(57)【要約】  本発明は、トランスジェニック動物モデルに関する。具体的には、本発明は、ＴＳＰＯ関連の正常な生理、疾患および障害に関連する用途のためのトランスジェニック動物モデルに関するものである。本発明は、非機能性内在性ＴＳＰＯ遺伝子の少なくとも一つのコピーを有する細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物を特徴とする。ＴＳＰＯ関連機能を研究または調節するための化合物も開示されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非機能性内在性ＴＳＰＯ遺伝子の少なくとも一つのコピーを有する細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２】
前記細胞が機能性ＴＳＰＯ遺伝子を含まない請求項１に記載の動物。
【請求項３】
前記非機能性ＴＳＰＯ遺伝子が、欠失、挿入、フレームシフト突然変異、転位または置換からなる群から選択される少なくとも一つの突然変異を含む請求項１または２に記載の動物。
【請求項４】
前記突然変異が構成的である請求項１から３のいずれか１項に記載の動物。
【請求項５】
前記突然変異が条件的である請求項１から３のいずれか１項に記載の動物。
【請求項６】
前記変異が、前記ＴＳＰＯ遺伝子内のエキソン１、２、３および／または４の全てもしくは一部の欠失を含む請求項３または４に記載の動物。
【請求項７】
前記突然変異が、前記ＴＳＰＯ遺伝子内のエキソン２および／または３の全てもしくは一部の欠失を含む請求項３から５のいずれか１項に記載の動物。
【請求項８】
前記動物がショウジョウバエ、ヒル、マウスまたはコイからなる群から選択される科からのものである前記請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
前記動物がマウスである請求項８に記載の動物。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載の動物の後代。
【請求項１１】
請求項９のマウスをｐＫＺ１マウス、Ｂｒｃａ２ホモ接合マウス、Ｔｇ（ＣＡＴ）（＋／＋）マウス、Ａ−Ｔ変異ヘテロ接合／ホモ接合マウス、Ｃｓｂｍ／ｍマウス、インシュリン様成長因子１ヘテロ接合およびホモ接合マウス、Ｐ５３ヘテロ接合およびホモ接合マウス、放射線感受性および抵抗性トランスジェニックマウス、統合失調症ＤＩＳＣ１ノックアウトマウス、統合失調症ニューレグリン１ノックアウトマウス、遺伝子工学モデル腫瘍マウス、神経炎症モデルマウス、アルツハイマー病モデルマウス、パーキンソン病モデルマウスまたはインシュリン抵抗性および食餌誘発肥満に対して感受性である２型脱ヨウ素酵素遺伝子（Ｄ２ＫＯ）の標的欠失を有するマウスと異種交配することで発生する後代。
【請求項１２】
対象者におけるＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害の治療で使用される化合物の同定方法であって、候補化合物を請求項１から９のいずれか１項に記載の非ヒト動物または請求項１０もしくは請求項１１に記載の後代に投与すること、および前記非ヒト動物の表現型に対する当該候補化合物の効果を評価することを含む方法。
【請求項１３】
対象者におけるＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害の治療で使用される化合物の同定方法であって、候補化合物を請求項１から９のいずれか１項に記載の非ヒト動物または請求項１０もしくは請求項１１に記載の後代に投与すること、およびＴＳＰＯ関連遺伝子産物または非ヒト動物に存在し得るＴＳＰＯ遺伝子産物の発現レベルに対する当該候補化合物の効果を評価することを含む方法。
【請求項１４】
対象者におけるＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害の治療で使用される候補化合物の結合の特異性もしくは選択性のスクリーニング方法であって、請求項１から９のいずれか１項に記載の被験非ヒト動物または請求項１０もしくは請求項１１に記載の後代、および同じ種の野生型非ヒト動物に候補化合物を投与すること、およびＴＳＰＯ関連遺伝子産物または野生型非ヒト動物に存在し得るＴＳＰＯ遺伝子産物に対する当該候補化合物の結合の特異性もしくは選択性を、ＴＳＰＯ関連遺伝子産物または被験非ヒト動物に存在し得るＴＳＰＯ遺伝子産物に対する当該候補化合物の結合の特異性もしくは選択性と比較することを含む方法。
【請求項１５】
対象者におけるＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害の治療で使用される化合物の確認に使用される場合の、請求項１から９のいずれか１項に記載の動物または請求項１０もしくは請求項１１に記載の後代。
【請求項１６】
対象者におけるＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害の治療で使用される候補化合物の結合の特異性もしくは選択性のスクリーニングに使用される場合の、請求項１から９のいずれか１項に記載の動物または請求項１０もしくは請求項１１に記載の後代。
【請求項１７】
対象者におけるＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害の診断に使用される場合の、請求項１から９のいずれか１項に記載の動物または請求項１０もしくは請求項１１に記載の後代。
【請求項１８】
請求項１から９のいずれか１項に記載の動物または請求項１０もしくは請求項１１に記載の後代由来の細胞、組織または不死化細胞系。
【請求項１９】
生体サンプルにおけるＴＳＰＯ遺伝子産物を検出するための陰性対照としての請求項１８に記載の細胞、組織または不死化細胞系の使用。
【請求項２０】
ＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害を有するかそれを有すると推定される対象者からの生体サンプル中のＴＳＰＯ遺伝子産物を検出するための陰性対照としての請求項１８に記載の細胞、組織または不死化細胞系の使用。
【請求項２１】
対象者におけるＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害の診断のための請求項１８に記載の細胞、組織または不死化細胞系の使用。
【請求項２２】
対象者におけるＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害の治療で使用される化合物を確認するのに使用される場合の、請求項１８に記載の細胞、組織または不死化細胞系。
【請求項２３】
対象者におけるＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害の治療で使用される候補化合物の結合の特異性もしくは選択性 をスクリーニングするのに使用される場合の、請求項１８に記載の細胞、組織または不死化細胞系。
【請求項２４】
対象者におけるＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害 の診断に使用される場合の、請求項８に記載の細胞、組織または不死化細胞系。
【請求項２５】
ＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害の治療で使用される化合物の同定方法であって、請求項１８に記載の細胞、組織または不死化細胞系を候補化合物に曝露すること、および前記細胞、組織または不死化細胞系の表現型に対する前記候補薬剤の効果を評価することを含む方法。
【請求項２６】
対象者におけるＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害の治療で使用される化合物の同定方法であって、請求項１８に記載の細胞、組織または不死化細胞系を候補化合物に曝露すること、およびＴＳＰＯ関連遺伝子産物または前記細胞、組織または不死化細胞系に存在し得るＴＳＰＯ遺伝子産物の発現レベルに対する当該候補化合物の効果を評価することを含む方法。
【請求項２７】
対象者におけるＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害の治療で使用される候補化合物の結合の特異性もしくは選択性をスクリーニングする方法であって、野生型細胞、野生型組織または野生型不死化細胞系、および請求項１８に記載の細胞または不死化細胞系を候補化合物に曝露すること、およびＴＳＰＯ関連遺伝子産物または野生型細胞、野生型組織もしくは野生型不死化細胞系に存在し得るＴＳＰＯ遺伝子産物に対する当該候補化合物の結合の特異性もしくは選択性を、ＴＳＰＯ関連遺伝子産物または請求項１８に記載の細胞、組織もしくは不死化細胞系に存在し得るＴＳＰＯ遺伝子産物に対する候補化合物の結合の特異性もしくは選択性と比較することを含む方法。
【請求項２８】
前記ＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害が、癌、神経炎症、アルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、脳損傷、虚血−再潅流損傷、急性および慢性ストレスなどの行動障害または神経もしくは精神障害、不安障害、気分障害、ならびに統合失調症、末梢神経障害、多発性硬化症、神経因性疼痛、肥満、糖尿病および悪液質からなる群から選択される請求項 １２から１４または２５から２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害が、癌、神経炎症、アルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、脳損傷、虚血−再潅流損傷、急性および慢性ストレスなどの行動障害または神経もしくは精神障害、不安障害、気分障害、ならびに統合失調症、末梢神経障害、多発性硬化症、神経因性疼痛、肥満、糖尿病および悪液質からなる群から選択される請求項１５から１７のいずれか１項に記載の動物または後代。
【請求項３０】
前記ＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害が、癌、神経炎症、アルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、脳損傷、虚血−再潅流損傷、急性および慢性ストレスなどの行動障害または神経もしくは精神障害、不安障害、気分障害、ならびに統合失調症、末梢神経障害、多発性硬化症、神経因性疼痛、肥満、糖尿病および悪液質からなる群から選択される請求項２０または請求項２１に記載の使用。
【請求項３１】
前記ＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害が、癌、神経炎症、アルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、脳損傷、虚血−再潅流損傷、急性および慢性ストレスなどの行動障害または神経もしくは精神障害、不安障害、気分障害、ならびに統合失調症、末梢神経障害、多発性硬化症、神経因性疼痛、肥満、糖尿病および悪液質からなる群から選択される請求項２２から２４のいずれか１項に記載の細胞、組織もしくは不死化細胞系。
【請求項３２】
請求項１２、１３、２５、２６または２８のいずれか１項に記載の方法によって確認される場合の化合物。
【請求項３３】
ＴＳＰＯ機能を阻害するための下記一般式（Ｉ）の化合物の使用。
【化１】
2016516399.tif 000032
［式中、
Ｘは、非存在、ヨウ素もしくはそれの同位体であり；
Ｙは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＣＮおよびＣＯＯＨから選択され；
Ｚは、Ｎ（Ｒ３）Ｃ（Ｏ）Ｒ４およびＣ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４から選択され；
Ｒ１およびＲ２は独立に、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、（Ｃ６−Ｃ１２）アリールオキシ、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、複素環、（Ｃ２−Ｃ６）アルカノイルおよび（Ｃ２−Ｃ７）アシルから選択され、それらはそれぞれ、置換されていないかハロゲンもしくはそれの同位体、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良く；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に、水素または（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、複素環、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニルおよび（Ｃ２−Ｃ５）アシルから選択される基であり、それらはそれぞれ、置換されていないか、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良く、
またはＲ３およびＲ４が一体となって、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良い（Ｃ２−Ｃ７）アルキリデンであり；
ｍおよびｎは独立に、０、１または２であり；
ｐは１であり；
各場合で、
（ｉ）アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し；
（ｉｉ）シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し；
（ｉｉｉ）ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。］
【請求項３４】
全身および／または細胞エネルギーハウスホールドを変えるための下記一般式（Ｉ）の化合物の使用。
【化２】
2016516399.tif 000033
［式中、
Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍ、ｎおよびｐは、請求項３３に記載の化合物について定義の通りであり；
各場合で、
（ｉ）アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し；
（ｉｉ）シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し；
（ｉｉｉ）ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。］
【請求項３５】
ミトコンドリア酸化的経路を変えるための下記一般式（Ｉ）の化合物の使用。
【化３】
2016516399.tif 000034
［式中、
Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍ、ｎおよびｐは、請求項３３に記載の化合物について定義の通りであり；
各場合で、
（ｉ）アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し；
（ｉｉ）シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し；
（ｉｉｉ）ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。］
【請求項３６】
ミトコンドリアＡＴＰ産生を調節するための下記一般式（Ｉ）の化合物の使用。
【化４】
2016516399.tif 000035
［式中、
Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍ、ｎおよびｐは、請求項３３に記載の化合物について定義の通りであり；
各場合で、
（ｉ）アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し；
（ｉｉ）シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し；
（ｉｉｉ）ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。］
【請求項３７】
ＴＳＰＯ介在シグナル伝達を調節するための下記一般式（Ｉ）の化合物。
【化５】
2016516399.tif 000036
［式中、
Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍ、ｎおよびｐは、請求項３３に記載の化合物について定義の通りであり；
各場合で、
（ｉ）アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し；
（ｉｉ）シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し；
（ｉｉｉ）ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。］
【請求項３８】
ＴＳＰＯ介在エネルギー貯蔵を調節するための下記一般式（Ｉ）の化合物の使用。
【化６】
2016516399.tif 000037
［式中、
Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍ、ｎおよびｐは、請求項３３に記載の化合物について定義の通りであり；
各場合で、
（ｉ）アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し；
（ｉｉ）シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し；
（ｉｉｉ）ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。］
【請求項３９】
前記使用が、肥満に対する保護を提供する請求項３３から３９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４０】
前記使用が、高脂肪食餌誘発体重増に対する保護を提供する請求項３３から３９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４１】
神経障害関連の炎症応答を調べるための下記一般式（Ｉ）の化合物の使用。
【化７】
2016516399.tif 000038
［式中、
Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍ、ｎおよびｐは、請求項３３に記載の化合物について定義の通りであり；
各場合で、
（ｉ）アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し；
（ｉｉ）シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し；
（ｉｉｉ）ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。］
【請求項４２】
本発明の一部の実施形態において、ｎが０である請求項３３から３８または請求項４１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４３】
Ｙが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮおよびＯＨから選択され；Ｚが、Ｎ（Ｒ３）Ｃ（Ｏ）Ｒ４およびＣ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４から選択され；
Ｒ１およびＲ２が独立に、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ３）アルケニル、（Ｃ５−Ｃ６）シクロアルキル、フェニル、ナフチル、フェノキシ、ナフチルオキシ、ベンジル、ピリジル、フラニル、チエニル、ピペリジニル、モルホリニル、テトラヒドロフラニル、ジオキサニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルカノイルおよび（Ｃ２−Ｃ４）アシルから選択され、それらはそれぞれ置換されていないか、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ２−Ｃ４）アルコキシ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ３）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルカノイル、オキソおよびアミドからなる群から選択される置換基で置換されていても良く；
Ｒ３およびＲ４がそれぞれ独立に、水素または（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ２−Ｃ３）アルケニル、（Ｃ５−Ｃ６）シクロアルキル、フェニル、ナフチル、ベンジルおよび（Ｃ２−Ｃ４）アシルから選択される基であり、それらはそれぞれ置換されていないか、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、ＮＨ２、（Ｃ−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ３）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルカノイル、オキソおよびアミドからなる群から選択される置換基で置換されていても良く、
またはＲ３およびＲ４が一体となって、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ３）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルカノイル、オキソおよびアミドからなる群から選択される置換基で置換されていても良い（Ｃ２−Ｃ３）アルキリデンであり；
ｍおよびｎが独立に、０または１である、請求項３３から３８または請求項４１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４４】
前記式（Ｉ）の化合物が、下記式（ＩＡ）の２−（４′−ヨードフェニル）−イミダゾール［１，２−ａ］ピリジン−３−アセトアミド誘導体である請求項３３から３８または請求項４１のいずれか１項に記載の使用。
【化８】
2016516399.tif 000039
［式中、
Ｘはヨウ素またはそれの同位体であり；
Ｙはハロゲンであり；
Ｒ３およびＲ４は独立に、水素、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルおよび（Ｃ２−Ｃ４）アルケニルから選択され、またはＲ３およびＲ４が一体となって、（Ｃ２−Ｃ３）アルキリジンである。］
【請求項４５】
Ｘが１２５Ｉであり；
ＹがＣｌであり；
Ｒ３およびＲ４がＣＨ２ＣＨ３である請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
前記化合物が［１２５Ｉ］ＣＬＩＮＤＥである請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
前記式（Ｉ）の化合物が、下記式（ＩＢ）の誘導体である請求項３３から３８または請求項４１のいずれか１項に記載の使用。
【化９】
2016516399.tif 000040
［式中、
Ｙはハロゲンであり；
Ｒ１は独立に、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、（Ｃ６−Ｃ１２）アリールオキシ、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、複素環、（Ｃ２−Ｃ６）アルカノイルおよび（Ｃ２−Ｃ７）アシルから選択され、それらはそれぞれ、置換されていないか、ハロゲンもしくはそれの同位体、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良く；
Ｒ３およびＲ４は独立に、水素、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルおよび（Ｃ２−Ｃ４）アルケニルから選択され、またはＲ３およびＲ４が一体となって、（Ｃ２−Ｃ３）アルキリジンである。］
【請求項４８】
ＹがＣｌであり；
Ｒ１がＯＣＨ２ＣＨ２１８Ｆであり；
Ｒ３およびＲ４がＣＨ２ＣＨ３である請求項４７に記載の使用。
【請求項４９】
前記化合物が［１８Ｆ］ＰＢＲ１１１である請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
前記突然変異が、前記ＴＳＰＯ遺伝子内のエキソン２および３の欠失である請求項３から６のいずれか１項に記載の動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニック動物モデルに関する。具体的には、本発明は、ＴＳＰＯ関連の正常な生理、疾患および障害関連の適用のためのトランスジェニック動物モデルに関する。
【背景技術】
【０００２】
以前は末梢ベンゾジアゼピン受容体（ＰＢＲ）として知られた輸送タンパク質（ＴＳＰＯ）は、主としてミトコンドリア外膜上に位置する１８ｋＤａ膜タンパク質であり、身体全体に広く分布している。それの発現レベルは、異なる組織および臓器で変動する。健康な成体の脳実質は特に、非常に低レベルのＴＳＰＯを有するが、腎臓、肺および心臓は高レベルを発現し、さらにより高いレベルのＴＳＰＯが腺組織およびステロイド産生組織に存在する。ＴＳＰＯは、細菌から昆虫そして哺乳動物まで、動物種全体にわたって比較的良好に保存されている。
【０００３】
ＴＳＰＯの主たる機能はステロイド産生に関連しているように見えるが、ＴＳＰＯは、タンパク質輸送、イオン輸送、ポルフィリン輸送およびヘム生合成、細胞の増殖および分化、ミトコンドリア機能の調節、細胞呼吸、糖新生および酸化プロセスでの関与、そしてアポトーシスにおいても示唆されている。不偏性大規模全生物スクリーニングで、ＴＳＰＯが中心的な重要性を有するタンパク質であることが確認され、ＴＳＰＯの機能が動物種全体に保存されていること、そしてある動物種で得られる知見が別の動物種に翻訳可能であることが確認される。これは、ＴＳＰＯが変化する生物が、健康および疾患における多くの基本的に重要な生理機能の研究において高い有用性を有するものであることを示す独立の証拠である。
【０００４】
やはり、現在の考え方によれば、ＴＳＰＯの最も重要な機能は、水系のミトコンドリア膜間空間を通ってのプレグネノロンの前駆体であるコレステロールの移行を助けることによるステロイドホルモン産生の調節であり、その観点はＰＢＲの名称をＴＳＰＯとすることで強調されている。ＴＳＰＯのステロイド介在ホメオスタシスに対する調節効果、例えば報告されているＴＳＰＯ遺伝子ノックアウトの胎仔致死効果などについてのかなりの文献により、ＴＳＰＯ遺伝子産生物が生命に必須であるという考え方が確立されている。上記で示したように、内分泌調節剤としてのＴＳＰＯの非常に重要な役割は、アルツハイマー病の抗炎症治療（Barron, A. M. et al.Ligand for translocator protein reverses pathology in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neurosci 33, 8891-8897, doi:10.1523/JNEUROSCI.1350-13.2013 (2013)）から中枢ＧＡＢＡＡ受容体タンパク質複合体に対する直接効果なしでの不安寛解（Rupprecht, R. et al. Translocator protein (18 kDa) (TSPO) as a therapeutic target for neurological and psychiatric disorders. Nat Rev Drug Discov 9, 971-988, doi:nrd3295 [pii] 10.1038/nrd3295 (2010); Rupprecht, R.et al. Translocator protein (18 kD) as target for anxiolytics without benzodiazepine-like side effects. Science325, 490-493, doi:10.1126/science.1175055 (2009)）に至る極めて広い治療スペクトルに渡るＴＳＰＯ結合性化合物の観察される作用についての現在支配的となっている説明である。従って、ＴＳＰＯは多くの病的状態もしくは疾患状態で示唆されてきた。
【０００５】
上記の点に対してさらに、それには、ＴＳＰＯが非常に上昇する神経炎症を伴う疾患、神経変性疾患、脳損傷、虚血−再潅流損傷、癲癇および癌などがある。画像法のためのターゲットとしてのＴＳＰＯの使用は、ＴＳＰＯ発現が比較的低い脳においては特に有用である。より基本的なレベルで、ＴＳＰＯは、画像法および診断手段のターゲットとなっており、各種神経傷害および精神障害の治療ターゲットとして提案されている。
【０００６】
数種類のリガンドが末梢ベンゾジアゼピン受容体への高アフィニティ結合を示すことが明らかになっており、最も広く検討されているものは、ベンゾジアゼピンＲｏ５−４８６４（７−クロロ−５−（４−クロロフェニル）−１，３−ジヒドロ−１−メチル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン）およびイソキノリンＰＫ−１１１９５（１−（２−クロロフェニル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（１−メチルプロピル）−３−イソキノリンカルボキサミド）である。１１Ｃ、１８Ｆおよび１２３Ｉで標識して、これらのリガンドを用いて、ヒトの心臓および脳における末梢ベンゾジアゼピン受容体のマッピングが行われている。乳房、卵巣、前立腺、副腎、脳および結腸などの各種腫瘍細胞において、［３Ｈ］ＰＫ−１１１９５の取り込み促進が報告されている。好適なレベルの放射性ヨウ素による放射性標識を用いて、最初にこれら腫瘍を診断し（１２３Ｉまたは１３１Ｉなどの放射性標識を使用）、次にその腫瘍を治療用量（例えば、１２３Ｉ、１２５Ｉまたは１３１Ｉを使用）で処理することができる。
【０００７】
ＴＳＰＯなどの末梢ベンゾジアゼピン受容体に対して高アフィニティを示す化合物が、中枢ベンゾジアゼピン受容体への強い結合も示すと報告されている（例えば、Anzini M. et al., J. Med. Chem. 39 4275-4284 (1996)およびTrapani G. et al. J. Med. Chem. 40 3109-3118 (1997)参照）。従って、ある種のＴＳＰＯ結合性化合物は、ＴＳＰＯ関連の疾患および状態の診断や治療に有用となるだけの選択性がない場合が多い。
【０００８】
さらに最近では、末梢ベンゾジアゼピン受容体に強く結合するが、中枢ベンゾジアゼピン受容体には強く結合しないある種の２−（ヨードフェニル）−イミダゾ［１．２−ａ］ピリジン類が報告されている（米国特許第６，３７９，６４９号；それの全開示内容が参照によって本明細書に組み込まれる。）。これらの２−（ヨードフェニル）−イミダゾ［１．２−ａ］ピリジン類は、電気陰性置換基を有する場合、特にはその置換基がピリジン核におけるハロゲンである場合、末梢ベンゾジアゼピン受容体に対する強い結合と中枢ベンゾジアゼピン受容体に対するそれよりかなり弱い結合とを示し、それによりこれら化合物は、末梢ベンゾジアゼピン受容体の異常密度を特徴とする障害の診断および治療（放射線療法を含む）に有用となる。
【０００９】
しかしながら、そしてＴＳＰＯ研究が広く応用されているにも拘わらず、現在のところ、推定ＴＳＰＯ結合性化合物を真のＴＳＰＯ結合性化合物とイン・サイツで確認および立証するための非ＴＳＰＯバックグラウンド細胞、組織および動物がない。代わりに、これまで行われているＴＳＰＯ研究の信頼性は、利用可能なイン・ビトロの競争リガンド結合系で見られるＴＳＰＯ結合効果が、単にイン・ビボのＴＳＰＯ機能に関して何の関連性もない非特異的および非選択的結合の結果である可能性によって損なわれている。
【００１０】
上記で示したように、非常に必要とされるＴＳＰＯノックアウト動物モデルを作るための過去の努力は、そのモデルが生育不能胎仔となることから不首尾であり、「胎仔致死性」表現型はＴＳＰＯ遺伝子ノックアウトが原因とされている。
【００１１】
明らかなように、ＴＳＰＯ研究の真の陰性対照を提供するために動物モデルが必要である。そのようなモデル系が利用可能となると、現行のＴＳＰＯ研究実施の方法が変わるものと考えられ、ＴＳＰＯ関連の疾患および状態に関する研究知見の遡及的再評価が可能となるものと考えられる。さらに、ＴＳＰＯ遺伝子の少なくとも一つのアレル（対立遺伝子）が非機能性であるか存在しない動物は、これまで制限のあった他のＴＳＰＯ依存性生理経路の調節研究の可能性を大いに広げるものと考えられる。従って、ＴＳＰＯ関連の疾患および条件を研究する上で有用な動物を得ることは、ＴＳＰＯ分野内での大きな出来事となるものと考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第6,379,649号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Barron, A. M. et al.Ligand for translocator protein reverses pathology in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neurosci33, 8891-8897, doi:10.1523/JNEUROSCI.1350-13.2013 (2013)
【非特許文献２】Rupprecht, R. et al.Translocator protein (18 kDa) (TSPO) as a therapeutic target for neurological and psychiatric disorders. Nat Rev Drug Discov 9, 971-988, doi:nrd3295 [pii] 10.1038/nrd3295 (2010)
【非特許文献３】Rupprecht, R. et al.Translocator protein (18 kD) as target for anxiolytics without benzodiazepine-like side effects. Science325, 490-493, doi:10.1126/science.1175055 (2009)
【非特許文献４】Anzini M. et al., J. Med. Chem. 39 4275-4284 (1996)
【非特許文献５】Trapani G. et al. J. Med. Chem. 40 3109-3118 (1997)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、先行技術の欠点のうちの少なくとも一つを克服もしくは改善すること、または有用な代替手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
ＴＳＰＯの相同分子種（オルソログ）は、細菌および古細菌の中で広く認められる。ＴＳＰＯタンパク質ファミリーのほとんどの構成員が、イソキノリンカルボキサミドＰＫ１１１９５に対する特異的結合部位を含み、それは薬理的にＴＳＰＯを定義し、ＧＡＢＡＡ受容体タンパク質複合体などの他のベンゾジアゼピン結合受容体とそれを識別するのに用いられてきた。進化的により若いＣ末端コレステロール認識アミノ酸コンセンサス（ＣＲＡＣ）ドメインは主として、動物門で認められる。
【００１６】
ＴＳＰＯは、ミトコンドリアエネルギー産生およびポルフィリン中間体の輸送に関与しているものと考えられる。しかしながら、それの最も重要な機能は、水系ミトコンドリア膜間空間にわたるプレグネノロンへの前駆体であるコレステロールの移行に関与することによるステロイドホルモン産生の調節であると考えられる。
【００１７】
高度に保存されたＴＳＰＯ遺伝子に対する変化またはそれの欠失があると生存可能な繁殖性動物とはならないという支配的な公表されている考え方および理論考察に対して、本発明者らは、機能性ＴＳＰＯ遺伝子が存在しないことが致死的ではない新規なトランスジェニック動物を得ることに成功した。
【００１８】
具体的には、本発明者らは驚くべきことに、本発明による全身ＴＳＰＯ遺伝子ノックアウトマウス（本明細書を通じてマウス系統Ｃ５７ＢＬ／６−ＴＳＰＯｔｍ１ＧｕＷｕ（ＧｕｗｉｙａｎｇＷｕｒｒａ）とも称される）が、正常なコレステロール輸送、プレグネノロン合成、繁殖性、プロトポルフィリンＩＸ代謝があり、健康な状態下で明瞭な臨床的障害なしに生存可能であることを明らかにした。
【００１９】
しかしながら、ホモ接合ＴＳＰＯノックアウトマウスにおいてＴＳＰＯが存在しないことにより、全身および／または細胞エネルギーハウスホールド（ｈｏｕｓｅｈｏｌｄ）の調節における、高脂肪食餌に応答したミトコンドリア酸化的経路、ミトコンドリアＡＴＰ産生およびエネルギー貯蔵の調節におけるＴＳＰＯについての役割が明らかになった。具体的には、本発明者らは驚くべきことに、長期高脂肪食餌の形でのエネルギー摂取増加により、野生型動物と比較した場合に、本発明によるＴＳＰＯノックアウト動物での体重増加が有意に低くなる（そして予想より少ない）ことを認めた。従って、高脂肪食餌によって生じる肥満に対する保護におけるＴＳＰＯおよびＴＳＰＯ介在シグナル伝達についての役割が提供されたのである。
【００２０】
さらに、ＴＳＰＯノックアウトマウスは、ＴＳＰＯ機能の全身的喪失が神経損傷後の小膠細胞活性化に対して全く効果を持たないかごくわずかな効果しか持たないという驚くべき所見を示した。これらの結果から、「神経炎症」関連のＴＳＰＯ機能によって神経−グリア相互作用が、通常は高レベルのＴＳＰＯ発現を示す炎症組織における応答と十分に識別されなかったことから、その機能についての最近の理解も再検討に値することが示唆された。
【００２１】
従って、本発明による全身ＴＳＰＯ遺伝子ノックアウト動物は、ＴＳＰＯに対するアフィニティを有する既存のおよび新規な化合物の診断および治療における選択性を評価する上での非常に重要な手段を提供するものである。推測に依存することを減らすことで、これまで議論されてきたステロイド生物発生の経路、行動を含むステロイド依存性全身効果(Rupprecht, R. et al.Translocator protein (18 kD) as target for anxiolytics without benzodiazepine-like side effects. Science325, 490-493; Miller, W. L. & Auchus, R. J. The molecular biology, biochemistry, and physiology of human steroidogenesis and its disorders. Endocr Rev 32, 81-151; Stocco, D. M. The Role of PBR/TSPO in Steroid Biosynthesis Challenged. Endocrinology 155, 6-9）、ならびにミトコンドリアエネルギー産生および食餌誘発肥満に対する保護の機序（Gut, P. et al. Whole-organism screening for gluconeogenesis identifies activators of fasting metabolism. Nat Chem Biol 9, 97-104; Divakaruni, A. S. & Brand, M. D. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology26, 192-205）における広範囲の基礎的実験が可能となる。
【００２２】
従って、第１の態様において本発明は、非機能性内在性ＴＳＰＯ遺伝子の少なくとも一つのコピーを有する細胞を有するトランスジェニック非ヒト動物に関する。
【００２３】
１実施形態において、当該細胞は機能性ＴＳＰＯ遺伝子を含まない。
【００２４】
別の実施形態において、非機能性の内在性ＴＳＰＯ遺伝子は、欠失、挿入、フレームシフト突然変異、転位または置換からなる群から選択される少なくとも一つの突然変異を含む。さらに別の実施形態において、当該突然変異は構成的または条件的であることができる。
【００２５】
別の実施形態において、当該突然変異は、前記ＴＳＰＯ遺伝子内のエキソン１、２、３もしくは４の全てもしくは一部の欠失を含む。さらに別の実施形態において、当該突然変異は、前記ＴＳＰＯ遺伝子内のエキソン２もしくは３の全てもしくは一部の欠失を含む。代表的には、当該突然変異は、前記ＴＳＰＯ遺伝子内のエキソン２および３の欠失である。
【００２６】
本発明の１実施形態において、前記非ヒト動物はショウジョウバエ、ヒル、マウスまたはコイからなる群から選択される科からのものである。
【００２７】
さらなる実施形態において、前記非ヒト動物はマウスである。
【００２８】
第２の態様において、本発明は、本発明の非ヒト動物のいずれかの後代に関する。当該後代は、本発明の非ヒト動物のいずれかと同じ種のいずれかの他の動物との交配から生じさせることができる。
【００２９】
特定の実施形態において、前記後代は、本発明のマウスとｐＫＺ１マウス、Ｂｒｃａ２ホモ接合マウス、Ｔｇ（ＣＡＴ）（＋／＋）マウス、Ａ−Ｔ変異ヘテロ接合／ホモ接合マウス、Ｃｓｂｍ／ｍマウス、インシュリン様成長因子１ヘテロ接合およびホモ接合マウス、Ｐ５３ヘテロ接合およびホモ接合マウス、放射線感受性および抵抗性トランスジェニックマウス、統合失調症ＤＩＳＣ１ノックアウトマウス、統合失調症ニューレグリン１ノックアウトマウス、遺伝子工学モデル腫瘍マウス、神経炎症モデルマウス、アルツハイマー病モデルマウス、パーキンソン病モデルマウスまたはインシュリン抵抗性および食餌誘発肥満に対して感受性である２型脱ヨウ素酵素遺伝子（Ｄ２ＫＯ）の標的欠失を有するマウスとの異種交配から生じる。
【００３０】
第３の態様において、本発明は、対象者におけるＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害の治療で使用される化合物の同定方法であって、候補化合物を本明細書に記載の本発明のいずれかの非ヒト動物に投与すること、および前記非ヒト動物の表現型に対する当該候補化合物の効果を評価することを含む方法に関する。
【００３１】
第４の態様において、本発明は、対象者におけるＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害の治療で使用される化合物の同定方法であって、候補化合物を本明細書に記載の本発明のいずれかの非ヒト動物に投与すること、およびＴＳＰＯ関連遺伝子産物または非ヒト動物に存在し得るＴＳＰＯ遺伝子産物の発現レベルに対する当該候補化合物の効果を評価することを含む方法に関する。
【００３２】
第５の態様において、本発明は、対象者におけるＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害の治療で使用される候補化合物の結合の特異性もしくは選択性のスクリーニング方法であって、本明細書に記載の本発明のいずれかの非ヒト動物および同じ種の野生型非ヒト動物に候補化合物を投与すること、およびＴＳＰＯ関連遺伝子産物または野生型非ヒト動物に存在し得るＴＳＰＯ遺伝子産物に対する当該候補化合物の結合の特異性もしくは選択性を、ＴＳＰＯ関連遺伝子産物または被験非ヒト動物に存在し得るＴＳＰＯ遺伝子産物に対する当該候補化合物の結合の特異性もしくは選択性と比較することを含む方法に関する。
【００３３】
１実施形態において、本発明は、対象者におけるＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害の治療で使用される化合物の確認に使用される場合の本明細書に記載の非ヒト動物本発明のに関する。
【００３４】
１実施形態において、当該非ヒト動物は、対象者におけるＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害の治療で使用される候補化合物の結合の特異性もしくは選択性のスクリーニングに使用される。
【００３５】
別の実施形態において、当該非ヒト動物は、対象者におけるＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害の診断に使用される。
【００３６】
第６の態様において、本発明は、第１の態様の動物またはそれの後代由来の細胞、組織または不死化細胞系に関する。
【００３７】
第７の態様において、本発明は、生体サンプルにおけるＴＳＰＯ遺伝子産物を検出するための陰性対照としての第６の態様の細胞、組織または不死化細胞系の使用に関する。
【００３８】
第８の態様において、本発明は、ＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害を有するかそれを有すると推定される対象者からの生体サンプル中のＴＳＰＯ遺伝子産物を検出するための陰性対照としての第６の態様の細胞、組織または不死化細胞系の使用に関する。
【００３９】
第９の態様において、本発明は、対象者におけるＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害の診断のための第６の態様の細胞、組織または不死化細胞系の使用に関する。
【００４０】
第１０の態様において、本発明は、ＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害の治療で使用される化合物の同定方法であって、第６の態様の細胞、組織または不死化細胞系を候補化合物に曝露すること、および前記細胞、組織または不死化細胞系の表現型に対する前記候補薬剤の効果を評価することを含む方法に関する。
【００４１】
第１１の態様において、本発明は、対象者におけるＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害の治療で使用される化合物の同定方法であって、第６の態様の細胞、組織または不死化細胞系を候補化合物に曝露すること、およびＴＳＰＯ関連遺伝子産物または細胞、組織または不死化細胞系に存在し得るＴＳＰＯ遺伝子産物の発現レベルに対する当該候補化合物の効果を評価することを含む方法に関する。
【００４２】
本発明の第１２の態様において、対象者におけるＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害の治療で使用される候補化合物の結合の特異性もしくは選択性をスクリーニングする方法であって、野生型細胞、野生型組織または不死化細胞系、および本明細書に記載の本発明の試験細胞または不死化細胞系を候補化合物に曝露すること、およびＴＳＰＯ関連遺伝子産物または野生型細胞、野生型組織もしくは不死化細胞系に存在し得るＴＳＰＯ遺伝子産物に対する当該候補化合物の結合の特異性もしくは選択性を、ＴＳＰＯ関連遺伝子産物または試験細胞、組織もしくは不死化細胞系に存在し得るＴＳＰＯ遺伝子産物に対する候補化合物の結合の特異性もしくは選択性と比較することを含む方法が提供される。
【００４３】
本発明の特定の実施形態において、前記ＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害は、癌、神経炎症、アルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、脳損傷、虚血−再潅流損傷、急性および慢性ストレスなどの行動障害または神経もしくは精神障害、不安障害、気分（ｍｏｄｅ）障害、ならびに統合失調症、末梢神経障害、多発性硬化症、神経因性疼痛、肥満、糖尿病および悪液質からなる群から選択される。
【００４４】
第１３の態様において、本発明は、第３、第４、第１０または第１１の態様の方法のいずれかによって確認される場合の化合物に関する。
【００４５】
第１４の態様において、本発明は、ＴＳＰＯ機能を阻害するための下記一般式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【００４６】
【化１】
2016516399.tif 000002
式中、
Ｘは、非存在、ヨウ素もしくはそれの同位体であり；
Ｙは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＣＮおよびＣＯＯＨから選択され；
Ｚは、Ｎ（Ｒ３）Ｃ（Ｏ）Ｒ４およびＣ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４から選択され；
Ｒ１およびＲ２は独立に、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、（Ｃ６−Ｃ１２）アリールオキシ、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、複素環、（Ｃ２−Ｃ６）アルカノイルおよび（Ｃ２−Ｃ７）アシルから選択され、それらはそれぞれ、置換されていないかハロゲンもしくはそれの同位体、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良く；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に、水素または（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、複素環、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニルおよび（Ｃ２−Ｃ５）アシルから選択される基であり、それらはそれぞれ、置換されていないか、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良く、
またはＲ３およびＲ４が一体となって、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良い（Ｃ２−Ｃ７）アルキリデンであり；
ｍおよびｎは独立に、０、１または２であり；
ｐは１であり；
各場合で、
（ｉ）アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し；
（ｉｉ）シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し；
（ｉｉｉ）ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
【００４７】
第１５の態様において、本発明は、全身および／または細胞エネルギーハウスホールドを変えるための下記一般式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【００４８】
【化２】
2016516399.tif 000003
式中、
Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍ、ｎおよびｐは、第１４の態様の化合物について定義の通りであり；
各場合で、
（ｉ）アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し；
（ｉｉ）シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し；
（ｉｉｉ）ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
【００４９】
第１６の態様において、本発明は、ミトコンドリア酸化的経路を変えるための下記一般式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【００５０】
【化３】
2016516399.tif 000004
式中、
Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍ、ｎおよびｐは、第１４の態様の化合物について定義の通りであり；
各場合で、
（ｉ）アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し；
（ｉｉ）シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し；
（ｉｉｉ）ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
【００５１】
第１７の態様において、本発明は、ミトコンドリアＡＴＰ産生を調節するための下記一般式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【００５２】
【化４】
2016516399.tif 000005
式中、
Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍ、ｎおよびｐは、第１４の態様の化合物について定義の通りであり；
各場合で、
（ｉ）アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し；
（ｉｉ）シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し；
（ｉｉｉ）ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
【００５３】
第１８の態様において、本発明は、ＴＳＰＯ介在シグナル伝達を調節するための下記一般式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【００５４】
【化５】
2016516399.tif 000006
式中、
Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍ、ｎおよびｐは、第１４の態様の化合物について定義の通りであり；
各場合で、
（ｉ）アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し；
（ｉｉ）シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し；
（ｉｉｉ）ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
【００５５】
第１９の態様において、本発明は、ＴＳＰＯ介在エネルギー貯蔵を調節するための下記一般式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【００５６】
【化６】
2016516399.tif 000007
式中、
Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍ、ｎおよびｐは、第１４の態様の化合物について定義の通りであり；
各場合で、
（ｉ）アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し；
（ｉｉ）シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し；
（ｉｉｉ）ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
【００５７】
本発明の１実施形態において、第１４から第１９の態様のいずれか一つの使用は、肥満に対する保護を提供する。代表的には、第１４から第１９の態様のいずれか一つの使用は、高脂肪食餌誘発体重増に対する保護を提供する。
【００５８】
第２０の態様において、本発明は、神経障害関連の炎症応答を調べるための下記一般式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【００５９】
【化７】
2016516399.tif 000008
式中、
Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍ、ｎおよびｐは、第１４の態様の化合物について定義の通りであり；
各場合で、
（ｉ）アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し；
（ｉｉ）シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し；
（ｉｉｉ）ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
【００６０】
本発明の一部の実施形態において、ｎは０である。
【００６１】
別の実施形態において、Ｙは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮおよびＯＨから選択され；Ｚは、Ｎ（Ｒ３）Ｃ（Ｏ）Ｒ４およびＣ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４から選択され；Ｒ１およびＲ２は独立に、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ３）アルケニル、（Ｃ５−Ｃ６）シクロアルキル、フェニル、ナフチル、フェノキシ、ナフチルオキシ、ベンジル、ピリジル、フラニル、チエニル、ピペリジニル、モルホリニル、テトラヒドロフラニル、ジオキサニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルカノイルおよび（Ｃ２−Ｃ４）アシルから選択され、それらはそれぞれ置換されていないか、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ２−Ｃ４）アルコキシ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ３）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルカノイル、オキソおよびアミドからなる群から選択される置換基で置換されていても良く；Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に、水素または（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ２−Ｃ３）アルケニル、（Ｃ５−Ｃ６）シクロアルキル、フェニル、ナフチル、ベンジルおよび（Ｃ２−Ｃ４）アシルから選択される基であり、それらはそれぞれ置換されていないか、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、ＮＨ２、（Ｃ−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ３）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルカノイル、オキソおよびアミドからなる群から選択される置換基で置換されていても良く、またはＲ３およびＲ４が一体となって、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ３）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルカノイル、オキソおよびアミドからなる群から選択される置換基で置換されていても良い（Ｃ２−Ｃ３）アルキリデンであり；ｍおよびｎは独立に、０または１である。
【００６２】
一部の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、下記式（ＩＡ）の２−（４′−ヨードフェニル）−イミダゾール［１，２−ａ］ピリジン−３−アセトアミド誘導体である。
【００６３】
【化８】
2016516399.tif 000009
式中、Ｘはヨウ素またはそれの同位体であり；Ｙはハロゲンであり；Ｒ３およびＲ４は独立に、水素、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルおよび（Ｃ２−Ｃ４）アルケニルから選択され、またはＲ３およびＲ４が一体となって、（Ｃ２−Ｃ３）アルキリジンである。
【００６４】
代表的には、Ｘは１２５Ｉであり；ＹはＣｌであり；Ｒ３およびＲ４はＣＨ２ＣＨ３であり、すなわち当該化合物は［１２５Ｉ］ＣＬＩＮＤＥである。
【００６５】
本発明の別の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、下記式（ＩＢ）の誘導体である。
【００６６】
【化９】
2016516399.tif 000010
式中、Ｙはハロゲンであり；Ｒ１は独立に、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、（Ｃ６−Ｃ１２）アリールオキシ、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、複素環、（Ｃ２−Ｃ６）アルカノイルおよび（Ｃ２−Ｃ７）アシルから選択され、それらはそれぞれ、置換されていないか、ハロゲンもしくはそれの同位体、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良く；Ｒ３およびＲ４は独立に、水素、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルおよび（Ｃ２−Ｃ４）アルケニルから選択され、またはＲ３およびＲ４が一体となって、（Ｃ２−Ｃ３）アルキリジンである。
【００６７】
代表的には、ＹはＣｌであり；Ｒ１はＯＣＨ２ＣＨ２１８Ｆであり；Ｒ３およびＲ４はＣＨ２ＣＨ３であり、すなわち当該化合物は［１８Ｆ］ＰＢＲ１１１である。
【００６８】
定義
本明細書を通じて、「一つの」または「１個の」要素に言及する場合、それは文脈が別の意味を決定するのでない限り、複数形を排除するものではない。
【００６９】
本明細書を通じて、「１実施形態」、「一部の実施形態」または「一つの実施形態」に言及する場合、それは、その実施形態との関係で記載されている特定の特徴、構造または特性が少なくとも一つの本発明の実施形態に含まれることを意味する。従って、本明細書を通じて色々な箇所で「１実施形態において」、「一部の実施形態において」または「一つの実施形態において」という表現が現れるが、それらは必ずしも全て同じ実施形態を指すとは限らず、そのようであり得るというものである。さらに、特定の特徴、構造または特性は、１以上の実施形態において、本開示から当業者には明らかであると考えられるように、いずれか好適な形態で組み合わせることができる。
【００７０】
本明細書で使用される場合、別段の断りがない限り、共通の対象を説明するのに通常の形容詞「第１の」、「第２の」、「第３の」等を用いることは単に、類似の対象の異なる場合が言及されており、そのように記載されている対象が時間的、空間的、順位で、またはいずれか他の形態において所定の配列となっていなければならないことを示唆するものではないことを示している。
【００７１】
本明細書の文脈において、下記の用語は次のように定義される。
【００７２】
本明細書の文脈における「治療」などの用語は、正常なＴＳＰＯ調節された生理における変化ならびにＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害関連の症状の緩和、ならびにＴＳＰＯ関連の疾患もしくは障害の軽減および寛解を指す。治療は、疾患もしくは障害を治癒することができるか、罹患を遅延させることができる。従って、本発明の文脈において、治療用途に関して使用される場合、「治療」という言葉またはそれの派生語は、治療される疾患もしくは障害関連の疼痛の軽減、治療される疾患もしくは障害の重度の軽減、治療される障害もしくは疾患の１以上の症状における改善、治療を受ける対象者の全体的な安寧における改善などの療法の全ての側面を含むものである。「治療」という言葉またはそれの派生語の使用は、「治療」を受ける患者が上記利益のうちのいずれか１以上を経験できることを意味するものと理解される。
【００７３】
本明細書で使用される「核酸」は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ヌクレオチドおよびそれらの断片もしくは部分、そして一本鎖もしくは二本鎖であることができ、センス鎖もしくはアンチセンス鎖を表すことができるゲノム起源もしくは合成起源のＤＮＡもしくはＲＮＡを含むものである。「核酸」を用いて特定の核酸配列を指す場合、「核酸」は、ＲＮＡ分子の言及されている転写物に機能的に等価である特定の転写物もしくはＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを包含するものである。
【００７４】
「ヌクレオチド」には、ピリミジン、プリンもしくはそれらの合成類縁体などの糖に連結した塩基、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）でのようにアミノ酸に連結した塩基を含むモノマーなどがあるが、これらに限定されるものではない。ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドにおける一つのモノマーである。ヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチドにおける塩基の配列を含む。
【００７５】
本明細書で使用される「ＴＳＰＯ関連遺伝子産物」は、機能的にＴＳＰＯ遺伝子産物に関連する遺伝子産物である。ＴＳＰＯ関連遺伝子産物は、ＴＳＰＯ遺伝子産物を含むシグナル伝達経路の上流または下流であるいずれかの遺伝子産物であることができる。ＴＳＰＯ関連遺伝子産物はタンパク質またはｍＲＮＡ転写物であることができ、シグナル伝達経路におけるＴＳＰＯ遺伝子産物のすぐ上流もしくは下流である必要は必ずしもない。
【００７６】
「遺伝子」は、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を指し、イントロン、エキソン、プロモーターもしくはエンハンサー配列などの制御配列および５′非翻訳領域を含んでも含まなくても良い。
【００７７】
本明細書で言及される場合の「転写物」は、コード遺伝子または核酸の転写によって誘導されるＲＮＡ分子である。
【００７８】
遺伝子関連での「ノックアウト」という用語は、機能性遺伝子産物が全く産生されないような、遺伝子の野生型配列の変化を指す。「遺伝子産物」という用語は、遺伝子の転写物ならびに前記転写物から翻訳されたタンパク質を包含する。例えば、野生型遺伝子配列のヌクレオチドの突然変異、挿入または欠失によって、その遺伝子の発現の完全なサイレンシング、または非機能性転写物のみが産生されるような変化した遺伝子配列の発現に至ることがあり得る。非機能性転写物は、機能性タンパク質に翻訳されることはできない。遺伝子の一方のみのアレルが変化した場合、ノックアウトされた遺伝子は、「ヘテロ接合ノックアウト」と称される。両方のアレルが変化した場合、ノックアウトは、「ホモ接合ノックアウト」と称される。当該分野における慣習によれば、ヘテロ接合遺伝子ノックアウトは、「ｈｅｔ」または「＋／−」によって示され、ホモ接合ノックアウトは、「ｈｏｍ」または「−／−」によって示される。遺伝子の両方のアレルが未変化（すなわち野生型遺伝子配列を有する）である場合、それは「ｗｔ」または「＋／＋」によって示される。
【００７９】
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって一緒に連結されたアミノ酸で構成されたポリマーを意味する。文脈で示されたり、他の形態が必要とされない限りにおいて、「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、本明細書においては互換的に使用される。従って、本発明に関して、「ポリペプチド」は、全長タンパク質または全長タンパク質の一部を構成することができる。本発明の「タンパク質」、「ペプチド」または「ポリペプチド」は、天然および合成のものおよびそれらの断片も包含するものである。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、それの意味の範囲内に直鎖および分岐のアルキル基を含む。そのような基の例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、アミル、イソアミル、ｓｅｃ−アミル、１，２−ジメチルプロピル、１，１−ジメチル−プロピル、ヘキシル、４−メチルペンチル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、１，２，２−トリメチルプロピルおよび１，１，２−トリメチルプロピルがある。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「シクロアルキル」という用語は、環状アルキル基、またはアルキル置換された環状アルキル基を指す。そのような基の例には、シクロプロピル、メチルシクロプロピル、シクロブチル、メチルシクロブチル、シクロペンチル、メチルシクロペンチル、シクロヘキシルなどがある。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「アルコキシ」という用語は、式アルキル−Ｏ−の基を指し、そのアルキル基は上記で定義の通りである。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「アルケニル」という用語は、それの意味の範囲内にエチレン性モノもしくはジ不飽和の前記で定義のアルキルまたはシクロアルキル基を含む。そのようなアルケニル基の例には、ビニル、アリル、１−メチルビニル、ブテニル、イソ−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−ペンテニル、シクロペンテニル、１−メチル−シクロペンチル、１−ヘキセニル、３−ヘキセニル、シクロヘキセニル、１，３−ブタジエニル、１，４−ペンタジエニル、１，３−シクロペンタジエニル、１，３−ヘキサジエニル、１，４−ヘキサジエニル、１，３−シクロヘキサジエニルおよび１，４−シクロヘキサジエニルがある。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「アルキニル」という用語は、それの意味の範囲内にアセチレン不飽和の前記定義のアルキル基を含む。そのようなアルキニル基の例には、エチニル、プロピニル、ｎ−ブチニル、ｎ−ペンチニル、３−メチル−１−ブチニル、ｎ−ヘキシニルおよびメチル−ペンチニルがある。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「アルキリデン」という用語は、不飽和であっても良い二価のアルキル基を指す。そのような基に例には、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ−、−（ＣＨ２）４−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２−および−（ＣＨ２）ｒ−（ｒは５から７である）がある。その用語は、基の結合のうちの１以上が環系の一部を形成している（ｆｒｏｍ）不飽和であっても良い二価のアルキル基も指す。
【００８６】
本明細書で使用される場合、「アリール」という用語は、芳香族炭化水素の単一、多核、共役および縮合残基を指す。そのような基の例には、フェニル、ビフェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インデニルおよびアズレニルがある。芳香族残基のいずれの利用可能な位置も、式（Ｉ）の分子の残りの部分への結合に用いることができる。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「アリールオキシ」という用語は、アリール基が上記で定義の通りである式アリール−Ｏ−の基を指す。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」という用語は、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基を指す。そのような基の例には、ピリジル、４−フェニルピリジル、３−フェニルピリジル、チエニル、フリル、ピリル（ｐｙｒｒｙｌ）、インドリル、ピリダジニル、ピラゾリル、ピラジニル（ｐｙｒａｌｚｉｎｙｌ）、チアゾリル、ピリミジニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、プリニル、キナゾリニル、フェナジニル、アクリジニル、ベンゾキサゾリル、ベンゾチアゾリルなどがある。ヘテロ芳香族残基のいずれの利用可能な位置も、式（Ｉ）の分子の残りの部分への結合に用いることができる。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「複素環」という用語は、３員および４員環の場合、１個のヘテロ原子；５員環の場合、１個もしくは２個のヘテロ原子；６員および７員環の場合、１から３個のヘテロ原子；８員および９員環の場合、１から４個のヘテロ原子；１０員および１１員環の場合、１から５個のヘテロ原子；１２員環の場合、１から６個のヘテロ原子を含む３から１２員の単環式、二環式もしくは多環式環を指し、そのヘテロ原子は酸素、窒素および硫黄から独立に選択される。「複素環」という用語は、複素環がベンゼン環に縮合している基を含む。複素環の例には、ピリル、ピリミジニル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、ピペリジニル、ピリジニル、フリル、チオフェニル、テトラヒドロフリル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、ピレニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリジニル、イミダゾリジニル、モルホリニル、ピロリジニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、フルフリル、チエニル、ベンゾチエニル、ベノキサゾリル、ベンゾイソキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、テトラゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、ベンズイミダゾリル、ピロリニル、キヌクリジニル、アザノルボニル、イソキヌクリジニルなどがある。窒素含有複素環は、窒素で酸素原子によって置換されていても良い。硫黄含有複素環は、硫黄で、１個もしくは２個の酸素原子によって置換されていても良い。不安定な複素環を生じるヘテロ原子の構成は、「複素環」の定義の範囲には包含されない。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「アルカノイル」という用語は、アルキル基が上記で定義の通りである式アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−の基を指す。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「アシル」という用語は、Ｑがアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキルおよび複素環であり、それらがそれぞれ、置換されていないか、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良い式ＱＣ（Ｏ）−の基を指す。
【００９２】
本明細書の文脈において、「含む」という用語は、包含することを意味するが、必ずしも単に包含することとは限らない。さらに、「含む」という言葉の変形形態、例えば「包含する」および「含んでいる」は、相応に変化した意味を有する。したがって、「含む」という用語およびそれの変形形態は、さらなる整数や特徴が、整数Ａを含むまたは整数ＡおよびＢを含むなどとして記載されている組成、方法などに存在してもよいように、除外的意味ではなく包括的意味で用いられる。
【００９３】
選択可能な要素の群の文脈で使用される場合の「少なくとも一つ」という用語は、個々の選択される群のありとあらゆる構成員を含み、その群の構成員のあらゆる組み合わせを含む。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、ＴＳＰＯノックアウトマウス発生を示す模式図である。ＴＳＰＯ野生型アレルは、４個のエキソンからなる。エキソン２および３に隣接するｌｏｘＰ部位およびエキソン３と４の間に挿入されたＦＲＴ隣接ネオマイシンカセットを用いて、標的化ベクターを作った。フリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）部位も含めて、後の段階での条件的ノックアウトマウスを作ることができるようにした。ネオマイシンカセットは、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＧＫ）を含むことで、ネオマイシン抵抗性遺伝子（ｎｅｏ）およびポリアデニル化シグナル（ｐＡ）の発現を推進するものである。野生型アレルと標的化ベクターとの間の相同的組換えによって、胚幹（ＥＳ）細胞に標的化アレルが生じる。条件的ノックアウト動物を作るため、ネオマイシンカセットをＦｌｐ介在切除によって除去して、ｌｏｘＰ導入されたアレル（flox化されたアレル）を作ることができる。ＴＳＰＯを壊すため、ｃｒｅ介在切除を用いて、エキソン２および３を除去する。ＰＣＲ遺伝子型決定に用いられる順方向（ＦＰ）および逆方向プライマー（ＲＰ１およびＲＰ２）の位置を示している。サザンブロット分析に使用されるプローブの位置も示してある（「Ｐｒｏｂｅ」）。
【図２】図２は、遺伝子型決定のためのＴＳＰＯプライマー設計およびゲル画像を示す図である。ＴＳＰＯ野生型およびＴＳＰＯノックアウトアレルが図２（ａ）に、プライマーアニーリング部位の大体の場所およびそれらのその後のＰＣＲ産物長さとともに示してある。ＴＳＰＯノックアウトマウスからのＰＣＲ産物の予想ゲル電気泳動画像を図２（ｂ）に示している。
【図３】図３は、遺伝子型決定推定ＴＳＰＯノックアウトマウスの場合に得られた結果を示す図である。パネル（Ａ）は、サザンブロット分析を用いて遺伝子型決定した時に得られた結果を示している。野生型アレルには４．２ｋｂ断片が予想され、ノックアウトアレルには８．８ｋｂ断片が予想される。パネル（Ｂ）は、動物をＰＣＲによって表現型決定した時に得られた結果を示している。野生型（＋／＋）アレルは４８９ｂｐ産物を産生し、ノックアウト（−／−）アレルは２４６ｂｐ産物を発生させる。
【図４】図４は、ＴＳＰＯ特異的放射性リガンド３Ｈ−ＰＫ１１１９５を用いてＴＳＰＯノックアウトマウスの腎臓組織をプロービングした放射性リガンド膜結合結果を示す図である。
【図５】図５は、脳、眼球、心臓、副腎、腎臓からの切片の、プローブ［３Ｈ］ＰＫ１１１９５を用いたフィルムオートラジオグラフを示す図である。フィルムオートラジオグラフィーに用いた臓器は、野生型（ＴＳＰＯ＋／＋）、ヘテロ接合（ＴＳＰＯ＋／−）およびホモ接合（ＴＳＰＯ−／−）マウスから切除したものである。左側の画像は全結合（特異的および非特異的）であり、右側の画像は非特異的結合である。画像が暗いほど、ＰＫ１１１９５結合が高く、それはＴＳＰＯの密度に比例する。右上隅の棒グラフは、左側の画像に相当する。
【図６】図６は、片側顔面神経軸索切断によって誘発された、顔面神経核での神経炎症のフィルムオートラジオグラフを示す図である。ヘテロ接合マウスにおけるＴＳＰＯ発現のレベル（中央画像）は、野生型およびホモ接合マウスについて観察されたレベルの中間であった。一番下の棒グラフは、全小脳および右側（顔面神経軸索切断の同側面）顔面神経核における野生型（ＴＳＰＯ＋／＋）、ヘテロ接合（ＴＳＰＯ＋／−）およびホモ接合（ＴＳＰＯ−／−）マウスでのＴＳＰＯレベルを示すものである。画像下の表に示した値は、ホモ接合マウスの値に対する相対値である。
【図７】図７は、野生型マウス（ＴＳＰＯ＋／＋）で記録された高強度の放射性トレーサー（［１８Ｆ］−ＰＢＲ１１１）のＰＥＴ画像を示す図であり、右側のＴＳＰＯノックアウト（ホモ接合、ＴＳＰＯ−／−）マウスでは放射性トレーサーは全く観察されなかった。副腎は、円形領域に示している。
【図８】図８は、野生型マウス（ＴＳＰＯ＋／＋）およびＴＳＰＯノックアウト（ホモ接合、ＴＳＰＯ−／−）マウスにおける一番下の画像での放射性トレーサー（［１８Ｆ］−ＰＢＲ１１１）のＰＥＴおよびＣＴ画像を示す図である。副腎は、円形領域に示している。黒色から白色の色は、低から高の放射性トレーサー強度を表す。
【図９】図９は、０分での放射性トレーサー注射後の取り込みの時間経過および副腎、心臓、腎臓および肝臓における４０分でのＰＢＲ１１１による置換を示す図である。
【図１０】図１０は、ＴＳＰＯノックアウトマウスを用いたオープン・フィールド試験からの結果を示す図である。不安様行動を、中央で経過した時間と中央に入る回数（ＡおよびＢ）によって測定した。活動的に過ごした時間（Ｃ）、移動距離（Ｄ）および非移動運動（Ｅ）を評価することで、探索行動を測定した。
【図１１】図１１は、ＴＳＰＯノックアウトマウスを用いた出現試験からの結果を示す図である。ハイドボックスで過ごした時間およびハイドボックスに入る回数（ＡおよびＢ）によって、不安様行動を測定した。さらに、活動的に過ごした時間（Ｃ）、移動距離（Ｄ）および非移動運動（Ｅ）を評価することで、探索行動も測定した。
【図１２】図１２は、ＴＳＰＯノックアウトマウスを用いた明／暗嗜好試験からの結果を示す図である。明コンパートメントで過ごした時間および明コンパートメントに入る回数（ＡおよびＢ）によって、不安様行動を測定した。さらに、活動的に過ごした時間（Ｃ）、移動距離（Ｄ）および非移動運動（Ｅ）を評価することで、探索行動も測定した。
【図１３】図１３は、ＴＳＰＯノックアウトマウスを用いた高架式十字迷路試験からの結果を示す図である。壁のない道で過ごした時間および壁のない道に入る回数（ＡおよびＢ）ならびに危険評価に関係する時間および危険評価の回数（ＣおよびＤ）によって、不安様行動を測定した。さらに、活動的に過ごした時間（Ｅ）および移動距離（Ｆ）を評価することで、探索行動も測定した。
【図１４】図１４は、ｎ＝７０でのＴＳＰＯノックアウトマウスのロータロッド成績を示す図である。動物がロータロッドから落ちる前の時間を測定した。
【図１５】図１５は、上記の図１と同様で、本発明によるＴＳＰＯノックアウトマウスを発生させるために開発された標的化戦略を示す模式図である。ＴＳＰＯ野生型アレルは４個のエキソンからなる。標的化構築物を、エキソン２および３に隣接するｌｏｘＰ部位を用いて作って、エキソン２および３のｃｒｅ介在切除ができるようにした。野生型アレルと標的化構築物の間の相同的組換えによって、ＴＳＰＯ標的化アレルが生じる。ＴＳＰＯを壊すため、すなわちＴＳＰＯノックアウトアレルを発生させるため、ｃｒｅ介在切除を用いて、エキソン２および３を除去する。ＰＣＲ遺伝子型決定に用いられる順方向プライマー（Ｐ１）および２個の交互の逆方向プライマー（Ｐ２およびＰ３）の位置を示している。サザンブロット分析に使用されるプローブの位置も示してある（「Ｐｒｏｂｅ」）。
【図１６】図１６は、上記の図３と同様で、推定ＴＳＰＯノックアウトマウスの遺伝子型決定結果を示す図である。パネル（Ａ）は、サザンブロット分析を用いて動物を遺伝子型決定した時に得られた結果を示している。野生型アレルには８．８ｋｂ断片が予想され、ノックアウトアレルには４．２ｋｂ断片が予想される。パネル（Ｂ）は、動物をＰＣＲによって表現型決定した時に得られた結果を示している。野生型（＋／＋）アレルは４８９ｂｐ産物を産生し、ノックアウト（−／−）アレルは２４６ｂｐ産物を発生させる。
【図１７】図１７は、１３種類の組織（副腎、肺、骨髄、腎臓、脾臓、肝臓、膀胱、心臓、膵臓、眼球、筋肉、骨および脳）にわたる相対的ＴＳＰＯｍＲＮＡ発現を評価した場合に得られた結果を示す図である。ＴＳＰＯｍＲＮＡ発現レベルは、相当する組織で測定された一般的なハウスキーピング遺伝子ＧａｐｄｈおよびＡｃｔｂのｍＲＮＡレベルに関して正規化した。
【図１８】図１８は、ウェスタンブロット分析によるＴＳＰＯタンパク質の測定を示す図である。ＴＳＰＯ＋／＋、ＴＳＰＯ＋／−およびＴＳＰＯ−／−マウスの腎臓、脾臓および睾丸から得られた溶解物について調べ、ＴＳＰＯ−／−マウスにおいてＴＳＰＯタンパク質産生が全くないことが確認された（上側パネル）。ＧＡＰＤＨタンパク質発現を、内部陽性対照として用いた（下側パネル）。
【図１９】図１９は、ＴＳＰＯ＋／＋マウス（左列）およびＴＳＰＯ−／−マウス（右列）の腎臓および睾丸から得られた組織切片の免疫組織化学的抗体染色を用いて得られた画像を示す図である。ＴＳＰＯ野生型マウスの組織切片にＴＳＰＯが存在し、ＴＳＰＯノックアウトマウスではそれが存在しないことが示されている。スケールバー：５００μｍ。
【図２０】図２０は、ＴＳＰＯ＋／＋マウス（左列）、ＴＳＰＯ＋／−マウス（中央列）およびＴＳＰＯ−／−マウス（右列）から得られたマクロファージの免疫細胞化学的抗体染色を用いて得られた画像を示す図である。一番上のパネルは、ＴＳＰＯタンパク質を分析するマクロファージの蛍光画像を示している。中央のパネルは、マクロファージの蛍光ミトコンドリア染色（ミトコンドリア電子輸送連鎖複合体ＩＶ）を示している。一番下のパネルでは、一番上および中央のパネルの相当する画像を合体させたものであり、ミトコンドリアにおけるＴＳＰＯタンパク質の支配的局在化を示している。一番上のパネルで見ることができる野生型からホモ接合ノックアウトへのＴＳＰＯタンパク質の漸減ならびにミトコンドリア染色によるＴＳＰＯタンパク質間の重なりによって、ミトコンドリアが、ＴＳＰＯ−／−マウスにおいて完全に存在しないことが示されているＴＳＰＯタンパク質の原発部位であることが確認される。そのミトコンドリアの細胞内密度または分布に明瞭な差がないことが、ＴＳＰＯ−／−マウスで検出された。スケールバー：２０μｍ。
【図２１−１】図２１は、ＴＳＰＯ−／−マウスで、構成的または誘発性ＴＳＰＯリガンド結合が全く生じないことを示す図である。図２１ａおよびｂは、二つのＴＳＰＯ結合リガンドＰＫ１１１９５およびＣＬＩＮＤＥ／ＰＢＲ１１１それぞれの化学構造を示している。図２１ｃは、顔面神経の軸索切断を示す模式図である。図２１ｄは、連続する脳切片についての［３Ｈ］ＰＫ１１１９５および［１２５Ｉ］ＣＬＩＮＤＥを用いるフィルムオートラジオグラフィーならびに小膠細胞活性化マーカー抗ＣＤ１１ｂの免疫組織化学的染色によって、ＴＳＰＯ＋／＋動物の小膠細胞の活性化と同時の損傷顔面神経核におけるＴＳＰＯリガンド結合の既報の局在的誘発が確認されたことを示す図である。対照的に、図２１ｅは、損傷顔面神経核における活性化小膠細胞が存在するにも拘わらずＴＳＰＯ−／−マウスで［３Ｈ］ＰＫ１１１９５および［１２５Ｉ］ＣＬＩＮＤＥの結合が全く誘発されなかったことから、ＴＳＰＯ上の個々の結合部位に対する［３Ｈ］ＰＫ１１１９５および［１２５Ｉ］ＣＬＩＮＤＥの高い選択性が、生理的に変化を受けた組織で保持されることを示す証拠が提供されることを示す図である。図２１ｆは、ＴＳＰＯ−／−マウスの損傷顔面神経核における活性化小膠細胞の免疫蛍光抗ＣＤ１１ｂ染色を示す図である。それらの画像から、ＴＳＰＯノックアウトマウスが、十分に研究されてきた野生型動物における小膠細胞活性化の通常の出現と明瞭な差を示さないことが分かる。すなわちそれらの画像は、活性化されたニューロン周囲小膠細胞の特徴的局在化も示している。星印は、ニューロンの細胞体を示す。図２１ｇは、より高倍率での図２１ｆで認められる活性化されたニューロン周囲小膠細胞の特徴的局在化を示す図である。スケールバーは１００μｍである。星印は、ニューロンの細胞体を示す。
【図２１−２】図２１ｈは、ＴＳＰＯ＋／＋、ＴＳＰＯ＋／−およびＴＳＰＯ−／−マウスが外観においては全く同じであったことを示す図である（一番上のパネル）。それに対して、下側のパネルには放射性リガンド［１８Ｆ］ＰＢＲ１１１（［１２５Ｉ］ＣＬＩＮＤＥに対する１８Ｆ標識類縁体）を用いるＰＥＴ／ＣＴで得られたイン・ビボ画像が示されているが、それは驚くべきことに、ＴＳＰＯ−／−マウスがリガンド結合を全く示さないことを示している（従って、使用されたリガンドの選択性も示している）。腸および膀胱などの排出経路を起源とするシグナルが時々ある。しかしながら、ＴＳＰＯ＋／＋およびＴＳＰＯ＋／−の両方のマウスとも、リガンド結合の同様の分布を示し、すなわち高いＴＳＰＯ発現が知られている臓器、特には腎臓および副腎（円形）においてそのような分布を示す。これらの画像は、徐々にスケーリングしながら示されており、直接比較可能である（最も高い値が白である）。図２１ｉは、非特異的結合を確立するための冷ＰＢＲ１１１（１ｍＭ）による注射（矢印によって示している）後の［１８Ｆ］ＰＢＲ１１１の動態および放射性リガンドの置換を示す図であり、ＴＳＰＯ−／−マウスがいずれの臓器においても［１８Ｆ］ＰＢＲ１１１の特異的結合を持たず、一方でＴＳＰＯ＋／＋およびＴＳＰＯ＋／−マウスにおけるリガンド動態は特異的結合を示すことが示された（ＩＤ＝注射用量；エラーバーは標準偏差を示す。）。
【図２２】図２２は、本発明による全身ＴＳＰＯノックアウトの機能的効果を示す図である。図２２ａからｃは、血液プレグネノロン濃度（ａ）、ステロイド産生急性調節（ＳｔＡＲ）タンパク質、Ｐ４５０Ｓｃｃ（ＣＹＰ１１Ａ１）、およびＴＳＰＯ２（ハウスキーピング遺伝子ＡｃｔｂおよびＧａｐｄｈに正規化）のｍＲＮＡ発現（遺伝子型当たりｎ＝３）（ｂ）およびプロトポルフィリンＩＸ（ＰＰＩＸ）活性単位（Ａ．Ｕ．）／ｍＬ血液（ｃ）（左：５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）添加後の代表的スペクトラム、右：ＰＰＩＸのレベルに有意差なし）（遺伝子型当たりｎ＝３から５）では、ＴＳＰＯ＋／＋およびＴＳＰＯ−／−マウスの間の有意差が認められなかったことがわかる。図２２ｄには、ＴＳＰＯ＋／＋およびＴＳＰＯ−／−動物が対照または高脂肪飼料下での飼料および飲料水摂取に差がなかったことが示されている（遺伝子型当たりｎ＝４）。図２２ｅには、ＴＳＰＯ−／−動物が、有意な相対体重増なしに、対照飼料と比較して高脂肪飼料に応答し、他方で野生型動物が相対体重増に予想通りの有意な増加を有していた（ｐ＜０．０５）（遺伝子型当たりｎ＝４）ことが示されている。図２２ｆには、全１０週間の期間にわたる正規化した体重発達の比較を示してあり、それは有意差のある体重発達を示している（遺伝子型当たりｎ＝４）．図２２ｇには、ＴＳＰＯ＋／＋マウスは対照飼料と比較して高脂肪飼料下に耐糖能障害に対する予想された傾向を示したが、ＴＳＰＯ−／−マウスはいずれの飼料給餌法下でのグルコース注射に対してほぼ同じ応答を示したことが示されている（遺伝子型当たりｎ＝４）。
【図２３】図２３は、本発明によるＴＳＰＯ−／−マウスにおける変化したミトコンドリアエネルギー代謝を示す図である。図２３ａは、ミトコンドリア電子輸送連鎖（ＥＴＣ）の模式図である。図２３ｂおよび２３ｃは、ＴＳＰＯ−／−マウスからの小膠細胞（ミトコンドリア豊富の細胞型）における基礎酸素消費（ＯＣＲ；ｂ）および細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ；ｃ）が野生型小膠細胞の場合より有意に低かったことを示す棒グラフである。図２３ｄおよび２３ｅは、ＴＳＰＯ−／−およびＴＳＰＯ＋／＋マウスの小膠細胞からのＯＣＲ（ｄ）およびＥＣＡＲ（ｅ）の測定を示す図であり、オリゴマイシン（３μＭ）によるＡＴＰ合成酵素の阻害により、ＴＳＰＯ＋／＋マウスの小膠細胞で誘発されるＡＴＰ産生と比較してＴＳＰＯ−／−マウスの小膠細胞におけるＡＴＰ産生が有意に減少したことを示している。図２３ｆおよび２３ｇは、脱共役剤ＦＣＣＰ（０．１μＭ）を用いるＴＳＰＯ−／−およびＴＳＰＯ＋／＋マウスの小膠細胞からのＯＣＲ（ｆ）およびＥＣＡＲ（ｇ）の測定を示す図である。示したデータから、野生型と比較して、ＴＳＰＯ−／−小膠細胞で認められるＯＣＲおよびＥＣＡＲの最大（貯蔵）呼吸に有意な減少が確認される。図２３ｈおよび２３ｉは、ＴＳＰＯ−／−およびＴＳＰＯ＋／＋マウスの小膠細胞からのＯＣＲ（ｈ）およびＥＣＡＲ（ｉ）の測定を示す図である。ロテノンおよびアンチマイシンＡによって阻害されるミトコンドリアの総呼吸容量はＴＳＰＯ＋／＋およびＴＳＰＯ−／−において同様のＯＣＲを示したが、ＥＣＡＲはＴＳＰＯ−／−小膠細胞において有意に低下した。図２３ｊから、電子輸送連鎖の阻害薬または脱共役剤の効果の合わせたデータが（図２３ｄ、ｆおよびｈ参照）、ＴＳＰＯ−／−小膠細胞におけるプロトン漏出がＴＳＰＯ＋／＋小膠細胞の場合より有意に大きいこと（＊、ｐ＜０．０５、ＴＳＰＯ＋／＋についてはｎ＝１４ウェル、ＴＳＰＯ−／−小膠細胞についてはｎ＝１０ウェル）を示すことがわかる。
【図２４】図２４は、ＴＳＰＯ＋／＋、ＴＳＰＯ＋／−およびＴＳＰＯ−／−マウスの組織における［１８Ｆ］ＰＢＲ１１１陽電子放射型断層撮影の定量から得られたデータを示す図である。副腎組織（ａ）、腎臓（ｂ）、心臓（ｃ）、肝臓（ｄ）、肺（ｅ）および脳（ｆ）。４０分での冷ＰＢＲ１１１（１ｍＭ）による置換までの［１８Ｆ］ＰＢＲ１１１の時間−活性曲線を矢印で示した。
【図２５】図２５は、オートラジオグラフィーおよび放射性リガンド結合によって明らかになったＴＳＰＯタンパク質発現を示す図である。脾臓切片での［３Ｈ］ＰＫ１１１９５（ａ）および（ｂ）［１２５Ｉ］ＣＬＩＮＤＥ、腎臓切片での［３Ｈ］ＰＫ１１１９５（ｃ）および［１２５Ｉ］ＣＬＩＮＤＥ（ｄ）、ならびに睾丸切片での［３Ｈ］ＰＫ１１１９５（ｅ）および［１２５Ｉ］ＣＬＩＮＤＥ（ｆ）を用いるＴＳＰＯ＋／、ＴＳＰＯ＋／−およびＴＳＰＯ−／−マウスからの１６μｍ切片の受容体オートラジオグラフィー。総結合が与えられ、ならびに１０μＭ未標識ＣＬＩＮＤＥ（ＣＢ（ＣＬ））、ＰＫ１１１９５（ＣＢ（ＰＫ））およびＰＢＲ−１１１（ＣＢ（ＰＢＲ））との競争的結合が与えられる。３ｎＭ［１２５Ｉ］ＣＬＩＮＤＥおよび１ｎＭ［３Ｈ］ＰＫ１１１９５の特異的結合がＴＳＰＯ＋／＋およびＴＳＰＯ＋／−マウスからの組織切片で明瞭に見ることができ、３種類全ての未標識リガンドによって置き換わっているが、ＴＳＰＯ−／−組織における結合はバックグラウンドレベルであり、置換可能ではない。［３Ｈ］ＰＫ１１１９５を用いる特異的結合が、睾丸組織（ｇ）および腎臓組織（ｈ）で示されている。両方の組織において、ＴＳＰＯ＋／＋マウスと比較して、ＴＳＰＯ＋／−マウスは約半分のシグナルを有しており、ＴＳＰＯ−／−マウスはゼロに近いシグナルを有していた。点線は実験的に得られたデータ点の非線形回帰を表し、データはＴＳＰＯ＋／＋特異的結合と比べたパーセントとして表される。
【発明を実施するための形態】
【００９５】
本発明者らは、驚くべきことに、そして公開された報告および広まっている考え方に反して、機能性ＴＳＰＯ遺伝子が欠けている生存可能なトランスジェニック非ヒト動物を発生させることができた。本発明は、診断および画像診断のための陰性対照として用いることができ、ＴＳＰＯ関連障害の治療で有用な生理活性薬剤を調べるのに用いることができる。
【００９６】
従って、本発明は、非機能性の内在性ＴＳＰＯ遺伝子の少なくとも一つのコピーを有する細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【００９７】
トランスジェニック動物
その動物は、非機能性内在性ＴＳＰＯ遺伝子産物の少なくとも一つのコピーを含む細胞を有する生存可能な子孫を生じるように繁殖させることができる動物であることができる。その動物は例えば、マウス、ラット、ヒツジ、イヌ、ウシ、ウマ、非ヒト霊長類、ブタ、ネコ、ウサギ、ヤギ、フェレット、モルモット、スナネズミまたはハムスターなど（これらに限定されるものではない）の哺乳動物であることができる。その動物は、ニワトリ、カモまたはウズラなど（これらに限定されるものではない）の鳥であることもできる。その動物は、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）などのショウジョウバエ科に属するものなどのハエ（これに限定されるものではない）などの昆虫であることができる。その動物は、コイ科に属するもの（これに限定されるものではない）などの魚であることもできる。例えば、その魚は、ゼブラフィッシュまたはメダカであることができる。その動物はヒル科に属するヒルであることもできる。
【００９８】
本発明の１実施形態において、動物は、マウス科の構成員である。さらに別の実施形態において、動物はマウスである。
【００９９】
トランスジェニック動物は例えば、安定かつ意図的に組み替えられた、後代にその組換えを伝えることができるゲノムを有するあらゆる動物であることができる。概して、トランスジェニック動物は、一部の外来ＤＮＡを含むゲノムを有し、その外来ＤＮＡは、前記ゲノムに対して行われた意図的改変がなければ前記トランスジェニック動物のゲノムには存在しないであろうＤＮＡ配列である。外来ＤＮＡ配列は例えば、１以上の遺伝子の全てもしくは一部、エキソンの全てもしくは一部、プロモーター領域、およびエンハンサー配列、コンセンサス配列、終止コドン、開始コドン、選択マーカー、蛍光タグ、または相同的組換え部位に相当することができる。
【０１００】
トランスジェニック動物における全ての細胞が同じ改変遺伝物質を含むように、ゲノムに対する改変がトランスジェニック動物の生殖細胞系列を介して伝えられることは理解されるものと考えられる。外来ＤＮＡ配列は、一旦前記トランスジェニック動物の生殖細胞系を介して伝えられるようにトランスジェニック動物のゲノムに取り込まれると、内在性ＤＮＡ配列となり得ることも理解されよう。
【０１０１】
非機能性内在性ＴＳＰＯ遺伝子は、例えば、細胞においてＴＳＰＯ遺伝子産物を産生せず、または細胞において非機能性ＴＳＰＯ遺伝子産物を産生するものである。ＴＳＰＯ遺伝子産物は、ＴＳＰＯ遺伝子発現の産物であり、例えば、ＴＳＰＯ遺伝子の転写またはＴＳＰＯｍＲＮＡ転写物の翻訳の産物であることができる。非機能性ＴＳＰＯ遺伝子産物は、何らかの形で正常な（対照）ＴＳＰＯ遺伝子産物と異なるものであり、例えば非機能性ｍＲＮＡ転写物（転写後改変の前または後）、または非機能性ポリペプチド（翻訳後改変の前または後）であることができる。
【０１０２】
当業者は、自由にアクセス可能な配列データベースを用いて、正常な（対照）ＴＳＰＯ遺伝子産物を構成するものを決定することができる。例えば、ＮＩＨ遺伝子配列データベース、Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)によって、正常なＴＳＰＯｍＲＮＡ転写物（転写後改変の前および後）の予想分子量、エキソン／イントロンスプライシング境界、および正常なＴＳＰＯポリペプチドの予想分子量についての情報が得られるものと考えられる。
【０１０３】
非機能性ＴＳＰＯｍＲＮＡ転写物は、正常なＴＳＰＯポリペプチドを産生するよう翻訳できないｍＲＮＡである。例えば、非機能性ＴＳＰＯｍＲＮＡ転写物は、ｍＲＮＡ転写物の翻訳を防止する非機能性３′非翻訳領域を含むものであることができるか、ＴＳＰＯｍＲＮＡ転写物の異常エキソン／イントロン境界による不正確なスプライシングを受ける可能性がある。別の例において、非機能性ＴＳＰＯｍＲＮＡ転写物はＴＳＰＯポリペプチドを全く産生することができない。さらに別の例において、非機能性ＴＳＰＯｍＲＮＡ転写物は、１以上のエキソンの欠失を含むことができることから、ＴＳＰＯポリペプチドも切断ＴＳＰＯポリペプチドを産生しない。
【０１０４】
非機能性ＴＳＰＯポリペプチドは、細胞または対照ＴＳＰＯポリペプチドにおける正常なＴＳＰＯポリペプチドの機能の全てまたは一部を行うことができないポリペプチドである。例えば、非機能性ＴＳＰＯポリペプチドは、発現後に正しく折り畳まれないものであることができる。非機能性ＴＳＰＯポリペプチドの例には、（１）ＴＳＰＯポリペプチドに１以上の置換を有することで、アミノ酸残基の１以上が正常なＴＳＰＯポリペプチドと異なっているもの；（２）ＴＳＰＯポリペプチドからの１以上のアミノ酸残基のうちの１以上の欠失を有するもの；（３）ＴＳＰＯポリペプチドの配列への１以上のアミノ酸残基の１以上の付加を有するもの；および（４）１以上のアミノ酸のＣ末端もしくはＮ末端切断を有するものなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【０１０５】
非機能性内在性ＴＳＰＯ遺伝子の一つのみのコピーを有する細胞が、機能性ＴＳＰＯ遺伝子産物を産生し得る機能性内在性ＴＳＰＯ遺伝子の一つのコピーを有することができることは理解されるものと考えられる。
【０１０６】
本発明の別の実施形態において、トランスジェニック動物は、非機能性内在性ＴＳＰＯ遺伝子の２個のコピーを有する細胞を含むことができる。これらの細胞は、機能性ＴＳＰＯタンパク質産物を産生できないものと考えられる。当業者であれば、野生型細胞および非機能性ＴＳＰＯ遺伝子の２個のコピーを有する細胞と比較した場合に、非機能性ＴＳＰＯ遺伝子の一つのコピーを有する細胞が、機能性ＴＳＰＯタンパク質産物の異なるレベルを発現する可能性があることは理解するものと考えられる。
【０１０７】
本発明の１実施形態において、非機能性内在性ＴＳＰＯ遺伝子は、ＴＳＰＯ遺伝子が正常なＴＳＰＯ遺伝子産物またはあらゆるＴＳＰＯ遺伝子産物を産生するのを防止する少なくとも一つの突然変異を含む。その突然変異は、例えば、１以上の１以上のヌクレオチドの欠失または挿入、フレームシフト突然変異、１以上のヌクレオチドの転位もしくは置換であることができる。例えば、その欠失は１以上のエキソンのものであることができ、またはその突然変異は、ナンセンス配列を有するＴＳＰＯプロモーター領域の一部もしくは全ての置換であることができる。その突然変異は、例えば、エキソン、イントロンまたはイントロン／エキソンスプライス部位で起こり得る。その突然変異は、遺伝子の上流の５′転写開始領域で起こるか、ｍＲＮＡ転写物の３′非翻訳領域に相当する領域で起こり得る。欠失は、例えば、組換え事象の場合に挿入と同時に起こり得るものであり、挿入は、欠失より多い、それより少ない、またはそれと同数のヌクレオチドを含むことができる。
【０１０８】
非機能性内在性ＴＳＰＯ遺伝子は複数の突然変異を含むことができ、これらの突然変異は同型または異なる型であることができる。その突然変異は遺伝子の異なる領域で起こり得る。例えば、ＴＳＰＯ遺伝子は、エキソンにおけるフレームシフト突然変異ならびに欠失または１以上のヌクレオチドを含むことができる。別の例では、ＴＳＰＯ遺伝子は、組換えコンセンサス配列を含む１以上のヌクレオチドの１以上の挿入を含むことができる。さらに別の例では、ＴＳＰＯ遺伝子は、組換えコンセンサス配列を含む１以上のヌクレオチドの少なくとも二つの挿入、ならびに前記挿入のいずれかの側の１以上のヌクレオチドの欠失を含むことができる。
【０１０９】
１実施形態において、非機能性内在性ＴＳＰＯ遺伝子は、ＴＳＰＯ遺伝子のエキソン１、２、３もしくは４の全てもしくは一部の欠失を含む突然変異を含む。別の実施形態において、非機能性内在性ＴＳＰＯ遺伝子は、ＴＳＰＯ遺伝子のエキソン２またはエキソン３の全てもしくは一部の欠失を含む突然変異を含む。例えば、その突然変異は、エキソン２の全てもしくは一部、エキソン３の全てもしくは一部、またはエキソン２および３の全てもしくは一部の欠失を含むことができる。代表的には、その突然変異は、エキソン２および３の欠失である。別の例において、その突然変異は、エキソン１のみの全てもしくは一部、エキソン２の全てもしくは一部、またはエキソン１および２の全てもしくは一部の欠失を含むことがでいる。エキソン１、２、３もしくは４の全てもしくは一部の欠失は、ＴＳＰＯ遺伝子がＴＳＰＯ遺伝子産物または正常なＴＳＰＯ遺伝子産物を産生するのを防止する欠失である。
【０１１０】
当業者であれば、本発明のトランスジェニック動物を発生させるのに使用することができる方法に気付くものと考えられる。概して、その方法は、例えば胚幹細胞（ＥＳ）細胞または各種発達段階での胚細胞などの多能性細胞への人工的ＤＮＡの組み込みを介した遺伝子破壊に依存する。人工ＤＮＡを導入するのに用いる方法は、胚細胞の発達の段階によって決まり得る。人工ＤＮＡでトランスフェクションしたＥＳ細胞を用いて、胚をコロニー化して、初代トランスジェニック動物を発生させることができる。
【０１１１】
初代動物を交配、同系交配、異系交配または異種交配して、特定の動物のコロニーを作ることができる。そのトランスジェニック動物をスクリーニングおよび評価して、対象の遺伝子型を有する動物を選択する。例えば、サザンブロット分析またはＰＣＲ技術を用いて、初期スクリーニングを行って、動物組織を分析して、動物のゲノムにおける非機能性ＴＳＰＯ遺伝子の少なくとも一つのコピーの存在を確認することができる。トランスジェニック動物の各種組織におけるＴＳＰＯ遺伝子のｍＲＮＡ発現のレベルも、動物から得られた組織サンプルのノーザンブロット分析、イン・サイツハイブリダイゼーション分析、および逆転写酵素−ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）など（これらに限定されるものではない）の技術を用いて評価することもできる。組織でのＴＳＰＯタンパク質発現のレベルは、ＴＳＰＯに特異的な抗体を用いる一般的な免疫学的技術、またはＴＳＰＯ結合性化合物もしくはリガンドを用いる受容体結合アッセイによって求めることができる。
【０１１２】
１以上の突然変異を有するＴＳＰＯ遺伝子を有する人工ＤＮＡの胚幹細胞細胞への導入に用いることができる方法の例には、相同的組換えおよび遺伝子トラッピングなどがあるが、これらに限定されるものではない。ｌｏｘＰ−Ｃｒｅリコンビナーゼ系および人工ＤＮＡ構築物を用いて、相同的組換えを一般的に用いて、トランスジェニック動物、特には、マウス科に属するトランスジェニック動物を発生させる。本発明の特定の実施形態において、トランスジェニック動物は従来のＣｒｅ／ｌｏｘ交配法を用いて発生させる。例えば、エキソン２もしくはエキソン３の欠失である突然変異を含む非機能性内在性ＴＳＰＯ遺伝子の少なくとも一つのコピーを有する細胞を含むトランスジェニック動物を、相同的組換えを用いて発生させることができる。例えば、エキソン２および３の欠失を有するＴＳＰＯ遺伝子についてホモ接合であるゲノムを有するトランスジェニックマウスの発生は、外来Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスを、ＴＳＰＯ遺伝子のエキソン２および３に隣接する二つのｌｏｘＰ部位を含むＴＳＰＯ遺伝子についてホモ接合であるゲノムを有するトランスジェニックマウスと異種交配する段階を含むことができる。
【０１１３】
本発明の１実施形態において、非機能性内在性ＴＳＰＯ遺伝子は、構成的突然変異を含む。構成的突然変異とは、ＴＳＰＯ遺伝子がトランスジェニック動物の全ての細胞でＴＳＰＯ遺伝子産物または正常ＴＳＰＯ遺伝子産物を産生するのを防止するＴＳＰＯ遺伝子における突然変異を意味する。本発明の別の実施形態において、ＴＳＰＯ遺伝子は、条件的である突然変異を含む。条件的突然変異は、ＴＳＰＯ遺伝子が、例えばトランスジェニック動物の選択された細胞のみで、またはトランスジェニック動物の発達中の選択された時期のみでＴＳＰＯ遺伝子産物または正常ＴＳＰＯ遺伝子産物を産生するのを防止するものである。
【０１１４】
当業者であれば、例えばｌｏｘＰ−Ｃｒｅリコンビナーゼ系などのトランスジェニック動物を発生させるのに用いられる従来の方法を操作して、特定の細胞および／または組織、または特定の時点での細胞および／または組織のみが非機能性遺伝子を有するようにすることが可能であることは理解するものと考えられる。トランスジェニック動物の発生に用いられる適切なＤＮＡ構築物を操作して、特定の細胞型もしくは特定の時期のみで活性であるプロモーターまたはエンハンサーなどの制御要素に操作可能に連結することができる。「操作可能に連結」という用語は、ＤＮＡ配列および制御配列／（複数）（すなわちプロモーター）が、適切な分子（すなわち転写因子）が制御配列／（複数）に結合した場合に遺伝子発現が可能となるように連結されることを意味する。制御要素に操作可能に連結されたＤＮＡ構築物の使用によって、対象の遺伝子の標的化発現が可能となる。当業者であれば、例えば所望の細胞および／または組織で、または所望の時点で人工ＤＮＡ構築物の発現を可能とする適切なプロモーターまたはエンハンサーを容易に決定することができる。細胞／組織特異的または時期特異的（すなわち時間的）発現は、好ましい細胞および／または組織以外の細胞および／または組織における発現の完全な不在や、好ましい時期以外の時期での発現の完全な不在を必要とするものではない。代わりに、「細胞特異的」または「組織特異的」または「時期特異的」発現は、好ましい細胞型もしくは組織での、または好ましい時期での特定のＤＮＡ配列の発現の大半を指す。
【０１１５】
例えば、本発明のトランスジェニックマウスの発生は、腎臓細胞特異的プロモーターによって制御される外因性Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子を含むトランスジェニックマウスを、ＴＳＰＯ遺伝子のエキソン２に隣接する２個のｌｏｘＰ部位挿入を含むＴＳＰＯ遺伝子を有するトランスジェニックマウスと異種交配する段階を含むことができる。この例では、得られたトランスジェニックマウスのあらゆる細胞が、同じ遺伝物質を含むことができる。各マウスの遺伝物質は、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子を含む外来ＤＮＡ、ならびに２個のｌｏｘＰ部位挿入を含むＴＳＰＯ遺伝子を含むことになる。Ｃｒｅリコンビナーゼは、適切な転写因子を発現して、腎臓細胞特異的プロモーターからのＣｒｅリコンビナーゼの発現を開始する腎臓細胞でのみ発現され得る。従って、その腎臓細胞は、ＴＳＰＯ遺伝子がＴＳＰＯ遺伝子産物または正常なＴＳＰＯ遺伝子産物を産生するのを防止する突然変異（その突然変異はＴＳＰＯ遺伝子のエキソン２の欠失である。）を有する非機能性内在性遺伝子の少なくとも一つのコピーを含む唯一の細胞であることができる。
【０１１６】
さらなる非限定的な例において、本発明のトランスジェニックマウスの発生は、時間的プロモーター（例えば、動物が成体に達した時のみ活性化されるもの）によって制御される外因性Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子を含むトランスジェニックマウスをＴＳＰＯ遺伝子の転写開始領域に隣接する２個のｌｏｘＰ部位挿入を含む改変内在性ＴＳＰＯ遺伝子を有するトランスジェニックマウスと最初に異種交配する段階を含むことができる。この場合、得られたトランスジェニックマウスのあらゆる細胞が、同じ遺伝物質を含むことができる。各マウスの遺伝物質は、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子を含む外来ＤＮＡ、ならびに２個のｌｏｘＰ部位挿入を含むＴＳＰＯ遺伝子を含むことになる。Ｃｒｅリコンビナーゼは、マウスが成体に達し、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現を開始するための適切な転写因子が細胞中に存在する場合にのみ細胞で発現され得る。従って、マウスが成体に達した場合にのみ、その成体マウスにおける細胞は、ＴＳＰＯ遺伝子がＴＳＰＯ遺伝子産物または正常なＴＳＰＯ遺伝子産物を産生するのを防ぐ突然変異（その突然変異はＴＳＰＯ遺伝子の転写開始領域の欠失である。）を有する非機能性内在性遺伝子の少なくとも一つのコピーを含むことができる。
【０１１７】
所望の突然変異のいずれかについてホモ接合であるマウスが、標準的な方法によって所望の突然変異についてヘテロ接合であるマウスの異種交配によって発生し得ることは理解されるものと考えられる。
【０１１８】
１実施形態において、本発明は、非機能性内在性ＴＳＰＯ遺伝子の少なくとも一つのコピーを有する細胞を含む本明細書に記載のトランスジェニック非ヒト動物のいずれかの後代に関する。
【０１１９】
その後代は、いずれの交配世代からのものであっても良い。例えば、その後代は第３世代の非ヒトトランスジェニック動物である非ヒトトランスジェニック動物からのものであっても良い。得られた後代は例えば、非機能性内在性ＴＳＰＯ遺伝子の１個もしくは２個のコピーを含むことができる。得られた後代は、例えば、交配ペアによって規定される遺伝子型のいずれについてもヘテロ接合またはホモ接合であることができる。
【０１２０】
その後代は、本発明の非ヒト動物と同じ生物種の他の動物とを交配させることから生じさせることができる。例えば、その後代は、本発明の非ヒト動物と異なる遺伝子組換えを有する同じ生物種のトランスジェニック動物とを交配させることで生じさせることができる。別の例において、その後代は、交配本発明の非ヒト動物と同じ生物種のいずれかの野生型動物との交配によって発生させることができる。
【０１２１】
さらに別の実施形態では、本発明は、ｐＫＺ１マウス、Ｂｒｃａ２ホモ接合マウス、Ｔｇ（ＣＡＴ）（＋／＋）マウス、Ａ−Ｔ変異ヘテロ接合／ホモ接合マウス、Ｃｓｂｍ／ｍマウス、インシュリン様増殖因子１ヘテロ接合およびホモ接合マウス、Ｐ５３ヘテロ接合およびホモ接合マウス、放射線感受性および抵抗性トランスジェニックマウス、統合失調症ＤＩＳＣ１ノックアウトマウス、統合失調症ニューレグリン１ノックアウトマウス、遺伝子工学モデル腫瘍マウス、神経炎症モデルマウス、アルツハイマー病モデルマウス、パーキンソン病モデルマウス、またはインシュリン抵抗性および食餌誘発肥満に対して感受性である２型脱ヨウ素酵素遺伝子（Ｄ２ＫＯ）の標的欠失を有するマウスなど（これらに限定されるものではない）の、非機能性内在性ＴＳＰＯ遺伝子の少なくとも一つのコピーを有する細胞を含む本明細書に記載のトランスジェニックマウスのいずれかを交配することから発生する後代に関するものである。
【０１２２】
トランスジェニック非ヒト動物に関係する方法および使用
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、ＴＳＰＯ機能およびＴＳＰＯ関連障害に関係するイン・ビボ試験およびＴＳＰＯ関連遺伝子産物またはＴＳＰＯと直接もしくは間接的に相互作用する化合物の試験において特に有用である。しかしながら、その動物は、ＴＳＰＯ機能およびＴＳＰＯ関連障害のイン・ビトロ試験にも用いることができる。ＴＳＰＯ関連遺伝子産物は、ＴＳＰＯ遺伝子産物に機能的に関連する遺伝子産物である。ＴＳＰＯ関連遺伝子産物は、ＴＳＰＯ遺伝子産物を含むあらゆるシグナル伝達経路の上流もしくは下流である遺伝子産物であることができる。ＴＳＰＯ関連遺伝子産物はタンパク質またはｍＲＮＡ転写物であることができ、シグナル伝達経路におけるＴＳＰＯ遺伝子産物のすぐ上流もしくは下流である必要は必ずしもない。例えば、ＴＳＰＯ関連遺伝子産物は、ＴＳＰＯ遺伝子の転写開始領域に結合し、転写を開始する転写因子であることができる。別の例では、ＴＳＰＯ関連遺伝子産物は、細胞においてＴＳＰＯ介在ステロイド産生に応答して発現されるタンパク質であることができる。
【０１２３】
１実施形態において、本発明は、本明細書に記載の非機能性内在性ＴＳＰＯ遺伝子のの少なくとも一つのコピーを有する細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物由来の細胞、組織および不死化細胞系に関するものである。本発明はまた、本明細書に記載の非機能性内在性ＴＳＰＯ遺伝子の少なくとも一つのコピーを有する細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物のいずれかの後代由来の細胞、組織および不死化細胞系に関する。
【０１２４】
その細胞または不死化細胞系は、胚細胞、幹細胞、神経細胞、感覚細胞、内皮細胞、心臓細胞、平滑筋細胞、骨芽細胞、メラニン細胞、肝細胞、腎臓細胞、副腎細胞、造血細胞および脂肪細胞など（これらに限定されるものではない）の動物から抽出された、得られたおよび／または由来の細胞であることができる。
【０１２５】
当業者であれば、動物から得られた細胞および組織から不死化細胞を発生させる方法は分かるものと考えられる。
【０１２６】
その組織は、脳組織、腎臓組織、肺組織、心臓組織、副腎組織および性腺組織など（これらに限定されるものではない）の動物から得られた組織であることができる。その組織は、例えば健常組織であることができるか、悪性腫瘍を含むことができる。
【０１２７】
その組織および細胞は、本明細書に記載の本発明のいずれかの動物から得られる成体サンプルから得られるか抽出されるものであることができる。生体サンプルの例には、生検および剖検サンプルなどの組織の切片、組織学的目的のために取った切片、例えば冷凍切片、血液、血漿、血清、痰、便、涙、粘液、毛および皮膚などがあるが、これらに限定されるものではない。生体サンプルにはさらに、リンパ液、腹水（ａｓｃｅｔｉｃ  ｆｌｕｉｄ）などがある。生体サンプルにはさらに、記録用サンプル、例えば処置もしくは転帰歴を有するサンプルなどもある。
【０１２８】
その生体サンプルは、取得して直ちに用いることができるか、使用前に適切な条件下で保存することができる。特定の実施形態に関して、適切な条件は、ＴＳＰＯ遺伝子産物またはＴＳＰＯ関連遺伝子産物の分解を実質的に防止または遅延させる条件下で所望の期間にわたり貯蔵を可能とする条件である。１以上の別の成分を生体サンプルに含めることができる。含めることができる別のサンプルの例には、生体サンプルのタンパク性成分の分解を阻害するためのプロテアーゼ阻害剤、生体サンプルの核酸成分の分解を阻害するためのＲＮａｓｅ阻害剤もしくはＤＮａｓｅ阻害剤、およびサンプルの細菌汚染を低減するための保存剤その他の抗菌成分がある。別の成分は、採取時もしくは採取後、貯蔵前もしくは貯蔵後に加えることができ、ＴＳＰＯ遺伝子産物もしくはＴＳＰＯ関連遺伝子産物の検出もしくは分析のための生体サンプルの使用時に残留していても良く、またはＴＳＰＯ遺伝子産物もしくはＴＳＰＯ関連遺伝子産物の検出もしくは分析のための生体サンプルの使用の前に除去もしくは失活させても良い。
【０１２９】
本発明の動物、後代、細胞、組織および不死化細胞系は、ＴＳＰＯと他の化合物もしくはタンパク質との相互作用の変化などのＴＳＰＯ関連の疾患もしくは障害を研究および分析する上で有用である。ＴＳＰＯ関連障害は、対象者における正常なＴＳＰＯ発現または正常なＴＳＰＯ機能の混乱を特徴とする障害であり得る。正常なＴＳＰＯ機能または発現関連の特徴は、対照において認められ得る。例を挙げると、異常なＴＳＰＯ機能または発現が疾患状態に関連するものである場合、正常なＴＳＰＯ機能または発現を示す適切な対照には、ＴＳＰＯ関連障害を患っていない個体、またはＴＳＰＯ関連障害を患っていないと考えられる個体の標準母集団などがあるものと考えられる。正常なＴＳＰＯ機能の欠点に適した対照には、既知もしくは測定された標準母集団または値に基づく実験室標準または値などがあり得るものであり、測定された実験的に求められた値の比較を容易にできるようにするグラフや表の型式で提供することができる。
【０１３０】
ＴＳＰＯ関連の疾患および障害の例には、癌、神経炎症、アルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、脳損傷、虚血−再潅流損傷、急性および慢性ストレス、不安障害、気分障害および統合失調症などの行動または神経もしくは精神障害、末梢神経障害、多発性硬化症、神経因性疼痛、肥満、糖尿病および悪液質などがあるが、これらに限定されるものではない。
【０１３１】
対象者は、遺伝性、後天性、誘発性もしくは一過性のＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害を有することがでいる。従って、対象者は、その対象者がＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害ではないと過去に診断されたか否かを問わず、生涯におけるいずれか特定の段階でＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害であると診断され得る。
【０１３２】
本発明の動物、後代、細胞、組織および不死化細胞系は、動物からの生体サンプル中のＴＳＰＯ遺伝子産物の画像化、さらには動物からの生体サンプル中のＴＳＰＯ遺伝子産物の検出およびＴＳＰＯ関連遺伝子産物の検出に関連する方法において特に有用である。
【０１３３】
本発明の方法において、「検出する」または「検出」は、サンプル中の遺伝子産物の存在、不在、活性もしくは量を測定することまたは測定を意味し、サンプル中の遺伝子産物の量を定量すること、または生体サンプル中の遺伝子産物の活性を定量することなどがあり得る。定量、従って検出には、所定の試験サンプルを、対照サンプルと比較することでＴＳＰＯ遺伝子産物の存在について評価し、試験サンプルが対照サンプルより多い、少ないまたはほぼ同量のＴＳＰＯ遺伝子産物を含むことを認める相対的定量などがある。この場合、非機能性内在性ＴＳＰＯ遺伝子についてホモ接合である本発明の動物からの生体サンプルは、陰性対照サンプルとして用いることができるものと考えられる。さらに、非機能性内在性ＴＳＰＯ遺伝子についてヘテロ接合である動物からの生体サンプルは、野生型動物より低いＴＳＰＯ遺伝子産物発現レベルを示すか、一つの機能性ＴＳＰＯアレルの喪失のために定量的だけでなく定性的にも異なる薬物動態または薬力学的相違も示す対照サンプルとして用いることができるものと考えられる。
【０１３４】
検出には、サンプル中のＴＳＰＯ遺伝子産物をそのサンプル中で検出可能な別の分析物と比較することも含まれる。例えば、所定の試験サンプル中のＴＳＰＯ遺伝子産物の量を、内部基準マーカーと比較して定量することができる。検出には、サンプル中のＴＳＰＯ遺伝子産物の量を求め、適切な単位で、例えば単位／サンプル体積として、例えばグラム、ミリグラム、ナノグラム、ピコグラム、フェムトグラムなど／ミリリットル、ミクロリットル、ナノリットルなどとして表すことができるような絶対定量も含まれる。当業者であれば、試験サンプル中のＴＳＰＯ遺伝子産物の検出において、分子量、核酸プローブ、抗体または天然および／または合成化合物に関する結合能力などのＴＳＰＯ遺伝子産物の物理特性も同時に測定可能であることは理解するであろう。
【０１３５】
本発明の方法で使用される生体サンプルの取得は、画像化または検出されるＴＳＰＯ遺伝子産物および使用される検出もしくは画像化技術によって決まり得るいずれか好適な手段によって行うことができることは理解されよう。ＴＳＰＯ遺伝子産物は、核酸、例えばｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡ転写物など、およびＴＳＰＯポリペプチド、およびそれらの断片など（これらに限定されるものではない）のいずれか適切な遺伝子産物であることができる。
【０１３６】
ＴＳＰＯポリペプチドまたはそれの断片の検出または画像化または機能試験が望まれる場合、サンプルは、サンプル中の１以上のポリペプチドの分析に好適な手段、例えばサンプルの粗ホモジネート、サンプルからの総タンパク質の抽出、サンプルからのリン酸化タンパク質の抽出、サンプルからのポリペプチド断片の取得、サンプルからの凍結切片の取得、および／またはサンプルからの固定化細胞または組織切片の取得によって得ることができる。ＴＳＰＯポリペプチドまたはそれの断片は、（ｉ）ＴＳＰＯポリペプチドもしくはそれの断片への抗体もしくはプローブの結合が関与するイムノアッセイ法；および（ｉｉ）プロテオミクス法および質量分析法など（これらに限定されるものではない）の確立されたタンパク質アッセイおよび画像化法によって画像化または検出することができる。
【０１３７】
イムノアッセイ技術およびプロトコールについては、Price and Newman, "Principles and Practice of Immunoassay," 2nd Edition, (Grove’s Dictionaries, 1997);およびGosling, "Immunoassays: A Practical Approach," (Oxford University Press, 2000）に記載されている。当業者に知られているイムノアッセイ法には、ウェスタンブロット法、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ＩｇＭ抗体捕捉ＥＬＩＳＡ（ＭＡＣＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学法（ＩＨＣ）、および免疫細胞化学法（ＩＣＣ）などがあるが、これらに限定されるものではない。所望に応じて、そのようなイムノアッセイを自動化することができる。イムノアッセイを、レーザー誘起蛍光法、例えばフローサイトメトリーと組み合わせて用いることもできる。
【０１３８】
当業界で公知であるプロテオミクス法および質量分析法は、"Methods in Molecular Biology" (Volume 428 Clinical Proteomics; Methods and Protocols; Vlahou, Antonia 2008）に記載されている。有用なプロテオミクスアッセイには、二次元ゲル電気泳動、質量分析（ＭＳ）、タンデム型質量分析および多重質量分析、および受容体膜結合法、例えばプラズモン共鳴法などの標識法もしくは無標識法の使用など（これらに限定されるものではない）の当業界で公知のプロテオミクスアッセイなどがある。
【０１３９】
本発明の方法で使用される抗体およびプローブは、いかなる入手源からのものであっても良い。抗体は、いずれの動物起源のものであっても良く、例えばＴＳＰＯポリペプチドまたはそれの断片に特異的に結合するモノクローナル、ポリクローナル、キメラ、多特異的、ヒト化、ならびにヒトモノクローナルおよびポリクローナル抗体であることができる。その抗体またはプローブは市販されていることができるか、本発明の方法で使用するために特に作ることができる。例えば、ＴＳＰＯ遺伝子産物を検出するのに使用されるプローブは、ＴＳＰＯ特異的プローブＰＫ１１１９５であることができる。そのプローブは、ＴＳＰＯ特異的放射標識プローブ［３Ｈ］ＰＫ１１１９５であることもできる。好適な抗体もしくはプローブの作製方法は、当業者には容易に明らかになろう。例えば、代表的にはＦａｂ部分を含む対象の標的分子に特異的なモノクローナル抗体は、Harlow and Lane (eds.), (1988), "Antibodies-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.に記載のハイブリドーマ法を用いて得ることができる。
【０１４０】
ＴＳＰＯｍＲＮＡ転写物またはそれの断片の検出もしくは画像化または機能試験が望まれる場合、サンプルは、例えばサンプルからの全ＲＮＡの抽出、サンプルからのｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡの抽出、および／またはサンプル内のメッセンジャーＲＮＡの発現を代表するｃＤＮＡの取得など、サンプル中の１以上の核酸の分析のためのいずれか好適な手段によって得ることができる。ｃＤＮＡ標本は、サンプル中の全てのもしくは実質的に全てのｍＲＮＡのライブラリを代表するような全ｃＤＮＡ標本であることができ、またはｃＤＮＡ標本は、所定の分析用の１以上の対象マーカーなどの特定の化学種が豊富化されて包含されるように作ることができる。
【０１４１】
ＴＳＰＯｍＲＮＡ転写物またはそれの断片の検出または画像化方法は、例えば、ｍＲＮＡ、または生体サンプルからのそれの増幅型もしくはクローニング型の、ＴＳＰＯ遺伝子配列の全てまたは一部に特有のポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって行うことができる。標識されたプローブを用いる好適な核酸検出は当業界では公知であり、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、蛍光イン・サイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、イン・サイツハイブリダイゼーション、ノーザン、サウス−ウェスタン、ノース−ウェスタンおよびサザンブロッティングまたはディファレンシャルディスプレイなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【０１４２】
プローブは、検出可能な標識分子または他のレポーター分子に結合することができる。代表的な標識の例には、放射性同位体、酵素基質、補因子、リガンド、化学発光剤もしくは蛍光剤、ハプテン類、および酵素類などがあるが、これらに限定されるものではない。標識方法および各種目的に適した選択における指針については、例えばサムブロックら（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1989)およびアウスヘ゛ルら(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1998)が記述している。
【０１４３】
核酸プローブの製造方法および使用方法については、例えばサムブロックら(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1989)、アウスベルら(Ausubel et al.(ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1998)、およびイニスら(Innis et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press、Inc., San Diego, CA, 1990)が記述している。
【０１４４】
１実施形態において、本明細書に記載の本発明の動物、後代、細胞、組織および／または不死化細胞系を、ＴＳＰＯ遺伝子産物の検出のための陰性対照として、または生体サンプルにおける選択的ＴＳＰＯ介在作用または１以上の機能性ＴＳＰＯアレルが存在しないことによる適応応答の分析のための陰性対照として用いられる。
【０１４５】
特定の実施形態において、生体サンプルは、ＴＳＰＯ関連障害を有するか、有すると疑われる対象者からのものである。
【０１４６】
ＴＳＰＯまたはＴＳＰＯ関連遺伝子産物の検出、画像化または機能試験に基づくアッセイおよび実験における陰性対照としての本発明の動物、後代、細胞、組織および／または不死化細胞系の使用は、ＴＳＰＯ関連の疾患および障害の診断に役立つことができる。
【０１４７】
「診断」という用語は、所定の時点でＴＳＰＯ関連障害を有することと持たないことの区別、ならびに対象者の生涯におけるいずれかの時点でのＴＳＰＯ関連障害を発症するリスクが高いかそうでないかの間の区別を含むものであることは理解されよう。例えば、異常ＴＳＰＯ遺伝子発現は、ＴＳＰＯ関連の疾患および障害ならびにＴＳＰＯ関連の疾患および障害を発症する傾向に関連すると言うことができる。本発明の動物、後代、細胞、組織および／または不死化細胞系は、ＴＳＰＯ関連の疾患および障害に関係するいずれか他の試験での陰性対象として用いられる。
【０１４８】
本明細書に記載の本発明の非ヒト動物、組織、細胞および不死化細胞系は、対象者におけるＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害の治療で使用される候補化合物の確認およびスクリーニングにも有用であり得る。
【０１４９】
従って、候補化合物には、ＴＳＰＯ遺伝子産物またはＴＳＰＯ関連遺伝子産物への確立されたまたは推定される結合アフィニティを有する化合物などがあり得る。候補化合物の例には、ＰＫ１１１９５、Ｒｏ５４８６４、ＰＢＲ１１１およびＣＬＩＮＤＥなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【０１５０】
ＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害の治療に有用であるためには、候補化合物は通常、ＴＳＰＯまたはＴＳＰＯ関連遺伝子産物などの所期の標的についての特異性および選択性に関しての特徴を必要とする。選択的もしくは特異的結合または相互作用の非選択的および非特異的結合もしくは他の標的との相互作用からの区別は、本発明による非ヒト動物、組織、細胞もしくは不死化細胞系モデルで、すなわち所期の標的が存在しないモデル、または野生型モデルより低いレベルの発現されるモデルで確実に確立することができる。研究により、ＴＳＰＯがほとんどの生物種にわたって高度に保存されることから、非ヒト動物を用いた研究から誘導される意味のある情報をヒトおよび他の対象者でのＴＳＰＯ関連疾患および障害に適用できることが明らかになっている。
【０１５１】
候補化合物に関して、結合選択性が、その化合物が別の標的より特定の標的に結合するアフィニティの尺度である。結合特異性は、選択性係数として数字で表すことができる。結合特異性は、候補化合物が標的分子に結合できる形態に関するものである。
【０１５２】
従って、本明細書に記載の本発明の非ヒト動物、組織、細胞および不死化細胞系を、多様なスクリーニングおよび確認アッセイで用いることができる。例えば、ＴＳＰＯ発現および活性、またはＴＳＰＯ関連遺伝子産物の発現および活性に影響すると推定される各種化合物がスクリーニングされ、対象者におけるＴＳＰＯ関連疾患および障害の治療で有用であると確認されている。
【０１５３】
本発明のある種の非限定的実施形態において、ＴＳＰＯ関連疾患もしくは障害の治療で有用な化合物は、米国特許第６，３７９，６４９号（これの開示内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。）に開示の下記一般式（Ｉ）の化合物である。
【０１５４】
【化１０】
2016516399.tif 000011
式中、
Ｘは、非存在、ヨウ素もしくはそれの同位体であり；
Ｙは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＣＮおよびＣＯＯＨから選択され；
Ｚは、Ｎ（Ｒ３）Ｃ（Ｏ）Ｒ４およびＣ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４から選択され；
Ｒ１およびＲ２は独立に、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、（Ｃ６−Ｃ１２）アリールオキシ、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、複素環、（Ｃ２−Ｃ６）アルカノイルおよび（Ｃ２−Ｃ７）アシルから選択され、それらはそれぞれ、置換されていないかハロゲンもしくはそれの同位体、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良く；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に、水素または（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、複素環、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニルおよび（Ｃ２−Ｃ５）アシルから選択される基であり、それらはそれぞれ、置換されていないか、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良く、
またはＲ３およびＲ４が一体となって、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良い（Ｃ２−Ｃ７）アルキリデンであり；
ｍおよびｎは独立に、０、１または２であり；
ｐは１であり；
各場合で、
（ｉ）アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し；
（ｉｉ）シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し；
（ｉｉｉ）ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
【０１５５】
記載の方法で有用な式（Ｉ）の化合物：
【０１５６】
【化１１】
2016516399.tif 000012
の例には、
Ｙが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮおよびＯＨから選択され；
Ｚが、Ｎ（Ｒ３）Ｃ（Ｏ）Ｒ４およびＣ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４から選択され；
Ｒ１およびＲ２が独立に、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ３）アルケニル、（Ｃ５−Ｃ６）シクロアルキル、フェニル、ナフチル、フェノキシ、ナフチルオキシ、ベンジル、ピリジル、フラニル、チエニル、ピペリジニル、モルホリニル、テトラヒドロフラニル、ジオキサニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルカノイルおよび（Ｃ２−Ｃ４）アシルから選択され、それらはそれぞれ置換されていないか、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ２−Ｃ４）アルコキシ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ３）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルカノイル、オキソおよびアミドからなる群から選択される置換基で置換されていても良く；
Ｒ３およびＲ４がそれぞれ独立に、水素または（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ２−Ｃ３）アルケニル、（Ｃ５−Ｃ６）シクロアルキル、フェニル、ナフチル、ベンジルおよび（Ｃ２−Ｃ４）アシルから選択される基であり、それらはそれぞれ置換されていないか、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、ＮＨ２、（Ｃ−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ３）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルカノイル、オキソおよびアミドからなる群から選択される置換基で置換されていても良く、
またはＲ３およびＲ４が一体となって、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ３）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルカノイル、オキソおよびアミドからなる群から選択される置換基で置換されていても良い（Ｃ２−Ｃ３）アルキリデンであり；
ｍおよびｎが独立に、０または１である化合物などがあるが、それに限定されるものではない。
【０１５７】
記載の方法で有用な式（Ｉ）の化合物の例には、下記式（ＩＡ）の２−（４′−ヨードフェニル）−イミダゾール［１，２−ａ］ピリジン−３−アセトアミド誘導体である化合物などがあるが、それに限定されるものではない。
【０１５８】
【化１２】
2016516399.tif 000013
式中、
Ｘはヨウ素またはそれの同位体であり；
Ｙはハロゲンであり；
Ｒ３およびＲ４は独立に、水素、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルおよび（Ｃ２−Ｃ４）アルケニルから選択され、またはＲ３およびＲ４が一体となって、（Ｃ２−Ｃ３）アルキリジンである。
【０１５９】
式（ＩＡ）の代表例は、Ｘが１２５Ｉであり；ＹがＣｌであり；ｍおよびｎが０であり；Ｒ３およびＲ４がＣＨ２ＣＨ３である［１２５Ｉ］ＣＬＩＮＤＥである。
【０１６０】
記載の方法で有用な式（Ｉ）の化合物の別の例には、下記式（ＩＢ）の誘導体である化合物などがあるが、それに限定されるものではない。
【０１６１】
【化１３】
2016516399.tif 000014
式中、
Ｙはハロゲンであり；
Ｒ１は独立に、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、（Ｃ６−Ｃ１２）アリールオキシ、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、複素環、（Ｃ２−Ｃ６）アルカノイルおよび（Ｃ２−Ｃ７）アシルから選択され、それらはそれぞれ、置換されていないか、ハロゲンまたはそれの同位体、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良く；
Ｒ３およびＲ４は独立に、水素、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルおよび（Ｃ２−Ｃ４）アルケニルから選択され、またはＲ３およびＲ４が一体となって（Ｃ２−Ｃ３）アルキリジンである。
【０１６２】
式（ＩＢ）の化合物の代表例は、ＹがＣｌであり；Ｒ１がＯＣＨ２ＣＨ２１８Ｆであり；Ｒ３およびＲ４がＣＨ２ＣＨ３である［１８Ｆ］ＰＢＲ１１１である。
【０１６３】
スクリーニングおよび確認の方法およびアッセイには、本発明の非ヒト動物、組織、細胞および／または不死化細胞系への候補化合物の投与もしくは曝露、ならびに非ヒト動物、組織、細胞および／または不死化細胞系の表現型に対する候補化合物の効果または非ヒト動物、組織、細胞および不死化細胞系におけるＴＳＰＯおよびＴＳＰＯ関連遺伝子産物の発現レベルの評価が関与する。その方法には、同じ生物種の野生型非ヒト動物、組織、細胞および／または不死化細胞系の表現型もしくは発現レベルの比較による、当該方法で使用される本発明の被験非ヒト動物、組織、細胞および不死化細胞系における表現型または発現レベルに対して候補化合物を有し得る効果の性質の決定が関与し得る。
【０１６４】
動物の表現型が、形態学、生化学的特徴、生理学および行動など（これらに限定されるものではない）の動物の観察可能な形質を含むことは理解されるものと考えられる。これらの形質は、動物、または組織もしくは細胞などの動物由来のサンプル、または動物由来の不死化細胞系由来のサンプルにおいて認められ得る。生化学的特徴には、例えば、対象の遺伝子産物の機能および相互作用などがあり得る。動物の表現型は、遺伝学的因子および外的環境因子、例えば候補化合物の投与もしくはそれへの曝露の両方によって影響を受け得る。遺伝子産物の発現レベルは、絶対的条件で、または対照遺伝子産物と比較して測定することができる。対照遺伝子産物は、同じ遺伝子産物または異なる遺伝子産物であることができる。
【０１６５】
本発明の非ヒト動物、細胞、組織および不死化細胞系を用いる候補化合物のスクリーニングおよび確認方法は、下記のものなど（これらに限定されるものではない）の各種部分の情報を提供し得るものである。
【０１６６】
最初に、その方法は、非機能性ＴＳＰＯ遺伝子の少なくとも一つのコピーを有する細胞を含む動物における候補化合物の非選択的もしくは非特異的結合もしくは相互作用（すなわちＴＳＰＯ以外の標的に結合する化合物の量）を示すことができる。第２に、機能性ＴＳＰＯ遺伝子産物が存在しないか、野生型動物より低いレベルで発現される動物は、動物がＴＳＰＯ関連遺伝子産物の不在、発現低下もしくは発現上昇などの機能性ＴＳＰＯ遺伝子産物の不在または低い発現を補償することで、他の関連するまたは機能的に関連した遺伝子の調節に影響する生理的経路および機序を示すことができる。第３に、ＴＳＰＯ遺伝子の一つのみのコピーが非機能性であるヘテロ接合動物は、他の関連するまたは機能的に関連する遺伝子における適応的または補償的調節を示し得るものであり、それは、ＴＳＰＯ遺伝子の両方のコピーが非機能性である動物で見られる適応的または補償的応答とは異なり得る。
【０１６７】
対象者におけるＴＳＰＯまたはＴＳＰＯ関連遺伝子産物への結合または機能的調節に関しての公知もしくは新規な候補化合物の選択性および特異性は、本明細書に記載の本発明の非ヒト動物、組織、細胞または不死化細胞系などの内在性ＴＳＰＯ遺伝子産物の発現を変えた非ヒト動物、組織、細胞または不死化細胞系についてのこれら化合物の試験を必要とすることは理解されるものと考えられる。
【０１６８】
従って、本発明は、ＴＳＰＯまたはＴＳＰＯ関連遺伝子産物に対する候補化合物の結合の特異性もしくは選択性をスクリーニングする方法も提供する。その方法は、本明細書に記載の本発明の非ヒト動物、組織、細胞もしくは不死化細胞系への候補化合物の投与もしくは曝露の段階、そして試験サンプルにおけるＴＳＰＯまたはＴＳＰＯ関連遺伝子産物に対する候補化合物の結合選択性もしくは特異性を野生型サンプルと比較する段階を含む。
【０１６９】
特に、そして下記の実施例、すなわち実施例１３に関して、本発明者らは、ＴＳＰＯが全身および／または細胞エネルギーハウスホールドの調節において、高脂肪食餌に応答してミトコンドリア酸化的経路、ミトコンドリアＡＴＰ産生およびエネルギー貯蔵の調節において役割を果たすことを明らかにした。具体的には、本発明者らは、長期高脂肪食餌の形でのエネルギー摂取増加によって、野生型動物と比較した場合に、本発明によるＴＳＰＯノックアウト動物における体重増の有意な低下（そして予想より少ない）が生じることを明らかにした。従って、高脂肪食餌によって生じる肥満に対する保護におけるＴＳＰＯおよびＴＳＰＯ介在シグナル伝達についての役割が提供されている。
【０１７０】
下記の実施例、具体的には実施例５（図９）ならびに実施例８（図１５から２１）を参照すると、本発明者らはさらに、本発明の方法に従って、一般式（Ｉ）の化合物が、高度に特異的および選択的ＴＳＰＯ結合性分子であることが確認されたことも示している。当業界で確立されているように、特異的および選択的受容体結合性分子は、受容体機能の強力な阻害剤であり、多くの場合、「薬理的ノックアウト」を発生させる、すなわち受容体機能を効率的に阻害することで、遺伝的ノックアウトによって達成される機能の全身的喪失を反映する表現型が得られるようにするために使用される。
【０１７１】
従って、ある種の非限定的実施形態において、本発明は、ＴＳＰＯ機能を阻害するための下記一般式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【０１７２】
【化１４】
2016516399.tif 000015
式中、
Ｘは、非存在、ヨウ素もしくはそれの同位体であり；
Ｙは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＣＮおよびＣＯＯＨから選択され；
Ｚは、Ｎ（Ｒ３）Ｃ（Ｏ）Ｒ４およびＣ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４から選択され；
Ｒ１およびＲ２は独立に、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、（Ｃ６−Ｃ１２）アリールオキシ、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、複素環、（Ｃ２−Ｃ６）アルカノイルおよび（Ｃ２−Ｃ７）アシルから選択され、それらはそれぞれ、置換されていないかハロゲンもしくはそれの同位体、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良く；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に、水素または（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、複素環、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニルおよび（Ｃ２−Ｃ５）アシルから選択される基であり、それらはそれぞれ、置換されていないか、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良く、
またはＲ３およびＲ４が一体となって、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良い（Ｃ２−Ｃ７）アルキリデンであり；
ｍおよびｎは独立に、０、１または２であり；
ｐは１であり；
各場合で、
（ｉ）アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し；
（ｉｉ）シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し；
（ｉｉｉ）ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
【０１７３】
他の非限定的実施形態において、本発明は、全身および／または細胞エネルギーハウスホールドを変えるための、一般式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【０１７４】
【化１５】
2016516399.tif 000016
式中、
Ｘは、非存在、ヨウ素もしくはそれの同位体であり；
Ｙは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＣＮおよびＣＯＯＨから選択され；
Ｚは、Ｎ（Ｒ３）Ｃ（Ｏ）Ｒ４およびＣ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４から選択され；
Ｒ１およびＲ２は独立に、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、（Ｃ６−Ｃ１２）アリールオキシ、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、複素環、（Ｃ２−Ｃ６）アルカノイルおよび（Ｃ２−Ｃ７）アシルから選択され、それらはそれぞれ、置換されていないかハロゲンもしくはそれの同位体、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良く；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に、水素または（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、複素環、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニルおよび（Ｃ２−Ｃ５）アシルから選択される基であり、それらはそれぞれ、置換されていないか、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良く、
またはＲ３およびＲ４が一体となって、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良い（Ｃ２−Ｃ７）アルキリデンであり；
ｍおよびｎは独立に、０、１または２であり；
ｐは１であり；
各場合で、
（ｉ）アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し；
（ｉｉ）シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し；
（ｉｉｉ）ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
【０１７５】
他の非限定的実施形態において、本発明は、ミトコンドリア酸化的経路を変えるための、一般式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【０１７６】
【化１６】
2016516399.tif 000017
式中、
Ｘは、非存在、ヨウ素もしくはそれの同位体であり；
Ｙは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＣＮおよびＣＯＯＨから選択され；
Ｚは、Ｎ（Ｒ３）Ｃ（Ｏ）Ｒ４およびＣ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４から選択され；
Ｒ１およびＲ２は独立に、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、（Ｃ６−Ｃ１２）アリールオキシ、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、複素環、（Ｃ２−Ｃ６）アルカノイルおよび（Ｃ２−Ｃ７）アシルから選択され、それらはそれぞれ、置換されていないかハロゲンもしくはそれの同位体、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良く；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に、水素または（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、複素環、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニルおよび（Ｃ２−Ｃ５）アシルから選択される基であり、それらはそれぞれ、置換されていないか、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良く、
またはＲ３およびＲ４が一体となって、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良い（Ｃ２−Ｃ７）アルキリデンであり；
ｍおよびｎは独立に、０、１または２であり；
ｐは１であり；
各場合で、
（ｉ）アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し；
（ｉｉ）シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し；
（ｉｉｉ）ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
【０１７７】
さらに別の非限定的実施形態において、本発明は、ミトコンドリアＡＴＰ産生を調節するための、一般式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【０１７８】
【化１７】
2016516399.tif 000018
式中、
Ｘは、非存在、ヨウ素もしくはそれの同位体であり；
Ｙは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＣＮおよびＣＯＯＨから選択され；
Ｚは、Ｎ（Ｒ３）Ｃ（Ｏ）Ｒ４およびＣ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４から選択され；
Ｒ１およびＲ２は独立に、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、（Ｃ６−Ｃ１２）アリールオキシ、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、複素環、（Ｃ２−Ｃ６）アルカノイルおよび（Ｃ２−Ｃ７）アシルから選択され、それらはそれぞれ、置換されていないかハロゲンもしくはそれの同位体、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良く；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に、水素または（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、複素環、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニルおよび（Ｃ２−Ｃ５）アシルから選択される基であり、それらはそれぞれ、置換されていないか、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良く、
またはＲ３およびＲ４が一体となって、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良い（Ｃ２−Ｃ７）アルキリデンであり；
ｍおよびｎは独立に、０、１または２であり；
ｐは１であり；
各場合で、
（ｉ）アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し；
（ｉｉ）シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し；
（ｉｉｉ）ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
【０１７９】
さらに別の非限定的実施形態において、本発明は、ＴＳＰＯ介在シグナル伝達を調節するための、一般式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【０１８０】
【化１８】
2016516399.tif 000019
式中、
Ｘは、非存在、ヨウ素もしくはそれの同位体であり；
Ｙは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＣＮおよびＣＯＯＨから選択され；
Ｚは、Ｎ（Ｒ３）Ｃ（Ｏ）Ｒ４およびＣ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４から選択され；
Ｒ１およびＲ２は独立に、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、（Ｃ６−Ｃ１２）アリールオキシ、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、複素環、（Ｃ２−Ｃ６）アルカノイルおよび（Ｃ２−Ｃ７）アシルから選択され、それらはそれぞれ、置換されていないかハロゲンもしくはそれの同位体、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良く；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に、水素または（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、複素環、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニルおよび（Ｃ２−Ｃ５）アシルから選択される基であり、それらはそれぞれ、置換されていないか、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良く、
またはＲ３およびＲ４が一体となって、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良い（Ｃ２−Ｃ７）アルキリデンであり；
ｍおよびｎは独立に、０、１または２であり；
ｐは１であり；
各場合で、
（ｉ）アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し；
（ｉｉ）シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し；
（ｉｉｉ）ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
【０１８１】
さらに別の非限定的実施形態において、本発明は、ＴＳＰＯ介在エネルギー貯蔵を調節するための、一般式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【０１８２】
【化１９】
2016516399.tif 000020
式中、
Ｘは、非存在、ヨウ素もしくはそれの同位体であり；
Ｙは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＣＮおよびＣＯＯＨから選択され；
Ｚは、Ｎ（Ｒ３）Ｃ（Ｏ）Ｒ４およびＣ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４から選択され；
Ｒ１およびＲ２は独立に、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、（Ｃ６−Ｃ１２）アリールオキシ、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、複素環、（Ｃ２−Ｃ６）アルカノイルおよび（Ｃ２−Ｃ７）アシルから選択され、それらはそれぞれ、置換されていないかハロゲンもしくはそれの同位体、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良く；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に、水素または（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、複素環、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニルおよび（Ｃ２−Ｃ５）アシルから選択される基であり、それらはそれぞれ、置換されていないか、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良く、
またはＲ３およびＲ４が一体となって、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良い（Ｃ２−Ｃ７）アルキリデンであり；
ｍおよびｎは独立に、０、１または２であり；
ｐは１であり；
各場合で、
（ｉ）アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し；
（ｉｉ）シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し；
（ｉｉｉ）ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
【０１８３】
一部の実施形態において、上記の本発明の使用は、肥満に対する保護を提供する。他の実施形態において、上記の本発明の使用は、高脂肪食餌誘発体重増に対する保護を提供する。
【０１８４】
本発明に従って使用される式（Ｉ）の化合物の例には、ＰＢＲ１１１およびＣＬＩＮＤＥなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【０１８５】
上記で示したように、そして実施例８および図２に関して、ＴＳＰＯノックアウトマウスは、ＴＳＰＯ機能の全身的喪失が、ニューロン損傷後の小膠細胞の活性化に対して全く効果を持たない、またはごく小さい効果しか持たないように思われるという驚くべき知見を示している。
【０１８６】
従って、さらに別の非限定的実施形態において、本発明は、神経障害関連の炎症応答を調べるための、一般式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【０１８７】
【化２０】
2016516399.tif 000021
式中、
Ｘは、非存在、ヨウ素もしくはそれの同位体であり；
Ｙは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＣＮおよびＣＯＯＨから選択され；
Ｚは、Ｎ（Ｒ３）Ｃ（Ｏ）Ｒ４およびＣ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４から選択され；
Ｒ１およびＲ２は独立に、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、（Ｃ６−Ｃ１２）アリールオキシ、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、複素環、（Ｃ２−Ｃ６）アルカノイルおよび（Ｃ２−Ｃ７）アシルから選択され、それらはそれぞれ、置換されていないかハロゲンもしくはそれの同位体、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良く；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に、水素または（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ４）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、複素環、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニルおよび（Ｃ２−Ｃ５）アシルから選択される基であり、それらはそれぞれ、置換されていないか、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良く、
またはＲ３およびＲ４が一体となって、ハロゲン、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、ジ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルカノイル、オキソ、アミド、ＣＮ、ＣＮＳ、ＳＣＮ、ＣＮＯ、ＯＣＮおよびＮＨＯＨからなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていても良い（Ｃ２−Ｃ７）アルキリデンであり；
ｍおよびｎは独立に、０、１または２であり；
ｐは１であり；
各場合で、
（ｉ）アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し；
（ｉｉ）シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し；
（ｉｉｉ）ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
【０１８８】
対象者
対象者（被験体）は、ヒトであっても良く、非ヒトであっても良い。対象者または個体についての言及は、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、ネコ、イヌ、霊長類、齧歯類の分類の構成員、特にはヒツジ、ウシ、ウマおよびイヌなどの分類の家畜化された構成員など（これらに限定されるものではない）の社会的、経済的もしくは研究的重要性のある生物種の個体などのヒトまたは非ヒトを意味する。
【０１８９】
広く記載される本発明の精神や範囲から逸脱しない限りにおいて、具体的な実施形態に開示の本発明に多くの変形形態および／または改変を行うことが可能であることは、当業者には明らかであろう。従って、本発明の実施形態は、あらゆる点で、例示的であって限定的ではないものと考えるべきである。
（実施例）
【実施例１】
【０１９０】
TSPOノックアウト動物の開発
材料および方法
構築物のデザインおよびトランスジェニック動物の作製
TSPOノックアウトマウスの開発はOzgene（Bentley DC, WA, Australia）によってなされた。TSPOノックアウトマウスは、Cre-Lox組換え法を用いて作製された。TSPOノックアウトマウスを作製するために、いくつかの付加を有する、野生型TSPOアレルと相同なターゲティング構築物を作製した（図1を参照されたい）。その構築物は、TSPO開始コドンを含むエクソン2および3の両端に一対のLoxP部位を含有し、さらにターゲティング構築物の獲得成功を選別するためのネオマイシンカセット、およびフリッパーゼ認識標的（FRT）部位も含有していた。FRT部位は、後に条件付きノックアウトマウスの作製を可能にするために含められた。ネオマイシンカセットは、構築物の組込みに成功した細胞にネオマイシン耐性を付与する。構築物は、エレクトロポレーションによってBruce4マウス胚性幹（ES）細胞に導入されたが、そうすることで、ターゲティング構築物由来の改変TSPO配列が相同組換えによって野生型TSPO配列を置き換えることができるようにした。G418は真核細胞のポリペプチド合成をブロックする抗生物質であるが、ネオマイシン遺伝子により与えられるG418耐性を用いて、その後、ターゲティング構築物を含有するES細胞を選別することができる。
【０１９１】
選択されたES細胞をアルビノC57BL/6胚盤胞に注入し、キメラの子孫を生じさせる仮親に移植した。キメラマウスを野生型アルビノC57BL/6マウスと交配し、改変TSPO配列についてヘテロである子孫を作製した。アルビノの胚盤胞および繁殖相手のみを使用したので、毛色の黒い子孫はいずれもターゲティング構築物を含有する。改変TSPO配列についてヘテロである毛色の黒いマウスを、その後C57BL/6 Creディリーターマウスと交配し、TSPO遺伝子についてヘテロである子孫を選択した。TSPOおよびCreリコンビナーゼ遺伝子についてヘテロであるこれらのマウスを、野生型C57BL/6マウスとさらに交配し、Creリコンビナーゼ遺伝子を除去した。TSPO遺伝子についてヘテロであって、Creリコンビナーゼ遺伝子を発現しない子孫をその後、相互に交配して、TSPOホモノックアウト、TSPOヘテロノックアウト、およびTSPO野生型動物を作製した。
【０１９２】
すべての動物処置は、シドニー大学動物倫理委員会（the University of Sydney Animal Ethics Committee）、およびオーストラリア原子力科学技術機構（ANSTO）動物愛護倫理委員会（Animal Care and Ethics Committee）の承認を受けた。TSPOホモノックアウトマウス系統は、追加的名称GuwiyangWurra（ダラウォル（Dharawal）の現地語で「ファイアーマウス」）が与えられた。したがって、C57BL/6-TSPOtm1GuMu(GuwiyangWurra)マウスもしくはマウス系統に言及することによって、本発明のTSPOホモノックアウトマウスにも言及することができる。
動物の繁殖
適当な数のTSPOホモノックアウト、TSPOヘテロノックアウト、およびTSPO野生型動物が利用できるように、TSPOノックアウト動物を繁殖させた。TSPOノックアウトマウスの妊孕性を評価するために、TSPOホモノックアウトマウスを、雌雄のTSPOホモおよびヘテロノックアウトマウスと交配した。
【０１９３】
出生後、それぞれの動物の遺伝子型を、糞便gDNA抽出、PCR、およびゲル電気泳動によって決定した。この出生から得られた動物を行動評価のために使用した；行動評価に使用しない動物を用いて、繁殖コロニーを確立し、このコロニーからの子孫を用いて、体重および一般的健康データを作成した。
遺伝子型決定
組織ゲノムDNA単離法
安楽死の後、末端尾部領域からマウス組織サンプルを採取した。末端尾部の約1cmを切り取って、gDNA抽出に使用した。gDNAは、PureLink Genomic DNA Mini Kit (Qiagen)を用いて、メーカーの説明書にしたがって組織サンプルから採取した。簡単に述べると、切り取った尾を滅菌エッペンドルフチューブに入れ、それにPureLink Genomic Digestion Buffer 180μlおよびプロテイナーゼK 20μlを添加した。チューブを短時間ボルテックスし、溶解が完了するまでときどきボルテックスしながら55℃でインキュベートしたが、典型的にはこれに約3-4時間を要した。完全に溶解した後、溶解物を室温にて10000 gで3分間遠心した。上清を新しいエッペンドルフチューブに移し、それにリボヌクレアーゼA 20μlを添加した。その後、これを短時間ボルテックス撹拌により混合し、室温にて2分間インキュベートしておいた。
【０１９４】
インキュベーション後、溶解物にPureLink Genomic Lysis/Binding Buffer 200μl、および96%エタノール200μlを添加し、5秒間ボルテックスした。全溶解物をPureLink Spin Columnにより200μlずつ、室温にて1分間10000 gで遠心した。そのスピンカラムを、500μlのWash Buffer 1および500μlのWash Buffer 2で洗浄し、それぞれ1分間および3分間、室温にて10000 gで遠心した。それぞれの洗浄後、採取チューブを廃棄し、新しいものを使用した。gDNAを溶出するために、PureLink Genomic Elution Buffer 100μlをスピンカラムに添加し、そのスピンカラムを滅菌微小遠心管に入れて、室温で1分インキュベーションした後、室温にて10000 gで遠心した。溶出されたgDNAは、必要となるまで-20℃で保存した。
【０１９５】
gDNAの濃度は、Nanodrop 2000c分光光度計を用いて分光学的に測定した。
ゲノムDNAを用いたサザンブロット分析
マウス尾部生検材料から単離されたゲノムDNAを用いて、サザンブロット分析によって動物の遺伝子型を決定したが、DNAはScaIで消化され、プローブとハイブリダイズして、野生型アレルについて8.8 kb断片、ならびにノックアウトアレルについて4.2 kb断片を生じた。
糞便サンプルゲノムDNA単離
1匹のマウスを清潔な動物飼育箱の中に入れることによって糞便サンプルを採取し、典型的には、糞便サンプルは30秒以内に得られた。糞便サンプルはすぐに使用するか、または液体窒素中で急速凍結して、必要になるまで-80℃で保存した。gDNAはQIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen)を用いて、メーカーの説明書にしたがって糞便サンプルから採取した。簡単に述べると、糞便サンプルは、ボルテックス撹拌によってホモジナイズし、1 mlピペットを用いてASLバッファー1.6 ml中で粉砕した。その後サンプルを室温にて10000 gで1分間遠心し、上清を新たなチューブに移し、それにInhibitEXタブレットを添加した。InhibitEXタブレットは、溶解するまでボルテックス撹拌し、室温で少なくとも1分間インキュベートしておいた。インキュベーション後、サンプルを室温にて10000 gで3分間遠心し、各サンプルの上清を新たなチューブに移して、再度フルスピードで、もう3分間遠心した。遠心後、上清600μlをピペットで取り、プロテイナーゼK 25μlおよびALバッファー600μlを入れた新たなチューブに入れて、これを15秒のボルテックス撹拌により混合した。次に混合物を70℃にて10分間インキュベートした。
【０１９６】
DNAを沈殿させるために、エタノール600μlを混合物に加え、短時間ボルテックスして混合した。gDNAは、室温にて10000 gで1分間の遠心によってスピンカラムで採取し、AW1バッファー500μl、およびAW2バッファー500μlで洗浄して、それぞれ1分間および3分間、室温にて10000 gで遠心した。gDNAを溶出するために、AEバッファーを直接スピンカラムメンブレン上に移し、少なくとも1分間インキュベートして、フルスピードで1分間遠心した。使用するAEバッファーの量は、最初の糞便サンプルのサイズに応じて変動した。溶出されたgDNAは必要となるまで-20℃で保存した。gDNAの濃度は、Nanodrop 2000c分光光度計を用いて分光学的に測定した。その後、単離されたgDNAについてPCRを実施して、TSPO遺伝子の存在を判定した。
ポリメラーゼ連鎖反応
通常の遺伝子型決定のために、TSPOノックアウトマウスの異なる遺伝子型を区別するようデザインされた1セットの3つのプライマーを用いて、単離されたgDNAについてPCRを実施した。そのプライマーセットは、1つのフォワードプライマー（FP）および2つのリバースプライマー（RP1およびRP2）からなり（図1を参照されたい）、野生型およびノックアウトアレルはそれぞれ、2つ、および1つの、特有のPCR産物サイズを生じる。このことは、標準的なゲル電気泳動および紫外線下での観測によって動物の遺伝子型を決定する、簡単で効率的な方法を可能にする。予想されるPCR産物バンドサイズは、野生型アレルについては489および1501塩基対であり、ノックアウトアレルについては約246塩基対である。図2は、プライマーデザインおよび予想されるゲルイメージの概略図を示す。このデザインの原理は、ノックアウトアレルを示すものとして不検出を回避したので、TSPOノックアウトアレルの存在を、DNA抽出時もしくはPCR設定時の能力不足や誤操作と混同しないという利点をもたらし、遺伝子型決定時の全体の精度を高めている。遺伝子型決定に使用されたプライマーについては表1を参照されたい。
【０１９７】
【表１】
2016516399.tif 000022
PCRは最終容量25μlで実施されたが、これはGreen GoTaq Reaction Buffer (Promega) 5μl、MgCL2 (Promega) 1.5μl、PCR Nucleotide Mix (Promega) 0.5μl、フォワードプライマー 0.625μl、リバース1プライマー 0.3125μl、リバース2プライマー 0.625μl、GoTaq(r) Hot Start Polymerase (Promega) 0.125μl、およびヌクレアーゼを含まないH2Oで16.3125μlに希釈されたgDNA 約200 ngからなる。PCRは、T100 Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を用いて実施された。PCR増幅実行サイクル条件は、95℃ 2分間；95℃ 30秒間、68℃ 30秒間、および72℃ 2分間を4サイクル；続いて95℃ 30秒間、65℃ 30秒間、および72℃ 2分間を4サイクル；続いて95℃ 30秒間、62℃ 30秒間、および72℃ 2分間を30サイクル；次に72℃ 5分間；そしてその後4℃に保持するよう設定された。PCR反応産物は必要となるまで4℃で保存した。
【０１９８】
増幅産物を観察するために、1%アガロースキャストをGelRed（Biotium）およびTAEバッファー（40 mM Tris、20 mM酢酸、および1mM EDTA、pH 8)とともに使用して、各PCRをゲル電気泳動で分析した。GoTaq反応バッファーは色素を含有しており、PCRを直接ゲル上にロードすることができる。全部で10μlの各PCRを100bp DNA Step Ladder (Promega)と共にゲル上にロードした。ゲルは45分間80 Vで泳動し、その後Gel Doc XR+ (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ゲルイメージングシステムで紫外線を当てて観測した。
結果
記載の繁殖戦略は、TSPOホモノックアウト、TSPOヘテロノックアウト、またはTSPO野生型動物のいずれかである子孫を生み出すことが可能であり、これらの遺伝子型はいずれもサザンブロット分析および/またはPCRによって明確に決定することができた。はじめに、初代動物をサザンブロット分析で評価したが、図3(a)は、子孫選択のゲノムDNAがTSPOエクソン4に向けられたプローブで検出されることを示す（アニーリング部位については図1を参照されたい）。レーン2（DO44）に8.8 kbおよび4.2 kbの産物が存在することは、ヘテロを示しているが、DO45（レーン3）はTSPOホモノックアウトマウスであり、DO47（レーン7）は野生型マウスである。
【０１９９】
図3(b)は、フォワードおよびリバースプライマーを用いたPCRで遺伝子型を決定されたマウスの結果を示す。確認された野生型マウス（レーン2および5）のPCR遺伝子型決定は、結果としてただ1つの489 bp PCR産物をもたらしたが、ホモTSPOノックアウトマウスのPCR遺伝子型決定は、結果としてただ1つの246 bp PCR産物をもたらした。TSPO野生型アレルに関してヘテロであるマウスは、両方のPCR産物を示した。こうした結果は図2で予測された通りであった。
【実施例２】
【０２００】
放射性リガンド膜結合
材料および方法
膜の調製
T25 デジタルUltra-Turraxホモジナイザー(Ika, Wilmington, NC, USA)を用いて、氷冷Trisバッファー（pH 7.4）約45 ml中で、速度設定値5、または20000 prmにおいて、組織サンプルをホモジナイズし、48000 gの遠心により収集した後、上清を捨てた。次いで、その手順をただちに繰り返したが、これは追加の洗浄ステップとして機能し、放射性リガンド結合に対するいかなる可溶性妨害物質も除去する（Byland et al. 1993）。2回目の遠心および上清除去後、サンプルを約50容の氷冷Trisバッファー(pH 7.4)中に再懸濁した。サンプルを分割し、必要になるまで-80℃で保存した。
タンパク質濃度測定
ビシンコニン酸（BCA）タンパク質アッセイキット（Thermo Fisher Scientific, Scoresby, VIC, Australia）を用いて、メーカーの使用説明書にしたがってタンパク質濃度を測定した。手短に述べると、BCA試薬AおよびBCA試薬Bを50:1（BCA試薬A:B）の割合で混ぜ合わせて、BCA作用試薬を作製し、Trisバッファーで希釈したタンパク質サンプルを、BCA作用試薬に20:1（作用試薬：タンパク質）の割合で添加した。次にサンプルを37℃にて30分間インキュベートし、分光光度計で562 nmにおいて測定した。キットと共に提供されるウシ血清アルブミン標準物質を用いて検量線を作製した。
飽和結合
TSPOノックアウトマウス研究のために、3H- PK11195ラセミ化合物を広範な濃度にわたって使用して、放射性リガンド結合を行った（図4）。PK11195はTSPO特異的プローブである。全結合および非特異的結合は、0.56 nMから20 nMまでの8つの濃度の3H-PK11195を用いて測定した。非特異的結合は、すべての濃度の3H-PK11195に5μM PK11195を添加することによって測定した。
【０２０１】
放射性リガンド結合の一般的プロトコルは、全結合用に3H-PK11195を調製すること、非特異的結合用にPK11195を加えた3H-PK11195を調製すること、ならびに凍結融解してホモジナイズしたタンパク質を添加することを含む。3H-PK11195、PK11195およびタンパク質サンプルをホウケイ酸ガラスチューブに加えたが、必要に応じて、タンパク質サンプルはTrisバッファー（pH 7.4）で希釈した。各チューブにタンパク質60μgを入れ、最終的な反応混合物は400μlとした。全結合および非特異的結合のいずれにおいても、放射性リガンドの各濃度は3連で行った。
【０２０２】
タンパク質結合3H-PK11195サンプルは、氷上で90分間インキュベートした後、0.5% ポリエチレンイミン溶液にあらかじめ浸漬したガラス繊維Whatman GF/Cフィルター（Crown Scientific, Minto, NSW, Australia）で急速濾過して回収した。氷冷Trisバッファー（pH 7.4）10 mlですべてのチューブを同時に洗浄することによって、回収を行った。フィルターを集め、液体シンチレーション計数に使用されるPony Vialに、Ultima Gold液体シンチレーションカクテル（Perkin Elmer, Waltham, MA, USA）2 mlとともに入れた。Tri-Carb 2100TR Liquid Scintillation Counter（Perkin Elmer, Waltham, MA, USA）を用いて放射能量を測定する前に、バイアルは室温で少なくとも12時間放置したが、これは液体シンチラント中への放射能の十分な拡散を可能にするために行われた（Bylund et al., 1993）。
【０２０３】
BmaxおよびKd値を求めるために、実験で得られた値に直線を当てはめることによって、3H-PK11195の4つの最高濃度で非特異的結合を推定した。全結合および非特異的結合を当てはめることにより、Windows(登録商標)用 GraphPad Prismバージョン5.04(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)を用いた非線形回帰によって、BmaxおよびKd値を決めた。
結果
野生型、TSPOヘテロ、およびTSPOホモマウス由来の腎組織の分析を図4に示す。野生型マウスは、最高のTSPO発現を示し、TSPOヘテロマウスがそれに次いだ。TSPOノックアウトマウスは、TSPO選択的プローブPK11195の結合を示さない。
【実施例３】
【０２０４】
オートラジオグラフィーによる組織のTSPOレベルの分析
材料および方法
急速凍結した組織は、クリオスタットで20μmの切片に切り、融解してポリL-リジンコートスライドグラス上に載せ、実験日まで-80℃で保存した。実験当日に、スライドグラスを室温で解凍し、冷気流で風乾した。全結合および非特異的結合は、130 mM TRIS-HClバッファー（pH 7.4）中で室温にて20分間、3μM PK11195の存在あり、またはなしで、1 nM 3H- PK11195とともにインキュベートすることによって測定した。インキュベート後、室温にて、スライドグラスを130 mM TRIS-HClバッファー中に2回、短時間浸し、新たな130 mM TRIS-HClで2回5分間洗浄した。最後にスライドグラスを冷却した蒸留水で短時間3回すすぎ、冷気流下で乾燥し、一晩風乾しておいた。X線フィルムカセット内で、既知の放射能濃度を有するトリチウム微量スケールとともに、切片をKodak BioMax MRフィルムに暴露した。フィルムは33日後に現像し、GS800 Calibrated Densitometer (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を用いてデジタル処理した；3H-PK11195結合レベルを評価するために、対象となる領域を組織上に描き、平均黒化濃度/mm2を算出した。個々のフィルムから得られたデータは、フィルム間のばらつきに左右されるので、トリチウム微小スケールの黒化濃度を用いて、他のフィルムに対して標準化した。
結果
フィルムオートラジオグラフィーに使用される、脳、網膜、心臓、腎臓、および精巣などの臓器は、野生型(TSPO+/+)、ヘテロ(TSPO+/-)、およびホモ(TSPO-/-)マウスから切除され、液体窒素中で急速凍結された。18μmのクリオスタット臓器切片をスーパーフロストスライドグラス（Menzel-Glaser, Braunschweig, Germany）上に載せ、暗下で-20℃にて、実験前に長くても1週間ほど保存した。フィルムオートラジオグラフィーは、3.14 TBq.mmol-1の比放射能を有するR-[N-メチル-3H] PK11195エタノール溶液（PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, U.S.A.）を用いて行った。トリチウム標準物質（Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden）は、それぞれのHyperfilm-3H（Kodak Film）上で4℃にて60日間、臓器切片とともに暴露されるが、その標準物質を用いて、オートラジオグラフィーにより測定される結合を定量化した。Kodak GBX現像液および定着液(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, U.S.A.)を用いて、このHyperfilmを現像した。Hyperfilmを一晩風乾した後、ArtixScan 1800fフラットベッドスキャナ（Microtek, Hsinchu, Taiwan）を用いてスキャンしたが、グレースケールは400%の倍率を使用し、光学的分解能は2400ピクセル/インチであった。プレスキャン操作もフィルターも利用しなかった。
【０２０５】
図5はオートラジオグラフィーの結果を示す。左側の画像は全結合（特異的および非特異的（NS））であり、右側の画像は非特異的結合である。暗いエリアほどPK1195結合が高い（すなわちTSPO密度が高い）ことを表す。右側の棒グラフは、左の画像に対応している。それは、すべての臓器で野生型(TSPO+/+)マウスのTSPO発現が最高であり、その次がヘテロ(TSPO+/-)マウスであるが、ホモ(TSPO-/-)マウスではTSPO発現がほとんどないことを示す。グラフに示す値は、バックグラウンドを差し引いて、次に非特異的結合（NS）を差し引いた後に得られる。選択されたバックグラウンドは、臓器スライスの外側の領域である。
【実施例４】
【０２０６】
オートラジオグラフィーによる脳組織の誘導性TSPOレベルの分析
材料および方法
顔面神経軸索切断の処置は、シドニー大学の動物倫理委員会によって承認された。イソフルラン麻酔を用いて動物を麻酔した。動物は、処置の間、麻酔の深さを確認するためにさまざまなモニタリング装置を用いて、呼吸、心拍数、酸素飽和度、および体温の組み合わせについてモニターした。足蹠または足底反射をもはや引き起こすことができなくなったら、手術プロセスを開始した。首の同側（右側）の毛を耳から下方に向かって剃り、皮膚を70%エタノールで清潔にした。茎乳突孔を覆う筋肉組織の上の位置に、小さな切開（0.5-0.7 cmの長さ）を行った。顔面神経を特定して分離し、完全に横に切断した。切開した皮膚は医療用接着剤で閉鎖した。同側のひげの動きは術後に消失し、顔面神経軸索切断の成功を示した。動物は、軸索切断の3日後にCO2により安楽死させ、脳幹および小脳の顔面神経核を含めた脳組織をただちに切除し、液体窒素中で急速凍結した後、凍結切片を作製するまで-80℃の冷凍庫で保存した。R-[N-メチル-3H] PK11195を用いたフィルムオートラジオグラフィーによって、TSPO発現レベルが明らかになった。
結果
顔面神経核の神経炎症は、片側の顔面神経軸索切断によって引き起こされた。切除された脳組織のフィルムオートラジオグラフィーを図6に示す。顔面神経軸索切断は、野生型マウスの同側の顔面神経核において高レベルのTSPO発現を引き起こした（左の画像の右側にある赤い円）。ヘテロマウスではもっと低いTSPO発現が観察された（中央の画像の右側にある円）が、ホモノックアウトマウスではTSPOは検出されなかった（右の画像の右側にある円）。TSPO発現レベルは野生型およびヘテロの軸索切断の対側でも増加したが、ホモマウスでは増加しなかったことに注目すべきである（各画像の左側にある円）。
【０２０７】
小脳では、野生型マウスのTSPO発現レベルが高かった。ホモマウスでは、PK11195結合の強度は周囲のバックグラウンドと同じであったので、TSPO発現は検出されなかった（図6、右の画像）。ヘテロマウスのTSPO発現レベル（図6、中央の画像）は、野生型とホモマウス（図6、左の画像）で観察されたレベルの間であった。
【０２０８】
齧歯類における顔面神経軸索切断パラダイムのような実験モデルは、さまざまなタイプの負荷に対するニューロンおよびその微小環境の反応をシステマティックに詳細に研究することを可能にする。よく研究された実験例は、軸索切断と組み合わせて、末梢神経損傷、神経毒の逆行性軸索輸送、および実験的に自己免疫性脳脊髄炎を引き起こした後の局所的に強まる炎症などを含む。これらの研究は、運動ニューロンの再生プログラム、ミクログリアおよびアストロサイトのシナプス可塑性における役割、ならびにグリア細胞の生物学に関する新たな見識をもたらした。得られた知見の多くが、他の機能的システムに有効であり、種の壁を越えても有効であると判明したことが重要である。なかでも、主要組織適合遺伝子複合体分子のミクログリア発現は、さまざまなタイプの神経損傷に応じて生じることが判明したので、現在「グリア炎症」の特徴的な構成要素とみなされている。
【０２０９】
重要なのは、顔面神経の末梢神経損傷が、通常は一側性に、損傷した顔面神経核においてTSPOのde novo発現を誘導するが、高齢の動物では損傷した両方の顔面神経核において両側性にその発現を誘導することである。パーキンソン病およびアルツハイマー病を含めて多数の神経変性疾患に関してそれが判明している。ミクログリアが、再生する運動ニューロンの表面膜から求心性軸索終末を剥離し、続いてそれらを排除すること（「シナプス・ストリッピング（synaptic stripping）」）、ならびにアストロサイトによる長期にわたる遮断が、ヒトにおいても確認された。これらの知見の医学的意味は重大である。また、ラットおよびマウスの顔面神経系は、神経栄養因子を評価するための、もっともよく研究され、もっとも広く利用されるテストシステムとなった。
【実施例５】
【０２１０】
陽電子放出断層撮影（PET）によるin vivoイメージングおよびコンピューター断層撮影（CT）による解剖学的情報
材料および方法
小動物用Inveon PET/CTスキャナー（Siemens, Knoxville, TN, USA）を用いて、試験マウスのPETスキャンを行った。スキャンする前に、マウスは、5% (v/v) イソフルランで麻酔し、PET/CTスキャナー内に配置した。イソフルランレベルは、それ以後1-2%に維持した。体温は、フィードバック制御された加温パッドで維持し、スキャンする全期間にわたって、生理学的パラメーター（呼吸および体温）をモニターした(BioVet; m2m Imaging Corp.)。マウスが麻酔されている間、マウスの目に、乾燥を防ぐためにLacri-lube（Allergan）を入れた。PETスキャンは、[18F]PBR111 (8-18 MBq/100μL、0.2nmol)の尾静脈注射と同時に開始した。40分のイメージング後、臓器における非特異的蓄積を測定するためにPBR111（1 mg/kg、2%酢酸-生理食塩水中)を尾静脈から注射して、さらに10分間イメージングした。PETスキャンが完了したら、解剖学的情報を求めてマウスを10分間CTスキャンした。実験が終了した時点で、イメージング直後に、動物がまだ完全に麻酔されている間に、頸椎脱臼によりマウスを安楽死させた。
結果
PBR111は、TSPOタンパク質に結合するリガンドである。図7は、左側の画像が野生型マウス（TSPO+/+）で記録された高密度の放射性トレーサー（[18F]-PBR111）を示すのに対して、右側のTSPOノックアウト（ホモ型、TSPO-/-）マウスマウスでは放射性トレーサーがまったく観察されなかったことを示す。注目すべき領域は、丸で囲んだ中に示される副腎であったが、それは副腎が野生型マウスでは最大のTSPO発現レベルを示すからである。腎臓は副腎の下に見ることができる。
【０２１１】
図9は、副腎、心臓、腎臓および肝臓における、0分に放射性トレーサーを注射した後の取り込みと40分時点でのPBR111による置き換えの経時変化を表す。野生型マウス（TSPO+/+）の副腎、腎臓、および肝臓における放射性トレーサーの取り込みは、ゆっくりと増加するが、放射性トレーサー[18F]PBR111と拮抗するリガンドPBR111を適用するまでピークレベルを維持する。しかしながら、TSPOノックアウトマウス（TSPO -/-）の副腎、腎臓、肝臓、および心臓での放射性トレーサーの取り込みは、急速にピークに達した後、非特異的レベル（すなわちPBR111後の値）まで低下する。野生型マウスの心臓における放射性トレーサー取り込みのパターンは、ノックアウトマウスと類似するが、低下はもっとずっとゆっくりである。
【実施例６】
【０２１２】
動物の健康評価
材料および方法
動物の感覚および反射検査
マウスの神経反射を月齢5ヶ月で調べた。反射は、次の順序で1回調べた：正向、角膜、耳介、洞毛、リーチング、および背地走性反射。反射の存在は次のように判定した：
正向反射：動物を背位に置き、腹部を下にした姿勢を回復する兆候を記録した。
角膜反射：綿棒を用いて目の領域を軽く刺激し、まばたき行動の兆候を記録した。
耳介反射：綿棒を用いて耳道を軽く刺激し、耳を引っ込める、および頭部を動かす兆候を記録した。
洞毛反射：綿棒を用いて洞毛を刺激し、頭部の動き、ひげの可動性、およびまばたき行動を記録した。
リーチング反射：動物を尾の付け根で、ゆっくりとテーブルの表面に向かって降ろし、前肢および後肢を伸ばすことを記録した。
背地走性反射：動物を、斜面上に頭部を下にしておき、上り坂にむかって向き直る傾向を記録した。
【０２１３】
反射に加えて、視力および聴力も調べた。視力は、リーチング反射試験の時に前足の到達によって評価したが、視力の評価は、リーチング反射が前肢および後肢両方の伸展を含む動物全体の姿勢を評価するのに対して、視力は前足による能動的な到達に関わるという点で、リーチング反射とは異なる。聴力は、動物の後ろで指をパチンと鳴らして、聴覚性驚愕または凍結挙動の存在を調べることにより評価した。
結果
結果を下記の表2にまとめて示す。TSPOノックアウトについてホモ型であるマウスはすべて、正常であるとみられた。
【０２１４】
【表２】
2016516399.tif 000023
【実施例７】
【０２１５】
不安関連行動に関する行動評価
材料および方法
不安関連行動の行動テストは、3-4月齢のマウスで実施したが、行動評価に関わるすべてのマウスは、行動実験中のハンドリングストレスの影響を減らすように、離乳後、頻繁にハンドリングした。不安関連行動は、行動テストバッテリーで調べたが、それは次の順序で行った：オープンフィールドテスト、エマージェンス（emergence）テスト、明暗選択テスト、および高架式十字迷路。すべての行動テストは、薄暗い室内で12:30 p.m.から6:30 p.m.までの間に行った。マウスは、実験環境に十分馴化することができるように、テストする少なくとも60分前に、ホームケージ内の一集団として実験室に運ばれた。すべての動物にわたって一貫した行動実験の経験を確保するために、動物は、ケージ内の全動物がテスト終了した時点で、即座にその動物のケージおよび飼育室に戻された。それぞれのテストの開始に先立って、尿および糞をすべて取り除き、その場所を80%エタノールで十分に清掃にし、次のテストが始まる前に乾燥させた。訓練履歴の影響を減らすために、行動テストは、少なくとも7日の間隔を置いて行った。
【０２１６】
すべての行動実験は、オーバーヘッドカメラでDVDに記録し、その後Motman Tracker 4.5ソフトウェア（Motion Mensura, Cooks Hill, NSW, Australia）を用いて解析した。Motman Trackerは、リアルタイムでの、そして記録されたビデオからの、運動の空間的および時間的な追跡を可能にして、それによって、関心領域の計算を含めて、さらに分析することができた。
オープンフィールドテスト
オープンフィールドテストは、一般自発運動活動性ならびに不安関連行動を査定した。テストは、障壁も物体もない、四方の壁で囲まれたオープンな正方形のアリーナで構成された。アリーナは44 cm×44 cmの大きさで、壁の高さは26 cmであり、アリーナの土台および壁はいずれも、うすく赤色がかったアクリル樹脂製であった。オープンフィールドテストの間、動物はアリーナの縁に沿って探索する傾向があり、より無防備となる中央部に滞在することはまれであった。アリーナの中央部を横切る時間および回数の総計を不安の指標として用いた。
【０２１７】
実験中、アリーナは、無影照明システムを用いて、赤い照明で均一に照らされた。アリーナの明るさは、Testo 545ルクスメーター（Testo, Croydon South, VIC, Australia）によって約28ルクスと測定された。マウスをアリーナの中心に置き、15分間自由に探索させた。アリーナの中央部を横切る時間および回数、総移動距離、活動時間、および排糞数を評価した。
エマージェンステスト
エマージェンステストは、オープンフィールドテストと類似して、同様の原理を利用しており、テストは、小さな隠れ箱を追加したオープンアリーナで実施された。隠れ箱から動物が「出てくる」ときに、テストは探索行動、不安および活動レベルを評価する。アリーナは44 cm×44 cmの大きさで、壁の高さは26 cmであった。隠れ箱は13×13 cmの大きさで高さ8.5 cmであり、隠れ箱の開口部はアーチ型で4×4 cmの大きさで、動物が実験中に隠れ箱の上に飛び乗らないように、透明なアクリル板が隠れ箱の上部に取り付けられた。隠れ箱はアリーナの一辺の中央に沿って置かれ、入り口はアリーナの中央に向かって面していた。アリーナおよび隠れ箱は、隠れ箱の上の透明アクリル板を除いて、赤いアクリル樹脂製であった。
【０２１８】
実験中、アリーナは、無影照明システムを用いて、赤い照明で均一に照らされた。アリーナおよび隠れ箱の明るさは、Testo 545ルクスメーター（Testo, VIC, Australia）によってそれぞれ約28および19ルクスと測定された。動物は、隠れ箱の開口部に向かってアリーナの中心に置き、15分間自由に探索させた。隠れ箱に入っている時間および回数、総移動距離、活動時間、および排糞数を評価した。
明暗選択テスト
明暗選択テストは、齧歯類が明るい光および新奇な環境をややストレスが多いと感じているという観察を利用した。このテストはオープンフィールドテストと同じアリーナを使用したが、そのアリーナを暗い区画と明るい区画に分けた。暗い区画は、開口部のある大きな箱を、通路を作るように縁に沿って追加することにより作製された。アリーナは44 cm×44 cmの大きさで、壁の高さは26 cmであった。暗区画の箱は、22 cm×43.5 cmの大きさで高さは26 cmであり、区画箱の開口部はアーチ型で4×4 cmの大きさであった。アリーナおよび暗区画箱はいずれも赤いアクリル樹脂製であった。
【０２１９】
テスト中、アリーナは無影照明システムを用いて、白い照明で均一に照らされ、明区画および暗区画の明るさは、Testo 545ルクスメーター（Testo, Croydon South, VIC, Australia）によってそれぞれ約16および3ルクスと測定された。マウスは、暗区画への開口部に向かって明区画に置き、その後マウスは15分間自由に探索させた。それぞれの区画に入っている時間および回数、総移動距離、活動時間、および排糞数を評価した。
高架式十字迷路
高架式十字迷路は、不安関連行動のためのテストであり、危険評価行動も検出することができる。それは、齧歯類が開けた空間を避けて閉ざされた空間にとどまる傾向があるという観察に基づいており、その理由はおそらく、より安全な環境と感じるからであろう。高架式十字迷路は、中央の台に連結された等間隔の4本の長いプラットフォームもしくはアームから構成され、それらは十字の形を形成した。アームは、オープンな、取り囲む壁のない状態と、閉ざされた、壁がアームを取り囲んでいる状態が交互になっている。アームは23 cmの高さに引き上げられ、長さ28 cm、幅6 cmであって、閉ざされたアームの壁は、高さ20 cmであった。高架式十字迷路は、赤色がかったアクリル樹脂、およびアームの上に置かれた白い十字型の取り外し可能な木製のプラットフォームで構成された。
【０２２０】
テスト中、迷路は標準的なオーバーヘッド蛍光照明で照らされ、その明るさは、Testo 545ルクスメーター（Testo, Croydon South, VIC, Australia）を用いた測定で、壁のあるアームで約100ルクス、壁のないアームで350ルクスと測定された。マウスを壁のないアームに向けて置き、15分間自由に探索させた。壁のないアームに入っている時間および回数、危険評価行動を取る時間および回数、総移動距離、活動時間、および排糞数を評価した。危険評価行動は、動物の頭の向きが壁のないアームの方向を向き、体の15%より多くが壁のないアームの中にあるが重心は壁のあるアームもしくは中央のプラットフォームの中に維持していると定義された。
ロータロッドテスト
ロータロッドは、運動の協調性および平衡能を評価するために広く使用されているテストである。一定のスピードで、または速度を上げながら、回転するロッドの上にマウスを載せ、ロッドから落ちる待ち時間を、運動の協調性および平衡能の指標として用いた。TSPOノックアウトマウスは、約5ヶ月齢の時に、European Mouse Phenotyping Resource of Standardised Screensガイドラインにしたがって、IITCシリーズ8 Rotarod (IITC Life Science, Woodland Hills, CA, USA)の上でテストした。手短に述べると、動物を実験室に運び、テストする前に15分間馴化させた。ロータロッドテストは、訓練セッションおよび実験セッションからなる。訓練セッションは、10分間の休憩間隔をおいた3回のトライアルからなり、実験セッションは15分間の休憩間隔をおいた4回のトライアルからなる。訓練および実験セッションの間には30分の休憩間隔をおいた。ロッドの回転方向は、動物が実験者に背を向けるように設定した。ロータロッドは各段階の開始時に、70%エタノールで清掃して乾燥させた。
【０２２１】
訓練段階は、ロッドを一定速度に保って各回60秒続く3回のトライアルで構成された。ロッドは最初のトライアルでは0 rpm、2回目と3回目については4 rpmに保持された。動物が3回目の訓練トライアルの間、60秒間フルにロッド上にとどまることができたならば、その動物は30分の休憩時間に続いて、実験段階に進んだ。動物が3回目の訓練トライアルの間に落ちたならば、その時は、追加の訓練トライアル（60秒で4 rpm）を行い、動物は成績にかかわらず標準の30分の休憩時間に続いて実験段階に進んだ。実験段階は、各回、4 rpmから40 rpmまで加速するロッドにより300分間続く、4回の同一のトライアルで構成された。最後の実験トライアル後、動物をケージに戻し、飼育室へと戻した。
結果
不安障害の行動評価の結果を図10から14に示す。野生型とTSPOホモノックアウトの間で明確な相違は報告されず、観察もされなかった。一般的健康状態、繁殖、離乳、成長、活動性の観察結果、遺伝子型の遺伝的分布、および雌雄比の分布は、野生型の対応するものと同じであった。さらに、正向、角膜、耳介、洞毛、リーチング、および背地走性反射の検査を含む神経学的検査では、TSPOノックアウトマウスにおいて、明白な欠点は見られなかった。それに加えて、聴力および視力は外見上正常である。一般的活動性レベル、毛づくろい、毛の状態、社会的活動、および食物/水の消費などの基本的な行動に関する詳細な検査は、すべて、TSPOノックアウトマウスにおいて正常であった。
【０２２２】
（実施例８〜１３）
下記の例に記載の実施例8から13に関連して、例示された実験に適切な材料および方法を記載する具体的なセクションがここに与えられる。しかしながら、当業者には当然のことであるが、対応するデータを得るために、他の同等な方法を行うことができる。
（実施例８〜１３）
材料および方法
TSPO-/-マウスの作製
TSPOノックアウトマウスは、エクソン2および3に隣接するloxP部位、およびエクソン3と4の間に挿入されたネオマイシンカセットを含有するターゲティング構築物を用いて作製した。ターゲティング構築物は、C57BL/6 Bruce4胚性幹（ES）細胞にエレクトロポレーションで導入され、相同組換えにより正しく標的化された細胞をアルビノC57BL/6胚盤胞に注入した。雄キメラを雌アルビノC57BL/6マウスと交配し、その結果得られた毛色の黒い子孫を、標的化されたTSPOアレルの存在で選別した。
【０２２３】
標的化アレルの存在が陽性であるマウスは、C57BL/6 Creディリーターマウスと交雑させて、ネオマイシンカセットおよびエクソン2および3を除去し、ヘテロ型グローバルTSPO欠損マウスを作製した。Creトランスジーンを除去するために、動物を野生型C57BL/6と交配した。
【０２２４】
実験用の動物を作製するために、ヘテロ型動物を交雑して野生型の同腹仔コントロールを作製した。すべての動物処置は、シドニー大学動物倫理委員会（the University of Sydney Animal Ethics Committee）、およびオーストラリア原子力科学技術機構（ANSTO）動物愛護倫理委員会（Animal Care and Ethics Committee）の承認を受けた。TSPO-/-マウス系統は、追加的名称GuwiyangWurra（ダラウォル（Dharawal）の現地語で「ファイアーマウス」）が与えられた。したがって、その後の名称はC57BL/6-TSPOtm1GuMu(GuwiyangWurra)となる。
【０２２５】
マウスは、尾の生体組織から単離されたゲノムDNAを用いてサザンブロット分析により遺伝子型を決定した。通常の遺伝子型決定のために、尾の生体組織、耳の生体組織、または糞便サンプルからゲノムDNAを単離し、プライマーP1 (5’-GGTAGACTAGTGTGGGAAGATTTGA)、P2 (5’-ATGGTGATTGCAACTGATGTTC)、およびP3 (5’-TAGATACTGACCCTATCTGGGATGT)を用いてPCRで増幅して、野生型アレルについて489 bp産物、およびノックアウトアレルについて246 bp産物を生じた。PCRは、95℃ 2分間；続いて95℃ 30秒間、68℃ 30秒間、および72℃ 2分間を4サイクル；その後95℃ 30秒間、65℃ 30秒間、および72℃ 2分間を4サイクル；次に95℃ 30秒間、62℃ 30秒間、および72℃ 2分間を30サイクル；そして72℃ 5分間の最終ステップで構成された。
【０２２６】
イムノブロッティング
溶解物（20μgタンパク質）をLaemmliサンプルバッファー（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）と混合し、10分間70℃に加熱して、4-20% Mini-PROTEAN TGXゲル（Bio-Rad）上で分離した。タンパク質は、Trans-Blot Turboトランスファーシステム（Bio-Rad）を用いてニトロセルロース膜に転写した。膜を、1:10000に希釈した抗TSPO抗体（#109497, Abcam, Cambridge, UK）または1:1000に希釈した抗GAPDH（#37168, Abcam）、および1:10000に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体（#A0545, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA）とともにインキュベートした。Pierce ECL Western Blotting Substrate (Thermo Scientific, Scoresby, VIC, Australia)を使用し、膜はImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare, Rydalmere, NSW, Australia)を用いて可視化した。
【０２２７】
RNA抽出、cDNA合成、および定量的リアルタイムPCR
組織サンプルはTRIzol (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)中でホモジナイズし、メーカーの使用説明書にしたがってPureLink RNAミニキット（Life Technologies）をオンカラムDNase処理とともに使用してトータルRNAを単離した。SuperScript III First-Strand Synthesisキット（Life Technologies）を用いて、精製RNA（1μg）をcDNAに逆転写した。定量的リアルタイムPCRのために、cDNAを、SsoFastEvaGreen Supermix (Bio-Rad) 2.5μlおよび各プライマーペア0.5μMに添加し最終反応容量5μlとした。以下のプライマーを使用した：Actb（フォワード5’-GGACCTGACGGACTACCTCATG、リバース5’-TCTTTGATGTCACGCACGATTT）32；P450Scc（フォワード5’-ACATGGCCAAGATGGTACAGTTG、リバース5’-ACGAAGCACCAGGTCATTCAC）33；Gapdh（フォワード5’-CCATGGAGAAGGCTGGGG、リバース5’-CAAAGTTGTCATGGATGACC）34；StAR（フォワード5’-TCTCTAGTGTCTCCCACTGCATAGC、リバース5’-TTAGCATCCCCTGTTCGTAGCT）33；TSPO（フォワード5’-GGGAGCCTACTTTGTGCGTGG、リバース5’-CAGGTAAGGATACAGCAAGCGGG）35；TSPO2（フォワード5’-CCAGTCGGTGTGAGGATGAG、リバース5’-AGTAGAGACCAAGGGGCAGT）。反応は、CFX 384リアルタイムPCR検出システム（Bio-Rad）で、98℃ 30秒；続いて98℃ 5秒および63℃（TSPO2アッセイについては61℃）10秒を45サイクルのサイクリングによって行った。融解曲線分析を行って、各反応の特異性を確認した。各サンプルは2連で実行した。TSPO2プライマーはPrimer-BLASTを用いてデザインされ、特異性はDNA配列決定により確認された。
【０２２８】
動物の体重およびブドウ糖負荷試験
マウスは標準的な食餌（Rat and Mouse Premium Breeder diet, Gordon’s Specialty Stockfeeds）で維持され、週1回体重を記録した。肥満を引き起こすために、マウスは14週齢で、Specialty Feedsから購入された、高脂肪食（HFD）（SF03-002、エネルギーの59%が脂肪から）またはコントロール食（AIN93M、エネルギーの9%が脂肪から）を与えられた。体重を毎週記録する一方、食物および水の摂取量は毎日測定した。コントロールまたはHFDを食べて9週間後、マウスはブドウ糖負荷試験を受けた。6時間の絶食後、尾静脈から採取した血液を、AlphaTRAK 2グルコース測定器(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA)を用いて測定した。マウスは、2 g/kg体重の腹腔内ブドウ糖注射を受け、その後15、30、60、および120分の時点で血糖を測定した。
【０２２９】
プロトポルフィリンIX
安楽死させたマウスから採取した血液を氷上のヘパリンチューブに入れ、血漿を除去し、細胞を氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄した後、それを元の容量となるようにPBS中に懸濁した。サンプルを均等に二分割し（各300μl）、一方には1 mM 5-ALA、もう一方には滅菌水を入れて、振盪培養器内で37℃にて4時間インキュベートした。酢酸エチル/酢酸（4:1）を各サンプルに添加し、そこで混合して遠心した後、上清（1 ml）を、1.5 M HCl 1 mlの入った新しいチューブに移した。サンプルを混合して遠心した後、下層のHCｌ相の一定分量を、蛍光光度計で測定した（励起波長は407 nm、スリット幅は10 nm、発光スペクトルは450から800まで1 nmきざみで）。ガラスチューブおよびコンテナが終始使用され、サンプルは光から保護された。
【０２３０】
顔面神経軸索切断
顔面神経軸索切断（Banati, R. B., Myers, R. & Kreutzberg, G. W. PK ('peripheral benzodiazepine')-binding sites in the CNS indicate early and discrete brain lesions: microautoradiographic detection of [3H]PK11195 binding to activated microglia. J Neurocytol 26, 77-82 (1997); Moran, L. B. & Graeber, M. B. The facial nerve axotomy model. Brain Res Brain Res Rev 44, 154-178, doi:10.1016/j.brainresrev.2003.11.004 (2004)）を、イソフルランで麻酔したTSPO+/+およびTSPO-/-マウスに実施した。耳の背側で0.5 cm外側の皮膚に小さな切開（0.5-0.7 cm）をして、手術用顕微鏡下で顔面神経を横に切断した。切開部は3M（商標名）Vetbond（商標名）Tissue Adhesive (St. Paul, MN, USA)で閉じた。手術の成功は、同側のひげの動きの消失によって確認した。マウスを注意深くモニターし、手術から3日後にCO2により安楽死させた。脳を切開してOCT内に置き、液体窒素に移し、凍結切片を作製するまで-80℃で保存した。
【０２３１】
PETおよびCTイメージング
5% (v/v)イソフルランで麻酔され1-2%に維持されたマウスを、既述の方法（Disselhorst, J. A. et al. Image-quality assessment for several positron emitters using the NEMA NU 4-2008 standards in the Siemens Inveon small-animal PET scanner. J Nucl Med 51, 610-617, doi:10.2967/jnumed.109.068858 (2010); Mattner, F. et al. Central nervous system expression and PET imaging of the translocator protein in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. J Nucl Med 54, 291-298, doi:10.2967/jnumed.112.108894 (2013)）にしたがって、小動物用Inveon PET/CTスキャナー（Siemens, Knoxville, TN, USA）を用いてスキャンした。体温はフィードバック制御された加温パッドで維持し、呼吸をモニターした（BioVet; m2m Imaging Corp, Cleveland, OH, USA）。スキャンは、[18F]PBR111 (8-18 MBq/100μL、0.2nM)の尾静脈注射から開始した。40分のイメージング後、臓器における非特異的蓄積を測定するためにPBR111（1 mg/kg、2%酢酸-生理食塩水中)を注射して、10分間イメージングした。その後、マウスは、解剖学的情報のために10分間のCTスキャンを受けた。すべてのPETデータは、OSEM3D-MAPアルゴリズムにより、放射能濃度（kBq/ml）の発生PET量に対して補正、標準化、および再構成された。
【０２３２】
オートラジオグラフィー
TSPO+/+、TSPO+/-およびTSPO-/-マウスから得られた組織切片を、室温にて20分間、1 nM [3H]PK11195（比放射能84 Ci/mmol; Perkin Elmer, Waltham, MA, USA）含有170 mM Tris-HCl pH 7.4中でインキュベートし、170 mM Tris-HCl中で5分間、2回洗浄し、氷冷MilliQ H2Oに3回浸漬してすすいで乾燥した。追加の切片は、氷上で1時間、3 nM [125I]CLINDE（比放射能100 Ci/mmol；ANSTO Life Sciencesにより合成された）含有50 mM Tris-HCl pH 7.4中でインキュベートし、氷冷50 mM Tris-HCl中で2分間2回、氷冷MilliQ H2O中1分間洗浄し、乾燥した。PK11195（10μM）、CLINDE（10μM）およびPBR-111（10μM）の存在下で置換結合を行った。片面乳剤フィルムを切片および標準品（14Cもしくは 3H）に、3時間（[125I]CLINDE）または10週間（[3H]PK11195）暴露した。
【０２３３】
免疫組織化学
既述のように免疫組織化学検査を行った（(Banati, R. B. et al. The peripheral benzodiazepine binding site in the brain in multiple sclerosis: quantitative in vivo imaging of microglia as a measure of disease activity. Brain 123 ( Pt 11), 2321-2337 (2000); Graeber, M. B., Streit, W. J. & Kreutzberg, G. W. Axotomy of the Rat Facial-Nerve Leads to Increased Cr3 Complement Receptor Expression by Activated Microglial Cells. J Neurosci Res 21, 18-24, doi:DOI 10.1002/jnr.490210104 (1988) ; Liu, G. J., Nagarajah, R., Banati, R. B. & Bennett, M. R. Glutamate induces directed chemotaxis of microglia. European Journal of Neuroscience 29, 1108-1118, doi:10.1111/j.1460-9568.2009.06659.x (2009)）。組織切片（オートラジオグラフィーに使用した）を3.7%ホルムアルデヒドのPBS溶液で5分間固定した後、氷冷アセトンで透過化処理した。非特異的結合を10%ウマ血清および2% BSAのPBS溶液によりブロックした。切片を、TSPOモノクローナル抗体（Abcam #109497）とともに4℃にて一晩、さらにHRP標識ヤギ抗ウサギ二次抗体（Sigma #A0545）とともにRTにて1時間インキュベートした。HRPの活性は、ペルオキシダーゼ 3,3’-ジアミノベンジジン四塩酸塩 液体基質システム（Sigma-Aldrich）で検出した。切片をエタノールで脱水して、キシレンと共にインキュベートし、スライドグラスはD.P.X.封入剤の中でカバーグラスによりマウントした。切片は、Olympus BX51倒立顕微鏡（オリンパス、東京、日本）下で可視化され、Q-イメージングカメラおよびImagePro 5.1プログラムにより記録された。
【０２３４】
顔面神経核の蛍光顕微鏡観察のために、5x EC Plan-Neofluar NA 0.16対物レンズを付けたZeiss LSM 710共焦点顕微鏡を使用した。Alexa Fluor 568は、488/561/633ダイクロイックミラーを用いて、561 nmレーザーにより励起され、発光は565から640 nmで捉えられた。
【０２３５】
免疫組織化学検査のために、腹腔マクロファージを、Zhangら（The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol Chapter 14, Unit 14 11, doi:10.1002/0471142735.im1401s83 (2008)）にしたがって分離した。完成品の培養培地に入れて2日後、マクロファージの純度は、FITC（Sigma-Aldrich）で標識されたマクロファージ特異的マーカーIB4で確認され、>97%であった。カバーグラス上の細胞は、組織切片と同様の方法で固定してインキュベートしたが、マウス抗ヒト/マウスミトコンドリア電子伝達系複合体IV抗体（Abcam AB14705）を添加した後、二次抗体Alexa Fluor (AF) 594標識ヤギ抗ウサギ抗体（Life Technologies）およびAF488標識ヤギ抗マウス抗体（Life Technologies）とともにインキュベートした。カバーグラス上の細胞はDAPI（Life Technologies）を含有するProLong Gold褪色防止封入剤によりマウントし、BX61WI Olympus顕微鏡下で観察した。画像は、デジタルカメラ（CoolSNAP, Photometrics, Tucson, AZ, USA）およびImage InVivoプログラム（Photometrics）により得られた。画像のデコンボリューションはAutoDeblurプログラム（Photometrics９によって行われ、さらにImageJ (NIH, Baltimore, MD, USA)で処理された。
【０２３６】
初代ミクログリア細胞培養
既述の方法にしたがって（Liu, G. J., Nagarajah, R., Banati, R. B. & Bennett, M. R. Glutamate induces directed chemotaxis of microglia. Eur J Neurosci 29, 1108-1118, doi:EJN6659 [pii]10.1111/j.1460-9568.2009.06659.x (2009)）、0〜2日齢TSPO+/+およびTSPO-/- マウスからミクログリアを培養した。手短に述べると、全脳を切除して、小片に切り分け、0.025%トリプシン（Sigma-Aldrich）で処理した。それを、10%ウシ胎仔血清（FBS; Life Technologies）、1%ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン（Sigma-Aldrich）および0.5 ng/ml GM-CSF（Abcam）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM/F12; Sigma-Aldrich）で培養した。
【０２３７】
ミクログリアは、37℃にて50分間350 rpmの振盪により精製し、遠心によりペレットとして、添加DMEM/F12中に再懸濁し、室温にて15分間、FBSでプレコートした96ウェルSeahorse XF細胞培養プレート（Seahorse Bioscience, North Billerica, MA, USA）に入れた（4x104 細胞/ウェル）。15分後、ウェルを2回洗浄し、付着しない細胞を除去した。ミクログリア培養物の純度は、ミクログリアマーカーAlexa Fluor標識イソレクチンGS-IB4（Life Technologies）による染色で確認され、>99%であった。ミクログリアは、Seahorse XF 96 Analyzer (Seahorse Bioscience)でミトコンドリア機能を評価する前に、2-3日間培養した。
【０２３８】
ミトコンドリア呼吸の測定
Seahorse XF 96 Analyzerを用いて、初代ミクログリア培養物の酸素消費速度（OCR）および細胞外酸性化速度（ECAR）を測定した。OCSはミトコンドリア呼吸の指標であり、ECARは主として解糖の結果である（Brand, M. D. & Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. The Biochemical journal 435, 297-312, doi:10.1042/BJ20110162 (2011); Yadava, N. & Nicholls, D. G. Spare respiratory capacity rather than oxidative stress regulates glutamate excitotoxicity after partial respiratory inhibition of mitochondrial complex I with rotenone. J Neurosci 27, 7310-7317, doi:10.1523/JNEUROSCI.0212-07.2007 (2007)）。実験の前日、Seahorse XF Calibrant（pH 7.4）200μlを、XF 96ウェルユーティリティプレートの各ウェルに添加した。センサーカートリッジをプレートの上に置き、non-CO2インキュベーター内で37℃にて16時間水和させた。37℃での細胞の基礎測定のためのプロトコール（スタート、プローブのキャリブレート、平衡化、2分混合、1分猶予、3分測定）を2回繰り返した。次にミトコンドリアのストレス化合物（オリゴマイシン、FCCP、ロテノン、およびアンチマイシンA）をインジェクトし、続いて2分混合、1分猶予、3分測定した（3回繰り返した）。
【０２３９】
実験当日に、野生型およびノックアウト型ミクログリアのいずれについても純度>98%ならびにバイアビリティ>92%のミクログリアを、緩衝化されていないDMEM＋25 mMグルコース（バッファーなし）で3回洗浄し、1時間37℃で（CO2なし）インキュベートした。Seahorse XF 96 Analyzerで4回の実験を実行したが、それぞれ4つの薬剤（オリゴマイシン、FCCP、およびアンチマイシンAと組み合わせたロテノン）を使用し、それらはミトコンドリア電子伝達系の4つの重要なパラメーター：基礎呼吸、ATP生産、プロトンリーク、および最大呼吸を調べるために選択された（Brand, M. D. & Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. The Biochemical journal 435, 297-312, doi:10.1042/BJ20110162 (2011); Yadava, N. & Nicholls, D. G. Spare respiratory capacity rather than oxidative stress regulates glutamate excitotoxicity after partial respiratory inhibition of mitochondrial complex I with rotenone. J Neurosci 27, 7310-7317, doi:10.1523/JNEUROSCI.0212-07.2007 (2007)）（図4A）。オリゴマイシン、ならびにロテノンおよびアンチマイシンAの組み合わせは、0.3μM、1μM、3μM（至適）および10μMの濃度でインジェクトされた。FCCPは0.1μM（至適）、0.3μM、1μM、および3μMの濃度でインジェクトされた。
【０２４０】
放射性リガンド結合
臓器をホモジナイズし、氷冷50 mM Tris-HCl (pH 7.4)に入れて48000 x gで遠心することにより2回洗浄し、50容の氷冷50 mM Tris-HClに再懸濁して、タンパク質濃度をBCAタンパク質アッセイキット（Thermo Fisher Scientific）により測定した。BmaxおよびKdは、膜タンパク質（60μl）を氷上で[3H]PK11195 (0.56 nM- 20 nM)とともに90分間インキュベートしてから、0.5%ポリエチレンイミン溶液中にあらかじめ浸しておいたWhatman GF/Cフィルター（GE Healthcare Life Science, Australia）で急速濾過することにより、飽和結合を用いて決定された。非特異的結合は、5μMPK11195を用いて測定された。フィルターを12時間シンチレーションカクテル（Perkin Elmer）の中に入れ、放射能を、Tri-Carb 2100TR液体シンチレーションカウンター（Perkin Elmer）を用いて測定した。BmaxおよびKd値は、GraphPad Prism 5.04 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)を用いた非線形回帰によって、全結合および非特異的結合をあてはめることにより得られた。
【０２４１】
コレステロール輸送および生合成
P450Scc代謝は、Tuckey (Tuckey, R. C., Woods, S. T. & Tajbakhsh, M. Electron transfer to cytochrome P-450scc limits cholesterol-side-chain-cleavage activity in the human placenta. European journal of biochemistry / FEBS 244, 835-839 (1997)) およびSlominski (Slominski, A. T. et al. Cytochrome P450scc-dependent metabolism of 7-dehydrocholesterol in placenta and epidermal keratinocytes. The international journal of biochemistry & cell biology 44, 2003-2018, doi:10.1016/j.biocel.2012.07.027 (2012))にしたがって、マウス精巣で測定された。手短に述べると、250 mMスクロース、50 mM Tris (pH7.4)中で遠心することによって、濃縮されたミトコンドリア画分を調製し、コレステロールからプレグネノロンへの酵素的変換を、次の条件下で最大2時間の時点まで実施した：50 mM HEPES pH7.4、250 mMスクロース、20 mM KCl、5 mM MgSO4、0.2 mM EDTA、1 mg/ml BSA、8μMトリロスタン（Trilostane）、0.05μCi3H-コレステロール、500 mMイソクエン酸、5 mM NaNADP。反応は、4℃のジクロロメタン添加によって終了させた。有機相はためておき、水相はジクロロメタン中に、あと2回再抽出した。抽出物を合わせて、窒素下で乾燥し、100μlの酢酸エチルに溶解した。プレグネノロンおよびコレステロールは、ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸（15:15:1）の移動相を用いて、薄層クロマトグラフィーで分離され、各スポットの放射能量は、液体シンチレーション計数により定量化した。
【０２４２】
血清プレグネノロンの検出
雄および雌TSPO+/-およびTSPO+/+マウスの血清プレグネノロンは、メーカーの使用説明書（Abnova Cooperation, Taiwan）にしたがって実施される酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）によって測定された。手短に述べると、血液を採取し、放置して血餅を凝集させて、血清を収集した。スタンダード、コントロールおよびサンプルは2連として、密封されたプレート内で、コンジュゲートおよび抗体とともに、または、それらなしで、室温にて1時間、200 rpmのプレートシェーカー（KS4000ic, IKA, Selangor, Malaysia）上でインキュベートした。インキュベーション後、ウェルを空にして5回洗浄し、糸くずの出ないペーパータオル上でプレートを軽くたたいて、残りのバッファーを除去した。ウェルをHRPコンジュゲートとともに、200rpmのプレートシェーカー上で室温にて30分間インキュベートし、5回洗浄して、TMB基質とともに室温で10分間インキュベートした。停止液を各ウェルに添加し、20分後に450 nmの光学濃度を測定した。データを血液量に対して標準化し、4パラメーターロジスティック曲線フィッティングプログラムMasterPlex ReaderFit：Curve-Fitting Software for ELISA Analysis (Hitachi Solution America, San Francisco, CA, USA)を用いて解析した。
【０２４３】
血液表現型検査
行動実験に使用した30匹のマウス（10 TSPO+/+、10 TSPO+/-、10 TSPO-/-、5月齢、雄/雌均等分布）は、CO2で安楽死させた。下大静脈を切断することによって肺腔から血液を採取し、ヘパリン（血液学およびリンパ球分析）またはゲル血餅アクチベーター（生化学分析）とともにマイクロチューブに入れた。脾臓を採取して氷冷滅菌PBS10 mlに入れた。血液（室温）および脾臓（氷上）は、フローサイトメトリー分析および生化学分析のために（採取から3-7時間以内に）Australian Phenomics Facilityに送られた。
【０２４４】
一般的な血液学的検査のために、血液は、1:2に希釈し、Advia 2120 Haematology System (Siemens, Munich, Germany)を用いた蛍光活性化セルソーティング（FACS）によって分析した。白血球および血小板を含めて、血液細胞サブセットを評価した。リンパ球分析のために、T細胞、B細胞、NK細胞、および単球の異常性の有無について血液を分析した。T細胞サブセットはCD4+およびCD8+サブセットを含み、B細胞サブセットは未熟および成熟B細胞およびIgE+単球を含んだ。脾臓はフローサイトメトリーにより分析し、NK細胞、B細胞（成熟および未熟サブセットを含む）、ならびにT細胞（CD4+およびCD8細胞ならびにそれらの活性化されたサブセットを含む）について染色した。調べた細胞型の一覧については表1を参照されたい。
【０２４５】
生化学検査のために、血液を遠心し、血清を集めて、Olympus AU400 Chemistry Analyzer (Olympus)を通して調べたが、これはコレステロール、トリグリセリド、グルコース、高密度リポタンパク質（HDL）、アルブミン、クレアチンキナーゼ活性、およびアラニンアミノトランスフェラーゼのレベルを検出する。調べた生化学パラメーターの一覧については表1を参照されたい。
【０２４６】
マウス精子分析
精子は、TSPO+/+およびTSPO-/-マウスの精巣上体尾部から、それぞれの尾部を外科用メスで切断することによって放出され、あらかじめ加温されたBiggers-Whitten-Whittingham (BWW)培地150μl中で37℃にて5分間インキュベートした。インキュベーション後、追加のBWW培地250μlを添加し、組織を除去して、コンピューター支援精子解析（CASA）システム（Hamilton Thorne, Beverly, MA, USA）を用いて精子を評価した。評価されるパラメーターは、全体的運動性、前進運動性、進行方向性速度平均(VAP)、直線地点移動平均(VSL)および曲線地点移動平均(VCL)とした。
【０２４７】
不安関連行動の評価
行動テストは、3-4月齢のマウスで実施し、実験中のハンドリングストレスの影響を減らすために、頻繁にハンドリングした。不安関連行動は下記によって調べた：オープンフィールドテスト、エマージェンステスト、明暗選択テスト、および高架式十字迷路。それぞれのテストでは、マウスは15分間装置内を自由に探索させた。各区画に入っている時間および回数、総移動距離、活動時間、および排糞数を評価した。高架式十字迷路では、危険評価は、動物の頭がオープンアームの方向に向き、体の15%より多くがオープンアームの中にあるが、重心は壁のあるアームまたは中央のプラットフォームの中に維持している場合として定義された。動物の遺伝子型は、実験中、実験者に伏せられている。訓練履歴の影響を減らすために、テストは、少なくとも7日の間隔を置いて行った（Paylor, R. & Lindsay, E. Mouse models of 22q11 deletion syndrome. Biol Psychiatry 59, 1172-1179, doi:10.1016/j.biopsych.2006.01.018 (2006)）。すべての実験は、オーバーヘッドカメラでDVDに記録し、その後Motman Tracker 4.5ソフトウェア（Motion Mensura, Cooks Hill, NSW, Australia）を用いて解析した。
【０２４８】
統計値
提示された結果は、少なくとも3つのウェルおよびバッチのミクログリア培養物から得られたものであるが、この(n)は、ミトコンドリア呼吸のためにサンプリングされたウェルの数を表す。他の実験では、一群あたり少なくとも3匹の動物を使用した。データは、SDが与えられるPET定量およびコレステロール輸送データを除いて、平均±SEMとして示される。群間の比較は、Bonferroniの事後検定による分散の単変量解析によって行った。P値 £ 0.05が、統計的に有意であるとみなされた。
【実施例８】
【０２４９】
グローバルTSPO+/-およびTSPO-/-ノックアウトの確認
結果
TSPO遺伝子のエクソン2および3を除去した結果、生存可能なTSPO+/- およびTSPO-/- 動物が得られた。TSPOの破壊は、サザンブロット、PCR、RT-qPCR、ウェスタンブロット、（図15〜18）、特異的抗体染色（図19、20、および21a〜21g）、TSPOリガンド[18F]PBR111を用いたin vivoトレーサー動態PET/CT 研究（図21hおよびi；図24）、受容体-オートラジオグラフィー、ならびに[3H]PK11195および[125I]CLINDEを用いた膜受容体結合（それぞれ図21aおよび21b）によって確認された。
【０２５０】
TSPOタンパク質がないことの確認に加えて、本発明者らのデータは、本来は末梢性ベンゾジアゼピン結合部位の特性を薬理学的に明らかにするために使用される分子である[3H]PK11195の高い選択性を明示する18。さらに、本発明者らは、in vivoおよびin vitroで[18F]PBR111および[125I]CLINDEの高い選択性を明らかに示す（図21a〜21g）ので、これらは、構成的もしくは誘導的な特異的TSPO結合のバックグラウンドのない、動物において有効な、TSPOに関する最初の新規化合物である。
【０２５１】
重要なことに、本発明者らは、TSPO-/-動物において、正常な野生型とは違って、末梢顔面神経損傷後の顔面神経核におけるミクログリア細胞の反応が、TSPOリガンド、[3H]PK11195および[125I]CLINDEの結合の増加と関連しないことを示す。このことは、病理学的組織変化において、[3H]PK11195および[125I]CLINDEの選択性が有効であり、追加の非選択的結合は出現しないことを示す。本発明者らのデータは、ミクログリア形態の典型的な変化をともなう、ニューロン周囲のミクログリア活性化の初期段階が、TSPOの欠損による目立った影響を受けず、神経グリア細胞シグナル伝達機構はインタクトなままであることを示す（図21fおよび21g）。
【実施例９】
【０２５２】
一般的健康状態、生存能力、妊孕性、および行動表現型
結果
600匹以上の動物の観察は、ヘテロ型TSPO+/-またはホモ型TSPO-/-動物のいずれにおいても、通常の摂餌および居住条件下で、明白な臨床上の障害も、付随的な病変の増加も示さず、これらの動物はいずれも、性比、成長速度、および経時的な体重増加がコロニーコントロールの野生型TSPO+/+動物と同じであった（図25）。同様に、妊孕性もしくは生存期間に減少の兆候はなく、最高齢動物はこれまでのところ病気もなく20ヶ月を越えた。精子の生存率および機能の検査は、TSPO+/+ （平均運動性：82.7±9.33%；平均前進性：47.7±10.2%；平均速度VAP：98.6±13.0μm/s、VSL: 65.7±8.90μm/s、およびVCL：179±20.2μm/s）、およびTSPO-/- 動物（平均運動性：86.1±5.74%；平均前進性：49.6±5.32%;平均速度VAP：105±6.54μm/s、VSL：67.5±5.08μm/s、およびVCL：197±11.2μm/s）由来の精子の間で相違をもたらさなかった。標準的なオープンフィールド、emergence、明暗選択、および高架式十字迷路テストは、すべての遺伝子型で類似した行動を示した（表3）。
【０２５３】
【表３】
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2016516399.tif 000025
遺伝子型の間で、有意な行動の相違はみられなかった。
【実施例１０】
【０２５４】
コレステロールおよびプレグネノロン生合成
結果
雄および雌のTSPO-/-マウスのいずれにおいても、すべての血清プレグネノロン濃度は、酵素結合免疫吸着法（ELISA）で測定され、コロニーコントロール野生型（TSPO+/+: 雄、131±46.5 ng/ml; 雌、150±36.5 ng/ml）および（TSPO-/-: 雄、145±44.8 ng/ml; 雌、141±26.8 ng/ml）に見られる正常範囲内であった（図22a）。
【０２５５】
最大2時間にわたる、P450Sccによる3H-コレステロールからプレグネノロンへの酵素的変換は、ミトコンドリアコレステロール輸送の表示情報であるが、あらゆる遺伝子型の間で平均パーセンテージ変換速度に、統計的に有意な相違を示さなかった（TSPO+/+: 14.35±4.6% (std); TSPO+/-: 14.28±3.6% (std); TSPO-/-: 15.6±4.0 % (std); p>>.05）。
【実施例１１】
【０２５６】
P450Scc、StARおよびTSPO2
結果
同様に、定量的RT-qPCRは、StAR、P450Scc、およびTSPO2の遺伝子発現プロファイルが、TSPOを発現すると判明している主な臓器のすべてにわたって、遺伝子型を越えて類似していることを示したが、これは、TSPOのグローバルな欠損が、ステロイド合成の制御因子としてTSPOともっとも密接に関連していると考えられるそれらの遺伝子の、代償的な転写制御を引き起こさなかったことを示唆した（図22b）。
【実施例１２】
【０２５７】
血液学的分析および生化学検査
結果
セルソーティングを含めた血液の分析から、雌雄ともに血液表現型はそのまま、TSPO遺伝子のヘテロ型もしくはホモ型欠損による影響をほとんど受けず、唯一の例外は、雌TSPO+/+と比べて雌TSPO-/-マウスでのナチュラルキラー（NK）細胞の統計上有意な増加傾向であることが示された（表4）。したがって、TSPO-/-マウスは、ゼブラフィッシュTSPO遺伝子サイレンシング実験で観察された血液細胞成分の変化を示さなかった。
【０２５８】
【表４】
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*雌TSPO-/-マウスのNK細胞の相対存在量(%)は、雌TSPO+/+ならびに雌TSPO+/-マウスより有意に大きかった（P<0.05）。
【０２５９】
内因性TSPOリガンドであると考えられるプロトポルフィリンIX（PPIX）の、TSPO+/+、TSPO+/-およびTSPO-/- マウス血中濃度は、区別できないほど似通っていて、ヘム生合成の最初の中間体でありPPIXの前駆体である5-アミノレブリン酸（ALA）で処理した後、同じように増加した（図22C）ので、こうして正常なヘム代謝が示唆された。
【実施例１３】
【０２６０】
ミトコンドリア代謝および高脂肪食に対する反応
結果
標準的な食餌では、TSPO+/+ およびTSPO-/-動物の間に体重増加の差異はなかったが、高脂肪食では、TSPO-/-動物は、同じ食餌および水の摂取にもかかわらずTSPO+/+動物とは異なり、相対的な体重増加が有意に減少した（図22d〜22fおよび表5）。高脂肪食に起因する耐糖能の有意な変化は、TSPO-/-動物では観察されなかったが、TSPO+/+動物は、予想される耐糖能異常傾向を示した（図22g）。
【０２６１】
【表５】
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TSPO+/+およびTSPO-/-マウス由来の、ミトコンドリアを多く含む細胞であるミクログリアの初代培養物における、ミトコンドリア呼吸およびATP生産の比較分析は、酸素およびプロトン感受性フルオロフォア、ならびに電子伝達系の選択的阻害剤もしくは脱共役剤を用いたが（図23a）、その分析により、TSPO-/-ミトコンドリアは野生型と比べて：
1) 基礎ミトコンドリア酸素消費速度（OCR）が有意に低い（図23b）；
2) オリゴマイシンで複合体Vを阻害した後、ATP生産が低下する（図23d）；
3) 脱共役、すなわちFCCPによるプロトン勾配の低下の後、最大呼吸（予備能力）が有意に低下する（図23f）；ならびに
4) ロテノンおよびアンチマイシンAの組み合わせによる複合体IおよびIIIの阻害下でのOCR（図23h）から、オリゴマイシンで阻害されたOCR（図23dに示す）を差し引くことにより計算される、プロトンリーク（図23j）が有意に増加する
ことが判明した。
【０２６２】
TSPO-/-ミトコンドリアによるATP生産の減少は、細胞外酸性化速度（ECAR）によって測定される解糖の代償的な増加を伴わなかったが（図23c、23e、23g、および23i）、そのことは、プロトンリーク増加に起因するATP生産の減少が非ミトコンドリア経路で補填されないことを示した。
【０２６３】
（実施例８〜１３）
考察
TSPOのオルソログは、真正細菌、古細菌、および真核生物に広く見いだされる（Gavish, M. et al. Enigma of the peripheral benzodiazepine receptor. Pharmacol Rev 51, 629-650 (1999); Papadopoulos, V. et al. Translocator protein (18kDa): new nomenclature for the peripheral-type benzodiazepine receptor based on its structure and molecular function. Trends Pharmacol Sci 27, 402-409, doi:S0165-6147(06)00153-2 [pii] 10.1016/j.tips.2006.06.005 (2006)）。ほとんどのTSPOタンパク質ファミリーメンバーは、イソキノリンカルボキサミドPK11195に特異的な結合部位を含有しており、このPK11195は、TSPOを薬理学的に明示し、GABAA受容体タンパク質複合体などの他のベンゾジアゼピン結合受容体から区別するためにこれまで使用されてきた（Gavish, M. et al. Enigma of the peripheral benzodiazepine receptor. Pharmacol Rev 51, 629-650 (1999); Le Fur, G. et al. Peripheral benzodiazepine binding sites: effect of PK 11195, 1-(2-chlorophenyl)-N-methyl-(1-methylpropyl)-3 isoquinolinecarboxamide. II. In vivo studies. Life Sci 32, 1849-1856 (1983)）。進化的に若いC末端コレステロール認識アミノ酸コンセンサス（CRAC）ドメインは、主に動物門に見られる。TSPOのパラログ、TSPO2は、遺伝子重複の結果として鳥類および哺乳類に存在するものであって、これはCRACドメインを保持しているがイソキノリン結合部位を失っている（Fan, J., Rone, M. B. & Papadopoulos, V. Translocator protein 2 is involved in cholesterol redistribution during erythropoiesis. J Biol Chem 284, 30484-30497, doi:10.1074/jbc.M109.029876 (2009)）。
【０２６４】
遺伝子のコア機能を保存しようとする見かけの進化圧力、およびステロイド生成におけるそのタンパク質のきわめて重要な役割を考慮すると、本発明のグローバルTSPOノックアウト動物が生存するだけでなく、「正常な」表現型を示すと判明したのは驚きであった。
【０２６５】
それにもかかわらず、また、TSPOノックアウトに及ぼす機能的な影響が目立たない一方で、上記実施例で概説される実験データは、TSPOおよびTSPOシグナル伝達が細胞および全身のエネルギーhouseholdに果たす重要な役割を示している。具体的には、本明細書に提示されるデータは、高脂肪食によるエネルギー摂取量の長期的増加が、野生型動物と比較した場合、TSPOノックアウト動物において有意な体重増加の減少（予想より減少）をもたらすことを示しており、したがって、TSPOおよびTSPOシグナル伝達の、高脂肪食の結果生じる肥満の防止に果たす役割を提示する。同様に、データは、TSPOがエネルギー貯蔵に関与することを示しており、エネルギー貯蔵はTSPOが存在しないと効率が劣るように思われる。したがって、TSPOはおそらくミトコンドリア酸化経路の活性化に関与しており、細胞測定からは、TSPOノックアウト動物で観察されるエネルギー貯蔵の効率の低下がミトコンドリアのプロトンリークの増加に起因することが示唆される。
【０２６６】
本発明の実施形態にしたがって示される結果は、TSPOの関与する細胞および全身のエネルギーhouseholdの変化（ATP生産の変化として測定される）が、ステロイド生合成への間接的な調節作用をどのように説明できるかを解明する一助となりうるが、このステロイド生合成はエネルギー依存性である。しかしながら、本発明によるトランスジェニック動物の作製により可能となった驚くべき観察によって、今や、TSPOおよびそのin vivo機能および関連性に関して以前得られたデータを、再評価して可能性を検証し、あるいはまた、放棄することができる。特に、これは、本発明の方法および使用においてTSPOに対する選択性および特異性があるとされる化合物を用いた研究を含む。
【０２６７】
したがって、本発明の好ましい実施形態であると思われることを記載しているが、本発明の精神から逸脱することなしに、これに、その他のそれ以上の修正を加えることができることは当業者に認識されているのであって、そうしたすべての変更および修正を、本発明の範囲内にあると主張するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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