(57)【要約】  本発明は、モノアセチルジアシルグリセロール化合物を有効成分として含有する、関節リウマチの予防、治療または改善用薬学的組成物、健康機能食品組成物および医薬部外品組成物を提供する。本発明のモノアセチルジアシルグリセロール化合物は、関節リウマチの治療標的物質として知られたＳＴＡＴ−３のリン酸化を抑制する効果が優れているため、現在使用される関節リウマチの治療剤の副作用を克服し、毒性がなく、かつ治療効果が優秀な化合物として関節リウマチの予防、治療および改善用組成物として有用に用いられる。
2016532701.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化学式１で表されるモノアセチルジアシルグリセロール化合物を有効成分として含有することを特徴とする、関節リウマチの予防または治療用薬学的組成物。
［化学式１］
2016532701.tif 000008
（上記の式において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ炭素数１４ないし２０の脂肪酸基である。）
【請求項２】
前記Ｒ１およびＲ２は、それぞれパルミトイル、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル、ステアロイル、ミリストイル、およびアラキドノイルで構成される群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記Ｒ１およびＲ２の組み合わせ（Ｒ１／Ｒ２）は、オレオイル／パルミトイル、パルミトイル／オレオイル、パルミトイル／リノレオイル、パルミトイル／リノレノイル、パルミトイル／アラキドノイル、パルミトイル／ステアロイル、パルミトイル／パルミトイル、オレオイル／ステアロイル、リノレオイル／パルミトイル、リノレオイル／ステアロイル、ステアロイル／リノレオイル、ステアロイル／オレオイル、ミリストイル／リノレオイル、ミリストイル／オレオイルで構成される群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記モノアセチルジアシルグリセロール化合物は、下記の化学式２で表される化合物であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
［化学式２］
2016532701.tif 000009
【請求項５】
前記モノアセチルジアシルグリセロール化合物は、鹿茸から分離されたことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記モノアセチルジアシルグリセロール化合物は、ＳＴＡＴ−３のリン酸化を抑制することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物は、化学式１で表されるモノアセチルジアシルグリセロール化合物を０．００１ないし５０重量％含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
［化学式１］
2016532701.tif 000010
（上記の式において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ炭素数１４ないし２０の脂肪酸基である。）
【請求項８】
下記の化学式１で表されるモノアセチルジアシルグリセロール化合物を有効成分として含有することを特徴とする、関節リウマチの予防または改善用健康機能食品組成物。
［化学式１］
2016532701.tif 000011
（上記の式において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ炭素数１４ないし２０の脂肪酸基である。）
【請求項９】
下記の化学式１で表されるモノアセチルジアシルグリセロール化合物を有効成分として含有することを特徴とする、関節リウマチの予防または改善用医薬部外品組成物。
［化学式１］
2016532701.tif 000012
（上記の式において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ炭素数１４ないし２０の脂肪酸基である。）
【請求項１０】
前記Ｒ１およびＲ２は、それぞれパルミトイル、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル、ステアロイル、ミリストイル、およびアラキドノイルで構成される群から選択されることを特徴とする、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記Ｒ１およびＲ２の組み合わせ（Ｒ１／Ｒ２）は、オレオイル／パルミトイル、パルミトイル／オレオイル、パルミトイル／リノレオイル、パルミトイル／リノレノイル、パルミトイル／アラキドノイル、パルミトイル／ステアロイル、パルミトイル／パルミトイル、オレオイル／ステアロイル、リノレオイル／パルミトイル、リノレオイル／ステアロイル、ステアロイル／リノレオイル、ステアロイル／オレオイル、ミリストイル／リノレオイル、ミリストイル／オレオイルで構成される群から選択されることを特徴とする、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１乃至７のうちいずれか一項に記載の組成物を非ヒト個体に投与する段階を含むことを特徴とする、関節リウマチの予防または治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノアセチルジアシルグリセロール化合物を有効成分として含有する関節リウマチの予防、治療または改善用薬学的組成物、健康機能食品組成物および医薬部外品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）とは、免疫体系の異常によって自分自身の関節や体の一部を攻撃して炎症を起こす自己免疫疾患であって、指、手、足、手首、足首、膝などのいろいろな関節が痛く腫れる症状を現し、筋肉、皮膚、肺、眼などのいろいろな他の臓器にも異常をもたらす可能性がある全身的な慢性炎症性疾患をいう。このような関節炎が発生する直接的な原因はまだ明らかでないため、これに対する研究が継続して進められており、現在までも関節リウマチなどの関節炎に対する効果的な治療方法や予防方法などはあまり知られておらず、これに対して解決方案が必要とされているのが実情である。関節炎の治療剤としてよく知られているステロイドホルモン剤のようなホルモン剤が用いられてきたが、これは根源的な治療法であるとは認め難く、副作用が報告されているので、その使用は難しくなった。関節炎、特に慢性関節リウマチは患者に激しい痛みを誘発するので、必ず抗炎症剤などを服用しなければならないが、このような痛みを緩和させるために長い間幅広く使用されてきたのがアスピリンである。しかし、このようなアスピリンは人間の胃に致命的な影響を与えるので、関節炎を治療するのに必要な量を服用し続けることは難しいと思われている。
【０００３】
既存のこのような化学療法的薬剤は薬剤の長期間服用による副作用、抗炎症効果の欠乏およびすでに発生した関節炎に対する効能の不足のような欠点を持っており、このような問題に対する解決策として効果的な関節炎治療剤の開発に対する要求が絶えず持続しており、現在用いられている大部分の関節炎治療剤は程度の差や個人的な差はあるが、いずれもある程度の副作用を持っており、特に関節リウマチの治療のためには薬剤を長期間服用する必要があるので、副作用の少ない薬剤を開発するのが大変重要で至急の問題となっている。
【０００４】
ＥＣ−１８はモノアセチルジグリセリド（ｍｏｎｏａｅｔｙｌｄｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）の一種であって、鹿茸から分離した。ＥＣ−１８はｃｅｃａｌ−ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｐｕｎｃｔｕｒｅを利用した敗血症動物モデルで動物の生存率を大きく増加させたことが知られており、ＧＬＰ（Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）毒性試験でも毒性がないことが示された。しかし、このようなＥＣ−１８を含むモノアセチルジアシルグリセロール類化合物が関節リウマチにおいていかなる効果を現すかについてはまだ開示されていない。これに本発明者らは、天然物由来あるいは新たな化合物の関節リウマチの治療剤を開発するために鋭意努力した結果、モノアセチルジアシルグリセロール化合物が関節リウマチの治療標的物質であるＳＴＡＴ−３の活性を抑制して関節リウマチの予防または治療に有用に使用できることを確認し本発明を完成させるに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の一つの目的は、下記化学式１で表されるモノアセチルジアシルグリセロール化合物を有効成分として含有する、関節リウマチの予防、治療または改善用の薬学的組成物、健康機能食品組成物および医薬部外品組成物を提供することにある。
【０００６】
［化学式１］
2016532701.tif 000003
【０００７】
上記の式において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ炭素数１４ないし２０の脂肪酸基である。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記薬学的組成物を関節リウマチの発症可能性があるまたは関節リウマチを患っている個体に投与する段階を含む、関節リウマチの予防または治療方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するための一つの様態として、本発明は、下記化学式１で表されるモノアセチルジアシルグリセロール化合物を有効成分として含有する、関節リウマチの予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００１０】
［化学式１］
2016532701.tif 000004
【００１１】
上記の式において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ炭素数１４ないし２０の脂肪酸基である。本明細書で脂肪酸基は脂肪酸のカルボキシル基から−ＯＨ基を除いた残りの部分を意味する。
【００１２】
具体的に、本発明の関節リウマチの予防または治療用薬学的組成物は前記化学式１で表されるモノアセチルジアシルグリセロール化合物を含むことができる。本発明において、用語“モノアセチルジアシルグリセロール化合物”とは、１つのアセチル基と２つのアシル基を有するグリセロールの誘導体を意味し、モノアセチルジグリセロール（ＭＡＤＧ）ともいう。
【００１３】
前記化学式１で表されるモノアセチルジアシルグリセロール化合物においてＲ１およびＲ２はそれぞれ炭素数１４ないし２０の脂肪酸基であり、好ましくはパルミトイル（ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）、オレオイル（ｏｌｅｏｙｌ）、リノレオイル（ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ）、リノレノイル（ｌｉｎｏｌｅｎｏｙｌ）、ステアロイル（ｓｔｅａｒｏｙｌ）、ミリストイル（ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ）またはアラキドノイル（ａｒａｃｈｉｄｏｎｏｙｌ）などであることができるが、これらに限定されない。さらに好ましくは、前記Ｒ１およびＲ２の組み合わせ（Ｒ１／Ｒ２）はオレオイル／パルミトイル、パルミトイル／オレオイル、パルミトイル／リノレオイル、パルミトイル／リノレノイル、パルミトイル／アラキドノイル、パルミトイル／ステアロイル、パルミトイル／パルミトイル、オレオイル／ステアロイル、リノレオイル／パルミトイル、リノレオイル／ステアロイル、ステアロイル／リノレオイル、ステアロイル／オレオイル、ミリストイル／リノレオイルまたはミリストイル／オレオイルなどであることができるが、これらに限定されない。また、前記モノアセチルジアシルグリセロール化合物は光学活性において、（Ｒ）−形、（Ｓ）−形またはラセミ体であることができる。
【００１４】
前記モノアセチルジアシルグリセロール化合物は、好ましくは、下記化学式２で表される化合物であることができる。
【００１５】
［化学式２］
2016532701.tif 000005
【００１６】
上記化学式２で表される化合物は１−パルミトイル（ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）−２−リノレオイル（ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ）−３−アセチルグリセロール（ａｃｅｔｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）といい、ＥＣ−１８とも命名される。前記化合物のＲ１とＲ２は、それぞれパルミトイルとリノレオイルに該当する。
【００１７】
前記モノアセチルジアシルグリセロール化合物は、鹿茸から抽出／分離したり、公知の有機合成法（大韓民国登録特許番号１０−０７８９３２３号公報）により製造される。具体的に、鹿茸をヘキサンで抽出し、その抽出の残余を再びクロロホルムにより抽出した後、収得した抽出液を減圧蒸留して鹿茸のクロロホルム抽出物を収得することができる。前記抽出において使用される抽出溶媒であるヘキサンおよびクロロホルムの量はそれぞれ使用された鹿茸が浸る程度の量であれば十分で、一般的には、鹿茸１ｋｇに対しヘキサンおよびクロロホルムをそれぞれ４〜５リットルの割合で使用されるが、抽出溶媒の種類および使用量は、これに限定されない。このような方法で収得した鹿茸のクロロホルム抽出物が、次いで一連のシリカゲルコラムクロマトグラフィーおよびＴＬＣ方法によりさらに分画化され精製されて、本発明に使用されるモノアセチルジアシルグリセロール化合物が得られる。前記クロマトグラフィー精製段階の溶離液としてはクロロホルム／メタノール、ヘキサン／酢酸エチル、ヘキサン／酢酸エチル／酢酸などが用いられるが、これに限定されない。
【００１８】
一方、本発明に使用されるモノアセチルジアシルグリセロール化合物を化学的に合成する方法は、大韓民国登録特許番号１０−０７８９３２３号公報に公開されている。具体的に、（ａ）１−Ｒ１−グリセロールの３番位置に保護基を導入して１−Ｒ１−３−保護基−グリセロールを製造する過程、（ｂ）１−Ｒ１−３−保護基−グリセロールの２番位置にＲ２基を導入して１−Ｒ１−２−Ｒ２−３−保護基−グリセロールを製造する過程および、（ｃ）１−Ｒ１−２−Ｒ２−３−保護基−グリセロールの脱保護反応およびアセチル化反応を同時に実行する過程を含み、必要に応じて精製して、目的とするモノアセチルジアシルグリセロール類化合物を合成でき、他の方法としてはホスファチジルコリンを加酢酸分解（ａｃｅｔｏｌｙｓｉｓ）して得られるが、これに限定されない。また、前記化学式１の化合物の立体異性体もすべて本発明の範囲内に含まれる。
【００１９】
本発明によってモノアセチルジアシルグリセロール化合物はＳＴＡＴ−３のリン酸化を抑制できるのを確認することによって、関節リウマチの予防または治療に効果的に用いられることが確認された。
【００２０】
本発明において、用語“関節リウマチ”とは、多発生関節炎を特徴とする原因不明の慢性炎症性疾患であって、初期には関節を包んでいる滑膜に炎症が発生するが、次第に周囲の軟骨と骨に炎症が拡散して関節の破壊および変形をもたらす疾患である。また、関節だけでなく、関節以外の症状として、貧血、乾燥症候群、皮下結節、肺線維症、血管炎、皮膚潰瘍など全身をおかすことができる。このような関節リウマチに使用される薬剤としては、非ステロイド性抗炎症剤とステロイド、抗リウマチ薬剤とＴＮＦ遮断剤などがあるが、各種の副作用などの危険が存在することが知られている。本発明において、用語“予防”とは、本発明の組成物の投与で関節リウマチの発症を抑制または遅延したりするあらゆる行為を意味し、“治療”とは、本発明の組成物によって関節リウマチによる症状が好転したり有益に変更されるあらゆる行為を意味する。
【００２１】
最近、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）を生産するＴｈ１７細胞が関節リウマチの病因に主導的な役割を果たし、特に関節炎症と骨破壊を直接誘導するのが明らかになった。具体的に、Ｔｈ１７細胞の分化および活性に核心転写因子として知られたＳＴＡＴ−３は直接的にＩＬ−１７のローカス（ｌｏｃｕｓ）を調節することができ、Ｔｈ１７分化と関連する多くの転写因子の発現に必須の要素として役割を果たすことが知られている。ＳＴＡＴ−３はリン酸化することで活性化されるが、Ｔｈ１７細胞内においてこのようなＳＴＡＴ−３の活性を抑制すれば、Ｔｈ１７細胞は制御され免疫調節Ｔ細胞の活性は増加して、関節リウマチを予防または治療できることが知られて、ＳＴＡＴ−３が関節リウマチの治療標的物質として明らかになった。
【００２２】
本発明の実施例においては、ｉ）Ｕ９３７細胞およびＮＫ−９２細胞にそれぞれＩＬ−６およびＰＭＡ（Ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ）を処理して活性化したＳＴＡＴ−３にＥＣ−１８を処理した場合、ＥＣ−１８の濃度依存的にＳＴＡＴ−３のリン酸化を抑制する効果を確認し（実験例１および２、図１および２）、ｉｉ）Ａ５４９およびＨｅｐＧ２細胞にＩＬ−１０を処理して活性化したＳＴＡＴ−３にＥＣ−１８を処理した場合、ＳＴＡＴ−３の活性が減少したことを確認した（実験例３、図３）。これは、前記モノアセチルジアシルグリセロール化合物が関節リウマチの治療に有効であることを良く示しているのである。コラーゲンで関節炎が誘導されたモデル動物の実施例においては肉眼的関節炎指数（実験例４、図５）と血中ＩＬ−６濃度（実験例４、図４）で陰性対照群と比較して有意に減少し、組織染色による検査結果（実験例４、図６および図７）、コラーゲンで誘発された関節炎に対して試験物質であるＥＣ−１８は１２５，５００および２，０００ｍｇ／ｋｇ容量で関節炎症状を改善させる効能があることを示している。
【００２３】
本発明のモノアセチルジアシルグリセロール化合物を含む薬学的組成物は、薬学的組成物の製造に通常使用する適切な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含むことができる。このとき、前記組成物に含まれるモノアセチルジアシルグリセロール化合物の含有量は、特に限定されないが、組成物総重量に対して０．０００１ないし１００．０重量％、好ましくは０．００１ないし５０．０重量％、さらに好ましくは０．０１ないし２０重量％を含むことができる。
【００２４】
前記薬学的組成物は錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、油剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥剤および坐剤からなる群から選択されるいずれか一つの剤形を有することができ、経口または非経口の様々な製剤であることができる。製剤化に際して、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いることができる。経口投与のための固形製剤には錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、一つ以上の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混合して調製することができる。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクなどのような潤滑剤も用いることができる。経口投与のための液状製剤としては懸濁剤、内用液剤、油剤、シロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを含むことができる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤にはプロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが用いることができる。坐剤の基剤にはウィテプソル（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが用いることができる。
【００２５】
本発明の組成物は薬学的に有効な量で投与することができる。本発明において、用語“薬学的に有効な量”とは、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／危険の比率で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量のレベルは個体の種類および重症度、年齢、性別、病気の種類、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素と、その他医学分野によく知られている要素とによって決定できる。本発明の組成物は個別治療剤として投与したり、他の治療剤と併用して投与が可能であり、従来の治療剤とは順次または同時に投与が可能である。そして、単一または多重投与することができる。前記要素のいずれもを考慮して副作用なしに最小限の量で最大効果が得られる量を投与するのが重要であり、当業者によって容易に決定可能である。本発明の組成物の望ましい投与量は、患者の状態および体重、病気の程度、薬物形態、投与経路および期間により異なり、適した一日の総使用量は、正しい医学的判断の範囲内で担当医によって決定されるが、一般に０．００１ないし１０００ｍｇ／ｋｇの量、好ましくは０．０５ないし２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１ないし１００ｍｇ／ｋｇの量を一日１回乃至複数回に分けて投与することができる。前記組成物は、関節リウマチの予防または治療を目的とする個体であれば特に限定されず、あらゆる個体に適用可能である。例えば、猿、犬、猫、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、牛、羊、豚、ヤギなどのような非人間動物および人間などすべての個体に適用でき、投与の方式は当業系の通常の方法であれば、限りはない。例えば、経口、直腸、または静脈、筋肉、皮下、子宮内頚膜または脳血管内注射によって投与できる。
【００２６】
また一つの様態として、本発明は下記化学式１で表されるモノアセチルジアシルグリセロール化合物を有効成分として含有する、関節リウマチの予防または改善用の健康機能食品組成物を提供する。
【００２７】
［化学式１］
2016532701.tif 000006
【００２８】
上記化学式１で表されるモノアセチルジアシルグリセロール化合物においてＲ１およびＲ２はそれぞれ炭素数１４ないし２０の脂肪酸基であることができるが、これに限定されない。
【００２９】
具体的に、本発明のモノアセチルジアシルグリセロール化合物を、関節リウマチの予防または改善を目的として、健康機能食品組成物に含むことができる。前記モノアセチルジアシルグリセロール化合物および関節リウマチについては前述のとおりである。本発明において、用語“改善”とは、前記組成物を利用して関節リウマチの疑いのあるおよび関節リウマチを発症した発症個体の症状が好転したり有益となるあらゆる行為を意味する。
【００３０】
本発明の組成物を健康機能食品に含んで用いる場合、前記組成物をそのまま添加したり他の健康機能食品または健康機能食品成分と共に使用することができ、通常の方法により適切に使用することができる。有効成分の混合量は、使用目的により適するように決定される。一般に、食品または飲料の製造の際、本発明の組成物は原料１００重量部に対して好ましくは１５重量部以下、より好ましくは１０重量部以下の量で添加することができる。しかし、健康調節および衛生を目的とする長期間摂取時の場合には前記量は前記範囲以下であることができ、安定性の面でも問題がないため、有効成分は前記範囲以上の量でも使用することができる。
【００３１】
本発明の組成物が含まれる健康機能食品の種類としては、特に制限はなく、具体的な例として、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、茶、ドリンク剤、アルコール飲料およびビタミン複合剤などが挙げられ、通常の意味での健康機能食品を全て含み、動物用飼料として利用される食品を含むことができる。また、本発明の健康機能食品組成物が飲料形態に用いられる場合は、通常の飲料と同様に、色々な甘味剤、香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。前記天然炭水化物とは、ブドウ糖、果糖などのモノサッカライド、マルトース、シュークロスなどのジサッカライド、デキストリン、サイクロデキストリンなどのポリサッカライド、およびキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。前記天然炭水化物の比率は、これに限定されないが、本発明の組成物１００ｍＬ当たり好ましくは、約０．０１ないし０．０４ｇ、より好ましくは０．０２乃至０．０３ｇである。前記甘味剤としては、タウマチン、ステビア抽出物などの天然甘味剤およびサッカリン、アスファルタムなどの合成甘味剤などが挙げられる。前記以外に本発明の健康機能食品組成物は種々の栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使われる炭酸化剤などを含有することができる。その他、天然果物ジュース、果物ジュース飲料および野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。
【００３２】
また一つの様態として、本発明は下記の化学式１で表されるモノアセチルジアシルグリセロール化合物を有効成分として含有する、関節リウマチの予防または改善用医薬部外品組成物を提供する。
【００３３】
［化学式１］
2016532701.tif 000007
【００３４】
上記化学式１で表されるモノアセチルジアシルグリセロール化合物においてＲ１およびＲ２はそれぞれ炭素数１４ないし２０の脂肪酸基であることができるが、これに限定されるものではない。
【００３５】
具体的に、本発明のモノアセチルジアシルグリセロール化合物を関節リウマチの予防または改善を目的で医薬部外品組成物に添加することができる。前記モノアセチルジアシルグリセロール化合物および関節リウマチについては前述したとおりである。
【００３６】
本発明において、用語“医薬部外品”とは、人や動物の病気を治療、緩和、処置または予防する目的で使用される繊維、ゴム製品またはこれに類似するもの、人体に対する作用が弱くなったり人体に直接作用せず、機械器具などでないものとこれに類似するもの、感染予防のために殺菌、殺虫およびこれに類似する用途に使用される製剤のうち一つに相当する物品で、人や動物の病気を診断、治療、緩和、処置または予防する目的で使用する物品中、器具、機械または装置でないものおよび人や動物の構造と機能に薬理学的影響を与える目的で使用する物品中、器具、機械または装置でないものを除いた物品を意味し、皮膚外用剤および個人用衛生用品も含む。
【００３７】
本発明の組成物を関節リウマチの予防または改善を目的で医薬部外品に含む場合、前記組成物をそのまま使用したり他の医薬部外品の成分と共に使用することができ、通常の方法により適切に使用することができる。有効成分の混合量は、使用目的により適するように決定される。前記皮膚外用剤は、特に制限されないが、例えば軟膏剤、ローション剤、スプレー剤、パッチ剤、クリーム剤、散剤、懸濁剤、ゲル剤またはゲル状に製造して用いることができる。
【００３８】
また一つの様態として、本発明は、前記薬学的組成物を関節リウマチの疑いのある個体に投与する段階を含む、関節リウマチの予防または治療方法を提供する。本発明において前記関節リウマチの疑いのある個体は、関節リウマチが発症したり発症する可能性のある人間を含むすべての動物を意味し、本発明の化合物を含む薬学的組成物を関節リウマチの疑いのある個体に投与することによって、個体を効率的に治療することができる。関節リウマチについては前述したとおりである。本発明において、用語“投与”とは、任意の適切な方法で関節リウマチの疑いのある個体に本発明の薬学的組成物を導入することを意味し、投与経路は目的組織に到達できる限り経口または非経口の多様な経路を通じて投与されることができる。
【００３９】
本発明の治療方法は、前記化学式１のモノアセチルジアシルグリセロール化合物を含む薬学的組成物を薬学的有効量で投与するのを含むことができる。適した１日の総使用量は、正しい医学的判断の範囲内で担当医によって決定され、一般に０．００１ないし１０００ｍｇ／ｋｇの量、好ましくは０．０５ないし２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１ないし１００ｍｇ／ｋｇの量を一日１回乃至複数回に分けて投与することができる。しかし、本発明の目的上、特定患者に対する具体的な治療的有効量は達成しようとする反応の種類と程度、場合によって他の製剤を使用するかどうかをはじめとする具体的組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別および食事、投与時間、投与経路および組成物の比率、治療期間、具体的組成物とともに使用されたり同時に使用される他の薬物、医薬分野において周知である多様な因子とその類似因子によって異なるように適用するのが望ましい。
【発明の効果】
【００４０】
本発明のモノアセチルジアシルグリセロール化合物は、関節リウマチの治療標的物質として知られたＳＴＡＴ−３のリン酸化を抑制する効果が優れているため、現在使用される関節リウマチの治療剤の副作用を克服し、毒性がなく、かつ治療効果が優秀な化合物として関節リウマチの予防、治療および改善用組成物として有用に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】Ｕ９３７細胞でＩＬ−６によってリン酸化されたＳＴＡＴ−３のＥＣ−１８濃度別処理に応じたリン酸化抑制効果を示すウェスタンブロットの結果を示した図である。（Ａ）はＥＣ−１８を１５分間処理した結果であり、（Ｂ）はＥＣ−１８を６０分間処理したときの結果である。
【００４２】
【図２】ＮＫ−９２細胞でＰＭＡ（Ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ）によってリン酸化されたＳＴＡＴ−３（Ａ）およびＳＴＡＴ−１（Ｂ）のＥＣ−１８濃度別処理に応じたリン酸化抑制効果を示すウェスタンブロットの結果を示した図である。
【００４３】
【図３】Ａ５４９細胞（Ａ）およびＨｅｐＧ２細胞（Ｂ）でＩＬ−１０によって活性化されたＳＴＡＴ−３のＥＣ−１８濃度別処理に応じたルシフェラーゼの発光値を示した図である。
【００４４】
【図４】正常対照群、陰性対照群、ＥＣ−１８投与群および陽性対照群に対して、組織摘出日に採取した血清でインターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）−６濃度の測定結果を示すグラフである。
【００４５】
【図５】正常対照群、陰性対照群、ＥＣ−１８投与群および陽性対照群の時間に応じた肉眼的な関節炎指数を示すグラフである。
【００４６】
【図６】正常対照群、陰性対照群、ＥＣ−１８投与群および陽性対照群に対して、関節炎症状に対する組織病理学的検査の結果を示すグラフである。
【００４７】
【図７】正常対照群、陰性対照群、ＥＣ−１８投与群および陽性対照群に対して、関節炎組織を染めて顕微鏡で拡大した写真である。
【図８】正常対照群、陰性対照群、ＥＣ−１８投与群および陽性対照群に対して、関節炎組織を染めて顕微鏡で拡大した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。ただし、これらの実施例は本発明の理解を助けるためのものであって、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４９】
実施例：細胞培養
【００５０】
ヒト細胞株ＮＫ−９２、Ｕ９３７、Ａ５４９、ＨｅｐＧ２（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）の培養は３７℃、５％ＣＯ２の湿化された条件下で行った。ＮＫ−９２細胞株は２０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ、ＦＣＳ、ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタメート、１００μｇ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むａｌｐｈａｌ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）培地で培養し、Ｕ９３７とＡ５４９、ＨｅｐＧ２細胞株は１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地で培養した。
【００５１】
実験例１：Ｕ９３７細胞でのＥＣ−１８によるＳＴＡＴ−３のリン酸化抑制効果
【００５２】
ＥＣ−１８とＩＬ−６サイトカインを処理した細胞に冷たいＳＤＳ−溶解バッファー［（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１０ｍＭ  ＮａＦ、ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）］を使って３０分間氷に溶解した。溶解した細胞溶液を高速回転機で３０分間、１３，０００ｒｐｍで回転して不溶性部分を沈殿させて水溶性溶液を分離した。分離した細胞水溶液を定量後、１０ないし１２％濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥを利用して電気泳動した。ゲル上で分離された細胞蛋白質をＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）に１００Ｖで２時間転写させた。
【００５３】
細胞内でリン酸化されたＳＴＡＴ−３を確認するために、ｐｏｌｙ  ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−（ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ１）、−ｐｈｏｓｐｈｏｒ（ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３）（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）（１：１０００）を１次抗体として使用して室温で６０分間反応させた。２次抗体としてはｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）（１：３０００）で室温で６０分間反応させた。細胞蛋白質の同じ量の測定はｐｏｌｙ  ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−（ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３）で確認した。免疫反応の終わったメンブレンはＥＣＬ試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）で反応させて、Ｘ−ｒａｙフィルムに露出させてＳＴＡＴ−３のリン酸化程度をフィルム上に現れたバンドで確認した。
【００５４】
その結果、免疫細胞であるＵ９３７細胞でＩＬ−６によってＳＴＡＴ−３がリン酸化されたことを確認し、前記リン酸化されたＳＴＡＴ−３は前処理したＥＣ−１８に対して濃度依存的に減少することを確認した（図１Ａ）。また、１時間経過後もＥＣ−１８によるＳＴＡＴ−３のリン酸化抑制効果が維持されることを確認した（図１Ｂ）。
【００５５】
実験例２：ＮＫ−９２細胞でのＥＣ−１８によるＳＴＡＴ−３のリン酸化抑制効果
【００５６】
ＥＣ−１８とＰＭＡ（Ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ）を処理した細胞に冷たいＳＤＳ−溶解バッファー［（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＮＰ−４０、０．１％  ＳＤＳ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１０ｍＭ  ＮａＦ、ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）］を使って３０分間氷に溶解した。溶解した細胞溶液を高速回転機で３０分間、１３，０００ｒｐｍで回転して不溶性部分を沈殿させ水溶性溶液を分離した。分離した細胞水溶液を定量後、１０ないし１２％濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して電気泳動した。ゲル上で分離された細胞蛋白質をＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）に１００Ｖで２時間転写させた。
【００５７】
細胞内でリン酸化されたＳＴＡＴ−１とＳＴＡＴ−３を確認するため、ｐｏｌｙ  ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ＳＴＡＴ３、−ＳＴＡＴ１、−ｐｈｏｓｐｈｏｒ  ＳＴＡＴ３（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）（１：１０００）を１次抗体として使用して室温で６０分間反応させた。２次抗体としては、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）（１：３０００）で室温で６０分間反応させた。細胞蛋白質の同じ量の測定は、ｐｏｌｙ  ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ＳＴＡＴ３で確認した。免疫反応の終わったメンブレンはＥＣＬ試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）で反応させて、Ｘ−ｒａｙフィルムに露出させてＳＴＡＴのリン酸化程度をフィルム上に現れたバンドで確認した。
【００５８】
その結果、免疫細胞であるＮＫ−９２細胞でＰＭＡによりＳＴＡＴ−３がリン酸化されたことを確認し、前記リン酸化されたＳＴＡＴ−３は前処理したＥＣ−１８に対して濃度依存的に減少することを確認した（図２Ａ）。一方、ＳＴＡＴ−１はＥＣ−１８によるリン酸化抑制効果がないことを確認した（図２Ｂ）。
【００５９】
実験例３：ルシフェラーゼレポーターを利用したＳＴＡＴ−３活性抑制
【００６０】
ＳＴＡＴ−３が結合するｓｉｓ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ（ＳＩＥ）を含んでいるｐＧＬ４．４７［ｌｕｃ２Ｐ／ＳＩＥ／Ｈｙｇｒｏ］ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＡ５４９細胞とＨｅｐＧ２細胞に導入させた後、ＥＣ−１８を前処理しＩＬ−１０を処理してＳＴＡＴ−３の活性抑制を分析した。
【００６１】
まず、Ａ５４９細胞とＨｅｐＧ２細胞をｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡを処理して分離した後、培養皿に分注し、Ａｔｔｒａｃｔｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｐＧＬ４．４７［ｌｕｃ２Ｐ／ＳＩＥ／Ｈｙｇｒｏ］ベクターを細胞に導入させた後、３７℃、５％ＣＯ２条件で一日間培養した。翌日に培養皿で細胞を分離した後、９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに５×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの個体数となるように０．１ｍＬずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ２条件で一日間培養した。翌日にＥＣ−１８を濃度別に１時間、前処理した後、ＩＬ−１０を１０ｎｇ／ｍＬを細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件で６時間培養した。６時間経過後にＩＬ−１０シグナル伝達によるルシフェラーゼの活性化程度をＯＮＥ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して確認した。具体的に、９６−ｗｅｌｌにＯＮＥ−ＧｌｏＴＭ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  ＢｕｆｆｅｒとＳｕｂｓｔｒａｔｅを１：１で混合した溶液０．１ｍＬを添加し、約３分経過後、発光する程度をＶＩＣＴＯＲ  Ｘ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して０．５秒間測定した。
【００６２】
ルシフェラーゼの発光値はＩＬ−１０だけ処理した値に比べて、ＥＣ−１８を濃度別に処理した場合の値が減って、相対的活性減少を確認することができた（図３Ａおよび図３Ｂ）。すなわち、ＩＬ−１０によって誘導されたＳＴＡＴ−３の活性がＥＣ−１８を処理したＡ５４９細胞およびＨｅｐＧ２細胞で顕著に減少することを確認した。
【００６３】
実験例４：モデル動物で関節炎治療の効能分析
【００６４】
関節炎モデル動物実験のために、雄ＤＢＡ／１Ｊマウスにｂｏｖｉｎｅ  ｔｙｐｅＩＩコラーゲンを投与して関節炎を誘発した後、ＥＣ−１８を反復経口投与して関節炎に対する治療（改善）効能を評価した。また、比較のために、‘陽性対照物質１’としてレミケードを反復腹腔投与し、‘陽性対照物質２’としてメトトレキサートを反復経口投与した。群構成は、正常対照群（Ｇ１、Ｎｏｒｍａｌ）、陰性対照群（Ｇ２、Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）、１２５，５００および２，０００ｍｇ／ｋｇ容量のＥＣ−１８（試験物質、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５）投与群、２０ｍｇ／ｋｇ容量の‘陽性対照群１’（Ｒｅｍｉｃａｄｅ、Ｇ６）および２．５ｍｇ／ｋｇ容量の‘陽性対照群２’（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ、Ｇ７）の総７群において各群当たり１０匹ずつ設定した。正常対照群および陰性対照群は‘賦形剤１’としてｏｌｉｖｅ  ｏｉｌを投与し、１２５，５００および２，０００ｍｇ／ｋｇ容量のＥＣ−１８、‘陽性対照群１’としてｒｅｍｉｃａｄｅ、‘陽性対照群２’としてｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅを１日１回、５週間、総３５回投与するが、‘陽性対照群１’は腹腔投与を、その他の残りの投与群は胃内に強制投与した。関節炎を誘発しない動物（正常対照群）を除いた全ての動物はｂｏｖｉｎｅ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎとｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔまたはｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔを乳化したエマルジョン（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）で総２回イミュニゼーション（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）して関節炎を誘発した。観察期間の間に毎日１回の一般症状観察、週１回の体重測定、週２回の肉眼的な関節炎指数評価および週２回の足の甲の厚さ測定を実施した。
【００６５】
組織摘出日に採取した血清（ｓｅｒｕｍ）でインターロイキン−６濃度（ｃｏｎｃｅｎｔａｔｉｏｎ）を測定した結果を図４に示した。図４に示したように、コラーゲンによって関節炎が誘発されたモデル動物でインターロイキン−６（ＩＬ−６）濃度が有意に増加し（Ｇ２、ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＥＣ−１８処理動物（Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５）で血液内ＩＬ−６濃度が陽性対照群（Ｒｅｍｉｃａｄｅ、Ｍｅｔｈｏｔｈｒｅｘａｔｅ処理群、Ｇ６およびＧ７）と同様に減少した。図５は正常対照群、陰性対照群、ＥＣ−１８投与群および陽性対照群の時間に応じた肉眼的な関節炎指数（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｓｃｏｒｅ）を示すグラフであって（投与日付別分析）、図５に示されているように、コラーゲンによって関節炎が誘発されたモデル動物でＥＣ−１８投与群の肉眼的な関節炎指数が陰性対照群（Ｇ２）と比較して有意に減少した。図６は正常対照群、陰性対照群、ＥＣ−１８投与群および陽性対照群に対して、両側後足のひざがしらを摘出して関節炎症状に対する組織病理学的（ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ）検査を実施した結果を示すグラフであって、図６に示されているように、コラーゲンによって関節炎が誘発されたモデル動物（Ｇ２）で病理組織学的関節炎指数（ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｓｃｏｒｅ）が高くなり、ＥＣ−１８処理動物（Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５）で病理組織学的関節炎指数が陽性対照群（Ｒｅｍｉｃａｄｅ、Ｍｅｔｈｏｔｈｒｅｘａｔｅ処理群、Ｇ６およびＧ７）と同様に減少した。図７および図８は正常対照群（Ｇ１、Ｎｏｒｍａｌ）、陰性対照群（Ｇ２、Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）、５００ｍｇ／ｋｇ容量のＥＣ−１８投与群、２０ｍｇ／ｋｇ容量のＲｅｍｉｃａｄｅ投与群（Ｇ６）に対して、関節炎組織を染めて顕微鏡で拡大した写真である（図７；ｘ４０、図８；ｘ１００）。図７および図８に示されているように、関節炎が誘発された陰性対照群（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｇ２）に比べてＥＣ−１８（Ｃ）およびＲｅｍｉｃａｄｅ（Ｄ）投与群で軟骨の破砕とパンヌス（Ｐａｎｎｕｓ）の増加現象が緩和されることが分かる。このように、正常対照群と比較して陰性対照群で関節炎評価項目である肉眼的な関節炎指数、足の甲の厚さ、血中インターロイキン−６（ＩＬ−６）およびａｎｔｉ−ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ（ａｎｔｉ−ＣＩＩ）ＩｇＧ濃度および組織病理学的関節炎点数が有意に増加して関節炎モデルが確立され、ＥＣ−１８は関節炎の治療に効果的であることが分かる。
【００６６】
以上の説明から、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者は本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施され得ることを理解できるものであろう。したがって、以上で記述した実施形態はすべての面で例示的なものであり、限定的ではないものとして理解しなければならない。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは後述する特許請求の範囲の意味および範囲そしてその均等概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれると解釈されなければならない。
【図１（Ａ）】
2016532701.tif 000013
【図１（Ｂ）】
2016532701.tif 000014
【図２】
2016532701.tif 000015
【図３（Ａ）】
2016532701.tif 000016
【図３（Ｂ）】
2016532701.tif 000017
【図４】
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【図５】
2016532701.tif 000019
【図６】
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【図７】
2016532701.tif 000021
【図８】
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【国際調査報告】
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