(57)【要約】  被験者からの皮膚サンプルの採取、上皮細胞サンプル／皮膚細胞サンプル中の１つ以上の小分子バイオマーカーの濃度の検出、検出された小分子バイオマーカーの濃度に基づく被験者の皮膚の状態の診断を含み、検出された小分子が、アミノ酸の代謝によって生成された化合物、ジペプチド代謝によって生成された化合物、核酸によって生成された化合物、脂質の代謝によって生成された化合物、炭水化物の代謝によって生成された化合物、及びこれらの混合物、並びに表１に列挙する更なる小分子バイオマーカーから選択された少なくとも１つの化合物である、被験者の皮膚の健康状態を診断する非侵襲的方法。更に、皮膚の健康のための製品の有効性を評価する非侵襲的方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）被験者から皮膚サンプルを採取する工程と、
ｂ）前記上皮細胞サンプル／皮膚細胞サンプル中の１つ以上の小分子バイオマーカーの濃度を検出する工程と、
ｃ）検出された小分子バイオマーカーの濃度に基づき、前記被験者の皮膚の状態を診断する工程と、を含み、
前記検出された小分子が、アミノ酸の代謝によって生成された化合物、ジペプチド代謝によって生成された化合物、核酸によって生成された化合物、脂質の代謝によって生成された化合物、炭水化物の代謝によって生成された化合物、及びこれらの混合物、並びに表１に列挙する更なる小分子バイオマーカーから選択された少なくとも１つの化合物である、被験者の皮膚の健康を診断するための非侵襲的方法。
【請求項２】
ａ）哺乳類の上皮に接着物品を貼付する工程と、
ｂ）上皮細胞の前記接着物品への付着を可能にする工程と、
ｃ）前記接着物品を前記哺乳類の上皮から取り外す工程と、
ｄ）抽出のために標準的な実験室法を用いて前記接着物品を調製する工程と、
ｅ）前記接着物品に付着した前記上皮細胞から小分子バイオマーカーを抽出する工程と、
ｆ）前記接着物品に付着した前記上皮細胞からの前記小分子バイオマーカーを測定する工程と、
ｇ）基準時サンプルと比べて前記上皮細胞中の前記小分子バイオマーカーの量を判定する工程と、
ｈ）検出された小分子バイオマーカーを抽出する工程と、を含み、
前記検出された小バイオマーカーが、アミノ酸の代謝によって生成された化合物、ジペプチド代謝によって生成された化合物、核酸によって生成された化合物、脂質の代謝によって生成された化合物、炭水化物の代謝によって生成された化合物、及びこれらの混合物、並びに表１に列挙する更なる小分子バイオマーカーから選択された少なくとも１つの化合物である、請求項１に記載の被験者の皮膚の健康を診断するための方法。
【請求項３】
ａ）前記被験者から皮膚細胞サンプルを採取する工程と、
ｂ）前記上皮細胞サンプル／皮膚細胞サンプル中の１つ以上の小分子バイオマーカーの濃度を検出する工程と、
ｃ）前記上皮細胞サンプル中の前記検出された小分子バイオマーカーの濃度を小分子バイオマーカーの基準レベルと比較して、それにより差分濃度を得る工程と、を含み、
前記小分子バイオマーカーの基準レベルが以下の１つ以上に相当し、前記検出された小分子がアミノ酸の代謝によって生成された化合物、ジペプチド代謝によって生成された化合物、核酸によって生成された化合物、脂質の代謝によって生成された化合物、炭水化物の代謝によって生成された化合物、及びこれらの混合物、並びに表１に列挙する更なる小分子バイオマーカーから選択された少なくとも１つの化合物である、請求項１又は２に記載の被験者の皮膚の健康を診断するための方法。
【請求項４】
前記検出された小分子バイオマーカーの前記濃度が、前記小分子バイオマーカーを前記接着物品上のタンパク質の量で除することによって標準化される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
小分子バイオマーカーの基準時濃度と比較すると、小分子バイオマーカー濃度において値の変化がある、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
適用前の小分子バイオマーカーの基準時濃度と比較すると、抗真菌ヘアトリートメントの適用後の標準化された小分子バイオマーカーにおいて前記基準時から少なくとも５％の変化がある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
適用前の小分子バイオマーカーの基準時濃度と比較すると、フケ予防シャンプーの適用後の標準化された小分子バイオマーカーにおいて少なくとも５％の減少がある、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
適用前の小分子バイオマーカーの基準時濃度と比較すると、ジンクピリチオンシャンプーの適用後の標準化された小分子バイオマーカーにおいて少なくとも５％の減少がある、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
適用前の小分子バイオマーカーの基準時濃度と比較すると、硫化セレンシャンプーの適用後の標準化された小分子バイオマーカーにおいて少なくとも５％の減少がある、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
適用前の小分子バイオマーカーの基準時濃度と比較すると、フケ予防シャンプーの適用後の標準化された小分子バイオマーカーにおいて少なくとも５％の上昇がある、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
適用前の小分子バイオマーカーの基準時濃度と比較すると、ジンクピリチオンシャンプーの適用後の標準化された小分子バイオマーカーにおいて少なくとも５％の上昇がある、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
適用前の小分子バイオマーカーの基準時濃度と比較すると、硫化セレンシャンプーの適用後の標準化された小分子バイオマーカーにおいて少なくとも５％の上昇がある、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
正常集団と比較したときに、皮膚の健康の点で少なくとも５％改善する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の哺乳類における症状の認識を客観的に測定する方法であって、
ａ）哺乳類の上皮に接着物品を貼付する工程と、
ｂ）上皮細胞の前記接着物品への付着を可能にする工程と、
ｃ）前記接着物品を前記哺乳類の上皮から取り外す工程と、
ｄ）抽出のために標準的な実験室法を用いて前記接着物品を調製する工程と、
ｅ）前記接着物品に付着した前記上皮細胞から小分子バイオマーカーを抽出する工程と、
ｆ）前記接着物品に付着した前記上皮細胞から前記小分子バイオマーカーを測定する工程と、
ｇ）基準時サンプルと比べて前記上皮細胞中の前記小分子バイオマーカーの量を判定する工程と、を含む、方法。
【請求項１５】
症状の認識の減少に正比例する、基準時濃度からの小分子バイオマーカーの減少がある、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚サンプルから１つ以上の小分子及び又は代謝産物バイオマーカーの量を測定する方法、並びにこれらのバイオマーカーの量の関連性及び相関関係に関する。これは、これらの量が哺乳類における皮膚の健康の向上に直接相関するためである。
【背景技術】
【０００２】
頭皮／皮膚は、環境的な損傷に対する防御の第一線として働く複数の特殊化した組織から構成される注目すべき器官系である。初期の研究が主に皮膚のバリア機能に重点を置いていた間に、この器官が動的であり、ホメオスタシスの維持を助けるために環境の小さな変化さえ感知し反応することが明らかになってきた。太陽放射、汚染、又は更にはスキンケア製品の塗布などの環境的影響は、最終的に数百又は数千の遺伝子の発現における変化を引き起こす事象の複合的な連鎖を結果としてもたらす。遺伝子発現におけるこれらの変化は、最終的に細胞応答につながる化学反応を触媒するタンパク質の産生（又は蓄積、放出、変異など）における変化に概して変換される。これらの化学反応が進むにつれて、代謝副産物は、生じた化学反応の指標としてしばしば残る。例えばフケなどの所与の皮膚の状態と互いに関係があるそれらの小分子バイオマーカーのプロファイル分析は、皮膚の状態の診断及び／又は改善のための製品の開発だけでなく状態を理解するのに有益な情報を提供することができる。
【０００３】
フケは、徴候及び症状としてフレーク化、掻痒、刺激を伴う、一般的な慢性再発性の頭皮皮膚状態である。フケの病因は複雑であり、頭皮、微生物相、及び宿主免疫系の間での相互作用の結果であるように見える。この状態に関するほとんどの先行研究は、少数の表面レベルの現象の検査に重点を置いてきた。表皮構造の従来の専門家による観察及び自己観察に基づく評価は、機器に基づく評価と大きく組み合わされ、生理学的レベルで機能する。新しい生体分子の能力は、従来の調査の手段では、以前には達成できなかった病態生理学の理解の深さを確立するが、この状態の主要な症状につながる分子学的事象のはっきりしたことはこれから明らかになる。これらの重要な分子学的事象を解明するために、生体分子のサンプル採取を、皮膚表面のテープ剥離と、その後に続く化学的又は生物分析方法論によって非侵襲的に得ることができる。ヒスタミンは、最近、頭皮掻痒のための高感度のバイオマーカーであると確認された。追加のバイオマーカーは、フケの治療的解決の範囲及び完全性を示す関連の評価基準として機能するのと同様にフケ状態のより詳細な病態生理学的説明を可能にするために必要である。非侵襲的にサンプル抽出することができるバイオマーカーは、日常的な臨床評価で使用するための最高の実用性を可能にする。
【０００４】
フケ状態のバイオマーカーを識別するためには、代謝産物プロファイリングのアプローチを使用して、非フケ被験者、フケ被験者、及びフケ予防シャンプーにより処置されたフケ被験者から得た頭皮テープストリップの抽出物間の違いを区別する。この代謝産物プロファイリング方法（メタボロミクス）は、各被験者群について細胞プロセスの固有のフットプリントを示す。ゲノミクス及びプロテオミクスは、生物システムで起こりつつあり得ることのスナップショットを提供する一方、メタボロミクスは、遺伝子及び環境の変化に応じた生物システムの増幅された出力と見なすことができ、その生物システムの生理学上の有益な情報を我々に与える。ゲノミクス及びプロテオミクスの理解とメタボノミクスプロファイルとの成功裡の統合は、皮膚科学における応用を含む生物システムのより完全な理解を可能にするだろう。
【０００５】
非侵襲的サンプル採取方法は、皮膚／頭皮のケアにおけるバイオマーカーの適用に重要である。テープストリップは、後に続く代謝産物プロファイリング分析用の皮膚／頭皮からの小分子のサンプル採取に成功裡に使用されてきた。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の実施形態は、被験者からの皮膚サンプルの採取、上皮細胞サンプル／皮膚細胞サンプル中の１つ以上の小分子バイオマーカーの濃度の検出、検出された小分子バイオマーカーの濃度に基づく被験者の皮膚の状態の診断を含み、検出された小分子が、アミノ酸の代謝によって生成された化合物、ジペプチド代謝によって生成された化合物、核酸によって生成された化合物、脂質の代謝によって生成された化合物、炭水化物の代謝によって生成された化合物、及びこれらの混合物、並びに表１に列挙する更なる小分子バイオマーカーから選択された少なくとも１つの化合物である、被験者の皮膚の健康状態を診断する非侵襲的方法を目的とする。
【０００７】
表の簡単な説明
表１ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅフケと非フケとフケ予防処置下でのフケとの間に統計上の有意な差がある代謝産物の変化倍率。
【０００８】
表２ａ及びｂ有意差があるアミノ酸バイオマーカー及びそれらの代謝産物。
【０００９】
表３ａ及びｂ有意差があるジペプチド代謝産物／バイオマーカー。
【００１０】
表４有意差がある核酸代謝産物／バイオマーカー。
【００１１】
表５ａ及びｂ有意差がある脂質バイオマーカー及びそれらの代謝産物／バイオマーカー。
【００１２】
表６有意差がある炭水化物及びそれらの代謝産物、補因子、並びにその他を含む各種バイオマーカー。
【００１３】
表７ａ及びｂ有意差がある構造不明の分子／バイオマーカー。
【００１４】
表８自己評価及び専門家の評価結果
【発明を実施するための形態】
【００１５】
明細書の各請求項から、その請求範囲は特定され明確にされているが、本発明は、下記記載により、より明確に理解されるであろう。
【００１６】
本発明は、本明細書に記載した本発明の必須要素及び制限事項、並びに本明細書に記載した追加若しくは任意の成分、構成成分又は制限事項のいずれも含むことができ、これらからなることができ、又はこれらから本質的になることができる。
【００１７】
特に断らないかぎり、比率、部、及び比はすべて、本発明の組成物の総重量に基づく。全てのこのような重量は、提示された成分に関する場合、活性成分の濃度に基づき、したがって市販材料に包含される場合のある基剤又は副生成物を包含しない。
【００１８】
以下では、本発明の様々な実施形態の構成成分及び／又は工程を、任意に加えてもよいものを含めて、詳細に記載する。
【００１９】
引用される全ての文献は、その関連部分において参照により本明細書に組み込まれるが、いずれの文献の引用もそれが本発明に関連する先行技術であることの容認として解釈されるべきではない。
【００２０】
特に記載しない限り、全ての比率は重量比である。
【００２１】
特に記載のない限り、すべての温度は摂氏である。
【００２２】
特に指摘される場合を除き、分量、百分率、部分、及び割合を含むすべての量は、「約」という単語により修正されると理解され、量は有効数字を示すことを意図しない。
【００２３】
特に断りのない限り、冠詞「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は「１つ以上の」を意味する。
【００２４】
本明細書において「含む」とは、最終結果に影響を与えない他の工程及び他の成分を追加できることを意味する。この用語には、「からなる」及び「から本質的になる」という用語が含まれる。本発明の組成物及び本発明の方法／プロセスは、本明細書に記載した発明の必須要素及び制限事項、並びに本明細書に記載した追加若しくは任意の成分、構成成分、工程、又は制限事項のいずれをも含むことができ、これらからなることができ、及びこれらから本質的になることができる。
【００２５】
本明細書において「有効な」とは、処置する症状の著しく好ましい改善をもたらすのに十分高い対象活性物質の量を意味する。対象活性物質の有効量は、処置する特定の症状、症状の重さ、処置期間、併用している処置の性質及び同様の要因により変化する。
【００２６】
本明細書で使用する場合、用語代謝産物の「差分濃度」は、いくらかの増加した又は減少した濃度を含んでもよい。一実施形態では、差分濃度は、少なくとも５％だけ、少なくとも１０％だけ、少なくとも２０％だけ、少なくとも３０％だけ、少なくとも４０％だけ、少なくとも５０％だけ、少なくとも６０％だけ、少なくとも７０％だけ、少なくとも８０％だけ、少なくとも９０％だけ、少なくとも１００％だけ、少なくとも１１０％だけ、少なくとも１２０％だけ、少なくとも１３０％だけ、少なくとも１４０％だけ、少なくとも１５０％だけ、又はそれ以上増加した濃度を意味する。別の実施形態では、差分濃度は、少なくとも５％だけ、少なくとも１０％だけ、少なくとも２０％だけ、少なくとも３０％だけ、少なくとも４０％だけ、少なくとも５０％だけ、少なくとも６０％だけ、少なくとも７０％だけ、少なくとも８０％だけ、少なくとも９０％だけ、少なくとも１００％だけ減少した濃度を意味する。代謝産物は、統計的に有意である差分濃度で生じる（即ち、ｐ値は、スチューデントｔ検定、ウェルチの二標本ｔ検定、マッチドペアｔ検定、又はウィルコクソンの順位和検定のいずれかを用いて決定されるように０．２以下（equal and less than）である）。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「代謝産物」という用語は、代謝によって生じる、又は特定の代謝プロセスに必要な若しくはこれに関与する任意の物質を意味する。この用語は、大きなタンパク質（例えば、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、又は１０，０００を超える分子量を有するタンパク質）、大きな核酸（例えば、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、又は１０，０００を超える分子量を有する核酸）、又は大きな多糖類（例えば、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、又は１０，０００を超える分子量を有する多糖類）のような大きな高分子を含まない。代謝産物という用語は、食物由来のエネルギーを、限定するものではないが、細胞プロセス中に形成される糖類、脂肪酸、アミノ酸、ヌクレオチド、抗酸化物質、ビタミン、補因子、脂質、中間体、及び他の小分子を含む使用可能な形態に、変換する化学反応におけるシグナル伝達分子及び中間体を含む。
【００２８】
本発明の実施形態では、検出された代謝産物は、アミノ酸代謝によって生成された化合物、ジペプチド代謝によって生成された化合物、核酸代謝によって生成された化合物、脂質代謝で生成された化合物、炭水化物代謝で生成された化合物、エネルギーサイクル中の中間体、及び酵素補因子から選択された小分子バイオマーカーであり得る。別の実施形態では、代謝産物は、表１、２、３、４、５、６、及び７に列挙した化合物のうち１つ以上を含んでもよい。
【００２９】
「皮膚」という用語は、脊椎動物の外皮を意味し、２層の細胞、つまり厚い内層（真皮）及び薄い外層（表皮）からなる。表皮は、皮膚の外側の非血管層である。表皮は５層の上皮で構成されており、これらは、内から外へ（１）基底層（表皮基底層）、（２）有棘層（表皮有棘層）、（３）顆粒層（表皮顆粒層）、（４）透明層（表皮透明層）、及び（５）角質層（表皮角質層）である。
【００３０】
「サンプル」という用語は、被験者の皮膚又は表皮からの任意の標本を指す。
【００３１】
「非侵襲的」という用語は、診断又は治療のために皮膚又は身体開口部に器具又は装置を挿入することを必要としない手順を意味する。
【００３２】
「接着装置」とは、基材上の接着剤又は接着性物質を用いることにより皮膚の表皮層の除去に用いられる装置を意味する。例えば、Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）（ポリアクリル酸エステル接着剤、ＣｕＤｅｒｍ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ））、Ｄｕｒａｐｏｒ，Ｓｅｂｕｔａｐｅ（商標）（アクリル酸ポリマーフィルム、ＣｕＤｅｒｍ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ））、Ｔｅｇａｄｅｒｍ（商標），Ｄｕｃｔテープ（３３３ダクトテープ、Ｎａｓｈｕａテープ製品）、Ｓｃｏｔｃｈ（登録商標）Ｔａｐｅ（３Ｍ  Ｓｃｏｔｃｈ  ８１０（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，Ｍｉｎｎ．）、Ｄｉａｍｏｎｄ（商標）（Ｔｈｅ  Ｓｅｌｌｏｔａｐｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｓｅｎｔｅｇａ（商標）（ポリプロピレンテープ、Ｓｅｎｔｅｇａ  Ｅｉｋｅｔｔｅｎ  ＢＶ（Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）などの接着テープを備える皮膚サンプルが用いられてよい。接着剤は、一般に用いられる感圧タイプの接着剤のいずれか又は皮膚含有物（skin content）上で直ちに凝固するもの（シアノアクリレートなど）であってよい。接着剤は、サンプル抽出を容易にするために、可撓性又は固形の裏材上にあってよい。定圧装置（例えば、Ｄｅｓｑｕａｍｅ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＣｕＤｅｒｍ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ））を用いて、サンプル抽出中に接着装置に圧力を加えてよい。
【００３３】
組織からのサンプルは、当該技術分野において周知のあらゆる方法によって分離されてよい。サンプルを分離するための侵襲的方法には、例えば血液採取中の針の使用、並びに様々な組織の生検、ブリスター法及びレーザーポレーションが挙げられる。これらの方法の侵襲的性質が原因で、死亡及び罹患リスクが増加する。更に、侵襲的方法は、皮膚の状態に悪影響を及ぼす場合があり、不正確な結果又は誤った結果をもたらし得る。その上更に、侵襲的方法は、大規模な集団での実行が困難である。侵襲的方法は、参加者に不快感をもたらす場合があり、感染又は他の副作用の可能性がより大きいことがある。本発明は、皮膚から小分子を測定するための非侵襲的方法を提供する。
【００３４】
「客観的に」という用語は、偏り又は先入観がないことを意味する。あるいは、いずれかの専門家による評価又は自己評価は、本質的に「主観的」である。
【００３５】
「正常化」及び／又は「正常化された」という用語は、フケ患者の集団が、正常な集団の状態に近づく程度を意味する。
【００３６】
「標準化」及び／又は「標準化された」という用語は、対応する接着剤又は接着物品上で測定されたタンパク質の量に対して表される小分子値を意味する。非限定的例は、ｎｇ小分子／μｇ可溶性タンパク質である。
【００３７】
「基準時」という用語は、調査開始時に収集され、調査で見出された変化を測定する基となる情報を意味する。基準時サンプルは、フケ患者又は非フケ患者のものであってよい。
【００３８】
本発明の更なる実施形態では、使用されてよい、多数の他の「非侵襲的」サンプル採取法が存在する。
【００３９】
Ｓｅｂｕｔａｐｅ（商標）：これは、Ｓｅｂｕｔａｐｅ（商標）（アクリル酸ポリマーフィルム、ＣｕＤｅｒｍ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ））が極めて弱い粘着性を示し、目に見えて炎症を起こしている皮膚にも不快感を与えずに貼付して、取り外すことができる非侵襲的手法である。この方法により回収／測定されたバイオマーカーは、タンパク質（例えば、サイトカイン）、ペプチド（例えば、神経ペプチド）、及び小分子（例えば、酸化窒素）伝達物質を含んでいる。歴史的には、このテープは皮脂収集用に製造販売されているので、脂質分析に有用であり得る。
【００４０】
Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）：Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）テープはポリアクリル酸エステル接着剤であり、これもまたＣｕＤｅｒｍが製造している。このテープは、Ｓｅｂｕｔａｐｅ（商標）と同一のバイオマーカーの回収に用いられてよいが、特定の表皮構造タンパク質（例えば、ケラチン、インボルクリン）も取り出す。カップスクラブ法：カップスクラブ法は、通常、緩衝液及び非イオン性界面活性剤の存在下で、皮膚の表面からタンパク質を直接抽出する。カップスクラブ法は、主にサイトカインなど可溶性バイオマーカーの回収に用いられるが、有機小分子の回収にも用いられてよい。カップスクラブ法では、テープストリップよりも多くのサイトカインを回収し、定量化することができる。これは、いくつかの理由のためであり得る。（ａ）洗剤の存在及びそれらの液体の性質のために、カップスクラブ法は、テープストリップの場合と異なるタンパク質集団をサンプル採取する可能性が高い。（ｂ）カップスクラブ法を用いると、サイトカインは溶液中に既に存在するため、サンプル採取後にサイトカインを更に抽出する必要はない。
【００４１】
毛髪引き抜き：毛髪の引き抜きは、単位体を所有者の本体から通常ピンセットを用いて機械的に引っ張ることによって、ヒト又は動物の毛を取り去るプロセスである。毛髪引き抜きで得た小胞部は、通常サイトカインのような可溶性バイオマーカーの回復用の緩衝剤及び非イオン性界面活性剤の存在下で抽出され、また有機小分子を回復するために有機溶剤を用いて抽出されることも可能である。
【００４２】
動物（即ち、イヌ）収集法：Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）：Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（商標）テープサンプルは、イヌの毛皮を（剃毛せずに）分けて、イヌの皮膚で収集される。皮膚の炎症、分化、及び関門の完全性に関する様々なバイオマーカー、例えば、総タンパク量、可溶性タンパク質、皮膚多項目同時解析（皮膚ＭＡＰ）、皮膚サイトカイン、及び角質層脂質（セラミド、コレステロール、脂肪酸）などがテープから分析されてよい。
【００４３】
本発明の実施形態では、本発明は、小分子の分離で用いるためのサンプルを非侵襲的に得るための方法及び分析を提供する。
【００４４】
ある実施形態では、接着装置の使用は、かかるサンプル採取を達成するために用いられてよい。フケサンプル採取のための、かかるサンプル採取調査に備えて、認定選別員は、基準訪問時に、被験者ごとに粘着性頭皮フレーク化スコア（ＡＳＦＳ）評価を完了し、テープストリップサンプルの採取に関する最高フレーク化オクタントを決定する。最高フレーク化オクタントは、基準時並びに製品による処置中及び処置後の種々の時点で採取される。テープストリップサンプルは、各時点（例えば、基準時及び第３週）で被験者ごとに回収する。
【００４５】
テープストリップによるサンプル採取手順は、必要に応じて同じ位置で追加の回数を繰り返し、各Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）テープディスクを前回サンプル採取した領域の上に置く。サンプル採取後のＤ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）テープは、ラベル付きプレートの適切にラベルが貼られたウェルに入れる。
【００４６】
サンプル採取に続いて、抽出及び定量化手順を実行する。本発明の実施形態では、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ又はＧＣ／ＭＳ／ＭＳのいずれかによる分析を介してＤ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）テープサンプルの抽出部から小分子の定量を行うことができる。本発明のこの実施形態では、代謝産物発現プロファイリング技術に備えたサンプル抽出を実行した。
【００４７】
Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）テープサンプルプレートは、サンプル採取後に保管されている−８０℃の冷凍庫から取り出され、ドライアイスの上に置かれる。接着剤面を内側にして、予めラベル付けされたポリプロピレン採取管にテープストライプを挿入する。メタノール及び水を含有する抽出緩衝剤を各採取管に追加し、次に１５分間の超音波処理を用いて氷の上で抽出する。必要な場合、追加のテープを、抽出液を収容する採取管内に置き、サンプルを濃縮する手段として抽出プロセスを繰り返す。各抽出液をテープストリップから分離し、各サンプルのアリコートを前標識されたポリプロピレン採取管の中に入れ、代謝産物発現プロファイリング分析用に−８０℃で冷凍した。ＢＣＡ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いた可溶性タンパク質分析用に別個のアリコートを指定する。この分析では、メタノール及び水からなるアリコートをゆるやかな窒素の流れの下で乾燥する。サンプルを適切な水性緩衝剤（例えば、ＰＢＳ／ＳＤＳ（１Ｘ  ＰＢＳ＋０．２％  ＳＤＳ）に再懸濁し、可溶性タンパク質を分析する。
【００４８】
抽出プロセスに従って、既に説明したように代謝産物発現プロファイリング技術を実行する（Ｌａｗｔｏｎら、２００８）。抽出物をＧＣ／ＭＳ／ＭＳ及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって正負イオンモードで分析する。クロマトグラフィー分離とこれに続くフルスキャンマススペクトル及びＭＳ／ＭＳスペクトルを実行して、サンプル中に存在する感知可能なイオンを全て記録し定量化する。既知の化学構造を有する代謝産物を、イオンのクロマトグラフィー保持指標及びマススペクトルのフラグメンテーションのサインと、実験サンプルと同一の分析手順の下で信頼できる標準の代謝産物から作製された参照ライブラリのエントリとを照合することによって同定することができる。ウェルチの二標本ｔ検定及びマッチドペアｔ検定を使用してデータを分析する。全ての分析について、欠損値（有する場合）をその特定の化合物の観測された最小値に帰属させる（帰属した値はブロック正規化後に追加される）。自然対数変換したデータに統計分析を行って、データ中の潜在的異常値の影響を低減する。ウェルチの二標本ｔ検定比較を、表の上欄に列挙された様々な群からの各生化学的方法間で実施し、Ａｒｒａｙ  Ｓｔｕｄｉｏ（Ｏｍｉｃｓｏｆｔ，Ｉｎｃ）又はＦｒｅｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｉｎｃより入手可能な「Ｒ」という統計分析ソフトウェアプログラムのどちらか又は両方を用いて計算する。
【００４９】
方法の拡張
用いた抽出手順は本明細書に記載したが、上述のアウトラインが示された多数の工程に用いることができる別の方法が多数存在し、これらの方法は、論理的拡張である。テープストリップから小分子を分離するために用いた抽出溶媒は、好適な回収をもたらす、任意の適切な水性、有機、又は有機／水性混合物であってよい。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ及びＧＣ／ＭＳ／ＭＳは、その高い選択性及び感度のために、生体マトリックスにおける有機小分子の定量分析の最新法と一般に見なされている。しかし、要求される感度及び選択性をもたらす任意の分析法及び／又は他の方法を用いてよい。例えば、キャピラリー電気泳動、超臨界流体、及び他のクロマトグラフィー技術並びに／又はそれらの併用を含む、小分子バイオマーカーを評価する他の方法が種々の異なる検出モード（例えば、ＵＶ／Ｖｉｓ、蛍光、ＥＬＳＤ、ＣＡＤ、ＭＳ、及びＭＳ／ＭＳ）で使用されてきた。同様に、核磁気共鳴分光法、質量分析法、電気化学的アッセイ及び蛍光定量アッセイを含む、分離技術を用いない機器による手法もまた使用されてきた。更に、競合及び非競合酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などリガンド結合法又は他の標識化スキームも用いられてきた。酵素を使用するアッセイは、小分子の分析において長い使用歴を有する。細胞又は組織のいずれかを使用する方法を用いるバイオアッセイも、検出手段として用いられてきた。本発明の実施形態では、テープストリップサンプルに使用した方法と同じ基本の抽出方法及び分析方法を用いて、毛髪引き抜きから得た小分子の定量化を実行することができる。
【００５０】
テープストリップ抽出物のタンパク質定量：
上記の好適な方法を用いて測定した皮膚のテープストリップサンプル上の小分子代謝産物の濃度は、テープストリップ抽出物に見られるタンパク質量を用いて標準化してよい。標準化は、テープストリップ抽出物中のタンパク質の量で小分子濃度を除して行う。
【００５１】
テープストリップ抽出物又は皮膚上での小分子濃度の定量化に用いる等価マトリックス中のタンパク質の量は、文献に記載される様々なタンパク質定量法を用いて定量化してよい。かかる方法の例としては、任意の比色分析法、蛍光法、及び発光法を使用する総窒素定量、総アミノ酸定量、及びタンパク質定量が挙げられる。これらの方法は、タンパク質定量前のテープストリップ抽出物の更なるサンプル調製を含んでも含まなくてもよい。テープストリップ抽出物中のタンパク質定量に用いる特定の方法の非限定例については、下記に述べる。タンパク質定量法の包括的なレビュー、適用性、及び制限は、ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍ／Ｆｉｌｅｓ／１６０１６６９＿ＰＡｓｓａｙＦＩＮＡＬ＿Ｉｎｔｌ．ｐｄｆからダウンロードできるＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋに記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。タンパク質定量に関する更なる情報は、Ｒｅｄｉｎｂａｕｇｈ，Ｍ．Ｇ．ａｎｄ  Ｔｕｒｌｅｙ，Ｒ．Ｂ（１９８６）．Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｗｉｔｈ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅｓ  ａｎｄ  ｓｕｃｒｏｓｅ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｆｒａｃｔｉｏｎｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５３，２６７〜２７１に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５２】
ヒトの皮膚からサンプル採取した接着テープは、ＢＣＡ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いてタンパク質含有物を抽出し、分析する。ヒト皮膚からサンプル採取したテープストリップを従来の抽出緩衝剤を用いて抽出する。以降の抽出では、テープ抽出物のアリコートを９６ウェルのポリプロピレンディープウェルプレートに移し入れ、タンパク質定量に備えて２〜８℃で保管する。
【００５３】
ＢＣＡ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔは、アルカリ媒質中のタンパク質によるＣｕ2+のＣｕ1+への還元を使用しており、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）によるＣｕ+1の高感度かつ選択的な比色検出を併用する。２個のＢＣＡ分子と１個のＣｕ1+イオンのキレート化によって形成された紫色の反応生成物は、波長５６２ｎｍで強い吸光度を示す。光学密度（ＯＤ）は、マイクロプレートリーダーを用いて測定する。１ミリリットル当たりのマイクログラム（μｇ／ｍＬ）で表されるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の濃度を増加させて、測定時に較正曲線を生成するために用いる。ＢＳＡ原液から調製された適切な分析用ＱＣを用いて、サンプル分析中に分析性能をモニタリングする。
【００５４】
本発明の別の実施形態では、タンパク質定量は、ＳｑｕａｍｅＳｃａｎ（登録商標）８５０Ａ（ＣｕＤｅｒｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｄａｌｌａｓ，Ｔｅｘａｓ））を用いたタンパク質測定値など接着剤又は接着物品上のタンパク質の直接測定により行われてもよい。
【実施例】
【００５５】
代謝産物発現プロファイリング小分子研究のための基本手順
認定採点者により被験者を評価して、頭皮の状態を確認する。認定採点者によって評価した目に見えるフレーク化のレベルによってフケ被験者を識別する。非フケの健康な頭皮の被験者を基準時に評価して、各バイオマーカーの正常化レベルを確定する。この調査では、基準時に評価される６０人の非フケ被験者が存在する。１％のＺＰＴを含有するフケ予防シャンプーに割り当てられた１１９人のフケ患者、１％の硫化セレンを含有するフケ予防シャンプーに割り当てられた１１５人のフケ患者が存在する。これらの被験者を基準時、及び製品使用の３週間後に評価する。被験者は、フケ防止シャンプーを使用する治療期間前に、コンディショニング剤を含まない従来の非フケシャンプーを使用する２週間の休薬期間を経る。フケ被験者は、３週間のフケ予防シャンプー（１％ジンクピリチオン又は１％硫化セレンを含有するシャンプー組成物）を用いた処置期間を経て、テープストリップサンプルは、認定採点者による基準訪問時に決定された最高フレーク化オクタントから採取される。フケ被験者に対しては、頭皮テープストリップを基準時及び３週間の製品処置後に用いる。非フケ被験者に対しては、頭皮テープストリップを基準時にのみ用いる。テープは、抽出時まで−８０℃に保つ。フケが含まれる位置は、髪を分けて、Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）テープ（ＣｕＤｅｒｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を貼付し、必要に応じてテープを擦りつけて、サンプル採取される。非フケ被験者に対しては、フレークのない位置をサンプル採取する。テープを保管のために前標識された無菌１２ウェルプレート内に移し入れる。
【００５６】
氷の上での超音波処理による従来の抽出緩衝剤でサンプルを抽出する。Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）テープサンプルの抽出物のアリコートを前標識されたポリプロピレン採取管内に移動し、代謝産物発現プロファイリング分析用に−８０℃で冷凍する。ＢＣＡ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いた可溶性タンパク質分析用に別個のアリコートを指定する。この分析では、メタノール及び水からなるアリコートをゆるやかな窒素の流れの下で乾燥する。サンプルを適切な水性緩衝剤（例えば、ＰＢＳ／ＳＤＳ（１Ｘ  ＰＢＳ＋０．２％  ＳＤＳ）に再懸濁し、可溶性タンパク質を分析する。
【００５７】
以降の抽出では、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ，ＩｎｃによるＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（正負イオンモード）又はＧＣ／ＭＳ／ＭＳプラットフォームで代謝産物発現プロファイリング用にサンプルを分析する。化合物の相対定量値を次にサンプルの容量に従って調整し、上記のようにＢＣＡタンパク質アッセイにより定める抽出物中の可溶性タンパク質の量に標準化する。フケ予防シャンプー処置群から得た基準時及び第３週のサンプル、並びに非フケ群に対しては基準時のみについて分析を行う。代謝産物を検出し、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ化学参照ライブラリで整合した既知の化学構造に基づいて識別する。代謝産物の既知の化学構造との整合は、それぞれの一般的な生化学経路にマッピングされる。マッチドペアｔ検定を使用して、非フケ（健康な）、フケ基準時、及びフケ処置被験者間の違いを分析した。フケ処置被験者を非フケと比較して、フケ予防製品による処置の下で正常化の程度を判定する。
【００５８】
結果
代謝産物プロファイリングの方法及び条件下でテープストリップ中の全２５５生化学物質を検出する。これらの生化学物質は、皮膚の健康を更に理解するための豊富な情報源を提供する。非フケ被験者対フケ被験者を比較する統計分析により、皮膚の状態から健康な皮膚を識別するために使用することができる多数の生化学物質が明らかになった。これらの生化学物質は、フケ状態を診断するためのバイオマーカーとして有用となるだろう。多数の生化学物質は、基準時のフケ被験者とフケ予防シャンプーによる処置後のフケ被験者との間で大きく変化する。これらの生化学物質は、フケ状態の治療的改善の範囲及び完成度を判定するための有用なバイオマーカーとなるだろう。
【００５９】
表１は、フケサンプルと、非フケサンプルと、ジンクピリチオン（ＺＰＴ）又は硫化セレンのいずれかを含む種々のフケ予防処置による３週間の処置の前と後との間のいずれかで何らかの統計的優位性がある分子を列挙している。両方の処置は、異なるフケ予防有効成分を有する有効なフケ予防処方である。このマーカー群は、フケ状態と正常な頭皮の状態との間の違いを示し、フケ予防処置の有効性を評価する際に有用である。
【００６０】
表２〜表７は、フケと非フケと、フケ予防処置前後と、非フケ対フケ処置との間の比較のためにｐ値と同様、代謝経路に基づき各生化学物質の平均値を列挙する。
【００６１】
頭皮の刺激は、フケ患者の共通の症状である。炎症及び微生物に対する宿主免疫応答がその大きな要因である。炎症が、タンパク質、核酸、脂質、及び炭水化物を含む生体分子の全てのタイプに対し重大な構造破壊につながる細胞死を誘発する場合があることは既知である。アミノ酸、アミノ酸代謝中間体（表２）、ジペプチド（表３）、プリン及びピリミジン代謝中間体（表４）を含む列挙された小分子を皮膚の状態のバイオマーカーとして識別する。これらの分子の濃度は、非フケ被験者に対してフケ被験者では上昇し、フケ状態の改善を示すフケ予防シャンプーによる処置後に減少する。これは、フケ予防シャンプーによる処置後により少ない頭皮の刺激を報告した同じ臨床被験者からの自己評価データと矛盾しない。これらの代謝産物を皮膚の刺激の客観的尺度として使用してもよい。
【００６２】
いくつかの生化学物質は、酸化的ストレスを引き起こすことによって炎症を増大することがあると信じられている。例えば、プリンの代謝は、増大した炎症反応の指標となることができる（即ち、表４）。具体的には、ヒポキサンチンからキサンチンの転換及びそれに続くキサンチンから尿酸の転換は、Ｈ2Ｏ2の主要な発生源であるキサンチン酸化酵素を活性化する酸素を必要とする。ヒト皮膚の状況（例えば、フケ）において、増大した酸化的ストレスは、より高いレベルのプリン分解をもたらし、ヒポキサンチン及びキサンチンの濃度の上昇に反映される。フケ患者の頭皮から得られるテープストリップ中のアデノシン、グアニン、グアノシン、イノシン、ヒポキサンチン、及びキサンチンの濃度の著しい上昇は、増大した酸化的ストレスを示唆し、したがってこれらの代謝産物は酸化的ストレスを評価する有用なバイオマーカーである。例として、フケ患者（suffers）におけるキサンチンの基準時濃度は、非フケ群と比較してキサンチンの１３．７２倍の上昇（ｐ＜０．０５）が見られ、３週間のＺＰＴによるフケ予防処置後のフケ患者におけるキサンチンの濃度は、基準時と比較して著しく低下し（０．１６の変化倍率（即ち、８４％減少）、ｐ＜０．０５）、かつ非フケ群と比較して統計的に違いがなく、フケ状態が改善されたことを示唆する。硫化セレンによる別のフケ予防処置は、キサンチンについてＺＰＴによる処置と同様の変化倍率パターンが見られた。硫化セレン処置群について、フケ患者におけるキサンチンの基準時濃度は、非フケ群と比較して１５．９６倍の上昇（ｐ＜０．０５）が見られ、３週間の硫化セレンによるフケ予防処置後のフケ患者におけるキサンチンの濃度は、基準時と比較して著しく低下する（０．１５の変化倍率（即ち、８５％減少）、ｐ＜０．０５）。フケ処置被験者におけるキサンチンの濃度を健康な被験者と比較すると、変化倍率は、ＺＰＴによる処置前の１３．７２から処置後の２．１９まで減少し、硫化セレンによる処置前の１５．９６から処置後の２．３７まで減少した。これは、処置後の実質的な正常化を示す。
【００６３】
脂質代謝中間体
脂質は、複数の生物学的機能を有し、このことはそれらの代謝パターンにも反映される。多くの脂質は、フケ被験者と非フケ被験者とフケ予防シャンプーで処置したフケ被験者との間で有意差を示す。（表５）観察された全体的な傾向は、非フケと対比してフケ被験者におけるより高い濃度の脂肪酸、及びフケ予防シャンプーによる処置後のフケ被験者における脂肪酸濃度の減少である。例えば、リノレートは非フケと対比してフケで著しく高かった（ＺＰＴ及び硫化セレンの基準時フケ群は、それぞれ２．４５及び１．６倍の上昇を非フケ群と対比して示す）。フケ予防シャンプーによる処置後に、その濃度はフケ患者で減少し、基準時フケの濃度と比較して、ＺＰＴシャンプーについては０．１８（即ち、８２％減少）、及びセレンシャンプーについては０．２２（即ち、７８％減少）の変化倍率となり、両方とも統計的有意性がある。この観察結果は、構造脂質が障害のある障壁の結果としてフケ被験者において通常減少するため、やや反直観的である。この観察の合理的な説明は、頭皮表面のサンプル採取によるものであり、主にサンプル採取されるものが、頭皮微生物相（マラセジア）による食料源として使用するための脂肪酸に転換されつつある皮脂中のトリグリセリドのためである。追加の説明は、脂肪酸の過多が皮膚バリアの完全性の回復を含む細胞損傷の修復に必要であることである。したがって、脂肪酸濃度の減少した濃度は、有効なフケ予防シャンプーによる頭皮の健康及び機能の改善を示す。
【００６４】
いくつかの脂質化合物は、細胞及び組織中の炎症のシグナル伝達の開始及び伝播に重要である。これらの炎症メディエーターにシグナル伝達する脂質は、ホスホリン脂質Ａ2酵素によって原形質膜のリン脂質から遊離される。アラキドン酸遊離は、炎症プロセスの初期の間に増加する組織の損傷によって開始され得る。１％  ＺＰＴ又は１％硫化セレンのシャンプーによって処置したフケ被験者は、フケ基準時と比較すると著しく低い濃度のアラキドン酸が見られる。０．５６の変化倍率がＺＰＴについて観察され（即ち、４４％減少、ｐ値＜０．０５）、硫化セレンについては０．３０の変化倍率（即ち、７０％減少、ｐ値＜０．０５）であり、これはフケ状態の炎症性表現型の改善と矛盾しない。
【００６５】
頭皮の健康における脂質の重要性の更なる証拠は、リノール酸、脂肪酸１３−及び９−ヒドロキシオクタデカジエン酸（１３−ＨＯＤＥ、９−ＨＯＤＥ）の酸化形の検出である。ＨＯＤＥの濃度は、非フケ患者と対比してフケ患者で相対的に高い（変化倍率：ＺＰＴシャンプーについては１．９３、セレンシャンプーについては１．４１）。３週間のフケ予防シャンプー処置後、１３−ＨＯＤＥ＋９−ＨＯＤＥの濃度は対応する基準時サンプルと比較して著しく変化する。１３−ＨＯＤＥ＋９−ＨＯＤＥの変化倍率は、ＺＰＴ処置については０．２６（即ち、７４％減少、０．０５≦ｐ≦０．１０）であり、硫化セレン処置については０．３４（即ち、６６％減少、ｐ≦０．０５）である。脂質過酸化の増加は、原形質膜に影響する酸化的ストレスの増加のサインであると信じられる。１３−ＨＯＤＥ、９−ＨＯＤＥを含み、リノール酸の酸化から生じるモノヒドロキシ脂肪酸の形成は、脂質過酸化及び酸化的ストレスを示す。フケ予防シャンプーによるフケの処置は、フケサンプルと比較して１３−ＨＯＤＥ／９−ＨＯＤＥにおける有意な減少という結果になる。これは、より高いレベルのプリン分解の観察と矛盾せず、総合すれば、フケ表現型が炎症及び酸化的ストレスの成分を示すこと、及びフケ予防シャンプーによる処置が治療的改善をもたらすことを示唆する。
【００６６】
代謝パターンの異なるタイプを呈する、頭皮の健康にとって重要な脂質の追加の例は、パルミトイルエタノールアミド（ＰＥＡ）である。１３−ＨＯＤＥ／９−ＨＯＤＥと違い、（ＰＥＡ）は、フケ患者と比較してフケ予防シャンプーで処置したフケにおいて著しく高い濃度を示した。ＰＥＡ濃度は、フケ群と非フケ群との間でほぼ同じ程度である（ＺＰＴの変化倍率：１．４４、硫化セレンの変化倍率：０．７９、両方に統計的有意性なし）。しかしながら、ＺＰＴ処置の３週間後、ＰＥＡ濃度は、ＺＰＴシャンプーについては３．０８まで倍率が上がり、硫化セレンシャンプーについては６．６９倍の上昇があり、ｐ≦０．０５である。また、両方のフケ予防処置は、３週間処置と非フケ群と間でＰＥＡ濃度の変化倍率を著しく上昇させた（ＺＰＴ及び硫化セレンについてそれぞれ４．４３、及び５．２６倍、ｐ≦０．０５）。ＰＥＡは、内因性脂肪酸アミドとして、慢性疼痛、掻痒、及び炎症に関連する多種多様の生物学的機能を働かせることが示された。有効なフケ予防シャンプー処置は、治療機構の一部として抗炎症及び痒み止め機能のためにＰＥＡを増強してもよい。これは、フケ予防シャンプーによる処置後により少ない頭皮の刺激及びより少ない頭皮の掻痒を報告している同じ臨床被験者からの自己評価データと矛盾しない（表８）。３週間処置と非フケ群との間で有意な変化倍率データが観察される（変化倍率はＺＰＴについては４．４３、硫化セレンについては５．２６、両方ともｐ≦０．０５である）。第３週の処置の時点でフケ頭皮はまだいくらかの炎症を呈し、余分のＰＥＡが必要であると仮定される。
【００６７】
代謝産物を列挙した表６は、炭水化物及びそれらの代謝産物、エネルギーサイクル中の中間体、並びに酵素補因子に関係した。示されるのは、フケサンプルと非フケサンプルとの間、又はジンクピリチオン（ＺＰＴ）若しくは硫化セレンという異なるフケ予防有効成分を有する有効なフケ予防処方である両方の処置を含む種々のフケ予防処置による３週間の処置の前後間のいずれかで有意差を示す生体分子である。その結果は、フケと正常の頭皮状態との間、及びフケ基準時とフケ処置状態との間の違いを示し、これはフケ予防処置の有効性を評価する際に有用である。
【００６８】
メタボノミクス技術は、代謝産物分離及び代謝産物識別という２つの主要な技術的側面を含む。この時点では、代謝産物及び小分子化合物のいくつかの素性が未知であるが、「名前のない」化合物は、分析技術により十分に特徴付けられ、そのような識別を可能にするため、そのような素性は被験者からの生体サンプル中の代謝産物又は小分子化合物の識別に必要ではない。全てのそのような「名前のない」化合物の分析的特徴付けを表７に列挙する。そのような「名前のない」代謝産物及び小分子化合物を、本明細書では「Ｘ」に続き特定の化合物番号という命名法を用いて指定する。表７は、フケサンプルと非フケサンプルとの間、又はジンクピリチオン（ＺＰＴ）若しくは硫化セレン、若しくは両方の処置を含む種々のフケ予防処置による３週間の処置の前後の間のいずれかで有意な統計的相違度を有する４５個の代謝産物を列挙する。これらの化合物はまた、フケを非フケと識別するためのマーカー及び／又はフケ予防シャンプー処置の有効性の指標として使用することもできる。
【００６９】
フケに関連する徴候及び症状を評価するために、アンケートを使用した。この情報は、頭皮の健康状態の独立した基準を提供する。自己評価の質問では、フケ被験者は、基準時及び製品使用の３週間後に以下に列挙した彼らのフケの徴候及び症状の程度に関する４つの質問に回答した。被験者が用いた尺度は以下の説明に従って０〜４で表された。
【００７０】
尺度：
１．自己評価尺度（０〜４）
０＝なし、１＝軽度、２＝中等度、３＝重度、４＝極めて重度
２．専門家の評価尺度（０〜８０）
フケ≧２４
非フケ≦８
【００７１】
自己評価の質問：
今日の痒みの程度はどのくらいだと思いますか？
今日の刺激の程度はどのくらいだと思いますか？
今日の乾燥の程度はどのくらいだと思いますか？
今日のフレーク化の程度はどのくらいだと思いますか？
【００７２】
小分子バイオマーカーと自己評価／臨床症状との関連性
臨床被験者は、フケ予防シャンプーによる３週間の処置期間後にフケの徴候及び症状の減少を報告した（表８）。専門検査員はまた、フケ予防シャンプーによる処置後にフレーク化のスコアにおいて実質的な減少を報告する。これらの結果は、頭皮の健康の全体的な改善と矛盾しない。これらの同じ被験者で観察された生化学物質分子はまた、頭皮の健康の全体的な改善と矛盾しない。例えば、刺激は、炎症及び宿主免疫防御反応と関連性が高い。フケ被験者における炎症のシグナル伝達に関わる脂質に加えて、高濃度の遊離アミノ酸、ジペプチド、核酸のような本発明によって明らかにされた多くの分子は、フケ患者が経験した刺激とこれらの炎症の分子指標との間のリンクを強く支援する。この直接相関は、刺激の認識に対する客観測定を提供してきた。主観的尺度は、皮膚状態を評価するために一般に用いられており、典型的には、専門検査員及び／又は自己評価のいずれかを含む。これらのタイプの測定は有用であるが、評価者によって本質的に偏りが生じる。客観的尺度は、偏りが生じる機会を有さないため、より厳密かつ科学的なデータを示す。
【００７３】
概して、これらの小分子バイオマーカーは、フケの治療的解決の範囲及び完全性を示す関連の評価基準として機能するのと同様にフケ状態のより詳細な病態生理学的説明を可能にするための客観的尺度として機能することができる。
【００７４】
特定の実施形態では、そのような性能評価は、組成物による処置の前後の被験者の皮膚の健康状態を比較するのに有利になり得る。例えば、一部のフケ予防組成物は、被験者が特定のフケ予防組成物又はレジメンに切り替え、維持する場合被験者が経験するであろう好転をより速い速度で促進することができる。被験者の個別の皮膚健康上の利益の客観測定を可能にする評価は、特定のフケ予防組成物又はレジメンによる処置前と、被験者が特定のフケ予防組成物又はレジメンに切り替えた後の被験者の状態の比較を可能にし得る。加えて、そのような評価は、特定の処置又はレジメンが促進する特定の皮膚健康上の利益の主張を支援する支援認定ツール（supporting credentialing tool）として使用することができる。例えば、特定の組成物又はレジメンが掻痒の症状を軽減することを宣伝している場合、掻痒からくる被験者の不快が低減したことを示すために本明細書に開示するような評価を使用して特定の健康上の利益の主張を支援することができる。フケ予防組成物及びレジメンによって利益を受け得る皮膚の健康の非限定的な要素として、掻痒、フレーク化、刺激、皮膚バリアの完全性、乾燥、酸化的ストレス及び酸化的損傷、自己防衛、自然な防御が挙げられる。
【００７５】
多数の分析の結果をマーケティング又は広告の情報として用いて、特定の製品、製品の併用、及び技術の有効性を宣伝することもできる。本発明によって確認され得る製品パッケージ上に記載できる広告主張の実施例として、証明の主張（例えば、「臨床的に証明された」又は「試験が示す」）、前後の主張（例えば、「使用後に５０％のフケ減少」）、単項の主張、比較による主張、係数の主張（例えば、「フケにおいて３倍の減少」）、並びに予防及び処置の主張が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、製品パッケージは、分析を参照し、客観的に証明された製品の有効性又は比較を示してもよい。また、異なる製品又は製品のグループと組み合わせて使用してもしなくてもよい異なるレジメンに関する臨床情報に分析データを使用してもよい。
【００７６】
更なる実施形態として、使用前のバイオマーカーの基準時濃度と比較すると、ジンクピリチオンシャンプーの使用後の標準化されたバイオマーカーに変化があることが挙げられる。別の実施形態では、使用前のバイオマーカーの基準時濃度と比較すると、硫化セレンシャンプーの使用後の標準化された分子バイオマーカーに変化がある。更なる実施形態では、処置後に正常な集団と比較して皮膚の健康において少なくとも５％の改善を立証するバイオマーカーの単位があってもよい。更なる実施形態では、処置後に正常な集団と比較して皮膚の健康において少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％の改善及び更に、１００％の改善があり得る。別の実施形態では、フケと非フケ（処置なし）との間に少なくとも５％の差があり得る。更に、少なくとも１０％の差がフケと非フケとの間に、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％の差がフケと非フケとの間に、及び更に、１００％以上の差がフケと非フケとの間にあり得る。
【００７７】
本明細書に開示した寸法及び値は、記載された正確な数値に厳密に限定されるものと理解されるべきではない。むしろ、特に断らないかぎり、そのような寸法のそれぞれは、記載された値及びその値の周辺の機能的に同等の範囲の両方を意味するものとする。例えば、「４０ｍｍ」として開示される寸法は、「約４０ｍｍ」を意味することを意図する。
【００７８】
「発明を実施するための形態」で引用する全ての文献は、関連部分において本明細書に参照により組み込まれるが、いずれの文献の引用も、それが本発明に関する先行技術であることを容認するものとして解釈されるべきではない。本明細書中の用語の任意の意味又は定義が、参照により組み込まれた文献中の同一用語の任意の意味又は定義と相反する限りにおいては、本明細書においてその用語に与えられた意味又は定義を適用する。
【００７９】
本発明の特定の実施形態が例示され記載されてきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく他の様々な変更及び修正を実施できることが、当業者には自明であろう。したがって、本発明の範囲内にあるそのようなすべての変更及び修正を添付の特許請求の範囲で扱うものとする。
【００８０】
【表１−１】
2016510878.tif 000002
【００８１】
【表１−２】
2016510878.tif 000003
【００８２】
【表１−３】
2016510878.tif 000004
【００８３】
【表１−４】
2016510878.tif 000005
【００８４】
【表１−５】
2016510878.tif 000006
*  ｐ≦０．０５、比＜１
**  ０．０５≦ｐ≦０．１０、比≧１
***  ｐ≦０．０５、比＜１
****  ０．０５≦ｐ≦０．１０、比≧１
【００８５】
【表２】
2016510878.tif 000007
【００８６】
【表３】
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【００８７】
【表４】
2016510878.tif 000009
【００８８】
【表５】
2016510878.tif 000010
【００８９】
【表６−１】
2016510878.tif 000011
【００９０】
【表６−２】
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【００９１】
【表７】
2016510878.tif 000013
【００９２】
【表８】
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【００９３】
【表９】
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【国際調査報告】
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