(57)【要約】  本発明は、フォールアーミーワーム鱗翅目昆虫を防除するための方法および植物を含み、前記植物は、昆虫による抵抗性の発達を遅らせるか阻止するための、Ｃｒｙ１Ｅａ殺虫性タンパク質ならびにＣｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１ＤａおよびＶｉｐ３Ａｂの群から選択される第二の殺虫性タンパク質を含む。
2016501511.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｒｙ１Ｅａ殺虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および第二の殺虫性タンパク質をコードする第二のポリヌクレオチドを含み、前記第二の殺虫性タンパク質は、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１ＤａおよびＶｉｐ３Ａｂからなる群から選択される、トランスジェニック植物。
【請求項２】
第三の殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡをさらに含む、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３】
前記異種ポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の植物の種子。
【請求項４】
前記異種ポリヌクレオチドを含む、請求項３に記載の植物の種子。
【請求項５】
非Ｂｔ緩衝帯植物および請求項１に記載の複数の植物を含む植物の圃場であって、前記緩衝帯植物は前記圃場の全ての作物植物の４０％未満を構成する、圃場。
【請求項６】
前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の３０％未満を構成する、請求項５に記載の植物の圃場。
【請求項７】
前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の２０％未満を構成する、請求項５に記載の植物の圃場。
【請求項８】
前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の１０％未満を構成する、請求項５に記載の植物の圃場。
【請求項９】
前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の５％未満を構成する、請求項５に記載の植物の圃場。
【請求項１０】
前記緩衝帯植物がブロックまたは帯状地にある、請求項５に記載の植物の圃場。
【請求項１１】
非Ｂｔ緩衝帯植物からの緩衝帯種子および請求項３に記載の複数の種子を含む組成物であって、前記緩衝帯種子は組成物の全ての種子の４０％未満を構成する、組成物。
【請求項１２】
前記緩衝帯種子が組成物の全ての種子の３０％未満を構成する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記緩衝帯種子が組成物の全ての種子の２０％未満を構成する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記緩衝帯種子が組成物の全ての種子の１０％未満を構成する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記緩衝帯種子が組成物の全ての種子の５％未満を構成する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
種子を播いて請求項５に記載の植物の圃場を作製することを含む、昆虫によるＣｒｙタンパク質への抵抗性の発達を管理する方法。
【請求項１７】
前記植物が１０エーカーよりも多くを占める、請求項５から１０のいずれかに記載の圃場。
【請求項１８】
トウモロコシ、ダイズ、ワタ、キャノーラおよびヒマワリからなる群から選択される、請求項１に記載の植物。
【請求項１９】
前記植物細胞が、前記Ｃｒｙ１Ｅａ殺虫性タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドを含み、前記Ｃｒｙ１Ｅａ殺虫性タンパク質が配列番号７と少なくとも９５％同一である、請求項１に記載の植物の植物細胞。
【請求項２０】
前記Ｃｒｙ１Ｅａ殺虫性タンパク質が配列番号７を含む、請求項１に記載の植物。
【請求項２１】
請求項１９に記載の植物細胞のポリヌクレオチドを生成する方法であって、複数の前記細胞の前記ポリヌクレオチドを再生させることを含む、方法。
【請求項２２】
フォールアーミーワーム昆虫を防除する方法であって、前記昆虫に経口摂取のためにＣｒｙ１Ｅａ殺虫性タンパク質および第二の殺虫性タンパク質を提供することを含み、前記第二の殺虫性タンパク質は、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１ＤａおよびＶｉｐ３Ａｂからなる群から選択される方法。
【請求項２３】
前記第二のポリヌクレオチドがＣｒｙ１Ａｂ殺虫性タンパク質をコードし、前記Ｃｒｙ１Ａｂ殺虫性タンパク質は配列番号８と少なくとも９５％同一である、請求項１に記載の植物の植物細胞。
【請求項２４】
前記Ｃｒｙ１Ａｂ殺虫性タンパク質が配列番号８を含む、請求項１に記載の植物。
【請求項２５】
Ｃｒｙ１Ｂｅ殺虫性タンパク質をコードする前記単離されたポリヌクレオチドを含み、前記Ｃｒｙ１Ｂｅ殺虫性タンパク質は配列番号９と少なくとも９５％同一である、請求項１に記載の植物の植物細胞。
【請求項２６】
前記Ｃｒｙ１Ｂｅ殺虫性タンパク質が配列番号９を含む、請求項１に記載の植物。
【請求項２７】
前記Ｃｒｙ１Ｃａ殺虫性タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドを含み、前記Ｃｒｙ１Ｃａ殺虫性タンパク質が配列番号１０と少なくとも９５％同一である、請求項１に記載の植物の植物細胞。
【請求項２８】
前記Ｃｒｙ１Ｃａ殺虫性タンパク質が配列番号１０を含む、請求項１に記載の植物。
【請求項２９】
前記Ｃｒｙ１Ｄａ殺虫性タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドを含み、前記Ｃｒｙ１Ｄａ殺虫性タンパク質が配列番号１１と少なくとも９５％同一である、請求項１に記載の植物の植物細胞。
【請求項３０】
前記Ｃｒｙ１Ｄａ殺虫性タンパク質が配列番号１１を含む、請求項１に記載の植物。
【請求項３１】
前記Ｖｉｐ３Ａｂ殺虫性タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドを含み、前記Ｖｉｐ３Ａｂ殺虫性タンパク質が配列番号６と少なくとも９５％同一である、請求項１に記載の植物の植物細胞。
【請求項３２】
前記Ｖｉｐ３Ａｂ殺虫性タンパク質が配列番号６を含む、請求項１に記載の植物。
【請求項３３】
前記昆虫に第三の殺虫性タンパク質を提供することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１に記載の植物の植物細胞。
【請求項３５】
請求項２に記載の植物の植物細胞。
【請求項３６】
請求項１８に記載の植物の植物細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１２年１０月５日に出願の米国特許仮出願第６１／７１０，１５４号の利益を主張する。その全開示は、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
人は、食物用途およびエネルギー用途のためにトウモロコシを栽培する。人は、ダイズおよびワタを含む他の多くの作物も栽培する。昆虫は、植物を食べて損傷し、それによってこれらの人の努力を台無しにする。害虫を防除するために毎年何１０億ドルも費やされ、害虫が与える損傷に対してさらに数１０億ドルが失われる。合成有機化学殺虫剤は、害虫を防除するために用いられる主な手段であったが、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）（Ｂｔ）に由来する殺虫性タンパク質などの生物殺虫剤が一部の領域である重要な役割を演じてきた。Ｂｔ殺虫性タンパク質遺伝子による形質転換を通して昆虫抵抗性植物を作出できたことにより、現代農業が革新し、殺虫性タンパク質およびその遺伝子の重要性および価値が高まっている。
【０００３】
今日までに登録され商品化に至った昆虫抵抗性のトランスジェニック植物を作製するために、数種のＢｔタンパク質が用いられてきた。このＢｔタンパク質としては、トウモロコシのＣｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ３Ｂｂ、ワタのＣｒｙ１ＡｃおよびＣｒｙ２Ａｂ、ならびにジャガイモのＣｒｙ３Ａが挙げられる。
【０００４】
これらのタンパク質を発現する市販製品は、２種のタンパク質の組合せ殺虫スペクトルが所望である場合（例えば、それぞれ鱗翅目害虫およびルートワームへの抵抗性を付与するために組み合わされた、トウモロコシのＣｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ３Ｂｂ）、または２種のタンパク質のそれぞれ独立した作用により、これらのタンパク質が感受性昆虫集団での抵抗性の発達を遅らせるための手段として有用となる場合（例えば、オオタバコガのための抵抗性管理を付与するために組み合わされた、ワタのＣｒｙ１ＡｃおよびＣｒｙ２Ａｂ）を除いて、単一のタンパク質しか発現しない。ヘリコベルパ・ゼア（Helicoverpa zea）またはヘリコベルパ・アーミゲライン（Helicoverpa armigerain）の防除のためのＣｒｙ２タンパク質＋Ｖｉｐ３Ａａ、Ｃｒｙ１ＦまたはＣｒｙ１Ａに関する米国特許出願公開第２００９／０３１３７１７号も参照されたい。国際公開第２００９／１３２８５０号は、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）を防除するためのＣｒｙ１ＦまたはＣｒｙ１ＡおよびＶｉｐ３Ａａに関する。米国特許出願公開第２００８／０３１１０９６号は、Ｃｒｙ１Ｆ抵抗性のＥＣＢを防除するためのＣｒｙ１Ａｂに一部関する。
【０００５】
すなわち、この技術の急速で広範囲な採用をもたらした昆虫抵抗性トランスジェニック植物の特質のいくつかは、これらの植物によって生成される殺虫性タンパク質に対する抵抗性を有害生物集団が発達させるという懸念も生む。高用量のタンパク質を、緩衝帯と組み合わせて、異なる毒素と交互にまたは同時利用で利用することを含め、Ｂｔに基づく昆虫抵抗性形質の有用性を保存するためのいくつかの戦略が提案されている（McGaughey et al. (1998), "B.t. Resistance Management," Nature Biotechnol. 16:144-146）。
【０００６】
あるタンパク質に対して発達した抵抗性が別のタンパク質に対する抵抗性を付与しない（すなわち、タンパク質に対する交差抵抗性がない）ように、昆虫抵抗性管理（ＩＲＭ）スタックで用いるために選択されるタンパク質毒素は、それらの殺虫効果を独立して発揮する必要がある。例えば、「タンパク質Ａ」に対する抵抗性のある有害生物集団が「タンパク質Ｂ」に感受性である場合、そこには交差抵抗性がなく、タンパク質Ａおよびタンパク質Ｂの組合せがタンパク質Ａ単独に対する抵抗性を遅らせるのに有効であろうと結論付けられるであろう。
【０００７】
抵抗性の昆虫集団が存在しない場合、作用機構および交差抵抗性能力に関連すると推測される他の特性に基づいて評価を行うことができる。交差抵抗性を示す可能性のない殺虫性タンパク質を同定することにおける受容体媒介結合の有用性が示唆されている（van Mellaert et al. 1999）。この手法に特有の交差抵抗性の欠如の重要な予測因子は、殺虫性タンパク質が感受性昆虫種の受容体をめぐって競合しないことである。
【０００８】
２つのＢｔ毒素が同じ受容体をめぐって競合する場合には、毒素の１つがその受容体にもはや結合せず、したがって昆虫に対してもはや殺虫性でないようにその受容体がその昆虫で突然変異するならば、昆虫は別の毒素（同じ受容体に競合的に結合する）にも抵抗性になる場合もある。すなわち、昆虫は両方のＢｔ毒素に交差抵抗性であると言われる。しかし、２つの毒素が２つの異なる受容体に結合する場合には、これは昆虫がそれら２つの毒素に対して抵抗性を同時に発達させないことを示す指標であろう。
【０００９】
代表的なＣｒｙ毒素は、公式なＢｔ命名委員会のウェブサイト（Crickmore et al.; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/）に記載されている。ほぼ６０個の主要群の「Ｃｒｙ」タンパク質（Ｃｒｙ１〜Ｃｒｙ５９）が現在あり、さらなるＣｙｔタンパク質およびＶＩＰタンパク質などがある。数字で表した各群の多くは大文字のサブグループを有し、大文字のサブグループは小文字のサブサブグループを有する。（例えば、Ｃｒｙ１はＡ〜Ｌを有し、Ｃｒｙ１Ａはａ〜ｉを有する）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、殺虫性タンパク質Ｃｒｙ１Ｅａがフォールアーミーワーム（ＦＡＷ；スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda））の腸細胞膜受容体調製物との結合に関してＣｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１ＤａまたはＶＩＰ３Ａｂと競合しないという意外な発見に一部関する。当業者であれば本開示に鑑みて認識するであろうが、互いと競合的に結合しない対象のタンパク質（完全長タンパク質の殺虫性部分を含む）の組のいずれかを生成する植物は、これらの殺虫性タンパク質のいずれか単独に対する抵抗性の発達を遅らせるか阻止することができる。
【００１１】
したがって、本発明は、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１Ｄａおよび／またはＶＩＰ３Ａｂタンパク質と組み合わせたＣｒｙ１Ｅａタンパク質の使用に一部関する。本明細書に記載される他のタンパク質の少なくとも１つと組み合わせてＣｒｙ１Ｅａを生成する植物（およびそのような植物を植える土地）が、本発明の範囲内に含まれる。
【００１２】
本発明は、３つ（以上）の毒素の三重スタックまたは「ピラミッド」にも一部関し、Ｃｒｙ１Ｅａがスタック中のタンパク質の少なくとも１つである。一部の好ましいピラミッドの実施形態では、選択される毒素の組合せは、ＦＡＷに対して交差抵抗性のない作用を提供する。一部の好ましい「３つの作用部位」のピラミッドの組合せは、ＦＡＷを標的にするための、対象のタンパク質の基礎となる組（Ｃｒｙ１Ｅａに加えて、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１Ｄａ、Ｖｉｐ３ＡｂまたはＣｒｙ１Ｂｅ）の１つおよびさらなるＢｔタンパク質を含む。本発明によるこれらの特定の三重スタックは、ＦＡＷに対して３つの作用部位を有利に意外にも提供する。これは、緩衝帯地所の要件を低減または除去するのを助けることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】非標識の相同的Ｃｒｙ１Ｅａおよび非相同的Ｃｒｙ１Ａｂによる競合に対してＦＡＷからのＢＢＭＶにおける１２５Ｉ  Ｃｒｙ１Ｅａ（０．５ｎＭ）の特異的結合百分率を示す図である。
【図２】ＦＡＷ幼虫からのＢＢＭＶへの１２５Ｉ  Ｃｒｙ１Ａｂの結合および非標識のＣｒｙ１Ａｂの濃度増加によるその以降の置換を示す図である。
【図３】非標識の相同的Ｃｒｙ１Ｅａおよび非相同的Ｃｒｙ１Ｃａによる競合に対してＦＡＷからのＢＢＭＶにおける１２５Ｉ  Ｃｒｙ１Ｅａの特異的結合百分率を示す図である。
【図４】１２５Ｉ  Ｃｒｙ１ＥａをＦＡＷ幼虫からのＢＢＭＶに結合させ、その後Ｃｒｙ１Ｅａ、Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１ＤａおよびＶＩＰ３Ａｂ１リガンドを加えた結合アッセイの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
配列の簡単な説明
配列番号１は、１１４８アミノ酸のＣｒｙ１Ｅａタンパク質（Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントを有する）のアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、完全長（１１５５アミノ酸）Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、１１８６アミノ酸のＣｒｙ１Ｂｅタンパク質（Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントを有する）のアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、１１６４アミノ酸のＣｒｙ１Ｃａタンパク質（Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントを有する）のアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、１１３９アミノ酸のＣｒｙ１Ｄａタンパク質（Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントを有する）のアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、完全長Ｖｉｐ３Ａｂタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、プロテアーゼ処理したＣｒｙ１Ｅａタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、プロテアーゼ処理したＣｒｙ１Ａｂタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、プロテアーゼ処理したＣｒｙ１Ｂｅタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号１０は、プロテアーゼ処理したＣｒｙ１Ｃａタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号１１は、プロテアーゼ処理したＣｒｙ１Ｄａタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００１５】
本発明は、Ｃｒｙ１Ｅａが特異で独立した作用様式を有し、フォールアーミーワーム（ＦＡＷ；スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda））の腸の結合部位に関してＣｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１ＤａまたはＶＩＰ３Ａｂ１と競合しないという意外な発見に一部関する。したがって、これらのタンパク質の単独への抵抗性をＦＡＷが発達させることを遅らせるか阻止するために、Ｃｒｙ１Ｅａタンパク質は、トランスジェニックトウモロコシ（および他の植物、例えばワタ）でＣｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１Ｄａおよび／またはＶＩＰ３Ａｂ１タンパク質と組み合わせて用いることができる。対象タンパク質は、本明細書に開示される他のＣｒｙまたはＶＩＰタンパク質と一緒に用いると、Ｃｒｙ抵抗性のフォールアーミーワームによる傷害から植物（メイズ植物および／またはダイズ植物など）を保護する効果を発揮することができる。すなわち、本発明の１つの用途は、単一のＣｒｙまたはＶＩＰタンパク質への抵抗性を発達させるかもしれないフォールアーミーワーム集団に起因する損害および収量減からトウモロコシおよび他の経済的に重要な植物種を保護することである。
【００１６】
したがって、本発明は、それ自身によって使用されるこれらのタンパク質の１つへのＦＡＷによる抵抗性の発達を阻止または軽減するための、Ｃｒｙ１ＥａおよびＣｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１Ｄａおよび／またはＶＩＰ３Ａｂ１を含む昆虫抵抗性管理（ＩＲＭ）スタックを教示する。
【００１７】
本発明は、Ｃｒｙ１Ｅａ殺虫性タンパク質と、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１Ｄａおよび／またはＶＩＰ３Ａｂ１殺虫性タンパク質を含む、ＦＡＷを防除するための組成物を含む。対象組成物は、植物および植物細胞を含む。
【００１８】
本発明は、Ｃｒｙ１Ｅａ殺虫性タンパク質およびＣｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１ＤａまたはＶＩＰ３Ａｂ１殺虫性タンパク質の両方を生成するように形質転換された、微生物または植物細胞である宿主をさらに含む。対象ポリヌクレオチド（複数可）は、好ましくは非バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）プロモーター（複数可）の制御下の遺伝子構築物中にある。用語「単離された」および「異種」は、ポリペプチドまたはＤＮＡ分子が、ヒトの手を含むそれらの天然の環境と異なる状態にあることを意味する。対象ポリヌクレオチドは、植物での強化された発現のためのコドン使用頻度を含むことができる。
【００１９】
さらに、本発明は、ＦＡＷを防除する方法であって、前記ＦＡＷまたは前記ＦＡＷの環境を、本発明のＣｒｙ１Ｅａコア毒素含有タンパク質の組を含有する組成物の有効量と接触させることを含む方法を含む。
【００２０】
本発明の実施形態は、本発明のＣｒｙ１Ｅａ殺虫性タンパク質の組をコードする、植物による発現が可能な遺伝子を含む植物（トウモロコシ、ダイズおよびワタを含むことができる）、およびそのような植物の種子を含む。
【００２１】
本発明のさらなる実施形態は、本発明のＣｒｙ１Ｅａ殺虫性タンパク質の組をコードする、植物による発現が可能な遺伝子が移入された植物、およびそのような植物の種子を含む。
【００２２】
実施例に記載されるように、放射性標識されたＣｒｙ１Ｅａタンパク質および／または放射性標識されたＣｒｙ１Ａｂタンパク質を用いた競合的受容体結合試験は、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１ＤａおよびＶＩＰ３Ａｂ１タンパク質は、Ｃｒｙ１Ｅａが結合するＦＡＷ中腸ブラシ縁膜小胞での結合に関してＣｒｙ１Ｅａと競合しないことを示す。これらの結果は、Ｃｒｙ１Ｅａおよびこれらの他のタンパク質の組合せが、これらのタンパク質に対するＦＡＷ集団での抵抗性の発達を軽減する効果的な手段になることができることも示す。したがって、本明細書に記載されるデータに一部基づいて、ＦＡＷを防除／抑制／殺滅するために高用量のＩＲＭスタックを生成するために、Ｃｒｙ１Ｅａと、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１Ｄａおよび／またはＶＩＰ３Ａｂ１タンパク質の同時生成（スタッキング）を用いることができると考えられる。
【００２３】
他のタンパク質を対象の組に加えることができる。例えば、本発明は、３つ（以上）の毒素の三重スタックまたは「ピラミッド」にも一部関し、対象の組が基礎となる組である。一部の好ましいピラミッドの実施形態では、選択される毒素は、ＦＡＷに対して３つの別々の作用様式を有する。一部の好ましい「３つの作用様式」のピラミッドの組合せは、対象のタンパク質の基礎となる組に加えて、ＦＡＷを標的にするための第三のタンパク質を含む。「別々の作用部位」は、所与のタンパク質のいずれも互いに交差抵抗性を引き起こさないことを意味する。本発明によるこれらの特定の三重スタックは、ＦＡＷに対して３つの作用部位を有利に、および意外にも提供する。これは、避難地所の必要を低減または除去するのを助けることができる。
【００２４】
したがって、１つの利用選択肢は、第三毒素／遺伝子と組み合わせて対象のタンパク質の組を用いること、およびこれらの毒素のいずれかに対するＦＡＷでの抵抗性の発達を軽減するためにこの三重スタックを用いることである。したがって、本発明は、３つ（以上）の毒素の三重スタックまたは「ピラミッド」にも一部関する。一部の好ましいピラミッドの実施形態では、選択される毒素は、ＦＡＷに対して３つの別々の作用部位を有する。
【００２５】
本発明の利用選択肢には、ＦＡＷが抵抗性集団を発達させることができる作物栽培地域で、対象タンパク質の２つ、３つまたはそれ以上のタンパク質を用いることが含まれよう。
【００２６】
対象のタンパク質の組合せのいずれかを生成する植物（およびそのような植物を植える土地）は、本発明の範囲内に含まれる。さらなる毒素／遺伝子を加えることもできるが、上記の特定のスタックは、ＦＡＷに対する複数の作用部位を有利に、および意外にも提供する。これは、緩衝帯地所の要件を低減または除去するのを助けることができる。したがって、１０エーカー以上のこのように植えられる圃場は、本発明に含まれる。
【００２７】
本明細書で開示または記載される遺伝子およびタンパク質のいずれかの配列を得るために、ＧＥＮＢＡＮＫを用いることもできる。関連する配列も、特許で入手できる。代表的なＣｒｙ毒素は、公式なＢｔ命名委員会のウェブサイト（Crickmore et al.；lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/）に記載されている。現在約７０個の主要群の「Ｃｒｙ」タンパク質（Ｃｒｙ１〜Ｃｒｙ７０）があり、さらなるＶＩＰタンパク質などがある。
【００２８】
本明細書に記載されるタンパク質の組合せは、鱗翅目害虫を防除するために用いることができる。成体の鱗翅目、例えばチョウおよびガは、主に花蜜を食し、受粉の重要な実行者である。ほとんど全ての鱗翅目幼虫、すなわちイモムシは植物を食し、多くは重大な有害生物である。イモムシは、植物の葉の表面もしくは内部、または根部または茎を食し、植物から栄養を奪い、多くの場合植物の物理的支持構造物を破壊する。さらに、イモムシは果物、織物ならびに保存された穀物および小麦粉を食し、売物のこれらの商品を破壊するかそれらの価値を激減させる。本明細書で用いるように、鱗翅目害虫への言及は、幼虫期を含めた、鱗翅目害虫の様々なライフステージを指す。
【００２９】
本発明の一部のキメラタンパク質は、完全なＢｔタンパク質毒素の完全なＮ末端コア毒素領域を含み、コア毒素部分の末端を過ぎたある場所で、タンパク質は異種プロトキシン配列への移行を有する。Ｂｔタンパク質毒素のＮ末端の殺虫活性毒素部分は、「コア」毒素と呼ばれる。コア毒素のＣ末端側の部分は、「プロトキシン」セグメントまたは部分と呼ばれる。コア毒素セグメントから異種プロトキシンセグメントへの移行は、ほぼコア毒素／プロトキシン接合部で起こることができるか、代わりに、元のプロトキシンの部分を保持することができ、異種プロトキシン部分への移行は下流で起こる。
【００３０】
例として、本発明の１つのキメラタンパク質は、Ｃｒｙ１Ｅａの完全なコア毒素部分（およそ最初の６００アミノ酸）および／または異種プロトキシン（Ｃ末端までの残りのアミノ酸）である。好ましい一実施形態では、プロトキシンを含むキメラタンパク質の部分は、Ｃｒｙ１Ａｂ毒素に由来する。Ｖｉｐ３Ａｂを除いて、本発明による使用のためのタンパク質の全ては、類似の完全長およびコア毒素のサイズおよび構造を共有する。
【００３１】
Ｂｔタンパク質毒素は、Ｃｒｙ１Ｅａなどの特定のクラス内でさえ、長さが多少異なり、コア毒素からプロトキシンへの移行の正確な位置もまた異なることを、当分野の技術者は認識する。一般的に、Ｃｒｙ１Ｅａタンパク質は、例えば、長さが約１１５０から約１２００アミノ酸である。コア毒素部分からプロトキシン部分への移行は、完全長毒素の約５０％から約６０％の間で一般的に起こる。本発明のキメラタンパク質は、このＮ末端コア毒素領域の全長を含む。したがって、キメラタンパク質は、Ｃｒｙ１Ｂｔ毒素タンパク質の完全長の少なくとも約５０％を構成する。これは、一般的に少なくとも約５９０アミノ酸である。プロトキシン部分に関して、Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシン部分の全長は、コア毒素部分の末端から分子のＣ末端まで伸びる。
【００３２】
遺伝子および毒素。本発明による有用な遺伝子および毒素には、開示される完全長配列だけでなく、本明細書で具体的に例示されるコア毒素の特徴的な殺虫活性を保持するこれらの配列の断片、変異体、突然変異体、および融合タンパク質も含まれる。本明細書で用いるように、遺伝子の「変異体」または「変形形態」という用語は、同じ毒素をコードするか、殺有害生物活性を有する同等毒素をコードするヌクレオチド配列を指す。本明細書で用いるように、用語「同等毒素」は、標的有害生物に対して請求されている毒素と同じか事実上同じである生物的活性を有する毒素を指す。
【００３３】
本明細書で用いるように、「Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins」、N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813、により、境界は約９５％（Ｃｒｙ１Ｅａ）、７８％（Ｃｒｙ１Ｅ）および４５％（Ｃｒｙ１）の配列同一性を表す。これらのカットオフは、コア毒素だけに適用することもできる。
【００３４】
活性毒素をコードする遺伝子は、いくつかの手段を通して同定し、得ることができることは、当分野の技術者に明らかとなるであろう。本明細書で例示される具体的な遺伝子または遺伝子部分は、培養株保管所に寄託されている分離株から得ることができる。これらの遺伝子、またはその部分もしくは変異体は、合成的に、例えば遺伝子合成装置を用いて構築することもできる。遺伝子の変形形態は、点突然変異を作製する標準技術を用いて、容易に構築することができる。また、これらの遺伝子の断片は、市販のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを標準手順に従って用いることによって作製することができる。例えば、これらの遺伝子の末端からヌクレオチドを体系的に切断するために、Ｂａｌ３１などの酵素または部位特異的突然変異誘発を用いることができる。活性断片をコードする遺伝子は、様々な制限酵素を用いて得ることもできる。これらのタンパク質毒素の活性断片を直接的に得るために、プロテアーゼを用いることができる。
【００３５】
例示される毒素の殺有害生物活性を保持する断片および同等物は、本発明の範囲内である。また、遺伝子コードの冗長性のため、様々な異なるＤＮＡ配列が本明細書で開示されるアミノ酸配列をコードすることができる。同じか事実上同じである毒素をコードするこれらの代替ＤＮＡ配列を作製することは、当業者の技術の範囲内である。これらの変異体ＤＮＡ配列は、本発明の範囲内である。本明細書で用いるように、「事実上同じ」配列への言及は、殺有害生物活性に実質的な影響を及ぼさないアミノ酸の置換、欠失、付加または挿入を有する配列を指す。殺有害生物活性を保持するタンパク質をコードする遺伝子の断片も、この定義に含まれる。
【００３６】
本発明により有用な毒素をコードする遺伝子および遺伝子部分を同定するためのさらなる方法は、オリゴヌクレオチドプローブを用いることによるものである。これらのプローブは、検出可能なヌクレオチド配列である。これらの配列は、適当な標識によって検出可能になることができるか、国際出願公開第９３／１６０９４号に記載されているように本来的に蛍光性にすることができる。当技術分野で周知であるように、プローブ分子および核酸試料が２つの分子間で強力な結合を形成することによってハイブリダイズする場合、プローブおよび試料は実質的な相同性を有すると合理的に仮定することができる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、例えばKeller, G. H., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169- 170に記載されているような、当分野で周知の技術によってストリンジェント条件の下で行われる。塩濃度および温度の組合せの一部の例は、以下の通りである（ストリンジェンシーの低い順序で）：室温で２×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ；４２℃で１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ；４２℃で０．１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ；６５℃で０．１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ。プローブの検出は、ハイブリダイゼーションが起こったかどうかを既知の方法で判定するための手段を提供する。そのようなプローブ分析は、本発明の毒素コード遺伝子を同定するための迅速な方法を提供する。本発明によるプローブとして用いられるヌクレオチドセグメントは、ＤＮＡ合成装置および標準手順を用いて合成することができる。本発明の遺伝子を増幅するＰＣＲプライマーとして、これらのヌクレオチド配列を用いることもできる。
【００３７】
変異体毒素。本発明の特定の毒素が、本明細書で具体的に例示された。これらの毒素は本発明の毒素の例示にすぎないので、本発明が例示毒素と同じか類似した殺有害生物活性を有する変異体または同等毒素（および同等毒素をコードするヌクレオチド配列）を含むことは容易に明らかなはずである。同等毒素は、例示される毒素とのアミノ酸相同性を有する。このアミノ酸相同性は、一般的に７５％を超え、好ましくは９０％を超え、最も好ましくは９５％を超える。アミノ酸相同性は、生物的活性を担うか、最終的に生物的活性を担う３次元構造の決定に関与する毒素の重要な領域で最も高くなる。この点に関しては、それらの置換が活性に重要でない領域にあるか、分子の３次元構造に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換であるならば、特定のアミノ酸置換が許容され、予想することができる。例えば、アミノ酸は以下のクラスに入れることができる：無極性、無電荷極性、塩基性および酸性。１つのクラスのアミノ酸が同じ種類の別のアミノ酸で置換される保存的置換は、その置換が化合物の生物的活性を実質的に変更しない限り本発明の範囲内である。下記は、各クラスに属するアミノ酸の例のリストである。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
場合によっては、非保存的置換を加えることもできる。重要な因子は、これらの置換が毒素の生物的活性をあまり損なってはならないということである。
【００４０】
組換え体宿主。本発明の毒素をコードする遺伝子は、多種類の微生物または植物宿主に導入することができる。毒素遺伝子の発現は、直接または間接的に、殺虫剤の細胞内での生成および維持をもたらす。本発明の両毒素を発現するＢｔ株を作製するために、接合転移および組換え転移を用いることができる。他の宿主生物体を毒素遺伝子の一方または両方で形質転換し、次に相乗効果を達成するために用いることもできる。適する微生物宿主、例えばシュードモナス（Pseudomonas）で、微生物を有害生物の位置へ施用することができ、そこでそれらは増殖して摂取される。結果は、有害生物の防除である。あるいは、毒素遺伝子を受け入れる微生物は、毒素の活性を長引かせ、細胞を安定させる条件の下で処理することができる。毒性活性を保持する処理細胞は、次に標的有害生物の環境に施用することができる。
【００４１】
Ｂｔ毒素遺伝子が適するベクターを通して微生物宿主に導入され、前記宿主が生きた状態で環境へ施用される場合、特定の宿主微生物が用いられることが必須である。対象の１つまたは複数の作物の「植物圏」（葉面、葉圏、根圏および／または根面）を占めることが知られている微生物宿主が選択される。これらの微生物は、特定の環境（作物および他の昆虫生息地）で野生型微生物とよく競合することが可能であるように、ポリペプチド殺虫剤を発現する遺伝子の安定した維持および発現を提供するように、および、望ましくは環境中での分解および不活性化からの殺虫剤の向上した保護を提供するように選択される。
【００４２】
多数の微生物が、多種類の重要作物の葉面（植物葉の表面）および／または根圏（植物根を囲む土）に生息することが知られている。これらの微生物には、細菌、藻および真菌類が含まれる。特に興味があるものは、細菌、例えばシュードモナス属（Pseudomonas）、エルウィニア属（Erwinia）、セラチア属（Serratia）、クレブシェラ属（Klebsiella）、キサントモナス属（Xanthomonas）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、根粒菌属（Rhizobium）、ロドシュードモナス属（Rhodopseudomonas）、メチロフィリウス（Methylophilius）、アグロバクテナム属（Agrobactenum）、アセトバクター属（Acetobacter）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、アルトロバクター属（Arthrobacter）、アゾトバクター属（Azotobacter）、ロイコノストック属（Leuconostoc）およびアルカリゲネス属（Alcaligenes）；真菌類、特に酵母、例えばサッカロミセス属（Saccharomyces）、クリプトコックス属（Cryptococcus）、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）、スポロボロミセス属（Sporobolomyces）、ロドトルラ属（Rhodotorula）およびオーレオバシジウム属（Aureobasidium）などの微生物である。特に興味があるものは、シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）、アグロバクテニウム・ツメファシエンス（Agrobactenium tumefaciens）、ロドシュードモナス・スフェロイデス（Rhodopseudomonas spheroides）、キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、リゾビウム・メリオチ（Rhizobium melioti）、アルカリゲネス・エントロファス（Alcaligenes entrophus）およびアゾトバクター・ビンランジ（Azotobacter vinlandii）のような植物圏細菌種；ならびにロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）、Ｒ．グルチニス（R. glutinis）、Ｒ．マリーナ（R. marina）、Ｒ．オーランチアカ（R. aurantiaca）、クリプトコックス・アルビダス（Cryptococcus albidus）、Ｃ．ジフルエンス（C. diffluens）、Ｃ．ローレンチ（C. laurentii）、サッカロミセス・ロゼイ（Saccharomyces rosei）、Ｓ．プレトリエンシス（S. pretoriensis）、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）、スポロボロミセス・ロゼウス（Sporobolomyces roseus）、Ｓ．オドルス（S. odorus）、クルイベロミセス・ベロネ（Kluyveromyces veronae）およびオーレオバシジウム・ポルランス（Aureobasidium pollulans）などの植物圏酵母種である。色の着いた微生物が、特に興味がある。
【００４３】
遺伝子の安定した維持および発現を可能にする条件の下で、毒素をコードするＢｔ遺伝子を微生物宿主に導入するために、多種類の方法を利用できる。これらの方法は当業者に周知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，１３５，８６７号に記載されている。
【００４４】
細胞の処理。Ｂｔ毒素を発現するバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）または組換え体の細胞は、毒素活性を長引かせ、細胞を安定させるために処理することができる。形成される殺虫剤マイクロカプセルは、安定化され、マイクロカプセルが標的有害生物の環境へ施用されるときに毒素を保護する細胞構造の中にＢｔ毒素（複数可）を含む。適する宿主細胞には、原核生物または真核生物のいずれかが含まれてよく、通常、哺乳動物などの高等生物体に有毒である物質を生成しない細胞に限定される。しかし、毒性物質が不安定であるか、哺乳動物宿主への毒性のいかなる可能性も避けるために施用量が十分に低い場合、高等生物体にとって有毒である物質を生成する生物体が用いられるかもしれない。宿主としては、原核生物および真菌類などの下等真核生物が特に興味がある。
【００４５】
処理時、細胞は通常そのままの状態であり、胞子の形態ではなく実質的に増殖形であるが、一部の例では胞子を利用してもよい。
【００４６】
微生物細胞、例えばＢｔ毒素遺伝子（複数可）を含む微生物の処理は、その技術が毒素の特性に悪い影響を及ぼさず、毒素を保護する細胞の能力も低下させない限り、化学的または物理的な手段に、または化学的および／または物理的な手段の組合せによることができる。化学試薬の例は、ハロゲン化剤、特に原子番号１７〜８０のハロゲン原子である。より詳しくは、温和条件の下で、および所望の結果を達成するのに十分な時間、ヨウ素を用いることができる。他の適する技術には、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド；塩化ゼフィランおよび塩化セチルピリジニウムなどの消毒剤；イソプロピルおよびエタノールなどのアルコール；ルゴールヨウ素、ブアン固定液、様々な酸およびヘリー固定液などの様々な組織固定剤（Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967を参照）；または細胞が宿主環境に投与されるときに細胞で生成される毒素の活性を保存し、長引かせる物理的（熱）および化学的作用因子の組合せによる処理が含まれる。物理的手段の例は、ガンマ線放射およびＸ線放射などの短波長放射、凍結、ＵＶ照射、凍結乾燥である。微生物細胞の処理のための方法は、米国特許第４，６９５，４５５号および４，６９５，４６２号で開示され、それらは参照により本明細書に組み込まれる。
【００４７】
細胞は、環境条件への抵抗性を増強する強化された構造安定性を一般に有する。殺虫剤がプロ型である場合、細胞処理の方法は、標的有害生物の病原体による殺虫剤のプロ型から成熟型への加工を妨げないように選択されるべきである。例えば、ホルムアルデヒドはタンパク質を架橋し、ポリペプチド殺虫剤のプロ型の加工を妨げることができる。処理の方法は、毒素の生物学的利用能または生物活性の少なくとも実質的な部分を保持するべきである。
【００４８】
生成のための宿主細胞の選択で特に興味がある特性には、Ｂｔ遺伝子（複数可）を宿主に導入することの容易さ、発現系の入手可能性、発現効率、宿主での殺虫剤の安定性および補助的遺伝子能力の存在が含まれる。殺虫剤マイクロカプセルとして用いるための興味がある特性には、厚い細胞壁、着色および細胞内パッケージングまたは封入体形成などの殺虫剤保護特性；水性環境での生存；人畜毒性の欠如；摂取のための有害生物への誘引効果；殺滅の容易さおよび毒素を害さずに固着させること；などが含まれる。他の考慮事項には、製剤および取扱いの容易さ、経済性、貯蔵安定性などが含まれる。
【００４９】
細胞の増殖。Ｂｔ殺虫性遺伝子（複数可）を含む細胞宿主は、ＤＮＡ構築物が選択有利性を提供し、細胞の実質的に全てまたは全てがＢｔ遺伝子を保持するように選択培地を提供する、任意の便利な栄養培地で増殖させることができる。これらの細胞は、従来の方法に従って次に収穫することができる。あるいは、収穫する前に細胞を処理することができる。
【００５０】
本発明の毒素を生成するＢｔ細胞は、標準技術の培地および発酵技術を用いて培養することができる。発酵サイクルの終了後、最初に当技術分野で周知である手段によってＢｔ胞子および結晶を発酵培養液から分離することによって細菌を収穫することができる。取扱いおよび特定の標的有害生物への施用を容易にするために、界面活性剤、分散剤、不活性担体および他の構成成分の添加によって、回収されたＢｔ胞子および結晶を水和剤、濃厚液剤、粒剤または他の製剤に製剤化することができる。これらの製剤および施用手法は、全て当技術分野で周知である。
【００５１】
製剤。誘引剤ならびにＢｔ分離株の胞子、結晶および毒素、または本明細書で開示されるＢｔ分離株から入手できる遺伝子を含む組換え体微生物を含む製剤化された餌粒剤は、土に施用することができる。製剤化された製品は、種子コーティングまたは作物サイクルの後期段階で根部処理もしくは植物全体処理として施用することもできる。Ｂｔ細胞の植物および土壌処理は、様々な不活性の材料、例えば無機鉱物（フィロシリケート、炭酸塩、硫酸塩、リン酸塩など）または植物材料（粉末状の穂軸、籾殻、クルミ殻など）と混合することによって、水和剤、粒剤または粉剤として使用することができる。製剤は、展着助剤、安定化剤、他の殺虫性添加剤または界面活性剤を含むことができる。液体製剤は水性または非水性であってよく、フォーム、ゲル、懸濁液、乳剤などとして使用することができる。成分には、流体力学的剤、界面活性剤、乳化剤、分散剤またはポリマーが含まれてよい。
【００５２】
当分野の技術者によって認識されるように、特定の製剤の性質、特にそれが濃厚剤であるか直接的に用いられるものであるかによって、殺虫剤濃度は広く変動する。殺虫剤は少なくとも１重量％で存在し、１００重量％であってもよい。乾燥製剤は約１〜９５重量％の殺虫剤を有するが、液体製剤は一般に液相中に約１〜６０重量％の固形分である。製剤は、１ｍｇにつき約１０２から約１０４細胞を一般に有する。これらの製剤は、１ヘクタールにつき約５０ｍｇ（液体または乾燥）から１ｋｇ以上で投与される。
【００５３】
製剤は、噴霧、散粉、散水その他によって、鱗翅目害虫の環境、例えば葉または土へ施用することができる。
【００５４】
植物の形質転換。本発明の殺虫性タンパク質を発現させるためのいくつかの好ましい組換え宿主は、植物である。非常により好ましい宿主は、食物、飼料、燃料および油を生産するために一般的に使用される作物植物である。非常により好ましい宿主作物植物は、メイズ、ダイズ、ワタおよびキャノーラである。メイズは、非常に好ましい実施形態である。本明細書で開示されるようなＢｔ毒素タンパク質をコードする遺伝子は、当技術分野で周知である様々な技術を用いて植物細胞に挿入することができる。例えば、大腸菌（Escherichia coli）の複製系および形質転換細胞の選択を可能にするマーカーを含む多数のクローニングベクターが、高等植物への外来遺伝子の挿入のための調製のために利用できる。ベクターは、例えば、とりわけｐＢＲ３２２、ｐＵＣシリーズ、Ｍ１３ｍｐシリーズ、ｐＡＣＹＣ１８４を含む。したがって、Ｂｔ毒素タンパク質をコードする配列を有するＤＮＡ断片は、適する制限部位でベクターに挿入することができる。生じたプラスミドは、大腸菌（E. coli）への形質転換のために用いられる。大腸菌（E. coli）細胞は適する栄養培地で培養され、次に収穫され、溶解される。プラスミドを回収する。配列分析、制限酵素解析、電気泳動および他の生化学的分子生物学的方法が、分析方法として一般に実行される。各操作の後、用いたＤＮＡ配列を切断して次のＤＮＡ配列に連結することができる。各プラスミド配列は、同じか他のプラスミドにクローニングすることができる。植物への所望の遺伝子の挿入の方法に従い、他のＤＮＡ配列が必要なこともある。例えば、植物細胞の形質転換のためにＴｉまたはＲｉプラスミドが用いられるならば、ＴｉまたはＲｉプラスミドＴ−ＤＮＡの少なくとも右の境界、しかし多くの場合右および左の境界が、挿入される遺伝子の隣接領域として連結されなければならない。植物細胞の形質転換のためのＴ−ＤＮＡの使用は集中的に研究されており、ＥＰ１２０５１６、Lee and Gelvin (2008)、Hoekema (1985)、Fraley et al., (1986)およびAn et al., (1985)で十分に記載され、当技術分野でよく確立されている。
【００５５】
挿入されたＤＮＡが植物ゲノムに組み込まれると、それは比較的安定である。形質転換ベクターは、形質転換された植物細胞に、とりわけビアラホス、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシンまたはハイグロマイシンなどの生物致死剤または抗生物質への抵抗性を付与する選択マーカーを通常含む。したがって、個々に使用されるマーカーは、挿入されたＤＮＡを含まない細胞ではなく形質転換された細胞の選択を可能にするはずである。
【００５６】
ＤＮＡを植物宿主細胞に挿入するために、多数の技術を利用できる。それらの技術には、形質転換ベクターとしてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）もしくはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を用いるＴ−ＤＮＡによる形質転換、融合、注入、微粒子銃（微小粒子衝撃）、またはエレクトロポレーション、ならびにナノ粒子形質転換および細胞透過ペプチド媒介形質転換を含む他の方法が含まれる。例えば、ＷＯ２００８／１４８２２３、ＷＯ２００９／０４６３８４、ＷＯ２０１１／０４６７８６、ＷＯ２０１１／１２６６４４、ＷＯ２０１２／００６４３９およびＷＯ２０１２／００６４４３を参照。アグロバクテリウム菌が形質転換のために用いられる場合、挿入されるＤＮＡは特別なプラスミド、すなわち中間型ベクターまたはバイナリーベクターのいずれかにクローニングされなければならない。中間型ベクターは、Ｔ−ＤＮＡの配列に相同的である配列のために、相同組み換えによってＴｉまたはＲｉプラスミドに組み込むことができる。ＴｉまたはＲｉプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡの転移のために必要なｖｉｒ領域も含む。中間型ベクターは、アグロバクテリウム菌ではそれ自身を複製することができない。中間型ベクターは、ヘルパープラスミド（コンジュゲーション）によってアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に移動させることができる。バイナリーベクターは、大腸菌（E. coli）およびアグロバクテリウム菌の両方でそれ自身を複製することができる。それらは、左右のＴ−ＤＮＡ境界領域によって組まれる選択マーカー遺伝子およびリンカーまたはポリリンカーを含む。それらは、アグロバクテリウム菌に直接に形質転換させることができる（Holsters et al., 1978）。宿主細胞として用いられるアグロバクテリウム菌は、ｖｉｒ領域を運ぶプラスミドを含むものとする。ｖｉｒ領域は、植物細胞へのＴ−ＤＮＡの転移のために必要である。さらなるＴ−ＤＮＡが含まれてもよい。そのように形質転換される細菌は、植物細胞の形質転換のために用いられる。植物外植片は、植物細胞へのＤＮＡの転移のために、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）と都合よく培養することができる。選択のための抗生物質または生物致死剤を含んでもよい適する培地で、感染植物材料（例えば、葉片、茎、根の断片だけでなく、プロトプラストまたは懸濁培養細胞も）から完全体植物を次に再生させることができる。そのように得られる植物は、挿入されたＤＮＡの存在について次に試験することができる。注射およびエレクトロポレーションの場合、プラスミドに特別に要求されるものはない。通常のプラスミド、例えばｐＵＣ派生体を用いることができる。
【００５７】
形質転換細胞は、通常の方法で増殖させ、完全で稔性の植物に分化させることができる。それらは胚細胞を形成することができ、後代植物へ形質転換形質（複数可）を伝えることができる。そのような植物は通常の方法で増殖させること、および同じ形質転換遺伝因子または他の遺伝因子を有する植物と交配することができる。生じる雑種個体は、対応する表現型特性を有する。本発明の植物細胞は、全能でなくても／完全な植物に再生させることができなくてもよい。そのような細胞には、例えば、葉細胞を含めることができる。しかし、本発明には、完全な植物に再生させることができる本発明の種子からの細胞も含まれる。
【００５８】
本発明の好ましい実施形態では、植物は遺伝子で形質転換され、そこではコドン使用頻度が植物のために最適化されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３８０，８３１号を参照。一部のトランケーションされた毒素が本明細書で例示されるが、１３０ｋＤａ型（完全長）毒素がコア毒素であるＮ末端半分およびプロトキシン「尾部」であるＣ末端半分を有することは、Ｂｔ技術の分野では周知である。したがって、適当な「尾部」を、本発明のトランケーションされた／コア毒素と用いることができる。例えば米国特許第６，２１８，１８８号および米国特許第６，６７３，９９０号を参照。さらに、植物で使用するための合成Ｂｔ遺伝子の作製方法が当技術分野で公知である（Stewart and Burgin, 2007）。好ましい形質転換植物の１つの非限定例は、Ｃｒｙ１Ｅａタンパク質をコードする植物で発現可能な遺伝子を含み、さらにＣｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１ＤａまたはＶＩＰ３Ａｂタンパク質をコードする第二の植物で発現可能な遺伝子を含む稔性の植物である。
【００５９】
近交系系統へのＣｒｙ１Ｅａの組の形質（複数可）の転移（または遺伝子移入）は、回帰性の選抜育種、例えば戻し交配によって達成することができる。この場合には、所望の反復親が、Ｃｒｙ１Ｅａの組の形質のための適当な遺伝子（複数可）を運ぶドナーの近交系（一回親）と先ず交配される。この交配の後代は、次に反復親と戻し交配され、続いて生じる後代において、一回親から移される所望の形質（複数可）について選択される。所望の形質（複数可）の選択を伴う反復親との３世代、好ましくは４世代、より好ましくは５世代以上の戻し交配の後、後代は移される形質（複数可）を支配する遺伝子座が異型接合的になるが、ほとんどまたはほとんど全ての他の遺伝子については反復親と同様である（例えば、Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175、Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1 : Theory and Technique, 360-376を参照）。
【００６０】
昆虫抵抗性管理（ＩＲＭ）戦略。例えばRoush et al.は、「ピラミッド化」または「スタッキング」とも呼ばれる、殺虫性トランスジェニック作物の管理のための２毒素戦略を概説している。（The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786）。
【００６１】
彼らのウェブサイトで、米国環境保護庁（epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips bt_corn_refuge_2006.htm）は、標的有害生物に対して活性である単一のＢｔタンパク質を生成するトランスジェニック作物で用いるための非トランスジェニック（すなわち、非Ｂｔ）緩衝帯（非Ｂｔ作物／トウモロコシの区域）を提供するための以下の要件を公表する。
「コーンボーラー保護Ｂｔ（Ｃｒｙ１ＡｂまたはＣｒｙ１Ｆ）トウモロコシ製品の特定の構造化要件は、以下の通りである：
構造化緩衝帯：
コーンベルトで２０％の非鱗翅目Ｂｔトウモロコシ緩衝帯；
コットンベルトで５０％の非鱗翅目Ｂｔ緩衝帯
ブロック
内部（すなわち、Ｂｔ圃場内）
外部（すなわち、任意交配を最大にするためにＢｔ圃場から１／２マイル（可能であれば１／４マイル）以内に別個の圃場）
圃場内の帯状地
幼虫の移動の影響を低減するために、帯状地は少なくとも４条（好ましくは６条）の幅でなければならない」
【００６２】
さらに、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｎ  Ｇｒｏｗｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎも、彼らのウェブサイト：（ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn）で、
緩衝帯要件に関して類似した指針を提供する。例えば：
「コーンボーラーＩＲＭの要件：
・トウモロコシ畑地の少なくとも２０％に緩衝帯雑種を植える
・綿花生産地では、緩衝帯は５０％でなければならない
・緩衝帯雑種の１／２マイル以内に植えなければならない
・緩衝帯は、Ｂｔ圃場内に帯状地として植えることができる；緩衝帯の帯状地は少なくとも４条の幅でなければならない
・標的昆虫の経済的許容限界に到達する場合だけ、緩衝帯を従来の殺虫剤で処理することができる
・Ｂｔベースの噴霧可能な殺虫剤を緩衝帯トウモロコシで用いることはできない
・Ｂｔトウモロコシのあらゆる農場に適当な緩衝帯を設けなければならない」
本発明のＦＡＷ保護Ｂｔ作物のために、類似の構造化緩衝帯ガイドラインを使用することができる。
【００６３】
Roush et al.（例えば、１７８０頁および１７８４頁の右欄）によって述べられているように、標的有害生物に各々有効で、ほとんど交差抵抗性のない２つの異なるタンパク質のスタッキングまたはピラミッド化は、より小さな緩衝帯の使用を可能にする。成功したスタックは、緩衝帯１０％未満の緩衝帯サイズが、単一（非ピラミッド化）形質のための約５０％の緩衝帯と同等の抵抗性管理を提供することができることをＲｏｕｓｈは示唆する。今日利用できるピラミッド化Ｂｔトウモロコシ製品については、米国環境保護庁は単一形質製品（一般に２０％）についてよりもかなり低く（一般に５％）構造化された非Ｂｔトウモロコシの緩衝帯を設けることを要求している。
【００６４】
Roush et al.（前掲）および米国特許第６，５５１，９６２号によってさらに論じられているように、圃場での様々な幾何学的栽植様式（上記のような）および袋入種子混合物を含む、緩衝帯のＩＲＭ効果を提供する様々な方法がある。
【００６５】
上記の百分率または類似した緩衝帯比率は、対象の二重または三重のスタックまたはピラミッドのために用いることができる。単一の標的有害生物に対して３つの作用部位を有する三重スタックについては、目標は緩衝帯がゼロ（または、例えば５％未満の緩衝帯）である。これは、例えば１０エーカー以上の商業用の土地に特にあてはまる。
【００６６】
本明細書で参照または引用される全ての特許、特許出願、仮出願および刊行物は、それらがこの明細書の明白な教示と矛盾しない範囲で、参照により全体が組み込まれる。
【００６７】
具体的に示されるか含意されない限り、本明細書で用いられるように、用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は「少なくとも１つ」を示す。
【００６８】
以下は、本発明を実施するための手法を例示する実施例である。これらの実施例は、限定するものと解釈されるべきでない。特記されない限り全ての百分率は重量によるものであり、全ての溶媒混合割合は容量によるものである。全ての温度は、摂氏温度である。
［実施例］
【実施例１】
【００６９】
Ｃｒｙ１ＥａおよびＣｒｙ１Ａｂタンパク質の１２５Ｉ標識
Ｃｒｙ毒素のヨウ素化。完全長Ｃｒｙ１ＥａおよびＣｒｙ１Ａｂタンパク質（配列番号１および２）をトリプシンによって開裂して、活性化された殺虫性の形（配列番号７および８によって表される）を生成した。Ｉｏｄｏ−ＢｅａｄまたはＩｏｄｏ−ｇｅｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、トランケーションされ、精製されたＣｒｙ毒素をヨウ素化した。簡潔には、２つのｌｏｄｏ−Ｂｅａｄを５００μｌのリン酸緩衝食塩水、ＰＢＳ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で２回洗浄し、鉛シールドの後の１．５ｍｌ遠心管に入れた。これに、１００μｌのＰＢＳを加えた。フード内で、および適切な放射能取扱い技術を用いることにより、０．５ｍＣｉ  Ｎａ１２５Ｉ（１７．４Ｃｉ／ｍｇ、Ｌｏｔ０１１４、Ａｍｅｒｓｈａｍ）をＩｏｄｏ−ＢｅａｄのＰＢＳ溶液に加えた。構成成分を室温で５分間反応させ、次に高度に純粋なトランケーションされたＣｒｙタンパク質の２〜２５μｇを溶液に加え、さらなる３〜５分間反応させた。Ｉｏｄｏ−Ｂｅａｄから溶液を取り出し、それをＰＢＳで平衡させた０．５ｍｌの脱塩Ｚｅｂａスピンカラム（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）に加えることによって、反応を停止した。Ｉｏｄｏ−Ｂｅａｄを各々１０μｌのＰＢＳで２回洗浄し、洗浄溶液も脱塩カラムに加えた。放射性溶液を１，０００×ｇで２分間の遠心によって脱塩カラムを通して溶出した。
【００７０】
ヨウ素化されたＣｒｙタンパク質の放射純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、蛍光画像化およびガンマ計数によって測定した。簡潔には、２μｌの放射性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。分離後、製造業者の説明書に従ってＢｉｏＲａｄゲル乾燥装置を用いてゲルを乾燥させた。マイラー膜（厚さ１２μｍ）で包み、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ保存蛍光スクリーン（３５ｃｍ×４３ｃｍ）の下でそれらを１時間露光させることによって、乾燥ゲルを画像化した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｓｔｏｒｍ８２０蛍光造影装置を用いてプレートを現像し、像はＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標）ソフトウェアを用いて分析した。放射性バンドと一緒にバンドの直ぐ上下の領域をかみそりの刃を用いてゲルから切断し、ガンマ計数器で数えた。放射能は、Ｃｒｙタンパク質バンドおよびバンドの下の領域で検出されただけであった。放射能はバンドより上で検出されず、全ての放射能汚染物質がトランケーションされたＣｒｙタンパク質より小さなタンパク質構成成分からなることを示した。これらの構成成分は、分解生成物を表す可能性が高い。
【実施例２】
【００７１】
ＢＢＭＶ調製プロトコル
可溶性ＢＢＭＶの調製および分画。終齢スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）幼虫を一晩絶食させ、次いで、翌朝、氷の上で１５分間冷やしたのちに解剖した。中腸組織を体腔から取り出し、外皮に接着した後腸を残した。中腸を、仕入先の推奨通りに希釈したプロテアーゼ阻害剤カクテル１（ＳｉｇｍａＰ−２７１４）を追加した、９倍容量の氷冷ホモジナイゼーション緩衝液（３００ｍＭマンニトール、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１７ｍＭトリス、塩基、ｐＨ７．５）に入れた。１５ストロークのガラス組織ホモジナイザーで組織をホモジナイズした。Ｗｏｌｆｅｒｓｂｅｒｇｅｒ（１９９３）のＭｇＣｌ２沈殿法によってＢＢＭＶを調製した。簡潔には、３００ｍＭマンニトール中の等量の２４ｍＭ  ＭｇＣｌ２溶液を中腸ホモジネートと混合し、５分間撹拌し、氷上で１５分間静置させた。４℃で１５分間、２，５００×ｇで溶液を遠心分離した。上清を保存し、元の容量の０．５倍希釈のホモジナイゼーション緩衝液にペレットを懸濁して再び遠心分離した。２つの上清を合わせ、４℃で３０分間、２７，０００×ｇで遠心分離してＢＢＭＶ分画を形成した。ペレットを１０ｍｌホモジナイゼーション緩衝液に懸濁し、プロテアーゼ阻害剤に追加し、４℃で３０分間、２７，０００×ｇで再び遠心分離してＢＢＭＶを洗浄した。生じたペレットをＢＢＭＶ保存緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１３０ｍＭ  ＫＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．４）に懸濁して、約３ｍｇ／ｍｌタンパク質の濃度にした。タンパク質濃度は、標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いてＢｒａｄｆｏｒｄ法（１９７６）を用いることによって測定した。製造業者の説明書に従ってＳｉｇｍａアッセイを用いて、試料を凍結させる前にアルカリ性ホスファターゼの測定を行った。ＢＢＭＶ分画中のこのマーカー酵素の比活性は、中腸ホモジネート分画で見られるものと比較して一般的に７倍増加した。ＢＢＭＶを２５０μｌの試料に等分し、液体Ｎ２で瞬間冷凍し、−８０℃で保存した。
（１カクテル構成成分の最終濃度（μΜ）は、ＡＥＢＳＦ（５００）、ＥＤＴＡ（２５０ｍＭ）、ベスタチン（３２）、Ｅ−６４（０．３５）、ロイペプチン（０．２５）およびアプロチニン（０．０７５）である。）
【実施例３】
【００７２】
ＢＢＭＶタンパク質への１２５Ｉ  Ｃｒｙタンパク質の結合を測定する方法
ＢＢＭＶへのｌ２５Ｉ  Ｃｒｙタンパク質の結合。結合アッセイで用いるＢＢＭＶタンパク質の最適量を決定するために、飽和曲線を作成した。１２５Ｉ放射性標識Ｃｒｙタンパク質（０．５ｎＭ）を、結合緩衝液（８ｍＭ  ＮａＨＰＯ４、２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４）中に０〜５００μｇ／ｍｌの様々な量のＢＢＭＶタンパク質と、２８℃で１時間インキュベートした。全容量は、０．５ｍｌであった。１．５ｍｌ遠心管から５００μｌ遠心管に反応混合液の１５０μｌを３反復で採取し、室温で６分間、１４，０００×ｇで試料を遠心分離することによって、結合した１２５Ｉ  Ｃｒｙタンパク質を未結合のものから分離した。上清を静かに除去し、氷冷結合緩衝液でペレットを３回静かに洗浄した。ペレットを含む遠心器の底を切り取り、１３×７５ｍｍガラス培養試験管に入れた。試料をガンマ計数器でそれぞれ５分間計数した。試料に含まれる計数をバックグラウンド計数（タンパク質なしでの反応）から引き、ＢＢＭＶタンパク質濃度に対してプロットした。用いるタンパク質の最適量は、０．１５ｍｇ／ｍｌのＢＢＭＶタンパク質であると決定された。
【００７３】
結合動態を決定するために、飽和曲線を作成した。簡潔には、ＢＢＭＶ（１５０μｇ／ｍｌ）を、０．０１から１０ｎＭの増大する濃度の１２５Ｉ  Ｃｒｙ毒素と２８℃で１時間インキュベートした。各濃度の１５０μｌを３反復で採取し、試料の遠心および計数は前記の通りに実行して、全結合を測定した。全ての非特異的受容体結合部位を飽和させるために反応混合液に加えられた、１，０００ｎＭの相同トリプシン処理非放射性Ｃｒｙ毒素（配列番号７〜１１で表される、トリプシン未処理は配列番号６）を添加して、非特異的結合を同様に測定した。特異的結合は、全結合と非特異的結合との間の差として計算された。
【００７４】
相同的および非相同的競合結合アッセイは、１５０μｇ／ｍｌのＢＢＭＶタンパク質および０．５ｎＭの１２５Ｉ放射性標識Ｃｒｙタンパク質を用いて実施した。真の結合競合を保証するために、反応混合液に加えられた競合的非放射性標識Ｃｒｙ毒素の濃度は０．０４５から１，０００ｎＭであって、放射性リガンドと同時に加えられた。インキュベーションは２８℃で１時間実施し、その受容体毒素に結合した１２５Ｉ  Ｃｒｙタンパク質の量は、非特異的結合を引いて前記のように測定した。１００パーセントの全結合は、競合リガンドの非存在下で測定した。加えた競合的リガンドの濃度に対する全特異的結合の百分率として、結果を片対数グラフにプロットした。
【実施例４】
【００７５】
結果の要約
図１は、非標識の相同的Ｃｒｙ１Ｅａ（●）および非相同的Ｃｒｙ１Ａｂ（■）による競合に対してＦＡＷからのＢＢＭＶにおける１２５Ｉ  Ｃｒｙ１Ｅａ（０．５ｎＭ）の特異的結合百分率を示す。Ｃｒｙ１Ｅａによる相同的競合の置換曲線は、約１ｎＭの非標識Ｃｒｙ１Ｅａで放射性リガンドの５０％の置換を示す曲線をもたらす。Ｃｒｙ１Ａｂは、１，０００ｎＭまで、またはアッセイで用いられた１２５Ｉ  Ｃｒｙ１Ｅａの濃度の２，０００倍までの、試験されたいかなる濃度においても１２５Ｉ  Ｃｒｙ１Ｅａの特異的結合を置換しない。
【００７６】
図２は、ＦＡＷ幼虫からのＢＢＭＶへの１２５Ｉ  Ｃｒｙ１Ａｂの結合、および非標識のＣｒｙ１Ａｂの濃度増加によるその以降の置換を示す。非標識のＣｒｙ１Ａｂは、約０．３ＮＭの濃度で、放射性標識されたＣｒｙ１Ａｂの結合を５０％置換する。ＦＡＷ  ＢＢＭＶへの１２５Ｉ  Ｃｒｙ１Ａｂの結合は、Ｃｒｙ１Ｅａによって置換されない。したがって、これらの２つのＣｒｙ毒素は、ＦＡＷ昆虫の腸の別々の部位で結合する。
【００７７】
図３は、非標識の相同的Ｃｒｙ１Ｅａ（●）および非相同的Ｃｒｙ１Ｃａ（▲）による競合に対してＦＡＷからのＢＢＭＶにおける１２５Ｉ  Ｃｒｙ１Ｅａの特異的結合百分率を示す。Ｃｒｙ１Ｅａによる相同的競合の置換曲線は、約１ｎＭの非標識Ｃｒｙ１Ｅａで放射性リガンドの５０％の置換を示す曲線をもたらす。Ｃｒｙ１Ｃａは、１２５Ｉ  Ｃｒｙ１Ｅａの結合を置換することができなかった。
【００７８】
図４は、１２５Ｉ  Ｃｒｙ１ＥａをＦＡＷ幼虫からのＢＢＭＶに結合させ、その後Ｃｒｙ１Ｅａ、Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１ＤａおよびＶＩＰ３Ａｂ１リガンドを加えた結合アッセイの結果を示す。１，０００ｎＭ濃度、またはアッセイで用いられた１２５Ｉ  Ｃｒｙ１Ｅａの濃度の２，０００倍のＣｒｙ１Ｄａによる約４０％の置換を除いて、Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１ＤａおよびＶＩＰ３Ａｂ１は、１２５Ｉ  Ｃｒｙ１Ｅａの結合を置換することができなかった。
（参考文献）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2016501511.tif 000011