(57)【要約】  本発明は、シナラ属種の抽出物、並びにＳＴＡＴ３転写因子の構成的活性化を特徴とする病理学的状態を予防及び／又は処置するための前記抽出物を含む組成物及びキットに関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するためのシナラ・カルドンクルス亜種スコリムス（ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓｃｏｌｙｍｕｓ）の抽出物。
【請求項２】
前記抽出物がシナラ属（ｃｙｎａｒａ）の葉若しくは頭状花又は両部分の混合物の乾燥又は凍結乾燥又は液体抽出物である、請求項１に記載のシナラ・カルドンクルス亜種スコリムス（ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓｃｏｌｙｍｕｓ）の抽出物。
【請求項３】
１種以上の抗腫瘍及び／又は抗炎症化合物と併用して、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための、請求項１又は２に記載のシナラ・カルドンクルス亜種スコリムス（ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓｃｏｌｙｍｕｓ）の抽出物。
【請求項４】
前記併用が、前記抽出物を前記１種以上の抗腫瘍及び／又は抗炎症化合物と同時投与又は連続投与することによって実施される、請求項３に記載のシナラ・カルドンクルス亜種スコリムス（ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓｃｏｌｙｍｕｓ）の抽出物。
【請求項５】
前記１種以上の抗腫瘍化合物がシスプラチン、ドキソルビシン、ペメトレキセド、メトトレキサート、ビノレルビン、ゲムシタビン及びタキソールを含む群から選択される、請求項３又は４に記載のシナラ・カルドンクルス亜種スコリムス（ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓｃｏｌｙｍｕｓ）の抽出物。
【請求項６】
前記病理学的状態が前立腺癌、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、メラノーマ、卵巣癌、腎細胞癌、膵臓腺癌、肺癌、脳腫瘍、赤白血病、頭頚部扁平上皮癌、結腸癌、悪性胸膜中皮腫を含む群から選択される腫瘍病理学的状態である、請求項１から５までのいずれか一項に記載のシナラ・カルドンクルス亜種スコリムス（ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓｃｏｌｙｍｕｓ）の抽出物。
【請求項７】
前記脳腫瘍が神経膠腫、脳髄膜腫、髄芽細胞腫であり、前記リンパ腫がセザリー症候群、ＥＢＶ関連バーキットリンパ腫、Ｓａｍｉｒｉ  ＨＳＶ依存性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞関連リンパ腫であり；前記白血病がＨＴＬＶ−１−依存性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、巨核球性白血病、大顆粒リンパ球白血病（ＬＧＬ）である、請求項６に記載のシナラ・カルドンクルス亜種スコリムス（ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓｃｏｌｙｍｕｓ）の抽出物。
【請求項８】
前記病理学的状態がＳＴＡＴを阻害しない化学療法剤による処置に耐性の腫瘍である、請求項１から７までのいずれか一項に記載のシナラ・カルドンクルス亜種スコリムス（ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓｃｏｌｙｍｕｓ）の抽出物。
【請求項９】
前記炎症性疾患がヘリコバクター・ピロリ（ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）による感染、Ｂ型肝炎ウイルスによる感染、ＨＰＶ（ヒト乳頭腫ウイルス）による感染、エプスタイン−バールウイルス感染などのウイルス感染によって引き起こされる炎症である、請求項１から４までのいずれか一項に記載のシナラ属種（ｃｙｎａｒａ  ｓｐｐ．）の抽出物。
【請求項１０】
ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための、活性成分として、シナラ・カルドンクルス亜種スコリムス（ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓｃｏｌｙｍｕｓ）の抽出物と担体及び／又は希釈剤及び／又は添加剤を含む組成物。
【請求項１１】
活性成分として、１種以上の抗腫瘍及び／又は抗炎症化合物をさらに含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記１種以上の抗腫瘍化合物がシスプラチン、ドキソルビシン、ペメトレキセド、メトトレキサート、ビノレルビン、ゲムシタビン及びタキソールを含む群から選択される、請求項１０又は１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記病理学的状態が前立腺癌、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、メラノーマ、卵巣癌、腎細胞癌、膵臓腺癌、肺癌、脳腫瘍、赤白血病、頭頚部扁平上皮癌、結腸癌、悪性胸膜中皮腫を含む群から選択される腫瘍病理学的状態である、請求項１０から１２までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記脳腫瘍が神経膠腫、脳髄膜腫、髄芽細胞腫であり、前記リンパ腫がセザリー症候群、ＥＢＶ関連バーキットリンパ腫、Ｓａｍｉｒｉ  ＨＳＶ依存性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞関連リンパ腫であり；前記白血病がＨＴＬＶ−１−依存性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、巨核球性白血病、大顆粒リンパ球白血病（ＬＧＬ）である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記病理学的状態がＳＴＡＴを阻害しない化学療法剤による処置に耐性の腫瘍である、請求項１０から１４までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記炎症性疾患がヘリコバクター・ピロリ（ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）による感染、Ｂ型肝炎ウイルスによる感染、ＨＰＶ（ヒト乳頭腫ウイルス）による感染、エプスタイン−バールウイルス感染などのウイルス感染によって引き起こされる炎症である、請求項１０又は１１に記載の組成物。
【請求項１７】
ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための、シナラ・カルドンクルス亜種スコリムス（ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓｃｏｌｙｍｕｓ）の抽出物と抗腫瘍活性を有する１種以上の化合物及び／又は抗炎症作用を有する１種以上の化合物の同時投与又は連続投与用のキットであって、シナラ・カルドンクルス亜種スコリムス（ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓｃｏｌｙｍｕｓ）の抽出物の１つ以上のアリコートと、抗腫瘍活性を有する１種以上の化合物の１つ以上のアリコート及び／又は抗炎症作用を有する１種以上の化合物の１つ以上のアリコートを含む、上記キット。
【請求項１８】
前記１種以上の抗腫瘍化合物がシスプラチン、ドキソルビシン、ペメトレキセド、メトトレキサート、ビノレルビン、ゲムシタビン及びタキソールを含む群から選択される、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記病理学的状態が前立腺癌、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、メラノーマ、卵巣癌、腎細胞癌、膵臓腺癌、肺癌、脳腫瘍、赤白血病、頭頚部扁平上皮癌、結腸癌、悪性胸膜中皮腫を含む群から選択される腫瘍病理学的状態である、請求項１７又は１８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２０】
前記脳腫瘍が神経膠腫、脳髄膜腫、髄芽細胞腫であり、前記リンパ腫がセザリー症候群、ＥＢＶ関連バーキットリンパ腫、Ｓａｍｉｒｉ  ＨＳＶ依存性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞関連リンパ腫であり；前記白血病がＨＴＬＶ−１−依存性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、巨核球性白血病、大顆粒リンパ球白血病（ＬＧＬ）である、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記病理学的状態がＳＴＡＴを阻害しない化学療法剤による処置に耐性の腫瘍である、請求項１７から２０までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項２２】
前記炎症性及び／又は前腫瘍が（文献に記載されているように）ウイルス感染、例えば、ヘリコバクター・ピロリ（ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）による感染、Ｂ型肝炎ウイルスによる感染、ＨＰＶ（ヒト乳頭腫ウイルス）による感染、エプスタイン−バールウイルス感染によって引き起こされる炎症であり得る、請求項１７又は１８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シナラ属種（Ｃｙｎａｒａ  ｓｐｐ．）の抽出物、ＳＴＡＴ３転写因子の構成的活性化を特徴とする病理学的状態を予防及び／又は処置するための前記抽出物を含む組成物及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ここ数十年、多くの文献中の証拠において、多種多様な病状、例えば、腫瘍を促進する炎症性の病状、及び腫瘍そのものにおけるＳＴＡＴファミリーに属する転写因子の基本的な役割が開示されている。ＳＴＡＴタンパク質は細胞質転写因子であって、（ＪＡＫ又はヤヌスキナーゼタンパク質のファミリー作用による特定残基セリン及び／又はチロシンでの）リン酸化／活性化が２種のＳＴＡＴモノマーの二量体化、核内での二量体の移行、ＳＴＡＴ特異的標的遺伝子のＤＮＡエレメントへの結合、及び遺伝子転写の誘導を決定する因子である。ＳＴＡＴ因子のファミリーは、７種のメンバー（遺伝子ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ及びＳＴＡＴ６によってコードされている）から構成されており、分化、増殖、成長、アポトーシス及び細胞の炎症における役割をはじめとする様々な生物学的機能を備えている。これらの遺伝子によってコードされているタンパク質の１つの特徴は、二系統の役割、より詳しくは、細胞質におけるシグナル伝達の役割と核における転写因子の役割を有するということである。特に、ＳＴＡＴ３の構造的活性化と、またそれほどではないがＳＴＡＴ５の構造的活性化は、様々な腫瘍形成において、いくつかの細胞内経路、例えば、腫瘍の生存、及び腫瘍細胞の増殖に関与する経路、また、血管新生及び腫瘍自体の転移のプロセスに関与する経路などの制御解除と関連している。
【０００３】
Ｙｕ  Ｈ．らは、２００９年のＮａｔｕｒｅで公表した概説（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ９、７９８〜８０９：２００９）において、ＳＴＡＴ３の持続的活性化が癌を促進する炎症を誘導し、炎症及び腫瘍の微小環境にとって重要な遺伝子を制御することを報告した。ＳＴＡＴ３によって活性化される遺伝子は、前述の研究の表１及び表２で明らかにされている。また、天然物質のうち、いくつかのＳＴＡＴ３活性化阻害剤、例えば、ククルビタシン（ｃｕｒｃｕｂｉｔａｃｉｎ）、レスベラトロール、ガリエララクトン及びインジルビンなども記載されている。しかし、これらの物質が作用する作用機序は解明されていないと記載されている。
【０００４】
いずれの場合にも、その研究では、ＳＴＡＴ３のモジュレーションが癌処置の新たな、より効果的で非常に有利な方法であると述べられており、様々な腫瘍モデルにおけるＳＴＡＴ３遺伝子の除去が腫瘍増殖を抑制することが報告されている。
【０００５】
ＳＴＡＴ３の構造的活性化は、多数の腫瘍、例えば、乳癌、前立腺癌、頭頚部扁平上皮癌、多発性骨髄腫、リンパ腫及び白血病、脳腫瘍、結腸癌、ユーイング肉腫、胃癌、食道癌、卵巣癌、上咽頭癌及び膵癌などにおいて報告されている（下記表１）。多くのタイプの癌において、高レベルの活性化ＳＴＡＴ３が予後不良と結び付いていた。ＳＴＡＴ３の活性化は、アポトーシスを阻止し、細胞増殖及び細胞生存を増加させ、血管新生及び転移が促進され、抗腫瘍免疫応答が阻害される。ＳＴＡＴ３が構造的に活性化される腫瘍細胞系は、ＳＴＡＴ３の連続的活性化、「発癌遺伝子依存」として定義されている表現型を必要とする（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＰＡ  ａｎｄ  Ｇｒａｎｄｉｓ  ＲＧ、Ｍｏｌｌｎｔｅｒｖ；１１（１）；１８〜２６：２０１１）。
【０００６】
悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）は、胸腔中皮細胞由来の侵襲性の高い腫瘍である。化学療法（多くの場合、ペメトレキセドが使用される）によって手術不可能なＭＰＭ罹患患者の生存期間が改善されるが、その平均の全体生存期間はわずか１２か月である。近年、ＭＰＭに対する可能性のある分子治療標的が、ＭＰＭ罹患患者の胸膜液中に存在する高レベルＩＬ−６によって活性化されるインターロイキン−６シグナル経路（ＩＬ−６）／ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３であると報告された。ＩＬ−６のその受容体への結合は、ＪＡＫ活性化を開始する受容体中の構造変化を引き起こし、次いでそれがＳＴＡＴ３転写因子の二量体化を開始し、ＳＴＡＴ３二量体は核内へ移行し、それによって、様々な標的遺伝子の転写活性化の開始が決定される。
【０００７】
この経路は、造血の発生、免疫応答の発生、及び腫瘍形成の発生にとって重要である。さらに、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３系の機能障害が癌の発症に関係していることも実証された。
【０００８】
また文献では、アスベストへの暴露が中皮腫の原因の１つであることが報告されている。
【０００９】
さらに、先進国の中皮腫の発病率は次の１５年で上昇することがことも予想されており、また、いくつかの予測では１９９８年と２０１８年の間、毎年ｈＭＰＭの症例が倍増していくことが想定される。必要な予防措置が取られることなくアスベストの使用が指数関数的に上昇し続けている、第三世界、特にインドにおける中皮腫の劇的な上昇も予想される。現在、中皮腫の症例は、米国では１年に約３，０００人、ヨーロッパでは約５，０００人の死亡をもたらす。中皮腫の頻度は、アスベストの除去プログラムにもかかわらず、過去２０年間、大きく変化しておらず、次の２５年でヨーロッパ諸国において１年に５％〜１０％まで上昇すると推測される。
【００１０】
ＷＨＯは、約１億２５００万人が職場でアスベストにさらされていると推定している。
【００１１】
米国では、５０年の間に男性人口における中皮腫の症例数の予測総数は７１，０００件になると推定される。
【００１２】
アスベストの商業的利用が長年禁止されているヨーロッパでは、最初の分析は、男性人口における中皮腫原因の死亡は上昇し続け、ほぼ２０２０年頃に最大ピークを迎えると推定しており、また最新の予測ではほぼ２０１５年ごろと推定している（平均潜伏期を４４．６年と考慮する）。
【００１３】
疾患の年間発病率は国によって変動するが、新興市場での症例数は、アスベスト鉱山における規制が欠如していることと産業レベル及び国内レベルでのアスベストの使用が増加することによって大幅に上昇することが疑われている。
【００１４】
ｈＭＰＭは、典型的には４つのサブグループに分類され、様々な予後因子が同定されている。現在の治療法としては、手術、放射線療法、化学療法及び多手法治療が挙げられるが、これまで、どちらかというと不本意な結果となっている。中皮腫が根本的な外科的切除に適するというのは非常に稀であり、また、化学療法及び放射線療法に対するその耐性についても文献で一般に報告されている。診断時点からの生存は８〜１８か月である。
【００１５】
さらに、腫瘍の発症及び進行においてＳＴＡＴ３が果たす役割に関する概要は、これまでの文献に記載されている。ＳＴＡＴ３の構造的活性化は、血液腫瘍（多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫）と固形腫瘍（メラノーマ、卵巣癌、前立腺癌及び腎細胞癌、膵臓腺癌、肺癌並びに脳腫瘍）の両方において観察されている。より詳細については、Ｔｕｒｋｓｏｎ  Ｊ  ａｎｄ  Ｊｏｖｅ  Ｒ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ；１９（５６）；６６１３〜２６：２０００から取得した下記の表３に、ＳＴＡＴ３の異常活性化に直接関係している多数の腫瘍を示す。特に、この異常活性化は、チロシンキナーゼ、例えば、ｖ−Ｓｒｃ、ｖ−Ｒｏｓ、ｖ−Ｆｐｓ、Ｅｔｋ／ＢＭＸ及びＬｃｋなどを変換する作用によって、或いはサイトカインのオートクリン又はパラクリン放出によって誘導される異常シグナルによって引き起こされると考えられる。ＳＴＡＴ３の構造的活性化は、アポトーシス阻害因子（例えば、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｍｃｌ−１）、細胞周期の制御因子（例えば、サイクリンＤ１／Ｄ２、ｃＭｙｃ）、及び血管新生の誘導因子（例えば、ＶＥＧＦ：血管内皮細胞増殖因子）をコードしている遺伝子の過剰発現をもたらす。最後に、最近、腫瘍形成における重要な役割を有していることとは別に、この転写因子の構造的活性化が化学療法剤により誘導される死滅に対する耐性を付与していることが明らかにされている（Ａｇｇａｒｗａｌ  Ｂ．Ｂ．ら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０９１；１５１〜６９：２００６）。
【００１６】
様々な臨床研究からは、インビボにおいて、固形腫瘍は、腫瘍そのものを細胞死のシグナルに対して非感受性にし、しかも放射線療法及び化学療法処置に対して耐性をもたせる、Ｏ２が低レベルの環境において増殖及び発症すること；一方、低酸素は血管新生、増殖及び転移能力を促進することが明らかになっている。この文脈において、腫瘍の悪性度とは、低酸素及びＳＴＡＴ３の過剰活性化の両方による、ＨＩＦ−１α因子の活性化及び安定化に関連していると思われる。
【００１７】
この理由のため、ＳＴＡＴ３因子の標的化に基づいた抗癌治療が非常に好ましい（Ｎｉｕ  Ｇ．ら、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６（７）；１０９９〜１０５：２００８）。
【００１８】
下記に示す表１は、Ａｇｇａｒｗａｌ  Ｂ．Ｂ．ら、２００６の研究から取得したものであり、構造的に活性のあるＳＴＡＴ３を発現する腫瘍、ＳＴＡＴ３の活性化因子、ＳＴＡＴ３によって制御される遺伝子及びＳＴＡＴ３の阻害因子のリストを示す。
【表１】
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【００１９】
表２は、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＰＡ  ａｎｄ  Ｇｒａｎｄｉｓ  ＲＧ  ２０１１から取得したものであり、ＳＴＡＴ３を多数の腫瘍と関連付け、ＳＴＡＴ３が抗癌治療における効果的な標的対象であるという事実を確認している。
【表２】
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【００２０】
Ｔｕｒｋｓｏｎ  Ｊ  ａｎｄ  Ｊｏｖｅ  Ｒ  ２０００から取得した表３は、ＳＴＡＴ３の異常活性化に直接関連している多数の腫瘍を示している。
【表３】
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【００２１】
特に、ＳＴＡＴ３に関して、以下のことが多数の刊行物で実証されている：
１）ＳＴＡＴ３は、多くの場合、多数のヒト癌細胞、例えば、多発性骨髄腫、リンパ腫、白血病、肺癌、前立腺癌、頭頚部扁平上皮癌細胞及び他の腫瘍タイプなどで構造的に活性化（リン酸化）される。
２）ＳＴＡＴ３は、増殖因子（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−２３、ＩＬ−２１、ＩＬ−１１、ＨＧＦ）、発癌性キナーゼ（例えば、Ｓｒｃ）によって活性化される。
３）ＳＴＡＴ３は、増殖遺伝子（例えば、ｃ−ｍｙｃ、サイクリンＤ１）、アポトーシス抑制遺伝子（例えば、Ｂｃｌ−ＸＬ及びスルビビン）、サイトカインコード遺伝子、並びに、血管新生を促進する遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ）の発現、活性化された場合の細胞増殖及び血管新生の増加並びにアポトーシスの抑制を媒介する。
４）ＳＴＡＴ３の活性化はまた、化学耐性及び放射線耐性の現象とも関係している。
５）ＳＴＡＴ３の持続的活性化は、様々なヒトの癌において、増殖、生存、血管新生及び転移を増加させ、抗腫瘍免疫を阻害する。
【００２２】
また、特定の臓器又は特定の部位の慢性炎症は悪性転換を促すこと、並びに、ＳＴＡＴ３が癌につながる炎症の外因性及び内因性経路にとって重要であることも公知であり、実際、ＳＴＡＴ３は、慢性炎症に関連した悪性の特性を誘導することが知られている。
【００２３】
腫瘍形成におけるＳＴＡＴ３の重要な役割により、ＳＴＡＴ３の阻害剤は、癌の予防及び処置において多大なる可能性を有している。おそらく、ＳＴＡＴ３の活性化で最もよく知られている阻害剤の１つは、ＪＡＫ２の活性化を阻害する、ＡＧ４９０である。他のＳＴＡＴ３の阻害剤としては、小ペプチド、オリゴヌクレオチド及び小分子が挙げられる。一部の著者は、ＤＮＡへの結合、及び遺伝子制御の活性、並びに細胞形質転換を媒介する機序である、ＳＴＡＴ３のリン酸化／活性化を遮断するペプチドを同定している。ＳＴＡＴ３を遮断する様々な小分子としては、ＰＧＪ２、白金複合体、エタノール、サリチル酸ナトリウム、レチン酸、アチプリモド、ＰＳ−３４１及びスタチンが挙げられる。多くのポリフェノール植物において、ＳＴＡＴ３の活性化を抑制するそれらの能力が同定された。これらには、クルクミン、レスベラトロール、ククルビタシン、ピセアタンノール、パルテノライド、フラボピリドール（ｆｌａｚｏｐｉｒｉｄｏｌ）、マグノロール及びエピガロカテキン−３−ガレートが含まれる。ＳＴＡＴ３活性化の抑制にこれらの分子が効を奏する方法は完全に明らかではない。例えば、クルクミンは、ＳＴＡＴ３活性化に全面的に関与している、ＪＡＫ２、Ｓｒｃ、Ｅｒｂ２及びＥＧＦＲの阻害効果と、発現がＳＴＡＴ３によって制御されている、Ｂｃｌ−ｘＬ、サイクリンＤ１、ＶＥＧＦ及びＴＮＦの発現の下方制御の効果が明らかになっている（Ａｇｇａｒｗａｌ  Ｂ．Ｂ．ら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０９１；１５１〜６９：２００６）。
【００２４】
ＳＴＡＴ３のシグナル伝達カスケードへの干渉：ＳＴＡＴ３のリン酸化／活性化の阻害、ＳＴＡＴ３が関与する分子間相互作用の阻害、ＳＴＡＴ３の核内取り込み／排出の阻害、ＳＴＡＴ３によって媒介される転写の阻害を可能にする、様々な方策及び様々なメカニズムがある。化学療法剤とは別に、ＳＴＡＴ３を阻害することが既に述べられており、さらに他のものも記載されている（セツキシマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブなど）。これらについては様々な影響：緩やかな有効性、耐性の発生、骨髄抑制、胃腸レベルでの毒性、及び心臓血管系毒性をはじめとする様々な有害反応が報告されている（表４を参照）。
【００２５】
下記の表４は、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＰＡ  ａｎｄ  Ｇｒａｎｄｉｓ  ＲＧ  ２０１１から取得したものであり、ＳＴＡＴ３のシグナルの治療的介入に関する方法及び結果を報告している。
【表４】
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【００２６】
腫瘍進行に直接関与している細胞の亜集団において、より特異的な方法で特定の標的分子を阻害する化合物による標的化治療法である治療法は、癌処置において新たな展望を示す。細胞増殖及び死滅をコントロールする分子、例えば、増殖因子に対する受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）などは、このタイプの治療的アプローチの最良の対象の一つである。標的療法の時代は、転移性乳癌を処置するためのトラスツズマブ（ＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体）と、慢性骨髄性白血病におけるイマチニブ（ｉｍａｔｉｂｉｎ）（ＢＣＲ−ＡＢＬの阻害因子）の承認で始まった。これらの処置効果に対する当初の熱意にもかかわらず、医師は、すぐに再発の問題に直面しなければならなかった。その理由は、癌に罹患している者には、多くの場合、代替経路が活性化することにより薬剤に対する耐性が出現したからである。腫瘍は、一般的に無秩序化された、多くの機序及び多くの遺伝子標的によって特徴づけられるので、併用療法を採用することは有利であり、応答及び許容性を増加させ、且つ耐性を低下させる合理的な方法となることから、癌処置における標準である。現在、低薬剤用量を使用することにより全身毒性を最小限にして、効果を最大化することを目的とした抗腫瘍薬剤の併用に対して関心が高まっている。
【００２７】
したがって、Ｓｒｃ及びＪＡＫを含む上流分子の薬理学的遮断によるＳＴＡＴ３リン酸化の阻害が腫瘍形成を低減させ、化学療法薬の必要用量の低下の可能性につながることがより多くの試験で結論付けられていることを考慮すると、ＳＴＡＴ３の構造的活性化又は誘導的活性化を遮断することができる天然由来分子などの薬理学的に安全で有効な治療薬は、癌処置において潜在的有効性を有している。
【００２８】
さらに、ＳＴＡＴ３の活性化は化学療法及び放射線療法に対する耐性にも関連するため、こうした活性化の阻害剤は、そのような耐性を制限し、化学療法及び放射線療法の効果を最適化するための大きな関心事でもある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
本発明の発明者らは、アーティチョーク（シナラ属種）の抽出物がタンパク質ＳＴＡＴ３のリン酸化を選択的にモジュレートし、本質的には阻害し、その結果、転写因子としての細胞内のその後の作用を阻害できることを実証した。本出願の実験部分で明らかなように、本発明の発明者らは、多数の実験において、また悪性胸膜中皮腫の様々な細胞系に対して、本明細書に記載の抽出物がＳＴＡＴ３の活性化（リン酸化）の有効な阻害剤であり、結果として、
−  腫瘍細胞系に対する有効な細胞障害作用を示し、
−  腫瘍細胞の再生を阻害することができ、したがって細胞増殖抑制剤として作用し、
−  腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し、
−  多くの化学療法剤との相加効果及び相乗効果を有し、それによって、化学療法剤単独による処置又は抽出物単独による処置と比べて腫瘍細胞の生存能力が低下し、
−  悪性胸膜中皮腫細胞及び非形質転換性中皮細胞に対し異なる方法で作用する
ことを実証した。
【００３０】
ＳＴＡＴ３因子に対するこうした抽出物の影響の見地から、本発明の発明者らは、本明細書に記載のシナラ属種の抽出物がＳＴＡＴ３へのＤＮＡへの結合を阻止し、それにより、通常、リン酸化ＳＴＡＴ３によって活性化される遺伝子発現の変化を阻止できることを実験によってさらに実証した。
【００３１】
言い換えれば、前記抽出物がリン酸化形態のタンパク質ＳＴＡＴ３をモジュレートし、本質的には阻害し、転写因子としての細胞内における前記タンパク質の連続的作用を阻止できることを証明した。特に、本開示の発明者らは、シナラ属種の抽出物がＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化を阻害できること、またＭＰＭ腫瘍細胞の培養におけるアポトーシスの再活性化を誘導できることを実証した。さらに、本発明の発明者らは、ＭＰＭ腫瘍細胞の培養に関する実験において、シナラ属種の抽出物は創傷治癒を抑制し、実際、腫瘍細胞の浸潤を阻止することも実証した。さらに、本発明の発明者らは、マウスの腫瘍細胞移植実験により、本発明の抽出物がインビボにおいてＭＰＭ細胞に対する抗腫瘍効果を発揮することも実証した。
【００３２】
本発明のすべての実施形態において、ＭＰＭは、ｈＭＰＭという用語と置き換えることができる。
【課題を解決するための手段】
【００３３】
したがって、本発明の第１の主題は、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するためのシナラ属種の抽出物である。
【００３４】
本発明の第２の主題は、１種以上の化学療法剤と併用して、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するためのシナラ属種の抽出物である。本開示の第３の主題は、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための、シナラ属種の抽出物と担体及び／又は希釈剤及び／又は添加剤を含む組成物である。
【００３５】
一実施形態において、本組成物はまた、抗アポトーシス成分を含む１種以上の成分を含む。
【００３６】
本発明の第４の主題は、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための、抗腫瘍成分及び／又は抗炎症成分を含む１種以上の成分と併用するシナラ属種の抽出物と担体及び／又は希釈剤及び／又は添加剤を含む組成物である。
【００３７】
本発明の第５の主題は、１種以上の化学療法剤と併用して、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための、シナラ属種の抽出物又はシナラ属種の抽出物を含む組成物の１つ以上のアリコートと、化学療法剤を含む１種以上の組成物の１つ以上の個別のアリコートを含む、シナラ属種の抽出物及び１種以上の化学療法剤の同時投与又は連続投与用のキットである。
【００３８】
本発明の第６の主題は、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態を予防及び／又は処置するための治療方法であって、それを必要とする個体に、シナラ属種の抽出物の治療上有効な量を、任意選択で抗腫瘍及び／又は抗腫瘍活性を有する１種以上の成分と併用して、投与するステップを含む、前記治療方法である。
【００３９】
記載したすべての主題は、特に、前記病理学的状態が悪性胸膜中皮腫の形成に関係している症例、又は悪性胸膜中皮腫である症例に関与し得る。
【００４０】
注：本図面において、使用されているシナラ属種の抽出物は、多くの場合、ＡＢＯ−１の略語で示されている。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ＳＴＡＴ３、ｐ−ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）のリン酸化の阻害。        図１Ａは、２４時間、１００μｇ／ｍｌのシナラ・スコリムス（Ｃｙｎａｒａ  ｓｃｏｌｙｍｕｓ）抽出物で処理したＭＳＴＯ２１１Ｈから得た細胞溶解産物のウェスタンブロット解析である。定量は、対照のアクチンと比較して実施した。        図１Ｂは、ＭＳＴＯ２１１Ｈ細胞でのウェスタンブロットで得られたデータの棒グラフである。ｐ−ＳＴＡＴ３（リン酸化ＳＴＡＴ３）は黒色で示し、ＳＴＡＴ３は灰色で示す。        この図は、対照と比べ、抽出物がｐ−ＳＴＡＴ３の形成を阻害することを示している。
【図２】ｐ−ＳＴＡＴ３の列に２５−５０−７５μｇ／ｍｌのシナラ・スコリムス抽出物で処理したＭＳＴＯ２１１Ｈ細胞の細胞溶解産物のウェスタンブロット解析を、下列の対照アクチンとともに示す。この図は、抽出物がＳＴＡＴ３リン酸化を阻害すること、またこの阻害が用量依存性であることを示す。
【図３】様々な用量のシナラ・スコリムス抽出物を用いたヒト悪性胸膜中皮腫細胞系でのクローン原性アッセイ（条件については実験の項目を参照のこと）である。        図３ａは、ヒト中皮腫細胞系ＭＳＴＯ２１１Ｈで実施したアッセイである。        図３ｂは、ヒト中皮腫細胞系ＮＣＩ−Ｈ２８で実施したアッセイである。        図３ｃは、ヒト中皮腫細胞系ＭＰＰ−８９で実施したアッセイである。        図３ｄは、ヒト中皮腫細胞系ＮＣＩ−Ｈ２０５２で実施したアッセイである。
【図４】本発明の抽出物は、３種の異なる炎症腫瘍系（ＨＣＴ１１６、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  Ｅ  ＤＵ１４５）が用量依存的に、それらのアイソタイプとは無関係にコロニーを形成する能力に影響を及ぼす。        図４ａは、結腸腫瘍細胞系ＨＣＴ１１６で実施したアッセイである。        図４ｂは、前立腺腫瘍細胞系ＤＵ１４５で実施したアッセイである。        図４ｃは、乳房腫瘍細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１で実施したアッセイである。
【図５】悪性胸膜中皮腫細胞系（ＭＳＴＯ２１１Ｈ、ＭＰＰ−８９、ＮＣＩ−Ｈ２８）でのＡＴＰｌｉｔｅ試験を使用する細胞生存能力アッセイである（条件については実験の項目を参照のこと）。このアッセイは、細胞生存能力が様々な中皮腫細胞系において用量依存的に本発明のシナラ・スコリムス抽出物によって阻害されることを示す。
【図６】正常中皮腫細胞（ＨＭＣ）をシナラ・スコリムス抽出物で処理して得られた増殖曲線と比較した図５の３種の生存能力曲線の比較（図６ａ：ＭＳＴＯ２１１Ｈ、図６ｂ：ＭＭＰ−８９、図６ｃ：ＮＣＩ−Ｈ２８）である。悪性中皮腫細胞系（ＭＰＭ）は、明らかに、ＨＭＣと比べ、シナラ・スコリムス抽出物の抗増殖作用を示す。
【図７】示した抽出物のシナロピクリンの含量で、様々な処理時間（２４時間及び４８時間）、各種濃度のアーティチョーク抽出物（５０〜６００μｇ／ｍｌ）で処理した、コンフルエントな前立腺腺癌細胞系ＤＵ−１４５における細胞活性のアッセイである。細胞の密集度は、構造的に活性化されたＳＴＡＴ３のレベルを増加させ、細胞自体を死滅耐性にさせる。生存能力は、ＷＳＴ−１アッセイを使用して分析した（ＷＳＴ−１試験、条件については実験の項目を参照のこと）。図は、抽出物が時間依存的及び用量依存性的に生存能力を阻害することを示す。正方形は、０〜６００μｇ／ｍｌの抽出物用量と、μｇ／ｍｌ及びμΜで表される様々な濃度（１００、２００、３００、４００、５００、６００μｇ／ｍｌ）の抽出物のシナロピクリンのそれぞれの含量での２４時間にわたる傾向を示し、円形は４８時間にわたる傾向を示す。        ＳＴＡＴ３の活性化が高レベル細胞：得られた結果は、抽出物が２４時間では細胞生存能力をＥＣ５０＝３８０μｇ／ｍｌで阻害し、４８時間では細胞生存能力をＥＣ５０＝１００μｇ／ｍｌで阻害することを示す。
【図８】各種処理時間（２４時間又は４８時間）、様々な濃度のシナロピクリン（０〜７０μｍ）で処理した、コンフルエントな前立腺腺癌細胞系ＤＵ−１４５における細胞生存能力のアッセイである。密集度は、構造的に活性化されたＳＴＡＴ３のレベルを増加させ、細胞を死滅耐性にする。生存能力は、ＷＳＴ−１アッセイを使用して分析した（ＷＳＴ−１試験、条件については実験の項目を参照のこと）。図は、シナロピクリンが時間依存的及び用量依存性的に細胞生存能力を阻害することを示す。正方形は、異なる濃度：１０、２０、３０、４０、５０、６０μΜのシナロピクリンでの２４時間の傾向を示し、三角形は４８時間の傾向を示す。        示したデータは、シナロピクリンがアーティチョーク抽出物ほど有効ではないことを示す。図からは、シナロピクリンが時間依存的及び用量依存的に細胞生存能力及び増殖を阻害するものの、アーティチョーク抽出物と比べ、その効果ははるかに低いことを示す（比較として図８を参照のこと）。例えば、約９０％に相当する生存能力低下の効果を得るためには、シナロピクリンが凍結乾燥抽出物内に含有されている場合、４８時間では、０．９４〜２．８２μΜに対して５０μΜでの処理が必要である。
【図９】様々な処理時間（２４−４８−７２時間）、様々な濃度のアーティチョーク抽出物で処理した、構造的に活性化されたＳＴＡＴ３のレベルが低い、コンフルエントでない細胞系ＤＵ−１４５における細胞生存能力のアッセイである。生存能力は、ＷＳＴ−１アッセイを使用して分析した（ＷＳＴ−１試験、条件については実験の項目を参照のこと）。円形は、５０μｇ／ｍｌのシナラ・スコリムスによる処理を示し、正方形は１００μｇ／ｍｌでの処理を示し、三角形は２００μｇ／ｍｌでの処理を示す。図は、細胞系ＤＵ１４５の細胞生存能力がシナラ・スコリムス２００μｇ／ｍｌによってどの程度大幅に損なわれるかを示す。得られた結果は、２００μ／ｍｌの抽出物が２４時間で６０％まで細胞生存能力を阻害することを示す。ＳＴＡＴ３の活性化レベルが高い細胞の実験に関する図８と比べた場合、この実験のＥＣ５０は極めて低く（２４時間で約２００対３８０μｇ／ｍｌ）、ＳＴＡＴ３の活性化レベルが低い（コンフルエントでない）細胞における本発明の抽出物の効果はより大きいことが明らかである。したがって、こうした実験から、ＳＴＡＴ３が活性である細胞は悪性度が高いことが確認される。ＳＴＡＴ３のリン酸化の阻害は、細胞生存能力を低減する重要な機序である。
【図１０】中皮腫細胞系ＭＰＭ（図１１ａ  ＭＳＴＯ２１１Ｈ及び図１１ｂ  ＮＣＩ−Ｈ２０５２）と転換中皮腫細胞（図１１ｃ  ＨＭＣ）でのペメトレキセド（ＰＭＴＸ）と併用してアーティチョーク抽出物で処理した後の細胞生存能力アッセイ（ＡＴＰＩｉｔｅアッセイ）。ＰＭＴＸによる処理はＭＰＭ細胞には細胞障害性であり、且つ非腫瘍細胞には毒性が高い。本発明の抽出物＋ＰＭＴＸによる細胞の併用処置は、ＭＰＭ細胞系における細胞生存能力に有意な効果があり、一方、非形質転換細胞（ＨＣＭ）ではペメトレキセドによって誘発される死滅率を低減した。結果として、本発明のアーティチョーク抽出物は、腫瘍細胞のみをペメトレキセド感受性にすることが明らかである。
【図１１】ヒト前立腺腫瘍細胞系ＤＵ１４５での様々な化学療法剤：ドキソルビシン、タキソール、シスプラチンと併用してアーティチョーク抽出物による処置後の細胞生存能力アッセイＷＳＴ−１（条件については実験の項目を参照のこと）。生存能力は、ＷＳＴ−１アッセイを使用して分析した（ＷＳＴ−１試験、条件については実験の項目を参照のこと）。          図１１ａは、２つの異なる用量のアーティチョーク抽出物（１００及び２００μｇｍｌ）を使用し、１０μｇ／ｍｌのシスプラチン単独、並びに１０μｇ／ｍｌのシスプラチンと併用するアーティチョーク抽出物（１００及び２００μｇ／ｍｌ）で２４時間処置した後の細胞生存能力を示す。          図１１ｂは、ヒト癌細胞ＤＵ１４５において、２つの異なる用量のアーティチョーク抽出物（１００及び２００μｇｍｌ）を使用し、１μｇ／ｍｌのドキソルビシン、並びに１μｇ／ｍｌのドキソルビシンと併用するアーティチョーク抽出物（１００及び２００μｇ／ｍｌ）で２４時間処置した後の細胞生存能力を示す。          図１１ｃは、ヒト癌細胞ＤＵ１４５において、２つの異なる用量のアーティチョーク抽出物（１００及び２００μｇ／ｍｌ）を使用し、３００ｎＭのタキソール、並びに３００ｎＭのタキソールと併用するアーティチョーク抽出物（１００及び２００μｇ／ｍｌ）で２４時間処置した後の細胞生存能力を示す。          すべての実験において、本発明の基礎を形成する抽出物は３種の化学療法剤の細胞毒性を増強し、シスプラチンの場合に効果が大きい。
【図１２】ヒト癌細胞ＤＵ１４５におけるアーティチョーク抽出物とシスプラチンとの併用による処置後の細胞生存能力のアッセイ（条件については実験の項目を参照のこと）である。図は、様々な濃度のアーティチョーク抽出物と１５μｇ／ｍｌの一定濃度のシスプラチンでのアーティチョーク抽出物（黒色）、シスプラチン（薄灰色）及びアーティチョーク＋シスプラチン（白色）の間の比較を示す。          シナロピクリンの相対濃度を図に示す。          本発明の基礎を形成する抽出物はシスプラチンの細胞毒性を増強し、２００μｇ／ｍｌの用量で効果の高い。
【図１３】ヒト癌細胞ＤＵ１４５におけるアーティチョーク抽出物とドキソルビシンの併用による処置後の生存能力アッセイである（条件については実験の項目を参照のこと）。図は、様々な濃度のアーティチョーク抽出物と２μｇ／ｍｌの一定濃度のドキソルビシンでのアーティチョーク抽出物（黒色）、ドキソルビシン（薄灰色）及びアーティチョーク＋ドキソルビシン（白色）の間の比較を示す。          シナロピクリンの相対濃度は図１３で報告したのと同様である。          本発明の基礎を形成する抽出物はドキソルビシンの細胞毒性を増強し、２００μｇ／ｍｌの用量で効果が大きい。
【図１４】ヒト癌細胞ＤＵ１４５におけるシナロピクリンとシスプラチンの併用による処置後の生存能力アッセイである（条件については実験の項目を参照のこと）。図は、様々な濃度のシナロピクリンと１５μｇ／ｍｌの一定濃度のシスプラチンでのシナロピクリン（黒色）、シスプラチン（薄灰色）及びシナロピクリン＋シスプラチン（白色）の間の比較を示す。          細胞生存能力を２０％未満に低減する効果を得るためには、アーティチョーク抽出物中に存在する濃度よりも４０倍以上のシナロピクリンモル濃度が必要であると思われる（図１２を参照）。
【図１５】ヒト癌細胞ＤＵ１４５におけるシナロピクリン及びドキソルビシンの併用による処置後の生存能力アッセイである（条件については実験の項目を参照のこと）。図は、様々な濃度のシナロピクリンと２μｇ／ｍｌの一定濃度のドキソルビシンでのシナロピクリン（黒色）、ドキソルビシン（薄灰色）及びシナロピクリン＋ドキソルビシン（白色）の間の比較を示す。          細胞生存能力を２０％未満に低減する効果を得るためには、アーティチョーク抽出物中に存在する濃度よりも２５倍以上のシナロピクリンモル濃度が必要であると思われる（図１３を参照）。
【図１６】ヒト中皮腫細胞系ＭＳＴＯ２２１Ｈにおける創傷治癒アッセイである（条件については実験の項目を参照のこと）。          図１６ａは、濃度６μｇ／ｍｌの担体単独、及び生成物を含む対照プレートにおける３６ｈの創傷治癒を示す。          図１６ｂは、示した時間、本発明の抽出物で、また担体で処置した創傷を閉じる効果に関する棒グラフを示す（細胞数の定量を％で示す）。
【図１７】シナラ・スコリムス抽出物は、ＤＵ１４５細胞のＳＴＡＴ３経路をモジュレートする：特に、図は、抽出物がＤＵ−１４５細胞のＳＴＡＴ３の構造的活性化を阻害し、またＤＮＡへのＳＴＡＴ３の結合を阻害することを示す。          ・１７ａ）ウェスタンブロット：シナラ・スコリムス抽出物（２００μｇ／ｍｌ）は、タンパク質の発現を変化させることなく、処置の２〜４時間後にＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害する。          ・１７ｂ）ＥＭＳＡ、          ＥＭＳＡ：シナラ・スコリムス抽出物（２００μｇ／ｍｌ）は、ＤＵ−１４５細胞系における処置の２〜４時間後にＤＮＡへのＳＴＡＴ３の結合を阻害する（図１７ｂ）。
【図１８】シナラ・スコリムス抽出物は、ＫＡＲＰＡＳ細胞におけるＳＴＡＴ３経路をモジュレートする：特に、図は、抽出物がＫＡＲＰＡＳ細胞のＳＴＡＴ３の構造的活性化を阻害し、またＤＮＡへのＳＴＡＴ３の結合を阻害することを示す。          ・１８ａ）ウェスタンブロット：シナラ・スコリムス抽出物（２００μｇ／ｍｌ）は、ＫＡＲＰＡＳ細胞系におけるタンパク質の発現を変化させることなく、処置の２〜４時間後にＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害する。          ・１８ｂ）ＥＭＳＡ：シナラ・スコリムス抽出物（２００μｇ／ｍｌ）は、ＫＡＲＰＡＳ細胞系における処置の２〜４時間後にＤＮＡへのＳＴＡＴ３の結合を阻害する。          使用したシナラ・スコリムス抽出物は０．１８１％のシナロピクリンを含有し、したがって、２００μｇ／ｍｌの抽出物は１．２μΜのシナロピクリンを含有している。
【図１９】シナロピクリンは、ＤＵ−１４５細胞のＳＴＡＴ３経路をモジュレートする。  シナロピクリンは、ＤＵ−１４５細胞において、ＳＴＡＴ３のリン酸化とＤＮＡに結合するその能力の両方を阻害し、ＥＣ５０＝２５μΜ（２５μΜシナロピクリン＝約０．７４μｇ／ｍｌ）である。          ・ウェスタンブロット：２５μΜのシナロピクリンは、ＤＵ−１４５細胞のＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害する（図１９ａ）。          ・ＥＭＳＡ：２５μＭのシナロピクリンは、ＤＵ−１４５細胞においてＤＮＡへのＳＴＡＴ３の結合を阻害する（図１９ｂ）。
【図２０】シナロピクリンは、ＫＡＲＰＡＳ細胞のＳＴＡＴ３経路をモジュレートする。  シナロピクリンは、ＫＡＲＰＡＳ細胞において、ＳＴＡＴ３のリン酸化とＤＮＡに結合するその能力の両方を阻害し、ＥＣ５０＝２５μΜ（２５μΜシナロピクリン＝約０．７４μｇ／ｍｌ）である。          ・ウェスタンブロット：シナロピクリン（２５μΜ）は、ＤＵ−１４５細胞のＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害する（図１９ａ）。          ・ＥＭＳＡ：シナロピクリン（２５μＭ）は、ＤＵ−１４５細胞においてＤＮＡへのＳＴＡＴ３の結合を阻害する（図１９ｂ）。
【図２１】細胞周期に対するシナラ・スコリムス抽出物の影響の評価（ＦＡＣＳ法）である。抽出物は、４８時間の処置の後（図２１ａ）及び７２時間の処置の後（図２１ｂ）の両方において、サブＧ１期の細胞割合を増加させ、ＭＰＭ細胞（ＭＳＴＯ２１１Ｈ）の死滅を誘導する。
【図２２】アポトーシスの誘導を評価するアッセイ（ウェスタン法）である。本発明の抽出物は、用量１００μｇ／ｍｌで、細胞系ＭＳＴＯ２１１ＨのＰＡＲＰ形態、並びにカスパーゼ３及び７切断形態などのいくつかのアポトーシスマーカーのレベル上昇によって明らかなように、アポトーシスを誘導する。
【図２３】アネキシンＶのレベル測定によるアポトーシス誘導を評価するアッセイである。本発明の抽出物は、時間依存的及び用量依存的に、アネキシンＶの呈色で判定したとおり、細胞系ＭＳＴＯ２１１Ｈにおいてアポトーシスを誘導する。
【図２４】様々な濃度のシナロピクリン：三角形１２．５μΜ、正方形２５μΜ、菱形５０μΜで処置した後のＧＳＨの細胞内濃度の分析である（条件については実験の項目を参照のこと）。          シナロピクリンは、ＧＳＨの細胞内濃度の時間依存的及び用量依存的減少を決定する。
【図２５】ＳＴＡＴ３のグルタチオン化のアッセイである（条件については実験の項目を参照のこと）。シナロピクリンは、ＳＴＡＴ３のグルタチオン化を決定する。レーン１は対照、レーン２はＧＳＨ  １ｍＭ、レーン３はジアミド０．５ｍＭ、レーン４はＧＳＳＧ、レーン５はシナロピクリン１２μＭ、レーン６はシナロピクリン２５μΜである。          この実験で得られたデータは、シナロピクリンがＧＳＨの細胞内濃度を低下させること（図２６）と、酸化還元状態の変化がＳＴＡＴ３のグルタチオン化を誘導し、そのリン酸化を妨げること（図２７）を示す。グルタチオンエチレンエステルを用いる前処置によってＧＳＨの生理学的値が回復すると、シナロピクリンがＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害する能力は反転する。          図２６及び図２７は、６〜７週齢の雌ＣＤ１ヌードマウス（ＭＰＭ腫瘍移植）で実施した、細胞系ＭＳＴＯ２１１Ｈにおけるアーティチョーク抽出物の抗腫瘍活性の評価に関する。
【図２６】ＭＰＭ細胞系移植に対するアーティチョークの効果である。          ＭＳＴＯ２１１Ｈは、２４時間、アーティチョークで前処置を行った。次いで、それらをＣＤ１ヌードマウスに接種した。アーティチョーク抽出物による前処置は腫瘍移植に影響を及ぼし、腫瘍体積の統計的有意差（ｐ＝０．０１）を誘導した。
【図２７】ＭＰＭ細胞移植に対するアーティチョーク抽出物の効果である。ＭＳＴＯの異種移植片を有するＣＤ１マウスを３週間、アーティチョーク抽出物の量を増やしながら処置した。用量依存的治療効果がアーティチョーク抽出物に対して確認された。ペメトレキセド（ＰＭＴＸ）は、既知の治療薬濃度でポジティブ対照として使用した。図は、既知の治療薬濃度のペメトレキセドと比べた本発明の抽出物の効果を示す＊ｐ＜０．０。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
したがって、本出願は、ＳＴＡＴ３因子の構造的活性化又は異常活性化が存在する病状の予防及び／又は処置におけるシナラ属種の抽出物の使用に関する。前述のように、異常活性化又は構造的活性化は、血液中及び組織中の炎症性及び／又は腫瘍原性作用の原因となるこの因子の異常リン酸化又は構造的リン酸化に関わっていると思われる。
【００４３】
以下の記載、特許請求の範囲及び図面において、「ＳＴＡＴ３」という用語は、ＳＴＡＴ３転写のシグナル及び活性化の形質導入因子を意味する（シグナル伝達兼転写活性化因子３）。慣例的には、遺伝子について言及する場合、イタリック体の大文字が使用されるが、タンパク質は非イタリック体の大文字によって表示される。
【００４４】
炎症及び腫瘍は、発癌経路及び環境経路と密接に関連しており、ＳＴＡＴ３因子（シグナル伝達兼転写活性化因子３）のリン酸化は、それらの活性化と核の置換をもたらし、そこでは、それは、多数のサイトカイン、ケモカイン、及び炎症に関連する他の伝達物質の転写の活性化因子として作用し、それにより癌を促進することは、文献において既知である。
【００４５】
したがって、ＳＴＡＴ３の活性化阻害因子は、ＳＴＡＴ３因子の構造的活性化が存在するそれらのすべての病状に対して予防効果及び／又は治療効果を有する因子である。本発明は、初めて、シナラ属種の抽出物のＳＴＡＴ３特異的阻害作用を開示している。
【００４６】
本発明の目的におけるアーティチョーク又はシナラ属種は、シナラ属（シナラ属種）、特にシナラ・カルドンクルス亜種スコリムス（Ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓｃｏｌｙｍｕｓ）に属する植物を意味する。
【００４７】
本発明を実施する目的において、抽出物は、葉及び／若しくは頭状花の抽出物又はその混合物であってもよく、新鮮なものでも乾燥されたものであってもよい。
【００４８】
「頭状花」という用語は、植物によって形成される花の頂部、例えば、アーティチョークそのもの（食品として一般に使用されている部分）を意味する。抽出物は、液体抽出物、又は既知の乾燥技術によって凍結乾燥又は乾燥された抽出物であってよい。抽出物は、以下の溶媒：水、エタノール、メタノール、アセトン又はイソプロパノールによる抽出によって、それぞれの場合、純粋な形態又は相互の混合物で取得することができる。アルコールはメタノール、エタノール、イソプロパノールであってよく、好ましくはエタノールである。エタノールは、純粋な形態で、又は以下のパーセンテージの水との混合物で使用することができる：９６％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％。本発明の限定されない実施形態において、抽出で使用される溶媒は、５０：５０の割合のエチルアルコールと水によって形成される混合物であってもよい。液体抽出物は、１：２〜１：１００の薬剤／溶媒比率で、好ましくは１：１０の比でアーティチョークの葉を浸出／温浸するヒドロアルコール抽出によって調製することができる。抽出時間は当業者によって一般に使用されている時間であり、例えば、最低４時間から約８時間までであってよい。抽出温度は通常コントロールされ、好ましくは、例えば約５０℃の温度であってよい。水性アルコール抽出物からのアルコール蒸発とその後の水性濃縮物の乾燥は、凍結乾燥又は乾燥によって実施し、凍結乾燥抽出物又は乾燥抽出物を得ることができる。
【００４９】
こうした抽出物の調製は、一般に当業者には公知であり、本開示において特に詳細に記述する必要はない。本発明の実施目的において、従来の技術に従って調製される、上記に示したうちのすべての抽出物を使用することができる。
【００５０】
特に、本発明の目的において、抽出物は本明細書に記載の抽出物の画分であってもよい。
【００５１】
この場合、標準方法は、アルコール度５０のアルコール抽出物中に存在するアルコールの蒸発、４０００ｒｐｍで１〜５分間の遠心分離によるアルコール中の不溶性物質の除去、吸着樹脂含有クロマトカラムで行う水溶液（水性濃縮物）の導入を含む。
【００５２】
前述の水性濃縮物は、同様に、乾燥又は凍結乾燥したアーティチョーク抽出物を１：１０ｐ／ｐの比で水に懸濁させることによって得ることができる。
【００５３】
樹脂の供給流体はＢｉｘ０．２から１°の間に直接的に含まれる懸濁固体を含んでいなければならず、供給速度は１〜４ＢＶ／時間であり、好ましくは２ＢＶ／時間である。対応する水性溶出液を回収し、凍結乾燥又は乾燥による脱水に供し、樹脂に吸着されている物質は９６％エチルアルコール又はメタノール又はアセトン、好ましくは９６％エチルアルコールを使用して溶出する。この最後の事例において、アルコール溶出液は、アルコール溶出液と１：１ｖ／ｖの比で水をこの最後の事例で加えた後に乾燥又は凍結乾燥に供し、エチルアルコールを蒸発させる。
【００５４】
本発明によれば、上記で定義したシナラ属種の抽出物は、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする病状の予防及び／又は処置で使用することができる。
【００５５】
こうした疾患は、例えば、また文献に記載されているように、炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍のタイプの疾患であり得る。
【００５６】
本発明の目的において、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする病理学的状態は、（文献に記載されているように）ウイルス感染、例えば、（Ｙｕら、２００９において報告されている）ヘリコバクター・ピロリによる感染、Ｂ型肝炎ウイルスによる感染、ＨＰＶ（ヒト乳頭腫ウイルス）による感染、エプスタイン−バールウイルスによる感染などによって引き起こされ得る。
【００５７】
既に記載のように、「ＳＴＡＴ３」という用語はこのように、ヒトにおいてＳＴＡＴ３遺伝子によってコードされている、ヒト転写因子「シグナル伝達兼転写活性化因子３」を示す。
【００５８】
本発明は、この遺伝子があらゆる場合において構造的又は異常的に活性化される、（例えば下記の）本明細書に詳細に定義されているヒトにおける病理学的状態に関する。
【００５９】
ＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化が存在する前腫瘍病理学的状態は、文献で報告されているように、腫瘍切除後の病理学的状態、したがって腫瘍が改善され得るという意味での前腫瘍であるか、又は細胞の一部に炎症から悪性の特性の発症までの変化がある病理学的状態であり得る。
【００６０】
本発明によれば、腫瘍病理学的状態は、従来技術において報告されているＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化を特徴とするすべての腫瘍、例えば、前立腺癌、多発性骨髄腫、リンパ腫、メラノーマ、卵巣癌、腎細胞癌、膵臓腺癌、肺癌、脳腫瘍、赤白血病、頭頚部扁平上皮癌、結腸癌、中皮腫（これは悪性胸膜中皮腫又はＭＰＭを意味するものとする）であり得る。
【００６１】
特に、本発明は、アスベストに暴露され、したがって悪性胸膜中皮腫のリスクのある個体群の処置、及びこうした患者の個体群の中皮腫の発生の低減に適し得る。
【００６２】
より詳しくは、前記脳腫瘍は、例えば、神経膠腫、脳髄膜腫、髄芽細胞腫であってよく、前記リンパ腫は、セザリー症候群、ＥＢＶ関連バーキットリンパ腫、Ｓａｍｉｒｉ  ＨＳＶ依存性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞関連リンパ腫であってもよい；前記白血病は、ＨＴＬＶ−１−依存性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、巨核球性白血病、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）であってもよい。
【００６３】
本発明の限定されない例によれば、上記で定義したシナラ属種の抽出物は、上記表１に挙げたＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化を特徴とするいずれか１つの病理学的状態の予防及び／又は処置で使用することができる。
【００６４】
本発明に記載の「構造的活性化」又は「異常活性化」という用語は、通常、正常細胞においては存在していない、（例えば、参考文献に記載されているような）ＳＴＡＴ３に関する文献内のこうした用語に起因する意味、又は、この因子の持続的な活性化の認識内で理解されたい。
【００６５】
本発明の抽出物によって示されるＳＴＡＴ３に活性化及び活性の阻害における特異性を考慮すると、本発明の抽出物は、ＳＴＡＴ３を阻害しない化学療法剤による処置に対して耐性のある腫瘍病変の処置において使用することができる。ＳＴＡＴ３を阻害しない化学療法剤の限定されない例は、構造的に活性化されたｐＳＴＡＴ３と化学療法に対し高耐性を有する腫瘍である中皮腫で使用される化学療法薬が挙げられる。一般に使用される薬剤の例としては、チミジル酸シンターゼの阻害剤であるペメトレキセド；ジヒドロ葉酸還元酵素の競合的及び可逆的阻害剤であるメトトレキサート；ピリミジンヌクレオチドの生合成経路における偽基質としてＤＮＡの合成を阻害するゲムシタビン；微小管の形成を阻害する、チューブリンのモノマーに結合する抗有糸分裂薬であるビノレルビン；ＤＮＡにおけるインターフィラメントとイントラフィラメントの架橋形成によってＤＮＡへの細胞周期結合のすべての段階に干渉することができる薬剤であるシスプラチンが挙げられる。
【００６６】
また、ＳＴＡＴ３の構造的活性化が知られている腫瘍細胞系で得られた下記及び図面で示した実験データは、本発明に記載のシナラ属種の抽出物を１種以上の抗腫瘍薬と有利に関連付けることができ、それによって、薬剤自体の抗腫瘍効果も相乗的に増加させることができることを示す。
【００６７】
したがって、本発明の実施形態に従い、本明細書に記載したシナラ属種の抽出物は、抗腫瘍活性を有する１種以上の化合物及び／又は抗炎症作用を有する１種以上の化合物と併用して、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性、前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置で使用することができる。
【００６８】
実施形態に従い、抗腫瘍活性を有する化合物は化学療法剤であってもよく、シスプラチン、ドキソルビシン、ペメトレキセド、メトトレキサート、ビノレルビン、ゲムシタビン及びタキソールを含む群から選択することができる。
【００６９】
したがって、本発明は、ＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする腫瘍又は前腫瘍病理学的状態を予防及び／又は処置するための１種以上の化学療法剤と併用する本明細書で定義したシナラ属種の抽出物の使用を含む。
【００７０】
１種以上の化学療法剤との併用は同時併用若しくは連続併用であってよく、又は、抽出物と化学療法剤は、（単回投与若しくは個別投与において）同時に、又は数分の一定時間にわたって投与することができるか、或いは、治療的処置の日又は期間にわたって、連続して、又はそれぞれを数分以上離して異なる時間に投与することができる。
【００７１】
投与計画は、患者の性別、年齢、疾患の状態、体重及び病歴に基づき、処置を行う医師によって決定される。
【００７２】
上述のような単独及び併用の両方において、処置は、例えば、上記に示した腫瘍原性作用を有し得るような既知の感染症の場合、又は前記腫瘍が変性するのを予防するような腫瘍の切除の場合に予防することができる。
【００７３】
本発明に記載の抽出物は、上記のような同一目的に使用することができる組成物で製剤化することができる。
【００７４】
したがって、本発明は、さらに、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための、活性成分としてシナラ属種の抽出物と担体及び／又は希釈剤及び／又は添加剤を含む組成物に関する。
【００７５】
上述のように、本発明の目的におけるアーティチョーク又はシナラ属種の抽出物は、上述の事例及び定義に従って、Ｃｙｎａｒａ属（シナラ属種）に属する植物抽出物であり得る。
【００７６】
本組成物は、活性成分として、凍結乾燥抽出物、乾燥抽出物又は液体抽出物の形態の上記で定義した抽出物を含むことができる。既に記載のように、抽出物は、新鮮な、又は乾燥させた、アーティチョークの葉、又はアーティチョークの頭状花、又は前述の部分の混合物の抽出によって得ることができる。抽出は、温度を５０℃にコントロールしながら浸出−温浸によって実施することができ、抽出の溶媒としては、例えば、水、９６％エタノール、メタノール、アセトン、イソプロパノールのそのもの又は混合物が挙げられる。次いで、得られた液体抽出物に対し蒸発を行うことができ、その後、凍結乾燥又は乾燥を行うことにより凍結乾燥抽出物又は乾燥抽出物を得ることができる。本発明によれば、上記で定義した組成物は、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする病状の予防及び／又は処置で使用することができる。
【００７７】
このような疾患は、例えば、また文献に記載されているように、炎症性疾患及び／又は前腫瘍疾患及び／又は腫瘍疾患であり得る。本発明の組成物で使用することができる様々な病理学的状態の定義は、本発明の抽出物の治療的使用に関して上記で規定したものと同じである。
【００７８】
本発明の目的において、本組成物は、既に上記で定義したＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする病理学的状態、ＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする、既に上記で定義した腫瘍病理学的状態、及び本明細書の範囲内において既に前述で説明したようなＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化が存在する前腫瘍病理学的状態を処置することができる。
【００７９】
本発明の限定されない例によれば、本明細書で定義した組成物は、上記表１に挙げたＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化を特徴とするいずれか１つの病理学的状態の予防及び／又は処置に使用することができる。
【００８０】
さらに、さらなる実施形態によれば、本明細書に記載した本発明の組成物は、活性成分として、１種以上の抗腫瘍薬剤及び／又は１種以上の抗炎症薬をさらに含んでいてもよい。
【００８１】
したがって、本発明はさらに、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための、活性成分として、シナラ属種の抽出物と、抗腫瘍活性及び／又は抗炎症活性を有する１種以上の化合物とを含む組成物に関する。
【００８２】
実施形態によれば、抗腫瘍活性を有するこうした化合物は、例えば、シスプラチン、ドキソルビシン、ペメトレキセド、メトトレキサート、ビノレルビン、ゲムシタビン及びタキソールを含む群から選択される化学療法剤であってよい。
【００８３】
本発明の組成物は、単位投与用量で、又は各患者のそれぞれのニーズに適合した治療法をさらに可能にする目的で処置を行う医師によって投薬可能な方法で製剤化することができる。
【００８４】
したがって、本発明は、ＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置における、任意選択で、抗腫瘍活性を有する１種以上のさらなる活性成分及び／又は抗炎症作用を有する１種以上のさらなる活性成分と併用する、本明細書で定義したシナラ属種の抽出物を含む組成物の使用を包含する。
【００８５】
こうしたさらなる活性成分は、例えば、化学療法化合物であってもよく、また、病理学的状態は、前腫瘍又は腫瘍の病理学的状態であってもよい。
【００８６】
１種以上の化学療法剤との併用は同時併用若しくは連続併用であってよく、又は、抽出物と化学療法剤は、（単回投与若しくは個別投与において）同時に、又は数分の一定時間にわたって投与することができるか、或いは、治療的処置の日又は期間にわたって、連続して、又はそれぞれを数分以上離して異なる時間に投与することができる。 
【００８７】
投与計画は、患者の性別、年齢、疾患の状態、体重及び病歴に基づき、処置を行う医師によって決定される。
【００８８】
上述のような単独及び併用の両方において、処置は、例えば、上記に示した腫瘍原性作用を有し得るような既知の感染症の場合、又は前記腫瘍が変性するのを予防するような腫瘍の切除の場合に予防することができる。
【００８９】
上述の１種以上の活性成分を含む組成物（任意選択で１種以上の抗腫瘍薬及び／又は１種以上の抗炎症薬と併用するシナラ属種の抽出物）は、通常の製薬業若しくは化粧品業で、又は食品産業で技術的に使用されている１種以上の添加剤又はアジュバントをもちろん含んでいてもよい。使用される添加剤は、希釈剤、可溶化剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、スリップ剤及び抗接着剤のカテゴリーに属するものであってよい。
【００９０】
必要に応じて、本組成物は、製薬、化粧品及び食品産業において一般に使用されている着香料、着色剤及び保存剤を含有していてもよい。
【００９１】
本発明に記載の組成物は、当業者に公知の技術に従い、上記で定義したシナラ属種の抽出物と、任意選択で１種以上の抗腫瘍薬剤、及び前述のカテゴリーに属する１種以上の添加剤とを使用して製造することができる。
【００９２】
本組成物は、経口投与（例えば、粉末、顆粒、カプセル剤、ハード又はソフトゼラチンのカプセル、錠剤、シロップ剤、ドロップ、溶液及び経口エマルジョン）、吸入（例えば、エアロゾル、液体及び粉末噴霧剤）、局所投与（ゲル剤、軟膏剤、エマルジョン、泥膏、フォーム剤、局所使用の無水固形剤型、及び貼付剤）、並びに当業者によって現在使用され既知である技術による非経口投与（例えば、皮下使用、筋肉内使用、静注使用又は皮内使用）向けの製剤を調製する当業者によって適切であると考えられるすべての製剤であってよい。すべての製剤において、技術上の添加剤又はアジュバントの使用は、製薬実務において一般に使用されているものに基づいて使用する物質を選択することにより決定される。
【００９３】
抗腫瘍活性を有する薬剤を併用する、又は併用しないシナラ属種の抽出物をベースとした製剤の調製において、当業者は、治療法での使用に適し得る安定製剤を得るために、従来技術により有用であると考えられるいずれかの添加剤を使用することができる。例えば、希釈剤のカテゴリーにおいて、固形剤において希釈剤を使用することが可能であり、例えば、糖、多価アルコール（例えばラクトース、マニトール、ソルビトール）、セルロース、無機酸の塩類（例えば第二リン酸カルシウム）、ナトリウム、カリウム及びカルシウムの塩類の形態のクエン酸塩、炭酸塩及び重炭酸塩をはじめとする有機酸の塩類、或いは液体の形態の希釈剤、例えば水、経口用途の食用油（ヒマワリ油、オリーブ油、トウモロコシ油、スイートアーモンド油、落花生油）又は局所製剤で使用される油（ホホバ油、短鎖、中鎖又は長鎖トリグリセリド）、多価アルコール（グリセリン、プロピレングリコール、ヘキシレングリコール）がある。
【００９４】
崩壊剤のカテゴリーにおいて、例えば、天然又は加工デンプン（トウモロコシデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン）、クロスカルメロースナトリウム、グリコール酸ナトリウムデンプン、クロスポビドン；ゴム系の天然産物を含む使用可能な結合剤（グアーガム、キサンタンガム、アラビアゴム）、スクロース及び合成品、例えば、ポリビニルピロリドン及びセルロースの半合成誘導体を使用することができる。
【００９５】
ステアリン酸及びそれらの塩、例えばマグネシウムの塩、エチレングリコールのポリマー、トリグリセリド及び滑沢剤としての天然又は合成ワックスが有効であることが判明している。
【００９６】
界面活性剤は、水でより溶解し得るか、洗浄可能である本発明の基剤を形成する製剤に含まれる１種以上の活性成分を調製するために使用され、これらの活性成分は、単独で作用するか、１種以上の希釈剤によって担持される。例えば、ソルビタンエステル、ソルビタンポリオキシエチレンエステル、スクロースエステル及びラウリル硫酸ナトリウムを挙げることができる。
【００９７】
スリップ剤は、例えば、コロイダルシリカ、沈降性シリカから選択することができ、一方、使用可能な付着防止剤としては、例えば、タルク又はデンプンが挙げられる。
【００９８】
注射用製剤の調製において、活性物質（単数又は複数）を有効に可溶化又は分散させることができる添加剤を選択することができる。例えば、注射よる投与に適したｐＨ及び浸透圧を得るために、水とともに、他の水溶性担体、例えば、多価アルコール及び有機酸又は無機酸の塩を使用することができる。
【００９９】
特定の事例において、非水溶性担体、例えば油、又は注射での使用について承認されている合成物質を使用することができる。
【０１００】
当業者は、公知の通常の調製スキーマを使用して、すべての製剤を調製することができる。
【０１０１】
単なる例ではあるが、カプセル剤の製剤は、シナラ属種の抽出物を事前に粉砕し、通常のミキサーで得られた粉末と、１種以上の抗腫瘍薬及び製剤の調製に選択した添加剤、例えば、上述のもの又は市販の経口使用が承認されているものから選択される希釈剤、崩壊剤、滑沢剤及びスリップ剤とを一緒に混合することによって簡易に製造することができる。
【０１０２】
錠剤の場合には、従来技術による造粒方法のアジュバントとして水を使用し、混合物の一部又は全部を、事前に水に溶解させておいた結合剤、又は混合物に入れておいた結合剤とともに造粒することが必要である。
【０１０３】
顆粒剤は、乾燥させ、篩にかけ、さらに、当業者に公知のものに従い、錠剤を得るのに好適な混合物を得るための他の粉末と混合することができる。
【０１０４】
非経口使用の場合には、組成物はまた、特定の操作要件に従って簡単に混和できる個別の容器中の活性成分とともに提供することができる。
【０１０５】
本明細書に記載の組成物の使用を容易にするために、これらは、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする特定の病理学的状態の予防的及び／又は治療的使用に有効な本明細書に記載の活性成分（シナラ属種の抽出物と任意選択で１種以上の抗腫瘍薬及び／又は１種以上の抗炎症薬）の１つを含有する単位投与用量の形態で提供することができる。
【０１０６】
本発明はさらに、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための、シナラ属種の抽出物と抗腫瘍活性を有する１種以上の化合物及び／又は抗炎症作用を有する１種以上の化合物の同時投与又は連続投与用のキットであって、前記キットが本明細書に定義したシナラ属種の抽出物の１つ以上のアリコートと、抗腫瘍活性を有する１種以上の化合物の１つ以上のアリコート及び／又は抗炎症作用を有する１種以上の化合物の１つ以上のアリコートを含む、キットに関する。
【０１０７】
或いは、本キットは、活性成分として、本明細書で定義したシナラ属種の抽出物と、腫瘍活性を有する１種以上の化合物の１つ以上のアリコート及び／又は抗炎症性活性を有する１種以上の化合物の１つ以上のアリコートを含有する組成物の１つ以上のアリコートを含んでいてもよい。
【０１０８】
上述のように、こうした化合物は、例えば、シスプラチン、ドキソルビシン、ペメトレキセド、メトトレキサート、ビノレルビン、ゲムシタビン及びタキソールを含む群から選択される化学療法剤であってよい。
【０１０９】
キットを使用し、本発明の組成物を使用して処置又は予防することができる病状は、上記で既に示したものであり、例えば、（文献に記載されているような）ウイルス感染、例えば、ヘリコバクター・ピロリによる感染、Ｂ型肝炎ウイルスによる感染、ＨＰＶ（ヒト乳頭腫ウイルス）による感染、（Ｙｕら、２００９に報告されているような）エプスタイン−バールウイルスによる感染によって引き起こされ得る、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする病理学的状態、或いは従来技術において報告されているＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化を特徴とするすべての腫瘍によって示され得る腫瘍病理学的状態である。
【０１１０】
こうした腫瘍の限定されない例は、前立腺癌、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、メラノーマ、卵巣癌、腎細胞癌、膵臓腺癌、肺癌、脳腫瘍、赤白血病、頭頚部扁平上皮癌、結腸癌、中皮腫を含む。
【０１１１】
より詳しくは、前記脳腫瘍は、例えば、神経膠腫、脳髄膜腫、髄芽細胞腫であってよく、前記リンパ腫は、セザリー症候群、ＥＢＶ関連バーキットリンパ腫、Ｓａｍｉｒｉ  ＨＳＶ依存性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞関連リンパ腫であってよい；前記白血病は、ＨＴＬＶ−１−依存性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、巨核球性白血病、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）であってもよい。
【０１１２】
ＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化が存在する前腫瘍病理学的状態は、文献において報告されているような、腫瘍の切除後の病理学的状態、したがって、腫瘍が変性し得るという意味での前腫瘍であり得るか、又は細胞の一部に炎症から悪性の特性の発症までの変化がある病理学的状態であり得る。
【０１１３】
最後に、本明細書はまた、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態を予防及び／又は処置する治療方法であって、それを必要とする個体にシナラ属種の治療上有効な量の抽出物を、任意選択で、１種以上の抗腫瘍及び／又は抗炎症化合物と併用して、投与するステップを含む、前記治療方法に関する。
【０１１４】
本発明の基礎を形成する方法は、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態を示す対象に、本明細書で定義した抽出物の治療有効量を、任意選択で、１種以上の抗腫瘍薬又は抗炎症薬と併用して投与することにより；或いは、任意選択で、１種以上の抗腫瘍薬及び／又は抗炎症薬をさらに含む、本明細書で定義した組成物の治療有効量を投与することにより、或いは、本明細書で定義したキットを使用して、本抽出物と１種以上の抗腫瘍及び／又は抗炎症薬を投与することにより実施することができる。
【０１１５】
上述の投与は、医師によって選択される投与計画に従って、同時に又は連続して実施することができる。
【０１１６】
本発明に記載の抽出物の効果を証明する多くの実験データを報告した。
【０１１７】
使用した細胞系
−  Ｌ４２８ヒトリンパ腫細胞系。ＤＳＭＺ  ＡＣＣ１９７から入手可能。
−  構造的に活性化されたＳＴＡＴ３を有するＫＡＲＰＡＳヒトリンパ腫細胞系。Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ  ＃６０７２６０４から入手可能。
１９８６年に非ホジキンＴ細胞リンパ腫細胞を用いて２５歳のヒト末梢血から樹立され、現在、リンパ芽球性リンパ腫細胞系として分類されている、ヒトＴ細胞性リンパ腫細胞系。Ｋａｒｐａｓ２９９は、チロシン７０５及びセリン７２７でリン酸化されたＳｔａｔ３を発現する。
−  構造的に活性化されたＳＴＡＴ３を有するＭＳＴＯ２１１Ｈヒト肺二相性中皮腫細胞系。ＡＴＣＣ  ＃ＣＬＲ−２０８１から入手可能。
過去にいかなる治療も受けていなかった中皮腫（二相性悪性腫瘍）のある６２歳のヒト胸膜流出から樹立された、ヒト中皮腫細胞系。細胞系ＭＳＴＯ２１１Ｈは高レベルのｐＳｔａｔ３を発現する（Ｔｓａｏら、悪性胸膜中皮腫組織におけるｃ−Ｓｒｃ発現及び活性化の阻害は、アポトーシス、細胞周期停止、遊走及び浸潤の低下を導く（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃ−Ｓｒｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｌｅｕｒａｌ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ，ａｎｄ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ．）、ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ  ２００７；６：１９６２〜１９７２）。
−  ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−８１から入手可能なＤＵ−１４５ヒト癌細胞系。
細胞系ＤＵ１４５は、転移性の可能性の高いＰＣ３細胞と比べ、転移性の可能性が中程度のヒト前立腺癌細胞系である。ＤＵ１４５細胞は、ホルモン非感受性で、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）を発現しない。細胞系ＤＵ１４５は、構成的にｐＳｔａｔ３を発現する。
−  ＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞系。ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２４７から入手可能。
−  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳房腺癌細胞系。ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−２６から入手可能。
−  ＮＣＩ−ｈ２８ヒトステージ−４中皮腫細胞系。ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−５８２０から入手可能。
−  ＭＰＰ−８９ヒト中皮腫細胞系。ＣＡＢＲＩから入手可能、アクセス番号ＩＣＬＣ  ＨＴＬ０００１２。
【０１１８】
以下の実施例は、本発明のシナラ・スコリムス抽出物によって次に記載のことがどの程度可能であるかを示す：
非形質転換中皮細胞（ＨＭＣ）にはそれほど強く作用することなく、中皮腫細胞（ＭＳＴＯ２１１Ｈ、ＭＰＰ−８９、ＮＣＩ−Ｈ２０５２、ＮＣＩ−Ｈ２８）の生存能力を用量依存的に低減する；
同一細胞系に対するクローン原性生存アッセイにおいてコロニーの形成能力を低下させ、アポトーシスアッセイにおいて悪性中皮腫細胞ＭＭの細胞死を誘導する；
創傷治癒アッセイにおいてＭＭ細胞の遊走及び増殖を阻害する；
ペメトレキセドなどの化学療法剤による連続処置でＭＭ細胞を感受性にする；
ＭＭ細胞のＤＮＡの損傷は誘導するが、ＨＭＣ細胞のＤＮＡの損傷は誘導しない；
抽出物で前処置した細胞においてＭＳＴＯ細胞による腫瘍移植の可能性を低減する；
ＭＳＴＯの異種間臓器移植の処置において用量依存的な効果を有する。
【実施例】
【０１１９】
１．  ウェスタンブロットによるＳＴＡＴ３のリン酸化の分析。結果は図１〜図３に報告した。
１．１．  細胞溶融及びウェスタンブロッティング。
細胞を氷中で３０分間、プロテアーゼ及びホスファターゼの阻害剤（５ｍＭ  ＰＭＳＦ、３ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＮａＶＯ４）を補充した溶融バッファーＮＰ４０（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶融させた。タンパク質の全抽出物の等量（３０μｇ）を８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で変性させることによって分解させ、２時間ニトロセルロース膜に移した。１時間、０．０５％のＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０に溶解させた５％のミルク溶液で膜をブロックし、特異的一次抗体とインキュベートした。一次抗体は以下のものを使用した：抗ベータアクチン（Ａ−２２２８、ＳＩＧＭＡ）、抗ｐＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ−７０５）（ｓｃ８０５９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）及び抗ＳＴＡＴ３（ｓｃ７１７９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）。二次抗体をペルオキシダーゼ結合されており（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、化学発光にはＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）を使用した。
【０１２０】
１．２．  ＭＰＭの細胞系、及び一般的に市販されている中皮細胞（ＨＭＣ）のシナラ・スコリムス抽出物による処置
ＭＰＭの細胞系（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ、ＮＣＩ−Ｈ２８、ＮＣＩ−Ｈ２０５２、ＭＰＰ８９）はＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から取得し、一方、ＨＭＣ（ヒト中皮細胞）はＴｅｂｕ−Ｂｉｏ（Ｆｒａｎｃｅ）から取得した。すべての細胞系は、特定の培地中、３７℃及び５％ＣＯ２で単層において増殖させた。アーティチョーク抽出物は、３０ｍｇ／ｍｌの初期濃度で、比率１：１の注射用溶液用の水及びエタノールの溶液中に都合よく溶解させた。次いで、抗腫瘍特性を試験するため、図面に示したように、生成物を様々な細胞系の培地に、様々な濃度及び様々な回数で直接添加した。
【０１２１】
１．３．  結果
図１〜３に示した結果は、抽出物で処置されていない対照と比べた場合に、アッセイした抽出物がどのようにＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害するかを示している。
【０１２２】
図１及び図２は、本明細書によるシナラ属種の抽出物で処置したＭＳＴＯ２１１Ｈの細胞に対して得られたデータを示す。
【０１２３】
図１は、担体単独で処置した対照と、シナラ属種の抽出物（２４時間培養した培地１００μｇ／ｍｌ）で処置した対照（対照アクチン）のデータを示し、図２は、様々な濃度のシナラ属種の抽出物：２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、７５μｇ／ｍｌで２４時間処置した細胞を含むデータを示す。
【０１２４】
図１に関し、担体単独で処置した対照とシナラ属種の抽出物（２４時間培養した培地１００μｇ／ｍｌ）で処置した対照（対照アクチン）のデータを示す。
【０１２５】
２．  シナラ・スコリムス抽出物及びシナロピクリンは、ＤＵ−１４５細胞及びＫＡＲＰＡＳ細胞でのＳＴＡＴ３の活性化を阻害する：
図１７〜図２０から明らかなように、シナラ・スコリムス抽出物及びシナロピクリンはともにＳＴＡＴ３に作用する。０．１８１％のシナロピクリンを含有する抽出物２００μｇ／ｍｌは、１．２μΜのシナロピクリンを含有する。図は、２５μΜのシナロピクリンで確認された効果は、２００μｇ／ｍｌの抽出物（シナロピクリンの力価は０．１８１％と等しく、言い換えると、１．２μΜのシナロピクリンを含んでいる）で確認された効果と同じであることを示す。使用した抽出物の用量は１．２ｍＭのシナロピクリンを含有しているので、得られたデータは、抽出物がシナロピクリンよりも有効であることを示している。
【０１２６】
３．  悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）の細胞に対するクローン原性アッセイ
ＭＰＭ細胞（ＭＳＴＯ２１１Ｈ、ＮＣＩ−Ｈ２８；ＭＰＰ−８９；ＮＣＩ−Ｈ２０５２）を１ウェル当たり２００個の細胞で接種し、本明細書による様々な増殖濃度のシナラ・スコリムス抽出物（対照担体単独；１２．５μｇ／ｍｌ；２５μｇ／ｍｌ；５０μｇ／ｍｌ；１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ）で処置した。各ポイントは、６ウェルのマルチウォールに二連でプレーティングした。形成されたコロニーは、１５〜２１日後にクリスタルバイオレットを用いて染色した。クローン原性アッセイとして知られているコロニー形成アッセイは、腫瘍細胞が単一細胞からコロニーを形成する能力の観点から抗腫瘍化合物の効果を評価する際に使用されている技術である。コロニーは、単一細胞に由来する５０個以上の細胞（クローン）の群であると考えられる。
【０１２７】
図３ａ〜図３ｄに示した実験結果は、本発明の抽出物が試験したすべてのＭＰＭ細胞系におけるコロニー形成を用量依存的に阻害する、用量依存的能力を示す。
【０１２８】
さらに、同様のアッセイをＨＣＴ１１６結腸癌細胞、ＤＵ１４５前立腺癌細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞に対して実施した。この場合もまた、図４ａ、ｂ、ｅ及びｃで示したデータからは、本発明の抽出物がコロニー形成を用量依存的に阻害する効果を有することが明らかである。
【０１２９】
４．  ＡＴＰｌｉｔｅ（商標）細胞活性アッセイ
様々な濃度の本発明の抽出物に暴露した後の各種細胞系の活性を、ＡＴＰｌｉｔｅ（商標）アッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を製造者の説明書に従って使用し、評価した。表示されている場合、「担体」という用語は、処置で用いる同一容量で使用される濃度１：１の注射溶液用の水とエタノールの溶液を意味する。
【０１３０】
ＡＴＰＬｉｔｅ（商標）は、ホタル（フォチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ））ルシフェラーゼの活性に基づいたアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のレベルをモニタリングする系である。この発光アッセイは、培地中に含まれている可能性物質で処置した培養哺乳動物細胞の増殖を定量的に評価するための比色定量試験、蛍光定量試験及び放射性同位体試験に代わるものである。ＡＴＰのモニタリングは、実際、広範囲の薬剤、生物学的応答調節物質及び生物学的化合物の細胞増殖抑制効果及び抗増殖効果を評価するために使用されている。ＡＴＰＬｉｔｅ（商標）試験の系は、ＡＴＰルシフェラーゼ及びＤ−ルシフェリンを添加する反応によって生じる光の生成に基づいている。放出された光は、ある一定範囲内でＡＴＰ濃度に比例する。細胞内のＡＴＰ量は、細胞の生存能力と相関する。
【０１３１】
ＭＰＭ細胞系（ＭＳＴＯ２１１Ｈ、ＭＰＰ８９、ＮＣＩ−Ｈ２８、ＮＣＩ−Ｈ２０５２）及びＨＭＣ細胞（ドナーの好意によって提供された非形質転換中皮細胞）の様々なタイプの細胞生存能力は、様々な濃度の本発明に記載の抽出物（対照担体単独；１２．５μｇ／ｍｌ；２５μｇ／ｍｌ；５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ）を使用した処置後にアッセイした。
【０１３２】
アッセイの結果を示す図５のグラフは、本抽出物が細胞生存能力を用量依存的に有意に低下させることができることを示す。
【０１３３】
これに対し、細胞生存能力に対する効果を非形質転換中皮細胞（ＨＭＣ）においても試験したところ、本発明の基礎を形成する抽出物は、腫瘍細胞系と比べた場合（図６Ａ〜図６Ｃ）、細胞毒性が低いことが示された（図６Ａ〜図６Ｃ）。
【０１３４】
５．  細胞生存能力及び増殖のＷＳＴアッセイ、本発明の抽出物とシナロピクリンの間の細胞障害効果の比較。
細胞毒性はＷＳＴアッセイ（ＷＳＴ＝水溶性テトラゾリウム塩）を使用してアッセイし、ミトコンドリアデヒドロゲナーゼが黄色に着色されたＷＳＴ分子（テトラゾリウム塩）からテトラゾール環を分離させ、オレンジ色のホルマザン塩を生じさせる能力を利用する。試験物質を用いて細胞を処置した後に生成されるホルマザンの量は分光光度計を使用して測定するが、これは生細胞数に比例する。ＷＳＴ−１及び特にＷＳＴ−８（２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムは、ＭＴＴにおいて都合がよい。その理由は、電子伝達物質としてのＰＭＳと結合し、細胞外で還元し、水溶性ホルマザンを生成するからである。最後に、ＷＳＴアッセイは、（１）（可溶化段階を必要とするＭＴＴとは異なり）直接測定することができる、（２）ＭＴＴよりも有効なシグナルを提供する、（３）（細胞内に蓄積する不溶性ホルマザンを生成する、ＭＴＴとは異なり）細胞に対する毒性を低減する。
【０１３５】
以下のＷＳＴアッセイを実施した：
６．１  ２４−４８−７２時間でのシナラ・スコリムス抽出物５０、１００及び２００μｇ／ｍｌを使用した細胞系ＤＵ１４５におけるＷＳＴ−１アッセイを図９に示した。
【０１３６】
６．２  ２４及び４８時間でのシナラ・スコリムス抽出物（シナロピクリン＝１．３６１％）０−１００−２００−３００−４００−５００−６００μｇ／ｍｌを使用した細胞系ＤＵ１４５におけるＷＳＴ−１アッセイ。これは、時間依存的及び用量依存的に、ＤＵ−１４５細胞の活性を阻害する。このアッセイを示す図７は、濃度１００μｇ／ｍｌ；２００μｇ／ｍｌ；３００μｇ／ｍｌ；４００μｇ／ｍｌ；５００μｇ／ｍｌ；６００μｇ／ｍｌ（それぞれ、０．４７μΜ、０．９４μΜ；１．４１μΜ；１．８８μΜ；２．３５μΜ及び２．８２μΜのシナロピクリンを含む）のアッセイ抽出物の、μｇ／ｍｌ及びμΜの両方で表したシナロピクリン含量も示す。
【０１３７】
６．３  シナロピクリン０−１０−２０−３０−４０−５０−６０μΜが細胞系ＤＵ１４５において用量依存的及び時間依存的にＤＵ−１４５細胞の活性を阻害する、２４及び４８時間でのＷＳＴ−１アッセイ。結果は図８に示す。
【０１３８】
図７及び図８の比較により、アッセイした抽出物はシナロピクリンよりも４０倍以上有効であることが明らかである。
【０１３９】
７．  化学療法剤との同時処置における細胞生存能力アッセイ
細胞系ＭＳＴＯ２１１Ｈ及びＮＣＩ−Ｈ２０５２を使用し、シナラ・スコリムス抽出物＋抗腫瘍薬の併用効果を評価した。
【０１４０】
図１０に示したアッセイは、製造者の説明書に従ってＡＴＰＩｉｔｅ（商標）アッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用し実施した。
【０１４１】
濃度１：１の注射溶液用の水とエタノールの溶液は、処置で使用した同一容量で用いた。
【０１４２】
試薬：
ペメトレキセド（Ａｌｉｍｔａ、Ｌｉｌｌｙ）は、製造者の説明書に従い希釈した。
【０１４３】
７．１  シナラ属種の抽出物とペメトレキセドの併用に関するＡＴＰＩｉｔｅ（商標）アッセイ
図１０は、ペメトレキセド、及びシナラ属種の抽出物を併用したペメトレキセドで処置した７２時間後のＭＳＴＯ２１１Ｈに関する生存能力曲線を示す。図Ａは、ＭＳＴＯ２１１Ｈ細胞に対する非細胞障害用量（６μｇ／ｍｌ）の抽出物及びペメトレキセドを用いた処置を示し、図Ｂは、ＮＣＩ−Ｈ２０５２細胞に対する非細胞障害性用量（６μｇ／ｍｌ）の抽出物による処置及び（様々な濃度の）ペメトレキセドを用いた処置を示し、図Ｃは、非形質転換ＨＭＣ細胞に対する非細胞障害性用量（６μｇ／ｍｌ）の抽出物による処置及び（様々な濃度の）ペメトレキセドによる処置を示す。アッセイした化合物の濃度を横座標上にプロットし、パーセンテージで表した細胞生存能力を縦座標上にプロットしている。
【０１４４】
図１０Ａ及び図１０Ｂは、抽出物による処置は、ペメトレキセドによる処置に対し腫瘍系をどのように感受性にするかを示す。二重処置の曲線において、ちょうど１０μΜのペメトレキセド濃度が被試験系の細胞生存能力を低下させるのに十分であることが明らかである。非腫瘍細胞系において、本抽出物がペメトレキセドに対する保護作用を有することを示していることは興味深い。
【０１４５】
７．２  ＷＳＴ−１アッセイによる細胞生存能力の評価
このアッセイは、抽出物の効果とシナロピクリンの効果を比較するため、抽出物の代わりに様々な用量のシナロピクリンを並行して実施した。
【０１４６】
図１０は、ＤＵ１４５細胞をシスプラチン（図Ａ）、ドキソルビシン（図Ｂ）及びタキソール（図Ｃ）とともに、担体単独（ｃｎｔｒ）、及び異なる２種の濃度のシナラ・スコリムス抽出物（ａｂｏ−１）、及び薬剤単独、及び薬剤と併用する異なる２種の濃度のシナラ・スコリムス抽出物（ａｂｏ−１）を用いてインキュベートすることにより得られたデータを示す。
【０１４７】
図１１に示した実験で使用した抽出物は、シナロピクリンで０．１８１％の含量を有していた。したがって、図は、１００μｇ／ｍｌ及び２００μｇ／ｍｌの抽出物がそれぞれ、０．１８μｇ／ｍｌ及び０．３６μｇ／ｍｌのシナロピクリンに相当するシナロピクリンの濃度を示す。
【０１４８】
図１１は、シナラ・スコリムス抽出物（シナロピクリン＝１．３６１％）の濃度増加と１５μｇ／ｍｌの一定濃度のシスプラチンとの間の関連性を示し、図１２は、シナラ・スコリムス抽出物（シナロピクリン＝１．３６１％）と２μｇ／ｍｌの一定濃度のドキソルビシンとの間の関連性を示す。
【０１４９】
また図は、抽出物単独（黒色）又は薬剤単独（白色）による処置に関する値も示す。
【０１５０】
図１３及び図１４は、図１１及び図１２と同様に、本発明の抽出物の代わりにシナロピクリンで実施した同一実験の結果を示し、抽出物がシナロピクリンよりもどの程度有意に有効であるかを示す。
【０１５１】
したがって、図１４は、濃度増加のシナロピクリンと１５μｇ／ｍｌの一定濃度のシスプラチンとの関連性を示し、また図１４は、２μｇ／ｍｌの一定濃度のシナロピクリンとドキソルビシンの間の関連性を示す。
【０１５２】
また図は、シナロピクリン単独（黒色）及び薬剤単独（白色）による処置に関する値も示す。
【０１５３】
８．  創傷治癒アッセイ
創傷治癒アッセイ（図１６）は、インビトロでの細胞指向性遊走を研究するために開発された、簡単で、安価な、最初の方法の１つである。この方法は、インビボにおける創傷治癒の間の細胞遊走を模倣する。基本的なステップは、細胞単層に「創傷」を生じさせ、次いで、「創傷」を閉じるのに必要な細胞遊走の間、開始時及び一定の間隔で画像を取り込むことにより「創傷」の特定領域をモニタリングすることを含む。９５％の密集度により培養されたＭＳＴＯ２１１Ｈ細胞を６ウェルのテキスタイルプレートに接種し、１０マイクロリットルの滅菌ピペットによって穴を開けることによって「創傷」（又は切り込み）を調製し、細胞を取り除いた。創傷後の示した時間にデジタル顕微鏡写真を得た。最後の棒グラフは、示した時間に担体又はＡＢＯ１で処置した切り込みを閉じる効果（定量した細胞の数を％で表示）を示す。
【０１５４】
９．アポトーシス誘導の評価アッセイ
図（２６〜２７）を参照されたい。
９．１  ウェスタンブロッティング
１．１の項目で述べたものと同じ技術を使用し、以下の一次抗体を使用した：抗ベータアクチン（Ａ−２２２８、ＳＩＧＭＡ）、抗カスパーゼ−３（３１Ａ１０６７、Ａｌｅｘｉｓ）、抗カスパーゼ−７（＃９４９２、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）及び抗ＰＡＲＰ（＃９５４２Ｓ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）。
【０１５５】
９．２  ＦＡＣＳ分析、並びにＰＩ染色及びＰＩ／アネキシンＶ染色分析
細胞周期に対する本発明抽出物の効果を判定するために、ＦＡＣＳ分析を実施した。
【０１５６】
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）による染色については、１０４細胞／ｍｌの密度で細胞を６ウェルプレートに接種した。２４時間後、様々な時間間隔で腫瘍細胞を提示濃度の本発明抽出物を用いて処置した。懸濁液中の細胞を収集し、付着細胞をＰＢＳで洗浄し、凍結エタノール（７０％ｖ／ｖ）で固定し、−２０℃で保存した。分析については、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ  １Ｚ、ＰＩ（２５ｍｇ／ｍｌ）及びＲＮａｓｉ  Ａ（２００ｍｇ／ｍｌ）の溶液に懸濁した。
【０１５７】
ＰＩ／アネキシンＶ二重染色法については、処置細胞を収集し、結合バッファー（ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、ＣａＣｌ２  ２．５ｍＭ、ＮａＣｌ  １４０ｍＭ）に再懸濁した。細胞のアリコートをアネキシンＶ  ＦＩＴＣ及びＰＩ（５ｍｇ／ｍＬ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに１５分間インキュベートした。
【０１５８】
すべてのＦＡＣＳ分析の間、１０５の事象を各々のサンプルについて分析した。フローサイトメトリー分析は、ＧｕａｖａＥａｓｙＣｙｔｅ  ８ＨＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フローサイトメーターで実施した。
【０１５９】
図２５から明らかなように、本発明の抽出物は、アネキシンＶ染色法で判定したとおり、時間依存的及び用量依存的にＭＳＴＯ２１１Ｈの細胞でアポトーシスを誘導する。
【０１６０】
１１．グルタチオンに関するアッセイ
還元型及び酸化型グルタチオンの間の割合の変化によって引き起こされる細胞の酸化還元状態の変化は、ＳＴＡＴ３のグルタチオン化、チロシンにおけるそれらのリン酸化の防止と最終的なそれらの活性化を決定する（Ｂｕｔｔｕｒｉｎｉ  Ｅら、ＬｏＳＯｎｅ．２０１１；６（５）：ｅ２０１７４．）。
【０１６１】
１１．１  ＧＳＨの細胞内分析。
ＧＳＨの細胞内濃度は、比色法によって評価した。１０％トリクロロ酢酸を用いてタンパク除去した細胞抽出液をジチオニトロベンゼン（ＤＴＮＢ）により処理し、ＧＳＨとの反応後に放出されるＴＮＢの量を４１２ｎｍの吸光度で分析することにより評価した。
【０１６２】
１１．２  ＳＴＡＴ３のグルタチオン化
ＳＴＡＴ３は、タンパク質細胞抽出液を抗ＳＴＡＴ３抗体と一晩インキュベートすることにより免疫沈降させた。得られたタンパク質は、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって単離し、ＰＶＤＦ膜上に転写した。グルタチオン化ＳＴＡＴ３は、抗ＧＳＨ抗体を使用して認識した。
【０１６３】
図２４及び図２５に示したデータは、シナロピクリンがＧＳＨの細胞内濃度を低下させること（図２４）、また、酸化還元状態の変化がＳＴＡＴ３のグルタチオン化を誘導し、それらのリン酸化を阻止すること（図２５）を実証している。グルタチオンエチレンエステルによる前処置によるＧＳＨの生理学的値の回復は、ＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害するシナロピクリンの能力を反転させる。
【０１６４】
１２．  本発明の抽出物による処置又は未処置腫瘍細胞の移植
第１移植実験の説明。
ＭＳＴＯ２１１Ｈ細胞を２４時間、５０μｇ／ｍｌ濃度のアーティチョークで処置した。ＰＢＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に２×１０６細胞の懸濁液を収集し、４週齢の雌ヌードマウスの右臀部に接種した。腫瘍の体積は、週に２回、２１日目までモニターした。マウスを屠殺し、塊を除去した。
【０１６５】
１３．  マウスにおける腫瘍細胞の移植とシナラ・スコリムス及びペメトレキセドによる処置
第２移植実験の説明。
細胞を移植までに増殖させ、それらの活性及び混成の観点から評価した。すなわち、細胞を計数し、２０×１０６／ｍｌの濃度でＰＢＳに再懸濁した。Ｍａｔｒｉｇｅｌを懸濁液に加え、ＰＢＳ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  １／１の最終濃度１０×１０６細胞／ｍｌを得た。ＭＳＴＯ細胞を４８匹のマウスの皮下に接種した。
【０１６６】
腫瘍が６０ｍｍ３の平均体積に達した時、異なる処置を受ける一群当たり６匹の動物によって形成される８群にマウスを分けた。
【０１６７】
２群は、３週間の間、週７日間、飲用水中のアーティチョークを摂取した；他の群は、３週間の間、週５日、ペメトレキセドを腹腔内投与した。
【０１６８】
これらの群を下記の表５に概説した：
【表５】
2016521689.tif 000007
【０１６９】
腫瘍の進行が出現したならば（すなわち、腫瘍が６０ｍｍ３に達した時）、処置は、以下のように投与するＡｂｏ１及びペメトレキセドで開始した：連続５日間、マウス１匹あたり８８ｍｌで用量１００ｍｇ／ｋｇのペメトレキセドを腹腔内投与、濃度が２５、５０及び７５マイクログラム／ｍｌの飲用水中アーティチョーク抽出物を投与。３週間の間、隔日で測定した。
【０１７０】
マウスに対し、あらゆる徴候を評価するため、毎日モニターした；体重は週に２回モニターした。
【０１７１】
実験の終了時に（接種４２日後）、腫瘍塊を回収し、１０％ホルマリンに固定した（２４時間後に７０％エタノールに移した）。
【０１７２】
腫瘍直径は週２回、Ｍｉｔｕｔｏｙｏキャリパーを使用して測定した。
（参考文献）
＃１  「ＳＴＡＴタンパク質：制癌剤を発見するための新規分子標的（ＳＴＡＴ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｎｏｖｅｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）」
＃２  「癌炎症及び免疫におけるＳＴＡＴ：ＳＴＡＴ３に関する主要な役割（ＳＴＡＴｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ：ａ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＳＴＡＴ３）」
【図１ａ】
2016521689.tif 000008
【図１ｂ】
2016521689.tif 000009
【図２】
2016521689.tif 000010
【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４】
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【図５】
2016521689.tif 000016
【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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2016521689.tif 000048
2016521689.tif 000049
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