(57)【要約】  アニオン性生物学的治療薬の送達に有用なナノスケールのｐＨ応答性ポリカチオンネットワーク及び関連する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カチオン性モノマー、疎水性部分及び架橋剤を含む、ｐＨ応答性ポリカチオンヒドロゲル。
【請求項２】
カチオン性モノマー及び疎水性部分の量が約２０％〜約５０％の割合で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
カチオン性モノマーが５０〜８０ｍｏｌ％であり、疎水性部分が２０〜５０ｍｏｌ％であり、架橋剤が０．５〜５ｍｏｌ％である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ヒドロゲルが１００ｕｇ／ｍＬで８０％を超える細胞適合性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
ヒドロゲルが約ｐＨ７．４で正の表面電荷を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
ヒドロゲルが約ｐＨ７．４で収縮した構造を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
ヒドロゲルに共有結合されている複数のポリ（エチレングリコール）ポリマーをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
ヒドロゲルに共有結合されている複数のポリオキサゾリンポリマーをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
ヒドロゲルの外面に共有結合されており、かつ少なくとも部分的に配置されている複数のポリ（エチレングリコール）又はポリオキサゾリンポリマー又はその両方をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
カチオン性モノマーが２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＥＡＥＭＡ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
カチオン性モノマーが２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）エチルメタクリレート（ＢＡＥＭＡ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
カチオン性モノマーが第三級アミノメタクリレート、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジエチルアミノエチルメタクリレート、ジイソプロピルアミノエチルメタクリレート、モルホリノエチルメタクリレート、ポリリシンメタクリレート又はそれらの組合せである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
疎水性部分がｔｅｒｔ−ブチルメタクリレート（ＢＭＡ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
疎水性部分が反応性メタクリレート又はアクリレートである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
疎水性部分が、脂肪族（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、ｔｅｒｔ−ブチル（メタ）アクリレート、２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）エチルメタクリレート、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、フェニル（メタ）アクリレート、イソ−ブチル（メタ）アクリレート、ヘキシル（メタ）アクリレート、イソ−デシル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、又はそれらの組合せである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
架橋剤が分解性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
架橋剤がホモ二官能性メタクリレートである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
架橋剤が、エチレングリコールジメタクリレート（ＥＧＤＭＡ）、テトラ（エチレングリコール）ジメタクリレート（ＴＥＧＤＭＡ）、ポリ（エチレングリコール）ジメタクリレート（ＰＥＧＤＭＡ）、ビス（２−メタクリロイルオキシエチル）ジスルフィド、又はそれらの組合せである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
ヒドロゲル内に配置されたアニオン性治療薬をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
ヒドロゲル内に配置されたｓｉＲＮＡをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
ヒドロゲルが約２０ｎｍ〜約２００ｎｍのｚ−平均粒子径を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
ポリカチオンネットワークがｐＨの変化に応答した、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項１に記載の組成物を含む医薬製剤。
【請求項２４】
約６．５以下のｐＨで、カチオン性モノマー、疎水性部分及び架橋剤を含むｐＨ応答性ポリカチオンヒドロゲルを提供するステップと、
約７以上のｐＨを有する環境にｐＨ応答性ポリカチオンヒドロゲルを導入するステップと
を含む方法。
【請求項２５】
カチオン性モノマーが５０〜８０ｍｏｌ％であり、疎水性部分が２０〜５０ｍｏｌ％であり、架橋剤が０．５〜５ｍｏｌ％である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ｐＨ応答性ポリカチオンヒドロゲルが、ヒドロゲル内に配置されたアニオン性治療薬をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ｐＨ応答性ポリカチオンヒドロゲルが、ヒドロゲル内に配置されたｓｉＲＮＡをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利に関する記述
本発明は、米国国立科学財団によって授与された助成第ＣＢＥＴ１０−３３７４６号の政府支援下で行われた。政府は本発明に関して一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願に関する相互参照
本出願は、参照により本明細書に組み込まれている、２０１２年１０月１４日に出願した米国仮出願第６１／７１３，６１０号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
ポリマーは薬剤送達技術の進歩に不可欠な役割を果たしてきており、長期間にわたる治療剤の一定用量での制御放出、周期的投与を提供し、親水性薬剤及び疎水性薬剤を調整可能に放出することができる。この分野は、既製の材料を使用した初期から、一部は化学技術者らの技術革新によって牽引され、飛躍的に成長してきた。薬剤送達における最近の進歩は、現在、特定のカーゴに適合し、異なる生物学的機能を発揮するように操作されたポリマーの合理的設計に基づいている。特に、ヒドロゲルは、治療剤を制御放出するポリマー系の開発を担ってきた。これらの材料は、経粘膜薬剤送達及び細胞内薬剤送達に好適である。それは、ヒドロゲルの合成における容易性、固有の生体適合性、調整可能な物理化学的特性、及び様々な生理学的な刺激に応答する能力があるからである。
【０００４】
１９９８年のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ、RNA interference）の画期的な発見は、生物科学の全分野において大規模な研究活動を促進し、遺伝子制御メカニズムに関する我々の理解を再定義した。理論的には、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、small interfering RNA）介在性ＲＮＡｉは、異常遺伝子発現に起因するほぼすべての疾患を処置する効果が高く、汎用性の高い治療法として使用することができる。ｓｉＲＮＡは、有効性が顕著で治療用量が少ないことから、新しい生物学的治療薬としての優れた可能性を有する。しかし、効率的な送達には、その広範な臨床応用への大きな障害があるとされてきた。ｓｉＲＮＡに関する合成ポリマー担体に向けて多大な労力を払ってきたが、経口送達系の開発に関するデータは依然として不十分なままである。臨床試験中のほぼすべての送達系（ＲＮＡｉ治療薬がＦＤＡの承認を受けていないもの）は、局所投与及び静脈内投与用のネイキッドｓｉＲＮＡ、複合ポリマー又は脂質担体に頼っており、また、それらをＧＩ標的用の有用な送達ベクターにするという性状は持っていない。ｓｉＲＮＡ送達用の新規なヒドロゲルプラットフォーム、特に消化管に沿って疾患標的にｓｉＲＮＡを提供することができる合成ポリマー担体を開発することが望まれている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、一般にアニオン性治療剤の送達に有用な組成物に関する。より詳細には、いくつかの実施形態において、本開示は、アニオン性生物学的治療薬の送達に有用なナノスケールのｐＨ応答性ポリカチオンネットワーク及び関連方法に関する。本開示は、ある特定の実施形態によれば、ポリマーネットワーク中にｓｉＲＮＡを含むｐＨ応答性ポリカチオンネットワークを提供する。こうしたｓｉＲＮＡ含有ネットワークは、ｓｉＲＮＡの送達に有用であり得る。
【０００６】
本開示においては、ヒドロゲル技術によって目下送達されている治療薬の範囲を拡大するための確固たる合成方法を概説する。適切な材料を選択しコポリマー組成及び分子構造を慎重に設計することによって、有用な巨大分子を担持し、保護し、かつそれらの目的の作用部位へ送達するように最適化されている調整可能な物理化学的特性を有する、異なる生理学的合図に応答可能な系を操作することができる。
【０００７】
本発明の特徴及び利点は、当業者には容易に明白となるであろう。多くの変更が当業者によって行われ得るが、そうした変更は本発明の趣旨の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
開示したいくつかの具体例の実施形態は、部分的に、以下の明細書及び添付の図面を参照することにより理解することができる。
【図１】ｐＨ応答性ヒドロゲルの概略図である。
【図２】ｐＨ応答性ヒドロゲルの合成で使用した特定のメタクリレートモノマー及び反応開始剤の分子構造を示す。
【図３】ＴＥＧＤＭＡ架橋ナノゲルの代表的な透過型電子顕微鏡画像を示す。ＰＤＥＴ（Ａ）、ＰＤＥＴＢ１０（Ｂ）、ＰＤＥＴＢ２０（Ｃ）、ＰＤＥＴＢ３０（Ｄ）、ＰＤＥＴＢＡ１０（Ｅ）、ＰＤＥＴＢＡ１０（Ｆ）、ＰＤＥＴＢＡ３０（Ｇ）。粒子は酢酸ウラニルで染色し、画像は４３，０００倍で収集した。スケールバーは２００ｎｍに相当する。
【図４】ＴＥＭ顕微鏡写真からの粒子の定量的定寸によって得られた乾燥Ｐ（ＤＥＡＥＭＡ−ｃｏ−ＴＢＭＡ−ｇ−ＰＥＧＭＡ）（ＰＤＥＴＢ３０）の試料数平均粒子径分布を示す。分布平均＝５２．０、Ｓｔｄ  Ｄｅｖ＝１７．３、ｎ＝２００。棒は測定データを表し、線は最適ガウス分布を表す（Ｒ２＝０．９８２）。
【図５】収縮状態（実線）及び膨潤状態（破線）における２．５ｍｏｌ％のＴＥＧＤＭＡと架橋しているＰ（ＤＥＡＥＭＡ−ｃｏ−ＴＢＭＡ−ｇ−ＰＥＧＭＡ）（ＰＤＥＴＢ３０）に関する代表的な強度−加重粒子サイズ分布を示す。測定はＰＢＳ中２５℃で行った。
【図６】ナノスケールヒドロゲルのコロイド安定性を示す。水性懸濁液中、４週間後（黒記号）及び８週間後（白記号）の２．５ｍｏｌ％ＴＥＧＤＭＡと架橋しているＰ（ＤＥＡＥＭＡ−ｃｏ−ＴＢＭＡ−ｇ−ＰＥＧＭＡ）ネットワークの流体力学的直径（左軸）及び多分散性指数（右軸）である。データ点は、測定１２回の平均を表し、線はデータの適合値を表す。双曲正接適性値を流体力学的直径の測定に適用し、線形適性値を多分散性指数の測定に適用した。
【図７】ＴＢＭＡ（Ａ）又はＴＢＡＥＭＡ（Ｂ）を含有するナノスケールヒドロゲルにおけるｐＨ依存性膨潤特性に対する疎水性部分導入の影響を示す。記号は、ＤＥＡＥＭＡに対して０ｍｏｌ％のコモノマー（白四角）、１０ｍｏｌ％のコモノマー（白菱形）、２０ｍｏｌ％のコモノマー（白上三角）又は３０ｍｏｌ％のコモノマー（黒丸）を示す。データ点は、測定１２回の平均を表し、線はデータの双曲正接適合値を示す。
【図８】ＴＢＭＡ（Ａ）及びＴＢＡＥＭＡ（Ｂ）を変えて合成したポリマー製剤の有効表面ゼータ電位を示す。データ点は、１０回測定値の平均±ＳＤを表す。
【図９】ｐＨ８．０（実線）及びｐＨ６．０（破線）のピレンを含む１００ｍＭリン酸緩衝液及び０．５ｍｇ  ｍＬ−１  ＰＤＥＴＢ３０の正規化蛍光性発光スペクトルを示す。
【図１０】ＴＢＭＡ（Ａ）又はＴＢＡＥＭＡ（Ｂ）と合成したナノゲルの蛍光発光スペクトルに対するｔ−ブチル導入の影響を示す。１００ｍＭリン酸緩衝液中に、ナノゲルは０．５ｍｇ  ｍＬ−１で懸濁させ、ピレンは６×１０−７Ｍで溶解させた。記号は、（Ａ）においては、ＰＤＥＴ（黒丸）、ＰＤＥＴＢ１０（黒下三角）、ＰＤＥＴＢ２０（黒四角）又はＰＤＥＴＢ３０（白菱形）を示し、（Ｂ）においては、ＰＤＥＴ（黒丸）、ＰＤＥＴＢＡ１０（黒下三角）、ＰＤＥＴＢＡ２０（黒四角）又はＰＤＥＴＢＡ３０（白菱形）を示す。測定点は測定データを示し、実線は最適Ｓ字形曲線を示す。
【図１１】ピレンの蛍光発光スペクトルに対する疎水性部分の影響を示す。ピレンは、０．５ｍｇ  ｍＬ−１のＰＤＥＴ（黒丸）、ＰＤＥＴＢ３０（黒下三角）又はＰＤＥＴＢＡ３０（黒四角）と共に１００ｍＭリン酸緩衝液に６×１０−７Ｍで溶解させた。測定点は測定データを示し、実線は最適Ｓ字形曲線を示す。
【図１２】ｐＨ８．０（実線）及びｐＨ６．０（破線）でのピレンを含む１００ｍＭリン酸緩衝液及び０．５ｍｇ  ｍＬ−１のＰＤＥＴの正規化蛍光励起スペクトルを示す。
【図１３】Ｐ（ＤＥＡＥＭＡ−ｃｏ−ＴＢＭＡ−ｇ−ＰＥＧＭＡ）ナノゲルにおけるピレン励起（Ｉ３３８／Ｉ３３３比）に対するＴＢＭＡ導入の影響を示す。示したｐＨ値での１００ｍＭリン酸緩衝液に、ナノゲルは０．５ｍｇ  ｍＬ−１で懸濁し、ピレンは６×１０−７Ｍで溶解させた。記号は、ＰＤＥＴ（黒丸）、ＰＤＥＴＢ１０（黒下三角）、ＰＤＥＴＢ２０（黒四角）又はＰＤＥＴＢ３０（白菱形）を示す。
【図１４】Ｐ（ＤＥＡＥＭＡ−ｃｏ−ＴＢＡＥＭＡ−ｇ−ＰＥＧＭＡ）ナノゲルにおけるピレン励起（Ｉ３３８／Ｉ３３３比）に対するＴＢＡＥＭＡ導入の影響を示す。示したｐＨ値での１００ｍＭリン酸緩衝液に、ナノゲルは０．５ｍｇ  ｍＬ−１で懸濁し、ピレンは６×１０−７Ｍで溶解させた。記号は、ＰＤＥＴ（黒丸）、ＰＤＥＴＢ１０（黒下三角）、ＰＤＥＴＢ２０（黒四角）又はＰＤＥＴＢ３０（白菱形）を示す。
【図１５】ピレンの蛍光励起スペクトルに対する疎水性部分の影響を示す。ピレンは、０．５ｍｇ  ｍＬ−１のＰＤＥＴ（黒丸）、ＰＤＥＴＢ３０（黒下三角）又はＰＤＥＴＢＡ３０（黒四角）と共に６×１０−７Ｍで１００ｍＭリン酸緩衝液に溶解させた。測定点は測定データを示し、実線は最適Ｓ字形曲線を示す。
【図１６】ナノゲル濃度及び溶液ｐＨの関数としての溶血を示す。ＰＤＥＴ、ＰＤＥＴＢ２０及びＰＤＥＴＢ３０（上図）、並びにＰＤＥＴ、ＰＤＥＴＢＡ２０及びＰＤＥＴＢＡ３０（下図）に対する等高線プロット。
【図１７】初期エンドソームｐＨ（ｐＨ６．０）での１５０ｍＭリン酸緩衝液中のＰＤＥＴ（白四角）、ＰＤＥＴＢ３０（黒丸）及びＰＤＥＴＢＡ３０（白四角）の濃度依存性溶血作用を示す。赤血球は、３７℃で６０分間、様々なポリマー濃度に暴露した。データ点は、トリプリケートの試料の平均±ｓ．ｄ．を示す。
【図１８】６０分（黒丸）、１８０分（白丸）又は３６０分（黒下三角）ＰＤＥＴに暴露した後のＣａｃｏ−２細胞からの代表的な時間依存性ＬＤＨ漏出を示す。データ点は、試料平均±標準誤差（ｎ＝４）を示す。ＬＤＨ漏出は、未処理細胞及び界面活性剤溶解細胞に対して計算した。
【図１９】６０分（黒丸）、１８０分（白丸）又は３６０分（黒下三角）ＰＤＥＴＢ３０に暴露した後のＣａｃｏ−２細胞からの代表的な時間依存性ＬＤＨ漏出を示す。データ点は、試料平均±標準誤差（ｎ＝４）を示す。ＬＤＨ漏出は、未処理細胞及び界面活性剤溶解細胞に対して計算した。
【図２０】６０分（黒丸）、１８０分（白丸）又は３６０分（黒下三角）ＰＤＥＴＢＡ３０に暴露した後のＣａｃｏ−２細胞からの代表的な時間依存性ＬＤＨ漏出を示す。データ点は、試料平均±標準誤差（ｎ＝４）を示す。ＬＤＨ漏出は、未処理細胞及び界面活性剤溶解細胞に対して計算した。
【図２１】６０分ＰＤＥＴ（黒丸）、ＰＤＥＴＢ１０（黒下三角）、ＰＤＥＴＢ２０（黒四角）若しくはＰＤＥＴＢ３０（白菱形）に暴露した後（Ａ）、又は６０分ＰＤＥＴ（黒丸）、ＰＤＥＴＢＡ１０（黒下三角）、ＰＤＥＴＢＡ２０（黒四角）若しくはＰＤＥＴＢＡ３０（白菱形）に暴露した後（Ｂ）のＣａｃｏ−２細胞からのポリマー介在性ＬＤＨ漏出を示す。
【図２２】ＧＵＶ膜の不安定化を示す。Intravesicle赤色蛍光は、スクロース−テキサスレッドを示す。緑色蛍光は、膜脂質ＤＨＰＥ−Bodipy FLを示す。ＧＵＶは、ｐＨ６．５で１００ｍＭリン酸緩衝液に懸濁した。等張リン酸緩衝液中のＰＤＥＴ（Ａ）又はＰＤＥＴＢ３０（Ｂ）を加え、最終濃度が５０μｇ  ｍｌ−１になるようにした。３０秒のインキュベーション後のＧＵＶ（Ｃ及びＤ）。画像は、１００倍のZeissスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して取り込んだ。
【図２３】ポリマー濃度の関数としてポリカチオン性ナノゲルの細胞適合性を示す。記号は、ＰＤＥＴ（黒丸）、ＰＤＥＴＢ２０（黒下三角）、ＰＤＥＴＢ３０（黒四角）、ＰＤＥＴＢＡ２０（白菱形）又はＰＤＥＴＢＡ３０（黒上三角）を示す。Ｃａｃｏ−２細胞の相対的生存能力は、９０分間のナノゲル暴露後にＭＴＳアッセイにより決定し、対照（未処理）細胞に対する比として表した。データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝８として示した。線は目を誘導するためのものである。統計的有意差は、ＰＤＥＴＢ２０及びＰＤＥＴ又はＰＤＥＴＢ３０及びＰＤＥＴに暴露された細胞間のペアのｔ検定によって決定した（＊ｐ＜０．００５）。
【図２４】ポリマー濃度の関数としてのＰ（ＤＥＡＥＭＡ−ｇ−ＰＥＧＭＡ）及びＰ（ＤＥＡＥＭＡ−ｃｏ−ＴＢＭＡ−ｇ−ＰＥＧＭＡ）ナノゲルの細胞適合性を示す。ＲＡＷ２６４．７細胞の相対的増殖は３時間のナノゲル暴露後にＭＴＳアッセイによって決定し、対照（未処理）細胞に対する比として表す。データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝４として示す。統計的有意差は、ＰＤＥＴＢ３０又はＰＤＥＴに暴露された細胞間のペアのｔ検定によって決定した（＃ｐ＜０．０５）。
【図２５】２４時間暴露した後のポリマー濃度の関数としてのＰＤＥＴ及びＰＤＥＴＢ３０ナノゲルの細胞適合性を示す。ＲＡＷ２６４．７細胞の相対的増殖はＭＴＳアッセイによって決定し、対照（未処理）細胞に対する比として表す。データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝４として示す。統計的有意差は、ＰＤＥＴ又はＰＤＥＴＢ３０に暴露された細胞間のペアのｔ検定によって決定した（＃ｐ＜０．０５）。
【図２６】グルタチオンへの応答における分解性ナノゲルの概略図を示す。ジスルフィド架橋は還元的条件に感度が高い。
【図２７】ビス（２−メタクリロイルオキシエチル）ジスルフィドに関する反応スキームを示す。
【図２８】ＰＢＳに懸濁したナノゲルのｐＨ応答性挙動を示す。ＰＤＥＴ（白四角）、ＰＤＥＴＢ３０（白丸）及びＰＤＥＳＳＢ３０（黒菱形）。
【図２９】３６０分間のＰＤＥＳＳＢ３０（黒丸）又はＰＤＥＴＢ３０（白丸）への暴露に対するＲＡＷ２６４．７細胞の相対的増殖を示す。ＲＡＷ細胞の相対的増殖はＭＴＳアッセイによって決定し、対照（未処理）細胞に対する比として表す。データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝４として示す。
【図３０】グルタチオン誘導性分解の光散乱分析を示す。ナノゲルをＰＢＳに溶解させ、１ｍＭ（灰色）及び１０ｍＭ（黒色）濃度のグルタチオン（ＧＳＨ）に暴露し、３７℃でインキュベートした。
【図３１】（Ａ）ＤＩ水及び（Ｂ）１０ｍＭグルタチオン溶液（左）中で２時間インキュベートしたＰＤＥＳＳＢ３０の代表的な透過型電子顕微鏡画像を示す。粒子は酢酸ウラニルで染色し、画像は２６，５００倍（左）及び２０，５００倍（右）で収集した。
【図３２】ｐＨ５．５０のＰＢＳ中のｐｏｌｙ（ＤＥＡＥＭＡ−ｇ−ＰＥＧＭＡ）（ＰＤＥＴ）、並びにｐｏｌｙ（ＤＥＡＥＭＡ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｇ−ＰＥＧＭＡ）（ＰＤＥＴＢ１０）、（ＰＤＥＴＢ２０）及び（ＰＤＥＴＢ３０）のＲＮＡ担持能力を示す。データは、平均±ｓ．ｄ．（ｎ＝３）を示す。
【図３３】ｐＨ５．５０のＰＢＳ中（灰色）、及びｐＨ７．４０の無血清ＤＭＥＭ中（白色）のｐｏｌｙ（ＤＥＡＥＭＡ−ｇ−ＰＥＧＭＡ）（ＰＤＥＴ）、並びにｐｏｌｙ（ＤＥＡＥＭＡ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｇ−ＰＥＧＭＡ）（ＰＤＥＴＢ１０）、（ＰＤＥＴＢ２０）及び（ＰＤＥＴＢ３０）のＲＮＡ担持能力を示す。ポリマーとｓｉＲＮＡは、［ポリマー］：［ｓｉＲＮＡ］を１０：１の比で組み合わせた。結合したＲＮＡの比は、ＰＢＳにおける１８０分間のインキュベーション及びＤＭＥＭにおける３０分間のインキュベーション後に、Ribogreenアッセイによって決定した。棒は、平均±ｓ．ｄ．（ｎ＝３）を示す。
【図３４】ＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８及びＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡの蛍光顕微鏡写真を示す。
【図３５】インキュベーション時間の関数としてのＣａｃｏ−２細胞へのｓｉＲＮＡ送達を示す。ナノゲル／Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ複合体は、２０：１のナノゲル／ｓｉＲＮＡ比（ｇ／ｇ）で調製し、示した時間、細胞とインキュベートした。データ点は、フローサイトメトリーによって決定した、生存細胞の蛍光の中央値を表す。死滅細胞はヨウ化プロピジウムによって除外した。
【図３６】ナノゲル組成及びインキュベーション温度の関数としてのＣａｃｏ−２細胞へのｓｉＲＮＡ送達を示す。ナノゲル／Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ複合体は、２０：１のナノゲル／ｓｉＲＮＡ比（ｇ／ｇ）で調製し、６０分間、Ｃａｃｏ−２細胞とインキュベートした。データ点は、フローサイトメトリーによって決定した、生存細胞の蛍光の中央値を表す。死滅細胞はヨウ化プロピジウムによって除外した。
【図３７】ｓｉＲＮＡ送達実験におけるＲＡＷ２６４．７細胞の蛍光強度を示す。ＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡ（Ａ）及びＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８（Ｂ）の蛍光強度ヒストグラムである。蛍光ヒストグラムは、ＰＢＳ（未処理、灰色）、ＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡ単独（青色）、ＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８単独（緑色）、又はＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８／ＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡ（赤色）に暴露した、焦点をあてた生存単一細胞から作成した。データは、２つのプールした実験の結果を表す。
【図３８】ＲＡＷ２６４．７細胞へのＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡ送達を示す。核染色（Hoechst 33342）は青色で示し、ＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８（Oregon Green 488）は緑色で示し、ＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡ（DyLight 647）は赤色で示す。ＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡ単独（Ａ〜Ｃ）、ＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８単独（Ｄ〜Ｆ）、又はＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８／ＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡ（Ｇ〜Ｉ）に暴露したＲＡＷ２６４．７細胞の３種類の代表例を示す。画像は、ＤＹ６４７ヒストグラムの中央値領域からサンプリングした。スケールバーは７μｍを表す。
【図３９】ｓｉＲＮＡ送達実験におけるＣａｃｏ−２細胞の蛍光強度を示す。ＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡ（Ａ）及びＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８（Ｂ）の蛍光強度ヒストグラムである。蛍光ヒストグラムは、ＰＢＳ（未処理、灰色）、ＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡ単独（青色）、ＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８単独（緑色）、又はＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８／ＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡ（赤色）に暴露した、焦点をあてた生存単一細胞から作成した。データは、２つのプールした実験の結果を表す。
【図４０】ＲＡＷ２６４．７細胞へのＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡ送達を示す。核染色（Hoechst 33342、青色）、ＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８（Oregon Green 488、緑色）、ＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡ（DyLight 647、赤色）を示す。ＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡ単独（Ａ〜Ｃ）、ＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８単独（Ｄ〜Ｆ）、又はＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８／ＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡ（Ｇ〜Ｉ）に暴露したＲＡＷ２６４．７細胞の３種類の代表例を示す。画像は、ＤＹ６４７ヒストグラムの中央値領域からサンプリングした。スケールバーは７μｍを表す。
【図４１】ＰＤＥＴＢ３０／ｓｉＲＮＡに暴露した後のＣａｃｏ−２細胞におけるＧＡＰＤＨノックダウンを示す。示した濃度のＰＤＥＴＢ３０と２５０ｎｇ  ｍＬ−１（約２０ｎＭ、灰色）又は１２５０ｎｇ  ｍＬ−１（約１００ｎＭ、黒色）のＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡのｓｉＲＮＡ担持ナノゲルに細胞を暴露した。発現レベルはトランスフェクションの４８時間後に測定した。棒は、残っているＧＡＰＤＨ発現の平均（％）±ｓ．ｄ．（ｎ＝３）を表す。＊ｐ＜０．０５、＃ｐ＜０．０１。
【図４２】ＰＤＥＴＢ３０／ｓｉＲＮＡ又はＰＤＥＳＳＢ３０／ｓｉＲＮＡに暴露した後のＣａｃｏ−２細胞におけるＧＡＰＤＨノックダウンを示す。細胞は、２００：１のナノゲル：ｓｉＲＮＡ比のｓｉＲＮＡ担持ナノゲル（ｇ／ｇ、５０μｇ  ｍＬ−１のナノゲル及び０．２５μｇ  ｍｌ−１のｓｉＲＮＡ）に暴露させた。発現レベルはトランスフェクションの４８時間後に測定した。棒は、残っているＧＡＰＤＨ発現の平均（％）±ｓ．ｄ．（ｎ＝３）を表す。＊ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
特許又は特許出願のファイルは、少なくとも１枚のカラー仕上げの図面を含む。カラー図面を含む本特許又は特許出願公開のコピーは、請求し必要な料金を支払った際に、官庁により提供される。
【００１０】
本開示は、様々な変更及び代替の形態に影響を受けやすいが、特定の例示的実施形態が図面に示されており、以下により詳細に記載されている。しかし、特定の例示的実施形態の記載は、開示されている特定の形態に本発明を限定するものではないが、反対に、本開示は、一部、添付の特許請求の範囲によって示されているように全ての変更及び等価物を網羅することであると理解されたい。
【００１１】
本開示は、一般にアニオン性治療剤の送達に有用な組成物に関する。より詳細には、いくつかの実施形態において、本開示は、アニオン性生物学的治療薬に有用なナノスケールのｐＨ応答性ポリカチオンネットワーク及び関連方法に関する。
【００１２】
本開示は、ある特定の実施形態によれば、カチオン性モノマー、疎水性部分（疎水性モノマーともいう）及び架橋剤から形成されるｐＨ応答性ポリカチオンヒドロゲルを提供する。こうしたヒドロゲルはランダムコポリマーを形成する。ｐＨ応答性ポリカチオンヒドロゲルは、ｐＨの変化に応じて体積相転移を受ける。本開示のｐＨ応答性ポリカチオンヒドロゲルは、メタクリレート系ヒドロゲルである。またヒドロゲルは、ヒドロゲルの外面に少なくとも部分的に配置されているＰＥＧ分子を含んでいてもよい。ｐＨ応答性ポリカチオンヒドロゲルは、ｐＨの変化に応じて膨潤及び解膨潤し得る。したがって、こうしたヒドロゲルは送達に使用することができ、またアニオン性治療薬、例えば、ｓｉＲＮＡなどのアニオン性生物学的製剤をさらに含むことができる。
【００１３】
操作において、アニオン性治療薬はｐＨ応答性ポリカチオンヒドロゲルのポリマーネットワーク内に含ませることが可能であって、さらにそれは細胞内在化を増強することができる。例えば、生理学的ｐＨ（約７．４）では、ｐＨ応答性ポリカチオンヒドロゲルは収縮状態で存在するため、ポリマーネットワーク内にアニオン性治療薬を捕捉することができる。ｐＨ応答性ポリカチオンヒドロゲルが低ｐＨ環境に、例えば、細胞のエンドソーム内に導入される場合、ポリマーネットワークは膨潤してアニオン性治療薬（例えば、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ及びＤＮＡ）を放出することができる。
【００１４】
特定の実施形態において、本開示のｐＨ応答性ポリカチオンヒドロゲルは細胞適合性があり（例えば、１００μｇ／ｍＬで８０％を超える）、細胞送達に適したサイズを有しており（例えば、２０〜２００ｎｍ）、核酸に結合可能であり（例えば、ＲＮＡ結合は５ｗｔ％を超える）、ｐＨ約７．４で正の表面電荷を有しており、調整可能なｐＨ応答を有し（例えば、ｐＨ７．４では収縮し、ｐＨ５．５〜６．５で膨潤する）、ｐＨ約７．４では細胞膜破壊が少なく、ｐＨ約７未満では細胞膜破壊が高くなる。
【００１５】
一般的に、適切なカチオン性モノマーは、イオン化可能な第三級アミン基を含有する。説明すると、第三級アミン基のプロトン化は、可動性対イオンを新たに取り込み、ヒドロゲルの浸透圧を上昇させることにより膨潤を引き起こす；また、隣接するアミン基の静電反発力もまたこの体積相転移に関与する。適切なカチオン性モノマーの例としては、第三級アミノメタクリレート、ジメチルアミノエチルメタクリレート（methacrolyates）、ジエチルアミエチルメタクリレート、ジイソプロピルアミノエチルメタクリレート、モルホリノエチルメタクリレート、ポリリシンメタクリレートが挙げられる。他の適切なカチオン性モノマーとしては、２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＥＡＥＭＡ）及び２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）エチルメタクリレート（ＢＡＥＭＡ）が挙げられる。カチオン含量は、過剰なカチオン含量による過度の毒性を回避しながら、アニオン性生体分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を結合させるよう最適化されなければならない。カチオン性モノマーは、典型的には、約５０〜約８０ｍｏｌ％のヒドロゲル製剤を含む。
【００１６】
ポリマー送達系における過剰のカチオン含量は悪影響を及ぼす可能性がある。カチオン電荷密度が高くなると、毒性に関わることが多くなる。したがって、本開示のヒドロゲルは、疎水性部分（例えば、細胞適合性及びポリマー誘発性の膜不安定化を改善するためのもの）も含む。疎水性部分は、ポリマー−ポリマー相互作用とポリマー−溶媒−イオン相互作用の間の相対的強度を変化させることにより、ヒドロゲルの生理化学的特性をモジュレートする。この方法において、ｐＨ応答性ポリカチオンヒドロゲルの疎水性含量の増加はポリマー−ポリマー相互作用の強度を高め、解膨潤（収縮）構造に都合がよい。この効果の結果には、ポリマー−溶媒−イオン相互作用に好都合であり、かつポリカチオンヒドロゲルの浸透圧膨潤の誘導に必要なイオン化エネルギーの増加（例えば、低ｐＨ）が必須である。疎水性含量が増加するにつれて、より大きなプロトン活性又はより大きなイオン化（すなわち低ｐＨ）が、ポリマー／ポリマー相互作用を上回るポリマー／溶媒／イオン相互作用の促進に必要となる。予想された通り、この効果は、ｐＨ依存性ゲル膨潤の発生の低下にもつながる。したがって、疎水性部分の化学的性質及び組成を調整して、ｐＨ応答性ポリカチオンヒドロゲルのｐＨ応答を調整することができる。
【００１７】
ｐＨ依存性の疎水性から親水性への遷移の誘導に必要な臨界ｐＨは、ナノスケールヒドロゲル中の疎水性部分のタイプ及び組成によって調整することができる。ヒドロゲル中の疎水性コモノマーは、ポリマー−ポリマー相互作用を促進し、浸透圧性ゲル膨潤に必要な臨界膨潤ｐＨを低下させる機能を果たす。これらのポリカチオンヒドロゲルは、その臨界膨潤ｐＨ又はその付近で、生体膜を最も効果的に不安定にすることができる。疎水性部分を使用して、ヒドロゲル臨界膨潤ｐＨをエンドソームｐＨ（ｐＨ約６．５〜７．０）に合わせ、封入カーゴのエンドソーム排出を促進させる。さらに、ポリカチオンヒドロゲル中の疎水性部分濃度の増加は、カチオン電荷密度を低下させる。カチオン電荷密度は、通常、高分子薬剤送達系で承諾しがたい特性の細胞毒性に関連している。これらのポリカチオンヒドロゲルにおいて、電荷密度を低下させることはモデル細胞系での非特異的毒性を低下させる。
【００１８】
カチオン性ポリマーと共重合可能ないかなる疎水性部分も適切であり得る。いくつかの実施形態において、カチオン性ポリマー及び疎水性部分はコポリマーを形成する。適切な疎水性部分の例としては反応性メタクリレート及びアクリレートが挙げられ、例えば、脂肪族（メタ）アクリレート、例えば、プロピル（メタ）アクリレート、ｔｅｒｔ−ブチル（メタ）アクリレート、２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）エチルメタクリレート、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、フェニル（メタ）アクリレート、イソ−ブチル（メタ）アクリレート、ヘキシル（メタ）アクリレート、イソ−デシル（メタ）アクリレート、及びラウリル（メタ）アクリレートである。疎水性部分の量は、ヒドロゲルをイオン化及び体積相転移させながら、臨界膨潤ｐＨを低下させるのに十分であるものでなければならない。一般に、疎水性部分の量は約２０％〜約５０ｍｏｌ％である。特定の実施形態において、疎水性部分の量は、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０ｍｏｌ％である。
【００１９】
一般に、カチオン性モノマー及び疎水性部分の量を調整して、所望の特性を得ることができる。説明すると、疎水性部分の含有が次第に多くなると、疎水性−親水性遷移が低ｐＨ値の方へシフトする。これは、疎水性の高いネットワークがファンデルワールス力を高くし、それによって、相構造を誘導するために（より多くのプロトン形態での）より大きなイオン化エネルギーが必要とされるからである。一般に、カチオン性モノマーの疎水性部分に対する適切な割合は約２０％〜約５０％である。特定の実施形態において、カチオン性モノマーの疎水性部分に対する割合は、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％又は５０％である。
【００２０】
ｐＨ応答性ポリカチオンヒドロゲルは架橋剤もさらに含む。架橋剤は、共有結合を介してポリマー鎖を結合することによりポリマーネットワークを形成するのに役立つ。こうした架橋はまた、得られるヒドロゲルに機械的完全性をもたらす。一般に、適切な架橋剤は、ポリカチオンポリマーを共有結合的に結合させることができる。適切な架橋剤は、ホモ二官能性（両末端が同一である）メタクリレート架橋剤であってもよく、例えば、エチレングリコールジメタクリレート（ＥＧＤＭＡ）、テトラ（エチレングリコール）ジメタクリレート（ＴＥＧＤＭＡ）、及びポリ（エチレングリコール）ジメタクリレート（ＰＥＧＤＭＡ）、又はそれらの組合せである。
【００２１】
架橋剤の量又は架橋密度は、所望する平均孔径に応じて変わり得る。架橋密度が増加すると、平均孔径はより小さなヒドロゲルとなる。したがって、平均孔径は、送達しようとする特定のアニオン性生物学的治療薬に対して最適化することができる。一般に、平均孔径は、選択したアニオン性生物学的治療薬を送達するのに十分大きくなければならないが、ヒドロゲルが収縮状態である場合には、選択したアニオン性生物学的治療薬のヒドロゲルからの本質的な拡散を防止するのに十分小さくなければならない。一般に、架橋剤の量は、ヒドロゲルの約０．５〜５ｍｏｌ％の範囲であってよい。特定の実施形態において、架橋剤は、０．５、１、２、３、４、又は５ｍｏｌ％である。
【００２２】
特定の実施形態において、架橋剤は分解性であってもよく、それにより分解性のｐＨ応答性ポリカチオンヒドロゲルを提供する。そうした実施形態において、架橋剤は、細胞内の条件によって少なくとも部分的に破壊される（例えば、共有結合破壊）。例えば、架橋剤は、細胞内に存在する酵素によって化学的に分解され得る。適切な分解性架橋剤の例としては、ホモ二官能性ジスルフィド架橋剤、例えば、ビス（２−メタクリロイルオキシエチル）ジスルフィド（ＳＳＸＬ）が挙げられる。
【００２３】
ある特定の実施形態において、ｐＨ応答性ポリカチオンヒドロゲルは、細胞への送達に適したサイズを有し得る。ある特定の実施形態において、ｐＨ応答性ポリカチオンヒドロゲルは、約２０ｎｍ〜約２００ｎｍのｚ−平均粒子径を有し得る。ある特定の実施形態において、ｐＨ応答性ポリカチオンヒドロゲルは、約９０ｎｍ〜約１００ｎｍのｚ−平均粒子径を有し得る。特定の実施形態において、収縮状態のｐＨ応答性ポリカチオンヒドロゲルは、約２０ｎｍ〜約１００ｎｍのｚ−平均粒子径を有し得る。特定の実施形態において、膨潤状態のｐＨ応答性ポリカチオンヒドロゲルは、約１００ｎｍ〜約２００ｎｍのｚ−平均粒子径を有し得る。ある特定の実施形態において、乾燥ヒドロゲルは、約４０ｎｍ〜約８０ｎｍの数平均粒子径を有する。ある特定の特異的な実施形態において、乾燥ヒドロゲルは、約５０ｎｍからの数平均粒子径を有する。
【００２４】
上述のように、本開示のｐＨ応答性ポリカチオンヒドロゲルはまた、ヒドロゲルの外面に少なくとも部分的に配置されている、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）又はポリオキサゾリン（ＰＯＺ）ポリマーも含み得る。説明すると、ＰＥＧは、ヒドロゲルに対する生体適合性とコロイド安定性の改善を提供することができる。ＰＥＧは、カチオン性ポリマーの骨格に共有結合で結合されている。適切なＰＥＧ／ＰＯＺとしては、１，０００Ｄａ〜１０，０００Ｄａ；例えば、１，０００〜５，０００Ｄａ、５，０００〜８，０００Ｄａ、８，０００〜１０，０００Ｄａの分子量を有するものが挙げられる。適切なＰＥＧ分子の例としては、限定するものではないが、官能性無水エステルを有するＰＥＧ、ヘテロ二官能性ＰＥＧ、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート（ＰＥＧＭＡ）、並びにメチルペンダント基（ＰＭＯＺ）、エチルペンダント基（ＰＥＯＺ）及びプロピルペンダント基（ＰＰＯＺ）を含むポリオキサゾリンポリマー、又はそれらの組合せが挙げられる。
【００２５】
一実施形態において、ｐＨ応答性ポリカチオンヒドロゲルはＰ（ＤＥＡＥＭＡ−ｃｏ−ＴＢＡＥＭＡ−ｇ−ＰＥＧＭＡ）であり、式中、ＰＥＧＭＡはポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレートであり、ＤＥＡＥＭＡは２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレートであり、ＴＢＡＥＭＡは２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）エチルメタクリレートである。
【００２６】
一実施形態において、ｐＨ応答性ポリカチオンヒドロゲルはＰ（ＤＥＡＥＭＡ−ｃｏ−ＴＭＢＡ−ｇ−ＰＥＧＭＡ）であり、式中、ＴＭＢＡはｔｅｒｔ−ブチルメタクリレートである。
【００２７】
本開示のｐＨ応答性ポリカチオンヒドロゲルは、ＵＶ開始系の水中油滴型感光乳剤重合によって合成され得る。
【００２８】
ある特定の実施形態において、ｐＨ応答性ポリカチオンヒドロゲルは、消化管内の標的部位への局所送達を容易にするために必要とされる保護カプセル化及び機械的完全性及び化学的安定性を提供する。こうした場合、ｐＨの変化は、例えば、胃液又は腸液などの消化管液への暴露から生じ得る。ある特定の実施形態において、ポリカチオンネットワークは、消化管に沿って疾患部位へ送達するように特に設計されており、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病及び消化管癌において潜在的な有用性を有する。この技術に関する他の潜在的な使用は、わずかな負電荷を持つあらゆる生物学的治療薬を包含する。この例としては、限定するものではないが、タンパク質、プラスミドＤＮＡ、マイクロＲＮＡ及びショートヘアピンＲＮＡが挙げられる。
【００２９】
本発明についてのより良い理解を容易にするため、いくつかの実施形態の特定の態様に関する以下の実施例を挙げる。以下の実施例は、本発明の範囲全体を制限又は限定するように読むものでは決してない。
【実施例】
【００３０】
ｔｅｒｔ−ブチルメタクリレート及び２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）エチルメタクリレートを含有する調整可能な応答性ナノゲル。本研究において、本発明者らは、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート（ＰＥＧＭＡ）−グラフト化ＤＥＡＥＭＡナノゲルの水溶液特性に対するＴＭＢＡ及びＴＢＡＥＭＡの影響を検討する。これは、本発明者らの知る限り、水性感光乳化重合によって合成されたＰ（ＤＥＡＥＭＡ−ｃｏ−ＴＢＡＥＭＡ−ｇ−ＰＥＧＭＡ）ナノゲルの最初に知られた例を示すものである。また本発明者らは、Ｐ（ＤＥＡＥＭＡ−ｃｏ−ＴＭＢＡ−ｇ−ＰＥＧＭＡ）ナノゲル系との物理化学的特性の直接比較を提供する。この重合方法は、メタクリレート系ヒドロゲルの大量の組合せを生成して、ナノスケール寸法及び調整可能な物理化学的特性を有する応答性ヒドロゲルを調製することができるプラットフォームを示す（図１）。
【００３１】
ナノゲルの合成。ナノスケール寸法のヒドロゲル粒子は、ＵＶ開始フリーラジカル感光乳化重合／架橋によって合成した。簡単に説明すると、ＤＥＡＥＭＡ、ＴＢＡＥＭＡ、ＴＢＭＡ及びＴＥＧＤＭＡは、使用前に塩基性アルミナ粉末のカラムに通して阻害剤を除去した。ＰＥＧＭＡはそのまま使用した。５ｗｔ％のＰＥＧＭＡ、全モノマーの０．５ｗｔ％のIrgacure 2959（Ciba Geigy社製、Tarrytown, NY）、４ｍｇ  ｍＬ−１のBrij-30、及び１．１６ｍｇ  ｍＬ−１（３．４ｍＭ）のイオン性界面活性剤MyTABを含有する水溶液に、ＤＥＡＥＭＡ、ＴＥＧＤＭＡ、及びＴＢＭＡ又はＴＢＡＥＭＡを添加した。反応ｐＨは、通常ｐＨ８．５であった。混合物は、Misonix超音波処理装置（Misonix社製、Newtown, CT）を使用して乳化した。エマルジョンに窒素ガスをパージし、絶えず撹拌しながら２．５時間、ＵＶ源に暴露した。試薬量を表１に示す。
【００３２】
【表１】
2016500681.tif 000002
【００３３】
ナノゲルの精製。MyTAB、Brij 30、及び未反応モノマーは、ポリマー−イオノマー収縮を繰り返し誘導し、３，２００×ｇで１０分間遠心分離を行うことにより粒子を分離し、０．５ＮのＨＣｌ中に再懸濁させることにより除去した。界面活性剤の除去とポリマーの精製の進行をモニターするため、各精製サイクルからの上清のアリコートを凍結し、凍結乾燥し、１Ｈ−ＮＭＲ分析のためＤＭＳＯ−ｄ６に溶解させた。１２〜１４ｋＤａ分子量画分透析チューブ（Spectrum Labs社製、Rancho Dominguez, CA）内で１日２回水を変えながら少なくとも７日間、ポリマー粒子をｄｄＨ２Ｏに対して透析した。透析後、ポリマーを液体Ｎ２中で急速凍結させ、５日間、凍結乾燥させた。
【００３４】
１Ｈ−ＮＭＲ分光法。未架橋ポリマー製剤及び精製画分の組成は、自動試料採取装置を装備したVarian（Palo Alto、CA）のDirectDrive４００ＭＨｚ核磁気共鳴分光計を使用して調べた。ＮＭＲチューブ（Wilmad Lab Glass社製、Vineland, NJ）を含むすべてのガラス器、２ｍＬ試料バイアル及びパスツールピペットは、真空オーブンで一晩乾燥させた。約５０ｍｇの未架橋ポリマー試料を試料バイアルに直接秤量し、最終ポリマー濃度が２５ｍｇ  ｍＬ−１になるようにＤ２Ｏを添加した。試料を音波浴中で短時間超音波処理し、後続の分析用のＮＭＲチューブに移した。精製上清のアリコートを−８０℃で凍結させ、４８時間、Labconco FreeZone  −１０５℃ベンチトップ凍結乾燥機（Kansas City、MO）で凍結乾燥させた。得られた乾燥残留物を０．７５ｍｌの重水素化ＤＭＳＯに溶解し、ＮＭＲチューブに移した。ＮＭＲスペクトルはすべて、SpinWorks 3（商標）ソフトウェアを使用して分析した。
【００３５】
ナノゲルの特性決定
透過型電子顕微鏡。透過電子顕微鏡写真は、１６，５００倍〜１６０，０００倍の倍率のFEI Tecnai（Hillsboro, OR）透過電子顕微鏡（８０ｋＶ）を使用して回収した。凍結乾燥粒子はｄｄＨ２Ｏで希釈し、画像診断の直前に、２％の酢酸ウラニルで染色した。典型的には、０．０２ｗ／ｖ％粒子懸濁液の５μＬを４００メッシュのホルムバール被覆銅ＴＥＭグリッド（Electron Microscopy Sciences社製、Hatfield, PA）に適下し、過剰の液体は濾紙を使用して吸い取った。次いで、等量の２ｗ／ｖ％酢酸ウラニルをグリッドに加え、６０秒間染色させた後、過剰の液体を濾紙により吸い取った。乾燥状態の粒子体積は、ＴＥＭ画像から平均直径の立方体として得た。粒子直径は、ImageJ粒子測定アルゴリズムによって測定した粒子面積から計算した。報告値は、平均±標準偏差で示す（ｎ＞５０）。
【００３６】
動的光散乱分析。水系懸濁液中のナノゲルの強度平均流体力学的直径は、６５９ｎｍのダイオードレーザー源で作動するBrookhaven ZetaPlus装置（Brookhaven Instruments社製、Holtsville, NY）を使用して測定した。粒子サイズの動的光散乱（ＤＬＳ）測定及び動的ｐＨに対するその応答は、ＰＢＳ中に０．７５ｍｇ  ｍＬ−１で凍結乾燥粒子を再懸濁することにより実施した。懸濁液のｐＨは、１ＮのＮａＯＨを使用して１０．５に調整し、１ＮのＨＣｌを使用してｐＨを３．５まで段階的に下げた。ｚ−平均粒子径の測定は、２３℃で収集した。続く試験では、MPT-2自動滴定装置を装備した６３３ｎｍレーザー源で作動するMalvern Zetasizer NanoZS（Malvern Instruments社製、Malvern, UK）を使用した。粒子サイズのＤＬＳ測定及びｐＨ応答性挙動は、ＰＢＳ中に０．５ｍｇ  ｍＬ−１で凍結乾燥粒子を再懸濁することにより実施した。懸濁液のｐＨは１ＮのＮａＯＨを使用して１０．５に調整し、１ＮのＨＣｌを使用してｐＨを３．５まで段階的に下げた。ｚ−平均粒子径の測定は、２５℃で、０．５のｐＨ間隔で収集した。
【００３７】
ナノゲル懸濁液の滴定。ナノゲル懸濁液に対するｐＫａ値は、Malvern MPT-2自動滴定装置を使用して測定した。ナノゲルは、使用前に、２４時間、１００ｍＭのＮａＣｌ中で１ｍｇ  ｍｌ−１で平衡化した。溶液のｐＨは、正規化０．１Ｍ  ＨＣｌでｐＨを３．０に調整した。溶液ｐＨは、正規化０．１Ｍ  ＮａＯＨを加えることでｐＨを１１．０までゆっくりと上げた。溶液のｐＨは、それぞれのＮａＯＨ添加後に記録した。ナノゲルｐＫａ値は、滴定曲線の変曲点として推定した。測定はすべて２０℃で行った。
【００３８】
蛍光分光学法。ピレン（Purissグレード、＞９９．０％、Sigma-Aldrich社製、St. Louis, MO）は、それ以上精製することなく使用した。リン酸二ナトリウム七水和物（Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ）及びリン酸ナトリウム一水和物（ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ）は、Fisher Chemical社から購入した。ｐＨ５．８〜ｐＨ８．０のリン酸緩衝液は、０．２ＭのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ及び０．２ＭのＮａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏの溶液を組み合わせることにより調製した。ポリマー溶液は、１ｍｇ  ｍＬ−１の濃度で超高純度ＤＩ水に乾燥ナノ粒子を懸濁させることにより調製した。次いで、先の２つの溶液を等容量で混合し、１００ｍＭリン酸塩緩衝液中に最終濃度が０．５ｍｇ  ｍＬ−１のナノ粒子を得た。ピレンは１ｍＭでメタノールに溶解させた。蛍光スペクトルは、Fluorlog-3分光蛍光計（Jobin Yvon, Horiba Scientific社製, Edison, NJ）で収集した。発光スペクトルは、λｅｘ＝３３９ｎｍ、１ｎｍの増分、励起スリット幅１．５ｎｍ、発光スリット幅１ｎｍ、及び積分時間０．８秒で収集した。励起スペクトルは、λｅｍ＝３９０ｎｍ、１ｎｍの増分、励起スリット１ｎｍ、及び発光スリット１．５ｎｍ、及び積分時間０．８秒で収集した。
【００３９】
電気泳動光散乱。ポリマーネットワークの有効表面ζ電位は、６５９ｎｍのダイオードレーザー源で作動するBrookhaven ZetaPlus装置（Brookhaven Instruments社製）を使用して測定した。ｐＨの関数としてのζ電位の測定は、５ｍＭリン酸塩緩衝液中に０．５ｍｇ  ｍＬ−１で凍結乾燥粒子を再懸濁することにより実施した。懸濁液のｐＨは１ＮのＮａＯＨを使用して１０．５に調整し、１ＮのＨＣｌを使用してｐＨ３．５まで段階的に下げた。表面ζ電位の電気泳動光散乱測定は、５ｍＭリン酸ナトリウム中に懸濁させたナノゲルにより２２℃で収集した。
【００４０】
結果及び考察
ナノゲルの合成。ＰＥＧでグラフト化したＰＤＥＡＥＭＡ表面の架橋コアから構成される一連の調整可能なポリカチオン系ナノスケールヒドロゲルは、感光乳化重合を使用して合成した。ポリマー組成は、コポリマー中のＴＢＭＡ又はＴＢＡＥＭＡを０〜２５ｍｏｌ％で変化させ、物理化学的特性に対するコア疎水性の効果を決定した。メトキシ末端ポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ、ＭＷ約２０８０）を乳化安定剤として使用し、ナノゲル表面にグラフトしたＰＥＧ鎖を提供した。ＰＥＧＭＡは市販されており、メタクリレートコポリマーの水性乳化重合における反応性安定化剤として日常的に使用されている。ＭＷ２０８０のＰＥＧＭＡを選択したが、それは、これまでの研究で、非特異タンパク質吸着を最小限にするには２ｋＤａの最小ＰＥＧグラフトサイズが必要であることが示されたからである。この合成で使用したモノマーを図２に示す。
【００４１】
この重合法はＵＶ開始フリーラジカル重合であるため、コポリマーはランダムであることが有利であると仮定でき、それにより、モノマーは、それらの相対供給濃度及び優先的順序のない反応性に基づいてコポリマーへ加えられる。この仮定は、構成モノマー対（Ｍ１及びＭ２）に対する反応性の比（ｒ１、ｒ２）を調べることにより評価することができる。一般に、１付近（ｒ１ｒ２＝０．５〜２）のペアの反応性比製品との共重合は、中程度の理想的重合挙動に従って反応すると考えることができる。メタクリレートモノマー対間の反応性比を推定するため、Ｑ−ｅスキームを使用して、構成モノマー対（Ｍ１及びＭ２）に対する反応性比（ｒ１及びｒ２）の値を計算した。記録されたＱ−ｅ値と得られた反応性比を表２にまとめる。
【００４２】
【表２】
2016500681.tif 000003
【００４３】
これらのデータから、ｒ１及びｒ２に対するすべての推定値は０．４〜２．０にあり、このことから、得られたコポリマーは理想的であると評価することができ、コポリマー組成物が供給濃度に密接に関連していることを示唆していると推察することができる。この分析の目的において、疎水性モノマー（ＴＢＭＡ又はＴＢＡＥＭＡ）とイオン化可能モノマー（ＤＥＡＥＭＡ）の間の比は、ネットワーク疎水性と得られる物理化学的特性、例えば、動的な膨潤／解膨潤、ゼータ電位などに対するその影響をモジュレートする際の重要な比となると考えられた。ポリマー組成を調整し、ポリマー−溶媒相互作用を変化させることは、ポリマー鎖が相転移を受ける温度（ＬＣＳＴ／ＵＣＳＴ）又はｐＨをはじめとする、様々な臨界現象に影響を及ぼす可能性があることは十分に知られている。このため、ポリマー製剤の命名は、ポリマー名の数値の添え字（例えば、ＰＤＥＴＢ３０又はＰＤＥＴＢＡ２０）は、１００モルのＤＥＡＥＭＡ当たりの疎水性モノマー（ＴＢＭＡ又はＴＢＡＥＭＡ）のモル数を意味するように設定した。
【００４４】
ナノゲルの精製。精製は、高分子電解質−イオノマー転移を繰り返し誘導することにより行った。重合後、１ＮのＨＣｌを、反応混合物と１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の比で反応フラスコに直接加え、ＤＥＡＥＭＡペンダント基をプロトン化した。このステップの後、酸性化した反応混合物をアセトンに加え、最終アセトン濃度を８０ｖｏｌ％にした。有機溶媒への添加を使用して懸濁液の絶縁強度（ε）を低下させ、高分子電解質レジームからイオノマーレジームへの移行を容易にした。高分子電解質レジームにおいては、対イオンはポリマーネットワークによって自由に拡散し、一方、イオノマーレジームにおいては、対イオンは、ポリマーネットワーク上のイオン化された基にイオン対で結合されている。イオンの静電引力からのエネルギー利得（Ｅ）は、式Ｅ＝ｅ２／（εａ）で表すことができ、式中、ｅはイオン種の電荷であり、εは絶縁強度であり、ａはイオン対における電荷間の距離である。
【００４５】
イオノマーレジームは、誘電率が十分に高い溶媒（例えば水、ε＝８１）では稀である。しかし、溶媒絶縁強度が低下するにつれて、イオン対の形成は、可動性対イオンの濃度を低下させ、同時にゲル浸透圧を低下させる。さらに、これらのイオン対は、双極子−双極子相互作用によって相互に引きつけ、多重項を形成する。これらの多重項は、ゲルにおいてさらなる物理的架橋として機能し、ゲル収縮をサポートする。ポリマー−イオノマー転移を使用することにより、これらのナノゲルは同時に収縮及びイオン化され、急速な凝集と沈殿が生じた状態になる可能性がある。次いで、イオノマー相を遠心分離によって溶媒から分離した。界面活性剤の除去は、１Ｈ−ＮＭＲによって各精製サイクルからの上清を分析することによりモニターした。精製サイクルは、（１）０．５ＮのＨＣｌによるＤＥＡＥＭＡのプロトン化、（２）４容量等量のアセトンを添加することによるイオノマー相転移（総アセトン８０ｖｏｌ％）、（３）イオノマー／溶媒混合物の遠心分離、と定義する。
【００４６】
未架橋ポリマー鎖は、相対遠心力（ＲＣＦ、relative centrifugal force）が非常に高いが、同様の方法で精製した。高分子電解質−イオノマー転移後の未架橋ポリマー鎖の沈降は、３０，０００×ｇ以上のＲＣＦが必要であった。ＰＥＧＭＡ、Ｐ（ＤＥＡＥＭＡ−ｃｏ−ＴＢＭＡ）（ＰＤＢ３０）なしで合成されたポリマーにおいてオキシエチレンピーク（δ＝３．６ｐｐｍ）が存在しないことは、Brij-30が精製過程で順調に除去されたということをさらに証明している。
【００４７】
ポリマー組成の決定。コポリマーの組成を確認するため、未架橋のナノスケールヒドロゲルの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを収集し、分析した。結果を表４にまとめる。得られたｔ−ブチル（ＴＢＭＡ又はＴＢＡＥＭＡのいずれかからのもの）のＤＥＡＥＭＡに対するコポリマーの割合は、供給物におけるコモノマーの割合を密に反映する。この結果からは、メタクリレート基をすべて含有する、所定の構成コモノマーの反応性比は、既に表２に示したように、相対的に類似していることが予想される。さらに、対の反応性比（ｒ１ｒ２）の生成物は、理想的なラジカル重合によって記載範囲内にあり、ランダムコポリマーが生じる。
【００４８】
【表３】
2016500681.tif 000004
【００４９】
ＴＢＭＡ含有コポリマー及びＴＢＡＥＭＡ含有コポリマーの両方に関するピーク同定及びスペクトルを実施した。この分析において、［−Ｎ−（ＣＨ２−ＣＨ３）２−］（ピークｄ、３．１ｐｐｍ）をＤＥＡＥＭＡの相対的モル量を決定するための基準として選択し、［−Ｃ−（ＣＨ３）３−］（ピークｈ、１．３ｐｐｍ）をＴＢＭＡ及びＴＢＡＥＭＡの相対的モル量を決定するために選択し、［−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−］（ピークｆ、３．６ｐｐｍ）をＰＥＧＭＡの相対的モル量を決定するために選択した。
【００５０】
表４のデータの注目すべき知見は、ＰＥＧＭＡがコポリマーに加えられた場合に効率が悪く、コポリマー中に供給物中の１０％未満のＰＥＧＭＡが検出された。ＰＥＧＭＡは大きく（ＭＷ約２，０８０）、親水性の高いマクロモノマーであるため、ＤＥＡＥＭＡ、ＴＢＭＡ及びＴＢＡＥＭＡが存在するエマルジョンの油相に分配される可能性はない。むしろ、ＰＥＧマクロモノマーはBrij（登録商標）-30及びMyTABと共に油滴表面に吸着され、油水境界での界面張力の低減に有効である可能性がかなり高いと思われる。表４で決定した相対的モル組成に基づき、コポリマーは約５ｗｔ％のＰＥＧを含有する。
【００５１】
ＰＥＧマクロモノマーのエマルジョン界面と水相との優先的会合の結果、それが主として粒子表面にグラフトし、加えたＰＥＧ鎖が周囲の水性媒体に突出する。実際、架橋ナノゲルの１Ｈ−ＮＭＲ試験（図Ｓ−１）からは、ＰＥＧからのオキシエチレンプロトンを示す、３．６ｐｐｍに強いピークがあることが明らかであった（ピークａ）。また、ＤＥＡＥＭＡのエチルアミノ基からのプロトンも、それらの未架橋スペクトルに比べると抑制されてはいたが、存在する（ピークｃ、３．２ｐｐｍ、及びピークｄ、１．２５ｐｐｍ）。これらの結果から、ＤＥＡＥＭＡ及びＴＢＭＡ／ＴＢＡＥＭＡのプロトンの大部分は、溶媒和及び１Ｈ−ＮＭＲによる検出には利用できない、ネットワークコア中に封鎖されていることが示唆される。このＰＥＧコーティングは、コロイド安定性を付与し、生物医学的用途におけるオプソニン作用の可能性を最小限とすることに有用であり得る。
【００５２】
ナノゲルサイズの決定
透過型電子顕微鏡。まずナノスケール寸法を確認するため、様々な組成のナノスケールヒドロゲルについてＴＥＭ測定を行った。ＴＥＭ顕微鏡写真の分析からは、ナノスケールヒドロゲルネットワークの形成に成功したことが明らかであった。図３に示したように、ほぼすべての調製物は平均直径が約５０ｎｍの狭い粒度分布を有することが明白である。乾燥ナノゲル製剤の直径を表５に示す。
【００５３】
【表４】
2016500681.tif 000005
【００５４】
粒子面積は、ImageJソフトウェアを使用して決定し、粒子とバックグラウンドとの間の相対的コントラストに基づいて粒子を同定した。次いで、この測定を使用し、ナノスケールヒドロゲルの乾燥直径を得た。２６，５００倍の倍率及び４３，０００倍の倍率で得られた画像を最も高頻度で使用し、粒子数（典型的には４０〜５０粒子／画像）と解像度の最良の組合せを提供するように、数平均粒度分布を構築した。しかし、実際には、１６，５００倍〜６０，０００倍の倍率で得られた画像を使用することができ、計算した直径及び標準偏差にばらつきはほとんどない。ＰＤＥＴＢＡ２０（図３、パネルＦ）及びＰＤＥＴＢＡ３０（図３、パネルＧ）はともに、他の製剤よりも大きな平均粒子径（６３ｎｍ及び６６ｎｍ）を示している。これは、おそらく染色方法によるものである。酢酸ウラニルがＴＥＧＤＭＡ−架橋Ｐ（ＤＥＡＥＭＡ−ｃｏ−ＴＢＭＡ−ｇ−ＰＥＧＭＡ）（ＰＤＥＴＢ３０）のナノゲルに染み込むのには１分の染色時間で十分であり、均質な染色と高コントラストが得られることが判明した。しかし、この染色時間は、２０ｍｏｌ％のＴＢＡＥＭＡ（ＰＤＥＴＢＡ２０）と３０ｍｏｌ％のＴＢＭＡ（ＰＤＥＴＢＡ３０）とのコポリマーに対しては十分ではなく、それは図３、パネルＧで最も明白であり、その図では粒子境界面を不鮮明な環が示している。これは、少し軽微ではあるが、図３、パネルＦに存在する。この不鮮明な境界により粒子境界面の同定がより不正確になり、真の粒子面積の過大評価が生じる。すべての事例において、数平均粒度分布はほとんどガウス分布であり、その一例を図４に示す。
【００５５】
動的光散乱。動的光散乱を使用して、水溶液中のナノゲル懸濁液の流体力学的直径を調べた。報告した流体力学的直径及び多分散性指数は、ＩＳＯ  １３３２１で概説されるキュムラント分析によって決定されたものを示す。他の分析アルゴリズム、例えばＣＯＮＴＩＮ及びＮＮＬＳなども存在するが、キュムラント分析が容易に受け入れられており、広く産業及び学界で採用されている。この方法の限定的推定は、球状微粒子の単一分布である。この方法は、強度加重粒子サイズ分布に基づいた流体力学的直径を示す、単一のｚ−平均粒子径を取り戻す。図５及び図６は、膨張し収縮した状態のナノスケールヒドロゲルに関する代表的な分布を示しているが、キュムラント分析はこれらの測定に適用可能であることを示唆している。多モードの粒子分布を記載するためにＣＯＮＴＩＮとＮＮＬＳの両方が数学的に備わっていることに注意されたい。
【００５６】
ナノ粒子分散液のコロイド安定性は、表面電荷及び／又は表面から突出している吸着分子若しくは結合分子から得られる任意の立体安定化の機能である。±３０ｍＶの純表面電荷、又はζ電位は、一般には、純粋な静電気安定化のための最小値であると見なされる。粒子−粒子凝集に対する耐性について、水性懸濁液中に疎水性コモノマー及びＴＢＭＡを含有するコポリマーで４週間及び８週間後に試験した。ネットワークコアの疎水性を高めるためにＴＢＭＡを加えた。こうした場合、これらのナノ粒子は、最も高い凝集又はフロキュレーション傾向を示すはずである。ＤＬＶＯ理論によれば、コロイド懸濁液におけるこのプロセスは、主として、ブラウン運動を受けている、接近粒子間のファンデルワールス引力によって起こる。図８に示した結果は、ナノゲルが水性懸濁液中で少なくとも８週間、凝集を阻止することができることを証明している。流体力学的直径は、解膨潤状態（ｐＨ＞７．５）において約９３〜９６ｎｍを維持し、膨潤状態（ｐＨ＜６．０）において１１９〜１２２ｎｍを維持する。さらに、ｐＨｃは水性懸濁液中で４週間〜８週間変化しない。
【００５７】
多分散性指数（ＰｄＩ）は、キュムラント分析の第２モーメント（μ２）と第１モーメント（Γ）の比（μ２／Γ２）として得られ、サイズ分布の見かけ上の幅を表している。キュムラント分析で定義した、このＰｄＩは、真の粒子サイズ分布を表しているのではなく、むしろ、得られた自己相関関数の単一指数関数的適合前後の想定ガウス分布の幅であることに注意されたい。水性懸濁液中で、４週間から８週間の間、ＰｄＩでは変化はほとんど見られない。さらに、ｐＨ７．０付近の疎水性相から親水性相への転移における測定値を除くほぼすべてのＰｄＩ値は、０．２未満である。これらのデータは、本発明者らのナノゲルが、水性懸濁液中で安定しており、少なくとも８週間にわたって粒子凝集に対して有意に耐え得ることを示唆している。本発明者らが感光乳化反応混合物中の反応性ＰＥＧＭＡ（ＭＷ約２０８０）を非反応性ＰＥＧモノメチルエーテル（ＭＷ約１９００）と置き換えた時に、得られたナノゲル（ｗ／ｏ  ＰＥＧグラフト）は安定性が不十分で、１時間以内に目視可能なフロキュレーション及び沈降が生じたことが明らかであった。その結果、本発明者らは、ＰＥＧグラフトがこれらのナノゲルへのコロイド安定性の付与に重要であると考える。
【００５８】
ｐＨ応答性相転移の評価
動的光散乱。動的光散乱を使用して、ナノゲルの容量膨潤転移、例えば、それらの膨潤比及び臨界膨潤ｐＨを調べた。後者は、ヒドロゲル介在性細胞内薬剤送達において特に興味深い。それは、このパラメーターが、ネットワークが膨潤し、周囲環境へ薬剤を流出させる生理学的ｐＨの指標（エンドソーム対細胞外）であるからである。
【００５９】
次の論題で記載しているｐＨ依存性相転移において、ナノゲルをまずｐＨ１０．５に調整し、ＨＣｌを使用して滴下し、徐々にｐＨ値を下げた。酸性化（エンドソームＡＴＰ依存性プロトンポンプの作用による）が、細胞内薬剤送達担体が経験する最も一般的なｐＨ依存性経路であることは正当である。本発明者らの試験において、ｐＨ依存性膨潤応答は、ｐＨ１０．５〜ｐＨ３．５の滴定、及びｐＨ１０．５への逆行の滴定の際に、ヒステリシスの証拠はないが完全に可逆的であった。これらの研究において、塩誘導性フロキュレーションは、２回の滴定サイクルにわたって認められなかった。
【００６０】
図７は、ナノゲル製剤のｐＨ依存性容量膨潤に対する疎水性部分の導入の影響を示すものである。イオン化可能なヒドロゲル系での膨潤は、熱力学的力及び物理的力のバランス、すなわち、ポリマーと溶媒の相互作用の自由エネルギー、ゲル内部の可動性対イオンによって生じる浸透圧、及びゲル変形に対する弾性収縮反応によって起こる。疎水性含量が増加するほど、ポリマー／ポリマー相互作用を超えるポリマー／溶媒／イオン相互作用を促進するために、より大きなプロトン活性又はより大きなイオン化（すなわち低ｐＨ）が必要とされる。予想されるように、この効果はまた、ｐＨ依存性ゲルの膨潤の発現の低下につながる。
【００６１】
ＴＢＭＡの添加は（図７、パネルＡ）は、明らかに、ｐＨ依存性膨潤の発現を約ｐＨ７．８〜ｐＨ７．０にシフトする。さらに、測定された流体力学的直径（ＤＨ）に双曲正接又はシグモイド関数を適合させ、変曲点を決定することにより、臨界膨潤ｐＨを定義することができる。この場合、データを次式：
ＤＨ＝Ａ＋Ｂ・ｔａｎｈ（Ｃ・ｐＨ＋Ｄ）    （１）
の双曲正接関数にあてはめた。式１の二次導関数を得ることによって曲線の変曲点が得られるが、これは臨界膨潤ｐＨであるｐＨｃを表すために得るものである。
【００６２】
【数１】
2016500681.tif 000006
（２）
【００６３】
ＴＢＭＡを含有するネットワークにおいて、ｐＨｃトレンドは以下のように低下した：ＰＤＥＴ（ｐＨｃ＝７．３７）〜ＰＤＥＴＢ２０（ｐＨｃ＝７．３６）〜ＰＤＥＴＢ１０（ｐＨｃ＝７．３１）＞ＰＤＥＴＢ３０（ｐＨｃ＝６．６５）。さらに、ＰＤＥＴ、ＰＤＥＴ１０及びＰＤＥＴ２０は、約ｐＨ６．８で最大膨潤容量に達したが、ＰＤＥＴＢ３０はｐＨ６．０付近で最大膨潤容量に達する。このｐＨは哺乳動物細胞の初期エンドソームの特徴であり、このことは、これらのネットワークが細胞内薬剤送達のビヒクルとしての有用性を有し得ることを示唆している。
【００６４】
膨潤容量の程度は、ＴＢＭＡのゲル濃度の増加とともに減少する。ＰＤＥＴＢ１０とＰＤＥＴＢ２０は共にベース製剤ＰＤＥＴよりも低い膨潤容量比を示すが、ＰＤＥＴＢ３０はネットワーク膨張に対し著しく低い能力を示す。この知見は、（１）溶媒和に抵抗し、ネットワーク弾性変形を制限する、ポリマーネットワーク内の疎水性会合の持続性、及び（２）イオン化可能なアミン含量の低下とそれによるネットワークコアへ移動する塩類によって生じる浸透圧の低下という、２つの作用によるものであろう。
【００６５】
様々な製剤全般の総モノマー濃度を一定に維持するために、ＴＢＭＡ濃度の増加には、ＤＥＡＥＭＡ濃度の同時低下が必要であった。簡単に説明すると、ＰＤＥＴＢ３０はＰＤＥＴに比べ第三級アミンをほとんど含有しておらず、したがって、静電反発力と浸透圧性膨潤に関する能力は、ＤＥＡＥＭＡ含量の減少に比例して減少する。これらのデータは、臨界［ＴＢＭＡ］：［ＤＥＡＥＭＡ］比が存在し、それ未満で、疎水性ＴＢＭＡ基は、疎水性ドメインに分離し、アミン基のイオン化及び浸透圧性膨潤の効果を平衡させる十分な濃度で存在していないことを示唆している。
【００６６】
またＴＢＡＥＭＡの導入により（図７、パネルＢ）、効果はそれほど顕著ではないが、ｐＨ依存性膨潤の発現を低下する。これらのコポリマーにおいて、ｐＨｃの低下は、いかなる特定の組成上のトレンドにも従わない：ＰＤＥＴ（ｐＨｃ＝７．３７）＞ＰＤＥＴＢＡ３０（ｐＨｃ＝７．１３）＞ＰＤＥＴＢＡ１０（ｐＨｃ＝７．０１）〜ＰＤＥＴＢＡ２０（ｐＨｃ＝６．９８）。またこれらの製剤は、容積膨潤に対する同様の能力も示す。ＴＢＡＥＭＡは第二級アミンを含有しているので、ネットワーク電荷密度（及び生じる浸透圧）は、ＰＤＥＴ、ＰＤＥＴＢＡ１０、ＰＤＥＴＢＡ２０及びＰＤＥＴＢＡ３０の間で相対的に一定のままでなければならない。さらに、このことは、ＴＢＡＥＭＡ中のイオン化可能な第二級アミン基がおそらく疎水性ｔ−ブチル基の別々のドメインの形成を妨げていることを示唆している。高分子電解質ゲル剤中の疎水性ドメインは、有効な架橋密度を増加させ、容積膨潤を低減することがわかった。これらのデータからは、ｔ−ブチル−Ｒ基の存在はｐＨｃを低下させるには必要かつ十分ではなく、むしろより一般的には、疎水性の効果は相変化の挙動変化を調節することが示唆される。
【００６７】
電気泳動光散乱。有効表面ζ電位を測定することによって、様々な製剤間の些細な違いを明らかにする。これらのデータは、これらのナノスケールヒドロゲルのＰＥＧグラフト化表面が非常に類似しており、またモノマー組成における変更は主としてネットワークコアに影響を及ぼすという予想と一致している。製剤はすべて、可逆的な表面電荷を有し、約ｐＨ８．０での等電点（ＩＥＰ）、ｐＨ７．４でのわずかに正のζ電位、及びｐＨ３．５０での２５〜３０ｍＶの最大ζ電位である（図８）。
【００６８】
生理学的ｐＨでは、わずかに正のζ電位は、非特異的な細胞取込みを容易にし得る。観察されたｐＨ１０．５〜約ｐＨ８．０の負のζ電位は、ＰＥＧコーティング表面に負荷電ヒドロキシルイオンを吸着させることができるが、同様のＤＥＡＥＭＡ系材料において既に言及されている。同じく、正のζ電位をヒドロニウムイオンに表面吸着させ、ネットワークコア内のアミン含有基をプロトン化させることができ、これは粒子の周りに電気二重層を確立するのに有用である。すべての製剤に対して測定されたζ電位は、静電気により生じるコロイド安定性（±３０ｍＶ）の制限の範囲外にあるが、ナノスケールヒドロゲルが±５ｍＶのネット表面電荷を有していたところであっても、フロキュレーション又は凝集はそのｐＨ範囲全体にわたって認められなかった。これは、ＰＥＧ表面グラフトによって付与される立体的安定化のさらなる証拠を提供するものである。さらに、これまでの研究では、純粋なＰＤＥＡＥＭＡナノゲルのζ電位がｐＨ１０では約−４５ｍＶであり、ｐＨ４では約７５ｍＶであると推測されている。したがって、ＰＥＧの表層面は、表面電荷の遮蔽において実際有効であった。
【００６９】
ピレン蛍光分光学法。ピレンの蛍光発光スペクトルにおける第１の電子振動ピークと第３の電子振動ピークとの比（Ｉ１／Ｉ３）を使用して、反応性ナノスケールヒドロゲルのｐＨ依存性構造転移を試験した。ピレンの蛍光スペクトルは、ピレンの微小環境の極性に応じて特有のシフトを受ける。強極性水性溶媒に溶解させた場合、発光スペクトルのＩ１／Ｉ３比は約１．５９であるが、ｎ−ヘキサン又はドデカンなどの無極性脂肪族炭化水素中では、この比は０．６１まで低下する。したがって、Ｉ１／Ｉ３の発光比の増加は、ピレンが疎水性ドメインで優先的に分割されていることを示す。図９は、収縮した疎水性物質（ｐＨ８．０）と膨潤した親水性物質（ｐＨ６．０）の間のＰＤＥＴＢ３０の水性懸濁液におけるピレン蛍光の代表的な変化を示している。この結果、ピレンの蛍光スペクトルを使用してナノスケールヒドロゲルの水性懸濁液の極性を調べ、関係するネットワーク疎水性に対するポリマー組成の影響、及び構造転移を誘導するのに必要な臨界ｐＨを決定することができる。図１０Ａは、ＴＢＭＡの導入は、組成依存的に、構造転移を誘導するのに必要なｐＨの低下を引き起こすことを明らかに示している。
【００７０】
この値は、ＰＤＥＴにおける約ｐＨ７．５からＰＤＥＴＢ３０におけるｐＨ７．０未満に低下し、ＰＤＥＴＢ１０及びＰＤＥＴＢ２０は共に中間値を示す。ＰＤＥＴ及びＰＤＥＴＢ３０に対して測定されたｐＫａ値は、それぞれ７．３と６．９である。ＰＤＥＴに対するｐＫａは、ＤＥＡＥＭＡ系ポリマーの以前の情報と非常に一致している。ネットワーク疎水性の増加がイオン化可能なアミンのｐＫａを低下させることが知られているので、ポリマーｐＫａの低下は予想される。
【００７１】
さらに、ＰＤＥＴは疎水性物質から親水性物質までのむしろ急激な転移を示すのに対し、ＴＢＭＡ含有ネットワークは、実質的に広範囲のｐＨ範囲にわたって転移する。本発明者らのナノゲルＰ（ＤＥＡＥＭＡ−ｃｏ−ＴＢＭＡ−ｇ−ＰＥＧＭＡ）に類似のモノマー組成物Ｐ（ＤＭＡＥＭＡ−ｃｏ−ＴＢＭＡ）のバルクゲルにおいて、疎水性マイクロドメインの残存は２０％のＴＢＭＡ含量で剪断弾性率を３５％上昇させ、４０％のＴＢＭＡ含量で２４５％上昇させた。本研究においては、ＤＥＡＥＭＡ系ナノゲル中のＴＢＭＡによって同様の強化効果が得られ、より広範囲の膨潤転移が生じる。
【００７２】
またこれらの研究は、ネットワークコアの相対的な疎水性に対するさらなる知見を提供する。例えば、ｐＨ８．０では、収縮したＰＤＥＴに関するＩ１／Ｉ３比は１．１５であるが、収縮したＰＤＥＴＢ３０に関するＩ１／Ｉ３比は約１．０９である。ｐＨ５．８の緩衝液中に懸濁した場合、これらの比は、ＰＤＥＴとＰＤＥＴＢ３０について、それぞれ１．５８、１．４９まで増加した。Ｉ１／Ｉ３に関するこれらの値は、ＤＥＡＥＭＡ系ポリマー材料におけるピレン蛍光プローブのこれまでの報告と非常に一致する。
【００７３】
しかし、ｐＨ依存性膨潤転移に対するＴＢＡＥＭＡの影響についての我々の理解はそれほど明確ではない。ＴＢＡＥＭＡ含有ナノゲルは、ＴＢＭＡコポリマーで示した同じタイプの組成物依存性相転移を示さなかった（図１０Ｂ）。低濃度のＤＥＡＥＭＡ系ナノゲル中で共重合させた場合（ＰＤＥＴＢＡ１０）、ＴＢＡＥＭＡは、光散乱（図７Ｂ）及びピレン（図１０Ｂ）での両試験において臨界膨潤ｐＨを低下させる。ＴＢＡＥＭＡもＴＢＭＡも含有していないＰＤＥＴと比較した場合、転移の幅は比較的一定のままである。２０ｍｏｌ％及び３０ｍｏｌ％のＤＥＡＥＭＡ（ＰＤＥＴＢＡ２０とＰＤＥＴＢＡ３０）で共重合させた場合、ＴＢＡＥＭＥＡは、ＤＬＳで測定したｐＨｃを上昇させ、ピレン蛍光で測定した疎水性物質−親水性物質相転移の幅を有意に増加させる。この知見は、ＴＢＭＡ含有ナノゲルに適用された鎖剛性理論と一見矛盾している。鎖剛性及び可動性が疎水性物質−親水性物質の相転移の幅を支配する主要な要因であった場合、ＰＤＥＴ、ＰＤＥＴＢＡ１０、ＰＤＥＴＢＡ２０及びＰＤＥＴＢＡ３０が同様の幅の相転移を有することが期待される。ＤＥＡＥＭＡ及びＴＢＡＥＭＡは、同一の分子量と同様の末端基膨嵩性を有する。したがって、本発明者らは、ＴＢＡＥＭＡが鎖剛性にほとんど影響を及ぼさないと推測する。
【００７４】
ＴＢＡＥＭＡ誘導性の疎水性物質−親水性物質相転移の広範囲特性について考えられる解釈の１つは、ネットワークコア内のイオン化可能なアミン種の不均質分布であり得る。滴定試験では、ＰＤＥＴＢＡ３０に対する２種のバッファー領域が明らかである；中央値はｐＨ７．３及びｐＨ８．３で生じる。これらの値は、ｐＫａが約７．０〜７．３のＰＤＥＡＥＭＡとｐＫａが約７．６〜８．０のＰＴＢＡＥＭＡに関するこれまでの報告と一致する。したがって、ＰＤＥＴＢＡ３０は、（図１０ＢのＩ１／Ｉ３の増加により示した）高ｐＨで高いネットワーク電荷密度を有し、複数のイオン化可能な種のｐＫａ範囲にわたり分布している極性の高い環境を作るはずである。この効果は、ＰＤＥＴＡＢ２０ではそれほど明らかではなく、ＰＤＥＴＢＡ１０ではほとんど存在しない。ＰＤＥＴ、ＰＤＥＴＢ３０及びＰＤＥＴＢＡ３０間の疎水性から親水性への相転移の比較は、図１１に示している。
【００７５】
結論。
ナノスケールのｐＨ応答性ポリカチオンネットワークは、感光乳化重合を使用して、順調に合成された。コポリマーの組成及び疎水性部分のＴＢＭＡ及びＴＢＡＥＭＡの導入は、１Ｈ−ＮＭＲを使用して確認した。ヒドロゲルナノ粒子は、ＴＥＭで測定した場合に約５０〜６５ｎｍの乾燥直径を示し、収縮しているがまだ水和されている約９０ｎｍの直径を示す。動的光散乱からは、少なくとも８週間、水性懸濁液中で安定性を維持する粒子サイズの単一分布が明らかである。Ｐ（ＤＥＡＥＭＡ−ｇ−ＰＥＧＭＡ）コポリマーにおいて、ｐＨ依存性膨潤の発現は約ｐＨ７．８〜８．０で生じ、ネットワークは、約ｐＨ６．７〜７．０で最大膨潤容量に達した。Ｐ（ＤＥＡＥＭＡ−ｃｏ−ＴＢＭＡ−ｇ−ＰＥＧＭＡ）コポリマーにおいては、ｐＨ依存性膨潤の発現はＴＢＭＡ含量の増加とともに減少し、約ｐＨ７．２で最大膨潤容量に達し、ＰＤＥＴＢ３０においては約ｐＨ５．５０で最大膨潤容量に達した。さらに、ＴＢＭＡは、光散乱及びピレンの蛍光分光学法試験において、収縮した疎水性物質と膨潤した親水性物質の転移を拡大する。Ｐ（ＤＥＡＥＭＡ−ｃｏ−ＴＢＡＥＭＡ−ｇ−ＰＥＧＭＡ）コポリマーにおいては、構成的依存はそれほど明白ではなく、ＴＢＡＥＭＡ及びＤＥＡＥＭＡ内の複数のイオン化可能な種の存在によって入り組んだ状態になり得る。本報告及び本発明者らの以前の研究で論じた重合により、材料特性を調整する必要のある様々な用途における有用性を有するヒドロゲルナノ粒子を信頼性高く形成することができる。特に、ＰＤＥＴＢ３０は、細胞内薬剤送達の用途に非常に適した、サイズ（ｄＨ約１００ｎｍ）、反応特性（ｐＨｃ約６．６）を有する。
【００７６】
実施例２−疎水性多塩基性ナノスケールヒドロゲルの膜破壊特性
組成の検討、例えば、カチオン性と非イオン性の親水性成分間のバランス、疎水性モノマーの割合などは、得られた薬剤送達特性（すなわち、トランスフェクション効率、複合体の安定性など）に有意な影響を及ぼす。一般に、カチオン含量の増加が核酸縮合の増加につながることは理解されよう。しかし、ポリマー送達系における過剰のカチオン含量には好ましくない影響を及ぼす可能性がある。高カチオン電荷密度は、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）などの従来のカチオン性ポリマーの毒性と関連していることが多く、またインビボにおいても望ましくない結果をもたらし得る。
【００７７】
しかし、過度のコア疎水性は、カチオン性コア基の欠如が原因で、ｓｉＲＮＡカプセル化の制限、緩衝能力の低下、及びエンドソーム溶解の非効率化を招く可能性がある。またコア疎水性の増加とともに観察される膨潤の低下も、臨界膨潤ｐＨ未満のナノゲル内外へのｓｉＲＮＡの拡散を制限する可能性がある。
【００７８】
本実施例は、膜不安定化をモジュレートする際の疎水性の役割を検討する。この相互作用を試験するため、３種類のモデル膜系を使用した。ヒツジ赤血球を使用して脂質二分子膜のｐＨ依存性膜及び濃度依存性膜の不安定化を評価し、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ，lactate dehydrogenase）漏出はＣａｃｏ−２細胞及びＲＡＷ２６４．７細胞から測定して生細胞における非特異的な細胞膜不安定化を評価し、巨大単ラメラ小胞（ＧＵＶ，giant unilamellar vesicles）を使用して膜不安定化のメカニズムに対する知見を得た。各コポリマーの細胞毒性も、濃度及び暴露時間に応じて調べた。
【００７９】
材料及び方法
細胞培養。ヒト結腸直腸腺癌細胞（Ｃａｃｏ−２，colorectal adenocarcinoma cell）及びマウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）を、１００Ｕ  ｍＬ−１ペニシリン、１００μｇ  ｍＬ−１ストレプトマイシン、０．２５μｇ  ｍＬ−１アンフォテリシンＢ、及び１０％ＦＢＳを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Dulbecco's Modified Eagles Medium）中に維持した。Ｃａｃｏ−２細胞は３４〜６２継代で使用した。ＲＡＷ２６４．７細胞は９〜１６継代で使用した。Ｃａｃｏ−２細胞は、予備加温したダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ，Dulbecco's phosphate buffered saline）で洗浄することにより継代し、続いて３７℃で０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡを用いてインキュベートした。予備加温した新しいＤＭＥＭを加えてトリプシンを中和し、細胞を遠心分離により分離した。得られたペレットを１０ｍＬのＤＭＥＭに懸濁し、細胞数は、６０μｍチップでScepter自動細胞計測器（Millipore社製、Billerica, MA）を使用して測定した。必要時に細胞懸濁液を希釈し、組織培養処理フラスコ又は多重ウェルプレートに加えた。Ｃａｃｏ−２細胞は、典型的には、２〜３日ごとに補充される培地で１：５の比で継代した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、予備加温したＤＰＢＳで洗浄し、元の培養物容量を新しいＤＭＥＭと置き換えることにより継代した。細胞は、２５ｃｍの細胞スクレーパー（BD Falcon社製、Franklin Lakes, NJ）で穏やかに掻き取ることによってフラスコ表面から取り出した。懸濁した細胞の数はScepter自動細胞計測器を使用して数え、必要時に希釈し、組織培養フラスコ又は多重ウェルプレートへ添加した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、典型的には２日ごとに継代した。
【００８０】
細胞適合性。ポリカチオンナノスケールヒドロゲルのインビトロでの細胞適合性は、市販の細胞毒性アッセイを使用して評価した。ＭＴＳアッセイは、CellTiter 96 AQueous One Solution細胞増殖アッセイキット（Promega社製、Madison, WI）を使用して実施し、この場合、可溶性テトラゾリウム塩［３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム］（ＭＴＳ）は紫色のホルマザン生成物に還元される。ホルマザン生成物の吸収度は、生細胞数に比例する。ポリマーの原液はＰＢＳに懸濁し、一晩平衡化させた。Ｃａｃｏ−２細胞は、１５，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、２００μＬのＤＭＥＭで行う前に３６時間インキュベートした。ＲＡＷ２６４．７細胞を１０，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、２００μＬのＤＭＥＭでのアッセイの前に３６時間インキュベートした。培地を吸引し、細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、９０分間、１６０μＬの無血清ＤＭＥＭでインキュベートした。このインキュベーション期間後、別の示した暴露時間用に、５倍のポリマー原液を細胞に添加した。培地及びポリマーを吸引し、ＤＭＥＭ／ＭＴＳ溶液と置き換えた。４９０ｎｍの吸収度は、ＤＭＥＭ／ＭＴＳ溶液で４時間インキュベーションした後に記録した。
【００８１】
溶血。クエン酸ナトリウム中のヒツジ血液はHemostat Laboratories（Dixon, CA）から入手し、受け取った後、２週間以内に使用した。ｐＨ５．０〜８．０のリン酸緩衝液（０．１５Ｍ）は、超高純度ＤＩ水中にリン酸一ナトリウム及びリン酸二ナトリウムの所定量を溶解することにより調製した。緩衝液のｐＨは、１ＮのＨＣｌ又は１ＮのＮａＯＨを使用して必要時に調整した。乾燥ナノスケールヒドロゲルは、２．５ｍｇ  ｍｌ−１の濃度で所望するｐＨの１５０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁させ、一晩平衡化させた。赤血球は、新たに調製した１５０ｍＭのＮａＣｌで３回連続洗浄することにより全ヒツジ血液から単離した。赤血球（ＲＢＣ，Red blood cell）は、１０分間、２，０００×ｇの遠心分離を行い分離した。上清及び残っている軟膜は慎重に吸引し廃棄した。最終洗浄後に上清を除去し、懸濁したポリマーと一致するｐＨの元の血液アリコートと同じ１５０ｍＭ容量のリン酸緩衝液中にＲＢＣを懸濁した。この溶液を１５０ｍＭのリン酸緩衝液で１０倍希釈し、約５×１０８細胞／ｍＬのＲＢＣ懸濁液を得た。典型的な実験において、３７℃で予備平衡化したビーズ浴（LabArmor社製、Cornelius, OR）中で振盪しながら、１×１０８個のＲＢＣを所定濃度でナノゲルに暴露した。６０分のインキュベーション期間後、試料を５分間、１４，５００ＲＰＭの遠心分離にかけて細胞及び細胞膜断片を分離させた。各試料のアリコートを透明な９６ウェルプレートに移し、ヘモグロビン吸収度を５４１ｎｍで測定した。実験ｐＨの１５０ｍＭリン酸緩衝液からなる陰性対照（０％溶解）とＲＢＣからなる陽性対照（１００％溶解）は、超高純度ＤＩ水中でインキュベートした。
【００８２】
ｐＨ値は、ｐＨ５．０〜ｐＨ８．０のこの分析範囲で試験した；実験は、ｐＨ５．００、５．５０、６．００、６．５０、７．４０、７．６０、７．８０及び８．００で行った。濃度は、１〜２０００μｇ  ｍｌ−１の範囲で試験した；実験は、指定したｐＨで１５０ｍＭリン酸緩衝液中に懸濁させた、２０００、１０００、５００、２５０、１００、５０、２５、１０、５、２．５及び１μｇ  ｍｌ−１のナノゲルで実施した。
【００８３】
乳酸脱水素酵素放出。ＬＤＨアッセイは、CytoTox-ONE（商標）ホモジニアス膜完全性アッセイ（Promega社製, Madison, WI）を使用して実施し、損傷を受けた細胞膜を有する細胞からの乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ，lactate dehydrogenase）の放出を測定した。細胞は、前に記載したように、９６ウェルプレートに播種し、ポリマー溶液を加えた。示した時点で、培地の５０μＬアリコートを吸引し、ブラックウォール９６ウェルプレートに入れた５０μＬのＬＤＨアッセイバッファーと合わせた。室温で１０分間インキュベーションした後、蛍光を５３０ｅｘ／５９０ｅｍで測定した。一般に、細胞培養プレートは、最高２種の異なるアリコートで使用した。
【００８４】
巨大単ラメラ小胞の破壊。１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、BODIPY（登録商標）FLで標識した１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＨＰＥ）、コレステロール、及びテキサスレッド−スクロースは、Jeanne Stachowiak教授（University of Texas at Austin, Austin, TX）の好意により寄贈を受けた。巨大単ラメラ小胞（ＧＵＶ）は、既に記載されているようにエレクトロフォーメーションにより合成した［１２、１３］。簡単に説明すると、脂質／コレステロール溶液は、ＰＯＰＣ：コレステロール：Bodipy FL  ＤＨＰＥ＝７：３：０．０１の比で合わせ、清潔なスライドガラス上に液滴を形成させた。この脂質溶液を乾燥させ、次いで、エレクトロフォーメーションチャンバーへ集めた。小胞は、テキサスレッド−スクロース（約３５０ミリオスモル（ｍＯｓｍ、milliosmole））溶液中６０℃でエレクトロフォーメーションさせた。
【００８５】
ＧＵＶは、リアルタイム共焦点顕微鏡法画像診断用の３５ｍｍガラス底ペトリ皿に置いた。ＰＤＥＴ及びＰＤＥＴＢ３０は、ｐＨ６．５０に調整した１００ｍＭリン酸緩衝液中で２ｍｇ  ｍｌ−１に調製した。得られた懸濁液の浸透圧モル濃度を測定し、必要時に約３５０ｍＯｓｍまでスクロースで調整した。１ｍｌのＧＵＶ懸濁液をガラス底ペトリ皿に移し、５分間沈殿させた。２５μＬのナノゲル懸濁液を皿に慎重に注ぎ入れ、焦点を当てたＧＵＶの空間分布を乱さないようにした。画像は、固定焦点面で５秒毎に収集した。
【００８６】
結果及び考察
ピレン蛍光分光学法。上記で実施したピレン発光試験と同様に、ピレン励起スペクトルを回収し、疎水性物質から親水性物質への相転移に必要なｐＨを確認した。ピレンの最大励起波長は、極性から無極性環境への転移時に３３３ｎｍ〜３３８ｎｍの赤色側にシフトした。したがって、励起Ｉ３３８／Ｉ３３３比の増加は、ピレンが疎水性ドメインにおいて優先的に分割されていることを示している。図１２は、収縮した疎水性物質（ｐＨ８．０）と膨潤した親水性物質（ｐＨ６．０）の間のＰＤＥＴＢ３０の水性懸濁液におけるピレン蛍光の代表的な変化を示す。結果的に、ピレンの蛍光励起スペクトルを使用して水性ナノゲル懸濁液の極性を調べ、ナノゲル疎水性に対するポリマー組成の影響と、構造上の転移を誘導するのに必要な臨界ｐＨを決定することができる。
【００８７】
図１３に示すように、ＴＢＭＡの割合が増加すると、ｐＨ依存性相転移の発現に明らかな低下が生じる。これらの観察は、予想した傾向、つまり、ＴＭＢＡ組成物の増加は、疎水性−親水性転移に関する見かけのｐＨ（ｐＨａｐｐ、apparent pH）を徐々に低下させることを精察するものである。さらに、これらのデータは、図７Ａに示したｐＨ応答性膨潤プロファイルを確証しており、かつ図１０Ａに示したピレン発光試験と非常に一致している。
【００８８】
同様に、図１４に示すように、ＴＢＡＥＭＡの割合が０ｍｏｌ％のＤＥＡＥＭＡから３０ｍｏｌ％のＤＥＡＥＭＡへ増加すると、ｐＨ依存性相転移の発現が明らかに増加する。また、この傾向は、ｐＫａを増加させ、それによりｐＨ依存性相転移の発現を高めるはずである第二級アミンをＴＢＡＥＭＡが含有することを考えると、ｐＨ値が高いことが予測される。ピレン発光試験においてＰＤＥＴＢＡ２０及びＰＤＥＴＢＡ３０について観察された広域転移は（図１０Ｂ）、ピレン励起スペクトルのＩ３３８／Ｉ３３３比では特に存在しない。実際、相転移の幅は、ＰＤＥＴ、ＰＤＥＴＢＡ１０、ＰＤＥＴＢＡ２０及びＰＤＥＴＢＡ３０の場合、全く類似している。疎水性物質−親水性物質の相シフトのｐＨに対するＴＢＭＡとＴＢＡＥＭＡの効果の直接比較は、図１５で確認することができる。
【００８９】
膜の不安定化。この一連の実験は、選択性膜を不安定化し得るナノゲルを同定するために構築した。最適なナノゲルは、正常な生理学的条件下で相対的に不活性であり、非破壊性である。エンドソーム条件へ移行した場合、この最適なナノゲルは構造上の転移を受け、それによって膜が不安定となり得る状態になる。逆に、最適でないナノゲルは、生理学的条件下で膜破壊に介在し、かつ／又はエンドソーム条件下で非破壊性である。
【００９０】
溶血。溶血実験を使用し、これらのナノゲルのエンドソーム溶解能力を推定した。ｐＨ依存性及び濃度依存性溶血は、式３によって決定した：
【００９１】
【数２】
2016500681.tif 000007
（３）
【００９２】
式中、Ａ試料は、所定のｐＨ及び濃度でポリマーに暴露されたＲＢＣを表し、Ａブランクは、所定のｐＨでリン酸緩衝液へＲＢＣを暴露した後の上清の吸収度であり、Ａｍａｘは、ＤＩ水にＲＢＣを暴露した後の最大の溶解を表す。様々な量のＴＢＭＡ又はＴＢＡＥＭＡを含有するナノスケールヒドロゲルに関する相対的な溶解は、図１６において等高線図の形態で示している。これらのデータは、ポリマー組成が膜破壊性能力に明らかに影響を及ぼしていることを実証している。動的光散乱試験で先に示したように（図７）、コポリマー中のｔ−ブチル基単独の単一的な存在は、得られる物理化学的特性を制御する臨界パラメーターではない。むしろ、ＴＢＭＡ含有ナノゲルのネットワークの疎水性の増加は、生体膜との相互作用を調節するようである。
【００９３】
図１６で明らかように、ナノゲル内へのＴＭＢＡの導入は、これらのネットワークが赤血球膜を効果的に破壊するｐＨ及び濃度の範囲の両方を顕著に拡大する。例えば、ＰＤＥＴは、高濃度（＞０．２５ｍｇ  ｍＬ−１）及びｐＨ７．０〜ｐＨ７．６で効果的な溶血を示す。逆に、ＰＤＥＴＢ３０は、１μｇ  ｍＬ−１という低濃度で、初期エンドソームのｐＨ範囲（ｐＨ５．５〜ｐＨ６．５）において非常に効果的な溶血を示す。ｐＨ６．０でのＰＤＥＴＢ３０の溶血能力の増大を、ＰＤＥＴ及びＰＤＥＴＢＡ３０の能力と共に図１７に示す。特に、ＰＤＥＴＢ３０は、インビトロでのｓｉＲＮＡ送達で効果が証明されている、以前の報告のポリカチオンブロックコポリマー系よりも（質量基準で）１０倍効果的であり、細胞内タンパク質送達で有用性が証明されている、フェニルアラニングラフト偽ペプチドよりも２５倍効果的である。これらのデータは、これらのナノゲルの膜破壊性特性が疎水性モノマーの導入を調節することにより調整することができることを示唆している。
【００９４】
乳酸脱水素酵素漏出。生細胞の細胞膜不安定化に対するポリマー組成と暴露時間の影響は、ＬＤＨ細胞膜完全性アッセイを使用して調べた。このアッセイでは、透過性細胞膜又は損傷細胞膜からのＬＤＨ漏出のパーセント値を式４に類似の方程式により得ることができる。
【００９５】
【数３】
2016500681.tif 000008
（４）
【００９６】
式中、ＲＦＵＳは試料からの蛍光読み取り値であり、ＲＦＵＰＢＳはＰＢＳにのみ暴露された細胞（０％溶解）からの蛍光読み取り値であり、ＲＦＵｍａｘ（１００％溶解）はプレートからの最大の蛍光読み取り値である。典型的な適用においては、ＲＦＵｍａｘは市販の溶解緩衝液で得られる。しかし、実際には、最大ポリマー濃度（２ｍｇ／ｍＬ）によって得られた蛍光読み取り値は、キット溶解緩衝液及びトリトンＸ１００の１％ｗ／ｖ溶液の値を超えた蛍光値を生じた。したがって、ＬＤＨ放出は、時折、ポリマー濃度１〜２ｍｇ  ｍｌ−１で１００％を超えるものとして報告されている。
【００９７】
ナノゲル濃度及び暴露時間の関数としてのＬＤＨ漏出は、ＰＤＥＴ（図１８）、ＰＤＥＴＢ３０（図１９）及びＰＤＥＴＢＡ３０（図２０）について示している。ＰＤＥＴ（図１８）については、ＬＤＨ漏出は暴露時間が長くなるにつれて（６０分〜１８０分）増加し、１８０分から３６０分は比較的一定のままである。ＰＤＥＴＢ３０（図１９）については、ＬＤＨ漏出は、６０分及び１８０分の暴露については２５０μｇ  ｍｌ−１以下の濃度で無視できる。しかし、３６０分の暴露後は漏出が大幅に増加する。ＰＤＥＴＢＡ３０への暴露後のＬＤＨ放出（図２０）は、時間依存性については明確ではなく、放出値はすべての時点にわたり類似している。これらのデータは、細胞膜の非選択的破壊を最小限にするために、今後の細胞毒性及びｓｉＲＮＡ送達実験におけるインキュベーション時間を慎重に検討する必要性があることの重要性を示している。
【００９８】
ＴＢＭＡ含有ポリマーに関する図２１Ａ及びＴＢＡＥＭＡ含有ポリマーに関する図２１Ｂに示した、ＬＤＨ漏出に対するナノゲル組成の影響は、ＰＤＥＴＢ３０がＰＤＥＴ、ＰＤＥＴＢ１０及びＰＤＥＴＢ２０よりも、Ｃａｃｏ−２細胞膜に与える損傷が少ないことを示している。ＬＤＨ膜漏出を誘導する一般的傾向は、ＰＤＥＴ〜ＰＤＥＴＢ１０〜ＰＤＥＴＢ２０＞ＰＤＥＴＢ３０である。ＴＢＡＥＭＡ含有ポリマーについては（図２１Ｂ）、一般的傾向は以下のとおりである：ＰＤＥＴＢＡ３０＞ＰＤＥＴＢＡ２０〜ＰＤＥＴＢＡ１０＞ＰＤＥＴ。特に、これらの傾向は、図１３及び図１４に示し、表６に要約した疎水性−親水性相転移における傾向と非常に一致している。
【００９９】
したがって、ｐＨ応答性転移レジーム（収縮した疎水性物質から膨潤した親水性物質まで）は、これらのナノゲルの膜破壊性能力を決定する上での重要な要因である。すべての場合において、ナノゲルは、ピレン蛍光試験によって決定されたｐＨａｐｐで、又はその付近で最大溶血を示した（表６）。このｐＨａｐｐが生理学的ｐＨ付近である場合、この膜破壊性効果は（ｐＨ７．４での）溶血アッセイ及びＬＤＨ漏出アッセイで明白であった。しかし、ポリマー疎水性が増加することによりｐＨａｐｐが低下する場合（例えばＰＤＥＴＢ３０）、ナノゲルは、生理学的条件では破壊性はほとんどなく、エンドソーム条件で破壊性が高くなる。
【０１００】
【表５】
2016500681.tif 000009
【０１０１】
巨大単ラメラ小胞の破壊。不安定化の際の脂質二重層モデルを可視化することにより、膜破壊のメカニズムに対するいくつかの知見を得ることができる。カチオン性ポリマーによる膜破壊性メカニズムに関する一般的な理論としては、リン酸アンモニウム相互作用を介する脂質先端基の再配向、ポリカチオンと細胞膜の間の静電引力に続く一時的なナノ細孔形成、又は劇的な膜破壊が挙げられる。もちろん、サイズ、表面電荷及びリガンド官能基化は、膜相互作用をモジュレートする際に重要な役割を果たす。しかし、これらの研究の多くは、支持されている脂質二重層などの制御モデル系の生物物理学的測定に依存している。実際には、哺乳動物細胞膜は、これらのモデル系よりもはるかに複雑である。哺乳動物細胞膜は、典型的には、表面タンパク質及び膜貫通型タンパク質、糖被覆、多様な脂質の組合せ、及びコレステロールの動態的組合せを含んでいる。残念なことに、哺乳動物細胞膜における細胞膜不安定化のメカニズム的理解は、現在のところ解明されていない。
【０１０２】
図２２の顕微鏡写真からは、一過性のナノ細孔形成は、ＰＤＥＴＢ３０が膜不安定化作用を及ぼすことによる主たるメカニズムであることが示唆される。これらの最初の試験において、初期エンドソーム環境のｐＨに近似するようにｐＨ６．５０を選択した。溶血に基づくと、これらの条件で、ＰＤＥＴは破壊性でないはずであり、ＰＤＥＴＢ３０は高破壊性であるはずである。ＰＤＥＴを緩衝ＧＵＶ溶液中、５０μｇ  ｍｌ−１となるよう注入した後、膜完全性に識別できる変化は検出されなかった。スクロース−テキサスレッドは注入後、数分間ＧＵＶ内に捕捉されたままであり、膜完全性の持続を立証している。図２２、パネルＡ及びパネルＣのＧＵＶ位置の違いは、ＧＵＶが焦点面からずれている機械的な障害によるものである。焦点面のずれから、多数のＧＵＶがＰＤＥＴ注入の力によって下方に押し下げられたことが明らかであった。
【０１０３】
反対に、図２２、パネルＢ及びパネルＤの顕微鏡写真は、脂質膜の本質的なＰＤＥＴＢ３０介在性不安定化を明らかにしている。ｐＨ６．５０の緩衝液中の５０ｕｇ  ｍｌ−１  ＰＤＥＴＢ３０への暴露によって、小胞内部からスクロース−テキサスレッドが素早く完全に流出した。これらのデータは、赤血球の完全な（ほぼ１００％）破壊を示す、この濃度とｐＨでのＰＤＥＴＢ３０に関する溶血データと一致する。この分野におけるさらなる研究により、膜不安定化のメカニズムがポリマー濃度への依存を示すかどうか決定される。さらに、捕捉された蛍光性溶質（一般にスクロース）の分子量を変えて、膜破壊性ナノゲルによって形成される平均細孔サイズを推定する。
【０１０４】
細胞適合性。細胞増殖におけるポリマー濃度及び組成の影響は、ＭＴＳアッセイを使用して評価した。これらのデータは、今後の薬剤送達実験での非毒性ポリマー用量を決定するのに重要である。このアッセイにおいて、実験群の対照群に対する代謝活性は、次の割合によって得ることができる：
【０１０５】
【数４】
2016500681.tif 000010
（５）
【０１０６】
式中、Ａｓは試料ウェルからの吸収度（λ＝４９０ｎｍ）であり、ＡｂｋｇはＤＭＥＭ／ＭＴＳ溶液からのバックグラウンド吸光度であり、ＡＰＢＳは、細胞をＤＰＢＳのみとインキュベートしたウェルからの吸収度である。
【０１０７】
Ｃａｃｏ−２細胞。図２３に示したように、ＰＤＥＴＢ２０及びＰＤＥＴＢ３０は、０．５ｍｇ  ｍＬ−１未満の濃度でＣａｃｏ−２細胞に対し非毒性である。０．０５ｍｇ  ｍＬ−１〜２ｍｇ  ｍＬ−１では、これらの製剤は、Ｐ（ＤＥＡＥＭＡ−ｇ−ＰＥＧ）（ＰＤＥＴ）の基剤製剤ほど有意に毒性はない。遊離アミノ基が多くのポリカチオン性送達剤の好ましくない細胞毒性の一因となること、またカチオン電荷密度の増加が細胞毒性の増加と関連することは十分に報告されている。予想した通り、類似のカチオン電荷密度を有するポリマー、例えば、２０ｍｏｌ％及び３０ｍｏｌ％のＴＢＡＥＭＡ、及びＰＤＥＴを有するナノゲルは、同様の毒性プロファイルを示す。ポリマー組成の性質によって、２０ｍｏｌ％及び３０ｍｏｌ％のＴＢＭＡを含むナノゲルは、カチオン電荷密度が低く、したがって毒性が低くなる。
【０１０８】
ＲＡＷ２６４．７細胞。腸食細胞のモデル細胞におけるポリマー担体の濃度依存性毒性及び時間依存性毒性を評価するため、ＭＴＳアッセイをマウスマクロファージ細胞で実施した。図２４に示したように、毒性プロファイルにおける組成依存傾向はＣａｃｏ−２細胞の知見と一致しているが、毒性の差の程度はそれほど明白ではなかった。濃度範囲全体での一般的傾向は、相対的毒性の点から、ＰＤＥＴ＞ＰＤＥＴＢ１０＞ＰＤＥＴＢ２０＞ＰＤＥＴＢ３０であった。ＰＤＥＴＢ３０は、５〜５００μｇ  ｍＬ−１のＰＤＥＴの基剤製剤ほど有意に毒性はなかった（ｐ＜０．０５）。
【０１０９】
Ｃａｃｏ−２細胞とＲＡＷ２６４．７細胞の間のポリマー用量依存性毒性の比較からは、マクロファージがＣａｃｏ−２細胞である場合よりもナノゲルの存在に対し感度が高いことが明らかである。この相違は、各細胞型によって示されたナノゲル取込みの相対量に起因し得る。マクロファージは食細胞であり、それらの環境から高分子を容易に吸収するため、細胞膜又はプロセスに対するナノゲルのいかなる有害な影響も増強される。
【０１１０】
さらなる実験において非毒性ナノゲル濃度に関する慎重な評価を示すために、ＲＡＷ２６４．７細胞を２４時間ナノゲルに暴露し、代謝活性をＭＴＳアッセイにより処置していない対照細胞と比較した。図２５で示したＰＤＥＴ及びＰＤＥＴＢ３０についてのこの比較からは、ＰＤＥＴＢ３０が５０μｇ  ｍｌ−１未満のナノゲル濃度で非毒性であることが明らかである。
【０１１１】
結論
臨界相転移ｐＨ、膜破壊及び細胞適合性をはじめとする、ナノスケールヒドロゲルネットワークの物理化学的特性は、ポリマー組成を調整することによってモジュレートすることができる。ＰＤＥＴＢ３０ナノゲルは、細胞内送達に対する好ましいｐＨ応答性相転移挙動を示し、溶血能力及び細胞適合性の優れた組合せを呈する。さらに、最大の膜破壊に関するｐＨ範囲の幅は、疎水性−親水性転移に関するｐＨ範囲と関連している。ＰＤＥＴＢ３０は、急速な疎水性−親水性相転移を受ける他のナノゲル（例えば、ＰＤＥＴ及びＰＤＥＴＢＡ３０）よりも広いｐＨ範囲にわたって膜破壊性である。これらの理由で、ＴＢＭＡ含有ナノスケールヒドロゲル、特にＰＤＥＴＢ３０は、細胞内薬剤送達ビヒクルに関する好ましい特性を有する。
【０１１２】
実施例−ｐＨ応答性ナノスケールヒドロゲルを使用する機能性ｓｉＲＮＡの細胞質送達
ｓｉＲＮＡ送達に対する最も有望な特性を有するナノゲルは、（１）２−（ジエチルアミノエチルメタクリレート）（ＤＥＡＥＭＡ）のイオン化可能なコア、（２）ｔｅｒｔ−ブチルメタクリレート（ＴＢＭＡ）の疎水性コモノマー、及び（３）ポリ（エチレングリコール）のグラフトコロナ（grafted corona）からなる。このナノゲル（ＰＤＥＴＢ３０）は、約ｐＨ６．５で収縮した疎水性物質から膨潤した親水性物質までの体積相転移を受け、この転移領域におけるモデル膜系に対して高破壊性である。さらに、ＰＤＥＴＢ３０は、インビトロでの毒性アッセイにおいて、Ｃａｃｏ−２細胞及びＲＡＷ２６４．７細胞に対して優れた生体適合性を示す。
【０１１３】
しかし、細胞内送達系の重要な側面は、放出又は分解のメカニズムである。ジスルフィド結合は、還元性トリペプチドグルタチオン（ＧＳＨ，glutathione）によって切断することができる；１〜１１ｍＭの細胞内濃度で存在する。ポリカチオンナノゲルへこれらのリンカーを加えることによって、本発明者らは、機械的完全性及びｐＨ応答性挙動を維持しながら、ネットワークに分解性を付与することができる（図２６）。
【０１１４】
本項では、還元可能なジスルフィド架橋をもつナノゲルの合成及び特性決定を記載するとともに、ｓｉＲＮＡ担体としてのそれらの適合性を、非分解性ＰＤＥＴＢ３０ナノゲルと比較する。
【０１１５】
材料及び方法
ジスルフィド架橋剤の合成。ジクロロメタン（＞９９．５％）は、Fisher Scientific（Plainfield, NJ）から購入した。塩化メタクリロイル（９７％）及び無水ピリジン（９９．８％）は、Sigma-Aldrich（St. Louis, MO）から購入した。２−ヒドロキシエチルジスルフィド（９０％）は、Acros（Geel, Belgium）から購入した。
【０１１６】
ホモ二官能性ジスルフィド架橋剤のビス（２−メタクリロイルオキシエチル）ジスルフィド（ＳＳＸＬ）は、以下のように合成した。有機溶媒は、使用前にＭｇＳＯ４で脱水した。ジクロロメタンは１５分間、Ｎ２でパージし、乾燥窒素雰囲気（Ｏ２＜０．１ｐｐｍ、Ｈ２Ｏ＜０．１ｐｐｍ）に置いた。ピリジン（１５．８ｍＬ、０．１９５ｍｏｌ）及びビス（２−ヒドロキシエチル）ジスルフィド（１０．００ｇ、０．０６５ｍｏｌ）は、冷却（４℃）ジクロロメタンに添加し、短時間撹拌した。塩化メタクリロイルは、２０分間かけて撹拌する有機混合物に滴下添加した。次いでフラスコを密閉し、氷浴から取り出し、反応を窒素雰囲気下で１２時間すすめた。
【０１１７】
ジクロロメタン中の粗製反応生成物を１ＮのＨＣｌ、１ＮのＮａＯＨ及びＤＩ水で連続して洗浄した。有機相を取得し、ロータリーエバポレーションによって粘着性の黄色液体まで乾燥させた。次いで、生成物をジエチルエーテルに溶解させ、炭酸ナトリウム及び塩基性アルミナのカラムに通した。ジエチルエーテルをロータリーエバポレーションによって除去し、再び粘着性の黄色の液体を得た。
【０１１８】
さらなるフラッシュクロマトグラフィー精製は、１００ｇのシリカカラムを装備したTeledyne-Isco Companion自動フラッシュクロマトグラフィー装置（Lincoln, NE）を使用して実施した。溶媒の勾配は以下のように構成した：溶媒Ａ−ヘキサン、溶媒Ｂ−酢酸エチル。勾配は４０分かけて０〜１５％のＢで調整し、次いで１０分かけて１５〜１００％のＢで調整した。目的の画分は、２５８ｎｍで吸光度をモニタリングして決定した。生成物画分をプールし、溶媒をロータリーエバポレーションによって取り除き、粘着性の黄色液体を得た。
【０１１９】
ジスルフィド架橋剤の特性決定。原材料の組成、精製画分、及びＳＳＸＬ合成の最終生成物は、自動試料採取装置を装備したVarian（Palo Alto, CA）DirectDrive４００ＭＨｚ核磁気共鳴分光計を使用して調べた。クロロホルム−ｄ（ＣＤＣｌ３、９９．８％）は、Acros Organics（Fairlawn, NJ）から入手した。ＮＭＲチューブ（Wilmad Lab Glass社製, Vineland, NJ）、２ｍＬ試料バイアル及びパスツールピペットを含むすべてのガラス器具は、真空オーブンで一晩乾燥させた。ＳＳＸＬは、１Ｈ−ＮＭＲ分析用のＣＤＣｌ３中に１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で溶解させた。ＮＭＲスペクトルはすべて、SpinWorks 3（商標）ソフトウェアを使用して分析した。
【０１２０】
ポリマー合成
分解性ナノゲルの合成。応答性ナノゲルＰＤＥＴＢ３０に生物分解メカニズムを付与するため、感光乳化重合においてテトラ（エチレングリコール）ジメタクリレート（ＴＥＧＤＭＡ）の代替品としてＳＳＸＬを使用した。ＳＳＸＬは全モノマーの２．５ｍｏｌ％でプレポリマー混合物に添加し、上述のように、感光乳化重合とナノゲル精製を行った。
【０１２１】
蛍光性ポリマー合成。ＰＤＥＳＳＢ３０の蛍光性バージョンは、セクション６．２．１に記載の方法と同様にして合成し精製した。ＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８の合成と同様に、Oregon Green 488（ＯＧ４８８）の共有結合は、ＰＤＥＳＳＢ３０コアに第一級アミンを導入することによって可能であった。さらに、２−アミノエチルメタクリレート塩酸塩（ＡＥＭＡ）を５ｍｏｌ％のＤＥＡＥＭＡでプレポリマー配合混合物に含有させた。得られたコポリマーは、アミン官能性を示すようにＰＤＥＳＳＢ３０ｆと命名した。ＡＥＭＡの第一級アミンは、合成及び精製後に、フルオレサミンアッセイにより確認した。
【０１２２】
Oregon Green 488カルボン酸、スクシンイミジルエステル（OG488, Molecular Probes社製, Eugene, OR）をＤＭＳＯに溶解し、１０ｍｇ  ｍｌ−１溶液を得た。蛍光性ポリマー複合体を形成させるため、ＰＤＥＳＳＢ３０ｆを１５０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．３０中に１０ｍｇ  ｍｌ−１で懸濁させた。ＯＧ４８８をＰＤＥＳＳＢ３０ｆ懸濁液に添加し、１：１のＡＥＭＡとＯＧ４８８の分子比を得た。反応物を６時間暗所で穏やかに撹拌した。反応完了後、未反応の色素は、ＤＩ水に対する透析により、標識したＰＤＥＳＳＢ３０−ＯＧ４８８から分離させた。透析は、３日間、１２，０００〜１４，０００ＭＷＣＯ透析チューブ材料（Spectrum Labs社製, Rancho Dominguez, CA）で３日間行った。標識したナノゲルのＰＤＥＳＳＢ３０−ＯＧ４８８は、３日間暗所にて凍結乾燥させた。
【０１２３】
分解性ナノゲルの特性決定。いくつかの特性決定技術を使用して、ＴＭＢＡ類似体、ＰＤＥＴＢ３０と比較したＰＤＥＳＳＢ３０ナノゲルの物理化学的特性を試験した。動的光散乱を使用して環境ｐＨに対する関数としてＰＤＥＳＳＢ３０の流体力学的直径を決定し、上述のように実施した。ζ電位の測定を行って、環境ｐＨの関数としての有効表面電荷を評価し、上述のように実施した。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用して乾燥ナノゲルの直径を決定し、上述のように実施した。ＰＤＥＳＳＢ３０及びＰＤＥＴＢ３０への暴露時のＲＡＷ２６４．７代謝活性の評価は、上述のように市販のＭＴＳアッセイキットを使用して実施した。
【０１２４】
ＲＮＡ結合。ＲＮＡ複合体形成緩衝液は、３．１５ｇの二塩基性リン酸ナトリウム七水和物、０．０２ｇのリン酸一カリウム一水和物、０．２０ｇの塩化カリウム、及び８．０１ｇの塩化ナトリウムをＭｉｌｌｉ−Ｑ精製水中に溶解させることにより調製した。塩溶解の後、溶液ｐＨを１ＮのＨＣｌを使用してｐＨ５．５０に調整し、超純水を加えて最終溶液容量を１００ｍＬにした。ヌクレアーゼを除去するため、ジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ，diethylpyrocarbonate）を０．１％で添加し、室温で一晩インキュベートした。次いで、緩衝液をオートクレーブにかけ、ＤＥＰＣを除去した。ポリマー−ｓｉＲＮＡ複合体は、ナノゲルの水溶液、ｓｉＲＮＡ、１０×ＲＮＡｓｅフリーＰＢＳ及びＲＮＡｓｅフリーの水を組み合わせることによって形成させ、所望の濃度を得た。
【０１２５】
Silencer（登録商標）GAPDH siRNA、Quant-iT（商標）Ribogreen（登録商標）ＲＮＡアッセイキット、及びＲＮＡｓｅフリーＨ２Ｏは、Life Technologies（Carlsbad, CA）から購入した。溶液中のｓｉＲＮＡフリーは、メーカーの使用説明書に従いRibogreen（登録商標）アッセイを使用して測定した。ナノゲル懸濁液をＲＮＡｓｅフリー複合体形成緩衝液（ｐＨ５．５０）で希釈した。濃縮ｓｉＲＮＡを添加し、示した濃度のナノゲル懸濁液中５００ｎｇ  ｍｌ−１  ＲＮＡを得た。ｓｉＲＮＡフリーの測定は、６０、１２０及び１８０分の複合体形成期間後に行った。
【０１２６】
細胞培養。一般的な細胞培養試薬及び細胞維持／継代手順は、セクション５．２．３で確認される。すべてのサイトメトリー試験において、Ｃａｃｏ−２細胞又はＲＡＷ２６４．７細胞を６ウェルプレートに播種し、使用前に８０％の密集度まで増殖させた。
【０１２７】
ｓｉＲＮＡ送達。DyLight 647−標識低分子干渉ＲＮＡ（センス：ＤＹ６４７−UAAGGCUAUGAAGAGAUACUU）は、Thermo Scientific（Lafayette, CO）から購入した。Ｃｙ３−標識Silencer（登録商標）ネガティブコントロールＮｏ．１  ｓｉＲＮＡは、Life Technologies（Carlsbad, CA）から購入した。蛍光性ナノゲル、ＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８及びＰＤＥＳＳＢ３０−ＯＧ４８８を合成し精製した。
【０１２８】
０．５ｍｇ  ｍＬ−１のナノゲル、２６．５μｇ  ｍＬ−１（約２０００ｎＭ）のｓｉＲＮＡ、１×複合体形成緩衝液、及びＲＮＡｓｅフリーＨ２Ｏを含むように、蛍光性ナノゲル（ＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８又はＰＤＥＳＳＢ３０−ＯＧ４８８）、蛍光性ｓｉＲＮＡ（ＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡ又はＣｙ３−ｓｉＲＮＡ）、又は蛍光性ナノゲル及び蛍光性ｓｉＲＮＡの濃縮懸濁液（２０倍）を調製した。対照試料（ナノゲル又はｓｉＲＮＡ）は、非存在成分（群）の容量をＲＮＡｓｅフリーＨ２Ｏに置き換えて、同様の方法で調製した。
【０１２９】
複合体形成緩衝液からナノゲル／ｓｉＲＮＡ複合体を分離するため、示した複合体形成期間の後に、４容量等量のアセトンを懸濁液に添加した。アセトンは、高分子電解質−イオノマー転移を誘導する役割を果たす。懸濁液を５分間、１５，０００ｒｐｍの遠心分離にかけ、上清を廃棄した。残留溶媒は、層流フード内に１５分置いた後蒸発させた。ポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体は、ｐＨ７．４０でＲＮＡｓｅフリーＰＢＳの最初の複合体形成容量中に再懸濁させた。
【０１３０】
再懸濁後、１００μＬのナノゲル／ｓｉＲＮＡ複合体を５００μｇ  ｍｌ−１で含むＰＢＳを各試験ウェルに加え、最終濃度を２５μｇ  ｍｌ−１とした。対照ウェルには、１００μＬのＰＢＳか、又は１００μＬの対応するナノゲル単独溶液若しくはｓｉＲＮＡ単独溶液を入れた。ナノゲルの暴露は、３７℃又は４℃で、示した時点で行った。暴露期間の後、細胞は３回ＤＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウム含有）ですすぎ、培地を２ｍＬの無血清ＤＭＥＭで置き換えた。
【０１３１】
Image Streamサイトメトリーについては、Hoechst 33342を２．５μｇ  ｍｌ−１の最終濃度で核染色用の各ウェルに添加した。核染色方法は、ＲＡＷ２６４．７細胞については３０分間、Ｃａｃｏ−２細胞については４５分間、３７℃、５％ＣＯ２で行った。Hoechstのインキュベーションを行った後、細胞をＤＰＢＳで３回すすいだ（カルシウム及びマグネシウム非含有）。核染色法は、従来のフローサイトメトリー実験では使用されなかった。
【０１３２】
ＲＡＷ２６４．７細胞は、ＤＰＢＳ最終洗浄を１ｍＬフローサイトメトリー緩衝液に置き換え、穏やかに細胞をこすり取ることにより単離した。各ウェルからの細胞懸濁液をマイクロチューブに移し、５００×ｇで５分間、遠心分離にかけた。上清を廃棄し、細胞ペレットをフローサイトメトリー緩衝剤に再懸濁した。フローサイトメトリー緩衝液はＦＢＳ、ＤＰＢＳ及びＮ３Ｎａを組み合わせ、１％のＦＢＳ及び０．１％のＮ３Ｎａを含むＤＰＢＳを形成させることにより調製した。
【０１３３】
Ｃａｃｏ−２細胞は、最終ＤＰＢＳ洗浄を５００μＬの０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで置き換え、３７℃、５％ＣＯ２で８分間インキュベートすることにより単離した。トリプシンは、１０％ＦＢＳを含むがフェノールレッドは含まない３ｍＬのＤＭＥＭを添加することにより中和させた。細胞懸濁液は５００×ｇで５分間、遠心分離にかけた。上清は廃棄し、細胞ペレットをフローサイトメトリー緩衝液に再懸濁した。
【０１３４】
すべての細胞懸濁液をImage Streamサイトメトリーで分析するまで凍結保存した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Propidium iodide）を生存／死滅ディスクリミネーターとして使用し、分析の直前に細胞懸濁液に１μｇ  ｍＬ−１の最終濃度で添加した。
【０１３５】
フローサイトメトリー。ＰＤＥＴＢ３０介在性及びＰＤＥＳＳＢ３０介在性Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ送達の効果は、４８８ｎｍ及び６３５ｎｍでレーザー装備のBD FACSCalibur（San Jose, CA）フローサイトメーターを使用して比較した。蛍光データは、ＦＬ−２（５７０〜６００ｎｍ、Ｃｙ３）及びＦＬ−３（６５３〜６６９ｎｍ、ＰＩ）を使用して収集した。死滅細胞又は死滅している細胞はヨウ化プロピジウムで同定した。典型的には、１試料当たり４０，０００個の細胞を収集した。
【０１３６】
Image Streamサイトメトリー。取込みのメカニズムとｓｉＲＮＡ送達の分析は、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、６５８ｎｍ及び７８５ｎｍでレーザー装備のAmnis Image Stream（Seattle, WA）画像フローサイトメーターを使用して行った。蛍光データは、チャネル１（４３０〜５０５ｎｍ、Hoechst）、チャネル２（５０５〜５９５ｎｍ、ＯＧ４８８）、チャネル４（５９５〜６６０ｎｍ、ＰＩ）、チャネル５（６６０〜７４５ｎｍ、ＤＹ６４７）及びチャネル６（７４５〜８００ｎｍ、側方散乱）を使用して収集した。明視野画像はチャネル３で収集した。
【０１３７】
細胞は、６０倍対物レンズにより画像化した。流体速度は４０ｍｍ／秒の公称値に設定した。蛍光補正マトリクスは、Amnis IDEAS（登録商標）ソフトウェアを使用して構築し、適切な適性値について手動で確認した。少なくとも５，０００個の細胞を分析用に収集した。死滅細胞（ＰＩポジティブ）は、分析から除外した。焦点外の細胞も、IDEAS（登録商標）ソフトウェアのＧｒａｄｉｅｎｔ  ＲＭＳ機能のゲート制御によってさらなる分析から除外した。この機能は、明視野像を横切るピクセル値の大きな変化を計算することによって画像の鮮鋭度を検出する。典型的には、４０未満のＧｒａｄｉｅｎｔ  ＲＭＳ値を有する細胞は焦点外にあると考えられた。
【０１３８】
ｓｉＲＮＡ介在性遺伝子サイレンシング。ＧＡＰＤＨ陽性対照ｓｉＲＮＡ、KD Alertアッセイキット、及び１０倍リン酸緩衝生理食塩水（ＲＮＡｓｅフリー）は、Life Technologies（Carlsbad, CA）から購入した。Ｃａｃｏ−２細胞は組織培養処理した９６ウェルプレートに２，５００細胞／ウェルで播種し、使用前に２４時間平衡化した。ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡは、ＰＤＥＴＢ３０又はＰＤＥＳＳＢ３０のナノゲルに担持させた。複合体形成緩衝液中で６０分間インキュベーションした後、アセトンを添加することによってナノゲル／ｓｉＲＮＡ複合体を沈殿させ、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけた。上清は廃棄し、複合体をＲＮＡｓｅフリーＰＢＳに再懸濁させた。使用前に、Ｃａｃｏ−２細胞をＰＢＳで１回洗浄し、培地を無血清ＤＭＥＭと置き換えた。濃縮した（２０倍）ナノゲル／ｓｉＲＮＡ複合体又は対照懸濁液を試験ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２で６０分間、インキュベートした。６０分間の暴露期間の後、細胞を予備加温したＰＢＳで３回洗浄し、培地を完全ＤＭＥＭと置き換えた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした後、KD Alert遺伝子サイレンシングアッセイをメーカーの使用説明書に従って実施した。メーカーの使用説明書に従って、マイクロプレートリーダーの感度が所定のＧＡＰＤＨ酵素検量線内にあるように調整するよう注意した。
【０１３９】
統計分析。実験群と対照群の間の統計学的比較は、対応の無い、両側スチューデントｔ検定を行った。差は、ｐ＜０．０５で統計的に有意であると認められた。
【０１４０】
結果及び考察
ジスルフィド架橋剤の合成
ホモ二官能性架橋剤２−ビス−（２−メタクリロイルオキシエチルジスルフィド）を合成し（図２７）、生物分解、すなわちジスルフィド結合の還元分解反応のメカニズムを持つ反応性ＤＥＡＥＭＡ系ナノゲルを得た。この試験の時点では、この二官能性リンカーは市販されていなかった。しかし、この架橋剤は、現在、Sigma-Aldrich（CAS No. 36837-97-5）から（ヒドロキノン阻害剤とともに）購入することができる。
【０１４１】
２−ビス−（２−メタクリロイルオキシエチルジスルフィド）（ＳＳＸＬ）の合成及び精製は成功し、反応物が約５０％のモル収率で得られた。ＳＳＸＬの構造は１Ｈ−ＮＭＲにより確認した。スペクトル（図示せず）は、δ＝１．９５ｐｐｍ（１Ｈ，Ｈ２Ｃ＝Ｃ−）、２．９６ｐｐｍ（１Ｈ，Ｈ２Ｃ＝Ｃ−）、４．４５（２Ｈ，ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−）、５．６０ｐｐｍ（２Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）、及び６．１４ｐｐｍ（３Ｈ，ＣＨ３−Ｃ＝）でピークを示す。質量スペクトル（図示せず）の分析からは、予想される分子量、２９０Ｄａの生成物が明らかである。
【０１４２】
分解性ナノゲルの合成及び特性決定
ＤＥＡＥＭＡ−ｃｏ−ＴＢＭＡのイオン化可能なコア及びＰＥＧコロナを含有するジスルフィド架橋ナノゲルは、感光乳化重合によって順調に合成された。非分解性リンカーＴＥＧＤＭＡ（ＰＤＥＴ、ＰＤＥＴＢ３０などで使用する場合）のＳＳＸＬとの置き換えでは、物理化学的特性、例えばｐＨ依存性膨潤（図２８）、ζ電位、及びＲＡＷ２６４．７細胞に対する細胞毒性（図２９）に識別できる変化はみられなかった。
【０１４３】
図２８で示したように、ＰＤＥＳＳＢ３０の臨界膨潤ｐＨは６．５５である。これらのナノゲルは、ｐＨ８．５で９６ｎｍ、ｐＨ６．０で１２６ｎｍのｚ−平均直径を有している。体積相転移の幅はＰＤＥＴＢ３０に類似しており、１．４５ｐＨ単位以上で生じる。ＰＤＥＴＢ３０について報告した値（上述）は１．５６ｐＨ単位である。ＰＤＥＳＢＢ３０ナノゲルは、体積相転移全体にわたって０．１２〜０．１５のＰｄＩを示す。
【０１４４】
ＰＤＥＳＳＢ３０のナノスケール寸法はＴＥＭによって確認し、乾燥粒子サイズは５０±１７ｎｍであると決定した。表５に示すように、これは前のナノゲル合成に全く似ている。
【０１４５】
ナノスケールヒドロゲルのサイズ、膨潤及び表面電荷が架橋剤の変化による影響を受けなかったことを確認した後、グルタチオン、還元性トリペプチドへの応答における反応速度及び分解の程度を定量化するために試験を行った。これまでの実験は、動的光散乱実験において観察された計数率（カウント数毎秒）と粒子濃度（ｍｇ  ｍＬ−１）の間の直線関係を確立する役割を果たした。この関係を使用して、還元的水性懸濁液中のＳＳＸＬ架橋ナノスケールヒドロゲルの分解の半定量的リアルタイム測定を行った。実験は、Malvern ZetaSizer Nano ZSを使用して試料細胞を３７℃にセットして実施し、測定値は約３分ごとに収集した。短時間の平衡後、試料キュベットにＰＢＳ又は水性グルタチオンを入れ、最終濃度がＰＢＳ中１ｍＭ又は１０ｍＭのグルタチオンになるようにした。
【０１４６】
分解プロファイルは、図３０で明らかなように、明らかなグルタチオン感度及びポリマー分解速度に対する所見を提供する。観察された計数率の減少は粒子濃度の低下として得られ、それはグルタチオン誘導性分解の指標である。興味深いことに、有意なポリマー分解を誘導するのに必要なグルタチオンの濃度は、細胞内グルタチオンの平均最小濃度（１ｍＭ）〜最大濃度（１１ｍＭ）にある。この特性は、それがＳＳＸＬ架橋ナノスケールヒドロゲルに、細胞外環境では無傷のままで細胞内環境では分解する能力を付与するので説得力がある。これらのデータは、分解の時間尺度は数分程度であり、かなり急速であることを示している。
【０１４７】
１０ｍＭグルタチオンへの暴露の際、１０ｍＭのＧＳＨに暴露されたＰＤＥＳＳＢ３０の分解の約５０％が１５分以内に生じる。ほぼすべての分解は６０分までに完了する。計数率分解についての同様の結果がジチオトレイトール（ＤＴＴ、dithiothreitol）に関して確認されたが、ここには示していない。比較のため、ＰＢＳ中のＰＤＥＳＳＢ３０について確認された計数率は、実験の時間経過にわたって一定のままであった。
【０１４８】
これらの知見は、Nanosight（Amesbury, UK）ナノ粒子トラッキング分析を使用して確認した。光散乱試験で使用したものと同一のグルタチオン：ＰＤＥＳＳＢ３０において、３７℃で１５分間の１０ｍＭグルタチオンへの暴露は、３３．２×１０８粒子ｍｌ−１〜１７．５×１０８粒子ｍｌ−１の粒子濃度で５２％の低下を引き起こした（データは示さず）。
【０１４９】
ＧＳＨへの２時間の暴露の後、試料は、分解の確証のためＴＥＭによって視覚的に検査した。図３１で明らかなように、離散粒子はＴＥＭグリッド上のいかなる領域でも検出されず、このことはポリマーネットワークの分解がほぼ完全であることを示している。
【０１５０】
ＰＤＥＳＳＢ３０の分解速度をモニターするための光散乱のこの適用によって、この最初の適用が十分に研究されたが、他の方法では分解速度及びジスルフィド分解の程度に補完的な見解を提供することができる。ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ、gel permeation chromatography）を使用する分解フラグメントの分析では、中間時点で直鎖状ポリマー鎖の多分散性が高く、ナノゲル分解が不完全であることによる問題があった。エルマンアッセイなどの比色法は、分解したＰＤＥＳＳＢ３０の遊離スルフヒドリル基の検出には十分な感度がなかった。水性懸濁液中の１ｍｇ  ｍＬ−１  ＰＤＥＳＳＢ３０のスルフヒドリル基の理論上の最大値は（１００％変換を仮定する）、約１５０ｎＭである。この濃度を超えるナノゲル濃度の増加は、溶液混濁度が原因の著しい吸収をもたらした。
【０１５１】
蛍光性ナノゲルの合成
ｓｉＲＮＡ送達実験においてナノゲル細胞内局在を可視化できるようにするには、ＰＤＥＳＳＢ３０ナノゲルの蛍光性バージョンが必要であった。ＰＤＥＳＳＢ３０ｆと命名したＰＤＥＳＳＢ３０の第一級アミン含有類似体を順調に合成し、精製した。
【０１５２】
アミン反応性色素のOregon Green 488（ＯＧ４８８）を、ナノゲルコア内の第一級アミンに結合させた。共役結合反応前に、ＰＤＥＳＳＢ３０ｆの第一級アミン含量は１７．０±０．４μｍｏｌ  ｇ−１であると決定されたが、これは１１．５％の導入効率を示す。続いて、ＯＧ４８８を１：１のアミン対色素のモル比でＰＤＥＳＳＢ３０ｆに添加した。透析及び凍結乾燥の後、Oregon Green 488官能基化を蛍光分光学法により試験し、官能基化のパーセントをＵＶ吸光度により計算し、Oregon Green488標準曲線と比較した。
【０１５３】
標識したナノゲル（ＰＤＥＳＳＢ３０−ＯＧ４８８）の蛍光発光（λｅｘ＝４６５ｎｍ）スペクトルを決定した。蛍光標識は、ＰＢＳ中のＯＧ４８８の標準曲線を使用して１６．９±０．３μｍｏｌ  ｇ−１、４９６ｎｍでの吸収度と７０，０００Ｌ  ｍｏｌ−１  ｃｍ−１のＯＧ−４８８吸光係数（ε）を使用して１９．５μｍｏｌ  ｇ−１と推定され、このことはほぼ１００％の結合効率を示唆している。
【０１５４】
ｐＨ応答性ナノゲルのｓｉＲＮＡ担持効果
ナノゲルがｓｉＲＮＡを封入する能力は、疾患部位にＲＮＡの治療関連用量を送達し、かつ遺伝子サイレンシングを開始するそれらの能力における重要な決定因子である。ＰＤＥＴＢ３０は、エンドソーム溶解薬剤送達ビヒクルに関する最も望ましい特性を明確に示すだけでなく、ＰＤＥＴ又はＰＤＥＴＢＡ３０よりも少ないイオン化可能なＤＥＡＥＭＡ基も含有している。これまでの研究では、カチオン性ポリマーは、カチオン濃度が増加すると、ＤＮＡにより効率的に結合できるということが証明された。このため、ＲＮＡ結合能力をハイスループット方法で評価した。ＲＮＡ結合は、各ナノゲルの担持効率を決定するためのナノゲル組成、ＲＮＡ：ナノゲル質量比、及び複合体形成時間の関数として評価された。
【０１５５】
遊離ＲＮＡの比（Ｆｆ）は、試料溶液の蛍光強度とポリマーフリー対照ＲＮＡ溶液の蛍光強度の比を得ることにより計算した。両測定値は、バックグラウンド蛍光及び結合したＲＮＡの比について補正した、Ｆｂ＝１−Ｆｆ。複合体形成期間６０分のこれらのデータは図３２にある。これらの結果は、製剤はすべて、１：１のポリマーとｓｉＲＮＡの質量比まで、遊離ｓｉＲＮＡを効率的に結合することができ、またこの結合は、ポリマー組成に相対的に依存しないことを示唆している。ほとんど同一の結果が複合体形成期間１２０分及び１８０分で得られた。
【０１５６】
この実験技術の制限の１つは、それが表面吸着又は静電カプセル化によって結合されているＲＮＡ間の違いを区別することができないということである。これらの２つのうち、後者が封入としてより望ましく、捕捉によってＲＮＡカーゴが良好に保護される。前に論じたように、ポリマーネットワークはすべてｐＨ５．５０で正の表面電荷を示すため、アニオン性ＲＮＡは静電相互作用を介して粒子表面上に吸着され得る可能性が高い。したがって、この最初の実験は、おそらく、ナノゲルの真のＲＮＡ担持能力を過大評価していると思われる。
【０１５７】
表面吸着と静電カプセル化の効果を区別するため、ナノゲルポリマー及びｓｉＲＮＡを６０分間、酸性の複合体形成緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ５．５０）中で複合体化させ、続いて、３倍容量の無血清ＤＭＥＭに移した。より塩基性の溶液にポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体を浸漬させることによって、有効表面電荷を約３０ｍＶから中性付近（０±５ｍＶ）に低下させることができる。表面電荷のこのステップ変化は、ナノゲル表面とｓｉＲＮＡの間の静電的相互作用に作用し、表面からＲＮＡを脱離させる。
【０１５８】
上記の実施例で示した光散乱データによれば、このｐＨは、（ナノゲル組成に応じて）完全に又は部分的にネットワーク構造を収縮させ、ネットワークコア中にＲＮＡを捕捉し、ネットワークからの拡散を抑制するよう機能する。１０：１のポリマーとｓｉＲＮＡの質量比に関する図３４から明らかなように、ＲＮＡの約７０％は、ＤＭＥＭに浸漬した後に結合状態で維持される。それぞれのナノゲル製剤の試料担持効率は、表７において１００：１及び１：１のナノゲル：ｓｉＲＮＡ比（ｇ／ｇ）について示している。
【０１５９】
ナノゲル／ｓｉＲＮＡ結合の定性的証明は図３４で確認することができる。ＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８及びＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡの複合体は、Image Streamサイトメトリーを使用して可視化した。予想した通り、ｓｉＲＮＡ担持ナノゲルは明視野顕微鏡検査法による視覚化には小さすぎたが、ＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８及びＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡからの蛍光シグナルは可視化可能であった。図３４のＤＹ６４７対ＯＧ４８８強度プロットで明らかなように、ＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８ナノゲルはほぼすべて、ＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡを含有している。同様の測定をＰＤＥＳＳＢ３０−ＯＧ４８８及びＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡの複合体についても行った。
【０１６０】
【表６】
2016500681.tif 000011
【０１６１】
ｓｉＲＮＡのナノゲル介在性送達
フローサイトメトリー
Ｃａｃｏ−２細胞に蛍光性ｓｉＲＮＡを送達するＰＤＥＴＢ３０及びその分解性類似体ＰＤＥＳＳＢ３０の能力は、フローサイトメトリーを使用して評価した。図３５は、Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡの取込みに対する暴露時間の影響を示す。予想した通り、ネイキッドｓｉＲＮＡをＣａｃｏ−２細胞に効率的に取り込むのは困難である。しかし、ＰＤＥＴＢ３０又はＰＤＥＳＳＢ３０との複合体形成によって、蛍光中央値は、５分間の暴露後に５倍増加する。特に、ＰＤＥＴＢ３０及びＰＤＥＳＳＢ３０によるｓｉＲＮＡ送達は０〜５分でｓｉＲＮＡ蛍光の急速な増加をもたらし、続いて、５分から６０分では、蛍光中央値にほぼ直線的な増加があった。
【０１６２】
前の実施例で論じたように、Ｃａｃｏ−２細胞における内在化のメカニズムは、主としてマクロピノサイトーシスである。これはエネルギー依存性内在化経路であり、ナノゲル／Ｃｙ−３ｓｉＲＮＡ複合体の取込みは、予想通り、４℃での取込みでは阻害される（図３６）。さらに、これらのデータは、ＰＤＥＴＢ３０がエネルギー依存性経路を介して取り入れられ得るという本発明者らの知見を確証するものである。４℃における６０分間の取込みの後、ＰＤＥＴＢ３０／Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ及びＰＤＥＳＳＢ３０／Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡに暴露された細胞は、Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ単独に暴露された細胞よりも高い蛍光中央値を示す。
【０１６３】
これらのデータは、ＰＤＥＴＢ３０及びＰＤＥＳＳＢ３０がＣａｃｏ−２細胞へのｓｉＲＮＡの送達を可能にすることを示唆している。この研究は、蛍光性ナノゲル／ｓｉＲＮＡ複合体の細胞内分布及び封入ｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング活性の評価に関するさらなる研究の基礎として有用であった。
【０１６４】
Image Streamサイトメトリー
上述のように、Image Streamサイトメトリーを使用して、統計フローサイトメトリーデータと高解像度蛍光顕微鏡写真を同時に得た。さらに、Image Streamサイトメトリーの画像分析能力によって、（表面吸着に対する）細胞の内在化又はプローブ共局在化など、特定の画像特徴を持つ現象の分類及びゲーティングが可能である。
【０１６５】
図３７Ａに示したように、ＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８は、ＲＡＷマクロファージにおけるＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡの効果的な送達ビヒクルである。ＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８及びＰＤＥＳＳＢ３０−ＯＧ４８８は共に、ｓｉＲＮＡ単独（青色ヒストグラム）及び未処理対照（灰色ヒストグラム）細胞に対するＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡの細胞質蛍光を増強する。図３７Ｂは、未処理（灰色）試料、ＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８（緑色）処理試料、及びＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８／ＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡ（赤色）処理試料におけるＯＧ４８８蛍光強度ヒストグラムを示す。特に、ナノゲル単独で処理した細胞の蛍光シグナルは、ナノゲル／ｓｉＲＮＡで処理した細胞よりも大きい。これは、ナノゲル／ｓｉＲＮＡ複合体の内在化がナノゲル単独と比べ効率性で劣ることを示唆している。
【０１６６】
図３８は、代表的なＲＡＷ２６４．７細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。細胞核は、青色（Hoechst）、ＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８の緑色及びｓｉＲＮＡの赤色（ＤＹ６４７）で示す。ナノゲル／ｓｉＲＮＡ共局在化の領域は、蛍光のオーバーレイで黄色に見える。パネルＡ〜Ｃは、６０分間１００ｎＭのＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡのみに暴露した細胞の代表画像を示し、パネルＤ〜Ｆは、６０分間２５μｇ  ｍＬ−１のＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８のみに暴露した細胞の代表画像を示し、パネルＧ〜Ｉは、６０分間２５μｇ  ｍＬ−１のＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８及び１００ｎＭのＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡに暴露した細胞の代表画像を示す。その高ＭＷ（約１３ｋＤａ）と負電荷によって予想されるように、ネイキッドｓｉＲＮＡでは内在化はほとんど又は全く認められなかった。パネルＧ〜Ｉ（ＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８／ＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡ）において、ｓｉＲＮＡ染色パターンからは、ほとんど拡散しており、細胞膜の付近に分布していることが明らかである。いくつかの明るい共局在スポットがパネルＨ及びパネルＩに出現しているが、これはポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体の一部の小胞捕捉を示唆している。小胞捕捉、及び／又はリソソーム集積は、ＲＡＷ２６４．７細胞によって示された異種の内在化経路によって一部のナノゲル／ｓｉＲＮＡ複合体で予想される。
【０１６７】
同一条件下でＰＤＥＴＢ３０／ＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡ又はＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡに暴露したＣａｃｏ−２細胞について同様の観察を行った。ＤＹ６４及びＯＧ４８８に関する蛍光強度ヒストグラムは、それぞれ、図３９Ａ及び図３９Ｂに示す。図３７（ＲＡＷ２６４．７細胞）及び図３９（Ｃａｃｏ−２細胞）からの蛍光中央値の比較によって、これらの２つの細胞型における同程度のナノゲル及びｓｉＲＮＡ内在化が示唆される。この観察での注目すべき例外は、ＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８／ＤＹ６４７−ｓｉＲＮＡに暴露したＲＡＷ細胞におけるＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８強度の低下である。この影響は、ＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８の内在化を主としてマクロピノサイトーシスに依存するＣａｃｏ−２細胞においては存在しない。ＲＡＷ２６４．７細胞は、クラスリン介在性エンドサイトーシスとマクロピノサイトーシスの組合せによって、ＰＤＥＴＢ３０−ＯＧ４８８を取り込む。このことは、ナノゲルのクラスリン依存性の取込みは、ナノゲル内のｓｉＲＮＡの存在によって妨げられることを示唆している。
【０１６８】
ｓｉＲＮＡ介在性遺伝子サイレンシング
モデル細胞株への機能性ｓｉＲＮＡの送達効果は、ポリマー送達系の評価における重要なパラメーターである。これらの試験において、ｓｉＲＮＡノックダウンの標的遺伝子としてＧＡＰＤＨを選択した。ＧＡＰＤＨは、ほぼすべての細胞型に遍在し発現される周知のハウスキーピング遺伝子であって、解糖経路におけるＮＡＤ＋のＮＡＤＨへの還元に関与している。ノックダウンは、KDAlert（商標）ＧＡＰＤＨアッセイキットを使用し、４分かけて蛍光（ｅｍ：５２０／ｅｘ：５９０）の増加をモニターして評価した。この遺伝子標的は、本来、これらの試験に対して選択された細胞型（Ｃａｃｏ−２及びＲＡＷ２６４．７）の遺伝子ノックダウン条件及びトランスフェクション条件の広範囲比較を容易にするために選択した。
【０１６９】
図４０に示したＧＡＰＤＨノックダウンは、ＰＤＥＴＢ３０によって送達されたＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡが強い遺伝子サイレンシング効果を誘導し、ＧＡＰＤＨ発現を６０〜８５％まで低減することを明らかにしている。このノックダウン効果は、８：１〜１０００：１の範囲の多重ポリマー：ｓｉＲＮＡ比で生じた。
【０１７０】
図４１及び図４２は、２００：１のナノゲル：ｓｉＲＮＡ比のＰＤＥＴＢ３０／ｓｉＲＮＡ又はＰＤＥＳＳＢ３０／ｓｉＲＮＡで処理したＣａｃｏ−２細胞におけるｓｉＲＮＡ介在性遺伝子サイレンシングを比較する。両ナノゲル製剤は、機能性ｓｉＲＮＡを送達し得る。ノックダウン効率はＰＤＥＳＳＢ３０／ｓｉＲＮＡで処理した細胞では５３％であり、ＰＤＥＴＢ３０／ｓｉＲＮＡで処理した細胞では８３％であった。図３５のフローサイトメトリーデータに基づいて、ＰＤＥＴＢ３０／ｓｉＲＮＡで処理したＣａｃｏ−２細胞は、ＰＤＥＳＳＢ３０／ｓｉＲＮＡで処理した細胞よりも高いｓｉＲＮＡ蛍光を特徴的に示した。したがって、ＰＤＥＴＢ３０／ｓｉＲＮＡのＰＤＥＳＳＢ３０／ｓｉＲＮＡに対する優れたノックダウン効率は、おそらく、前者の組合せによりｓｉＲＮＡ送達効率が高まったことによるものである。
【０１７１】
ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡアッセイ及びKD Alertアッセイは、Ｃａｃｏ−２細胞における遺伝子サイレンシングに関する最初の試験に適切であったが、このアッセイは、ＲＡＷ２６４．７マクロファージには十分に移行しなかった。ＧＡＰＤＨ酵素活性を検出する直線範囲は、典型的には、約２，０００〜１０，０００細胞／ウェルに対応することができる。Ｃａｃｏ−２細胞（倍増時間約６０時間）において、アッセイ時の細胞密度（トランスフェクション後、約４８時間）は、播種密度の１〜２倍であることが予想される。これに対し、ＲＡＷ２６４．７細胞は、倍増時間約１５時間で、急激に増殖する。したがって、ＲＡＷ２６４．７細胞は、トランスフェクションとアッセイの間、３〜４倍増サイクルとなる。このため、ＲＡＷ２６４．７細胞は、典型的には、これらの試験に関して低密度で（９６ウェルプレートにおいて１，０００細胞／ウェル）で播種した。その後、細胞播種密度におけるいかなるバリエーションもＲＡＷ分裂の連続循環によって増幅された。このことは、KD Alertが実験ウェルと外部対照ウェルの比較によるものであるため、問題となる。実際、アッセイ時のＲＡＷ細胞密度における高変動は、ＲＡＷ細胞におけるあらゆるＰＤＥＴＢ３０／ｓｉＲＮＡ介在性遺伝子サイレンシングの評価の際、KD Alertアッセイキットの有用性を制限した。内部対照を提供する分析法、例えばｑＰＣＲは、遺伝子サイレンシングの評価に好適である。
【０１７２】
結論
ジスルフィド架橋剤を合成して還元的環境でｐＨ応答性ナノゲルを分解させた。この架橋剤は、ＰＤＥＳＳＢ３０と命名された応答性ナノゲルへ加えられたが、臨界膨潤ｐＨ、ナノゲルのサイズ、又はインビトロにおける生体適合性をはじめとする物理化学的特性に対する変化は全くないか、ほとんどなかった。これらのナノゲルは、光散乱及び電子顕微鏡検査によって測定した場合、生理学的レベルのグルタチオンへの暴露時に数分以内に分解する。細胞内在化の分析からは、分解性ナノゲル（ＰＤＥＳＳＢ３０）及び非分解性ナノゲル（ＰＤＥＴＢ３０）によって送達されたｓｉＲＮＡの効率的な取込みが証明された。さらに、ＰＤＥＳＳＢ３０及びＰＤＥＴＢ３０は共に、Ｃａｃｏ−２細胞に機能性ｓｉＲＮＡを送達することができ、それぞれ、４７％及び８３％の遺伝子サイレンシングを達成する。好ましい物理化学的特性及びｓｉＲＮＡ送達効率の組合せによって、治療薬ｓｉＲＮＡ送達系として好ましいＰＤＥＴＢ３０及びＰＤＥＳＳＢ３０が得られる。
【０１７３】
したがって、本発明は、記載した目的及び利点、並びに本発明に固有のものを達成するのに十分適している。当業者によって多くの変更がなされ得るが、そうした変更は、一部は、添付の特許請求の範囲によって説明されている本発明の趣旨の範囲内に包含されている。
【図１】
2016500681.tif 000012
【図２】
2016500681.tif 000013
【図３】
2016500681.tif 000014
【図４】
2016500681.tif 000015
【図５】
2016500681.tif 000016
【図６】
2016500681.tif 000017
【図７】
2016500681.tif 000018
【図８】
2016500681.tif 000019
【図９】
2016500681.tif 000020
【図１０】
2016500681.tif 000021
【図１１】
2016500681.tif 000022
【図１２】
2016500681.tif 000023
【図１３】
2016500681.tif 000024
【図１４】
2016500681.tif 000025
【図１５】
2016500681.tif 000026
【図１６】
2016500681.tif 000027
【図１７】
2016500681.tif 000028
【図１８】
2016500681.tif 000029
【図１９】
2016500681.tif 000030
【図２０】
2016500681.tif 000031
【図２１】
2016500681.tif 000032
【図２２】
2016500681.tif 000033
【図２３】
2016500681.tif 000034
【図２４】
2016500681.tif 000035
【図２５】
2016500681.tif 000036
【図２６】
2016500681.tif 000037
【図２７】
2016500681.tif 000038
【図２８】
2016500681.tif 000039
【図２９】
2016500681.tif 000040
【図３０】
2016500681.tif 000041
【図３１】
2016500681.tif 000042
【図３２】
2016500681.tif 000043
【図３３】
2016500681.tif 000044
【図３４】
2016500681.tif 000045
【図３５】
2016500681.tif 000046
【図３６】
2016500681.tif 000047
【図３７】
2016500681.tif 000048
【図３８】
2016500681.tif 000049
【図３９】
2016500681.tif 000050
【図４０】
2016500681.tif 000051
【図４１】
2016500681.tif 000052
【図４２】
2016500681.tif 000053
【国際調査報告】
2016500681.tif 000054
2016500681.tif 000055
2016500681.tif 000056