(57)【要約】  本発明は、Ａβに対する抗体、血液脳関門レセプターに結合する一価結合性本体及びネプリライシンを含む融合タンパク質に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａβに対する抗体、血液脳関門レセプターに結合する一価結合性本体及びネプリライシン部分を含む融合タンパク質。
【請求項２】
血液脳レセプターが、トランスフェリンレセプター、インスリンレセプター、インスリン様成長因子レセプター、低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質８、低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質１及びヘパリン結合性上皮成長因子様成長因子からなる群より選択される、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項３】
一価結合性本体が、血液脳関門リガンド、又は好ましくはｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ、ＶＨＨより選択される一価抗体フラグメントである、請求項１又は２記載の融合タンパク質。
【請求項４】
２つの重鎖及び２つの軽鎖を含むＡβに対する抗体、
Ａβに対する抗体の第１の重鎖のＣ末端部分に第１のリンカーによって連結されている、血液脳レセプターに結合する一価結合性本体、並びに
Ａβに対する抗体の第２の重鎖のＣ末端部分に第２のリンカーによって連結されているネプリライシン部分
を含む、請求項１〜３記載の融合タンパク質。
【請求項５】
血液脳レセプターに結合する一価結合性本体が、Ａβに対する完全長抗体の第１の重鎖のＦｃ部分のＣ末端に第１のリンカーによって連結されており、
ネプリライシン部分が、Ａβに対する完全長抗体の第２の重鎖のＦｃ部分のＣ末端に第２のリンカーによって連結されている、請求項４記載の融合タンパク質。
【請求項６】
第１及び第２のリンカーが、ペプチド又は化学的リンカー、好ましくはペプチドリンカーである、請求項１〜５記載の融合タンパク質。
【請求項７】
血液脳関門レセプターに結合する一価結合性本体が、トランスフェリンレセプターに対するｓｃＦａｂである、請求項１〜６記載の融合タンパク質。
【請求項８】
Ａβに対する抗体が、（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ２及び（ｆ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ３、を含む、請求項１〜７記載の融合タンパク質。
【請求項９】
Ａβに対する抗体が、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、請求項１〜８記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
Ａβに対する抗体の重鎖の１つが、第１の二量体化モジュールを含み、Ａβに対する抗体の第２の重鎖が、第２の二量体化モジュールを含み、当該２つの重鎖のヘテロ二量体化を可能にする、請求項４〜９記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
ノブズ−イントュ−ホールズストラテジーにより、第１の二量体化モジュールがノブを含み、第２の二量体化モジュールがホールを含む、請求項１０記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
血液脳関門レセプターに結合する１つの一価結合性本体、好ましくはトランスフェリンレセプターに対する１つのｓｃＦａｂを含む、請求項１〜１１記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項１〜１２記載の融合タンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項１４】
請求項１３記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１〜１２記載の融合タンパク質及び医薬担体を含む医薬製剤。
【請求項１６】
医薬としての使用のための、請求項１〜１２記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
医薬の製造における、請求項１〜１２記載の融合タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ａβに対する抗体、血液脳関門レセプターに結合する一価結合性本体及びネプリライシン部分を含む融合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
認知症の全症例の約７０％は、認知に重要な脳領域及び神経回路の選択的損傷に関連するアルツハイマー病が原因である。アルツハイマー病は、特に海馬の錐体ニューロンにおける神経原線維変化並びに有芯のアミロイド沈着及び拡散したハロー(halo)を主として含有する多数のアミロイド斑によって特徴付けられる。
【０００３】
細胞外老人斑は、「アミロイドβ」、「Ａ−ベータ」、「Ａβ４」、「β−Ａ４」又は「Ａβ」と呼ばれる、多量の主に線維性のペプチドを含有する；非特許文献１、非特許文献２、特許文献１又は非特許文献３を参照されたい。このアミロイドは、「アルツハイマー前駆タンパク質／Ｐ−アミロイド前駆タンパク質」（ＡＰＰ）に由来する。ＡＰＰは、膜内在性糖タンパク質であり（非特許文献４参照）、細胞膜プロテアーゼであるα−セクレターゼによってＡＰ配列内で細胞内タンパク質分解的に切断される（非特許文献４, Joe. cit.参照）。その上、さらなるセクレターゼ活性、特にβ−セクレターゼ及びγ−セクレターゼ活性は、アミノ酸３９個（Ａβ３９）、アミノ酸４０個（Ａβ４０）、アミノ酸４２個（Ａβ４２）又はアミノ酸４３個（Ａβ４３）のいずれかを含むアミロイド−β（Ａβ）の細胞外放出を導く；非特許文献５；非特許文献６；特許文献２又は非特許文献７を参照されたい。
【０００４】
Ａβにはいくつかの天然の型があり、ヒト型は、上記のＡβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２及びＡβ４３と呼ばれることに留意すべきである。最も著名な型であるＡβ４２は、アミノ酸配列（Ｎ末端から開始）：
ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号１）を有する。Ａβ４１、Ａβ４０、Ａβ３９では、それぞれＣ末端アミノ酸Ａ、ＩＡ及びＶＩＡが欠如している。Ａβ４３型には、上記配列（配列番号１）のＣ末端に追加的なトレオニン残基が含まれる。
【０００５】
Ａβ４０細線維を核形成するために必要な時間は、Ａβ４２細線維を核形成するために必要な時間よりも有意に長いことが示されていた；非特許文献８を参照されたい。非特許文献９に概説されているように、Ａβ４２の方が老人斑に関連してより頻繁に見出され、インビトロでより原線維形成性であると見なされている。Ａβ４２は、秩序化された非結晶性Ａβペプチドの核形成依存性重合における「シード」として役立つことも示唆されていた；非特許文献１０。ＡＰＰプロセシングの改変及び／又はタンパク質性沈着物を含有する細胞外斑の発生は、アルツハイマーの病態からだけでなく、他の神経障害及び／又は神経変性障害を患う対象からも公知である。これらの障害は、とりわけ、ダウン症候群、アミロイドーシスを伴う遺伝性の脳出血（オランダ型）、パーキンソン病、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、クロイツフェルト−ヤコブ病、ＨＩＶ関連認知症及び運動ニューロパチーを含む。
【０００６】
今日までに、アミロイド関連疾患のためにほんの限られた医学的介入スキームだけが記載されている。例えば、ガランタミン、リバスチグミン又はドネペジルのようなコリンエステラーゼ阻害剤が、軽度から中等度の疾患だけのアルツハイマー病患者に有益であるとして論じられている。しかし、これらの薬物のコリン作動作用による有害事象も報告されている。これらのコリン作動強化処置は、いくらかの症候性の利益を生じるものの、処置された大部分の患者にとって治療応答は不満足である。処置された患者の約５％だけに有意な認知改善が起こると推定されており、該処置がこの進行性疾患の経過を有意に変化させるという証拠はほとんどない。
【０００７】
その結果、より有効な処置、特に疾患の進行を停止又は遅延させ得る処置の臨床的必要性は、極めて大きいままである。メマンチンのようなＮＭＤＡレセプター拮抗剤も、さらに最近採用されている。
【０００８】
しかし、有害事象は、薬理活性が原因と報告されている。さらに、これらのＮＭＤＡレセプター拮抗剤を用いたそのような処置は、疾患修飾アプローチではなく、症候性アプローチと単に見なすことができる。
【０００９】
アミロイド関連障害の処置のための免疫調節アプローチも提唱されている。特許文献３は、Ａβペプチドの部分及び担体分子を含むコンジュゲートであって、担体分子が免疫応答を高めるはずであるコンジュゲートを開示している。免疫応答を誘導するためにＡβフラグメントも採用される別の能動免疫アプローチが、特許文献４に言及されている。
【００１０】
一般的な抗Ａβ抗体を用いた受動免疫アプローチも、特許文献３又は特許文献５に提唱されており、Ａβの部分に対する特異的ヒト化抗体が、特許文献６、特許文献７及び特許文献８に記載されている。特許文献９は、加水分解中にβアミロイドによって採られた遷移状態に結合する抗体を記載している。特許文献１０は、Ａβペプチド上の２つの不連続なアミノ酸配列を認識する抗体分子を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第４６６６８２９号明細書
【特許文献２】国際公開第００／７２８８０号
【特許文献３】国際公開第９９／２７９４４号
【特許文献４】国際公開第００／１７２８８０号
【特許文献５】国際公開第０１／６２８０１号
【特許文献６】国際公開第０２／４６２３７号
【特許文献７】国際公開第０２／０８８３０６号
【特許文献８】国際公開第０２／０８８３０７号
【特許文献９】国際公開第００／１７７１７８号
【特許文献１０】国際公開第０３／０７０７６０号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Selkoe (1994), Ann. Rev. Cell Bio. 10, 373-403
【非特許文献２】Koo (1999), PNAS Vol. 96, pp. 9989-9990
【非特許文献３】Glenner (1984), BBRC 12, 1131
【非特許文献４】Sisodia (1992), PNAS Vol. 89, pp. 6075
【非特許文献５】Sinha (1999), PNAS 96, 11094-1053
【非特許文献６】Price (1998), Science 282, 1078-1083
【非特許文献７】Hardy (1997), TINS 20, 154
【非特許文献８】P.T. Lansbury, Jr. and J.D. Harper (1997), Ann. Rev. Biochem. 66, 385-407
【非特許文献９】Wagner (1999), J. Clin. Invest. 104, 1239-1332
【非特許文献１０】Jarrett (1993), Cell 93, 1055-1058
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の根底にある技術的問題は、アミロイド障害の医学的管理において有効な手段及び方法、特に医学的介入を必要とする患者における有害なアミロイド斑の減少のための手段及び方法を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＥＬＩＳＡによるＡβ１−４０線維へのｍＡｂ３１及び三機能性ポリペプチドＴｒｉＧａｎｔのインビトロ結合を示す。対照抗体は、マウストランスフェリンレセプター抗体（マウスＴｆＲ）である。
【図２】図２は、ＦＡＣＳ分析によるマウストランスフェリンレセプターへのｍＡｂ３１及び三機能性ポリペプチドＴｒｉＧａｎｔのインビトロ結合を示す。
【図３】図３は、ネプリライシン（R&D Systems、カタログ番号 1182-ZNC）及び三機能性ポリペプチドＴｒｉＧａｎｔのインビトロ酵素活性を示す。
【図４】図４は、アルツハイマー病患者の脳切片由来のネイティブなヒトβアミロイド斑に結合したｍＡｂ３１及び三機能性ポリペプチドＴｒｉＧａｎｔの免疫組織化学染色を示す。
【図５】図５は、アルツハイマー病のマウスモデルにおけるｍＡｂ３１及び三機能性ポリペプチドＴｒｉＧａｎｔによるβアミロイド斑のインビボ装飾を示す。ＧＡＨ５５５＝Alexa555色素（Molecular Probes）にコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）。ＢＡＰ−２＝Alexa 488にコンジュゲートした、Ａβに対するマウスモノクローナル抗体。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
［発明の実施態様の詳細な説明］
第１の局面では、本発明は、Ａβに対する抗体、血液脳関門レセプターに結合する一価結合性本体及びネプリライシン部分を含む融合タンパク質を提供する。
【００１６】
本発明の特定の一実施態様では、血液脳レセプターは、トランスフェリンレセプター、インスリンレセプター、インスリン様成長因子レセプター、低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質８、低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質１及びヘパリン結合性上皮成長因子様成長因子からなる群より選択される。
【００１７】
本発明の特定の一実施態様では、融合タンパク質の一価結合性本体は、血液脳関門リガンド又は一価抗体フラグメント（好ましくはｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ、ＶＨＨより選択される）である。
【００１８】
本発明の特定の一実施態様では、融合タンパク質は：
−  ２つの重鎖及び２つの軽鎖を含むＡβに対する抗体、
−  血液脳関門レセプターに結合する一価結合性本体は、Ａβに対する抗体の第１の重鎖のＣ末端部分に第１のリンカーによって連結されている、並びに
−  ネプリライシン部分は、Ａβに対する抗体の第２の重鎖のＣ末端部分に第２のリンカーによって連結されている
を含む。
【００１９】
本発明の特定の一実施態様では、融合タンパク質は：
−  ２つの重鎖及び２つの軽鎖を含むＡβに対する抗体、
−  血液脳関門レセプターに結合する一価結合性本体は、Ａβに対する抗体の第１の重鎖のＦｃ部分のＣ末端に第１のリンカーによって連結されている、並びに
−  ネプリライシン部分は、Ａβに対する抗体の第２の重鎖のＦｃ部分のＣ末端に第２のリンカーによって連結されている
を含む。
【００２０】
本発明の特定の一実施態様では、融合タンパク質の第１及び第２のリンカーは、ペプチド又は化学的リンカーである。
【００２１】
本発明の特定の一実施態様では、融合タンパク質の一価結合性本体は、トランスフェリンレセプターに対するｓｃＦａｂである。
【００２２】
本発明の特定の一実施態様では、Ａβに対する融合タンパク質の抗体は、（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ２及び（ｆ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ３、を含む。
【００２３】
本発明の特定の一実施態様では、Ａβに対する融合タンパク質の抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、を含む。
【００２４】
本発明の特定の一実施態様では、Ａβに対する融合タンパク質の抗体の第１の重鎖は、第１の二量体化モジュールを含み、Ａβに対する融合タンパク質の抗体の第２の重鎖は、第２の二量体化モジュールを含み、当該２つの重鎖のヘテロ二量体化を可能にする。
【００２５】
本発明の特定の一実施態様では、ノブズ−イントゥ−ホールズ（knobs into holes）ストラテジーにより、Ａβに対する融合タンパク質の抗体の第１の重鎖の第１の二量体化モジュールは、ノブを含み、Ａβに対する融合タンパク質の抗体の第２の重鎖の第２の二量体化モジュールは、ホールを含む。
【００２６】
本発明の特定の一実施態様では、融合タンパク質は、血液脳関門レセプターに結合する一価結合性本体の１つの単一ユニットの存在によって特徴付けられ、好ましくは、融合タンパク質は、トランスフェリンレセプターに対する１つの単一ｓｃＦａｂの存在によって特徴付けられる。
【００２７】
本発明の特定の一実施態様では、融合タンパク質は：
−  ２つの重鎖及び２つの軽鎖を含むＡβに対する抗体、
−  Ａβに対する抗体の第１の重鎖のＦｃ部分のＣ末端に第１のリンカーによって連結されている、血液脳関門レセプターに結合する一価結合性本体の単一ユニット、好ましくはトランスフェリンレセプターに対するｓｃＦａｂの単一ユニット、並びに
−  Ａβに対する抗体の第２の重鎖のＦｃ部分のＣ末端に第２のリンカーによって連結されているネプリライシン部分の単一ユニット
を含む。
【００２８】
本発明の特定の一実施態様では、ネプリライシン部分は、ヒトネプリライシン（配列番号２）に由来し、より詳細には、ネプリライシン部分は、ヒトネプリライシンのアミノ酸５２〜７５０、すなわち配列番号２のアミノ酸５２〜７５０を含む。
【００２９】
第２の局面では、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする単離された核酸に関する。
【００３０】
第３の局面では、本発明は、本発明の単離された核酸を含む宿主細胞に関する。
【００３１】
第４の局面では、本発明は、本発明の融合タンパク質及び医薬担体を含む医薬製剤に関する。
【００３２】
本発明の融合タンパク質は、医薬として、特にアミロイド障害の処置のために、特にアルツハイマー病の処置のために使用することができる。
【００３３】
［定義］
ノブズ−イントゥ−ホールズ二量体化モジュール及び抗体工学へのそれらの使用は、Carter P.; Ridgway J.B.B.; Presta L.G.: Immunotechnology, Volume 2, Number 1, February 1996 , pp. 73-73(1)）に記載されている。
【００３４】
「血液脳関門」又は「ＢＢＢ」は、脳毛細血管内皮細胞膜内の密着結合によって形成され、脳内への分子の輸送を尿素（６０ダルトン）などの非常に小さな分子の輸送でさえ限定する厳重な関門を生み出す末梢循環と脳及び脊髄との間の生理学的関門を表す。脳内のＢＢＢ、脊髄内の血液脊髄関門、及び網膜内の血液−網膜関門は、ＣＮＳ内の連続的毛細血管関門であり、本明細書において、ひとまとめにして血液脳関門又はＢＢＢと呼ばれる。ＢＢＢは、また、毛細血管内皮細胞よりもむしろ上衣細胞から構成される血液−ＣＳＦ関門（脈絡叢）を包含する。
【００３５】
用語「Ａβに対する抗体」は、十分な親和性でＡβペプチドに結合する能力があり、その結果、Ａβペプチドのターゲティングにおける診断剤及び／又は治療剤として有用である抗体を表す。
【００３６】
Ａβにはいくつかの天然の型があり、ヒト型は、上記のＡβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２及びＡβ４３と呼ばれることに留意すべきである。最も著名な型であるＡβ４２は、アミノ酸配列（Ｎ末端から開始）：
ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号１）を有する。Ａβ４１、Ａβ４０、Ａβ３９では、それぞれＣ末端アミノ酸Ａ、ＩＡ及びＶＩＡが欠如している。Ａβ４３型には、上記配列（配列番号１）のＣ末端に追加的なトレオニン残基が含まれる。
【００３７】
「中枢神経系」又は「ＣＮＳ」は、身体の機能を制御する神経組織の複合体を表し、脳及び脊髄を含む。
【００３８】
「血液脳関門のレセプター」（本明細書において「Ｒ／ＢＢＢ」と略記）は、ＢＢＢを通して分子を輸送する能力のある、又は外因的に投与された分子を輸送するために使用される能力のある、脳内皮細胞上に発現された細胞外膜結合型レセプタータンパク質である。本明細書におけるＲ／ＢＢＢの例は：トランスフェリンレセプター（ＴｆＲ）、インスリンレセプター、インスリン様成長因子レセプター（ＩＧＦ−Ｒ）、非限定的に低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質１（ＬＲＰ１）及び低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、及びヘパリン結合上皮成長因子様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）を含む低密度リポタンパク質レセプターを含む。本明細書における例示的なＲ／ＢＢＢは、トランスフェリンレセプター（ＴｆＲ）である。
【００３９】
「エフェクター本体」は、ＢＢＢを通して脳に輸送されるべき分子を表す。エフェクター本体は、典型的には、脳に送達したい特徴的な治療活性を有する。エフェクター本体は、例えばペプチド、タンパク質、及び抗体、特にモノクローナル抗体などの神経障害薬及び細胞傷害剤を含む。
【００４０】
「一価結合性本体」は、Ｒ／ＢＢＢに特異的に一価結合様式で結合することができる分子を表す。一価結合性本体は、例えば、単一ｓｃＦａｂフラグメントなどのＩｇＧの部分であり得る。一価結合性本体は、例えば、ファージディスプレイ又は免疫のような最新技術を用いて設計された足場タンパク質であり得る。一価結合性本体は、また、ペプチドであり得る。
【００４１】
「一価結合様式」は、一価結合性本体とＲ／ＢＢＢとの間の相互作用が１つの単一エピトープを介して起こる、Ｒ／ＢＢＢへの特異的結合を表す。一価結合様式は、単一のエピトープ相互作用点のせいで、Ｒ／ＢＢＢの任意の二量体化／多量体化を防止する。一価結合様式は、Ｒ／ＢＢＢの細胞内ソーティングが変化されることを防止する。
【００４２】
「トランスフェリンレセプター」（「ＴｆＲ」）は、脊椎動物での鉄取り込みに関与する、ジスルフィド結合した２個のサブユニット（見かけの分子量はそれぞれ約９０，０００）から構成される膜貫通糖タンパク質（分子量約１８０，０００）である。一態様では、本明細書におけるＴｆＲは、例えばSchneider et al. Nature 311:675-678 (1984)におけるようなアミノ酸配列を含むヒトＴｆＲである。
【００４３】
本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２種のインタクトな抗体から形成された多重特異性抗体｛例えば二重特異性抗体）、及び抗体フラグメント（所望の生物学的活性を示す限り）を包含する。
【００４４】
本明細書における「抗体フラグメント」は、抗原と結合する能力を保持するインタクトな抗体の部分を含む。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント；二重特異性抗体；線状抗体；ｓｃＦｖ及びｓｃＦａｂなどの単鎖抗体分子、並びに抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を含む。
【００４５】
本明細書に使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を表し、すなわち、当該集団を含む個別の抗体は、モノクローナル抗体の産生中に発生し得る可能な変異体（そのような変異体は一般的に少量存在する）を除き、同一であり、かつ／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンが混入していない点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明により使用されるべきモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって製造され得、又は組換えＤＮＡ法（例えば米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって製造され得る。「モノクローナル抗体」は、また、例えばClackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)及びMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載されている技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離され得る。本明細書におけるモノクローナル抗体の具体例は、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体（その抗原結合性フラグメントを含む）を含む。本明細書におけるモノクローナル抗体は、具体的には、重鎖及び／又は軽鎖の部分が、特定の種に由来する又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同である一方で、鎖（単数又は複数）の残りが、別の種に由来する又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びに所望の生物学的活性を示す限りそのような抗体のフラグメント、を含む（米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)）。本明細書における目的のキメラ抗体は、非ヒト霊長類｛例えばヒヒ、アカゲザル又はカニクイザルなどの旧世界ザル）由来の可変ドメイン抗原結合性配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む（米国特許第５，６９３，７８０号）。
【００４６】
「ヒト化」型の非ヒト｛例えばマウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。大部分は、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。その上、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体に見られない残基を含み得る。これらの改変は、さらに、抗体の性能を改良するために加えられる。一般的に、ヒト化抗体は、超可変領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に対応し、上記のようなＦＲ置換（単数又は複数）を除き、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合により、免疫グロブリン定常領域、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、Jones et al, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332:323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol 2:593-596 (1992)を参照されたい。
【００４７】
本明細書における「ヒト抗体」は、ヒトＢ細胞から入手可能な抗体のアミノ酸配列構造に対応するアミノ酸配列構造を含むヒト抗体であり、ヒト抗体の抗原結合性フラグメントを含む。そのような抗体は、非限定的に、免疫したときに内因性免疫グロブリン産生なしにヒト抗体を産生する能力があるトランスジェニック動物｛例えばマウス）による産生（例えばJakobovits et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al, Year in Immuno., 7:33 (1993)；並びに米国特許第５，５９１，６６９号、同第５，５８９，３６９号及び同第５，５４５，８０７号参照））；ヒト抗体又はヒト抗体フラグメントを発現するファージディスプレイライブラリーからの選択（例えば、McCafferty et al, Nature 348:552-553 (1990); Johnson et al, Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993); Clackson et al, Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991); Griffith et al, EMBO J. 12:725-734 (1993)；米国特許第５，５６５，３３２号及び同第５，５７３，９０５号参照）；インビトロ活性化Ｂ細胞による産生（米国特許第５，５６７，６１０号及び同第５，２２９，２７５号参照）；並びにヒト抗体産生ハイブリドーマからの単離、を含む多様な技術により同定又は製造することができる。
【００４８】
本明細書における「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なるエピトープに結合特異性を有する抗体である。例示的な多重特異性抗体は、Ｒ／ＢＢＢ及び脳抗原の両方に結合し得る。多重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体フラグメント（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。２、３個、又はそれを超える（例えば４個の）機能性抗原結合部位を有する設計された抗体も意図される（例えば、米国特許出願公開第２００２／０００４５８７Ａ１号、Millerら参照）。多重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体フラグメントとして調製することができる。
【００４９】
本明細書における抗体は、改変された抗原結合活性又は生物学的活性を有する「アミノ酸配列変異体」を含む。そのようなアミノ酸改変の例は、抗原に対する親和性が増強した抗体（例えば「親和性成熟」抗体）、及びＦｃ領域が存在するならば、改変されたＦｃ領域、例えば改変された（増加若しくは減少した）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／若しくは補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を有する抗体（例えば、国際公開第００／４２０７２号、Presta, L.及び国際公開第９９／５１６４２号、Iduosogieら参照）；並びに／又は増大若しくは減少した血清半減期（例えば国際公開第００／４２０７２号、Presta, L.参照）を有する抗体を含む。
【００５０】
本明細書に使用される「可変ドメイン」（軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ））は、抗原への抗体の結合に直接関与する軽鎖ドメイン及び重鎖ドメインの対のそれぞれを意味する。可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインは、同じ一般構造を有し、各ドメインは、３つの「超可変領域」（又は相補性決定領域、ＣＤＲ）によって連結された、配列が広く保存された４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域は、βシートコンフォメーションを採り、ＣＤＲは、βシート構造を連結するループを形成し得る。各鎖内のＣＤＲは、フレームワーク領域によってそれらの三次元構造に保持され、他の鎖からのＣＤＲと一緒に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖ＣＤＲ３領域及び軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明による抗体の結合特異性／親和性に特に重要な役割を果たし、したがって、本発明のさらなる目的を提供する。
【００５１】
本明細書に使用される場合の用語「抗体の抗原結合部分」は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を表す。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、本明細書において定義された超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にかけてドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に最も大きく寄与し、抗体の性質を定義する領域である。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的な定義及び／又は「超可変ループ」からの残基に従って決定される。
【００５２】
本明細書における抗体は、「グリコシル化変異体」であり得、その結果、Ｆｃ領域に結合している任意の糖質が存在するならば、それは改変されている。例えば、抗体のＦｃ領域に結合しているフコースを欠如する成熟糖質構造を有する抗体は、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Presta, L.）に記載されている。米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd）も参照されたい。抗体のＦｃ領域に結合している糖質に二分しているＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する抗体は、国際公開第２００３／０１１８７８号（Jean-Mairetら）及び米国特許第６，６０２，６８４号（Umanaら）に参照されている。抗体のＦｃ領域に結合しているオリゴ糖中に少なくとも１個のガラクトース残基を有する抗体は、国際公開第１９９７／３００８７号（Patelら）に報告されている。そのＦｃ領域に結合している糖質が改変された抗体に関する国際公開第１９９８／５８９６４号（Raju, S.）及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Raju, S.）も参照されたい。グリコシル化が改変された抗体を記載している米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Umanaら）も参照されたい。本明細書に使用される場合の用語「超可変領域」は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を表す。超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）及び８９〜９７（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）及び９５〜１０２（Ｈ３）；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）並びに／又は「超可変ループ」由来の残基（例えば軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）及び９１〜９６（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）及び９６〜１０１（Ｈ３）；Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901- 917 (1987)）を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書定義の超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００５３】
「完全長抗体」は、抗原結合性可変領域、並びに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは、ネイティブな配列の定常ドメイン（例えばヒトのネイティブな配列の定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体であり得る。
【００５４】
抗体の「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（ネイティブな配列のＦｃ領域又はアミノ酸配列変異Ｆｃ領域）に起因し得る生物学的活性を表す。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合性、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃレセプター結合性、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などが挙げられる。一実施態様では、本明細書における抗体は、本質的に、エフェクター機能を欠如する。
【００５５】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、完全長抗体を異なる「クラス」に割り当てることができる。完全長抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２にさらに分類され得る。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元配置は周知である。本明細書に使用される用語「組換え抗体」は、抗体をコードする核酸を含む組換え宿主細胞によって発現される抗体（例えば、キメラ、ヒト化若しくはヒト抗体、又はその抗原結合性フラグメント）を表す。組換え抗体を産生するための「宿主細胞」の例は：（１）哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、骨髄腫細胞（Ｙ０細胞及びＮＳＯ細胞を含む）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、Ｈｅｌａ細胞及びＶｅｒｏ細胞；（２）昆虫細胞、例えばｓｆ９、ｓｆ２１及びＴｎ５；（３）植物細胞、例えばタバコ（Nicotiana）属（例えばニコチアナ タバカム（Nicotiana tabacum））に属する植物；（４）酵母細胞、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属（例えばサッカロミセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））又はアスペルギルス（Aspergillus）属（例えばアスペルギルス ニガー（Aspergillus niger））に属するもの；（５）細菌細胞、例えば大腸菌（Escherichia, coli）細胞又は枯草菌（Bacillus subtilis）細胞などを含む。
【００５６】
本明細書に使用される「特異的に結合性」又は「に特異的に結合する」は、抗原に選択的又は優先的に結合する抗体を表す。結合親和性は、一般的に、ＥＬＩＳＡ又は表面プラズモン共鳴技術（例えばBIACORE（登録商標）を使用）などの標準アッセイ法を用いて決定される。
【００５７】
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイ法においてその抗原への参照抗体の結合を５０％以上遮断する抗体を表し、逆に、参照抗体は、競合アッセイ法においてその抗原への抗体の結合を５０％以上遮断する。
【００５８】
本明細書における用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、ネイティブな配列のＦｃ領域及び変異のＦｃ領域を含む。一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、重鎖のＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０からカルボキシル末端に及ぶ。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端のリジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても、存在しなくてもよい。本明細書において特に明記しない限り、Ｆｃ領域又は定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載のように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００５９】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）の残基以外の可変ドメイン残基を表す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、４種のＦＲドメイン、すなわちＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４、からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）中の以下の配列中に出現する：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００６０】
本明細書に使用される「リンカー」は、エフェクター本体を一価結合性本体に共有結合的又は非共有結合的に連結する構造である。特定の実施態様では、リンカーはペプチドである。他の実施態様では、リンカーは化学的リンカーである。
【００６１】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離された抗体である。いくつかの実施態様では、抗体は、例えば電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えばイオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）によって決定されたときに９５％超又は９９％まで精製される。抗体純度の判定方法の総説については、例えばFlatman et al, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照されたい。
【００６２】
用語「医薬製剤」は、その中に含有される活性成分の生物学的活性を有効にさせるような形態の調製物であって、その製剤が投与される対象に許容できないほど有毒な追加的な成分を含有しない調製物を表す。
【００６３】
「薬学的に許容し得る担体」は、医薬製剤中の活性成分以外の成分であって、対象に非毒性の成分を表す。薬学的に許容し得る担体は、非限定的に、緩衝剤、賦形剤、安定化剤、又は保存剤を含む。
【００６４】
本明細書に使用される「処置」（及び「処置する」又は「処置すること」などのその文法的変形）は、処置される個体の自然経過を変えようとする臨床的介入を表し、予防のため、又は臨床病理の経過中のいずれかに行うことができる。望ましい処置効果は、非限定的に、疾患の発生又は再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的病理学的結果の減少、転移の予防、疾患の進行速度の低下、病状の改善又は緩和、及び寛解又は予後改善を含む。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、疾患の発生を遅延又は疾患の進行を減速するために使用される。
【００６５】
医薬製剤
本発明により使用される融合タンパク質の治療用製剤は、任意で薬学的に許容し得る担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより｛Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で保存用に調製される。許容し得る担体、賦形剤、又は安定化剤は、採用される投薬量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、それらは、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール若しくはベンジルアルコール；メチルパラベン若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む単糖、二糖、及び他の糖質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；並びに／又はTWEEN（商標）、PLURONICS（商標）若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【００６６】
本明細書における製剤は、また、必要に応じて１つを超える活性化合物を、場合により相互に悪影響しない相補的活性を有する活性化合物を、含有し得る。そのような医薬の種類及び有効量は、例えば、製剤中に存在する融合タンパク質の量、並びに対象の臨床パラメーターに依存する。例示的なそのような医薬を後述する。
【００６７】
活性成分は、また、例えばコアセルベーション技術により若しくは界面重合により調製されたマイクロカプセル中に、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチンのマイクロカプセル及びポリメチルメタクリレートマイクロカプセル中に、コロイド薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノパーティクル及びナノカプセル）中に、又はマクロエマルジョン中に、封入され得る。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
【００６８】
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、そのマトリックスは、造形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放マトリックス例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ２−ヒドロキシエチルメタクリレート、又はポリビニルアルコール、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とＬ−グルタミン酸γ−エチルとのコポリマー、非分解性のエチレン−酢酸ビニル、LUPRON DEPOT（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なマイクロスフェア）などの分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー、並びにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。
【００６９】
インビボ投与のために使用されるべき製剤は、無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。一実施態様では、製剤は等張性である。
【００７０】
一局面では、医薬としての使用のための本発明の融合タンパク質が提供される。さらなる局面では、アミロイド障害、特にアルツハイマー病などの神経疾患又は障害の処置に使用するための本発明の融合タンパク質が提供される。特定の実施態様では、処置の方法に使用するための本発明の融合タンパク質が提供される。特定の実施態様では、本発明は、個体に本発明の融合タンパク質の有効量を投与することを含む、神経疾患又は神経障害を有する個体を処置する方法に使用するための本発明の融合タンパク質を提供する。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、場合によりヒトである。
【００７１】
本発明の融合タンパク質は、単独で又は他の薬剤と組み合わせてのいずれかで、治療に使用することができる。例えば、本発明の融合タンパク質は、少なくとも１つの追加的な治療剤と共投与され得る。特定の実施態様では、追加的な治療剤は、処置するために採用されている本発明の融合タンパク質と同じ又は異なる神経障害を処置するために有効な治療剤である。例示的な追加的な治療剤は、非限定的に：上記の様々な神経薬、コリンエステラーゼ阻害薬（ドネペジル、ガランタミン、ロバスチグミン（rovastigmine）、及びタクリンなど）、ＮＭＤＡレセプター拮抗薬（メマンチンなど）、アミロイドベータペプチド凝集阻害薬、抗酸化剤、γ−セクレターゼモジュレーター、神経成長因子（ＮＧＦ）模倣体又はＮＧＦ遺伝子療法、ＰＰＡＲｙ作動薬、ＨＭＳ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬（スタチン）、アンパカイン、カルシウムチャネル遮断薬、ＧＡＢＡレセプター拮抗薬、グリコーゲンシンターゼキナーゼ阻害薬、静脈内免疫グロブリン、ムスカリンレセプター作動薬、ニコチン（nicrotinic）レセプターモジュレーター、能動的又は受動的アミロイドベータペプチド免疫、ホスホジエステラーゼ阻害薬、セロトニンレセプター拮抗薬及び抗アミロイドベータペプチド抗体を含む。特定の実施態様では、少なくとも１つの追加的な治療剤は、それが神経薬の１つ以上の副作用を緩和する能力について選択される。
【００７２】
そのような上述の併用療法は、組み合わせ投与（２つ以上の治療剤が同一又は別々の製剤中に含まれる）及び分離投与（その場合、本発明の融合構築物の投与が、追加的な治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又は後に起こる可能性がある）を包含する。本発明の融合タンパク質は、また、当技術分野において公知の、治療又は予防されるべき神経障害に適切な、非限定的に放射線療法、行動療法、又は他の治療法などの他の介入治療と組み合わせて使用することができる。本発明のＲ／ＢＢＢに対する一価結合性本体（及び任意の追加的な治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所処置を望むのであれば病巣内投与を含む、任意の適切な手段により投与することができる。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を含む。
【００７３】
投薬は、投与が短期間又は長期間であるかに部分的に依存して、任意の適切な経路による、例えば静脈内又は皮下注射などの注射による、ものでありうる。非限定的に、様々な時点にわたる単回（monovalent）又は多回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む様々な投薬スケジュールが本明細書において考えられている。
【００７４】
ＢＢＢを通して融合構築物又は化合物を輸送する脂質ベースの方法は、非限定的に、ＢＢＢの血管内皮上のレセプターに結合する一価結合性本体に連結しているリポソーム中に融合構築物又は化合物を封入すること（例えば米国特許出願公開第２００２００２５３１３号参照）、及び低密度リポタンパク質粒子（例えば米国特許出願公開第２００４０２０４３５４号参照）又はアポリポタンパク質Ｅ（例えば米国特許出願公開第２００４０１３１６９２号参照）中に一価結合性本体をコーティングすることを含む。
【００７５】
疾患の予防又は治療のために、本発明の融合タンパク質の適切な投薬（単独で、又は１つ以上の他の追加的な治療剤と組み合わせて使用する場合）は、処置されるべき疾患の種類、融合構築物の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防的目的それとも治療的目的のために投与されるか、以前の治療、患者の臨床歴及び融合構築物に対する応答、並びに担当医師の判断に依存する。融合タンパク質は、患者に１回で又は一連の処置にわたり適切に投与される。疾患の種類又は重症度に応じて、約１μg/kg〜１５mg/kg（例えば０．１mg/kg〜１０mg/kg）の融合構築物が、例えば１回以上の別々の投与によるか又は連続注入によるかのいずれかで、患者に投与するための初回候補投薬であり得る。一つの典型的な１日投薬は、上述の要因に応じて、約１μg/kgから１００mg/kg又はそれ以上までの範囲であり得る。状態に応じて、数日間又はそれ以上にわたる反復投与について、処置は、疾患の症状の所望の抑制が起こるまで一般的に継続されるだろう。抗体の一つの例示的な投薬は、約０．０５mg/kg〜約１０mg/kgの範囲だろう。したがって、約０．５mg/kg、２．０mg/kg、４．０mg/kg又は１０mg/kg（又はその任意の組合せ）の１回以上の用量が患者に投与され得る。そのような用量は、断続的に、例えば毎週又は３週間毎に（例えば患者が抗体の約２〜約２０回、又は例えば約６回の用量を受けるように）投与され得る。最初のより高い負荷用量、続いて、１回以上のより低い用量が投与され得る。しかし、他の投薬レジメンも有用であり得る。この治療法の進展は、従来の技法及びアッセイ法により容易にモニターされる。
【実施例】
【００７６】
実施例で使用される融合ポリペプチド
実施例でさらに特徴付けられた三機能性ポリペプチド（TriGant）は、Ａベータに対する完全長抗体（ＭＡＢ３１）、トランスフェリンレセプターに対する単一Ｆａｂ及びネプリライシンを含む。
【００７７】
抗Ａベータ抗体：Ｍａｂ３１＝ガンテネルマブ（Gantenerumab）（ＩＮＮ）。トランスフェリンレセプターに対する単一Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）：マウス８Ｄ３抗トランスフェリン抗体（Boado, R.J. Zhang, Y. Wang, Y and Pardridge, W.M., Biotechnology and Bioengineering (2009) 102, 1251-1258）。
【００７８】
実施例の三機能性ポリペプチドの重鎖及び可変鎖の配列は、以下の通りである：
Ｍａｂ３１重鎖ノブ−ｓＦａｂ８Ｄ３：ＭＡＢ３１−ＩｇＧ１−ＫＮＯＢ−ＳＳ＿Ｇ４Ｓ−４＿ＶＬ−８Ｄ３−ＣＫ＿Ｇ４Ｓ−６−ＧＧ＿ＶＨ−８Ｄ３−ＣＨ１（配列番号１１）
配列番号１１の組成：
・  Ｃ末端Ｌｙｓを有さないＭａｂ３１ヒトＩｇＧ１重鎖
・  グリシンセリン−リンカー
・  マウス８Ｄ３抗トランスフェリン抗体の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）変異体（Ｌ５９６Ｖ及びＬ５９８Ｉ）（Boado, R.J. Zhang, Y. Wang, Y and Pardridge, W.M., Biotechnology and Bioengineering (2009) 102, 1251-1258）
・  ヒトＣ−カッパ軽鎖
・  グリシンセリン−リンカー
・  マウス８Ｄ３抗トランスフェリン抗体の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）（Boado, R.J. Zhang, Y. Wang, Y and Pardridge, W.M., Biotechnology and Bioengineering (2009) 102, 1251-1258）
・  ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３重鎖ドメイン
Ｍａｂ３１重鎖ホール−ネプリライシン：ＭＡＢ３１＿８Ｄ３＿ＨＣ−ＨＯＬＥ＿ＮＥＰＲＩ（配列番号１２）。
配列番号１２の組成：
・  Ｃ末端Ｌｙｓを有さないＭａｂ３１ヒトＩｇＧ１重鎖
・  グリシンセリン−リンカー
・  配列番号２のアミノ酸５２〜７５０（ヒトネプリライシン）
Ｍａｂ３１軽鎖：ＴＰＩＰ：５１７０＿ＭＡＢ３１−ＬＣ（配列番号１３）。
【００７９】
実施例１：ＥＬＩＳＡによるＡβ１−４０線維へのインビトロ結合の決定
線維性Ａβへの融合ポリペプチドの結合をＥＬＩＳＡアッセイ法によって測定した。簡潔には、Maxisorpプレート上にＰＢＳ中７μg/mLのＡβ（１−４０）を３７℃で３日間コーティングして、線維性Ａベータを産生させ、次にＲＴで３時間乾燥した。ＰＢＳ（ブロッキング緩衝液）中１％ Crotein C及び０．１％ ＲＳＡでプレートをＲＴで１時間ブロッキングし、次に洗浄緩衝液で１回洗浄した。融合ポリペプチド又は対照をブロッキング緩衝液中最大１００nMの濃度で添加し、４℃で一晩インキュベートした。４回の洗浄工程後に、ブロッキング緩衝液（１ＲＴ）中に１：１０，０００希釈した抗ヒト−ＩｇＧ−ＨＲＰ（Jackson Immunoresearch）の添加によって構築物を検出し、続いて６回洗浄し、ＴＭＢ（Sigma）中でインキュベートした。１N ＨＣｌで発色を停止させた後に吸光度を４５０nmで読み出した（図１参照）。
【００８０】
実施例２：マウストランスフェリンレセプターへのインビトロ結合の決定
マウストランスフェリンレセプターへの融合ポリペプチドの結合を、マウスＸ６３．ＡＧ８−５６３骨髄腫細胞に対するＦＡＣＳ解析によって検査した。Ａβ抗体ｍＡｂ３１（ＨＥＫ）が、Ａｇ８細胞に非特異的に結合する特定の傾向を示したので、２０倍過剰の抗マウス−ＴｆＲ抗体との同時インキュベーションによって特異的結合を定量した。細胞を遠心分離によって回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、細胞５×１０４個を１．５pM〜１０nMの希釈系列のポリペプチド融合体と共に、ＲＰＭＩ／１０％ ＦＣＳ １００μL中の２００nM抗マウスＴｆＲ抗体を添加して又は添加せずに、氷上で１．５時間インキュベートした。ＲＰＭＩ／１０％ ＦＣＳで２回洗浄後に、フィコエリトリンに連結したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Jackson Immunoresearch）をＲＰＭＩ／１９％ ＦＣＳ中に１：６００希釈したものと共に細胞を氷上で１．５時間インキュベートした。細胞を再洗浄し、ＲＰＭＩ／１０％ ＦＣＳ中に再懸濁し、フィコエリトリンの蛍光をＦＡＣＳアレイ装置（Becton-Dickinson）で測定した（図２参照）。
【００８１】
実施例３：ネプリライシンのインビトロ酵素活性（見かけのＫｍ）の決定
低容量黒色Costar 384ウェルプレートを用いて２０μlアッセイ法を２５Ｃ°で行った。１６０μMペプチド基質ＭＣＡ−ＲＰＰＧＦＳＡＦＫ（Ｄｎｐ）−ＯＨ（R&D Systems カタログ番号ES005）の作業溶液を５０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、２５mM ＮａＣｌ及び５mM ＺｎＣｌ２中に調製した。アッセイ緩衝液中１nMに希釈したネプリライシン（R&D Systems、カタログ番号1182-ZNC）又はネプリライシン融合ポリペプチド１０μlをプレートに移した。見かけのＫｍ値の決定のために、様々な濃度の基質（２倍希釈物中０．０７８〜８０nM）を添加し、酵素反応を開始させた。Envision Readerを用いて励起３２０nm及び発光４０５nmで蛍光の増加をモニターした。XLFit（登録商標）ソフトウェア（ＩＤＢＳ）を使用して加水分解速度及び見かけのＫｍ値を計算した（図３及び表１参照）。
【００８２】
【表１】
2016527260.tif 000002
【００８３】
実施例４：間接免疫蛍光法によるアルツハイマー病患者の脳切片由来のネイティブヒトβアミロイド斑への融合ポリペプチドの染色
間接免疫蛍光法を用いた免疫組織化学分析によりネイティブヒトβアミロイド斑を染色する能力について融合ポリペプチドを検査した。本物のヒトβアミロイド斑の特異的で高感度の染色が示された。アルツハイマー病陽性と診断された患者から死後に得られた側頭皮質からの未固定組織のクリオスタット切片を間接的免疫蛍光法によって標識した。結合している融合ポリペプチドを検出するために２段階インキュベーションを用い、これを、Alexa 555色素にコンジュゲートしたアフィニティー精製ヤギ抗ヒト（ＧＡＨ５５５）ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Molecular Probes）によって明らかにした。対照は、無関係なヒトＩｇＧ１抗体（Sigma）及び二次抗体単独を含み、これら全ては陰性の結果を与えた。全ての種類のβアミロイド斑が、１０ng/ml〜５μg/mlで検査された融合ポリペプチド濃度で明白に一貫して明らかとなった。０．９５μg/ml及び１．９μg/ml濃度の融合ポリペプチドに関する本物のヒトアミロイドβ斑の特異的で高感度の染色を示す（図４参照）。
【００８４】
実施例５：アルツハイマー病のマウスモデルにおける融合ポリペプチドによるβアミロイド斑のインビボ装飾
融合ポリペプチドがβアミロイド斑をインビボで免疫装飾する能力について、ＡＤ関連アミロイドーシスのマウスモデルであるＡＰＰ／ＰＳ２ダブルトランスジェニックマウス（Richards (2003), J. Neuroscience, 23, 8989-9003）を用いて検査した。この検査は、脳浸透及びアミロイドβ斑への結合の程度の判定を可能にした。裸の抗Ａβモノクローナル抗体に比べて種々の用量の融合ポリペプチドを投与し、６日後に動物をリン酸緩衝生理食塩水で潅流し、脳をドライアイス上で凍結させ、凍結切片作製用に調製した。融合ポリペプチドは、（裸の抗Ａβモノクローナル抗体に比べて）実質的に改善された高度に有効なインビボ脳浸透を示した。
【００８５】
いずれかの未固定クリオスタット切片を使用して、濃度１５μg/mlのAlexa555色素にコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＧＡＨ５５５）（Molecular Probes）を用いた室温で１時間の単一標識間接免疫蛍光法によって、βアミロイド斑に結合している抗体の存在を判定した。アミロイド斑についての対比染色は、濃度０．５μg/mlのAlexa488コンジュゲートしたＡβに対するマウスモノクローナル抗体であるＢＡＰ−２と共に室温で１時間インキュベートすることによって行った。蛍光染色用マウンティングメディウム（S3023 Dako）を用いてスライドを包埋し、共焦点レーザ顕微鏡法によって画像化を行った（図５）。
【００８６】
融合ポリペプチドは、等モル濃度用量（２及び３．８mg/kg）で血液脳関門を実質的によりうまく通過し、全てのβアミロイド斑をインビボで強く免疫装飾することが分かった。図５に示す代表的な画像は、ずっと低い程度で血液−脳境界を通過する裸のモノクローナル抗体に比べて、融合ポリペプチドの結合能が向上していることを示している。
【００８７】
実施例６：融合ポリペプチドの組換え産生
ＤＮＡの調製：
一晩細菌ＬＢ培養物５００ml又は５Ｌを回収し、製造業者のプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを抽出した（High speed Maxi kit, Qiagen、カタログ番号12663）。結果として生じたプラスミドＤＮＡをＴＥ緩衝液１ml中に溶出させ、分光光度測定（Epoch, BioTek）によってＤＮＡ濃度を決定した。
【００８８】
発現プラスミド：
重鎖及び軽鎖の発現用の発現カセットを含む発現プラスミドを、哺乳動物細胞発現ベクター中に別々に集合させた。
【００８９】
コドン使用頻度を推定することができる、ヒト軽鎖及び重鎖ヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication No 91-3242に示されている。
【００９０】
ａ）ネプリライシンを有さない抗体：
κ軽鎖の転写ユニットは、以下の要素から構成されている：
−  ヒト軽鎖生殖細胞系列遺伝子の５’ＵＴＲを含むヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）由来最初期エンハンサー及びプロモーター、
−  ヒト生殖細胞系列遺伝子のゲノムＤＮＡセグメントをコードするシグナルペプチド配列（Ｌ１、シグナル配列−イントロン、Ｌ２）を含む軽鎖可変領域、
−  マウスκ軽鎖遺伝子イントロン２を含むヒトκ軽鎖遺伝子定常領域、並びに
−  ＳＶ４０ポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列。
【００９１】
γ１重鎖の転写ユニットは、以下の要素から構成されている：
−  ヒト重鎖生殖細胞系列遺伝子の５’−ＵＴＲを含む、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）由来の最初期エンハンサー及びプロモーター、
−  ヒト生殖細胞系列遺伝子の、シグナルペプチド配列をコードするゲノムＤＮＡセグメント（Ｌ１、シグナル配列−イントロン、Ｌ２）を含むγ１鎖可変領域、
−  マウス重鎖イントロン２を含むゲノムヒトγ１重鎖遺伝子定常領域；
−  ＳＶ４０ポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列。
【００９２】
さらに、プラスミドは、
−  ネオマイシン耐性遺伝子、
−  大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８由来複製起点、及び
−  大腸菌にアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子
を含む。
【００９３】
ｂ）ネプリライシンが重鎖のＣ末端に融合された抗体：
軽鎖用の発現プラスミドは、
−  以下の要素から構成されるκ軽鎖の転写ユニット：
−  ヒト軽鎖生殖細胞系列遺伝子の５’ＵＴＲを含むヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）由来最初期エンハンサー及びプロモーター、
−  マウス生殖細胞系列遺伝子の、シグナルペプチド配列をコードするゲノムＤＮＡセグメント（Ｌ１、シグナル配列−イントロン、Ｌ２）を含む軽鎖可変領域、
−  マウスκ軽鎖遺伝子イントロン２を含むヒトκ軽鎖遺伝子定常領域、並びに
−  ＢＧＨポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列；
−  ネオマイシン耐性遺伝子、
−  大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８由来複製起点、並びに
−  大腸菌にアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子
を含む。
【００９４】
重鎖用の発現プラスミドは、
−  以下の要素から構成されるγ１重鎖の転写ユニット：
−  ヒト重鎖生殖細胞系列遺伝子の５’−ＵＴＲを含むヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）由来最初期エンハンサー及びプロモーター、
−  ヒト生殖細胞系列遺伝子の、シグナルペプチド配列をコードするゲノムＤＮＡセグメント（Ｌ１、シグナル配列−イントロン、Ｌ２）を含むγ１鎖可変領域、
−  マウス重鎖イントロン２を含むゲノムヒトγ１重鎖遺伝子定常領域；
−  ネプリライシンをコードする核酸、
−  ＢＧＨポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列；
−  大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８由来複製起点、並びに
−  大腸菌にアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子
を含む。
【００９５】
トランスフェクション：
トランスフェクションの前日にＨＥＫ２９３細胞を８×１０５個/mlに希釈した。製造業者のプロトコールに従って細胞約１〜１．６×１０６個/mlをトランスフェクトした。最終トランスフェクション容積１０００mlに対して、Opti-MEM（登録商標）I Reduced Serum Medium（Gibco、カタログ番号31985070）でＤＮＡ １０００μgを最終容積５０mlに希釈した。ＤＮＡ １μgあたり293fectin（商標）試薬（Invitrogen、カタログ番号12347019）２μlをOpti-MEM（登録商標）培地で終容積１mlに等希釈し、５分間インキュベートした。インキュベーション後に、希釈後のＤＮＡを希釈後の293fectin（商標）試薬に添加し、穏やかに混合し、さらに２０〜３０分間インキュベートし、その後ＨＥＫ２９３細胞懸濁液９５０mlにピペットで滴下して最終容積１０００mlを得た。１２５rpmで回転しているオービタルシェーカー上で細胞を細胞培養条件（３７℃、８％ ＣＯ２、湿度８０％）でインキュベートし、７２時間後に回収した。回収物を１０００rpmで１０分間、続いて３０００rpmで１０分間、遠心分離し、２２μm滅菌フィルター（Millipore、カタログ番号SCGPU05RE）を通して濾過した。
【００９６】
精製：
遠心分離によって培養培地から細胞を除去した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（AEKTA-Avant上のMabSelect-Sepharose）によって上清から複合体を精製した。溶出後の複合体をAmicon遠心チューブでタンパク質濃度３mg/mlに濃縮した。アリコートをサイズ排除クロマトグラフィー（HPLC TSKgel GFC300 Sys89）で分析した。Superdex 200で調製用ＳＥＣを行って、凝集物を除去し、２０mM ヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中に融合タンパク質を緩衝化した。溶出後の複合体をAmicon遠心チューブでタンパク質濃度１mg/mlに濃縮し、濾過滅菌した（孔径０．２μm）。
【００９７】
分析論：
ＵＶ分光光度計を使用して複合体試料をＯＤ２８０で分析し、溶液中のタンパク質濃度を決定した。これに必要な消衰係数を、Pace（Pace et al., Protein Science 4 (1995) 2411-2423）に従ってアミノ酸配列から計算した。試料中の単量体種、凝集種、及び分解種の含量を決定するために、０．２５Ｍ ＫＣｌを含む０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を移動相とするTSK-Gel300SWXL又はSuperdex 200カラムでサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）を行った。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（還元及び非還元）を行って、産物関連分解産物及び無関係の不純物に関して複合体調製物の純度を分析した。還元（ＴＣＥＰ）後の試料及び脱グリコシル化（Ｎ−グリコシダーゼＦ）試料を用いてエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を行い、各鎖の正確な質量／同一性を確認し、化学修飾を検出した。脱グリコシル化試料のＥＳＩ−ＭＳを実施して、完全に組み立てられたタンパク質の性質及び品質を分析し、潜在的な産物関連副産物を検出した（表２）。
【００９８】
【表２】
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【００９９】
Ｍａｂ３１の抗体重鎖の１つにネプリライシン部分を融合させることで、融合ポリペプチドの発現収率がＭａｂ３１抗体の収率よりも増加したことが理解できる。
【０１００】
【表３】
2016527260.tif 000004
【図５】
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2016527260.tif 000006
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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