(57)【要約】  本発明は、−  １６Ｓ  ｒＤＮＡと呼ばれる配列番号１に１００％相同である細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む細菌、−  配列番号１に１００％相同である細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む細菌が増殖したが、前記細菌を実質的に含まない培養培地であって、配列番号１に１００％相同であるＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドを含む培養培地からなる群より選択される少なくとも１つの生物学的因子を含む処置組成物を適用する、植物物質の処置方法であって、細菌がパスツール研究所のＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ）に対して寄託され、番号１−４４６７の下、２０１１年４月７日付で登録された株と同一の細菌、及びこの寄託された株の変異体細菌からなる群より選択される、方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  １６Ｓ  ｒＤＮＡと呼ばれる配列番号１に１００％相同である細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む細菌、
−  配列番号１に１００％相同である１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む細菌が増殖したが、前記細菌を実質的に含まない培養培地であって、配列番号１に１００％相同であるＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドを含む培養培地
からなる群より選択される少なくとも１つの生物学的因子を含む処置組成物を適用する植物物質の処置方法であって、
前記細菌が、パスツール研究所のＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ）に対して寄託され、番号Ｉ−４４６７の下、２０１１年４月７日付で登録された株と同一の細菌、及びこの寄託された株の変異体細菌からなる群より選択される、植物物質の処置方法。
【請求項２】
植物物質が、栽培中の植物、収穫後の果実若しくは野菜、植物の種子の全体又は一部からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分割された状態の固形の栄養分をさらに含む処置組成物を使用することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記植物物質の成長を活性化するために、前記植物物質に対して前記処置組成物を適用することを特徴とする、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの標的微生物の増殖を阻害するために、前記植物物質に対して前記処置組成物を適用することを特徴とする、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記植物物質の自然の防御力を刺激するために、前記植物物質に対して前記処置組成物を適用することを特徴とする、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
−  １６Ｓ  ｒＤＮＡと呼ばれる配列番号１に１００％相同である細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む細菌、
−  配列番号１に１００％相同であるＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチド
からなる群より選択される、少なくとも１つの生物学的因子を含む組成物であって、
前記細菌が、パスツール研究所のＣＮＣＭに対して寄託され、番号Ｉ−４４６７の下、２０１１年４月７日付で登録された株と同一の細菌、及びこの寄託された株の変異体細菌からなる群より選択される、組成物。
【請求項８】
液体であることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
固体であることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
処置すべき植物物質に対する適用を可能とするために、許容可能な少なくとも１つの賦形剤を含むことを特徴とする、請求項７から９の何れかに一項記載の組成物。
【請求項１１】
請求項７から１０の何れか一項に記載の組成物の農業における使用。
【請求項１２】
植物の成長を刺激するための、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
種子の発芽を刺激するための、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
植物の施肥処置のための、請求項１１に記載の使用。
【請求項１５】
植物の抗微生物処置及び／又は抗ウイルス処置のための、請求項１１に記載の使用。
【請求項１６】
植物の自然の防御力を刺激するための、請求項１１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の新規細菌の農業における使用に関する。本発明は特に、植物の処置方法、植物処置組成物、及び植物処置のための、そのような処置組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、世界的な食糧需要を満たすために、集約的な農業植物耕作地の開発が必要とされている。この目的のため、そのような集中的な農業植物耕作地は、関心のある植物の成長を最適化するため、また、望ましくない植物の成長及び／又は病原体の増殖を最小化するための薬剤の使用を必要とする。特に、植物の栄養を改善することを目的とした薬剤、並びに病原性生物に対する、特に植物病原性の細菌及び／又は植物の最適な成長に影響を与える可能性のある真菌に対する植物保護剤が知られている。
【０００３】
また、土壌肥沃化の製品も知られている。それは一般に、化学工業から生じる肥料であるが、これは固体の形態を呈し、土壌中でほとんど溶けず、したがって、これらの肥料製品が植物の最適な成長のために必要とされる的確な時期に大量に与えられる必要がある。土壌に施され、植物に摂取されないこれらの固体肥料製品の余剰は、一時的に土壌中に留まり、雨水や灌漑水によって徐々に溶解された後、地下水面に到達し、それを汚染する。
【０００４】
したがって、栄養と植物の成長を完全に促進すると共に、環境、特に地下水面を汚染することなく、土壌肥沃度を改善するための解決法が求められている。
【発明の概要】
【０００５】
よって、本発明は、この課題に対する解決策を提供することを目的としている。
【０００６】
また、多くの植物病原性因子が植物耕作地において増殖して、その損害のために、その生産の収量と作物生産の品質が低下する可能性がある。
【０００７】
したがって、本発明は、植物病原性の特定の生物−細菌及び／又は真菌−に対する植物の保護のための解決策をもたらすことも目的としている。
【０００８】
これを行うために、本発明は、
−  配列番号１に１００％相同である細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、いわゆる１６Ｓ  ｒＤＮＡを含む細菌、
−  配列番号１に１００％相同である細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む細菌が増殖した、前記細菌を実質的に含まない培養培地であって、配列番号１に１００％相同であるＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドを含む培養培地
からなる群より選択される少なくとも１つの生物学的因子を含む処置組成物であって、
細菌が、パスツール研究所ＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ）に対して寄託され、２０１１年４月７日付で番号Ｉ−４４６７の下、登録された株と同一の細菌、及びこれらの寄託された株の変異体細菌からなる群より選択される、処置組成物を適用する、植物物質の処置方法に関する。
【０００９】
配列番号１の配列を以下に記載する：
2016538874.tif 000002
【００１０】
上記の配列番号１の配列において、配列番号１の配列の第１０３６位と第１０４９位における記号「ｎ」は、ＩＵＰＡＣ（「国際純正・応用化学連合」）に従い、ａ、ｔ、ｃ又はｇの４つのヌクレオチドのうちの任意の１つを示す。したがって、第１０３６位のヌクレオチドｎは、ヌクレオチド「ａ」、ヌクレオチド「ｔ」、ヌクレオチド「ｇ」、及びヌクレオチド「ｃ」からなる群より選択され、第１０４９位のヌクレオチドｎは、第１０３６位のヌクレオチドとは独立にヌクレオチド「ａ」、ヌクレオチド「ｔ」、ヌクレオチド「ｇ」、及びヌクレオチド「ｃ」からなる群より選択される。
【００１１】
本発明は、したがって、処置組成物を植物物質の少なくとも一部に対して、又は植物物質の耕作地の基部に対して適用する、植物物質の処置方法に関する。
【００１２】
本発明者らは、完全に意外かつ予想外なことに、本発明に係る処置組成物が、例えば、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような特定の細菌、並びにストレプトマイセス・スカビエス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｃａｂｉｅｓ）、灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒａｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フィチウム・ウルチムム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ）、ファエモニエラ・クラミドスポラ（Ｐｈａｅｏｍｏｎｉｅｌｌａ  ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒａ）、ファエモニエラ・アエロフィルム（Ｐｈａｅｏｍｏｎｉｅｌｌａ  ａｅｌｏｐｈｉｌｕｍ）、エウティパ・ラタ（Ｅｕｔｙｐａ  ｌａｔａ）、フォミチポリア・メジテラネア（Ｆｏｍｉｔｉｐｏｒｉａ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ）及びボトリオスフェリア・オブツサ（Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｏｂｔｕｓａ）のような特定の植物病原性細菌若しくは真菌の増殖の阻害能を示すことを見出した。
【００１３】
配列番号１に１００％相同なＤＮＡ配列を有する細菌の株は、ブダペスト条約に基づく国際寄託機関の地位を有するパスツール研究所（その住所は７５７２４パリ市ドクタールー通り２５セデックス番号１５である）ＣＮＣＭに対して申請者により寄託され、２０１１年４月７日付で番号Ｉ−４４６７の下、登録された。
【００１４】
本発明に係る処置方法では、ストレプトマイセス属のものであり、配列番号１に１００％相同なＤＮＡ配列を有する細菌を使用する。
【００１５】
有利には、本発明によれば、単離された細菌は、配列番号８に相同なＲＮＡポリメラーゼのβサブユニット（ｐｏｌＢ）をコードするＤＮＡ配列を有する。したがって、単離された細菌は、ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニット（ｐｏｌＢ）をコードする配列として、配列番号８の配列を有する。
【００１６】
有利には、本発明によれば、単離された細菌は配列番号９に相同なジャイレース（ｇｙｒＢ）をコードするＤＮＡ配列を有する。したがって、単離された細菌は、ジャイレース（ｇｙｒＢ）をコードする配列として、配列番号９の配列を有する。
【００１７】
有利には、本発明によれば、単離された細菌は配列番号１０に相同なリコンビナーゼ（ＲｅｃＡ）をコードするＤＮＡ配列を有する。したがって、単離された細菌は、リコンビナーゼ（ＲｅｃＡ）をコードする配列として、配列番号１０の配列を有する。
【００１８】
有利には、本発明によれば、単離された細菌は、配列番号１１に相同なトリプトファンシンターゼのβサブユニット（ｔｒｐＢ）をコードするＤＮＡ配列を有する。したがって、単離された細菌は、トリプトファンシンターゼ（ｔｒｐＢ）をコードする配列として、配列番号１１の配列を有する。
【００１９】
有利には、本発明によれば、単離された細菌は、配列番号１２に相同なＡＴＰシンターゼのβサブユニット（ＡｔｐＢ）をコードするＤＮＡ配列を有する。したがって、単離された細菌は、ＡＴＰシンターゼのβサブユニット（ＡｔｐＢ）をコードする配列として、配列番号１２の配列を有する。
【００２０】
有利には、本発明によれば、単離された細菌は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８の配列の少なくとも１つを有する。有利には、本発明によれば、単離された細菌は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８の配列をそれぞれ有する。
【００２１】
有利には、本発明によれば、処置組成物は、パスツール研究所のＣＮＣＭに対して寄託され、２０１１年４月７日付で番号Ｉ−４４６７の下、登録された株と同一の細菌、及び配列番号１に１００％相同なＤＮＡ配列の一部を含むこの寄託された株の変異体細菌からなる群より選択される細菌を含む。
【００２２】
本発明に係る方法の第１の変形形態では、パスツール研究所ＣＮＣＭに対して寄託され、２０１１年４月７日付で番号Ｉ−４４６７の下、登録された株と同一の細菌であって、配列番号１に対し１００％の相同性を有するＤＮＡ配列の一部を含む、寄託された株と同一の細菌を使用する。
【００２３】
番号Ｉ−４４６７の下、ＣＮＣＭに対して寄託された株は、ＩＳＰ−２培地又はベネット固形培地で培養された場合、細菌の群又は「コロニー」を形成し、以下を有する：
−  固形培地の奥で分岐して増殖した、固形培地の組成に応じて黄褐色から灰褐色に変化する色の菌糸体、いわゆる基中菌糸；
−  白色の空気／固体界面で増殖する空中菌糸。
【００２４】
ＣＮＣＭに寄託された株は、任意の自然環境から分離された細菌の株である。特に、ＣＮＣＭに寄託された株は、既存の原産自然環境から単離された。
【００２５】
ＣＮＣＭに寄託された株の細菌は、以下の特徴の全て又は一部により特徴付けられる：
−  ヒトに対して非病原性（無害）である；
−  グラム陽性菌である；
−  腐生菌、つまり、土壌の有機物質を分解することができる菌である；
−  １２℃から３７℃、好ましくは２８℃から３０℃の至適増殖温度を有する；
−  ６から８の至適増殖ｐＨを有する；
−  炭素源として、Ｄ−グルコース、マンニトール、ラクトース、スクロース、マルトース及びデキストリンを利用する能力をもつ；
−  唯一の炭素源として、優先的にガラクトース、イノシトール、ソルボース、フルクトース、アラビノース、ラフィノース、ラムノース、セルロースを使用する能力をもたない；
−  窒素源として、アミノ酸、硝酸塩及びアンモニウム塩を使用する能力をもつ；
−  硝酸塩を亜硝酸塩に還元する能力をもち、アデニン、ｔｗｅｅｎ２０及び酢酸ナトリウムを分解できる；
−  デンプンを加水分解する能力をもたず、その加水分解産物を利用できない。
【００２６】
本発明に係る方法の第２の変形形態では、ＣＮＣＭに寄託された株の細菌の変異体細菌、つまり、すなわちＣＮＣＭに寄託された株の細菌の変異により得られるものであって、配列番号１の配列に１００％相同な１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列を含む変異体細菌であるようなものを使用する。
【００２７】
突然変異誘発の任意の方法、特に、ランダムな突然変異誘発法及び部位特異的突然変異誘発法からなる群より選択される方法によって、ＣＮＣＭに寄託された株の細菌を処理することにより、このような変異体細菌が得られる。
【００２８】
ＣＮＣＭに寄託された株と同一の細菌を、物理的変異原−特に、ＣＮＣＭに寄託された株と同一の細菌を紫外線又は電離放射線に曝露する−及び化学的変異誘発物質からなる群より選択される少なくとも１つの変異誘発剤にゆだねる、ランダム突然変異誘発による処理を行う。
【００２９】
変異体細菌は、ＣＮＣＭに寄託された株の細菌と比べてＤＮＡ配列に相違を有する。これらのＤＮＡ配列の相違は、本発明に係る細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列とは別のＤＮＡ配列に影響を与える。
【００３０】
本発明に係る方法の第１又は第２の有利な変形形態によれば、配列番号１に１００％相同なＤＮＡ配列を有する細菌（すなわちＣＮＣＭに寄託された株と同一の細菌及び／又は寄託されたこの株の変異体細菌）を含む処置組成物を、前記植物物質の少なくとも一部に接触させる。
【００３１】
本発明に係る方法のこれら第１又は第２の変形形態によれば、処置組成物の細菌は、栄養増殖期の細菌であり得る。用語「栄養増殖期の細菌」は、活性な代謝を呈している、及び／又は細胞分裂により増殖している細菌を意味する。したがって、栄養増殖期又は定常期にある生菌である。したがって、処置組成物が、細菌及び培養培地から形成される。培養培地は、有利には水性培養培地である。有利には、水性培養培地は、本発明に係る細菌の増殖に必要な全ての無機成分と有機前駆体、特に、炭素源、窒素源、リン源、ビタミン及び痕跡元素を含む富栄養培地からなる群より選択される培養培地である。
【００３２】
有利には、水性培養培地は、Ｄ−グルコース、酵母抽出物、リン酸二カリウム、硫酸アンモニウム、塩化カリウム、及びグリセリンを含み得る。
【００３３】
本発明に係る方法のこれら第１又は第２の変形形態によれば、処置組成物の細菌はまた、配列番号１の配列と１００％相同なＤＮＡ配列を有する胞子の形態でもあり得る。栄養増殖期の細菌が空気／固体界面で増殖して、一次菌糸体を形成し、空中増殖を開始するとき、胞子の形成が観察される。分岐していない空中のフィラメント又は「菌糸」は、一次菌糸体から生長し、その端部に胞子前駆体の区画化構造を有する。これは、パスツール研究所ＣＮＣＭに寄託され、２０１１年４月７日付で番号Ｉ−４４６７の下、登録された株と同一な細菌、又は配列番号１の配列を有するＤＮＡ配列を含む、寄託されたこの株の変異体細菌の胞子であり得る。これは、したがって、胞子の形態にある生菌である。
【００３４】
ＣＮＣＭに寄託された株の細菌の胞子は、「Ｓ」型の螺旋状につながれた滑らかな胞子であり、これらの滑らかな胞子鎖は平均１０から５０個の胞子を有する。
【００３５】
細菌のストレスを生じることができる培養培地、特に、炭素及び／又は窒素及び／又はリン及び／又はビタミン及び／又は痕跡元素が制限された、又は欠乏した液体培養培地中における本発明に係る細菌の培養により、本発明に係る細菌の胞子の産生が促進される。
【００３６】
有利には、このような胞子は、富栄養培地中に置かれて、再水和の対象となり、栄養期にある本発明に係る細菌の集団を形成することができる。
【００３７】
有利には、栄養期にある細菌及び／又は胞子の形態にある細菌を含む処置組成物を植物物質に対して適用する。何れの場合も、細菌の増殖型及び胞子は、配列番号１の配列に１００％相同な１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を有する。
【００３８】
水性培養培地は、固形水性培養培地又は液体水性培養培地であり得る。
【００３９】
本発明に係る方法のこの第１の変形形態の第１の実施態様では、配列番号１に一致する１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を有する細菌（寄託された株及び／又は寄託された株の変異体細菌）を含む処置組成物は、液体処置組成物である。有利には、液体処置組成物は、水性液体処置組成物である。水性液体処置組成物は、したがって、水性液体培地における、配列番号１に一致する１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を有する細菌を含む細菌の負荷から形成され得る。
【００４０】
この第１の実施態様では、有利には、前記植物物質の少なくとも一部に対して、ＣＮＣＭに寄託された株の細菌及び／又は変異体細菌を液体培養培地中に含む、液体処置組成物を適用する。
【００４１】
本発明係る方法のこの第１の変形形態の第２の実施態様では、配列番号１の配列を有する細菌を含む処置組成物は、固体処理組成物である。
【００４２】
この第２の実施態様では、有利には、前記植物物質の少なくとも一部に対して、ＣＮＣＭに寄託された株の細菌及び／又は変異体細菌、並びに固形培養培地を含む、固体処理組成物を適用する。この第２の実施態様では、固形培養培地は、一定割合の寒天（Ｅ４０６）を含み得る。
【００４３】
本発明に係る方法の第３の変形形態では、配列番号１に相同なＤＮＡ配列の少なくとも一部を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、処置組成物を適用する。
【００４４】
有利には、本発明に係る方法のこの第３の変形形態では、処置組成物は、このようなポリヌクレオチド、及び／又は、パスツール研究所ＣＮＣＭに対して寄託され、番号Ｉ−４４６７の下、２０１１年４月７日付で登録された株と同一の細菌、及び／又はこの寄託された株の変異体細菌からなる群より選択される細菌を含み得る。
【００４５】
有利には、本発明に係る方法のこの第３の変形形態では、処置組成物は無細胞性の組成物、すなわち、配列番号１の配列を有する細菌を実質的に含まない組成物であり得る。本発明に係る方法のこの第３の変形形態では、配列番号１の配列を有する細菌を取り除いた無細胞性の組成物に前記植物物質の少なくとも一部を接触させる。
【００４６】
有利には、本発明によれば、そのような無細胞性組成物は、特に、配列番号１の配列を含む細菌が増殖したが、前記細菌を実質的に含まない培養培地である。
【００４７】
本発明は、１１．９２５分の保持時間における第１の主要なシグナル（Ｐ７２，６）と２０．０４分の保持時間における第２の主要なシグナル（Ｐ７２，１４）を含むＨＰＬＣのクロマトグラムを有する細菌培養培地から形成される処置組成物も対象としている。
【００４８】
本発明に係る細菌培養培地から形成されるこのような処置組成物は、ヒマワリ、トウモロコシ、ナタネ、コムギ及びトマトなどの栽培中の植物の成長への刺激効果を呈し、また、ブドウの葉における抗真菌活性−特に灰色かび病菌に対する活性−も有する。
【００４９】
このような処置組成物は、配列番号１の配列を含む細菌が増殖したが、前記細菌を実質的に含まない、又は全く含まない培養培地であり得る。
【００５０】
本発明に係る株の培養の２４時間後に得られる、本発明に係る無細胞性組成物は、逆相カラムＨＰＬＣ分析により、以下の表１に列挙された保持時間（ｔｉ）を有する複数のピーク（Ｐ２４，ｉ）を呈し得る。
2016538874.tif 000003
【００５１】
本発明に係る株の培養の３日（７２時間）後に得られる本発明に係る無細胞性組成物は、逆相カラムＨＰＬＣ分析により、以下の表２に列挙された保持時間（ｔｉ）と、相対値で表されたピーク（Ｐ７２，ｉ）下面積（Ａ７２，ｉ）を有する、複数のピーク（Ｐ７２，ｉ）を呈し得る。
2016538874.tif 000004
【００５２】
酢酸エチルによる本発明に係る株の培養培地の抽出、酢酸エチル溶液の乾燥、及びメタノールにおける抽出物の可溶化によって得られる抽出物をＨＰＬＣによって分析する。ＨＰＬＣクロマトグラフィーは２５ｃｍ／４．６ｍｍ／５μｍのサイズのＸｂｒｉｄｇｅカラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｇｕｙａｎｃｏｕｒｔ  Ｆｒａｎｃｅ）により行われる。溶離は、水中２０％から９５％のアセトニトリル勾配により０．８ｍＬ／ｍｉｎの流速で行われる。検出は２５４ｎｍの波長で行われる。
【００５３】
有利には、本発明によれば、処置組成物は、前記配列番号１の配列を含む細菌が増殖した、配列番号１の配列を有する前記細菌を実質的に含まない培養培地から形成される、配列番号１の配列を有する細菌を実質的に含まない、上記の抽出及び分析の条件において１１．９２５分の保持時間における第１の主要なシグナル（Ｐ７２，６）及び２０．０４分の保持時間における第２の主要なシグナル（Ｐ７２，１４）を含むＨＰＬＣのクロマトグラムを有する、無細胞性組成物である。
【００５４】
上記の分析条件において、有利には、本発明によれば、本発明に係る株の培養から３日（７２時間）後に得られる無細胞性組成物は、マイナーシグナルと呼ばれるシグナルを３．９３分、５．３０分、６．５９分、８．８３分、９．６３分、１２．３９分、１２．８７分、１３．７６分、１３．７６分、１５．９３分、１６．２７分、１８．４１分及び１９．３８分の保持時間で含むＨＰＬＣのクロマトグラムを有する。
【００５５】
このような無細胞性組成物は、以下の方法によって得ることができる：
−  細菌の増殖を可能とするのに適した培養培地において、２４時間より長い期間、配列番号１のＤＮＡ配列を有するＣＮＣＭに寄託された株の少なくとも１つの細菌を培養し、それから；
−  細菌を少なくとも実質的に含まない無細胞性組成物を形成するように、培養培地から前記細菌を取り除く。
【００５６】
有利には、細菌をその増殖を可能とするのに適した培養培地に播種し、十分な期間、すなわち、およそ２４時間の最小の期間から１０日間、１２℃から３７℃、好ましくは２８℃から３０℃、特におよそ３０℃の温度で培養し、それから、無細胞性組成物を形成するように−例えば培養培地の遠心によって−培養培地から細胞を抽出するか、細菌を不活化する。したがって、このような無細胞性組成物は、細菌の増殖に適した条件で培養培地において細胞を接触させ、培養することにより得られた、もはや細菌を含まない培養培地であるか、又は、死滅した細菌を含む培養培地である。
【００５７】
任意の公知技術、特に、酵素処理による細菌の溶解又は機械化学的処理によって、細菌の不活性化を得ることが可能である。
【００５８】
有利には、本発明によれば、植物物質にとって許容可能な（植物に許容される）少なくとも１つの賦形剤をさらに含む処置組成物を植物物質の一部に適用する。
【００５９】
有利には、本発明によれば、栽培植物、収穫後の果実若しくは野菜、植物の種子−特に穀粒、球根、花柱、根茎、塊茎−の全体又は一部からなる群より植物物質を選択する。特に、処置組成物を少なくとも１つの植物の地上部、例えば、葉又は種子に適用する。
【００６０】
有利には、本発明によれば、果樹−特にオリーブ、アプリコット、チェリー、マルメロ、アーモンド、イチジク、ヘーゼルナッツ、クルミ、モモ、ナシ、リンゴ、プラム、ブドウ及び柑橘類の木−、装飾用の高木及び小低木、食用植物−特にアスパラガス、ナス、ビート、テンサイ、ニンジン、セロリ、チコリー、エンダイブ、十字花若しくはアブラナ（例えばキャベツ）、キュウリ、小キュウリ、ズッキーニ、エシャロット、タマネギ、ソラマメ、春ソラマメ、冬ソラマメ、イチゴ、ラズベリー、インゲンマメ、レタス、縮れチコリー、キクヂシャ、ホップ、レンズマメ、ウマゴヤシ、ノヂシャ、トウモロコシ、メロン、カブ、ネギ、エンドウマメ、ピーマン、ジャガイモ、ダイコン、ルタバガ、ダイズ、タバコ、トマト、ヒマワリ−、穀物−特にコムギ、ナタネ、アマ、油アマ、繊維アマ、オオムギ、ソルガム−、様々な花の作物−特にキク、アジサイ、カーネーション、バラ、チューリップ−、並びに芳香性の植物−特にパセリ、ニンニク、シブレット−からなる群より、栽培植物を選択する。
【００６１】
有利には、本発明によれば、植物物質は、植物の種子、植物の地上部、及び植物の根からなる群より選択される。
【００６２】
有利には、発芽を活性化するために、植物の種子に処置組成物を適用する。
【００６３】
有利には、植物の植物衛生処置のために、又は植物の自然の防御力の刺激処置のために、又は、植物の成長の刺激処置のために、植物の地上部に処置組成物を適用する。
【００６４】
本発明は、したがって、以下の群より選択される少なくとも１つの生物学的物質を含む処置組成物を、植物物質の少なくとも一部に対して適用する、植物物質の処置方法を対象とする：
−  配列番号１に１００％相同であるＤＮＡ配列を含む、少なくとも１つの細菌；
−  配列番号１に１００％相同であるＤＮＡ配列を含む、液体組成物；
−  配列番号１に１００％相同であるＤＮＡ配列を含む、固形組成物；
−  配列番号１に１００％相同であるＤＮＡ配列を含む、無細胞性組成物。
【００６５】
栄養
有利には、本発明によれば、分割された状態の固形栄養分を含む処置組成物が利用される。したがって、栽培中の植物の全体又は一部に対して、少なくとも１つの分割された状態の固形栄養分をさらに含む処置組成物を適用する。少なくとも１つの固体状態の栄養分と、配列番号１に対して９９％より高い−境界を除く−相同性を有するＤＮＡ配列を含む生物学的因子を含む、処置組成物。特に、有利には、本発明によれば、植物の耕作地の基部−特に土壌−に対して処置組成物を適用する。しかしながら、植物の地上部に対して処置組成物を適用することも可能である。本発明者らは、配列番号１に対して９９％より高い−境界を除く−相同性を有するＤＮＡ配列を含む細菌−特にＣＮＣＭに寄託されたもののような株の細菌−を含む処置組成物が、植物の耕作地の基部の固形栄養分、特にリンの可溶化を向上させ、こうして、植物の栄養と施肥に有利に働くことを見出した。
【００６６】
植物の成長の刺激
有利には、本発明によれば、前記植物物質の成長を活性化するために、前記植物物質に対して前記処置組成物を適用する。
【００６７】
特に、有利には、本発明によれば、種子の発芽を活性化するように、種子に対して前記処置組成物を適用する。本発明者らは、種子−特にヒマワリの種又はトウモロコシの種−に対する栄養型及び／又は胞子型の細菌を含む本発明に係る処置組成物の適用が、ヒマワリ及びトウモロコシの種子の発芽と苗の成長を加速できることを見出した。
【００６８】
植物病原体の抑制
有利には、本発明によれば、少なくとも１つの標的微生物の増殖を阻害するために、前記植物物質に対して前記処置組成物を適用する。植物病原性の微生物（細菌又は真菌）からなる群より選択される標的微生物の増殖を阻害するために、前記植物材料に対して前記処置組成物を適用する。特に、有利には、本発明によれば、植物の葉の少なくとも一部に対して、前記処置組成物を適用する。処置組成物は、前記植物物質の治療処置組成物又は予防（又は防止）処置組成物であることができる。したがって、処置組成物を疾病の発症前にあらかじめ、又は疾病の発症後に適用する。
【００６９】
植物の自然の防御力の刺激
有利には、本発明によれば、前記植物物質の自然の防御力を刺激するために、前記植物物質に対して前記組成物を適用する。
【００７０】
本発明者らは、意外にも予期せぬことに、本発明に係る処置組成物が、植物の自己防衛メカニズムを刺激できること−特にイオン流及び／又は植物における防御化合物の合成を担うＰＲ−１（「Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−Ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  １」）遺伝子の発現を活性化できること−を見出した。
【００７１】
本発明は、
−  １６Ｓ  ｒＤＮＡと呼ばれる、配列番号１に１００％相同である細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む細菌、
−  配列番号１に１００％相同である１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む細菌が増殖した、前記細菌を実質的に含まない培養培地であって、配列番号１に１００％相同であるＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドを含む培養培地
からなる群より選択される少なくとも１つの生物学的因子であって、
細菌が、パスツール研究所ＣＮＣＭに対して寄託され、番号Ｉ−４４６７の下、２０１１年４月７日付で登録された株と同一の細菌、及びこの寄託された株の変異体細菌からなる群より選択される、
生物学的因子を含む、植物物質の処置組成物に及ぶ。
【００７２】
本発明は、そのような植物物質の処置組成物に及ぶ。
【００７３】
本発明者らは、以下のような本発明に係る処置組成物を見出した：
−  ミクロコッカス・ルテウス及び枯草菌のような、いくつかの細菌の増殖を遅らせる能力をもつ；
−  灰色かび病菌、ストレプトマイセス・スカビエス、フザリウム・クルモルム、フィチウム・ウルチムム、ファエモニエラ・クラミドスポラ、ファエモニエラ・アエロフィルム、エウティパ・ラタ、フォミチポリア・メジテラネア及びボトリオスフェリア・オブツサのような、いくつかの標的植物病原性微生物の増殖を遅らせる能力をもつ、そして；
−  例えば、ヒマワリやトウモロコシなどの栽培植物の成長の刺激効果を有する、そして；
−  栽培している植物の自然の防御力を刺激する能力をもつ。
【００７４】
特に、本発明者らは、本発明に係る処置組成物が、植物の自然の防御力の刺激活性を有すること、言い換えれば、植物病原性生物に対する防御遺伝子−例えばＰＲ−１−の植物における発現を活性化する能力をもつことを発見した。
【００７５】
有利には、本発明によれば、処置組成物は液体である。特に、処置組成物は環境温度で液体である。
【００７６】
有利には、本発明によれば、処置組成物は固体である。特に、処置組成物は環境温度で固体である。
【００７７】
有利には、本発明によれば、処置組成物は、処置する植物物質に対する適用を可能とするために、少なくとも１つの許容可能な（植物に許容される）賦形剤を含む。
【００７８】
本発明はまた、本発明に係る処置組成物、すなわち、
−  １６Ｓ  ｒＤＮＡと呼ばれる、配列番号１に１００％相同な細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む細菌、
−  配列番号１に１００％相同であるＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチド
からなる群より選択される、少なくとも１つの生物学的因子であって、
細菌が、パスツール研究所ＣＮＣＭに対して寄託され、番号Ｉ−４４６７の下、２０１１年４月７日付で登録された株と同一の細菌、及びこの寄託された株の変異体細菌からなる群より選択される、
生物学的因子を含む処置組成物の、農業におけるいかなる使用をも対象としている。
【００７９】
特に、本発明は、配列番号１のＤＮＡ配列を有する、ＣＮＣＭに寄託されたもののような株の少なくとも１つの細菌を含む、本発明に係る処置組成物の、農業におけるあらゆる用途を対象としている。
【００８０】
より詳細には、本発明は、
−  植物の成長を刺激するため、又は；
−  種子の発芽を刺激するため、又は；
−  植物の施肥処置のため、又は；
−  抗微生物処置−特に抗真菌処置又は抗菌処置−及び／又は抗植物ウイルス処置のため、又は；
−  植物の自然の防御力を刺激するため
のような処置組成物の使用を対象としている。
【００８１】
本発明は同様に、上記又は下記の特徴の全て又は一部の組み合わせを特徴とする、植物物質の処置方法、植物物質の処置組成物、及び、そのような処置組成物の農業における使用にも関する。
【００８２】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の説明、非限定的にのみ与えられている例示的な実施例、及び以下の添付の図面を読むことで明らかになるであろう：
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、本発明に係る処置組成物による処置の灰色かび病菌に対する保護／治療効果を示しているブドウの葉の対比写真を再現したものである（１ａ及び１ｂ）。
【図２】図２は、本発明に係る細菌による病原性真菌の増殖の阻害を示している写真を再現したものである。
【図３】図３は、本発明に係る細菌によるリン酸カルシウムの可溶化の例示的な写真を再現したものである。
【図４】図４は、本発明に係る液体組成物によるヒマワリの種の処置による、ヒマワリの苗の成長の刺激の例示的な写真を再現したものである。
【図５】図５は、本発明に係る液体組成物によるトウモロコシの種子の処置による、トウモロコシの苗の成長の刺激の例示的な写真を再現したものである。
【図６−６ｂ】図６ａ及び図６ｂは、本発明に係る細菌を含む液体組成物による、ナタネの実生の根の成長の刺激の例示的な写真を再現したものである。
【図７】図７は、本発明に係る組成物による植物の自然の防御力のＰＲ−１タンパク質の発現の刺激を示している、電気泳動ゲルの写真である。
【図８】図８は、カルシウム流の刺激に対する、本発明に係る組成物の効果をグラフにより表示したものである、そして；
【図９】図９は、植物のＰＲ−１遺伝子の発現に対する、本発明に係る組成物の効果をグラフにより表示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
番号Ｉ−４４６７の下でＣＮＣＭに寄託されたストレプトマイセス株は、ブドウの株の根圏の試料及び深部の根から単離した。土壌表面の下１０ｃｍから５０ｃｍのこの深部から採取された根圏の試料は、採取の表面部を除いて、密封した滅菌小袋に入れ、ストレプトマイセスの株の単離に先立ち＋４℃で保存した。
【００８５】
採取された試料は、３０分間、毎分２００回転の速度で磁気撹拌しながら、水３６ｍＬに試料４ｇの割合で、滅菌蒸留水中に懸濁させる。次に、得られた懸濁液を１０分間、５０℃の温度に置く。次いで、１０−７の希釈係数に従って、懸濁液を滅菌蒸留水で希釈する。この希釈液０．１ｍＬを、抗生物質としてナリジクス酸（１０ｍｇ／Ｌ）若しくはノボビオシン（２５ｍｇ／Ｌ）、並びに／又は抗真菌剤としてシクロヘキシミド（４０ｍｇ／Ｌ）を補充した固形寒天培地ＳＥＡ（「土壌抽出液寒天」）を含むペトリ皿に無菌的に塗布する。その後、ペトリ皿は、２１日間、インキュベーター中、３０℃の温度に置く。
【００８６】
塗布、光学顕微鏡による観察、及びその形態学的特徴の視覚的な認識により、放線菌を単離する。このようにして単離、精製された放線菌は、クローニングのためにベネット培地上に移す。単離されたコロニーは２ヶ月間、４℃で維持し、採取し、２０％の滅菌グリセロール中に懸濁させ、その後、−２０℃に置いて保存する。
【００８７】
識別する細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列を分析するために、前記細菌を液体培地中で培養し、それから、そのゲノムＤＮＡを抽出し、特に、ＰＣＲ（「ポリメラーゼ連鎖反応」）により、以下を用いたＰＣＲによって１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を選択的に増幅させる：
−  以下の配列番号２の配列のユニバーサルプライマー「２７ｆ」：
「ａｇａｇｔｔｔｇａｔ  ｃｃｔｇｇｃｔｃａｇ」、及び；
−  以下の配列番号３の配列のユニバーサルプライマー「１４９２ｒ」：
「ｇｇｔｔａｃｃｔｔｇ  ｔｔａｃｇａｃｔｔ」。
【００８８】
次いで、当業者に公知の任意の方法により、１６Ｓ  ｒＤＮＡのシークエンシングを行い、得られた１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列を配列番号１の配列と比較する。
【００８９】
これを行うには、識別する細菌を３０℃で５日間、１００ｍＬの液体ＩＳＰ−２培地（「ＩＳＰ培地２、国際ストレプトマイセスプロジェクト酵母麦芽エキス寒天」）中で撹拌培養する。得られた菌糸体と培養培地を遠心によって分離し、再蒸留水で２回洗浄する。菌糸体の溶解は環境温度で１０分間、５００μｌの溶解バッファー（４００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、６０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳ、ｐＨ８．０）中で行う。次に、６０ｍＬの５Ｍ酢酸カリウム、１１．５ｍＬの氷酢酸及び２８．５の蒸留水の混合により得られる溶液（ｐＨ４．８）１５０μＬを溶解液に加え、強く撹拌する。得られた溶解液を１００００ｇで１分間、遠心する。再度１００００ｇ、１分間の遠心工程を行い、上清を回収する。上清を回収し、これに等量のイソプロパノールを加える。撹拌後、１００００ｇで２分間、遠心する。沈殿したＤＮＡは、３００μＬの７０％エタノールで洗浄し、遠心し、その後、風乾し、５０μＬの滅菌再蒸留水に溶解させる。
【００９０】
キット（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、以下の熱プロファイルに従い、ＰＣＲを行う（「テクネタッチジーンＰＣＲサーマルサイクラー」）：
−  ９８℃で３分間、変性；
−  「Ｔａｑポリメラーゼ」の添加；
−  以下を含む３０サイクルの増幅：
■  ９４℃で１分間の加熱段階、続いて；
■  ５２℃で１分間の加熱段階、続いて；
■  ７２℃で２分間の加熱段階、続いて；
−  ７２℃で１０分間の伸長段階。
【００９１】
ＰＣＲ産物をゲル電気泳動によって分析、検出し、紫外光下で臭化エチジウムによって回収する。その後、識別する細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列を配列番号１の配列と比較する。
【００９２】
本発明に係る植物物質の処置方法の第１の変形形態の第１の実施態様では、番号Ｉ−４４６７の下でＣＮＣＭに寄託された株の細菌又は配列番号１の配列を有する少なくとも１つのその変異体の接種による培養培地、例えば、液体培養培地若しくは固形培養培地の播種により、配列番号１に対して９９％より高い−境界を除く−相同性を有するＤＮＡ配列を有する、少なくとも１つの栄養型の細菌を含む処置組成物を調製する。培養培地は、完全培地（又は経験培地）、すなわち、ＣＮＣＭに寄託された株の細菌の増殖のために必要な全ての要素を含む不定の富栄養培地であり得る。ＣＮＣＭに寄託された細菌の一定量の種菌を２０倍量の完全培地に播種する。培養を撹拌しながら５日間、３０℃の温度に維持する。
【００９３】
栄養型の細菌を含む処置組成物の製造のための、そのような完全培地は、例えば、ｐＨ７．２でＤ−グルコース、酵母抽出物、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、塩化カリウム（ＫＣｌ）及びグリセロールを含む。
【００９４】
本発明に係る植物物質の処置方法の第１の変形形態の第２の実施態様では、番号Ｉ−４４６７の下、ＣＮＣＭに寄託された株の細菌又はその変異体の１つの接種による胞子形成培地の播種により、配列番号１に対して１００％相同であるＤＮＡ配列を有する、少なくとも１つの胞子型の細菌を含む処置組成物を調製する。胞子形成培地は、例えば、ｐＨ７．２でＤ−グルコース、酵母抽出物、ペプトン、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）及び蒸留水を含む培地であり得る。培養を６日間、３０℃の温度に維持する。
【００９５】
本発明に係る植物物質の処置方法の第２の変形形態では、第１の実施態様に係る培養培地又は第２の実施態様に係る胞子形成培地の遠心により、細菌及び／又は胞子が実質的に排除されている無細胞組成物を調製する。
【実施例】
【００９６】
実施例１  −  施肥
ＣＮＣＭに寄託されたような株に一致する本発明に係る細菌は、培養培地の固形栄養素−特にリン−の可溶化を促進する。本発明者らは、リン酸カルシウム粉末によって不透明化された固形寒天培地９において、本発明に係る細菌のコロニー２を取り囲む半透明の光輪１０の形成を観察した（図３）が、これは、細菌によるリン酸カルシウムの可溶化を証明している。本発明に係る細菌は、植物により吸収されない固形施肥製品の−植物の根圏における−溶解を増大させ、植物の栄養を改善することができる。
【００９７】
実施例２  −  ヒマワリ及びトウモロコシの成長の刺激
本発明に係る細菌の栄養型の細胞と胞子を含む、本発明に係る液体組成物を調製し、ヒマワリの種子とトウモロコシの種子に対して薄膜コーティングによって適用する。液体組成物は、組成物１リットル当たり１から２ｇの細菌を含むが、ここで細菌の質量は、細菌の湿重量である。並行して、本発明に係る組成物によって処置していない対照として、ヒマワリ（図４ａ）及びトウモロコシ（図５ｃ）の種まきと苗の栽培を行う。また、本発明者らは、ヒマワリの苗（図４ｂ）及びトウモロコシの苗（図５ｄ）の初期の成長の刺激も観察した。種子に対して適用した本発明に係る細菌は、ヒマワリやトウモロコシのような植物の成長−特に植物の地上部の成長−を刺激することができる。
【００９８】
実施例３  −  灰色かび病菌に対するブドウの葉の保護
ＣＮＣＭに寄託された本発明に係る株の胞子のブドウの葉への適用は、前処理されたブドウの葉に対して、灰色かび病菌の症状（図１ｂで灰色の模様１によって表されている、葉の茶色の斑点）の出現を予防／排除することができる。本発明に係る細菌の胞子の組成物で前処理し（図１ａ）、又は処理せず（図１ｂ）、灰色かび病菌に感染させたブドウの葉の写真を再現したものを図１に示す。また、このような適用は、ブドウの葉に対して後で適用された灰色かび病菌の胞子の発芽とその増殖も阻止できる。
【００９９】
実施例４  −  標的微生物の増殖の阻止
ＣＮＣＭに寄託された株の細菌を固形寒天ベネット培地に播種し、固体処理組成物を形成するように、この播種した培地を５日間、３０℃に置く円筒法（Bauer等, 1996）により、標的微生物の増殖の阻止活性を測定し、定量する。固体処理組成物の円筒形の断片、例えば、直径６ｍｍの円筒形の断片を採取し、標的微生物、例えば、植物病原性の標的微生物を播種した培養培地の表面に、この円筒形の断片を置く。標的微生物の培養培地は、例えば、植物病原性真菌用のＰＤＡ（「ポテトデキストロース寒天」）培地又は植物病原性細菌用のベネット培地であり得る。標的微生物を播種した培地における本発明に係る細菌の培養培地の化合物の拡散を可能とするように、標的微生物を播種した培養培地の表面に４℃で４時間、円筒形の断片を維持する。
【０１００】
標的微生物を播種した培地を４８時間、３０℃に置く。標的微生物の増殖阻止領域の直径を測定する。
【０１０１】
本発明に係る固体処理組成物は、植物病原性の細菌及び／又は真菌の増殖に対する阻害活性を有する。微生物の増殖に対する固体処理組成物の活性スペクトルを以下の表３に示すが、ここで、記号（−）は阻止活性がないことに対応し、記号（＋）は１０ｍｍから１５ｍｍの阻止直径に対応し、記号（＋＋）は１５ｍｍから２０ｍｍの阻止直径に対応し、そして、記号（＋＋＋）は２０ｍｍより大きい阻止直径に対応している。
2016538874.tif 000005
【０１０２】
これらの条件において、本発明に係る株による、灰色かび病菌株の菌糸増殖の阻止直径は２８ｍｍであり、フザリウム・クルモルム株の菌糸増殖の阻止直径は３０ｍｍであり、フィチウム・ウルチムム株の菌糸増殖の阻止直径は２６ｍｍである。本発明に係る細菌は、有利には、例えば、ファエモニエラ・クラミドスポラ、ファエモニエラ・アエロフィルム、エウティパ・ラタ、フォミチポリア・メジテラネア及びボトリオスフェリア・オブツサのようなブドウの植物病原性因子の増殖の阻止能を有する。
【０１０３】
ＣＮＣＭに寄託された株の細菌を含む固体処理組成物は、細菌性又は真菌性の植物病原性因子の増殖を制限することができる。
【０１０４】
図２には、ＣＮＣＭに寄託された本発明に係る株の細菌２による、ブドウの木の病原性因子として選択されたファエモニエラ・クラミドスポラ真菌の菌糸８の増殖の阻止距離が大きいことが、本発明に係る株とは別のコレクション株３、４及び５によるファエモニエラ・クラミドスポラ真菌の菌糸８の増殖の阻止との比較で視覚化されている。コレクション株７及び８が、病原性因子の菌糸８の増殖を阻止しないことは注目に値する。本発明に係る細菌は、細菌性又は真菌性の植物病原性因子の増殖を制限することができる。
【０１０５】
実施例５  −  シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の自然の防御力の刺激（ＳＤＮ）
株の増殖を可能とするのに十分な期間の間、胞子の生成を促進するのに適合した欠乏性液体培地中において、番号Ｉ−４４６７の下でＣＮＣＭに寄託された株のストレプトマイセス属の細菌を培養する。前培養１リットル当たり１から２ｇの細菌を含む、定常増殖期の前培養が得られるが、ここで細菌の質量は、細菌の湿重量である。その後、１体積の前培養を１００体積の水において希釈することによって、本発明に係る処置組成物を形成させる。シロイヌナズナの実生の根を本発明に係る細菌を含む処置組成物と接触させ、それから、植物病原性因子として灰色かび病菌の胞子懸濁液（１０５コロニー形成単位（「ｃｆｕ」）の濃度）をあらかじめ播種したガンボーグＢ５寒天培地に前記実生を植え付ける。植え付けた培養培地を２５℃の部屋に置く。
【０１０６】
１週間後、本発明に係る細菌を含む処置組成物によるシロイヌナズナの実生の本発明に係る予防処置は、灰色かび病菌の発芽を予防すること（浸透性の効果）、及び、灰色かび病菌に対するシロイヌナズナの実生の自然の防御力を刺激することによって、灰色かび病菌の影響を予防できることが確認される。対照として、灰色かび病菌の胞子懸濁液をあらかじめ播種したガンボーグＢ５寒天栄養培地上で、本発明に係る処置組成物で処置していないシロイヌナズナの実生を培養する。
【０１０７】
ＲＴ−ＰＣＲによりシロイヌナズナの実生の防御遺伝子、特に植物における抗真菌化合物の合成に関与するＰＲ−１遺伝子の発現を測定する。シロイヌナズナの実生の培養の１０日後に、シロイヌナズナの実生の遺伝子活性化を分析する。これを行うには（対照及び本発明に係る予防処置の）実生のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を抽出し、これらのｍＲＮＡを「ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）」ＩＩ  ＲＮＡｓｅ  Ｈ逆転写酵素キット（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳＡ）とオリゴ（ｄＴ）２２プライマーを用いてｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）へと変換する。
【０１０８】
以下の特異的プライマーを用いたＰＣＲにより、ＰＲ−１に特異的なｃＤＮＡを増幅する：
−  以下の配列番号４の配列の「ＰＲ−１  ｆ」：
５’−ＣＴＧＧＣＴＡＴＴＣＴＣＧＡＴＴＴＴＴＡＡＴＣＧ−３’、及び；
−  以下の配列番号５の配列の「ＰＲ−１  ｒ」：
５’−ＴＣＣＴＧＣＡＴＡＴＧＡＴＧＣＴＣＣＴＴＡＴＴＧ−３’。
【０１０９】
加えて、発現の対照として、以下の特異的プライマーを用いたＰＣＲにより、ＥＦ−１αＡ４遺伝子（Liboz等, (1990), Plant Mol. Biol, 14, 107-110. The four members of the gene family encoding the Arabidopsis thaliana translation elongation factor EF-1α are actively transcribed）に特異的なｃＤＮＡを増幅する：
−  以下の配列番号６の配列の「ＥＦ−１ｆ」：
５’−ＡＴＧＣＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＴＴＣＡ−３’、及び；
−  以下の配列番号７の配列の「ＥＦ−１ｒ」：
５’−ＴＴＧＧＣＧＧＣＡＣＣＣＴＴＡＧＣＴＧＧＡＴＣＡ−３’。
【０１１０】
ＰＣＲ産物はゲル電気泳動により分析し、臭化エチジウムの存在下、紫外光下で可視化させる。結果を図７に示す。処置組成物により処置されたシロイヌナズナの実生におけるＰＲ−１遺伝子の発現（Ａ２）の刺激を、処置組成物により処置しておらず、ＰＲ−１の発現が検出不能である対照のシロイヌナズナの実生（Ａ１）と比較して、観察する。
【０１１１】
処置組成物により処置していないシロイヌナズナの実生（Ｂ３）と比較して、処置組成物により処置されたシロイヌナズナの実生（Ｂ４）におけるＰＡＬ１遺伝子の発現（Ｂ）の刺激が観察されるが、ここで前記ＰＡＬ１遺伝子は、植物の自然の防御力の刺激のための分子マーカー及び陽性対照となることが知られている。
【０１１２】
ＥＦ１αＡ４遺伝子（遺伝子発現レベルの正規化のための陰性対照）について、ストレプトマイセス属の細菌で処置していないシロイヌナズナの実生（Ｃ５）と、ストレプトマイセス属の細菌で処置したシロイヌナズナの実生（Ｃ６）で、実質的に変化していない発現が観察される。
【０１１３】
ストレプトマイセス属の細菌によるシロイヌナズナの処置は、ＰＲ−１遺伝子の活性化、植物抗生物質の産生、フィトアレキシン及び植物細胞壁を強化する化合物の産生を導く。
【０１１４】
実施例６  −  シロイヌナズナの自然の防御力の刺激（ＳＤＮ）  −  カルシウム流の刺激
実施例５に記載の前培養の１０倍又は１００倍の希釈により得られる処置組成物による、シロイヌナズナの実生の処置により誘導されるカルシウム流を発光によって測定する。結果を図８に示す。１００倍希釈した処置組成物（Ｂ）による処置の２０分後、水による処置（Ａ）に対して２．７倍のカルシウム流の増加が観察される。
【０１１５】
また、１０倍希釈した処置組成物（Ｄ）による処置の２０分後、水による処置（Ａ）に対して１１．６倍、病原性卵菌フィトスポラ・パラシチカ（Ｐｈｙｔｏｓｐｏｒａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）の壁抽出物を含む植物の自然の防御の誘導の陽性対照（Ｃ）による処置に対して２．３倍のカルシウム流の増加が観察される。
【０１１６】
本発明に係る１０倍又は１００倍希釈の処置組成物は、植物の自然の防御の初期段階を活性化させる。
【０１１７】
実施例７  −  本発明に係る処置組成物による処置の４８時間後におけるＰＲ−１の発現
実施例５に記載されているような１００倍希釈の処置組成物による処置から４８時間後に、トランスジェニックシロイヌナズナモデルのＰＲ−１遺伝子の発現レベルを蛍光定量によって分析する。結果を図９に示す。水で処置した植物（Ａ）のＰＲ−１遺伝子の発現レベルに対して１６倍、病原性卵菌フィトスポラ・パラシチカの壁抽出物を含む植物自然防御の誘導の陽性対照（Ｂ）により処置した植物のＰＲ−１遺伝子の発現レベルに対して４．４倍の、１００倍希釈した本発明に係る処置組成物（Ｃ）により処置した植物のＰＲ−１遺伝子の発現レベル（タンパク質１ｍｇ当たりの蛍光単位で表される）の増加が観察される。
【０１１８】
実施例８  −  コレトトリカム・ヒッギンシアナム（Colletotrichum higginsianum）に対するシロイヌナズナの実生の保護
シロイヌナズナの実生へのコレトトリカム・ヒッギンシアナムによる感染に対する、本発明に係る無細胞性組成物により与えられる保護を発光により評価する。前培養１ｍＬあたり１ｍｇのバイオマスを含む本発明に係る細菌の前培養の１０倍希釈により、本発明に係る無細胞性組成物を調製する。本発明に係る無細胞性組成物のサーミゼーション処理を行う（９０℃で１５分）。３週齢のシロイヌナズナの実生に対して、このサーミゼーション処理した無細胞性組成物を４８時間適用し、それから、実生にコレトトリカム・ヒッギンシアナムを接種する。陰性対照（２０００ｒｆｕ）に対して改善（１６００ｒｆｕ）したコレトトリカム・ヒッギンシアナムに対する保護が観察される。サーミゼーション処理された無細胞性組成物によって与えられる保護は、サーミゼーション処理されていない無細胞性組成物によって与えられる保護と実質的に同等である。
【０１１９】
本発明が多くの実施態様の変形及び応用の対象となり得ることは言うまでもない。
【０１２０】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年5月28日(2015.5.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  ストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の細菌であって、１６Ｓ  ｒＤＮＡと呼ばれる配列番号１に１００％相同である前記細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む細菌、
−  配列番号１に１００％相同である１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む細菌が増殖したが、前記細菌を実質的に含まない培養培地であって、配列番号１に１００％相同であるＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドを含む培養培地
からなる群より選択される少なくとも１つの生物学的因子を含む処置組成物を適用する植物物質の処置方法であって、
前記細菌が、パスツール研究所のＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ）に対して寄託され、番号Ｉ−４４６７の下、２０１１年４月７日付で登録された株と同一の細菌、及びこの寄託された株の変異体細菌からなる群より選択される、植物物質の処置方法。
【請求項２】
植物物質が、栽培中の植物、収穫後の果実若しくは野菜、植物の種子の全体又は一部からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分割された状態の固形の栄養分をさらに含む処置組成物を使用することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記植物物質の成長を活性化するために、前記植物物質に対して前記処置組成物を適用することを特徴とする、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの標的微生物の増殖を阻害するために、前記植物物質に対して前記処置組成物を適用することを特徴とする、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記植物物質の自然の防御力を刺激するために、前記植物物質に対して前記処置組成物を適用することを特徴とする、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
−  ストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の細菌であって、１６Ｓ  ｒＤＮＡと呼ばれる配列番号１に１００％相同である前記細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む細菌、
−  配列番号１に１００％相同である１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む細菌が増殖したが、前記細菌を実質的に含まない培養培地であって、配列番号１に１００％相同であるＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドを含む培養培地
からなる群より選択される、少なくとも１つの生物学的因子を含む組成物であって、
前記細菌が、パスツール研究所のＣＮＣＭに対して寄託され、番号Ｉ−４４６７の下、２０１１年４月７日付で登録された株と同一の細菌、及びこの寄託された株の変異体細菌からなる群より選択される、組成物。
【請求項８】
液体であることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
固体であることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
処置すべき植物物質に対する適用を可能とするために、許容可能な少なくとも１つの賦形剤を含むことを特徴とする、請求項７から９の何れかに一項記載の組成物。
【請求項１１】
請求項７から１０の何れか一項に記載の組成物の農業における使用。
【請求項１２】
植物の成長を刺激するための、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
種子の発芽を刺激するための、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
植物の施肥処置のための、請求項１１に記載の使用。
【請求項１５】
植物の抗微生物処置及び／又は抗ウイルス処置のための、請求項１１に記載の使用。
【請求項１６】
植物の自然の防御力を刺激するための、請求項１１に記載の使用。
【国際調査報告】
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