(57)【要約】  ヒトパピローマウイルスに感染した人々を治療する治療ワクチン用のペプチド及び組成物が提示される。その組成物を使用する方法、及びがんのリスクがある者又は既にヒトパピローマウイルスによるがんをもつ者を含むヒトパピローマウイルスに感染した人々を治療する方法が提示される。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＰＶ  Ｅ６ペプチドを溶解する方法であって、
長さが２０〜１００個のアミノ酸の、ＨＰＶ  Ｅ６  ８１〜１１５（配列番号１の残基８１〜１１５）の少なくとも２０個の連続残基を含むＨＰＶ  Ｅ６ペプチドＡを、前記ＨＰＶペプチドＡを溶解する工程の前に、各々の長さが１０〜１００個のアミノ酸の、少なくとも５０％のＨＰＶ  Ｅ６  １〜８０（配列番号１の残基１〜８０）の配列及び少なくとも５０％のＨＰＶ  Ｅ６  １１６〜１５８（配列番号１の残基１１６〜１５８）を集合的に含む、２つ以上のＨＰＶペプチドＹを完全溶存形態で含むバッファーに溶解して、前記ペプチドＡを完全溶存形態で含み、前記ペプチドＹを完全溶存形態で含む最終可溶性組成物を創り出すことを含む方法。
【請求項２】
前記ペプチドＡが、そのアミノ末端がアセチル化され、そのカルボキシル末端がアミド化されている請求項１の方法。
【請求項３】
前記ＨＰＶペプチドＡが配列番号１の残基８１〜１１５を含む請求項１の方法。
【請求項４】
前記ＨＰＶペプチドＡが配列番号１の残基８１〜１１５から成る請求項１の方法。
【請求項５】
前記ペプチドＡが、そのアミノ末端がアセチル化され、そのカルボキシル末端がアミド化されている請求項４の方法。
【請求項６】
前記バッファーのｐＨが約ｐＨ３．０〜ｐＨ５．０である請求項１〜５のいずれか一項の方法。
【請求項７】
前記バッファーが少なくとも２ｍＭグルタミン酸（塩）を含む請求項１〜６のいずれか一項の方法。
【請求項８】
前記ペプチドＡ及びＹが集合的に配列番号１のすべてを含む請求項１〜７のいずれか一項の方法。
【請求項９】
ペプチドＡが配列番号１の残基８１〜１１５から成り、前記ペプチドＹが配列番号１の残基１〜４５、４６〜８０、及び１１６〜１５８から成る３つのペプチドである請求項１の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドＡ及びＹの各々が、そのアミノ末端がアセチル化され、そのカルボキシル末端がアミド化され、前記バッファーのｐＨが約ｐＨ３．０〜ｐＨ５．０であり、ペプチドＡ及び前記３つのペプチドＹの各々が溶解後に０．１〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度である請求項９の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドＹの各々が、前記最終可溶性組成物中でペプチドＡの少なくとも８０％の重量／体積濃度である請求項１〜１０のいずれか一項の方法。
【請求項１２】
ペプチドＡ及び前記ペプチドＹの各々が、前記最終可溶性組成物中で０．１〜５ｍｇ／ｍｌである請求項１〜１１のいずれか一項の方法。
【請求項１３】
医薬組成物であって
・各々の長さが１０〜１００個のアミノ酸残基の、１つ以上のＨＰＶ  Ｅ６ペプチド、
・２〜４０ｍＭの濃度のグルタミン酸（塩）、
・０．３％〜５％（重量／体積）の濃度のトレハロース、
・０．２％〜１０％（重量／体積）の濃度のグリシン、
を含み、
・ｐＨが３．０〜５．０である組成物。
【請求項１４】
前記１つ以上のＨＰＶの少なくとも１つが、Ｅ６ペプチドが、配列番号１の残基４６〜７０を含む、又は配列番号１の残基９１〜１１５を含む、又は配列番号１の残基８０〜８８を含む請求項１３の医薬組成物。
【請求項１５】
前記製剤が、各々の長さが１０〜１００個のアミノ酸残基であり、集合的にＨＰＶ  Ｅ６配列の少なくとも５０％を含む少なくとも３つのＨＰＶ  Ｅ６ペプチドを含む請求項１３の医薬組成物。
【請求項１６】
前記組成物が配列番号１の残基１〜４５、４６〜８０、８１〜１１５、又は１１６〜１５８から成る少なくとも１つのペプチドを含む請求項１３〜１５のいずれか一項の医薬組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、配列番号１の残基１〜４５から成るペプチド、配列番号１の残基４６〜８０から成るペプチド、配列番号１の残基８１〜１１５から成るペプチド、及び配列番号１の残基１１６〜１５８から成るペプチドを含む請求項１３〜１５のいずれか一項の医薬組成物。
【請求項１８】
前記ペプチドの各々が、そのアミノ末端がアセチル化され、そのカルボキシル末端がアミド化されている請求項１３〜１７のいずれか一項の医薬組成物。
【請求項１９】
リコール抗原をさらに含む請求項１３〜１８のいずれか一項の医薬組成物。
【請求項２０】
医薬組成物であって、
ＨＰＶ  Ｅ６ペプチドＡ及び１つ以上のＨＰＶペプチドＹを含み、
長さが２０〜１００個のアミノ酸で、ＨＰＶ  Ｅ６  ８１〜１１５（配列番号１の残基８１〜１１５）の少なくとも２０個の連続残基を含むＨＰＶ  Ｅ６ペプチドＡを、前記ＨＰＶペプチドＡを溶解する工程前に、集合的にＨＰＶ  Ｅ６  １〜８０（配列番号１の残基１〜８０）の配列の少なくとも５０％及びＨＰＶ  Ｅ６  １１６〜１５８（配列番号１の残基１１６〜１５８）の少なくとも５０％を含む、２つ以上の、各々の長さが１０〜１００個のアミノ酸のＨＰＶペプチドＹを完全溶存形態で含有するバッファーに溶解して、前記ペプチドＡを完全溶存形態で、前記ペプチドＹを完全溶存形態で含有する最終可溶性組成物を創出することを含む方法によって作成される医薬組成物。
【請求項２１】
リコール抗原をさらに含む請求項２０の医薬組成物。
【請求項２２】
個人のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）による感染症を減少又はＨＰＶ陽性の個人のＨＰＶ関連病変の退縮を増加させる方法であって、
請求項１３又は請求項２０の前記医薬組成物を、それを必要とするＨＰＶ陽性の個人に投与することを含む方法。
【請求項２３】
前記医薬組成物がリコール抗原をさらに含む請求項２２の方法。
【請求項２４】
リコール抗原を皮内に注射することをさらに含む請求項２２の方法。
【請求項２５】
前記医薬組成物を皮内に注射することを含む請求項２２の方法。
【請求項２６】
ＨＰＶ陽性の個人のＨＰＶ関連病変の退縮を増加させる方法であって、前記病変が悪性腫瘍である請求項２２〜２５のいずれか一項の方法。
【請求項２７】
前記病変が子宮頸がんである請求項２６の方法。
【請求項２８】
前記病変が頭頸部癌である請求項２６の方法。
【請求項２９】
ＨＰＶ関連病変の退縮を増加させる方法であって、前記病変が、子宮頸部、外陰部、膣、陰茎、肛門、又は咽頭口腔部の腫瘍である請求項２２〜２６のいずれか一項の方法。
【請求項３０】
ＨＰＶ関連病変の退縮を増加させる方法であって、前記病変が高度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）である請求項２２〜２５のいずれか一項の方法。
【請求項３１】
個人のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）による感染症を減少又はＨＰＶ陽性の個人のＨＰＶ関連病変の退縮を増加させて、ＨＰＶに対するＴ細胞応答を誘導する方法であって、
前記個人に１つ以上のＨＰＶ抗原を含む組成物を投与すること及び前記個人にＨＰＶ抗原ではないリコール抗原を投与すること含み、前記リコール抗原が投与されて前記個人の前記１つ以上のＨＰＶ抗原と接触させられ、
前記個人が前記１つ以上のＨＰＶ抗原に対するＴ細胞応答を必要とし、
前記１つ以上のＨＰＶ抗原がＥ６抗原ではない方法。
【請求項３２】
ＨＰＶ抗原ではないリコール抗原を投与することを含まず、それ以外の点では同一の方法と比べて、より強力な、投与している前記個人における前記ＨＰＶ抗原に対するＴ細胞応答を生じさせる請求項３１の方法。
【請求項３３】
前記１つ以上のＨＰＶ抗原を含む組成物もまた前記リコール抗原を含む請求項３１又は３２の方法。
【請求項３４】
前記個人に１つ以上のＨＰＶ抗原を投与する工程及び前記個人に前記リコール抗原を投与する工程が、前記１つ以上のＨＰＶ抗原及び前記リコール抗原を皮内に注射することを含む請求項３１〜３３のいずれか一項の方法。
【請求項３５】
前記１つ以上のＨＰＶ抗原がＨＰＶ  Ｅ７抗原を含む請求項３１〜３４のいずれか一項の方法。
【請求項３６】
前記１つ以上のＨＰＶ抗原が、長さが８〜１００個のアミノ酸、８〜７０個のアミノ酸、８〜５０個のアミノ酸、又は８〜４０個のアミノ酸のペプチドである請求項３１〜３５のいずれか一項の方法。
【請求項３７】
前記ペプチドが化学的に合成される請求項３６の方法。
【請求項３８】
単位投与量医薬組成物であって、
２５〜１１０ｕｇの配列番号２から成るペプチド
２５〜１１０ｕｇの配列番号３から成るペプチド、
２５〜１１０ｕｇの配列番号４から成るペプチド、
２５〜１１０ｕｇの配列番号５から成るペプチド、及び
リコール抗原を、１００〜９００ｕｌ容の皮内注射用単位剤形で含む組成物。
【請求項３９】
前記リコール抗原がカンジダ抽出物である請求項３８の単位投与量医薬組成物。
【請求項４０】
前記組成物が、３００ｕｌのキャンディン（ＣＡＮＤＩＮ）又は等価総効力のカンジダ抽出物を含む請求項３９の単位投与量医薬組成物。
【請求項４１】
量が２００〜５００ｕｌである請求項３８の単位投与量医薬組成物。
【請求項４２】
前記組成物が３０〜７０ｕｇの前記ペプチドを各々含む請求項３８の単位投与量医薬組成物。
【請求項４３】
前記組成物が約５０ｕｇの前記ペプチドを各々含む請求項３８の単位投与量医薬組成物。
【請求項４４】
前記ペプチドが各々、そのアミノ末端がアセチル化され、そのカルボキシ末端がアミド化されている請求項３８〜４３のいずれかの単位投与量医薬組成物。
【請求項４５】
患者に請求項４３の前記単位投与量医薬組成物を皮内に注射することを含むＨＰＶ感染症を治療する方法。
【請求項４６】
前記患者に請求項４４の前記単位投与量医薬組成物を、各注射の間を５日以上２８日以下あけて、連続して少なくとも３回皮内注射することを含む請求項４５の方法。
【請求項４７】
前記患者に請求項４４の前記単位投与量医薬組成物を、各注射の間を１０日以上２１日以下あけて、連続して少なくとも３回皮内注射することを含む請求項４５の方法。
【請求項４８】
前記患者に請求項１の前記単位投与量医薬組成物を、各注射の間を１０日以上２１日以下あけて、連続して少なくとも２回皮内注射することを含む請求項４５の方法。
【請求項４９】
前記患者に請求項１の前記単位投与量医薬組成物を、各注射の間を５日以上２８日以下あけて、２年の期間内に少なくとも３回多くても６回皮内注射することを含む請求項４６の方法。
【請求項５０】
哺乳類対象において微生物によって起こされる疾患を治療する方法であって、
前記微生物の１つ以上の抗原を含む組成物を前記対象に皮内投与すること及び前記微生物の抗原ではないリコール抗原を前記対象に皮内投与することを含み、前記リコール抗原が投与されて、前記対象の前記微生物の前記１つ以上の抗原と接する方法。
【請求項５１】
前記微生物がウイルスである請求項５０の方法。
【請求項５２】
前記微生物がヒトパピローマウイルスではない請求項５０の方法。
【請求項５３】
前記リコール抗原がカンジダ抽出物である請求項５０の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
子宮頸がんは全世界の女性で４番目によく見られるがんであり、年間５２８，０００の罹病症例、２６６，０００の死亡症例がある。アメリカ合衆国では、新たな子宮頸がん症例は毎年１２，３６０例であり、死亡は４，０２０例である。ハイリスクヒトパピローマウイルスは最もよく見られる型がＨＰＶ１６であり、子宮頸がんの主因である。１００を超えるさまざまな型のヒトパピローマウイルスのうち、少なくとも１５の型が子宮頸部の浸潤性扁平上皮癌と強く関連する。ＨＰＶ１６はこのがんと最も一般的に関連するとわかっているものである。
【０００２】
また、ヒトパピローマウイルス感染症は子宮頸がんの前駆病変、扁平上皮内病変とも関連する。大部分の低度扁平上皮内病変が将来的に自然に消退する一方で、高度扁平上皮内病変に進行するものもある。これらの高度病変、特に子宮頸部扁平上皮内腫瘍３は、高率での浸潤性子宮頸がんへの進行に関連する。
【０００３】
２つの初期遺伝子産物、Ｅ６及びＥ７は、ヒトパピローマウイルスによる悪性の表現型への形質転換を媒介する。これらのウイルスタンパク質はともに、細胞のヒトがん抑制遺伝子の産物と相互作用することが示されている。Ｅ６タンパク質は細胞にコードされるｐ５３と結合し、その分解を促進でき、一方でＥ７タンパク質は網膜芽腫感受性遺伝子産物と相互作用する。ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７タンパク質の恒常的発現が、子宮頸がんの悪性の表現型の維持に必要とされる。
【０００４】
細胞性免疫は、ヒトパピローマウイルス感染症及びヒトパピローマウイルス関連疾患の制御に重要な役割を担う。ＣＤ４Ｔ細胞が抗腫瘍反応を起こすのに重要である。これらのＣＤ４Ｔ細胞の有効性は、腫瘍排除において支配的なエフェクター細胞として働くと思われているＣＤ８細胞傷害性Ｔリンパ球のプライム及び維持を促進する能力にあると考えられている。扁平上皮内病変及び子宮頸がん検体試料の免疫組織化学的分析により、活性化した細胞傷害性Ｔリンパ球が病変に存在することが示されている。ＣＤ４Ｔ細胞は、Ｔヘルパー１サイトカインを産生すること、及び腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球をプロフェッショナル抗原提示細胞にプライムするための活性化シグナルをもたらすことによって細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化する。ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔリンパ球は、長さが８〜１１個のアミノ酸の外来ペプチドを認識し、ヒト白血球型抗原クラスＩ分子に結合し、その分子によって提示される。これらのペプチドはＴ細胞エピトープと呼ばれる。
【０００５】
メモリーＴ細胞は、以前に遭遇した病原体又は腫瘍抗原に対する長期にわたる免疫の維持に重要な役割を果たす。それらのメモリーＴ細胞は増殖して急速にエフェクター機能を獲得し、ウイルス感染した細胞又は腫瘍細胞を死滅させ、抗原への再曝露による再刺激後の病原体の複製を阻害するサイトカインを分泌しうる。末梢抗原性シグナルをリンパ器官に伝えうる抗原提示細胞は、ヒトパピローマウイルス感染症及びヒトパピローマウイルス関連腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞免疫応答の誘導に重要な役割を果たす。プロフェッショナル抗原提示細胞としての樹状細胞は、高いレベルの主要組織適合遺伝子複合体及び共刺激分子を発現する。炎症促進性シグナルが不足することによって引き起こされる、適切な共刺激が無い状況での抗原提示を導く、樹状細胞の不充分又は不適切な活性化が抗腫瘍免疫の障害の理由の１つである。
【０００６】
予防的ＨＰＶワクチンは利用可能であり、ＨＰＶ感染症を予防することによって作用する。しかし、それらの予防的ＨＰＶワクチンは、既に感染している個人では効果的ではない。標準的な外科的治療は早産のリスクの増加に関連するので、ＨＰＶ治療ワクチンは前がん病変があるが子どもを産むことを希望する女性に恩恵をもたらすことになるだろう。また、世界の発展途上地域に居住し、外科的モダリティにアクセスできない男女に恩恵をもたらすことにもなるだろう。
【発明の概要】
【０００７】
治療ワクチンとして使用するためのＨＰＶペプチドを含有する医薬製剤が提供される。また、製剤を作製する方法、とりわけ、難溶性のＨＰＶペプチドを溶解する方法が提供される。また、ＨＰＶ感染症及びＨＰＶ関連がんを含むＨＰＶ関連病変を治療する方法が提供される。
【０００８】
１つの実施形態は、長さが２０〜１００個のアミノ酸の、ＨＰＶ  Ｅ６  ８１〜１１５（配列番号１の残基８１〜１１５）の少なくとも２０個の連続残基を含むＨＰＶ  Ｅ６ペプチドＡを、ＨＰＶペプチドＡを溶解する工程の前に、各々の長さが１０〜１００個のアミノ酸の、少なくとも５０％のＨＰＶ  Ｅ６  １〜８０（配列番号１の残基１〜８０）の配列及び少なくとも５０％のＨＰＶ  Ｅ６  １１６〜１５８（配列番号１の残基１１６〜１５８）を集合的に含む、２つ以上のＨＰＶペプチドＹを溶存形態で含むバッファーに溶解して、ペプチドＡを溶存形態で含み、ペプチドＹを溶存形態で含む最終可溶性組成物を創り出すことを含むＨＰＶ  Ｅ６ペプチドを溶解する方法を提供する。ペプチドＡを溶解する工程の前のバッファー中のペプチドＹは好ましくは完全溶存形態（不溶のペプチドＹがない）であり、最終可溶性組成物ではペプチドＡ及びＹは好ましくは完全溶存形態である。
【０００９】
別の実施形態は、（ａ）各々の長さが１０〜１００個のアミノ酸残基の、１つ以上のＨＰＶ  Ｅ６ペプチド、（ｂ）２〜４０ｍＭの濃度のグルタミン酸（塩）、（ｃ）０．３％〜５％（重量／体積）の濃度のトレハロース、（ｄ）０．２％〜１０％（重量／体積）の濃度のグリシンを含み、ｐＨが３．０〜５．０である医薬製剤を提供する。
【００１０】
別の実施形態は、ＨＰＶ  Ｅ６ペプチドＡ及び１つ以上のＨＰＶペプチドＹを含む医薬製剤を提供し、その組成物は、長さが２０〜１００個のアミノ酸の、ＨＰＶ  Ｅ６  ８１〜１１５（配列番号１の残基８１〜１１５）の少なくとも２０個の連続残基を含むＨＰＶ  Ｅ６ペプチドＡを、前記ＨＰＶペプチドＡを溶解する工程の前に、各々の長さが１０〜１００個のアミノ酸の、少なくとも５０％のＨＰＶ  Ｅ６  １〜８０（配列番号１の残基１〜８０）の配列及び少なくとも５０％のＨＰＶ  Ｅ６  １１６〜１５８（配列番号１の残基１１６〜１５８）を集合的に含む、２つ以上のＨＰＶペプチドＹを溶存形態で含むバッファーに溶解して、前記ペプチドＡを溶存形態で含み、前記ペプチドＹを溶存形態で含有する最終可溶性組成物を創り出すことを含む方法によって作製される。
【００１１】
別の実施形態は、（ａ）各々の長さが１０〜１００個のアミノ酸残基の１つ以上のＨＰＶ  Ｅ６ペプチド、（ｂ）２〜４０ｍＭの濃度のグルタミン酸（塩）（ｃ）０．３％〜５％（重量／体積）の濃度のトレハロース、（ｄ）０．２％〜１０％（重量／体積）の濃度のグリシンを含む医薬製剤を投与することを含む、個人のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）による感染症を減少又はＨＰＶ陽性の個人のＨＰＶ関連病変の退縮を増加させる方法を提供する。
【００１２】
本願明細書では、キャンディン（CANDIN）などのリコール抗原が試験したＨＰＶペプチドに対するＴ細胞免疫応答を増強することが実施例２で示される。リコール抗原とＨＰＶペプチドの混合物は末梢血単核細胞と接触する。よって、疾患特異的抗原と共にリコール抗原を含むワクチンを投与することは一般的な適用性があって疾患特異的抗原に対する細胞（Ｔ細胞）免疫応答を促進しうる。
【００１３】
したがって、１つの実施形態は、個人のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）による感染症を減少又はＨＰＶ陽性の個人のＨＰＶ関連病変の退縮を増加させてＨＰＶに対するＴ細胞応答を誘導する方法を提供し、該方法は、個人に１つ以上のＨＰＶ抗原を含む組成物を投与すること及び個人にＨＰＶ抗原ではないリコール抗原を投与すること含み、リコール抗原は投与されて個人の１つ以上のＨＰＶ抗原と接触させられ、個人は１つ以上のＨＰＶ抗原に対するＴ細胞応答を必要とし、１つ以上のＨＰＶ抗原はＥ６抗原ではない。
【００１４】
生検によって診断された高度扁平上皮（ＨＳＩＬ）をもつ女性との患者の第Ｉ相治験では、女性らは、ＨＰＶタンパク質Ｅ６残基１〜４５（配列番号２）、Ｅ６  ４６〜８０（配列番号３）、Ｅ６  ８１〜１１５（配列番号４）、及びＥ６  １１６〜１５８（配列番号５）を含み、すべてがアジュバントとしてのキャンディンと混合された組成物の皮内注射で治療される。試験投与量は、５０ｕｇ、１００ｕｇ、及び２５０ｕｇの各々のペプチドであった。驚いたことに、５０ｕｇ投与量群では６名の対象のうち４名（６７％）、１００ｕｇ投与量群では６名の対象のうち３名（５０％）、２５０ｕｇ投与量群では３名の対象のうち０名に、彼女らの病変の完全な退縮があった。くわえて、５０ｕｇ投与量群中の１名のさらなる対象に部分的退縮（＜０．２ｍｍ２の病変が残る）があった。これは最も低い投与量が最も効果的であったという驚くべき結果である。このことは下記実施例３に報告されている。
【００１５】
よって、別の実施形態は、２５〜１１０ｕｇの配列番号２から成るペプチド、２５〜１１０ｕｇの配列番号３から成るペプチド、２５〜１１０ｕｇの配列番号４から成るペプチド、２５〜１１０ｕｇの配列番号５から成るペプチド、及びリコール抗原を、皮内注射用単位剤形で、１００〜９００ｕｌの量で含む単位投与量医薬組成物を提供する。
【００１６】
別の実施形態は、２５〜１１０ｕｇの配列番号２から成るペプチド、２５〜１１０ｕｇの配列番号３から成るペプチド、２５〜１１０ｕｇの配列番号４から成るペプチド、２５〜１１０ｕｇの配列番号５から成るペプチド、及びリコール抗原を、皮内注射用単位剤形で、１００〜９００ｕｌの量で含む単位投与量医薬組成物を、患者に皮内注射することを含むＨＰＶ感染症を治療する方法を提供する。
【００１７】
別の実施形態は、微生物の１つ以上の抗原を含む組成物を前記対象に皮内投与すること及び微生物の抗原ではないリコール抗原を前記対象に皮内投与することを含み、リコール抗原が投与されて、対象の微生物の１つ以上の抗原と接する、哺乳類対象において微生物によって起こされる疾患を治療する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】ＣＤ１ａ（上）、ランゲリン（中央）、及びＥカドヘリン（下）の表面発現は、ＬＣ（実線）への転換の成功を示す。点線は関連アイソタイプ対照を示す。
【図１Ｂ】同上。
【図１Ｃ】同上。
【図２Ａ】ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＨＬＡ−ＤＲの表面発現によって検討したＬＣの成熟効果。（Ａ）対象２の代表的なＦＡＣＳヒストグラム。影付き灰色領域、黒点線、黒実線、短破線、及び長破線はそれぞれ、アイソタイプ対照、培地、キャンディン、「ペプチド」、及びキャンディン／「ペプチド」を示す。（Ｂ）試験対象全員の結果のまとめ
【図２Ｂ】同上。
【図３】アラマーブルーを用いて測定したＴ細胞増殖キャンディン及びキャンディン／「ペプチド」でパルスしたＬＣは、培地と比較して、Ｔ細胞増殖の顕著な増加を誘発する。ウェルは全て、ＣＤ３Ｔ細胞（１．５×１０５細胞）及び自己由来ＬＣ（３×１０３細胞）を含んだ。
【図４】キャンディン（１５０μｌ／ｍｌ）又はキャンディン／「ペプチド」で治療した対象４のＬＣによるサイトカイン発現の代表的な結果を示す。バーは反復の標準偏差を表す。
【図５Ａ】キャンディン又はキャンディン／「ペプチド」でパルスしたＬＣで刺激したＣＤ４Ｔ細胞のＩＦＮ−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−１７Ａの細胞内サイトカイン染色。（Ａ）対象１のリンパ球のゲーティングを示す代表的なドットプロット。（Ｂ）ｅＦｌｕｏｒ４５０を用いて分別した対象１の生細胞の代表的なドットプロット。（Ｃ）キャンディン／「ペプチド」でのパルスを受けたＬＣに曝した、対象１のＩＬ−４選択ＣＤ４細胞を示す代表的なドットプロット。（Ｄ）ＩＬ−４の対応アイソタイプ対照。（Ｅ）キャンディン／「ペプチド」でパルスしたＬＣに曝した、対象１のＩＦＮ−γ選択ＣＤ４細胞を示す代表的なドットプロット。（Ｆ）ＩＦＮ−γの対応アイソタイプ対照。（Ｇ）キャンディン／「ペプチド」でのパルスを受けたＬＣに曝したＩＬ−１７Ａ選択ＣＤ４細胞を示す代表的なドットプロット。（Ｈ）ＩＬ−１７Ａの対応アイソタイプ対照。（Ｉ）対象全員の結果をまとめたダイアグラム。
【図５Ｂ】同上。
【図５Ｃ】同上。
【図５Ｄ】同上。
【図５Ｅ】同上。
【図５Ｆ】同上。
【図５Ｇ】同上。
【図５Ｈ】同上。
【図５Ｉ】同上。
【図６】図６は、ワクチン接種計画のダイアグラムを示す。対象は各々、全回、同一投与量で接種を受ける。ＣＲＣ、臨床研究センター；Ｃｏｌｐｏ、コルポスコピー；Ｂｘ、生検
【図７】図７は、ワクチン接種の投与量漸増計画を示す。計２４名の対象が投与量漸増相に登録し、さらに３０名の対象を最終の投与時に採用した。
【図８】ワクチン接種前、２回のワクチン接種後、及び４回のワクチン接種後のＨＰＶ１６  Ｅ６及びＥ７特異的ＣＤ３Ｔ細胞応答。Ｔ細胞株は、ＨＰＶ１６  Ｅ６−ｖａｃ、Ｅ６−ＧＳＴ、Ｅ７−ｖａｃ、及びＥ７−ＧＳＴでパルスした自己由来樹状細胞でＣＤ３Ｔ細胞を刺激することによって確立した。別個の来院からの試料は、オーバーラッピングペプチドを用いる同一のＥＬＩＳＰＯＴアッセイで試験し、各領域は３連で試験した。Ｅ６ペプチドに対して統計的に有意な増加を示す対象の結果を示し、対応のあるｔ検定を用いて決定された有意な増加がある領域に「＊」印を付けた。また、対象１１ではＨＰＶ１６がワクチン接種の前後に検出され、恐らくエピトープ拡大の最初の例を表しうる「ｅ」で印付けられたＥ７に対する有意な増加があった。
【図９】ワクチン接種前、２回のワクチン接種後、及び４回のワクチン接種後の、ワクチン接種を受けた者（ｎ＝１４）の循環免疫細胞。リンパ球の％割合はＣＤ４細胞について示す。ＣＤ４及びＴｂｅｔ陽性のＣＤ４細胞の％割合はＴｈ１細胞について、ＣＤ４及びＧＡＴＡ３陽性のＣＤ４細胞の％割合はＴｈ２細胞について、並びにＣＤ４、ＣＤ２５、及びＦｏｘＰ３陽性のＣＤ４細胞の％割合はＴｒｅｇについて示す。ＣＤ１４及びＨＬＡ−ＤＲｌｏｗ／ｎｅｇ陽性の単球の％割合はＭＤＳＣについて示す。ワクチン接種前と比較して、４回のワクチン接種後、ＣＤ４細胞の％割合は有意に減少した（対応のあるｔ検定、ｐ＝０．０２）。バーは平均の標準誤差を表す。
【図１０】我々のＨＰＶ治療ワクチンの第ＩＩ相治験に関してスケジュールされた治験来院の概略図。血液検査は臨床分析用である。採血は科学的分析用である。ＣＲＳＣ、臨床研究サービスコアユニット（Clinical Research Services Core Unit）；Ｃｏｌｐｏ、コルポスコピー、Ｂｘ、生検、ＥＣＣ、子宮頸管内膜掻爬、ＬＥＥＰ、電気外科的ループ切除
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は治療ワクチンで用いるＨＰＶペプチドに関わる。
【００２０】
ヒトパピローマウイルスによる扁平上皮の悪性の表現型への形質転換は、２つの初期遺伝子産物−Ｅ６及びＥ７によって媒介される。ウイルスタンパク質はともに、細胞のヒト腫瘍抑制遺伝子の産物と相互作用することが示されている。Ｅ６タンパク質は細胞にコードされるｐ５３に結合し、その分解を促進できる一方で、Ｅ７タンパク質は網膜芽腫感受性遺伝子産物と相互作用する。Ｅ６及びＥ７オープンリーディングフレームの発現がＨＰＶ１６によるヒト細胞の形質転換に必要かつ十分であることが示されている。
【００２１】
我々はこれまで、ＨＰＶに対する好ましい免疫反応答において認識されるＥ６及びＥ７のエピトープを研究してきた（Nakagawa, M. et al, 2010, Journal of Lower Genital Tract Disease, Vol. 14, No. 2, p. 124-129；米国特許（U.S. Patent Publication）第２０１１０２９３６５１号、同第２００９０１３６５３１号、同第２００９０１１７１４０号、同第２００６０１８２７６３号）。
【００２２】
我々は、治療ワクチンで用いるＨＰＶ  Ｅ６及びＥ７ペプチド、とりわけ、ＨＰＶ  Ｅ６ペプチドを特定した（米国特許第２０１１０２９３６５１号、同第２００９０１３６５３１号、同第２００９０１１７１４０号）。
【００２３】
非常に多くの型のＨＰＶが存在する。がんと最もよく関連するものはＨＰＶ１６である。
【００２４】
本明細書に記載されるペプチドはＨＰＶのＥ６タンパク質（ＨＰＶ  Ｅ６）に由来する。ＨＰＶ１６由来のＥ６の配列は下記配列番号１である。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
以下の実施形態のペプチドはＨＰＶ  Ｅ６ペプチドであり、それらのペプチドがＨＰＶ  Ｅ６タンパク質の配列に由来することを意味する。Ｅ６タンパク質はいずれのＨＰＶ株に由来できる。好ましい実施形態では、ペプチドはＨＰＶ１６のＥ６に由来する。
【００２７】
好ましくは、ペプチドはＨＰＶ  Ｅ６配列のみを含む。しかし、それらのペプチドは他のアミノ酸残基を含んでもよい。それらのペプチドは、ＨＰＶ１６だけでなく、いずれのＨＰＶ株からのＥ６配列を含んでもよい。
【００２８】
ペプチドは好ましくは化学的に合成されるが、それらのペプチドは組換えＤＮＡ技術による組換え生物で作製されてもよい。また、それらのペプチドは当業者に公知の他の手段によって、例えば、Ｅ６のタンパク質分解又は作製されるペプチドより長いペプチドペプチドのタンパク質分解によって作製されてもよい。
【００２９】
幾つかの実施形態では、ペプチドは、そのアミノ末端がアセチル化されるか、そのカルボキシ末端がアミド化されるか、又は両方である。その他の実施形態では、いずれの末端も修飾を受けない。
【００３０】
特定の実施例では、ペプチドは、長さが１０〜１００個、８〜１００個、８〜７５個、８〜５０個、８〜４０個、１０〜７５個、１０〜５０個、１０〜４０個、２０〜１００個、２０〜７５個、２０〜５０個、２０〜４０個、３０〜１００個、３０〜７５個、３０〜５０個、又は３０〜４０個のアミノ酸残基である。
【００３１】
一般にペプチドは、配列が記載のものであり、アミノ酸がＬ立体異性体であることを意味する「フォワードＬ（forward L）」である。しかし、特定の実施形態では、ペプチドはアミノ酸残基の通常配列（ordinary sequence）が反転され、アミノ酸がＤ立体異性体であることを意味するリバースＤ（reverse D）ペプチドであることができる。
【００３２】
１つの実施形態は、長さが２０〜１００個のアミノ酸の、ＨＰＶ  Ｅ６  ８１〜１１５（配列番号１の残基８１〜１１５）の少なくとも２０個の連続残基を含むＨＰＶ  Ｅ６ペプチドＡを、ＨＰＶペプチドＡを溶解する工程の前に、各々の長さが１０〜１００個のアミノ酸の、少なくとも５０％のＨＰＶ  Ｅ６  １〜８０（配列番号１の残基１〜８０）の配列及び少なくとも５０％のＨＰＶ  Ｅ６  １１６〜１５８（配列番号１の残基１１６〜１５８）を集合的に含む、２つ以上のＨＰＶペプチドＹを完全溶存形態で含むバッファーに溶解して、ペプチドＡを完全溶存形態で含み、ペプチドＹを完全溶存形態で含む最終可溶性組成物を創り出すことを含むＨＰＶ  Ｅ６ペプチドを溶解する方法を含む。
【００３３】
特定の実施形態では、ペプチドＡは、そのアミノ末端がアセチル化され、そのカルボキシル末端がアミド化される。
【００３４】
特定の実施形態では、ＨＰＶペプチドＡは配列番号１の残基８１〜１１５を含む。その他の実施形態では、ＨＰＶペプチドＡは、配列番号１の残基８１〜１１５の２５個の連続残基を含むか、又は配列番号１の残基８１〜１１５の３０個の連続残基を含む。
【００３５】
特定の実施形態では、ＨＰＶペプチドＡは配列番号１の残基８１〜１１５から成る。
【００３６】
特定の実施形態では、ペプチドＡは、そのアミノ末端がアセチル化され、そのカルボキシル末端がアミド化される。
【００３７】
特定の実施形態では、バッファーは、ｐＨが約ｐＨ３．０〜約ｐＨ５．０、約ｐＨ３．５〜約ｐＨ４．５、又は約ｐＨ２．５〜約ｐＨ５．５である。
【００３８】
特定の実施形態では、バッファーは少なくとも２ｍＭグルタミン酸（塩）を含む。その他の実施形態では、バッファーは、２〜５０ｍＭグルタミン酸（塩）、少なくとも５ｍＭグルタミン酸（塩）、５〜５０ｍＭグルタミン酸（塩）、又は５〜２５ｍＭグルタミン酸（塩）、又は２〜２５ｍＭグルタミン酸（塩）を有しうる。この文脈で「グルタミン酸（塩）」という用語は、グルタミン酸のプロトン化及び非プロトン化されたすべての形態、すなわちグルタミン酸塩及びグルタミン酸を含むことを意図する。
【００３９】
特定の実施形態では、ペプチドＡ及びＹは集合的に配列番号１のすべて又はＨＰＶ  Ｅ６配列のすべてを含む。
【００４０】
特定の実施形態では、ペプチドＡは、配列番号１の残基８１〜１１５から成り、並びにペプチドＹは、配列番号１の残基１〜４５、４６〜８０、及び１１６〜１５８から成る３つのペプチドである。
【００４１】
本発明のより特定の実施例では、ペプチドＡ及びＹの各々は、そのアミノ末端がアセチル化され、そのカルボキシル末端がアミド化され、バッファーは、ｐＨが約ｐＨ３．０〜ｐＨ５．０であり、溶解後、ペプチドＡ及び３つのペプチドＹの各々は、濃度が０．１〜２０ｍｇ／ｍｌである。その他の実施形態では、溶解後に、ペプチドＡ及び３つのペプチドＹの各々は、濃度が０．１〜５ｍｇ／ｍｌ又は０．０２〜５ｍｇ／ｍｌである。
【００４２】
特定の実施形態では、ペプチドＹの各々は、最終可溶性組成物中でペプチドＡの少なくとも８０％の重量／体積濃度である。
【００４３】
特定の実施形態では、ペプチドＡ及びペプチドＹの各々は、最終可溶性組成物中で０．１〜５ｍｇ／ｍｌである。その他の実施形態では、それらのペプチドＡ及びペプチドＹの各々は、０．１〜２０ｍｇ／ｍｌ又は０．０２〜５ｍｇ／ｍｌである。
【００４４】
１つの実施形態は、（ａ）各々の長さが１０〜１００個のアミノ酸残基の１つ以上のＨＰＶ  Ｅ６ペプチド、（ｂ）濃度が２〜４０ｍＭのグルタミン酸（塩）、（ｃ）濃度が０．３％〜５％（重量／体積）のトレハロース、（ｄ）濃度が０．２％〜１０％（重量／体積）のグリシンを含む医薬組成物を提供し、その組成物は、ｐＨが３．０〜５．０である。
【００４５】
グルタミン酸（塩）濃度の他の可能性のある範囲は、２〜２０ｍＭ及び５〜２０ｍＭである。トレハロース濃度の他の可能性のある範囲は、０．２％〜５％（重量／体積）、０．５％〜５％（重量／体積）、及び０．３％〜２％（重量／体積）、及び０．５％〜２％（重量／体積）である。グリシン濃度の他の可能性のある範囲は、０．２％以上、０．３％以上、０．５％以上、１％以上、並びに最大でも３％、最大でも５％、最大でも８％、最大でも１０％  、最大でも１５％、及び最大でも２０％である。
【００４６】
特定の実施形態では、１つ以上のＨＰＶ  Ｅ６ペプチドの少なくとも１つは、配列番号１の残基４６〜７０を含むか、又は配列番号１の残基９１〜１１５を含むか、又は配列番号１の残基８０〜８８を含む。特定の実施形態では、１つ以上のＨＰＶ  Ｅ６ペプチドの少なくとも１つは、配列番号１の残基４６〜７０を含むか、又は配列番号１の残基９１〜１１５を含む。
【００４７】
特定の実施形態では、医薬組成物は、各々の長さが１０〜１００個のアミノ酸残基の、集合的にＨＰＶ  Ｅ６配列の少なくとも５０％を含む、少なくとも３つのＨＰＶ  Ｅ６ペプチドを含む。
【００４８】
特定の実施形態では、組成物は、配列番号１の残基１〜４５、４６〜８０、８１〜１１５、又は１１６〜１５８から成る少なくとも１つのペプチド、配列番号１の残基１〜４５、４６〜８０、８１〜１１５、又は１１６〜１５８から成る少なくとも２つのペプチド、配列番号１の残基１〜４５、４６〜８０、８１〜１１５、又は１１６〜１５８から成る少なくとも３つのペプチドを含むか、又は配列番号１の残基１〜４５、４６〜８０、８１〜１１５、及び１１６〜１５８からそれぞれ成る４つのペプチドを含む。
【００４９】
特定の実施形態では、ペプチドは各々、そのアミノ末端がアセチル化され、そのカルボキシ末端がアミド化される。
【００５０】
医薬組成物はまた、リコール抗原を含みうる。プロトタイプのリコール抗原は、一般的に免疫学的皮膚試験に使用して免疫反応を試験するものであり、特に、流行性耳下腺炎抗原、カンジダ抗原、及び白癬菌抗原である。該試験は、身体が抗原を「記憶」又は「リコール」するか否か、すなわち抗原が皮内注射によって投与される皮膚の遅延型過敏症応答があるか否かを示す。
【００５１】
「リコール抗原」という用語は、複数の蛋白様抗原を含有する物質又は混合物として本明細書では定義され、混合物は皮内皮膚試験において以前にリコール抗原に感作又は露出された大部分の人々に遅延型過敏症応答を誘発する。プロトタイプのリコール抗原は、一般的に免疫学的皮膚試験に使用して免疫反応を試験するものであり、特に、流行性耳下腺炎抗原、カンジダ抗原、及び白癬菌抗原である。これらの各々は、単数形「抗原（antigen）」によって言及されるが、実際には、免疫応答を誘導できる数個又多くの分子性物質から構成される。
【００５２】
特定の実施形態では、リコール抗原は、流行性耳下腺炎抗原（例えば、不活化全ムンプスウイルス）、カンジダ抽出物、又は白癬菌抽出物でありうる。
【００５３】
特定の実施形態では、リコール抗原は、不活化全ウイルス、不活化全細菌、又は不活化全微生物である。
【００５４】
下記実施例２は、Ｅ６ペプチドがインビトロでランゲルハンス細胞に部分的な成熟効果を及ぼす一方で、Ｅ６ペプチドに曝された細胞でカンジダ抽出物はインビトロでＴ細胞増殖に関与したことを示す。そこで、カンジダ抽出物は、強力なＨＰＶに対するＴ細胞応答を誘導するＥ６ペプチドの優れたアジュバントである。
【００５５】
我々は、４つのＨＰＶ  Ｅ６ペプチドとキャンディンとの皮内注射に関する治験を行なっている。ペプチドは、１０ｍＭグルタミン酸（塩）、１．０％（重量／体積）トレハロース、２．０％（重量／体積）グリシン、及び０．７１４ｍｇ／ｍｌの各々の４つのＨＰＶ１６  Ｅ６ペプチド（配列番号１の残基１〜４５、４６〜８０、８１〜１１５、及び１１６〜１５８から成り、各々、そのカルボキシ末端がアミド化され、そのアミノ末端がアセチル化されている）を含有する薬剤溶液（pharmaceutical solution）Ａにある。薬剤溶液Ａは、５０μｇ、１００μｇ、２５０μｇ、又は５００μｇ（７０〜７００μｌの溶液Ａ）の量で注射器に吸い取り、注射器内で３００ｕｌのキャンディンと混ぜる。次いで、注射器内の混合物は子宮頸部病変を有するＨＰＶ陽性患者に皮内注射される。
【００５６】
キャンディン（登録商標）（カンジダ・アルビカンス）は、カンジダ・アルビカンスの２つの株の培養ろ過液及び細胞から作られる。該菌類は、無機塩、ビオチン、及び蔗糖から成る化学組成既知の培地的で増殖させる。凍結乾燥原材料は、０．２５％ＮａＣｌ、０．１２５％ＮａＨＣＯ３及び５０％（体積／堆積）グリセロールの溶液で抽出する。濃縮抽出物は０．５％ＮａＣｌ、０．２５％ＮａＨＣＯ３、０．０３％米国薬局方アルブミン（ヒト）、８ｐｐｍポリソルベート８０、及び０．４％フェノールの溶液で希釈する。
【００５７】
キャンディン（登録商標）（カンジダ・アルビカンス）の効力は、ヒトではＤＴＨ皮膚試験で測定する。手順には、以前にスクリーニングされ、試験対象として役目を果たすのに適格とされた感受性のある成人（sensitive adult）を使って、内部基準（ＩＲ）とともに生産ロットを同時に（並行して）テストすることが含まれる。０．１ｍＬの生産ロットによって生じる４８時間時の硬結反応を測定し、０．１ｍＬのＩＲによって引き起こされる反応と比較する。０．０５のｐ値で対応のあるｔ検定（両側）によって解析した際に、生産ロットの効力がＩＲの効力と比べて±２０％を超えて違わない場合、試験は基準内である。
【００５８】
ＩＲの効力はＤＴＨ皮膚試験によってモニターされる。効力検定に関わる人々は、平均硬結反応（ｍｍ）が計算される４回のＩＲでの皮膚試験を受けることによって試験対象として適格とされる。ＩＲでの現行皮膚試験は、０．０５のｐ値で対応のあるｔ検定（両側）によって解析した際に、ＩＲの効力が、同じ試験対象での平均適格反応と比べて±２０％を超えて変化しないことを示さなければならない。求められるＩＲに対する４８時間時の硬結反応は１５ｍｍ±２０％である。
【００５９】
キャンディン（登録商標）（カンジダ・アルビカンス）の皮膚試験の濃度は成人健常者における用量反応試験から決定される。製品が意図するの、抗原に対する細胞過敏症をもつ免疫学的に適格な人々において≧５ｍｍの硬結反応を引き起こすことである。
【００６０】
別の実施形態は、（ａ）各々の長さが１０〜１００個のアミノ酸残基の１つ以上のＨＰＶ  Ｅ６ペプチド、（ｂ）２〜４０ｍＭの濃度のグルタミン酸（塩）（ｃ）０．３％〜５％（重量／体積）の濃度のトレハロース、（ｄ）０．２％〜１０％（重量／体積）の濃度のグリシンを含む医薬製剤を投与することを含む、個人のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）による感染症を減少又はＨＰＶ陽性の個人のＨＰＶ関連病変の退縮を増加させる方法を提供する。
【００６１】
別の実施形態は、医薬組成物を、それを必要とするＨＰＶ陽性の個人に投与することを含む、個人のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）による感染症を減少又はＨＰＶ陽性の個人のＨＰＶ関連病変の退縮を増加させる方法を提供する。この場合、医薬組成物は、ＨＰＶ  Ｅ６ペプチドＡ及び１つ以上のＨＰＶペプチドＹを含む医薬組成物でありうる。その組成物は、長さが２０〜１００個のアミノ酸の、ＨＰＶ  Ｅ６  ８１〜１１５（配列番号１の残基８１〜１１５）の少なくとも２０個の連続残基を含むＨＰＶ  Ｅ６ペプチドＡを、前記ＨＰＶペプチドＡを溶解する工程の前に、各々の長さが１０〜１００個のアミノ酸の、少なくとも５０％のＨＰＶ  Ｅ６  １〜８０（配列番号１の残基１〜８０）の配列及び少なくとも５０％のＨＰＶ  Ｅ６  １１６〜１５８（配列番号１の残基１１６〜１５８）を集合的に含む、２つ以上のＨＰＶペプチドＹを溶存形態で含むバッファーに溶解して、前記ペプチドＡを溶存形態で含み、前記ペプチドＹを溶存形態で含有する最終可溶性組成物を創り出すことを含む方法によって作製される。
【００６２】
これらの治療法の特定の実施形態では、該方法は医薬組成物を皮内に注射することを含む。また、医薬組成物は他の経路によって、例えば静脈注射若しくは皮下注射によって、又は腸内に投与されてもよい。しかし、皮内注射が好ましい経路である。
【００６３】
該治療法の特定の実施形態では、医薬組成物はリコール抗原をさらに含む。
【００６４】
該治療法の特定の実施形態では、該方法はリコール抗原を皮内に注射することをさらに含む。
【００６５】
特定の実施形態では、該方法はＨＰＶ陽性の個人のＨＰＶ関連病変の退縮を増加させる方法であり、病変は悪性腫瘍である。
【００６６】
特定の実施形態では、病変は子宮頸がんである。
【００６７】
特定の実施形態では、病変は頭頸部癌である。
【００６８】
特定の実施形態では、該方法はＨＰＶ関連病変の退縮を増加させる方法であり、病変は子宮頸部、外陰部、膣、陰茎、肛門、又は咽頭口腔部の腫瘍である。
【００６９】
特定の実施形態では、該方法はＨＰＶ関連病変の退縮を増加させる方法であり、病変は高度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）である。
【００７０】
その他の実施形態では、該方法はＨＰＶ陽性の個人のＨＰＶ関連病変の退縮を増加させる方法であり、病変は良性腫瘍又は前がん病変である。
【００７１】
幾つかの実施形態でのペプチドは、そのアミノ末端がアセチル化されるか、そのカルボキシ末端がアミド化されるか、又は両方である。その他の実施形態では、いずれの末端も修飾を受けない。
【００７２】
好ましくは、該方法では組成物は皮内注射によって投与される。しかし、組成物はいずれの好適な方法、例えば、筋肉内注射によって投与されてよい。
【００７３】
１つの実施形態は、個人のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）による感染症を減少又はＨＰＶ陽性の個人のＨＰＶ関連病変の退縮を増加させてＨＰＶに対するＴ細胞応答を誘導する方法を提供し、該方法は、個人に１つ以上のＨＰＶ抗原を含む組成物を投与すること及び個人にＨＰＶ抗原ではないリコール抗原を投与すること含み、リコール抗原は投与されて個人の１つ以上のＨＰＶ抗原と接触させられ、個人は１つ以上のＨＰＶ抗原に対するＴ細胞応答を必要とする。特定の実施形態では、１つ以上のＨＰＶ抗原はＥ６抗原又はＥ７抗原である。他の特定の実施例では、それらはＥ６抗原ではない。別の特定の実施形態では、それらはＥ７抗原ではない。
【００７４】
該方法は、ＨＰＶ抗原ではないリコール抗原を投与することを含まない、その他は同一の方法と比べて、投与する個人におけるＨＰＶ抗原に対するより強力なＴ細胞応答を生じさせることが期待される。「より強力なＴ細胞応答」は、例えば、インビトロで、リコール抗原無しに疾患特異的抗原で治療された対象由来のＴ細胞に対して、リコール抗原と疾患特異的抗原の混合物で治療された対象由来のＴ細胞における抗原特異的Ｔ細胞によって媒体される細胞傷害性又は抗原特異的Ｔ細胞増殖応答がより大きいことよって示されうる。これは、治験でヒト被験者を試験することによって、より可能性があるのは動物モデル試験で、又は例えば下記実施例２の図３に示されるようにヒト由来のＴ細胞のインビトロ試験によって示されることができる。
【００７５】
好ましくは、１つ以上のＨＰＶ抗原及びリコール抗原の投与は、１つ以上のＨＰＶ抗原及びリコール抗原の両方を含む組成物を投与することによって行なわれる。しかし、その投与は、１つ以上のＨＰＶ抗原及びリコール抗原の連続した別々の投与でも、例えば、１つの組成物中の１つ以上のＨＰＶ抗原の皮内注射並びに第２の組成物中のリコール抗原の同じ場所への別個の皮内注射によっても行なうことができる。
【００７６】
よって、１つの実施形態では、１つ以上のＨＰＶ抗原を含む組成物はリコール抗原も含む。
【００７７】
１つの実施形態では、個人に１つ以上のＨＰＶ抗原を投与する工程及び個人にリコール抗原を投与する工程は、１つ以上のＨＰＶ抗原及びリコール抗原を皮内に注射することを含む。他の特定の実施例では、リコール抗原及びＨＰＶ抗原は皮下注射によって投与される。ランゲルハンス細胞は皮膚で最も一般的な抗原提示細胞であり、最も多量に見られるので、皮内注射が特に好ましい。
【００７８】
特定の実施形態では、１つ以上のＨＰＶ抗原はＨＰＶ  Ｅ７抗原を含む。
【００７９】
特定の実施形態では、１つ以上のＨＰＶ抗原は、長さが８〜１００個のアミノ酸、８〜７０個のアミノ酸、８〜５０個のアミノ酸、又は８〜４０個のアミノ酸のペプチドである。より特定の実施例では、１つ以上のペプチドは化学的に合成される。
【００８０】
生検によって診断された高度扁平上皮（ＨＳＩＬ）をもつ女性との患者の第Ｉ相治験では、女性らは、ＨＰＶタンパク質Ｅ６残基１〜４５（配列番号２）、Ｅ６  ４６〜８０（配列番号３）、Ｅ６  ８１〜１１５（配列番号４）、及びＥ６  １１６〜１５８（配列番号５）を含み、すべてがアジュバントとしてのキャンディンと混合された組成物の皮内注射で治療される。試験投与量は、５０ｕｇ、１００ｕｇ、及び２５０ｕｇの各々のペプチドであった。驚いたことに、５０ｕｇ投与量群では６名の対象のうち４名（６７％）、１００ｕｇ投与量群では６名の対象のうち３名（５０％）、２５０ｕｇ投与量群では３名の対象のうち０名に、彼女らの病変の完全ＨＳＩＬ退縮があった。くわえて、５０ｕｇ投与量群中の１名のさらなる対象に部分的退縮（＜０．２ｍｍ２の病変が残る）があった。これは最も低い投与量が最も効果的であったという驚くべきの結果である。このことは下記実施例３に報告されている。
【００８１】
よって、別の実施形態は、２５〜１１０ｕｇの配列番号２から成るペプチド、２５〜１１０ｕｇの配列番号３から成るペプチド、２５〜１１０ｕｇの配列番号４から成るペプチド、２５〜１１０ｕｇの配列番号５から成るペプチド、及びリコール抗原を、皮内注射用単位剤形で、１００〜９００ｕｌ、２００〜９００ｕｌ、３００〜９００ｕｌ、又は１００〜６００ｕｌの量で含む単位投与量医薬組成物を提供する。
【００８２】
リコール抗原は、ヒトへの皮内注射、以前に抗原に曝されたことがある免疫が適格な成人（immunocompetent adults）の大部分への皮内注射の際に硬結反応を生じさせるの充分な量及び濃度にあるべきである。
【００８３】
特定の実施形態では、リコール抗原はカンジダ抽出物である。
【００８４】
特定の実施形態では、単位投与量医薬組成物は、２００〜４００ｕｌのキャンディン又は等価総効力のカンジダ抽出物を含む。
【００８５】
単位投与量医薬組成物の特定の実施形態では、総量は２００〜５００ｕｌである。
【００８６】
特定の実施形態では、単位投与量医薬組成物は３０〜７０ｕｇの各々のペプチドを含むか、又は他の実施形態では、約５０ｕｇの各々のペプチドを含む。
【００８７】
特定の実施形態では、ペプチドは各々、そのアミノ末端がアセチル化され、そのカルボキシ末端がアミド化される。
【００８８】
実施例３では、各々の４つのペプチドを１００ｕｇ含む組成物を注射することは、病変の退縮を引き起こすのにも良好に作用した。よって、別の実施形態は、５５〜１５０ｕｇの配列番号２から成るペプチド、５５〜１５０ｕｇの配列番号３から成るペプチド、５５〜１５０ｕｇの配列番号４から成るペプチド、５５〜１５０ｕｇの配列番号５から成るペプチド、及びリコール抗原を、皮内注射用単位剤形で、１００〜９００ｕｌの量で含む単位投与量医薬組成物を提供する。
【００８９】
別の実施形態は、約１００ｕｇの配列番号２から成るペプチド、約１００ｕｇの配列番号３から成るペプチド、約１００ｕｇの配列番号４から成るペプチド、約１００ｕｇの配列番号５から成るペプチド、及びリコール抗原を、皮内注射用単位剤形で、１００〜９００ｕｌの量で含む単位投与量医薬組成物を提供する。
【００９０】
別の実施形態は、患者に、２５〜１１０ｕｇの配列番号２から成るペプチド、２５〜１１０ｕｇの配列番号３から成るペプチド、２５〜１１０ｕｇの配列番号４から成るペプチド、２５〜１１０ｕｇの配列番号５から成るペプチド、及びリコール抗原を、皮内注射用単位剤形で、１００〜９００ｕｌの量で含む単位投与量医薬組成物を皮内投与することを含むＨＰＶ感染症を治療する方法を提供する。
【００９１】
特定の実施形態では、方法は患者に単位投与量医薬組成物を、各注射の間を５日以上２８日以下あけて、連続して少なくとも３回皮内注射することを含む。
【００９２】
別の実施形態では、方法は患者に単位投与量医薬組成物を、各注射の間を１０日以上２１日以下あけて、連続して少なくとも３回皮内注射することを含む。
【００９３】
特定の実施形態では、方法は患者に単位投与量医薬組成物を、各注射の間を１０日以上２１日以下あけて、連続して少なくとも２回皮内注射することを含む。
【００９４】
特定の実施形態では、方法は患者に単位投与量医薬組成物を、各注射の間を５日以上２８日以下あけて、２年の期間内に少なくとも３回多くても６回皮内注射することを含む。
【００９５】
本願明細書で実施例２に、キャンディンなどのリコール抗原が、試験ＨＰＶペプチドに対するＴ細胞免疫応答を高めることが示される。リコール抗原とＨＰＶペプチドの混合物は末梢血単核細胞と接触する。よって、疾患特異的抗原とともリコール抗原を含むワクチンの投与は、一般的な適用性がり、疾患特異的抗原に対する細胞（Ｔ細胞）免疫応答を促進しうる。
【００９６】
よって、１つの実施形態は、微生物の１つ以上の抗原を含む組成物を対象に投与すること及び微生物の抗原ではないリコール抗原を対象に投与することを含み、リコール抗原が投与されて、対象の微生物の１つ以上の抗原と接する、哺乳類対象において微生物によって起こされる疾患を治療する方法を提供する。
【００９７】
特定の実施形態では、微生物は、ウイルス、細菌、又は真菌（例えば、酵母）でありうる。特定の実施形態では、微生物はＨＰＶではない。特定の実施形態では、微生物は単純ヘルペスウイルスではない。
【００９８】
微生物の１つ以上の抗原は、長さが１０〜１００個、８〜１００個、８〜７５個、８〜５０個、８〜４０個、１０〜７５個、１０〜５０個、１０〜４０個、２０〜１００個、２０〜７５個、２０〜５０個、２０〜４０個、３０〜１００個、３０〜７５個、３０〜５０個、又は３０〜４０個のアミノ酸残基の特定の実施例におけるペプチドでありうる。
【００９９】
ペプチドは好ましくは化学的に合成されるが、それらのペプチドは組換えＤＮＡ技術による組換え生物で作製されてもよい。また、それらのペプチドは当業者に公知の他の手段によって、例えば、微生物のタンパク質のタンパク質分解によって作製されてもよい。
【０１００】
幾つかの実施形態でのペプチドは、そのアミノ末端がアセチル化されるか、そのカルボキシ末端がアミド化されるか、又は両方である。その他の実施形態では、いずれの末端も修飾を受けない。
【０１０１】
好ましくは、該方法では組成物は皮内注射によって投与される。しかし、組成物はいずれの好適な方法、例えば、筋肉内注射によって投与されてよい。
【実施例】
【０１０２】
実施例１
アミド化及びアセチル化したＨＰＶ  Ｅ６  ８１〜１１５ペプチドを溶解すること、並びに医薬製剤の形成
我々は、４つのＨＰＶ  Ｅ６ペプチドを用いて医薬製剤を作製することを試みた。４つのペプチドは、配列番号１の残基１〜４５、４６〜８０、８１〜１１５、及び１１６〜１５８から成るペプチドであった。各ペプチドは、そのカルボキシル末端をアミド化し、そのアミノ末端をアセチル化した。ペプチドは各々化学的に合成した。
【０１０３】
ＨＰＶ１６  Ｅ６  ８１〜１１５ペプチドは、製造に適したバッファーのいずれにも不溶であることが分かった。しかし、そのペプチドは、溶解したＥ６  １〜４５、Ｅ６  ４６〜８０、及びＥ６  １１６〜１５８を既に含有する１０ｍＭグルタミン酸のｐＨ４．０溶液に加えた場合、４つのペプチドの各々が５ｍｇ／ｍｌの濃度にて溶解可能で溶解したままと思われることがわかった。
【０１０４】
医薬製剤のために、これと、安定化剤としてのトレハロース及び浸透圧調節剤としてのグリシンを混ぜた。製剤の最終濃度は、グルタミン酸が１０ｍＭ、トレハロースが１．０％（重量／体積）、グリシンが２．０％（重量／体積）、及び４つのペプチド各々が０．７１４ｍｇ／ｍｌであった。
【０１０５】
保存するために製剤を凍結乾燥し、適量の注射用水を添加することによって再溶解して上記の濃度を得た。
【０１０６】
実施例２：ヒトパピローマウイルスペプチドに基づく治療ワクチン用の新規アジュバントとしてのカンジダ皮膚試験試薬
細胞性免疫を効果的に促進できるワクチンアジュバントは現在のところない。カンジダ皮膚試験試薬注射には尋常性疣贅の消退を誘導する能力があることから、我々のグループはペプチドに基づくヒトパピローマウイルス治療ワクチンの治験でそれを新規アジュバントとして使用している。この現在の試験の目的は、どのようにカンジダがワクチン免疫反応を高めるかのメカニズムを調べることであった。ランゲルハンス細胞の成熟効果、Ｔ細胞増殖能、ランゲルハンス細胞によるサイトカイン及びパターン認識受容体の発現、並びにＴｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７応答を誘導する能力を健康な対象で調べた。ワクチン、カンジダを伴うヒトパピローマウイルスペプチド、ＣＤ４０（ｐ＝０．００００７）及びＣＤ８０（ｐ＜０．００００１）レベルの有意な上方制御によって示唆されるランゲルハンス細胞への部分的成熟効果を示し、インビトロでランゲルハンス細胞によって提示された場合、Ｔ細胞増殖能（ｐ＜０．００００１）を示した。興味深いことに、成熟効果はペプチドに起因した一方でカンジダはＴ細胞増殖の原因となった。ワクチン又はカンジダのみで処理したランゲルハンス細胞のサイトカイン分析結果（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−２３Ａｐ１９、ＩＦＮ−γ、及びＴＮＦ−α）は、ＩＬ−１２ｐ４０のｍＲＮＡが最も高い頻度で誘導されたことを示し、ＩＬ−１２ｐ７０タンパク質が上澄みに検出された。カンジダ・アルビカンスに関連することが知られているパターン認識受容体（ＤＣ−ＳＩＧＮ、デクチン−１、デクチン−２、ガレクチン−３、ミンクル、マンノース受容体、Ｔｏｌｌ様受容体−１、２、４、６、及び９）の存在が対象全員で示された。他方では、ワクチン又はカンジダでのパルスを受けたランゲルハンス細胞で刺激したＣＤ４細胞によるＩＦＮ−γ分泌によって示されるＴｈ１応答の誘導は、１名の対象のみで示された。まとめると、ワクチンのランゲルハンス細胞成熟効果はペプチドに起因した一方で、Ｔ細胞増殖能はカンジダに由来し、最も高い頻度で誘導されたサイトカインはＩＬ−１２であった。
【０１０７】
略称：ＡＰＣ、抗原提示細胞；ＨＰＶ、ヒトパピローマウイルス；ＬＣ、ランゲルハンス細胞；ＭＦＩ、平均蛍光強度；ＰＡＭＰ、病原体関連分子パターン；ＰＢＭＣ、末梢血単核細胞；ＰＥ、フィコエリスリン；ｑＲＴ‐ＰＣＲ、定量リアルタイムＰＣＲ；ＰＲＲ、パターン認識受容体
【０１０８】
１  序論
認可されているヒトワクチンに最も広く使用されるアジュバントは、主にＴｈ２免疫応答を引き起こすことが示されているミョウバンに基づくアジュバントである［１］。よって、ミョウバンに基づくアジュバントは、抗体応答をブーストするように設計されたワクチンでは有用であると思われるが、細胞性免疫応答を刺激するように設計されたワクチンに対しては有用ではない。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染症の排除の成功は、細胞性免疫によって誘導されると考えられているので［２、３］、そのような免疫を促進すると思われるアジュバントが必要であるが、手に入れることができない。
【０１０９】
我々のグループ及び他のグループは、カンジダ、ムンプス、及び／又はトリコフィトンなどの皮膚試験試薬を用いた連続尋常性疣贅病巣内注射が治療した疣贅の退縮だけでなく離れた未治療の疣贅の退縮も誘導できることを示している［４〜９］。第Ｉ相治験（ＮＣＴ００５６９２３１）において我々のグループは、カンジダ・アルビカンスの無色抽出物であるキャンディン（登録商標）（Ａｌｌｅｒｍｅｄ社、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して尋常性疣贅を治療した。治療した疣贅の消散が８２％の対象で起こり、抗ＨＰＶＴ細胞応答が示された［８］。キャンディンがカンジダ・アルビカンスに由来することを考えれば、多数の病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を含有するはずである。我々は、キャンディンは複数のパターン認識受容体（ＰＲＲ）を刺激し、先天性免疫及び獲得免疫を誘導すると思われる効果的なワクチンアジュバントでありうると仮説をたてた。
【０１１０】
子宮頸がんはほとんどの場合ハイリスクＨＰＶ感染症によって引き起こされ、世界中の女性で２番目に多いがんである。２つの非常に効果的な予防ＨＰＶワクチン、ガーダシル（登録商標）（メルク社、ニュージャージー州、アメリカ合衆国）及びサーバリックス（登録商標）（グラクソ・スミスクライン社、ミドルセックス、英国）がｓ使用可能であり、それらのワクチンは高い力価の中和抗体を誘導することによって作用する［１０〜１２］。しかし、予防ＨＰＶワクチンは、前から存在するＨＰＶ感染症をもつ女性には効果的ではない［１０、１２、１３］。したがって、既にＨＰＶに感染した人及び／又はＨＰＶ関連腫瘍を発症している人に使用できる治療ＨＰＶワクチンはない。我々のグループは、ＨＰＶ感染症及び／又は子宮頸部病変をもつ女性において自然に誘導される免疫を研究し、ハイリスクＨＰＶの腫瘍性タンパク質の１つであるＥ６に対するＴ細胞応答を誘導する能力が、ＨＰＶ排除及び子宮頸部病変の消退に関連することを見出してきた［３、１４、１５］。したがって、我々は４つのＨＰＶ１６  Ｅ６ペプチド及びキャンディン（Ｃａｎｄｉｎ）から成るＨＰＶ治療ワクチンを設計し、第Ｉ相治験（ＮＣＴ０１６５３２４９）を行っっている。
【０１１１】
現在の試験では、我々はキャンディンのワクチンアジュバントとしての免疫増強効果を調べた。驚いたことに、Ｅ６ペプチドはランゲルハンス細胞（ＬＣ）の部分的成熟に関与した一方で、キャンディンはＴ細胞増殖効果に関与した。最もよく誘導されたＬＣによるサイトカインはＩＬ−１２であった。
【０１１２】
２．材料及び方法
２．１  単球由来ＬＣの産生
単核細胞をアフェレーシスによって健常な血液ドナー（ｎ＝１０）から集めた（キー・バイオロジーズ有限責任会社（Key Biologies, LLC）、テネシー州メンフィス）。対象は時系列順に番号を付けた。フィコール勾配遠心分離法を用いて末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を精製した。単球を単球単離キットＩＩ（ミルテニーバイオテク社、カリフォルニア州オーバーン）を用いてＰＢＭＣからネガティブに単離し、Ｆａｈｅｙら［１７］の記載のように顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、ＩＬ−４、及びトランスフォーミング増殖因子β−１を用いてＬＣに形質転換した。ＬＣへの転換の有効性は、選択された実験においてＣＤ１ａ（イーバイオサイエンス社、カリフォルニア州サンディエゴ）、ランゲリン（ベックマン・コールター社、カリフォルニア州ブレア）、及びＥカドヘリン（イーバイオサイエンス社）を、ＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（アーカンソー州大学メディカルサイエンス（University of Arkansas for Medical Sciences）微生物学及び免疫学フローサイトメトリーコア研究室）及びＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェア（ＢＤバイオサイエンス社、カリフォルニア州サンノゼ）を用いて検出することによって示された（図１）。ＬＣ成熟実験を行うことができなかった対象１を除いた対象全員から充分な数の細胞を得ることができた。
【０１１３】
２．２  キャンディン及び／又はＨＰＶペプチドで処理したＬＣの成熟分析
キャンディンをスライド−Ａ−ライザーＧ２透析カセット（サーモ・サイエンティフィック社、イリノイ州ロックフォード）を用いて使用前に透析して少量の溶媒（０．４％フェノール）を除去した。ＬＣを上記のように調製し、１００万個のＬＣをそれぞれ、キャンディン（１５０μｌ／ｍｌ）、４つの現行適正製造基準グレードＨＰＶ１６  Ｅ６ペプチド［Ｅ６  １〜４５、Ｅ６  ４６〜８０、Ｅ６  ８１〜１１５、及びＥ６  １１６〜１５８（以降、「ペプチド」と呼ぶ）；１０μｇ／ｍｌ／ペプチド；ＣＰＣサイエンティフィック社、カリフォルニア州サニーベールによって製造され、インテグリティ・バイオ社（Integrity Bio）、カリフォルニア州カマリロによってバイアル化］、又はキャンディン／「ペプチド」で処理した。ザイモサン（１０μｇ／ｍｌ、インビボジェン社、カリフォルニア州サンディエゴ）、β−グルカン及びマンナンを含む多くの多糖類酵母細胞壁粒子［１８］を陽性対照として用いた。４８時間インキュベーションした後、抗ヒトＣＤ４０フィコエリスリン（ＰＥ）−Ｃｙ５．５、ＣＤ８０フルオレセインイソチオシアネート、ＣＤ８６ＰＥ−Ｃｙ５  、及びＨＬＡ−ＤＲ  ＰＥ（イーバイオサイエンス社、カリフォルニア州サンディエゴ）で細胞を染色した。１万の事象を獲得し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（ＢＤバイオサイエンス社）を用いてデータを解析した。
【０１１４】
2.3 キャンディン及び／又は「ペプチド」で処理したＬＣによって誘導したＴ細胞増殖の分析
ＬＣ形質転換の７日目に、同じ対象のＣＤ３Ｔ細胞を、汎Ｔ細胞単離キットＩＩ（ミルテニーバイオテク社）を用いてＰＢＭＣからネガティブに単離した。ＣＤ２５制御性Ｔ細胞を除去するために、ヒトＣＤ２５抗体−ビオチン（ミルテニーバイオテク社）を加えた。９６ウェルプレートの各ウェル中で、１％ヒト血清を含有する１００μｌの完全Ｙｓｓｅｌの培地（ジェミニ・バイオ−プロダクツ社（Gemini Bioproducts Inc）、カリフォルニア州ウッドランド）でＴ細胞（１．５×１０６個の細胞／ｍＬ）を自己由来ＬＣ（３×１０４個の細胞／ｍＬ）と共培養することによって、Ｔ細胞増殖アッセイを６連反復ウェルで行った。細胞（Ｔ細胞及びＬＣ）を含み、細胞及びキャンディン（１５０μｌ／ｍｌ）、細胞及びキャンディン／「ペプチド」、並びに細胞及び破傷風トキソイド（５００ｎｇ／ｍｌ、ＥＭＤミリポア社、マサチューセッツ州ビレリカ）を入れたウェルをセットアップした。インキュベーションの７日後に、１０μｌのアラマーブルー（ライフテクノロジーズ社、ニューヨーク州グランドアイランド）を使用して、各ウェルの培地に相当する量を置換した後、プレートを３７℃で６時間インキュベーションした。バイオテックシナジー２（BioTek Synergy-2）マルチプレートリーダー（ＵＳバイオテック社、ワシントン州シアトル）を用いて培地中で、蛍光を測定した（励起波長５３０ｎｍ及び発光波長５９０ｎｍ）。
【０１１５】
２．４  定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ‐ＰＣＲ）によるサイトカイン及びＰＲＲ分析
「ペプチド」（１０μｇ／ｍｌ／ペプチド）と共に又は「ペプチド」無しで、キャンディン（５０μｌ／ｍｌ、１００μｌ／ｍｌ、及び１５０μｌ／ｍｌ）で各キャンディン濃度にて１００万個のＬＣをそれぞれ処理した。ザイモサンを陽性対照として１０ｕｇ／ｍｌで使用し、培地のみを陰性対照として使用した。８時間及び２４  時間後にＲＮＡ用に細胞を採取した。ＲＮｅａｓｙキット（キアゲン、カリフォルニア州バレンシア）を用いてＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅＩ（プロメガ、ウィスコンシン州マディソン）で処理した。ｃＤＮＡ合成をスーパースクリプト（Superscript）ＩＩＩ第一鎖合成システム（ライフテクノロジーズ社）を用いて実施した。
【０１１６】
ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−２３Ａｐ１９、ＩＦＮ−γ、及びＴＮＦ−αを含むサイトカインについて、定量ＰＣＲ分析をｉＱ−ＳＹＢＲミックス（バイオ・ラッド社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて２連で行った。くわえて、カンジダ・アルビカンスと関連することが知られているＰＲＲ（ＤＣ−ＳＩＧＮ、デクチン−１、デクチン−２、ガレクチン−３、ミンクル、マンノース受容体、ＴＬＲ−１、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−６、及びＴＬＲ−９）［１９〜２８］の発現を調べた。ＩＬ−１２を検出するために使用したプライマーは、Ｖｅｒｎａｌら［２９］によって以前に報告されている。他のプライマーはすべて、Ｂｅａｃｏｎ  Ｄｅｓｉｇｎソフトウェア（バイオ・ラッド社、表１）を用いて設計した。閾値サイクル数（threshold cycle）は、ヒトハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド  ３−リン酸デヒドロゲナーゼに対して正規化し、８時間時点の未処理のＬＣと比較して倍率変化（fold change）として計算した。ｃＤＮＡの増幅が示された場合、ｍＲＮＡが検出されたとみなす。
【０１１７】
２．５  ＥＬＩＳＡによるＩＬ−１２ｐ７０タンパク質分析
「ペプチド」（１０μｇ／ｍｌ／ペプチド）と共に又は「ペプチド」無しでキャンディン（５０μｌ／ｍｌ、１００μｌ／ｍｌ、及び１５０μｌ／ｍｌ）で処理したＬＣの上澄みを、２４時間時点でｑＲＴ‐ＰＣＲ実験から採取し、ＩＬ−１２ｐ７０高感度ＥＬＩＳＡキット（イーバイオサイエンス社）を用いて試験した。培地のみのウェルの値を実験用のウェルから減算する。
【０１１８】
２．６  細胞内サイトカイン染色
方法はＺｉｅｌｉｎｓｋｉら［３０］によって記載されたものを適合した。ＣＤ４Ｔ細胞はＰＢＭＣからＣＤ４Ｔ細胞単離キットＩＩ（ミルテニーバイオテク社）を用いてネガティブに単離し、た自己由来ＬＣと５０：１（ＣＤ４Ｔ細胞：ＬＣ）の比で共培養した。「ペプチド」（１０μｇ／ｍｌ／ペプチド）と共に又は無しにキャンディン（１５０μｌ／ｍｌ）を加えて細胞を刺激した。培地のみを陰性対照として使用した。共培養の６日後、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（２００ｎＭ、シグマ社、ミズーリ州セントルイス）、及びイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ、シグマ社）で細胞を２時間刺激した。次に、ブレフェルジンＡ（１０μｇ／ｍｌ、イーバイオサイエンス社）  をさらに２時間加えた。Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ４５０（登録商標）（イーバイオサイエンス社）を用いて染色した後、細胞を透過処理／固定して、抗ヒトＩＦＮ−γＰＥ、ＩＬ−１７Ａペリジニンクロロフィルタンパク質−Ｃｙ５．５、ＩＬ−４アロフィコシアニン、又は関連アイソタイプ対照（イーバイオサイエンス社）で染色した。１万事象をＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａを用いて獲得した。生存リンパ球をゲートし、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７Ａ、及びＩＬ−４陽性ＣＤ４Ｔ細胞の％割合をＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ（ＢＤバイオサイエンス社）及びＦｌｏｗｊｏソフトウェアを用いて解析した。
【０１１９】
２．７  統計解析
混合効果モデルによるＡＮＯＶＡを用いて、群間の従属性を考慮しつつ群を比較した。成熟マーカーについてテューキーの多重比較法を用いてすべての対比較ペアを行った（図２Ｂ）一方で、Ｔ細胞増殖についてダネットの検定を用いて培地対照値を残りの群と比較した（図３）。
【０１２０】
３．結果
３．１  ＬＣの表現型成熟
我々は、キャンディン（Ｃａｎｄｉｎ）及び／又は「ペプチド」のＬＣに対する成熟効果を評価した（図１〜２）。ＣＤ４０に関して、未処理のＬＣと比較して、ザイモサン（ｐ＜０．００００１）、「ペプチド」（ｐ＝０．００００３）、及びキャンディン／「ペプチド」（ｐ＝０．００００７）で処理したＬＣで平均蛍光強度（ＭＦＩ）の統計的に有意な増加が見られた。くわえて、「ペプチド」及びキャンディン／「ペプチド」で処理したＬＣのＭＦＩは、キャンディンのみで処理したＬＣのＭＦＩと比べて有意に高かった（それぞれ、ｐ＝０．００１及び０．００３）。ＣＤ８０に関して、培地と比較して、「ペプチド」（ｐ＜０．００００１）及びキャンディン／「ペプチド」（ｐ＜０．００００１）で処理したＬＣでＭＦＩの有意な増加が見られた。キャンディンで処理したＬＣと比較して、「ペプチド」及びキャンディン／「ペプチド」で処理したＬＣでＣＤ８０発現が有意に高かった（共にｐ＜０．００００１）。ザイモサンのみが、有意にＣＤ８６のＭＦＩを増加させた（ｐ＜０．００００１）。ＨＬＡ−ＤＲに関しては有意な増加は観察されなかった。まとめると、「ペプチド」は、部分的ＬＣ成熟効果を発揮した一方でキャンディンは発揮しなかった。個別に試験した「ペプチド」のエンドトキシンレベルはすべて検出限界未満であった（＜１．０ＥＵ／ｍｇ）。
【０１２１】
３．２  アラマーブルーで測定したＴ細胞増殖
培地と比較してキャンディン（ｐ＜０．００００１）及びキャンディン／「ペプチド」（ｐ＜０．００００１）で増殖が有意に増加した（図３）。「ペプチド」は測定可能な増殖を誘導しなかった。破傷風トキソイドで測定可能な増殖（＞５０００の蛍光の増加）が対象２及び５で示されたが、全体として培地と比較して有意な増加は見られなかった（図３）。ありそうもないが、Ｔ細胞に加えてＬＣも増殖したかもしれない可能性を排除することはできない。
【０１２２】
３．３  キャンディン又はキャンディン／「ペプチド」でパルスしたＬＣによるサイトカインの発現
１０名の対象のＬＣをキャンディン又はキャンディン／「ペプチド」で処理し、８つのサイトカインｍＲＮＡ発現（表１）をｑＲＴ‐ＰＣＲによって調べた（図４、表２）。選択した実験ではゲルを精製した後、目的の産物の増幅をＤＮＡシークエンシングによって確認した。全体として、キャンディン及びキャンディン／「ペプチド」で処理したＬＣのサイトカイン発現分析結果は同じようなものであった。ＩＬ−１２ｐ４０が最も高い頻度で強化されたサイトカイン（未処理のものと比較して＞５倍）であり、その発現は、キャンディンでは５名の対象で、キャンディン／「ペプチド」では７名の対象で検出された。ＩＦＮ−γが２番目に高い頻度で誘導されたサイトカイン（６名の対象）であり、キャンディンでは５名の対象で、キャンディン／「ペプチド」では４名の対象で検出された。また、ＩＬ−１βも６名の対象で誘導され、キャンディンでは４名の対象で、キャンディン／「ペプチド」では６名の対象であった。ＩＬ−６及びＩＬ−２３ｐ１９は、キャンディン（ＩＬ−６については２名の対象及びＩＬ−２３ｐ１９については１名の対象）でのみ誘導された。ＴＮＦ−αは１名の対象でキャンディン／「ペプチド」でのみ発現した。ＩＬ−８及びＩＬ−１０はいずれの対象でも発現しなかった。
【０１２３】
キャンディン又はキャンディン／「ペプチド」で２４時間処理したＬＣからの上澄みを、ＩＬ１２ｐ７０タンパク質の有無について分析した。ＩＬ１２ｐ７０は、キャンディン（３８〜１７７ｎｇ／ｍｌの範囲）で処理した３０個のサンプルのうち２７個で、キャンディン／「ペプチド」（３８〜２９９ｎｇ／ｍｌの範囲）で処理した３０個のサンプルのうち２７個で検出された。
【０１２４】
表１  ｑＲＴ‐ＰＣＲに使用したプライマー
【０１２５】
【表２】
2016538333.tif 000004
【０１２６】
＊同一プライマーを使用して、２つの遺伝子の間の１００％相同領域を増幅してＴＬＲ１及び６を分析した。
【０１２７】
表２
最も高い頻度で増加した３つのサイトカインに関するｑＲＴ‐ＰＣＲ結果の概要
【０１２８】
【表３】
2016538333.tif 000005
【０１２９】
倍率増加が≧５を示す。
【０１３０】
３．４  ＬＣのＰＲＲ発現
対象全員の未処理のＬＣで、調べた１１つのＰＲＲがすべて検出可能であった（データ示さず）。キャンディン又はキャンディン／「ペプチド」で刺激した際、発現の増加を示したＰＲＲはほとんどなかった（未処理と比較して＞５倍）。キャンディンで処理したＬＣとキャンディン／「ペプチド」で処理したＬＣの間にＰＲＲの発現に明らかな違いは観察されなかった。ＴＬＲ−９の発現は３名の対象において（キャンディンで５〜１８倍、キャンディン／「ペプチド」で９〜１６倍）、ミンクルの発現は２名の対象において（キャンディン及びキャンディン／「ペプチド」で５倍）、マンノース受容体の発現は２名の対象において（キャンディンで５〜９倍、キャンディン／「ペプチド」で５〜１１倍）、デクチン−２の発現は２名の対象において（キャンディンで５〜５４倍、キャンディン／「ペプチド」で５〜８倍）、並びにＤＣ−ＳＩＧＮの発現は１名の対象において（キャンディンで５〜２２倍）増加した。ＰＲＲの発現が増加した５名の対象では、彼女らのうち３名が、ＬＣの２つ以上のＰＲＲの発現の増加を示した。
【０１３１】
３．５  キャンディンでパルスしたＬＣ又はキャンディン／「ペプチド」でパルスしたＬＣで刺激したＣＤ４Ｔ細胞の細胞内サイトカイン発現
ＩＦＮ−γ（Ｔｈ１）、ＩＬ−４（Ｔｈ２）、及びＩＬ−１７Ａ（Ｔｈ１７）の細胞内分泌について、１０名の対象の、キャンディン又はキャンディン／「ペプチド」で処理したＬＣで刺激したＣＤ４Ｔ細胞を染色した（図５）。対象４では、培地と比較して、キャンディン又はキャンディン／「ペプチド」で処理したＬＣに曝したＣＤ４Ｔ細胞でＩＦＮ−γ分泌の増加（＞５％）が見られた（それぞれ、９．５％及び６．９％）。全体として、ＬＣのみで処理したＣＤ４Ｔ細胞と、キャンディンで処理したＬＣで処理したＣＤ４Ｔ細胞との間でも、ＬＣのみで処理したＣＤ４Ｔ細胞と、キャンディン／「ペプチド」で処理したＬＣで処理したＣＤ４Ｔ細胞との間でも、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、及びＩＬ−１７Ａの分泌に違いは見られなかった。
【０１３２】
４  考察
「アジュバント」はラテン語の単語、ａｄｊｕｖａｒｅに由来し、補助すること又は増強することを意味する。効果的なワクチンアジュバントは、サイズ及び耐久性の点からワクチン抗原に対して強い免疫応答を促進できるべきである。抗原提示細胞（ＡＰＣ）を免疫応答の始動に決定的な役割を担う。アジュバントの所望の特徴の１つは、ＡＰＣの成熟及びその結果としての効果的なＴ細胞応答のプライミングを増強する能力である。ＣＤ４０及びＣＤ８０は抗原特異的なヘルパーＴ細胞［３１］及び細胞傷害性Ｔ細胞［３２］の活性化に決定的に重要であることが示されている。我々の結果は、「ペプチド」はＣＤ４０及びＣＤ８０の有意に高い発現を誘導できることが示す。本ＨＰＶ治療ワクチンは、アジュバントよりもむしろペプチド抗原がＡＰＣを成熟させることを一層可能にする点で稀なワクチンであるかもしれない。これらの結果は、カンジダ・アルビカンスによる樹状細胞上のＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＨＬＡ−ＤＲの上方調節を示したＲｏｍａｇｎｏｌｉら［３３］によって報告されているものとは異なる。エンドトキシンは「ペプチド」で中に検出限界未満であったので、ＬＣに対する予想外の部分的成熟効果に混入が寄与しているということはありそうにない。我々のワクチンは表皮での充分なＬＣをうまく利用するために皮内経路用に製剤されていたので、我々はＬＣ成熟効果を調べることに重点的に取り組んだ。樹状細胞や単球などの他のＡＰＣに対する成熟効果の研究は将来的に重要であろう。
【０１３３】
正常フローラの構成要素としてのカンジダ・アルビカンスは多くの場合、健常人の皮膚及び粘膜表面にコロニーを作る。カンジダ・アルビカンスに対する潜在的獲得免疫は通常、免疫が正常な個人に存在する［３４］。この研究では、キャンディン及びキャンディン／「ペプチド」は、顕著なＴ細胞増殖を誘導したが、「ペプチド」は誘導しなかった。我々の結果と同様に、Ｇｏｒｄｏｎら［３５］は９２％の健康な対象でのカンジダ・アルビカンスに対する皮膚試験陽性反応を示し、Ｂａｕｅｒｌｅらは７１％の健康な対象でのカンジダ特異的Ｔ細胞応答を示した。キャンディンは、細胞性免疫が損なわれていない状態であることを評価するのに臨床で使用され、そこで、本研究で我々がカンジダ・アルビカンスからの抽出物にはＴ細胞増殖効果があることを見出すことと一致する。しかし、残念ながら、カンジダ・アルビカンスの成熟効果［３３］は抽出物では失われる。他方では、「ペプチド」が幾分の成熟効果を発揮することが本研究で見出される。
【０１３４】
本ワクチンの創出では、Ｅ６タンパク質が疎水性であることは既知のため、直面した障害は「ペプチド」が溶解した製剤の開発を可能にすることにあった。それらは製剤の酸性のｐＨでは溶存しても残る一方で、中性のｐＨでは不溶で微粒子を形成する（未発表データ）。この独特の特性は、ＬＣを刺激してこれらの微粒子を貪食することによって成熟効果に寄与しているのかもしれない。
【０１３５】
ＰＲＲシグナリングは、ＡＰＣを誘導してＴリンパ球の活性化及び分化に必要な共刺激分子及びサイトカインを発現できる［３７］。複数のＰＲＲを刺激することによるＡＰＣでのさまざまなＰＲＲの協調は、相乗的なＴｈ１応答［２０、３８］及び細胞傷害性Ｔリンパ球応答［３９］を導く。カンジダ・アルビカンスは、ＤＣ−ＳＩＧＮ［１９］、デクチン−１［２０］、デクチン−２［２１］、ガレクチン−３［２２］、マンノース受容体［１９］、ミンクル［４０］、及び幾つかのＴＬＲ［２５〜２７、４１、４２］を含む多くのＰＲＲを活性化することが示されている。幾つかのＰＲＲが活性化の間に増加するので［４３、４４］、我々はこれらのＰＲＲの存在及び発現の増幅を調べた。本研究では、調べたＰＲＲはすべて、キャンディン及びキャンディン／「ペプチド」でパルスしたＬＣによって発現し、ある特定のＰＲＲ（ＤＣ−ＳＩＧＮ、デクチン−２、ミンクル、単球受容体、及びＴＬＲ−９）の発現の増加が、１０名の対象のうち５名で示された。どのＰＲＲが本ＨＰＶ治療ワクチンからのシグナルの伝達に関与しうるかを決定するのにさらなる研究が必要である。デクチン−１はＴＬＲ−２と共に、ＮＦ−κΒ［２０］を活性化でき、またデクチン−１は独立して樹状細胞でのＮＦＡＴ活性化を媒介でき、ＩＬ−１２ｐ７０などの炎症性メディエーターの発現を導く［４５］。したがって、キャンディン又はキャンディン／「ペプチド」がＮＦ−κΒ及びＮＦＡＴ活性化で何らかの役割を担うか否かを研究することは将来的に興味深いであろう。
【０１３６】
ＡＰＣによって分泌されるサイトカインは、ヘルパーＴ細胞をＴｈ１、Ｔｈ２、又はＴｈ１７細胞に分化する過程において重要な役割を果たす。ＩＬ−１２ｐ７０がＴｈ１応答を導く一方で、ＩＬ−１β及びＩＬ−６はＴｈ１７応答を導く［３７、４６］。処理したＬＣのサイトカイン分析結果は、ＩＬ−１２ｐ４０は最も高い頻度で強化されたサイトカインであったことを示し、ＩＬ−１２ｐ７０はタンパク質レベルでも検出された。既報の研究は、カンジダ・アルビカンスが特異的なＴｈ１及びＴｈ１７細胞の分化を誘導できること［３０、３３］、並びにカンジダ特異的Ｔｈ１免疫応答が健康な対象で検出できること［４７、４８］を示した。これらのデータから我々はカンジダ・アルビカンスの抽出物であるキャンディンがＴｈ１とＴｈ１７の偏り効果（skewing effect）を誘導とすると予想した。Ｔｈ１応答（ＩＦＮ−γ分泌＞５％）の増加が１名の対象で観察されたが、１０名の対象の全体としての結果はＴｈ１応答及びＴｈ１７応答への偏りを示さなかった。カンジダは複数のメカニズムを通してＴｈ１及びＴｈ１７効果を発揮するかもしれない。皮膚には、抗原提示及びＴ細胞活性化の過程において役割を担いうる真皮のＤＣのような他のＡＰＣのサブセットが存在する［４９］。さらに、本ＨＰＶ治療ワクチンがＨＰＶ特異的Ｔ細胞応答を誘導する能力を評価することが重要であろう。そのことは現在進行中の治験の状況で調べられている。
【０１３７】
まとめると、「ペプチド」（抗原）がＬＣ成熟効果に関与している一方で、キャンディン（アジュバント）が本ＨＰＶ治療ワクチンに対する顕著なＴ細胞増殖を誘導する。したがって、抗原及びアジュバントは相補的な免疫増強効果がある。やがて、現在進行中の治験から、これらの相補的な効果が効果的な臨床反応につながるか否かが明らかにされるであろう。
【０１３８】
実施例２の参考文献
【０１３９】
【表４】
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【０１４０】
【表５】
2016538333.tif 000007
【０１４１】
【表６】
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【０１４２】
【表７】
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【０１４３】
【表８】
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【０１４４】
【表９】
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【０１４５】
【表１０】
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【０１４６】
【表１１】
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【０１４７】
実施例３  生検によって診断された高度扁平上皮内病変をもつ女性におけるＥ６  ペプチド及びキャンディンを含有するＨＰＶ治療ワクチンの第Ｉ相治験
生検によって診断された高度扁平上皮内（ＨＳＩＬ）をもつ女性におけるＥ６ペプチド及びキャンディンを含有するＨＰＶ治療ワクチンの単一群、非盲験、投与量漸増第Ｉ相治験を行う。ワクチンはＨＰＶペプチド及びキャンディンの混合物で構成される。ペプチドは、１０ｍＭグルタミン酸（塩）、１．０％（重量／体積）トレハロース、２．０％（重量／体積）グリシン、及び０．７１４ｍｇ／ｍｌの各々の４つのＨＰＶ１６  Ｅ６ペプチド（配列番号１の残基１〜４５、４６〜８０、８１〜１１５、及び１１６〜１５８から成り、各々、そのカルボキシ末端がアミド化され、そのアミノ末端がアセチル化されている）を含有する薬剤溶液（pharmaceutical solution）Ａにある。薬剤溶液Ａを５０ｕｇ、１００ｕｇ、２５０ｕｇ、又は５００ｕｇ（７０〜７００ｕｌの溶液Ａ）の量で注射器に吸い取り、注射器内で３００ｕｌのキャンディンと混ぜる。次いで、子宮頸部病変を有するＨＰＶ陽性患者に注射器内の混合物を皮内注射する。
【０１４８】
ワクチンを受ける者は、未治療の生検によって診断されたＨＳＩＬをもつ女性である。４回のワクチン注射（３週間に１回）は上肢に皮内投与される。２回目の注射及び４回目の注射の前後に、（ＣＤ４及びＣＤ８応答を評価するための）ＣＤ３  ＥＬＩＳＰＯＴ及び免疫抑制細胞分析のために血液を採取する。臨床反応は４回目の注射後にＬＥＥＰ切除を行うことによって評価する。４回目の注射前後にＨＰＶ−ＤＮＡ検査を行う（図６）。対象は各々、４回の接種すべて単回投与レベルを受ける。最初のコホートの６名の対象は５０ｕｇ投与量を受け、そのコホートが完了すると、次の対象は次のより高い投与量レベルを受ける（詳くは下記及び図７）。全投与量を試験した後（用量制限毒性は見られないと仮定）、最大耐量（ＭＴＤ）、免疫学的至適投与量（ＩＯＤ）、及び臨床的至適投与量（ＣＯＤ）を決定する。さらなる３０名の対象を最終投与量でワクチン接種する（下記参照）。
【０１４９】
最初の６名の対象は各々、用量制限毒性が２名以上のワクチン接種者で見られない限り、各ペプチドの最低投与量（５０ｕｇ）を受ける。各投与量レベルでは最初の２名の対象は、ＦＤＡの推奨により少なくとも１週間ずらす。図７に示されるように、最大耐量に達するか、試験が完了するまで投与量レベルを上げる。３０名のさらなる対象は、臨床反応のさらなる評価のための最終投与量でワクチン接種を受ける。
【０１５０】
シンプレップ試料を、製造業者の取扱説明書に従って、「リニアアレイ  ＨＰＶジェノタイピングテスト」（ロシュ・モレキュラー・ダイアグノスティックス社、カリフォルニア州アラメダ）を用いて３７のＨＰＶ遺伝子型について検査する。検査するＨＰＶ型としては、６型、１１型、１６型、１８型、２６型、３１型、３３型、３５型、３９型、４０型、４２型、４５型、５１型、５２型、５３型、５４型、５５型、５６型、５８型、５９型、６１型、６２型、６４型、６６型、６７型、６８型、６９型、７０型、７１型、７２型、７３型、８１型、８２型、８３型、８４型、ＩＳ３９型、及びＣＰ６１０８型が挙げられる。ヒトベータ−グロビンシグナルを、各試料のＤＮＡ含有量の試料妥当性のための陽性対照としてアッセイした。陽性対照試料（ＨＰＶプラスミドＤＮＡ及びプラスミドにコードされたヒトベータ−グロビン遺伝子を加えて含む）並びに陰性対照試料（ＨＰＶプラスミドＤＮＡもヒトベータ−グロビン遺伝子も無し）が製造業者によって供給され、各実験に含まれる。
【０１５１】
各回の採血後に、ＰＢＭＣをＣＤ１４＋とＣＤ１４−集団に分け、凍結保存する。アッセイ間のばらつきをなくすために、３つの血液試料（ワクチン接種前、２回のワクチン接種後、及び４回のワクチン接種後）をすべて使用してＴ細胞株を確立し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行う。インビトロで磁気的に選択したＣＤ３細胞を、ＨＰＶ１６  Ｅ６−ｖａｃ、Ｅ７−ｖａｃ、Ｅ６−ＧＳＴ、及びＥ７−ＧＳＴに曝した自己由来の成熟樹状細胞で刺激することによってＣＤ３Ｔ細胞株を確立する。記載のようにＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行う（１）。ＨＰＶ１６  Ｅ６及びＥ７タンパク質の１６領域（Ｅ６  １〜２５、Ｅ６  １６〜４０、Ｅ６  ３１〜５５、Ｅ６  ４６〜７０、Ｅ６  ６１〜８５、Ｅ６  ７６〜１００、Ｅ６  ９１〜１１５、Ｅ６  １０６〜１３０、Ｅ６  １２１〜１４５、Ｅ６  １３６〜１５８、Ｅ７  １〜２５、Ｅ７  １６〜４０、Ｅ７  ３１〜５５、Ｅ７  ４６〜７０、Ｅ７  ６１〜８５、及びＥ７  ７６〜９８）を調べる。アッセイは３連で行う。ワクチン接種前と２回の接種後又は４回の接種後の各領域を比較するために、前述のように、対応のある標本のｔ検定を行う（２）。したがって、２回の接種後又は４回の接種後のＴ細胞応答の統計的に有意な増加をもつ領域の数の点から各対象を評価する。
【０１５２】
循環Ｔｒｅｇ細胞及び骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の測定には、各回採血の少量のＰＢＭＣ（２×１０６個の細胞）を使用し、循環Ｔｒｅｇ及びＭＤＳＣのレベルをモニターしてワクチン接種がそれらを不注意に刺激するか否かを評価する（３）。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋フォークヘッドボックス（ＦＯＸ）Ｐ３＋細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）＋細胞の数を、抗ヒトＦｏｘＰ３染色キット（アロフィコシアニン、イーバイオサイエンス社、カリフォルニア州サンディエゴ）、ＣＤＬＡ−４ペリジニン−クロロフィル−タンパク質複合体（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社、カリフォルニア州サンノゼ）、ＣＤ２５フィコエリスリン、及びＣＤ４フルオレセインイソチオシアネート（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、カリフォルニア州サンノゼ）を用いてフローサイトメトリーで決定する（４）。細胞はフローサイトメトリー（ＸＬ−ＭＣＬ、ベックマン・コールター社、カリフォルニア州フラトン）によって分析する。ワクチン接種前、２回の接種後、及び４回の接種後の循環Ｔｒｅｇ細胞の割合（％  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋ＣＴＬＡ−４＋／総ＣＤ４＋）を求める。その割合が接種前と比べて、２回の接種後又は４回の接種後、少なくとも２倍の大きい場合、Ｔｒｅｇ細胞は増加したときなされる。ＭＤＳＣを数えるには、ＰＢＭＣをＣＤ１４及びＨＬＡ−ＤＲ抗体で染色し、ＣＤ１４＋ＨＬＡ−ＤＲ−／ｌｏｗの％割合を評価する（５）。ＬＥＥＰ検査試料の代表的な断面をＦＯＸＰ３（ウサギポリクローナル、アブカム社、マサチューセッツ州ケンブリッジ）を用いる免疫組織化学的染色に使用して子宮頸部Ｔｒｅｇの数を数える（６）。ＦＯＸＰ３＋細胞の密度は、画像解析ソフトウェアを用いて決定し、核染色をもつ細胞のみを数える。
【０１５３】
結果
募集  今日まで、４４名の対象が登録しており、そのうち２７名が生検によって診断されたＨＳＩＬをもち、少なくとも１回のワクチン接種をうけている（最大で２７名のさらなる対象が４／１２／１５より前にワクチン接種可能）。
【０１５４】
安全性  ９９回の注射が２７名の対象になされた。＞グレード２のワクチン関連有害事象（ＡＥ）は報告されていない（表３）。（表３中の２つのグレード３の事象はワクチン関連ではなかった。）
グレード４の事象は全く報告されていない。
【０１５５】
表３
【０１５６】
【表１２】
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【０１５７】
ａワクチン接種の時間から＜２４時間で出現する；ｂワクチン接種の時間から＞２４時間で出現する；ｃ＞３８．０度の体温の所見なしに熱感がある
【０１５８】
最もよく見られた有害事象（ＡＥ）は、即時注射部位反応及び遅延注射部位反応（注射部位のびまん性軽度紅班）であった。
【０１５９】
インビトロでの研究は予想外にも、ＨＰＶ１６  Ｅ６タンパク質を対象とする４つの現行医薬品適正製造基準ペプチドが、ＣＤ４０（ｐ＝０．００００７）及びＣＤ８０（ｐ＜０．００００１）レベルの上方制御で判断されるランゲルハンス細胞（ＬＣ）の成熟効果をもつことを明らかにした［３０］。これらの成熟効果は、中性ｐＨでのペプチドによって（製剤の酸性ｐＨで溶解している）微粒子が形成されることによるものである可能性が高い。不溶性微粒子はＬＣによって貪食される可能性が高く、結果としてその活性化及び抗原提示をもたらすので、第Ｉ相治験の間に見られた即時注射部位反応及び遅延注射部位反応は、これらの微粒子によるものでありうる。
【０１６０】
直径が約１〜３ミクロンの微粒子は、酸性ｐＨで溶解したペプチドが中性ｐＨのバッファーと混ぜられた場合に形成する。ペプチドが中性ｐＨのバッファーに加える前にカンジダ抽出物と混ぜられたか否かにかかわらず微粒子は形成する。
【０１６１】
臨床反応１５名のワクチン接種者（平均年齢、３３．４±６．５歳）からの結果を用いることができる。完全ＨＳＩＬ退縮が、５０ｕｇ投与量群では６名の対象のうち４名（６７％）、１００ｕｇ投与量群では６名の対象のうち３名（５０％）、２５０ｕｇ投与量群では３名の対象のうち０名に起こった。部分的な退縮は試験参加終了時に残っている＜０．２ｍｍ２のＨＳＩＬ病変として定義され、５０ｕｇ投与量群では１名に、２５０ｕｇ投与量群ではもう１名にが見られた。
【０１６２】
組織学的な全奏効率は６０％（１５名のうち９名）であった。これは、２２％〜２８％の範囲の歴史的プラシーボ群の退縮率より高い。５名のベースラインでＨＰＶ１６をもつ対象のうち２名（４０％）で退縮があり、１０名の１６型以外のＨＰＶをもつ対象うち７名（７０％）で退縮があった。扁平上皮癌に進行した者はいなかった。
【０１６３】
ウイルス排除  少なくとも１つのＨＰＶ型が１５名の対象のうち９名（６０％）で検出できなくなった。これらの９名の対象のうち７名（７８％）が臨床反応を示した。
【０１６４】
免疫応答  ワクチンによって誘導されたＣＤ３Ｔ細胞のＥ６への応答（陽性指数≧２）は、１３名の対象のうち１０名（７７％）で検出され、増加は６名の対象で統計的に有意であった（４６％）（図８）。
【０１６５】
ワクチン接種後に、末梢のＴｈ１細胞、Ｔｒｅｇ、及び骨髄由来抑制細胞の％割合は変化せず、ＣＤ４（ｐ＝０．０２）及びＴｈ２細胞の％割合は減少した（図９）。
【０１６６】
上皮（１ｍｍ２当たり１２７．４±１７４．９対１ｍｍ２当たり１１９．１±１１５．６）及び上皮下間質（１ｍｍ２当たり３５１．９±３５５対１ｍｍ２当たり３８０．４±１５２）において、非レスポンダー（ｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒｓ）（ｎ＝７）の病変でのＦｏｘＰ３陽性Ｔｒｅｇの数には、レスポンダー（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒｓ）（ｎ＝７）の病変（ＣＩＮ１又は代表的な正常領域）と比較して違いが測定されなかった。
【０１６７】
実施例３の参考文献
【０１６８】
【表１３】
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【０１６９】
実施例４  第ＩＩ相治験
ＨＰＶ治療ワクチンの必要性
過去数十年、数多くの前臨床治験及び治験が予防的ＨＰＶワクチンを評価してきたが、これらのワクチンは、すでに罹患しているＨＰＶ感染者には役立たない［５１］。ガーダシル、四価ＨＰＶ  Ｌ１ウイルス様粒子ワクチン（ＨＰＶ１６型、１８型、６型、及び１１型）は最初のものであり、２００６年にＦＤＡ認可され、その３年後に、二価バージョン（ＨＰＶ１６型及び１８型）のサーバリックスがＦＤＡに認可された。治験ではＨＰＶ１６型陰性又はＨＰＶ１８型陰性の女性での優れたワクチン有効性が示されているが［５２、５３］、防御期間はまだ明らかにされていない。また、二価ワクチンの試験では既存のＨＰＶ感染症をもつ女性においてウイルス排除を高めることの証拠は示されていない（ｎ＝１，２５９；排除はワクチン接種群では３５．５％、陰性対照ワクチン接種群では３１．５％、ｐ＝ＮＳ）［５１］。したがって、治療ワクチンが、ＨＰＶ感染症にすでに罹患している症例及びＨＰＶ関連疾患がすでに発症している症例に必要とされる。このことは特に当てはまる。というのは、ターゲット群（年齢が１３〜１７歳の少女）の予防ワクチン接種率は全国的にわずか３２％であることが報告されているからである［５４］。ＬＥＥＰなどのＨＳＩＬに対する標準的な外科的治療は非常に効果的である［１４］が、早産の発生率が４．４％から８．９％に増加する意図せぬ副作用［１４、１５］が懸念されてきた。以降、最新のガイドラインは、若い女性（狭義には≦２４歳、広義には今後妊娠を計画しているいずれの女性［１４］）ではＣＩＮ２に対して治療することをもはや推奨していない。ＣＩＮ３に対して依然として治療が推奨されるが、現在、経過観察が許容可能と考えられている。ＨＰＶ治療ワクチンのような子宮頸部の解剖学的に完全な状態を変えない新たな治療が本当に必要である。要するに、以下のことからＨＰＶ治療ワクチンは必要である。（１）予防ワクチンはすでに罹患したＨＰＶ感染症に対して効果的ではない、（２）予防ワクチンの利用が少ない、（３）治療ワクチンは子宮頸部を完全な状態のままに残すと思われ、早産のリスクを増加させそうにない、（４）治療ワクチンは、肛門がん、咽頭口腔がん、陰茎がん、膣がん、及び外陰部がんなどのＨＰＶによって引き起こされる他のがんに対して効果的でありうる。
【０１７０】
１．５．２  提案したＨＰＶペプチド投与量に関する理論的根拠
第Ｉ相治験では、４つの投与量レベル（ペプチド当たり５０、１００、２５０、及び５００ｕｇ）を試験した。最も高い臨床反応を伴う投与量レベルを選択して第ＩＩ相治験で用いることになる。今のところ、ペプチド当たり１００ｕｇ（５０％の完全奏効）と比較して、ペプチド当たり５０ｕｇの投与量のほうが、奏効率（６７％の完全奏効及び１７％の部分奏効）が高い。
【０１７１】
初期の４つの投与量レベルは、文献で入手可能な情報に基づいて選んだ。さまざまなペプチドワクチンを用いた治験の既報の研究は、ペプチド当たり５〜３，０００ｕｇの範囲の投与量を用いることを報告した［３１〜３８］。免疫原性を達成するための最適投与量（及び２つの投与量レベルが同じ場合は少ない方の投与量）はワクチン間で大きく異なった：９６−ｍｅｒマラリアペプチドの３０ｕｇ［３１］、前立腺がん治療用９−ｍｅｒペプチドの５００ｕｇ［３４］、長さが２５〜３５個のアミノ酸の範囲の１３の型のＨＰＶ１６  Ｅ６及びＥ７ペプチドの各々の５０ｕｇ［３５］。したがって、最適な免疫原性を生じさせそうな投与量レベルが選ばれた。
【０１７２】
最高率の組織学的な退縮によって決定された第Ｉ相試験で試験した４つの投与量（５０、１００、２５０、及び５００ｕｇ／ペプチド／注射）からの臨床的に最適な投与量は、第ＩＩ相治験の投与量として使用されることになる。
【０１７３】
１．５．３  提案したキャンディン（登録商標）投与量に関する理論的根拠
３００μｌのキャンディン（登録商標）が注射１回当たり投与されることになる。その量は、疣贅の病巣内注射に使用された量［４７、５５］であり、第Ｉ相治験でワクチンアジュバントとして使用されたキャンディンの量である。この量は安全かつ効果的であることが示されているので、同じ量が第ＩＩ相治験に使用されることになる。
【０１７４】
１．５．４  提案注射経路に関する理論的根拠
抗原提示細胞としてＬＣを利用するために内皮経路が使用されることになる。この経路もまた、安全で、効果的で、免疫原性であることが第Ｉ相治験で示されており、第ＩＩ相治験に使用されることになる。
【０１７５】
１．５．５  提案注射部位に関する理論的根拠
使用し易いこと、及びこれらの部位から送達したＨＰＶペプチドの有効性を示す十分なデータが入手可能であることから、四肢が投与の部位として選ばれている［３５、５６］。肢への注射は、安全で、効果的で、免疫原性であることが第Ｉ相治験で示されており、第ＩＩ相治験での注射に使用されることになる。
【０１７６】
１．５．７  注射間隔に関する理論的根拠
既報の研究では注射間隔は２週間〜９０日の範囲に及ぶが［３１〜３８］、大部分は３週間の間隔を用いた。Ｋｅｎｔｅｒと同僚は、血液試料が最後のワクチン接種の７日後に採血された場合、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで測定したペプチドワクチン免疫原性が認められることが少なかったが、血液試料が最後のワクチン接種の３週間後に採血された場合、該免疫原性は高かったことを報告した［３５］。したがって、免疫応答が充分に高まるのに十分長いと思われるので、我々は３週（±７日）の間隔を選んだ。この間隔は、安全で、効果的で、免疫原性であることが示されており、同じ間隔が第ＩＩ相治験に使用されることになる。
【０１７７】
１．５．８  最後の注射と最終組織学的な評価との間隔に関する理論的根拠
組織学的な反応を第Ｉ相治験でＬＥＥＰを行なうことによって最後のワクチン接種の３か月後に評価したが、完全な効果は１年かかることが知られている［１７〜１９］。第ＩＩ相治験では、ＰｅｐＣａｎがＬＥＥＰの代わりとして投与されることになり、最後の注射の１２か月後にコルポスコピー誘導下生検を得ることによって、組織学的な反応を評価することになる（図１０）。同様のペプチドに基づくＨＰＶ治療ワクチンを使用して高度外陰上皮内病変を治療した治験では、組織学的な退縮が、ワクチン接種後３か月〜１２か月の間に２５％〜４７％増加した［１８］。
【０１７８】
１．５．９  主要評価項目：有効性に関する理論的根拠
ワクチン有効性を評価する臨床反応は、パンチ生検結果をスクリーニング来院（ＨＳＩＬ罹患でワクチン接種に適格とされる）と１２か月来院（±２週間）との間で比較することによって評価することになる（図８）。有効性を評価するのにＬＥＥＰを行わないことになるが、１２か月来院時に、ＨＳＩＬが持続する対象に無料で提供されることになる。
【０１７９】
提案した第ＩＩ相治験のデザインは、非盲験、単一施設、及び単一群である。我々は、比較ために、類似したデザインの治験からの歴史的プラシーボ群（すなわち、生検によって診断されたＣＩＮ２／３をもつ対象の登録及び１５か月で生検によって評価される臨床反応）を用いることを計画している［５７］。我々の第Ｉ相治験で試験した最初２つの投与量レベルのうち、５０ｕｇ投与量が最良の臨床反応（６名のうち４名、又は６７％の完全奏効）を示した。歴史的対照群の１１７名のうち３４名（２９％）が退縮を示したので、ワクチン群の２０名の対象数は９０％検出力（α＝０．０５、すそ＝２）をもたせることになると思われる。しかし、６７％の臨床奏効率は少数の対象に基にしたものである。我々が控えめに奏効率は５５％であると見積もった場合、５３名の対象数が必要とされることになると思われる（９０％検出力、α＝０．０５、すそ＝２）。潜在的なスクリーニングの失敗及び試験中止率を考慮して、我々は第ＩＩ相治験に１１０名の対象をスクリーニングし、７０名の対象のワクチン接種する計画である。歴史的プラシーボ群の使用は同時プラシーボ群を用いるほど厳密でない一方で、１２か月間未治療のままであることになると思われる生検によって診断されたＣＩＮ２／３をもつ同時プラシーボ群は倫理的に正当化し難いと思われる。
【０１８０】
１．５．１０  副次評価項目：安全性に関する理論的根拠
ＨＰＶペプチドとキャンディン（登録商標）の混合物は、第Ｉ相治験で最初に試験され、＞グレード２のワクチン関連ＡＥは報告されたことがないので安全と思われる（表２）。第ＩＩ相治験では、ＣＴＣＡＥ４．０３を用いて安全性を同様に評価することになる。
【０１８１】
１．５．１１  三次評価項目：免疫応答及びウイルス排除に関する理論的根拠
１．５．１１．１  ＨＰＶ特異的Ｔ細胞応答の測定に関する理論的根拠
ＨＰＶ特異的ＣＤ３Ｔ細胞応答は、第Ｉ相治験で行われたように、ワクチン接種前、２回のワクチン接種後、及び４回のワクチン接種後に、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイなどの免疫アッセイを用いて評価することになる（図８）。ワクチン有効性でのＣＤ３Ｔ細胞に役割を評価するために、臨床反応及びウイルス排除がＣＤ３Ｔ細胞活性に基づいて予測できるか否かが評価されることになる。
【０１８２】
１．５．１１．２  循環免疫細胞の測定に関する理論的根拠
ＣＤ４Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、及び骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）を含む循環免疫細胞のレベルを、ワクチン接種前、２回のワクチン接種後、及び４回のワクチン接種後に評価することになる。第Ｉ相治験からの予備データは、ＰｅｐＣａｎがＴｈ２応答を減少させ、結果としてエフェクター免疫活性の増加をもたらしうることを示す（図９）。これらの循環免疫細胞のレベルを用いて、臨床反応及びウイルス排除の点でワクチン有効性を予想できるか否かを調べることになる。
【０１８３】
１．５．１１．３  ウイルス排除の測定に関する理論的根拠
ＨＰＶ−ＤＮＡ検査は、スクリーニング来院、６か月来院、及び１２か月来院時に行うことになる（図１０）。これまで、試験参加者全員はスクリーニング来院時に少なくとも１つの型のＨＰＶをもつ。少なくとも１つの型のＨＰＶの排除が、臨床反応と相関すると思われる。第ＩＩ相試験では、スクリーニング来院時に存在するが、６か月来院及び１２か月来院時には存在しない場合に、ＨＰＶの型は排除されたとみなされることになるであろう。
【０１８４】
１．５．１２  他の評価項目に関する理論的根拠：年齢、ＨＬＡタイプ、ＨＰＶ型、プロテオミクス分析結果、サイトカイン／ケモカイン分析結果、及び臨床検査などの様々な因子を用いてワクチン反応を予想する；交差防御を見つけ出し、考えられるメカニズムとしてエピトープ拡大及び交差反応を検討する
ワクチン接種者全員に臨床反応があるとは期待されない。ＨＳＩＬが持続する者がいることもあり、浸潤性扁平上皮癌に進行する者がいることもある。好ましい反応と関連する因子を特定することは価値があると思われ、その結果として、誰がワクチンに反応するはずでるか、外科的治療をすることを決める前にどのくらい待つべきかに関して知識に基づく判断ができる。したがって、システム生物学的なアプローチを採用して、臨床反応及びウイルス排除に関連する因子は決定されうる。
【０１８５】
第Ｉ相治験は、ＰｅｐＣａｎがＨＰＶ１６型及び１６型ではないＨＰＶ型をもつＨＳＩＬに効果的であることを示している。第ＩＩ相治験では、１６型ではないＨＰＶのどの型に対してＰｅｐＣａｎが効果的であるかが決定されうる。さらに、エピトープ拡大及び交差反応は、交差防御の裏の可能なメカニズムとして調べられうる。
【０１８６】
２  目的
主要目的：有効性  ２．１
コルポスコピー誘導下生検を１２か月来院時に得ることによって評価されることになる臨床反応を決定することによって第ＩＩ相治験でのＰｅｐＣａｎの有効性を評価すること。１２か月来院生検の際に、対象にＣＩＮ  ２／３のいずれの兆候がない場合、彼女は「レスポンダー（responder）」とみなされることになる。ＣＩＮ１に退縮する者もいると思われ、異形成がない者もいることもある。１２か月来院時に依然としてＣＩＮ２及び／又は３がある場合、その対象は「非レスポンダー（non-responder）」とみなされることになる。副次的目的：安全性  ２．２
【０１８７】
安全性は、登録時から１２か月来院までＣＴＣＡＥ  ｖ４．０３に従ってＡＥを記録することによって評価することになる。
【０１８８】
三次的目的：免疫応答及びウイルス排除  ２．３
ワクチン接種前、２回のワクチン接種後、及び４回のワクチン接種後、ＨＰＶ特異的ＣＤ３Ｔ細胞応答の点からの免疫学的評価をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて評価することになり、一方で、ＣＤ４、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｒｅｇ、及びＭＤＳＣ細胞の循環レベルをＦＡＣＳ分析によって評価することになる。ウイルス学的評価は、スクリーニング来院、６か月来院、及び１２か月来院時に行なわれことになる。
【０１８９】
他の目的  ２．４
（どの特定の集団の女性がワクチンを受けるべきかや、外科的治療のタイミングを決定するために）ワクチンに対する反応に関する予測因子を評価するために、年齢、ＨＬＡタイプ、ＨＰＶ型、プロテオミクス分析結果、サイトカイン／ケモカイン分析結果、臨床検査結果、予防ＨＰＶワクチン接種、喫煙、経口避妊薬の使用、パップスメアの結果、ＣＩＮグレード（ＣＩＮ２対ＣＩＮ３）、初期バイタルサイン、ボディマス指数、ＨＰＶ１６  Ｅ６に対するＣＤ３Ｔ細胞応答、及び循環免疫細胞などのさまざまなパラメーターが解析されうる。
【０１９０】
臨床反応の点からの交差防御は、試験した３６のＨＰＶ型（１６型以外）の各々についてＨＳＩＬ退縮を示す対象でワクチン接種前に検出される各ＨＰＶ事象を数えることによって決定されうる。
【０１９１】
ウイルス排除の点からの交差防御は、試験した３６のＨＰＶ型の各々についてスクリーニング来院時には存在するが、６か月来院及び１２か月来院時の両方では検出不能になる各ＨＰＶ事象を数え上げることによって決定されうる。
【０１９２】
エピトープ拡大及び交差反応は選択され対象で調べられうる。
【０１９３】
３  治験薬
被験物質  ３．１
３．１．１  ＨＰＶペプチド
ＰｅｐＣａｎは、４つのＨＰＶ１６  Ｅ６ペプチド、つまりＥ６  １〜４５（Ａｃ−ＭＨＱＫＲＴＡＭＦＱＤＰＱＥＲ  ＰＲＫＬＰＱＬＣＴＥＬＱＴＴＩＨＤＩＩＬＥＣＶＹＣＫＱＱＬＬ−ＮＨ２（配列番号２））、Ｅ６  ４６〜８０（Ａｃ−ＲＲＥＶＹＤＦＡＦＲＤＬＣＩＶ  ＹＲＤＧＮ  ＰＹＡ  ＶＣＤＫＣＬＫＦＹＳＫＩ−ＮＨ２（配列番号３））、Ｅ６  ８１〜１１５（Ａｃ−ＳＥＹＲＨＹＣＹＳＬＹＧＴＴＬＥＱＱＹＮＫ  ＰＬＣＤＬＬＩＲＣＩＮＣＱＫ−ＮＨ２（配列番号４））、及びＥ６  １１６〜１５８（Ａｃ−ＰＬＣＰＥＥＫＱＲＨＬＤＫＫＱＲＦＨＮＩＲＧＲＷＴ  ＧＲＣＭＳＣＣＲＳＳＲＴＲＲＥＴＱＬ−ＮＨ２（配列番号５））を含有することになる（米国特許第８，６５２，４８２号）。商業的に生産された現行医薬品適正製造基準（ｃＧＭＰ）グレードペプチド（ＣＰＣ  サイエンティフィック社、カリフォルニア州サンノゼ）が試験されることになる。
【０１９４】
４つのペプチドが個々のバイアルに凍結乾燥形態で提供されることになり、輸送中及び使用直前を除いて、−７０℃（許容可能な範囲は−６５℃〜−７５℃）で保存されることになる。
【０１９５】
３．１．２  キャンディン（登録商標）
細胞性過敏症用カンジダ・アルビカンス皮膚試験抗原は、市販薬キャンディン（登録商標）に供給されることになる。バイアルは使用するまで添付文書の指示の通り２℃〜８℃で保存されることになる。この製品は複数回投与に認可されている。本試験の注射１回当たりのキャンディン（登録商標）の投与量は０．３ｍｌである。
【０１９６】
３．１．３  ＨＰＶペプチドとキャンディン（登録商標）の混合
滅菌水を、４つの現行医薬品適正製造基準ペプチドを含有するバイアルに加えることになる。再溶解したペプチドの適量を投与量レベルに応じて注射器に吸い取り、０．３ｍｌのキャンディン（登録商標）を同じ注射器に吸い取ることになる。混合したペプチド−キャンディン（登録商標）混合物は、注射直前まで氷上又は冷蔵庫内に保存すべきである。
【０１９７】
治療レジメン  ３．２
対象は  ＰｅｐＣａｎ（５０〜５００μｇ／ペプチド／注射）の注射を４回、皮内注射で四肢に各注射の間隔を３週間とって受けることになる。
【０１９８】
４  試験デザイン
概要  ４．１
本試験は、生検によって診断されたＨＳＩＬをもつ女性を治療するためのＰｅｐＣａｎの単一群、非盲験、第ＩＩ相治験である。試験デザインはＨＳＩＬをもつ若い女性を治療するための最新のガイドラインによく似ている［１４］。試験参加者は、ＵＡＭＳ産婦人科クリニックに通う、未治療の、生検によって診断されたＨＳＩＬをもつ患者及び他のクリニックから紹介される患者であることになる。４回のワクチン注射（３週間に１回）は、四肢に皮内投与されることになる。臨床反応は、ワクチン接種前と１２か月来院時に得られるコルポスコピー誘導下生検結果を比較することによって評価されることになる。安全性は、登録から１２か月来院まで通してモニターされることになる。臨床検査及び免疫学的分析のために、接種前並びに２回目及び４回目ワクチン接種後に血液を採取することになる（「血液検査」）。Ｔ細胞分析を補助するために、１回目及び３回目ワクチン接種後、並びに出来る限り６か月、１２か月、及び任意ＬＥＥＰ来院時に血液を採取することになる（「採血」）。ＨＰＶ−ＤＮＡ検査は、スクリーニング並びに６か月及び１２か月来院時に行うことになる（図１０）。対象に１２か月来院時に持続するＨＳＩＬがある場合、又は過度の毒性のために対象が治験参加をやめる場合、彼女はＬＥＥＰ来院に戻ってくる選択を与えられることになる。代替的には、彼女は治験参加をやめることを選択し、外科的治療の前に推奨される通り担当医師による最長２年間の観察を続けてもよい［１４］。
【０１９９】
毒性モニタリング  ４．２
重度毒性は、薬物に関連する以下のものとして（ＣＴＣＡＥ  ｖ４．０３を用いて）定義されることになる。
・グレードＩＩ以上のアレルギー反応
グレードＩＩは、「治療介入又は注入中断の適応；対症療法（例えば、抗ヒスタミン剤、ＮＳＡＩＤ、麻薬性鎮痛薬）に即時に反応する；≦２４  時間の予防的薬物治療の適応」として定義される。グレードＩＩＩは、「長期に及ぶ（例えば、対症療法的薬物治療及び／又は注入の短い中断）に対して速やかに反応しない；初期改善に続く症状の再発；臨床的続発症（例えば、腎臓障害、肺浸潤）に適応される入院」として定義される。
・グレードＩＩ以上の自己免疫反応
グレードＩＩは、「非本質的な（non-essential）臓器又は機能に関わる自己免疫反応（例えば、甲状腺機能低下）の兆候」として定義される。グレードＩＩＩは、「主要臓器に関わる自己免疫反応（例えば、大腸炎、貧血、心筋炎、腎臓）」として定義される。
・いずれのグレードＩＩＩ以上の事象
重度の毒性を経験するいずれの対象は試験をやめることになる。
【０２００】
中止規則  ４．３
・いずれかの対象がワクチンに関連するグレードＩＶ又はそれより高いＡＥを経験した場合、試験登録及びワクチン投与は一時中断されることになる。これらの活動は、メディカル・モニター（Medical Monitor）及び適用される規制当局が許可を与えた後のみ再開できる。
・治験依頼者は、どの時点であっても、いかなる理由でも試験をやめる決定をしてよい。
【０２０１】
５  対象登録及び試験期間
５．１．  対象集団、募集、及びインフォームド・コンセントのプロセス
・年齢が１８〜５０歳であって、ＵＡＭＳ産婦人科クリニック及びＡＮＧＥＬＳテレコルポスコピー（Telecolposcopy）プログラムで診察を受け、最近のパップスメアがＨＳＩＬ陽性又は「ＨＳＩＬを除外できない（Cannot rule out HSIL）」の結果である女性が、医師の照会、小冊子、チラシ、ＵＡＭＳウェブサイト、及び治験チームによる口伝えを通して募集されることになる。関心のある潜在的な対象は、治験コーディネーターと連絡を取って試験については話し合うことになる。コーディネーターは、初期組み入れ／除外基準評価を行い、スクリーニング来院ために対象をスケジュールし、同意書書類のコピーを対象が見直せるように送付することになる。
・最近の異常なパップスメアがＨＳＩＬ陽性又は「ＨＳＩＬを除外できない」の結果である他の女性が、クリニックによる照会、小冊子、チラシ（大学構内外で配布）、ＵＡＭＳウェブサイト、並びに新聞広告、ラジオ、及び／又はソーシャルネットワーキングを通して募集されることになる。関心のある潜在的な対象は、治験コーディネーターと連絡を取って試験については話し合うことになる。コーディネーターは、初期組み入れ／除外基準評価を行い、スクリーニング来院ために対象をスケジュールし、同意書書類のコピーを対象が見直せるように送付することになる。コーディネーターは、パップスメアの結果の写しを診療所（physician's office）から入手して、それをスクリーニング来院に持参するように、対象に依頼することになる。
・コルポスコピー誘導下パンチ生検でＨＳＩＬと最近診断された女性（診断日と１回目の接種日の間の期間は≦６０日である必要がある）が、クリニックによる照会、小冊子、チラシ（大学構内外で配布）、ＵＡＭＳウェブサイト、並びに新聞広告、ラジオ、及び／又はソーシャルネットワーキングを通して募集されることになる。関心のある潜在的な対象は、治験コーディネーターと連絡を取って試験については話し合うことになる。コーディネーターは、初期組み入れ／除外基準評価を行い、スクリーニング来院ために対象をスケジュールし、同意書書類のコピーを対象が見直せるように送付することになる。コーディネーターは、異常生検の診療記録の写しを診療所から入手して、それをスクリーニング来院に持参するように、対象に依頼することになる。
【０２０２】
５．１．１  組み入れ基準
・年齢が１８〜５０歳
・最近（≦６０日）のパップスメアの結果がＨＳＩＬと一致した、又はコルポスコピー誘導下生検で、「ＨＳＩＬを除外できない」若しくはＨＳＩＬであった
・ＨＳＩＬ又は「ＨＳＩＬを除外できない」が未治療
・同意書を提供できる
・プロトコールの要件に応諾する意思がある、又は該要件に応諾でき、英語を使いこせる
【０２０３】
５．１．２  除外基準
・免疫抑制（例えば、がん、ＨＩＶ、臓器移植、自己免疫疾患）を引き起こす病歴又は治療歴
・試験参加期間内に妊娠している、又は妊娠しようとしている
・試験参加期間内に授乳している、又は授乳の予定がある
・カンジダ抗原に対するアレルギー
・救急外来受診又は入院を要する重度のぜんそくの病歴
・ベータ遮断薬物治療を現在使用している（アナフィラキシーが起こった場合に、エピネフリンに反応しないことがある）
・子宮頸部の浸潤性扁平上皮癌の病歴
・治験責任医師又は他の治験分担医師に意見により、この試験に参加することが患者の最善の利益にならない場合
【０２０４】
５．１．３  インフォームド・コンセントのプロセス
・潜在的な候補は、スクリーニング来院の前にインフォームド・コンセント用紙を受け取り、試験参加を決めるのに必要な可能な限りの時間を与えられるであろう。
・ＰＩがインフォームド・コンセントに関する説明を行なう権限を与えた治験コーディネーター／治験チームメンバーは、対象候補と試験について詳細に話し合うことになる（米国コルポスコピー・子宮頸部病理学会によって定期的に発表されるガイドラインの年齢特有の基準を含む）。スクリーニング来院の前のどの時点でも、又はスクリーニング来院で訪れる際にＵＡＭＳ婦人科クリニックにて（いずれの治験関連手順前に）、対象がもちうる治験に関する質問のすべてに回答するであろう。説明は英語で行われるであろう。
・コンセントは継続する過程であるので、対象らは、各治験来院時の試験手順前に、依然として試験に参加することを望むか否かを尋ねられるであろう。
【０２０５】
登録のペース  ５．２
第Ｉ相試験の間に、登録した対象の約３分の２がワクチン接種に適格とされた。スクリーニング失敗率及び試験中止率（現在１年で約５％）を考慮して、我々は、スクリーニングに１１０名の対象を登録し、７０名の対象にワクチン接種を開始する計画である。
【０２０６】
試験期間  ５．３
試験期間は最長で６６か月であろう。ＬＥＥＰ切除が行われる場合、各対象は約１６か月間以上、治験に入っていることが期待される。
【０２０７】
６  治験来院
治験来院のスケジューリング  ６．１
治験コーディネーターは、ＵＡＭＳ産婦人科クリニック及び臨床研究サービスコア（Clinical Research Services Core）（ＣＲＳＣ）の治験来院（スクリーニング、ワクチン接種、６か月、１２か月、及び任意ＬＥＥＰ来院）のスケジュールをたてるであろう。スクリーニング、６か月、１２か月、及び任意ＬＥＥＰ来院は、約９０分間かかることが見込まれる。しかし、クリニックの忙しい日にはそれより長くかかる可能性がある。ワクチン接種来院は約６０分かかると見込まれる。
【０２０８】
治験来院許容期間  ６．２
６．２．１  個々の対象の来院の間隔
・１回目のワクチン接種来院（来院１）は、できるだけスクリーニング来院の結果がすべて入手でき、対象が試験のワクチン接種フェーズの続行に適格とみなされ後、パンチ生検が得られた日（大部分の対象にとってスクリーニング日）から６０日以内にスケジュールすべきである。
・以降のワクチン接種／検査（lab）来院（来院２〜５）は、３週±７日間空けてスケジュールすべきである。
・６か月来院は、４回目の来院の６か月＋２週間後にスケジュールすべきである。
・１２か月来院は、６か月来院の来院の６か月＋２週間後にスケジュールすべきである。
・任意ＬＥＥＰ来院（対象が選択する場合）は、１２か月来院の後又は対象が重度毒性のために治験参加をやめた後、できるだけ早くスケジュールすべきである。
【０２０９】
スクリーニング来院  ６．４
６．４．１  スクリーニング来院の手順
・組み入れ基準／除外基準を再確認する
・（それまでに得ていない場合）同意書を得る
・来院中に「対象連絡先情報」（付属書類２）を対象に記入してもらう
・来院中に「スクリーニング来院調査票」（付属書類３）を対象に記入してもらう
・人口統計学的情報を得る
・対象の既往歴を得る
・病歴：これまでの異常パップスメアの病歴と、それをどのように治療したかを必ず尋ねる
・薬物アレルギー
・併用薬
・身体検査を行う
・バイタルサインを得る
血圧（＜２００／１２０ｍｍＨｇが許容可能）
・心拍数（５０〜１２０ｂｐｍが許容可能）
・呼吸数（＜２５ｂｐｍが許容可能）
・体温（＜１００．４°Ｆ）
・体重（制限無し）
・妊娠可能性のある対象について
・ワクチンを受けている間の妊娠に関わるリスクについて説明する
・ワクチン治験に参加する間にどの避妊方法を使用することを考えているかを尋ねる。ＦＤＡに認可されている形態として、殺菌、インプラントロッド（implantable rod）、ＩＵＤ、注射（shot）／注射（injection）、経口避妊薬、バリア法（膣リング、コンドーム、ペッサリー、子宮頸部キャップ）、及び緊急避妊が挙げられる。
・コルポスコピーを行う
・ＨＰＶ−ＤＮＡ検査のためのシンプレップを得る
・医師が必要と判断する場合、パンチ生検及び子宮頸管内膜掻爬を得る（適格であるためにＨＳＩＬが確認される必要がある）
・病変領域をコルポスコピーで見ることができない場合、医師は四半部盲目生検を得ることがある
・病変、子宮頸部上での位置を記録する、（利用可能な場合）コルポスコープ付き画像取得システムを用いて子宮頸部の画像を撮る、どこで生検が採られたかを示す
・いくつの子宮頸部四半部で病変を見ることができるかを記録する
・対象が生検ですでにＨＳＩＬと診断されている場合、再度行う必要はない。しかし、コルポスコピーを再度行って、病変部位を記録し、ＨＰＶ−ＤＮＡ検査のためのシンプレップを採ることがある。
・ＣＢＣ、肝機能、及び腎機能用のチューブ採血（ＵＡＭＳ臨床検査室で行われる）
【０２１０】
接種来院（来院１〜５）６．５
６．５．１  来院１に関する手順
・最終来院以降に何らかの投薬治療を開始又は中止したかを尋ねる
・ワクチン接種前尿妊娠検査
・身長と体重を測定してＢＭＩを求める
・接種前にバイタルサインをとる
・以下のための採血することになる
・免疫モニタリング（Immunomonitoring）及び他の分析（６〜８本の１０．０ｍｌ容緑色ゴムキャップヘパリンナトリウムチューブ）
・ＣＢＣ（１本の３．０ｍｌ容紫色キャップＥＤＴＡチューブ、ＵＡＭＳ臨床検査室で行われる）
・肝パネル及び腎パネル（２本の４．５ｍｌ容淡緑色キャップリチウムヘパリンチューブ、ＵＡＭＳ臨床検査室で行われる）
・ワクチンを注射投与する
・注射後少なくとも３０分が経過した後のバイタルサインを再度とる
・あらゆる即時有害反応をモニターする
・イブプロフェン又はナプロキセンの投与を提供する
・「対象日記（Subject Diary）」（付属書類４）を手渡し、対象に記入して、次回来院時に持ってくるよう依頼する
【０２１１】
６．５．２  来院２に関する手順
・記入した「対象日記」を求める。対象がそれを返さなかった場合、「最後の接種以来なにか副作用を経験したか」を尋ねる。
・最終来院以降に何らかの投薬治療を開始又は中止したかを尋ねる
・ワクチン接種前尿妊娠検査
・接種前のバイタルサインをとる
・以下のために採血されることになる
・免疫モニタリング及び他の分析（６〜８本の１０．０ｍｌ容緑色ゴムキャップヘパリンナトリウムチューブ）
・ワクチンを注射投与する
・接種後少なくとも３０分経過後のバイタルサインを再度とる
・あらゆる即時有害反応をモニターする
・イブプロフェン又はナプロキセンの投与を提供する
・「対象日記」（付属書類４）を手渡し、対象に記入して、次回来院時に持ってくるよう依頼する
【０２１２】
６．５．３  来院３に関する手順
・記入した「対象日記」を求める。対象がそれを返さなかった場合、「最後の接種以来なにか副作用を経験したか」を尋ねる。
・最終来院以降に何らかの投薬治療を開始又は中止したかを尋ねる
・ワクチン接種前尿妊娠検査
・接種前のバイタルサインをとる
・以下のために採血されることになる
・免疫モニタリング及び他の分析（６〜８本の１０．０ｍｌ容緑色ゴムキャップヘパリンナトリウムチューブ）
・ＣＢＣ（１本の３．０ｍｌ容紫色キャップＥＤＴＡチューブ、ＵＡＭＳ臨床検査室で行われる）
・肝パネル及び腎パネル（２本の４．５ｍｌ容淡緑色キャップリチウムヘパリンチューブ、ＵＡＭＳ臨床検査室で行われる）
・ワクチンを注射投与する
・注射後少なくとも３０分が経過した後のバイタルサインを再度とる
・イブプロフェン又はナプロキセンの投与を提供する
・あらゆる即時有害反応をモニターする
・「対象日記」（付属書類４）を手渡し、対象に記入して、次回来院時に持ってくるよう依頼する
【０２１３】
６．５．４  来院４に関する手順
・記入した「対象日記」を求める。対象がそれを返さなかった場合、「最後の接種以来なにか副作用を経験したか」を尋ねる。
・最終来院以降に何らかの投薬治療を開始又は中止したかを尋ねる
・ワクチン接種前尿妊娠検査
・接種前のバイタルサインをとる
・以下のために採血されることになる
・免疫モニタリング及び他の分析（６〜８本の１０．０ｍｌ容緑色ゴムキャップヘパリンナトリウムチューブ）
・ワクチンを注射投与する
・接種後少なくとも３０分経過後のバイタルサインを再度とる
・あらゆる即時有害反応をモニターする
・イブプロフェン又はナプロキセンの投与を提供する
・「対象日記」（付属書類４）を手渡し、対象に記入して、次回来院時に持ってくるよう依頼する
【０２１４】
６．５．５  来院５に関する手順
・記入した「対象日記」を求める。対象がそれを返さなかった場合、「最後の接種以来なにか副作用を経験したか」を尋ねる。
・以下のために採血されることになる
・免疫モニタリング及び他の分析（６〜８本の１０．０ｍｌ容緑色ゴムキャップヘパリンナトリウムチューブ）
・ＣＢＣ（１本の３．０ｍｌ容紫色キャップＥＤＴＡチューブ）
・肝パネル及び腎パネル（２本の４．５ｍｌ容淡緑色キャップリチウムヘパリンチューブ）
【０２１５】
６か月来院  ６．６
６か月来院は、ワクチン接種４の約６か月（±２週間）後にスケジュールされることになる。
【０２１６】
６．６．１  ６か月来院に関する手順
・最後の来院以降に何らかの投薬治療を開始又は中止したかを尋ねる
・コルポスコピーを行う
・ＨＰＶ−ＤＮＡ検査のためのシンプレップを得る
・病変、子宮頸部上での位置を記録する、（利用可能な場合）コルポスコープ付き画像取得システムを用いて子宮頸部の画像を撮る、
・いくつの子宮頸部四半部で病変を見ることができるかを記録する
・医師が必要と判断する場合（進行性疾患の疑いがある場合のみ）、パンチ生検及び子宮頸管内膜掻爬を得る
・ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果に基づいて、何名かの対象は、さらに交差反応、エピトープ拡大、及び／又は新規Ｔ細胞エピトープの特徴付けについて調べられることになる。採血が行なわれることになる
・６〜８本の１０．０ｍｌ容緑色ゴムキャップヘパリンナトリウムチューブ
【０２１７】
１２か月来院  ６．７
１２か月来院は、６か月来院の約６か月（±２週間）後にスケジュールされることになる。６．７．１  １２か月来院に関する手順
・身体検査を行う
・バイタルサインを得る
・血圧
・心拍数
・呼吸数
・体温
・体重
・最後の来院以降に何らかの投薬治療を開始又は中止したかを尋ねる
・コルポスコピーを行う
・ＨＰＶ−ＤＮＡ検査のためのシンプレップを得る
・病変、子宮頸部上での位置を記録する、（利用可能な場合）コルポスコープ付き画像取得システムを用いて子宮頸部の画像を撮る
・いくつの子宮頸部四半部で病変を見ることができるかを記録する
・パンチ生検及び出来る限り子宮頸管内膜掻爬を得る
・医師が必要と判断した場合、子宮頸管内膜掻爬術を行う
・上記で説明したように以下のために何名かの対象から採血することがある
・免疫モニタリング及び他の分析（６〜８本の１０．０ｍｌ容緑色ゴムキャップヘパリンナトリウムチューブ）
・来院中に「１２か月来院調査票」（付属書類７）を対象に記入してもらう
【０２１８】
６．７．２  １２か月来院の追跡調査
治験コーディネーター及び治験責任医師又は共同治験分担医師（Co-Investigator）は、１２か月来院の情報及び試験結果をすべて精査することになる。生検でＨＳＩＬの兆候がない場合、対象は試験を完了することになる。持続するＨＳＩＬがある場合、対象は、（１）ＬＥＥＰの前にさらに１年間、自身のかかりつけの婦人科医に診てもらうか、又は（２）試験の一部としてＬＥＥＰを受けるかを選択してよい。
【０２１９】
任意ＬＥＥＰ来院  ６．８
６．８．１  ＬＥＥＰ来院の手順
・上で説明したように以下のために数名の対象が採血されうる。
・免疫モニタリング及び他の分析（６〜８本の１０．０ｍｌ容緑色ゴムキャップヘパリンナトリウムチューブ）
・ＬＥＥＰ生検を行なう
・ＨＰＶ−ＤＮＡ検査のためのシンプレップ検査試料を得る
・可視病変を摘出するか、可視病変が見られない場合、生検を１２か月来院時に得た領域から摘出する
【０２２０】
８  評価項目
臨床評価（ＵＡＭＳ臨床検査室）８．１
臨床反応はスクリーニングからのパンチ生検結果（ＨＳＩＬに罹患していることは組み入れ基準である）を１２カ月来院時に行なうパンチ生検と比較することによって（病理学科所属病理学者によって）評価されることになる。対象は、１２カ月生検がＨＳＩＬ陰性（ＣＩＮ２／３の兆候無し）である場合、「レスポンダー」とみなされ、生検がＨＳＩＬ（ＣＩＮ２及び／又は３）を示す場合、「非レスポンダー」とみなされることになる。
【０２２１】
ウイルス学的試験  ＨＰＶ−ＤＮＡ検査（中川研究室（Nakagawa Laboratory））８．２
シンプレップ試料をＨＰＶ−ＤＮＡの有無について検査することになる。「リニアアレイ  ＨＰＶジェノタイピングテスト」（ロシュ・モレキュラー・ダイアグノスティックス社、カリフォルニア州アラメダ）などの市販のキットを使用してよい。このキットは、３７のＨＰＶ型（６型、１１型、１６型、１８型、２６型、３１型、３３型、３５型、３９型、４０型、４２型、４５型、５１型、５２型、５３型、５４型、５５型、５６型、５８型、５９型、６１型、６２型、６４型、６６型、６７型、６８型、６９型、７０型、７１型、７２型、７３型、８１型、８２型、８３型、８４型、ＩＳ３９型、及びＣＰ６１０８型）についてテストする。また、ヒトベータ−グロビンシグナルを、各試料のＤＮＡ含有量の試料妥当性のための陽性対照としてアッセイすることになる。陽性対照試料（ＨＰＶプラスミドＤＮＡ及びプラスミドにコードされたヒトベータ−グロビン遺伝子を加えて含む）並びに陰性対照試料（ＨＰＶプラスミドＤＮＡもヒトベータ−グロビン遺伝子も無し）が製造業者によって供給され、各実験に含まれることになる。ＨＰＶ３１型、３３型、３５型、５２型、５８型、及び６７型は、「ＨＰＶ１６型関連」とみなされ、さらにＨＰＶ１８型、３９型、４５型、５１型、５３型、５６型、５９型、６６型、６８型、６９型、７０型、７３型、及び８２型は、「ハイリスク」とみなされ、６型、１１型、４０型、４２型、５４型、６１型、６２型、７１型、７２型、８１型、８３型、８４型、及びＣＰ６１０８型は、「ローリスク」とみなされることになる［５８］。
【０２２２】
ウイルス学的反応は、ワクチン接種前後のＨＰＶ−ＤＮＡ検査結果を比較することによって評価することになる。ワクチン接種前に存在する少なくとも１つのＨＰＶ型が６か月来院及び１２か月来院時の両方で検出不可になる場合、対象は「クリヤラー（clearer）」とみなされることになる。そうでなければ、少なくとも１つのＨＰＶ型のベースラインで検出される限り、対象は「パーシスター（persistor）」とみなされることになる。
【０２２３】
免疫学的評価  ８．３
８．３．１  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（中川研究室）
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイなどのＨＰＶ特異的Ｔ細胞の有無を評価する免疫アッセイを行なうことになる。各採血の後、ＰＢＭＣをＣＤ１４＋集団とＣＤ１４−集団に分離し、凍結保存することになる。アッセイ間のばらつきをなくすために、３つの血液試料（ワクチン接種前、２回のワクチン接種後、及び４回のワクチン接種後）をすべて使用してＴ細胞株を確立し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行うことになる。インビトロで磁気的に選択したＣＤ３細胞を、ＨＰＶ１６  Ｅ６−ｖａｃ、Ｅ７−ｖａｃ、Ｅ６−ＧＳＴ、及びＥ７−ＧＳＴに曝した自己由来の成熟樹状細胞で刺激することによってＣＤ３Ｔ細胞株を確立することになる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは以前に記載されたように行なうことになる［２８］。我々は典型的に、ＨＰＶ１６  Ｅ６及びＥ７タンパク質内の１６領域（Ｅ６  １〜２５、Ｅ６  １６〜４０、Ｅ６  ３１〜５５、Ｅ６  ４６〜７０、Ｅ６  ６１〜８５、Ｅ６  ７６〜１００、Ｅ６  ９１〜１１５、Ｅ６  １０６〜１３０、Ｅ６  １２１〜１４５、Ｅ６  １３６〜１５８、Ｅ７  １〜２５、Ｅ７  １６〜４０、Ｅ７  ３１〜５５、Ｅ７  ４６〜７０、Ｅ７  ６１〜８５、及びＥ７  ７６〜９８）を調べる。十分な細胞が入手可能である場合、アッセイは３連で行われることになる。ワクチン接種前と２回の接種後又は４回の接種後の各領域を比較するために、以前に記載されているように［５９］、対応のある標本のｔ検定を行うことになる。したがって、各対象を、２回の接種後又は４回の接種後のＴ細胞応答のスチューデントの対応のあるｔ検定を用いて決定された統計的に有意な増加を伴う領域の数の点から評価することになる。残りのＣＤ３Ｔ細胞を使用して、他のハイリスクＨＰＶ型由来の相同エピトープの認識の評価、新規のエピトープの説明、及び／又はそのようなエピトープの内部プロセシングの評価を行なってもよい。
【０２２４】
８．３．２  免疫細胞の測定
８．３．２．１  循環免疫細胞（中川研究室）
また、来院１、来院３、及び来院５時の採血からの少量のＰＢＭＣ（約３×１０６個の細胞）を使用してＴｒｅｇ及びＭＤＳＣなどの循環免疫細胞のレベルをモニターし、ワクチン接種がそれらのレベルを減少させうるか否かを評価することになる［６０］。フローサイトメトリーを使用してＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋（Ｔｒｅｇ）及びＣＤ１４＋ＨＬＡ−ＤＲ−／ｌｏｗ  （ＭＤＳＣ）細胞の数を決定することになる［２９、６１］。Ｔｂｅｔ（Ｔｈ１）、ＧＡＴＡ３（Ｔｈ２）、及び／又はＲＯＲガンマＴ（ＴＨ１７）陽性細胞も調べてもよい。循環免疫細胞の数は、ワクチン接種前、２回の接種後、及び４回の接種後に決定することになる。
【０２２５】
８．３．２．２  子宮頸部免疫細胞（ＵＡＭＳ実験病理学コア（Experimental Pathology Core））
慣用的な病理診断が任意ＬＥＥＰ来院時に得るＬＥＥＰ試料からなされた後、さらなる断面を、ＣＤ３（Ｔ細胞）、ＣＤ４（ヘルパーＴ細胞）、ＣＤ８（細胞傷害性Ｔ細胞）、ＣＤ５６（ＮＫ細胞）、ＣＤ１ａ（抗原提示に重要なランゲルハンス細胞）、ＣＤ２０（Ｂ細胞）、ＣＤ６８（マクロファージ）、ＦＯＸＰ３（Ｔｒｅｇ）、Ｔｂｅｔ（Ｔｈ１）、及びＭａｄＣＡＭ−１（Ｔ細胞浸潤に関与するアドレシン）が陽性のものなどの子宮頸部免疫細胞について調べてもよい。好酸球（Ｔｈ２）も調べてもよい。
【０２２６】
８．３．３  その他
血液試料を用いて行なってワクチン反応を評価しうるさらなる分析としては、ＨＰＶタンパク質に対する抗体産生、サイトカイン応答（中川研究室）、及びタンパク質発現の変化（ＵＡＭＳプロテオミクスコア研究室（Proteomics Core Laboratory））が挙げられる。
【０２２７】
９  データ分析
有効性の評価  ９．１
類似した試験デザイン（すなわち、生検によって診断されたＣＩＮ２／３をもつ対象の登録、及び１５か月で生検によって評価された臨床反応）を含む以前に報告されている試験からの歴史的プラシーボ群を比較のために使用することになる［５７］。治験を完了したワクチン接種者（５０〜６０名の対象と推定される）の奏効率を、２９％（１１７名中３４名）であった歴史的プラシーボ群の奏効率と、フィッシャーの直接確率検定を用いて比較することになる。検出力分析及び対象数の正当な根拠について「主要評価項目に関する理論的根拠：効力」（セクション１．５．９）を参照されたい。安全性の評価：有害事象のまとめ  ９．２
【０２２８】
少なくとも１回のワクチン投与を受けた対象は安全性評価に含まれることになる。表３に示すように結果は表にされるであろう。有害反応の種類、ＣＴＣＡＥグレード、及び反応がワクチン関連か否かが示されるであろう。
【０２２９】
免疫応答及びウイルス排除の評価  ９．３
９．３．１  免疫応答
９．３．１．１  ＨＰＶに対するＣＤ３Ｔ細胞応答
図８のように、ワクチン接種前と、２回又は４回の接種後とで各領域を比較するために、上記の通り対応のある標本のｔ検定を行うことになる。
【０２３０】
ＨＰＶに対するＣＤ３Ｔ細胞応答と臨床反応との相関は、「レスポンダー」及び「非レスポンダー」におけるＥ６に対する統計的に有意な増加を伴う少なくとも１つの領域をもつ多くの対象に関する分割表を作成することによって検討されることになる。フィッシャーの直接確率検定が使用されることになる。
【０２３１】
９．３．１．２  循環免疫細胞
図９に示すように、２回のワクチン接種後及び４回のワクチン接種後のＣＤ４、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｒｅｇ、及びＭＤＳＣなどの循環免疫細胞の％割合の変化をベースラインで比較されることになる。対応のあるｔ検定及び一元配置分散分析を行なって、統計的有意性が決定されることになる。
【０２３２】
循環免疫細胞と臨床反応の相関は検討されることになる。ワクチン接種前試料と４回の接種後の試料との間の循環免疫細胞の％割合の変化は「レスポンダー」と「非レスポンダー」との間で比較されることになる。
【０２３３】
９．３．２  ウイルス排除
ＨＰＶ−ＤＮＡ検査は、スクリーニング、６か月、及び１２か月来院のシンプレップ試料を用いて行なうことになる。
【０２３４】
ＨＰＶに対するＣＤ３Ｔ細胞応答とウイルス学的反応との相関は、「クリヤラー」及び「パーシスター」におけるＥ６に対する統計的に有意な増加を伴う少なくとも１つの領域をもつ多くの対象について分割表を作成することによって検討されることになる。フィッシャーの直接確率検定が使用されることになる。
【０２３５】
循環免疫細胞とウイルス排除の相関は検討されることになる。ワクチン接種前試料と４回の接種後の試料との間の循環免疫細胞の％割合の変化は「クリヤラー」と「パーシスター」との間で比較されることになる。
【０２３６】
試験参加者募集及び保持率に寄与する要因  ９．４
「スクリーニング来院調査票」、「早期中止調査票」、及び」「１２か月来院調査票」に提供されるデータに基づいて、対象募集及び保持率に寄与する要因が評価されうる。フィッシャーの直接確率検定を用いて、フェイスブックの非公開グループ（private group）の使用頻度、試験参加動機などの要因が比較されることになり、又は幼児の有無が試験を離脱した対象と試験を完了した対象の間で比較されることになる。
【０２３７】
臨床反応及びウイルス排除の予測因子  ９．５
プロテオミクスデータは３つの時点で集められることになるので、我々はワクチンに対する特有の動的応答（例えば、増加、減少、Ｕ字型）に関連するタンパク質のクラスタ群を特定し、また、ワクチン反応を予測するタンパク質発現特性も特定するであろう。タンパク質クラスタリングをもともと遺伝子発現マイクロアレイ時系列データ用に開発されたが、プロテオミクスデータへの応用に成功している［６３］ノイズロバスト（noise-robust）クラスタリング法であるＭｆｕｚｚ［６２］を用いて行うことになる。我々は、頻度の高い特定の遺伝子オントロジー（ＧＯ）アノテーションについて試験タンパクのクラスタ群を解析して、ワクチンに対する異なる反応の根本にある原因を解明することになる。プロテオミクスデータにくわえて、我々は、最初に単変量解析によって、次に１０分割交差検証でラッソ（lasso）［６４］を用いる変数選択を含む多変量解析によって、ワクチン反応を予測するための他の変数を解析することになる。コンピューター計算はＲ環境及びＲ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ［６５］環境で行われることになる。ラッソを用いる変数選択はパッケージｇｌｍｍＬａｓｓｏを用いて実行されることになる一方で、遺伝子オントロジー機能情報（Gene Ontology terms）のエンリッチメント解析はｔｏｐＧＯを用いて行なわれることになる。
【０２３８】
定義  １０．１
１０．１．１  有害事象
有害事象は、ワクチンの使用と時間的に関連する、望ましくない又は意図されない兆候、症状、又は疾患のいずれの発生又は悪化であり、有害事象共通用語規準（Common Terminology Criteria for Adverse Events）（ＣＴＣＡＥ）第４．０３版に従ってグレードが類別されることになる。局所及び／又は全身有害事象としては、かゆみ、灼熱感（burning）、痛み、皮膚剥離、発疹、毛細血管性出血、発赤、圧痛、瘢痕化、発熱、吐き気、目まい、及び喘鳴が挙げられうる。対象は接種後に、適切な用量に従う鎮痛剤（イブプロフェン又はナプロキセンなど）の使用が許可され、鎮痛剤の提供を受け、起こりうるいずれの有害事象を制限することになる。いずれの有害事象も検討され、ワクチンと関連するか関連しないかを判断されることになる。当てはまる事象はすべて、ＩＲＢポリシー１０．２に従ってＩＲＢに、及び２１  ＣＦＲ  ３１２．３２に従ってＦＤＡに報告されることになる。
【０２３９】
１０．１．２  重篤有害事象
重篤有害事象は以下のいずれかの医療事象である。
・死亡の転帰をとる
・生命への差し迫った脅威である
・入院が必要若しくは現在の入院の延長
・先天性異常若しくは先天障害である、又は
・死の転帰をとらない、生死に関わるものではなく、若しくは入院を必要としない他の重要な医療事象が、適切な医学的判断に基づいて、それらの医療事象が対象を危険にさらすとみなされ、内科的若しくは外科的介入が上記転帰の１つを防ぐのに必要とされる場合には、重篤有害事象とみなされることがある。
【０２４０】
実施例４の参考文献
【０２４１】
【表１４】
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【０２４２】
【表１５】
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【０２４３】
【表１６】
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【０２４４】
【表１７】
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【０２４５】
【表１８】
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【０２４６】
【表１９】
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【０２４７】
【表２０】
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【０２４８】
【表２１】
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【０２４９】
【表２２】
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【０２５０】
【表２３】
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【０２５１】
【表２４】
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【０２５２】
【表２５】
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【０２５３】
【表２６】
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【０２５４】
【表２７】
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【０２５５】
【表２８】
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【０２５６】
【表２９】
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【０２５７】
【表３０】
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【０２５８】
引用された出版物、特許、及び特許文献はすべて、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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