(57)【要約】本開示は、脂肪酸誘導体の産生をもたらすアシルキャリアータンパク質（ACP）の発現増大を示す組換え微生物に関する。本開示はさらに、脂肪酸誘導体および関連組成物を生産する目的で、組換え微生物を発酵培養物中で用いる方法にも関する。2016500261.tif 000017
2016500261.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）外因性アシルキャリアータンパク質（ACP）をコードするポリヌクレオチド配列；および
（b）外因性脂肪酸誘導体生合成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列
を含み、脂肪酸誘導体組成物を産生する、組換え宿主細胞。
【請求項２】
炭素源を含有する培地中で、（a）および（b）のポリヌクレオチド配列を過剰発現させるのに有効な条件下で培養した時に、組換え宿主細胞と同じ条件下で増殖させた対応する野生型宿主細胞と比較して、前記脂肪酸誘導体組成物をより高い力価、より高い収量またはより高い生産性で産生する、請求項1記載の組換え宿主細胞。
【請求項３】
脂肪酸誘導体組成物が、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、脂肪アルデヒド、アルカン、アルケン、オレフィンおよびケトンからなる群より選択される脂肪酸誘導体を含む、請求項1記載の組換え宿主細胞。
【請求項４】
脂肪酸誘導体生合成タンパク質がチオエステラーゼ活性を有し、脂肪酸誘導体組成物が脂肪酸を含む、請求項1記載の組換え宿主細胞。
【請求項５】
カルボン酸レダクターゼ（CAR）活性を有するタンパク質をさらに含み、脂肪酸誘導体組成物が脂肪アルコールを含む、請求項4記載の組換え宿主細胞。
【請求項６】
脂肪酸誘導体生合成タンパク質がアシルACPレダクターゼ（AAR）活性を有し、脂肪酸誘導体組成物が脂肪アルコールを含む、請求項1記載の組換え宿主細胞。
【請求項７】
脂肪酸誘導体生合成ポリペプチドがエステルシンターゼ活性を有し、脂肪酸誘導体組成物が脂肪エステルを含む、請求項1記載の組換え宿主細胞。
【請求項８】
前記組換え宿主細胞のより高い力価が、対応する野生型宿主細胞と比較して少なくとも約10％〜少なくとも約90％上回る、請求項2記載の組換え宿主細胞。
【請求項９】
前記組換え宿主細胞のより高い収量が、対応する野生型宿主細胞と比較して少なくとも約5％〜少なくとも約80％上回る、請求項2記載の組換え宿主細胞。
【請求項１０】
脂肪酸誘導体組成物が約100mg／L〜約300g／Lの力価で産生される、請求項2記載の組換え宿主細胞。
【請求項１１】
脂肪酸誘導体組成物が約1g／L〜約250g／Lの力価で産生される、請求項10記載の組換え宿主細胞。
【請求項１２】
脂肪酸誘導体組成物が少なくとも約30g／Lの力価で産生される、請求項10記載の組換え宿主細胞。
【請求項１３】
脂肪酸誘導体組成物が約0.7mg／L／時〜約2.5g／L／時の生産性で産生される、請求項2記載の組換え宿主細胞。
【請求項１４】
ACPがシアノバクテリアアシルキャリアータンパク質（cACP）である、請求項1記載の組換え宿主細胞。
【請求項１５】
ACPがマリノバクター・アクアエオレイ（Marinobacter aquaeolei）VT8アシルキャリアータンパク質（mACP）である、請求項1記載の組換え宿主細胞。
【請求項１６】
ACPが大腸菌（E. coli）アシルキャリアータンパク質（ecACP）である、請求項1記載の組換え宿主細胞。
【請求項１７】
4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼタンパク質をコードするsfp遺伝子をさらに含む、請求項1記載の組換え宿主細胞。
【請求項１８】
sfp遺伝子が枯草菌（B. subtilis）sfp遺伝子である、請求項17記載の組換え宿主細胞。
【請求項１９】
脂肪酸誘導体組成物が細胞外または細胞内で産生される、請求項1記載の組換え宿主細胞。
【請求項２０】
請求項1記載の組換え宿主細胞を含む、細胞培養物。
【請求項２１】
脂肪酸誘導体組成物が培養培地中で見出される、請求項20記載の細胞培養物。
【請求項２２】
脂肪酸誘導体組成物が、脂肪酸、脂肪アルコールおよび脂肪エステルからなる群より選択される少なくとも1つの脂肪酸誘導体を含む、請求項21記載の細胞培養物。
【請求項２３】
脂肪酸誘導体がC6、C8、C10、C12、C13、C14、C15、C16、C17またはC18脂肪酸誘導体である、請求項22記載の細胞培養物。
【請求項２４】
脂肪酸誘導体がC10：1、C12：1、C14：1、C16：1またはC18：1不飽和脂肪酸誘導体である、請求項23記載の細胞培養物。
【請求項２５】
脂肪酸誘導体組成物が脂肪酸を含む、請求項22記載の細胞培養物。
【請求項２６】
脂肪酸誘導体組成物が脂肪アルコールを含む、請求項22記載の細胞培養物。
【請求項２７】
脂肪酸誘導体組成物が脂肪エステルを含む、請求項22記載の細胞培養物。
【請求項２８】
脂肪酸誘導体組成物が、脂肪酸、脂肪エステルまたは脂肪アルコールの還元末端から7番目と8番目の炭素の間に二重結合を有する脂肪酸誘導体を含む、請求項22記載の細胞培養物。
【請求項２９】
脂肪酸誘導体組成物が不飽和脂肪酸誘導体を含む、請求項22記載の細胞培養物。
【請求項３０】
脂肪酸誘導体組成物が飽和脂肪酸誘導体を含む、請求項22記載の細胞培養物。
【請求項３１】
脂肪酸誘導体組成物が分枝鎖脂肪酸誘導体を含む、請求項22記載の細胞培養物。
【請求項３２】
脂肪酸誘導体が約1.003〜約1.5の現代炭素分率（fraction of modern carbon）を有する、請求項22記載の細胞培養物。
【請求項３３】
脂肪酸誘導体が約-10.9〜約-15.4のδ13Cを有する、請求項22記載の細胞培養物。
【請求項３４】
脂肪酸誘導体組成物を作製する方法であって、
（a）請求項1記載の組換え宿主細胞を、脂肪酸誘導体組成物を生産する目的で炭素源の存在下で培養する段階；および
（b）脂肪酸誘導体組成物を培養培地から収集する段階
を含む、方法。
【請求項３５】
脂肪酸誘導体組成物の収量、力価または生産性が、同じ条件下で培養した対応する野生型宿主細胞によって産生される脂肪酸誘導体組成物の収量、力価または生産性を少なくとも約10％上回る、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
任意で、脂肪酸誘導体組成物を組換え宿主細胞から単離する段階をさらに含む、請求項34記載の方法。
【請求項３７】
脂肪酸誘導体組成物が、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、脂肪アルデヒド、アルカン、アルケン、オレフィンおよびケトンからなる群より選択される、請求項34記載の方法。
【請求項３８】
脂肪酸誘導体組成物が任意の1つまたは複数の脂肪酸誘導体の組み合わせである、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
組換え宿主細胞において発現される脂肪酸誘導体生合成タンパク質がチオエステラーゼ活性を有し、脂肪酸誘導体組成物が脂肪酸を含む、請求項34記載の方法。
【請求項４０】
組換え宿主細胞が、カルボン酸レダクターゼ（CAR）活性を備えるタンパク質を発現するようにさらに遺伝子操作され、脂肪酸誘導体組成物が脂肪アルコールを含む、請求項34記載の方法。
【請求項４１】
組換え宿主細胞において発現される脂肪酸誘導体生合成タンパク質がアシルACPレダクターゼ（AAR）活性を有し、脂肪酸誘導体組成物が脂肪アルコールを含む、請求項34記載の方法。
【請求項４２】
組換え宿主細胞において発現される脂肪酸誘導体生合成タンパク質がエステルシンターゼ活性を有し、脂肪酸誘導体組成物が脂肪エステルを含む、請求項34記載の方法。
【請求項４３】
ACPがシアノバクテリアアシルキャリアータンパク質（cACP）である、請求項34記載の方法。
【請求項４４】
cACPがマリノバクター・アクアエオレイVT8アシルキャリアータンパク質（mACP）である、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
ACPが大腸菌アシルキャリアータンパク質（ecACP）である、請求項34記載の方法。
【請求項４６】
ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼタンパク質が、sfp遺伝子によってコードされる4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼタンパク質である、請求項34記載の方法。
【請求項４７】
sfp遺伝子が枯草菌sfp遺伝子である、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
脂肪酸誘導体組成物が培養培地中に認められる、請求項34記載の方法。
【請求項４９】
脂肪酸誘導体組成物がC6、C8、C10、C12、C13、C14、C15、C16、C17またはC18脂肪酸誘導体を含む、請求項34記載の方法。
【請求項５０】
脂肪酸誘導体組成物がC10：1、C12：1、C14：1、C16：1またはC18：1不飽和脂肪酸誘導体を含む、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
脂肪酸誘導体組成物が脂肪酸を含む、請求項34記載の方法。
【請求項５２】
脂肪酸誘導体組成物が脂肪アルコールを含む、請求項34記載の方法。
【請求項５３】
脂肪酸誘導体組成物が脂肪エステルを含む、請求項34記載の方法。
【請求項５４】
脂肪酸誘導体組成物が、脂肪酸、脂肪エステルまたは脂肪アルコールの還元末端から7番目と8番目の炭素の間に二重結合を有する脂肪酸誘導体を含む、請求項34記載の方法。
【請求項５５】
脂肪酸誘導体組成物が不飽和脂肪酸誘導体を含む、請求項34記載の方法。
【請求項５６】
脂肪酸誘導体組成物が飽和脂肪酸誘導体を含む、請求項34記載の方法。
【請求項５７】
脂肪酸誘導体組成物が分枝鎖脂肪酸誘導体を含む、請求項34記載の方法。
【請求項５８】
脂肪酸誘導体が約1.003〜約1.5の現代炭素分率を有する、請求項34記載の方法。
【請求項５９】
脂肪酸誘導体が約-10.9〜約-15.4のδ13Cを有する、請求項34記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2012年12月12日に提出された米国仮出願第61／736,428号の恩典を主張し、それはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表
本出願は、ASCII書式で電子的に提出される配列表を含み、それはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。2013年11月1日に作成された前記ASCIIコピーの名称はLS00045PCT_SL.txtであり、サイズは232,659バイトである。
【０００３】
分野
本開示は、脂肪酸誘導体の産生をもたらすアシルキャリアータンパク質（ACP）の発現増大を示す組換え微生物に関する。本開示はさらに、脂肪酸誘導体および関連組成物を生産する目的で、組換え微生物を発酵培養物中で用いる方法にも関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、炭化水素（例えば、アルカンおよびオレフィン）、脂肪エステル（例えば、蝋、脂肪酸エステル、脂肪エステル）およびケトンなどの脂肪酸誘導体は、産業用化学品および燃料の重要なカテゴリー用の構成単位となっている。これらの化合物には、界面活性剤、潤滑剤、溶媒、乳化剤、軟化剤、増粘剤、香味剤、芳香剤および燃料としてのものを含む、数多くの産業的用途がある。例えば、代替燃料の1つであるバイオディーゼルは、主として、脂肪酸メチルエステル（FAME）、脂肪酸エチルエステル（FAEE）などのエステルで構成される。ある種の低分子量エステルは心地よい香りの揮発性物質であり、芳香剤および香味剤の生産に用いられる。加えて、脂肪エステルは、ラッカー、塗料およびワニス用の溶媒として；樹脂およびプラスチック中の柔軟剤として、可塑剤として、難燃剤として、ガソリンおよび油中の添加物として、ならびにポリマー、フィルム、繊維、染料および医薬品の製造にも用いられる。
【０００５】
自然界では、ほとんどの脂肪アルコールは、細菌、植物および動物によって産生される脂肪酸および脂肪アルコールのエステルである蝋として見出される。産業環境では、脂肪アルコールには多くの商業的用途がある。比較的短鎖の脂肪アルコールは、化粧品産業および食品産業において、乳化剤、軟化剤および増粘剤として用いられる。脂肪アルコールは、その両親媒性ゆえに、パーソナルケア用品および家事用品、例えば化粧品および洗剤などに役立つ非イオン性界面活性剤として振る舞う。加えて、脂肪アルコールは、蝋、ゴム、樹脂、医薬用の軟膏およびローション、潤滑油添加物、繊維用帯電防止剤および表面処理剤、可塑剤、工業用溶媒、ならびに脂肪用の溶媒としても用いられる。脂肪アルコールとは、鎖長が8〜22炭素原子である脂肪族アルコールのことである。脂肪アルコールは通常、偶数の炭素原子と、末端炭素に結びついた単一のアルコール基（OH）とを有し、これらの中には不飽和性のものもあれば分枝性のものもある。脂肪アルコールはまた、工業化学にも広く用いられている。
【０００６】
脂肪アルデヒドは、産業用の特殊化学品を生産するために用いることができる。例えば、アルデヒドは、ポリマー、樹脂、染料、香味剤、可塑剤、香料および医薬品を生産するためによく用いられる。アルデヒドはまた、溶媒、保存料および消毒剤として用いることもできる。ビタミンおよびホルモンといった、ある種の天然化合物および合成化合物はアルデヒドであり、多くの糖はアルデヒド基を含有する。脂肪アルデヒドは、化学的または酵素的な還元によって脂肪アルコールに変換させることができる。
【０００７】
歴史的に、産業用化学品および燃料は、石油化学品から生産されてきた。石油化学品の原材料は、脂肪酸、脂肪エステル、脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、ケトン、炭化水素などである。産業用化学品および燃料製品に用いるための石油の探査、採収、輸送および精製につきまとう難題ゆえに、よりコスト効果が高く、環境負荷の少ない原材料を生産するための代替的な手段に対しては需要がある。そのような代替的な手段の1つは、発酵性炭素源からの生物由来の化学品および燃料の生産である。しかし、生物由来の化学品および燃料を、発酵性糖またはバイオマスから商業的に実現可能な様式で生産するためには、生産物の効率的な変換および回収のために既存の工程を継続的に最適化しなければならない。産業界では注目に値する成果が得られてきているが、生物由来の化学品および燃料がより広く入手可能な選択肢となるためには、関連した工程のさらなる改良が依然として必要である。改良の対象となる分野には、生産工程の効率および生産物の収量が含まれる。本開示は、この需要に応えるものである。
【発明の概要】
【０００８】
概要
本開示は、脂肪酸誘導体組成物の生産を目的とする、脂肪酸生合成のために利用可能なアシルキャリアータンパク質（ACP）の量の増加をもたらすために有効なベクターおよび菌株改変による新規組換え宿主細胞を提供する。本開示はまた、組換え宿主細胞を培養すること、および脂肪酸誘導体組成物を培養培地から収集することによって、脂肪酸誘導体組成物を作製する方法も提供する。脂肪酸誘導体組成物の例には、脂肪酸、脂肪エステル、脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、ケトン、アルカン、アルケン、オレフィン、および／またはそれらの組み合わせを含む組成物が非限定的に含まれる。
【０００９】
本開示の1つの局面は、異種アシルキャリアータンパク質（ACP）をコードするポリヌクレオチド配列、および異種脂肪酸誘導体生合成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞であって、脂肪酸誘導体組成物を産生する、組換え宿主細胞を提供する。1つの特定の局面において、組換え宿主細胞は、炭素源を含有する培地中で、ポリヌクレオチド配列を過剰発現させるのに有効な条件下で培養した時に、組換え宿主細胞と同じ条件下で増殖させた対応する野生型宿主細胞と比較して、脂肪酸誘導体組成物をより高い力価、より高い収量および／またはより高い生産性で産生する。したがって、組換え宿主細胞は、脂肪酸誘導体を含む脂肪酸誘導体組成物を、対応する野生型宿主細胞よりも高い力価、高い収量および／または高い生産性で産生する。脂肪酸誘導体には、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、脂肪アルデヒド、アルカン、アルケン、オレフィンおよび／またはケトンが非限定的に含まれる。1つの態様において、組換え宿主細胞は、異種アシルキャリアータンパク質（ACP）をコードするポリヌクレオチド配列、およびチオエステラーゼ活性を有する異種脂肪酸誘導体生合成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、ここで組換え宿主細胞は脂肪酸を含む脂肪酸誘導体組成物を産生する。もう1つの態様において、組換え宿主細胞は、異種アシルキャリアータンパク質（ACP）をコードするポリヌクレオチド配列、チオエステラーゼ活性を有する異種脂肪酸誘導体生合成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、およびカルボン酸レダクターゼ（CAR）活性を有するタンパク質を含み、ここで組換え宿主細胞は脂肪アルコールを含む脂肪酸誘導体組成物を産生する。さらになおもう1つの態様において、組換え宿主細胞は、異種アシルキャリアータンパク質（ACP）をコードするポリヌクレオチド配列、およびアシル-ACPレダクターゼ（AAR）活性を有する異種脂肪酸誘導体生合成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、ここで組換え宿主細胞は脂肪アルコールを含む脂肪酸誘導体組成物を産生する。さらにもう1つの態様において、組換え宿主細胞は、異種アシルキャリアータンパク質（ACP）をコードするポリヌクレオチド配列、およびエステルシンターゼ活性を有する異種脂肪酸誘導体生合成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、ここで組換え宿主細胞は脂肪エステルを含む脂肪酸誘導体組成物を産生する。
【００１０】
本開示のもう1つの局面は、異種アシルキャリアータンパク質（ACP）をコードするポリヌクレオチド配列、および異種脂肪酸誘導体生合成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞であって、脂肪酸誘導体組成物を、対応する野生型宿主細胞と比較して少なくとも約10％〜少なくとも約90％上回る、より高い力価で産生する、組換え宿主細胞を提供する。脂肪酸誘導体組成物には、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、脂肪アルデヒド、アルカン、アルケン、オレフィンおよび／またはケトンを伴う組成物が非限定的に含まれる。
【００１１】
本開示のもう1つの局面は、異種アシルキャリアータンパク質（ACP）をコードするポリヌクレオチド配列、および異種脂肪酸誘導体生合成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞であって、脂肪酸誘導体組成物を、対応する野生型宿主細胞と比較して少なくとも約5％〜少なくとも約80％上回る収量で産生する、組換え宿主細胞を提供する。脂肪酸誘導体組成物には、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、脂肪アルデヒド、アルカン、アルケン、オレフィンおよび／またはケトンを伴う組成物が非限定的に含まれる。
【００１２】
本開示のもう1つの局面は、異種アシルキャリアータンパク質（ACP）をコードするポリヌクレオチド配列、および異種脂肪酸誘導体生合成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞であって、脂肪酸誘導体組成物を、約100mg／L〜約300g／Lの力価；および／または約1g／L〜約250g／Lの力価；および／または少なくとも約30g／Lもしくは約35g／Lもしくは約40g／Lもしくは約45g／Lもしくは約50g／Lもしくは約55g／Lもしくは約60g／Lもしくは約65g／Lもしくは約70g／Lもしくは約75g／Lもしくは約80g／Lもしくは約85g／Lもしくは約90g／Lもしくは約95g／Lもしくは約100g／Lもしくは約150g／Lもしくは約200g／Lの力価で産生する、組換え宿主細胞を提供する。加えて、脂肪酸誘導体組成物は、約0.7mg／L／時〜約2.5g／L／時の生産性で産生される。
【００１３】
本開示のもう1つの局面は、異種アシルキャリアータンパク質（ACP）をコードするポリヌクレオチド配列、および異種脂肪酸誘導体生合成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞であって、脂肪酸誘導体組成物を産生する、組換え宿主細胞を提供する。1つの態様において、ACPはシアノバクテリアアシルキャリアータンパク質（cACP）である。もう1つの態様において、ACPはマリノバクター・アクアエオレイ（Marinobacter aquaeolei）VT8アシルキャリアータンパク質（mACP）である。もう1つの態様において、ACPは大腸菌（Escherichia coli）アシルキャリアータンパク質（ecACP）である。
【００１４】
本開示のもう1つの局面は、異種アシルキャリアータンパク質（ACP）をコードするポリヌクレオチド配列、および異種脂肪酸誘導体生合成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞であって、脂肪酸誘導体組成物を産生する、組換え宿主細胞を提供する。1つの特定の局面において、組換え宿主細胞は、4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（PPTアーゼ）タンパク質をコードするsfp遺伝子をさらに発現する。1つの態様において、sfp遺伝子は、組換え細胞にとって異種である枯草菌（B. subtilis）sfp遺伝子である。もう1つの態様において、組換え細胞は生来の4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼタンパク質を有する。さらにもう1つの態様において、組換え宿主細胞は脂肪酸誘導体組成物を細胞外に産生する。さらになおもう1つの態様において、組換え宿主細胞は脂肪酸誘導体組成物を細胞内に産生する。
【００１５】
本開示はさらに、異種アシルキャリアータンパク質（ACP）をコードするポリヌクレオチド配列および異種脂肪酸誘導体生合成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を発現する組換え宿主細胞を含む細胞培養物であって、組換え宿主細胞が脂肪酸誘導体組成物を産生する細胞培養物を想定している。1つの態様において、脂肪酸誘導体組成物（例えば、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル）は培養培地中で見出される。組成物の脂肪酸誘導体は、C6、C8、C10、C12、C13、C14、C15、C16、C17および／またはC18脂肪酸誘導体である。1つの態様において、組成物の脂肪酸誘導体は、C10：1、C12：1、C14：1、C16：1、および／またはC18：1不飽和脂肪酸誘導体といった不飽和脂肪酸誘導体である。もう1つの態様において、組成物の脂肪酸誘導体は飽和脂肪酸誘導体である。1つの特定の態様において、脂肪酸誘導体組成物は、脂肪酸、脂肪エステルまたは脂肪アルコールの還元末端から7番目と8番目の炭素の間に二重結合を有する脂肪酸誘導体を含む。さらにもう1つの態様において、脂肪酸誘導体組成物は分枝鎖脂肪酸誘導体を含む。さらになおもう1つの態様において、脂肪酸誘導体組成物は、現代炭素分率（fraction of modern carbon）が約1.003〜約1.5である；および／またはδ13Cが約-10.9〜約-15.4である脂肪酸誘導体を含む。
【００１６】
本開示のもう1つの局面は、脂肪酸誘導体組成物を作製する方法を提供する。本方法は、上記のような組換え宿主細胞（前記）を、脂肪酸誘導体組成物を生産する目的で炭素源の存在下で培養する段階、および脂肪酸誘導体組成物を培養培地から収集する段階を含み、ここで脂肪酸誘導体組成物の収量、力価および／または生産性は、同じ条件下で培養した対応する野生型宿主細胞によって産生される脂肪酸誘導体組成物の収量、力価および／または生産性を少なくとも約10％上回る。本方法は任意で、産生された脂肪酸誘導体組成物を組換え宿主細胞から単離する段階を含む。1つの特定の態様において、脂肪酸誘導体組成物は培養培地中で見出される。脂肪酸誘導体組成物は、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、脂肪アルデヒド、アルカン、アルケン、オレフィンおよびケトンを非限定的に含む。1つの態様において、脂肪酸誘導体組成物は、脂肪酸または脂肪アルコールまたは脂肪エステルまたは脂肪アルデヒドまたはアルカンまたはアルケンまたはオレフィンまたはケトンを含む。もう1つの態様において、脂肪酸誘導体組成物は、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、脂肪アルデヒド、アルカン、アルケン、オレフィン（例えば、内部オレフィンまたは末端オレフィン）およびケトンを非限定的に含む、任意の1つまたは複数の脂肪酸誘導体の組み合わせである。脂肪酸誘導体組成物は、飽和性および／または不飽和性の脂肪酸誘導体を含みうる。1つの態様において、本方法では、C6、C8、C10、C12、C13、C14、C15、C16、C17またはC18脂肪酸誘導体を含む脂肪酸誘導体組成物が産生される。1つの特定の態様において、本方法では、C10：1、C12：1、C14：1、C16：1またはC18：1不飽和脂肪酸誘導体を含む脂肪酸誘導体組成物が産生される。もう1つの特定の態様において、脂肪酸誘導体組成物は脂肪酸を含む。もう1つの特定の態様において、脂肪酸誘導体組成物は脂肪アルコールを含む。もう1つの特定の態様において、脂肪酸誘導体組成物は脂肪エステルを含む。もう1つの特定の態様において、脂肪酸誘導体組成物は脂肪アルデヒドを含む。もう1つの特定の態様において、脂肪酸誘導体組成物はアルカンを含む。もう1つの特定の態様において、脂肪酸誘導体組成物はアルケンを含む。もう1つの特定の態様において、脂肪酸誘導体組成物は、内部および／または末端オレフィンなどのオレフィンを含む。もう1つの特定の態様において、脂肪酸誘導体組成物はケトンを含む。もう1つの態様において、脂肪酸誘導体組成物は分枝鎖脂肪酸誘導体を含む。さらにもう1つの態様において、脂肪酸誘導体組成物は、現代炭素分率が約1.003〜約1.5である；および／またはδ13Cが約-10.9〜約-15.4である脂肪酸誘導体を含む。さらにもう1つの特定の態様において、脂肪酸誘導体組成物は、脂肪酸、脂肪エステルおよび／または脂肪アルコールの還元末端から7番目と8番目の炭素の間に二重結合を有する脂肪酸誘導体を含む。
【００１７】
本開示はさらに、脂肪酸、脂肪エステルおよび／または脂肪アルコールの還元末端から7番目と8番目の炭素の間に二重結合を有する、上記の方法（前記）によって生産されるような脂肪酸誘導体組成物も想定している。この脂肪酸誘導体組成物は、上記のような異種アシルキャリアータンパク質（ACP）をコードするポリヌクレオチド配列および異種脂肪酸誘導体生合成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞（前記）によって産生される。
【００１８】
本開示は、脂肪酸誘導体組成物を、組換え宿主細胞と同じ条件下で増殖させた対応する野生型宿主細胞よりも高い力価、高い収量および／または高い生産性で産生する新規組換え宿主細胞、関連した方法および工程を提供する。特に、本開示の1つの局面は、異種アシルキャリアータンパク質（ACP）をコードするポリヌクレオチド配列および異種脂肪酸誘導体生合成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むかまたは発現する組換え宿主細胞であって、脂肪酸誘導体または脂肪酸誘導体組成物を産生する、組換え宿主細胞を提供する。もう1つの局面において、本開示は、異種アシルキャリアータンパク質（ACP）をコードするポリヌクレオチド配列；異種ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（PPTアーゼ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列；および異種脂肪酸誘導体生合成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むかまたは発現する組換え宿主細胞であって、脂肪酸誘導体組成物を産生する、組換え宿主細胞を提供する。1つの態様において、ACPはシアノバクテリアアシルキャリアータンパク質（cACP）である。もう1つの態様において、ACPはマリノバクター・アクアエオレイVT8アシルキャリアータンパク質（mACP）である。さらにもう1つの態様において、ACPは大腸菌アシルキャリアータンパク質（ecACP）である。さらにもう1つの態様において、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（PPTアーゼ）タンパク質は、sfp遺伝子によってコードされる4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼタンパク質である。脂肪酸誘導体生合成タンパク質には、チオエステラーゼ活性を有するタンパク質；カルボン酸レダクターゼ（CAR）活性を有するタンパク質；アシルACPレダクターゼ（AAR）活性を有するタンパク質；および／またはエステルシンターゼ活性を有するタンパク質が非限定的に含まれる。1つの特定の局面において、組換え宿主細胞は、炭素源を含有する培地中で、ポリヌクレオチド配列を過剰発現させるのに有効な条件下で培養した時に、組換え宿主細胞と同じ条件下で増殖させた対応する野生型宿主細胞と比較して、脂肪酸誘導体組成物を、より高い力価、より高い収量および／またはより高い生産性で産生する。組換え宿主細胞によって産生される脂肪酸誘導体組成物には、組換え宿主細胞によって産生される脂肪酸、脂肪エステル、脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、ケトン、アルカン、アルケン、オレフィン、および／またはそれらの組み合わせが非限定的に含まれる。
【００１９】
本開示のもう1つの局面は、異種アシルキャリアータンパク質（ACP）をコードするポリヌクレオチド配列およびチオエステラーゼ活性を有する異種脂肪酸誘導体生合成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むかまたは発現する、組換え宿主細胞を提供する。1つの態様において、脂肪酸誘導体生合成タンパク質はチオエステラーゼタンパク質である。もう1つの態様において、組換え宿主細胞は、異種ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（PPTアーゼ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含むかまたは発現する。本明細書において、これらの組換え宿主細胞によって産生される脂肪酸誘導体組成物は脂肪酸である。もう1つの態様において、組換え宿主細胞は、カルボン酸レダクターゼ（CAR）活性を備えるタンパク質をさらに含むかまたは発現する。さらにもう1つの態様において、組換え宿主細胞は、カルボン酸レダクターゼ（CAR）タンパク質をさらに含むかまたは発現する。これらの組換え宿主細胞によって産生される脂肪酸誘導体組成物は、脂肪アルコールおよび／または脂肪アルデヒドである。
【００２０】
本開示のもう1つの局面は、異種アシルキャリアータンパク質（ACP）をコードするポリヌクレオチド配列およびカルボン酸レダクターゼ（CAR）活性を有する異種脂肪酸誘導体生合成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むかまたは発現する、組換え宿主細胞を提供する。1つの態様において、組換え宿主細胞は、カルボン酸レダクターゼ（CAR）タンパク質を含むかまたは発現する。もう1つの態様において、組換え宿主細胞は、異種ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（PPTアーゼ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含むかまたは発現する。これらの組換え宿主細胞によって産生される脂肪酸誘導体組成物は、脂肪アルコールおよび／または脂肪アルデヒドである。
【００２１】
本開示のもう1つの局面は、異種アシルキャリアータンパク質（ACP）をコードするポリヌクレオチド配列およびアシル-ACPレダクターゼ（AAR）活性を有する異種脂肪酸誘導体生合成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むかまたは発現する宿主細胞を提供する。1つの態様において、組換え宿主細胞は、アシル-ACPレダクターゼ（AAR）タンパク質を含むかまたは発現する。もう1つの態様において、組換え宿主細胞は、異種ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（PPTアーゼ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含むかまたは発現する。これらの組換え宿主細胞によって産生される脂肪酸誘導体組成物は、脂肪アルコールおよび／または脂肪アルデヒドである。
【００２２】
本開示はまた、新規組換え宿主細胞を含む細胞培養物および細胞培養物を用いる方法も範囲に含む。本開示はさらに、本開示の組換え宿主細胞を培養することによって脂肪酸誘導体を含む組成物を作製する方法、そのような方法によって作製された組成物、およびさらなる検討によって明らかになる他の特徴も提供する。
【００２３】
1つの局面において、本開示は、異種ACPタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、および脂肪酸誘導体生合成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む培養組換え宿主細胞であって、炭素源を含有する培地中で、ポリヌクレオチドを過剰発現させるのに有効な条件下で培養した時に、組換え宿主細胞と同じ条件下で増殖させた対応する野生型宿主細胞における発現レベルと比較して、脂肪酸誘導体組成物を、脂肪酸誘導体のより高い力価、より高い収量またはより高い生産性で産生する培養組換え宿主細胞を提供する。脂肪酸誘導体組成物は、脂肪酸、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステル、アルカン、アルケン、オレフィンおよび／またはケトンなどの脂肪酸誘導体を含む。ACPは、シアノバクテリアアシルキャリアータンパク質（cACP）、マリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカス（Marinobacter hydrocarbonoclasticus）アシルキャリアータンパク質（mACP）、または大腸菌アシルキャリアータンパク質（ecACP）であってよい。組換え培養宿主細胞がsfp遺伝子をさらに含んでもよく、ここでsfp遺伝子は、補酵素A（CoA）の4'-ホスホパンテテイニル部分をセリン残基に転移させる改変4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（PPTアーゼ）タンパク質をコードする枯草菌sfp遺伝子であってよい。これらの態様および他の態様は、本明細書において提供される本開示を考慮すれば当業者には容易に想到されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
本開示は、好ましい態様を例示する役割を果たす添付の図面と併せて読むと、最も良く理解される。しかし、本開示が、図面中に開示された具体的な態様に限定されないことは理解されよう。
【図１】組換え宿主細胞における脂肪酸誘導体産生への前駆体としてのアシル-CoAの生産に用いるための、例示的な生合成経路の図式的概観である。このサイクルは、マロニル-ACPとアセチル-CoAとの縮合によって始まる。
【図２】マロニル-ACPとアシル-ACPとの縮合から始まってアシル-ACPで終わる、例示的な脂肪酸生合成サイクルのもう1つの図式的概観を描写している。
【図３】アセチル-CoAカルボキシラーゼ酵素複合体（accABCD遺伝子によってコードされる）の構造および機能を図示している。
【図４】アシル-ACPから出発する脂肪アルコールの生成のための例示的な生合成経路の図式的概観を提示している。
【図５】アシル-ACPから出発する脂肪エステルの生成のための2つの例示的な生合成経路の1つの概観を提示している。
【図６】アシル-ACPから出発する炭化水素（オレフィンおよびアルカン）の生成のための例示的な生合成経路のもう1つの概観を提示している。
【図７】標準的なマイクロタイタープレート発酵実験において、リーダーレス大腸菌チオエステラーゼ（'tesA遺伝子によってコードされる）を発現させること、ならびにシアノバクテリアアシルキャリアータンパク質（cACP）および枯草菌sfpを共発現させることによる、大腸菌DV2細胞における脂肪酸の産生を図示している。
【図８】シネココッカス・エロンガタス（Synechococcus elongatus）アシル-ACPレダクターゼ（AAR）を発現させること、および表2のさまざまなシアノバクテリアアシルキャリアータンパク質（ACP）を共発現させることによる、大腸菌DV2細胞における脂肪アルコールの産生を図示している。
【図９】pEP.100プラスミドを含有する菌株の96ウェルプレート発酵の結果を示している。stEP604株は、対照株sven038を上回る大きな力価改善（3倍）を生じた。BD64株バックグラウンドにおける同じプラスミドは、対照KEV075株よりも幾分低い力価をもたらした。
【図１０】stEP604株の5リットルのタンク発酵の結果を示している。stEP604株は、ラン（run）の全体を通じて、対照（sven38）に比して一貫してより高い力価を生じた。
【図１１】mACPを過剰発現するように遺伝子操作された菌株のプレート発酵の結果を示している。菌株はすべてGLPH-077宿主菌株に由来しており、ACP過剰発現の存在下および非存在下において比較を行った。
【図１２】pKEV022またはpSHU018を含有する菌株における、総力価（総脂肪酸種（FAS）のg／L）およびω-ヒドロキシ（β-OH）エステル産生の比率（％）に対するecACPの過剰発現の影響を図示している。
【図１３】mACPまたはecACPを過剰発現する菌株の5リットルのバイオリアクター発酵の間のFAS力価（g／L）を図示している（すなわち、24〜72時間）。これらの結果は、ecACPを伴うpSHU18が、総FAS産生に関して、他のエステルシンターゼバリアントよりも成績が優れることを示している。
【図１４】5リットルのバイオリアクター内で培養した時にさまざまな菌株によって産生されるω-ヒドロキシ（β-OH）FAMEのパーセンテージを図示している。ecACPを過剰発現したpSHU18株は、β-OH FAMEをおよそ68％産生した。
【図１５】5リットルのバイオリアクター発酵ランの間のグルコースに関する収量（％）を、グルコースに関する収量を比較したデータとともに示している（すなわち、24〜72時間）。ecACPを過剰発現したpSHU18株は、この試験において検討した他の菌株よりも高い収量を明らかに示した。
【図１６】プラスミドpDS171Sを含有する菌株iDJにおけるアルカン産生のmg／Lを図示している（右側から3つ目のカラムを参照）。ノストック（Nostoc）属73102 acp＋sfpの発現により、アルカン産生の改善が実証された。対照（acp／sfpを伴わない）はpLS9-185とした（第1および第2のカラムを参照されたい）。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
詳細な説明
全体的概観
石油および石油化学品に対する我々の依存をなくす方策の1つは、小型の生産宿主として役立つ環境負荷の少ない微生物を通じて脂肪酸誘導体を産生させることである。そのような細胞宿主（すなわち、生産宿主細胞または生産菌株）は、再生可能な供給源、例えば再生可能な原料（例えば、発酵性の糖、糖質、バイオマス、セルロース、グリセロール、CO、CO2など）などから脂肪酸誘導体を産生するように遺伝子操作されている。これらの脂肪酸誘導体は、産業用の特殊化学品および燃料を含むほとんどの工業製品の原材料または構成単位である。生物由来の化学品および燃料の基盤となる生物由来の脂肪酸誘導体には、石油から作られる化学品および燃料に勝る明白な利点がある。何よりもまず第1に、それらは環境を保護すること、および天然資源を保全することによって、より汚染源となりにくい（cleaner）選択肢を提供する。人口は2050年までに90億人に達すると推定されており、天然油の備蓄量は刻々と減少している。第2に、生物由来の化学品および燃料の製造により、地球により優しく、かつより持続可能な生産方法が可能になることによって、地球温暖化のリスクが軽減される。第3に、生物由来の化学品および燃料の製造は、石油の採取および油脂分解工程よりもはるかに費用のかからない再生可能な炭素源（例えば、糖質、CO2、バイオマス、グリセロール）を製造工程に用いるという理由から、高騰しているエネルギー費用とも軌を一つにしている。例えば、リグノセルロースバイオマスは糖質の含有量が多いことから、酵素反応のための魅力のある原料となっている。費用がかからず、しかも豊富にある同じような再生可能な原料には、他の産業工程の副産物（bi-product）であるCO2およびグリセロールが含まれる。
【００２６】
本明細書において想定している生物由来の化学品および燃料は、脂肪酸、脂肪エステル、脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、炭化水素（例えば、アルカン、アルケンおよび／またはオレフィン）および／またはケトンから作られる。そのため、所望の化学製品を得る目的で、それらを発酵性糖、糖質、バイオマス、CO2、CO、セルロース、グリセロールなどから生産することができる（例えば、脂肪アルコールの生産については米国特許第8,535,916号；第8,283,143号；第8,268,599号；および第8,110,670号を参照；脂肪エステルの生産については米国特許第8,110,670号および第8,313,934号を参照；奇数鎖脂肪酸誘導体の生産については米国特許第8,372,610号を参照、ならびに分枝鎖脂肪酸誘導体の生産については米国特許第8,530,221号を参照；アルカンおよびアルケンの生産については米国特許第8,323,924号を参照；オレフィンの生産については米国特許第8,183,028号を参照；脂肪アルデヒドの生産については米国特許第8,097,439号を参照；ならびに、バイオクルード（biocrude）からの低分子量炭化水素の生産については米国特許第8,110,093号を参照。これらはすべて、参照により本明細書に組み入れられる）。
【００２７】
本開示は、脂肪酸誘導体の生産を目的として、アシルキャリアータンパク質（ACP）を過剰発現し、かつ脂肪酸誘導体生合成タンパク質（例えば、末端酵素）を発現する（または過剰発現する）環境負荷の少ない微生物を遺伝子操作によって作製することによる、さらなる改良も提供する。本発明者らは、驚いたことに、ACPを過剰発現させることと、末端酵素（例えば、チオエステラーゼ（TE）、カルボン酸レダクターゼ（CAR）、エステルシンターゼ、アシル-ACPレダクターゼ（AAR）、その他）などの生合成タンパク質を発現または過剰発現させることを組み合わせることが、微生物を介した脂肪酸誘導体の力価、収量および／または生産性の大幅な増大につながることを見いだした。そのような改変された微生物は、このため、それらの生来の対応物または対応する野生型微生物と比較した場合に、より高い力価、より高い収量および／またはより高い生産性の脂肪酸誘導体産生であることを特徴とすることができる。
【００２８】
定義
別に定義する場合を除き、本明細書において用いる技術用語および科学用語はすべて、本開示が属する当技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同等の他の方法および材料を本開示の実施に用いることができるが、好ましい材料および方法は本明細書に記載されている。
【００２９】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる場合、単数形の「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、文脈によって明らかに別様に規定されている場合を除き、複数形の指示物も含む。したがって、例えば、「1つの組換え宿主細胞」への言及は2つまたはそれを上回るそのような組換え宿主細胞を含み、「1つの脂肪アルコール」への言及は1つもしくは複数の脂肪アルコール、または脂肪アルコールの混合物への言及を含み、「1つの核酸コード配列」への言及は1つまたは複数の核酸コード配列を含み、「1つの酵素」への言及は1つまたは複数の酵素を含み、他についても同様である。
【００３０】
配列アクセッション番号は、本記載を通じて、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health, U.S.A.）によって管理されているNCBI（National Center for Biotechnology Information）によって提供されるデータベースから（これらは本明細書では「NCBIアクセッション番号」として、または代替的には「GenBankアクセッション番号」として識別される）、ならびにSwiss Institute of Bioinformaticsによって提供されるUniProt Knowledgebase（UniProtKB）およびSwiss-Protデータベースから（これらは本明細書では「UniProtKBアクセッション番号」として識別される）入手した。
【００３１】
酵素分類（EC）番号は、国際生化学分子生物学連合（International Union of Biochemistry and Molecular Biology）（IUBMB）の命名委員会（Nomenclature Committee）によって確立されており、その記述はWorld Wide WebのIUBMB Enzyme Nomenclatureウェブサイトで入手可能である。EC番号は、酵素により触媒される反応に応じて酵素を分類する。例えば、異なる酵素（例えば、異なる生物に由来する）が同じ反応を触媒するならば、それらは同じEC番号に分類される。加えて、収束進化を通じて、異なるタンパク質フォールドが同一の反応を触媒しうるようになり、そのため同一のEC番号が割り当てられることもある（Omelchenko et al. (2010) Biol. Direct 5:31を参照）。進化の上では関係がなく、同じ生化学反応を触媒しうるタンパク質は、相似酵素（すなわち、相同酵素とは対照的なものとして）と呼ばれることがある。EC番号は、例えば、タンパク質をそのアミノ酸配列によって特定するUniProt識別子とは異なる。
【００３２】
本明細書で用いる場合、「ヌクレオチド」という用語は、複素環塩基、糖、および1つまたは複数のリン酸基からなるポリヌクレオチドのモノマー単位を指す。天然の塩基（グアニン（G）、アデニン（A）、シトシン（C）、チミン（T）およびウラシル（U））は、典型的にはプリンまたはピリミジンの誘導体であるが、天然および非天然の塩基類似体も含まれることが理解されるべきである。天然の糖は、ペントース（五炭糖）デオキシリボース（DNAを形成する）またはリボース（RNAを形成する）であるが、天然および非天然の糖類似体も含まれることが理解されるべきである。核酸は、典型的にはリン酸結合を介して連結して核酸またはポリヌクレオチドを形成するが、多くの他の結合も当技術分野において公知である（例えば、ホスホロチオエート、ボラのホスフェートなど）。
【００３３】
本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド（RNA）またはデオキシリボヌクレオチド（DNA）の重合体を指し、それらは一本鎖でも二本鎖でもよく、非天然または改変ヌクレオチドを含むこともできる。「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」および「ヌクレオチド配列」という用語は、本明細書において、RNAまたはDNAのいずれかである任意の長さの重合型のヌクレオチドを指す目的で互換的に用いられる。これらの用語は分子の一次構造を指しており、それ故、二本鎖および一本鎖のDNA、ならびに二本鎖および一本鎖のRNAを含む。これらの用語は、同等のものとして、メチル化および／またはキャッピングされたポリヌクレオチドなどの、ただしそれらに限定はされないヌクレオチド類似体および修飾ポリヌクレオチドでできたRNAまたはDNAのいずれかの類似体を含む。ポリヌクレオチドは、プラスミド、ウイルス、染色体、EST、cDNA、mRNA、およびrRNAを非限定的に含む、任意の形態にあってよい。
【００３４】
本明細書で用いる場合、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基の重合体を指す目的で互換的に用いられる。「組換えポリペプチド」という用語は、組換え手法によって産生されるポリペプチドを指し、ここでは概して、発現させるタンパク質をコードするDNAまたはRNAを適した発現ベクター中に挿入し、続いてそれを、該ポリペプチドを産生させる目的で宿主細胞を形質転換するために用いる。
【００３５】
本明細書で用いる場合、「ホモログ」および「相同な」という用語は、対応するポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に対して少なくとも約50％同一である配列を含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。好ましくは、相同なポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、対応するアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または少なくとも約99％の相同性を有するポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有する。本明細書で用いる場合、配列「相同性」および配列「同一性」という用語は、互換的に用いられる。当業者は、2つまたはそれ以上の配列の間の相同性を決定するための方法を熟知しているであろう。手短に述べると、2つの配列間の「相同性」の計算は、以下のように行うことができる。配列を、最適な比較のために整列させる（例えば、最適なアラインメントのために第1および第2のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較のために非相同配列を無視することができる）。1つの好ましい態様において、比較のために整列させる第1の配列の長さは、第2の配列の長さの少なくとも約30％、好ましくは少なくとも約40％、より好ましくは少なくとも約50％、さらにより好ましくは少なくとも約60％、さらにより好ましくは少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、または約100％である。続いて、第1および第2の配列の対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1の配列における位置が第2の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められている場合には、その分子はその位置で同一である。2つの配列間の％相同性は、2つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、配列が共通に持つ同一な位置の数の関数である。2つの配列間での配列の比較および％相同性の決定は、BLAST（Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol, 215(3): 403-410）などの数学的アルゴリズムを用いて実現することができる。2つのアミノ酸配列間の％相同性を、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunschのアルゴリズムを用い、Blossum 62行列またはPAM250行列のいずれか、ならびに16、14、12、10、8、6または4のギャップ加重および1、2、3、4、5または6の長さ加重を用いて決定することもできる（Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol., 48: 444-453）。また、2つのヌクレオチド配列間の％相同性を、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを用いNWSgapdna.CMP行列、ならびに40、50、60、70または80のギャップ加重および1、2、3、4、5または6の長さ加重を用いて決定することもできる。当業者は、初期の相同性計算を行い、それに応じてアルゴリズムパラメーターを調整することができる。好ましいパラメーターのセット（および、分子が添付の特許請求の範囲の相同性の限度内にあるか否かを判定するためにどのパラメーターを適用すべきかを実施者が分かっていない場合に用いるべきセット）では、Blossum 62スコアリング行列を、ギャップペナルティ12、ギャップ延長ペナルティ4およ���フレームシフトギャップペナルティ5で用いる。配列アラインメントのそのほかの方法は、バイオテクノロジーの技術分野で公知である（例えば、Rosenberg (2005) BMC Bioinformatics, 6: 278；Altschul, et al. (2005) FEBS J., 272(20): 5101-5109を参照されたい）。
【００３６】
本明細書で用いる場合、「低ストリンジェントな、中ストリンジェントな、高ストリンジェントなまたは超高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する条件を述べている。ハイブリダイゼーション反応を行うための手引きは、水性および非水性の方法が記載されたCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 - 6.3.6.に見ることができる。本明細書において言及する具体的なハイブリダイゼーション条件は、以下の通りである：1）低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件--6×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）、約45℃の後に、0.2×SSC、0.1％ SDS中、少なくとも50℃で2回洗浄（低ストリンジェントな条件の場合、洗浄の温度は55℃まで上げることができる）；2）中ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件--6×SSC、約45℃の後に、0.2×SSC、0.1％ SDS中、60℃での1回または複数回の洗浄；3）高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件--6×SSC、約45℃の後に、0.2.X SSC、0.1％ SDS中、65℃での1回または複数回の洗浄；および4）超高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件--0.5Mリン酸ナトリウム、7％ SDS、65℃の後に、0.2×SSC、1％ SDS、65℃での1回または複数回の洗浄。別に指定する場合を除き、通常は、超高ストリンジェントな条件（4）が好ましい条件である。
【００３７】
「内因性」という用語は、「内部で生じる」ことを意味する。そのため、「内因性」ポリペプチドとは、宿主細胞の生来のゲノムによってコードされるポリペプチドのことを指す。例えば、内因性ポリペプチドは、組換え細胞が遺伝子操作により作製される（または由来する）親微生物細胞（例えば、親宿主細胞）のゲノムによってコードされるポリペプチドのことを指すことができる。
【００３８】
「外因性」という用語は、「外側から生じる」ことを意味する。そのため、「外因性」ポリペプチドとは、細胞の生来のゲノムによってはコードされないポリペプチドのことを指す。そのような外因性ポリペプチドは細胞内に移行しており、異なる細胞型もしくは種からクローニングされるかもしくはそれに由来することもあれば；または、同じ細胞型もしくは種からクローニングされるかもしくはそれに由来することもある。例えば、バリアント（すなわち、突然変異体のまたは改変された）ポリペプチドは、外因性ポリペプチドの一例である。同様に、非天然の核酸分子も、細胞に導入されると、細胞にとって外因性であると判断される。また、「外因性」という用語を、非生来の状態にある組換え宿主細胞内に存在するポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質に言及して用いることもできる。例えば、「外因性」ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列は、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質の発現レベルまたは配列の点での改変というように、対応する野生型宿主細胞内に天然に存在する野生型配列に比して改変されていてもよい。同様に、天然に存在する核酸分子も、特定の細胞にとっては外因性である場合がある。例えば、細胞Xから単離されたあるコード配列の全体は、そのコード配列が細胞Yに導入されると、たとえXとYが同じ細胞型であったとしても、細胞Yに対しては外因性核酸である。
【００３９】
「過剰発現された」という用語は、ある遺伝子が、その遺伝子の内因性転写速度と比較して高い速度で転写されるようになっていることを意味する。いくつかの例では、過剰発現は、対応するタンパク質の翻訳の速度が、そのタンパク質の内因性翻訳速度と比較して上昇していることをさらに含む。過剰発現を検査するための方法は当技術分野において周知であり、例えば、転写されたRNAのレベルをrtPCRを用いて評価すること、およびタンパク質レベルをSDS pageゲル分析を用いて評価することができる。
【００４０】
「異種」という用語は、「異なる細胞、異なる生物、異なる細胞型、および／または異なる種に由来する」ことを意味する。本明細書で用いる場合、「異種」という用語は、典型的には、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたはタンパク質に関連しており、ある所与の生物、細胞型または種に天然では存在しないポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質のことを指す。例えば、ある植物由来のポリヌクレオチド配列を微生物宿主細胞に組換え法によって導入することができるが、そうするとその植物ポリヌクレオチドはその組換え微生物宿主細胞にとって異種となる。同様に、シアノバクテリア由来のポリヌクレオチド配列をエシェリキア属の微生物宿主細胞に組換え法によって導入することができ、そうするとシアノバクテリア由来のポリヌクレオチドはその組換え微生物宿主細胞にとって異種となる。いくつかの態様において、「異種」という用語を、「外因性」という用語と互換的に用いることもできる。例えば、細胞Xから単離されたあるコード配列の全体は、そのコード配列が細胞Yに導入されると、たとえXとYが同じ細胞型であったとしても、細胞Yに対しては異種核酸である。
【００４１】
本明細書で用いる場合、ポリペプチドの「断片」という用語は、完全長ポリペプチドまたはタンパク質のより短い部分を指し、そのサイズは、4アミノ酸残基から、アミノ酸配列全体マイナス1アミノ酸残基までの範囲にわたる。本開示のある態様において、断片とは、ポリペプチドまたはタンパク質のあるドメイン（例えば、基質結合ドメインまたは触媒ドメイン）のアミノ酸配列全体を指す。
【００４２】
本明細書で用いる場合、「突然変異誘発」という用語は、生物の遺伝情報を安定的な様式で変化させる工程を指す。核酸配列をコードするタンパク質の突然変異誘発により、突然変異体タンパク質が生じる。また、突然変異誘発とは、タンパク質活性の改変をもたらす非コード性核酸配列の変化も指す。
【００４３】
本明細書で用いる場合、「遺伝子」という用語は、RNA産物またはタンパク質産物のいずれかをコードする核酸配列、ならびに、そのRNAもしくはタンパク質の発現に影響を及ぼす機能的に連結された核酸配列（例えば、そのような配列には、プロモーター配列またはエンハンサー配列が非限定的に含まれる）またはそのRNAもしくはタンパク質に影響を及ぼす配列をコードする機能的に連結された核酸配列（例えば、そのような配列には、リボソーム結合部位または翻訳制御配列が非限定的に含まれる）を指す。
【００４４】
発現制御配列は当技術分野において公知であり、これには例えば、宿主細胞におけるポリヌクレオチド配列の発現をもたらす、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写終結因子、配列内リボソーム進入部位（IRES）などが含まれる。発現制御配列は、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する（Maniatis et al. (1987) Science, 236: 1237-1245）。例示的な発現制御配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。本開示の方法において、発現制御配列は、ポリヌクレオチド配列と機能的に連結されている。「機能的に連結された」という用語は、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が発現制御配列に結合した時に遺伝子発現を可能にするような様式で、ポリヌクレオチド配列と該発現制御配列が接続されていることを意味する。機能的に連結されたプロモーターは、転写および翻訳の方向の観点では、選択されたポリヌクレオチド配列の上流に位置する。機能的に連結されたエンハンサーは、選択されたポリヌクレオチドの上流、内部または下流に位置することができる。
【００４５】
本明細書で用いる場合、「ベクター」という用語は、それに連結された別の核酸、すなわちポリヌクレオチド配列を輸送しうる核酸分子を指す。有用なベクターの一種は、エピソーム（すなわち、染色体外での複製が可能な核酸）である。有用なベクターは、それに連結された核酸の自律複製および／または発現を可能にするものである。機能的に連結された遺伝子の発現を導くことができるベクターを、本明細書では「発現ベクター」と称する。一般に、組換えDNA手法において有用な発現ベクターは、ベクター形態では染色体に結合していない環状二本鎖DNAループ全般を指す「プラスミド」の形態にあることが多い。他の有用な発現ベクターは、直鎖形態で提供される。同等の機能を果たす他の形態の発現ベクター、および当技術分野において今後公知となる他の形態の発現ベクターも同じく含まれる。いくつかの態様において、組換えベクターは、ポリヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターをさらに含む。いくつかの態様において、プロモーターは、発生段階調節性（developmentally-regulated）プロモーター、オルガネラ特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、構成性プロモーター、または細胞特異的プロモーターである。組換えベクターは典型的に、ポリヌクレオチド配列と機能的に結びついた発現制御配列；ポリヌクレオチド配列と機能的に結びついた選択マーカー；ポリヌクレオチド配列と機能的に結びついたマーカー配列；ポリヌクレオチド配列と機能的に結びついた精製部分；ポリヌクレオチド配列と機能的に結びついた分泌配列；およびポリヌクレオチド配列と機能的に結びついたターゲティング配列より選択される、少なくとも1つの配列を含む。ある態様において、ヌクレオチド配列は宿主細胞のゲノムDNAに安定的に組み込まれており、ヌクレオチド配列の発現は、調節プロモーター領域の制御下にある。本明細書で使用される発現ベクターは、本明細書に記載の特定のポリヌクレオチド配列を、宿主細胞におけるポリヌクレオチド配列の発現に適した形態で含む。当業者には、発現ベクターの設計が、形質転換させようとする宿主細胞の選択、所望のポリペプチドの発現レベルなどの要因に依存しうることが理解されるであろう。本明細書に記載の発現ベクターは、本明細書に述べるようなポリヌクレオチド配列によってコードされる、融合ポリペプチドを含むポリペプチドを産生させるために宿主細胞に導入することができる。原核生物、例えば大腸菌（E. coli）におけるポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、融合または非融合ポリペプチドのいずれかの発現を導く構成性または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて実施されることが最も多い。融合ベクターは、その中にコードされているポリペプチド、通常は組換えポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に、いくつかのアミノ酸を付加する。そのような融合ベクターは、典型的には、組換えポリペプチドの発現を増大させること；組換えポリペプチドの溶解性を高めること；およびアフィニティー精製におけるリガンドとして作用することによって、組換えポリペプチドの精製を助けることを含む3つの目的のうちの1つまたは複数に役立つ。多くの場合、融合発現ベクターでは、融合部分���組換えポリペプチドの接合部にタンパク質分解切断部位が導入されている。これにより、融合ポリペプチドの精製後に、融合部分からの組換えポリペプチドの分離が可能になる。ある態様において、本開示のポリヌクレオチド配列は、バクテリオファージT5由来のプロモーターと機能的に連結されている。
【００４６】
ある態様において、宿主細胞は酵母細胞であり、発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母S.セレビシエ（S. cerevisiae）における発現のためのベクターの例には、pYepSec1（Baldari et al. (1987) EMBO J., 6: 229-234）, pMFa（Kurjan et al. (1982) Cell, 30: 933-943）、pJRY88（Schultz et al. (1987) Gene, 54: 113-123）、pYES2（Invitrogen Corp., San Diego, CA）、およびpicZ（Invitrogen Corp., San Diego, CA）が含まれる。他の態様において、宿主細胞は昆虫細胞であり、発現ベクターはバキュロウイルス発現ベクターである。培養昆虫細胞（例えば、Sf9細胞）におけるタンパク質の発現のために利用しうるバキュロウイルスベクターには、例えば、pAc系列（Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol., 3: 2156-2165）およびpVL系列（Lucklow et al. (1989) Virology, 170: 31-39）が含まれる。さらにもう1つの態様において、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列を、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞において発現させることもできる。原核細胞および真核細胞のいずれについても他の適した発現系が当技術分野において周知である；例えば、Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)を参照されたい。
【００４７】
本明細書で用いる場合、「CoA」とは、アルキル鎖のカルボニル炭素と補酵素A（CoA）の4'-ホスホパンテチオニル部分のスルフヒドリル基との間に形成され、式R-C(O)S-CoAを有するアシルチオエステルを指し、式中、Rは少なくとも4個の炭素原子を有する任意のアルキル基である。
【００４８】
「ACP」という用語はアシルキャリアータンパク質を意味する。ACPは脂肪酸生合成におけるアシル中間体の高度に保存された担体であり、この場合には、成長中の鎖が合成中にチオールエステルとして、4'-ホスホパンテテイン部分の遠位チオールと結合する。このタンパク質は、2種類の形態、すなわち、アポ-ACP（脂肪酸生合成においては不活性）およびACPまたはホロ-ACP（脂肪酸生合成において活性がある）として存在する。「ACP」および「ホロ-ACP」という用語は本明細書において互換的に用いられ、活性型のタンパク質のことを指す。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼと呼ばれる酵素は、不活性アポ-ACPの活性ホロ-ACPへの変換に関与する。より詳細には、ACPは不活性なアポ-ACP形態として発現され、ホロ-ACPが生成されるためには、4'-ホスホパンテテイン部分が、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの1つであるホロ-アシルキャリアータンパク質シンターゼ（ACPS）の作用によって、ACP上の保存されたセリン残基と翻訳後に結びつかなければならない。
【００４９】
本明細書で用いる場合、「アシル-ACP」という用語は、アルキル鎖のカルボニル炭素とアシルキャリアータンパク質（ACP）のホスホパンテテイニル部分のスルフヒドリル基との間に形成されるアシルチオエステルを指す。いくつかの態様において、ACPは完全飽和アシル-ACPの合成における中間体である。他の態様において、ACPは不飽和アシル-ACPの合成における中間体である。いくつかの態様において、炭素鎖は約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、または26個の炭素を有すると考えられる。
【００５０】
本明細書で用いる場合、「脂肪酸誘導体」という用語は、「脂肪酸」または「脂肪酸誘導体」を意味し、これは「脂肪酸またはその誘導体」とも呼ばれ得る。「脂肪酸」という用語は、式RCOOHを有するカルボン酸を意味する。Rは脂肪族基、好ましくはアルキル基を表す。Rは約4〜約22個の炭素原子を含むことができる。脂肪酸は飽和、一不飽和または多不飽和であってよい。「脂肪酸誘導体」とは、産生宿主生物の脂肪酸生合成経路から部分的に作られた生成物である。「脂肪酸誘導体」には、ACP、アシル-ACPまたはアシル-ACP誘導体から部分的に作られた生成物が含まれる。例示的な脂肪酸誘導体には、例えば、アシル-CoA、脂肪酸、脂肪アルデヒド、短鎖および長鎖アルコール、脂肪酸アルコール、炭化水素、エステル（例えば、蝋、脂肪酸エステルまたは脂肪エステル）、末端オレフィン、内部オレフィン、およびケトンが含まれる。
【００５１】
本明細書において言及される「脂肪酸誘導体組成物」は、組換え宿主細胞によって産生され、典型的には、脂肪酸誘導体の混合物を含む。場合によっては、混合物は、複数の種類の生成物（例えば、脂肪酸および脂肪アルコール、脂肪酸および脂肪酸エステルまたはアルカンならびにオレフィン）を含む。また別の場合には、脂肪酸誘導体組成物は、例えば、さまざまな鎖長および飽和性または分枝の特徴を有する脂肪アルコール（または別の脂肪酸誘導体）の混合物を含みうる。さらに別の場合には、脂肪酸誘導体組成物は、複数の種類の生成物と、さまざまな鎖長および飽和性または分枝の特徴を有する生成物との両方の混合物を含む。
【００５２】
本明細書で用いる場合、「脂肪酸生合成経路」という用語は、脂肪酸およびその誘導体を生成する生合成経路を意味する。脂肪酸生合成経路は、所望の特性を有する脂肪酸誘導体を産生するためのさらなる酵素を含みうる。
【００５３】
「脂肪酸誘導体生合成タンパク質」という用語は、脂肪酸およびその誘導体を生成する生合成タンパク質（例えば、酵素）を意味する。末端酵素（例えば、チオエステラーゼ（TE）、カルボン酸レダクターゼ（CAR）、エステルシンターゼ、アシル-ACPレダクターゼ（AAR）、デカルボニラーゼ、アシル-CoAレダクターゼ、その他）は、脂肪酸生合成タンパク質の一例である。脂肪酸誘導体生合成タンパク質（またはそのような脂肪酸誘導体生合成タンパク質の組み合わせ）は、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、脂肪アルデヒド、アルカン、アルケン、オレフィン、ケトンなどを生成させることができる。1つの態様において、脂肪酸誘導体生合成タンパク質は酵素活性を有する。もう1つの態様において、脂肪酸誘導体生合成タンパク質は、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、脂肪アルデヒド、アルカン、アルケン、オレフィン（例えば、末端オレフィン、内部オレフィン）および／またはケトンなどの脂肪酸誘導体の生成を触媒しうる酵素である。1つの特定の態様において、脂肪酸誘導体生合成タンパク質は、脂肪酸を生産するために、チオエステラーゼ活性を有するか、またはチオエステラーゼである。もう1つの特定の態様において、脂肪酸誘導体生合成タンパク質は、脂肪アルコールを生産するために、カルボン酸レダクターゼ（CAR）活性を有するか、またはCARである。もう1つの特定の態様において、脂肪酸誘導体生合成タンパク質は、脂肪アルコールならびに／または脂肪アルデヒドならびに／または脂肪アルカンおよびアルケンを生産するために、アシル-ACPレダクターゼ（AAR）活性を有するか、またはAARである。もう1つの特定の態様において、脂肪酸誘導体生合成タンパク質は、脂肪エステルを生産するために、エステルシンターゼ活性を有するか、またはエステルシンターゼである。もう1つの特定の態様において、脂肪酸誘導体生合成タンパク質は、オレフィンなどの炭化水素を生産するために、OleABCD活性を有するか、またはOleABCDタンパク質である。もう1つの特定の態様において、脂肪酸誘導体生合成タンパク質は、ケトンを生産するために、OleA活性を有するか、またはOleAタンパク質である。
【００５４】
本明細書で用いる場合、「脂肪エステル」は、式RCOOR'を有するエステルを意味する。本明細書において言及される脂肪エステルは、脂肪酸から作られるあらゆるエステル、例えば脂肪酸エステルでありうる。いくつかの態様において、R基は、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、または少なくとも19炭素長である。代替的または追加的に、R基は20もしくはそれ未満、19もしくはそれ未満、18もしくはそれ未満、17もしくはそれ未満、16もしくはそれ未満、15もしくはそれ未満、14もしくはそれ未満、13もしくはそれ未満、12もしくはそれ未満、11もしくはそれ未満、10もしくはそれ未満、9もしくはそれ未満、8もしくはそれ未満、7もしくはそれ未満、または6もしくはそれ未満の炭素長である。したがって、R基は、上記の終点の任意の2つを境界とするR基を有しうる。例えば、R基は、6〜16炭素長、10〜14炭素長、または12〜18炭素長でありうる。いくつかの態様において、脂肪エステル組成物は、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25、およびC26脂肪エステルのうち1つまたは複数を含む。他の態様において、脂肪エステル組成物は、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、およびC18脂肪エステルのうち1つまたは複数を含む。さらに他の態様において、脂肪エステル組成物は、C12、C14、C16およびC18脂肪エステル；C12、C14およびC16脂肪エステル；C14、C16およびC18脂肪エステル；またはC12およびC14脂肪エステルを含む。
【００５５】
脂肪酸誘導体、例えば脂肪エステルのR基は、直鎖でも分枝鎖でもありうる。分枝鎖は複数の分枝点を有してもよく、環状分枝を含んでもよい。いくつかの態様において、分枝脂肪酸、分枝脂肪アルデヒドまたは分枝脂肪エステルは、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25、またはC26分枝脂肪酸、分枝脂肪アルデヒドまたは分枝脂肪エステルである。特定の態様において、分枝脂肪酸、分枝脂肪アルデヒドまたは分枝脂肪エステルは、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、またはC18分枝脂肪酸または分枝脂肪エステルである。本開示の脂肪エステルは、A側およびB側を含むと称することもできる。本明細書で用いる場合、エステルの「A側」とは、エステルのカルボン酸酸素に結びついた炭素鎖のことを指す。本明細書で用いる場合、エステルの「B側」とは、エステルの親カルボン酸を含む炭素鎖のことを指す。脂肪エステルが脂肪酸生合成経路に由来する場合、A側は典型的にはアルコールからきており、B側は脂肪酸からきている。
【００５６】
本明細書で用いる場合、「脂肪アルデヒド」とは、カルボニル基（C=O）を特徴とする式RCHOを有するアルデヒドを意味する。ある態様において、R基は、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、または少なくとも19炭素長である。代替的または追加的に、R基は、20もしくはそれ未満、19もしくはそれ未満、18もしくはそれ未満、17もしくはそれ未満、16もしくはそれ未満、15もしくはそれ未満、14もしくはそれ未満、13もしくはそれ未満、12もしくはそれ未満、11もしくはそれ未満、10もしくはそれ未満、9もしくはそれ未満、8もしくはそれ未満、7もしくはそれ未満、または6もしくはそれ未満の炭素長である。したがって、R基は、上記の終点の任意の2つを境界とするR基を有しうる。例えば、R基は、6〜16炭素長、10〜14炭素長、または12〜18炭素長でありうる。いくつかの態様において、脂肪アルデヒドはC6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25、またはC26脂肪アルデヒドである。ある態様において、脂肪アルデヒドは、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、またはC18脂肪アルデヒドである。
【００５７】
本明細書で用いる場合、「脂肪アルコール」は、式ROHを有するアルコールを意味する。いくつかの態様において、R基は、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、または少なくとも19炭素長である。代替的または追加的に、R基は、20もしくはそれ未満、19もしくはそれ未満、18もしくはそれ未満、17もしくはそれ未満、16もしくはそれ未満、15もしくはそれ未満、14もしくはそれ未満、13もしくはそれ未満、12もしくはそれ未満、11もしくはそれ未満、10もしくはそれ未満、9もしくはそれ未満、8もしくはそれ未満、7もしくはそれ未満、または6もしくはそれ未満の炭素長である。したがって、R基は、上記の終点の任意の2つを境界とするR基を有しうる。例えば、R基は、6〜16炭素長、10〜14炭素長、または12〜18炭素長でありうる。いくつかの態様において、脂肪アルコールは、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25、またはC26脂肪アルコールである。ある態様において、脂肪アルコールは、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14''、C15、C16、C17、またはC18脂肪アルコールである。
【００５８】
本明細書で用いる場合、「アルカン」という用語は、単一の炭素-炭素結合のみを含む炭化水素を意味する。アルカンは3〜25個の炭素を含みうる。いくつかの例示的な場合において、アルカンは、トリデカン、メチルトリデカン、ノナデカン、メチルノナデカン、ヘプタデカン、メチルヘプタデカン、ペンタデカンまたはメチルペンタデカンである。
【００５９】
本明細書で用いる場合、「アルケン」および「オレフィン」という用語は、少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含む不飽和化合物に関して使用される。アルケンは、3〜25個の炭素を含みうる。オレフィンは、末端オレフィンであってもよく、内部二重結合を有してもよい。
【００６０】
脂肪酸誘導体、例えば脂肪アルコールのR基は直鎖であっても分枝鎖であってもよく、その炭素数は偶数であっても奇数であってもよい。分枝鎖は複数の分枝点を有してもよく、環状分枝を含んでもよい。いくつかの態様において、分枝脂肪酸、分枝脂肪アルデヒドまたは分枝脂肪アルコールはそれぞれ、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25、またはC26分枝脂肪酸、分枝脂肪アルデヒドまたは分枝脂肪アルコールである。特定の態様において、分枝脂肪酸、分枝脂肪アルデヒドまたは分枝脂肪アルコールはそれぞれ、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17またはC18分枝脂肪酸、分枝脂肪アルデヒドまたは分枝脂肪アルコールである。ある態様において、分枝脂肪酸、分枝脂肪アルデヒドまたは分枝脂肪アルコールのヒドロキシル基は、第一級（C1）位置にある。
【００６１】
ある態様において、分枝脂肪酸誘導体は、イソ-脂肪酸誘導体、例えばイソ-脂肪アルデヒド、イソ-脂肪アルコール、イソ-脂肪エステル、またはアンテイソ（antesio）-脂肪酸誘導体、アンテイソ-脂肪アルデヒド、アンテイソ-脂肪エステル、またはアンテイソ-脂肪アルコールである。例示的な態様において、分枝脂肪酸誘導体は、イソ-C7:0、イソ-C8:0、イソ-C9:0、イソ-C10:0、イソ-C11:0、イソ-C12:0、イソ-C13:0、イソ-C14:0、イソ-C15:0、イソ-C16:0、イソ-C17:0、イソ-C18:0、イソ-C19:0、アンテイソ-C7:0、アンテイソ-C8:0、アンテイソ-C9:0、アンテイソ-C10:0、アンテイソ-C11:0、アンテイソ-C12:0、アンテイソ-C13:0、アンテイソ-C14:0、アンテイソ-C15:0、アンテイソ-C16:0、アンテイソ-C17:0、アンテイソ-C18:0、およびアンテイソ-C19:0分枝脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステル、または脂肪酸から選択される。
【００６２】
分枝または非分枝脂肪酸誘導体のR基は、飽和性でも不飽和性でもよい。不飽和である場合には、R基は1つまたは複数の不飽和点を有しうる。いくつかの態様において、不飽和脂肪酸誘導体は一不飽和脂肪酸誘導体である。ある態様において、不飽和脂肪酸誘導体は、C6:1、C7:1、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1、C20:1、C21:1、C22:1、C23:1、C24:1、C25:1、またはC26:1不飽和脂肪酸誘導体である。ある態様において、不飽和脂肪酸誘導体は、C10:1、C12:1、C14:1、C16:1、またはC18:1不飽和脂肪酸誘導体である。他の態様において、不飽和脂肪酸誘導体は、ω-7位置で不飽和である。ある態様において、不飽和脂肪酸誘導体は、シス二重結合を含む。
【００６３】
本明細書で用いる場合、「組換え宿主細胞または遺伝子操作された宿主細胞」とは、アシル-CoA、脂肪酸、短鎖および長鎖アルコール、脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、脂肪エステル（例えば、蝋、脂肪酸エステルまたは脂肪エステル）、炭化水素（例えば、末端オレフィンおよび内部オレフィン）ならびにケトンを非限定的に含む脂肪酸誘導体のうち1つまたは複数を産生するように（またはそれらを増加した量で産生するように）改変された宿主細胞（例えば、微生物または微生物細胞）のことである。1つの好ましい態様において、組換え宿主細胞は、ある特定の脂肪酸誘導体（またはある特定の脂肪酸誘導体のより多く）を生産するための、上昇した酵素活性を含む。組換え宿主細胞を、そのような上昇した酵素活性の1つまたは複数を含むように改変または遺伝子操作することができる。他の好ましい態様において、組換え宿主細胞は、各ポリヌクレオチドが脂肪酸誘導体生合成タンパク質活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを含み、ここで組換え宿主細胞は、炭素源の存在下で、それらのポリヌクレオチドを発現させるのに有効な条件下で培養した場合に、脂肪酸誘導体組成物を産生する。
【００６４】
本明細書で用いる場合、「変更された」または「改変されたレベルの」組換え宿主細胞という用語は、親または生来の宿主細胞を基準として決定された、活性における1つまたは複数の特性の差異を指す。典型的には、活性の差異は、改変された活性を有する組換え宿主細胞と、対応する野生型宿主細胞との間で決定される（例えば、対応する野生型宿主細胞に対する組換え宿主細胞の培養物の比較）。活性の改変は、例えば、組換え宿主細胞によって発現されるタンパク質の量の改変（例えば、タンパク質をコードするDNA配列のコピー数の増加もしくは減少、タンパク質をコードするmRNA転写物の数の増加もしくは減少、および／またはmRNAからのタンパク質のタンパク質翻訳の量の増加もしくは減少の結果として）；タンパク質の構造の変化（例えば、基質特異性の変化、観察される速度論的パラメーターの変化をもたらすタンパク質のコード配列に対する変化などの、一次構造に対する変化）；および、タンパク質安定性の変化（例えば、タンパク質の分解の増加もしくは減少）の結果でありうる。いくつかの態様において、ポリペプチドは、本明細書に記載のいずれかのポリペプチドの突然変異体またはバリアントである。場合によっては、本明細書に記載のポリペプチドのコード配列は、特定の宿主細胞における発現のためにコドンが最適化される。例えば、大腸菌における発現のために、1つまたは複数のコドンを、例えば、Grosjean et al. (1982) Gene 18:199-209に記載されたように最適化することができる。
【００６５】
本明細書で用いる場合、「クローン」という用語は、典型的には、単一の共通の祖先の子孫でありかつ該祖先と本質的に遺伝的に同一である、細胞または細胞群、例えば、単一の細菌細胞から生じたクローン化された細菌コロニーの細菌を指す。
【００６６】
本明細書で用いる場合、「培養物」という用語は、典型的には、生細胞を含む液体培地を指す。1つの態様において、培養物は、制御された条件下で所定の培地中で再生する細胞、例えば、選択された炭素源および窒素を含む液体培地中で増殖させた組換え宿主細胞の培養物が含まれる。
【００６７】
「培養する」または「培養」は、組換え宿主細胞の集団を、液体培地または固体培地中で、適した条件下で増殖させることを指す。特定の態様において、培養するとは、基質の最終産物への発酵性生物変換を指す。培養培地は周知であり、そのような培地の個々の構成成分は、例えば、DIFCOおよびBBLブランドとして、販売元から入手可能である。1つの非限定的な例では、水性栄養培地は、窒素、塩および炭素の複合的な供給源を含む富栄養培地、例えばYP培地であり、これは、約10g/Lのペプトンおよび10g/Lの酵母エキスを含有する。培養される任意の宿主細胞は、米国特許第5,000,000号；第5,028,539号；第5,424,202号；第5,482,846号；第5,602,030号；および特許出願公開WO2010127318号に記載に記載された方法に従って、炭素を効率的に同化し、セルロース系材料を炭素源として用いるように遺伝子操作することができる。加えて、いくつかの態様において、スクロースを炭素源として用いうるようなインベルターゼを発現するように宿主細胞を遺伝子操作することができる。
【００６８】
本明細書で用いる場合、「外来性または異種性のヌクレオチド配列を発現するのに有効な条件下」という用語は、宿主細胞（例えば、組換え宿主細胞）が所望の脂肪酸誘導体を産生することを可能にする任意の条件を意味する。適した条件には、例えば、発酵条件が含まれる。
【００６９】
「調節配列」という用語は、本明細書で用いる場合、典型的には、タンパク質をコードするDNA配列と機能的に連結された、該タンパク質の発現を最終的に制御するDNAの塩基の配列を指す。調節配列の例には、RNAプロモーター配列、転写因子結合配列、転写終結配列、転写のモジュレーター（エンハンサーエレメントなど）、RNA安定性に影響を及ぼすヌクレオチド配列、および翻訳調節配列（リボソーム結合部位（例えば、原核生物におけるShine-Dalgarno配列、または真核生物におけるKozak配列）、開始コドン、終止コドンなど）が非限定的に含まれる。
【００７０】
本明細書で用いる場合、「前記ヌクレオチド配列の発現が野生型ヌクレオチド配列に比して改変されている」という語句は、内因性ヌクレオチド配列の発現および／もしくは活性のレベル、または外因性もしくは異種もしくは非生来のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現および／もしくは活性のレベルの、上昇または低下を意味する。
【００７１】
本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチドに関して「発現する」という用語は、それが機能するようにさせることである。ポリペプチド（またはタンパク質）をコードするポリヌクレオチドは、発現されると、転写され、翻訳されて、そのポリペプチド（またはタンパク質）を産生すると考えられる。本明細書で用いる場合、「過剰発現する」という用語は、細胞においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、同じ条件下で対応する野生型細胞において通常発現されるよりも高い濃度で発現されること（または発現されるようにすること）を意味する。
【００７２】
「変更されたレベルの発現」および「改変されたレベルの発現」という用語は互換的に用いられ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、遺伝子操作された宿主細胞において、同じ条件下での対応する野生型細胞におけるその濃度と比較して異なる濃度で存在することを意味する。
【００７３】
本明細書で用いる場合、「力価」という用語は、宿主細胞培養物の単位容積当たりで産生される脂肪酸誘導体の数量を指す。本明細書に記載の組成物および方法の任意の局面において、脂肪酸誘導体は、約25mg/L、約50mg/L、約75mg/L、約100mg/L、約125mg/L、約150mg/L、約175mg/L、約200mg/L、約225mg/L、約250mg/L、約275mg/L、約300mg/L、約325mg/L、約350mg/L、約375mg/L、約400mg/L、約425mg/L、約450mg/L、約475mg/L、約500mg/L、約525mg/L、約550mg/L、約575mg/L、約600mg/L、約625mg/L、約650mg/L、約675mg/L、約700mg/L、約725mg/L、約750mg/L、約775mg/L、約800mg/L、約825mg/L、約850mg/L、約875mg/L、約900mg/L、約925mg/L、約950mg/L、約975mg/L、約1000mg/L、約1050mg/L、約1075mg/L、約1100mg/L、約1125mg/L、約1150mg/L、約1175mg/L、約1200mg/L、約1225mg/L、約1250mg/L、約1275mg/L、約1300mg/L、約1325mg/L、約1350mg/L、約1375mg/L、約1400mg/L、約1425mg/L、約1450mg/L、約1475mg/L、約1500mg/L、約1525mg/L、約1550mg/L、約1575mg/L、約1600mg/L、約1625mg/L、約1650mg/L、約1675mg/L、約1700mg/L、約1725mg/L、約1750mg/L、約1775mg/L、約1800mg/L、約1825mg/L、約1850mg/L、約1875mg/L、約1900mg/L、約1925mg/L、約1950mg/L、約1975mg/L、約2000mg/L（2g/L）、3g/L、5g/L、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、または前記の値の任意の2つを境界とする範囲の力価で産生される。他の態様において、脂肪酸誘導体は、100g/Lを上回る、200g/Lを上回る、300g/Lを上回る、またはそれ以上の力価で産生される。本開示の方法による組換え宿主細胞によって産生される脂肪酸誘導体の好ましい力価は、5g/L〜200g/L、10g/L〜150g/L、20g/L〜120g/L、および30g/L〜100g/Lである。力価が、所与の組換え宿主細胞培養物によって産生されるある特定の脂肪酸誘導体または脂肪酸誘導体の組み合わせを指してもよい。
【００７４】
本明細書で用いる場合、「宿主細胞によって産生される脂肪酸誘導体の収量」とは、投入炭素源が宿主細胞において生成物（すなわち、脂肪酸、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステル、アルカン、アルケン、オレフィン、ケトンなど）に変換される効率を指す。本開示の方法による脂肪酸誘導体を産生するように遺伝子操作された宿主細胞は、少なくとも3％、少なくとも4％、少なくとも5％、少なくとも6％、少なくとも7％、少なくとも8％、少なくとも9％、少なくとも10％、少なくとも11％、少なくとも12％、少なくとも13％、少なくとも14％、少なくとも15％、少なくとも16％、少なくとも17％、少なくとも18％、少なくとも19％、少なくとも20％、少なくとも21％、少なくとも22％、少なくとも23％、少なくとも24％、少なくとも25％、少なくとも26％、少なくとも27％、少なくとも28％、少なくとも29％、または少なくとも30％、または前記の値の任意の2つを境界とする範囲の収量を有する。他の態様において、1つまたは複数の脂肪酸誘導体は、30％を上回る、40％を上回る、50％を上回る、60％を上回る、70％を上回る、80％を上回る、90％を上回る、またはそれ以上の収量で産生される。代替的または追加的に、収量は、約30％もしくはそれ未満、約27％もしくはそれ未満、約25％もしくはそれ未満、または約22％もしくはそれ未満である。したがって、収量は上記の終点の任意の2つを境界とすることができる。例えば、本開示の方法による組換え宿主細胞によって産生される脂肪アルコールまたは脂肪アルデヒドの収量は、5％〜15％、10％〜20％、10％〜22％、10％〜25％、15％〜20％、15％〜22％、15％〜25％、18％〜22％、20％〜28％、または20％〜30％でありうる。収量が、所与の組換え宿主細胞培養物によって産生されるある特定の脂肪酸誘導体または脂肪酸誘導体の組み合わせを指してもよい。
【００７５】
本明細書で用いる場合、「産生能」という用語は、宿主細胞培養物の単位容積当たり・単位時間当たりに産生される1つまたは複数の脂肪酸誘導体の数量を指す。本明細書に記載の組成物および方法の任意の局面において、組換え宿主細胞によって産生される1つまたは複数の脂肪酸誘導体の産生能は、少なくとも100mg/L/時、少なくとも200mg/L/時、少なくとも300mg/L/時、少なくとも400mg/L/時、少なくとも500mg/L/時、少なくとも600mg/L/時、少なくとも700mg/L/時、少なくとも800mg/L/時、少なくとも900mg/L/時、少なくとも1000mg/L/時、少なくとも1100mg/L/時、少なくとも1200mg/L/時、少なくとも1300mg/L/時、少なくとも1400mg/L/時、少なくとも1500mg/L/時、少なくとも1600mg/L/時、少なくとも1700mg/L/時、少なくとも1800mg/L/時、少なくとも1900mg/L/時、少なくとも2000mg/L/時、少なくとも2100mg/L/時、少なくとも2200mg/L/時、少なくとも2300mg/L/時、少なくとも2400mg/L/時、または少なくとも2500mg/L/時である。例えば、本方法による組換え宿主細胞によって産生される1つまたは複数の脂肪酸誘導体の産生能は、500mg/L/時〜2500mg/L/時、または700mg/L/時〜2000mg/L/時であってよい。産生能は、所与の組換え宿主細胞培養物によって産生されるある特定の脂肪酸誘導体にも脂肪酸誘導体の組み合わせにも適用され得る。
【００７６】
本明細書で用いる場合、「総脂肪種」および「総脂肪酸生成物」という用語は、例えばGC-FIDによって評価される、脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、脂肪エステル、脂肪酸、および炭化水素などの合計量に関連して、本明細書において互換的に用いられうる。例えば、脂肪エステル分析について述べる場合、「総脂肪種」および「総脂肪酸生成物」という用語は、脂肪エステルおよび遊離脂肪酸の合計量に言及するために用いられる。
【００７７】
本明細書で用いる場合、「グルコース利用率」という用語は、グラム数/リットル/時（g/L/hr）として報告される、培養物によって単位時間当たりに用いられるグルコースの量を指す。
【００７８】
本明細書で用いる場合、「炭素源」という用語は、原核細胞または単純な真核細胞の増殖のための炭素の供給源として用いるのに適した基質または化合物を指す。炭素源は、重合体、炭水化物、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、ペプチドおよび気体（例えば、COおよびCO2）を非限定的に含む、さまざまな形態をとりうる。例示的な炭素源には、単糖類、例えばグルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、キシロースおよびアラビノース；オリゴ糖類、例えばフルクトオリゴ糖およびガラクトオリゴ糖；多糖類、例えばデンプン、セルロース、ペクチンおよびキシラン；二糖類、例えばスクロース、マルトース、セロビオースおよびツラノース；セルロース系材料および異形物、例えばヘミセルロース、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム；飽和または不飽和脂肪酸、コハク酸塩、乳酸塩および酢酸塩；アルコール、例えばエタノール、メタノールおよびグリセロール、またはそれらの混合物が非限定的に含まれる。また、炭素源が、光合成の生成物、例えばグルコースであってもよい。ある態様において、炭素源は、排ガス（flu gas）を元にした、COを含有するガス混合物である。もう1つの態様において、炭素源は、炭素含有材料、例えばバイオマス、石炭または天然ガスなどを再構成したものを元にした、COを含有するガス混合物である。他の態様において、炭素源は、合成ガス、メタンまたは天然ガスである。ある好ましい態様において、炭素源はバイオマスである。他の好ましい態様において、炭素源はグルコースである。他の好ましい態様において、炭素源はスクロースである。他の態様において、炭素源はグリセロールである。他の好ましい態様において、炭素源は、サトウキビ汁、サトウキビシロップ、またはコーンシロップである。他の好ましい態様において、炭素源は、再生可能な原料、例えば、CO2、CO、グルコース、スクロース、キシロース、アラビノース、グリセロール、マンノース、またはそれらの混合物に由来する。他の態様において、炭素源は、デンプン、セルロース性バイオマス、モラッセ、およびセルロース性バイオマスの加水分解に由来する糖質混合物を含む他の糖質源、または植物油もしくは天然油の処理に由来する廃棄材料を含む、再生可能な原料に由来する。
【００７９】
本明細書で用いる場合、「バイオマス」という用語は、炭素源の由来となる任意の生体物質を指す。いくつかの態様において、バイオマスは処理されて、生物変換に適した炭素源となる。他の態様において、バイオマスは炭素源にするためのさらなる処理を必要としない。例示的なバイオマス源は、植物体または草木、例えばトウモロコシ、サトウキビまたはアメリカクサキビである。もう1つの例示的なバイオマス源は、代謝廃棄産物、例えば動物性物質（例えば、牛糞肥料）である。さらに例示的なバイオマス源には、藻類および他の海洋植物が含まれる。バイオマスにはまた、グリセロール、発酵廃棄物、エンシレージ、わら、木材、廃水、ゴミ、セルロース系都市廃棄物、および残飯（例えば石けん、油、および脂肪酸）を非限定的に含む、工業、農業、林業および家庭からの廃棄物も含まれる。「バイオマス」という用語はまた、炭水化物（例えば、単糖類、二糖類または多糖類）などの炭素源も指し得る。
【００８０】
本明細書で用いる場合、生成物（脂肪酸およびその誘導体など）に関する「単離された」という用語は、細胞構成成分、細胞培養培地、または化学前駆体もしくは合成前駆体から単離された生成物を指す。本明細書に記載の方法によって産生される脂肪酸およびその誘導体は、発酵ブロス中、さらには細胞質中で比較的不混和性でありうる。このため、脂肪酸およびその誘導体は、細胞内または細胞外のいずれかで有機相に収集することができる。
【００８１】
本明細書で用いる場合、「精製する」、「精製された」、または「精製」という用語は、例えば単離または分離による、分子のその環境からの除去または単離を意味する。「実質的に精製された」分子は、それらに付随する他の構成成分を少なくとも約60％含まない（例えば、少なくとも約70％含まない、少なくとも約75％含まない、少なくとも約85％含まない、少なくとも約90％含まない、少なくとも約95％含まない、少なくとも約97％含まない、少なくとも約99％含まない）。本明細書で用いる場合、これらの用語はまた、試料からの混入物の除去も指す。例えば、混入物の除去は、試料中の脂肪酸誘導体のパーセンテージの増加をもたらすことができる。例えば、脂肪酸誘導体が組換え宿主細胞において産生される場合、脂肪酸誘導体は、組換え宿主細胞タンパク質または他の宿主細胞物質の除去によって精製することができる。精製後に、試料中の脂肪酸誘導体のパーセンテージは増加する。「精製する」、「精製された」、および「精製」という用語は、完全に純粋であることを必要としない相対的な用語である。したがって、例えば、脂肪酸誘導体が組換え宿主細胞において産生される場合、精製された脂肪酸誘導体は、他の細胞構成成分（例えば、核酸、ポリペプチド、脂質、炭水化物、または他の炭化水素）から実質的に分離された脂肪酸誘導体である。
【００８２】
生合成経路の遺伝子操作
脂肪酸誘導体の生産を増加させる目的で、特異的酵素活性を備えるタンパク質をコードする遺伝子を追加または除去するように、生合成経路を遺伝子操作すること、または操作することができる。図2は、マロニル-ACPとアシル-ACPとの縮合から始まってアシル-ACPで終わる例示的な生合成経路を示しており、アシル-ACPは、遺伝子操作された多くの生化学経路にとっての出発点となる。図示されているように、マロニル-ACPはマロニル-CoAのマロニル-ACPへのトランスアシル化によって生成され（すなわち、マロニル-CoA：ACPトランスアシラーゼ；fabDによって触媒される）、続いてβ-ケトアシル-ACPシンターゼIII（fabH）がマロニル-ACPのアセチル-CoAとの縮合を開始する。図2にさらに示されているように、伸長サイクルは、β-ケトアシル-ACPシンターゼI（fabB）およびβ-ケトアシル-ACPシンターゼII（fabF）によって触媒されるマロニル-ACPとアシル-ACPとの縮合から始まり、β-ケト-アシル-ACPが生成される。続いてβ-ケト-アシル-ACPがNADPH依存性β-ケトアシル-ACPレダクターゼ（fabG）によって還元されてβ-ヒドロキシ-アシル-ACPが生成され、それがβ-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラターゼ（fabAまたはfabZ）によって脱水されてtrans-2-エノイル-アシル-ACPとなる。FabAはまた、trans-2-エノイル-アシル-ACPをcis-3-エノイル-アシル-ACPに異性化することもでき、これはfabIを迂回してfabBによって用いられて（典型的にはC16までの長さの脂肪族鎖の場合）、β-ケト-アシル-ACPを生成することができる。各サイクルにおける最終段階は、trans-2-エノイル-アシル-ACPをアシル-ACPに変換するNADHまたはNADHPH依存性エノイル-ACPレダクターゼ（fabI）によって触媒される。
【００８３】
本明細書に記載の方法において、脂肪酸生合成の完了は、遊離脂肪酸（FFA）の放出のための、アシル-ACPからのアシル基のチオエステラーゼ除去によって起こる。本明細書において、チオエステラーゼは、スルフヒドリル結合を介してアシル鎖とACPとの間に存在するチオエステル結合を加水分解する。したがって、チオエステラーゼをアップレギュレートするか過剰発現させることによって脂肪酸誘導体の産生を増加させて、脂肪酸のより多くの産生を導くことができる。チオエステラーゼを、カルボン酸レダクターゼ（CAR）などの他の脂肪酸誘導体生合成酵素と組み合わせて過剰発現させれば、この経路により、より多くの量の脂肪アルデヒドがもたらされると考えられる。図4に示されているように、脂肪アルコールの生成のための例示的な生合成経路は、アシル-ACPレダクターゼ（AAR）；またはチオエステラーゼとカルボン酸レダクターゼ（CAR）との組み合わせの酵素活性によって触媒される脂肪アルデヒドの生成から始まる。脂肪アルデヒドは続いて、脂肪アルデヒドレダクターゼ活性（アルコールデヒドロゲナーゼ活性とも称される）によって脂肪アルコールに変換されうる。
【００８４】
アシル-ACPから始まる、遺伝子操作された生合成経路のもう1つの例は図5に示されており、ここでは脂肪エステルは2つの代替的な経路を介して生成される。図示されているように、1つの例示的な生合成経路は、一酵素系（すなわち、エステルシンターゼ）を使用して脂肪エステルを生成する。もう1つの例示的な生合成経路では、脂肪エステルを生成する目的で、三酵素系（すなわち、チオエステラーゼ（TE）、アシル-CoAシンテターゼ（FadD）およびエステルシンターゼ（ES））を用いる。
【００８５】
アシル-ACPから始まる、さらにもう1つの例示的な生合成経路は、炭化水素の生成である。図6に示されているように、内部オレフィンの生成はOleABCDの酵素活性によって触媒される。アルカンの生成は、AARによるアシル-ACPの脂肪アルデヒドへの酵素変換、および続いてアルデヒドデカルボニラーゼ（ADC）を介した脂肪アルデヒドのアルカンへの酵素変換によって触媒される。末端オレフィンの生成は、デカルボキシラーゼによる脂肪酸の末端オレフィンへの酵素変換によって触媒される。加えて、ケトンの生成は、アシル-ACPを脂肪族ケトンに変換するOleAの酵素活性によって触媒される。
【００８６】
脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、脂肪アルデヒドなどの生成といった脂肪酸誘導体の生成は、アセチル-CoAカルボキシラーゼをアップレギュレートするかまたは過剰発現させることによってさらに増加させることができる。これが起こるのは、ACCがマロニル-CoAを生成させ、それが続いて、アセトアセチル-ACP開始分子の環状伸長を経由して作られるすべての脂肪アシル化合物の基質であるマロニル-ACPに変換されるためである。図3は、アセチル-CoAカルボキシラーゼ酵素複合体（accABCD遺伝子によってコードされる）の構造および機能を図示している。ビオチンカルボキシラーゼはaccC遺伝子によってコードされ、一方、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（BCCP）はaccB遺伝子によってコードされる。カルボキシルトランスフェラーゼ活性に関与する2つのサブユニットは、accA遺伝子およびaccD遺伝子によってコードされる。BCCPに共有結合したビオチンはカルボン酸部分を保有している。birA遺伝子の産物であるbirAは、ホロ-accBをビオチン化する（図3参照）。BirAは、二機能性のビオチン-[アセチル-CoA-カルボキシラーゼ]リガーゼおよび転写リプレッサーのことである。このように、birAは、ビオチンリガーゼ活性を示すとともにビオチンオペロンのDNA結合転写リプレッサーとしても作用する二機能性タンパク質である。
【００８７】
脂肪酸誘導体の産生に対するACP増加の影響
本開示は、脂肪酸誘導体の生産を目的として、アシルキャリアータンパク質（ACP）および脂肪酸誘導体生合成タンパク質を過剰産生する組換え微生物を提供する。これらの改変された微生物は、それらの生来の対応物または対応する野生型微生物と比較した場合に、脂肪酸誘導体産生がより高い力価、より高い収量および／またはより高い生産性であることを特徴とすることができる。
【００８８】
本開示を例証することを目的として、微生物（例えば、微生物細胞）を、脂肪酸誘導体の産生を増加させる目的で、ACPおよび脂肪酸誘導体生合成タンパク質を過剰発現するように改変した（下記の実施例を参照）。アセチル-CoAカルボキシラーゼ（ACC）複合体および脂肪酸生合成（Fab）経路を介したアセチル-CoAからのアシル-ACPの供給は、生来の細胞における脂肪酸および脂肪酸誘導体の産生速度に影響を及ぼしうる。脂肪酸生合成を経由する流れを増大させる1つのアプローチは、Fab経路内のさまざまな酵素を操作すること、および／またはACPなどの律速性出発材料の量を増やすことである。ACPタンパク質はあらゆる生物においてある程度は保存されているものの、それらの一次配列は大きく異なる可能性がある。脂肪アシル-ACPを産物に変換させる目的で大腸菌（E. coli）以外の供給源からの末端経路酵素を大腸菌において発現させる場合、組換え経路酵素の脂肪アシル-ACPに対する認識、親和性および／または代謝回転などに制約が存在する可能性があることが、示唆されている（Suh et al. (1999) The Plant Journal 17(6):679-688；Salas et al. (2002) Archives of Biochemistry and Biophysics 403:25-34を参照）。
【００８９】
しかし、ACPは脂肪酸の伸長に重要な役割を果たすことが知られている。例えば、acpP遺伝子によってコードされる大腸菌ACP（ecACP）は、鎖が伸長する際に、ホスホパンテテイン補欠分子族とのチオエステル結合を介して脂肪酸鎖を保有する。理論に拘束されることは望まないが、本明細書では、ACP遺伝子の過剰発現がアシル-ACPの量を増加させるのに有効な可能性があり、そのことが脂肪酸の生合成および伸長の効率のレベルに対してプラスの影響を及ぼす可能性があることを提唱している。例えば、細胞における産物の産出はアシル-ACPの利用可能性にある程度依存しており、このため、ACP発現を増加させることは細胞内のアシル-ACP分子の数を増加させて、より多くの脂肪酸誘導体産物をもたらすと考えられているが、これはより多くの数のアシル鎖が脂肪酸生合成機構によって伸長すると考えられるためである。また、ACPの発現が増加すると、種々のノード（node）、例えば、ACC、fabHおよび／またはfabIなどで脂肪酸生合成の調節が解除される可能性もある。酵素ACC、fabHおよび／またはfabIは、長鎖アシル-ACPによって阻害されると考えられている（Davis et al. (2001) Journal of Bacteriology 183(4):1499-1503；Heath et al. (1996) The Journal of Biological Chemistry 271 (4):1833-1836；およびHeath et al. (1996) The Journal of Biological Chemistry 271(18): 10996-11000を参照）。このため、長鎖アシル-ACPの蓄積は、脂肪酸誘導体の産生を減速させると考えられる。ACPの利用可能性を高めることにより、ACC、fabHおよび／またはfabIの阻害が解除され、そのためにひいては脂肪酸誘導体産出が増加するはずである。
【００９０】
化合物アセチル-CoAおよびマロニル-CoAは、脂肪酸生合成のための重要な前駆体である。細胞におけるこれらの前駆体の利用可能性が低下すると、脂肪酸誘導体の合成の減少がもたらされうる。脂肪酸生合成を経由する流れを増大させる1つのアプローチは、経路内のさまざまな酵素を操作することである（図1〜3を参照）。アセチル-CoAカルボキシラーゼ（ACC）複合体および脂肪酸生合成（Fab）経路を介したアセチル-CoAからのアシル-ACPの供給は、脂肪酸誘導体産生の速度に影響を及ぼす可能性がある（図2参照）。脂肪酸誘導体の産生に対するACPの過剰発現の影響について、実施例1〜4において検討した（下記）。驚いたことに、細胞は最終産物産出、すなわち脂肪酸誘導体産生の有意な増加を示した。ACP（これは細胞内部で最も存在量の多いタンパク質の1つである）の過剰発現は大腸菌における細胞増殖を阻害すること、すなわち、ACPを約20倍に過剰発現させて3〜4時間以内に大腸菌細胞の増殖速度は完全に停止したことが示されていた（Keating et al. (1995) The Journal of Biological Chemistry 270(38):22229-22235）ため、このことは予想外であった。ACPを多コピープラスミドから過剰産生させた場合には、ACPの翻訳後修飾を行う細胞能力が律速性となってアポ-ACP（不活性型）が細胞内に蓄積するが、野生型細胞にはアポ-ACPの検出可能なプールは存在しないことから、これは毒性につながる可能性が高いことが以前に明らかになっている（Keating、前記を参照）。このため、ACP発現を増加させることは、以前に観察された細胞フィードバック阻害および増殖制約をもたらすと予想された。しかし実際には、ACPを過剰発現する細胞は、脂肪酸誘導体産生の有意な増加を示した（実施例1〜4参照（下記））。
【００９１】
組換えACPを発現する宿主細胞は、脂肪酸誘導体組成物または特定の脂肪酸誘導体の力価の増大を示すことができ、ここで増大は、同じ条件下で培養した時にACPを発現しない対応する宿主細胞によって産生される脂肪酸誘導体組成物または特定の脂肪酸誘導体の力価を少なくとも3％、少なくとも4％、少なくとも5％、少なくとも6％、少なくとも7％、少なくとも8％、少なくとも9％、少なくとも10％、少なくとも11％、少なくとも12％、少なくとも13％、少なくとも14％、少なくとも15％、少なくとも16％、少なくとも17％、少なくとも18％、少なくとも19％、少なくとも20％、少なくとも21％、少なくとも22％、少なくとも23％、少なくとも24％、少なくとも25％、少なくとも26％、少なくとも27％、少なくとも28％、少なくとも29％、または少なくとも30％上回る。ACPを発現する宿主細胞による、より多くの脂肪酸誘導体の産生は確かめられており（下記の実施例1〜4参照）、脂肪酸、脂肪エステル、脂肪アルコールおよびアルカンを含む、より多くの量の脂肪酸誘導体が生じた。
【００９２】
ACPタンパク質
1つの局面において、本開示は、生来（内因性）のまたは非生来（外因性もしくは異種）のACPタンパク質を発現するように宿主細胞を遺伝子操作することによる、脂肪酸誘導体、例えば、脂肪アルコールおよび／または脂肪エステルなどの改良生産に関する。ACPポリペプチド、またはACPポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、非生来または外因性または異種であってもよく、すなわち、対応する野生型宿主細胞に天然に存在する野生型配列とは異なってもよい。その例には、ヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質の発現レベルまたは配列の改変が含まれる。本開示は、ACPポリペプチドおよびそのホモログを含む。
【００９３】
1つの態様において、本開示の実施に用いるためのACPポリペプチドは、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8またはSEQ ID NO：10に対して少なくとも70％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、ACPはマリノバクター属（Marinobacter）種または大腸菌に由来する。他の態様において、本開示の実施に用いるためのACPポリペプチドは、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8またはSEQ ID NO：10の野生型ACPポリペプチド配列に対して、少なくとも75％（例えば、少なくとも76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または少なくとも99％）の配列同一性を有し、さらに、本明細書に記載されたような有用な特徴および／または特性をもたらす1つまたは複数の置換を含んでもよい。本開示の1つの局面において、本開示の実施に用いるためのACPポリペプチドは、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8またはSEQ ID NO：10に対して100％の配列同一性を有する。他の態様において、改良型のまたはバリアントACPポリペプチド配列は、M.ハイドロカーボノクラスティカス(M. hydrocarbonoclasticus）および大腸菌以外の種に由来する。1つの関連した局面において、本開示の実施に用いるためのACPポリペプチドは、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7またはSEQ ID NO：9に対して100％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。1つの関連した局面において、本開示は、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7またはSEQ ID NO：9に対して、少なくとも75％（例えば、少なくとも76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または／および少なくとも99％）の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むACPポリペプチドに関する。いくつかの態様において、核酸配列は、本明細書に記載されたような改良された特徴および／または特性をもたらす1つまたは複数の置換を有するACPバリアントをコードする。他の態様において、改良型のまたはバリアントACP核酸配列は、M.ハイドロカーボノクラスティカスおよび大腸菌以外の種に由来する。もう1つの局面において、本開示は、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7またはSEQ ID NO：9に対応する核酸の実質的に全長に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むACPポリペプチドに関する。いくつかの態様において、核酸配列は、マリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカスおよび大腸菌以外の種に由来する改良型のまたはバリアントACP核酸配列をコードする。
【００９４】
ACP突然変異体およびバリアント
いくつかの態様において、ACPポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドのいずれかの突然変異体またはバリアントである。「突然変異体」および「バリアント」という用語は、本明細書で用いる場合、野生型ポリペプチドとは少なくとも1つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。例えば、突然変異体は、以下の保存的アミノ酸置換、例えば、脂肪族アミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）の、別の脂肪族アミノ酸による置き換え；セリンのトレオニンによる置き換え；トレオニンのセリンによる置き換え；例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸などの酸性残基の、別の酸性残基による置き換え；アスパラギンおよびグルタミンなどのアミド基を保有する残基の、アミド基を保有する別の残基による置き換え；リジンおよびアルギニンなどの塩基性残基の、別の塩基性残基との交換；ならびに、フェニルアラニンおよびチロシンなどの芳香族残基の、別の芳香族残基による置き換えのうちの、1つまたは複数を含みうる。いくつかの態様において、突然変異体ポリペプチドは、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100個、またはそれ以上のアミノ酸置換、付加、挿入または欠失を有する。ポリペプチドの好ましい断片または突然変異体は、対応する野生型ポリペプチドの生物学的機能（例えば、酵素活性）の一部またはすべてを保っている。いくつかの態様において、断片または突然変異体は、対応する野生型ポリペプチドの生物学的機能の少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％または少なくとも98％、またはそれ以上を保っている。他の態様において、断片または突然変異体は、対応する野生型ポリペプチドの生物学的機能の約100％を保っている。生物活性に影響を及ぼさずにどのアミノ酸残基を置換し、挿入し、または欠失させることができるかを判定する上での手引きは、当技術分野において周知のコンピュータプログラム、例えば、LASERGENEソフトウェア（DNASTAR, Inc., Madison, WI）を用いて見いだすことができる。さらに他の態様において、断片または突然変異体は、対応する野生型ポリペプチドと比較して増大した生物学的機能を示す。例えば、断片または突然変異体は、対応する野生型ポリペプチドと比較して、酵素活性の点で少なくとも10％、少なくとも25％、少なくとも50％、少なくとも75％または少なくとも90％の改善を呈しうる。他の態様において、断片または突然変異体は、対応する野生型ポリペプチドと比較して、酵素活性の点で少なくとも100％、または少なくとも200％、または少なくとも500％の改善を呈する。
【００９５】
本明細書に記載のポリペプチドが、ポリペプチドの機能に実質的な影響を及ぼさないさらなる保存的または非必須のアミノ酸置換を有してもよいことは理解されよう。ある特定の置換が許容される（すなわち、ACP活性といった所望の生物学的機能に有害な影響を及ぼさない）か否かは、当技術分野において記載されるように判定することができる（Bowie et al. (1990) Science, 247: 1306-1310を参照されたい）。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基によって置き換えられたもののことである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β-分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。
【００９６】
バリアントは天然に存在してもよく、またはインビトロで作製してもよい。特に、そのようなバリアントは、部位指定突然変異誘発、ランダム化学的突然変異誘発、エキソヌクレアーゼIII削除手順、または標準的なクローニング手法といった遺伝子工学の手法を用いて作製することができる。または、そのようなバリアント、断片、類似体または誘導体を、化学的な合成または修飾の手順を用いて作製することもできる。バリアントの作製方法は当技術分野において周知である。これらには、産業用または研究室での用途における価値を高める特性を有するポリペプチドをコードする核酸を作製するために、天然の分離物から得られた核酸配列を改変する手順が含まれる。そのような手順では、天然の分離物から得られた配列とは1つまたは複数のヌクレオチドが異なる多数のバリアント配列を作製し、特徴づけを行う。典型的には、これらのヌクレオチドの違いによって、天然の分離物の核酸によってコードされるポリペプチドとのアミノ酸変化がもたらされる。例えば、バリアントは、ランダム突然変異誘発および部位指定突然変異誘発を用いることによって調製することができる。ランダム突然変異誘発および部位指定突然変異誘発は、当技術分野において公知である（Arnold, (1993) Ciirr. Opin. Biotech, 4: 450-455を参照されたい）。ランダム突然変異誘発は、エラープローンPCR（Leung et al. (1989), Technique, 1: 11-15；およびCaldwell et al. (1992) PCR Methods Applic, 2: 28-33を参照されたい）。エラープローンPCRでは、PCR産物の全長にわたって高い点突然変異率が得られるように、DNAポリメラーゼのコピー忠実度（copying fidelity）が低くなる条件下で実際のPCRを行う。手短に述べると、そのような手法では、突然変異誘発させる核酸（例えば、ACPをコードするポリヌクレオチド配列）を、PCRプライマー、反応緩衝液、MgCl2、MnCl2、Taqポリメラーゼ、およびPCR産物の全長にわたって高い点突然変異率を得るのに適した濃度のdNTPと混合する。例えば、反応は、20fmolの突然変異誘発させる核酸、30pmolの各PCRプライマー、50mM KCl、10mM Tris HCl（pH 8.3）、0.01％ゼラチン、7mM MgCl2、0.5mM MnCl2、5単位のTaqポリメラーゼ、0.2mM dGTP、0.2mM dATP、1mM dCTP、および1mM dTTPを含む反応緩衝液を用いて行うことができる。PCRは、94℃で1分、45℃で1分、および72℃で1分を30サイクルとして行うことができる。しかし、これらのパラメーターを適宜変更しうることは理解されるであろう。続いて、突然変異誘発された核酸を適切なベクター中にクローニングし、突然変異誘発された核酸によってコードされるポリペプチドの活性を評価する。部位指定突然変異誘発はまた、クローニングされた関心対象の任意のDNA中に部位特異的突然変異を生じさせるためにオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発を用いて達成することもできる。オリゴヌクレオチド突然変異誘発は当技術分野において記載されている（Reidhaar-Olson et al. (1988) Science, 241 : 53-57を参照されたい）。手短に述べると、そのような手順では、クローニングされたDNA中に導入しようとする1つまたは複数の突然変異を保有する複数の二本鎖オリゴヌクレオチドを合成し、突然変異誘発させるクローニングされたDNA（例えば、CARポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列）中に挿入する。突然変異誘発されたDNAを含有するクローンを回収し、それらがコードするポリペプチドの活性を評価する。
【００９７】
バリアントを作製するためのもう1つの方法は、アセンブリPCRである。アセンブリPCRでは、小さなDNA断片の混合物からのPCR産物のアセンブリが行われる。同一のバイアル内で多数の異なるPCR反応が並行して起こり、ある反応の産物が別の反応の産物をプライミングする。アセンブリPCRは、例えば、米国特許第5,965,408号に記載されている。バリアントを作製するさらにもう1つの方法は、セクシャル（sexual）PCR突然変異誘発である（Stemmer, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 91: 10747-10751を参照されたい）。セクシャルPCR突然変異誘発では、DNA分子のランダム断片化の結果として、異なってはいるが類縁性の高いDNA配列のDNA分子間で、配列相同性に基づき、強制的な相同組換えがインビトロで起こる。これに続いて、PCR反応におけるプライマー伸長により、交差組換え（crossover）の固定が行われる。
【００９８】
バリアントを、インビボ突然変異誘発によって作製することもできる。いくつかの態様においては、DNA修復経路の1つまたは複数に突然変異を保持する大腸菌株などの細菌株において配列を増幅させることにより、核酸配列中にランダム突然変異を生じさせる。そのような「ミューテーター（mutator）」菌株は、野生型菌株よりも高いランダム突然変異率を有する。これらの菌株の1つでDNA配列（例えばCARポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列）を増幅させることにより、最終的には、DNA内にランダム突然変異が生じることになる。インビボ突然変異誘発における使用に適したミューテーター菌株は、例えば、国際特許出願公開WO 91/16427に記載されている。また、バリアントを、カセット突然変異誘発を用いて作製することもできる。カセット突然変異誘発では、二本鎖DNA分子の小さな領域を、生来の配列とは異なる合成オリゴヌクレオチドカセットで置き換える。オリゴヌクレオチドは、多くの場合、完全および／または部分的にランダム化された生来の配列を含有する。また、リカーシブ・アンサンブル（recursive ensemble）突然変異誘発を、バリアントを作製するために用いることもできる。リカーシブ・アンサンブル突然変異誘発は、表現型が関連している突然変異体の多様な集団（メンバーのアミノ酸配列が異なっている）を作製するために開発されたタンパク質工学（すなわち、タンパク質突然変異誘発）のためのアルゴリズムである。この方法では、フィードバック機構を用いて、連続した複数回のコンビナトリアルカセット突然変異誘発を制御する。リカーシブ・アンサンブル突然変異誘発は当技術分野において公知である（Arkin et al, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 89: 7811-7815を参照されたい）。いくつかの態様においては、エクスポネンシャル・アンサンブル（exponential ensemble）突然変異誘発を用いてバリアントが作製される（Delegrave et al. (1993) Biotech. Res, 11: 1548-1552を参照されたい）。エクスポネンシャル・アンサンブル突然変異誘発は、ユニークかつ機能的な突然変異体のパーセンテージが高いコンビナトリアルライブラリーを作製するための工程であり、この工程では、少数の残基群を並行してランダム化することにより、変更された各位置で機能的タンパク質をもたらすアミノ酸を同定する。いくつかの態様においては、シャフリング（shuffling）手順を用いてバリアントが作製され、この手順では、例えば、米国特許第5,965,408号および第5,939,250号に記載されているように、別個のポリペプチドをコードする複数の核酸の部分を融合させて、キメラポリペプチドをコードするキメラ核酸配列を作製する。
【００９９】
脂肪酸誘導体の産生
本開示は、本明細書に記載の脂肪酸生合成経路における使用に適する活性を有するポリペプチド（すなわち、酵素）の数多くの例を提供する。そのようなポリペプチドは、本明細書において脂肪酸生合成ポリペプチドもしくはタンパク質または脂肪酸生合成酵素と総称される。本開示の組換え宿主細胞における使用に適する脂肪酸経路ポリペプチドの非限定的な例は、本明細書において提供される。いくつかの態様において、本開示は、脂肪酸生合成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（本明細書において、脂肪酸生合成ポリヌクレオチド配列とも称される）を含む組換え宿主細胞を含む。脂肪酸生合成ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームおよび機能的に連結された調節配列を含むポリヌクレオチド配列を、組換え宿主細胞の染色体中に組み込むこと、組換え宿主細胞内に常在する1つもしくは複数のプラスミド発現系の中に組み入れること、またはその両方が可能である。ACPと組み合わせて発現させることのできる生合成ポリペプチドまたはタンパク質の例には、カルボン酸レダクターゼ（CAR）、チオエステラーゼ（TE）、アシル-ACPレダクターゼ（AAR）、アシル-CoAレダクターゼ（ACR）、エステルシンターゼ（ES）、デカルボニラーゼ、アセチル-CoAカルボキシラーゼ（ACC）、脂肪アルコール生成性アシル-CoAレダクターゼ（FAR）などがある（下記の表1も参照されたい）。実施例1〜4（下記）では、本開示の種々の態様を例証するために、プラスミド発現系と宿主ゲノム中への組み込みの両方を用いている。
【０１００】
いくつかの態様において、脂肪酸生合成ポリヌクレオチド配列は、遺伝子操作される組換え細胞の親宿主細胞にとって内因性であるポリペプチドをコードする。他の態様において、脂肪酸生合成ポリヌクレオチド配列は、遺伝子操作される組換え細胞の親宿主細胞にとって外因性であるポリペプチドをコードする。さらに他の態様において、脂肪酸生合成ポリヌクレオチド配列は、遺伝子操作される組換え細胞の親宿主細胞にとって異種であるポリペプチドをコードする。さらに他の態様において、脂肪酸生合成ポリヌクレオチド配列は、対応する親宿主細胞と比較した場合に組換え細胞において発現される、外因性または異種ポリペプチドをコードする。さらに他の態様において、脂肪酸生合成ポリヌクレオチド配列は、対応する親宿主細胞と比較した場合に組換え細胞において過剰発現される、内因性ポリペプチドをコードする。ある態様において、過剰発現される遺伝子によってコードされる酵素は、脂肪酸生合成に直接関与する。いくつかの態様において、脂肪酸生合成ポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも1つのポリペプチドは、外因性または異種ポリペプチドである。他の態様において、脂肪酸生合成ポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも1つのポリペプチドは、過剰発現されるポリペプチドである。表1は、特定の脂肪酸誘導体の産生を促進するために組換え宿主細胞において発現または過剰発現させることのできる例示的なタンパク質のリストを提示している。
【０１０１】
（表１）遺伝子の名称
2016500261.tif 000003
2016500261.tif 000004
2016500261.tif 000005
2016500261.tif 000006
2016500261.tif 000007
【０１０２】
脂肪酸の産生
組換え宿主細胞は、脂肪酸を産生するために、ACPおよび、EC 3.1.1.5またはEC 3.1.2.‐（例えば、EC 3.1.2.14）のチオエステラーゼをコードするオープンリーディングフレームを、組換え宿主細胞におけるタンパク質の発現を促進する機能的に連結された調節配列とともに含有する、1つまたは複数のポリヌクレオチド配列を含みうる。組換え宿主細胞において、オープンリーディングフレームコード配列および／または調節配列は、チオエステラーゼおよび／またはACPをコードする対応する野生型遺伝子に比して改変される。組換え宿主細胞におけるチオエステラーゼの活性は、対応する宿主細胞において対応する野生型遺伝子から発現されるチオエステラーゼの活性に比して改変される。いくつかの態様において、脂肪酸を含む脂肪酸誘導体組成物は、組換え細胞を、炭素源の存在下で、チオエステラーゼを発現させるのに適した条件下で培養することによって産生される。関連した態様において、組換え宿主細胞は、チオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ACPポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および任意で、他の脂肪酸生合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数のさらなるポリヌクレオチドを含む。いくつかのそのような場合には、チオエステラーゼの作用によって生成された脂肪酸が、異なる脂肪酸生合成酵素活性を有する1つまたは複数の酵素によって、別の脂肪酸誘導体、例えば脂肪エステル、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、または炭化水素などに変換される。
【０１０３】
それらから作られる脂肪酸または脂肪酸誘導体の鎖長は、特定のチオエステラーゼの発現を改変することによって選択することができる。特定のチオエステラーゼは、生成される脂肪酸誘導体の鎖長に影響を及ぼす。脂肪酸誘導体基質の鎖長は、選択されたチオエステラーゼ（例えばEC 3.1.2.14またはEC 3.1.1.5）の発現を改変することによって選択することができる。従って、宿主細胞は、好ましい脂肪酸誘導体基質の産生を増加させるために、1つまたは複数の選択されたチオエステラーゼを発現するように、過剰発現するように、発現が減弱するように、または全く発現しないように遺伝子操作することができる。例えば、C10脂肪酸は、C10脂肪酸を生成する選好性を有する特定のチオエステラーゼを発現させること、および、C10脂肪酸以外の脂肪酸を生成する選好性を有するチオエステラーゼ（例えば、C14脂肪酸を生成することを選好するチオエステラーゼ）を減弱させることによって産生させることができる。このことは、炭素鎖長10を有する脂肪酸の比較的均一な集団をもたらすと考えられる。また別の場合には、非C14脂肪酸を生成する内因性チオエステラーゼを減弱させること、およびC14-ACPを利用するチオエステラーゼを発現させることによって、C14脂肪酸を産生させることができる。場合によっては、C12脂肪酸は、C12-ACPを利用するチオエステラーゼを発現させること、および非C12脂肪酸を生成するチオエステラーゼを減弱させることによって産生させることができる。例えば、C12脂肪酸は、C12脂肪酸を生成する選好性を有するチオエステラーゼを発現させること、およびC12脂肪酸以外の脂肪酸を生成する選好性を有するチオエステラーゼを減弱させることによって産生させることができる。このことは、炭素鎖長12を有する脂肪酸の比較的均一な集団をもたらすと考えられる。1つの好ましい態様において、脂肪酸組成物は組換え宿主細胞の細胞外環境、すなわち細胞培養培地から回収される。別の態様において、脂肪酸組成物は、組換え宿主細胞の細胞内環境から回収される。組換え宿主細胞によって産生された脂肪酸誘導体組成物は、個々の脂肪酸誘導体の分布、ならびに脂肪酸誘導体組成物の構成成分の鎖長および飽和度を決定する目的で、当技術分野において公知の方法、例えばGC-FIDを用いて分析することができる。アセチル-CoA、マロニル-CoAおよび脂肪酸の過剰産生は、当技術分野において公知の方法を用いて、例えば、細胞溶解後の放射活性前駆体、HPLCまたはGC-MSの使用によって検証することができる。脂肪酸経路に用いるためのチオエステラーゼおよびそれらをコードするポリヌクレオチドのさらなる例は、参照により本明細書に明示的に組み入れられるPCT公開第WO2010/075483号に提供されている。
【０１０４】
脂肪アルデヒドの産生
組換え宿主細胞は、脂肪アルデヒドを生産する目的で、ACPと、1つまたは複数の生合成タンパク質とを、例えばEC 1.2.1.42もしくは1.2.1.80のアシル-ACPレダクターゼ（AAR）；またはEC 6.2.1.3もしくはEC 1.2.1.42のカルボン酸レダクターゼ（CAR）などとをコードするオープンリーディングフレームを、組換え宿主細胞におけるタンパク質の発現を促進する機能的に連結された調節配列とともに含む、1つまたは複数のポリヌクレオチド配列を含んでもよい。組換え宿主細胞において、オープンリーディングフレームコード配列および／または調節配列は、AARまたはCARおよび／またはACPをコードする対応する野生型遺伝子に比して改変されている。組換え宿主細胞はまた、ACPと、1つまたは複数の生合成タンパク質とを、例えばEC 3.1.1.5またはEC 3.1.2.-（例えば、EC 3.1.2.14）のチオエステラーゼおよび6.2.1.3のアシル-CoAシンテターゼ（FadD）と組み合わせたEC 1.2.1.42のアシル-CoAレダクターゼなどとをコードするオープンリーディングフレームを含む、1つまたは複数のポリヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０１０５】
いくつかの態様において、組換え宿主細胞によって産生された脂肪酸は脂肪アルデヒドに変換される。いくつかの態様において、組換え宿主細胞によって産生された脂肪アルデヒドは、続いて脂肪アルコールまたは炭化水素に変換される。いくつかの態様においては、生来の（内因性）脂肪アルデヒド生合成ポリペプチド、例えばアルデヒドレダクターゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼが宿主細胞（例えば、大腸菌）に存在し、脂肪アルデヒドを脂肪アルコールに変換させるのに有効である。他の態様においては、生来の（内因性）脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドを過剰発現させる。さらなる他の態様においては、外来性脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドを組換え宿主細胞に導入して、発現または過剰発現させる。生来の宿主細胞または組換え宿主細胞は、脂肪アルデヒド生合成活性を有する酵素（本明細書において、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドまたは脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドもしくは酵素とも称される）をコードするポリヌクレオチドを含みうる。脂肪アルデヒドは、脂肪アルデヒド生合成酵素（例えばAAR）が宿主細胞において発現または過剰発現された時に産生される。脂肪アルデヒドを産生するように遺伝子操作された組換え宿主細胞は、典型的には、脂肪アルデヒドの一部を脂肪アルコールに変換する。
【０１０６】
いくつかの態様において、脂肪アルデヒドは、脂肪アルデヒド生合成活性、例えばカルボン酸レダクターゼ（CAR）活性またはアシル-ACPレダクターゼ（AAR）活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、組換え宿主細胞において発現または過剰発現させることによって産生される。CarBは例示的なカルボン酸レダクターゼの1つである。本開示の実施に当たっては、カルボン酸レダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子を、宿主細胞において発現または過剰発現させる（図4を参照されたい）。いくつかの態様において、CarBポリペプチドはSEQ ID NO：90のアミノ酸配列を有する。他の態様において、CarBポリペプチドはSEQ ID NO: 88（CarB）もしくはSEQ ID NO: 89（CarB60）によってコードされるか、またはそれらのバリアントもしくは突然変異体である。カルボン酸レダクターゼ（CAR）ポリペプチドおよびそれらをコードするポリヌクレオチドの例には、FadD9（EC 6.2.1.-、UniProtKB Q50631、GenBank NP_217106）、CarA（GenBank ABK75684）、CarB（GenBank YP889972）、ならびに参照により本明細書に明示的に組み入れられるPCT公開第WO2010/042664号および米国特許第8,097,439号に記載された関連ポリペプチドが非限定的に含まれる。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、チオエステラーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
【０１０７】
いくつかの態様において、脂肪アルデヒドは、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えばアシル-ACPレダクターゼ（AAR）活性を有するポリペプチドを、組換え宿主細胞において発現または過剰発現させることによって産生される。組換え宿主細胞におけるAARの発現は、脂肪アルデヒドおよび／または脂肪アルコールの産生をもたらす（図4）。例示的なAARポリペプチドは、PCT公開第WO2009/140695号および第WO/2009/140696号に記載されており、これらはいずれも参照により本明細書に明示的に組み入れられる。脂肪アルデヒドを含む組成物（脂肪アルデヒド組成物）は、炭素源の存在下で、脂肪アルデヒド生合成酵素を発現させるのに有効な条件下で宿主細胞を培養することによって、産生される。いくつかの態様において、脂肪アルデヒド組成物は脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールを含む。1つの好ましい態様において、脂肪アルデヒド組成物は、組換え宿主細胞の細胞外環境、すなわち細胞培養培地から回収される。別の態様において、脂肪アルデヒド組成物は、組換え宿主細胞の細胞内環境から回収される。
【０１０８】
脂肪アルコールの産生
組換え宿主細胞は、脂肪アルコールを生産する目的で、ACPと、1つまたは複数の生合成タンパク質とを、例えば、内因性または外因性のアルデヒドレダクターゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼと組み合わせた、EC 1.2.1.42もしくは1.2.1.80のアシル-ACPレダクターゼ（AAR）；またはEC 6.2.1.3もしくはEC 1.2.1.42のカルボン酸レダクターゼ（CAR）などとをコードするオープンリーディングフレームを、組換え宿主細胞におけるタンパク質の発現を促進する機能的に連結された調節配列とともに含む、1つまたは複数のポリヌクレオチド配列を含んでもよい。組換え宿主細胞において、オープンリーディングフレームコード配列および／または調節配列は、AARもしくはCARおよび任意でアルデヒドレダクターゼもしくはアルコールデヒドロゲナーゼならびに／またはACPをコードする対応する野生型遺伝子に比して改変されている。
【０１０９】
いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、脂肪アルコール生合成活性を有するポリペプチド（酵素）（本明細書において、脂肪アルコール生合成ポリペプチドまたは脂肪アルコール生合成酵素とも称される）をコードするポリヌクレオチドを含み、脂肪アルコールが組換え宿主細胞によって産生される。脂肪アルコールを含む組成物（脂肪アルコール組成物）は、炭素源の存在下で、脂肪アルコール生合成酵素を発現させるのに有効な条件下で組換え宿主細胞を培養することによって、産生させうる。組換え宿主細胞（例えば、大腸菌）に存在する生来の（内因性）アルデヒドレダクターゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼは、脂肪アルデヒドを脂肪アルコールに変換する。いくつかの態様において、脂肪アルコール組成物は1種または複数種の脂肪アルコールを含むが、脂肪アルコール組成物は、他の脂肪酸誘導体を含んでもよい。1つの好ましい態様において、脂肪アルコール組成物は、組換え宿主細胞の細胞外環境、すなわち細胞培養培地から回収される。別の態様において、脂肪アルコール組成物は、組換え宿主細胞の細胞内環境から回収される。
【０１１０】
1つのアプローチでは、アシル-ACPの遊離脂肪酸（FFA）への変換を触媒するチオエステラーゼ、および遊離脂肪酸を脂肪アルデヒドに変換するカルボン酸レダクターゼ（CAR）を発現させることによって、脂肪アルコールを産生するように組換え宿主細胞を遺伝子操作した。宿主細胞（例えば、大腸菌）に存在する生来の（内因性）アルデヒドレダクターゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼは、脂肪アルデヒドを脂肪アルコールに変換することができる。いくつかの態様において、宿主細胞に存在する生来の（内因性）脂肪アルデヒド生合成ポリペプチド、例えばアルデヒドレダクターゼおよび／またはアルコールデヒドロゲナーゼは、脂肪アルデヒドを脂肪アルコールに変換するのに十分でありうる。しかし、他の態様において、生来の（内因性）脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドは過剰発現され、さらに別の態様において、外来性脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドは組換え宿主細胞に導入されて、発現または過剰発現される。いくつかの態様において、脂肪アルコールは、脂肪アルデヒドを脂肪アルコールに変換する脂肪アルコール生合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、組換え宿主細胞において発現または過剰発現させることによって産生される。例えば、アルコールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドレダクターゼ（例えば、EC 1.1.1.1）を、本開示の実施に際して用いてもよい。本明細書で用いる場合、アルコールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドレダクターゼとは、脂肪アルデヒドのアルコール（例えば、脂肪アルコール）への変換を触媒しうるポリペプチドを指す。当業者は、ある種のアルコールデヒドロゲナーゼは他の反応も触媒しうることを理解していると考えられ、これらの非特異的アルコールデヒドロゲナーゼも、アルコールデヒドロゲナーゼという用語の範囲に含まれる。本開示に従って有用なアルコールデヒドロゲナーゼポリペプチドの例には、アシネトバクター属種M-1（Acinetobacter sp. M-1）のAlrA（CAG70252）またはAlrAホモログ、例えばAlrAadp1、内因性大腸菌アルコールデヒドロゲナーゼ、例えばYjgB（AAC77226）、DkgA（NP_417485）、DkgB（NP_414743）、YdjL（AAC74846）、YdjJ（NP_416288）、AdhP（NP_415995）、YhdH（NP_417719）、YahK（NP_414859）、YphC（AAC75598）、YqhD（446856）およびYbbO［AAC73595.1］が非限定的に含まれる。そのほかの例は、国際特許出願公開第WO2007/136762号、WO2008/119082号およびWO 2010/062480号に記載されており、これらはそれぞれ、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。ある態様において、脂肪アルコール生合成ポリペプチドはアルデヒドレダクターゼ活性またはアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する（EC 1.1.1.1）。
【０１１１】
もう1つのアプローチでは、脂肪アルコール生成性アシル-CoAレダクターゼ、または脂肪アシル-チオエステル基質（例えば、脂肪アシル-CoAまたは脂肪アシル-ACP）を脂肪アルコールに変換する脂肪アシルレダクターゼ（FAR）を発現させることによって、脂肪アルコールを産生するように組換え宿主細胞を遺伝子操作した。いくつかの態様において、脂肪アルコールは、脂肪アルコール生成性アシル-CoAレダクターゼ（FAR）活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組換え宿主細胞において発現または過剰発現させることによって産生される。この態様に従って有用なFARポリペプチドの例は、PCT公開第WO2010/062480号に記載されており、これは参照により本明細書に明示的に組み入れられる。脂肪アルコールを、脂肪アシル-ACPおよび脂肪アシル-CoA中間体を利用するアシル-CoA依存性経路、ならびに脂肪アシル-ACP中間体を利用するが脂肪アシル-CoA中間体は利用しないアシル-CoA非依存的経路を介して産生させることもできる。特定の態様において、過剰発現される遺伝子によってコードされる酵素は、脂肪酸シンターゼ、アシル-ACPチオエステラーゼ、脂肪アシル-CoAシンターゼおよびアセチル-CoAカルボキシラーゼ（ACC）を含むが、これらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、過剰発現される遺伝子によってコードされるタンパク質は、宿主細胞にとって内因性である。他の態様において、過剰発現される遺伝子によってコードされるタンパク質は、宿主細胞にとって異種または外因性である。
【０１１２】
脂肪アルコールはまた、さまざまなアシル-ACP分子またはアシル-CoA分子を対応する第一級アルコールに還元することのできる酵素により、天然にも作られる（参照により本明細書に明示的に組み入れられる、米国特許公開第20100105963号および第20110206630号ならびに米国特許第8,097,439号を参照されたい）。組換え宿主細胞による脂肪アルコールの産生を増加させるための戦略には、脂肪アルコール生合成を増加させるような産生宿主における生来の脂肪酸生合成遺伝子の過剰発現および／または異なる生物由来の外因性脂肪酸生合成遺伝子の発現により、脂肪酸生合成経路を経由する流れを増大させることが含まれる。
【０１１３】
エステルの産生
組換え宿主細胞は、脂肪エステルを生産する目的で、ACPと、1つまたは複数の生合成タンパク質とを、例えばEC 2.3.1.75のエステルシンターゼ（ES）とを；または、EC 3.1.1.5もしくはEC 3.1.2.-の内因性もしくは外因性チオエステラーゼ（TE）およびEC 6.2.1.3のアシル-CoAシンテターゼ／シンターゼ（fadD）と組み合わせたESなどとをコードするオープンリーディングフレームを、組換え宿主細胞におけるタンパク質の発現を促進する機能的に連結された調節配列とともに含む、1つまたは複数のポリヌクレオチド配列を含んでもよい（図5参照）。組換え宿主細胞において、オープンリーディングフレームコード配列および／または調節配列は、ESおよび任意でTEおよびfadDならびに／またはACPをコードする対応する野生型遺伝子に比して改変されている。
【０１１４】
本明細書において言及される脂肪エステルは、脂肪酸から作られるあらゆるエステル、例えば脂肪酸エステルでありうる。いくつかの態様において、脂肪エステルはA側およびB側を含む。エステルのA側とは、エステルのカルボン酸酸素に結びついた炭素鎖を指す。エステルのB側とは、エステルの親カルボン酸を含む炭素鎖を指す。脂肪エステルが脂肪酸生合成経路に由来する態様において、A側はアルコールにより与えられ、B側は脂肪酸により与えられる。あらゆるアルコールを、脂肪エステルのA側を形成するために用いることができる。例えば、アルコールが脂肪酸生合成経路に由来してもよい。または、アルコールを非脂肪酸生合成経路を介して生成させることもできる。さらに、アルコールを外来的に与えることもできる。例えば、脂肪エステルが生物によって産生される場合には、アルコールを発酵ブロス中に供給することができる。または、脂肪エステルがアルコールも産生しうる生物によって産生される場合には、脂肪酸または酢酸などのカルボン酸を外来的に供給することもできる。A側またはB側を含む炭素鎖は、任意の長さであってよい。1つの態様において、エステルのA側は少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16、または18炭素長である。脂肪エステルが脂肪酸メチルエステルである場合、エステルのA側は1炭素長である。脂肪エステルが脂肪酸エチルエステルである場合、エステルのA側は2炭素長である。エステルのB側は、少なくとも約4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、または26炭素長であってよい。A側および／またはB側は、直鎖または分枝鎖でありうる。分枝鎖は1つまたは複数の分枝点を有しうる。加えて、分枝鎖が環状分枝を含むこともできる。その上、A側および／またはB側は飽和性でも不飽和性でもよい。不飽和である場合には、A側および／またはB側は1つまたは複数の不飽和点を有しうる。
【０１１５】
1つの態様において、脂肪エステルは生合成で生成される。この態様においては、脂肪酸が最初に活性化される。活性化脂肪酸の例には、アシル-CoA、アシルACPおよびアシルリン酸がある。アシル-CoAは脂肪酸の生合成または分解の直接的な生成物でありうる。加えて、アシル-CoAを、遊離脂肪酸、CoAおよびアデノシンヌクレオチド三リン酸（ATP）から合成することもできる。アシル-CoAを生成する酵素の一例はアシル-CoAシンターゼである。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、エステルシンターゼ活性を有するポリペプチド、例えば、酵素（本明細書において、エステルシンターゼポリペプチドまたはエステルシンターゼとも称される）をコードするポリヌクレオチドを含む。脂肪エステルは、組換え宿主細胞において発現または過剰発現されたエステルシンターゼポリペプチドによって触媒される反応によって生成される。いくつかの態様において、組成物は、脂肪エステル（本明細書において、脂肪エステル組成物とも称される）、例えば、炭素源の存在下で、エステルシンターゼを発現させるのに有効な条件下で組換え細胞を培養することによって産生される脂肪エステルを包含する。いくつかの態様において、脂肪エステル組成物は細胞培養物から回収される。エステルシンターゼポリペプチドには、例えば、EC 2.3.1.75に分類されるエステルシンターゼポリペプチド、または、チオエステラーゼ、エステルシンターゼ、アシル-CoA:アルコールトランスアシラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、または脂肪アシル-CoA:脂肪アルコールアシルトランスフェラーゼを非限定的に含む、アシル-チオエステルの脂肪エステルへの変換を触媒する他の任意のポリペプチドが含まれる。例えば、組換え宿主細胞中で発現させるポリヌクレオチドが、ホホバ（Simmondsia chinensis）、アシネトバクター属種菌株ADP、アルカニボラックス・ボルクメンシス（Alcanivorax borkumensis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、ファンジバクター・ジャデンシス（Fundibacter jadensis）、アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）、またはアルカリゲネス・ユートロフス（Alkaligenes eutrophus）由来の二機能性エステルシンターゼ/アシル-CoA:ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼであるwax/dgatをコードしてもよい。1つの特定の態様において、エステルシンターゼポリペプチドは、アシネトバクター属種のジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ（wax-dgat；UniProtKB Q8GGG1、GenBank AAO17391）またはホホバの蝋シンターゼ（UniProtKB Q9XGY6、GenBank AAD38041）である。もう1つの態様において、エステルシンターゼポリペプチドは、例えば、ws2遺伝子（SEQ ID NO：93）によってコードされる、マリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカス（Marinobacter hydrocarbonoclasticus）由来の蝋エステルシンターゼであるES9； DSM 8798、UniProtKB A3RE51（SEQ ID NO：94）；または、ws1遺伝子によってコードされる、M. ハイドロカーボノクラスティカスDSM8798のES8（GenBankアクセッション番号ABO21020）である。1つの特定の態様においては、エステルシンターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、組換え宿主細胞において過剰発現させる。いくつかの態様において、脂肪酸エステルは、チオエステラーゼ（TE）酵素、アシル-CoAシンテターゼ（fadD）酵素、およびエステルシンターゼ（ES）酵素を含む3種の脂肪酸生合成酵素を発現するように遺伝子操作された組換え宿主細胞によって産生される（図5、三酵素系を参照されたい）。他の態様において、脂肪酸エステルは、エステルシンターゼ（ES）酵素という1つの脂肪酸生合成酵素を発現するように遺伝子操作された組換え宿主細胞によって産生される（図5、一酵素系を参照されたい）。これらの態様における使用に適するエステルシンターゼポリペプチド（およびそれらをコードするポリヌクレオチド）の例には、PCT公開第WO2007/136762号、WO2008/119082号、ならびにWO/2011/038134号（三酵素系）およびWO/2011/038132号（一酵素系）に記載されたものが含まれ、これらはそれぞれ、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。組換え宿主細胞は、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸エチルエステル、および／または蝋エステルなどの脂肪エステルを産生することができる。1つの好ましい態様において、エステル組成物は組換え宿主細胞の細胞外環境、すなわち細胞培養培地から回収される。別の態様において、エステル組成物は、組換え宿主細胞の細胞内環境から回収される。
【０１１６】
炭化水素の産生
組換え宿主細胞は、炭化水素（例えば、アルカン、オレフィン）および／またはケトンを生産する目的で、ACPと、1つまたは複数の生合成タンパク質とを、例えば、EC 1.2.1.42もしくは1.2.1.80のアシル-ACPレダクターゼ（AAR）と内因性もしくは外因性デカルボニラーゼ（ADC）の組み合わせとを；またはEC 3.1.1.5もしくはEC 3.1.2.-の内因性もしくは外因性チオエステラー（TE）とデカルボキシラーゼとの組み合わせとをコードするオープンリーディングフレームを、組換え宿主細胞におけるタンパク質の発現を促進する機能的に連結された調節配列とともに含む、1つまたは複数のポリヌクレオチド配列を含んでもよい。組換え宿主細胞において、オープンリーディングフレームコード配列および／または調節配列は、AARおよびADCもしくはTEおよびデカルボキシラーゼならびに／またはACPをコードする対応する野生型遺伝子に比して改変されている。
【０１１７】
したがってこの局面は、少なくとも一部には、組換え宿主細胞において、AARなどの脂肪アルデヒド生合成ポリペプチド、および、デカルボニラーゼポリペプチドなどの炭化水素生合成ポリペプチドの発現レベルを変更することにより、該細胞による炭化水素の産生強化が促進されるという発見に基づく。1つの態様において、組換え宿主細胞は、アルカンまたはアルケンなどの炭化水素を産生する。いくつかの態様において、組換え宿主細胞によって産生された脂肪アルデヒドは、脱カルボニルによって変換され、炭素原子が除去されて炭化水素となる。他の態様において、組換え宿主細胞によって産生された脂肪酸は脱カルボキシルによって変換され、炭素原子が除去されて末端オレフィンとなる。いくつかの態様において、アシル-ACP中間体は脱カルボキシルによって変換され、炭素原子が除去されて内部オレフィンまたはケトンとなる（図6を参照されたい）。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、炭化水素生合成活性を有するポリペプチド（酵素）（本明細書において、炭化水素生合成ポリペプチドまたは炭化水素生合成酵素とも称される）をコードするポリヌクレオチドを含み、組換え宿主細胞における炭化水素生合成酵素の発現または過剰発現によって炭化水素が産生される。アシル-ACPレダクターゼ（AAR）およびEC 4.1.99.5のアルデヒドデカルボニラーゼ（ADC）（これらは一緒になって脂肪酸代謝の中間体をアルカンおよびアルケンに変換する）を包含するアルカン生合成経路を用いて、炭化水素の産生のための組換え宿主細胞を遺伝子操作した（参照により本明細書に明示的に組み入れられる米国特許第8,323,924号を参照されたい）。
【０１１８】
いくつかの態様において、炭化水素を含む組成物（本明細書において、炭化水素組成物とも称される）は、組換え細胞を、炭素源の存在下で、AARおよびADCポリヌクレオチドを発現させるのに有効な条件下で培養することによって産生される。いくつかの態様において、炭化水素組成物は飽和および不飽和炭化水素を含むが、炭化水素組成物は他の脂肪酸誘導体を含んでもよい。1つの好ましい態様において、炭化水素組成物は、組換え宿主細胞の細胞外環境、すなわち細胞培養培地から回収される。別の態様において、炭化水素組成物は、組換え宿主細胞の細胞内環境から回収される。アルカンなどの炭化水素は、飽和炭化水素または、炭素（C）および水素（H）でできている化合物であって、これらの原子が単一の結合によって一緒に連結されている、化合物（すなわち、飽和化合物）を指す。オレフィンおよびアルケンは、少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含む、同じタイプの炭化水素（化合物）（すなわち、不飽和化合物）を指す。アルケン/オレフィンの例は、化学式CxH2xを有する末端オレフィン（α-オレフィン、末端アルケン、または1-アルケンとも称される）であり、該化学式は、炭化水素鎖が直鎖状であることおよび二重結合の位置が第一の位置またはα位置にあることにより区別される類似の分子式を有する他のオレフィンとは異なる。いくつかの態様において、末端オレフィンは、例えば、参照により本明細書に明示的に組み入れられるPCT公開第WO2009/085278号に記載されたようなデカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドといった、炭化水素生合成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、組換え宿主細胞において発現または過剰発現させることによって産生される。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、チオエステラーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
【０１１９】
他の態様において、ケトンは、例えば、参照により本明細書に明示的に組み入れられるPCT公開第WO2008/147781号に記載されたようなOleA活性を有するポリペプチドといった、炭化水素生合成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、組換え宿主細胞において発現または過剰発現させることによって産生される。関連した態様において、内部オレフィンは、OleCD活性またはOleBCD活性を有するポリペプチドといった炭化水素生合成ポリペプチドを、例えば、参照により本明細書に明示的に組み入れられるPCT公開第WO2008/147781号に記載されたようなOleA活性を有するポリペプチドとともにコードするポリヌクレオチドを、組換え宿主細胞において発現または過剰発現させることによって産生される。
【０１２０】
組換え宿主細胞および細胞培養物
上述の通り、組換え宿主細胞による脂肪酸誘導体の産生を増加させるための戦略には、産生宿主における、生来の脂肪酸生合成遺伝子の過剰発現および異なる生物由来の外因性脂肪酸生合成遺伝子の発現による、脂肪酸生合成経路を経由する流れの増大が含まれる（前記）。組換え宿主細胞（または遺伝子操作された宿主細胞）とは、例えば、新たな遺伝因子の人為的導入、および／または宿主細胞内に天然に存在する遺伝因子の人為的改変によって、対応する野生型宿主細胞に比して遺伝子構造が変更された宿主細胞を指す。そのような組換え宿主細胞の子孫も、これらの新たな、および／または改変された遺伝因子を含有する。本明細書に記載の本開示の諸局面の任意のものにおいて、宿主細胞は、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞（例えば、カンジダ属種（Candida sp.）などの糸状菌、またはサッカロミセス属種（Saccharomyces sp.）などの出芽酵母）、藻類細胞および細菌細胞より選択されうる。1つの好ましい態様において、組換え宿主細胞は細菌由来の組換え微生物である。別の態様において、組換え宿主細胞は真菌由来の組換え微生物である。さらに別の態様において、組換え宿主細胞は藻類由来の組換え微生物である。さらに別の態様において、組換え宿主細胞は植物または昆虫由来の組換え微生物である。
【０１２１】
微生物細胞である宿主細胞の例には、エシェリキア属（Escherichia）、バチルス属（Bacillus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ザイモモナス属（Zymomonas）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、アスペルギルス属（Aspergillus）、トリコデルマ属（Trichoderma）、ニューロスポラ属（Neurospora）、フザリウム属（Fusarium）、ヒューミコーラ属（Humicola）、リゾムコール属（Rhizomucor）、クリベロミセス属（Kluyveromyces）、ピキア属（Pichia）、ムコール属（Mucor）、ミセリオフトラ属（Myceliophtora）、ペニシリウム属（Penicillium）、ファネロカエテ属（Phanerochaete）、プレウロタス属（Pleurotus）、トラメテス属（Trametes）、クリソスポリウム属（Chrysosporium）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、ステノトロホモナス属（Stenotrophamonas）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、ヤロウイア属（Yarrowia）、またはストレプトミセス属（Streptomyces）に由来する細胞が非限定的に含まれる。いくつかの態様において、宿主細胞はグラム陽性細菌細胞である。他の態様において、宿主細胞はグラム陰性細菌細胞である。1つの好ましい態様において、宿主細胞は大腸菌細胞である。他の態様において、宿主細胞は、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）細胞、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）細胞、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）細胞、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus lichenoformis）細胞、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus）細胞、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）細胞、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）細胞、バチルス・プミルス（Bacillus pumilis）細胞、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）細胞、バチルス・クラウジ（Bacillus clausii）細胞、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）細胞、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）細胞、またはバチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）細胞である。他の態様において、宿主細胞は、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）細胞、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）細胞、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）細胞、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）細胞、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）細胞、アスペルギルス・フミガータス（Aspergillus fumigates）細胞、アスペルギルス・フェチダス（Aspergillus foetidus）細胞、アスペルギルス・ニディランス（Aspergillus nidulans）細胞、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）細胞、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）細胞、ヒューミコラ・インソレンス（Humicola insolens）細胞、ヒューミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginose）細胞、ロドコッカス・オパクス（Rhodococcus opacus）細胞、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）細胞、またはムコール・ミエヘイ（Mucor michei）細胞である。さらに他の態様において、宿主細胞は、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）細胞またはストレプトミセス・ムリヌス（Streptomyces murinus）細胞である。さらに他の態様において、宿主細胞はアクチノミセス（Actinomycetes）細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞である。他の態様において、宿主細胞は、真核植物、藻類、ラン色細菌、緑色��黄細菌、緑色非硫黄細菌、紅色硫黄細菌、紅色非硫黄細菌、好極限性細菌、酵母、真菌、それらの遺伝子操作された生物、または合成生物に由来する細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、光依存性であるかまたは炭素を固定する。いくつかの態様において、いくつかの態様において、宿主細胞は独立栄養活性を有する。いくつかの態様において、宿主細胞は、光の存在下などにおいて光独立栄養活性を有する。いくつかの態様において、宿主細胞は、光の非存在下において従属栄養性または混合栄養性である。ある態様において、宿主細胞は、アラビドプシス・タリアナ、パニカム・ウィルガツム（Panicum virgatum）、ミスカンサス・ギガンテス（Miscanthus giganteus）、トウモロコシ（Zea mays）、ボツリオコッカス・ブラウニー（Botryococcuse braunii）、クラミドモナス・レインハルディ（Chlamydomonas reinhardtii）、ドナリエナ・サリナ（Dunaliela salina）、シネココッカス属種PCC7002、シネココッカス属種PCC7942、シネコシスティス（Synechocystis）属種PCC 6803、サーモシネココッカス・エロンガタス（Thermosynechococcus elongates）BP-1、クロロビウム・テピダム（Chlorobium tepidum）、クロロフレクサス・オウランティアカス（Chlorojlexus auranticus）、クロマチウム・ビノサム（Chromatiumm vinosum）、ロドスピリラム・ラブラム（Rhodospirillum rubrum）、ロドバクター・カプスラータ（Rhodobacter capsulatus）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palusris）、クロストリジウム・リュングダーリイ（Clostridium ljungdahlii）、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridiumthermocellum）、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、またはザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）に由来する細胞である。
【０１２２】
脂肪酸、アシル-CoA、脂肪アルデヒド、短鎖アルコール、脂肪アルコール、炭化水素（例えば、アルカン、アルケン、または末端オレフィンもしくは内部オレフィンなどのオレフィン）、蝋エステルまたは脂肪酸エステル（例えば、脂肪酸メチルエステル（FAME）または脂肪酸エチルエステル（FAEE））などのエステル、ならびにケトンを非限定的に含む多種多様な脂肪酸誘導体を、本明細書に記載の組換え宿主細胞および菌株改良によって産生させることができる。本開示のいくつかの態様において、ある特定の組成物における脂肪酸誘導体の力価がより高いとは、組換え宿主細胞培養物によって産生されるある特定の種類の脂肪酸誘導体（例えば、脂肪アルコール、脂肪酸エステルまたは炭化水素）の力価が、対応する野生型宿主細胞の対照培養物によって産生される同じ脂肪酸誘導体の力価に比してより高いことをいう。そのような場合に、脂肪酸誘導体組成物は、例えば、種々の鎖長および飽和性または分枝の特性を有する脂肪アルコールの混合物を含みうる。本開示の他の態様において、特定の組成物における脂肪酸誘導体の力価がより高いとは、複数の異なる脂肪酸誘導体の組み合わせ（例えば、脂肪アルデヒドおよびアルコール、または脂肪酸およびエステル）の力価が、対応する野生型宿主細胞の対照培養物によって産生される同じ脂肪酸誘導体の力価に比してより高いことをいう。
【０１２３】
宿主細胞の遺伝子操作
いくつかの態様においては、ポリヌクレオチド（または遺伝子）配列が、ポリヌクレオチド配列と機能的に連結したプロモーターを含む組換えベクターにより、宿主細胞に与えられる。ある態様において、プロモーターは、発生段階調節性の、オルガネラ特異的な、組織特異的な、誘導性の、構成性の、または細胞特異的なプロモーターである。いくつかの態様において、組換えベクターは、ポリヌクレオチド配列と機能的に結びついた発現制御配列；ポリヌクレオチド配列と機能的に結びついた選択マーカー；ポリヌクレオチド配列と機能的に結びついたマーカー配列；ポリヌクレオチド配列と機能的に結びついた精製部分；ポリヌクレオチド配列と機能的に結びついた分泌配列；およびポリヌクレオチド配列と機能的に結びついたターゲティング配列より選択される、少なくとも1つの配列を含む。本明細書に記載の発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列を、宿主細胞における該ポリヌクレオチド配列の発現に適した形態で含む。当業者には、発現ベクターの設計が、形質転換させようとする宿主細胞の選択、および所望のポリペプチドの発現レベルなどの要因に依存しうることが理解されるであろう。上述のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、例えば融合ポリペプチドを産生させるために、本明細書に記載の発現ベクターは宿主細胞に導入することができる（前記）。原核生物、例えば大腸菌（E. coli）におけるポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、融合または非融合ポリペプチドのいずれかの発現を導く構成性または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて実施されることが最も多い。融合ベクターは、その中にコードされているポリペプチド、通常は組換えポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に、いくつかのアミノ酸を付加する。そのような融合ベクターは、典型的には、組換えポリペプチドの発現を増大させること；組換えポリペプチドの溶解性を高めること；および、アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することによって組換えポリペプチドの精製を助けることを含む3つの目的の、1つまたは複数に役立つ。多くの場合、融合発現ベクターでは、融合部分と組換えポリペプチドの接合部にタンパク質分解切断部位が導入されている。これにより、融合ポリペプチドの精製後に、融合部分からの組換えポリペプチドの分離が可能になる。そのような酵素およびそれらのコグネイト認識配列の例には、第Xa因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが含まれる。例示的な融合発現ベクターには、pGEXベクター（Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ；Smith et al. (1988) Gene 67: 31-40）、pMALベクター（New England Biolabs, Beverly, MA）、およびpRITSベクター（Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, N. J.）が含まれ、これらはそれぞれ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、マルトースE結合タンパク質またはプロテインAを標的組換えポリペプチドと融合させるものである。
【０１２４】
誘導性の非融合大腸菌発現ベクターの例には、pTrcベクター（Amann et al. (1988) Gene 69:301-315）およびpET 11dベクター（Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89）が含まれる。pTrcベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドtrp-lac融合プロモーターからの宿主RNAポリメラーゼ転写に依拠する。pET 11dベクターからの標的遺伝子発現は、共発現させたウイルスRNAポリメラーゼ（T7 gn1）によって媒介されるT7 gn10-lac融合プロモーターからの転写に依拠する。このウイルスポリメラーゼは、BL21（DE3）またはHMS174（DE3）などの宿主菌株により、lacUV 5プロモーターの転写制御下にあるT7 gn1遺伝子を保有する常在性λプロファージから供給される。原核細胞および真核細胞の両者に適した発現系は、当技術分野において周知である（例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratoryを参照されたい）。誘導性の非融合大腸菌発現ベクターの例には、pTrcベクター（Amann et al. (1988) Gene, 69: 301-315）およびPET 11dベクター（Studier et al. (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA, pp. 60-89）が含まれる。ある態様において、本開示のポリヌクレオチド配列は、バクテリオファージT5に由来するプロモーターと機能的に連結されている。1つの態様において、宿主細胞は酵母細胞である。この態様において、発現ベクターは酵母発現ベクターである。ベクターは、外来性核酸（例えば、DNA）を宿主細胞に導入するための、当技術分野で認知された種々の手法を介して原核細胞または真核細胞に導入することができる。宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションのために適した方法は、例えば、Sambrook et al.（前記）に見いだすことができる。細菌細胞の安定的な形質転換に関しては、用いる発現ベクターおよび形質転換手法に応じて、特定の割合の細胞が発現ベクターを取り込んで複製することが知られている。これらの形質転換体の同定および選択のために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子を、関心対象の遺伝子とともに宿主細胞に導入することができる。選択マーカーには、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、またはテトラサイクリンなど、ただしこれらには限定されない薬物に対する耐性を付与するものが含まれる。選択マーカーをコードする核酸は、本明細書に記載のポリペプチドをコードするベクターと同一ベクター上で宿主細胞中に導入することができ、または別個のベクター上で導入することもできる。導入された核酸によって安定的に形質転換された細胞は、適切な選択薬の存在下における増殖によって同定することができる。本明細書に記載の、遺伝子操作された宿主細胞または組換え宿主細胞（前記）とは、脂肪酸誘導体組成物を産生させるために用いられる細胞である。本明細書に記載の本開示の任意の局面において、宿主細胞は、真核植物、細菌、藻類、ラン色細菌、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、紅色硫黄細菌、紅色非硫黄細菌、好極限性細菌、酵母、真菌、それらの遺伝子操作された生物、または合成生物より選択することができる。いくつかの態様において、宿主細胞は光依存性であるかまたは炭素を固定する。宿主細胞は独立栄養活性を有する。本明細書に��べるように、さまざまな宿主細胞を、脂肪酸誘導体を産生させるために用いることができる。
【０１２５】
本開示の宿主細胞または微生物には、酵素活性に対する特定の突然変異の効率を検討するための変更を含むように遺伝子操作された宿主菌株または宿主細胞（すなわち、組換え細胞または微生物）が含まれる。どの生来の酵素経路が元の宿主細胞に存在しているかに応じて、さまざまな任意選択的な遺伝的操作および変更を、1つの宿主細胞から別のものまでに互換的に用いることができる。1つの態様において、宿主菌株は、他の生合成ポリペプチド（例えば、酵素）と組み合わせてACPポリペプチドの発現を検討するために用いることができる。宿主菌株は、発酵の構成成分、炭素源（例えば、原料）、温度、圧力、培養物混入低減条件（reduced culture contamination condition）および酸素レベルを含む培養条件を非限定的に含む、具体的な変数を検討するためのいくつかの遺伝的変更を含みうる。
【０１２６】
1つの態様において、宿主菌株は、任意でfadEおよびfhuAの欠失を含む。アシル-CoAデヒドロゲナーゼ（FadE）は、脂肪酸を代謝するために重要な酵素である。これは、脂肪酸（アシル-CoA）の長鎖を分解してアセチル-CoA分子にする過程である、脂肪酸利用における第2の段階（β-酸化）を触媒する。より詳細には、細菌における脂肪酸分解のβ-酸化サイクルの第2の段階はアシル-CoAの2-エノイル-CoAへの酸化であり、これはFadEによって触媒される。大腸菌がFadEを欠いていると、それは脂肪酸を炭素源として増殖することができないが、酢酸塩によって増殖することはできる。あらゆる鎖長の脂肪酸を利用できないことは、fadE菌株、すなわち、FadE機能が破壊されているfadE突然変異体株について報告されている表現型とも合致している。fadE遺伝子を任意選択的にノックアウトまたは減弱させることができ、それにより、脂肪酸誘導体経路の中間体と考えられるアシル-CoAが、細胞内に蓄積して、その結果、すべてのアシル-CoAが脂肪酸誘導体へと効率的に変換されうることを確かめることができる。しかし、糖が炭素源として用いられる場合にはfadEの減弱化は任意選択的であり、これは、そのような条件下ではFadEの発現が抑制される可能性が高く、そのためFadEが少量でしか存在せず、エステルシンターゼまたはアシル-CoAを基質とする他の酵素と効率的に競合しないと考えられるためである。FadEは異化代謝産物抑制が原因となって抑制される。大腸菌および他の多くの微生物は脂肪酸よりも糖を消費することを選好するため、両方の供給源が利用可能である場合には、fadレギュロンを抑制することによって糖がまず消費される（D. Clark, J Bacteriol. (1981) 148(2):521-6)を参照）。その上で、糖の欠如によってFadE発現が誘導される。fadレギュロン（FadEを含む）によって発現されるタンパク質がアップレギュレートされ、アシル-CoAと効率的に競合すると考えられるため、β酸化経路に向かうアシル-CoA中間体は失われる可能性がある。したがって、fadE遺伝子をノックアウトまたは減弱させることが有益となりうる。ほとんどの炭素源は主として糖を基にしているため、FadEを減弱させることは任意選択的である。遺伝子fhuAは、大腸菌の外膜にあるエネルギー共役輸送体・受容体であるTonAタンパク質をコードする（V. Braun (2009) J Bacteriol. 191(11):3431-3436）。その欠失は任意選択的である。fhuA欠失により、細胞をファージ攻撃に対してより抵抗性にすることができ、これはある特定の発酵条件では有益となる可能性がある。したがって、発酵ラン中に混入が起こる可能性が低い宿主細胞では、fhuAを欠失させることが望ましいと考えられる。
【０１２７】
もう1つの態様において、宿主菌株（前記）はまた、fadR、fabA、fabD、fabG、fabH、fabVおよび／またはfabFを含む、以下の遺伝子のうち1つまたは複数の任意選択的な過剰発現も含む。そのような遺伝子の例には、大腸菌由来のfadR、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）由来のfabA（NP_460041）、ネズミチフス菌由来のfabD（NP_460164）、ネズミチフス菌由来のfabG（NP_460165）、ネズミチフス菌由来のfabH（NP_460163）、コレラ菌（Vibrio cholera）由来のfabV（YP_001217283）、およびクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）由来のfabF（NP_350156）がある。脂肪酸生合成における酵素および調節因子をコードする、これらの遺伝子のうち1つまたは複数の過剰発現を、脂肪酸誘導体化合物の力価をさまざまな培養条件下で増大させるために役立てることができる。
【０１２８】
もう1つの態様においては、脂肪酸誘導体の生産のための宿主細胞として大腸菌株が用いられる。同様に、これらの宿主細胞も、fadR、fabA、fabD、fabG、fabH、fabVおよび／またはfabFを非限定的に含む、脂肪酸誘導体（例えば、脂肪酸、脂肪エステル、脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、炭化水素、その他）などの脂肪酸誘導体化合物の力価をさまざまな培養条件下でさらに増大させるかまたは強化することのできる、1つまたは複数の生合成遺伝子（すなわち、脂肪酸生合成の酵素および調節因子をコードする遺伝子）の任意選択的な過剰発現を提供する。遺伝的変更の例には、大腸菌由来のfadR、ネズミチフス菌由来のfabA（NP_460041）、ネズミチフス菌由来のfabD（NP_460164）、ネズミチフス菌由来のfabG（NP_460165）、ネズミチフス菌由来のfabH（NP_460163）、コレラ菌由来のfabV（YP_001217283）、およびクロストリジウム・アセトブチリカム由来のfabF（NP_350156）が含まれる。いくつかの態様においては、さまざまな培養条件下での脂肪酸誘導体過剰発現を検討する目的および／または脂肪酸誘導体産生をさらに強化する目的で、これらの生合成遺伝子を保有する合成オペロンを遺伝子操作により作製して、細胞において発現させることができる。そのような合成オペロンは、1つまたは複数の生合成遺伝子を含む。例えば、ifab138オペロンは、特定の培養条件について検討する目的で脂肪酸誘導体の過剰発現を促進するために用いることのできる、コレラ菌由来のfabV、ネズミチフス菌由来のfabH、ネズミチフス菌由来のfabD、ネズミチフス菌由来のfabG、ネズミチフス菌由来のfabAおよび／またはクロストリジウム・アセトブチリカム由来のfabFを含む任意選択的な脂肪酸生合成遺伝子を含む、遺伝子操作により作製されたオペロンである。そのような合成オペロンの1つの利点は、脂肪酸誘導体産生の速度をさらに高めることができるかまたは増強できることである。
【０１２９】
いくつかの態様において、ACPおよび他の生合成酵素（例えば、TE、ES、CAR、AAR、ADC、その他）を発現させるために用いられる宿主細胞または微生物は、脂肪エステル、脂肪アルコール、脂肪アミン、脂肪アルデヒド、二官能性脂肪酸誘導体、二酸（diacid）などの1つまたは複数の特定の脂肪酸誘導体の産生を増加させることのできる、ある特定の酵素活性を含む遺伝子をさらに発現すると考えられる。1つの態様において、宿主細胞は、遺伝子を過剰発現させることによって増加させることのできる、脂肪酸の生産のためのチオエステラーゼ活性（E.C. 3.1.2.*またはE.C. 3.1. 2.14またはE.C. 3.1.1.5）を有する。もう1つの態様において、宿主細胞は、脂肪エステルの生産のためのエステルシンターゼ活性（E.C. 2.3.1.75）を有する。もう1つの態様において、宿主細胞は、脂肪アルコールの生産のための、アシル-ACPレダクターゼ（AAR）（E.C. 1.2.1.80）活性および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ活性（E.C. 1.1.1.1.）および／または脂肪アルコールアシル-CoAレダクターゼ（FAR）（E.C. 1.1.1.*）活性および／またはカルボン酸レダクターゼ（CAR）（EC 1.2.99.6）活性を有する。もう1つの態様において、宿主細胞は、脂肪アルデヒドの生産のためのアシル-ACPレダクターゼ（AAR）（E.C. 1.2.1.80）活性を有する。もう1つの態様において、宿主細胞は、アルカンおよびアルケンの生産のためのアシル-ACPレダクターゼ（AAR）（E.C. 1.2.1.80）活性およびデカルボニラーゼ（ADC）活性を有する。もう1つの態様において、宿主細胞は、脂肪アルコールの生産のための、アシル-CoAレダクターゼ（E.C. 1.2.1.50）活性、アシル-CoAシンターゼ（FadD）（E.C. 2.3.1.86）活性およびチオエステラーゼ（E.C. 3.1.2.*またはE.C. 3.1. 2.14またはE.C. 3.1.1.5）活性を有する。もう1つの態様において、宿主細胞は、脂肪エステルの生産のための、エステルシンターゼ活性（E.C. 2.3.1.75）、アシル-CoAシンターゼ（FadD）（E.C. 2.3.1.86）活性およびチオエステラーゼ（E.C. 3.1.2.*またはE.C. 3.1. 2.14またはE.C. 3.1.1.5）活性を有する。もう1つの態様において、宿主細胞はケトンの生産のためのOleA活性を有する。もう1つの態様において、宿主細胞は、内部オレフィンの生産のためのOleBCD活性を有する。もう1つの態様において、宿主細胞は、脂肪アルコールの生産のためのアシル-ACPレダクターゼ（AAR）（E.C. 1.2.1.80）活性およびアルコールデヒドロゲナーゼ活性（E.C. 1.1.1.1.）を有する。もう1つの態様において、宿主細胞は、末端オレフィンの生成のためのチオエステラーゼ（E.C. 3.1.2.*またはE.C. 3.1. 2.14またはE.C. 3.1.1.5）活性およびデカルボキシラーゼ活性を有する。微生物および微生物細胞における酵素活性の発現は、米国特許第8,097,439号；第8,110,093号；第8,110,670号；第8,183,028号；第8,268,599号；第8,283,143号；第8,232,924号；第8,372,610号；および第8,530,221号に教示されており、それらは参照により本明細書に組み入れられる。他の態様において、ACPおよび他の生合成酵素を発現させるために用いられる宿主細胞または微生物は、脂肪酸誘導体などの1つまたは複数の特定の脂肪酸誘導体を生産する目的でアップレギュレートまたは過剰発現される、ある特定の生来の酵素活性を含むと考えられる。1つの態様において、宿主細胞は、チオエステラーゼ遺伝子を過剰発現させることによって増加させることのできる脂肪酸の生産のため���生来のチオエステラーゼ（E.C. 3.1.2.*またはE.C. 3.1. 2.14またはE.C. 3.1.1.5）活性を有する。
【０１３０】
本開示は、ACPおよび他の生合成酵素（前記）をコードする遺伝子を発現する宿主菌株または微生物を含む。組換え宿主細胞は、脂肪酸誘導体、ならびにそれらの組成物および配合物を産生する。脂肪酸誘導体は典型的には、培養培地から回収される、および／または宿主細胞から単離される。1つの態様において、脂肪酸誘導体は培養培地から回収される（細胞外）。もう1つの態様において、脂肪酸誘導体は宿主細胞から単離される（細胞内）。もう1つの態様において、脂肪酸誘導体は培養培地から回収され、かつ宿主細胞から単離される。宿主細胞によって産生された脂肪酸誘導体組成物は、特定の脂肪酸誘導体の分布、ならびに脂肪酸誘導体組成物の構成成分の鎖長および飽和度を決定する目的で、当技術分野において公知の方法、例えばGC-FIDを用いて分析することができる。
【０１３１】
微生物（例えば、微生物細胞）として機能する宿主細胞の例には、エシェリキア属（Escherichia）、バチルス属（Bacillus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ザイモモナス属（Zymomonas）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、アスペルギルス属（Aspergillus）、トリコデルマ属（Trichoderma）、ニューロスポラ属（Neurospora）、フザリウム属（Fusarium）、ヒューミコーラ属（Humicola）、リゾムコール属（Rhizomucor）、クリベロミセス属（Kluyveromyces）、ピキア属（Pichia）、ムコール属（Mucor）、ミセリオフトラ属（Myceliophtora）、ペニシリウム属（Penicillium）、ファネロカエテ属（Phanerochaete）、プレウロタス属（Pleurotus）、トラメテス属（Trametes）、クリソスポリウム属（Chrysosporium）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、ステノトロホモナス属（Stenotrophamonas）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、ヤロウイア属（Yarrowia）、またはストレプトミセス属（Streptomyces）に由来する細胞が非限定的に含まれる。いくつかの態様において、宿主細胞はグラム陽性細菌細胞である。他の態様において、宿主細胞はグラム陰性細菌細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は大腸菌細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は大腸菌B細胞、大腸菌C細胞、大腸菌K細胞、または大腸菌W細胞である。他の態様において、他の態様において、宿主細胞は、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）細胞、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）細胞、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）細胞、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus lichenoformis）細胞、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus）細胞、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）細胞、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）細胞、バチルス・プミルス（Bacillus pumilis）細胞、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）細胞、バチルス・クラウジ（Bacillus clausii）細胞、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）細胞、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）細胞、またはバチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）細胞である。さらに他の態様において、宿主細胞は、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）細胞、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）細胞、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）細胞、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）細胞、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）細胞、アスペルギルス・フミガータス（Aspergillus fumigates）細胞、アスペルギルス・フェチダス（Aspergillus foetidus）細胞、アスペルギルス・ニディランス（Aspergillus nidulans）細胞、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）細胞、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）細胞、ヒューミコラ・インソレンス（Humicola insolens）細胞、ヒューミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginose）細胞、ロドコッカス・オパクス（Rhodococcus opacus）細胞、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）細胞、またはムコール・ミエヘイ（Mucor michei）細胞である。さらに他の態様において、宿主細胞は、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）細胞またはストレプトミセス・ムリヌス（Streptomyces murinus）細胞である。さらに他の態様において、宿主細胞はアクチノミセス（Actinomycetes）細胞である。いくつかの��様において、宿主細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞である。他の態様において、宿主細胞は、真核植物、藻類、ラン色細菌、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、紅色硫黄細菌、紅色非硫黄細菌、好極限性細菌、酵母、真菌、それらの遺伝子操作された生物、または合成生物に由来する細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、光依存性であるかまたは炭素を固定する。いくつかの態様において、宿主細胞は独立栄養活性を有する。いくつかの態様において、宿主細胞は、光の存在下などにおいて光独立栄養活性を有する。いくつかの態様において、宿主細胞は、光の非存在下において従属栄養性または混合栄養性である。ある態様において、宿主細胞は、アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）、パニカム・ウィルガツム（Panicum virgatum）、ミスカンサス・ギガンテス（Miscanthus giganteus）、トウモロコシ（Zea mays）、ボツリオコッカス・ブラウニー（Botryococcuse braunii）、クラミドモナス・レインハルディ（Chlamydomonas reinhardtii）、ドナリエナ・サリナ（Dunaliela salina）、シネココッカス（Synechococcus）属種PCC 7002、シネココッカス属種PCC 7942、シネコシスティス（Synechocystis）属種PCC 6803、サーモシネココッカス・エロンガタス（Thermosynechococcus elongates）BP-1、クロロビウム・テピダム（Chlorobium tepidum）、クロロフレクサス・オウランティアカス（Chlorojlexus auranticus）、クロマチウム・ビノサム（Chromatiumm vinosum）、ロドスピリラム・ラブラム（Rhodospirillum rubrum）、ロドバクター・カプスラータ（Rhodobacter capsulatus）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palusris）、クロストリジウム・リュングダーリイ（Clostridium ljungdahlii）、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、またはザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）に由来する細胞である。1つの特定の態様において、微生物細胞は、プロクロロコッカス属（Prochlorococcus）、シネココッカス属、シネコシスティス属、シアノセイス属（Cyanothece）、およびノストック・パンクチフォルメ（Nostoc punctiforme）を非限定的に含むシアノバクテリアに由来する。もう1つの態様において、微生物細胞は、シネココッカス・エロンガタスPCC7942、シネコシスティス属種PCC6803、およびシネココッカス属種PCC7001を非限定的に含む、特定のシアノバクテリウム種に由来する。
【０１３２】
組換え宿主細胞および発酵
本明細書で用いる場合、発酵という用語は、組換え宿主細胞の培養物を炭素源を含む培地中で繁殖させることによる、宿主細胞による有機材料の標的物質への変換、例えば、組換え宿主細胞による炭素源の脂肪酸またはその誘導体への変換を広く指す。産生を許容する条件とは、宿主細胞が所望の生成物、例えば脂肪酸または脂肪酸誘導体を産生することを可能にする、あらゆる条件を指す。同様に、ベクターのポリヌクレオチド配列が発現される1つまたは複数の条件とは、宿主細胞がポリペプチドを合成することを可能にする、あらゆる条件を意味する。適した条件には、例えば、発酵条件が含まれる。発酵条件は、温度範囲、通気レベル、供給速度および培地組成を非限定的に含む多くのパラメーターを含みうる。これらの条件のそれぞれは、個々に、または組み合わされて、宿主細胞が増殖することを可能にする。発酵は、好気性、嫌気性、またはそれらの変形物（微好気性など）であってよい。例示的な培養培地には、ブロスまたはゲルが含まれる。一般に、培地は、宿主細胞によって直接代謝されうる炭素源を含む。加えて、炭素源の動態化（例えば、デンプンまたはセルロースの発酵性糖への解重合）およびその後の代謝を促進するために、培地中に酵素を用いることもできる。
【０１３３】
小規模産生のためには、遺伝子操作された宿主細胞を、例えば約100μL、200μL、300μL、400μL、500μL、1mL、5 mL、10 mL、15 mL、25 mL、50 mL、75 mL、100mL、500mL、1L、2L、5Lまたは10Lバッチ中で増殖させ、発酵させて、所望のポリヌクレオチド配列、例えばACPおよび／または生合成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現するように誘導することができる。大規模産生のためには、遺伝子操作された宿主細胞を、約10L、100L、1000L、10,000L、100,000L、および1,000,000Lまたはそれ以上のバッチ中で増殖させ、発酵させて、所望のポリヌクレオチド配列を発現するように誘導することができる。または、大規模流加発酵を実施することもできる。本明細書に記載の脂肪酸誘導体組成物は、組換え宿主細胞培養物の細胞外環境で見出され、培養培地から容易に単離することができる。脂肪酸誘導体は組換え宿主細胞によって分泌され、組換え宿主細胞培養物の細胞外環境に輸送されるか、または細胞外環境に受動的に移行する。脂肪酸誘導体は、当技術分野において公知の慣行的な方法を用いて、組換え宿主細胞培養物から単離される。
【０１３４】
組換え宿主細胞由来の生成物
本明細書で用いる場合、現代炭素分率すなわちfMという用語は、米国国立標準技術研究所（National Institute of Standards and Technology（NIST））標準物質（Standard Reference Material（SRM））4990Bおよび4990C、それぞれシュウ酸標準品HOxIおよびHOxIIとして知られるもの、によって定義されるものと同じ意味を有する。基本的定義はHOxIの14C／12C同位体比の0.95倍に相当する（西暦1950年を基準とする）。これは、減衰補正された産業革命前の木とおおむね等しい。現在の生体生物圏（植物材料）については、fMはおよそ1.1である。バイオ生成物（bioproduct）（例えば、本開示に従って産生された脂肪酸誘導体）は、生物的に産生された有機化合物を含む。特に、本明細書における脂肪酸生合成経路を用いて産生された脂肪酸誘導体は、これまで再生可能資源から産生されたことはなく、したがって新規な組成物である。これらの新たなバイオ生成物は、石油化学炭素由来の有機化合物とは、二核種炭素同位体フィンガープリント法（dual carbon-isotopic fingerprinting）または14C年代測定法（14C dating）に基づいて区別することができる。さらに、生物起源炭素の具体的な供給源（例えば、グルコースとグリセロールとの対比）を、二核種炭素同位体フィンガープリント法によって決定することもできる（例えば、米国特許第7,169,588号を参照されたい）。バイオ生成物を石油ベースの有機化合物と区別しうることは、これらの材料の流通下でのトラッキングに有益である。例えば、生物学に基づく炭素同位体プロファイルと石油ベースの炭素同位体プロファイルの両方を含む有機化合物または化学物質は、石油ベースの材料だけでできた有機化合物および化学物質と区別することができる。それ故に、本明細書におけるバイオ生成物は、そのユニークな炭素同位体プロファイルに基づいて、流通下で追跡またはトラッキングすることができる。バイオ生成物は、各試料中の安定炭素同位体比（13C／12C）を比較することによって、石油ベースの有機化合物と区別することができる。所与のバイオ生成物における13C／12C比は、二酸化炭素が固定された時点の大気中の二酸化炭素における13C／12C比の結果である。それはまた、厳密な代謝経路も反映する。地域的変動も起こる。石油、C3植物（広葉植物）、C4植物（イネ科草本）、および海洋炭酸塩はすべて、13C／12Cおよび対応するδ13C値の点で有意差を示す。さらに、C3植物およびC4植物の脂質物質は、代謝経路の結果として、同じ植物の炭水化物成分から誘導される材料とは異なる分析結果を示す。測定精度内で、13Cは同位体分別効果に起因する大きな変動を示し、バイオ生成物に関して最も重要なのは光合成機構である。植物における炭素同位体比の違いの主因は、植物における光合成炭素代謝の経路の違い、特に一次カルボキシル化（すなわち、大気CO2の初期固定）時に起こる反応の違いと密接に関連している。草木の二大クラスは、C3（またはカルビン・ベンソン）光合成回路が組み込まれているものと、C4（またはハッチ・スラック）光合成回路が組み込まれているものである。C3植物では、一次CO2固定またはカルボキシル化反応にリブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ酵素が関与し、最初の安定生成物は3-炭素化合物である。広葉樹および針葉樹などのC3植物は、温帯気候帯において優勢である。C4植物では、もう1つの酵素であるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが関与するさらなるカルボキシル化反応が、一次カルボキシル化反応である。最初の安定炭素化合物は4-炭素酸であり、それが後に脱炭酸される。そのようにして放出されたCO2は、C3回路によって再び固定される。C4植物の例には、暖地型牧草、トウモロコシ、およびサトウキビがある。C4植物およびC3植物はいずれも、ある範囲の13C／12C同位体比を示すが、典型的な値は、C4植物については約-7〜約-13パーミル、C3植物については約-19〜約-27パーミルである（例えば、Stuiver et al. (1977) Radiocarbon 19:355を参照されたい）。石炭および石油は一般に後者の範囲に含まれる。13C測定尺度は、元はピーディー（Pee Dee）ベレムナイト（PDB）石灰石によって設定されたゼロ点によって定義されたものであり、ここでの値は、この材料からの千分の一偏位（parts per thousand deviations）で与えられる。δ13C値は、千分率（パーミル）で表されて‰と略記され、以下のように計算される。
δ13C（‰）＝[(13C／12C)試料-(13C／12C)標準物質]／(13C／12C)標準物質×1000
【０１３５】
PDB標準物質（reference material；RM）が枯渇したことから、IAEA、USGS、NIST、および他の選ばれた国際的同位体研究所の協同で、一連の代替RMが開発されている。PDBからのパーミル偏位の表記がδ13Cである。測定は、CO2に対して、高精度安定同位体比質量分析（high precision stable ratio mass spectrometry）（IRMS）により、質量44、45および46の分子イオンに関して行われる。本明細書に記載の組成物は、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生されたバイオ生成物を含み、これには例えば、脂肪酸誘導体生成物が含まれる。具体的には、バイオ生成物は、約-28もしくはそれ以上、約-27もしくはそれ以上、-20もしくはそれ以上、-18もしくはそれ以上、-15もしくはそれ以上、-13もしくはそれ以上、-10もしくはそれ以上、または-8もしくはそれ以上のδ13Cを有することができる。例えば、バイオ生成物は、約-30〜約-15、約-27〜約-19、約-25〜約-21、約-15〜約-5、約-13〜約-7、または約-13〜約-10のδ13Cを有することができる。別の場合には、バイオ生成物は、約-10、-11、-12、または-12.3のδ13Cを有することができる。本明細書における本開示に従って産生されたバイオ生成物は、各化合物における14Cの量を比較することによって、石油ベースの有機化合物と区別することもできる。14Cは5730年という核半減期を有するので、古い（older）炭素を含有する石油ベース燃料を、新しい（newer）炭素を含有するバイオ生成物と区別することができる（例えば、Currie, Source Apportionment of Atmospheric Particles, Characterization of Environmental Particles, J. Buffle and H. P. van Leeuwen, Eds., 1 of Vol.I of the IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series (Lewis Publishers, Inc.) 3-74, (1992)を参照されたい）。放射性炭素年代測定法における基本的仮定は、大気中の14C濃度の不変性が生体における14Cの不変性をもたらすというものである。しかし、1950年以降の大気圏内核実験および1850年以降の化石燃料の燃焼により、14Cはもう1つの地球化学的時間特性（geochemical time characteristic）を獲得した。大気CO2における（したがって生体生物圏（living biosphere）における）その濃度は、1960年代中頃の核実験のピーク時にはおよそ2倍になった。それ以後は、7〜10年というおよその緩和「半減期」で、約1.2×10-12という定常状態宇宙線起源（大気）ベースライン同位対比（14C／12C）へと徐々に戻りつつある。この後者の半減期は文字通りに解釈してはならない；そうではなくて、核時代の幕開け以降の大気および生物圏14Cの変動を追跡するには、詳細な大気核投入／減衰関数（atomospheric nuclear input/decay function）を用いなければならない。近年の生物圏炭素の年代測定（annual dating）に裏づけを与えるのは、この後者の生物圏14C時間特性である。14Cは加速器質量分析（AMS）によって測定することができ、その結果は現代炭素分率（fM）という単位で与えられる。fMは、米国国立標準技術研究所（National Institute of Standards and Technology（NIST））標準物質（Standard Reference Material（SRM））4990Bおよび4990Cによって定義される。本明細書で用いる場合、現代炭素分率すなわちfMは、米国国立標準技術研究所（NIST）標準物質（SRM）4990Bおよび4990C、それぞれシュウ酸標準品HOxIおよびHOxIIとして知られるものによって定義されるのと同じ意味を有する。基本的定義はHOxIの14C／12C同位体比の0.95倍に相当する（西暦1950年を基準とする）。これは、減衰補正された産業革���前の木にほぼ等しい。現在の生体生物圏（植物材料）については、fMはおよそ1.1である。本明細書に記載の組成物は、少なくとも約1のfM 14Cを有しうるバイオ生成物を含む。例えば、バイオ生成物は、少なくとも約1.01のfM 14C、約1〜約1.5のfM 14C、約1.04〜約1.18のfM 14C、または約1.111〜約1.124のfM 14Cを有しうる。
【０１３６】
14Cのもう1つの測定値は、現代炭素パーセント（percent of modern carbon）（pMC）として知られている。14C年代値を用いる考古学者または地質学者にとっては、西暦1950年が0年前（zero years old）に相当する。これはまた、100pMCも表す。熱核兵器のピークであった1963年に、大気中の爆弾由来炭素（bomb carbon）は、正常レベルのほぼ2倍に達した。その出現以降、大気圏内でのその分布は概算されており、西暦1950年以降に生きる植物および動物については100pMCを上回る値を示す。これは時間の経過とともに徐々に減少しており、現在の値は107.5pMC付近である。これは、トウモロコシなどの新鮮なバイオマス材料が107.5pMCに近い14C特性を与えると考えられることを意味する。石油ベースの化合物はpMC値がゼロであると考えられる。化石炭素を現代炭素と混合すると、現代pMC含有量の希釈が起こることになる。107.5pMCが現代バイオマス材料の14C含有量を表し、0pMCが石油ベース生成物の14C含有量を表すと仮定すると、その材料について測定されるpMC値は、この2種類の構成成分の比率を反映することになる。例えば、現代の大豆に100％由来する材料は、107.5pMCに近い放射性炭素特性を与えると考えられる。この材料を石油ベース生成物で50％希釈したとすると、放射性炭素特性は約54pMCになると考えられる。生物学に基づく炭素含有量は、100％を107.5pMCに割り当て、0％を0pMCに割り当てることによって導き出される。例えば、99pMCと測定される試料は、93％の生物学に基づく炭素含有量換算値を与えることになる。この値は、生物学に基づく炭素結果平均値と呼ばれ、分析される材料内のすべての構成成分が現代生物材料または石油ベース材料のいずれかに由来すると仮定している。本明細書に述べたような1つまたは複数の脂肪酸誘導体を含むバイオ生成物は、少なくとも約50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100のpMCを有することができる。別の場合には、本明細書に記載の脂肪酸誘導体は、約50〜約100；約60〜約100；約70〜約100；約80〜約100；約85〜約100；約87〜約98；または約90〜約95のpMCを有することができる。さらに別の場合には、本明細書に記載の脂肪酸誘導体は、約90、91、92、93、94、または94.2のpMCを有することができる。
【０１３７】
組換え宿主細胞によって産生された脂肪酸誘導体組成物のスクリーニング
条件が発現を可能とするのに十分であるかを判定するために、宿主細胞を、例えば、約4、8、12、24、36または48時間にわたって培養することができる。培養中および／または培養後に、試料を集菌して分析し、該条件が発現を可能にするかを判定することができる。例えば、試料中の宿主細胞または宿主細胞を増殖させた培地を、所望の生成物の存在について調べることができる。ある生成物の存在について調べる場合には、TLC、HPLC、GC/FID、GC/MS、LC/MS、MSなどの、ただしこれらには限定されないアッセイを用いることができる。総脂肪酸種（FAS）に関しては、GC/FIDアッセイを用いて、96ウェルプレートレベルで、1リットル、5リットルのタンクレベルで、ならびに1000Lパイロットプラントスケールで、組換え宿主細胞培養物をスクリーニングする。
【０１３８】
脂肪アルコール産生に対するACPの増加の影響
組換え宿主細胞を、ACP（例えば、シアノバクテリアACP、下記の表3参照）を過剰発現するように遺伝子操作することができる。いくつかの態様において、組換え宿主細胞を、1つまたは複数の脂肪酸生合成ポリペプチド、例えば、チオエステラーゼ（TE）活性を有するポリペプチドおよびカルボン酸レダクターゼ（CAR）活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むようにさらに遺伝子操作してもよく、ここで組換え宿主細胞は脂肪アルデヒドおよび／または脂肪アルコールを合成する。他の態様において、組換え宿主細胞は、TE活性、CAR活性およびアルコールデヒドロゲナーゼ活性をコードするポリヌクレオチド配列を含むようにさらに遺伝子操作され、ここで組換え宿主細胞は脂肪アルコールを合成する。さらに他の態様において、組換え宿主細胞は、アシル-ACPレダクターゼ（AAR）活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むように遺伝子操作され、ここで組換え宿主細胞は脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールを合成する；または、AAR活性およびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むように遺伝子操作され、ここで組換え宿主細胞は脂肪アルコールを合成する。場合によっては、組換え宿主細胞は、脂肪アルコール生成性アシル-CoAレダクターゼ（FAR）活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むように遺伝子操作され、ここで組換え宿主細胞は脂肪アルコールを合成する。シアノバクテリアACP（下記の表3参照）をコードする核酸配列の過剰発現は、脂肪アルコールの力価および収量を改善することが示された（下記の実施例1および図8を参照）。
【０１３９】
脂肪エステル産生に対するACPの増加の影響
組換え宿主細胞を、ACP（例えば、M.アクアエオレイVT8 ACP（SEQ ID NO：122、NCBI：YP_959135.1）を過剰発現するように、遺伝子操作することができる。いくつかの態様において、組換え宿主細胞を、1つまたは複数の脂肪酸生合成ポリペプチド、例えば、エステルシンターゼ（ES）活性を有するポリペプチド；またはチオエステラーゼ（TE）活性、アシル-CoAシンターゼ／シンテターゼ（fadD）活性およびエステルシンターゼ活性を有する1つもしくは複数のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むようにさらに遺伝子操作してもよく、ここで組換え宿主細胞は脂肪エステル（例えば、FAME、FAEE）を合成する。いくつかの態様において、組換え宿主細胞を、エステルシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むように遺伝子操作してもよく、ここで組換え宿主細胞は脂肪エステルを合成する（一酵素系、図5参照）；またはチオエステラーゼ活性、アシル-CoAシンターゼ活性およびエステルシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むように遺伝子操作してもよく、ここで組換え宿主細胞は脂肪エステルを合成する（三酵素系、図5参照）。M.アクアエオレイVT8 ACP（SEQ ID NO：122、NCBI：YP_959135.1）をコードする核酸配列の過剰発現は、脂肪アシルメチルエステル（FAME）の力価および収量を改善することが示された（下記の実施例2および3ならびに図9〜15を参照）。
【０１４０】
炭化水素産生に対するACPの増加の影響
組換え宿主細胞を、ACP（例えば、シアノバクテリアACP、下記の表3参照）を過剰発現するように遺伝子操作することができる。いくつかの態様において、組換え宿主細胞を、1つまたは複数の脂肪酸生合成ポリペプチド、例えば、アシル-ACPレダクターゼ（AAR）活性を有するポリペプチドおよびデカルボニラーゼ（ADC）活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むようにさらに遺伝子操作してもよく、ここで組換え宿主細胞はアルカンを合成する。シアノバクテリアACP（下記の表3参照）をコードする核酸配列の過剰発現は、アルカンの力価および収量を改善することが示された（下記の実施例4参照）。
【０１４１】
いくつかの態様において、アルカンはC3〜C25アルカンである。例えば、アルカンは、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25またはC26アルカンである。いくつかの態様において、アルカンはトリデカン、メチルトリデカン、ノナデカン、メチルノナデカン、ヘプタデカン、メチルヘプタデカン、ペンタデカン、またはメチルペンタデカンである。アルカンは、直鎖アルカン、分枝鎖アルカン、または環状アルカンであってよい。ある態様において、本方法は、宿主細胞を飽和脂肪酸誘導体の存在下で培養する段階をさらに含み、産生される炭化水素はアルカンまたはアルケンである。ある態様において、飽和脂肪酸誘導体はC6〜C26脂肪酸誘導体基質である。特定の態様において、脂肪酸誘導体基質は、2-メチルイコサナール、イコサナール、オクタデカナール、テトラデカナール、2-メチルオクタデカナール、ステアリンアルデヒド、またはパルミチンアルデヒドである。いくつかの態様において、本方法は、宿主細胞から、または培養培地からアルカンを単離する段階をさらに含む。他の態様において、本方法は、アルカンを分解または精製する段階をさらに含む。
【０１４２】
他の態様において、産生される炭化水素はアルケンである。いくつかの態様において、アルケンはC3〜C25アルケンである。例えば、アルケンは、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25またはC26アルケンである。いくつかの態様において、アルケンはペンタデセン、ヘプタデセン、メチルペンタデセン、またはメチルヘプタデセンである。アルケンは、直鎖アルケン、分枝鎖アルケン、または環状アルケンであってよい。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、アシル-CoAレダクターゼ（AAR）活性およびアルデヒドデカルボニラーゼ（ADC）活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むように遺伝子操作され、ここで組換え宿主細胞は炭化水素（アルカンおよびアルケン）を合成する。他の態様において、組換え宿主細胞は、チオエステラーゼ活性、カルボン酸レダクターゼ活性およびアルデヒドデカルボニラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むように遺伝子操作され、ここで組換え宿主細胞は炭化水素（アルカンおよびアルケン）を合成する。さらに他の態様において、組換え宿主細胞は、アシル-CoAレダクターゼ活性およびOleA活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むように遺伝子操作され、ここで組換え宿主細胞は脂肪族ケトンを合成する；OleABCD活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むように遺伝子操作され、ここで組換え宿主細胞は内部オレフィンを合成する；または、チオエステラーゼ活性およびデカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むように遺伝子操作され、ここで組換え宿主細胞は末端オレフィンを合成する。
【０１４３】
脂肪酸誘導体組成物およびその使用
脂肪酸は、長い脂肪族尾部（鎖）を有するカルボン酸であり、これは飽和性または不飽和性のいずれかである。天然に存在するほとんどの脂肪酸は、4〜28個の偶数の炭素原子の鎖を有する。脂肪酸は通常、トリグリセリドに由来する。それらに他の分子が結びついていない場合、それらは遊離脂肪酸として知られる。脂肪酸は通常、工業的には、トリグリセリドの加水分解により、グリセロールが除去されて製造される。現在は、ヤシ油、ダイズ油、ナタネ油、ココナッツ油およびヒマワリ油などが、脂肪酸の最も一般的な供給源である。そのような供給源に由来する脂肪酸の大半は、ヒトの食品に用いられる。ココナッツ油およびパーム核油（主として炭素12個および14個の脂肪酸からできている）。これらは、洗浄剤およびクレンジング剤ならびに化粧品用の界面活性剤としてさらに加工するのに特に適する。ヤシ油、ダイズ油、ナタネ油およびヒマワリ油、さらには獣脂などの動物性脂肪は、主として長鎖脂肪酸（例えば、C18、飽和および不飽和）を含有し、それらはポリマー用途および潤滑剤のための原料として用いられる。生態学的および毒物学的研究により、再生可能資源をベースとする脂肪酸由来生成物は石油化学品ベースの物質よりも好適な特性を有することが示唆されている。
【０１４４】
脂肪アルデヒドは、多くの特殊化学物質を産生するために用いられる。例えば、アルデヒドは、ポリマー、樹脂（例えば、BAKELITE樹脂）、染料、香味剤、可塑剤、香料、医薬品および他の化学物質を産生するために用いられ、溶媒、保存料、または消毒薬として用いられるものもある。加えて、ビタミンおよびホルモンなどのある種の天然化合物および合成化合物はアルデヒドであり、多くの糖類はアルデヒド基を含有する。脂肪アルデヒドは、化学的または酵素的還元によって脂肪アルコールに変換することができる。
【０１４５】
脂肪アルコールは多くの商業用途を有する。全世界での脂肪アルコールおよびその誘導体の年間売上高は10億米ドルを超える。短鎖（shorter chain）脂肪アルコールは、化粧品産業および食品産業において、乳化剤、軟化剤、および増粘剤として用いられる。脂肪アルコールは、その両親媒性ゆえに、パーソナルケア用品および家事用品、例えば洗剤などに役立つ非イオン界面活性剤として作用する。また、脂肪アルコールは、蝋、ゴム、樹脂、医薬軟膏およびローション、潤滑油添加物、繊維用帯電防止剤および表面処理剤、可塑剤、化粧品、工業用溶媒、ならびに脂肪用の溶媒として使用される。本開示はまた、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生された脂肪アルコールを含む界面活性剤組成物または洗剤組成物も提供する。当業者は、界面活性剤組成物または洗剤組成物の意図する目的に応じて、異なる脂肪アルコールを産生して用いることができることを理解するであろう。例えば、本明細書に記載の脂肪アルコールが、界面活性剤または洗剤の産生のための原料として用いられる場合、当業者は、脂肪アルコール原料の特性が、産生される界面活性剤または洗剤組成物の特性に影響を及ぼすことを理解するであろう。それ故に、原料として用いるための特定の脂肪アルコールを産生することにより、界面活性剤または洗剤組成物の特性を選択することができる。本明細書に記載の脂肪アルコールベースの界面活性剤および／または洗剤組成物は、当技術分野において周知の他の界面活性剤および／または洗剤と混合することができる。いくつかの態様において、混合物は、重量比で少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、または前記の値の任意の2つを境界とする範囲の脂肪アルコールを含むことができる。他の例では、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22炭素長である炭素鎖を含む脂肪アルコールを、重量比で少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または前記の値の任意の2つを境界とする範囲で含む界面活性剤または洗剤組成物を製造することができる。そのような界面活性剤または洗剤組成物は、植物油または石油などの非微生物源由来のマイクロエマルションまたは界面活性剤または洗剤などの少なくとも1つの添加物も含むことができ、それらは脂肪アルコールとの重量比で少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％または前記の値のいずれか2つを境界とする範囲の量で存在しうる。
【０１４６】
エステルには多くの商業的用途がある。例えば、代替燃料の1つであるバイオディーゼル油は、エステル（例えば、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸エチルエステルなど）でできている。ある種の低分子量エステルは心地よい香りの揮発性物質であり、そのため芳香剤または香味剤として有用である。加えて、エステルは、ラッカー、塗料およびワニス用の溶媒としても用いられる。その上、蝋、脂肪および油といった天然物にも、エステルでできているものがある。エステルはまた、樹脂およびプラスチック中の柔軟剤および可塑剤、難燃剤、ならびにガソリンおよび油中の添加物としても用いられる。加えて、エステルは、ポリマー、フィルム、繊維、染料および医薬品の製造にも用いることができる。
【０１４７】
炭化水素には多くの商業的用途がある。例えば、比較的短鎖のアルカンは燃料として用いられる。より長鎖のアルカン（例えば、炭素が5〜16個）は、輸送燃料（例えば、ガソリン、ディーゼル油、または航空燃料）として用いられる。16個を上回る炭素原子を有するアルカンは、燃料油および潤滑油の重要な構成成分である。室温では固体であるさらに長いアルカンは、例えば、パラフィン蝋として用いることができる。加えて、より長鎖のアルカンを分解して、商業的に有用な短鎖炭化水素を製造することもできる。短鎖アルカンと同様に、短鎖アルケンも輸送燃料に用いられる。より長鎖のアルケンは、プラスチック、潤滑剤および合成潤滑剤に用いられる。加えて、アルケンは、アルコール、エステル、可塑剤、界面活性剤、第三級アミン、石油増進回収剤、脂肪酸、チオール、アルケニルコハク酸無水物、エポキシド、塩素化アルカン、塩素化アルケン、蝋、燃料添加物、および牽引流低減剤を産生するための原料としても用いられる。
【０１４８】
ケトンは、溶媒として商業的に用いられる。例えば、アセトンは溶媒としてよく用いられるが、ポリマーを製造するための原料でもある。ケトンはまた、ラッカー、塗料、爆薬、香料、および繊維の加工にも用いられる。さらに、ケトンは、アルコール、アルケン、アルカン、イミン、およびエナミンを製造するのにも用いられる。
【０１４９】
潤滑剤は、典型的には、オレフィン、特にポリオレフィンおよびα-オレフィンで構成される。潤滑剤は、原油から精製することができ、または原油から精製された原料を用いて製造することもできる。原油からこれらの特殊化学品を得るには、莫大な金融投資ならびに大量のエネルギーを必要とする。それはまた、多くの場合、より小さいモノマーを産生するために原油中の長鎖炭化水素が分解されることから、非効率な工程でもある。続いて、これらのモノマーは、より複雑な特殊化学品を製造するための原料として用いられる。
【実施例】
【０１５０】
以下の具体的な例は、本開示を例証することを意図しており、添付の特許請求の範囲を限定するものとみなされるべきではない。
【０１５１】
96ウェルプレート中で増殖させたLB培養物から、30μLのLB培養物を用いて270μLのFA2P培地（下記の表2参照）に接種し、続いてそれを振盪機上にて32℃でおよそ16時間インキュベートして、一晩播種物（overnight seed）を得た。30μLの一晩播種物を用いて、300μLのFA4P培地＋2％ MeOH＋1mMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）（下記の表2参照）に接種した。培養物を振盪機上にて32℃で24時間インキュベートし、その後にそれらを、以下に詳述する標準的な抽出プロトコールを用いて抽出した。
【０１５２】
（表２）培地の名称および配合
2016500261.tif 000008
【０１５３】
脂肪酸種の標準的な抽出プロトコール：
抽出しようとする各ウェルに対して、40μLの1M HClを添加し、続いて内部標準物質として500mg／LのC11-FAMEを含む300μLの酢酸ブチルを添加した。96ウェルプレートを、プレートシーラー（ALPS-300；Abgene、ThermoScientific, Rockford, IL）を用いて熱溶着させて、MixMate（Eppendorf, Hamburg, Germany）を用いて2000rpmで15分間振盪させた。振盪の後に、プレートを室温にて4500rpmで10分間遠心処理して（Allegra X-15R、ローターSX4750A、Beckman Coulter, Brea, CA）、水層と有機層を分離した。有機層50μLを96ウェルプレートに移した（96ウェルプレート、ポリプロピレン製、Corning, Amsterdam, Netherlands）。プレートを熱溶着させた後に、以下に述べるUpstream_Biodiesel_FAME_BOH-FAME-underivitized法（下記）を用いるGC-FIDによって評価するまで-20℃で保存した。
【０１５４】
Upstream Biodiesel FAME BOH FAME Underivitized法：
1mLの試料を、水素炎イオン化検出器（FID）を備えたTrace GC Ultra（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）のUFMカラム（カタログ番号：UFMC00001010401、Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）に注入した。機器はC8〜C18 FAMEおよびC8〜C18 β-OH FAMEを検出するように設定した。
【０１５５】
上記に詳述したプロトコールは標準的な条件を表しており、分析結果を最適化するための必要に応じて、抽出容積または別のパラメーターが変化するように改変してもよい。
【０１５６】
実施例1
脂肪酸合成経路を経由する、アシルキャリアータンパク質（ACP）媒介性の流れの増大
いくつかのシアノバクテリア由来のacp遺伝子を、pCL1920誘導体であるプラスミドpLS9-185（3〜5コピー／細胞）中の、シネココッカス・エロンガタスPCC7942アシル-ACPレダクターゼ（AAR）の下流にクローニングした。枯草菌（Bacillus subtilis）由来のsfp遺伝子（アクセッション番号X63158；SEQ ID NO：11）は、不活性型アポ-ACPタンパク質の活性型ホロ-ACPタンパク質への変換に関与するホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードする。幅広い基質特異性を有するこのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（SEQ ID NO：12）を、各々のacp遺伝子の下流にクローニングした。いくつかの試験を実施するために、表3（下記）に列記したプラスミドを構築した。
【０１５７】
（表３）（基礎プラスミドpLS9-185中の）S.エロンガタスPCC7942 AARの下流のシアノバクテリアACPを、枯草菌sfpを伴ってまたは伴わずに共発現するプラスミド
2016500261.tif 000009
【０１５８】
脂肪酸の産生
ACPの過剰発現によって遊離脂肪酸の産生を増加させうるか否かについて評価する目的で、sfpを伴う1つのシアノバクテリアACP遺伝子をpDS171s（前記の表3参照）から増幅させて、pCLベクター中の、'tesA（リーダーレスチオエステラーゼ遺伝子）の下流にクローニングした。その結果得られたオペロンを、Ptrc野生型プロモーターよりも幾分低い転写レベルをもたらすPtrc3プロモーターの制御下に置いた。この構築物を大腸菌DV2中にクローニングして、脂肪酸産生について評価した。対照菌株は同一のプラスミドを含有するが、シアノバクテリアACPおよび枯草菌sfpは有しなかった。標準的なマイクロタイタープレート発酵実験による結果を図7に示す。図示されているように、異種ACPを共発現する宿主菌株では脂肪酸力価の有意な改善が観察され、このことは、この場合にはおそらく脂肪酸生合成経路を経由する流れが増大することによって、ACP過剰発現が脂肪酸産生のために有益となる可能性を実証している。
【０１５９】
脂肪アルコールの産生
いくつかのシアノバクテリアacp遺伝子を、pLS9-185中のノストック属73102アシル-ACPレダクターゼ（AAR；SEQ ID NO：80）の下流にクローニングした。このプラスミドはpCL1920を基にしており、約3〜5コピー／細胞で存在する。加えて、いくつかのプラスミドでは、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードする枯草菌由来のsfp遺伝子も、各々のacp遺伝子の下流にクローニングした。acp遺伝子はすべて、IN-FUSION技術（IN-FUSION HDクローニングキット；Clonetech Laboratories, Inc.）を用いて、pLS9-185中のaar遺伝子のすぐ下流にあるEcoRI部位に合成RBSとともにクローニングした。EcoRI部位はacp遺伝子の下流に再構築した。同様に、枯草菌sfp遺伝子も、このEcoRI部位に合成RBSとともにIN-FUSIONによりクローニングした。
【０１６０】
シネコシスティス属7942 acp（SEQ ID NO：7）は、プライマー168IFF（SEQ ID NO：13）および168IFR（SEQ ID NO：14）を用いてプラスミドpEP09から増幅させた。このPCR産物を、IN-FUSIONキット（前記）を用いて、プラスミドpLS9-185のEcoRI部位にクローニングして、プラスミドpDS168を形成させた。
【０１６１】
シネコシスティス属6803 acp（SEQ ID NO：3）は、プライマー169IFF（SEQ ID NO：15）および169IFR（SEQ ID NO：16）を用いてプラスミドpTB044から増幅させた。このPCR産物を、IN-FUSIONキット（前記）を用いて、プラスミドpLS9-185のEcoRI部位にクローニングして、プラスミドpDS169を形成させた。
【０１６２】
プロクロロコッカス・マリヌス（Prochlorococcus marinus）MED4 acp（SEQ ID NO：5）は、プライマー170IFF（SEQ ID NO：17）および170IFR（SEQ ID NO：18）を用いてプラスミドpEP07から増幅させた。このPCR産物を、IN-FUSIONキット（前記）を用いて、プラスミドpLS9-185のEcoRI部位にクローニングして、プラスミドpDS170を形成させた。
【０１６３】
ノストック属73102 acp（SEQ ID NO：1）は、プライマー171IFF（SEQ ID NO：19）および171IFR（SEQ ID NO：20）を用いてプラスミドpEP11から増幅させた。このPCR産物を、IN-FUSIONキット（前記）を用いて、プラスミドpLS9-185のEcoRI部位にクローニングして、プラスミドpDS171を形成させた。
【０１６４】
ノストック属7120 acp（SEQ ID NO：9）は、プライマー172IFF（SEQ ID NO：21）および172IFR（SEQ ID NO：22）を用いてプラスミドpTB045から増幅させた。このPCR産物を、IN-FUSIONキット（前記）を用いて、プラスミドpLS9-185のEcoRI部位にクローニングして、プラスミドpDS172を形成させた。
【０１６５】
合成sfp遺伝子（改変4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードする）は、増幅させた上で、プラスミドpDS168-pDS172のEcoRI部位にクローニングした。sfp＋合成RBSは、以下の順方向プライマーの1つを用いて増幅させた：168SIFF（SEQ ID NO：23）、170SIFF（SEQ ID NO：24）、171SIFF（SEQ ID NO：25）。同じ逆方向プライマーを、以下の通りに各増幅のために用いた：168SIFR（SEQ ID NO：26）。168S PCR産物は、EcoRIを制限部位とするpDS168にIN-FUSION技術（前記）を用いてクローニングして、pDS168Sを形成させた。170S PCR産物は、EcoRIを制限部位とするpDS170にIN-FUSION技術（前記）を用いてクローニングして、pDS170Sを形成させた。171S PCR産物は、EcoRIを制限部位とするpDS171にINFUSION技術（前記）を用いてクローニングして、pDS171Sを形成させた。172S PCR産物は、EcoRIを制限部位とするpDS172にIN-FUSION技術（前記）を用いてクローニングして、pDS172Sを形成させた。
【０１６６】
標準的な振盪フラスコ発酵実験による結果を図8に示す。図示されているように、プラスミドpDS168およびpDS169（前記の表3参照）を含有する宿主菌株では脂肪アルコール力価の有意な改善が観察され、このことは、この場合にはおそらく異種末端経路酵素によるアシル-ACPの認識、親和性および／または代謝回転を促進することによって、ACP過剰発現が脂肪アルコール産生のために有益となる可能性を実証している。加えて、プラスミドpDS171SおよびpDS172Sを含有する宿主菌株でも、力価の有意な改善が観察された。これらのプラスミドはノストック属7120または73102_acp遺伝子をsfp遺伝子の前に含有している。pDS169（シネコシスティス属6803_acp）を含有する宿主菌株も力価の改善を示した。このことは、いくつかの独立した実験において再現性があることが示された。生来のアルコールデヒドロゲナーゼは、インビボでアルデヒドをアルコールに変換させた。
【０１６７】
実施例2
脂肪酸合成経路を経由する、アシルキャリアータンパク質（ACP）媒介性の流れの増大‐脂肪エステル産生
本明細書において、メチルエステルの産生が、M.アクアエオレイVT8アシルキャリアータンパク質（mACP）の過剰発現によって改善されることが示された。マリノバクター・アクアエオレイVT8由来のACPのタンパク質配列（SEQ ID NO：122）は、マリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカス由来のACPのタンパク質配列（DSM8798；ATCC49840；SEQ ID NO：124）と同一である。しかし、M.アクアエオレイVT8の核酸配列（SEQ ID NO：121）は、DSM8798の核酸配列（SEQ ID NO：123）とは、1塩基対が異なる（すなわち、サイレント突然変異）。
【０１６８】
脂肪エステル（すなわち、FAME）を産生するように事前に遺伝子操作された宿主細胞菌株（すなわち、DfadE、DtonA、rph+およびilvG+ T5_ifab138 T5_fadRを有するMG1655を基にしたsven.036）を、pKEV022と名付けられた生産プラスミド（エステルシンターゼ、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）由来のACC、およびコリネバクテリウム・グルタミクム由来のbirAの遺伝子を保有する）のbirA遺伝子の前にmACPがクローニングされたもの（すなわちpEP.100、これはpKEV022-mACPと同じである）を保有するようにさらに改変した。ここでは、birAをACC活性を強化するために用いたが、これはそれがビオチンをAccB（ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質）と連結させるためである。
【０１６９】
これらの菌株は、プレート発酵および5Lのバイオリアクター発酵において、mACPを含有しない脂肪エステル宿主細胞生産菌株と比較して、脂肪酸メチルエステル（FAME）をより高い収量および力価で産生した。マリノバクターACPとも称するM.アクアエオレイVT8アシルキャリアータンパク質（mACP）は、プライマーEP343（SEQ ID NO：27）およびEP345（SEQ ID NO：28）を用いてプラスミドpNH153Lから増幅させ、続いてIN-FUSIONキット（前記）を用いて、pKEV022プラスミド中のbirA遺伝子の手前にクローニングした。pNH153Lは、M.アクアエオレイVT8のゲノムDNA調製物からmACPを増幅させることによって作製した。
【０１７０】
最適化されたIGR配列［birA-TAAtagaggaggataactaaATG-mACP（SEQ ID NO：29）］を、mACPの前方に用いた。インフュージョンクローニングのためのpKEV022プラスミド骨格は、プライマーEP342（SEQ ID NO：30）およびEP344（SEQ ID NO：31）を用いて増幅させた。pEP.100プラスミド中のエステルシンターゼ遺伝子、ACC-birA遺伝子およびmACP遺伝子の配列は、シークエンシングにより確認した。プラスミドpEP.100を、BD64およびsven036大腸菌株に形質転換導入した。その結果得られた菌株を、それぞれstEP598およびstEP604と命名した。Sven036株はBD64と同質遺伝子であるが、さらにrph+およびilvG+の補正、ならびにifab138オペロンの前方にあるT5プロモーターを有する（PCT／US13／35037号を参照）。各菌株による2つのコロニーを、適切な対照（KEV075＝BD64／pKEV022およびsven038＝sven036／pKEV022）とともに、上記のプレート内エステルスクリーニングのプロトコールを用いて三重反復試験によって検討した。図9は、pEP.100プラスミドを含有する菌株のプレート発酵の結果を示している。描写されているように、stEP604株は、驚いたことに、対照sven038株を上回る高度の力価改善（3倍）を示す。同じプラスミドはBD64株バックグラウンドにおいて、対照KEV075株よりも幾分低い力価をもたらす。これらの発酵の結果に基づき、次に5LバイオリアクターにおいてstEP604を評価した。図10は、stEP604に関するタンクデータを図示している。図示されているように、StEP604は、ラン全体を通じて、一貫して対照（sven38）を上回るより高い力価を有していた。
【０１７１】
これらの結果は、pKEV022プラスミド中のbirAの手前にM.アクアエオレイVT8 ACPをクローニングして、それをsven036バックグラウンドで発現させることにより、対照sven038株と比較して、10％の収量改善および35％を上回る力価増大がもたらされたことを示している。これらの結果は、他の微生物由来のACPを含むACPの過剰発現により、脂肪酸誘導体の収量を有効に増加させうることを示唆している。M.アクアエオレイVT8 ACPの発現レベルを、RBSまたはプロモーターライブラリーを通じてさらに最適化して、さらにより高度の収量改善およびより高度の力価を得ることができると考えられる。
【０１７２】
実施例3
大腸菌またはマリノバクター・アクアエオレイVT8 ACPの過剰発現により、脂肪酸合成経路を経由する流れが増大する‐脂肪エステルの産生
組換え宿主細胞によって産生されたFAMEを商業用バイオディーゼルの生産に用いることができるが、経済的に実行可能な商業規模での発酵工程の最適化のためには、FAME産生の力価および収量を最大化することが必要である。商業用菌株の候補は、ハイスループットスクリーニング、ならびに5Lバイオリアクターにおける培養によって同定することができる。この試験において、大腸菌ACPまたはM.アクアエオレイVT8 ACPの過剰発現はそれぞれ、組換え宿主細胞による脂肪アシルメチルエステル（FAME）の力価および収量を増大させることが示された。上記のように、M.アクアエオレイVT8 ACP（mACP）、例えばプラスミドpKEV022を発現するように遺伝的に改変された宿主細胞菌株は、FAMEをより高い力価で産生することが示されている（前記の実施例2参照）。本実施例では、大腸菌ACPを同様の条件下で評価した。大腸菌ACP（ecACP）およびM.アクアエオレイVT8s ACP（mACP）を種々のエステルシンターゼバリアントと組み合わせて検討し、それらが酵素バリアントと適合性があるか否かを調べた。
【０１７３】
プラスミドの構築
プラスミドpSven.036はpKEV022-ecACPを含み、プラスミドpSven.037はpSHU18-ecACPを含む。ecACPは、生産用宿主菌株sven.036から、プライマーoSV44（SEQ ID NO：32）およびoSV45（SEQ ID NO：33）を用いて増幅させた。続いてこの遺伝子配列を、pKEV022およびpSHU18プラスミド中のbirA遺伝子の手前に、IN-FUSIONキット（前記）クローニングを介してクローニングした。最適化されたIGR配列（プライマーoSV44中の下線部）を、大腸菌ACPの手前に用いた。インフュージョンクローニングのためのpKEV022／pSHU18プラスミド骨格は、プライマーEP342（SEQ ID NO：30）およびEP344（SEQ ID NO：31）を用いて増幅させた。クローニング反応物を、まずSTELLARケミカルコンピテント（chemically competent）細胞に形質転換導入し、続いて配列を確認した後に、新たなプラスミドpSven.036およびpSven.037を精製した。同様の戦略を、種々のエステルシンターゼバリアントにmACPをクローニングする目的にも用い、この場合には、プライマーEP343（SEQ ID NO：27）およびEP345（SEQ ID NO：28）を用いてmACPを増幅するためのテンプレートとしてプラスミドpEP100を用いた。その結果得られたプラスミドを以下の表4（下記）に示す。D+は、エステルシンターゼの下流にaccDA遺伝子、accBC遺伝子およびbirA遺伝子が存在することを指す（accDA遺伝子、accBC遺伝子およびbirA遺伝子はコリネバクテリウム・グルタミクムに由来した）。
【０１７４】
（表４）プラスミドの説明
2016500261.tif 000010
【０１７５】
発酵の結果
表4に示されたすべてのプラスミドを、生産用宿主であるGLPH-077に形質転換導入した。菌株GLPH-077およびGLPH-009は、ファージに対する耐性を選択することによって、sven.036から導き出した。sven.036は、WT MG1655菌株に天然に存在するilvGおよびrphのフレームシフト突然変異に対する補正を含み、脂肪酸生合成に関与する遺伝子の過剰発現を促すifab138オペロン（前記）を動作させるT5プロモーターも有する。4種の個別の形質転換体を選び出して、上記のプレート内エステルスクリーニングのプロトコールを用いて、適切な対照に対して比較した。表4に示したプラスミドによって形質転換された生産用宿主GLPH-077によって産生されたFAMEの力価およびβ-OH含有量を、ACPの過剰発現を伴わない同じエステルシンターゼバリアントを発現する生産用宿主GLPH-077によって産生されたFAMEの力価およびβ-OH含有量と比較した。マリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカス由来のエステルシンターゼバリアントを含有する、この試験に用いた菌株を表5に列記している。
【０１７６】
（表５）菌株の説明
2016500261.tif 000011
【０１７７】
図11に見てとれるように、mACPの過剰発現を伴う菌株は、各々の対照を上回る総FAME力価の有意な増大を示し、特に、pKEV022プラスミドを用いた場合には（pSven.037はpKEV022-mACPを含む）、対照菌株（sven.315およびsven.205）のおよそ3倍となる力価を生じた。図12は、pKEV022およびpSHU018におけるecACPの過剰発現を図示している。この発酵結果に基づき、5Lバイオリアクターにおいて菌株のランを行った。図13は、mACPおよびecACPの過剰発現によるバイオリアクター力価データを示している。ecACPを伴うpSHU18は、産生された総脂肪酸種（FAS）の点で、他のエステルシンターゼバリアントを上回る成績を示した。図14は、バイオリアクターにおけるβ-OH FAME産生を図示している。ecACPの過剰発現を伴うpSHU18は、β-OH FAMEをおよそ68％産生した。図15は、グルコースに関する収量を比較したバイオリアクターデータを図示している。ecACPの過剰発現を伴うpSHU18は、この試験において検討した他の菌株よりも高い収量を明らかに示した。このデータは、pSHU18プラスミド中のbirAの手前にecACPをクローニングして、それをGLPH77バックグラウンド（sven.315）において発現させることにより、step604と比較して8％の収量改善および6％のFAS力価改善がもたらされたことを示している。sven.315も、sven.241（pSHU18プラスミド中にて過剰発現されるmACPを有する）に比して、2倍の力価改善および60％の収量改善を有していた。菌株sven.315は、FASに関して64％の収量増大および67％の力価増大を示す。sven.313（pSven.023プラスミド中にて過剰発現されるmACPを有する）をsven.227と比較したところ、36％の力価改善および32％の収量改善が観察された。このデータは、ecACPまたはmACPの存在により、FASの収量および力価の大きな増大がもたらされることを指し示している。
【０１７８】
mACPおよびecACPの配列を、NCBIのツール「BLASTp」を用いて比較した。結果は以下の通りであった：クエリー1配列（77アミノ酸長）。
【０１７９】
方法：コンポジショナルマトリックスアジャスト法（Compositional Matrix Adjust）
同一性＝62／76（82％）、陽性＝68／76（89％）、ギャップ＝0／76（0％）
2016500261.tif 000012
【０１８０】
配列アラインメントの結果から、mACPタンパク質およびecACPタンパク質はアミノ酸残基に関する同一性が82％で類似性が89％であることが指し示されている。このことは、他の生物由来のACP（ある特定の配列類似性を有する）が、脂肪アルコールおよび脂肪エステルなどの脂肪酸誘導体の産生を強化する上で同程度の効果（mACP配列およびecACP配列において例示されるような）を有する可能性を示唆する。細胞におけるACPの発現レベルは、IGRライブラリーを通じてさらに最適化することができる。大腸菌染色体へのACP遺伝子の組み込み、および／または中程度ないし強力なプロモーターの制御下での発現により、収量のさらなる改善が得られる可能性がある。これらの菌株を用いてプロモーターライブラリーを構築することもできる。または、他の生物由来のACPを検討することもできる。
【０１８１】
実施例4
大腸菌ACPまたはマリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカスACPの過剰発現は、脂肪酸合成経路を経由する流れを増大させる‐アルカンの産生
いくつかのシアノバクテリアacp遺伝子を、pLS9-185中に存在するノストック属73102アシル-ACPレダクターゼ（SEQ ID NO：80）の下流にクローニングした。プラスミドpDS171Sは、pLS9-185中のaar遺伝子のすぐ下流にあるEcoRI部位に、合成RBSとともにクローニングされたノストック属73102 acpを含有する。枯草菌由来のsfp遺伝子を、各々のacp遺伝子の下流にクローニングした。これらのプラスミドを、ADC（ノストック属PCC73102由来のアルデヒドデカルボニラーゼ；SEQ ID NO：38）を含有するプラスミドpLS9-181と共発現させた。両方のプラスミドを含有する菌株を、25mM Mn2+を添加した上で32℃での標準的な発酵プロトコールに供した。図16は、誘導後24時間で産生されたアルカンの平均量を示している（三重反復試験+/-標準誤差）。プラスミドpDS171Sを含有する菌株では、アルカン力価の有意な5倍の改善（図16中のカラム3を参照）が観察された。対照（acp／sfpを有しない）はpLS9-185とした。これらの結果は、ノストック属73102 acp＋sfpの発現により、アルカン産生が改善したことを指し示している。
【０１８２】
シアノバクテリアacp＋sfp遺伝子は、例えば、アルカンオペロンに付随させるか、または別個のユニットとして存在させるかのいずれかで染色体中の部位に組み込むといった、いくつかの形態で供給することができる。acpおよびsfpの発現は、プロモーターおよび／またはリボソーム結合部位の操作によって変化させることができる。これらの結果は、活性型シアノバクテリアACPの発現により、組換え宿主生産菌株によるアルカンの力価／収量の増加を促しうることを示唆する。
【０１８３】
実施例1から4までの結果は、グルコースなどの原材料を脂肪酸、脂肪エステル、脂肪アルコールおよび脂肪アルカンに変換する能力が強化および改変された新たな組換え宿主細胞菌株が作り出されたことを例証している。すなわち、ACPの過剰発現により、組換え宿主細胞による脂肪酸誘導体の産生が改善され、対応する野生型細胞と比較して、より高い力価、より高い収量およびより高い生産性がもたらされることが本明細書において示された。すべての配列識別番号（SEQ ID NO）を、以下の表6に列記している（完全な配列情報については配列表を参照されたい）。
【０１８４】
（表６）配列の表
2016500261.tif 000013
2016500261.tif 000014
2016500261.tif 000015
2016500261.tif 000016
【０１８５】
当業者には明らかであろうが、上記の諸局面および諸態様のさまざまな改変物および変形物を、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく作製することができる。そのような改変物および変形物は本開示の範囲内にある。
【図１】
2016500261.tif 000018
【図２】
2016500261.tif 000019
【図３】
2016500261.tif 000020
【図４】
2016500261.tif 000021
【図５】
2016500261.tif 000022
【図６】
2016500261.tif 000023
【図７】
2016500261.tif 000024
【図８】
2016500261.tif 000025
【図９】
2016500261.tif 000026
【図１０】
2016500261.tif 000027
【図１１】
2016500261.tif 000028
【図１２】
2016500261.tif 000029
【図１３】
2016500261.tif 000030
【図１４】
2016500261.tif 000031
【図１５】
2016500261.tif 000032
【図１６】
2016500261.tif 000033
【配列表】
2016500261000001.app
【国際調査報告】
2016500261.tif 000034
2016500261.tif 000035
2016500261.tif 000036
2016500261.tif 000037
2016500261.tif 000038