(57)【要約】  本発明は、好ましくは組換え型であるアミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼと好ましくは組換え型であるアシル−ＣｏＡシンテターゼとを発現し、かつ低下された脂肪酸分解能を有する前記細胞、アシルアミノ酸を製造するための方法であって：アミノ酸とアシル−ＣｏＡとを、好ましくは単離されておりかつ／または組換え型であるアミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼの存在下に接触させるステップであって、その際、前記アミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼは好ましくはヒトアミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼであるものとする前記ステップ、または前記細胞を培養するステップを含む前記方法、反応混合物であって：好ましくは単離されておりかつ／または組換え型であるアミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼ、好ましくは単離されておりかつ／または組換え型であるアシル−ＣｏＡシンテターゼ、アミノ酸、およびアシルＣｏＡかまたは脂肪酸およびアシル−ＣｏＡ−シンテターゼかのいずれか一方を含む前記反応混合物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
好ましくは組換え型である、アミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼと、好ましくは組換え型である、アシル−ＣｏＡシンテターゼと、を発現する細胞であって、低下された脂肪酸分解能を有する、前記細胞。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞であって、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、２，４−ジエノイル−ＣｏＡレダクターゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよび３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼを含む群から選択される少なくとも１種の酵素、好ましくはアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼの活性が野生型細胞に対して減少している結果、前記脂肪酸分解能が低下されている、前記細胞。
【請求項３】
請求項１または２に記載の細胞であって、前記アミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼが、ヒトアミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼであり、好ましくは配列番号４、配列番号５またはその変異体である、前記細胞。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれか１項に記載の細胞であって、前記細胞が細菌細胞であり、好ましくは腸内細菌細胞であり、さらに好ましくはＥ．ｃｏｌｉである、前記細胞。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれか１項に記載の細胞であって、前記細胞が、タンパク質を構成するアミノ酸および／または脂肪酸を作出可能な、前記細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の細胞であって、前記細胞が、タンパク質を構成するアミノ酸および／または脂肪酸を作出可能な、β−ケトアシル−ＡＣＰ−シンターゼＩ、３−オキソアシル−ＡＣＰ−シンターゼＩ、マロニル−ＣｏＡ−ＡＣＰトランスアシラーゼ、エノイルＡＣＰレダクターゼおよびβ−ケトアシル−ＡＣＰ−シンターゼＩＩＩからなる群から選択される少なくとも１種の酵素を含む、前記細胞。
【請求項７】
請求項１から６までのいずれか１項に記載の細胞であって、前記細胞がアシル−ＣｏＡチオエステラーゼを発現し、前記アシル−ＣｏＡチオエステラーゼが、好ましくは組換え型でありかつさらに好ましくは配列番号１またはその変異体である、前記細胞。
【請求項８】
請求項１から７までのいずれか１項に記載の細胞であって、前記アシル−ＣｏＡシンテターゼが配列番号６またはその変異体である、前記細胞。
【請求項９】
請求項１から８までのいずれか１項に記載の細胞であって、前記細胞が、少なくとも１種のトランスポータータンパク質の発現を、野生型細胞に対して増加するように遺伝的に改変されており、前記トランスポータータンパク質が、ＦａｄＬおよびＡｌｋＬからなる群から選択されている、前記細胞。
【請求項１０】
アミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼ、
アシル−ＣｏＡシンテターゼ、並びに、
アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ、ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（またはエロンガーゼ）、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼおよび３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素
を発現し、かつ任意に野生型細胞に対してアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼの発現が減少しており、かつ低下された脂肪酸分解能を有する、細胞。
【請求項１１】
アシルアミノ酸を製造するための方法であって、次のステップ：
ｂ）アミノ酸とアシルＣｏＡとを、好ましくは単離されておりかつ／または組換え型であるアミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼの存在下に接触させるステップであって、その際、前記アミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼは好ましくはヒトアミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼであり、さらに好ましくは配列番号４、配列番号５またはそれらの変異体であり、かつその際、前記アシル−ＣｏＡシンテターゼは好ましくは配列番号６またはその変異体であるものとする前記ステップ、
または、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の細胞を培養するステップ
を含む、前記方法。
【請求項１２】
請求項１４に記載の方法であって、ステップｂ）に加えてさらに次のステップ：
ａ）脂肪酸を、好ましくは単離されておりかつ／または組換え型であるアシル−ＣｏＡシンテターゼを用いてアシルＣｏＡに転化させるステップ、
および／または
ｃ）水素化するステップ
を含む、前記方法。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の方法であって、アミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼおよびアシル−ＣｏＡシンテターゼを含む群から選択される前記酵素の少なくとも１種、好ましくは前記酵素の全てを、前記１種以上の酵素を発現する細胞の形態で提供する、前記方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、前記１種以上の酵素を発現する細胞が、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の細胞である、前記方法。
【請求項１５】
好ましくは単離されておりかつ／または組換え型である、アミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼ、
好ましくは単離されておりかつ／または組換え型である、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、
アミノ酸、および
アシルＣｏＡか、または脂肪酸およびアシル−ＣｏＡ−シンテターゼかのいずれか一方
を含む反応混合物であって、
その際、前記アミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼは、好ましくはヒトアミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼであり、さらに好ましくは配列番号４、配列番号５またはそれらの変異体であり、かつ前記アシル−ＣｏＡシンテターゼは好ましくは配列番号６またはその変異体である、前記反応混合物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の反応混合物であって、アミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼおよびアシル−ＣｏＡシンテターゼを含む群から選択される前記酵素の少なくとも１種、好ましくは前記酵素の全てが細胞の形態で提供されており、好ましくは請求項１から１０までのいずれか１項に記載の細胞の形態で提供されている、前記反応混合物。
【請求項１７】
請求項１１から１６までのいずれか１項に記載の方法または反応混合物であって、前記アミノ酸がタンパク質を構成するアミノ酸であり、好ましくは、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギンおよびアラニンを含む群から選択され、さらに好ましくはグリシンである、前記方法または反応混合物。
【請求項１８】
８〜１６個の炭素原子を有する飽和アシルとグリシンとからなる第１のアシルアミノ酸、
１０〜１８個の炭素原子を有する不飽和アシルとグリシンとからなる第２のアシルアミノ酸、
および任意に、１２個の炭素原子を有する飽和または不飽和アシルと、グルタミン、グルタミン酸、アラニンおよびアスパラギンを含む群から選択されるアミノ酸とからなる第３のアシルアミノ酸
を含む組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組成物であって、前記第１のアシルアミノ酸が、１２個の炭素原子を有する飽和アシル、好ましくはラウリルと、グリシンと、からなる、前記組成物。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載の組成物であって、前記第２のアシルアミノ酸が、１２個または１４個の炭素原子を有する不飽和アシルと、グリシンと、からなる、前記組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好ましくは組換え型であるアミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼと好ましくは組換え型であるアシル−ＣｏＡシンテターゼとを発現する細胞であって、低下された脂肪酸分解能を有する前記細胞、アシルアミノ酸を製造するための方法であって、次のステップ：アミノ酸と脂肪酸−ＣｏＡとを、好ましくは単離されておりかつ／または組換え型であるアミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼの存在下に接触させるステップであって、その際、前記アミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼは好ましくはヒトアミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼであるものとする前記ステップ、または前記細胞を培養するステップを含む前記方法、並びに、反応混合物であって、次のもの：好ましくは単離されておりかつ／または組換え型であるアミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼ、好ましくは単離されておりかつ／または組換え型であるアシル−ＣｏＡシンテターゼ、アミノ酸、およびアシルＣｏＡかまたは脂肪酸およびアシル−ＣｏＡ−シンテターゼかのいずれか一方を含む前記反応混合物に関する。
【０００２】
アシルアミノ酸は、種々の用途を有する界面活性剤の１つのクラスであり、例えば、洗浄目的での洗剤として、食品における乳化剤として、および様々なパーソナルケア製品、例えばシャンプー、石鹸、保湿剤等における必須成分としての用途を有する。界面活性剤として使用するための前提条件は、疎水性領域と親水性領域の双方を有することの他に、化合物（界面活性剤）が、天然に存在する分子から、より具体的にはアミノ酸および脂肪酸から製造され、これらが無害でかつ環境的に許容されうるだけでなく安価な生物学的原材料を使用して大規模で容易に製造可能であることである。薬理学的研究では、アシルアミノ酸が新規創薬ターゲットのための神経修飾物質およびプローブとして使用されている。
【０００３】
アシルアミノ酸は多数の生物学的供給源から単離されており、様々な機能を有するものと考えられており、例えば哺乳動物の組織におけるシグナル伝達分子としての機能（Ｔａｎ，  Ｂ．，  Ｏ’Ｄｅｌｌ，  Ｄ．  Ｋ．，  Ｙｕ，  Ｙ．  Ｗ．，  Ｍｏｎｎ，  Ｍ．  Ｆ．，  Ｈｕｇｈｅｓ，  Ｈ．  Ｖ．，  Ｂｕｒｓｔｅｉｎ，  Ｓ．，  Ｗａｌｋｅｒ，  Ｊ．Ｍ．  （２０１０），  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ａｃｙｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｌｉｐｉｄｏｍｉｃｓ  ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．  ５１（１），  １１２−１１９））、細菌培養における抗生物質のための構成単位としての機能（Ｃｌａｒｄｙ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｂｒａｄｙ，  Ｓ．  Ｆ．  （２００７），  Ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ＮａｓＰ，  ａｎ  Ｎ−ａｃｙｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ  ｃｌｏｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂｅｔａ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８９（１７），  ６４８７−６４８９）、または細菌タンパク質のソーティングに関与する化合物としての機能（Ｃｒａｉｇ，  Ｊ．  Ｗ．，  Ｃｈｅｒｒｙ，  Ｍ．  Ａ．，  Ｂｒａｄｙ，  Ｓ．  Ｆ．（２０１１），  Ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ  Ｎ−ａｃｙｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅｓ  ａｒｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ＰＥＰ−ＣＴＥＲＭ／ｅｘｏｓｏｒｔａｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｏｒｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９３（２０），  ５７０７−５７１５）を有するものと考えられている。
【０００４】
伝統的には、アシルアミノ酸は石油化学物質由来の材料を用いて出発して工業的規模で製造されてきた。より具体的には、ＧＢ１４８３５００に記載されるように、酸塩化物の形態で提供される活性化脂肪酸を用いて、水性アルカリ媒体中でアミノ酸をアシル化することができる。このようなアプローチの欠点としては、有害な化学物質、例えば硫酸またはその無水物を添加する必要があることが挙げられる。他の合成アプローチは、副生成物、例えばこのような界面活性作用に対して望ましくない作用を有する塩化物塩の蓄積を伴う。
【０００５】
すでに、アシルアミノ酸の製造に向けた様々な生物工学的経路が記載されている。しかし、それらのいずれも収率が低く、純度が不十分であり、かつ多段階の精製手順が必要であるために、アシルアミノ酸の商業的な大規模製造には適さない。特に、求められる生成物へと実際に転化されるのは、生物工学的に有用な生物に供給された炭素基質のわずかな割合のみであり、その多くは一次代謝の反応により消費されてしまう。
【０００６】
生物工学的経路に付随する他の問題は、得られるものが生成物の混合物であるため、組成物の制御が困難であるという事実である。より具体的には、単一付加物の製造が望ましい場合があるにもかかわらず、様々な脂肪酸がアシルアミノ酸へと転化されうる。この混合物は化学構造に関して関連性が高い化合物を含むため、効率的かつ簡単な方法での単一の成分の精製または少なくとも富化は、通常は技術的に実現可能な域を超えている。
【０００７】
こうした問題は、添付の特許請求の範囲の主題により解決されうる。特に本発明は、アシルアミノ酸に向けた効率的な生物工学的経路を提供することができる。特に本発明の生成物の収率および純度は、触媒または望ましくない副生成物の点で従来技術における方法と比較して改善されうる。
【０００８】
本発明はまた、アシルアミノ酸を作出するための方法を提供し、その際、アシルアミノ酸へと転化される脂肪酸の範囲は、従来技術における方法よりも広い。特に本発明の方法は、短鎖不飽和脂肪酸からアシルアミノ酸への転化に好適でありうる。
【０００９】
本発明はまた、アシルアミノ酸を作出するための生物工学的方法を提供し、その際、アシルアミノ酸生成物中のアシル残基の長さを制御することができ、好ましくはラウリルが富化されるようにまたは優勢となるように制御することができる。
【００１０】
第１の態様において、本発明は、好ましくは組換え型であるアミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼと好ましくは組換え型であるアシル−ＣｏＡシンテターゼとを発現する細胞であって、低下された脂肪酸分解能を有する前記細胞を提供する。特に前記細胞は、野生型細胞に対してアミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼおよび／またはアシル−ＣｏＡシンテターゼの増加された発現を示すことができる。
【００１１】
第１の態様の第１の実施形態において、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、２，４−ジエノイル−ＣｏＡレダクターゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよび３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素、好ましくはアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼの活性が野生型細胞に対して減少している結果、前記細胞の脂肪酸分解能が低下されることができる。
【００１２】
第１の実施形態の一実施形態でもある第２の実施形態において、前記アミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼはヒトアミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼであることができ、好ましくは配列番号４、配列番号５またはそれらの変異体であることができる。特に、前記アミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼは、配列番号４、配列番号５またはそれらの変異体を含むポリペプチド配列を有することができる。
【００１３】
第１の実施形態および第２の実施形態の一実施形態でもある第３の実施形態において、前記細胞は細菌細胞であることができ、好ましくは腸内細菌細胞であることができ、さらに好ましくはＥ．ｃｏｌｉであることができる。
【００１４】
第１の実施形態から第３の実施形態の一実施形態でもある第４の実施形態において、前記細胞は、タンパク質を構成するアミノ酸および／または脂肪酸を作出することができる。
【００１５】
第１の実施形態から第４の実施形態の一実施形態でもある第５の実施形態において、前記細胞はアシル−ＣｏＡチオエステラーゼを発現し、前記アシル−ＣｏＡチオエステラーゼは、好ましくは組換え型でありさらに好ましくは配列番号１またはその変異体である。
【００１６】
第１の実施形態から第５の実施形態の一実施形態でもある第６の実施形態において、前記アシル−ＣｏＡシンテターゼは配列番号６またはその変異体であることができる。
【００１７】
第２の態様において、本発明は、アシルアミノ酸を製造するための方法であって、次のステップ：
ｂ）アミノ酸とアシルＣｏＡとを、好ましくは単離されておりかつ／または組換え型であるアミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼの存在下に接触させるステップであって、その際、前記アミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼは好ましくはヒトアミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼであることができ、さらに好ましくは配列番号４、配列番号５またはそれらの変異体であることができ、かつその際、前記アシル−ＣｏＡシンテターゼは好ましくは配列番号６またはその変異体であるものとする前記ステップ、
または、第１の態様またはそのいずれかの実施形態による細胞を培養するステップ
を含む前記方法を提供する。
【００１８】
第２の態様の第１の実施形態において、前記方法はステップｂ）に加えて次のステップ：
ａ）脂肪酸を、好ましくは単離されておりかつ／または組換え型であることができるアシル−ＣｏＡシンテターゼを用いてアシルＣｏＡに転化させるステップ、
および／または
ｃ）水素化するステップ
を含む。
【００１９】
第２の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第２の実施形態において、アミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼおよびアシル−ＣｏＡシンテターゼからなる群から選択される前記酵素の少なくとも１種、好ましくは前記酵素の全てが、前記１種以上の酵素を発現する細胞の形態で提供されることができる。
【００２０】
第２の態様の第１の実施形態または第２の実施形態の一実施形態でもある第３の実施形態において、前記１種以上の酵素を発現する細胞は、第１の態様またはそのいずれかの実施形態による細胞であることができる。
【００２１】
第３の態様において、本発明は、反応混合物であって、次のもの：
好ましくは単離されておりかつ／または組換え型であることができるアミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼ、
好ましくは単離されておりかつ／または組換え型であることができるアシル−ＣｏＡシンテターゼ、
アミノ酸、および／または
アシルＣｏＡか、または脂肪酸およびアシル−ＣｏＡ−シンテターゼかのいずれか一方
を含む反応混合物であって、
その際、前記アミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼは好ましくはヒトアミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼであることができ、さらに好ましくは配列番号４、配列番号５またはそれらの変異体であることができ、かつその際、前記アシル−ＣｏＡシンテターゼは好ましくは配列番号６またはその変異体であるものとする前記反応混合物を提供する。
【００２２】
第３の態様の第１の実施形態において、アミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼおよびアシル−ＣｏＡシンテターゼからなる群から選択される前記酵素の少なくとも１種、好ましくは前記酵素の全てが細胞の形態で提供されることができ、好ましくは第１の態様またはそのいずれかの実施形態による細胞の形態で提供されることができる。
【００２３】
第１の実施形態の一実施形態でもある第２の実施形態において、前記アミノ酸はタンパク質を構成するアミノ酸であることができ、好ましくは、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギンおよびアラニンからなる群から選択されることができ、さらに好ましくはグリシンであることができる。
【００２４】
第１の実施形態および第２の実施形態の一実施形態でもある第３の実施形態において、前記脂肪酸は不飽和脂肪酸であることができ、好ましくはミリストレイン酸、ラウロレイン酸、パルミトレイン酸およびシス−バクセン酸からなる群から選択されることができる。
【００２５】
第２の態様または第３の態様の他の実施形態において、前記脂肪酸は飽和脂肪酸であることができ、好ましくはラウリン酸、ミリスチン酸およびパルミチン酸からなる群から選択されることができる。
【００２６】
第２の態様または第３の態様の他の実施形態において、前記脂肪酸は液体有機溶媒と該脂肪酸とを含む有機相の形態で提供されることができ、その際、前記有機溶媒は、好ましくは該脂肪酸のエステルであることができる。
【００２７】
第４の態様において、本発明は、組成物であって、次のもの：
８〜１６個の炭素原子を有する飽和アシルとグリシンとを含むかまたはこれらからなる第１のアシルアミノ酸、
１０〜１８個の炭素原子を有する不飽和アシルとグリシンとを含むかまたはこれらからなる第２のアシルアミノ酸、
および任意に、１２個の炭素原子を有する飽和または不飽和アシルと、グルタミン、グルタミン酸、アラニンおよびアスパラギンからなる群から選択されるアミノ酸とを含むかまたはこれらからなる第３のアシルアミノ酸
を含む前記組成物を提供する。
【００２８】
第４の態様の第１の実施形態において、前記第１のアシルアミノ酸は、１２個の炭素原子を有する飽和アシル、好ましくはラウリルと、グリシンと、を含むか、またはこれらからなることができる。
【００２９】
第４の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第４の態様の第２の実施形態において、前記第２のアシルアミノ酸は、１２個または１４個の炭素原子を有する不飽和アシルとグリシンとを含むか、またはこれらからなることができる。
【００３０】
本発明の任意の態様によれば、形成される前記アシルアミノ酸はアミノ酸の混合物であることができる。前記アミノ酸の混合物は、下記で定義するような、タンパク質を構成するアミノ酸を少なくとも２種含むことができる。特に、前記アミノ酸の混合物は、タンパク質を構成するアミノ酸を３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種または２１種有することができる。一例では、前記アミノ酸の混合物を使用してココイルグリシンおよびその塩を形成することができる。
【００３１】
本発明は、様々な脂肪酸を、さらに好ましくは不飽和および飽和脂肪酸を含む混合物をアシルアミノ酸へと転化させるのに、好ましくは、低下された脂肪酸分解能を有する細胞により発現されるアミノ酸−Ｎ−アシルトランスフェラーゼと、アシル−ＣｏＡシンテターゼとの組合せを用いることができるという驚くべき発見に基づく。
【００３２】
さらに本発明は、短鎖不飽和脂肪酸、例えばラウロレイン酸をアシルアミノ酸へと転化させるのに用いることができるアミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼが存在するという驚くべき発見に基づく。
【００３３】
さらに本発明は、様々な脂肪酸、例えば短鎖不飽和脂肪酸、例えばラウロレイン酸をアシルアミノ酸へと転化させることができるアミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼを用いることによって、製造されるアシルアミノ酸の収率を高めることができるという驚くべき発見に基づく。
【００３４】
さらに本発明は、細胞内で製造されるアシルアミノ酸の組成を、より具体的にはそのようなアシルアミノ酸に組み込まれる脂肪酸の長さを、該細胞に１種以上の特定のアシル−ＣｏＡチオエステラーゼを導入することにより、または該細胞により内因的に発現される１種以上のアシル−ＣｏＡチオエステラーゼの発現を変化させることにより制御できるという驚くべき発見に基づく。
【００３５】
本発明の中心となるのは、アシルアミノ酸を作出するためのアミノ酸−Ｎ−アシルトランスフェラーゼおよびアシル−ＣｏＡシンテターゼの使用である。好ましい一実施形態において、「アミノ酸−Ｎ−アシルトランスフェラーゼ」という用語は、本明細書で用いられる場合には、アシル−ＣｏＡ、好ましくはラウロレイン酸のＣｏＡエステルと、アミノ酸、好ましくはタンパク質を構成するアミノ酸、さらに好ましくはグリシンとからアシルアミノ酸への転化を触媒できる酵素を指す。適したアミノ酸−Ｎ−アシルトランスフェラーゼは先行技術においてすでに記載されており、例えばＷａｌｕｋ，  Ｄ．  Ｐ．，  Ｓｃｈｕｌｔｚ，  Ｎ．，  ａｎｄ  Ｈｕｎｔ，  Ｍ．  Ｃ．  （２０１０），  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｎ−ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｌｉｋｅ  ２  （ＧＬＹＡＴＬ２）  ａｓ  ａ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  Ｎ−ａｃｙｌ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２４，  ２７９５−２８０３に記載されている。好ましい一実施形態において、前記アミノ酸−Ｎ−アシルトランスフェラーゼは配列番号４のヌクレオチド配列を含む。特に、前記アミノ酸−Ｎ−アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、
【００３６】
【化１】
2016528904.tif 000002
【００３７】
【化２】
2016528904.tif 000003
【００３８】
【化３】
2016528904.tif 000004
【００３９】
またはそれらの変異体からなる群から選択されることができる。本出願全体を通して、いずれのデータベースコードも、別段の記載がない限りＮＣＢＩのデータベースから利用可能な配列、より具体的には２０１３年８月５日付けのオンラインのバージョンを指し、かつそのような配列がヌクレオチド配列の場合には、該ヌクレオチド配列の翻訳により得られるポリペプチド配列を含む。
【００４０】
好ましい一実施形態において、「アシルアミノ酸」という用語は、本明細書で用いられる場合にはアミノ酸−Ｎ−アシルトランスフェラーゼにより触媒される反応の生成物を指し、さらに好ましくは式アシル−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＯＯＨで表される化合物を指し、ここで、Ｒはタンパク質を構成するアミノ酸の側鎖であり、「アシル」という用語は脂肪酸のアシル残基を指す。本発明の好ましい一実施形態において、「脂肪酸」という用語は、本明細書で用いられる場合には、少なくとも６個、好ましくは８個、さらに好ましくは１０個、最も好ましくは１２個の炭素原子を有するカルボン酸、好ましくはアルカン酸を意味する。好ましい一実施形態においてはこれは直鎖脂肪酸であり、他の実施形態においてはこれは分岐状である。好ましい一実施形態においては、これは飽和脂肪酸である。特に好ましい一実施形態においては、これは不飽和である。他の好ましい実施形態においては、これは、少なくとも１２個の炭素原子を有しかつ二重結合を好ましくは９位に含む直鎖脂肪酸である。他の好ましい実施形態において、これは、９位または１１位に位置する二重結合を１つ有する一不飽和脂肪酸である。最も好ましい実施形態においては、これは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個の炭素原子、好ましくは１２個の炭素原子を有する脂肪酸である。
【００４１】
本出願全体を通して、水溶液中で解離しうる化合物の解離状態または非解離状態を表す化学基を示す式は、解離状態および非解離状態の双方、並びに該基の様々な塩形態を含む。例えば−ＣＯＯＨ残基は、プロトン化（−ＣＯＯＨ）カルボン酸および非プロトン化（−ＣＯＯ−）カルボン酸の双方を含む。
【００４２】
本発明の反応において消費されるアシル−ＣｏＡ基質は、細胞から精製されてもよいし、化学合成されてもよいし、アシル−ＣｏＡシンテターゼを用いて製造されてもよく、後者が好ましい選択肢である。好ましい一実施形態において、「アシル−ＣｏＡシンテターゼ」という用語は、本明細書で用いられる場合には、脂肪酸とＣｏＡとからアシルＣｏＡへのＡＴＰ依存性転化を触媒しうる酵素を指す。
【００４３】
本発明の任意の態様によれば、「アシル−ＣｏＡシンテターゼ」という用語は、アシルグリシネートを製造することができかつ／または次の反応を触媒することができるアシル−ＣｏＡ／ＡＣＰシンテターゼを指すことができる：
脂肪酸＋ＣｏＡ／ＡＣＰ＋ＡＴＰ→アシル−ＣｏＡ／ＡＣＰ＋ＡＤＰ＋Ｐｉ
【００４４】
アシル−ＣｏＡ／ＡＣＰシンテターゼの例として、ＥＣ６．２．１．３、ＥＣ６．２．１．１０、ＥＣ６．２．１．１５、ＥＣ６．２．１．２０等を挙げることができる。従来技術では、アシル−ＣｏＡシンテターゼ活性を検出するための様々な方法が記載されている。例えば、アシル−ＣｏＡシンテターゼの活性は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中の該当するサンプルを、ｐＨ８で、２５０μＭラウロイルＣｏＡ、５００μＭグリシンおよびＤＴＮＢ（５，５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸。エルマン試薬とも呼ばれる）の存在下に分光測光法により４１０ｎｍでの吸光度をモニタリングし、次いで反応の進行に伴って遊離チオール基をＣｏＡＳＨの形態で遊離させ、かつエルマン試薬と反応させることによりアッセイ可能である。
【００４５】
従来技術ではすでに様々なアシル−ＣｏＡシンテターゼが記載されており、例えばＹＰ＿００１７２４８０４．１、ＷＰ＿００１５６３４８９．１およびＮＰ＿７０７３１７．１が記載されている。好ましい一実施形態において、前記アシル−ＣｏＡシンテターゼは配列番号６またはＹＰ＿００１７２４８０４．１またはその変異体を含む。アシル−ＣｏＡシンテターゼの活性は、従来技術において例えばＫａｎｇ，  Ｙ．，  Ｚａｒｚｙｃｋｉ−Ｓｉｅｋ，  Ｊ．，  Ｗａｌｔｏｎ，  Ｃ．  Ｂ．，  Ｎｏｒｒｉｓ，  Ｍ．  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｈｏａｎｇ，  Ｔ．  Ｔ．  （２０１０），  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＦａｄＤ  Ａｃｙｌ−ＣｏＡ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，    ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ５  （１０），  ｅ１３５５７に記載の通りにアッセイ可能である。簡潔には、未反応のＣｏＡＳＨの形態の遊離チオールの量は、エルマン試薬を添加し、かつ、好ましくは１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５ｍＭ  ＡＴＰ、０．５ｍＭ  補酵素Ａ（ＣｏＡＳＨ）および脂肪酸（３０〜３００ｍＭ）を含む反応緩衝液中で分光測光法で４１０ｎｍでの吸光度をモニタリングすることにより測定される。
【００４６】
一例では、本発明の任意の態様に記載の細胞を、少なくともアミノ酸−Ｎ−アシルトランスフェラーゼおよびアシル−ＣｏＡシンテターゼの酵素を過剰発現するように遺伝的に改変することができる。特に前記細胞は、酵素グリシンＮ−アシルトランスフェラーゼおよびアシル−ＣｏＡ／ＡＣＰシンテターゼを過剰発現することができる。
【００４７】
本発明の教示は、例えば名称またはアクセッション番号により本出願において明示的に言及された通りのアミノ酸若しくは核酸配列を有する生体高分子、または暗示的に言及されたアミノ酸若しくは核酸配列を有する生体高分子を用いて実施されうるだけでなく、そのような配列の変異体を用いても実施されうる。好ましい一実施形態において、「変異体（variant）」という用語は、本明細書で用いられる場合には、参照アミノ酸または核酸配列に対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸または核酸配列をそれぞれ含み、その際、好ましくは、例えばタンパク質の触媒活性または分子のフォールディング若しくは構造といった機能に必須なもの以外のアミノ酸が欠失しているかまたは置換されているかまたは挿入により置き換えられているか、あるいは、参照配列若しくはそれに由来する分子の生物学的活性が保存されるように必須アミノ酸が保守的な様式で置き換えられている。従来技術には、２つの所与の核酸またはアミノ酸配列を整列して同一性の程度を算出するために使用することのできるアルゴリズムが含まれる。Ａｒｔｈｕｒ  Ｌｅｓｋ  （２００８），  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２，  ４６３７−４６８０，  １９９４、およびＫａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  １６（１），  ２２−３３，  ２００５参照。「変異体」という用語は、「相同体（homologue）」という用語と同義的かつ互換的に用いられる。このような変異体は、アミノ酸または核酸配列における欠失、挿入または置換の導入、およびそのような高分子若しくはその変異体を含む融合によって準備されることができる。好ましい一実施形態において、アミノ酸配列に関する「変異体」という用語は、好ましくは上記の配列同一性に加えて、それぞれの参照配列若しくは野生型配列に対して１つ以上の保存的なアミノ酸変更を含むアミノ酸配列を含むか、または１種以上の保存的なアミノ酸変更を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。好ましい一実施形態において、アミノ酸配列または核酸配列の「変異体」という用語は、好ましくは配列同一性の上記の程度に加えて、それぞれアミノ酸配列または核酸配列の任意の活性部分および／若しくはフラグメント、またはアミノ酸配列の活性部分および／若しくはフラグメントをコードする任意の核酸配列を含む。好ましい一実施形態において、「活性部分」という用語は、本明細書で用いられる場合には、完全長のアミノ酸配列より短いアミノ酸配列若しくは核酸配列か、または完全長のアミノ酸配列より短い配列をコードするアミノ酸配列若しくは核酸配列をそれぞれ指し、その際、前記アミノ酸配列またはコードされたアミノ酸配列は、それぞれその本質的な生物学的活性の少なくとも一部を保持する。例えばプロテアーゼの活性部分および／またはフラグメントは、ポリペプチド中のペプチド結合を加水分解することができる。好ましい一実施形態において、「その本質的な生物学的活性の少なくとも一部を保持す���」という用語は、本明細書で用いられる場合には、当該アミノ酸配列が、バックグラウンド活性を超えかつこれとは異なる生物学的活性とこの活性を特徴付ける動態パラメーターとを有することを意味し、より具体的には、ｋｃａｔとＫＭが、特定の基質に対して参照分子により示される値の好ましくは３桁以内、さらに好ましくは２桁以内、最も好ましくは１桁以内であることを意味する。好ましい一実施形態において、核酸の「変異体」という用語は、核酸であって、その相補鎖が、好ましくはストリンジェントな条件下に参照核酸または野生型の核酸にハイブリダイズする前記核酸を含む。アミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼの変異体の例は、少なくとも図６に提供されることができる。当業者であれば、タンパク質を構成するアミノおよび／または脂肪酸を作出しうるであろうアミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼを容易に調べることができる。特に、前記変異体として、次のものに限定されるものではないが、次のものからなる生物の群から選択されるアミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼ変異体が挙げられる：ホオジロテナガザル（Ｎｏｍａｓｃｕｓ  ｌｅｕｃｏｇｅｎｙｓ）（Ｎｌ、ＸＰ＿００３２７５３９２．１、配列番号５３）、ボリビアリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ  ｂｏｌｉｖｉｅｎｓｉｓ）（Ｓｂ、ＸＰ＿００３９２０２０８．１、配列番号５４）、ネコ（Ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ）（Ｆｃ、ＸＰ＿００３９９３５１２．１、配列番号５５）、ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）（Ｂｔ、ＮＰ＿００１１７８２５９．１、配列番号５６）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（Ｍｍ、ＮＰ＿６６６０４７．１、配列番号５７）。
【００４８】
ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは当業者によって容易に調べられることができ、これは一般的には、プローブ長、洗浄温度および塩濃度に依存する経験的算出である。一般的に、プローブが長いほど適切なアニーリングに必要な温度が高いのに対して、プローブが短いほど必要な温度は低い。ハイブリダイゼーションは、一般には、その融点より低い環境中に存在する場合には、変性ＤＮＡが再アニーリングにより相補鎖を生成する能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望の相同性の程度が高いほど、使用可能な相対温度は高くなる。その結果、相対温度が高いほど反応条件はよりストリンジェントになる傾向にあるのに対して、相対温度が低いほど反応条件はストリンジェントでなくなる傾向にある。ハイブリダイゼーション反応のさらなる詳細および説明については、Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  （１９９５），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃを参照のこと。さらに当業者は、ハイブリダイゼーションによりＤＮＡ配列を同定する方法について、マニュアル”Ｔｈｅ  ＤＩＧ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｕｓｅｒｓ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”  ，  Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ，  １９９３およびＬｉｅｂｌ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ４１：  ２５５−２６０  （１９９１）に記載の指示に従うことができる。好ましい一実施形態において、ストリンジェントな条件は全てのハイブリダイゼーションに対して適用され、すなわち、プローブが標的配列に対して７０％以上同一である場合にのみハイブリダイゼーションが生じる。標的配列に対してより低い同一性の程度を有するプローブは、ハイブリダイズすることはできるものの、そのようなハイブリッドは不安定であり、かつストリンジェントな条件下での洗浄ステップで除去されてしまい、例えば、塩濃度は２×ＳＳＣに低下されるか、または場合によりおよび引き続き０．５×ＳＳＣに低下され、かつ温度は、優先度が増加する順序で、約５０℃〜６８℃、約５２℃〜６８℃、約５４℃〜６８℃、約５６℃〜６８℃、約５８℃〜６８℃、約６０℃〜６８℃、約６２℃〜６８℃、約６４℃〜６８℃、約６６℃〜６８℃である。特に好ましい一実施形態において、温度は約６４℃〜６８℃または約６６℃〜６８℃である。塩の濃度は、０．２×ＳＳＣ、またさらには０．１×ＳＳＣに調整されることができる。参照配列または野生型の配列に対して少なくとも７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の同一性の程度を有するポリヌクレオチドフラグメントが単離されることができる。好ましい一実施形態において、核酸配列の「相同体」という用語は、本明細書で用いられる場合には、遺伝コードの縮重と共に参照核酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を指す。
【００４９】
本発明を実施するために使用される１種以上の酵素が細胞の形態で提供される場合には、該細胞は低下された脂肪酸分解能を有することが好ましい。好ましい一実施形態において、「低下された脂肪酸分解能を有する」という用語は、本明細書で用いられる場合には、それぞれの細胞が、脂肪酸、好ましくは環境から取り込まれた脂肪酸を、通常の脂肪酸分解能を有する同等の細胞または野生型細胞が同一の条件下に示すであろう速度よりも低い速度で分解することを意味する。好ましい一実施形態において、そのような細胞の脂肪酸分解は、β酸化経路に関与する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失、阻害または不活性化のために、より低い。本発明の好ましい一実施形態において、β酸化経路に関与する少なくとも１種の酵素は、それぞれの野生型微生物における同等の条件の下での同一の酵素の活性に対して、優先度が増加する順序で、５、１０、２０、４０、５０、７５、９０または９９％の活性を失っている。当業者は、例えば放射能への細胞の曝露、およびそれに続く、結果として生じる突然変異体の蓄積またはスクリーニング、点突然変異の部位特異的導入、または活性酵素をコードする染色体に組み込まれた遺伝子のノックアウトにより、酵素をコードする遺伝子を欠失させるか、または細胞におけるそのような酵素の活性を減少させるために使用することができる様々な技術に精通しており、これらはＳａｍｂｒｏｏｋ／Ｆｒｉｔｓｃｈ／Ｍａｎｉａｔｉｓ  （１９８９）に記載されている。さらに、転写リプレッサーＦａｄＲが、β酸化経路に関与する酵素の発現が抑制されるように過剰発現されることができる。（Ｆｕｊｉｔａ，  Ｙ．，  Ｍａｔｓｕｏｋａ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｈｉｒｏｏｋａ，  Ｋ．  （２００７）  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６６（４），  ８２９−８３９）。好ましい一実施形態において、「遺伝子の欠失」という用語は、本明細書で用いられる場合には、核酸配列をコードする前記遺伝子が、該遺伝子によってコードされる活性ポリペプチドの発現が減少するように改変されていることを意味する。例えば、ポリペプチドの触媒活性中心をコードする配列を含む配列の一部をインフレームで除去することにより遺伝子を欠失させることができる。あるいは、リボソーム結合部位を、リボソームがもはや対応するＲＮＡを翻訳しないように変更することができる。さらに当業者は、酵素学の教科書、例えばＣｏｒｎｉｓｈ−Ｂｏｗｄｅｎ  （１９９５），  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ，  Ｐｏｒｔｌａｎｄ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，  １９９５に記載されるような標準的なアッセイを用いて、生細胞により発現される酵素の活性をルーチン的に測定することができる。
【００５０】
脂肪酸の分解は、一連の酵素触媒反応によって達成される。まず、脂肪酸が取り込まれ、かつ、少なくとも１つの外膜タンパク質と少なくとも１つの内膜関連タンパク質とが関与する輸送／アシル活性化機構を経て細胞膜を通って運ばれ、ここで、前記タンパク質は脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ活性を有し、かつＥ．ｃｏｌｉの場合にはそれぞれＦａｄＬおよびＦａｄＤ／ＦａｄＫと呼ばれる。細胞内では、分解されるべき脂肪酸がβ酸化経路の他の反応を触媒する酵素に供される。最初の細胞内ステップは、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによるアシル−ＣｏＡからエノイル−ＣｏＡへの転化を含み、ここで、このアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼはＥ．ｃｏｌｉの場合にはＦａｄＥと呼ばれる。アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼの活性は、従来技術において記載されているように、例えばｐＨ７．４の１００ｍＭ  ＭＯＰＳ、０．２ｍＭエノイル−ＣｏＡ、０．４ｍＭ  ＮＡＤ+中で分光測光法により３４０ｎｍでのＮＡＤＨの濃度をモニタリングすることによりアッセイ可能である。生じるエノイル−ＣｏＡは、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ／３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉにおいてはＦａｄＢおよびＦａｄＪと呼ばれる）により触媒される水和および酸化によって、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡを経て３−ケトアシル−ＣｏＡへ転化される。エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ／３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性、より具体的には生成物ＮＡＤＨの形成は、従来技術に記載されているように、例えばＦａｄＥに関して概説した通りに分光測光法によりアッセイ可能である。最後に、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉにおいてはＦａｄＡおよびＦａｄｌ）が３−ケトアシル−ＣｏＡの開裂を触媒し、それにより、アセチル−ＣｏＡと、導入されたアシル−ＣｏＡよりも炭素原子２個分短縮されたアシル−ＣｏＡとが生じる。ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼの活性は、従来技術において、例えばＡｎｔｏｎｅｎｋｏｖ，  Ｖ．，  Ｄ．．  Ｖａｎ  Ｖｅｌｄｈｏｖｅｎ，  Ｐ．，  Ｐ．，  Ｗａｅｌｋｅｎｓ，  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｍａｎｎａｅｒｔｓ，  Ｇ．Ｐ．  （１９９７）  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ３−ｏｘｏａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｔｈｉｏｌａｓｅ  ａｎｄ  ｓｔｅｒｏｌ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２／３−ｏｘｏａｃｙｌ−ｃｏａ  ｔｈｉｏｌａｓｅ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｆｒｏｍ  ｎｏｒｍａｌ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｓ．  Ｓｔｅｒｏｌ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２／３−ｏｘｏａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｔｈｉｏｌａｓｅ  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ２−ｍｅｔｈｙｌ−ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９７，  ２７２：２６０２３−２６０３１に記載の通りにアッセイ可能である。好ましい一実施形態において、「低下された脂肪酸分解能を有する細胞」という用語は、本明細書で用いられる場合には、脂肪酸、好ましくは少なくとも炭素数８の炭素鎖を有する脂肪酸の取り込みおよび／または分解の能力が低下した細胞を指す。細胞の脂肪酸分解能を、様々な方法で低下させることができる。好ましい一実施形態において、前記細胞は、β酸化経路に関与する酵素の活性が、その野生型に対して低下している。好ましい一実施形態において、「β酸化経路に関与する酵素」という用語は、本明細書で用いられる場合には、脂肪酸またはβ−酸化経路により該脂肪酸の分解物の一部として形成されたその誘導体と直接相互作用し、その際、一連の反応によって、好ましくは脂肪酸またはその誘導体を基質として認識することによって、脂肪酸からアセチル−ＣｏＡおよび短縮された脂肪酸のＣｏＡエステルへの転化がもたらされるものとし、かつこれをβ酸化経路の一部として形成される代謝物質へと転化する酵素を指す。例えば、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、脂肪酸−ＣｏＡと相互作用し、かつ脂肪酸−ＣｏＡエステルをβ酸化の一部として形成される代謝物質であるエノイル−ＣｏＡへと転化するため、β酸化経路に関与する酵素である。好ましい一実施形態において、「β酸化経路に関与する酵素」という用語は、本明細書で用いられる場合には、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよび３−ケト−アシル−ＣｏＡチオラーゼを含む群からのいずれものポリペプチドを含む。続いて、アシル−ＣｏＡシンテターゼが、好ましくは脂肪酸をβ酸化経路に導入するために、該脂肪酸から脂肪酸のＣｏＡエステル、すなわち、カルボキシ基の官能基−ＯＨが−Ｓ−ＣｏＡに置換されている分子への転化を触媒することができる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるポリペプチドＦａｄＤおよびＦａｄＫ（アクセッション番号：ＢＡＡ１５６０９．１）は、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼである。好ましい一実施形態において、「アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ」という用語は、本明細書で用いられる場合には、好ましくはβ酸化経路の一部としてのアシル−ＣｏＡからエノイル−ＣｏＡへの転化を触媒しうるポリペプチドである。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるポリペプチドＦａｄＥ（アクセッション番号：ＢＡＡ７７８９１．２）は、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼである。好ましい一実施形態において、「２，４−ジエノイル−ＣｏＡレダクターゼ」という用語は、本明細書で用いられる場合には、好ましくはβ酸化経路の一部としての、不飽和脂肪酸からエノイル−ＣｏＡへの２，４−ジエノイル−ＣｏＡの転化を触媒しうるポリペプチドである。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるポリペプチドＦａｄＨは、２，４−ジエノイル−ＣｏＡレダクターゼである。好ましい一実施形態において、「エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ」という用語は、本明細書で用いられる場合には３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼとも呼ばれ、これは、好ましくはβ酸化経路の一部としての、水和および酸化によりエノイル−ＣｏＡから３−ケトアシル−ＣｏＡへの転化を触媒しうるポリペプチドを指す。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるポリペプチドＦａｄＢおよびＦａｄＪ（アクセッション番号：ＢＡＥ７７４５７．１）は、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼである。好ましい一実施形態において、「ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ」という用語は、本明細書で用いられる場合には、３−ケトアシル��ＣｏＡの開裂の転化を触媒しうるポリペプチドを指し、それにより、好ましくはβ酸化経路の最終ステップとして、炭素原子２個分短縮されたアシル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡとが生じる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるポリペプチドＦａｄＡおよびＦａｄｌ（アクセッション番号：ＡＰ００９０４８．１）は、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼである。
【００５１】
一例では、本発明の任意の態様による細胞は、少なくとも１種のアミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼの増加された活性と、少なくとも１種のアシル−ＣｏＡシンテターゼの増加された活性と、少なくとも１種のトランスポータータンパク質ＦａｄＬおよび／またはＡｌｋＬの増加された活性との組み合わせが生じるように遺伝的に改変されることができる。特に、本発明の任意の態様による細胞は、グリシンＮ−アシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡ／ＡＣＰシンテターゼおよびトランスポータータンパク質ＦａｄＬおよび／またはＡｌｋＬを野生型細胞に対して過剰発現するように遺伝的に改変されることができる。これらの細胞は、アシルグリシネートを製造可能であってもよい。他の例では、本発明の任意の態様による細胞は、野生型細胞に対して、
−  アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼの発現が増加し；かつ
−  アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＥ、多機能性３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡエピメラーゼ、Δ３−シス−Δ２−トランス−エノイル−ＣｏＡイソメラーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＢ、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、電子伝達フラビンタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種の酵素の活性が減少する
ように遺伝的に改変されることができる。
【００５２】
さらに他の例では、本発明の任意の態様による細胞は、野生型細胞に対して、
−  アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび少なくとも１種のトランスポータータンパク質ＦａｄＬおよび／またはＡｌｋＬの発現が増加し；かつ
−  アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＥ、多機能性３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡエピメラーゼ、Δ３−シス−Δ２−トランス−エノイル−ＣｏＡイソメラーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＢ、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、電子伝達フラビンタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種の酵素の活性が減少する
ように遺伝的に改変されることができる。
【００５３】
特に、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＥ（ＥＣ１．３．８．７、ＥＣ１．３．８．８またはＥＣ１．３．８．９）は、次の反応を触媒しうる：アシル−ＣｏＡ＋電子伝達フラビンタンパク質＝トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ＋減少された電子伝達フラビンタンパク質；多機能性３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡエピメラーゼ（ＥＣ５．１．２．３）、Δ３−シス−Δ２−トランス−エノイル−ＣｏＡイソメラーゼ（ＥＣ５．３．３．８）、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１７）および３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３５）ＦａｄＢは、次の反応を触媒しうる：（Ｓ）−３−ヒドロキシブタノイル−ＣｏＡ→（Ｒ）−３−ヒドロキシブタノイル−ＣｏＡ、（３Ｚ）−３−エノイル−ＣｏＡ→（２Ｅ）−２−エノイル−ＣｏＡ、（３Ｓ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ→トランス−２−エノイル−ＣｏＡ＋Ｈ2Ｏ、（Ｓ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ＋ＮＡＤ+＝３−オキソアシル−ＣｏＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+；３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ（ＥＣ２．３．１．１６）は、次の反応を触媒しうる：アシル−ＣｏＡ＋アセチル−ＣｏＡ→ＣｏＡ＋３−オキソアシル−ＣｏＡ；および電子伝達フラビンタンパク質（ＥＣ１．５．５．１）は、次の反応を触媒しうる：減少された電子伝達フラビンタンパク質＋ユビキノン→電子伝達フラビンタンパク質＋ユビキノール。
【００５４】
より詳細には、本発明の任意の態様による細胞は、該細胞の野生型に対して、グリシンＮ−アシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡ／ＡＣＰシンテターゼ、トランスポータータンパク質ＦａｄＬおよびＡｌｋＬの発現が増加し；かつアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＥ、多機能性３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡエピメラーゼ、Δ３−シス−Δ２−トランス−エノイル−ＣｏＡイソメラーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＢ、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、電子伝達フラビンタンパク質の活性が減少するように遺伝的に改変されることができる。
【００５５】
一例では、本発明の任意の態様による細胞は、該細胞の野生型に対して、
−  アミノ酸Ｎ−アシル−トランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼの発現が増加し；かつ
−  グリシン開裂系Ｈタンパク質、グリシン開裂系Ｐタンパク質、グリシン開裂系Ｌタンパク質、グリシン開裂系Ｔタンパク質、トレオニンアルドラーゼおよびセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素の活性が減少する
ように遺伝的に改変されることができる。
【００５６】
他の例では、本発明の任意の態様による細胞は、該細胞の野生型に対して、
−  アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび少なくとも１種のトランスポータータンパク質ＦａｄＬおよび／またはＡｌｋＬの発現が増加し；かつ
−  アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＥ、多機能性３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡエピメラーゼ、Δ３−シス−Δ２−トランス−エノイル−ＣｏＡイソメラーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＢ、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼおよび電子伝達フラビンタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種の酵素の活性が減少する
ように遺伝的に改変されることができる。
【００５７】
さらに他の例では、本発明の任意の態様による細胞は、該細胞の野生型に対して、
−  アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび少なくとも１種のトランスポータータンパク質ＦａｄＬおよび／またはＡｌｋＬの発現が増加し；
−  アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＥ、多機能性３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡエピメラーゼ、Δ３−シス−Δ２−トランス−エノイル−ＣｏＡイソメラーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＢ、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼおよび電子伝達フラビンタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種の酵素の活性が減少し；かつ
−  グリシン開裂系Ｈタンパク質、グリシン開裂系Ｐタンパク質、グリシン開裂系Ｌタンパク質、グリシン開裂系Ｔタンパク質、トレオニンアルドラーゼおよびセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素の活性が減少する
ように遺伝的に改変されることができる。
【００５８】
特に、本発明の任意の態様による細胞は、該細胞の野生型に対して、グリシンＮ−アシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡ／ＡＣＰシンテターゼ、トランスポータータンパク質ＦａｄＬおよびＡｌｋＬの発現が増加し；アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＥ、多機能性３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡエピメラーゼ、Δ３−シス−Δ２−トランス−エノイル−ＣｏＡイソメラーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＢ、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、電子伝達フラビンタンパク質の活性が減少し；かつグリシン開裂系Ｈタンパク質、グリシン開裂系Ｐタンパク質、グリシン開裂系Ｌタンパク質、グリシン開裂系Ｔタンパク質、トレオニンアルドラーゼおよびセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性が減少するように遺伝的に改変されることができる。
【００５９】
より具体的には、グリシン開裂系Ｈタンパク質はリポ酸を有し、かつグリシン開裂系タンパク質Ｐ、ＬおよびＴと相互作用し；グリシン開裂系Ｐタンパク質（ＥＣ１．４．４．２）は、次の反応を触媒する：グリシン＋［グリシン開裂複合Ｈタンパク質］−Ｎ（６）−リポイル−Ｌ−リシン→［グリシン開裂複合Ｈタンパク質］−Ｓ−アミノメチル−Ｎ（６）−ジヒドロリポイル−Ｌ−リシン＋ＣＯ2；グリシン開裂系Ｌタンパク質（ＥＣ１．８．１．４）は、次の反応を触媒する：タンパク質Ｎ６−（ジヒドロリポイル）リシン＋ＮＡＤ+→タンパク質Ｎ６−（リポイル）リシン＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+；グリシン開裂系Ｔタンパク質（ＥＣ２．１．２．１０）は、次の反応を触媒する：［タンパク質］−Ｓ８−アミノメチルジヒドロリポイルリシン＋テトラヒドロ葉酸→［タンパク質］−ジヒドロリポイルリシン＋５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸＋ＮＨ3；トレオニンアルドラーゼ（ＥＣ４．２．１．４８）は、次の反応を触媒する：Ｌ−トレオニン→グリシン＋アセトアルデヒド；セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．１．２．１）は、次の反応を触媒する：５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸＋グリシン＋Ｈ2Ｏ＋テトラヒドロ葉酸＋Ｌ−セリン。
【００６０】
一例では、本発明の任意の態様による細胞は、該細胞の野生型に対してアミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼの発現が増加するように遺伝的に改変されることができ、かつ少なくとも１種の炭水化物から少なくとも１種の脂肪酸を製造しうる細胞において遺伝的改変が行われる。酵素または酵素活性の非限定的な遺伝的改変のリストを、後出の第１表に示す。本発明の任意の態様による細胞は、脂肪酸を製造しかつ該脂肪酸をＮ−アシルアミノ酸へと転化させる遺伝的改変の組み合わせを含むことができる。特に、本発明の任意の態様による細胞は、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼの発現が増加し、かつ第１表に挙げられた遺伝的改変のいずれかを含むように遺伝的に改変されることができる。より具体的には、前記細胞は、Ｎ−アシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスポータータンパク質ＦａｄＬおよびＡｌｋＬの発現が増加し、かつ第１表に挙げられた遺伝的改変のいずれかを含むように遺伝的に改変されることができる。さらに具体的には、前記細胞は、Ｎ−アシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、トランスポータータンパク質ＦａｄＬおよびＡｌｋＬの発現が増加し、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＥ、多機能性３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡエピメラーゼ、Δ３−シス−Δ２−トランス−エノイル−ＣｏＡイソメラーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＢ、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、電子伝達フラビンタンパク質の活性が減少し；グリシン開裂系Ｈタンパク質、グリシン開裂系Ｐタンパク質、グリシン開裂系Ｌタンパク質、グリシン開裂系Ｔタンパク質、トレオニンアルドラーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性が減少し、かつ第１表に挙げられた遺伝的改変のいずれかを含むように遺伝的に改変されることができる。
【００６１】
一例では、本発明の任意の態様による細胞は、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡ／ＡＣＰシンテターゼの発現が増加し、かつ、β−ケトアシル−ＡＣＰ−シンターゼＩ、３−オキソアシル−ＡＣＰ−シンターゼＩ、マロニル−ＣｏＡ−ＡＣＰトランスアシラーゼ、エノイルＡＣＰレダクターゼおよびβ−ケトアシル−ＡＣＰ−シンターゼＩＩＩからなる群から選択される少なくとも１種の酵素の発現が減少するように遺伝的に改変されることができる。特に、本発明の任意の態様による細胞における遺伝的改変は、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡ／ＡＣＰシンテターゼの発現の増加と、β−ケトアシル−ＡＣＰ−シンターゼＩ、３−オキソアシル−ＡＣＰ−シンターゼＩ、マロニル−ＣｏＡ−ＡＣＰトランスアシラーゼ、エノイルＡＣＰレダクターゼおよびβ−ケトアシル−ＡＣＰ−シンターゼＩＩＩの発現の減少とを含むことができる。
【００６２】
本発明の教示は、広範な細胞を用いて実施されることができる。好ましい一実施形態において、「細胞」という用語は、本明細書で用いられる場合には、古細菌、菌類、藻類等を含む任意の永続的に単細胞である生物を指す。好ましい一実施形態において、前記細胞は細菌細胞であり、さらに好ましくは、シュードモナス属、コリネバクテリウム属、バチルス属およびエシェリキア属を含む群からの細菌細胞であり、最も好ましくは大腸菌である。他の好ましい実施形態において、前記細胞は下等真核生物であり、さらに好ましくはサッカロミセス属、カンジダ属、ピキア属、シゾサッカロミセス属およびヤロウィア属を含む群からの菌類であり、最も好ましくはサッカロミセス・セレビシエ属である。前記微生物は、単離された細胞、すなわち単一株の純粋培養物であってもよいし、少なくとも２種の株の混合物を含んでもよい。バイオテクノロジーにおいて重要な細胞は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）またはドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ）から商業的に入手可能である。細胞を保持および改変するための詳細は先行技術から入手可能であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ／Ｆｒｉｔｓｃｈ／Ｍａｎｉａｔｉｓ  （１９８９）：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｐｒｅｓｓ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｆｕｃｈｓ／Ｓｃｈｌｅｇｅｌ  （２００７），  Ａｌｌｇｅｍｅｉｎｅ  Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ，  ２００８，  Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇから入手可能である。
【００６３】
本発明の教示は野生型細胞を用いて実施されてもよいが、関与する酵素の少なくとも１種、特に、アミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよびアシル−ＣｏＡチオエステラーゼを含む群からの少なくとも１種または全てが組換え型であることが好ましい。好ましい一実施形態では、「組換え型」という用語は、本明細書で用いられる場合には、それ自体では天然に存在しないが遺伝子操作の結果である分子であるかまたはそのような分子によりコードされるもの、好ましくはポリペプチドまたは核酸を指すか、または組換え分子を含む細胞を指す。例えば、核酸分子が触媒活性ポリペプチドをコードする配列に機能的に連結されたプロモーターを含み、かつこのプロモーターが、触媒活性ポリペプチドが元の未改変核酸分子を含む対応する野生型細胞におけるポリペプチドのレベルに対して過剰発現するように操作された場合に、この核酸分子は組換え型である。
【００６４】
核酸分子、ポリペプチド、より具体的には本発明の実施に必要な酵素が組換え型であるか否かは、その発現レベルにとって必ずしも潜在的に重要であるとは限らない。しかし、１種以上の組換え型の核酸分子、ポリペプチドまたは本発明の実施に必要な酵素が過剰発現されることが好ましい。好ましい一実施形態において、「過剰発現」という用語は、本明細書で用いられる場合には、コードされるまたは発現されるそれぞれのポリペプチドが、発現を増加させるために行われる遺伝的改変の非存在下に同一の条件下に細胞において、例えばそれぞれの野生型細胞において通常見出されるであろうレベルまたは活性よりも高いレベルまたは高い活性で発現されることを意味する。当業者は、過剰発現をもたらすための多くの方法に精通している。例えば、過剰発現されるべき、または過剰発現されるべきポリペプチド若しくは酵素をコードする核酸分子は、強力な誘導性プロモーター、例えばｌａｃプロモーターの制御下に置かれることができる。従来技術では、この目的のために使用することができる標準的なプラスミドが記載されており、例えば（Ｎｏｖａｇｅｎより商業的に入手可能である）ｐＥＴ−３ａにより例示されるベクターのｐＥＴ系が記載されている。核酸またはポリペプチドが過剰発現されるか否かは、核酸分子の場合には定量的ＰＣＲ反応により調べることができ、ポリペプチドの場合にはＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動、ウェスタンブロッティングまたは比較活性アッセイにより調べることができる。遺伝的改変は、転写、翻訳および／または翻訳後修飾に向けられていてよく、これにより、選択されるおよび／または特定される培養条件下での酵素活性および／または選択性の変化がもたらされる。従って、本発明の様々な実施例において、より効率的に機能するように、微生物は１つ以上の遺伝子欠失を含むことができる。遺伝子欠失は、突然変異遺伝子欠失アプローチによって、かつ／またはこれらの酵素のうち１つ以上の発現が減少されているかまたは発現を有しない突然変異体株を用いて出発することにより、かつ／または当業者に知られている他の方法により、達成されることができる。
【００６５】
さらに、本発明の教示を実施するために必要な酵素のいずれか、特にＮ−アシル−トランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよびアシル−ＣｏＡチオエステラーゼを含む群からの少なくとも１種または全てが、単離された酵素であってもよい。いずれの場合においても、本発明を実施するために必要ないずれの酵素も、好ましくは活性状態で、かつ全ての補因子、基質、補助および／または活性化ポリペプチドまたはその活性に必須の因子の存在下に使用される。好ましい一実施形態において、「単離された」という用語は、本明細書で用いられる場合には、対象となる酵素が、それが天然に存在する細胞と比較して富化されていることを意味する。酵素が富化されているか否かは、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動および／または活性アッセイによって調べることができる。例えば、クマシーブルー染料で染色後のポリアクリルアミドゲルの目視検査によって判断される際に、対象となる酵素は、調製物中に存在する全てのポリペプチドの５、１０、２０、５０、７５、８０、８５、９０、９５または９９パーセント超を占めることができる。
【００６６】
アミノ酸−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼおよびアシル−ＣｏＡシンテターゼを発現しかつ低下された脂肪酸分解能を有する細胞が使用される場合、該細胞がタンパク質を構成するアミノ酸および／または脂肪酸を作出しうることが好ましい。好ましい一実施形態では、「タンパク質を構成するアミノ酸」という用語は、本明細書で用いられる場合には、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンを含む群から選択されるアミノ酸を指す。タンパク質を構成するアミノ酸および脂肪酸は、反応において多くの野生型細胞の主要な代謝の一部として、かつ生化学の教科書、例えばＪｅｒｅｍｙ  Ｍ  Ｂｅｒｇ，  Ｊｏｈｎ  Ｌ  Ｔｙｍｏｃｚｋｏ，  ａｎｄ  Ｌｕｂｅｒｔ  Ｓｔｒｙｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ，  ２００２に詳細に記載されている酵素を用いて合成される。
【００６７】
好ましい一実施形態において、本発明の教示を実施するために使用される細胞は、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼを発現する。より好ましい一実施形態において、「アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ」という用語は、本明細書で用いられる場合には、アシル−ＣｏＡを加水分解しうる酵素を指す。好ましい一実施形態において、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼは、配列番号１、ＡＥＭ７２５２１．１およびＡＡＣ４９１８０．１またはその変異体、さらに好ましくは配列番号１またはその変異体を含む群からの配列を含む。アシル−ＣｏＡチオエステラーゼの活性は、従来技術において記載されている様々なアッセイを用いてアッセイ可能である。簡潔には、アシル−ＣｏＡの加水分解の際に形成されるＣｏＡＳＨに伴う遊離チオール基と反応するエルマン試薬の反応を、４１２ｎｍでの吸光度の分光測光法によるモニタリングにより検出することができる。
【００６８】
好ましい一実施形態において、「接触」という用語は、本明細書で用いられる場合には、アミノ酸、アシル−ＣｏＡおよびアミノ酸−Ｎ−アシルトランスフェラーゼまたは本発明の細胞および／または本発明の教示を実施するために必要な任意の他の試薬を、好ましくは水溶液中で直接接触させることを意味する。例えば、細胞、アミノ酸およびアシル−ＣｏＡは、無機膜のようなバリアによって分離された異なる区画内に存在してはならない。アミノ酸または脂肪酸が可溶性でありかつ細胞に取り込まれうるか、または生体膜を通って拡散しうる場合には、これは単に水溶液中で本発明の細胞に添加されることができる。その溶解性が不十分である場合には、これは水溶液への添加の前に適当な有機溶媒に溶解されることができる。当業者は、適切な有機および／または極性溶媒の添加により、不十分な溶解性を有するアミノ酸または脂肪酸の水溶液を調製することができる。このような溶媒は、好ましくは、液体有機溶媒を含む有機相の形態で提供される。好ましい一実施形態では、前記有機溶媒または有機相は、２５℃で標準大気圧で液体である場合に液体と考えられる。他の好ましい実施形態では、脂肪酸は、脂肪酸エステル、例えばそれぞれメチルエステルまたはエチルエステルの形態で提供される。ＥＰ１１１９１５２０．３に記載されているように、例えば脂肪酸ラウレートはラウリン酸メチルエステルに溶解されることができる。本発明によれば、前記化合物および触媒は、インビトロで、すなわち多少なりとも富化されたかまたは精製された状態で接触されてもよいし、インサイチュ（in situ）で接触されてもよく、すなわちこれらは細胞の代謝の一部として作出され、次いで細胞内で反応することもできる。
【００６９】
「水溶液」という用語には、本発明の細胞を少なくとも一時的に代謝的に活性なおよび／または生存可能な状態で保持するために使用されうる溶媒として、水を含む、好ましくは主に水を含む、いかなる溶液も包含され、かつ必要であればいかなる付加的な基質も包含される。当業者は数多くの水溶液の調製に精通しており、この水溶液は、通常は本発明の細胞を保持するために使用されうる培地と呼ばれ、例えばＥ．ｃｏｌｉの場合にはＬＢ培地である。望ましくない副生成物による生成物の不要な汚染を回避するためには、水溶液として、複雑な培地とは対照的に、最少培地、すなわち細胞を代謝的に活性なおよび／または生存可能な状態で保持するのに不可欠な塩および栄養素の最小限のセットのみを含む合理的にも単純な組成の培地を使用することが有利である。最少培地として、例えばＭ９培地を使用することができる。
【００７０】
本発明の特別な利点の一つに、飽和脂肪酸だけでなく不飽和脂肪酸をもアシルアミノ酸へと転化させうることが挙げられる。ステップｂ）の後に存在する量よりも高い収量の飽和アシル残基を最終生成物が含むことが求められる場合には、ステップｂ）の後にアシルアミノ酸のアシル残基を水素化することにより、本方法を補完することができる。この場合、不飽和アシル残基を有するアシルアミノ酸の混合物を含む本発明の第５の態様による本発明の組成物は必須の中間体を成しており、これを、最終生成物へと、すなわち飽和アシル残基を有するアシルアミノ酸の混合物へと転化させることができる。前記水素化は、従来技術の様々な方法により、例えばＵＳ５７３４０７０に記載の方法により行われてよい。簡潔には、水素化されるべき化合物は、１００℃で、水素および適切な触媒の存在下に、例えば担体としての酸化ケイ素上のニッケル触媒の存在下にインキュベートされることができる。
【００７１】
アシルアミノ酸へと転化されるべき脂肪酸は、本発明による細胞により製造されることができる。一例では、アシルアミノ酸を製造する細胞自体が脂肪酸を製造することができ、この脂肪酸からアシルアミノ酸が製造される。特に前記細胞は、脂肪酸を製造しうるように遺伝的に改変されることができる。一例では、この遺伝的改変は、特定の酵素活性を減少させることであってもよく、これは、遺伝子破壊または遺伝的改変によって行われることができる。この遺伝的改変によって、特定の酵素活性を増加させることもできる。特に、この遺伝的改変によって、選択される脂肪酸または脂肪酸由来の化学的生成物の微生物合成を、対照または野生型の細胞の割合を上回って増加させることができる。この対照または野生型の細胞は、選択される化学的生成物を製造するためのこうした遺伝的改変を欠くことができる。
【００７２】
特に、前記細胞は少なくとも１つの遺伝子突然変異を含んでおり、それによって該細胞は少なくとも１種の脂肪酸を製造できるようになる。特に、前記遺伝子突然変異によって、前記細胞は、マロニル−ＣｏＡ依存性でかつマロニル−ＡＣＰ非依存性の脂肪酸アシル−ＣｏＡの代謝経路により少なくとも１種の脂肪酸を製造することができる。より具体的には、前記細胞においては、マロニル−ＣｏＡ依存性でかつマロニル−ＡＣＰ非依存性の脂肪酸アシル−ＣｏＡの代謝経路において、酵素活性が野生型細胞に対して増加している。前記細胞は、微生物のマロニル−ＣｏＡ依存性でかつマロニル−ＡＣＰ非依存性の脂肪酸アシル−ＣｏＡの代謝経路（「ＭＤＭＩＦＡＡ」）における酵素活性が増加するように遺伝的に改変されることができる。この経路は、本明細書中では、マロニル−ＣｏＡ依存性であるがマロニル−ＡＣＰ非依存性である脂肪酸アシル−ＣｏＡ代謝経路とも呼ばれる。前記細胞のマロニル−ＣｏＡ依存性でかつマロニル−ＡＣＰ非依存性の脂肪酸アシル−ＣｏＡの代謝経路におけるこのような増加は、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ、ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（またはエロンガーゼ）、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼおよび／または３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼを含む遺伝子または経路の増加された活性または発現と、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼの発現または活性の減少とを組み合わせることによって達成されうる。あるいは、微生物のマロニル−ＣｏＡ依存性でかつマロニル−ＡＣＰ非依存性の脂肪酸アシル−ＣｏＡの代謝経路における増加された活性は、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼおよび／または３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼを含む遺伝子または経路の増加された発現と、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼの発現または活性の減少とを組み合わせることにより達成されうる。
【００７３】
酵素または酵素活性に対する非限定的な遺伝的改変であって、それにより細胞が脂肪酸および／またはそのアシル補酵素Ａを製造しうるようになり、かつ本発明の任意の態様による少なくとも１種の遺伝子突然変異と考えることができる前記遺伝的改変のリストは、後出の第１表に提供されており、かつＵＳ２０１４００５１１３６において説明されている。
【００７４】
一例では、これらのポリペプチドの温度感受性形態をコードする核酸配列がネイティブ酵素の代わりに導入されてよく、そのような遺伝的に改変された微生物が高められた温度（これらの熱不安定性のポリペプチドが、タンパク質構造の変化または完全な変性により部分的にまたは完全に不活性化される温度）で培養された場合に、化学的生成物の増加が観察される。例えばＥ．ｃｏｌｉにおいては、これらの温度感受性突然変異体遺伝子には、特にｆａｂＩｔｓ（Ｓ２４１Ｆ）、ｆａｂＢｔｓ（Ａ３２９Ｖ）またはｆａｂＤｔｓ（Ｗ２５７Ｑ）が含まれうる。これらの例の大半では、遺伝的改変によってマロニル−ＣｏＡの利用を増加させることができ、そのため、全バイオマスで天然の経路を経由したマロニル−ＣｏＡから脂肪酸への転化が減少し、かつマロニル−ＣｏＡ依存性でかつマロニル−ＡＣＰ非依存性の経路を経由した炭素源から脂肪酸または脂肪酸由来生成物を含む化学的生成物への転化が比例して増加する。また、例えばマロニル−ＣｏＡの製造が増加するような付加的な遺伝的改変がいくつかの例について行われてもよい。
【００７５】
他の例では、酵素エノイル−アシル輸送タンパク質レダクターゼ（ＥＣ番号１．３．１．９、エノイル−ＡＣＰレダクターゼとも呼ばれる）が、マロニル−ＣｏＡからの脂肪酸生合成の鍵酵素である。大腸菌において、この酵素Ｆａｂｌは遺伝子ｆａｂｌ（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｊ．  Ｈｅａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）によりコードされる。一例では、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ａｂｄｅｌ−Ａｈｍｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）の発現レベルが、本発明の任意の態様による細胞において、減少されるかまたは機能的に削除されることができる。ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子は、酵素、例えばＥＣ１．２．３．３をコードすることができる。特に、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子はｐｏｘＢ遺伝子であることができる。一例では、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｍａｔ−Ｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｕｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）の発現レベルが減少されるかまたは機能的に削除されることができる。いくつかの例では、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、酵素、例えばＥＣ１．１．１．２７をコードする。乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、ＮＡＤ結合型発酵性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子であることができる。特に、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子はｌｄｈＡ遺伝子である。
【００７６】
一例では、細胞内の脂肪酸の発現を増加させうる遺伝子突然変異は、フィードバック耐性酵素の発現の増加をもたらす細胞の少なくとも１つのフィードバック耐性酵素中に存在することができる。特に、前記酵素は、パントテン酸キナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ等であることができる。Ｅ．ｃｏｌｉにおいては、これらのフィードバック耐性突然変異体遺伝子には、ｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）および／またはｌｄｐ（Ｅ３５４Ｋ）が含まれうる。
【００７７】
さらなる例では、細胞のマロニル−ＣｏＡ依存性であるがマロニル−ＡＣＰ非依存性である脂肪酸アシル−ＣｏＡ代謝経路の増加は、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ活性および／またはトリガー因子活性および／または細胞分裂に関与する分子シャペロンの活性の減少により生じうる。一例では、前記細胞はｔｉｇ遺伝子における遺伝子突然変異を含むことができる。
【００７８】
一例では、細胞における遺伝子突然変異によって、野生型細胞に対して、ＮＡＤＰＨ依存性トランスヒドロゲナーゼ経路において増加された酵素活性が生じうる。この結果は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ活性をコードする異種核酸配列の導入により生じうる。他の例では、細胞における遺伝子突然変異によって、当技術分野において知られている任意の方法により脂肪酸アシル−ＣｏＡシンテターゼの発現および／またはリガーゼ活性の減少が生じうる。さらに他の例では、細胞における遺伝子突然変異によって、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有する酵素の過剰発現が生じうる。
【００７９】
一例では、前記細胞は、シアナーゼ（ｃｙａｎａｓｅ）活性および／またはカルボニックアンヒドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列の導入によりもたらされた、増加された細胞内重炭酸塩レベルを有しうる。より具体的には、前記細胞のいずれかの態様による遺伝子突然変異によって、脂肪酸アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ活性レベルの増加および／または減少が生じうる。この結果によって、鎖長特異性の脂肪酸アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ活性のレベルの増加と、望ましくない脂肪酸の鎖長に対する脂肪酸アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ活性の減少とによって、所望の脂肪酸生成物の鎖長特異性が増加されうる。一例では、脂肪酸または脂肪酸由来生成物の鎖長特異性の増加は、鎖長特異性のケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼまたは３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼの活性レベルを個々にまたは組み合わせて増加させることにより生じうる。
【００８０】
本発明の任意の態様による細胞における遺伝子突然変異によって、上記の酵素のリストから選択される１種のみの酵素の発現の増加または減少が生じることができ、また上記の酵素の組み合わせの発現の増加または減少も生じることができる。
【００８１】
他の例において、前記細胞における遺伝子突然変異は、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ、ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（またはエロンガーゼ）、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼおよびアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素において存在することができる。より具体的には、前記細胞における遺伝子突然変異によって、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ、ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（またはエロンガーゼ）、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼおよび３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼの発現の増加が、任意にアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼの発現または活性の減少と組み合わせて生じることができる。特に、エノイル−ＣｏＡレダクターゼおよび／またはケトアシル−ＣｏＡレダクターゼは、補因子ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨを利用することができる。
【００８２】
特に、本発明の任意の態様による細胞における遺伝的改変は、第１表に挙げられた酵素のいずれかを、次の酵素：アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ、ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（またはエロンガーゼ）、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼおよび／または３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼおよびアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼと組み合わせて含むことができ、その際、酵素アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ、ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（またはエロンガーゼ）、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼおよび３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼの発現または活性は増加されており、かつアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼの活性は減少されている。
【００８３】
さらに他の例では、本発明の任意の態様による細胞におけるマロニル−ＣｏＡ依存性でかつマロニル−ＡＣＰ非依存性の脂肪酸アシル−ＣｏＡの代謝経路は、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼおよび／または３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼを含む遺伝子または経路の増加された発現と、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼの発現または活性の減少とを組み合わせることにより達成されることができる。
【００８４】
特に、本発明の任意の態様による細胞における遺伝的改変は、第１表に挙げられた酵素のいずれかを、次の酵素：アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼおよび／または３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼと組み合わせ、かつアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼの発現または活性の減少と組み合わせて含むことができる。
【００８５】
一例では、本発明の任意の態様による細胞は、第１表に挙げられた酵素のいずれかと次の酵素との組み合わせにおいて、遺伝的改変を含むことができる：アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、マロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼ（ＦａｂＤ）、β−ケトアシル−ＡＣＰ−シンターゼＩＩＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰ−シンターゼＩ（ＦａｂＢ）、β−ケトアシル−ＡＣＰ−シンターゼＩＩ（ＦａｂＦ）、３−オキソアシル−ＡＣＰ−シンターゼＩおよびエノイルＡＣＰレダクターゼ。
【００８６】
より具体的には、前記遺伝子突然変異によって、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、マロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼ（ＦａｂＤ）、β−ケトアシル−ＡＣＰ−シンターゼＩＩＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰ−シンターゼＩ（ＦａｂＢ）、β−ケトアシル−ＡＣＰ−シンターゼＩＩ（ＦａｂＦ）、３−オキソアシル−ＡＣＰ−シンターゼＩおよびエノイルＡＣＰレダクターゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素の発現の、野生型細胞に対する増加が生じうる。特に、前記遺伝子突然変異によって、本発明の任意の態様による細胞において１種超の酵素の発現の増加が生じることができ、これによって、マロニル−ＣｏＡ依存性でかつマロニル−ＡＣＰ非依存性の脂肪酸アシル−ＣｏＡの代謝経路の野生型細胞に対する前記細胞における増加された酵素活性により該細胞は脂肪酸および／またはそのアシル補酵素Ａを製造できるようになる。
【００８７】
一例では、本発明の任意の態様による細胞において、β−ケトアシル−ＡＣＰ−シンターゼおよび３−オキソアシル−ＡＣＰ−シンターゼの発現が増加しうる。他の例では、本発明の任意の態様による細胞において、β−ケトアシル−ＡＣＰ−シンターゼおよびマロニル−ＣｏＡ−ＡＣＰトランスアシラーゼの発現が増加しうる。さらに他の例では、本発明の任意の態様による細胞において、β−ケトアシル−ＡＣＰ−シンターゼおよびエノイルＡＣＰレダクターゼの発現が増加しうる。一例では、本発明の任意の態様による細胞において、β−ケトアシル−ＡＣＰ−シンターゼ、マロニル−ＣｏＡ−ＡＣＰトランスアシラーゼおよびエノイルＡＣＰレダクターゼの発現が増加しうる。いずれの例においても、エノイルＡＣＰレダクターゼおよび／またはアシル−ＣｏＡチオエステラーゼの発現が増加しうる。
【００８８】
「酵素の増加された活性」という句は、本明細書で用いられる場合には、増加された細胞内活性と理解されるべきである。基本的には、酵素活性の増加は、強力なプロモーターを使用して、または増加された活性を有する対応する酵素をコードする遺伝子または対立遺伝子を用いて、かつ任意にこれらの措置を組み合わせることにより、酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列のコピー数を増加させることによって達成されることができる。本発明の任意の態様により用いられる遺伝的に改変された細胞は、例えば形質転換、形質導入、接合またはこれらの方法の組合せにより、所望の遺伝子、この遺伝子の対立遺伝子またはその部分を含むベクターと、遺伝子の発現を可能にするベクターとを用いて作製される。異種発現は、特に、前記細胞の染色体または染色体外複製ベクターへの遺伝子または対立遺伝子の組込みによって達成される。
【００８９】
一例では、本発明の細胞における遺伝的改変は、上記酵素のいずれかと、次のものからなる群から選択される少なくとも１種の酵素における遺伝的改変とを組み合わせて含むことができる：β−ケトアシル−ＡＣＰ−シンターゼＩ、３−オキソアシル−ＡＣＰ−シンターゼＩ、マロニル−ＣｏＡ−ＡＣＰトランスアシラーゼ、エノイルＡＣＰレダクターゼおよびβ−ケトアシル−ＡＣＰ−シンターゼＩＩＩ。特に、本発明の任意の態様による細胞における遺伝的改変は、第１表に挙げられた酵素のいずれかを、次の酵素と組み合わせて含むことができる：β−ケトアシル−ＡＣＰ−シンターゼＩ、３−オキソアシル−ＡＣＰ−シンターゼＩ、マロニル−ＣｏＡ−ＡＣＰトランスアシラーゼ、エノイルＡＣＰレダクターゼおよびβ−ケトアシル−ＡＣＰ−シンターゼＩＩＩ。
【００９０】
【表１】
2016528904.tif 000005
【００９１】
【表２】
2016528904.tif 000006
【００９２】
本発明の任意の態様によれば、前記細胞は、少なくとも１種のトランスポータータンパク質の発現が野生型細胞に対して増加するように遺伝的に改変されることができる。前記トランスポータータンパク質は、ＦａｄＬおよび／またはＡｌｋＬであることができる。一例では、前記細胞は、ＦａｄＬ遺伝子およびＡｌｋＬ遺伝子の双方を過剰発現するように遺伝的に改変されることができる。
【００９３】
前記細胞は、野生型細胞に対して、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ、ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（またはエロンガーゼ）、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼおよび３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素の発現が増加し、かつ任意にアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼの発現が減少するように遺伝的に改変されることもでき、その際、前記細胞は低下された脂肪酸分解能を有する。
【００９４】
従って、本発明の細胞および方法は、脂肪酸または脂肪酸由来生成物への製造経路と、減少された活性を示すマロニル−ＡＣＰ依存性脂肪酸シンターゼ系の酵素をコードする改変されたポリヌクレオチドとの双方を含む遺伝的に改変された微生物の提供を含むことができ、それにより、そのような改変を欠く同等（対照）の微生物と比較して、マロニル−ＣｏＡの利用が製造経路側にシフトする。本方法は、栄養培地を備えた容器中でのそのように遺伝的に改変された微生物の集合体を用いた化学的生成物の製造を含む。他の酵素、例えばアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼおよび／またはＮＡＤＰＨ依存性トランスヒドロゲナーゼへの本明細書に記載の他の遺伝的改変が、このようないくつかの例において存在することができる。これらの酵素活性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのさらなるコピーの提供によって脂肪酸または脂肪酸由来生成物の製造が増加することが示されている。これらのそれぞれの酵素活性を増加させる他の方法は当技術分野において知られており、かつ本発明の様々な実施例に適用されうる。
【００９５】
これに限定されるものではないが、脂肪酸を作出するいくつかの多段法の実施形態における最初のステップは、容器、例えば培養容器またはバイオリアクター容器への栄養培地、例えば当業者に知られているような最少培地および遺伝的に改変された微生物の接種材料の提供により例示されることができ、それにより、微生物、例えば細菌、より具体的には腸内細菌科の一員、例えばＥ．ｃｏｌｉの集合体が提供され、その際、遺伝的に改変された微生物は、マロニル−ＣｏＡを脂肪酸へと転化する代謝経路を含む。この接種材料は容器内で培養され、それにより、細胞密度が、前記方法の次のステップを考慮して全体的な製造指標を満たす脂肪酸または脂肪酸由来生成物の製造レベルに達するのに適した細胞密度へと増加する。様々な代替的実施形態において、これらの遺伝的に改変された微生物の集合体は、第１の予備容器内で第１の細胞密度まで培養されることができ、その後、上記容器に移されることによって、選択される細胞密度が提供される。多数の多槽培養戦略が当業者に知られている。このような実施形態はいずれも、本方法の第１の上記ステップにより、選択される細胞密度を提供する。
【００９６】
またこれに限定されるものではないが、後続のステップは２つのアプローチにより例示されることができ、これらは様々な実施形態において組み合わせて実施されてもよい。第１のアプローチにより提供されるのは、遺伝的改変により、そのエノイル−ＡＣＰレダクターゼ酵素活性を制御できるように遺伝的に改変された微生物を得ることである。一例として、ネイティブエノイル−ＡＣＰレダクターゼを温度感受性突然変異体エノイル−ＡＣＰレダクターゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＦａｂＩＴＳ）に置換するという遺伝的改変が行われることができる。温度感受性突然変異体エノイル−ＡＣＰレダクターゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＦａｂＩTS）は、３０℃超の温度で低下された酵素活性を示すことがあるが、３０℃では通常の酵素活性を示し、培養温度が例えば３４℃、３５℃、３６℃、３７℃またはさらには４２℃に上昇するとエノイル−ＡＣＰレダクターゼの酵素活性が低下する。このような場合には、３０℃での場合よりも多くのマロニル−ＣｏＡが、脂肪酸または脂肪酸由来生成物または他の化学的生成物へと転化され、その際、有効性の低いエノイル−ＡＣＰレダクターゼは、マロニル−ＣｏＡから脂肪酸への転化を妨げない。
【００９７】
前記細胞内には、脂肪酸および／またはアミノ酸の製造において有用でありうる他の遺伝的改変が含まれていてもよい。例えば、スクロースを利用する能力が提供されることができ、これによって、脂肪酸または脂肪酸由来生成物または他の化学的生成物の製造に利用されうる供給原料の範囲が拡張されるであろう。Ｅ．ｃｏｌｉの一般的な実験室用および工業的な株、例えば本明細書に記載の株は、唯一の炭素源としてスクロースを利用することができない。スクロースおよびスクロースを含有する供給原料、例えば糖蜜は豊富であり、かつ微生物発酵による製造のための供給原料としてしばしば使用されるため、スクロースの取り込みおよび使用が可能となるような適切な遺伝的改変の追加が、本明細書において提供されるような他の特徴を有する株において実施されうる。様々なスクロースの取り込みおよび代謝系は、当技術分野において知られている（例えばＵＳ特許６，９６０，４５５参照）。
【００９８】
また、より複雑な炭素源、例えばセルロース系バイオマスまたはその生成物を、そのような炭素源の取り込みのためおよび／または利用のために分解するための機能を追加する遺伝的改変が提供されてもよい。例えば、多数のセルラーゼおよびセルラーゼベースのセルロース分解系について、研究および特性決定がなされている（Ｂｅｇｕｉｎ，  Ｐ  ａｎｄ  Ａｕｂｅｒｔ，  Ｊ−Ｐ  （１９９４）  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．  Ｒｅｖ．  １３：  ２５−５８；  Ｏｈｉｍａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｅｎｇ．  Ｒｅｖ．  １４：  ３６５４１４）。
【００９９】
いくつかの例では、遺伝的改変によって補因子ＮＡＤＰＨのプールおよび可用性が高められ、かつ／または、その結果、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ+比が提供されることができる。例えばＥ．ｃｏｌｉにおいては、このことは、次の遺伝子の１種以上の活性を例えば遺伝的改変により高めることにより：ｐｇｉ（突然変異された形態で）、過剰発現されたｐｎｔＡＢ、ｇａｐＡ：ｇａｐＮの置換／置き換え、並びに可溶性トランスヒドロゲナーゼ、例えばｓｔｈＡの破壊または改変により、並びに／またはｚｗｆ、ｇｎｄおよびｅｄｄの１つ以上の遺伝的改変により行われることができる。
【０１００】
任意のそのような遺伝的改変が、そのような機能を有しないかまたはそのような機能を所望のレベルより低く有する種に提供されることができる。より包括的に、かつ遺伝的改変のために選択される微生物の特定の代謝経路に応じて、遺伝的改変のいずれかのサブグループが、アセテート、アセトイン、アセトン、アクリル酸（acrylic）、マレート、ベンゾイル−ＣｏＡ、脂肪酸エチルエステル、イソプレノイド、グリセリン、エチレングリコール、エチレン、プロピレン、ブチレン、イソブチレン、酢酸エチル、酢酸ビニル、他のアセテート、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ブチレート、イソブチレート、２−ＯＨ−イソブチレート、３−ＯＨ−ブチレート、エタノール、イソプロパノール、Ｄ−ラクテート、Ｌ−ラクテート、ピルベート、イタコネート、レブリネート、グルカレート、グルタメート、カプロラクタム、アジピン酸、プロパノール、イソプロパノール、フーゼルアルコールおよび１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、フォルメート、フマル酸、プロピオン酸、コハク酸、吉草酸およびマレイン酸からなる群から選択される発酵産物の細胞製造を減少するように行われることができる。遺伝子欠失は本明細書に包括的に開示されているように行われることができ、また、選択される発酵産物の細胞製造の所望の減少を達成するために他のアプローチが用いられてもよい。
【０１０１】
本発明を、以下の図面および非限定的な実施例によりさらに説明する。これにより、本発明のさらなる実施形態、態様および利点を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ｐＪ２９４｛Ｐｔａｃ｝［ｓｙｎＵｃＴＥ］／ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）＿ｆａｄＤ＿Ｅｃ］の４８時間の発酵からのサンプルのトータルイオンクロマトグラムを示す。
【図２】図２は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ｐＪ２９４｛Ｐｔａｃ｝［ｓｙｎＵｃＴＥ］／ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ３（ｃｏ＿Ｅｃ）＿ｆａｄＤ＿Ｅｃ］の４８時間の発酵からのサンプルのトータルイオンクロマトグラムを示す。
【図３】図３は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ｐＪ２９４｛Ｐｔａｃ｝［ｓｙｎＵｃＴＥ］／ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１の４８時間の発酵（陰性対照）からのサンプルのトータルイオンクロマトグラムを示す。
【図４】図４は、Ｅ．ｃｏｌｉ株  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］によるラウロイルグリシネートの製造を示す。
【図５】図５は、Ｅ．ｃｏｌｉ株  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］によるラウロイルグリシネートの製造を示す。
【図６】図６のツリーは、実施例１６において試験された様々な生物におけるＧＬＹＡＴ２の配列同一性のパーセンテージを示す。
【０１０３】
実施例
配列番号：
本出願全体を通して様々な配列番号を用いる。これらを以下の第２表に示す。
【０１０４】
【表３】
2016528904.tif 000007
【０１０５】
実施例１
カリフォルニアゲッケイジュ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）遺伝子ｓｙｎＵｃＴＥのための発現ベクターの作製
カリフォルニアゲッケイジュのアシル−ＣｏＡ−チオエステラーゼをコードするカリフォルニアゲッケイジュｓｙｎＵｃＴＥ遺伝子（配列番号１）のための発現ベクターを作製するために、この遺伝子を大腸菌における発現のためにコドン最適化させた。この遺伝子をｔａｃプロモーター（配列番号２）と一緒に合成し、それと同時に、このプロモーターの上流に１つの切断部位を導入し、かつターミネーターの下流に１つの切断部位を導入した。合成されたＤＮＡフラグメントＰｔａｃ−ｓｙｎＵｃＴＥを、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、かつ相応して切断されたベクターｐＪ２９４（ＤＮＡ２．０  Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州メンローパーク）に連結した。完成したＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターを、ｐＪ２９４［Ｐｔａｃ−ｓｙｎＵｃＴＥ］（配列番号３）と命名した。
【０１０６】
実施例２
大腸菌ｆａｄＤとヒト遺伝子ｈＧＬＹＡＴ３およびｈＧＬＹＡＴ２のいずれか一方との共発現のためのベクターの作製
ヒトグリシン−Ｎ−アシルトランスフェラーゼをコードするヒト遺伝子ｈＧＬＹＡＴ２（配列番号４）またはｈＧＬＹＡＴ３（配列番号５）と、Ｅ．ｃｏｌｉアシル−ＣｏＡシンテターゼをコードする大腸菌ｆａｄＤ（配列番号６）との共発現のためのベクターを作製するために、これらの遺伝子ｈＧＬＹＡＴ２およびｈＧＬＹＡＴ３を大腸菌における発現のためにコドン最適化させ、かつ合成した。合成されたＤＮＡフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩで消化し、かつ、ａｆｔＡ１遺伝子を除去して相応して切断されたｐＣＤＦ［ａｔｆＡ１＿Ａｂ（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］（配列番号７）に連結した。このプロセスにおいてさらに除去した配列セグメントを、遺伝子合成の間に共合成した。このベクターは、合成ｔａｃプロモーター（配列番号２）および大腸菌ＦａｄＤ遺伝子をすでに含むｐＣＤＦ誘導体である。生じる発現ベクターを、ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］（配列番号８）およびｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ３（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］（配列番号９）と命名した。
【０１０７】
実施例３
ヒトｈＧＬＹＡＴ２、大腸菌ｆａｄＤおよびシュードモナス・プチダａｌｋＬ遺伝子の共発現のためのベクターの作製
ｈＧＬＹＡＴ２遺伝子と、細胞内への疎水性基質の取り込みを容易にする外膜タンパク質ＡｌｋＬをコードする改変されたシュードモナス・プチダａｌｋＬ遺伝子との共発現のためのベクターを作製するために、ａｌｋＬ遺伝子（配列番号１０）を、ｌａｃｕｖ５プロモーター（配列番号１１）と一緒にプラスミドｐＣＤＦ［ａｌｋＬｍｏｄ１］（配列番号１２）から配列特異的オリゴヌクレオチドを用いて増幅させた。ＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＮｓｉＩで切断し、かつそれに応じて切断されたベクターｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］（配列番号８）に連結した。標的遺伝子の正確な挿入を制限分析により確認し、かつ導入遺伝子の真正性をＤＮＡ配列決定により確認した。得られた発現ベクターを、ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］（配列番号１３）と命名した。
【０１０８】
次のパラメーターをＰＣＲのために使用した：１×：初期変性、９８℃、３：００分；３５×変性、９８℃、０：１０分；アニーリング、６５℃、０：２０分；エロンゲーション、７２℃、０：１７分；１×：最終エロンゲーション、７２℃、１０分。増幅のために、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（フランクフルト）からのＰｈｕｓｉｏｎTM  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを製造業者のマニュアルに従って使用した。ＰＣＲ反応物５０μＬを１％ＴＡＥアガロースゲル上で分析した。ＰＣＲの手順、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡの臭化エチジウム染色およびＰＣＲフラグメントサイズの測定を、当業者に知られている通りに行った。
【０１０９】
実施例４
カリフォルニアゲッケイジュｓｙｎＵｃＴＥ、大腸菌ｆａｄＤおよびヒトｈＧＬＹＡＴ２およびｈＧＬＹＡＴ３遺伝子を過剰発現する、ｆａｄＥ遺伝子が欠失したＥ．ｃｏｌｉ株の作製
カリフォルニアゲッケイジュｓｙｎＵｃＴＥと大腸菌ｆａｄＤとヒトｈＧＬＹＡＴ２またはヒトｈＧＬＹＡＴ３遺伝子とを組み合わせて共発現するＥ．ｃｏｌｉ株を作製するために、株Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥを、プラスミドｐＪ２９４｛Ｐｔａｃ｝［ｓｙｎＵｃＴＥ］およびｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）＿ｆａｄＤ＿Ｅｃ］またはｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ３（ｃｏ＿Ｅｃ）＿ｆａｄＤ＿Ｅｃ］を用いてエレクトロポレーションにより形質転換し、かつスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）およびアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を補充したＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。形質転換体を、プラスミド調製および制限分析により正しいプラスミドの存在について調べた。株Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ｐＪ２９４｛Ｐｔａｃ｝［ｓｙｎＵｃＴＥ］／ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）＿ｆａｄＤ＿Ｅｃ］およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ｐＪ２９４｛Ｐｔａｃ｝［ｓｙｎＵｃＴＥ］／ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ３（ｃｏ＿Ｅｃ）＿ｆａｄＤ＿Ｅｃ］を、このようにして作製した。
【０１１０】
実施例５
大腸菌ｆａｄＤおよびヒトｈＧＬＹＡＴ２またはｈＧＬＹＡＴ３遺伝子のいずれか一方を過剰発現する、ｆａｄＥ遺伝子が欠失したＥ．ｃｏｌｉ株の作製
大腸菌ｆａｄＤ遺伝子とヒトｈＧＬＹＡＴ２またはｈＧＬＹＡＴ３遺伝子とを組み合わせて共発現するＥ．ｃｏｌｉ株を作製するために、Ｅ．ｃｏｌｉ株  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥのエレクトロコンピテントセルを作製した。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥを、プラスミドｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］を用いて形質転換し、かつスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を補充したＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。形質転換体を、プラスミド調製および制限分析により正しいプラスミドの存在について調べた。このようにして作製した株を、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］と命名した。
【０１１１】
実施例６
ｓｙｎＵｃＴＥおよびｆａｄＤ遺伝子とｈＧＬＹＡＴ２またはｈＧＬＹＡＴ３のいずれか一方とを組み合わせて過剰発現するｆａｄＥ遺伝子が欠失したＥ．ｃｏｌｉ株による、脂肪酸／アミノ酸付加物の製造
実施例４において作製された株を、脂肪酸／アミノ酸付加物を製造する該株の能力について調べるために用い、次のように進めた：
−８０℃のグリセロール培養から出発して、実験されるべき株をまず１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを補充したＬＢ寒天プレート上にプレーティングし、かつ３７℃で一晩インキュベートした。いずれの場合にも単一コロニーから出発し、その後、この株を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを補充したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ  ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ（Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット）中の５ｍＬ前培養物として増殖させた。さらなる培養ステップをＭ９培地中で行った。３８ｍＭリン酸水素二ナトリウム二水和物、２２ｍＭリン酸二水素カリウム、８．６ｍＭ塩化ナトリウム、３７ｍＭ塩化アンモニウム、２％（ｗ／ｖ）グルコース、２ｍＭ硫酸マグネシウム七水和物（いずれの化学物質もＭｅｒｃｋ、ダルムシュタットより）および０．１％（ｖ／ｖ）微量元素溶液から構成されるこの培地を、濃度２５％の水酸化アンモニウム溶液を用いてｐＨを７．４にした。添加されたこの微量元素溶液（１Ｍ塩酸中に溶解された、９．７ｍＭ塩化マンガン（ＩＩ）四水和物、６．５ｍＭ硫酸亜鉛七水和物、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡナトリウム（Ｔｉｔｒｉｐｌｅｘ  ＩＩＩ）、４．９ｍＭホウ酸、１ｍＭモリブデン酸ナトリウム二水和物、３２ｍＭ塩化カルシウム二水和物、６４ｍＭ硫酸鉄（ＩＩ）七水和物および０．９ｍＭ塩化銅（ＩＩ）二水和物（いずれの化学物質もＭｅｒｃｋ、ダルムシュタットより）から構成される）を、Ｍ９培地への添加前にろ過滅菌した。１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンおよび１００μｇ／ｍＬアンピシリンを補充したＭ９培地２０ｍＬをバッフル付き１００ｍＬ容三角フラスコに導入し、かつ前培養物０．５ｍＬを接種した。このフラスコを、シェーカーインキュベーター内で３７℃で２００ｒｐｍで培養した。８時間の培養時間後、１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンおよび１００μｇ／ｍＬアンピシリンを補充したＭ９培地５０ｍＬをバッフル付き２５０ｍＬ容三角フラスコに導入し、かつ培養物１０ｍＬを接種することにより、０．２の光学密度（６００ｎｍ）を達成した。このフラスコをシェーカーインキュベーター内で３７℃で２００ｒｐｍで培養した。光学密度（６００ｎｍ）が０．７〜０．８に達したら、１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加により遺伝子発現を誘導した。これらの株を、３０℃で２００ｒｐｍでさらに４８時間培養した。この誘導と同時に、１ｇ／Ｌグリシンをこれらの培養物の一部に添加した。培養中にサンプルを採取して、存在する脂肪酸／アミノ酸付加物を分析した。結果を図１および図２に示す。Ｅ．ｃｏｌｉ株  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ｐＪ２９４｛Ｐｔａｃ｝［ｓｙｎＵｃＴＥ］／ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）＿ｆａｄＤ＿Ｅｃ］およびＥ．ｃｏｌｉ株  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ｐＪ２９４｛Ｐｔａｃ｝［ｓｙｎＵｃＴＥ］／ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ３（ｃｏ＿Ｅｃ）＿ｆａｄＤ＿Ｅｃ］の双方が、グルコースから様々な脂肪酸／アミノ酸付加物、例えばラウロイルグルタミン酸を形成しうることを実証することができた。対照的に、プラスミドを欠いている陰性対照としての細胞内では、このような付加物を見出すことができない（��３）。第３表に示されるように、わずかな配列変異、例えばｈＧＬＹＡＴ２とｈＧＬＹＡＴ３とが区別されるアミノ酸置換は、細胞が脂肪酸／アシルアミノ酸付加物を作出する能力を損なわないものと考えられる。
【０１１２】
【表４】
2016528904.tif 000008
【０１１３】
実施例７
ＨＰＬＣ／ＭＳによる生成物のクロマトグラフィーによる定量化
Ｎ−ラウロイルグリシン、Ｎ−ミリストイルグリシンおよびＮ−パルミトイルグリシンの定量化および発酵サンプル中の他のアシルアミノ酸の検出を、ＨＰＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳにより行った。定量化を、外部校正（約０．１〜５０ｍｇ／ｌ）を用いて、３つの標的化合物について「シングルイオンモニタリング」モード（ＳＩＭ）で行った。並行して、スキャンを質量範囲ｍ／ｚ＝１００〜１０００にわたって行うことにより、さらなるアシルアミノ酸を同定した。
【０１１４】
脂肪酸グリシネートを測定するためのサンプルを、次のように調製した：溶媒（アセトン）８００μＬおよびサンプル２００μＬを、２ｍＬ容反応容器にピペットで移した。この混合物をレッチェミル中で３０Ｈｚで１分間振とうし、その後約１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。澄明な上清をピペットを用いて除去し、希釈剤（８０％アセトニトリル／２０％水＋０．１％ギ酸）で適切な希釈した後に分析した。使用される校正標準物質を同様に溶解させ、かつこの希釈液で希釈した。
【０１１５】
次の機器を用いた：
・ＭＳポンプ、オートサンプラーＰｌｕｓおよびＰＤＡ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｐｌｕｓで構成されるＳｕｒｖｅｙｏｒ  ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）
・ＨＥＳＩ  ＩＩソースを搭載した質量分析計ＴＳＱ  Ｖａｎｔａｇｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）
・ＨＰＬＣカラム：１００×２ｍｍ  Ｐｕｒｓｕｉｔ  ＸＲＳ  Ｕｌｔｒａ  Ｃ８；２．８μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ、米国カリフォルニア州サンタクララ）
化学薬品：
・Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｓｙｓｔｅｍからの水
・ＨＰＬＣ用アセトニトリル（Ｍｅｒｃｋ  ＡＧ、ドイツ連邦共和国ダルムシュタット）
・ｐ．ａ．グレードのギ酸（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ連邦共和国ダルムシュタット）
・Ｎ−プロパノールＬｉｃｈｒｏｓｏｌｖ（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ連邦共和国ダルムシュタット）
・Ｎ−ラウロイルグリシン  ９９％（Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、米国イリノイ州ウッドデール）
・Ｎ−ミリストイルグリシン  ＞９８％（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国テキサス州）
・Ｎ−パルミトイルグリシン  ＞９９％（出所不明）
ＨＰＬＣ分離を、上記ＨＰＬＣカラムを用いて行った。注入体積は２μＬであり、カラム温度は４０℃であり、流量は０．３ｍＬ／分であった。移動相は、溶離液Ａ（濃度０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸水溶液）および溶離液Ｂ（７５％アセトニトリル／２５％ｎ−プロパノール（ｖ／ｖ）および０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸）からなっていた。以下のグラジエントプロファイルを用いた：
【表５】
2016528904.tif 000009
【０１１６】
ＨＰＬＣ／ＭＳ分析を、次のＥＳＩソースのパラメーターを用いてポジティブイオン化モードで行った：
スプレー電圧：３５００Ｖ
蒸発器温度：５０℃
シースガス圧力：４０
補助ガス圧力：１０
キャピラリー温度：２５０℃
スプレイヤー間隔：リングＣ
３つの分析物の検出および定量化を、第５表に示す次のパラメーターを用いて「シングルイオンモニタリング」（ＳＩＭ）により行った。
【０１１７】
【表６】
2016528904.tif 000010
【０１１８】
実施例８
並列発酵系においてｓｙｎＵｃＴＥおよびｆａｄＤ遺伝子をｈＧＬＹＡＴ２またはｈＧＬＹＡＴ３と組み合わせて過剰発現するｆａｄＥ遺伝子が欠失したＥ．ｃｏｌｉ株による、脂肪酸アミノ酸付加物の製造
実施例４で作製された株を、グルコースから脂肪酸アミノ酸付加物を製造する該株の能力について調べるために用いた。この目的のために、この株を振とうフラスコ中および流加発酵の双方において培養した。この発酵を、８つのバイオリアクターを有するＤＡＳＧＩＰからの並列発酵系において行った。
【０１１９】
製造細胞を、実施例６に記載の通りに調製した。
【０１２０】
発酵を、オーバーヘッドスターラーおよびインペラーブレードを備えた１Ｌ容反応器を用いて行った。ｐＨおよびＰＯ2を、プロセスモニタリングのためにオンラインで測定した。ＯＴＲ／ＣＴＲ測定は、特に代謝活性および細胞適合性を推定するための役割を果たした。
【０１２１】
ＤＡＳＧＩＰの技術説明書に規定されている通りに、ｐＨ電極を、ｐＨ４．０およびｐＨ７．０の標準溶液を用いた２点校正によって校正した。この反応器に、この技術説明書に規定されている通りに必要なセンサーおよび接続物を取り付け、かつ撹拌軸を取り付けた。次いで、この反応器に水３００ｍＬを充填し、かつ無菌性を保証するために１２１℃で２０分間オートクレーブ処理を行った。ｐＯ２電極を測定増幅器に接続し、かつ一晩（少なくとも６時間）分極させた。その後、水をクリーンベンチ下に除去し、かつ、３．０ｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、６．７９ｇ／ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、２．０ｇ／ｌ  ＮＨ４Ｃｌ、滅菌１Ｍ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ溶液２ｍＬ、および１ｍＬ／ｌ  ろ過滅菌微量元素ストック溶液（ＨＣｌ（３７％）３６．５０ｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  １．９１ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．８７ｇ／Ｌ、エチレンジアミン四酢酸二水和物０．８４ｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３  ０．３０ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．２５ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ４．７０ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １７．８０ｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．１５ｇ／Ｌで構成）で構成されるＭ９培地（ｐＨ７．４）、並びに１００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンおよび３ｍＬ／ｌ  ＤＯＷ１５００を補充した炭素源としての１５ｇ／Ｌグルコース（５００ｇ／Ｌグルコース、１．３％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏで構成される３０ｍＬ／ｌ滅菌フィード溶液中への計量供給により添加）で置き換えた。
【０１２２】
その後、ｐＯ２電極を１点校正で１００％に校正し（撹拌機：４００ｒｐｍ／通気：１０ｓｌ／ｈ  空気）、かつ、フィード、補正剤および誘導剤ラインを、この技術説明書に規定されている通りに「定置洗浄」で洗浄した。この目的のために、チューブをまず７０％エタノールでリンスし、その後１Ｍ  ＮａＯＨでリンスし、その後滅菌完全脱塩水でリンスし、最後にそれぞれの媒体を充填した。
【０１２３】
実施例４のＥ．ｃｏｌｉ株を用いて、希釈ストリークを、最初に、１００ｍｇ／ｌスペクチノマイシンを補充したＬＢ寒天プレート上で凍結培養物（ｃｒｙｏｃｕｌｔｕｒｅ）を用いて行い、かつこのプレートを３７℃で約１６時間インキュベートした。その後、１００ｍｇ／ｌスペクチノマイシンを補充したＬＢ培地（１００ｍｌ容バッフルフラスコ中で１０ｍＬ）に単一コロニーを接種し、かつこの培養物を３７℃で２００ｒｐｍで約１６時間にわたって一晩増殖（grow、成育）させた。その後、この培養物を、３．０ｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、６．７９ｇ／ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、２．０ｇ／ｌ  ＮＨ４Ｃｌ、滅菌１Ｍ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ溶液２ｍＬ、および１ｍＬ／ｌろ過滅菌微量元素ストック溶液（ＨＣｌ（３７％）３６．５０ｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  １．９１ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．８７ｇ／Ｌ、エチレンジアミン四酢酸二水和物０．８４ｇ／ｌ、Ｈ３ＢＯ３  ０．３０ｇ／ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．２５ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ４．７０ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １７．８０ｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．１５ｇ／Ｌで構成）で構成されるＭ９培地５０ｍＬに、炭素源としての２０ｇ／Ｌグルコース（５００ｇ／Ｌグルコースで構成される４０ｍＬ／Ｌ滅菌フィード溶液中への計量供給により添加）を上記抗生物質と共に補充したものの中での、初期ＯＤ０．２での第２の前培養段階のために使用し、これを５００ｍＬ容バッフルフラスコに移し、かつ３７℃／２００ｒｐｍで８〜１２時間インキュベートした。
【０１２４】
０．１の光学密度で反応器に接種するために、第２の前培養段階のＯＤ600を測定し、かつ接種に必要な培養物の量を算出した。培養物の必要量を、セプタムを通じて５ｍＬ容シリンジを用いて、加熱および通気された反応器に入れた。
【０１２５】
第６表のａ−ｃに示す標準的なプログラムを用いた：
【表７】
2016528904.tif 000011
【０１２６】
ｐＨを、濃度１２．５％のアンモニア溶液を用いてｐＨ７．０に一方的に調整した。増殖期および生体内変化の間に、この培養物中の溶存酸素（ＰＯ2またはＤＯ）を、撹拌速度および通気速度によって少なくとも３０％に調整した。接種後に、ＤＯは１００％からこの３０％へと低下し、その際、これを残りの発酵について安定的に保持した。
【０１２７】
発酵を流加として行い、供給開始を、５００ｇ／ｌグルコース、１．３％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏで構成される５ｇ／ｌ・ｈグルコースフィードを用いた供給段階の開始として行い、これは、バッチ段階の終了を示すＤＯピークをトリガとした。供給開始以降、温度を３７℃から３０℃に低下させた。供給開始の２時間後に、発現を１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。
【０１２８】
ラウロイル、ミリストイルおよびパルミトイルグリシネートを定量化するために、発酵開始の４７時間後および６４時間後にサンプルを採取した。これらのサンプルを分析用に調製し、実施例７に記載の通りに分析した。
【０１２９】
株Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ｐＪ２９４｛Ｐｔａｃ｝［ｓｙｎＵｃＴＥ］／ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）＿ｆａｄＤ＿Ｅｃ］が、グルコースからラウロイルグリシネートを形成しうることを実証することができた。結果を第７表および第８表に示す。
【０１３０】
【表８】
2016528904.tif 000012
【０１３１】
【表９】
2016528904.tif 000013
【０１３２】
実施例９
実施例５の株を、ラウリン酸とグリシンとを結合してラウロイルグリシネートを形成する能力を調べるために、流加発酵で発酵させた。この発酵を、８つのバイオリアクターを有するＤＡＳＧＩＰからの並列発酵系において行った。
【０１３３】
実験の設定は、グルコースの代わりに脱塩水中の１００ｇ／ｌグリシンおよびラウリン酸メチルエステル中の１００ｇ／ｌラウレートを供給すること以外は、実施例８に記載した通りであった。発酵サンプルにおけるラウロイル、ミリストイルおよびパルミトイルグリシネートを定量化するために、発酵開始の２３時間後および４２時間後にサンプルを採取した。これらのサンプルを分析用に調製し、実施例７に記載した通りに分析した。結果を第９表および第１０表に示す。
【０１３４】
株Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）＿ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｖｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］が、ラウリン酸とグリシンとを結合してラウロイルグリシネートを製造しうることを実証することができた。
【０１３５】
【表１０】
2016528904.tif 000014
【０１３６】
実施例１０
マロニル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡを介して脂肪酸を製造するＥ．ｃｏｌｉ株におけるヒト遺伝子ｈＧＬＹＡＴ３およびｈＧＬＹＡＴ２の発現のためのベクターの作製
（ＷＯ２０１４０２６１６２Ａ１の第３．２表から）後出の第１３表に挙げられた脂肪酸を製造する株におけるヒト遺伝子ｈＧＬＹＡＴ２（配列番号４）またはｈＧＹＬＡＴ３（配列番号５）の発現のためのベクターを作製するために、遺伝子ｈＧＬＹＡＴ２およびｈＧＹＬＡＴ３を最初に増幅した。配列特異的オリゴヌクレオチドを用いて、遺伝子ｈＧＬＹＡＴ２をプラスミドｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］（配列番号１３）から増幅し、かつｈＧＹＬＡＴ３遺伝子をプラスミドｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ３（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］（配列番号９）から増幅した。これらのＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩおよびＳａｃＩで切断し、かつそれに応じて切断されたベクターｐＥＴ−２８ｂ（配列番号１４）に連結した。標的遺伝子の正確な挿入を制限分析により確認し、かつ導入遺伝子の真正性をＤＮＡ配列決定により確認した。得られた発現ベクターを、ｐＥＴ−２８ｂ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）］（配列番号１５）およびｐＥＴ−２８ｂ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ３（ｃｏ＿Ｅｃ）］（配列番号１６）と命名した。
【０１３７】
実施例１１
振とうフラスコ実験におけるｈＧＬＹＡＴ２またはｈＧＬＹＡＴ３を過剰発現する株によるマロニル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡを介した脂肪酸アミノ酸付加物の製造
実施例１０により作製されたベクターを、その後、当技術分野で知られている任意の形質転換方法を用いて、後出の第１１表（ＯＰＸ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、米国）からの微生物株を作製するために使用した。具体的には、ＷＯ２０１４０２６１６２Ａ１の第ＩＶ節において提供される方法を用いた。
【０１３８】
作製された株を、グルコースから脂肪酸、特にアミノ酸付加物を製造する該株の能力を調べるために使用した。この目的のために、これらの株を、ベクターｐＥＴ−２８ｂ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）］（配列番号１５）およびｐＥＴ−２８ｂ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ３（ｃｏ＿Ｅｃ）］（配列番号１６）で形質転換し、かつ振とうフラスコ中で培養した（ＷＯ２０１４０２６１６２Ａ１の第ＩＶ節の小節Ｃ）。空のベクターｐＥＴ−２８ｂを有する株ＢＸＦ＿０３１（ＯＰＸ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、米国）を対照として使用した。
【０１３９】
３重反復評価を行った。簡潔には、一晩スターター培養物を適切な抗生物質を含むＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ５０ｍＬ中で作製し、かつ２２５ｒｐｍで振とうしながら３０℃で１６〜２４時間インキュベートした。これらの培養物を、各株の培養物１５０ｍＬをＳＭ１１最小培地に接種して０．８のＯＤ６００および５％のＴＢ培養キャリーオーバーとするために、出発接種材料および抗生物質として使用した。ＳＭ１１培地１Ｌは次のものからなる：ＦＭ１０  Ｔｒａｃｅ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｓｔｏｃｋ  ２ｍＬ、１Ｍ  ＭｇＳＯ４  ２．２６ｍＬ、グルコース３０ｇ、２００ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．４）、１ｇ／Ｌ酵母抽出物、ＶＭ１  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｍｉｘ  １．２５ｍＬ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．３２９ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１７３ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ３ｇ、クエン酸（無水）０．１５ｇ；ＦＭ１０  Ｔｒａｃｅ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｓｔｏｃｋは次のものからなる：濃ＨＣｌ  １ｍＬ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ４．９ｇ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  ０．９７ｇ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．０４ｇ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．２７ｇ、ＺｎＣｌ２  ０．０２ｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．０２４ｇ、Ｈ３ＢＯ３  ０．００７ｇ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．０３６ｇ、１００ｍＬまでの適量のＤＩ水；ＶＭ１  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｍｉｘ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎは次のものからなる：チアミン５ｇ、パントテン酸５．４ｇ、ナイアシン６．０ｇ、０．０６ｇ、１０００ｍＬまでの適量のＤＩ水。本実施例において使用される培養培地のための成分はいずれも、（ＷＯ２０１４０２６１６２Ａ１の第ＩＶ節の小節Ａ）において提供されている。
【０１４０】
培養物を、２２５ｒｐｍで振とうしながら３０℃で２時間インキュベートした。２時間後、細胞をＳＭ１１（リン酸塩不含のＳＭ１１培地）で洗浄した。細胞を２回スピンダウンし（４０００ｒｐｍ、１５分）、上清を傾瀉し、ペレットをＳＭ１１（リン酸塩不含のＳＭ１１培地）１５０ｍＬ中に再懸濁させた。この培養物を、ＳＭ１１（リン酸塩不含）に各株５０ｍＬ×３を接種するために使用した。この培養物を、約２時間後の細胞が１．０〜１．５のＯＤ６００となるように３０℃で約２時間にわたって増殖させ、かつ３７℃にシフトさせ、かつサンプルを生成物測定のために７２時間にわたって周期的に採取した。
【０１４１】
Ｎ−ラウロイルグリシン、Ｎ−ミリストイルグリシンおよびＮ−パルミトイルグリシンの定量化および発酵サンプル中の他のアシルアミノ酸の検出を、実施例７に記載の通りにＨＰＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳにより行った。
【０１４２】
【表１１】
2016528904.tif 000015
【０１４３】
実施例１２
大腸菌  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥにおけるｇｃｖＴＨＰオペロンを欠失させるためのベクターの作製
グリシン開裂系（ｇｃｖＴ：アミノメチルトランスフェラーゼ、グリシン開裂複合体のテトラヒドロ葉酸依存性サブユニット（Ｔタンパク質）；ｇｃｖＨ：グリシン開裂複合体リポイルタンパク質；ｇｃｖＰ：グリシンデカルボキシラーゼ、グリシン開裂複合体のＰＬＰ依存性サブユニット（Ｐタンパク質））をコードするＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０のｇｃｖＴＨＰオペロンを欠失させるためのベクターを作製するために、このｇｃｖＴＨＰオペロンの約５００ｂｐ上流および下流をＰＣＲにより増幅した。ｇｃｖＴＨＰの上流領域を、オリゴヌクレオチドｏ−ＭＯ−４０（配列番号２２）およびｏ−ＭＯ−４１（配列番号２３）を用いて増幅した。ｇｃｖＴＨＰの下流領域を、オリゴヌクレオチドｏ−ＭＯ−４２（配列番号２４）およびｏ−ＭＯ−４３（配列番号２５）を用いて増幅した。ＰＣＲ手順は、上記で実施例３において記載されている。
【０１４４】
いずれの場合にも、予想されるサイズのＰＣＲフラグメントを増幅することができた（ＰＣＲ  １５５３ｂｐ（配列番号２６）；ＰＣＲ  ２５４７ｂｐ、配列番号２７）。これらのＰＣＲサンプルをアガロースゲル電気泳動により分離し、かつＤＮＡフラグメントをＱｉａＱｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン）を用いて単離した。精製されたＰＣＲフラグメントをベクターｐＫＯ３（配列番号２８）にクローニングし、かつＧｅｎｅａｒｔ（登録商標）  Ｓｅａｍｌｅｓｓ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州カールズバッド）を用いてＢａｍＨＩで切断した。アセンブルされた生成物を化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、フランクフルト）に形質転換した。ＰＣＲ精製、インビトロでのクローニングおよび形質転換の手順を、製造業者のマニュアルに従って行った。標的遺伝子の正確な挿入を制限分析により確認し、かつ導入ＤＮＡフラグメントの真正性をＤＮＡ配列決定により確認した。得られたノックアウトベクターを、ｐＫＯ３ΔｇｃｖＴＨＰ（配列番号２９）と命名した。
【０１４５】
株Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰの構築を、１９９７年にＬｉｎｋらにより記載された方法を用いてｐＫＯ３ΔｇｃｖＴＨＰを用いて行った。ｇｃｖＴＨＰ欠失後のＤＮＡ配列は、配列番号３０である。このＥ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰを、プラスミドｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］（配列番号１３、実施例３）を用いてエレクトロポレーションにより形質転換し、かつスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を補充したＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。形質転換体を、プラスミド調製および制限分析により正しいプラスミドの存在について調べた。得られた株を、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］と命名した。
【０１４６】
実施例１３
ｈＧＬＹＡＴ２、ｆａｄＤおよびａｌｋＬ遺伝子を過剰発現するｆａｄＥまたはｆａｄＥ／ｇｃｖＴＨＰ遺伝子が欠失したＥ．  ｃｏｌｉ株によるラウロイルグリシネートの製造
実施例１で作製された株を、ｇｃｖＴＨＰが欠失していない参照株と比較してより多くのラウロイルグリシネートを製造する該株の能力を調べるために使用した。
【０１４７】
−８０℃のグリセリン培地から出発して、実験されるべき株をまず、１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを補充したＬＢ寒天プレート上にプレーティングし、かつ３７℃で一晩インキュベートした。いずれの場合にも単一コロニーから出発し、その後、これらの株を、１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを補充したＬＢ培地Ｍｉｌｌｅｒ（Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット）中の前培養物５ｍＬとして増殖させた。さらなる培養ステップをＭ９−ＦＩＴ培地中で行った。３８ｍＭリン酸水素二ナトリウム二水和物、２２ｍＭリン酸二水素カリウム、８．６ｍＭ塩化ナトリウム、３７ｍＭ塩化アンモニウム、２ｍＭ硫酸マグネシウム七水和物（いずれの化学物質もＭｅｒｃｋ、ダルムシュタットより）、５％（ｗ／ｖ）マルトデキストリン溶液（デキストロース当量１３．０〜１７．０、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、タウフキルヒェン）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）からの１％（ｗ／ｖ）アミログリコシダーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、タウフキルヒェン）、Ｄｅｌａｍｅｘ  １８０（Ｂｕｓｓｅｔｔｉ＆Ｃｏ、ウィーン）１滴および０．１％（ｖ／ｖ）微量元素溶液から構成されるこの培地を、濃度２５％の水酸化アンモニウム溶液を用いてｐＨ７．４にした。１Ｍ塩酸中に溶解された、９．７ｍＭ塩化マンガン（ＩＩ）四水和物、６．５ｍＭ硫酸亜鉛七水和物、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡナトリウム（Ｔｉｔｒｉｐｌｅｘ  ＩＩＩ）、４．９ｍＭホウ酸、１ｍＭモリブデン酸ナトリウム二水和物、３２ｍＭ塩化カルシウム二水和物、６４ｍＭ硫酸鉄（ＩＩ）七水和物および０．９ｍＭ塩化銅（ＩＩ）二水和物（いずれの化学物質もＭｅｒｃｋ、ダルムシュタットより）から構成される添加されたこの微量元素溶液を、Ｍ９培地への添加前にろ過滅菌した。１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを補充したＭ９培地２０ｍＬをバッフル付き１００ｍＬ容三角フラスコに導入し、かつ前培養物０．５ｍＬを接種した。このフラスコを、シェーカーインキュベーター内で３７℃で２００ｒｐｍで培養した。８時間の培養時間後、１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを補充したＭ９培地５０ｍＬをバッフル付き２５０ｍＬ容三角フラスコに導入し、かつ培養物１０ｍＬを接種することにより、０．１の光学密度（６００ｎｍ）に達した。このフラスコをシェーカーインキュベーター内で３７℃で２００ｒｐｍで培養した。光学密度（６００ｎｍ）が０．６〜０．８に達したら、１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加により遺伝子発現を誘導した。これらの株を、３７℃でかつ２００ｒｐｍでさらに４８時間培養した。この誘導の１〜３時間後に、（ラウリン酸メチルエステル中に溶解された）６ｇ／Ｌグリシンおよび６ｇ／Ｌラウリン酸をこの培養物に添加した。０時間および２４時間の培養後にサンプルを採取して、存在するラウロイルグリシネート、ラウリン酸およびグリシンを分析した。結果を図４および図５に示す。Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］およびＥ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ��Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］の双方がラウロイルグリシネートを形成しうることを実証することができた。しかしながら、新たな株バックグラウンドΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰにおいて、より多量のラウロイルグリシネートが合成され、かつより多量のグリシンが検出された。このΔｇｃｖＴＨＰバックグラウンドにおいて代謝されるグリシンはより少なく、これをラウロイルグリシネート合成に使用できるものと考えられる。
【０１４８】
実施例１４
大腸菌Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥにおけるｇｌｙＡ遺伝子を欠失させるためのベクターの作製
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０のグリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの成分をコードするｇｌｙＡ−遺伝子を欠失させるためのベクターを作製するために、ｇｌｙＡ−遺伝子の約５００ｂｐ上流および下流をＰＣＲにより増幅した。ｇｌｙＡの上流領域を、オリゴヌクレオチドｏ−ＭＯ−４４（配列番号３１）およびｏ−ＭＯ−４５（配列番号３２）を用いて増幅した。ｇｌｙＡの下流領域を、オリゴヌクレオチドｏ−ＭＯ−４６（配列番号３３）およびｏ−ＭＯ−４７（配列番号３４）を用いて増幅した。
【０１４９】
いずれの場合にも、予想されるサイズのＰＣＲフラグメントを増幅することができた（ＰＣＲ  １５４６ｂｐ（配列番号３５）；ＰＣＲ  ２５２０ｂｐ、配列番号３６）。これらのＰＣＲサンプルをアガロースゲル電気泳動により分離し、かつＤＮＡフラグメントをＱｉａＱｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン）を用いて単離した。精製されたＰＣＲフラグメントをクロスオーバーＰＣＲによりアセンブルした。作製されたフラグメントを精製し、かつ製造業者のマニュアルに従ってクローニングベクターｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩＴＯＰＯ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にサブクローニングした。このフラグメントを標的プラスミドｐＫＯ３（配列番号２８）にクローニングするために、これを、オリゴヌクレオチドｏ−ＭＯ−５２（配列番号３７）およびｏ−ＭＯ−５３（配列番号３８）を用いて、フランキングＢａｍＨＩ制限部位を用いて増幅した。精製されたＢａｍＨＩ切断ＰＣＲ３フラグメント（配列番号３９）を、相応して切断されたベクターｐＫＯ３（配列番号２８）に連結した。アセンブルされた生成物を、化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、フランクフルト）に形質転換した。ＰＣＲ精製、インビトロでのクローニングおよび形質転換の手順を、製造業者のマニュアルに従って行った。標的遺伝子の正確な挿入を制限分析により確認し、かつ導入遺伝子の真正性をＤＮＡ配列決定により確認した。得られたノックアウトベクターを、ｐＫＯ３ΔｇｌｙＡ（配列番号４０）と命名した。
【０１５０】
株Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｇｌｙＡの構築を、１９９７年にＬｉｎｋらにより記載された方法を用いてｐＫＯ３ΔｇｌｙＡを用いて行った。配列番号４１は、ｇｌｙＡ欠失後のＤＮＡ配列である。このＥ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰを、プラスミドｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］（実施例３からの配列番号１３）を用いてエレクトロポレーションにより形質転換し、かつスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を補充したＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。形質転換体を、プラスミド調製および制限分析により正しいプラスミドの存在について調べた。得られた株を、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｇｌｙＡ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］と命名した。
【０１５１】
実施例１５
大腸菌Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥにおけるｌｔａＥ遺伝子を欠失させるためのベクターの作製
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０のＬ−アロ−トレオニンアルドラーゼをコードするにおけるｌｔａＥ−遺伝子を欠失させるためのベクターを作製するために、ｌｔａＥの約５００ｂｐ上流および下流を上記の通りにＰＣＲにより増幅した。ｌｔａＥの上流領域を、オリゴヌクレオチドｌｔａＥ−ＵＰ＿ｆｗ（配列番号４２）およびｌｔＡＥ−ＵＰ−ＸｈｏＩ＿ｒｅｖ（配列番号４３）を用いて増幅した。ｌｔａＥの下流領域を、オリゴヌクレオチドｌｔａＥ−ＤＯＷＮ＿ｆｗ（配列番号４４）およびｌｔａＥ−ＤＯＷＮ＿ｒｅｖ（配列番号４５）を用いて増幅した。
【０１５２】
いずれの場合にも、予想されるサイズのＰＣＲフラグメントを増幅することができた（ＰＣＲ  ４５５０ｂｐ（配列番号４６）；ＰＣＲ  ５５３６ｂｐ、配列番号４７）。これらのＰＣＲサンプルをアガロースゲル電気泳動により分離し、かつＤＮＡフラグメントをＱｉａＱｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン）を用いて単離した。精製されたＰＣＲフラグメントをクロスオーバーＰＣＲによりアセンブルした。作製されたフラグメントを精製し、かつ製造業者のマニュアルに従ってクローニングベクターｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩＴＯＰＯ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングした。このフラグメントを標的プラスミドｐＫＯ３（配列番号２８）にクローニングするために、これを、オリゴヌクレオチドｏ−ＭＯ−５４（配列番号４８）およびｏ−ＭＯ−５５（配列番号４９）を用いて、フランキングＢａｍＨＩ制限部位を用いて増幅した。精製されたＢａｍＨＩ切断ＰＣＲ６フラグメント（配列番号５０）を、相応して切断されたベクターｐＫＯ３（配列番号２８）に連結した。アセンブルされた生成物を、化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、フランクフルト）に形質転換した。ＰＣＲ精製、インビトロでのクローニングおよび形質転換の手順を、製造業者のマニュアルに従って行った。標的遺伝子の正確な挿入を制限分析により確認し、かつ導入遺伝子の真正性をＤＮＡ配列決定により確認した。得られたノックアウトベクターを、ｐＫＯ３ΔｌｔａＥ（配列番号５１）と命名した。
【０１５３】
株Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｌｔａＥの構築を、１９９７年にＬｉｎｋら（Ｌｉｎｋ  ＡＪ，  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ｄ，  Ｃｈｕｒｃｈ  ＧＭ．  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９９７．  １７９（２０））により記載された方法を用いてｐＫＯ３ΔｌｔａＥを用いて行った。ｌｔａＥ欠失後のＤＮＡ配列は、配列番号５２で示される。このＥ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｌｔａＥを、プラスミドｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］（実施例３からの配列番号１３）を用いてエレクトロポレーションにより形質転換し、かつスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を補充したＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。形質転換体を、プラスミド調製および制限分析により正しいプラスミドの存在について調べた。得られた株を、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｌｔａＥ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］と命名した。
【０１５４】
実施例１６
ラウリン酸のＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ2をベースとした定量化
発酵サンプル中のラウリン酸の定量化を、ラウリン酸（０．１〜５０ｍｇ／Ｌ）の外部校正に基づくＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ2により内部標準物質ｄ３−ＬＳを用いることにより行った。
【０１５５】
次の機器を使用した：
・オートサンプラー（Ｇ１３６７Ｅ）、バイナリポンプ（Ｇ１３１２Ｂ）およびサーモスタット制御カラム（Ｇ１３１６Ａ）を備えたＨＰＬＣシステム１２６０（Ａｇｉｌｅｎｔ；ベーブリンゲン）
・ＥＳＩソースを搭載した質量分析計ＴｒｉｐｅｌＱｕａｄ  ６４１０（Ａｇｉｌｅｎｔ；ベーブリンゲン）
・ＨＰＬＣカラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ  Ｃ１８、１００×２．１ｍｍ、粒子径：２．６μｍ、孔径１００Å（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ；アシャッフェンブルク）
・プレカラム：ＫｒｕｄＫａｔｃｈｅｒ  Ｕｌｔｒａ  ＨＰＬＣ  Ｉｎ−Ｌｉｎｅ  Ｆｉｌｔｅｒ；フィルター厚さ０．５μｍ、内径０．００４ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ；アシャッフェンブルク）
溶媒（８０％（ｖ／ｖ）ＡＣＮ、２０％２回蒸留Ｈ2Ｏ（ｖ／ｖ）＋０．１％ギ酸）１９００μＬおよびサンプル１００μＬを２ｍＬ容反応容器にピペットで移すことにより、サンプルを調製した。この混合物を約１０秒間ボルテックス処理し、その後、約１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。澄明な上清をピペットを用いて除去し、かつ希釈剤（８０％（ｖ／ｖ）ＡＣＮ、２０％２回蒸留Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）＋０．１％ギ酸）で適切に希釈した後に分析した。いずれの場合にも、ＩＳＴＤ  １００μＬをサンプル９００μＬに添加した（１０μＬに対してサンプル体積９０μＬ）。
【０１５６】
ＨＰＬＣ分離を、上記のカラムおよびプレカラムを用いて行った。注入体積は１．０μＬであり、カラム温度は５０℃であり、流量は０．６ｍＬ／分であった。移動相は、溶離液Ａ（濃度０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸水溶液）および溶離液Ｂ（０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を含有するアセトニトリル）からなる。第１４表に示すグラジエントプロファイルを用いた：
【表１２】
2016528904.tif 000016
【０１５７】
ＥＳＩ−ＭＳ２分析を、次のＥＳＩソースのパラメーターを用いてポジティブモードで行った：
・ガス温度  ３２０℃
・ガス流量  １１Ｌ／分
・ネブライザー圧力  ５０ｐｓｉ
・キャピラリー電圧  ４０００Ｖ
ラウリン酸の検出および定量化を、次のＭＲＭパラメーターを用いて行った。
【０１５８】
【表１３】
2016528904.tif 000017
【０１５９】
実施例１７
グリシンの検出
グリシンの検出を、ｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）での誘導体化およびＡｇｉｌｅｎｔ１２００ＨＰＬＣシステムを用いたＵＶ／ＶＩＳ検出により行った。
【０１６０】
均質な発酵ブロスシンプル２００μＬを３０％（ｖ／ｖ）１−プロパノール１８００μＬと混合し、１０秒間ボルテックス処理し、次いで１３，０００×ｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、かつ次のパラメーターを用いたＨＰＬＣ分析に使用した：
【表１４】
2016528904.tif 000018
【０１６１】
【表１５】
2016528904.tif 000019
【０１６２】
ＯＰＡ試薬の調製
ｏ−フタルジアルデヒド１００ｍｇをメタノール１ｍＬに溶解し、次いで０．４ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．４）を添加して１０ｍＬとした。次いで、メルカプトエタノール５０μＬを添加し、かつこの試薬を４℃で保存した。使用前に、さらにメルカトエタノール１０μＬを添加した。
【０１６３】
ホウ酸緩衝液の調製（０．４ｍＭ  Ｈ３ＢＯ４）：
Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ（０．１モル）３８．１ｇを蒸留水１Ｌに溶解させ、かつ１０．４Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨを１０．４に調整した。次いで、２５％Ｂｒｉｊ３５（ｖ／ｖ）１ｍＬを添加した。
保持時間：グリシン：７．１５３分間
【０１６４】
実施例１８
ｈＧＬＹＡＴ２−相同体の発現のためのベクターの作製
様々な生物のＮ−アシルトランスフェラーゼの発現のためのベクターを作製するために、ＨＧＬＹＡＴ２と相同性を有するＮＣＢＩデータベースにおいて探し出した変異体を合成し、かつＥ．ｃｏｌｉのためにコドン最適化した。これらは、ホオジロテナガザルのグリシンＮ−アシルトランスフェラーゼ様タンパク質２アイソフォーム１（Ｎｌ、ＸＰ＿００３２７５３９２．１、配列番号５３）、ボリビアリスザルのグリシンＮ−アシルトランスフェラーゼ様タンパク質（Ｓｂ、ＸＰ＿００３９２０２０８．１、配列番号５４）、ネコのグリシン−Ｎ−アシルトランスフェラーゼ様２（Ｆｃ、ＸＰ＿００３９９３５１２．１、配列番号５５）、ウシのグリシンＮ−アシルトランスフェラーゼ様タンパク質２（Ｂｔ、ＮＰ＿００１１７８２５９．１、配列番号５６）およびハツカネズミのグリシンＮ−アシルトランスフェラーゼ（Ｍｍ、ＮＰ＿６６６０４７．１、配列番号５７）であった。
【０１６５】
ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］（実施例３の配列番号１３）のｈＧＬＹＡＴ２−遺伝子を、次のような変異体で置き換えた：合成されたＤＮＡフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＡｓｉＳＩで消化し、かつ相応して切断されたｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］に連結した。
【０１６６】
標的遺伝子の正確な挿入を制限分析により確認し、かつ導入遺伝子の真正性をＤＮＡ配列決定により確認した。得られた発現ベクターを、次のように命名した：
ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ＧＬＹＡＴ＿Ｎｌ（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］
ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ＧＬＹＡＴ＿Ｓｂ（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］
ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ＧＬＹＡＴ＿Ｆｃ（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］
ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ＧＬＹＡＴ＿Ｂｔ（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］
ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ＧＬＹＡＴ＿Ｍｍ（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］。
【０１６７】
実施例１９
ｈＧＬＹＡＴ−変異体、ｆａｄＤおよびａｌｋＬ遺伝子を過剰発現するｆａｄＥ遺伝子が欠失したＥ．ｃｏｌｉ株によるラウロイルグリシネートの製造
実施例１８で作製された株を、実施例１２に記載されたプロトコルを適用して、プラスミドｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］を有するｈＧＬＹＡＴ２を発現する参照株と比較してラウロイルグリシネートを製造する該株の能力を調べるために用いた。
【０１６８】
誘導の１〜３時間後に、（ラウリン酸メチルエステル中に溶解された）６ｇ／Ｌグリシンおよび６ｇ／Ｌラウリン酸を培養物に添加した。４８時間の培養時間後に、振とうフラスコの全ブロスをアセトンで抽出した（比１：２）。さらなるサンプル処理は、実施例７に記載されている。サンプルを採取して、存在するラウロイルグリシネート、ラウリン酸およびグリシンを分析した。結果を第１４表に示す。
【０１６９】
プラスミド不含の対照を除く全ての株が、ラウロイルグリシネートを０．４４〜２１０９．８ｍｇ／Ｌの量で製造した。
【０１７０】
【表１６】
2016528904.tif 000020
【図１】
2016528904.tif 000021
【図２】
2016528904.tif 000022
【図３】
2016528904.tif 000023
【図４】
2016528904.tif 000024
【図５】
2016528904.tif 000025
【図６】
2016528904.tif 000026
【配列表】
2016528904000001.app
【国際調査報告】
2016528904.tif 000027
2016528904.tif 000028
2016528904.tif 000029
2016528904.tif 000030
2016528904.tif 000031