(57)【要約】本明細書において、マラバタンパク質Ｎ、Ｐ及びＬ又はそれらの変異型；並びにマラバタンパク質Ｍ若しくはタンパク質デルタ５１Ｍ又はそれらの変異型；及びバイア・グランデＧタンパク質、ＬＣＭＶ  Ｇタンパク質又はエボラＧタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むゲノムを有する単離されたウイルス粒子が記載される。マラバタンパク質Ｎは配列番号１を含む配列を有してもよい。マラバタンパク質Ｐは配列番号２を含む配列を有してもよい。マラバタンパク質Ｌは配列番号３を含む配列を有してもよい。マラバタンパク質Ｍ及びデルタ１Ｍはそれぞれ、配列番号４及び５を含む配列を有してもよい。バイア・グランデＧタンパク質は配列番号６を含む配列を有してもよい。ＬＣＭＶ  Ｇタンパク質は配列番号７を含む配列を有してもよい。エボラＧタンパク質は配列番号８を含む配列を有してもよい。【選択図】  図５
2016501528.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１を含む配列を有するタンパク質又はその変異型、
配列番号２を含む配列を有するタンパク質又はその変異型、
配列番号３を含む配列を有するタンパク質又はその変異型、
配列番号４若しくは５を含む配列を有するタンパク質又はその変異型、及び
配列番号６、７若しくは８を含む配列を有するタンパク質
をコードするオープンリーディングフレームを含むゲノムを有する単離されたウイルス粒子。
【請求項２】
参照されたタンパク質の前記変異型が、参照されたタンパク質の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一である配列を有するタンパク質であり、前記変異型のタンパク質は、参照されたタンパク質と同じ生物学的機能を維持している、請求項１に記載の単離されたウイルス粒子。
【請求項３】
前記ゲノムが、配列番号６を含む配列を有するタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項１に記載の単離されたウイルス粒子。
【請求項４】
前記ゲノムが、配列番号７を含む配列を有するタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項１に記載の単離されたウイルス粒子。
【請求項５】
前記ゲノムが、配列番号８を含む配列を有するタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項１に記載の単離されたウイルス粒子。
【請求項６】
前記ウイルスゲノムが、
配列番号１を含む配列を有するタンパク質、
配列番号２を含む配列を有するタンパク質、
配列番号３を含む配列を有するタンパク質、
配列番号５を含む配列を有するタンパク質、及び
配列番号７を含む配列を有するタンパク質
をコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項１に記載の単離されたウイルス粒子。
【請求項７】
配列番号１０の６４〜１３３２位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型、
配列番号１０の１３９３〜２１９０位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型、
配列番号１０の４９４３〜１１２７２位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型、
配列番号１０の２２５６〜２９４５位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型、
配列番号１０の３０４１〜４８１６位によって定義される配列の逆相補配列、及び
それらのプロモータの逆相補配列
を含む配列を有するＲＮＡポリヌクレオチドを備える、単離されたウイルス粒子。
【請求項８】
ヌクレオチド配列の保存的変異型が、参照されたヌクレオチド配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列である、請求項８に記載の単離されたウイルス粒子。
【請求項９】
保存的変異型が、１つ又は複数のサイレント置換を含む配列である、請求項８に記載の単離されたウイルス粒子。
【請求項１０】
ウイルスが宿主細胞内にあるとき、配列番号９に係る配列を含むｃＤＮＡポリヌクレオチドを産生することが可能な単離されたウイルス粒子。
【請求項１１】
配列番号１０に係る配列を含むＲＮＡポリヌクレオチドを含む、単離されたウイルス粒子。
【請求項１２】
配列番号１２の６４〜１３３２位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型、
配列番号１２の１３９３〜２１９０位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型、
配列番号１２の４６６４〜１０９９３位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型、
配列番号１２の２２５６〜２９４５位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型、
配列番号１２の３０４１〜４５３７位によって定義される配列の逆相補配列、及び
それらのプロモータの逆相補配列
を含む配列を有するＲＮＡポリヌクレオチドを備える、単離されたウイルス粒子。
【請求項１３】
ヌクレオチド配列の保存的変異型が、参照されたヌクレオチド配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列である、請求項１２に記載の単離されたウイルス粒子。
【請求項１４】
保存的変異型が、１つ又は複数のサイレント置換を含む配列である、請求項１２に記載の単離されたウイルス粒子。
【請求項１５】
ウイルスが宿主細胞内にあるとき、配列番号１１に係る配列を含むｃＤＮＡポリヌクレオチドを産生することが可能な単離されたウイルス粒子。
【請求項１６】
配列番号１２に係る配列を含むＲＮＡポリヌクレオチドを含む、単離されたウイルス粒子。
【請求項１７】
配列番号１４の６４〜１３３２位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型、
配列番号１４の１３９３〜２１９０位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型、
配列番号１４の５１９５〜１１５２４位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型、
配列番号１４の２２５６〜２９４２位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型、
配列番号１４の３０３８〜５０６８位によって定義される配列の逆相補配列、及び
それらのプロモータの逆相補配列
を含む配列を有するＲＮＡポリヌクレオチドを備える、単離されたウイルス粒子。
【請求項１８】
ヌクレオチド配列の保存的変異型が、参照されたヌクレオチド配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列である、請求項１７に記載の単離されたウイルス粒子。
【請求項１９】
保存的変異型が、１つ又は複数のサイレント置換を含む配列である、請求項１７に記載の単離されたウイルス粒子。
【請求項２０】
ウイルスが宿主細胞内にあるとき、配列番号１３に係る配列を含むｃＤＮＡポリヌクレオチドを産生することが可能な単離されたウイルス粒子。
【請求項２１】
配列番号１４に係る配列を含むＲＮＡポリヌクレオチドを含む、単離されたウイルス粒子。
【請求項２２】
癌の治療のための、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の単離されたウイルス粒子の使用。
【請求項２３】
前記癌が、脳癌である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記脳癌が、膠芽腫である、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記単離されたウイルス粒子を使用して細胞を感染させ、感染した細胞を前記癌の治療のために使用する、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２６】
ウイルスが投与されたヒトにおいて細胞傷害反応を誘導するための、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の単離されたウイルス粒子の使用。
【請求項２７】
前記細胞傷害反応が、抗癌反応である、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記単離されたウイルス粒子を使用して細胞を感染させ、感染した細胞を使用して前記細胞傷害反応を引き起こす、請求項２６又は２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記単離されたウイルス粒子が、中枢神経系に、血液／脳関門の外部に、血液／脳関門の内部に、又はそれらの任意の組み合わせに直接送達されるために製剤化されている、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３０】
前記単離されたウイルス粒子が、髄腔内注入、静脈内注入、頭蓋内注入、又はそれらの任意の組み合わせを介した投与のために製剤化されている、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記感染した細胞が、中枢神経系に、血液／脳関門の外部に、血液／脳関門の内部に、又はそれらの任意の組み合わせに直接送達されるために製剤化されている、請求項２５又は２８に記載の使用。
【請求項３２】
前記感染した細胞が、髄腔内注入、静脈内注入、頭蓋内注入、又はそれらの任意の組み合わせを介した投与のために製剤化されている、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
癌を有する患者に、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の単離されたウイルス粒子を投与するステップを含む、癌を治療するための方法。
【請求項３４】
前記癌が、脳癌である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記脳癌が、膠芽腫である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記単離されたウイルス粒子が前記患者に直接投与される、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記単離されたウイルス粒子が、中枢神経系に、血液／脳関門の外部に、血液／脳関門の内部に、又はそれらの任意の組み合わせに直接投与される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記単離されたウイルス粒子が、髄腔内に、静脈内に、頭蓋内注入を介して、又はそれらの任意の組み合わせで同時的若しくは連続的に前記患者に投与される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記単離されたウイルス粒子で細胞を感染させ、感染した細胞が前記患者に投与される、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の癌を治療するための方法。
【請求項４０】
前記感染した細胞が、中枢神経系に、血液／脳関門の外部に、血液／脳関門の内部に、又はそれらの任意の組み合わせに直接投与される、請求項３９に記載の癌を治療するための方法。
【請求項４１】
前記感染した細胞が、髄腔内に、静脈内に、頭蓋内注入を介して、又はそれらの任意の組み合わせで同時的若しくは連続的に前記患者に投与される、請求項３９に記載の癌を治療するための方法。
【請求項４２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の単離されたウイルス粒子を患者に投与するステップを含む、患者において細胞傷害反応を誘導するための方法。
【請求項４３】
前記単離されたウイルス粒子が前記患者に直接投与される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記単離されたウイルス粒子が、中枢神経系に、血液／脳関門の外部に、血液／脳関門の内部に、又はそれらの任意の組み合わせに直接投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記単離されたウイルス粒子が、髄腔内に、静脈内に、頭蓋内注入を介して、又はそれらの任意の組み合わせで同時的若しくは連続的に前記患者に投与される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記単離されたウイルス粒子で細胞を感染させ、感染した細胞が前記患者に投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記感染した細胞が、中枢神経系に、血液／脳関門の外部に、血液／脳関門の内部に、又はそれらの任意の組み合わせに直接投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記感染した細胞が、髄腔内に、静脈内に、頭蓋内注入を介して、又はそれらの任意の組み合わせで同時的若しくは連続的に前記患者に投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
患者における癌を治療するためのキットであって、
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の単離されたウイルス粒子と、
前記単離されたウイルス粒子を前記患者に投与するための指示書と
を含む、キット。
【請求項５０】
前記癌が、脳癌である、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
前記脳癌が、膠芽腫である、請求項４９に記載のキット。
【請求項５２】
前記単離されたウイルス粒子が、中枢神経系に、血液／脳関門の外部に、血液／脳関門の内部に、又はそれらの任意の組み合わせに直接送達されるために製剤化されている、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５３】
前記単離されたウイルス粒子が、髄腔内注入、静脈内注入、頭蓋内注入、又はそれらの任意の組み合わせを介した同時的若しくは連続的な投与のために製剤化されている、請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
前記単離されたウイルス粒子が、細胞に感染するように製剤化されており、前記細胞は中枢神経系に、血液／脳関門の外部に、血液／脳関門の内部に、又はそれらの任意の組み合わせに送達されるためのものである、請求項５９〜５１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５５】
前記細胞が、髄腔内注入、静脈内注入、頭蓋内注入、又はそれらの任意の組み合わせを介した同時的若しくは連続的に投与されるためのものである、請求項５４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本開示は、ラブドウイルスキメラ、及び腫瘍溶解による治療としてのその使用に関する。より詳細には、本開示はマラバ（Ｍａｒａｂａ）ラブドウイルスキメラ、並びに原発性及び二次性脳癌の治療のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]脳腫瘍は、脳内で無制限の増殖を示す細胞で構成される。それらは良性（つまり、非癌性）の場合もあるし、又は悪性（つまり、癌性）の場合もある。癌性脳腫瘍は、原発性腫瘍又は二次性腫瘍としてさらに分類される。
【０００３】
[0003]原発性腫瘍は脳内で発生するが、二次性腫瘍は乳又は肺などの別の部位から脳へ広がったものである。二次性腫瘍は転移性と称されることもある。二次性（つまり、転移性）脳腫瘍は、癌細胞が、身体の別の部位の原発性癌から脳内に広がったときに生じる。二次性腫瘍は、脳で生じる原発性腫瘍よりも３倍よくみられる。転移性の脳腫瘍は全て悪性である。
【０００４】
[0004]脳腫瘍は、一般的に、癌の元となる脳細胞の種類、又は癌が発生する部位に従って呼称又は分類される。これらの腫瘍の生物学的多様性のために、分類は複雑である。悪性原発性脳腫瘍の約８０％は、集約的に膠腫（つまり、膠細胞で発生する腫瘍）として知られており、悪性度を反映して４つの等級に分類される。
【０００５】
[0005]脳癌は、３５歳未満の患者における癌関連死の原因の第１位であり、北米で診断された全ての癌のおよそ１０％を占める。脳腫瘍の治療は、脳腫瘍に１２０を超える様々な種類があり、低悪性度の星状細胞腫からグレード４の多形性膠芽腫（ＧＢＭ）まで及ぶために、複雑である。
【０００６】
[0006]悪性膠腫、例えばＧＢＭは、成人で最も高頻度の脳癌であるが、最も増殖が速く、最も悪性度の高い原発性脳腫瘍であることから、最も治療が困難である。積極的な単一様式及び複数様式の治療、例えば、手術、化学療法、放射線及び小分子阻害剤を行っても、生存率は過去３０年にわたり変わらず、平均的な生存期間は診断から１年未満である。
【０００７】
[0007]従来の治療が成功しなかった理由としては、複数の要因があり、例えば、ＧＢＭの高い浸潤性／侵襲性、血液脳関門及び神経柔組織を介する薬物送達の限界、利用可能な治療に対する内在的な抵抗性を引き起こす遺伝子異質性、及び攻撃耐性クローンの発生が挙げられる。従って、新たな治療の選択肢に対して切迫した必要性があることから、脳癌一般、特にＧＢＭに対する腫瘍溶解性ウイルス療法が再び注目されることとなった。
【０００８】
[0008]水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、広範囲の種類の腫瘍細胞に感染して殺傷する強力な腫瘍溶解性ラブドウイルスである（Ｂｒｕｎら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １８：１４４０−１４４９、２０１０）。他のラブドウイルスと同様に、神経向性及び続いての神経毒性並びに非常に強いｎＡｂ応答が難点である（Ｄｉａｌｌｏら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７９７：１２７−１４０、２０１１）。ＶＳＶは神経学的腫瘍モデルにおいて全身送達による効果があることが知られているが（Ｃａｒｙら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８５：５７０８−５７１７、２０１１；Ｌｕｎら、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ９８：１５４６−１５４７、２００６；Ｗｏｌｌｍａｎｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８４：１５６３−１５７３、２０１０）、ＶＳＶの本来的な神経毒性により、臨床的薬物候補としての検討は進められていない（Ｈｏｆｆｍａｎｎら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ９１：２７８２−２７９３、２０１０；Ｓｕｒら、Ｖｅｔ  Ｐａｔｈｏｌ  ４０：５１２−５２０、２００３）。
【０００９】
[0009]マラバは、最近特徴づけられた腫瘍溶解性ラブドウイルスであり、ＶＳＶといくらかの配列類似性を有しており、ＶＳＶに対して類似でより強力な腫瘍溶解性スペクトルと同様の神経毒性プロファイルとを有している（Ｂｒｕｎら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １８：１４４０−１４４９、２０１０）。ラブドウイルスのＶＳＶとマラバは、前臨床試験を受けている最も有効なウイルスの一部である。しかしながら、脳癌のためのウイルス投与に望ましい経路が大脳内送達である一方で、ＶＳＶとマラバはいずれも本来的神経毒性のために、現在、大脳内経路による送達が可能となっていない。
【００１０】
[0010]癌の治療、より詳細には脳癌の治療のために、従来の腫瘍溶解性ウイルス療法における少なくとも１つの欠点を除去又は軽減する腫瘍溶解性ウイルス療法を提供することが所望される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
[0011]本開示の目的は、従来の腫瘍溶解性ウイルス療法における少なくとも１つの欠点を除去又は軽減することである。いくつかの例において、腫瘍溶解性ウイルス療法は、神経毒性レベルの低下を示すことができる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
[0012]本開示の一態様によれば、配列番号１を含む配列を有するタンパク質又はその変異型；配列番号２を含む配列を有するタンパク質又はその変異型；配列番号３を含む配列を有するタンパク質又はその変異型；配列番号４若しくは５を含む配列を有するタンパク質又はその変異型；及び配列番号６、７若しくは８を含む配列を有するタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むゲノムを有する単離されたウイルス粒子が提供される。
【００１３】
[0013]参照されたタンパク質の変異型は、参照されたタンパク質の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一である配列を有するタンパク質であってもよく、このような変異型のタンパク質は、参照されたタンパク質と同じ生物学的機能を維持している。
【００１４】
[0014]ゲノムは、配列番号６を含む配列を有するタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含んでもよい。代替的にゲノムは配列番号７を含む配列を有するタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含んでもよい。代替的にゲノムは配列番号８を含む配列を有するタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含んでもよい。
【００１５】
[0015]ウイルスゲノムは、配列番号１を含む配列を有するタンパク質；配列番号２を含む配列を有するタンパク質；配列番号３を含む配列を有するタンパク質；配列番号５を含む配列を有するタンパク質；及び配列番号７を含む配列を有するタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含んでもよい。
【００１６】
[0016]本開示の別の態様によれば、配列番号１０の６４〜１３３２位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型；配列番号１０の１３９３〜２１９０位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型；配列番号１０の４９４３〜１１２７２位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型；配列番号１０の２２５６〜２９４５位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型；配列番号１０の３０４１〜４８１６位によって定義される配列の逆相補配列；及びそれらのプロモータの逆相補配列を含む配列を有するＲＮＡポリヌクレオチドを備える単離されたウイルス粒子が提供される。
【００１７】
[0017]ヌクレオチド配列の保存的変異型は、参照されたヌクレオチド配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列であってもよい。保存的変異型は、１つ又は複数のサイレント置換を含む配列であってもよい。
【００１８】
[0018]単離されたウイルス粒子は、ウイルスが宿主細胞内にあるとき、配列番号９に係る配列を含むｃＤＮＡポリヌクレオチドを産生することが可能な単離されたウイルス粒子であってもよい。
【００１９】
[0019]単離されたウイルス粒子は、配列番号１０に係る配列を含むＲＮＡポリヌクレオチドを含む単離されたウイルス粒子であってもよい。
【００２０】
[0020]本開示のさらに別の態様によれば、配列番号１２の６４〜１３３２位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型；配列番号１２の１３９３〜２１９０位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型；配列番号１２の４６６４〜１０９９３位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型；配列番号１２の２２５６〜２９４５位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型；配列番号１２の３０４１〜４５３７位によって定義される配列の逆相補配列；及びそれらのプロモータの逆相補配列を含む配列を有するＲＮＡポリヌクレオチドを備える単離されたウイルス粒子が提供される。
【００２１】
[0021]ヌクレオチド配列の保存的変異型は、参照されたヌクレオチド配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列であってもよい。保存的変異型は、１つ又は複数のサイレント置換を含む配列であってもよい。
【００２２】
[0022]単離されたウイルス粒子は、ウイルスが宿主細胞内にあるとき、配列番号１１に係る配列を含むｃＤＮＡポリヌクレオチドを産生することが可能な単離されたウイルス粒子であってもよい。
【００２３】
[0023]単離されたウイルス粒子は、配列番号１２に係る配列を含むＲＮＡポリヌクレオチドを含む単離されたウイルス粒子であってもよい。
【００２４】
[0024]本開示のさらに別の態様によれば、配列番号１４の６４〜１３３２位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型；配列番号１４の１３９３〜２１９０位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型；配列番号１４の５１９５〜１１５２４位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型；配列番号１４の２２５６〜２９４２位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型；配列番号１４の３０３８〜５０６８位によって定義される配列の逆相補配列；及びそれらのプロモータの逆相補配列を含む配列を有するＲＮＡポリヌクレオチドを備える単離されたウイルス粒子が提供される。
【００２５】
[0025]ヌクレオチド配列の保存的変異型は、参照されたヌクレオチド配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列であってもよい。保存的変異型は、１つ又は複数のサイレント置換を含む配列であってもよい。
【００２６】
[0026]単離されたウイルス粒子は、ウイルスが宿主細胞内にあるとき、配列番号１３に係る配列を含むｃＤＮＡポリヌクレオチドを産生することが可能な単離されたウイルス粒子であってもよい。
【００２７】
[0027]単離されたウイルス粒子は、配列番号１４に係る配列を含むＲＮＡポリヌクレオチドを含む単離されたウイルス粒子であってもよい。
【００２８】
[0028]本開示のさらなる態様によれば、癌の治療のための、本開示による単離されたウイルス粒子の使用が提供される。癌は脳癌であってもよい。脳癌は膠芽腫であってもよい。
【００２９】
[0029]単離されたウイルス粒子は、細胞に感染させ、感染した細胞を使用して癌を治療するために、使用してもよい。
【００３０】
[0030]本開示のさらなる態様によれば、ウイルスが投与された患者において細胞傷害反応を誘導するための、本開示による単離されたウイルス粒子の使用が提供される。細胞傷害反応は、抗癌反応であってもよい。
【００３１】
[0031]単離されたウイルス粒子は、中枢神経系に、血液／脳関門の外部に、血液／脳関門の内部に、又はそれらの任意の組み合わせに直接送達されるために製剤化されていてもよい。単離されたウイルス粒子は、髄腔内注入、静脈内注入、頭蓋内注入、又はそれらの任意の組み合わせを介した連続的若しくは同時的な投与のために製剤化されていてもよい。
【００３２】
[0032]単離されたウイルス粒子は、細胞に感染させ、感染した細胞を使用して細胞傷害反応を引き起こすために使用してもよい。感染した細胞は、中枢神経系に、血液／脳関門の外部に、血液／脳関門の内部に、又はそれらの任意の組み合わせに直接送達されるために製剤化されていてもよい。感染した細胞は、髄腔内注入、静脈内注入、頭蓋内注入、又はそれらの任意の組み合わせを介した連続的若しくは同時的な投与のために製剤化されていてもよい。
【００３３】
[0033]本開示の別の態様によれば、癌を治療するための方法が提供される。方法は、本開示による単離されたウイルス粒子を、癌を有する患者に投与するステップを含む。癌は脳癌であってもよい。脳癌は膠芽腫であってもよい。
【００３４】
[0034]単離されたウイルス粒子は、患者に直接投与されてもよい。単離されたウイルス粒子は、中枢神経系に、血液／脳関門の外部に、血液／脳関門の内部に、又はそれらの任意の組み合わせに直接投与されてもよい。単離されたウイルス粒子は、髄腔内注入、静脈内注入、頭蓋内注入、又はそれらの任意の組み合わせを介して連続的若しくは同時的に患者に投与されてもよい。
【００３５】
[0035]方法は、単離されたウイルス粒子で細胞を感染させるステップ、及び感染した細胞を患者に投与するステップを含んでもよい。感染した細胞は、中枢神経系に、血液／脳関門の外部に、血液／脳関門の内部に、又はそれらの任意の組み合わせに直接投与されてもよい。感染した細胞は、髄腔内に、静脈内に、頭蓋内注入を介して、又はそれらの任意の組み合わせによって連続的若しくは同時的に患者に投与されてもよい。
【００３６】
[0036]本開示のさらに別の態様によれば、患者において細胞傷害反応を誘導するための方法が提供される。方法は、本開示による単離されたウイルス粒子を、患者に投与するステップを含む。
【００３７】
[0037]単離されたウイルス粒子は、患者に直接投与されてもよい。単離されたウイルス粒子は、中枢神経系に、血液／脳関門の外部に、血液／脳関門の内部に、又はそれらの任意の組み合わせに直接投与されてもよい。単離されたウイルス粒子は、髄腔内に、静脈内に、頭蓋内注入を介して、又はそれらの任意の組み合わせによって連続的若しくは同時的に患者に投与されてもよい。
【００３８】
[0038]方法は、単離されたウイルス粒子で細胞を感染させるステップ、及び感染した細胞を患者に投与するステップを含んでもよい。感染した細胞は、中枢神経系に、血液／脳関門の外部に、血液／脳関門の内部に、又はそれらの任意の組み合わせに直接投与されてもよい。感染した細胞は、髄腔内に、静脈内に、頭蓋内注入を介して、又はそれらの任意の組み合わせによって連続的若しくは同時的に患者に投与されてもよい。
【００３９】
[0039]本開示のさらに別の態様によれば、患者における癌を治療するためのキットが提供される。キットは、本開示による単離されたウイルス粒子と、単離されたウイルス粒子を患者に投与するための指示書とを含む。
【００４０】
[0040]癌は脳癌であってもよい。脳癌は膠芽腫であってもよい。
【００４１】
[0041]単離されたウイルス粒子は、中枢神経系に、血液／脳関門の外部に、血液／脳関門の内部に、又はそれらの任意の組み合わせに直接送達されるために製剤化されていてもよい。単離されたウイルス粒子は、髄腔内注入、静脈内注入、頭蓋内注入、又はそれらの任意の組み合わせを介した連続的若しくは同時的な投与のために製剤化されていてもよい。
【００４２】
[0042]単離されたウイルス粒子は、細胞に感染するように製剤化されていてもよく、感染された細胞は、中枢神経系に、血液／脳関門の外部に、血液／脳関門の内部に、又はそれらの任意の組み合わせに送達されるために製剤化されていてもよい。細胞は、髄腔内注入、静脈内注入、頭蓋内注入、又はそれらの任意の組み合わせを介して連続的若しくは同時的に投与されるものであってもよい。
【００４３】
[0043]本開示の他の態様及び特徴は、以下の本発明の具体的な例の記載を添付の図面と組み合わせて参照することで、当業者に明らかとなるであろう。
【００４４】
[0044]本開示の実施形態を、例示にすぎない方法で、添付された図面を参照しながら、以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】提示のウイルスの単回大脳内投与（１ｅ７ｐｆｕ）後のＢａｌｂ／Ｃマウスの生存に基づく非神経毒性ラブドウイルスの同定を図示するグラフである。動物を、体重減少、立毛、後脚麻痺、病的状態及び死亡率について観察した。
【図２Ａ】ＭＲＢのＧをＢＧＧ又はＥＢＧと交換したＧの模式図である。
【図２Ｂ】正常ヒト星状細胞（ＮＨＡ）及びＧＭ３８皮膚線維芽細胞におけるウイルス減弱化を実証する生存性アッセイの結果を示すグラフである。エラーバーは、４つの生物学的複製物の平均標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
【図２Ｃ】正常ヒト星状細胞（ＮＨＡ）及びＧＭ３８皮膚線維芽細胞におけるウイルス減弱化を実証する生存性アッセイの結果を示すグラフである。エラーバーは、４つの生物学的複製物の平均標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
【図２Ｄ】ＭＲＢＧＧがヒト脳癌細胞株において細胞溶解性であることを実証する生存性アッセイの結果を示すグラフである。生存性は、処理７２時間後にアラマーブルーを使用して評価した。エラーバーは、４つの生物学的複製物のＳＥＭを表す。
【図２Ｅ】ＭＲＢＧＧがヒト脳癌細胞株において細胞溶解性であることを実証する生存性アッセイの結果を示すグラフである。生存性は、処理７２時間後にアラマーブルーを使用して評価した。エラーバーは、４つの生物学的複製物のＳＥＭを表す。
【図２Ｆ】ＭＲＢＧＧがヒト脳癌細胞株において細胞溶解性であることを実証する生存性アッセイの結果を示すグラフである。生存性は、処理７２時間後にアラマーブルーを使用して評価した。エラーバーは、４つの生物学的複製物のＳＥＭを表す。
【図２Ｇ】ＭＲＢＧＧがヒト脳癌細胞株において細胞溶解性であることを実証する生存性アッセイの結果を示すグラフである。生存性は、処理７２時間後にアラマーブルーを使用して評価した。エラーバーは、４つの生物学的複製物のＳＥＭを表す。
【図２Ｈ】ＭＲＢＧＧがヒト脳癌細胞株において細胞溶解性であることを実証する生存性アッセイの結果を示すグラフである。生存性は、処理７２時間後にアラマーブルーを使用して評価した。エラーバーは、４つの生物学的複製物のＳＥＭを表す。
【図２Ｉ】ＭＲＢＧＧがヒト脳癌細胞株において細胞溶解性であることを実証する生存性アッセイの結果を示すグラフである。生存性は、処理７２時間後にアラマーブルーを使用して評価した。エラーバーは、４つの生物学的複製物のＳＥＭを表す。
【図２Ｊ】ＭＲＢＧＧがヒト脳癌細胞株において細胞溶解性であることを実証する生存性アッセイの結果を示すグラフである。生存性は、処理７２時間後にアラマーブルーを使用して評価した。エラーバーは、４つの生物学的複製物のＳＥＭを表す。
【図２Ｋ】ＭＲＢＧＧがヒト脳癌細胞株において細胞溶解性であることを実証する生存性アッセイの結果を示すグラフである。生存性は、処理７２時間後にアラマーブルーを使用して評価した。エラーバーは、４つの生物学的複製物のＳＥＭを表す。
【図３Ａ】野生型ＦＭＴ、ＢＧ、ＭＳ、ＭＲＢ並びにＶＳＶ及びＭＲＢベクター骨格のいくつかの設計されたラブドウイルス株の大脳内毒性の概要図である。ＭＲＢＧＧ及びマラバＥｂＧΔ５１は本開示によるウイルスである。
【図３Ｂ】大脳内接種後３か月で屠殺した動物の脳ホモジネートにおけるウイルス負荷の概要図である。検出限界は１０１である。
【図３Ｃ】病理学的写真を示す図である。ＦＭＴ及びＭＲＢＧＧ急性感染Ｂａｌｂ／Ｃマウスの病理学的写真は、食塩水を注入された動物の写真と区別がつかない。Ｂａｌｂ／Ｃマウスに提示のウイルスを大脳内接種し（１ｅ７ｐｆｕ）、接種から４８時間後で屠殺した。
【図３Ｄ】非神経毒性ラブドウイルスで処理したマウス及び対照マウスの運動機能を説明するグラフである。運動機能は、非神経毒性ラブドウイルスの大脳内接種後に機能低下していない。運動機能は、加速するロッドから落ちるまでのレイテンシを測定するロトロッド分析によって評価した。
【図３Ｅ】様々な用量でＦＭＴ又はＭＲＢＧＧキメラのいずれかを単回ＩＶ注入した後の毒性プロファイルを図示するグラフである。最大耐用量（ＭＴＤ）は、挙動と重量によって測定するときの永続的病的状態に帰着しない最高用量と等しい。
【図４Ａ】ＰＢＳによる対照処理に対するＭＲＢＧＧ又はＥｂＧ  ＩＶ処理（３用量、１ｅ９ｐｆｕ）後のＵ８７ＭＧ腫瘍のＩＶＩＳ画像である。これらのウイルスの全身送達により、ヒトＵ８７ＭＧ異種移植モデルにおける有効性は増強する。
【図４Ｂ】ＭＲＢＧＧ又はＥｂＧの３回ＩＶ投与（１ｅ９ｐｆｕ）に応答する顕著な腫瘍退縮を実証する流動プロットを図示するグラフである。エラーバーはＳＥＭを表す。
【図４Ｃ】ＭＲＢＧＧ（ログランク検定Ｐ＝０．０１）及びＥｂＧ（ログランク検定Ｐ＝０．０１）ＩＶ処理動物のカプラン・マイヤー生存プロットである。
【図５】一群のヒト膠芽腫細胞上の様々なウイルスの腫瘍溶解活性を図示するグラフである。
【図６Ａ】対照ウイルスに対する本開示によるマラバキメラウイルスのインビボ神経毒性を図示するグラフである。グラフは、提示のウイルスの大脳内単回投与（１ｅ６ｐｆｕ）後のＢａｌｂ／Ｃマウスのカプラン・マイヤー生存プロットを示す。
【図６Ｂ】図６Ａの動物の体重の変動を示すグラフである。
【図７Ａ】対照ウイルスに対する本開示によるマラバキメラのインビボ有効性を図示するグラフである。グラフは、処理後のＵ８７ＭＧ腫瘍を有するＣＤ−１ヌードマウスのカプラン・マイヤー生存プロットを示す。
【図７Ｂ】図７Ａの動物の体重の変動を示すグラフである。
【図８Ａ】ヒトＵ８７ＭＧ異種移植モデルにおけるＰＢＳ対照のインビボ有効性を説明するＵ８７ＭＧ腫瘍のＩＶＩＳ画像である。画像は、処理前及び処理後（１週、２週、３週、４週）の腫瘍を示す。
【図８Ｂ】未処理の対照動物における経時的な腫瘍負荷の著しい増加を図示する流動プロットである。
【図９Ａ】ヒトＵ８７ＭＧ異種移植モデルにおけるＢＧ野生型（ＢＧ−ＷＴ）ウイルス処理のインビボ有効性を図示するＵ８７ＭＧ腫瘍のＩＶＩＳ画像である。画像はＢＧ処理（１用量、１ｅ７ｐｆｕ：ＩＣ）の後（１週、２週、３週、４週）のＵ８７ＭＧ腫瘍を示す。
【図９Ｂ】ＢＧのＩＣ投与（１ｅ７ｐｆｕ）に応答する初期の中程度の腫瘍退縮とその後の腫瘍負荷の再発を説明する流動プロットである。
【図１０Ａ】ヒトＵ８７ＭＧ異種移植モデルにおけるＦＭＴ野生型（ＦＭＴ−ＷＴ）ウイルス処理のインビボ有効性を図示するＵ８７ＭＧ腫瘍のＩＶＩＳ画像である。画像は、ＦＭＴ−ＷＴ処理（１用量、１ｅ７ｐｆｕ：ＩＣ）の後（１週、２週、３週、４週）のＵ８７ＭＧ腫瘍を示す。
【図１０Ｂ】ＦＭＴ−ＷＴのＩＣ投与（１ｅ７ｐｆｕ）に応答する顕著な腫瘍退縮を実証する流動プロットである。
【図１１Ａ】ヒトＵ８７ＭＧ異種移植モデルにおけるＭＲＢ  ＢＧ（Ｇ）処理のインビボ有効性を図示するＵ８７ＭＧ腫瘍のＩＶＩＳ画像である。画像は、ＭＲＢ  ＢＧ（Ｇ）処理（１用量、１ｅ７ｐｆｕ：ＩＣ）の後（１週、２週、３週、４週）のＵ８７ＭＧ腫瘍を示す。
【図１１Ｂ】ＭＲＢ  ＢＧＧのＩＣ投与（１ｅ７ｐｆｕ）に応答する中程度の腫瘍退縮を図示する流動プロットである。
【図１２Ａ】ヒトＵ８７ＭＧ異種移植モデルにおけるＭＲＢ  ＦＭＴ（Ｇ）処理のインビボ有効性を図示するＵ８７ＭＧ腫瘍のＩＶＩＳ画像である。画像は、ＭＲＢ  ＦＭＴ（Ｇ）処理（１用量、１ｅ７ｐｆｕ）の後（１週、２週、３週）のＵ８７ＭＧ腫瘍を示す。
【図１２Ｂ】ＭＲＢ  ＦＭＴ  ＧのＩＣ投与（１ｅ７ｐｆｕ）に応答する顕著な腫瘍退縮を実証する流動プロットである。但し、動物は全て処理から４週間経過する前にＭＲＢ  ＦＭＴ（Ｇ）処理の神経毒性作用により死亡した。
【図１３Ａ】ヒトＵ８７ＭＧ異種移植モデルにおけるＦＭＴ  ＭＲＢ（Ｇ）処理のインビボ有効性を説明するＵ８７ＭＧ腫瘍のＩＶＩＳ画像である。画像は、ＦＭＴ  ＭＲＢ（Ｇ）処理（１用量、１ｅ７ｐｆｕ：ＩＣ）の後（１週、２週、３週）のＵ８７ＭＧ腫瘍を示す。
【図１３Ｂ】ＦＭＴ  ＭＲＢ（Ｇ）のＩＣ投与（１ｅ７ｐｆｕ）に応答する顕著な腫瘍退縮を図示する流動プロットである。但し、動物は全て処理から４週間経過する前にＦＭＴ  ＭＲＢ  Ｇの神経毒性作用により死亡した。
【図１４Ａ】ヒトＵ８７ＭＧ異種移植モデルにおけるＶＳＶ−ＬＣＭＶ（Ｇ）処理のインビボ有効性を図示するＵ８７ＭＧ腫瘍のＩＶＩＳ画像である。画像は、ＶＳＶ  ＬＣＭＶ  Ｇ処理（１用量、１ｅ７ｐｆｕ：ＩＣ）の後（１週、２週、３週、４週）のＵ８７ＭＧ腫瘍を示す。
【図１４Ｂ】ＶＳＶ−ＬＣＭＶ（Ｇ）のＩＣ投与（１ｅ７ｐｆｕ）に応答する顕著な腫瘍退縮を図示する流動プロットである。
【図１５Ａ】ヒトＵ８７ＭＧ異種移植モデルにおけるＭＲＢ  ＬＣＭＶ（Ｇ）処理のインビボ有効性を説明するＵ８７ＭＧ腫瘍のＩＶＩＳ画像である。画像は、ＭＲＢ  ＬＣＭＶ  Ｇ処理（１用量、１ｅ７ｐｆｕ：ＩＣ）の後（１週、２週、３週、４週）のＵ８７ＭＧ腫瘍を示す。
【図１５Ｂ】ＭＲＢ−ＬＣＭＶ（Ｇ）のＩＣ投与（１ｅ７ｐｆｕ）に応答する顕著な腫瘍退縮を説明する流動プロットである。
【図１６】野生型マラバウイルス、減弱化ＶＳＶ（ＶＳＶ−Δ５１）、マラバＬＣＭＶ（Ｇ）キメラ、又はＶＳＶ−ＬＣＭＶ（Ｇ）キメラで処理したＢａｌｂ／Ｃマウスにおける中和抗体力価を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
[0079]定義
[0080]本開示を通して、以下の段落で定義するいくつかの用語を用いる。
【００４７】
[0081]用語「所望する」又は「所望の」は、本明細書で使用される場合、所定の状況下で所定の利点をもたらす技術の実施形態を指す。但し、他の実施形態が同じ又は他の状況下で望ましいことがあってもよい。さらに１つ又は複数の望ましい実施形態の記載は、他の実施形態が有用でないことを示唆するものではなく、技術範囲から他の実施形態を排除することを意図するものではない。
【００４８】
[0082]用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及びその変化形は、本明細書で使用される場合、非制限的であることを意図し、列挙での事柄の記載は、本技術の材料、組成物、装置及び方法で有用でありうる他の同様の事柄を排除しないことを意図している。同様に、用語「できる（ｃａｎ）」及び「でもよい（ｍａｙ）」又はそれらの変化形は、非制限的であることを意図し、例えば、実施形態が特定の要素又は特徴を含むことができる又は含んでもよいとの記載は、本技術の他の実施形態がそれらの要素又は特徴を有しないことを排除しないことを意図している。
【００４９】
[0083]開放形の用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）、含有する、又は有するなどの非制限的用語の同意語として、本発明の技術の実施形態を記載及び主張するために本明細書で使用されるが、代替的に実施形態を「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」又は「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などのより限定的な用語を使用して記載する場合もある。従って、材料、成分又はプロセスの工程を記載する任意の所与の実施形態について、本発明の技術は、本出願において追加の材料、成分又はプロセスに関する明確な言及がない場合であっても、記載された材料、成分、プロセスから成る又はから本質的に成り、追加の材料、成分又はプロセスを含まない実施形態（〜から成る場合）、及び実施形態の重要な特性に影響を与えるさらなる材料、成分又はプロセスを含まない実施形態（〜から本質的に成る場合）も具体的に含む。例えば、要素Ａ、Ｂ及びＣを列挙する組成物又は方法が言及される場合、本明細書において要素Ｄを排除するとの明確な記載がない場合であっても、当該分野で記載される可能性のある要素Ｄを排除した、Ａ、Ｂ及びＣから成る、及びＡ、Ｂ及びＣから本質的に成る実施形態を具体的に想定する。
【００５０】
[0084]本明細書で参照するとき、全ての組成のパーセンテージは、別段の定めがない限り、全組成物の重量に対する値である。範囲の開示は、別段の定めがない限り、終点を含み、全ての個別の値及び全範囲をさらに分割した範囲も含む。従って、例えば、「Ａ〜Ｂ」又は「約Ａ〜約Ｂ」の範囲は、Ａ及びＢを含む。具体的なパラメータ（温度、分子量、重量パーセンテージなど）についての値の開示及び値の範囲は、本明細書で有用な他の値及び値の範囲を排除するものではない。所与のパラメータに対する２つ以上の例示された具体的な値は、パラメータに対して主張される可能性がある一連の値の範囲の終点を定義する場合があることも想定される。例えば、パラメータＸが本明細書において値Ａを有すると例示され、また値Ｚを有するとも例示されている場合には、パラメータＸは約Ａ〜約Ｚの値の範囲を有する可能性があると想定される。同様に、パラメータについて２つ以上の値の範囲（範囲は、入れ子関係であっても、重複していても、別個であってもよい）の開示は、開示された範囲の終点を使用して主張される可能性がある値の全ての可能な組み合わせの範囲を含むことが想定される。例えば、本明細書においてパラメータＸが１〜１０、２〜９又は３〜８の範囲の値を有すると例示される場合、パラメータＸは、１〜９、１〜８、１〜３、１〜２、２〜１０、２〜８、２〜３、３〜１０及び３〜９を含む他の範囲の値を有する場合があることも想定される。
【００５１】
[0085]「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、本明細書で使用される場合、「少なくとも１つの」事柄が存在しており、可能な場合には複数の事柄が存在していてもよいことを示す。
【００５２】
[0086]「約」は、値に適用されるとき、計算又は測定において値に多少の不正確さが許容される（その値の正確さにある程度迫っている；概ね又は合理的にその値に近接している；ほぼその値である）ことを示す。もし何らかの理由で「約」によってもたらされる不正確さが当該分野の通常の意味で理解されない場合、本明細書で使用される「約」は、少なくとも、このようなパラメータの測定又は使用における通常の方法から発生しうる変動を示す。
【００５３】
[0087]用語「及び／又は」は、本明細書で使用される場合、関連する列挙された事柄の１つ又は複数の任意及び全ての組合せを含む。
【００５４】
[0088]「低下したレベルの神経毒性」又は「低下した神経毒性」を有するウイルスは、本明細書で使用される場合、マウス脳の右の線条体に所定用量で注入されたとき、対応する野生型ウイルスを注入されたマウスより、神経毒性（例えば、体重減少、立毛、後脚麻痺、病的状態及び死）の徴候が少ないマウスを生じるウイルスを指すと理解されるものとする。
【００５５】
[0089]「実質的なレベルの神経毒性のない」又は「実質的に神経毒性のない」ウイルスは、本明細書で使用される場合、患者に対する標準プロトコルを使用して有効量を投与したとき、ウイルス注入前の患者と比較して、検出可能な運動機能低下の徴候を示さない結果をもたらすウイルスを指すと理解されるものとする。例えば、「実質的に神経毒性のない」ウイルスは、１ｅ７ｐｆｕでマウスに注入されたとき、ウイルス注入前のマウスと比較して、ロトロッド上の時間で測定される運動機能の低下の徴候が検出されないマウスを生じさせるウイルスを指すと理解されるものとする。
【００５６】
[0090]詳細な説明
[0091]本開示の著者は、現在識別されている２５０種を超えるラブドウイルスのうち、いくつかの野生型ラブドウイルスを試験し、ＣＮＳ腫瘍細胞株の殺傷に有効な複数のウイルスを明らかにした。強力なウイルス単離株のいくつかが顕著な減弱化を実証し、大脳内接種後に１００％生存をもたらすことも明らかにした。従前の試験で示されたマラバ及びＶＳＶウイルスとは全く対照的なウイルスである。それに続いて本開示の著者は配列決定を行い、公知の非神経毒性野生型単離株と共に試験するためのキメラウイルスを設計した。
【００５７】
[0092]一般的に、本開示は、設計されたキメラマラバラブドウイルス、並びにそれに関連するヌクレオチド及びタンパク質の配列に関連する、システム、方法、使用、プロセス、物品、及び組成物を提供する。例えば、本開示は、キメラマラバラブドウイルスの腫瘍溶解性治療、例えば原発性又は二次性脳癌の治療における使用を提供する。
【００５８】
[0093]企図される腫瘍溶解性ウイルスは、患者にウイルスを直接投与して癌を治療するように使用してもよく、又はウイルスで細胞を感染させ、感染した細胞を患者に投与してウイルスを送達させることにより癌を治療するように使用してもよい。ウイルスによって感染される細胞は、患者由来の癌細胞、正常な免疫細胞、又は幹細胞であってもよい。いくつかの例において、治療される癌は、脳癌、例えば、悪性膠腫である。悪性膠腫の一例は、膠芽腫である。
【００５９】
[0094]本開示によるウイルス粒子は、野生型プラスミドを含んでいなくてもよいし、野生型マラバＧタンパク質をコードする配列を含んでいなくてもよいし、又はその両方を含んでいなくてもよい。
【００６０】
[0095]本開示によるウイルス粒子の一例において、マラバタンパク質Ｎ、Ｐ及びＬ又はそれらの任意の変異型；並びにマラバタンパク質Ｍ若しくはタンパク質Δ５１Ｍ又はそれらの任意の変異型；及びバイア・グランデ（Ｂａｈｉａ  Ｇｒａｎｄｅ）Ｇタンパク質、ＬＣＭＶ  Ｇタンパク質又はエボラＧタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むゲノムを有する単離されたウイルス粒子が提供される。
【００６１】
[0096]マラバタンパク質Ｎは配列番号１を含む配列を有してもよい。マラバタンパク質Ｐは配列番号２を含む配列を有してもよい。マラバタンパク質Ｌは配列番号３を含む配列を有してもよい。マラバタンパク質Ｍ及びΔ５１Ｍはそれぞれ配列番号４及び５を含む配列を有してもよい。バイア・グランデＧタンパク質は配列番号６を含む配列を有してもよい。ＬＣＭＶ  Ｇタンパク質は配列番号７を含む配列を有してもよい。エボラＧタンパク質は配列番号８を含む配列を有してもよい。
【００６２】
[0097]参照されたタンパク質の変異型は、参照されたタンパク質の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一である配列を有するタンパク質であってもよく、このような変異型のタンパク質は、参照されたタンパク質と同じ生物学的機能を維持している。例えば、変異型のタンパク質で修飾されたウイルス粒子が、参照されたタンパク質を有するウイルス粒子と同じ細胞傷害性及び神経毒性を有している場合には、変異型のタンパク質は、参照されたタンパク質と同じ生物学的機能を維持していると考えられるものとする。
【００６３】
[0098]特定の例において、単離されたウイルス粒子は、配列番号１、２、３、４及び６を含む配列を有するタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むゲノムを有する。
【００６４】
[0099]別の例において、単離されたウイルス粒子は、配列番号１、２、３、４及び７を含む配列を有するタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むゲノムを有する。
【００６５】
[00100]さらに別の例において、単離されたウイルス粒子は、配列番号１、２、３、４及び８を含む配列を有するタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むゲノムを有する。
【００６６】
[00101]さらなる例において、単離されたウイルス粒子は、配列番号１、２、３、５及び６を含む配列を有するタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むゲノムを有する。
【００６７】
[00102]さらに別の例において、単離されたウイルス粒子は、配列番号１、２、３、５及び７を含む配列を有するタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むゲノムを有する。
【００６８】
[00103]またさらなる例において、単離されたウイルス粒子は、配列番号１、２、３、５及び８を含む配列を有するタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むゲノムを有する。
【００６９】
[00104]本開示によるウイルス粒子の別の例において、配列番号１０の６４〜１３３２位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型；配列番号１０の１３９３〜２１９０位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型；配列番号１０の４９４３〜１１２７２位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型；配列番号１０の２２５６〜２９４５位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型；配列番号１０の３０４１〜４８１６位によって定義される配列の逆相補配列；及びそれらのプロモータの逆相補配列を含む配列を有するＲＮＡポリヌクレオチドを備える単離されたウイルス粒子が提供される。
【００７０】
[00105]保存的変異型は、参照されたヌクレオチド配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列であってもよい。保存的変異型は、１つ又は複数のサイレント置換を含む配列であってもよい。
【００７１】
[00106]本開示によるウイルス粒子の特定の例は、ウイルスが宿主細胞内にあるとき、配列番号９に係る配列を含むｃＤＮＡポリヌクレオチドを産生することが可能な単離されたウイルス粒子である。
【００７２】
[00107]本開示によるウイルス粒子の特定の例は、配列番号１０に係る配列を含むＲＮＡポリヌクレオチドを含む単離されたウイルス粒子である。
【００７３】
[00108]本開示によるウイルス粒子の別の例において、配列番号１２の６４〜１３３２位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型；配列番号１２の１３９３〜２１９０位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型；配列番号１２の４６６４〜１０９９３位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型；配列番号１２の２２５６〜２９４５位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型；配列番号１２の３０４１〜４５３７位によって定義される配列の逆相補配列；及びそれらのプロモータの逆相補配列を含む配列を有するＲＮＡポリヌクレオチドを備える単離されたウイルス粒子が提供される
【００７４】
[00109]保存的変異型は、参照されたヌクレオチド配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列であってもよい。保存的変異型は、１つ又は複数のサイレント置換を含む配列であってもよい。
【００７５】
[00110]本開示によるウイルス粒子の特定の例は、ウイルスが宿主細胞内にあるとき、配列番号１１に係る配列を含むｃＤＮＡポリヌクレオチドを産生することが可能な単離されたウイルス粒子である。
【００７６】
[00111]本開示によるウイルス粒子の特定の例は、配列番号１２に係る配列を含むＲＮＡポリヌクレオチドを含む単離されたウイルス粒子である。
【００７７】
[00112]本開示によるウイルス粒子の別の例において、配列番号１４の６４〜１３３２位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型；配列番号１４の１３９３〜２１９０位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型；配列番号１４の５１９５〜１１５２４位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型；配列番号１４の２２５６〜２９４２位によって定義される配列の逆相補配列又はその保存的変異型；配列番号１４の３０３８〜５０６８位によって定義される配列の逆相補配列；及びそれらのプロモータの逆相補配列を含む配列を有するＲＮＡポリヌクレオチドを備える単離されたウイルス粒子が提供される。
【００７８】
[00113]保存的変異型は、参照されたヌクレオチド配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列であってもよい。保存的変異型は、１つ又は複数のサイレント置換を含む配列であってもよい。
【００７９】
[00114]本開示によるウイルス粒子の特定の例は、ウイルスが宿主細胞内にあるとき、配列番号１３に係る配列を含むｃＤＮＡポリヌクレオチドを産生することが可能な単離されたウイルス粒子である。
【００８０】
[00115]本開示によるウイルス粒子の特定の例は、配列番号１４に係る配列を含むＲＮＡポリヌクレオチドを含む単離されたウイルス粒子である。
【００８１】
[00116]本開示の別の態様によれば、本開示による単離されたウイルス粒子を、癌の治療のために使用することができる。癌は、脳癌、例えば膠芽腫であってもよい。
【００８２】
[00117]単離されたウイルス粒子を使用して細胞に感染させ、感染した細胞を癌の治療のために使用してもよい。
【００８３】
[00118]本開示の別の態様によれば、本開示による単離されたウイルス粒子を、ウイルスが投与されたヒトにおいて細胞傷害反応を誘導するために使用してもよい。細胞傷害反応は抗癌反応であってもよい。単離されたウイルス粒子を細胞に感染させてもよいし、感染した細胞を使用して細胞傷害反応を引き起こしてもよい。
【００８４】
[00119]単離されたウイルス粒子は、中枢神経系に、血液／脳関門の外部に、血液／脳関門の内部に、又はそれらの任意の組み合わせに直接送達されるために製剤化されていてもよい。単離されたウイルス粒子は、髄腔内注入、静脈内注入、頭蓋内注入、又はそれらの任意の組み合わせを介した連続的若しくは同時的な投与のために製剤化されていてもよい。
【００８５】
[00120]感染した細胞は、中枢神経系に、血液／脳関門の外部に、血液／脳関門の内部に、又はそれらの任意の組み合わせに直接送達されるために製剤化されていてもよい。感染した細胞は、髄腔内注入、静脈内注入、頭蓋内注入、又はそれらの任意の組み合わせを介した連続的若しくは同時的な投与のために製剤化されていてもよい。
【００８６】
[00121]本開示のさらなる態様によれば、癌を有する患者に本開示による単離されたウイルス粒子を投与するステップを含む、癌の治療のための方法が提供される。癌は、脳癌、例えば膠芽腫であってもよい。
【００８７】
[00122]単離されたウイルス粒子は、患者に直接投与されてもよい。単離されたウイルス粒子は、中枢神経系に、血液／脳関門の外部に、血液／脳関門の内部に、又はそれらの任意の組み合わせに直接投与されてもよい。単離されたウイルス粒子は、髄腔内に、静脈内に、頭蓋内注入を介して、又はそれらの任意の組み合わせによって連続的若しくは同時的に患者に投与されてもよい。
【００８８】
[00123]方法は、単離されたウイルス粒子で細胞を感染させるステップ、及び感染した細胞を患者に投与するステップを含んでもよい。感染した細胞は、中枢神経系に、血液／脳関門の外部に、血液／脳関門の内部に、又はそれらの任意の組み合わせに直接投与されてもよい。感染した細胞は、患者に髄腔内に、静脈内に、頭蓋内注入を介して、又はそれらの任意の組み合わせによって連続的若しくは同時的に投与されてもよい。
【００８９】
[00124]本開示の別の態様によれば、患者に本開示による単離されたウイルス粒子を投与するステップを含む、患者において細胞傷害反応を誘導するための方法が提供される。
【００９０】
[00125]単離されたウイルス粒子は、患者に直接投与されてもよい。単離されたウイルス粒子は、中枢神経系に、血液／脳関門の外部に、血液／脳関門の内部に、又はそれらの任意の組み合わせに直接投与されてもよい。単離されたウイルス粒子は、髄腔内に、静脈内に、頭蓋内注入を介して、又はそれらの任意の組み合わせによって同時的若しくは連続的に患者に投与されてもよい。
【００９１】
[00126]方法は、単離されたウイルス粒子で細胞を感染させるステップ、及び感染した細胞を患者に投与するステップを含んでもよい。感染した細胞は、中枢神経系に、血液／脳関門の外部に、血液／脳関門の内部に、又はそれらの任意の組み合わせに直接投与されてもよい。感染した細胞は、患者に髄腔内に、静脈内に、頭蓋内注入を介して、又はそれらの任意の組み合わせによって連続的若しくは同時的に投与されてもよい。
【００９２】
[00127]本開示の別の態様によれば、患者における癌の治療のためのキットが提供される。キットは、本開示による単離されたウイルス粒子と、患者に単離されたウイルス粒子を投与するための指示書とを含む。
【００９３】
[00128]癌は、脳癌、例えば膠芽腫であってもよい。
【００９４】
[00129]単離されたウイルス粒子は、中枢神経系に、血液／脳関門の外部に、血液／脳関門の内部に、又はそれらの任意の組み合わせに直接送達されるために製剤化されていてもよい。単離されたウイルス粒子は、髄腔内注入、静脈内注入、頭蓋内注入、又はそれらの任意の組み合わせを介した連続的若しくは同時的な投与のために製剤化されていてもよい。
【００９５】
[00130]単離されたウイルス粒子は、細胞に感染させるために製剤化されるが、該細胞は、中枢神経系に、当該細胞は血液／脳関門の外部に、血液／脳関門の内部に、又はそれらの任意の組み合わせに送達させるためのものである。該細胞は、髄腔内注入、静脈内注入、頭蓋内注入、又はそれらの任意の組み合わせを介した連続的若しくは同時的な投与のために製剤化されていてもよい。
【００９６】
[00131]上記の任意の態様において、１つの経路を介する投与を、１つ又は複数の他の投与経路と組み合わせてもよい。様々な経路を介するウイルス粒子の投与は、連続的及び／又は同時であってもよい。本開示によるウイルスの投与経路又は投与様式は、ウイルスを患者に直接投与しても、又は細胞に先ず感染させてその細胞を患者に投与しても、ウイルスの癌性細胞に対する感染及び殺傷能力に影響を与えないと予測される。本開示によるウイルスは、血液／脳の内部又は外部のいずれかに投与されたとき、血液／脳関門を通過して、血液／脳関門の向こう側で癌細胞に感染することが可能であると予測される。
【００９７】
[00132]ウイルスを細胞に感染させるための技術、及びウイルスを送達させるために感染した細胞を使用する技術は、例えば、Ｐｏｗｅｒ  ＡＴら、Ｃａｒｒｉｅｒ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｎ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｓ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００７年１月；１５（１）：１２３−３０、及びＴｙｌｅｒ  ＭＡら、Ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ  ｇｌｉｏｍａ  ｔｏ  ｄｅｌｉｖｅｒ  ａｎ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００９年２月；１６（２）：２６２−７８で検討されている。
【００９８】
[00133]ポリヌクレオチド及びアミノ酸配列
[00134]分子生物学分野の当業者に公知の様々な方法及び技術で使用できる核酸配列を含むポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）並びにアミノ酸（例えば、タンパク質）の配列が提供される。このような配列には、例えば、列挙された配列の単離した形態、精製した形態、及び組換えの形態が含まれ、さらに列挙された配列の完全な形態又は部分的な形態も含まれる。アミノ酸配列に関する非限定的な使用としては、開示されたアミノ酸配列を含むタンパク質又はペプチドに対する抗体を作製することを含む。ポリヌクレオチド配列に関する非限定的な用途としては、ハイブリダイゼーションプローブの作製、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で使用するためのプライマーとして、染色体用途及びジーンマッピング用途などが挙げられる。完全又は部分アミノ酸又はポリヌクレオチド配列を、そのような方法及び技術において使用してもよい。
【００９９】
[00135]本開示は、遺伝子配列及びコーディング核酸配列を含むポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同定を特徴として有する。添付の配列表で明示的に提供されている配列に加えて、構造的及び／又は機能的に関連しているポリヌクレオチド配列も含まれる。配列表におけるポリヌクレオチド配列のいずれかにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列又はその部分配列（例えば、少なくとも１００個の連続するヌクレオチドを含む配列）もさらに含まれる。ポリヌクレオチド配列にはＲＮＡ産生及び／又は翻訳のために形成された配列及び／又は部分配列、例えばｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、センスＲＮＡ、ＲＮＡサイレンシング及び干渉構造などもさらに含まれる。
【０１００】
[00136]配列表で提供されるポリヌクレオチド配列と実質的に同一のポリヌクレオチド配列は、本明細書に開示の組成物及び方法で使用することができる。実質的に同一又は実質的に類似のポリヌクレオチド配列は、少なくとも参照ポリヌクレオチドの部分配列とヌクレオチドごとに同一のポリヌクレオチド配列として定義される。ポリヌクレオチドは、配列表に列挙されたいずれかのポリヌクレオチドと比べて、例えば挿入、欠失、及び置換を含んだものであってもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、典型的に、配列表に記載されているもの又はその部分配列から選択される参照ポリヌクレオチドと少なくとも約７０％同一である。例えば、比較ウィンドウ内の１０個のヌクレオチドのうちの少なくとも７個のヌクレオチドが、選択された参照配列と同一である。さらに配列は、参照配列と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は少なくとも約９９．５％同一でありうる。ポリヌクレオチドの部分配列としては、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約１００、少なくとも約５００、約１０００若しくはより多数の連続的ヌクレオチド又は相補的部分配列を挙げることができる。部分配列は、例えばオリゴヌクレオチド、例えば合成オリゴヌクレオチド、単離されたオリゴヌクレオチド、又は完全長遺伝子若しくはｃＤＮＡであってもよい。記載された配列のいずれかに相補的なポリヌクレオチド配列も含まれる。
【０１０１】
[00137]アミノ酸配列としては、配列表に示されるアミノ酸配列及びその部分配列が挙げられる。構造的及び／又は機能的に高度に関連づけられるアミノ酸配列も含まれる。例えば、配列表のアミノ酸配列に加えて、実質的に同一のアミノ酸配列も、開示された組成物及び方法で使用することができる。実質的に同一又は実質的に類似のアミノ酸配列は、アミノ酸ごとの比較に基づいて、少なくとも参照アミノ酸配列の部分配列と同一のアミノ酸配列として定義される。アミノ酸配列は、配列表のいずれかのアミノ酸配列と比べて、例えば挿入、欠失、及び置換を含んでいてもよい。例えば、アミノ酸は、典型的に、参照アミノ酸配列又はその部分配列と少なくとも約７０％同一である。例えば、比較ウィンドウ内の１０個のアミノ酸のうちの少なくとも７個のアミノ酸が、選択された参照アミノ酸配列と同一である。しばしばアミノ酸配列は、参照配列と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は少なくとも約９９．５％同一である。アミノ酸の部分配列としては、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約１００、少なくとも約５００、約１０００又はより多くの連続的アミノ酸を挙げることができる。また、アミノ酸配列又は部分配列の保存的変異型が存在していてもよい。アミノ酸配列は、例えば細胞傷害性、酵素的に活性、又は酵素的に不活性であってもよい。
【０１０２】
[00138]ポリヌクレオチド配列がポリペプチド又はポリペプチドの部分配列を形成するように翻訳される場合、ヌクレオチドの変化は、保存的又は非保存的アミノ酸置換を生じるものであってもよい。保存的アミノ酸置換は、機能的に類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。機能的に類似のアミノ酸を示す保存的置換表は、当該分野において周知である。表１に、相互に「保存的置換」であるアミノ酸を含む６つのグループの例を示している。他の保存的置換表も当該分野において利用可能であり、同様に使用することができる。
【表１】
2016501528.tif 000003
【０１０３】
[00139]当業者は、多数の保存的置換から機能的に同一の構築物が生じることを認識しているであろう。例えば、上述のように、遺伝子コードの縮重のために、「サイレント置換」（つまり、コードされるポリペプチドにおいて変化を生じさせないポリヌクレオチド配列の置換）は、アミノ酸をコードする全てのポリヌクレオチド配列に必然的に包含される特徴である。同様に、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸配列における１又は数個のアミノ酸（例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％以上）において、極めて類似した特性を有する異なるアミノ酸で置換されており、開示された構築物と極めて類似していることも容易に確認される。開示された各配列のこのような保存的変異型も想定される。
【０１０４】
[00140]保存的変異型並びにポリヌクレオチド及びアミノ酸配列のより多様な変異型を取得する方法は、当該技術分野において広く知られている。例えばＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００４年にかけて補遺）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、１−３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）及びＢｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（「Ｂｅｒｇｅｒ」）に参照されるような十分に確立された様々なプロトコルのいずれかによってゲノム又は発現ライブラリを例えばスクリーニングすることによって取得可能な天然に存在する同族体に加えて、様々な突然変異誘発手順を用いてさらなる変異型を作製することもできる。多くの突然変異誘発手法が当該分野において公知であり、例えば、部位特異的突然変異誘発、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発、及び他の多くの手法が挙げられる。例えば、部位特異的突然変異誘発は、例えばＳｍｉｔｈ（１９８５）「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３−４６２及び文献中の参照文献Ｂｏｔｓｔｅｉｎ＆Ｓｈｏｒｔｌｅ（１９８５）「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１１９３−１２０１及びＣａｒｔｅｒ（１９８６）「Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−７に記載されている。オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発は、例えばＺｏｌｌｅｒ＆Ｓｍｉｔｈ（１９８２）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｎｙ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００）に記載されている。修飾塩基を用いる突然変異誘発は、例えばＫｕｎｋｅｌ（１９８５）「Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２及びＴａｙｌｏｒら（１９８５）「Ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１��：８７６５−８７８７に記載されている。ギャップ二重鎖ＤＮＡ（ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ）を用いる突然変異誘発は、例えば、Ｋｒａｍｅｒら（１９８４）「Ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：９４４１−９４６０）に記載されている。点ミスマッチ突然変異誘発は、例えば、Ｋｒａｍｅｒら（１９８４）「Ｐｏｉｎｔ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｒｅｐａｉｒ」  Ｃｅｌｌ  ３８：８７９−８８７に記載されている。二本鎖切断突然変異誘発は、Ｍａｎｄｅｃｋｉ（１９８６）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：７１７７−７１８１及びＡｒｎｏｌｄ（１９９３）「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４５０−４５５に記載されている。修復−欠損宿主株を用いる突然変異誘発は、Ｃａｒｔｅｒら（１９８５）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ  １３  ｖｅｃｔｏｒｓ」  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３に記載されている。全遺伝子合成による突然変異誘発は、例えば、Ｎａｍｂｉａｒら（１９８４）「Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ」  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９−１３０１に記載されている。ＤＮＡシャフリングは、例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）「Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１及びＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４）「ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１に記載されている。
【０１０５】
[00141]上記の方法の多くは、さらにＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５４巻にも記載されており、ここでは様々な突然変異誘発法における問題解決のために有用な制御も記載されている。突然変異誘発、ライブラリ構築及び他の多様性生成法のためのキットも市販されている。例えば、キットは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｐｉｃ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）（例えば、上記のＥｃｋｓｔｅｉｎ法を用いて）、Ｂｉｏ／Ｃａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、ＣＡＮＡＤＡ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．）（例えば、上記のＫｕｎｋｅｌ法を用いて）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．（Ｒｉｄｇｅｆｉｅｌｄ、Ｃｏｎｎ．）、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｏｆ  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ）、ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）（例えば、５プライム３プライムキット）；Ｇｅｎｐａｋ  Ｉｎｃ．（Ｓｔｏｎｙ  Ｂｒｏｏｋ、Ｎ．Ｙ．）、Ｌｅｍａｒｇｏ  Ｉｎｃ（Ｔｏｒｏｎｔｏ、ＣＡＮＡＤＡ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｅａｐａｃｋ、Ｎ．Ｊ．）、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、ＱＢｉｏｇｅｎｅ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ）、並びにＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）（例えば、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的突然変異誘発キット及びＣｈａｍｅｌｅｏｎ（商標）二重鎖部位特異的突然変異誘発キット）などから入手可能である。
【０１０６】
[00142]配列関係の決定
[00143]類似した配列は、いくつかの方法によって、例えば、パーセント同一性、ハイブリダイゼーション、免疫学的方法などによって客観的に決定することができる。２つ以上の配列間の関係を決定するための種々の方法（例えば、同一性、類似性及び／又は相同性）が当該分野で利用可能であり、周知である。例えば、手動アラインメント、コンピュータ支援配列アラインメント及びそれらの組合せなどの方法が挙げられる。配列アラインメントを実行するための多くのアルゴリズム（一般的にコンピュータで実行）が広く利用可能であり、又は当業者によって作製可能である。これらの方法としては、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２；ｔｈｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｏｆ  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の局地的相同性アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：２４４４の類似性検索法、及び／又はコンピュータによるこれらのアルゴリズムの実行（例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）によるものが挙げられる。
【０１０７】
[00144]例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、配列同一性（及び配列類似性）分析を行うためのソフトウェアは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されている。このソフトウェアは公的に利用可能であり、例えば、インターネット上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．で国立生物工学情報センターを通して利用できる。このソフトウェアのアルゴリズムは、最初に検索配列において長さＷの短いワードを同定し、データベース配列の同じ長さのワードと整列させたときにいくつかの正の値の閾値スコアＴに一致するか又はスコアＴを充足させる高得点配列ペア（ＨＳＰ）を識別することを含んでいる。Ｔは隣接ワードスコア閾値と呼ばれる。最初の隣接ワードヒットは、それらのワードを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして機能する。次いでワードヒットを、累積アラインメントスコアが増加しうるかぎり、各配列に沿って両方向に伸長させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（１ペアの一致する残基についての報酬スコア；常に＞０）及びＮ（ミスマッチの残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列については、得点マトリックスを使用して累積スコアを計算する。各方向におけるワードヒットの伸長は、累積アライメントスコアがその最大の達成値から量Ｘだけ減少するとき、累積スコアが１つ又は複数のネガティブスコアの残基アラインメントの蓄積に起因してゼロ以下になるとき、又は配列のいずれかの末端に達したときに停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ値１００、Ｍ＝５、Ｎ＝−４を使用して、両鎖を比較する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰ（ＢＬＡＳＴタンパク質）プログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５参照）を使用する。
【０１０８】
[00145]さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性について統計学的分析を実行する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率を示す確率の最小和（ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸の参照核酸への比較において、確率の最小和が約０．１未満、又は約０．０１未満、さらには約０．００１未満の場合、核酸は参照配列と類似（従ってこの状況では相同）と考えられる。
【０１０９】
[00146]配列アラインメントアルゴリズムの別の例は、ＰＩＬＥＵＰであり、これはプログレッシブ、ペアワイズのアラインメントを使用して、一群の関連する配列から複数の配列アラインメントを作成する。アラインメントを作成するために使用するクラスタの関連を示すツリーもプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブ・アラインメント法のＦｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０の単純化を使用する。使用される方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ５：１５１−１５３で記載されている方法と類似している。プログラムは、例えば、最大５，０００個の文字の長さの配列を最大３００配列まで整列させることができる。複数のアラインメント手順では、２つの最も類似する配列のペアワイズアラインメントから開始して、２つの整列した配列のクラスタを作成する。次いで、このクラスタを、次に最も関連する配列又は整列させた配列のクラスタに整列させることができる。２つの配列クラスタは２つの別個の配列のペアワイズアライメントの単純な伸長によって整列させることができる。最終アラインメントは、一連の進行性のペアワイズアラインメントによって達成される。プログラムを使用してクラスタ関係を示す樹状図又はツリーをプロットするために使用することもできる。プログラムは、特定の配列を設計し、配列比較の領域のためのアミノ酸若しくはヌクレオチド座標を設計して実行させる。
【０１１０】
[00147]複数のＤＮＡ、又はアミノ酸、配列アラインメントに適したアルゴリズムのさらなる例は、ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら（１９９４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０）である。ＣＬＵＳＴＡＬＷは、グループ配列間の複数のペアワイズ比較を行い、相同性に基づいてそれらを複数のアラインメントへ組み立てる。ギャップオープンペナルティ及びギャップ延長ペナルティは、例えば、それぞれ１０及び０．０５であってもよい。アミノ酸アラインメントについて、ＢＬＯＳＵＭアルゴリズムはタンパク質重量マトリックスとして使用することができる。例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９を参照。
【０１１１】
[00148]ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション類似性は、相補的又は部分相補的ポリヌクレオチド配列を有する一本鎖（又は一本鎖領域の）核酸間のハイブリダイゼーションによって評価することもできる。ハイブリダイゼーションは、核酸間の、典型的には、溶液中における、又は、固体支持体、例えば膜、ビーズ、チップ、フィルタなどの上に固定された核酸鎖の１つとの物理的関係の尺度である。核酸ハイブリダイゼーションは、十分に特徴付けられた様々な物理化学的な力、例えば、水素結合、溶媒排除、塩基スタッキングなどに基づいて生じる。核酸ハイブリダイゼーションのための多数のプロトコルが当該技術分野において周知である。核酸ハイブリダイゼーションについての詳細な解説は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ、第Ｉ部、第２章、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」、（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．）、並びにＡｕｓｕｂｅｌらＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００４年にかけて補遺）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）；ＳａｍｂｒｏｏｋらＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、１−３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）及びＢｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２巻  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（「Ｂｅｒｇｅｒ」）において見出される。Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  １、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  １）並びにＨａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ２、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ２）には、ＤＮＡ及びＲＮＡの合成、標識化、検出及び定量が、オリゴヌクレオチドに関するものを含め、詳細に記載されている。
【０１１２】
[00149]ハイブリダイゼーション、例えばディファレンシャルハイブリダイゼーションを得るために適切な条件は、相補及び部分相補核酸間の理論的な融解温度（Ｔｍ）によって選択される。所与の一群の条件、例えば、溶媒組成、イオン強度などの下で、Ｔｍはハイブリダイズしている核酸鎖間の二重鎖が５０％変性する温度である。つまり、Ｔｍは、ヘリックスからランダムコイルまでの推移の中間点に対応する温度に相当する；Ｔｍは、長いストレッチのヌクレオチドについて、ポリヌクレオチドの長さ、ヌクレオチド組成及びイオン強度に依存する。
【０１１３】
[00150]ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしていない核酸は一連の洗浄によって除去することがき、洗浄のストリンジェンシーは、所望の結果に依存して調節することができる。低ストリンジェンシーの洗浄条件（例えば、より高い塩濃度及びより低い温度の使用）により感度は増加するが、非特異的なハイブリダイゼーションシグナルと高いバックグラウンドシグナルが生じることがある。ストリンジェンシー条件が高くなる（例えば、より低い塩濃度及びＴｍに近いより高い温度を使用する）ほど、通常は主要な特異的シグナルは維持されたままで、バックグラウンドシグナルが低くなる。Ｒａｐｌｅｙ，Ｒ．及びＷａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．編．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｍｅｔｈｏｄｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９８）も参照されたい。
【０１１４】
[00151]核酸ハイブリダイゼーション実験、例えば、サザン及びノザンハイブリダイゼーションの環境において「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」又は「ストリンジェントな条件」は、配列に依存し、様々な環境パラメータの下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションについての詳細な解説は、前述のＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）並びに前述のＨａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  １及びＨａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ２に見出せる。
【０１１５】
[00152]サザンブロット又はノザンブロットにおけるフィルタ上の１００を超える相補性残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、２×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、４２℃でのハイブリダイゼーションの一晩（例えば、およそ２０時間）の実施である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、０．２×ＳＳＣ洗浄、６５℃、１５分間である（前述のＳａｍｂｒｏｏｋのＳＳＣ緩衝液に関する説明を参照）。ストリンジェンシーを決定する洗浄では、残りのハイブリダイズしていないプロープによるシグナルを除去するための低いストリンジェンシーによる洗浄を先に行ってもよい。低いストリンジェンシー洗浄の一例は、２×ＳＳＣ、室温（例えば、２０℃で１５分間）である。
【０１１６】
[00153]一般的には、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて非関連のプローブに対して観察されるより少なくとも２．５倍〜５倍の（通常はより高い）シグナルノイズ比は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。２つの配列間の少なくともストリンジェントなハイブリダイゼーションの検出は、本明細書の配列表で提供される配列に対する比較的強い構造類似性を示す。
【０１１７】
[00154]一般的に、「高ストリンジェント」のハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、規定されたイオン強度及びｐＨでの特定の配列に対する熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃以内で低い温度になるように選択される（下記のように、高ストリンジェント条件は比較形で延べられる場合もある）。対象ヌクレオチド配列に密接に関連する又は同一の標的配列（例えば、「プローブ」）は、ストリンジェント又は高ストリンジェント条件下で同定することができる。より低いストリンジェンシー条件は、より相補性の低い配列に適している。
【０１１８】
[00155]例えば、ストリンジェント又は高ストリンジェントなハイブリダイゼーション（又はよりいっそう高ストリンジェントなハイブリダイゼーション）及び洗浄条件の決定において、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーは、選択された一組の基準に合致するまで徐々に増加させる（例えば、ハイブリダイゼーション又は洗浄において、温度を上昇、塩濃度を低下、界面活性剤濃度を増加、及び／又は有機溶媒、例えばホルムアミドの濃度の増加）。例えば、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを、本発明のポリヌクレオチド配列又はその部分配列の１つ又は複数を含むプローブ、及び／又はその相補ポリヌクレオチド配列が、所望により一致しない標的に対するプローブのハイブリダイゼーションに対して観察される高さの少なくとも２．５×、場合により５×、又は１０×、又は１００×又はそれ以上のシグナルノイズ比で、完全に一致する相補標的に結合するまで徐々に増加させる。
【０１１９】
[00156]配列表に列挙される核酸に由来する部分配列を使用して標的核酸を取得することができ、そのような標的核酸も本開示の特徴でありうる。例えば、そのような標的核酸としては、配列表のいずれかのポリヌクレオチドの固有の部分配列に相当するオリゴヌクレオチドプローブにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列又はその相補配列、場合により配列表のいずれかのアミノ酸配列の固有の部分配列をコードするプローブが含まれる。
【０１２０】
[00157]例えば、オリゴヌクレオチドプローブに完全に相補的な標的オリゴヌクレオチドが、そのプローブと、陰性対照非相補的核酸に対する標的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションよりも少なくとも約５〜１０倍高いシグナルノイズ比でハイブリダイズする、ハイブリダイゼーション条件が選択される。より高いシグナルノイズ比は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを、約１５×、２０×、３０×、５０×、又はより高い比が得られるように増加させることによって達成することができる。特定のシグナルは、関連アッセイで使用される標識、例えば、蛍光標識、熱量標識、放射性標識などに依存すると予想される。
【０１２１】
[00158]ベクター、プロモータ及び発現系
[00159]本開示のポリヌクレオチド配列は、任意の様々な形態、例えば発現カセット、ベクター、プラスミド、ウイルス粒子又は直鎖状核酸配列であることができる。例えば、ベクター、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ファージ、ウイルス及び核酸セグメントが、本発明の核酸配列又はその部分配列を含んでもよい。これらの核酸構築物は、プロモータ、エンハンサ、ポリリンカー、制御調節遺伝子などをさらに含んでもよい。従って、本開示は、例えば本明細書に開示のポリヌクレオチドを含むベクター、これらのベクターが組み込まれた宿主細胞、及び組み換え技術による様々な開示ポリペプチド（配列表のものを含む）の産生物にも関する。
【０１２２】
[00160]これらの態様において、ベクターは、例えばプラスミドベクター、一本鎖若しくは二本鎖のファージベクター、又は一本鎖若しくは二本鎖のＲＮＡ若しくはＤＮＡウイルスベクターであってもよい。そのようなベクターは、ポリヌクレオチドとして、好ましくはＤＮＡとして、細胞へＤＮＡ及びＲＮＡを導入するために周知の技術によって、細胞へ導入することができる。ファージベクター及びウイルスベクターの場合、ベクターは、感染又は形質導入で周知の技術によって、パッケージされた又はキャプシド形成されたウイルスとして細胞に導入されてもよく、好ましくは導入される。ウイルスベクターは複製能を有していてもよいし、又は複製不能であってもよい。後者の場合、ウイルスの増殖は、一般的に宿主細胞が補足されたときにのみ生じると予想される。
【０１２３】
[00161]いくつかの例において、ベクターには、本開示のポリヌクレオチド及びポリペプチドの発現に有用なベクターが含まれる。一般的にそのようなベクターは、宿主での発現に有効なシス作用制御領域を含み、発現するポリヌクレオチドに操作可能に連結されている。適切なトランス作用因子は、宿主によって、補足ベクターによって、又は宿主への導入の際にベクター自身によって供給される。
【０１２４】
[00162]上記ベクターに関する特定の例において、ベクターは、タンパク質発現をもたらす。そのような好ましい発現は、誘導可能な発現、一時的に制限された発現、又は特定の細胞種に主に限定された発現、又は上記の任意の組合せであってもよい。誘導可能なベクターのいくつかの実施形態は、操作が容易な環境因子、例えば、温度及び栄養性添加物質などによって発現を誘導するものであってもよい。この態様に適した種々のベクター、例えば原核生物及び真核生物宿主で使用するための構成性及び誘導可能な発現ベクターが当該分野で周知であり、当業者によって常套的に用いられている。そのようなベクターとしては、特に、クロモソーム、エピソーム及びウイルス由来ベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入因子由来、酵母クロモソーム由来、ウイルス由来、例えばラブドウイルス、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、フォウルポックスウイルス、シュードラビスウイルス及びレトロウイルス由来のベクター、並びにそれらの組合せに由来するベクター、例えばプラスミド及びバクテリオファージ遺伝要素由来のベクター、例えばコスミド及びファージミド由来のベクター、及びアグロバクテリウム媒介形質転換に使用されるバイナリーなどが挙げられる。
【０１２５】
[00163]ベクターは選択可能なマーカー及びレポーター遺伝子を含んでもよい。十分な量のベクターの取得を容易にするために、大腸菌における複製を可能にする細菌起源のベクターを使用してもよい。例として以下に市販のベクターを示す。細菌で使用するために好ましいベクターとしては、Ｑｉａｇｅｎから入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０及びｐＱＥ−９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；及びＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が挙げられる。好ましい真核生物ベクターとしては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１及びｐＳＧ、並びにＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬが挙げられる。有用な植物バイナリーベクターとしては、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから利用可能なＢＩＮ１９及びその誘導体が挙げられる。これらのベクターは単に例示のために列挙しているにすぎず、多くの市販の及び周知のベクターが当業者にとって利用可能である。本発明の配列表に提供される１つ又は複数のポリヌクレオチド及び／又はポリペプチド並びにそれらの変異型に対して適切な、例えば導入、維持、増殖又は発現に適切な、任意の他のプラスミド又はベクターを宿主において使用できることが理解されるものとする。
【０１２６】
[00164]一般的に、発現構築物は、転写開始領域及び転写終結領域を含むと予想され、構築物がポリペプチドをコードする場合、転写領域に翻訳のためのリボソーム結合部位を含むと予想される。構築物によって発現される成熟転写物のコーディング部分は、翻訳されるポリペプチドの初めの部分には翻訳を開始するＡＵＧを、終わりの部分には適切に配置された終止コドンを含む。さらに、構築物は、発現を制御し、発現を生じさせる制御領域を含んでもよい。一般的に制御領域は、多くの通常の実施手順に従って、特に転写因子、リプレッサ結合領域及び終止シグナルなどを制御することによって転写を制御するように操作されると予想される。小胞体の内腔への、細胞膜周辺腔への、又は細胞外環境への翻訳されたタンパク質の分泌のために適切な分泌シグナルを発現ポリペプチドに組み込んでもよい。これらのシグナルはポリペプチドにとって内因的なものであってもよく、又は異種起源のシグナルであってもよい。
【０１２７】
[00165]より高等の真核生物による本開示のＤＮＡ（例えば、ポリペプチドをコードしているＤＮＡ）の転写は、ベクターにエンハンサ配列を挿入して増加させることができる。エンハンサはＤＮＡのシス作用エレメントであり、通常約１０〜３００ｂｐであり、所与の宿主細胞型のプロモータの転写活性を増加するように作用する。エンハンサの例としては、複製起点の後方側部にｂｐ１００〜２７０で配置されるＳＶ４０エンハンサ、サイトメガロウイルス初期プロモータエンハンサ、複製起点の後方側部のポリオーマエンハンサ、及びアデノウイルスエンハンサが挙げられる。導入されたＤＮＡセグメントの転写を増強させるための本開示で有用なさらなるエンハンサとしては、特にＯｄｅｌｌら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２６３−７２（１９８８）によって示される３５Ｓプロモータ内にあるもののようなウイルスエンハンサ、及びＦｒｏｍｍら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：９７７（１９８９）に記載のｏｐｉｎｅ遺伝子由来のエンハンサなどが挙げられる。エンハンサは、ベクターに含まれる配列の発現における組織的特異性及び／又は一時的特異性に影響を与えることがある。
【０１２８】
[00166]終結領域も適切な点で転写を終結することにより効率的な発現を促進する。有用なターミネータとしては、限定するものではないが、アグロバクテリウム由来のｐｉｎＩＩ（Ａｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １（１）：１  １５−１２２（１９８９）参照）、ｇｌｂ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｌ２２３４５参照）、ｇｚ（ｇｚｗ６４ａターミネータ、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｓ７８７８０参照）、及びｎｏｓターミネータが挙げられる。終結領域は、プロモータヌクレオチド配列にとって野生型のものであってもよく、対象ＤＮＡ配列にとって野生型のものであってもよく、別の供給源に由来するものであってもよい。例えば、他の好都合な終結領域は、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドから利用可能であり、例えば、オクトピン合成酵素及びノパリン合成酵素終結領域が挙げられる。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１−１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６４：６７１−６７４；Ｓａｎｆａｃｏｎら（１９９１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：１４１−１４９；Ｍｏｇｅｎら（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１２６１−１２７２；Ｍｕｎｒｏｅら（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９１：１５１−１５８；Ｂａｌｌａｓら１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７８９１−７９０３；及びＪｏｓｈｉら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５：９６２７−９６３９も参照されたい。
【０１２９】
[00167]一般的な発現に適した既知の真核生物プロモータとしては、ＣＭＶ最初期プロモータ、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモータ、初期及び後期ＳＶ４０プロモータ、レトロウイルスＬＴＲのプロモータ、例えば、ラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）のＬＴＲプロモータ、メタロチオネインプロモータ、例えばマウスメタロチオネイン−Ｉプロモータ、及び様々な植物プロモータ、例えばグロブリン−１が挙げられる。配列表に列挙されるポリヌクレオチド配列にとって野生型のプロモータが使用されてもよい。原核生物のプロモータの例としては、周知のプロモータからいくつか例を挙げると、ファージラムダＰＬプロモータ、大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ及びｔａｃプロモータが挙げられる。
【０１３０】
[00168]単離若しくは組み換えウイルス、ウイルス感染した細胞、又は本開示のポリヌクレオチド配列の１つ又は複数の部分を含む及び／又は本開示のアミノ酸配列の１つ又は複数の部分を発現する細胞も企図される。
【０１３１】
[00169]ポリヌクレオチドは、開示されるアミノ酸配列と異種起源の構造配列を場合によりコードしており、一般的に、標準的技術を使用して、発現のためのプロモータに操作可能に連結されるようにベクターに挿入される。操作可能に連結とは、本明細書で使用される場合、プロモータと二次配列との間の機能的連結への言及を含んでおり、機能的連結において、プロモータ配列は二次配列に対応するＤＮＡの転写を開始し、媒介する。一般的に、操作可能に連結されるとは、連結されているポリヌクレオチド配列が接近しており、必要に応じて２つのタンパク質のコーディング領域を接近させて同じリーディングフレーム内で合体させることを意味する。ポリヌクレオチドがポリペプチドの発現を意図するものであるとき、転写開始部位がリボソーム結合部位の５’側に適切に位置するようにポリヌクレオチドは配置される。リボソーム結合部位は、発現するポリペプチドの翻訳を開示するＡＵＧの５’側にあると予想される。一般的には、開始コドン、通常ＡＵＧから始まり、リボソーム結合部位と開始コドンとの間に位置するオープンリーディングフレームのみが存在すると予想される。また一般的には、ポリペプチドの最後に翻訳終止コドンが存在し、構築物内に真核生物宿主で使用するためのポリアデニル化シグナルが存在すると予想される。転写領域の３’末端に適切に配置された転写終止シグナルを、ポリヌクレオチド構築物に含めてもよい。
【０１３２】
[00170]ポリペプチドを発現するように設計した核酸構築物については、発現カセットにさらに５’リーダー配列を含めてもよい。そのようなリーダー配列は翻訳を増強するように作用しうる。翻訳リーダーは当該分野で公知であり、ピコルナウイルスリーダー、例えばＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’非コーディング領域）、Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６１２６−６１３０；ポティウイルスリーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓ）、Ａｌｌｉｓｏｎら（１９８６）；ＭＤＭＶリーダー（Ｍａｉｚｅ  Ｄｗａｒｆ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５４：９−２０；ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、Ｍａｃｅｊａｋら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：９０−９４；アルファルファモザイクウイルスのコートタンパク質ｍＲＮＡ（ＡＭＶ  ＲＮＡ  ４）由来の非翻訳リーダー、Ｊｏｂｌｉｎｇら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：６２２−６２５）；タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ）、Ｇａｌｌｉｅら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＲＮＡ、２３７−２５６頁；及びトウモロコシ退緑斑紋ウイルスリーダー（ＭＣＭＶ）Ｌｏｍｍｅｌら（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８１：３８２−３８５が挙げられる。Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａら（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ８４：９６５−９６８も参照されたい。カセットは、翻訳及び／又はｍＲＮＡ安定性を増強する配列、例えばイントロンを含んでもよい。発現カセットはさらに単離された対象ヌクレオチド配列の３’末端に、翻訳終結領域を含んでもよい。
【０１３３】
[00171]特別の細胞器官に向けられた、又は細胞表面で分泌されたポリヌクレオチド配列の発現産物を得ることが所望される場合には、発現カセットにさらに輸送ペプチドのためのコーディング配列を含めてもよい。輸送ペプチドは当該分野において周知であり、例えば、限定されないが、アシルキャリアタンパク質の一過性ペプチド、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット、植物ＥＰＳＰシンターゼなどが挙げられる。
【０１３４】
[00172]発現カセットを作製する際には、ポリヌクレオチド配列が適切な配向にあるように、及び必要に応じて適切なリーディングフレームにあるように、様々なＤＮＡ断片を操作することができる。この目的のために、アダプター又はリンカーを用いてＤＮＡ断片を連結することができ、又は他の操作手法を、好都合な制限部位、余剰ＤＮＡの除去、制限部位の除去などのために含めることができる。この目的のために、インビトロ突然変異誘発、プライマー修復、制限消化、アニーリング、及び再置換、例えば、転位、塩基置換などを利用してもよい。
【０１３５】
[00173]宿主細胞内への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、顕微鏡下注射、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、スクレープ負荷、遺伝子銃導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、感染又は他の方法によって実行することができる。そのような導入方法は、多くの標準実験マニュアル、例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、（１９８６）及びＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載されている。
【０１３６】
[00174]適切な宿主の代表的な例としては、連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌、ストレプトマイセス及びサルモネラ・ティフィムリウム細胞などの細菌細胞；酵母菌及びアスペルギルス細胞のような菌細胞、ショウジョウバエＳ２細胞及びスポドプテラＳｆ９細胞のような昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ及びＢｏｗｅｓメラノーマ細胞などの動物細胞、及び植物細胞が挙げられる。
【０１３７】
[00175]宿主細胞を従来の栄養培地で培養することができ、培地には、特にプロモータの活性化、形質転換体の選択、又は遺伝子増幅の目的で適切な改変を行ってもよい。当業者には明らかであると予想されるが、これまでに発現のために選択された宿主細胞で使用されていた例えば、温度、ｐＨなどの培養条件が、一般的に核酸及び／又はポリペプチドの発現にとって適切であると予想される。成熟タンパク質は、適切なプロモータの制御下で、哺乳類細胞、酵母、細菌、又は他の細胞において発現させることができる。無細胞翻訳系も、本明細書に開示されたポリヌクレオチドに由来するＲＮＡを使用してこのようなタンパク質を産生するために利用することができる。
【０１３８】
[00176]適切な宿主株を形質転換し、宿主株を選択されたプロモータが誘導可能な適切な細胞密度に成長させた後、適切な手段（例えば、温度変化又は化学誘導剤への曝露）で誘導を行い、細胞をさらなる期間、培養させる。次いで細胞を、典型的には、遠心分離によって回収し、物理的又は化学的手段によって破砕し、得られた粗抽出物をさらなる精製のために保持する。タンパク質の発現で使用する微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破砕、又は細胞溶解剤を含む、任意の好都合な方法の使用によって破砕することができ、そのような破砕方法は当業者にとって周知である。
【０１３９】
[00177]本開示の組成物及び方法には、本明細書で提供されるポリヌクレオチド及び／又はアミノ酸の投与を含むことができる。例えば、膠芽腫の治療には、１つ又は複数のポリヌクレオチド及び／又はアミノ酸の投与を含むことができる。１つ又は複数のポリヌクレオチド及び／又はアミノ酸は、単離された形態であってもよく、又は組成物、例えばウイルス粒子の一部であってもよい。様々な実施形態において、投与は、皮内、経皮、腸管外、血管内、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、局所、経皮的、気管内、腹腔内、動脈内、膀胱内、腫瘍内、吸入、潅流、洗浄、直接注入、食事による、経口、又は頭蓋内投与の形態をとることができる。投与の形式は、依存しうる。
【実施例】
【０１４０】
[00178]実施例
[00179]実施例１：非神経毒性ラブドウイルス及びインビトロ細胞傷害性の同定
[00180]インビボ神経毒性の測定：６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／／ｃマウスのグループ（ｎ＝３／グループ）に、提示のウイルスを１ｅ７ｐｆｕで単回頭蓋内（ＩＣ）注入した。ＩＣ注入後、マウスを、体重減少、立毛、後足麻痺及び呼吸困難を含む苦痛の徴候について毎日モニターした。
【０１４１】
[00181]図１は、提示のウイルスのＩＣ単回投与（１ｅ７ｐｆｕ）後のＢＡＬＢ／ｃマウスの生存を示す。ＶＳＶ、マラバウイルス（ＭＲ）又はカラジャス（Ｃａｒａｊａｓ）ウイルス（ＣＲＪ）をＩＣ注入処理したマウスは、１０日未満しか生存しなかったが、対照マウス（ＰＢＳ）並びにファーミントン（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ）（ＦＭＴ）、バイア・グランデ（ＢＧ）及びミュア・スプリングス（Ｍｕｉｒ  Ｓｐｒｉｎｇｓ）（ＭＳ）をＩＣ注入した他の全てのマウスはＩＣ注入後、３０日より長く１００％生存したことが示され、後者のウイルスが非神経毒能を有することを示した。カプラン・マイヤー生存プロットは、マンテル・コックス（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）ログランク分析（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ）を用いて比較した。
【０１４２】
[00182]本開示の著者は、野生型のＦＭＴ、ＢＧ及びＭＳの腫瘍溶解性を調査することに加えて、マラバウイルス（ＭＲＢ）と非神経毒性のウイルス（例えば、ＢＧ）とのキメラウイルスの生成により、両方の望ましい特性を有するウイルスが得られるであろうと推論した。ＢＧ由来の糖タンパク質をＭＲＢに置換して、ＢＧ糖タンパク質を有し、「マラバＢＧＧ」又は「ＭＲＢＧＧ」又は「ＭＲＢ−ＢＧ（Ｇ）」と称されるキメラマラバウイルス又はその変異型を作製し、配列番号１０の逆相補配列であるＲＮＡ配列を含めた。マラバウイルスなどのラブドウイルスは、その遺伝物質をネガティブセンス一本鎖ＲＮＡの形態で保有する。本明細書に開示するＲＮＡ配列は、ウイルス遺伝物質をコードするＲＮＡ鎖に相当し、従って、ラブドウイルスによって運ばれる遺伝的ＲＮＡの逆相補配列である。
【０１４３】
[00183]マラバＭＧＧウイルス粒子のゲノムは、マラバタンパク質Ｎ、Ｐ及びＬ並びにマラバタンパク質Ｍ及びバイア・グランデＧタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する。マラバタンパク質Ｎは、配列番号１に相当する配列を有する。マラバタンパク質Ｐは、配列番号２に相当する配列を有する。マラバタンパク質Ｌは、配列番号３に相当する配列を有する。マラバタンパク質Ｍは、配列番号４に相当する配列を有する。バイア・グランデＧタンパク質は、配列番号６に相当する配列を有する。
【０１４４】
[00184]別のキメラウイルスは、ＭＲＢ  Ｇ糖タンパク質をエボラ糖タンパク質と置換し、今度はより減弱化したマラバベクター（Δ５１ＭＲＢ）に組み入れて、「マラバＥｂＧ」又は「ＥｂＧ」と称されるキメラウイルス又はその変異型を作製し、配列番号１４の逆相補配列であるＲＮＡ配列を含めることにより生成した（図２Ａ参照）。マラバＥｂＧウイルス粒子のゲノムは、マラバタンパク質Ｎ、Ｐ及びＬ並びにマラバタンパク質Δ５１Ｍ及びエボラＧタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有している。マラバタンパク質Ｎは、配列番号１に相当する配列を有する。マラバタンパク質Ｐは、配列番号２に相当する配列を有する。マラバタンパク質Ｌは、配列番号３に相当する配列を有する。マラバタンパク質Δ５１Ｍは、配列番号５に相当する配列を有する。エボラＧタンパク質は、配列番号８に相当する配列を有する。
【０１４５】
[00185]本開示の著者は、マラバＥｂＧ変異型が、複製腫瘍溶解性ラブドウイルスにおけるキメラウイルスの治療範囲を増加させるだろうと仮定した（図２Ａ）。その理由は、エボラ−ザイール糖タンパク質で偽性したレンチウイルスベクターは、マウスＣＮＳにウイルス形質導入をもたらさなかったが、２９３Ｔ癌細胞株に形質導入する能力は保持していることが従前に実証されていたためである（Ｗａｔｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．、Ｋｏｂｉｎｇｅｒ，Ｇ．Ｐ．、Ｐａｓｓｉｎｉ，Ｍ．Ａ．、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．＆Ｗｏｌｆｅ，Ｊ．Ｈ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ  ｂｙ  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ  ｗｉｔｈ  ＶＳＶ，Ｅｂｏｌａ，Ｍｏｋｏｌａ，ＬＣＭＶ，ｏｒ  ＭｕＬＶ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ５、５２８−５３７（２００２）；及びＷａｔｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．、Ｐａｓｓｉｎｉ，Ｍ．Ａ．＆Ｗｏｌｆｅ，Ｊ．Ｈ．Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｏｒｏｉｄ  ｐｌｅｘｕｓ  ａｎｄ  ｅｐｅｎｄｙｍａ  ｉｎ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ  ｂｙ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ５  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １６、４９−５６（２００５）参照）。
【０１４６】
[00186]これらのキメラウイルスの殺傷能力を試験するために、野生型ウイルス単離株と比較して、細胞殺傷分析を、２つの正常なヒト２倍体細胞株の一次正常ヒト星状細胞（ＮＨＡ）及び一次線維芽細胞（ＧＭ３８）（図２Ｂ及び２Ｃ）、並びに一群の８つのＣＮＳ腫瘍細胞株ＳＦ２６８、ＳＮＢ１９、Ｕ１１８、Ｕ３４３、ＳＦ２９５、ＳＮＢ７５、ＳＦ５３９及びＵ３７３（図２Ｄ〜２Ｋ）に対して行った。
【０１４７】
[00187]細胞を、国立一般医科学研究所の変異細胞集積部門（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｓｅ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）（Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ）から取得し、１０％ウシ胎仔血清（Ｃａｎｓｅｒａ、Ｅｔｏｂｉｃｏｋｅ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を補足したダルベッコ改変イーグル培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）中で増殖させた。生存性アッセイは、提示の細胞株を用いて以下のように行った：細胞を、１００００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、翌日、野生型マラバ、野生型ＦＭＴ、野生型ＢＧ、減弱化マラバ、マラバＥｂＧ又はマラバＢＧＧのいずれかを様々な多重感染度（０．０００１〜１０ｐｆｕ／細胞）で感染させた。
【０１４８】
[00188]４８時間インキュベーションした後、アラマーブルー（レサズリンナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を最終濃度が２０μｇ／ｍｌとなるように添加した。６時間インキュベーションした後、吸光度を５７３ｎｍの波長で読み取った。野生型マラバはＧＢＭ細胞株の全てに対して非常に有効であったが、ＮＨＡとＧＭ３８の両方に対しても高い溶解性があった。対照的に、マラバＥｂＧ及び野生型ＢＧは、ＭＯＩ（１０ｐｆｕ）で正常細胞（ＮＨＡとＧＭ３８）には無害であり、腫瘍細胞株に対しては顕著に選択的な殺傷を実証した。キメラウイルス「ＭＲＢＧＧ」は、大半のＧＢＭ細胞株に対してマラバＥｂＧ又は野生型ＢＧよりも非常に強い効力を実証した一方で、正常線維芽細胞において良好な安全性を維持していた。野生型ＦＭＴは、最高の治療指数を実証し、大半のＧＢＭ株においてＭＲＢに匹敵する効力を有したが、一方でＮＨＡとＧＭ３８原発性細胞株で著しく減弱した。この結果は、野生型ＦＭＴ、並びにＢＧ又はエボラの糖タンパク質に対してキメラとなるように設計されたマラバウイルスが、脳癌細胞株に対して試験されたときに、強力で選択的な腫瘍溶解活性を示すことを実証する。
【０１４９】
[00189]実施例２：２つのマラバウイルスキメラのインビボでの安全性
[00190]野生型単離株（ＦＭＴ、ＢＧ及びＭＳ）並びにインビトロの非形質転換細胞中で減弱化を実証した２つのキメラウイルス（ＥｂＧ及びＭＲＢＧＧ）（実施例１参照）を用いて、観察された減弱化によりインビボでの安全性が説明されるかどうかを確認する試験を行った。これらのウイルスを動物に、低用量（１ｅ３ｐｆｕ）及び高用量（１ｅ７ｐｆｕ）の２つの用量で大脳内投与した（図３Ａ）。
【０１５０】
[00191]５つのウイルスは全て持続感染がなく、処理から１００日後に１００％の動物が生存し、安全であることが見出された。これらの２つの用量で、動物は、ウイルス感染に相応する一時的な体重減少と立毛を示したが、これらの症状は接種後５〜７日以内に解消された。対照的に、野生型又は減弱化したマラバ及びＶＳＶ株で同様のＩＣ用量を受けた動物は全て一週間以内に感染により死亡した（図３Ａ）。これらの動物は、急速及び進行性の体重減少並びに後脚麻痺を伴うＣＮＳ感染の臨床的徴候を示し、死亡直前に脳内で顕著なウイルス力価を有していた（データ示さず）。
【０１５１】
[00192]ウイルス力価を、野生型ＦＭＴ（ＩＣ及びＩＶ）及びキメラマラバウイルス（ＥｂＧ及びＭＲＢＧＧ）による処理から３か月後の動物脳においてプラークアッセイにより測定した。プラークアッセイは、６ウェルの皿に５ｅ５細胞／ウェルの密度で播種したベロ細胞を用いて実施した。翌日、１００μｌの連続ウイルス希釈液を調製し、１時間かけてベロ細胞に添加した。ウイルス吸着後、２ｍｌのアガロースオーバーレイを添加し（１：１の１％アガロース：２×ＤＭＥＭ及び２０％ＦＣＳ）、翌日、プラークを計数した。ウイルスはＩＣ感染から３ヶ月後において動物脳内で検出されなかった（図３Ｂ）。
【０１５２】
[00193]さらに、脳内に高用量のＦＭＴ（１ｅ７ｐｆｕ）及びＭＲＢＧＧ（１ｅ７ｐｆｕ）を投与後、細胞死又は炎症反応の徴候は見られず、生理食塩水が注入された対照マウスと同等の結果であった（図３Ｃ）。この結果は、炎症細胞、縮合核及び穿孔形態の著しい増加を示した野生型ＭＲＢ注入マウスと劇的に異なっていた。
【０１５３】
[00194]ＦＭＴ、ＢＧ又はＭＳを用いたＩＣ処理に起因する急性神経毒性は生じなかったが、認知及び運動機能の評価をウイルス感染から数日後に実施した。運動機能をこれらの３つの野生型ウイルスによる処理の前後に評価した（図３Ｄ）。Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、ウイルスＩＣ投与に先立って、運動機能／回転ロッド装置上の行動に関して試験した。マウスを、ロトロッド上に配置して１日当たり３回の試行を４日間連続して行った。動物を装置に０．５分間慣れさせた後、ロッドを直線的に０．１ｒｐｍ／ｓで加速した。落下するまでのレイテンシを数分間測定して、動物を３つのグループに分類した。運動機能を、未処理（注入せず）、ＰＢＳ、ＦＭＴ、マラバＥｂＧ、ＢＧ、ＭＲＢＧＧ及びＭＳ  ＩＣ処理動物において、注入後１週間、評価した。平均標準誤差を計算した。詳細には、落下までのレイテンシに、偽感染マウスとウイルス感染マウスとの間で注入１週間前及び１週間後において顕著な差異はない（図３Ｄ）。
【０１５４】
[00195]頭蓋内毒性に加えて、ＦＭＴとＭＲＢＧＧの毒性を、免疫不全マウスにウイルス量を増加させながら静脈内（ＩＶ）投与して評価した（図３Ｅ）。ＭＲＢＧＧは、最大３ｅ８ｐｆｕの用量まで耐容性があり、野生型マラバの公開された結果よりも１桁高いＩＶの安全性を有することを実証している。ＦＭＴはＩＶで十分な忍容性があり、以前記述されたマラバの減弱型ウイルス（Ｂｒｕｎ，Ｊ．ら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｍａｒａｂａ  Ｖｉｒｕｓ  ａｓ  ａｎ  Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １８、１４４０（２０１０））に匹敵する最も高用量の３ｅ９ｐｆｕでさえ、決してＬＤ５０に達しない。３ｅ８ｐｆｕより高用量でＩＶ投与したＦＭＴ動物は、一過性の体重減少と中程度の立毛を示したが、処理後５〜７日間で解消した（図示せず）。
【０１５５】
[00196]実施例３：マラバウイルスキメラのインビボ有効性
[00197]キメラマラバウイルスのインビボ有効性を膠芽腫マウスモデルにおいても測定した。ヒト膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧのインビトロでのウイルス感染に対する感受性を測定した。ＦＭＴ及び野生型マラバは、Ｕ８７ＭＧ細胞殺傷において同等の効力を有し、ＥＣ５０スコアは多重感染度０．００１未満であった（データ示さず）。さらに、マラバウイルスキメラ（マラバＥｂＧ、マラバＢＧＧ）及びＢＧ野生型は、インビトロにおいてＵ８７ＭＧ細胞殺傷においても効力を有し、ＥＣ５０スコアは多重感染度０．１未満であった（データ示さず）。
【０１５６】
[00198]ヒトＵ８７ＭＧ膠腫細胞を生物発光イメージング用に適合させた後で、無胸腺マウスで大脳内Ｕ８７ＭＧ膠腫モデルを確立し、本開示によるマラバウイルスキメラのＩＶ有効性をこのモデルで調べた（図４Ａ〜Ｃ）。ヒト膠芽腫異種移植片モデルにおいて、膠芽腫Ｕ８７ＭＧ細胞を、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬＵＣ）を含有し、ＦＬＵＣプラスミドをトランスフェクトするレンチウイルスでそれぞれ形質移入することによって生物発光イメージング用に適合させた。Ｕ８７ＭＧ  ＦＬＵＣ細胞をＣＤ１ヌードマウスにＩＣ注入した。未処理ＣＤ−１動物では、約１５〜２１日目で腫瘍が発生する。
【０１５７】
[00199]ＦＬＵＣ発現腫瘍を有する動物を、ルシフェリン（Ｇｏｌｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ）のＩＰ注入後、ＩＶＩＳ  Ｘｅｎｏｇｅｎ２００システムのライブ画像を使用して腫瘍進行をモニターした。動物を生存、体重減少、病的状態、立毛、後足麻痺及び呼吸困難を含む苦痛の徴候に関してモニターした。最初の処理から３日後に、腫瘍負荷の著しい減少が観察され、最大効果が７日目に観察された（図４Ａ及びＢ）。しかしながら１４日までに腫瘍が再発し始めた。さらに、マラバウイルスキメラで静脈内処理した後、死までの時間が延びることが観察された（図４Ｃ）。興味深いことに、このモデルのマラバウイルスキメラ処理動物における脊椎転移は、全ての腫瘍担持動物において完全に消失している。対照的にＵＶ不活化ウイルスで処理した動物は７日までに腫瘍負荷が顕著に増加し、この７日目から脳腫瘍による神経学的症状が現れ始めた。ＩＶ処理した動物は全て処理に反応し、８匹のうち３匹は永続的に治癒し、処理後１００日を超えて生存した。
【０１５８】
[00200]実施例４：他のマラバウイルスキメラの調査
[00201]水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は強力な腫瘍溶解性ラブドウイルスである。
しかしながら、神経向性及び続いての神経毒性並びに非常に有力なｎＡｂ反応がＶＳＶ治療に関連して問題となる。この本来的な神経毒性により、臨床用の候補としての検討は進まなかった。
【０１５９】
[00202]本来的な神経毒性は糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）によって媒介されると考えられている。しかしながら、典型的にＶＳＶ−Ｇを使用するレンチウイルスベクターはリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスＧタンパク質（ＬＣＭＶ−Ｇ）でのシュードタイピングを介して減弱化した神経毒性を示した（Ｂｅｙｅｒら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６：１４８８−１４９５、２００２；及びＶｏｎ  Ｌａｅｒの米国特許出願公開第２０１１／０２５０１８８号）。ＬＣＭＶは、エンベロープ型ネガティブセンスＲＮＡウイルスのアレナウイルスファミリーのプロトタイプの一員である。本開示の著者は、マラバウイルスの神経毒性が、糖タンパク質（マラバ−Ｇタンパク質）をＬＣＭＶ−Ｇタンパク質で置換することで減弱化しうるかもしれないと仮定した。ＬＣＭＶ−Ｇタンパク質を有するキメラマラバウイルスは、ＭＲＢ  Ｇ糖タンパク質をＬＣＭＶ糖タンパク質に置換して、「マラバＬＣＭＶ−Ｇ」又は「マラバＬＣＭＶ（Ｇ）」と称されるキメラウイルスを作製し、配列番号１２の逆相補配列であるＲＮＡ配列を含めることにより生成した（図２Ａ参照）。
【０１６０】
[00203]マラバＬＣＭＶ−Ｇウイルス粒子のゲノムは、マラバタンパク質Ｎ、Ｐ及びＬ並びにマラバタンパク質Ｍ及びＬＣＭＶ−Ｇタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有している。マラバタンパク質Ｎは、配列番号１に相当する配列を有する。マラバタンパク質Ｐは、配列番号２に相当する配列を有する。マラバタンパク質Ｌは、配列番号３に相当する配列を有する。マラバタンパク質Ｍは、配列番号４に相当する配列を有する。ＬＣＭＶ−Ｇタンパク質は、配列番号７に相当する配列を有する。
【０１６１】
[00204]マラバキメラウイルスの作製と回収を以下のようにして行った。野生型組み換えマラバウイルスゲノムをコードするプラスミド（Ｂｒｕｎら、２０１０）を、標準的ＤＮＡクローニング方法によって、マラバ糖タンパク質配列がバイア・グランデウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）又はファーミントンウイルス由来の糖タンパク質配列によって置換されるように、改変した。簡潔には、Ｎｏｔｌ制限部位を、マラバＧ配列の終止コドンの直後に、ＰＣＲに基づく突然変異誘発によって導入した。この新しく導入されたＮｏｔｌ部位と、ＭとＧタンパク質配列間の既存のＫｐｎｌサイトを使用して、マラバＧを制限消化によって除去し、ｐＭＲＢ（−Ｇ）−Ｋｐｎｌ／Ｎｏｔｌを生成した。ファーミントン及びバイア・グランデの両方の糖タンパク質配列を増幅するプライマーに５’Ｋｐｎｌ及び３’Ｎｏｔｌ制限部位を導入するように設計した。これらの配列をＰＣＲによって増幅し、ｐＭＲＢ（−Ｇ）−Ｋｐｎｌ／Ｎｏｔｌに連結した。ＬＣＭＶ糖タンパク質前駆配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＥＦ１６４９２３．１）は５’Ｋｐｎｌ及び３’Ｎｏｔｌ部位を導入して合成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）。このＤＮＡ断片を上記ｐＭＲＢ（−Ｇ）−Ｋｐｎｌ／Ｎｏｔｌに連結したところ、ｐＭＲＢ−ＬＣＭＶ−Ｇ、ｐＭＲＢ−ＢＧ−Ｇ及びｐＭＲＢ−ＦＭＴ−Ｇになった。
【０１６２】
[00205]さらに、ファーミントンウイルスの組み換えゲノムを、国際出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０５０３８５号に記載されているように、野生型ファーミントン糖タンパク質をマラバ糖タンパク質に置換することによって改変し、同様の方法で上記のマラバ糖タンパク質変異型を作製した。
【０１６３】
[00206]組み換えマラバウイルス粒子［ＭＲＢＧＧ、ＭＲＢ  ＦＭＴＧ、ＭＲＢ  ＬＣＭＶＧ］を、従前に記載された技術（Ｂｒｕｎら、２０１０）を使用して、上述の改変マラバゲノムプラスミドから生成した。簡潔には、Ａ５４９細胞に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ発現ワクシニアウイルスを、ＭＯＩが１０で１．５時間感染した。続いて細胞に、リポフェクタミン２０００により、マラバＮ、Ｐ及びＬタンパク質をコードするｐＣＩ−Ｎｅｏ構築物と共に上述の改変組み換えマラバゲノムプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、培地を除去し、０．２μｍフィルタを通して濾過し、濾物を使用してＳＮＢ１９細胞に感染させた。４８時間後にうまく回収されたもので細胞変性作用が観察され、次いでウイルスをベロ細胞で３回プラーク精製した。初期トランスフェクションにファーミントンＮ、Ｐ及びＬタンパク質をコードするｐＦＭＴ−ＭＲＢ−Ｇ及びＰＣＩ−Ｎｅｏ構築物を含有させたことを除いては、上記と同様の方式でＦＭＴ−ＭＲＢ−Ｇウイルスを生成した。
【０１６４】
[00207]組み換えウイルスに、プラーク精製を３回（ＳＮＢ１９細胞で）実施して、次いでスケールを上げ、ショ糖クッションで精製し、１５％グルコースを含有するＰＢＳで再懸濁した。
【０１６５】
[00208]ヒト膠芽腫（星状細胞腫）細胞（Ｕ８７ＭＧ、ＳＦ２６８、Ｕ１１８、Ｕ３７３、Ｕ３４３、ＳＮＢ１９、２種の原発性患者ＧＢＭ細胞試料）のパネルで様々なウイルスの相対的細胞傷害性を測定した。提示の細胞株を、９６ウェルプレート中に播種した（１ｅ４細胞／ウェル）。翌日、細胞を様々なＭＯＩ（０．０００１〜１０ｐｆｕ／細胞）で、以下に提示のウイルスにより感染させた：野生型ＢＧ、野生型ＦＭＴ、ＶＳＶ  ＬＣＭＶＧ（「ＶＳＶ（ＬＣＭＶ  Ｇ）」）、ＭＲＢ  ＢＧＧ（「ＭＲＢ（ＢＧＧ）」）、又はＭＲＢ  ＬＣＭＶＧ（「ＭＲＢ（ＬＣＭＶ  Ｇ）」）。９６時間インキュベーションした後、アラマーブルー（レサズリンナトリウム塩（（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を最終濃度が２０μｇ／ｍｌとなるように添加した。６時間のインキュベーション後、吸光度を５７３ｎｍの波長で読み取った。細胞代謝活性（Ｃｅｌｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）をプロットし、多重感染度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、ＭＯＩ）ＥＣ５０値を測定し、以下のような範囲で評定した：１＝ＭＯＩ＜０．０１；２＝ＭＯＩ＜０．１；３＝ＭＯＩ＜１；４＝ＭＯＩ＜１０；５＝ＭＯＩ＞１０；６＝耐性。８個全ての膠腫株についてＥＣ５０スコアの平均を、各ウイルスについてプロットした（図５）。ＭＲＢ−ＬＣＭＶＧキメラは、ＭＲＢＢＧ及びＶＳＶ−ＬＣＭＶＧキメラ又は野生型非神経毒性ＢＧ及びＦＭＴウイルスと比較して、最小のＥＣ５０値（従って、脳癌細胞株に対する腫瘍溶解活性に関して最高効力）を示した。
【０１６６】
[00209]実施例５：他のラブドウイルスキメラのインビボでの安全性
[00210]インビボでの神経毒性を測定するために、６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／／ｃマウスグループ（ｎ＝２〜１０／グループ）に、提示のウイルスを１ｅ７ｐｆｕで単回頭蓋内（ＩＣ）注入した。全身麻酔薬（イソフルラン）の投与後、マウスを手術のために頭を剃って準備し、クロルヘキシジン消毒剤を頭皮に塗布し、抗菌性軟膏で目を覆い、耳に局所麻酔薬を塗布した。次いで、マウスを定位でマウント上に置き、耳棒を使用して固定した。メスで頭皮の中線に０．５ｃｍの切り込みを入れ、頭の頂部を露出させた。使い捨て２３Ｇ針を使用して、頭の右側、冠状縫合のおよそ０．５ｍｍ上及び矢状縫合から２ｍｍのところに穴を設けた。１０μＬの硝子製ハミルトン注射器に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈したウイルスを充填し、固定したシリンジポンプ上にマウントした。針を４ｍｍの深さで挿入し、３０秒後に０．５ｍｍ引き戻した。次いで、ウイルス（１ｅ７ｐｆｕの用量）を、５μＬ／分の速度で脳へ注入した。３０秒の待機期間後、針を引き出し、頭皮を獣医学用接着剤で合わせ、マウスを保育器中で全身麻酔から回復させた。マウスに、手術後７２時間、術後の疼痛制御（ブプレノルフィン）を行い、その間１２時間毎に体質量を測定し、健康評価を行った。
【０１６７】
[00211]図６Ａは、提示のウイルス（１ｅ７ｐｆｕ）を単回ＩＣ投与した後のＢＡＬＢ／ｃマウスのカプラン・マイヤー生存プロットを示す。生存プロットを、マンテル・コックスログランク分析（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ）を用いて比較した。野生型マラバウイルス（ＭＲＢ−ＷＴ）又はマラバ−Ｇタンパク質を有するキメラファーミントンウイルス（ＦＭＴ−ＭＲＢ（Ｇ））のＩＣ注入で処理した動物は１０日未満しか生存しなかったが、野生型ファーミントン（ＦＭＴ−ＷＴ）、マラバＬＣＭＶ−Ｇ及びマラバＢＧＧのＩＣ注入で処理したマウスは、ＩＣ注入後３０日で１００％生存を示し、それらのウイルスの非神経毒性能を示した。ファーミントンＧタンパク質を有するキメラマラバウイルス（ＭＲＢ−ＦＭＴ（Ｇ））は、ＩＣ注入後３０日での生存は１００％に満たなかったことが示されたが、対照と比較して生存性は増加した。キメラＭＲＢ−ＦＭＴ（Ｇ）で処理した動物は、体質量の喪失により初期に安楽死させられた２匹のマウスのために中間的な生存率を示した。
【０１６８】
[00212]ＭＲＢ−ＦＭＴ（Ｇ）ウイルス粒子は、ウイルスが宿主細胞内にあるとき、配列番号１５を含むｃＤＮＡポリヌクレオチドを産生する。ＭＲＢ−ＦＭＴ（Ｇ）ウイルス粒子は、配列番号１６の逆相補配列であるＲＮＡ配列を含んでいる。ＭＲＢ−ＦＭＴ（Ｇ）ウイルスのゲノムは、マラバタンパク質Ｎ、Ｐ及びＬ並びにマラバタンパク質Ｍ及びファーミントンＧタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有している。マラバタンパク質Ｎは、配列番号１に相当する配列を有する。マラバタンパク質Ｐは、配列番号２に相当する配列を有する。マラバタンパク質Ｌは、配列番号３に相当する配列を有する。マラバタンパク質Ｍは、配列番号４に相当する配列を有する。ファーミントン−Ｇタンパク質は、配列番号１７に相当する配列を有する。
【０１６９】
[00213]ＦＭＴ−ＭＲＢ（Ｇ）ウイルス粒子は、ウイルスが宿主細胞内にあるとき、配列番号１８を含むｃＤＮＡポリヌクレオチドを産生する。ＦＭＴ−ＭＲＢ（Ｇ）ウイルス粒子は、配列番号１９の逆相補配列であるＲＮＡ配列を含んでいる。ＦＭＴ−ＭＲＢ（Ｇ）ウイルスのゲノムは、ファーミントンタンパク質Ｎ、Ｐ及びＬ並びにファーミントンタンパク質Ｍ及びマラバＧタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有している。ファーミントンタンパク質Ｎは、配列番号２０に相当する配列を有する。ファーミントンタンパク質Ｐは、配列番号２１に相当する配列を有する。ファーミントンタンパク質Ｌは、配列番号２２に相当する配列を有する。ファーミントンタンパク質Ｍは、配列番号２３に相当する配列を有する。マラバ−Ｇタンパク質は、配列番号２４に相当する配列を有する。
【０１７０】
[00214]図６Ｂは対応する体質量の変化を示す。動物は全て処理後３〜５日で体質量の初期減少を示した。野生型ＦＭＴ又はキメラＭＲＢＧＧ若しくはＭＲＢ  ＬＣＭＶＧのＩＣ注入で処理した動物において、体質量の低下は一時的であり、処理後２０〜２５日の間で初期体質量を回復した。キメラＭＲＢ  ＦＭＴＧで処理したグループで生存していた３匹の動物は、同時期に体質量の中程度の回復を示した。
【０１７１】
[00215]図６Ａ及び６Ｂは、（ｉ）非神経毒性ウイルスのファーミントンウイルスが、Ｇタンパク質を神経毒性ウイルスのマラバウイルス由来の野生型Ｇタンパク質で置換することで神経毒性となりうること、及び（ｉｉ）神経毒性ウイルスのマラバウイルスは、Ｇタンパク質を、任意の非神経毒性ウイルス由来のＧタンパク質で置換することでは非神経毒性とはならないこと、その理由としてファーミントンウイルス由来のＧタンパク質を用いて置換しても非神経毒性は付与されないこと（明確にいえば、マラバウイルスは、Ｇタンパク質を、特定の非神経毒性Ｇタンパク質で置換すると非神経毒性となること）を示している。
【０１７２】
[00216]実施例６：本開示によるマラバキメラウイルス及び対照ウイルスのインビボ有効性
[00217]キメラウイルスのインビボ有効性を膠芽腫マウスモデルでも測定した。６〜８週齢のＣＤ−１ヌードマウスに、１ｅ６で、Ｕ８７ＭＧ−Ｆｌｕｃ細胞（ホタルルシフェラーゼを発現するようにレンチウイルスを形質導入したヒト膠芽腫細胞）を、上記のように頭蓋内注入した。１週間後に、マウスをインビボ画像化システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ２００画像システム、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して画像化し、５つのグループが脳内で確立されている腫瘍からのホタルルシフェラーゼ発現レベルが同様であるように分けた。簡潔には、マウスにイソフルランを使用して麻酔をかけ、ルシフェリン溶液を注入し（２ｍｇ／マウス）、ＩＶＩＳ装置に配置した。画像を撮り、発光を製造業者のソフトウェア（Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ（登録商標）、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して定量した。各マウスからの腫瘍シグナルは、曝露からのバックグラウンドシグナルに対して標準化した。この処理前の値に１００％の値を割り当て、それに続く全ての値はこの開始点と比較した。翌日、提示のウイルスをマウスに前述のように定位で注入した（１ｅ７ｐｆｕの用量、又は対照としてのリン酸緩衝生理食塩水）。マウスを１週間隔で５週間、ＩＶＩＳによって画像化し、この５週間の間に、認可されている腫瘍関連健康指標により、マウスを規制ガイドラインに従って安楽死させた。
【０１７３】
[00218]図７Ａは、対照ウイルスと比較した本開示によるマラバキメラのインビボ有効性を説明するグラフである。グラフは、処理後のＵ８７ＭＧ腫瘍を有するＣＤ−１ヌードマウスのカプラン・マイヤー生存プロットを示している。ＦＭＴ−ＭＲＢ（Ｇ）及びＭＲＢ−ＦＭＴ（Ｇ）で処理した動物は、ＩＣ注入後２０日より長いが３０日未満しか生存しなかった。ＰＢＳで処理した動物は、ＩＳ注入後、腫瘍で死ぬまで、約３０日間生存した。ＭＲＢ−ＢＧＧで処理した動物は、ＩＣ注入後３０日で５０％以上の生存を示した。野生型ＢＧを用いた処理は、ＩＣ注入後３０日で７５％を超える生存を示した。ＭＲＢ−ＬＣＭＶ（Ｇ）、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ（Ｇ）及びＦＭＴ−ＷＴを用いた処理は、ＩＣ注入後３０日で１００％生存を示した。図７Ｂは、図７Ａの動物の体重の変動を示すグラフである。動物は全て処理後３〜５日で体質量の初期減少を示した。野生型ＦＭＴ、ＢＧ又はキメラＭＲＢ  ＬＣＭＶＧ若しくはＶＳＶ  ＬＣＭＶＧのＩＣ注入で処理した動物において、体質量の低下は一時的であり、処理後２０日までに初期体質量を回復した。キメラＭＲＢ  ＦＭＴＧ若しくはＦＭＴ  ＭＲＢＧ、又はＰＢＳ対照で処理した動物は、同時期で体質量の回復を示さなかった。詳細な結果を図８〜１５に示す。
【０１７４】
[00219]図８Ａは、ヒトＵ８７ＭＧ異種移植モデルにおけるＰＢＳ対照のインビボ有効性を説明するＵ８７ＭＧ腫瘍のＩＶＩＳ画像である。画像は、処理前及び処理後（１週、２週、３週、４週）の腫瘍を示す。図８Ｂは、未処理の対照動物における経時的な腫瘍負荷の著しい増加を説明する流動プロットである。
【０１７５】
[00220]図９Ａは、ヒトＵ８７ＭＧ異種移植モデルにおけるＢＧ野生型（ＢＧ−ＷＴ）ウイルス処理のインビボ有効性を説明するＵ８７ＭＧ腫瘍のＩＶＩＳ画像である。画像は、ＢＧ処理（１用量、１ｅ７ｐｆｕ：ＩＣ）の後（１週、２週、３週、４週）のＵ８７ＭＧ腫瘍を示す。図９Ｂは、ＢＧのＩＣ投与（１ｅ７ｐｆｕ）に応答する初期の中程度の腫瘍退縮と後の腫瘍負荷の再発を図示する流動プロットである。
【０１７６】
[00221]図１０Ａは、ヒトＵ８７ＭＧ異種移植モデルにおける  ＦＭＴ野生型（ＦＭＴ−ＷＴ）ウイルス処理のインビボ有効性を説明するＵ８７ＭＧ腫瘍のＩＶＩＳ画像である。画像は、ＦＭＴ−ＷＴ処理（１用量、１ｅ７ｐｆｕ：ＩＣ）の後（１週、２週、３週、４週）のＵ８７ＭＧ腫瘍を示す。図１０Ｂは、ＦＭＴ−ＷＴのＩＣ投与（１ｅ７ｐｆｕ）に応答する顕著な腫瘍退縮を実証する流動プロットである。
【０１７７】
[00222]図１１Ａは、ヒトＵ８７ＭＧ異種移植モデルにおけるＭＲＢ  ＢＧ（Ｇ）処理のインビボ有効性を説明するＵ８７ＭＧ腫瘍のＩＶＩＳ画像である。画像は、ＭＲＢ  ＢＧ（Ｇ）処理（１用量、１ｅ７ｐｆｕ：ＩＣ）の後（１週、２週、３週、４週）のＵ８７ＭＧ腫瘍を示す。図１１Ｂは、ＭＲＢ  ＢＧＧのＩＣ投与（１ｅ７ｐｆｕ）に応答する中程度の腫瘍退縮を図示する流動プロットである。
【０１７８】
[00223]図１２Ａは、ヒトＵ８７ＭＧ異種移植モデルにおけるＭＲＢ  ＦＭＴ（Ｇ）処理のインビボ有効性を説明するＵ８７ＭＧ腫瘍のＩＶＩＳ画像である。画像は、ＭＲＢ  ＦＭＴ（Ｇ）処理（１用量、１ｅ７ｐｆｕ：ＩＣ）の後（１週、２週、３週）のＵ８７ＭＧ腫瘍を示す。図１２Ｂは、ＭＲＢ  ＦＭＴ  ＧのＩＣ投与（１ｅ７ｐｆｕ：ＩＣ）に応答する顕著な腫瘍退縮を実証する流動プロットである。しかしながら、動物は全て、処理後４週間経過する前にＭＲＢ  ＦＭＴ（Ｇ）の神経毒性作用により死亡した。
【０１７９】
[00224]図１３Ａは、ヒトＵ８７ＭＧ異種移植モデルにおけるＦＭＴ  ＭＲＢ（Ｇ）処理のインビボ有効性を説明するＵ８７ＭＧ腫瘍のＩＶＩＳ画像である。画像は、ＦＭＴ  ＭＲＢ（Ｇ）処理（１用量、１ｅ７ｐｆｕ：ＩＣ）の後（１週、２週、３週）のＵ８７ＭＧ腫瘍を示す。図１３Ｂは、ＦＭＴ  ＭＲＢ（Ｇ）のＩＣ投与（１ｅ７ｐｆｕ）に応答する顕著な腫瘍退縮を図示する流動プロットである。しかしながら、動物は全て、処理後４週間経過する前に、ＦＭＴ  ＭＲＢ  Ｇの神経毒性作用により死亡した。
【０１８０】
[00225]図１４Ａは、ヒトＵ８７ＭＧ異種移植モデルにおけるＶＳＶ−ＬＣＭＶ（Ｇ）処理のインビボ有効性を説明するＵ８７ＭＧ腫瘍のＩＶＩＳ画像である。画像は、ＶＳＶ  ＬＣＭＶ  Ｇ処理（１用量、１ｅ７ｐｆｕ：ＩＣ）後（１週、２週、３週、４週）のＵ８７ＭＧ腫瘍を示す。図１４Ｂは、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ（Ｇ）のＩＣ投与（１ｅ７ｐｆｕ）に応答する顕著な腫瘍退縮を図示する流動プロットである。
【０１８１】
[00226]図１５Ａは、ヒトＵ８７ＭＧ異種移植モデルにおけるＭＲＢ−ＬＣＭＶ（Ｇ）処理のインビボ有効性を説明するＵ８７ＭＧ腫瘍のＩＶＩＳ画像である。画像は、ＭＲＢ  ＬＣＭＶ  Ｇ処理（１用量、１ｅ７ｐｆｕ：ＩＣ）後（１週、２週、３週、４週）のＵ８７ＭＧ腫瘍を示す。図１５Ｂは、ＭＲＢ  ＬＣＭＶ（Ｇ）のＩＣ投与（１ｅ７ｐｆｕ）に応答する顕著な腫瘍退縮を図示する流動プロットである。
【０１８２】
[00227]実施例７：マラバキメラウイルスに対する中和抗体反応
[00228]提示のウイルスに対する中和抗体の存在を定量するためのアッセイは、従前に記述された方法（Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｔｒａｉｎｓ、Ｊ−Ｓ  Ｄｉａｌｌｏら、Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ  ７９７（２０１２））に従って実施した。
【０１８３】
[00229]簡潔には、０日目に、６〜８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスから５０μｌの伏在静脈血液をヘパリン被覆チューブへと回収し、遠心分離し、血清を取り出した。続いて、１グループ当たり３匹の動物に１ｅ７ｐｆｕの提示のウイルスの尾静脈への注入により静脈内注入した。マウスを再び出血させ、次いで７日目に、０日目と同様にして注入した。マウスを最終時間の１４日目に、末端心穿刺によって出血させた。動物由来の３時間点（０、７、１４日目）それぞれからの血清を、初期希釈１／５０として９６ウェルプレートにわたって１：２で段階希釈した。各血清含有ウェルに、２．５ｅ４ｐｆｕ／ウェルでウイルスを注入して１時間インキュベートすることにより、１／１００の初期血清希釈液を得た。次いで、血清とウイルスとの混合物を、前日に１．２５ｅ４ベロ細胞／ウェルを播種した９６ウェルプレートに加えた。２日後、細胞変性作用（ＣＰＥ）の証拠に関して顕微鏡検査によって単層を評価した。５０パーセントＣＰＥでの最も低い希釈液により、特定のサンプルに対する中和抗体力価が明確に決定された。
【０１８４】
[00230]図１６は、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ（Ｇ）若しくはマラバ−ＬＣＭＶ（Ｇ）キメラウイルスと比較した減弱化ＶＳＶ（ＶＳＶ−Δ５１）又は野生型マラバウイルス（ＭＲＢ−ＷＴ）で処理したＢａｌｂ／Ｃマウスにおける中和抗体力価を図示するグラフである。野生型ＭＲＢ及びＶＳＶΔ５１（減弱化）は著しい中和抗体力価を引き起こしたが、一方、対応するキメラＶＳＶ−ＬＣＭＶ（Ｇ）及びＭＲＢ−ＬＣＭＶ（Ｇ）は中和抗体応答を引き起こさなかった。１４日目のマウス由来血清にもレシプロカル負荷を行った。野生型ＭＲＢ、ＶＳＶ  Δ５１（減弱化）（ＶＳＶ−ＬＣＭＶ（Ｇ））、ＭＲＢ−ＬＣＭＶ（Ｇ）のそれぞれから回収した血清に、それぞれＭＲＢ−ＬＣＭＶ（Ｇ）、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ（Ｇ）、ＶＳＶ−Δ５１（減弱化）及び野生型ＭＲＢを負荷した。全ての場合で中和抗体応答は顕在化しなかった。
【０１８５】
[00231]実施例８：産生細胞中のキメラウイルス力価
[00232]提示のウイルスを作製するために、各ウイルスを、ベロ細胞のサブコンフルエントな単層を備えた４０枚の１５ｃｍのプラスチック組織培養プレートに多重感染度０．０１で接種した。２０時間後に、培地を回収し、ウイルスを精製し、Ｄｉａｌｌｏら、２０１２に従って滴定した。収率を計算し、それぞれのＬＣＭＶ（Ｇ）キメラを親野生型と比較した。親株と比較したとき、ＭＲＢ−ＬＣＭＶ（Ｇ）ウイルスは、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ（Ｇより２倍多く産出された（ＶＳＶ−ＬＣＭＶＧの野生型ＶＳＶに対する力価比率は０．０２８；それと比べて、ＭＲＢ−ＬＣＭＶ（Ｇ）の野生型ＭＲＢに対する力価比率は０．０６７））。
【０１８６】
[00233]上述の記載においては、説明の目的で、多数の詳細を実施例の完全な理解を提供するために明らかにした。しかしながら、当業者には、これらの特別な詳細が必須ではないことが明らかであろう。上記実施例は例示を意図するものにすぎない。本明細書に添付の特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を逸脱することなく、当業者によって変更、修正及び変化を特定の実施形態になすことができる。
【図１】
2016501528.tif 000004
【図２Ａ】
2016501528.tif 000005
【図２Ｂ】
2016501528.tif 000006
【図２Ｃ】
2016501528.tif 000007
【図２Ｄ】
2016501528.tif 000008
【図２Ｅ】
2016501528.tif 000009
【図２Ｆ】
2016501528.tif 000010
【図２Ｇ】
2016501528.tif 000011
【図２Ｈ】
2016501528.tif 000012
【図２Ｉ】
2016501528.tif 000013
【図２Ｊ】
2016501528.tif 000014
【図２Ｋ】
2016501528.tif 000015
【図３Ａ】
2016501528.tif 000016
【図３Ｂ】
2016501528.tif 000017
【図３Ｃ】
2016501528.tif 000018
【図３Ｄ】
2016501528.tif 000019
【図３Ｅ】
2016501528.tif 000020
【図４Ａ】
2016501528.tif 000021
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
2016501528.tif 000024
【図６Ａ】
2016501528.tif 000025
【図６Ｂ】
2016501528.tif 000026
【図７Ａ】
2016501528.tif 000027
【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
2016501528.tif 000029
【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
2016501528.tif 000031
【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
2016501528.tif 000033
【図１０Ｂ】
2016501528.tif 000034
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
2016501528.tif 000037
【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
2016501528.tif 000039
【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
2016501528.tif 000041
【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
2016501528.tif 000043
【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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