(57)【要約】  本開示は一般に、毒素不活性化の分野に関する。より詳細には、本開示はクロストリジウム毒素、これらの毒素を不活化する方法および（例えば、これらの方法で製造される）トキソイドを含む組成物（例えば、ワクチン）に関する。Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ）毒素をホルムアルデヒドで不活化することを含むＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドを製造する方法が提供される。これらの方法で調製されるトキソイドは高温（例えば、３７℃）で安定であり、最小限の残存ホルムアルデヒドで非毒性のままである。
2016516721.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドを製造する方法において、精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａまたは精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂを、約０．１５％〜０．５％ホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）と共に、約１７〜３２℃で約２〜約２１日間インキュベートすることにより不活化する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
トキソイドＡを生成するために、毒素Ａが約０．２％ホルムアルデヒドと共に約２５℃で約２日間インキュベートされることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
トキソイドＢを生成するために、毒素Ｂが約０．４％ホルムアルデヒドと共に約２５℃で約１３日間インキュベートされることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載の方法で調製されるトキソイドＡ、および／または請求項１または３に記載の方法で調製されるトキソイドＢを含むことを特徴とする組成物。
【請求項５】
精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを、残存量のホルムアルデヒドを含む組成物と混ぜ合わせる工程を含むことを特徴とする、精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを含む免疫原性組成物を調製する方法。
【請求項６】
前記精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢが３７℃で約６週間まで安定であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記残存量のホルムアルデヒドが約０．００１％〜０．０２５％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法を使用して調製されることを特徴とする組成物。
【請求項９】
精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを含む免疫原性組成物を調製する方法において、
精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂを約０．１５％〜０．５％ホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）と共に約１７〜３２℃で約２〜２１日間インキュベートすることによって不活化する工程と、
精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを、残存量のホルムアルデヒドを含む組成物と混ぜ合わせる工程と
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１０】
前記精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢが３７℃で約６週まで安定であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記残存量のホルムアルデヒドが約０．００１％、０．００４％、０．００８％、または０．０１６％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記トキソイドＡおよび／またはトキソイドＢが２０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ７．５、８％スクロース、および０．０１６％ホルムアルデヒドの組成物中に維持されることを特徴とする、請求項１〜３、請求項５〜７または請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
トキソイドＡおよび／またはトキソイドＢを含む前記組成物が凍結乾燥されることを特徴とする、請求項１〜３、請求項５〜７、または請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法を使用して調製されることを特徴とする組成物。
【請求項１５】
前記方法が毒素Ａおよび毒素Ｂを含むＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）培養を提供する工程と、培養から毒素Ａおよび毒素Ｂを精製する工程とをさらに含むことを特徴とする、請求項１〜３、請求項５〜７、または請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１、請求項２、請求項５〜７、または請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法に従って製造されることを特徴とする、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡ。
【請求項１７】
請求項１、請求項３、請求項５〜７、または請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法に従って製造されることを特徴とする、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢ。
【請求項１８】
請求項１、請求項２、請求項５〜７、または請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法に従って前記Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡが製造され、また請求項１、請求項３、請求項５〜７、または請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法に従ってトキソイドＢが製造されることを特徴とする、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよびＣディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを含むワクチン組成物。
【請求項１９】
前記ワクチン組成物が約０．００１％〜０．０２０％ホルムアルデヒドを含むことを特徴とする、請求項１８に記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
前記ワクチン組成物が約０．００４％ホルムアルデヒドを含むことを特徴とする、請求項１９に記載のワクチン組成物。
【請求項２１】
前記ワクチン組成物が０．００８％ホルムアルデヒドを含むことを特徴とする、請求項１９に記載のワクチン組成物。
【請求項２２】
前記ワクチン組成物が約０．０１６％ホルムアルデヒドを含むことを特徴とする、請求項１９に記載のワクチン組成物。
【請求項２３】
前記トキソイドＡおよび前記トキソイドＢが５：１〜１：５のＡ：Ｂ比で前記組成物中に存在することを特徴とする、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２４】
前記トキソイドＡおよび前記トキソイドＢが３：１または３：２のＡ：Ｂ比で前記組成物中に存在することを特徴とする、請求項２３に記載のワクチン組成物。
【請求項２５】
前記ワクチン組成物が凍結乾燥、噴霧乾燥、または泡沫乾燥されることを特徴とする、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２６】
前記ワクチン組成物が液体であることを特徴とする、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２７】
１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２８】
クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、炭酸緩衝液、重炭酸緩衝液、またはｐＨ−制御水溶液を含むことを特徴とする、請求項４、請求項８、請求項１４または請求項１８〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
糖、または糖アルコールをさらに含むことを特徴とする、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
スクロースおよびクエン酸塩を含むことを特徴とする、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記毒素Ａを約０．２１％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドと共に約２５℃で約６〜１３日間インキュベートする工程によって、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａをトキソイド（Ｔｏｘｏｉｄ  Ａ）に変換する方法。
【請求項３２】
前記インキュベーションが約６日間であることを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記インキュベーションが０．２１％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒド／１００ｍＭ  ＰＯ４、ｐＨ７中で行われることを特徴とする、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記毒素Ｂを約０．４２％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドと共に約２５℃で約１３〜約２０日間インキュベートする工程によってＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂをトキソイド（Ｔｏｘｏｉｄ  Ｂ）に変換する方法。
【請求項３５】
前記インキュベーションが約１３日間であることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記インキュベーションが０．４２％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒド／１００ｍＭ  ＰＯ４、ｐＨ７中で行われることを特徴とする、請求項３４または３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、全体として本明細書に援用される、２０１３年３月１５日に出願した米国特許出願第６１／７９０，４２３号明細書に基づく優先権を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本開示は一般に、毒素不活化の分野に関する。より詳細には、本開示は、クロストリジウム毒素、これらの毒素を不活化する方法、結果として生じるトキソイドを含む組成物（例えば、ワクチン）に関する。
【背景技術】
【０００３】
細菌毒素は、当業者に周知の薬剤、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドまたはβ−プロピオラクトンなどを使用して不活化することが可能である。不活化毒素（トキソイドとしても知られる）は、状況によって、細胞毒性に戻ったり細胞毒性を取り戻したりすることがある。
【０００４】
１つのクロストリジウム・ディフィシルワクチンは、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）菌株ＡＴＣＣ  ４３２５５の嫌気性培養から精製したトキソイドＡおよびトキソイドＢを含むホルマリン−不活化ワクチンである。毒素は、個別に精製し、不活化（トキソイド化）して、目標とするトキソイドＡ：トキソイドＢ比（例えば、３：２）で混合することが可能である。毒素Ａおよび毒素Ｂのホルマリン介在トキソイド化は、製剤の製品特性および品質特性の多くを、そして最も重要なことには、細胞毒性を防止することによるワクチンの安全性を規定し管理する上で、中心的な役割を果たす。
【０００５】
ホルムアルデヒドを使用してＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ＡおよびＢを不活化する方法は公開されている。例えば、（特許文献１）は、４．２５％  ｍｇ／ｍｌホルムアルデヒドと共に４℃で１８日間インキュベートした、部分的に精製されたＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ＡとＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂの混合物を記述している。結果として得られるトキソイド混合物を使用して、ホルムアルデヒド有りと無しで、調製物を調製した。残存ホルマリンの非存在下で、有毒型への部分的逆戻りは、より高温（２８〜３７°Ｃ）で生じ、トキソイドは検出可能な生物活性を数日から数週間にわたって取り戻した。残存ホルムアルデヒドを使用して逆戻りを防止することも可能であるが、（例えば、幾つかの監督機関によって設定された必要条件を満たすように）ワクチンに存在する量を制限することが望ましい。高温（例えば、３７℃）で安定性を保持し、且つ、特に、様々な薬物監督機関によって設定された必要条件を満たすように、最小限のホルムアルデヒドを含むトキソイドが、当該技術分野で必要である。本明細書に記載の方法は、残存ホルマリンのみを含有する、高温で安定なトキソイドを提供する。このような方法およびその追加的利点は、本開示により提供される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６，６６９，５２０号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、高温で安定な、最小限のホルマリン（例えば、残存ホルムアルデヒド）のみを含有するトキソイドを調製する方法および試薬を提供する。例示的な方法は、とりわけ、０．１５％〜約０．５％のいずれかの間のホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）（例えば、０．２％〜０．８％のいずれかの間、例えばトキソイドＡでは約０．２％（例えば、０．２１％）および／またはトキソイドＢでは約０．４％（例えば、０．４２％）など）と共に、適温（例えば、１７〜３２℃のいずれかの間（例えば、約２５℃））で、適当な時間（例えば、約２〜約３０日）（例えば、それぞれの毒素が対応するトキソイドに不活化されるように）、インキュベートすることにより、精製された毒素Ａおよび精製された毒素Ｂを不活化する工程によって、高温（例えば、３７℃）で安定した、少量（例えば、残存量）のホルムアルデヒドを含有するトキソイド組成物を提供する。次いで、トキソイドを混ぜ合わせて、残存量のホルムアルデヒド（例えば、０．０００１％〜０．０２５％のいずれかの間、例えば０．００４％、０．００８％、または０．０１６％（ｗ／ｖ）など）のみを含有するトキソイド含有免疫学的組成物および／またはワクチンを製造することが可能である。トキソイド免疫学的組成物は、例えば、宿主に投与するために再構成された組成物（例えば、０．００１％、０．００４％または０．００８％のいずれかの間のホルムアルデヒド（ｗ／ｖ））より高濃度のホルムアルデヒド（例えば、約０．０１６％ホルムアルデヒド（ｗ／ｖ））を含み得る凍結乾燥形であってもよい。この開示は、トキソイド、および免疫学的組成物および／またはワクチンを包含するそのようなトキソイドを含む組成物、ならびにその中間物（例えば、トキソイドＡまたはトキソイドＢのみを含む組成物）を製造する方法を提供する。当業者には明白になるであろうが、他の実施形態が本開示で提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】細胞毒性アッセイ結果のグラフ表示である。記載の方法（実施例２）に従って不活化を受けた毒素Ａおよび毒素Ｂの各１バッチからの試料を使用して、ＩＭＲ９０細胞を使用した細胞毒性アッセイを実施した。毒素を不活化するためにホルムアルデヒドを添加した後、０日目、および幾日か後に、試料を採取して、材料の細胞毒性を評価した。ｙ−軸は、毒性物質の存在下で細胞の５０％が（それらの通常の線条形態とは対照的に）丸くなった最小濃度（ＭＣ５０）を示す。アッセイの検出下限値（ＬＯＤ）は、破線を使用して示されている。
【図２】Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび毒素Ｂを不活化する例示的な方法の略図である。
【図３】免疫試験結果のグラフ表示である。ハムスター負荷モデル（９匹のハムスター／群を５群使用）で実施した試験（実施例２に記載）で、トキソイドＡおよびトキソイドＢを、記載の方法に従って調製し、混ぜ合わせて、凍結乾燥組成物として処方した。組成物を再構成し、ワクチン接種前にアジュバント添加した。１群のハムスターにはプラセボを投与した。他の４群のハムスターのそれぞれに１つずつ、ヒト用量（ＨＤ）の組成物（１００μｇ／用量）の異なる４つの希釈物を調製した。投与された組成物（すなわち、プラセボまたはＨＤ希釈物）をＸ−軸に示す。致死的負荷量のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を投与後、グラフに示す通りに、各群の％生存（Ｙ−軸）が決定された。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本開示は、クロストリジウムトキソイドを調製する方法、これらの方法で調製されるクロストリジウムトキソイドおよびこれらのトキソイドを含む組成物を提供する。本明細書で特に興味深いものは、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／またはＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂおよび／またはそれらの誘導体（例えば、遺伝的に無毒化したバージョン、切断型、フラグメントなど）である。本開示の目的上、毒素Ａおよび／または毒素Ｂは、当該技術分野における標準的な技術を使用して毒素Ａおよび／または毒素Ｂと同定され得る任意のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を含み得る。例示的な技術としては、例えば、ＥＬＩＳＡ、ドットブロットまたはインビボアッセイなどのイムノアッセイを挙げることができる。そのような同定を行うのに有用な試薬としては、例えば、抗毒素Ａウサギポリクローナル抗血清（例えば、Ａｂｅａｍ（登録商標）製品番号ａｂ３５０２１またはＡｂｅａｍ（登録商標）製品番号ａｂ９３３１８）または抗毒素Ａマウスモノクローナル抗体（例えば、Ａｂｅａｍ（登録商標）製品番号ａｂ１９９５３（ｍＡｂ  ＰＣＧ４）または製品番号ａｂ８２２８５（ｍＡｂ  Ｂ６１８Ｍ）のいずれか）、抗毒素Ｂウサギポリクローナル抗血清（例えば、Ａｂｅａｍ（登録商標）製品番号ａｂ８３０６６）または抗毒素Ｂマウスモノクローナル抗体（例えば、Ａｂｅａｍ（登録商標）製品番号ａｂ７７５８３（ｍＡｂ  Ｂ４２８Ｍ）、製品番号ａｂ１３０８５５（ｍＡｂ  Ｂ４２３Ｍ）、または製品番号ａｂ１３０８５８（ｍＡｂ  Ｂ４２４Ｍ）のいずれか）（Ａｂｅａｍ（登録商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から全て入手可能）を挙げることができる。
【００１０】
本開示は、クロストリジウムトキソイドを調製する方法、これらの方法で調製されるクロストリジウムトキソイドおよびこれらのトキソイドを含む組成物を提供する。本明細書で特に興味深いものは、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／またはＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂおよび／またはそれらの誘導体（例えば、遺伝的に無毒化したバージョン、切断型、フラグメントなど）である。本開示の目的上、毒素Ａおよび／または毒素Ｂは、当該技術分野における標準的な技術を使用して毒素Ａおよび／または毒素Ｂと同定され得る任意のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を含み得る。例示的な技術としては、例えば、ＥＬＩＳＡ、ドットブロットまたはインビボアッセイなどのイムノアッセイを挙げることができる。そのような同定の実施に有用な試薬としては、例えば、抗毒素Ａウサギポリクローナル抗血清（例えば、Ａｂｅａｍ（登録商標）製品番号ａｂ３５０２１またはＡｂｅａｍ（登録商標）製品番号ａｂ９３３１８）または抗毒素Ａマウスモノクローナル抗体（例えば、Ａｂｅａｍ（登録商標）製品番号ａｂ１９９５３（ｍＡｂ  ＰＣＧ４）または製品番号ａｂ８２２８５（ｍＡｂ  Ｂ６１８Ｍ）のいずれか）、抗毒素Ｂウサギポリクローナル抗血清（例えば、Ａｂｅａｍ（登録商標）製品番号ａｂ８３０６６）または抗毒素Ｂマウスモノクローナル抗体（例えば、Ａｂｅａｍ（登録商標）製品番号ａｂ７７５８３（ｍＡｂ  Ｂ４２８Ｍ）、製品番号ａｂ１３０８５５（ｍＡｂ  Ｂ４２３Ｍ）、または製品番号ａｂ１３０８５８（ｍＡｂ  Ｂ４２４Ｍ）のいずれか）（Ａｂｅａｍ（登録商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から全て入手可能）を挙げることができる。
【００１１】
本明細書では、１）毒素Ａおよび毒素Ｂを含むＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）培地を提供する工程；２）各毒素の別々の組成物を提供するために、培地から毒素Ａおよび毒素Ｂを精製する工程；３）それぞれ、トキソイドＡ組成物およびトキソイドＢ組成物を生成するために、０．１５％〜約０．５％のいずれかの間（ｗ／ｖ）（例えば、０．２％〜０．８％のいずれかの間、トキソイドＡでは約０．２％（例えば、０．２１％）および／またはトキソイドＢでは約０．４％（例えば、約０．４２％）など）のホルムアルデヒドと共に、適温（例えば、１７〜３２℃のいずれかの間（例えば、約２５℃））で、適当な時間（例えば、約２〜約２１日）（例えば、それぞれの毒素が対応するキソイドに不活化されるように）インキュベートすることによって、精製した毒素Ａおよび精製した毒素Ｂを不活化する工程；および、４）残存量のホルムアルデヒド（例えば、約０．０００１％〜０．０２５％のいずれかの間、例えば０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．０１％、０．０１６％、０．０２％または０．０２５％（ｗ／ｖ）のいずれかの間（好ましくは、０．００４％または０．００８％のいずれかの間））のみを含有するトキソイド免疫学的組成物および／またはワクチンを製造するために、トキソイドを混ぜ合わせる工程；の１つまたは複数によって、高温（例えば、３７℃）で安定な、且つ少量のホルムアルデヒドを含有するＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイド組成物を製造する方法が提供される。組成物に含まれるホルムアルデヒドの量は一般に、組成物のパーセンテージ（重量／容量（「ｗ／ｖ」））として言及されるが、タンパク質濃度などの、特定の要因に基づいて化学量論を調整することが重要であろう。例えば、ここで考えられる好適なホルムアルデヒド濃度は、互いにポリペプチドを実質的に架橋せずに（例えば、分子間架橋を生成せずに）、個々の毒素Ａポリペプチドおよび／または毒素Ｂポリペプチド内で分子間架橋を提供する濃度である。実施例に示す通り、０．５ｍｇ／ｍｌの毒素Ａを含む組成物は、０．２１％（ｗ／ｖ）のホルムアルデヒドを必要とするにすぎないかもしれない。しかし、より高濃度の毒素Ａを含む組成物は、相当量の分子間架橋を生じないで必要な分子内架橋を生成するため（例えば、トキソイド化）に、より高濃度またはより低濃度のホルムアルデヒドを必要とするかもしれない。同じ原理が毒素Ｂのトキソイド化にも当てはまる可能性がある。特定の組成物に適した条件は、本明細書に記載の技術を使用して当業者により決定されてもよく、当該技術で入手できる通りであってもよい。例えば、ある特定の量のホルムアルデヒドが、組成物中の特定の毒素をトキソイド化するのに有効かどうかは、実施例部分に記載の細胞毒性アッセイ、陰イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、アミン含量分析、抗原性および免疫原性アッセイのいずれか１つ以上を使用して決定することが可能である。本明細書ではホルムアルデヒドが使用されるが、当業者により決定され得る他の類似した薬剤をその代わりに使用できることも理解すべきである。例えば、特定の実施形態では、ホルムアルデヒドの代わりにグルタルアルデヒドを使用することが可能である。加えて、本明細書では、リン酸緩衝液中でのトキソイド化が使用されるが、当業者により決定され得る他の類似した薬剤をその代わりに使用できることも理解すべきである。例えば、特定の実施形態では、グリシンおよび／またはリジンを含有する緩衝液。そのような代用を行うためには異なる濃度が必要な可能性があるが、そのような代用に適した条件は、本明細書に記載の技術（例えば、実施例部分に記載の細胞毒性アッセイ、陰イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、アミン含量分析、抗原性および免疫原性アッセイのいずれか１つ以上）を使用して決定することが可能である。
【００１２】
特定の実施形態で、毒素Ａは、適当な時間（例えば、１〜６０分のいずれかの間、例えば１０分など）、適量のホルムアルデヒド（例えば、約０．２％）ホルムアルデヒドと混合してトキソイドＡを製造し、次いで適温（例えば、約２５℃）で適当な時間（例えば、約２〜２１日、例えば約６〜１２日のいずれか（例えば、約６日）など）、インキュベートすることが可能である。幾つかの好ましい実施形態では、本明細書の実施例に示す通り、毒素Ａを、約０．２１％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドを含む調合物の中で、約２５℃で約６〜約１２日間インキュベートすることにより、毒素ＡをトキソイドＡに変換することが可能である。特定の実施形態で、毒素Ｂを適当な時間（例えば、１〜６０分のいずれかの間、例えば１０分など）、適量のホルムアルデヒド（例えば、約０．４２％）と混合し、次いで適温（例えば、約２５℃）で適当な時間（例えば、約２〜３０日、例えば約１３〜２１日のいずれか（例えば、約２１日））インキュベートして、トキソイドＢを製造することが可能である。幾つかの好ましい実施形態では、本明細書の実施例に示す通り、約０．４２％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドを含む調合物中、約２５℃で約１３〜約２０日間、毒素Ｂをインキュベートすることにより、毒素ＢをトキソイドＢに変換することが可能である。ホルムアルデヒドを、３７％ホルムアルデヒドの原液から、毒素Ａまたは毒素Ｂを含む溶液に所望の量まで（例えば、無菌的に）導入し、続いて暫く（例えば、５〜１０分）インキュベートして、適温で適当な期間（例えば、２〜８℃で複数日）貯蔵することが可能である。特定の実施形態で、精製毒素Ａおよび精製毒素Ｂを混ぜ合わせ、次いで適当な時間（例えば、１〜６０分のいずれかの間、例えば１０分など）適量のホルムアルデヒド（例えば、約０．４２％）と混合し、次いで適温（例えば、約２５℃）で適当な時間（例えば、約２〜３０日、例えば約１３〜２１日のいずれか（例えば、約２１日）インキュベートして、トキソイドＡおよびトキソイドＢを製造することが可能である。トキソイドは、適当な緩衝液（例えば、２０〜１５０ｍＭのいずれかの間のリン酸塩（例えば、１００ｍＭ）、ｐＨ７．０）に含まれていてもよい。次いで、トキソイドＡ組成物およびトキソイドＢ組成物を適当な緩衝液中で混ぜ合わせて（例えば、２０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ７．５、５％〜８％スクロース（例えば、８％）などの適当な緩衝液中への透析濾過による）、トキソイドＡ／Ｂ免疫学的組成物および／またはワクチン（例えば、本明細書では「組成物」と集合的に呼ばれることがある）を製造することが可能である。このような組成物は、標準技術を使用して凍結乾燥形で調製することも可能である。このように、特定の実施形態で、トキソイド免疫学的組成物は、例えば、それ（例えば、製剤）から再構成された組成物より高濃度のホルムアルデヒドを含み得る、凍結乾燥形であってもよい。例えば、凍結乾燥組成物は、約０．０１６％ホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）を含み得るが、宿主に投与するために再構成した後は、組成物（例えば、製剤）は、０．０１６％未満のホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）（例えば、０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．０１（ｗ／ｖ）のいずれかの間）を含み得る。次いで、特定の実施形態で、トキソイドＡ／Ｂ免疫学的組成物および／またはワクチン（例えば、「製剤」）は、０．０００１％〜０．０２５％のいずれかの間のホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）（例えば、０．００１％、０．００２％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％０．００８％、０．０１％、０．０１６％、０．０２％または０．０２５％（ｗ／ｖ）のいずれかの間）（例えば、「残存ホルムアルデヒド」）を含み得る。製剤中に残存ホルムアルデヒドが含まれることは、組成物がより高温（例えば、４℃以上、例えば室温または３７℃など）で暫く（例えば、約６週）で維持される場合に、トキソイドＡおよび／またはトキソイドＢが、それぞれ、毒素Ａまたは毒素Ｂに逆戻りするのを減少および／または防止することが可能な点で特に有益であることが判明している。場合によっては、ホルムアルデヒドの量を増加して、毒素不活性化時間を減少し得ることは理解される。最終組成物（例えば、免疫学的組成物、ワクチン）は、残存量のホルムアルデヒドを含むに過ぎないであろう。実施例に示す通り、これらのプロセスは意外なことに、好ましい生化学的特性および機能特性を有する、免疫学的トキソイドＡ／Ｂ−含有組成物を提供する。
【００１３】
特定の実施形態で、本明細書に記載の方法におけるどの時点でも、中のホルムアルデヒドの官能性を妨害し得る特定の緩衝液成分の量を調整することは、有益であろう。例えば、ＴＲＩＳは、ホルムアルデヒド介在修飾に関してタンパク質と事実上競合できるアミン基を有し、その結果、反応混合物中のホルムアルデヒド実効濃度を低減させる。したがって、毒素および／またはトキソイドが製造される組成物中のＴＲＩＳの量を低レベルに維持することは有益かもしれない。例えば、毒素調製物中の残存ＴＲＩＳ値は、より好適なレベル（例えば、約１〜約５μｇ／ｍｌ未満（例えば、１μｇ／ｍｌ（例えば、検出限界未満）または５μｇ／ｍｌ）に低減させることが可能である。実施例に示す通り、毒素調製物中の残存ＴＲＩＳ値は、例えば、（例えば、フラットストックＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＰＥＳ５０Ｋを用いた）タンジェント流濾過を使用して（例えば、中空糸膜または他のタイプの膜に対立するものとして）、精製毒素Ａおよび／または精製毒素Ｂを２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ中に透析濾過し（ＭｇＣＩ２を除去するため）、次いでリン酸緩衝液（例えば、１００ｍＭ  ＰＯ４、ｐＨ７）中に透析濾過することによって、驚くほど、より好適なレベル（例えば、１μｇ／ｍｌ未満）に低減させることが可能である。結果として得られる低濃度のＴＲＩＳは、特定の実施形態で、人がトキソイド化プロセスを成し遂げるために必要なホルムアルデヒドの量をより効果的に調節することを可能にすることができる。他の実施形態は、例えば、アミン基を含まない緩衝液（例えば、ＭＥＭ、酢酸塩、クエン酸塩）および／またはｐＨ−制御水溶液（例えば、酸または塩基を添加し得る生理食塩水または水）を使用することを含んでもよい。
【００１４】
このように、幾つかの好ましい実施形態では、トキソイド化反応において、Ｔｒｉｓはリン酸緩衝液などの別の緩衝液に代替され得る。例えば、実施例に記載の通り、清澄Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）培養濾液を、Ｔｒｉｓ緩衝液（例えば、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＮａＣＩ／０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ／１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．５）に処理される（例えば、タンジェント流濾過などによって濃縮され透析濾過される）ことが可能である。次いで、結果として生じる溶液を（例えば、メンブランフィルターを使用して）濾過し、硫酸アンモニウム濃度をほぼ適量に（例えば、約０．４Ｍに）調節し、次いで（例えば、メンブランフィルターを使用して）さらなる濾過を実施することが可能である。Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび毒素Ｂを含有する、この水溶液を、次には、疎水性相互作用クロマトグラフィにかけ、毒素を、Ｔｒｉｓ緩衝液で洗浄することが可能なサイズ排除（例えば、セファロース）カラムに結合させることが可能である。次いで、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を、ＤＴＴおよびＩＰＡを含有するＴｒｉｓ緩衝液で溶離してプールし、ＷＦＩを使用して伝導度を約９ｍＳ以下に調節することが可能である。（プールして溶離した）これらのＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を、次には、Ｔｒｉｓ緩衝液を用いた平衡化を含む陰イオン交換クロマトグラフィなどの、別の方法で、さらに精製することが可能である。次いで、毒素Ａを低塩Ｔｒｉｓ緩衝液で溶離し、毒素Ｂを高塩Ｔｒｉｓ緩衝液で溶離することが可能である。精製毒素Ａまたは精製毒素Ｂを含有する溶液を、次には、それぞれ濃縮して、１００ｍＭ  ＰＯ４、ｐＨ７などのリン酸緩衝液中に透析濾過することが可能である（この場合、残存ＴＲＩＳ値は、好ましくは約１未満〜約５μｇ／ｍｌである）。より低濃度のリン酸塩（例えば、２０ｍＭ）は適当でない可能性があり、多量体化の増加につながり得る（これは、可能な場合には最小限に抑えるべきである）ことが判明している。したがって、好ましい好適なリン酸緩衝液は、例えば２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５または２００ｍＭのいずれかの間の、約２０ｍＭ以上から約２００ｍＭまでの任意の濃度のリン酸塩を含んでもよい。本明細書の実施例に示す通り、次には、毒素Ａを、１００ｍＭ  ＰＯ４、ｐＨ７中に約０．２１％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドを含む調合物と約２５℃で約６日間、混合することによって、毒素ＡをトキソイドＡに変換することが可能である。また、幾つかの好ましい実施形態では、本明細書の実施例に示す通り、毒素Ｂを、１００ｍＭ  ＰＯ４、ｐＨ７中に約０．４１％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドの調合物と約２５℃で約１３日間混合することによって、毒素ＢをトキソイドＢに変換することが可能である。当業者には理解されるであろうが、他の好適な緩衝液も考えられる。
【００１５】
トキソイドＡ組成物および／またはトキソイドＢ組成物を分析して、その組成物の特性が許容できるかどうかを決定することにより、当業者は、特定の条件（例えば、緩衝液（またはその成分）、時間、温度）が、トキソイドＡ組成物および／またはトキソイドＢ組成物の調製および／または維持に使用するのに好適かどうかを決定することが可能である。例えば、組成物は、細胞毒性アッセイ（例えば、ＩＭＲ−９０細胞系（例えば、実施例参照）またはベロ（Ｖｅｒｏ）細胞を使用して）、陰イオン交換高速液体クロマトグラフィ（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）、サイズ排除高速液体クロマトグラフィ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、２８０ｎｍにおける吸光度を使用して測定された濃度、復帰分析（例えば、実施例参照）、および／またはインビボ力価アッセイ（例えば、実施例に記載のハムスター力価アッセイ）を使用してテストすることが可能である。好ましい条件で調製された組成物は一般に次のいずれか１つまたは複数を示す：細胞毒性アッセイで測定される細胞で皆無またはそれに近い細胞毒性；トキソイドの多量体化を殆どまたは全く示さない（または別の条件と比べてある条件下では少なくともより少ない、より少ないことが好ましい）ＡＥＸ−ＨＰＬＣおよび／またはＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラム；（例えば、一般に１から遠いＥＬＩＳＡ／Ａ２８０値を示す可能性がある好ましくない条件で調製された組成物と比較して）１に近いＥＬＩＳＡ／Ａ２８０値；テスト期間中に、トキソイドから毒素への皆無またはそれに近い復帰；および／またはインビボアッセイ中の免疫原性（例えば、ハムスター力価アッセイにおける４．８以上のＬｏｇ１０力価）。当業者により決定され得る通り、他の方法を使用してこれらの決定を行うことも可能である。
【００１６】
本明細書に記載の方法は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の事実上のあらゆる菌株に由来する毒素に適用できる。Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の好ましい菌株は、毒素Ａおよび／または毒素Ｂを産生する菌株であり、例えば、トキシノタイプ０（例えば、ＶＰＩ１０４６３／ＡＴＣＣ４３２５５，６３０）、ＩＩＩ（例えば、０２７／ＮＡＰ／Ｂ１）、Ｖ（例えば、０７８）およびＶＩＩＩ（例えば、０１７）の菌株を挙げることができるが、その限りではない。方法は、組み換え方法を使用して産生されるＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素にも適用できる。毒素（例えば、毒素Ａおよび／または毒素Ｂ）は、当該技術分野で公知（例えば、米国特許第６，６６９，５２０号明細書）の方法を使用して、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の培養濾液から精製することが可能である。Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの培養濾液から毒素を精製する例示的な方法は、本明細書の実施例に記述されている。好ましくは、毒素は、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％のいずれかの間、またはそれを超える純度を有する。毒素は、一緒に不活化してもよく、または別々に不活化してもよい。例えば、精製毒素を所望の毒素Ａ：毒素Ｂ比（例えば、３：１、３：２、５：１、１：５）で混合し、次いで不活化してもよく、個々に不活化してもよい。好ましくは、毒素は個々に不活化して、トキソイドを製造する。用語「トキソイド」は本明細書では、化学処理によって部分的にまたは完全に不活化された毒素を記述するために使用される。毒素は、例えば、インビトロ細胞毒性アッセイで、またはインビボアッセイで、測定するとき、未処理の毒素より少ない毒性（例えば、１００％、９９％、９５％、９０％、８０％、７５％、６０％、５５％、５０％、２５％または１０％以下の毒性）を有する場合、不活化されていると言われる。本明細書で開示される通り、毒素はホルムアルデヒド処理を使用して不活化される。他の可能な化学的手段としては、例えば、グルタルアルデヒド、過酸化物、β−プロピオラクトンまたは酸素処理などが挙げられる。
【００１７】
トキソイドが毒素に逆戻りするのを防止する量のホルムアルデヒドと共に毒素をインキュベートすることによって、不活化を実行することが可能である。逆戻りは、精製毒素Ａまたは精製毒素Ｂを含む緩衝液中に適量のホルムアルデヒドを含有することによって防止することが可能である。緩衝液中のホルムアルデヒドの量は、逆戻りを防止するのに適当なホルムアルデヒド濃度を維持するように調節することが可能である。この目的を達成するために、残存濃度のホルムアルデヒドが緩衝液（および／または医薬組成物）中に含まれてもよい。残存濃度のホルムアルデヒドは、逆戻りを防ぎ且つ／または本明細書に記載の組成物が投与される者に対して副作用を示す危険性が低いものである。例えば、残存ホルムアルデヒド濃度は、０．０００１％〜０．０２５％ホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）のいずれかの間の範囲（例えば、０．００４％、０．００８％、０．０１６％、または０．０１％のいずれかの間）、約０．００１％〜約０．０２０％（ｗ／ｖ）、約０．００４％〜約０．０２０％（ｗ／ｖ）（例えば、約０．０１６％±０．０４％）、または特に約０．００４％〜０．０１０％（ｗ／ｖ）（例えば、約０．００８％）の範囲であってもよい。逆戻りの防止は一般に、３７℃での貯蔵後、本明細書に記載のインビトロアッセイなどのインビトロアッセイで、検出可能な細胞毒性が認められない場合に分かる（例えば、実施例における細胞毒性アッセイ参照）。逆戻りの「実質的な」防止は一般に、３７℃での貯蔵後、実施例に記載のインビトロアッセイで、トキソイドの１０％以下が毒素に戻ることを意味する。好適なインビトロ細胞毒性アッセイは、例えばベロ（Ｖｅｒｏ）細胞を使用した、細胞ベースの蛍光アッセイであってもよい。別の好適なインビトロ細胞毒性アッセイは、ＩＭＲ９０細胞（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）寄託番号ＣＣＬ−１８６）を使用して実施することが可能である。試験物質（例えば、トキソイド）の毒性は、細胞の５０％が、その正常な線状形態と比較して丸くなる最小濃度（例えば、ＭＣ−５０）として決定し得る。本明細書の実施例に記載の通り、本明細書に記載の方法で作られたトキソイドおよび０．００８％以下のホルムアルデヒドを含むワクチン組成物は、３７℃で貯蔵後、インビトロアッセイで検出可能な細胞毒性を示さなかった。物理化学的分析（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィ）を使用して逆戻りを確認することも可能であるが、インビトロ細胞毒性アッセイの方が有益であろう。トキソイドの力価は、Ｉｏｇ１０抗毒素Ａまたは抗毒素ＢＩｇＧ力価の平均値を測定する、ハムスターインビボ力価アッセイでも測定し得る。
【００１８】
特定の実施形態では、３７％ホルムアルデヒドの溶液から適量のホルムアルデヒドを毒素に加えることが可能である。毒素は、好ましくは、ホルムアルデヒドを加える前に、好適な緩衝液（例えば、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）中にある。その中の毒素濃度は、例えば、約０．１〜約５ｍｇ／ｍＬ（例えば、０．５ｍｇ／ｍＬ）であってもよい。不活化プロセスを開始するために、毒素をまず最初に、適当な濃度のホルムアルデヒド（例えば、約０．１％〜約０．６％）と、適当な時間（例えば、１０分）混合してもよい。例えば、精製毒素Ａ（１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中、０．５ｍｇ／ｍｌ精製毒素Ａ）を、約０．２％のホルムアルデヒド中で約１０分間混合してもよい。また精製毒素Ｂ（例えば、１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中、０．５ｍｇ／ｍｌ精製毒素Ｂ）を約０．４％のホルムアルデヒド中で約１０分間混合してもよい。次いで、このような混合物を、（例えば、０．２μｍメンブランフィルターを使用して）濾過して、２８０ｎｍにおける吸光度によるタンパク質濃度に影響を及ぼす可能性がある小さいタンパク質集合体を除去することが可能である（例えば、所期のトキソイドＡ：トキソイドＢ比で医薬組成物の精密な調合を可能にする）。次いで、混合物を約１〜約２１日（例えば、約２日、約６日、または約１３日）間インキュベートすることにより、不活化を続けることが可能である。例えば、毒素Ａ混合物を、適温（例えば、約２５℃）で、１３日間以下（例えば、約２日、約６日、または約１３日）、インキュベートすることが可能である。毒素Ｂ混合物を、適温（例えば、約２５℃）で、２１日間以下（例えば、約２日、約６日、または約１３日）、インキュベートすることが可能である。この方法で、トキソイドＡおよび／またはトキソイドＢの調合物を提供することが可能である。そのような調合物は一般に、少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％のいずれかの間のトキソイド（例えば、不活化毒素）を含む。
【００１９】
これらのトキソイド調合物は、緩衝液と直接混合することが可能であるが、好ましくは調合物を濃縮して適当な緩衝液中に透析濾過する。好ましくは、ホルムアルデヒドの除去および緩衝液への交換を確実にしながらタンパク質奪取を最小限に抑えるために、濃縮および透析濾過は、タンジェント流濾過を使用して行われる。緩衝液は、好ましくは、トキソイドの安定性を高め且つ／またはトキソイドの凝集を遅延または減少させる少なくとも１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む。使用に適した賦形剤としては、例えば糖類（例えば、スクロース、トレハロース）または糖アルコール類（例えば、ソルビトール）、および塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム）またはそれらの組合せなどが挙げられるが、その限りではない。加えて、好適な賦形剤は、例えば、米国特許出願公開第２０１１／０４５０２５号（米国特許出願第１２／６６７，８６４号）明細書に記載のもののいずれであってもよい。不活化に次いで、不活化された毒素（すなわち、トキソイド）の溶液を濃縮および／または限外濾過および／または透析濾過して、トキソイドの、細胞毒性形への（例えば、毒素への）逆戻りを防止、または実質的に防止する、ｐＨ８．０以下（例えば、６．５〜７．７、たとえば６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９または８．０のいずれかの間）の適当な緩衝液（例えば、約５〜約１００ｍＭ（例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ｍＭのいずれかの間のクエン酸塩、リン酸塩、グリシン、炭酸塩、重炭酸塩などの、しかしその限りではない、緩衝液）（例えば、２０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ７．５）中に保存する。例示的な緩衝液は、例えば、適量のホルムアルデヒド（例えば、０．０１６％（ｗ／ｖ））を含有する２０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ７．５、５％〜８％スクロースであってもよい。当業者に理解されるであろうが、他の緩衝液なども適する可能性がある。
【００２０】
トキソイドは、医薬組成物（例えば、免疫原性および／またはワクチン組成物）として使用するために処方され得る。例えば、薬学的に許容される希釈剤（例えば、生理食塩水）に懸濁したトキソイド懸濁液によって、または薬学的に許容される担体とのトキソイドの共同によって、投与するための、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドを含む組成物を調製することが可能である。このような医薬製剤は、当該技術分野で公知の１つまたは複数の賦形剤（例えば、希釈剤、増粘剤、緩衝剤、保存料、アジュバント、デタージェントおよび／または免疫賦活薬）を含んでもよい。好適な賦形剤は、トキソイドと、そしてアジュバント（アジュバント添加組成物中）と混合可能であり、その例は当業者に公知であり、入手可能である。組成物は液体であってもよく、凍結乾燥（標準方法通り）または泡沫乾燥（例えば、米国特許公開第２００９／１１０６９９号明細書に記載）されていてもよい。例示的な凍結乾燥ワクチン組成物は、例えば、トキソイドＡおよびトキソイドＢ、２０ｍＭクエン酸塩、８％スクロース、０．０１６％ホルムアルデヒド、ｐＨ７．５を含んでもよい。
【００２１】
投与用ワクチンを調製するために、例えば、注射用水、または好適な希釈剤または緩衝液などの水溶液で、乾燥組成物を再構成することが可能である。幾つかの例で、希釈剤は、本明細書に記載のホルムアルデヒドを含む。希釈剤は、ホルムアルデヒドを含む、または含まずに、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）を含んでもよい。例示的な希釈剤は、ＮａＣｌおよび水酸化アルミニウムの水溶液であってもよい。このような希釈剤を使用して、乾燥組成物を再構成することが可能である。医薬組成物は、約１０〜１５０μｇ／ｍＬ（例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０μｇ／ｍＬのいずれか）の、１回量のトキソイドを含んでもよい。一般に、注射１回量の体積は約０．５ｍｌ．または１．０ｍｌである。対象者で誘発される免疫応答を調整するために、投薬量を増減することができる。トキソイドは、アジュバントの存在下または非存在下で、当業者が決定することができる量で投与することができる。有益なアジュバントとしては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびアルミニウムヒドロキシリン酸などの、アルミニウム化合物などが挙げられる。
【００２２】
免疫学的組成物および／またはワクチン組成物は、経皮（例えば、筋肉内、静脈内、腹腔内または皮下）経路、経皮経路、粘膜経路によって、当業者により適当であると決定される量および投薬計画で、症候性Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症を発症する危険性がある、または危険にさらされている対象者に投与することができる。これらの対象個体群としては、例えば、広域スペクトル抗生物質を受けた対象者、例えば高齢の入院患者、介護施設入所者、慢性疾患患者、癌患者、ＡＩＤＳ患者、集中治療室の患者、および透析治療を受けている患者などが挙げられる。ワクチンは、１、２、３、４回またはそれ以上、投与することができる。多回投与されるとき、投与は、例えば、１週間、１ヵ月または数か月、互いに離れていてもよい。したがって、この開示は、医薬組成物を対象者に投与することによって、毒素、トキソイド、および／またはＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対する免疫応答を誘発する方法も提供する。これは、対象者の免疫系にトキソイドを曝露するために、本明細書に記載の医薬組成物（例えば、免疫原性組成物および／またはワクチン）を対象者に投与することにより達成することが可能である。このように、免疫原性組成物および／またはワクチンを使用して、症候性Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症を予防および／または治療することが可能である。
【００２３】
組成物は、キット（例えば、ワクチンキット）に含まれてもよい。例えば、キットは、本明細書に記載の組成物が乾燥状態で入っている第１の容器および組成物を再構成するための水溶液が入っている第２の容器を含んでもよい。キットは、再構成された液体の組成物を投与するための機器（例えば、皮下注射器、マイクロニードルアレイ）および／または使用説明書を任意選択的に含んでもよい。本明細書に記載の組成物は良好な安定性を有することができ、中温（例えば、約２〜８℃）およびより高い温度（例えば、約１５℃、２５℃、３７℃またはそれ以上）での貯蔵期間後、無細胞毒性のままであり得ることが分かっているため、このようなキットは可能である。以下にさらに記述する通り、幾つかの実施例で、組成物は、３７℃での貯蔵後、無細胞毒性のままであった（例えば、逆戻りの証拠がない）。
【００２４】
したがって、この開示は、例えば、約０．１５％〜０．５％ホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）と共に約１７〜３２℃で約２〜約２１日間インキュベートすることにより精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／または精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂを不活化することによって、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドを製造する方法を提供する。特定の実施形態では、毒素Ａを、約０．２％ホルムアルデヒドと共に約２５℃で約２日間インキュベートして、トキソイドＡを製造することが可能である。特定の実施形態では、毒素Ｂを約０．４％ホルムアルデヒドと共に約２５℃で約１３日間インキュベートして、トキソイドＢを製造することが可能である。このような方法で調製されるトキソイドＡおよび／またはトキソイドＢを含む組成物も提供される。精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを、残存量のホルムアルデヒド（例えば、０．００１％〜０．０２５％のいずれかの間、たとえば０．００４％、０．００８％、または０．０１６％（ｗ／ｖ）のいずれかの間）を含む組成物と混ぜ合わせることにより、精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを含む免疫原性組成物を調製する方法も提供する。特定の実施形態で、本方法は、３７℃で約６週間まで安定な、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび／または精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢの組成物を提供することが可能である。このように、特定の実施形態で、本明細書に記載の方法は、約０．１５％〜０．５％ホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）と共に約１７〜３２℃で約２〜約２１日間インキュベートすることにより精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａまたは精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）Ｂ毒素を不活化すること、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを残存量のホルムアルデヒドを含む組成物と合わせることも含んでもよい。このような方法で調製されるＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよびＢ組成物は、３７℃で約６週間まで安定であり得る。このような組成物中の残存量のホルムアルデヒドは、０．００１％〜０．０２５％、０．００４％、０．００８％、または０．０１６％（ｗ／ｖ）のいずれかの間であり得る。本組成物は、約２０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ７．５、４％〜８％スクロース、および０．０１６％ホルムアルデヒドも含んでもよい。特定の実施形態で、組成物は凍結乾燥されていてもよい。これらの方法は、毒素Ａおよび毒素Ｂを含むＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）培養を提供することおよびその培養から毒素Ａおよび毒素Ｂを精製することも含んでもよい。これらの方法に従って製造されるＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡまたはトキソイドＢも提供される。特定の実施形態で、このような組成物はワクチン（例えば、症候性Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症に対して防護反応、予防反応および／または治療反応を提供する組成物）である。組成物（例えば、ワクチン組成物）は、トキソイドＡおよびトキソイドＢを、５：１〜１：５、例えば、３：１または３：２などのＡ：Ｂ比で含んでもよい。特定の実施形態で、組成物は、凍結乾燥、フリーズドライ、噴霧乾燥、または泡沫乾燥されていてもよく、あるいは液体であってもよい。このような組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含んでもよい。組成物は、例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、炭酸緩衝液、または重炭酸緩衝液などの緩衝液、またはｐＨ−制御水溶液、および／または１つまたは複数の糖類（例えば、スクロース、トレハロース）および／または糖アルコール（ソルビトール）を含んでもよい。他の実施形態は、当業者に明白になるであろう。
【００２５】
「精製」毒素は一般に、毒素が例えば培養濾液から単離されて、当該技術分野で公知の方法を使用して、少なくともある程度精製されていることを意味する。毒素を精製する例示的な方法は、例えば本明細書に記述されている。特定の実施形態で、精製毒素は、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上のいずれかの間の純度を有し得る。同様に、「精製」トキソイドは、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上のいずれかの間の純度を有するトキソイドであり得る。
【００２６】
用語「約」、「およそ」などは、数値の列挙または範囲の前に来る場合、まるでその用語がその列挙または範囲の中の各個々の値の直前に来るかのように、その列挙または範囲の中の各個々の値に個別的に関係する。これらの用語は、それらが関係する値が正確にその値である、その値に近い、またはその値と類似していることを意味している。例えば、「約」または「およそ」は、示された値の１０％の範囲内の値を示し得る（例えば、「約３０％」は、２７％から３３％までの任意のところを含み得る）。
【００２７】
本明細書で使用される場合、被験体または宿主とは、個体であることが意図される。被験体には、飼い慣らされた動物（例えば、ネコおよびイヌ）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、およびヤギ）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット）およびトリが含まれ得る。一態様において、被験体は、哺乳動物（例えば、霊長類またはヒト）である。
【００２８】
用語「インキュベート」、「混合」、「貯蔵」（またはその同義語および／または派生語）は、互換的に使用することが可能である。例えば、毒素を、ホルムアルデヒドを含む溶液と共にインキュベートすることが可能である。このようなインキュベーションは、場合によって、例えば、組成物が運動によって積極的に混合される（例えば、ミキシングバーなどを使用して）かまたは本質的に定常状態で維持されていることを意味することがある。
【００２９】
任意選択のまたは任意選択でとは、その後に記述される事象または状況が、起こってもよいし起こらなくてもよいこと、および、その記述には、その事象または状況が起こる場合とそれが起こらない場合とが含まれることを意味している。例えば、任意選択で組成物はある組合せを含み得るという語句は、その組成物が、異なる分子の組合せを含んでもよいし、組合せを含まなくてもよいことを意味しており、その結果、この記述には、組合せと組合せの不在（すなわち、組合せの個々の構成要素）との両方が含まれることとなる。
【００３０】
範囲は、本明細書において、約ある特定の値から、および／または約別の特定の値までとして表され得る。そのような範囲が表される場合、別の態様は、そのある特定の値からおよび／またはその他方の特定の値までを含む。同様に、既述約またはおよそというの使用により値が概数として表される場合、その特定の値は別の態様を構成することが理解されよう。さらに、各範囲の端点は、他方の端点との関連でも他方の端点から切り離しても意味があることが理解されよう。範囲（例えば、９０〜１００％）は、その範囲自体に加えてその範囲内の各個別の値もまるで各値が個々に列挙されているかのように含むことが意図される。
【００３１】
予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）、予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）、および予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）という用語が所与の状態のための所与の処置に関連して本明細書において使用される場合（例えば、感染症を予防する）、処置された被験体が臨床的に観察可能なレベルの状態を全く発現させないか、彼／彼女が処置の無い場合に罹るであろうよりも緩慢にかつ／または劣る程度にそうした状態を発現させるかのいずれかであることを意味することが意図される。これらの用語は、被験体がそうした状態の態様を全く経験しない状況のみに限定されるものではない。例えば、処置は、それが、状態の所与の発現を生じさせることが予想されたであろう刺激への被験体の曝露の間与えられ、そうでない場合に予想されるよりも少ないかつ／または軽いその状態の症状を被験体が経験することを結果としてもたらすならば、その状態を予防したと言われるであろう。処置は、被験体が感染症の軽度の顕在症状しか示さないことを結果としてもたらすことにより症候性感染症を「予防」し得るのであり、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）微生物が全く存在してはならないということを含意するものではない。
【００３２】
同様に、所与の処置に関して症候性感染症の危険性に関連して本明細書において使用される低減する（ｒｅｄｕｃｅ）、低減する（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）、および低減（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）（例えば、症候性Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の危険性を低減する）とは、典型的に、被験体が、処置（例えば、開示される毒素またはトキソイドを用いた投与またはワクチン接種）の不在下における症候性感染症発現のコントロールまたは基礎レベルと比較してより緩慢にまたはより劣る程度に症候性感染症を発現させることをいう。症候性感染症の危険性の低減は、被験体が感染症の軽度の顕在症状または感染症の遅延した症状しか示さないことを結果としてもたらし得るのであり、これは、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）微生物が全く存在してはならないということを含意するものではない。
【００３３】
本開示内において引用される全ての参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書により援用される。特定の実施形態が、以下の実施例においてさらに説明される。これらの実施形態は、例として提供されるにすぎず、決して特許請求の範囲の範囲を限定することが意図されるものではない。
【実施例】
【００３４】
以下の実施例は、説明目的のためだけに提供されるものであり、本開示の範囲を限定することが意図されるものではない。形態の変更および等価物の代用は、状況が示唆し得るまたは好都合とし得る場合に企図されている。本明細書においては特定の用語が採用されてきたが、そのような用語は、説明的な意味で解釈されるものであり、限定目的のものではない。本開示およびこれらの実施例において使用されるが明示的に説明されていない分子遺伝学、タンパク質生化学、および免疫学の方法は、科学文献に詳細に報告されており、当業者の能力の範囲に十分に入る。
【００３５】
実施例１
Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワーキングシード（菌株ＶＰＩ  １０４６３／ＡＴＣＣ４３２５５）を使用して、大豆ペプトン、酵母抽出物、リン酸緩衝液および炭酸水素ナトリウムを含む、ｐＨ６．３５〜７．４５の予備状態調節培地（ＳＹＳ培地）に接種し、４ｍＬワーキングセルバンク（Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（ＷＣＢ））バイアルから１６０Ｌ培養にスケールアップした。所望の密度および１０〜１２時間インキュベーション期間に達したとき、清澄化および０．２μｍ濾過．のために全１６０Ｌの培養を処理した。もう１つの生産発酵槽から培養を採取し、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞および細胞片不純物を除去するために、（例えば、マイスナー（Ｍｅｉｓｎｅｒ）メンブランフィルターを使用して）膜濾過を行った。結果として生じる清澄化した培養濾液を濃縮し、タンジェント流濾過により５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＮａＣＩ／０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ／１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．５中に透析濾過した。結果として生じる溶液を、メンブランフィルターを使用して濾過し、硫酸アンモニウムの濃度を高め（例えば、約０．４Ｍに）、次いで（例えば、メンブランフィルターを使用して）さらなる濾過を実施した。この水溶液は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび毒素Ｂを含んでいた。この水溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィにかけた。Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素は、セファロースカラムに結合された。カラムをＴｒｉｓ緩衝液で洗浄し、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の２画分を、ＤＴＴおよびＩＰＡを含有するＴｒｉｓ緩衝液で溶離した。ＨＩＣから溶離した２つの毒素画分をプールし、ＷＦＩを使用して、伝導度を９ｍＳ以下に調整した。（プールされた溶離液中の）Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を、陰イオン交換クロマトグラフィでさらに精製した。溶離した水溶液を、陰イオン交換カラムを通過させて、毒素をカラムに結合させた。カラムをＴｒｉｓ緩衝液で平衡化し、毒素Ａを低塩Ｔｒｉｓ緩衝液で溶離し、毒素Ｂを高塩Ｔｒｉｓ緩衝液で溶離した。精製毒素Ａおよび精製毒素Ｂをそれぞれ濃縮し、１００ｍＭ  ＰＯ４、ｐＨ７中に透析濾過した。タンパク質濃度は約０．５ｍｇ／ｍＬであり、各毒素の純度は９０％以上であった。
【００３６】
３７％ホルムアルデヒド溶液を、毒素Ａ透析濾液および毒素Ｂ透析濾液のそれぞれに無菌的に加えて、最終濃度０．４２％を得た。溶液を混合し、その後２〜８℃で１８〜２２日間貯蔵した。不活化後、毒素透析濾液を、製剤緩衝液（２０ｍＭクエン酸塩／５％スクロース、ｐＨ７．５）中に透析した。３７％ホルムアルデヒド溶液を添加することにより、必要に応じてホルムアルデヒド濃度を調整した。トキソイドＡおよびトキソイドＢを、重量で３：２（Ａ：Ｂ）の比率で混ぜ合わせ、凍結乾燥した。凍結乾燥生成物は、トキソイドＡ（０．２４ｍｇ／ｍＬ）、トキソイドＢ（０．１６ｍｇ／ｍＬ）、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５％（ｗ／ｖ）スクロースおよび指示濃度のホルムアルデヒドを含んでいた。
【００３７】
３７℃で６週間にわたって潜在的逆戻りを観察するために、復帰分析を実施した。トキソイドＡおよびトキソイドＢを含む組成物は、異なる量の残存ホルムアルデヒド（０％、０．００８％、および０．０１６％（ｗ／ｖ））を用いて処方し、３７℃または４℃のいずれかで貯蔵して、毎週１回６週間、細胞毒性アッセイによりテストした。これらの試験のデータを表１に示す。４℃で、生成物は、残存ホルムアルデヒド無添加であっても復帰分析を通過する。しかし３７℃では、復帰テストを通過するためには０．０１６％残存ホルムアルデヒドが必要である。
【００３８】
【表１】
2016516721.tif 000003
【００３９】
実施例２
３７℃で安定なトキソイドを提供するであろうトキソイド化方法を特定するために、本明細書に記載の実験を実施した。Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワーキングシード（菌株ＶＰＩ１０４６３／ＡＴＣＣ４３２５５）を使用して、無菌の使い捨てバッグ内の予備状態調節培地（大豆ペプトン、酵母抽出物、リン酸緩衝液およびＤ−ソルビトールを含む、ｐＨ７．１〜７．３）に接種し、目標とするＯＤが達成されるまで３５〜３９℃で培養をインキュベートした。３０Ｌシード１培養を使用して、２５０Ｌ無菌使い捨て培養バッグ内の培地に接種し、目標とするＯＤが達成されるまで３５〜３９℃で、培養をインキュベートした。シード２培養を使用して、１０００Ｌ無菌使い捨て培養バッグに接種し、目標のＯＤが達成されるまで３５〜３９℃で培養をインキュベートした。もう１つの生産発酵槽から培養を採取し、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞および細胞片不純物を除去するために、（例えば、Ｐａｌｌ  Ｄｅｐｔｈ  ７００ｐ／８０ｐ／０．２μｍ  ０．０２平方メートル／Ｌを使用した）深層濾過にかけ、プロテアーゼ活性を制限するために同時に冷却した（例えば、約３７℃〜１９℃）。結果として生じる清澄化された培養濾液を濃縮し、フラットストック・ミリポオア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用したタンジェント流濾過により、約４℃の温度で（プロテアーゼ活性低下のため）、２５ｍＭ、Ｔｒｉｓ／５０ｍＭ、ＮａＣＩ／０．２ｍＭ、ＥＤＴＡ、ｐＨ、７．５〜８．０中に、透析濾過し、ＤＴＴを添加しなかった。結果として生じる溶液を、メンブランフィルターを使用して濾過し、硫酸アンモニウムの濃度を、（例えば、約０．９Ｍに）、高め、次いで、（例えば、メンブランフィルターを使用して）さらなる濾過を実施した。この水溶液は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび毒素Ｂを含んでいた。この水溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィにかけた。Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素は、ブチルセファロース樹脂（例えば、ＧＥ  Ｂｕｔｙｌ  Ｓ  ＦＦセファロースなど）に結合された。カラムを０．９ｍＭ硫酸アンモニウム２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で洗浄し、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で溶離し、ＷＦＩを使用して伝導度を７ｍＳ以下に調整した。（溶離液中の）Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を、陰イオン交換クロマトグラフィでさらに精製した。溶離した水溶液を、陰イオン交換カラム（例えば、Ｔｏｓｏｈ  Ｑ  ６５０Ｍ）を通過させて、毒素をカラムに結合させた。カラムを２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５で平衡化し、毒素Ａを、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０中２７ｍＭ  ＭｇＣＩ２で溶離し、毒素Ｂを、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０中１３５ｍＭ  ＭｇＣＩ２で溶離した。精製毒素Ａおよび精製毒素Ｂをそれぞれ濃縮し、先ず２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ中に（例えば、ＭｇＣＩ２を除去するため）に、次いで１００ｍＭ  ＰＯ４、ｐＨ７中に透析濾過した。毒素Ａの平均収率は約０．０２１ｇ純毒素／Ｌ発酵（ＵＶ２８０）であり、ＳＤＳ  Ｐａｇｅで評価した純度は、平均して約９７．２％であった。毒素Ｂの平均収率は��０．０１１ｇ純毒素／Ｌ発酵（ＵＶ２８０）であり、ＳＤＳ  Ｐａｇｅで評価した純度は、平均して約９９３．９％であった。このプロセスから生成される毒素は９０％以上の純度を示し、前の処理工程の後に残されるマトリックス残存（例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ））の減少も示す。実質的に実施例１に記載の通りのプロセスからの毒素マトリックス中の残存ＴＲＩＳ値は、約１００〜８００μｇ／ｍｌ変化したが、この実施例に記載の精製プロセスからの毒素マトリックス中の残存ＴＲＩＳ値は１μｇ／ｍｌ未満（すなわち、検出限界未満）である。ホルムアルデヒドとのトキソイド化反応に関して、ホルムアルデヒド介在修飾に関してタンパク質と事実上競合できるアミン基を有し、その結果、反応混合物中の有効なホルムアルデヒド濃度を低減させる。したがって、このプロセスで作られるトキソイドのトキソイド化速度論は、実施例１に記載のプロセスで調製されるトキソイドの速度論と比較して速いことがデータから示唆される。
【００４０】
温度およびホルムアルデヒド濃度に関して、トキソイド化プロセスで試験を実施し、トキソイド化インキュベーション期間の関数として解析した。同レベルの免疫原性を維持しながら、（実施例１に記載されているような）従来のプロセスを使用して生成されるトキソイドより優れた安全性プロフィールおよび優れた逆戻り特性を提供する頑強なトキソイド化プロセスを開発することが目的であった。３７℃で復帰分析を通過し、最小量の残存ホルムアルデヒドを含む製剤を生産するであろうトキソイド化条件が望まれた。これらの実験で、毒素濃度は０．５ｍｇ／ｍｌで一定であり、反応は全て１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０中で実施された。各トキソイド化反応で評価した温度は４℃、１５℃および２５℃であった。ホルムアルデヒド濃度は、トキソイドＡ反応では０．２１％（「０．２％」）または０．４２％（「０．４％」）の間で変化し、トキソイドＢ反応では０．４２％「（０．４％」）と０．８４％（「０．８％」）の間で変化した。各反応条件について、毒素濃度は０．５ｍｇ／ｍｌに調整され、１００ｍｌ規模で実施された。次いで、個々の反応の各々が目標濃度に到達するまで、３７パーセント（３７％）ホルムアルデヒドを加えた。反応を、５〜１０分間、穏やかに撹拌して目標温度のインキュベーター内に置いた（インキュベーションの１時間以内に目標温度が達成された）。個々の反応を、毎日、最高２１日間モニーした。試料を抜き取り、細胞毒性分析、ＡＥＸ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＴＮＢＳアッセイで分析した。トキソイド化条件に応じて特定の時間間隔で、試料を抜き取り、処方して動物実験、復帰分析およびＥＬＩＳＡテストを実施した。
【００４１】
速度論的細胞毒性分析
トキソイド化反応に続いて細胞毒性分析を実施し、従って試料を反応混合物から毎日直接抜き取り、同日分析にかけた。トキソイド化プロセスに続いてＩＭＲ９０細胞で細胞毒性分析を実施し、トキソイド化の速度論は単相であり、細胞毒性中和に毒素Ａでは平均５±１日かかり、毒素Ｂは１３±２日に近かかった（全反応で３倍安全域に及ばない）。１バッチを使用して得られたデータを図１に示す。ｙ−軸は、物質の毒性の反映であり、細胞の正常な線状形態の代わりに、毒性物質の存在下で細胞の５０％が丸くなる最小濃度を表す、ＭＣ５０値を含む。２つの毒素のＭＣ５０値は、１０００倍異なり；Ｂはより細胞毒性であり、そのＭＣ５０値は低ｐｇ／ｍｌの範囲であった。これらの実験で、最高濃度である２００μｇ／ｍｌでテストしたとき、細胞毒性は皆無であったため、トキソイドの絶対ＭＣ５０値は未確認であった。不活化プロセスの全期間は１８〜２１日であった。
【００４２】
表２に、毒素Ａおよび毒素Ｂのトキソイド化反応に関する細胞毒性分析のデータを示す。表２は、毒素とのホルムアルデヒドの別々の反応のそれぞれの細胞毒性の減損を示すために必要な時間量（日数）を表す。毒素Ａおよび毒素Ｂのトキソイド化反応のデータから、２、３の一般的傾向が明白である。ホルムアルデヒド濃度が上昇するにつれて、毒素を不活化するために必要な時間は減少する。加えて、反応温度が上昇するにつれて、毒素を不活化するために必要な時間はやはり減少する。温度またはホルムアルデヒド濃度のいずれかの上昇と共にトキソイド化の速度が加速されることがデータから示唆される。多くの可能性のある条件は、速度論的細胞毒性分析から特定され、また３倍安全域は、細胞毒性の初期減損を３倍外挿することによって達成できることがデータから示唆される。例えば、毒素Ａは２５℃にて０．２％ホルムアルデヒドで２日に無毒化し、したがって、適当な安全域を適用することは、反応を６日間続けることが最小限必要であろう。細胞毒性の減損に関する承認基準に基づけば（速度論的分析に基づけば）、種々のトキソイド化反応条件は予想通りになり、他の分析を使用したさらなる評価は、条件を絞り込むであろう。
【００４３】
【表２】
2016516721.tif 000004
【００４４】
ＤｏＥ反応の速度論的ＡＥＸ−ＨＰＬＣ分析
種々のトキソイド化パラメータをさらに評価するツールとして、ＡＥＸ−ＨＰＬＣ（拡張勾配方法）を使用することができる。ＡＥＸプロフィールは、好適なトキソイド化条件の絞り込みに有益なツールであり得る。トキソイドＡおよびトキソイドＢの両者で、２つの部分母集団が、共に毒素より長い保持時間を有するＡＥＸクロマトグラムで観察された。ピーク母集団は、反応が進行するにつれて移動し、毒素へのさらなる修飾が示唆される。潜在的に、これは、タンパク質上の荷電特性をより少ない正に変え、その結果カラム樹脂（四級アンモニウム樹脂）との結合親和力を高める、毒素上のアミン基と反応するホルムアルデヒドを表す。温度およびホルムアルデヒド濃度は、より多いホルムアルデヒドタンパク質修飾を示す時間の関数としてピーク母集団プロフィールに影響して「シフトする」ことができる；毒素Ａおよび毒素Ｂの両トキソイド化反応で、温度およびホルムアルデヒド濃度の上昇と共に第２のピーク母集団へのより急速なシフトが確認される。評価の見地から、より多くのタンパク質修飾を確実にするためには、第２のピークで単分散プロフィールを有することがより望ましいであろう。トキソイドＡでは、２５℃で０．２１％ホルムアルデヒド、＞６日、または１５℃で４２％ホルムアルデヒド、＞６日の条件は、所望の単分散第２ピークプロフィールを与える。トキソイドＢでは、１５℃で０．４％または０．８％ホルムアルデヒド、＞１０日間、または２５℃で０．４％ホルムアルデヒド＞５日間の条件は、所望の単分散第２ピークプロフィールを結果的にもたらした。最高のホルムアルデヒド濃度および温度での反応は、より多いトキソイド母集団を時間の関数として生成し始め、より広範なタンパク質修飾（特に、０．４％ホルムアルデヒド、２５℃での毒素Ａの不活化の場合）が示唆されることに注目することは重要である。
【００４５】
速度論的ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析
ＳＥＣプロフィールは、好適なトキソイド化条件の絞り込みに有益なツールであり得る。クロマトグラムによって、ホルムアルデヒド誘導性分子間架橋の結果として起こり得る多量体化の程度を理解することができる。トキソイド上の多量体化の量を最小限に抑え、実施例で製造される生成物のものと類似したプロフィールを達成することが望ましい。個々の反応をＳＥＣ−ＭＡＬＳで毎日モニターし、多量体化の出現について定性的に分析した。トキソイドＢ反応に関して分析した条件は全て多量体化を何も示さなかった。トキソイドＡでは、主として最高のホルムアルデヒド濃度を用いた条件で、過度の多量体化が確認された。このようにＳＥＣ−ＭＡＬＳデータは、温度、時間またはホルムアルデヒド濃度に関して、トキソイドＢ条件を差別しない。しかし、トキソイドＡでは、より高温およびホルムアルデヒド濃度は連携して多量体化に導けることがデータから示唆される。
【００４６】
速度論的アミン含量（ＴＮＢＳ）分析
ホルマリン介在トキソイド化は、ホルムアルデヒドを基本とする部分を形成する反応を通して、タンパク質上の遊離アミン含量（例えば、リジンのε−アミノ基）の減少をもたらす。トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）アッセイを使用して、以前の物質上の修飾の程度をモニターしようと試み、反応終了時の修飾の程度は、トキソイドＡおよびトキソイドＢはそれぞれ−３５％および６５％であることが分かった（残っている遊離アミン含量の逆関数）。この試験では、ＴＮＢＳアッセイを使用して遊離アミン含量もモニターした。温度および時間が増加するにつれて、％遊離アミン含量はより速く漸近線に接近することを、条件は示した。このように、アミン修飾の程度は、最大限、毒素Ａでは〜４０％、毒素Ｂでは７５％と推定され得る（残存する遊離アミン含量の逆関数）。アミン含量は細胞毒性の減損とほとんど相関関係がないが、ホルムアルデヒドと毒素との反応の程度を追跡するのに使用することができる。例えば、アミン修飾は、２５℃で、Ａに関しては６日で、Ｂに関しては約１０日で、完成しているようである。反応がより低温で実施されると、同程度のアミン修飾を達成するために要する時間は増加する。このように、より高温は、より短い期間でより完全な反応をもたらすであろうということがデータから示唆される。
【００４７】
抗原性の解析
種々のトキソイド化パラメータをさらに評価するツールとして、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）も使用することができる。生成物のＥＬＩＳＡプロフィールを使用して、好適なトキソイド化条件を絞り込むことができる。生成されたトキソイドを、以前の物質から生成された抗体に対してＥＬＩＳＡで測定し、トキソイド化時間の関数として解析した。ここでＥＬＩＳＡを使用して毒素量を検出し、２８０ｎｍにおける吸光度を使用して測定した濃度と比較した。トキソイド化反応で抗原が進行するにつれて、ＥＬＩＳＡ値は低下する可能性があり、実施例１トキソイドで確認された反応からの変化を示す（潜在的に多量体化を示す）。変化性がアッセイでみられたが、より高温度およびより高いホルムアルデヒド濃度はより低いＥＬＩＳＡ応答をもたらすことがデータから示唆される。例えば、２５℃の０．４％ホルムアルデヒドを使用すると、２５℃の０．２％ホルムアルデヒドよりも速くＥＬＩＳＡ値が下がることになる。同様に、０．４％ホルムアルデヒド、２５℃を用いる条件は、４℃の０．４％ホルムアルデヒドにおけるものよりも速くＥＬＩＳＡ値が下がることになる。評価ツールとして、ＥＬＩＳＡ応答を７０％以上に保つことが望ましかった；多くの条件が特定された。
【００４８】
免疫原性の解析
ハムスター力価検定による免疫原性の測定を使用して、トキソイド化条件を評価することが可能である。トキソイドＡおよびトキソイドＢには、４．８以上の平均Ｌｏｇ１０  ＩｇＧ力価応答というＩｇＧ応答が選択された。これらの研究から生成されるトキソイドは、以前の条件から誘導されるトキソイドから有意に低い応答を持たないため、それらの仕様に従って評価され、さらに精査された。加えて、全ての可能性がある浸透性（時間、温度およびホルムアルデヒド濃度に関して）を評価できるというわけではなかったため、速度論的細胞障害性分析（３ｘ安全域）ならびに本明細書に記載の生理化学的特徴に基づいて、トキソイドが選択された。トキソイドは、ハムスター力価検定のための二価物質（非凍結乾燥）として処方され、ＩｇＧ応答について血清を分析した。全てのトキソイド化条件は、力価仕様を通過したばかりでなく（すなわち、平均ＩｇＧ価応答  ４．８Ｌｏｇ１０）以前（実施例１）の物質と統計学的に等しい力価応答を有していた（有意差は認められなかった）。加えて、インビトロ負荷アッセイを使用して全ての血清をテストしたところ、中和抗体活性を有していた。重要な品質特性として、これらのトキソイド化条件はいずれも許容できたことがデータから示唆される。
【００４９】
製剤（「ＤＰ」）の復帰分析
評価段階にあるトキソイド化条件を使用して調製したトキソイドＡおよびトキソイドＢを使用して、製剤（トキソイドＡおよびトキソイドＢを含む組成物）を調合した。調合物は、０％、０．００４％、および場合によって．００８％（ｗ／ｖ）の残存ホルムアルデヒドのいずれかを含んでいた。トキソイドＡ組成物またはトキソイドＢ組成物から全て（または本質的に全て）のホルムアルデヒドを除去し、次いで除去された組成物に指示量のホルムアルデヒドを添加することによって、調合物を調製した。製剤を、３７℃で実施される復帰分析にかけた。製剤復帰分析のデータを表３に示す。細胞毒性が陰性であった製剤は、（−）と記述されている。
【００５０】
多数の製剤調合物が復帰分析を通過した（すなわち、３７℃で貯蔵後、検出可能な細胞毒性がなかった）。２製剤（０．００４％ホルムアルデヒドまたは０．００８％ホルムアルデヒド（「残存ホルムアルデヒド」）を含む）は、３７℃で貯蔵後、検出可能な細胞毒性がなかった：（ｉ）１３日間、０．２％ホルムアルデヒド、１５℃でのインキュベーションにより不活化されたトキソイドＡ、１３日間、０．８％ホルムアルデヒド、１５℃でのインキュベーションにより不活化されたトキソイドＢを含む製剤（表３、テスト１３および１４のパラメータ）；および（ｉｉ）６日間、０．２％ホルムアルデヒド、２５℃でのインキュベーションにより不活化されたトキソイドＡ、１３日間、０．４％ホルムアルデヒド、２５℃で不活化されたトキソイドＢを含む製剤（表３、テスト２２および２３のパラメータ）。例えば、１３日間、０．４％ホルムアルデヒド、４℃でのインキュベーションよって不活化されたトキソイドＡおよび２１日間、０．８％、４℃で不活化されトキソイドＢを含む製剤ならびに１３日間、０．４％ホルムアルデヒド、４℃で不活化されたトキソイドＡおよび２１日間、０．８％ホルムアルデヒドおよび４℃で不活化されたトキソイドＢを含む製剤を含む、０．００８％ホルムアルデヒドを含む他の幾つかの製剤もまた、３７℃で貯蔵後、検出可能な細胞毒性がなかった。この分析から特定された最適トキソイド化条件は次の通りであった：毒素Ａのトキソイド化：１００ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ７中、０．５ｍｇ／ｍｌ毒素Ａ、０．２１％ホルムアルデヒド、２５℃、６日間；および毒素Ｂのトキソイド化：１００ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ７中、０．５ｍｇ／ｍｌ毒素Ｂ、０．４２％ホルムアルデヒド、２５℃、１３日間（表３、テスト２２のパラメータ）。これらの条件はまた、他の生理化学的アッセイで測定するとき、所望のプロフィールを有していた。ＡＥＸは、各トキソイドで、同質のピーク母集団を示した。ＳＥＣ  ＭＡＬＳは最小限の多量体化を示し、ＴＮＢＳは所与の時点で最大アミン修飾を達成する各反応を示した。加えて、ＥＬＩＳＡ（Ａ２８０）応答は維持された。
【００５１】
【表３−１】
2016516721.tif 000005
【００５２】
【表３−２】
2016516721.tif 000006
【００５３】
表１および表３は、毒素Ａおよび毒素Ｂからトキソイドを調製するためにはパラメータ２２が最適であることを示す。これらの条件は以下の通りである：
トキソイドＡの調製：１００ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ７中０．５ｍｇ／ｍｌ毒素Ａ、０．２１％ホルムアルデヒド、２５℃、６日間；および、
トキソイドＢの調製：１００ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ７中０．５ｍｇ／ｍｌ毒素Ｂ、０．４２％ホルムアルデヒド、２５℃、１３日間。
【００５４】
これらの手順は、６日（トキソイドＡ）または１３日（トキソイドＢ）インキュベーションの前に、１０分混合ステップに続いて０．２μｍ濾過も含む。３７℃での逆戻りをテストする前に、トキソイドＡおよびトキソイドＢを２０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ７．５、０．００４％ホルムアルデヒド中に透析濾過した。この手順を図２に図示する。クエン酸塩緩衝液中０．００８％ホルムアルデヒドも、一般に３７℃で良好な安定性を提供する。
【００５５】
このデータは、トキソイドＡでは、より長いインキュベーション時間は結果的により低いＥＬＩＳＡ値になることを示す意外な免疫学的データ（ハムスターにおけるＩｇＧ応答）によってさらに検証され、ホルムアルデヒド誘導性毒素修飾の増加が示唆される（ＥＬＩＳＡ／Ａ２８０  ６日目＝０．９４；１２日目＝０．６４）。対照的に、トキソイドＢでは、より長いインキュベーション時間はより高いＥＬＩＳＡ値をもたらした（ＥＬＩＳＡ／Ａ２８０  １３日目＝０．５３；２０日目＝０．７３）。望ましいＥＬＩＳＡ／Ａ２８０値は、１．０前後である。１２日インキュベーション期間は毒素Ａをトキソイド化するために適当かもしれず、２０日インキュベーション期間は毒素Ｂのトキソイド化に適当かもしれないと、当業者は理解すべきである。しかし、上述の通り、このデータを考慮しても、１３日インキュベーション期間は、毒素Ｂをトキソイド化するのに最適であると考えられた。
【００５６】
スケール解析
トキソイドは、特定された最適トキソイド化条件を使用して、より大規模で製造された（発売規模（２００Ｌ発酵）の１／１０）；すなわち、下記の条件を使用して毒素Ａおよび毒素Ｂを不活化した：Ａのトキソイド化：１００ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ７中、０．５ｍｇ／ｍＬ毒素Ａ、０．２１％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒド、２５℃、６日間；および、Ｂのトキソイド化：１００ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ７中、０．５ｍｇ／ｍＬ毒素Ｂ、０．４２％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒド、２５℃、１３日間。反応中の様々な期間に採取したトキソイド試料を使用して、トキソイド化反応の速度論を評価した。小規模で製造されたトキソイドと比較して、トキソイドは同一の速度論的細胞毒性プロフィールを有しており、反応の２日目に細胞毒性の減損が確認された。加えて、トキソイドは、小規模で製造されたトキソイドと類似したＡＥＸプロフィールおよび類似したアミン修飾を有していた（ＴＮＢＳアッセイで測定したとき）。１／１０規模のトキソイド化反応から生成されたトキソイドの免疫原性もハムスター力価アッセイで評価した。小規模で製造されたトキソイドと同様、トキソイドは４．８Ｌｏｇ以上の平均ＩｇＧ力価応答を与え、実施例１に記載のプロセスに従って調製されたトキソイドと統計学的に同等の力価応答を提供した。１／１０規模でトキソイドから誘導された製剤に対して復帰分析を実施し、小規模で同一トキソイド化条件から誘導された製剤と比較した。１／１０規模でトキソイドから誘導された製剤は、小規模で誘導されたものと同じ逆戻り特性を有し、０．００４％ホルムアルデヒドでも復帰分析を通過した。より大規模で（例えば、１０００Ｌおよび２０００Ｌ発酵培養を使用して）、製造されたトキソイドで、類似した結果が得られた。これらの研究データは、トキソイド化方法が拡大縮小可能であることを示す。大規模で製造されたトキソイドは、小規模で製造されたものと同じ速度論的細胞毒性プロフィール、ハムスター力価および逆戻り特性を有していた。再現性に関して、毒素Ａおよび毒素Ｂのトキソイド化プロセスは、６回以上再現され、解析は、類似したロット間特性を示した。
【００５７】
免疫付与試験
精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよび精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを、実質的に上述の方法（例えば、表３におけるパラメータ２２）に従って調製し、ワクチン組成物として処方した。トキソイドＡおよびトキソイドＢを、重量で３：２の比率で混ぜ合わせ、スクロース（４．０％〜６．０％  ｗ／ｖ）およびホルムアルデヒド（０．０１２％〜０．０２０％  ｗ／ｖ）を含むクエン酸塩緩衝液を用いて処方し、凍結乾燥した。各組成物を下記の希釈剤で再構成し、ワクチンとして使用する前に水酸化アルミニウムをアジュバント添加した。シリアゴールデンハムスターが、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチン開発のための強力なモデルとなる。（例えばワクチン接種なしでは）ハムスターは、クリンダマイシン抗生物質の単一腹腔内（ＩＰ）用量で前処置した後、および毒素原性Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）生物の胃内（ＩＧ）接種を受けた後に、激症下痢および出血性盲腸炎を迅速に発現させ、２〜４日以内に死亡する。ワクチンを、希釈剤（０．５７％塩化ナトリウムおよび８００μｇ／ｍＬアルミニウムを含む）で再構成した。再構成したワクチンは、１００μｇ／用量のトキソイド、０．００８％ホルムアルデヒドおよび４００μｇ／用量のアルミニウムを含有していた。ハムスター（９匹のハムスター／群）に、異なる用量のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチン（ヒト用量（１００μｇ／用量）（ＨＤ）の４つの希釈物）での（０日目、１４日目、および２７日目における）３回の筋肉内免疫によりワクチン接種したか、またはプラセボ（ＡｌＯＨ）を注射した。４１日目に、ハムスターを、１０ｍｇ／ｋｇの２−リン酸クリンダマイシンという化学形態の抗生物質で、ＩＰ経路により前処置した。４１日目に、ハムスターを、１０ｍｇ／ｋｇの２−リン酸クリンダマイシンという化学形態の抗生物質で、ＩＰ経路により前処置した。４２日目に、抗生物質を用いた前処置の２８時間後に、致死量の、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＡＴＣＣ４３２５５菌株由来の胞子調製物をＩＧ経路によりハムスターに負荷した。保護抗力を、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症と関係する症状の出現の動態および死亡率を測定することにより評価した。結果は、当該ワクチンがＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素原性細菌での致死的攻撃から用量依存的な様式でハムスターを保護することを証明するものであり、ＨＤ／２０（１００μｇ／ｍＬのＡｌＯＨの存在下における５μｇのトキソイドＡ＋Ｂ）という用量でのワクチン接種により、１００％保護が誘導された（図３）。死および疾患（体重減少および下痢）から保護された。本研究の結果は、いくつかのインビボ研究を代表するものである。したがって、開示される方法により調製されたトキソイドは、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）疾患に対する防御免疫を提供する。
【００５８】
好ましい実施形態に関して特定の実施形態を記述してきたが、変更および修正が当業者に思い浮かぶであろうことが理解される。したがって、添付の特許請求の範囲は、以下の特許請求の範囲の範囲内に入る全てのそのような等価の変更を対象として含むことが意図されている。
【図１】
2016516721.tif 000007
【図３】
2016516721.tif 000008
【図２】
2016516721.tif 000009
【国際調査報告】
2016516721.tif 000010
2016516721.tif 000011
2016516721.tif 000012
2016516721.tif 000013
2016516721.tif 000014