(57)【要約】  疼痛の処置に、それぞれ単独で、またはオルソステリックオピオイド受容体アゴニストと併用して有用であり得る、μ−（μ）−オピオイド受容体に対するポジティブアロステリックモジュレーター（ＰＡＭ）およびサイレントアロステリックモジュレーター（ＳＡＭ）を開示する。疼痛の処置方法およびｍｕ（μ）−オピオイド受容体の調節方法もまた開示する。
2016509671.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ポジティブアロステリックモジュレーターである試験化合物および低濃度のμ−選択的オルソステリックアゴニストを、それぞれ単独で、または式Ｉで示されるサイレントアロステリック化合物（ＢＭＳ−９８６１２３）と共に細胞に添加し、
（ｉｉ）該μ−選択的オルソステリックアゴニストおよび該試験化合物の、それぞれ単独での、または該式Ｉの化合物の存在下での、該細胞に対する効果を測定し、そして
（ｉｉｉ）該式Ｉの化合物が、該試験化合物のポジティブアロステリックアゴニスト活性の低減により証明されて、該試験化合物との競合的結合を示すとき、該試験化合物がポジティブアロステリックモジュレーターであると同定する
工程を含む、μ−オピオイド受容体ポジティブアロステリックモジュレーターを同定するためのスクリーニング方法。
【請求項２】
低濃度のμ−選択的オルソステリックアゴニストが、
（ａ）該細胞において計算されたＥＣ８０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｂ）該細胞において計算されたＥＣ７０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｃ）該細胞において計算されたＥＣ６０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｄ）該細胞において計算されたＥＣ５０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｅ）該細胞において計算されたＥＣ４０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｆ）該細胞において計算されたＥＣ３０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｇ）該細胞において計算されたＥＣ２０濃度以下またはそれにほぼ等しい、および
（ｈ）該細胞において計算されたＥＣ１０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）ネガティブアロステリックモジュレーターである試験化合物および高濃度のμ−選択的オルソステリックアゴニストを、それぞれ単独で、または式Ｉで示されるサイレントアロステリック化合物（ＢＭＳ−９８６１２３）と共に細胞に添加し、
（ｉｉ）該μ−選択的オルソステリックアゴニストおよび該試験化合物の、それぞれ単独での、または該式Ｉの化合物の存在下での、該細胞に対する効果を測定し、そして
（ｉｉｉ）該式Ｉの化合物が、該試験化合物のネガティブアロステリックアゴニスト活性の低減により証明されて、該試験化合物との競合的結合を示すとき、該試験化合物がネガティブアロステリックモジュレーターであると同定する
工程を含む、μ−オピオイド受容体ネガティブアロステリックモジュレーターを同定するためのスクリーニング方法。
【請求項４】
低濃度のμ−選択的オルソステリックアゴニストが、
（ａ）該細胞において計算されたＥＣ１０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｂ）該細胞において計算されたＥＣ２０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｃ）該細胞において計算されたＥＣ３０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｄ）該細胞において計算されたＥＣ４０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｅ）該細胞において計算されたＥＣ５０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｆ）該細胞において計算されたＥＣ６０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｇ）該細胞において計算されたＥＣ７０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｈ）該細胞において計算されたＥＣ８０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｉ）該細胞において計算されたＥＣ９０濃度以上またはそれにほぼ等しい、および
（ｊ）該細胞において計算されたＥＣ１００濃度以上またはそれにほぼ等しい、
からなる群より選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
該細胞がＵ２ＯＳ細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該細胞が、ＯＰＲＭ１のＣ末端に結合したβ−ガラクトシダーゼの変異アミノ末端フラグメントに加えて、β−アレスチン２のＣ末端に結合したβ−ガラクトシダーゼのＮ末端欠失変異体の両方を組み換え的に発現する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
該μ−選択的オルソステリックアゴニストがエンドモルフィン−Ｉである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
該細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
該細胞が、ヒトμ−オピオイド受容体（ＣＨＯ−ｍｕ）を組み換え的に発現する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該μ−選択的オルソステリックアゴニストがエンドモルフィン−Ｉである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該細胞がＣ６神経膠腫細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
該細胞が、ヒトμ−オピオイド受容体（Ｃ６−ｍｕ）を組み換え的に発現する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
該μ−選択的オルソステリックアゴニストがＤＡＭＧＯである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
（ｉ）ポジティブアロステリックモジュレーターである試験化合物および低濃度のμ−選択的オルソステリックアゴニストを、それぞれ単独で、または式Ｉで示されるサイレントアロステリック化合物（ＢＭＳ−９８６１２３）と共に細胞に添加し、
（ｉｉ）該μ−選択的オルソステリックアゴニストおよび該試験化合物の、それぞれ単独での、または該式Ｉの化合物の存在下での、該細胞に対する効果を測定し、そして
（ｉｉｉ）該式Ｉの化合物が、該試験化合物のポジティブアロステリックアゴニスト活性の低減により証明されて、該試験化合物との競合的結合を示すとき、該試験化合物がポジティブアロステリックモジュレーターであると確認する
工程を含む、ポジティブアロステリックモジュレーターである試験化合物が、μ−オピオイド受容体ポジティブアロステリックモジュレーター活性を有することを確認するための方法。
【請求項１５】
低濃度のμ−選択的オルソステリックアゴニストが、
（ａ）該細胞において計算されたＥＣ８０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｂ）該細胞において計算されたＥＣ７０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｃ）該細胞において計算されたＥＣ６０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｄ）該細胞において計算されたＥＣ５０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｅ）該細胞において計算されたＥＣ４０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｆ）該細胞において計算されたＥＣ３０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｇ）該細胞において計算されたＥＣ２０濃度以下またはそれにほぼ等しい、および
（ｈ）該細胞において計算されたＥＣ１０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
からなる群より選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
（ｉ）ネガティブアロステリックモジュレーターである試験化合物および高濃度のμ−選択的オルソステリックアゴニストを、それぞれ単独で、または式Ｉで示されるサイレントアロステリック化合物（ＢＭＳ−９８６１２３）と共に細胞に添加し、
（ｉｉ）該μ−選択的オルソステリックアゴニストおよび該試験化合物の、それぞれ単独での、または該式Ｉの化合物の存在下での、該細胞に対する効果を測定し、そして
（ｉｉｉ）該式Ｉの化合物が、該試験化合物のネガティブアロステリックアゴニスト活性の低減により証明されて、該試験化合物との競合的結合を示すとき、該試験化合物がネガティブアロステリックモジュレーターであると確認する
工程を含む、ネガティブアロステリックモジュレーターである試験化合物が、μ−オピオイド受容体ネガティブアロステリックモジュレーター活性を有することを確認するための方法。
【請求項１７】
低濃度のμ−選択的オルソステリックアゴニストが、
（ａ）該細胞において計算されたＥＣ１０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｂ）該細胞において計算されたＥＣ２０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｃ）該細胞において計算されたＥＣ３０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｄ）該細胞において計算されたＥＣ４０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｅ）該細胞において計算されたＥＣ５０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｆ）該細胞において計算されたＥＣ６０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｇ）該細胞において計算されたＥＣ７０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｈ）該細胞において計算されたＥＣ８０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｉ）該細胞において計算されたＥＣ９０濃度以上またはそれにほぼ等しい、および
（ｊ）該細胞において計算されたＥＣ１００濃度以上またはそれにほぼ等しい、
からなる群より選択される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
該細胞がＵ２ＯＳ細胞である、請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
該細胞が、ＯＰＲＭ１のＣ末端に結合したβ−ガラクトシダーゼの変異アミノ末端フラグメントに加えて、β−アレスチン２のＣ末端に結合したβ−ガラクトシダーゼのＮ末端欠失変異体の両方を組み換え的に発現する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
該μ−選択的オルソステリックアゴニストがエンドモルフィン−Ｉである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
該細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１４記載の方法。
【請求項２２】
該細胞が、ヒトμ−オピオイド受容体（ＣＨＯ−ｍｕ）を組み換え的に発現する、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該μ−選択的オルソステリックアゴニストがエンドモルフィン−Ｉである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
該細胞がＣ６神経膠腫細胞である、請求項１４記載の方法。
【請求項２５】
該細胞が、ヒトμ−オピオイド受容体（Ｃ６−ｍｕ）を組み換え的に発現する、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
該μ−選択的オルソステリックアゴニストがＤＡＭＧＯである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
μ−オピオイド受容体に対するポジティブアロステリックモジュレーターである化合物をそれを必要とする患者に投与することを含む、該患者における疼痛の処置方法。
【請求項２８】
μ−オピオイド受容体に対するポジティブアロステリックモジュレーターである化合物を、μ−オピオイド受容体に対するオルソステリックアゴニストである別の化合物と組み合わせて、それを必要とする患者に投与することを含む、該患者における疼痛の処置方法。
【請求項２９】
該化合物が、δ−オピオイド受容体よりもμ−オピオイド受容体に選択的である、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
μ−オピオイド受容体に対するポジティブアロステリックモジュレーターである化合物が、δ−オピオイド受容体よりもμ−オピオイド受容体に選択的である、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
該化合物が、Ｇタンパク質活性化、アデニリルシクラーゼ活性の阻害、またはβ−アレスチン動員から選択される少なくとも１種のμ−オピオイド受容体機能の増強を提供するのに有効である、請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
μ−オピオイド受容体に対するポジティブアロステリックモジュレーターである化合物が、Ｇタンパク質活性化、アデニリルシクラーゼ活性の阻害、またはβ−アレスチン動員から選択される少なくとも１種のμ−オピオイド受容体機能の増強を提供するのに有効である、請求項２８記載の方法。
【請求項３３】
オルソステリックな外因性または内因性アゴニストの存在下、μ−オピオイド受容体と該受容体機能の増強を提供するのに有効な化合物を接触させることを含む、該受容体の調節方法。
【請求項３４】
受容体機能における増強が、最大効果、効力またはその両方で観察される、請求項３３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１月４日出願の米国仮特許出願第６１／７４８，９４６に基づく優先権の利益を主張し、それは引用により本明細書中に包含される。
【背景技術】
【０００２】
本発明の説明
先行技術文献（１）から（３４）を含む文献目録が本明細書中に記載され、それらは引用により本明細書中に包含される。
【０００３】
本発明は、例示のために記載されている２つの化合物、すなわち、ＢＭＳ−９８６１２１およびＢＭＳ−９８６１２２（図１に示される）に関して本明細書中に具体的に記載している。
【０００４】
本発明の適用が、これらの２つの化合物の範囲に限定されることは意図されない。本発明の適用は、本発明の望ましい面を提供するように機能する全ての化合物を包含することが意図される。特に、本発明が適用され得る化合物には、オピオイド受容体に結合し、オルソステリックアゴニストの結合親和性または有効性（または両方）を増強するように機能する、全ての化合物が含まれる。
【０００５】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のスーパーファミリーは、細胞機能の多くの面に関与する細胞内シグナル伝達カスケードをもたらす細胞膜の内部表面上のヘテロ三量体Ｇタンパク質を通してシグナルを伝達する細胞膜貫通タンパク質を含む（１）。これらのＧＰＣＲの細胞表面の局在、組織分布および多様性は、それらを薬物療法のための理想的な標的とする。実際に、市販薬の約３０％が特定のＧＰＣＲ活性を標的とする（１、２）。
【０００６】
オピオイド受容体は、ＧＰＣＲのクラスＡファミリーメンバーである。４種のオピオイド受容体タイプが存在し（μ（ミュー）、δ（デルタ）、κ(カッパ)、およびＯＲＬ１）、それらは、約６０％のアミノ酸同一性を有し（主に、膜貫通ドメインにおいて）、かつヘテロ三量体Ｇタンパク質のＧｉ／ｏファミリーを通してシグナル伝達し、その結果、細胞におけるアデニリルシクラーゼの阻害、イオンチャネル活性の調節、および転写の変化がもたらされる（３）。オピオイド受容体（および多くの他のＧＰＣＲ）はまた、受容体へのβ−アレスチン動員によって開始されるシグナル伝達の１つである、Ｇタンパク質非依存性経路(non-G protein mediated pathway)を通したシグナル伝達が可能である。β−アレスチンは、受容体の脱感作および内在化／再利用に関与している（４、５）。オピオイド受容体は、疼痛の管理における主な標的であり、モルヒネおよびその誘導体は、オピオイド受容体、とりわけμ−オピオイド受容体のアゴニストとして作用することにより疼痛の緩和を誘導する（６、７）。オピオイド受容体は、有害な副作用を低減または排除しようとするとき、より良好な疼痛管理の必要性のために広く研究されている。これらの副作用は、薬物耐性、呼吸抑制、便秘、胃痛、および依存症を含む（３、８）。
【０００７】
これらの副作用を克服するために、多数の研究は、他の受容体よりも１つの特定のオピオイド受容体タイプを標的とする、より選択的なアゴニスト、または部分アゴニスト（それは完全アゴニストと比較して低い効果を有する）、または併用療法において共に使用されるアゴニストの開発に焦点を当てている（９、１０）。しかしながら、これらの種々の方法は、それらが受容体のオルソステリック（内因性）アゴニスト結合部位を標的とするという、１つの共通性を有する。他のＧＰＣＲで成功裏に使用されている別の方法は、それらのオルソステリックな対応物（counterparts）を超える特別な利点を有し得るアロステリックリガンドの発見および開発である。
【０００８】
ＧＰＣＲのアロステリックリガンドは、オルソステリック（または、内因性）アゴニストを結合する部位とは異なる受容体上のある部位に結合する（１１、１２）。アロステリックモジュレーター（ＡＭ）は、標的タンパク質において一定範囲の活性を示し得る。ポジティブアロステリックモジュレーター（ＰＡＭ）は、何ら固有の有効性を有さないが、それらが受容体へ結合するとき、オルソステリックアゴニストの結合親和性または有効性（または両方）を増強する。ネガティブアロステリックモジュレーター（ＮＡＭ）は、何ら固有の有効性を有さないが、それらが受容体へ結合するとき、オルソステリックアゴニストの結合親和性または有効性（または両方）を阻害する。サイレントアロステリックモジュレーター（ＳＡＭ）はまた、ニュートラルアロステリックリガンド（ＮＡＬ）としても公知であり、受容体へ結合するが、オルソステリックアゴニストの親和性または有効性に影響を与えない。しかしながら、ＳＡＭは、同じアロステリック部位で競合的アンタゴニストとして作用することができ、ＰＡＭまたはＮＡＭ活性を阻害する。治療的観点からは特に有用ではないが、ＳＡＭは、推定ＰＡＭまたはＮＡＭの効果が受容体を通して発揮されていることを示すために有効なツールであり得る。そして、アロステリックアゴニストは、オルソステリックアゴニストの不存在下でさえ、受容体に結合し、その直接的なアゴニスト活性を生じ得る。
【０００９】
アロステリックリガンドは、オルソステリックリガンドと比較して、同じファミリー内のＧＰＣＲのサブタイプ間により広い選択性を示す可能性を有する。このことは、代謝型グルタミン酸受容体、アデノシン受容体およびムスカリン受容体を含むいくつかのＧＰＣＲについて証明されている（１３−１７）。この高選択性は、同じ内因性リガンドを結合する密接に関連する受容体サブタイプ間のオルソステリック部位に位置する進化上の制約（evolutionary constraint）によるものとの仮説がある。この進化上の制約は、アロステリック部位には必要とされないかもしれない。
【００１０】
オピオイド受容体に対して高選択性のオルソステリックアゴニストリガンドが存在するが、ＰＡＭのさらなる利点は、オピオイド受容体のＰＡＭに疼痛管理における潜在的な治療薬としての魅力的な機会を提供する。
【００１１】
ＰＡＭは、アロステリックアゴニストとは異なり、オルソステリックアゴニストの不存在下でそれらが受容体に結合するとき、多くは何の効果も有しない。それ故に、モジュレーション（修飾）は、オルソステリックアゴニストが受容体に結合しているときのみ生じる。インビボでは、このことは、細胞シグナル伝達の時間的および空間的特性の保存をもたらす。これは、とりわけ脳神経系および腸管神経系における複雑な神経ネットワークにおけるシグナル伝達のために重要である。さらに、天然の受容体シグナル伝達の時間的側面を保存することにより、ＰＡＭは、外因性のオルソステリックアゴニストにより生じる持続的受容体活性化によって誘発される、受容体の下方制御および他の代償機構(compensatory mechanism)を回避することができる。従って、オピオイド受容体のＰＡＭは、外因性のオルソステリックアゴニストよりも低い耐性および依存性を生じることが期待され得る。ここに、本発明者等は、μ−オピオイド受容体ＰＡＭおよびＳＡＭの発見および特徴付けを記載する。ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）が開発され、β−アレスチン動員アッセイを実施した。ＨＴＳから得られるμ−選択的ＰＡＭは、β−アレスチン動員アッセイおよびＧタンパク質仲介シグナル伝達アッセイ（アデニリルシクラーゼ活性の阻害および［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合）の両方で活性であることが示された。これらの研究は、厳密に規定された疼痛治療の構築のための潜在的な新規手段としてポジティブなアロステリック性を示すμ−選択的ＰＡＭおよびＳＡＭの存在を初めて開示する。
【００１２】
潜在的なオピオイド受容体リガンドは、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ(登録商標)酵素相補性アッセイ技術(enzyme complementation assay technology)（DiscoveRx, CA）を用いてＨＴＳ化合物キャンペーン(HTS campaign)から同定された（１８）。このシステムにおいて、酵素アクセプター（ＥＡ）と称されるβ−ガラクトシダーゼのＮ末端欠失変異体は、Ｕ２ＯＳ細胞中で安定に発現されるβ−アレスチン２のＣ末端に結合される。ＰｒｏＬｉｎｋ(商標)（ＰＫ）と称されるβ−ガラクトシダーゼの変異アミノ末端フラグメントは、これらの細胞（Ｕ２ＯＳ−ＯＰＲＭ１）中で組み換え的に発現されるＯＰＲＭ１受容体のカルボキシル末端に結合される。活性化μ−オピオイド受容体へのアレスチンの結合は、酵素の相補および酵素活性の再構成をもたらす。故に、補完された酵素活性は、μ−オピオイド受容体へのアレスチン動員の尺度として用いることができる。ＨＴＳ化合物キャンペーンは、アゴニストおよびポジティブアロステリックモジュレーター（ＰＡＭ）の両方を同定するために、低濃度（２０ｎＭ、〜ＥＣ１０）のμ−選択的オルソステリックアゴニストであるエンドモルフィン−Ｉの存在下で行われた。２つの化合物が、潜在的μ−オピオイド受容体ＰＡＭ（μ−ＰＡＭ）として同定された。これらの化合物は、それぞれＢＭＳ−９８６１２１およびＢＭＳ−９８６１２２なる化合物番号を付与されており、それらの構造は、図１に示されている。ＢＭＳ−９８６１２１もＢＭＳ−９８６１２２も、それ自体は顕著なβ−アレスチン動員を生じなかったが（アゴニスト検出モード）、両化合物は、低濃度のエンドモルフィン−Ｉによって生じたβ−アレスチン動員応答を顕著に増大させた（ＰＡＭ検出モード）（図１ＣおよびＤ）。ＰＡＭ検出モードにおいて、ＢＭＳ−９８６１２１は、２０ｎＭのエンドモルフィン−Ｉによるβ−アレスチン動員を、１．０（０．７−１．４）μＭのＥＣ５０（９５％ＣＩ）で、エンドモルフィン−Ｉの最大有効濃度（１ｕＭ）により誘発される応答の７２（６６−７８）％のＥｍａｘ（９５％ＣＩ）に増大させた。ＢＭＳ−９８６１２２は、低濃度のエンドモルフィン−Ｉの効果を、３．０（２．３−３．８）μＭのＥＣ５０で最大エンドモルフィン−Ｉ応答の７９（７３−８４）％に増大させる、同様のＰＡＭ検出モード応答を生じた。
【００１３】
応答の特異性を試験するために、化合物を、ＰＫ標識したδ−オピオイド受容体を発現するＵ２ＯＳ  ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ(登録商標)細胞（Ｕ２ＯＳ−ＯＰＲＤ１）における同様のアッセイにおいて試験した。どちらの化合物も、〜ＥＣ１０（０．４ｎＭ）濃度のδ−アゴニストであるｌｅｕ−エンケファリンの不存在下（アゴニスト検出モード）または存在下（ＰＡＭ検出モード）で有意な効果を有しなかった（図１ＣおよびＤ）。これらの結果は、ＢＭＳ−９８６１２１およびＢＭＳ−９８６１２２の効果が、μ−オピオイド受容体の活性化を通して仲介され、該化合物が、δ−オピオイド受容体よりもμ−オピオイド受容体に選択的であることを示唆している。
【００１４】
μ−ＰＡＭ活性をさらに評価するために、ＢＭＳ−９８６１２１およびＢＭＳ−９８６１２２を３つの機能的アッセイ、β−アレスチン動員、アデニリルシクラーゼ活性の阻害、および［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を用いるＧタンパク質活性化にて試験した。さらに、化合物を受容体結合アッセイで評価した。
【００１５】
エンドモルフィン−Ｉ仲介β−アレスチン動員についての濃度応答曲線（ＣＲＣ）を、種々の濃度の各μ−ＰＡＭの不存在下または存在下で作成した。ＢＭＳ−９８６１２１（図２Ａ）またはＢＭＳ−９８６１２２（図２Ｂ）は、エンドモルフィン−Ｉの効力下で濃度依存的かつ飽和左方シフトを生じた。ＢＭＳ−９８６１２１は、エンドモルフィン−Ｉの効力の最大９倍の増加を生じた。半分の最大左方シフトを生じたＢＭＳ−９８６１２１の濃度は、１．７μＭであった。ＢＭＳ−９８６１２２は、エンドモルフィン−Ｉの効力の最大８倍の増加を生じ、半分の最大左方シフト値となるときの濃度が４．９μＭであった（図２Ｃ）。
【００１６】
オピオイド受容体は、Ｇαｉ／ｏタンパク質を通してアデニリルシクラーゼを阻害する（１９）。このシグナル伝達経路に対するμ−ＰＡＭの効果を評価するために、それらの効果をｃＡＭＰ蓄積アッセイにおいて測定した。Ｕ２０Ｓ  ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ(登録商標)細胞においてオピオイドアゴニストにより生じたｃＡＭＰ阻害応答は小さく、ロバスト測定のためには不十分であった。従って、ヒトのμ−オピオイド受容体を組み換え的に発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（ＣＨＯ−ｍｕ）をこれらの実験に用いた。この細胞株において、μ−オピオイド受容体アゴニストは、フォルスコリン（１ｕＭ）により刺激されたｃＡＭＰ蓄積のロバスト性かつ再現性の阻害を生じる。エンドモルフィン−Ｉは、ＥＣ５０値７６（６０−９６）ｐＭでｃＡＭＰ蓄積の１７倍の減少をもたらした（図Ｓ１）。ＢＭＳ−９８６１２１およびＢＭＳ−９８６１２２は、ＣＨＯ−ｍｕ細胞において〜ＥＣ１０（３０ｐＭ）濃度のエンドモルフィン−Ｉにより生じたフォルスコリンにより刺激されたアデニリルシクラーゼ活性の阻害を顕著に増加した（図３ＡおよびＢ）。ＢＭＳ−９８６１２１およびＢＭＳ−９８６１２２は両方とも、それぞれ２．２（１．７−２．８）および８．９（６．１−１３．１）μＭのＥＣ５０値で増強された。ＰＡＭの存在下でのエンドモルフィン−Ｉにより生じた最大阻害は、最大濃度（１０ｎＭ）のエンドモルフィン−Ｉ単独と同様であった。このアッセイにおいて、両μ−ＰＡＭは、オルソステリックアゴニストの不存在下でのｃＡＭＰ蓄積の阻害を引き起こす内因性アゴニスト活性を示した（図３ＡおよびＢ）。ＢＭＳ−９８６１２１の低有効性アゴニスト活性（１４（２−１００）μＭのＥＣ５０；３５（６−６３）％のＥｍａｘ）は、必ずしも再現性があるとは限らず、いくつかの場面では、濃度応答データの適合を決定するには低すぎた。ＢＭＳ−９８６１２２アゴニスト活性（４１（２０−８６）μＭのＥＣ５０；６０（２４−９５）％のＥｍａｘ）は、より明らかであった。ＢＭＳ−９８６１２１およびＢＭＳ−９８６１２２のアゴニスト活性は、エンドモルフィン−Ｉ応答の大幅な増強を生じるために必要とされる以上の濃度でのみ見られ、両アゴニスト応答は、エンドモルフィン−Ｉの最大効果に達することができなかった。
【００１７】
このアッセイで見られたＰＡＭのアゴニスト活性と、Ｕ２ＯＳ−ＯＰＲＭ１細胞におけるβ−アレスチン動員アッセイで見られたアゴニスト活性の欠失の間の矛盾は、２つのアッセイに対する見かけの余剰受容体(receptor reserve) および／または細胞株の違いであり得る。組み換えＣＨＯ細胞において、エンドモルフィン−Ｉは、Ｕ２ＯＳ  ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ(登録商標)細胞におけるアレスチン動員と比較して、フォルスコリンにより刺激されたｃＡＭＰ蓄積の阻害について〜１０００倍以上強力であり、このことは、顕著なレベルの余剰受容体がアレスチンアッセイと比較してｃＡＭＰアッセイにおいて存在することを示唆する。ＰＡＭは、高レベルのＧＰＣＲタンパク質を発現する組み換え細胞においてアゴニスト活性（ＰＡＭ活性について見られるものより高濃度ではあるが）を示し得ることが既に報告されている（２０）。実際に、ＰＡＭがアロステリックアゴニストであり、観察されるアゴニスト効果の程度は、シグナル検出のために用いられるシステムおよびアッセイの感度に大きく依存することが示唆されている（２１）。
【００１８】
次いで、μ−ＰＡＭは、組み換えμ−オピオイド受容体を安定的に発現するＣ６神経膠腫細胞（Ｃ６−ｍｕ）由来の膜におけるＧタンパク質活性化［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合実験において特徴付けられている（２２）。アゴニストにより刺激された［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を、この細胞株において完全アゴニストから部分的アゴニストを区別することができるＧタンパク質活性化の初期速度を入手するために、インキュベーションの５分後に測定した。１０μＭでのμ−オピオイド受容体アゴニストＤＡＭＧＯは、２２２（１７９−２７４）ｎＭのＥＣ５０で、基底活性を超える［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の２５０％刺激を生じた。ＢＭＳ−９８６１２１（１０μＭ）は、ＤＡＭＧＯ  ＣＲＣの４倍の左方シフトをもたらした（５７（３７−８９）ｎＭのＥＣ５０）（図４Ａ）。ＢＭＳ−９８６１２２（１０ｕＭ）は、ＤＡＭＧＯ  ＣＲＣの７倍の左方シフトをもたらした（３２（２５−４０）ｎＭのＥＣ５０）（図４Ｂ）。このアッセイにおいて、いずれのＰＡＭ化合物についても有意なアゴニスト活性は検出されなかった。
【００１９】
μ−オピオイド受容体リガンド結合を、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０μＭ  ＧＴＰγＳの存在下で決定した。飽和結合実験において、μ−ＰＡＭであるＢＭＳ−９８６１２２は、［３Ｈ］ジプレノルフィン結合親和性に影響を及ぼさなかったが（ビークルの存在下でのＫｄは、０．２７（０．２１−０．３２）ｎＭであり、ＢＭＳ−９８６１２２（１０ｕＭ）の存在下でのＫｄは０．３５（０．１８−０．５１）ｎＭであった）、ＤＡＭＧＯの親和性を、０．２−０．３ｎＭの［３Ｈ］ジプレノルフィン結合での競合試験において有意に６倍増大させた（ビークルの存在下でのＫｉは３４０（２０８−５５２）ｎＭであり、ＢＭＳ−９８６１２２（１０μＭ）の存在下でのＫｉは５６（４１−７６）ｎＭであった）（図４Ｅ；図Ｓ２Ａ；表Ｓ１）。これらのデータは、ＢＭＳ−９８６１２２が、少なくとも部分的に、オルソステリックアゴニスト  ＤＡＭＧＯに対するμ−オピオイド受容体の正の親和性モジュレーターであることを示唆する。
【００２０】
［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合アッセイにおける部分的アゴニストに対する最大応答の増強は、μ−ＰＡＭが、このシステムにおいて観察された有効性を調節可能であることを示唆し得る。モルヒネは、１１０（７１−１７１）ｎＭのＥＣ５０で、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳとのインキュベーションの５分後に３０μＭのＤＡＭＧＯによって誘導される応答の４２（３８−４５）％のＥｍａｘを生じた（図４ＣおよびＤ）。このことは、モルヒネが、ＤＡＭＧＯに対して、このアッセイシステムにおいて部分的アゴニストであることを確認する（２２）。ＢＭＳ−９８６１２１は、モルヒネの効力を２．５倍増加させた（４５（２９−６８）ｎＭのＥＣ５０）（図４Ｃ）。モルヒネの効力は、１０μＭのＢＭＳ−９８６１２２の存在下で左に３倍シフトした（３８（２４−６１）ｎＭのＥＣ５０）（図４Ｄ）。ＤＡＭＧＯと比較したモルヒネの最大効果（Ｅｍａｘ）は、ＢＭＳ−９８６１２１により（７２（６７−７８）％）増加し（図４Ｃ）、そしてＢＭＳ−９８６１２２により（７４（６８−８１）％）増加した（図４Ｄ）。これらのデータは、ＢＭＳ−９８６１２１およびＢＭＳ−９８６１２２が、このシステムにおいて部分的アゴニストであるモルヒネの最大応答の増加として測定される、観察された有効性を正に調節し得ることを確認する。
【００２１】
これまでの実験は、受容体を高度に発現する異種細胞系を用いていた。μ−ＰＡＭ活性を天然の組織で観察することができるかどうかを決定するために、マウス脳由来の膜におけるＤＡＭＧＯにより刺激した［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を評価した（図４Ｆ）。ＤＡＭＧＯの［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を刺激する効力（４５８（２４５−８５６）ｎＭのＥＣ５０）は、ＢＭＳ−９８６１２２の存在下で左へ４．５倍シフトした（１０１（５６−１８３）ｎＭのＥＣ５０）。アゴニスト活性は、ＢＭＳ−９８６１２２で観察されなかった。従って、μ−ＰＡＭ活性はまた、内因性レベルの受容体およびＧ−タンパク質を有する生理学的に関連する組織由来の膜におけるＤＡＭＧＯ仲介Ｇタンパク質活性化に対しても観察され得る。
【００２２】
化合物の構造−活性相関（ＳＡＲ）を探索するために、多数のＢＭＳ−９８６１２２の近似類縁体がβ−アレスチン動員アッセイにおいて試験された。試験された１５個の類縁体のうち、１３個が、μ受容体で少なくともある程度のＰＡＭ活性を示した。これらの化合物は、いずれもμ−オピオイド受容体でのアゴニスト活性を示さなかった（図Ｓ３）。しかしながら、該類縁体のうち５個が、δ受容体での低い有効性のアゴニストまたはＰＡＭ活性を示し（図Ｓ３）、この化合物タイプへの改変が、δ−オピオイド受容体 対 μ−オピオイド受容体間の選択性を変化させることができることが示唆された。ＢＭＳ−９８６１２２の構造の改変は、Ｕ２ＯＳ−ＯＰＲＭ１細胞における化合物のＰＡＭ活性に影響を与えた（図Ｓ３；表Ｓ２）。ほとんどの場合、試験された類縁体は、ＢＭＳ−９８６１２２と同様の効力を維持する（低いμＭ範囲のＥＣ５０値）。しかしながら、ＢＭＳ−９８６１２２の構造の若干の変更は、ＰＡＭ検出モードで観察されるＥｍａｘ値の顕著な低減をもたらした。このことは、化合物によって生じ得るエンドモルフィン−Ｉの効力の最大左方シフトの減少に対応するように推論され得る。試験された類縁体のうち、元々のスクリーニングでヒットしたＢＭＳ−９８６１２２よりも強いＰＡＭ活性を示すものはなかった。
【００２３】
ＧＰＣＲのアロステリックモジュレーターは、化合物中の“活性スイッチング”を示すことが多いことが確認されている。僅かな化学構造の変更により、化合物がＰＡＭからネガティブ（ＮＡＭ）またはサイレント（ＳＡＭ）アロステリックモジュレーターに変更され得る（２３）。２個の類縁体で観察されたＰＡＭの有効性の欠如は、ＰＡＭからＮＡＭまたはＳＡＭへの、結合親和性の喪失または機能スイッチングが原因であり得る。
【００２４】
従って、２個のこれらのＢＭＳ−９８６１２２類縁体（ＢＭＳ−９８６１２３およびＢＭＳ−９８６１２４と称する）について、Ｕ２ＯＳ−ＯＰＲＭ１細胞におけるβ−アレスチン動員アッセイおよびＣ６−ｍｕ細胞における［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイにおいて、それらのオルソステリックアゴニスト活性を阻害する能力（ＮＡＭ検出モードアッセイにおいて）、またはそれらのＢＭＳ−９８６１２２ＰＡＭ活性を阻害する能力（ＳＡＭ検出モードアッセイ）を評価した。両化合物は、ＥＣ８０濃度のエンドモルフィン−Ｉ（３００ｎＭ）を顕著に阻害せず（図Ｓ４）、それらがＮＡＭまたはオルソステリックアンタゴニストではないことが示唆された。しかしながら、両化合物は、３０ｎＭ（〜ＥＣ２０）のエンドモルフィン−Ｉの存在下で、Ｕ２ＯＳ−ＯＰＲＭ１細胞において、１２．５μＭ（〜ＥＣ８０）のＢＭＳ−９８６１２２に対するＰＡＭ応答を阻害することが可能であった（図５Ａ）。ＢＭＳ−９８６１２３およびＢＭＳ−９８６１２４のＳＡＭ活性について計算されたＫｂ値（アゴニストの不存在下で、受容体の５０％を占める平衡状態における競合アンタゴニストの阻害定数）は、それぞれ１μＭおよび２μＭであった（表Ｓ２）。実験の別のセットにおいて、Ｃ６−ｍｕ細胞膜における［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を刺激するためのＤＡＭＧＯの効力（２２４（１６７−３００）ｎＭのＥＣ５０）は、ＢＭＳ−９８６１２２（１０μＭ）（２９（２２−３８）ｎＭのＥＣ５０）の存在下で８倍に増大した（図５Ｂ、図Ｓ５）。ＢＭＳ−９８６１２２（１０μＭ）とＢＭＳ−９８６１２４（５０μＭ）の共添加は、ＰＡＭ効果の阻害をもたらし、ＤＡＭＧＯの効力を、ビークル対照の存在下のＤＡＭＧＯの効力と比較して２倍未満（１２８（９７−１６８）ｎＭのＥＣ５０）増大させた（図５Ｂ；図Ｓ５）。これらのデータをまとめると、ＢＭＳ−９８６１２２のＰＡＭ効果は、ＢＭＳ−９８６１２４によって拮抗されることが確認され、ＢＭＳ−９８６１２３およびＢＭＳ−９８６１２４が、μ−オピオイド受容体ＳＡＭ（μ−ＳＡＭ）であり、ＢＭＳ−９８６１２２が結合するアロステリック部位における競合的アンタゴニストであることを強く示唆する。
【００２５】
μ−ＳＡＭであるＢＭＳ−９８６１２３は、僅かであるが（〜２倍）、［３Ｈ］ジプレノルフィンの結合親和性の顕著な低下をもたらしたけれども（図Ｓ２）、ＤＡＭＧＯ結合親和性に有意な影響を与えなかった（表Ｓ１）。［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイにおけるＤＡＭＧＯまたはモルヒネの効力は、１０μＭにてＢＭＳ−９８６１２３またはＢＭＳ−９８６１２４により有意に増大されなかったが（図Ｓ６およびＳ７）、両ＳＡＭは、モルヒネのＥｍａｘを僅かに増加させた（図Ｓ７）。このアッセイにおいて、何れのＳＡＭ化合物についても有意なアゴニスト活性は検出されなかった。
【００２６】
プローブ依存性（probe dependence）（あるオルソステリックアゴニストを調節するが他のものは調節しないアロステリックモジュレーターの能力）は、いくつかのアロステリックモジュレーターの特筆すべき特性である（２４）。ＢＭＳ−９８６１２１（１００μＭ）は、ＣＨＯ−ｍｕ細胞におけるフォルスコリンにより刺激されたｃＡＭＰ蓄積の阻害アッセイにおいて、エンドモルフィン−Ｉ、モルヒネ、およびｌｅｕ−エンケファリンの効力を左方シフトし、それぞれ４．３倍、６．５倍および４．５倍増大させる（図Ｓ８）。［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合実験からのＤＡＭＧＯおよびモルヒネデータセットおよびβ−アレスチンデータを合わせて考慮しても、ＢＭＳ−９８６１２１が、ペプチドアゴニスト−および低分子アゴニスト−誘発性応答に同様の増強をもたらしたとするような、強力なプローブ依存性を示唆する証拠はない。
【００２７】
上記の通り、ＰＡＭ（アロステリックアゴニストとは異なる）は一般的に、オルソステリックアゴニストが結合するときのみ受容体の活性を調節し、インビボでの細胞シグナル伝達の時間的かつ空間的側面を保存している。従って、ＰＡＭは、それらのオルソステリックアゴニスト対応物を超える顕著な利点を有する。従来型アゴニストリガンドを用いると、受容体は、長時間、活性型の状態であり（用量レジメンに基づき）、長期刺激により引き起こされる受容体応答の脱感作または受容体仲介副作用のような副作用をもたらすことが多い。オピオイド受容体の場合、オピエート(鎮静剤)の長期投与は、耐性および依存性の発生、ならびに他の急性の受容体仲介副作用、例えば呼吸抑制、便秘および異痛症等をもたらす（３、８）。本発明者らは、本明細書に記載のμ−ＰＡＭが、内因性アゴニストであるエンドモルフィン−Ｉおよびｌｅｕ−エンケファリンに対するμ−オピオイド受容体応答を正に調節することが可能であることを確認した。インビボで単独投与されたとき、μ−ＰＡＭが抗侵害受容作用(antinociceptive effect)を生じ、内因性オピオイドアゴニストに対する応答を増強し得るかどうかを決定することが重要である。μ−オピオイド受容体活性化の基礎緊張(basal tone)の証拠は存在しない。例えば、エンケファリナーゼの阻害は、炎症性および神経障害性疼痛の動物モデルにおいて抗侵害受容をもたらす内因性オピオイドペプチドを分解する（２５）。加えて、オピオイド受容体アンタゴニストであるナロキソンは、外来性オピエートを服用しなかった手術後の患者に投与されたとき、疼痛知覚を増大させ、内因性オピオイドペプチドがナロキソンにより低減され得る基礎鎮痛緊張をもたらすことが示唆される（２６）。
【００２８】
ＰＡＭの別の利点は、限られた量でオルソステリックアゴニストの効力を左方にシフトさせる能力である。例えば、ＢＭＳ−９８６１２２の類縁体（表Ｓ２）は、オルソステリックアゴニストの効力を左方にシフトさせる特異的能力を示し、該化合物が低用量のエンドモルフィン−Ｉと併用投与されたとき、異なるＥｍａｘ値をもたらす。薬物開発プログラムは、効果の必要なレベルを超え得ないＰＡＭを設計することにより、安全性を向上させるために、この限られた効力シフトの利点を利用することができる。
【００２９】
オピオイド受容体耐性および依存性はオピエートへの長時間暴露によりもたらされ、結果として、細胞機能に変化が起こり、それにより同じ鎮痛効果を生じるのに増加用量のアゴニストが必要とされる。１つには、μ−ＰＡＭと共に投与される低用量のモルヒネは、高用量のモルヒネ単独と同様の機能的応答を生じることが可能であり、耐性の発生を免れる可能性があることが予測される。アゴニストとＰＡＭの組み合わせが、アゴニスト単独に対して脱感作および／または耐性および依存性の減少をもたらすかどうかを決定することが重要である。ＧＡＢＡ−Ｂ受容体を用いるこのことの先例が示されている。ＧＡＢＡ−Ｂ受容体  ＰＡＭ、ＧＳ３９７８３は、低用量のアゴニストと併用されるとき、高用量のＧＡＢＡ−Ｂアゴニストと同レベルの機能的応答を生じるが、ＧＡＢＡ−Ｂ受容体脱感作をほとんど生じなかった（２７）。このことは、低用量のオピエートとμ−ＰＡＭの共投与が、オピエートの治療的鎮痛特性と、それらの耐性および薬物依存性とを区別し得ることを示唆する。加えて、μ−ＰＡＭが、耐性および依存性を仲介するシグナル伝達経路と異なるオルソステリックアゴニスト応答ならびに他のシステムで観察されるような治療応答を仲介するシグナル伝達経路を支持する他の望ましくない効果を低減させ得る可能性がある（２４、２７、２８）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００３０】
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【発明の概要】
【００３１】
本特許において、本発明者等は、２個のμ−オピオイド受容体に選択的なＰＡＭの発見および特性化を具体的に記載している。ＢＭＳ−９８６１２２は、構造活性相関に関する研究から化学的な取り扱いやすさが示されており、また、μ−オピオイド受容体ＳＡＭの同定につながった。本発明者らが知る限り、これらは、文献に記載された最初のオピオイド受容体ＰＡＭおよびＳＡＭである。２個のＰＡＭは、オルソステリックアゴニストにより仲介されるβ−アレスチン動員、アデニル酸シクラーゼの阻害、およびＧタンパク質活性化の増強を示す。ＢＭＳ−９８６１２２は、マウス脳膜におけるＤＡＭＧＯにより仲介される［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を増強し、少なくとも部分的に、ＤＡＭＧＯ結合のためのμ−オピオイド受容体の正の親和性モジュレーターであると考えられる。これらの研究は、改善された副作用ならびに低減された耐性および薬物依存性を伴う慢性疼痛管理における治療可能性を有し得る、新規のオピオイドアロステリックモジュレーターの開発のための概念実証を提供する。
【００３２】
本発明のいくつかの面を以下に記載する。
本発明の一面では、
（ｉ）ポジティブアロステリックモジュレーターである試験化合物および低濃度のμ−選択的オルソステリックアゴニストを、それぞれ単独で、または式Ｉで示されるサイレントアロステリック化合物（ＢＭＳ−９８６１２３）と共に細胞に添加し、
（ｉｉ）該μ−選択的オルソステリックアゴニストおよび該試験化合物の、それぞれ単独での、または該式Ｉの化合物の存在下での、該細胞に対する効果を測定し、そして
（ｉｉｉ）該式Ｉの化合物が、該試験化合物のポジティブアロステリックアゴニスト活性の低減により証明されて、該試験化合物と競合的に結合することが示されるとき、該試験化合物をポジティブアロステリックモジュレーターであると同定する
工程を含む、μオピオイド受容体ポジティブアロステリックモジュレーターを同定するためのスクリーニング方法を提供する。
【００３３】
好ましくは、低濃度のμ−選択的オルソステリックアゴニストは、
（ａ）該細胞において計算されたＥＣ８０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｂ）該細胞において計算されたＥＣ７０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｃ）該細胞において計算されたＥＣ６０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｄ）該細胞において計算されたＥＣ５０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｅ）該細胞において計算されたＥＣ４０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｆ）該細胞において計算されたＥＣ３０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｇ）該細胞において計算されたＥＣ２０濃度以下またはそれにほぼ等しい、および
（ｈ）該細胞において計算されたＥＣ１０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
からなる群より選択される。
【００３４】
好ましくは、細胞は、Ｕ２ＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞またはＣ６神経膠腫細胞である。
【００３５】
本発明の別の面では、
（ｉ）ネガティブアロステリックモジュレーターである試験化合物および高濃度のμ−選択的オルソステリックアゴニストを、それぞれ単独で、または式Ｉで示されるサイレントアロステリック化合物（ＢＭＳ−９８６１２３）と共に細胞に添加し；
（ｉｉ）          該μ−選択的オルソステリックアゴニストおよび該試験化合物の、それぞれ単独での、または該式Ｉの化合物の存在下での、該細胞に対する効果を測定し、そして
（ｉｉｉ）該式Ｉの化合物が、該試験化合物のネガティブアロステリックアゴニスト活性の低減により証明されて、該試験化合物と競合的に結合することが示されるとき、該試験化合物をネガティブアロステリックモジュレーターであると同定する
工程を含む、μオピオイド受容体ネガティブアロステリックモジュレーターを同定するためのスクリーニング方法を提供する。
【００３６】
好ましくは、低濃度のμ−選択的オルソステリックアゴニストが、
（ａ）該細胞において計算されたＥＣ１０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｂ）該細胞において計算されたＥＣ２０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｃ）該細胞において計算されたＥＣ３０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｄ）該細胞において計算されたＥＣ４０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｅ）該細胞において計算されたＥＣ５０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｆ）該細胞において計算されたＥＣ６０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｇ）該細胞において計算されたＥＣ７０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｈ）該細胞において計算されたＥＣ８０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｉ）該細胞において計算されたＥＣ９０濃度以上またはそれにほぼ等しい、および
（ｊ）該細胞において計算されたＥＣ１００濃度以上またはそれにほぼ等しい、
からなる群より選択される。
【００３７】
好ましくは、該細胞は、ＯＰＲＭ１のＣ末端に結合したβ−ガラクトシダーゼの変異アミノ末端フラグメントに加えて、β−アレスチン２のＣ末端に結合したβ−ガラクトシダーゼのＮ末端欠失変異体の両方を組み換え的に発現する。
【００３８】
好ましくは、該μ−選択的オルソステリックアゴニストは、エンドモルフィン−Ｉである。
【００３９】
好ましくは、該細胞は、ヒトμ−オピオイド受容体（ＣＨＯ−ｍｕ）を組み換え的に発現する。
【００４０】
好ましくは、該細胞は、ヒトμ−オピオイド受容体（Ｃ６−ｍｕ）を組み換え的に発現する。
【００４１】
好ましくは、該μ−選択的オルソステリックアゴニストはＤＡＭＧＯである。
【００４２】
本発明の別の面では、
（ｉ）ポジティブアロステリックモジュレーターである試験化合物および低濃度のμ−選択的オルソステリックアゴニストを、それぞれ単独で、または式Ｉで示されるサイレントアロステリック化合物（ＢＭＳ−９８６１２３）と共に細胞に添加し、
（ｉｉ）該μ−選択的オルソステリックアゴニストおよび該試験化合物の、それぞれ単独での、または該式Ｉの化合物の存在下での、該細胞に対する効果を測定し、そして
（ｉｉｉ）該式Ｉの化合物が、該試験化合物のポジティブアロステリックアゴニスト活性の低減により証明されて、該試験化合物との競合的結合を示すとき、該試験化合物がポジティブアロステリックモジュレーター活性を有することを確認する
工程を含む、ポジティブアロステリックモジュレーターである試験化合物が、μ−オピオイド受容体ポジティブアロステリックモジュレーター活性を有することを確認するための方法を提供する。
【００４３】
好ましくは、低濃度のμ−選択的オルソステリックアゴニストが、
（ａ）該細胞において計算されたＥＣ８０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｂ）該細胞において計算されたＥＣ７０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｃ）該細胞において計算されたＥＣ６０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｄ）該細胞において計算されたＥＣ５０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｅ）該細胞において計算されたＥＣ４０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｆ）該細胞において計算されたＥＣ３０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｇ）該細胞において計算されたＥＣ２０濃度以下またはそれにほぼ等しい、および
（ｈ）該細胞において計算されたＥＣ１０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
からなる群より選択される。
【００４４】
本発明の別の面では、
（ｉ）ネガティブアロステリックモジュレーターである試験化合物および高濃度のμ−選択的オルソステリックアゴニストを、それぞれ単独で、または式Ｉで示されるサイレントアロステリック化合物（ＢＭＳ−９８６１２３）と共に細胞に添加し、
（ｉｉ）該μ−選択的オルソステリックアゴニストおよび該試験化合物の、それぞれ単独での、または該式Ｉの化合物の存在下での、該細胞に対する効果を測定し、そして
（ｉｉｉ）該式Ｉの化合物が、該試験化合物のネガティブアロステリックアゴニスト活性の低減により証明されて、該試験化合物との競合的結合を示すとき、該試験化合物がネガティブアロステリックモジュレーターであると確認する
工程を含む、ネガティブアロステリックモジュレーターである試験化合物がμ−オピオイド受容体ネガティブアロステリックモジュレーター活性を有することを確認するための方法を提供する。
【００４５】
好ましくは、低濃度のμ−選択的オルソステリックアゴニストが、
（ａ）該細胞において計算されたＥＣ１０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｂ）該細胞において計算されたＥＣ２０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｃ）該細胞において計算されたＥＣ３０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｄ）該細胞において計算されたＥＣ４０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｅ）該細胞において計算されたＥＣ５０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｆ）該細胞において計算されたＥＣ６０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｇ）該細胞において計算されたＥＣ７０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｈ）該細胞において計算されたＥＣ８０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｉ）該細胞において計算されたＥＣ９０濃度以上またはそれにほぼ等しい、および
（ｊ）該細胞において計算されたＥＣ１００濃度以上またはそれにほぼ等しい、
からなる群より選択される。
【００４６】
好ましくは、該細胞は、Ｕ２ＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞またはＣ６神経膠腫細胞である。
【００４７】
好ましくは、該細胞は、ＯＰＲＭ１のＣ末端に結合したβ−ガラクトシダーゼの変異アミノ末端フラグメントに加えて、β−アレスチン２のＣ末端に結合したβ−ガラクトシダーゼのＮ末端欠失変異体の両方を組み換え的に発現する。
【００４８】
好ましくは、μ−選択的オルソステリックアゴニストはエンドモルフィン−Ｉである。
【００４９】
好ましくは、該細胞は、ヒトμ−オピオイド受容体を組み換え的に発現する（ＣＨＯ−ｍｕ）。
【００５０】
好ましくは、該細胞は、ヒトμ−オピオイド受容体を組み換え的に発現する（Ｃ６−ｍｕ）。
【００５１】
好ましくは、該μ−選択的オルソステリックアゴニストはＤＡＭＧＯである。
【００５２】
本発明の別の面では、μ−オピオイド受容体に対するポジティブアロステリックモジュレーターである化合物を、それを必要とする患者に投与することを含む、該患者における疼痛の処置方法を提供する。
【００５３】
好ましくは、該化合物は、δ−オピオイド受容体よりもμ−オピオイド受容体に選択的である。
【００５４】
好ましくは、該化合物は、Ｇタンパク質活性化、アデニリルシクラーゼ活性の阻害、またはβ−アレスチン動員から選択される少なくとも１種のμ−オピオイド受容体機能の増強を提供するのに有効である。
【００５５】
本発明の別の面では、μ−オピオイド受容体に対するポジティブアロステリックモジュレーターである化合物を、μ−オピオイド受容体に対するオルソステリックアゴニストである別の化合物と組み合わせて、それを必要とする患者に投与することを含む、該患者における疼痛の処置方法を提供する。
【００５６】
好ましくは、μ−オピオイド受容体に対するポジティブアロステリックモジュレーターである化合物は、δ−オピオイド受容体よりもμ−オピオイド受容体に選択的である。
【００５７】
好ましくは、μ−オピオイド受容体に対するポジティブアロステリックモジュレーターである化合物は、Ｇタンパク質活性化、アデニリルシクラーゼ活性の阻害、またはβ−アレスチン動員から選択される少なくとも１種のμ−オピオイド受容体機能の増強を提供するのに有効である。
【００５８】
本発明の別の面では、オルソステリックな外因性または内因性アゴニストの存在下、μ−オピオイド受容体と該受容体機能の増強を提供するのに有効な化合物を接触させることを含む、該受容体の調節方法を提供する。
【００５９】
好ましくは、受容体機能における増強が、最大効果、効力またはその両方で観察される。
【００６０】
本発明は特定の面について記載しているが、添付の特許請求の範囲が記載される特定の面に限定されるわけではないこと、および特許請求の範囲は、特許法下で提供される全範囲に効力がおよび得ることが意図される。
【００６１】
上記の実験で用いた材料および方法は以下の通りである。
【００６２】
試薬および細胞
Ｐｒｏｌｉｎｋ／酵素ドナー（ＰＫ）でタグ付けされたＯＰＲＭ１（μ−オピオイド）受容体またはＰｒｏｌｉｎｋ／酵素ドナー（ＰＫ）でタグ付けされたＯＰＲＤ１（δ−オピオイド）受容体の何れかを発現するように作製されたＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）β−アレスチンＵ２ＯＳ細胞は、ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ（Fremont, CA）から入手した。組み換えμ−オピオイド受容体（ＣＨＯ−ｍｕ）を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（Waltham, MA）から入手した。組み換えμ−オピオイド受容体（Ｃ６−ｍｕ）を安定に発現するＣ６神経膠腫細胞は、文献（２９）に記載の通りに作成された。細胞培養培地および添加剤は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ(商標)（Carlsbad, CA）から入手した。ＨＴＲＦ（登録商標）ｃＡＭＰ検出試薬は、Ｃｉｓｂｉｏ（Cambridge, MA）から入手した。ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）検出試薬は、ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ（商標）（Freemont, CA）から入手した。硫酸モルヒネ、ｌｅｕ−エンケファリン、β−エンドルフィン、および全ての他の非オピオイド受容体リガンドの生化学試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）（St. Louis, MO）から入手した。［３５Ｓ］ＧＴＰγＳおよび［３Ｈ］ジプレノルフィンは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒから入手した。全ての他のオピオイドリガンドは、Ｔｏｃｒｉｓ（Ellisville, MO）から入手した。
【００６３】
β−アレスチン動員アッセイ
βアレスチン動員アッセイは、ＤｉｓｃｏｖｅＲｘにより確立されたプロトコル（ＳＩ法参照のこと）によりＵ２ＯＳ−ＯＰＲＭ１およびＵ２ＯＳ−ＯＰＲＤ１細胞懸濁液中で実施した。
【００６４】
フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ蓄積アッセイの阻害
フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ蓄積の阻害は、確立されたプロトコール（ＳＩ法参照のこと）により、ＣｉｓＢｉｏ社のＨＴＲＦ ｃＡＭＰ 検出キットを用いてＣＨＯ−ｍｕ細胞懸濁液で行った。
【００６５】
細胞膜ホモジネート
ラットＭＯＲを安定に発現するＣ６神経膠腫細胞（Ｃ６−ｍｕ）を増殖させ、細胞膜を文献（３０）に記載の通りに調製した。マウス脳膜に関して、マウスを頚椎脱臼により安楽死させた。小脳を除く全脳組織を取り出し、氷冷した５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中ですぐに冷却し、文献（３１）に記載の通りに膜ホモジネートを調製した。最終的な膜ペレットを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中に懸濁し、等分し、−８０℃で保存した。タンパク質含量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（３２）を用いて決定した。
【００６６】
［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合アッセイ
膜における［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を、文献（２２）に記載の通りに実施した（ＳＩ法を参照のこと）。
【００６７】
［３Ｈ］ジプレノルフィン飽和結合実験
［３Ｈ］ジプレノルフィン飽和結合実験を、文献（３３）に記載の通りに実施した。簡単には、膜（５μｇ）を、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０μＭ  ＧＴＰγＳ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中、０−４ｎＭの［３Ｈ］ジプレノルフィンおよび１０μＭのモジュレーターと共に、１０μＭのナロキソンの有無下で、８０分間、室温にてインキュベートした。サンプルを、ＳＩ法にて［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合について記載の通りに、ガラス繊維フィルターマットで迅速に濾過した。
【００６８】
［３Ｈ］ジプレノルフィン競合結合実験
［３Ｈ］ジプレノルフィン競合結合実験を、文献（３４）に記載の通りに実施した。膜（１０μｇ）を、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０μＭ  ＧＴＰγＳ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中、０．２ｎＭの［３Ｈ］ジプレノルフィンおよび０−１０μＭのＤＡＭＧＯと共に、１０μＭのモジュレーターおよび／または１０μＭのナロキソンの有無下で、６０分間、室温にてインキュベートした。サンプルを、ＳＩ法にて［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合について記載の通りに、ガラス繊維フィルターマットで迅速に濾過した。
【００６９】
濃度応答データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（商標）５．０１（可変勾配を有するシグモイド用量反応）を用いて、Ｙｍｉｎ（底部（Bottom））、Ｙｍａｘ（頂部（Top））、効力（ＥＣ５０）および勾配因子（傾き（Hill slope））の推定値を提供するために、非線形回帰分析を用いてロジスティック方程式（式１）に適合させた。
【００７０】
Ｙ＝底部（Bottom）＋（頂部（Top）−底部（Bottom））／（１＋１０＾（（ＬｏｇＥＣ５０−Ｘ）＊HillSlope））      （式１）
（ここで、Ｐ値が記載されるとき、データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（商標）５．０１を用いて、Bonferroni（ボンフェローニ）の事後検定による分散の２ウェイＡＮＯＶＡ分析により分析した。）
【００７１】
β−アレスチン動員アッセイ
ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）Ｕ２ＯＳ−ＯＰＲＭ１およびＵ２ＯＳ−ＯＰＲＤ１細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、５００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８、および２５０μｇ／ｍｌ ハイグロマイシンを含む改変イーグル培地（ＭＥＭ）中で増殖させた。細胞を、細胞培養用ヌンク三層フラスコ（Thermo Fisher Scientific）中でコンフルエントまで増殖させ、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓを用いて集め、そしてアッセイバッファー（Ｈａｎｋの緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）＋２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、０．０５％ ＢＳＡ）中に１ｘ１０６細胞／ｍｌ濃度で再懸濁した。化合物（２０ｎｌの、１００％ＤＭＳＯ中１００ｘ終濃度）を、Ｅｃｈｏ−ｑｕａｌｉｆｉｅｄ  １５３６−ウェルソースプレート（Labcyte）からのＥｃｈｏ−５５０（Labcyte, Sunnyvale, CA）を用いて音響エネルギーによる液体分注により、白色の未処理の１５３６−ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に添加した。次いで、１μｌの、アッセイバッファー（アゴニスト検出モード）、または低濃度（〜ＥＣ１０）のオルソステリックアゴニスト（ＰＡＭ検出モード）を含むアッセイバッファー、または〜ＥＣ８０濃度のオルソステリックアゴニストを含むアッセイバッファー（アンタゴニスト／ＮＡＭ検出モード）を、アッセイプレートに添加した。用いるオルソステリックアゴニストおよびそれらの終濃度は結果に記載している。最後に、１μｌのアッセイバッファー中の細胞（１０００細胞／ウェル）をウェルに添加し、インキュベーションを開始した。プレートは蓋をして、室温にて９０分間、インキュベートした。インキュベーションを、１μｌのＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）試薬の添加により停止させた。１時間後、発光をＶｉｅｗｌｕｘ（登録商標）イメージングプレート読取装置（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて検出した。β−アレスチンアッセイにおける任意のμ−選択的ＰＡＭのさらなる特徴付けは、実質的に、結果に記載の種々のオルソステリックアゴニストリガンドおよび細胞株を用いて上記の通りに行った。
【００７２】
フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ蓄積の阻害アッセイ
組み換えヒトμ−オピオイド受容体（ＣＨＯ−ｍｕ）を発現するＣＨＯ細胞を、Ｔ−１７５組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中、１０％ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンおよび４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含むＦ１２培地中にコンフルエントまで増殖させ、ＴｒｉｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓで集めた。細胞を遠心によりペレットにし、６．６７ｘ１０５細胞／ｍｌ濃度でアッセイバッファー中に再懸濁した。
【００７３】
化合物（３０ｎｌの、１００％ＤＭＳＯ中１００ｘ終濃度）を、Ｅｃｈｏ−５５０を用いて音響エネルギーによる液体分注により、白色の未処理の１５３６−ウェルプレートに添加した。次いで、１．５μｌの、１ｍＭ  ＩＢＭＸおよび２ｘフォルスコリン（１μＭ  終濃度）を含むアッセイバッファーを、２ｘエンドモルフィン−Ｉ（３０ｐＭ終濃度、〜ＥＣ１０濃度）の不存在（アゴニスト検出モード）または存在（ＰＡＭ検出モード）下で該プレートに添加した。最後に、細胞（１．５μｌ／ウェル）を添加し、インキュベーションを開始した。プレートを、室温にて３０分間インキュベートし、その後、Ｃｉｓｂｉｏ  ＨＴＲＦ（登録商標）ｄｙｎａｍｉｃ  ｃＡＭＰ検出試薬（溶解緩衝液中１．５μｌのＤ２標識したｃＡＭＰトレーサー、次いで、溶解緩衝液中の１．５μｌのＥｕ−クリプテート結合抗−ｃＡＭＰ抗体）を添加した。室温にて１時間のインキュベーション後、時間分解蛍光測定（ＴＲＦ）を、３３７ｎｍでの励起および６１５ｎｍおよび６６５ｎｍでの発光をＶｉｅｗｌｕｘ（登録商標）またはＥｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）を用いて検出した。その後、レシオメトリックデータ（６６５ｎｍ読み取り／６１５ｎｍ読み取り）＊１０，０００を、アッセイと同時に同一条件下で行ったｃＡＭＰの標準曲線に基づいてｃＡＭＰ（ｎＭ）に変換した（細胞の添加工程を置き換える）。
【００７４】
曲線シフトアッセイおよびプローブ依存性アッセイを用いて、ＣＨＯ−ｍｕ ｃＡＭＰアッセイにおけるμ−選択的ＰＡＭの特徴付けを、結果に記載のオルソステリックアゴニストおよびモジュレーターを用いて、上記の通りに行った。
【００７５】
［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合アッセイ
膜を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で希釈し、ＧＤＰ（１容量の膜＋２容量の２ｘアッセイバッファー）を含むアッセイバッファーを用いて、室温にて３０分間、水浴中で振とうしながら、予めインキュベートした。その後、１５０μｌの膜／アッセイバッファー混合物を、５０μｌの薬剤および［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（終濃度：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ジチオスレイトール、３０−１００μＭ  ＧＤＰ、０．１ｎＭ  ［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ、０−３０μＭ  ＤＡＭＧＯまたはモルヒネ、１０μＭ  モジュレーターまたは２％  ＤＭＳＯ終濃度を達成するためのＤＭＳＯ、およびＣ６−ｍｕ細胞膜ｓについて１５μｇ  膜タンパク質／ウェル、またはマウス脳膜について１０μｇ膜タンパク質／ウェル）を含むウェルに添加した。さらに５分間室温にてインキュベーション後、サンプルを、Ｂｒａｎｄｅｌのセル・ハーベスタを用いてガラス繊維フィルターマットを通して迅速に濾過し、氷冷洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で５回濯いだ。濾過マットを乾燥させ、シンチレーションカクテルを加え、フィルター上に残った放射性物質をＷａｌｌａｃマイクロベータ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）でカウントした。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】μ−ＰＡＭの構造およびβ−アレスチン動員に対する効果。ＢＭＳ−９８６１２１（Ａ）およびＢＭＳ−９８６１２２（Ｂ）として示される２種の見掛け上のμ−オピオイド受容体選択的ポジティブアロステリックモジュレーター（μ−ＰＡＭ）の化学構造は、ハイスループットのβ−アレスチン動員スクリーニングより同定された。ＢＭＳ−９８６１２１（Ｃ）およびＢＭＳ−９８６１２２（Ｄ）を、アゴニスト検出モード（化合物単独）およびＰＡＭ検出モード（低濃度（〜ＥＣ１０）のオルソステリックアゴニストの存在下での化合物）にて種々の濃度でアッセイした。μ−オピオイド受容体を発現する細胞（Ｕ２ＯＳ−ＯＰＲＭ１）に対して、エンドモルフィン−Ｉ（２０ｎＭ）がオルソステリックアゴニストとして使用され、δ−オピオイド受容体を発現する細胞（Ｕ２ＯＳ−ＯＰＲＤ１）に対して、ｌｅｕ−エンケファリン（０．４ｎＭ）がオルソステリックアゴニストとして使用された。データは３回の実験の平均±標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）として表す。アゴニスト検出モードにおいて、０および１００％の活性は、基底の活性を示し、それぞれ、エンドモルフィン−ＩのＥｍａｘ（Ｕ２ＯＳ−ＯＰＲＭ１において、６倍のシグナル）またはｌｅｕ−エンケファリンのＥｍａｘ（Ｕ２ＯＳ−ＯＰＲＤ１において、４倍のシグナル）であった。ＰＡＭ検出モードにおいて、０％活性は、低濃度（〜ＥＣ１０）のオルソステリックアゴニスト（Ｕ２ＯＳ−ＯＰＲＭ１細胞においてエンドモルフィン−Ｉ、およびＵ２ＯＳ−ＯＰＲＤ１細胞においてｌｅｕ−エンケファリン）について正規化される。１００％活性は、これらのそれぞれのアゴニストのＥｍａｘ濃度に対する応答を表す。
【００７７】
【図２】Ｕ２ＯＳ−ＯＰＲＭ１細胞における、エンドモルフィン−Ｉにより刺激されたβ−アレスチン動員に対する、μ−ＰＡＭであるＢＭＳ−９８６１２１およびＢＭＳ−９８６１２２の効果。ＢＭＳ−９８６１２１（Ａ）およびＢＭＳ−９８６１２２（Ｂ）は両方とも、アゴニストであるエンドモルフィン−Ｉへのβ−アレスチン動員応答を濃度依存的に左方向へシフトさせた。化合物の各濃度でのエンドモルフィン−Ｉについての計算値ＥＣ５０（ｎＭ）は、各図の説明文に示される。ＰＡＭ化合物の増加濃度の存在下でのエンドモルフィン−ＩについてのＥＣ５０値の左方向シフト倍数を（Ｃ）に示す。データは、４回の実験の平均±標準誤差で表す。
【００７８】
【図３】ＣＨＯ−ｍｕ細胞におけるフォルスコリンにより刺激されたｃＡＭＰ蓄積の阻害に対するμ−ＰＡＭの効果。ＢＭＳ−９８６１２１（Ａ）およびＢＭＳ−９８６１２２（Ｂ）は両方とも、低濃度（〜ＥＣ１０；３０ｐＭ）のエンドモルフィン−Ｉ（ＰＡＭ検出モード）の効果を濃度依存的に増加させた。しかしながら、両化合物はまた、単独で添加されたとき（アゴニスト検出モード）、基底活性より高いアゴニスト活性を示した。アゴニスト検出モードでは、０％活性は、ビークル（基底）活性を表す。ＰＡＭ検出モードでは、０％は、〜ＥＣ１０（３０ｐＭ）濃度のエンドモルフィン−Ｉに対する応答に正規化される。１００％応答は、両アゴニストおよびＰＡＭ検出モードにおけるエンドモルフィン−Ｉ（１０ｎＭ）のＥｍａｘ濃度に対する応答を表す。データは、３回の実験の平均±標準誤差で表す。
【００７９】
【図４】Ｃ６−ｍｕ細胞およびマウス脳由来の膜におけるμ−オピオイドアゴニストにより刺激された［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合、ならびにＣ６−ｍｕ細胞膜におけるＤＡＭＧＯ結合親和性に対するμ−ＰＡＭの効果。Ｃ６−ｍｕ膜における［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合は、方法および材料に記載の通りに決定された。［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を刺激するためのＤＡＭＧＯのＥＣ５０は、１０μＭのμ−ＰＡＭ ＢＭＳ−９８６１２１の存在下で４倍左方シフトした（Ａ）。ＢＭＳ−９８６１２２は、ＤＡＭＧＯ効力を７倍増加させた（Ｂ）。ＤＡＭＧＯによる最大刺激は、ＢＭＳ−９８６１２２またはＢＭＳ−９８６１２１に影響されなかった。μ−ＰＡＭは、基底値に有意な影響を与えなかった（ビークル対照基底＝３．２±０．２ｆｍｏｌ  結合／ｍｇ  タンパク質）。［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を刺激するモルヒネのＥＣ５０は、１０μＭ  ＢＭＳ−９８６１２１の存在下で２．５倍左方シフトした（Ｃ）。ＢＭＳ−９８６１２２（１０μＭ）は、モルヒネ効力を３倍増加させた（Ｄ）。ＤＡＭＧＯと比較したモルヒネの最大効果は、ＢＭＳ−９８６１２１（Ｃ）およびＢＭＳ−９８６１２２（Ｄ）により増加した。ＢＭＳ−９８６１２２（１０μＭ）は、［３Ｈ］ジプレノルフィンとのＤＡＭＧＯ競合結合実験においてＤＡＭＧＯ親和性を６倍左方シフトさせたが（Ｅ）、［３Ｈ］ジプレノルフィン結合親和性には影響を及ぼさなかった（図Ｓ２、表Ｓ１）。マウス脳由来の膜における［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を刺激するＤＡＭＧＯのＥＣ５０は、１０μＭ  ＢＭＳ−９８６１２２の存在下で４．５倍左方シフトした（Ｆ）。基底［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合（４．８±０．４ｆｍｏｌ  結合／ｍｇ  タンパク質）は、１０μＭ  ＢＭＳ−９８６１２２の影響を受けなかった。それぞれデュプリケートで行われた３〜７回の別個のアッセイからのデータをまとめて平均±標準誤差で表す。
【００８０】
【図５】β−アレスチン動員アッセイおよびＤＡＭＧＯ仲介［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合における機能的ＳＡＭの特徴付け。（Ａ）ＢＭＳ−９８６１２３およびＢＭＳ−９８６１２４は、Ｕ２ＯＳ−ＯＰＲＭ１細胞におけるβ−アレスチン動員アッセイにおいて、〜ＥＣ８０濃度のＢＭＳ−９８６１２２（１２．５μＭ）＋〜ＥＣ２０濃度のエンドモルフィン−Ｉ（３０ｎＭ）（ＳＡＭ検出モード）に対するＰＡＭ応答を阻害した。１００％活性は、ＢＭＳ−９８６１２２＋エンドモルフィン−Ｉの併用の活性を表し、０％活性は、〜ＥＣ２０濃度のエンドモルフィン−Ｉ単独の活性を表す。グラフは、３回の実験の平均±標準誤差を示す。ＢＭＳ−９８６１２３およびＢＭＳ−９８６１２４は、Ｕ２ＯＳ−ＯＰＲＭ１細胞またはＵ２ＯＳ−ＯＰＲＤ１細胞の何れかにおけるアゴニストまたはＰＡＭ検出モードにおいて活性を示さなかった（図Ｓ３）。同様に、これらの２個の化合物は、Ｕ２ＯＳ−ＯＰＲＭ１細胞においてＮＡＭ／アンタゴニスト活性（〜ＥＣ８０（３００ｎＭ）濃度のエンドモルフィン−Ｉの存在下）を示さなかった（図Ｓ４）。（Ｂ）Ｃ６−ｍｕ膜において［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を刺激するＤＡＭＧＯの効力は、μ−ＰＡＭ ＢＭＳ−９８６１２２（１０μＭ）の存在下で８倍増加した。ＳＡＭ  ＢＭＳ−９８６１２４（５０μＭ）とＢＭＳ−９８６１２２（１０μＭ）との共インキュベーションは、ＤＡＭＧＯの効力を２倍のみ増加させ、このことは、ＢＭＳ−９８６１２４が、ＢＭＳ−９８６１２２のＰＡＭ効果に拮抗し得ることを示唆する。それぞれデュプリケートで行われた３−７回の別個のアッセイからのデータはまとめて平均±標準誤差で表される。ＥＣ５０値を、GraphPad Prism（グラフパッド プリズム）を用いるスチューデントのｔ検定により比較した。（＊＊）は、ｐ＜０．０１を表す。種々の条件下でＤＡＭＧＯにより刺激された［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の濃度応答曲線を図Ｓ５に示す。
【００８１】
【図Ｓ１】ＣＨＯ−ｍｕ細胞における１μＭ  フォルスコリンにより刺激されたｃＡＭＰ蓄積の阻害に対するエンドモルフィン−Ｉの効果。エンドモルフィン−Ｉは、フォルスコリンにより刺激されたｃＡＭＰ蓄積を１７倍低減させ、ＥＣ５０濃度が７６（６０−９６）ｐＭである。データは、３回の実験の平均±標準誤差として表される。
【００８２】
【図Ｓ２】Ｃ６−ｍｕ細胞由来の膜における［３Ｈ］ジプレノルフィン飽和結合に対する、μ−ＰＡＭであるＢＭＳ−９８６１２２、およびＳＡＭであるＢＭＳ−９８６１２３の効果。ＢＭＳ−９８６１２２（Ａ）は、［３Ｈ］ジプレノルフィン結合親和性に有意な影響を及ぼさなかったが、競合結合実験においてＤＡＭＧＯの親和性を６倍増加させた（図５Ｃ、表Ｓ１参照）。ＢＭＳ−９８６１２３（Ｂ）は、［３Ｈ］ジプレノルフィン親和性の少ないが有意な（〜２倍）減少を生じ、ＤＡＭＧＯ親和性には有意な影響を及ぼさなかった（表Ｓ１参照）。データは、３−７回の実験の平均±標準誤差として表す。
【００８３】
【図Ｓ３】Ｕ２ＯＳ−ＯＰＲＤ１およびＵ２ＯＳ−ＯＰＲＭ１細胞におけるβ−アレスチン動員アッセイにおけるＢＭＳ−９８６１２２および１８種の類縁体の活性。化合物を、アゴニスト検出モード（ｌｅｕ−エンケファリンの不存在下）およびＰＡＭ検出モード（〜ＥＣ１０濃度のｌｅｕ−エンケファリンの存在下）においてＵ２ＯＳ−ＯＰＲＤ１細胞にて試験した。化合物をまた、アゴニスト検出モード（エンドモルフィン−Ｉの不存在下）およびＰＡＭ検出モード（〜ＥＣ１０濃度のエンドモルフィン−Ｉの存在下）においてＵ２ＯＳ−ＯＰＲＭ１細胞にて試験した。最後に、Ｕ２ＯＳ−ＯＰＲＭ１細胞においてアゴニスト活性またはＰＡＭ活性を示さなかった化合物を、ＳＡＭ検出モード（〜ＥＣ２０濃度のエンドモルフィン−Ｉ＋〜ＥＣ８０濃度のＰＡＭ  ＢＭＳ−９８６１２２の存在下）にて試験した。グラフィカル・カーブフィット(非線形回帰)データは、３回の併用実験の代表である。ＥＣ５０値およびＥｍａｘ値は、表Ｓ２に示される。アゴニスト検出モードについて、０％および１００％活性は、それぞれ基底活性およびＥｍａｘ濃度のオルソステリックアゴニストを示す。ＰＡＭ検出モードについて、０％活性は、低（〜ＥＣ１０）濃度のアゴニスト単独に対する応答を示し、１００％活性は、Ｅｍａｘ濃度のアゴニストに対する応答を示す。ＳＡＭ検出モードについて、０％阻害は、低（〜ＥＣ２０）濃度のエンドモルフィン−Ｉと〜ＥＣ８０濃度のμ−ＰＡＭであるＢＭＳ−９８６１２２の併用に対する応答を示す。１００％阻害は、低（〜ＥＣ２０）濃度のエンドモルフィン−Ｉ単独に対する応答を示す。
【００８４】
【図Ｓ４】Ｕ２ＯＳ−ＯＰＲＭ１細胞における〜ＥＣ８０濃度のエンドモルフィン−Ｉ（アンタゴニスト／ＮＡＭ検出モード）に対するβ−アレスチン応答へのＢＭＳ−９８６１２３およびＢＭＳ−９８６１２４の効果。ＢＭＳ−９８６１２３およびＢＭＳ−９８６１２４は、Ｕ２ＯＳ−ＯＰＲＭ１細胞におけるエンドモルフィン−Ｉ（３００ｎＭ）により仲介されるβ−アレスチン活性に有意な影響を及ぼさなかった。１００％活性は、エンドモルフィン−Ｉ（３００ｎＭ）単独に対する応答に対して正規化された。０％活性は、基底活性を表す。データは、３回の実験の平均±標準誤差として示される。
【００８５】
【図Ｓ５】Ｃ６−ｍｕ細胞膜におけるＤＡＭＧＯにより刺激される［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合に対するＢＭＳ−９８６１２２により仲介されるＰＡＭ活性へのＢＭＳ−９８６１２４の効果。Ｃ６−ｍｕ膜におけるＤＡＭＧＯにより刺激される［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合効力は、μ−ＰＡＭ  ＢＭＳ−９８６１２２（１０μＭ）の存在下で８倍増加した（Ａ）。ＤＡＭＧＯにより刺激される［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合効力は、５０μＭ  ＢＭＳ−９８６１２４とのインキュベーションによって影響を受けなかった（Ｂ）。ＢＭＳ−９８６１２４（５０μＭ）とＢＭＳ−９８６１２２（１０μＭ）との共インキュベーションは、ＢＭＳ−９８６１２２単独でのインキュベーションと比較して、ＤＡＭＧＯ効力の右方シフトをもたらした（Ｃ）。ＤＡＭＧＯの効力は、ＢＭＳ−９８６１２２およびＢＭＳ−９８６１２４の両方の存在下で、ビークル対照の存在下におけるＤＡＭＧＯ効力と比較してわずかに２倍左方シフトした。これらのデータは、ＢＭＳ−９８６１２４が、ＢＭＳ−９８６１２２のＰＡＭ効果を拮抗することができることを示唆する。それぞれデュプリケートで行われた３−７回の個別のアッセイからのデータをまとめて平均±標準誤差で示す。ＥＣ５０値は、結果および考察の項および図５Ｂに示す。
【００８６】
【図Ｓ６】Ｃ６−ｍｕ細胞由来の膜における基底活性以上のＳＡＭであるＢＭＳ−９８６１２３およびＢＭＳ−９８６１２４のＤＡＭＧＯにより刺激される［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合に対する効果。ＤＡＭＧＯ効力（２２２（１７９−２７４）ｎＭのＥＣ５０）は、ＢＭＳ−９８６１２３（Ａ）（３２１（２３９−４３２）ｎＭのＥＣ５０）またはＢＭＳ−９８６１２４（Ｂ）（２２３（１５０−３３１）ｎＭのＥＣ５０）により顕著な影響を受けなかった。ＤＡＭＧＯによる最大刺激（対照  ｍａｘ＝２３２（２２３−２４２）％）は、ＢＭＳ−９８６１２４により影響を受けなかった（２４３（２２４−２６２）％。最大刺激は、ＢＭＳ−９８６１２３によりわずかに減少した（２０６（１９３−２１８）％。モジュレーターは、基底値に顕著な影響を与えなかった（ビークル対照  基底＝３．２±０．２ｆｍｏｌ  結合／ｍｇ  タンパク質）。それぞれデュプリケートで行われた３−７回の個別のアッセイからのデータをまとめて示す。
【００８７】
【図Ｓ７】Ｃ６−ｍｕ細胞由来の膜におけるモルヒネにより刺激される［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合に対する、ＳＡＭであるＢＭＳ−９８６１２３およびＢＭＳ−９８６１２４の効果。［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を刺激するためのモルヒネのＥＣ５０（１１０（７１−１７１）ｎＭ）は、ＢＭＳ−９８６１２３（Ａ）（１４０（６７−２９３）ｎＭ；６７−２９３）ｎＭ）の顕著な影響を受けなかったが、ＢＭＳ−９８６１２４（Ｂ）（２４５（１６１−３７２）ｎＭ）により減少した。ＤＡＭＧＯ（３０μＭ）（対照  ｍａｘ＝４２（３８−４５）％）と比較したモルヒネの最大効果は、ＢＭＳ−９８６１２３（６２（５２−７３）％）およびＢＭＳ−９８６１２４（５８（５３−６４）％）によりわずかに増加した。それぞれデュプリケートで行われた３−７回の個別のアッセイからのデータをまとめて示す。
【００８８】
【図Ｓ８】ＣＨＯ−ｍｕ細胞における異なるオルソステリックアゴニストにより仲介される、フォルスコリンにより刺激されたｃＡＭＰ蓄積の阻害に対するμ−ＰＡＭ  ＢＭＳ−９８６１２１の効果。ＢＭＳ−９８６１２１（１００μＭ）は、使用される３種のオルソステリックリガンドそれぞれのアゴニスト効力を左方シフトさせた（（Ａ）エンドモルフィン−Ｉ＝４倍、（Ｂ）モルヒネ＝６．５倍、および（Ｃ）ｌｅｕ−エンケファリン＝４．５倍））。各ＢＭＳ−９８６１２１濃度でのアゴニストのＥＣ５０値は、図中の説明文に示される。データは、３回の実験の平均±標準誤差で表す。
【実施例】
【００８９】
表Ｓ１
Ｃ６−ｍｕ細胞由来の膜における［３Ｈ］ジプレノルフィン飽和結合およびＤＡＭＧＯ競合的結合に対する、μ−ＰＡＭであるＢＭＳ−９８６１２２、およびＳＡＭ、ＢＭＳ−９８６１２３の効果
【表１】
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【００９０】
表Ｓ２
ＰＡＭ検出モードでのＵ２ＯＳ−ＯＰＲＭ１細胞におけるβ−アレスチン動員アッセイにて試験した、ＢＭＳ−９８６１２２および類縁体の構造活性相関。
ＰＡＭ活性を示す化合物は、それらの有効性を、完全（Ｆｕｌｌ）、強い（Ｓｔｒｏｎｇ）、普通（Ｍｏｄｅｒａｔｅ）、または弱い（Ｗｅａｋ）ＰＡＭとして記載された。０％活性は、低（〜ＥＣ１０）濃度のエンドモルフィン−Ｉ単独に対する応答を示し、１００％活性は、Ｅｍａｘ濃度のエンドモルフィン−Ｉに対する応答を示す。ＰＡＭ活性を示さなかった２種の化合物は、ＳＡＭ検出モード（低濃度（〜ＥＣ２０）のエンドモルフィン−Ｉの存在下でのＢＭＳ−９８６１２２（〜ＥＣ８０）応答の阻害）でさらに試験され、ここで、化合物は、ＢＭＳ−９８６１２２応答の阻害を示した（図Ｓ３）。計算値Ｋｂは、ＩＣ５０値から得られた。ＳＡＭ化合物であるＢＭＳ−９８６１２３およびＢＭＳ−９８６１２４の濃度応答曲線を図５Ａに示す。データは、３回の実験の平均として表される。
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図Ｓ１】
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【図Ｓ２】
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【図Ｓ３−１】
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【図Ｓ３−２】
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【図Ｓ３−３】
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【図Ｓ４】
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【図Ｓ５】
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【図Ｓ６】
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【図Ｓ７】
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【図Ｓ８】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年9月4日(2015.9.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ポジティブアロステリックモジュレーターである試験化合物および低濃度のμ−選択的オルソステリックアゴニストを、それぞれ単独で、または式Ｉで示されるサイレントアロステリック化合物（ＢＭＳ−９８６１２３）と共に細胞に添加し、
（ｉｉ）該μ−選択的オルソステリックアゴニストおよび該試験化合物の、それぞれ単独での、または該式Ｉの化合物の存在下での、該細胞に対する効果を測定し、そして
（ｉｉｉ）該式Ｉの化合物が、該試験化合物のポジティブアロステリックアゴニスト活性の低減により証明されて、該試験化合物との競合的結合を示すとき、該試験化合物がポジティブアロステリックモジュレーターであると同定する
工程を含む、μ−オピオイド受容体ポジティブアロステリックモジュレーターを同定するためのスクリーニング方法。
【請求項２】
低濃度のμ−選択的オルソステリックアゴニストが、
（ａ）該細胞において計算されたＥＣ８０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｂ）該細胞において計算されたＥＣ７０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｃ）該細胞において計算されたＥＣ６０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｄ）該細胞において計算されたＥＣ５０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｅ）該細胞において計算されたＥＣ４０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｆ）該細胞において計算されたＥＣ３０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
（ｇ）該細胞において計算されたＥＣ２０濃度以下またはそれにほぼ等しい、および
（ｈ）該細胞において計算されたＥＣ１０濃度以下またはそれにほぼ等しい、
からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）ネガティブアロステリックモジュレーターである試験化合物および高濃度のμ−選択的オルソステリックアゴニストを、それぞれ単独で、または式Ｉで示されるサイレントアロステリック化合物（ＢＭＳ−９８６１２３）と共に細胞に添加し、
（ｉｉ）該μ−選択的オルソステリックアゴニストおよび該試験化合物の、それぞれ単独での、または該式Ｉの化合物の存在下での、該細胞に対する効果を測定し、そして
（ｉｉｉ）該式Ｉの化合物が、該試験化合物のネガティブアロステリックアゴニスト活性の低減により証明されて、該試験化合物との競合的結合を示すとき、該試験化合物がネガティブアロステリックモジュレーターであると同定する
工程を含む、μ−オピオイド受容体ネガティブアロステリックモジュレーターを同定するためのスクリーニング方法。
【請求項４】
低濃度のμ−選択的オルソステリックアゴニストが、
（ａ）該細胞において計算されたＥＣ１０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｂ）該細胞において計算されたＥＣ２０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｃ）該細胞において計算されたＥＣ３０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｄ）該細胞において計算されたＥＣ４０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｅ）該細胞において計算されたＥＣ５０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｆ）該細胞において計算されたＥＣ６０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｇ）該細胞において計算されたＥＣ７０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｈ）該細胞において計算されたＥＣ８０濃度以上またはそれにほぼ等しい、
（ｉ）該細胞において計算されたＥＣ９０濃度以上またはそれにほぼ等しい、および
（ｊ）該細胞において計算されたＥＣ１００濃度以上またはそれにほぼ等しい、
からなる群より選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
該細胞がＵ２ＯＳ細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該細胞が、ＯＰＲＭ１のＣ末端に結合したβ−ガラクトシダーゼの変異アミノ末端フラグメントに加えて、β−アレスチン２のＣ末端に結合したβ−ガラクトシダーゼのＮ末端欠失変異体の両方を組み換え的に発現する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
該μ−選択的オルソステリックアゴニストがエンドモルフィン−Ｉである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
該細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
該細胞が、ヒトμ−オピオイド受容体（ＣＨＯ−ｍｕ）を組み換え的に発現する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該μ−選択的オルソステリックアゴニストがエンドモルフィン−Ｉである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該細胞がＣ６神経膠腫細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
該細胞が、ヒトμ−オピオイド受容体（Ｃ６−ｍｕ）を組み換え的に発現する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
該μ−選択的オルソステリックアゴニストがＤＡＭＧＯである、請求項１２記載の方法。
【国際調査報告】
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