(57)【要約】  本発明は、アトロピン又はその塩、アコニチン及びシアン化水銀を含む、ウイルス感染を治療する方法に用いられる医薬組成物に関する。【選択図】図1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)アトロピン又はその塩、b)アコニチン及びc)シアン化水銀を含む、ウイルス感染を治療する方法に用いられる医薬組成物。
【請求項２】
前記ウイルス感染は、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス及び/又はエンテロウイルスによって引き起こされる、請求項１に記載のウイルス感染を治療する方法に用いられる医薬組成物。
【請求項３】
前記ウイルス感染は、HRV14(ヒトライノウイルスタイプ14)、RSV(ヒト呼吸器合胞体ウイルス)、HSV1(単純ヘルペスウイルス1型)及び/又はCA9(ヒトコクサッキーウイルスタイプ9)によって引き起こされる、請求項１又は2に記載のウイルス感染を治療する方法に用いられる医薬組成物。
【請求項４】
前記組成物は、水溶液/エタノール溶液として存在し、約5μg/mlのアトロピン硫酸塩、約1μg/mlのアコニチン及び約0.004μg/mlのシアン化水銀を含む、請求項１から3のいずれかに記載のウイルス感染を治療する方法に用いられる医薬組成物。
【請求項５】
前記組成物は、1から10μg/ml、好ましくは2から7μg/ml、最も好ましくは3.13から6.25μg/mlのアトロピン硫酸塩を含む、請求項１から3のいずれかに記載のウイルス感染を治療する方法に用いられる医薬組成物。
【請求項６】
前記組成物は、0.05から5μg/ml、好ましくは0.5から2μg/ml、最も好ましくは0.16から1.56μg/mlのアコニチンを含む、請求項１から3のいずれかに記載のウイルス感染を治療する方法に用いられる医薬組成物。
【請求項７】
前記組成物は、0.001から0.1μg/ml、好ましくは0.001から0.01μg/ml、最も好ましくは0.003から0.006μg/mlのシアン化水銀を含む、請求項１から3のいずれかに記載のウイルス感染を治療する方法に用いられる医薬組成物。
【請求項８】
前記組成物は、約20μg/mlのアトロピン硫酸塩、4μg/mlのアコニチン及び0.016μg/mlのシアン化水銀を一日量として投与される、請求項１から7のいずれかに記載のウイルス感染を治療する方法に用いられる医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、アトロピン又はその塩、アコニチン及びシアン化水銀を含む、ウイルス感染を治療する方法に用いられる医薬組成物に関する。
【０００２】
発明の背景
ウイルスは、風邪の主要な病原体である。このウイルスの中で、ライノウイルス及びコロナウイルスは、全ての気道感染症の原因となるものの50から70%を占めている主犯であり、その次が、パラインフルエンザウイルス、RSV、アデノウイルス及びエンテロウイルスである。同様に、インフルエンザや他の急性気道疾患は、ウイルスによって引き起こされる。更に、単純ヘルペスウイルス(HSV)は、免疫系が弱ることに伴って有効となり、対応する症状(例えば、口唇ヘルペス)を誘発できるようになる。
【０００３】
細菌感染症を治療するための抗生物質は豊富であるのに対して、狭いウイルススペクトラムに対する比較的数少ない抗ウイルス剤だけが、ウイルス関連疾患の治療に利用可能である。無理もない話だが、抗生物質は、多くの副作用を伴うものであり、ウイルスが通常関係する風邪の治療にはほとんど関与しないが、長引く風邪に伴う細菌性の二次感染の可能性があるものにだけ作用する。頻繁で早まった多量の抗生物質の処方は、更に、抵抗性を進行させる割合を高めるか、多くのケースで全く効果を発揮しなくなる。従って、効果的且つ許容可能な代替物が望まれている。
【０００４】
フィトテラピー剤や複合ホメオパシー剤は、このような代替物となり得る可能性がある。事実、このような代替物は、合成治療薬と比較して治療スペクトラムが広く、許容性が良好であり、そして、薬物相互作用が小さいという点でメリットがあり、抵抗性が進行する危険性がないため、絶えず議論されてきた。
【０００５】
近年、植物に基づく医薬が抗ウイルス効果を示すことができたという試験結果の公表が増加している。複合ホメオパシーメディトシン(Meditonsin)(登録商標)は、植物成分であるアトロピン及びアコニチン並びにシアン化水銀塩からなり、気管支炎、鼻炎及び咽頭腔炎の治療に既に60年以上もの間使われてきた。臨床調査は、上気道炎の治療効果と良好な認容性が確認されている。
【０００６】
EP 0 513 878は、とりわけ、0.10gのセチルピリジニウム塩化物、0.004gのアトロピンヒドロクロリド及び0.004gのシアン化水銀(II)(100ml当たり)を含む溶液を開示している。インフルエンザウイルスに対する溶液の抗ウイルス効果は、より正確に言うと、シアン化水銀(II)及びセチルピリジニウム塩化物によるものであると記載されている。
【０００７】
WheelerらのThe Effect of Atropine Sulfate on the Course of Influenza Virus Infection", Science, 08.12.1944, Vol. 100, No. 2606は、アトロピン硫酸塩の抗ウイルス効果(インフルエンザAウイルス)に関するものである。しかしながら、実際に使用するアトロピン濃度は、特定されていない。更に、インフルエンザAウイルスに対するアトロピンの持続的な効果についての証拠はない。逆に、この効果は、試験動物に対するウイルス接種時間に関係する、腹腔内投与の時間次第である。
【０００８】
Z. YamazakiらのAntiviral Effects of Atropine and Caffeine", J. Gen. Virol. (1980), 50, 429-431は、ヘルペスウイルス及びインフルエンザウイルスに対するアトロピンの抗ウイルス効果を開示している。最大効果は、アトロピンの濃度が2mMで達成される。
【０００９】
Oezcelikらの"Cytotoxicity, antiviral and antimicrobial activities of alkaloids, flavonoids, and phenolic acids", Pharmaceutical Biology, 2011; 49(4): 396-402は、とりわけ、多数のアルカロイドの抗ウイルス効果、抗菌効果、抗カビ効果及びそれらの細胞毒性を記載している。0.8から0.05μg/mlの濃度範囲内のアトロピンの抗ウイルス効果(例えば、HSV1に対する効果)は、記載されている。
【００１０】
本発明の基礎となる研究から、驚くべきことに、アトロピン、アコニチン及びシアン化水銀の混合物は、強い抗ウイルス特性を有することが明らかになった。この混合物がどの濃度でどのウイルスに効果があるかについて特に注意を払った。これには、風邪ウイルス及びヘルペスウイルスに対する試験が含まれている。
【００１１】
従って、本特許出願は、アトロピン又はその塩、アコニチン及びシアン化水銀を含む医薬組成物をウイルス感染の治療に有利な方法で用いることができるという驚くべき見識に関するものである。
【００１２】
発明の開示
本発明は、様々な濃度範囲における、活性成分であるアトロピン、アコニチン及びシアン化水銀の混合物の抗ウイルス特性を示す。試験した全てのウイルス活性は、この混合物の非常に強い阻害によって強く阻害されることを示し得た。
【００１３】
従って、本発明は、アトロピン又はその塩、アコニチン及びシアン化水銀を含む、ウイルス感染を治療する方法に用いられる医薬組成物に関するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図1は、濃度に応じた本発明による医薬組成物の抗ウイルス効果(相対阻害の割合として測定)を報告する。対応する個々の値は、表3に示している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、a)アトロピン又はその塩、b)アコニチン及びc)シアン化水銀から実質的になる又はそれを含む、ウイルス感染を治療する方法に用いられる医薬組成物に関するものである。
【００１６】
本願において用いられる「医薬組成物」という用語には、特に、経口投与形態(例えば、経口投与のための固体、半流体又は流体組成物)が含まれる。本願において、点滴用水溶液/エタノール溶液が特に有利であることが明らかになった。例えば、94%(g/g)のエタノール、85%のグリセリン及び精製水の混合物(重量比は、5:10:85)が、特に有利に用いられる。
【００１７】
しかしながら、他の投与形態も、代わりに可能であり、例えば、固体の経口投与形態(例えば、粉末、タブレット又はカプセル)である。特に、製造は、Homoeopathisches Arzneibuch 2012 (HAB 2012) [Homeopathic pharmacopoeia](公式版)に従って、ホメオパシー医薬の標準的な製造法に従ってなされた。例えば、HABの指示に従って、粉末の製造が可能であり、段階的に出発物質をすりつぶしてラクトース一水和物を有する粉末にする。また、対応する粉末を圧縮してタブレットとすることもできる。この点について、潤滑油としてのステアリン酸マグネシウム又はベヘン酸カルシウム、及び、崩壊剤としての澱粉を添加剤として僅かに用いることができる。顆粒の場合、水溶性ラクトース溶液、エタノール及び適切な濃度の澱粉糊を用いることができる。
【００１８】
更に、HAB指示10に従って、糖丸を、1/100質量の関連希釈剤にて均一に湿らせて、空気乾燥させて、丸薬を製造することができる。
【００１９】
経口投与形態に加えて、本発明の医薬組成物には、HAB指示11-15及び45に従って製造される非経口投与薬、即ち、注射用液体希釈剤、液体塗布剤、軟膏、坐薬、点眼、点鼻剤を含むことができる。前述した通り、最も好ましい実施形態にかかる本医薬組成物は、Homoeopathisches Arzneibuchの指示に従って製造された経口溶液である。
【００２０】
「から実質的になる」という表現は、医薬組成物がこれらの成分を有効成分として含むことを意味する。しかしながら、溶媒、賦形剤等の、医薬組成物の製造のために必要である一方で薬理学的効果に実質的に寄与しないものを1又は複数追加的に含むことができる。
【００２１】
医薬組成物の成分の1つは、アトロピンである。アトロピンは、以下の構造式によるアイソマー(R)-及び(S)-ヒヨスチアミンのラセミ化合物であるトロパンアルカロイドである。
【化１】
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(R)-型は、上側に示しており、(S)-型は下側に示している。
【００２２】
アトロピンは、副交感神経遮断薬の一種であり、副交感神経系のムスカリン受容体において神経伝達物質アセチルコリンと競合する。アトロピンの経口摂取の物理的効果は、心拍数の高速化、気管支の拡張、唾液形成の低下等である。更に、稀ではあるが、他の使用領域として、例えば、消化管の痙攣、排尿困難、尿失禁の際の使用が述べられている。しかしながら、抗ウイルス剤としての使用は、これまで述べられていない。
【００２３】
本発明により使用するアトロピン塩は、通常、アトロピン硫酸塩(例えば、アトロピン硫酸塩一水和物)である。
【００２４】
本発明の組成物において、アトロピン又はその塩は、1から100μg/ml、好ましくは1から10μg/ml、より好ましくは2から7μg/ml、最も好ましくは3.13から6.25μg/mlの濃度で用いられる。本発明によれば、アトロピン硫酸塩を医薬組成物の他の成分と組み合わせて使用する場合、より低い用量のアトロピン硫酸塩としてもよいことが明らかである(以下参照)。言い換えると、より低い濃度で、少なくとも比較的、場合によっては、明確に良好な抗ウイルス効果を達成することができる。
【００２５】
アコニチンは、医薬組成物の他の成分として使用される。アコニチンは、電位依存的ナトリウムチャネルの不活性化を遅延させることによって、神経の電位活動中にナトリウムイオンの流入を長引かせるジテルペノイドアルカロイドである。最初の刺激よって、中枢的及び末梢的に運動神経及び感覚神経に初めに作用し、続いて麻痺となる。心臓への影響には、不整脈、徐脈及び弛緩性心停止を含み得る。成人の場合、アコニチンの致死量は、およそ5mgである。アコニチンは、以下の構造式を有する。
【化２】
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【００２６】
化学分子式は、C34H47NO11である。アコニチンの抗ウイルス効果は、これまで記載されていなかった。
【００２７】
アコニチンは、0.05から100μg/ml(例えば、0.5から100μg/ml)、好ましくは0.05から5μg/ml、より好ましくは0.5から2μg/ml及び最も好ましくは0.16から1.56μg/mlのアコニチン濃度で、本発明の組成物の有効成分として使用する。更に、本発明の医薬組成物の他の2つの有効成分、即ち、シアン化水銀(II)とアトロピンとの組み合わせにおいて、相乗効果が成し遂げられる、即ち、同じ又はより少ない個々の成分量で相加的抗ウイルス効果を上回る。
【００２８】
本発明の医薬組成物の第三成分は、シアン化水銀(Hg(CN)2)である。シアン化水銀は、ジフテリア、重症アンギナ及び風邪を治療するホメオパシーにおいてだけ用いられる有毒性が高い化合物である。
【００２９】
シアン化水銀は、溶液中において0.001から10μg/ml、好ましくは0.001から0.1μg/ml、より好ましくは0.001から0.01μg/ml、最も好ましくは0.003から0.006μg/mlのシアン化水銀濃度で、本発明の組成物の成分として用いられる。
【００３０】
上にて説明した通り、本発明の医薬組成物は、アトロピン(又はその塩)、特にアトロピン硫酸塩及びアコニチン及びシアン化水銀の組み合わせを含む。そのような組成物に関して、特定の物質だけの場合よりも、個々の成分の濃度をより低いレベルで有利に調製できることが明らかになった。例えば、本発明の医薬組成物(例えば、水溶液/エタノール溶液の形のもの)は、約1から10μg/ml、好ましくは5μg/mlのアトロピン硫酸塩、約0.5から5μg/ml、好ましくは1μg/mlのアコニチン及び約0.001から0.1μg/ml、好ましくは0.004μg/mlのシアン化水銀を含むことができる。
【００３１】
本発明の有利な組成物は、合計濃度がおよそ3から9μg/mlの上述した成分を含む。図1から明らかのように、抗ウイルス効果に関する最善の結果は、合計濃度が6μg/mlで示されているが、たとえ低い値(例えば、合計濃度が3μg/ml)であっても、優れた阻害値がまだ達成される。
【００３２】
特に好ましい組成物には、約5μg/mlのアトロピン硫酸塩、1μg/mlのアコニチン及び0.004μg/mlのシアン化水銀を含むエタノール、グリセリン及び水の溶液が含まれる。導入部で説明したように、かかる組成物は、既に知られており、「メディトシン」(登録商標)の名前で数十年間、ヨーロッパの市場でうまく販売されている。驚いたことに、３つの組み合わせの使用が、個々の成分の抗ウイルス活性に関して相乗効果を示すことが明らかになった。実施例からまとめることができるように、いわゆる「メディトシン」混合物は強く、抗ウイルス効果、特にRSV、CA9、HRV14及びHSV1に対する効果が非常に強い。これは、特に、混合物において用いられる個々の成分の濃度が、個々の試験で使用する量よりも低いという事実を考慮する場合である。
【００３３】
表2は、アトロピン硫酸塩、アコニチン及びシアン化水銀物質並びにそれらの混合物間での抗ウイルス効果の比較を示すものである。記録した測定結果は、プラーク阻害の割合である。例えば、5μg/mlのアトロピン硫酸塩、1μg/mlのアコニチン及び0.004μg/mlのシアン化水銀の混合物に関するプラーク阻害割合は、HSV1に基づいて、69.53%である。個々の物質のプラーク阻害を考慮すると、これは驚くほど高い値である:これは、アトロピン硫酸塩の場合でおよそ35%、アコニチンでおよそ8%及びシアン化水銀ではほぼ負の値である。個々の測定値から予想される値と比較して、HSV1に対する混合物の阻害作用は、ほぼ二倍高い。それとは別に、ほぼ70%のプラーク阻害は、優れた値であり、混合物の使用が高い治療潜在性を示している。
【００３４】
同様の驚くべき結果が、CA9、RSV及びHRV14に関して、表2からまとめることができる。ここでも、混合物における個々の成分に関する相加効果を上回ることが明らかであり、その効果は個々の物質に対して約2倍であると推定することができる。
【００３５】
本発明の医薬組成物(混合物)は、毎日、約20μg/mlのアトロピン硫酸塩、4μg/mlアコニチン及び0.016μg/mlのシアン化水銀の全量を成人患者に投与される。この点について、特定の量からおよそ±30%の偏差を許容できる。
【００３６】
言い換えると、一日当たり、およそ2から6mlの医薬組成物(濃度は、上記の特定のもの)を成人患者に投与する。上記用量は、6から12歳の児童では半分量であり、1歳からの小さな子供では更に少なくし、年齢7ヵ月から乳児では約25%である。
【００３７】
本発明は、以下の例示的な実施形態を参照しながら説明する。これにより、本発明の組成物の効果が示されるだろう。
【実施例】
【００３８】
目標/目的
以下に記載の抗ウイルス試験の目的は、アトロピン硫酸塩、アコニチン及びシアン化水銀並びにこれら3つの物質の混合物に関する抗ウイルス効果を調査することとした。
【００３９】
試験方針
アトロピン硫酸塩、アコニチン及びシアン化水銀並びにこれら3つの物質の混合物に関する抗ウイルス試験は、二つの段階に分けられる。第一段階においては、ウイルス保有者としての役割を果す非ウイルス感染細胞株に対して試験物質がどの濃度であれば細胞毒性を発揮しないかを明らかにする目的で、様々な希釈レベルにて試験物質の細胞毒性を試験する。第二段階においては、細胞毒性が細胞株に発揮されない試験物質の希釈レベルから始めて、試験で使用するウイルスに対する様々な希釈レベルでの試験物質の抗ウイルス効果を調査する。
【００４０】
材料
試験用試料
原材料であるアトロピン硫酸塩(AT)、アコニチン(AC)及びシアン化水銀(QC)を由来とする、抗ウイルス効果のための毒性試験とその後の試験のための測定用試料は、以下の表に従って調製した。
【００４１】
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【００４２】
細胞
・RSV及びHSV1が感染したヒト上皮細胞(HEp-2細胞)
・CA9が感染したバッファローグリーンモンキー細胞(BGM細胞)
・HRV14が感染したＨｅＬａ細胞(子宮頸癌のヒト上皮細胞由来のＨｅＬａ細胞株)
【００４３】
ウイルス
・ヒト呼吸器合胞体ウイルスのLong株(RSV)
・ヒトコクサッキーウイルスタイプ9(CA9)
・ヒトヘルペスウイルス1型(HSV1)
・ヒトライノウイルスタイプ14(HRV14、主要グループ)
【００４４】
参照コントロール及び検査内部標準
・RSVに対するリバビリン(バイラゾール(登録商標))(ICN Pharmaceuticals)(5μg/ml)
・CA9の感染に対する検査内部標準(L-Std)(L-Std、6μg/ml)
・HSV1に対するアシクロビル(2.5μg/ml)
・HRV14に対する塩酸オキシメタゾリン(OMZ、10μg/ml)
【００４５】
細胞培養の中毒の可能性を排除するための細胞毒性アッセイ
測定用試料の細胞毒性は、MTTアッセイ(代謝試験)によって調査した。MTTアッセイにおける代謝能を試験するためのアッセイ調製物を、96穴マイクロタイタープレートに施し、顕微鏡分析のための同じアッセイ調製物を24穴マイクロタイタープレートに施した。
【００４６】
MTTアッセイ
原理
MTTアッセイにおける代謝能の測定は、ミトコンドリア酵素活性の定量分析によって行った。Mosmann比色アッセイ(Mosmann 1983)は、ミトコンドリアデヒドロゲナーゼによって、無色のMTT塩(臭化ジメチルチアゾールジフェニルテトラゾリウム)を青色の不水溶性ホルマザン結晶に変換することを伴う。この点について、細胞の生存度又は代謝能と細胞の酵素活性との間の直接的な相関を判断することができる。
【００４７】
試験プロトコール
毒性試験は、セクション0に従って測定用試料を溶解して調製した後に実行した。続いて、全ての試験溶液を更に段階的なlog2又はlog10希釈を行った。希釈した全ての試験物質を、生育中のBGM、HEp-2及びHeLa細胞に、並列サンプル(parallel samples)として加えた。その後、処理した細胞培養を、37℃及び5%CO2下で、合計3日又は5日間インキュベートした。用いたコントロールは、培地のみを含む細胞(未処理コントロール)又は培地に8、4、2、1及び0.004%エタノールを含む細胞(エタノールコントロール)とした。
【００４８】
評価
MTTアッセイの分析は、上記物質の追加後の1日目及び3日目、又は、1日目及び5日目に行った。このために、ジメチルスルホキシド(DMSO)中にホルマザン結晶を可溶化した後、処理した細胞をMTT溶液にて更に2〜4時間インキュベートして、細胞培養上清の光学濃度(OD)を、570nm(RF690nm)の光度計にて決定した。評価において、損傷を受けたより多くの細胞、形成した少量のホルマザン結晶、そして、ODの低下を適用した。変化があった細胞形態の顕微鏡的評価は、変化がない細胞形態の基準によって、又は、単離した細胞叢由来の、膜胞形成を伴った細胞の肥大化によって、上記物質の追加後の3日目又は5日目に行った。
【００４９】
相対生存度の割合の算出(Excel2000での統計)
未処理コントロールのOD値は、100%の生存度として規定した。従って、アッセイ調製物のOD値は、パーセンテージ値(%毒性)として記録した。本願において、多重並列サンプルによって、抗ウイルス試験における使用に関して、試験物質関連妨害を全く示さない濃度を通じて、様々な測定用試料の用量反応曲線から50%阻害量(IC50)を決定することができた。
【００５０】
細胞形態の分析に関する顕微鏡的所見
酵素MTTアッセイにおいて代謝能を決定するための並列調製において、細胞に対する試験物質の影響を、以下の基準で、アッセイ調製後の3日目又は5日目に細胞形態の顕微鏡的評価によって決定した。
・細胞形態に変化なし(-)
・わずかな膜胞形成を伴う細胞(+)
・細胞の肥大化及び著しい膜胞形成(++)
・細胞の丸化(+++)
・死滅した細胞叢(++++)
・表面活性成分によるものであろう細胞叢の固定(F)
・細胞叢に対する培地成分の沈殿によるもの(N)
【００５１】
抗ウイルス効果の試験
抗ウイルス活性を、プラーク減少アッセイ及びウイルス特異的エンザイムイムノアッセイにて量的に分析した。
【００５２】
使用するアッセイプラーク減少アッセイ(PFU/ml)
原理
プラーク減少アッセイを実行するために、密集成長細胞(細胞叢)に、規定のウイルス溶液を感染させた(M.O.I. = 感染多重度)。1時間のインキュベーション後、ウイルス接種物を除去して、細胞(細胞叢)を洗浄した。その後、ウイルス感染細胞を生理物質濃縮物及び固形培地成分(アガロース又はメチルセルロース)の追加で覆って、更に培養した。覆った培地における固形成分は、感染領域を制限し、その結果、ウイルス感染細胞(「プラーク」)の中心点が形成される。未処理ウイルスコントロールにおいて所定のプラーク数(M.O.I.)が顕微鏡によって観察できるまで、様々なアッセイ調製物を培養した。
【００５３】
評価
細胞叢を固定して染色することによって、暗い色の細胞叢において明るい環としてウイルスプラークが見えるようになった。プラーク数は、映像処理システムを使用して決定した。
【００５４】
阻害割合の算出(%阻害、Excel2000での統計)
未処理コントロールにおけるプラーク数は、100%感染として規定した。対照的に、様々なアッセイ調製物におけるプラーク数を評価し、分析される物質の阻害作用を物質阻害の割合(%阻害)として示すことができるようにした。
【００５５】
エンザイムイムノアッセイ(ELISA)(ウイルス生成の分析)
原理
ここで使用するサンドイッチELISA技術において、マイクロタイターウェルは、特異的ウイルスに対する抗体で被覆されている。感染細胞株の細胞培養上清に存在するウイルスを、固相に固定した抗体に結合させる。反応を可視化するために、酵素ペルオキシダーゼを有する標識化した病原体特異的検出抗体を使用する。この抗体は、対応するウイルスを目的とする。更なるステップにおいて、基質/色素原及び過酸化水素及びテトラメチルベンジジンを加えて、酵素-基質-色素原反応を引き起こして青色に染色させる。色の強度は、波長450nm(OD450)の光度計において光度分析的に決定される(吸光度)。これは、ウイルス抗原の含有量と比例する。
【００５６】
手順
感染処理した細胞におけるウイルス生成を、ELISAにて、ウイルス蛋白(RSVの場合、ウイルス特異的抗原を保存したもの)を決定することによって分析した。この目的で、密集成長ウイルス感受性細胞(細胞叢)に、規定のウイルス溶液を感染させた(M.O.I.)。1時間のインキュベーション後、ウイルス接種物を除去して、感染細胞叢を洗浄した。この次に、生理物質濃縮物を追加した。未処理ウイルスコントロールにおいて70%〜90%のCPEが顕微鏡によって観察できるまで、様々なアッセイ調製物を培養した。新しく合成されたウイルスは、この段階において、細胞培養上清に存在していた。この次に、ELISAにおけるウイルス蛋白の分析のためにウイルス含有細胞の培養上清を除去した。
【００５７】
阻害割合の算出(%阻害、Excel2000での統計)
未処理コントロールの吸光度の値(OD492nm)は、ELISAの酵素反応後、光度計において決定されるものであり、100%の感染として規定した。対照的に、様々なアッセイ調製物のODを評価して、分析される物質の阻害作用を物質阻害の割合(%阻害)として示すことができるようにした。
【００５８】
試験プロトコール
ウイルス感染細胞は、感染後、試験物質で直接処理した。この目的のために、ウイルス感受性細胞を、様々な調製ウイルス溶液に感染させた(HEp-2: RSV, HSV1; BGM: CA9; HeLa: HRV14)。抗ウイルス試験のために、様々なウイルス感染を、0.0004(RSV、HSV1、HRV14)又は0.0003(CA9)の介在感染量(M.O.I.感染多重度)によって行った。
【００５９】
感染細胞に対する様々な希釈レベルの試験溶液の添加は、細胞生存率アッセイにおける中毒の可能性をチェックした後に実行した。一連の希釈は、細胞に対して毒性を示さない濃度である50μg/ml(試験用試料番号1及び2)、2μg/ml(試験用試料番号3)、そして、6μg/ml(試験用試料番号4)にて開始した。希釈は、段階的なlog2又はlog10にて実行した。表1は、抗ウイルス試験で使用する試験用試料の濃度を示す。
【００６０】
抗ウイルス活性の定量分析は、映像処理システムを用いて、プラーク減少アッセイにおいて、アッセイ調製後の3日目〜5日目のウイルスプラークを計数することによって成し遂げた。更に、RSVの場合、ウイルスプラーク分析に関する実験に加えて、感染処理した細胞の細胞培養上清は、実施したアッセイ調製と同様に、エンザイムイムノアッセイ(ELISA)において新しく合成されたウイルス蛋白の含有量について試験した。
【００６１】
試験系は、有効な抗ウイルス物質：RSVに対するリバビリン(バイラゾール(登録商標))、HSV1に対するアシクロビル(ゾビラックス(登録商標))及びHRV14に対する塩酸オキシメタゾリン(OMZ)を用いて確認した。0.0004のM.O.I.での、10μgのOMZ/ml、5μgのリバビリン/ml又は2.5μgのアシクロビル/mlの使用濃度は、平均して約50〜60%の感染の減少を得た。CA9の場合、検査内部標準を含めた。50%〜70%の感染減少を示すことができるように、検査内部標準をセットした。
【００６２】
更に、試験系において、培地(MEM)における最終濃度が0.8%(番号1、番号2)、0.0043%(番号3)及び0.048%(番号4)EtOHでる様々な試験溶液のエタノール溶媒が、ポジティブコントロールに加えられている。これによって、ウイルスプラークの進行又はウイルスの感染性に対して影響がないようにすることができた。
【００６３】
【表１】
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【００６４】
アトロピン硫酸塩、アコニチン及びシアン化水銀の混合物の相乗効果
表2:アトロピン硫酸塩、アコニチン及びシアン化水銀物質並びにそれらの混合物間の抗ウイルス効果の比較。ここで、測定結果として、プラーク阻害の割合を報告している。個々の物質の測定結果は、混合物に存在するものに対応する濃度範囲に関して報告している。
【００６５】
【表２】
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【００６６】
表2は、アトロピン硫酸塩、アコニチン及びシアン化水銀並びにこれら3つの物質の混合物の抗ウイルス効果(ウイルス活性の阻害割合に基づいて測定)の値である。個々の物質の場合、混合物における個々の物質の測定値に対応する濃度範囲において測定した測定値だけを報告している。以下の物質濃度：5μg/mlのアトロピン硫酸塩、1μg/mlのアコニチン及び0.004μg/mlのシアン化水銀で、混合物に存在していた。
【００６７】
表2は、第１に、混合物全体の効果が単独物質の効果よりも大きく、第２に、混合物の抗ウイルス効果は、個々の物質の抗ウイルス効果の加算に基づくものではなく、相乗効果に基づくものであることを明確に示している。例えば、HSV1に対する抗ウイルス効果において相加効果がある場合、混合物の測定値は、22.69〜51.73でなければならないが、そうではない。事実、混合物の値は、69.53である。
【００６８】
表3:濃度による医薬組成物の抗ウイルス効果(相対阻害の割合として測定)のインビトロアッセイ(図1を参照)
【表３】
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【図１】
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【国際調査報告】
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