(57)【要約】  本発明は、任意でＶＥＧＦ拮抗薬および化学療法剤と共に、ＤＬＬ４拮抗薬、具体的には、ヒトＤＬＬ４と特異的に結合するＤＬＬ４抗体およびそのフラグメントを投与することによって、癌／腫瘍増殖を治療するための方法を提供する。また、ＤＬＬ４拮抗薬、ＶＥＧＦ拮抗薬、および化学療法剤を含む薬学的組成物、ならびにキットも提供される。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において卵巣癌を治療するか、または卵巣腫瘍の増殖を低減もしくは停止させる方法であって、癌が治療されるように、前記対象にＤｌｌ４拮抗薬を投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記Ｄｌｌ４拮抗薬が、ヒトＤｌｌ４（ｈＤｌｌ４）に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントである、請求項１に記載の方法。  
【請求項３】
前記抗体が、ヒトＤｌｌ４のＮ末端ドメインもしくはＤＳＬドメイン、またはその両方内のエピトープと結合する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体またはそのフラグメントが、それぞれ、配列番号２２、２４、および２６の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と、それぞれ、配列番号３０、３２、および３４の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と、を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体が、配列番号２０または配列番号１１６のＨＣＶＲ配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が、配列番号２８または配列番号１１８のＬＣＶＲ配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が、配列番号２０／２８または１１６／１１８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲの組み合わせを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記対象へのＶＥＧＦ拮抗薬の投与をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記ＶＥＧＦ拮抗薬が、ＶＥＧＦのＶＥＧＦ受容体への結合を遮断することができるＶＥＧＦ抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＶＥＧＦ拮抗薬が、配列番号１２１を含むＶＥＧＦトラップである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
化学療法剤の投与をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記化学療法剤が、抗有糸分裂剤、白金系化学療法剤、ピリミジン類似体、トポイソメラーゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、およびアジュバントからなる群から選択される少なくとも一種である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗有糸分裂剤が、ドセタキセルもしくはパクリタキセル、またはその薬学的に許容される類似体もしくは塩である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記白金系化学療法剤が、シスプラチン、カルボプラチン、イプロプラチン、もしくはオキサリプラチン、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記受容体チロシンキナーゼ阻害剤が、ソラフェニブ、スニチニブ、もしくはパゾパニブ、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ピリミジン類似体が、ゲムシタビン、５−ＦＵ、もしくはカペシタビン、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記トポイソメラーゼ阻害剤が、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、もしくはラメラリンＤ、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記アジュバントが、フォリン酸、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記化学療法剤が、５−ＦＵ、フォリン酸、およびオキサリプラチン；５−ＦＵ、フォリン酸、およびイリノテカン；カペシタビンおよびオキサリプラチン；またはシスプラチンおよびゲムシタビンの組み合わせである、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｄｌｌ４拮抗薬およびＶＥＧＦ拮抗薬が、同時に投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｄｌｌ４拮抗薬および前記化学療法剤が、同時に投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｄｌｌ４拮抗薬および前記化学療法剤が、順次投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｄｌｌ４拮抗薬および前記化学療法剤が、順次投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象が、ヒト対象である、請求項４に記載の方法。
【請求項２５】
卵巣癌または腫瘍を有する対象において所望の治療効果を達成するのに必要な化学療法剤の量を低減させる方法であって、ｈＤｌｌ４に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントおよびＶＥＧＦ阻害剤と組み合わせて、前記対象に前記化学療法剤を投与することを含み、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、それぞれ、配列番号２２、２４、および２６の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含むＨＣＶＲと、それぞれ、配列番号３０、３２、および３４の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含むＬＣＶＲと、を含み、前記化学療法剤の量が、前記抗体またはその抗原結合フラグメントの不在下での同じ治療効果のために必要な量と比較して低減される、方法。
【請求項２６】
前記ＶＥＧＦ拮抗薬が、ＶＥＧＦのＶＥＧＦ受容体への結合を遮断することができるＶＥＧＦ抗体またはその抗体フラグメントである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＶＥＧＦ拮抗薬が、配列番号１２１を含むＶＥＧＦトラップである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号２０／２８または１１６／１１８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲの組み合わせを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記化学療法剤が、ドセタキセル、パクリタキセル、ソラフェニブ、スニチニブ、パゾパニブ、ゲムシタビン、シスプラチン、５−ＦＵ、フォリン酸、オキサリプラチン、イリノテカン、カルボプラチン、カペシタビン、トポテカン、イプロプラチン、カンプトテシン、ラメラリンＤ、およびその薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記所望の治療効果を達成するのに必要な化学療法剤の量が、少なくとも２０％低減される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記所望の治療効果を達成するのに必要な化学療法剤の量が、約３０％〜約５０％低減される、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デルタ様リガンド４（Ｄｌｌ４）拮抗薬、具体的には、ヒトＤｌｌ４に特異的に結合するヒト抗体またはそのフラグメントを用いて、癌または腫瘍を治療する方法に関する。Ｄｌｌ４拮抗薬は、１つ以上の追加の薬剤（例えば、化学療法剤および／またはＶＥＧＦ拮抗薬）と共に投与され得る。
【背景技術】
【０００２】
Ｄｌｌ４は、血管内皮によって高度に選択的発現を示すＮｏｔｃｈリガンドのデルタファミリーのメンバーである（非特許文献１）。Ｄｌｌ４は、Ｎｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ４を含むＮｏｔｃｈ受容体に対するリガンドである。Ｄｌｌ４拮抗薬は、種々の癌における腫瘍増殖を阻害するのに有用である。ヒトＤｌｌ４（ｈＤｌｌ４）の核酸およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１および２に示されている。ヒトＤｌｌ４に特異的な抗体およびＤｌｌ４抗体を用いた癌／腫瘍処置は、特許文献１、特許文献２、および特許文献３に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際特許出願公開第ＷＯ２００７／１４３６８９号
【特許文献２】国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０４２２３６号
【特許文献３】国際特許出願公開第ＷＯ２００７／０７０６７１号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｈｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．１４：１３１３−１３１８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第１の態様において、本発明は、癌（例えば、卵巣癌）を治療することを、それを必要とする対象において行う方法であって、対象にＤｌｌ４拮抗薬を投与することを含み、その際、癌が治療される、方法を特徴とする。本発明の方法によって治療される対象には、あらゆる哺乳動物種が含まれ得るが、好ましくは癌を患っているヒトである。
【０００６】
本発明はまた、Ｄｌｌ４拮抗薬を用いて卵巣癌を治療する方法および卵巣腫瘍の増殖を低減または停止する方法を対象とし、対象にＤｌｌ４拮抗薬を投与することを含み、その際、癌が治療され、および／または卵巣腫瘍の増殖が低減もしくは停止され、これは、ＶＥＧＦ拮抗薬および／または化学療法剤を用いる併用療法の投与を含む。
【０００７】
一実施態様において、Ｄｌｌ４拮抗薬は、高親和性でＤｌｌ４を特異的に結合し、Ｄｌｌ４がＮｏｔｃｈ受容体に結合するのを遮断するおよび／またはＤｌｌ４活性を中和するＤｌｌ４抗体またはそのフラグメント（「Ｄｌｌ４Ａｂ」）である。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、マウス、ヒト化、または完全なヒト抗体であってもよい。好ましくは、抗体は、完全にヒトモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体フラグメントである。抗体フラグメントは、一本鎖抗体、Ｆａｂ、または（Ｆａｂ’）２であってもよい。
【０００８】
別の実施態様において、Ｄｌｌ４Ａｂは、Ｄｌｌ４（配列番号２）のＮ末端ドメイン（Ｓ２７−Ｒ１７２）、またはＤＳＬドメイン（Ｖ１７３−Ｃ２１７）、またはＮ末端−ＤＳＬドメイン（Ｓ２７−Ｃ２１７）内のエピトープと結合する。本発明の方法に用いられるＤｌｌ４Ａｂは、高親和性でヒトＤｌｌ４に結合することができ、その解離定数（ＫＤ）は、表面プラスモン共鳴で測定して、約３００ｐＭ以下、約２００ｐｍ以下を含む、約５００ｐＭ以下である。例えば、Ｄｌｌ４Ａｂは、３個の重鎖ＣＤＲ（Ｈ−ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および３個の軽鎖ＣＤＲ（Ｌ−ＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を有し、３個の重鎖ＣＤＲは、配列番号２０のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、３個の軽鎖ＣＤＲは、配列番号２８のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。別の実施態様において、Ｄｌｌ４Ａｂの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２２、２４、および２６のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、Ｄｌｌ４Ａｂの軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号３０、３２、および３４のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様において、Ｄｌｌ４Ａｂは、それぞれ配列番号２２、２４、および２６を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列と、それぞれ配列番号３０、３２、および３４を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列とを含む。さらに別の実施態様において、Ｄｌｌ４Ａｂは、配列番号２０もしくは１１６のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、または配列番号２８もしくは１１８のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲとを含む。さらに別の実施態様において、Ｄｌｌ４Ａｂは、配列番号２０／２８（ＲＥＧＮ２８１）または１１６／１１８（ＲＥＧＮ４２１）のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲの組み合わせを含む。
【０００９】
別の実施態様において、Ｄｌｌ４Ａｂは、それぞれ配列番号６／８／１０および配列番号１４／１６／１８；それぞれ配列番号３８／４０／４２および配列番号４６／４８／５０；それぞれ配列番号５４／５６／５８および配列番号６２／６４／６６；それぞれ配列番号７０／７２／７４および配列番号７８／８０／８２；それぞれ配列番号８６／８８／９０および配列番号９４／９６／９８；ならびにそれぞれ配列番号１０２／１０４／１０６および配列番号１１０／１１２／１１４から選択される、重鎖ＣＤＲ１／ＣＤＲ２／ＣＤＲ３の組み合わせと、軽鎖ＣＤＲ１／ＣＤＲ２／ＣＤＲ３の組み合わせとを含む。別の実施態様において、Ｄｌｌ４Ａｂは、配列番号４、３６、５２、６８、８４、もしくは１００のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、または配列番号１２、４４、６０、７６、９２、もしくは１０８のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む。さらに別の実施形態において、Ｄｌｌ４Ａｂは、以下から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲの組み合わせを含む：配列番号４／１２（ＲＥＧＮ２７９）、配列番号３６／４４（ＲＥＧＮ２９０）、配列番号５２／６０（ＲＥＧＮ３０６）、配列番号６８／７６（ＲＥＧＮ３０９）、配列番号８４／９２（ＲＥＧＮ３１０）、および配列番号１００／１０８（ＲＥＧＮ２８９）。
【００１０】
配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、および１１８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、および１１７として示される。
【００１１】
一実施形態では、本発明の方法は、ＶＥＧＦ拮抗薬の投与を含む。特定の実施形態では、ＶＥＧＦ拮抗薬は、ＶＥＧＦのＶＥＧＦ受容体への結合を遮断することができる、ＶＥＧＦ抗体またはその抗原結合フラグメントである。一実施形態では、ＶＥＧＦ拮抗薬は、配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＶＥＧＦトラップである。
【００１２】
一実施態様において、化学療法剤は、抗有糸分裂剤（ドセタキセル、パクリタキセルなど）；白金ベースの化学療法化合物（シスプラチン、カルボプラチン、イプロプラチン、オキサリプラチンなど）；または他の従来の細胞傷害性剤（５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビン、イリノテカン、ロイコボリン、ゲムシタビンなど）；受容体チロシンキナーゼおよび／または血管形成の阻害剤（ＥｒｂＢ阻害剤、ＲＴＫクラスＩＩＩ阻害剤など）であり、Ｄｌｌ４拮抗薬は、上に記載されるＤｌｌ４抗体またはそのフラグメントである。
【００１３】
一実施形態では、本発明はまた、Ｄｌｌ４拮抗薬と共に化学療法剤を投与することを含む、各薬剤単独の投与と比較して所望の治療効果を達成するのに必要な化学療法剤またはＤｌｌ４拮抗薬の量を低減させる方法を特徴とする。一実施形態では、ＶＥＧＦ拮抗薬も投与される。一実施態様において、例えば、腫瘍増殖を停止または低減させるといった所望の治療効果を達成するための化学療法剤の量は、併用投与されるＤｌｌ４拮抗薬の存在下で少なくとも１０％未満、少なくとも２０％未満、少なくとも３０％未満、少なくとも４０％未満、もしくは少なくとも５０％未満であり、またはその逆も同じである。一般に、化学療法剤またはＤｌｌ４拮抗薬の量は、約３０％〜約５０％低減され得ることが所望である。したがって、本発明の方法は、いずれかの薬剤単独による治療で必要とされる高い投与量によって引き起こされた副作用に対する耐性が低い癌患者にとっては、有効な投与量を低減させることができるので特に有益である。
【００１４】
他の目的および利点は、続く詳述の考察から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ヒト化Ｄｌｌ４タンパク質を発現する重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（ヒト化Ｄｌｌ４ＳＣＩＤマウス）に移植されたヒトＶＭＣｕｂ１腫瘍（膀胱癌）の増殖に対するシスプラチンと組み合わせたＤｌｌ４Ａｂの効果を示す（実施例１）。ヒトＦｃ対照（実線を伴う◆）、ＲＥＧＮ４２１（Ｄｌｌ４Ａｂ）２ｍｇ／ｋｇ／注射（破線を伴う◆）、シスプラチン０．５ｍｇ／ｋｇ／注射（□）、シスプラチン２ｍｇ／ｋｇ／注射（■）、ＲＥＧＮ４２１  ２ｍｇ／ｋｇ／注射＋シスプラチン０．５ｍｇ／ｋｇ／注射（○）、およびＲＥＧＮ４２１  ２ｍｇ／ｋｇ／注射＋シスプラチン２ｍｇ／ｋｇ／注射（●）。
【図２】ヒト化Ｄｌｌ４ＳＣＩＤマウスに移植されたヒトＡ５４９腫瘍（非小細胞肺癌）の増殖に対するシスプラチンと組み合わせたＤｌｌ４Ａｂの効果を示す（実施例２）。ヒトＦｃ対照（●）、ＲＥＧＮ全量４２１６ｍｇ／ｋｇ（○）、シスプラチン全量５ｍｇ／ｋｇ（△）、シスプラチン全量９ｍｇ／ｋｇ（▲）、ＲＥＧＮ４２１  ６ｍｇ／ｋｇ＋シスプラチン全量５ｍｇ／ｋｇ（◇）、およびＲＥＧＮ４２１  ６ｍｇ／ｋｇ＋シスプラチン９ｍｇ／ｋｇの全量（◆）。
【図３】ヒト化Ｄｌｌ４ＳＣＩＤマウスに移植されたヒトＨＣＴ１１６（大腸癌）の増殖に対する５−ＦＵと組み合わせたＤｌｌ４Ａｂの効果を示す（実施例５）。ヒトＦｃ対照（●）、ＲＥＧＮ全量４２１６ｍｇ／ｋｇ（○）、５−ＦＵ全量４５ｍｇ／ｋｇ（△）、５−ＦＵ７５全量ｍｇ／ｋｇ（▲）、ＲＥＧＮ４２１  ６ｍｇ／ｋｇ＋５−ＦＵ全量４５ｍｇ／ｋｇ（◇）、およびＲＥＧＮ４２１  ６ｍｇ／ｋｇ＋５−ＦＵ  ７５ｍｇ／ｋｇの全量（◆）。
【図４】ヒト化Ｄｌｌ４ＳＣＩＤマウスに移植されたヒトＨＣＴ１１６腫瘍の増殖に対するイリノテカンと組み合わせたＤｌｌ４Ａｂの効果を示す（実施例６）。ヒトＦｃ対照（●）、ＲＥＧＮ４２１全量６ｍｇ／ｋｇ（○）、イリノテカン全量２２．５ｍｇ／ｋｇ（△）、イリノテカン全量７５ｍｇ／ｋｇ（▲）、ＲＥＧＮ４２１  ６ｍｇ／ｋｇ＋イリノテカン２２．５ｍｇ／ｋｇの全量（◇）、およびＲＥＧＮ４２１  ６ｍｇ／ｋｇ＋イリノテカン７５ｍｇ／ｋｇの全量（◆）。
【図５】０．５、５、または１５ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ４２１の単回投与による、ヒト化Ｄｌｌ４ＳＣＩＤマウスに移植されたＣｏｌｏ２０５ヒト結腸直腸腫瘍細胞における、投与の５、１０、２４、および７２時間後ならびに７日後に測定された、Ｈｅｙ１遺伝子発現の平均（４匹のマウス／群）倍率変化を、１５ｍｇ／ｋｇのｈＦｃと比較して示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本方法を説明する前に、本発明は特定の方法および記載された実験条件に限定されないことを理解すべきである。それは、そのような方法および条件は変化し得るからである。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書に用いられる用語は特定の実施態様を記載するためのものに過ぎず、限定することを意図しないことを理解すべきである。
【００１７】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられるとき、文脈が別途明確に指示しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、複数での言及も含む。したがって、例えば、「方法」についての言及には、１つ以上の方法、ならびに／または本明細書に記載されたおよび／もしくは本開示を読むと当業者に明らかになる種類のステップが含まれる。
【００１８】
特に明記しない限り、本明細書に用いられるすべての技術および科学用語は、本発明が属する当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同等のあらゆる方法および物質を本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および物質をここに記載する。
【００１９】
定義
「デルタ様のリガンド４」、「Ｄｌｌ４」、「ｈＤｌｌ４」は、配列番号１の核酸配列によりコードされるタンパク質と、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質とを同義的に指すために用いられる。
【００２０】
Ｄｌｌ４拮抗薬は、（例えば、Ｎｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ４など）Ｎｏｔｃｈ受容体へのＤｌｌ４の結合を遮断することができるＤｌｌ４に対する抗体およびそのフラグメント、多量体形成成分に融合したＤｌｌ４の細胞外ドメインを含む融合タンパク質、またはそのフラグメント（例えば、米国特許出願公開第２００６／０１３４１２１号および同第２００８／０１０７６４８号を参照のこと）、ペプチドおよびペプチボディ（例えば、米国特許第７，１３８，３７０号を参照のこと）を含む。
【００２１】
特に明記しない限り、本明細書に用いられる「抗体」という用語は、２個の免疫グロブリン重鎖および２個の免疫グロブリン軽鎖を含む抗体分子（すなわち、「完全な抗体分子」）ならびにその抗原結合性フラグメントを包含することが理解されよう。本明細書に用いられるとき、抗体の「抗原結合性の部分」、抗体の「抗原結合性フラグメント」などの用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、あらゆる自然発生の、酵素によって得られる、合成の、または遺伝子組換えのポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合性フラグメントは、タンパク分解などの任意の好適な標準技術、または抗体可変ドメインおよび任意に定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を含む組換え型遺伝子工学技術を用いて、例えば、完全な抗体分子から誘導され得る。そのようなＤＮＡは既知である、および／または例えば商業的な供給源、（例えば、ファージ−抗体ライブラリーを含む）ＤＮＡライブラリーから容易に入手可能であるか、または合成することができる。ＤＮＡを配列決定し、化学的にまたは分子的生物学技術を用いることにより操作して、例えば、１個以上の可変および／または定常ドメインを好適な配置に配列し、またはコドンを導入し、システイン残基を作り、アミノ酸の修飾、付加、もしくは欠失などをし得る。
【００２２】
抗原結合性フラグメントの非限定的な例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント、（ｉｖ）Ｆｖフラグメント、（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント、および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域に類似するアミノ酸残基からなる最小限の認識単位（例えば、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））が挙げられる。また、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体およびミニ抗体などの他の操作された分子も、本明細書で用いられる「抗原結合性フラグメント」という表現に包含される。
【００２３】
抗体の抗原結合性フラグメントは、典型的に、少なくとも１個の可変ドメインを含む。可変ドメインは、あらゆるサイズまたはアミノ酸組成であってもよく、１個以上のフレームワーク配列に隣接しているか、それらとインフレームである少なくとも１個のＣＤＲを一般に含む。ＶＬドメインを伴ってＶＨドメインを有する抗原結合性フラグメントでは、ＶＨおよびＶＬドメインは、任意の好適な配置で互いに対して配置され得る。例えば、可変領域は、二量体であり得、ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ、またはＶＬ−ＶＬ二量体を含有し得る。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体ＶＨまたはＶＬドメインを含み得る。
【００２４】
ある特定の実施態様では、抗体の抗原結合性フラグメントは、少なくとも１個の定常ドメインに共有結合された少なくとも１個の可変ドメインを含み得る。本発明の抗体の抗原結合性フラグメント内に見出され得る可変および定常ドメインの非限定的な例示的な配置としては、（ｉ）ＶＨ−ＣＨ１、（ｉｉ）ＶＨ−ＣＨ２、（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＨ３、（ｉｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２、（ｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｖｉ）ＶＨ−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｖｉｉ）ＶＨ−ＣＬ、（ｖｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１、（ｉｘ）ＶＬ−ＣＨ２、（ｘ）ＶＬ−ＣＨ３、（ｘｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２、（ｘｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｘｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３、および（ｘｉｖ）ＶＬ−ＣＬが挙げられる。上に列挙された例示的な配置のうちのいずれかを含む、可変および定常ドメインの任意の配置において、可変および定常ドメインは、互いに直接結合され得か、または完全なもしくは部分的なヒンジもしくはリンカー領域によって結合され得る。ヒンジ領域は、単一ポリペプチド分子中の隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメインの間に柔軟性または半柔軟性の結合をもたらす少なくとも２個（例えば、５個、１０個、１５個、２０個、４０個、６０個、またはそれ以上）のアミノ酸からなり得る。さらに、本発明の抗体の抗原結合性フラグメントは、互いにおよび／または１個以上の単量体ＶＨまたはＶＬドメインとの非共有結合的結合で（例えば、ジスルフィド結合によって）上に列挙された可変および定常ドメイン配置のうちのいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含んでもよい。
【００２５】
完全な抗体分子と同様に、抗原結合性フラグメントは単一特異性または多重特異性（例えば、二重特異性）であってもよい。抗体の多重特異性抗原結合性フラグメントは、典型的に少なくとも２個の異なる可変ドメインであって、各可変ドメインが同じ抗原上の別々の抗原または異なるエピトープに特異的に結合することができる、可変ドメインを含む。本明細書で開示された例示的な二重特異性抗体フォーマットを含むすべての多重特異性抗体フォーマットは、当該技術分野で利用可能な慣例の技術を用いて本発明の抗体の抗原結合性フラグメントに関する使用に適応され得る。
【００２６】
本明細書に用いられる「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列から誘導された可変および定常領域を有する抗体を含むことが意図される。本発明のヒトｍＡｂは、例えば、ＣＤＲ中、特にＣＤＲ３中にヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでランダムなもしくは部位特異的な突然変異誘発によってまたはインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含んでもよい。しかし、本明細書に用いられる「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖細胞系列から誘導されたＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列に接合されたｍＡｂを含まないことが意図される。
【００２７】
本明細書で開示される完全なヒト抗Ｄｌｌ４抗体は、対応する生殖細胞系列配列と比較して重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域中に１個以上のアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含んでもよい。このような突然変異は、本明細書で開示されるアミノ酸配列を、例えば抗体配列の公開データベースから入手可能な生殖細胞系列配列と比較することによって容易に確認することができる。本発明は、本明細書で開示されたアミノ酸配列のうちのいずれかから誘導され、その際、１個以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１個以上のアミノ酸が、対応する生殖細胞系列残基（複数可）または対応する生殖細胞系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換（天然または非天然）に復帰突然変異する（このような配列変化は、本明細書において「生殖細胞系列復帰突然変異」と称される）抗体およびその抗原結合性フラグメントを含む。当業者は、本明細書で開示された重鎖および軽鎖可変領域配列を用いて出発し、１つ以上の個々の生殖細胞系列復帰突然変異またはそれらの組み合わせを含む多くの抗体および抗原結合性フラグメントを容易に製造することができる。ある特定の実施態様において、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基のすべてが、生殖細胞系列配列に復帰突然変異される。別の実施態様において、ある種の残基のみ、例えば、ＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内もしくはＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に見出される突然変異残基のみ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３内に見出される突然変異残基のみが、生殖細胞系列配列に復帰突然変異される。さらにまた、本発明の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖細胞系列復帰突然変異の任意の組み合わせを含んでもよく、すなわち、その際、ある種の個々の残基は、生殖細胞系列配列に復帰突然変異されるが、生殖細胞系列配列と異なるある種の他の残基は維持される。一旦得られると、１つ以上の生殖細胞系列復帰突然変異を含む抗体および抗原結合性フラグメントは、改善された結合特異性、増強された結合親和性、改善されたまたは強化された拮抗薬または作動薬の生物学的性質（場合による）、低減された免疫原性などの１つ以上の所望の性質について容易に試験することができる。この一般的な方法で得られた抗体および抗原結合性フラグメントが本発明内に包含される。
【００２８】
また、本発明は、１つ以上の保存的置換を有する本明細書で開示されたＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む抗Ｄｌｌ４抗体を含む。例えば、本発明は、本明細書で開示されたＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば、１０個以下、８個以下、６個以下、４個以下、２個、または１個の保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗Ｄｌｌ４抗体を含む。一実施態様において、ＨＣＶＲは、中に１０個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１１６のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、ＨＣＶＲは、中に８個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１１６のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、ＨＣＶＲは、中に６個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１１６のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、ＨＣＶＲは、中に４個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１１６のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様において、ＨＣＶＲは、中に２個または１個の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１１６のアミノ酸配列を含む。一実施態様において、ＬＣＶＲは、中に１０個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１１８のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、ＬＣＶＲは、中に８個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１１８のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、ＬＣＶＲは、中に６個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１１８のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、ＬＣＶＲは、中に４個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１１８のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様において、ＬＣＶＲは、中に２個または１個の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１１８のアミノ酸配列を含む。
【００２９】
「中和する」または「遮断する」抗体は、Ｄｌｌ４への結合が、Ｄｌｌ４の生物学的活性の阻害をもたらす抗体を指すことが意図される。Ｄｌｌ４の生物学的活性のこの阻害は、Ｄｌｌ４生物学的活性の１つ以上の指示薬を測定することによって評価することができる。Ｄｌｌ４の生物学的活性のこれらの指標は、当該技術分野で既知のインビトロまたはインビボアッセイにおけるいくつかの基準のうちの１つ以上によって評価することができる。例えば、Ｄｌｌ４の活性を中和する抗体の能力は、Ｎｏｔｃｈ受容体へのＤｌｌ４結合の阻害によって評価される。
【００３０】
本発明はまた、マウスＤｌｌ４に特異的に結合する抗Ｄｌｌ４抗体を含む。例えば、本発明は、それぞれ配列番号１２２および１２３のＬＣＶＲおよびＨＣＶＲアミノ酸配列を有する抗Ｄｌｌ４抗体（ＲＥＧＮ１０３５として既知であるｍＤｌｌ４Ａｂ１）、ならびにその抗原結合フラグメントを含む。本発明の実施形態において、マウスＤｌｌ４に特異的に結合する抗Ｄｌｌ４抗体は、ヒトＤｌｌ４に有意に結合しない。
【００３１】
「特異的に結合する」または同様の用語は、抗体またはその抗原結合性フラグメントが生理学的状条件下で比較的安定的である、抗原との複合体を形成することを意味する。特異的結合は、少なくとも約１×１０−６Ｍ以下の平衡解離定数（例えば、ＫＤが小さいほど、より緊密な結合を表す）を特徴とすることができる。２個の分子が特異的に結合するかどうかを測定する方法は当該技術分野で公知であり、例えば、平衡透折、表面プラスモン共鳴などが挙げられる。しかしながら、ｈＤｌｌ４を特異的に結合する単離された抗体は、他の種からのＤｌｌ４分子などの他の抗原に対する交差反応性を示すことがあり得る。さらに、それにもかかわらず、ｈＤｌｌ４および１個以上の追加の抗原に結合する多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃｓ））は、本明細書に用いられるように、ｈＤｌｌ４に「特異的に結合する」抗体とみなされる。
【００３２】
本明細書に用いられる「ＫＤ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を指すことが意図される。
【００３３】
「高親和性」抗体という用語は、例えば、単量体Ｄｌｌ４を用いて表面プラスモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）または溶液親和性ＥＬＩＳＡ）で測定して、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、または約２００ｐＭ未満のＫＤ；または二量体Ｄｌｌ４を用いて表面プラスモン共鳴で測定して約１００ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、または約２０ｐＭ未満のＫＤでＤｌｌ４に結合するそれらの抗体を指す。
【００３４】
本明細書に用いられる「表面プラスモン共鳴」という用語は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ  ａｎｄ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を用いてバイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度における変化を検出することによってリアルタイム生物特異性相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。
【００３５】
「エピトープ」という用語は、抗体によって結合される抗原の領域である。エピトープは、構造的または機能的に定義し得る。機能性エピトープは一般に構造性エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接関与するそれらの残基を有する。エピトープはまた、立体配置的（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）であり得る、すなわち、非線形アミノ酸で構成され得る。ある特定の実施態様において、エピトープは、分子の化学的に活性な表面基である決定要素（アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基またはスルホニル基など）を含んでもよく、ある実施態様において、特定の三次元構造特性および／または特定の電荷特性を有してもよい。
【００３６】
本発明の方法は、ある特定の実施形態に従って、対象にＶＥＧＦ拮抗薬を投与することを含む。本明細書で使用されるとき、「ＶＥＧＦ拮抗薬」という表現は、ＶＥＧＦの正常な生物学的活性を遮断、低減、または妨害する任意の分子を意味する。ＶＥＧＦ拮抗薬としては、ＶＥＧＦと天然ＶＥＧＦ受容体との間の相互作用を妨害する分子（例えば、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に結合し、ＶＥＧＦとＶＥＧＦ受容体との間の相互作用を防ぐ、あるいはべつように妨害する分子）が挙げられる。特定の例示的なＶＥＧＦ拮抗薬としては、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦ受容体抗体、およびＶＥＧＦ受容体ベースのキメラ分子（本明細書で「ＶＥＧＦ−トラップ」とも呼ばれる）が挙げられる。ＶＥＧＦトラップの好ましい実施形態は、（国際特許第ＷＯ００／７５３１９号に記載されるように）ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）（配列番号１２１）である。
【００３７】
ＶＥＧＦ受容体ベースのキメラ分子は、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ１とも呼ばれる）および／またはＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１またはＫＤＲとも呼ばれる）などの、ＶＥＧＦ受容体の２個以上の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインを含むキメラポリペプチドを含み、また、多量体化ドメイン（例えば、２個以上のキメラポリペプチドの多量体化［例えば、二量体化］を促進するＦｃドメイン）を含んでいてもよい。上述のように、例示的なＶＥＧＦ受容体ベースのキメラ分子は、配列番号１１９の核酸配列によってコードされるＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）と呼ばれる分子である。ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）は、３つの成分を含む：（１）配列番号１２０のアミノ酸２７〜１２９を含むＶＥＧＦＲ１成分（２）配列番号１２０のアミノ酸１３０〜２３１を含むＶＥＧＦＲ２成分、および（３）配列番号１２０のアミノ酸２３２〜４５７を含む多量体形成成分（「ＦｃΔＣ１（ａ）」）（配列番号１２０のＣ端末アミノ酸［すなわち、Ｋ４５８］は、本発明の方法において使用されるＶＥＧＦ拮抗薬に含まれていてもいなくてもよい（例えば、米国特許第７，３９６，６６４号を参照のこと））。配列番号１２０のアミノ酸１〜２６は、シグナル配列である。
【００３８】
化学療法剤は癌の治療に有用な化学化合物であり、増殖阻害剤または他の細胞傷害性剤が挙げられる。本方法において用いることができる化学療法剤の例としては、アルキル化剤（チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））など）；スルホン酸アルキル（ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなど）；アジリジン（ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）など）；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスファオルアミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）およびトリメチルオロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミンおよびメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）；ナイトロジェンマスタード（クロランブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロルエタミン、塩酸メクロルエタミンオキシド、メルファラン、ノブエンビキン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなど）；ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）（カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなど）；抗生物質（アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎｓ）、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、プロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなど）；代謝拮抗剤（メトトレキセートおよび５−ＦＵなど）；葉酸類似体（デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートなど）；プリン類似体（フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなど）；ピリミジン類似体（アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなど）；アンドロゲン（カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなど）；抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌｓ）（アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなど）；葉酸補充液（フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）など）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａ���ｉｄｅ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン；エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイドまたはタキサンファミリーのメンバー（パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標），Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）；Ａｖｅｎｔｉｓ  Ａｎｔｏｎｙ，フランス）およびそれらの類似体など）；クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金類似体（シスプラチンおよびカルボプラチンなど）；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラマイシン；カペシタビン；ソラフェニブ（Ｂａｙｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐ．によるＮｅｘａｖａｒ（登録商標））、スニチニブ（ＰｆｉｚｅｒによるＳｕｔｅｎｔ（登録商標））、パゾパニブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅによるＶｏｔｒｉｅｎｔ（登録商標））、トセラニブ（ｔｏｃｅｒａｎｉｂ）（ＰｆｉｚｅｒによるＰａｌｌａｄｉａ（商標））、バンデタニブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａによるＺａｃｔｉｍａ（商標））、セジラニブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａによるＲｅｃｅｎｔｉｎ（登録商標））、レゴラフェニブ（ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ）（ＢａｙｅｒによるＢＡＹ７３−４５０６）、アキシチニブ（ＰｆｉｚｅｒによるＡＧ０１３７３６）、レストールチニブ（ＣｅｐｈａｌｏｎによるＣＥＰ−７０１）、エルロチニブ（ＧｅｎｅｎｔｅｃｈによるＴａｒｃｅｖａ（登録商標））、ゲフィチニブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａによるＩｒｅｓｓａ（商標））、ＢＩＢＷ２９９２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＩｎｇｅｌｈｅｉｍによるＴｏｖｏｋ（商標））、ラパチニブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅによるＴｙｋｅｒｂ（登録商標））、ネラチニブ（Ｗｙｅｔｈ／ＰｆｉｚｅｒによるＨＫＩ−２７２）、および同様のものを���む受容体チロシンキナーゼおよび／または血管形成の阻害剤、ならびに薬学的に許容される塩、酸、または上記のすべてのものの誘導体が挙げられる。この定義にはまた、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストンおよびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ（登録商標））を含む抗エストロゲン；フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン；ならびに上記のすべての薬学的に許容される塩、酸または誘導体などの、腫瘍においてホルモン作用を調節または阻害する抗ホルモン剤が含まれる。Ｗｉｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｃａｌａｂｒｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，編），第１０章，ＭｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇで開示されたもののような他の従来の細胞傷害性の化学化合物も、本発明の方法に適用できる。
【００３９】
「増殖阻害剤」という用語は、インビトロまたはインビボのいずれかで細胞、特に癌細胞の増殖を阻害する化合物または組成物を指す。増殖阻害剤の例としては、Ｇ１期停止およびＭ期停止を誘導する薬剤など、（Ｓ期以外の箇所で）細胞周期進行を遮断する薬剤が挙げられる。典型的なＭ期遮断剤としては、ビンカス（ｖｉｎｃａｓ）（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））、およびそれらの類似体（例えば、ＸＲＰ９８８１およびＸＲＰ６２５８；Ｏｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  ４：７３７，２００３を参照のこと）を含むが、それらに限定されるわけではないタキサンファミリーメンバー、ならびにイリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、ラメラリンＤ、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンなどのトポイソメラーゼ阻害剤が挙げられる。また、Ｇ１期を停止するそれらの薬剤（ＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロルエタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−ＦＵおよびａｒａ−Ｃなど）は、Ｓ期停止にも広がる。
【００４０】
一般的な説明
本発明は、Ｄｌｌ４に特異的に結合し、Ｄｌｌ４の活性を遮断するＤｌｌ４拮抗薬、例えば、Ｄｌｌ４抗体またはそのフラグメントの投与は、卵巣腫瘍の増殖を阻害することができるという知見に基づくものである。組換え型のヒトＤｌｌ４Ａｂを含む完全ヒトＤｌｌ４Ａｂの説明については、国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０７６３７９号を参照のこと。
【００４１】
Ｄｌｌ４Ａｂの製造方法
抗体を調製するための方法は当該技術分野で既知である。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７；Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照のこと。マウス、ラット、ウサギ、ウシのようなヒト以外の生物から単離された抗体は、キメラ化またはヒト化を通してよりヒト様にすることができる。
【００４２】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」またはキメラ形態は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された抗原結合に必要な最小限の配列を含む免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合性部分配列など）である。それらは、キメラまたはヒト化抗体を作成するための出発物質を提供するマウスまたは他の非ヒト抗体として同じまたは類似の結合特異性および親和性を有する。キメラ抗体は、軽鎖および重鎖遺伝子が、異なる種に属している免疫グロブリン遺伝子部分から典型的に遺伝子工学によって構成された抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体からの遺伝子の可変（Ｖ）部分をＩｇＧ１およびＩｇＧ４などのヒト定常（Ｃ）部分に結合してもよい。したがって、典型的なキメラ抗体は、マウス抗体からのＶまたは抗原結合ドメインおよびヒト抗体からのＣまたはエフェクタドメインからなるハイブリッドタンパク質である。ヒト化抗体は、実質的にヒト抗体からの可変領域フレームワーク残基（受容体抗体と称する）および実質的にマウス抗体からの相補性決定領域（ＣＤＲ領域）（ドナー免疫グロブリンと称する）を有する。Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１００２９−１００３３（１９８９）ならびに国際特許出願公開第ＷＯ９０／０７８６１号および米国特許第５，６９３，７６２号、同第５，６９３，７６１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，５３０，１０１号および同第５，２２５，５３９号を参照のこと。また、定常領域は、存在する場合、実質的にまたは完全にヒト免疫グロブリンからである。ヒト可変ドメインは、通常、そのフレームワーク配列が、ＣＤＲを誘導するマウス可変領域ドメインと高度の配列同一性を示すヒト抗体から選ばれる。重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク残基は、同じまたは異なるヒト抗体配列から誘導することができる。ヒト抗体配列は、自然発生のヒト抗体の配列でもあることもでき、またはいくつかのヒト抗体のコンセンサス配列であることもできる。国際特許出願公開第ＷＯ９２／２２６５３号を参照のこと。ヒト可変領域フレームワーク残基からのある種のアミノ酸は、ＣＤＲコンフォメーションおよび／または抗原への結合におけるそれらの起こりうる影響に基づく置換のために選択される。このような起こりうる影響の試験は、モデリング、特定位置でのアミノ酸の特性試験、または特定アミノ酸の置換、もしくは突然変異誘発の効果の実験的観察によって実施してもよい。例えば、マウス可変領域フレームワーク残基と選択されたヒト可変領域フレームワーク残基との間でアミノ酸が異なるとき、アミノ酸が：（１）非共有結合的に直接抗原に結合する（２）ＣＤＲ領域に隣接している（３）別様に、ＣＤＲ領域（例えば、ＣＤＲ領域の約６Å内にある）と相互作用する、または（４）ＶＬ−ＶＨインターフェイスに加わることを合理的に期待する場合、ヒトフレームワークアミノ酸を、通常、マウス抗体からの同等のフレームワークアミノ酸によって置換しなければならない。置換のための他の候補体は、その位置でヒト免疫グロブリンにとって異なる受容体ヒトフレームワークアミノ酸である。これらのアミノ酸は、マウスドナー抗体の同等の位置からまたはより典型的なヒト免疫グロブリンの同等の位置からのアミノ酸で置換することができる。置換のための他の候補体は、その位置でヒト免疫グロブリンにとって通常は存在しない受容体ヒトフレームワークアミノ酸である。ヒト化免疫グロブリンの可変領域フレームワークは、通常、ヒト可変領域フレームワーク配列またはこのような配列のコンセンサス（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）に対して少なくとも８５％の配列同一性を示す。
【００４３】
ヒト抗体の生成方法としては、例えば、ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ（商標）（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）技術（Ａｂｇｅｎｉｘ）、「ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）」アプローチ、およびファージディスプレイが挙げられる。ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ（商標）技術（米国特許第６，５９６，５４１号）は、選択抗原に対するヒト高特異性の完全抗体の生成方法を包含する。この技術は、マウスが抗原性刺激に反応してヒト可変領域およびマウス定常領域含む抗体を産生するように内因性マウス定常領域座に対して作動可能に結合されたヒト重鎖および軽鎖可変領域を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスの生成を含む。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードしているＤＮＡを単離し、ヒト重鎖および軽鎖定常領域をコードしているＤＮＡに作動可能に結合させる。次いで、完全ヒト抗体を発現することができる細胞中でＤＮＡを発現させる。一実施態様において、細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【００４４】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）技術（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１）では、重鎖およびカッパ軽鎖座の両方からヒト可変および定常領域の両方を有するマウスを作成する。代替アプローチでは、外因性Ｉｇ遺伝子座がＩｇ遺伝子座からの個々の遺伝子の封入（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）を通して模倣される「ミニ遺伝子座」アプローチが利用されている（例えば、米国特許第５，５４５，８０７号を参照のこと）。可変領域をコードするＤＮＡは、ヒト重鎖および軽鎖定常領域をコードしているＤＮＡに作動可能に結合されてまたは結合されずに単離することができる。
【００４５】
あるいは、ファージディスプレイまたは関連ディスプレイ技術を、Ｄｌｌ４に特異的に結合する抗体、可変ドメインなどの抗体フラグメント、およびヘテロメリックＦａｂフラグメントの特定に用いることができる。（例えば、米国特許第７，１３８，３７０号を参照のこと）。
【００４６】
好ましい免疫グロブリン（抗体）のスクリーニングおよび選択は、当該技術分野において既知である様々な方法によって実施することができる。Ｄｌｌ４に特異的なモノクローナル抗体の存在についての最初のスクリーニングは、例えば、ＥＬＩＳＡベースの方法またはファージディスプレイの使用により実施してもよい。第２のスクリーンを、所望のモノクローナル抗体を特定および選択するために実施するのが好ましい。第２のスクリーニングは、当該技術分野において既知である任意の好適な方法で実施してもよい。「Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ（「ＢｉａＭＡＰ」）と称する１つの好ましい方法が、米国特許出願公開第２００４／０１０１９２０号に記載されている。ＢｉａＭＡＰは、所望の特性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンの迅速特定が可能である。より具体的には、モノクローナル抗体が、抗体：抗原相互作用の評価に基づいて明瞭なエピトープ関連基に分類される。あるいは、ＥＬＩＳＡベース、ビーズベース、またはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）ベースの競合アッセイを、Ｄｌｌ４の異なるエピトープに結合し、したがって、協働して高親和性でリガンドに結合する可能性の高い結合対の特定に用いることができる。
【００４７】
投与方法
本発明は、Ｄｌｌ４ＡｂなどのＤｌｌ４拮抗薬を含む有効量の組薬学的組成物を、任意でＶＥＧＦ拮抗薬（例えば、ＶＥＧＦ−トラップまたは抗−ＶＥＧＦ抗体）および／もしくは抗有糸分裂剤（例えば、ドセタキセル、パクリタキセルなど（タキサン））などの化学療法剤；シスプラチン、カルボプラチン、イプロプラチン、オキサリプラチン、および同様のものなどの白金ベースの化学療法化合物；５−Ｆｕ、カペシタビン（（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）などのピリミジン類似体；イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、ラメラリンＤなどのトポイソメラーゼ阻害剤；ならびに／またはロイコボリン（フォリン酸）などのアジュバントと共に、対象に投与することを含む治療方法を提供する（詳細については、上の定義の節を参照のこと）。
【００４８】
Ｄｌｌ４拮抗薬、ＶＥＧＦ拮抗薬、および化学療法剤は、一緒にまたは別々に併用投与することができる。別々の投薬製剤を用いる場合、Ｄｌｌ４拮抗薬、ＶＥＧＦ拮抗薬、および化学療法剤は、同時に、または時間をずらして別々に、すなわち、順次投与することができる。
【００４９】
種々の送達系（例えば、リポソーム中のカプセル化、微小粒子、マイクロカプセル、突然変異体ウイルスを発現することができる組換え型の細胞、受容体介在性エンドサイトーシス）が既知であり、本発明の薬学的組成物を投与するために用いることができる（例えば、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９  ４４３２参照）。導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、眼内、硬膜外および経口経路が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。組成物は、任意の経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、経口粘膜、直腸および腸粘膜、など）を通した吸収によって投与してもよく、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与してもよい。投与は全身性または局所性であることができる。投与は、急性もしくは慢性（例えば、毎日、毎週、毎月など）、または他の薬剤と組み合わせることができる。また、例えば吸入器またはネブライザーおよびエアロゾル化剤を用いた製剤の使用によって肺投与を用いることができる。
【００５０】
皮下送達に関して、ペン送達機器が、本発明の薬学的組成物を送達する際に容易に適用される。このようなペン送達機器は、再使用可能または使い捨てであることができる。再使用可能なペン送達機器は、一般に、薬学的組成物を含む交換可能なカートリッジを用いる。カートリッジ内の薬学的組成物のすべてが投与され、カートリッジが空になったら、空のカートリッジを容易に捨て、薬学的組成物を含む新しいカートリッジで置き換えることができる。次いで、ペン送達機器を再利用することができる。使い捨てのペン送達機器では、交換可能なカートリッジがない。それよりも、使い捨てのペン送達機器は、機器内のリザーバー中に保持された薬学的組成物で予め充填されている。リザーバーから薬学的組成物が空になったら、機器全体を廃棄する。
【００５１】
多くの再使用可能なペン送達機器が、本発明の薬学的組成物の皮下送達において適用される。ほんの少し例を挙げれば、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ  Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ、英国）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｕｒｇｈｄｏｒｆ、スイス）、ＨＵＭＡＬＯＧ  ＭＩＸ  ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ  ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．、インディアナポリス、ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、コペンハーゲン、デンマーク）、ＮＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、コペンハーゲン、デンマーク）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、フランクリンレイクス、ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、およびＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ、フランクフルト、ドイツ）が例として挙げられるが、必ずしもこれらに限定されるわけではない。本発明の薬学的組成物の皮下送達において適用される使い捨てのペン送達機器の例としては、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されるわけではない。
【００５２】
別の実施態様において、活性な薬剤は、ベシクルまたはリポソーム中で送達することができる（Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３参照のこと）。さらに別の実施態様において、活性な薬剤は、制御放出系で送達することができる。一実施態様において、ポンプを用いてもよい（前出、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）参照のこと）。別の実施態様において、ポリマー物質を用いることができる（Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５参照）。本発明の活性剤がタンパク質をコードしている核酸である別の実施態様において、核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構成し、かつそれが細胞内となるようにそれを投与することによって、例えば、レトロウイルスベクター（例えば、米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）の使用によって、または直接注射によって、または微粒子銃（例えば、遺伝子銃、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤によるコーティングの使用によって、または核に入ることが知られているホメオボックス様のペプチドへの結合内にそれを投与する（例えば、Ｊｏｌｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８６４−１８６８を参照のこと）などによって、核酸をインビボ投与してそのコードされたタンパク質の発現を促進することができる。あるいは、核酸を細胞内に導入することができ、相同組み換えによって、発現のための宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。
【００５３】
特定の実施態様において、治療を必要とする領域に本発明の薬学的組成物を局所的に投与することが所望であり得る；これは、例えば、限定されるわけではないが、手術中の局所注入、局所適用、例えば、注射、カテーテル、またはインプラントによって達成してもよく、前述のインプラントは、シアラスティック膜などの膜、繊維または商業的な皮膚代用品を含む多孔性、非多孔性またはゼラチン状の材料である。
【００５４】
癌／腫瘍の治療に有効な本発明の活性剤の量は、本説明に基づく標準臨床技術によって決定することができる。さらに、任意に、インビトロアッセイを用いて適量範囲の特定に役立ててもよい。また、処方物中に用いられる正確な用量は、投与経路、および状態の重症度にも左右され、医療従事者の判断および各対象の状況に従って決定されるべきである。しかし、静脈内投与に好適な投与量範囲は、一般に体重１キログラム当たり約０．２〜３０ｍｇの活性化合物である。鼻腔内投与に適した投与量範囲は、一般的には、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。有効用量は、インビボまたは動物モデル試験システムから誘導された用量応答曲線から推定することができる。
【００５５】
投与レジメン
本発明のある特定の実施形態に従って、Ｄｌｌ４拮抗薬（例えば、抗Ｄｌｌ４抗体）の複数回の用量が、定義された時間経過にわたって対象に投与され得る。本発明のこの態様に従う方法は、対象に抗Ｄｌｌ４抗体の複数回の用量を順次投与することを含む。本明細書で使用されるとき、「順次投与」は、抗Ｄｌｌ４抗体の各用量が、時間的に異なる時点で（例えば、所定の間隔（例えば、時間、日、週、または月）で区切られた異なる日に）対象に投与されることを意味する。本発明は、患者に抗Ｄｌｌ４抗体の単回の初回用量、続いて抗Ｄｌｌ４抗体の１回以上の２次用量、任意に、抗Ｄｌｌ４抗体の１回以上の３次用量を順次投与することを含む方法を含む。
【００５６】
「初回用量」、「２次用量」、および「３次用量」という用語は、抗Ｄｌｌ４抗体の投与の時間的順序を指す。したがって、「初回用量」は、治療レジメン（「基準用量」とも称される）の開始時に投与される用量であり、「２次用量」は、初回用量の後に投与される用量であり、「３次用量」は、２次用量の後に投与される用量である。初回、２次、および３次用量は全て、同じ量の抗Ｄｌｌ４抗体を含有し得るが、一般に、投与の頻度の点で互いに異なり得る。しかし、ある特定の実施形態において、初回、２次、および／または３次用量に含まれる抗Ｄｌｌ４抗体の量は、処置の過程で互いに変化する（例えば、上下に適切に調整される）。ある特定の実施形態において、２回以上（例えば、２、３、４、または５回）の用量が「装填用量」として処置レジメンの開始時に、続いて、より低い頻度で投与される後続の用量（例えば、「維持用量」）が投与される。
【００５７】
本発明の例示的な一実施形態において、２次および／または３次用量の各々は、直前の投与の１〜２６週（例えば、１、１  １／２、２、２  １／２、３、３  １／２、４、４  １／２、５、５  １／２、６、６  １／２、７、７  １／２、８、８  １／２、９、９  １／２、１０、１０  １／２、１１、１１  １／２、１２、１２  １／２、１３、１３  １／２、１４、１４  １／２、１５、１５  １／２、１６、１６  １／２、１７、１７  １／２、１８、１８  １／２、１９、１９  １／２、２０、２０  １／２、２１、２１  １／２、２２、２２  １／２、２３、２３  １／２、２４、２４  １／２、２５、２５  １／２、２６、２６  １／２、またはそれ以上）後に投与される。本明細書で使用されるとき、「直前の投与」は、一連の複数回の投与において、その一連の投与における直後の用量の投与前に、それらの間にいかなる投与もなく患者に投与される抗−Ｄｌｌ４抗体の用量を意味する。
【００５８】
本発明のこの態様に従う方法は、患者に抗−Ｄｌｌ４抗体の、任意の数の２次および３次用量を投与することを含むことができる。例えば、ある特定の実施形態では、単回の２次用量のみが患者に投与される。他の実施形態において、２回以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８回、またはそれ以上）の２次用量が患者に投与される。同様に、ある特定の実施形態において、単回の３次用量のみが患者に投与される。他の実施形態において、２回以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８回、またはそれ以上）の３次用量が患者に投与される。
【００５９】
複数回の２次用量が関与する実施形態において、各々の２次用量は、他の２次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各々の２次用量は、直前の投与の１〜２週間後に患者に投与され得る。同様に、複数回の３次用量に関与する実施形態において、各々の３次用量は、他の３次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各々の３次用量は、直前の投与の２〜４週間後に患者に投与され得る。あるいは、２次および／または３次用量が患者に投与される頻度は、治療レジメンの過程で変化し得る。投与の頻度はまた、臨床検査後の個々の患者のニーズに応じて医師による治療の過程において調節され得る。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態において、追加の治療剤（例えば、ＶＥＧＦ拮抗薬および／または化学療法剤）は、上述したものと同様の方法で複数回の用量で投与される。
【００６１】
全身投与では、最初にインビトロアッセイから治療有効用量を推定することができる。例えば、細胞培養で測定されたＩＣ５０を含む循環血中の濃度範囲を達成する用量を動物モデルに処方することができる。ヒトにおける有用な用量をより正確に測定するためにそのような情報を用いることができる。初回投与量はまた、当該技術分野で公知である技術を用いてインビボデータ、例えば、動物のモデルから推定することができる。当業者は、動物データに基づいてヒトへの投与を容易に最適化することができる。
【００６２】
用量は、投与すべき対象の年齢およびサイズ（例えば、体重または体表面積）、標的疾患、状態、投与経路などに応じて変化し得る。Ｄｌｌ４拮抗薬の全身投与では、特に、Ｄｌｌ４抗体について、静脈内投与の典型的な投与量範囲は、約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、または約０．２〜約１０ｍｇ／ｋｇの日用量である。皮下投与では、抗体は、少なくとも１日につき１〜５回、１週間につき１〜５回、または１ヵ月につき１〜５回、少なくとも約２５ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ、約７５ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ、約１２５ｍｇ／ｍｌ、約１５０ｍｇ／ｍｌ、約１７５ｍｇ／ｍｌ、約２００ｍｇ／ｍｌ、または約２５０ｍｇ／ｍｌの抗体濃度で、約１０ｍｇ〜約５００ｍｇ、約２０ｍｇ〜約４００ｍｇ、約３０ｍｇ〜約３００ｍｇ、または約５０ｍｇ〜約２００ｍｇで投与することができる。あるいは、最初に静脈内注射、続く順次の皮下投与により抗体を投与することができる。
【００６３】
ＶＥＧＦ拮抗薬の全身投与では、特に、ＶＥＧＦ−トラップについて、静脈内投与の典型的な投与量範囲は、約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、または約０．２〜約１０ｍｇ／ｋｇの日用量である。皮下投与では、ＶＥＧＦ拮抗薬は、少なくとも１日につき１〜５回、１週間につき１〜５回、または１ヵ月につき１〜５回、少なくとも約２５ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ、約７５ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ、約１２５ｍｇ／ｍｌ、約１５０ｍｇ／ｍｌ、約１７５ｍｇ／ｍｌ、約２００ｍｇ／ｍｌ、または約２５０ｍｇ／ｍｌの抗体濃度で、約１０ｍｇ〜約５００ｍｇ、約２０ｍｇ〜約４００ｍｇ、約３０ｍｇ〜約３００ｍｇ、または約５０ｍｇ〜約２００ｍｇで投与することができる。あるいは、最初に静脈内注射、続いて、順次の皮下投与により、ＶＥＧＦ拮抗薬を投与することができる。
【００６４】
一般に、化学療法剤は、１週間につき５０ｍｇ／ｍ２〜５０００ｍｇ／ｍ２の用量範囲で静脈内にまたは経口的に用いられるが、投与量範囲は、処置する対象、対象の体重および年齢、苦痛の重症度、投与の仕方、使用する化学療法剤の種類、処方する医師の判断、および同様のものを含む種々の要因に応じて変化する。治療は、症状が認められる間、または症状が認められない時でも、断続的に繰り返してよい。また、治療の持続時間は、治療する状態の重症度、ならびに、もしあれば、起こりうる副作用について対象の耐性レベルに応じて変化してもよく、必要な限りまたは利益があらゆる副作用を上回る限り続けてよい。
【００６５】
各薬剤の投与量は、いずれかの薬剤の単独投与と比較して所望の治療効果を達成するのに必要な各薬剤の量が低減される（すなわち、相乗効果を示す）併用療法においてさらに調整してもよい、（以下の実施例１および２を参照のこと）。
【００６６】
また、本発明の併用療法に用いることができる化学療法剤としては、公知の化学療法レジメンに用いられるものが挙げられる。例えば、ＦＯＬＦＯＸは、大腸癌（ＣＲＣ）を治療するための化学療法レジメンであり、５−ＦＵ、フォリン酸およびオキサリプラチンの組み合わせである。ＦＯＬＦＩＲＩは、ＣＲＣのための別の化学療法レジメンであり、５−ＦＵ、フォリン酸およびイリノテカンの組み合わせである。ＸＥＬＯＸは、ＣＲＣについて第二次化学療法レジメンであり、かつカペシタビンおよびオキサリプラチンの組み合わせである。
【００６７】
さらに、Ｄｌｌ４拮抗薬（例えば、抗−Ｄｌｌ４抗体）、ＶＥＧＦ拮抗薬（例えば、ＶＥＧＦ−トラップ）、および／または化学療法剤の組み合わせによる治療は、原因となる癌／腫瘍に付随する症状を改善および／または低減するために、単独でまたは、抗−ＶＥＧＦ抗体（例えば、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈによるＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）および同様のもの）を含む、他の抗血管新生剤（例えば、他のＶＥＧＦ拮抗薬）、ならびにＣｏｘ−２阻害剤および同様のものなどの非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含む、鎮痛剤、抗炎症剤などの他の治療剤といった追加の薬物と組み合わせて提供され得る。
【００６８】
メトロノミック化学療法
メトロノミック化学療法は、化学療法を施す改善されたやり方として現れてきている。従来の化学療法は、致命的な毒性レベルを生じることなしに可能な最も高い用量として、例えば、最大許容量（ＭＴＤ）で単回投与または短期療法で投与されてきた。ＭＴＤ療法は、連続した治療周期間に２〜３週間の長期中断が必要である。このような化学療法剤の数およびそれらを試験するために行われる多数の臨床試験にもかかわらず、癌患者の人生を回復するまたは有意に延長することに関して、進歩はゆるやかである（Ｋｅｒｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ４：４２３−４３６）。
【００６９】
メトロノミック化学療法は、薬物を使用しない長期中断なしにＭＴＤよりもかなり下の用量で化学療法剤を頻繁に、毎日でも投与することを指す。低減された急性毒性に加えて、ＶＥＧＦ拮抗薬などの特定の抗血管新生薬と組み合わせて投与したときにメトロノミック化学療法の有効性は、高められうる（前出、Ｋｅｒｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【００７０】
したがって、本発明は、Ｄｌｌ４拮抗薬を化学療法剤と組み合わせて対象に投与し、その際、癌が治療されることを含む、癌を治療することを、それを必要とする対象において行うためのメトロノミック化学療法を特徴とする。特定の実施態様において、Ｄｌｌ４拮抗薬および化学療法剤を、比較的短期間、例えば１〜１２週間、一緒にまたは逐次的に投与し、続いて長期間、例えば６〜２４ヵ月にわたって化学療法剤をメトロノミック投与してもよい。
【００７１】
薬学的組成物
本発明は、Ｄｌｌ４拮抗薬、化学療法剤および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府もしくは州政府の監督機関によって承認されたこと、または動物、より具体的には、ヒトに使用するために米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。「担体」という用語は、治療剤と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。このような薬学的担体は、落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などのような石油、動物、植物または合成由来のものを含む水および油などの無菌液体であることができる。好適な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。また、組成物は、所望により、少量の湿潤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含むこともできる。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤などの形態をとることができる。組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドなどの担体を用いて坐剤として処方することができる。経口製剤は、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準担体を含むことができる。好適な薬学的担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。
【００７２】
好ましい態様において、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適応した薬学的組成物として慣例の方法に従って処方される。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤および注射部位の痛みを和らげるためのリドカインなどの局所麻酔剤を含んでもよい。組成物を輸液によって投与する場合、組成物は、無菌の薬学的グレードの水または生理食塩水を含む輸液ボトルを用いて投与することができる。組成物を注射によって投与する場合、投与前に成分を混合してもよいように無菌注射用水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【００７３】
本発明の活性剤は、中性または塩形態として処方することができる。薬学的に許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、などから誘導されたものなどの遊離アミノ基を用いて形成されたものと、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、第二鉄水酸化物、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されたものなどの遊離カルボキシル基を用いて形成されたものとが挙げられる。
【００７４】
本発明の方法の実施に有用である組成物は、溶液中、懸濁液中、または両方に本発明の薬剤を含む液体であってもよい。「溶液／懸濁液」という用語は、活性剤の第１の部分が溶液中に存在し、活性剤の第２の部分が液体マトリックス中の懸濁液中に粒状形態で存在する液体組成物を指す。液体組成物は、水性であってもよく、また、ゲル剤および軟膏剤の形態を含む。
【００７５】
本発明の方法の実施に有用な水性懸濁液または溶液／懸濁液は、懸濁化剤として１個以上のポリマーを含んでもよい。有用なポリマーとしては、架橋されたカルボキシル含有ポリマーなどの水溶性ポリマーが挙げられる。本発明の水性懸濁液または溶液／懸濁液は、好ましくは粘稠または粘膜付着性であり、またはさらにより好ましくは、粘稠および粘膜付着性の両方である。
【００７６】
キット
さらに、本発明は、包装材、容器および容器内に含まれる薬剤を含む製造品またはキットであって、薬剤が少なくとも１つのＤｌｌ４拮抗薬（Ｄｌｌ４抗体など）を含み、Ｄｌｌ４拮抗薬が癌を治療するか、または腫瘍増殖を低減もしくは停止させるために使用され得ることを示すラベルまたは添付文書を包装材が含む、物品を提供する。一実施形態において、製造品またはキットは、包装材、容器、および容器内に含まれる薬剤を含み、薬剤が少なくとも１つのＶＥＧＦ拮抗薬を含み、Ｄｌｌ４拮抗薬およびＶＥＧＦ拮抗薬が癌を治療するか、または腫瘍増殖を低減もしくは停止させるために使用され得ることを示すラベルまたは添付文書を包装材が含む。一実施形態において、製造品またはキットは、包装材、容器、および容器内に含まれる薬剤を含み、薬剤が少なくとも１つの化学療法剤を含み、Ｄｌｌ４拮抗薬および化学療法剤が癌を治療するか、または腫瘍増殖を低減もしくは停止させるために使用され得ることを示すラベルまたは添付文書を包装材が含む。一実施態様において、Ｄｌｌ４拮抗薬、ＶＥＧＦ拮抗薬および／または化学療法剤は、別々の容器中に含まれてもよく、したがって、本発明は、その中にｈＤｌｌ４を特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む容器、および中に少なくとも１つのＶＥＧＦ拮抗薬および／または化学療法剤を含む１個以上の追加の容器を含むキットを提供する。
【実施例】
【００７７】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物の製造および使用方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために記載されており、発明者らが彼らの発明とみなすものの範囲を限定することを意図していない。使用した数（例えば、量、温度など）に関しては、正確さを確保するように努力したが、多少の実験的な誤差および偏差が考慮されるべきである。特記しない限り、部は、質量部であり、温度は、摂氏温度であり、圧力は、大気圧であるか、またはそれに近い。（図のエラーバー＝平均±標準誤差）。
【実施例１】
【００７８】
シスプラチンと組み合わせた抗ｈＤｌｌ４抗体の効果
腫瘍増殖におけるシスプラチン（プラチノール、シス−ジアンミンジクロロプラチナ）と組み合わせた抗Ｄｌｌ４抗体（ＲＥＧＮ４２１）の効果を、ヒト化Ｄｌｌ４タンパク質（ヒト化Ｄｌｌ４ＳＣＩＤマウス）を発現する重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス中に移植された腫瘍において評価した。マウスＤｌｌ４遺伝子の全細胞外ドメインを胚幹（ＥＳ）細胞中のヒトＤｌｌ４遺伝子（７ｋｂ）の対応する細胞外領域で置き換えることによってヒト化Ｄｌｌ４ＳＣＩＤマウスを作った。ホモ接合のｈＤｌｌ４マウスを生成し、ＳＣＩＤバックグラウンドに飼育した。
【００７９】
各マウスに１×１０６ヒトＶＭ−Ｃｕｂ１腫瘍細胞（膀胱癌細胞）＋ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃３５４２３４）を皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍がマウスに確立された後、（１５０〜２００ｍｍ３の腫瘍サイズ、移植の約１４日後）、腫瘍を測定し、無作為割り当てし、ｈＦｃ、ＲＥＧＮ４２１、シスプラチンまたはＲＥＧＮ４２１およびシスプラチンの組み合わせで処置した。全４５匹のマウスを９群（コホート当たりｎ＝５）に分けた。第１群は、２ｍｇ／ｋｇのｈＦｃで皮下（ｓｃ）処置し；第２および第３群は、それぞれ０．５および２ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ４２１で皮下処置し；第４および第５群は、それぞれ０．５および２ｍｇ／ｋｇのシスプラチンで腹腔内（ｉｐ）処置し；第６群は、０．５ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ４２１で皮下および０．５ｍｇ／ｋｇのシスプラチンで腹腔内処置し；第７群は、０．５ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ４２１で皮下および２ｍｇ／ｋｇのシスプラチンで腹腔内処置し；第８群は、２ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ４２１で皮下および０．５ｍｇ／ｋｇのシスプラチンで腹腔内処置し；第９群は、２ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ４２１で皮下および２ｍｇ／ｋｇのシスプラチンで腹腔内処置した。ＲＥＧＮ４２１は、１４日目に開始して３〜４日毎に投与し、合計３用量をマウスに与えた。シスプラチンは、１４日目に開始して２４時間毎に投与し、全４用量をマウスに与えた。
【００８０】
単一薬剤としてまたは併用処置におけるＲＥＧＮ４２１およびシスプラチンの効果を評価するため、腫瘍サイズにおける変化を記録した。腫瘍増殖、初回ＲＥＧＮ４２１処置の３日前、各ＲＥＧＮ４２１処置日（１４、１７、および２１日目）に、その後、腫瘍が約６００ｍｍ３のサイズに到達するまで３〜４日毎に測定した。インビボ腫瘍サイズは、式（長さ×幅２）／２を用いて算出した（図１および表１）。
【００８１】
【表１】
2016501201.tif 000003
【００８２】
腫瘍増殖阻害、ＴＧＩは、対照コホートを安楽死させた日（すなわち、３２日目）の処置（Ｔ）腫瘍対ビヒクル対照（Ｃ）腫瘍の腫瘍サイズにおける差を算出することによって測定した（すなわち、３２日目）；ＴＧＩ＝［１−（Ｔ最終−Ｔ最初）／（Ｃ最終−Ｃ最初）］×１００。
【００８３】
腫瘍増殖遅延、ＴＧＤは、各コホートが明記された腫瘍サイズに到達したときの処置（Ｔ）腫瘍対対照（Ｃ）腫瘍間の日数の差として評価した。本実験の所定の腫瘍サイズは、６００ｍｍ３であった。
【００８４】
結果は、ＲＥＧＮ４２１単独で処置すると腫瘍増殖が５４％低減したことを示している。シスプラチン単独の処置では、腫瘍増殖が低減した（０．５ｍｇ／ｋｇ／注射の用量では６１％低減、２ｍｇ／ｋｇ／注射の用量では５４％低減）。併用処置では、いずれの単一薬剤処置よりも腫瘍増殖における低減が大きかった（０．５ｍｇ／ｋｇ／注射シスプラチン＋２ｍｇ／ｋｇ／注射ＲＥＧＮ４２１では１０４％低減、２ｍｇ／ｋｇ／注射シスプラチン＋２ｍｇ／ｋｇ／注射ＲＥＧＮ４２１では５８％低減）。
【００８５】
これらの結果は、Ｄｌｌ４遮断剤２ｍｇ／ｋｇ／注射およびシスプラチン０．５ｍｇ／ｋｇ／注射で、Ｄｌｌ４遮断剤をシスプラチンと共に組み合わせた腫瘍処置では、いずれかの単一薬剤よりも腫瘍増殖をより大きく阻害することができることを示した。
【実施例２】
【００８６】
シスプラチンと組み合わせた抗ｈＤｌｌ４抗体の効果
腫瘍増殖におけるシスプラチンと組み合わせたＲＥＧＮ４２１の効果を、上に記載のヒト化Ｄｌｌ４ＳＣＩＤマウスに移植された腫瘍において評価した。各マウスに、５×１０６のヒトＡ５４９腫瘍細胞（非小細胞肺癌または「ＮＳＣＬＣ」）を皮下（ＳＣ）移植した。腫瘍がマウスに確立された後（１００〜１５０ｍｍ３の腫瘍サイズ、移植の約２９日後）、腫瘍を測定し、無作為に割り当て、ｈＦｃ、ＲＥＧＮ４２１、シスプラチン、またはＲＥＧＮ４２１およびシスプラチンの組み合わせにより処置した。全３６匹のマウスを６群（コホート当たりｎ＝６）に分けた。第１群は、２ｍｇ／ｋｇのｈＦｃで皮下処置し；第２群は、２ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ４２１で皮下処置し；第３および第４群は、それぞれ２．５および４．５ｍｇ／ｋｇのシスプラチンで腹腔内処置し；第５群は、２ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ４２１で皮下および２．５ｍｇ／ｋｇのシスプラチンで腹腔内処置し；第６群は、２ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ４２１で皮下および４．５ｍｇ／ｋｇのシスプラチンで腹腔内処置した。ＲＥＧＮ４２１は、２９日目に開始して３〜４日毎に投与し、合計３用量をマウスに与えた。シスプラチンは、２９日目に開始して２４時間毎に投与し、全２用量をマウスに与えた。
【００８７】
単一薬剤としてまたは併用におけるＲＥＧＮ４２１およびシスプラチンの効果を評価するため、腫瘍サイズ（体積）の測定を、初回ＲＥＧＮ４２１処置の３日前に開始し、各薬剤の処置日（２９、３０、３３、３６日目）、その後、腫瘍が約６００ｍｍ３のサイズに到達するまで３〜４日毎に行った。インビボ腫瘍サイズは、式（長さ×幅２）／２を用いて算出した。腫瘍増殖における効果を、図２および表２に示す。
【００８８】
【表２】
2016501201.tif 000004
【００８９】
結果は、ＲＥＧＮ４２１単独で処置すると腫瘍増殖が５４％低減したことを示している。シスプラチン単独による処置では、腫瘍増殖が低減した（２．５ｍｇ／ｋｇ／注射の用量では３５％低減、４．５ｍｇ／ｋｇ／注射の用量では２２％低減）。併用処置では、いずれの単一薬剤処置よりも腫瘍増殖における低減がより大きかった（シスプラチン２．５ｍｇ／ｋｇ／注射＋ＲＥＧＮ４２１  ２ｍｇ／ｋｇ／注射では６９％低減、シスプラチン４．５ｍｇ／ｋｇ／注射＋ＲＥＧＮ４２１  ２ｍｇ／ｋｇ／注射では８０％低減）。併用処置では、対照およびいずれかの単一薬剤と比較して有意に腫瘍増殖が遅れた（ｐ＜０．０１）（シスプラチン２．５ｍｇ／ｋｇ／注射＋ＲＥＧＮ４２１  ２ｍｇ／ｋｇ／注射では２１日、シスプラチン４．５ｍｇ／ｋｇ／注射＋ＲＥＧＮ４２１  ２ｍｇ／ｋｇ／注射では２６日）。
【００９０】
これらの結果は、Ｄｌｌ４遮断剤２ｍｇ／ｋｇ／注射およびシスプラチン２．５〜４．５ｍｇ／ｋｇ／注射でＤｌｌ４遮断剤とシスプラチンとの組み合わせによる腫瘍の処置が、いずれの単一薬剤よりも腫瘍増殖の阻害を大きくできることを示している。
【実施例３】
【００９１】
ドセタキセルと組み合わせた抗ｈＤｌｌ４抗体の効果
腫瘍増殖におけるドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））と組み合わせた抗Ｄｌｌ４抗体の効果を重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに移植された腫瘍において評価した。各マウスに、１×１０６ラットＣ６腫瘍細胞（グリア芽腫細胞）を皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍が確立された後（約１００〜１５０ｍｍ３の腫瘍サイズ、移植の約１３日後）、マウスを、ｈＦｃ、ドセタキセル、Ｄｌｌ４抗体、またはドセタキセル＋Ｄｌｌ４抗体の組み合わせで処置した。これらのマウスはマウスＤｌｌ４を発現したため、本実験に用いるＤｌｌ４Ａｂは、公開された配列（国際特許第ＷＯ２００７／１４３６８９号）に基づいて自家製造し、ＲＥＧＮ５７７と命名した。ＲＥＧＮ５７７は、ヒトおよびマウスＤｌｌ４に結合するが、ヒトＤｌｌ１およびＪＡＧ１を検出可能に結合することはない。全３０匹の癌担持の雄マウスを６群（Ｎ＝５）に無作為に割り当てた。第１群は、ｈＦｃ（２５ｍｇ／ｋｇで）で皮下、かつビヒクルで静脈内（ｉｖ）処置し、第２群は、５ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ５７７で皮下処置し、第３群は、４．５ｍｇ／ｋｇのドセタキセルで静脈内処置し、第４群は、６ｍｇ／ｋｇのドセタキセルで静脈内処置し、第５群は、４．５ｍｇ／ｋｇのドセタキセルで静脈内＋５ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ５７７で皮下処置し、第６群は、６ｍｇ／ｋｇのドセタキセルで静脈内＋５ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ５７７で皮下処置した。ドセタキセルおよび／またはＤｌｌ４抗体は、同じ日に投与した。動物を１週間につき２回処置し、合計３用量を与えた。初回処置日から開始して、腫瘍が約６００ｍｍ３のサイズに到達してマウスを安楽死させるまで、体重および腫瘍を週に２回測定した。腫瘍サイズは、式（長さ×幅２）／２を用いて算出した。
【００９２】
対照腫瘍は２５日目に約６００ｍｍ３のサイズに到達し、採取した。２５日目に、Ｄｌｌ４抗体単独による処置により腫瘍増殖における中程度の低減（約４４％）を生じたことが結果からわかる。ドセタキセル単独による処置では、腫瘍増殖の低減が生じた（４．５ｍｇ／ｋｇの用量では６２％低減、６ｍｇ／ｋｇの用量では７０％低減）。併用処置では、対照およびいずれの単一薬剤処置よりも腫瘍増殖における低減が大きかった（４．５ｍｇ／ｋｇドセタキセル＋Ｄｌｌ４Ａｂでは７５％低減、６ｍｇ／ｋｇドセタキセル＋Ｄｌｌ４Ａｂでは８１％低減）。ＴＧＩおよびＴＧＤを測定した（表３）。
【００９３】
【表３】
2016501201.tif 000005
【００９４】
これらの結果は、Ｄｌｌ４遮断剤を種々の用量のドセタキセルと共に組み合わせて腫瘍を処置すると、腫瘍増殖をほとんど２倍の長さに遅らせることができ、いずれの単一薬剤よりも腫瘍増殖阻害がより大きかったことを示している。
【実施例４】
【００９５】
ドセタキセルと組み合わせた抗ｈＤｌｌ４抗体の効果
腫瘍増殖におけるドセタキセルと組み合わせた抗Ｄｌｌ４抗体の効果（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）を重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに移植された腫瘍において評価した。各マウスに５×１０６ヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳房腫瘍細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｌｏｔ＃８
４５４０）と共に「偽同所的に」（乳腺中に皮下＃３）移植した。腫瘍がマウスに確立された後（約１５０〜２００ｍｍ３の腫瘍サイズ、移植の約４５日後）、マウスを、ｈＦｃ、ドセタキセル、Ｄｌｌ４抗体、またはドセタキセル＋Ｄｌｌ４抗体の組み合わせで処置した。全２５匹の担癌の雄マウスを５群（群当たりＮ＝５マウス）に無作為に割り当てた。第１群は、ｈＦｃ（２５ｍｇ／ｋｇで）で皮下およびビヒクルで静脈内（ｉｖ）処置し；第２群は、５ｍｇ／ｋｇのＤｌｌ４抗体ＲＥＧＮ５７７で皮下処置し；第３群は、４．５ｍｇ／ｋｇのドセタキセルで静脈内処置し；第４群は、６ｍｇ／ｋｇのドセタキセルで静脈内処置し；第５群は、６ｍｇ／ｋｇのドセタキセルで静脈内＋５ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ５７７で皮下処置した。ドセタキセルおよび／またはＤｌｌ４抗体は、同じ日に投与した。動物を１週間につき２回処置し、合計３用量を与えた。初回処置日から開始して、マウスを安楽死させるまで、体重および腫瘍を週に２回測定した。腫瘍が約６００ｍｍ３のサイズに到達したとき、マウスを安楽死させた。腫瘍サイズは、式（長さ×幅２）／２を用いて算出した。
【００９６】
対照腫瘍は、６３日目に約６００ｍｍ３  に到達し、採取した。６３日目に、ドセタキセル単独での処置により腫瘍増殖に中程度の低減が生じたことが結果からわかる（４．５ｍｇ／ｋｇの用量では３７％低減、６ｍｇ／ｋｇの用量では５２％低減）。Ｄｌｌ４抗体単独による処置により腫瘍増殖における有意な低減が生じたが（約８５％低減）、一方で、併用処置では、腫瘍退縮が生じた（６ｍｇ／ｋｇのドセタキセル＋Ｄｌｌ４Ａｂでは１０５％低減）。ＴＧＩおよびＴＧＤを決定した（表４）。
【００９７】
【表４】
2016501201.tif 000006
【００９８】
ドセタキセル処置単独では、腫瘍増殖における最小限の遅延が生じた（４．５ｍｇ／ｋｇの用量では４日；６ｍｇ／ｋｇの用量では４日）。Ｄｌｌ４抗体単独で処置された腫瘍では、腫瘍増殖が２１日遅れた。さらに、併用処置では、対照およびいずれかの単一薬剤処置と比較して腫瘍増殖が遅れた（６ｍｇ／ｋｇのドセタキセル＋Ｄｌｌ４Ａｂでは２８日、ｐ＜０．５）。
【００９９】
これらの結果は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍が、ドセタキセル処置単独に対しては中程度の応答性があるが、抗Ｄｌｌ４抗体による処置に対して非常に感受性であることを示している。Ｄｌｌ４遮断剤とドセタキセルとの組み合わせは、腫瘍増殖をさらに遅らせることができ、いずれかの単一薬剤と比較して腫瘍増殖阻害をわずかに改善する（腫瘍退縮）。
【実施例５】
【０１００】
５−ＦＵと組み合わせた抗ｈＤｌｌ４抗体の効果
腫瘍増殖における５−ＦＵと組み合わせた抗Ｄｌｌ４抗体（ＲＥＧＮ４２１）の効果をヒト化Ｄｌｌ４ＳＣＩＤマウスに移植された腫瘍において評価した。各マウスに、５×１０６ヒトＨＣＴ１１６腫瘍細胞（ＣＲＣ）を皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍がマウスに確立された後（約１５０ｍｍ３の腫瘍サイズ、移植の２２日後）、腫瘍を測定し、無作為に割り当てた。次いで、マウスをｈＦｃ、ＲＥＧＮ４２１、５−ＦＵまたはＲＥＧＮ４２１および５−ＦＵの組み合わせで処置した。全３０匹のマウスを６群（コホート当たりｎ＝５）に分けた。第１群は、２ｍｇ／ｋｇのｈＦｃで皮下処置し、第２群は、２ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ４２１で皮下処置し、第３および第４群は、それぞれ１５および２５ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵで腹腔内処置し、第５群は、２ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ４２１で皮下および１５ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵで腹腔内処置し、かつ第６群は、２ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ４２１で皮下および２５ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵで腹腔内処置した。ＲＥＧＮ４２１は、２２日目に開始して３〜４日毎に投与し、合計３用量をマウスに与えた。５−ＦＵは、２２日目に開始して３〜４日毎に投与し、合計３用量をマウスに与えた。
【０１０１】
単一薬剤としてまたは組み合わせにおいてＲＥＧＮ４２１および５−ＦＵの効果を評価するため、初回ＲＥＧＮ４２１処置の３日前に開始し、次いで各薬剤処置日（２２、２６、２９日目）に、その後、腫瘍が約６００ｍｍ３のサイズに到達するまで３〜４日毎に腫瘍サイズ（体積）における変化を測定した。インビボ腫瘍サイズは、式（長さ×幅２）／２を用いて算出した（図３および表５）。
【０１０２】
【表５】
2016501201.tif 000007
【０１０３】
５−ＦＵ処置単独では、腫瘍増殖における最小限の遅延を生じた（全量４５ｍｇ／ｋｇでは４日、全量７５ｍｇ／ｋｇでは２日）。Ｄｌｌ４抗体単独で処置した腫瘍は、腫瘍増殖が６日遅れた。併用処置は、対照と比較して、腫瘍増殖を更に遅延させた（ｐ＜０．０４３）。
【実施例６】
【０１０４】
イリノテカンと組み合わせた抗ｈＤｌｌ４抗体の効果
腫瘍増殖におけるイリノテカン（塩酸イリノテカン）と組み合わせにおいて抗Ｄｌｌ４Ａｂ（ＲＥＧＮ４２１）の効果をヒト化Ｄｌｌ４ＳＣＩＤマウスに移植された腫瘍において評価した。
【０１０５】
各マウスに、５×１０６のヒトＨＣＴ１１６腫瘍細胞を皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍がマウスに確立された後（約１５０ｍｍ３の腫瘍サイズ、移植の１５日後）、腫瘍を測定し、無作為に割り当てた。次いで、マウスを、ｈＦｃ、ＲＥＧＮ４２１、イリノテカン、またはＲＥＧＮ４２１およびイリノテカンの組み合わせで処置した。全３０匹のマウスを６群（コホート当たりｎ＝５）に分けた。第１群は、２ｍｇ／ｋｇのｈＦｃで皮下処置し、第２群は、２ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ４２１で皮下処置し、第３および第４群は、それぞれ７．５および２５ｍｇ／ｋｇのイリノテカンで腹腔内処置し、第５群は、２ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ４２１で皮下および７．５ｍｇ／ｋｇのイリノテカンで腹腔内処置し、かつ第６群は、２ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ４２１で皮下および２５ｍｇ／ｋｇのイリノテカンで腹腔内処置した。ＲＥＧＮ４２１は、１５日目に開始して３〜４日毎に投与し、合計３用量をマウスに与えた。イリノテカンは、１５日目に開始して３〜４日毎に投与し、合計３用量をマウスに与えた。
【０１０６】
単一薬剤としてまたは併用処置におけるＲＥＧＮ４２１およびイリノテカンの効果を評価するため、初回ＲＥＧＮ４２１処置の３日前に開始し、次いで各薬剤処置日（１５、１９、２２日目）、その後、腫瘍が６００ｍｍ３のサイズに到達するまで３〜４毎に腫瘍サイズ（体積）における変化を測定した。インビトロ腫瘍サイズは、式（長さ×幅２）／２を用いて算出した。結果を図４および表６に示す。
【０１０７】
【表６】
2016501201.tif 000008
【０１０８】
イリノテカン処置単独では、腫瘍増殖に遅延を生じた（全量２２．５ｍｇ／ｋｇでは８日、全量７５ｍｇ／ｋｇでは１６日）。Ｄｌｌ４抗体単独で処置された腫瘍では、腫瘍増殖が９日遅れた。併用処置では、抗腫瘍有効性が有意に改善され、いずれかの単一薬剤処置と比較して腫瘍の更なる増殖が遅れた（７５ｍｇ／ｋｇのイリノテカン＋Ｄｌｌ４Ａｂでは１９日；ｐ＜０．０００１）。
【実施例７】
【０１０９】
Ｃｏｌｏ２０５腫瘍中のＨｅｙ１遺伝子発現における抗ｈＤｌｌ４抗体の効果
腫瘍中の識別的遺伝子発現における抗ｈＤｌｌ４抗体の効果をヒトＣｏｌｏ２０５結腸直腸腫瘍細胞で移植されたヒト化Ｄｌｌ４ＳＣＩＤマウスで試験した。簡潔には、雄および雌のヒト化Ｄｌｌ４ＳＣＩＤマウスにマウス当たり２×１０６のＣｏｌｏ２０５細胞を皮下移植した。腫瘍が約１５０ｍｍ３に到達したとき、マウス（群当たり４匹の動物）を一回量の０．５、５または１５ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ４２１、または１５ｍｇ／ｋｇのｈＦｃ対照で処置した。処置後５時間、１０時間、２４時間、７２時間および７日で腫瘍を切除し、ＲＮＡ  ｌａｔｅｒ安定化試薬（Ｑｉａｇｅｎ）中に保存した。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて腫瘍ＲＮＡを精製した。ミキサーミル中にβ−メルカプトエタノールを含むリシスバッファー（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）中で組織をホモジナイズし、カラム上に装填し、非結合汚染物を十分に洗浄した。ＤＮａｓｅ  Ｉ消化をカラム上で実施し、ＲＮａｓｅを含まない水中にＲＮＡを溶離した。Ｑｕｉｃｋ  Ａｍｐ（商標）ＲＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてシアニン３（Ｃｙ３）−ＣＴＰを全ＲＮＡ５００ｎｇからの増幅ｃＲＮＡ中に組み込んだ。次いで、各試料からのＣｙ３標識ｃＲＮＡをマウスおよびヒトトランスクリプトームをカバーしているカスタムアレイにハイブリッド形成した。アレイのハイブリッド形成および洗浄は、製造者のプロトコールに従って実施し、アレイをＡｇｉｌｅｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙスキャナ上で走査した。走査されたアレイ画像から、ＡｇｉｌｅｎｔＦｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ９．５を用いてデータを抽出した。
【０１１０】
対照群と処置群との間で示差的に発現された遺伝子を特定するため、チップごとのセンタリング中央値（ｐｅｒ−ｃｈｉｐ  ｍｅｄｉａｎ  ｃｅｎｔｅｒｉｎｇ）を各試料の完全ゲノムプロファイルに適用した。次いで、無作為分散モデルｔ検定を用いて遺伝子発現値を２群間で比較した（Ｓｉｍｏｎ，  Ｒ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  “Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＤａｔａＵｓｉｎｇ  ＢＲＢ−Ａｒｒａｙ  Ｔｏｏｌｓ”，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｆｏｒｍ  ３：１１−７）。１．５倍を超える平均差および２群間でｐ値＜０．０５を有する遺伝子を選択し、下行性の倍率変化をランク付けした。また、包括的試験を実施し、その際、個々の試料標識を１０００回まで入れ換え、遺伝子選択過程を繰り返した。これにより２群間で示差的に発現されたと特定される遺伝子数が単独の機会によって期待されるよりも多いかどうかを決定する。
【０１１１】
Ｈｅｙ１は、Ｎｏｔｃｈ活性化のすぐ下流の標的として特定されたＨｅｙファミリーのメンバーであり、マウス試験においてインビボ腫瘍中のＤｌｌ４−Ｎｏｔｃｈ経路シグナル伝達を阻害するとＨｅｙ−１  ＲＮＡレベルが低減することがわかっている（Ｎｏｇｕｅｒａ−Ｔｒｏｉｓｅ，Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔｕｒｅ  ４４４（７１２２）：１０３２−７）。図５に示すように、マイクロアレイを用いた本試験におけるＨｅｙ１  ｍＲＮＡレベルの分析は、対照ｈＦｃ処置マウスと比較してＲＥＧＮ４２１処置マウスにおけるＨｅｙ１  ｍＲＮＡレベルは、処置後１０時間で減少が始まったが、処置後７２時間および７日で最も有意に減少した。有意な減少は、０．５ｍｇ／ｋｇ、すなわち、ＲＥＧＮ４２１で最も少ない用量で観察されなかった。これらの結果は、ＲＥＧＮ４２１がＮｏｔｃｈシグナル経路を効果的に遮断し、Ｈｅｙ１がＤｌｌ４抗体によるＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害の有用な薬力学的マーカーとなりうることを示している。
【実施例８】
【０１１２】
第Ｉ相における予備的な薬物動態学的試験
ＲＥＧＮ４２１は、現在、ヒトにおける第一試験において試験されている。本試験の第１の目的は、将来の有効性試験のためのＲＥＧＮ４２１の推奨用量を決定することである。第２の目的は、薬物安全性プロファイル、その薬物動態、免疫原性および薬力学、ならびに有効性の予備的証拠を特徴づけることである。本試験では、従来の療法で癌が進行した患者に抗ｈＤｌｌ４抗体ＲＥＧＮ  ４２１を３週毎に静脈内投与する。試験設計は、用量漸増および用量制限毒性の定義についての標準手法に従う。現在まで、７人の患者を、３週毎に０．２５ｍｇ／ｋｇ／用量で処置し、６人の患者を、３週毎に０．５０ｍｇ／ｋｇ／用量で処置している。薬物動態学的試験のため、１日目の投薬前、０時間、ならびに投薬後１、２、４および８時間、続いて周期１の２、３、４、８、および１５日目、かつ投薬前、周期２以降の１日目の０時間、１５、３０、および６０日目における処置後のフォローアップで血液試料を採取した。試料中のＲＥＧＮ４２１の血漿／血清レベルを無希釈の血清試料中で２．５μｇ／ｍＬの定量上限および０．０３９μｇ／ｍＬの定量下限のＥＬＩＳＡによって測定した。試験は、１、２、４および７ｍｇ／ｋｇ／用量としてプロトコールに定義された、より高い用量を投与する目的で継続中である。
【０１１３】
０．２５ｍｇ／ｋｇ（７人の患者）および０．５ｍｇ／ｋｇ（２人の患者）のＲＥＧＮ４２１の一回３０分のＩＶ注入後に血漿薬物動態学的パラメーターを示す現在入手可能なデータを表７に示す。Ｃｍａｘ：薬物の最大血清中濃度；Ｔ最終：定量化可能な最終薬物濃度までの時間；Ｃ最終：定量化可能な最終薬物濃度；ＡＵＣ最終：薬物の最終濃度までの曲線下面積；ＡＵＣ：全曲線下面積（すなわち、薬物曝露）；ｔ１／２Ｚ：終末相半減期；Ｖｓｓ：定常状態の分布体積；ＣＬ：薬物除去速度。値は：平均（ＣＶ％）、および［範囲］（ａ：中央値［範囲］）である。
【０１１４】
【表７】
2016501201.tif 000009
【０１１５】
表７に示すように、ＲＥＧＮ４２１のピーク血清中濃度は、０．２５ｍｇ／ｋｇの用量レベルで６．２７μｇ／ｍＬ、０．５０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで９．８８・ｇ／ｍＬの平均値であった。これらの値は、動物の異種移植モデルにおける抗腫瘍活性に関連するＲＥＧＮ４２１濃度の範囲内にある。
【０１１６】
ＲＥＧＮ４２１投与前および投与後２４時間に採取された患者の血清試料においてマイクロアレイ技術を用いてＤｌｌ４−ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路におけるＲＥＧＮ４２１の薬力学的効果を分析した。結果を表８に示す。
【０１１７】
【表８】
2016501201.tif 000010
【０１１８】
表８に示すように、ＲＥＧＮ４２１投与によるＨｅｙ−１遺伝子の発現は、すべての試料で、処置前の試料と比較して低減した。ヒト化Ｄｌｌ４ＳＣＩＤマウスの異種移植腫瘍モデルで観察されたように（上の実施例７を参照のこと）、試験結果は、ＲＥＧＮ４２１がヒトにおけるＤｌｌ４の生物学的活性を実際に阻害していることを示唆している。
【実施例９】
【０１１９】
第Ｉ相患者に対するゲムシタビンと組み合わせたＤｌｌ４Ａｂ
本試験は、標準療法に対して難治性であるまたは承認された処置の選択肢がない進行性または転移性癌を有する成人患者において実施される。診断される患者。本試験は、標準療法に対して難治性であるまたは承認された処置の選択肢がない進行性または転移性癌を有する成人患者において実施される。ＥＣＯＧ（Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ）パフォーマンスステイタススコア０〜２（０〜５のスケール）ならびに妥当な腎臓、肝臓および血液学的検査パラメーターを有する、病理学的、物理的および放射線学的試験に従って進行性固形悪性腫瘍を有すると診断された患者が、本試験に参加する資格がある。患者は、本試験中に、同時に輸血および鎮痛剤などの支持的治療を受けることができる。患者は以前に転移性疾患のための化学療法または生物学的療法を受けている場合がある。患者は、３＋３のひな型の順次投薬コホートに割り当てられる。３人の患者を１つの用量レベルに登録し、用量制限毒性（ＤＬＴ）が生じない場合、次の用量レベルに用量漸増を行う。最初の３人の患者のうちの１人がＤＬＴを経験する場合、さらに３人の患者をその用量レベルで登録してもよい。最初の３人の患者のうちの２人がＤＬＴを経験する場合、その用量レベルは過度の毒性を有するとみなされ、さらに３人の患者を以前の用量レベルに登録する。患者は、１日目：３０分かけて抗Ｄｌｌ４抗体（例えば、ＲＥＧＮ４２１またはＲＥＧＮ２８１）０．２５〜１０ｍｇ／ｋｇＩＶ＋３０分かけてゲムシタビン１２５０ｍｇ／ｍ2ＩＶ注入および８日目：３０分かけてゲムシタビン１２５０ｍｇ／ｍ2ＩＶ注入を受ける。癌進行または過度の毒性が生じるまで併用レジメンを３週毎に繰り返す。
【０１２０】
主要エンドポイントは、ゲムシタビンと組み合わせた抗Ｄｌｌ４抗体の安全性、忍容性および用量制限毒性を評価すること、および進行性固形悪性腫瘍を有する患者においてゲムシタビンと組み合わせて抗Ｄｌｌ４抗体の最大耐量（ＭＴＤ）を特定することである。副次エンドポイントとしては、ＲＥＣＩＳＴ基準（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４  ５：２２８−２４７による）に従った抗腫瘍活性の説明、ゲムシタビンと組み合わせて与えたときの抗Ｄｌｌ４抗体の薬物動態学的（ＰＫ）プロファイルの評価、および抗Ｄｌｌ４抗体に対する免疫原性の測定が挙げられる。疾患寛解は、身体的検査、放射線学的方法（Ｘ線、コンピューター断層撮影または磁気共鳴画像法）用いて評価する。有害事象は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔｓ（ＣＴＣＡＥ  ｖ  ４．０，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅウェブサイトのＣａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ＰｒｏｇｒａｍまたはＣＴＥＰの下で入手可能）を用いて評価する。血清試料を患者から採取して抗Ｄｌｌ４抗体の濃度、ならびに抗Ｄｌｌ４抗体に対する可能な抗体の存在を測定する。
【実施例１０】
【０１２１】
ＣＲＣ患者へのＤｌｌ４ＡｂおよびＦＯＬＦＯＸの投与
簡潔には、ＥＣＯＧ（Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ）パフォーマンスステイタススコア０〜２（０〜５のスケール）ならびに妥当な腎臓、肝臓および血液学的検査パラメーターを有する病理学的、物理的および放射線学的試験に従って局所的進行性または転移性大腸癌を有すると診断された成人患者が、本試験に参加する資格がある。患者は、本試験中に、同時に輸血および鎮痛剤などの支持的治療を受けることができる。患者は、以前に転移性疾患のための化学療法（または抗血管新生、もしくは抗ＥＧＦＲ療法）を受けていない場合があり、それらの疾患のアジュバント処置のための以前のこのような療法が許されており、本試験の登録の少なくとも１２ヵ月前に終了していなければならない。患者を１：１の比率で無作為割り当てして静脈内ＦＯＬＦＯＸ化学療法（１日目：オキサリプラチン８５ｍｇ／ｍ2ＩＶ注入およびロイコボリン（フォリン酸）２００ｍｇ／ｍ2ＩＶ注入、続いて２〜４分かけて与えた５−ＦＵ４００ｍｇ／ｍ2ＩＶボーラス、続いて２２時間連続注入として５−ＦＵ６００ｍｇ／ｍ2ＩＶ。２日目：ロイコボリン２００ｍｇ／ｍ2ＩＶ注入、続いて２〜４分かけて与えた５−ＦＵ４００ｍｇ／ｍ2ＩＶボーラス、続いて２２時間連注入として５−ＦＵ６００ｍｇ／ｍ2ＩＶ注入）を２週毎にビバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）：血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対するヒト化モノクローナルＡｂ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）（１日目：１０ｍｇ／ｋｇＩＶ）、または１日目に０．２５〜１０ｍｇ／ｋｇの抗Ｄｌｌ４抗体（ＲＥＧＮ４２１）ＩＶと共に、先に記載された処置と組み合わせて行う。癌進行または過度の毒性が生じるまで処置を２週毎に繰り返す。
【０１２２】
主要エンドポイントは、少なくとも部分寛解（ＲＥＣＩＳＴ基準（前出、Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９による）に従って、確認された癌病変の直径の合計における３０％またはより以上の減少））を達成した患者の比率であり、副次エンドポイントとしては、腫瘍進行までの期間および全生存期間が挙げられる。疾患寛解を、身体的検査、放射線学的方法（Ｘ線、コンピューター断層撮影または磁気共鳴画像法）、および血清中に測定された癌胎児性抗原（ＣＥＡ）レベルを用いて評価する。また、有害事象などの他の臨床パラメーターもＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔｓ（ＣＴＣＡＥ  ｖ  ４．０，  前出）を用いて評価する。患者の血清試料を採取して抗Ｄｌｌ４抗体の血清中濃度、ならびに抗Ｄｌｌ４抗体に対する可能な抗体の存在を測定する。
【実施例１１】
【０１２３】
ドセタキセルと組み合わせたＤｌｌ４Ａｂの第ＩＩ相
本試験は、進行性の手術不能なまたは転移性乳癌を有する成人患者で実施する。患者は、以前にアジュバント療法に失敗している場合がある。ＥＣＯＧ（Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ）パフォーマンスステイタススコア０〜２（０〜５のスケールで）ならびに妥当な腎臓、肝臓および血液学的検査パラメーターを有する病理学的、物理的および放射線学的試験に従って乳癌を有すると診断された患者が、本試験に参加する資格がある。患者は、本試験中に、同時に輸血および鎮痛剤などの支持的治療を受けることができる。患者は、以前に転移性疾患のための化学療法または生物学的療法を受けていない場合がある。患者の適格性を決定するスクリーニング方法を良好に通過した後、患者１００人までの一連のコホートを処置する。患者は、１日目：３０分かけて０．２５〜１０ｍｇ／ｋｇの抗Ｄｌｌ４抗体（ＲＥＧＮ４２１）ＩＶ、加えて、３０分かけてドセタキセル７５ｍｇ／ｍ2ＩＶ注入を受ける。癌進行または過度の毒性が生じるまで併用レジメンを３週毎に繰り返す。
【０１２４】
主要エンドポイントは、ＲＥＣＩＳＴ基準（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ４  ５：２２８−２４７による）に従う腫瘍奏効率（ｔｕｍｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｒａｔｅ）、および無憎悪期間（ｔｉｍｅ  ｔｏ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）に基づいて処置の有効性を評価することである。副次エンドポイントとしては、ドセタキセルと組み合わせて与えたときの抗Ｄｌｌ４抗体の安全性および薬物動態学的（ＰＫ）プロファイルの説明、ならびに抗Ｄｌｌ４抗体に対する免疫原性の測定が挙げられる。疾患寛解は、身体的検査、放射線学的方法（Ｘ線、コンピューター断層撮影または磁気共鳴画像法）用いて評価する。有害事象は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔｓ（ＣＴＣＡＥ  ｖ  ４．０，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅウェブサイトのＣａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ＰｒｏｇｒａｍまたはＣＴＥＰの下で入手可能）を用いて評価する。血清試料を患者から採取して抗Ｄｌｌ４抗体の濃度、ならびに抗Ｄｌｌ４抗体に対する可能な抗体の存在を測定する。
【実施例１２】
【０１２５】
シスプラチン／ゲムシタビンを用いたＤｌｌ４Ａｂの第ＩＩ相試験
本試験は、進行性の手術不能なまたは転移性膀胱癌を有する成人患者で実施する。ＥＣＯＧ（Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ）パフォーマンスステイタススコア０〜２（０〜５のスケールによる）、ならびに妥当な腎臓、肝臓、および血液学的検査パラメーターを有する、病理学的、物理的および放射線学的試験に従って浸潤性膀胱癌を有すると診断された患者が、本試験に参加する資格がある。患者は、本試験中に、同時に輸血および鎮痛剤などの支持的治療を受けることができる。患者は、以前に転移性疾患のための化学療法または生物学的療法を受けていない場合がある。患者の適格性を決定するスクリーニング方法を良好に通過した後、患者１００人までの一連のコホートを処置する。患者は、１日目に３０分かけて０．２５〜１０ｍｇ／ｋｇの抗Ｄｌｌ４抗体（ＲＥＧＮ４２１）ＩＶ、加えて、１、８、および１５日目に３０〜６０分かけてゲムシタビン１，０００ｍｇ／ｍ2、および２日目にシスプラチン７０ｍｇ／ｍ2を受ける。癌進行または過度の毒性が生じるまで併用レジメンを４週毎に繰り返す。
【０１２６】
主要エンドポイントは、ＲＥＣＩＳＴ基準（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４  ５：２２８−２４７による）に従う腫瘍奏効率、および無憎悪期間に基づいて処置の有効性を評価することである。副次エンドポイントとしては、ドセタキセルと組み合わせて与えた時の抗Ｄｌｌ４抗体の安全性プロファイルおよび薬物動態学的（ＰＫ）プロファイルの説明ならびに抗Ｄｌｌ４抗体に対する免疫原性の測定が挙げられる。疾患寛解は、身体的検査、放射線学的方法（Ｘ線、コンピューター断層撮影または磁気共鳴画像法）用いて評価する。有害事象は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔｓ（ＣＴＣＡＥ  ｖ  ４．０，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅウェブサイトのＣａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ＰｒｏｇｒａｍまたはＣＴＥＰの下で入手可能）を用いて評価する。血清試料を患者から採取して抗Ｄｌｌ４抗体の濃度、ならびに抗Ｄｌｌ４抗体に対する可能な抗体の存在を測定する。
【実施例１３】
【０１２７】
卵巣異種移植モデルにおける抗−ｈＤｌｌ４抗体の効果
上述のように、ヒト抗Ｄｌｌ４抗体ＲＥＧＮ４２１での処置は、ヒトＤｌｌ４を発現するように操作された免疫不全マウスにおいて増殖した特定起源（例えば、非小細胞肺癌、結腸直腸癌など）のいくつかのヒト腫瘍異種移植の強力かつ用量依存的阻害を引き起こした。卵巣腫瘍異種移植におけるＤｌｌ４遮断の効果を検査するための試験もなされた。さらに、腫瘍細胞発現Ｄｌｌ４を標的とするのではなく、腫瘍ストロマ内のＤｌｌ４を標的としたＤｌｌ４遮断の効果、ならびにＤｌｌ４遮断のＶＥＧＦ阻害との併用療法の効果を調べた。
【０１２８】
卵巣腫瘍異種移植細胞を、ヒト化Ｄｌｌ４  ＳＣＩＤマウスまたはベンダーＳＣＩＤマウス（すなわち、天然マウスＤｌｌ４を発現するＳＣＩＤマウス）に移植した。移植後、マウスをＲＥＧＮ４２１（抗ヒトＤｌｌ４抗体、ヒトＤｌｌ４に結合する）、ｍＤｌｌ４Ａｂ１（抗マウスＤｌｌ４抗体、マウスＤｌｌ４に結合する）、またはヒトＦｃドメイン対照タンパク質で処理した。一試験において、マウスをＶＥＧＦ−トラップ、ｍＤｌｌ４Ａｂ１、またはＶＥＧＦ−トラップ＋ｍＤｌｌ４Ａｂ１で処置した。ＴＯＶ−１１２Ｄ細胞（５×１０６）をヒト化Ｄｌｌ４（ｎ＝４）またはベンダーＳＣＩＤマウス（ｎ＝７）の右脇腹に皮下移植した。ＲＥＧＮ４２１（２．５ｍｇ／ｋｇ、１×／週）またはｍＤｌｌ４Ａｂ１（５ｍｇ／ｋｇ、１×週）対ｈＦｃ対照での処置を、腫瘍細胞移植の１週間後に開始した。動物を２〜３週間処置した。Ａ２７８０細胞（２×１０６）を、ヒト化Ｄｌｌ４またはベンダーＳＣＩＤマウス（ｎ＝４〜５）内に腹腔内移植した。ＲＥＧＮ４２１（２．５ｍｇ／ｋｇ、１×／週）またはｍＤｌｌ４Ａｂ１（５ｍｇ／ｋｇ、１×週）対ｈＦｃ対照での処置を、腫瘍細胞移植の１週間後に開始した。Ａ２７８０併用試験のために、ｍＤｌｌ４Ａｂ１（５ｍｇ／ｋｇ、１×／週）およびＶＥＧＦ−トラップ（１０ｍｇ／ｋｇ、２×／週）での同時処置を、腫瘍細胞移植の１週間後に開始した。この試験にはＶＥＧＦ−トラップシグナル処置アームが含まれた。Ａ２７８０腫瘍を有する動物を４〜５週間処置した。マトリゲル内のＳＫＯＶ−３細胞（５×１０６）を皮下移植し、腫瘍を担持する動物（ｎ＝１０）にＲＥＧＮ４２１（２．５ｍｇ／ｋｇ）およびｍＤｌｌ４Ａｂ１（５ｍｇ／ｋｇ）を週１回投与した。ＯＶＣＡＲ−３細胞（１×１０７）をベンダーＳＣＩＤマウス（ｎ＝７）の右脇腹に皮下移植した。ｍＤｌｌ４Ａｂ１（５ｍｇ／ｋｇ１×／週）対ｈＦｃ対照での処置を腫瘍細胞移植の６６日後に開始した。動物を合計５週間処置した。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を上で詳述されるように測定した。
【０１２９】
【表９】
2016501201.tif 000011
【０１３０】
表９に示されるように、卵巣異種移植モデルのＤｌｌ４抗体処置は、腫瘍細胞を発現するＤｌｌ４ではなく、腫瘍ストロマ内の標的Ｄｌｌ４に依存して強力な抗腫瘍効果が生じる。具体的には、確立された皮下ＴＯＶ−１１２Ｄを担持するヒト化Ｄｌｌ４マウスのＲＥＧＮ４２１処置（２．５ミリグラム／ｋｇ、週１回）、皮下ＳＫＯＶ−３または腹腔内Ａ２７８０ヒト腫瘍異種移植は、それぞれ、８６％、８３％、および６１％の増殖阻害をもたらした。同様の抗腫瘍効果が、ＯＶＣＡＲ３またはＳＫＯＶ−３腫瘍（すなわち、ｈＤｌｌ４を発現するヒト卵巣腫瘍細胞）を有するＳＣＩＤマウスにおいて、マウスＤｌｌ４特異的代理抗体ｍＤｌｌ４Ａｂ１を有するストロマＤｌｌ４に限定して標的とすることによって観察された。対照的に、腫瘍細胞発現ヒトＤｌｌ４の特異的遮断（すなわち、ベンダーＳＣＩＤマウスに移植されたヒト卵巣腫瘍異種移植細胞によって発現されたＤｌｌ４の遮断）は、際立った抗腫瘍活性を示さず、これらのモデルにおいて腫瘍増殖を促進する自己分泌Ｄｌｌ４−Ｎｏｔｃｈ腫瘍細胞シグナル伝達の欠如を示す（例えば、表９のＳＣＩＤマウスにおける皮下ＴＯＶ−１１２Ｄおよび腹腔内Ａ２７８０腫瘍のＲＥＧＮ４２１処理についてのデータを参照のこと）。最後に、Ｄｌｌ４抗体の抗−ＶＥＧＦ剤ｚｉｖ−ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ（ＶＥＧＦ−トラップ）との併用処置は、強化された抗腫瘍効果および腹腔内Ａ２７８０腫瘍増殖のほぼ完全な抑制をもたらし、卵巣癌におけるＶＥＧＦおよびＤｌｌ４の併用遮断の臨床的利益を実証する。
【０１３１】
【表１０】
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【０１３２】
腫瘍微小血管密度の定量を、ＣＤ３１染色を用いて免疫組織化学的に評価した。ＴＯＶ−１１２ＤおよびＳＫＯＶ−３卵巣腫瘍異種移植を有する天然Ｄｌｌ４ＳＣＩＤマウスを、抗−マウスＤｌｌ４抗体ｍＤｌｌ４Ａｂ１またはｈＦｃ（対照）で処置した。表１０に示されるように、ｍＤｌｌ４Ａｂ１での処置は、腫瘍脈管構造の著しい増加を伴い、血管新生出芽の調節因子としてＤｌｌ４の機能を強調した。腫瘍灌流の低減も見られた（図示されず）。
【０１３３】
これらの試験は、単剤としても、抗ＶＥＧＦ剤と組み合わせても、卵巣癌における新血管新生ベースの抗癌戦略としてＤｌｌ４の治療標的化を実証する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2016501201.tif 000019
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