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ融合およびＡＲ増幅を含む）およびネズミＭｙｃ−ＣａＰ株（Ｍｙｃを過剰発現する）に、変異体ＡＲを安定して発現するように形質導入した。
【０３２４】
ＬＮＣａＰ細胞において観察される耐性表現型と一致して、両方の株は、ＭＤＶ３１００に対する部分的耐性も示し、このことは、ＡＲにおけるＦ８７６Ｌ変異が、様々な遺伝的状況下においてＭＤＶ３１００に対する耐性を付与する可能性を有していることを示唆している。
【０３２５】
まとめると、本発明者らのデータは、ＡＲ−Ｆ８７６Ｌ、ＡＲ−Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａ、および潜在的に構成的に活性なＡＲバリアント、例えばＷ７４１Ｃ／Ｔ８７７Ａなどの、ＭＤＶ３１００に対する耐性のドライバーとしての直接的な役割を示唆している。構成的活性なバリアントは、様々なクラスの抗アンドロゲン剤に対する耐性を無差別に促進するが、その一方で、本発明者らは、ＡＲにおけるＦ８７６Ｌ変異がＭＤＶ３１００に対する耐性を選択的に促進することを示す。
【０３２６】
実施例１０  ＡＲ−Ｆ８７６Ｌ保有細胞がインビボでの性腺摘除設定においてＭＤＶ３１００に対して耐性である
ＡＲにおけるＦ８７６Ｌ変異が、耐性を促進することができる、ＭＤＶ３１００に対するアゴニスト切り替えを付与することを示したが、本発明者らは次に、Ｆ８７６Ｌ保有細胞が、アンドロゲン枯渇条件下において細胞成長に対してこの切り替えに依存するようになるか否かについて、すなわち、フルタミドなどの他の抗アンドロゲン剤に対して診療所において観察された依存性（Suzuki et al. 1996 Prostate 29: 153-8）、について検討した。興味深いことに、当該切り替えは、インビトロにおいてＦ８７６Ｌ保有クローンの増殖を駆動しなかったが、本発明者らは、Ｆ８７６Ｌ保有細胞を性腺摘除された雄のマウスに移植した場合、インビボでの成長についてＭＤＶ３１００に対する顕著な依存を観察した。対照腫瘍（Ｃ１）は、ＭＤＶ３１００処理に対して即座の停滞を示したが、耐性腫瘍（クローン＃１）は、ＭＤＶ３１００によって刺激されるまで成長できなかった。具体的には、長期間の停滞の後、ビヒクル群の１５匹のうちの２匹と比べて、ＭＤＶ３１００で処置した１５匹のマウスのうち１０匹が腫瘍の急速な成長を示したが（Ｐ  ＝  ０．００７８、フィッシャー直接ｔ検定、両側）、その一方で、当該腫瘍は、対照細胞（Ｃ１）における比率に対しては有意な差はなかった（１５匹のうちの９匹対１５匹のうちの１０匹）。さらに、耐性腫瘍は、以前のインビトロでの観察に一致して、ＭＤＶ３１００の存在下において成長し続け、これは、累積的に、ＡＲ−Ｆ８７６Ｌ保有細胞が、インビボにおいて成長のためにＭＤＶ３１００を必要とすることを示唆した。全ての４つのグループにおいて、処置期間中に有意な体重減少は観察されなかった。エンドポイント分子分析により、ＭＤＶ３１００で処置した耐性腫瘍が、ビヒクルで処置した耐性腫瘍と比べた場合、ＡＲ標的遺伝子発現によって示されたように、やや高いＡＲ経路活性を示し、ならびに、ビヒクルで処置した対照腫瘍に比べた場合、著しく高い活性を示したので、ＭＤＶ３１００のアゴニスト切り替えがインビボにおいてＦ８７６Ｌ変異と関連することを確認した。これらのデータは、アンドロゲン枯渇条件下でのインビボでの成長にとっての、ＭＤＶ３１００に対するＦ８７６Ｌ保有細胞の依存性を累積的に強調している。
【０３２７】
実施例１１  ＭＤＶ３１００耐性を克服するための治療戦略としてのＣＤＫ４／６標的化
次に、本発明者らは、インビトロおよびインビボにおいて様々な遺伝学的状況下でＡＲ−Ｆ８７６ＬがＭＤＶ３１００に対する抵抗性を促進することができることを確証することにより、変異体対立遺伝子と拮抗するための合理的な戦略を開発することを目的とした。ＡＲの高変異可能なリガンド結合ポケットを標的とし続ける新規の抗アンドロゲン剤の開発（Balbas et al. 2013 eLife 2: e00499）に対する代替策として、本発明者らは、診療所においてより持続可能であり得る治療戦略を同定することを目的とした。このために、本発明者らは、ＭＤＶ３１００で処理された強耐性クローンにおける「ＡＲ活性化」に加えて、「細胞周期」に属する遺伝子および「Ｅ２Ｆ１活性化」遺伝子セットに対するかなりの強化を観察し、これらのクローンが、Ｅ２Ｆ１標的遺伝子の継続的発現により、ＭＤＶ３１００処理条件下での増殖を潜在的に維持し得ることを提案した。アンドロゲンシグナリング（Ｇ１−Ｓ移行の重要なレギュレーター）が活性ＣＤＫ４／サイクリンＤ１アセンブリを、したがってＥ２Ｆ１機能の活性化を、促進することが知られているため、上記は、魅力的な仮説である（Schiewer et al. End. Relat. Cancer 19: 1-12）。この概念に一致して、本発明者らは、ＭＤＶ３１００処理が、対照株においてＥ２Ｆ１標的遺伝子ＤＨＦＲおよびＴＫ１の発現を抑制するのを観察し、Ｅ２Ｆ１機能のレギュレーターとしてのＡＲシグナリングを確認した。対照的に、Ｆ８７６Ｌを保有する細胞は、対照株と比べて、ＭＤＶ３１００処理条件下においてＤＨＦＲおよびＴＫ１のより高い発現を維持することが可能であった（図６Ａ）。これらのデータに基づいて、本発明者らは、Ｅ２Ｆ１活性は、ＡＲシグナリングの下流エフェクターとして機能し得、そのため、Ｅ２Ｆ１機能のレギュレーターは、ＡＲを対象とする療法が効果を失ったときに、重要な治療的ノードとして機能し得ると推論した。この仮説に従って、本発明者らは、強耐性クローン（図６Ｂ）およびＡＲ−Ｆ８７６Ｌ／Ｔ８７７Ａを発現するように遺伝子操作されたＬＮＣａＰ株（図６Ｃ）の成長が、ビカルタミドと同程度にＣＤＫ４／６阻害剤ＬＥＥ０１１およびＰＤ０３３２９９に対して感受性であることを見出した。興味深いことに、アンドロゲン非依存性２２Ｒｖ１細胞（ＷＴ  ＡＲを発現し、ＭＤＶ３１００処理条件下においてＡＲシグナリングならびにＤＨＦＲおよびＴＫ１の発現を維持することができるＰＣａ株（図６Ｄ））も、ＣＤＫＬ４／６阻害に対して強い感受性を示した（図６Ｅ）ので、ＣＤＫ４／６阻害に対する反応は、Ｆ８７６Ｌを保有する細胞のみに限定されない。これらのデータは、ＣＤＫ４／６機能の標的化が、一般的におそらくアンドロゲン非依存性である、ＭＤＶ３１００に対する抵抗性の複数のメカニズムの処置に対して効果的な戦略として役に立ち得ることを繰り返し示唆している。
【０３２８】
実施形態
１．位置８７６を含むかまたは位置８７６にまたがるアンドロゲンレセプターまたはその断片もしくはバリアントを含むポリペプチドを含む組成物であって、位置８７６のアミノ酸が、置換されているかまたは欠失しているかまたはフェニルアラニン（Ｆ）以外である（アミノ酸の位置は、配列番号５４の付番に従う）、組成物。
２．位置８７６のアミノ酸が欠失している、実施形態１の組成物。
３．位置８７６のアミノ酸がロイシン（Ｌ）である、実施形態１の組成物。
４．位置８７６を含むかまたは位置８７６にまたがるアンドロゲンレセプターまたはその断片もしくはバリアントを含むポリペプチドを含む組成物であって、位置８７６のアミノ酸が、置換されているかまたは欠失しているかまたはフェニルアラニン（Ｆ）以外であり（アミノ酸の位置は、配列番号５４の付番に従う）、
ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントが、任意により、他の位置の１つまたは複数の変異を含む、組成物。
５．位置８７７のアミノ酸がトレオニン（Ｔ）ではなく、位置８７４のアミノ酸がヒスチジン（Ｈ）ではなく、位置７１５のアミノ酸がバリン（Ｖ）ではなく、かつ／または位置７４１のアミノ酸がトリプトファン（Ｗ）ではない、実施形態４の組成物。
６．断片が、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７５、少なくとも１００、または少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも７００、少なくとも７５０、少なくとも８００、少なくとも８５０、および／または少なくとも９００のアミノ酸長である、実施形態４の組成物。
７．断片またはバリアントが、Ｆ８７６の変異を欠く野生型ＡＲ、またはＦ８７６の少なくとも１つの活性を保持する、実施形態１または４の組成物。
８．配列番号５４の残基の５０％以下での１つまたは複数のアミノ酸の欠失、付加、挿入、または置換において異なる、配列番号５４に記載される配列またはそのバリアントを有する、ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントを含み、その結果、ポリペプチドが、配列番号５４のポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持する組成物。
９．配列番号５４の残基の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０％以下での１つまたは複数のアミノ酸の欠失、付加、挿入、または置換において異なる、配列番号５４に記載される配列またはそのバリアントを有する、ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントを含み、その結果、ポリペプチドが、配列番号５４のポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持する組成物。
１０．断片が、配列番号５４の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含む、実施形態９の組成物。
１１．断片が、配列番号５４の少なくとも１５個の連続するアミノ酸を含む、実施形態９の組成物。
１２．ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントを含む組成物であって、ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号５４に示され、前記配列が、位置８７６のアミノ酸が置換されているかまたは欠失しているかまたはフェニルアラニン（Ｆ）ではないような、配列番号５４のアミノ酸位置８７６におけるもしくは位置８７６にまたがる変異を含有し、任意により、位置８７７のアミノ酸がトレオニン（Ｔ）ではなく、位置８７４のアミノ酸がヒスチジン（Ｈ）ではなく、位置７１５のアミノ酸がバリン（Ｖ）ではなく、かつ／または位置７４１のアミノ酸がトリプトファン（Ｗ）ではなく、断片の配列が、配列番号５４の少なくとも５個、１０個、または１５個の連続するアミノ酸を含み、かつ位置８７６を含む、組成物。
１３．配列番号３から５３のいずれかを含む配列を含むポリペプチドを含む組成物。
１４．患者からの試料におけるＡＲポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおける位置Ｆ８７６での変異を検出する方法であって、（ａ）患者からＡＲを含む試料を得る工程；および（ｂ）ＡＲが位置Ｆ８７６の変異を含むか否かを決定するために、ＡＲポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはその一部の配列を決定する工程を含む方法。
１５．患者を診断、予後診断、および／または処置する方法であって、（ａ）患者からＡＲを含む試料を得る工程；（ｂ）ＡＲが位置Ｆ８７６の変異を含むか否かを決定するために、ＡＲポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはその一部の配列を決定する工程；および（ｃ）ＡＲがＦ８７６の変異を含まない場合にＭＤＶ３１００を含む治療的組成物を投与する工程もしくはその投与を推奨する工程；または、ＡＲがＦ８７６の変異を含む場合にＭＤＶ３１００を含まない治療的組成物を投与する工程もしくはその投与を推奨する工程を含む方法。
１６．ＭＤＶ３１００を含まない治療的組成物が、ビカルタミドまたはＬＥＥ０１１もしくはＰＤ０３３２９９１などのＣＤＫ４／６阻害剤、あるいは治療的核酸を含む、実施形態１５の方法。
１７．患者を診断、予後診断、および／または処置する方法であって、（ａ）患者におけるアンドロゲンレセプターまたはその断片の位置７４１および８７７のアミノ酸が、それぞれ、トリプトファン（Ｗ）およびトレオニン（Ｔ）であるか否かを決定する工程、（ｂ）（１）位置７４１および８７７のアミノ酸が、それぞれ、トリプトファン（Ｗ）およびトレオニン（Ｔ）である場合にはビカルタミドもしくはＭＤＶ３１００；または（２）位置７４１および８７７のアミノ酸が、それぞれ、トリプトファン（Ｗ）およびトレオニン（Ｔ）でない場合にはビカルタミドもしくはＭＤＶ３１００以外の前立腺疾患処置、の患者への投与を推奨する工程および／またはそれを９患者に投与する工程を含む方法。
１８．ビカルタミドまたはＭＤＶ３１００を含まない処置が、ＬＥＥ０１１もしくはＰＤ０３３２９９１などのＣＤＫ４／６阻害剤または治療的核酸を含む、実施形態１７の方法。
１８．位置８７６を含む配列番号５４の少なくとも５個の連続するアミノ酸をコードする第１の配列を有し、かつ／またはそれに対して相補的な配列を有する、０、１、２、または３つのミスマッチを含む少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドであって、位置８７６のアミノ酸が、置換されているかもしくは欠失しており、フェニルアラニン（Ｆ）以外のアミノ酸である、ポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチド。
１９．第１の配列が、配列番号２の少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個の連続するアミノ酸をコードし、少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個の連続するアミノ酸が、配列番号２の位置８７６を含むかもしくは位置８７６にまたがり、位置８７６のアミノ酸はフェニルアラニン（Ｆ）ではなく、任意により、位置８７７のアミノ酸はトレオニン（Ｔ）ではなく、８７４のアミノ酸はヒスチジン（Ｈ）ではなく、位置７１５のアミノ酸はバリン（Ｖ）ではなく、かつ／または位置７４１のアミノ酸はトリプトファン（Ｗ）ではない、実施形態１８のポリヌクレオチド。
２０．実施形態１８または１９のポリヌクレオチドを含む発現構築物もしくはベクター。
２１．実施形態２０の発現構築物もしくはベクターを含む宿主細胞。
２２．コードされた変異体アンドロゲンレセプタータンパク質が配列番号２の位置８７６にロイシン（Ｌ）を含有することを除いて、配列番号２のアミノ酸配列を含む変異体アンドロゲンレセプターをコードするポリヌクレオチド。
２３．プロモーター；および変異体アンドロゲンレセプターもしくはその断片をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む発現構築物またはベクターであって、アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列が配列番号２に示され、前記配列が、位置８７６のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｆ）ではなく、任意により、位置８７７のアミノ酸がトレオニン（Ｔ）ではなく、８７４のアミノ酸がヒスチジン（Ｈ）ではなく、位置７１５のアミノ酸がバリン（Ｖ）ではなく、かつ／または位置７４１のアミノ酸がトリプトファン（Ｗ）ではないような、配列番号２のアミノ酸位置８７６における変異を含有し、断片の配列が、配列番号２の少なくとも５個の連続するアミノ酸を含み、かつ位置８７６を含み、ポリヌクレオチドセグメントが、プロモーターの下流に位置し、ポリヌクレオチドセグメントの転写がプロモーターにおいて開始される、発現構築物またはベクター。
２４．単離ポリヌクレオチドもしくはその相補体が、配列番号５４の少なくとも１０個、１５個、または２０個の連続するアミノ酸をコードし、少なくとも１０個の連続するアミノ酸が配列番号５４の位置８７６を含むかもしくは位置８７６にまたがり、位置８７６のアミノ酸が、置換されているかまたは欠失しているかまたはフェニルアラニン（Ｆ）ではない、単離ポリヌクレオチド。
２５．プロモーター、および実施形態２２または２４のポリヌクレオチドを含む構築物を含む宿主細胞。
２６．ＭＤＶ３１００に対する細胞の感受性を決定する方法であって、
（ａ）もしあれば、細胞におけるアンドロゲンレセプターの位置８７６のアミノ酸を決定する工程であって、位置８７６が配列番号５４の付番に従って決定される、工程；
（ｂ）もしあれば、位置８７６のアミノ酸を、野生型アンドロゲンレセプターと比較する工程であって、アミノ酸の不在またはフェニルアラニン以外のアミノ酸の存在が、細胞がＭＤＶ３１００に対して感受性でないことを示す、工程
を含む方法。
２７．細胞が、前立腺がん細胞、乳がん細胞、または他のＡＲ関連疾患細胞である、実施形態２６の方法。
２８．ＡＲ関連疾患が、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、またはケネディ病である、実施形態２７の方法。
２９．ＭＤＶ３１００による処置に対するＡＲ関連疾患の患者の感受性を予測する方法であって、
（ａ）もしあれば、患者におけるまたは患者から得られる試料におけるアンドロゲンレセプターの位置８７６のアミノ酸を決定する工程であって、位置８７６が配列番号５４の付番に従って決定される、工程；
（ｂ）もしあれば、位置８７６のアミノ酸を、野生型アンドロゲンレセプターと比較する工程であって、アミノ酸の不在またはフェニルアラニン以外のアミノ酸の存在が、患者がＭＤＶ３１００に対して感受性でないことを示す、工程
を含む方法。
３０．ＡＲ関連疾患が前立腺がんまたは乳がんである、実施形態２９の方法。
３１．ＡＲ関連疾患が、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、またはケネディ病である、実施形態２９の方法。
３２．ＡＲ関連疾患を有する患者を処置する方法であって、
（ａ）もしあれば、患者におけるまたは患者から得られる試料におけるアンドロゲンレセプターの位置８７６のアミノ酸を決定する工程であって、位置８７６が配列番号５４の付番に従って決定される、工程；
（ｂ）もしあれば、位置８７６のアミノ酸を、野生型アンドロゲンレセプターと比較する工程であって、アミノ酸の不在またはフェニルアラニン以外のアミノ酸の存在が、患者がＭＤＶ３１００に対して感受性でないことを示す、工程；
（ｃ）８７６の位置のアミノ酸がフェニルアラニンでない場合、ＭＤＶ３１００を含まない処置を投与する工程；または、位置８７６のアミノ酸がフェニルアラニンである場合、ＭＤＶ３１００を含む処置を投与する工程；ならびに
（ｄ）疾患の進行または緩和についてアッセイする工程
を含む方法。
３３．ＡＲ関連疾患が前立腺がんまたは乳がんである、実施形態３２の方法。
３４．ＡＲ関連疾患が、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、またはケネディ病である、実施形態３２の方法。
３５．ＭＤＶ３１００に対する細胞の感受性を決定する方法であって、
（ａ）もしあれば、細胞におけるアンドロゲンレセプターの位置７４１および８７７のアミノ酸を決定する工程であって、位置７４１および８７７が配列番号５４の付番に従って決定される、工程；
（ｂ）もしあれば、位置７４１および８７７のアミノ酸を、野生型アンドロゲンレセプターと比較する工程であって、位置７４１におけるアミノ酸の不在またはトリプトファン（Ｗ）以外のアミノ酸の存在および位置８７７におけるアミノ酸の不在またはトレオニン（Ｔ）以外のアミノ酸の存在が共に、細胞がＭＤＶ３１００に対して感受性でないことを示す、工程
を含む方法。
３６．細胞が、前立腺がん細胞、乳がん細胞、または他のＡＲ関連疾患細胞である、実施形態３５の方法。
３７．ＡＲ関連疾患が、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、またはケネディ病である、実施形態３５の方法。
３８．ＭＤＶ３１００による処置に対するＡＲ関連疾患の患者の感受性を予測する方法であって、
（ａ）もしあれば、患者におけるまたは患者から得られる試料におけるアンドロゲンレセプターの位置７４１および８７７のアミノ酸を決定する工程であって、位置７４１および８７７が配列番号５４の付番に従って決定される、工程；
（ｂ）もしあれば、位置７４１および８７７のアミノ酸を、野生型アンドロゲンレセプターと比較する工程であって、位置７４１におけるアミノ酸の不在またはトリプトファン（Ｗ）以外のアミノ酸の存在および位置８７７におけるアミノ酸の不在またはトレオニン（Ｔ）以外のアミノ酸の存在が共に、患者がＭＤＶ３１００に対して感受性でないことを示す、工程
を含む方法。
３９．ＡＲ関連疾患が前立腺がんまたは乳がんである、実施形態３８の方法。
４０．ＡＲ関連疾患が、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、またはケネディ病である、実施形態３８の方法。
４１．ＡＲ関連疾患を有する患者を処置する方法であって、
（ａ）もしあれば、患者におけるまたは患者から得られる試料におけるアンドロゲンレセプターの位置７４１および８７７のアミノ酸を決定する工程であって、位置７４１および８７７が配列番号５４の付番に従って決定される、工程；
（ｂ）もしあれば、位置７４１および８７７のアミノ酸を、野生型アンドロゲンレセプターと比較する工程であって、位置７４１におけるアミノ酸の不在またはトリプトファン（Ｗ）以外のアミノ酸の存在および位置８７７におけるアミノ酸の不在またはトレオニン（Ｔ）以外のアミノ酸の存在が共に、患者がＭＤＶ３１００に対して感受性でないことを示す、工程；
（ｃ）８７６の位置のアミノ酸がフェニルアラニンでない場合、ＭＤＶ３１００を含まない処置を投与する工程；または、位置７４１および８７７のアミノ酸がフェニルアラニンである場合、ＭＤＶ３１００を含む処置を投与する工程；ならびに
（ｄ）疾患の進行または緩和についてアッセイする工程、
を含む方法。
４２．ＡＲ関連疾患が前立腺がんまたは乳がんである、実施形態４１の方法。
４３．ＡＲ関連疾患が、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、またはケネディ病である、実施形態４１の方法。
４４．アンドロゲンレセプター（ＡＲ）関連疾患を有する患者を処置する方法であって、ＡＲの８７６の位置のアミノ酸が不在であるか、またはフェニルアラニンではなく、方法がＭＤＶ３１００を含まない治療的組成物を投与する工程を含む、方法。
４５．ＭＤＶ３１００を含まない治療的組成物が、ビカルタミドまたはＬＥＥ０１１もしくはＰＤ０３３２９９１などのＣＤＫ４／６阻害剤、あるいは治療的核酸を含む、実施形態４４の方法。
４６．ＡＲ関連疾患が前立腺がんまたは乳がんである、実施形態４１の方法。
４７．ＡＲ関連疾患が、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、またはケネディ病である、実施形態４１の方法。
４８．アンドロゲンレセプター（ＡＲ）関連疾患を有する患者を処置する方法であって、ＡＲの位置７４１および８７７のアミノ酸がフェニルアラニンであり、方法がＭＤＶ３１００を含む治療的組成物を投与する工程を含む、方法。
４９．ＡＲ関連疾患が前立腺がんまたは乳がんである、実施形態４８の方法。
５０．ＡＲ関連疾患が、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、またはケネディ病である、実施形態４８の方法。
５１．アンドロゲンレセプター（ＡＲ）関連疾患を有する患者を処置する方法であって、ＡＲの８７６の位置のアミノ酸が不在であるか、またはフェニルアラニンではなく、方法がＣＤＫ４／６阻害剤を含む治療的組成物を投与する工程を含む、方法。
５２．ＣＤＫ４／６阻害剤が、ＬＥＥ０１１またはＰＤ０３３２９９１である、実施形態５１の方法。
５３．ＡＲ関連疾患が前立腺がんまたは乳がんである、実施形態５１の方法。
５４．ＡＲ関連疾患が、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、またはケネディ病である、実施形態５１の方法。
５５．アンドロゲンレセプター（ＡＲ）関連疾患を有する患者を処置する方法であって、ＡＲが野生型であるか、またはＡＲの８７６の位置のアミノ酸が不在であるかもしくはフェニルアラニンではなく、方法がＣＤＫ４／６阻害剤を含む治療的組成物を投与する工程を含む、方法。
５６．ＣＤＫ４／６阻害剤が、ＬＥＥ０１１またはＰＤ０３３２９９１である、実施形態５１の方法。
５７．ＡＲ関連疾患が前立腺がんまたは乳がんである、実施形態５１の方法。
５８．ＡＲ関連疾患が、ポリグルタミン酸病、脱毛症、良性前立腺肥大、多毛症、座瘡、脊髄および筋萎縮症、またはケネディ病である、実施形態５１の方法。
５９．ＣＤＫ４／６阻害剤が、インビトロまたはインビボにおいて、アンドロゲンレセプターを発現する細胞株の成長を阻害し、アンドロゲンレセプターの８７６の位置のアミノ酸が不在であるかまたはフェニルアラニンではない、実施形態５５の方法。
６０．成長阻害が、増殖速度、コロニーアッセイ、顕微鏡アッセイ、および／または画像分析によって決定される、実施形態５９の方法。
【０３２９】
特に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、本開示が属する分野に精通する専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。特に明記されない限り、具体的に詳細に説明されていない全ての方法、工程、技術、および操作を実施することができ、当業者にとって明らかなそれ自体既知である方式において実施した。例えば、再び、標準のハンドブックと本明細書に参照された一般的な背景技術と更なるそこに引用された文献を参照する。特に明記されない限り、本明細書において引用される各参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０３３０】
請求項は非限定的であり、以下に提供する。
【０３３１】
特定の実施形態および請求項が本明細書において詳細に開示されているが、これは、一例として例示目的のみのために為され、あるいは、添付の特許請求の範囲または任意の対応する将来の応用の特許請求の範囲の主題の範囲に関する限定であることを意図するものではない。特に、本発明者らは、請求項によって定義される開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、本開示に対して様々な置換、代替、変更を為し得ることに想到する。核酸出発物質、関心対象のクローン、またはライブラリータイプの選択は、本明細書において説明される実施形態の知識を有する当業者にとって日常的仕事であると考えられる。他の態様、利点、および変更は、以下の特許請求の範囲の範囲内であると見なされた。当業者は、通常の実験を使用するだけで、本明細書において説明した開示の特定の実施形態の多くの同等物を認識し、または確認することができるであろう。そのような同等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。後に出願された対応する出願における特許請求の範囲の補正は、様々な国の特許法による限定のためであって、特許請求の範囲の主題を放棄すると解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2016516005.tif 000026
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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