(57)【要約】  本発明は、腫瘍細胞、特に転移性がん細胞の播種を調節するための組成物に関する。特に、本発明は、転移性がんの治療および／または予防に使用するための、転移性腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤に関し、その薬剤は腫瘍細胞の捕獲剤および／または化学誘引物質である。本発明は、転移性腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤を含む生成物およびがんを治療または予防する方法にも関する。
2016500122.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
転移性がんの治療および／または予防に使用するための、転移性腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤であって、前記転移性腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤が腫瘍細胞の捕獲剤および／または化学誘引物質である薬剤。
【請求項２】
転移性がんの治療および／または予防における転移性腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤の使用であって、前記転移性腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤が腫瘍細胞の捕獲剤および／または化学誘引物質である使用。
【請求項３】
転移性がんの治療および／または予防のための医薬の調製における転移性腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤の使用であって、前記転移性腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤が腫瘍細胞の捕獲剤および／または化学誘引物質である使用。
【請求項４】
前記転移性腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤が、細胞接着分子または細胞接着を促進するかもしくは転移性腫瘍細胞の着床のための好発部位を発生させる何れかの分子である、先行する請求項の何れかに記載の薬剤または使用。
【請求項５】
前記転移性腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤が、エクソソーム；腹水；幹細胞、たとえば間葉系幹細胞；細胞外マトリックスタンパク質；ケモカインおよび成長因子を含む群から選択される、先行する請求項の何れかに記載の薬剤または使用。
【請求項６】
前記転移性腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤が、担体に含有および／または付着されている、先行する請求項の何れかに記載の薬剤または使用。
【請求項７】
前記担体が、前記転移性腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤を被包し、使用時にその放出を可能にする、請求項６に記載の薬剤または使用。
【請求項８】
前記転移性腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤および／または前記担体が、多孔性および／または３Ｄ足場および／またはハイドロゲルおよび／またはアルギネートである、先行する請求項の何れかに記載の薬剤または使用。
【請求項９】
前記腫瘍細胞の転移性播種を調節するための薬剤および／または前記担体が、ポロキサマー、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリウレタンおよびポリカプロラクトンのうち１種以上を含む、先行する請求項の何れかに記載の薬剤または使用。
【請求項１０】
１種以上の化学療法剤をさらに含む、先行する請求項の何れかに記載の薬剤または使用。
【請求項１１】
前記薬剤が経腸投与または非経口投与を意図している、先行する請求項の何れかに記載の薬剤または使用。
【請求項１２】
前記腫瘍細胞が、転移性腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞、播種された腫瘍細胞または原発腫瘍から播種された何れかの細胞である、先行する請求項の何れかに記載の薬剤または使用。
【請求項１３】
前記薬剤または使用が、がんの転移の治療および／または予防のためである、先行する請求項の何れかに記載の薬剤または使用。
【請求項１４】
前記がんが、乳がん、結腸直腸がん、膵臓がん、腎がん、前立腺がん、尿路上皮がん、食道がん、頭頸部がん、肝細胞がん、中皮腫、カポジ肉腫、卵巣がん、軟部組織肉腫、グリオーマ、メラノーマ、小細胞および非小細胞肺がん、子宮内膜がん、基底細胞癌腫、尿路の移行上皮癌腫、子宮頸がん、子宮内膜がん、胃がん、膀胱がん、子宮肉腫、多発性骨髄腫、軟部組織および骨の肉腫ならびに胆管癌腫を含む群から選択される、先行する請求項の何れかに記載の薬剤または使用。
【請求項１５】
使用が腹膜腔のがんの治療および／または予防のためである、先行する請求項の何れかに記載の薬剤または使用。
【請求項１６】
前記薬剤または生成物が対象の腹部の移植用である、腹膜がんの治療および／または予防に使用するための先行する請求項の何れかに記載の薬剤または使用。
【請求項１７】
前記薬剤が腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞、播種された腫瘍細胞または原発腫瘍から播種された何れかの細胞を誘引する、先行する請求項の何れかに記載の薬剤または使用。
【請求項１８】
前記腫瘍細胞が前記薬剤によって誘引および／または捕獲された後に除去または不活性化される、先行する請求項の何れかに記載の薬剤または使用。
【請求項１９】
担体および腫瘍細胞の転移性播種を調節するための薬剤を含む生成物であって、前記腫瘍細胞の転移性播種を調節するための薬剤が担体に含有および／または付着されている生成物。
【請求項２０】
前記担体が多孔性および／もしくは３Ｄ足場であり、ならびに／または前記担体がハイドロゲルであり、ならびに／または前記担体がアルギネートであり、ならびに／または前記担体が前記腫瘍細胞の転移性播種を調節するための薬剤を被包し、使用時にその放出を可能にする、請求項１９に記載の生成物。
【請求項２１】
前記担体が３Ｄ構造中にポロキサマー、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリウレタンおよびポリカプロラクトンのうち１種以上を含む、請求項１９または２０に記載の生成物。
【請求項２２】
前記転移性腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤が、腫瘍細胞の捕獲剤または化学誘引物質である、請求項１９から２１の何れかに記載の生成物。
【請求項２３】
前記転移性腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤が、細胞接着分子もしくは接着を促進する何れかの分子または転移性腫瘍細胞の着床のための好発部位を発生させる何れかの分子である、請求項１９から２２の何れかに記載の生成物。
【請求項２４】
前記転移性腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤が、エクソソーム；腹水；幹細胞、たとえば間葉系幹細胞；細胞外マトリックスタンパク質；ケモカインおよび成長因子を含む群から選択される、請求項１９から２３の何れかに記載の生成物。
【請求項２５】
１種以上の化学療法剤をさらに含む、請求項１９から２４の何れかに記載の生成物。
【請求項２６】
経腸投与または非経口投与を意図している、請求項１９から２５の何れかに記載の生成物。
【請求項２７】
前記腫瘍細胞が、転移性腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞、播種された腫瘍細胞または原発腫瘍から播種された何れかの細胞である、請求項１９から２６の何れかに記載の生成物。
【請求項２８】
前記薬剤が請求項１９から２７の何れかに記載の生成物である、請求項１から１８までの何れかに記載の薬剤または使用。
【請求項２９】
腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞、播種された腫瘍細胞または原発腫瘍から播種された何れかの細胞を対象内で誘引および／または捕獲する方法であって、請求項１９から２７の何れかに記載の生成物または請求項１から１８の何れかに記載の腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤を対象に投与することを含む方法。
【請求項３０】
がん、特に転移性がんを治療および／または予防する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１９から２７の何れかに記載の生成物または請求項１から１８の何れかに記載の腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤を投与することを含む方法。
【請求項３１】
前記がんが、乳がん、結腸直腸がん、膵臓がん、腎がん、前立腺がん、尿路上皮がん、食道がん、頭頸部がん、肝細胞がん、中皮腫、カポジ肉腫、卵巣がん、軟部組織肉腫、グリオーマ、メラノーマ、小細胞および非小細胞肺がん、子宮内膜がん、基底細胞癌腫、尿路の移行上皮癌腫、子宮頸がん、子宮内膜がん、胃がん、膀胱がん、子宮肉腫、多発性骨髄腫、軟部組織および骨の肉腫、胆管癌腫ならびにそこから播種されたがんを含む群から選択される、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記がんが腹膜腔のがんまたは腹膜腔内に播種されたがんである、請求項２９、３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記がんが腹膜がんであり、前記生成物または薬剤が対象の腹腔に埋め込まれる、請求項２９から３２の何れかに記載の方法。
【請求項３４】
前記生成物または薬剤が対象の腹腔に埋め込まれる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記生成物または薬剤が対象の腹壁に埋め込まれる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記誘引および／または捕獲した腫瘍細胞を除去または不活性化する工程をさらに含む、請求項２９から３５の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
本発明は、がん細胞、特に転移性がん細胞の播種を調節するための薬剤およびがんの治療または予防における該薬剤の使用に関する。組成物は、がん細胞、特に転移性がん細胞を捕獲および／または誘引してもよい。本発明は、がんを治療または予防する方法にも関する。
【０００２】
転移の過程はがん関連死の９０％以上に関係しており、腫瘍学の主要な難題を代表するものである。原疾患は、外科手術および／または放射線治療を合理的に利用することができ、予後の良い化学療法に対して許容可能な反応を呈するが、一方、転移性播種は、外科手術および放射線治療の禁忌ならびに特に化学療法に対する抵抗性を伴い、さらに悪い予後をもたらす。
【０００３】
近年、転移の過程は、攻撃的な腫瘍細胞が周囲の間質および組織に侵入する能力を獲得し、血管内に侵入して血液流内で生き延び、血管外に遊出して遠方の器官に微小転移を発生させるという段階的な過程として位置付けられている。概ね、原発病変からの腫瘍細胞の播種については２通りの主要な道筋がある。すなわち、血管およびリンパ管を介した転移性腫瘍細胞の全身性播種と、周囲への転移性腫瘍細胞の放出または遊走／侵入による局所領域性播種である。原発腫瘍から血流に播種される腫瘍細胞は循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）として知られており、転移の主要な原因である。血管およびリンパ管を介した播種について認識されているのは、腫瘍細胞が遊走と周囲の間質への侵入（上皮間葉転換）とを可能にする攻撃的な表現型を獲得するに違いないということである。すなわち、内皮細胞を誘引することによって、かつ栄養だけでなく播種のため経路を発生させて腫瘍細胞に提供する新しい血管を作り出すことによって、血管新生を活性化して、次いで、腫瘍細胞が新しい血管に侵入して取り込まれ（血管内異物侵入）、いずれ取り付いて血管を去ることになる（血管外遊出）有機体の部位に播種されて、最後に、これらの転移性腫瘍細胞がニッチを構築して、いずれ転移病変に発展する微小転移を発生させることができるというものである。全体の過程は極めて不十分ではあるが、劇的に致死的である。あるいは、播種は、細胞遊走ならびに周囲の間質および器官などの侵入を介して起こる場合があるが、卵巣がんでは、転移性細胞が腹水中に取り込まれて体腔で接近可能な腹膜および器官に着床することによって、腫瘍細胞が腹膜腔に曝露されて放出される。
【０００４】
転移の過程を決定する分子的細胞的基盤は、原発腫瘍と環境との激しいやりとりを示唆する［Ｓｌｅｅｍａｎ，ＪＰら，Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．  ２０１２  Ｊｕｎ；２２（３）：１７４−８６］。組織特異的転移［Ｎｇｕｙｅｎら，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２００９；９（４）：２７４−８４］および前転移ニッチ［Ｐｓａｉｌａ＆Ｌｙｄｅｎ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．２００９；９（４）：２８５−９３］は、定着に最適な部位の決定における癌腫の積極的な役割を説明しようとする概念である。腫瘍および環境から発せられたシグナルは、原発病変から播種された腫瘍細胞が都合よく受け入れられるように標的組織の再構築を統制することがある。
【０００５】
本発明の目的は、腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞と宿主との間のコミュニケーションに干渉して、転移性播種のパターンが調節されるようにすることである。本発明は、ある種の態様では、そのような細胞を物理的にトラップすることおよび／またはそのような細胞のホーミングのための好発部位（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ）を提供することによって機能してもよい。
【０００６】
第１の側面では、本発明は、がんの治療および予防における使用のために、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤を提供する。
【０００７】
本発明はまた、がんの治療および／または予防における腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤の使用を提供する。
【０００８】
本発明はさらにまた、がんの治療および／または予防のための医薬の調製における腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤の使用を提供する。
【０００９】
好ましくは、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤は転移性腫瘍細胞の播種を調節するためのものである。好ましくは、薬剤は転移性がんの治療および／または予防における使用のためのものである。
【００１０】
腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤は、腫瘍細胞の播種の本来の過程に干渉するように働いてもよく、好ましくはそのような細胞の挙動を調節するように働いてもよいが、その結果、特定の部位、好ましくは腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤の位置に細胞が誘引されるか捕獲されるようにする。
【００１１】
腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤は、腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞の捕獲剤および／または化学誘引物質であってもよい。転移性腫瘍細胞は、循環腫瘍細胞、播種された腫瘍細胞または原発腫瘍から播種された何れの細胞であってもよい。
【００１２】
腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤は、腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞、播種された腫瘍細胞または原発腫瘍から播種された何れかの細胞を捕獲またはトラップすることを意図する捕獲剤であってもよい。捕獲剤は、たとえば腫瘍細胞の接着によって、腫瘍細胞の捕獲を直接的に媒介してもよく、あるいは宿主の特定の部位での腫瘍細胞の接着を高めるという間接的な影響があってもよい。
【００１３】
本発明で使用するための捕獲剤は、腫瘍細胞を物理的に捕獲してトラップすることのできる材料であってもよい。捕獲剤は腫瘍細胞を接着する接着性材料であってもよい。
【００１４】
捕獲剤は、転移性細胞が接着して係留するのに好適な基材を提供することによって、細胞を捕獲／トラップしてもよい。この基材は、固体の２Ｄもしくは３Ｄポリマーの表面、または化学的に改変された表面、またはパターン化された表面、またはゲル、またはハイドロゲルなどであってもよく、これらでは、細胞は接着斑、密着結合、係留結合、ＧＡＰ結合などの接着性のある構造を作り出すことができる。
【００１５】
捕獲剤は２Ｄまたは３Ｄの多孔性構造であってもよい。一態様では、捕獲剤は３Ｄの多孔性の組織足場型の材料であってもよい。捕獲剤は３Ｄの多孔性メッシュ構造であってもよい。
【００１６】
捕獲剤は１種以上の多数の異なる材料から作られていてもよく、材料には天然および合成の材料ならびに生分解性および耐久性のある材料が含まれる。そのような多数の材料は周知であり、実に多くが医療分野に使用されている。本発明の捕獲剤として使用するのに適した合成ポリマーとしては、ポリ（アルファ−ヒドロキシ酸）特にポリ乳酸（ＰＬＡ）またはポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸ポリグリコール酸コポリマー、ポリ乳酸ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コポリマー；ポリカプロラクトンを含む他のポリエステル、たとえばポリ（エプシロン−カプロラクトン）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）、ポリ（ｓ−カプロン酸）、ポリ（ｐ−ジオキサノン）およびポリ（プロピレンフマレート）；ポリオール／ジケテンアセタール添加ポリマーを含むポリ（オルトエステル）；ポリ（セバシックアンハイドライド）（ＰＳＡ）、ポリ（カルボキシビスカルボキシフェノキシフェノキシヘキサン）（ＰＣＰＰ）、ポリ［ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）メタン］（ＰＣＰＭ）ならびにＳＡ、ＣＰＰおよびＣＰＭのコポリマーを含むポリアンハイドライド；ポリ（アミノ酸）；ポリ（偽アミノ酸）；ポリ［（ジクロロ）ホスファゼン］の誘導体を含むポリホスファゼン；ポリ［（オルガノ）ホスファゼン］ポリマー；ポリスチレン；ポリウレタン；ポリカーボネート；ポリホスフェート；ポリエチレングリコールポリプロピレンブロックコポリマー；ポロキサマー、たとえばＰｌｕｒｏｎｉｃ（商標）が挙げられる。そのようなポリマーを３Ｄの多孔性担体を生成するのに使用してもよい。あるいは、またはさらに、天然のポリマー、たとえば絹、エラスチン、キチン、キトサン、フィブリン、フィブリノーゲン、天然ゴム（キサンタンなど）、多糖（ペクチンを含む）、アルギネート、コラーゲン、ポリ（アミノ酸）、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質も使用してもよい。さらにまた、そのようなポリマーは３Ｄ多孔性担体を生成するのに使用してもよい。上記のポリマーの何れかのモノマーから調製されるコポリマーもまた使用してもよく、ポリマーもしくは混合物の無作為な配合またはその組み合わせであってもよい。
【００１７】
捕獲剤はハイドロゲルの形態であってもよい。
【００１８】
一態様では、捕獲剤はポリスチレンおよび／またはポリカプロラクトンを含んでいてもよい。ポリスチレンおよび／またはポリカプロラクトンを、３Ｄの多孔性構造、たとえば多孔性メッシュを生成するのに使用してもよい。たとえば、本発明では、３Ｄ  Ｂｉｏｔｅｋ（商標）、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡによって提供される３Ｄ  ＩｎｓｅｒｔＴＭ−ＰＳ  Ｎａｎｏｍｅｓｈ（商標）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｃａｆｆｏｌｄを使用してもよい。代替の一態様では、捕獲剤は、アルギネートスポンジ、たとえばＧｉｂｃｏ（商標）からのＡｌｇｉＭａｔｒｉｘ（商標）３Ｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍを含む。さらなる態様では、捕獲剤は、尿素架橋のあるポリカーボネートポリウレタン、たとえばＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡからのＢｉｏｍｅｒｉｘ（商標）３Ｄ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓであってもよい。
【００１９】
固体の表面を含む捕獲剤では、表面への腫瘍細胞および特に転移性腫瘍細胞の付着を高めるために、表面は接着分子で作られているか、修飾されているか、接着分子を中に包埋していてもよい。接着分子は、タンパク質または細胞−細胞接着もしくは細胞−基材接着を媒介する他の分子であってもよく、ＣＡＭ、カドヘリン、インテグリン、セレクチン、テトラスパニン、細胞外マトリックスタンパク質、ＲＧＤ−ペプチドまたは細胞接着を高めることのある改変ペプチド、または細胞接着を促進するタンパク質もしくは分子などがある。さらに、捕獲剤は、本発明の着床部位の再構築によって、着床部位の細胞性構造物の再構築を用いて、または細胞外マトリックスの再構築によって、異物反応（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００８）もしくは炎症反応を介した部位の再構築によって、転移性細胞を捕獲／トラップしてもよい。
【００２０】
あるいは、接着分子は捕獲剤であってもよく、好ましくは固体表面のないものである。
【００２１】
腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤は、あるいは、またはさらには、腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞、播種された腫瘍細胞または原発腫瘍から播種された何れかの細胞に対する化学誘引物質であってもよい。
【００２２】
いくつかの態様では、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤は、腫瘍細胞の捕獲剤と化学誘引物質の両方として働いてもよい。
【００２３】
有用な化学誘引物質は、腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞、播種された腫瘍細胞または原発腫瘍から播種された何れかの細胞を誘引することのできる何れの薬剤でもよい。腫瘍細胞は、中間細胞（すなわち免疫細胞または幹細胞）の誘引を介して直接的または間接的に誘引されてもよい。たとえば、本発明の薬剤の埋め込みによって、転移性がん細胞のための追加の化学走性効果を与える炎症反応が発生してもよい。
【００２４】
腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤、たとえば捕獲剤および／または化学誘引物質は、細胞に由来する小胞を含んでいてもよく、小胞にはエクソソームが含まれる。エクソソームは多くの、そしておそらくはあらゆる生体液に存在する細胞由来の微小胞であり、生体液には血液、尿および腹水が含まれる。それらは一般的に直径３０〜１００ｎｍである。それらは正常な生理的過程の間に多くの種類の細胞によって放出されるが、腫瘍は大量のエクソソームを異常に分泌すると思われる。本発明で使用するためのエクソソームを、体液、たとえば血液もしくは尿から得るか、または有機体の多数の異なる種類の細胞から得てもよい。エクソソームを精製する元の体液は健康なドナーからであってもよい。本発明に使用するためのエクソソームは、がん細胞、たとえば卵巣がん細胞によって分泌され、あるいは、またはさらに、エクソソームは非がん細胞、たとえば間葉系幹細胞から分泌される。非がん細胞由来のエクソソームを使用することが好ましい。
【００２５】
あるいは、またはさらに、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤は、卵巣がんを有する対象からの腹水であってもよい。腹水はエクソソームを含んでもよい。捕獲剤または化学誘引物質は、卵巣がんのある対象からの腹水から得るエクソソームであってもよい。
【００２６】
あるいは、またはさらに、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤は、間葉系幹細胞自体またはまさに幹細胞の別の形態であってもよいが、ヒトの胚性幹細胞ではないことが好ましい。脂肪、臍帯または骨髄起源の間葉系幹細胞を化学誘引物質として使用してもよい。
【００２７】
あるいは、またはさらに、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤は、細胞接着分子、たとえばセレクチン、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバー、インテグリンまたはカドヘリンであってもよい。細胞接着分子は、エクソソーム、たとえばＣＤ９および／またはＣＤ８１に付随して見出されてもよい。
【００２８】
あるいは、またはさらに、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤は、１種以上のケモカインおよび／または１種以上の成長因子、たとえばＳＤＦ１、９０Ｋ、オステオポンチン、ＥＧＦ、ＴＧＦｂ１、ＦＧＦおよびＩＧＦのうち１種以上を含んでいてもよい。一態様では、化学誘引物質は、ＥＧＦ、ＴＧＦｂ１およびＦＧＦの組み合わせを含む。
【００２９】
あるいは、またはさらに、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤は、１種以上の細胞外マトリックスタンパク質、たとえばフィブロネクチンまたはコラーゲンを含んでもよい。
【００３０】
腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤は、担体に含有および／または付着されていてもよい。
【００３１】
腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤は、物理的または化学的に担体に含有または付着されていてもよく、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤は、恒久的に足場内に含有されており、制御または非制御の様式で担体から放出されてもよい。
【００３２】
担体と共に使用する場合に、化学誘引物質および／または捕獲剤を担体にまたはその内部に付着させたままにするか、または担体から放出もしくは浸出して担体の周囲に化学誘引物質および／または捕獲剤の勾配を作り出してもよい。
【００３３】
担体は、そこに含有するか付着していることによって、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤を運搬することのできる何れの適切な材料であってよい。腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤は、捕獲剤および／または化学誘引物質であってもよい。
【００３４】
担体自体が、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤、たとえば捕獲剤および／または化学誘引物質であってもよい。
【００３５】
担体は好ましくは生体適合性があり、その結果、ヒトまたは非ヒト動物に配置した場合に、許容できない免疫反応の原因とならないようにする。いくつかの態様では、担体は、配置部位に限定された免疫反応、たとえば炎症性免疫反応または異物反応に関係していてもよい。
【００３６】
担体は多孔性であってもよい。担体は２Ｄまたは３Ｄの多孔性構造であってもよい。一態様では、担体は３Ｄ多孔性組織足場型の材料であってもよい。担体は３Ｄ多孔性メッシュ構造であってもよい。
【００３７】
担体は多数の異なる材料のうち１種以上から作られていてもよく、材料には天然および合成の材料ならびに生分解性および耐久性のある材料が含まれる。多数のそのような材料は周知であり、実に多くが医療分野に使用されている。本発明の担体として使用するのに適した合成ポリマーとしては、ポリ（アルファ−ヒドロキシ酸）特にポリ乳酸（ＰＬＡ）またはポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸ポリグリコール酸コポリマー、ポリ乳酸ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コポリマー；ポリカプロラクトンを含む他のポリエステル、たとえばポリ（エプシロン−カプロラクトン）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）、ポリ（ｓ−カプロン酸）、ポリ（ｐ−ジオキサノン）およびポリ（プロピレンフマレート）；ポリオール／ジケテンアセタール添加ポリマーを含むポリ（オルトエステル）；ポリ（セバシックアンハイドライド）（ＰＳＡ）、ポリ（カルボキシビスカルボキシフェノキシフェノキシヘキサン）（ＰＣＰＰ）、ポリ［ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）メタン］（ＰＣＰＭ）ならびにＳＡ、ＣＰＰおよびＣＰＭのコポリマーを含むポリアンハイドライド；ポリ（アミノ酸）；ポリ（偽アミノ酸）；ポリ［（ジクロロ）ホスファゼン］の誘導体を含むポリホスファゼン；ポリ［（オルガノ）ホスファゼン］ポリマー、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリホスフェート、ポリエチレングリコールポリプロピレンブロックコポリマー、ポロキサマー、たとえばＰｌｕｒｏｎｉｃ（商標）が挙げられる。そのようなポリマーを３Ｄの多孔性担体を生成するのに使用してもよい。
【００３８】
あるいは、またはさらに、天然のポリマー、たとえば絹、エラスチン、キチン、キトサン、フィブリン、フィブリノーゲン、天然ゴム（キサンタンなど）、多糖（ペクチンを含む）、アルギネート、コラーゲン、ポリ（アミノ酸）、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質も使用してもよい。さらにまた、そのようなポリマーは３Ｄ多孔性担体を生成するのに使用してもよい。
【００３９】
上記のポリマーの何れかのモノマーから調製するコポリマーも使用してもよく、ポリマーもしくはその混合物の無作為の配合またはその組み合わせであってもよい。
【００４０】
担体はハイドロゲルの形態であってもよい。
【００４１】
一態様では、担体はポリスチレンおよび／またはポリカプロラクトンを含んでいてもよい。ポリスチレンおよび／またはポリカプロラクトンを、３Ｄの多孔性構造、たとえば多孔性メッシュを生成するのに使用してもよい。たとえば、本発明では、３Ｄ  Ｂｉｏｔｅｋ（商標）、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡによって提供される３Ｄ  ＩｎｓｅｒｔＴＭ−ＰＳ  Ｎａｎｏｍｅｓｈ（商標）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｃａｆｆｏｌｄを使用してもよい。
【００４２】
代替の態様では、担体はＧｉｂｃｏ（商標）からのＡｌｇｉＭａｔｒｉｘ（商標）３Ｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍなどのアルギネートスポンジを含む。
【００４３】
さらなる態様では、担体は、尿素架橋のあるポリカーボネートポリウレタン、たとえばＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ、ＵＳＡからのＢｉｏｍｅｒｉｘ（商標）３Ｄ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓであってもよい。
【００４４】
担体は可溶性または分解性のある材料であるか、または少なくとも部分的に可溶性であるか、もしくは部分的に分解性があってもよい。
【００４５】
担体は、本質的に薬剤を経時的に放出することによって薬剤の勾配を作り出すことを機能とする、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤の受容器であってもよい。薬剤は制御または非制御の様式で放出されてもよい。薬剤の放出は能動的もしくは受動的または両方であってもよい。
【００４６】
好ましくは、担体は、使用に際して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以上の薬剤を、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間またはそれより長く保持する。
【００４７】
好ましくは、担体は、使用に際して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれより多い薬剤を、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間またはそれより長く放出する。
【００４８】
好ましくは、担体は、使用に際して、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間またはそれより長く、薬剤の勾配を作り出す。
【００４９】
好ましくは、本発明の担体は、腫瘍細胞の播種を調節するための十分な薬剤を放出して、転移性播種を回避するのに十分な期間に、対象での局所領域性播種および／または全身性播種に対して効果的な薬剤の勾配を発生させることができる。好ましくは、薬剤は化学誘引物質であり、本発明の生成物は保持される期間の間は腫瘍細胞を誘引することができる。好ましくは、本発明の生成物は、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間またはそれより長く、腫瘍細胞を誘引することができる。
【００５０】
腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤は、リポソームまたはナノ／ミクロ粒子またはエクソソーム擬似小胞などの改変型細胞性小胞の中に被包されていてもよい。腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤を（付着によって）含有させるか運搬するために、可溶性の錠剤および／またはカプセルもまた使ってもよい。錠剤および／またはカプセルは、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤を所望の部位で選択的に放出するために構成されていてもよい。錠剤またはカプセルを形成するために使用してもよいポリマーとしては、これらに限定されないが、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ポリビニルアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸コポリマー、シェラック、メチルセルロースフタレート、セルロースアセテートトリメリテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、セルロースアセテートフタレート、セルロースアセテートサクシネート、セルロースアセテートマレート、セルロースベンゾエートフタレート、セルロースプロピオネートフタレート、カルボキシメチルエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロースフタレート、シェラック、スチレンアクリル酸コポリマー、メチルアクリレート−アクリル酸コポリマー、メチルアクリレート−メタクリル酸コポリマー、ブチルアクリレート−スチレン−アクリル酸コポリマー、メタクリル酸−メチルメタクリレートコポリマー、メタクリル酸−エチルアクリレートコポリマー、メチルアクリレート−メタクリル酸−オクチルアクリレートコポリマー、ビニルアセテート−無水マレイン酸コポリマー、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、スチレン−マレイン酸モノエステルコポリマー、ビニルメチルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、エチレン−無水マレイン酸コポリマー、ビニルブチルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、アクリロニトリル−メチルアクリレート−無水マレイン酸コポリマー、ブチルアクリレート−スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリビニルアルコールフタレート、ポリビニルアセタールフタレート、ポリビニルブチレートフタレートおよびポリビニルアセトアセタールフタレート、またはその組み合わせが挙げられる。腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤を被包する材料は、投与された時に溶解して、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤を放出するようにしてもよい。一態様では、カプセルは軟ゼラチンカプセルであってもよい。
【００５１】
担体は体組織または体液であってもよく、たとえば、担体は体脂肪であってもよい。
【００５２】
腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤は、液体もしくは粉末の形態または他の適した何れの形態でもよい。化学誘引物質は凍結乾燥の形態でもよい。
【００５３】
さらなる側面では、本発明は担体および腫瘍細胞の転移性播種を調節するための薬剤を含む生成物を提供し、上記では腫瘍細胞の転移性播種を調節するための薬剤は担体に含有および／または付着される。
【００５４】
生成物はここに記載するような担体を含んでいてもよく、腫瘍細胞の転移性播種を調節するための薬剤はここに記載する通りである。
【００５５】
生成物は腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤を、たとえば重量で約１０％から約９８％、好ましくは約８０％、好ましくは重量で少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％またはそれより多く含んでいてもよい。
【００５６】
生成物は、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤、たとえば捕獲剤および／または化学誘引物質を０．１ナノグラム〜１０ｍｇ含有していてもよい。好ましくは、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤、たとえば捕獲剤および／または化学誘引物質を０．１ナノグラム〜１ｍｇ、または０．１ナノグラム〜１００マイクログラム含有していてもよい。
【００５７】
腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤に加えて、本発明の生成物はさらに化学療法剤、たとえば細胞分裂停止剤を含んでいてもよい。上記で細胞分裂停止剤は、細胞の成長および増殖を阻害または抑制することのできる薬理学的に活性のある化合物である。作用機構および化合物の投与量によっては、これは細胞毒性剤であってもよい。特に、細胞分裂停止剤は、腫瘍細胞を殺傷または成長阻害することのできる化合物であり、好ましくは、この腫瘍細胞は転移性腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞、播種された腫瘍細胞または原発腫瘍から播種された何れかの細胞であってもよい。
【００５８】
細胞分裂停止剤は、たとえば下記から選択してもよい。
【００５９】
（ａ）アントラサイクリン類とその類縁体、たとえばダウノマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、バルルビシン、アクラシノマイシンおよびミトキサントロン。
【００６０】
（ｂ）代謝拮抗物質、たとえばゲムシタビン、シトシンアラビノシド、シタラビン、ビダラビン、チオグアニン、ペントスタチン、クラドリビン、メトトレキセート、フロクスウリジン、フルオロウラシルおよび他のフッ化ピリミジン、プリンまたはヌクレオシド。
【００６１】
（ｃ）アルキル化剤、たとえばシクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミドを含むナイトロジェンマスタード；カルムスチン、ロムスタチンおよびストレプトゾシンを含むニトロソウレア；ブスルファンを含むアルキルスルホネート；チオテパ；シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、サトラプラチンおよびトリプラチンテトラニトレートを含む白金化合物；プロカルバジン；ならびにアルトレタミン。
【００６２】
（ｄ）植物アルカロイドおよびテルペノイド、たとえばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビンおよびビンデシンを含むビンカアルカロイド；タキソール、パクリタキセル、ドセタキセルを含むタキサン；ならびにポドフィロトキシン。
【００６３】
（ｅ）トポイソメラーゼ阻害剤、たとえばアムサクリン、エトポシド、エトポシドホスフェート、テニポシドおよび他のエピポドフィロトキシンの誘導体；イリノテカン、トポテカンおよび他のカンプトテシン。
【００６４】
（ｆ）他の抗新生物薬、たとえばダクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、エトポシド、ブレオマイシンおよびプリカマイシン。
【００６５】
腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤を、単体でまたは他の活性剤と組み合わせて、たとえば１種以上の細胞分裂停止剤と組み合わせて使用してもよい。
【００６６】
本発明の腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤または生成物は、何れの公知の方法による投与、例として経腸投与、たとえば経口もしくは直腸内、または非経口投与、例として注入または外科手術によるものを意図していてもよい。
【００６７】
好ましい態様では、本発明の腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤または生成物は、外科手術によって使用部位に配置される。腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤または腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤に用いる担体が、３Ｄメッシュまたは足場であるならば、外科手術によって投与してもよい。
【００６８】
あるいは、本発明の腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤または生成物を注入によって使用部位に配置してもよく、この場合、担体を使用するならば、担体は注入可能でなければならず、たとえばハイドロゲルやアルギネート材でなければならない。
【００６９】
本発明の腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤または生成物は、多数の種類のがんに使用することを意図していてもよく、がんとしては、これらに制限されないが、乳がん、結腸直腸がん、膵臓がん、腎がん、前立腺がん、尿路上皮がん、食道がん、頭頸部がん、肝細胞がん、中皮腫、カポジ肉腫、卵巣がん、軟部組織肉腫、グリオーマ、メラノーマ、小細胞および非小細胞肺がん、子宮内膜がん、基底細胞癌腫、尿路の移行上皮癌腫、子宮頸がん、子宮内膜がん、胃がん、膀胱がん、子宮肉腫、多発性骨髄腫、軟部組織および骨の肉腫、胆管癌腫ならびにそこから播種されるがんが挙げられる。
【００７０】
特に、本発明の腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤または生成物は、腹膜腔のがん、たとえば胃、胆嚢、肝臓、小腸、ＧＩＳＴ、食道、腹部肉腫、軟部組織肉腫、中皮腫、卵巣、膵臓、結腸、直腸、子宮、頸部、腎がんやそこから播種されるがんに使用することを意図していてもよい。好ましい態様では、がんは卵巣がんまたはそこから播種されたがんである。がんが卵巣がんまたはそこから播種されたがんである場合には、本発明の生成物は対象の腹壁に埋め込んでもよい。あるいは、がんは結腸がんであってもよい。がんは膵臓がんであってもよい。
【００７１】
本発明はがんの転移の予防における、特に腹膜転移の予防のための使用を意図していてもよい。
【００７２】
別の側面では、本発明は、がんの治療または予防のための医薬の調製における腫瘍細胞をトラップするための捕獲剤の使用を提供する。
【００７３】
別の側面では、本発明は、がんの治療または予防のための医薬の調製における腫瘍細胞の化学誘引物質の使用を提供する。
【００７４】
好ましくは、がんの治療または予防は、腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞、播種された腫瘍細胞または原発腫瘍から播種された何れかの細胞の誘引および／またはトラップを含む。
【００７５】
好ましくは、誘引された細胞を、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤、すなわち捕獲剤および／または化学誘引物質の作用によって保持またはトラップし、その結果、それらを特定の場所に局在させて処理することができるようにする。
【００７６】
好ましくは、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤を、ここに記載するような担体に含有または付着させて提供する。いくつかの態様では、担体自体が、腫瘍細胞を誘引および／またはトラップすることが可能な、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤であって、さらなる捕獲剤および／または化学誘引物質を付与するかを任意選択できる。いくつかの態様では、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤は、３Ｄポリマー足場、ハイドロゲルまたはポロキサマーポリマーである。そのようなポリマー担体は、接着特性を有し、たとえばそのような細胞の接着し得るニッチの提供および／またはそのような細胞のホーミングのための好発部位の提供によって、腫瘍細胞をトラップすることが可能であることが見出されている。
【００７７】
腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤、すなわち捕獲剤および／または化学誘引物質は、何れの適切な薬剤であってもよく、特に前述した何れの捕獲剤および／または化学誘引物質であってもよい。一態様では、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤、すなわち捕獲剤および／または化学誘引物質は、エクソソームを含む。別の態様では、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤、すなわち捕獲剤および／または化学誘引物質は、接着分子、たとえばコラーゲンおよび／またはフィブロネクチンで修飾された、架橋されたポリカーボネートポリウレタン−ウレアのマトリックス（３Ｄ−Ｋｕｂｅ  Ｂｉｏｍｅｒｉｘ足場）を含む。
【００７８】
あるいは、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤、すなわち捕獲剤および／または化学誘引物質を、自身に、たとえば体組織に投与してもよく、その場合は効果を発揮するのに十分な期間の間保持される。本発明は１種を超える捕獲剤および／または１種を超える化学誘引物質の投与を提供してもよい。１種を超える捕獲剤および／または１種を超える化学誘引物質を同時に、逐次的にまたは別々に投与してもよい。
【００７９】
好ましくは、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤、すなわち捕獲剤および／または化学誘引物質を、単体でまたは本発明の生成物の形で、失活した器官に投与する。こうして、腫瘍細胞はこの組織に誘引されて保持されるようになり、次いで外科手術によって除去されてもよい。そのような位置によって身体のあらゆる場所から化学誘引物質が接近可能になってもよく、たとえば、本発明の生成物が新生血管を形成するようになり、その結果血液循環に化学誘引物質を到達させるようにする。
【００８０】
あるいは、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤、すなわち捕獲剤または化学誘引物質を、単体または本発明の生成物の形で、対象の脂肪に投与してもよい。
【００８１】
なおさらなる態様では、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤、すなわち捕獲剤および／または化学誘引物質を、単体または本発明の生成物の形で、対象の腹膜内へ投与して、腹膜腔に播種された転移性細胞を誘引および／または捕獲してもよい。同様に、胸膜は、肺癌腫および中皮腫または胸膜内へ播種された腫瘍細胞を治療する際に、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤、すなわち捕獲剤および／または化学誘引物質を配置させるために良好な場所であろう。
【００８２】
腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤、すなわち捕獲剤および／または化学誘引物質を、ヒトまたは非ヒト動物の脂肪内への直接注入によって投与してもよい。たとえば、腹膜の転移性細胞を誘引するために、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤、すなわち捕獲剤および／または化学誘引物質を、腹膜または周囲組織へ注入してもよく、周囲組織には脂肪組織、たとえば性腺脂肪が含まれる。
【００８３】
好ましくは、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤、すなわち捕獲剤および／または化学誘引物質は、一旦は本来の位置で、腫瘍細胞、および特に転移性腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞、播種された腫瘍細胞または原発腫瘍から播種された何れかの細胞を、誘引し集合させるかまたは「トラップさせる」。好ましい態様では、誘引された細胞は、その細胞が処理されるまで、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤、すなわち捕獲剤および／または化学誘引物質の作用によって、保持されるかまたはトラップされる。好ましくは、誘引された細胞の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれより多くが、本発明の生成物によって捕獲される。
【００８４】
誘引またはトラップした細胞を次いで処理してもよい。誘引またはトラップした細胞を、物理的に除去することによって、たとえば外科手術によって、または細胞を破壊するか不活性化するために処理することによって、たとえば化学療法または放射線療法によって、処理してもよい。担体が細胞分裂停止剤もしくは細胞毒性剤を含むか、または腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤を細胞分裂停止剤もしくは細胞毒性剤と共に投与する場合には、次いで誘引された細胞の複製を根絶または防止するように働いてもよい。
【００８５】
処理されることになる腫瘍細胞は、前述した１種以上の何れかのがんでもよく、特に、腫瘍細胞は腹膜がん、たとえば卵巣がんから派生して／播種されていてもよい。
【００８６】
別の側面によれば、本発明は、腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞、播種された腫瘍細胞または原発腫瘍から播種された何れかの細胞を対象内で誘引する方法を提供し、その方法は、腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞、播種された腫瘍細胞または原発腫瘍から播種された何れかの細胞の播種を調節するための薬剤を対象に投与することを含む。腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤は、本発明の何れかの側面の参照によって記載されているような担体に、含有されるかまたは接着されて提供されてもよい。好ましくは、誘引された細胞は、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤の作用によって保持されるかまたはトラップされる。腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤によってトラップされた後、がん細胞自体が  他のがん細胞に対する捕獲剤および／または化学誘引物質として働いてもよい。
【００８７】
別の側面によれば、本発明は、腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞、播種された腫瘍細胞または原発腫瘍から播種された何れかの細胞を対象内で誘引する方法を提供し、その方法は、腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞、播種された腫瘍細胞または原発腫瘍から播種された何れかの細胞の化学誘引物質を対象に投与することを含む。化学誘引物質は、本発明の何れかの側面の参照によって記載されているような担体に、含有されるかまたは接着されて提供されてもよい。好ましくは、誘引された細胞は、化学誘引物質の作用によって保持されるかまたはトラップされる。誘引された細胞が、トラップされた後に、次いで他のがん細胞に対する捕獲剤および／または化学誘引物質として働いてもよい。
【００８８】
別の側面によれば、本発明は、対象内で、腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞、播種された腫瘍細胞または原発腫瘍から播種された何れかの細胞を誘引する方法を提供し、その方法は、腫瘍細胞をトラップするための捕獲剤を患者に投与することを含む。捕獲剤は、ここで本発明の態様または側面に記載するような担体の形態であり、かつそこに含有されるかまたは付着する追加の捕獲剤または化学誘引物質のないものであってもよい。別の態様では、ここに提供した発明の何れかの態様または側面に記載されているようなさらなる捕獲剤の添加によって、担体を補完してもよい。誘引された細胞が、捕獲剤によってトラップされた後に、次いで他のがん細胞に対する捕獲剤および／または化学誘引物質として働いてもよい。
【００８９】
その上さらなる側面によれば、本発明は、がん、特に転移性がんを治療または予防する方法を提供し、その方法は、腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞の播種、たとえば循環腫瘍細胞、播種された腫瘍細胞または原発腫瘍から播種された何れかの細胞の播種を調節するための薬剤を、上記を必要とする患者に投与することを含む。腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤は、担体に含有または付着されていてもよい。好ましくは、治療を必要とする対象は既に原発がんと診断されており、そのがんは転移性と非転移性との両方である。好ましくは、腫瘍細胞は、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤の作用によって保持またはトラップされる。好ましくは、本法は、トラップされた細胞を処理する工程をさらに含む。
【００９０】
その上さらなる側面によれば、本発明は、がん、特に転移性がんを治療または予防する方法を提供し、その方法は、腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞、播種された腫瘍細胞または原発腫瘍から播種された何れかの細胞の化学誘引物質を、必要とする患者に投与することを含む。化学誘引物質は、担体に含有または付着されていてもよい。好ましくは、治療を必要とする対象は既に原発がんと診断されており、そのがんは転移性と非転移性との両方である。好ましくは、誘引された細胞は、化学誘引物質の作用によって保持されるかトラップされる。好ましくは、本法は、誘引された細胞を処理する工程をさらに含む。
【００９１】
その上さらなる側面によれば、本発明は、がん、特に転移性がんを治療または予防する方法を提供し、本法は、腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞、播種された腫瘍細胞または原発腫瘍から播種された何れかの細胞をトラップするための捕獲剤を、必要とする患者に投与することを含む。捕獲剤は、腫瘍細胞が接着する接着物であってもよい。捕獲剤は、ここで本発明の態様または側面に記載するような担体の形態であり、かつそこに含有されるかまたは付着する追加の捕獲剤または化学誘引物質のないものであってもよい。別の態様では、ここに提供した発明の何れかの態様または側面に記載されているようなさらなる捕獲剤の添加によって、担体を保管してもよい。好ましくは、本法は、トラップされた細胞を処理する工程をさらに含む。好ましくは、治療を必要とする対象は既に原発がんと診断されており、そのがんは転移性と非転移性との両方である。
【００９２】
いくつかの態様では、捕獲剤は、そこに含有されてまたは付着している他の捕獲剤の非存在下で投与されるポロキサマーポリマーハイドロゲルを含む。あるいは、捕獲剤は、ポリスチレンおよび／もしくはポリカプロラクトン、またはアルギネートスポンジ、または尿素架橋のあるポリカーボネートポリウレタン足場を含んでいてもよい。
【００９３】
物理的な除去、たとえば外科手術によって、または細胞を破壊もしくは不活性化するために、たとえば化学療法もしくは放射線療法により処理することによって、誘引またはトラップされた細胞を処理してもよい。担体が細胞分裂停止剤または細胞毒性剤を含む場合には、次いでこれは誘引された細胞の複製を根絶または防止するように働いてもよい。本法は、誘引された細胞を外科的に除去する工程ならびに／または誘引またはトラップされた細胞を処理するための化学療法および／もしくは放射線療法の投与を行う工程を含んでいてもよい。
【００９４】
本発明の方法は、外科手術、放射線療法および化学療法のうちの１種以上との組み合わせを含めて、現在の臨床的なシナリオとの組み合わせで使用してもよい。
【００９５】
がんは何れのがんでもよく、特に腹膜がん、たとえば卵巣がんであってもよい。
【００９６】
その上さらなる側面によれば、本発明は、対象でのがん、好ましくは転移性がんの予防または治療に使用するための医療用デバイスを提供し、デバイスは、本発明の腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤および生成物を含む。
【００９７】
当業者は、本発明の何れの態様および／または側面および／または請求項の好ましい特徴も、本発明の他のあらゆる態様および／または側面および／または請求項に適用されてもよいことを認識するであろう。
【００９８】
本発明を例のみによって以下の図を参照してより詳細にさらに記載する。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１は卵巣がん転移のマウスモデルを図示する。Ｉｎ  ｖｉｖｏの発光像は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を導入してマウス内へ腹腔内注入した１×１０6個のＳＫＯＶ３卵巣がん細胞を示す。図１Ａは、対照としてルシフェリン基質のない結果を示す。図１Ｂは、注入時の発光のパターンを示し、ＳＫＯＶ３細胞の腹腔内の播種を表す。図１Ｃ〜Ｅは、細胞注入から１週間後の発光のパターンを示し、結果は性腺脂肪および膵臓内での転移について再現性のあるパターンを示す。図１Ｅは、膵臓および性腺脂肪においてルシフェラーゼ陽性シグナルを示している器官の外植片を示す。
【図２】図２は３Ｄポリマー性足場およびエクソソームからなる本発明による生成物を図示する。図２Ａ〜２Ｃは、エクソソームを化学誘引物質として含有する構築基盤として、３Ｄ  ＩｎｓｅｒｔＴＭ−ＰＳ  Ｎａｎｏｍｅｓｈ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ（３Ｄ  Ｂｉｏｔｅｋ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）を示す（ＢおよびＣに拡大図あり）。図２Ｄおよび図２Ｅは、卵巣がん患者の腹水から超遠心分離によって精製した微小胞粒子「エクソソーム」のＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）像を示す（Ｅに拡大図あり）。図２Ｆは、赤色蛍光マーカーであるＤＩＤ（オクタデシルインドカルボシアニン）により修飾し、図２Ａ〜図２ＣのＮａｎｏｍｅｓｈ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｃａｆｆｏｌｄの内部に播種したエクソソームを示す。
【図３】図３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＳＫＯＶ３細胞の化学走性を促進するいくつかの薬剤をグラフ化して図示する。化学走性のレベルを、供試した最も強力な化学誘引物質である腹水に対するパーセンテージとして表記する。基本的には、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するＳＫＯＶ３細胞は、提示された化学誘引物質に応答して、ボイデンチャンバー内の多孔性膜（８μｍ）を通り抜けて遊走するよう誘導された。注目すべきことに、卵巣がんの患者の腹水から精製された１μｇのエクソソームは、ＦＢＳ不含培地と３Ｄ  ＩｎｓｅｒｔＴＭ−ＰＳ足場内への包埋との両方で効率的な化学走性を示した。ケモカインＥＧＦ、ＴＧＦｂ１およびＦＧＦの組み合わせは、化学走性の相乗的促進を示した。最後に、脂肪起源の間葉系幹細胞は、効率的にＳＫＯＶ３細胞の遊走を誘導することが可能であった（臍帯および骨髄起源からのＭＳＣで同様の結果が得られた）。
【図４】図４は、エクソソームがＳＫＯＶ３細胞の化学走性を促進することをさらに明示する。ＨＰＬＣによる卵巣がん患者からの腹水の分画（上方のパネル）およびＳＫＯＶ３細胞の遊走アッセイの結果、最初の４画分は化学走性を促進するための非分画の腹水の能力を保持していた（下方のパネルの各バー対の左手のバー）。超遠心分離によるエクソソームの枯渇は、腹水の分画後に、第１画分にタンパク質が完全に不在であったことによって証明された（中間のパネル）。付随した画分１の化学走性の消失によって、卵巣がん患者の腹水から精製されたエクソソームの化学走性を促進する能力が明らかにされた。
【図５】図５は、担体中の腹水エクソソームへの応答におけるＳＫＯＶ−３転移性細胞の播種の改変されたパターンを図示する。図（ＡおよびＢ）は、腹水エクソソームを有する足場の、転移性腫瘍細胞の播種を調節する能力に関するｉｎ  ｖｉｖｏ評価を提供する。図５Ａは、腹腔内注入の１週間後に、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する１×１０６個のＳＫＯＶ３細胞が性腺脂肪および膵臓に転移を発生させたことを示す（図５Ａに挿入）。図５Ｂは、５０μｇの腹水エクソソームを有する足場を腹壁の対側に移植することによって、ＳＫＯＶ３細胞の転移性播種が防止され、性腺脂肪および膵臓の転移巣の完全な消失と足場／トラップの内部および周囲のＳＫＶＯ３細胞の配置とを伴っていたことを示す（図５Ｂに挿入）。図５Ｃは、健常人の血液から精製したエクソソームを使用した時に同じ結果が見られることを示す。
【図６】図６は、エクソソームを伴うＳＫＯＶ−３転移性細胞の播種の改変されたパターンを図示する。図は、ＰＢＳおよびマトリゲルに再懸濁したエクソソームが足場非存在下で転移性腫瘍細胞の播種を調節する能力に関するｉｎ  ｖｉｖｏ評価を提供する。図６Ａでは、エクソソームを性腺脂肪内に注入して１週間後に、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する１×１０6個のＳＫＯＶ３細胞を腹腔内注入した。図６Ｂは、ＳＫＯＶ３細胞の注入の７日後にマウスを屠殺した時に発光によって評価した腫瘍細胞のパターンを図示する。ＳＫＯＶ３細胞は、対照の転移パターンに比べると、エクソソームを埋め込んだ性腺脂肪に限局して局在しており、膵臓には転移巣がなかった（図５Ａまたは７Ｂを参照）。図６Ｃは、貯留槽としてエクソソームをマトリゲルに包埋し、性腺細胞に注入した時に同様の結果が見出されたことを示す。
【図７】図７は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を化学誘引物質および／または捕獲剤として伴うＳＫＯＶ−３転移性細胞の播種の改変されたパターンを示す。図は、ＭＳＣを伴う足場が転移性腫瘍細胞を誘引して捕獲する能力に関するｉｎ  ｖｉｖｏ評価を提供する。図７Ａでは、脂肪のＭＳＣを３Ｄ足場内に播種して、膵臓に対向する腹壁内に外科的に埋め込んだ。腹腔内注入から１週間後に、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する１×１０6個のＳＫＯＶ３細胞は、図７Ｂに図示するように性腺脂肪および膵臓に転移を発生させた。図７Ｃでは、マウスに、５０，０００個のａＭＳＣを伴う足場を腹壁の対側部に埋め込んだ。このことは、ＳＫＯＶ３細胞の転移性播種を防止し、かつ性腺脂肪および膵臓の転移巣の完全な消失ならびに足場および化学誘引物質の内部のＳＫＶＯ３細胞の配置を伴うという効果があった。足場および化学誘引物質はまた、時にはトラップと称される。
【図８】図８は、エクソソームを化学誘引物質および捕獲剤として伴うＨＣＴ１１６およびＩｓｈｉｋａｗａの転移性細胞の播種の改変されたパターンを図示する。図は、エクソソームを有する足場が転移性腫瘍細胞を誘引して捕獲する能力に関するｉｎ  ｖｉｖｏ評価を提供する。図８Ａは、腹腔内注入から１週間後に、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する１×１０6個のＨＣＴ１１６結腸がん細胞が、主に肝臓および膵臓に転移を発生させ、いくらかの細胞の性腺脂肪への転移を伴ったことを示す。図８Ｂは、腹壁の対側部にエクソソームを有する足場を埋め込んだことが、ＨＣＴ１１６細胞の転移性播種を防止し、肝臓および膵臓の転移巣の完全な消失ならびに足場／トラップの内部および周囲のＨＣＴ１１６細胞の配置を伴ったことを示す。同様に、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞は、化学誘引物質の非存在下で膵臓に優先的に播種されるが（図８Ｃ）、一方、エクソソームを有する足場の存在下で腹腔内注入された時には、大部分がトラップ（足場および周囲域）に誘引および／または捕獲されて内部に配置された（図８Ｄ）。
【図９】図９は、間葉系幹細胞を伴う３Ｄ  ＩｎｓｅｒｔＴＭ−ＰＳ  Ｎａｎｏｍｅｓｈ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ（３Ｄ  Ｂｉｏｔｅｋ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）の播種の概略図である。足場はポリスチレンおよびポリカプロラクトンで作られる。
【図１０】図１０は、エクソソームが３Ｄ−Ｂｉｏｔｅｋ足場への腫瘍細胞の接着能を向上させることを示す。ＳＫＯＶ３細胞の接着能を短期および長期の接着アッセイにて評価した。（ａ）短期の接着アッセイには、前処理した９６ウェル培養プレートに、カルセインで標識した５０，０００個のＳＫＯＶ３細胞を播種し、１時間後に細胞を洗浄して、プレートに接着したそれらを蛍光によって定量した。ウェルの前処理を以下のように行った。すなわち、エクソソームを用いて、受動的な吸収によりウェルプレートの底を一晩修飾した。あるいは、ＣＤ９およびＣＤ８１に対する抗体を用いてエクソソームを１時間処理し、テトラスパニン認識部位をブロックした。最後に、腫瘍細胞の接着を避けるために、エタノール中のポリヘマ（２０ｍｇ／ｍｌ）を使用してウェルの底を覆った。（ｂ）長期の接着アッセイには、３Ｄ−Ｂｉｏｔｅｋ足場を上述のように前処理し、さらに空の足場を１００ｎｇのＣＤ９（空の足場＋ＣＤ９）とＣＤ８１（空の足場＋ＣＤ８１）の両方で修飾することを含めた。ここでの「Ｍ−Ｔｒａｐ」の呼称は、エクソソームで修飾された３Ｄ−Ｂｉｏｔｅｋ足場［ポリスチレン／ポリカプロラクトンの３Ｄ  ｉｎｓｅｒｔ  ｗｉｔｈ  ｎａｎｏｍｅｓｈ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．３ｄｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｗｅｂ／ｐｒｏｄ＿３ｄｎａｎｏｍｅｓｈ．ａｓｐｘ）からなる］を指す。次いで足場を３５ｍｍ培養プレートに配置し、２００，０００個のカルセイン標識ＳＫＯＶ３細胞を播種して、３７℃で一晩、振盪器の利用による軌道運動に供した。足場を回収して、異なる条件下で捕獲されたＳＫＯＶ３の量を蛍光によって定量した。（ｃ）濃度を増加させた（１０ｎｇ、５０ｎｇおよび１００ｎｇ）両方のタンパク質（ｃｄ９およびｃｄ８１）で４℃で一晩、ならびに異なる濃度のエクソソーム（１０μｇ、５０μｇおよび１００μｇ）で前培養した足場を用いて、（ｂ）と同様に行った接着アッセイ。（ｄ）動的な条件でのＭ−Ｔｒａｐへの接着を、カルセイン標識したＳＫＯＶ３細胞に定常流速（７５０ｕｌ／分、補足図２を参照のこと）を発生させる灌流ポンプを利用してさらに評価した。Ｍ−Ｔｒａｐ、空の足場および接着を避けるためにポリヘマで前処理した空の足場を、ＳＫＯＶ３細胞の流れに１時間供して、捕獲されたＳＫＯＶ３細胞を蛍光によって定量した。
【図１１】図１１は、ここでは（および図１０の参照により上述したように）Ｍ−Ｔｒａｐと呼ばれている本発明によるデバイスが、卵巣性腹膜転移のｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルで効率良く転移性ＳＫＯＶ３細胞を捕獲することを示す。（ａ）マウスの腹膜内器官および膵臓に対向するＭ−Ｔｒａｐの配置の図解。（ｂ）ルシフェラーゼタンパク質を発現する１００万個のＳＫＯＶ３細胞をマウスに腹腔内注入し、１週間後、屠殺前にマウスにルシフェラーゼの基質としてルシフェリンを注入した。ＩＶＩＳ技術（Ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステム）を使用すると、細胞は本来の転移部位（膵臓および性腺脂肪体）に局在していた。空の足場（ｃ）およびＭ−Ｔｒａｐデバイス（ｄ）を腹膜の内壁に外科的に埋め込んで、１週間後に、ルシフェラーゼタンパク質を発現するＳＫＯＶ３細胞を腹腔内に注入した。１週間後、ＳＫＯＶ３細胞の転移のパターンを（ｂ）の通りに解析した。カラースケールは細胞の量に相当し、生物発光シグナルを基準としている。注目すべきことに、卵巣性腹膜転移の本来のパターンが、空の足場への接着によって徐々に調節され、Ｍ−Ｔｒａｐ技術によって完全に再構築された。
【図１２】図１２は、ポリスチレン／ポリカプロラクトン３Ｄ  ｉｎｓｅｒｔｓ  ｗｉｔｈ  ｎａｎｏｍｅｓｈからなる３Ｄ−Ｂｉｏｔｅｋ足場へのＳＫＯＶ３細胞の接着が調節されることを示す。（ａ）細胞接着を避けるためにポリヘマ（エタノール中に２０ｍｇ／ｍｌ）を用いて前処理した空の足場を、外科用接着剤を利用して腹膜の内壁に埋め込んだ。１週間後、ルシフェラーゼタンパク質を発現するＳＫＯＶ３細胞を腹腔内に注入し、１週間後にマウスを屠殺して、ＩＶＩＳ技術（Ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステム）を使用してＳＫＯＶ３細胞の転移を可視化した。（ｂ）ＣＤ８１タンパク質と共に４℃で一晩培養した空の足場を使用して、同様のアッセイを行った。
【図１３】図１３は、卵巣がんの腹水からの初代培養に応答した腹膜転移の調節を示す。Ｍ−ｔｒａｐに使用されているポリスチレン／ポリカプロラクトン足場に加えて、いくつかの足場を供試して、生体材料の種類とは無関係に腹膜転移のパターンを再構築する能力を確認した。パネルは、ＤｉＤで標識した卵巣がんの腹水から発生させた初代培養によって行った、同様のｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ（右上のパネル）を示しており、Ｍ−Ｔｒａｐポリスチレン／ポリカプロラクトン足場および代替の足場（Ｂｉｏｍｅｒｉｘ  ３Ｄ  Ｓｃａｆｆｏｌｄは右中央のパネル、ＡｌｇｉＭａｔｒｉｘ  ３Ｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍは右下のパネル）の効率を、関連の臨床試料に置き換えるためのものである。供試した全試料が、生体材料とは無関係に効率良く転移性腫瘍細胞を捕獲した。
【図１４】図１４は、フィブロネクチンおよびコラーゲンが本発明の生成物中の有効な捕獲剤であること、およびどちらも足場への細胞接着を亢進することを明示する。この例では、ポリスチレン／ポリカプロラクトン足場を使用した。
【図１５】図１５は、それ自体の上にポリマープルロニックで作られたハイドロゲルが転移性がん細胞の有効な捕獲剤であることを明示している。
【図１６】図１６ＡおよびＢは、マウス卵巣がんモデルで、本発明のトラップ、言い換えればエクソソームおよびＢｉｏｍｅｒｉｘ  ３Ｄ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ（尿素架橋されたポリカーボネートポリウレタン−ウレアマトリックスから作られる）を含むものを、対象の生存期間を延長するのに使用することができることを明示している。図１６ＣおよびＤは、転移性ＳＫＯＶ３細胞の完全な根絶を伴って、マウスモデルの腹膜腔から本発明のトラップを除去することができることを示す。
【０１００】
材料および方法
エクソソームの精製および特徴付け。
【０１０１】
Ｓａｎｔｉａｇｏ  ｄｅ  Ｃｏｍｐｏｓｔｅｌａ大学病院で卵巣腺癌腫と診断された患者の腹水からのエクソソームを超遠心分離によって精製した。端的に述べれば、細胞と残骸をペレットにするために、腹水３６ｍｌを３００ｇで１０分間、２，０００ｇで２０分間、１０，０００ｇで３０分間連続的に遠心分離した。上清を２２マイクロメートル孔径のシリンジフィルターで濾過し、さらに１００，０００ｇで９０分間遠心分離した（ＳＷ８０ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。得られたペレットをリン酸緩衝食塩水１００ｕｌに再懸濁し、等分して−２０℃で保存した。エクソソームの定量は、エクソソームタンパク質を溶解し、ナノドロップおよびブラッドフォードアッセイによって行った。エクソソームのサイズを、２５℃で９０°の検出角度およびレーザードップラー流速測定を用いてそれぞれ解析した（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ３０００ＨＳ  Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。エクソソームの形態を、ナノ粒子水性懸濁液１０μＬを使用して透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって評価した。
【０１０２】
トラップデバイス
担体および腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤を含む本発明の生成物、または担体のない腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤はまた、腫瘍細胞を「トラップ」するのに役立つため、ここではトラップデバイスまたはトラップまたはＭ−ｔｒａｐと称する。一例では、トラップデバイスは、単離したエクソソームをＤＩＤ（オクタデシルインドカルボシアニン）という赤い蛍光マーカーを用いて標識し、それらを３Ｄ  ＩｎｓｅｒｔＴＭ−ＰＳ  ｗｉｔｈ  Ｎａｎｏｍｅｓｈ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ（３Ｄ  Ｂｉｏｔｅｋ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）の内部へ滴下することによって作られる。麻酔したマウス内へ、エクソソームを有する足場を外科的開腹術によって埋め込み、外科用接着剤を利用して腹壁の表面に付着させた（ＳｕｒｇｙＳｅａｌ  Ｆｉｂｒｉｎ  Ｓｅａｌａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ；ＢｉｏＳＴＡＲ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｃａｎａｄａ）。
【０１０３】
あるいは、トラップデバイスは、マウスへの移植の２４時間前に、製造者の指示書に従ってキャピラリーによって３Ｄ足場内へ播種される、脂肪起源の５００００個の間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ  Ａｄｉｐ  Ｐ１０７６３  Ｉｎｎｏｐｒｏｔ，  Ｂｉｚｋａｉａ，  Ｓｐａｉｎ）を使用して作られる（図９の図解を参照のこと）。３Ｄ足場は３Ｄ  ＩｎｓｅｒｔＴＭ−ＰＳ  ｗｉｔｈ  Ｎａｎｏｍｅｓｈ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ（３Ｄ  Ｂｉｏｔｅｋ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）である。
【０１０４】
ここでの「Ｍ−Ｔｒａｐ」の呼称は、ポリスチレン／ポリカプロラクトン３Ｄ  ｉｎｓｅｒｔｓ  ｗｉｔｈ  ｎａｎｏｍｅｓｈからなる３Ｄ−Ｂｉｏｔｅｋ足場（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．３ｄｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｗｅｂ／ｐｒｏｄ＿３ｄｎａｎｏｍｅｓｈ．ａｓｐｘ）を指し、典型的には、Ｍ−Ｔｒａｐは、腫瘍細胞の播種を調節するための薬剤、たとえば捕獲剤または化学誘引物質を用いて修飾されている。
【０１０５】
マウスモデル
ルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定的に発現している１×１０6個のＳＫＯＶ３細胞をリン酸緩衝食塩水２００ｍｌに再懸濁し、マウスの腹膜に注入した。注入から１週間後、ルシフェリン基質を腹腔内注入によってマウスに投与し、屠殺後に、ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ＣＴ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍでの発光イメージングを使用して、マウスの腹膜内へのＳＫＯＶ３細胞の転移のパターンを決定した。
【０１０６】
ＳＫＯＶ３細胞は、卵巣腺癌腫の腹水から派生した上皮細胞である（より多くの情報はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ＡＴＣＣＡｄｖａｎｃｅｄＣａｔａｌｏｇＳｅａｒｃｈ／ＰｒｏｄｕｃｔＤｅｔａｉｌｓ／ｔａｂｉｄ／４５２／Ｄｅｆａｕｌｔ．ａｓｐｘ？ＡＴＣＣＮｕｍ＝ＨＴＢ−７７＆Ｔｅｍｐｌａｔｅ＝ｃｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ）。
【０１０７】
使用したマウスは６〜８週齢のＳＣＩＤの雌である。
【０１０８】
本発明の目的は、腫瘍細胞を捕獲し得る生成物／トラップデバイスを提供することにあり、生成物またはトラップデバイスは、腫瘍細胞を誘引することが可能な強力なシグナル伝達器としても働く。この生成物は腫瘍細胞のトラップを代表しており、腫瘍細胞の播種を調節することによって、この生成物（トラップ）は、望まない場所での転移巣の発生を防ぐことになる。
【０１０９】
結果
卵巣がんモデル
ここで提示するデータは、本発明の生成物／トラップが、腫瘍播種を模した卵巣がんモデルでがんの転移を調節し得るということを証明する。本モデルでは、注入の１週間後に膵臓および性腺脂肪の病巣に再現性のある転移のパターンを発生させるマウスへ、１×１０6個のＳＫＯＶ３卵巣がん細胞を腹腔内注入した（図１）。
【０１１０】
転移性腫瘍細胞を捕獲／トラップするために使用する本発明の生成物は、３Ｄ  ＩｎｓｅｒｔＴＭ−ＰＳ  ｗｉｔｈ  Ｎａｎｏｍｅｓｈ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ（３Ｄ  Ｂｉｏｔｅｋ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）からなるＭ−Ｔｒａｐであり、子宮がん患者の腹水から精製したエクソソーム５０μｇを含有していた（図２）。
【０１１１】
ＳＫＯＶ３細胞を誘引してトラップするためのエクソソームの能力は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのボイデンチャンバー遊走アッセイで明らかになった。端的に述べれば、５０，０００個のＳＫＯＶ３細胞を上部の隔室に播種し、エクソソームをボイデンチャンバーの下部の隔室に配置した。２４時間の培養後に、エクソソームの化学誘引の勾配に起因して、多孔性膜を通り抜けて遊走しているＳＫＯＶ３細胞の数を定量した。図３に示すように、エクソソームは、何の化学誘引物質もない対照の培養培地に比べてＳＫＯＶ３細胞を効率的に誘引した。これらの結果から、エクソソームは腫瘍細胞の効率の良い化学誘引物質であり、誘引された細胞を捕獲し得ると結論付けられた。
【０１１２】
ＳＫＯＶ３細胞を捕獲するためのエクソソームの能力は、動物モデルを使用してｉｎ  ｖｉｖｏで明らかにされたが、そこでは、本発明の生成物またはＭ−Ｔｒａｐは、足場およびエクソソームからなっていた。これらの実験は、本発明の生成物が転移性腫瘍細胞を捕獲することが可能であるということを明示した。実験では、注入の効率を観察するために、および転移の形成をｉｎ  ｖｉｖｏで追跡調査するために、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現している１×１０6個のＳＫＯＶ３細胞をマウスの腹腔内へ注入した。足場の存在および非存在下でエクソソームを腹壁の対側部に埋め込まれるようにマウスへ注入した。膵臓はこのモデルでの本来の転移巣の１つとみなされた。エクソソームを有する足場を、外科用接着剤（ＳｕｒｇｙＳｅａｌ  Ｆｉｂｒｉｎ  Ｓｅａｌａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ；ＢｉｏＳＴＡＲ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｃａｎａｄａ）を利用して開腹により腹膜内に埋め込み、外科手術の１週間後にＳＫＯＶ３細胞を注入した。図５に示すように、腹腔内に注入したＳＫＯＶ３細胞は膵臓および性腺脂肪に転移巣を発生させ（図５Ａ）、化学誘引物質および／または捕獲剤としてエクソソームを含有する足場／トラップの内側および周囲には、ＳＫＯＶ３細胞の独特の局在が見出された（図５Ｂ）。
【０１１３】
これらの結果は、本発明のトラップ／生成物が腫瘍細胞の播種に干渉し、独特の局在に転移性細胞を誘引して捕獲し、その結果、転移を防止することが可能であることを明らかにした。
【０１１４】
足場とは無関係に腫瘍細胞の播種を調節することによる、腫瘍細胞を誘引しトラップして転移巣の成長を防止するためのエクソソームの効能をさらに明らかにするために、マウスの性腺脂肪内へ注入したエクソソームの存在下での転移性卵巣がん播種のｉｎ  ｖｉｖｏモデルを考案した。このため、卵巣がん患者の腹水から精製したエクソソームをＰＢＳ１００μｌに再懸濁し（エクソソーム１５ｍｇ／ｍｌ）、腹膜手術を行ってマウスの子宮の基部に位置する脂肪（図６Ａの性腺脂肪）にエクソソーム溶液を注入した。この場合、脂肪がエクソソームの担体に相当する。１週間後、１×１０6個のＳＫＯＶ３細胞を腹腔内注入し、７日後にマウスを屠殺して転移性播種のパターンを解析した。図６Ｂに示すように、性腺脂肪に局在したエクソソームは、全てのＳＫＯＶ３細胞を誘引してトラップすることが可能であり、膵臓の転移巣を取り除いた（図５Ａまたは７ＢのＳＫＯＶ３細胞の播種の通常のパターンを参照のこと）。同様の結果は、エクソソームに半固体の粘稠性を与える細胞外マトリックスであるマトリゲル（商標）に、精製エクソソームを包埋した場合に得られた（図６Ｃ）。エクソソームを有するマトリゲルは、エクソソームを有する足場の代替として考えることができる。
【０１１５】
腫瘍細胞の播種を調節するための他の薬剤を用いて本発明の生成物／トラップデバイスが腫瘍細胞を誘引および／またはトラップする有効性を評価するために、エクソソームの代替として間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を播種した３Ｄ足場を含む生成物を考案した。転移性細胞の播種を調節するためのＭＳＣの能力を試験するために、マウスの腹壁内への埋め込みの２４時間前に、脂肪起源からの５０，０００個のＭＳＣを含むトラップデバイスを３Ｄ  Ｂｉｏｔｅｋ足場に播種した（図７Ａ）。前回の実験のように、この代替の生成物の埋め込みの７日後に、１×１０6個のＳＫＯＶ３細胞を腹腔内に注入し、１週間後にマウスを屠殺して転移性播種のパターンを解析した。前記の図のように、このモデルでのＳＫＶＯ３細胞の播種の通常のパターンは、膵臓と性腺脂肪の転移巣にある（図７Ｂ）。しかし、３Ｄ足場内にあるＭＳＣからなる生成物は、ＳＫＯＶ３細胞を効率良く誘引した（図７Ｃ）。これらの結果により、生成物／トラップデバイスが、使用した腫瘍細胞の播種を調節するための異なる薬剤を用いて転移性腫瘍細胞をトラップする能力が裏付けられた。
【０１１６】
結腸および子宮内膜がんモデル
本発明の生成物／トラップデバイスががんの型とは無関係に腫瘍細胞の播種を調節する有効性を評価するために、卵巣腫瘍細胞ではなく、結腸（ＨＣＴ１１６）および子宮内膜（Ｉｓｈｉｋａｗａ）起源の腫瘍細胞を使用して、３ＤＢｉｏｔｅｋ足場とエクソソームとを用いた実験を再度行った。これらの２つの型のがんにもまた、腹膜内での腫瘍細胞の播種が存在する。
【０１１７】
膵臓に対向する腹壁に、エクソソームを有する足場を記載のように埋め込んだ（図５、図７）。外科手術の１週間後、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定的に発現している１×１０6個のＨＣＴ１１６またはＩｓｈｉｋａｗａ細胞を腹腔内注入し、注入の７日後にマウスを屠殺して、腫瘍細胞の播種と腹膜転移のパターンとを発光によって評価した。並行して、マウスにＨＣＴ１１６およびＩｓｈｉｋａｗａ細胞を足場なしで注入して、通常の転移のパターンを証明した。図８に示したように、結腸ＨＣＴ１１６腫瘍細胞は、主に膵臓および肝臓に転移するが（図８Ａ）、一方で子宮内膜Ｉｓｈｉｋａｗａ腫瘍細胞の播種は、優先的に独特の転移巣を膵臓にもたらした（図８Ｃ）。ＳＫＯＶ３卵巣がん細胞を用いて観察された通り、これらのモデルでは、膵臓は、腹膜播種に関連する転移が成長するための好発部位に相当する。さらに、卵巣腫瘍細胞の場合、細胞型特異的な指向性には性腺脂肪が含まれており、結腸腫瘍細胞の場合には肝臓が含まれていた。
【０１１８】
卵巣がんを用いた場合のように、エクソソームを有する足場の存在下でＨＣＴ１１６とＩｓｈｉｋａｗａ細胞の両方を注入した場合に、転移性播種のパターンは完全に改変される。圧倒的多数の細胞が足場の内部および周囲に局在化されるが、このことは、エクソソームを化学誘引物質として含有する３Ｄ足場からなるトラップデバイスが、ＨＣＴ１１６結腸がん細胞（図８Ｂ）およびＩｓｈｉｋａｗａ子宮内膜腫瘍細胞（図８Ｄ）を効率良く誘引してトラップする能力を明らかにした。これらの結果は、本発明の生成物／トラップデバイスが、がんの型とは無関係に転移性腫瘍細胞を誘引およびトラップすることが可能であることを明らかにする。
【０１１９】
本発明の生成物は移植のための優先的なニッチとして働き、腹膜の転移性細胞を効率良く捕獲する
Ｍ−Ｔｒａｐ（上記のようにエクソソームで修飾した３Ｄ−Ｂｉｏｔｅｋ足場）を使用して例示される本発明の生成物が、非薬理学的デバイスとしても機能することができるか否かを確かめるために、かつ生成物の１つの作用機序が、転移性腫瘍細胞の優先的な着床（または捕獲）を支援するものであることを明らかにするために、細胞接着アッセイをｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で行った。まず、短期間の接着アッセイを、Ｍ−Ｔｒａｐ足場と同じポリスチレン材料で作られたウェルにカルセイン標識したＳＫＯＶ３細胞を播種して、３７℃で１時間培養した後に洗浄し、次いでウェルの底に付着したＳＫＯＶ３を蛍光により定量することによって行った。図１０Ａに示すように、ＳＫＯＶ３細胞は、ウェルの底を修飾するエクソソームの存在下では、さらに高い接着能を呈した。さらに、エクソソームへのＳＫＯＶ３細胞の接着は、同定済みの２つのエクソソームタンパク質に対する抗体によって部分的に消失した。細胞接着を媒介することを既に記載したこれらのエクソソームタンパク質は、テトラスパニンのＣＤ９およびＣＤ８１であり、このことはＳＫＯＶ３細胞の接着を媒介するエクソソームの具体的な役割を示している（図１０Ａ）。次に、腹膜腔内での腹水の本来の流れは、重力によってその最も依存的な部位へ向かい、遊離した腫瘍細胞に体腔間播種性の経路を提供するが（Ｔａｎら，  Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．  ２００６；７：９２５−３４）、この流れをｉｎ  ｖｉｔｒｏで模することを狙いとして、軌道運動に供したＭ−ＴｒａｐデバイスへのＳＫＯＶ３細胞の接着を評価した（図１０Ｂ）。これらの動力学的な条件下では、足場ならびに接着を避けるためにポリヘマで前処理された足場への接着に比較して、エクソソームの存在下でＳＫＯＶ３細胞の優先的な移植が亢進された（図１０Ｂ）。さらに、ＣＤ９およびＣＤ８１タンパク質を用いた修飾によって、空の足場によるＳＫＯＶ３細胞の捕獲を亢進することができたが（図１０Ｂ）、Ｍ−Ｔｒａｐによる捕獲は抗ＣＤ９または抗ＣＤ８１抗体によるエクソソームの封鎖によって減少した（図１０Ｂ）。また、これらの２つのタンパク質を有する空の足場の修飾によって、エクソソームの増量と同様に、投与量依存的に接着特性が亢進された（図１０Ｃ）。最後に、ポリヘマで前処理した足場およびしないものならびにＭ−Ｔｒａｐ技術に対するＳＫＯＶ３細胞の動力学的な接着を、足場を配置したチャンバー内へ定常流速７５０μｌ／分の懸濁液状の腫瘍細胞を押し出すという灌流条件下でさらに調査した。図１０Ｄに示すように、接着特性に起因する足場内へのＳＫＯＶ３細胞の基本捕獲は、エクソソームの存在下でさらに高められた。これらの結果から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、Ｍ−Ｔｒａｐ技術の接着能は、腫瘍細胞を捕獲するための作用機序として機能すること、すなわち、３Ｄ−Ｂｉｏｔｅｋ足場へのＳＫＯＶ３細胞の基本接着は、精製されたエクソソームを用いてもエクソソーム性接着タンパク質であるＣＤ９およびＣＤ８１を用いても亢進されることが結論付けられる。さらに、卵巣がん転移で腹膜腔に存在する体腔間播種性の播種を模した軌道流は、転移性腫瘍細胞のＭ−Ｔｒａｐでの通過と接触を促進する可能性��あり、それゆえ効率を高める。
【０１２０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで特徴付けた後、卵巣がん播種および腹膜転移を模した、ＳＫＯＶ３細胞を腹腔内注入したｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルに、Ｍ−Ｔｒａｐのこの作用機序を移すための実験に着手した。このため、腹膜の内壁でかつ膵臓の対向側に（図１１Ａの図解）Ｍ−Ｔｒａｐを外科的に埋め込んで、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定的に発現する１×１０6個のＳＫＯＶ３細胞を１週間後に注入した。腹腔内注入から１週間後に動物を屠殺し、生物発光によって播種のパターンを評価した。足場が非存在の腹膜転移のパターンは２つの主要な病巣を膵臓および性腺脂肪体に呈した（図１１Ｂ）。一方、エクソソームを有さない空の足場の存在下では、ＳＫＯＶ３細胞の追加の病巣が足場内に観察されたが（図１１Ｃ）、このことにより、転移性腫瘍細胞を接着するための足場の能力はｉｎ  ｖｉｖｏモデルに移された。注目すべきことには、Ｍ−Ｔｒａｐデバイスの存在下での転移性卵巣腫瘍細胞の播種のパターンは、完全に再構築／調節されており、定型の位置の転移が根絶されて、エクソソームを有する足場の内部に独特の病巣を呈していた（図１１Ｄ）。
【０１２１】
さらに、ポリヘマを用いた前処理によって空の足場の接着能が制限された際には、転移性ＳＫＯＶ３細胞を捕獲する能力の減少が観察された（図１２Ａ）。逆に、テトラスパニンＣＤ８１で修飾されることによって足場の接着能が亢進された時に、転移性ＳＫＯＶ３細胞を捕獲する能力が上昇したことは、膵臓転移が取り除かれたことによって証明された（図１２Ｂ）。同様の結果は、ＣＤ９テトラスパニンを用いて足場を修飾することによって得られた（データ示さず）。これらの結果から結論付けられるのは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータに類似して、転移性ＳＫＯＶ３細胞の捕獲をもたらす段階的な足場の接着能を観察することができるが、ポリヘマで前処理した足場では、おそらくは生体材料に対する異物炎症反応のために残余の接着を明示し、関連の埋め込まれた３Ｄ−Ｂｉｏｔｅｋ足場への接着は、ＣＤ９またはＣＤ８１テトラスパニンの修飾によってさらに高められ、精製したエクソソームを用いると、転移のパターンが完全に再構築されるということである。全体的には、これらの結果は卵巣腹膜転移のｉｎ  ｖｉｖｏモデルに当てはまるが、このことは、播種された腫瘍細胞を捕獲するためのＭ−Ｔｒａｐまたは本発明のトラップの能力を明示するが、そこでは、トラップは強力で人工的な前転移性ニッチとして主に働き、腹膜中で循環する転移性細胞は、転移着床の本来の部位への競争において優先的に接着する可能性がある。
【０１２２】
図１４はさらに、マウスモデルの腹膜を介して播種される転移性ＳＫＯＶ３細胞を捕獲するための、本発明によるトラップの能力を明示する。この図では、フィブロネクチンおよびコラーゲンで修飾された３Ｄ−Ｋｕｂｅ  Ｂｉｏｍｅｒｉｘ足場（足場は、非吸収性かつ網状の架橋されたポリカーボネートポリウレタン−ウレアマトリックスで作られている）が卵巣性腹膜転移のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいてＳＫＯＶ３細胞を捕獲することが示されている。
【０１２３】
図１５はまた、トラップが足場を含む場合に、マウスモデルの腹膜を介して播種される転移性ＳＫＯＶ３細胞を捕獲するための、本発明によるトラップの能力を明示する。この図では、ポロキサマーで作られ、かつプルロニックとして知られるハイドロゲルをトラップとして使用した。空の３Ｄ−Ｂｉｏｔｅｋ足場を低温でハイドロゲルにより満たすことによってトラップを作成し、液体の形態を保つようにした。次いで温度を上げて重合化し、ハイドロゲルを凝固させた。凝固したハイドロゲルを次いでマウスの腹膜内へ導入した。図１５に観察されるように、この代替の非生物学的トラップは、エクソソームのように効率良く転移性細胞を捕獲することができた。
【０１２４】
転移のパターンを再構築するため、および播種された疾患を限局化された疾患に転換するための、Ｍ−Ｔｒａｐおよび本発明による他の生成物／トラップの効率性は、結腸直腸および子宮内膜がんでの腹膜転移の同様のモデルでさらに明らかにされた。どちらも、肝性、全身血液性およびリンパ性の拡散に加えて、臨床的には腹膜腔を介して播種する腫瘍である（図１３）。同様に、卵巣がん患者の腹水から単離した初代培養は、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルに腹腔内注入した際に、Ｍ−Ｔｒａｐ／トラップデバイス内に効率良く捕獲され（図１３）、このことによってさらに、転移性細胞を捕獲するための本発明の可能性が関連の臨床試料に当てはまる。最後に、多孔性のアルギネート構築基盤（ＡｌｇｉＭａｔｒｉｘ（商標）  ３Ｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｇｉｂｃо（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）または生物的に統合された足場（Ｂｉｏｍｅｒｉｘ  ３Ｄ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ（商標）；Ｂｉｏｍｅｒｉｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）に包埋されたエクソソームは、腹腔内注入されたＳＫＯＶ３細胞を効率良く捕獲するが（図１３）、このことは、本発明の受容性が足場非依存的であることを明示する。これら全ての結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて、本発明によるトラップデバイスが腫瘍細胞を捕獲する能力、足場内のエクソソームが腹膜を介して播種する転移性腫瘍細胞のホーミングのための好発部位を発生させることを明示する。
【０１２５】
本発明によるトラップは卵巣転移モデルで生存を改善する
卵巣がんの腹膜癌腫症を模した動物モデルにおける本発明によるトラップの生存への影響を調査した。動物の対照群には２．５×１０6個のＳＫＯＶ３細胞を腹腔内に注入して、エクソソームを有する足場を予め埋め込んだ動物の群（Ｍ−Ｔｒａｐ群）と比較した。疾患の進行段階での有病率の増加ならびに動物の行動および性能の状態について動物を調査し、エンドポイントを２５％の体重の低下と定義した。Ｍ−Ｔｒａｐ技術のない場合、マウスはＳＫＯＶ３細胞注入後およそ１００日で体重を失い始め、４カ月でエンドポイントに達して屠殺されざるを得なかったが、Ｍ−Ｔｒａｐ技術を埋め込まれたマウスの体重は、１５０日目で低下を始め、有意な生存の累積を呈した（ｐ＝０．０２５、図１６Ａ）。これらの結果は、卵巣がんの腹膜転移性播種を模した動物モデルにおける本発明のトラップ技術の臨床上の優位性を明確に示していた。
【０１２６】
注目すべきことには、Ｍ−Ｔｒａｐ群での腹膜転移の分布を解析した際に、腫瘍塊は足場内での成長を見出されたのみであった。足場の組織学的検査では、腹膜の右側に足場内の線維芽細胞の浸潤性成分および卵巣性腫瘍細胞の着床（図１６Ｂ）があり、かつそれらが転移性腫瘍細胞の誘引および捕獲に有意な影響を何ら及ぼすことがないことが示された。これらの結果はさらに、転移性腫瘍細胞を捕獲すること、および全身性の疾患を限局的な疾患に転換することを狙いとする適正な技術として、本発明のトラップ技術を補強するものである。
【０１２７】
Ｍ−Ｔｒａｐの外科的除去
さらに現実的な臨床のシナリオにおける本発明のトラップ技術の影響を評価するために、エクソソームを有する足場（Ｍ−Ｔｒａｐ）を用いて処理した動物に、卵巣性の転移性細胞を捕獲した後、足場を外科的に除去した。この実験では、先に記載したようにＭ−Ｔｒａｐデバイスを外科的に埋め込み、１週間後に２．５×１０6個のＳＫＯＶ３細胞を腹腔内注入した。注入の１カ月後、転移性腫瘍細胞が捕獲されてＭ−Ｔｒａｐ内の腫瘍塊が証明された時に（図１６Ｃの左パネル）、足場を除去してマウスを追跡調査した。図１６Ｃの右パネルに観察されるように、Ｍ−Ｔｒａｐデバイスの除去によって、腹膜腔からの転移性ＳＫＯＶ３細胞の完全な根絶がもたらされた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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