(57)【要約】  本発明は、第１および第２のデングワクチンを含むデングウイルスワクチン組成物であって、前記第１のデングワクチンが生弱毒化デングワクチンであり、前記第２のデングワクチンが組換えデングサブユニットワクチンまたは不活性化デングワクチンであり；前記生弱毒化デングワクチンが、少なくとも１つの生弱毒化デングウイルスまたは少なくとも１つの生弱毒化キメラフラビウイルスを含むデングウイルスワクチン組成物に関する。本発明のデングウイルスワクチン組成物は、１つ以上のアジュバントをさらに含み得る。本発明の好ましい実施形態では、第１および第２のデングワクチンは四価である。本発明はまた、本発明のデングウイルスワクチン組成物を使用して、デング感染症を治療もしくは予防するか、またはその臨床徴候の発症もしくは進行を予防、改善もしくは遅延する方法に関する。【選択図】図１
2016523251.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１および第２のデングワクチンを含むデングウイルスワクチン組成物であって、前記第１のデングワクチンが生弱毒化デングワクチンであり、前記第２のデングワクチンが非複製デングワクチンであり；前記生弱毒化デングワクチンが、少なくとも１つの生弱毒化デングウイルスまたは少なくとも１つの生弱毒化キメラフラビウイルスを含む、デングウイルスワクチン組成物。
【請求項２】
前記非複製デングワクチンが、組換えデングサブユニットワクチンまたは不活性化デングワクチンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第２のデングワクチンが、デングウイルス１型（ＤＥＮ１）、デングウイルス２型（ＤＥＮ２）、デングウイルス３型（ＤＥＮ３）およびデングウイルス４型（ＤＥＮ４）由来のデングＥタンパク質またはその断片を含む四価デングサブユニットワクチンである、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記Ｅタンパク質がそれぞれ、Ｎ末端のアミノ酸残基１から開始して、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４の野生型Ｅの長さの約８０％を構成する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
アジュバントをさらに含む、請求項３または請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記アジュバントがアルミニウム塩アジュバントである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物中のアルミニウム元素の量が約５０μｇ〜約１．２５ｍｇである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物中のアルミニウム元素の量が約２００μｇ〜約８５０μｇである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記アジュバントがサポニン系アジュバントである、請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物中の各Ｅタンパク質の量が約０．５μｇ〜約５００μｇである、請求項３〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物中の各Ｅタンパク質の量が約１．０μｇ〜約１００μｇである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ＤＥＮ４  Ｅタンパク質の量が、ＤＥＮ１  Ｅタンパク質、ＤＥＮ２  Ｅタンパク質およびＤＥＮ３  Ｅタンパク質の量の約１．５〜約２．５倍である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
各Ｅタンパク質を組換え生産し、昆虫宿主細胞で発現させる、請求項１０〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
前記生弱毒化デングワクチンが四価である、請求項１〜１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
前記生弱毒化デングワクチンが４つのキメラフラビウイルスを含み；各キメラフラビウイルスが、単一のデングウイルス血清型のｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質と、異なるフラビウイルスのカプシドタンパク質および非構造タンパク質とを含み、前記各キメラフラビウイルスが弱毒化されている、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記４つのキメラフラビウイルスのカプシドタンパク質および非構造タンパク質が黄熱病ウイルスに由来する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記４つの各キメラフラビウイルスのカプシドタンパク質および非構造タンパク質が、前記ｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質と異なるデング血清型に由来する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記生弱毒化デングワクチンの効力が、１０〜約１×１０７プラーク形成単位（ＰＦＵ）である、請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
前記生弱毒化デングワクチンの効力が、約１×１０３〜約１×１０５ＰＦＵである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
デングに対する免疫応答の誘導を必要とする患者におけるデングに対する免疫応答を誘導する方法であって、有効量の請求項１〜１９のいずれかに記載のデングウイルスワクチン組成物を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項２１】
デング感染症の予防またはその症候の予防もしくは改善を必要とする患者におけるデング感染症を予防するか、またはその症候を予防もしくは改善する方法であって、有効量の請求項１〜１９のいずれかに記載のデングウイルスワクチン組成物を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項２２】
デング感染症を予防するか、またはその症候を予防もしくは改善する方法であって、
（ａ）第１および第２のデングワクチンを混合して、デングウイルスワクチン組成物を形成する工程であって、前記第１のデングワクチンが生弱毒化デングワクチンであり、前記第２のデングワクチンが非複製デングワクチンである工程；ならびに
（ｂ）工程（ａ）のデングウイルスワクチン組成物を、デング感染症またはその症候を予防または改善すべき患者に投与する工程
を含む、方法。
【請求項２３】
前記非複製デングワクチンが、組換えデングサブユニットワクチンまたは不活性化デングワクチンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１のデングワクチンが四価であり、ＤＥＮ１成分、ＤＥＮ２成分、ＤＥＮ３成分およびＤＥＮ４成分を含み、各成分が、生弱毒化デングウイルスまたは生弱毒化キメラフラビウイルスのいずれかを含む、請求項２２または請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２のデングワクチンが、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４由来のデングＥタンパク質またはその断片を含む四価組換えデングサブユニットワクチンである、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記生弱毒化ワクチンが凍結乾燥されており、前記組換えサブユニットワクチンが混合前には液体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
工程（ａ）の混合が、前記液体ワクチンで前記凍結乾燥ワクチンを再構成することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
工程（ａ）で前記液体ワクチンと混合する前に、滅菌希釈剤で前記凍結乾燥ワクチンを再構成する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記生弱毒化ワクチンおよび前記組換えサブユニットワクチンの両方が、混合前には液体の形態である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｅタンパク質がそれぞれ、Ｎ末端のアミノ酸残基１から開始して、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４の野生型Ｅの長さの約８０％を構成する、請求項２５〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記生弱毒化ワクチンが４つのキメラフラビウイルスを含み；前記各キメラフラビウイルスが、単一のデングウイルス血清型のｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質と、異なるフラビウイルスのカプシドタンパク質および非構造タンパク質とを含み、前記各キメラフラビウイルスが弱毒化されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
前記４つのキメラフラビウイルスのカプシドタンパク質および非構造タンパク質が黄熱病ウイルスに由来する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記４つの各キメラフラビウイルスのカプシドタンパク質および非構造タンパク質が、前記ｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質と異なるデング血清型に由来する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
デング感染症の可能性の防止または低減を必要とする患者におけるデング感染症の可能性を防止または低減する方法であって、
（ａ）請求項１〜１９のいずれかに記載の第１のデングウイルスワクチン組成物を前記患者に投与する工程；
（ｂ）工程（ａ）の後、所定の期間が経過するのを待つ工程；
（ｃ）請求項１〜１９のいずれかに記載の第２のデングウイルスワクチン組成物を前記患者に投与する工程；
を含み、それにより、前記患者における前記デング感染症を予防するか、またはデング感染の可能性を低減する、方法。
【請求項３５】
前記第１および第２のデングウイルスワクチン組成物が同じものである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
工程（ｂ）における前記期間が２カ月間〜２年間である、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
工程（ｂ）および（ｃ）を１回以上繰り返すことをさらに含む、請求項３４〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
筋肉内注射または皮下注射によって、前記第１および第２のデングウイルスワクチン組成物を投与する、請求項３４〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
デング感染症に関連する疾患を治療または予防するための、請求項１〜１９のいずれかに記載のデングウイルスワクチン組成物の使用。
【請求項４０】
患者におけるデングウイルスに対する免疫応答を誘導するための、請求項１〜１９のいずれかに記載のデングウイルスワクチン組成物の使用。
【請求項４１】
デング感染症に関連する疾患の治療または予防に使用するための、請求項１〜１９のいずれかに記載のデングウイルスワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デングウイルス感染症に対する免疫応答を誘発する組成物であって、被験体におけるデングウイルス感染症および／またはその臨床徴候の予防および／または治療に有用な組成物に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年６月２１日に出願された米国仮出願第６１／８３７，７２１号（この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
【０００３】
電子提出された配列表の参照
本出願の配列表は、ＡＳＣＩＩ形式の配列表（ファイル名「２３５３２ＷＯＰＣＴ−ＳＥＱＬＩＳＴ−１３ＪＵＮＥ２０１４．ＴＸＴ」、作成日２０１４年６月１３日およびサイズ１７．５ＫＢ）としてＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子提出される。ＥＦＳ−Ｗｅｂで提出されるこの配列表は本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
フラビウイルス科は、原型黄熱病ウイルス（ＹＦ）、デングウイルスの４つの血清型（ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４）、日本脳炎ウイルス（ＪＥ）、ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）、西ナイルウイルス（ＷＮ）、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥ）および約７０の他の疾患を引き起こすウイルスを含む。フラビウイルスは、一本鎖のプラス鎖ＲＮＡゲノムを含む小型のエンベロープウイルスである。１０個の遺伝子産物が単一のオープンリーディングフレームにコードされており、カプシド（Ｃ）、「プレ膜」（ｐｒＭ、細胞からビリオンが放出する直前に「膜」（Ｍ）になる）、「エンベロープ」（Ｅ）、に続いて非構造（ＮＳ）タンパク質ＮＳ１、ＮＳ２ａ、ＮＳ２ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂおよびＮＳ５の順に組織化され、ポリタンパク質として翻訳される（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９０）４４：６４９−６８８；Ｈｅｎｃｈａｌ，Ｅ．Ａ．ａｎｄ  Ｐｕｔｎａｋ，Ｊ．Ｒ．，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．（１９９０）３：３７６−３９６に概説されている）。次いで、ウイルスがコードするプロテアーゼだけではなく、宿主によっても媒介される正確なプロセシングイベントによって、個々のフラビウイルスタンパク質が産生される。
【０００５】
フラビウイルスのエンベロープは宿主細胞膜に由来し、ウイルスがコードする、膜にアンカリングされた膜（Ｍ）糖タンパク質およびエンベロープ（Ｅ）糖タンパク質を含む。Ｅ糖タンパク質は、最大のウイルス構造タンパク質であり、細胞表面接着および内部エンドゾーム融合活性に関与する機能ドメインを含む。それはまた、防御免疫に関連するウイルス中和抗体の産生を誘導する宿主免疫系の主な標的である。
【０００６】
デングウイルスはヤブカ属の蚊、主にネッタイシマカおよびヒトスジシマカによって人に伝染する。デングウイルスによる感染は、不顕性または軽度の熱病から、典型的なデング熱（ＤＦ）を経由して、デング出血熱／デングショック症候群（ＤＨＦ／ＤＳＳ）に至る様々な範囲の臨床像をもたらす。デング熱は、高熱、頭痛、関節痛と筋肉痛、発疹、リンパ節症および白血球減少症によって特徴付けられる（Ｇｉｂｂｏｎｓ，Ｒ．Ｖ．ａｎｄ  Ｄ．Ｗ．Ｖａｕｇｈｎ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２００２）３２４：１５６３−１５６６）。ＤＨＦ／ＤＳＳは、点状出血および斑状出血の存在から重度の特発性出血および深いショックにまでの範囲の血管透過性および／または重度の出血症状によって特徴付けられる、子供においてより多いより重度の感染形態である。診断および迅速な医療介入がなければ、ＤＨＦ／ＤＳＳの突然の発病と急速な進行は、治療しなければ死に至り得る。
【０００７】
デングウイルスは、地球規模の罹患率および死亡率の観点から、節足動物媒介性ウイルスの最も重要なグループであり、推定１億件のデング感染症（少なくとも３６００万症例のデング熱および２５０，０００〜５００，０００症例のＤＨＦ／ＤＳＳを含む）が毎年発生している（Ｇｕｂｌｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９８）１１：４８０−４９６；上記Ｇｉｂｂｏｎｓ）。地球規模の人口増加、特に熱帯全域の住民の都市化、および長期の蚊対策の欠如により、デングウイルスのベクターである蚊は、熱帯、亜熱帯およびいくつかの温帯地域全域にその分布を拡げ、デング感染症のリスクを世界人口の半分以上にもたらした。現代のジェット機旅行および人間の移住がデングウイルス血清型の地球規模の分布を助長した結果、今やデングウイルスの複数の血清型が多数の地域において風土病となっている。過去２０年以上にわたり、デング熱流行の頻度およびＤＨＦ／ＤＳＳの発生率が増加している。例えば、東南アジアでは、ＤＨＦ／ＤＳＳは、子供の入院および死亡の主因である（上記Ｇｕｂｌｅｒ；上記Ｇｉｂｂｏｎｓ  ａｎｄ  Ｖａｕｇｈｎ）。
【０００８】
これまで、フラビウイルスワクチンの開発は、失敗と成功の繰り返しであった。フラビウイルスによって引き起こされる疾患を防ぐためのワクチン候補を生産するために行われてきた基本的なアプローチは４つある：生弱毒化、不活性化全ウイルス、組換えサブユニットタンパク質およびＤＮＡ系ワクチン。黄熱病ウイルスの生弱毒化ワクチンは何十年も利用されており、より最近では、日本脳炎の生弱毒化ワクチンが世界中の様々な国々で登録されている。不活性化全ウイルスワクチンの使用は、ＴＢＥおよびＪＥウイルスに対して実証されており、いくつかの登録製品が利用可能である。Ｈｅｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０：４３０１−０６（２０１２）。
【０００９】
上で強調したＹＥ、ＪＥおよびＴＢＥワクチンの成功にもかかわらず、デングウイルスのワクチンを開発するための生弱毒化ウイルスおよび不活性化ウイルス法の使用は、重大な難題に突き当たっている。デングウイルスの血清型は４つあり（ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４）、各血清型のウイルス株は、世界のデング熱風土病地域全域で広まっていることが認められている。自然感染は、感染血清型に対する長期持続型の免疫を付与するが、他のデング血清型に対する免疫を付与しない。ある血清型のデングウイルスが感染した後に他の血清型が二次感染すると、ほとんどの場合において、デング二次感染後に重症型の疾患（ＤＨＦ／ＤＳＳ）が生じる。ＤＨＦおよびＤＳＳと二次デング感染との高い関連性は、第２のデングウイルス型の感染性を増強するウイルス型による感染によって誘導される非中和抗体によるものであると仮説されている（抗体依存性増強‐ＡＤＥ）。
【００１０】
これまで、臨床試験されたワクチンの大部分は、生弱毒化ワクチンである。非複製ワクチン候補の使用も検討されている。例えば、Ｉｖｙら（米国特許第６，４３２，４１１号）には、ＤＥＮ１−４  ８０％Ｅ（ＤＥＮ−２エンベロープポリペプチドのアミノ酸１〜３９５に相当する）タンパク質を含む四価サブユニットワクチンが開示されている。上記Ｉｖｙらには、ＤＥＮ１−４  ８０％ＥおよびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントも報告されている。Ｃｏｌｌｅｒら（国際公開第２０１２／１５４２０２号）には、ＤＥＮ１−４のＤＥＮ１−４  ８０％Ｅを含む四価製剤が開示されている。不活性化ウイルスはまた、潜在的なワクチン候補として、または有効なワクチンの成分として使用され得る（Ｐｕｔｎａｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３：４４４２−４４５２（２００５）、米国特許第６１９０８５９号、米国特許第６２５４８７３号およびＳｔｅｒｎｅｒらの国際公開第２００７／００２４７０号）。
【００１１】
しかしながら、このようなデングワクチンの開発努力にもかかわらず、これまでに、デングワクチンは現在登録されていない。したがって、デング感染症および／またはデング関連疾患に対する防御免疫応答を誘導し得る安定した安全かつ有効なワクチンが依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第６，４３２，４１１号
【特許文献２】国際公開第２０１２／１５４２０２号
【特許文献３】米国特許第６１９０８５９号
【特許文献４】米国特許第６２５４８７３号
【特許文献５】国際公開第２００７／００２４７０号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９０）４４：６４９−６８８
【非特許文献２】Ｈｅｎｃｈａｌ，Ｅ．Ａ．ａｎｄ  Ｐｕｔｎａｋ，Ｊ．Ｒ．，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．（１９９０）３：３７６−３９６
【非特許文献３】Ｇｉｂｂｏｎｓ，Ｒ．Ｖ．ａｎｄ  Ｄ．Ｗ．Ｖａｕｇｈｎ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２００２）３２４：１５６３−１５６６
【非特許文献４】Ｇｕｂｌｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９８）１１：４８０−４９６
【非特許文献５】Ｈｅｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０：４３０１−０６（２０１２）
【非特許文献６】Ｐｕｔｎａｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３：４４４２−４４５２（２００５）
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、生弱毒化デングワクチン（「ＬＡＶ」）および第２のデングワクチンを含むデングウイルスワクチン組成物であって、前記第２のデングワクチンが非複製デングワクチンであるデングウイルスワクチン組成物に関する。いくつかの実施形態では、非複製デングワクチンは、組換えデングサブユニットワクチン、ＤＮＡワクチン、コンジュゲートワクチンまたは不活性化デングワクチンから選択され、生弱毒化デングワクチンは、少なくとも１つの生弱毒化デングウイルスまたは生弱毒化キメラデングウイルスを含む。さらなる実施形態では、非複製ワクチンは、デングサブユニットワクチンまたは不活性化デングワクチンのいずれかである。本発明のいくつかの実施形態では、ＬＡＶは、四価である（すなわち、ＤＥＮ１−４由来の生弱毒化デングウイルスまたはＤＥＮ１−４由来のキメラ生弱毒化デングウイルスまたはそれらの組み合わせを含む）。本発明のいくつかの実施形態では、第２のワクチンは、少なくとも１つのデングエンベロープ（Ｅ）タンパク質またはその断片を含む組換えサブユニットワクチンである。本発明の好ましい実施形態では、デングサブユニットワクチンは四価であり、Ｎ末端のアミノ酸残基１から開始して、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４の野生型Ｅの長さの約８０％からそれぞれがなる切断型デングＥタンパク質を含む。第２デングワクチンが生弱毒化ワクチンと同じ組成物中に存在することは、生ウイルスの生存率に有意な影響を与えないことが見出されたので、生ワクチンおよび非複製ワクチンを同じ製剤で投与することが可能になる。
【００１５】
本発明のさらに好ましい実施形態では、生弱毒化デングワクチンは四価であり、４つのキメラフラビウイルスを含み；４つの各キメラフラビウイルスは、単一のデングウイルス血清型のｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質と、異なるフラビウイルスのカプシドタンパク質および非構造タンパク質とを含み、各キメラフラビウイルスは弱毒化されている。本発明のいくつかの実施形態では、４つのキメラフラビウイルスのカプシドタンパク質および非構造タンパク質は、黄熱病ウイルスに由来する。代替的な好ましい実施形態では、４つの各キメラフラビウイルスのカプシドタンパク質および非構造タンパク質は、ｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質と異なるデング血清型に由来する。
【００１６】
本発明はまた、生弱毒化デングワクチンと、組換えデングサブユニットワクチンと、アジュバントとを含むデングウイルスワクチン組成物に関する。本明細書に記載されるいくつかの実施形態では、アジュバントは、アルミニウム塩アジュバントである。代替的な実施形態では、アジュバントは、サポニン系アジュバントまたはｔｏｌｌ様受容体アゴニストアジュバントである。
【００１７】
本発明の他の態様は、デング感染症を予防するか、またはその症候を予防もしくは改善する方法であって、有効量の本発明のデングウイルスワクチン組成物を被験体に投与することを含む方法を含む。本発明のこの態様のさらなる実施形態では、前記組成物の用量を患者に投与し、所定の期間を経過させ、２回目に前記組成物の第２の用量を患者に投与するプライム／ブーストレジームで、前記組成物を投与する。各投与間において所定の期間が経過した後に、さらなる用量を患者に投与してもよい。
【００１８】
さらなる実施形態では、本発明は、デング感染症に対する免疫応答を誘導することによって、デング感染症の可能性を低減する方法であって、（ａ）生弱毒化四価デングワクチンを含む第１のワクチンと、組換え四価デングサブユニットワクチンまたは不活性化デングワクチンを含む第２のワクチンとを混合して、デングウイルスワクチン組成物を形成する工程であって、前記生弱毒化四価デングワクチンが、デング血清型１−４の生弱毒化デングウイルスまたは生弱毒化キメラデングウイルスを含み；前記組換え四価デングサブユニットワクチンが、デング血清型１−４のデングエンベロープ（Ｅ）タンパク質またはその断片を含む工程；（ｂ）混合後の工程（ａ）のデングウイルスワクチン組成物を、免疫応答を誘導すべき患者に投与することによって、デング感染症の可能性を低減する工程を含む方法に関する。前記方法のいくつかの実施形態では、免疫応答は、デング感染症を予防するか、またはその症候を予防もしくは改善する。本発明のこの態様のさらなる実施形態では、所定の期間を経過させた後に、前記組成物の第２の用量を患者に投与する。単一のバイアル中または２つの別個のバイアル中で、前記組成物の第２の用量の第１および第２のワクチンを製剤化し、患者への投与前に一緒に混合し得る。
【００１９】
本発明はまた、デング感染症に関連する疾患、例えばデング熱、ＤＳＳまたはＤＨＦを治療または予防するための、本発明のデングウイルスワクチン組成物の使用に関する。
【００２０】
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して使用される場合、特に文脈上明確な指示がない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、複数の指示対象を含む。
【００２１】
示されている可能性の一方が文脈上明確に指示されていない限り、「または」への言及は、いずれかまたは両方の可能性を示す。いくつかの場合では、いずれかまたは両方の可能性を強調するために、「および／または」を用いた。
【００２２】
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して使用される場合、以下の定義および略語が適用される：
本明細書では「ＬＡＶ」とも称される用語「生弱毒化ワクチン」は、有効量の少なくとも１つの生弱毒化デングウイルスおよび／またはキメラデングウイルスと、薬学的に許容され得る担体とを含むワクチンであって、疾患を引き起こすウイルスの能力が野生型デングウイルスと比較して低下しているワクチンを意味する。
【００２３】
用語「キメラフラビウイルスワクチン」は、デングウイルス血清型のｐｒＭタンパク質および／またはＥタンパク質を含有する有効量のウイルスと、第２の異なるフラビウイルスのカプシドタンパク質および非構造タンパク質と、薬学的に許容され得る担体とを含むワクチンを指す。第２のフラビウイルスは、異なるデング血清型または別のフラビウイルス、例えば黄熱病ウイルスであり得る。
【００２４】
「非複製ワクチン」は、デングウイルス感染症またはその臨床症候を予防または治療するためのデングウイルスワクチンであって、組換えサブユニットワクチン、不活性化ワクチン、コンジュゲートワクチンまたはＤＮＡワクチンから選択されるデングウイルスワクチンを指す。
【００２５】
「不活性化ワクチン」は、有効量の死滅または不活性化全デングウイルスと、薬学的に許容され得る担体とを含むワクチンであって、化学物質、熱または放射線を含む任意の手段によって、ウイルスが不活性化されているワクチンを指す。不活性化ワクチンは、不活性化後に低い残存感染性（例えば、不活性化後に５プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍＬ未満）を有する。好ましい実施形態では、不活性化後に非常に少量の残存感染性、例えば０．４ＰＦＵ／ｍＬ以下、３ＰＦＵ／ｍＬ以下、または２ＰＦＵ／ｍＬ以下、１ＰＦＵ／ｍＬ未満、０．５ＰＦＵ／ｍＬ以下、または０．１ＰＦＵ／ｍＬ以下がある。特定のワクチンのＰＦＵは、例えば、プラークアッセイ、免疫染色アッセイ、またはウイルス感染性を検出するための当技術分野で公知の他の方法を使用することによって決定され得る。
【００２６】
「コンジュゲートワクチン」は、担体タンパク質に共有結合したデング抗原を含むワクチンを指す。
【００２７】
「ＤＮＡワクチン」は、デングタンパク質、デングタンパク質断片およびデング熱融合タンパク質ならびにそれらの変異体を含むデングタンパク質抗原をコードするヌクレオチド配列を含むワクチンである。ＤＮＡワクチンは、目的の抗原をコードするヌクレオチド配列であって、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含むプラスミド（例えば、ＤＮＡまたはウイルスプラスミド）を含む。
【００２８】
「サブユニットワクチン」は、完全なデングウイルスではない１つ以上のデング抗原成分、例えばデング免疫原性エピトープ、デングタンパク質、デング抗原融合タンパク質（異なるデング血清型抗原の融合物を含む）またはデングタンパク質断片を含むワクチンを指す。本明細書で使用されるサブユニットワクチンは、一価（単一のデング抗原を含む）または多価（複数の抗原成分を含む）であり得る。好ましい実施形態では、サブユニットワクチンは、四価である。
【００２９】
本発明の組成物に使用されるデングウイルスワクチンは、ヒト志願者における相同デングウイルスに対するウイルス中和抗体応答を誘導するのに有効であり、健常ヒト被験体および有リスクヒト被験体に関して許容され得る安全性プロファイルを有するべきである。
【００３０】
用語「治療」は、治療的処置および予防措置または防御措置の両方を指す。治療を必要とする個体は、デング熱に感染するリスクを有する個体と同様に、任意の臨床徴候が顕在化しているか否かにかかわらず、既にデング熱に感染した個体を含む。本発明のデングワクチン組成物による患者の治療は、以下の１つ以上を含む：患者におけるデングに対する免疫応答の誘導／増加、１つ以上のデングウイルスに対するウイルス中和抗体応答の誘導、デングに感染した患者におけるデング熱の臨床徴候の可能性の防止、改善、抑制または低減、デング熱、ＤＨＦまたはＤＳＳおよび／またはデング感染症に関連する他の疾患もしくは合併症を発症する可能性の防止または低減、デング感染症および／またはデングに関連する他の疾患もしくは合併症の臨床症候の重症度または持続期間の低減、ならびにデング感染症の可能性の防止または低減。
【００３１】
用語「治療有効量」または「有効量」は、所望の効果（限定されないが、患者におけるデングに対する免疫応答の誘導／増加、患者におけるデングに対するウイルス中和抗体応答の誘導／増加、デング感染症の可能性の防止または低減、再発性デング感染症の可能性の防止または低減、デングに感染した患者におけるデング感染症の臨床徴候の防止、改善、抑制または低減、デング熱、ＤＨＦおよび／またはＤＳＳの予防、デングに関連する疾患の重症度または持続期間の低減を含む）を生じさせるのに十分なワクチン組成物を患者に導入することを意味する。当業者であれば、このレベルが変動し得ることを認識している。
【００３２】
用語「免疫応答」は、細胞性（Ｔ細胞）免疫応答および／または抗体（Ｂ細胞）応答を指す。
【００３３】
用語「患者」は、本明細書に記載されるデングワクチン／免疫原性組成物を受容する予定の任意のヒト（免疫応答性および易感染性の個体の両方を含む）を指す。本明細書で定義される場合、「患者」は、自然感染かまたはワクチン接種かによって既にデング熱に感染した個体または今後曝露されるかもしれない個体を含む。
【００３４】
「ＭＡＡ」は、メルクアルミニウムアジュバントを意味する。ＭＡＡは、非晶質ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウムアジュバントである。用語「ＭＡＡ」は、本明細書では、用語「非晶質ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム」または「ＡＡＨＳ」と互換的に使用される。
【００３５】
「ＩＳＣＯＭ様アジュバント」は、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）を含むアジュバントであり、サポニン、コレステロールおよびリン脂質から構成され、それらは共に、その機能に寄与するユニークな球形のケージ型構造を有する、特徴的なケージ型粒子を形成する（総説については、Ｂａｒｒ  ａｎｄ  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７４：８−２５（１９９６）を参照のこと）。この用語は、抗原により産生されＩＳＣＯＭ（商標）粒子の内部に抗原を含むＩＳＣＯＭ（商標）アジュバント、および抗原無添加で産生される中空型のＩＳＣＯＭ型アジュバントであるＩＳＣＯＭ（商標）マトリックスアジュバントの両方を含む。本明細書で提供される組成物および方法の好ましい実施形態では、ＩＳＣＯＭ型アジュバントは、抗原無添加で製造されるＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）などのＩＳＣＯＭ（商標）マトリックス粒子アジュバントである（ＩＳＣＯＭ（商標）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）はＣＳＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａの登録商標である）。
【００３６】
「Ｖ１８０」は、４つの各デングウイルス血清型（デングウイルス（ＤＥＮＶ）１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４）に由来する切断型エンベロープ糖タンパク質（ＤＥＮ−８０Ｅ）から構成される四価サブユニットワクチンを指す。Ｃｏｌｌｅｒらの国際公開第２０１２／１５４２０２号を参照のこと。
【００３７】
以下の略語は本明細書で使用されるものであり、以下の意味を有する：ＤＥＮ（あるいはＤＥＮＶ）はデングウイルスであり、ｈは時間であり、ＧＭＴは幾何平均力価であり、ＩＭは筋肉内であり、ＩＭＸはＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ（商標）あり、ＬＡＶは生弱毒化ウイルスであり、ＭＡＡはメルクアルミニウムアジュバントであり、ＭＡＰＡはメルクリン酸アルミニウムアジュバントであり、ＰＦＵはプラーク形成単位であり、ＳＣは皮下であり、ＷＮＶは西ナイルウイルスであり、ＹＦ（あるいはＹＦＶ）は黄熱病ウイルスであり、ｗｔは野生型である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】実施例１および２に記載されているように、フィールド混合のＴ＝０時間後およびＴ＝２４時間後のウイルス力価に対する、記載されているアジュバント、抗原またはその組み合わせとｒＹＦ−ＤＥＮ２  ＬＡＶとのフィールド混合の効果を示す。ウイルスの最終濃度は、１×１０５ＰＦＵ／用量（すなわち、２×１０５ＰＦＵ／ｍｌ）であった。
【図２】アジュバントおよび／またはデングサブユニットワクチンと組換えキメラＹＦ−ＤＥＮ（１−４）ウイルスとの混合の効果を示す。４つの各キメラＹＦ−ＤＥＮウイルスを適切な濃度の四価ＤＥＮ−８０Ｅまたは四価ＤＥＮ−８０Ｅ＋アジュバントとフィールド混合し、フィールド混合の０時間後および２４時間後に、生ウイルスについて混合物を力価測定した（実施例３および４を参照のこと）。ウイルスの最終濃度は、１×１０５ＰＦＵ／用量（すなわち、２×１０５ＰＦＵ／ｍｌ）であった。
【図３】アジュバントおよび／またはデング抗原（四価ＤＥＮ−８０Ｅ、Ｖ１８０）の存在下で野生型デングウイルスを含む複合製剤の適合性／安定性データを提供する。実施例５に記載されているように、抗原／アジュバントサンプルを調製し、ｗｔデングウイルスとフィールド混合した。実施例６に記載されているように、フィールド混合の０時間後（斜線のバー）および２４時間（黒色のバー）に、インビトロプラークアッセイを使用して、Ｖｅｒｏ細胞において、ウイルス生存率を試験した。各デングウイルス（Ｄ１−Ｄ４）について、ウイルス力価（ＰＦＵ／ｍｌ）が示されている。
【図４】アジュバントおよび／またはデング抗原（全不活性化ｒＹＦ−ＤＥＮ２）の存在下でｒＹＦ−ＤＥＮ２キメラ生弱毒化ウイルスを含む複合製剤の適合性／安定性データを提供する。実施例７に記載されているように、抗原／アジュバントサンプルを調製し、実施例８に記載されているように、ｒＹＦ−ＤＥＮ２  ＬＡＶとフィールド混合した。実施例６に記載されているように、フィールド混合の０時間後（斜線のバー）および２４時間後（黒色のバー）に、インビトロプラークアッセイを使用して、Ｖｅｒｏ細胞において、ウイルス生存率を試験した。ｒＹＦ−ＤＥＮ２  ＬＡＶと（１）ＰＢＳ、（２）全不活性化ｒＹＦ−ＤＥＮ２（「ＰＩＶ」）、（３）ＰＩＶ＋ＭＡＡおよび（４）ＰＩＶ＋アルヒドロゲルとの混合物について、ウイルス力価（ＰＦＵ／ｍｌ）が示されている。
【図５】アカゲザルにおける免疫原性研究の結果を要約したものであり、「プライムブースト」ワクチン接種戦略（グループ４および５）の一環として複合製剤の免疫原性を、従来のプライムブースト戦略（グループ１〜３）と比較して評価した。複合製剤には、四価組換えデングサブユニットワクチン候補（Ｖ１８０）および四価デングＬＡＶが含まれていた。４週目（投与１の４週間後）のすべてのグループのＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４の幾何平均中和力価（ＬｉＣｏｒ５０  ＧＭＴ）が示されている。実施例９を参照のこと。
【図６】２８週目（投与２の４週間後）の、図５に示されているのと同じグループのＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４の幾何平均中和力価を提供する。
【図７】実施例９に記載されているグループのＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４の縦方向幾何平均中和力価を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明は、生弱毒化デングワクチン（ＬＡＶ）と第２のデングワクチンとの複合製剤であって、前記第２のデングワクチンが非複製デングワクチンである複合製剤に関する。本発明の実施形態では、第２のワクチンは、デングサブユニットワクチンまたは不活性化デングワクチンであり、アジュバントをさらに含んでいてもよい。同じバイアル中または別個のバイアル中で、ＬＡＶおよび第２のワクチンを製剤化し、患者への投与前に一緒に混合する。本発明の実施形態では、プライムブースト治療レジームで、本発明の組成物を患者に２回以上投与する。
【００４０】
ある時点でＬＡＶを投与し、その２週間〜２年後に第２のデングワクチンを投与することを含む従来の不均一なプライムブーストレジームは、使用され得る代替的なアプローチであるが、このアプローチは、どのワクチンを（ＬＡＶまたは第２のワクチン）を最初に投与すべきかということに関する混乱を引き起こし得る。順序の逆転（最初にサブユニットまたは不活性化ワクチン、続いてＬＡＶ）は、自然感染した場合により重度のデング疾患リスクを増加させ得る免疫応答不良につながり得るので、ＬＡＶおよび第２のワクチンを適切な順序で投与することが重要である。したがって、患者へのＬＡＶおよび第２のワクチンの同時投与は、完全な治療レジームの実行を容易にする。プライムブーストレジームで投与する場合、（１）ＬＡＶおよび（２）非複製ワクチンの複合製剤は、初回刺激時にはＬＡＶによって主に駆動され、追加刺激時には非複製ワクチンによって主に駆動される強力な免疫応答を誘発するであろう。
【００４１】
本発明以前には、生弱毒化ウイルスを含むデングワクチン組成物中にサブユニット抗原または不活性化ワクチンおよび／またはアジュバントが存在すると、生弱毒化ウイルスが不活性化されてウイルス力価が減少する可能性があると考えられていた。Ｍｉｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｖａｃｃｉｎｅ  ２９（２０１１）４６０８−４６１２およびＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．１１１（２００６）４７−５７）およびＧｕｔｈｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７（２００９）４４３４−４４３８）では、ＷＮＶ由来のｐｒＭ／Ｅ遺伝子を発現する改変生組換えカナリア痘ウイルスをカルボマーアジュバント中に製剤化したものが報告された。しかしながら、このワクチン組成物は、別個のウイルスサブユニット抗原を含有していなかった。
【００４２】
プライムブースト戦略による異なるデングウイルスワクチンの使用が試験されている。アカゲザルにおけるデング熱について、Ｓｉｍｍｏｎｓら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９６  ２８０−２８８（２０１０））は、不活性化ワクチンまたはＤＮＡ系ワクチンのいずれかの形態の非複製ワクチンで動物を初回刺激し、続いて、四価生弱毒化ワクチンで追加刺激することによって、プライムブーストアプローチを試験した。また、Ｋａｎａｋａｔｔｅら（国際公開第２００８１２７３０７号）には、ＤＮＡ発現系、アデノウイルス発現ベクターまたはベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン系を含む免疫原で初回刺激し、四価生弱毒化ワクチンを含む免疫原で追加刺激することによる、デング熱に対する不均一なプライムブーストレジメンが記載されている。この方法では、免疫原の追加刺激は、初回刺激の実行の２週間〜２カ月間に行われる。
【００４３】
Ｇｕｙら（国際公開第２００８／０４７０２３号）には、患者におけるＤＥＮ１−４に対する防御を誘導するための方法であって、（ａ）（ｉ）第１の血清型のワクチンデングウイルスの用量および第２の血清型のワクチンデングウイルスの用量ならびに（ｉｉ）第３の血清型のワクチンデングウイルスの用量および第４の血清型のワクチンデングウイルスの用量の１回目の投与、ならびに（ｂ）用量（ｉ）および（ｉｉ）の２回目の投与を行うことを含み、前記用量（ｉ）および（ｉｉ）を別個の解剖学的部位に同時投与し、前記１回目の少なくとも３０日後〜多くとも１２カ月後に前記２日目を実行する方法が報告されている。したがって、デング熱に対するプライム／ブーストアプローチの以前の報告では、追加刺激免疫原としてＬＡＶを使用することに焦点が当てられており、初回刺激組成物の投与からＬＡＶの投与までに、一定の期間（すなわち、数週間〜数カ月間）が経過することを要件としている。
【００４４】
本発明者らは、驚くべきことに、デングサブユニット抗原（ＤＥＮ２−８０Ｅまたは四価ＤＥＮ１−４  ８０Ｅ）および／またはアジュバントを同じバイアルに追加することによって、生弱毒化ＤＥＮウイルス（一価および四価キメラｒＹＦ−ＤＥＮ）のウイルス力価は有意な影響を受けなかったが（図１および２、実施例２および４を参照のこと）、２４時間後にアジュバントを追加すると、ＤＥＮ１の力価のわずかな減少が観察されたことを本明細書で示した。本発明者らはまた、単独のデングサブユニット抗原、またはＭＡＡもしくはアルヒドロゲルアジュバントと混合したデングサブユニット抗原と製剤化／混合することによって、ｗｔデングウイルスの生存率は影響を受けなかったことを示した（図３および実施例５を参照のこと）。単独の全不活性化ｒＹＦ−ＤＥＮ２、またはＭＡＡもしくはアルヒドロゲルアジュバントと混合した全不活性化ｒＹＦ−ＤＥＮ２と混合することによって、キメラｒＹＦ−ＤＥＮ２  ＬＡＶのウイルス力価は影響を受けなかったことがさらに示された（図４、実施例７〜８を参照のこと）。
【００４５】
従来のプライムブーストアプローチ（四価ＬＡＶによる初回刺激、Ｖ１８０サブユニットによる追加刺激）および複合製剤プライムブーストアプローチ（四価ＬＡＶ＋四価サブユニット複合製剤による初回刺激、続いて四価ＬＡＶ＋四価サブユニット複合製剤による追加刺激）の使用は、４つのＤＥＮＶ型すべてについて、初回刺激および追加刺激の両方として四価ＹＦ−ＤＥＮ  ＬＡＶワクチンを使用するプライムブーストレジームと比較して優れた中和力価を誘導したことが本明細書でさらに示された（実施例９、図５および６を参照のこと）。投与２の４週間後に複合製剤群で測定した中和応答は、従来のプライムブーストレジメンを受けた群で誘導されたものと同等であった。これは、ＹＦ−ＤＥＮワクチンと四価デングサブユニットワクチンおよびアジュバント（ＭＡＡまたはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標））との複合製剤が、前記サブユニットによる追加刺激に対する応答に悪影響を与えないことを示している。
【００４６】
したがって、不均一なプライム／ブーストアプローチの利点は、（１）デングＬＡＶおよび（２）非複製デングワクチンである第２のデングワクチンを含む複合製剤の投与によって達成され得る。本発明のいくつかの実施形態では、非複製ワクチンは、初回刺激組成物および追加刺激組成物の両方としてサブユニットデングワクチンおよび不活性化デングワクチンから選択される。
【００４７】
したがって、本発明は、デング感染症の可能性を防止もしくは低減するか、またはその臨床徴候を予防、治療もしくは改善する方法であって、
（ａ）生弱毒化デングワクチン（ＬＡＶ）を含む第１のデングウイルスワクチン組成物および非複製デングワクチンである第２のデングワクチンを、それを必要とする患者に投与すること；
（ｂ）工程（ａ）の後、所定の期間が経過するのを待つこと；ならびに
（ｃ）デングＬＡＶを含む第２のデングウイルスワクチン組成物、および非複製デングワクチンである第２のデングワクチンを前記患者に投与すること；
を含む方法に関する。上記方法のいくつかの実施形態では、非複製ワクチンは、デングサブユニットワクチンまたは不活性化デングワクチンである。
【００４８】
いくつかの実施形態では、工程（ｃ）の第２のデングウイルスワクチン組成物（複合製剤）は、工程（ａ）の複合製剤（第１のデングウイルスワクチン組成物）と同じものである。代替的な実施形態では、工程（ｃ）の複合製剤は、工程（ａ）の複合製剤と同じものではない。さらなる実施形態では、前記方法は、工程（ｂ）および（ｃ）を１回以上繰り返すこと含む。いくつかの実施形態では、別個のバイアル中で、工程（ａ）および／または工程（ｃ）のＬＡＶおよび第２のデングワクチンを製剤化し、投与前に一緒に混合する。プライム／ブーストレジームによる本発明の組成物の使用は、初回刺激（第１の投与）時にはＬＡＶによって主に駆動され、追加刺激（第２の投与）時には非複製（例えば、サブユニットまたは不活性化ワクチン）によって主に駆動される強力な免疫応答を誘発すると考えられる。
【００４９】
したがって、本発明は、有効量の第１のデングワクチンおよび第２のデングワクチンと、薬学的に許容され得る担体とを含むデングウイルスワクチン組成物であって、前記第１のデングワクチンが生弱毒化デングワクチンであり、前記第２のデングワクチンが非複製デングワクチンであり、前記生弱毒化デングワクチンが少なくとも１つの生弱毒化デングウイルスまたは少なくとも１つの生弱毒化キメラフラビウイルスを含むデングウイルスワクチン組成物に関する。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のデングウイルスワクチン組成物の非複製ワクチンは、組換えデングサブユニットワクチンまたは不活性化デングワクチンから選択される。
【００５０】
本発明の医薬または滅菌デングウイルスワクチン組成物を調製するために、第１のデングワクチンおよび第２のデングワクチンを、薬学的に許容され得る担体または賦形剤と混合する。あるいは、混合前に、第１のデングワクチンおよび第２のデングワクチンは、薬学的に許容され得る担体を含んでおり、ワクチンの混合時に、さらなる担体は必要とされない。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＳｃｉｅｎｃｅｓおよびＵ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８４）を参照のこと。薬学的に許容され得る担体としては、任意のすべての溶媒、分散媒体、等張剤および吸収遅延剤、ならびに生理学的に適合し得るものが挙げられる。担体は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、直腸投与、脊髄投与または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適切であり得る。
【００５１】
本明細書で使用される用語「薬学的に許容され得る担体」は、本発明の有効成分（例えば、全不活性化ウイルス、生弱毒化ウイルス、生弱毒化キメラウイルス、ウイルスタンパク質、デング抗原タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド、またはデング抗原コンジュゲート）と混合される上記のような物質であって、ヒトへの投与に適切なものを指す。本発明の実施形態では、薬学的に許容され得る担体は、同じ形態で天然に存在しない（例えば、前記物質は、天然に存在しないので人工のものであるか、または前記物質の純度および／もしくは無菌性は、対応する天然物質と同じではない）。例えば、注射用滅菌水（これは、滅菌されており、細菌を含まず、溶質を含まない注射用蒸留水の調製物である）は、同じ形態で天然に存在せず、薬学的に許容され得る担体と考えられる。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、１つ以上の本明細書に開示される有効成分（例えば、四価ＬＡＶ）と、注射用滅菌水とを含む。さらなる実施形態では、薬学的に許容され得る担体は、医薬調製物または生物学的調製物に適切な別の形態の水であり得、天然に存在する水と同じものではない（精製水、注射用水、滅菌精製水および注射用静菌水を含む）。
【００５２】
典型的には、医薬組成物は滅菌されており、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならない。治療剤および診断剤の製剤は、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液、懸濁液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、またはワクチンの製剤化および投与に適切な他の規則構造の形態の許容され得る担体、賦形剤または安定剤と混合することによって調製され得る（例えば、Ｈａｒｄｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｗｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照のこと）。
【００５３】
本発明のデングウイルスワクチン組成物は、限定されないが、下記のようなアジュバント、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、塩、抗菌性保存剤、界面活性剤、張度調節剤、キレート剤、デキストラン、デキストラン硫酸、デキストランＴ４０、ジエタノールアミン、グアニジン、塩化カルシウム、クエン酸ナトリウム、アルブミン、ゼラチン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、脂質およびヘパリンを含むさらなる要素をさらに含み得る。当業者であれば、製剤化における機能および計画された投与様式、投与量および他の要因、例えば組成物の予想される貯蔵期間および温度に応じて、どのさらなる賦形剤を所望のデングウイルスワクチン組成物に含めるべきであるかを容易に決定することができる。当業者であれば、さらなる賦形剤の量は変化し得ることを認識し、ヒトへの投与に安全であり、かつ所望の機能に有効である適切な量を容易に決定し得る。
【００５４】
生弱毒化デングウイルスワクチン
上記のように、本発明のデングウイルスワクチン組成物は、デングに対する免疫応答を誘導し、デングに対するウイルス中和抗体応答を誘導し、デングウイルス１型（ＤＥＮ１）、デングウイルス２型（ＤＥＮ２）、デングウイルス３型（ＤＥＮ３）およびデングウイルス４型（ＤＥＮ４）の少なくとも１つによる感染症を防ぐかもしくは感染症の可能性を低減し、またはその臨床徴候の重症度もしくは期間を減少させる生弱毒化デングワクチンを含む。本発明の実施形態では、生弱毒化デングワクチンは、一価、二価、三価または四価である。本発明の好ましい実施形態では、ＬＡＶは、四価である（すなわち、ＤＥＮ１−４型から保護し、ＤＥＮ１  ＬＡＶ成分、ＤＥＮ２  ＬＡＶ成分、ＤＥＮ３  ＬＡＶ成分およびＤＥＮ４  ＬＡＶ成分を含む。
【００５５】
本発明の各ＬＡＶ成分は、独立して弱毒化キメラフラビウイルスまたは弱毒化デングウイルスのいずれかである生弱毒化ウイルスを含む。デングウイルスの弱毒化は、当技術分野で公知の方法を含む様々な技術によって、例えば、組織培養における連続継代によって、またはより定義された遺伝子操作によって達成され得る。デングウイルスおよびキメラデングウイルスを弱毒化するのに有用な突然変異は、当技術分野で公知である。例えば、国際公開第０２／０９５０７５号、国際公開第２００６／４４８５７号、米国特許第７，１８９，４０３号、国際公開第２００３／１０３５７１号、国際公開第２０００／０１４２４５号および国際公開第２００８／０２２１９６号を参照のこと。国際公開第０６／１３４４３３号、国際公開第２００６／１３４４４３号、国際公開第２００７／１４１２５９号、国際公開第９６／４０９３３号、国際公開第２０００／０５７９０７号、国際公開第２０００／０５７９０８号、国際公開第２０００／０５７９０９号、国際公開第２０００／０５７９１０号および国際公開第２００７／０１５７８３号に記載されている株などの公知の弱毒化デング株も本明細書の組成物に使用され得る。
【００５６】
好ましい実施形態は、四価生弱毒化デングワクチンを含む。このような四価生弱毒化ワクチンは、４つの弱毒化デング株、３つの弱毒化デング株および１つの弱毒化キメラフラビウイルス株、２つの弱毒化デング株および２つの弱毒化キメラフラビウイルス株、１つの弱毒化デング株および３つの弱毒化キメラフラビウイルス、または４つの弱毒化キメラフラビウイルスを含み得る。
【００５７】
キメラフラビウイルスを含む本発明の実施形態では、各キメラフラビウイルスは、単一のデングウイルス血清型のｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質と、異なるフラビウイルスのカプシドタンパク質および非構造タンパク質（すなわち、「骨格」）と含み、各キメラフラビウイルスは弱毒化されている。組換え生弱毒化フラビウイルス株の構築方法は、ベースとして公知の弱毒化株を使用することを含み得、前記方法は、目的の関連ウイルス由来の適切な遺伝子（ｐｒＭおよびＥ）を、ベースウイルスの対応する遺伝子の代わりとすることを含む。例えば、キメラウイルスが、ｐｒＭ遺伝子およびＥ遺伝子を含む弱毒化ＤＥＮ−４株をベースとする内部型キメラであるＷＮＶでは、このアプローチが使用されている（Ｂｒａｙ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：４１６２−４１６６；Ｃｈｅｎ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：５１８６−５１９０；Ｂｒａｙ，Ｍ．ａｎｄ  Ｌａｉ，Ｃ．−Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：１０３４２−１０３４６；Ｌａｉ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）１０：１７３−１７９）。
【００５８】
別のアプローチは、ベースとしてＹＦ１７Ｄ弱毒化黄熱病株を使用して、組換えキメラワクチンを開発することであり、これは、ＪＥウイルス、ＤＥＮウイルスおよびＷＮウイルスのために以前に使用された。黄熱病株（例えば、ＹＦＶ１７Ｄ）由来のｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質をコードする遺伝子をデング血清型のものと交換することによって、黄熱病骨格を含むキメラ黄熱ワクチンを構築し得る。ＤＮＡクローニングの後、ＲＮＡを転写し、Ｖｅｒｏ細胞にトランスフェクトして、ＹＦＶ１７Ｄの複製機構と、関連デングウイルスの外被とを有するキメラウイルスを得る。Ｇｕｉｒａｋｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７４（１２）：５４７７−５４８５（２０００）；Ｇｕｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８：６３２−６４９（２０１０）；Ｍｏｎａｔｈ  Ｔ．Ｐ．Ａｄｖ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ（２００３）６１：４６９−５０９；Ｍｏｎａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００６）１０３：６６９４；および国際公開第９８／３７９１１号を参照のこと。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、生弱毒化ワクチンは、単一のデング血清型のｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質と、黄熱病骨格とを含むキメラフラビウイルスを含む。
【００５９】
本発明の組成物に有用なキメラ生弱毒化ワクチンはまた、デングキメラウイルスを含み得、ｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質は、単一のデングウイルス血清型のものであり、カプシドタンパク質および非構造タンパク質は、異なるデングウイルス血清型のものである。キメラウイルスが第２のデング血清型由来の骨格を含む実施形態では、弱毒化された任意のデング骨格をキメラウイルスに使用し得る。弱毒化は、連続継代によって、定義された遺伝子突然変異の導入によって、または公知の弱毒化デング株の使用によって達成され得る。デングキメラワクチンは、例えば、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄらの国際公開第０３／０９２５９２号に記載されている。本発明のいくつかの実施形態では、生弱毒化ワクチンは、カプシドタンパク質および非構造タンパク質がｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質と異なるデング血清型に由来するキメラフラビウイルスを含む。
【００６０】
本発明のデングウイルスワクチン組成物は、有効量の生弱毒化ウイルスワクチンを含む。本発明のいくつかの実施形態では、生弱毒化デングワクチンの効力は、１０〜約１×１０７プラーク形成単位（ＰＦＵ）である。代替的な実施形態では、生弱毒化デングワクチンの効力は、約１×１０２〜約１×１０６ＰＦＵである。他の実施形態では、生弱毒化デングワクチンの効力は、約１×１０３〜約１×１０５ＰＦＵである。
【００６１】
デングサブユニットワクチン
本発明のいくつかの実施形態では、前記組成物は、１つ以上のデング抗原タンパク質を含むデングサブユニットワクチンを含む。本発明のこの態様の好ましい実施形態では、サブユニットワクチンは、１つ以上のデングタンパク質、融合タンパク質または１もしくは複数のそれらの断片を含む。さらに好ましい実施形態では、デングサブユニットワクチンは、デングエンベロープまたはＥタンパク質またはそれらの断片を含む。
【００６２】
さらに好ましい実施形態では、サブユニットワクチンは、四価である（すなわち、４つのデング血清型すべてに対する免疫応答をターゲティングする）。四価サブユニットワクチンは、４つの組換えデングタンパク質を含み得るか、または４つ未満の例えば組換えＤＥＮ１タンパク質、組換えＤＥＮ２タンパク質および組換えＤＥＮ３／４融合タンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、サブユニットワクチンは、組換え発現系を使用して生産および分泌される、ＤＥＮ１−４（例えば、ＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−８０Ｅ、ＤＥＮ４−８０ＥまたはＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐ）のデングウイルスエンベロープ糖タンパク質またはその断片を含む。以下により詳細に記載されているように、前記サブユニットワクチンは、アジュバントを含んでいてもよい。
【００６３】
本発明のこの態様のいくつかの実施形態では、デングサブユニットワクチンは、１つ以上の精製デングウイルスエンベロープ（「Ｅ」）タンパク質と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含み、宿主細胞における組換え発現の際に前記Ｅタンパク質が成長培地中に分泌可能となるように、Ｅタンパク質はそれぞれ、Ｎ末端のアミノ酸残基１から開始して、野生型Ｅの長さの約８０％を構成し、前記組成物は、ヒト被験体における中和抗体の産生を誘導する。本発明のいくつかの実施形態では、デングサブユニットワクチンは、有効量のアジュバントをさらに含む。本発明のいくつかの実施形態では、米国特許第６，７４９，８５７号および国際公開第２０１２／１５４２０２号に記載されているように、ＤＥＮ−４  Ｅタンパク質は二量体（「ＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐ」）である。
【００６４】
本発明のこの態様のいくつかの実施形態では、上記組成物中のＥタンパク質は、昆虫宿主細胞で組換え産生され、発現される。より好ましい実施形態では、Ｅタンパク質は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ２（Ｓ２）の宿主細胞で組換え産生され、発現される。
【００６５】
本発明の組換えサブユニットデングウイルスＥタンパク質は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ２（Ｓ２）細胞を使用する細胞培養発現系の方法によって産生され得る。この系は、ネイティブ様構造を維持するデング組換えエンベロープタンパク質を産生することが証明されている（Ｃｕｚｚｕｂｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）８：１１５０−５５；Ｍｏｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００３）１００：６９８６−９１；Ｍｏｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００４）４２７：３１３−９；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（２００４）１２（９）：１６０７−１８）。この発現系はまた、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびダニ媒介脳炎ウイルスなどの他のフラビウイルス由来の他の組換えエンベロープタンパク質を発現することも示されている。組換えエンベロープタンパク質は、ネイティブなエンベロープタンパク質の８０％を残してＣ末端で切断され得る（「８０Ｅ」）。したがって、８０Ｅは、Ｎ末端のアミノ酸１から開始して、Ｅタンパク質の連続するアミノ酸の最初の約８０％と定義される。
【００６６】
上述のように、本発明のこの態様のいくつかの実施形態では、Ｎ末端のアミノ酸残基１から開始して、野生型Ｅの長さの約８０％からなる切断型８０Ｅタンパク質を含む。本発明のいくつかの実施形態で使用されるＥタンパク質は、前記タンパク質の膜アンカー部分（Ｅのカルボキシ末端の最後の約１０％）（換言すれば、Ｎ末端のアミノ酸１から開始して、Ｅの連続するアミノ酸の最初の９０％まで）を欠くので、それを細胞外の培地に分泌することを可能とし、回収を容易にする。切断は、Ｅタンパク質の８０Ｅタンパク質部分を膜アンカー部分と連結する「ステム」部分をさらに削除し得る；ステム部分は、顕著な抗原エピトープを含まないので、好ましい抗原（ＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−８０Ｅ、ＤＥＮ４−８０ＥまたはＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐ）に含まれない。Ｅタンパク質の９０％超１００％未満をクローニングして分泌させることができ（すなわち、前記タンパク質は、カルボキシ末端が切断された９０％＋の長さであり得る）、切断型Ｅタンパク質が分泌可能である限り、膜貫通ドメインの部分を含み得る。「分泌可能」は、分泌され得ることを意味し、典型的には発現系における形質転換細胞から分泌される。したがって、当業者であれば、前記タンパク質が分泌可能である限り、本発明の組成物および方法に有用なデングＥタンパク質は、本明細書で例示される８０％から変動し得ることを理解するだろう。本発明の各態様の好ましい実施形態では、ＤＥＮのＥタンパク質は、Ｎ末端のアミノ酸から開始して、エンベロープＥタンパク質の長さの約８０％であり、デングウイルス２型の３９３番目〜４０１番目の範囲のアミノ酸（例えば、アミノ酸１〜アミノ酸３９５）で終了する。本発明の各態様の代替的な実施形態では、デングＥタンパク質は、Ｎ末端のアミノ酸１から開始して、Ｅの連続するアミノ酸の約７５％、約８５％、約９０％、約９５％または約９８％であり得る。本明細書の本発明の態様の例示的な実施形態では、ＤＥＮのＥタンパク質は、Ｎ末端のアミノ酸１から開始して、Ｅタンパク質の連続するアミノ酸の約８０％である；例えば、配列番号１に示されるＤＥＮ１−８０Ｅ、配列番号２に示されるＤＥＮ２−８０Ｅ、配列番号３に示されるＤＥＮ３−８０Ｅおよび配列番号４に示されるＤＥＮ４−８０Ｅ。
【００６７】
組換えタンパク質の免疫原性がさらに増強されるように、分泌されるＥタンパク質は、例えばＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐタンパク質のように、二量体化を促進するドメインをさらに含有し得る。例示的なＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐタンパク質は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む。本発明のこの態様のいくつかの実施形態では、組成物に含まれるＤＥＮ１、ＤＥＮ２およびＤＥＮ３  ８０Ｅ抗原は単量体であり、ＤＥＮ４  ８０Ｅ抗原は二量体である。
【００６８】
本発明のこの態様の代替的な実施形態では、組成物中のＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−８０ＥおよびＤＥＮ４−８０Ｅタンパク質は、単量体である。このような実施形態では、ＤＥＮ４成分は、ＤＥＮ１タンパク質、ＤＥＮ２タンパク質およびＤＥＮ３タンパク質の個々の量の約１．５〜約３倍、好ましくは、ＤＥＮ１成分、ＤＥＮ２成分およびＤＥＮ３成分（タンパク質）の量の約２倍の量で存在する。本発明のこの態様の好ましい実施形態では、組成物中のＤＥＮ１：ＤＥＮ２：ＤＥＮ３：ＤＥＮ４抗原の比は、約１：１：１：２である。
【００６９】
デングＥタンパク質を含む本発明の実施形態では、組成物中の各Ｅタンパク質の量は、約０．５μｇ〜約５００μｇである。代替的な実施形態では、各Ｅタンパク質の量は、約０．５μｇ〜約４５０μｇ、０．５μｇ〜約４００μｇ、０．５μｇ〜約３５０μｇ、０．５μｇ〜約３００μｇ、０．５μｇ〜約２５０μｇ、０．５μｇ〜約２００μｇ、０．５μｇ〜約１５０μｇ、０．５μｇ〜約１００μｇ、０．５μｇ〜約５０μｇ、５．０μｇ〜約５００μｇ、５．０μｇ〜約４５０μｇ、５．０μｇ〜約４００μｇ、５．０μｇ〜約３５０μｇ、５．０μｇ〜約３００μｇ、５．０μｇ〜約２５０μｇ、５．０μｇ〜約２００μｇ、５．０μｇ〜約１５０μｇ、５．０μｇ〜約１００μｇ、５．０μｇ〜約５０μｇ、１０μｇ〜約４５０μｇ、１０μｇ〜約４５０μｇ、１０μｇ〜約４００μｇ、１０μｇ〜約３５０μｇ、１０μｇ〜約３００μｇ、１０μｇ〜約２５０μｇ、１０μｇ〜約２００μｇ、１０μｇ〜約１５０μｇ、１０μｇ〜約１００μｇ、１０μｇ〜約５０μｇ、２５μｇ〜約５００μｇ、２５μｇ〜約４５０μｇ、２５μｇ〜約４００μｇ、２５μｇ〜約３５０μｇ、２５μｇ〜約３００μｇ、２５μｇ〜約２５０μｇ、２５μｇ〜約２００μｇ、２５μｇ〜約１５０μｇ、２５μｇ〜約１００μｇまたは２５μｇ〜約５０μｇである。さらに好ましい実施形態では、組成物中の各Ｅタンパク質の量は、約１．０μｇ〜約１００μｇである。別のさらなる実施形態では、組成物中の各Ｅタンパク質の量は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００μｇから選択される。
【００７０】
不活性化デングワクチン
本発明のデングワクチン組成物中のデングサブユニットワクチンの代わりとして、全不活性化デングワクチンまたは不活性化デングキメラワクチンも使用し得る。本明細書の組成物の不活性化デングワクチンは、１つ以上の全不活性化デングウイルスおよび／または１つ以上の不活性化キメラウイルスを含む。本発明のこの態様のいくつかの実施形態では、不活性化デングワクチンは四価であり、全不活性化ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４を含む。代替的な実施形態では、不活性化ワクチンは、４つの不活性化キメラデングウイルスを含む。さらに他の実施形態では、不活性化ワクチンは四価であり、１つ以上の全不活性化デングウイルスおよび１つ以上の不活性化デングキメラウイルス（例えば、不活性化全ＤＥＮ１ウイルス、不活性化全ＤＥＮ２ウイルス、不活性化ＤＥＮ３キメラウイルスおよび不活性化ＤＥＮ４キメラウイルス）を含む。当業者であれば、ワクチン組成物が４つのデング血清型すべてをターゲティングする限り、不活性化全ＤＥＮウイルスまたはキメラＤＥＮウイルスの任意の組み合わせを、本発明の四価組成物および方法に使用し得ることを理解する。
【００７１】
本発明の組成物および方法に有用な不活性化デングワクチンは、Ｐｕｔｎａｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３：４４４２−４４５２（２００５）、米国特許第６１９０８５９号、米国特許第６２５４８７３およびＳｔｅｒｎｅｒらの国際公開第２００７／００２４７０号に記載されている。あるいは、本発明の組成物および方法に使用するために、当技術分野で公知の方法によって、例えば、化学物質、熱または放射線を用いて、デングウイルス株およびキメラデング株／キメラフラビウイルス株を不活性化し得る。
【００７２】
アジュバント
目的の抗原に対する免疫応答を増強し得るアジュバントとして公知の化合物と共にワクチンを同時投与することが広く研究されている。目的の抗原に対する免疫応答を増加させることに加えて、いくつかのアジュバントは、所望の免疫応答を誘発するのに必要な抗原の量を減少させるために、または長期的な免疫応答を誘導して疾患からの保護を提供するための臨床レジメンで必要な注射回数を減少させるために使用され得る。
【００７３】
このために、本発明は、アジュバントを用い得る本発明のデングウイルスワクチン組成物に関する。本明細書に記載される組成物のアジュバントは、上記のように、所望の機能を果たす任意のアジュバントであって、組成物のＬＡＶを不活性化せず、組成物のＬＡＶの力価に有意に影響しないものであり得る。
【００７４】
６０年以上前に、アルミ系化合物はアジュバント活性を有すると決定された（総説については、Ｌｉｎｄｂｌａｄ，Ｅ．Ｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８２：４９７−５０５（２００４）；Ｂａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：Ｓ１８−Ｓ２３（２００２）を参照のこと）。適切な投与量で使用する場合、アルミニウムアジュバントは、一般に、安全とみなされている。ヒトへの投与について、多くが世界中の規制当局によって承認されている。
【００７５】
したがって、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）、ヒドロキシリン酸アルミニウム（ＡｌＰＯ４）、非晶質ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム（ＡＡＨＳ）またはいわゆる「ａｌｕｍ」（ＫＡｌ（ＳＯ４）・１２Ｈ２Ｏ）（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｂｙ  Ａｌ  ＭＡＳ  ＮＭＲ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８９（３）：３１１−２１（２０００）を参照のこと）などのアルミニウム系化合物を、本明細書で提供される組成物と組み合わせ得る。本明細書で提供される本発明の例示的な実施形態では、アルミニウムアジュバントは、ヒドロキシリン酸アルミニウムまたはＡＡＨＳ（あるいは、「ＭＡＡ」と称される）である。代替的な実施形態では、アルミニウムアジュバントは、本明細書では「ＭＡＰＡ」と称されるリン酸アルミニウムアジュバントである。他の実施形態では、アジュバントは、水酸化アルミニウムである。
【００７６】
当業者であれば、ターゲティングデングウイルスに対する免疫応答を増加させるのに安全かつ有効なアルミニウムアジュバントの最適投与量を決定することができるであろう。アルミニウムの安全性プロファイルの議論、およびＦＤＡ承認ワクチンに含まれるアルミニウムの量については、Ｂａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：Ｓ１８−Ｓ２３（２００２）を参照のこと。一般に、アルミニウムアジュバントの有効かつ安全な用量は、１用量当たり５０μｇ〜１．２５ｍｇのアルミニウム元素（濃度１００μｇ／ｍＬ〜２．５ｍｇ／ｍＬ）で変化する。
【００７７】
したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書の任意の実施形態に記載されているように、生弱毒化デングウイルスワクチンと、非複製ワクチンである第２のデングワクチンとを含む組成物であって、アルミニウムアジュバントをさらに含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、非複製ワクチンは、デングサブユニットワクチンまたは不活性化デングワクチンから選択される。本発明の実施形態では、デング熱組成物は、１用量のワクチン当たり約５０μｇ〜約１．２５ｍｇのアルミニウム元素を含むアジュバントを含む。他の実施形態では、１用量のワクチン組成物当たりのアルミニウムアジュバントは、約１００μｇ〜約１．０ｍｇ、約１００μｇ〜約９００μｇ、約１００μｇ〜約８５０μｇ、約１００μｇ〜約８００μｇ、約１００μｇ〜約７００μｇ、約１００μｇ〜約６００μｇ、約１００μｇ〜約５００μｇ、約１００μｇ〜約４００μｇ、約１００μｇ〜約３００μｇ、約１００〜約２５０μｇ、約２００μｇ〜約１．２５ｍｇ、約２００μｇ〜約１．０ｍｇ、約２００μｇ〜約９００μｇ、約２００μｇ〜約８５０μｇ、約２００μｇ〜約８００μｇ、約２００μｇ〜約７００μｇ、約２００μｇ〜約６００μｇ、約２００μｇ〜約５００μｇ、約２００μｇ〜約４００μｇ、約２００μｇ〜約３００μｇ、約３００μｇ〜約１．２５ｍｇ、約３００μｇ〜約１．０ｍｇ、約３００μｇ〜約９００μｇ、約３００μｇ〜約８５０μｇ、約３００μｇ〜約８００μｇ、約３００μｇ〜約７００μｇ、約３００μｇ〜約６００μｇ、約３００μｇ〜約５００μｇ、約３００μｇ〜約４００μｇ、約４００μｇ〜約１．２５ｍｇ、約４００μｇ〜約１．０ｍｇ、約４００μｇ〜約９００μｇ、約４００μｇ〜約８５０μｇ、約４００μｇ〜約８００μｇ、約４００μｇ〜約７００μｇ、約４００μｇ〜約６００μｇ、約４００μｇ〜約５００μｇ、約５００μｇ〜約１．２５ｍｇ、約５００μｇ〜約１．０ｍｇ、約５００μｇ〜約９００μｇ、約５００μｇ〜約８５０μｇ、約５００μｇ〜約８００μｇ、約５００μｇ〜約７００μｇ、約５００μｇ〜約６００μｇ、約６００μｇ〜約１．２５ｍｇ、約６００μｇ〜約１．０ｍｇ、約６００μｇ〜約９００μｇ、約６００μｇ〜約８５０μｇ、約６００μｇ〜約８００μｇまたは約６００μｇ〜約７００μｇの範囲の量のアルミニウム元素を含む。
【００７８】
本発明のデングウイルスワクチン組成物と併せて使用され得る他のアジュバントとしては、限定されないが、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、またはＴＬＲ４およびＴＬＲ９などのｔｏｌｌ様受容体（総説については、Ｄａｕｂｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９（１）：４５−５２（２００７）；Ｄｕｔｈｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２３９（１）：１７８−１９６（２０１１）；Ｈｅｄａｙａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３２（２）：２９４−３２５（２０１２）を参照のこと）に対して作用する他の分子（リポ多糖、モノホスホリル脂質Ａおよびアミノアルキルグルコサミニド４−リン酸を含む）を含有するアジュバントが挙げられる。本発明の組成物に有用なさらなるアジュバントとしては、免疫刺激性オリゴヌクレオチド（ＩＭＯ；例えば、米国特許第７，７１３，５３５号および米国特許第７，４７０，６７４号を参照のこと）；Ｔヘルパーエピトープ、脂質Ａおよびその誘導体または変異体、リポソーム、リン酸カルシウム、サイトカイン（例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、Ｆｌｔ−３Ｌ）、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＣＤ７０、ＩＬ−１２、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）９０、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７、コワクチンＨＴ、非イオン性ブロックコポリマー、不完全フロイントアジュバント、ケモカイン、コレラ毒素；大腸菌熱不安定性エンテロトキシン；百日咳毒素；ムラミルジペプチド、ムラミルペプチド類似体、ＭＦ５９、ＳＡＦ、免疫刺激複合体、生分解性マイクロスフェア、ポリホスファゼン；合成ポリヌクレオチドが挙げられる。
【００７９】
本明細書に記載される組成物と共に使用するためのさらなるアジュバントは、単独で、またはコレステロールおよびリン脂質と組み合わせてサポニン（例えば、ＱＳ２１）を含有する特徴的なＩＳＣＯＭ（「免疫刺激複合体」、総説については、Ｂａｒｒ  ａｎｄ  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７４：８−２５（１９９６）；およびＳｋｅｎｅ  ａｎｄ  Ｓｕｔｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４０：５３−５９（２００６）を参照のこと）形態のアジュバントである。このようなアジュバントは、「サポニン系アジュバント」と称される。本明細書で提供される組成物および方法の特定の実施形態では、突然変異体毒素および／または毒素タンパク質をＩＳＣＯＭ型アジュバントまたは「ＩＳＣＯＭ」（これは、ＩＳＣＯＭマトリックス粒子アジュバントである）、例えばＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）（これは、抗原を用いずに製造される）と組み合わせる（ＩＳＣＯＭ（商標）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）は、ＣＳＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａの登録商標である）。
【００８０】
使用方法
本発明の実施形態はまた、（ａ）（例えば、人体の）治療；（ｂ）医薬；（ｃ）ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３および／またはＤＥＮ４を含むデングウイルス複製の阻害；（ｄ）ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３および／またはＤＥＮ４の１つ以上に対する免疫応答もしくは防御免疫応答の誘導；（ｅ）１種類以上のデングに対するウイルス中和抗体応答の誘導；（ｆ）デングウイルスによる感染症の治療もしくは予防；（ｇ）デングウイルス感染症の再発の予防；（ｈ）デングウイルス感染症に関連する病的症候の進行、発症もしくは重症度の軽減、および／もしくはデングウイルス感染症の可能性の低減、または（ｉ）（１または複数の）デング関連疾患（限定されないが、デング熱、デング出血熱、デングショック症候群を含む）の発症、重症度もしくは進行の治療、予防もしくは遅延（ｉ）に使用するための、（ｉｉ）これらのための医薬もしくは組成物として使用するための、または（ｉｉｉ）これらのための医薬の調製に使用するための、本明細書に記載されるデングワクチン組成物の１つ以上を含む。これらの使用では、デングワクチン組成物を１つ以上のアジュバント（例えば、本明細書に記載されるＭＡＡ、リン酸アルミニウム、アルヒドロゲル、または他のアルミニウム塩アジュバント、サポニン系アジュバント、例えばＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）（ＣＳＬ，Ｌｔｄ．）、ＴＬＲアゴニストまたは脂質ナノ粒子）と組み合わせて用いてもよい。
【００８１】
したがって、本発明は、デングウイルス感染症またはデング関連疾患の予防的処置または治療的処置のための方法であって、本発明の組成物の１つ以上を、処置を必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。
【００８２】
「患者」（あるいは、本明細書では「被験体」と称される）は、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４などのデングウイルスが感染することができる哺乳動物を指す。好ましい実施形態では、患者はヒトである。患者は、予防的または治療的に処置され得る。予防的処置は、デング感染症またはその効果、例えばデング熱の可能性または重症度を軽減するのに十分な防御免疫を提供する。治療的処置は、デング感染症またはその臨床効果の重症度を軽減するか、またはこれらの再発を予防するために実施され得る。
【００８３】
予防的処置は、本明細書に記載されるように、本発明のデングウイルスワクチン組成物を使用して実施され得る。本発明の組成物は、一般集団に、またはデング感染症のリスクが増加している者（例えば、Ａｅｄｅｓ属の蚊が蔓延している世界の地域に居住しているか、または前記地域への訪問を予定している者）に投与され得る。
【００８４】
「治療を必要とする」者としては、デング感染症を既に有する（例えば、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４の１つ以上に感染している）者、および感染症にかかりやすい者、または感染症の可能性の低減が望まれる任意の者が挙げられる。
【００８５】
本発明のデングウイルスワクチン組成物を製剤化し、当技術分野で周知の技術を使用して患者に投与し得る。一般的な薬学的投与のガイドラインは、例えば、Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｅｄｓ．Ｐｌｏｔｋｉｎ  ａｎｄ  Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９９；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２０ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００；およびＭｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄｓ．Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｒｈｏｄｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０に示されている。
【００８６】
したがって、本発明は、患者におけるデング感染症に対する防御免疫応答を誘導する方法であって、免疫学的有効量の本明細書に記載されるデングウイルスワクチン組成物のいずれかを前記患者に投与する工程を含む方法を提供する。
【００８７】
本発明はまた、デング感染症を治療するための方法、またはデング感染症に関連する任意の病的症状を治療するための方法であって（このような治療は、感染症の予防、および臨床症候の重症度の軽減、疾患進行の遅延もしくは防止、および／または感染症もしくはその臨床症候の可能性の低減を含む）、免疫学的有効量の本明細書に記載されるワクチン組成物のいずれかを患者に投与する工程を含む方法を提供する。
【００８８】
本発明のさらなる実施形態は、プライム／ブーストレジームで、２つ以上の本発明の組成物を患者に投与することを含む。したがって、本発明は、デング感染症の可能性の防止または低減を必要とする患者におけるデング感染症の可能性を防止または低減する方法であって、
（ａ）本発明の第１のデングウイルスワクチン組成物を前記患者に投与する工程；
（ｂ）工程（ａ）の後、所定の期間が経過するのを待つ工程；
（ｃ）本発明の第２のデングウイルスワクチン組成物を前記患者に投与する工程；および、（ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）を繰り返してもよい工程；
を含み、
それにより、前記患者における前記デング感染症を予防するか、またはデング感染の可能性を低減する方法に関する。
【００８９】
上記方法の実施形態では、本発明のデングウイルスワクチン組成物は、液体の形態である（すなわち、同じバイアルまたは容器中で、デングＬＡＶおよび非複製デングウイルスワクチンを液体として一緒に製剤化する）。代替的な実施形態では、デングウイルスワクチン組成物を凍結乾燥し（すなわち、同じバイアルまたは容器中で、デングＬＡＶおよび非複製デングウイルスワクチンを一緒に製剤化し、凍結乾燥し）、患者への投与前に滅菌希釈剤で再構成する。さらなる実施形態では、別個のバイアルまたは容器中に、ＬＡＶおよび非複製ワクチンを提供し、患者への投与前に一緒に混合する。このような実施形態では、ＬＡＶおよび非複製ワクチンは、（１）両方が液体の形態でもよいし、（２）両方が凍結乾燥されていてもよいし、または（３）一方のワクチンが液体の形態であり、一方のワクチンが凍結乾燥されていてもよい。一方のワクチンが液体の形態であり、一方のワクチンが凍結乾燥されている場合、液体ワクチンで凍結乾燥ワクチンを再構成して、本発明のデングウイルスワクチン組成物を形成してもよいし、または滅菌希釈剤で凍結乾燥ワクチンを再構成し、次いで、液体ワクチンと混合して、本発明のデングウイルスワクチン組成物を形成してもよい。
【００９０】
第１の投与と第２の投与またはその後の任意の投与との間の期間は、約２週間〜約２年間である。本発明の好ましい実施形態では、複数の投与間において、２カ月間〜１２カ月間を経過させる。本発明のこの態様の代替的な実施形態では、各用量のワクチン組成物の各投与間の期間は、２週間、１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、７カ月間、８カ月間、９カ月間、１０カ月間、１１カ月間、１２カ月間、１３カ月間、１４カ月間、１５カ月間、１６カ月間、１７カ月間、１８カ月間、１９カ月間、２０カ月間、２１カ月間、２２カ月間、２３カ月間および２４カ月間からなる群より独立して選択される。
【００９１】
本発明のいくつかの実施形態では、第１および第２のデングウイルスワクチン組成物は、同じものである。代替的な実施形態では、第１および第２のデングウイルスワクチン組成物は、同じものではない。
【００９２】
本発明のデングウイルスワクチン組成物は、異なる経路によって投与され得る。本発明の好ましい実施形態では、本発明の組成物は、非経口的に（すなわち、皮内注射、皮下注射または筋肉内注射によって）投与される。皮下投与および筋肉内投与は、例えば、針またはジェット注入器を使用して実施され得る。
【００９３】
本明細書に記載される組成物は、デング感染症を治療し、および／またはデング感染症の可能性を低減するのに免疫学的に有効な量で、投与製剤に適合するように投与される。本発明との関連では、患者に投与される用量は、患者における有益な経時的応答（例えば、デングウイルスのレベルの減少）に影響を及ぼすために、またはデングによる感染症の可能性を低減するために十分であるべきである。投与すべきデングウイルスワクチンの量は、年齢、性別、体重およびその一般健康状態を含め、治療すべき被験体に依存し得る。これに関して、投与することが必要なワクチンの正確な量は、医師の判断に依存するであろう。デング感染症に対する治療または予防において投与すべきワクチンの有効量の決定において、医師は、循環血漿レベル、疾患の進行、および抗デング抗体の産生を評価し得る。いずれにせよ、当業者であれば、本発明の免疫原性組成物の適切な投与量を容易に決定し得る。
【００９４】
適切な投与計画は、好ましくは、患者の年齢、体重、性別および医学的状態；投与経路；所望の効果；および用いられる特定の組成物を含む当技術分野で周知の要因を考慮して決定される。投与のタイミングは、当技術分野で周知の要因に依存し、２週間〜２４カ月間の範囲であり得る。初回投与後、１つ以上のさらなる用量を投与して、抗体力価を維持および／または増強し得る。
【００９５】
本発明はまた、デング感染症を予防するか、またはその症候を予防もしくは改善するための方法であって、（ａ）第１および第２のデングワクチンを混合して、デングウイルスワクチン組成物を形成する工程であって、前記第１のデングワクチンが生弱毒化デングワクチンであり、前記第２のデングワクチンが非複製デングワクチンである工程；ならびに（ｂ）工程（ａ）のデングウイルスワクチン組成物の用量を、デング感染症またはその症候を予防または改善すべき患者に投与する工程を含む方法に関する。この方法では、デングウイルスワクチン組成物を、それが依然として安定である混合後一定期間内（例えば、２４時間以内）に患者に投与する。本発明のこの態様のいくつかの実施形態では、非複製デングワクチンは、組換えデングサブユニットワクチンまたは不活性化デングワクチンである。
【００９６】
本発明のこの態様のさらなる実施形態は、（ｃ）デングウイルスワクチン組成物の投与後に、所定の期間を経過させること、および（ｄ）本発明の組成物の第２の用量を投与することを含む。前記実施形態では、工程（ｃ）および（ｄ）を１回以上繰り返してもよい。
【００９７】
上記方法では、本明細書に記載されるように、第１のデングワクチンは好ましくは四価であり、ＤＥＮ１成分、ＤＥＮ２成分、ＤＥＮ３成分およびＤＥＮ４成分を含み、各成分は、生弱毒化デングウイルスまたは生弱毒化キメラフラビウイルスのいずれかを含む。例示的な実施形態では、生弱毒化ワクチンは、４つのキメラフラビウイルスを含み；４つの各キメラフラビウイルスは、単一のデングウイルス血清型のｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質と、異なるフラビウイルスのカプシドタンパク質および非構造タンパク質とを含み、各キメラフラビウイルスは弱毒化されている。特定の実施形態では、４つのキメラフラビウイルスのカプシドタンパク質および非構造タンパク質は、黄熱病ウイルスに由来する。代替的な実施形態では、４つの各キメラフラビウイルスのカプシドタンパク質および非構造タンパク質は、ｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質と異なるデング血清型に由来する。
【００９８】
本発明のこの態様のいくつかの実施形態では、第２のデングワクチンは、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４由来のデングＥタンパク質またはその断片を含む四価組換えデングサブユニットワクチンである。本発明のこの方法に有用なサブユニットワクチンは、本明細書に記載されている。好ましい実施形態では、Ｅタンパク質はそれぞれ、Ｎ末端のアミノ酸残基１から開始して、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４の野生型Ｅの長さの約８０％を構成する。
【００９９】
上記方法の特定の実施形態では、生弱毒化ワクチンは凍結乾燥されており、組換えサブユニットワクチンは混合前には液体である。いくつかの実施形態では、工程（ａ）の混合は、液体ワクチンで凍結乾燥ワクチンを再構成することを含む。代替的な実施形態では、工程（ａ）で液体ワクチンと混合する前に、滅菌希釈剤で凍結乾燥ワクチンを再構成する。
【０１００】
本発明に関連して使用され得る方法および材料を説明および開示する目的のために、本明細書で言及される刊行物はすべて、参照により組み込まれる。本明細書のいかなる記載も、本発明が先行発明の開示に先行する権利がないことを自認するものと解釈されるべきではない。
【０１０１】
添付の図面を参照して本明細書における本発明の様々な実施形態を説明したが、本発明は、これらの厳密な実施形態に限定されるものではなく、当業者であれば、添付の特許請求の範囲に規定される本発明の範囲または精神を逸脱することなく、様々な変更および改変を行い得ることを理解すべきである。
【０１０２】
［実施例１］
アジュバントまたはデング抗原の存在下におけるｒＹＦ−ＤＥＮ２キメラ生弱毒化ウイルスの安定性試験のための製剤の調製
本発明者らは、インビトロプラークアッセイを使用して、様々なアジュバントおよび／またはデング抗原の存在下で、生弱毒化キメラデング２ワクチン（「ｒＹＦ−ＤＥＮ２  ＬＡＶ」）を含む製剤の安定性を試験した。この研究に使用したＬＡＶは、ＹＦ−ＤＥＮ２キメラウイルスを作るために、ＤＥＮ２ウイルスのｐｒＭ遺伝子およびＥ遺伝子を黄熱病ウイルス骨格に配置したデング／黄熱病（「ＹＦ」）キメラウイルスから構成されていた。ＹＦＶ１７Ｄ由来のｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質をコードする遺伝子をデング２のものと交換することによって、黄熱病−デングキメラワクチンベクターを構築した。ＤＮＡクローニングの後、ＲＮＡを転写し、Ｖｅｒｏ細胞にトランスフェクトして、ＹＦＶ１７Ｄの複製機構と、デング２ウイルスの外被とを有するキメラウイルスを得た（Ｇｕｉｒａｋｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（１２）：５４７７−８５（２０００）を参照のこと）。
【０１０３】
無菌技術を使用して、バイオセーフティキャビネット内で、すべての製剤を調製した。最初に、所望のアジュバント、デング抗原またはアジュバント／抗原組み合わせのダルベッコＰＢＳ溶液を用いて、試験用のサンプルを製剤化し、２ｍｌ滅菌ＩＳＯバイアルに入れて、１３ｍｍ  Ｆｌｕｒｏｔｅｃストッパーで密封した。本研究で試験したアジュバント／抗原サンプルは、以下のとおりであった：（１）ＰＢＳのみ；（２）メルクリン酸アルミニウムアジュバント（「ＭＡＰＡ」）；（３）メルク非晶質ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウムアジュバント（「ＭＡＡ」）；（４）ＤＥＮ２  ８０％Ｅ、ＤＥＮ−２エンベロープポリペプチドのアミノ酸１〜３９５（「ＤＥＮ２−８０Ｅ」）；（５）ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）（「ＩＭＸ」）；（６）ＴＬＲ９アゴニストアジュバント（「ＩＭＯ−２０５５」）；（７）ＤＥＮ２−８０Ｅ＋ＭＡＰＡ；および（８）ＤＥＮ２−８０Ｅ＋ＭＡＡ。ＭＡＡまたはＭＡＰＡのいずれかと共にＤＥＮ２−８０Ｅを含有するサンプルをテーブルトップ遠心機でスピンし、ＵＶ分光光度計を使用して上清をスキャンして、ＤＥＮ２−８０Ｅがアルミニウムアジュバントに吸着したことを確認した。ｒＹＦ−ＤＥＮ２  ＬＡＶとフィールド混合する前に、すべての製剤を２〜８℃で保存した。
【０１０４】
下記のように、アジュバント／抗原サンプルをｒＹＦ−ＤＥＮ２  ＬＡＶと１：１の比でフィールド混合した。ｒＹＦ−ＤＥＮ２  ＬＡＶとフィールド混合する前後のサンプルの用量および濃度は、表１に示されているとおりであった。
【表１】
2016523251.tif 000003
【０１０５】
１ｍｌの各製剤を調製した。
【０１０６】
［実施例２］
ＤＥＮ２−８０Ｅ抗原および／またはアジュバントと組み合わせてｒＹＦ−ＤＥＮ２キメラＬＡＶを含む製剤の安定性試験
表１に記載されている抗原／アジュバントサンプルをｒＹＦ−ＤＥＮ２  ＬＡＶとフィールド混合し、下記のように、インビトロプラークアッセイを使用して、Ｖｅｒｏ細胞においてウイルス生存率について試験した。
【０１０７】
１ウェル当たり９×１０５個のＶｅｒｏ細胞を６つのウェルプレートに播種した。Ｖｅｒｏ細胞の継代レベルは、Ｐ３１であった。プラークアッセイ（Ｔ＝０時間の時点）用のウイルスサンプルを希釈するために、１ｍＬアリコートのＹＦ−ＤＥＮ２  ＬＡＶ由来Ｐ２ウイルス（力価３．３×１０６ＰＦＵ／ｍＬ）を２２℃の水浴中で解凍した。２％培地１９９中でウイルスの希釈を実施して、ウイルス力価２×１０５ＰＦＵ／ｍＬの希釈ストックを生産した。この希釈ストックから、０．５ｍＬのウイルスを新たなチューブに分注し、実施例１に記載されているアジュバント／抗原製剤の一方０．５ｍＬと混合して、１：１希釈物を得た。得られた全容量は１ｍＬであり、このうちの０．５ｍＬをＴ＝０時間のプラークアッセイに使用し、０．５ｍＬをＴ＝２４の時点のプラークアッセイに使用するまで４℃で保存した。
【０１０８】
９６ウェルプレート中で、１：１のＬＡＶ：アジュバント／抗原サンプルのさらなる希釈物を調製して、各試験サンプルの１：１０、１：１００、１：１，０００、１：１０，０００、１：１００，０００および１：１，０００，０００希釈物を得た。アッセイを実施するために、ＰＢＳでＶｅｒｏ細胞単層を洗浄し、２００μｌの希釈サンプル（２回反復）をプレートの各ウェルに追加した。ウイルス接種材料を細胞に十分に拡散させ、プレートをインキュベーター内に配置した。プレートを１時間にわたって１０〜１５分間ごとに振盪して、接種材料を均一に拡散させた。吸着の１時間後、３ｍｌの０．８％メチルセルロースを各ウェルに追加することによって、細胞をオーバーレイし、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０１０９】
５日間インキュベートした後、各ウェルのメチルセルロースオーバーレイを吸引し、２ｍＬの１×クリスタルバイオレット染色溶液を追加した。染色を室温で１時間行い、その時点で染色溶液を吸引した。２ｍＬの滅菌蒸留水で各ウェルを２回洗浄した。洗浄液を真空容器内に吸引し、プレートを空気乾燥させた。適切なウイルス希釈時にプラークの数を計数することによって、ウイルス力価を決定した。
【０１１０】
２４時間後、上記手順を繰り返して、保存後の各サンプルのウイルス力価を決定した。上記のように、サンプルを調製した。結果は、アジュバント、サブユニット抗原のみおよびアジュバント／抗原の製剤がいずれも、Ｔ＝０のＬＡＶのウイルス力価に対していかなる影響も及ぼさなかったことを示している（図１を参照のこと）。結果は、サブユニット抗原のみおよびほとんどのアジュバントの場合には、４℃で２４時間インキュベートした後でさえ、ｒＹＦ−ＤＥＮ２  ＬＡＶが安定であったことをさらに示している；しかしながら、ＩＭＯ−２０５５は、２４時間後のウイルス力価の有意な（約２ｌｏｇ）の減少を引き起こした。このサンプルでは、試験した他のサンプル群と比べて、細胞生存率も最低であった。
【０１１１】
［実施例３］
アジュバントおよび／またはデング抗原の存在下におけるｒＹＦ−ＤＥＮ（１−４）キメラ生弱毒化ウイルスの安定性試験のための製剤の調製
四価ＤＥＮ−８０Ｅ（１−４）サブユニットワクチンのみと、またはＭＡＡもしくはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）（ＣＳＬ，Ｌｔｄ．，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）と組み合わせたデング１−４型の生弱毒化キメラ黄熱病／デングウイルス（「ｒＹＦ−ＤＥＮ（１−４）ＬＡＶ」）を含むワクチンの安定性を評価するために、別の研究を実施した。ＹＦＶ１７Ｄ由来のｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質をコードする遺伝子を４つの各デング血清型のものと交換することによって、黄熱病−デングキメラワクチンベクターを構築した。ＤＮＡクローニングの後、ＲＮＡを転写し、Ｖｅｒｏ細胞にトランスフェクトして、ＹＦＶ１７Ｄの複製機構と、関連デングウイルスの外被とを有するキメラウイルスを得た。
【０１１２】
無菌技術を使用して、バイオセーフティキャビネット内で、すべての製剤を調製した。所望のアジュバント、（１または複数の）デング抗原または（１または複数の）アジュバント／抗原組み合わせのダルベッコＰＢＳ溶液を用いて、試験用のサンプルを製剤化し、２ｍｌ滅菌ＩＳＯバイアルに入れて、Ｆｌｕｒｏｔｅｃストッパーで密封した。本研究で試験したアジュバント／抗原サンプルは、以下のとおりであった：（１）ＰＢＳのみ；（２）四価ＤＥＮ−８０Ｅ（ＤＥＮ１−８０Ｅ＋ＤＥＮ２−８０Ｅ＋ＤＥＮ３−８０Ｅ＋ＤＥＮ４−８０Ｅ）；（３）四価ＤＥＮ−８０Ｅ＋ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）；（４）四価ＤＥＮ−８０Ｅ＋ＭＡＡ。下記のように、アジュバント／抗原サンプルをＹＦ−ＤＥＮ（１−４）ＬＡＶと１：１の比でフィールド混合した。ＹＦ−ＤＥＮ（１−４）ＬＡＶとフィールド混合する前後のサンプルの用量および濃度は、表２に示されているとおりであった。
【表２】
2016523251.tif 000004
【０１１３】
ＬＡＶとフィールド混合する前に、すべての製剤を２〜８℃で保存した。
【０１１４】
［実施例４］
生弱毒生ＹＦ−ＤＥＮ（１−４）ウイルスを含む製剤の安定性試験
実施例３で調製した抗原／アジュバントサンプルをｒＹＦ−ＤＥＮ（１−４）ＬＡＶとフィールド混合し、下記のように、インビトロプラークアッセイを使用して、Ｖｅｒｏ細胞においてウイルス生存率について試験した。
【０１１５】
１ウェル当たり９×１０５個の細胞を６つのウェルプレートに播種した。Ｖｅｒｏ細胞の継代レベルは、Ｐ３７であった。基本的には、一価研究に関する実施例２に記載されているように、ウイルスを調製し、ｒＹＦ−ＤＥＮ（１−４）ＬＡＶ＋アジュバント／ＤＥＮ−８０Ｅサブユニットサンプルを１：１で混合した。９６ウェルプレート中で、１：１ＬＡＶ：アジュバント／抗原サンプルのさらなる希釈物を調製して、各試験サンプルの１：１０、１：１００、１：１，０００、１：１０，０００、１：１００，０００および１：１，０００，０００希釈物を得た。基本的には実施例２に記載されているように、Ｔ＝０時間およびＴ＝２４時間のサンプルにおいて、プラークアッセイを実施した。
【０１１６】
結果は、試験したすべての製剤が、ウイルス生存率に影響しないと思われたことを示している（図２を参照のこと）。しかしながら、四価ＤＥＮ−８０Ｅ、四価ＤＥＮ−８０Ｅ＋ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）および四価ＤＥＮ−８０Ｅ＋ＭＡＡを含むサンプル中で２４時間インキュベートした後のｒＹＦ−ＤＥＮ１ウイルス力価は、わずかに（約１ｌｏｇ）減少した。
【０１１７】
［実施例５］
アジュバントおよび／またはデング抗原（四価ＤＥＮ−８０Ｅ）の存在下における他のデングウイルスの適合性／安定性試験のための製剤の調製
四価ＤＥＮ−８０Ｅ（１−４）サブユニットワクチンのみと、またはＭＡＡもしくはアルヒドロゲルと組み合わせた四価ＤＥＮ−８０Ｅ（１−４）サブユニットワクチンと組み合わせて共製剤化した場合の他のデングウイルス（ＤＥＮＶ１〜４）の適合性／安定性を評価するために、別の研究を実施した。使用した野生型（ｗｔ）デングウイルスは、ＷＨＯ参照株（ＤＥＮ１−Ｗｅｓｔ  Ｐａｃｉｆｉｃ  ７４；ＤＥＮ２−１６８０３；ＤＥＮ３−ＣＨ５３４８９；およびＤＥＮ４−ＴＶＰ−３６０）であった。
【０１１８】
無菌技術を使用して、バイオセーフティキャビネット内で、すべての製剤を調製した。所望のアジュバント、（１または複数の）デング抗原または（１または複数の）アジュバント／抗原組み合わせのダルベッコＰＢＳ溶液を用いて、試験用のサンプルを製剤化し、２ｍｌ滅菌ＩＳＯバイアルに入れて、Ｆｌｕｒｏｔｅｃストッパーで密封した。本研究で試験したアジュバント／抗原サンプルは、以下のとおりであった：（１）ＰＢＳのみ；（２）四価ＤＥＮ−８０Ｅ（Ｖ１８０；ＤＥＮ１−８０Ｅ＋ＤＥＮ２−８０Ｅ＋ＤＥＮ３−８０Ｅ＋ＤＥＮ４−８０Ｅ）；（３）四価ＤＥＮ−８０Ｅ（Ｖ１８０）＋ＭＡＡ；および（４）四価ＤＥＮ−８０Ｅ（Ｖ１８０）＋アルヒドロゲル。下記のように、アジュバント／抗原サンプル（１）〜（４）をｗｔデングウイルスと１：１の比で別個にフィールド混合した。ｗｔデングウイルスとフィールド混合する前後のサンプルの用量および濃度は、表３に示されているとおりであった。
【表３】
2016523251.tif 000005
【０１１９】
ＬＡＶとフィールド混合する前に、すべての製剤を２〜８℃で保存した。
【０１２０】
［実施例６］
アジュバントおよび／またはデング抗原（四価ＤＥＮ−８０Ｅ（Ｖ１８０））の存在下における野生型デングウイルスを含む複合製剤の適合性／安定性試験
実施例５で調製した抗原／アジュバントサンプル（１）〜（４）をｗｔデングウイルスとフィールド混合し、下記のように、インビトロプラークアッセイを使用して、Ｖｅｒｏ細胞においてウイルス生存率について試験した。
【０１２１】
Ｖｅｒｏ細胞（ｐ３８）を細胞４．０×１０５個／ウェルで２４ウェルプレートに播種した。基本的には、一価研究に関する実施例２に記載されているように、ウイルスを調製し、ｗｔデングウイルス＋アジュバント／ＤＥＮ−８０Ｅサブユニット（Ｖ１８０）サンプルを１：１で混合した。９６ウェルプレート中で、１：１ｗｔデングウイルス／抗原サンプルのさらなる希釈物を調製して、各試験サンプルの１：１０、１：１００、１：１，０００、１：１０，０００、１：１００，０００および１：１，０００，０００希釈物を得た。基本的には実施例２に記載されているように、Ｔ＝０時間およびＴ＝２４時間のサンプルにおいて、プラークアッセイを実施した。
【０１２２】
結果は、記載したすべての製剤が、ウイルス生存率に影響しないと思われたことを示している（図３を参照のこと）。しかしながら、ＰＢＳ、四価ＤＥＮ−８０Ｅおよび四価ＤＥＮ−８０Ｅ＋ＭＡＡを含むサンプル中で２４時間インキュベートした後のＤＥＮＶ３力価は、わずかに（約１ｌｏｇ）減少した。
【０１２３】
［実施例７］
アジュバントおよび／またはデング抗原（全不活性化ｒＹＦ−ＤＥＮ２）の存在下におけるｒＹＦ−ＤＥＮ２キメラ生弱毒化ウイルスの適合性／安定性試験のための製剤の調製
全精製不活性化ｒＹＦ−ＤＥＮ２（ＰＩＶ）のみと、またはＭＡＡもしくはアルヒドロゲルと組み合わせた全精製不活性化ｒＹＦ−ＤＥＮ２（ＰＩＶ）と組み合わせたｒＹＦ−ＤＥＮ２  ＬＡＶの安定性を評価するために、別の研究を実施した。Ｐｕｔｎａｋ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１７４（６）：１１７６−８４（１９９６））に記載されている方法にしたがって、精製不活性化ｒＹＦ−ＤＥＮ２ウイルス（ＰＩＶ）を調製した。簡潔に言えば、ｒＹＦ−ＤＥＮ２感染Ｖｅｒｏ細胞由来の上清を回収し、１０００ｒｐｍで１０分間清澄化し、０．４５μｍフィルタ（ＣＮ／ＣＡ型）に通してろ過し、次いで、ろ過速度約１００ｍｌ／分、圧力１５〜２０ｐｓｉのタンジェント流ろ過（低タンパク質結合１００ｋＤａカットオフ膜）に供した。濃縮後、サンプルを４℃、１７Ｋｒｐｍでスクロース勾配（１５〜６０％）超遠心分離に１８時間供した。勾配管の底部から画分（各１ｍｌ）を回収し、全タンパク質およびデング特異的タンパク質について分析した。陽性画分をプールし、ＰＢＳで希釈し、０．２２μｍ低タンパク質結合フィルタ（ＧＶ  ｔｙｐｅ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通してろ過した。一定温度の水浴中、２２℃の５０ｍｌポリプロピレンチューブ内で、ろ過したプールを０．０５％ホルマリンで１０日間不活性化した。プラークアッセイによって、ウイルスの完全な不活性化を確認した。不活性化後、溶液を０．２２μｍフィルタに通してろ過し、亜硫酸水素ナトリウムで遊離ホルマリンを中和した。
【０１２４】
無菌技術を使用して、バイオセーフティキャビネット内で、すべてのＰＩＶ製剤を調製した。所望のアジュバント、（１または複数の）デング抗原または（１または複数の）アジュバント／抗原組み合わせのダルベッコＰＢＳ溶液を用いて、試験用のサンプルを製剤化し、２ｍｌ滅菌ＩＳＯバイアルに入れて、Ｆｌｕｒｏｔｅｃストッパーで密封した。本研究で試験したアジュバント／抗原サンプルは、以下のとおりであった：（１）ＰＢＳのみ；（２）全不活性化ｒＹＦ−ＤＥＮ２  ＰＩＶ；（３）全不活性化ｒＹＦ−ＤＥＮ２  ＰＩＶ＋ＭＡＡ；および（４）全不活性化ｒＹＦ−ＤＥＮ２  ＰＩＶ＋アルヒドロゲル。下記のように、アジュバント／抗原サンプルをｒＹＦ−ＤＥＮ  ＬＡＶと１：１の比でフィールド混合した。ｒＹＦ−ＤＥＮ２生弱毒化デングウイルスとフィールド混合する前後のサンプルの用量および濃度は、表４に示されているとおりであった。
【表４】
2016523251.tif 000006
【０１２５】
ＬＡＶとフィールド混合する前に、すべての製剤を２〜８℃で保存した。
【０１２６】
［実施例８］
アジュバントおよび／またはデング抗原（全不活性化ｒＹＦ−ＤＥＮ２）の存在下におけるｒＹＦ−ＤＥＮ２キメラ生弱毒化ウイルスを含む製剤の適合性／安定性試験
実施例７で調製した抗原／アジュバントサンプルをｒＹＦ−ＤＥＮ２  ＬＡＶとフィールド混合して複合製剤を調製し、下記のように、インビトロプラークアッセイを使用して、Ｖｅｒｏ細胞においてウイルス生存率について試験した。
【０１２７】
Ｖｅｒｏ細胞（ｐ４０）を細胞４．０×１０５個／ウェルで２４ウェルプレートに播種した。基本的には、一価研究に関する実施例２に記載されているように、ウイルスを調製し、ｒＹＦ−ＤＥＮ２＋アジュバント／全不活性化ＹＦ−ＤＥＮ２サンプルを１：１で混合した。９６ウェルプレート中で、１：１ｒＹＦ−ＤＥＮ２  ＬＡＶ／抗原サンプルのさらなる希釈物を調製して、各試験サンプルの１：１０、１：１００、１：１，０００、１：１０，０００、１：１００，０００および１：１，０００，０００希釈物を得た。基本的には実施例２に記載されているように、Ｔ＝０時間およびＴ＝２４時間のサンプルにおいて、プラークアッセイを実施した。
【０１２８】
結果は、試験したすべての製剤が、ウイルス生存率に影響しないと思われたことを示している（図４を参照のこと）。
【０１２９】
［実施例９］
アカゲザルにおけるデングプライム−ブーストワクチン接種戦略の評価
アカゲザルで行ったこの非ＧＬＰ研究の目的は、複合製剤「プライム−ブースト」ワクチン接種戦略を評価し、それを従来のプライムブースト戦略と比較することであった。研究のために、様々なレジメンを使用して、２つのワクチン候補（四価組換えデングサブユニットワクチン候補（Ｖ１８０）および四価デング生弱毒化ワクチン（ＬＡＶ））を投与した。四価Ｖ１８０候補は、４つの各デングウイルス血清型（デングウイルス（ＤＥＮＶ）１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４）由来の切断型エンベロープ糖タンパク質（ＤＥＮ−８０Ｅ）を含んでいた。四価ＬＡＶは、デング１−４４型の生弱毒化キメラ黄熱病／デングウイルス（「ＹＦ−ＤＥＮ」）を含んでいた。ＹＦＶ１７Ｄ由来のｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質をコードする遺伝子を４つの各デング血清型のものと交換することによって、黄熱病−デングキメラワクチンベクターを構築した。ＤＮＡクローニングの後、ＲＮＡを転写し、Ｖｅｒｏ細胞にトランスフェクトして、ＹＦＶ１７Ｄの複製機構と、関連デングウイルスの外被とを有するキメラウイルスを得た。
【０１３０】
体重３ｋｇ超であり、中和力価（ＤＥＮＶの場合）およびＥＬＩＳＡ（ＷＮＶの場合）によればフラビウイルス（ＤＥＮＶ１、２、３および４ならびにＷＮＶ）抗体陰性のいずれかの性別の健常成体インドアカゲザル（ｎ＝４／群）を本研究で利用した。表５に記載されているように、ワクチンを投与した。本研究では、グループ１には、０週目および２４週目において、ＹＦ−ＤＥＮワクチンを皮下（ＳＣ）投与した。グループ２および３は、０週目においてＹＦ−ＤＥＮワクチンを投与し、続いて２４週目において、ＭＡＡと共に製剤化したＶ１８０を投与する従来のプライムブーストを受けた。グループ２には、標準的なＳＣ経路によってＹＦ−ＤＥＮワクチンを投与し、グループ３には、筋肉内（ＩＭ）経路によってワクチンを投与した。これにより、本発明者らは、筋肉内（ＩＭ）投与（これは、グループ４および５に投与した複合製剤に使用したのと同じ投与経路であった）したＹＦ−ＤＥＮワクチンの免疫原性を評価することができた。グループ４および５には、０週目および２４週目において、ＹＦ−ＤＥＮワクチンおよびＶ１８０の複合製剤を投与した。グループ４では、アジュバントとしてＭＡＡを含め、グループ５では、アジュバントとしてＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）を含めた。すべてのワクチンを０．５ｍＬ／用量で投与した。ワクチン接種後、接種部位のあらゆる変化、またはワクチンに対する有害反応を示し得る活動もしくは食性に関する他の変化について、動物を毎日観察した。
【表５】
2016523251.tif 000007
【０１３１】
３２週間の研究を通して、ＬｉＣｏｒベースのマイクロ中和アッセイを使用して、ウイルス中和活性を４週間ごとに決定した。ＬｉＣｏｒアッセイでは、平底９６ウェル組織培養プレート中の１００μｌの１０％培地１９９に、Ｖｅｒｏ細胞を細胞１．５×１０４個／ウェルで一晩播種した。別個の９６ウェルプレート中で、血清サンプルを２回反復で連続２倍希釈した（１：１０から開始して８回希釈）。エンドポイント滴定に達することができなかったサンプルについては、より高倍率の希釈からサンプルを再試験した。５０ｐｆｕ／ウェルに希釈した等量のウイルスと共に血清をインキュベートした。２％培地１９９中で、すべてのアッセイ希釈を実施した。混合物を３７℃＋５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。中和後、プレートしたＶｅｒｏ細胞に全部の混合物を追加し、３７℃＋５％ＣＯ２で４日間インキュベートした。培養培地を除去した後、３．７％ホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液で細胞を３０分間固定した。それぞれ２００μｌの０．１％ＴｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳで、プレートを５分間かけて２回洗浄した。２．８μｇ／ｍｌの４Ｇ２抗体５０μｌで、プレートを染色した。次いで、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧを７．５μｇ／ｍｌで追加し、続いて、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ（Ｌｉ−Ｃｏｒ，Ｉｎｃ．，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）ストレプトアビジン（１：１０００）およびＤＲＡＱ５（１：１０，０００）のカクテルを追加した。この最終的な現像のために、プレートを暗所で保持した。０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を補充したＯｄｙｓｓｅｙ  Ｂｌｏｃｋ緩衝液によって、抗体および試薬を希釈した。抗体交換の間に、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳを使用して、プレートを３回洗浄した。インキュベーション工程を室温で１時間実施した。ＢｉｏＴｅｋ（登録商標）ＥＬ４０６プレート洗浄システム（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を使用して、洗浄および分注工程を自動化した。プレートを空気乾燥し、赤外線Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）Ｓａイメージングシステム（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてスキャンした。生データをＥｘｃｅｌプロセシングワークシートにインポートした。２連ウェルを平均し、血清エンドポイント中和力価は、８００ｎｍ／７００ｎｍ蛍光積分強度比を、各アッセイプレートに含まれるウイルス対照と比較して５０％超減少させる最高血清希釈の逆数と定義した。Ｐｒｉｓｍ（登録商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して、結果をプロットした。１：１０希釈から開始して、すべてのサンプルをセットアップした。この希釈において、サンプルが中和することができなかった場合には、１：５の力価を割り当てた。
【０１３２】
４週目（投与１の４週間後）のすべてのグループのＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４の幾何平均中和力価を図５に要約する。この時点で、ＤＥＮＶ３に反応しなかったグループ１の１匹の動物を除くすべての免疫動物において、ウイルス中和抗体応答が検出された。４週目の結果の重要な結論は、以下のとおりである：
・筋肉内（ＩＭ）投与した四価ＹＦ−ＤＥＮワクチンは、標準的な皮下（ＳＣ）経路によってワクチンを投与した場合に誘導されたものよりも優れているとは言わないまでも同等の中和力価を刺激した（グループ３とグループ１およびまたは２との比較）。
【０１３３】
・投与１の４週間後の複合製剤グループ（グループ４および５）で測定した中和応答は、ＹＦ−ＤＥＮワクチンを単独で投与した場合（グループ１、２および３）に誘導されたものよりも優れているとは言わないまでも同等であった。これは、ＹＦ−ＤＥＮワクチンとＶ１８０サブユニットワクチンおよびアジュバント（ＭＡＡまたはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標））との複合製剤が、第１の用量のワクチン中のＬＡＶに対する応答に悪影響を与えない。
【０１３４】
２８週目（投与２の４週間後）のすべてのグループのＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４の幾何平均中和力価を図６に要約する。この時点で、すべての免疫動物において、ウイルス中和抗体応答が検出された。２８週目の結果の重要な結論は、以下のとおりである：
・従来のプライムブースト（グループ２および３）および複合製剤のプライムブーストアプローチ（グループ４および５）は両方とも、四価ＹＦ−ＤＥＮワクチン（グループ１）と比較して、４つのＤＥＮＶ型すべてに対する優れた中和力価を誘導した。力価は、ＤＥＮＶ型に応じて３〜１９倍以上の範囲であった。
【０１３５】
・投与２の４週間後の複合製剤グループ（グループ４および５）で測定した中和応答は、従来のプライムブーストレジメンを受けたグループ（グループ２および３）で誘導されたものと同等であった。これは、ＹＦ−ＤＥＮワクチンとＶ１８０サブユニットワクチンおよびアジュバント（ＭＡＡまたはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標））との複合製剤が、サブユニットによる追加刺激に対する応答に悪影響を与えない。
【０１３６】
すべてのグループのＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４の縦方向幾何平均中和力価を図７に示す。全体として、このデータは、０週目および２４週目において、四価ＬＡＶと一緒に混合したＶ１８０サブユニットワクチンを動物に投与した複合製剤プライム−ブーストレジメンが、従来のプライムブーストアプローチと同程度の応答を誘発し、その応答が、均一なワクチンとして投与したＬＡＶよりも優れていることを実証している。
【図１】
2016523251.tif 000008
【図２】
2016523251.tif 000009
【図３】
2016523251.tif 000010
【図４】
2016523251.tif 000011
【図５】
2016523251.tif 000012
【図６】
2016523251.tif 000013
【図７】
2016523251.tif 000014
【配列表】
2016523251000001.app
【国際調査報告】
2016523251.tif 000015
2016523251.tif 000016