(57)【要約】  合成ＦＭＤペプチド免疫原及びそれを含む組成物を開示する。合成ＦＭＤペプチド免疫原を用いて動物のＦＭＤ感染を検出し、処置し、予防する方法も開示する。具体的な態様として、口蹄疫に対するペプチドベースの緊急ワクチン及びその製剤を記述する。種々のワクチン製剤は、ＦＭＤＶ  ＶＰ１タンパク質由来のペプチドの混合物を含み、各ペプチドは、人工的Ｔｈエピトープと結合するＢ細胞ＦＭＤＶ中和／受容体結合エピトープ配列を含み、各ペプチドの免疫原性を高める。ウイルス性免疫原を含む、開示するワクチン製剤は、任意に、ＦＭＤＶタンパク質、及びそのホモログ並びに機能的な類似体由来のＦＭＤＶ内因性Ｔｈエピトープを表すペプチドの混合物で、任意に補充されてもよい。そのようなウイルス性ペプチド組成物を、ワクチン製剤として、許容可能なデリバリシステム内で調製し、ＦＭＤＶ負荷による感染から、単回投与のみでブタ及びウシの保護をもたらすことができる。
2016501850.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＦＭＤＶ  ＶＰ１ループ状Ｂ細胞エピトープ配列及びＴｈエピトープ配列を有する合成免疫原性ペプチド；
ｂ）合成ＦＭＤＶヘルパーＴエピトープ配列を有する別のペプチド；及び
ｃ）獣医学上許容可能なデリバリビヒクル又はアジュバント；
を有する口蹄疫（ＦＭＤ）ワクチン組成物であって、
（ａ）の合成免疫原性ペプチドは、
ｉ）配列番号１又は２；
ｉｉ）  （ａ）のホモログ；及び
ｉｉｉ）  （ａ）又は（ｂ）の任意の組合せ；
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、上記組成物。
【請求項２】
（ａ）の合成免疫原性ペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有する請求項１記載のＦＭＤワクチン。
【請求項３】
（ａ）の合成免疫原性ペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を有する請求項１記載のＦＭＤワクチン。
【請求項４】
（ｂ）のホモログが、配列番号３〜２３からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する、配列番号２のホモログである請求項１記載のＦＭＤワクチン。
【請求項５】
（ａ）の合成免疫原性ペプチドが、Ｔｈエピトープ配列のカルボキシ末端で共有結合する請求項１記載のＦＭＤワクチン。
【請求項６】
Ｔｈエピトープ配列が配列番号２４である請求項５記載のＦＭＤワクチン。
【請求項７】
ヘルパーＴエピトープが、イプシロンリジン残基を有するスペーサを介してペプチド抗原と共有結合する請求項５記載のＦＭＤワクチン。
【請求項８】
（ａ）の合成免疫原性ペプチドが、配列番号２５〜３３及びその組合せからなる群から選ばれる請求項５記載のＦＭＤワクチン。
【請求項９】
（ｂ）のＦＭＤＶヘルパーＴエピトープペプチドが、配列番号３４〜９５及びその組合せからなる群から選ばれる請求項５記載のＦＭＤワクチン。
【請求項１０】
（ａ）のペプチド抗原の全量が、投与当たり約１０μｇ〜約１ｍｇである請求項１記載のＦＭＤワクチン。
【請求項１１】
デリバリビヒクル又はアジュバントが、モンタニド（Montanide）ISA 50V、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、エマルシゲン（Emulsigen）、エマルシゲンＤ（Emulsigen D）及びＣｐＧオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれる請求項１記載のＦＭＤワクチン。
【請求項１２】
（ａ）の合成免疫原性ペプチドが、配列番号２５、２７、２８、２９、及び／又はその組合せである請求項８記載のＦＭＤワクチン。
【請求項１３】
（ｂ）のＦＭＤＶヘルパーＴエピトープペプチドが、配列番号３４〜６３、９０、及び／又はその組合せである請求項９記載のＦＭＤワクチン。
【請求項１４】
（ａ）の合成免疫原性ペプチドが、配列番号２５、２７、２８、２９及び／又はその組合せであり、（ｂ）のＦＭＤＶヘルパーＴエピトープペプチドが、配列番号３４〜６３、９０、及び／又はその組合せである請求項１記載のＦＭＤワクチン。
【請求項１５】
医薬上有効量の請求項１４記載のワクチンを動物に単回投与することを有する、動物の免疫反応を引き出す方法。
【請求項１６】
動物がブタである請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
医薬上有効量の請求項１４記載のワクチンを動物に単回投与することを有する、ＦＭＤ感染から動物を保護する方法。
【請求項１８】
動物がブタである請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）の合成免疫原性ペプチドが、配列番号２５、２７、２８、２９、３１、及び／又はその組合せである請求項８記載のＦＭＤワクチン。
【請求項２０】
医薬上有効量の請求項１９記載のワクチンを動物に単回投与することを有する、動物の免疫反応を引き出す方法。
【請求項２１】
動物が雌ウシである請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
医薬上有効量の請求項１９記載のワクチンを動物に単回投与することを有する、ＦＭＤ感染から動物を保護する方法。
【請求項２３】
動物が雌ウシである請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）の合成免疫原性ペプチドが、配列番号２６、３０、３２、３３、及び／又はその組合せである請求項８記載のＦＭＤワクチン。
【請求項２５】
（ｂ）のＦＭＤＶヘルパーＴエピトープペプチドが、配列番号９１〜９５、及びその組合せである請求項９記載のＦＭＤワクチン。
【請求項２６】
（ａ）の合成免疫原性ペプチドが、配列番号２６、３０、３２、３３、及び／又はその組合せであり、（ｂ）のＦＭＤＶヘルパーＴエピトープペプチドが、配列番号９１〜９５、及びその組合せである請求項１記載のＦＭＤワクチン。
【請求項２７】
医薬上有効量の請求項２６記載のワクチンを動物に単回投与することを有する、動物の免疫反応を引き出す方法。
【請求項２８】
動物が雌ウシである請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
医薬上有効量の請求項２６記載のワクチンを動物に単回投与することを有する、ＦＭＤ感染から動物を保護する方法。
【請求項３０】
動物が雌ウシである請求項２９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、口蹄疫（ＦＭＤ）の制御のための口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）に対する合成ペプチドベースの緊急ワクチン及びその製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
口蹄疫（ＦＭＤ）は、最も伝染性の強い、動物の疾病である。病原体である口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）は、ピコルナウイルス科のアフトウイルスであり、４種のカプシドタンパク質（ＶＰ１〜ＶＰ４）及び非構造ポリペプチド（２Ａ〜２Ｃおよび３Ａ〜３Ｄ）をコードするプラスセンスＲＮＡゲノムを有する（Carrillo,C.et al,2005による概説）。
【０００３】
ＦＭＤＶは迅速に複製し、感染動物および接触感染性（in-contact susceptible）動物、例えばウシ、ブタ、ヒツジ、およびヤギのような偶蹄類の間で空気を介して広がり得る（空気感染性）。ＦＭＤは、国際獣疫事務局（Office International des Epizooties：ＯＩＥ）によるリストＡの動物感染症であり、動物および動物製品の貿易で最も重要な制約として認識されている。現在、ＦＭＤは、感染及び曝露した動物を隔離および破棄することによって、及び多くの国では、化学的に不活化されたウイルス組成物を用いたワクチンを接種することによって、制御されている。ＦＭＤが存在することにより経済的な悪影響をもたらすため、この疾病が発生していない国では、この状態をワクチン接種なしで維持するために幾つかの手段を講じている。
【０００４】
ＦＭＤＶの異なる７種の血清型が報告されており、それぞれの血清型はさらに複数の亜型に分類される。これらの血清型には、Ａ、Ｏ、Ｃ、Ａｓｉａ、ならびに南アフリカ型ＳＡＴ−１、２および３があり、Ａ、ＯおよびＡｓｉａが最も一般的である。ウイルスの遺伝的複雑性および遺伝的変異性に加え、ＦＭＤＶは高率で無秩序に変異することができる。
【０００５】
ＦＭＤＶのワクチンを処方する上で著しく困難なこととして、ウイルスの抗原性が非常に多様であり、血清型の間で交叉反応がないことが挙げられる。即ち、ある１種の血清型のウイルスに対するワクチンを接種したか、又はこのウイルス感染から回復した動物は、残り６種の血清型のウイルスに感染する可能性がある。また、血清型内での抗原変異の程度は、ある１種の亜型に対して有効なワクチンが、同じ血清型内での他の亜型を防御し得ないほどである。
【０００６】
現在のＦＭＤワクチンは、各々関連性のある血清型または亜型それぞれの参照株を含む不活化ウイルスの混合物を含み、該血清型又は亜型は局所循環に存在するウイルス株をモニターすることにより測定される。新興ＦＭＤ変異型の大流行を阻止するために、野生単離株（field isolates）を定期的にモニターし、現在産生されているワクチンと比較する必要がある。このように、ワクチンが最新かつ有効であることを保証するために、不活化ＦＭＤウイルスワクチンの産生には以下の事項が要求される。（１）ワクチンに含まれる幾つかのウイルス株を増殖させ、かつ不活化すること、（２）各不活化株の効力および有効性をモニターすること、および（３）ワクチン製品を定期的に再処方し、新興株が含まれるようにし、新しい変異型の出現によって保護効率が失われることを阻止すること。
【０００７】
ＦＭＤＶ血清型同士における著しい抗原変異を鑑みると、効果的な不活化ウイルスワクチンを産生かつ維持することは厄介で、複雑なことである。不活化ＦＭＤＶワクチンに関する既知の幾つかの問題及び不都合として、バイオハザードリスク及びバイオセキュリティーリスク、製品の不安定性及びバラツキ、並びに処置される動物における意図されない有害な副作用が挙げられる。
【０００８】
例えば、不活化ウイルスワクチンの製造によってバイオハザードリスク／バイオセキュリティーリスクがもたらされることから、ウイルスは、周辺環境の汚染を阻止するための高度な封じ込め施設内で産生しなければならない。加えて、不活化ウイルス製品が完全に無害であるとは保証できない。事実、欧州における最近の幾つかのＦＭＤＶの事例は、完全に不活化されていないウイルスにまで突き詰められた。これらの潜在的なバイオハザードリスク／バイオセキュリティーリスクにより、正規のワクチン供給業者の数は少数に限定されている。このような制限は、ある地域での大流行に対する効果的かつ緊急な対応の妨げとなり得る。
【０００９】
現在のＦＭＤワクチンは、製品の不安定性と共にロット間のバラツキにも、悩まされている。上述したように、ＦＭＤＶの現在の株と新興株の両方を含むように、ワクチンをモニターし、定期的に再処方しなければならない。また、世界の各地域は、ＦＭＤＶの異なる現在の株／新興株から、ある時間で、保護されることを要求するであろう。このように、不活化ウイルスワクチンの複雑かつ定義されていない組成物が世界中で産生されている。不活化ウイルスワクチンのこれらの複雑な混合物を、一定の間隔をおいて継続的に検査し、免疫効力（immunopotency）を確実化しなければならない。
【００１０】
上記の問題に加え、現在のＦＭＤＶワクチンは、処置される動物に意図されない有害な副作用を引き起こすことが知られている。例えば、現在のワクチンによって処置した動物における、アレルギー反応、アナフィラキシーショックおよび自然死についての報告がなされている。
【００１１】
現存する不活化ウイルスライセート（lysate）ベースの市販ワクチンに不都合な点があったため、安全で、より良く定義されたサブユニット製品を作り出すための研究が奨励された（Brown,F.1992）。しかしながら、このようなサブユニット製品が不活化ウイルスの代替として許容されるためには、不活化ウイルスワクチンと同等の免疫原性を有し、抗原変異体に対する広い防御スペクトルを提供しなければならない。最も重要なこととして、サブユニット製品がＦＭＤ緊急ワクチンに適するためには、ワクチン単回投与後に、負荷試験に対するＯＩＥの指針を満たすことが挙げられる。
【００１２】
現存する市販のウイルスライセートベースのＦＭＤワクチンにみられる幾つかの問題点を克服するために、本発明者とその研究チームは、過去１５年間、合成ペプチドベースのＦＭＤＶワクチンの開発において大きな進歩を遂げ、ＦＭＤＶを負荷したブタを保護している。特に本発明者は、最適化したＶＰ１ループＢ細胞エピトープペプチドを含む製剤を用いて、ＦＭＤＶに対する中和抗体を広範囲に誘発可能な、効果的なＦＭＤＶワクチンの開発に成功した。このＶＰ１ループＢ細胞エピトープペプチドの免疫原性は、該ペプチドを人工のヘルパーＴエピトープへ共有結合させることによってさらに増強可能である（Wang, CY and Shen, M, 2000；Wang, CY et al, 2001；Wang, CY, et al, 2002）。このワクチンは、製剤を複数回投与した後に、ＦＭＤＶ負荷からブタを効果的に保護することが示された（Wang, CY, et al. 2002）。ＶＰ１ループＢ細胞エピトープペプチド製剤は、古典的なＦＭＤＶウイルス株から動物を保護する上で重要なワクチンであることが証明されている。
【００１３】
製剤がＯＩＥプロトコルに従った「緊急」ＦＭＤワクチンに適するためには、単回投与のみで、ＦＭＤ血清型の抗原性を広くカバーする防御免疫を迅速に誘導しなければならない。ＶＰ１ループＢ細胞エピトープペプチド製剤の複数回投与によって古典的ＦＭＤＶウイルス株からは効果的に保護されるが、該製剤の緊急時の単回投与では、ブタをＦＭＤＶ負荷から保護することはできなかった。加えて、ＶＰ１ループＢ細胞エピトープペプチド製剤が、１回または２回の投与後に、ウシをＦＭＤＶ負荷から保護することは示されていない（Rodriguez, LL. et al. 2003）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ＦＭＤＶに対する緊急的および一般的な防御のための、安全で有効な、ペプチドベースのＦＭＤワクチンおよびその製剤が開発できるように、パブリックドメイン内の文献を広範囲に探索し、ＦＭＤ緊急ワクチンに必要とされる防御免疫反応との関連を同定し、検証することが緊急に必要とされている。
【００１５】
ＦＭＤに対して現在利用可能なワクチンの不都合および制限に鑑みると、単回投与のみでブタおよびウシをＦＭＤＶから保護できる緊急ワクチン製剤がなお緊急に必要とされている。
【００１６】
参考文献
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【課題を解決するための手段】
【００１７】
発明の簡単な説明
本開示は、動物における口蹄疫（ＦＭＤ）の検出、処置、及び／又は予防に有用な合成ペプチドを対象とする。本開示の合成ペプチドは、動物におけるＦＭＤ感染を高感度かつ特異的に検出するために用いることのできるペプチド抗原を包含する。該合成ペプチドは、Ｂ細胞（Ｂ）およびヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープの双方を有するペプチド免疫原も含み、それらは共に作用してＦＭＤ感染に対する防御免疫反応の生成を刺激する。ある態様において、該合成ペプチドは、ペプチド抗原およびペプチド免疫原の双方である。幾つかの態様において、該合成ペプチドを用いて、動物におけるＦＭＤウイルス（ＦＭＤＶ）に対する抗体の存在を検出する。他の態様において、該合成ペプチドを用いて、試験によってＦＭＤＶ陽性であると判定された動物及び／又は試験によってＦＭＤＶ陽性であると判定された動物に曝露された動物を処置する。また、他の態様において、該合成ペプチドを用いて、動物のＦＭＤ感染を予防する。
【００１８】
本開示は、合成ペプチドを含む組成物も対象とする。このような組成物は、動物におけるＦＭＤの検出、処置、及び／又は予防のために用いることができる。ある態様において、該合成ペプチドを含む組成物は、ＦＭＤＶに対する抗体をサンプル中に検出するために用いられる。他の態様において、該合成ペプチドを含む組成物は、動物のＦＭＤ感染を処置及び／又は予防するための医薬組成物である。ある特定の態様において、該医薬組成物を用いて、動物におけるＦＭＤＶに対する免疫応答を誘発する。ある具体的な態様において、該医薬組成物は、ウイルスに曝露した動物のＦＭＤ感染を予防可能なワクチン組成物である。
【００１９】
本開示はまた、動物におけるＦＭＤ感染を検出し、処置し、かつ／または予防するための方法も含む。開示する方法は、本明細書に開示される合成ペプチドおよび合成ペプチドを含む組成物を利用する。
【００２０】
ある態様において、組成物の単回投与後に、該組成物は、ＦＭＤ感染に対する十分かつ適切な防御を有する動物を提供するため、本開示はＯＩＥの指針に従った緊急ワクチンに適する、ペプチドベースの医薬組成物を対象とする。これらの態様において、緊急ワクチンとして使用することができる該医薬組成物は、内在性Ｔ細胞エピトープに由来する、天然ＦＭＤタンパク質上および病原体タンパク質上の抗原部位を模倣したペプチド免疫原を含む。ここに記載する製剤は、標的となるＦＭＤタンパク質に対する機能性抗体を効果的に誘発して、ＦＭＤ負荷からの防御を有する動物を提供する。
【００２１】
様々な態様において、合成ペプチド免疫原は、ＦＭＤＶに対する中和抗体を誘発可能なＢ細胞抗原部位を有するＶＰ１ループペプチド（配列番号１および２）、そのホモログ（例えば配列番号３〜２３、９６〜９９）およびそれらの組合せを含むことができる。
【００２２】
開示するＶＰ１ループペプチドは、ヘルパーＴエピトープ（配列番号２４）も含むことができ、それは、ペプチド抗原のアミノ末端またはカルボキシル末端に共有結合してＢ細胞抗原ペプチド（例えば配列番号２５〜３３、１００〜１０２）の免疫原性を増強する。ある変形として、ペプチド免疫原は、ヘルパーＴエピトープを示すペプチドの混合物を追加され、宿主細胞介在性の免疫を提供する。このようなペプチドは、ＦＭＤＶ  ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂおよび３Ｄタンパク質（例えば配列番号３４〜６３）に由来するヘルパーＴエピトープ、そのホモログおよびその機能性類似体、ならびにライブラリーペプチド（例えば配列番号６４〜８７）およびＵＢＩＴｈ（登録商標）増強カセット内に設計されたＦＭＤＶ  Ｔｈエピトープペプチド（例えば配列番号８８〜９５）に由来するコンビナトリアル配列を包含する。
【００２３】
本開示は、動物におけるＦＭＤＶに対する抗体および細胞介在性免疫応答の両方を誘発する方法も提供する。このような方法により、ＦＭＤＶ抗体フリーである動物に、ＦＭＤＶウイルスを負荷した場合に、ＦＭＤの交差防御が提供される。具体的な態様として、開示する方法は、ＦＭＤＶ  ＢエピトープクラスターペプチドとヘルパーＴエピトープクラスターペプチドとの組み合わせを含む医薬組成物を動物に投与する工程を含む。
【００２４】
本開示は、ＦＭＤ免疫原性ペプチド、これを含有する緊急ワクチン製剤およびワクチン製剤の単回投与のみによって動物をＦＭＤＶ負荷から緊急に保護することが可能なデリバリ系の、低費用での製造および品質管理のための方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本明細書に開示する、ある特定の態様による、ＦＭＤＶタンパク質におけるＢおよびＴｈエピトープの分布及び位置を示した図である。図に同定したタンパク質のアミノ酸の位置は、ＦＭＤＶ  ＯＴａｉｗａｎ９９のゲノム配列に基づく。各遺伝子産物の名称（ＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１＋２Ａ、２Ｂ＋２Ｃ、３Ａ＋３Ｂ１＋Ｂ２、Ｂ３、３Ｃおよび３Ｄ）を同定した後に、コードする各タンパク質の大きさに基づいて長さの異なる白いバーを示す。ＢおよびＴ細胞エピトープもまた、各エピトープの大きさ（アミノ酸の数）および位置（エピトープが由来するタンパク質のアミノ酸番号）に基づいて同定しており、各エピトープは、その最初と最後のアミノ酸およびタンパク質におけるそれらの番号によって表される（例えばＶＰ４：Ｓ２２１−Ｍ２３５は、ＶＰ４タンパク質において、アミノ酸の位置２２１のセリンに始まり、アミノ酸の位置２３５のメチオニンに終わる、長さが１５アミノ酸のＴ細胞エピトープを意味する）。
【図２】本明細書に開示する、ある特定の態様によるワクチン製剤の発見から商品化までの開発過程をフローチャートによって示した図である。
【図３】図３Ａは、ＵＢＩＴｈ（登録商標）ＶＰ１ワクチン（配列番号２５）を２回投与されたウシに由来する中和抗体（ＮＡ）の力価を示すグラフである。ＦＭＤＶフリーである、６〜１２か月齢のウシ１５頭を、０および３週目に免疫した。０週目から６週目まで毎週血清を回収し、各免疫後のＮＡ力価を測定した。  図３Ｂは、ＵＢＩＴｈ（登録商標）ＶＰ１ワクチン（配列番号２５）を２回投与されたブタに由来する中和抗体（ＮＡ）の力価をグラフによって示した図である。ＦＭＤＶフリーである、３〜５週齢のブタ１５頭を、０および３週目に免疫した。０週目から６週目まで毎週血清を回収し、各免疫後のＮＡ力価を測定した。
【図４】図４Ａは、ＶＰ１由来のＢ細胞エピトープ（ＯＣｏｎｓｅｎｓｕｓ  配列番号２５）とＵＢＩＴｈ（登録商標）増強型内在性ＦＭＤＶ  Ｔｈカセットクラスターペプチド（配列番号９０）とを１０：１の重量比で、ＩＳＡ５０Ｖ２油中水（ｗ／ｏ  ５０／５０）乳剤中に投与あたり２７．５μｇ／ｍＬ含むＵＢＩＴｈ（登録商標）ＦＭＤワクチン製剤を単回投与されたブタのＰＢＭＣによって誘導された細胞性免疫応答（ＩＦＮ−γ産生）を示すグラフである。動物からは毎週採血を行い、実施例３に記載するように、ＰＢＭＣがインビトロ（in vitro）でワクチンペプチド抗原に応答して、ＩＦＮ−γ反応を起こす能力を判定した。  図４Ｂは、ＶＰ１由来のＢ細胞エピトープ（ＯＣｏｎｓｅｎｓｕｓ  配列番号２５）とＵＢＩＴｈ（登録商標）増強型内在性ＦＭＤＶ  Ｔｈカセットクラスターペプチド（配列番号９０）とを１０：１の重量比で、ＩＳＡ５０Ｖ２油中水（ｗ／ｏ  ５０／５０）乳剤中に投与あたり２７．５μｇ／ｍＬ含むＵＢＩＴｈ（登録商標）ＦＭＤワクチン製剤を単回投与されたブタのＰＢＭＣによって誘導された細胞性免疫応答（ＩＦＮ−γ産生）（黒四角■）を、免疫していないネガティブコントロール動物（白丸○）と比較したものを示すグラフである。負荷前の２８日目に動物から採血を行い、最終値から０日目のベースライン値を差し引くことによって補正した。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
本開示は、動物における口蹄疫（ＦＭＤ）の検出、治療、及び／又は予防に有用な合成ペプチドを対象とする。本開示の該合成ペプチドはペプチド抗原を含み、該ペプチド抗原を用いて、動物におけるＦＭＤウイルスに対する抗体を高感度かつ特異的に検出することができる。該合成ペプチドは、Ｂ細胞（Ｂ）およびヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープの両方を有するペプチド免疫原も含み、これらは共に作用してＦＭＤ感染に対する防御免疫反応を刺激する。ある態様において、該合成ペプチドはペプチド抗原およびペプチド免疫原の両方である。幾つかの態様において、該合成ペプチドを用いて、動物におけるＦＭＤウイルス（ＦＭＤＶ）に対する抗体の存在を検出する。別の態様において、該合成ペプチドを用いて、試験によってＦＭＤＶの存在が陽性であると判定された動物を処置するか、及び／又は試験によってＦＭＤＶ陽性であると判定された動物に曝露された動物を処置する。さらに別の態様において、該合成ペプチドを用いて、動物におけるＦＭＤ感染を予防する。
【００２７】
本開示は、合成ペプチドを含有する組成物も対象とする。このような組成物を、動物におけるＦＭＤの検出、処置、及び／又は予防のために用いることができる。ある態様において、該合成ペプチドを含有する組成物は、サンプル中のＦＭＤＶの存在を検出するために用いられる。別の態様において、該合成ペプチドを含有する組成物は、動物におけるＦＭＤ感染を処置するか及び／又は予防するための医薬組成物である。ある特定の態様において、該医薬組成物を用いて、動物におけるＦＭＤＶに対する免疫応答を誘発する。ある具体的な態様において、該医薬組成物はワクチン組成物であり、該組成物はウイルスに曝露された動物におけるＦＭＤ感染を予防することができる。
【００２８】
本開示はまた、動物におけるＦＭＤ感染を検出するか、処置するか、及び／又は予防する方法も含む。開示する方法は、合成ペプチド及び本明細書に開示される合成ペプチドを含む組成物を利用する。
【００２９】
ａ．Ｂ細胞エピトープ−ＦＭＤＶ合成ペプチド免疫原
合成ペプチド免疫原のアミノ酸配列は、複数の相同的なＦＭＤＶ血清型Ｏ株由来のＶＰ１構造タンパク質におけるＢ細胞抗原部位を整列させ評価することによって得た。表２に示すアラインメントに基づき、完全長ＦＭＤＶ  ＶＰ１構造タンパク質のアミノ酸残基１３４〜１５８に相当する２５アミノ酸を抗原性の共通配列として得た（配列番号１）。（完全長ＶＰ１配列に対するアミノ酸番号の例はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿７４０４６０に見出すことができる）。位置１３４及び１５８に対応するアミノ酸がシステイン残基によって置換されていることから、ペプチドは内部にジスルフィドループ構造を形成可能である。４１アミノ酸を含む比較的長いＦＭＤＶ抗原共通ペプチド（配列番号２）も、このアラインメントから得た。第２の共通配列は配列番号１を包含し、Ｎ末端及びＣ末端両方に隣接する配列もさらに含む。第２の共通配列は完全長ＦＭＤＶ  ＶＰ１構造タンパク質のアミノ酸残基１２９ないし１６８に相当し、位置１３４および１５８のアミノ酸はシステイン残基によって置換されている。二つの共通配列は、表１に示すように同定される。
【００３０】
同様のホモログアラインメントによって得た血清型Ｏ、Ａｓｉａ  １およびＡに由来するＶＰ１  Ｂ細胞エピトープの共通配列を、表２の配列番号２、１２および１６に示す。各共通配列内の様々な位置のアミノ酸は、各血清型株におけるそれらの位置で最も高頻度にみられるアミノ酸に基づいて指定した。
【００３１】
合成ペプチド免疫原、配列番号１および２の効果的かつ許容可能な変異型として、ＦＭＤＶの変異体および変異型株由来の対応する配列およびコンフォメーション要素を有する免疫機能性ホモログが挙げられる。相同的なＦＭＤＶ抗原ペプチドは、最初の変異型であるＦＭＤＶ  ＯＴａｉｗａｎ株のＶＰ１構造タンパク質の位置１２９〜１６８およびＦＭＤＶ血清型Ｏの複数の株に由来する共通配列に密接に関連するアミノ酸残基を有する（Mason,PW et al,2003）。このようなホモログは、クラスタルＷ（Clustal W）（独国の欧州分子生物学研究所（European Molecular Biology Laboratory）のJulie D.Thompson及びToby Gibson、並びに英国ケンブリッジの欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute）のDesmond Higginsによって開発されたアルゴリズム）のような配列アラインメントプログラムを用いて容易に同定できる。表２は、ＦＭＤＶ  ＯＣｏｎｓｅｎｓｕｓの配列（２５７０ａ、配列番号２）およびＯＣａｍｐｏｓ、ＯＴａｉｗａｎ、ＯＭｙａｎｍａｒ、ＯＯｚｋ、ＯＬａｎｚｏｕ、Ａｓｉａ  １Ｙｕｎｎａｎ、Ａｓｉａ  １Ｊｉａｎｓｕ、Ａ２４、ＡＧａｎｓｕ、ＡＸｉｎｊｉａｎｇ、ＣＩｎｄａｉａｌ、Ｃ３Ｂｅｌｇｉｕｍ、Ｃ３Ａｒｇｅｎｔｉｎａなど（配列番号３〜２３）のような複数の血清型および多様な株から得たＦＭＤＶ  ＶＰ１構造タンパク質における２２の抗原配列のクラスタルＷアラインメントを示す。
【００３２】
本発明に含まれる、ＶＰ１の追加のホモログとして、すべてのＦＭＤＶ株由来のＶＰ１配列のループ構造に常に見出される、特徴的な“ＲＧＤ”（Arg-Gly-Asp）細胞受容体結合配列を含むペプチドおよびタンパク質が挙げられる。このＲＧＤ配列は、ＶＰ１タンパク質のアミノ酸の位置１４５〜１４７に相当する。
【００３３】
表２に示すように、“ＲＧＤ”配列の下流（Ｃ末端への方向）に見出されるアミノ酸の数は、異なるＶＰ１配列の間で同じである。しかしながら、ＲＧＤ配列よりも上流（Ｎ末端への方向）のアミノ酸の数は特定の血清型（例えばＯ、Ａｓｉａ  １、Ａ、又はＣ）によって異なる。各血清型において、Ｎ末端配列は、その特定の血清型の共通配列に対して少なくとも７５％同一である（例えば血清型Ａｓｉａ  １に関して配列番号１２と比較したときの配列番号１３〜１５、血清型Ａに関して配列番号１６と比較したときの配列番号１７〜１９）。ある態様において、変異型ＯＭｙａｎｍａｒ／７／０２株のホモログ（配列番号７）は、配列番号２に対して８５％を超えて同一である（網掛けによって示した共通配列内の残基とは異なる残基を有する）。他の態様において、変異型株ＯＯｚｋ／９３のホモログ（配列番号８）は、配列番号２に対しておおよそ９０％同一である（網掛けによって示した共通配列内の残基とは異なる残基を有する）。
【００３４】
表２に示しかつ他所にも記載する相同的なＶＰ１ペプチドは、ある組成物中で適切な比で組み合わせることができ、動物に投与して特定のＦＭＤＶ株を標的とする中和抗体を効果的に誘発することができる。したがって、相同的なＶＰ１ペプチドを含む医薬組成物はＦＭＤ感染を予防するために効果的なワクチンである。例えば油中水（ｗ／ｏ）乳剤（例えばＩＳＡ５０Ｖ２）または水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）乳剤（例えばエマルシゲン（Emulsigen））として調製した、単数または複数の相同的なＶＰ１ペプチドを含む製剤はＦＭＤ感染の予防に有効である。
【００３５】
複数のＶＰ１配列ペプチドを含む組成物の効果を利用することについて考察した、様々な態様および実施例を以下に記載する。例えば実施例６、７、９及び１０は、ＯＣｏｎｓｅｎｓｕｓ、Ｏｓｗｉｎｅ／ｃａｔｔｌｅ／Ｏ／Ｍｙａ／７／０２（ＯＭｙａｎｍａｒと略称する）及びＯＯｚｋ／９３（ＯＯｚｋと略称する）の配列に対応する、三つのＦＭＤＶ血清型Ｏ  ＶＰ１ペプチドの組み合わせを含む、多価ＦＭＤＶブタ及び／又はウシワクチン組成物について記載する。このペプチド混合物を含む組成物は、複数の異なるＯ株による感染に対抗する、強力な三価のブタワクチンを産生することができる。同様に、ＯＣｏｎｓｅｎｓｕｓ（２５７０ａ）、Ａｓｉａ  １ＪｉａｎｇＳｕ／Ｃｈｉｎａ／２００５（Ａｓｉａ  １ＪｉａｎｇＳｕと略称する）およびＡＧａｎｓｕ／Ｃｈｉｎａ／６０Ｙ（ＡＧａｎｓｕと略称する）を有するＶＰ１ペプチドの組み合わせを用いた複数の血清型のワクチンを混合して三価の血清型のウシワクチンを形成し、中国における複数のＦＭＤＶ血清型由来の株による感染に対抗することができる。なお、南アメリカに適応させた効果的な複数の血清型のウシワクチンは、ＯＣａｍｐｏｓ／Ｂｒａｚｉｉ／５８Ｙ（ＯＣａｍｐｏｓと略称する）、Ａ２４  Ｃｒｕｚｅｉｒｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ａ２４と略称する）、及びＣＩｎｄａｉａｌ／Ｂｒａｚｉｉ／８４Ｙ（ＣＩｎｄａｉａｌと略称する）由来のＶＰ１配列ペプチドの組み合わせを含有しており、これは南アメリカで最も流行している複数の血清型由来の株によるＦＭＤ感染に対抗する上で効果的である。
【００３６】
本発明の合成ペプチドに含まれるように選択したＦＭＤＶ  ＶＰ１タンパク質におけるＢ細胞エピトープの位置を、ＦＭＤＶのその他の領域およびタンパク質に対して相対的に、図１に示す。タンパク質配列は、ＦＭＤＶ  ＯＴａｉｗａｎ９９ゲノム／コードされるアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号  ＡＪ５３９１３７）に基づく。
【００３７】
合成ペプチド免疫原の免疫学的な機能性類似体もまた、動物における免疫応答を誘発するのに効果的であり、本発明の一部として含まれる。免疫学的な機能性類似体として、配列番号１、２、１２、及び１６の共通配列の変異型及び／又は配列番号３〜１１、１３〜１５、及び１７〜２３のホモログが挙げられ、元のペプチドと実質的に同じ抗原性及び免疫原性を保持する。例えば、機能性類似体である変異型は、アミノ酸の位置における保存された置換、全体的な電荷の変化、別の部分への共有結合、またはアミノ酸の付加、挿入、もしくは欠失、及び／又はそれらのいずれかの組み合わせを有することができる。
【００３８】
保存された置換とは、一つのアミノ酸残基が、同様の化学的特性を有する別のアミノ酸残基によって置換される場合を指す。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられ、極性中性アミノ酸として、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられ、正電荷（塩基性）アミノ酸として、アルギニン、リジン及びヒスチジンが挙げられ、負電荷（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。
【００３９】
ある態様において、ある特定のペプチドの免疫学的な機能性類似体は、元のペプチドと同じアミノ酸配列を含み、かつ該ペプチドのアミノ末端に付加された三つのリジン（Lys-Lys-Lys）をさらに含む。この態様において、元のペプチド配列に三つのリジンが含まれることによって元のペプチドの全体的な電荷が変化するが、元のペプチドの機能は変化しない。
【００４０】
ある特定の態様において、機能性類似体は、元のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％同一である。他の態様において、機能性類似体は、元のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一である。さらに他の態様において、機能性類似体は、元のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一である。さらに他の態様において、機能性類似体は、元のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である。
【００４１】
ｂ．ＦＭＤＶ内在性ヘルパーＴ（Ｔｈ）エピトープ
合成免疫原ペプチドを含む組成物は、ＦＭＤＶ内在性Ｔｈエピトープペプチドを含むことができる。医薬品／ワクチン製剤中のＴｈエピトープの存在は、ＦＭＤＶ防御に決定的に関連するものである、抗原特異的なＴ細胞の活性化を開始することによって、処置した動物における免疫応答を刺激する。加えて、ＦＭＤＶタンパク質に存在する、注意深く選択された免疫優性のＴｈエピトープを含む製剤は、広範な細胞介在性免疫をもたらすことができ、これによって、、ウシのような、多様な遺伝的構造を有する動物を処置し、保護するのに該製剤が効果的となる。
【００４２】
ＦＭＤＶタンパク質由来のヘルパーＴエピトープと組み合わせたＢ細胞エピトープを有する免疫原ペプチドを含む製剤を単回投与することによって免疫化した動物は、自然感染またはＦＭＤＶの負荷試験のいずれかによってＦＭＤＶ曝露後の、リンパ球増殖応答を引き起こすことができる。増殖応答によってＩＦＮ−γ産生を含むサイトカイン産生がもたらされ、動物における様々な細胞壊死性のウイルス感染に対する細胞介在性免疫応答が増強される。
【００４３】
配列番号３４〜６３のＴｈエピトープペプチドを、インビトロＴ細胞増殖アッセイを用い、且つＴｈエピトープを含むＦＭＤ製剤／ワクチンによって免疫化した宿主動物におけるサイトカインＩＦＮ−γのインビボ（in vivo）産生およびインビトロ産生を評価することによって、同定した。また、（ａ）ＦＭＤＶ  ＢエピトープクラスターＶＰ１ペプチドおよび（ｂ）ＦＭＤＶ内在性Ｔｈペプチドの大規模なプールによる組み合わせを含む製剤を分析して、ウシのような、多様な遺伝的背景を有する様々な宿主動物において必要とされる細胞免疫を効果的且つ恒常的にもたらすことができる、適切な医薬組成物を決定した。免疫化した／ワクチン投与された宿主におけるインビトロＩＦＮ−γ産生をモニターすることに加え、中和抗体力価も評価し、これらの宿主が該製剤の単回投与のみでＦＭＤＶに対する中和抗体が増加し得るか否かを判定した。
【００４４】
様々な態様において、ＦＭＤＶ内在性Ｔｈエピトープペプチドは、ＦＭＤＶタンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ及び３Ｄの抗原部分に由来する。表４は、本発明の製剤に用いた際に特に有用であることが見出された、具体的なＦＭＤＶ内在性Ｔｈペプチド（配列番号３４〜６３）を同定する。具体的には、表４に挙げるＦＭＤＶ内在性Ｔｈエピトープは、（ａ）ＦＭＤＶウイルスライセート製剤／ワクチンおよび（ｂ）候補となるＦＭＤＶ  Ｔｈペプチドを含むペプチド製剤によって免疫化した宿主から得たブタのＴ細胞及びウシのＴ細胞によって認識される。ＦＭＤＶ  ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、及び３Ｄタンパク質（表４に挙げる）上のＴｈエピトープの分布および位置を、ＦＭＤＶのその他の領域およびタンパク質に対して相対的に、図１に示す。タンパク質配列は、ＦＭＤＶ  ＯＴａｉｗａｎ９９ゲノム／コードされるアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号  ＡＪ５３９１３７）に基づく。
【００４５】
表４で同定されたＴｈエピトープのホモログもまた効果的であり、本発明に含まれる。例えば、配列番号６４〜７８は、ＦＭＤＶ  ＯＴＡＷ／２／９９（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号  ＡＪ５３９１３７）に由来する相同Ｔｈエピトープ配列である。表５は、ＦＭＤＶ  ＯＴａｉｗａｎ９９由来のＴｈエピトープを、ＦＭＤＶ  ＯＴＡＷ／２／９９由来の相同Ｔｈエピトープと比較した配列アラインメントを提供する。具体的には、表５は、ＦＭＤＶ  ３Ｄタンパク質（配列番号６１対６４、６２対６５、６３対６６、６０対７１および７２）；ＦＭＤＶ  ２Ｂタンパク質（配列番号４８対６７および６８）、ＦＭＤＶ  ３Ａタンパク質（配列番号５３対６９および７０）、ＦＭＤＶ  ＶＰ４タンパク質（配列番号３４対７３および７４）、ＦＭＤＶ  ＶＰ２タンパク質（配列番号３６対７５および７６）、およびＦＭＤＶ  ＶＰ３タンパク質（配列番号３７対７７および７８）に由来する相同Ｔｈエピトープを整列する。
【００４６】
ＦＭＤＶ内在性Ｔｈエピトープペプチドの免疫学的な機能性類似体もまた効果的であり、本発明の一部として含まれる。免疫学的な機能性類似体として、配列番号３４〜６３の変異型及び／又は配列番号６４〜７８のホモログが挙げられ、これらは元のペプチドと実質的に同じ免疫原性を保持する。例えば機能性類似体である変異型は、アミノ酸の位置における保存された置換、全体的な電荷の変化、別の部分への共有結合、又はアミノ酸の付加、挿入、もしくは欠失及び／又はそれらのいずれかの組み合わせを有することができる。
【００４７】
保存された置換とは、一つのアミノ酸残基が、同様の化学的特性を有する別のアミノ酸残基によって置換される場合を指す。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられ、極性中性アミノ酸として、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられ、正電荷（塩基性）アミノ酸として、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられ、負電荷（酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
【００４８】
ある特定の態様において、機能性類似体は、元のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％同一である。他の態様において、機能性類似体は、元のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一である。さらに他の態様において、機能性類似体は、元のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一である。さらに他の態様において、機能性類似体は、元のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である。
【００４９】
ある態様において、ある特定のペプチドの免疫学的な機能性類似体は、元のペプチドと同じアミノ酸配列を含み、かつペプチドのアミノ末端に付加された三つのリジン（Lys-Lys-Lys）をさらに含む。この態様において、元のペプチド配列に三つのリジンが含まれることによって元のペプチドの全体的な電荷が変化するが、元のペプチドの機能は変化しない。
【００５０】
表６は、Ｔｈエピトープペプチドに対する機能性類似体の別の変異型を同定する。特に、配列番号３９及び４０は、それらがＣ末端の四つのアミノ酸を欠失しているか（配列番号３９）または含んでいる（配列番号４０）ことのみによって異なるため、互いに機能性類似体である。これら二つの類似配列の違いは、これらの配列内に含まれるＴｈエピトープの機能に影響することはないであろう。
【００５１】
その他の変異型において、ＦＭＤＶ内在性Ｔｈエピトープペプチドはコンビナトリアル配列として存在することができ、該コンビナトリアル配列は、その特定のペプチドのホモログにおける可変性の残基に基いた、ペプチドフレーム構造内の特定の位置のアミノ酸残基の混合物を含む。コンビナトリアルペプチドの集合体は、合成過程の間に、ある具体的な位置において、ある特定のアミノ酸に代えて、指定した保護アミノ酸の混合物を加えることにより、一過程によって合成可能である。このようなコンビナトリアルＦＭＤＶ内在性Ｔｈペプチド集合体により、Ｔｈエピトープは、多様な遺伝的背景を有する動物を広くカバーすることが可能となる。ＦＭＤＶ内在性Ｔｈペプチドの代表的なコンビナトリアル配列として、配列番号７９〜８７が挙げられ、表７に示す。これらのコンビナトリアル配列は、代表的なＦＭＤＶ内在性Ｔｈエピトープに対する配列番号３４〜６３（表４に示す）に由来する。
【００５２】
様々な態様において、共に一つのペプチド内で、複数のＦＭＤＶ内在性Ｔｈエピトープ配列を連結することによって、Ｔ細胞免疫原性を増強することができる。共に連結されたＴｈエピトープ配列は、同じＴｈエピトープ配列（反復したＴｈエピトープ配列を有するペプチドを作製するため）、異なったＴｈエピトープ配列（様々なＴｈエピトープ配列を有するペプチドを作製するため）、またはそれらの組み合わせとすることができる。加えて、Ｔｈエピトープ配列を、スペーサと共に、またはスペーサなしで連結することができる。ある態様において、スペーサを用いて、複数のＦＭＤＶ  Ｔｈエピトープを適切な位置における単一配列として含むペプチドの、細胞内での切断を容易にする。幾つかの態様において、スペーサはアミノ酸を含む。好ましい態様において、スペーサはリジンである。
【００５３】
本発明のＴｈエピトープペプチドは、標的とする動物種の遺伝的多様な集団に由来する動物に対して広範な反応性および免疫原性を提供する。本発明の製剤に特に有用であることが見出されたペプチドとして、配列番号３４〜７８のような、複数のＦＭＤＶ  Ｔｈエピトープのクラスターを含むペプチド、及び配列番号７９〜８７のような、Ｔｈエピトープ配列のコンビナトリアル配列を含むペプチドが挙げられる。ある態様において、ＦＭＤＶ内在性Ｔｈエピトープクラスターペプチドは、表７に示すように（配列番号８８〜９５）、Ｔｈエピトープを人工Ｔｈ（ＵＢＩＴｈ（登録商標））（配列番号２４）に連結することによって、Ｔ細胞免疫原性をさらに増強することができる。
【００５４】
ｃ．スペーサ
合成ＦＭＤＶペプチド免疫原は、そのホモログおよび類似体を含む。該合成ＦＭＤＶペプチド免疫原は、スペーサと共にまたはスペーサなしで、Ｔｈエピトープを含むことが知られている配列を含むペプチドと共有結合することができる。連結したペプチドにより、Ｔｈエピトープペプチドに共有結合していない免疫原と同等以上に増強された免疫原性を提供することができる。
【００５５】
幾つかの態様において、人工Ｔｈエピトープを含むペプチドは、合成ＦＭＤＶペプチド免疫原のＮ末端に共有結合する。幾つかの変形において、スペーサは、二つの配列間に存在する。好ましくは、スペーサは、単一アミノ酸のεＮＬｙｓである。ある具体的な態様において、配列番号２４の人工Ｔｈエピトープペプチドは、配列番号２の合成ＦＭＤＶペプチド免疫原のＮ末端に、εＮＬｙｓスペーサ（配列番号２５として表３にも示す）を介して共有結合する。合成ＦＭＤペプチド免疫原のアミノ末端に共有結合するＴｈエピトープ配列を含む、さらなる例示的なペプチドを表３に示す。特に、配列番号２４のＴｈエピトープペプチドは、様々な合成ＦＭＤＶペプチド免疫原のアミノ末端にεＮＬｙｓスペーサを介して連結する（配列番号２５〜３３）。
【００５６】
ｄ．組成物
本開示は、合成ペプチドを含有する組成物もまた対象とする。該組成物を、動物におけるＦＭＤを検出、処置、及び／又は予防に用いることができる。ある態様において、ＦＭＤＶ  Ｂ細胞エピトープを有する合成ペプチドを含む組成物は、サンプル中のＦＭＤＶに対する抗体の存在を検出するために用いられる。別の態様において、ＦＭＤＶ  Ｂ細胞エピトープを有する合成ペプチドを含む組成物は、動物におけるＦＭＤ感染を処置するか及び／又は予防するための医薬組成物である。ある態様において、ＦＭＤＶ  Ｂ細胞エピトープを有する合成ペプチドを含む医薬組成物を用いて、動物におけるＦＭＤＶに対する免疫応答を誘発する。ＦＭＤＶ  Ｂ細胞エピトープを有する合成ペプチドを含む医薬組成物は、ＦＭＤＶに対するワクチンとして使用することができる。
【００５７】
合成ＦＭＤＶペプチド免疫原を含む医薬組成物は、標的となるＦＭＤタンパク質に対する機能性抗体を効果的に誘発して、ＦＭＤ負荷からの防御を有する動物を提供する。実際、これらの医薬組成物を単回投与された動物は、ＦＭＤ感染から十分かつ適切に保護される。このように、動物がＦＭＤ感染から完全に保護されるために、複数回の投与および追加投与は必要とされない。したがって、合成ＦＭＤＶペプチド免疫原を含有する医薬組成物は、ＯＩＥの指針に従った緊急ワクチンとして適格である。
【００５８】
本開示の組成物は、１つの又は２以上の合成ＦＭＤＶペプチド免疫原を含むことができる。例えば、該組成物は、表１に示す共通配列（配列番号１又は２）を有する合成ＦＭＤＶペプチド免疫原、及び／又は表２に示すそのホモログまたは類似体、及び／又はそれらの組み合わせを含むことができる。また、該組成物に用られるＦＭＤＶペプチド免疫原を人工コンビナトリアルヘルパーＴエピトープと連結させ、該組成物のＢ細胞免疫原性を増強させることができる。好ましい態様において、合成ＦＭＤＶペプチド免疫原は、配列番号２４の人工コンビナトリアルヘルパーＴエピトープと連結される。様々な血清型由来の代表的なＦＭＤＶ  ＶＰ１ペプチド免疫原を表３に同定する。
【００５９】
ＦＭＤＶペプチド免疫原を含む組成物もまた、１つの又は２以上のＦＭＤＶ内在性Ｔｈエピトープペプチドを含有することができる。例えば、該組成物は、ＦＭＤＶ  ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、及び３Ｄタンパク質由来のＴｈエピトープペプチドを含むことができる。組成物において特に有用であることが見出されたＴｈエピトープペプチドとして、表４、５、６、及び７（配列番号３４〜９５）ならびに実施例９および１０に記載される、表１８、１９、２５及び２６に示すペプチドが挙げられる。ワクチン製剤を含む医薬組成物は、ＦＭＤＶ特異的な抗体反応を誘発し、かつ単回投与のみでブタおよびウシをＦＭＤＶ感染から保護する、ペプチド抗原特異的なＴ細胞反応を開始することができる。
【００６０】
また、組成物は、薬剤的に許容可能なデリバリ系内にキャリア及び／又はその他の添加物を含むことができる。したがって、合成ＦＭＤＶペプチド免疫原を含む組成物は、ワクチン製剤中に通常含まれる、アジュバント、薬剤的に許容可能なキャリア又はその他の成分を用いる医薬品ワクチン製剤として処方することができる。本発明において用いてもよい成分のうち、アジュバントまたは乳化剤として、ミョウバン、フロイント不完全アジュバント、リポシン、サポニン、スクアレン、Ｌ１２１、エマルシゲン、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ＱＳ２１、ＩＳＡ３５、ＩＳＡ２０６、ＩＳＡ５０Ｖ２およびＩＳＡ７２０、ならびにその他の効果的なアジュバントおよび乳化剤が挙げられる。ある特定の態様において、デリバリビヒクルおよびアジュバントは、モンタニド（Montanide）（商標）ＩＳＡ５０Ｖ２（油中水乳剤とするために植物油とオレイン酸マンニドとから構成される、油性ワクチンアジュバント組成物）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（ポリソルベート８０またはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートとしても知られる）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、及び／又はこれらのいずれかの組み合わせである。別の態様において、医薬組成物は、アジュバントとしてエマルシゲンまたはエマルシゲンＤを用いた水中油中水（すなわちｗ／ｏ／ｗ）乳剤である（実施例９、表１９のグループ２７、２８、３１、及び３２に記載される）。ワクチン製剤に通常取り込まれるその他の成分も提供され、単回投与のみでバランスの取れたＢ細胞およびＴ細胞免疫応答が増大し、ウイルス負荷から保護されるような投与量の指示も提供される（実施例９および１０）。
【００６１】
医薬組成物は、即時放出型または持続放出型製剤として処方することができる。また、該医薬組成物は、免疫原の捕捉および微粒子との共投与を通して、全身性の、または局所粘膜の免疫を誘導するように処方することができる。このようなデリバリ系は、当業者によって容易に決定される。
【００６２】
本開示のペプチドを含む種々のワクチン製剤が、ＦＭＤＶから有蹄動物を保護するために有効である。例えば、ＦＭＤＶワクチン製剤として有用な医薬組成物は、合成ＦＭＤＶペプチド免疫原および獣医学的に許容可能なデリバリビヒクルまたはアジュバントを含み、該合成ＦＭＤＶペプチド免疫原は、
ａ）配列番号１〜２、
ｂ）（ａ）のホモログ、
ｃ）（ａ）または（ｂ）の、抗原的および免疫学的な機能性類似体、
ｄ）少なくとも１の保存されたアミノ酸置換、アミノ酸付加及び／又はアミノ酸欠失を有する（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）；及び
ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかの組み合わせ；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【００６３】
特定の製剤において、該合成ＦＭＤペプチド免疫原は、配列番号２、７および８からなる群より選択される。
【００６４】
別の製剤において、該組成物は、スペーサを介して人工コンビナトリアルＴｈペプチドと連結する合成ＦＭＤＶペプチド免疫原を含み、かつ配列番号２５の配列を有する。
【００６５】
その他の製剤は、配列番号３４〜６３の、３０のＦＭＤＶ  Ｔｈエピトープペプチドを、同じ重量比でさらに含み、投与あたりの量は約０．１μｇ〜約１ｍｇである。ある具体的な製剤において、同じ重量比の配列番号３４〜６３の量は、投与あたり約１μｇ〜約１００μｇである。
【００６６】
さらに別の製剤において、該組成物は、配列番号２５、２７、及び２８の合成ＦＭＤＶペプチド抗原と、配列番号３４〜６３のＦＭＤＶ内在性Ｔｈエピトープペプチドの同じ重量比によるプールとの混合物を、獣医学的に許容可能なデリバリビヒクルまたはアジュバント中に含み、該ペプチド抗原の量は投与あたり約１０μｇ〜約１ｍｇである。
【００６７】
ｅ．投与
医薬組成物およびワクチン製剤は、皮下、経口、筋肉内、又はその他の非経口もしくは経腸経路を含む、いずれかの好都合な経路によって投与することができる。同様に、該ワクチンは、単回投与又は複数回投与とすることができる。免疫スケジュールは、当業者によって容易に決定される。
【００６８】
医薬組成物は、有効量の合成ペプチド免疫原および薬剤的に許容可能なキャリアを含有するように処方される。医薬組成物はまた、一般にｋｇ体重あたり約０．５μｇ〜約１ｍｇの免疫原を含む、適切な単位剤形として処方される。複数回投与によって送達される場合、該医薬組成物は、単位剤形あたりの適切な量に、都合よく分割されてもよい。投与量は、ワクチンおよび治療の技術分野において周知されているように、被験体の年齢、体重および全般的な健康に依存するであろう。
【００６９】
合成ＦＭＤＶペプチド免疫原を含む医薬組成物、例えばワクチン製剤は、単回投与であっても効果的な応答をもたらすことができる。これらの医薬組成物の単回投与は、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギおよびその他の感受性の野生種を含む、ヘルパーＴ細胞の多様な集団を有する動物を抗原刺激するために十分である。特に、Ｔｈエピトープペプチドと組み合わせる合成ＦＭＤＶペプチド免疫原を含む医薬組成物は、バランスの取れたＢ細胞免疫応答（中和抗体）およびＴ細胞免疫応答（サイトカイン放出など）を誘発して、それに続くウイルスへの曝露から動物を保護することができる。
【００７０】
Ｔｈエピトープペプチドと組み合わせる合成ＦＭＤＶペプチド免疫原を含む製剤を用いた単回投与による免疫化を、ＯＩＥ、台湾および中華人民共和国の指針に従って、広範に評価した（実施例９及び１０においてさらに考察する）。これらの試験によって得られた結果は、これらの製剤がＦＭＤ感染に対する免疫付与を行った宿主を保護するために有効であることを、繰り返し、再現性をもって示してきた。したがって、これらの試験により、ＦＭＤＶ製剤の設計およびＦＭＤＶ製剤を動物用の緊急ＦＭＤＶワクチンとして使用した際の効能が検証された。
【００７１】
ｆ．製造方法
本開示はまた、ＦＭＤＶ感染に対して免疫応答を誘発して動物を保護するための、合成ＦＭＤＶペプチド免疫原、Ｔｈエピトープペプチド、組成物および医薬製剤／ワクチンの製造方法も対象とする。
【００７２】
合成ＦＭＤＶペプチド免疫原を用いることによって、従来の不活化ウイルスワクチンを超えた、多くの重要な利点がもたらされる。例えば、従来の不活化ウイルスワクチンには高価な生物学的封じ込め用の機器が必要とされるが、封じ込め用の機器／プロトコルが機能しなかった場合には、研究室で作業する人々および公衆に深刻なバイオハザードリスクがもたらされる。一方、バイオハザード物質はペプチド抗原の製造に用いられないため、健康および安全のリスクが大幅に減少し、かつ高価な生物学的封じ込め用の機器を用いる必要もない。また、部位特異的な免疫原によって、選択されたエピトープが高いモル濃度で提示されるため、ＦＭＤＶ抗原ペプチドを用いたワクチンの安全性および免疫効力を確実なものにする助けとなる。
【００７３】
また、免疫原として既知のＢ細胞エピトープおよびＴｈエピトープを有する規定の合成ペプチドをワクチンの免疫原性成分として用いると、ＦＭＤＶもしくは組換えウイルスに感染した宿主細胞に由来するか、またはＦＭＤＶ及び／又は組換えタンパク質と共に精製された可能性のある組換えタンパク質の発現系に由来する抗原物質によって引き起こされる望ましくない非ＦＭＤＶ特異的免疫応答が排除される。例えばブタから採取した血清は、宿主細胞に対する抗体、または組換え大腸菌、酵母、もしくはバキュロウイルスに対する抗体を有している可能性があり、これらの抗体は、生物学的な由来の抗原に基づいた診断検査において使用する抗原物質と交差反応を起こし得る。成分としてこれらの異質免疫原を有するワクチンによって誘導されたこのような免疫応答によって、保護はされ得ない。これとは対照的に、本明細書に記載する合成ＦＭＤＶペプチドワクチンを投与されたブタまたはウシには目的の免疫応答が誘導され、宿主細胞または発現ベクターに由来するタンパク質に対する不都合な抗体またはその他の免疫応答は誘導されない。
【００７４】
さらに、不活化ウイルスの産生の間に導入され得る矛盾または誤りは、処置された動物における適切かつ／または望ましい免疫応答を阻止し得る。しかしながら、長い合成ＦＭＤＶペプチド免疫原の合成中に導入され得る矛盾及び／又は誤りは、ほとんどの場合、処置された動物における望ましい免疫応答を妨害および阻止することはない。事実、ペプチドの合成中に導入され得る矛盾／誤りによって、標的となるペプチド合成と共に複数のペプチド類似体が産生される。これらの類似体には、アミノ酸の挿入、欠失、置換および中途終止が含まれ得る。上述したように、このようなペプチド類似体は、免疫診断のための固相抗原またはワクチン接種のための免疫原として免疫学的に応用する場合、抗原性および免疫原性に役立つため、ペプチドの調製には適したものである。
【００７５】
合成ペプチドの免疫学的応用における２５年間の経験から、本出願者は、意図された免疫活性を保持するための構造的変異の範囲は、低分子薬物による特異的な薬物活性、または生物学的な由来の薬物によって同時にもたらされる、大分子中に見出される望ましい活性および望ましくない毒性を保持するための構造的変異の範囲よりもはるかに調整可能であることを見出した。このようにペプチド類似体は、意図的に設計されたか、または合成過程での誤りにより、欠失配列副生成物の混合物として必然的に生成したものであり、意図されたペプチドと同様のクロマトグラフィー特性および免疫学的特性を有し、しばしば所望のペプチドを精製した調製物と同等に効果的である。設計された類似体および意図されない類似体混合物は、識別のためのＱＣ手順が開発されて製造過程および産物評価過程の両方がモニターされ、これらのペプチドを用いた最終産物の再現性および有効性が保証される限りにおいて有効である。
【００７６】
上述の利点に鑑みて、本開示に記載したペプチドは、合成の固相法およびこの方法に利用できる種々の改良のような標準的な技術を用いて容易に合成可能である（Moore, V, 1992）。ペプチドは、核酸分子、ベクター及び／又は宿主細胞を含む組換えＤＮＡ技術を用いても作製できる。このように、ＦＭＤＶ  Ｂ細胞およびＴ細胞エピトープクラスター抗原ペプチドおよびＦＭＤＶ  Ｂ細胞エピトープクラスター抗原ペプチドの免疫学的な機能性類似体をコードする核酸分子ならびにそれらの相補体もまた、本発明の一部として本開示により包含される。同様に、核酸分子を含有する発現ベクターを含むベクターおよびベクターを含む宿主細胞もまた、本発明の一部として本開示により包含される。
【００７７】
様々な代表的態様は、ＦＭＤＶ抗原ペプチドおよびＦＭＤＶ抗原ペプチドの免疫学的な機能性類似体の産生方法も包含する。例えば方法は、ＦＭＤＶ抗原ペプチド及び／又はその免疫学的な機能性類似体をコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞を、該ペプチド及び／又は類似体が発現する条件下でインキュベートする工程を含んでよい。
【００７８】
また、ペプチドは固相合成によって産生することができる。この化学的方法によって産生されたペプチドの質は制御および規定することが可能であり、その結果、抗原性、免疫原性および収率の再現性を保証することができる。
【００７９】
ｇ．具体的な態様
本発明の具体的な態様として、次のものを含むが、これらに限定されない。
（１）  ａ）合成ＦＭＤＶ  ＶＰ１ペプチド抗原；
ｂ）合成ＦＭＤＶヘルパーＴエピトープペプチド；及び
ｃ）獣医学上許容可能なデリバリビヒクル又はアジュバント；
を有する口蹄疫（ＦＭＤ）ワクチン組成物であって、
ａ）のＦＭＤＶ  ＶＰ１ペプチド抗原は、
ｉ）配列番号１又は２；
ｉｉ）  （ａ）のホモログ；及び
ｉｉｉ）  （ａ）又は（ｂ）の任意の組合せ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
（ｂ）の合成ＦＭＤＶヘルパーＴエピトープペプチドは、（ａ）のペプチド抗原と共有結合しない、上記組成物。
（２）  （ａ）のペプチド抗原が、配列番号１のアミノ酸配列を有する、１のＦＭＤワクチン。
（３）  （ａ）のペプチド抗原が、配列番号２のアミノ酸配列を有する、１のＦＭＤワクチン。
（４）  （ｂ）のホモログが、配列番号３〜２３からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する、配列番号２のホモログである、１のＦＭＤワクチン。
（５）  （ａ）のペプチド抗原が、Ｔｈエピトープ配列を有するペプチドにアミノ末端又はカルボキシ末端で共有結合する、１のＦＭＤワクチン。
（６）  Ｔｈエピトープ配列が、配列番号２４である、５のＦＭＤワクチン。
（７）  ヘルパーＴエピトープが、イプシロンリジン残基を有するスペーサを介してペプチド抗原と共有結合する、５のＦＭＤワクチン。
（８）  （ｂ）のＦＭＤＶヘルパーＴエピトープペプチドが、配列番号３４〜９５及びその組合せからなる群から選ばれる、１のＦＭＤワクチン。
（９）  （ａ）のペプチド抗原の全量が、投与当たり約１０μｇ〜約１ｍｇである、１のＦＭＤワクチン。
（１０）  デリバリビヒクル又はアジュバントが、モンタニド（Montanide）ISA 50V、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、エマルシゲン（Emulsigen）、エマルシゲンＤ（Emulsigen D）及びＣｐＧオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれる、１のＦＭＤワクチン。
【００８０】
（１１）  ａ）  配列番号２５〜３３及びその組合せからなる群から選ばれる合成ＦＭＤＶ  ＶＰ１ペプチド抗原；
ｂ）  配列番号３４〜９５からなる群から選ばれる合成ＦＭＤＶヘルパーＴエピトープペプチド；及び
ｃ）  獣医学上許容可能なデリバリビヒクル又はアジュバント；
を有する口蹄疫（ＦＭＤ）ワクチン組成物。
（１２）  （ａ）のペプチド抗原が、配列番号２５、２７、２８、２９及び／又はその組合せである、１１のＦＭＤワクチン。
（１３）  （ｂ）のＦＭＤＶヘルパーＴエピトープペプチドが、配列番号３４〜６３、９０、及びその組合せである、１１のＦＭＤワクチン。
（１４）  （ａ）のペプチド抗原が、配列番号２５、２７、２８、２９及び／又はその組合せであり、（ｂ）のＦＭＤＶヘルパーＴエピトープペプチドが、配列番号３４〜６３、９０、及びその組合せである、１１のＦＭＤワクチン。
（１５）  医薬上有効量の１４のワクチンを動物に単回投与することを有する、動物の免疫反応を引き出す方法。
（１６）  動物がブタである、１５の方法。
（１７）  医薬上有効量の１４のワクチンを動物に単回投与することを有する、ＦＭＤ感染から動物を保護する方法。
（１８）  動物がブタである、１７の方法。
（１９）  （ａ）のペプチド抗原が、配列番号２５、２７、２８、２９及び／又はその組合せである、１１のＦＭＤワクチン。
（２０）  医薬上有効量の１９のワクチンを動物に単回投与することを有する、動物の免疫反応を引き出す方法。
（２１）  動物が雌ウシである、２０の方法。
（２２）  医薬上有効量の１９のワクチンを動物に単回投与することを有する、ＦＭＤ感染から動物を保護する方法。
（２３）  動物が雌ウシである、２２の方法。
（２４）  （ａ）のペプチド抗原が、配列番号２６、３０、３２、３３、及び／又はその組合せである、１１のＦＭＤワクチン。
（２５）  （ｂ）のＦＭＤＶヘルパーＴエピトープペプチドが、配列番号９１〜９５、及びその組合せである、１１のＦＭＤワクチン。
（２６）  （ａ）のペプチド抗原が、配列番号２６、３０、３２、３３、及び／又はその組合せであり、（ｂ）のＦＭＤＶヘルパーＴエピトープペプチドが、配列番号９１〜９５、及びその組合せである、１１のＦＭＤワクチン。
（２７）  医薬上有効量の２６のワクチンを動物に単回投与することを有する、動物の免疫反応を引き出す方法。
（２８）  動物が雌ウシである、２７の方法。
（２９）  医薬上有効量の２６のワクチンを動物に単回投与することを有する、ＦＭＤ感染から動物を保護する方法。
（３０）  動物が雌ウシである、２９の方法。
以下の実施例は、本発明を説明するために役立つものであり、本発明の範囲を限定するために用いられるべきでない。
【００８１】
実施例１
ＦＭＤＶペプチドの合成
医薬組成物に含まれたＦＭＤＶペプチドを合成するための方法について記載する。該ペプチドは、実験室での試験および実地試験に有用であるように少量合成してもよく、ワクチンおよびアッセイ用製剤の工業的／商業的産生に有用であるように大量（キログラム）合成してもよい。
【００８２】
おおよそ１０〜７０アミノ酸長の配列を有するＦＭＤＶ  ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、及び３Ｄタンパク質に由来するＦＭＤＶ  Ｂ細胞およびＴ細胞エピトープクラスター部位の双方を表すＦＭＤＶ抗原ペプチドの多数のレパトアを設計した。幾つかのペプチドに対して、アミノ酸置換を適切な部位に施し、環状ペプチドが形成されるようにし、局所的構造を保存し、対応する天然タンパク質との交差反応が最大になるようにした（例えばシステイン残基への置換）。代表的なＦＭＤＶ抗原ペプチドを表２に同定する（配列番号１〜２３）。
【００８３】
各ペプチドそれぞれの免疫原性を増強するため、人工コンビナトリアルＴｈペプチドに連結させた抗原ペプチドも合成した。配列番号２４（ＵＢＩＴｈ（登録商標））のコンビナトリアルＴｈペプチドに連結させた代表的なＦＭＤＶ抗原ペプチドを、表３（配列番号２４〜３３）ならびに表７および８（配列番号８９〜１０２）に同定する。
【００８４】
免疫原性試験のために用いられるすべてのペプチドは、Ｆｍｏｃ化学を用いて、アプライド・バイオシステムズペプチド合成機モデル（Applied BioSystems Peptide Synthesizer Models）４３０Ａ、４３１および４３３により合成した。各ペプチドは、三官能性アミノ酸のＮ末端および側鎖保護基にＦｍｏｃ保護を用いて、固相支持体上で個別に産生した。完成したペプチドを固相支持体から切断し、９０％トリフルオロ酢酸によって側鎖保護基を除去した。正確なアミノ酸量を確実にするため、合成ペプチド調製物は、マトリックス支援レーザー脱離飛行時間（Matrix-Assisted Laser Desorption Time-Of-Flight：ＭＡＬＤＴＯＦ）質量分析計（Mass Spectrometry）を用いて評価した。合成ペプチドはまた、合成プロファイルおよび調製物の濃度を確認するため、逆相ＨＰＬＣによっても評価した。
【００８５】
合成過程の厳密な制御（カップリング効率のモニターを含む）にもかかわらず、ペプチド類似体は、アミノ酸の挿入、欠失、置換および中途終止のような、伸長サイクルの間の意図されない現象によって産生される。このように、合成された調製物は、標的となるペプチドと共に複数のペプチド類似体を典型的に含む。このような意図されないペプチド類似体が含まれているにもかかわらず、得られた合成ペプチド調製物は免疫診断（抗体捕捉用抗原として）およびワクチン接種（ペプチド免疫原として）のような免疫学的応用に適している。典型的には、このようなペプチド類似体は、意図的に設計されたかまたは合成過程の間に副生成物の混合物として生成したものであり、識別のためのＱＣ手順が開発されて製造過程および産物評価過程の両方がモニターされ、これらのペプチドを用いた最終産物の再現性および有効性が保証される限りにおいて、しばしば所望のペプチドを精製した調製物と同等に効果的である。
【００８６】
すべてのペプチドを、労力を要し、かつ時間的な制約のある、血清学的スクリーニング過程またはインビトロＩＦＮ−γ産生に対するスクリーニング過程（ペプチド合成サイクルの反復、ワクチンの処方、動物の免疫を含む）並びに血清学的試験およびインビトロＩＦＮ−γ産生試験に供し、診断およびワクチンそれぞれへ応用するための、標的動物におけるさらなる試験を行うための候補ペプチドを得た。様々な実施例において用いた具体的な製剤について、以下に記載する。
【００８７】
実施例２
アッセイおよび試薬
本発明の合成ペプチドおよび製剤を評価するために開発したアッセイおよび試薬について、以下に記載する。
【００８８】
ａ．ＦＭＤＶ  ＶＰ１（ａａ１３４〜１６８）またはＶＰ１（ａａ１２９〜１６８）ペプチドベースのＥＬＩＳＡ
次の実施例に記載する様々なサンプルを評価するＥＬＩＳＡアッセイを開発し、以下に記載する。
９６ウェルプレートの各ウェルを、１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３緩衝液、ｐＨ９．５（他に記載のない限り）中の２μｇ／ｍＬ（特記しない限り）の各標的ペプチド１００μＬにより、３７℃にて１時間コートした。
【００８９】
ペプチドによってコートされたウェルに３重量％ゼラチンを含むＰＢＳ溶液２５０μＬを加え、３７℃にて１時間インキュベートして非特異的なタンパク質結合部位をブロックした後、０．０５容量％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、乾燥した。分析する血清を、２０容量％正常ヤギ血清、１重量％ゼラチンおよび０．０５容量％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＰＢＳによって、１：２０（特記しない限り）に希釈した。各ウェルに１００マイクロリットル（１００μＬ）の希釈検体を加え、３７℃にて６０分間反応させた。
【００９０】
０．０５容量％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＰＢＳによってウェルを６回洗浄し、結合していない抗体を除去した。陽性ウェル内に形成された抗体／ペプチド抗原複合体に結合する標識トレーサーとして、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗ブタＩｇＧを用いた。予め用量設定を行い、１容量％正常ヤギ血清と０．０５容量％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０とを含むＰＢＳによって至適に希釈した１００マイクロリットルのペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ブタＩｇＧを各ウェルに加え、３７℃にて３０分間インキュベートした。０．０５容量％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＰＢＳによってウェルを６回洗浄し、結合していない抗体を除去した後、3’,3’,5’,5’-テトラメチルベンジジン（3’,3’,5’,5’-tetramethylbenzidine：ＴＭＢ）０．０４重量％と過酸化水素０．１２容量％を含むクエン酸ナトリウム緩衝液中の基質混合液１００μＬと共に、さらに１５分間反応させた。この基質混合液を用いて、呈色産物の形成によるペルオキシダーゼ標識を検出した。１．０Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を１００μＬ加えて反応を停止させ、４５０ｎｍにおける吸光度（Ａ４５０）を決定した。
【００９１】
血清希釈を、動物血清中にＦＭＤＶ抗体を検出する目的に従って以下のように行った。（ａ）潜在的な自然感染を同定するために、１：２０希釈を用い、Ａ４５０の読み取りを記録し、カットオフ値算出のための固有のネガティブコントロールを用いた。または、（ｂ）ペプチドベースのＦＭＤＶワクチン製剤を負荷されたブタの抗体力価を決定するために、１：１０〜１：１０，０００まで１０倍連続希釈を行った血清を試験し、Ｌｏｇ１０で表される試験血清の力価を、カットオフ値を０．５に設定したＡ４５０の線形回帰分析によって算出した。血清中のアイソタイプ特異的な抗ＦＭＤＶ抗体（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＡ）の検出を、必要な場合には、セロテック（Serotec）で供給されるこれらのアイソタイプに特異的なモノクローナル抗体を用いて、測定した。抗体力価も上記と同様に測定した。
ＦＭＤＶ  ＶＰ１  Ｂ細胞エピトープクラスターペプチド（配列番号１〜２３）の１０ｍＬ  ＮａＨＣＯ３緩衝液、ｐＨ９．５の溶液を、２μｇ／ｍＬで、ウェルあたり１００μＬ用いて、それぞれのＶＰ１  ＥＬＩＳＡにおけるコート用抗原として、用いた。
【００９２】
ｂ．非構造タンパク質３ＢペプチドベースのＥＬＩＳＡ
ＦＭＤＶ非構造（non-structural：ＮＳ）タンパク質３Ｂでの血清抗体反応性についてのＥＬＩＳＡを、１：２１希釈により、以前の報告に従って行った（Wang, CY et al 2001）。各試験には、ペプチド免疫化したウシおよびネガティブコントロールのウシから採取した血清が含まれた。得られた結果を、カットオフＯＤ値（一般には０．２２０  ＯＤ）を差し引いた後のＯＤ単位によって報告する。
このＦＭＤＶ  ＮＳ  ３ＢペプチドベースのＥＬＩＳＡアッセイにより、ワクチン接種された動物を感染動物から区別することが可能である。具体的には、ワクチン接種された動物と感染動物とは、動物から得た血清が非構造ＦＭＤＶタンパク質と反応するか否かによって区別される。特に、本開示のワクチン製剤で免疫化した動物から得た血清は、該ワクチン製剤が構造タンパク質であるＶＰ１由来のエピトープのみを含むため、非構造ＦＭＤＶタンパク質とは反応しない。このように、感染動物から得た血清サンプルのみが、非構造ＦＭＤＶタンパク質と反応する。
【００９３】
ｃ．感染動物をワクチン接種された動物から区別する（Differentiation of Infected from Vaccinated Animals：ＤＩＶＡ）診断システム
血清型特異的なＦＭＤＶ  ＶＰ１ペプチドベースのＥＬＩＳＡと組み合わせてＦＭＤＶ  ＮＳ  ３ＢペプチドベースのＥＬＩＳＡを用いることにより、（１）感染動物をワクチン接種された動物から区別するため、および（２）動物が感染したか、またはそれに対してワクチン接種された、ＦＭＤＶの特定の血清型を同定するための、有用かつ便利な手段が提供される。したがって、このＥＬＩＳＡアッセイの組み合わせにより、ウイルス負荷に対するＦＭＤＶワクチンの有効性が、血清学的手段を通して便利かつ有用に評価される。
【００９４】
ｄ．免疫原性の評価
以下の実施例に記載する方法に従って動物を免疫化した。ワクチン製剤投与後に血液サンプルを得て免疫原性を評価した。
具体的には、免疫化した動物からサンプルを、ウシの場合には初回免疫後０、３および５週目（weeks post initial immunization：ｗｐｉ）に、ブタの場合には０、４および６ｗｐｉに、採取した。サンプルを５６℃にて３０分間加熱して、血清中の補体因子を不活化した。合成ペプチドを含む製剤の免疫原性を、上述したように、固相抗原として対応するＦＭＤＶ  ＶＰ１抗原ペプチドを用いるペプチドベースＥＬＩＳＡによって評価した。連続希釈した実験動物の血清を試験し、陽性の場合の力価を希釈の逆数のＬｏｇ１０として表した。
血清陽性サンプルをグループごとにプールし、後述するようにＦＭＤＶの様々な単離株の中和活性を求めた。
【００９５】
ｅ．ＦＭＤＶウイルス
血清型ＡのＦＭＤＶ  Ａ１２およびＡ２４；血清型ＯのＯ１、Ｏ２、ＯＴａｉｗａｎ、ＯＯｚｋおよびＯＭｙａｎｍａｒ；Ａｓｉａ  １ｘｊ株；などを含む、ＦＭＤＶの様々な株を用いる負荷試験（以下の実施例で考察する）に、動物を供した。これらの実験で用いたＦＭＤＶ株は、単層のベビーハムスター腎臓（baby hamster kidney：ＢＨＫ）細胞内で増殖させ、ＵＳＤＡプラムアイランド動物疾病センター（Plum Island Animal Disease Center,USDA）（グリーンポート、ニューヨーク州）及び／又は台湾動物衛生研究所（National Institute of Animal Health,Taiwan：ＮＩＡＨＴ）において、封じ込め環境下で精製した。ウイルスはまた、工業的使用のために、中華人民共和国農業部の基準検査所（reference laboratory）である中国農業科学院蘭州獣医学研究所（PRC’s Ministry of Agriculture reference laboratory, Lanzhou Veterinary Research Institute of the Chinese Academy of Agriculture Sciences）からも、ペレットを１％ＳＤＳまたは１％ノニデットＰ−４０によって処理した後に１５〜４５％ショ糖勾配を通した遠心分離を行う、以前に記載された方法（Brown 1963）に基本的に従って得た。
各遠心管の内容物をポンピングによって２６０ｎｍに設定した分光光度計のフローセルに通過させ、精製したウイルスのピークを同定して単離した。
【００９６】
ｆ．中和指数としてのＦＭＤＶ中和活性の血清学的評価
動物から得た血液より血清サンプルを処理し、試験時まで−２０℃で保存した。上述のように調製した様々な血清型の一定分量（１０，０００ＭＰＤ５０）を用いて、ウイルス量を段階的に増加させたインプットに対する中和を決定することにより、１：１００に希釈した血清サンプルによって中和したウイルスの一覧を求めた。
血清サンプルを既述の方法（Morgan 1990）を用いて評価した。１：１００希釈によってＦＭＤＶのマイクロプラークが２．５  Ｌｏｇ１０減少したサンプルは、ＦＭＤＶ感染に対して高い防御免疫を有するとみなされた。
【００９７】
ｇ．ＦＭＤＶ特異性中和抗体アッセイ：標準的なベータ中和試験
標準的なベータ中和試験は、９６ウェルプレート内で、２倍連続希釈した各血清を１００または２００  ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）のＦＭＤＶと共に３７℃にて３０分間インキュベートすることにより行った。残ったウイルス活性を、新しい単層のＢＨＫ−２１細胞を含む９６ウェルプレート内で測定した。血清中和力価を、接種したウイルスの５０％を中和する血清希釈のｌｏｇ１０として測定した。
【００９８】
例えば、ＦＭＤＶ  Ｏ１ Ｔａｉｗａｎを中和する抗体の定量アッセイは、ＢＨＫ−２１細胞に対して、同じ２００μＬ量によって平底マイクロタイタープレート内で行った。個々の実験動物から、５０マイクロリットル（５０μＬ）の免疫前または免疫後の希釈血清を採取した。これらの血清を、２００  ＴＣＩＤ５０のＦＭＤＶ  Ｏ１ Ｔａｉｗａｎを含む５０μＬの一定分量と共に別々に混合した後、３７℃にて１時間インキュベートした。次に、２．５×１０５ＢＨＫ−２１細胞を含む１００マイクロリットル（１００μＬ）の培地（１０．０％ウシ胎仔血清を加えたＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ））を各アッセイに加えた。４８時間後に、培養中の細胞変性効果（cytopathic effect：ＣＥ）を鏡検した。力価は、２００  ＴＣＩＤ５０のウイルスによって誘導されたＣＥを５０％阻害する血清の最終希釈の逆数として表した。
【００９９】
ｈ．免疫原性試験に用いた動物
モルモット：免疫原性試験は、成熟した、無処置の、成体の雄および雌のDuncan-Hartleyモルモット（３００〜３５０ｇ／体重）において行った。実験では、一群あたり３匹のモルモットを用いた。
特定病原体が除去された（specific pathogen-free：ＳＰＦ）飼育場から入手した約４〜１２週齢のブタを、免疫原性試験のために耳に印をつけ、試験プロトコルに従って３〜５頭の子ブタ／群となるように群分けをした。
【０１００】
ウシ：地元の供給業者から入手した２〜６か月齢の健康な去勢牛を、試験プロトコルに従って３〜５頭の雌ウシ／群となるように群分けを行い、免疫原性試験を行った。ウイルス負荷試験に用いた動物は、バイオセイフティーレベル３の農学用封じ込め施設に収容し、試験開始前の１週間順応させた。
【０１０１】
ヤギ：地元の供給業者から入手した健康なヤギを用いて免疫原性試験を行った。
免疫前、個別の動物に由来する血清サンプルを、ＦＭＤＶ特異性中和抗体の存在について試験を行い、動物が予めＦＭＤＶのワクチンを接種されていないかまたはＦＭＤＶに感染していないことを確認した。これらの動物から採取した血清は、上記のＮＳ  ３ＢおよびＦＭＤＶ  ＶＰ１に対するＥＬＩＳＡアッセイを用いて評価を行い、動物がこれらのタンパク質に対する抗体を有していないこともさらに確実にした。
各動物は、種およびプロトコルに依存するが、ワクチン１投与あたり２５〜３００μｇで免疫化した。
【０１０２】
ｉ．組成物
各実験で用いた医薬組成物およびワクチン製剤を、後述の実施例に詳細に記載する。簡単に述べると、各試験群において特定される製剤は一般に、（１）配列番号１〜２３、２５〜３２から選択される単一のＶＰ１  Ｂ細胞エピトープクラスターペプチド免疫原；（２）配列番号１〜２３、および２５〜３２から選択されるホモログを含む、ＶＰ１  Ｂ細胞エピトープクラスターペプチド免疫原の混合物；または（３）配列番号３３〜９２から選択されるＦＭＤＶ内在性Ｔｈエピトープクラスターペプチドの混合物を追加した、配列番号１〜２３および２５〜３２から選択されるＶＰ１  Ｂ細胞エピトープクラスターペプチド免疫原の混合物；を含んだ。ペプチドは特定のアジュバント製剤中で乳化した。ワクチンは通常、合成ＦＭＤＶペプチド免疫原を約２５〜３００μｇ／ｍＬになるように水に溶解し、セピック・モンタニド（Seppic Montanide）ＩＳＡ  ５０Ｖ２を用いて油中水（ｗ／ｏ）乳剤に処方（容量により１：１）することにより、調製した。ワクチン製剤を室温にて約３０分間静置し、免疫前に約１０〜１５秒間渦流した（vortex）。
【０１０３】
何頭かの動物は、特定のワクチン製剤の２用量を０（刺激）および３ｗｐｉ（ブースター）に筋肉内（intramuscularly：ＩＭＯ）投与することによって免疫化した。これらの免疫化動物を試験し、ワクチン製剤に存在する合成ＦＭＤＶエピトープ免疫原の免疫原性を評価した。残りの動物を特定のワクチン製剤の単回投与によって免疫化し、該製剤に用いたペプチドが、ＦＭＤＶに対する緊急ワクチンとして適格である、十分な中和抗体反応を効率的に増大させ得るか否かについて評価した。
【０１０４】
実施例３
ＦＭＤＶ内在性ＴＨエピトープクラスターペプチドのスクリーニング用および同定用のＴ細胞機能アッセイ
Ｔ細胞機能実験の手順を、以下に詳しく述べる。
【０１０５】
ａ．末梢血単核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells：ＰＢＭＣｓ）の単離、凍結および解凍
ヘパリン処理した血液を回収し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅを用いる密度勾配遠心分離によってＰＢＭＣを単離した。リン酸緩衝食塩水（phosphate-buffered saline：ＰＢＳ）によって２回洗浄した後、１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ  １６４０から構成される細胞培養用培地にＰＢＭＣを再懸濁した。幾つかの実験のために、単離したＰＢＭＣを凍結して液体Ｎ２中に保存し、後にインビトロ培養のために解凍した。
【０１０６】
ｂ．血清ＩＦＮ−γの定量
サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、ブタ又はウシから採取した血清サンプル中のＩＦＮ−γを定量した。動物へのワクチン接種前およびＦＭＤＶ負荷前２１日目または２８日目にＩＦＮ−γを定量した。まず、Ｍａｘｉｓｏｒｂ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）の個別のウェルに、ウェルあたり０．５μｇの捕捉抗体（PBL Biomedical Laboratories、米国から購入）をコートしてアッセイを行った。固定化抗体がコートされていない部位は、各アッセイウェルに２００μＬのＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液を加えてブロックした。０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ２０）を、各回２００μＬ用いてプレートを４回洗浄した後、ＥＬＩＳＡ希釈緩衝液で個別に希釈（１０、２５および７５中に１）した血清サンプルをアッセイウェルに加えた。プレートを３７℃にて１時間インキュベートし、サイトカインを固相抗ＩＦＮ−γ捕捉抗体に結合させた。次にプレートをＰＢＳによって４回洗浄した後、アッセイウェルに、検出のための抗ＩＦＮ−γ抗体をウェルあたり０．２５μｇ加えた。３７℃における１時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、各試験ウェルにプロテインＡ複合物１００μＬを加えた。１時間のインキュベーション後に余剰の複合物を洗い流した後（ＰＢＳによって６回）、反応検出のために望ましい基質溶液を１００μＬ加えた。３０分後に、個々のアッセイウェルに１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４  ５０μＬを加えて発色を停止させ、４５０ｎｍにて吸光度を測定することによって色の強度を記録した。まず、各血清について得たＡ４５０の測定値を、希釈した組換えＩＦＮ−γ標準物質（PBL Biomedical Laboratories、米国）を同じ試験条件下でアッセイすることにより作成した検量線図と比較することにより、結果を算出した。ワクチン接種後２８日目の各動物における血清中のＩＦＮ−γ応答を、免疫前の動物に対して測定した値を差し引くことによって表した。最終結果は、血清中のｐｇ／ｍｌとして表した。
【０１０７】
ｃ．ＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ産生のアッセイ
ワクチン投与された動物のＰＢＭＣを、２．５×１０６細胞／ｍＬにて、２４ウェル培養プレート（Ｎｕｎｃ）の個々のウェル内で、選択したワクチン免疫原組成物１０．０μｇの存在下で培養した。抗原刺激のないＰＢＭＣのみを含むネガティブコントロール培養も行った。すべての培養は、５．０％  ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて３日間維持した。培養開始後３日目に上清を回収し、ＩＦＮ−γの含有量を上述した定量アッセイを用いて測定した。
【０１０８】
実施例４
ブタおよびウシ動物におけるＦＭＤＶ負荷の手順
負荷手順は、一般に、ＯＩＥ標準マニュアル（Manual of Standards）の口蹄疫の章に記載されるプロトコルに基づく。負荷手順に用いたＦＭＤＶ株には、Ｏ−１Ｔａｉｗａｎ（９９）、Ｏ−１Ｍｙａｎｍａｒ（０２）、Ｏ−１Ｏｚｋ（Ｃｈｉｎａ，９３）、Ｏ−１ＣａｍｐｏｓおよびＡｓｉａ  １（ＸＪ ｏｒ Ｊｉａｎｓｕ，Ｃｈｉｎａ，０５）が含まれる。中国で行われたブタへの負荷試験の手順を、農業部の指針に従い、筋肉内経路を介してＦＭＤＶウイルスを投与するように改変した。
【０１０９】
ａ．ブタ
動物において、標準化された感染防御用量（ＰＤ５０）（すなわち試験動物の５０％が保護された場合の投与量）を測定した。体重がほぼ４０ｋｇである１５頭のブタ（各群が５頭のブタを含むように、無作為に３群へと分けた）を用いて効力試験を行い、ブタにおけるＰＤ５０を決定した。３群には、それぞれ１用量、１／３用量および１／９用量の試験用ワクチン製剤を投与した。特定の製剤の効力を評価するため、例えば投与量が２×、１×、０．５×および０．２５×の用量となるように、投薬の改変も行った。加えて、１×用量による製剤の迅速なスクリーニングも頻繁に行った。
【０１１０】
ワクチン製剤の有効性を評価するため、実験計画および特定の試験時における動物の利用可能性に基づいて、１群あたり３頭（５頭の代わりに）のブタを含むように、ブタを群分けした。これら３群内のそれぞれのブタは、耳の後方に筋肉内（ＩＭ）経路を介してワクチンを接種した。記載するように、単回のワクチン接種から２８日後に、ワクチン接種した１５頭のブタおよび２頭のコントロールブタそれぞれに、ブタＦＭＤ  Ｏ型株由来の病原ウイルスを１，０００ＩＤ５０接種することによって負荷を行った。
理想的な実験では、モニター開始後１０日目のコントロールブタにおいて、少なくとも１の蹄に水疱性の病変部が見出されるはずである。また、ワクチン接種されたブタには、ワクチンによる防御が作用しなかった場合を除き、ＦＭＤの症状および徴候は観察されないはずである。負荷試験の結果に基づき、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法を用いてワクチン製品のＰＤ５０を算出した。発売のための品質試験に合格するためには、ワクチンの標的用量が最低でも３ＰＤ５０を含むものでなければならない。
【０１１１】
台湾では、台湾淡水区の動物衛生研究所（National Institute for Animal Health）のＰ３施設内部で、農業委員会（Council of Agriculture）の指針に従って、組織培養において予め力価を決定した１×１０５ＴＣＩＤ５０のＦＭＤＶ  Ｏ−１Ｔａｉｗａｎウイルス（中華人民共和国の指針に従ったウイルスの投与量より、少なくとも約１０倍多い）をブタ前脚の踵球内に接種することにより、ウイルス負荷を行った。１４日にわたる観察期間に、ＦＭＤの臨床徴候について実験動物をモニターした。これらの観察には、（１）毎日の体温の記録、（２）動物の脚における跛行の発生をモニターすること、および（２）動物の脚の蹄冠帯および鼻部に発生した水疱性の病変部をモニターすることが含まれた。負荷試験の結果に基づき、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法を用いてワクチン製品のＰＤ５０を算出した。ワクチン発売のためには、ワクチンの標的用量が最低でも３ＰＤ５０を含むものでなければならない。
【０１１２】
ｂ．ウシ
ウシでは、力価を決定し、総量１×１０４ＴＣＩＤ５０のＦＭＤＶ（ウシ感染単位（Bovine Infectious Unit：ＢＩＵ））を含むように調整した１ｍＬ（舌の１０部位それぞれに１００μＬ）のマセレート（macerate）の舌皮内（intradermolingual：ＩＤＬ）接種によってウイルス負荷を行った。動物に対しては毎日直腸温を測定し、病変部の出現時期、数および重症度に基づいた防御スコアを求めた。
完全な防御は病変部の完全な欠如（スコア０）として定義し、８未満のスコア値は部分的な防御であるとみなした。以下のように臨床スコアを算出した。
【０１１３】
ｉ）４０℃（スコア１）、＞４０．５（スコア２）、または＞４１（スコア３）の体温上昇、
ｉｉ）食欲減退（１点）、または食物を摂取せず、前日からの食物が残っている状態（２点）、
ｉｉｉ）跛行（１点）、または立つことを嫌がる状態（２点）、
ｉｖ）蹄冠帯を触診により熱および疼痛をみとめる（１点）または冒された脚によって立てない状態（２点）、
ｖ）冒された脚の数に依存し、最高４点である、脚にみられる小水疱、
ｖｉ）舌（１点）、歯茎もしくは唇（１点）、または鼻部（１点）により、最高３点である、目に見える口の病変部。
生きた動物を用いたすべての実験は、ＯＩＥ標準マニュアル、中華人民共和国農業部、または台湾農業委員会の指針の下に行った。特定の製剤の効力を評価するため、例えば投与量が２×、１×、０．５×および０．２５×の用量となるように、投薬の改変も行った。また、１×用量による製剤の迅速なスクリーニングも頻繁に行った。
【０１１４】
実施例５
ペプチド免疫原設計のための、アミノ酸フレーム構造として、ならびにＦＭＤＶ  Ｂエピトープおよび内在性ＴＨエピトープの位置としてＯＴＡＩＷＡＮ９９単離株の配列を用いる、ＦＭＤＶ単離株の完全ゲノム配列の比較解析
ＦＭＤＶゲノムの構成を通して概観した後、ＦＭＤＶ血清型ＯＴａｉｗａｎ９９のポリタンパク質アミノ酸配列を、ＦＭＤＶ抗原ペプチドの同定および設計の基礎として用いた。フレーム構造がいったん確立されたこれらのペプチドは、地域的な応用のため、複数の血清型の配列を代表するように調整可能である。ＦＭＤＶ  ＯＴａｉｗａｎ９９の配列と、以前に記載されたように（Carrillo 2005）対応するＧｅｎＢａｎｋ受託番号によってアクセスした七種の血清型すべてを代表する１０３のＦＭＤＶ単離株の完全ゲノム配列とのアラインメントにより、可変性および潜在的に生物学的関連のある新規なウイルスモチーフを機能的に制限する、高度に保存されたＦＭＤＶタンパク質領域を同定した。特に、ＦＭＤＶ  ＶＰ１タンパク質“ＲＧＤ”受容体結合部位周囲の配列およびそれらの血清型関連共通配列（すなわち、設計する特定の血清型のＦＭＤＶ単離株の配列比較に基づいたそれぞれの位置に、最も頻繁に出現するアミノ酸）は、Ｂ細胞エピトープクラスターペプチド免疫原設計のための青写真である一方で、高度に保存されたＦＭＤＶタンパク質領域は、ＦＭＤＶ内在性Ｔｈエピトープクラスターペプチド免疫原を設計する上での標的部位であった。実施例３に詳述する手順を用いた、血清学的アッセイおよび細胞学的アッセイの両方によるスクリーニング後、参照した一連のＢ細胞およびヘルパーＴ細胞エピトープクラスターペプチド（配列番号１〜１０２）を、図１および表１〜８に示す様々な株および血清型を代表するＦＭＤＶワクチン製剤への応用のために同定した。
【０１１５】
実施例６
ＦＭＤＶペプチドベースのワクチンの鍵となる成分であるＦＭＤＶ  Ｂ細胞エピトープクラスターペプチド免疫原の分析
ａ．設計の経緯
ワクチンまたは免疫治療用製品は、治療介入に必要な特定の疾病機構および単数または複数の標的タンパク質に基づいて、それら自身の設計の焦点およびアプローチを必要とする。設計は、疾病経路または幾つかのタンパク質が関連し得る感染病原体に関わる細胞タンパク質を含む可能性のある標的をモデルとして行われる。
【０１１６】
Ｂ細胞およびＴ細胞エピトープの同定および分布についてのこれまでの知識もまた、分子設計の過程に有益である。単数または複数の標的分子がいったん選択されると、詳細な血清学的検証が必要となる。続いて、小動物における連続的な免疫原性予備試験を行い、設計したペプチドのワクチン製剤によって誘発された抗体の機能的特性を評価する。その後、このような血清学的応用は、標的となる動物種において、ワクチンの免疫原性及び誘発された抗体の機能的特性のさらなる検証のために行われる。すべての試験は、免疫化宿主から評価のために採取した血清を用い、複数の並行群において行われる。標的種における早期の負荷試験もまた行い、設計の方向をさらに検証する。次に、様々に混合した標的ペプチドを調製し、それぞれの製剤設計のためにペプチドを組み合わせて用いる場合の、ペプチド構築物間の相互作用それぞれに関連する機能的特性のわずかな違いを評価する。さらなる評価の後に、最終的なペプチド構築物、ペプチド組成物およびその製剤を各製剤の物理的パラメータと共に確立して、最終的な製品開発過程へと進む。
広範な設計経験により、図２に示す発見から商品化までの、次世代ワクチン製品の開発が促進される。
【０１１７】
特定のＦＭＤＶペプチドおよび組成物の開発中には、以下の開発目標が考慮された。１）中和抗体を広範に誘発するために十分なＶＰ１ループドメイン標的部位を同定すること、２）免疫系に対して最適に提示されるペプチド標的部位を設計すること、３）ブタおよび反芻動物である標的種に免疫効力を与えるＵＢＩＴｈ（登録商標）部位を選択すること、４）これらの重要な構成要素を、高いコスト効率で産生可能なペプチド免疫原の設計に取り入れること、および５）防御免疫のためのワクチン製剤、用量サイズ、および免疫プロトコルを開発すること。ＦＭＤＶペプチド免疫原の分析および評価の全般的なゴールは、ＦＭＤＶ配列データベースおよび分子モデルの集中的かつ経験的な調査と、それに続く、動物免疫用ワクチン製剤のための多数の候補免疫原の合成を必要とした。ブタ及びウシに組成物および製剤を単回投与し、その後にウイルスを負荷した際にブタおよびウシが効果的に保護されるか否かを調べるため、総数８３１頭のブタおよび８６０頭のウシを免疫原性試験および中和抗体力価試験に供した。全部で、ブタには２５試験、およびウシには３２試験を行い、さらに本発明の発展に関わるモルモットおよびヤギに対する初期試験も行った。
【０１１８】
ｂ．最も潜在能力あるＶＰ１ループドメインの標的の同定
ＦＭＤＶに対して有効なペプチドワクチンに決定的な要素は、中和抗体の産生を誘発するＢ細胞エピトープが最適に提示される正確な配列をＶＰ１のＧ−Ｈループドメインから選択することである。ペプチド免疫原によるドメインの提示に最適なフレームは、単一のアミノ酸の位置ほどの小さなシフトによって影響され得る。ＶＰ１カプシドタンパク質の立体構造の入手可能な分子モデルを調べ、この超可変領域内の配列の比較を評価することにより、合成免疫原がＶＰ１との良好な交差反応性を示すためには、ループドメインの延長された部分を含まなければならないということが分かった。
【０１１９】
表８に示すように、血清型ＡのＦＭＤＶ  Ａ１２の配列に基づき、ａａｌ３４〜１５９又はａａｌ３４〜１６９をカバーする、ＶＰ１標的部位を有するペプチド免疫原を産生した。ペプチドの免疫原性を、ペプチドのみを含む組成物において、又はＴ細胞補助（help）を補足するためのＦＭＤＶ内在性Ｔｈエピトープもしくは外来性のＴｈエピトープを含んだ組成物において測定した。免疫原性アッセイは、ループ構造を安定化させるための環状構造をもつペプチドおよびもたないペプチドに対しても行った。ペプチドの環化は、特定の位置のアミノ酸残基をシステイン残基によって置換し、ジスルフィド結合を形成することによって促進された（例えばＶＰ１の位置１３４（Ｎ−＞Ｃ）および１５８（Ｑ−＞Ｃ））。
【０１２０】
様々なペプチドを含む組成物を、モルモットの免疫効力に対して評価した。表９は、様々なペプチドの評価から得た実験結果を提供する。表９は次の事項を示す：
ｉ．比較的長いペプチド構築物は、より良い中和応答を提供した。例えば、配列番号９７は、配列番号９６と比較して、より良い中和応答を提供した。また、標的部位を１２９残基に延長した場合にも（配列番号９９）、一部の応用には有用であることが証明された。
ｉｉ．環化ペプチドは、この構造を持たないペプチドと比較して、より高い中和活性を提供した。例えば、環状ペプチド配列番号９８は、配列番号９７と比較して、より高い中和活性を提供した。
ｉｉｉ．ＦＭＤＶ  ＶＰ１ドメインと連結した人工ＴｈエピトープＵＢＩＴｈ（登録商標）（配列番号２４）由来のＴｈ部位により提供された外来性Ｔｈは、このエピトープを含まない構築物よりも中和効率を上昇させた。例えば、配列番号１００は、配列番号９９、９８、９７及び９６と比較して、より良い中和活性を提供した。
ｉｖ．免疫原性は、組成物中に外来性Ｔｈエピトープを加えることによって、さらに増強された。
これらの結果に鑑み、アミノ酸１２９から１６９までの延長されたＶＰ１標的部位を含む環状ペプチド（例えば配列番号９９）に最も免疫増強効果があると結論付けた。
【０１２１】
ｃ．血清型特異的なＶＰ１標的部位の設計
英国パーブライト（Pirbright, UK）の世界参考実験室（the world reference lab）により提供された、世界的なＦＭＤＶに対するＦＭＤＶ配列データベースを検索して、血清型Ｏ、Ａ、Ａｓｉａ、Ｃおよびその他に由来する亜型の様々なＶＰ１ループドメイン（アミノ酸１２９〜１６９）を得た。その後、表２に示すように各位置の共通アミノ酸を設計した。一つの位置に複数のアミノ酸を有する、表８に示すようなコンビナトリアルライブラリー標的配列（配列番号１０１および１０２）も作製し、ＶＰ１ループドメインの抗原可変性がさらに広く包含された。
単一の共通配列（表１１、配列番号２５）を用いた免疫原性試験をコンビナトリアルライブラリーの標的（表１０、配列番号９８および９９）を用いた免疫原性試験と比較すると、ＶＰ１ベースのＥＬＩＳＡによる免疫原性の力価によって、およびそれぞれの血清型のＦＭＤＶ株に対する中和指数によって判定されたように、共通配列は、これら二つのアプローチに対して、血清型がカバーする広さにわたって同じように有効であることがわかる（表１０および１１）。したがって、製造およびＱＣを容易にするため、標的のＶＰ１部位を環化させた単一の共通配列と、地域的な必要性に基づいて特定の血清型から選択した幾つかの特定のＶＰ１配列とを、配列番号２〜２３および２５〜３３に示すように選択した。
【０１２２】
ｄ．ＶＰ１の免疫原性を増強させるための潜在能力あるＴｈエピトープの選択
以前の研究者たちは、ＶＰ１２１〜４０エピトープのようなＦＭＤＶ抗原内のＴｈ部位を同定し、これらを合成ＶＰ１免疫原の設計に取り入れた。しかしながら、ブタおよびウシにおける免疫原性試験によれば、標的種ではこれらの乱交雑が制限されており、かつ遺伝的制限があるため、これらのＦＭＤＶ内在性Ｔｈ部位は、ＶＰ１免疫原性を増強させるために完全に有効ではないことがわかった。したがって、部分的に有効なＦＭＤＶ  Ｔｈエピトープを用いず、これをさらに潜在能力あるＵＢＩＴｈ（登録商標）人工Ｔｈエピトープに置き換えて、ＦＭＤＶ  ＶＰ１ループペプチド免疫原を増強させた。人工ＵＢＩＴｈ（登録商標）部位には、遺伝的に多様な集団の様々なＴ細胞応答性に適応するように設計されたコンビナトリアルライブラリーのＴｈの位置のようなＴｈモチーフが組み入れられている。このようなＴｈエピトープの変更により、同種のＦＭＤＶに対する潜在的なメモリー応答（曝露された場合）は失われたが、より広く、さらに潜在能力ある免疫応答がもたらされた。人工ＵＢＩＴｈ（登録商標）配列（配列番号２４）がもつ免疫効力は、ブタを含む複数の種において証明された。
【０１２３】
表１０に要約する、実験に用いた構築物として、人工ＵＢＩＴｈ（登録商標）部位（配列番号２４）、スペーサとしてのイプシロンリジンおよびコンビナトリアルライブラリー（配列番号１０１および１０２）として設計された、血清型Ｏまたは血清型Ａｓｉａのいずれかのアミノ酸の位置１３４ないし１６９に由来する環状ＶＰ１標的部位が挙げられた。免疫化したモルモットの抗体および中和応答（中和指数として示す）によって示すように、両方の構築物は免疫原性であった。
表１１は、共通Ｏ配列（配列番号２５）と共に、イプシロンリジンスペーサを介してアミノ酸の位置１２９〜１６９由来の環状ＶＰ１標的部位に連結するＵＢＩＴｈ（登録商標）部位（配列番号２４）を有する、類似の血清型Ｏ免疫原に対するモルモットの応答性を示す。Ｏ共通配列を含むこのＶＰ１構築物はまた、初回免疫後３週間という早期にみられる、潜在能力ある広範な中和抗体応答によって証明される、強い免疫原性も示した（表１１）。
【０１２４】
ｅ．予想外に広範囲の中和応答
表１０および１１に示すように、モルモット免疫血清の中和活性を分析すると、予想外に広範囲の中和が見られた。具体的には、配列番号１０１および２５の血清型Ｏ免疫原によって二つのＯ亜型に対する中和抗体が誘発され、また、血清型ＡおよびＡｓｉａに由来する亜型に対する中和もみられた。これらの結果は、ＵＢＩＴｈ（登録商標）ＦＭＤＶ免疫原では、個別の免疫原が複数の血清型に対して潜在的に広く有効であることを示唆している。
このように広範囲な血清型の中和は、表１２に示す幾つかの免疫原（配列番号２５、２７、および２８の三つのペプチド混合物を含むＵＢＩ  ＦＭＤＶ  Ｏワクチン）を単一のワクチン内に組み合わせた場合にもみられ、これによって免疫し、かつ負荷したブタの血清は、ＯＴａｉｗａｎ、ＯＭａｎｉｓａ、ＯＣａｍｐｏｓおよびＯＭｙａｎｍａｒに対する広い中和指数を呈した。
【０１２５】
ｆ．ブタにおける免疫／負荷試験
標的種であるブタにおける別々の３回の免疫／負荷試験において、第１のユナイテッド・バイオメディカル社（ＵＢＩ）ＦＭＤＶ用合成ペプチドワクチンであるＵＢＩＴｈ（登録商標）ＦＭＤＶ−Ｏワクチンが、ＦＭＤＶ  Ｏ１Ｔａｉｗａｎ株での感染負荷に対して防御的であることが証明された。試験は、台湾動物衛生研究所（National Institute of Animal Health,Taiwan：ＮＩＡＨＴ）およびＵＳＤＡプラムアイランド動物疾病センター（Plum Island Animal Disease Center：ＰＩＡＤＣ）を含む別々の３施設で行われた。
これらの試験結果を表１３にまとめる。第１群〜第４群は、ＵＢＩＴｈ（登録商標）ＦＭＤＶ−ＯＣｏｎｓｅｎｓｕｓ（配列番号２５、ペプチド２５７０）ワクチンを２回投与した。用量範囲は２５、５０、１００ないし３００μｇであった（第１群〜第４群）。第５群〜第７群はプラセボコントロールとした。
【０１２６】
すべてのブタの踵球内に、１０４．５ＴＣＩＤ５０のＦＭＤＶ  Ｏ１Ｔａｉｗａｎ（ウイルスは、ベビーハムスター腎臓細胞またはブタのいずれかにおいて増殖させた）を注射によって負荷した。ブタへの負荷は、最終免疫後、２〜１０週間の間隔をおいて行った。ＵＢＩＴｈ（登録商標）によって免疫化した１５頭のブタを含むすべてのブタは保護されていた。ＵＢＩＴｈ（登録商標）によって免疫化したブタの防御免疫は１０週目まで持続した。中和抗体力価によって示されるように、実験的に免疫化したブタでは最終免疫後２０週目まで防御免疫がみられるが、負荷していないブタではそうではないことも証明された。
ワクチン投与された動物はすべて中和抗体の血清濃度が高く、負荷から保護された。別々の３試験で用いたウイルス負荷用ストックの感染力は、プラセボを用いたブタの感染率が１００％であることによって設定した。３試験すべての結果はこれに従って確認された。得られた結果に鑑みると、用量サイズ２５μｇのＵＢＩＴｈ（登録商標）ＦＭＤＶ−ＯＣｏｎｓｅｎｓｕｓ（配列番号２５、ペプチド２５７０）ワクチンを用いてわずかに２回免疫化しただけで、完全な防御免疫が得られた（第１群）。
【０１２７】
ｇ．負荷されたブタにおける防御免疫の範囲
別の負荷試験では、３種のＶＰ１  Ｏ構築物（それぞれ配列番号２５、２７および２８によって表される２５７０ａ  共通、Ｏｏｚｋ／９３、ＯＭｙａｎｍａｒ株由来の配列を含む）を同量で含むＵＢＩＴｈ（登録商標）ＦＭＤＶ  Ｏワクチンを投与あたり２５μｇ用い、０週目および３週目において２回投与した。６頭のブタはすべてが同じようにＦＭＤＶ  Ｏ１Ｔａｉｗａｎを負荷され、すべてが保護された。負荷試験のために免疫化した６頭のブタから血清を回収し、広く流行しているＦＭＤＶ  Ｏの亜型である、Ｏ１Ｔａｉｗａｎ、ＯＭａｎｉｓａ、ＯＭｙａｎｍａｒおよびＯｃａｍｐｏｓに対する中和抗体について調べた（表１２）。すべてのブタは、ＯＭａｎｉｓａ、ＯＭｙａｎｍａｒおよびＯｃａｍｐｏｓに対しても強い中和応答を示す、安定した免疫（solid immunity）としてふさわしい程度のＯ１Ｔａｉｗａｎに対する中和抗体を産生していることから、血清型Ｏの亜型全体に対する防御免疫の傾向が示唆される。
【０１２８】
ｈ．反芻動物における免疫原性
ＵＢＩＴｈ（登録商標）ＦＭＤＶ−Ｏ  ＯＣｏｎｓｅｎｓｕｓ（配列番号２５、ペプチド２５７０）ワクチンの免疫原性を、反芻動物種において、１２頭のヤギに対する免疫原性試験によって示した。ヤギは、０週目及び８週目の２回投与、または０、４及び８週目の３回投与のいずれかで、免疫化した。用量は、３０μｇ、１００μｇ、又は３００μｇであった。有効性は、ＦＭＤＶ  Ｏ１Ｔａｉｗａｎに対する中和抗体の血清濃度を測定することによって評価した。防御効果が予想される中和抗体濃度は、８週目の最終免疫後１２週間（すなわち試験期間の２０週間を通して）得られた。２回投与および３回投与スケジュールの双方は同程度に有効であり、３０μｇ用量は３００μｇ用量と同様に有効であった。このように、ブタにおける防御免疫のために使用した用量サイズおよびワクチン製剤と同じものを用いて、２回投与又は３回投与のＵＢＩＴｈ（登録商標）ＦＭＤＶ−Ｏワクチンを標的となる反芻動物種に投与した際に、免疫原性がみられた。
【０１２９】
ｉ．知見についての結論および解釈
上述の実験から得られた結果は以下のように要約することができる：
３か所の国際的研究施設にて４実験群によって行われた試験によれば、ＵＢＩＴｈ（登録商標）ＦＭＤＶ  ＶＰ１ベースのＯワクチン（配列番号２５）は、投与あたり２５、５０、１００および３００μｇ用いて２回免疫化した後で、このワクチンを投与されたブタを全て（１５／１５）、ＦＭＤＶ  ＯＴａｉｗａｎの負荷から効果的に保護した。コントロール動物は全て（１０／１０）、ウイルス負荷の２日目までに感染した。
ＶＰ１  Ｏ構築物の混合物を含むＵＢＩＴｈ（登録商標）ＦＭＤＶ  Ｏワクチン（同じ比率の配列番号２５、２７および２８を、投与あたり２５μｇ、初回免疫後０週目および３週目に２回投与した）は、ブタにおいて、ＯＴａｉｗａｎ、ＯＣａｍｐｏｓ、ＯＭｙａｎｍａｒおよびＯＭａｎｉｓａを含む複数のＦＭＤＶ  Ｏ単離株に対して広範な防御作用を示す中和抗体を誘発した。
【０１３０】
ＵＢＩＴｈ（登録商標）ＦＭＤＶ  Ｏワクチンは、反芻動物種であるヤギにおいて、ブタと同等の免疫原性を示した。この結果は、本ＵＢＩ製剤が、ブタにおける免疫原性の用量範囲と同程度の用量範囲においてウシにも有効であることを予想させるものである。
個々のＵＢＩＴｈ（登録商標）合成ＦＭＤＶ免疫原は、モルモットにおいて、血清型Ａ、ＯおよびＡｓｉａ  １に対する中和抗体を同時に誘発した。これらから、複数の血清型にわたる予想外に広範囲の潜在的な有効性が示された。
血清型ＯＣｏｎｓｅｎｓｕｓ配列を用いたＵＢＩＴｈ（登録商標）ＦＭＤＶ  Ｏペプチドは、中和指数により測定した、血清型Ａ、Ａｓｉａ  １およびＯに由来する亜型を含む複数の血清型に対する中和抗体を誘発することができる。
【０１３１】
ＵＢＩＴｈ（登録商標）ＦＭＤＶワクチン免疫原は、「機能的部位」を標的とした、事実上の合成品である。処方されたワクチンは安全、潜在能力があり、広範囲に中和可能、再現可能、かつ安定であるため、産生および品質管理に関連した困難および従来の死滅ウイルスによるワクチンにみられる不都合が回避される。
完璧に安全で化学的に規定されたワクチンが利用できることにより、ＦＭＤが発生していない状態に近い地域であっても、ワクチン接種の奨励によってＦＭＤＶの根絶が促進される。
【０１３２】
実施例７
ＦＭＤＶペプチドベースの多価ワクチンを地域的な必要性に合わせるための鍵となる成分である、合成ＦＭＤＶペプチド免疫原のペプチドホモログ
口蹄疫ワクチンは、家畜に関する生物学的事業全体の売上げの２６．４％と、伝統的に世界中の獣医学ワクチン市場の最も大きなシェアを占める。ＦＭＤＶ血清型および亜型の高い可変性のため、伝統的なウイルスライセートベースのＦＭＤワクチンの抗原組成物は、世界の特定の地域、多くの場合にはその中の特定の国または地域に適合される。現在、ＦＭＤ流行地におけるワクチンの使用には、（１）標的地域に広まっている単数または複数の株に対してワクチンが有効であるか否かを決定するため、および（２）ワクチンの実際の特性が制御と根絶に適していることを保証するために、疾病疫学の詳細な検討およびワクチンの協調性試験が必要とされる。
【０１３３】
分子ウイルス学の登場により、口蹄疫ウイルスのカプシドタンパク質ＶＰ１配列の大部分は、全国的調査の実施に従って提出されたＦＭＤの症例の組織サンプル、ならびにＦＭＤＶの大流行時に採取した複数の組織およびプロバング（probang）サンプルより得たウイルス単離株から、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって容易に増幅できる。同定されたＶＰ１配列は、アラインメントに用いることができる。アラインメントには、指定されたその他の単離株に遺伝的関連をもつ血清型の配列が含まれる。標的地域に広まっている単数または複数の株のＶＰ１配列は、本発明の開示において確立されたアミノ酸のフレーム構造（ＶＰ１  １２９〜１６８）、ならびにＦＭＤＶが大流行している地域で同定されたＶＰ１配列を表す、このフレーム構造に対するペプチドホモログ（表２、配列番号２〜２３）およびこのように設計されたＶＰ１ペプチドホモログ（表３、配列番号２５〜３３）に基づいて容易に取得することができ、これらのＶＰ１配列をワクチン製剤に含有させて特定地域の必要性に適合させることで、制御および根絶のために確実に適したものとすることができる。
【０１３４】
２以上の投薬を投与した際に鍵となる成分である、合成ＦＭＤＶペプチド免疫原に由来するペプチドホモログを含有する特定の製剤（ＶＰ１  ａａｌ２９ないしａａｌ６８を有する）としては、表１４に示す以下の例が挙げられる。
（ａ）ペプチドホモログ（配列番号２５）を有する一価ブタＦＭＤＶ血清型Ｏワクチン、
（ｂ）２種のペプチドホモログ（配列番号２５及び２８）を等重量比で混合した二価ブタＦＭＤＶ血清型Ｏワクチン、
（ｃ）３種のペプチドホモログ（配列番号２５、２７及び２８）を等重量比で混合した三価ブタＦＭＤＶ血清型Ｏワクチン、
（ｄ）アジアにおいて使用するため、２種のペプチドホモログ（配列番号２５及び２９）を等比で混合した二価ウシ／反芻動物ＦＭＤＶ血清型Ｏ及びＡｓｉａ  １ワクチン、
（ｅ）中国において使用するため、等比で混合した三価ウシ／反芻動物ＦＭＤＶ血清型Ｏ、Ａｓｉａ  １ＪｉａｎｓｕおよびＡＧａｎｓｕワクチン（配列番号２５、２９及び３１）、
（ｆ）ブラジルにおいて使用するため、等比で混合した三価ウシ／反芻動物ＦＭＤＶ血清型ＯＣａｍｐｏｓ、Ａ２４及びＣＩｎｄａｉａｌワクチン（配列番号２６、３０及び３２）、
（ｇ）アルゼンチンにおいて使用するため、等比で混合した三価ウシ／反芻動物ＦＭＤＶ血清型ＯＣａｍｐｏｓ、Ａ２４／Ａｒｇｅｎｔｉｎａ  ２００１およびＣＩｎｄａｉａｌワクチン（配列番号２６、３０、３３及び３２）。
【０１３５】
最終的なワクチン製剤に使用するために設計したペプチドホモログの適合性は、相対的な免疫原性および異なる単離株に由来するＦＭＤＶ  ＶＰ１抗原への交差反応性を、実施例１に記載するように特異的なＦＭＤＶ  ＶＰ１配列ベースのペプチドＥＬＩＳＡを用いて検出することによって評価できる。
表１５〜表１７に示すように、ＶＰ１ホモログベースのワクチン製剤（ａ）〜（ｇ）（配列番号２５〜３３のホモログを含有する）は、特定の地域的な必要性（例えば中国、東南アジア、ブラジルおよびアルゼンチン）を満たすものである。具体的には、これらの製剤によって、標的の血清型（例えばＯＴａｉｗａｎ、ＯＣａｍｐｏｓ、ＯＯｚｋ、ＯＭｙａｎｍａｒ、Ａｓｉａ  １、ＡＧａｎｓｕ、Ａ２４、ＡＡｒｇｅｎｔｉｎａ  ２００１、ＣＩｎｄａｉａｌ）のＶＰ１配列に対する所望の免疫原性が提供される。また、限定はされないが血清型ＯＴａｉｗａｎを含む標的の血清型に対する中和抗体の誘発能によって示されるように、これらのＦＭＤＶワクチン製剤には機能的な免疫原性も観察された（実施例６、表１２に記載される）。ワクチン製剤中に使用された、ＦＭＤＶ中和抗体を誘導するＶＰ１ベースのＢ細胞成分の総量は、免疫スケジュールにおいて２回投与を行う際、投与あたり２５μｇという低量であってよい。
【０１３６】
実施例８
ＶＰ１タンパク質に由来するＢ細胞エピトープクラスターペプチドのみを含むＦＭＤＶワクチン製剤は、ＦＭＤＶウイルス負荷に対し、単回投与による緊急ワクチンとしては不適である。
実施例７に記載するように、合成ＦＭＤペプチドホモログを含む特定の製剤を調製した。これらの製剤は、ブタ及びウシ／反芻動物のＦＭＤＶワクチンにおいて２回以上を投与した後、ＦＭＤＶ中和免疫応答を誘発することができた。しかしながらこれらの製剤は、ＯＩＥのウイルス負荷手順によって要求されているように、製剤の単回投与によってＦＭＤＶウイルス負荷からブタおよびウシを一貫して保護することはできない。これらの製剤は、単回投与によってＦＭＤＶ負荷から動物を完全に保護することができないため、ＶＰ１ペプチドホモログベースのＦＭＤＶワクチン製剤を商品化することへのハードルは高い。
【０１３７】
すべてのＶＰ１ホモログベースのワクチン製剤における中和抗体発生の動態についての詳細な検討により、中和抗体力価は、単回投与後４週目まで低いままであるか、またはバックグラウンド力価（＜＝３）に近いことが明らかになった（図３Ａおよび３Ｂ）。ブタ及びウシの双方の中和抗体力価は、初回投与後４週目に行った２回目の投与後、６週目に著しく上昇した（図３Ａ及び３Ｂ、並びに表１５〜表１７）。高力価の中和抗体の産生が遅延することにより、ＶＰ１ベースのペプチドワクチンにおいて特定の免疫応答要素が欠如（又は量が減少）していることが示唆される。このような要素の欠如／減少は、緊急ワクチンとしての防御作用を増大することが可能な、ＦＭＤＶウイルスライセートベースのワクチンにみられると考えられる。
【０１３８】
単回投与後の完全な防御免疫反応に必要とされる、ウイルスへの曝露後にウイルス複製を著しく減少させる刺激および迅速な想起応答は、ＶＰ１ホモログベースのワクチン製剤にはない要素であると考えられる。外来性のＵＢＩＴｈ（登録商標）エピトープがＶＰ１ペプチドホモログと連結している場合、図３Ａ及び３Ｂ並びに表１５〜表１７に示す中和抗体力価の著しい上昇によって証明されるように、２回投与以上の使用後に強力なヘルパーＴ応答が引き起こされる。しかしながら、緊急ワクチンは、ワクチン製剤の単回投与後に動物の免疫系を迅速かつ十分に刺激して、ウイルス負荷後に素早く想起応答を起こすことに効果的でなければならない。
【０１３９】
以下の実施例に、ＦＭＤＶに由来するＢおよびＴエピトープの複数成分を含有するワクチン製剤の使用によって、即効型のＴ細胞応答を評価する実験について記載する。
【０１４０】
実施例９
単回投与緊急ワクチンのための、ＢおよびＴエピトープベースの複数成分ＦＭＤＶワクチン製剤の原理、スクリーニング、同定および最適化
実施例８に記載したように、ＦＭＤＶ  ＶＰ１由来のＢ細胞エピトープクラスターペプチドのみの組み合わせを用いた緊急ＦＭＤワクチン製剤の開発が繰り返し試みられてきたが、単回投与での初回免疫後３ないし４週目に、高力価の中和抗体を常に産生させることはできなかった。このように、これらの製剤によって、ＦＭＤＶを負荷された動物を保護することはできなかった。高い効力をもつ緊急ＦＭＤワクチンの開発を成功させるために必要な免疫学的要素を同定するために、さらなる努力が為されてきた。
【０１４１】
市販のＦＭＤウイルスライセートベース緊急ワクチンは、ブタナイーブγδＴ細胞の増殖を誘導し、これらのブタナイーブγδＴ細胞は、ＦＭＤワクチンウイルス抗原への曝露後に様々なサイトカイン／ケモカインｍＲＮＡを発現する。効力の高い緊急ＦＭＤワクチンを投与された動物にみられる明らかな変化のひとつは、ＩＦＮ−γを含むサイトカインの高濃度な全身的産生である（Cox 2003）。ＦＭＤウイルスの負荷から回復した直後の、ＦＭＤにより免疫されたブタ（ワクチン投与され、ウイルスを負荷された動物）から得たＰＢＬをインビトロでＦＭＤＶ抗原によって刺激すると、増殖している亜集団は主にγδＴ細胞であったことから、このようなγδＴ細胞の増殖が、特定のウイルス感染の特徴であることが示唆された。γδＴ細胞とＭＨＣクラスＩＩ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞との間の、細胞と細胞の直接の相互作用が、はっきりとしたシナプス形成を示す細胞クラスターとして観察され、このような相互作用によりもたらされるＴ細胞の増殖は、ＭＨＣクラスＩＩおよびＣＤ４に対するモノクローナル抗体によって遮断できることから、ＭＨＣクラスＩＩを介したγδＴ細胞による抗原提示能が示唆される（Takamatsu 2002）。炎症および差次的なサイトカイン産生の誘導に対するγδＴ細胞の関与によって、自然免疫および獲得免疫応答の両方を免疫調節および制御する、γδＴ細胞の重要な役割が明らかになった。これらの細胞は、専門的な抗原提示細胞（Antigen Presenting Cells：ＡＰＣ）としての特色を有し得る。γδＴ細胞は、ウイルスライセートベースの、効力の高い緊急ＦＭＤワクチン中のＦＭＤＶ抗原に対する迅速な免疫応答に関わることから重要であり、ＦＭＤＶ内在性Ｔｈエピトープクラスターペプチドを介したＴ細胞活性化の指標としてのＩＦＮ−γ産生をインビトロ測定することを通して、本発明者らによる合成ペプチドベースの、効力の高い緊急ＦＭＤワクチン中に１以上のＦＭＤＶ内在性Ｔエピトープクラスターペプチドを含めるための設計、スクリーニングおよび選択について広く評価することが促される。
【０１４２】
実施例３に詳述する特異的なＴ細胞機能アッセイは、（ａ）ＦＭＤＶウイルスライセートワクチンおよび（ｂ）候補となるＦＭＤＶ  Ｔｈペプチドを含むペプチド製剤によって免疫化した宿主に由来するブタおよびウシのＴ細胞によって認識される、ＦＭＤＶタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂおよび３Ｄの抗原性部分に由来するＦＭＤＶ内在性Ｔｈエピトープクラスターペプチドをスクリーニングおよび同定するために用いた。
【０１４３】
ａ．免疫Ｔ細胞活性化開始の指標としてのＩＦＮ−γ産生をインビトロ測定することによる、ブタおよびウシにおけるＦＭＤＶ内在性Ｔｈクラスターペプチドの同定
インビトロ刺激の際、ＦＭＤＶ内在性Ｔｈエピトープペプチドを含む製剤で免疫化した動物から得たＴ細胞はＩＦＮ−γを放出し、ＦＭＤＶ中和抗体の産生を一貫して増大した。このようなアッセイの再現は非常に容易であるため、効力を評価するための確実なスクリーニングアッセイとして、かつ最終的なＦＭＤＶワクチン製剤中に含有させるＦＭＤＶ内在性Ｔｈエピトープクラスターを同定するために用いられている。
【０１４４】
Ｔ細胞エピトープクラスターペプチド免疫原の設計は、最初に、ＦＭＤＶ  ＯＴａｉｗａｎウイルスライセートワクチンによって免疫し、後に負荷を行って回復したブタおよび雌ウシから得た末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を培養した際にＩＦＮ−γ応答を誘導する、ＭＨＣクラスＩＩ結合モチーフのクラスター配列を有するペプチドを試験することによって行った。このスクリーニングにより、低い、中程度のおよび高いＩＦＮ−γ産生を誘導するペプチドを、さらなるスクリーニングおよびこれを含有するワクチン製剤の設計のために群分けした。図１は、実施例１および３に記載する方法によって同定し、次にワクチン製剤へ応用したＦＭＤＶ  ＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄタンパク質上の、選択したＢ細胞および内在性Ｔ細胞エピトープの分布／局在を示す。
【０１４５】
ＦＭＤＶ  ＯＴａｉｗａｎ９９株に由来するＴ細胞エピトープクラスターペプチドそれぞれの配列を表４に同定した（配列番号３４〜６３）。ＦＭＤＶ  Ｔｈペプチドを、表５に示すように（配列番号６４〜７８）、その他のＦＭＤＶ株由来の相同なＦＭＤＶヘルパーＴエピトープ配列とのアラインメントを行った。個々のヘルパーＴペプチド免疫原のＮ末端に三つのリジン残基（ＫＫＫ）を付加し、どちらかといえば疎水性であるこれらのペプチド抗原の溶解度を改善した。同定したＴｈペプチド免疫原の幾つかまたはすべて（配列番号３４〜８７）を同じ重量比で含むＴ細胞クラスターペプチドのプールを、ワクチン製剤中のＶＰ１ペプチドホモログの混合物に添加して、ブタおよびウシ両方における、ＦＭＤＶ  Ｂ細胞クラスターペプチド免疫原の免疫原性をさらに増大させた。これらのワクチン製剤は、単回投与後のインビボ保護効率の目安として０週目および３週目の中和抗体力価をインビトロ測定／評価する、大規模な実験に用いた（表１８、１９）。これらのプールしたＦＭＤＶ  Ｔｈペプチドは、細胞介在性免疫のためのＦＭＤＶ  Ｔ細胞ペプチド免疫原としても作用することができる。
【０１４６】
多様な遺伝的背景を有する動物に対してＴ細胞エピトープがカバーする範囲をさらに広げるため、９種のＴエピトープ特異的な相同配列（表１９、第７群、配列番号７９〜８７）それぞれに基づいたコンビナトリアルペプチドも設計した。同様に、三つのリジン残基（ＫＫＫ）をコンビナトリアルＴエピトープクラスターペプチド免疫原それぞれのＮ末端に付加し、さらなる製剤使用のために水溶性を改善した。これらのＴエピトープクラスターコンビナトリアルペプチド免疫原のプールもまた、ＦＭＤＶ  ＶＰ１  Ｂ細胞エピトープクラスターペプチド免疫原の免疫原性をさらに増強させるたためにワクチン製剤の補助剤（supplement）として用いるか、それ自体で細胞介在性免疫のためのＦＭＤＶ  Ｔ細胞ペプチド免疫原として用いた（表１９）。
【０１４７】
広範な試験を通して得た好ましいＦＭＤＶ内在性Ｔｈクラスターペプチドのリストは、ブタに対しては配列番号６１〜６３、ウシに対しては配列番号３４〜６０である。これらの短いペプチドは、ＴｈエピトープクラスターペプチドのＮ末端にリジン残基（例えばＫＫＫ）を付加して可溶性にすることができる。これらのペプチドの免疫原性は、コンビナトリアルライブラリー配列の設計に用いた単数または複数の血清型（例えばＯ、Ａｓｉａ  １、Ａ、Ｃ、など）に基づく各Ｔｈエピトープを用いてコンビナトリアルペプチド配列を作製すること、およびＦＭＤＶ  Ｔｈ構築物の結合体として、カセット型内にある選択した個々のＦＭＤＶ  Ｔｈクラスターペプチド（単一配列またはコンビナトリアル配列として）をＵＢＩＴｈ（登録商標）エピトープ（配列番号２４）へさらに連結させることによって増大させることができる。これらの特色を含む代表的な配列を、表７に配列番号８８〜９５として示す。
【０１４８】
ウシの特に多様な遺伝的背景のため、最適化されたＦＭＤＶ  ＢエピトープクラスターＶＰ１ペプチドを既に含んでいるワクチン製剤を投与された動物において、抗原特異的なＴ細胞応答を開始させることのできるペプチドの大きなプールに由来する予め選択したＦＭＤＶ内在性Ｔｈペプチドの様々な組み合わせによる一般的な免疫原性を試験した（表１９）。このようなワクチン製剤を単回投与された動物における抗原特異的なＴ細胞応答の開始能は、ブタおよびウシの両方において中和抗体の力価を著しく上昇させることの可能なワクチンによって例証される（表１８及び表１９）。ＦＭＤＶ内在性Ｔｈエピトープクラスターペプチドを含まない状態では、ＶＰ１ペプチド免疫原ホモログのみを含有する各ワクチン製剤による初回免疫後０週目および３週目に上昇する中和抗体の力価は無視できる程度のものである（すなわち＜＝３）（図３Ａ及び表３Ｂ）。
【０１４９】
（１）血清型Ｏ由来のＦＭＤＶ  ＶＰ１  Ｂ免疫原（配列番号２５）；（２）設計した１０（重量）％のＦＭＤＶ  Ｔｈエピトープペプチド構築物（配列番号９０）；及び（３）ＵＢＩＴｈ（登録商標）に連結したカセット型内の、３種のブタＦＭＤＶ  Ｔｈエピトープ（配列番号２４）；を含む、単純なＦＭＤＶワクチン製剤を調製した、この製剤をブタに単回投与し、インビトロではＰＢＭＣに対し、インビボでは血清に対して、ＩＦＮ−γの濃度を４週間、定量ＥＬＩＳＡアッセイにより（実施例３に記載するように）測定した。図４Ａおよび４Ｂに示すように、本試験では免疫後にＩＦＮγの産生増大が観察された。
【０１５０】
この知見により、選択したＦＭＤＶ内在性Ｔｈエピトープクラスターペプチドが免疫直後の宿主のＴ細胞を刺激することをさらに確認した。自然感染または負荷試験のいずれかによってＦＭＤＶに曝露された後、曝露されたウイルス抗原は、以前にＦＭＤＶワクチンヘルパーＴペプチド抗原によって刺激されたメモリーＴ細胞を介した抗原特異的Ｔ細胞応答を開始させる。ＦＭＤＶ  ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂおよび３Ｄタンパク質上に存在する、注意深く選択されたこれらの免疫優性Ｔｈエピトープは、ＦＭＤＶに関連したＴｈ細胞を前もって刺激し（priming）、各ワクチン製剤の単回投与後に、免疫された宿主がＦＭＤＶに曝露された際に著しいリンパ球増殖応答を誘導して、ＩＦＮ−γを含むサイトカインを産生する。サイトカインは、動物の様々な細胞壊死性のウイルス感染に対する細胞介在性免疫応答において重要な役割を果たすことが知られている。
【０１５１】
ｂ．中和アッセイにより測定した、ブタ及びウシの双方における緊急ワクチンとしての使用に最も最適化したワクチン製剤の同定
ワクチン化及び負荷した動物におけるＦＭＤＶに対するリンパ球増殖応答は一般に、ＦＭＤＶ内在性Ｔｈエピトープクラスターペプチドを含むワクチン製剤に対して、それを含まない製剤に対してよりも著しく高いことが見出された。特異的なＴ細胞エピトープをペプチド製剤に含ませることによって、ウイルスに遭遇した際に提示されるウイルスエピトープをさらに効率的に認識可能なＴ細胞を刺激する（priming）ことができる。
【０１５２】
ＩＦＮ−γはマクロファージの主要な活性化因子であり、その抗菌活性および抗原をプロセシングしてＴリンパ球に提示する能力を増大させる。ＩＦＮ−γは、抗原提示細胞のＭＨＣ発現を刺激して、ＦＭＤＶ複製を効果的に阻害することが報告されている。このように、これらの初期活性化の機構は、単回投与による緊急ワクチンに必要な、ＦＭＤＶに対する防御免疫反応の誘導に関連するものである。ＦＭＤＶ内在性Ｔｈエピトープクラスターペプチドの存在によって、ＦＭＤＶ  ＶＰ１反応性Ｂ細胞が活性化され、迅速なＢ細胞増殖および抗体の産生が誘導される。これらのＦＭＤＶ内在性ＴｈエピトープクラスターペプチドはヘルパーＴ細胞も活性化し、サイトカインを分泌させて環境をＢ細胞メモリーの生成に適したものとする。これらの知見により、ＦＭＤＶ  ＶＰ１  Ｂペプチドおよび内在性Ｔｈペプチドの組み合わせがＶＰ１  Ｂペプチド単独と比較してより良い臨床的防御をもたらすことは、さらに効率的なリンパ球増殖応答およびＩＦＮγの放出によるものであり、初期現象の一部として、中和抗体も高い力価でより良く誘導されることが示唆される。
【０１５３】
緊急ワクチンに必要とされる、インビボにおけるこのような初期の防御免疫反応の誘導に最も適したワクチン製剤をスクリーニングするために、標準的な中和アッセイを用いた。ワクチン投与したブタ（表１８）およびウシ（表１９）の、初回免疫から３週間後に採取した血清を評価した。中和抗体アッセイは、官公庁によっては緊急ＦＭＤＶワクチンの発売基準の一部として要求される、高価で面倒な物理的負荷試験に代える代替アッセイとして用いられてきたため、ＦＭＤＶ  ＶＰ１に由来するＢおよび内在性Ｔｈエピトープクラスターペプチドの様々な組み合わせ及び様々な比を用いる多くのＦＭＤＶワクチン製剤での体系的試験を行い、実施例２に簡単に記載したこの代替中和抗体アッセイによる、それぞれの保護効率について評価した。
【０１５４】
具体的には、それぞれ８〜１２週齢および６〜１２か月齢のブタおよびウシについて、１群あたり３頭〜５頭のＦＭＤＶフリーの動物を、０週目に複数成分のＢおよびＴエピトープペプチドベースのＦＭＤＶワクチン製剤の様々な組み合わせによって免疫化し、単回投与後に血清を採取して中和抗体力価を測定した。
【０１５５】
１．ブタ
ブタにおける試験に用いた、１３群の動物より得たデータを表１８に示す。これらの実験に用いた製剤は、以下に記載するように調製した。すべてのブタは、ワクチン製剤として１ｍＬの乳剤を用いて免疫化した。
第１群：プロトタイプＦＭＤＶ  ＶＰ１  ＯＣｏｎｓｅｎｓｕｓペプチド（配列番号２５）のみを含んだ。
第２群〜第４群：等重量比の混合物である内在性ＦＭＤＶ  Ｔｈペプチド（例えば配列番号３４〜６３、配列番号６１〜６３、または配列番号９０）を組み合わせたプロトタイプＦＭＤＶ  ＶＰ１  ＯＣｏｎｓｅｎｓｕｓペプチド（配列番号２５）の、アジュバントとして０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含むＩＳＡ５０Ｖ２（Seppics社、仏国）を用いる油中水乳剤２５＋２．５μｇ／ｍＬ、Ｂ：Ｔｈの重量比が１０：１で、調製した。
【０１５６】
第５群〜第７群：ＦＭＤＶワクチンＢ細胞成分として、等重量比で総量２５μｇ／ｍＬのＦＭＤＶ  ＶＰ１  ＯＣｏｎｓｅｎｓｕｓ（配列番号２５）およびＯＯｚｋ（配列番号２８）に、その各々に等重量比の混合物である内在性ＦＭＤＶ  Ｔｈペプチド（例えば配列番号３４〜６３、配列番号６１〜６３、または配列番号９０）を追加し、アジュバントとして０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含むＩＳＡ５０Ｖ２（Seppics社、仏国）を用いる油中水乳剤２５＋２．５μｇ／ｍＬ、Ｂ：Ｔｈの重量比が１０：１で、免疫化した。
【０１５７】
第８群〜第１０群：ＦＭＤＶワクチンＢ細胞成分として、等重量比で総量２５μｇ／ｍＬのＦＭＤＶ  ＶＰ１  ＯＣｏｎｓｅｎｓｕｓ（配列番号２５）、ＯＯｚｋ（配列番号２８）およびＯＭｙａｎｍａｒ（配列番号２７）に、その各々に等重量比の混合物である配列番号３４〜６３、配列番号６１〜６３および配列番号９０の内在性ＦＭＤＶ  Ｔｈペプチドを追加し、アジュバントとして０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含むＩＳＡ５０Ｖ２（Seppics社、仏国）を用いる油中水乳剤２５＋２．５μｇ／ｍＬ、Ｂ：Ｔｈの重量比が１０：１で、免疫化した。
【０１５８】
第１１群〜第１３群：ＦＭＤＶワクチンＢ細胞成分として、等重量比で総量２５μｇ／ｍＬのＦＭＤＶ  ＶＰ１  ＯＣｏｎｓｅｎｓｕｓ（配列番号２５）、ＯＯｚｋ（配列番号２８）、ＯＭｙａｎｍａｒ（配列番号２７）、およびＡｓｉａ  １Ｊｉａｎｇｓｕ（配列番号２９）に、その各々に等重量比の混合物である内在性ＦＭＤＶ  Ｔｈペプチド（例えば配列番号３４〜６３、配列番号６１〜６３および配列番号９０）を追加し、アジュバントとして０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含むＩＳＡ５０Ｖ２（Seppics社、仏国）を用いる油中水乳剤２５＋２．５μｇ／ｍＬ、Ｂ：Ｔｈの重量比が１０：１で、免疫化した。
【０１５９】
要約すると、それぞれの試験を様々な時点で開始する際、０週目においてすべてのブタはＦＭＤＶ抗体を有していなかった。様々なＦＭＤＶ  ＶＰ１に由来するＢおよび内在性Ｔｈエピトープクラスターペプチドを含有する複数成分のＦＭＤＶワクチン製剤の単回投与によって、標的ペプチド（または標的ペプチドの一つ）であるＯＣｏｎｓｅｎｓｕｓ（配列番号２５）に対する著しい量の抗体産生が誘発され、ＥＬＩＳＡによるＬｏｇ１０力価は２〜３（すなわち１０Ｅ２〜１０Ｅ３）であった。
【０１６０】
２．ウシ
ウシにおける試験に用いた、１群あたり３頭、総数３２群の動物より得たデータを表１９に示す。これらの実験に用いた製剤は、以下に記載するように調製した。すべてのウシは、ワクチン製剤として２ｍＬの乳剤を用いて免疫化した。
第１群〜第８群は、プロトタイプＦＭＤＶ  ＶＰ１  ＯＣｏｎｓｅｎｓｕｓペプチド（配列番号２５）を、それぞれに等重量比の混合物である、内在性ＦＭＤＶ  Ｔｈペプチド、例えば、すべて等重量比の配列番号３４〜６３（３０種のＴｈ）；配列番号３４〜３９、４４、４６〜５１、５３〜６３（２４種のＴｈ）；配列番号３４〜３９、４４、４６〜５１、５３〜６０（２１種のＴｈ）；配列番号３４、３６、３７、４０〜４３、４５、４８、５２、５３、６０〜６３（１５種のＴｈ）；配列番号３４、３６、３７、４８、５０、５３（６種のＴｈ）；配列番号６２〜７８（１７Ｔｈホモログ）；配列番号７９〜８７（９Ｔｈの短いライブラリー）；および配列番号８８、８９（２種のＵＢＩＴｈ（登録商標）増強Ｔｈカセット）；を組み合わせて、アジュバントとして０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含むＩＳＡ５０Ｖ２（Seppics社、仏国）を用いる油中水乳剤５０＋５μｇ／ｍＬ、Ｂ：Ｔｈの重量比が１０：１で、調製した。
【０１６１】
第９群〜第１１群は、ＦＭＤＶワクチンＢ細胞成分として等重量比で総量５０μｇ／ｍＬのＦＭＤＶ  ＶＰ１  ＯＣｏｎｓｅｎｓｕｓ（配列番号２５）、ＯＯｚｋ（配列番号２８）およびＯＭｙａｎｍａｒ（配列番号２７）のそれぞれに、等重量比の混合物である内在性ＦＭＤＶ  Ｔｈペプチド、すなわちすべて等重量比の配列番号８８、８９（２種のＵＢＩＴｈ（登録商標）増強Ｔｈカセット）；配列番号９１、９２（２種のＵＢＩＴｈ（登録商標）増強Ｔｈカセット）；配列番号９１、９３〜９５（４種のＵＢＩＴｈ（登録商標）増強Ｔｈカセット）；および配列番号３４、３６、３７、４０〜４３、４５、４８、５２、５３、６０〜６３（１５種のＴｈ）；を追加して、アジュバントとして０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含むＩＳＡ５０Ｖ２（Seppics社、仏国）を用いる油中水乳剤５０＋５μｇ／ｍＬ、Ｂ：Ｔｈの重量比が１０：１で、免疫化した。すべてのウシは、ワクチン製剤として乳剤２ｍＬで免疫化した。
【０１６２】
第１２群〜第１６群は、ＦＭＤＶワクチンＢ細胞成分として、等重量比で総量５０μｇ／ｍＬのＦＭＤＶ  ＶＰ１  ＯＣｏｎｓｅｎｓｕｓ（配列番号２５）、ＯＯｚｋ（配列番号２８）およびＯＭｙａｎｍａｒ（配列番号２７）のそれぞれに、等重量比の混合物である内在性ＦＭＤＶ  Ｔｈペプチド、すなわちすべて等重量比の配列番号３４、３６、３７、４０〜４３、４５、４８、５２、５３、６０〜６３（１５種のＴｈ）を追加し、アジュバントとして０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含むＩＳＡ５０Ｖ２（Seppics社、仏国）を用いる油中水乳剤、Ｂ：Ｔｈの重量比が１：１、５：１、１０：１、５０：１および１００：１で、免疫化した。すべてのウシは、ワクチン製剤として乳剤２ｍＬで免疫化した。
【０１６３】
第１７群〜第１９群は、ＦＭＤＶワクチンＢ細胞成分として、等重量比で総量５０μｇ／ｍＬのＦＭＤＶ  ＶＰ１  ＯＣｏｎｓｅｎｓｕｓ（配列番号２５）、ＯＯｚｋ（配列番号２８）、ＯＭｙａｎｍａｒ（配列番号２７）およびＡｓｉａ  １Ｊｉａｎｇｓｕ（配列番号２９）のそれぞれに、等重量比の混合物である内在性ＦＭＤＶ  Ｔｈペプチド、すなわちすべて等重量比の配列番号３４、３６、３７、４０〜４３、４５、４８、５２、５３、６０〜６３（１５種のＴｈ）；配列番号８８、８９（２種のＵＢＩＴｈ（登録商標）増強Ｔｈカセット）；配列番号９１、９２（２種のＵＢＩＴｈ（登録商標）増強Ｔｈカセット）；配列番号９１、９３〜９５（４種のＵＢＩＴｈ（登録商標）増強Ｔｈカセット）；を追加して、アジュバントとして０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含むＩＳＡ５０Ｖ２（Seppics社、仏国）を用いる油中水乳剤５０＋５μｇ／ｍＬ、Ｂ：Ｔｈの重量比が１０：１で、免疫化した。すべてのウシは、ワクチン製剤として乳剤２ｍＬで免疫化した。
【０１６４】
第２５群および第２６群は、ＦＭＤＶワクチンＢ細胞成分として、等重量比で総量５０μｇ／ｍＬのＦＭＤＶ  ＶＰ１  ＯＣａｍｐｏｓ（配列番号２６）、Ａ２４（配列番号３０）およびＣＩｎｄａｉａｌ（配列番号３２）のそれぞれに、等重量比の混合物である内在性ＦＭＤＶ  Ｔｈペプチド、すなわちすべて等重量比の配列番号９１、９２（２種のＵＢＩＴｈ（登録商標）増強Ｔｈカセット）；配列番号９１、９３〜９５（４種のＵＢＩＴｈ（登録商標）増強Ｔｈカセット）；を追加して、アジュバントとして０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含むＩＳＡ５０Ｖ２（Seppics社、仏国）を用いる油中水乳剤５０＋５μｇ／ｍＬ、Ｂ：Ｔｈの重量比が１０：１で、免疫化した。すべてのウシは、ワクチン製剤として乳剤２ｍＬで免疫化した。
【０１６５】
第２７群および第２８群は、ＦＭＤＶワクチンＢ細胞成分として、等重量比で総量５０μｇ／ｍＬのＦＭＤＶ  ＶＰ１  ＯＣａｍｐｏｓ（配列番号２６）、Ａ２４（配列番号３０）およびＣＩｎｄａｉａｌ（配列番号３２）のそれぞれに、等重量比の混合物である内在性ＦＭＤＶ  Ｔｈペプチド、すなわちすべて等重量比の配列番号９１、９２（２種のＵＢＩＴｈ（登録商標）増強Ｔｈカセット）；配列番号９１、９３〜９５（４種のＵＢＩＴｈ（登録商標）増強Ｔｈカセット）を追加して、アジュバントとしてエマルシゲンＤ（１２％）を用いる油中水乳剤５０＋５μｇ／ｍＬ、Ｂ：Ｔｈの重量比が１０：１で、免疫化した。すべてのウシは、ワクチン製剤として乳剤２ｍＬで免疫化した。
【０１６６】
第２９群および第３０群は、ＦＭＤＶワクチンＢ細胞成分として、等重量比で総量５０μｇ／ｍＬのＦＭＤＶ  ＶＰ１  ＯＣａｍｐｏｓ（配列番号２６）、ＡＡｒｇｅｎｔｉｎａ２００１（配列番号３３）およびＣＩｎｄａｉａｌ（配列番号３２）のそれぞれに、等重量比の混合物である内在性ＦＭＤＶ  Ｔｈペプチド、すなわちすべて等重量比の配列番号９１、９２（２種のＵＢＩＴｈ（登録商標）増強Ｔｈカセット）；配列番号９１、９３〜９５（４種のＵＢＩＴｈ（登録商標）増強Ｔｈカセット）；を追加し、アジュバントとして０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含むＩＳＡ５０Ｖ２（Seppics社、仏国）を用いる油中水乳剤５０＋５μｇ／ｍＬ、Ｂ：Ｔｈの重量比が１０：１で、免疫化した。すべてのウシは、ワクチン製剤として乳剤２ｍＬで免疫化した。
【０１６７】
第３１群および第３２群は、ＦＭＤＶワクチンＢ細胞成分として、等重量比で総量５０μｇ／ｍＬのＦＭＤＶ  ＶＰ１  ＯＣａｍｐｏｓ（配列番号２６）、ＡＡｒｇｅｎｔｉｎａ２００１（配列番号３３）およびＣＩｎｄａｉａｌ（配列番号３２）のそれぞれに、等重量比の混合物である内在性ＦＭＤＶ  Ｔｈペプチド、すなわちすべて等重量比の配列番号９１、９２（２種のＵＢＩＴｈ（登録商標）増強Ｔｈカセット）；配列番号９１、９３〜９５（４種のＵＢＩＴｈ（登録商標）増強Ｔｈカセット）；を追加して、アジュバントとしてエマルシゲンＤ（１２％）を用いる油中水乳剤５０＋５μｇ／ｍＬ、Ｂ：Ｔｈの重量比が１０：１で、免疫化した。すべてのウシは、ワクチン製剤として乳剤２ｍＬで免疫化した。
【０１６８】
要約すると、それぞれの試験を様々な時点で開始する際、０週目においてすべてのウシはＦＭＤＶ抗体を有していなかった。様々なＦＭＤＶ  ＶＰ１に由来するＢおよび内在性Ｔｈエピトープクラスターペプチドを含有する複数成分のＦＭＤＶワクチン製剤の単回投与によって、異なる血清型の、その他の関連するＶＰ１  Ｂ免疫原が存在するため（主にこれらのＶＰ１ペプチド免疫原の間の高い交差反応性のため）、標的ペプチド免疫原がＢ成分の画分に存在した場合でも、標的ペプチド（または標的ペプチドの一つ）であるＯＣｏｎｓｅｎｓｕｓ（配列番号２５）に対する著しい量の抗体が産生され、通常のＬｏｇ１０力価は２ないし３の範囲であった。
【０１６９】
予想外なことに、Ｂ：Ｔｈペプチドの比に幅のある製剤は、試験動物において免疫応答を効果的に誘発した。すなわち、動物の初回免疫後３週目に採取した血清中の中和抗体を著しく上昇させるのに有効な製剤では、このようなＦＭＤＶ内在性Ｔｈクラスターペプチドを含有させる％範囲が、１％と同じ程低いところから（すなわちＴｈ：Ｂの比が１：１００）から５０％と同じほど高いところ（すなわちＴｈ：Ｂの比が１：１）まで変化してもよい（ウシ免疫試験の第１２群ないし第１６群を参照されたい）。
【０１７０】
一般に、ＦＭＤＶ  Ｔｈクラスターペプチド：ＦＭＤＶ  ＶＰ１  Ｂエピトープクラスターペプチドが１０％〜２０％（すなわち１：５または１：１０の比）であるものが選択され、最終的なペプチドベースのＦＭＤＶワクチン製剤に用いられて、筋肉内経路への注射を介してＦＭＤＶワクチン製剤を単回投与された動物に、安定したＢおよびＴ免疫応答を開始させる。
【０１７１】
実施例１０
単回投与緊急ワクチンとして、ＢおよびＴエピトープベースの複数成分のＦＭＤＶワクチン製剤を投与されたブタおよびウシの、ＦＭＤＶウイルス負荷からの保護
ａ．ブタにおいて行われた負荷試験
単回投与緊急ワクチンとして設計された、初回免疫後３週目に採取した血清中の中和抗体力価を有意に上昇させる、最適化された複数成分のＢおよびＴエピトープベースのＦＭＤＶワクチン製剤を用いて、台湾淡水区にて６回の負荷試験をさらに行い、実施例９において前に試験し、選択した代表的製剤の保護効率を評価および確認した。
特に、ＦＭＤＶ  ＯＴａｉｗａｎ株を用いるＦＭＤＶ負荷試験を、ワクチン投与された動物に対して行った。負荷試験は、同様のプロトコル／方法に従って行った。この実施例（以下）では、一つの代表的な／典型的な負荷試験について詳述する。特に、表２０に示す負荷試験（表２５に示す試験ＩＩの第５、６および７群、試験ＩＶの第１２、１３および１４群、ならびに試験Ｖの第１５、１６、１７、１８および１９群に対応する）を、表２０〜表２４に詳細に記述／評価する。ブタおよびウシに対して行ったこのような負荷試験に関わるその他の群についての要約を、それぞれ表２５及び表２６に記載する。
【０１７２】
動物：８週齢（０ｗｐｉの時点で）のＳＰＦ交雑種ブタ３２頭を負荷試験に用いた。ブタはＦＭＤフリーであり、以前にＦＭＤワクチンによって免疫化してはいなかった（すなわちナイーブ）。ブタは、行政院農業委員会家畜衛生試験所（Animal Health Research Institute （ＡＨＲＩ）, Council of Agriculture, Executive Yuan）にて飼育した。試験は、初回免疫から負荷試験終了までＡＨＲＩにて行った。
特別な飼育条件：現実的条件に依存して、異なる群を共同ケージ内で飼育した。コントロール群は、個別の部屋で飼育した。感染の徴候を示した動物は別室へ移した。
【０１７３】
ウイルス：ＦＭＤＶ  ＯＴＡＷ／９７  Ｋ株。
キット：ＦＭＤＶ非構造タンパク質ＥＬＩＳＡキットおよびＦＭＤペプチド２５７０ａ  ＥＩＡ用量設定キットを、実施例１に記載されるように用いた。
群分け：３２頭のブタを無作為に１１群に分けた。動物のＩＤ番号、投与の量（volume）、注射経路および注射部位について表２０にまとめた。
採血スケジュール：ワクチン接種後０、２、４週目（week(s)post vaccination（ＷＰＶ））および負荷後１４日目（days post challenge（ＤＰＣ））。
ワクチン接種：ワクチン接種は、指定のそれぞれの用量により０ＷＰＶに行った。
負荷スケジュール：免疫後４週目に、免疫したブタおよびコントロールのブタの右前脚の踵球内に、ＳＣ経路を介してＦＭＤＶ  Ｏ−Ｔａｉｗａｎ（ブタにおいて継代したウイルス）を負荷した。ウイルス量は０．５ｍｌ（１０５ＴＣＩＤ５０）であった。
【０１７４】
アッセイの単回または複数回のモニター：ウイルス負荷後、ブタにおけるＦＭＤの臨床徴候および症候群の発生を、毎日体温を記録しながら１４日間モニターした。
ウイルス負荷後のブタの体温を、表２１に記録した。ブタの体温は、モニターした負荷後１４日（days post challenge（ＤＰＣ））の間わずかに上昇したが、ほとんどの場合４０℃未満であった。
中和力価：ブタから、ワクチン接種後０、２、４週目（week(s)post vaccination（ＷＰＶ））及び１４ＤＰＣに採血した。各動物の凝固サンプルから遠心分離によって血清を回収し、ウイルス中和アッセイに供した。算出した中和力価及び幾何平均を表２２に示す。すべての製剤において、用量依存性に著しい中和抗体（ＮＡ）力価が観察された。ある群では、４ＷＰＶにおけるＮＡ力価の幾何平均が１６未満であったが、１４ＤＰＣではすべての実験群の動物が保護されていた（１００％）。しかし、プラセボコントロール群またはネガティブコントロールの２動物のうちの２頭は共に、２日目には感染の臨床徴候を示していた。陽性コントロールとしてＦＭＤＶウイルスライセートベースの血清型Ｏワクチン（ロシアより入手）を用いた試験Ｖの第１９群では、単回投与によって３動物のすべてが保護された。
【０１７５】
ＦＭＤＶ  ＮＳ  ＥＬＩＳＡ：血清サンプルは、ＡＨＲＩにおいてＦＭＤＶ非構造タンパク質ＥＬＩＳＡによりアッセイを行い、その結果を表２３に示す。試験したすべての群は負荷前にはナイーブであり、ＦＭＤＶ  ＮＳタンパク質に対する反応性を示さなかった。プラセボ・ネガティブコントロール群の動物のみが１４ＤＰＣにおいてＮＳタンパク質に対する陽性の反応性を示したことから、それらの感染性が示唆される。
抗ＶＰ１（ペプチド２５７０ａ）ＥＬＩＳＡ用量設定：実施例１に記載するように、ＶＰ１ペプチド２５７０ａベースのＥＬＩＳＡによって抗ＶＰ１抗体の力価を試験し、その結果を表２４に示す。ほとんどのブタは、免疫後２週目には著しい免疫応答を呈した。
ＦＭＤＶペプチドワクチン製剤が、各製剤について示すように内在性ＦＭＤＶ  Ｔｈペプチドを含有していた場合、ネガティブ・プラセボコントロール群を除く実験群のすべての動物は、そのＮＡ力価に関わらず、ＦＭＤＶによる負荷から保護された。
【０１７６】
ある実験群では、４ＷＰＶにおける中和抗体力価の幾何平均が１６未満であったが、すべてのブタは保護されていた。このことは、中和抗体に加え、ウイルス負荷から動物を保護するその他の因子が存在することをはっきりと示している。短いかまたは長いカセットフォーマットに含まれた内在性ＦＭＤＶ  Ｔｈペプチドはすべて、ペプチドワクチン製剤の単回投与による細胞性免疫の誘発に決定的な役割を果たしていることが示された。単数または複数のＶＰ１ループペプチドと組み合わせた際にこのような保護を可能にする細胞性免疫をブタに誘発するためには、３０種ほどの多数のＦＭＤＶ  Ｔｈ（配列番号３４〜６３）を用いてもよいか、または予め厳選した３種ほどの少数のＴｈ（配列番号６１〜６３）を用いてもよい。ＦＭＤＶ  ＶＰ１  Ｏホモログ由来の配列を組み合わせて含むワクチンは、ＯＴａｉｗａｎ株によるＦＭＤＶ負荷からブタを保護するために、少なくとも同等に有効であった。各ワクチン製剤を投与された実験群では、モニターした期間を通してＦＭＤＶ  ＮＳタンパク質に対する抗体は検出されなかったが、これらの動物は、高用量のＦＭＤＶウイルス負荷（ＯＩＥにより要求されるウイルス投与量の１０×）にもかかわらず、ＦＭＤＶ感染から完全に保護されていることがさらに示された。試験したすべての製剤において、投与あたりわずかに０．５ｍＬを投与されたブタは、投与あたり２ｍＬを投与されたブタと比較して同等に保護された。
【０１７７】
１３群（第１〜３、５〜７、８〜１０、１２〜１５群）は、ＦＭＤＶ  ＶＰ１由来のＢエピトープ免疫原として、ＦＭＤＶ  ＯＣｏｎｓｅｎｓｕｓ（配列番号２５）を用いた。ＦＭＤＶ  ＶＰ１由来のＢエピトープ免疫原として、第１６群はＦＭＤＶ  ＯＣｏｎｓｅｎｓｕｓ、ＯＯｚｋ、ＯＭｙａｎｍａｒ（配列番号２５、２８、及び２７）を用い、第１７群はＦＭＤＶ  ＯＣｏｎｓｅｎｓｕｓ、ＯＯｚｋ、ＯＭｙａｎｍａｒ及びＡｓｉａ  １Ｊｉａｎｇｓｕ（配列番号２５、２８、２７、及び２９）をそれぞれ用いた（等重量比で）。残りの群はプラセボコントロールを用いた。
【０１７８】
プラセボコントロール群を除くこれらの製剤すべてにおいて、表２５に詳しく示すように、すべての群のＦＭＤＶ  ＶＰ１  Ｂエピトープ成分に内在性ＦＭＤＶ  Ｔｈエピトープクラスターペプチドを加えた。試験ＩＩおよびＩＶは、各試験において投与あたり２ｍＬ、１ｍＬ、０．５ｍＬを投与する群によって実施し、それぞれのワクチン製剤の効力（ＰＤ５０）を試験した。１４日間にわたる観察期間に、ＦＭＤの臨床徴候についてすべての実験動物をモニターした。試験ＩＩＩの第８群〜第１０群では、ＦＭＤＶ  ＶＰ１  ＯＣｏｎｓｅｎｓｕｓ（配列番号２５）とＵＢＩＴｈ（登録商標）増強ＦＭＤＶ  Ｔｈカセットペプチド（配列番号９０）との比を１：１、５：１および１０：１に変化させて試験を行った。試験Ｖの第１５群及び第１６群では、ＦＭＤＶ  ＶＰ１結合ペプチド免疫原とＵＢＩＴｈ（登録商標）増強ＦＭＤＶ  Ｔｈカセットペプチド（配列番号９０）との比をそれぞれ５：１および１０：１に変化させて、同様の試験を行った。
【０１７９】
要約すると、すべてのプラセボコントロール群またはネガティブ（注射していない）群のすべての動物は、ＦＭＤＶ  ＯＴａｉｗａｎ株の負荷後２日目にはこれに感染していたことから、すべての負荷試験は妥当であったことが示唆された。これらの負荷試験では、ＯＩＥによって要求される量よりも１０×高い用量のＦＭＤＶウイルス単離株を用いたにもかかわらず、モニターした期間を通して臨床徴候が陰性であったこと、およびＦＭＤＶ  ＮＳ  ＥＬＩＳＡによって得たシグナルも陰性であったことによって示されるように、すべての実験群において、すべてのブタの完全な保護が観察された。投薬試験を通して算出したＰＤ５０は、ＩＩおよびＩＶの両群において少なくともＰＤ５０＞１１．２３であった。
【０１８０】
ＦＭＤＶウイルスの負荷からブタを効果的に保護するため、３０種のＦＭＤＶ  Ｔｈエピトープペプチド（配列番号３４〜６３）のうち、３種のＦＭＤＶ  Ｔｈペプチド（配列番号６１〜６３）を選択した。配列番号９０に示すように、これら３種のペプチドのＮ末端を、リジンスペーサを介してＵＢＩＴｈ（登録商標）（配列番号２４）にさらに連結するカセット様設計を用いて、これら３種のＦＭＤＶブタＴｈエピトープペプチドの提示を増大させた。このようなＦＭＤＶ  Ｔｈエピトープペプチドを、ＦＭＤＶ  ＶＰ１由来のＢエピトープペプチド免疫原に対して様々な比率で加えることにより、ＦＭＤＶウイルスの負荷からの保護が可能になる。負荷試験の試験Ｖにおいて、Ｂエピトープペプチド組成物が、一価のＯ血清型ペプチド（配列番号２５、２５７０ｋｂ）、Ｏ血清型結合製剤（配列番号２５、２８および２７）、または血清型ＯとＡｓｉａ  １とを組み合わせた多価製剤（配列番号２５、２８、２７および２９）である場合、内在性Ｔｈエピトープペプチドが１０％存在することによって完全な保護が達成されることから、ＶＰ１  Ｂエピトープペプチドの免疫原性の適応可能性が示される。
【０１８１】
ｂ．ウシにおける負荷試験
ウシでは、１×１０４ＴＣＩＤ５０のＦＭＤＶ（ウシ感染単位（Bovine Infectious Unit：ＢＩＵ））を、動物の首の後ろに改変型筋肉内注射することによって、ウイルスを負荷した。血清型Ｏの負荷にはＯＳ／９９株を用い、血清型Ａｓｉａ  １の負荷にはＡｓｉａ  １強毒性株を用いた。それぞれのＦＭＤＶワクチン製剤を単回投与した後にウイルスを負荷した動物は、２８日間毎日直腸温をモニターし、病変部の出現時期、数および重症度に基づいた保護スコアを決定した。生きた動物を用いたすべての実験は、中華人民共和国農業部の指針の下に行った。特定の製剤の効力を評価するため、例えば試験ワクチンの２×、１×、及び０．５×用量を用いるような、投薬の改変も行った。製剤の保護効率を迅速にスクリーニングするため、１×も用いた。ワクチン製剤の有効性を評価するため、実験計画および試験時における動物の利用可能性に基づいて、動物を１群あたり３〜５頭に群分けした。
【０１８２】
試験Ｉにおいて、内在性ＦＭＤＶ  Ｔｈエピトープペプチドの不存在下の、又はＤＴ、ＴＴ、及びＰＴトキソイドタンパク質由来の外来性Ｔｈエピトープペプチドの１０％存在下の、ワクチン製剤の鍵となる成分として、最適化されたＦＭＤＶ  ＶＰ１由来のＢ細胞エピトープクラスターペプチド免疫原（配列番号２５）を含むペプチドワクチン製剤を用いた第１群〜第４群（表２６に示す）の動物は、ＦＭＤＶ血清型Ｏｏｓ／９９株の負荷からは保護されなかった。表２６に示すように、単回投与緊急ワクチンのために最適化された複数成分のＢおよびＴエピトープベースのＦＭＤＶワクチン製剤を用いて、さらに４回の負荷試験を行い、実施例９で前に試験し選択した代表的製剤の保護効率を評価した。
【０１８３】
８つの群（試験ＩＩ及びＩＩＩの第６群〜第８群及び第１０群〜第１４群）は、ＦＭＤＶ  ＶＰ１由来のＢエピトープ免疫原としてＦＭＤＶ  ＯＣｏｎｓｅｎｓｕｓ（配列番号２５）を用いた。試験ＩＶ（第１６群）は、ＦＭＤＶ  ＶＰ１由来のＢエピトープ免疫原としてＦＭＤＶ  ＯＣｏｎｓｅｎｓｕｓ、ＯＯｚｋ、ＯＭｙａｎｍａｒ（配列番号２５、２８、及び２７）を（等重量比で）用いた。試験Ｖ（第１８群）は、ＦＭＤＶ  ＶＰ１由来のＢエピトープ免疫原としてＦＭＤＶ  ＯＣｏｎｓｅｎｓｕｓ、Ｏｏｚｋ、ＯＭｙａｎｍａｒ、Ａｓｉａ  １ＪｉａｎｇＳｕ、及びＡＧａｎｓｕ（配列番号２５、２８、２７、２９、及び３１）を（等重量比で）用いた。
【０１８４】
プラセボコントロール群および試験Ｉの実験群を除くこれらの製剤すべてにおいて、試験ＩＩＩの第１０群における、配列番号３４〜６３（３０種のＴｈ）の内在性ＦＭＤＶ  Ｔｈエピトープクラスターペプチド；試験ＩＩＩの第１１群における、配列番号３４〜３９、４４、４６〜５１および５３〜６０（２１種のＴｈ）のペプチド；試験ＩＩの第６ないし８群における、配列番号８８および８９のＵＢＩＴｈ（登録商標）増強ＦＭＤＶ  Ｔｈカセットペプチドの混合物；および試験ＩＶの第１６群および試験Ｖの第１８群における、配列番号９１、９３、９４および９５の、別の４種のカセットＦＭＤＶ  Ｔｈペプチドの混合物を、表２６に詳しく示すように、ＦＭＤＶ  ＶＰ１  Ｂエピトープ成分に加えた。
【０１８５】
試験ＩＩの第６、７および８群のそれぞれの動物に、投与あたり２ｍＬ、１ｍＬ、０．５ｍＬのワクチン製剤を投与してワクチン製剤の効力を試験した際、それぞれの群において、５頭のうち４頭；５頭のうち４頭；および５頭のうち３頭の動物が保護された場合に、ワクチン製剤が著しい潜在能力を有することが示唆された。
【０１８６】
要約すると、すべてのプラセボコントロール群のすべての動物は、負荷試験に用いたＦＭＤＶ  Ｏｏｓ／９９またはＡｓｉａ  １株の負荷後２日目と同じほど早期にこれらに感染していたことから、すべての負荷試験は妥当であったことが示唆される。保護された動物では、モニターした期間を通して臨床徴候が陰性であったことによって示されるように、すべての実験群で著しい保護（５頭中４頭、または５頭中３頭）または完全な保護が達成された。多様な遺伝的背景を有するウシを効果的に保護するため、３０種のＦＭＤＶ  Ｔｈエピトープペプチド（配列番号３４〜６３）から、等重量比の２１種（配列番号３４〜３９、４４、４６〜５１、５３〜６０（２１種のＴｈ）、等重量比の１５種のＴｈ（配列番号３４、３６、３７、４０〜４３、４５、４８、５２、５３、６０〜６３）（１５種のＴｈ）および最後に等重量比の６種のＦＭＤＶ  Ｔｈペプチド（配列番号３４、３６、３７、４８、５０、５３）（６種のＴｈ）の選択が可能であった。これらの１５種から６種までのＦＭＤＶウシＴｈエピトープペプチドの提示は、３種のＴｈペプチドをリジンスペーサを介して連結し、次にそのＮ末端をＵＢＩＴｈ（登録商標）（配列番号２４）に連結させてＦＭＤＶ  Ｔｈカセットペプチド（配列番号８８、８９、９１、９２、９３、９４、９５）とすることによって作製したカセット様の構造によって増大される。このようなＦＭＤＶ  Ｔｈエピトープカセットペプチドは、ＦＭＤＶ  ＶＰ１由来のＢエピトープペプチド免疫原に１０％または２０％加えることによって、必要度の高い、ＦＭＤＶに対するＴ細胞性免疫の開始を補助することができた。試験ＩＶおよびＶにおいて、４種のＵＢＩＴｈ（登録商標）増強ペプチドによるカセット型に存在する１２種のＦＭＤＶ  Ｔｈエピトープ（配列番号９１、９３、９４、９５）から選択された内在性Ｔｈエピトープペプチドの１０％存在下で、第１６および１８群の５頭のうち４頭の動物が、ＦＭＤＶ血清型Ｏｏｓ／９９株（試験ＩＶ）または強毒性ＦＭＤＶ  Ａｓｉａ  １株（試験Ｖ）からそれぞれ保護された一方、Ｂエピトープペプチド組成物は、Ｏ血清型結合製剤（配列番号２５、２８および２７）として、又はＯ、Ａｓｉａ  １およびＡＧａｎｓｕの多価血清型製剤（配列番号２５、２８、２７、２９および３１）として存在し、これにより、ＶＰ１  Ｂエピトープペプチドの免疫原性の適応可能性が示される。
【０１８７】
実施例１１
ＦＭＤブラジル型Ｏウイルス／Ａ２４／ＣＩＮＤＡＩＡＬによるウシのウイルス感染を予防するための、ＵＢＩＴＨ（登録商標）ＦＭＤＶ多価ワクチンであるＵＢＩＴＨ（登録商標）口蹄疫（ＦＭＤ）合成ペプチド三価ワクチン（ブラジル）の添付文書のサンプル製品添付文書
以下は、ブラジルおよび中国における、ＵＢＩＴＨ（登録商標）ＦＭＤＶ多価ワクチンであるＵＢＩＴＨ（登録商標）口蹄疫（ＦＭＤ）合成ペプチドワクチンのサンプル製品の添付文書である。
【０１８８】
ａ．ブラジル
注射用無菌油中水乳剤
警告：獣医学専用。
詳細：ＵＢＩＴｈ（登録商標）口蹄疫（ＦＭＤ）合成ペプチド三価ワクチン（ブラジル）は、３種のＵＢＩＴｈ（登録商標）ＦＭＤ  ＶＰ１合成ペプチド構築物を含む、油中水乳剤の三価ワクチンである。それぞれのペプチド構築物は、南アメリカ地域での需要に特化した血清型であるブラジルＯ、Ａ２４およびＣＩｎｄａｉａｌの口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）に由来する免疫優性のＶＰ１エピトープを、人工のヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞ペプチドであるＵＢＩＴｈ（登録商標）エピトープへ連結させた、抗原としての合成ペプチドから構成される。これら３種のＦＭＤＶ血清型に対する細胞介在性免疫をさらに増強するため、４種のＴｈペプチドが追加で含まれる。３種のＵＢＩＴｈ（登録商標）ＦＭＤ  ＶＰ１構築物は等比で混合され、これに４種のＴｈ構築物を混合した小画分を加えた。次にこのＦＭＤＶ  ＢおよびＴエピトープ関連の合成構築物混合物を油性アジュバントと混合して油中水乳剤とした。
【０１８９】
使用に際する指示：ＵＢＩＴｈ（登録商標）口蹄疫（ＦＭＤ）合成ペプチド三価ワクチン（ブラジル）は、ブラジルＯ、Ａ２４およびＣＩｎｄａｉａｌの口蹄疫ウイルス血清型によるウシの感染を予防するために用いられる。
用量及び投与：ＵＢＩＴｈ（登録商標）口蹄疫（ＦＭＤ）合成ペプチド三価ワクチン（ブラジル）。
本ワクチン製剤は、肩の前の首部分への筋肉内注射によって投与される。針と皮膚表面との角度をできるだけ４５度に近い状態に維持して、針を抜いた際に針穴からワクチンが流れ落ちることを防ぐようにする。緊急用には単回投与することが望ましい。以前にＦＭＤワクチンを接種されていないウシに対しては、免疫を増強させ、かつ免疫応答を延長させてＦＭＤＶ感染からより効果的に保護されるように、４〜５週の間隔をあけて２ｍＬの投与による免疫を２回行うべきである。その後の追加免疫は６か月ごとに実施してもよい。ＦＭＤＶに感染した動物がいる領域では、６か月ごとの再ワクチン投与が望ましい。送達される投与量は２．０ｍＬである。
【０１９０】
使用法
・使用前にワクチン製品の温度を室温にすること。
・使用前にワクチンの内容物を完全に混合すること。
・内容物の取出しには滅菌された注射器および針を用いること。
・いったん開封した容器の内容物は、全部を直ちに使用すること。
コンテナーおよび未使用の内容物は、全部を政府の規制によって許可された手順で破棄すること。
【０１９１】
ｂ．中国
ＦＭＤ中国型Ｏ／Ａｓｉａ  １／ＡＧａｎｓｕウイルスによるウシの感染を予防するための、ＵＢＩＴｈ（登録商標）口蹄疫（ＦＭＤ）合成ペプチド三価ワクチン（中国）
注射用無菌油中水乳剤
警告：獣医学専用。
詳細：ＵＢＩＴｈ（登録商標）口蹄疫（ＦＭＤ）合成ペプチド三価ワクチン（中国）は、３種のＵＢＩＴｈ（登録商標）ＦＭＤ  ＶＰ１合成ペプチド構築物を含む、油中水乳剤の三価ワクチンである。それぞれのペプチド構築物は、中国およびアジア地域での需要に基づいた血清型である中国型Ｏ、Ａｓｉａ  １およびＡＧａｎｓｕの口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）に由来する免疫優性のＶＰ１エピトープを、人工のヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞ペプチドであるＵＢＩＴｈ（登録商標）エピトープへ連結させた、抗原としての合成ペプチドから構成される。これら３種のＦＭＤＶ血清型に対する細胞介在性免疫をさらに増強するため、４種のＴｈペプチドが追加で含まれる。３種のＵＢＩＴｈ（登録商標）ＦＭＤ  ＶＰ１構築物は、等比で混合され、これに４種のＴｈ構築物を混合した小画分を加えた。次にこのＦＭＤＶ  ＢおよびＴエピトープ関連の合成構築物混合物を油性アジュバントと混合して油中水乳剤とした。
使用に際する指示：ＵＢＩＴｈ（登録商標）口蹄疫（ＦＭＤ）合成ペプチド三価ワクチン（中国）は、中国型Ｏ／Ａｓｉａ  １／ＡＧａｎｓｕウイルスの口蹄疫血清型によるウシの感染を予防するために用いられる。
【０１９２】
用量及び投与：ＵＢＩＴｈ（登録商標）口蹄疫（ＦＭＤ）合成ペプチド三価ワクチン（中国）は、肩の前の首部分への筋肉内注射によって投与される。針と皮膚表面との角度をできるだけ４５度に近い状態に維持して、針を抜いた際に針穴からワクチンが流れ落ちることを防ぐようにする。緊急用には単回投与することが望ましい。以前にＦＭＤワクチンを接種されていないウシに対しては、免疫を増強させ、かつ免疫応答を延長させてＦＭＤＶ感染からより効果的に保護されるように、４〜５週の間隔をあけて２ｍＬの投与による免疫を２回行うべきである。その後の追加免疫は６か月ごとに実施してもよい。ＦＭＤＶに感染した動物がいる領域では、６か月ごとの再ワクチン投与が望ましい。送達される投与量は２．０ｍＬである。
【０１９３】
使用法
・使用前にワクチン製品の温度を室温にすること。
・使用前にワクチンの内容物を完全に混合すること。
・内容物の取出しには滅菌された注射器および針を用いること。
・いったん開封した容器の内容物は、全部を直ちに使用すること。
・コンテナーおよび未使用の内容物は、全部を政府の規制によって許可された手順で破棄すること。
【０１９４】
【表１】
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【０１９５】
【表２】
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【０１９６】
【表３】
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【０１９７】
【表４】
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【０１９８】
【表５】
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【０１９９】
【表６】
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【０２００】
【表７】
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【０２０１】
【表８】
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【０２０２】
【表９】
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【０２０３】
【表１０】
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【０２０４】
【表１１】
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【０２０５】
【表１２】
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【０２０６】
【表１３】
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【０２０７】
【表１４】
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【０２０８】
【表１５】
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【０２０９】
【表１６】
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【０２１０】
【表１７】
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【０２１１】
【表１８】
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【０２１２】
【表１９】
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【０２１３】
【表２０】
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【０２１４】
【表２１】
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【０２１５】
【表２２】
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【０２１６】
【表２３】
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【０２１７】
【表２４】
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【０２１８】
【表２５】
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【０２１９】
【表２６】
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【０２２０】
【表２７】
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【０２２１】
【表２８】
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【０２２２】
【表２９】
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【０２２３】
【表３０】
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【０２２４】
【表３１】
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【０２２５】
【表３２】
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【０２２６】
【表３３】
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【０２２７】
【表３４】
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【０２２８】
【表３５】
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【０２２９】
【表３６】
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【０２３０】
【表３７】
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【０２３１】
【表３８】
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【０２３２】
【表３９】
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【０２３３】
【表４０】
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【０２３４】
【表４１】
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【０２３５】
【表４２】
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【０２３６】
【表４３】
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【０２３７】
【表４４】
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【０２３８】
【表４５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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