(57)【要約】  白血病を処置するための薬物の調製におけるアルテメテルの使用が開示される。その薬物は、アルテメテル注射剤又は凍結乾燥された注射剤であり、重量比１：３０〜７０のアルテメテル及び水溶性シクロデキストリン誘導体から調製される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
白血病を処置するための医薬の調製におけるアルテメテルの使用。
【請求項２】
医薬が、アルテメテル注射剤又は注射用凍結乾燥粉末であることを特徴とする、請求項１記載の使用。
【請求項３】
アルテメテル注射剤又は注射用凍結乾燥粉末が、重量比１：３０〜７０のアルテメテル及び水溶性シクロデキストリン誘導体からなることを特徴とする、請求項２記載の使用。
【請求項４】
水溶性シクロデキストリン誘導体が、様々な置換度のα−シクロデキストリン誘導体、β−シクロデキストリン誘導体及びγ−シクロデキストリン誘導体の１つ以上を含むことを特徴とする、請求項２記載の使用。
【請求項５】
β−シクロデキストリン誘導体が、メチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、チオエーテル−β−シクロデキストリン及びスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンの１つ、又はその組み合わせを含むことを特徴とする、請求項４記載の使用。
【請求項６】
アルテメテル注射剤又は注射用凍結乾燥粉末が、アルテメテルが低温粉砕器中にて０℃〜１０℃で粉砕され、粉砕されたアルテメテルが５０℃〜９０℃の水溶性シクロデキストリン誘導体水溶液中に添加され、アルテメテルを溶解するために撹拌され、次に注射剤の従来工程により処理又は凍結乾燥されて最終製品が得られる段階を含む方法によって調製されることを特徴とする、請求項３〜５のいずれか一項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、医学の分野、特に白血病を処置するための医薬の調製におけるアルテメテルの使用に関する。
【０００２】
発明の背景
白血病は、クローニングでの白血病細胞が成熟細胞にさらに分化することで種々の細胞発生段階に残る能力を失った、異常な造血幹細胞を有する悪性疾患である。骨髄及び他の造血組織において、多数の白血病細胞が他の器官及び組織中に増殖、蓄積及び浸潤することによって正常な造血を阻害する。白血病の臨床徴候には、貧血、出血及び様々な浸潤器官の症状が含まれる。この疾患は、子供における主要な悪性疾患であるが、その原因はまだ十分には理解されていない。ウイルスが重要な病原因子であり得るのに対して、放射線、化学毒素又は薬物、遺伝的素因などの多数の他の因子が病原性補因子であり得る。増殖中の細胞の種類に応じて、本疾患は、顆粒球白血病、リンパ性白血病及び単球性白血病の３種類に分類することができる。
【０００３】
近年の研究から、抗マラリア薬であるアルテミシニン及びその誘導体が、顕著な抗腫瘍活性を表すことが示され、したがって、それらの薬理作用に関する研究は広く注目された。アルテメテルは、アルテミシニンの主誘導体の１つであり、アルテミシニンよりも良好な抗マラリア活性を表す。最近のますます多くの実験から、アルテミシニン系薬物が、より広い薬理作用を有することが実証され、そして、それらの薬物が様々な腫瘍細胞を選択的に阻害及び／又は殺滅でき、ほとんど副作用を有さず、さらに薬物耐性も招かないことが、より重要である。アルテミシニン系薬物の抗腫瘍活性は、多数の態様で確認されており、その主な作用機序は以下の通りである。
【０００４】
１．  鉄イオンによって媒介される細胞損傷：悪性腫瘍細胞は正常細胞よりも高いＦｅ含量を有する。アルテミシニン系薬物は、鉄イオンの媒介によりエンドペルオキシド架橋を形成し、活性酸素種（ＲＯＳ）及び炭素中心フリーラジカルを産生することができるが、ここで、後者は大きな分子損傷及び細胞死を引き起こす。
【０００５】
２．  細胞周期の停止：アルテスナートは、カポジ肉腫の細胞周期を顕著に減速することができ、ジヒドロアルテミシニンは、ヒト乳ガンＭＣＦ−７細胞をＧ０＋Ｇ１期に停止し得る。
【０００６】
３．  アポトーシスを誘導：アルテスナートは、カポジ肉腫のアポトーシスを用量依存的に誘導することができるが、正常細胞のアポトーシスを誘導することはできない。アルテミシニンは、膜内外電位差を減少させることによってヒト赤白血病Ｋ５６２細胞のアポトーシスを誘導することができる。
【０００７】
４．  血管新生阻害作用：アルテミシニン系薬物は、ＶＥＧＦ及びＫＤＲ／ｆｌｋ−１の発現を阻害することによって腫瘍の新血管新生を防止することができる。
【０００８】
５．  アルテミシニン系薬物は、腫瘍関連遺伝子の発現を調節することによって抗腫瘍活性を達成することができる。
【０００９】
６．  その他：例えば、アルテスナートは、多剤耐性に対する能力を有する。アルテミシニンは、星状細胞腫Ｔ６７細胞における核因子ＮＦ−κＢの合成を阻害することができる。さらに、アルテメテルは、ミトコンドリアの損傷及び膨張、クリステの破損、減少及び消失を誘導する場合があり、同様にミトコンドリア呼吸鎖複合体Ｉ及びＩＶの活性を阻害し、それによって細胞死を招く。
【００１０】
発明の概要
本発明の目的は、白血病を処置するための医薬の調製におけるアルテメテルの使用を提供することである。
【００１１】
好ましくは、該薬物は、アルテメテル注射剤又は注射用凍結乾燥粉末である。
【００１２】
本発明のアルテメテル注射剤又は注射用凍結乾燥粉末は、重量比１：３０〜７０のアルテメテル及び水溶性シクロデキストリン誘導体からなる。水溶性シクロデキストリン誘導体は、様々な置換度のα−シクロデキストリン誘導体、β−シクロデキストリン誘導体、γ−シクロデキストリン誘導体などの１つ以上を含む。β−シクロデキストリン誘導体は、メチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、チオエーテル−β−シクロデキストリン、及びスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンの１つ以上、又はその組み合わせを含む。
【００１３】
アルテメテル注射剤又は注射用凍結乾燥粉末の調製方法は、アルテメテルが低温粉砕器中にて０℃〜１０℃で粉砕され、粉砕されたアルテメテルが５０℃〜９０℃の水溶性シクロデキストリン誘導体水溶液中に添加され、アルテメテルを溶解するために撹拌され、次に注射剤の従来工程により処理又は凍結乾燥されて最終製品が得られる段階を含む。
【００１４】
本出願のアルテメテル注射剤又は注射用凍結乾燥粉末は、従来の粉砕技法において局所的な過度の温度によって起こるアルテメテルの分解を避けて、低温（０℃〜１０℃）での微粒子化技法によって調製される。アルテメテルは、粒子径に応じて異なる群に分類され、試験され、その結果は、同じ温度では粒子径が増加するほどアルテミシニン誘導体の溶解速度が減少することを示す。粒子径が３１５gmを超える場合、調製温度は７０℃〜９０℃である。微粒子化されたアルテメテル薬物は、０．５μm〜０μmの範囲、最適には１．０μm〜１０μmの範囲の粒子径を有する。調製温度の上昇はアルテメテルの溶解を促進し、最適調製温度は５０℃〜６０℃であり、この温度は、該薬物の分解、酸化などを低下させ得る。
【００１５】
本発明者らは、多数の実験により、高用量１００mg/kgで３週間（５回／週、合計１５回）投与されたアルテメテル注射用凍結乾燥粉末が、Ｋ５６２ヌードマウス移植腫瘍モデルの成長に有意な阻害効果を表し、３週間投与後に阻害比率が６８％〜８０％（Ｐ＜０．０１）に達したことを実証した。中用量６０mg/kgで３週間（それぞれ合計１５回及び２１回）投与されたアルテメテル注射用凍結乾燥粉末について、阻害比率はそれぞれ３１％及び５６％（Ｐ＞０．０５及びＰ＜０．０１）に達した。アルテメテル注射用凍結乾燥粉末が低用量４０mg/kgで３週間投与された場合、１５回投与で有意な阻害は見いだされず、２１回投与で阻害比率は５５％（Ｐ＜０．０１）であった。アルテメテルがそれぞれ用量１００mg/kg、６０mg/kg及び４０mg/kgで３週間（１週間に５日投与及び２日休薬、合計１５回）投与された場合、薬物蓄積により死亡する動物は見られなかった。
【００１６】
以上の結果は、アルテメテル注射剤又は注射用凍結乾燥粉末が、１００mg/kg及び６０mg/kgの２用量でＫ５６２ヌードマウス移植腫瘍モデルの成長に有意な阻害効果を表し、阻害比率が６０％〜８０％（Ｐ＜０．０１）に達し得ることを示している。結果は、アルテメテルが白血病に有意な治療効果を有し、陽性対照としてのシクロホスファミドに近い阻害比率を有し、したがって新しい潜在的抗腫瘍薬であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、予備試験での投与４週間後の各群の担腫瘍動物における腫瘍サイズを示す。
【図２】図２は、予備試験での投与４週間後の各群の動物の腫瘍サイズを示す。
【図３】図３は、実験１での投与４週間後の各群の担腫瘍動物における腫瘍サイズを示す。
【図４】図４は、実験１での投与４週間後の各群の動物の腫瘍サイズを示す。
【図５】図５は、実験２での投与４週間後の各群の担腫瘍動物における腫瘍サイズを示す。
【図６】図６は、実験２での投与４週間後の各群の動物の腫瘍サイズを示す。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、白血病を処置するための医薬の調製におけるアルテメテルの使用を開示する。当業者は、本発明を達成するために、本明細書開示による工程においてパラメーターを適切に改変することができる。類似の交換及び改変の全ては、当業者に明白であり、したがって本発明に含まれると考えられることに留意すべきである。本発明の使用は、実施例によって説明されている。本発明の製品及び使用の変更、改変又は適切な組み合わせは、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく当業者に明白であろう。
【００１９】
当業者に本発明をより十分に理解させるために、以下に実施例と共に本発明を詳細にさらに例示する。
【００２０】
実施例：白血病に対するアルテメテルの治療効果
本発明者らは、Ｋ５６２ヌードマウス移植腫瘍に対する異なる用量のアルテメテルの治療効果を観察した。結果は、高用量１００mg/kg及び６０mg/kgで１５回投与されたアルテメテルが担腫瘍マウスにおいて腫瘍の成長を有意に阻害でき、用量４０mg/kgで２１回投与されたアルテメテルも有意な阻害効果を表すことを示している。実験結果は、アルテメテルがヒト白血病Ｋ５６２ヌードマウス移植腫瘍の成長を阻害でき、したがって有意な抗腫瘍活性を有することを示している。
【００２１】
１．  研究の目的：ヌードマウスにおいてＫ５６２ヌードマウス移植腫瘍モデルを樹立し、ヌードマウス移植腫瘍の成長に対するアルテメテルの阻害効果を観察すること。
【００２２】
２．  実験材料：
２．１  被験薬物：アルテメテル注射用凍結乾燥粉末、ロット番号：２００９０９０３。調製方法は、アルテメテルが低温粉砕器中にて０℃〜１０℃で粉砕され、粉砕されたアルテメテルが５０℃〜９０℃の水溶性シクロデキストリン誘導体水溶液中に添加され、アルテメテルを溶解するために撹拌され、次に注射剤の従来工程により処理又は凍結乾燥されて最終製品が得られる段階を含むが、但し、アルテメテルと水溶性シクロデキストリン誘導体との重量比は１：３０〜７０である。
【００２３】
２．２  対照：
２．２．１  陰性対照：２０％賦形剤水溶液を陰性対照として使用する。
２．２．２  陽性対照：シクロホスファミド（LIAN HUA Pharmaceutical Factory, Shanghai, China）、ロット番号：１００２２３２１。
【００２４】
２．３  ビヒクル：２０％賦形剤水溶液。
【００２５】
２．４  Ｋ５６２細胞：プライマリーＫ５６２細胞は白血病を有する患者の骨髄から得られ、海外からBlood Research Instituteによって導入され、Pathologic Cell Bankで保管及び継代され、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ウシ胎児血清を含む）中で培養された。
【００２６】
２．５  実験装置
２．５．１  従来の細胞培養装置。
２．５．２  セシウム線源照射ユニット：NORDION Corp., Canada。
２．５．３  ＩＩＩクラス（ＳＰＦ）動物実験室。
【００２７】
２．６  実験動物：Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス、４〜５週齢、体重：１７〜２０ｇ、性別：雄半数及び雌半数、Chinese Academy of Medical SciencesのExperimental Animal Instituteの実験動物認証番号：ＳＣＸＫ（ＪＩＮＧ）２００５−００１３。
２．７  環境条件並びに飼育及び管理：ヌードマウスの実験は、Chinese Academy of Medical SciencesのBlood Research InstituteにてＳＰＦ条件下で行われる。実験動物施設許可番号：ＳＹＸＫ（ＪＩＮ）２００９−０００２。飼料：オートクレーブ済みマウス飼料、Vitalriver Technologies. Ltd.製標準品：GB14924.2-2001；ロット番号：２００９１１０。水：逆浸透精製された滅菌水。床敷：モミの木及びイトスギの混合の細かい削り屑を篩にかけて微塵を除き、使用のためにオートクレーブにかける。給餌：雄性及び雌性マウスをケージ１個につき５匹ずつ異なるケージに収容し、摂取に応じて飼料を加え、水を自由に与える。ケージを清掃後にオートクレーブにかけ、ケージ及び床敷は２週間毎に交換する。ハウスを１週間に２回、過酢酸及びブロモ−ゲラミンで交互に滅菌する。
【００２８】
３．  実験手順
３．１  予備試験：
３．１．１  Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにプライマリーＫ５６２細胞を皮下接種後、３．０Gy全身照射に供した。接種の約４週間後に、成長中の腫瘍塊を取り出し、正常なマウスに移植し、この工程を２〜３回の継代の間繰り返して高腫瘍形成性Ｋ５６２細胞系を樹立した。
３．１．２  ヌードマウスにＫ５６２細胞を皮下接種後、３．０Gy全身照射に供した。接種の１週間後に、視認可能な腫瘍を有するヌードマウスを、それぞれ６匹からなる以下の４群に分けた。以下の用量を１週間に７回、連続する３週間にわたり合計２１回投与した。
モデル対照群：２０％賦形剤水溶液を０．２ml/匹で腹腔内注射。
高用量群：アルテメテルを１５０ml/kgで腹腔内注射。
中用量群：アルテメテルを１００ml/kgで腹腔内注射。
低用量群：アルテメテルを５０ml/kgで腹腔内注射。
【００２９】
３．２  実験１：
ヌードマウスにＫ５６２細胞を皮下接種後、３．０Gy全身照射に供した。接種の１週間後に、視認可能な腫瘍を有するヌードマウスを、それぞれ６匹からなる以下の５群に分けた。以下の用量を１週間に５回、連続する３週間にわたり合計１５回投与した。
モデル対照群：２０％賦形剤水溶液を０．２ml/匹で腹腔内注射。
陽性対照群：シクロホスファミドを１０ml/kgで腹腔内注射。
高用量群：アルテメテルを１００ml/kgで腹腔内注射。
中用量群：アルテメテルを６０ml/kgで腹腔内注射。
低用量群：アルテメテルを４０ml/kgで腹腔内注射。
【００３０】
３．３  実験２：
ヌードマウスにＫ５６２細胞を皮下接種後、３．０Gy全身照射に供した。接種の１週間後に、視認可能な腫瘍を有するヌードマウスをそれぞれ６匹のヌードマウスからなる以下の５群に分けた。
モデル対照群：２０％賦形剤溶液を０．２ml/匹で腹腔内注射。該用量を１週間に７回、３週間にわたり合計２１回投与した。
陽性対照群：シクロホスファミドを１０ml/kgで腹腔内注射。該用量を１週間に７回、３週間にわたり合計２１回投与した。
高用量群：アルテメテルを１００ml/kgで腹腔内注射。該用量を１週間に５回、３週間にわたり合計１５回投与した。
中用量群：アルテメテルを６０ml/kgで腹腔内注射。該用量を１週間に７回、３週間にわたり合計２１回投与した。
低用量群：アルテメテルを４０ml/kgで腹腔内注射。該用量を１週間に７回、３週間にわたり合計２１回投与した。
【００３１】
４．  実験結果
４．１  予備試験の結果を表１〜３及び図１〜２に要約する。
【００３２】
【表１】
2016500116.tif 000002
【００３３】
【表２】
2016500116.tif 000003
【００３４】
【表３】
2016500116.tif 000004
【００３５】
腫瘍細胞のアポトーシスに及ぼす薬物の効果：予備試験の結果（表３）から、対照群におけるアポトーシス比率は処置群よりも高いように見える。実際、これは、対照群の腫瘍の方が迅速に成長し、大きな体積を有し、したがって、より有意な壊死を有するからである。本発明者らの経験により、インビトロ試験とは異なり、インビボ試験で、薬物は腫瘍の成長を阻害し、実験群において遅い腫瘍成長及び小さな腫瘍質量を示す。しかし、薬物によって阻害されない細胞は、対照群における腫瘍質量とあまり変わらない腫瘍質量を形成する。したがって、メカニズム研究においては、インビボ腫瘍細胞は使用されるべきでなく、インビトロ試験が好ましい。
【００３６】
４．２  実験１の結果を表４〜５及び図３〜４に要約する。
【００３７】
【表４】
2016500116.tif 000005
【００３８】
【表５】
2016500116.tif 000006
【００３９】
上記の結果は、アルテメテルがそれぞれ用量１００mg/kg、６０mg/kg及び４０mg/kgで連続する３週間（１週間に５日投与及び２日休薬、合計１５回）投与された場合、薬物蓄積により死亡する動物が見られないことを示している。
【００４０】
投与の１週間後（５回）に、高用量群の腫瘍成長速度は阻害され、腫瘍体積は対照群よりも有意に小さい。投与終了までに、高用量群の腫瘍成長（腫瘍質量）は、６８％以上阻害される。中用量群は３０％以上阻害されるが統計解析で有意差はない。低用量群は有意な効果を有さない。
【００４１】
４．３  実験２の結果を表６〜７及び図５〜６に要約する。
【００４２】
【表６】
2016500116.tif 000007
【００４３】
【表７】
2016500116.tif 000008
【００４４】
１．  上記の結果は、アルテメテルがそれぞれ用量１００mg/kg、６０mg/kg及び４０mg/kgで連続する３週間（高用量について合計１５回、中用量及び低用量のそれぞれについて合計２１回）投与された場合、薬物蓄積により死亡する動物が見られないことを示している。
【００４５】
２．  投与の１週間後（５〜７回）に、各用量群の腫瘍成長速度は阻害され、腫瘍体積は対照群よりも有意に小さい。投与の３週間後に、高用量群の腫瘍成長（腫瘍質量）は８０％以上阻害される。中及び低用量群は５０％以上阻害されるが、投与群と対照群の間で腫瘍体積及び腫瘍質量に有意差（ｐ＜０．０１）は観察されない。
【００４６】
３．  中及び低用量を使用し、投与時間を増加する場合、中及び低用量の治療効果は毒性なしに改善される。
【００４７】
結論及び評価
研究の結果は、高用量１００mg/kgで連続する３週間（１週間に５回、合計１５回）投与されたアルテメテル注射用凍結乾燥粉末は、Ｋ５６２ヌードマウス移植腫瘍モデルの成長に非常に有意な阻害効果を表し、阻害比率は、投与の３週間後に６７％〜８０％（Ｐ＜０．０１）に達することができ、中用量６０mg/kgで連続する３週間（それぞれ合計１５回及び２１回）投与されたアルテメテル注射用凍結乾燥粉末について、阻害比率はそれぞれ３１％及び５６％（Ｐ＞０．０５及びＰ＜０．０１）に達し；低用量４０mg/kgで連続する３週間投与されたアルテメテル注射用凍結乾燥粉末について、１５回で有意な阻害は見られず、阻害比率は２１回で５５％（Ｐ＜０．０１）であることを示している。
【００４８】
上記結果は、アルテメテルが２用量１００mg/kg及び６０mg/kgでＫ５６２ヌードマウス移植腫瘍モデルの成長に有意な阻害効果を表し、阻害比率が６０％〜８０％（Ｐ＜０．０１）に達し得ることを示している。結果は、被験薬物が白血病に有意な治療効果を有し、陽性対照としてのシクロホスファミドに近い阻害比率を有し、したがって新しい潜在的抗腫瘍薬であることを示している。
【００４９】
上記実施例は、本発明の単に好ましい実施態様である。本発明の精神及び範囲から逸脱せずに当業者がいくつかの改良及び改変を行い得ることに留意すべきである。そのような改良及び改変の全ては、本発明の範囲内に入ると見なされるべきである。
【図１】
2016500116.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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