(57)【要約】規則正しいタンパク質格子を作製するための方法であって、（ａ）ヘテロオリゴマータンパク質集合体の第１のサブユニットに融合しているホモオリゴマータンパク質集合体のサブユニットを含む第１の構成成分、及びヘテロオリゴマータンパク質集合体の第２のサブユニットを含む第２の構成成分を提供するステップであって、ホモオリゴマータンパク質集合体及びヘテロオリゴマータンパク質集合体がそれぞれ二次元又は三次元で対称的であり、同じ次数の回転対称軸を共有する、ステップと；（ｂ）第１のモノマー及び第２のモノマーを混合して混合物を作製するステップと；（ｃ１）（ｉ）混合物を、視認できる解離温度よりも約２℃〜約１０℃低い温度まで加熱するステップ；（ｉｉ）混合物を約１０℃〜約２０℃冷却するステップ；及び（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）を少なくとも１０回繰り返すステップ；又は（ｃ２）（ｉ）混合物を、視認できる解離温度よりも約２℃〜約３０℃以上低い温度まで加熱するステップ；及び（ｉｉ）混合物を溶融温度よりも約２℃〜約３０℃以上低い温度で保持するステップとを含み、それによって規則正しいタンパク質格子を作製する方法。【選択図】図１
2016527914.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
規則正しいタンパク質格子を作製するための方法であって、
（ａ）ヘテロオリゴマータンパク質集合体の第１のサブユニットに融合しているホモオリゴマータンパク質集合体のサブユニットを含む第１の構成成分、及び前記ヘテロオリゴマータンパク質集合体の第２のサブユニットを含む第２の構成成分を提供するステップであって、前記ホモオリゴマータンパク質集合体及び前記ヘテロオリゴマータンパク質集合体が各々二次元又は三次元で対称的であり、同じ次数の回転対称軸を共有する、ステップと；
（ｂ）前記第１のモノマー及び前記第２のモノマーを混合して混合物を作製するステップと；
（ｃ１）（ｉ）前記混合物を、視認できる解離温度よりも約２℃〜約１０℃低い温度まで加熱するステップ；
（ｉｉ）前記混合物を約１０℃〜約２０℃冷却するステップ；及び
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）を少なくとも１０回繰り返すステップ；又は
（ｃ２）（ｉ）前記混合物を、視認できる解離温度よりも約２℃〜約３０℃以上低い温度まで加熱するステップ；及び
（ｉｉ）前記混合物を溶融温度よりも約２℃〜約３０℃以上低い温度で保持するステップと
を含み、それによって規則正しいタンパク質格子を作製する、方法。
【請求項２】
前記ホモオリゴマータンパク質が熱安定性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｃ１）（ｉ）及び（ｉｉ）の各サイクルが５秒以上である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｃ２）において、温度が約１時間〜約３カ月の間一定に保たれる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記混合物が、溶融温度を低下させる１つ又は複数の添加物を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記混合物が約１〜１００ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｂ）において、前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分が８：１〜１：８の比率で混合される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
（ｉ）ヘテロオリゴマータンパク質集合体の第１のサブユニットに融合しているホモオリゴマータンパク質集合体のサブユニットを含む第１の構成成分と；
（ｉｉ）前記ヘテロオリゴマータンパク質集合体の第２のサブユニットを含む第２の構成成分と
を含む規則正しいタンパク質格子であって、
前記ホモオリゴマー集合体及び前記ヘテロオリゴマー集合体が各々二次元又は三次元で対称的であり、同じ次数の回転対称軸を共有し、かつ、
前記ホモオリゴマータンパク質集合体が熱安定性であり、及び／又は十二量体のアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ＡＨＩＲ）である、
規則正しいタンパク質格子。
【請求項９】
前記ホモオリゴマータンパク質集合体が好熱生物に由来する、請求項８に記載の規則正しいタンパク質格子。
【請求項１０】
前記ホモオリゴマータンパク質がアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ＡＨＩＲ）である、請求項８又は９に記載の規則正しいタンパク質格子。
【請求項１１】
前記ヘテロオリゴマータンパク質の前記第１のサブユニット及び前記第２のサブユニットが、ストレプトアビジン中のビオチン結合部位に結合するペプチド、及びストレプトアビジンである、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の規則正しいタンパク質格子。
【請求項１２】
前記ヘテロオリゴマータンパク質集合体の前記第１のサブユニットがペプチドである、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の規則正しいタンパク質格子。
【請求項１３】
前記ペプチドがアミノ酸配列ＷＳＨＰＱＦＥＸを含むか、あるいは前記ペプチドが、アミノ酸配列ＨＰＱを含むその変異体である、請求項１２に記載の規則正しいタンパク質格子。
【請求項１４】
前記ヘテロオリゴマータンパク質集合体の前記第１のサブユニットが、前記ホモオリゴマータンパク質の前記サブユニットのアミノ酸配列の内部で融合している、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の規則正しいタンパク質格子。
【請求項１５】
前記ペプチドが、前記ペプチドの片方又は両方の末端で２〜６つの連結アミノ酸によって、前記ホモオリゴマータンパク質の前記サブユニットに連結している、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の規則正しいタンパク質格子。
【請求項１６】
前記第１の構成成分が、配列番号１〜８のいずれか１つに示されたアミノ酸配列、又はその変異体を含む、請求項８〜１５のいずれか一項に記載の規則正しいタンパク質格子。
【請求項１７】
ナノ粒子又は巨大分子をさらに含む、請求項８〜１６のいずれか一項に記載の規則正しいタンパク質格子。
【請求項１８】
バイオセンシング又は分子イメージングの方法における、請求項８〜１７のいずれか一項に記載の規則正しいタンパク質格子の使用。
【請求項１９】
前記規則正しいタンパク質格子が、請求項８〜１８のいずれか一項において定義されているタンパク質格子である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
請求項８〜１６のいずれか一項に記載の第１の構成成分を含むポリペプチド。
【請求項２１】
請求項２０に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項２１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、二次元又は三次元で反復される規則的構造（ｒｅｇｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を有する規則正しいタンパク質格子（ｏｒｄｅｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌａｔｔｉｃｅ）に関する。本発明は、このような規則正しいタンパク質格子を作製するための方法にも関する。タンパク質格子は多くの潜在的用途があるナノ構造体であり、本発明は、これらの用途にも関する。
【発明の背景】
【０００２】
ナノメートルスケールで規則正しい超分子構造体の自己集合化は、ナノテクノロジーにおける重要な目的である。ＤＮＡ及びペプチドナノテクノロジーによって、様々な二次元又は三次元構造体が作製されたが、タンパク質分子は、この研究分野において十分に活用されてきていない。
【０００３】
整合する回転対称を有するタンパク質集合体由来のサブユニットの遺伝子融合物が、自己集合して広範な分子間相互作用によって安定化された、秩序だった、予め決定された一次元、二次元、及び三次元アレイを構築することができる分子種を生ずることが示されている。この方法で作製された超分子構造体は、従来の方法を使用して作製されたタンパク質結晶と区別され、Ｓｉｎｃｌａｉｒら（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：５５８：５６２に記載されている。
【０００４】
超分子構造体は、等しい次数の回転対称軸を有するマルチサブユニットタンパク質集合体に由来するペプチド鎖の遺伝子融合によって作製できる。二成分構造体（ｂｉｎａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）は、「構成成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」と称する別々の実体（ｅｎｔｉｔｙ）から形成される。二成分構造体は第１の構成成分を含み、第１の構成成分は、相同タンパク質集合体（マルチサブユニットタンパク質）由来のペプチド鎖を異種タンパク質集合体（サブユニットの２つ以上の型を含む）由来のペプチド鎖に融合することによって形成されている。二成分構造体の第２の構成成分は、異種タンパク質集合体由来の第２のサブユニットを含む。これらの相補的な構成成分が混合された場合、それらは、自己集合して、超分子構造体を形成する。
【０００５】
マルチサブユニットタンパク質集合体に由来する構成成分は、隣接する構成成分が、２つ以上の対称的に等価な相互作用によって結びつけられる結果として、自然に集合して、規則的格子（ｒｅｇｕｌａｒ  ｌａｔｔｉｃｅ）を形成する。この結果、構成成分は、それらの共通の対称軸に沿って整列させられ、隣接するサブユニットの固定された相対配置を課す。要求される対称性の詳細は、Ｓｉｎｃｌａｉｒら、国際公開第２００４／０３３４８７号、及び国際公開第２００８／１４５９５１号に開示されている。
【０００６】
Ｓｉｎｃｌａｉｒらは、一次元及び二次元タンパク質格子を記載しており、自己集合性二成分三次元格子（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｂｉｎａｒｙ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｌａｔｔｉｃｅ）に関する彼らの予備設計を使用して作製された固相材料が、Ｘ線回折による研究を可能にするのに十分な長距離秩序を欠くことを開示している。したがって、格子秩序（ｌａｔｔｉｃｅ  ｏｒｄｅｒ）を改善し、より大きな結晶の成長を促進するための方法を開発することが、依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
第１の態様によれば、本発明は、規則正しいタンパク質格子を作製するための方法であって、（ａ）ヘテロオリゴマータンパク質集合体の第１のサブユニットに融合しているホモオリゴマータンパク質集合体のサブユニットを含む第１の構成成分、及びヘテロオリゴマータンパク質集合体の第２のサブユニットを含む第２の構成成分を提供するステップであって、ホモオリゴマータンパク質集合体及びヘテロオリゴマータンパク質集合体が各々二次元又は三次元で対称的であり、同じ次数の回転対称軸を共有する、ステップと；（ｂ）上記第１の構成成分及び上記第２の構成成分を混合して混合物を作製するステップと；並びに（ｃ１）（ｉ）混合物を、視認できる解離温度よりも約２℃〜約１０℃低い温度まで加熱するステップ；（ｉｉ）混合物を約１０℃〜約２０℃冷却するステップ；及び（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）を少なくとも１０回繰り返すステップ；又は（ｃ２）（ｉ）混合物を、視認できる解離温度よりも約２℃〜約３０℃低い温度まで加熱するステップ；及び（ｉｉ）混合物を溶融温度よりも約２℃〜約３０℃低い温度で保持するステップとを含み、それによって規則正しいタンパク質格子を作製する方法を提供する。
【０００８】
さらなる態様では、本発明は、
（ｉ）ヘテロオリゴマータンパク質集合体の第１のサブユニットに融合している熱安定性ホモオリゴマータンパク質集合体のサブユニットを含む第１の構成成分と；（ｉｉ）ヘテロオリゴマータンパク質集合体の第２のサブユニットを含む第２の構成成分とを含む規則正しいタンパク質格子であって、ホモオリゴマー集合体及びヘテロオリゴマー集合体が各々二次元又は三次元で対称的であり、同じ次数の回転対称軸を共有する、規則正しいタンパク質格子；
（ｉ）ヘテロオリゴマータンパク質集合体の第１のサブユニットに融合している十二量体のアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ＡＨＩＲ）のサブユニットを含む第１の構成成分と；（ｉｉ）ヘテロオリゴマー集合体の第２のサブユニットを含む第２の構成成分とを含む規則正しいタンパク質格子であって、第２のホモオリゴマー集合体が二次元又は三次元で対称的であり、ＡＨＩＲの回転対称軸と同じ次数の回転対称軸を共有する、規則正しいタンパク質格子；
本発明による規則正しいタンパク質格子の第１の構成成分を含むポリペプチド；
本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
本発明によるポリヌクレオチドを含む発現ベクター；
本発明による発現ベクターを含む宿主細胞；並びに
バイオセンシング又は分子イメージングの方法における本発明の規則正しいタンパク質格子の使用
を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１（Ｆｉｇ．１）は、第１の構成成分がＳｔｒｅｐｔａｇペプチドに融合しているＡＨＩＲであり、第２の構成成分がストレプトアビジンである、結晶格子の写真である。
【図２】図２（Ｆｉｇ．２）は、ＡＨＩＲ／Ｓｔｒｅｐｔａｇとストレプトアビジンとの間の対称性相互作用の詳細を示す図である。写真の中央左のＳｔｒｅｐｔａｇは、暗い陰影で示されている。中央右の対称的なＳｔｒｅｐｔａｇは、より明るい色で示されている。ＡＨＩＲは、写真の上部に示されている。ストレプトアビジンは、下部に示されている。
【配列表の簡単な説明】
【００１０】
配列番号１は、Ｓｔｒｅｐｔａｇ配列に融合しているサーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ＡＨＩＲ）のサブユニットを含む構成成分の一例のアミノ酸配列である。最初の４つ及び最後の２つのアミノ酸は、ベクター由来である。残基５〜１４４は、ＡＨＩＲの残基１〜１４０である。Ｓｔｒｅｐｔａｇ配列は、位置１４９〜１５７にある。残基１６２〜３４４は、ＡＨＩＲの残基１４３〜３２５である。リンカー残基は、位置１４５〜１４８及び１５８〜１６１に存在する。
配列番号２〜７は、Ｓｔｒｅｐｔａｇ配列に融合しているサーマス・サーモフィラス由来のＡＨＩＲのサブユニットを含む構成成分のさらなる例である。
配列番号８は、配列番号１に示した例示的な構成成分を作製するために使用する発現プラスミドの配列である。
配列番号９は、標準的Ｓｔｒｅｐｔａｇ  ＩＩ配列のアミノ酸配列である。
配列番号１０〜１２は、変異Ｓｔｒｅｐｔａｇ配列の例のアミノ酸配列である。
配列番号１３は、コンセンサスＳｔｒｅｐｔａｇ配列である。
配列番号１４〜２０は、４つ以上のアミノ酸を有するリンカー配列の例である。
配列番号２１は、コアストレプトアビジンのアミノ酸配列である。
【発明の詳細な説明】
【００１１】
本発明は、規則正しいタンパク質格子を作製するための方法を提供する。規則正しいタンパク質格子は、２つの構成成分を含む。第１の構成成分は、ヘテロオリゴマータンパク質集合体の第１のサブユニットに融合しているホモオリゴマータンパク質集合体のサブユニットを含む。第２の構成成分は、ヘテロオリゴマータンパク質集合体の第２のサブユニットを含む。ヘテロオリゴマータンパク質集合体及びホモオリゴマータンパク質集合体はそれぞれ、二次元又は三次元で対称的であり、同じ次数の回転対称軸を共有する。第１の構成成分では、ヘテロオリゴマータンパク質集合体の第２のサブユニットは、共有された回転対称軸近傍のホモオリゴマータンパク質集合体のサブユニットに融合していてもよい。
【００１２】
第１の構成成分及び第２の構成成分は、隣接する構成成分が、２つ以上の対称的に等価な相互作用によって結びつけられる結果として、自然に集合して、規則的格子を形成する。この結果、構成成分は、それらの共通の対称軸に沿って整列させられ、隣接するサブユニットの固定された相対配置を課す。
【００１３】
適合する対称性を有する相同タンパク質集合体及び異種タンパク質集合体の組合せは、国際公開第２００４／０３３４８７号及び国際公開第２００８／１４５９５１号の教示に従って選択することができる。
【００１４】
相同タンパク質集合体のサブユニットは、天然の配列であってもよい。サブユニットが集合して相同タンパク質集合体を構築する能力を維持するという条件で、１又は複数のアミノ酸（例えば、約２〜３００、３〜２００、５〜１００、１０〜５０、１２〜３０、又は１５〜２０のアミノ酸）のいくつかの改変（例えば、欠失、置換又は付加）をサブユニットに対して行うことができる。一実施形態では、異種タンパク質集合体のサブユニット以外のタンパク質全体又はタンパク質のドメインは、相同タンパク質集合体のサブユニットに融合していてもよい。欠失、置換及び／又は付加を、サブユニット内の任意の部位で、例えばＮ末端若しくはＣ末端で又は異種タンパク質集合体の第１のサブユニットの挿入部位で行うことができる。サブユニットは、Ｎ末端及び／又はＣ末端が切断されていても、及び／又は内部欠失を含有していてもよい。欠失したアミノ酸は、通常ヘテロオリゴマータンパク質集合体の第１のサブユニットの挿入部位にあるが、改変は、他の部位でも行うことができる。
【００１５】
ホモオリゴマー集合体は、有利には、熱安定性集合体である。熱安定性ホモオリゴマータンパク質は、熱が加えられた場合、そのタンパク質構造における不可逆変化に抵抗性である。熱安定性タンパク質集合体は、通常５０℃を超える温度（例えば、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃以上の温度）で安定である。
【００１６】
熱安定性ホモオリゴマータンパク質は、好熱生物に存在する。したがって、第１の構成成分は、サーマス・サーモフィラス、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アゾトバクター・ビネランジイ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、サッカロファガス・デグラダンス（Ｓａｃｃｈｒｏｐｈａｇｕｓ  ｄｅｇｒａｄａｎｓ）、テレディニバクター・ツルネラエ（Ｔｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒ  ｔｕｒｎｅｒａｅ）、セルビブリオ・ジャポニカス（Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ  ｊａｐｏｎｉｃａｓ）、アルカニボラクス・ジエセロレイ（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｄｉｅｓｅｌｏｌｅｉ）、チオスリックス・ニベア（Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘ  ｎｉｖｅａ）、メイオサーマス・シルヴェナス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｉｌｖａｎｕｓ）、ニトロコッカス・モビリス（Ｎｉｔｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｘｉｄａｎｓ）、アルカリリムニコラ・エールリケイ（Ａｌｋａｌｉｌｉｍｎｉｃｏｌａ  ｅｈｒｌｉｃｈｅｉ）又はペロバクター・プロピオニカス（Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｓ）などの好熱生物由来のホモオリゴマータンパク質のサブユニットを含んでもよい。好熱生物におけるホモオリゴマータンパク質は、熱安定性タンパク質において余分な水素結合が存在するなど、タンパク質構造がわずかに違うだけの相同体が通常、他の生物にある。したがって、他の生物由来のタンパク質を、第１の構成成分に存在するホモオリゴマータンパク質集合体のサブユニットを得るために使用することができる。これは、本発明の方法において構成成分を加熱することができる温度に影響することになる。
【００１７】
規則正しいタンパク質格子の第１の構成成分を得るために使用することができるホモオリゴマータンパク質集合体の一例は、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ＡＨＩＲ）である。ＡＨＩＲは、分枝鎖アミノ酸の合成に関与する酵素である。ＡＨＩＲは、細菌、真菌及び植物に存在するが、動物には存在しない。種々の生物が、集合して２つのオリゴマー型：二量体（例えばホウレンソウにおけるクラスＩＩ）；又は十二量体（例えば緑膿菌におけるクラスＩ）の１つを構築するＡＨＩＲを発現することが示されている。本発明の目的にとって、対称性を考慮すると、集合して十二量体型を構築するＡＨＩＲだけを使用することができる。決定されたＡＨＩＲ十二量体の構造から、これらの十二量体は折り畳み方の点で非常に類似していることが示されている。したがって、いずれの十二量体ＡＨＩＲを使用しても、本発明の方法を使用して作製することができる本発明の規則正しいタンパク質格子を作製することができるであろう。
【００１８】
ヘテロオリゴマータンパク質集合体の第１のサブユニットは、通常、サーマス・サーモフィラス由来のＡＨＩＲのナンバリングを用いるとＡＨＩＲの残基１２０〜１４４の間の部位において、又は他の生物由来のＡＨＩＲの相当する残基において、ＡＨＩＲ配列の内部で融合していてもよい。追加のリンカー残基を、ヘテロオリゴマータンパク質集合体の第１のサブユニットの挿入配列の片方又は両方の末端に含めてもよい。
【００１９】
ヘテロオリゴマータンパク質集合体は、通常２つのサブユニットを含む。ヘテロオリゴマータンパク質の集合体は、両方のサブユニットが存在する場合にのみ生じる。第１の構成成分におけるホモオリゴマータンパク質集合体のサブユニットに融合している第１のサブユニットは、通常ペプチドである。第２の構成成分に存在するヘテロオリゴマータンパク質集合体の第２のサブユニットは、通常、より長いタンパク質である。
【００２０】
第１の構成成分に存在するヘテロオリゴマー集合体由来のペプチドは、長さが約６〜約２０のアミノ酸（例えば、約７〜１５又は８〜１０のアミノ酸）であってもよい。ペプチド配列は、天然の配列であっても、又は非天然の配列であってもよい。ペプチドが集合して第２の構成成分に存在する第２のサブユニットと一緒にヘテロオリゴマータンパク質集合体を構築する能力を維持するという条件で、ペプチドは１又は複数のアミノ酸（例えば、２〜５のアミノ酸、３又は４のアミノ酸）の欠失、置換及び／又は付加を含んでいてもよい。
【００２１】
ヘテロオリゴマータンパク質集合体の第２のサブユニットは、天然又は非天然の配列であってもよい。サブユニットが集合して第１の構成成分に存在する第１のサブユニットと一緒にヘテロオリゴマー集合体を構築する能力を維持するという条件で、１又は複数のアミノ酸（例えば、約２〜３００、３〜２００、５〜１００、１０〜５０、１２〜３０又は１５〜２０のアミノ酸）のいくつかの改変（例えば、欠失、置換及び／又は付加）をサブユニットに行うことができる。一実施形態では、異種タンパク質集合体のサブユニット以外のタンパク質全体又はタンパク質のドメインは、異種タンパク質集合体のサブユニットに融合していてもよい。欠失、置換及び／又は付加を、第２のサブユニット内の任意の部位で（例えば、Ｎ末端若しくはＣ末端で又は異種タンパク質集合体の第２のサブユニット内の部位で）行うことができる。通常、サブユニットは、Ｎ末端及び／又はＣ末端が切断されていてもよい。
【００２２】
好ましいヘテロオリゴマータンパク質集合体は、第１のサブユニットとしてＳｔｒｅｐｔａｇ及び第２のサブユニットとしてストレプトアビジンを含む。通常、ＳｔｒｅｐｔａｇはＳｔｒｅｐｔａｇ  ＩＩである。Ｓｔｒｅｐｔａｇ  ＩＩは、従来のビオチンポケット内でストレプトアビジンにｉｎ  ｖｉｔｒｏで結合することが見出されたモチーフ「ＨＰＱ−」を含有するペプチドである。標準的Ｓｔｒｅｐｔａｇ  ＩＩ配列は、「ＷＳＨＰＱＳＥＫ」である。この配列は、コア「ＨＰＱ」モチーフが維持されるという条件で、１又は複数のアミノ酸（例えば、２、３、４又は５のアミノ酸）の付加、欠失又は置換によって変動してもよい。変異配列は、通常長さが８〜１１のアミノ酸（例えば、９又は１０のアミノ酸）である。例えば、モチーフ「ＳＨＰＱ」は、維持されてもよく、他の位置の１つ、２つ、３つ若しくは全てが変えられても、及び／又は付加的なアミノ酸が付加されてもよい。「Ｗ」残基は、例えば、「Ｇ」によって置換されてもよく、「Ｑ」の後の「Ｓ」は、「Ｆ」で、及び／又は「Ｋ」は、「Ｇ」で置換されてもよい。「Ｐ」、「Ｎ」又は「Ｇ」残基が、Ｎ末端に付加されてもよい。これらの変異の任意の組合せを作製することができる。コンセンサスＳｔｒｅｐｔａｇ配列を配列番号１３に示す。変異配列の特定の例は、ＮＷＳＨＰＱＦＥＫ、ＰＷＳＨＰＱＦＥＫ、及びＧＧＳＨＰＱＦＥＧである。
【００２３】
ストレプトアビジンは、そのビオチンパートナーへの極度に強い親和性を有する天然の四量体の集合体である。全長配列を切断しても、ストレプトアビジンは機能的に未変化のままである。「コアストレプトアビジン」と称するストレプトアビジンの一般的な切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｆｏｒｍ）が通常使用される。しかしながら、類似した結合特異性及び四量体の集合体を形成する能力を有する任意のストレプトアビジン変異体を使用することができる。ストレプトアビジンは、配列番号２１に示した配列を含む若しくはこれからなることができる、又は配列番号２１との少なくとも７０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％）の同一性を有する配列を含む若しくはこれからなることができる。第１の構成成分が集合してストレプトアビジンと一緒に四量体のストレプトアビジン／Ｓｔｒｅｐｔａｇ集合体を構築する能力を維持するという条件で、例えば上記で詳しく述べたように、任意の変異を行うことができる。
【００２４】
第１の構成成分では、ヘテロオリゴマータンパク質集合体の第１のサブユニットは、直接、又はヘテロオリゴマータンパク質集合体の第１のサブユニットの片方又は両方の末端でリンカー残基を使用して、ホモオリゴマータンパク質集合体のサブユニットに融合してある。種々の特徴及び長さの多数のリンカーが上手く使用されている。一実施形態では、リンカーは、通常長さが１〜１０、好ましくは２〜５のアミノ酸（例えば、３又は４のアミノ酸）のものである。リンカーは、例えば、以下のアミノ酸：リシン、セリン、アルギニン、プロリン、グリシン及びアラニンのうちの１つ又は複数で構成されてもよい。適したリンカーの例は、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ＧＧＧＳ、ＰＧＧＳ、ＰＧＧＧ、ＲＰＰＰＰＰ、ＲＰＰＰＰ、ＶＧＧ、ＲＰＰＧ、ＰＰＰＰ、ＲＰＰＧ、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰ、ＲＰＰＧ、ＧＧ及びＧＧＧ。
【００２５】
適切な連結基を従来のモデリング技術を使用して設計することができる。リンカーは、通常、サブユニットが集合して、それらのそれぞれのタンパク質集合体を構築することを可能にするのに十分にフレキシブルであるだけでなく、タンパク質格子内で規則的構造を作製するために第１及び第２の構成成分がそれらの共通の対称軸に沿って整列させられるように十分に強固でもある。
【００２６】
第１の構成成分及び／又は第２の構成成分は、さらなるタンパク質の組込み（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を可能にするために改変されていてもよい。付加的なタンパク質又はペプチドが、第１の構成成分及び／又は第２の構成成分に付加されていてもよい。例えば、タンパク質又はペプチドは、ホモオリゴマータンパク質のサブユニットのＮ末端若しくはＣ末端に、又はヘテロオリゴマータンパク質の第２のサブユニットのＮ末端若しくはＣ末端に直接融合していてもよい。タンパク質又はペプチドは、相同タンパク質集合体のサブユニットと第１の構成成分における異種タンパク質集合体の第１のサブユニットの間で融合していてもよい。相同タンパク質のサブユニットの配列の一部は、付加的なタンパク質又はペプチドを包含するために欠失させてもよい。付加的なタンパク質又はペプチドは、リンカーに隣接していてもよい。
【００２７】
第１の構成成分及び第２の構成成分は、標準的な生化学的方法を使用して、通常独立に発現されて、精製される。次いで、精製された構成成分は、通常水溶液中で混合される。溶液は、６．５〜９．０、好ましくは６．６〜８．０のｐＨ、及び０〜５００ｎＭ、好ましくは０〜１５０ｍＭのＮａＣｌ濃度を通常有する。水溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）であってもよい。他の適した溶液としては、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓ  Ｐｒｏｐａｎｅ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ及びＨＥＰＥＳが挙げられる。
【００２８】
規則正しい格子（ｏｒｄｅｒｅｄ  ｌａｔｔｉｃｅ）の形成は、２つの構成成分の種々の比率で達成することができる。通常、構成成分は、第１の構成成分対第２の構成成分の比率が８：１〜１：８（例えば、第１の構成成分対第２の構成成分の比率が２：１〜１：４）で混合される。第２の構成成分の方が大きくなる比率が好ましい。好ましい比率の一例は、第１の構成成分対第２の構成成分の比率が１：４である。この比率は、ホモオリゴマータンパク質集合体が十二量体であり、ヘテロオリゴマータンパク質集合体が四量体である場合、特に有利である。
【００２９】
第１及び第２の構成成分の混合物中のタンパク質濃度が、約１〜約１００ｍｇ／ｍｌ（例えば、約５〜約５０ｍｇ／ｍｌ、約１０〜約３０ｍｇ／ｍｌ）であることが好ましい。
【００３０】
２つの構成成分が適切な比率及び濃度で混合される場合、沈殿物が形成される。これらの沈殿物は、加熱することによって「溶解」され得る。沈殿物が消滅する温度は、本明細書で「視認できる解離温度」（ｖｉｓｉｂｌｅ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）又は「溶融温度」と称する。
【００３１】
視認できる解離温度は、第１及び第２の構成成分を調製するために、厳密にどのタンパク質を使用するかによって決まり、またサブユニットが混合される比率によっても影響されることになる。
【００３２】
本発明の方法では、２つの構成成分の混合物は、視認できる解離温度まで、又はこの温度よりわずかに低い温度まで加熱され、混合物は、視認できる解離温度よりも約１℃〜１０℃低い温度まで（例えば、視認できる解離温度よりも約２℃〜８℃の間、２℃〜６℃の間又は３℃〜５℃の間だけ低い温度まで）加熱され得る。混合物は、視認できる解離温度よりも１０℃を超えて低い温度まで（例えば、視認できる解離温度よりも１２℃、１５℃、２０℃又は３０℃低い温度まで）加熱され得る。
【００３３】
その場合、規則正しいタンパク質格子の形成は、２つの方法のうちの１つで促進され得る。本発明の方法は、混合物を、視認できる解離温度の手前約２０℃以内まで加熱するステップ；及び、次いで混合物を約１０℃冷却することと、混合物を、視認できる解離温度の手前約２０℃以内まで再加熱することとを繰り返すステップを含み、又は、混合物を、視認できる解離温度の手前約２０℃又は３０℃以内まで加熱し、混合物の温度を長期間、視認できる解離温度の手前約２０℃又は３０℃以内に保持するステップを含み、それによって規則正しいタンパク質格子を作製する。
【００３４】
したがって、１つの方法では、混合物の温度は、上昇させた温度で一定に保持される。例えば、混合物は、視認できる解離温度よりも約２℃〜約３０℃低い温度（例えば、約５℃〜約１５℃又は約６℃〜約１０℃低い温度）で保持される。上昇させた温度は、通常約２０℃（室温）〜約８０℃（例えば、約３０℃〜約７０℃、約４０℃〜約６５℃、約４５℃〜約６０℃、又は約５０℃〜約５５℃）の範囲内である。温度は、長期間、この上昇させたレベルで維持され得る。この期間は、１時間〜約３カ月（例えば、約２時間〜２カ月、２４時間〜１カ月又は２週間〜３週間）であってもよい。一般的に、温度が一定に保持される期間は、温度が低いほど長くなる。例えば、格子形成は室温でも起きるが、より高い温度が使用される場合よりも遅い速度で格子は成長する。
【００３５】
ＡＨＩＲ及びストレプトアビジンからなるタンパク質格子に関して、１００μｍを超える直径（ｄｉａｍｅｔｅｒ）を有する立方格子が５５℃の一定温度で２時間未満で観察された。２４時間の期間では、より大きな結晶が生じた。
【００３６】
温度は、任意の適した手段によって、例えばインキュベーター、加熱ブロック又はサーモサイクラーにおいて一定に保持され得る。
【００３７】
規則正しいタンパク質格子の形成を促進する第２の効果的な方法は、熱サイクルである。通常、これは、混合物を例えば、視認できる解離温度よりも約２℃〜６℃低い温度まで加熱し、次いで混合物の温度を低下させた後、混合物を、視認できる解離温度よりも２℃〜６℃低い温度まで再加熱し、次いで温度を再び低下させ、このサイクルを繰り返すことを伴う。このサイクル中に低下させた混合物の温度は、混合物が加熱された温度よりも通常約１０℃低い、すなわち視認できる解離温度よりも約１２℃〜１６℃低い温度である。熱サイクルにおける最も高い温度と最も低い温度間の差は、１０℃を超えても又は１０℃未満であってもよい。例えば、それは、６℃、８℃、１２℃、１５℃、又は２０℃であり得る。サイクルは、通常約１０〜１０００回より多く、例えば、１００、５００、２０００回以上繰り返される。サイクルの長さは、通常、２秒〜１０分（例えば、３０秒〜５分又は１分〜２分）である。混合物の温度は、約１秒〜約５分、例えば約５秒〜約２分、約１５秒〜約１分又は約３０秒〜約４５秒の期間、高い温度で及び／又は低い温度で保持され得る。
【００３８】
通常、サイクルは、数時間、例えば、１時間〜７２時間（例えば、２時間〜４８時間、１２時間〜２４時間、又は１６時間〜２０時間）の期間にわたって何回も繰り返される。
【００３９】
一実施形態では、通常ＡＨＩＲ及びストレプトアビジンを使用して、熱サイクルは、高い温度及び低い温度のそれぞれで３０秒、合計約１分間で、約５２℃〜６２℃の温度範囲にわたって約１６〜約７２時間周期的に変動させることを伴う。
【００４０】
熱サイクルは、通常サーモサイクラーを使用して行われる。
【００４１】
タンパク質格子が形成される温度は、第１及び第２の構成成分を含む混合物中に添加物を含むことによって増加又は減少され得る。温度の低下を引き起こす適切な添加物は、グリセロール、スクロース、塩及びポリエチレングリコールを含む。ヘテロオリゴマータンパク質の第１と第２のサブユニット間の、したがって第１と第２の構成成分間の相互作用に影響する任意の他の添加物は、視認できる解離温度の減少又は増加を引き起こし得る。このことは、規則正しいタンパク質格子が形成される温度を変えることになる。
【００４２】
本発明は、（ｉ）ヘテロオリゴマータンパク質集合体の第１のサブユニットに融合している熱安定性ホモオリゴマータンパク質集合体のサブユニットを含む第１の構成成分であって、ホモオリゴマー集合体及びヘテロオリゴマー集合体が各々二次元又は三次元で対称的であり、同じ次数の回転対称軸を共有する、第１の構成成分と；（ｉｉ）ヘテロオリゴマータンパク質集合体の第２のサブユニットを含む第２の構成成分とを含む、規則正しいタンパク質格子を提供する。
【００４３】
第１及び第２の構成成分は、通常共有された回転対称軸に沿って集合し、相同タンパク質集合体のサブユニットが集合し、ヘテロオリゴマータンパク質集合体の第１及び第２のサブユニットが集合する。
【００４４】
本発明は、（ｉ）ヘテロオリゴマータンパク質集合体の第１のサブユニットに融合している十二量体のＡＨＩＲのサブユニットを含む第１の構成成分であって、ヘテロオリゴマー集合体が二次元又は三次元で対称的であり、十二量体のＡＨＩＲと回転対称軸を共有する、第１の構成成分と；（ｉｉ）ヘテロオリゴマータンパク質集合体の第２のサブユニットを含む第２の構成成分とを含む、規則正しいタンパク質格子も提供する。ヘテロオリゴマータンパク質集合体は、四量体であることが好ましい。異種タンパク質集合体の第１のサブユニットは、ストレプトアビジン中のビオチンポケットに結合するペプチドであり、異種タンパク質集合体の第２のサブユニットは、ストレプトアビジンであることがより好ましい。ＡＨＩＲは、熱安定性又は熱感受性であってもよい。
【００４５】
本発明は、本発明のタンパク質格子の第１の構成成分であるポリペプチドも提供する。本発明のポリペプチドは、ヘテロオリゴマータンパク質の第１の構成成分に融合している熱安定性ホモオリゴマータンパク質又はＡＨＩＲのサブユニットの配列を通常含む。熱安定性ホモオリゴマータンパク質又はＡＨＩＲのサブユニットは、天然の配列又は上記天然の配列を改変した配列を含んでもよい。熱安定性タンパク質は、上述の好熱生物に由来していてもよい。ヘテロオリゴマータンパク質の第１の構成成分は、通常上述のペプチドである。
【００４６】
１つの特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１に示した配列を含む。ポリペプチドは、配列番号１の変異体である配列を含んでもよい。変異体は、配列番号１との、又は配列番号２〜８のいずれかとの少なくとも７０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％）の同一性を有してもよい。第１の構成成分が集合して十二量体のＡＨＩＲとなり、ストレプトアビジンと一緒に四量体のストレプトアビジン／Ｓｔｒｅｐｔａｇ集合体を構築する能力を維持するという条件で、任意の変異を行うことができる。このような変異体は、上述の他の生物由来のＡＨＩＲサブユニット配列の相当する部分、ＨＰＱモチーフを含む変異Ｓｔｒｅｐｔａｇ配列、及び／又は上述の種々のリンカー残基を含む。変異配列の例は、配列番号１における残基１４１及び１４２の欠失に加えて、ＡＨＩＲ配列の残基１３２〜１４０が欠失している変異体；リンカーＧＧＧＳがリンカーＰＧＧＧ、ＲＰＰＰＰＰ、ＲＰＰＰＰ若しくはＶＧＧと置き換えられている変異体；Ｓｔｒｅｐｔａｇ配列がＰＷＳＨＰＱＦＥＫ若しくはＧＧＳＨＰＱＦＥＧである変異体；及び／又はリンカーＲＰＰＧがリンカーＰＰＰＰ、ＲＰＰＧ、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰ、ＧＧ若しくはＧＧＧと置き換えられている変異体を含む。本発明者らが結晶格子を作製するために使用したより特定の例は、配列番号２〜７に示されており、表１に詳述されている。
【００４７】
【表１】
2016527914.tif 000003
表１：試験に成功したＡＨＩＲ、Ｓｔｒｅｐｔａｇ及びリンカー配列の例
【００４８】
本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。ポリヌクレオチドは、コード配列の５’末端及び／又は３’末端に付加的な配列も含んでもよい。ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はｃＤＮＡを含めて、ＲＮＡ又はＤＮＡであってもよい。ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。本発明の典型的なポリヌクレオチドを配列番号８に示す。
【００４９】
ポリヌクレオチドは、メチルホスホネート骨格及びホスホロチオエート骨格、又はポリヌクレオチド分子の３’末端及び／又は５’末端でのアクリジン又はポリリジン鎖の付加などの、合成又は改変ヌクレオチドを含んでもよい。このようなポリヌクレオチドは、標準的技術を使用して作製及び使用することができる。
【００５０】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含み、本発明の第１の構成成分を発現する能力がある発現ベクターも提供する。このようなベクターは、タンパク質発現を可能にするために、必要であり得、正しい向きに位置している適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサー、及び他のエレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）も含んでもよい。
【００５１】
したがって、ベクター中のコード配列は、エレメントがコード配列の発現（通常、細胞において）を提供するように、このようなエレメントに作動可能に連結している。「作動可能に連結している」という用語は、上述の成分が、それらの意図された様式で機能することを可能にする関係となるように並列していることを表す。
【００５２】
ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス又はファージベクターであってもよい。通常、ベクターは複製起点を有する。ベクターは、１つ又は複数の選択マーカー遺伝子（例えば、細菌プラスミドの場合のアンピシリン耐性遺伝子、又は真菌ベクターに関する耐性遺伝子）を含んでもよい。
【００５３】
プロモーター及び他の発現調節シグナルは、発現が設計される宿主細胞と適合するように選択され得る。例えば、酵母プロモーターは、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＡＬ４及びＡＤＨプロモーター、分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）ｎｍｔ１及びａｄｈプロモーターを含む。哺乳類プロモーターは、カドミウムなどの重金属に応答して誘導され得るメタロチオネインプロモーターを含む。ＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーター又はアデノウイルスプロモーターなどのウイルスプロモーターも使用することができる。
【００５４】
βアクチンプロモーターなどの哺乳類プロモーターを使用することができる。組織特異的プロモーターが特に好ましい。ウイルスプロモーター、例えばモロニーマウス白血病ウイルス末端反復配列（ＭＭＬＶ  ＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーター、アデノウイルス、ＨＳＶプロモーター（ＨＳＶ  ＩＥプロモーターなど）、又はＨＰＶプロモーター、特にＨＰＶ上流調節領域（ＵＲＲ）も使用することができる。
【００５５】
タンパク質構成成分の発現に使用することができる別の方法は、例えば細菌、酵母又は哺乳類の無細胞発現である。
【００５６】
本発明は、本発明の構成成分を発現するように改変された細胞も含む。このような細胞は、一過性発現、又は好ましくは安定発現している、哺乳類細胞若しくは昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用したもの）などの高等真核細胞株、酵母などの下等真核細胞、又は細菌細胞などの原核細胞を含む。本発明によるポリペプチドをコードするベクターの挿入によって改変され得る細胞の特定の例は、哺乳類ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ及びＣＯＳ細胞を含む。選択された細胞株は、安定であるだけでなく、ポリペプチドの成熟したグリコシル化を可能にするものとなることが好ましい。発現は、形質転換された卵母細胞において達成されてもよい。
【００５７】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞は、実質的に単離された形で存在してもよい。それらは、実質的に精製された形でもあってもよく、その場合、それらは、調製物のタンパク質、ポリヌクレオチド、細胞又は乾燥質量の少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、９８％又は９９％を一般的に構成することになる。
【００５８】
タンパク質格子の構成成分は、標準的技術を使用して、ベクター及び宿主細胞を使用して調製することができる。
【００５９】
本発明によるタンパク質格子は、種々の使用法を多数有する。本発明の規則正しいタンパク質格子は、ナノメートルスケールでのパターン化が有利である場合、特にゲスト分子の規則的なアレイ（ｒｅｇｕｌａｒ  ａｒｒａｙ）が必要である場合に有用性が見出される。一般に、このような使用は、格子内の規則的な繰返し構造及びポアを利用することになる。本発明による格子は、ナノメートル〜数十ナノメートルの桁のものであることが期待されている寸法を有するポアを有するように設計されてもよい。格子は、所望の使用法のための適切なポアサイズで設計されてもよい。
【００６０】
タンパク質格子のポアサイズが高度に画定され、通常と異なるサイズであり、且つ精密に制御されており、同時にその格子構造が安定していると、直前に記述した範囲のポアサイズを有する微孔質材料を必要とする用途にとって理想的なタンパク質格子となる。一例として、これらの格子は、ろ過又は分離プロセスのためのフィルターエレメント又は分子ふるいとして有用であることが期待されている。この使用では、達成可能なポアサイズ及びポアのサイズを設計する能力は、特に有利である。
【００６１】
使用法の別のクラスでは、巨大分子実体がタンパク質格子に付加されている。このような付加は、従来の技術を使用して達成することができる。巨大分子実体は、適切なサイズの任意の実体、例えばタンパク質、ポリヌクレオチド又は非生物学的実体であってもよい。そのようなものとして、タンパク質格子は、巨大分子実体を運ぶための、例えば薬物送達における使用のための、又は巨大分子実体を結晶化するための生物学的マトリックスとして有用であることが期待されている。
【００６２】
タンパク質格子への巨大分子実体の付加は、タンパク質構成成分又は目的の巨大分子実体のいずれか又は両方を「タギング」（ｔａｇｇｉｎｇ）することによって行うことができる。ここで、タギングとは、タンパク質構成成分又は標的巨大分子実体のいずれか又は両方に、標的構造体との強い相互作用を形成するタグとして既知である構造体を、共有結合させることである。標的構造体は、タンパク質格子若しくは標的巨大分子実体の構成成分の１つに付加されているさらなるタグであってもよい、又は構成成分若しくは標的巨大分子実体の部分であってもよい。タンパク質構成成分又はタンパク質である巨大分子実体の場合、これは、例えばその終端の１つで、又はループ領域においてタグを構成するペプチドエレメントの付加的な配列を有するように遺伝的に改変されたバージョンのタンパク質を発現させることによって達成することができる。タグを付加する代替の方法は、インテインテクノロジー（ｉｎｔｅｉｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）などの技術による、発現後のタンパク質の共有結合性の改変を含む。
【００６３】
したがって、巨大分子実体をタンパク質格子に付加するために、タンパク質構成成分の片方又は両方は、構成成分中の所定の位置で、目的の巨大分子実体に付加する親和性タグを含んでもよい。
【００６４】
代わりに、目的の巨大分子実体は、構成成分の１つにおける所定の位置で、巨大分子実体に付加する親和性タグを有してもよい。
【００６５】
タンパク質格子の構成成分が既知のペプチド配列との強い相互作用を形成することが知られている場合、そのペプチド配列を標的巨大分子実体に付加するタグとして使用することができる。このような堅固に結合するパートナーが既知でない場合、適したタグは、スクリーニングによって同定することができる。可能なスクリーニングの型は、ファージディスプレイ法、又は多数の種々の短い（例えば３〜５０アミノ酸）ペプチドを作製するための重複性の化学物質ライブラリーの手法（ｒｅｄｕｎｄａｎｔ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｂｒａｒｙ  ａｐｐｒｏａｃｈ）である。最も堅固に結合するペプチドエレメントは、標準的技術、例えばファージディスプレイによるライブラリーの場合、増幅及び配列決定を使用して又は重複性のライブラリーの場合、ペプチド配列決定によって同定することができる。
【００６６】
タンパク質格子又は巨大分子実体上の親和性タグを使用して巨大分子実体をタンパク質格子に付加するためには、巨大分子実体を、予め形成されたタンパク質格子中に拡散させることで、予め形成されたタンパク質格子に付加されるようにしてもよい。例えば、タンパク質格子におけるその最も低いエネルギー配置中への結合した巨大分子実体のアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）は、液体窒素クライオストリーム中での制御された冷却を使用して行うことができる。代わりに、巨大分子実体は、タンパク質格子の形成中に格子と集合する構成成分と混合することができる。
【００６７】
使用法の別のクラスでは、有用な特性を有するタンパク質は、構成成分の１つにおけるサブユニットの１つとして組み込むことができる。
【００６８】
本発明のタンパク質格子は、巨大分子及び結晶化に抵抗する複合体のイメージングを促進するために使用することができる。
【００６９】
実体をタンパク質格子に付加させる使用目的は、巨大分子実体のＸ線結晶解析を行うためである。この場合、タンパク質格子の規則的構造は、巨大分子実体が規則的なアレイとして規則的な向きで保持されるように、巨大分子実体が繰返し単位に対して所定の位置でアレイとして保持されることを可能にする。Ｘ線結晶解析は、生化学的研究及び合理的な薬物設計に重要である。
【００７０】
巨大分子実体のアレイを支持するタンパク質格子は、標準的なＸ線結晶技術を使用して研究することができる。Ｘ線結晶解析における支持体としてのタンパク質格子の使用は、以下のものを含めて、Ｘ線結晶解析に関する現在のテクノロジー及びプロトコールに優る多数の顕著な利点があることが期待されている：
（１）（おそらくミリグラムではなくマイクログラムのオーダーの）極めて微量の巨大分子しか必要ではない。これによって、以前は困難であった標的の決定を可能にすることになる。
（２）親和性タグを使用することで、通常必要とされるいくつかの精製ステップなしで、構造決定が可能になる。
（３）巨大分子実体を結晶化する必要がなくなる。巨大分子実体の結晶化は、従来のＸ線構造決定における難しく、時折克服できないステップである。
（４）必要な位相情報を得るために新規な各結晶構造について結晶性誘導体を得る必要がなくなる。散乱物質の大部分は、各場合において既知のタンパク質格子であることになるので、構造の決定は、自動化され、結晶学的専門知識をほとんど又は全く持たないコンピューター使用者によって迅速に達成することができる。
（５）化学物質（基質／薬物）とのタンパク質の複合体及び他のタンパク質とのタンパク質の複合体を、完全に新しい結晶化条件を必要とせずに試験することができる。
（６）プロセスは、極度に迅速で普遍的に適用可能であることが期待されており、これによって、時間及び費用の甚大な節約を提供することになる。
【００７１】
生体内変化を触媒することにおける使用法では、酵素をタンパク質格子に付加する、又はタンパク質格子に組み込むことができる。
【００７２】
データ保存における使用法では、光学的に又は電子工学的に活性であるタンパク質を付加することが可能であり得る。一例は、バクテリオロドプシンであるが、多くの他のタンパク質をこの能力において使用することができる。この場合、タンパク質格子は、付加されたタンパク質を、高度に規則正しいアレイとして保持し、それによってアレイを扱うことを可能にする。タンパク質格子は、データ保存における使用法のためにタンパク質を保持するための現行のマトリックスのサイズ制限を克服することができることが期待されている。
【００７３】
表示における使用法では、光活性又は蛍光性のタンパク質を付加することが可能であり得る。この場合、タンパク質格子は、高度に規則正しいアレイにおいて付加されたタンパク質を保持し、それによって画像の表示のためにアレイを扱うことを可能にする。
【００７４】
電荷分離における使用法では、電荷分離プロセスを行う能力があるタンパク質を、タンパク質格子に付加する、又はタンパク質格子に組み込むことができる。その場合、タンパク質は、例えばＡＴＰなどの「燃料」によって生化学的に又はクロロフィルなどの光活性中心若しくはロドプシンなどの光活性タンパク質の場合は光学的に、分離を行うように誘導され得る。様々な電荷分離プロセスがこの方法、例えばイオンポンピング又は光起電性電荷の発生において行われる。
【００７５】
ナノワイヤーとしての使用では、電気伝導の能力があるタンパク質をタンパク質格子に付加する、又はタンパク質格子に組み込むことができる。異方性タンパク質格子を使用すると、特定の方向で電流を運ぶ能力が提供され得る。
【００７６】
モーターとしての使用では、拡大／収縮誘導の能力があるタンパク質を、タンパク質格子中に組み込むことができる。
【００７７】
タンパク質格子は、鋳型として使用することができる。例えば、シリコンは、タンパク質格子のポアに拡散又はさもなければ浸透し、したがって、格子間隙を部分的又は完全に充填し得る。次いで、元の格子を含むタンパク質材料は、必要ならば、例えば、加水分解溶液を使用して除去することができる。
【００７８】
規則正しい格子は、金ナノ粒子などのナノ粒子を捕獲するために使用することができ、光学及び電子回路網において又はバイオセンシング方法において使用することができる。
【００７９】
本発明を、以下の実施例において例証する。
【実施例】
【００８０】
実施例１：融合構築物の作製
ＬＣ４と命名された、ＡＨＩＲ−Ｓｔｒｅｐｔａｇ融合物の、安定した１つの成功例は、アミノ酸配列：
【化１】
2016527914.tif 000004
を有する。
【００８１】
下線のみの配列はベクター由来であり、太字のみの配列はリンカー配列であり、太字下線配列はＳｔｒｅｐｔａｇ  ＩＩである。残りの配列は、サーマス・サーモフィラスＡＨＩＲ残基１〜３２５である。ＡＨＩＲ遺伝子のこの部分を、サーマス・サーモフィラスゲノムＤＮＡからｐＵＣ−１９由来プラスミド中にクローニングしてから、残基１４０〜１４３の間にＳｔｒｅｐｔａｇ  ＩＩ及びリンカー配列を挿入した。全てのクローニングは、標準的な分子生物学技術を使用して達成した。ベクター配列を配列番号２に示す。
【００８２】
発現
ＬＣ４タンパク質の発現は、１０ｍｌ〜１リットルのＬＢブロスに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（株ＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）だが、他の株も使用できる。）の単一のコロニーを播種することによって達成し、その後一晩インキュベーション（通常１６時間、３７℃）した。
【００８３】
精製
培養物を回収し（５０００ｇ、５分）、培養体積の５０分の１の体積のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に、超音波処理によって溶解した。
２つの異なる経路によって、粗溶解物からのＬＣ４の精製に成功した。ただし、他の標準的な生化学的精製方法も可能である。
【００８４】
方法１
１）溶解物を加熱し（６５℃、３０分）、ペレット化した（５０００ｇ、２０分）；
２）３つの硫酸アンモニウムカット（ｃｕｔ）を行い、各々について、２５％飽和（２２℃）で沈殿する画分を取り、５ｍｌ  ＰＢＳに再懸濁した；
３）再懸濁した溶液をスーパーローズ６（ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６）サイズ排除カラム上で分画し、ＰＢＳ中で溶出し、４５３ｋＤａ十二量体に相当するピークをプールし、必要に応じて濃縮した。
【００８５】
方法２
１）溶解物を清澄化した（５００００ｇ、３０分、４℃）；
２）清澄化した溶解物をストレプタクチン（ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライし、製造者の説明書に従ってデスチオビオチンを使用して溶出した；
３）溶出したタンパク質をスーパーローズ６サイズ排除カラム上で分画し、ＰＢＳ中で溶出し、４５３ｋＤａ十二量体に相当するピークをプールし、必要に応じて濃縮した。
【００８６】
ストレプトアビジン
コアストレプトアビジンは、ＩＢＡ（ｗｗｗ．ｉｂａ−ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｄｅｔａｉｌｓ／ｐｒｏｄｕｃｔ／２．ｈｔｍｌ）から、精製された形態のものを購入した。
【００８７】
実施例２：３Ｄ格子形成
Ｓｔｒｅｐタグを付けたＡＨＩＲ及びストレプトアビジンの組合せによって形成された沈殿物を、加熱することによって「溶解」した。沈殿物が消滅した正確な温度は、厳密にどの構築物を用いたかによって変動したが、ＰＢＳ（ダルベッコＡリン酸緩衝生理食塩水）においては、通常６０〜７０℃の範囲であった。ストレプトアビジンを有する１：１サブユニット比率から形成されたＬＣ４に関して、視認できる解離が生じた温度は６３℃〜６５℃の間であった。この温度を、我々は溶融温度と称する。
【００８８】
ＬＣ４での最適な格子形成は、上昇させた温度（５０℃を超える）で生じる。この温度は、一定であっても（例えばインキュベーター、加熱ブロック又はサーモサイクラーにおいて）又は高い温度と低い温度との間を繰り返し循環してもよい（サーモサイクラーを使用して）。
【００８９】
精製ＬＣ４をＰＢＳ中でコアストレプトアビジンと混合した（通常５〜２０ｍｇ／ｍの間の最終濃度を得る）。ＬＣ４対ストレプトアビジンの最適なモル比は、おおよそ、ＬＣ４（十二量体）対ストレプトアビジン（四量体）の比率が１：４、すなわち第１の構成成分対第２の構成成分の比率が３：４であった。しかしながら、比率がこれよりも低くても高くても格子形成は成功裏に達成された。
【００９０】
１００μｍを超える立方格子が５５℃の一定温度にて２時間未満で観察された。２４時間成長させたら、より大きな結晶が生じた。
【００９１】
温度サイクルは、１サイクル当たり合計約１分間（高い及び低い温度でそれぞれ３０秒）で、温度範囲（通常５２℃〜６２℃）にわたって４〜７２時間周期的に変動させることを伴う。
【００９２】
両方の方法を使用して、最大０．５ｍｍの線寸法を有する格子を作製した。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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