(57)【要約】本開示は、第１の生体分子および第２の生体分子の構造類似性を、浸透圧変化および誘電変化によって誘発される熱力学的ストレス条件への上記第１のおよび第２の生体分子の１もしくはそれより多くの応答を検出すること（蛍光発光のシフトおよび／もしくは上記発光強度の変化を検出することを包む）によって評価するための方法を提供する。上記方法の一実施形態において、本開示は、周りの媒体における浸透圧もしくは誘電条件を変化させることによってタンパク質構造に対して穏やかなストレスを生じ、水分子の結合の変化およびおそらく、トリプトファン、フェニルアラニンおよびチロシンのような官能基を有するイオンの結合の変化を生じる。同じタンパク質の２つの供給源は、次いで、浸透圧および誘電条件の変化（イオン強度の変化を含む）の種々の条件下でのスペクトルのシフトおよび発光強度の変化によって比較される。
2016527523.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の生体分子と第２の生体分子との構造類似性を比較するための方法であって、該方法は、
−第１の生体分子を含む溶液中の１種もしくはそれより多くの成分の濃度を変化させる工程；
−該溶液中の該第１の生体分子の蛍光発光波長および／もしくは蛍光発光の強度のうちの少なくとも一方を測定する工程；ならびに
−該溶液中の該第１の生体分子の蛍光発光波長および／もしくは蛍光の強度と、第２の生体分子を含み、該１種もしくはそれより多くの成分の同じ濃度を有する第２の溶液中での蛍光発光波長および／もしくは蛍光発光の強度とを比較する工程、
を包含する方法。
【請求項２】
２種より多くの生体分子溶液が、等しい数の参照生体分子溶液と比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１種もしくはそれより多くの成分が、１種もしくはそれより多くの浸透圧調節物質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１種もしくはそれより多くの浸透圧調節物質が、グリセロール、ポリエチレングリコール、緩衝剤、塩、尿素、非イオン性、イオン性の洗剤、酸、疎水性分子、天然の浸透圧調節物質、および任意のこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記１種もしくはそれより多くの浸透圧調節物質が、アセテート緩衝剤である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記１種もしくはそれより多くの浸透圧調節物質が、トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）、ジメチルスルホニオプロピオネート、トリメチルグリシン、サルコシン、ベタイン、グリセロホスホリルコリン、ミオイノシトール、もしくはタウリンを含む天然の浸透圧調節物質である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
複数の浸透圧調節物質が使用される、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記１種もしくはそれより多くの浸透圧調節物質が、前記第１の溶液および前記第２の溶液において１００〜１０００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の重量オスモル濃度を提供する、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記１種もしくはそれより多くの成分が、前記第１の生体分子を含む溶液および前記第２の生体分子を含む前記第２の溶液の誘電特性を調節することができる化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記１種もしくはそれより多くの成分が、イオン性もしくは非イオン性の界面活性剤を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記界面活性剤が、ポリソルベートである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記蛍光発光波長および／もしくは前記蛍光発光の強度が、１５０〜３００ｎｍの間の励起波長を使用して記録される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の生体分子および前記第２の生体分子が各々、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、もしくはこれらアミノ酸残基の任意の組み合わせから選択される１種もしくはそれより多くの蛍光活性アミノ酸残基を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記蛍光発光波長および／もしくは前記蛍光発光の強度を記録するための前記励起波長が、２５７ｎｍ、２７４ｎｍもしくは２８０ｎｍである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の生体分子および前記第２の生体分子が、ポリクローナル抗体調製物；モノクローナル抗体；抗体フラグメント、抗体由来構築物、ワクチン、治療用タンパク質、酵素、ペプチド、タンパク質消化物、変性タンパク質、およびこれらの任意の改変体もしくは誘導体からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の生体分子および前記第２の生体分子が、抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の生体分子および前記第２の生体分子のうちの少なくとも一方が、天然供給源に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の生体分子および前記第２の生体分子のうちの少なくとも一方が、組換え供給源に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
第１の生体分子が第２の生体分子に対して構造的に類似であるか否かを決定するための方法であって、該方法は、
−第１の生体分子を含む溶液中の１種もしくはそれより多くの成分の濃度を変化させる工程；
−該溶液中の該第１の生体分子の蛍光発光波長および／もしくは蛍光発光の強度のうちの少なくとも一方を測定する工程；
−第２の生体分子を含む第２の溶液中の１種もしくはそれより多くの成分の濃度を変化させる工程；
−該第２の溶液中の該第２の生体分子の蛍光発光波長および／もしくは蛍光発光の強度を測定する工程；
−該溶液中の該第１の生体分子の蛍光発光波長および／もしくは蛍光発光の強度と、該１種もしくはそれより多くの成分の同じ濃度、および該第１の生体分子の濃度と同じ該第２の生体分子の濃度を有する第２の溶液中の該第２の生体分子の蛍光発光波長および／もしくは蛍光発光の強度とを比較する工程；ならびに
−該第１の生体分子が該第２の生体分子に対して構造的に類似であるか否かを決定する工程であって、ここで該第１の生体分子は、該溶液中の第１の生体分子および該第２の溶液中の該第２の生体分子の蛍光発光波長および／もしくは蛍光発光の強度が実質的に類似である場合に、該第２の生体分子に対して構造的に類似であると決定される工程、
を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年６月４日に出願された「ＴＨＥＲＭＯＤＹＮＡＭＩＣ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＡＬ  ＣＯＭＰＡＲＡＢＩＬＩＴＹ  ＯＦ  ＢＩＯＭＯＬＥＣＵＬＥＳ」という表題の米国仮特許出願第６１／８３０，８８９号に対する優先権を主張し、その内容の全体が本明細書に参考として援用される。
【０００２】
（分野）
本開示は、治療用タンパク質、抗体およびペプチド（各々、本明細書では生体分子といわれる）の、第２の生体分子（例えば、参照生体分子）に対する類似性（例えば、構造類似性）を評価して、匹敵する安全性および効力を保証するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
バイオシミラー（バイオ後続品（ｆｏｌｌｏｗ−ｏｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）としても公知）は、活性な薬物物質が生きている生物によって作製されているか、または組換えＤＮＡもしくは制御された遺伝子発現法によって生きている生物に由来する生物医薬製品である。バイオシミラーおよびバイオ後続品は、イノベーター製品に関する特許および独占の有効期間満了後に、異なる後援者によって作製され当局に承認された上記イノベーターバイオ医薬製品の後発バージョンを説明するために使用される用語である。バイオシミラーはまた、カナダでは後続生物製剤（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｅｎｔｒｙ  ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）（ＳＥＢ）ともいわれる。上記イノベーター製品への参照は、承認の不可欠な構成要素である。
【０００４】
より一般的な低分子薬物とは異なり、生物製剤は一般に、高分子的な複雑性を示し、製造プロセスの変化に極めて敏感であり得る。バイオシミラー製造業者は、上記イノベーターの分子クローンおよび元の細胞バンクへの接近手段も、その正確な発酵および精製プロセスへの接近手段も、その活性な薬物物質への接近手段をも有さない。彼らは、その商品化されたイノベーター製品および産業上のノウハウへの接近手段を有さない。しかし、不純物および／もしくは分解生成物の差異は、重大な健康状態との関係を有し得る。このことは、生物製剤の模倣品がその製品の元のブランドのバージョンとは異なって機能し得るという懸念を生み出した。その結果として、わずか数バージョンの生物製剤だけしか、低分子ジェネリックのために認められている簡易化した手順を通じて米国で認可されておらず（すなわち、メノトロピン（１９９７年１月）およびエノキサパリン（２０１０年７月））、さらに８種の生物製剤が５０５（ｂ）（２）経路を通じて認可されている。
【０００５】
バイオシミラーは、化学的ジェネリックに必要とされる実質的追加データを要する承認プロセスを受けるが、元のバイオテクノロジーによる医薬品（ｂｉｏｔｅｃｈ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ）に関するものほど包括的ではない。公に発売されるために、バイオシミラーは、臨床研究、動物研究および分析研究を通じて蓄積されたデータに基づいて、その親の生物学的製品に近いないし同一であると示されなければならない。その結果は、それらが同じ臨床結果を生じ、既に市場に出ているその参照するＦＤＡ認可の生物学的製品と交換可能であることを実証しなければならない。米国ＦＤＡは、勝負のルールを明確に公表しており、それは、これら製品を承認するために「製品ごと（ｐｒｏｄｕｃｔ  ｂｙ  ｐｒｏｄｕｃｔ）のベース」に基づき、「エビデンスの総合性（ｔｏｔａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ）」ベースに基づく。このことは、科学者が、新規かつ革新的な方法を開発して、上記イノベーターとの構造の類似性、または基準収載薬（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｅｄ  Ｄｒｕｇ）もしくはＲＬＤと慣用的に称されているものを実証するようにさせた。
【０００６】
熱力学的安定状態でタンパク質構造類似性を評価して、生体分子の安全性を保証するための方法に関して、タンパク質工学およびバイオ医薬製造の分野でかなりの必要性が未だ満たされていない。本開示は、浸透圧変化および誘電変化によって誘発される熱力学的ストレス条件下で蛍光を検出する非破壊的方法を提供することによって、この必要性を満たす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（要旨）
本開示は、第１の生体分子および第２の生体分子の構造類似性を、浸透圧変化および誘電変化によって誘発される熱力学的ストレス条件への上記第１のおよび第２の生体分子の１もしくはそれより多くの応答を検出すること（蛍光発光のシフトおよび／もしくは発光強度の変化を検出することを含む）によって評価するための方法を提供する。上記方法の一実施形態において、本開示は、周りの媒体における浸透圧もしくは誘電条件を変化させることによってタンパク質構造に対して穏やかなストレスを生じ、水分子の結合の変化およびおそらく、トリプトファン、フェニルアラニンおよびチロシンのような官能基を有するイオンの結合の変化を生じる。同じタンパク質の２つの供給源は、次いで、浸透圧および誘電条件の変化（イオン強度の変化を含む）の種々の条件下でのスペクトルのシフトおよび発光強度の変化によって比較される。種々のストレス条件下での類似の変化は、構造の高度の類似性を表す。
【０００８】
本開示の方法は、トリプトファン、チロシンもしくはフェニルアラニン（蛍光応答を提供し得る芳香族アミノ酸）を含む少なくとも１つのフルオロフォアを含む任意の官能性タンパク質の分析に適用可能である。
【０００９】
上記３種の芳香族アミノ酸の蛍光特性を利用する方法は、複雑なタンパク質もしくはタンパク質混合物の構造類似性を評価するために使用され得る。本開示の一実施形態において、上記方法は、ポリクローナル抗体調製物、モノクローナル抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ）；抗体由来構築物（例えば、ｓｃＦｖおよび単鎖抗体ドメイン）；タンパク質治療剤（これは、酵素、産業用酵素、ペプチド、およびタンパク質消化物であり得る）；およびこれらの任意の改変体もしくは誘導体の生物学的類似性を評価することに、これら生体分子が蛍光応答を提供し得る芳香族アミノ酸を含むことを条件として適用され得る。
【００１０】
本開示の別の局面において、上記方法は、浸透圧ストレス分析（ＯＳＡ）を使用して、タンパク質の構造を変化させ、適用されたストレス下での変化が同じである場合に、その初期構造もまた同じであるはずであるという仮定に基づいて構造類似性を実証する。本開示のこの方法は、タンパク質構造に関する情報が有用なパラメーターであるタンパク質生成物の研究もしくは開発の任意の局面に適用され得る。本開示の種々の局面において、上記方法は、選択プロセスの初期ステージで生成されるタンパク質改変体もしくは代替の候補のスクリーニングの間に本来備わっている構造を決定するか、最後の選択プロセスにおいて候補の本来備わっている構造を決定するか、医薬開発における異なる製剤下でのサンプル構造変化を決定するか、または種々の貯蔵およびストレス条件下でサンプル構造を決定するために、使用される。
【００１１】
本開示のさらに別の局面において、上記方法は、界面活性剤の濃度の変化によって引き起こされる誘電性のストレスを使用して、タンパク質の構造を変化させ、適用されたストレス下での変化が同じである場合、初期構造もまた同じであるはずであるというという仮定に基づいて構造類似性を実証する。本開示のこの方法は、タンパク質構造に関する情報が有用なパラメーターであるタンパク質生成物の研究もしくは開発の任意の局面に適用され得る。本開示の種々の局面において、上記方法は、選択プロセスの初期ステージで生成されるタンパク質改変体もしくは代替の候補のスクリーニングの間に本来備わっている構造を決定するか、最後の選択プロセスにおいて候補の本来備わっている構造を決定するか、医薬開発における異なる製剤下でのサンプル構造変化を決定するか、または種々の貯蔵およびストレス条件下でサンプル構造を決定するために、使用される。
【００１２】
本開示の別の局面において、上記方法は、組換え治療用タンパク質の生物学的類似性を実証するために使用される。
【００１３】
本開示の別の局面において、上記方法は、組換え治療用タンパク質の同等の安全性を立証するために使用される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
前述の要旨、ならびに以下の本開示の詳細な説明は、添付の図面とともに読まれれば、よりよく理解される。本開示を例証する目的で、現在好ましい実施形態が図中に示される。しかし、本開示が、示される正確な取り合わせ、例および手段に限定されないことは、理解されるべきである。
【００１５】
【図１】図１は、溶液の重量オスモル濃度変化の効果を示す。
【００１６】
【図２】図２は、ＴＰＩ−フィルグラスチム（Ｔｈｅｒａｇｒａｓｔｉｍ（登録商標））およびＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標）中のフィルグラスチムの蛍光特性に対する、ポリソルベート８０濃度の６倍（０．００４％から０．０２４％  ｗ／ｖへ）の増大の効果を示す。
【００１７】
【図３】図３は、張度の増大によるＴＰＩ−ＰＥＧ−フィルグラスチムの結果を示す。
【００１８】
【図４】図４は、ＰＳ−８０濃度の増大によるＴＰＩ−ＰＥＧ−フィルグラスチムの結果を示す。
【００１９】
【図５】図５は、張度の増大によるＨＳＡの結果を示す。
【００２０】
【図６】図６は、ＰＳ−８０濃度の増大によるＨＳＡの結果を示す。
【００２１】
【図７】図７は、張度の増大によるリゾチームの結果を示す。
【００２２】
【図８】図８は、ＰＳ−８０濃度の増大によるリゾチームの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（詳細な説明）
（定義）
「生体分子」とは、天然もしくは組換えのいずれのタンパク質も含み得る、生物学的プロセスによって生成される化学的実体を意味する。
【００２４】
「タンパク質」とは、単一のサブユニットもしくは複数のサブユニットを含み得るペプチド分子もしくはポリペプチド分子を意味する。
【００２５】
生体分子に関して、用語「構造的に類似」および「構造類似性」とは、本明細書では交換可能に使用され、第１の生体分子と第２の生体分子（例えば、参照生体分子）との間で類似である生体分子の１もしくはそれより多くの構造特性（例えば、上記生体分子を含む溶液の蛍光発光波長および／もしくは蛍光強度を含む）を指す。第１の生体分子は、上記第１の生体分子および第２の生体分子の１もしくはそれより多くの構造特性が１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％、もしくは７５％同一である場合に、上記第２の生体分子に構造的に類似であるとみなされ得る。いくつかの実施形態において、第１の生体分子は、第１の構造特性が、上記第１の生体分子と第２の生体分子との間で１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％、もしくは７５％同一であり、第２の構造特性が、上記第１と第２の生体分子との間で１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である場合に、上記第２の生体分子に構造的に類似であるとみなされる。
【００２６】
「浸透圧調節物質」とは、溶液の重量オスモル濃度を変化させ、従って、タンパク質内の共有結合的相互作用（水素結合、静電結合、ファン・デル・ワールス力、疎水性相互作用、もしくはジスルフィド結合を含む）を破壊し得、および同様に水分子と結合し得ることが公知の薬剤を意味する。浸透圧調節物質の例としては、ポリエチレンおよび緩衝剤、塩、尿素、非イオン性およびイオン性の洗剤、酸（例えば、塩酸（ＨＣｌ）、酢酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）、ハロゲン化酢酸）；ならびに疎水性分子（例えば、リン脂質）が挙げられる。
【００２７】
「浸透圧ストレス分析（ＯＳＡ）」とは、変化した重量オスモル濃度を生じる緩衝剤の組成の変化、および上記タンパク質の観察される挙動におけるこの変化の影響を意味する。
【００２８】
「生物学的類似性」とは、新たに開発された薬物とイノベーター製品もしくは基準収載薬（ＲＬＤ）との間における、比較モードでの構造、臨床応答、毒性および副作用の類似性の証明を意味する。
【００２９】
「組換え生成物」とは、ＤＮＡが生体分子の発現を担う遺伝子配列を挿入もしくは組み合わせることによって改変された細胞もしくは生物において生成される生体分子を意味する。
【００３０】
タンパク質構造の評価は、バイオシミラー分子の安全性の最終試験とみなされ得る。遺伝的に改変された生物において発現された組換えタンパク質は、一次構造もしくは二次構造を超える、およびさらには三次構造をも超える構造バリエーションを生じ得る；タンパク質分子が他の実体とどのように会合するか、溶液中で荷電しているかもしくはそうでないかは、その活性、毒性および副作用をしばしば決定する。
【００３１】
本開示は、浸透圧調節物質、より具体的には、イオン性浸透圧調節物質のより高濃度から生じる、適用される浸透圧ストレスによって影響を及ぼされる場合の、折りたたまれた状態における差異を突き止める。重量オスモル濃度を増大させると、天然の構造に影響を及ぼすことなく、上記生体分子の周りの分子の境界が改変される。浸透圧調節物質の選択はまた重要である。なぜならその目的は、上記分子に対するわずかな変化としてもたらすことであり、この理由から、ポリエチレングリコールおよびグリセロールのような一般に使用される浸透圧調節物質は、回避される。試験される製品を、それらの元の緩衝溶液中に入れ、上記緩衝剤中のイオン濃度のみを調節して、重量オスモル濃度の数倍の増大を達成した。よって、これは、タンパク質を突き止める最も穏やかな方法であり、上記構造における差異の熱力学的に安定な評価を提供する。しかし、一般原則として、任意の浸透圧調節物質、イオン性などは、上記タンパク質がフルオロフォアを含む場合に、蛍光上で実証可能な効果を示す。
【００３２】
蛍光は、フルオロフォアと呼ばれるある種の分子において起こる三段階プロセスの結果である。蛍光プロセス全体は、循環的である。上記フルオロフォアが励起状態（フォトブリーチングとして公知の重要な現象）において不可逆的に破壊されなければ、そのフルオロフォアが、反復して励起されて検出され得る。単一のフルオロフォアが数千もの検出可能な光子を生成し得るという事実は、蛍光検出技術が高感度であることに必須である。溶液中での多原子の分子に関しては、不連続の電子遷移が、それぞれ、蛍光励起スペクトルおよび蛍光発光スペクトルと呼ばれるかなり広いエネルギースペクトルによって置き換えられる。これらスペクトルのバンド幅は、２種もしくはそれより多くの異なるフルオロフォアが同時に検出される用途にとっては特に重要なパラメーターである。若干の例外はあるものの、希釈溶液中の単一のフルオロフォア種の蛍光励起スペクトルは、その吸収スペクトルに同一である。同じ条件下で、上記蛍光発光スペクトルは、その励起状態の寿命の間に励起エネルギーが部分的に消失することに起因して、励起波長とは無関係である。蛍光強度は、吸光度（モル吸光係数、光路長および溶質濃度の積としてランベルト・ベールの法則によって定義される）と同じパラメーター、ならびに上記フルオロフォアの蛍光量子収量、機器の励起源強度および蛍光収集効率に定量的に依存する。希釈溶液または懸濁物において、蛍光強度は、これらパラメーターに直線的に比例する。タンパク質折りたたみは、タンパク質がその天然の３Ｄ構造をとる反応である。その天然の構造は、上記タンパク質の機能的状態である。折りたたみは、いくつかの工程で、単純な様式で起こり、第１は、二次構造（２Ｄ）の形成であり、続いて、三次構造（３Ｄ）配置、およびオリゴマー複合体タンパク質の場合には、場合によってはさらに四次構造（４Ｄ）組織化の獲得が起こる。タンパク質の２Ｄは、円偏光二色性（ＣＤ）によってモニターされ得るのに対して、３Ｄ構造は、蛍光分光法、特に、固有のタンパク質蛍光を使用して、追跡してとらえられ得る。
【００３３】
３種のアミノ酸、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ）には、固有の蛍光特性があるが、チロシンおよびトリプロファンのみが実験的により有用である。なぜなら、それらの量子収量（放出される光子／励起される光子）が良好な蛍光シグナルを与えるのに十分高いからである。本開示は、ほとんど全ての組換えタンパク質で見出されるこれら３種の芳香族アミノ酸の存在を活用する。トリプトファン（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＭＢ略語：ＴｒｐもしくはＷ；  ＩＵＰＡＣ略語：Ｌ−ＴｒｐもしくはＤ−Ｔｒｐ；  医療用のためにトリプタンとして販売）は、標準遺伝コードでコドンＵＧＧとしてコードされる。チロシン（ＴｙｒもしくはＹと略される）もしくは４−ヒドロキシフェニルアラニンは、コドンＵＡＣおよびＵＡＵとしてコードされる。これは、極性側鎖を有する非必須アミノ酸である。フェニルアラニン（ＰｈｅもしくはＦと略される）は、α−アミノ酸であり、ベンジル側鎖の疎水的性質から非極性として分類される必須アミノ酸である。Ｌ−フェニルアラニン（ＬＰＡ）は、電気的に中性のアミノ酸であり、タンパク質を生化学的に形成するために使用される２０個の一般的アミノ酸のうちの１つである。Ｌ−フェニルアラニンのコドンは、ＵＵＵおよびＵＵＣである。フェニルアラニンは、チロシンの前駆体である。
【００３４】
よってこの技術は、ＴｒｐもしくはＴｙｒのいずれかまたはその両方を有するタンパク質に基づく（これは、一般に、大部分のタンパク質にあてはまる）；従って、本開示は、タンパク質のいずれかの特別なクラスもしくはタイプに限定されない。これらアミノ酸は、特定の励起および発光特性を有する（表１）。
【表１】
2016527523.tif 000003
【００３５】
励起波長２８０ｎｍに関しては、ＴｒｐおよびＴｙｒの両方が励起される。Ｔｒｐのみを選択的に励起するためには、２９５ｎｍ波長が使用されなければならない。それら残基は、タンパク質折りたたみを追跡するために使用され得る。なぜならそれらの蛍光特性（量子収量）は、タンパク質が折りたたまれる／展開する（ｕｎｆｏｌｄ）ときに変化するそれらの環境に感受性があるからである。天然の折りたたまれた状態では、ＴｒｐおよびＴｙｒは一般に、タンパク質のコアの中に位置するのに対して、部分的に折りたたまれたもしくは展開された状態では、それらは溶媒に露出されるようになる。疎水性環境（上記タンパク質のコアの中に埋まっている）では、ＴｙｒおよびＴｒｐは、高い量子収量、従って、高い蛍光強度を有する。対照的に、親水性環境では、（溶媒に露出され）それらの量子収量は低下し、低い蛍光強度をもたらす。Ｔｒｐ残基に関しては、溶媒に依存する強いストークシフトがある。これは、Ｔｒｐの最大発光波長がＴｒｐ環境に依存して異なることを意味する。タンパク質を折りたたんで維持する弱い相互作用（水素結合、静電相互作用、疎水性相互作用）の破壊に基づいてタンパク質を展開するには、いくつかの手段がある。
【００３６】
タンパク質を展開する最も一般的な方法は、カオトロピック薬剤（尿素、塩酸グアニジウム）、ｐＨの変化（酸、塩基）もしくは温度上昇である。タンパク質展開の定常状態もしくは動的状態のいずれかを試験することが可能である。例えば、タンパク質は、温度を上昇させることによって展開されるので、各温度で、タンパク質は展開を受け、その条件に依存して、部分的に折りたたまれたかもしくは完全に展開された状態に相当する平衡状態に達する。蛍光強度（ＦＩ）は展開の際に変化し、Ｔｒｐがモニターとして使用される場合には、最大発光波長（λｍａｘ）も変化する。このパラメーター（ＦＩもしくはλｍａｘ）の変化の後に、展開曲線が、ＦＩ＝ｆ（温度）もしくはλｍａｘ＝ｆ（温度）をプロットすることによって作成される。その種の試験は、定常状態試験である。動的試験に関しては、上記タンパク質は１つの温度に置かれ、その展開反応は、時間で追跡される。ここで繰り返すと、ＦＩもしくはλｍａｘいずれかの変化は、時間単位以外で測定される。
【００３７】
水は、タンパク質折りたたみ、安定性、および変性から生理学的調節およびアロステリック効果まで、広い範囲の生体分子プロセスにおいて中心的役割を果たす。水は、直接的架橋（ｄｉｒｅｃｔ  ｂｒｉｄｇｉｎｇ）から集合的効果（例えば、疎水性効果）までの範囲に及ぶ種々の方法でこれらプロセスに関与する。水分子を数えることは、生体分子プロセスがどのように機能するかを理解するために重要である。浸透圧ストレス分析（ＯＳＡ）は、生体分子プロセスの結果として吸収される（もしくは放出される）水分子の数を概算することを目的とする。そのために、浸透圧調節物質（例えば、タンパク質安定化剤として公知のグリセロールおよびポリエチレングリコール）は、この系に添加される。タンパク質を安定化する浸透圧調節物質は、タンパク質表面から優先的に排除され、生体分子が形成する腔、溝、チャネル、もしくはポケットに接近できないので、これら領域は、浸透圧ストレスを受けやすい。浸透圧ストレスおよび水分活性の付随する変化は、上記プロセスの平衡を調節し、浸透圧調節物質の非存在下での反応の際に吸着される水の数は、浸透圧に関して平衡定数の変化を測定することによって数えられる。その根底にある仮定は、浸透圧調節物質が「不活性」であるということである：それらは高分子と相互作用もしなければ、高分子に対して直接作用することもない。なぜならそれらは排除されるからである。ＯＳＡは、ヘモグロビンにまず適用された：約６５の水分子が、Ｔ状態からＲ状態へと遷移する際に吸着されると想定される。この概算は、埋もれている表面積の変化と一致する。それ以来、ＯＳＡは、種々の生体分子プロセス（イオンチャネル、ＤＮＡ−タンパク質、および炭水化物−タンパク質相互作用が挙げられる）に適用されてきた。
【００３８】
本開示においては、浸透圧ストレス分析（ＯＳＡ）をツールとして使用して、異なるサンプルからタンパク質サンプルの生物学的類似性が確立され得ることが実証された。治療用タンパク質に関与する水分子は、いくつかの重要な役割を果たす。例えば、タンパク質折りたたみ、安定性、認識、および活性を左右する相互作用は、水和によって媒介される。小角中性子散乱と浸透圧ストレス試験とを合わせて使用して、溶質の存在下で、リゾチームおよびグアニレートキナーゼ（ＧＫ）の水和を調査した。これら溶質の添加の際に起こる中性子コントラストバリエーションを利用することによって、タンパク質会合（溶質排除）水分子の数が、ゼロ角散乱強度および回転半径の両方の変化から概算され得る。ポリエチレングリコールは、浸透圧ストレスを生成するために使用され、生成されるストレスの効果は、その分子量とともに変動する。この感度は、大きな内部ＧＫ腔のような構造特徴を突き止めるために活用されてきた。ＧＫに関しては、小角中性子散乱を、リガンド結合に付随する水和の変化も測定するために、浸透圧ストレスを用いた等温滴定熱量測定によって補完した。
【００３９】
四次構造変化の速度に対する溶媒和化の影響が、ヒトヘモグロビン（低下した水分活性がＴ状態と比較してＲ状態を不安定化するアロステリックタンパク質）を使用して報告されている。ヘムのソーレー帯のナノ秒吸収分光法を使用して、非結合性共溶質であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によって誘発される浸透圧ストレス下で、水性ＨｂＣＯ複合体の光分解後のタンパク質緩和をモニターした。浸透圧ストレスおよび粘度の関数として６つの指数時間定数および振幅に関して包括的に分析した光分解データを使用して、Ｔ状態に特徴的な遅い速度定数での一酸化炭素（ＣＯ）を再結合するヘムの割合の低下とともに、対再結合（ｇｅｍｉｎａｔｅ  ｒｅｂｉｎｄｉｎｇ）、三次緩和（ｔｅｒｔｉａｒｙ  ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ）、および四次緩和（ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ）と関連した時間定数の増大が、ＰＥＧの存在下で観察されたことを示す。これら結果とともに、低分子共溶質に関して他者が得た結果とを分析すると、浸透圧ストレスおよび溶媒粘度の両方が、微視的なＲ→Ｔ速度定数の重要な決定因子であることが示された。浸透圧ストレス効果の大きさおよび方向性は、少なくとも９個のさらなる水分子が、Ｒ状態水和と比較してアロステリック遷移状態を溶媒和化するために必要とされることを示唆する。このことは、上記遷移状態がいずれの最終状態よりも大きな溶媒露出面積を有することを暗示する。
【００４０】
核酸構造の熱安定性は、細胞内環境（典型的には、不活性成分が豊富）を摸倣する条件下で、および浸透圧ストレス下で乱される。試験は、中性共溶質の高いバックグラウンド濃度の存在下で、ＤＮＡオリゴヌクレオチド構造の熱力学的安定性を説明する。低分子共溶質は、塩基対構造を不安定化し、同じ最も近い隣接組成からなるＤＮＡ構造は、種々のタイプの共溶質の存在下で、類似の熱力学的パラメーターを示す。上記浸透圧ストレス実験は、可撓性ループへ結合する水、不安定なミスマッチ、およびＤＮＡ折りたたみの際の無塩基部位が、ほぼ無視できる程度であるのに対して、安定なミスマッチ対への結合が重要であることを明らかにする。塩基対摸倣ヌクレオシドおよびペプチド核酸を使用するこれらの研究は、糖−ホスフェート骨格および塩基対コンホメーションの完全性が、ＤＮＡ塩基および螺旋溝への水分子の結合に重大に貢献することを示唆する。ＤＮＡ水和の試験は、非水性溶媒系における核酸構造の理解および予測の基礎を提供する。
【００４１】
膜変形および張力は、潜在的に、非特異的脂質−タンパク質相互作用を通じて、ロドプシンのような膜タンパク質のコンホメーションのエネルギー特性に影響を及ぼす。どのように膜変形がこれらタンパク質−脂質相互作用を変化させ得、従って、膜タンパク質機能に影響を及ぼし得るかという疑問は、固体状態２Ｈ  ＮＭＲによってＤＭＰＣ−ｄ５４膜の変形を観察するために、浸透圧調節物質の使用および脱水を通して研究されてきた。測定された秩序パラメーターは、変形がその分子レベルで到達されることを可能とする。脱水および浸透圧から生じるストレスは、熱力学的に等価である。なぜなら水をラメラ内空間からバルク水相へ移動させる場合の化学ポテンシャルの変化は、誘発されるストレスに相当するからである。２つのストレスが等価であることに起因して、秩序パラメーターを介して適用された浸透圧に対する膜水和の直接的関係性が存在する。これら知見は、膜タンパク質の圧力および水和感受性の研究のために、膜構造を制御された様式で変化させることができることを示す。
【００４２】
本質的に、水が果たす重要な役割に鑑み、種々の熱力学的状態における水の活性と関連させると、浸透圧ストレスストラテジーの有効性は、高分子性の生体分子を研究するために再考され得る。水は、必須の空間（ｏｂｌｉｇａｔｏｒｙ  ｓｐａｃｅ）を満たし得、それは、大きな表面の間の最も近接する非特異的相互作用を支配する。なぜなら水は、コンホメーション変化を調節する反応物であり得るからであり、全てのこのことは立体特異的分子内構造の統合的な部分としてのそのより一般に認められる静的役割に加えたものである。
【００４３】
浸透圧ストレスは、活性な酵素のコンホメーション変化を付随する溶媒和変化を測定するために使用される。ヘキソキナーゼに関しては、グルコースに関する平衡解離定数およびミカエリスメンテンの速度定数の両方が、大分子量（＞２０００）の浸透圧調節物質で調節される場合に、線形的にかつ同程度にタンパク質媒体中の水の活性とともに変動する。試験された全浸透圧範囲にわたるバリエーションは、グルコース結合には、少なくとも６５±１０の水分子の放出が付随することを示し、これは、酵素ターンオーバーについて逆になる。結果は、圧力の生理学的範囲に近くなると、その数はより高くなり得ることを示す。この水の大部分は、インヒビターのように機能し、おそらく、基質の周り近くに誘導される裂け目から来る。ターンオーバーの間のこのような大きな脱水／再水和反応は、コンホメーション変化のエネルギー特性に対する溶媒和の重大な寄与を暗示する。浸透圧ストレスは、機能している分子への水の寄与を突き止めるための一般的に利用可能な方法である。
【００４４】
タンパク質折りたたみおよびコンホメーション変化は、タンパク質−水相互作用によって影響され、よって、タンパク質機能のエネルギー特性は、水の活性に必然的に関連づけられる。モデル系としてポリグルタミン酸を使用するヘリックス−コイル転移に関する研究は、浸透圧ストレス法と円偏光二色性分光法とを組み合わせて使用することによって、タンパク質構造への水和の重要性を調べるために報告されている。浸透圧ストレスは、ポリエチレングリコール（分子量４００）を浸透圧調節物質として使用して適用される。適用される浸透圧ストレス下での上記ヘリックス−コイル転移のエネルギー特性は、熱的に誘発されるコンホメーション変化に付随する残基あたりの、優先的に含まれる水分子の数における変化の計算を可能にする。浸透圧ストレスが、より水和したコイル状態よりも、より密集したαヘリックス状態を好むことによって、ヘリックス−コイル転移温度を上昇させることが報告されている。αヘリックス安定性に対する他の力の寄与もまた、ｐＨを変化させ、ランダムコポリマー、ポリ（グルタミン酸−ｒ−アラニン）を研究することによって調査される。ペプチド折りたたみ平衡に対する浸透圧の影響に関する証拠が入手可能であり、インビトロでのタンパク質折りたたみに関する研究は、浸透圧が、ｐＨおよび塩濃度に加えて、細胞内の混み合った環境をよりよく近似するように制御されるべきであることを示す。
【００４５】
種々の分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を酵母ヘキソキナーゼを浸す溶液に添加することは、上記酵素のその基質であるグルコースに対する親和性を増大させる。その結果は、ＰＥＧが上記タンパク質に対して直接的に作用するか、または水分活性を通じて間接的に作用するということに基づいて解釈され得る。上記効果の性質は、ＰＥＧの作用が間接的であることを示唆する。浸透圧効果としての上記結果の解釈は、グルコース結合反応と関連した水分子の数の低下、ΔＮｗをもたらす。上記ΔＮｗは、ヘキソキナーゼのグルコース結合コンホメーションとグルコースなしのコンホメーションとの間のＰＥＧが近づけない水分子の数の差異である。低ＰＥＧ濃度では、ΔＮｗは、ＰＥＧのＭＷが３００から１０００へと増大するとともに、５０から３２６へと増大し、その後は、最大１０，０００までのＭＷ−ＰＥＧに関しては一定のままである。このことは、最大ＭＷ  １０００まで、増大するサイズの溶質が、上記タンパク質の周りのなおより大きな水性区画から排除されることを示唆する。３２６個の水は、２種類のヘキソキナーゼコンホメーションの結晶構造の周りの溶媒容積をモデル化することから予測されるものより多い。ＭＷ＞１０００のＰＥＧに関しては、ΔＮｗは、ＰＥＧ濃度の増大とともに、３２６個から約２５個の水へと減少する。すなわち、ＰＥＧ単独で、溶液中のヘキソキナーゼの結合していないコンホメーションを「脱水」するようである。顕著なことには、この脱水の浸透圧の仕事は、ヘキソキナーゼ１分子あたりわずか１ｋＴの程度である。熱揺らぎの下で、溶液中のヘキソキナーゼは、結晶構造では認められない広い範囲の水和状態を調査するコンホメーションの可撓性を有する。
【００４６】
タンパク質−水界面の構造、すなわち、タンパク質の水和構造は、低温Ｘ線結晶構造分析によって調査されている。水和構造は、おそらく冷却が水和水分子の運動をクエンチしたので、周囲温度よりも低温においてはるかに明瞭に見えた。得られた構造モデルに基づいて、上記水和構造を、水分子の量、水分子とタンパク質との間の相互作用様式、タンパク質の表面上の水分子の局所分布および全体分布に関して体系的に分析した。バルクにおける水の標準的な四面体相互作用ジオメトリーは、界面で保持され、水和水分子と極性タンパク質原子との間の水素結合の三次元鎖連結を可能にした。タンパク質の表面全体を覆う水素結合の大規模ネットワークは、タンパク質の大規模コンホメーション変化に順応するように非常に可撓性であり、タンパク質の動力学および機能に対して大きな影響を有するようである。
【００４７】
タンパク質表面の直ぐそばにある水は、タンパク質折りたたみ、安定性、認識および活性に重要である。回折法によって研究されるタンパク質構造は、いくつかの荷電した、極性の、および非極性の（疎水性）アミノ酸の周りの秩序だった水分子を示すが、後者は、結晶の中の対称性関連分子の間の界面に水分子がある場合に観察されるに過ぎない。タンパク質の周りを囲む水のネットワークは、小さなタンパク質について観察されてきた。結晶学的に観察される水分子は、結合構造水分子といわれる。結晶学データ分析の間に、結合水分子はしばしば、これらがタンパク質に属するかのように処理される。低次回折データへのバルク溶媒の寄与の処理における近年の進展は、タンパク質の表面構造のよりよい評価および結合水のよりよい局在化を可能にした。結合水の移動性は、温度および占有率によって研究される。バルク溶媒は、比較的より大きな不規則さを有し（液体様）、これは、流動性因子（ｌｉｑｕｉｄｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ）によって表される。この状況では、タンパク質の周りの水層はほとんど移動性がない。
【００４８】
コンホメーション不安定性とは、展開、凝集、もしくは変性のみを指すのではなく、局在化したタンパク質ドメインにおける微妙な変化ならびに緩衝剤によってまたは緩衝剤がそれ自体偽基質として作用することによって直接的もしくは間接的に媒介される緩衝剤成分結合、プロトン転移、および金属もしくは基質結合効果から生じ得る酵素触媒特性の変化も指す。塩は、上記塩のアニオンもしくはカチオンが潜在的な緩衝剤成分であり得る程度までタンパク質コンホメーションに影響を及ぼし得る。塩濃度が、緩衝剤の濃度より遙かに大きい場合、上記塩は、反応において有効な緩衝剤になる。緩衝剤がタンパク質安定化（もしくは不安定化）を引き起こし得る機構もしくはその組み合わせは、複雑であり、十分に理解されてはいない。この問題は、種々のタンパク質安定化機構および球状タンパク質の安定化の小さな自由エネルギーを決定的に区別することは不可能であることによっていっそう大きくなる。タンパク質の製剤化で使用される緩衝剤に関連する場合、これら課題のうちのいくつかに決定的に対処する先行技術は存在しない。タンパク質の抽出、精製、透析、再折りたたみ、もしくはアッセイにおいて使用され得る緩衝剤のタンパク質コンホメーションに対する効果は、未知である。しかし、例えば、ｐＨ４．０の酢酸緩衝剤の濃度が凍結乾燥前に５から１５ｍＭへと増大した場合に、凍結乾燥されたナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ、ｐＩ  １０）の凝集が顕著に低下したことが観察されている。凝集の機構は、遊離チオレートイオンを形成するようなジスルフィド結合からのアルカリ誘発性除去に起因すると考えられている。上記チオレートアニオンはその後、ＡＮＰによるチオール−ジスルフィド交換を受けて、ジスルフィド結合したマルチマーを形成する。しかし、凍結乾燥後の表面上は不完全に結晶化したマンニトールの、貯蔵時におけるガラスから結晶への相転移が、凍結乾燥製品における局所ｐＨの上昇の引き金となる（これは、チオレートイオンの生成に起因すると考えられる）理由は、明らかではない。
【００４９】
機械的ストレスによって引き起こされる凝集に対する保護は、広く示唆される。例えば、凝集に対するＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）の安定性は、３種の異なる緩衝溶液（８０ｍＭ）中でのｐＨ値のある範囲にわたって、３６０ｎｍで散乱する光によって測定されている。機械的ストレスによって誘発される変性に対するＧ−ＣＳＦの安定化は、緩衝剤のタイプおよびｐＨに依存して異なる。緩衝剤は、タンパク質−界面活性剤結合特性を変化させ、それによって、タンパク質コンホメーションを変化させ得る。研究結果から、リン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ  約７．１）の濃度を１０ｍＭから１００ｍＭへと増大させると、還元−カルボキシアミドメチル化ウシ血清アルブミン（ＲＣＡＭ−ＢＳＡ）に結合したドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の量が１．０ｇ／ｇから２．２ｇ／ｇへと増大することが示された。別の研究では、ＳＤＳおよびリゾチームの共吸着マルチレイヤーが、８．８ｍＭ  ホスフェート緩衝剤中、ｐＨ６．９で移行性の結合状況において形成されたが、５．０ｍＭ  アセテート緩衝剤中、ｐＨ５．０では形成されなかった。結合等温線は、ＳＤＳのほぼ同じ分子数が、両方のｐＨ値における移行性の結合の開始と完了との間でリゾチームに結合することを示した。ホスフェート緩衝剤中におけるより大きな凝集傾向は、一価アセテートイオンによるよりも、二価ホスフェートイオンによるより効率的な電荷スクリーニングによって引き起こされるようである。
【００５０】
歴史的には、緩衝剤は、タンパク質の三次構造および四次構造に対して顕著な効果を有するとは一般に考えられていない。緩衝剤が、独立した機構によるよりむしろ、種々の効果の間での複雑な相互作用のためにタンパク質コンホメーション安定性を乱すということを理解することが重要である。例えば、グッド緩衝剤の抗酸化効果のうちのいくらかは、それらの金属結合能のために生じ得る。結合もしくは基質効果は、低緩衝剤濃度において、緩衝剤とタンパク質との相互作用の優位を占め得る；静電荷スクリーニングは、中間濃度で優勢であり得、コスモトロピック／カオトロピック効果は、より高濃度で勝り得る。チオール−ジスルフィド交換反応に対する緩衝剤アニオンによる電荷反発の寄与は、アミド交換速度に対する緩衝剤の寄与が変動し得るように、緩衝剤脱プロトン化の程度で変動し得る。
【００５１】
タンパク質の極めて多様な構造および関連する特性のために、任意の所定のタンパク質分子にとって「最良の」緩衝剤を演繹的に推定することは可能でないと思われる。しかし、いくらかの相関的一般化は、これらが性質上必ずしも原因とはならない可能性があることを認識して試みられ得る。所定のタンパク質を種々の変性ストレスから最良に保護し得る緩衝剤は、以下の属性を有するはずである：１つの分子上に電子供与部位および電子受容部位を組み込む能力があること（すなわち、双性イオン性であること）；タンパク質ドメインから優先的に排除され（すなわち、水の表面張力を増大させる）そしてコスモトロピックイオン（例えば、スルフェート、ホスフェート、マグネシウム、リチウム、亜鉛、およびアルミニウム）を組み込むこと；低いイオン化熱を有すること；水分子の移動性を減少させること；そのタンパク質に関しての変性ギブズエネルギーにおいて無視できる程度の変化を引き起こすこと；グリコシル化タンパク質の炭水化物部分との複合体化を受けもせず触媒もしないこと；ジスルフィド結合に対するチオレートアニオンの求核性の攻撃を阻害し、従って、チオール−ジスルフィド交換を妨げること；意図されなければ、酵素の基質として作用せず、金属媒介性レドックス反応を触媒せず、タンパク質への界面活性剤結合特性も変化させないこと；タンパク質を機械的ストレスに対してより感受性にしないこと；「不活性」緩衝剤媒体と比較して、上記緩衝剤でタンパク質残基に関してプロトンアミド交換速度の増大を引き起こさないこと。
【００５２】
比誘電率（ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）、もしくは誘電率（ｐｅｒｍｉｔｔｉｖｉｔｙ）（ε）は、材料が、絶縁材料上で電場をかけることによってどの程度容易に分極され得るかを示す無次元定数である。上記定数は、真空が交流電流を運ぶ能力に対する実際の材料が交流電流を運ぶ能力の比である。比誘電率は、以下のように表され得る：
ε＝εｓ／ε０，  ここで
ε＝比誘電率；
εｓ＝上記材料の静的誘電率（ｓｔａｔｉｃ  ｐｅｒｍｉｔｔｉｖｉｔｙ）；および
ε０＝真空の誘電率。
水の比誘電率は、約８０（真空）であり、水銀は、約１である。それは、温度に非常に依存する。
【００５３】
ポリソルベート２０および８０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０もしくは８０としても公知）のような界面活性剤は、治療用タンパク質の製剤中で賦形剤として一般に使用される。上記両親媒性ポリソルベートの主な機能は、表面誘発性変性および凝集をもたらし得る、液体−液体、液体−固体もしくは液体−空気界面でのタンパク質吸着を防止することである。タンパク質安定性に対するポリソルベートの保護効果は、凍結−融解、凍結−乾燥、機械的ストレス（例えば、撹拌（ａｇｉｔａｔｉｎｇ）、振盪もしくは撹拌（ｓｔｉｒｒｉｎｇ）および乾燥タンパク質調製物の再構成の間に、ならびにシリコーン油滴を含む製剤に関して示される。しかし、ポリソルベートはまた、例えば、長期の安定性の間の静的条件（ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）において、安定性に否定的に影響を及ぼし得る。さらに、ポリソルベートは、種々の分解反応を受け得、これは、その安定化特性の喪失およびタンパク質の化学的修飾（例えば、酸化）をもたらし得る。
【００５４】
非イオン性界面活性剤は、表面（例えば、撹拌もしくは振盪）およびストレス誘発性凝集（例えば、凍結、凍結乾燥、および再構成）からタンパク質を保護し得る。界面活性剤は、容器表面（ｃｏｎｔａｉｎ  ｓｕｒｆａｃｅ）、空気／水界面、氷／水界面、もしくは任意の他の固体表面に対してタンパク質と競合し、非特異的吸着および吸着誘発性変性およびその後の凝集を防止する。いくつかの場合には、界面活性剤はまた、シャペロンとして働くことによって凝集を防止し、タンパク質折りたたみおよび再折りたたみを促進する（例えば、界面活性剤による膜タンパク質の折りたたみの誘発）。しかし、一般に使用されるポリソルベートは、酸化もしくは加水分解によって分解し得、それらの分解生成物は、タンパク質安定性に対して種々の影響を発揮し得る。さらに、膜濾過工程の間の複合体の挙動に起因して、製剤中の界面活性剤のレベルを制御することは困難であり得る。
【００５５】
市販されているモノクローナル抗体製剤のうちのほぼ７０％が、安定化賦形剤としてポリソルベート２０もしくはポリソルベート８０を含む。それらの商業的調製物の中では、上記ポリソルベート濃度は、０．００１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０（Ｒｅｏｐｒｏ（登録商標））〜０．１６％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０（Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標））の間の範囲に及び、大部分の製剤は、約０．００５〜０．０２％のポリソルベート２０もしくは８０を含む。上記ポリソルベートの間の１つの差異は、ポリソルベート２０（約０．００７％（ｗ／ｖ）と比較すると、ポリソルベート８０の臨界ミセル濃度（約０．００１７％（ｗ／ｖ））がより低いことである。従って、この特性は、治療用タンパク質の溶液中で誘電性のストレスを作り出すために使用され得る。
【００５６】
しばしば熱力学的系の周辺もまた、別の熱力学的系と考えられ得る。この観点では、上記系およびその周辺は、それらをまた関連づける遠距離力とともに、相互に接触した２つの系として考えられ得る。上記系の囲いは、上記２つの系の間の接近もしくは境界の表面である。熱力学的な形式論において、その表面は、透過性の特異的特性を有するとみなされる。例えば、接近の表面は電荷に対して透過性であると想定され得、周りの熱力学的系の誘電特性の拡張を可能にする。例として、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）を、本開示で使用して、本発明の方法の有用性を実証した。組換えヒトＧ−ＣＳＦは、１７５残基を有し、Ｅ．ｃｏｌｉで発現される。上記タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現に必須のＮ末端メチオニンの付加を除いて、ヒトＤＮＡ配列分析から推定される天然の配列と同一であるアミノ酸配列を有する。
【００５７】
Ｇ−ＣＳＦは、３個のチロシン、６個のフェニルアラニンおよび２個のトリプトファン（蛍光を発することが可能な芳香族アミノ酸）を有する。フェニルアラニンおよびトリプトファンは両方とも非極性であるので、これらの、水分子とのもしくは緩衝溶液との相互作用は、極性であるチロシンの相互作用とは異なる機構によって起こる。試験したＧ−ＣＳＦの製品の製剤中に見出される水および他の実体は、極性および非極性両方のアミノ酸と結合もしくは相互作用し得る。本発明者らが、水の構造化がどのようにしてこの非常に極性の実体を非極性実体にするのかを考慮する場合、本発明者らは、上記３種の芳香族アミノ酸の各々が、タンパク質構造検証のための頑強なプロトコルを確立するにあたって重要であるということを十分に理解している。
【００５８】
本開示の方法は従って、タンパク質の化学構造に関する情報を提供するために有利に使用され得るか、または上記方法は、プロセス制御における小さな変化がそれらの構造に影響を及ぼし得る組換えタンパク質およびモノクローナル抗体の製造のプロセス開発に必要とされ得るように、上記タンパク質全体の参照タンパク質への構造的コンプライアンスに基づいて、一連の改変体もしくは種々の調製物の中でランク付けおよび選択するために経験的に使用され得る。
【００５９】
一実施形態において、アセテート緩衝剤を、イオン強度の供給源として使用したが、これは、いかなる特定の緩衝剤の種にも限定されない。なぜなら浸透圧ストレスは、非イオン性浸透圧調節物質（例えば、ポリエチレングリコール）を含む種々の浸透圧調節物質から達成され得るからである。本開示の他の局面において、従って他の浸透圧調節物質は、アセテートイオン種の代わりに使用され得る。天然の浸透圧調節物質としては、トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）、ジメチルスルホニオプロピオネート、トリメチルグリシン、サルコシン、ベタイン、グリセロホスホリルコリン、ミオイノシトール、およびタウリンが挙げられる。浸透圧調節物質はまた、グリセロール、ポリエチレングリコール、緩衝剤（例えば、アセテート緩衝剤）、塩、尿素、非イオン性、イオン性の界面活性剤、酸および疎水性分子であり得る。
【００６０】
一実施形態において、ポリソルベート８０を、誘電特性の調節源として使用したが、これは、いかなる特定の界面活性剤にも限定されない。なぜなら誘電特性の変化は、種々の極性および非極性成分（界面活性剤を含む）から達成され得るからである。
【００６１】
タンパク質コンホメーションの構造および統合を決定するための方法は、後続品タンパク質および抗体の生物学的類似性を実証することに非常に関連している。代表的な二次元および三次元の差異を開示する標準的方法の使用が非常に大きく進歩したが、タンパク質の免疫原性と関連する問題は、タンパク質の四次元構造のさらなる研究を要する。タンパク質分子中の官能基と媒体の成分との会合は、種々の供給源に由来するサンプル間の構造的差異を評価するための迅速な方法であると報告される。最終製剤緩衝剤のイオン強度を増大させることによって理想的には生成される浸透圧ストレスは、非常に臨床的に関連性のある所見に理想的な溶液を提供する。タンパク質を物理的もしくは化学的に壊す他の方法は、バイオシミラー製品の安全性を十分に確立するために必要とされる繊細な情報を提供しない。
【００６２】
本明細書で開示されるものは、多量の活性なタンパク質が生成される産業上の状況では特に有用である。本開示の方法はまた、他の類似の特性を有するタンパク質間を識別するためのさらなる方法として使用され得る。タンパク質の熱力学的に安定な構造に基づいてそれらの間を識別することによって、タンパク質構造類似性を測定するための代替的なパラメーターが達成される。構造における差異は、上記で記載される手動のもしくは自動化されたいずれかの方法を使用し、経時的にシグナル強度を記録して測定され得る。
【００６３】
本開示で試験した市販の製品は、静脈内注射が意図されている場合には等張性であるのに対して、本開示は、少なくとも２つの範囲（一方は、上記製品が溶血を引き起こさないものに近く、他方は、丸鋸歯状形成（ｃｒｅｎａｔｉｏｎ）を引き起こさないものに近い）を使用する。これらの範囲を超えると、上記製品は、ヒトへの投与に不適である。丸鋸歯状形成もしくは溶血を回避するために、注射および注入は、可能な限り血漿に近い重量オスモル濃度を有するべきである。もう一方のものと同じ浸透圧を有する溶液は、等張性といわれる。生理学では、等張性は一般に、溶液が血液と同じ重量オスモル濃度を有すると想定する。大容積注入は、２８７〜２９０ｍＯｓｍ／ｋｇに近い程度の重量オスモル濃度を有するべきであり、全ての注射は、可能な限り正常範囲に近い重量オスモル濃度（２８５〜２９５ｍＯｓｍ／ｋｇ）を有するべきである。
【００６４】
重量オスモル濃度を高くすると、水分子の喪失、芳香族の蛍光性基の露出および予測されるとおりの蛍光の増大が生じる。試験した２つのサンプルは、上記溶液を２８４ｎｍで励起した場合に、蛍光のシフトの同一のプロファイルを示した。これは、上記試験した２つの溶液間の熱力学的構造類似性の十分な証拠を提供する。
【実施例】
【００６５】
（実施例１）
誘電性および浸透圧ストレスの効果を試験するために、ＴｈｅｒａｇｒａｓｔｉｍおよびＮｅｕｐｏｇｅｎを、アセテートの濃度およびポリソルベート８０（非イオン性界面活性剤）の濃度の増大に供した。上記溶液の蛍光特性を、同じ溶液条件下で比較した。この処理を、２Ｍのアセテートおよびフィルグラスチム製剤緩衝剤での各薬物製品の３倍希釈を行った後に行った。従って、上記試験物品のフィルグラスチム濃度は、バイアル製品に関しては０．１ｍｇ／ｍＬ、およびシリンジ製品に関しては０．２ｍｇ／ｍＬであった。ポリソルベート８０の濃度は、０．００４％〜０．０２４％の範囲（６倍の変化）に及んだ。
【００６６】
Ｔｈｅｒａｇｒａｓｔｉｍで使用されるＴＰＩフィルグラスチム薬物物質を、１．２ｍｇ／ｍＬから０．６ｍｇ／ｍＬへと、フィルグラスチム製剤緩衝剤（１０ｍＭ  アセテート、５％  ソルビトール、０．００４％  ポリソルベート８０（ｐＨ４．０））で希釈した。この０．６ｍｇ／ｍＬ  フィルグラスチム溶液をその後、０．２ｍｇ／ｍＬへと、２００ｍＭ  アセテート、５％  ソルビトール、０．０１％  ポリソルベート８０（ｐＨ４．０）、または１０ｍＭ  アセテート、０．００４％  ポリソルベート８０（ｐＨ４．０）のいずれかで、３倍希釈した。これら試験物品の最終溶液条件はそれぞれ、１３７ｍＭ  アセテート、５％  ソルビトール、０．００７％  ポリソルベート８０（ｐＨ４．０）、または１０ｍＭ  アセテート、１．７％  ソルビトール、０．００４％  ポリソルベート８０（ｐＨ４．０）であった。
【００６７】
０．６ｍｇ／ｍＬのＮｅｕｐｏｇｅｎ薬物製品を、０．２ｍｇ／ｍＬへと、２００ｍＭ  アセテート、５％  ソルビトール、０．０１％  ポリソルベート８０（ｐＨ４．０）、または１０ｍＭ  アセテート、０．００４％  ポリソルベート８０（ｐＨ４．０）のいずれかで３倍希釈した。これら試験物品の最終溶液条件はそれぞれ、１３７ｍＭ  アセテート、５％  ソルビトール、０．００７％  ポリソルベート８０（ｐＨ４．０）、または１０ｍＭ  アセテート、１．７％  ソルビトール、０．００４％  ポリソルベート８０（ｐＨ４．０）であった。
【００６８】
蛍光顕微鏡法によって試験物品のスペクトルを獲得する前に、適切なブランク溶液を作製し、各溶液の重量オスモル濃度を決定した。上記１３７ｍＭ  アセテート、５％  ソルビトール、０．００７％  ポリソルベート８０（ｐＨ４．０）溶液の重量オスモル濃度は、４１４ｍＯｓｍ／ｋｇであることが決定され、上記１０ｍＭ  アセテート、１．７％  ソルビトール、０．００４％  ポリソルベート８０（ｐＨ４．０）の重量オスモル濃度は、１５１ｍＯｓｍ／ｋｇであることが分かった。
【００６９】
３つの蛍光スペクトルを、励起波長２５７ｎｍを使用して、周囲温度でスキャン速度１００ｎｍ／分において２９５〜４００ｎｍの発光をモニターしながら各ブランク溶液に対して獲得した。３つのスペクトルの平均を、その後に獲得するサンプルスペクトルからの自動差し引きのために、機器のソフトウェアの中に保存した。図１は、溶液の重量オスモル濃度の変化の効果を示す。発光強度における約３０％の低下を、アセテート含有量を約０．６７Ｍ（重量オスモル濃度１１４１ｍＯｓｍ／ｋｇ）に増大させた場合に、ＴＰＩ−フィルグラスチム薬物物質およびＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標）（Ａｍｇｅｎの製品）の両方について認めたが、発光波長の有意なシフトは認められなかった。
【００７０】
３つの蛍光スペクトルを、周囲温度で、ブランクのスペクトルを獲得するために使用したものと同じパラメーターを使用して、各０．２ｍｇ／ｍＬのＴｈｅｒａｇｒａｓｔｉｍおよびＮｅｕｐｏｇｅｎサンプルに対して獲得した。その３つのスペクトルを、機器のソフトウェアで自動的に平均化し、ブランク溶液を、上記サンプルスペクトルから自動的に差し引いた。図２は、ＴＰＩ−フィルグラスチム（Ｔｈｅｒａｇｒａｓｔｉｍ（登録商標））およびＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標）（Ａｍｇｅｎの製品）の蛍光特性に対するポリソルベート８０濃度の６倍（０．００４％から０．０２４％  ｗ／ｖ）増大の効果を示す。約３４１ｎｍから約３３８ｎｍへの発光波長における青色へのシフトが、ポリソルベート８０の濃度を増大させた場合に認められた。このシフトにはまた、蛍光強度の有意な増大が付随した。
【００７１】
試験したＴｈｅｒａｇｒａｓｔｉｍおよびＮｅｕｐｏｇｅｎの重量オスモル濃度は、１１４１ｍＯｓｍ／ｋｇ〜１０３ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲に及んだ。正常ヒト血漿は、２８５〜２９５ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の重量オスモル濃度を有する。６００ｍＯｓｍ／ｋｇより高い重量オスモル濃度を有する薬剤は、赤血球の丸鋸歯状形成（収縮して皺が寄る）を引き起こして、重大な疼痛を生じる。約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇより低い重量オスモル濃度を有する溶液は、注射の部位で溶血（赤血球の破壊）および疼痛を引き起こす。
（実施例２）
【００７２】
３種のタンパク質を、浸透圧ストレスおよびＰＳ−８０濃度の増大（誘電性）に供した：（１）ＴＰＩ−ＰＥＧ−フィルグラスチム；（２）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）；および（３）リゾチーム。各タンパク質を、ＴＰＩ−フィルグラスチムに関する実施例１に記載されるのと正確に同じ様式で調製した。Ｇ−ＣＳＦは、６個のＰｈｅ（３．４％）、２個のＴｒｐ（１．１％）および３個のＴｙｒ（１．７）を含む。ＨＳＡは、３１個のＰｈｅ（５．３％）、１個のＴｒｐ（０．１％）、および１８個のＴｙｒ（３．１％）を含む。リゾチームは、３個のＰｈｅ（２．３％）、６個のＴｒｐ（４．７％）および３個のＴｙｒ（２．３％）を含む。
【００７３】
各タンパク質を、０．２ｍｇ／ｍＬで分析した。張度の影響を、以下の条件の各々の下で評価した：（１）１０ｍＭ  アセテート、１．７％  ソルビトール、０．００４％  ＰＳ−８０（１０４ｍＯｓｍ／ｋｇ）；（２）０．１７Ｍ  アセテート、５％  ソルビトール、０．００４％  ＰＳ−８０（４１４ｍＯｓｍ／ｋｇ）；および（３）０．６７Ｍ  アセテート、５％  ソルビトール、０．００４％  ＰＳ−８０（１１４２ｍＯｓｍ／ｋｇ）。
【００７４】
誘電性の影響を、各タンパク質に関して高張度サンプルを使用して評価した。そのＰＳ−８０濃度を、０．０１２および０．０２４％（およびＨＳＡに関しては０．０３６％）へと増大させた。蛍光発光は、励起波長２７８ｎｍを使用して、２９５〜４００ｎｍからのものを測定した。
【００７５】
図３は、ＴＰＩ−ＰＥＧ−フィルグラスチムについて張度の増大を図示する。結果は、ＴＰＩ−フィルグラスチムに関して得られたものに類似である。発光強度の低下が認められたが、発光最大の有意なシフトは認められなかった。
【００７６】
図４は、ＰＳ−８０濃度の増大を伴う高張度条件下でのＴＰＩ−ＰＥＧ−フィルグラスチムの結果を示す。結果は、ＴＰＩ−フィルグラスチムに関して得られたものに類似である。ＰＳ−８０濃度を増大させるにしたがって、発光強度の増大が認められ、同時に青色へのシフトが認められた。
【００７７】
図５は、張度を増大させた場合のＨＳＡの結果を示す。発光強度の低下が、張度の増大に伴って認められた。有意な青色へのシフトが、張度を４１４ｍＯｓｍ／ｋｇから１１４２ｍＯｓｍ／ｋｇへと増大させた場合に認められた。
【００７８】
図６は、ＰＳ−８０濃度の増大を伴う高張度条件下でのＨＳＡの結果を示す。発光強度の低下が、ＰＳ−８０濃度の増大とともに認められた。約１ｎｍの青色へのシフトが、ＰＳ−８０濃度の増大とともに認められた。
【００７９】
図７は、張度の増大に伴うリゾチームの結果を示す。ＨＳＡに類似して、発光強度の低下が、張度の増大に伴って認められた。青色へのシフトもまた、張度の増大に伴って認められた。
【００８０】
図８は、ＰＳ−８０濃度の増大を伴う高張度条件下でのリゾチームの結果を示す。発光強度の僅かな低下が、ＰＳ−８０濃度の増大とともに認められた。発光最大の有意なシフトは、ＰＳ−８０濃度の増大に伴って認められなかった。
【００８１】
ＴＰＩ−ＰＥＧ−フィルグラスチムは、張度および誘電性の変化の際に、ＴＰＩ−フィルグラスチムと比較して類似の挙動を示した。ＨＳＡおよびリゾチームは両方とも、張度の増大とともに発光強度の低下を現した。発光最大における有意なシフトは、ＨＳＡに関しては認められなかったのに対して、リゾチームの発光最大は、張度の増大に伴って有意な青色へのシフトを示した。蛍光強度の低下は、サンプルの蛍光強度の低下を引き起こす消光プロセスに起因すると考えられる。種々の分子相互作用が、励起状態反応、分子再配置、エネルギー移動、基底状態複合体形成および衝突消光を含め、消光を生じ得る。消光の原因は、上記サンプルの溶液条件に依存するのみならず、上記タンパク質のコンホメーションおよび蛍光発光を提供する芳香族アミノ酸の接近可能性にも依存する。リゾチームおよびＨＳＡは、異なる一次構造、二次構造および三次構造を有するので、その芳香族の接近可能性は、フィルグラスチムと比較して異なる。従って、その構造特性および蛍光特性は、各タンパク質が同じ浸透圧ストレスおよび誘電性ストレスに供されても、各々に関して異なって変化する。
【００８２】
ＨＳＡは、ＰＳ−８０濃度の増大に伴って、約１ｎｍの青色へのシフトとともに、発光強度の低下を示した。リゾチームは、発光強度の中程度の低下を示したが、ＰＳ−８０濃度の増大に伴う発光最大の有意なシフトを示さなかった。これら結果は、ＴＰＩ−ＰＥＧ−フィルグラスチムおよびＴＰＩ−フィルグラスチムに関して得られたもの（これら両方が、ＰＳ−８０濃度の増大に伴って蛍光発光強度の有意な増大ならびに青色へのシフトを示した）とは著しく対照をなしている。誘電性改変の結果としての蛍光発光の波長および強度における変化の程度は、蛍光性芳香族アミノ酸の接近可能性に依存する。ＨＳＡは、例えば、このタンパク質の疎水性結合ポケットの中に深く埋まっている特有のトリプトファン残基を含む（Ｋｒａｇｈ−Ｈａｎｓｅｎ，  Ｕ．，  「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ」，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｒｅｖ．  １９８１，  ３３，  １７−５３；  Ｐｅｔｅｒｓ，  Ｔ．，  「Ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ」，  Ａｄｖ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．  １９８５，  ３７，  １６１−２４５）のに対して、リゾチームおよびフィルグラスチムは、異なるコンホメーション配置を有し、従って、溶媒の接近可能性の程度が異なる１個より多くのＴｒｐ残基を含む。従って、誘電性の変化の効果は、各タンパク質の構造が同じではないことから、各タンパク質に関して異なる。
【００８３】
本開示を、種々の具体的材料、手順および例を参照することによって本明細書中で記載および例証してきたが、本開示がその目的のために選択された材料および手順の特定の組み合わせに制限されないことが理解される。このような詳細の多くのバリエーションは、当業者によって認識されるように暗示され得る。記載および例は例示とみなされるに過ぎず、本開示の真の範囲および趣旨は、以下の特許請求の範囲によって示されると解釈される。本願で言及される全ての参考文献、特許、および特許出願は、それらの全体において本明細書に参考として援用される。
【図１】
2016527523.tif 000004
【図２】
2016527523.tif 000005
【図３】
2016527523.tif 000006
【図４】
2016527523.tif 000007
【図５】
2016527523.tif 000008
【図６】
2016527523.tif 000009
【図７】
2016527523.tif 000010
【図８】
2016527523.tif 000011
【国際調査報告】
2016527523.tif 000012