(57)【要約】  本発明は、好ましくは質量分析法によるサンプル中における目的の分子の検出の分野に関する。本発明は、ラベル化合物、該化合物によりラベルされた分子（コンジュゲート）、該コンジュゲートを用いてサンプル中における目的の分子（標的分子）を検出する方法、該方法を行うためのキット、及び前記ラベルの調製のためのプロセスに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式（Ｉ）の化合物であって、
2016510413.tif 000031
該化学式（Ｉ）において、
Ｔａｇ（タグ）は、分析の技術により同定及び／又は検出可能な原子団であり、
Ｔｒｉｇｇｅｒ（トリガー）は、刺激を受けた際に切断される化学基であり、
ｎは０又は１であり、
Ａｒは芳香族基であり、
Ｒは、水素原子と、任意に酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）及び硫黄（Ｓ）原子からなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子が挿入され、任意にヒドロキシ基、アルコキシ基、アミノ基（ＮＨ２）、ニトロ基（ＮＯ２）及びカルボキシル基（ＣＯＯＨ）からなる群から選択される少なくとも１つで置換された飽和型又は不飽和型の直鎖又は分枝鎖アルキル基とからなる群から選択され、
Ｒ１は水素原子であり、Ｒ２は水素原子と、任意にフェニル基で置換されたＣ１−Ｃ４アルキル基とからなる群から選択され、又は、Ｒ１及びＲ２は窒素及び炭素原子と共にそれぞれ結合して５員環を形成し、
Ｒ３は、−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ２−ＦＧで示される化学基であり、ｍは０、１、２又は３であり、ＦＧは結合分子の化学基と反応できる官能基であり、
Ｒ４は、Ｃ１−Ｃ４アルキル基であり、
Ｘは、酸素（Ｏ）、ＮＨ及び硫黄（Ｓ）からなる群から選択される、化合物。
【請求項２】
化学式（ＩＩ）のコンジュゲートであって、
2016510413.tif 000032
該化学式（ＩＩ）において、
前記Ｔａｇ（タグ）、Ｔｒｉｇｇｅｒ（トリガー）、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ａｒ、Ｘ及びｎは、請求項１に記載の定義と同一であり、
Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ（結合分子）は、請求項１に記載のＲ３に結合可能な分子であり、
Ｒ’３は、−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ２−ＦＧ’の化学基であり、ｍは０、１、２又は３であり、ＦＧ’は請求項１に記載のＦＧ基と結合分子との反応から得られる官能基である、コンジュゲート。
【請求項３】
前記結合分子は、抗体、抗原、アプタマー、タンパク質、ペプチド、オリゴ糖、多糖類、ペプチドグリカン、脂質及びＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸からなる群から選択される、請求項２に記載のコンジュゲート
【請求項４】
前記タグは、既知の質量のタグ、又はペプチド、好ましくは、Gly-Arg-Aa-Phe-Arg-Gly-Aa-Glyである配列番号１の配列のペプチドであり、前記Ａａのそれぞれは、独立してアラニン、セリン、バリン、アスパラギン、グルタミン、ロイシン及びプロリンからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物又は請求項２若しくは３に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
前記Ａｒは７−ヒドロキシクマリン誘導体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はコンジュゲート。
【請求項６】
請求項２〜５のいずれか１項に記載のコンジュゲートを調製する方法であって、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の少なくとも１つの化合物と前記結合分子とを、好ましくは約４℃で接触させることと、それにより得られたコンジュゲートを好ましくは約４℃で精製することとを含む、方法。
【請求項７】
サンプル中において少なくとも１つの標的分子を検出するための方法であって、
少なくとも１つの請求項２〜５のいずれか１項に記載のコンジュゲートと前記サンプルとを接触させるステップ（ａ）と、
前記サンプルから非結合性コンジュゲートを除去するステップ（ｂ）と、
前記ステップ（ｂ）の後に得られたサンプルに対して少なくとも１つの刺激を与えて前記コンジュゲートを活性化させるステップ（ｃ）と、
適切な分析技術、好ましくはＭＡＬＤＩ質量分析法によりＴａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−（Ｒ４−Ｏ）ｎ−Ｈ化合物の放出を検出するステップ（ｄ）と、を備え、
前記Ｔａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−（Ｒ４−Ｏ）ｎ−Ｈ化合物は、前記サンプル中において対応する標的分子の存在を示し、
前記Ｔａｇ（タグ）、Ａｒ、Ｘ、Ｒ４及びｎは、請求項１〜５のいずれか１項に記載の定義と同一である、方法。
【請求項８】
対象における特定の症状のリスクの測定、該症状の素因の検出、又は該症状の存在の検出をする方法であって、
少なくとも１つの請求項２〜５のいずれか１項に記載のコンジュゲートを用いて前記症状に係る特定の標的分子を検出することを含む、方法。
【請求項９】
組織切片において標的分子マップを決定する方法であって、
前記標的分子を結合するのに適する少なくとも１つの請求項２〜５のいずれか１項に記載のコンジュゲートと前記組織切片とをハイブリダイズするステップ（ａ）と、
マトリクスをスプレーするステップ（ｂ）と、
前記組織切片表面をスキャンし、ＭＡＬＤＩ質量分析法を用いて隣接するスポットをそれぞれ分析し、この分析において、ＭＡＬＤＩレーザは、好ましくはＴａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−（Ｒ４−Ｏ）ｎ−Ｈ化合物を放出するために、及び前記サンプルのイオン化を誘導するために用いられ、その後、前記分析により得られた各スポットのデータが保存されるステップ（ｃ）と、
それぞれ別個のＴａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−（Ｒ４−Ｏ）ｎ−Ｈ化合物の分子質量ウインドウにおいて得られたデータを分析して、調査対象である別個の標的分子の数と同一の組織切片のマップを作製するステップ（ｄ）とを含む、方法。
【請求項１０】
免疫センシングアッセイにおいてサンプル中の少なくとも１つの標的分子を検出する方法であって、
前記少なくとも１つの標的分子を結合できる少なくとも１つの化合物が付けられた固体基質と前記サンプルとを、該サンプル中に前記化合物が存在するならば前記化合物が前記標的分子に結合できる条件下で接触させるステップ（ａ）と、
前記固体基質から非結合性の前記サンプルを除去するステップ（ｂ）と、
ステップ（ａ）で得られた固体基質と、少なくとも１つの請求項２〜５のいずれか１項に記載のコンジュゲートとを、前記標的分子が前記固体基質上に存在するならば該コンジュゲートが前記標的分子に結合できる条件下で接触させるステップ（ｃ）と、
非結合性の前記コンジュゲートを除去するステップ（ｄ）と、
ステップ（ｃ）で得られた前記サンプルに刺激を与えて前記コンジュゲートを活性化させるステップ（ｅ）と、
適切な分析技術、好ましくはＭＡＬＤＩ質量分析法によりＴａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−（Ｒ４−Ｏ）ｎ−Ｈ化合物の放出を検出するステップ（ｆ）と、を備え、
前記Ｔａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−（Ｒ４−Ｏ）ｎ−Ｈ化合物の存在は、前記サンプル中における対応する標的分子の存在を示す、方法。
【請求項１１】
前記標的分子のそれぞれの検出のために、
前記ステップ（ａ）の固体基質に付けられた標的分子を結合可能な少なくとも１つの化合物と、
前記標的分子を結合できる化合物と共に前記標的分子に結合する請求項２〜５のいずれか１項に記載の少なくとも１つのコンジュゲートと、が用いられ、
少なくとも１つのコンジュゲートの前記タグは、他の標的分子を結合するコンジュゲートのタグとは異なる検出信号、特に質量を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
免疫センシングアッセイにおいてサンプル中の少なくとも１つの標的分子を検出する方法であって、
前記標的分子に結合する固体基質と前記サンプルとを、前記サンプル中に前記標的分子が存在するならば前記固体基質が前記標的分子に結合できる条件下で接触させるステップ（ａ）と、
前記固体基質から非結合性サンプルを除去するステップ（ｂ）と、
前記固体基質と共に前記標的分子に結合する請求項２〜５のいずれか１項に記載の少なくとも１つのコンジュゲートとステップ（ａ）で得られた前記固体基質とを、該固体基質上に前記標的分子が存在するならば前記コンジュゲートが前記標的分子に結合できる条件下で接触させるステップ（ｃ）と、
非結合性の前記コンジュゲートを除去するステップ（ｄ）と、
ステップ（ｄ）で得られた前記サンプルに刺激を与えて前記コンジュゲートを活性化させるステップ（ｅ）と、
適切な分析技術、好ましくはＭＡＬＤＩ質量分析法によりＴａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−（Ｒ４−Ｏ）ｎ−Ｈ化合物の放出を検出するステップ（ｆ）と、を備え、
前記Ｔａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−（Ｒ４−Ｏ）ｎ−Ｈ化合物の存在は、前記サンプル中における対応する標的分子の存在を示す、方法。
【請求項１３】
前記ステップ（ａ）の固体基質は、複数の標的分子に結合し、
前記標的分子のそれぞれに対して、前記固体基質と共に前記標的分子のいずれかに結合する請求項２〜５のいずれか１項に記載の少なくとも１つのコンジュゲートが用いられ、前記少なくとも１つのコンジュゲートの前記タグは、他の標的分子を結合するコンジュゲートのタグとは異なる検出信号、特に異なる質量を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）固体基質と、
（ｂ）前記固体基質に結合された、少なくとも１つの標的分子に結合可能な化合物と、
（ｃ）前記化合物に結合された標的分子と、
（ｄ）前記化合物と共に前記標的分子に結合する請求項２〜５のいずれか１項に記載のコンジュゲートと、を備えた組成物。
【請求項１５】
サンプル中における標的分子を検出するためのキットであって、
（ａ）固体基質と、
（ｂ）前記固体基質に付けるための標的分子を結合可能な化合物と、
（ｃ）前記化合物と共に前記標的分子を結合する請求項２〜５のいずれか１項に記載のコンジュゲートと、
（ｄ）前記サンプル中における前記標的分子を検出するために前記キットを使用するための説明書と、を備えたキット。
【請求項１６】
サンプル中における標的分子を検出するためのキットであって、
（ａ）前記標的分子を結合できる化合物が付けられた固体基質と、
（ｂ）前記標的分子に結合する請求項２〜５のいずれか１項に記載のコンジュゲートと、
（ｃ）前記サンプル中における前記標的分子を検出するために前記キットを使用するための説明書と、を備えたキット。
【請求項１７】
サンプル中における標的分子を検出するためのキットであって、
（ａ）前記標的分子と結合する固体基質と、
（ｂ）前記標的分子と結合する請求項２〜５のいずれか１項に記載のコンジュゲートと、
（ｃ）前記サンプル中における前記標的分子を検出するために前記キットを使用するための説明書とを、備えたキット。
【請求項１８】
サンプル中における少なくとも１つの標的分子を検出するためのキットであって、
（ａ）固体基質と、
（ｂ）前記固体基質に付けるための標的分子を結合可能な複数の化合物と、
（ｃ）請求項２〜５のいずれか１項に記載の複数のコンジュゲートと、
（ｄ）前記サンプル中における少なくとも１つの標的分子を検出するために前記キットを使用するための説明書と、を備え、
前記標的分子のそれぞれに対して、前記化合物と共に前記標的分子のいずれかに結合する少なくとも１つのコンジュゲートが用いられ、
前記コンジュゲートのそれぞれのタグは、他の標的分子と結合するコンジュゲートのタグとは異なる検出信号、特に異なる質量を有する、キット。
【請求項１９】
サンプル中における少なくとも１つの標的分子を検出するためのキットであって、
（ａ）前記標的分子に結合可能な複数の化合物が付けられている固体基質と、
（ｂ）請求項２〜５のいずれか１項に記載の複数のコンジュゲートと、
（ｃ）前記サンプル中における少なくとも１つの標的分子を検出するために前記キットを使用するための説明書と、を備え、
前記標的分子のそれぞれに対して、該標的分子のいずれかに結合する少なくとも１つの化合が用いられ、
前記標的分子のそれぞれに対して、前記化合物と共に該標的分子のいずれかに結合する少なくとも１つのコンジュゲートが用いられ、
前記コンジュゲートのそれぞれのタグは、他の標的分子と結合するコンジュゲートのタグとは異なる検出信号、特に異なる質量を有する、キット。
【請求項２０】
サンプル中における少なくとも１つの標的分子を検出するためのキットであって、
（ａ）前記標的分子のそれぞれに結合する固体基質と、
（ｂ）請求項２〜５のいずれか１項に記載の複数のコンジュゲートと、
（ｃ）前記サンプル中における少なくとも１つの標的分子を検出するために前記キットを使用するための説明書と、を備え、
前記標的分子のそれぞれに対して、該標的分子のいずれかに結合する少なくとも１つのコンジュゲートが用いられ、
前記コンジュゲートのそれぞれのタグは、他の標的分子と結合するコンジュゲートのタグとは異なる検出信号、特に異なる質量を有する、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好ましくは質量分析によるサンプルにおける目的の分子の検出の分野に関する。本発明は、ラベル化合物、該化合物でラベルされた分子（コンジュゲート）、該コンジュゲートを含むサンプルにおける目的の分子（標的分子）の検出の方法、該方法を実施するためのキット、及び前記ラベルの調製のためのプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
サンプル、例えば生物学的サンプルにおける分子の検出は、特に分析及び医学分野において非常に大きい関心ごとである。サンプルにおける分子の存在を検出するための種々の方法が既に開発されている。いくつかの方法は、分子をタグにより標識し、適切な技術で前記タグの放出を検出することを含む。例えば、タグの放出は、測色、蛍光分析及び／又は質量分析により検出され得る。タグの放出は、生化学的プロセス、化学的活性化又は特定の波長での照射等の種々の活性化型又は刺激により引き起こされ得る。
【０００３】
これに関して、種々の方法が、以下の結合を可能とするために開発されてきた。
−目的の分子に結合する、特に特異的に結合する成分、
−少なくとも１つの刺激により活性化され得る、例えば少なくとも１つの刺激により切断され得る又は反応し得る自壊トリガー成分、
−トリガー分子が適切な刺激を受けるときに媒体に放出されるタグ成分。
【０００４】
２つの主の方法は、図２２からわかる。第１の方法において、タグ及びトリガー成分は同一である。刺激は、トリガーを活性化すると同時にタグを放出する。第２の方法において、トリガー成分は、タグ成分と目的の分子を結合可能な成分との間に配置される。刺激によるトリガーの活性化は、トリガー分子のレベルで化合物の分裂を引き起こし、次に、タグ成分の放出を起こす。上記方法は、化合物に結合された分子を検出するために、刺激が適用された後にタグを放出及び検出することの可能性を与える。化合物、特にトリガー成分の化学的構造は、それを活性化するのに用いる刺激の型に依存する。その結果、一トリガーは、刺激の一特定の型に適する。タグの放出のための種々の刺激の使用を可能とするために、トリガー成分の修飾は、全体として（トリガーのみならずリンカー及びタグ）化合物の変更を引き起こす重要な化学修飾を必要とする。
【０００５】
出願人は、今般、化合物の３つの成分（目的の分子を結合できる成分、トリガー及びタグ）を結合するための新規の方法を開発した。この方法において、トリガー成分は、化合物の側鎖に挿入される。当該方法は、化合物、特にタグの残部に独立してトリガー成分の性質及び／又は構造を容易に修飾する可能性を提供する。得られる化合物は、種々の刺激に容易に適合され得る。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の第１の対象は、以下の化学式のラベル化合物（ラベル）であり：
2016510413.tif 000002
上記化学式中、
−タグ（Ｔａｇ）及びトリガー（Ｔｒｉｇｇｅｒ）成分は以下のように定義され、
−ｎは０又は１であり、
−Ａｒは芳香族基であり、
−Ｒは水素原子、並びに、任意に酸素Ｏ、窒素Ｎ及び硫黄Ｓ原子からなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子が組み込まれ、任意にヒドロキシ基、アルコキシ基、ＮＨ２アミノ基、ＮＯ２ニトロ基、ＣＯＯＨカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基により置換された飽和又は不飽和である直鎖又は分枝鎖アルキル基からなる群から選択され、
−Ｒ１は水素原子であり、Ｒ２は水素原子、及び任意にフェニル基で置換されたＣ１−Ｃ４アルキル基からなる群から選択され、代替的に、Ｒ１及びＲ２は窒素原子及び炭素原子と共にそれぞれ結合して５員環を形成し、特に−Ｒ１−Ｒ２−は−（ＣＨ２）３−基となり得て、
−Ｒ３は結合分子に結合可能、好ましくは共有結合可能な化学基であり、好ましくは、Ｒ３は化学式−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ２−ＦＧであり、該式においてｍは０、１、２又は３であり、ＦＧは結合分子の化学基と反応可能な官能基であり、
−Ｒ４はＣ１−Ｃ４アルキル基であり、
−Ｘは酸素Ｏ、ＮＨ及び硫黄Ｓからなる群から選択される。
【０００７】
好ましくは、ＦＧは、アミノ基（ＮＨ２）、カルボキシル基（ＣＯＯＨ）、エステル、ハロゲン化アシル基、塩化アシル基（ＣＯＣｌ）、無水物基及びその活性化又は保護化誘導体等の誘導体からなる群から選択される。第１の実施形態において、ＦＧはアミノ基であり、例えばＮ−スクシンイミジルカルバメート（ＮＳＣ）に変換し、結合分子のアミノ基と反応することにより、尿素リンカーを介して結合分子に結合し得る。第２の実施形態において、ＦＧは活性化エステルであり、例えば分子のアミノ基と反応することにより、アミドリンカーを介して結合分子に結合し得る。第３の実施形態において、ＦＧはカルボキシル基（ＣＯＯＨ）、エステル、塩化アシル基（ＣＯＣｌ）等のハロゲン化アシル基又は無水物基であり、例えばＮ−スクシンイミジルカルボキシルエステルに変換し、分子のアミノ基と反応することにより、アルキルジアミドリンカーを介して結合分子に結合し得る。アルキルジアミドリンカーは、以下の化学式のリンカーであり、
2016510413.tif 000003
上記化学式において、Ａはアルキル基であり、ジグザグ形に分断されている結合は、ラベル及び結合分子へのリンカーに結合する結合である。
【０００８】
化学的官能基の活性化誘導体は、良い脱離基である前記官能基の誘導体である。例えば、活性化エステルは、ヒドロキシスクシンイミド又はヒドロキシベンゾトリアゾールとカルボン酸との反応により生成され得る。化学的官能基の保護化誘導体は、保護基を含む前記官能基の誘導体である。
【０００９】
アミノ官能基の保護基は、２−トリメチルシリルエチルカルバメート（Ｔｅｏｃ）、１−（１−アダマンチル）−１−メチルエチルカルバメート（Ａｄｐｏｃ）、１−メチル−１−（４−ビフェニル）エチルカルバメート（Ｂｐｏｃ）、tert-ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、１−（３，５−ジ−ｔ−ブチルフェニル）−１−メチルエチルカルバメート（ｔ−Ｂｕｍｅｏｃ）、１−アダマンチルカルバメート（Ａｄｏｃ）、ｐ−メトキシベンジルカルバメート（ＭｅＯＺ）、９−アンスリルメチルカルバメート、ジフェニルメチルカルバメート、９−フルオレニルメチルカルバメート（Ｆｍｏｃ）、９−（２−スルホ）フルオロエニルメチルカルバメート、９−（２，７−ジブロモ）フルオレニルメチルカルバメート、２，７−ジ−ｔ−ブチル−［９−（１０，１０−ジオキソ−１０，１０，１０，１０−テトラヒドロチオキサンチル）］メチルカルバメート（ＤＢＤ−Ｔｍｏｃ）、２−（Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボキサミド）エチルカルバメート、２−ホスホニオエチルカルバメート（Ｐｅｏｃ）、２−フェニルエチルカルバメート、ベンジルカルバメート（Ｃｂｚ）、アリルカルバメート（Ａｌｌｏｃ）、１−イソプロピルアリルカルバメート（Ｉｐａｏｃ）、４−ニトロシンナミルカルバメート（Ｎｏｃ）等のカルバメート、８−キノリルカルバメート、アセチル（Ａｃ）基、ベンゾイル（Ｂｚ）基、ベンジル（Ｂｎ）基、ｐ−メトキシベンジル（ＰＭＢ）基、３，４−ジメトキシベンジル（ＤＭＰＭ）基、ｐ−メトキシフェニル（ＰＭＰ）基、Ｎ−フタルイミド基、及びトシル（Ｔｓ）基が挙げられ得る。
【００１０】
カルボキシル官能基の保護基としては、メチルエステル、ベンジルエステル、tert-ブチルエステル、シリルエステル、オルトエステル及びオキサゾリンが挙げられ得る。
【００１１】
当業者は、ラベル及び結合分子の構造に依存して、適切な官能基の活性化及び／又は保護化誘導体を選択できる。
【００１２】
構造（Ｉ）における卵形の点線内の原子は、ジペプチド成分を生成する。
【００１３】
本発明において、目的の分子（又は標的分子）の「検出」は、その存在の検出、及び／又はサンプル中の目的の分子の（絶対又は相対）量の定量化を意味する。好ましくは、分子の「検出」は、サンプル中の分子の量の定量化を含む。本発明において、「刺激」は、光化学的ストレス、化学的反応、及び／又は生化学的プロセス等のトリガーを活性化するのに適する事象を意味する。例えば、刺激は、照射又は酵素による分解であってもよい。
【００１４】
本発明において、「アルキル」基は、１〜８つの炭素原子を含む（Ｃ１−Ｃ８）飽和型又は不飽和型、好ましくは飽和型の直鎖又は分枝鎖炭化水素基を意味する。好ましくは、アルキル基は、１〜４つの炭素原子を含む（Ｃ１−Ｃ４アルキル）。Ｃ１−Ｃ４アルキル基は、特にメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル又はtert-ブチル基であってもよい。特定の実施形態において、ｎは１であり、Ｒ４はエチル、プロピル及びブチル基から選択される。本発明において、アルキル基は、置換されていないことが好ましい。一実施形態において、アルキル基は、フェニル基により置換され得る。特に、アルキル基は、ベンジル基（Ｂｎ）であってもよい。「アルコキシ」基は、酸素Ｏ原子を介して分子の残部に結合される上記のようなアルキル基を意味する。
【００１５】
「芳香族」基は、任意に酸素Ｏ、窒素Ｎ又は硫黄Ｓ等の少なくとも１つのヘテロ原子、好ましくは一つの酸素原子が挿入された炭化水素の芳香環を含む炭化水素基を意味する。芳香環は、単環又は多環であってもよく、例えばフェニル、ナフタレニル、アントラセニル又はベンゾピラニル基であってもよい。Ａｒは、例えば４−ヒドロキシ安息香酸若しくは４−ヒドロキシけい皮酸といったフェノール誘導体、又は、例えば７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸、７−ヒドロキシ−４−メチル−３−クマリニル酢酸若しくは７−ヒドロキシクマリニル−４−酢酸といった７−ヒドロキシクマリン誘導体から生成され得る。従って、Ｘ−Ａｒ−Ｃ（＝Ｏ）成分は、
2016510413.tif 000004
から選択され得る。
【００１６】
本発明のラベルは、以下に説明するようなラベル化分子（又はコンジュゲート）を生成するために、Ｒ３成分を介して結合分子と結合、特に共有結合するのに適切なものである。一実施形態において、結合分子は、複数の、例えば２、３又はそれ以上のラベルに同時に結合する。
【００１７】
結合分子は、分子のアミノ成分、特にリジンのアミノ側鎖を介してラベルに結合されることが好ましい。代替的に、分子は、結合分子のヒドロキシルＯＨ又はチオールＳＨ成分等の非アミノ成分を介してコンジュゲートに結合され得る。
【００１８】
トリガー成分の側位は、その化学的構造を、好ましくはラベル構造の残部、特にタグ成分に影響を与えることなく容易に修飾できるようにし、従って、タグ成分を放出することに関する刺激を容易に変更できるようにする。
【００１９】
本発明において、ラベルのトリガーの活性化、及びトリガーとトリガー成分がラベルの残部に結合される際に介するＮＲ基との間の切断は、タグ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−（Ｒ４−Ｏ）ｎ−Ｈ化合物の放出で終わる、ジペプチド成分の分子内環化をジケトピペラジン内に誘導する。
【００２０】
本発明の他の対象は、本発明に係るラベルの調製のためのプロセスである。
【００２１】
本発明の他の対象は、本発明に係るラベルでラベル化された分子、及びそのコンジュゲートを調製する方法である。
【００２２】
本発明の他の対象は、本発明に係るコンジュゲートを用いたサンプル中の目的の標的分子の検出方法である。
【００２３】
本発明の他の対象は、少なくとも１つの本発明に係るコンジュゲートを用いた特定の症状の特定標的分子を検出することを含む、対象における該症状のリスクを測定する、該症状の素因を検出する又は該症状の存在を検出する方法である。
【００２４】
本発明の他の対象は、少なくとも１つの本発明に係るラベル又はコンジュゲートの使用を含む、標的分子マップの決定のための方法である。
【００２５】
本発明の他の対象は、少なくとも１つの本発明に係るラベル又はコンジュゲートの使用を含む、免疫センシングアッセイにおいてサンプル中の少なくとも１つの標的分子を検出する方法である。
【００２６】
本発明の他の対象は、固体基質を含む組成物、該固体基質に結合され、少なくとも１つの標的分子に結合可能な化合物、該化合物に結合された標的分子、及び該化合物と共に該標的分子に結合する本発明のコンジュゲートである。
【００２７】
本発明の他の対象は、サンプル中における少なくとも１つの標的分子を検出するためのキットである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、化合物５の特徴を示す。ａ）は、MALDI-TOFスペクトル−MALDI-TOFマトリクスを示す：ＣＨＣＡ−C70H97N19O20[M+H]+ 計算値1524.7、測定値1524.8 ; [M+Na]+ 計算値1546.7, 測定値1546.8。ｂ）は、RP-HPLC分析,RT=20.9 minを示す。Buffer A H2O-0.05%TFA / Buffer B 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1) カラム C18 Nucleosil 100 A 5 μm (2.1x250 mm)、３０分で線形勾配 0-100%B (1.0 mL/min, 210〜400 nmで検出)。
【図２】図２は、化合物６の特徴を示す。ａ）は、MALDI-TOFスペクトル−MALDI-TOFマトリクスを示す：CHCA-C65H89N19O18 [M+H]+ 計算値1424.7, 測定値1424.8; [M+H-O]+ 計算値1408.7, 測定値1408.8。ｂ）は、RP-HPLC分析, RT=16.1 minを示す。Buffer A H2O-0.05%TFA / Buffer B 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1) カラム C18 Nucleosil 100 A 5 μm (2.1x250 mm)、３０分で線形勾配 0-100%B (1.0 mL/min, 210〜400 nmで検出)。
【図３】図３は、化合物７の特徴を示す。ａ）は、MALDI-TOFスペクトル−MALDI-TOFマトリクスを示す：CHCA-C70H92N20O22 [M+H-NHS]+計算値1450.7, 測定値1450.6。ｂ）は、RP-HPLC分析、RT=18.8minを示す。Buffer A H2O-0.05%TFA / Buffer B 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1) カラム C18 Nucleosil 100 A 5 μm (2.1x250 mm)、３０分で線形勾配 0-100%B (1.0 mL/min, 210〜400 nmで検出)。
【図４】図４は、化合物８の特徴を示す。ａ）は、MALDI-TOFスペクトル−MALDI-TOFマトリクスを示す：3,5-ジメトキシ-4-ヒドロキシけい皮酸。ｂ）は、RP-HPLC分析を示し、ラベルされたリゾチーム、RT=16.9minである。BufferA H2O-0.05% TFA / Buffer B 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1) カラム C18 Nucleosil 100 A 5 μm(2.1x250 mm)、３０分で線形勾配0-100% B (1.0 mL/min, 210〜400 nmで検出)。
【図５】図５は、化合物８ａの特徴を示す。ａ）は、MALDI-TOFスペクトル−MALDI-TOFマトリクスを示す：3,5-ジメトキシ-4-ヒドロキシけい皮酸。ｂ）は、RP-HPLC分析を示し、リゾチームRT=16.6 min、ラベルされたリゾチームRT=16.9 minである。Buffer A H2O-0.05% TFA / Buffer B 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1) カラム C18 Nucleosil 100 A 5 μm(2.1x250 mm)、３０分で線形勾配0-100%B (1.0 mL/min, 210〜400 nmで検出)。
【図６】図６は、化合物１ａ及び９の特徴を示す。ａ）は、物質９のＥＳＩ分析を示す(RT= 14.4 min)‐C16H27N3O4[M+H-Boc]+ 計算値226.2, 測定値226.2、[M+Na]+ 計算値348.2, 測定値348.3。ｂ）はRP-HPLC分析を示し、１ａはRT=11.7minであり、９はRT=14.4 minである。Buffer A H2O-0.05% TFA / BufferB 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1) カラム C18 Nucleosil 100 A 5 μm (2.1x250 mm)、３０分で線形勾配0-100% B (1.0 mL/min, 210〜400 nmで検出)。ｃ）はタグペプチド１ａのMALDI-TOFマトリクスを示す：CHCA -C44H61N15O12[M+H]+ 計算値992.5, 測定値992.1、[M+Na]+ 計算値1014.4, 測定値1013.9。ｄ）はペプチド１ａのＥＳＩ分析を示す(RT=11.7 min)。C44H61N15O12[M+H]+ 計算値992.5、測定値992.7。
【図７】図７は、化合物１ａ及び１０の特徴を示す。ａ）はタグペプチド１ａのMALDI-TOF −MALDI-TOFマトリクスを示す：3,5-ジメトキシ-4-ヒドロキシけい皮酸。ｂ）は、RP-HPLC分析を示し、１ａのRT=11.7 minであり、１０の RT=17.1 minである。BufferA H2O-0.05% TFA / Buffer B 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1)、 カラム C18 Nucleosil 100 A 5 μm(2.1x250 mm)、３０分で線形勾配0-100%B (1.0 mL/min, 210〜400 nmで検出)。
【図８】図８は、化合物１６ａの特徴を示す。ａ）はMALDI-TOFスペクトル −MALDI-TOFマトリクスを示す：CHCA -C72H101N19O21[M+H]+ 計算値1568.7, 測定値1568.9。ｂ）はRP-HPLC分析、RT=19.2 minを示す。Buffer A H2O-0.05%TFA / Buffer B 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1) カラム C18 Nucleosil 100 A 5 μm (2.1x250 mm)、３０分で線形勾配0-100%B (1.0 mL/min, 210〜400 nmで検出)。ｃ）はＥＳＩスペクトルを示す、[M+2H]+/2計算値784.8,測定値785.5, [M+H]+ 計算値1568.7, 測定値1569.5。
【図９】図９は、化合物１６ｂの特徴を示す。ａ）はMALDI-TOFスペクトル −MALDI-TOFマトリクスを示す：CHCA -C73H103N19O21[M+H]+ 計算値1582.8, 測定値1582.8。ｂ）はRP-HPLC分析、RT=19.6 minを示す。Buffer A H2O-0.05%TFA / Buffer B 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1) カラム C18 Nucleosil 100 A 5 μm (2.1x250 mm)、３０分で線形勾配0-100%B (1.0 mL/min, 210〜400 nmで検出)。ｃ）はＥＳＩスペクトルを示す、[M+2H]+/2計算値791.9,測定値792.5。
【図１０】図１０は、化合物１６ｃの特徴を示す。ａ）はMALDI-TOFスペクトル −MALDI-TOFマトリクスを示す：CHCA -C74H105N19O21[M+H]+ 計算値1596.8, 測定値1596.8。ｂ）はRP-HPLC分析、RT=20.0 minを示す。Buffer A H2O-0.05%TFA / Buffer B 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1) カラム C18 Nucleosil 100 A 5 μm (2.1x250 mm)、３０分で線形勾配0-100%B (1.0 mL/min, 210〜400 nmで検出)。ｃ）はＥＳＩスペクトルを示す、[M+2H]+/2計算値798.9,測定値799.5。
【図１１】図１１は、化合物１６ｄの特徴を示す。ａ）はMALDI-TOFスペクトル −MALDI-TOFマトリクスを示す：CHCA -C72H101N19O21[M+H]+ 計算値1568.7, 測定値1568.7。ｂ）はRP-HPLC分析、RT=19.2 minを示す。Buffer A H2O-0.05%TFA / Buffer B 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1) カラム C18 Nucleosil 100 A 5 μm (2.1x250 mm)、３０分で線形勾配0-100%B (1.0 mL/min, 210〜400 nmで検出)。ｃ）はＥＳＩスペクトルを示す、[M+2H]+/2計算値784.8,測定値785.5。
【図１２】図１２は、化合物１７の特徴を示す。ａ）はMALDI-TOFスペクトル −MALDI-TOFマトリクスを示す：CHCA - 計算値C67H93N19O19[M+H]+ 1468.7, 測定値1468.7。ｂ）はRP-HPLC分析、RT=14.4 minを示す。Buffer A H2O-0.05% TFA / Buffer B 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1) カラム C18 Nucleosil 100 A 5 μm (2.1x250 mm)、３０分で線形勾配0-100%B (1.0 mL/min, 210〜400 nmで検出)。ｃ）はＥＳＩスペクトルを示す、[M+2H]+/2計算値734.8,測定値735.4。
【図１３】図１１は、化合物１８の特徴を示す。ａ）はMALDI-TOFスペクトル −MALDI-TOFマトリクスを示す：CHCA -C68H91N19O20[M+H-NHS]+ 計算値1494.7, 測定値1494.7。ｂ）はRP-HPLC分析、RT=16.9 minを示す。Buffer A H2O-0.05%TFA / Buffer B 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1) カラム C18 Nucleosil 100 A 5 μm (2.1x250 mm)、３０分で線形勾配0-100%B (1.0 mL/min, 210〜400 nmで検出)。ｃ）はＥＳＩスペクトルを示す、C72H96N20O23[M+2H]+/2 計算値805.3, 測定値806.1。
【図１４】図１４は、化合物１９の特徴を示す。ａ）はMALDI-TOFスペクトル −MALDI-TOFマトリクスを示す：3,5-ジメトキシ-4-ヒドロキシけい皮酸。ｂ）は、RP-HPLC分析を示し、リゾチームはRT=16.6 minであり、ラベルされたリゾチームは RT=17.1 minである。Buffer A H2O-0.05% TFA / BufferB 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1)、カラム C18 Nucleosil 100 A 5 μm (2.1x250 mm)、３０分で線形勾配0-100%B (1.0 mL/min, 210〜400 nmで検出)。ｃ）は１９のＥＳＩスペクトルである。
【図１５】図１５は、化合物２０の特徴を示す。ａ）はMALDI-TOFスペクトル −MALDI-TOFマトリクスを示す：3,5-ジメトキシ-4-ヒドロキシけい皮酸。ｂ）は、RP-HPLC分析を示し、ラベルされたニュートラアビジンは 15.6 minである。Buffer A H2O-0.05% Formic Acid /Buffer B 0.05% Formic Acid CH3CN/水(4/1)、 カラム C3 Zorbax 300 SB, 3.5 μm(4.6x150 mm)、５０℃、３０分で線形勾配0-100%B (1.0 mL/min, 210〜400 nmで検出)。ｃ）は２０のＥＳＩスペクトルである。
【図１６】図１６は、化合物９ａ及び２１ａの特徴を示す。ａ）は２１ａのMALDI-TOFスペクトル −MALDI-TOFマトリクスを示す：CHCA - C46H65N15O13[M+H]+ 計算値1036.5, 測定値1035.8。ｂ）は、RP-HPLC分析を示し、２１ａはRT=10.3 minであり、９ａはRT= 12.3 minである。Buffer A H2O-0.05% TFA / Buffer B 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1)、 カラム C18 Nucleosil 100 A 5 μm(2.1x250 mm)、３０分で線形勾配0-100%B (1.0 mL/min, 210〜400 nmで検出)。ｃ）は９ａのＥＳＩスペクトルを示し、C16H27N3O4 [M+Na]+計算値348.2, 測定値348.3; [M+H-Boc]+ 計算値226.1, 測定値226.3である。ｄ）は２１ａのＥＳＩスペクトルを示し、C46H65N15O13[M+H]+ 計算値1036.5, 測定値1037.1 ; [M+2H]+/2 計算値518.7, 測定値519.2である。
【図１７】図１７は、化合物９ａ及び２１ｂの特徴を示す。ａ）は２１ｂのMALDI-TOFスペクトル −MALDI-TOFマトリクスを示す：CHCA - C47H67N15O13[M+H]+ 計算値1050.5, 測定値1050.5。ｂ）は、RP-HPLC分析を示し、２１ｂはRT=11.0 minであり、９ａはRT= 12.3 minである。Buffer A H2O-0.05% TFA / Buffer B 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1)、 カラム C18 Nucleosil 100 A 5 μm (2.1x250mm)、３０分で線形勾配0-100%B (1.0 mL/min, 210〜400 nmで検出)。ｃ）は９ａのＥＳＩスペクトルを示し、C16H27N3O4 [M+Na]+計算値348.2, 測定値348.3; [M+H-Boc]+ 計算値226.1, 測定値226.2である。ｄ）は２１ｂのＥＳＩスペクトルを示し、C47H67N15O13[M+H]+ 計算値1050.5, 測定値1051.0 ; [M+2H]+/2 計算値525.7, 測定値526.0である。
【図１８】図１８は、化合物９ａ及び２１ｃの特徴を示す。ａ）は２１ｃのMALDI-TOFスペクトル −MALDI-TOFマトリクスを示す：CHCA - C48H69N15O13[M+H]+ 計算値1064.5, 測定値1064.4。ｂ）は、RP-HPLC分析を示し、２１ｃはRT=11.2 minであり、９ａはRT= 12.3 minである。Buffer A H2O-0.05% TFA / Buffer B 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1)、 カラム C18 Nucleosil 100 A 5 μm(2.1x250 mm)、３０分で線形勾配0-100%B (1.0 mL/min, 210〜400 nmで検出)。ｃ）は９ａのＥＳＩスペクトルを示し、C16H27N3O4 [M+Na]+計算値348.2, 測定値348.3; [M+H-Boc]+ 計算値226.1, 測定値226.2である。ｄ）は２１ｃのＥＳＩスペクトルを示し、C48H69N15O13[M+H]+ 計算値1064.5, 測定値1065.0 ; [M+2H]+/2 計算値532.7, 測定値533.1である。
【図１９】図１９は、化合物９ｂ及び２１ａの特徴を示す。ａ）は２１ａのMALDI-TOFスペクトル −MALDI-TOFマトリクスを示す：CHCA - C46H65N15O13[M+H]+ 計算値1036.5, 測定値1035.8。ｂ）は、RP-HPLC分析を示し、２１ａはRT=10.1 minであり、９ｂはRT= 12.1 minである。Buffer A H2O-0.05% TFA / Buffer B 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1)、 カラム C18 Nucleosil 100 A 5 μm(2.1x250 mm)、３０分で線形勾配0-100%B (1.0 mL/min, 210〜400 nmで検出)。ｃ）は９ｂのＥＳＩスペクトルを示し、C16H27N3O4 [M+Na]+計算値348.2, 測定値348.3; [M+H-Boc]+ 計算値226.1, 測定値226.2である。ｄ）は２１ａのＥＳＩスペクトルを示し、C46H65N15O13[M+H]+ 計算値1036.5, 測定値1037.0 ; [M+2H]+/2 計算値518.7, 測定値519.0である。
【図２０】図２０は、化合物１０及び２１ａの特徴を示す。ａ）は１０のMALDI-TOFスペクトル −MALDI-TOFマトリクスを示す：ＤＨＢ。ｂ）は２１ａのMALDI-TOFスペクトル −MALDI-TOFマトリクスを示す：CHCA - C46H65N15O13[M+H]+ 計算値1036.5, 測定値1035.8。ｃ）は、RP-HPLC分析を示し、２１ａはRT=10.3 minであり、１０はRT= 16.0 minである。Buffer A H2O-0.05% TFA / Buffer B 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1)、 カラム C18 Nucleosil 100 A 5 μm(2.1x250 mm)、３０分で線形勾配0-100%B (1.0 mL/min, 210〜400 nmで検出)。ｄ）は１０のＥＳＩスペクトルを示す。ｅ）は２１ａのＥＳＩスペクトルを示し、C46H65N15O13[M+H]+ 計算値1036.5, 測定値1037.1 ; [M+2H]+/2 計算値518.7, 測定値519.2である。
【図２１】図２１は、化合物２２及び２１ａの特徴を示す。ａ）は１０のMALDI-TOFスペクトル −MALDI-TOFマトリクスを示す：ＤＨＢ。ｂ）は２１ａのMALDI-TOFスペクトル −MALDI-TOFマトリクスを示す：CHCA - C46H65N15O13[M+H]+ 計算値1036.5, 測定値1035.8。ｃ）は、RP-HPLC分析を示し、２１ａはRT=10.1 minであり、２２はRT= 19.5 minである。Buffer A H2O-0.05% TFA / Buffer B 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1)、 カラム C3 Zorbax 300 SB, 3.5 μm(4.6x150 mm)、５０℃、３０分で線形勾配0-100%B (1.0 mL/min, 210〜400 nmで検出)。ｄ）は２１ａのＥＳＩスペクトルを示し、C46H65N15O13 [M+H]+計算値1036.5, 測定値1037.1; [M+2H]+/2 計算値518.7, 測定値519.2である。
【図２２】図２２は、従来の結合分子のラベル化のための方法を示す図である。
【図２３】図２３は、化合物５、１６ａ、１６ｂ、１６ｃ及び１６ｄのタグ放出速度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
（ラベルの構成の説明）
トリガー成分は、刺激を受けた際に切断される化学基である。刺激は、例えば光化学的ストレス、化学反応（酸、塩基又は金属）、又は生化学的プロセスであってもよい。特に、トリガーは、適切な刺激が光照射の場合、光分解性成分であってもよく、本発明で用いられる光分解成分は、３’−ニトロフェニルプロピルオキシカルボニル（ＮＰＰＯＣ）
2016510413.tif 000005
及び、２−ニトロベンジル基
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であってもよい。当該基は、保護基のＣ＝Ｏの炭素原子とアミン基との間の結合を介してアミンの保護基として用いられ得る。当該保護基は、ジペプチドのＮ末端に導入されることが好ましい。Ｒａは、水素原子、及びメトキシ基等のアルコキシ基からなる群から選択される。Ｒｂは、塩素原子等のハロゲン原子、ヒドロキシ基、メトキシ基等のアルコキシ基、アミノ基（ＮＨ２）及びピペラジン、
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からなる群から選択される。ＮＰＰＯＣトリガーは、約３６５ｎｍの波長で光分解され得る。２−ニトロベンジルトリガーは、Ｒａ及びＲｂ置換基に依存して、約２７０〜約３７０ｎｍの波長で光分解され得る。刺激によるトリガー成分の活性化は、中間体、一級（ＲがＨの場合）又は二級アミンを生じる。該アミンは、求核性であることが好ましい。該アミンは、ジケトピペラジン基に至る分子内環化、及びＴａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−（Ｒ４−Ｏ）ｎ−Ｈ化合物の放出を進める。本発明において、「約」の用語は示した値の±１０％の範囲を意味する。
【００３０】
タグは、コンジュゲートからの放出後、任意に該タグを含む化合物の形態で、分析技術により同定及び／又は検出される感受性原子団である。トリガーの活性化及びジケトピペラジンの分子内環化後に放出される化合物は、好ましくはＴａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−（Ｒ４−Ｏ）ｎ−Ｈである。
【００３１】
例えば、タグは、ペプチド、蛍光及び／若しくは燐光剤でマークされた分子、脂質、タンパク質、薬剤、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ等の核酸、金属化合物、又はリガンドであってもよい。
【００３２】
タグの検出又は該タグを含む化合物の検出は、例えばスキャナ、ラマン分光計、質量分析計、共焦点分析計、紫外線（ＵＶ）若しくは赤外線（ＩＲ）分光計、ＮＭＲ（核磁気共鳴）分析計、液体若しくはガスクロマトグラフィ、又はキャピラリー電気泳動による技術によって果たされ得る。好ましくは、タグは質量が既知のタグである。質量が既知のタグ又はコンジュゲートから放出された該タグを含む化合物は、質量分析法、特にＭＡＬＤＩ（マトリクス支援レーザ脱離イオン化法）若しくはＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）質量分析法、又は液体クロマトグラフィーにより検出され得る。
【００３３】
特定の実施形態において、タグは、既知の質量のペプチド、特に配列番号１Gly-Arg-Aa-Phe-Arg-Gly-Aa-Glyの配列のペプチドである。Ｇｌｙはグリシン（Ｇ）であり、Ａｒｇはアルギニン（Ｒ）であり、Ｐｈｅはフェニルアラニン（Ｆ）である。前記ペプチド成分のＣ末端基は一級アミドであることが好ましい。主鎖を完成させるアミノ酸Ａａは、互いに独立して、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）及びプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）からなる群から選択される。この配列内の３つのグリシンは、独立して、分析の際に同位体滴定が可能な例えば２，２−ｄ２グリシンである重水素ラベル化グリシンに置換され得る。この特定の実施形態のＴａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−（Ｒ４−Ｏ）ｎ−Ｈ化合物の質量は既知であり、８００〜３０００Ｄａ、好ましくは８００〜１５００Ｄａである。
【００３４】
ジペプチドは、第１のアミノ酸及び第２のアミノ酸の２つのアミノ酸からなる。第１のアミノ酸は、天然若しくは非天然アミノ酸、又はその誘導体であってもよい。第１のアミノ酸は、バイオ分子と結合、特に特異的結合が可能な調整可能側鎖（Ｒ３）であることが好ましい。第１のアミノ酸は、リジン（ｍ＝３）等のアミノ基（ＮＨ２）を有する側鎖を含む天然アミノ酸であることが好ましい。アスパラギン酸（Ａｓｐ）又はグルタミン酸（Ｇｌｕ）の側鎖から生じる酸機能の変換は、バイオ分子誘導体を許容し得る。２，３−ジアミノプロピオン酸（ｍ＝０）又は２，３−ジアミノブチル酸（ｍ＝１）等の非天然アミノ酸も考えられ得る。第２のアミノ酸は、グリシン（Ｇｌｙ、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ）、アラニン（Ａｌａ、Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝Ｍｅ）、バリン（Ｖａｌ、Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝ｉ‐Ｐｒ）、ロイシン（Ｌｅｕ，Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝ｉ−Ｂｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝ｓ−Ｂｕ）又はプロリン（Ｐｒｏ、Ｒ１＝Ｒ２＝−（ＣＨ２）３−）等の天然疎水性脂肪族アミノ酸、及びフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝Ｂｎ）等の芳香族アミノ酸から選択される。
【００３５】
トリガー成分の切断において、ジペプチドの遊離第１又は第２のＮＨＲ末端は、Ｘが酸素原子の場合はエステル基等であるＣ（＝Ｏ）Ｘ官能基と反応し、分子内環化、ジケトピペラジンの生成及びＴａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−（Ｒ４−Ｏ）ｎ−Ｈ化合物の放出を引き起こす。以下のスキームは、ｎ＝０及びＲ＝Ｈの場合の環化を示す。
2016510413.tif 000008
【００３６】
ジペプチドとｔａｇ−Ｃ（＝Ｏ）成分との間の結合は、Ｘが酸素原子の場合にアリールエステル（ｎ＝０）、Ｘが窒素原子の場合にアリールアミド（ｎ＝０）、又はＸが硫黄原子の場合にチオエステル（ｎ＝０）であってもよい。Ａｒは、例えば４−ヒドロキシ安息香酸若しくは４−ヒドロキシけい皮酸といったフェノール誘導体、又は例えば７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸、７−ヒドロキシ−４−メチル−３−クマリニル酢酸若しくは７−ヒドロキシクマリニル−４−酢酸といった７−ヒドロキシクマリン誘導体から生成され得る。ヒドロキシクマリニル成分は、強い離隔性を示し、ＭＡＬＤＩ及び／又はＥＳＩ質量分析法においてペプチドの検出率を増大するため、本発明に特に有用である。
【００３７】
ラベルが結合され得る結合分子は、Ｒ３、好ましくは上記のようなＲ３に含まれるＦＧ基を結合可能な分子である。結合分子は、好ましくは、少なくとも１つのアミノ基（ＮＨ２）を含む。結合分子は、特定の標的分子に結合するオリゴ核酸又はペプチド分子を含むアプタマーであってもよい。結合分子は、例えばモノクローナル抗体、ネイティブポリクローナル抗体及び組換え型ポリクローナル抗体等の抗体、ネイティブ抗原及び組換え型抗原等の抗原、ハプテン、特にリガンド及びレセプターといったタンパク質、糖タンパク質、膜タンパク質、ペプチド、糖類、オリゴ糖類、多糖類、ペプチドグリカン、脂質、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸、オリゴヌクレオチド、アプタマー、単層を含む細胞等の細胞、並びに薬物又はホルモン等の有機化合物からなる群から選択され得る。当業者は、検出のための標的分子に結合分子を容易に適合し得る。好ましくは、結合分子は、抗体又は抗原であり、特に抗体である。
【００３８】
本発明において、「抗体」の用語は、以下に限定されないが、（ａ）２つの重鎖及び２つの軽鎖を含み、抗原を認識するイムノグロブリン分子、（ｂ）ポリクローナル又はモノクローナルイムノグロブリン分子、並びに（ｃ）それらの一価又は二価断片を含む。イムノグロブリン分子は、以下のものに限定されないが、ＩｇＡ１、分泌性ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ及びＩｇＭを含む一般に既知の分類のいずれか由来であってもよい。ＩｇＧサブクラスは、当業者に周知であり、以下のものに限定されないが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。抗体は、天然起源及び非天然起源の両方あり得る。さらに、抗体は、キメラ抗体、完全合成抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、単鎖抗体及びそれらの断片を含む。抗体は、ヒト若しくは非ヒト抗体、又はヒト化若しくは非ヒト化抗体であってもよい。抗体断片は、以下のものに限定されないが、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片及び他の抗原結合断片を含む。
【００３９】
（本発明に係るラベルの調製）
本発明に係るラベルは、ｎ＝０又はｎ＝１に依存して異なるプロセスによって調製され得る。
【００４０】
ｎ＝０の場合、ラベル化合物は、以下のステップに従って調製され得る。
‐ステップ１：ジペプチド（化学式（Ｉ）の卵形の点線内の原子により示される）の調製、ここで、側鎖Ｒ３の末端官能基は、該官能基がアミン成分の場合に例えばtert-ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）保護基で保護され得る、
‐ステップ２：上記のようなトリガーと上記ジペプチドの結合、
‐ステップ３：Ｔａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−Ｈとステップ２で得られた化合物の結合、
‐ステップ４：ジペプチドの側鎖の官能基の任意の脱保護、
‐ステップ５：ジペプチド側鎖の官能基の任意の化学的活性化又は修飾
（ステップ１）
ステップ１は、本技術分野において周知の方法に従って２つのアミノ酸をペプチド結合することにより行われることが好ましい。より具体的に、ジペプチドは、標準的な固相合成アプローチ(Fmoc/t-butyl又はBoc/benzyl 化学合成, Merrifield R.B. Science 1986 232, 341-347)により、ペプチド合成装置を用いて生成され得る。好ましくは、その結合は、結合試薬としてのジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（特に１当量）と、活性剤としてのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（特に１当量）と、塩基としてのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（特に２当量）とを用いて行われる。結合は、少なくとも部分的にアミノ酸で保護され、例えば末端ＮＨ２成分がＦｍｏｃ（フルオレニルメチルオキシカルボニル）基で保護され得る。そのような場合、ステップ１は、ピペリジンによるＦｍｏｃの脱保護を含み得る。
【００４１】
（ステップ２）
ステップ２は、トリガー成分を含む試薬と、ステップ１で得られたジペプチドのＮ末端アミン基とを反応させて、ジペプチドとトリガー成分との間に結合を生成することからなる。反応は、その結合を生成するための本技術分野において周知の方法により行われ得る。好ましくは、その反応は、トリガーハロゲン化アシルと、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とを０℃でジクロロメタン‐ピリジン混合液中で例えば１時間、第１接触させることにより行われ、トリガー成分を含む活性化された試薬を生成する。得られた試薬は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）等の有機溶媒中で、ステップ１で得られたジペプチドの溶液に加えられることが好ましい。
【００４２】
（ステップ３）
ステップ２で得られたトリガー‐ジペプチドと、Ｔａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−Ｈ化合物との間の結合は、本技術分野において周知の方法により行われ得る。ステップ３は、活性化剤としてのＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（特に１．５当量）と、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（特に１．５当量）とを用い、塩基としてのＤＩＥＡ（特に５当量）を用いて、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の有機溶媒中で行われることが好ましい。Ｔａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−Ｈ試薬は、本技術分野において周知の方法により調製され得る。それは、以下のプロセスに従って調製されることが好ましい：タグは、例えばＩＮＴＡＶＩＳ合成装置においてＮｏｖａｓｙｎＴＧＲレジンでＦｍｏｃ／tert-ブチルストラテジーを用いた固相合成によって調製される。ペプチド伸長は、例えば５当量のアミノ酸、４．５当量の結合試薬Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−リン酸塩（ＨＢＴＵ）、及び１０当量の塩基としてのＤＩＥＡを用いて行われる。任意に固相レジンに結合したＮ末端のペプチド（タグ）は、７−ヒドロキシクマリン−４−酢酸等のＨＯＯＣ−Ａｒ−Ｘ−Ｈ化合物と反応する。その反応は、５当量のＨＯＯＣ−Ａｒ−Ｘ−Ｈ、５当量のＨＯＢｔ、及び結合試薬としての５当量のＤＩＣの存在中で行われ得る。必要であれば、最後に、例えばトリフルオロ酢酸ＴＦＡを用いて脱保護、及び／又はレジン分離が行われる。
【００４３】
（ステップ４）
ステップ４は、ジペプチドの側鎖の官能基（ＦＧ）の任意の脱保護である。ステップ４の条件は、その化合物の保護基及び構造に依存して当業者により適合される。例えば、保護された官能基がtert-ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）保護基を用いて保護されたアミン基である場合、ステップ４はジクロロメタン（ＤＣＭ）−トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１：１）混合物中で、０℃で２時間行われ得る。
【００４４】
（ステップ５）
ステップ５は、結合分子との更なる反応を可能にする又は促進するために、ジペプチドの側鎖の官能基（ＦＧ）の化学的修飾又は活性化をすることからなる。官能基（ＦＧ）が一級又は二級アミンである場合、結合分子の尿素成分のリジンアミノ酸で生成するために後者は例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミジルカルボニルに変換され得る。ステップ５は、当業者に周知の従来の化学反応を行うことにより実施され得る。
【００４５】
ｎ＝１の場合、ラベル化合物は、以下のステップに従って調製され得る：
‐ステップ１：ＨＯＯＣ−Ａｒ−Ｘ−Ｒ４−ＯＨ化合物の調製、ここで、Ａｒ、Ｘ及びＲ４は上記の定義通りである、
‐ステップ２：上記のようなトリガーとアミノ酸との結合、ここで、側鎖Ｒ３の末端官能基は、例えば該官能基がアミン成分である場合にtert-ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）保護基で保護され得る、
‐ステップ３：アミンラベル化合物であるＴａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−Ｒ４−Ｏ−ジペプチド−トリガーの調製、
‐ステップ４：任意の、ジペプチド側鎖の官能基の化学的活性化又は修飾。
【００４６】
本実施形態において、ステップ３は、以下のステップ３’に置換され得る。ステップ３’は以下を含む。
‐ステップ３’ａ：Ｔａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−Ｒ４−Ｏ−Ｐｒｏの調製、ここでＲ４はエチル、プロピル又はブチル基であることが好ましく、Ｐｒｏはプロリンである、
‐ステップ３’ｂ：ステップ２で得られた分子とステップ３’で得られたＴａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−Ｒ４−Ｏ−Ｐｒｏとの結合、及び、
‐ステップ３’ｃ：任意のジペプチドの側鎖の官能基の脱保護。
【００４７】
（ステップ１）
ステップ１は、スペーサＲ４で修飾された芳香族基を調製することからなり、Ｒ４は好ましくはエチル、プロピル又はブチル基である。その調製は、本技術分野において周知の適切な方法により行われ得る。好ましくは、その調製は、開始の芳香族化合物に存在するヒドロキシル基のアルキル化、例えば７−ヒドロキシクマリン−４−酢酸のヒドロキシル基のアルキル化のステップを含み得る。
【００４８】
（ステップ２）
ステップ２は、アミノ酸、好ましくは保護されたアミノ酸、典型的にＮε−Ｂｏｃ−Ｌ−リジンのＮ末端アミン基と、トリガー成分を含む試薬とを反応することからなる。その反応は、前記結合を生成するための本技術分野において周知の方法により行われ得る。好ましくは、その反応は、トリガーのハロゲン化アシルとＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とをジクロロメタン−ピリジン混合物内で、０℃で、例えば１時間、第１の接触をさせることで行われて、トリガー成分を含む活性化試薬を生成する。その後、得られた試薬は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）等の有機溶媒中にアミノ酸を含む溶液に加えられることが好ましい。
【００４９】
（ステップ３）
ステップ３は、Ｂｏｃ−プロリンの代わりにＦｍｏｃ−プロリンが用いられること以外、以下に記載のステップ３‘ａと同様に行われることが好ましい。プロリンのＦｍｏｃ塩基脱保護は、固体基質において、ピペリジン（２０％）含有ＤＭＦを用いて行われることが好ましい。その後、ステップ２において得られたトリガー‐アミノ酸と、支持された遊離アミン化合物との間の結合は、本技術分野において周知の方法により、好ましくはジメチルホルムアミド等の有機溶媒に含まれる活性化剤としてのＤＩＣ（特に４．０当量）及びＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（特に４．０当量）を用いて、行われ得る。最後に、脱保護及びレジン分離が、例えばＴａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−Ｒ４−Ｏ−ジペプチド−トリガー化合物に接近できるトリフルオロ酢酸を用いて達成され得る。
【００５０】
（ステップ４）
ステップ４は、結合分子との更なる反応を可能にする又は促進するために、ジペプチドの側鎖の官能基（ＦＧ）を化学的修飾又は活性化することからなる。官能基（ＦＧ）は、一級又は二級アミンである場合、結合分子の尿素成分のリジンアミノ酸で生成するために、後者は例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミジルカルボニルに変換され得る。ステップ４は、当業者により周知の従来の化学反応を実施することにより行われ得る。
【００５１】
（ステップ３ａ’）
タグは、本技術分野において周知の方法により調製され得る。タグがペプチドの場合、それは、例えばＩＮＴＡＶＩＳ合成装置又はＣ．Ｅ．Ｍ．合成装置によりＮｏｖａｓｙｎＴＧＲレジンでＦｍｏｃ／tert-ブチルストラテジーを用いて固相合成により調製されることが好ましい。ペプチド伸長は、例えば５当量のアミノ酸、４．５当量の結合試薬のＯ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−リン酸（ＨＢＴＵ）、および１０当量の塩基としてのＤＩＥＡを用いて行われる。ＨＯＯＣ−Ａｒ−Ｘ−Ｒ４−ＯＨとタグとの結合は、ペプチドタグのＮ末端等のタグのアミノ成分と前記化合物との結合により行われることが好ましい。その結合は、例えば５当量のＨＯＯＣ−Ａｒ−Ｘ−Ｒ４−ＯＨ、５当量のＨＯＢｔ、及び５当量の結合試薬としてのＤＩＣの存在下で行われ得る。プロリンとＨＯＯＣ−Ａｒ−Ｘ−Ｒ４−ＯＨとの結合は、Ｂｏｃ−プロリン等のプロリンの誘導体を用いたヒドロキシル基のアシル化により行われ、そのプロリンはＬ又はＤ型である。前記結合は、例えば８当量のＢｏｃ−プロリン、４当量の結合試薬であるＤＩＣ、及び触媒量のＤＭＡＰを用いて行われ得る。必要であれば、脱保護及びレジン分離が、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて行われ得る。
【００５２】
（ステップ３’ｂ及び３’ｃ）
ステップ２で得られたトリガー‐アミノ酸と、ステップ３’ａで得られたＴａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−Ｒ４−Ｏ−Ｐｒｏとの間の結合は、本技術分野において周知の方法により行われ得る。ステップ３’ｂは、活性化剤としてのＥＤＣ（特に１．３当量）及びＮヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（特に１．３当量）を用い、ジメチルホルムアミド‐ジクロロメタン（ＤＭＦ−ＤＣＭ）等の有機溶媒混合液に含まれた塩基としてのＤＩＥＡ（特に４当量）を用いて行われることが好ましい。必要であれば、最終の脱保護（ステップ３’ｃ）及び／又はレジン分離は、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて行われる。
【００５３】
（コンジュゲート）
本発明の他の対象は、本発明に係るラベルに結合された分子であり、コンジュゲートとも呼ばれる。該コンジュゲートは、特に化学式（ＩＩ）で示される：
2016510413.tif 000009
Ｔａｇ（タグ）、Ｔｒｉｇｅｒ（トリガー）、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ（結合分子）、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｘ及びｎは上述の通りであり、Ｒ’３は、ラベルのＲ’３基と結合分子との反応から得られる化学基である。特にＲ’３は、式−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ２−ＦＧ’であり、ＦＧ’はラベルのＦＧ基と結合分子との反応から得られた化学基である。Ｒ’３は、結合分子と結合するような、尿素、アミド又はアルキルジアミド基を含むことが好ましい。特にＲ’３は、尿素基を含む。特にＦＧ’は尿素、アミド又はアルキルアミド基、好ましくは尿素基である。
【００５４】
本発明の他の対象は、本発明に係るコンジュゲートを調製する方法である。
【００５５】
本発明のコンジュゲートを調製する方法は、上記のような結合分子と少なくとも１つの本発明のラベルとを接触することを含む。一実施形態において、本発明のコンジュゲートを調製する方法は、結合分子を含むサンプル、特に結合分子を含む生物学的サンプルと本発明の少なくとも１つのラベルとを接触することを含む。
【００５６】
ラベルと結合分子とを接触させることは、好ましくは約０℃〜約１０℃、より好ましくは約２℃〜約５℃、特に約４℃で行われる。コンジュゲートを調製する方法は、好ましくは、コンジュゲートの精製の追加ステップを含む。その精製は、好ましくは約０℃〜約１０℃、より好ましくは約２℃〜約５℃、特に約４℃で行われる。
【００５７】
（適用）
本発明のコンジュゲートは、サンプル、特に生物学的サンプル中で該コンジュゲートに結合する標的分子の検出に特に有用である。
【００５８】
標的分子は、目的の分子である。それは、実施される試験条件でコンジュゲートと標的分子とを結合、好ましくは特異的結合させる化学的構造を示し得る。標的分子は、例えば薬剤、モノクローナル抗体、ネイティブポリクローナル抗体及び組換え型ポリクローナル抗体等の抗体、ネイティブ抗原及び組換え型抗原等の抗原、ハプテン、特にリガンド及びレセプターといったタンパク質、糖タンパク質、膜タンパク質、ペプチド、糖類、オリゴ糖類、多糖類、ペプチドグリカン、脂質、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸、オリゴヌクレオチド、アプタマー、単層を含む細胞等の細胞、並びに薬物又はホルモン等の有機化合物からなる群から選択され得る。好ましくは、標的分子は、抗体、タンパク質又は抗原であり、特にタンパク質又は抗体である。標的分子は、好ましくは、本発明のコンジュゲートと結合又は相互作用、特に特異的結合又は特異的相互作用をする。特に、標的分子は、コンジュゲートの結合分子と結合する。
【００５９】
一実施形態において、生物学的サンプル中に存在する因子である標的分子は、症状のリスク、素因又は存在を示す。
【００６０】
本発明の対象は、サンプル、好ましくは生物学的サンプル中における少なくとも１つの標的分子を検出する方法であり、以下のステップを含む：
（ａ）本発明の少なくとも１つのコンジュゲートとサンプルとを接触する、
（ｂ）前記サンプルから非結合性コンジュゲートを除去する、
（ｃ）少なくとも１つの適切な刺激をステップ（ｂ）後に得られたサンプルに与えてコンジュゲートを活性化する、
（ｄ）適切な分析技術、好ましくはＭＡＬＤＩ質量分析法により、Ｔａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−（Ｒ４−Ｏ）ｎ−Ｈ化合物の放出を検出する、
ここで、Ｔａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−（Ｒ４−Ｏ）ｎ−Ｈ化合物の存在は、サンプル中における対応する標的分子の存在を示す。
【００６１】
少なくとも１つの標的分子を検出する方法は、ステップ（ａ）前に、上記のコンジュゲートを調製するステップ（ａ’）を含み得る。
【００６２】
一実施形態において、少なくとも１つの標的分子を検出する方法は、本発明の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは５〜２５の、好ましくはＴａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−（Ｒ４−Ｏ）ｎ成分を含むコンジュゲートの使用を含み、サンプル中における少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは５〜２５の標的分子を検出する。一実施形態において、本発明の、好ましくは種々の好ましくは、Ｔａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−（Ｒ４−Ｏ）ｎ成分を含むコンジュゲートの数は、サンプル中における検出するための標的分子の数と同一である。
【００６３】
種々のトリガーを含む複数のコンジュゲートが用いられる場合、適切な刺激による種々のコンジュゲートの活性化は、同時及び／又は連続的になされ得る。ステップ（ｃ）又は少なくとも１つのコンジュゲートの活性化、及びステップ（ｄ）は、同時に行われ得る。例えば、Ｔａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−（Ｒ４−Ｏ）ｎ−Ｈ化合物の放出を検出するのに用いられる分析技術がＬＡＳＥＲＭＡＬＤＩである場合、ＭＡＬＤＩのＬＡＳＥＲ照射が少なくとも１つのコンジュゲートを活性化するために適切な刺激となり得る。
【００６４】
好ましくは、サンプル中におけるＴａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−（Ｒ４−Ｏ）ｎ−Ｈ化合物の存在は、ＭＡＬＤＩ若しくはＥＳＩ質量分析法当の質量分析法、又は液体クロマトグラフィーにより検出され得る。マトリクス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法は、生物学的研究の分野で強力なツールとなっており、複合混合物から核酸、ペプチド及びタンパク質を検出、同定及び特徴付けするのに用いられる。
【００６５】
一実施形態において、トリガーは、ＮＰＰＯＣ基であり、照射波長は約３６５ｎｍである。他の実施形態において、トリガーは、ニトロベンジル基であり、照射波長は約２７０ｎｍ〜３７０ｎｍである。
【００６６】
好ましい実施形態において、サンプル中における少なくとも１つの標的分子を検出する方法は、７〜９、好ましくは約８のｐＨで行われる。
【００６７】
生物学的サンプル及び／又は本発明のコンジュゲートにおける少なくとも１つの標的分子を検出する方法は、医療診断及び／又は臨床生物学において用いられ得る。本発明において、生物学的サンプルは、血液、血漿、血清、唾液、尿等の生物学的流体、生物学的組織若しくはそれらの一部、又は細胞を意味する。有利には、本発明の検出方法は、組織切片に直接に適用され得る。適用分野は、遺伝子検査、生物化学、免疫化学、感染免疫学、微生物学及び血液学が挙げられ得る。例えば、本発明は、種々の生物学的サンプル中における薬物等の目的の分子の分布及び／又は薬物動態の研究に用いられ得る。
【００６８】
本発明の他の対象は、本発明に係る少なくとも１つのコンジュゲートを用いて症状特異的標的分子を検出することを含む、対象における特定の症状のリスクの測定、又は素因若しくは存在の検出の方法である。特に、症状特異的標的分子の検出は、上記生物学的サンプル中における少なくとも１つの標的分子を検出する方法を用いて行われ得る。症状の例は、癌、自己免疫疾患、先天性甲状腺機能低下症、心臓疾患、リン酸カルシウム代謝疾患、細菌性疾患及び新生児疾患である。癌は、特に神経膠芽腫、（前骨髄球）白血病、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、乳癌、特に肝臓といった消化器癌、膵臓癌、頭部及び頸部癌、結腸癌、膀胱癌、非ホジキンリンパ腫、及び黒色腫が挙げられ得る。
【００６９】
上記標的分子を検出する方法は、組織切片における少なくとも１つの標的分子マップ（すなわち分布）の決定、及び／又は複合免疫センシングアッセイでのサンプル中における少なくとも１つの標的分子の検出のために適用され得る。
【００７０】
（標的分子マップの決定）
本発明のコンジュゲートは、好ましくは組織切片、例えばWO 2007/000669 又は Lemaire et al. J. Prot.Res. 2007, 6, 2057に記載されるようなサンプル、好ましくは切片組織における少なくとも１つの標的分子マップの決定の方法に用いられ得る。
【００７１】
好ましくは、標的分子マップの決定の方法は、光分解性成分を含む少なくとも１つのコンジュゲートの使用を含み、好ましくは該方法に含まれるすべてのコンジュゲートは光分解性トリガー成分を含む。
【００７２】
本発明において、「組織切片」は、以下の特性を有することが好ましい：それは、凍結又はパラフィン包埋であってもよく、その厚さは哺乳動物細胞の径のオーダーであることが好ましく、従って５〜２０μｍである。クライオスタットを用いて凍結組織から得られた凍結切片の場合、好ましくはＯＣＴ（最適切削温度ポリマー）が組織の固定にのみ用いられるが、凍結組織はＯＣＴで包埋はされず、組織切片はＯＣＴと接触されない。組織切片は、金属、金、鉄、ガラス、繊維、ガラス、ナイロン６／６、シリコン、プラスチック、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリビニリデンジフルオリド、又はニッケル若しくはＩＴＯ（酸化インジウムスズ）等の透明特性を維持する導電性金属でコーティングされたガラス断片等の無機若しくは有機材料を含む更なるＭＡＬＤＩ分析に適する材料で構成されたＭＡＬＤＩプレートに移され得る。
【００７３】
一実施形態において、本発明に係る組織切片における標的分子マップの決定方法は、以下のステップを含む：
（ａ）標的分子の結合に適する本発明に係る少なくとも１つのコンジュゲートと組織切片をハイブリダイズする、
（ｂ）マトリクスをスプレーする、
（ｃ）ＭＡＬＤＩ質量分析法を用いて、組織切片表面をスキャンする、ここで、ＭＡＬＤＩレーザは、Ｔａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−（Ｒ４−Ｏ）ｎ−Ｈ化合物を放出する、及びサンプルのイオン化を誘導するのに用いられることが好ましく、得られた結果が保存される、
（ｄ）それぞれ別個のＴａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−（Ｒ４−Ｏ）ｎ−Ｈ化合物の分子質量ウインドウ中で得られたデータを分析して、別個の対象標的分子の数と同一の組織切片のマップを生成する。
【００７４】
本発明において、「少なくとも１つのコンジュゲートと組織切片とのハイブリダイズ」は、組織切片とコンジュゲートとが、コンジュゲートが組織切片内の標的分子に特異的に結合可能な条件で接触される反応を意味する。コンジュゲート及び標的分子の性質に依存して、周知のハイブリダイゼーションのプロトコールが当業者に利用され得る。「マトリクス」は、分析物と混合された場合、レーザ照射によって良好に脱離され、固相結晶から気体又は蒸気相へイオン化され、及び分子イオンに促進させる結晶性マトリクス包埋分析物分子を生成する材料を意味する。一般に用いられるＭＡＬＤＩ−ＭＳのマトリクスは、通常、小さく、レーザ波長を吸収する酸性化学物質であり、ニコチン酸、けい皮酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（２，５−ＤＨＢ）、α−シアノ−４−ヒドロキシけい皮酸（ＣＨＣＡ）、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシけい皮酸（シナピン酸又はＳＡ）、３−メトキシ−４−ヒドロキシけい皮酸（フェルラ酸）、３，４−ジヒドロキシけい皮酸（コーヒー酸）、２−（４−ヒドロキシフェニラゾ）安息香酸（ＨＡＢＡ）、３−ヒドロキシピコリン酸（ＨＰＡ）、２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）及び２−アミノ−４−メチル−５−ニトロピリジンを含む。これらのマトリクスの調製のためのプロトコールは、本技術分野において周知であり、これらのマトリクスのほとんどは商業的に入手可能である。ペプチド／タンパク質分析に一般に用いられるマトリクスは、α−シアノ−４−ヒドロキシけい皮酸（ＣＨＣＡ）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（２，５−ＤＨＢ）及びシナピン酸（ＳＡ）を含む。ＤＮＰＨは２，４−ジニトロフェニルヒドラジンであり、アルデヒド及びケトンの検出に用いられる。
【００７５】
（複合免疫センシングアッセイ）
本発明のコンジュゲートは、例えばWO 2007/062105に記載されるような免疫センシングアッセイにおいて、サンプル中における少なくとも１つの標的分子を検出するための方法に用いられ得る。
【００７６】
本発明の対象は、本発明に係る少なくとも１つのラベル又はコンジュゲートの使用を含む、免疫センシングアッセイにおいてサンプル中における少なくとも１つの標的分子を検出する方法である。
【００７７】
免疫センシングアッセイは、間接、直接（サンドイッチ）又は競合免疫センシングアッセイであってもよい。例えば、本発明の少なくとも１つの標的分子を検出する方法は、好ましくはＴＳＨに対するモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ直接免疫センシングアッセイ、及びＴ４の競合法を介して、ＴＳＨ（チロイド刺激ホルモン）及びＴ４（チロキシンＴ４）ホルモンの投与に用いられ得る。増大したＴＳＨ及び減少したＴ４は、先天性甲状腺機能低下症の明確な指標である。
【００７８】
第１の実施形態において、免疫センシングアッセイでサンプル中の少なくとも１つの標的分子を検出する方法は、以下のステップを含む：
（ａ）サンプルと、少なくとも１つの標的分子に結合可能な少なくとも１つの化合物が付けられた固体基質とを接触する、ここで、当該接触は、サンプルに標的分子が存在するならば、該標的分子と化合物とが結合できる条件下で行われる、
（ｂ）固体基質から非結合性サンプルを除去する、
（ｃ）本発明の少なくとも１つのコンジュゲートと、ステップ（ａ）で得られた固体基質とを接触する、ここで、当該接触は、固体基質に標的分子が存在するならば、該標的分子とコンジュゲートとが結合できる条件下で行われる、
（ｄ）非結合性コンジュゲートを除去する、
（ｅ）ステップ（ｃ）で得られたサンプルに適切な複数の（単数の）刺激を与えて、コンジュゲートを活性化する、及び、
（ｆ）適切な分析技術、好ましくはＭＡＬＤＩ質量分析法によりＴａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−（Ｒ４−Ｏ）ｎ−Ｈ化合物の放出を検出する、ここで、Ｔａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−（Ｒ４−Ｏ）ｎ−Ｈ化合物の存在は、サンプル中における対応する標的分子の存在を示す。
【００７９】
他の実施形態において、各標的分子に対して、
‐ステップ（ａ）の固体基質に付けられた標的分子に結合可能な少なくとも１つの化合物、及び、
‐標的分子に結合可能な化合物と共に標的分子に結合する少なくとも１つのコンジュゲートがあり、
少なくとも１つのコンジュゲートのタグは、他の標的分子に結合するコンジュゲートのタグとは異なる検出信号、特に異なる質量を有する。
【００８０】
本発明において、異なる検出信号を有するということは、好ましくは適切な検出及び／又は分析技術を用いた場合に検出信号が区別可能であるように十分に異なることを意味する。
【００８１】
第３の実施形態において、免疫センシングアッセイでサンプル中における少なくとも１つの標的分子を検出する方法は、以下のステップを含む：
（ａ）標的分子に結合する固体基質とサンプルとを接触させる、ここで、当該接触は、サンプル中に標的分子が存在するならば、該標的分子とその固体基質とが結合できる条件下で行われる、
（ｂ）固体基質から非結合性サンプルを除去する、
（ｃ）ステップ（ａ）で得られた固体基質と、当該固体基質と共に標的分子に結合する本発明の少なくとも１つのコンジュゲートとを接触させる、ここで、当該接触は、固体基質に標的分子が存在するならば、該標的分子にコンジュゲートが結合できる条件下で行われる、
（ｄ）非結合性コンジュゲートを除去する、
（ｅ）ステップ（ｄ）で得られたサンプルに適切な複数（単数）の刺激を与えて、コンジュゲートを活性化する、
（ｆ）適切な分析技術、好ましくはＭＡＬＤＩ質量分析法によりＴａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−（Ｒ４−Ｏ）ｎ−Ｈ化合物の放出を検出する、ここで、Ｔａｇ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｒ−Ｘ−（Ｒ４−Ｏ）ｎ−Ｈ化合物の存在は、サンプル中における対応する標的分子の存在を示す。
【００８２】
第４の実施形態において、ステップ（ａ）の固体基質は複数の標的分子に結合し、各標的分子に対して、固体基質と共に標的分子のいずれかに結合する少なくとも１つのコンジュゲートがあり、少なくとも１つのコンジュゲートのタグは、他の標的分子に結合するコンジュゲートのタグとは異なる検出信号、特に異なる質量を有する。
【００８３】
本発明の対象は、以下を含む組成物である：
（ａ）固体基質、
（ｂ）少なくとも１つの標的分子と結合可能な、前記固体基質に結合された化合物、
（ｃ）前記化合物に結合された標的分子、及び、
（ｄ）前記化合物と共に標的分子に結合する本発明のコンジュゲート、ここで、該コンジュゲートは標的分子に結合される。
【００８４】
本発明において、「固体基質」は、少なくとも１つの標的分子と結合可能な化合物が付けられ得る固相に存在する適切な媒体を意味する。一実施形態において、固体基質は、ガラス、石英、シリコン、プラスチック又は金である。他の実施形態において、固体基質は、少なくとも１つのアガロースゲル又はポリスチレン等の不溶性ポリマーを含む、好ましくは不溶性ポリマーからなる。固体基質は、例えばビーズ、チップ又はウェルの形態であってもよい。「少なくとも１つの標的分子と結合可能な化合物」は、該標的分子に特異的に結合可能、好ましくは共有結合可能な化合物である。該化合物は、好ましくは抗原又は抗体であり、特に抗原である。該化合物は、例えばストレプトアビジン‐ビオチン結合又は１，３−双極子環状付加を介して固体基質に付けられ得る。
【００８５】
本発明の対象は、サンプル中における標的分子を検出するためのキットであり、以下を含むキットである：
（ａ）固体基質、
（ｂ）該固体基質に付けるための標的分子に結合可能な化合物、
（ｃ）該化合物と共に標的分子に結合する本発明のコンジュゲート、及び、
（ｄ）サンプル中における標的分子を検出するためにキットを使用するための説明書。
【００８６】
本発明の対象は、サンプル中における標的分子を検出するためのキットであり、以下を含むキットである：
（ａ）標的分子に結合可能な化合物が付けられた固体基質、
（ｂ）標的分子に結合する本発明のコンジュゲート、及び、
（ｃ）サンプル中における標的分子を検出するためにキットを使用するための説明書。
【００８７】
本発明の対象は、サンプル中における標的分子を検出するためのキットであり、以下を含むキットである：
（ａ）標的分子に結合する固体基質、
（ｂ）標的分子に結合する本発明のコンジュゲート、及び、
（ｃ）サンプル中における標的分子を検出するためにキットを使用するための説明書。
【００８８】
本発明の対象は、サンプル中における少なくとも１つの標的分子を検出するためのキットであり、以下を含むキットである：
（ａ）固体基質、
（ｂ）該固体基質に付けるための標的分子に結合可能な複数の化合物、ここで、各標的分子に対して、該標的分子と結合可能な少なくとも１つの化合物がある、
（ｃ）本発明の複数のコンジュゲート、ここで、各標的分子に対して、前記化合物と共に標的分子と結合する少なくとも１つの化合物があり、各コンジュゲートのタグは、他の標的分子と結合するコンジュゲートのタグとは異なる検出信号、特に異なる質量を有する、及び、
（ｄ）サンプル中における少なくとも１つの標的分子を検出するためにキットを使用するための説明書。
【００８９】
本発明の対象は、サンプル中における少なくとも１つの標的分子を検出するためのキットであり、以下を含むキットである：
（ａ）標的分子と結合可能な複数の化合物が取り付けられた固体基質、ここで、各標的分子に対して、該標的分子と結合可能な少なくとも１つの化合物がある、
（ｂ）本発明の複数のコンジュゲート、ここで、各標的分子に対して、前記化合物と共に該標的分子のいずれかと結合する少なくとも１つのコンジュゲートがあり、各コンジュゲートのタグは、他の標的分子と結合するコンジュゲートのタグとは異なる検出信号、特に異なる質量を有する、及び、
（ｃ）サンプル中における少なくとも１つの標的分子を検出するためにキットを使用するための説明書。
【００９０】
本発明の最後の対象は、サンプル中における少なくとも１つの標的分子を検出するためのキットであり、以下を含むキットである：
（ａ）各標的分子に結合する固体基質、
（ｂ）本発明の複数のコンジュゲート、ここで、各標的分子に対して、該標的分子のいずれかと結合する少なくとも１つのコンジュゲートがあり、各コンジュゲートのタグは、他の標的分子と結合するコンジュゲートのタグとは異なる検出信号、特に異なる質量を有する、及び、
（ｃ）サンプル中における少なくとも１つの標的分子を検出するためにキットを使用するための説明書。
【００９１】
以下の実施例は、単に本発明の説明のためのものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００９２】
・ｎ＝０の場合
（実施例１：本発明に係るコンジュゲートの調製）
固相合成は、ＩＮＴＡＶＩＳ合成装置によりＮｏｖａｓｙｎＴＧＲレジンでＦｍｏｃ／tert-ブチルストラテジーを用いて達成された。ペプチド伸長は、５当量のアミノ酸、４．５当量の結合試薬Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−リン酸（ＨＢＴＵ）、及び１０当量の塩基としてのＤＩＥＡを用いて行った。ペプチドレジンのＮ末端は、７−ヒドロキシクマリン−４−酢酸（５当量）と、結合試薬としてのヒドロキシベンゾトリアゾール（５当量）及びジイソプロピルカルボジイミド（５当量）と反応する。最後の脱保護及びレジン分離は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）により行われ、タグペプチド（１ａ〜ｅ）は、４８〜７９％の収率で精製された後に得られる（ステップ１）。そのプロセスの全ての化合物は、０．０５％ＴＦＡを含む線形勾配水／アセトニトリルを用いたＮｕｃｌｅｏｓｉｌＣ１８カラムでの逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により精製された。化合物の純度は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより９５％を超える値が測定された。全ての合成構造は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により確認された。ペプチド１ａのＮＭＲ分析も行われた（ＰＧ＝保護基）。
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【００９３】
（ステップ１）
Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎε−Ｂｏｃ−Ｌ−リジン（Ｌｙｓ）は、結合試薬としてのＤＩＣ（１当量）、活性化剤としてのＮＨＳ（１当量）及び塩基としてのＤＩＥＡ（２当量）を用いて、Ｌ−プロリン（Ｐｒｏ）に結合される。ジペプチドの２であるＦｍｏｃＬｙｓ（Ｂｏｃ）Ｐｒｏは、次のステップのために更なる精製をすることなく用いられる。ピペリジンを用いたＦｍｏｃ脱保護で、２つのステップでの精製後に５０％の収率でジペプチドＬｙｓ（Ｂｏｃ）Ｐｒｏである３が得られる。
2016510413.tif 000011
【００９４】
（ステップ２）
次のステップは、２−（ニトロフェニル）プロピルオキシカルボニル基でジペプチドＬｙｓ（Ｂｏｃ）Ｐｒｏである３のＮ末端アミン基を保護することからなる。まず、２−（ニトロフェニル）プロピルオキシカルボニル塩化物（ＮＰＰＯＣ）は、ジクロロメタン−ピリジン混合物中において０℃で１時間、ＮＨＳと反応する。対応するＮＰＰＯＣ−ＯＳｕは、ジクロロメタン（ＤＣＭ）に含まれるジペプチドＬｙｓ（Ｂｏｃ）Ｐｒｏである３の溶液に１滴ずつ加えられ、室温で１８時間撹拌される。予備的ＲＰ−ＨＰＬＣ精製の後、ジペプチドＮＰＰＯＣＬｙｓ（Ｂｏｃ）Ｐｒｏである４が４５％の収率で単離される。
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【００９５】
（ステップ３）
ＮＰＰＯＣｌｙｓ（Ｂｏｃ）Ｐｒｏである４と、タグペプチドである１ａとの間の結合は、活性化剤としてのＤＩＣ（１．５当量）及びＨＯＢｔ（１．５当量）と塩基としてのＤＩＥＡ（５当量）を用いて、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）内で２０時間行われる。エステルである５は、４６％の収率で精製後に単離された。
2016510413.tif 000013
【００９６】
５は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及びＲＰ−ＨＰＬＣにより特徴付けられ、その結果を図１に示す。
【００９７】
（ステップ４）
ジペプチドエステルである５のtert-ブチルオキシカルボニルＢｏｃ保護基の除去は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）とトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の混合液（１：１）内において０℃で２時間行われる。精製により４９％の収率でジペプチドアミンエステルである６が得られる。光分解性の副反応を防止するために、Ｎ−末端において保護基のＮＰＰＯＣを生じる化合物との全ての反応は、暗所で行われる。
2016510413.tif 000014
【００９８】
６は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及びＲＰ−ＨＰＬＣにより特徴付けられ、その結果を図２に示す。
【００９９】
（ステップ５）
アミンエステルジペプチドである６は、室温の暗所で３０分間、ＤＭＦ内でジ（Ｎ−スクシンイミジル）カルボネート（ＤＳＣ）（１０当量）及び触媒量のトリエチルアミン（０．５当量）と反応する。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルボニルジペプチドである７は、精製後に９８％の収率で単離される。
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【０１００】
７は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及びＲＰ−ＨＰＬＣにより特徴付けられ、その結果を図３に示す。
【０１０１】
イソシアネート形態が現れるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法での化合物７の分析は、ＮＳＣ形態と比較してまさっていた。
【０１０２】
（実施例２：本発明に係るバイオ分子ラベリング）
光分解性タグペプチドＮＳＣである７を用いたラベリングに関する概念実証の方法を確認するために、リゾチームが結合分子として選択された。リゾチームは、１４．３ｋＤａの分子量を有する１２９のアミノ酸で構成された球状タンパク質であり、７つの一級アミン基、より正確には６つのリジン及びＮ末端アミン基を有する。光分解性タグペプチドＮＳＣである７によるリゾチームのラベリングは、Mhidia et al. Bioconjugate Chem.2010, 21, 219-228に記載されたプロトコールに従って調べられた。ｐＨ７．４のＰＢＳバッファーを溶媒とする０．２ｍＭリゾチーム溶液は、暗所において４℃で、光分解性タグペプチドＮＳＣである７が加えられた。ＲＰ−ＨＰＬＣ動態分析は、２時間後にさらなる変換が無いことを示した。反応媒体分析は、８０％のリゾチームが１つ又は複数の光分解性タグペプチドである７によりラベル化されたことを示した。それにもかかわらず、クロマトグラムは、まず、全てではないＮＳＣである７の化合物が消費され（ＲＴ＝１８．８ｍｉｎでピーク）、第２に、アミンエステルジペプチドである６を生じる加水分解副反応（ＲＴ＝１６．１ｍｉｎでピーク）が起きたことを示した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法は、それらの結果を確認した。実際に、わずかに少ない量のリゾチームが検出された、[M+H]+ 14296 Da。主要な生成物は、ラベル８（ｐ＝１）でラベルされたリゾチームであり、[M+H]+質量15760 Daで特徴付けられる。リゾチームは、[M+H]+ 質量17213 Daで定義される２つのラベル７（ｐ＝２）、及び[M+H]+ 質量18662 Daで同定される３つのラベル７（ｐ＝３）を用いてラベル化されている。
2016510413.tif 000016
【０１０３】
少量の加水分解されたアミンエステルジペプチドである６及び未反応の光分解性タグペプチドＮＳＣである７を除去するために、ラベル化されたリゾチームが、Ｖｉｖａｓｐｉｎカートリッジ（カットオフ１００００）で、４℃で４時間の遠心分離下で（ＲＣＦ＝３０００）、リン酸バッファーを用いて３度洗浄することにより精製される。
【０１０４】
８は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及びＲＰ−ＨＰＬＣにより特徴付けられ、その結果を図４に示す。
【０１０５】
同一の反応は、光分解性タグペプチドＮＳＣである７の１当量のみを用いて達成され、得られた生成物は８ａである。速度決定で現れた全ての化合物７が３０分後に消費され、４０％のリゾチームがラベルされた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析は、リゾチームが、[M+H]+質量15742 Daにより特徴付けられた１つの光分解性タグペプチド（ｐ＝１）により部分的にラベル化されていることを示した。
【０１０６】
（実施例３：化合物５の光分解及びタグ１ａの放出）
光解離性ＮＰＰＯＣ保護基は、１００ワットのＵＶランプ（λ＝３６５ｎｍ）を用いて室温で１０分間、リン酸バッファーを溶媒とするタグペプチドエステル５の１ｍＭ溶液を照射することにより分離された。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、照射曝露が開始物質であるＮＰＰＯＣタグペプチドエステル５の完全な消失（ＲＴ＝２０．９ｍｉｎ、ステップ４）、並びにＲＴ＝１１．７ｍｉｎ及びＲＴ＝１４．４ｍｉｎの保持時間を有する２つの主要な生成物の出現を引き起こすことを証明した。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）による質量分析法は、[M+Na]+ 質量348.3を有するジケトピペラジンである９に対応するＲＴ＝１４．４ｍｉｎを有する生成物を確認した。ＥＳＩ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析は、ＲＴ＝１１．７ｍｉｎにより特徴付けられた生成物がタグペプチド１ａであることも確認した。
【０１０７】
本発明の概念実証、すなわちタグペプチド５の光解離性保護基ＮＰＰＯＣのＵＶ照射による分離を確認した以下の光分解ステップは、対応する一級アミンを生成し、それはジケトピペラジン９及び上記タグペプチド１ａの全ての放出を引き起こす分子内環化反応を直ぐに誘導する。
2016510413.tif 000017
【０１０８】
１ａ及び９は、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＥＳＩ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（１ａ）により特徴付けられる。結果は図６に示す。
【０１０９】
（実施例４：化合物８の光分解及びタグ１ａの放出）
光分解性タグペプチドラベル化リゾチーム８に対する１００ワットのＵＶランプ（λ＝３６５ｎｍ）を用いたｐＨ７．５、室温で１５分間の照射は、ＲＰ−ＨＰＬＣにおけるクロマトグラフィープロファイルの変化を引き起こす。実際にＲＴ＝１１．７ｍｉｎの保持時間を有する生成物が現れた。この生成物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析後にタグペプチド１ａであることが確認された。ＲＴ＝１７．１ｍｉｎでの第２の生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析は、ジケトピペラジンリゾチーム１０に合う[M+H]+主要質量14557.7 Daを示した。この結果は、分子内環化及びタグペプチド１の放出を引き起こす光解離性ラベル化リゾチーム８の照射の概念実証を確認する。
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【０１１０】
１ａ及び１０は、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（１ａ）により特徴付けられる。結果は図７に示す。
・ｎ＝１の場合
（実施例５：本発明に係るコンジュゲートの調製）
（ステップ１）
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【０１１１】
ヒドロキシアルキル酸１３ａ〜ｃは、７−ヒドロキシクマリン−４−酢酸から開始する３つのステップで合成された。開始材料である７−ヒドロキシクマリン−４−酢酸は、メタノールを溶媒とするチオニル塩化物を用いた反応により、９３％の収率でメチルエステル１１への第１の修飾がなされる。メチルエステル１１のフェノール成分は、アセトンに含まれる炭酸カリウム（３当量）により脱プロトン化され、ブロモアルキル（１．３当量）（ｎ＝０、１、２）と反応することによりフェノールアルキルエーテルを生成する。対応するフェノールアルキルエーテル１２ａ〜ｃは、２２〜４５％の収率で精製後に得られた。次に、メタノールを溶媒とする水酸化ナトリウムを用いた１２ａ〜ｃの鹸化は、９１〜９９％の収率で水酸化アルキル酸１３ａ〜ｃを生成する。
【０１１２】
１１：C12H10O5[M+H]+ 235.1, 測定値235.1 ; RP-HPLC分析, RT=11.5 min.バッファーA H2O-0.05% TFA /バッファー B 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1) カラム C18 Nucleosil 100 A 5 μm (2.1x250 mm) ３０分で線形勾配0-100%B (1.0 mL/min, 210 〜 400 nmで検出)。
【０１１３】
１２ａ：C16H16O7[M+H]+ 321.1, 測定値321.2 ; RP-HPLC Analysis,RT=15.7 min. バッファー A H2O-0.05%TFA / バッファー B 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1) カラム C18 Nucleosil 100 A 5 μm (2.1x250 mm) ３０分で線形勾配0-100%B (1.0 mL/min, 210 〜 400 nmで検出)。
【０１１４】
１２ｂ：C17H18O7[M+H]+ 335.1, 測定値335.3 ; RP-HPLC 分析, RT=17.6 min.バッファー A H2O-0.05% TFA / バッファー B 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1) カラム C18 Nucleosil 100 A 5 μm (2.1x250 mm) ３０分で線形勾配0-100%B (1.0 mL/min, 210 〜 400 nmで検出)。
【０１１５】
１２ｃ：C18H20O7[M+H]+ 349.1, 測定値349.2 ; RP-HPLC 分析, RT=19.2 min.バッファーA H2O-0.05% TFA /バッファー B 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1) カラム C18 Nucleosil 100 A 5 μm (2.1x250 mm) ３０分で線形勾配0-100%B (1.0 mL/min, 210 〜 400 nmで検出)。
【０１１６】
１３ａ：MALDI-TOF: マトリクス DHB -  C13H12O6[M+H]+ 計算値265.1, 測定値265.0 ; [M+Na]+ 計算値287.0, 測定値287.0。RP-HPLC分析, RT=9.4 min. バッファーAH2O-0.05% TFA / バッファーB 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1) カラムC18 Nucleosil 100 A 5 μm(2.1x250 mm) ３０分で線形勾配0-100%B (1.0 mL/min, 210 〜 400 nmで検出)。 1H NMR (300 MHz, DMF) δ 7.7 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.1 - 6.9(m, 2H), 6.4 (s, 1H), 4.2 (t, J = 4.5 Hz, 2H), 4.0 (s, 2H), 3.9 (t, J= 4.5 Hz, 2H), 3.6 (s, 2H). D)13C NMR (75 MHz, DMF) δ 171.2, 136.1, 161.0, 156.1, 150.9, 127.3,113.7, 113.4, 113.3, 102.0, 71.3, 60.6, 38.1。
【０１１７】
１３ｂ：MALDI-TOF: マトリクスDHB - C14H14O6[M+H]+ 計算値279.1, 測定値279.1 ; [M+Na]+ 計算値301.1, 測定値301.1。RP-HPLC分析, RT=10.8 min. バッファーAH2O-0.05% TFA / バッファーB 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1) カラムC18 Nucleosil 100 A 5 μm(2.1x250 mm) ３０分で線形勾配0-100%B (1.0 mL/min, 210 〜 400 nmで検出)。 1H NMR (300 MHz, DMF) δ 7.7 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.1 - 6.9(m, 2H), 6.4 (s, 1H), 4.2 (t, J = 4.5 Hz, 2H), 4.0 (s, 2H), 3.9 (t, J= 4.5 Hz, 2H), 3.6 (s, 2H). D) 13C NMR (75 MHz, DMF) δ 171.2, 163.0, 161.0, 156.1, 150.9, 127.3,113.7, 113.4, 113.3, 102.0, 71.3, 60.6, 38.1; 37.7。
【０１１８】
１３ｃ：MALDI-TOF: マトリクスDHB - C15H16O6[M+H]+ 計算値293.1, 測定値293.1 ; [M+Na]+ 計算値315.1, 測定値315.1。RP-HPLC 分析, RT=11.7 min. バッファーA H2O-0.05% TFA / バッファー B 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1) カラム C18 Nucleosil 100 A 5 μm (2.1x250 mm) ３０分で線形勾配0-100%B (1.0 mL/min, 210 〜 400 nmで検出)。1H NMR (300MHz, DMF) δ 7.8 (d, J = 8.5 Hz, 1H),7.1 - 6.9 (m, 2H), 6.4 (s, 1H), 4.2 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.6 (t, J= 6.3 Hz, 3H), 2.0 - 1.8 (m, 2H), 1.8 - 1.6 (m, 2H). D) 13C NMR (75 MHz, DMF) δ 171.2, 163.2, 161.0, 156.2, 151.0, 127.3, 113.7, 113.4,113.3, 101.9, 69.3, 61.5, 38.0, 29.8, 26.3。
【０１１９】
（ステップ２）
2016510413.tif 000020
【０１２０】
Ｎε−Ｂｏｃ−Ｌ−リジン（Ｌｙｓ）は、トリガー成分を導入するために修飾される。２−（ニトロフェニル）プロピルオキシカルボニル塩化物ＮＰＰＯＣＣｌは、反応性ＮＰＰＯＣ−ＯＳｕ中間物を生成するために、０℃でＮＨＳにより活性化され、反応性ＮＰＰＯＣ−ＯＳｕ中間物はＬｙｓアミノ酸に一滴ずつ加えられ、室温で５時間撹拌される。ＮＰＰＯＣＬｙｓ（Ｂｏｃ）は、予備的ＲＰ−ＨＰＬＣ精製後に５５％の収率で単離される。
【０１２１】
１４：MALDI-TOF: マトリクス CHCA - C21H31N3O8[M+Na]+ 計算値476.2, 測定値475.8 ; [M+K]+ 計算値492.2, 測定値491.8。RP-HPLC 分析, RT=21.1 min. バッファーAH2O-0.05% TFA / バッファー B 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1) カラムC18 Nucleosil 100 A 5 μm (2.1x250 mm) ３０分で線形勾配0-100%B (1.0 mL/min, 210 〜 400 nmで検出)。ESI スペクトル C12H10O5[M+H]+ 計算値454.2, 測定値454.4, [M-Boc]+ 計算値354.2, 測定値354.3。
【０１２２】
（ステップ３’ａ）
2016510413.tif 000021
【０１２３】
プロリンエステル１５ａ〜ｄは、オクタペプチドレジンＮｏｖａｓｙｎＴＧＲから開始する３つのステップで合成された。Ｆｍｏｃ／tert-ブチルストラテジーを用いた従来の固相ペプチド合成から得られた保護されたオクタペプチドレジンＧＲＡＦＲＧＡＧは、結合試薬としてのＨＯＢｔ（５当量）及びＤＩＣ（５当量）を用いてヒドロキシアルキル酸１３ａ〜ｃ（５当量）によってＮ末端を第１の修飾がなされる。ＤＣＭ（５×１ｍｉｎ）及びＤＭＦ（５×１ｍｉｎ）による複数回の洗浄後、クマリンレジンにおける遊離ヒドロキシ基は、Ｌ−プロリン又はＤ−プロリンのいずれか（８当量）、ＤＩＣ（４当量）及びジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（１０％）を混合することにより予め調製された対称無水物と室温で４時間反応する。次に、プロリンは、室温で１６時間、下記同一の方法で再結合された。ペプチジルレジンは、補足剤としてのＴＩＳ（トリイソプロピルシラン）を含むＴＦＡ溶液により処理され、残りの粗ペプチドは、予備的ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製された。プロリンエステル１５ａ〜ｄは、２５〜４６％の収率で単離された。
【０１２４】
１５ａ：MALDI-TOF: マトリクス CHCA - C51H72N16O14[M+H]+ 計算値1133.5, 測定値1133.6 ; [M+Na]+ 計算値1155.5, 測定値1155.5。RP-HPLC 分析, RT=9.8 min. バッファーA H2O-0.05% TFA / バッファー B 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1) カラム C18 Nucleosil 100 A 5 μm (2.1x250 mm) ３０分で線形勾配0-100%B (1.0 mL/min, 210 〜 400 nmで検出)。ESIスペクトル C12H10O5[M+H]+ 計算値1133.5, 測定値1134.1, [M+2H]+/2 計算値567.2, 測定値567.6。
【０１２５】
１５ｂ：MALDI-TOF : マトリクス CHCA - C52H74N16O14[M+H]+ 計算値1147.6, 測定値1147.6。 RP-HPLC 分析, RT=10.4 min.バッファーA H2O-0.05% TFA / バッファー B 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1) カラムC18 Nucleosil 100 A 5 μm (2.1x250 mm) ３０分で線形勾配0-100%B (1.0 mL/min, 210 〜 400 nmで検出)。ESIスペクトル [M+2H]+/2 計算値 574.3, 測定値574.7。
【０１２６】
１５ｃ：MALDI-TOF: マトリクス CHCA - C53H76N16O14[M+H]+ 計算値1161.6, 測定値1161.5。 RP-HPLC 分析, RT=11.0 min.バッファー A H2O-0.05% TFA / バッファー B 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1) カラム C18 Nucleosil 100 A 5 μm (2.1x250 mm) ３０分で線形勾配0-100%B (1.0 mL/min, 210 〜 400 nmで検出)。ESIスペクトル [M+2H]+/2 計算値581.3, 測定値581.7。
【０１２７】
１５ｄ：MALDI-TOF: マトリクス CHCA - C51H72N16O14[M+H]+ 計算値1133.5, 測定値1133.5。 RP-HPLC 分析, RT=9.9 min.バッファー A H2O-0.05% TFA / バッファー B 0.05% TFA CH3CN/水 (4/1) カラム C18 Nucleosil 100 A 5 μm (2.1x250 mm) ３０分で線形勾配0-100%B (1.0 mL/min, 210 〜 400 nmで検出)。ESI スペクトル [M+2H]+/2 計算値 567.2, 測定値567.6, [M+H]+ 計算値 1133.5, 測定値 1134.9。
【０１２８】
（ステップ３'ｂ）
2016510413.tif 000022
【０１２９】
ＮＰＰＯＣＬｙｓ（Ｂｏｃ）１４とプロリンエステル１６ａ〜ｄとの間の結合は、結合試薬としてのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）（１．３当量）、活性化剤としてのＨＯＢｔ（１．３当量）、及び塩基としてのＤＩＥＡ（４当量）を用いてＤＭＦ−ＤＣＭ混合液（１：１）中で２０時間行われる。エステル１６ａ〜ｂは、３６〜７１％の収率で精製後に得られた。１６ａ、１６ｂ、１６ｃ及び１６ｄは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＥＳＩにより特徴付けられる。結果を図８〜１１に示す。
【０１３０】
（ステップ３）
2016510413.tif 000023
【０１３１】
アミン１７の調製は、１６ａ〜ｄのために説明されたものと同一の固相ストラテジーを用いて行われる。Ｂｏｃ−プロリンの代わりに、Ｆｍｏｃ−Ｌ−プロリンは、クマリンレジンにおける遊離ヒドロキシル基に導入される。２０％ピペリジンを用いた二重Ｆｍｏｃ脱保護は、レジン上で現れる。ＤＣＭ（５×１分）及びＤＭＦ（５×１分）を用いた複数回の洗浄後、ＮＰＰＯＣＬｙｓ（Ｂｏｃ）（４当量）は、ＤＭＦ中において室温で４時間、ＤＩＣ（４当量）及びＨＯＢｔ（４当量）を用いてプロリンアミンに導入される。ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏでの最終の脱保護は、予備的ＲＰ−ＨＰＬＣ精製後に２１％でアミン１７を得る。１７はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＥＳＩにより特徴付けられる。結果を図１２に示す。
【０１３２】
（ステップ４）
2016510413.tif 000024
【０１３３】
アミンエステル１７は、化合物６について上記説明したのと同様に、室温でＤＭＦに含まれるＤＳＣ（１０当量）と反応する。ＮＨＣ１８は、精製後に７５％の収率で単離される。１８は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＥＳＩにより特徴付けられる。結果を図１３に示す。
【０１３４】
（実施例６：本発明に係るバイオ分子のラベリング）
リゾチームのラベリングは、化合物８について上記説明したのと同様に、タグペプチドＮＳＣ１８を用いてなされた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及びＬＣ−ＭＳ分析で現れた約７０〜８０％のリゾチームは、１つ又は複数の光分解性タグペプチド１８によりラベル化された。主要な生成物は、[M+H]+ 質量15797 Daにより同定されるラベル１９（ｐ＝１）でラベル化されたリゾチームであった。２回ラベル化されたリゾチーム（ｐ＝２）は、[M+H]+ 質量17240 Daにより特徴付けられる。ラベル化されたリゾチームは、Ｖｉｖａｓｐｉｎカートリッジ（カットオフ１００００）で、８℃の遠心分離（ＲＣＦ＝３０００）でのリン酸バッファーによる３回の洗浄により精製された。
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【０１３５】
１９は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＥＳＩにより特徴付けられる。結果を図１４に示す。
【０１３６】
この方法は、ニュートラアビジンのラベリングにも適用された。ニュートラアビジンは、卵白からのネイティブアビジンを脱糖化したものである。そのタンパク質は、より中性の等電店ｐＩ＝６．３を有し、非特異的結合特性がほとんどない。ニュートラアビジンは、６００００ダルトンの総質量を有する４つの等しいサブユニットを含み、各サブユニットは、１２７アミノ酸で構成され、より具体的に９つのリジンを含む１０個の一級アミンで構成される。ラベリングのプロトコールは、ラベル化ニュートラアビジン２０が沈殿するのを避けるために、１０〜２０％のグリセロールを加えることにより少し変更された。ｐＨ７．４であるリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及びグリセロール（１０％）を含む１６μＭのニュートラアビジン溶液（１当量）は、４℃で光分解性タグペプチドＮＳＣ１８（４当量）に加えられ、その溶液は４℃で２時間撹拌された。反応媒体のＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、８０〜９０％のニュートラアビジンがラベル化されたことを示した。質量分析法は、[M+H]+ 質量14840 Daにより特徴付けられるラベル化されていない最初の単量体ニュートラアビジンを含む５つのタンパク質種を示した。主要な生成物は、[M+H]=16291 Daで同定された１つのラベル２０（ｑ＝１）でラベル化されたニュートラアビジンであった。２、３及び４度ラベル化されたタンパク質は、それぞれ[M+H]+ 質量17705 Da, 19147 Da 及び20578 Daで同定された。ラベル化されたニュートラアビジンタンパク質は、ＰＢＳ−グリセロール（１０％）溶液中において、４℃で２０時間、透析カセット（カットオフ３５００Ｄａ）により精製された。
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【０１３７】
２０は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＥＳＩにより特徴付けられる。結果を図１５に示す。
【０１３８】
（実施例７：化合物１６ａ〜ｄの光分解及びタグ２１ａ〜ｃの放出）
１００ワットのＵＶランプ（λ＝３６５ｎｍ）を用いた室温で１５分間のリン酸バッファーを溶媒とするタグペプチドエステル１６ａ〜ｄの１ｍＭ溶液の照射による光解離性ＮＰＰＯＣ保護基の分離を評価した。
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【０１３９】
タグペプチドエステル１６ａ、１６ｂ及び１６ｃの照射は、Ｌ−プロリン由来のジケトピペラジン９ａの出現、及び対応するタグペプチド２１ａ、２１ｂ及び２１ｃの放出を引き起こす。ジケトピペラジン９ａは、エレクトロスプレーイオン化ＥＳＩ質量分析法により[M+Na]+ 質量348.3 Daで、ＲＴ＝１２．３ｍｉｎで確認された。各タグペプチド２１ａ〜ｃはＥＳＩ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析により確認され、それぞれRT=10.3, 11.0, 11.2 min、[M+H]+=1035.8, 1050.5, 1064.4 Daであった。タグペプチドエステル１６ｄに関して、ＵＶ照射曝露は、タグペプチド２１ａと、ＥＳＩ質量分析法によるRT=10.1 min.及び[M+Na]+ 質量 348.3 Daによって特徴付けられたＤ−プロリンから生じるジケトピペラジン９ｂの出現を引き起こす。９ａ、９ｂ、２１ａ、２１ｂ及び２１ｃは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＥＳＩにより特徴付けられる。結果を図１６〜１９に示す。
【０１４０】
タグペプチドエステル５、１６ａ、１６ｂ、１６ｃ及び１６ｄのＵＶ照射曝露の動態研究は、図２３に要約され、タグペプチド１ａ、２１ａ、２１ｂ及び２１ｃの放出の速度と比較可能である。ＰＢＳ溶液中の１ｍＭタグペプチドエステルの１５分間のＵＶ曝露の後、タグペプチドの放出は、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析により検出及び測定された。１００％のタグペプチド１ａは１５分で放出されたので、タグペプチドエステル５は速い環化速度を示す。Ｄ−プロリン成分に起因して、１００％のタグペプチド２１ａが４時間後に検出されたので、タグペプチドエステル１６ｄは速い放出速度を示す。タグペプチド２１ａのわずかに低い放出速度は、５時間で１００％が観察された。タグペプチドエステル１６ｂ及び１６ｃに関して、たった５０％のタグペプチド２１ｂ及び２１ｃが６時間後に検出されたので、環化速度がとても低いことを示した。図２３は、タグペプチドエステル５、１６ａ、１６ｂ、１６ｃ及び１６ｄにおけるＵＶ照射曝露のタグ放出動態を示す。
【０１４１】
（実施例８：化合物１９〜２０の光分解及びタグ２１ａの放出）
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【０１４２】
タグペプチド１９への室温での照射は、RT=10.3 minでタグペプチド２１ａの放出を引き起こす。タグペプチド２１ａは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により[M+H]+=1035.8 Daと確認された。１０及び２１ａは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＥＳＩにより特徴付けられる。結果を図２０に示す。
【０１４３】
タグペプチドラベル化ニュートラアビジン２０のＵＶ照射は、タグペプチド２１ａの放出を引き起こす。タグペプチド２０からジケトピペラジンニュートラアビジン２２への総変換は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により[M+H]+=15015 Daの質量で確認され、複数ラベル化タグペプチドニュートラアビジン２０の消失が確認された。
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【０１４４】
２２及び２１ａは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＥＳＩにより特徴付けられる。結果を図２１に示す。
【０１４５】
（実施例９：異なるペプチドタグの調製）
以下の表１に示されたペプチドは、実施例１で示されるように合成されて、本発明に係るラベルにおいてタグとして用いられた。
【０１４６】
【表１】
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【０１４７】
ペプチド１〜１０のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１の配列と同一である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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