(57)【要約】  本発明は、ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子を大量生産する方法に関し、より詳しくは、ａ）ｉ）ＧＣリッチ領域（GC-Rich region）において少なくとも１つのＣＣＧＣＣＣが除去されたジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーターの塩基配列及びそれに作動可能に連結されたジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする塩基配列と、ｉｉ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期遺伝子プロモーターの塩基配列及びそれに作動可能に連結されたヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体をコードする塩基配列とを含む発現ベクターを作製するステップと、ｂ）前記ａ）ステップの発現ベクターで動物細胞株を形質転換するステップと、ｃ）ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤の存在下で前記ｂ）ステップの形質転換された動物細胞株を培養することにより、高効率でヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を発現する細胞株を選別するステップと、ｄ）前記ｃ）ステップで選別された動物細胞株に酪酸ナトリウム、ビタミンＫ及び培地添加剤からなる群から選択される少なくとも１つを添加して培養するステップとを含む、ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を大量生産する方法及びヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を大量生産する細胞株に関する。本発明は、ＤＨＦＲプロモーター部位のＧＣリッチ（rich）反復配列が欠失したベクターを用いてヒト血液凝固因子第ＶＩＩ因子誘導体を高効率で大量に発現させることができるので、血友病治療剤の製造に有用である。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ｉ）ＧＣリッチ領域（GC-Rich region）において少なくとも１つのＣＣＧＣＣＣが除去されたジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーターの塩基配列及びそれに作動可能に連結されたジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする塩基配列と、
ｉｉ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期遺伝子プロモーターの塩基配列及びそれに作動可能に連結されたヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体をコードする塩基配列とを含む発現ベクターを作製するステップと、
ｂ）前記ａ）ステップの発現ベクターで動物細胞株を形質転換するステップと、
ｃ）ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤の存在下で前記ｂ）ステップの形質転換された動物細胞株を培養することにより、高効率でヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を発現する細胞株を選別するステップと、
ｄ）前記ｃ）ステップで選別された動物細胞株に酪酸ナトリウム、ビタミンＫ及び培地添加剤からなる群から選択される少なくとも１つを添加して培養するステップとを含む、ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を大量生産する方法。
【請求項２】
前記ＧＣリッチ領域が、１個以下のＣＣＧＣＣＣ反復配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体をコードする塩基配列は、配列番号８の塩基配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記発現ベクターが、図１に示すｐＸＯＧＣ−ＦＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ｂ）ステップの動物細胞株が、ＣＨＯ（Chinese hamster ovary）細胞株、サル腎臓細胞７（COS7 : Monkey kidney cells）細胞株、ＮＳＯ細胞株、ＳＰ２／０細胞株、Ｗ１３８、ベビーハムスター腎臓（BHK: Baby hamster kidney）細胞株、ＭＤＣＫ、骨髄腫細胞株、ＨｕＴ ７８細胞及び２９３細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記動物細胞株は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子が欠乏したことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ｃ）ステップで選別された細胞株はＨＭＦ７０９（寄託番号ＫＣＴＣ １２０２２ＢＰ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ｄ）ステップの酪酸ナトリウムの濃度は０．１〜４．０ｍＭである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ｄ）ステップの培養温度が３２．５〜３５．０℃であれば、酪酸ナトリウムの濃度は１．１〜３．５ｍＭである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｄ）ステップの培養温度が３１〜３２．５℃であれば、酪酸ナトリウムの濃度は１．２〜２．０ｍＭである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｄ）ステップの培養温度が３３．０℃であれば、酪酸ナトリウムの濃度は１．５ｍＭである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｄ）ステップのビタミンＫはビタミンＫ１である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｄ）ステップのビタミンＫの濃度は０．１〜３ｍｇ／Ｌである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｄ）ステップの培地添加剤は、大豆加水分解物又はイースト抽出物（Yeast extract）である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｄ）ステップの培地添加剤はイースト抽出物である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記大豆加水分解物又はイースト抽出物（Yeast extract）は、培地に０．１〜３ｇ／Ｌの濃度で添加される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を精製するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を活性化するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を生産するＨＭＦ７０９（寄託番号ＫＣＴＣ １２０２２ＢＰ）細胞株。
【請求項２０】
ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を生産するＨＭＦ７０９（寄託番号ＫＣＴＣ １２０２２ＢＰ）細胞株に酪酸ナトリウム、ビタミンＫ及び培地添加剤からなる群から選択される少なくとも１つを添加して培養するステップを含む、ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を大量生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子を大量生産する方法に関し、より詳しくは、ａ）ｉ）ＧＣリッチ領域（GC-Rich region）において少なくとも１つのＣＣＧＣＣＣが除去されたジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーターの塩基配列及びそれに作動可能に連結されたジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする塩基配列と、ｉｉ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期遺伝子プロモーターの塩基配列及びそれに作動可能に連結されたヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体をコードする塩基配列とを含む発現ベクターを作製するステップと、ｂ）前記ａ）ステップの発現ベクターで動物細胞株を形質転換するステップと、ｃ）ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤の存在下で前記ｂ）ステップの形質転換された動物細胞株を培養することにより、高効率でヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を発現する細胞株を選別するステップと、ｄ）前記ｃ）ステップで選別された動物細胞株に酪酸ナトリウム、ビタミンＫ及び培地添加剤からなる群から選択される少なくとも１つを添加して培養するステップとを含む、ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を大量生産する方法及びヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を大量生産する細胞株に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子（Factor VII; FVII）は、肝臓で産生されて血液に分泌され、血液凝固第Ｘ因子（Factor X）又は血液凝固第ＩＸ因子（Factor IX）を活性化することにより血液を凝固させるセリンプロテアーゼ（serine protease）の前駆体であり、分子量５０，０００Ｄａの単鎖糖タンパク質である。ＦＶＩＩは、第Ｘａ因子（Factor Xa）、第ＸＩＩａ因子（Factor XIIa）、第ＩＸａ因子（Factor IXa）、トロンビン（Thrombin）により二本鎖形態に分解された第ＶＩＩａ因子（Factor VIIa）により活性化形態となる。第ＶＩＩａ因子は、組織因子（tissue factor）、負電荷を帯びたリン脂質Ａに結合することにより酵素活性が強化されることが知られている（非特許文献１）。
【０００３】
生体内において、第ＶＩＩａ因子（Factor VIIa）は組織因子、カルシウムイオン存在下で第Ｘ因子を第Ｘａ因子に転換し、第Ｘａ因子は第Ｖａ因子、カルシウムイオン、リン脂質の存在下でプロトロンビンをトロンビンに転化することにより血液凝固が起こる。
【０００４】
第ＶＩＩ因子は計４０６個のアミノ酸から構成されており、アルギニン（１５２番目のアミノ酸）とイソロイシン（１５３番目のアミノ酸）間の単一ペプチド結合の切断により第ＶＩＩａ因子に転換される。その結果、軽鎖（１５２個のアミノ酸残基）と重鎖（２５４個のアミノ酸残基）がジスルフィド結合により連結された構造を有する。軽鎖にはγ−カルボキシグルタミン酸ドメイン（Ｇｌａ）と２つのＥＧＦ（epidermal growth factor）ドメインがあり、重鎖にはセリンプロテアーゼ活性部位がある。
【０００５】
第ＶＩＩａ因子の生物学的活性に関与するＮ末端の１０個のγ−カルボキシグルタミン酸を形成するためにはビタミンＫが必要である（非特許文献２）。このＧｌａドメインは、組織因子を含む細胞表面に第ＶＩＩ因子が結合するのに関与することが知られている（非特許文献３）。
【０００６】
現在、第ＶＩＩａ因子を生産する方法には２種類ある。第１の方法は、血漿から第ＶＩＩ因子を分離精製し、その後第ＶＩＩａ因子に活性化するものであり（非特許文献４）、第２の方法は、第ＶＩＩ因子に相当するＤＮＡ配列を挿入した動物細胞の培養により得るものである（特許文献１）。
【０００７】
血漿由来製品は、製造の際に効率性が低く、供給が不安定であり、特に安全性面で多くの危険性を内包している。これに対して、遺伝子組換え製品は遺伝工学技術を用いて血漿由来製品の欠点を克服することができる。
【０００８】
しかし、第ＶＩＩ因子を遺伝子組換え技術を用いて動物細胞株において生産する場合、概して発現量が少なく、高い生産性を示すことが困難であるという問題がある。よって、第ＶＩＩ因子を治療剤として用いるためには安定して大量生産できる細胞株の確保が必須であり、その細胞株を確保するためには高効率で発現する発現ベクターの開発も不可欠である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】欧州特許出願第８６３０２８５５号明細書
【特許文献２】韓国登録特許第０８８０５０９号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Nemerson et al, Thromb. Res, 1985, 40:351〜358
【非特許文献２】Hagen et al, Natl.Acad. SC. U.S.A, 1986, 83:2412〜2416
【非特許文献３】Sakai et al, J.Biol Chem, 1990, 265:1890〜1894
【非特許文献４】Broze et al, J. Biol.Chem, 1980, 225:1242〜1247
【非特許文献５】Ehrhardt, A. et al. (2003) Hum Gene Ther 10: 215-25
【非特許文献６】Yet, N. S. (2002) MoI Ther 5: 731-38
【非特許文献７】Chen, Z. Y. et al. (2004) Gene Ther 11 : 856-64
【非特許文献８】Izsvak et al. J. MoI. Biol. 302:93-102 (2000)
【非特許文献９】Urlaub et al., Somat. Cell. Mol. Genet., 12, 555-566, 1986
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、血液凝固第ＶＩＩ因子及びその誘導体を大量生産する方法を見出すために鋭意努力した結果、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーター部位のＧＣリッチ（rich）反復配列が欠失したベクターを用いて Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩを高効率で発現させることのできる動物細胞株用発現ベクターを作製し、その発現ベクターで動物細胞株を形質転換することにより、Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩを安定して大量生産できるモノクローナル形質転換体を作製した。単クローンから血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体の生産量を増加させるために酪酸ナトリウムを低濃度から高濃度まで様々な濃度で添加して培養した結果、比較的高濃度の酪酸ナトリウムを添加した場合に、そしてビタミンＫを低濃度から高濃度まで様々な濃度で添加して培養した結果、比較的高濃度のビタミンＫを添加した場合に、血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体の発現が大幅に増加することを確認し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を大量生産する方法に関し、より詳しくは、ａ）ｉ）ＧＣリッチ領域（GC-Rich region）において少なくとも１つのＣＣＧＣＣＣが除去されたジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーターの塩基配列及びそれに作動可能に連結されたジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする塩基配列と、ｉｉ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期遺伝子プロモーターの塩基配列及びそれに作動可能に連結されたヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体をコードする塩基配列とを含む発現ベクターを作製するステップと、ｂ）前記ａ）ステップの発現ベクターで動物細胞株を形質転換するステップと、ｃ）ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤の存在下で前記ｂ）ステップの形質転換された動物細胞株を培養することにより、高効率でヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を発現する細胞株を選別するステップと、ｄ）前記ｃ）ステップで選別された動物細胞株に酪酸ナトリウム、ビタミンＫ及び培地添加剤からなる群から選択される少なくとも１つを添加して培養するステップとを含む、ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を大量生産する方法を提供することを目的とする。
【００１３】
また、本発明は、ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を生産するＨＭＦ７０９（寄託番号ＫＣＴＣ １２０２２ＢＰ）細胞株を提供することを目的とする。
【００１４】
さらに、本発明は、ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を生産するＨＭＦ７０９（寄託番号ＫＣＴＣ １２０２２ＢＰ）細胞株に酪酸ナトリウム、ビタミンＫ及び培地添加剤からなる群から選択される少なくとも１つを添加して培養するステップを含む、ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を大量生産する方法を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、ＤＨＦＲプロモーター部位のＧＣリッチ（rich）反復配列が欠失したベクターを用いてヒト血液凝固因子第ＶＩＩ因子誘導体を高効率で大量に発現させることができるので、血友病治療剤の製造に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）発現ベクターの地図（map）を示す図である。
【図２】ｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）発現ベクターで形質転換された細胞株から得たコロニーの酵素免疫測定法によるｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）発現量を示す図である。
【図３】ｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）発現ベクターで形質転換された細胞株から得たコロニーを無血清培地に適応させたＴｄ（Doubling Time）を示す図である。
【図４】酪酸ナトリウムの各濃度と各温度でＣＨＯ細胞株から発現するｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）を酵素免疫測定法によって示す図である。
【図５】ビタミンＫの各濃度でＣＨＯ細胞株から発現するｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）を酵素免疫測定法によって示す図である。
【図６】生物反応器で培養するＣＨＯ細胞株の培養プロファイルを示す図である。
【図７】生物反応器で大豆加水分解物添加剤を用いて培養するＣＨＯ細胞株の培養プロファイルを示す図である。
【図８】生物反応器でイースト抽出物添加剤を用いて培養するＣＨＯ細胞株の培養プロファイルを示す図である。
【図９】フラスコにイースト抽出物を各濃度で添加して培養するＣＨＯ細胞株の培養プロファイルを示す図である。
【図１０】フラスコにイースト抽出物を各濃度で添加して培養するＣＨＯ細胞株の発現量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
上記目的を達成するために、本発明の一態様は、ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を大量生産する方法に関し、より詳しくは、ａ）ｉ）ＧＣリッチ領域（GC-Rich region）において少なくとも１つのＣＣＧＣＣＣが除去されたジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーターの塩基配列及びそれに作動可能に連結されたジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする塩基配列と、ｉｉ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期遺伝子プロモーターの塩基配列及びそれに作動可能に連結されたヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体をコードする塩基配列とを含む発現ベクターを作製するステップと、ｂ）前記ａ）ステップの発現ベクターで動物細胞株を形質転換するステップと、ｃ）ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤の存在下で前記ｂ）ステップの形質転換された動物細胞株を培養することにより、高効率でヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を発現する細胞株を選別するステップと、ｄ）前記ｃ）ステップで選別された動物細胞株に酪酸ナトリウム、ビタミンＫ及び培地添加剤からなる群から選択される少なくとも１つを添加して培養するステップとを含む、ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を大量生産する方法に関する。
【００１８】
具体的には、本発明の前記ａ）ステップは、ｉ）ＧＣリッチ領域（GC-Rich region）において少なくとも１つのＣＣＧＣＣＣが除去されたジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーターの塩基配列及びそれに作動可能に連結されたジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする塩基配列と、ｉｉ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期遺伝子プロモーターの塩基配列及びそれに作動可能に連結されたヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体をコードする塩基配列とを含む発現ベクターを作製するステップである。
【００１９】
本発明における「ＧＣリッチ領域（GC-Rich region）」とは、ジヒドロ葉酸レダクターゼの転写調節因子であるプロモーターに含まれるＣＣＧＣＣＣ反復配列を意味し、この反復配列の全部又は一部を欠失、変異などの方法で人為的に欠損させると、ジヒドロ葉酸レダクターゼの発現は最小限になる。ここで、発現が最小に維持された状態でジヒドロ葉酸阻害剤を添加すると、細胞は生存のためにより多くのジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を増幅するので、前記ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を含む発現ベクター内に含まれる目的とする組換え遺伝子も同時に増幅されて高発現することが観察された。
【００２０】
よって、本発明の具体的な一態様においては、ＣＣＧＣＣＣ反復配列が少なくとも１つ除去されたプロモーターを含むジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子の塩基配列を含む高発現誘導カセットを提供する。前記高発現誘導カセットは、６個以下のＣＣＧＣＣＣ反復配列を含むジヒドロ葉酸レダクターゼのプロモーターを含み、好ましくは３個以下のＣＣＧＣＣＣ反復配列を含むプロモーターを含み、より好ましくは１個以下のＣＣＧＣＣＣ反復配列を含むプロモーターを含み、特により好ましくはＣＣＧＣＣＣ反復配列が全て除去されたプロモーターを含む。
【００２１】
これらＣＣＧＣＣＣ反復配列の除去は、当業界で周知の遺伝子組換え技術による塩基配列の置換や欠失などの方法により行うことができ、本発明の具体的実施例においては、ＣＣＧＣＣＣ反復配列を含む塩基配列の一部を欠失させる方法によりプロモーター内のＧＣリッチ配列の一部又は全部を除去した。
【００２２】
本発明における「ジヒドロ葉酸レダクターゼ」とは、ＮＡＤＰＨを電子供与体としてジヒドロ葉酸をテトラヒドロ葉酸に還元する酵素を意味する。ヒトにおいてはＤＨＦＲ遺伝子によりコードされる。
【００２３】
本発明における「ヒト血液凝固因子」とは、傷による出血の際に血液凝固により身体を保護する作用をする血液凝固関連タンパク質であり、血液凝固は、このようなタンパク質の第ＸＩＩ因子が関与して起こる一連の反応である。
【００２４】
本発明における「ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子」とは、プロコンバーチン（Proconvertin）ともいい、肝臓で合成されて５０，０００Ｄａの分子量を有する、熱に不安定なタンパク質であり、血液内濃度は２０〜４０ｍｇ／ｍｌのタンパク質である。このような第ＶＩＩ因子は、第ＶＩＩａ因子に活性化させることにより、血液を凝固させる血液凝固剤として用いられる。血液凝固第ＶＩＩ因子の塩基配列には、血液凝固第ＶＩＩ因子の活性を示す公知の配列と７０％、８０％、９０％、９５％、好ましくは９７％の配列相同性を有する塩基配列が制限なく含まれる。配列番号３であることが好ましい。
【００２５】
本発明における「ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体」とは、前記ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子を形成するアミノ酸又は化学残基に対して除去、添加及び／又は置換を起こした物質を意味し、特に前記アミノ酸又は化学残基に対する除去、添加及び／又は置換により生体内安定性が向上したり、保存性が優れていたり、活性が増加したり、他成分との結合部位を含むなどの別途の機能が追加されて治療用タンパク質として有利な特性が増加しているか、又は新たに追加されたものであってもよい。本発明におけるヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体は、ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子に特定のアミノ酸配列が追加されたものであり、特にＣ末端に追加されたものであってもよく、前記追加されたアミノ酸配列はペプチドリンカーであってもよい。ＳＯＤ１（Superoxide dismutase 1）の一部の配列が追加されたものであることが好ましく、特にＳＯＤ１の１〜６位のアミノ酸配列（ＡＴＫＡＶＣ，配列番号５）が追加されたものであることが好ましい。
【００２６】
本発明における「ＳＯＤ１（superoxide dismutase 1）」とは、生体内で活性酸素である超酸化物（superoxide）イオンを酸素と過酸化水素に分解する不均等化反応を触媒する酵素を意味し、酸素に露出するほとんど全ての細胞において主な抗酸化防御機構を果たすことが知られている。生体内で多く見出されるタンパク質の一種であるＳＯＤ１由来配列を用いることにより、追加される配列の免疫原性を低下させることができる。
【００２７】
本発明における「ベクター」とは、宿主細胞への塩基のクローニング及び／又は転移のための任意の媒体を意味する。ベクターは、他のＤＮＡ断片が結合することにより、結合した断片の複製を作製するレプリコン（replicon）であってもよい。「レプリコン」とは、生体内でＤＮＡ複製の自己ユニットとして機能する、すなわち自己調節により複製可能な任意の遺伝的単位（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）を意味する。「ベクター」には、試験管内、生体外又は生体内で宿主細胞に塩基を導入するためのウイルス及び非ウイルス媒体が含まれる。また、「ベクター」には、ミニサークルＤＮＡが含まれてもよい。例えば、前記ベクターは、バクテリアＤＮＡ配列を有さないプラスミドであってもよい。ＣｐＧ領域における豊富なバクテリアＤＮＡ配列の除去は、転移遺伝子の発現サイレンシングを減少させてプラスミドＤＮＡベクターからさらに持続的な発現をもたらすために行われている（例えば、非特許文献５、６、７）。さらに、「ベクター」には、スリーピングビューティー（Sleeping Beauty）などのトランスポゾン（非特許文献８）、又は人工染色体が含まれてもよい。本発明における「発現ベクター」とは、前記血液凝固因子を発現させることにより、目的とするタンパク質を高効率で発現させることができるものであり、ｉ）ＧＣリッチ領域（GC-Rich region）において少なくとも１つのＣＣＧＣＣＣが除去されたジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーターの塩基配列及びそれに作動可能に連結されたジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする塩基配列を含むベクターであってもよい。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターなどが挙げられ、プラスミドベクターであることが好ましい。
【００２８】
前記発現ベクターは、ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体をコードする塩基配列をさらに含んでもよく、このような発現ベクターを発現させることにより、目的とするヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を高効率で発現させることができる。前記ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体をコードする塩基配列をさらに含む発現ベクターは、図１に示すｐＸＯＧＣ−ＦＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣベクターであることが好ましい。
【００２９】
前記ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体は、前記ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子のプロモーターにより発現するか、又は別のプロモーターにより発現が調節される。前記ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体は、別のプロモーターにより発現が調節されることが好ましい。このようなプロモーターは、当業界で周知のものであり、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＥＦαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター及びＴＫプロモーターからなる群から当業者が容易に選択して用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
本発明の発現ベクターは、動物細胞株における高発現を誘導するためのものであり、動物細胞における永久的な発現のための選択標識因子として用いられる動物細胞株用耐性遺伝子をさらに含むことが好ましい。前記動物細胞株用耐性遺伝子としては、通常当業界で用いられる動物細胞株用耐性遺伝子であるネオマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
また、本発明の発現ベクターは、その他にも、一般的なベクターの構成要素、例えば複製原点及びポリアデニル化シグナルと、その他転写調節因子などをさらに含んでもよいが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
本発明のｂ）ステップは、前記ａ）ステップの発現ベクターで動物細胞株を形質転換するステップであることが好ましい。
【００３３】
本発明における「形質転換」又は「トランスフェクション」とは、外部遺伝子が宿主細胞に導入され、導入された遺伝子がそれ自体で複製するか、又は宿主ゲノム中に挿入されて人工的な遺伝的変異を起こすこと意味する。
【００３４】
前記細胞内に本発明のベクターを形質転換する方法は、塩基を細胞に導入するいかなる方法であってもよく、当該分野において公知であるように、好適な標準技術を選択して行うことができる。エレクトロポレーション（electroporation）、リン酸カルシウム共沈殿（calcium phosphate co-precipitation）、レトロウイルス感染（retroviral infection）、微量注入法（microinjection）、ＤＥＡＥ−デキストラン（DEAE-dextran）、カチオン性リポソーム（cationic liposome）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
具体的には、本発明において、ＣＨＯ細胞にリポフェクタミンを用いて組換えタンパク質を発現するベクターを形質転換した。
【００３６】
また、本発明における動物細胞株の培養は、当業界で公知の好適な培地と培養条件で行われる。このような培養過程は、当業者であれば選択される動物細胞株に応じて容易に調整して用いることができる。細胞の成長様式によって浮遊培養（懸濁培養）と付着培養に分けられ、培養方法によって回分、流加及び連続培養方法に分けられる。培養に用いられる培地は、特定の細胞株の要件を満たさなければならない。
【００３７】
動物細胞培養における前記培地は、様々な炭素源、窒素源及び微量元素成分を含む。用いることのできる炭素源の例としては、ブドウ糖、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースなどの炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナッツ油などの脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸などの脂肪酸、グリセリン及びエタノールなどのアルコール、並びに酢酸などの有機酸が挙げられる。これら炭素源は、単独で用いることもでき、組み合わせて用いることもできる。用いることのできる窒素源の例としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液（ＣＳＬ）及び大豆粕などの有機窒素源、並びに尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムなどの無機窒素源が挙げられる。これら窒素源は、単独で用いることもでき、組み合わせて用いることもできる。その他、アミノ酸、ビタミン及び適切な前駆体などが含まれてもよい。
【００３８】
また、前記培地には、メトトレキサート（Methotrexate）などのジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤を添加してもよい。これは、前述したように、本発明の好ましい実施例によるタンパク質組換え方法は、ジヒドロ葉酸レダクターゼが欠失した動物細胞株に本発明による発現ベクターを形質転換し、組換え遺伝子を増幅するためにジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤を添加してベクター内のジヒドロ葉酸レダクターゼが増幅されることにより選択されるようにするシステムを短期間で効率的に実現することを目的とするからである。
【００３９】
これら目的組換えタンパク質は、動物細胞株における発現が求められるものであり、そのような目的に照らすと、本発明において使用可能な好ましい動物細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣（CHO: Chinese hamster ovarian cacer）細胞株、サル腎臓細胞７（COS7 : Monkey kidney cells）細胞株、ＮＳＯ細胞株、ＳＰ２／０細胞株、Ｗ１３８、ベビーハムスター腎臓（BHK: Baby hamster kidney）細胞株、ＭＤＣＫ、骨髄腫細胞株、ＨｕＴ ７８細胞、２９３細胞などが含まれるが、これらに限定されるものではない。当該技術分野における通常の知識を有する技術者であれば、本発明のジヒドロ葉酸レダクターゼを用いた増幅技術に適用できる適切な動物細胞株を容易に選択することができる。本発明においては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子が欠乏したことを特徴とする細胞株であることが好ましい。
【００４０】
本発明における「組換えベクターで形質転換された宿主細胞」とは、少なくとも１つの目的とするタンパク質をコードする遺伝子を有するベクターでトランスフェクションした細胞を意味し、組換え哺乳動物細胞、齧歯類細胞、好ましくは動物細胞又は動物細胞由来の細胞であってもよく、 最も好ましくはＣＨＯ細胞であってもよい。宿主細胞がＣＨＯ細胞の場合、遺伝子を安定して発現させ、かつ細胞内における遺伝子のコピー数（copy number）の増幅を目的とするので、塩基合成経路が欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩなど）を導入して、メトトレキサート（methotrexate, MTX）により増幅することができる。
【００４１】
本発明の具体的な一実施例においては、ジヒドロ葉酸レダクターゼが欠乏したチャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−）を用いた。すなわち、ジヒドロ葉酸レダクターゼが欠乏したＣＨＯ細胞株にヒト血液凝固第ＶＩＩ因子をコードする遺伝子を含む本発明による発現ベクターを形質転換し、１００ｎＭ以下、より好ましくは５０ｎＭ以下の低いメトトレキサート濃度でも十分な数の遺伝子が増幅され、生産性が検証された動物細胞株を提供する。
【００４２】
本発明のｃ）ステップは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤の存在下で前記ｂ）ステップの形質転換された動物細胞株を培養することにより、高効率でヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を発現する細胞株を選別するステップであることが好ましい。
【００４３】
本発明におけるｃ）ステップで選別される細胞株はＨＭＦ７０９（ＫＣＴＣ １２０２２ＢＰ）であることが好ましい。
【００４４】
本発明の具体的な一実施例においては、前記選別された細胞株をＨＭＦ７０９と命名し、当該細胞株を２０１１年９月２３日付けでブダペスト条約の下の国際寄託機関である韓国生命工学研究院生物資源センター（韓国大田市儒城区科学路１１１韓国生命工学研究院）に寄託番号ＫＣＴＣ １２０２２ＢＰとして寄託した。
【００４５】
一方、前記ｃ）ステップで選別された細胞株は、無血清培地（EX-CELL CHO培地，米国Sigma社，cat. no. 14360C）を用いることにより浮遊培養に適応させることができる。本発明の具体的な一実施例においては、ＨＭＦ７０９（ＫＣＴＣ １２０２２ＢＰ）を無血清培地（EX-CELL CHO培地，米国Sigma社，cat. no. 14360C）を用いて浮遊培養に適応させた。
【００４６】
また、本発明における前記ｄ）ステップは、前記ｃ）ステップで選別されて浮遊培養に適応させた動物細胞株に酪酸ナトリウム、ビタミンＫ及び培地添加剤からなる群から選択される少なくとも１つを添加して培養するステップである。
【００４７】
本発明における「酪酸ナトリウム」とは、ヒストンデアセチラーゼの阻害によりヒストンの過剰アセチル化を引き起こすことが知られている物質であり、細胞の分化及び遺伝子の発現を誘導することが知られている。本発明においては、ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を大量に生産するための培地添加剤として用いられ、添加量は培養条件に応じて当業者が容易に選択することができ、０．１〜４．０ｍＭの濃度で添加することが好ましく、前記ｄ）ステップの培養温度が３２．５〜３５．０℃であれば１．１〜３．５ｍＭの濃度で添加し、培養温度が３１〜３２．５℃であれば１．２〜２．０ｍＭの濃度で添加することがより好ましい。特に、前記ｄ）ステップの培養温度が３３．０℃であれば酪酸ナトリウムは１．５ｍＭの濃度で添加することができる。
【００４８】
前記ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体タンパク質は、前記ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子のプロモーターにより発現するか、又は別のプロモーターにより発現が調節される。前記ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体タンパク質は、別のプロモーターにより発現が調節されることが好ましい。このようなプロモーターは、当業界で周知のものであり、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＥＦαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター及びＴＫプロモーターからなる群から当業者が容易に選択して用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
本発明における「ビタミンＫ」とは、通常ビタミンＫ１（フィロキノン，phylloquinone）、Ｋ２（メナキノン，menaquinone）及び前駆体であるＫ３（メナジオン，menadione）を全て含む意味で用いられ、血液凝固を促進する脂溶性ビタミンの一種である。ビタミンＫのＫは、凝固を意味するKoagulationに由来する。特に、プロトロンビン（prothrombin）などの血液凝固タンパク質の生成に関与して正常な血液凝固を助けることが知られている。また、骨に主に存在するオステオカルシンタンパク質のカルボキシル化に関わることが知られている。本発明におけるビタミンＫは、ビタミンＫ１又はビタミンＫ３であり、特にビタミンＫ１であるが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
本発明における「培地添加剤」には、細胞及び個体を培養する培地に添加できるあらゆる成分が含まれ、特に動物細胞株の細胞生存、細胞増殖又はタンパク質生産を促進するものであるが、これらに限定されるものではない。本発明においては、特に大豆加水分解物又はイースト抽出物（Yeast extract, イーストエクストラクト）であり、前記大豆加水分解物又はイースト抽出物は、培地に０．１〜３ｇ／Ｌの濃度で添加することができる。
【００５１】
具体的には、本発明の一実施例において、ジヒドロ葉酸レダクターゼのプロモーター中にＣＣＧＣＣＣ反復配列を１つのみ有する高発現誘導カセット、及びＣＣＧＣＣＣ反復配列を全く含まない高発現誘導カセットをそれぞれ作製し、これら発現カセットを含む発現ベクターで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞株を用いる。これら細胞株は、本発明者らの先行発明により、２００６年１０月２日付けで韓国大田市儒城区所在の生命工学研究院内の遺伝子バンクに受託番号ＫＣＴＣ １０９９１ ＢＰ及びＫＣＴＣ １０９９２ ＢＰとしてそれぞれ寄託されている。これらの細胞株は、所望の目的組換えタンパク質の高発現を誘導するために、前記細胞株から前記高発現誘導カセットを含む発現ベクターを分離し、遺伝子組換え技術などによるクローニング方法により、ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体タンパク質をコードする遺伝子をさらに含む発現ベクターの作製に用いられる。本発明に用いられる発現ベクターとしては、図１に示すｐＸＯＧＣ−ＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）ベクターを作製することが好ましく、前記発現ベクターで形質転換されたＣＨＯ細胞株を酪酸ナトリウム、ビタミンＫ又は培地添加剤（大豆加水分解物又はイースト抽出物）が添加された培養培地で培養することにより、所望のヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を大量に生産した。
【００５２】
まず、酪酸ナトリウムを添加した結果、図４に示すように、特に３３．０℃にて１．５ｍＭの酪酸ナトリウム濃度でｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）生産量が増加することが分かった。
【００５３】
また、ビタミンＫを添加した結果、図５に示すように、所定量のビタミンＫ３を対照群とし、ビタミンＫ１の添加量を増加すると、ビタミンＫ１は多量に添加しても細胞毒性がなく、濃度依存的にヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体の発現を増加させることが確認された。すなわち、ビタミンＫ１の添加濃度が増加するにつれて、ｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）生産量が増加することが分かった。
【００５４】
最後に、対照群として酪酸ナトリウム又は培地添加剤（大豆加水分解物又はイースト抽出物）を添加した結果、表１及び図６〜図８に示すように、大豆加水分解物１ｇ／Ｌとイースト抽出物１ｇ／Ｌをそれぞれ添加すると、ｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）生産量が増加することが分かった。特に、大豆加水分解物を加えると生産量が最も増加することが確認された。
【００５５】
また、本発明は、前記細胞株からヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を生産する場合、酪酸ナトリウムを添加するステップを含んで生産したヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を大量に精製するステップをさらに含んでもよい。
【００５６】
また、生産されたヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を活性化するステップをさらに含んでもよい。
【００５７】
本発明の具体的な一実施例においては、ジヒドロ葉酸レダクターゼのプロモーター中のＧＣリッチ配列を人為的に欠損させることによりジヒドロ葉酸レダクターゼの発現が最小限となるようにし、その後ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤を添加することにより導入遺伝子を増幅した。遺伝子増幅が行われた細胞株の１つの細胞を起源とするクローンを得るために、限界希釈を行ってモノクローナル細胞株を得て、これを大量培養し、無血清培地で酪酸ナトリウム、ビタミンＫ又は培地添加剤を添加することによりヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を生産した。また、精製及び活性化を行ったヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を生産した。
【００５８】
さらに、本発明は、ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を生産するＨＭＦ７０９（寄託番号ＫＣＴＣ １２０２２ＢＰ）細胞株に酪酸ナトリウム、ビタミンＫ及び培地添加剤からなる群から選択される少なくとも１つを添加して培養するステップを含む、ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を大量生産する方法を提供する。
【００５９】
本発明の他の態様は、ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を生産する細胞株を提供する。本発明の細胞株は、ＨＭＦ７０９（ＫＣＴＣ １２０２２ＢＰ）細胞株であることが好ましい。
【００６０】
本発明の具体的な一実施例においては、本発明のｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）発現ベクターで形質転換してジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤の存在下で培養することにより、高効率でヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体を発現する細胞株を選別し、ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子誘導体発現能が最も優れる細胞株を選別して２０１１年９月２３日付けで韓国生命工学研究院生物資源センター（韓国大田市儒城区科学路１１１韓国生命工学研究院）に寄託番号ＫＣＴＣ １２０２２ＢＰとして寄託した。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。しかし、下記実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【００６２】
実施例１：組換えＦａｃｔｏｒ ＶＩＩ発現のための発現ベクター（ｐＸ０ＧＣ−ｈＦＶＩＩ）の作製
１−１．ヒトＦａｃｔｏｒ ＶＩＩ遺伝子の取得
まず、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction）方法を用いてシグナル配列を含むヒトのＦａｃｔｏｒ ＶＩＩ遺伝子を取得した。Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ（ＦａｃＶＩＩ）遺伝子増幅のために、ヒト胎児肝臓（fetal liver）ｃＤＮＡライブラリー（TAKARA BIO USA）を鋳型とし、配列番号１及び２の正方向及び逆方向プライマーを用いてＰＣＲを行った。
【００６３】
ポリメラーゼ、プライマー、ｃＤＮＡライブラリー及びｄＮＴＰを含む反応物を９５℃で１分間変性させ、その後９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の反応を３０回繰り返し、次いで最終的に６８℃で５分間反応させた。
【００６４】
ここで、クローニング作業を容易にするために、配列番号１のプライマーには制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位を挿入し、配列番号２のプライマーには制限酵素ＸｈｏＩ認識部位を挿入した。前記プライマーを表１に示す。
【００６５】
【表１】
2016528921.tif 000003
【００６６】
前記ポリメラーゼ連鎖反応により得られた約１．３ｋｂのＰＣＲ産物に対してＤＮＡシークエンシングにより塩基配列を確認し、配列番号３で表される塩基配列を有することを確認した。
【００６７】
１−２．組換えＦａｃｔｏｒ ＶＩＩ発現ベクター（ｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ）の作製
実施例１−１で得られたＦａｃｔｏｒ ＶＩＩ ＰＣＲ産物をＣＭＶプロモーターの制御下で発現させるために、動物細胞発現ベクターであるｐＸ０ＧＣベクターにクローニングした。前記ｐＸ０ＧＣベクターは、少なくとも１つのＣＣＧＣＣＣ反復配列が除去されたＤＨＦＲプロモーターの塩基配列、及びそれに作動可能に連結されたＤＨＦＲをコードする塩基配列を含む発現ベクターであり、組換えタンパク質の高発現誘導のために作製されたベクターである（特許文献２参照）。
【００６８】
具体的には、前記ポリメラーゼ連鎖反応により取得した約１．３ｋｂのＦａｃｔｏｒ ＶＩＩ遺伝子を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩにより３７℃で２時間反応させて切断し、ＰＣＲ精製キット（Qiagen, USA）を用いて切断されたＤＮＡ断片を得た。また、動物細胞発現ベクターであるｐＸ０ＧＣベクターを上記と同じ条件で同じ制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩにより処理し、電気泳動することにより分離精製した。前述したように切断したＤＮＡ断片とｐＸＯＧＣベクターを混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いてクローニングすることにより、Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ遺伝子を含む発現ベクター（ｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ）を作製した。
【００６９】
実施例２：組換えＦａｃＶＩＩ誘導体の発現のための発現ベクターの作製
実施例１で作製したＦａｃＶＩＩ遺伝子を含む発現ベクター（ｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ）を用いて、ＦａｃＶＩＩのＣ末端にＳＯＤ１（Superoxide Dismutase 1）の一部の配列が結合された形態のＦａｃＶＩＩ誘導体をコードするポリヌクレオチドを得て、前記誘導体を発現させる発現ベクターを作製した。
【００７０】
２−１．ヒトＦａｃｔｏｒ ＶＩＩ誘導体遺伝子の取得
実施例１で作製された発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩに含まれるＦａｃＶＩＩ遺伝子の３’末端にＳＯＤ１の１〜６位のアミノ酸配列（ＡＴＫＡＶＣ，配列番号５）をコードするポリヌクレオチドが追加されたポリヌクレオチドを含む組換えＦａｃＶＩＩ誘導体発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣを作製した。具体的には、前記発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩを鋳型とし、配列番号６及び７の正方向及び逆方向プライマーを用いてＰＣＲを行った（９５℃で１分間の変性，３０回（９５℃で６０秒間、６０℃で６０秒間、及び６８℃で９０秒間），６８℃で５分間）。ここで、クローニング作業を容易にするために、配列番号６のプライマーには制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位を挿入し、配列番号７のプライマーには制限酵素ＸｈｏＩ認識部位を挿入した。次に、前記ＰＣＲにより得られた約１．４ｋｂのＰＣＲ産物の塩基配列（配列番号８）を確認した。
【００７１】
【表２】
2016528921.tif 000004
【００７２】
２−２．組換えＦａｃＶＩＩ誘導体発現ベクターｐＸＯＧＣ−ＦＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣの作製
前述したように得られたＦａｃＶＩＩ誘導体ＰＣＲ産物をＣＭＶプロモーターの制御下で発現させるために、動物細胞発現ベクターであるｐＸ０ＧＣベクターにクローニングした。具体的には、前記ＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにより３７℃で２時間反応させて切断し、ＰＣＲ精製キット（Qiagen, USA）を用いて切断されたＤＮＡ断片を得た。また、動物細胞発現ベクターであるｐＸ０ＧＣベクターを上記と同じ条件で同じ制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにより処理し、電気泳動することにより分離精製した。前述したように切断したＤＮＡ断片とｐＸＯＧＣベクターを混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いてクローニングすることにより、発現ベクター（ｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ）を作製した。
【００７３】
実施例３：ｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ誘導体（ｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ））発現細胞株の作製
実施例２で作製した発現ベクターを用いてｈＦＶＩＩ誘導体を発現させた。
【００７４】
３−１．ＣＨＯ細胞株を用いたＦａｃＶＩＩ誘導体（ｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ）の形質転換
実施例２−２で作製した組換え発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣをＤＨＦＲ遺伝子が破壊されて核酸の生合成過程が不完全なＤＧ４４／ＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−）（非特許文献９）に導入することにより形質転換体を得て、前記形質転換体からＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ誘導体を発現させた。
【００７５】
具体的には、前記ＤＧ４４／ＣＨＯ細胞株を培養容器の底の約８０〜９０％を覆う程度に培養し、次いで前記細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Gibco社，cat. No. 51985034）で３回洗浄した。
【００７６】
一方、３ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと５μｇの発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣの混合物と、３ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと２０μｌのリポフェクタミン（Gibco社，cat. no. 18324-012）の混合物をそれぞれ常温で３０分間静置した。次に、前記各混合物を混合して前記培養したＤＧ４４／ＣＨＯ細胞株に加え、３７℃及び５％ＣＯ２の条件で約１８時間培養することにより、前記発現ベクターｐＸ０ＧＣ−ＦＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣをＤＧ４４／ＣＨＯ細胞株に導入した。次に、前記培養した細胞を１０％ＦＢＳが含まれるＤＭＥＭ−Ｆ１２（Gibco社，cat. no. 11330）培地で３回洗浄し、次いで前記培地を加えてさらに４８時間培養した。培養した細胞にトリプシンを加えて培養した細胞をそれぞれ分離し、それらを選別培地（ＨＴ補充剤（Hypoxanthine-Thymidine）を含まず、１０％ＦＢＳ及び１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Cellgro社，cat. no. 61-234 -RG）を含むＭＥＭ−α培地（WELGENE社，cat. no. LM008-02））に接種した。形質転換された細胞のみ生存してコロニーを形成するまで、前記選別培地を２日又は３日置きに交換して培養することにより、前記分離した細胞から形質転換された細胞を選抜した。ここで、前記選抜した形質転換された細胞においてＦａｃＶＩＩ−ＡＴＫＡＶＣ誘導体の発現レベルを向上させるために、１０ｎＭ ＭＴＸ（Sigma社，cat. no. M8407）を選別培地に加え、次第にその濃度を増加し、２〜３週間後には３０ｎＭまでＭＴＸの含有量を増加した。
【００７７】
また、前述したように形質転換された細胞の異種性（heterogeneity）を減少させるために、限界希釈法（limiting dilution method）を行うことにより単クローンを得た。具体的には、９６ウェルプレートに１ウェル当たりの細胞数の割合が０．７となるように希釈した前記形質転換細胞をそれぞれ分注し、２〜３週間培養して単クローンが観察されるか否かを確認した。単クローンがクラスターを形成するウェルが観察されると、前記単クローンを２４ウェルプレートに移し、各クローンの細胞増殖率（cell growth rate）とＦａｃＶＩＩ誘導体の発現量をＥＬＩＳＡ方法で分析し、ＦａｃＶＩＩ誘導体の発現量が最も多いクローンを選別した。これを「ＨＭＦ７０９」と命名し、当該細胞株をブダペスト条約の下の国際寄託機関である韓国大田市儒城区科学路１１１韓国生命工学研究院所在の生物資源センター（Korean Collection for Type Culture）に２０１１年９月２３日付けで寄託番号「ＫＣＴＣ １２０２２ＢＰ」として寄託した。
【００７８】
３−２．酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いたｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）発現の確認
実施例３−１で形質導入された細胞の一部を２４ウェルプレートに２×１０４細胞数／ウェルの濃度で移して培養容器の底をほぼ覆う程度に培養し、その後０．３ｍＭの酪酸ナトリウム（sodium butyrate；Sigma社，cat. no. B5887）が添加された無血清培地ＣＨＯ−Ａ−ＳＦＭ（Gibco社，cat. no. 05-5072EF）を１ウェル当たり２００μＬずつ加え、５％ＣＯ２培養器にて３３℃で４８時間培養した。細胞の培養液を１．５ｍＬチューブに移し、その後遠心分離により上清のみ再び回収してｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）の発現量を測定した。発現量測定は、キットメーカーのプロトコルに従って、酵素免疫測定キット（Molecular Innovation, cat. no. HFVIIKT-TOT）を用いて行った。
【００７９】
具体的には、まず細胞培養液とキットに含まれる標準物質をＴｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）で一定に希釈し、その後キットのウェルに１００μＬずつ添加し、プレートシェーカー（plate shaker）にて常温、３００ｒｐｍで３０分間反応させた。次いで、キットメーカーの洗浄液を用いてウェルを４回ずつ洗浄し、その後抗ｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ抗体をウェルに１００μＬずつ添加し、プレートシェーカー（plate shaker）にて常温、３００ｒｐｍで３０分間反応させた。再びキットメーカーの洗浄液で４回洗浄し、その後ＨＲＰ（horseradish peroxidase）が結合された抗ｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ 抗体に対する抗体も１ウェル当たり１００μＬずつ添加し、同じ方法にて常温、３００ｒｐｍで３０分間反応させた。反応終了後に４回洗浄し、その後基質液を１００μＬずつ加えて常温で静置して反応させた。約５分後に５０μＬの反応停止液を加えて反応を停止させ、次いで４５０ｎｍの吸光度で測定した。キットメーカーが提供する標準液の濃度と得られた吸光度の値とを用いて標準曲線及び関数を得て、それを用いてｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）の量を定量化した。その結果、形質導入されて選別された細胞が所定量のｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）を発現することが確認された。
【００８０】
３−３．ｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）発現細胞株の選別
実施例３−２でｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ誘導体の発現が確認された混合種個体群（Mixed population）において、限界希釈法（limiting dilution method）を用いた単クローン選別を行った。すなわち、不均一なｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ誘導体発現率を示すクローンにおいて、限界希釈法を用いてｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ誘導体発現率が均一で生産性に優れた単一細胞を分離する実験を行った。具体的には、６ウェルプレートの細胞のうち最も発現量が高いウェルの細胞を９６ウェルプレートに細胞が１ウェル当たり１つ以下で接種されるように希釈し、その後細胞が１つのみ接種されたプレートを選別して２〜３週間培養した。次に、コロニーを形成するウェルプレートの細胞を分離し、その後継代培養してｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ誘導体の発現量を酵素免疫測定法で測定した（図２）。限界希釈法により分離した細胞株のうちｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ誘導体の高生産性を示す組換えＣＨＯ細胞株を最終選別し、ＨＭＦ７０９と命名した。当該細胞株を韓国大田市儒城区科学路１１１韓国生命工学研究院所在の生物資源センター（Korean Collection for Type Culture）に２０１１年９月２３日付けで寄託番号「ＫＣＴＣ １２０２２ＢＰ」として寄託した。
【００８１】
選別された細胞株は、無血清培地（EX-CELL CHO培地，米国Sigma社，cat. no. 14360C）を用いて浮遊培養に適応させた（図３）。
【００８２】
実施例４：酪酸ナトリウム添加による細胞株の成長及びｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）生産量の測定
４−１．種菌及び本培養
実施例３−３で選別後に浮遊培養に適応させて液体窒素タンクに保管中のｈＦＶＩＩ発現細胞株１バイアル（１×１０７細胞／ｍｌ）を取り出し、３７℃の恒温水槽で可能な限り迅速に溶解し、その後種菌培養培地（グルタミン０．３ｇ／Ｌが添加されたＥＸ−ＣＥＬＬ ＣＨＯ培地（Sigma社，cat. no. 63225C））で１回洗浄し、９０×ｇで５分間遠心分離して種菌培養培地５０ｍＬが入った三角フラスコ（Erlenmeyer flask；米国Corning社，cat. no. 431144）に接種した。ＣＯ２培養器（３７℃，５％ＣＯ２）で細胞濃度が１０×１０５細胞／ｍｌになるまで１〜２日間培養し、次いで上記と同様に遠心分離して新鮮な種菌培養培地１００ｍＬが入った新たな三角フラスコで継代培養した。同じ方法により、十分な数の細胞が得られるまで２倍ずつ培養体積を増加させて継代培養した。
【００８３】
４−２．生産培地中への酪酸ナトリウムの添加による細胞株の成長及びｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）生産量の測定
生産培地中への酪酸ナトリウムの添加がｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）の生産量に及ぼす効果を調べるために、培養中の組換えＣＨＯ細胞株約５．０×１０６細胞／ｍｌを３つの三角フラスコに５０ｍＬの培養体積で接種した。ここで、培養培地に酪酸ナトリウム（cat. no. B5887，シグマ社，米国）がそれぞれ１．０、１．２、１．５及び２．０ｍＭとなるように添加し、酪酸ナトリウム１．０ｍＭを入れたフラスコ対照群として培養を始めた。ｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）の生産のために、培養温度を３２．０℃又は３３．０℃に調整して３日間培養した。培養３日目に培養液を回収して細胞株の細胞濃度及び細胞活性度を観察した結果、酪酸ナトリウムによる細胞濃度及び細胞活性度の変化はなかった。
【００８４】
一方、培養３日目に遠心分離により培養上清を回収し、実施例３−２と同様に、酵素免疫法を用いて各培養上清に発現したｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）の量を測定した。測定した値を対照群と比較した生産量（％）に計算して示した（図４）。
【００８５】
図４に示すように、特に３３．０℃で１．５ｍＭの酪酸ナトリウムを添加すると、最も高い生産量が得られることが確認された。
【００８６】
実施例５：ビタミンＫの濃度によるｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）生産量の測定
５−１．種菌及び本培養
実施例３−３で選別後に浮遊培養に適応させて液体窒素タンクに保管中のｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）発現細胞株１バイアル（１×１０７細胞／ｍｌ）を取り出し、３７℃の恒温水槽で可能な限り迅速に溶解し、その後種菌培養培地（グルタミン０．３ｇ／Ｌが添加されたＥＸ−ＣＥＬＬ ＣＨＯ培地（Sigma社，cat. no. 63225C））で１回洗浄し、９０×ｇで５分間遠心分離して種菌培養培地５０ｍＬが入った三角フラスコ（Erlenmeyer flask；米国Corning社，cat.no. 431144）に接種した。ＣＯ２培養器（３７℃，５％ＣＯ２）で細胞濃度が１０×１０５細胞／ｍｌになるまで１〜２日間培養し、次いで上記と同様に遠心分離して新鮮な種菌培養培地１００ｍＬが入った新たな三角フラスコで継代培養した。同じ方法により、十分な数の細胞が得られるまで２倍ずつ培養体積を増加させて継代培養した。
【００８７】
５−２．生産培地中へのビタミンＫの添加による細胞株の成長及びｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）生産量の測定
生産培地中へのビタミンＫの添加がｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）の生産量に及ぼす効果を調べるために、培養中の組換えＣＨＯ細胞株約５．０×１０６細胞／ｍｌを３つの三角フラスコに５０ｍＬの培養体積で接種した。ここで、培養培地にビタミンＫ１（cat. No. 501890，メルクミリポア，米国）を０、１０、２５、５０、２５０、１０００μｇ／Ｌとなるように添加し、ビタミンＫ３（cat. No. M2518，シグマ，米国）を６０μｇ／Ｌとなるように入れたフラスコを対照群として培養を始めた。ｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）の生産のために、培養温度を３３．０℃に調整して３日間培養した。培養３日目に培養液を回収して細胞株の細胞濃度及び細胞活性度を観察した結果、ビタミンＫによる細胞濃度及び細胞活性度の変化はなかった。
【００８８】
一方、培養３日目に遠心分離により培養上清を回収し、実施例３−２と同様に、酵素免疫法を用いて各培養上清に発現したｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）の量を測定した。測定した値を対照群と比較した生産量（倍）に計算して示した（図５）。
【００８９】
図５に示すように、ビタミンＫ添加濃度が増加するにつれてｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）生産量が増加することが分かった。
【００９０】
実施例６：培地添加剤の使用による細胞株の成長並びにｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）生産量及び活性の測定
６−１．種菌及び本培養
実施例３−３で選別後に浮遊培養に適応させて液体窒素タンクに保管中のｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）発現細胞株１バイアル（１×１０７細胞／ｍｌ）を取り出し、３７℃の恒温水槽で可能な限り迅速に溶解し、その後種菌培養培地（グルタミン０．３ｇ／Ｌが添加されたＥＸ−ＣＥＬＬ ＣＨＯ培地（Sigma社，cat. no. 63225C））で１回洗浄し、９０×ｇで５分間遠心分離して種菌培養培地５０ｍＬが入った三角フラスコ（Erlenmeyer flask；米国Corning社，cat.no. 431144）に接種した。ＣＯ２培養器（３７℃，５％ＣＯ２）で細胞濃度が１０×１０５細胞／ｍｌになるまで１〜２日間培養し、次いで上記と同様に遠心分離して新鮮な種菌培養培地１００ｍＬが入った新たな三角フラスコで継代培養した。同じ方法により、十分な数の細胞が得られるまで２倍ずつ培養体積を増加させて継代培養した。
【００９１】
６−２：生産培地中への添加剤の使用による細胞株の成長及びｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）生産量の測定
生産培地中への添加剤の使用がｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）の生産量に及ぼす効果を調べるために、培養中の組換えＣＨＯ細胞株約４．０×１０６細胞／ｍｌを５Ｌの生物反応器に４Ｌの培養体積で接種した。目的とする細胞濃度である１５×１０６細胞／ｍｌに達したら、培養培地に酪酸ナトリウム（cat. no. B5887，シグマ社，米国）１．０ｍＭ、大豆加水分解物（cat. No. 58903C，シグマ社，米国）１ｇ／Ｌ、又はイースト抽出物（cat. no. Y4375，シグマ社，米国）１ｇ／Ｌとなるように添加し、酪酸ナトリウム１．０ｍＭのみ加えた生物反応器を対照群として培養を始めた。ｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）の生産のために、培養温度を３３．０℃に調整して１０日以上培養した。培養液を１日単位で回収して細胞株の細胞濃度及び細胞活性度を観察した。
【００９２】
一方、培養液に１日単位で遠心分離を行うことにより培養上清を回収し、実施例３−２と同様に、酵素免疫法を用いて各培養上清に発現したｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）の量を測定した。生物反応器の培養プロファイルと測定した値を計算して示した（図６、図７及び図８）。
【００９３】
【表３】
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【００９４】
表３に示すように、大豆加水分解物１ｇ／Ｌとイースト抽出物１ｇ／Ｌを添加すると、ｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）生産量が増加することが分かった。特に、大豆加水分解物を加えると、生産量が最も増加することが確認された。
【００９５】
６−３：生産培地中への添加剤の使用によるｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）力価の分析
生産培地中への添加剤の使用がｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）の力価に及ぼす効果を調べるために、培養中の組換えＣＨＯ細胞株約４．０×１０６細胞／ｍｌを５Ｌの生物反応器に４Ｌの培養体積で接種した。目的とする細胞濃度である１５×１０６細胞／ｍｌに達したら、培養培地に酪酸ナトリウム（cat. no. B5887，シグマ社，米国）１．０ｍＭ、大豆加水分解物（cat. No. 58903C，シグマ社，米国）１ｇ／Ｌ、イースト抽出物（cat. No. Y4375，シグマ社，米国）１ｇ／Ｌとなるように添加し、酪酸ナトリウム１．０ｍＭのみ加えた生物反応器を対照群として培養を始めた。ｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）の生産のために、培養温度を３３．０℃に調整して１０日以上培養した。培養液を１日単位で回収して細胞株の細胞濃度及び細胞活性度を観察した。
【００９６】
一方、培養液に１日単位で遠心分離を行うことにより培養上清を回収し、その後ＣＯＡＳＥＴ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Chromogenix, Italy）を用いてＥｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ５０（ＥＣ５０）を測定した。最終精製工程を経たｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）を前記キットに含まれるワーキングバッファー（working buffer）で６０ｎｇ／ｍｌから０．０３ｎｇ／ｍｌまで２倍連続希釈法で希釈し、これを９６ウェルプレートの各ウェルに５０ｕｌずつ分注した。その後、ＦａｃＸ、ＣａＣｌ２及びトロンボプラスチン（thromboplastin）が含まれる組み合わせ試薬（combined reagent）を各ウェルに５０ｕｌずつ分注して３７℃で７分間反応させ、次いで基質を各ウェルに５０ｕｌずつ分注した。最後に、４０５ｎｍで吸光度を測定して各ＦａｃＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）のＥＣ５０を比較分析した（表４）。
【００９７】
【表４】
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【００９８】
表４に示すように、大豆加水分解物１ｇ／Ｌを添加するとｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）活性が低下し、イースト抽出物１ｇ／Ｌを添加して生産量を促進させるとｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）活性が１００％保持されることが確認された。すなわち、イースト抽出物を添加すると、目的タンパク質であるｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）の生産量が増加するだけでなく、その活性も１００％保持されることが確認された。
【００９９】
よって、ｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）の生産において優れた培地添加物であることが確認されたイースト抽出物の添加量による細胞株の成長及びｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）の生産量を測定する実験を行った。
【０１００】
６−４：生産培地中のイースト抽出物濃度による細胞株の成長及びｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）生産量の測定
生産培地中のイースト抽出物の濃度によるｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）の生産量に及ぼす効果を調べるために、培養中の組換えＣＨＯ細胞株約１０×１０５細胞／ｍｌを２５０ｍＬのＦｌａｓｋに５０ｍＬの培養体積で接種した。目的とする細胞濃度である１５×１０６細胞／ｍｌに達したら、培養培地に酪酸ナトリウム（cat. no. B5887，シグマ社，米国）１．０ｍＭ、イースト抽出物（cat. no. Y4375，シグマ社，米国）１ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌとなるように添加し、酪酸ナトリウム１．０ｍＭのみ加えた生物反応器を対照群として培養を始めた。ｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）の生産のために、培養温度を３３．０℃に調整して３日以上培養した。培養液を１日単位で回収して細胞株の細胞濃度を観察した（図９）。
【０１０１】
一方、培養液に１日単位で遠心分離を行うことにより培養上清を回収し、実施例３−２と同様に、酵素免疫法を用いて各培養上清に発現したｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）の量を測定した。生物反応器の培養プロファイルと測定した値を計算して示した（図１０）。
【０１０２】
実施例７：培養培地における第ＶＩＩ因子誘導体精製方法
限外濾過膜（SARTOCON Slice Cassette, PESU, Sartorius社, MWCO 30 K）を１Ｌの１Ｎ ＮａＯＨで１時間以上洗浄し、５Ｌの滅菌水を用いて洗浄した。その後、１次精製カラムの平衡バッファで限外濾過膜を平衡させ、次いで第ＶＩＩ因子誘導体生産細胞培養液を注入して１０倍に濃縮した。濃縮した培養液に同一体積の１次精製カラム平衡バッファを添加して２倍に希釈し、それを再び初期濃縮体積まで濃縮した。このような希釈・濃縮過程を７回以上繰り返して培養液を１次精製カラム平衡により定容濾過した。ここで、第ＶＩＩ因子誘導体の損失はほとんどなく、濃縮した第ＶＩＩ因子誘導体の最終濃度は０．３ｍｇ／ｍｌに維持された。限外濾過及び定容濾過過程は４℃の条件で行った。定容濾過された第ＶＩＩ因子誘導体培養液は０．２２μｍ（NALGENE, PES）濾過フィルタで最終濾過して陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。本発明においては、陰イオン交換クロマトグラフィーとしてＱセファロース（Q Sepharose Fast Flow, GE Healthcare）レジンが充填されたカラムを用いた。カラムにかけた試料は、平衡バッファＡ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０＋２ｍＭ ベンズアミジン）及び洗浄バッファＢ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０＋２ｍＭ ベンズアミジン＋０．２Ｍ ＮａＣｌ）、洗浄バッファＣ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０＋２ｍＭ ベンズアミジン＋０．１Ｍ ＮａＣｌ）及び溶出バッファＤ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０＋２ｍＭ ベンズアミジン＋２５ｍＭ ＮａＣｌ＋３５ｍＭ ＣａＣｌ２）溶液を用いて、洗浄バッファＣから溶出バッファＤになるように、２．５カラム容量で線形濃度勾配を用いてタンパク質を溶出した。陰イオン交換クロマトグラフィー過程で溶出した第ＶＩＩ因子誘導体を含むタンパク質溶出液は、溶出が終わると直ちにサイズ排除クロマトグラフィーにより２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０＋２ｍＭ ベンズアミジンバッファにバッファ交換した。濾過及び陰イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー過程は、４℃の条件で行った。サイズ排除クロマトグラフィーによりバッファ交換された試料を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。本発明においては、Ｑセファロース（Q Sepharose High Performance, GE Healthcare）レジンが充填されたカラムを用いた。カラムにかけた試料は、平衡バッファＡ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０＋２ｍＭ ベンズアミジン）及び溶出バッファＢ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０＋２ｍＭ ベンズアミジン＋１Ｍ ＮａＣｌ）溶液を用いて、溶出バッファＢの濃度が２０％から３５％になるように、１５カラム容量で線形濃度勾配を用いてタンパク質を溶出した。溶出した第ＶＩＩ因子誘導体タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーにより２０ｍＭリン酸カリウムｐＨ５．５バッファで剤形化した。全ての過程は４℃の条件で行った。前述したように、Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ誘導体は不活性化形態に精製した後保管することができ、必要に応じて実施例８のように活性化したＦａｃｔｏｒ ＶＩＩａ誘導体に転換することができる。
【０１０３】
実施例８：精製された第ＶＩＩ因子誘導体の活性化ステップ
第ＶＩＩ因子誘導体タンパク質を活性化（activation）させるために、精製された第ＶＩＩ因子誘導体試料を平衡バッファＡ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０＋２ｍＭ ベンズアミジン）で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。陰イオン交換クロマトグラフィーは、ソース１５Ｑ（Source 15Q, GE Healthcare）レジンが充填されたカラムを用いた。カラムにかけた試料は、平衡バッファＡ及び溶出バッファＢ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０＋２ｍＭ ベンズアミジン＋２５ｍＭ ＮａＣｌ＋３５ｍＭ ＣａＣｌ２）を用いて５％溶出バッファＢの濃度で４０分間のｏｎ−ｃｏｌｕｍｎ活性化過程を行い、溶出バッファＢを用いて定組成溶離法（isocratic elution）によりタンパク質を溶出した。精製されたＦａｃｔｏｒ ＶＩＩ誘導体の活性化ステップは常温で行った。
【０１０４】
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、明細書よりは特許請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態を含むものであると解釈すべきである。
【図１】
2016528921.tif 000007
【図２】
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【図３】
2016528921.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年6月27日(2016.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
最後に、対照群として酪酸ナトリウム又は培地添加剤（大豆加水分解物又はイースト抽出物）を添加した結果、表３及び図６〜図８に示すように、大豆加水分解物１ｇ／Ｌとイースト抽出物１ｇ／Ｌをそれぞれ添加すると、ｈＦＶＩＩ−ＳＯＤ１（ＡＴＫＡＶＣ）生産量が増加することが分かった。特に、大豆加水分解物を加えると生産量が最も増加することが確認された。
【国際調査報告】
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