(57)【要約】  遺伝的に多様な刺激応答遺伝子関連（ＧＤＳＲＧＡ）研究の影響を改善するための方法を提供する。この方法には、ドナー集団の各ドナーから生物学的試料を得るステップと；各生物学的試料から少なくとも部分的なゲノム配列を得ること、生物学的試料の配列を整列させること、および、正確に配列決定することができないかまたは整列できない生物学的試料を除去すること、によって生物学的試料から共通するコホートを選択するステップと；生物学的試料に試験分子または試験条件を適用して、コホートのメンバーの中で表現型が異なる応答を誘導するステップと；表現型が異なる応答に基づいて生物学的試料を亜集団に分けるステップ；とによって、ＧＤＳＲＧＡ研究で対比する亜集団を作製することを含み得る。これらの亜集団は、ＧＤＳＲＧＡ研究において使用され得る。
2016528927.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝的に多様な刺激応答遺伝子関連研究において比較される亜集団を作製する方法であって、
ａ．ドナー集団の各ドナーから生物学的試料を得るステップと；
ｂ．各生物学的試料から少なくとも部分的なゲノム配列を得ること、生物学的試料の配列を整列させること、および、正確に配列決定することができないかまたは整列できない生物学的試料をコホートから排除すること、によって生物学的試料から共通するコホートを選択するステップと；
ｃ．生物学的試料に分子または条件を適用して、コホートのメンバーの中で表現型が異なる応答を誘導するステップと；
ｄ．表現型が異なる応答に基づいて生物学的試料を亜集団に分けるステップ；
とを含み、
亜集団は、遺伝的に多様な刺激応答遺伝子関連研究において対比される、方法。
【請求項２】
遺伝的に多様な刺激応答遺伝子関連研究が、動物、哺乳動物、またはヒトに対して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物学的試料が、器官系、器官、組織、細胞、幹細胞、複能性(multipotent)幹細胞もしくはその派生物、または多能性(pluripotent)幹細胞もしくはその派生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
生物学的試料がインビトロまたはインシリコのいずれかで含有される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
生物学的試料のコホートの複数の同一コピーを作出すること、およびこのコホートが関与する将来の実験で使用するためにこれらのコピーを別々に保存することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
コピーを凍結保存する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
試験分子または試験条件が、低分子医薬品、生物学的作用物質、ワクチン、工業化学物質、病原体、毒素、または環境条件からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
表現型が異なる集団が、指定した応答程度を引き起こすために必要な試験分子の量または環境条件の程度を定量的に測定することによって定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
表現型が異なる集団が、試験分子または環境条件への曝露と指定した応答程度が生じる時間との間の時間間隔によって定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
表現型が異なる集団が、同じ実験で測定された多数のパラメータについての試験対象応答に基づいて定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
表現型が異なる集団が、２つ以上の独立した実験で測定された１つまたは複数のパラメータに基づく試験対象応答に基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
遺伝的に多様な刺激応答遺伝子関連研究を実施する方法であって、
ａ．ドナー集団の各ドナーから生物学的試料を得るステップと；
ｂ．各生物学的試料から少なくとも部分的なゲノム配列を得ること、生物学的試料の配列を整列させること、および、正確に配列決定することができないかまたは整列できない生物学的試料をコホートから排除すること、によって生物学的試料から共通するコホートを選択するステップと；
ｃ．生物学的試料に試験分子または試験条件を適用して、コホートのメンバーの中で表現型が異なる応答を誘導するステップと；
ｄ．表現型が異なる応答に基づいて生物学的試料を亜集団に分けるステップと
ｅ．亜集団間の試験分子または試験条件に対する応答を対比するステップであって、陽性応答が有効な刺激を示し、陰性応答が有害な刺激を示す、ステップ；
とを含み、
ドナーが、遺伝子以外の多様性を排除するかまたは最小限に抑える方法を使用して得られる、方法。
【請求項１３】
試料を収集したときドナーが所定の年齢の１年以内である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ドナーが新生仔である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
生物学的試料が周産期幹細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ドナーが妊娠中に類似の環境条件に曝露されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ドナーが同じ共同体において生まれたか、ドナーの母親が妊娠中に同じ共同体に住んでいたか、ドナーの母親が妊娠中に同じ職業に就いていたか、またはドナーが所定の時間内に出生した、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
遺伝的に多様な刺激応答遺伝子関連研究を実施するために試験対象のコホートを２つ以上の表現型の異なる集団に分ける方法であって、
ａ．ドナー集団の各ドナーから生物学的試料を得るステップと；
ｂ．各生物学的試料から少なくとも部分的なゲノム配列を得ること、生物学的試料の配列を整列させること、および、正確に配列決定することができないかまたは整列できない生物学的試料をコホートから排除すること、によって生物学的試料から試験対象の共通するコホートを選択するステップと；
ｃ．試験対象のコホートの生物学的試料に試験分子または試験条件を適用して、コホートのメンバーの中で表現型が異なる応答を誘導するステップと；
ｄ．表現型が異なる応答に基づいて生物学的試料を２つ以上の亜集団に分けるステップ；
とを含み、
２つ以上の亜集団が、試験分子または試験条件に対する試験対象の応答の定量的測定の所定の範囲によって定義される、方法。
【請求項１９】
試験を実施したコホートのサブセットのみが遺伝的に多様な刺激応答遺伝子関連研究に含まれ、
サブセットには、症例亜集団に含めるために応答が最高である試験対象、および対照亜集団に含めるためにスコアが最低である試験対象が含まれる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
試験を実施したコホートのサブセットのみが遺伝的に多様な刺激応答遺伝子関連研究に含まれ、
サブセットには、症例亜集団に含めるために応答が最低である試験対象、および対照亜集団に含めるためにスコアが最高である試験対象が含まれる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
次に高いスコア、および次に低いスコアが付いた試験対象の応答と比較したときの試験対象による応答レベルの変位点に基づいて、試験対象が多数の亜集団に分離され、全ドナーが亜集団に入る、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
分離させる試験対象がコホート内の試験対象のサブセットのみを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
表現型が異なる集団が、所定の程度の応答を引き起こすために必要な刺激の程度を定量的に測定することによって定義される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
表現型が異なる集団が、刺激への曝露と所定の程度の応答が引き起こされる時間との間の時間間隔によって定義される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
表現型が異なる集団が、同じ実験で測定された多数のパラメータについての試験対象の応答に基づいて定義される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
表現型が異なる集団が、２つ以上の独立した実験で測定された１つまたは複数のパラメータに基づく試験対象の応答に基づく、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
分離した異なる範囲が、刺激が同じ実験または異なる実験で発生するかどうかに関わらず、刺激に対する試験対象の応答を別の刺激に対する試験対象の応答と数学的に比較するアルゴリズムを使用して定義される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
分離した異なる範囲が、刺激が同じ実験または異なる実験で発生するかどうかに関わらず、刺激に対する試験対象の応答を同一の刺激に対する異なる試験対象の応答と数学的に比較するアルゴリズムを使用して定義される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
どの細胞、組織、器官または器官の種類が特定の対立遺伝子によって影響を受けるかを同定する方法であって、
ａ．ドナー集団の各ドナーから生物学的試料を得るステップと；
ｂ．各生物学的試料から少なくとも部分的なゲノム配列を得ること、生物学的試料の配列を整列させること、および、正確に配列決定することができないかまたは整列できない生物学的試料をコホートから排除すること、によって生物学的試料から共通するコホートを選択するステップと；
ｃ．共通コホートの各生物学的試料から２つ以上の異なる細胞、組織、器官または器官の種類を生成するステップと；
ｄ．生物学的試料に分子または条件を適用して、コホートのメンバーの中で表現型が異なる応答を誘導するステップと；
ｅ．刺激応答遺伝子関連研究によって応答を分析するステップと；
ｆ．ドナーの１細胞、組織、器官または器官の種類を遺伝的に多様な刺激応答遺伝子関連研究によって分析したときには、刺激に対する所定の応答に関連するが、同じドナーの異なる細胞、組織、器官または器官の種類を遺伝的に多様な刺激応答遺伝子関連研究によって分析したときには、刺激に対する所定の応答に関連しない、対立遺伝子を同定するステップ；
とを含み、
細胞、組織、器官または器官の種類が同定した対立遺伝子によって影響を受ける、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、遺伝子関連研究の分野に関する。詳細には、本出願は、刺激応答に基づく遺伝子関連研究における試験対象による様々な応答に関与した対立遺伝子の検索が関与する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
文明の夜明け以来、哲学者および科学者等は、（１）なぜ人類は種として存在するのか（すなわち、共通性の問題）、そして（２）なぜ人類は互いに異なるのか（すなわち、多様性の問題）を理解しようとしてきた。高い抽象的レベルでは、これらの問題はそれぞれ２つの観点、すなわち、内在性（例えば、なぜほとんどの成人は一般的に身長が約５から６フィートなのか、何が原因で異常に低いまたは高い人になるのか？）および外来性、または刺激に対する応答性（例えば、なぜ特定の化学物質がほとんどの人類において１つの反応を引き起こすのか、なぜその他の人には別の反応を引き起こすのか？）において追求することができる。
【０００３】
ＤＮＡの構造の発見およびその後のヒトゲノムの解読によって、これらの問題の内在性および刺激応答の両方の解釈を進展させる新たな機会が作出された。しかし、この２点の間の進展の様相は利用可能な技術が大きく違うため異なっていた。本発明の方法は、刺激応答の観点における多様性の問題に関連した技術の比較的弱い部分に取り組む。
【０００４】
内在性の観点では、遺伝学の科学者等は、ここでは論じないが内在性に係る共通性の問題、および内在性に係る多様性の問題の両方を探究するためにゲノムを使用してきた。特定の１つの技術である遺伝子関連研究は、個体の外観、機能などの表現型の違いを引き起こす遺伝的変異の役割を発見するために貴重であることが分かってきた。これらの研究では、コホート内では共通しているがコホート間では統計学的に意味のある程度にまで異なっている表現型要素（身長、目の色など）に基づいて対象をコホートに分ける。次に、同じコホートを統計学的にも区別する遺伝子変異を分離するためにコホートの遺伝組成を比較する。
【０００５】
この取り組みは、１つまたは複数の遺伝子のパターンおよび関連程度を分析する技術を含めて非常に高度に発展してきた。例えば、科学者等は、限定されることなく、全ゲノム、全エキソーム、ゲノムもしくはエキソームの特定の領域または個々に同定した遺伝子を含む一塩基多形の様々な集合を調べるために、遺伝子情報の多数のサブセットを開発した。科学者等は、ＤＮＡ自体を調べるよりも、ＤＮＡの産物、例えば、トランスクリプトームを使用したＲＮＡから得られる情報を利用した。科学者等は、単一の遺伝子座の効果、多数の遺伝子座の効果、および主要効果対純粋な上位性効果を分離するために調べた。科学者等は、直接的および間接的な遺伝子関連性の両方を調べた。そして、様々な数学的手段、例えば、２次元マトリクス、ヒートマップ、自己組織化マップ、クラスター解析手段などを開発した。
【０００６】
刺激応答の観点では、遺伝子関連研究は多様性の問題よりもまず共通性の問題に使用されてきた。例えば、種の多数のメンバーの組織試料に化学物質を適用し、その後どの遺伝子（複数可）の発現レベルが変化するかを測定することによって、（一般的に、集団において）どの遺伝子が化学物質（刺激）に対する種の応答に関連しているかを決定することが一般的な手法である。しかし、これらの技術への刺激応答の入力は常に、暗黙の前提、すなわち、刺激を適用された（応答し、その後測定される）対象は（実験の目的の観点において）互いに科学的に同等であるということに基づいている。言い換えると、任意の特定の２つの試験対象の間でその結果は同じで一致しており、それぞれの刺激は交換可能と考えられるので、様々な試験対象からの結果を比較することが可能である。したがって、例えば、Ｗａｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｏｌｌｅａｇｕｅｓ（２００１）はまさに試験したそれぞれのラットの各種の遺伝子は試験した任意のその他のラットの同じ遺伝子と同じように応答すると仮定したので、多数のラットを使用した多数の化学物質に対する多数の遺伝子の反応を比較することができた。
【０００７】
対照的に、刺激応答の場合における多様性の問題（すなわち、なぜ１人のヒトは同じ刺激に対して別のヒトと異なる応答をするのか？）に取り組むために、遺伝子関連研究を使用することはより困難であることが分かってきた。共通性に係る中心の刺激応答研究では、応答測定の精度は比較的低く（すなわち、「対象は応答するか、しないか？」）、対象の応答間の小さな差は、または時には大きな差であっても、無視された。対照的に、多様性の研究においては、様々なコホートを定義する応答の程度を区別するためには、応答の非常に正確な測定が必要となり得る。同様に、試験対象間のわずかな、または識別困難な差は、共通性の研究においては問題ではなかった（例えば、結果が「ほとんど、または全ての人々」のレベルで報告される場合）が、多様性の研究においては非常に問題である。最後に、多様性の研究において問題となり得る応答の差の細分性(granularity)が非常に高いと、（応答のいかなる測定においてもシグナルノイズ比で単に「ノイズ」として表される）外来性刺激におけるいかなる差も、発見し排除するのに非常に大変な努力を要する。
【０００８】
したがって、正確に試験コホートを作出し、次に刺激およびそれらコホートの応答の両方を正確に測定する科学者の能力は、遺伝子−多様性−刺激−応答−遺伝子−関連研究（本明細書ではＧＤＳＲＧＡ研究と称する）の潜在的な科学的利益を完全に得るのに障壁となり得ることがわかってきた。さらに、いかなる分析も精度および識別が基礎となるデータ自体の安定性によって制限されるので、研究する集団の完全性のこのような脆弱さ、およびそれぞれの応答の測定の脆弱さのために引き起こされる制限は、このような集団に適用することができる分析の種類および精度も制限する。
【０００９】
ＧＤＳＲＧＡ研究の能力は、（１）現在の制限の多くを排除する新たな標準化パネル集団を開発すること、（２）以前、対比する亜集団の完全性およびそれらのそれぞれの応答の測定において脆弱性を引き起こした実験条件を制御するための新たなプロトコルを開発すること、および（３）対比集団の応答から正確に引き出すことができるデータセットおよび分析比較を拡充すること、によって非常に高めることができる。
【００１０】
より強力なＧＤＳＲＧＡ研究が多種多様な分野において有用となろう。分野の１例は、ヒトに対する毒作用について医薬品を試験することで、この分野には様々な問題および制限が現在存在している。例えば、インビトロ試験および動物実験などの前臨床試験には数百万ドルもの費用と長い年月がかかることを含めて、製薬会社が実験的医薬品を適切に試験するために精力的に努力しているにもかかわらず、新たな医薬品は、臨床試験参加者または規制当局の承認プロセスが完了した後および市場に導入された後に薬物を摂取した患者のほんの一部、しかし重要な一部において、薬物有害反応を引き起こすことがある。得られた薬物有害反応の損害は、影響を受けた個体、製薬会社および社会全体にとって、人間的な面および金銭の面の両方において極めて甚大であることが多い。
【００１１】
人類の間の遺伝的な差は、薬物に対する反応における人々の間の差の３つの主要な原因の１つであることは十分に確立されており（その他は、人の年齢、人が生活を通じて曝されてきた環境である）、大部分の人が有害作用を伴うことなく特定の薬物に対して耐性を有し得るが、ごく一部の人々が問題に直面する。したがって、ヒト間の薬物応答の差の特定の遺伝的原因を決定方法は、大きな関心事である。
【００１２】
この分野の研究のほとんどは、同じ薬物を摂取したが、薬物有害反応を経験していないその他の患者ではなく、薬物有害反応を起こした患者において統計学的に有意に、より一般的な特定の対立遺伝子を決定しようとするＧＤＳＲＧＡ研究に焦点を当てている。ＧＤＳＲＧＡ研究は、少なくとも以下の理由のために困難であることがわかった：（１）このような研究に利用可能なデータは一般的に、１回限りの臨床試験または患者における規制当局承認後の実際の利用から得られ、症例対照条件が統計学的分析には理想的ではない、（２）これらの試験から得ることができるデータには制約がある、（３）これらの制約されたデータセットは次に、使用可能な統計学的分析アプローチおよび試験を、比較的「低能力の」試験にしてしまう、かつ（４）臨床試験または患者病歴のそれぞれの特有の性質が、薬物相互のデータパターンおよび学習を活用することができる、薬物相互のデータセットの使用および新たな分析アプローチを妨げる。
【００１３】
これらの要素がマイナスに組み合わさって、ＧＤＳＲＧＡ研究は証拠としての階層が低い、と以前に特徴づけられた。したがって、必要とされているのは、ＧＤＳＲＧＡ研究の能力を著しく改善する方法である。
【発明の概要】
【００１４】
本明細書で記載した方法および組成物は、様々なヒト、または動物標本の、ある種の刺激、例えば、化学物質または生物学的物質への曝露に対する異なる反応と関連した原因となる対立遺伝子を検出するために、ＧＤＳＲＧＡ研究の能力を改善することを対象としている。
【００１５】
これらの方法および適用には、以下のいくつかの連係したプロセスが含まれる：（１）単一の研究内で使用するために、および、多くの独立した物理的試験について比較する場合は同一のコホートとして使用するために、遺伝子構成のみが異なる高度に制御された試験対象セット（本明細書では「ドナー」のコホートと称する）となる、細胞、組織、器官または器官系型の生物学的モデル（本明細書では多能性(pluripotent)幹細胞系およびその派生物によって例示される）の大規模で均一なコホートを確立すること、（２）それらのドナーに関連したゲノムを完全に配列決定して整列させたセットを作出し、配列決定およびアラインメント操作によって決定づけられるようにコホートを修正し、（３）実験内および実験間の両方の高感度の科学試験を支持するさらに正確な測定データを抽出するために、このコホートを使用して実験全体に適用する共通の実験制御手順のセットを確立すること、（４）このコホートを１回限り使用して抽出したデータに対して、以前には使用に適さなかった分析技術および／または新規の分析技術を適用すること、ならびに（５）複数の化合物および／または複数の細胞種への適用を含む多数の実験についてこのコホートを繰り返し使用することによって可能になった、以前には使用に適さなかった分析技術および／または新規の分析技術を適用すること。
【００１６】
この方法は、任意のＧＤＳＲＧＡ研究に適用することができ、研究者は、特定の共通条件下で多数の対象の「生物学的モデル」（限定されることなく、細胞、組織、器官および器官系を含む、インビトロまたはインシリコにおいて保持された１ドナーの個々の細胞の任意の集合体または組成物として定義される）の応答を観察または測定し、その観察または測定に基づいて対象を任意のサイズの亜集団に分類し、それらの亜集団のいくつかの中の対象の遺伝子構成を、限定されることなく、内在性の概念に関連して前述したものを含めた既知の方法のいずれかを使用して、それらの亜集団のその他の対象の遺伝子組成と比較しようとする。
【００１７】
この方法は、限定されることなく、医薬品およびワクチンの毒性または有効性の調査、その他の化学物質の生物学的効果の研究、疾患の易罹患性または進行の研究、ある種の曝露における環境条件の影響の研究ならびに栄養の研究のために、使用することができる。さらに、この方法はヒトだけでなく、全種類の動物にも適用することができる。
【００１８】
方法の多くの側面およびその広範な適用性を考えると、全適用における全側面を包括的に議論することは冗長で、方法の様々な側面を互いに関連付ける能力が妨害される可能性がある。したがって、この特許出願の残りの部分では、インビトロ実験を通じて測定したような医薬品の毒作用の遺伝的原因を分析するためにＧＤＳＲＧＡ研究を使用した１例の実施形態に対するこの方法の適用に留める。この方法のその他の用途への応用範囲は、この例から容易に推測することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
本発明の方法の非限定的実施形態を以下の図面に例示する。これらの図面は、医薬品の毒作用の遺伝的原因を分析する場合に適用したように、説明した方法によって支持される３つの種類の分析を例示している。
【００２０】
【図１】ドナーまたは対象のコホートに対して試験薬物の毒性をプロットした棒グラフである。５００人のドナーを１０人の群（すなわち、１０人のドナー毎に１本の棒）で、試験薬物に対する応答におけるドナーの毒性重症度スコアを昇順にｘ軸に沿ってプロットする。毒性重症度スコアのレベルをｙ軸にプロットする。
【００２１】
【図２】毒性重症度スコアが高い５０人のドナーのそれぞれにおける２つの対立遺伝子、ＡおよびＢ（それぞれ異なる遺伝子から得られる）の有無を示した表である。列の「１」は指示した対立遺伝子型が存在することを示す。
【００２２】
【図３】図２の表のデータに基づき、毒性重症度スコアが高い５０人のドナーにおける対立遺伝子、ＡおよびＢの存在とドナー順位との間の相関を示した棒グラフである。５０人のドナーを１０人の群（すなわち、１０個のドナー毎に１本の棒）で、毒性重症度スコアに基づいてｘ軸に沿ってプロットする（すなわち、ドナー１〜１０は５０人のドナーの中で最も高い毒性重症度スコアを有し、ドナー４１〜５０は５０人のドナーの中で最も低い毒性重症度スコアを有する）。ｙ軸は対立遺伝子が存在している例のパーセントを示す。対立遺伝子Ａのみが存在するものが３本の棒セット毎に最も左の棒に示されており（白い水玉がある濃色）、対立遺伝子Ｂのみが存在するものが３本の棒セット毎に中央の棒に示されており（無地）、対立遺伝子Ａおよび対立遺伝子Ｂの両方が存在するものが３本の棒セット毎に最も右の棒に示されている（斜線のある淡色）。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書で記載した方法は、様々な人類、または動物の検体のある種の刺激、例えば、化学物質または生物学的物質への曝露に対する異なる反応に関連した原因となる対立遺伝子を検出するＧＤＳＲＧＡ研究の能力を改善することを対象としている。インビトロ実験を通じて測定したような医薬品の毒作用の遺伝的原因を分析するためにＧＤＳＲＧＡ研究を使用する実施形態によって、この方法を本明細書で例示する。
【００２４】
この方法には、ドナー集団の各ドナーから生物学的試料を得るステップと；各生物学的試料から少なくとも部分的なゲノム配列を得ること、生物学的試料の配列を整列させること、および、正確に配列決定することができないかまたは整列できないなど、一貫しない挙動をするかアラインメントを乱す生物学的試料をコホートから排除または除去すること、によって生物学的試料から共通するコホートを作出するステップと；生物学的試料に試験分子または条件を適用して、コホートのメンバーの中で表現型が異なる応答を誘導するステップと；表現型が異なる応答に基づいて生物学的試料を亜集団に分けるステップ；とによってＧＤＳＲＧＡ研究において対比する亜集団を作製することが含まれる。これらの亜集団は、ＧＤＳＲＧＡ研究において使用することができる。
【００２５】
ＧＤＳＲＧＡ研究におけるこれらの亜集団の作製および使用には、いくつかの連係したプロセスが含まれ、限定されることなく、以下のものが含まれる：（１）単一の研究内で使用するため、および多くの独立した物理的試験において比較する場合は同一のコホートとして使用するため、それらの遺伝子構成のみが異なる、高度に制御されたドナーセットとなる、細胞、組織、器官または器官系型の生物学的モデルの大規模で均一なコホートを確立すること、（２）それらのドナーに関連した部分的または完全なゲノムを配列決定して整列させたセットを作出し、その配列決定およびアラインメント操作によって決定づけられるようにコホートから生物学的試料を除去または排除すること、（３）実験内および実験間両方の高感度の科学試験を支持するさらに正確な測定データを抽出するために、このコホートを使用して全実験に適用する共通の実験制御手順のセットを確立すること、（４）このコホートを１回限り使用して抽出したデータに対して以前の使用に適さない、および／または新規の分析技術を適用すること、ならびに（５）複数の細胞種に複数の化合物および／または適用を関与させる多数の実験について、このコホートを繰り返し使用することによって可能になった以前の使用に適さない、および／または新規分析技術を適用すること。これらのプロセスのそれぞれを以下に詳細に説明する。
【００２６】
実用上の観点から、ごく最近までＧＤＳＲＧＡ研究は主に実生活事象の結果、例えば、医薬の臨床試験の結果の分析、または毒性のある環境事象に曝露した人由来の組織試料の収集および分析に限定されてきた。インビトロ試験のために組織試料を使用して制限された研究が行われてきたが、一次組織を使用することに関連した量および時間枠の両方に関する制限のため（すなわち、試料サイズが小さいので反復できる回数は少なく、細胞の死滅も速い）、癌細胞または操作された細胞によるいかなる応答についても「確実性」に関して疑いがあるため、これは困難であることがわかってきた。
【００２７】
したがって、ＧＤＳＲＧＡ研究の「刺激／応答」面の２つの特徴が「因果関係」面（すなわち、遺伝子の関連）で実行することができる分析を制限してきた。第１に、応答に関するデータは、応答は不完全にしか測定できないことが多く、研究するもの以外の数多くの刺激の結果であり得ることが多いので、通常「汚染している」。例えば、臨床試験で収集した応答は、ほとんどいつも様々な「混入物」、例えば、重要な応答（例えば、疼痛レベル）の質的な報告、試験対象による報告の挙動または正確度のばらつき、報告されていない要因、例えば、研究するもの以外の刺激に対する曝露（例えば、試験対象が毒性化学物質または伝染性関連物に曝露した場合）の影響を受ける。この結果、実験計画は質的なものにしかならず、試験対象は症例または対照の状態（通常２成分）に種別される。
【００２８】
第２に、（実生活実験では）最初の刺激に対する対象自体の応答は、２回目ではどうしても対象が何らか異なってしまうので、刺激応答サイクルは「同じ」実験対象では反復することができない。
【００２９】
ごく最近、細胞のその後の挙動を変化させることなく極低温で保存することができる多数の類似の多能性幹細胞系が発見され（Ｈａａｓの米国特許第７，５６９，３８５号または国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５０７６２号）、これらの制限を軽減するかまたは排除することができる条件を作出する可能性がもたらされた。これらの幹細胞は、要求に応じて使用することができる細胞を無制限に供給し、次々と実験を実行することを可能にする。したがって、初めて、研究者等は、研究するもの以外の刺激源を除去するために必要な実験対照を作製し遂行することができ、試験対象と「同じ」（すなわち、この場合、同一のコピー）に対して実験を繰り返すか、または次々と実施することができる。
【００３０】
しかし、同一の試験対象を再生するこの能力は、同時再現性の質を自動的には付与しない。本発明を構成しているさらにいくつかの技術革新が、同時再現性に欠かせない実験制御の実現に必要である。これらには、（１）実験計画の焦点を任意の１実験からメタ比較セットにおける全実験について同一であるように制御しなければならない要素に移動させること、（２）しばしば、試料選択のために既に受け入れられた基準に反するような方法で、試験するコホートにおける対象を含める管理規則を修正すること、および（３）許容可能な耐性の範囲をこのような刺激応答実験において既に必要とされている以上に狭めることが含まれる。
【００３１】
定義
本明細書で使用した「遺伝的に多様な刺激応答に基づく遺伝子関連研究（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ  ｓｔｉｍｕｌｕｓ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ）」、「遺伝的に多様な刺激応答に基づく遺伝子関連研究（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ  ｓｔｉｍｕｌｕｓ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ）」、「ＧＤＳＲＧＡ研究（ＧＤＳＲＧＡ  ｓｔｕｄｙ）」または「ＧＤＳＲＧＡ研究（ＧＤＳＲＧＡ  ｓｔｕｄｉｅｓ）」という用語は、別の試験対象による異なる応答とは対照的に、限定されることなく、確認された刺激に対する生物学的試験対象による特定の応答に統計学的に関連する一塩基多形、コピー数変動、挿入欠失および反転を含む遺伝子特性を決定することを企図した１つまたは複数の任意の研究として定義する。ＧＤＳＲＧＡ研究には、限定されることなく、全ゲノム、全エキソーム、ゲノムもしくはエキソームの特定の領域または遺伝子もしくは非コーディング位置の特に同定されたサブセットを含む試験対象ゲノム内のヌクレオチド全て、またはそれらの任意のサブセットを含めることができる。さらに、ＧＤＳＲＧＡ研究には、連鎖分析または連鎖不均衡分析などの直接的および間接的な遺伝子関連方法論の両方が特に含まれ、１座位および多座位研究が含まれる。ＧＤＳＲＧＡ研究は、ＤＮＡの組成に関する情報を直接利用するか、またはトランスクリプトームの使用によって、限定されることなく、ＲＮＡなどのＤＮＡ産物から得られる情報を利用することができる。
【００３２】
本明細書で使用した「対立遺伝子（ｇｅｎｅ  ａｌｌｅｌｅ）」または「対立遺伝子（ｇｅｎｅ  ａｌｌｅｌｅｓ）」という用語は、多数の様々な遺伝子の特定の対立遺伝子に対する特定の遺伝子の複数の変異体または様々な遺伝子の対立遺伝子の任意の組み合わせを意味する。
【００３３】
プロセス１：大規模で均一なコホートバンクの確立
少なくとも３０〜４０人のドナー、好ましくは３００〜３５０人のドナー、またはより好ましくは５００人以上のドナーの細胞、組織、器官または器官系型生物学的モデルを有する単一の大規模なコホートを得る。ヒト多能性幹細胞系およびそれらから派生した機能的細胞、例えば、心筋細胞を使用することによってこの方法を例示する。しかし、当業者であれば、任意のその他の適切な細胞、組織、器官または器官型（インシリコにおける適用を含む）も記載した方法で使用することができることを認識する。ドナーは特に、目的の大規模な集団（例えば、アメリカ合衆国の国民、西アフリカの特定の部族、または世界中の人々）を表現型的に代表するように選択し、いわゆる「交絡効果」および集団階層化問題を同定（その後数学的に補正）するために各ドナーの遺伝的形質を十分に研究する。
【００３４】
古典的な試料選択プロトコルとは対照的に、ドナーは、遺伝以外の次元の多様化を排除するかまたは最小限に抑える方法を使用して得られる。例えば、ドナー間の年齢差による応答の差を排除するために、試料は周産期幹細胞であってもよい。さらに、周産期幹細胞を使用する場合、ドナーは、同じ共同体において生まれていてもよく、さらに母親が妊娠中に曝露された環境条件の差を最小限に抑えるために、短期間に同じ病院で生まれていてもよい（それによって、母親が互いに近くに住んでいる可能性が増加してもよい）。例えば、ドナーは試料サイズに応じて同じ１、２または３カ月の時間枠内で生まれていてもよい。別の例として、ドナーの母親は、同じ共同体に住んでおり、かつ／または妊娠中に同じ職業に就いていてもよい。
【００３５】
この点から、各ステップおよび試験の全操作およびデータ（集団階層化の必要性、各薬物の各用量に対する反応などを含む）は、個々のドナーに基づいて追跡し、分析は集合レベルよりも個々のドナーのレベルで実行する。
【００３６】
ドナー細胞系は、当業者によく知られた高制御のインビトロ毒性試験手順を使用して、例えば、既知の較正された毒性を有する医薬化合物にドナー細胞系を晒すことによって、個々に検証される。これらの試験は、様々な用量の各対照薬物に対する個々のドナー毎の反応を詳細に記録する。通常の毒性試験プロトコルを使用したとき、何回も反復した実験について一貫した結果の実現を著しく妨害する応答（例えば、プレートへの付着が不均一な傾向、ならびに／または一貫しない、および／もしくは非常に異常な反応）を表すいかなるドナー細胞系もコホートから排除する。これらのドナーは、排除したドナーと同じ集団区分の表現型を表すその他のドナーと交換し、必要ならば集団階層化プロセス全体を較正し直す。
【００３７】
プロセス２：完全に配列決定し整列させたゲノムセットの作出および必要に応じたコホートバンクの修正
次に、各ドナーのＤＮＡの完全な、または部分的なゲノム配列決定を行う。コホートの全ドナーゲノムを次に、例えば、限定されることなく、ＢＡｌｉ−Ｐｈｙ、Ｂａｓｅ−ｂｙ−Ｂａｓｅ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＤＮＡ  Ｂａｓｅｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ、ＭＡＦＦＴ、Ｐｈｙｌｏ、ＰｉｃＸＡＡおよびＴ−Ｃｏｆｆｅｅなどの多数の配列アラインメントソフトウェアプログラムを使用して全体的規模で整列させる。発見的技術はアラインメントの早期段階では使用してもよいが、配列決定の最終段階では使用しなくてよい。次に、最終アラインメントは、第２のグローバルアラインメント最適化アルゴリズムを使用して検証しなければならない。どのドナーのＤＮＡも、正確な配列決定を妨げる（例えば、このような配列の細胞数の標準偏差の３倍よりもしばしば、人の判断、塩基対の呼び出しを必要とすることによる）か、またはその他のゲノムとの順調な整列を妨げる、特有の特性を含有するならば、ドナーはコホートから排除され、プロセス１で前述したものと類似の手順で交換される（必要ならば集団の再階層化を含む）。
【００３８】
次に、コホート内の個々のドナー細胞系それぞれは、ドナー全員について同じプロトコルに従ってならびに同一の増殖因子および試薬を使用することによって増殖される。増殖は、ロボットによる細胞培養機を使用して実現することができる。増殖のための特定の技術は、当業者によく知られた多くの技術のいずれか１つであってもよい。特定の実施形態では、増殖技術は、例えば、米国特許第７，５６９，３８５号に記載されたものであってもよい。
【００３９】
重要なことに、細胞の継代それぞれの記録を維持し、特定の細胞系の増殖プロセスは２つの基準：（１）このコホートの将来の使用全て（派生する細胞型への分化全て、およびこれらの細胞またはそれらの派生した細胞に基づく実験全てを含む）が特定の幹細胞系の同じ継代の細胞に基づくように十分な細胞がその系から生成されたこと、および（２）実行可能な程度まで、同じ継代終止点を全細胞系に適用することによって定義された特定の継代数で停止させる。本明細書は、いずれもドナー間および／または実験間の比較性を低下させる可能性がある「継代数の偏り(passage drift)」および「遺伝的偏り(genetic drift)」として知られる現象を回避する。
【００４０】
次に、全細胞系は全ドナーについて共通のプロトコルを使用して凍結保存する。
【００４１】
この点から、ドナーのコホートの構成は将来の実験全てを通じて一定に維持される。
【００４２】
プロセス３：実験間の共通実験制御条件の確立
実験制御はインビトロ試験にとって業界の標準的な手法で、実験内および実験間の両方に共通の制御を課すことはＧＤＳＲＧＡ研究の分野では新しく、このような制御は、この出願において後で記載したＧＤＳＲＧＡ研究の方法論および適用のいくつかの向上に必要な実現要素である。
【００４３】
条件Ａ
【００４４】
研究者は、事前に、一実験内のドナー全体に共通のプロトコルの全要素を確立し、厳密に従わなければならない。その目的は、ドナー間の遺伝的差以外の意図していない変動源は全て除去することである。したがって、共通のプロトコルは、限定されることなく、凍結保存および解凍、細胞計数、試薬、インキュベーション条件、投薬量、装置の分類および／または仕様、ならびに観察方法および測定方法を含む、結果に影響を及ぼし得る要素全てを網羅しなければならない。
【００４５】
共通の実験制御条件を作出することによって、同じ実験または１つだけ変動がある多数の実験を同じドナーの生物学的モデルに対して何回も遂行して、生物系固有の結果の変動を決定することが可能となる。その後この変動を定量的に分析し、ドナー間の結果の比較にそれらの知見を組み込むことによって、過去のＧＤＳＲＧＡ研究の特性であった偽陽性および偽陰性の可能性がほとんどを回避される。
【００４６】
その後、反復間の変動が小さい場合、限定されることなく、任意の症例メンバーの反応の最小の観察結果が任意の対照集団メンバーの反応の最大の観察結果を超えるような反応の重要なドナー間変動として処理することなど、以前はＧＤＳＲＧＡ研究に利用できなかった統計学的比較によって、原因となる対立遺伝子を発見する可能性を高めることができる。
【００４７】
条件Ｂ
【００４８】
研究者は、多数の実験について同じプロトコルおよび対照を課さなければならない。実験間の結果を比較するために、または実験の結果を一緒にした分析の集合データセットと組み合わせるために、前記の項の実験内で適用したように、実験間の意図しない変動源全てを除去するために同じ対象を取り入れることが必要である。したがって、いかなる新たな実験も、前記とは故意に変化させるべき要素全てを明確に同定しなければならず、前記のプロトコルは特定の変化に対応するために必要な程度までは変化させなければならない。プロトコルのその他の要素は全て、前記の実験のものと変わらないように維持する。
【００４９】
この方法のこの部分から生じる価値の一実施形態において、その他の参考薬物（同じ種類の化学物質など）に曝露したとき、自身の「平均」終点スコアと比較して大きな終点スコアを薬物に対して示すドナーは、その後の分析において「症例」として処理する。これは、同じ薬物に曝露したとき単にその他のドナーのスコアと比較して観察して、特定の薬物について大きな終点スコア（絶対的に）を示すドナーを症例として処理する現在の手法とは対照的である。症例を選択するこの新たな方法は、単に薬物の全種類に対する感受性に関連した対立遺伝子を同定するよりも、個体が化合物に特異的な重度の反応を示す原因となる対立遺伝子を検索することと一致する。このような分析は、患者に合わせた薬物治療に重要である。
【００５０】
プロセス４：ＧＤＳＲＧＡ研究内のコホートから抽出されたデータに対する、以前には使用に適さなかった分析技術および／または新規の分析技術の適用
ドナー細胞系とほぼ同等のコホートと組み合わせて、本発明の方法において共通実験制御を適用することによって、細胞の挙動のあらゆる種類の測定に関連した誤差の範囲をはるかに小さくすることができる。これによって、この方法はＧＤＳＲＧＡ研究にとって新たに使用できる３種類の対立遺伝子検索戦略および分析となる。
【００５１】
戦略Ａ−ゲノム比較用に試験対象を新たにグループ分けするために、通常使用した終点をより正確に測定する対立遺伝子検索戦略を展開する。
【００５２】
単純化した大まかな分類（例えば、症例／対照の２つからなる分類）から「連続した定量的測定」への転換は、限定されることなく、（１）測定した挙動において最も強い程度の差を有する集団の一部分のゲノムのみを比較対比する遺伝子検索戦略、および（２）ビニング戦略（例えば、十分位数、五分位数など）を使用するよりも、反応の程度における変曲点に基づいてコホートを分割する遺伝子検索戦略、を含む新たなグループ分けの可能性を広げる。
【００５３】
この手順は、対照集団と症例集団との間の反応レベルの差を最大にし、それによって遺伝的差の可能性を最大にする。よく知られているＧＤＳＲＧＡ技術を原因となる対立遺伝子の同定に使用して、これらの新たな亜集団の間の比較を行う。
【００５４】
関連のあるその後の実施形態では、対立遺伝子が薬物の反応の程度に関連することが前記の分析によって同定されたならば、全コホート内のドナー全てのゲノムそれぞれにおける疑いのある対立遺伝子の存在を、１つの最も重度に影響を受けた症例から始めて、最も影響の少ない症例まで順次調べる。その後、元の反応もまた示す、同定された対立遺伝子を有するドナーから得られたデータを使用して、症例集団のサイズを再計算し、新たな能力および信頼レベルを算出する。
【００５５】
第３の関連のあるその後の実施形態では、ドナーおよびそれらそれぞれの定量化された反応の順番リストはその後、分布内の特定の点での遺伝子パターンの任意の顕著な変化について順次調べる。ここで、前記で同定した対立遺伝子の各試験対象における存在（または非存在）のマップを作成し、定量した反応レベルと比較し、対立遺伝子の存在のいくつかの顕著な変化のいずれかが生じるかどうかを決定するために注意を集中して見分けるべき点があるかどうかを決定するために、その２つを一緒に分析する。例えば、反応の高いドナー全てが疑いのある対立遺伝子を有し、一方、その点を下回る反応を有するドナーが疑いのある対立遺伝子を有さない、ということは１つの変化といえる。第２の変化は、ドナーの次の群には共通するが、第１の群またはまだ反応が低い群のいずれかにおいては存在しない（同じ遺伝子か、または異なる遺伝子の）第２の対立遺伝子の新たな出現であってもよい。
【００５６】
第４の実施形態では、影響について昇順にドナーを配置したグラフによって、ドナーの反応レベルが隣の低いレベルと比較すると、コホートにおいて以前に隣と比較した場合よりも不釣り合いに上昇している特定の変曲点（以前のドナーのスコアと比較すると反応スコアのパーセント差が順番リストにおける周辺のその他のドナーに関連した同程度の測定値を顕著に上回るドナーとして定義される）を明らかにすることができる。次に、この点は亜集団のゲノムをこの点の左右と比較するための分界点として使用することができる。
【００５７】
戦略Ｂ−以前はそれ自体測定不可能と考えられたか、または参加者の間の反応の差が測定するには困難すぎると以前は考えられた、新たな終点によって対立遺伝子検索戦略を展開する。
【００５８】
例には、限定されることなく、（１）今日では一般的プロトコルであるような、実験後に得られた測定値だけではなく最終点以外の時点のパラメータ（実験中の所与の時点での効果の程度など）の収集、または（２）同じドナーにおいて同じ実験条件下で実験を（例えば、異なる濃度で）反復することができるときにのみ捕捉することができる新たなベクター情報（ある種の影響閾値を実現する投薬量またはミトコンドリア活性もしくはイオンチャンネル活性などの細胞内での機能的測定値など）の収集が含まれる。
【００５９】
この種の検索戦略の一実施形態では、研究中に特定の１回用量の化合物に曝露したドナー間の細胞死滅率の一般的な比較では、閾値レベルの効果を生じるために必要な投薬量または濃度レベル（例えば、晒された細胞の２０パーセント以上の細胞死を引き起こすために必要な投薬量）に一方的に焦点を当てることは避ける。別の実施形態では、閾値効果（例えば、２０パーセントの細胞死滅率）を引き起こすために必要な時間に、焦点を移す。
【００６０】
プロセス５：多数の実験についてコホートの反復使用によって可能になった、以前には使用に適さなかった分析技術および／または新規の分析技術の適用。
実験全体で共通の細胞プール、共通のドナーコホート、および共通のプロトコルを使用すると実験間の意図しない変動の多くの原因を排除することができるので、今日では、１実験の結果をその他の実験において原因となる対立遺伝子の検索を実施するのに情報提供するために使用することが可能で、以前は得られなかった洞察を行うために、実験の物理的結果およびゲノムによる結果の両方を組み合わせることができる。このような（前の項で説明した技術と組み合わせることができる）技術および関連する実例には、限定されることなく、以下のものが含まれる。
【００６１】
技術Ａ−同じ物理的実験では測定することができない多数のパラメータについての試験対象の「刺激」反応に基づいて、症例集団および対照集団を形成する対立遺伝子検索戦略を展開する。
【００６２】
１試験を実施するだけでもその他の試験によって得られるデータを妨害してしまうので、多くの種類の物理的試験（ある種の生物学的マーカー試験など）を同時に展開することはできない。このような場合、研究者等は相争う試験の片方のみを展開するように制限された。さらに、実験対象の供給は最初の試験で消耗してしまうか、対象自体がその初回の試験によって変化して対象の最初の状態とはもはや「同等」とは見なすことができなくなるので、研究者等は同じ個々のドナーに対して多数の試験の結果を相互比較することはできなかった。本発明の方法では各ドナーについて同等の複製を数限りなく作出することができることにより、別の方法では相争う任意の数の試験の結果を相互比較して、新たな症例集団および対照集団を形成することができる。
【００６３】
例えば、（１）症例集団として１パラメータについてある種の範囲内の反応を表し、別のパラメータについて（異なる）ある種の範囲内の反応も示すドナーを選択すること、（２）症例集団として１パラメータについてある種の範囲内の応答かまたは第２のパラメータについてある種の範囲内の応答を示すメンバーを選択すること、あるいは（３）症例としてその他の複数パラメータ挙動の包含基準および除外基準、例えば、応答Ａは示すが応答Ｂは示さないなどを表すメンバーを選択することなど、目的のパラメータのベン図分析の変法が全て含まれ得る。
【００６４】
技術Ｂ−相互実験比較および対比を実施する。
【００６５】
様々な相互比較は、原因となる対立遺伝子の検索、および遺伝子自体の機能についてより一層理解を深めることに有用である。
【００６６】
一実施形態では、１化合物を与えたとき、別の化合物に曝露したときよりも終点スコアが（絶対的に、または相対的に）高い個体のみを症例として選択することによって、多数の新たな症例集団対対照集団を所与の実験セットから作製する。例えば、所与のスタチンが任意の特定の個体に、別の、以前に分析したスタチンよりも顕著に大きく、または小さく悪影響を与えるかどうか、もしそうであれば、原因となる対立遺伝子が以前の薬物から得た症例集団−対照集団を使用してＧＤＳＲＧＡ研究から以前に同定されたものと異なるかどうか、を（初めて）問うことができる。
【００６７】
別の実施形態には、同じ化合物を与えられたとき、機能的に異なる細胞種全体の個々のドナーの結果を比較すること（例えば、同じドナーの心筋細胞対肝細胞を使用したときの結果を比較すること）が含まれる。１細胞種対その他の細胞種（複数可）による反応に顕著な差（絶対的または相対的）があるならば、そしてその差が多数のドナー細胞について真実を表しているならば、症例となる反応性の高いドナーに基づくＧＤＳＲＧＡ研究によって同定された任意の対立遺伝子は、化合物および特定の機能的細胞種の両方に関連した対立遺伝子である。したがって、遺伝子自体はその特定の組織の機能に直接影響を及ぼすものであると仮定することができる。これは、以前に明らかにされなかった遺伝子の機能を同定するための一助となり得る。
【００６８】
技術Ｃ−１実験から別の実験に、習得型の検索戦略をうまく適用する。
【００６９】
生物学的プロセスおよび反応は、複数の遺伝子間および複数の遺伝子の特定の対立遺伝子間の相互作用によって引き起こされ得るので、１つの効果の可能性のある遺伝的原因の数は、既存の最も強力なコンピュータによって包括的に検索することができる数すらも上回る可能性がある。これは、遺伝子がその他の遺伝子の効果を促進、遅延、または変化させることができる、多重遺伝子要因および上位効果(epistatic effects)にとりわけ当てはまる。したがって、今日、科学者等は、原因となる対立遺伝子の検索において発見的技術に逆戻りせざるを得ない。
【００７０】
このような発見的方法の原理は、調査されている新たな状況が過去の（より理解されている）状況により一致すればするほど、過去の解決法が本発明の解決法と近似する可能性がより高くなることである。しかし、過去において、各実験全体で多くのパラメータが変化したので、以前の状況が現在調査されている状況に本当に一致しているというのは困難であった。したがって、教訓を共有する戦略は、大きな無作為の要素を含有し、情報に基づく推測と大差ない。これによって、十分な検索努力にもかかわらず未だに検出されていない原因となる対立遺伝子が根底にある可能性が高い。
【００７１】
本発明の方法の実験内および実験相互の制御によって、実験全体のこのような近似性を体系的に評価し、したがって傾向スポット、パターンの線形および非線形外挿などによる発見法を体系的に改善することが今日では可能である。
【００７２】
一実施形態では、検索空間は限定され、同じ薬物種のその他のメンバーを分析したとき毒性に関連していることが以前に同定された遺伝子領域に焦点を当てることによって、利用可能な検索資源はより効果的に使用される（上位性効果の検索を含む）。さらに、これらの初期研究の結果は、試験する特定の仮説を発展させるために使用される。
【００７３】
これ以上に、検索は強制的に包括されることなく、体系的にすることができる。例えば、別の実施形態では、個々の設計パラメータを故意にかつ体系的に変化させる、計画的な一連の類似実験から収集したデータを、どのデータが効果増大の原因となるかまたはならないかを確認するために比較し、次に、実験成績が識別に最適になったときのみ対立遺伝子の検索を実施する。
【００７４】
技術Ｄ−個々の実験所見を「クラス」の所見にまとめる。
【００７５】
今日まで、研究者等は、任意の２つ以上の刺激（独立して加えられる）の影響について共通性を仮定するのにかなりの制約を課すことが必要だった。研究者は、統計学的測定値についてのみ見解を述べることができた。例えば、研究者は、「化合物Ａは１４人の試験対象に反応を引き起こすが、化合物Ｂは１０人に反応を引き起こす」と言うことはできたが、個々のドナーレベルで比較を行うことはできなかった。本発明の方法の特異性レベルはより高く、したがって洞察をより高めることが可能である。例えば、先ほどの例を続けて、研究者は今日では「化合物Ａが反応を引き起こす１４人のドナーのうち、１２人において化合物Ｂは反応を引き起こさなかった。しかし、１４人のうち２人に反応を引き起こすことに加えて、化合物Ｂは化合物Ａに反応しなかった８人のドナーに反応を引き起こした。」と言うことができる。
【００７６】
一実施形態では、関連するセット（例えば、同じ化学物質のクラス内のいくつかの化合物）内で実施された多数の実験の個々のドナーレベルの結果を比較して、共通性を見いだし、影響の一般的パターンを推測する。これらは、反応レベルの所見から基礎となる原因対立遺伝子についての記述までに及ぶ。例えば、ある種の対立遺伝子を有する個体がクラス内の薬物全てに対して有害な反応を有するかどうか、または特定の個体とクラス内の特定の薬物とを適合させる価値があるかどうか（すなわち個別化医療）、を見いだすことが可能である。
【００７７】
前述は本発明のある種の実施形態に関し、本発明の範囲を逸脱することなく数多くの変更を行うことができることを理解されたい。本発明はさらに、以下の実施例によって例示されるが、それらは本発明の範囲に決して制限を設けるものではない。反対に、本明細書の記載を読んだ後、本発明の精神および／または添付の特許請求の範囲を逸脱することなく、当業者に示唆される様々なその他の実施形態、変更およびそれらの均等物を用いることができることを明確に理解されたい。
【実施例】
【００７８】
本発明は、以下の非限定的実施例を参照にしてよりよく理解することができる。
【００７９】
ある種の実施形態では、本明細書で記載した方法によって、新規医薬品を開発している者が開発中の候補薬物の様々な毒作用をより正確に理解するために設計された総括的プログラムを実践することを可能にし、したがって試験プログラムの結果に基づいて４つの可能な一連の行動、（１）化合物の破棄、（２）低い毒性を示すが、同等もしくはほぼ同等の有効性を示す関連化合物を再検索する努力、（３）（例えば、毒性を抑えるが、有効性を維持するために、化合物と組み合わせて使用するための緩衝剤の開発による）化合物自体の代謝化学の変更、または（４）毒性反応の疑いがあり得る個体が薬物を使用するのを防止するための事前の遺伝学的スクリーニングの開発、の１つの推進することができる。重要なことに、関連する特定の環境に応じて、これらの４つの方針のいずれか１つは、臨床試験が失敗することが分かるまでただ愚直に開発を継続するしかなかった、以前には利用可能であった唯一の行動方針よりも優れている可能性がある。
【００８０】
３つの実施例をここで挙げるが、それぞれは以下の別個の特許請求の範囲を明確にする。
【００８１】
実施例１：多数の増強された遺伝子関連研究のための「プラットフォーム」の確立
この実施例は、多数の増強された遺伝子関連研究のためのプラットフォーム、すなわち、一貫性の高い細胞系の大きなコホートのための一貫性の高い大量の細胞、関連した遺伝学的データおよび基礎となる共通の実験制御の確立を開示する。この実施形態では、目的は、有害作用の指標として予め確立された終点を用いて、新生仔またはヒト新生児から得られた特定の幹細胞を使用したインビトロ試験を実施することによって（例えば、米国特許第７，５６９，３８５号に記載されたように）、所与の化合物によって有害な影響を受けるアメリカ合衆国の人々の割合を見積もるために多数の候補医薬化合物を試験することである。さらに、選択された終点は、「ＭＴＴ染色試験によって判断したとき、化合物の投与後にインキュベーター条件下で１０日間生存することができなかった細胞のパーセント」と仮定する。
【００８２】
第１のステップは、作出される幹細胞系のコホートの適切なサイズおよび組成を設計することである。（１）よく知られた統計学的方法によって、５００個の試料サイズが、アメリカ合衆国の人口における実際の発生率が１パーセント以上である場合に、コホートの少なくとも１人のメンバーが有害反応を表すことの確率が９９パーセントになるということを決定し、かつ（２）費用、細胞ドナー源の入手しやすさ、ある種の統計試験に必要な試料サイズ、統計学的に別々に試験するべき試料の小部分の数などを含むその他の重要な問題を評価した後で、５００個の最終コホート試料サイズを選択する。
【００８３】
次のステップは、試料による所見から集団の推定への変換を混乱させるある種の要素を補正するために、コホート試料全体のサイズを特定の関連のある亜集団の標的サイズに分割することである。先行技術では、新生児において個々の薬物有害反応を経験する傾向に影響を及ぼすのは、２つの既知の表現型によって識別可能な要素、すなわち人種および性別のみであることが確立された。その後の統計学的分析を容易にして強化するために、任意の性別−人種サブコホートの最小限のサイズは３０人とすることに決定する。米国国勢調査から、白人が人口の７２パーセント、黒人が１３パーセント、およびアジア人が５パーセント（残りの１０パーセントは混血またはいくつかの希少な人種の１つに属する）であり、男女はそれぞれアメリカ合衆国の人口のほぼ５０パーセントを構成することがわかる。これらのパーセントに基づいて、５００個の使用可能な試料「枠（ｓｌｏｔ）」を以下のように階層化した試料に割り当てることを決定する：白人女性１８７人（または３７パーセント）；白人男性１８７人（または３７パーセント）；黒人女性３３人（または７パーセント）、黒人男性３３人（または７パーセント）；アジア人女性３０人（または６パーセント）；およびアジア人男性３０人（または６パーセント）。階層化した試料のための標準的な統計技術（試料採取できない希少な人種については全平均を使用することを含める）を利用してアメリカ合衆国の人口への任意の知見に規模拡大する。
【００８４】
この特定の幹細胞源から細胞系を確立した過去の経験によって、ドナーの１０から１５パーセントの細胞が後に適用されるゲノムアラインメントステップでおそらく失敗することが示される。したがって、幹細胞源の試料の特定数を２５パーセント増加させる。こうして、収集する試料の実際の数は以下のように設定する：白人女性２３４人、白人男性２３４人、黒人女性４２人、黒人男性４２人、アジア人女性３８人、およびアジア人男性３８人。
【００８５】
得られた全部で６２８個の試料について一貫性が必ず最大限になるように、同程度の細胞系を形成するのに一般的に使用されるプロトコルを、供給源の組織の収集から目的の細胞の単離、幹細胞の増殖までの方法の各ステップについて、単純に６２８個の細胞系を作出するために通常使用されるプロトコルよりもずっと厳密になるように改正する。例えば、ドナーは全て同じ病院において３カ月以内に供給されるように指定し、単離および増殖ステップはロボット液体操作およびインキュベーションシステムによって物理的に行う。
【００８６】
実施例のこの段階では、６２８個の試料全体の標準化レベルが低下し得る問題が生じる。具体的に、過去において幹細胞研究者等は試薬のバッチ毎の不均一性の影響を懸念したことがある。慣習的な解決法は、使用するいかなる試薬も必ず製造者の単一バッチから入手するようにすることである。しかし、この場合、試薬の期限は４カ月であるが、この場合のドナー細胞の収集および処理は８カ月にわたって続けなければならないので、６２８種のドナー細胞全てを単一バッチ由来の試薬を使用して培養するように指定するという選択肢はない。異なる時点で収集し処理しなくてはならないドナー試料間の試薬の不均一性を改善するために、収集物を２つの期間に分割するように指定する。次に、同じ製造者からその時点で得られた少なくとも４つの異なる原料バッチ由来の試薬を少量ずつ混合することによって、大きな試薬バッチ（３１４人のドナーまたは全ドナーの半分の細胞を処理することができる）を２つの期間のそれぞれの開始時に研究室で作出するように指定する。こうして、得られた２つの大きなバッチそれぞれは、４つ以上の小さなバッチの同じ「平均的」ブレンドから構成され、したがって、その組成は全バッチの平均的組成に類似している可能性が高い。これによって、製造者指定の平均から逸脱した製造者試薬の任意の１つのバッチの組成のためにドナーのサブセットにおける細胞増殖が標準から外れる可能性を低下させる。
【００８７】
これらの高標準化プロトコルを設計した後で、プロセスの遂行全体を通じて必ずこのプロトコル通りになるように特に注意を傾ける。
【００８８】
いずれか１人のドナーの細胞を単離し最初に増殖させたら、それらの細胞のサブセットを５つの濃度の標準化合物（この場合、ＡＴＲＡ）に曝露し、ＭＴＴ細胞毒性試験を標準プロトコルに従って実施する。細胞が極端な感受性（最低濃度に曝露したとき、８０パーセント超が死滅すると定義される）、極端な非感受性（最高濃度に曝露したとき、２０パーセント未満しか死滅しないと定義される）、または不適切な濃度応答性（最低濃度と最高濃度との間の細胞死パーセントの間の変化が２０パーセント未満と定義される）を表すいかなるドナーもこの点で除外する。さらに、いかなる側面においても細胞複製間の挙動が一致せず、（全部ではないが、いくつかの複製においてプレートに接着することができないなど）実験間の比較性を妨害し得るドナーもこの時点で除外する。この実施例において、いずれも白人男性群から得られた３人のドナーは除外される。
【００８９】
毎回残りのドナー試料をうまく処理して幹細胞の第１バッチを作出するが、これらの細胞を凍結保存する前に少量の細胞を分離して遺伝子配列決定用に調製する。次に、そのドナーの完全なゲノムは、正確度を確実に最大限にするために、シークエンサー製造者の指定したプロトコルに従って必要ならば製造者の仕様を調整して配列決定する。１回の操作では重複性が入り込み、得られる正確度についてはシークエンサー製造者が主張する問題があるが、同じドナーの試料の２つの独立した読み取りの結果を比較することによって読み取りの正確度を検査し、２つの分析の間のコンフルエンス(confluence)が９９．９パーセントを上回る時のみ配列を受け入れる。この方法の結果として、６つの亜集団全体において３５人のドナーをさらに除外する。
【００９０】
一旦ドナーを配列決定し、品質基準を満たさなかった３８人のドナー（すなわち、第１のスクリーニングに基づいて３人のドナー、次に第２のスクリーニングに基づいて３５人のドナー）を除外した後、各亜集団に必要な数（例えば、白人女性１８７人）を無作為に選択し、ゲノム整列のプロセスを開始する。
【００９１】
全体的なアラインメントプロセスはより単純なアラインメントモデルで開始するが、最後から２番目のアラインメントは反復動的プログラミングの決定版に基づいて最適化したものである。次に、５００個の個々のドナーのゲノムそれぞれの集合したアラインメントスコアへの寄与、および残りの「予備の」９０人のドナー（すなわち、元の１２８人の「予備の」ドナーから濃度感受性の問題のために除外した３人を減じ、最初の遺伝子配列決定問題のために除外した３５人を減じる）それぞれの「影」(shadow)の寄与を計算する。統計学によって、５００個のゲノムのうち３個の遺伝子組成が極端な異常値であり得ることが示される。したがって、アラインメントではこれらの残りのドナーのうち３人を元の５００人のうちの３人と置換し、それぞれの場合において、必ず同じ人種−性別の亜集団内からの交換を行うことによって、（大きな集団に対して標的の５００個の試料サイズに関連する無作為性に関する完全性を犠牲にすることなく）アラインメントを改善することができる。次に最適化ステップを反復して、アラインメントがドナーの新たなコホートに本当に最適であることを確かなものにする。
【００９２】
この段階において、増殖、分化および細胞系の保存においてさらに一連のプロトコルを採用して、単一のドナーに対して多くの相互比較実験を実行する能力の基礎となるプロセスの反復について厳密な標準化を行い、コホートにおける５００人のドナー全体の標準化も提供し続ける。
【００９３】
最高１０００種の別々の「実験」を支持するためにこの特定のコホートを設計することを決定する。これらの実験はそれぞれ、コホートの５００個の試料メンバーそれぞれの別々のバイアルにおいて、１濃度の１化合物をその１メンバー由来の１，０００個の細胞集団に適用することから構成される。したがって、コホートの５００個のメンバーそれぞれについて、試験時に全部で１，０００，０００個の細胞を所有しなくてはならず、これらはそれぞれ１，０００個の細胞を含有する１，０００個の別々のバイアルに小分けしなければならない。
【００９４】
１，０００個のバイアルそれぞれにおける細胞が必ずバイアル間で完全に一致するために、５００人の元のドナーそれぞれについて、組織試料から単離された細胞全てで開始するのではなく、１個の細胞を単離し、次に１，０００，０００個の細胞になるまでクローニングすることに決定する。さらに、単一の細胞クローンから１，０００，０００個の細胞を実現するには理論的に２１回の集団倍加が必要であるが、これらの種類の細胞を単離し、増殖させた過去の経験によって、単一の「倍加」から生じる細胞数のパーセント増加に関して、ドナー間で実際には１．９１から１．９６の範囲に亘る結果の分散があることが示された。したがって、少なくとも２２回の倍加が必要となり、場合によっては２３回の倍加が必要となる。全ドナーについて同じ継代数を使用することが重要なので、ほとんどのドナーでは２２回の倍加後に利用可能な必要な細胞は１，０００，０００個超であったとしても、全ドナーを２３回倍加して増殖させることに決定する。
【００９５】
早期のステップのように、増殖、分化および細胞保存に必要なステップはそれぞれ（バイアル当たり１，０００個の細胞のロットに細胞を小分けするなど）、可能な限り最大程度までロボットシステムによって物理的に行う。
【００９６】
実施例２：１回の実験内での増強した遺伝子関連分析の実施
この実施例では、様々な濃度の特定の化合物のインビトロにおける毒性試験を高度に標準化したコホートの５００人のメンバーに対して実施する。その試験によるデータ出力の１つは毒性の指標であり、「正常」スコアは２．０を下回り、７．０以上のスコアが「顕著に上昇した毒性感受性」と見なされる。
【００９７】
この試験の結果は、本特許出願の最後に図１として示し、図においてドナーは最低スコアから最高スコアまで配置され、１本の棒がドナー１０人を表す。数値的に、２７０人のドナーのスコアは２．０を下回り、一方、１０人のドナーのスコアは７．０以上である。ドナースコアの中央値は１．９で、下位四分位点のスコアは１．５で、上位四分位点のスコアは２．３である。
【００９８】
この場合、遺伝子に関連する標準的取り組みでは、毒作用に関連して同定可能な対立遺伝子を生成することができない。その他に対して統計学的に信頼のおける比較を可能にする「顕著に上昇した毒性感受性」カットオフ（７．０以上）に達したドナーは十分ではなかった、すなわち、１０人のドナーがこのレベルに達したが、８０パーセントを上回る信頼性を実現するためには最低１４人が必要であった。さらに、２３０人の「正常を上回る」ドナーと２７０人の「正常な」ドナーとの比較によっては、任意の特定の対立遺伝子の存在率において、統計学的に適切な差は生じなかった。最後に、四分位の比較によって、最高に反応する四分位を２番目に高い反応の四分位と比較する場合、２つの対立遺伝子が関与する弱い相関のみが示される。
【００９９】
実施例のこの段階で、本明細書で説明した方法の一部を使用した一連の新たな分析を行う。
【０１００】
第１に、前段落で説明した最小限のカットオフ数１４を使用して、「症例」群を確立するために最高の反応スコアを有する１４人のドナーを選択し、任意に定めた閾値７．０は無視する。１４の症例を２００の対照群と比較すると同定した任意の対立遺伝子が本当に２群間で異なっていることが統計学的に８０パーセントの信頼性でもたらされたので、次に最低の反応スコアを有する２００人のドナーを選択して、人工的な「対照」群を確立する。この分析によって、それぞれ異なる遺伝子に位置する２つの対立遺伝子、ＡおよびＢが同定される。さらに分析することさえせずに、これらの有用性の高い所見は、この研究を支援する製薬会社に報告するものとする。
【０１０１】
次のステップは、２つの対立遺伝子、ＡおよびＢのそれぞれ、または両対立遺伝子の存在を探すために、全コホート内のある種の下位コホートの各メンバー、例えば、１個の最高の反応スコアを有する５０人のドナーのゲノムを調べることである。この下位コホートの例の結果を図２および３に示す。この図は、対立遺伝子Ａの存在とコホート内のドナーの順位の間には強い相関があることを示している。具体的に、最高のスコアのドナー１０人の８０パーセントに対立遺伝子Ａが存在する一方、次の１０人の７０パーセントに対立遺伝子Ａが存在し、次の１０人には３０パーセント、次の１０人には２０パーセント、そして次の１０人には０パーセントに存在する。したがって、次により厳密な統計学的試験を行うことができる、原因として有望なパターンが迅速に同定される。
【０１０２】
その一方で、対立遺伝子Ｂはより一定した存在を示し、最高のスコアのドナー１０人の７０パーセントに、次の１０人の６０パーセントに、次の１０人の６０パーセントに、次の１０人の７０パーセントに、次の１０人の４０パーセントに存在する。この情報によって、対立遺伝子Ｂの影響を理解するにはさらにランク付けされたドナーリストを継続することが必要であるという結論が導かれる。そうすることによって、対立遺伝子Ｂは最高のスコアのドナーの四分位全体にわたって存在することが多いが、そのレベルを下回ると実際には希であることが示される。また、次に厳密に試験することができる新たな仮説が出現した。
【０１０３】
個々の対立遺伝子のスコアを超えて、この図はまた、対立遺伝子ＡおよびＢの両方は最高のスコアのドナー１０人（症例の６０パーセント）において非常によく見られ、その後の１０人の群それぞれでは対立遺伝子ＡおよびＢの両方の出現率は、次の１０人では５０パーセントに、次の１０人では２０パーセントに、次の１０人では２０パーセントに、次の１０人の０パーセントに低下することを示す。したがって、２つの対立遺伝子は、一緒に出現したとき強い上位性効果があると仮定することが妥当である。
【０１０４】
対立遺伝子ＡおよびＢの統計学的分析が完了したら、第３の検索戦略を使用して弱いが、まだ顕著な効果を有する対立遺伝子を探す。図１のグラフをより厳密に調べると、毒性スコアが上方に急上昇しているようないくつかの変曲点がある様子が明らかになる。したがって、最低のスコアを有するドナーから開始して上方に進め、以前のドナーのスコアに対する各ドナーの毒性スコアのパーセント差を計算する。所与のドナーのパーセント差がそのドナー周辺のその他のドナーから統計学的に重要である点が本当に存在することを算術的に確認する。次に、変曲点の次の１０人のドナーのゲノム関連領域を変曲点の前の１０人と比較して、２つの群の間の１個の対立遺伝子の変化があるかどうかを確認する。さらに、この方法はさらなる調査の候補を生み出す。
【０１０５】
実施例３：実験間の結果を比較することによる増強した遺伝子関連分析の実施
この実施例では、目的の化合物の試験に加えて、既に市場にあり、同じ治療目的を有する３つのその他の化合物の毒性試験を実施するために同じプロトコルを使用する。４つの化合物全ての結果を個々のドナーに基づいて追跡する。
【０１０６】
実施する１つの重要な分析は、目的の化合物を与えた個々のドナーそれぞれの毒性試験スコア（実施例２で前述した通り）をその他の３つの化合物それぞれを与えたときの同じ個々のドナーの毒性試験スコアと比較することである。使用した測定法は、目的の化合物によって生じたスコアをその他の化合物それぞれによって生じたスコアで除することである。得られた測定値が２．０を上回るドナー（目的の化合物に対する毒性反応がその他の化合物の１つの毒性反応と比較して２倍以上強いことを意味する）を「症例候補(pre-case)」と同定する。次に、絶対的な毒性スコア４．０以上も示す症例候補群の亜集団のドナー（すなわち、実施例２で前述した規模で「正常」スコア２．０の２倍）を症例／対照遺伝子関連分析で使用するための「症例」集団と称する。したがって、症例は、高い絶対スコア並びに高い相対スコアの両方を有するものだけから構成される。さらなる分析によってこの特定の化合物の特有の毒性に関連する対立遺伝子Ｘが同定される。
【０１０７】
本発明のある種の実施形態を参考にして本発明を記載し例示したが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、様々な変化、変更および置換を行うことができることは当業者に理解されよう。本明細書で言及した特許、公開された特許出願、およびその他の非特許参考文献は全て、その全体が参照により組み込まれる。
【図１】
2016528927.tif 000003
【図２】
2016528927.tif 000004
【図３】
2016528927.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成27年7月6日(2015.7.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝的に多様な刺激応答遺伝子関連研究において比較される亜集団を作製する方法であって、
ａ．ドナー集団の各ドナーから生物学的試料を得るステップと；
ｂ．各生物学的試料の遺伝子型を決定すること、および、正確に遺伝子型決定することができないかまたは整列できない生物学的試料をコホートから排除すること、によって生物学的試料から共通するコホートを選択するステップと；
ｃ．コホートの生物学的試料に分子または条件を適用して、コホートのメンバーの中で表現型が異なる応答を誘導するステップと；
ｄ．表現型が異なる応答に基づいて生物学的試料を亜集団に分けるステップ；
とを含み、
亜集団は、遺伝的に多様な刺激応答遺伝子関連研究において比較される、方法。
【請求項２】
遺伝的に多様な刺激応答遺伝子関連研究が、動物、哺乳動物、またはヒトに対して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物学的試料が、幹細胞、複能性(multipotent)幹細胞もしくはその派生物、または多能性(pluripotent)幹細胞もしくはその派生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
生物学的試料がインビトロまたはインシリコのいずれかで含有される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
生物学的試料のコホートの複数の同一コピーを作出すること、およびこのコホートが関与する将来の実験で使用するためにこれらのコピーを別々に保存することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
コピーを凍結保存する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
試験分子または試験条件が、低分子医薬品、生物学的作用物質、ワクチン、工業化学物質、病原体、毒素、または環境条件からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
表現型が異なる集団が、指定した応答程度を引き起こすために必要な試験分子の量または環境条件の程度を定量的に測定することによって定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
表現型が異なる集団が、試験分子または環境条件への曝露と指定した応答程度が生じる時間との間の時間間隔によって定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
表現型が異なる集団が、同じ実験で測定された多数のパラメータについての試験対象応答に基づいて定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
表現型が異なる集団が、２つ以上の独立した実験で測定された１つまたは複数のパラメータに基づく試験対象応答に基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
遺伝的に多様な刺激応答遺伝子関連研究を実施する方法であって、
ａ．遺伝子以外の多様性を排除するかまたは最小限に抑える方法を使用して得られるドナー集団の各ドナーから生物学的試料を得るステップと；
ｂ．各生物学的試料の遺伝子型を決定すること、および、正確に遺伝子型決定することができないかまたは整列できない生物学的試料をコホートから排除すること、によって生物学的試料から共通するコホートを選択するステップと；
ｃ．コホートの生物学的試料に試験分子または試験条件を適用して、コホートのメンバーの中で表現型が異なる応答を誘導するステップと；
ｄ．表現型が異なる応答に基づいて生物学的試料を亜集団に分けるステップと
ｅ．亜集団間の試験分子または試験条件に対する応答を対比するステップ；
とを含む、方法。
【請求項１３】
試料を収集したときドナーが所定の年齢の１年以内である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ドナーが新生仔である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
生物学的試料が周産期幹細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ドナーが妊娠中に類似の環境条件に曝露されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ドナーが同じ共同体において生まれたか、ドナーの母親が妊娠中に同じ共同体に住んでいたか、ドナーの母親が妊娠中に同じ職業に就いていたか、またはドナーが所定の時間内に出生した、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
遺伝的に多様な刺激応答遺伝子関連研究を実施するために試験対象のコホートを２つ以上の表現型の異なる亜集団に分ける方法であって、
ａ．ドナー集団の各ドナーから生物学的試料を得るステップと；
ｂ．各生物学的試料の遺伝子型を決定すること、および、正確に遺伝子型決定することができないかまたは整列できない生物学的試料をコホートから排除すること、によって生物学的試料から試験対象の共通するコホートを選択するステップと；
ｃ．試験対象のコホートの生物学的試料に試験分子または試験条件を適用して、コホートのメンバーの中で表現型が異なる応答を誘導するステップと；
ｄ．表現型が異なる応答に基づいて生物学的試料を２つ以上の亜集団に分けるステップ；
とを含み、
２つ以上の亜集団が、試験分子または試験条件に対する試験対象の応答の定量的測定の所定の範囲によって定義される、方法。
【請求項１９】
試験を実施したコホートのサブセットのみが遺伝的に多様な刺激応答遺伝子関連研究に含まれ、
サブセットには、症例亜集団に含めるために応答が最高である試験対象、および対照亜集団に含めるためにスコアが最低である試験対象が含まれる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
試験を実施したコホートのサブセットのみが遺伝的に多様な刺激応答遺伝子関連研究に含まれ、
サブセットには、症例亜集団に含めるために応答が最低である試験対象、および対照亜集団に含めるためにスコアが最高である試験対象が含まれる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
次に高いスコア、および次に低いスコアが付いた試験対象の応答と比較したときの試験対象による応答レベルの変位点に基づいて、試験対象が多数の亜集団に分離され、全ドナーが亜集団に入る、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
分離させる試験対象がコホート内の試験対象のサブセットのみを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
表現型が異なる集団が、所定の程度の応答を引き起こすために必要な刺激の程度を定量的に測定することによって定義される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
表現型が異なる集団が、刺激への曝露と所定の程度の応答が引き起こされる時間との間の時間間隔によって定義される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
表現型が異なる集団が、同じ実験で測定された多数のパラメータについての試験対象の応答に基づいて定義される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
表現型が異なる集団が、２つ以上の独立した実験で測定された１つまたは複数のパラメータに基づく試験対象の応答に基づく、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
分離した異なる範囲が、刺激が同じ実験または異なる実験で発生するかどうかに関わらず、刺激に対する試験対象の応答を別の刺激に対する試験対象の応答と数学的に比較するアルゴリズムを使用して定義される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
分離した異なる範囲が、刺激が同じ実験または異なる実験で発生するかどうかに関わらず、刺激に対する試験対象の応答を同一の刺激に対する異なる試験対象の応答と数学的に比較するアルゴリズムを使用して定義される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
どの細胞、組織、器官または器官の種類が特定の対立遺伝子によって影響を受けるかを同定する方法であって、
ａ．ドナー集団の各ドナーから生物学的試料を得るステップと；
ｂ．各生物学的試料の遺伝子型を決定すること、および、正確に遺伝子型決定することができないかまたは整列できない生物学的試料をコホートから排除すること、によって生物学的試料から共通するコホートを選択するステップと；
ｃ．共通コホートの各生物学的試料から２つ以上の異なる細胞、組織、器官または器官の種類を生成するステップと；
ｄ．生物学的試料に分子または条件を適用して、コホートのメンバーの中で表現型が異なる応答を誘導するステップと；
ｅ．刺激応答遺伝子関連研究によって応答を分析するステップと；
ｆ．ドナーの１細胞、組織、器官または器官の種類を遺伝的に多様な刺激応答遺伝子関連研究によって分析したときには、刺激に対する所定の応答に関連するが、同じドナーの異なる細胞、組織、器官または器官の種類を遺伝的に多様な刺激応答遺伝子関連研究によって分析したときには、刺激に対する所定の応答に関連しない、対立遺伝子を同定するステップ；
とを含み、
細胞、組織、器官または器官の種類が同定した対立遺伝子によって影響を受ける、方法。
【国際調査報告】
2016528927.tif 000006
2016528927.tif 000007
2016528927.tif 000008
2016528927.tif 000009