(57)【要約】  個体において肝臓障害を特徴づけるための方法およびキットを提供する。本方法は、肝臓障害を検出するため、および肝臓障害に罹患している個体が命に関わる肝不全を起こす確度を予測するためのバイオマーカーとしての免疫性分析物の使用を採用する。血清アルブミンおよび他の特定された免疫性分析物の濃度の値を、個体から取得した血液試料から得るかまたは決定する。次いで、得られた濃度の値を、健常な肝臓を有する個体からの対応する濃度と比較する。濃度を比較することによって、所与の期間（例えば６か月）以内で命に関わる肝不全が発生して肝移植が必要となる個体の確度を特定することができる。
2016500825.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における肝臓障害を特徴づけるための方法であって、
（ａ）前記個体由来の血液試料中の血清アルブミンの濃度の値を直接的または間接的に得るステップと、
（ｂ）前記個体由来の血液試料中のＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＦＧＦ  ｂおよびＰＤＧＦ−ｂｂからなる群から選択される１種以上の免疫性分析物の濃度の値を直接的または間接的に得るステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）からの前記血清アルブミンの濃度の値が、（ｉ）２．８ｇ／ｄＬ以下であるかどうか、または、（ｉｉ）２．８ｇ／ｄＬを超えるかどうかを判定するステップと、
（ｄ）ステップ（ｂ）からの前記１種以上の免疫性分析物の濃度を、健常個体からの対応する免疫性分析物の濃度の中央値と比較して、ステップ（ｂ）からの前記１種以上の免疫性分析物の濃度のいずれかが、健常個体からの前記対応する免疫性分析物の濃度の中央値未満であるかどうかを判定するステップと、
（ｅ）前記個体を、
（ｉ）ステップ（ａ）からの前記血清アルブミンの濃度の値が、２．８ｇ／ｄＬ以下であり、かつ、ステップ（ｂ）からの前記１種以上の免疫性分析物の濃度のそれぞれが、健常個体からの前記対応する免疫性分析物の濃度の中央値未満である場合に、命に関わる肝臓障害を有するとして特定し、あるいは、
（ｉｉ）ステップ（ａ）からの前記血清アルブミンの濃度の値が、２．８ｇ／ｄＬを超え、および／または、ステップ（ｂ）からの前記免疫性分析物の濃度のすべてが健常個体からの前記対応する免疫性分析物の濃度の中央値未満であるわけではない場合に、命に関わらない肝臓障害を有するとして特定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記個体の特定の状況に適した医療を処方するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記個体が命に関わる肝臓障害を有するとして特定される場合に、前記処方が、前記個体に肝移植法を推奨することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記個体が命に関わる肝臓障害を有するとして特定される場合に、前記個体に肝移植を実施するステップをさらに含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記血液試料が血清試料である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記個体がヒトである、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｂ）が、ＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＦＧＦ  ｂ、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＩＬ−６からなる群から選択される少なくとも３つの免疫性分析物の濃度の値を直接的または間接的に得ることを含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｂ）が、ＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＦＧＦ  ｂ、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＩＬ−６からなる群から選択される４つの免疫性分析物の濃度の値を直接的または間接的に得ることを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｂ）が、ＩＬ−１７の濃度の値を得ることを含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｂ）が、ＲＡＮＴＥＳの濃度の値を得ることを含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）が、ＰＤＧＦ  ｂｂの濃度の値を得ることを含む、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）が、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−９およびＦＧＦ  ｂからなる群から選択される免疫性分析物の濃度の値を得ることを含む、請求項９から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｂ）が、ＴＮＦαおよびＦＧＦ  ｂの濃度の値を得ることを含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｂ）が、前記個体由来の血液試料中のＩＬ−６の濃度の値を得ることをさらに含み、健常個体からの前記対応する免疫性分析物の濃度の中央値を超えるＩＬ−６濃度の値が、急性または亜急性肝障害を有するとして前記個体を特定することと一致する、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
臨床試験に登録されている対象において肝臓障害を評価するための方法であって、
（ａ）前記対象由来の血液試料中の血清アルブミンの濃度の値を直接的または間接的に得るステップと、
（ｂ）前記対象由来の血液試料中のＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＦＧＦ  ｂおよびＰＤＧＦ−ｂｂからなる群から選択される１種以上の免疫性分析物の濃度の値を直接的または間接的に得るステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）からの前記血清アルブミンの濃度の値が、（ｉ）２．８ｇ／ｄＬ以下であるかどうか、または、（ｉｉ）２．８ｇ／ｄＬを超えるかどうかを判定するステップと、
（ｄ）ステップ（ｂ）からの前記１種以上の免疫性分析物の濃度を、健常対象からの対応する免疫性分析物の濃度の中央値と比較して、ステップ（ｂ）からの前記１種以上の免疫性分析物の濃度のいずれかが、健常対象からの前記対応する免疫性分析物の濃度の中央値未満であるかどうかを判定するステップと、
（ｅ）前記対象を、
（ｉ）ステップ（ａ）からの前記血清アルブミンの濃度の値が２．８ｇ／ｄＬ以下であり、かつ、ステップ（ｂ）からの前記１種以上の免疫性分析物の濃度のそれぞれが健常対象からの前記対応する免疫性分析物の濃度の中央値未満である場合に、命に関わる肝臓障害を有するとして特定し、
（ｉｉ）ステップ（ａ）からの前記血清アルブミンの濃度が２．８ｇ／ｄＬを超えるか、またはステップ（ｂ）からの前記免疫性分析物の濃度のすべてが健常対象からの前記対応する免疫性分析物の濃度の中央値未満であるわけではないか、あるいはその両方である場合に、命に関わらない肝臓障害を有するとして特定し、あるいは、
（ｉｉｉ）ステップ（ａ）からの前記血清アルブミン濃度の値が２．８ｇ／ｄＬを超え、かつ、ステップ（ｂ）からの前記１種以上の免疫性分析物の濃度のすべてが健常対象からの前記対応する免疫性分析物の濃度の中央値以上である場合に、正常な肝機能を有するとして特定するステップと
を含む方法。
【請求項１６】
前記血液試料が血清試料である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｂ）が、ＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＦＧＦ  ｂ、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＩＬ−６からなる群から選択される少なくとも３つの免疫性分析物の濃度の値を直接的または間接的に得ることを含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｂ）が、ＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＦＧＦ  ｂ、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＩＬ−６からなる群から選択される４つの免疫性分析物の濃度の値を直接的または間接的に得ることを含む、請求項１５から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｂ）が、ＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳ、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＩＬ−９の濃度の値を直接的または間接的に得ることを含む、請求項１５から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が命に関わる肝臓障害を有するとして特定される場合に、前記対象が臨床試験から除外される、請求項１５から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象が命に関わらない肝臓障害を有するとして特定される場合に、前記対象が臨床試験から除外される、請求項１５から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ａ）〜（ｅ）が臨床試験の開始時に実施され、次いで臨床試験中に少なくとも１回反復して実施される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
臨床試験の経過中に、対象の正常な肝機能を有するとの特定が、命に関わらないまたは命に関わる肝臓障害を有するとの特定へと変化する場合に、前記対象を臨床試験から除外することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
臨床試験の経過中に、対象の命に関わらない肝臓障害を有するとの特定が、命に関わる肝臓障害を有するとの特定へと変化する場合に、前記対象を臨床試験から除外することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＦＧＦ  ｂ、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＩＬ−６および血清アルブミンからなる群から選択される免疫性分析物の検出および定量化に適した第１の抗体と、請求項１に記載の方法に従って個体において肝臓障害を特徴づけるための指示書とを含む、キット。
【請求項２６】
それぞれがＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＦＧＦ  ｂ、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＩＬ−６および血清アルブミンからなる群から選択される免疫性分析物の検出に適した第２、第３および第４の抗体をさらに含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記第１の抗体が、ＩＬ−９、ＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳおよびＰＤＧＦ−ｂｂからなる群から選択される免疫性分析物に結合する、請求項２５に記載のキット。
【請求項２８】
前記第１、第２、第３および第４の抗体が、ＩＬ−９、ＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳおよびＰＤＧＦ−ｂｂのそれぞれを検出および定量化する、請求項２５に記載のキット。
【請求項２９】
前記第１の抗体が固体支持体に結合している、請求項２５に記載のキット。
【請求項３０】
前記第１、第２、第３および第４の抗体が固体支持体に結合している、請求項２６に記載のキット。
【請求項３１】
前記固体支持体がマルチプレックスアッセイを提供し、前記マルチプレックスアッセイが、ＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＦＧＦ  ｂ、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＩＬ−６からなる群から選択される少なくとも４つの免疫性分析物の同時検出および定量化に適している、請求項２９または３０に記載のキット。
【請求項３２】
前記マルチプレックスアッセイが、ＩＬ−９、ＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳおよびＰＤＧＦ−ｂｂのそれぞれを検出および定量化する、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記指示書が、健常な肝臓を有する個体における各免疫性分析物の濃度の中央値を収載する表をさらに含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項３４】
肝移植を受けることについて複数の患者の優先順位をつけるための方法であって、
（ａ）第１の個体および第２の個体を含めた複数の個体由来のそれぞれの血液試料中の血清アルブミンの濃度の値を直接的または間接的に得るステップと、
（ｂ）第１の個体および第２の個体を含めた複数の個体由来のそれぞれの血液試料中のＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＦＧＦ  ｂ、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＩＬ−６からなる群から選択される１種以上の免疫性分析物の濃度の値を直接的または間接的に得るステップと、
（ｃ）前記第１の個体に関連するステップ（ｂ）からの前記１種以上の免疫性分析物の濃度を、健常個体からの対応する免疫性分析物の濃度の中央値と比較して、ステップ（ｂ）からの前記１種以上の免疫性分析物の濃度のいずれかが、健常個体からの前記対応する免疫性分析物の濃度の中央値未満であるかどうかを判定するステップと、
（ｄ）前記第２の個体に関連するステップ（ｂ）からの前記１種以上の免疫性分析物の濃度を、健常個体からの対応する免疫性分析物の濃度の中央値と比較して、ステップ（ｂ）からの前記１種以上の免疫性分析物の濃度のいずれかが、健常個体からの前記対応する免疫性分析物の濃度の中央値未満であるかどうかを判定するステップと、
（ｅ）（ｉ）前記第１の個体が、２．８ｇ／ｄＬを超えるステップ（ａ）からの血清アルブミン濃度の値を有すること、または、（ｉｉ）ステップ（ｂ）からの前記１種以上の免疫性分析物の濃度のいずれかが、健常個体からの前記対応する免疫性分析物の濃度の中央値未満であることを判定するステップと、
（ｆ）（ｉ）前記第２の個体が、２．８ｇ／ｄＬ以下であるステップ（ａ）からの血清アルブミン濃度の値を有すること、および、（ｉｉ）ステップ（ｂ）からの前記１種以上の免疫性分析物の濃度のすべてが、健常個体からの前記対応する免疫性分析物の濃度の中央値未満であることを判定するステップと、
（ｇ）前記第２の個体を、前記第１の個体よりも肝臓障害が原因で死亡する危険性が高いとして同定するステップと
を含む方法。
【請求項３５】
前記第１の個体に肝移植を実施する前に、前記第２の個体に肝移植を実施することを推奨することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記推奨を行ってから６か月以内に前記第２の個体に肝移植が実施される、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、２０１２年１０月２４日に出願された米国特許仮出願第６１／７１７、９７７号に対する優先権を主張するものであり、その開示全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［発明の分野］
ここに開示された発明は、一般に、哺乳動物において肝臓障害を特定するためおよび／または肝臓障害に罹患している哺乳動物の生存可能性を予測するためのバイオマーカーとしての免疫性分析物の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
薬物および化学物質に起因する肝臓損傷は、有病率および重要性が高まり続けている問題である。薬物性肝障害（ＤＩＬＩ）は、米国における急性肝不全の共通原因であり、そのような症例の約１３％を占める（１〜３）。ＤＩＬＩはまた、その他の点では有望な新薬候補を放棄させることになる、または新薬を市場から撤退させることになる、最もよくある薬物有害事象であり、わずか数か月間の使用後に起こることが多い。そうした出来事は、ＤＩＬＩを発生する者が経験する疼痛、苦痛および死亡の点から明白かつ重大な人的損失があるだけでなく、これらの薬物を開発した企業、その企業の株主および社会全体にとって重大な経済的損失がある。なぜなら、そうした不運な薬物の開発に投入されたリソースを我々の健康および幸福を向上させるための他の方策により良く費やすことが可能であったからである（４〜７）。
【０００４】
ＤＩＬＩの有病率はハーブ療法および栄養補助食品（ＨＤＳ）の使用の増加によって悪化する。これらは「天然」であるので、安全であると考えられることが多い。しかし、これらの多くが重篤な肝臓損傷を引き起こし得ることは明らかである。近年では、米国におけるＤＩＬＩの事例の約１０％がＨＤＳと関係しており（１０）、さらに高い頻度が極東で報告されている（１１）。
【０００５】
ＤＩＬＩに加えて、哺乳動物の肝臓は、ウイルス感染による炎症（例えばＡ型、Ｂ型、Ｃ型またはＥ型肝炎）、胆汁流の閉塞、コレステロールまたはトリグリセリドの蓄積および肝臓への血流障害を含めた、他の様々な方法で損傷され得る。
【０００６】
その病因にかかわらず、肝臓障害は診断が難しい場合がある。肝臓障害について一般に使用されるバイオマーカー、例えば血清アミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼおよび他の酵素は、感度および特異性が限られている（７、９）。さらに、肝臓障害に対する正確な予後を提供することは、よりいっそう困難である。急性肝不全に罹患している患者については、近い将来（例えば６か月の時間枠）に肝移植が必要になるどうかを予測するための信頼できる検査がない。移植手術用の肝臓の供給は限られているので、近い将来移植を必要とする患者と必要としない患者を区別することは非常に重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、肝臓障害を正確に検出するため、および命に関わる肝臓障害に罹患している対象の所与の時間枠内における生存可能性を予測するための方法およびキットが緊急に必要な状況である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、個体、例えば哺乳動物（例えばヒト）における肝臓損傷を特徴づけるための方法を提供する。この方法は、例えば、命に関わる肝臓障害を起こしている個体と命に関わらない肝臓障害を起こしている患者を区別するのに使用することができる。この方法は、（例えば、ＤＩＬＩ、ウイルス性肝炎、自己免疫性肝炎、虚血性肝炎などが原因で）肝臓障害の危険性がある個体をモニターするのに、ならびにそうした個体が命に関わる肝不全を起こしそうかどうか、および特定の時間枠内に肝移植を必要とするかどうかを判定するのに使用することもできる。本発明は、中でも、命に関わる肝臓障害の危険性の増大と相関する血中濃度レベルの協調的変化を示す免疫学的マーカー（すなわち、免疫性分析物および血清アルブミン）を首尾よく同定したことに基づく。
【０００９】
したがって、一態様では、本発明は個体における肝臓障害を特徴づけるための方法を提供する。ある種の実施形態では、本方法は、個体由来の血液試料中の血清アルブミン濃度を直接的または間接的に得ることを含む。次いで、得られた血清アルブミン濃度を、あらかじめ決定された血清アルブミン濃度（例えば、３．５ｇ／ｄＬ、３．２ｇ／ｄＬまたは２．８ｇ／ｄＬ）と比較する。ある種の実施形態では、本方法は、個体由来の血液試料中のＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＦＧＦ  ｂ、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＩＬ−６からなる群から選択される１種以上の免疫性分析物の濃度（複数可）を直接的または間接的に得ることを含む。次いで、このようにして得られた１種以上の免疫性分析物の濃度を、健常個体（例えば、健常な肝臓を有する個体）の血液で見られる免疫性分析物の濃度と比較する。ある種の実施形態では、（１）個体の血清アルブミン濃度があらかじめ決定された血清アルブミン濃度（例えば２．８ｇ／ｄＬ）以下であり、（２）個体の血液中の１種以上の免疫性分析物の濃度が健常個体の血液中の対応する免疫性分析物の濃度の中央値未満である（しかしＩＬ−６に関しては、適用可能な条件は、健常個体の血液中のＩＬ−６の濃度の中央値を超える、個体の血液中の濃度である）場合、個体は命に関わる肝臓障害を有するとして特定される。ある種の実施形態では、個体の血清アルブミン濃度があらかじめ決定された血清アルブミン濃度（例えば２．８ｇ／ｄＬ）を超え、および／または、個体の血液中の得られた免疫性分析物濃度の少なくとも１つが健常個体の血液中の対応する免疫性分析物の濃度の中央値未満ではない（しかしＩＬ−６に関しては、適用可能な条件は、健常個体の血液中のＩＬ−６の濃度の中央値を超えない、個体の血液中の濃度である）場合、個体は命に関わらない肝臓障害を有するとして特定される。
【００１０】
ある種の実施形態では、本方法は、命に関わる肝臓障害を有するとして特定されたことを個体に通知することをさらに含む。他の実施形態では、本方法は、命に関わらない肝臓障害を有するとして特定されたことを個体に通知することをさらに含む。ある種の実施形態では、本方法は、個体の特定の状況（すなわち、命に関わるまたは命に関わらない肝臓障害を有する）に相応の医療を個体に提供することをさらに含む。例えば、ある種の実施形態では、本方法は、個体が命に関わる肝臓障害を有するとして特定される場合に、コルチコステロイド（例えばプレドニゾン）を個体に処方するステップをさらに含む。他の実施形態では、本方法は、個体が命に関わる肝臓障害を有するとして特定される場合に、肝移植法を個体に推奨するステップをさらに含む。ある種の実施形態では、本方法は、個体が命に関わる肝臓障害を有するとして特定される場合に、個体に対して肝移植を実施するステップをさらに含む。
【００１１】
本発明に係る方法で用いられる血液試料は血清試料でもよい。あるいは、血液試料は血漿試料でもよい。一般に、個体について測定された免疫性分析物の濃度は、同じタイプの試料から測定された濃度（例えば濃度の中央値）と比較する必要がある（例えば、個体の血清中のＩＬ−１７の濃度は、健常個体からの血清試料で検出されるＩＬ−１７の濃度の中央値と比較する必要がある）。好ましい実施形態では、個体は哺乳動物、例えばヒトである。
【００１２】
好ましい実施形態では、１種以上の免疫性分析物の濃度（複数可）を直接的または間接的に得ることは、ＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＦＧＦ  ｂ、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＩＬ−６からなる群から選択される、少なくとも３つ、より好ましくは４つの免疫性分析物の濃度を得ることを含む。好ましくは、本方法は、ＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳおよび／またはＰＤＧＦ  ｂｂについて濃度を得ることを含む。好ましくは、本方法は、ＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳおよび／またはＰＤＧＦ  ｂｂならびにＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−９およびＦＧＦ  ｂからなる群から選択される、少なくとも１つのさらなる免疫性分析物について濃度を得ることを含む。ある種の実施形態では、本方法は、ＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳおよび／またはＰＤＧＦ  ｂｂならびにＴＮＦαとＦＧＦ  ｂの両方について濃度を得ることを含む。前記の方法のいずれも、個体からの血液試料中のＩＬ−６について濃度を得ることをさらに含むことができる。本明細書の他の個所で述べるように、健常個体のＩＬ−６の濃度の中央値を超えるＩＬ−６濃度は、命に関わる肝臓障害を有する個体と一致する。
【００１３】
関連した態様では、本発明は、臨床試験に登録されている対象において肝臓障害を評価するための方法を提供する。この方法は、本明細書の上記および他の個所で述べるように、個体において肝臓障害を特徴づけるための方法のように実施することができる。しかしある種の実施形態では、臨床試験に登録される対象において肝臓障害を評価する方法は、命に関わる肝臓障害を有するか、命に関わらない肝臓障害を有するか、または正常な肝機能を有しているとして対象を特定するステップを含む。命に関わる肝臓障害および命に関わらない肝臓障害は、本明細書の上記および他の個所で述べるように特定される。正常な肝機能は、例えば、（ｉ）対象の血液試料から得られた血清アルブミン濃度の値が、あらかじめ決定された血清アルブミン濃度（例えば２．８ｇ／ｄＬ、３．２ｇ／ｄＬまたは３．５ｇ／ｄＬ）を超え、（ｉｉ）対象の血液試料から得られた１種以上の免疫性分析物の濃度のすべてが、健常対象の血液中の対応する免疫性分析物の濃度の中央値以上である（しかしＩＬ−６に関しては、適用可能な条件は、健常個体の血液中のＩＬ−６の濃度の中央値以下の、個体の血液中の濃度である）場合に特定することができる。
【００１４】
ある種の実施形態では、対象は哺乳動物、例えばヒトである。ある種の実施形態では、臨床試験は、新薬（例えば、抗がん剤または抗炎症薬）を目的とする。ある種の実施形態では、対象はＤＩＬＩの危険性がある。
【００１５】
別の態様では、本発明は、肝臓障害に罹患している個体の生存可能性を評価するための方法を提供する。典型的には、個体は哺乳動物、例えばヒトである。ある種の実施形態では、本方法は、直接的または間接的のいずれかで、個体由来の血液試料中の血清アルブミン濃度（例えば血清試料）を得ることを含む。ある種の実施形態では、本方法は、直接的または間接的のいずれかで、個体由来の血液試料（例えば血清試料）中のＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＦＧＦ  ｂ、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＩＬ−６からなる群から選択される１種以上の免疫性分析物の濃度を得ることを含む。目的の免疫性分析物の濃度を得た後に、個々に、健常個体（例えば、健常な肝臓を有する個体）の血液で見られる対応する免疫性分析物の濃度の中央値と値を比較する。本発明のある種の実施形態によれば、本方法は、患者の血液試料から得た１種以上の免疫性分析物の濃度のいずれかが、健常個体からの対応する免疫性分析物の濃度の中央値未満（しかしＩＬ−６に関しては、適用可能な条件は、健常個体の血液中のＩＬ−６の濃度の中央値を超える、個体の血液中の濃度である）かどうかを判定するステップを含む。目的の免疫性分析物の測定値の比較に加えて、個体の血液試料から得られた血清アルブミン濃度を、あらかじめ決定された濃度範囲またはカットオフ値（例えば、２〜５ｇ／ｄＬ、２〜４ｇ／ｄＬ、２〜３ｇ／ｄＬ、２．５〜３ｇ／ｄＬまたは２．８ｇ／ｄＬ）と比較し、個体の血清アルブミン濃度が、（ｉ）濃度範囲未満（もしくはあらかじめ決定されたカットオフ値以下、または（ｉｉ）濃度範囲内（もしくはあらかじめ決定されたカットオフ値を超える）であるかどうかに関して判定を行う。
【００１６】
ある種の実施形態では、本方法は、肝臓障害から生存する確度が高い（例えば、次の６か月について生存の可能性が９０％以上である）または肝臓障害による死亡の確度が高い（例えば、肝移植が実施されない限り、次の６か月以内に死亡する可能性が９０％以上である）のいずれかとして、個体を特定するステップを含む。特定は、測定した免疫性分析物の濃度および血清アルブミン濃度の解析および比較に基づいて完了することができる。例えば、試料から測定した血清アルブミン濃度の値が、あらかじめ決定されたカットオフ値（例えば２．８ｇ／ｄＬ）を超える場合、または個体から得られた１種以上の免疫性分析物の濃度のいずれかが、健常個体の血液で見られる対応する免疫性分析物の濃度の中央値以上である（しかしＩＬ−６に関しては、適用可能な条件は、健常個体の血液中のＩＬ−６の濃度の中央値以下の、個体の血液中の濃度である）場合に、肝臓障害から生存する確度が高いとして個体を特定することができる。逆に、個体から得られた血清アルブミン濃度が、あらかじめ決定されたカットオフ値（例えば２．８ｇ／ｄＬ）以下である場合、および個体から得られた１種以上の免疫性分析物の濃度のすべてが、健常個体の血液で見られる対応する免疫性分析物の濃度の中央値未満である（しかしＩＬ−６に関しては、適用可能な条件は、健常個体の血液中のＩＬ−６の濃度の中央値を超える、個体の血液中の濃度である）場合に、肝臓障害による死亡の確度が高いとして個体を特定することができる。
【００１７】
別の態様では、本発明は、第１の患者および第２の患者を含めた複数の患者に、肝移植を受けることについて優先順位をつけるための方法を提供する。その際、より早急に肝移植の必要がある患者を、肝移植を全く必要としない可能性がある（または少なくとも肝移植の緊急の必要性がより少ない）患者よりも優先することができる。本発明のある種の実施形態によれば、それぞれの血液試料は、肝臓障害に罹患している（または罹患していると考えられる）複数の個体から入手する。各試料について、血清アルブミンの濃度値を得（例えば、適切なアッセイで測定し）、ＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＦＧＦ  ｂ、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＩＬ−６からなる群から選択される１種以上の免疫性分析物に対するそれぞれの濃度値を得る（例えばアッセイする）。
【００１８】
第１の個体から得られた免疫性分析物の濃度を、健常個体の血液で見られる対応する免疫性分析物の濃度の中央値と比較して、その個体の１種以上の免疫性分析物の濃度のいずれかが、健常個体の血液で見られる対応する免疫性分析物の濃度の中央値未満である（しかしＩＬ−６に関しては、適用可能な条件は、健常個体の血液中のＩＬ−６の濃度の中央値を超える、個体の血液中の濃度である）かどうかを判定することができる。同様に、第２の個体から得られた免疫性分析物の濃度を、健常個体の血液で見られる対応する免疫性分析物の濃度の中央値と比較して、その個体の１種以上の免疫性分析物の濃度のいずれかが、健常個体の血液で見られる対応する免疫性分析物の濃度の中央値未満である（重ねて、ＩＬ−６に関しては、適用可能な条件は、健常個体の血液中のＩＬ−６の濃度の中央値を超える、個体の血液中の濃度である）かどうかを判定することができる。
【００１９】
ある種の実施形態では、本方法は、以下の１つを判定するステップを含む。（ｉ）第１の個体の試料が、あらかじめ決定された範囲またはカットオフ値（例えば２．８ｇ／ｄＬ）を超える血清アルブミン濃度の値を有すること、または、（ｉｉ）第１の個体の試料からの１種以上の免疫性分析物の濃度のいずれかが、健常個体の血液中の対応する免疫性分析物の濃度の中央値以上である（しかしＩＬ−６に関しては、適用可能な条件は、健常個体の血液中のＩＬ−６の濃度の中央値以下の、個体の血液中の濃度である）こと。ある種の実施形態では、本方法は、以下の１つを判定するステップを含む。（ｉ）第２の個体の試料が、あらかじめ決定された範囲（例えば、２．５〜３．０ｇ／ｄＬ）未満であるまたはあらかじめ決定されたカットオフ値（例えば２．８ｇ／ｄＬ）以下である血清アルブミン濃度の値を有すること、および（ｉｉ）第２の個体の試料からの１種以上の免疫性分析物の濃度のすべてが、健常個体の血液で見られる対応する免疫性分析物の濃度の中央値未満である（しかしＩＬ−６に関しては、適用可能な条件は、健常個体の血液中のＩＬ−６の濃度の中央値を超える、個体の血液中の濃度である）こと。本発明のある種の実施形態によれば、第２の個体を、肝臓障害が原因で死亡する危険性が第１の個体よりも高いとして同定するステップを実施することができる。したがってある種の実施形態では、第１の個体について肝移植を実施する前に、第２の個体について肝移植を実施することを推奨するさらなるステップを行うことができる。その際、肝移植を受けることについて、第２の個体は、第１の個体よりも優先される。
【００２０】
さらに別の態様では、本発明は、本発明に係る方法を実施するために使用することができるキットを提供する。ある種の実施形態では、キットは、（ｉ）血清アルブミンならびに／またはＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＦＧＦ  ｂ、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＩＬ−６からなる群から選択される免疫性分析物を検出および定量化するのに適している第１の抗体と、（ｉｉ）それぞれ、健常な肝臓を有する個体を代表する対応する免疫性分析物の中央濃度および血清アルブミンに関するあらかじめ決定された範囲（例えば２．５〜３．０ｇ／ｄＬ）またはカットオフ値（例えば２．８ｇＬ）と比べた免疫性分析物および血清アルブミンの濃度に基づいて肝臓障害を特徴づけるための指示書とを含むことができる。ある種の実施形態では、指示書は、健常な肝臓を有する個体における免疫性分析物（例えば、ＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＦＧＦ  ｂ、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＩＬ−６）の濃度の中央値を収載する表をさらに含む。
【００２１】
ある種の実施形態では、キットは、血清アルブミンならびに／またはＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＦＧＦ  ｂ、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＩＬ−６からなる群から選択される免疫性分析物の検出に適している第２の抗体をさらに含む。ある種の実施形態では、第２の抗体は、第１の抗体と同じ免疫性分析物に結合するが、異なるエピトープに結合する。他の実施形態では、第２の抗体は、第１の抗体と異なる免疫性分析物に結合する。
【００２２】
ある種の実施形態では、キットは、それぞれが血清アルブミンならびに／またはＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＦＧＦ  ｂ、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＩＬ−６からなる群から選択される免疫性分析物の検出に適している第２の抗体および第３の抗体をさらに含む。ある種の実施形態では、第３の抗体は、第１のまたは第２の抗体と同じ免疫性分析物に結合するが、異なるエピトープに結合する。他の実施形態では、第３の抗体は、第１および第２の抗体と異なる免疫性分析物に結合する。
【００２３】
ある種の実施形態では、キットは、それぞれが血清アルブミンならびに／またはＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＦＧＦ  ｂ、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＩＬ−６からなる群から選択される免疫性分析物の検出に適している第２の抗体、第３の抗体および第４の抗体をさらに含む。ある種の実施形態では、第４の抗体は、第１の抗体、第２の抗体または第３の抗体と同じ免疫性分析物に結合するが、異なるエピトープに結合する。他の実施形態では、第４の抗体は、第１、第２および第３の抗体と異なる免疫性分析物に結合する。
【００２４】
ある種の実施形態では、キットの第１の抗体は、ＩＬ−９、ＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳおよびＰＤＧＦ−ｂｂからなる群から選択される免疫性分析物に結合する。ある種の実施形態では、キットの第１および第２の抗体は、ＩＬ−９、ＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳおよびＰＤＧＦ−ｂｂからなる群から選択される免疫性分析物に結合する。ある種の実施形態では、キットの第１、第２および第３の抗体は、ＩＬ−９、ＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳおよびＰＤＧＦ−ｂｂからなる群から選択される免疫性分析物に結合する。ある種の実施形態では、キットの第１、第２、第３および第４の抗体は、ＩＬ−９、ＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳおよびＰＤＧＦ−ｂｂからなる群から選択される免疫性分析物に結合する。
【００２５】
ある種の実施形態では、少なくとも１つの抗体（例えば、第１、第２、第３または第４の抗体）は、固体支持体に結合している。ある種の実施形態では、すべての抗体が固体支持体に結合している。固体支持体は、血清アルブミンならびに／またはＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＦＧＦ  ｂ、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＩＬ−６からなる群から選択される免疫性分析物（例えば３つまたは４つの分析物）の検出および定量化に適すると思われるような、マルチプレックスアッセイを提供することができる。ある種の実施形態では、マルチプレックスアッセイは、ＩＬ−９、ＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳおよびＰＤＧＦ−ｂｂのそれぞれを検出および定量化する。
【００２６】
このように本発明の実施形態を概括的に説明してきたが、ここで、必ずしも縮尺通りではない添付の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明のある種の実施形態による方法を示す図である。
【図２】本発明のある種の実施形態による１つの特定の方法を示す図である。
【図３】免疫応答の単純化モデルを示す図である。
【図４】特定の研究に対するコホートを示す流れ図を示す図である。
【図５】ＤＩＬＩ発症時での血清における免疫性分析物のプロファイルを示す図である。
【図６】６か月の経過観察時点でのＤＩＬＩ対象の血清におけるサイトカインのプロファイルを示す図である。
【図７】ＤＩＬＩ発症時でのＤＩＬＩ対象の血清におけるケモカインのプロファイルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
ここで、本発明の実施形態のすべてではないが、いくつかが示されている添付の図面を参照して、以下に、本発明をさらに十分に説明する。実際に、本発明は、多くの異なる形態で具体化され得、本明細書に示す実施形態に限定されると解釈されるべきでなく、むしろ、本開示が適用可能な法的必要条件を満たすために、これらの実施形態は提供される。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、文脈において別段明記しない限り、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」は複数の指示物を含む。
【００２９】
その最も一般的な形態では、本発明は、個体における肝臓障害を特徴づけるための方法に関する。肝臓障害の起源は、例えば、ウイルス性肝炎、虚血性肝炎、自己免疫性肝炎、ＤＩＬＩまたは肝不全を引き起こす代謝疾患であり得る。したがってある種の実施形態では、肝臓障害の起源はＤＩＬＩである。しかし、方法のいくつかの適用では、肝臓障害の起源は不明である。肝臓障害は、命に関わる肝臓障害でもあり得るし、命に関わらない肝臓障害でもあり得る。本明細書で使用する場合、用語「命に関わる肝臓障害」は、治療しない場合、定義された時間枠内で死亡する結果になる確率が高い肝臓障害を指す。本明細書で使用する場合、用語「命に関わらない肝臓障害」は、治療しない場合、定義された時間枠で死亡する結果になる確率が低い肝臓障害を指す。高確率とは７０％を超える（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上）ものである。低確率とは３０％未満（例えば、わずか２５％、２０％、１５％、１０％、５％またはそれ未満）ものである。定義された時間枠とは、例えば、数か月（例えば、３か月、６か月、９か月、１年）でもよいが、好ましくは６か月である。本明細書で使用する場合、用語「肝臓障害」は、肝不全（例えば、急性肝不全および亜急性肝不全）を含む。
【００３０】
個体において肝臓障害を特徴づける方法のステップは、様々な状況で適用することができる。したがって、本発明は、臨床試験に参加する対象において肝臓障害を評価する方法、肝臓障害に罹患している個体の生存可能性を評価する方法、および肝移植を受けることについて、複数の患者において１種以上の患者の優先順位をつける方法を包含する。各方法は、急性肝臓病と関係があるバイオマーカーとして特定された特定の免疫性分析物の濃度レベルを解析することを含む。用いられる免疫性分析物バイオマーカーは、ＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＦＧＦ  ｂ、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＩＬ−６およびそれらの任意の組み合わせから選択することができる。ある種の免疫性分析物バイオマーカーの解析に加えて、肝臓障害と関係がある血清アルブミンについてあらかじめ決定された範囲（例えば、２〜５ｇ／ｄＬ、２〜４ｇ／ｄＬ、２〜３ｇ／ｄＬ、２．５〜３ｇ／ｄＬ）またはカットオフ値（例えば、３．５ｇ／ｄＬ、３．２ｇ／ｄＬまたは２．８ｇ／ｄＬ）に対して、患者の血清アルブミン濃度レベルを評価することもできる。ある種の実施形態では、血清アルブミンのあらかじめ決定された範囲は、２．５〜３．０ｇ／ｄＬである。特定の好ましい実施形態では、血清アルブミンのあらかじめ決定されたカットオフ値は、２．８ｇ／ｄＬである。血清アルブミンのあらかじめ決定された範囲またはカットオフ値の選択は、関連する偽陽性および偽陰性率を考慮に基づいて行うことができる。
【００３１】
免疫性分析物および／または血清アルブミンの濃度の値は、間接的または直接的に得ることができる。ある種の実施形態では、「間接的に得る」は、第三者、例えば診断に関する企業から濃度の値を得ることを指すが、「直接的に得る」は、（例えば、「組織内」の実験室を使用する）直接的な測定によって、濃度を得ることを指す。免疫性分析物は、適切なアッセイ（例えば、目的の特定の免疫性分析物を検出および／または定量化するために設計または構成されたマルチプレックスアッセイ）を用いて測定することによって得ることができる。同様に、当技術分野で周知のように、血清アルブミンの濃度の値を試料から直接的または間接的に得ることができる。適切なアッセイとしては、抗体に基づいたアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）および抗体に基づかないアッセイ（例えば質量分析）が挙げられる。あるいはある種の実施形態では、（例えば、ＰＣＲまたは任意の他の適切な増幅形態を使用して）対応するｍＲＮＡの発現を測定することによって、免疫性分析物および／または血清アルブミンを間接的に検出することができる。当業者なら容易に理解するように、ＰＣＲのような間接的な技法の使用は、十分なｍＲＮＡを含有する試料、好ましくは、目的の分析物を分泌する細胞（例えば組織または全血試料など）を必要とする。
【００３２】
目的の特定の免疫性分析物のそれぞれの濃度の値を得た後、次いでこれらの値を、健常個体（例えば、健常な肝臓を有する個体）の血液（例えば、血清または血漿）で見られる対応する免疫性分析物の濃度の中央値と、個々に比較することができる。本発明のある種の実施形態によれば、（例えば患者の血液試料から）得られた免疫性分析物の濃度の１種以上のいずれかが、健常個体からの対応する免疫性分析物の濃度の中央値未満であるかどうかを判定するステップを含む。目的の免疫性分析物の測定値の比較に加えて、患者の血液試料から得られた血清アルブミンの濃度の値を、あらかじめ決定された範囲（例えば、２〜５ｇ／ｄＬ、２〜４ｇ／ｄＬ、２〜３ｇ／ｄＬもしくは２．５〜３ｇ／ｄＬ）またはカットオフ値（例えば、３．５ｇ／ｄＬ、３．２ｇ／ｄＬもしくは２．８ｇ／ｄＬ）と比較し、試料からの血清アルブミン濃度の値が、（ｉ）あらかじめ決定された範囲（もしくは、あらかじめ決定されたカットオフ値以下）未満、または（ｉｉ）あらかじめ決定された範囲内（もしくは、あらかじめ決定されたカットオフ値を超える）であるかどうかを判定する。
【００３３】
本発明のある種の実施形態によれば、（１）個体の血清アルブミン濃度が、あらかじめ選択された範囲（例えば２．５〜３．０ｇ／ｄＬ）またはカットオフ値（例えば２．８ｇ／ｄＬ）以下であり、（２）個体の血液中の１種以上の免疫性分析物の濃度が、健常個体の血液中の対応する免疫性分析物の濃度の中央値未満である（しかしＩＬ−６に関しては、適用可能な条件は、健常個体の血液中のＩＬ−６の濃度の中央値を超える、個体の血液中の濃度である）場合に、個体は、命に関わる肝臓障害を有するとして特定される。あるいは、個体の血清アルブミン濃度が、あらかじめ選択された範囲（例えば２．５〜３．０ｇ／ｄＬ）以内（もしくはそれを超える）もしくはあらかじめ選択されたカットオフ（例えば２．８ｇ／ｄＬ）を超え、および／または、個体の血液中の免疫性分析物の濃度（複数可）のすべてが健常個体からの対応する免疫性分析物の濃度の中央値（複数可）未満というわけではない（しかしＩＬ−６に関しては、適用可能な条件は、健常個体の血液中のＩＬ−６の濃度の中央値を超えない個体の血液中の濃度である）場合に、個体は命に関わらない肝臓障害を有するとして特定される。本発明の他の実施形態によれば、（ｉ）対象の血液試料から得られた血清アルブミン濃度の値が、あらかじめ選択された範囲（例えば、３．０〜４．０ｇ／ｄＬまたは３．５〜５．０ｇ／ｄＬ）以内（もしくはそれを超える）またはあらかじめ選択されたカットオフ（例えば２．８ｇ／ｄＬ、３．２ｇ／ｄＬもしくは３．５ｇ／ｄＬ）を超え、（ｉｉ）対象の血液試料から得られた１種以上の免疫性分析物の濃度のすべてが、健常対象からの対応する免疫性分析物の濃度の中央値以上である場合に、個体（例えば、臨床試験における対象）は、正常な肝機能を有するとして特定される。
【００３４】
臨床試験に参加している対象における肝臓障害の評価を含む本発明の方法については、対象が命に関わる肝臓障害を有するとして特定される場合に、対象を臨床試験から除くことができる。同様に、対象が命に関わらない肝臓障害を有するとして特定される場合に、対象を臨床試験から除くことができる。
【００３５】
臨床試験に含まれる対象については、臨床試験中の複数の時点で（例えば、臨床試験より前、臨床試験開始直ぐ、および臨床試験中の１または複数の時点で）肝臓障害を評価する可能性がある。したがってある種の実施形態では、肝臓障害の評価を、臨床試験中に少なくとも２回実施する。したがって、肝臓障害（もしあれば）の程度を臨床試験の経過にわたって追跡することができる。ある種の実施形態では、臨床試験の経過中に、対象の正常な肝機能を有するとの特定が、命に関わらない肝臓障害を有するとの特定へと変化することを理由に、対象は臨床試験から除外される。ある種の実施形態では、臨床試験の経過中に、対象の正常な肝機能を有するとの特定が、命に関わる肝臓障害を有するとの特定へと変化することを理由に、対象は臨床試験から除外される。他の実施形態では、臨床試験の経過中に、対象の命に関わらない肝臓障害を有するとの特定が、命に関わる肝臓障害を有するとの特定へと変化する場合、対象は臨床試験から除外される。
【００３６】
本発明のある種の実施形態によれば、肝臓障害から生存する確度が高い（例えば、次の６か月について生存の可能性が９０％以上である）または肝臓障害による死亡の確度が高い（例えば、肝移植が実施されない限り、次の６か月以内に死亡する可能性が９０％以上である）のいずれかとして患者を同定するステップは、測定した免疫性分析物の濃度および血清アルブミン濃度の解析および比較に基づいて完了することができる。例えば、試料から測定した血清アルブミン濃度の値が２．８ｇ／ｄＬを超える場合、または１種以上の、試料から測定した免疫性分析物の濃度のいずれかが、健常個体の血液で見られる対応する免疫性分析物の濃度の中央値未満である場合、肝臓障害から生存する確度が高いとして患者を特定することができる。また、試料から得られた血清アルブミン濃度の値が２．８ｇ／ｄＬ以下である場合、および試料からの１種以上の免疫性分析物の濃度のすべてが、健常個体の血液で見られる対応する免疫性分析物の濃度の中央値未満である場合、肝臓障害による死亡の確度が高いとして患者を特定することができる。
【００３７】
本発明のある種の実施形態では、目的の免疫性分析物は、ＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳ、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＦＧＦ  ｂを含む。例えば、ＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳ、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＦＧＦ  ｂのそれぞれの濃度の値を得ることができ（例えば、測定またはアッセイする）、ＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳ、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＦＧＦ  ｂのそれぞれについて健常個体（例えば、健常な肝臓）を代表する所与の中央濃度値と比較することができる。すなわち、血液試料から測定したＩＬ−１７の濃度の値を、健常個体を代表するＩＬ−１７の所与の中央濃度値と比較する、血液試料から測定したＲＡＮＴＥＳの濃度の値を、健常個体を代表するＲＡＮＴＥＳの所与の中央濃度値と比較する、などである。ある種の実施形態では、濃度の値が患者の血液試料から得られる最適な免疫性分析物は、ＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳ、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＦＧＦ  ｂである。
【００３８】
本発明のある種の実施形態では、目的の免疫性分析物は、ＩＬ−１７、ＴＮＦａ、ＲＡＮＴＥＳおよびＦＧＦ  ｂを含む。例えば、ＩＬ−１７、ＴＮＦａ、ＲＡＮＴＥＳおよびＦＧＦ  ｂのそれぞれの濃度の値を得ることができ（例えば、測定またはアッセイする）、ＩＬ−１７、ＴＮＦａ、ＲＡＮＴＥＳおよびＦＧＦ  ｂのそれぞれについて健常個体（例えば、健常な肝臓）を代表する所与の中央濃度値と比較することができる。すなわち、血液試料から測定したＩＬ−１７の濃度の値を、健常個体を代表するＩＬ−１７の所与の中央濃度値と比較する、血液試料からＰＧＦ  ｂの測定した濃度の値を、健常個体を代表するＰＧＦ  ｂの所与の中央濃度値と比較する、などである。ある種の実施形態では、濃度の値が患者の血液試料から得られる最適な免疫性分析物は、ＩＬ−１７、ＴＮＦａ、ＲＡＮＴＥＳおよびＦＧＦ  ｂである。
【００３９】
本発明のある種の実施形態では、目的の免疫性分析物は、ＩＬ−１７、ＰＤＧＦ  ｂｂ、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＬ−４を含む。例えば、ＩＬ−１７、ＰＤＧＦ  ｂｂ、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＬ−４のそれぞれの濃度の値を得ることができ（例えば、測定またはアッセイする）、ＩＬ−１７、ＰＤＧＦ  ｂｂ、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＬ−４のそれぞれに対する健常個体（例えば、健常な肝臓）を代表する所与の中央濃度値と比較することができる。すなわち、血液試料から測定したＩＬ−１７の濃度の値を、健常個体を代表するＩＬ−１７の所与の中央濃度値と比較する、血液試料から測定したＩＬ−４の濃度の値を、健常個体を代表するＩＬ−４の所与の中央濃度値と比較する、などである。ある種の実施形態では、濃度の値が患者の血液試料から得られる最適な免疫性分析物は、ＩＬ−１７、ＰＤＧＦ  ｂｂ、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＬ−４である。
【００４０】
本発明のある種の実施形態では、目的の免疫性分析物は、ＩＬ−１７、ＰＤＧＦ  ｂｂ、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＬ−１３を含む。例えば、ＩＬ−１７、ＰＤＧＦ  ｂｂ、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＬ−１３のそれぞれの濃度の値を得ることができ（例えば、測定またはアッセイする）、ＩＬ−１７、ＰＤＧＦ  ｂｂ、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＬ−１３のそれぞれに対する健常個体（例えば、健常な肝臓）を代表する所与の中央濃度値と比較することができる。すなわち、血液試料から測定したＩＬ−１７の濃度の値を、健常個体を代表するＩＬ−１７の所与の中央濃度値と比較する、血液試料から測定したＩＬ−１３の濃度の値を、健常個体を代表するＩＬ−１３の所与の中央濃度値と比較する、などである。ある種の実施形態では、濃度の値が患者の血液試料から得られる最適な免疫性分析物は、ＩＬ−１７、ＰＤＧＦ  ｂｂ、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＬ−１３である。
【００４１】
本発明のある種の好ましい実施形態では、目的の免疫性分析物は、ＩＬ−１７、ＰＤＧＦ  ｂｂ、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＬ−９を含む。例えば、ＩＬ−１７、ＰＤＧＦ  ｂｂ、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＬ−９のそれぞれの濃度の値を得ることができ（例えば、測定またはアッセイする）、ＩＬ−１７、ＰＤＧＦ  ｂｂ、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＬ−９のそれぞれに対する健常個体（例えば、健常な肝臓）を代表する所与の中央濃度値と比較することができる。すなわち、血液試料から測定したＩＬ−１７の濃度の値を、健常個体を代表するＩＬ−１７の所与の中央濃度値と比較する、血液試料からＩＬ−９の測定した濃度の値を、健常個体を代表するＩＬ−９の所与の中央濃度値と比較するなどである。ある種の実施形態では、濃度の値が患者の血液試料から得られる最適な免疫性分析物は、ＩＬ−１７、ＰＤＧＦ  ｂｂ、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＬ−９である。
【００４２】
別の一実施形態では、目的の免疫性分析物は、ＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−９およびＩＬ−６を含む。例えば、ＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−９およびＩＬ−６のそれぞれの濃度の値を得ることができ（例えば、測定またはアッセイする）、ＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−９およびＩＬ−６のそれぞれに対する健常個体（例えば、健常な肝臓）を代表する所与の中央濃度値と比較することができる。すなわち、血液試料から測定したＩＬ−１７の濃度の値を、健常個体を代表するＩＬ−１７の所与の中央濃度値と比較する、血液試料から測定したＩＬ−６の濃度の値を、健常個体を代表するＩＬ−６の所与の中央濃度値と比較する、などである。ある種の実施形態では、濃度の値が患者の血液試料から得られる唯一の免疫性分析物は、ＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−９およびＩＬ−６である。目的の免疫性分析物がＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−９およびＩＬ−６を含むまたはそれらからなるこれらの特定の実施形態では、（ｉ）患者の血液試料中のＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−９の測定した濃度の値が健常個体を代表する中央値より低い、（ｉｉ）患者の血液試料におけるＩＬ−６の測定した濃度の値が健常個体を代表する中央値より高く、患者の血液試料における血清アルブミンの測定値があらかじめ決定された範囲（例えば、２〜５ｇ／ｄＬ、２〜４ｇ／ｄＬ、２〜３ｇ／ｄＬもしくは２．５〜３．０ｇ／ｄＬ）未満またはあらかじめ決定されたカットオフ値（例えば、３．５ｇ／ｄＬ、３．２ｇ／ｄＬもしくは２．８ｇ／ｄＬ）以下である場合に、死亡の確度が高いという特定が、予測または特定される。
【００４３】
ある種の実施形態によれば、方法は、診断（すなわち特定）を個体または対象に通知する、および／または適切な療法を処方する、さらなるステップを含むことができる。命に関わらない肝臓障害を有するとして特定された個体または対象については、適切な療法は、支援的ケア、例えば、栄養摂取の向上ならびに水分補給および電解質の維持を含むことができる。命に関わる肝臓障害を有するとして特定された個体または対象については、適切な療法は、薬物治療（例えば、プレドニゾンのようなコルチコステロイド）を処方すること、および／または肝移植法を推奨することを含むことができる。本発明のある種の実施形態による方法は、肝移植が実施されない限り、肝臓障害による死亡の確度が高い（例えば、肝臓障害の発症から６か月以内に死亡する確率が９０％を超える）として特定の患者を特定した後に、患者に対して肝移植を実施するステップをさらに含むことができる。
【００４４】
本発明のある種の実施形態による方法は、どの患者（例えばヒトまたは他の哺乳動物）が肝臓障害（例えば、ＤＩＬＩ）の発症から６か月以内の死亡の確度が高いかを正確に予測または同定することができる。例えば、本発明の実施形態による方法は、患者に対して肝臓障害による死亡の確度が高いことを特定または予測することができ、死亡の確度は、約８０％〜１００％（例えば、８５％〜９９％、９０％〜９９％または９５％〜９９％）である。すなわち、患者に対する肝臓障害による死亡の「高い確度」の判定または特定は、約８０％〜１００％（例えば、８５％〜９９％、９０％〜９９％または９５〜９９％）の精度を含み得る。
【００４５】
同様に、本発明のある種の実施形態による方法は、どの患者（例えばヒトまたは他の哺乳動物）が肝臓障害の発症から６か月を超えて生存する確度が高いかを正確に予測または特定することができる。例えば、本発明の実施形態による方法は、患者に対して生存の確度が高いことを特定または予測することができ、生存の確度は、約８０％〜１００％（例えば、８５％〜９９％、９０％〜９９％または９５％〜９９％）の、肝臓障害の発症から６か月を超える生存の可能性である。すなわち、患者に対する肝臓障害からの生存の「高い確度」の判定または特定は、約８０％〜１００％（例えば、８５％〜９９％、９０％〜９９％または９５〜９９％）の精度を有し得る。
【００４６】
図１は、本発明のある種の実施形態による方法を示す。図１に示すように、最初のステップは、患者から血液試料を得るステップ（１）を含むことができる。血液試料を１つまたは複数の解析技法にかけて、目的の免疫性分析物のそれぞれの濃度を測定する（１０）および血清アルブミン濃度を測定する（１５）ことができる。ステップ１２では、目的の免疫性分析物（例えば、ＩＬ−１７、ＰＤＧＦ  ｂｂ、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＬ−９）のそれぞれの測定した濃度を、これらの特定の分析物に対する中央値と比較することができる。健常個体を代表する免疫性分析物に対する中央値は、以下の表１に提供される値を含むことができる。
【００４７】
【表１】
2016500825.tif 000003
【００４８】
ステップ１７では、（ステップ１５からの）測定した血清アルブミン濃度を解析して、測定濃度が、２．８ｇ／ｄＬのあらかじめ決定されたカットオフ以下かどうかを判定することができる（これらの特定の実施形態による）。ステップ３０は、試料中の測定した血清アルブミン濃度が、２．８ｇ／ｄＬのあらかじめ決定されたカットオフ（これらのある種の実施形態による）以下であるか、および目的の免疫性分析物の濃度のそれぞれが（例えば、健常な肝臓を有する）健常個体を代表する対応する中央値より低いかどうかを判定することを含む。血液試料からの測定濃度レベルが両方の要件を満たす判定が行われる場合、次いで、好ましくは判定の６か月以内での、または（肝臓障害が確認できるもしくは既知の場合）肝臓障害発症の６か月以内での肝移植を推奨することを含むステップ４０を実施することができる。測定濃度レベルがいずれかの（または両方の）要件を満たさない場合は、次いで、次の６か月以内にまたは（肝疾患が既知もしくは確認できる場合）肝疾患の発症から６か月以内に患者は死亡する危険性がないと結論づけることを含むステップ５０を実施することができる。ステップ５０は、肝移植に対する患者の優先順位を下げるステップをさらに含むことができる。
【００４９】
図２は、本発明によるある種の好ましい実施形態を示す。そのような実施形態では、患者から血液試料を得ることを含む最初のステップ１００を実施する。血液試料を、以下の４つの特定の免疫性分析物、すなわちＩＬ−１７、ＰＤＧＦ  ｂｂ、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＬ−９を測定することを含むステップ２００にかける。さらに、試料中の血清アルブミン濃度を得る。続いて、測定した免疫性分析物の濃度を各免疫性分析物に対する参照濃度中央値レベルと比較することを含むステップ３００を実施する。図２に示すこれらの特定の実施形態では、所与の免疫性分析物に対する測定濃度が参照濃度中央値未満であるかどうかに応じて、測定した免疫性分析物のそれぞれに「中央値未満」（「ＢＭ」）の値または「１」もしくは「０」のいずれかを割り当てる。ステップ４００、５００、６００および７００は、測定した目的の免疫性分析物のそれぞれにＢＭを割り当てることを含む（すなわち、ＩＬ−１７についてステップ４００、ＩＬ−９についてステップ５００、ＰＤＦＧＦ  ｂｂについてステップ６００およびＲＡＮＴＥＳについてステップ７００）。目的の各免疫性分析物について一旦ＢＭが割り当てられると、すべてのＢＭ値を合計することによって「中央値未満の数（ＮＢＭ）」を計算するステップ８００を実施する。図２に示される実施形態については、４つの免疫性分析物のみを測定したので、最大ＮＢＭは４である。続いて、計算したＮＢＭおよび測定した血清アルブミン濃度に基づいて、患者が生存するか生存しないかを判定または予測することを含むステップ９００を実施する。例えば、（これらの特定の実施形態について）測定した血清アルブミン濃度が、２．８ｇ／ｄＬを超えるまたはＮＢＭが４未満である場合は、患者は肝臓障害発症から少なくとも６か月間、肝臓障害から生き延びると予想される。しかし、測定した血清アルブミン濃度が、２．８ｇ／ｄＬを超えず、ＮＢＭが４に等しい場合は、患者は肝臓障害から生き延びるとは期待されず、肝移植がない限り、その発症から６か月以内に死亡すると予想される。
【００５０】
別の態様では、本発明は、肝移植を受けることについて、第１の患者および第２の患者を含めた複数の患者に優先順位をつけるための方法を提供する。その際、肝移植が全く必要でない可能性がある患者、または少なくとも肝移植の緊急の必要性が少ない患者よりも、より早急に肝移植の必要がある患者を優先することができる。本発明のある種の実施形態によれば、それぞれの血液試料を、肝臓障害に罹患している（または罹患していると考えられる）複数の個体から入手する。各試料について、血清アルブミンの濃度値を得（例えば、適切なアッセイで測定する）、ＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＦＧＦ  ｂ、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＩＬ−６からなる群から選択される１種以上の免疫性分析物に対するそれぞれの濃度値を得る（例えばアッセイする）。第１の個体から得られた免疫性分析物濃度の値を、健常個体からの対応する免疫性分析物の濃度の中央値と比較して、試料から測定した１種以上の免疫性分析物の濃度のいずれかが、健常個体からの対応する免疫性分析物の濃度の中央値未満であるかどうかを判定することができる。同様に、第２の個体から得られた免疫性分析物の濃度の値を、健常個体からの対応する免疫性分析物の濃度の中央値と比較して、試料から測定した１種以上の免疫性分析物の濃度のいずれかが、健常個体からの対応する免疫性分析物の濃度の中央値未満であるかどうかを判定することができる。次に、以下の１つを判定するためのステップを実施する。（ｉ）第１の個体の試料が、あらかじめ決定されたカットオフ値（例えば２．８ｇ／ｄＬ）を超える血清アルブミン濃度の値を有する、または（ｉｉ）第１の個体の試料からの１種以上の免疫性分析物の濃度のいずれかが、健常個体からの対応する免疫性分析物の濃度の中央値未満である。第２の個体に関しては、以下の１つを判定するためのステップを実施する。（ｉ）第２の個体の試料が、あらかじめ決定されたカットオフ値（例えば２．８ｇ／ｄＬ）以下である血清アルブミン濃度の値を有する、および（ｉｉ）第２の個体の試料からの１種以上の免疫性分析物の濃度のすべてが、健常個体からの対応する免疫性分析物の濃度の中央値未満である。本発明のある種の実施形態によれば、肝臓障害が原因で死亡する危険性が第１の個体よりも高いとして、第２の個体を同定するステップを実施することができる。したがってある種の実施形態では、第１の個体に肝移植を実施する前に、第２の個体に肝移植を実施することを推奨するさらなるステップを行うことができる。その際、肝移植を受けることについて、第２の個体は、第１の個体よりも優先される。好ましくは、肝移植法は、（既知または確認できる場合は）肝臓障害の発症から、または肝臓障害が原因で死亡する危険性が高いとして第２の個体を特定した日から６か月以内に、第２の個体について実施する。
【００５１】
本発明のある種の実施形態による、肝移植を受けることについて複数の患者に優先順位をつける方法は、本明細書に開示される免疫性分析物の任意の特定の群の解析を含むことができる。例として、各試料について、先に述べたように、ＩＬ−９、ＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳおよびＰＤＧＦ−ｂｂ；ＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳ、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＦＧＦ  ｂ；ＩＬ−１７、ＴＮＦα、ＲＡＮＴＥＳおよびＦＧＦ  ｂ；ＩＬ−１７、ＰＤＧＦ  ｂｂ、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＬ−４；ならびにＩＬ−１７、ＰＤＧＦ  ｂｂ、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＬ−１３の濃度の値が利用可能である。
【００５２】
さらに別の態様では、本発明は、肝臓障害を特徴づけるために使用することができるキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、臨床試験に参加する対象において肝臓障害を評価するために使用される。他の実施形態では、キットは、（肝移植がない場合に）肝臓障害から患者が生存するか死亡するかを予測または特定するのに使用される。これらのキットは、肝移植を受けることについて複数の患者の優先順位をつけることを支援することもできる。本発明のある種の実施形態によれば、キットは、（ｉ）ＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＦＧＦ  ｂ、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＩＬ−６からなる群から選択される免疫性分析物を検出および／または定量化するように構成された、少なくとも１つの抗体に基づいたアッセイ、ならびに（ｉｉ）本明細書に開示される方法のいずれか（例えば、範囲またはカットオフ値（例えば２．８ｇ／ｄＬ）と比較した場合の、個体からの血液試料中の血清アルブミン濃度、および健常な肝臓を有する個体を代表する中央濃度値と比較した場合の、血液試料中の測定した免疫性分析物の濃度の値に基づいて、肝臓障害に罹患している個体の生存可能性を特定することを行うこと）を実行するための指示書を含むことができる。特定の好ましい実施形態では、少なくとも１つの抗体に基づいたアッセイは、ＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＦＧＦ  ｂ、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＩＬ−６からなる群から選択される免疫性分析物を同時に検出および／または定量化するように構成されたマルチプレックスアッセイを含む。
【００５３】
本発明のある種の実施形態によるキットは、本明細書に開示される免疫性分析物の任意の特定の群の免疫性分析物を検出および／または定量化するように構成される、１つまたは複数の抗体に基づいたアッセイを含むことができる。例として、各試料について、１つまたは複数の抗体に基づいたアッセイを、免疫性分析物の次の特定の群のいずれかを特に検出および／または定量化するように構成することができる。ＩＬ−９、ＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳおよびＰＤＧＦ−ｂｂ；ＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳ、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＦＧＦ  ｂ；ＩＬ−１７、ＴＮＦα、ＲＡＮＴＥＳおよびＦＧＦ  ｂ；ＩＬ−１７、ＰＤＧＦ  ｂｂ、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＬ−４；ならびにＩＬ−１７、ＰＤＧＦ  ｂｂ、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＬ−１３。
【００５４】
特定の好ましい実施形態では、少なくとも１つの抗体に基づいたアッセイは、ＩＬ−９、ＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳおよびＰＤＧＦ−ｂｂからなる群から選択される免疫性分析物を検出および定量化する。より好ましくは、少なくとも１つの抗体に基づいたアッセイは、ＩＬ−９、ＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳおよびＰＤＧＦ−ｂｂのそれぞれを検出および定量化する。特定の好ましい実施形態では、少なくとも１つの抗体に基づいたアッセイは、ＩＬ−９、ＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳおよびＰＤＧＦ−ｂｂのそれぞれを同時に検出および／または定量化するように構成されるマルチプレックスアッセイを含む。
【００５５】
本発明のある種の実施形態によるキットは、健常な肝臓を有する個体における目的の各免疫性分析物の濃度の中央値を収載する表を含むこともできる。例えば、指示書は表１に提供される値のいずれかを含むことができる。
【実施例】
【００５６】
本発明のある種の実施形態を、以下の研究によってさらに例示するが、これは、本発明を限定するものとして決して解釈すべきではない。すなわち、記載される特定の方法および結果は、好ましい実施形態を含めた本発明のある種の実施形態の例示であり、本発明を限定するものではない。
【００５７】
よく特徴づけられ、注意深く研究された急性ＤＩＬＩを患っている対象の血清において２７個の免疫性分析物のレベルを測定し、次いで、プロスペクティブ（前向き）米国薬物性肝障害ネットワークにおいて少なくとも１年間その患者を追跡する研究を行った。このネットワークおよびその主要な方法は、以前に記載されており（１０、２５、２６）、登録された最初の３００人の対象における発見が記載されている（１０）。本研究では、急性ＤＩＬＩを有する７８人の対象からの結果を、血清プロテオミックプロファイルが最近報告された（２７）４０人の正常な対照（例えば、健常な肝臓を有するボランティアの血液ドナー）のものと比較した。以下に述べるように、選定性および適応性の細胞応答における著しい変化が観察され、本発明のある種の実施形態により、４つの血清免疫性分析物（インターロイキン９、インターロイキン１７、血小板由来増殖因子ｂｂおよびＲＡＮＴＥＳ）ならびに血清アルブミンレベルに対する初期急性症状における結果に基づいて、転帰を早期予測するための新しい手段が開発された。
【００５８】
［研究対象］
薬物性肝障害ネットワーク（ＤＩＬＩＮ）のプロスペクティブ・スタディ（前向き研究）の一部としてＤＩＬＩを有する対象から血清試料を収集し、ここでは、疑わしいＤＩＬＩを有する対象を登録し、詳細な臨床データを収集した（２５）。本研究で研究したＤＩＬＩを有する対象は、Ｂｅｌｌら（２７）によって最近記載されたように、２００４年１２月から２０１０年７月の間の登録された、すべて急性ＤＩＬＩ（例えば、登録より２週間前以内に発症）を有する７８人の対象であった。臨床データはＤＩＬＩＮ因果関係委員会によって精査され、ここでこのケースが本物のＤＩＬＩとして認められるかどうかに関して最終的な判定が行われ、関与する薬物のそれぞれにＤＩＬＩを引き起こした確率を割り当てた（２６）。肝臓損傷のタイプおよびＲ値は記載された通りであった（１０、２７）。可能な限り、少なくとも６か月間対象を追跡して、慢性ＤＩＬＩの発生の回復またはエビデンスがあるかどうかを評価した。血液試料を収集し、ＤＩＬＩＮ中央試料貯蔵所に送って、処理し、−８０℃で保管した。健常対照（ボランティア血液ドナー）からの血清は、血液バンクから得た（２７）。
【００５９】
［組み入れ／除外基準］
以下の判定基準のいずれかによって証明されるような記録化された臨床的に有意なＤＩＬＩを有する、２歳を超える大人および子供をＤＩＬＩＮ前向き研究に含めた。１）＞２．５ｍｇ／ｄＬの黄疸または血清ビリルビン、およびＡＬＴ、ＡＳＴまたはアルカリホスファターゼのいずれかの上昇、２）＜２．５ｍｇ／ｄＬの黄疸および血清ビリルビンがないが、血清ＡＬＴもしくはＡＳＴの２つ以上の上昇（＞５×ＵＬＮ）または血清アルカリホスファターゼの上昇がある（＞２×ＵＬＮ）、ならびに、３）既知の既存の肝疾患を有する人において、＞５×ベースライン値の血清ＡＬＴもしくはＡＳＴの上昇または＞２×ベースライン値の血清アルカリホスファターゼの上昇。また、以下に基づいて対象を除外した。１）急性肝障害の他の既知の原因、例えば急性胆管炎、急性ウイルス性肝炎または自己免疫性肝疾患、２）アセトアミノフェン肝毒性、および、３）ＤＩＬＩ発症より前の肝移植、４）インフォームドコンセントを与えなかったこと、または症例確認の手順に従うことができないもしくは従う気がないこと。
【００６０】
［Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘアッセイによる免疫性分析物のプロファイリング］
血清中の免疫性分析物の濃度を、ヒト２７−ｐｌｅｘアッセイ［１４種のサイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α）；７種のケモカイン（エオタキシン、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ）；および６種の増殖因子（ＩＬ−７、塩基性ＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＶＥＧＦ）］を使用して測定し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）から提供されたＢｉｏ−Ｐｌｅｘサスペンションアレイシステムを用いて測定した。
【００６１】
製造者の指示書に従って、（発症時および６か月の経過観察時における）ＤＩＬＩ対象および健常対照の血清を処理し、解析した。簡単に述べると、試料を試料希釈剤中に１：４（ｖ：ｖ）に希釈し、捕捉抗体結合磁気ビーズと共に３０分間（室温、３００ｒｐｍの撹拌）インキュベートした。Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｐｒｏ洗浄ステーション中で３回洗浄してから、試料を、ビオチン標識した検出抗体と共に３０分間暗所（室温、３００ｒｐｍの撹拌）でインキュベートした。ストレプトアビジン−フィコエリトリンを添加して、各捕獲分析物を検出し、ＢｉｏＰｌｅｘアレイリーダーを使用して定量化した。分析物の濃度を、このアッセイと共に提供される組換え体標準物質に由来する検量線を使用して、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアを用いて計算した。
【００６２】
［ＤＩＬＩ対象のサイトカインヒートマップ］
ＤＩＬＩ対象間の免疫応答パターンを確立および比較するのに使用するサイトカインヒートマップを作成するために、図３に示すように、それらの発現および主としてそれらが関係する免疫プロセスを本来引き起こす、主要な既知の転写因子に基づいて、サイトカインを以下のようにグループ化した。先天免疫（ＮＦκＢ依存的）と関係があるサイトカイン：ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα；適応性細胞免疫（Ｔ−ｂｅｔまたはＲｏＲγｔ依存的）と関係があるサイトカイン：ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７；適応性体液免疫（Ｇａｔａ３またはＩＲＦ−４依存的）と関係があるサイトカイン：ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、および免疫抑制／炎症の消散と関係があるサイトカイン：ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１０（２９〜３３）。図３は、免疫応答の単純化モデルを示す。図３に示すように、免疫性の刺激は、ＮＦκＢの核移行、および損傷組織による早期／先天性のサイトカイン産生（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α）を引き起こす。この早期の炎症状態が持続する場合は、その状態は、細胞性（Ｔ−ｂｅｔ依存的／ＴＨ１型：ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−１５）または体液性（Ｇａｔａ３依存的／ＴＨ２型：ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３）応答のいずれかを支持する適応免疫プロセスを活性化する。この炎症状態は、抗炎症性プロセス（ＩＬ−１０、ＩＬ−１ｒａ）を引き起こすことによって、最終的にそれ自体を消散し得る。炎症状態が消散されない場合は、先天性および抗炎症性プロセスが相乗的に作用して、ＲｏＲγｔ依存的／ＴＨ１７型：ＩＬ−１７またはＩＲＦ４依存的ＴＨ９型ＩＬ−９適応免疫へ進む。
【００６３】
血清免疫性分析物の濃度に対する正常範囲は、４０人の健常対照から得られた測定値に基づき、平均±１標準偏差（ＳＤ）として記録した。健常対象の平均より高いまたは低い、ＤＩＬＩ対象の血清における濃度１ＳＤを、異常であると定義した。発症時のＤＩＬＩコホート間における異常なサイトカイン発現の共通の反復性パターンに基づいて、４つの主な免疫プロファイルを特定した。１）少なくとも１つの先天性のおよび１つまたは複数の適応性の細胞性および体液性サイトカイン濃度が正常より高いそれらのプロファイルについて「混合免疫性ＤＩＬＩ」、２）１つまたは複数の先天性サイトカイン濃度が正常より高く、正常より高い適応性サイトカインがないプロファイルについて「先天免疫性ＤＩＬＩ」、３）１つまたは複数の適応性の細胞性または体液性サイトカイン濃度が正常より高いプロファイルについて「適応免疫性ＤＩＬＩ」、ならびに４）１つのみ（またはなし）の血清が異常なサイトカイン濃度であるプロファイルについて「非免疫性ＤＩＬＩ」。上記の判定基準のいずれかに一致しない免疫プロファイルは、「未分類のＤＩＬＩ」としてラベルした。
【００６４】
［統計方法］
平均および標準偏差を含めた記述統計、または数値およびパーセンテージを計算した。間隔尺度で測定したデータについては、スチューデントのｔ検定または分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用した。データが正常に分布しなかった場合は、ウィルコクソン順位和検定またはクラスカル・ウォリスの検定を用いた。対応ｔ検定またはウィルコクソン符号順位検定を使用して、ベースライン値と６か月時点での値を比較した。名目データについては、カイ二乗またはフィッシャーの正確確率検定を用いた。スピアマンの相関を使用して、間隔尺度で測定した変数間の直線関係について検定した。特に明記しない限り、０．０５未満の両側Ｐ値を統計的に有意であるとみなした。すべての解析について、ＳＡＳ（登録商標）バージョン９．２を使用した。
【００６５】
以下のモデリングプロセスを使用して、早期死亡（ＤＩＬＩ発症の６か月以内）の予測のために、２７個の免疫性分析物と２つの臨床検査結果（血清アルブミンまたは総ビリルビン）の間の変数を選択した。サンプルサイズおよび比較的多数の変数のため、目標は、早期死亡を高度に予測する少数の変数を有する安定モデル（３４）を見つけることであった。第１ステップでは、単変量解析を行って、ウィルコクソン順位和検定を使用してＤＩＬＩ発症の６か月以内に死亡したものと生存したものを比較した。高度な選択性にするために、ｐ＜０．０１レベルで統計的に有意な変数のみを、第２のステップで考慮した。以下の３群のそれぞれの中の免疫性分析物が相関する可能性が高いことが期待された。すなわち、サイトカイン、ケモカインおよび増殖因子である。したがって第２のステップでは、各群内のペアワイズ相関を検討した。早期死亡と関連が最も高い（Ｐ値が最低の）免疫性分析物を用いて開始した。この免疫性分析物と有意に相関しない群内の免疫性分析物のみを、さらに考慮するために保持した。残りの免疫性分析物のペアワイズ相関が有意であった場合は、早期死亡と関連が最も低い免疫性分析物をペアから除外した。第３ステップでは、発現のヒートマッププロファイルに基づいて、十分にモジュレートされていない群内の免疫性分析物を除外した。最終ステップとして、残りの免疫性分析物と臨床検査値の間のペアワイズ相関を検討することによって、最終的な変数セットを得た。ペアワイズ相関が有意であったならば、早期死亡と関連が低い変数をペアから除外した。
【００６６】
一旦最終的な変数セットが選択されると、各変数について曲線下面積（ＡＵＣ）を推定して、その潜在的な予測的および診断的値を調べた。これらの変数のすべてを用いるロジスティック回帰モデルを適合させて、予測因子としての変数の線形結合に適合させたモデルに基づいて、ＡＵＣを推定した。免疫性分析物の値が歪められる傾向があり得るので、これらの変数の線形結合は、早期死亡に対する最良の予測因子でなくてもよい。したがって、次のバイナリー変数を予測因子として作成した。免疫性分析物を観察された中央値で二分し、臨床検査値を確立された臨床的カットポイントに基づいて二分した。一方がバイナリー免疫性分析物のみに基づき、他方は、バイナリー免疫性分析物と臨床検査データの両方に基づく、２つの略式のバイナリー変数を作成した。免疫性分析物と臨床検査データの両方に基づくバイナリー変数は、早期死亡に対して最高の予測能力を有するはずである。このバイナリー変数は、変数（免疫性分析物および臨床検査値）の値がすべて関連性の方向に基づいて早期死亡を予測したバイナリーカテゴリーに落ちる場合、１の値を有し、そうでなければ０の値を有する。早期死亡に対するこのバイナリー変数の予測能力を、陽性的中率（ＰＰＶ）、陰性適中率（ＮＰＶ）および精度（正確な予測のパーセント）によって評価した。比較のために、感度および特異性も同様に推定した。
【００６７】
＜結果＞
［研究コホートの特徴］
既に述べたように、図４に示すように、合計で７８人のＤＩＬＩおよび４０人の健常対象を研究に含めた（２７）。図４は、７８人のＤＩＬＩ対象および４０人の健常対照（ボランティア血液ドナー）からの血清を研究で解析したことを図表で示す。急性ＤＩＬＩを有するそうした患者の中で、１０人がＤＩＬＩ発症の６か月以内に死亡し、３７人が６か月の経過観察通院に戻り、これらの人々の中の３２人から血清試料を得た。
【００６８】
上記のように、３７人の対象が６か月の経過観察を完了し、これらの対象の内、３２人のＤＩＬＩ患者について経過観察の血清試料を得た（様々な理由のため、５人の患者が６か月での血清試料を提供しなかった）。１０人の対象（１２．８％）がＤＩＬＩ発症の６か月以内に死亡したことが分かり、一方、ＤＩＬＩを発症してから３１５日後に、非ＤＩＬＩが原因で１人が死亡した。肝移植を受けた人はいなかった。６か月の経過観察通院を完了しなかった、生存している３１人の対象に対する理由の評価により、それらの大部分は、仕事または長すぎる旅行行程とスケジュールの調整がつかないことが原因であることがわかった。
【００６９】
研究に含まれるすべての対象の詳細な人口統計および肝臓化学情報を以下の表２に示す。
【００７０】
【表２】
2016500825.tif 000004
【００７１】
簡単に述べると、ＤＩＬＩコホートの平均年齢は４８（±１７．９）歳であった。性別分布は５５％が女性であり、患者の大部分（７３％）がコーカサス人であった。７８人のうちの６人（８％）のＤＩＬＩ対象は既存の肝疾患を有しており、２５人（３２％）は潜在的な糖尿病を呈していた。表３に示すように、ＤＩＬＩ対象の５９％、２２％、１５％および４％がそれぞれ、肝細胞性、胆汁うっ滞性、混合性または不明な、肝臓損傷のパターンを示した。これらのパーセンテージは、ＤＩＬＩコホート全体のものと類似している（１０）。
【００７２】
【表３】
2016500825.tif 000005
【００７３】
［縦モード解析：免疫性分析物およびＤＩＬＩの経過］
ＤＩＬＩの実験モデルおよびレトロスペクティブ（後向き）臨床研究（１５〜１８、２０〜２４）によって、急性肝障害と関係がある免疫活性化機構が仮定された。障害のパターンおよび重症度にかかわらず、ＤＩＬＩと関係がある免疫成分を特徴づけるために、ＤＩＬＩ発症（ｎ＝７８）、６か月の経過観察（ｎ＝３２）および健常対照（ｎ＝４０）の間で、免疫性分析物の血清レベルを比較した。３つの群は、高い不均一性を示した。２７個の免疫性分析物のうちの２６個について、結果は正常に分布されなかった。
【００７４】
ウィルコクソン順位和検定を実施して、以下の表３に示すように、どのサイトカイン、ケモカインまたは増殖因子が、ＤＩＬＩで変化しているかを評価した。１０個の免疫性分析物の血清レベルの分布は、健常対照、発症時でのＤＩＬＩと６か月の経過観察時点でのＤＩＬＩの間で有意に異なっていた。これらの１０個は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＦＮ−γ、エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＭＣＰ−１であった。さらに、４つの免疫性分析物の血清レベルが対照と発症時でのＤＩＬＩの間で異なって分布し（ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＰ−１０、塩基性ＦＧＦ）、４つ（ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＶＥＧＦ、ＭＩＰ−１β）が対照と６か月の経過観察時点でのＤＩＬＩの間で異なって分布した（表４）。６か月の経過観察試料を有する対象（ｎ＝３２）について、ベースラインと経過観察試料の差を検討した。８つの免疫性分析物（ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＩＦＮγ、塩基性ＦＧＦ、ＭＩＰ−１β、ＧＭ−ＣＳＦおよびＶＥＧＦ）について、有意な変化が観察された（表４）。全体的に見て、研究した２７個の免疫性分析物の間で、１９個が、健常対照と発症時および／または６か月の経過観察時点でのＤＩＬＩの間に有意な差を示した。
【００７５】
【表４】
2016500825.tif 000006
【００７６】
［ＤＩＬＩ対象の免疫性分析物パターン（複数可）の比較解析］
対照群、ＤＩＬＩ発症群およびＤＩＬＩ６か月群において観察された不均一性をより良く理解するためのフレームワーク提供するために、個々のＤＩＬＩ対象の免疫プロファイルを評価および比較した。これらの免疫プロファイルは、サイトカインの血清レベルに基づいて、および既知の免疫成分を考慮して確立した。個々の免疫性分析物の機能および起源は判定することができるが、サイトカインは、ネットワーク（相乗作用、拮抗作用）において実際に機能する。例えば、免疫プロセスの単純化モデル（図３）では、免疫性刺激（例えば、薬物または他の化学物質に起因する細胞損傷）は、ＮＦκＢの核移行、および損傷組織による早期／先天性のサイトカイン産生（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α）を引き起こす。この早期の炎症状態が持続する場合、その状態は、細胞性（Ｔ−ｂｅｔ依存的／ＴＨ１型：ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−１５；ＲｏＲγｔ依存的／ＴＨ１７型：ＩＬ−１７）または体液性（Ｇａｔａ３依存的／ＴＨ２型：ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３；ＩＲＦ４依存的／ＴＨ９型：ＩＬ−９）応答のいずれかを支持する適応免疫プロセスを活性化する（２９、３０、３３）。通常、免疫応答は、最終的に、抗炎症性プロセス（ＩＬ−１０、ＩＬ−１ｒａ）を引き起こすことによって、それ自体を消散する（３２）。
【００７７】
各免疫性分析物を「正常な」健常対照の値と比較することによって、ＤＩＬＩ対象に対する血清サイトカインプロファイルを判定した。健常対照の平均値より高いまたは低い１ＳＤを超えるサイトカイン測定値を「異常」とみなした。図５に示すように、このアプローチを使用すると、疾患発症時でのＤＩＬＩ対象間において、４つの異なる免疫プロファイルが明らかになった（ｎ＝７８）。１９人の対象（２４．３％）は、１つまたは複数の早期／先天性サイトカインが正常より高い「先天免疫」パターンを示した。２１人の患者（２６．９％）は、少なくとも１つの適応性サイトカインが正常より高い「適応免疫」免疫パターンを示した。４人の対象は、「混合免疫性ＤＩＬＩ」パターン（早期と先天性の両方のサイトカインが正常より高い）を有しており、８人が「非免疫性ＤＩＬＩ」プロファイル（１以下の異常なサイトカインレベル）を有していた。最終的に、２６人の対象（３３．３％）は分類されなかった（２以上の異常なサイトカインレベル）。注目すべきことに、「適応免疫」サイトカインプロファイルを有する２１人の対象の間で、典型的なＴＨ１およびＴＨ２適応応答はまれであった。図５に示すように、むしろＤＩＬＩ発症時では、ＴＨ１７（ＤＩＬＩコホート全体の１５．４％）およびＴＨ９（ＤＩＬＩコホート全体の６．４％）の増大が、この群において優勢であった。
【００７８】
さらに、図５は、ＤＩＬＩ発症に近接して（発症の１４日以内）得られた血清中の個々のサイトカイン濃度であって、各患者について記録し、健常の「正常の」平均±ＳＤ値と比較した濃度を示す。ＤＩＬＩ発症時での異常な血清サイトカイン濃度は、正常な対照に対する平均のものよりも高い（赤）または低い（青）値であると定義した。発症時のＤＩＬＩ対象のプロファイルは、パターンの観察された類似性および分析物の生理的役割に関する知識に基づいて定義した。
【００７９】
同様の方法体系を使用して、６か月の経過観察試料およびデータが利用可能な３２人のＤＩＬＩ対象を比較すると、図６に示すように、１２人（３７．５％）が正常または正常な血清サイトカインレベルより低いことを示し、１７人（５３．１％）のＤＩＬＩ対象が、適応性サイトカインの正常血清レベルより高いことを示した。３２人のコホートの間で、過剰発現した適応性サイトカインは、主としてＴＨ１（６／３２）または細胞性／体液性の複合型（６／３２）であった。図６に示すように、ほんの数人の対象がＴＨ１７（４／３２）またはＴＨ９プロファイル（１／３２）を示した。
【００８０】
特に図６は、６か月の経過観察時点でのＤＩＬＩ対象の血清におけるサイトカインのプロファイルを示す。６か月の経過観察の血清における個々のサイトカイン濃度を各患者について記録し、健常の「正常の」平均±ＳＤ値と比較した。６か月の経過観察時点での異常な血清サイトカイン濃度は、正常な対照に対する平均のものよりも高い（赤）または低い（青）測定ＳＤであると定義した。６か月の経過観察時点でのＤＩＬＩ対象のプロファイルは、パターンの観察された類似性および分析物の生理的役割に関する知識に基づいて定義した。
【００８１】
［サイトカインプロファイリングの方法体系の検証］
ＤＩＬＩ発症のコホートにおける先天性対適応性サイトカイン群の精度を試験するために、したがって、本発明者らのサイトカインプロファイリングの方法体系の妥当性を試験するために、個々のケモカインの発現プロファイルを解析した。３つのＮＦκＢ依存的（ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＭＣＰ−１）（３５、３６）および１つのＩＲＦ３依存的（ＩＰ１０）ケモカイン（３７）についてヒートマップを作成し、上記のサイトカインプロファイルと比較した。
【００８２】
既に述べたように、図７に示すように、健常対照の平均値より高いまたは低い１ＳＤを超えるケモカイン測定値を「異常」とみなした。１９人の「先天免疫」患者の間で、１４人（７３．６％）は、正常より高い１つまたは複数のＮＦκＢ依存的ケモカインも示し、一方４人（２１％）のみが異常に上昇したＩＰ１０の発現を有していた。２１人の「適応免疫」患者を用いて同じ比較を実施すると、図７に示すように、５人（２３．８％）のみが１つまたは複数の正常より高いＮＦκＢ依存的ケモカインを有していたが、すべてが正常より高い先天性サイトカイン発現も示した。最終的に、５／２６（１９．２％）の未分類のＤＩＬＩ患者が、過免疫のＤＩＬＩ患者で観察されたものと類似している、正常より高いＭＩＰ１α、ＭＩＰ１βまたはＭＣＰ−１の発現を示した。
【００８３】
特に、図７は、ＤＩＬＩ発症時でのＤＩＬＩ対象の血清におけるケモカインのプロファイルを示す。血清中の個々のケモカイン濃度をＤＩＬＩ発症時での各患者について記録し、健常の「正常の」平均±ＳＤ値と比較した。発症時の異常な血清ケモカイン濃度は、正常な健常対照に対する平均のものより高い（赤）または低い（青）測定値であると定義した。３つのＮＦκＢ依存的（ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＭＣＰ−１）および１つのＩＲＦ３依存的（ＩＰ１０）ケモカインの発現を、以前に確立されたサイトカインプロファイルと比較した。
【００８４】
［ＤＩＬＩの免疫性分析物および臨床的特徴］
臨床的特徴とサイトカインレベルの間の相関を調査した。いくつかのサイトカイン、ケモカインおよび増殖因子は、高ビリルビン血症（血清総ビリルビン＞１．２ｍｇ／ｄＬ）および自己報告された黄疸と有意に関係があることが分かった。以下の表５を参照されたい。予想通り、高ビリルビン血症と自己報告された黄疸の間に有意な関連があった（自己報告された黄疸に対する血清総ビリルビンの中央値＝８．７ｍｇ／ｄＬ、黄疸を報告していない対象に対する中央値＝０．９ｍｇ／ｄＬ、ｐ＜．００１）。高ビリルビン血症または自己報告された黄疸を有するものは、他のＤＩＬＩ対象のものと有意差がない平均血清ＡＬＴおよびＡＳＴレベルを有していた。ほぼすべての免疫性分析物に対する中央値は、高ビリルビン血症または自己報告された黄疸を有する対象に関して、それらを有さないものと比較して高かった。次の臨床的特徴および測定したサイトカインのいずれかについて、有意な関連がないことが明らかであった。性別、年齢、ＤＩＬＩのパターン、ＤＩＬＩの重症度、発症時の血清ＡＬＴ、最大の血清ＡＬＴ、発症時の血清ＡＰ、最大の血清ＡＰ、Ｒ値（すなわち、［血清ＡＬＴ／ＵＬＮ  ＡＬＴ］÷［血清ＡＰ／ＵＬＮ  ＡＰ］）、ＢＭＩ、好酸球絶対数値、感染症歴、精神疾患歴、心疾患歴、全身系動脈高血圧歴、腎疾患歴、肺疾患歴、胃腸疾患歴、悪性疾患歴（データ非表示）。さらに、免疫性分析物の濃度またはプロファイルと原因となる薬物（抗感染剤、抗痙攣剤、抗高血圧剤、脂質低下剤、免疫抑制剤および抗癌化学療法剤）の主な治療クラスの間に有意な関連はなかった。
【００８５】
【表５】
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【００８６】
［免疫性分析物およびＤＩＬＩの転帰］
免疫性分析物プロファイルならびにベースラインでの血清アルブミンおよび総ビリルビンの臨床検査の結果を、ＤＩＬＩ発症の６か月以内の早期死亡を予測するパターンについて検討した。モデリングプロセスによって、予測に使用するための以下の５つの変数が選択された：４つの免疫性アナリスト（ＩＬ−９、ＩＬ−１７、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＲＡＮＴＥＳ）ならびに血清アルブミン。表６に示すように、単変量解析に基づいて、モデリングプロセスのステップ１によって、７つのサイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−９）、２つのケモカイン（ＭＩＰ−１β、Ｒａｎｔｅｓ）、２つの増殖因子（ＦＧＦｂ、ＰＤＧＦ−ｂｂ）およびアルブミンが、ＤＩＬＩ発症の６か月以内での死亡と有意に（０．０１のレベルで）関係があることが示された。４つのサイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−４、ＩＬ−５）および１つの増殖因子（ＦＧＦｂ）は、（Ｐ値に基づいて）最も高くランクづけされたサイトカインＩＬ−１７および最も高くランクづけされた増殖因子ＰＤＧＦ−ｂｂとそれらが有意に相関するので、ステップ２で除外した。サイトカインＩＬ−１３は、サイトカインの発現プロファイルのヒートマップに基づいて十分にモジュレートされないので（例えば、表５を参照されたい）、ステップ３で除外した。ケモカインＭＩＰ−１βは、増殖因子ＰＤＧＦ−ｂｂと有意に相関するので、最終ステップで除外した。
【００８７】
【表６】
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【００８８】
低い免疫性分析物値および低い血清アルブミン値は、ＩＬ−９について０．７９（０．６５、０．９３）、ＩＬ−１７について０．８６（０．６７、１．０）、ＰＤＧＦ−ＢＢについて０．８４（０．６８、１．０）、Ｒａｎｔｅｓについて０．９０（０．８１−０．９８）、および血清アルブミンについて０．８３（０．７３、０．９４）の推定ＡＵＣ（９５％ＣＩ）を伴って早期死亡を予測した。ロジスティック回帰モデルに基づくこれらの変数の線形結合のＡＵＣ（９５％ＣＩ）は、０．９８（０．９５、１．０）であった。免疫性分析物の値が非常に歪められたので、バイナリー変数を作成して、これらの変数を組み合わせ、これらの変数からの情報をまとめた。４つの免疫性分析物の観察された中央値および（クラスＣ肝疾患を有する対象を特定するために、Ｃｈｉｌｄ−Ｔｕｒｃｏｔｔｅ−Ｐｕｇｈスコアリングシステムで使用された）アルブミンに対する２．８ｇ／ｄＬという既知のカットポイントを使用して、連続変数をバイナリー変数に二分した。表７に示すように、２．８ｇ／ｄＬを超える血清アルブミンのベースライン値を有するＤＩＬＩコホートの対象はすべて１００％のＮＰＶを伴って生存したが、ＤＩＬＩ発症の６か月以内に死亡したものはすべて１００％の感度を有するこのカットオフ以下の値であった。４つの免疫性分析物の値がすべて観察された中央値以下であった場合、最終的な４つの免疫性分析物（Ｉｌ−９、ＩＬ−１７、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＲＡＮＴＥＳ）に基づくバイナリー変数は、推定されたＰＰＶ、ＮＰＶならびにそれぞれ６７％、９７％および９２％の精度を有していた。４つのバイナリー免疫性分析物とバイナリー血清アルブミンの組み合わせは、急性ＤＩＬＩで死亡するものまたは少なくとも６か月間生存する（および通常は完全に回復する）ものの最適な識別を提供した。このベンチマークを使用して、ＩＬ−９＞１３．６、ＩＬ−１７＞４５．２、ＰＤＧＦ−ｂｂ＞４２０７、ＲＡＮＴＥＳ＞２５２９またはアルブミン＞２．８ｇ／ｄＬを有する６９人の対象のうちの６７人（９７％のＮＰＶ）が、６か月時点で急性ＤＩＬＩ事象から生存し、一方、ＩＬ−９＜１３．６、ＩＬ−１７＜４５．２、ＰＤＧＦ−ｂｂ＜４２０７、ＲＡＮＴＥＳ＜２５２９およびアルブミン≦２．８ｇ／ｄＬを有する８人の対象のうちの７人（８８％のＰＰＶ）が、ＤＩＬＩ発症の６か月以内に死亡した（表７）。全体的な予測精度は、７４／７７＝９６％（９５％ＣＩ、９２％〜１００％）である。早期死亡の予測能力について、ベースラインＭＥＬＤスコアも調査した。表８に示すように、ＭＥＬＤスコア（３８）はまた、４つの免疫性分析物とアルブミンの組み合わせたバイナリー変数と同様ではないが、いくらかの精度で予測した。残念ながら、ＭＥＬＤスコアの計算に必要であるすべてのデータは、６か月以内に死亡した１０人のうちの６人を含めた、７８人の研究対象のうちの３４人からしか入手できなかった。欠けていることの多い値は、血清クレアチニンおよびＩＮＲであった。
【００８９】
【表７】
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【００９０】
【表８】
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【００９１】
上述した研究は、少なくとも以下の主な発見を提供する。１）血清免疫性分析物のプロファイルは、急性ＤＩＬＩにおいて変化する、２）そのようなプロファイルを異なるタイプに分類することができる、３）プロファイルは、ＤＩＬＩの潜在的な薬物原因にも、肝細胞性、胆汁うっ滞性または「混合性」であろうとなかろうとＤＩＬＩのパターンにも、またベースラインまたはその後の時点でのＲ値にも、特異的ではないまたは相関しない、および、４）本発明のある種の実施形態によれば、ＤＩＬＩ発症時での低い血清アルブミン値および４つの免疫性分析物のみ（ＩＬ−１７、ＩＬ−９、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＲＡＮＴＥＳ）の集計変数は、急性ＤＩＬＩ事象の後６か月間生存するものおよび生存しないものを予測する。したがって、そうした本発明による実施形態は、生存するまたは生存しないと思われる対象を急性ＤＩＬＩの経過の初期に予測する能力を有利に提供する。
【００９２】
ＤＩＬＩの病原を理解することを進めることについては、異なる免疫応答パターンが、有用な新しい洞察を提供するＤＩＬＩ対象のサイトカインプロファイリングの解析から示唆される。ＤＩＬＩは通常、宿主のタンパク質に結合する薬物（または薬物代謝産物）に対する過剰増殖性の免疫応答が原因であることが多いことが明らかになりつつある。例えば、血清アルブミンは、薬物由来ハプテンのよくある「シュレッパー」として関与しており、これらの複合体は、肝臓損傷をもたらす第四の免疫応答と呼ばれている（７、３９〜４１）。肝細胞または胆管細胞に主に向けられるそうした応答は、他の器官および組織、特に皮膚、腎臓または骨髄を攻撃する可能性がある（４２）。ＤＩＬＩ［自己免疫性様または免疫アレルギー性］の免疫的特徴づけに関する現在のパラダイムは、疾患の臨床病理学的な症状発現、自己抗体の存在（適応免疫）、好酸球（先天免疫）および／または皮膚の発疹に基づく（７、４３）。自己免疫性型のＤＩＬＩは、発症が遅延する傾向があり、再攻撃の際に緩徐に発達する傾向がある（４４）。免疫アレルギー性様ＤＩＬＩの徴候である皮膚発疹は、先天免疫または適応免疫の成分によって引き起こされ得る（例えばＤＲＥＳＳ症候群、全身性エリテマトーデス）（４５、４６）。まとめると、プロトタイプの自己免疫性様または免疫アレルギー性のＤＩＬＩの分類は重複を示し、これは、臨床経験、米国ＤＩＬＩＮデータベースのデータ、ならびにＤＩＬＩＮからの臨床報告［（４７〜４９）およびＧｈａｂｒｉｌら、Ｒｕｓｓｏら、未発表の知見］と矛盾しない。上記のサイトカインおよびケモカインのプロファイル解析は、ＤＩＬＩにおける先天免疫性成分を強調し（１９／７８人の対象）、大部分は細胞性である、ＤＩＬＩ発症時での異なる適応免疫性成分を示す（２１／７８人の対象）。興味深いことに、異常な、典型的な、または標準のＴＨ１およびＴＨ２適応性サイトカイン発現は、研究したＤＩＬＩコホートにおいてまれであったが（４／７８人の対象）、過剰増殖性のＴＨ１７およびＴＨ９先天免疫応答はより広く認められた（１７／７８人の対象）。
【００９３】
個々の薬物を研究する最近の研究によって、ＤＩＬＩにおけるＴＨ１７経路の大きな貢献に関するエビデンスが提供された（１９、５０）。本発明者らは、「適応免疫性ＤＩＬＩ」の顕著な特徴となる、ＩＬ−１７の異常な血清濃度を発見したが、ＴＨ１７経路がその病状に寄与する機構は、依然として解明されていない。自己反応性のＴＨ１７細胞は、多発性硬化症および大腸炎などの慢性の自己免疫性状態と関係づけられており、主として調節不全のＴＨ１７経路によって引き起こされる（５１、５２）。自己反応性に特に重点を置いた、「適応免疫性ＤＩＬＩ」におけるＴＨ１７細胞のさらなる特徴づけは、ＩＬ−１７が細胞性自己免疫と関連しているかどうかを明らかにし得る。関節リウマチでは、ＩＬ−１７が自己抗体産生を促進できることが最近示された（５３）。それにもかかわらず、本発明者らはＤＩＬＩ発症時において、異常なＴＨ１７産生と自己抗体の存在の間に相関がないことを発見した。慢性の肝臓病状／障害（アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、自己免疫性肝疾患）の多くの例において、ＴＨ１７成分が特定され（５０）、これによって、ＤＩＬＩ発症時において正常より高い血清ＩＬ−１７濃度を示す患者は、長期持続性かつ解決されない肝障害を有する素因がある［または傾向が強い］可能性があることが示唆される。
【００９４】
主な臨床的ジレンマは、（原因薬物を速やかに中止すると仮定して）急性ＤＩＬＩを有するどの対象が無事に回復するか、およびどの患者が、薬物中止にもかかわらず肝不全に進行し、６か月以内に死亡するかまたは肝移植を必要とするかを知ることである。本発明のある種の実施形態は、ＤＩＬＩの経過の極初期に対象を分類するための重要な情報を提供する。
【００９５】
本発明のある種の実施形態によれば、単一のバイナリー予測因子は、疾患経過の初期に、血清アルブミンおよび４つの免疫性分析物（すなわち、Ｉｌ−９、ＩＬ−１７、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＲＡＮＴＥＳ）のみの必要とする測定値を比較的使用しやすい。本発明のある種の実施形態によれば、この特定のバイナリー予測因子は、急性ＤＩＬＩによる死亡の予測において高い精度を示す［表６］。免疫性分析物の測定値を解析するのに用いられる根本的に異なる２つのストラテジー、すなわち、既知の生物学的機能および免疫性分析物の制御に基づくストラテジーならびにこれらの研究において観察された結果に基づく統計学的／数学的ストラテジーは、２つの主な発見、１）ＩＬ−１７（および程度の差はあるがＩＬ−９）は、発症時でのＤＩＬＩの病状（より正確には「適応免疫性ＤＩＬＩ」）に対する重要な要因であること、ならびに２）低ＩＬ−１７／ＩＬ−９血清濃度は、ＤＩＬＩの予後不良と関係がある、または相反的に、「適応免疫性ＤＩＬＩ」は、予後良好と関係があること、をもたらすように収束したことは、特に重要である。
【００９６】
前述の説明および関連する図面に提示された教示の利益を有する、本明細書に示す本発明の多くの改変および他の実施形態を、本発明が関係する当業者なら想到するであろう。したがって、本発明は、開示する特定の実施形態に限定されるものではないこと、ならびに改変および他の実施形態が添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されることを理解されたい。本明細書において特定の用語を用いたが、それらは、一般的かつ説明的意味でのみ使用され、限定のためではない。
【００９７】
以下は引用文献（それぞれが、参照により本明細書に組み込まれる）を示す。
【表９Ａ】
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【表９Ｂ】
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【表９Ｃ】
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【表９Ｄ】
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【表９Ｅ】
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【図１】
2016500825.tif 000016
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【国際調査報告】
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