(57)【要約】  本発明は、医薬としての使用のための、バレッチンおよびその誘導体を含む、本明細書の式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩に関する。さらに、本発明は、酸化ストレスに関連する疾患の治療および炎症性疾患の治療における使用のための同化合物に関する。本発明のなお別の態様は、皮膚老化の美容的処置のための、バレッチンおよびその誘導体の使用である。さらに別の態様は、臓器の保存および／または洗浄用の溶液における、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用である。本発明の最後の態様は、食品および／または飼料添加物としての、バレッチンおよびその誘導体の使用である。【選択図】図１
2016523813.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん、心血管疾患、パーキンソン病、運動ニューロン疾患、ハンチントン病、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、双極性障害、脆弱Ｘ症候群、鎌状赤血球症、扁平苔癬、白斑、自閉症、および慢性疲労症候群からなる群から選択される酸化ストレスに関連する疾患の治療における使用のための、式（Ｉ）の化合物
【化１】
2016523813.tif 000050
（式中、
ＸおよびＹは、水素およびハロゲンからなる群から独立して選択され、
【化２】
2016523813.tif 000051
は、単結合または二重結合を表し、
Ｒは、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され、
ｎは、１、２、３、および４から選択される整数である）、
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
前記疾患が、冠動脈性心疾患、心筋症、高血圧性心疾患、肺性心、炎症性心疾患、心内膜炎、炎症性心肥大、心筋炎、心臓弁膜症、脳卒中、脳血管疾患、および末梢動脈疾患からなる群から選択される心血管疾患である、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項３】
酸逆流／胸焼け、座瘡、尋常性座瘡、アレルギーおよび過敏症、強直性脊椎炎、虫垂炎、関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患、気管支炎、滑液包炎、心炎、セリアック病、慢性疼痛、慢性前立腺炎、大腸炎、クローン病、肝硬変、大腸炎、膀胱炎、皮膚炎、糖尿病、憩室炎、ドライアイ、浮腫、肺気腫、湿疹、線維筋痛症、胃腸炎、歯肉炎、糸球体腎炎、心疾患、肝炎、高血圧、炎症性心血管疾患、炎症性腸疾患、インスリン抵抗性、間質性膀胱炎、関節痛、全身性エリテマトーデス、髄膜炎、メタボリックシンドローム（シンドロームＸ）、筋炎、腎炎、肥満、変形性関節症、骨減少症、骨粗鬆症、パーキンソン病、歯周病、骨盤内炎症性疾患、静脈炎、多発動脈炎、多発軟骨炎、乾癬、乾癬性関節炎、再灌流傷害、関節リウマチ、鼻炎、サルコイドーシス、強皮症、副鼻腔炎、シェーグレン症候群、痙攣性結腸、全身性カンジダ症、腱炎、扁桃炎、移植片拒絶反応、膣炎、潰瘍性大腸炎、ならびに血管炎からなる群から選択される炎症性疾患の治療における使用のための、式（Ｉ）の化合物
【化３】
2016523813.tif 000052
（式中、
ＸおよびＹは、水素およびハロゲンからなる群から独立して選択され、
【化４】
2016523813.tif 000053
は、単結合または二重結合を表し、
Ｒは、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され、
ｎは、１、２、３、および４から選択される整数である）、
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
前記疾患が、アテローム性動脈硬化症である、請求項３に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項５】
治療が、予防的治療である、請求項１から４のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項６】
Ｘが、ハロゲンであり、Ｙが、水素である、請求項１から５のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項７】
ハロゲンが、臭素である、請求項１から６のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項８】
Ｒが、水素である、請求項１から７のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項９】
ｎが、２である、請求項１から８のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１０】
【化５】
2016523813.tif 000054
が、二重結合を表す、請求項１から９のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１１】
Ｘが、臭素であり、Ｙが、水素であり、
【化６】
2016523813.tif 000055
が、二重結合を表し、Ｒが、水素であり、ｎが、２である、請求項１から１０のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１２】
前記化合物がバレッチンである、請求項１から１１のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１３】
前記式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、臓器用の保存溶液および／または洗浄溶液。
【請求項１４】
臓器を保存および／または洗浄するための、前記式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む溶液の使用。
【請求項１５】
皮膚老化の美容的処置のための、式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項１６】
食品および／または飼料添加物としての、式（Ｉ）の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬としての使用のための、化合物バレッチンおよびその誘導体に関する。特に、本発明は、心血管疾患などの酸化ストレスに関連する疾患の治療における使用のための、バレッチンおよびその誘導体、ならびに炎症性疾患の治療における使用のための、バレッチンおよびその誘導体に関する。別の態様は、皮膚老化の処置のための美容剤としての、バレッチンおよびその誘導体の使用、ならびに食品または飼料添加物としての、バレッチンおよび誘導体の使用である。
【背景技術】
【０００２】
海綿は、生物活性化合物の豊富な供給源である。本発明者らは、北ノルウェー沖で採取された海綿Ｇｅｏｄｉａ  ｂａｒｅｔｔｉから、バレッチン（シクロ−［（６−ブロモ−８−エン−トリプトファン）−アルギニン］あるいはＮ−｛３［（６−ブロモ−１Ｈ−インドール−３−イルメチレン）−３，６−ジオキソ−ピペラジン−２−イル］−プロピル｝−グアニジン）およびその誘導体を単離した。２００２年に、バレッチンの構造を示唆するデータが公開された（Ｓｏｌｔｅｒ  Ｓ．ら、ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ｌｅｔｔｅｒｓ、２００２、４３、３３８５〜３３８６頁）。これは後に、バレッチンの合成の成功によって確認された（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ａ．−Ｌ．ら、ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２００４、６０、９６１〜９６５頁）。それ以降、バレッチンおよび誘導体の抗汚損特性がＷＯ０３／０８１１９９に開示されており、バレッチンがセロトニン受容体リガンドであること、およびバレッチンのセロトニン様構造が恐らく分子にその抗汚損特性を与えていることが示されている（Ｈｅｄｎｅｒ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．２００６、６９、１４２１〜１４２４頁）。
【０００３】
バレッチンおよびその誘導体の潜在的治療能は、これまで調査されていない。よって、生物活性化合物、例えば、バレッチンまたはその誘導体を使用した医学的状態の改良されたまたは代替の治療は有利となり、特に、心血管疾患などの酸化ストレスに関連する疾患、および炎症性状態の改良されたまたは代替の治療は有利となる。本発明者らは、驚くべきことに、本発明の化合物、すなわち、バレッチンおよびその誘導体が、潜在的治療能を有し、医学的使用のための代替のおよび改良された薬剤の典型となることを見出した。特に、本発明の化合物は、驚くべき抗酸化性および抗炎症性を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ０３／０８１１９９
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｏｌｔｅｒ  Ｓ．ら、ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ｌｅｔｔｅｒｓ、２００２、４３、３３８５〜３３８６頁
【非特許文献２】Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ａ．−Ｌ．ら、ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２００４、６０、９６１〜９６５頁
【非特許文献３】Ｈｅｄｎｅｒ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．２００６、６９、１４２１〜１４２４頁
【非特許文献４】ｂｅｎｚｉｅ，Ｉ．Ｆ．Ｆ．ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９６、２３９、７０〜７６頁
【非特許文献５】Ｈｕａｎｇ，Ｄ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００２、５０、４４３７〜４４４４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の目的は、医薬としての使用のための代替のまたは改良された化合物を提供することに関する。
【０００７】
特に、医学的使用、特に心血管疾患などの酸化ストレスに関連する疾患、およびまた炎症性状態の治療における使用のための新たな化合物を提供することによって先行技術の上述の課題を解決する、バレッチンおよびその誘導体などの化合物を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明の一態様は、医薬としての使用のための、式（Ｉ）の化合物
【０００９】
【化１】
2016523813.tif 000003
【００１０】
（式中、
ＸおよびＹは、水素およびハロゲンからなる群から独立して選択され、
【００１１】
【化２】
2016523813.tif 000004
【００１２】
は、単結合または二重結合を表し、
Ｒは、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され、
ｎは、１、２、３、および４から選択される整数である）、
またはその薬学的に許容される塩に関する。
【００１３】
本発明の別の態様は、酸化ストレスに関連する疾患の治療における使用のための、式（Ｉ）の化合物
【００１４】
【化３】
2016523813.tif 000005
【００１５】
（式中、
ＸおよびＹは、水素およびハロゲンからなる群から独立して選択され、
【００１６】
【化４】
2016523813.tif 000006
【００１７】
は、単結合または二重結合を表し、
Ｒは、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され、
ｎは、１、２、３、および４から選択される整数である）、
またはその薬学的に許容される塩に関する。
【００１８】
本発明のさらに別の態様は、炎症性疾患の治療における使用のための、式（Ｉ）の化合物
【００１９】
【化５】
2016523813.tif 000007
【００２０】
（式中、
ＸおよびＹは、水素およびハロゲンからなる群から独立して選択され、
【００２１】
【化６】
2016523813.tif 000008
【００２２】
は、単結合または二重結合を表し、
Ｒは、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され、
ｎは、１、２、３、および４から選択される整数である）、
またはその薬学的に許容される塩を提供することである。
【００２３】
さらに別の態様は、臓器の保存および／または洗浄用の溶液における、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用である。
【００２４】
本発明のなお別の態様は、皮膚老化の美容的処置のための、式（Ｉ）の化合物の使用である。
【００２５】
本発明の最後の態様は、食品および／または飼料添加物としての、式（Ｉ）の化合物の使用である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】試験化合物バレッチン（ＭＢＣ−００５／ＭＢＣ−０１１、それぞれ単離および合成されたもの）および脱ブロモバレッチン（ＭＢＣ−００７）を示す図である。アルキルおよびグアニジンのプロトンは示されていないが、内在する。
【図２】鉄還元酸化防止力（ＦＲＡＰ）アッセイにおけるＭＢＣ−００５およびＭＢＣ−００７の酸化防止作用を示す図である。いずれの分子も、用量依存的に鉄を還元する。データは、１つの代表的な実験、ｎ＝２からのものである。
【図３】ＭＢＣ−００５およびＭＢＣ−００７が、酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）アッセイにおいて、いかにフルオレセインを分解から保護するよう用量依存的に働くかを示す図である。示した結果は、１つの代表的な実験、ｎ＝２からのものである。
【図４】ＭＢＣ−００５およびＭＢＣ−００７についての細胞脂質過酸化酸化防止活性（ＣＬＰＡＡ）結果を示す図である。ＭＢＣ−００５は、ＨｅｐＧ２細胞における脂質過酸化を減少させるよう用量依存的に働く。この作用は、この特定のアッセイについて、ＭＢＣ−００７では見られない。ＢＨＴ（１０μＭ）を比較対照として使用した。結果は、陽性対照ＣｕｍＯＯＨ、ｎ＝３に対して正規化されている。
【図５】合成されたバレッチン（ここではＭＢＣ−０１１と称される）の抗炎症作用を示す図である。グラフは、ＬＰＳで誘導した単球（ＴＨＰ−１細胞）における、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）およびインターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）の阻害パーセントを示す。
【図６】ＨｅｐＧ２細胞を使用したＭＢＣ−００５およびＭＢＣ−００７化合物の細胞毒性試験からの結果を示す図である。結果は２４時間の曝露後の生存百分率として表示する。提示した結果は、１つの代表的な実験、ｎ＝３からのものである。
【図７】ＭＲＣ５細胞を使用したＭＢＣ−００５およびＭＢＣ−００７化合物の細胞毒性試験からの結果を示す図である。結果は２４時間の曝露後の生存百分率として表示する。提示した結果は、１つの代表的な実験、ｎ＝３からのものである。
【図８Ａ】７週間後に給餌実験の異なる群から得られた総コレステロール（ｍｍｏｌ／Ｌ）およびＬＤＬコレステロール（ｍｍｏｌ／Ｌ）を示す図である。
【図８Ｂ】７週間後に給餌実験の異なる群から得られたトリアシルグリセロール（ｍｍｏｌ／Ｌ）およびＯｘＬＤＬ（ｎｇ／ｍＬ）を示す図である。
【図９】ａ）は、大動脈弓における病変面積を示す（関連する大動脈領域は、ｂ）において写真の上部に図示されたとおりである）。
【図１０】ａ）は、下行大動脈における病変面積を示す（関連する大動脈領域は、ｂ）において写真の中央部に図示されたとおりである）。
【図１１】ａ）は、大動脈の腎下部における病変面積を示す（関連する領域は、ｂ）において写真の下部に図示されたとおりである）。
【図１２】ａ）は、全大動脈における病変面積を示す（全大動脈は、ｂ）において図示されている）。
【図１３】ＴＨＰ−１細胞からのＬＰＳで誘導したＩＬ−６放出に対するバレッチンの作用を示す図である（ｎ＝６）。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＬＰＳで処置した対照との比較（バレッチンまたはデキサメタゾンなし；一元配置ＡＮＯＶＡとＤｕｎｎｅｔｔの事後検定）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明をこれから以下でより詳細に説明する。
定義
本発明についてさらに詳細に論じる前に、以下の用語および規則をまず定義する。
【００２８】
本明細書において、「Ｃ１〜Ｃ６アルキル」は、１から６個の炭素原子を有するアルキル部分として定義される。アルキル部分は、直鎖でも分岐鎖でもよい。同様に、「Ｃ１〜Ｃ３アルキル」は、１から３個の炭素原子を有するアルキル部分として定義される。アルキル部分は、直鎖でも分岐鎖でもよい。直鎖アルキルとしては、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３が挙げられる。分岐鎖アルキルとしては、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００２９】
本明細書において、「水素」は、−Ｈ部分として定義され、プロトンと言うこともある。
【００３０】
本明細書において、「ハロゲン」は、化学的に関連する５つの元素、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）、およびアスタチン（Ａｔ）からなる周期表の１７族に由来する元素として定義される。しかしながら、アスタチンは、有機化学ではほとんど使用されることがなく、したがって、本文脈において、ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素のいずれか１つを指すと言える。
【００３１】
本明細書において、「薬学的に許容される塩」は、例えば、１個または複数のプロトンが化合物から除去されて負に荷電した種を形成し、別の正に荷電したイオン種が負に荷電した種と結合して中性塩を形成する、イオン種として定義される。あるいは、１個または複数のプロトンが化合物に付加されて正に荷電した種を形成し、別の負に荷電したイオン種が正に荷電した種と結合して中性塩を形成する。中性塩とは、正味電荷がゼロである塩を意味する。形成された塩は、医薬の薬理学的要件を満たし、例えば、容認できない毒性または溶解の特徴を有さず、そのため、薬学的に許容されると特徴付けられる。そのような塩は、リチウム、ナトリウム、およびカリウム塩を含むアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム、およびストロンチウム塩を含むアルカリ土類金属塩、アルミニウムおよび亜鉛塩を含む金属塩、例えば、塩酸塩または臭化水素酸塩を含む酸性塩、およびより複雑な塩、例えば、硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシネート（ｇｅｎｔｉｓｉｎａｔｅ）、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルカロネート（ｇｌｕｃａｒｏｎａｔｅ）、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、パモ酸塩など、ならびに前記塩の任意の組合せからなる群から選択され得るが、これらに限定されない。
【００３２】
本明細書において、「酸化ストレスに関連する疾患」は、疾患の発症または進行が酸化ストレスによって促進される、疾患または医学的状態として定義される。酸化ストレスは、抗酸化種よりも多くの酸化種が存在する、体内の不均衡によって引き起こされる。特に、「活性酸化種」（ＲＯＳ）は、この点において有害と見なされる。酸化ストレスは、多くの神経疾患、心血管疾患、悪性疾患、および年齢に伴う疾患の病因に関与すると考えられていることから、本発明は、すべてのそのような疾患を企図する。あるいは、「酸化ストレスに関連する疾患」は、「酸化ストレス」と称されることもある。
【００３３】
本明細書において、「炎症性疾患」は、炎症によって引き起こされる任意の疾患として定義される。炎症は、病原体、損傷細胞、または刺激物を含む有害な刺激に対する血管組織の生物学的応答の一部である。あるいは、炎症性疾患は、「炎症」または「炎症性状態」と称されることもある。身体のどの部分が状態に冒されるかによって、多数の型の炎症性疾患が存在する。炎症性疾患のいくつかの例としては、虫垂炎、滑液包炎、大腸炎、膀胱炎、皮膚炎、髄膜炎、静脈炎、鼻炎、腱炎、扁桃炎、血管炎、および関節炎、ならびに炎症性心血管疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
本発明者らは、驚くべきことに、化合物バレッチンおよびその誘導体の潜在的治療能を特定した。本発明者らが行った多数のインビトロおよびインビボ実験は、酸化ストレスに関連する疾患および炎症性状態の治療におけるバレッチンの潜在性を実証し、それと同時に、これらの化合物の細胞毒性が、インビトロで抗酸化および抗炎症作用を示す実験において使用された用量範囲内において、存在しないかまたはごくわずかであることを示した。
【００３５】
したがって、本発明の第１の態様は、医薬としての使用のための、式（Ｉ）の化合物
【００３６】
【化７】
2016523813.tif 000009
【００３７】
（式中、
ＸおよびＹは、水素およびハロゲンからなる群から独立して選択され、
【００３８】
【化８】
2016523813.tif 000010
【００３９】
は、単結合または二重結合を表し、
Ｒは、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され、
ｎは、１、２、３、および４から選択される整数である）、
またはその薬学的に許容される塩である。
【００４０】
好ましい一実施形態では、Ｘは、ハロゲンであり、Ｙは、水素およびハロゲンからなる群から独立して選択される。別の好ましい実施形態では、Ｘは、ハロゲンであり、Ｙは、水素である。別の実施形態では、ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群から選択され得る。最も好ましくは、ハロゲンは、臭素である。
【００４１】
Ｃ１〜Ｃ６アルキルは、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキサン、およびイソプロピルを含む最大６個の炭素を有する任意の分岐誘導体、およびｔｅｒｔ−ブチルを含み得る。さらに別の好ましい実施形態では、Ｒは、水素およびＣ１〜Ｃ３アルキルからなる群から選択される。Ｃ１〜Ｃ３アルキルは、メチル、エチル、プロピル、およびイソプロピルを含み得る。さらに好ましくは、Ｒは、水素である。
【００４２】
別の好ましい実施形態では、ｎは、２である。これは、アミノ酸アルギニンの側鎖に相当するバレッチン中の関連する炭素鎖の長さに相当する。最後に、別の好ましい実施形態では、
【００４３】
【化９】
2016523813.tif 000011
【００４４】
は、二重結合を表す。やはり、これは、バレッチン中に存在する二重結合に相当する。
【００４５】
【化１０】
2016523813.tif 000012
【００４６】
が、二重結合を表す、式（Ｉ）の化合物中に存在する二重結合に起因して、この化合物は、ＺおよびＥ異性体の形態で存在し得る。好ましい実施形態では、前記化合物は、ＺおよびＥ異性体の混合物である。別の興味深い実施形態では、前記化合物は、Ｅ異性体である。さらに別の好ましい実施形態では、前記化合物は、Ｚ異性体である。
【００４７】
非常に好ましい実施形態では、Ｘは、臭素であり、Ｙは、水素であり、
【００４８】
【化１１】
2016523813.tif 000013
【００４９】
は、二重結合を表し、Ｒは、水素であり、ｎは、２である。さらに好ましい実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、バレッチンである、すなわち、式（ＩＩ）の化合物に相当する：
【００５０】
【化１２】
2016523813.tif 000014
【００５１】
本発明の化合物が二重結合を含む場合、特に、式（ＩＩ）に定義されたバレッチンである場合、化合物は、好ましくは、海綿Ｇｅｏｄｉａ  ｂａｒｅｔｔｉから化合物を単離すると得られる、ＺおよびＥ異性体の混合物である。さらに好ましくは、化合物は、海綿Ｇｅｏｄｉａ  ｂａｒｅｔｔｉから化合物を単離すると得られる、化合物の主異性体に相当する。代替の実施形態では、化合物は、海綿Ｇｅｏｄｉａ  ｂａｒｅｔｔｉから化合物を単離すると得られる、化合物の副異性体に相当する。バレッチンに関して、ＺおよびＥ異性体は、ＨＰＬＣによって分離可能である。したがって、本発明の化合物は、好ましくは、Ｚ−バレッチン、Ｅ−バレッチン、またはそれらの任意の混合物からなる群から選択され得る。好ましくは、本発明の化合物は、Ｚ−バレッチンである。一般的に、本発明の化合物の所与の異性体またはエナンチオマーに言及する場合、これは、その異性体またはエナンチオマーが、他の異性体および／またはエナンチオマーを実質的に含まない、あるいは他の異性体および／またはエナンチオマーを本質的に含まないことを意味する。したがって、異性体またはエナンチオマーは、９０％の単一の異性体および／またはエナンチオマー、例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、好ましくは、９９．９％の単一の異性体および／またはエナンチオマーであり得る。
【００５２】
さらに、
【００５３】
【化１３】
2016523813.tif 000015
【００５４】
が、二重結合を表す、式（Ｉ）の化合物において、この化合物は、アルギニン側鎖が複素環に連結している、１つのエナンチオマー中心を含む。この位置は、式（ＩＩ）の化合物において「＊」で印が付けられ、
【００５５】
【化１４】
2016523813.tif 000016
【００５６】
が、二重結合を表す、本明細書のすべての化合物におけるこの中心の一般的な位置を示す。
【００５７】
したがって、式（Ｉ）の化合物は、好ましくは、エナンチオマーの混合物であり得る。化合物は、好ましくは、ラセミ体であり得る。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、（Ｓ）−エナンチオマーであり得る。あるいは、それは、（Ｒ）−エナンチオマーであり得る。非常に好ましい実施形態では、化合物は、式（ＩＩ）の化合物バレッチンであり、エナンチオマーまたはエナンチオマーの混合物は、海綿Ｇｅｏｄｉａ  ｂａｒｅｔｔｉからバレッチンを単離すると得られるものである。さらに好ましくは、それは、海綿Ｇｅｏｄｉａ  ｂａｒｅｔｔｉからバレッチンの主（Ｚ／Ｅ）異性体を単離すると得られる、エナンチオマーまたはエナンチオマーの混合物である。一実施形態では、化合物は、（Ｚ，（Ｓ））−バレッチン、（Ｚ，（Ｒ））−バレッチン、（Ｅ，（Ｓ））−バレッチン、および（Ｅ，（Ｒ））−バレッチンからなる群から選択され得る。非常に好ましい実施形態では、本発明の化合物は、（Ｚ，（Ｓ））−バレッチンである。
【００５８】
本発明の別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、
【００５９】
【化１５】
2016523813.tif 000017
【００６０】
が、単結合を表す、化合物である。この実施形態では、ＺおよびＥ異性体は存在しないが、化合物は、ここでは２つのエナンチオマー中心を含み、その理由は、ここで導入された単結合の環炭素もまたエナンチオマー中心であるからである。したがって、
【００６１】
【化１６】
2016523813.tif 000018
【００６２】
が、単結合を表す、これらの式（Ｉ）の化合物は、化合物の４つのエピマー、すなわち、（Ｓ，Ｓ）、（Ｒ，Ｒ）、（Ｒ，Ｓ）、および（Ｓ，Ｒ）形態を含み得る。好ましい実施形態では、
【００６３】
【化１７】
2016523813.tif 000019
【００６４】
が、単結合を表す、式（Ｉ）の化合物は、任意のそのエピマーを含む（８，９）−ジヒドロバレッチンである。
【００６５】
本発明の化合物を、例えば、鉄還元酸化防止力（ＦＲＡＰ）アッセイ、細胞脂質過酸化酸化防止活性（ＣＬＰＡＡ）アッセイ、および酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）アッセイを含む、いくつかのインビトロアッセイにおいて、酸化防止作用について調査した。化合物は、これらのアッセイにおいて、有意な潜在性を示した。
【００６６】
そのため、本発明の第２の態様は、酸化ストレスに関連する疾患の治療における使用のための、式（Ｉ）の化合物
【００６７】
【化１８】
2016523813.tif 000020
【００６８】
（式中、
ＸおよびＹは、水素およびハロゲンからなる群から独立して選択され、
【００６９】
【化１９】
2016523813.tif 000021
【００７０】
は、単結合または二重結合を表し、
Ｒは、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され、
ｎは、１、２、３、および４から選択される整数である）、
またはその薬学的に許容される塩である。
【００７１】
酸化ストレスに関連する疾患は、がん、心血管疾患、運動ニューロン疾患、アテローム性動脈硬化症、心不全、心筋梗塞、統合失調症、認知症、双極性障害、脆弱Ｘ症候群、鎌状赤血球症、扁平苔癬、白斑、自閉症、白内障、糖尿病、糖尿病性血管障害、慢性疲労症候群、および神経変性疾患からなる群から選択され得る。
【００７２】
特に好ましい実施形態では、酸化ストレスに関連する疾患は、心血管疾患である。心血管疾患は、好ましくは、冠動脈性心疾患（また、虚血性心疾患または冠動脈疾患）、心筋症、高血圧性心疾患、心不全、肺性心、不整脈、炎症性心疾患、心内膜炎、炎症性心肥大、心筋炎、心臓弁膜症、脳卒中、脳血管疾患、および末梢動脈疾患からなる群から選択され得る。
【００７３】
神経変性疾患は、パーキンソン病、多発性硬化症、ＡＬＳ、多系統萎縮症、アルツハイマー病、ハンチントン病、脳卒中、およびピック病からなる群から選択され得る。
【００７４】
酸化ストレスに関連する疾患は、好ましくは、がん、心血管疾患、パーキンソン病、運動ニューロン疾患、ハンチントン病、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、双極性障害、脆弱Ｘ症候群、鎌状赤血球症、扁平苔癬、白斑、自閉症、および慢性疲労症候群からなる群から選択される。
【００７５】
心血管疾患は、好ましくは、冠動脈性心疾患、心筋症、高血圧性心疾患、肺性心、炎症性心疾患、心内膜炎、炎症性心肥大、心筋炎、心臓弁膜症、脳卒中、脳血管疾患、および末梢動脈疾患からなる群から選択される。
【００７６】
別の実施形態では、酸化ストレスに関連する前記疾患は、好ましくは、がんである。がんは、癌腫、肉腫、リンパ腫および白血病、胚細胞腫瘍、ならびに芽細胞腫を含み得る。具体的には、がんは、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄白血病、副腎皮質癌腫、ＡＩＤＳ関連がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星細胞腫、基底細胞癌腫、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳がん、脳腫瘍−小脳星細胞腫、脳腫瘍−大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、脳腫瘍−上衣腫、脳腫瘍−髄芽細胞腫、脳腫瘍−テント上原始神経外胚葉腫瘍、脳腫瘍−視経路および視床下部神経膠腫、乳がんまたは乳癌腫、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、カルチノイド腫瘍、消化管、原発不明の癌腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫または悪性神経膠腫、子宮頸がん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸がんまたは結腸癌腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼がん−眼内黒色腫、眼がん−網膜芽細胞腫、胆嚢がん、胃の（胃）がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍−頭蓋外、性腺外、または卵巣、妊娠性絨毛性腫瘍、脳幹の神経膠腫、神経膠腫−小児大脳星細胞腫、神経膠腫−小児視経路および視床下部、胃のカルチノイド、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、島細胞癌腫（膵臓内分泌腺）、カポジ肉腫、腎臓がん（腎細胞がん）、喉頭がん、白血病−急性リンパ芽球性（急性リンパ性白血病とも呼ばれる）、白血病−急性骨髄（急性骨髄性白血病とも呼ばれる）、白血病−慢性リンパ性（慢性リンパ性白血病とも呼ばれる）、白血病−慢性骨髄性（慢性骨髄白血病とも呼ばれる）、白血病−有毛細胞、口唇および口腔がん、脂肪肉腫、肝臓がん（原発性）、肺がん、非小細胞肺がん、リンパ腫、バーキット、リンパ腫、皮膚Ｔ細胞、リンパ腫、ホジキン、リンパ腫−原発性中枢神経系、マクログロブリン血症、ワルデンストレーム、骨の悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽細胞腫、黒色腫、黒色腫−眼内（眼）、メルケル細胞癌腫、中皮腫、多発性内分泌腺腫症候群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭癌腫、神経芽細胞腫、口腔咽頭がん、卵巣がん、上皮性卵巣がん（表面上皮−間質腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、膵臓がん、膵臓がん−島細胞、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体星細胞腫、松果体胚細胞腫、松果体芽細胞腫およびテント上原始神経外胚葉腫瘍、下垂体腺腫、形質細胞腫瘍形成／多発性骨髄腫、胸膜肺芽細胞腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞癌腫（腎臓がん）、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫−軟部組織、肉腫−子宮、セザリー症候群、皮膚がん（非黒色腫）、皮膚癌腫−メルケル細胞、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、皮膚、精巣がん、喉がん、胸腺腫および胸腺癌腫、甲状腺がん、絨毛性腫瘍、妊娠性、尿道がん、子宮がん−子宮内膜、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ならびにウィルムス腫瘍（腎臓がん、小児）からなる群から選択され得る。
【００７７】
好ましい実施形態では、酸化ストレスに関連する疾患の治療は、予防的治療であり得る。酸化ストレスに関連する疾患の治療において、本発明の化合物は、好ましくは、他の製品有効成分（Ａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）と同時投与してもよく、換言すれば、酸化ストレスに関連する疾患の併用療法において使用してもよい。
【００７８】
好ましい実施形態は、好ましくは保存および／または輸送、好ましくは低温保存および／または輸送中に、臓器移植用の臓器における酸化ストレスの治療に使用するための、式（Ｉ）の化合物である。好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、保存および／または洗浄溶液として提供される。好ましくは、移植される臓器は、前記溶液中で浸漬および／または洗浄される。好ましくは、保存溶液は、ヒト臓器用である。臓器は、任意の身体部分または内臓であり得るが、好ましくは、心臓、肝臓、腎臓、および膵臓からなる群から選択され得る。
【００７９】
本発明者らはまた、驚くべきことに、本発明の化合物が、インビトロでの抗炎症アッセイにおいて有意な有効性を示すことを見出した。したがって、バレッチンは、ＬＰＳで誘導した単球、例えば、ＴＨＰ−１細胞において、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）およびインターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）を阻害することが実証された。
【００８０】
そのため、本発明の第３の態様は、炎症性疾患の治療における使用のための、式（Ｉ）の化合物
【００８１】
【化２０】
2016523813.tif 000022
【００８２】
（式中、
ＸおよびＹは、水素およびハロゲンからなる群から独立して選択され、
【００８３】
【化２１】
2016523813.tif 000023
【００８４】
は、単結合または二重結合を表し、
Ｒは、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され、
ｎは、１、２、３、および４から選択される整数である）、
またはその薬学的に許容される塩である。
【００８５】
多数の医学的状態が慢性炎症と関係するかまたは炎症性要素を有しており、したがって、前記炎症性疾患は、好ましくは、酸逆流／胸焼け、座瘡、尋常性座瘡、アレルギーおよび過敏症、アルツハイマー病、強直性脊椎炎、虫垂炎、関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患、気管支炎、滑液包炎、心炎、セリアック病、慢性疼痛、慢性前立腺炎、大腸炎、クローン病、肝硬変、大腸炎、膀胱炎、認知症、皮膚炎、糖尿病、憩室炎、ドライアイ、浮腫、肺気腫、湿疹、線維筋痛症、胃腸炎、歯肉炎、糸球体腎炎、心疾患、肝炎（Ａ、Ｂ、およびＣ型）、高血圧、炎症性心血管疾患、炎症性腸疾患、インスリン抵抗性、間質性膀胱炎、過敏性腸症候群、関節痛、全身性エリテマトーデス、髄膜炎、メタボリックシンドローム（シンドロームＸ）、筋炎、腎炎、肥満、変形性関節症、骨減少症、骨粗鬆症、パーキンソン病、歯周病、骨盤内炎症性疾患、静脈炎、多発動脈炎、多発軟骨炎、乾癬、乾癬性関節炎、再灌流傷害、関節リウマチ、鼻炎、サルコイドーシス、強皮症、副鼻腔炎、シェーグレン症候群、痙攣性結腸、全身性カンジダ症、腱炎、扁桃炎、移植片拒絶反応、膣炎、潰瘍性大腸炎、ならびに血管炎からなる群から選択され得る。
【００８６】
炎症性疾患は、好ましくは、酸逆流／胸焼け、座瘡、尋常性座瘡、アレルギーおよび過敏症、強直性脊椎炎、虫垂炎、関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患、気管支炎、滑液包炎、心炎、セリアック病、慢性疼痛、慢性前立腺炎、大腸炎、クローン病、肝硬変、大腸炎、膀胱炎、皮膚炎、糖尿病、憩室炎、ドライアイ、浮腫、肺気腫、湿疹、線維筋痛症、胃腸炎、歯肉炎、糸球体腎炎、心疾患、肝炎、高血圧、炎症性心血管疾患、炎症性腸疾患、インスリン抵抗性、間質性膀胱炎、関節痛、全身性エリテマトーデス、髄膜炎、メタボリックシンドローム（シンドロームＸ）、筋炎、腎炎、肥満、変形性関節症、骨減少症、骨粗鬆症、パーキンソン病、歯周病、骨盤内炎症性疾患、静脈炎、多発動脈炎、多発軟骨炎、乾癬、乾癬性関節炎、再灌流傷害、関節リウマチ、鼻炎、サルコイドーシス、強皮症、副鼻腔炎、シェーグレン症候群、痙攣性結腸、全身性カンジダ症、腱炎、扁桃炎、移植片拒絶反応、膣炎、潰瘍性大腸炎、ならびに血管炎からなる群から選択される。
【００８７】
炎症性疾患は、好ましくは、アテローム性動脈硬化症である。
【００８８】
好ましい実施形態では、炎症性疾患の治療は、予防的治療であり得る。炎症性疾患の治療において、本発明の化合物は、好ましくは、他の製品有効成分と同時投与してもよく、換言すれば、炎症性疾患の併用療法において使用してもよい。
【００８９】
好ましい実施形態は、好ましくは保存および／または輸送、好ましくは低温保存および／または輸送中に、臓器移植用の臓器における炎症の治療に使用するための、式（Ｉ）の化合物である。好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、保存および／または洗浄溶液として提供される。好ましくは、移植される臓器は、前記溶液中で浸漬および／または洗浄される。好ましくは、保存溶液は、ヒト臓器用である。臓器は、任意の身体部分または内臓であり得るが、好ましくは、心臓、肝臓、腎臓、および膵臓からなる群から選択され得る。
【００９０】
上記の本発明の第２のおよび第３の態様に関して、式（Ｉ）の化合物には、本発明の第１の態様について記載されたのと同じ好ましい実施形態が適用される。したがって、酸化ストレスに関連する疾患または炎症性疾患の治療における使用のための、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩に関する好ましい実施形態では、Ｘは、ハロゲンであり、Ｙは、水素およびハロゲンからなる群から独立して選択され、別の実施形態では、Ｘは、ハロゲンであり、Ｙは、水素である。別の実施形態では、ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群から選択され得る。最も好ましくは、ハロゲンは、臭素である。
【００９１】
Ｃ１〜Ｃ６アルキルは、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキサン、ならびに最大６個の炭素を有する任意の分岐誘導体、例えば、イソプロピルおよびｔｅｒｔ−ブチルを含み得る。さらに別の好ましい実施形態では、Ｒは、水素およびＣ１〜Ｃ３アルキルからなる群から選択される。Ｃ１〜Ｃ３アルキルは、メチル、エチル、プロピル、およびイソプロピルを含み得る。さらに好ましくは、Ｒは、水素である。
【００９２】
別の好ましい実施形態では、ｎは、２である。これは、バレッチン中の炭素鎖の長さに相当する。最後に、別の好ましい実施形態では、
【００９３】
【化２２】
2016523813.tif 000024
【００９４】
は、二重結合を表す。やはり、これは、バレッチン中に存在する二重結合に相当する。
【００９５】
【化２３】
2016523813.tif 000025
【００９６】
が、二重結合を表す、式（Ｉ）の化合物中に存在する二重結合に起因して、この化合物は、ＺおよびＥ異性体の形態で存在し得る。好ましい実施形態では、前記化合物は、ＺおよびＥ異性体の混合物である。別の興味深い実施形態では、前記化合物は、Ｅ異性体である。さらに別の実施形態では、前記化合物は、Ｚ異性体である。
【００９７】
非常に好ましい実施形態では、Ｘは、臭素であり、Ｙは、水素であり、
【００９８】
【化２４】
2016523813.tif 000026
【００９９】
は、二重結合を表し、Ｒは、水素であり、ｎは、２である。さらに好ましい実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、バレッチンである、すなわち、式（ＩＩ）の化合物に相当する：
【０１００】
【化２５】
2016523813.tif 000027
【０１０１】
本発明の化合物が二重結合を含む場合、特に、式（ＩＩ）に定義されたバレッチンである場合、化合物は、好ましくは、海綿Ｇｅｏｄｉａ  ｂａｒｅｔｔｉから化合物を単離すると得られる、ＺおよびＥ異性体の混合物である。さらに好ましくは、化合物は、海綿Ｇｅｏｄｉａ  ｂａｒｅｔｔｉから化合物を単離すると得られる、化合物の主異性体に相当する。代替の実施形態では、化合物は、海綿Ｇｅｏｄｉａ  ｂａｒｅｔｔｉから化合物を単離すると得られる、化合物の副異性体に相当する。バレッチンに関して、ＺおよびＥ異性体は、ＨＰＬＣによって分離可能である。したがって、本発明の化合物は、好ましくは、Ｚ−バレッチン、Ｅ−バレッチン、またはそれらの任意の混合物からなる群から選択され得る。好ましくは、本発明の化合物は、Ｚ−バレッチンである。一般的に、本発明の化合物の所与の異性体またはエナンチオマーに言及する場合、これは、その異性体またはエナンチオマーが、他の異性体および／またはエナンチオマーを実質的に含まない、あるいは他の異性体および／またはエナンチオマーを本質的に含まないことを意味する。したがって、異性体またはエナンチオマーは、９０％の単一の異性体および／またはエナンチオマー、例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、好ましくは、９９．９％の単一の異性体および／またはエナンチオマーであり得る。
【０１０２】
さらに、
【０１０３】
【化２６】
2016523813.tif 000028
【０１０４】
が、二重結合を表す、式（Ｉ）の化合物において、この化合物は、アルギニン側鎖が複素環に連結している、１つのエナンチオマー中心を含む。この位置は、式（ＩＩ）の化合物において「＊」で印が付けられ、
【０１０５】
【化２７】
2016523813.tif 000029
【０１０６】
が、二重結合を表す、本明細書のすべての化合物におけるこの中心の一般的な位置を示す。
【０１０７】
したがって、式（Ｉ）の化合物は、好ましくは、エナンチオマーの混合物であり得る。化合物は、ラセミ体であり得る。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、（Ｓ）−エナンチオマーであり得る。あるいは、それは、（Ｒ）−エナンチオマーであり得る。非常に好ましい実施形態では、化合物は、式（ＩＩ）の化合物バレッチンであり、エナンチオマーまたはエナンチオマーの混合物は、海綿Ｇｅｏｄｉａ  ｂａｒｅｔｔｉからバレッチンを単離すると得られるものである。さらに好ましくは、それは、海綿Ｇｅｏｄｉａ  ｂａｒｅｔｔｉからバレッチンの主（Ｚ／Ｅ）異性体を単離すると得られる、エナンチオマーまたはエナンチオマーの混合物である。一実施形態では、化合物は、（Ｚ，（Ｓ））−バレッチン、（Ｚ，（Ｒ））−バレッチン、（Ｅ，（Ｓ））−バレッチン、および（Ｅ，（Ｒ））−バレッチンからなる群から選択され得る。非常に好ましい実施形態では、本発明の化合物は、（Ｚ，（Ｓ））−バレッチンである。
【０１０８】
本発明の別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、
【０１０９】
【化２８】
2016523813.tif 000030
【０１１０】
が、単結合を表す、化合物である。この実施形態では、ＺおよびＥ異性体は存在しないが、化合物は、ここでは２つのエナンチオマー中心を含み、その理由は、ここで導入された単結合の環炭素もまたエナンチオマー中心であるからである。したがって、
【０１１１】
【化２９】
2016523813.tif 000031
【０１１２】
が、単結合を表す、これらの式（Ｉ）の化合物は、化合物の４つのエピマー、すなわち、（Ｓ，Ｓ）、（Ｒ，Ｒ）、（Ｒ，Ｓ）、および（Ｓ，Ｒ）形態を含み得る。好ましい実施形態では、
【０１１３】
【化３０】
2016523813.tif 000032
【０１１４】
が、単結合を表す、式（Ｉ）の化合物は、任意のそのエピマーを含む（８，９）−ジヒドロバレッチンである。
【０１１５】
本発明の別の態様は、哺乳動物において酸化ストレスまたは炎症を治療する方法であって、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩
【０１１６】
【化３１】
2016523813.tif 000033
【０１１７】
（式中、
ＸおよびＹは、水素およびハロゲンからなる群から独立して選択され、
【０１１８】
【化３２】
2016523813.tif 000034
【０１１９】
は、単結合または二重結合を表し、
Ｒは、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され、
ｎは、１、２、３、および４から選択される整数である）
を前記哺乳動物に投与することを含む、方法である。好ましくは、前記哺乳動物は、ヒトである。
【０１２０】
本発明の別の態様は、臓器用の保存および／または洗浄溶液における使用のための、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩である。好ましくは、溶液は、ヒト臓器用である。臓器は、任意の身体部分または内臓であり得るが、好ましくは、心臓、肝臓、腎臓、および膵臓からなる群から選択され得る。好ましくは、移植される臓器は、前記溶液中で浸漬および／または洗浄される。
【０１２１】
さらに別の態様は、臓器の保存および／または洗浄用の溶液における、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用である。好ましくは、溶液は、ヒト臓器用である。臓器は、任意の身体部分または内臓であり得るが、好ましくは、心臓、肝臓、腎臓、および膵臓からなる群から選択され得る。好ましくは、移植される臓器は、前記溶液中で浸漬および／または洗浄される。
【０１２２】
本発明の別の態様は、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬調製物である。
【０１２３】
本発明のさらに別の態様は、式（Ｉ）の化合物または任意の薬学的に許容されるその塩と、好ましくはまた薬学的に許容される担体とを含む、臓器用の保存および／または洗浄溶液である。好ましくは、保存溶液は、ヒト臓器用である。臓器は、任意の身体部分または内臓であり得るが、好ましくは、心臓、肝臓、腎臓、および膵臓からなる群から選択され得る。好ましくは、移植される臓器は、前記溶液中で浸漬および／または洗浄される。
【０１２４】
ヒトまたは動物の身体の老化は、その生涯の間に前記身体がさらされる酸化ストレスに密接に関連する。式（Ｉ）の化合物は、酸化ストレスに関連する疾患の治療における潜在性を示したことから、化合物はまた、例えば皮膚の老化を含む、様々な老化の前兆を処置する潜在性を持つということになる。したがって、本発明の別の態様は、皮膚老化の美容的処置のための、その塩を含む式（Ｉ）の化合物の使用である。皮膚老化は、しわを含み得る。
【０１２５】
最後に、式（Ｉ）の化合物は潜在的抗酸化能を示したことから、また酸化防止剤は食品または飼料製品において使用され得ることから、本発明の化合物は、食品または飼料添加物としても有用であり得る。そのため、本発明のさらに別の態様は、食品および／または飼料添加物としての、式（Ｉ）の化合物の使用である。
【０１２６】
本発明の態様の１つに関して記載された実施形態および特徴は、本発明の他の態様にも適用されることに留意されたい。
【０１２７】
本出願において引用したすべての特許および非特許参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２８】
本発明をこれから以下の非限定的な実施例においてさらに詳細に説明する。
【実施例】
【０１２９】
［実施例１］
バレッチンの精製、単離、および同定
海綿は、バレンツ海の深さ３９０ｍで底引き網によって２００５．０８．０８に採取された。
【０１３０】
凍結乾燥された材料を、４℃で暗所において８時間超純水（２×１０００ｍｌ）で２回抽出した。試料を４５００ｇおよび５℃で３０分間遠心分離し、ペレットを凍結乾燥した。凍結乾燥されたペレットを、４℃で暗所において８時間ジクロロメタン：メタノール（１：１、体積：体積）１０００ｍｌで２回抽出し、その後、試料をＷｈａｔｍａｎ  Ｎｏ３フィルターを通して濾過した。濾液を４０℃および減圧でロータリーエバポレーターにおいて減少させて橙色油状液体とし、９．１７ｇの有機抽出物が得られた。有機抽出物を、５、２５、５０、および７５％メタノール水溶液ならびに２つの最終段階の１００％メタノールおよび１００％アセトンによる溶媒段階勾配系を使用して、ＨＰ２０樹脂でクロマトグラフにかけた。５０％メタノールで溶出する画分を減少させて乾固し、５０％アセトニトリル水溶液１ｍｌに溶解し、Ｗａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣ自動精製システムを使用してバレッチンを単離した。バレッチンは、Ｗａｔｅｒｓ  ＸＴｅｒｒａ  Ｃ１８カラム（１０×３００ｍｍ、１０μｍ）で、ともに０．１％ギ酸を含有する２５から３５％のアセトニトリルおよび水の勾配ならびに６ｍｌ／分の流速で単離した。バレッチンの２つの異性体が２つのピークにおいて溶出され、１２．９および３．９ｍｇの純粋化合物が得られた（それぞれ保持時間５．１および６．３）。高分解能ＥＳＩＭＳにより、ｍ／ｚ４１９．０８３０［Ｍ＋Ｈ］＋が得られた、Ｃ１７Ｈ１９ＢｒＮ６Ｏ２（［Ｍ＋Ｈ］＋）の計算値ｍ／ｚ４１９．０８２６。
【０１３１】
［実施例２］
バレッチンおよび脱ブロモバレッチンの合成
バレッチンおよびその脱臭素化類似体は、以下の合成工程によって提供される合成方法によって得ることもできる。
２−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）−２−ヒドロキシ酢酸（３）（バッチ６５８、６６１）
【０１３２】
【化３３】
2016523813.tif 000035
【０１３３】
カルバミン酸ベンジル（１５１．１７ｇ／ｍｏｌ、２３ｇ、０．１５ｍｏｌ、１当量）およびグリオキシル酸一水和物（９２．０５ｇ／ｍｏｌ、１５．３ｇ、０．１６６ｍｏｌ、１．０９当量）を、Ｅｔ２Ｏ  １２５ｍｌに懸濁した。室温で１時間撹拌した後、透明混合物が得られた。室温で終夜撹拌を続けた。得られた白色沈殿物を濾過し、冷Ｅｔ２Ｏで洗浄し、真空で乾燥した。化合物（２１．２３ｇ、６３％、１３．６７ｇ、６８％）を、その後精製することなく次の工程において直接使用した。
1HNMR (MeOD): ppm, 7.37-7.28 (m, 5H), 5.41 (s, 1H, NH), 5.11 (s, 1H), 4.89 (s, 2H); MS 248.0530 C10H11O5NNa
メチル２−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）−２−メトキシアセテート（４）（バッチ６５９、６６２）
【０１３４】
【化３４】
2016523813.tif 000036
【０１３５】
ＭｅＯＨ  ２１４ｍｌ中のＣｂｚ−アミノヒドロキシ酢酸（上記参照）の溶液に、濃Ｈ２ＳＯ４（２．１ｍｌ）を室温で添加した。混合物を室温で２日間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をＥｔＯＡｃ（約１００ｍｌ）に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３（約１００ｍｌ）を０℃（氷浴）で添加し、有機層をＨ２Ｏ（２×６０ｍｌ）およびブライン（６０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させた後、これは白色固体６．５０ｇ（４１％）として得られた。
メチル２−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）−２−（ジエトキシホスホリル）アセテート（５）
【０１３６】
【化３５】
2016523813.tif 000037
【０１３７】
ＰＣｌ３（１３７．３３ｇ／ｍｏｌ、１．５７ｇ／ｍｌ、Ｒ＝Ｅｔ  １．１８ｍｌ、１３．３ｍｍｏｌ）を、トルエン４０ｍｌ中のＣｂｚＮＨ−エステル（２５３．２４ｇ／ｍｏｌ、Ｒ＝Ｅｔ  ３．３４ｇ、１３．３ｍｍｏｌ）の溶液に８０℃で添加した。混合物を７５〜８０℃で終夜撹拌し、次いで、Ｐ（ＯＥ）３（１６６．１６ｇ／ｍｏｌ、０．９５５ｇ／ｍｌ、２３ｍｌ、１３．３ｍｍｏｌ）を添加し、以後３〜６時間加熱を続けた。溶媒を蒸発させ、残渣をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（ＮａＨＣＯ３水溶液をＥｔＯＡｃで過抽出（ｅｘｔｒａ  ｅｘｔｒａｃｔ）した）およびブラインで洗浄した。溶媒相をＭｇＳＯ４で乾燥した。得られた結晶をＥｔＯＡｃ：Ｃ５から再結晶した。白色結晶、Ｒ＝Ｅｔ、４．１０ｇ（８６％）。
1HNMR (meod): ppm, 7.37 - 7.29 (m, 5H, Ph), 5.14 - 5.07 (q, 2H), 4.95 - 4.89 (dd, 1H), 4.17 - 4.12 (m, 4H), 3.78 (s, 3H, OCH3), 1.31 - 1.25 (m, 6H).
1HNMR (cdcl3): ppm, 7.30 - 7.25 (m, 5H, Ph), 5.86 - 5.84 (d, 1H), 5.12 - 4.89 (q, 2H), 4.89 - 4.81 (dd, 1H), 4.14 - 4.07 (m, 4H), 3.78 (s, 3H, OCH3), 1.30 - 1.22 (m, 6H).
【０１３８】
【表１】
2016523813.tif 000038
【０１３９】
メチル２−アミノ−２−（ジエトキシホスホリル）アセテート（６）
【０１４０】
【化３６】
2016523813.tif 000039
【０１４１】
化合物５（１ｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ中室温でパラジウム触媒１０％Ｐｄ／Ｃ（０．１ｍｏｌ）およびバルーンからのＨ２流の存在下で、水素化／脱ベンジル化して生成物６とした。１時間または終夜の後、触媒をセライトで濾別し、ＭｅＯＨで洗浄し、溶媒を蒸発させ、得られた油状物を直ちにＤＣＭに溶解し、次の工程に使用した。
ＴＬＣ：ＥｔＯＡｃまたはＥｔＯＡｃ：Ｃ５（２：１）。
バッチ６６４：1HNMR (CDCl3, ppm): 4.22 - 4.15 (m, 4H), 3.98 - 3.89 (m, 1H, CH), 3.80 (s, 3H), 1.79 - 1.74 (m, dd, 2H, NH), 1.36 - 1.32 (m, 6H).
【０１４２】
【表２】
2016523813.tif 000040
【０１４３】
メチル−２−（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎω，Ｎω’−ビス（Ｂｏｃ）−Ｌ−アルギニル）アミノ−２−ジエトキシホスフィニルアセテート（７）
【０１４４】
【化３７】
2016523813.tif 000041
【０１４５】
Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２００４、（６０）、４、９６１〜９６５頁に準拠。ＤＣＭ  ５０ｍｌに溶解した新たに得られた化合物６（上記参照）を、ＤＣＭ  ２５ｍｌ中のＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＯＨ（４．６ｇ、９．７ｍｍｏｌ、４７４．５６ｇ／ｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１．５ｇ、１１ｍｍｏｌ、１３５．１３ｇ／ｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（２．６ｇ、１３ｍｍｏｌ、１９１．７ｇ／ｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（２．３４ｇ、１３ｍｍｏｌ、１２９．２５ｇ／ｍｏｌ、０．７４２ｇ／ｍｌ）の氷冷混合物に添加した。反応混合物を室温まで温め、３日間撹拌した。溶媒を蒸発させ、ＥｔＯＡｃを添加し、２×Ｈ２Ｏおよびブラインで洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥した。生成物をシリカ、ＥｔＯＡｃ：ペンタン（１：１から３：１）で精製した。白色結晶、１．１ｇ（１２．５％、化合物５から計算）が得られた。
６６５：1HNMR (CDCl3, ppm): 9.48 - 9.18 (d, 2H), 7.23 - 7.18 (?), 7.17 - 7.05(?), 5.84 - 5.64 (d, 1H), 5.21 - 5.11 (m, 1H), 4.18 - 4.10 (m, 4H), 3.91 - 3.88 (m, 1H), 3.82 - 3.79 (d, 3H, OCH3), 1.82 - 1.76 (m, 1H), 1.69 - 1.67 (m, 2H), 1.51 - 1.45 (m, Boc), 1.32 - 1.29 (m, 4H), 1.27 - 1.23 (m, 1H). HRMS (MeOH): (M+H)+ C28H53N5O12Pの計算値 682.3429, 実測値: 682.3417;
【０１４６】
【表３】
2016523813.tif 000042
【０１４７】
メチル（２Ｓ）−２−（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎω，Ｎω’−ビス（Ｂｏｃ）−Ｌ−アルギニル）アミノ−３−（１−Ｂｏｃ−インドール−３−イル）プロパ−２−エノエート（８）
【０１４８】
【化３８】
2016523813.tif 000043
【０１４９】
Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２００４、（６０）、４、９６１〜９６５頁に準拠して、化合物７（１．１ｇ、１．６ｍｍｏｌ、６８１ｇ／ｍｏｌ、１当量）を、アルゴン下でＤＣＭ（モレキュラーシーブで乾燥）８ｍｌに溶解した。溶液に、ＤＣＭ  ８ｍｌ中のＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ７エン、０．５ｍｌ、３．２ｍｍｏｌ、１５２．２４ｇ／ｍｏｌ、１．０１８ｇ／ｍｏｌ）を−７８℃（ドライアイス／アセトン）でゆっくりと添加した。混合物を−７８℃で３０分間撹拌し、ＤＣＭ  ８ｍｌ中の６−ブロモ−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−インドール−３−カルボキシアルデヒド１１（０．５２ｇ、１．６ｍｍｏｌ、３２３ｇ／ｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温まで温め、終夜撹拌した。溶媒を蒸発させ、ＥｔＯＡｃを添加し、Ｈ２Ｏおよびブラインで洗浄し、有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、生成物をシリカで精製した（６％ＭｅＯＨ：ＤＣＭまたはＥｔＯＡｃ：Ｃ５  １：２）。白色固体（１．０６ｇ、７８％）が得られた。
1HNMR (400 MHz, CDCl3, ppm): δ 9.47 (s, 1H), 9.34 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 8.33 (s, 1H), 7.82 (s, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.56 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.39 (dd, J = 8.5, 1.8 Hz, 1H), 6.16 (s, 1H), 4.56 - 4.46 (m, 1H), 4.09 (s, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.49 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 1.89 - 1.81 (m, 2H), 1.78 - 1.74 (m, 2H), 1.66 (s, 9H), 1.59 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 1.52 (s, 9H), 1.46 (s, 9H), 1.35 (s, 9H). HRMS (MeOH): C38H56N6O11Brの計算値851.3193, 実測値: 851.3168.
【０１５０】
【表４】
2016523813.tif 000044
【０１５１】
バレッチン（Ｒ＝Ｂｒ）（９）（ＭＢＣ−０１１と称される）
ａ．Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２００４、（６０）、４、９６１〜９６５頁に準拠した手順
【０１５２】
【化３９】
2016523813.tif 000045
【０１５３】
バレッチンの調製のための手順：ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸、０．８６ｍｌ、１１ｍｍｏｌ、１１４．０２ｇ／ｍｏｌ、１．４８９ｇ／ｍｌ）を、ＤＣＭ  １０．４ｍｌ中の化合物８（０．５２ｇ、０．６１ｍｍｏｌ、８５１ｇ／ｍｏｌ）の溶液に添加し、混合物を室温で終夜撹拌した（反応中にＭＳを確認）。溶媒を蒸発させ、赤色油状物に、１−ブタノール１０ｍｌ中の酢酸０．７５ｍｌおよびＮＭＭ（Ｎ−メチルモルホリン）６０μｌを添加した。混合物を２〜４時間還流し（１２８℃）、室温に冷却した後、Ｈ２Ｏおよびブラインで洗浄し、有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、溶媒を蒸発させ、得られた赤みを帯びた白色固体０．２２ｇ（８６％）を真空で乾燥した。
【０１５４】
【表５】
2016523813.tif 000046
【０１５５】
脱ブロモバレッチン（Ｒ＝Ｈ）は、それに準じて、すなわち、Ｒ＝Ｈである上記と類似の手順に従って調製した。
ｂ．代替の手順：
メチル２−（２−アミノ−５−グアニジノペンタンアミド）−３−（６−ブロモ−１Ｈ−インドール−３−イル）アクリレート（１２）
【０１５６】
【化４０】
2016523813.tif 000047
【０１５７】
ジオキサン（３．８ｍｌ）中の４Ｍ  ＨＣｌを化合物８（１７１ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）に添加した。混合物を室温で終夜撹拌した。得られた赤みを帯びた沈殿物を濾過し、真空で乾燥した。収率１００％超（ＨＣｌ塩からなる）。
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.16 (s, 1H), 10.15 (s, 1H), 8.46 (s, 3H), 8.20 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.77 - 7.69 (m, 2H), 7.66 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.26 (dd, J = 8.4, 1.8 Hz, 1H), 4.58 (s, 2H), 4.18 (s, 1H), 3.72 (s, 3H), 3.22 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 1.91 (s, 2H), 1.72 (s, 2H). HRMS (MeOH): C18H24BrN6O3の計算値451.1093, 実測値: 451.1089.
【０１５８】
バレッチン（９）（（１２）から）
【０１５９】
【化４１】
2016523813.tif 000048
【０１６０】
粗化合物１２（約０．１３ｇ）をＥｔＯＨ  １２ｍｌに溶解し、塩基を添加した。混合物を８０℃で１〜２時間マイクロ波で照射した。溶媒を蒸発させ、赤みを帯びた残渣をｎ−ＢｕＯＨに溶解し、Ｈ２Ｏ  ３×２０ｍｌで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥した。赤色固体が得られた。
ＨＲＭＳ（ＭｅＯＨ）：Ｃ１７Ｈ２０ＢｒＮ６Ｏ２の計算値４１８．０７５３、実測値：４１９．０８２１。
【０１６１】
【表６】
2016523813.tif 000049
【０１６２】
実施例および図面において、別段の記述がない限り、単離されたバレッチンの主な異性体は、ＭＢＣ−００５と称され、脱臭素化合成類似体、すなわち、臭素が水素で置き換えられたバレッチンのＺ異性体は、ＭＢＣ−００７と称される。ＭＢＣ−０１１と称される化合物は、ＭＢＣ−００５に相当するが、上記の合成方法によって得られたものであり、したがって、Ｚ−異性体である。これはまた、（Ｂｏｃ保護された）天然アミノ酸アルギニンを出発材料として使用することによって得られる（Ｓ）−エナンチオマーである。化合物構造は図１にも示される。
【０１６３】
抗酸化作用
本発明者らは、下記の実施例に概説するように、バレッチンおよび類似体の抗酸化作用を実証した。酸化ストレスは、特に心血管疾患およびがんを含む、多数の疾患に関連することから、これらの結果は、そのような疾患に対するバレッチンの新規な潜在的治療能の裏付けとなる。
【０１６４】
［実施例３］
ＦＲＡＰアッセイ
本発明者らは、生化学的アッセイＦＲＡＰ（鉄還元酸化防止力）を使用して、ＭＢＣ−００５（単離された臭素化）およびＭＢＣ−００７（合成の脱臭素化）の潜在的酸化防止能の兆候を得た。用量応答活性が両方の化合物について観察された（図２）。３０μｇ／ｍｌ（７１．６μＭ）の濃度において、ＭＢＣ−００５は、７７μＭ  ＴＥのＦＲＡＰ値を有していた。比較のため、３０μｇ／ｍｌ（１０５μＭ）のルテオリンは、１５１μＭ  ＴＥのＦＲＡＰ値を有していた（データ示さず）。
【０１６５】
試薬はｂｅｎｚｉｅ，Ｉ．Ｆ．Ｆ．ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９６、２３９、７０〜７６頁に準拠して調製し、ＤＴＸ８８０  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＣＡ、米国）において５９５ｎｍで実施した。Ｔｒｏｌｏｘ（Ｓｉｇｍａ、２３８８１３）を使用して、標準曲線を準備した（０〜２５０μＭ；作用濃度）。ＦＲＡＰ試薬（ＴＰＴＺ（２，４，６−トリス（２−ピリジル）−ｓ−トリアジン）：Ｆｌｕｋａ、９３２８５；Ｆｅ：Ｍｅｒｃｋ１０３９４３）は毎日調製した。アッセイは、透明９６ウェルプレート中で、試料２０μｌおよびＦＲＡＰ試薬１５０μｌを各ウェルに２連で添加して実施した。水をブランクとして使用した。試料を３７℃で３０分間インキュベートした後で、プレートを読み取った。各試料からブランクを減算し、２連のＴｒｏｌｏｘ試料の平均吸光度から標準曲線を作成した。標準曲線から生成された方程式を使用して、各試料からｔｒｏｌｏｘ当量（ＴＥ）を計算した。結果はμＭ  ＴＥとして表示した。
【０１６６】
［実施例４］
ＯＲＡＣアッセイ
本発明者らは、生化学的アッセイＯＲＡＣ（酸素ラジカル吸収能）を使用して、ＭＢＣ−００５（単離された臭素化）およびＭＢＣ−００７（合成の脱臭素化）の潜在的酸化防止能の兆候を得た。用量応答活性が両方の化合物について観察された（図３）。３０μｇ／ｍｌ（７１．６μＭ）の濃度において、ＭＢＣ−００５は、５．５μＭ  ＴＥを有していた。
【０１６７】
方法は、Ｈｕａｎｇ，Ｄ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００２、５０、４４３７〜４４４４頁から改変した。アッセイは、黒色９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ７３５０００４）中で、Ｖｉｃｔｏｒ３  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＭＡ、米国）を使用して３７℃で実施した（励起４８６ｎｍ、発光５２０ｎｍ）。すべての試薬を７５ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢ）（ｐＨ７．４）に溶解した。異なる濃度のＭＢＣ−００５およびＭＢＣ−００７調製物を２連で添加し、続いて、フルオレセイン（Ｆｌｕｋａ、４６９６０）１２５μｌを添加した（５２ｎＭの最終濃度）。３７℃で１５分間インキュベートした後、ＡＡＰＨ（２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、４４０９１４）６０μｌを各試料に素早く添加した（４４ｍＭの最終濃度）。蛍光を３７℃で２５回、繰り返し間隔７０秒で記録した。Ｔｒｏｌｏｘ（０〜２５μＭの作用濃度）を各実行に含めて、標準曲線を作成した。ＰＢをブランクとしておよび０μＭのＴｒｏｌｏｘ試料に使用した。ＡＵＣＢｌａｎｋ値を減算することによって曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。Ｔｒｏｌｏｘ値を使用して標準曲線を作成し、得られた方程式から試料のＴｒｏｌｏｘ当量を計算した。結果はμＭ  ＴＥとして表示した。
【０１６８】
［実施例５］
ＣＬＰＡＡアッセイ
ＨｅｐＧ２細胞を、ゲンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ、Ａ２７１２）、非必須アミノ酸（１％、Ｋ０２９３）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ、Ｌ０４７３）、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン（２ｍＭ、Ｋ０３０２）、およびウシ胎仔血清（１０％、Ｓ０１１５）を補充したＭＥＭイーグル培地（Ｆ０３２５）中で増殖させ、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。培地および補充物は、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ（Ｂｅｒｌｉｎ、ドイツ）製であった。
【０１６９】
本発明者らは、細胞脂質過酸化酸化防止活性（ＣＬＰＡＡ）アッセイを使用した。このアッセイは、細胞内ＲＯＳ（活性酸素種）および膜酸化防止活性をそれぞれ測定する。臭素化バレッチン分子は、ＣＬＰＡＡアッセイにおいて、対照と比較して５５％の酸化減少をもたらした。しかしながら、脱臭素化合成類似体は、このアッセイにおいて、いかなる有意な活性も示さなかった（図４）。
【０１７０】
１ウェル当たりおよそ８０，０００個のＨｅｐＧ２細胞を、透明底の黒色９６ウェルプレート（＃３６０３、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、米国）に播種し、終夜インキュベートした。細胞をＣ１１−ＢＯＤＩＰＹ（＃Ｄ３８６１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で３０分間標識し、様々な濃度の試験化合物とともに１時間インキュベートした。クメンヒドロペルオキシド（ｃｕｍＯＯＨ、＃２４７５０２、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加して脂質過酸化を開始させ、プレートを直ちにＶｉｃｔｏｒ３  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＭＡ、米国）に入れた。赤色（５９０／７ｎｍ（励起）、６３２／４５ｎｍ（発光））および緑色（４８５／１４ｎｍ、５２０／１０ｎｍ）蛍光の両方を、約１時間の間記録した。新たな試薬の添加の間に、細胞をＰＢＳで洗浄した。総反応体積は１００μｌであった。インキュベートはすべて３７℃、５％ＣＯ２で実施した。阻害パーセントを陽性対照（試験化合物なしのｃｕｍＯＯＨ）に対して計算した。
【０１７１】
［実施例６ａ]
炎症に関連するサイトカインの阻害
腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）およびインターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）はともに、炎症応答に関係するサイトカイン（小さい細胞シグナル伝達タンパク質分子）である。したがって、本発明者らは、単離されたバレッチン（本実験ではＭＣＢ−０１１と称される）がＬＰＳで誘導した単球（ＴＨＰ−１細胞）におけるこれらのサイトカインの分泌を阻害する能力を試験した。結果を図５に示し、ここで、バレッチンは、７５および１００μｇ／ｍｌの濃度において、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの有意な阻害を示す。
【０１７２】
ＴＨＰ−１細胞を、ゲンタマイシンおよびＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０中で増殖させ、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。単球をマクロファージに分化させるため、５０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡを添加した。５０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡを補充したおよそ１０５個の細胞を９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。２４時間後に顕微鏡を使用して細胞を制御して、それらが分化を始めたことを確かめた。４８時間後、細胞を洗浄し、新たなＲＰＭＩ（ＰＭＡなし）を添加した後で、さらに２４時間インキュベートした。
【０１７３】
細胞に、新鮮な培地９０μｌおよび様々な濃度の試験化合物１０μｌを２重で添加した。１時間インキュベートした後、陰性対照を除くすべての試料に１ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを添加した。続いて、３７℃で６時間インキュベートした。インキュベート直後に、プレートを−８０℃で凍結させることによって反応を停止させた。ＥＬＩＳＡ試験の１日前に、ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６Ｆウェルプレートを２μｇ／ｍｌの捕捉抗体（Ａｂ）でコーティングし、終夜冷蔵庫に入れた。各工程の間に、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＴＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。２００μｌの体積のブロッキング緩衝液（２％ＢＳＡを添加したＴＢＳ）をプレートに添加し、それらを振盪しながら室温で１時間インキュベートした。試料を適切に希釈し、プレートに添加した。標準物質を各プレートに添加した。振盪しながら室温で２時間さらにインキュベートを行った。ビオチン抗ヒトＡｂをアッセイ希釈液（１％ＢＳＡを含むＴＢＳ）で３μｇ／ｍｌに希釈し、各ウェルに添加した。続いて、室温で１時間インキュベートした。希釈したＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）−Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを添加し、プレートを３０分間インキュベートした。ｐＮＰＰ基質を１Ｍジエタノールアミン緩衝液ｐＨ９．８で１ｍｇ／ｍｌに溶解し、１００μｌを各ウェルに添加し、プレートを４５分間インキュベートした。結果をＤＴＸ８８０で４０５ｎｍで読み取った。
【０１７４】
［実施例６ｂ］
炎症に関連するサイトカインの阻害
単球は、多様なサイトカインを放出することによって炎症性刺激に応答することが広く認識されており、ＩＬ−６は、活性化単球における高度に発現される炎症促進性サイトカインである。このアッセイの原理は、単球由来細胞株（ＴＨＰ−１）に由来するヒト細胞を公知の抗炎症薬（デキサメタゾン；Ｄｅｘ）、または多様な濃度のバレッチンとプレインキュベートすることが、炎症性刺激、リポ多糖（ＬＰＳ）に応答したＩＬ−６産生に及ぼす作用を比較することであった。
【０１７５】
ＴＨＰ−１細胞（Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ、Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ、英国）を、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミンと１００ＩＵ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＰＡＡ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ、Ｙｅｏｖｉｌ、英国）を含有するＲＰＭＩ１６４０中、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。細胞を浮遊状態で増殖させ、次いで、２４ウェルプレートに１ウェル当たり細胞２×１０５個でプレーティングした。
【０１７６】
処置：
ａ．ビヒクル対照（ＲＰＭＩ１６４０＋０．５％ＤＭＳＯ）
ｂ．１０μＭのＤｅｘで２４時間
ｃ．１０μｇ／ｍｌのＬＰＳで２４時間
ｄ．１０μＭのＤｅｘで３０分間前処置、続いて、１０μｇ／ｍｌのリポ多糖ＬＰＳで２４時間
ｅ．１、３、１０、３０、および１００μｇ／ｍｌのバレッチンで３０分間前処置、続いて、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳで２４時間
Ｄｅｘおよびバレッチンの濃度は、インキュベート期間を通じて一定のままであり、最終ＤＭＳＯ濃度は０．５％であった。細胞を３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
【０１７７】
インキュベートに続いて、細胞および上清を１．５ｍｌ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）チューブに回収し、３００ｇで室温で３分間遠心分離することによって、上清から細胞および残屑を取り除いた。上清を清浄な１．５ｍｌ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）チューブに移し、−８０℃で保存した。
【０１７８】
ＩＬ−６発現を、ＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ヒトＩＬ−６  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＥＬＩＳＡ）によって製造業者の指示に準拠して測定した。ＶａｒｉｏＳｋａｎ  ＦｌａｓｈプレートリーダーおよびＳｋａｎＩｔソフトウェアｖ２．４．３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ、英国）を使用してデータを収集した。
【０１７９】
パイロットデータは、バレッチン単独でのＴＨＰ−１細胞の処置により、ＩＬ−６発現の上方調節が生じないことを示した。
【０１８０】
結果を図１３に示す。ＬＰＳで誘導したＩＬ−６産生に対するバレッチン（１〜１００μｇ／ｍｌ）の明らかな濃度依存性作用が存在する。作用は１μｇ／ｍｌ（約２．４μＭ）の濃度においても有意であった。デキサメタゾン（１０μＭ）は、ＬＰＳで処置した細胞におけるＩＬ−６産生を消失させた。バレッチンの細胞毒性作用は、最高濃度においては否定することができないが、３０μｇ／ｍｌ以下のバレッチンについての結果は、これらの細胞における真の抗炎症作用を反映している。
【０１８１】
細胞毒性
ある特定の疾患の治療においていくらかの細胞毒性は容認され得るが、一般的に、医薬の活性種が、関連する疾患に対する有効性が有意となる濃度において、細胞毒性をほとんどまたは全く示さなければ有利である。下記の実施例では、本発明者らは、バレッチンおよび類似体が、治療的に意義のある濃度において、細胞毒性をほとんどまたは全く示さないことを示した。
【０１８２】
［実施例７］
ＨｅｐＧ２およびＭＲＣ５細胞に対する細胞毒性アッセイ
バレッチンの以前に報告された抗汚損特性は、ＨｅｐＧ２細胞において毒性を示す可能性があり、臭素はバレッチンに細胞毒性の性質を与える。そのため、化合物の細胞毒性を確認することは重要であった。肝細胞は、毒性を研究するための良好なモデルであり、その理由は、肝臓が、薬物の代謝および生体内変換の主要部位であるからである。薬物は、多くの場合、肝臓で生体内変換されて代謝物の親水性を高め、これは、毒性代謝物を生成することによって薬物化合物を毒性にすることがある。肝細胞および正常肺線維芽細胞を使用して、細胞毒性を試験した。
【０１８３】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、細胞毒性を、ＨｅｐＧ２およびＭＲＣ−５細胞（正常肺線維芽細胞）で、２時間（ＨｅｐＧ２）および２４時間（ＨｅｐＧ２およびＭＲＣ−５）試験した。ＭＢＣ−００５およびＭＢＣ−００７は、試験した濃度では、ＨｅｐＧ２またはＭＲＣ５細胞に対して毒性でなかった（図６および図７）。ＣＬＰＡＡアッセイでは、細胞を試験化合物に１時間曝露した後で洗浄した。したがって、２時間の曝露により、ＭＢＣ化合物がＣＬＰＡＡアッセイにおいて細胞死および誤った結果を引き起こす可能性があるかどうかが検出される。ＭＲＣ５およびＨｅｐＧ２細胞をまた、バレッチン化合物に２４時間曝露した。これにより、より長期的な損傷、または何らかの毒性が膜溶解以外の何かによって引き起こされたかどうかが明らかになる。単離されたバレッチンの細胞毒性をまた、７２時間の期間にわたり試験した（データ示さず）ところ、化合物は濃度が１００μｇ／ｍｌに達するまで細胞毒性を示さなかった。これは、ＣＬＰＡＡアッセイにおいて使用された濃度を上回った。
【０１８４】
ＨｅｐＧ２およびＭＲＣ−５細胞を、ゲンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ、Ａ２７１２）、非必須アミノ酸（１％、Ｋ０２９３）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ、Ｌ０４７３）、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン（２ｍＭ、Ｋ０３０２）、およびウシ胎仔血清（１０％、Ｓ０１１５）を補充したＭＥＭイーグル培地（Ｆ０３２５）中で増殖させ、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。培地および補充物は、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ（Ｂｅｒｌｉｎ、ドイツ）製であった。
【０１８５】
細胞毒性を、ＨｅｐＧ２およびＭＲＣ−５細胞（正常ヒト肺線維芽細胞）において、２時間（ＨｅｐＧ２）および２４時間（ＨｅｐＧ２およびＭＲＣ−５）研究した。２時間の研究については、１ウェル当たり８００００個のＨｅｐＧ２細胞を播種した。２４時間の研究については、５００００個のＨｅｐＧ２細胞および７５００個のＭＲＣ−５細胞を使用した。細胞を終夜増殖させ、次いで、ＰＢＳで洗浄し、上記のとおり補充したがＦＢＳを含まないＭＥＭイーグル培地で希釈した様々な濃度の試験化合物５０μｌを添加した。インキュベート後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）１０μｌを添加し、次いで、プレートをさらに１時間インキュベートした。吸光度をＤＴＸ８８０  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒにおいて４８５ｎｍで測定した。結果を陽性対照と比較した生存％として計算した。
【０１８６】
［実施例８］
インビボアッセイ：
動物および飼育
３６匹のメスのａｐｏＥ−／−マウス（Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ）、５週齢をＴａｃｏｎｉｃから入手した。１週間の馴化後に、マウスに耳標を付け、処置当たりケージ数が等しい３つの実験群に無作為に割り振った。マウスはすべて、従来の実験動物ユニットにおいて、１２時間の昼夜サイクル（０６００時に点灯）で、２１℃および５５％相対湿度の同じ室内で飼育した。マウスは１６週間飼料を自由に摂取し、ケージおよび床敷は週に１回交換した。研究は、ノルウェー国立動物実験委員会（Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認され、欧州実験動物学会連合（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ）の推奨に従って、実験用動物の管理および使用に関するノルウェー法に準拠して行われた。マウスは病原体を持たないと健康証明書に記述された。
【０１８７】
食餌
マウスを３つの群（１群当たり１２匹）に割り当て、西洋型食（ＷＤ、対照食）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｄｉｅｔ  Ｄ１２０７９Ｂ、１７エネルギーパーセントのタンパク質、４３エネルギーパーセントの炭水化物、および４０エネルギーパーセントの脂質）を与えた。バレッチン食（ＢＡＲ）は、食餌１ｋｇ当たりバレッチン５７ｍｇを補充したものであり、Ｏｌｉｖｉｔａ食（ＯＬＩ）は、１％（質量／質量）のＯｌｉｖｉｔａ（Ｏｌｉｖｉｔａ  ＡＳから入手したアザラシ油およびオリーブ油の混合物）で強化されたＷＤであった。実験食は、等カロリーおよび等コレステロール（ｉｓｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｉｃ）となるよう設計された。
【０１８８】
アテローム性動脈硬化症の分析
マウスを３時間の絶食に供した後で安楽死させた。心臓穿刺によって採血し、主な臓器に残留血液が残存しなくなるまで、マウスを滅菌生理食塩水（０．９％）で左心室を通して灌流した。近位上行大動脈から腸骨動脈の分岐部までの大動脈全体をインサイチューで外膜周囲組織から剥がし、大動脈弓から腸骨分岐部まで切開した。大動脈を縦に開き、固定し、スライドに載せて準備した。対物レンズを走査することによって大動脈画像を作成し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して病変面積を評価し、アテローム性動脈硬化症の程度を、アテローム性動脈硬化病変が占める動脈の総面積の百分率として報告した。
【０１８９】
血清コレステロール、ＬＤＬコレステロール、トリアシルグリセロール、およびｏｘＬＤＬの決定
血清総コレステロール、ＬＤＬコレステロール、およびトリグリセリド濃度は、ＭａｘＭａｔバイオアナライザー（ＭａｘＭａｔ  ＰＬ  ＩＩ、Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、フランス）を使用して従来の酵素キットによって決定した。血清ｏｘＬＤＬは、Ｕｓｃｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．製のＥＬＩＳＡキットを使用して製造業者の指示に準拠して決定した。
【０１９０】
統計分析
結果は平均６ＳＥＭとして提示する。Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−ＳｍｉｒｎｏｖおよびＳｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ検定を使用して変数の分布を決定し、正規分布していない変数は、統計分析の前に対数変換した。データをＡＮＯＶＡによって分析し、続いて、Ｔｕｋｅｙの事後検定またはＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定を行った（ＳＰＳＳ１７．０；ＳＰＳＳ）。Ｐ、０．０５を有意と見なした。
【０１９１】
図８Ａ、８Ｂは、バレッチン（ＢＡＲ）またはＯｌｉｖｉｔａ（ＯＬＩ）を含有するＷＤと比較した西洋食（ＷＤ）の、アポリポタンパク質Ｅ欠損マウスへの７週間の給餌が、血清総コレステロール（ｍｍｏｌ／Ｌ）および血清ＬＤＬコレステロール（ｍｍｏｌ／Ｌ）（図８Ａ）、ならびにトリアシルグリセリド（ｍｍｏｌ／Ｌ）および血清ｏｘ−ＬＤＬ（ｎｇ／ｍＬ）（図８Ｂ）に及ぼす作用を示す。
【０１９２】
図９ａ）は、バレッチン（ＢＡＲ）またはＯｌｉｖｉｔａ（ＯＬＩ）を含有するＷＤと比較した西洋食（ＷＤ）の、アポリポタンパク質Ｅ欠損マウスへの１６週間の給餌が、マウス大動脈におけるアテローム性動脈硬化病変発生に及ぼす作用を示す。ここに図示したのは、大動脈弓における病変面積である（関連する大動脈領域は、ｂ）において図示されたとおりである）；データは、中央値＋／−９５％信頼区間である。共通文字のない標識されたボックスには差がある、すなわち、ａ≠ｂである；ＡＮＯＶＡとＧａｍｅｓ−Ｈｏｗｅｌｌ事後検定、等分散性を仮定しない。
【０１９３】
図１０ａ）は、バレッチン（ＢＡＲ）またはＯｌｉｖｉｔａ（ＯＬＩ）を含有するＷＤと比較した西洋食（ＷＤ）の、アポリポタンパク質Ｅ欠損マウスへの１６週間の給餌が、マウス大動脈におけるアテローム性動脈硬化病変発生に及ぼす作用を示す。ここに図示したのは、下行大動脈における病変面積である（関連する大動脈領域は、ｂ）において図示されたとおりである）；データは、中央値＋／−９５％信頼区間である。共通文字のない標識されたボックスには差がある、すなわち、ａ≠ｂである；ＡＮＯＶＡとＧａｍｅｓ−Ｈｏｗｅｌｌ事後検定、等分散性を仮定しない。
【０１９４】
図１１ａ）は、バレッチン（ＢＡＲ）またはＯｌｉｖｉｔａ（ＯＬＩ）を含有するＷＤと比較した西洋食（ＷＤ）の、アポリポタンパク質Ｅ欠損マウスへの１６週間の給餌が、マウス大動脈におけるアテローム性動脈硬化病変発生に及ぼす作用を示す。ここに図示したのは、大動脈の腎下部における病変面積である（関連する領域は、ｂ）において図示されたとおりである）；データは、中央値＋／−９５％信頼区間である。共通文字のない標識されたボックスには差がある、すなわち、ａ≠ｂである；ＡＮＯＶＡとＧａｍｅｓ−Ｈｏｗｅｌｌ事後検定、等分散性を仮定しない。
【０１９５】
図１２ａ）は、バレッチン（ＢＡＲ）またはＯｌｉｖｉｔａ（ＯＬＩ）を含有するＷＤと比較した西洋食（ＷＤ）の、アポリポタンパク質Ｅ欠損マウスへの１６週間の給餌が、マウス大動脈におけるアテローム性動脈硬化病変発生に及ぼす作用を示す。ここに図示したのは、全大動脈における病変面積である（全大動脈は、ｂ）において図示されている）。データは、中央値＋／−９５％信頼区間である。共通文字のない標識されたボックスには差がある、すなわち、ａ≠ｂである；ｐ＜０．００１  ＡＮＯＶＡとＧａｍｅｓ−Ｈｏｗｅｌｌ事後検定、等分散性を仮定しない。
【図１】
2016523813.tif 000056
【図４】
2016523813.tif 000057
【図６】
2016523813.tif 000058
【図７】
2016523813.tif 000059
【図８Ａ】
2016523813.tif 000060
【図８Ｂ】
2016523813.tif 000061
【図２】
2016523813.tif 000062
【図３】
2016523813.tif 000063
【図５】
2016523813.tif 000064
【図９】
2016523813.tif 000065
【図１０】
2016523813.tif 000066
【図１１】
2016523813.tif 000067
【図１２】
2016523813.tif 000068
【図１３】
2016523813.tif 000069
【国際調査報告】
2016523813.tif 000070
2016523813.tif 000071
2016523813.tif 000072