(57)【要約】  本発明は、式（ＩＡ）の化合物の製造のための方法を提供する。本発明はさらに、式（ＩＡ）の化合物からプレガバリンへの変換のための改良された方法を提供する。【化１】2016516744.tif 000138
2016516744.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＶＩ）による化合物
【化１】
2016516744.tif 000112
［式中、Ｒは、
水素、
（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、
（Ｃ１〜Ｃ６）ハロアルキル、
（Ｃ１〜Ｃ３）アルコキシ（Ｃ２〜Ｃ６）アルキル、
（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、
ハロ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルオキシから独立に選択される１、２または３つの基で置換されていてもよい、（Ｃ３〜Ｃ１０）シクロアルキル、
シクロアルキル基が、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルオキシから独立に選択される１、２または３つの基で置換されていてもよい、（Ｃ３〜Ｃ１０）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、
ハロ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルオキシから独立に選択される１、２または３つの基で置換されていてもよい、アリール、
アリール基が、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルオキシから独立に選択される１、２または３つの基で置換されていてもよい、アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、
Ｒ１−Ｃ（Ｏ）−、ならびに
Ｒ２−ＳＯ２−
から選択され、
Ｒ１は、
水素、
（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、
（Ｃ１〜Ｃ６）ハロアルキル、
（Ｃ１〜Ｃ３）アルコキシ（Ｃ２〜Ｃ６）アルキル、
（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、
ハロ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルオキシから独立に選択される１、２または３つの基で置換されていてもよい、（Ｃ３〜Ｃ１０）シクロアルキル、
シクロアルキル基が、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルオキシから独立に選択される１、２または３つの基で置換されていてもよい、（Ｃ３〜Ｃ１０）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、
ハロ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルオキシから独立に選択される１、２または３つの基で置換されていてもよい、アリール、
アリール基が、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルオキシから独立に選択される１、２または３つの基で置換されていてもよい、アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル
から選択され、
Ｒ２は、
（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、
（Ｃ１〜Ｃ６）ハロアルキル、
（Ｃ１〜Ｃ３）アルコキシ（Ｃ２〜Ｃ６）アルキル、
（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、
ハロ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルオキシから独立に選択される１、２または３つの基で置換されていてもよい、（Ｃ３〜Ｃ１０）シクロアルキル、
シクロアルキル基が、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルオキシから独立に選択される１、２または３つの基で置換されていてもよい、（Ｃ３〜Ｃ１０）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、
ハロ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルオキシから独立に選択される１、２または３つの基で置換されていてもよい、アリール、
アリール基が、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルオキシから独立に選択される１、２または３つの基で置換されていてもよい、アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル
から選択される］。
【請求項２】
式（ＶＩＡ）による５−ヒドロキシ−４−（２−メチル−１−プロペニル）−５Ｈ−２−フラノン
【化２】
2016516744.tif 000113
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
式（ＶＩＢ）の、請求項１に記載の化合物
【化３】
2016516744.tif 000114
［式中、Ｒ＊は、キラル（Ｃ５〜Ｃ１５）炭化水素基である］。
【請求項４】
Ｒ＊が、（Ｒ）−または（Ｓ）−α−メチルベンジル、（Ｒ）−または（Ｓ）−１−（１−ナフチル）エチル、（Ｒ）−または（Ｓ）−１−（２−ナフチル）エチル、メンチルおよびボルニルから選択される、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒが、Ｒ１−Ｃ（Ｏ）−またはＲ２−ＳＯ２−であり、Ｒ１およびＲ２が、キラル（Ｃ５〜Ｃ１５）炭化水素基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
式（ＩＸ）の化合物
【化４】
2016516744.tif 000115
［式中、
ｎは１であり、Ｍ＋は、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、ＮＨ４＋、（（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル）ＮＨ３＋、（（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル）２ＮＨ２＋、（（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル）３ＮＨ＋および（（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル）４Ｎ＋から選択されるか、または
ｎは２であり、Ｍ２＋は、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋およびＺｎ２＋から選択される］。
【請求項７】
ｎが１であり、Ｍ＋が、ＮＨ４＋および（（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル）ＮＨ３＋から選択される、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
ｎが１であり、Ｍ＋が、Ｌｉ＋、Ｎａ＋およびＫ＋から選択される、請求項６に記載の化合物。
【請求項９】
式（ＶＩＩ）の化合物
【化５】
2016516744.tif 000116
［式中、−Ｘ−は、単結合、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル）−、−Ｎ（ベンジル）−、または
【化６】
2016516744.tif 000117
を表す］。
【請求項１０】
４−（２−メチルプロペニル）−５−ピロリジン−１−イル−５Ｈ−フラン−２−オン；
４−（２−メチルプロペニル）−５−ピペリジン−１−イル−５Ｈ−フラン−２−オン；
４−（２−メチルプロペニル）−５−モルホリン−４−イル−５Ｈ−フラン−２−オン；および
１，４−ビス−（４−（２−メチルプロペニル）−５Ｈ−フラン−２−オン−５−イル）ピペラジン
から選択される、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
式（ＶＩＩ）の化合物
【化７】
2016516744.tif 000118
［式中、−Ｘ−は、単結合、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル）−、−Ｎ（ベンジル）−、または
【化８】
2016516744.tif 000119
を表す］
を、酸触媒の存在下、水で処理するステップを含む、
請求項２に記載の式（ＶＩＡ）の化合物の製造のための方法。
【請求項１２】
Ｒが、水素、Ｒ１−Ｃ（Ｏ）−およびＲ２−ＳＯ２−以外である、請求項１に記載の式（ＶＩ）の化合物の製造のための方法であって、式（ＶＩＡ）の化合物を、酸触媒の存在下、アルコールＲ−ＯＨで処理するステップを含む、方法。
【請求項１３】
Ｒが、水素、Ｒ１−Ｃ（Ｏ）−およびＲ２−ＳＯ２−以外である、請求項１に記載の式（ＶＩ）の化合物の製造のための方法であって、式（ＶＩＩ）の化合物を、化学量論酸の存在下、アルコールＲ−ＯＨで処理するステップを含む、方法。
【請求項１４】
ＲがＲ１−Ｃ（Ｏ）−である、請求項１に記載の式（ＶＩ）の化合物の製造のための方法であって、式（ＶＩＡ）の化合物を、酸塩化物Ｒ１−Ｃ（Ｏ）−Ｃｌまたは酸無水物（Ｒ１−Ｃ（Ｏ））２Ｏで処理するステップを含む、方法。
【請求項１５】
ＲがＲ２−ＳＯ２−である、請求項１に記載の式（ＶＩ）の化合物の製造のための方法であって、式（ＶＩＡ）の化合物を、スルホニルクロリドＲ２−ＳＯ２−Ｃｌで処理するステップを含む、方法。
【請求項１６】
３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（ＩＩ）
【化９】
2016516744.tif 000120
または薬学的に許容できるその塩の製造のための方法であって、
（ａ）５−ヒドロキシ−４−（２−メチル−１−プロペニル）−５Ｈ−２−フラノン（ＶＩＡ）
【化１０】
2016516744.tif 000121
を調製するステップと、
（ｂ）前記５−ヒドロキシ−４−（２−メチル−１−プロペニル）−５Ｈ−２−フラノンを、５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）−３，４−ジヒドロ−５Ｈ−２−フラノン（ＩＡ）
【化１１】
2016516744.tif 000122
に変換するステップと、
（ｃ）前記５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）−３，４−ジヒドロ−５Ｈ−２−フラノンを、３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（ＩＩ）に変換するステップと
を含む、方法。
【請求項１７】
３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（ＩＩ）が、（Ｓ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（（Ｓ）−ＩＩ）
【化１２】
2016516744.tif 000123
であり、前記（Ｓ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸が、少なくとも８０％の鏡像体過剰率を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ａ）が、請求項１１に記載の方法を含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｂ）が、
（ｂ１）５−ヒドロキシ−４−（２−メチル−１−プロペニル）−５Ｈ−２−フラノン（ＶＩＡ）を、金属酸化物、水酸化物、炭酸塩もしくは重炭酸塩、アンモニア、モノ、ジもしくはトリ−（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルアミン、またはテトラ−（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルアンモニウムヒドロキシドで処理して、式（ＩＸ）の塩
【化１３】
2016516744.tif 000124
［式中、
ｎは１であり、Ｍ＋は、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、ＮＨ４＋、（（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル）ＮＨ３＋、（（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル）２ＮＨ２＋、（（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル）３ＮＨ＋および（（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル）４Ｎ＋から選択されるか、または
ｎは２であり、Ｍ２＋は、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋およびＺｎ２＋から選択される］
を形成するステップと、
（ｂ２）式（ＩＸ）の塩を水素化して、式（Ｘ）の塩
【化１４】
2016516744.tif 000125
を取得するステップと、
（ｂ３）式（Ｘ）の塩を酸で処理するステップと
を含む、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｂ）が、
（ｂ１）５−ヒドロキシ−４−（２−メチル−１−プロペニル）−５Ｈ−２−フラノン（ＶＩＡ）を、Ｒがキラル（Ｃ５〜Ｃ１５）炭化水素基である、請求項３に記載の式（ＶＩ）の化合物に変換するステップと、
（ｂ２）式（ＶＩ）の化合物を水素化して、式（ＸＩ）の化合物
【化１５】
2016516744.tif 000126
［式中、Ｒ＊は、キラル（Ｃ５〜Ｃ１５）炭化水素基である］
を取得するステップと、
（ｂ３）式（ＸＩ）の化合物を酸で処理して、（（Ｓ）−ＩＡ）を得るステップと
を含む、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（ＩＩ）
【化１６】
2016516744.tif 000127
または薬学的に許容できるその塩の製造のための方法であって、
（ａ）５−ヒドロキシ−４−（２−メチル−１−プロペニル）−５Ｈ−２−フラノン（ＶＩＡ）
【化１７】
2016516744.tif 000128
を調製するステップと、
（ｂ）５−ヒドロキシ−４−（２−メチル−１−プロペニル）−５Ｈ−２−フラノン（ＶＩＡ）を、アンモニアまたはモノ−（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルアミンで処理して、式（ＩＸＡ）の塩
【化１８】
2016516744.tif 000129
［式中、
ｎは１であり、Ｍ＋は、ＮＨ４＋および（（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル）ＮＨ３＋から選択される］
を形成するステップと、
（ｃ）式（ＩＸＡ）の塩を水素化して、式（ＸＡ）の塩
【化１９】
2016516744.tif 000130
を取得するステップと、
（ｄ）式（ＸＡ）の塩を、トランスアミナーゼまたはアミンオキシダーゼ／イミンレダクターゼ酵素で処理して、３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（ＩＩ）を提供するステップと
を含む、方法。
【請求項２２】
３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（ＩＩ）が、（Ｓ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（（Ｓ）−ＩＩ）
【化２０】
2016516744.tif 000131
であり、前記（Ｓ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸が、少なくとも８０％の鏡像体過剰率を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ａ）が、請求項１１に記載の方法を含む、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）−３，４−ジヒドロ−５Ｈ−２−フラノン（ＩＡ）
【化２１】
2016516744.tif 000132
の製造のための方法であって、
（ａ）３−イソブチリデン−２−オキソペンタン二酸（ＸＩＩＡ）またはその環化異性体（ＸＩＩＢ）
【化２２】
2016516744.tif 000133
を取得するステップと、
（ｂ）順次にまたは同時に、炭素−炭素二重結合を還元し、α−ケト酸官能基を脱炭酸するステップと
を含む、方法。
【請求項２５】
α−ケト酸官能基の脱炭酸の前に、炭素−炭素二重結合を還元して、３−イソブチル−２−オキソペンタン二酸（ＸＶ）またはその環化異性体（ＸＶＡ）
【化２３】
2016516744.tif 000134
を提供する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
炭素−炭素二重結合の還元の前に、α−ケト酸官能基を脱炭酸して、３−ホルミル−５−メチル−３−ペンテン酸（ＸＶＩ）またはその環化異性体（ＸＶＩＡ）
【化２４】
2016516744.tif 000135
を提供する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
α−ケト酸官能基を脱炭酸し、同時に炭素−炭素二重結合を還元する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
脱炭酸が、デカルボキシラーゼ酵素の存在下で行われる、請求項２４から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
炭素−炭素二重結合の還元が、エノエートレダクターゼ酵素の存在下で行われる、請求項２４から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
３−イソブチリデン−２−オキソペンタン二酸、
３−イソブチル−２−オキソペンタン二酸、および
３−ホルミル−５−メチル−３−ペンテン酸
から選択される化合物、
またはその塩、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルエステルもしくは環化異性体。
【請求項３１】
（Ｓ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（（Ｓ）−ＩＩ）
【化２５】
2016516744.tif 000136
または薬学的に許容できるその塩の製造のための方法であって、
（ａ）請求項２３から２８のいずれか一項に記載の方法を使用して、５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）−３，４−ジヒドロ−５Ｈ−２−フラノン（ＩＡ）を製造するステップと、
（ｂ）前記５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）−３，４−ジヒドロ−５Ｈ−２−フラノンを、（Ｓ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸に変換するステップと
を含む、方法。
【請求項３２】
（Ｒ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸を（Ｓ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸に変換するための方法であって、（Ｒ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸を、トランスアミナーゼ酵素またはアミンデヒドロゲナーゼ／イミンレダクターゼ酵素で処理するステップを含む、方法。
【請求項３３】
（Ｒ）−および（Ｓ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸の混合物中における（Ｓ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸の割合を増大させるための方法であって、混合物を、トランスアミナーゼ酵素またはアミンデヒドロゲナーゼ／イミンレダクターゼ酵素で処理するステップを含む、方法。
【請求項３４】
アミノ酸配列
ＭＮＫＰＱＳＷＥＡＲＡＥＴＹＳＬＹＧＦＴＤＭＰＳＬＨＸ２７ＲＧＴＶＶＶＴＨＧＥＧＰＹＸ４１ＶＤＶＸ４５ＧＲＲＹＬＤＡＮＳＧＬＹＮＭＶＡＧＦＤＨＫＧＬＩＤＡＡＫＡＱＹＥＲＦＰＧＹＨＳＦＦＧＲＭＳＤＱＴＶＭＬＳＥＫＬＶＥＶＳＰＦＤＳＧＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＡＮＤＴＭＶＫＭＬＷＦＬＨＡＡＥＧＫＰＱＫＲＫＩＬＴＲＸ１４７ＮＡＹＨＧＶＴＡＶＳＡＳＭＴＧＸ１６３ＰＸ１６５ＮＳＶＦＧＬＰＬＰＧＦＶＨＬＸ１８０ＣＰＨＹＷＲＹＧＥＥＧＥＴＥＥＱＦＶＡＲＬＡＲＥＬＥＥＴＩＱＲＥＧＡＤＴＩＡＧＦＦＡＥＰＶＭＧＡＧＧＶＩＰＰＡＫＧＹＦＱＡＩＬＰＩＬＲＫＹＤＩＰＶＩＳＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＮＴＷＧＣＶＴＹＤＦＴＰＤＡＩＩＳＳＫＮＬＴＡＧＦＦＰＶＧＡＶＩＬＧＰＥＬＸ３０４ＫＲＬＥＴＡＩＥＡＩＥＥＦＰＨＧＦＴＡＸ３２４ＧＨＰＶＧＣＡＩＡＬＫＡＩＤＶＶＭＮＥＧＬＡＥＮＶＲＲＬＡＰＲＦＥＥＲＬＫＨＩＡＥＲＰＮＩＧＥＹＲＧＩＧＦＭＷＡＬＥＡＶＫＤＫＡＳＫＴＰＦＤＧＮＬＳＶＳＸ４０１ＲＩＡＮＴＣＸ４０８ＤＬＧＬＩＣＸ４１５Ｘ４１６Ｘ４１７ＧＱＳＶＩＬＸ４２４ＰＰＦＩＬＴＥＡＱＭＤＥＭＦＤＫＬＥＫＡＬＤＫＶＦＡＥＶＡ（配列番号１）
［ここで、
Ｘ２７は、グルタミン（Ｑ）およびグルタミン酸（Ｅ）から選択され、
Ｘ４１は、イソロイシン（Ｉ）およびバリン（Ｖ）から選択され、
Ｘ４５は、アスパラギン（Ｎ）およびヒスチジン（Ｈ）から選択され、
Ｘ１４７は、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）から選択され、
Ｘ１６３は、ロイシン（Ｌ）およびメチオニン（Ｍ）から選択され、
Ｘ１６５は、チロシン（Ｙ）およびヒスチジン（Ｈ）から選択され、
Ｘ１８０は、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）から選択され、
Ｘ３０４は、アラニン（Ａ）およびセリン（Ｓ）から選択され、
Ｘ３２４は、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）から選択され、
Ｘ４０１は、リシン（Ｋ）およびグルタミン酸（Ｅ）から選択され、
Ｘ４０８は、トレオニン（Ｔ）およびグルタミン（Ｑ）から選択され、
Ｘ４１５は、セリン（Ｓ）およびアラニン（Ａ）から選択され、
Ｘ４１６は、プロリン（Ｐ）およびアラニン（Ａ）から選択され、
Ｘ４１７は、ロイシン（Ｌ）およびメチオニン（Ｍ）から選択され、
Ｘ４２４は、システイン（Ｃ）およびセリン（Ｓ）から選択される］
と少なくとも９５％相同性を有するアミノ酸配列を有する、トランスアミナーゼ酵素。
【請求項３５】
配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項３４に記載のトランスアミナーゼ酵素。
【請求項３６】
Ｘ２７がグルタミン酸（Ｅ）であり、
Ｘ１４７がグルタミン（Ｑ）であり、
Ｘ１６５がヒスチジン（Ｈ）であり、
Ｘ３０４がセリン（Ｓ）であり、
Ｘ３２４がグリシン（Ｇ）であり、
Ｘ４０１がリシン（Ｋ）であり、
Ｘ４０８がグルタミン（Ｑ）であり、
Ｘ４１６がアラニン（Ａ）であり、
Ｘ４１７がメチオニン（Ｍ）であり、
Ｘ４２４がセリン（Ｓ）である、
請求項３４または３５に記載のトランスアミナーゼ酵素。
【請求項３７】
ＭＮＫＰＱＳＷＥＡＲＡＥＴＹＳＬＹＧＦＴＤＭＰＳＬＨＱＲＧＴＶＶＶＴＨＧＥＧＰＹＩＶＤＶＮＧＲＲＹＬＤＡＮＳＧＬＹＮＭＶＡＧＦＤＨＫＧＬＩＤＡＡＫＡＱＹＥＲＦＰＧＹＨＳＦＦＧＲＭＳＤＱＴＶＭＬＳＥＫＬＶＥＶＳＰＦＤＳＧＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＡＮＤＴＭＶＫＭＬＷＦＬＨＡＡＥＧＫＰＱＫＲＫＩＬＴＲＮＮＡＹＨＧＶＴＡＶＳＡＳＭＴＧＬＰＹＮＳＶＦＧＬＰＬＰＧＦＶＨＬＴＣＰＨＹＷＲＹＧＥＥＧＥＴＥＥＱＦＶＡＲＬＡＲＥＬＥＥＴＩＱＲＥＧＡＤＴＩＡＧＦＦＡＥＰＶＭＧＡＧＧＶＩＰＰＡＫＧＹＦＱＡＩＬＰＩＬＲＫＹＤＩＰＶＩＳＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＮＴＷＧＣＶＴＹＤＦＴＰＤＡＩＩＳＳＫＮＬＴＡＧＦＦＰＶＧＡＶＩＬＧＰＥＬＡＫＲＬＥＴＡＩＥＡＩＥＥＦＰＨＧＦＴＡＳＧＨＰＶＧＣＡＩＡＬＫＡＩＤＶＶＭＮＥＧＬＡＥＮＶＲＲＬＡＰＲＦＥＥＲＬＫＨＩＡＥＲＰＮＩＧＥＹＲＧＩＧＦＭＷＡＬＥＡＶＫＤＫＡＳＫＴＰＦＤＧＮＬＳＶＳＥＲＩＡＮＴＣＴＤＬＧＬＩＣＳＰＭＧＱＳＶＩＬＣＰＰＦＩＬＴＥＡＱＭＤＥＭＦＤＫＬＥＫＡＬＤＫＶＦＡＥＶＡ（配列番号２）；
ＭＮＫＰＱＳＷＥＡＲＡＥＴＹＳＬＹＧＦＴＤＭＰＳＬＨＥＲＧＴＶＶＶＴＨＧＥＧＰＹＩＶＤＶＮＧＲＲＹＬＤＡＮＳＧＬＹＮＭＶＡＧＦＤＨＫＧＬＩＤＡＡＫＡＱＹＥＲＦＰＧＹＨＳＦＦＧＲＭＳＤＱＴＶＭＬＳＥＫＬＶＥＶＳＰＦＤＳＧＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＡＮＤＴＭＶＫＭＬＷＦＬＨＡＡＥＧＫＰＱＫＲＫＩＬＴＲＮＮＡＹＨＧＶＴＡＶＳＡＳＭＴＧＬＰＹＮＳＶＦＧＬＰＬＰＧＦＶＨＬＴＣＰＨＹＷＲＹＧＥＥＧＥＴＥＥＱＦＶＡＲＬＡＲＥＬＥＥＴＩＱＲＥＧＡＤＴＩＡＧＦＦＡＥＰＶＭＧＡＧＧＶＩＰＰＡＫＧＹＦＱＡＩＬＰＩＬＲＫＹＤＩＰＶＩＳＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＮＴＷＧＣＶＴＹＤＦＴＰＤＡＩＩＳＳＫＮＬＴＡＧＦＦＰＶＧＡＶＩＬＧＰＥＬＳＫＲＬＥＴＡＩＥＡＩＥＥＦＰＨＧＦＴＡＧＧＨＰＶＧＣＡＩＡＬＫＡＩＤＶＶＭＮＥＧＬＡＥＮＶＲＲＬＡＰＲＦＥＥＲＬＫＨＩＡＥＲＰＮＩＧＥＹＲＧＩＧＦＭＷＡＬＥＡＶＫＤＫＡＳＫＴＰＦＤＧＮＬＳＶＳＫＲＩＡＮＴＣＱＤＬＧＬＩＣＳＡＬＧＱＳＶＩＬＣＰＰＦＩＬＴＥＡＱＭＤＥＭＦＤＫＬＥＫＡＬＤＫＶＦＡＥＶＡ（配列番号３）；
ＭＮＫＰＱＳＷＥＡＲＡＥＴＹＳＬＹＧＦＴＤＭＰＳＬＨＥＲＧＴＶＶＶＴＨＧＥＧＰＹＶＶＤＶＮＧＲＲＹＬＤＡＮＳＧＬＹＮＭＶＡＧＦＤＨＫＧＬＩＤＡＡＫＡＱＹＥＲＦＰＧＹＨＳＦＦＧＲＭＳＤＱＴＶＭＬＳＥＫＬＶＥＶＳＰＦＤＳＧＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＡＮＤＴＭＶＫＭＬＷＦＬＨＡＡＥＧＫＰＱＫＲＫＩＬＴＲＱＮＡＹＨＧＶＴＡＶＳＡＳＭＴＧＬＰＨＮＳＶＦＧＬＰＬＰＧＦＶＨＬＴＣＰＨＹＷＲＹＧＥＥＧＥＴＥＥＱＦＶＡＲＬＡＲＥＬＥＥＴＩＱＲＥＧＡＤＴＩＡＧＦＦＡＥＰＶＭＧＡＧＧＶＩＰＰＡＫＧＹＦＱＡＩＬＰＩＬＲＫＹＤＩＰＶＩＳＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＮＴＷＧＣＶＴＹＤＦＴＰＤＡＩＩＳＳＫＮＬＴＡＧＦＦＰＶＧＡＶＩＬＧＰＥＬＳＫＲＬＥＴＡＩＥＡＩＥＥＦＰＨＧＦＴＡＧＧＨＰＶＧＣＡＩＡＬＫＡＩＤＶＶＭＮＥＧＬＡＥＮＶＲＲＬＡＰＲＦＥＥＲＬＫＨＩＡＥＲＰＮＩＧＥＹＲＧＩＧＦＭＷＡＬＥＡＶＫＤＫＡＳＫＴＰＦＤＧＮＬＳＶＳＫＲＩＡＮＴＣＱＤＬＧＬＩＣＳＡＬＧＱＳＶＩＬＳＰＰＦＩＬＴＥＡＱＭＤＥＭＦＤＫＬＥＫＡＬＤＫＶＦＡＥＶＡ（配列番号４）；
ＭＮＫＰＱＳＷＥＡＲＡＥＴＹＳＬＹＧＦＴＤＭＰＳＬＨＥＲＧＴＶＶＶＴＨＧＥＧＰＹＩＶＤＶＮＧＲＲＹＬＤＡＮＳＧＬＹＮＭＶＡＧＦＤＨＫＧＬＩＤＡＡＫＡＱＹＥＲＦＰＧＹＨＳＦＦＧＲＭＳＤＱＴＶＭＬＳＥＫＬＶＥＶＳＰＦＤＳＧＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＡＮＤＴＭＶＫＭＬＷＦＬＨＡＡＥＧＫＰＱＫＲＫＩＬＴＲＱＮＡＹＨＧＶＴＡＶＳＡＳＭＴＧＭＰＨＮＳＶＦＧＬＰＬＰＧＦＶＨＬＴＣＰＨＹＷＲＹＧＥＥＧＥＴＥＥＱＦＶＡＲＬＡＲＥＬＥＥＴＩＱＲＥＧＡＤＴＩＡＧＦＦＡＥＰＶＭＧＡＧＧＶＩＰＰＡＫＧＹＦＱＡＩＬＰＩＬＲＫＹＤＩＰＶＩＳＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＮＴＷＧＣＶＴＹＤＦＴＰＤＡＩＩＳＳＫＮＬＴＡＧＦＦＰＶＧＡＶＩＬＧＰＡＬＳＫＲＬＥＴＡＩＥＡＩＥＥＦＰＨＧＦＴＡＧＧＨＰＶＧＣＡＩＡＬＫＡＩＤＶＶＭＮＥＧＬＡＥＮＶＲＲＬＡＰＲＦＥＥＲＬＫＨＩＡＥＲＰＮＩＧＥＹＲＧＩＧＦＭＷＡＬＥＡＶＫＤＫＡＳＫＴＰＦＤＧＮＬＳＶＳＫＲＩＡＮＴＣＱＤＬＧＬＩＣＳＡＭＧＱＳＶＩＬＳＰＰＦＩＬＴＥＡＱＭＤＥＭＦＤＫＬＥＫＡＬＤＫＶＦＡＥＶＡ（配列番号５）；
ＭＮＫＰＱＳＷＥＡＲＡＥＴＹＳＬＹＧＦＴＤＭＰＳＬＨＥＲＧＴＶＶＶＴＨＧＥＧＰＹＶＶＤＶＮＧＲＲＹＬＤＡＮＳＧＬＹＮＭＶＡＧＦＤＨＫＧＬＩＤＡＡＫＡＱＹＥＲＦＰＧＹＨＳＦＦＧＲＭＳＤＱＴＶＭＬＳＥＫＬＶＥＶＳＰＦＤＳＧＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＡＮＤＴＭＶＫＭＬＷＦＬＨＡＡＥＧＫＰＱＫＲＫＩＬＴＲＱＮＡＹＨＧＶＴＡＶＳＡＳＭＴＧＬＰＨＮＳＶＦＧＬＰＬＰＧＦＶＨＬＧＣＰＨＹＷＲＹＧＥＥＧＥＴＥＥＱＦＶＡＲＬＡＲＥＬＥＥＴＩＱＲＥＧＡＤＴＩＡＧＦＦＡＥＰＶＭＧＡＧＧＶＩＰＰＡＫＧＹＦＱＡＩＬＰＩＬＲＫＹＤＩＰＶＩＳＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＮＴＷＧＣＶＴＹＤＦＴＰＤＡＩＩＳＳＫＮＬＴＡＧＦＦＰＶＧＡＶＩＬＧＰＥＬＳＫＲＬＥＴＡＩＥＡＩＥＥＦＰＨＧＦＴＡＧＧＨＰＶＧＣＡＩＡＬＫＡＩＤＶＶＭＮＥＧＬＡＥＮＶＲＲＬＡＰＲＦＥＥＲＬＫＨＩＡＥＲＰＮＩＧＥＹＲＧＩＧＦＭＷＡＬＥＡＶＫＤＫＡＳＫＴＰＦＤＧＮＬＳＶＳＫＲＩＡＮＴＣＱＤＬＧＬＩＣＡＡＭＧＱＳＶＩＬＳＰＰＦＩＬＴＥＡＱＭＤＥＭＦＤＫＬＥＫＡＬＤＫＶＦＡＥＶＡ（配列番号６）；および
ＭＮＫＰＱＳＷＥＡＲＡＥＴＹＳＬＹＧＦＴＤＭＰＳＬＨＥＲＧＴＶＶＶＴＨＧＥＧＰＹＩＶＤＶＨＧＲＲＹＬＤＡＮＳＧＬＹＮＭＶＡＧＦＤＨＫＧＬＩＤＡＡＫＡＱＹＥＲＦＰＧＹＨＳＦＦＧＲＭＳＤＱＴＶＭＬＳＥＫＬＶＥＶＳＰＦＤＳＧＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＡＮＤＴＭＶＫＭＬＷＦＬＨＡＡＥＧＫＰＱＫＲＫＩＬＴＲＱＮＡＹＨＧＶＴＡＶＳＡＳＭＴＧＬＰＨＮＳＶＦＧＬＰＬＰＧＦＶＨＬＳＣＰＨＹＷＲＹＧＥＥＧＥＴＥＥＱＦＶＡＲＬＡＲＥＬＥＥＴＩＱＲＥＧＡＤＴＩＡＧＦＦＡＥＰＶＭＧＡＧＧＶＩＰＰＡＫＧＹＦＱＡＩＬＰＩＬＲＫＹＤＩＰＶＩＳＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＮＴＷＧＣＶＴＹＤＦＴＰＤＡＩＩＳＳＫＮＬＴＡＧＦＦＰＶＧＡＶＩＬＧＰＥＬＳＫＲＬＥＴＡＩＥＡＩＥＥＦＰＨＧＦＴＡＧＧＨＰＶＧＣＡＩＡＬＫＡＩＤＶＶＭＮＥＧＬＡＥＮＶＲＲＬＡＰＲＦＥＥＲＬＫＨＩＡＥＲＰＮＩＧＥＹＲＧＩＧＦＭＷＡＬＥＡＶＫＤＫＡＳＫＴＰＦＤＧＮＬＳＶＳＫＲＩＡＮＴＣＱＤＬＧＬＩＣＳＡＭＧＱＳＶＩＬＳＰＰＦＩＬＴＥＡＱＭＤＥＭＦＤＫＬＥＫＡＬＤＫＶＦＡＥＶＡ（配列番号７）
から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項３５に記載のトランスアミナーゼ酵素。
【請求項３８】
（Ｓ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（（Ｓ）−ＩＩ）
【化２６】
2016516744.tif 000137
または薬学的に許容できるその塩の製造のための方法であって、５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）−３，４−ジヒドロ−５Ｈ−２−フラノン（ＩＡ）およびアミンを、請求項３４から３７のいずれか一項に記載のトランスアミナーゼ酵素で処理するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（Ｓ）−（＋）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（プレガバリン）の製造において使用するための、５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）−３，４−ジヒドロ−５Ｈ−２−フラノンおよびその誘導体の製造に関する。本発明はさらに、５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）−３，４−ジヒドロ−５Ｈ−２−フラノンからプレガバリンへの変換のための改良された方法に関する。プレガバリンは、ヒトα２δカルシウムチャネルサブユニットに対する結合親和性を呈するγ−アミノ酸である。
【背景技術】
【０００２】
プレガバリン、または（Ｓ）−（＋）−３−アミノメチル−５−メチル−ヘキサン酸（（Ｓ）−ＩＩ）、
【０００３】
【化１】
2016516744.tif 000003
は、てんかん、神経因性疼痛、線維筋痛および全般性不安障害の治療用に承認されている、Ｌｙｒｉｃａ（登録商標）中の活性剤である。プレガバリンは、米国特許第５，５６３，１７５号において論じられている通りの抗けいれん活性、および米国特許第６，００１，８７６号において論じられている通りの抗侵害受容活性を呈する。プレガバリン（ＩＩ）の薬理活性は、カルシウムチャネルのアルファ−２−デルタ（α２δ）サブユニットとの結合の結果であると仮定されている。プレガバリン（ＩＩ）は、精神運動刺激、炎症、胃腸損傷、アルコール依存症、不眠症、ならびに不安神経症、鬱病、躁病および双極性障害を包含する種々の精神障害に関連する生理学的状態等、他の状態において有用性を有するとしても記述されている。
【０００４】
プレガバリンを製造するための多数の方法が開示されてきた。５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）−３，４−ジヒドロ−５Ｈ−２−フラノン（ＩＡ）は、有用な前駆体として同定されている。
【０００５】
【化２】
2016516744.tif 000004
【０００６】
化合物（ＩＡ）は、本明細書で論じられている多数の他の化合物と共通して、４−オキソブタン酸誘導体の環化異性体であるとみなされ得ることが分かるであろう。４−オキソブタン酸の誘導体は、開鎖形態として、または環状形態としてのいずれかで存在することができる。
【０００７】
【化３】
2016516744.tif 000005
【０００８】
これらの２つの異性形態は、平衡状態で共存することができ、２つの形態の相対寄与は、種の正確な化学的性質によって決まることになる。
【０００９】
国際特許出願公開第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００４６９９号（ＷＯ２００８／１２７６４６Ａ２として公開されている）は、化学的または酵素媒介性還元的アミノ化を使用する、５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）−３，４−ジヒドロ−５Ｈ−２−フラノン（ＩＡ）または開環異性形態のエステル（ＸＩＩＩ、ここでＲＡはアルキルである）から（ＩＩ）への変換を提唱している。トランスアミナーゼ酵素の使用は、好ましい（（Ｓ）−ＩＩ）鏡像異性体を選択的に提供するであろうことが示唆されている。
【００１０】
【化４】
2016516744.tif 000006
【００１１】
エステル（ＸＩＩＩ）は、４−メチルペンタナール（ＩＩＩ）から、ジイソブチルアミンの存在下での適切なハロアセテートによるアルキル化によって調製される。前駆体（ＩＡ）は、エステル（ＸＩＩＩ）のエステル加水分解によって、またはグリオキシル酸（ＩＶ）による４−メチルペンタナール（ＩＩＩ）の縮合および後続の二重結合の還元によってのいずれかで作製される。酵素媒介性還元の使用も、所望の立体化学を導入する手法として示唆されている。
【００１２】
【化５】
2016516744.tif 000007
【００１３】
国際特許出願公開第ＰＣＴ／ＩＮ２０１０／０００１４０号（ＷＯ２０１１／０８６５６５として公開されている）は、関連する方法を開示している。４−メチルペンタナール（ＩＩＩ）およびグリオキシル酸（ＩＶ）の縮合生成物を、α−メチルベンジルアミン等のキラルアミンと反応させて、ピロロン（Ｖ）を得る。水素化によりある程度の立体選択性が得られ、脱保護によりキラル形態のプレガバリン（ＩＩ）が得られる。
【００１４】
【化６】
2016516744.tif 000008
【００１５】
プレガバリン（ＩＩ）のまたさらに改良された合成が求められている。費用効率が高く、かつ安全な方法を提供することがとりわけ望ましい。特に、商業規模で行うことができ、容易に入手可能な、安価かつ安全な出発材料および試薬を使用し、困難な分離の必要性を回避する、プレガバリン（ＩＩ）の合成を提供することが重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）−３，４−ジヒドロ−５Ｈ−２−フラノン（ＩＡ）の製造のための改良された方法、およびこれらの改良された方法において有用である中間体を提供する。
【００１８】
第一の態様Ａ１において、本発明は、式（ＶＩ）による化合物
【００１９】
【化７】
2016516744.tif 000009
を提供する。
【００２０】
第一の実施形態Ａ１Ｅ１において、本発明は、式（ＶＩ）による化合物［式中、Ｒは、
水素、
（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、
（Ｃ１〜Ｃ６）ハロアルキル、
（Ｃ１〜Ｃ３）アルコキシ（Ｃ２〜Ｃ６）アルキル、
（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、
ハロ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルオキシから独立に選択される１、２または３つの基で置換されていてもよい、（Ｃ３〜Ｃ１０）シクロアルキル、
シクロアルキル基が、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルオキシから独立に選択される１、２または３つの基で置換されていてもよい、（Ｃ３〜Ｃ１０）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、
ハロ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルオキシから独立に選択される１、２または３つの基で置換されていてもよい、アリール、
アリール基が、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルオキシから独立に選択される１、２または３つの基で置換されていてもよい、アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、
Ｒ１−Ｃ（Ｏ）−、ならびに
Ｒ２−ＳＯ２−
から選択され、
Ｒ１は、
水素、
（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、
（Ｃ１〜Ｃ６）ハロアルキル、
（Ｃ１〜Ｃ３）アルコキシ（Ｃ２〜Ｃ６）アルキル、
（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、
ハロ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルオキシから独立に選択される１、２または３つの基で置換されていてもよい、（Ｃ３〜Ｃ１０）シクロアルキル、
シクロアルキル基が、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルオキシから独立に選択される１、２または３つの基で置換されていてもよい、（Ｃ３〜Ｃ１０）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、
ハロ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルオキシから独立に選択される１、２または３つの基で置換されていてもよい、アリール、ならびに
アリール基が、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルオキシから独立に選択される１、２または３つの基で置換されていてもよい、アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル
から選択され、
Ｒ２は、
（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、
（Ｃ１〜Ｃ６）ハロアルキル、
（Ｃ１〜Ｃ３）アルコキシ（Ｃ２〜Ｃ６）アルキル、
（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、
ハロ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルオキシから独立に選択される１、２または３つの基で置換されていてもよい、（Ｃ３〜Ｃ１０）シクロアルキル、
シクロアルキル基が、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルオキシから独立に選択される１、２または３つの基で置換されていてもよい、（Ｃ３〜Ｃ１０）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、
ハロ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルオキシから独立に選択される１、２または３つの基で置換されていてもよい、アリール、ならびに
アリール基が、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルオキシから独立に選択される１、２または３つの基で置換されていてもよい、アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル
から選択される］
を提供する。
【００２１】
さらなる実施形態Ａ１Ｅ２において、本発明は、式（ＶＩ）の化合物が、式（ＶＩＡ）による５−ヒドロキシ−４−（２−メチル−１−プロペニル）−５Ｈ−２−フラノンであるように、Ｒが水素である、実施形態Ａ１Ｅ１による化合物を提供する。
【００２２】
【化８】
2016516744.tif 000010
【００２３】
さらなる実施形態Ａ１Ｅ３において、本発明は、式（ＶＩＢ）の、実施形態Ａ１Ｅ１による化合物
【００２４】
【化９】
2016516744.tif 000011
［式中、Ｒ＊は、キラル（Ｃ５〜Ｃ１５）炭化水素基である］
を提供する。
【００２５】
さらなる実施形態Ａ１Ｅ４において、本発明は、式（ＶＩ）の化合物が式（ＶＩＣ）〜（ＶＩＫ）の化合物であるように、Ｒ＊が、（Ｒ）−または（Ｓ）−α−メチルベンジル、（Ｒ）−または（Ｓ）−１−（１−ナフチル）エチル、（Ｒ）−または（Ｓ）−１−（２−ナフチル）エチル、メンチルおよびボルニルから選択される、実施形態Ａ１Ｅ３による化合物を提供する。
【００２６】
【化１０】
2016516744.tif 000012
【００２７】
さらなる実施形態Ａ１Ｅ５において、本発明は、Ｒが、Ｒ１−Ｃ（Ｏ）−またはＲ２−ＳＯ２−であり、Ｒ１およびＲ２が、キラル（Ｃ５〜Ｃ１５）炭化水素基である、実施形態Ａ１Ｅ１による化合物を提供する。
【００２８】
別の態様Ａ２において、本発明は、式（ＩＸ）の化合物
【００２９】
【化１１】
2016516744.tif 000013
を提供する。
【００３０】
式（ＩＸ）の化合物は、（Ｅ）もしくは（Ｚ）幾何異性体として、または２つの幾何異性体の混合物としてのいずれかで、存在し得る。
【００３１】
第一の実施形態Ａ２Ｅ１において、本発明は、式（ＩＸ）の化合物［式中、
ｎは１であり、Ｍ＋は、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、ＮＨ４＋、（（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル）ＮＨ３＋、（（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル）２ＮＨ２＋、（（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル）３ＮＨ＋および（（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル）４Ｎ＋から選択されるか、または
ｎは２であり、Ｍ２＋は、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋およびＺｎ２＋から選択される］
を提供する。
【００３２】
さらなる実施形態Ａ２Ｅ２において、本発明は、ｎが１であり、Ｍ＋が、ＮＨ４＋および（（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル）ＮＨ３＋から選択される、実施形態Ａ２Ｅ１による化合物を提供する。
【００３３】
さらなる実施形態Ａ２Ｅ３において、本発明は、ｎが１であり、Ｍ＋が、Ｌｉ＋、Ｎａ＋およびＫ＋から選択される、実施形態Ａ２Ｅ１による化合物を提供する。
【００３４】
別の態様Ａ３において、本発明は、式（ＶＩＩ）の化合物
【００３５】
【化１２】
2016516744.tif 000014
を提供する。
【００３６】
第一の実施形態Ａ３Ｅ１において、本発明は、式（ＶＩＩ）の化合物［式中、−Ｘ−は、単結合、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＮＨ−，−Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル）−、−Ｎ（ベンジル）−、または
【００３７】
【化１３】
2016516744.tif 000015
を表す］を提供する。
【００３８】
さらなる実施形態Ａ３Ｅ２において、本発明は、
４−（２−メチルプロペニル）−５−ピロリジン−１−イル−５Ｈ−フラン−２−オン；
４−（２−メチルプロペニル）−５−ピペリジン−１−イル−５Ｈ−フラン−２−オン；
４−（２−メチルプロペニル）−５−モルホリン−４−イル−５Ｈ−フラン−２−オン；および
１，４−ビス−（４−（２−メチルプロペニル）−５Ｈ−フラン−２−オン−５−イル）ピペラジン
から選択される、実施形態Ａ３Ｅ１による化合物を提供する。
【００３９】
別の態様Ａ４において、本発明は、式（ＶＩＩＩ）の化合物
【００４０】
【化１４】
2016516744.tif 000016
を提供する。
【００４１】
第一の実施形態Ａ４Ｅ１において、本発明は、式（ＶＩＩＩ）の化合物［式中、−Ｙ−は、単結合、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル）−、−Ｎ（ベンジル）−、または
【００４２】
【化１５】
2016516744.tif 000017
を表す］を提供する。
【００４３】
さらなる実施形態Ａ４Ｅ２において、本発明は、
４−（４−メチル−１，３−ペンタジエン−１−イル）モルホリン；
１−（４−メチル−１，３−ペンタジエン−１−イル）−ピペラジン、
１−（４−メチル−１，３−ペンタジエン−１−イル）−４−メチルピペラジン、
４−エチル−１−（４−メチル−１，３−ペンタジエン−１−イル）−ピペラジン、
４−ベンジル−１−（４−メチル−１，３−ペンタジエン−１−イル）−ピペラジン、および
１，４−ビス−（４−メチル−１，３−ペンタジエン−１−イル）ピペラジン
から選択される、実施形態Ａ４Ｅ１による化合物を提供する。
【００４４】
別の態様Ａ５において、本発明は、式（ＶＩＡ）の化合物の製造のための方法であって、式（ＶＩＩ）の化合物を、酸触媒の存在下、水で処理するステップを含む方法を提供する。
【００４５】
第一の実施形態Ａ５Ｅ１において、本発明は、式（ＶＩＡ）の化合物の製造のための方法であって、
（ａ）式（ＶＩＩ）の化合物
【００４６】
【化１６】
2016516744.tif 000018
［式中、−Ｘ−は、単結合、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル）−、−Ｎ（ベンジル）−、または
【００４７】
【化１７】
2016516744.tif 000019
を表す］
を調製するステップと、
（ｂ）式（ＶＩＩ）の化合物を、酸触媒の存在下、水で処理するステップと
を含む方法を提供する。
【００４８】
さらなる実施形態Ａ５Ｅ２において、本発明は、ステップ（ａ）からの式（ＶＩＩ）の化合物が、加水分解ステップ（ｂ）の前に単離される、実施形態Ａ５Ｅ１による方法を提供する。
【００４９】
さらなる実施形態Ａ５Ｅ３において、本発明は、式（ＶＩＩ）または（ＶＩＩＢ）の化合物が加水分解ステップ（ｂ）の前に単離されないように、加水分解ステップ（ｂ）がステップ（ａ）の直後に行われる、実施形態Ａ５Ｅ１による方法を提供する。
【００５０】
さらなる実施形態Ａ５Ｅ４において、本発明は、式（ＶＩＩ）の化合物が、式（ＶＩＩＩ）の化合物
【００５１】
【化１８】
2016516744.tif 000020
［式中、−Ｙ−は、単結合、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル）−、−Ｎ（ベンジル）−、または
【００５２】
【化１９】
2016516744.tif 000021
を表す］を、グリオキシル酸またはその水和物で処理することによって調製される、実施形態Ａ５Ｅ１、Ａ５Ｅ２またはＡ５Ｅ３による方法を提供する。
【００５３】
別の態様Ａ６において、本発明は、Ｒが、水素、Ｒ１−Ｃ（Ｏ）−およびＲ２−ＳＯ２−以外である、式（ＶＩ）の化合物の製造のための方法であって、式（ＶＩＡ）の化合物を、酸触媒の存在下、アルコールＲ−ＯＨで処理するステップを含む方法を提供する。
【００５４】
実施形態Ａ６Ｅ１において、本発明は、Ｒが、水素、Ｒ１−Ｃ（Ｏ）−およびＲ２−ＳＯ２−以外である、式（ＶＩ）の化合物の製造のための方法であって、
（ａ）上記で定義した通りの実施形態Ａ５Ｅ１、Ａ５Ｅ２、Ａ５Ｅ３およびＡ５Ｅ４のいずれかによる方法を使用して、式（ＶＩＡ）の化合物を調製するステップと、
（ｂ）式（ＶＩＡ）の化合物を、酸触媒の存在下、アルコールＲ−ＯＨで処理するステップと
を含む方法を提供する。
【００５５】
別の態様Ａ７において、本発明は、Ｒが、水素、Ｒ１−Ｃ（Ｏ）−およびＲ２−ＳＯ２−以外である、式（ＶＩ）の化合物の製造のための方法であって、式（ＶＩＩ）の化合物を、化学量論酸の存在下、アルコールＲ−ＯＨで処理するステップを含む方法を提供する。
【００５６】
実施形態Ａ７Ｅ１において、本発明は、Ｒが、水素、Ｒ１−Ｃ（Ｏ）−およびＲ２−ＳＯ２−以外である、式（ＶＩ）の化合物の製造のための方法であって、
（ａ）式（ＶＩＩ）の化合物を調製するステップと、
（ｂ）式（ＶＩＩ）の化合物を、化学量論酸の存在下、アルコールＲ−ＯＨで処理するステップと
を含む方法を提供する。
【００５７】
別の態様Ａ８において、本発明は、ＲがＲ１−Ｃ（Ｏ）−である、式（ＶＩ）の化合物の製造のための方法であって、式（ＶＩＡ）の化合物を、酸塩化物Ｒ１−Ｃ（Ｏ）−Ｃｌまたは酸無水物（Ｒ１−Ｃ（Ｏ））２Ｏで処理するステップを含む方法を提供する。
【００５８】
実施形態Ａ８Ｅ１において、本発明は、ＲがＲ１−Ｃ（Ｏ）−である、式（ＶＩ）の化合物の製造のための方法であって、
（ａ）上記で定義した通りの実施形態Ａ５Ｅ１、Ａ５Ｅ２、Ａ５Ｅ３およびＡ５Ｅ４のいずれかによる方法を使用して、式（ＶＩＡ）の化合物を調製するステップと、
（ｂ）式（ＶＩＡ）の化合物を、酸塩化物Ｒ１−Ｃ（Ｏ）−Ｃｌまたは酸無水物（Ｒ１−Ｃ（Ｏ））２Ｏで処理するステップと
を含む方法を提供する。
【００５９】
別の態様Ａ９において、本発明は、ＲがＲ２−ＳＯ２−である、式（ＶＩ）の化合物の製造のための方法であって、式（ＶＩＡ）の化合物を、スルホニルクロリドＲ２−ＳＯ２−Ｃｌで処理するステップを含む方法を提供する。
【００６０】
実施形態Ａ９Ｅ１において、本発明は、ＲがＲ２−ＳＯ２−である、式（ＶＩ）の化合物の製造のための方法であって、
（ａ）上記で定義した通りの実施形態Ａ５Ｅ１、Ａ５Ｅ２、Ａ５Ｅ３およびＡ５Ｅ４のいずれかによる方法を使用して、式（ＶＩＡ）の化合物を調製するステップと、
（ｂ）式（ＶＩＡ）の化合物をスルホニルクロリドＲ２−ＳＯ２−Ｃｌで処理するステップと
を含む方法を提供する。
【００６１】
別の態様Ａ１０において、本発明は、４−メチル−２−ペンテナールのエナミン誘導体の製造のための方法を提供する。
【００６２】
第一の実施形態Ａ１０Ｅ１において、本発明は、４−メチル−２−ペンテナールのエナミン誘導体の製造のための方法であって、アセトアルデヒドを、好適なアミンの存在下、イソブチルアルデヒドと反応させるステップを含む方法を提供する。
【００６３】
さらなる実施形態Ａ１０Ｅ２において、本発明は、好適なアミンが第二級アミンである、実施形態Ａ１０Ｅ１による方法を提供する。
【００６４】
さらなる実施形態Ａ１０Ｅ３において、本発明は、第二級アミンが、（（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル）２ＮＨ、ピロリシン、ピペリシン、モルホリン、ピペラジン、Ｎ−メチルピペラジン、Ｎ−エチルピペラジンおよびＮ−ベンジルピペラジンから選択される、実施形態Ａ１０Ｅ２による方法を提供する。
【００６５】
さらなる実施形態Ａ１０Ｅ４において、本発明は、第二級アミンが、ピロリシン、ピペリシン、モルホリンおよびピペラジンから選択される、実施形態Ａ１０Ｅ３による方法を提供する。
【００６６】
さらなる実施形態Ａ１０Ｅ５において、本発明は、反応が酸触媒の存在下で実施される、実施形態Ａ１０Ｅ１、Ａ１０Ｅ２、Ａ１０Ｅ３およびＡ１０Ｅ４のいずれかによる方法を提供する。
【００６７】
さらなる実施形態Ａ１０Ｅ６において、本発明は、イソブチルアルデヒドが、アセトアルデヒドの添加前に好適なアミンと合わせられる、実施形態Ａ１０Ｅ１、Ａ１０Ｅ２、Ａ１０Ｅ３、Ａ１０Ｅ４およびＡ１０Ｅ５のいずれかによる方法を提供する。
【００６８】
さらなる実施形態Ａ１０Ｅ６において、本発明は、イソブチルアルデヒドおよびアセトアルデヒドが反応容器に同時に添加される、実施形態Ａ１０Ｅ１、Ａ１０Ｅ２、Ａ１０Ｅ３、Ａ１０Ｅ４およびＡ１０Ｅ５のいずれかによる方法を提供する。
【００６９】
別の態様Ａ１１において、本発明は、３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（ＩＩ）の製造のための方法を提供する。
【００７０】
【化２０】
2016516744.tif 000022
【００７１】
第一の実施形態Ａ１１Ｅ１において、本発明は、３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（ＩＩ）または薬学的に許容できるその塩の製造のための方法であって、
（ａ）５−ヒドロキシ−４−（２−メチル−１−プロペニル）−５Ｈ−２−フラノン（ＶＩＡ）
【００７２】
【化２１】
2016516744.tif 000023
を調製するステップと、
（ｂ）前記５−ヒドロキシ−４−（２−メチル−１−プロペニル）−５Ｈ−２−フラノン（ＶＩＡ）を、５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）−３，４−ジヒドロ−５Ｈ−２−フラノン（ＩＡ）
【００７３】
【化２２】
2016516744.tif 000024
に変換するステップと、
（ｃ）前記５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）−３，４−ジヒドロ−５Ｈ−２−フラノン（ＩＡ）を、３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（ＩＩ）に変換するステップと
を含む方法を提供する。
【００７４】
さらなる実施形態Ａ１１Ｅ２において、本発明は、３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（ＩＩ）が（Ｓ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（（Ｓ）−ＩＩ）であり、
【００７５】
【化２３】
2016516744.tif 000025
前記（Ｓ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸が、少なくとも８０％の鏡像体過剰率を有する、実施形態Ａ１１Ｅ１による方法を提供する。
【００７６】
さらなる実施形態Ａ１１Ｅ３において、本発明は、ステップ（ａ）が、上述した通りの実施形態Ａ５Ｅ１、Ａ５Ｅ２、Ａ５Ｅ３またはＡ５Ｅ４による方法を含む、実施形態Ａ１１Ｅ１またはＡ１１Ｅ２による方法を提供する。
【００７７】
さらなる実施形態Ａ１１Ｅ４において、本発明は、ステップ（ｂ）が、
（ｂ１）５−ヒドロキシ−４−（２−メチル−１−プロペニル）−５Ｈ−２−フラノン（ＶＩＡ）を、金属酸化物、水酸化物、炭酸塩もしくは重炭酸塩、アンモニア、モノ、ジもしくはトリ−（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルアミン、またはテトラ−（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルアンモニウムヒドロキシドで処理して、式（ＩＸ）の塩
【００７８】
【化２４】
2016516744.tif 000026
［式中、
ｎは１であり、Ｍ＋は、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、ＮＨ４＋、（（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル）ＮＨ３＋、（（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル）２ＮＨ２＋、（（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル）３ＮＨ＋および（（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル）４Ｎ＋から選択されるか、または
ｎは２であり、Ｍ２＋は、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋およびＺｎ２＋から選択される］
を形成するステップと、
（ｂ２）式（ＩＸ）の塩を水素化して、式（Ｘ）の塩
【００７９】
【化２５】
2016516744.tif 000027
を取得するステップと、
（ｂ３）式（Ｘ）の塩を酸で処理するステップと
を含む、実施形態Ａ１１Ｅ１、Ａ１１Ｅ２またはＡ１１Ｅ３による方法を提供する。
【００８０】
さらなる実施形態Ａ１１Ｅ５において、本発明は、ステップ（ｂ）が、
（ｂ１）５−ヒドロキシ−４−（２−メチル−１−プロペニル）−５Ｈ−２−フラノン（ＶＩＡ）を、実施形態Ａ１Ｅ３で定義されている通りの式（ＶＩ）の化合物［式中、Ｒは、キラル（Ｃ５〜Ｃ１５）炭化水素基である］に変換するステップと、
（ｂ２）式（ＶＩ）の化合物を水素化して、式（ＸＩ）の化合物
【００８１】
【化２６】
2016516744.tif 000028
［式中、Ｒ＊は、キラル（Ｃ５〜Ｃ１５）炭化水素基である］
を取得するステップと、
（ｂ３）式（ＸＩ）の化合物を酸で処理して、（（Ｓ）−ＩＡ）を得るステップと
を含む、実施形態Ａ１１Ｅ１、Ａ１１Ｅ２またはＡ１１Ｅ３による方法を提供する。
【００８２】
別の態様Ａ１２において、本発明は、３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（ＩＩ）の製造のためのさらなる方法を提供する。
【００８３】
第一の実施形態Ａ１２Ｅ１において、本発明は、３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（ＩＩ）または薬学的に許容できるその塩の製造のための方法であって、
（ａ）５−ヒドロキシ−４−（２−メチル−１−プロペニル）−５Ｈ−２−フラノン（ＶＩＡ）
【００８４】
【化２７】
2016516744.tif 000029
を調製するステップと、
（ｂ）５−ヒドロキシ−４−（２−メチル−１−プロペニル）−５Ｈ−２−フラノン（ＶＩＡ）を、アンモニアまたはモノ−（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルアミンで処理して、式（ＩＸＡ）の塩
【００８５】
【化２８】
2016516744.tif 000030
［式中、ｎは１であり、Ｍ＋は、ＮＨ４＋および（（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル）ＮＨ３＋から選択される］
を形成するステップと、
（ｃ）式（ＩＸＡ）の塩を水素化して、式（ＸＡ）の塩
【００８６】
【化２９】
2016516744.tif 000031
を取得するステップと、
（ｄ）式（ＸＡ）の塩を、トランスアミナーゼまたはアミンオキシダーゼ／イミンレダクターゼ酵素で処理して、３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（ＩＩ）を提供するステップと
を含む方法を提供する。
【００８７】
さらなる実施形態Ａ１２Ｅ２において、本発明は、３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（ＩＩ）が（Ｓ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（（Ｓ）−ＩＩ）であり、
【００８８】
【化３０】
2016516744.tif 000032
前記（Ｓ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸が、少なくとも８０％の鏡像体過剰率を有する、実施形態Ａ１２Ｅ１による方法を提供する。
【００８９】
さらなる実施形態Ａ１２Ｅ３において、本発明は、ステップ（ａ）が、上述した通りの実施形態Ａ５Ｅ１、Ａ５Ｅ２、Ａ５Ｅ３またはＡ５Ｅ４による方法を含む、実施形態Ａ１２Ｅ１またはＡ１２Ｅ２による方法を提供する。
【００９０】
別の態様Ａ１３において、本発明は、５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）−３，４−ジヒドロ−５Ｈ−２−フラノン（ＩＡ）の製造のためのさらなる方法を提供する。
【００９１】
第一の実施形態Ａ１３Ｅ１において、本発明は、５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）−３，４−ジヒドロ−５Ｈ−２−フラノン（ＩＡ）の製造のためのさらなる方法であって、
（ａ）３−イソブチリデン−２−オキソペンタン二酸（ＸＩＩＡ）またはその環化異性体（ＸＩＩＢ）
【００９２】
【化３１】
2016516744.tif 000033
を取得するステップと、
（ｂ）順次にまたは同時に、炭素−炭素二重結合を還元し、α−ケト酸官能基を脱炭酸するステップと
を含む方法を提供する。
【００９３】
さらなる実施形態Ａ１３Ｅ２において、本発明は、α−ケト酸官能基の脱炭酸の前に、炭素−炭素二重結合を還元して、３−イソブチル−２−オキソペンタン二酸（ＸＶ）またはその環化異性体（ＸＶＡ）
【００９４】
【化３２】
2016516744.tif 000034
を提供する、実施形態Ａ１３Ｅ１による方法を提供する。
【００９５】
さらなる実施形態Ａ１３Ｅ３において、本発明は、炭素−炭素二重結合の還元の前に、α−ケト酸官能基を脱炭酸して、３−ホルミル−５−メチル−３−ペンテン酸（ＸＶＩ）またはその環化異性体（ＸＶＩＡ）
【００９６】
【化３３】
2016516744.tif 000035
を提供する、実施形態Ａ１３Ｅ１による方法を提供する。
【００９７】
さらなる実施形態Ａ１３Ｅ４において、本発明は、α−ケト酸官能基を脱炭酸し、同時に炭素−炭素二重結合を還元する、実施形態Ａ１３Ｅ１による方法を提供する。
【００９８】
さらなる実施形態Ａ１３Ｅ５において、本発明は、脱炭酸が、デカルボキシラーゼ酵素の存在下で行われる、実施形態Ａ１３Ｅ１、Ａ１３Ｅ２、Ａ１３Ｅ３またはＡ１３Ｅ４による方法を提供する。
【００９９】
さらなる実施形態Ａ１３Ｅ６において、本発明は、炭素−炭素二重結合の還元が、エノエートレダクターゼ酵素の存在下で行われる、実施形態Ａ１３Ｅ１、Ａ１３Ｅ２、Ａ１３Ｅ３、Ａ１３Ｅ４またはＡ１３Ｅ５による方法を提供する。
【０１００】
別の態様Ａ１４において、本発明は、
３−イソブチリデン−２−オキソペンタン二酸、
３−イソブチル−２−オキソペンタン二酸、および
３−ホルミル−５−メチル−３−ペンテン酸
から選択される化合物、またはその塩、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルエステルもしくは環化異性体を提供する。
【０１０１】
別の態様Ａ１５において、本発明は、（Ｓ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（（Ｓ）−ＩＩ）
【０１０２】
【化３４】
2016516744.tif 000036
または薬学的に許容できるその塩の製造のための方法であって、
（ａ）上記で定義した通りの実施形態Ａ１３Ｅ１、Ａ１３Ｅ２、Ａ１３Ｅ３、Ａ１３Ｅ４、Ａ１３Ｅ５またはＡ１３Ｅ６のいずれか１つによる方法を使用して、５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）−３，４−ジヒドロ−５Ｈ−２−フラノン（ＩＡ）を製造するステップと、
（ｂ）前記５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）−３，４−ジヒドロ−５Ｈ−２−フラノンを、（Ｓ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸に変換するステップと
を含む方法を提供する。
【０１０３】
別の態様Ａ１６において、本発明は、（Ｒ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸を（Ｓ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸に変換するための方法であって、（Ｒ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸を、トランスアミナーゼ酵素またはアミンオキシダーゼ／イミンレダクターゼ酵素で処理するステップを含む方法を提供する。
【０１０４】
別の態様Ａ１７において、本発明は、（Ｒ）−および（Ｓ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸の混合物中における（Ｓ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸の割合を増大させるための方法であって、該混合物を、トランスアミナーゼ酵素またはアミンオキシダーゼ／イミンレダクターゼ酵素で処理するステップを含む方法を提供する。
【０１０５】
別の態様Ａ１８において、本発明は、５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）−３，４−ジヒドロ−５Ｈ−２−フラノン（ＩＡ）からプレガバリンへの変換に有用な、トランスアミナーゼ酵素を提供する。
【０１０６】
第一の実施形態Ａ１８Ｅ１において、本発明は、アミノ酸配列
ＭＮＫＰＱＳＷＥＡＲＡＥＴＹＳＬＹＧＦＴＤＭＰＳＬＨＸ２７ＲＧＴＶＶＶＴＨＧＥＧＰＹＸ４１ＶＤＶＸ４５ＧＲＲＹＬＤＡＮＳＧＬＹＮＭＶＡＧＦＤＨＫＧＬＩＤＡＡＫＡＱＹＥＲＦＰＧＹＨＳＦＦＧＲＭＳＤＱＴＶＭＬＳＥＫＬＶＥＶＳＰＦＤＳＧＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＡＮＤＴＭＶＫＭＬＷＦＬＨＡＡＥＧＫＰＱＫＲＫＩＬＴＲＸ１４７ＮＡＹＨＧＶＴＡＶＳＡＳＭＴＧＸ１６３ＰＸ１６５ＮＳＶＦＧＬＰＬＰＧＦＶＨＬＸ１８０ＣＰＨＹＷＲＹＧＥＥＧＥＴＥＥＱＦＶＡＲＬＡＲＥＬＥＥＴＩＱＲＥＧＡＤＴＩＡＧＦＦＡＥＰＶＭＧＡＧＧＶＩＰＰＡＫＧＹＦＱＡＩＬＰＩＬＲＫＹＤＩＰＶＩＳＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＮＴＷＧＣＶＴＹＤＦＴＰＤＡＩＩＳＳＫＮＬＴＡＧＦＦＰＶＧＡＶＩＬＧＰＥＬＸ３０４ＫＲＬＥＴＡＩＥＡＩＥＥＦＰＨＧＦＴＡＸ３２４ＧＨＰＶＧＣＡＩＡＬＫＡＩＤＶＶＭＮＥＧＬＡＥＮＶＲＲＬＡＰＲＦＥＥＲＬＫＨＩＡＥＲＰＮＩＧＥＹＲＧＩＧＦＭＷＡＬＥＡＶＫＤＫＡＳＫＴＰＦＤＧＮＬＳＶＳＸ４０１ＲＩＡＮＴＣＸ４０８ＤＬＧＬＩＣＸ４１５Ｘ４１６Ｘ４１７ＧＱＳＶＩＬＸ４２４ＰＰＦＩＬＴＥＡＱＭＤＥＭＦＤＫＬＥＫＡＬＤＫＶＦＡＥＶＡ（配列番号１）
［ここで、
Ｘ２７は、グルタミン（Ｑ）およびグルタミン酸（Ｅ）から選択され、
Ｘ４１は、イソロイシン（Ｉ）およびバリン（Ｖ）から選択され、
Ｘ４５は、アスパラギン（Ｎ）およびヒスチジン（Ｈ）から選択され、
Ｘ１４７は、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）から選択され、
Ｘ１６３は、ロイシン（Ｌ）およびメチオニン（Ｍ）から選択され、
Ｘ１６５は、チロシン（Ｙ）およびヒスチジン（Ｈ）から選択され、
Ｘ１８０は、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）から選択され、
Ｘ３０４は、アラニン（Ａ）およびセリン（Ｓ）から選択され、
Ｘ３２４は、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）から選択され、
Ｘ４０１は、リシン（Ｋ）およびグルタミン酸（Ｅ）から選択され、
Ｘ４０８は、トレオニン（Ｔ）およびグルタミン（Ｑ）から選択され、
Ｘ４１５は、セリン（Ｓ）およびアラニン（Ａ）から選択され、
Ｘ４１６は、プロリン（Ｐ）およびアラニン（Ａ）から選択され、
Ｘ４１７は、ロイシン（Ｌ）およびメチオニン（Ｍ）から選択され、
Ｘ４２４は、システイン（Ｃ）およびセリン（Ｓ）から選択される］
と少なくとも９５％相同性を有するアミノ酸配列を有する、トランスアミナーゼ酵素を提供する。
【０１０７】
さらなる実施形態Ａ１８Ｅ２において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有する、実施形態Ａ１８Ｅ１によるトランスアミナーゼ酵素を提供する。
【０１０８】
さらなる実施形態Ａ１８Ｅ３において、本発明は、
Ｘ２７がグルタミン酸（Ｅ）であり、
Ｘ１４７がグルタミン（Ｑ）であり、
Ｘ１６５がヒスチジン（Ｈ）であり、
Ｘ３０４がセリン（Ｓ）であり、
Ｘ３２４がグリシン（Ｇ）であり、
Ｘ４０１がリシン（Ｋ）であり、
Ｘ４０８がグルタミン（Ｑ）であり、
Ｘ４１６がアラニン（Ａ）であり、
Ｘ４１７がメチオニン（Ｍ）であり、
Ｘ４２４がセリン（Ｓ）である、
実施形態Ａ１８Ｅ１またはＡ１８Ｅ２によるトランスアミナーゼ酵素を提供する。
【０１０９】
さらなる実施形態Ａ１８Ｅ４において、本発明は、
ＭＮＫＰＱＳＷＥＡＲＡＥＴＹＳＬＹＧＦＴＤＭＰＳＬＨＱＲＧＴＶＶＶＴＨＧＥＧＰＹＩＶＤＶＮＧＲＲＹＬＤＡＮＳＧＬＹＮＭＶＡＧＦＤＨＫＧＬＩＤＡＡＫＡＱＹＥＲＦＰＧＹＨＳＦＦＧＲＭＳＤＱＴＶＭＬＳＥＫＬＶＥＶＳＰＦＤＳＧＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＡＮＤＴＭＶＫＭＬＷＦＬＨＡＡＥＧＫＰＱＫＲＫＩＬＴＲＮＮＡＹＨＧＶＴＡＶＳＡＳＭＴＧＬＰＹＮＳＶＦＧＬＰＬＰＧＦＶＨＬＴＣＰＨＹＷＲＹＧＥＥＧＥＴＥＥＱＦＶＡＲＬＡＲＥＬＥＥＴＩＱＲＥＧＡＤＴＩＡＧＦＦＡＥＰＶＭＧＡＧＧＶＩＰＰＡＫＧＹＦＱＡＩＬＰＩＬＲＫＹＤＩＰＶＩＳＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＮＴＷＧＣＶＴＹＤＦＴＰＤＡＩＩＳＳＫＮＬＴＡＧＦＦＰＶＧＡＶＩＬＧＰＥＬＡＫＲＬＥＴＡＩＥＡＩＥＥＦＰＨＧＦＴＡＳＧＨＰＶＧＣＡＩＡＬＫＡＩＤＶＶＭＮＥＧＬＡＥＮＶＲＲＬＡＰＲＦＥＥＲＬＫＨＩＡＥＲＰＮＩＧＥＹＲＧＩＧＦＭＷＡＬＥＡＶＫＤＫＡＳＫＴＰＦＤＧＮＬＳＶＳＥＲＩＡＮＴＣＴＤＬＧＬＩＣＳＰＭＧＱＳＶＩＬＣＰＰＦＩＬＴＥＡＱＭＤＥＭＦＤＫＬＥＫＡＬＤＫＶＦＡＥＶＡ（配列番号２）；
ＭＮＫＰＱＳＷＥＡＲＡＥＴＹＳＬＹＧＦＴＤＭＰＳＬＨＥＲＧＴＶＶＶＴＨＧＥＧＰＹＩＶＤＶＮＧＲＲＹＬＤＡＮＳＧＬＹＮＭＶＡＧＦＤＨＫＧＬＩＤＡＡＫＡＱＹＥＲＦＰＧＹＨＳＦＦＧＲＭＳＤＱＴＶＭＬＳＥＫＬＶＥＶＳＰＦＤＳＧＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＡＮＤＴＭＶＫＭＬＷＦＬＨＡＡＥＧＫＰＱＫＲＫＩＬＴＲＮＮＡＹＨＧＶＴＡＶＳＡＳＭＴＧＬＰＹＮＳＶＦＧＬＰＬＰＧＦＶＨＬＴＣＰＨＹＷＲＹＧＥＥＧＥＴＥＥＱＦＶＡＲＬＡＲＥＬＥＥＴＩＱＲＥＧＡＤＴＩＡＧＦＦＡＥＰＶＭＧＡＧＧＶＩＰＰＡＫＧＹＦＱＡＩＬＰＩＬＲＫＹＤＩＰＶＩＳＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＮＴＷＧＣＶＴＹＤＦＴＰＤＡＩＩＳＳＫＮＬＴＡＧＦＦＰＶＧＡＶＩＬＧＰＥＬＳＫＲＬＥＴＡＩＥＡＩＥＥＦＰＨＧＦＴＡＧＧＨＰＶＧＣＡＩＡＬＫＡＩＤＶＶＭＮＥＧＬＡＥＮＶＲＲＬＡＰＲＦＥＥＲＬＫＨＩＡＥＲＰＮＩＧＥＹＲＧＩＧＦＭＷＡＬＥＡＶＫＤＫＡＳＫＴＰＦＤＧＮＬＳＶＳＫＲＩＡＮＴＣＱＤＬＧＬＩＣＳＡＬＧＱＳＶＩＬＣＰＰＦＩＬＴＥＡＱＭＤＥＭＦＤＫＬＥＫＡＬＤＫＶＦＡＥＶＡ（配列番号３）；
ＭＮＫＰＱＳＷＥＡＲＡＥＴＹＳＬＹＧＦＴＤＭＰＳＬＨＥＲＧＴＶＶＶＴＨＧＥＧＰＹＶＶＤＶＮＧＲＲＹＬＤＡＮＳＧＬＹＮＭＶＡＧＦＤＨＫＧＬＩＤＡＡＫＡＱＹＥＲＦＰＧＹＨＳＦＦＧＲＭＳＤＱＴＶＭＬＳＥＫＬＶＥＶＳＰＦＤＳＧＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＡＮＤＴＭＶＫＭＬＷＦＬＨＡＡＥＧＫＰＱＫＲＫＩＬＴＲＱＮＡＹＨＧＶＴＡＶＳＡＳＭＴＧＬＰＨＮＳＶＦＧＬＰＬＰＧＦＶＨＬＴＣＰＨＹＷＲＹＧＥＥＧＥＴＥＥＱＦＶＡＲＬＡＲＥＬＥＥＴＩＱＲＥＧＡＤＴＩＡＧＦＦＡＥＰＶＭＧＡＧＧＶＩＰＰＡＫＧＹＦＱＡＩＬＰＩＬＲＫＹＤＩＰＶＩＳＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＮＴＷＧＣＶＴＹＤＦＴＰＤＡＩＩＳＳＫＮＬＴＡＧＦＦＰＶＧＡＶＩＬＧＰＥＬＳＫＲＬＥＴＡＩＥＡＩＥＥＦＰＨＧＦＴＡＧＧＨＰＶＧＣＡＩＡＬＫＡＩＤＶＶＭＮＥＧＬＡＥＮＶＲＲＬＡＰＲＦＥＥＲＬＫＨＩＡＥＲＰＮＩＧＥＹＲＧＩＧＦＭＷＡＬＥＡＶＫＤＫＡＳＫＴＰＦＤＧＮＬＳＶＳＫＲＩＡＮＴＣＱＤＬＧＬＩＣＳＡＬＧＱＳＶＩＬＳＰＰＦＩＬＴＥＡＱＭＤＥＭＦＤＫＬＥＫＡＬＤＫＶＦＡＥＶＡ（配列番号４）；
ＭＮＫＰＱＳＷＥＡＲＡＥＴＹＳＬＹＧＦＴＤＭＰＳＬＨＥＲＧＴＶＶＶＴＨＧＥＧＰＹＩＶＤＶＮＧＲＲＹＬＤＡＮＳＧＬＹＮＭＶＡＧＦＤＨＫＧＬＩＤＡＡＫＡＱＹＥＲＦＰＧＹＨＳＦＦＧＲＭＳＤＱＴＶＭＬＳＥＫＬＶＥＶＳＰＦＤＳＧＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＡＮＤＴＭＶＫＭＬＷＦＬＨＡＡＥＧＫＰＱＫＲＫＩＬＴＲＱＮＡＹＨＧＶＴＡＶＳＡＳＭＴＧＭＰＨＮＳＶＦＧＬＰＬＰＧＦＶＨＬＴＣＰＨＹＷＲＹＧＥＥＧＥＴＥＥＱＦＶＡＲＬＡＲＥＬＥＥＴＩＱＲＥＧＡＤＴＩＡＧＦＦＡＥＰＶＭＧＡＧＧＶＩＰＰＡＫＧＹＦＱＡＩＬＰＩＬＲＫＹＤＩＰＶＩＳＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＮＴＷＧＣＶＴＹＤＦＴＰＤＡＩＩＳＳＫＮＬＴＡＧＦＦＰＶＧＡＶＩＬＧＰＡＬＳＫＲＬＥＴＡＩＥＡＩＥＥＦＰＨＧＦＴＡＧＧＨＰＶＧＣＡＩＡＬＫＡＩＤＶＶＭＮＥＧＬＡＥＮＶＲＲＬＡＰＲＦＥＥＲＬＫＨＩＡＥＲＰＮＩＧＥＹＲＧＩＧＦＭＷＡＬＥＡＶＫＤＫＡＳＫＴＰＦＤＧＮＬＳＶＳＫＲＩＡＮＴＣＱＤＬＧＬＩＣＳＡＭＧＱＳＶＩＬＳＰＰＦＩＬＴＥＡＱＭＤＥＭＦＤＫＬＥＫＡＬＤＫＶＦＡＥＶＡ（配列番号５）；
ＭＮＫＰＱＳＷＥＡＲＡＥＴＹＳＬＹＧＦＴＤＭＰＳＬＨＥＲＧＴＶＶＶＴＨＧＥＧＰＹＶＶＤＶＮＧＲＲＹＬＤＡＮＳＧＬＹＮＭＶＡＧＦＤＨＫＧＬＩＤＡＡＫＡＱＹＥＲＦＰＧＹＨＳＦＦＧＲＭＳＤＱＴＶＭＬＳＥＫＬＶＥＶＳＰＦＤＳＧＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＡＮＤＴＭＶＫＭＬＷＦＬＨＡＡＥＧＫＰＱＫＲＫＩＬＴＲＱＮＡＹＨＧＶＴＡＶＳＡＳＭＴＧＬＰＨＮＳＶＦＧＬＰＬＰＧＦＶＨＬＧＣＰＨＹＷＲＹＧＥＥＧＥＴＥＥＱＦＶＡＲＬＡＲＥＬＥＥＴＩＱＲＥＧＡＤＴＩＡＧＦＦＡＥＰＶＭＧＡＧＧＶＩＰＰＡＫＧＹＦＱＡＩＬＰＩＬＲＫＹＤＩＰＶＩＳＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＮＴＷＧＣＶＴＹＤＦＴＰＤＡＩＩＳＳＫＮＬＴＡＧＦＦＰＶＧＡＶＩＬＧＰＥＬＳＫＲＬＥＴＡＩＥＡＩＥＥＦＰＨＧＦＴＡＧＧＨＰＶＧＣＡＩＡＬＫＡＩＤＶＶＭＮＥＧＬＡＥＮＶＲＲＬＡＰＲＦＥＥＲＬＫＨＩＡＥＲＰＮＩＧＥＹＲＧＩＧＦＭＷＡＬＥＡＶＫＤＫＡＳＫＴＰＦＤＧＮＬＳＶＳＫＲＩＡＮＴＣＱＤＬＧＬＩＣＡＡＭＧＱＳＶＩＬＳＰＰＦＩＬＴＥＡＱＭＤＥＭＦＤＫＬＥＫＡＬＤＫＶＦＡＥＶＡ（配列番号６）；および
ＭＮＫＰＱＳＷＥＡＲＡＥＴＹＳＬＹＧＦＴＤＭＰＳＬＨＥＲＧＴＶＶＶＴＨＧＥＧＰＹＩＶＤＶＨＧＲＲＹＬＤＡＮＳＧＬＹＮＭＶＡＧＦＤＨＫＧＬＩＤＡＡＫＡＱＹＥＲＦＰＧＹＨＳＦＦＧＲＭＳＤＱＴＶＭＬＳＥＫＬＶＥＶＳＰＦＤＳＧＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＡＮＤＴＭＶＫＭＬＷＦＬＨＡＡＥＧＫＰＱＫＲＫＩＬＴＲＱＮＡＹＨＧＶＴＡＶＳＡＳＭＴＧＬＰＨＮＳＶＦＧＬＰＬＰＧＦＶＨＬＳＣＰＨＹＷＲＹＧＥＥＧＥＴＥＥＱＦＶＡＲＬＡＲＥＬＥＥＴＩＱＲＥＧＡＤＴＩＡＧＦＦＡＥＰＶＭＧＡＧＧＶＩＰＰＡＫＧＹＦＱＡＩＬＰＩＬＲＫＹＤＩＰＶＩＳＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＮＴＷＧＣＶＴＹＤＦＴＰＤＡＩＩＳＳＫＮＬＴＡＧＦＦＰＶＧＡＶＩＬＧＰＥＬＳＫＲＬＥＴＡＩＥＡＩＥＥＦＰＨＧＦＴＡＧＧＨＰＶＧＣＡＩＡＬＫＡＩＤＶＶＭＮＥＧＬＡＥＮＶＲＲＬＡＰＲＦＥＥＲＬＫＨＩＡＥＲＰＮＩＧＥＹＲＧＩＧＦＭＷＡＬＥＡＶＫＤＫＡＳＫＴＰＦＤＧＮＬＳＶＳＫＲＩＡＮＴＣＱＤＬＧＬＩＣＳＡＭＧＱＳＶＩＬＳＰＰＦＩＬＴＥＡＱＭＤＥＭＦＤＫＬＥＫＡＬＤＫＶＦＡＥＶＡ（配列番号７）
から選択されるアミノ酸配列を有する、実施形態Ａ１８Ｅ２によるトランスアミナーゼ酵素を提供する。
【０１１０】
別の態様Ａ１９において、本発明は、（Ｓ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（（Ｓ）−ＩＩ）
【０１１１】
【化３５】
2016516744.tif 000037
または薬学的に許容できるその塩の製造のための方法であって、５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）−３，４−ジヒドロ−５Ｈ−２−フラノン（ＩＡ）およびアミンを、実施形態Ａ１８Ｅ１、Ａ１８Ｅ２、Ａ１８Ｅ３およびＡ１８Ｅ４のいずれか１つによるトランスアミナーゼ酵素で処理するステップを含む方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【０１１２】
用語「アルキル」は、指定数の炭素原子を含有する、直鎖または分枝鎖飽和脂肪族炭化水素ラジカルを意味する。アルキルラジカルの例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ネオペンチルおよびｎ−ヘキシルを包含する。
【０１１３】
用語「アルコキシ」は、酸素原子と結合している上記で定義した通りのアルキル基で構成されている基を意味する。アルコキシ基の例は、メトキシ、エトキシおよびイソプロポキシを包含する。
【０１１４】
用語「アルコキシ−アルキル」は、アルコキシ基がアルキル水素原子を置換している、直鎖または分枝鎖飽和脂肪族炭化水素ラジカルを意味する。アルコキシ−アルキル基の例は、２−メトキシエチルである。
【０１１５】
用語「ハロアルキル」は、１個または複数の水素原子が、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素によって置きかえられている、上記で定義した通りのアルキル基を意味する。１個を超える水素原子が置きかえられている場合、置きかえハロゲン原子は、同じであってもよいし、または異なっていてもよい。ハロアルキル基の例は、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロジフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチルおよび３−ブロモプロピルを包含する。
【０１１６】
用語「アリール」は、フェニルまたはナフチル基を意味する。
【０１１７】
用語「アリール−アルキル」は、アリール基がアルキル水素原子を置換している、直鎖または分枝鎖飽和脂肪族炭化水素ラジカルを意味する。アリール−アルキル基の例は、ベンジルである。
【０１１８】
用語「シクロアルキル」は、指定数の炭素原子を含有する、飽和単環式または多環式炭素環式環を意味する。単環式シクロアルキル基の例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルを包含する。多環式シクロアルキル基の例は、ビシクロ［２，２，１］ヘプチルおよびビシクロ［３，２，１］オクチルを包含する。
【０１１９】
アルキルまたはアリール基に関連する用語「置換されていてもよい」は、アルキルまたはアリール基の水素原子が、収載されている基の１つで置きかえられていてよいことを意味する。置換は、アルキルまたはアリール基内の任意の位置で為されてよい。任意選択の置換が「１つまたは複数の基」によるものである場合、最大でアルキルまたはアリール基中に存在する水素の数と等しい数までの、アルキルまたはアリール基の任意の数の水素原子が置きかえられていてよく、各置きかえは、互いに無関係である。
【０１２０】
用語「鏡像体過剰率」は、時に「ｅ．ｅ．」と略され、所与の試料について、その対掌体を超過する１つの鏡像異性体の過剰の測定値であり、百分率として表現される。鏡像体過剰率は、次のように定義される：
１００×（ｅｒ−１）／（ｅｒ＋１）
［式中、「ｅｒ」は、より豊富な鏡像異性体対あまり豊富でない鏡像異性体の比率である］。
【０１２１】
５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）−３，４−ジヒドロ−５Ｈ−２−フラノン（ＩＡ）は、３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（ＩＩ）の製造における好都合な中間体である。化学的還元剤の存在下、アンモニアによるラセミ（ＩＡ）の処理により、ラセミ３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（（Ｒ／Ｓ）−ＩＩ）が提供される（ＷＯ２００８／１２７６４６Ａ２を参照）。反応は、開環異性体（ＩＢ）を伴うと推定される。
【０１２２】
【化３６】
2016516744.tif 000038
【０１２３】
トランスアミナーゼ酵素の存在下でのアミン供与体による還元的アミノ化により、鏡像異性的に富化された３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸を提供することができる。好適なアミン供与体は、モノ−アルキルアミン、特にイソプロピルアミン等の第一級アミン、およびα−アミノ酸である。
【０１２４】
【化３７】
2016516744.tif 000039
【０１２５】
アンモニアの存在下での、（ＩＡ）と好適なアミンデヒドロゲナーゼ／イミンレダクターゼとの反応は、プレガバリンにも好適な経路となり得る。ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨ等の補因子が化学量論量で必要とされ得るか、またはホルメートデヒドロゲナーゼ等の第二のオキシドレダクターゼが補因子を再利用するために包含され得る。
【０１２６】
【化３８】
2016516744.tif 000040
【０１２７】
ジヒドロフラノン（ＩＡ）がＣ−４位に定義された立体化学を有する場合、この立体化学は、還元的アミノ化反応中、保存され得る。プレガバリンは（Ｓ）−立体化学を有するため、ジヒドロフラノン中に既に存在するこの立体化学を有することが好ましい場合がある。
【０１２８】
【化３９】
2016516744.tif 000041
【０１２９】
代替として、ジヒドロフラノン（ＩＡ）をラセミ形態のように使用してよい。次いで、生成物の所望の立体異性体は、トランスアミナーゼ酵素の存在下で転換を行うことによって等、単一の鏡像異性体の立体選択的生成を可能にする条件下で還元的アミノ化反応を行うことによって、またはキラル酸もしくは塩基による結晶化によって等、生成物を別個の分割ステップに供することによってのいずれかで、取得され得る。
【０１３０】
ジヒドロフラノン（ＩＡ）は、以下で説明する方法を使用して、ラセミまたは鏡像異性的に富化された形態で好都合に調製され得る。
【０１３１】
第一の方法において、ジヒドロフラノン（ＩＡ）は、５−ヒドロキシ−４−（２−メチル−１−プロペニル）−５Ｈ−２−フラノン（ＶＩＡ）の還元によって調製される。
【０１３２】
【化４０】
2016516744.tif 000042
【０１３３】
還元は、好適な触媒の存在下での水素化によって好都合に遂行され得る。好適な触媒は、均一系および不均一系触媒を包含する。触媒は、典型的には、パラジウム、白金、ロジウム、ルテニウムもしくはニッケル等の遷移金属、またはそれらの塩もしくは酸化物を含む。不均一系触媒は、微粉化した金属および基質支持金属ならびに金属酸化物を包含し、ここで、基質は、炭素、シリカ、アルミナまたは任意の他の好適な不活性材料であってよい。均一系触媒は、遷移金属のホスフィン配位子複合体を包含する。ホスフィン配位子がキラルである場合、触媒はキラルである。アキラル触媒が使用される場合、生成物は、ラセミジヒドロフラノン（ＩＡ）である。キラル触媒の使用は、ジヒドロフラノン（ＩＡ）をエナンチオ選択的様式で提供し得る。
【０１３４】
水素化反応の選択性、および全収率は、反応がアルカリ性媒質中で行われる場合に改良され得る。理論に縛られることなく、塩基の存在下では、フラノンは主に開環塩（ＩＸ）として存在すると考えられている。
【０１３５】
【化４１】
2016516744.tif 000043
【０１３６】
触媒を汚染することによって等、水素化プロセスに干渉しない好適な塩基が提供され得る。好適な塩基の例は、アルカリ（Ｌｉ、Ｎａ、ＫおよびＲｂ等）およびアルカリ土類金属（ＣａおよびＭｇ等）酸化物、水酸化物、炭酸塩ならびに重炭酸塩を包含する。亜鉛塩等の他の金属塩を使用してもよい。アルカリ金属塩は、それらの良好な溶解性および／または低い毒性により、好ましい場合がある。アンモニア、ならびに第一級、第二級および第三級アミン等のアミン塩基を使用して、アンモニウム塩を調製してよい。テトラ−アルキルアンモニウム塩の形成につながる、テトラ−アルキルアンモニウムヒドロキシドを使用してもよい。
【０１３７】
式（ＩＸ）の塩の水素化により、式（Ｘ）の塩を提供する。
【０１３８】
【化４２】
2016516744.tif 000044
【０１３９】
水素化反応後、好適な酸によるこの塩の処理によって、ジヒドロフラノン（ＩＡ）を回収する。代替として、塩を、トランスアミナーゼまたはアミンオキシダーゼ／イミンレダクターゼ酵素による処理によって、３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（ＩＩ）に直接変換してよい。この場合、アンモニウムまたはアルキルアンモニウムイオンは補基質に酵素を提供することから、アンモニウム塩（Ｍ＋＝ＮＨ４＋）または第一級アルキルアンモニウム塩（Ｍ＋＝アルキル−ＮＨ３＋）を使用することが好ましい場合がある。トランスアミナーゼ酵素と組み合わせたイソプロピルアンモニウム塩の使用は、好ましい例である。
【０１４０】
【化４３】
2016516744.tif 000045
【０１４１】
Ｒが水素以外である、式（ＶＩ）のフラノンを、水素化によって還元してもよい。Ｒが、アルキル、ハロアルキル、アルコキシアルキルアルケニル、シクロアルキル、シクロアルキル−アルキル、アリールまたはアリール−アルキル基である場合、これらのフラノンは、式（ＶＩＡ）の化合物から、酸触媒の存在下、アルコールＲ−ＯＨとの反応によって調製され得る。ＲがＲ１−Ｃ（Ｏ）−である場合、フラノンは、式（ＶＩＡ）の化合物から、場合により塩基、例えば第三級アミンの存在下、酸無水物（Ｒ１−Ｃ（Ｏ））２Ｏまたは酸塩化物Ｒ１−Ｃ（Ｏ）−Ｃｌとの反応によって調製され得る。ＲがＲ２−ＳＯ２−である場合、フラノンは、式（ＶＩＡ）の化合物から、場合により塩基、例えば第三級アミンの存在下、スルホニルクロリドＲ２−ＳＯ２−Ｃｌとの反応によって調製され得る。
【０１４２】
水素化ステップの後、式（ＩＡ）のジヒドロフラノンを、還元生成物から、酸（式中、Ｒは、アルキル、ハロアルキル、アルコキシアルキルアルケニル、シクロアルキル、シクロアルキル−アルキル、アリールまたはアリール−アルキル基である）または塩基（式中、Ｒは、Ｒ１−Ｃ（Ｏ）−またはＲ２−ＳＯ２−である）による処理によって、生成することができる。
【０１４３】
キラルＲ基の使用により、キラル触媒を必要とせずに、キラル水素化生成物を提供し得る。
【０１４４】
例えば、フラノン（ＶＩＡ）をキラルアルコールＲ＊−ＯＨと反応させて、キラルエーテル誘導体（ＶＩＢ）を得る。
【０１４５】
【化４４】
2016516744.tif 000046
【０１４６】
好適なキラルアルコールは、１−フェニルエタノールおよび１−ナフチルエタノール等のα−アリールアルコール、ならびにメントールおよびボルネオール等のテルペンアルコールを包含し得る。誘導体（ＶＩＢ）の水素化は、エナンチオ選択的様式で進行してよく、次いで、得られた生成物の、好適な酸による水の存在下での処理により、ジヒドロフラノン（ＩＡ）がキラル形態で提供される。
【０１４７】
【化４５】
2016516744.tif 000047
【０１４８】
フラノン（ＶＩＡ）は、式（ＶＩＩ）の化合物
【０１４９】
【化４６】
2016516744.tif 000048
［式中、−Ｘ−は、単結合、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル）−、−Ｎ（ベンジル）−、または
【０１５０】
【化４７】
2016516744.tif 000049
を表す］
から、酸触媒の存在下、式（ＶＩＩ）の化合物を水で処理することによって調製され得る。好適な酸は、硫酸等の鉱酸を包含する。代替として、式（ＶＩＩ）の化合物を、アルコールＲ−ＯＨで処理して、式（ＶＩ）の化合物［式中、Ｒは、アルキル、ハロアルキル、アルコキシアルキルアルケニル、シクロアルキル、シクロアルキル−アルキル、アリールまたはアリール−アルキル基である］を直接提供することができる。
【０１５１】
式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩＩ）のジエナミン
【０１５２】
【化４８】
2016516744.tif 000050
［式中、−Ｙ−は、単結合、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル）−、−Ｎ（ベンジル）−、または
【０１５３】
【化４９】
2016516744.tif 000051
を表す］と、グリオキシル酸またはその水和物との反応によって、調製することができる。
【０１５４】
【化５０】
2016516744.tif 000052
【０１５５】
式（ＶＩＩ）中の−Ｘ−は、−Ｙ−が
【０１５６】
【化５１】
2016516744.tif 000053
である場合、−Ｘ−が
【０１５７】
【化５２】
2016516744.tif 000054
であることを除いて、式（ＶＩＩＩ）の出発材料の中の−Ｙ−に対応することが理解されるであろう。
【０１５８】
−Ｙ−が、単結合または−ＣＨ２−を表す、式（ＶＩＩＩ）の化合物は、４−メチル−２−ペンテナールと、ピロリジンまたはピペリジンとの反応によって調製されてきた（Ｋｉｅｎｚｌｅ，Ｆ．ら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １９８５、６８（５）、１１３３〜３９）。式（ＶＩＩＩ）の他の化合物は、類似的に調製され得る。
【０１５９】
代替として、ピロリジン、ピペリジンまたはモルホリン等の好適なアミンの存在下、アセトニトリル等の溶媒中での触媒酸によるイソブチルアルデヒドおよびアセトアルデヒドの縮合により、ジエナミン誘導体（ＶＩＩＩ）が提供される。
【０１６０】
【化５３】
2016516744.tif 000055
【０１６１】
ピペラジンがアミンとして使用されるならば、ビス−ジエナミンが取得される。
【０１６２】
【化５４】
2016516744.tif 000056
【０１６３】
ＹがＮＨである、式（ＶＩＩＩ）の化合物は、モノ保護ピペラジンをアミンとして使用すること、続いて脱保護ステップによって取得され得る。
【０１６４】
ジエチルアミンおよびジ−イソプロピルアミン等の非環式第二級アミンを使用してもよいが、環式第二級アミンが好ましい。
【０１６５】
イソブチルアルデヒドおよびアセトアルデヒドのこのモードの反応は、イソブチルアルデヒドが求核試薬として作用する場合に付加物２，２−ジメチル−３−ヒドロキシブタナールのみが得られる直接塩基触媒反応（例えば、炭酸カリウムを塩基として使用する：英国特許第ＧＢ８３４１００号）とは異なる。
【０１６６】
【化５５】
2016516744.tif 000057
【０１６７】
いかなる特定の理論にも縛られることを望まないが、アセトアルデヒドおよびイソブチルアルデヒドの両方が、最初にそれらのエナミン誘導体に変換されると仮定する。酸触媒の存在下では、より塩基性のイソブチルアルデヒドエナミンが、そのイミニウムイオンに変換される。この求電子種は、アセトアルデヒドエナミンである立体障害の少ない求核試薬と優先的に反応し、このことにより、所望の手法での反応が確実となる。
【０１６８】
【化５６】
2016516744.tif 000058
【０１６９】
本発明の方法は、より経済的であり、アセトアルデヒドがＯ−シリル化エノール誘導体に変換され、向山アルドール条件下でイソブチルアルデヒドとカップリングされる、通常のアセトアルデヒド反応性のこの「極反転」に影響を及ぼす文献の方法よりも、スケールアップの影響を受けやすい。本発明において、両方のカップリングパートナーは同時に活性化され、電子的および立体的効果が、観察された反応性パターンを配向させる。他の利点は、生成物ジエナミンが、所望の５−アミノフラノン（ＶＩＩ）を形成するためのグリオキシル酸との反応のために所望の「活性化」形態の４−メチル−２−ペンテナールであることである。
【０１７０】
式（ＶＩＩＩ）のこれらのジエナミン誘導体を、単離および精製してよく、または代替として、グリオキシル酸（またはその水和物）で直接処理することができ、これにより、フラノン誘導体（ＶＩＩ）を直接提供する。
【０１７１】
フラノン誘導体（ＶＩＩ）を、単離および精製してよい。次いで、酸水溶液での処理により、フラノン（ＶＩＡ）が提供される。
【０１７２】
全体的に、上記で列挙した転換は、安価かつ安全な出発材料を使用する、プレガバリンの製造のための短縮経路を提供する。
【０１７３】
代替的な実施形態において、ジヒドロフラノン（Ｉ）は、イソブチルアルデヒドと２−オキソペンタン二酸（α−ケトグルタル酸）（ＸＩＶ）との縮合によって容易に取得される、３−イソブチリデン−２−オキソペンタン二酸（ＸＩＩ）から調製される。
【０１７４】
【化５７】
2016516744.tif 000059
【０１７５】
二酸（ＸＩＩ）からジヒドロフラノン（Ｉ）への変換は、脱炭酸ステップおよび還元ステップを必要とする。これら２つのプロセスステップは、別個に行われてよく、この場合、脱炭酸ステップもしくは還元ステップのいずれかを第一ステップとしてもよいし、または２つのプロセスを同時に行ってもよい。還元ステップが最初に行われる場合、中間体（ＸＶ）が生成されることになる。脱炭酸ステップが最初に行われる場合、中間体（ＸＶＩ）が生成されることになる。
【０１７６】
【化５８】
2016516744.tif 000060
【０１７７】
還元ステップは、水素化によって等、化学的に行われ得るが、好ましくは、エノエートレダクターゼ酵素で処理することによって等、酵素媒介性還元を使用して実現される。脱炭酸ステップは、好ましくは、化合物をデカルボキシラーゼ酵素で処理することによって実施される。
【０１７８】
酵素媒介性転換が企図されている場合、酵素は、担体に固定化された酵素を包含する、単離された酵素であってよく、該酵素は、細胞ホモジネート等の部分的に単離された酵素調製物であってもよく、または単離されていない酵素であってもよく、この場合、全細胞調製物が使用される。細胞は、所望の酵素を自然に発現しているもの、および所望の酵素を発現するように操作されている細胞を包含し得る。
【０１７９】
式（ＩＡ）の化合物の酵素媒介性還元的アミノ化は可逆的であるため、トランスアミナーゼ酵素またはアミンオキシダーゼ／イミンレダクターゼ酵素による３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸（ＩＩ）の処理は、ジヒドロフラノン（ＩＡ）の形成につながり得る。これの開環異性体が、エピマー化可能な化合物（ＩＢ）である。これを考慮すると、そのような酵素を使用して、（（Ｒ）−ＩＩ）を（（Ｓ）−ＩＩ）に変換するか、または（（Ｒ）−ＩＩ）および（（Ｓ）−ＩＩ）の混合物の光学純度を増大させることが可能である。
【０１８０】
【化５９】
2016516744.tif 000061
【実施例】
【０１８１】
本発明を下記の非限定的な例によって例証し、その中で、下記の略語および定義を使用する：
【０１８２】
【表１−１】
2016516744.tif 000062
【０１８３】
【表１−２】
2016516744.tif 000063
【０１８４】
市販の化学物質は、別段の定めがない限り、受け取ったままで使用した。薄層クロマトグラフィーは、プレコートプラスチックプレート（Ｍｅｒｃｋシリカ６０Ｆ２５４）で実施し、ＵＶ光およびＫＭｎＯ４浸漬を使用して視覚化した。プロトン（１Ｈ）および炭素（１３Ｃ）ＮＭＲスペクトルは、ＶａｒｉａｎＩＮＯＶＡ３００ＭＨｚ分光計で記録した。化学シフトは、テトラメチルシランに対して引用されており、残留溶媒ピークを適宜参照する。別段の指示がない限り、キラルＨＰＬＣ分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ１２００ＨＰＬＣシステムを使用して実施し、Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、またはＧａｌａｘｉｅソフトウェアを使用するＶａｒｉａｎ半分取／分析的ＨＰＬＣで、データを加工した。
【０１８５】
（実施例１）
４−メチル−２−ペンテナールからの４−（２−メチル−１−プロペニル）−５−モルホリノ−５Ｈ−２−フラノンの調製
【０１８６】
【化６０】
2016516744.tif 000064
水中グリオキシル酸の５０％溶液（２９．６ｇ、０．２ｍｏｌ）を、０〜１０℃に予め冷却したモルホリン（１７．８ｇ、０．２ｍｏｌ）およびヘプタン（７５ｍＬ）の二相撹拌混合物に添加した。温度を１０℃未満に保った。混合物を２０℃に加温し、４−メチル−２−ペンテナール（１９．６ｇ、０．２ｍｏｌ）を添加した。混合物を４５℃で２０時間撹拌した。大量の固体が形成された。水（１００ｍＬ）を周囲温度で添加し、混合物を２時間撹拌した。混合物をシクロペンチルメチルエーテル（１００ｍＬ）で抽出し、有機溶液を水（１００ｍＬ）で２回洗浄し、濃縮すると、３０．４ｇの粗生成物が残った。この固体を、メタノール（１００ｍＬ）からの再結晶によって精製して、１７．７ｇ（４０％）の純粋な４−（２−メチル−１−プロペニル）−５−モルホリノ−５Ｈ−２−フラノンを得た。
GC/MS: m/z=223
1H NMR: δ 6.0 (s, 1H); 5.9 (s, 1H); 5.5 (s, 1H), 3.7 (d, 4H), 2.7 (d, 4H),
2.00 (s, 3H), 1.95 (s, 3H).
【０１８７】
（実施例２）
４−（４−メチル−１，３−ペンタジエン−１−イル）モルホリンの調製
【０１８８】
【化６１】
2016516744.tif 000065
イソブチルアルデヒド（４６．９０ｇ、０．６５ｍｏｌ、１．４３当量）をアセトニトリル（３００ｍＬ）中で撹拌した。モルホリン（５６．６３ｇ、０．６５ｍｏｌ、１．４３当量）、続いてｐＴｓＯＨ（８．６３ｇ、０．１当量）を、イソブチルアルデヒド溶液に室温でゆっくり添加した。アセトニトリル（１００ｍＬ）中のアセトアルデヒド（２０ｇ、０．４５４ｍｏｌ）の溶液を、内部温度を５０℃でモニターしながら、１時間かけて滴下添加した。添加完了後、混合物を５０℃で３０分間撹拌し、次いで、室温に冷却した後、真空での溶媒の蒸発により、橙色油（１２３．３ｇ）を得た。安息香酸ベンジルを内標準として使用する定量的ＮＭＲによる粗製物のアッセイは４０％であり、これにより、６５％収率の所望のジエナミンを得た。
GC/MS: m/z=167
1H NMR: δ 6.01 (d, 1H); 5.69 (d, 1H); 5.31 (dd, 1H), 3.70 (m, 4H), 2.89 (m,
4H), 1.71 (s, 3H), 1. 63 (s, 3H).
【０１８９】
（実施例３）
粗製４−（４−メチル−１，３−ペンタジエン−１−イル）モルホリンからの４−（２−メチル−１−プロペニル）−５−モルホリノ−５Ｈ−２−フラノンの調製
【０１９０】
【化６２】
2016516744.tif 000066
実施例２の粗製４−（４−メチル−１，３−ペンタジエン−１−イル）モルホリンジエナミン（１２３．３ｇ、４０％アッセイ）を、メタノール（３００ｍＬ）に室温で溶解した。溶解が完了したら、グリオキシル酸（５０ｗｔ％、６０ｇ、１．１当量）を添加し、結果として生じた二相混合物を５０℃で１８時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、回転蒸発によって溶媒を除去した。残留物を、酢酸エチル（２００ｍＬ）と飽和炭酸ナトリウム溶液（２００ｍＬ）とに分配した。水性相を酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機物をブラインで洗浄し、蒸発させて濃厚油とし、これを静置して凝固させた（８９．０ｇ、ｑＮＭＲにより６７％アッセイ、６０％収率）。
GC/MS: m/z = 223
NMR: 実施例1の通り。
【０１９１】
（実施例４）
イソブチルアルデヒドおよびアセトアルデヒドからのワンポットでの４−（２−メチル−１−プロペニル）−５−モルホリノ−５Ｈ−２−フラノンの調製。
【０１９２】
【化６３】
2016516744.tif 000067
イソブチルアルデヒド（１０２．９０ｇ、１．４３ｍｏｌ）をアセトニトリル（６００ｍＬ）中で撹拌した。モルホリン（１２４．３ｇ、１．４３ｍｏｌ）、続いてｐＴｓＯＨ（１９．０ｇ、０．１当量）を、イソブチルアルデヒド溶液に室温でゆっくり添加した。アセトニトリル（１５０ｍＬ）中のアセトアルデヒド（４４．０５ｇ、１．０ｍｏｌ）の溶液を、内部温度を５０℃でモニターしながら、１時間かけて滴下添加した。添加完了後、混合物を５０℃で３０分間撹拌し、次いで１０℃未満に冷却した。グリオキシル酸（５０ｗｔ％、２１１．３ｇ、１．４３ｍｏｌ）を添加し、結果として生じた二相混合物を５０℃で１８時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、回転蒸発によって溶媒を除去した。残留物を、酢酸エチル（１Ｌ）と飽和炭酸ナトリウム溶液（１Ｌ）とに分配した。水性物を酢酸エチルで抽出し、合わせた有機物をブラインで洗浄し、蒸発させて濃厚油とし、これを静置して凝固させた（１６６ｇ）。粗生成物を室温にてＭＴＢＥで細砕した。生成物を濾過によって収集し、ＭＴＢＥで洗浄して、実施例１において調製された材料と同一の、純粋な４−（２−メチル−１−プロペニル）−５−モルホリノ−５Ｈ−２−フラノン（８４ｇ、３７％収率）を得た。粗固体（１６６ｇ）の分析は、約５０％収率を示した。
【０１９３】
（実施例５）
１，４−ビス−（４−メチル−１，３−ペンタジエン−１−イル）ピペラジンの調製
【０１９４】
【化６４】
2016516744.tif 000068
アセトニトリル（６００ｍＬ）中のピペラジン（４３．０ｇ、０．５ｍｏｌ）および４−トルエンスルホン酸一水和物（４．４ｇ、０．０２３ｍｏｌ）の溶液を調製した。この溶液を５０℃に加熱し、イソブチルアルデヒド（１００ｍＬ、１．１０ｍｏｌ）を１０分間かけて添加した。溶液が赤橙色になり、一時的な白色沈殿物が出現した。次いで、アセトニトリル（３０ｍＬ）中のアセトアルデヒド（３０．８ｇ、０．７０ｍｏｌ）の溶液を、シリンジポンプを介して５０℃で３時間かけて添加した。懸濁液が形成され、これを５０℃で０．５時間撹拌した。溶媒を除去し、残留固体をメタノール（５００ｍＬ）から−５℃で単離した。これを濾過し、冷やしたメタノールで洗浄し、乾燥させて、５２．９ｇ（６０％）の１，４−ビス−（４−メチル−１，３−ペンタジエン−１−イル）ピペラジンを得た。
GC/MS: m/z=246.
1H NMR: δ 6.00 (d, 2H); 5.70 (d, 2H); 5.28 (dd, 2H); 2.92 (s, 8H); 1.73
(s,6H); 1.68 (s, 6H). 13C NMR (CDCl3): 140.6 (C), 126.3
(CH), 123.4 (CH), 100.2 (CH), 48.2 (CH2), 25.8 (CH3),
18.1 (CH3).
【０１９５】
（実施例６）
１，４−ビス−（４−メチル−１，３−ペンタジエン−１−イル）ピペラジンからの５，５’−（ピペラジン−１，４−ジイル）ビス（４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オン）の調製。
【０１９６】
【化６５】
2016516744.tif 000069
１，４−ビス−（４−メチル−１，３−ペンタジエン−１−イル）ピペラジン（３７．３ｇ、０．１５１ｍｏｌ；実施例５を参照）をメタノール（３００ｍＬ）に投入した。温度を３４℃に調整し、水中グリオキシル酸の５０％溶液（４４．９ｇ、０．３０２ｍｏｌ）を迅速に（５分間かけて）添加した。得られた懸濁液を４５℃で１５時間撹拌し、０〜１０℃に２時間冷却し、濾過した。固体をメタノール（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させて、純粋な５，５’−（ピペラジン−１，４−ジイル）ビス（４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オン）（３２．３ｇ、６０％）を得た。濃縮によって母液から余分の５％を取得することができる。
1H NMR: δ 5.96 (d, 2H), 5.87 (d, 2H), 5.56 (m, 2H), 2.71 (s, 8H), 2.07-1.90
(m,12H). 13C NMR (CDCl3): 172.3 (C), 159.2 (C), 150.9
(C), 116.6 (CH), 115.4 (CH), 99.2 (CH), 46.7 (CH2), 28.2 (CH3),
21.4 (CH3).
【０１９７】
この反応を、イソプロパノール、アセトニトリル−水、トルエン−水中で、またはヘプタン水中で同様の収率で行うこともできる。
【０１９８】
（実施例７）
イソブチルアルデヒドおよびアセトアルデヒドからのワンポットでの５，５’−（ピペラジン−１，４−ジイル）ビス（４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オン）の調製。
【０１９９】
【化６６】
2016516744.tif 000070
トシック酸（６．５ｇ、０．０３ｍｏｌ）を、アセトニトリル（２４０ｍＬ）中のピペラジン（５９ｇ、０．６９ｍｏｌ）の溶液に投入した。反応物を５０℃に加熱し、固体の溶解が観察されるまでかき混ぜた後、イソブチルアルデヒド（１３８ｍＬ、１．５１ｍｏｌ）を添加した。反応物を５０℃で保持した後、アセトニトリル（３０ｍＬ）中のアセトアルデヒド（６０ｍＬ、１．０７ｍｏｌ）の溶液を、シリンジポンプを介して容器に３時間かけて投入した。添加が完了したら、反応物をさらに３０分間撹拌した後、水中グリオキシル酸の５０％ｗ／ｗ溶液（１４８ｇ、１．０ｍｏｌ）を５分間かけて反応混合物に、続いて水（５０ｍｌ）を添加した。次いで、反応物を７０℃に２時間、次いで５０℃に終夜加熱した。次いで、反応物を５℃に冷却し、３０分間保持した。５，５’−（ピペラジン−１，４−ジイル）ビス（４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オン）が沈殿し、濾過によって単離し、アセトニトリル（２×１００ｍＬ）で洗浄して、所望生成物（１２６ｇ、９３．５％アッセイ、アセトアルデヒドから６６％収率）を得た。
【０２００】
（実施例８）
５，５’−（ピペラジン−１，４−ジイル）ビス（４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オン）の溶媒フリー調製
イソブチルアルデヒド（７９ｇ、１００ｍＬ、１．１ｍｏｌ）を三口丸底フラスコに投入し、アルゴンをシステムに通してフラッシュした。ピペラジン（４３ｇ、０．５ｍｏｌ）およびＴｓＯＨ−Ｈ２Ｏ（４．４ｇ、０．０２３ｍｏｌ）を、ピペラジン（１０．７５ｇ）およびＴｓＯＨ−Ｈ２Ｏ（１．１ｇ）を含有する４等分に分けた。第一部のピペラジン（１０．７５ｇ）の添加は、２４℃から３５℃までの発熱をもたらした。この後に、第一部のＴｓＯＨ（１．１ｇ）を続けた。反応物をすべてのピペラジンが溶解するまで（ｔ＝３５℃）かき混ぜ、その後、第二部のピペラジン（１０．７５ｇ）、続いてＴｓＯＨ（１．１ｇ）を添加した（ｔ＝４１℃）。ピペラジンのすべてが溶解するまで撹拌を続け（ｔ＝４１℃）、次いで、第三部のピペラジン（１０．７５ｇ）、続いてＴｓＯＨ（１．１ｇ）を添加した。第三の投入の後、透明溶液が生成され、次いで、第四部のピペラジン（１０．７５ｇ）およびＴｓＯＨ−Ｈ２Ｏ、続いてＴｓＯＨ（１．１ｇ）を添加した（ｔ＝５２℃）。添加が完了したら、反応物を５０℃で３０分間撹拌した。
【０２０１】
別のフラスコ（５０ｍＬ）に、アセトアルデヒド（３０．８ｇ、３９ｍＬ、０．７ｍｏｌ）を投入し、氷水浴（０〜２℃）に入れた。アセトアルデヒドフラスコを、隔膜を介するカニューレよって三口フラスコと接続した。次いで、アルゴン流を、アセトアルデヒドの添加が３時間以内に完了することを確実にする速度で、アセトアルデヒドフラスコに通過させた。すべてのアセトアルデヒドを添加した後、反応物を５０℃で３０分間撹拌し、次いで４０℃に冷却し、５０％グリオキシル酸（１０４ｇ、７８ｍＬ）を、温度を５０℃未満に保つ速度で、４５分間かけて滴下添加した。次いで、水（１００ｍＬ）を添加し、反応物を７０℃で５時間加熱した。反応物を氷水浴中で４℃に冷却した。沈殿した生成物を濾過し、濾過ケーキを冷水（１００ｍＬ）で洗浄した。５０℃の真空で乾燥させた後、８８．９ｇ（７１％）の所望生成物が取得された。沈殿物は、７８．５％の表題化合物（ＨＰＬＣアッセイ）を含有している。
【０２０２】
（実施例９）
両方のアルデヒドの同時添加による５，５’−（ピペラジン−１，４−ジイル）ビス（４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オン）の代替的調製
ピペラジン（２３６．６ｇ）を、温度計、添加漏斗（１００ｍＬ）および還流冷却器が装着された清浄な３Ｌの乾燥した容器に投入した。ｐＴｓＯＨ（２５．３ｇ）、続いてアセトニトリル（５５０ｍＬ）を容器に投入した。かき混ぜ機を開始し、容器に窒素を挿入した（ｉｎｅｒｔｅｄ）。イソブチルアルデヒド（１５０ｍＬ、全投入の２７％）を、かき混ぜたピペラジン／ｐＴｓＯＨスラリーに投入し、約４３℃への温度上昇が観察された。次いで、白色懸濁液を５０℃（＋／−５℃）に加熱した。イソブチルアルデヒド（４００ｍＬ、全投入の７３％）および冷やしたアセトアルデヒド（２６０ｍＬ）の予め混合し冷やした溶液を、清浄な乾燥した１Ｌの容器に投入し、この混合物を氷浴中に維持した。イソブチルアルデヒド／アセトアルデヒド混合物を、３Ｌ容器の内容物に、１００ｍＬアリコートで、５０℃で５〜６時間かけて投入した。反応フラスコの内容物は、アセトアルデヒドの添加中に、白色懸濁液からワインレッド色の溶液、最終的には橙色懸濁液に変化した。添加完了後、懸濁液を５０℃で約０．５から１．０時間かき混ぜた。
【０２０３】
グリオキシル酸（５０％ｗｔ／ｗｔ）水溶液を、懸濁液に１０〜１５分間かけて投入し、温度は約７５℃に上昇した。５，５’−（ピペラジン−１，４−ジイル）ビス（４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オン）が溶液から結晶化するのが観察された。懸濁液を７０℃（＋／−５℃）で６時間撹拌し、次いで、撹拌しながら周囲温度に冷却した。次いで、バッチを−５から０℃に冷却し、３〜４時間保持した後、懸濁液を濾過し、ケーキを、冷やしたメタノール（１×５００ｍＬ）、次いで２×５００ｍＬのメタノールで周囲温度にて洗浄した。洗浄した生成物を、真空オーブン内、４０〜５０℃で乾燥させて一定重量とし、４７４ｇの９８％純粋な５，５’−（ピペラジン−１，４−ジイル）ビス（４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オン）（７０％）を得た。
【０２０４】
（実施例１０）
４−（２−メチル−１−プロペニル）−５−モルホリノ−２（５Ｈ）−フラノンまたは５，５’−（ピペラジン−１，４−ジイル）ビス（４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オン）からの５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オンの調製。
【０２０５】
【化６７】
2016516744.tif 000071
１０％ｗ／ｗ硫酸水溶液（１１０ｇ）を４−（２−メチル−１−プロペニル）−５−モルホリノ−２（５Ｈ）−フラノン（２０．０ｇ、０．８９６ｍｏｌ）に投入し、混合物を４時間またはＴＬＣ（１００：３  ＣＰＭＥ：ＨＯＡｃ）が反応完了を示すまで撹拌還流した。混合物は常に懸濁液のままであった。次いでこれを５℃に冷却し、２時間保持し、濾過した。白色固体を水で洗浄し、乾燥させて、５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オン（１２．９ｇ、９３％）を得た。
【０２０６】
代替として、硫酸の１０％ｗ／ｗ水溶液（４１２ｇ）を、５，５’−（ピペラジン−１，４−ジイル）ビス（４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オン）（６０ｇ、０．１６７ｍｏｌ）を含有する容器に投入した。内容物をかき混ぜ、次いで、還流まで加熱した。反応物を、出発材料が消費されるまで還流で保持し、これを溶解によって決定した。反応が完了したら、バッチを３５℃に冷却し、その時点で標的化合物が結晶化し始めた。スラリーを０〜５℃にさらに冷却し、次いで、フィルターに移した。生成物を濾過し、水（２×１００ｍＬ）で洗浄し、次いで、真空下、５０℃未満で乾燥させて、５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オン（４２．０ｇ、８１％）を得た。
GC/MS: m/z=154
1H NMR
(CDCl3): δ 6.10 (s, 1H); 5.92 (s, 1H); 5.88
(s, 1H); 5.35 (bs, 1H, O-H); 1.98 (s,3H); 1.93 (s, 3H). 13C NMR
(CDCl3): 172.8 (C), 161.4 (C), 152.3 (C), 115.3 (CH), 114.9 (CH),
99.5 (CH), 28.2 (CH3), 21.4 (CH3).
【０２０７】
（実施例１１）
イソブチルアルデヒドおよびアセトアルデヒドからのワンポットでの５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オンの調製。
【０２０８】
【化６８】
2016516744.tif 000072
ピペラジン（４３．０ｇ、０．５ｍｏｌ）およびイソブチルアルデヒド（２００ｍＬ）の混合物を、理論量の水（１８ｍＬ）が収集されるまで、ディーン・スターク下で還流させた。過剰のイソブチルアルデヒドを留去すると、１，４ビス（２−メチルプロペン−１−イル）ピペラジンの結晶塊が残った。これをアセトニトリル（１．２Ｌ）に溶解し、過剰のイソブチルアルデヒド（１００ｍＬ、１．０ｍｏｌ）を添加した。過剰のピペラジン（４．４ｇ）、続いてｐ−トルエンスルホン酸（４．４ｇ、２３．２ｍｍｏｌ）を添加した。温度を４０℃に調整し、アセトニトリル（４０ｍＬ）中のアセトアルデヒド（４４ｇ、１．０ｍｏｌ）の溶液を４時間かけて添加した。反応混合物を、４０℃で１時間および周囲温度で４時間撹拌した。アセトニトリルを留去し、残留物をトルエン（４００ｍＬ）に懸濁した。５０％グリオキシル酸（１４８ｇ）および水（１５０ｍＬ）の混合物を、０．５時間かけて添加した。次いで、混合物を４５℃で１５時間撹拌した。固体沈殿物があった。希釈硫酸（１０％、１Ｌ）を添加し、混合物を３時間還流させた。二相混合物が結果として生じた。トルエン相を分離した。この相は、分析により、約５０％収率（アセトアルデヒドに基づく）の５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロペン−１−イル）−２−フラノンを含有していた。
【０２０９】
（実施例１２）
５−メトキシ−４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オンの調製
【０２１０】
【化６９】
2016516744.tif 000073
４−（２−メチル−１−プロペニル）−５−モルホリノ−２（５Ｈ）−フラノン（７．７０ｇ、３４．５ｍｍｏｌ）を、Ｈ２ＳＯ４（４ｍＬ、２．２当量）を加えたＭｅＯＨ（５０ｍＬ）中、ＧＣによる出発材料の消失まで３時間、撹拌還流した。反応混合物を室温に冷却した。次いで、溶媒を真空で蒸発させ、残留物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で希釈した。有機相をＨ２Ｏ（３×５０ｍＬ）で洗浄した。次いで、溶媒を真空で蒸発させて、５−メトキシ−４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オンを橙色油（５．５０ｇ、９５％）として得、これを精製することなく使用することができる。
【０２１１】
代替として、５，５’−（ピペラジン−１，４−ジイル）ビス（４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オン）（１３０ｇ、３６３ｍｍｏｌ）およびＭｅＯＨ（６９０ｍＬ）を、２Ｌの丸底フラスコに機械的にかき混ぜながら投入して、懸濁液を形成した。濃Ｈ２ＳＯ４（４３ｍＬ、７６２ｍｍｏｌ）を、２０〜２５℃で撹拌しながら滴下添加し、わずかな発熱が観察され、存在する固体の性質は、分散し簡単に混合された状態からより濃厚なスラリーに変化した。反応混合物を５時間還流させた。０．５時間後、完全溶解（橙色液体）が観察された。５時間後、ＬＣＭＳは、約９９％の所望生成物を示した。混合物を周囲温度に冷却すると、硫酸ピペラジンの結晶体が残った。堆積物を濾過し、濾過ケーキを氷冷ＭｅＯＨ（４００ｍＬ）で洗浄した。濾液を真空で濃縮し（４０℃浴温度）、残留物を、水（５０ｍＬ）とＭＴＢＥ（３００ｍＬ）とに分配した。水層を分離し、さらに抽出した（２×３００ｍＬのＭＴＢＥ）。合わせた有機抽出物を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２００ｍＬ）で洗浄した。ＭＴＢＥ層を１．５時間撹拌しながらＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、５−メトキシ−４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オンを橙色油（１２０ｇ、９８％）として得た。
【０２１２】
０．２〜０．３ｍｂａｒ真空、沸点１００〜１０５℃で蒸留した。GC/MS:
m/z=168; 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ
5.59 (1H, s) 5.88-5.86 (1H, m) 5.75 (1H, d, J=0.6) 3.53 (3H, s) 2.01-2.00 (3H,
m) 1.97-1.96 (3H, m). 13C NMR (CDCl3): 171.4 (C), 159.2
(C), 151.9 (C), 115.8 (CH), 115.2 (CH), 104.4 (CH), 56.1 (CH3), 28.2
(CH3), 21.4 (CH3).
【０２１３】
下記の化合物は、４−（２−メチル−１−プロペニル）−５−モルホリノ−２（５Ｈ）−フラノンから、上記の方法の第一に従い、メタノールを、３−メチルブタノール（イソアミルアルコール）、ｎ−ペンタノール（アミルアルコール）またはｎ−ブタノールで置きかえることによって調製した：
【０２１４】
実施例１２Ａ
５−（３−メチルブトキシ）−４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オン
０．４ｍｂａｒ真空、沸点１３９〜１４０℃で蒸留した；GC/MS: m/z=224; 1H-NMR
(400MHz, CDCl3) δ 5.94 (1H, s) 5.87-5.84
(1H, m) 5.80 (1H, s) 3.86-3.80 (1H, m) 3.70-3.64 (1H, m) 2.00 (3H, s) 1.96 (3H,
s) 1.77-1.66 (1H, m) 1.57-1.50 (2H, m) 0.93-0.91 (3H, m) 0.91-0.89 (3H, m)
【０２１５】
実施例１２Ｂ
４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）−５−ペンチルオキシフラン−２（５Ｈ）−オン
０．０８ｍｂａｒ真空、沸点１２３〜１３４℃で蒸留した；GC/MS: m/z=224;
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ 5.94 (s,
1H); 5.86 (s, 1H); 5.80 (s, 1H); 3.84-3.75 (m, 1H); 3.68-3.59 (m, 1H); 2.01 (s,
3H); 1.95 (s, 3H); 1.69-1.59 (m, 2H); 1.38-1.29 (m, 4H); 0.95-0.85 (m, 3H)
【０２１６】
実施例１２Ｃ
５−ブトキシ−４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オン
０．０５ｍｂａｒ真空、沸点１３６〜１４６℃で蒸留した；GC/MS: m/z=210;
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ 5.94 (s,
1H); 5.86 (s, 1H); 5.80 (s, 1H); 3.85-3.76 (m, 1H); 3.69-3.60 (m, 1H); 2.00 (s,
3H); 1.95 (s, 3H); 1.68-1.58 (m, 2H); 1.45-1.32 (m, 2H); 0.93 (t, 3H, J=7.4Hz)
【０２１７】
（実施例１３）
５−メトキシ−４−（２−メチルプロピル）−ジヒドロフラン−２（３Ｈ）−オンの調製
【０２１８】
【化７０】
2016516744.tif 000074
ＭＴＢＥ（７００ｍＬ）中の５−メトキシ−４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オン（１００ｇ、実施例１２を参照）の溶液、５ｇ（５ｗｔ％）の１０％Ｐｄ／Ｃを、水素化容器に投入した。１気圧の水素を導入し、反応中、圧力を一定に保った。２０℃で７時間後、反応物をセライトパッド（φ６０ｍｍ、Ｈ＝３０ｍｍ）に通して濾過し、ＭＴＢＥ（３×５０ｍＬ）ですすいだ。濾液を、１Ｍ  ＮａＨＣＯ３溶液（２００ｍＬ）、水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒除去後、５−メトキシ−４−（２−メチルプロピル）−ジヒドロフラン−２（３Ｈ）−オンが無色液体（９８ｇ、９６％）として取得された。
GC/MS: m/z=172
1H NMR
(400MHz, CDCl3) δ 5.25 (d, J=5.0Hz, 0.53 H, 主異性体), 5.04 (d, J=2.4Hz, 0.26H, 副異性体), 3.48 (s,
0.92H, 副異性体), 3.46 (s, 1.66H, 主異性体), 2.78 (dd, J=17.7, 8.6Hz, 0.33H), 2.59-2.42 (m, 1.27H, 主異性体), 2.42-2.34 (m, 0.33H, 副異性体), 2.29 (dd,
J=16.7, 11.8Hz, 0.63H, 主異性体), 2.15 (dd, J=17.7, 4.6Hz,
0.33H, 副異性体), 1.67-1.31 (m, 2.63H 両異性体), 1.28-1.19 (m, 0.33H, 副異性体), 0.95-0.86 (m,
6H 両異性体). 13C NMR (CDCl3): 177.7
(C, 主異性体), 176.04 (C, 副異性体),
110.1 (CH, 副異性体), 106.1 (CH, 主異性体), 57.0 (CH3, 副異性体), 56.6 (CH3,
主異性体), 41.2 (CH2, 副異性体), 39.1 (CH2, 副異性体), 38.3 (CH2,
主異性体), 37.1 (CH2, 主異性体), 33.9 (CH, 副異性体), 32.8 (CH, 主異性体), 26.0 (CH, 主異性体), 25.8 (CH, 副異性体), 23.0 (CH3, 主異性体), 22.9 (副異性体), 22.7 (主異性体), 22.6 (副異性体).
【０２１９】
同じ一般的方法を使用し、実施例１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃの化合物からそれぞれ出発して、下記の化合物も取得された：
（実施例１３Ａ）
５−（３−メチルブトキシ）−４−（２−メチルプロピル）−ジヒドロフラン−２（３Ｈ）−オン
GC/MS: m/z=228; 1H-NMR (400MHz,
CDCl3) δ 5.35 (0.86H, d, J=5.0Hz) 5.13
(0.14H, d, J=2.7Hz) 3.87-3.79 (m, 1H) 3.57-3.45 (m, 1H) 2.58-2.37 (2H, m)
2.35-2.27 (0.79H, m) 2.20-2.11 (0.21H, m) 1.74-1.62 (1H, m) 1.61-1.44 (4H, m)
1.42-1.31 (1H, m) 0.95-0.86 (12H, m)
（実施例１３Ｂ）
４−（２−メチルプロピル）−５−ペンチルオキシジヒドロフラン−２（３Ｈ）−オン
GC/MS: m/z=228; 1H-NMR (400MHz,
CDCl3) δ 5.35 (0.77H, d, J=5.0Hz) 5.13
(0.23H, d, J=2.6Hz,) 3.83-3.75 (1H, m) 3.55-3.40 (1H, m) 2.59-2.37 (2H, m) 2.32
(0.73H, dd, J=16.6, 11.8Hz) 2.15 (0.27H, dd, J=17.7, 5.0Hz) 1.67-1.45 (4H, m)
1.41-1.25 (5H, m) 0.96-0.86 (9H, m)
（実施例１３Ｃ）
５−ブトキシ−４−（２−メチルプロピル）−ジヒドロフラン−２（３Ｈ）−オン
GC/MS: m/z=214; 1H-NMR (400MHz,
CDCl3) δ 5.35 (0.8H, d, J=5.0Hz) 5.13 (0.2H,
d, J=2.6Hz,) 3.85-3.75 (1H, m) 3.56-3.41 (1H, m) 2.59-2.38 (2H, m) 2.31 (0.76H,
dd, J=16.5, 11.7Hz) 2.15 (0.24H, dd, J=17.6, 5.0Hz) 1.66-1.45 (4H, m) 1.43-1.30
(3H, m) 0.95-0.87 (9H, m)
【０２２０】
（実施例１４）
５−（Ｌ−メンチルオキシ）−４−（２−メチル−１−プロペニル）−２（５Ｈ）−フラノンの調製および水素化
【０２２１】
【化７１】
2016516744.tif 000075
５−ヒドロキシ−４−（２−メチル−１−プロペニル）−２−フラノン（５９．５ｇ、０．３８６ｍｏｌ）、Ｌ−メントール（８９．５ｇ、１．５当量）およびメタンスルホン酸（１．５ｇ）の混合物を、真空下（水を除去するために）、７０〜８０℃で１００時間撹拌した。液塊を（熱いまま）アセトニトリル（４５０ｍＬ）に注ぎ入れ、表題化合物を、冷却、濾過および洗浄によって単離した。収量は７６．２ｇ（６７％）であった。ＸＲＤに好適な結晶を、アセトン溶液の緩徐蒸発によって成長させた。アセタール炭素における配置は、（Ｒ）であった。
【０２２２】
実施例１３の条件を使用する酢酸エチル中での５−（Ｌ−メンチルオキシ）−４−（２−メチル−１−プロペニル）−２−フラノンの水素化により、飽和誘導体を定量的収率で得た。１Ｈ  ＮＭＲにより、化合物はジアステレオマーの１：１混合物であった。
【０２２３】
（実施例１５）
５−アセトキシ−４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オンの調製
【０２２４】
【化７２】
2016516744.tif 000076
酢酸エチル（１００ｍＬ）中の５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オン（１９ｇ、０．１２３ｍｏｌ）の懸濁液を、固体炭酸ナトリウム（１３．１ｇ、０．１２３ｍｏｌ）および硫酸水素テトラブチルアンモニウム（０．５ｇ）で処理した。無水酢酸（１８．８ｇ、１．５当量）を一度に添加した。穏やかに発熱する反応が続いて起こった。混合物を終夜撹拌し、水（１００ｍＬ）を添加し、有機相を分離した（水性相のｐＨは６．０であった）。酢酸エチル相を水洗浄し、濃縮すると、固体（２４．６ｇ、１００％）が残った。これは、ＴＬＣ（１００：３  ＣＰＭＥ：酢酸）により純粋であった。この反応が酢酸イソプロピル中で行われるならば、純粋な化合物は、水洗浄後に酢酸イソプロピル溶液を冷却することによって、約７０％収率で単離することができる。
m/z: 196
【０２２５】
（実施例１６）
５−アセトキシ−４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オンの水素化
【０２２６】
【化７３】
2016516744.tif 000077
実施例３４の材料を、実施例１３において概説されているものと同様の条件下で水素化して、９０％超収率の５−アセトキシ−４−（２−メチルプロピル）−３，４−ジヒドロ−２（５Ｈ）−フラノンを、ジアステレオマーの１：１混合物として得た。生成物には、約５％の４−（２−メチルプロピル）−３，４−ジヒドロフラン−２（５Ｈ）−オンが付随している。生成物を、実施例３０のように加水分解して、５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）−３，４−ジヒドロ−５Ｈ−２−フラノン／３−ホルミル−５−メチルヘキサン酸の収率を得ることができる。
【０２２７】
（実施例１７）
アルカリ性溶液中での５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オンの水素化による５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）ジヒドロフラン−２（３Ｈ）−オン（ＩＡ）の調製
【０２２８】
【化７４】
2016516744.tif 000078
５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロペン−１−イル）−２−フラノン（３．３５ｇ、２１．７ｍｍｏｌ）および水（２０ｍＬ）を、水素化装置に投入した。次いで、水酸化カリウム（１．２１ｇ、１当量）を容器に投入し、内容物を、溶解が起こるまで４０℃に加熱した。１０％Ｐｄ／炭素触媒（０．６７ｇ）を容器に投入し、次いで、反応器の内容物を４０℃および５ｂａｒｇ水素圧力で水素化した。反応が完了したら、反応物を冷却し、触媒を濾過によって除去した。３６％塩酸の添加によってｐＨをｐＨ２に調整し、水性層をトルエンで洗浄して、所望生成物を抽出した。合わせたトルエン抽出物を濃縮して、表題化合物（３．１７ｇ、９２％）を得た。
【０２２９】
（実施例１８）
中性溶液中での５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オンの水素化
５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロペン−１−イル）−２−フラノンを、１０％ｗ／ｗのＰｄ／Ｃ触媒を加えた出発材料１グラム当たり６ｍＬの水中で水素化した（２２時間、４０℃、１０ｂａｒ）。濾過して、油性相を水から分離した。これは、５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）ジヒドロフラン−２（３Ｈ）−オン（ＩＡ）および４−（２−メチルプロピル）−ジヒドロフラン−２−オンの１：１混合物であった。化合物（ＩＡ）は、酸塩基抽出によって純粋なまま簡単に分離できる。この反応を、２−プロパノールを加えた有機溶媒中で繰り返して、比較的純粋な（ＩＡ）を得た。
【０２３０】
（実施例１９）
ワンポットでの５，５’−（ピペラジン−１，４−ジイル）ビス（４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オン）からの５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）ジヒドロフラン−２（３Ｈ）−オン（ＩＡ）の調製
【０２３１】
【化７５】
2016516744.tif 000079
５，５’−（ピペラジン−１，４−ジイル）ビス（４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オン）（５０．０ｇ、０．１４ｍｏｌ）を、硫酸（１６．０ｇ、０．１６３ｍｏｌ）を含有する水（３００ｍＬ）に投入した。酢酸イソプロピル（２００ｍＬ）を添加した。５０％水湿式５％パラジウム炭素（３．０ｇ）を添加し、混合物を周囲温度で１５時間水素化（５ｂａｒ水素）した。反応混合物を触媒から濾過し、酢酸イソプロピル（３００ｍＬ）で洗浄し、この酢酸イソプロピルは容器を洗い流すのにも使用した。有機相を分離し、水（１００ｍＬ）で洗浄し、ロータリーエバポレーターで濃縮して、３８．８ｇの透明油を得た。これは、所望化合物（ＩＡ）および過還元されたラクトン（４−（２−メチルプロピル）−ジヒドロフラン−２−オン）の混合物であった。これを、炭酸カリウム水溶液での抽出によって容易に精製し、トルエンで洗浄した。ギ酸による炭酸カリウム抽出物の酸性化により、所望生成物（ＩＡ）（２５．６ｇ、５８％）を得た。
1H NMR
(D2O、K2CO3添加): δ 9.5 (1H), 2.8 (m, 2H), 2.40 (m,2H),
1.55 (m, 2H), 1.30 (m, 2H), 0.95 (m, 6H).
【０２３２】
（実施例２０）
３−イソブチリデン−２−オキソペンタン二酸一カリウム塩の調製。
【０２３３】
【化７６】
2016516744.tif 000080
２Ｌの丸底フラスコに、３００ｇのα−ケトグルタル酸および４５０ｍＬの氷水を投入した。撹拌および冷却しながら、４５０ｍＬの水中３１４ｇの水酸化カリウムを投入し、その間、ポット温度を２５℃未満に保った。反応器を窒素下に置き、イソブチルアルデヒドを０．２ｍＬ／分で５０時間かけて添加した。得られた二相黄色溶液を分離し、１００ｍＬのＭＴＢＥで洗浄した。より低い水性相のｐＨを３．２〜３．４に調整し、真空下、６５℃で１／３の体積に濃縮した。５℃未満に冷却した後、得られた固体を収集し、いくらか少量の水で洗浄して、乾燥した後、６０％の３−イソブチリデン−２−オキソペンタン二酸一カリウム塩および残りのＫＣｌを含有する、２３０ｇの白色固体を得た。
1H NMR
(D2O、pH 8-10, 400MHz) δ 6.4 (d, 1H), 3.3 (s, 2H), 2.7 (m, 1H), 0.96 (d, 6H). 13C
NMR (D2O、pH 8-10, 400MHz) δ 23 (2CH3), 31 (CH), 35 (CH2), 133 (C), 164
(CH), 170 (C), 176 (C), 182 (C).
【０２３４】
（実施例２１）
３−（２−メチルプロピル）−２−オキソペンタン二酸一カリウム塩の調製
【０２３５】
【化７７】
2016516744.tif 000081
実施例２０で生成した通りの３−イソブチリデン−２−オキソペンタン二酸一カリウム塩の水溶液を、ｐＨ６〜８に調整し、５％Ｐｄ／Ｃを添加し、溶液を１０ｂａｒ  Ｈ２  ２５℃で１０時間水素化した。触媒を濾過によって除去し、溶液のｐＨをｐＨ３．８に調整した。混合物を５℃未満に冷却し、濾過し、少量の冷水で洗浄した。得られた白色結晶を、真空下、４０℃で乾燥させて、表題化合物、２８６ｇ、２ステップにわたって５８％収率を得た。
1H NMR
(D2O、pH 8-10, 400MHz) δ 3.5 (m, 1H), 2.5 (dd, 1H), 2.3 (dd, 1H), 1.6-1.5 (m, 2H) 1.3-1.2
(m, 1H) 0.9 (d, 6H).  13C NMR (D2O、pH 8-10, 400MHz) δ 21.7 (CH3),
22.2 (CH3), 25.5 (CH), 38.4 (CH2), 39.3 (CH2),
43.4 (CH), 167.8 (C), 170.6 (C), 180.7 (C).
【０２３６】
（実施例２２）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるデカルボキシラーゼ酵素の発現
ＰｕｂＭｅｄを使用して、幅広い活性を持つデカルボキシラーゼ酵素についての文献を調査した。ＫＥＧＧ（京都遺伝子ゲノム百科事典）プログラムを使用して、３−（２−メチルプロピル）−２−オキソペンタン二酸または３−イソブチリデン−２−オキソペンタン二酸と構造が幾分類似している化合物に対して活性を持つ微生物のデカルボキシラーゼについて調査した。７つのクラスのデカルボキシラーゼを、いくらかの構造的類似性を持つ化合物に対する活性の報告に基づき、調査のために選択した。デカルボキシラーゼクラスは、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ、分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ、芳香族−Ｌ−アミノ−酸デカルボキシラーゼ、リシンデカルボキシラーゼおよびベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼであった。証明された、または推定上のデカルボキシラーゼ酵素について、４１配列の遺伝子を選択した。遺伝子は、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ  ＵＳＡ）、またはＢｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ  ＵＳＡ）によって合成された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のためにコドン最適化し、発現ベクターｐＳＴＲＣ５２（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）にクローン化し、発現株大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＤＧ６２（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）に入れた（以下の表１）。２つの遺伝子を、ＰＣＲによって適切な生物由来のゲノムＤＮＡから増幅させ、同じ発現ベクターおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株にクローン化した。４つのデカルボキシラーゼ酵素をＳｉｇｍａから購入し、３−（２−メチルプロピル）−２−オキソペンタン二酸に対する活性について試験した。
【０２３７】
クローン化したデカルボキシラーゼ遺伝子を含有する各大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を、適切な抗生物質を加えたＬＢ培養液中で終夜成長させた。少量（５０μＬ〜１００μＬ）の終夜種培養物を使用して、直径２０ｍｍの培養管中に、適切な抗生物質を加えた４．０ｍＬのテリフィックブロス培地を植菌した。培養物を、振とうインキュベーター内、３２℃および３００ｒｐｍで成長させた。５時間の成長後、ＩＰＴＧを０．４ｍＭの最終濃度まで添加して、酵素発現を誘導した。培養物をインキュベーターに戻し、追加で１９時間成長させた。
【０２３８】
（実施例２３）
デカルボキシラーゼ酵素による３−（２−メチルプロピル）−２−オキソペンタン二酸カリウム塩および３−イソブチリデン−２−オキソペンタン二酸カリウム塩の脱炭酸
【０２３９】
【化７８】
2016516744.tif 000082
組換えデカルボキシラーゼ酵素を、３−（２−メチルプロピル）−２−オキソペンタン二酸（ＸＶ）および３−イソブチリデン−２−オキソペンタン二酸（ＸＩＩ）の脱炭酸について、実施例２２で記述されている通りに調製した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を使用して試験した。反応（１ｍＬ）は、デカルボキシラーゼ（６０ｍｇ湿細胞）、５０ｍＭの３−（２−メチルプロピル）−２−オキソペンタン二酸または３−イソブチリデン−２−オキソペンタン二酸、ＴｈＤＰ（０．１ｍＭ）およびＭｇＳＯ４（２．５ｍＭ）を加えたリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ６．４）中、３７℃で行った。３−（２−メチルプロピル）−２−オキソペンタン二酸および３−イソブチリデン−２−オキソペンタン二酸の脱炭酸は、ＵＰＬＣアッセイによって決定した。アリコート（０．１ｍＬ）の反応物を、０．５ｍＬのリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、リン酸でｐＨ２．２に調整したもの）および０．３ｍＬの２，４−ジニトロフェニルヒドラジンの溶液（１Ｍ  ＨＣｌ：アセトニトリル、３：１、ｖ／ｖ中２０ｍＭ）により、５０℃で３０分間処理した。誘導体化された試料を、０．５ｍＬのアセトニトリルで希釈し、濾過し、水：アセトニトリル（５５：４５、ｖ／ｖ）中０．１％トリフルオロ酢酸により１．１ｍＬ／分で溶離するＡｇｉｌｅｎｔエクリプス・プラスＣ１８カラム（１００ｍｍ×３．０ｍｍ、１．８μｍ）でのＵＰＬＣによって分析した。カラムを４０℃で維持し、流出物を３６０ｎｍおよびＥＳ＋質量分析でモニターした。３−（２−メチルプロピル）−２−オキソペンタン二酸からの３−ホルミル−５−メチルヘキサン酸、または３−イソブチリデン−２−オキソペンタン二酸からの３−ホルミル−５−メチルヘキサ−３−エン酸について、ピークの存在によって陽性結果が指示された。分析の結果を、表１に示す。
【０２４０】
【表２−１】
2016516744.tif 000083
【０２４１】
【表２−２】
2016516744.tif 000084
【０２４２】
【表２−３】
2016516744.tif 000085
【０２４３】
（実施例２４）
３−ホルミル−５−メチルヘキサ−３−エン酸の調製
【０２４４】
【化７９】
2016516744.tif 000086
２５０ｍＬの丸底フラスコに、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ（実施例２３を参照）を発現している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む８０ｇの細胞濃縮物を投入した。これに、５０ｍＬの水中の３−イソブチリデン−２−オキソペンタン二酸一カリウム塩（１０ｇ、実施例２０を参照）のｐＨ６．２に調整した溶液を、０．５ｇの硫酸マグネシウムおよび０．５ｇのチアミンピロリン酸とともに添加した。得られたｐＨ６．２のスラリーを５０℃に加熱し、濃ＨＣｌで６．２から７．２の間に調整されたｐＨを保ちながら、１４５時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、遠心分離した。上澄み液を５０ｍＬのＭＴＢＥで、かき混ぜを最小限に抑えて洗浄した。水性相のｐＨを４に調整し、セライトに通して濾過した。濾液を５０ｍＬのＭＴＢＥで、かき混ぜを最小限に抑えて３回抽出した。ＭＴＢＥを無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、濃厚赤色油とした。この油を数部の熱ヘキサンで抽出し、合わせたヘキサンを０℃未満に冷却し、得られた結晶を単離し、風乾させて、３−ホルミル−５−メチルヘキサ−３−エン酸を白色固体（０．６ｇ）として得た。
1H NMR
(D2O、pH 8-10, 400MHz) δ 9.2 (s, 1H), 6.6 (d, 1H), 3.1 (s, 2H), 2.7 (m, 1H), 1 (d, 6H)
【０２４５】
（実施例２５）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるエノエートレダクターゼ同族体の発現
リコペルシコン・エスカレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）（トマト）１２−オキソフィトジエン酸レダクターゼ１（ＯＰＲ１）を表す遺伝子に対応するＤＮＡ配列を、ジーンバンクデータベース（受託番号ＡＣ  Ｑ９ＸＧ５４）から呼び出し、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成した。配列を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のためにコドン最適化し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現プラスミドｐＳＴＲＣ１８（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）にサブクローン化した。タンパク質配列を以下に示す。ＯＰＲ１発現構築物を、指示通りにＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）に転換し、終夜培養物をＬＢ＋ストレプトマイシン培地中でインキュベートした。ＬＢ培養物を使用して、発現培養物（ＬＢ、Ｍ９ＹまたはＴＢ）を植菌し、これを３７℃（２１０ｒｐｍ）でインキュベートした。培養物が好適なバイオマス濃度（Ａ６００でＯＤ１）に到達した後、ＩＰＴＧを添加し（１ｍＭ）、培養物をもう２０時間インキュベートした（３０℃、２１０ｒｐｍ）。細胞を遠心分離（４０００×ｇ、３０分、４℃）によって収集し、−２０℃で貯蔵した。
【０２４６】
ＢＬＡＳＴＰプログラムを使用して、リコペルシコン・エスカレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）由来の１２−オキソフィトジエン酸レダクターゼ（ＯＰＲ１）に関係する遺伝子配列について、ＮＣＢＩ非冗長タンパク質配列データベースを調査した。関連遺伝子について３８配列を選択し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のためにコドン最適化し、ｐＥＴ２８ｂ（＋）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現プラスミド（ノバジェン、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）にサブクローン化した。ＯＰＲ１関連発現構築物を、指示通りにＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）に転換し、終夜培養物をＬＢ＋カナマイシン培地中で成長させた。ＬＢ培養物を使用して、オーバーナイト・エクスプレス・インスタントＴＢ培地（ノバジェン、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）中で成長させた発現培養物を植菌した。培養物を３０℃で２０時間インキュベートし、細胞を遠心分離（４０００×ｇ、３０分、４℃）によって収集し、−２０℃で貯蔵した。
【０２４７】
リコペルシコン・エスカレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）（トマト）１２−オキソフィトジエン酸レダクターゼ１タンパク質配列：
ＭＥＮＫＶＶＥＥＫＱ  ＶＤＫＩＰＬＭＳＰＣ  ＫＭＧＫＦＥＬＣＨＲ  ＶＶＬＡＰＬＴＲＱＲ  ＳＹＧＹＩＰＱＰＨＡ  ＩＬＨＹＳＱＲＳＴＮ  ＧＧＬＬＩＧＥＡＴＶ  ＩＳＥＴＧＩＧＹＫＤ  ＶＰＧＩＷＴＫＥＱＶ  ＥＡＷＫＰＩＶＤＡＶ  ＨＡＫＧＧＩＦＦＣＱ  ＩＷＨＶＧＲＶＳＮＫ  ＤＦＱＰＮＧＥＤＰＩ  ＳＣＴＤＲＧＬＴＰＱ  ＩＲＳＮＧＩＤＩＡＨ  ＦＴＲＰＲＲＬＴＴＤ  ＥＩＰＱＩＶＮＥＦＲ  ＶＡＡＲＮＡＩＥＡＧ  ＦＤＧＶＥＩＨＧＡＨ  ＧＹＬＩＤＱＦＭＫＤ  ＱＶＮＤＲＳＤＫＹＧ  ＧＳＬＥＮＲＣＲＦＡ  ＬＥＩＶＥＡＶＡＮＥ  ＩＧＳＤＲＶＧＩＲＩ  ＳＰＦＡＨＹＮＥＡＧ  ＤＴＮＰＴＡＬＧＬＹ  ＭＶＥＳＬＮＫＹＤＬ  ＡＹＣＨＶＶＥＰＲＭ  ＫＴＡＷＥＫＩＥＣＴ  ＥＳＬＶＰＭＲＫＡＹ  ＫＧＴＦＩＶＡＧＧＹ  ＤＲＥＤＧＮＲＡＬＩ  ＥＤＲＡＤＬＶＡＹＧ  ＲＬＦＩＳＮＰＤＬＰ  ＫＲＦＥＬＮＡＰＬＮ  ＫＹＮＲＤＴＦＹＴＳ  ＤＰＩＶＧＹＴＤＹＰ  ＦＬＥＴＭＴ（配列番号８）
【０２４８】
リコペルシコン・エスカレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）（トマト）１２−オキソフィトジエン酸レダクターゼ１コドン最適化配列：
ＡＴＧＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＴＴＧＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＡＣＡＧＧＴＴＧＡＴＡＡＡＡＴＣＣＣＧＣＴＧＡＴＧＡＧＣＣＣＧＴＧＴＡＡＡＡＴＧＧＧＴＡＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＧＴＧＴＣＡＴＣＧＣＧＴＴＧＴＡＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＴＧＡＣＴＣＧＴＣＡＧＣＧＴＴＣＴＴＡＴＧＧＴＴＡＣＡＴＴＣＣＧＣＡＧＣＣＧＣＡＣＧＣＡＡＴＣＣＴＧＣＡＴＴＡＣＴＣＴＣＡＧＣＧＣＡＧＣＡＣＣＡＡＣＧＧＴＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＴＣＧＧＴＧＡＡＧＣＡＡＣＣＧＴＧＡＴＣＡＧＣＧＡＡＡＣＴＧＧＣＡＴＣＧＧＴＴＡＣＡＡＡＧＡＴＧＴＧＣＣＧＧＧＴＡＴＣＴＧＧＡＣＧＡＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＴＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＡＡＣＣＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＧＣＧＧＴＧＣＡＴＧＣＣＡＡＡＧＧＴＧＧＴＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＧＧＣＡＣＧＴＴＧＧＴＣＧＴＧＴＡＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＴＴＴＴＣＡＧＣＣＧＡＡＣＧＧＣＧＡＡＧＡＴＣＣＧＡＴＴＴＣＣＴＧＴＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＣＣＧＣＡＧＡＴＣＣＧＴＴＣＣＡＡＣＧＧＣＡＴＴＧＡＣＡＴＴＧＣＣＣＡＣＴＴＣＡＣＣＣＧＴＣＣＡＣＧＴＣＧＣＣＴＧＡＣＴＡＣＴＧＡＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＣＡＧＡＴＣＧＴＧＡＡＣＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＧＣＡＧＣＧＣＧＴＡＡＴＧＣＴＡＴＴＧＡＡＧＣＧＧＧＴＴＴＣＧＡＴＧＧＣＧＴＣＧＡＧＡＴＴＣＡＴＧＧＴＧＣＣＣＡＣＧＧＴＴＡＣＣＴＧＡＴＣＧＡＣＣＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＡＧＡＣＣＡＡＧＴＴＡＡＣＧＡＣＣＧＣＡＧＣＧＡＴＡＡＧＴＡＴＧＧＣＧＧＴＴＣＴＣＴＧＧＡＧＡＡＣＣＧＴＴＧＴＣＧＣＴＴＣＧＣＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＧＴＴＧＡＡＧＣＡＧＴＡＧＣＣＡＡＣＧＡＧＡＴＴＧＧＣＴＣＣＧＡＣＣＧＴＧＴＴＧＧＴＡＴＣＣＧＴＡＴＣＴＣＴＣＣＡＴＴＣＧＣＡＣＡＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡＧＣＧＧＧＣＧＡＣＡＣＴＡＡＣＣＣＧＡＣＣＧＣＡＣＴＧＧＧＣＣＴＧＴＡＴＡＴＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＣＴＧＡＡＴＡＡＡＴＡＣＧＡＣＣＴＧＧＣＧＴＡＴＴＧＴＣＡＣＧＴＧＧＴＣＧＡＧＣＣＧＣＧＣＡＴＧＡＡＡＡＣＣＧＣＣＴＧＧＧＡＡＡＡＧＡＴＴＧＡＧＴＧＣＡＣＣＧＡＡＡＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣＧＡＴＧＣＧＴＡＡＡＧＣＣＴＡＣＡＡＡＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＴＣＧＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＴＡＣＧＡＣＣＧＴＧＡＡＧＡＣＧＧＴＡＡＣＣＧＣＧＣＴＣＴＧＡＴＣＧＡＡＧＡＣＣＧＴＧＣＣＧＡＣＣＴＧＧＴＴＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＴＣＴＧＴＴＣＡＴＣＡＧＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＧＣＣＧＡＡＧＣＧＴＴＴＴＧＡＡＣＴＧＡＡＣＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＡＣＡＡＡＴＡＣＡＡＣＣＧＴＧＡＣＡＣＴＴＴＣＴＡＣＡＣＴＴＣＣＧＡＣＣＣＧＡＴＣＧＴＴＧＧＴＴＡＣＡＣＣＧＡＴＴＡＣＣＣＧＴＴＴＣＴＧＧＡＡＡＣＴＡＴＧＡＣＴＴＡＡＴＡＡ（配列番号９）
【０２４９】
（実施例２６）
組換えレダクターゼによる（Ｅ）−３−ホルミル−５−メチルヘキサ−３−エン酸の還元
【０２５０】
【化８０】
2016516744.tif 000087
組換えエノエートレダクターゼを、（Ｅ）−３−ホルミル−５−メチルヘキサ−３−エン酸の還元について、実施例２５で記述されている通りに調製した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を使用して試験した。反応（０．５ｍＬ）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（１００ｍｇ湿細胞／ｍＬ）、ＮＡＤＰＨ（１０ｍＭ）、ＮＡＤＨ（１０ｍＭ）および（Ｅ）−３−ホルミル−５−メチルヘキサ−２−エン酸（１０ｍＭ）を加えたリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）中、３０℃で行った。１６時間後、アセトニトリル（０．５ｍｌ）を各反応物に添加し、得られた混合物を遠心分離した（２０００ｒｐｍ×５分）。アリコート（０．１ｍＬ）の得られた上清を、０．１ｍＬのリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、リン酸でｐＨ２．２に調整したもの）および０．２２５ｍＬの２，４−ジニトロフェニルヒドラジンの溶液（１Ｍ  ＨＣｌ：アセトニトリル、３：１、ｖ／ｖ中２０ｍＭ）により、５０℃で３０分間処理した。誘導体化された試料を、０．２２５ｍＬのアセトニトリルで希釈し、水：アセトニトリル（６５：３５、ｖ／ｖ）中０．１％トリフルオロ酢酸により２ｍＬ／分で溶離するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｘ  ５μアミロース−２カラム（内径２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）でのＨＰＬＣによって分析した。カラムを５０℃で維持し、流出物を３６０ｎｍでモニターした。ＨＰＬＣ分析の結果を、表２に示す。
【０２５１】
【表３−１】
2016516744.tif 000088
【０２５２】
【表３−２】
2016516744.tif 000089
【０２５３】
【表３−３】
2016516744.tif 000090
【０２５４】
（実施例２７）
組換えレダクターゼおよびホルメートデヒドロゲナーゼによる（Ｅ）−３−ホルミル−５−メチルヘキサ−３−エン酸の還元
【０２５５】
【化８１】
2016516744.tif 000091
組換えエノエートレダクターゼを、ＮＡＤ＋およびホルメートデヒドロゲナーゼによる（Ｅ）−３−ホルミル−５−メチルヘキサ−３−エン酸の還元について評価した。エノエートレダクターゼを、実施例２５で記述されている通りの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞において発現させた。ホルメートデヒドロゲナーゼを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞において、次の通りに発現させた：ｐＥＴ２６ｂホルメートデヒドロゲナーゼ発現構築物を、指示通りにＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）に転換し、終夜培養物をＬＢ＋カナマイシン培地中で成長させた。ＬＢ培養物を使用して、オーバーナイト・エクスプレス・インスタントＴＢ  Ｍｅｄｉｕｍ＋カナマイシン（ノバジェン、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）中で成長させた発現培養物を植菌した。培養物を３０℃で２０時間インキュベートし、細胞を遠心分離（４０００×ｇ、３０分、４℃）によって収集し、−２０℃で貯蔵した。オキソフィトジエン酸レダクターゼ３（受託番号Ｑ９ＦＥＷ９）の変異体（Ｄ７４Ｍ）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞において、次の通りに発現させた：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発法キットを使用して、オキソフィトジエン酸レダクターゼ３変異体Ｄ７４Ｍを指示通りに作製した。プライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ、ＵＳＡ）に発注した。ｐＳＴＲＣ１８オキソフィトジエン酸レダクターゼ３（ＯＰＲ３）発現構築物を、指示通りにＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）に転換し、終夜培養物を拡張培養液＋ストレプトマイシン（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）中で成長させた。ＬＢ培養物を使用して、過剰発現培養液＋ストレプトマイシン（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）中で成長させた発現培養物を植菌した。培養物を２３℃で２０時間インキュベートし、細胞を遠心分離（４０００×ｇ、３０分、４℃）によって収集し、−２０℃で貯蔵した。
【０２５６】
反応（０．５ｍＬ）は、エノエートレダクターゼ（４０ｍｇ湿細胞／ｍＬ）、ホルメートデヒドロゲナーゼ（８０ｍｇ湿細胞／ｍＬ）、ＮＡＤ＋（０．０２ｍＭ）、ギ酸アンモニウム（３０ｍＭ）および（Ｅ）−３−ホルミル−５−メチルヘキサ−３−エン酸（２０ｍＭ）を加えたリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）中、３０℃で行った。２４時間後、反応混合物を０．０２５ｍＬの４Ｎ  ＨＣｌで酸性化し、１ｍＬの酢酸エチルで抽出した。アリコート（０．５ｍＬ）の酢酸エチル抽出物（０．５ｍＬ）を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、メタノール（０．０２ｍＬ）および（トリメチルシリル）ジアゾメタン（０．０１ｍＬのジエチルエーテル中２Ｍ溶液）で処理して、カルボン酸部分を、それらの対応するメチルエステルに誘導体化した。誘導体化された試料を、Ｃｈｉｒａｌｄｅｘ（商標）Ｇ−ＴＡカラム（３０Ｍ×０．２５ｍｍカラム、カラム温度：１３５℃等温、注入器温度：２００℃、担体ガス：ヘリウム、流速およそ１ｍＬ／分）でのＧＣによって分析して、表３に示す結果を得た。
【０２５７】
【表４】
2016516744.tif 000092
【０２５８】
（実施例２８）
組換えレダクターゼによる（Ｅ）−３−ホルミル−５−メチルヘキサ−３−エン酸の還元
【０２５９】
【化８２】
2016516744.tif 000093
組換えエノエートレダクターゼを、ＮＡＤＰ＋およびラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｘ−ｚｙｍｅ）による（Ｅ）−３−ホルミル−５−メチルヘキサ−３−エン酸の還元について評価した。エノエートレダクターゼを、実施例２５で記述されている通りの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞において発現させた。オキソフィトジエン酸レダクターゼ３（ＯＰＲ３）の変異体（Ｄ７４Ｍ）を、実施例２７で記述されている通りに調製した。反応（０．５ｍＬ）は、エノエートレダクターゼ（４０ｍｇ湿細胞／ｍＬ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）アルコールデヒドロゲナーゼ（３２Ｕ／ｍＬ）、ＮＡＤＰ＋（０．０２ｍＭ）、２−プロパノール（３体積％）および（Ｅ）−３−ホルミル−５−メチルヘキサ−２−エン酸（２０ｍＭ）を加えたリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）中、３０℃で行った。２４時間後、反応混合物を０．０２５ｍＬの４Ｎ  ＨＣｌで酸性化し、１ｍＬの酢酸エチルで抽出した。アリコート（０．５ｍＬ）の酢酸エチル抽出物（０．５ｍＬ）を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、メタノール（０．０２ｍＬ）および（トリメチルシリル）ジアゾメタン（０．０１ｍＬのジエチルエーテル中２Ｍ溶液）で処理して、カルボン酸部分をそれらの対応するメチルエステルに誘導体化した。誘導体化された試料を、Ｃｈｉｒａｌｄｅｘ（商標）Ｇ−ＴＡカラム（３０Ｍ×０．２５ｍｍカラム、カラム温度：１３５℃等温、注入器温度：２００℃、担体ガス：ヘリウム、流速およそ１ｍＬ／分）でのＧＣによって分析して、表４に示す結果を得た。
【０２６０】
【表５】
2016516744.tif 000094
【０２６１】
（実施例２９）
３−ホルミル−５−メチルヘキサン酸の調製
反応容器に、７．５ｍＬのリン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）、８．４ｍｇのＮＡＤＰ＋、０．２ｍＬのラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）アルコールデヒドロゲナーゼ（３２Ｕ／ｍＬ、Ｘ−ｚｙｍｅ）、０．３ｍＬの２−プロパノール、四硝酸ペンタエリスリトールレダクターゼ（リン酸カリウム緩衝液中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の２００ｍｇ／ｍＬ懸濁液２ｍＬ）、および１５６ｍｇの（Ｅ）−３−ホルミル−５−メチルヘキサ−３−エン酸を投入し、４０℃でかき混ぜた。６．７５時間後、反応混合物を遠心分離し、上清を４Ｎ  ＨＣｌでｐＨ２に調整し、酢酸エチル（２×１０ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、１４１ｍｇの無色油（８９％収率）を得た。
1H NMR
(D2O、pH 8-10) δ
2.53-2.43 (m, 2 H), 2.34-2.28 (m, 1H), 1.53-1.42 (m, 1H), 1.41-1.34 (m, 1H),
1.20-1.12 (m, 1H), 0.76 (d, 3H), 0.74 (d, 3H).
【０２６２】
（実施例３０）
組換えω−トランスアミナーゼによる３−ホルミル−５−メチルヘキサン酸からプレガバリンへの生体内変換
【０２６３】
【化８３】
2016516744.tif 000095
プレガバリンを形成するための３−ホルミル−５−メチルヘキサン酸のアミノ基転移を、種々の組換えトランスアミナーゼを用いて評価した。ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）およびパラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）由来の組換えω−トランスアミナーゼを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、次の通りに発現させた：ｐＥＴ２８ｂω−トランスアミナーゼ発現構築物を、指示通りにＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）に転換し、終夜培養物をＬＢ＋カナマイシン培地中で成長させた。ＬＢ培養物を使用して、オーバーナイト・エクスプレス・インスタントＴＢ＋カナマイシン培地（ノバジェン、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）中で成長させた発現培養物を植菌した。培養物を３０℃で２０時間インキュベートし、細胞を遠心分離（４０００×ｇ、３０分、４℃）によって収集し、−２０℃で貯蔵した。
【０２６４】
反応（０．５ｍＬ）は、リン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）、ピリドキサールリン酸（２ｍＭ）、イソプロピルアミン（１５０ｍＭ）、３−ホルミル−５−メチルヘキサン酸（５０ｍＭ）、およびビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）またはパラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）由来のω−トランスアミナーゼ（４０ｍｇ湿細胞／ｍＬ）中、３０℃で行った。２４時間後、反応試料（０．１ｍＬ）を、０．４ｍＬのアセトニトリル：水（１：１、ｖ／ｖ）で希釈した。アリコート（０．０５ｍＬ）の希釈した反応試料を、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（０．０１ｍＬ）およびマーフィー試薬（Ｎ−α−（２，４−ジニトロ−５−フルオロフェニル）アラニンアミド、０．２ｍＬのアセトニトリル中５ｇ／Ｌ溶液）により、４０℃で処理した。１時間後、誘導体化反応物を０．０１ｍＬの１Ｎ塩酸水溶液でクエンチし、０．２３ｍＬのアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｉｒｌｅ）で希釈した。誘導体化された反応試料を、ＵＰＬＣ（カラム：ＢＥＨ  Ｃ１８、内径５０ｍｍ×２．１ｍｍ、勾配溶離：７０％Ａ：３０％Ｂから５５％Ａ：４５％Ｂを５分間で（Ａ＝１％トリエチルアミン（リン酸によりｐＨ３）；Ｂ＝アセトニトリル）、流速：０．８ｍＬ／分、カラム温度：３０℃、検出：２１０〜４００ｎｍ）によって分析して、表５に示す結果を得た。
【０２６５】
【表６】
2016516744.tif 000096
【０２６６】
（実施例３１）
組換えω−トランスアミナーゼによる３−ホルミル−５−メチルヘキサン酸からプレガバリンへの生体内変換
【０２６７】
【化８４】
2016516744.tif 000097
ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）の組換え変異体を、プレガバリンを形成するための３−ホルミル−５−メチルヘキサン酸の還元的アミノ化について試験した。Ｖ．フルビアリス（Ｖ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）ω−トランスアミナーゼ（受託番号ＡＥＡ３９１８３）の変異体を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、次の通りに発現させた：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発法キットを使用して、Ｖ．フルビアリス（Ｖ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）アミノトランスフェラーゼ変異体を指示通りに作製した。プライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ、ＵＳＡ）に発注した。ｐＥＴ２８ｂω−トランスアミナーゼ発現構築物を、指示通りにＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）に転換し、終夜培養物をＬＢ＋カナマイシン培地中で成長させた。ＬＢ培養物を使用して、オーバーナイト・エクスプレス・インスタントＴＢ＋カナマイシン培地（ノバジェン、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）中で成長させた発現培養物を植菌した。培養物を３０℃で２０時間インキュベートし、細胞を遠心分離（４０００×ｇ、３０分、４℃）によって収集し、−２０℃で貯蔵した。
【０２６８】
反応（０．５ｍＬ）は、ピリドキサールリン酸（２ｍＭ）、イソプロピルアミン（３００ｍＭ）、３−ホルミル−５−メチルヘキサン酸（１００ｍＭ）およびＶ．フルビアリス（Ｖ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）ω−トランスアミナーゼ野生型または変異体（４０ｍｇ湿細胞／ｍＬ）を加えたリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）中、３０℃で行った。２８時間後、反応試料（０．１ｍＬ）を０．４ｍＬのアセトニトリル：水（１：１、ｖ／ｖ）で希釈した。アリコート（０．０５ｍＬ）の希釈した反応試料を、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（０．０１ｍＬ）およびマーフィー試薬（Ｎ−α−（２，４−ジニトロ−５−フルオロフェニル）アラニンアミド、０．２ｍＬのアセトニトリル中５ｇ／Ｌ溶液）により、４０℃で処理した。１時間後、誘導体化反応物を、０．０１ｍＬの１Ｎ塩酸水溶液でクエンチし、０．２３ｍＬのアセトニトリルで希釈した。誘導体化された反応試料を、ＵＰＬＣ（カラム：ＢＥＨ  Ｃ１８、内径５０ｍｍ×２．１ｍｍ、勾配溶離：７０％Ａ：３０％Ｂから５５％Ａ：４５％Ｂを５分間で（Ａ＝１％トリエチルアミン（リン酸によりｐＨ３）；Ｂ＝アセトニトリル）、流速：０．８ｍＬ／分、カラム温度：３０℃、検出：２１０〜４００ｎｍ）によって分析して、表６に示す結果を得た。
【０２６９】
【表７−１】
2016516744.tif 000098
【０２７０】
【表７−２】
2016516744.tif 000099
【０２７１】
（実施例３２）
（Ｅ）−３−ホルミル−５−メチルヘキサ−２−エン酸から３−ホルミル−５−メチルヘキサン酸への酵素的還元およびω−トランスアミナーゼによるプレガバリンへのインサイチュ変換
【０２７２】
【化８５】
2016516744.tif 000100
四硝酸ペンタエリスリトールレダクターゼによる（Ｅ）−３−ホルミル−５−メチルヘキサ−３−エン酸から３−ホルミル−５−メチルヘキサン酸への還元およびプレガバリンへのインサイチュ変換を、種々のω−トランスアミナーゼを用いて評価した。ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）およびパラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）由来の組換えω−トランスアミナーゼを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、次の通りに発現させた：ｐＥＴ２８ｂω−トランスアミナーゼ発現構築物を、指示通りにＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）に転換し、終夜培養物をＬＢ＋カナマイシン培地中で成長させた。ＬＢ培養物を使用して、オーバーナイト・エクスプレス・インスタントＴＢ＋カナマイシン培地（ノバジェン、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）中で成長させた発現培養物を植菌した。培養物を３０℃で２０時間インキュベートし、細胞を遠心分離（４０００×ｇ、３０分、４℃）によって収集し、−２０℃で貯蔵した。
【０２７３】
反応（０．５ｍＬ）は、四硝酸ペンタエリスリトールレダクターゼ（４０ｍｇ湿細胞／ｍＬ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）アルコールデヒドロゲナーゼ（３２Ｕ／ｍＬ）、ＮＡＤＰ＋（０．０２ｍＭ）、２−プロパノール（３体積％）、ピリドキサールリン酸（２ｍＭ）、イソプロピルアミン（１００ｍＭ）、（Ｅ）−３−ホルミル−５−メチルヘキサ−２−エン酸（２０ｍＭ）、およびビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）またはパラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）由来のω−トランスアミナーゼ（４０ｍｇ湿細胞／ｍＬ）を加えたリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）中、３０℃で行った。４３時間後、反応試料（０．１ｍＬ）を、０．１ｍＬのアセトニトリル：水（１：１、ｖ／ｖ）で希釈した。アリコート（０．１ｍＬ）の希釈した反応試料を、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（０．０１ｍＬ）およびマーフィー試薬（Ｎ−α−（２，４−ジニトロ−５−フルオロフェニル）アラニンアミド、０．４ｍＬのアセトニトリル中５ｇ／Ｌ溶液）により、４０℃で処理した。１時間後、誘導体化反応物を０．１ｍＬの１Ｎ塩酸水溶液でクエンチした。誘導体化された反応試料を、ＵＰＬＣ（カラム：ＢＥＨ  Ｃ１８、内径５０ｍｍ×２．１ｍｍ、勾配溶離：７０％Ａ：３０％Ｂから５５％Ａ：４５％Ｂを５分間で（Ａ＝１％トリエチルアミン（リン酸によりｐＨ３）；Ｂ＝アセトニトリル）、流速：０．８ｍＬ／分、カラム温度：３０℃、検出：２１０〜４００ｎｍ）によって分析して、表７に示す結果を得た。
【０２７４】
【表８】
2016516744.tif 000101
【０２７５】
（実施例３３）
（Ｅ）−３−ホルミル−５−メチルヘキサ−２−エン酸から３−ホルミル−５−メチルヘキサン酸への酵素的還元およびＶ．フルビアリス（Ｖ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）ω−トランスアミナーゼによるプレガバリンへのインサイチュ変換
【０２７６】
【化８６】
2016516744.tif 000102
四硝酸ペンタエリスリトールレダクターゼによる（Ｅ）−３−ホルミル−５−メチルヘキサ−３−エン酸から３−ホルミル−５−メチルヘキサン酸への還元およびプレガバリンへのインサイチュ変換を、Ｖ．フルビアリス（Ｖ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）アミノトランスフェラーゼの変異体を用いて評価した。Ｖ．フルビアリス（Ｖ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）ω−トランスアミナーゼ（受託番号ＡＥＡ３９１８３）の変異体を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、次の通りに発現させた：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発法キットを使用して、Ｖ．フルビアリス（Ｖ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）アミノトランスフェラーゼ変異体を指示通りに作製した。プライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ、ＵＳＡ）に発注した。ｐＥＴ２８ｂω−トランスアミナーゼ発現構築物を、指示通りにＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）に転換し、終夜培養物をＬＢ＋カナマイシン培地中で成長させた。ＬＢ培養物を使用して、オーバーナイト・エクスプレス・インスタントＴＢ＋カナマイシン培地（ノバジェン、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）中で成長させた発現培養物を植菌した。培養物を３０℃で２０時間インキュベートし、細胞を遠心分離（４０００×ｇ、３０分、４℃）によって収集し、−２０℃で貯蔵した。
【０２７７】
反応（０．５ｍＬ）は、四硝酸ペンタエリスリトールレダクターゼ（４０ｍｇ湿細胞／ｍＬ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）アルコールデヒドロゲナーゼ（３２Ｕ／ｍＬ）、ＮＡＤＰ＋（０．１ｍＭ）、２−プロパノール（３体積％）、ピリドキサールリン酸（２ｍＭ）、イソプロピルアミン（３００ｍＭ）、（Ｅ）−３−ホルミル−５−メチルヘキサ−２−エン酸（１００ｍＭ）およびＶ．フルビアリス（Ｖ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）ω−トランスアミナーゼ野生型または変異体（４０ｍｇ湿細胞／ｍＬ）を加えたリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）中、３０℃で行った。４８時間後、反応試料（０．０２ｍＬ）を０．１８ｍＬのアセトニトリル：水（１：１、ｖ／ｖ）で希釈した。アリコート（０．１ｍＬ）の希釈した反応試料を、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（０．０１ｍＬ）およびマーフィー試薬（Ｎ−α−（２，４−ジニトロ−５−フルオロフェニル）アラニンアミド、０．４ｍＬのアセトニトリル中５ｇ／Ｌ溶液）により、４０℃で処理した。１時間後、誘導体化反応物を、０．１ｍＬの１Ｎ塩酸水溶液でクエンチした。誘導体化された反応試料を、ＵＰＬＣ（カラム：ＢＥＨ  Ｃ１８、内径５０ｍｍ×２．１ｍｍ、勾配溶離：７０％Ａ：３０％Ｂから５５％Ａ：４５％Ｂを５分間で（Ａ＝１％トリエチルアミン（リン酸によりｐＨ３）；Ｂ＝アセトニトリル）、流速：０．８ｍＬ／分、カラム温度：３０℃、検出：２１０〜４００ｎｍ）によって分析して、表８に示す結果を得た。
【０２７８】
【表９】
2016516744.tif 000103
【０２７９】
（実施例３４）
ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｌｕｖａｌｉｓ）ω−トランスアミナーゼの代替的な変異体
ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）ω−トランスアミナーゼの下記のさらなる組換え変異体を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、次の通りに発現させた：ｐＥＴ２８ｂω−トランスアミナーゼ発現構築物を、指示通りにＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）に転換し、終夜培養物をＬＢ＋カナマイシン培地中で成長させた。ＬＢ培養物を使用して、オーバーナイト・エクスプレス・インスタントＴＢ＋カナマイシン培地（ノバジェン、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）中で成長させた発現培養物を植菌した。培養物を３０℃で２０時間インキュベートし、細胞を遠心分離（４０００×ｇ、３０分、４℃）によって収集し、−２０℃で貯蔵した。
【０２８０】
実施例３４ａ：Ｖｆａｔ９０６
ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＧＡＡＧＣＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＡＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＧＴＡＣＧＧＣＴＴＣＡＣＴＧＡＴＡＴＧＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＡＣｇＡＧＣＧＴＧＧＴＡＣＣＧＴＧＧＴＴＧＴＣＡＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＣＡＴＡＣＡＴＣＧＴＧＧＡＣＧＴＣＡＡＣＧＧＴＣＧＣＣＧＴＴＡＣＣＴＧＧＡＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＡＴＧＧＴＴＧＣＣＧＧＣＴＴＣＧＡＣＣＡＣＡＡＧＧＧＴＣＴＧＡＴＣＧＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＧＣＣＣＡＧＴＡＣＧＡＡＣＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＣＣＡＴＡＧＣＴＴＣＴＴＣＧＧＴＣＧＴＡＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＡＡＣＴＧＴＴＡＴＧＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＡＣＴＧＧＴＡＧＡＧＧＴＧＴＣＴＣＣＡＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＧＴＣＧＣＧＴＧＴＴＣＴＡＴＡＣＴＡＡＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＡＧＧＣＴＡＡＣＧＡＴＡＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＣＡＧＡＧＧＧＣＡＡＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＣＧＣＡＡＡＡＴＣＣＴＧＡＣＴＣＧＴａａｃＡＡＣＧＣＡＴＡＣＣＡＣＧＧＴＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＧＧＴＣＴＧＣＣＧＴＡＣＡＡＣＴＣＴＧＴＡＴＴＣＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＧＧＴＴＴＣＧＴＴＣＡＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＡＣＴＡＴＴＧＧＣＧＴＴＡＣＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡＡＡＣＣＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣＴＣＧＴＣＴＧＧＣＣＣＧＣＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＣＴＡＴＣＣＡＡＣＧＴＧＡＡＧＧＣＧＣＧＧＡＣＡＣＧＡＴＴＧＣＧＧＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＡＧＣＣＧＧＴＣＡＴＧＧＧＣＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＴＡＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＣＧＡＡＡＧＧＴＴＡＣＴＴＣＣＡＧＧＣＧＡＴＣＣＴＧＣＣＧＡＴＴＣＴＧＣＧＴＡＡＧＴＡＣＧＡＣＡＴＣＣＣＧＧＴＴＡＴＣＴＣＴＧＡＴＧＡＡＧＴＴＡＴＣＴＧＣＧＧＣＴＴＴＧＧＴＣＧＴＡＣＣＧＧＴＡＡＴＡＣＴＴＧＧＧＧＴＴＧＣＧＴＴＡＣＣＴＡＴＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＣＧＧＡＴＧＣＧＡＴＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＡＡＡＴＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＧＴＴＴＣＴＴＴＣＣＧＧＴＴＧＧＴＧＣＴＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＣＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＡＡＣＧＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＧＣＧＡＴＣＧＡＡＧＣＴＡＴＣＧＡＡＧＡＧＴＴＣＣＣＧＣＡＣＧＧＣＴＴＴＡＣＧＧＣＣｇｇｃＧＧＴＣＡＣＣＣＧＧＴＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＡＴＣＧＣＴＣＴＧＡＡＡＧＣＡＡＴＣＧＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＡＴＧＡＧＧＧＴＣＴＧＧＣＡＧＡＧＡＡＣＧＴＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＧＴＴＴＴＧＡＧＧＡＧＣＧＴＣＴＧＡＡＡＣＡＣＡＴＴＧＣＣＧＡＡＣＧＴＣＣＧＡＡＣＡＴＣＧＧＴＧＡＡＴＡＴＣＧＴＧＧＣＡＴＣＧＧＴＴＴＴＡＴＧＴＧＧＧＣＡＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＴＧＡＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＡＴＣＴＡＡＡＡＣＣＣＣＡＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡＡＴＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＧＣａａａＣＧＴＡＴＣＧＣＴＡＡＣＡＣＣＴＧＴｃａｇＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＡＴＣＴＧＴＡＧＣｇＣＧＣＴＧＧＧＴＣＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＣＴＧＴＧＣＣＣＧＣＣＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣＧＡＧＧＣＧＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＡＧＡＴＧＴＴＴＧＡＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＧＴＣＴＴＴＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＴＡＡ（配列番号１１）
アミノ酸配列：
ＭＮＫＰＱＳＷＥＡＲＡＥＴＹＳＬＹＧＦＴＤＭＰＳＬＨＥＲＧＴＶＶＶＴＨＧＥＧＰＹＩＶＤＶＮＧＲＲＹＬＤＡＮＳＧＬＹＮＭＶＡＧＦＤＨＫＧＬＩＤＡＡＫＡＱＹＥＲＦＰＧＹＨＳＦＦＧＲＭＳＤＱＴＶＭＬＳＥＫＬＶＥＶＳＰＦＤＳＧＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＡＮＤＴＭＶＫＭＬＷＦＬＨＡＡＥＧＫＰＱＫＲＫＩＬＴＲＮＮＡＹＨＧＶＴＡＶＳＡＳＭＴＧＬＰＹＮＳＶＦＧＬＰＬＰＧＦＶＨＬＴＣＰＨＹＷＲＹＧＥＥＧＥＴＥＥＱＦＶＡＲＬＡＲＥＬＥＥＴＩＱＲＥＧＡＤＴＩＡＧＦＦＡＥＰＶＭＧＡＧＧＶＩＰＰＡＫＧＹＦＱＡＩＬＰＩＬＲＫＹＤＩＰＶＩＳＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＮＴＷＧＣＶＴＹＤＦＴＰＤＡＩＩＳＳＫＮＬＴＡＧＦＦＰＶＧＡＶＩＬＧＰＥＬＳＫＲＬＥＴＡＩＥＡＩＥＥＦＰＨＧＦＴＡＧＧＨＰＶＧＣＡＩＡＬＫＡＩＤＶＶＭＮＥＧＬＡＥＮＶＲＲＬＡＰＲＦＥＥＲＬＫＨＩＡＥＲＰＮＩＧＥＹＲＧＩＧＦＭＷＡＬＥＡＶＫＤＫＡＳＫＴＰＦＤＧＮＬＳＶＳＫＲＩＡＮＴＣＱＤＬＧＬＩＣＳＡＬＧＱＳＶＩＬＣＰＰＦＩＬＴＥＡＱＭＤＥＭＦＤＫＬＥＫＡＬＤＫＶＦＡＥＶＡ（配列番号３）
【０２８１】
（実施例３４ｂ）
Ｖｆａｔ９９９
ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＧＡＡＧＣＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＡＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＧＴＡＣＧＧＣＴＴＣＡＣＴＧＡＴＡＴＧＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＡＣＧＡＧＣＧＴＧＧＴＡＣＣＧＴＧＧＴＴＧＴＣＡＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＣＡＴＡＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＣＡＡＣＧＧＴＣＧＣＣＧＴＴＡＣＣＴＧＧＡＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＡＴＧＧＴＴＧＣＣＧＧＣＴＴＣＧＡＣＣＡＣＡＡＧＧＧＴＣＴＧＡＴＣＧＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＧＣＣＣＡＧＴＡＣＧＡＡＣＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＣＣＡＴＡＧＣＴＴＣＴＴＣＧＧＴＣＧＴＡＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＡＡＣＴＧＴＴＡＴＧＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＡＣＴＧＧＴＡＧＡＧＧＴＧＴＣＴＣＣＡＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＧＴＣＧＣＧＴＧＴＴＣＴＡＴＡＣＴＡＡＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＡＧＧＣＴＡＡＣＧＡＴＡＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＣＡＧＡＧＧＧＣＡＡＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＣＧＣＡＡＡＡＴＣＣＴＧＡＣＴＣＧＴＣＡＡＡＡＣＧＣＡＴＡＣＣＡＣＧＧＴＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＧＧＴＣＴＧＣＣＧＣＡＣＡＡＣＴＣＴＧＴＡＴＴＣＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＧＧＴＴＴＣＧＴＴＣＡＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＡＣＴＡＴＴＧＧＣＧＴＴＡＣＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡＡＡＣＣＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣＴＣＧＴＣＴＧＧＣＣＣＧＣＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＣＴＡＴＣＣＡＡＣＧＴＧＡＡＧＧＣＧＣＧＧＡＣＡＣＧＡＴＴＧＣＧＧＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＡＧＣＣＧＧＴＣＡＴＧＧＧＣＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＴＡＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＣＧＡＡＡＧＧＴＴＡＣＴＴＣＣＡＧＧＣＧＡＴＣＣＴＧＣＣＧＡＴＴＣＴＧＣＧＴＡＡＧＴＡＣＧＡＣＡＴＣＣＣＧＧＴＴＡＴＣＴＣＴＧＡＴＧＡＡＧＴＴＡＴＣＴＧＣＧＧＣＴＴＴＧＧＴＣＧＴＡＣＣＧＧＴＡＡＴＡＣＴＴＧＧＧＧＴＴＧＣＧＴＴＡＣＣＴＡＴＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＣＧＧＡＴＧＣＧＡＴＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＡＡＡＴＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＧＴＴＴＣＴＴＴＣＣＧＧＴＴＧＧＴＧＣＴＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＣＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＡＡＣＧＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＧＣＧＡＴＣＧＡＡＧＣＴＡＴＣＧＡＡＧＡＧＴＴＣＣＣＧＣＡＣＧＧＣＴＴＴＡＣＧＧＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＣＧＧＴＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＡＴＣＧＣＴＣＴＧＡＡＡＧＣＡＡＴＣＧＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＡＴＧＡＧＧＧＴＣＴＧＧＣＡＧＡＧＡＡＣＧＴＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＧＴＴＴＴＧＡＧＧＡＧＣＧＴＣＴＧＡＡＡＣＡＣＡＴＴＧＣＣＧＡＡＣＧＴＣＣＧＡＡＣＡＴＣＧＧＴＧＡＡＴＡＴＣＧＴＧＧＣＡＴＣＧＧＴＴＴＴＡＴＧＴＧＧＧＣＡＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＴＧＡＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＡＴＣＴＡＡＡＡＣＣＣＣＡＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡＡＴＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＣＧＴＡＴＣＧＣＴＡＡＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＡＴＣＴＧＴＡＧＣＧＣＧＣＴＧＧＧＴＣＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＣＴＧＡＧＣＣＣＧＣＣＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣＧＡＧＧＣＧＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＡＧＡＴＧＴＴＴＧＡＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＧＴＣＴＴＴＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＴＡＡ（配列番号１２）
アミノ酸配列：
ＭＮＫＰＱＳＷＥＡＲＡＥＴＹＳＬＹＧＦＴＤＭＰＳＬＨＥＲＧＴＶＶＶＴＨＧＥＧＰＹＶＶＤＶＮＧＲＲＹＬＤＡＮＳＧＬＹＮＭＶＡＧＦＤＨＫＧＬＩＤＡＡＫＡＱＹＥＲＦＰＧＹＨＳＦＦＧＲＭＳＤＱＴＶＭＬＳＥＫＬＶＥＶＳＰＦＤＳＧＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＡＮＤＴＭＶＫＭＬＷＦＬＨＡＡＥＧＫＰＱＫＲＫＩＬＴＲＱＮＡＹＨＧＶＴＡＶＳＡＳＭＴＧＬＰＨＮＳＶＦＧＬＰＬＰＧＦＶＨＬＴＣＰＨＹＷＲＹＧＥＥＧＥＴＥＥＱＦＶＡＲＬＡＲＥＬＥＥＴＩＱＲＥＧＡＤＴＩＡＧＦＦＡＥＰＶＭＧＡＧＧＶＩＰＰＡＫＧＹＦＱＡＩＬＰＩＬＲＫＹＤＩＰＶＩＳＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＮＴＷＧＣＶＴＹＤＦＴＰＤＡＩＩＳＳＫＮＬＴＡＧＦＦＰＶＧＡＶＩＬＧＰＥＬＳＫＲＬＥＴＡＩＥＡＩＥＥＦＰＨＧＦＴＡＧＧＨＰＶＧＣＡＩＡＬＫＡＩＤＶＶＭＮＥＧＬＡＥＮＶＲＲＬＡＰＲＦＥＥＲＬＫＨＩＡＥＲＰＮＩＧＥＹＲＧＩＧＦＭＷＡＬＥＡＶＫＤＫＡＳＫＴＰＦＤＧＮＬＳＶＳＫＲＩＡＮＴＣＱＤＬＧＬＩＣＳＡＬＧＱＳＶＩＬＳＰＰＦＩＬＴＥＡＱＭＤＥＭＦＤＫＬＥＫＡＬＤＫＶＦＡＥＶＡ（配列番号４）
【０２８２】
（実施例３４ｃ）
Ｖｆａｔ１０１０
ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＧＡＡＧＣＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＡＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＧＴＡＣＧＧＣＴＴＣＡＣＴＧＡＴＡＴＧＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＡＣＧＡＧＣＧＴＧＧＴＡＣＣＧＴＧＧＴＴＧＴＣＡＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＣＡＴＡＣＡＴＣＧＴＧＧＡＣＧＴＣＡＡＣＧＧＴＣＧＣＣＧＴＴＡＣＣＴＧＧＡＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＡＴＧＧＴＴＧＣＣＧＧＣＴＴＣＧＡＣＣＡＣＡＡＧＧＧＴＣＴＧＡＴＣＧＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＧＣＣＣＡＧＴＡＣＧＡＡＣＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＣＣＡＴＡＧＣＴＴＣＴＴＣＧＧＴＣＧＴＡＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＡＡＣＴＧＴＴＡＴＧＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＡＣＴＧＧＴＡＧＡＧＧＴＧＴＣＴＣＣＡＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＧＴＣＧＣＧＴＧＴＴＣＴＡＴＡＣＴＡＡＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＡＧＧＣＴＡＡＣＧＡＴＡＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＣＡＧＡＧＧＧＣＡＡＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＣＧＣＡＡＡＡＴＣＣＴＧＡＣＴＣＧＴＣＡＡＡＡＣＧＣＡＴＡＣＣＡＣＧＧＴＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＧＧＴＡＴＧＣＣＧＣＡＣＡＡＣＴＣＴＧＴＡＴＴＣＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＧＧＴＴＴＣＧＴＴＣＡＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＡＣＴＡＴＴＧＧＣＧＴＴＡＣＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡＡＡＣＣＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣＴＣＧＴＣＴＧＧＣＣＣＧＣＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＣＴＡＴＣＣＡＡＣＧＴＧＡＡＧＧＣＧＣＧＧＡＣＡＣＧＡＴＴＧＣＧＧＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＡＧＣＣＧＧＴＣＡＴＧＧＧＣＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＴＡＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＣＧＡＡＡＧＧＴＴＡＣＴＴＣＣＡＧＧＣＧＡＴＣＣＴＧＣＣＧＡＴＴＣＴＧＣＧＴＡＡＧＴＡＣＧＡＣＡＴＣＣＣＧＧＴＴＡＴＣＴＣＴＧＡＴＧＡＡＧＴＴＡＴＣＴＧＣＧＧＣＴＴＴＧＧＴＣＧＴＡＣＣＧＧＴＡＡＴＡＣＴＴＧＧＧＧＴＴＧＣＧＴＴＡＣＣＴＡＴＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＣＧＧＡＴＧＣＧＡＴＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＡＡＡＴＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＧＴＴＴＣＴＴＴＣＣＧＧＴＴＧＧＴＧＣＴＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＣＧＧＣＡＣＴＧＡＧＣＡＡＡＣＧＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＧＣＧＡＴＣＧＡＡＧＣＴＡＴＣＧＡＡＧＡＧＴＴＣＣＣＧＣＡＣＧＧＣＴＴＴＡＣＧＧＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＣＧＧＴＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＡＴＣＧＣＴＣＴＧＡＡＡＧＣＡＡＴＣＧＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＡＴＧＡＧＧＧＴＣＴＧＧＣＡＧＡＧＡＡＣＧＴＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＧＴＴＴＴＧＡＧＧＡＧＣＧＴＣＴＧＡＡＡＣＡＣＡＴＴＧＣＣＧＡＡＣＧＴＣＣＧＡＡＣＡＴＣＧＧＴＧＡＡＴＡＴＣＧＴＧＧＣＡＴＣＧＧＴＴＴＴＡＴＧＴＧＧＧＣＡＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＴＧＡＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＡＴＣＴＡＡＡＡＣＣＣＣＡＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡＡＴＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＣＧＴＡＴＣＧＣＴＡＡＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＡＴＣＴＧＴＡＧＣＧＣＧＡＴＧＧＧＴＣＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＣＴＧＡＧＣＣＣＧＣＣＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣＧＡＧＧＣＧＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＡＧＡＴＧＴＴＴＧＡＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＧＴＣＴＴＴＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＴＡＡ（配列番号１３）
アミノ酸配列：
ＭＮＫＰＱＳＷＥＡＲＡＥＴＹＳＬＹＧＦＴＤＭＰＳＬＨＥＲＧＴＶＶＶＴＨＧＥＧＰＹＩＶＤＶＮＧＲＲＹＬＤＡＮＳＧＬＹＮＭＶＡＧＦＤＨＫＧＬＩＤＡＡＫＡＱＹＥＲＦＰＧＹＨＳＦＦＧＲＭＳＤＱＴＶＭＬＳＥＫＬＶＥＶＳＰＦＤＳＧＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＡＮＤＴＭＶＫＭＬＷＦＬＨＡＡＥＧＫＰＱＫＲＫＩＬＴＲＱＮＡＹＨＧＶＴＡＶＳＡＳＭＴＧＭＰＨＮＳＶＦＧＬＰＬＰＧＦＶＨＬＴＣＰＨＹＷＲＹＧＥＥＧＥＴＥＥＱＦＶＡＲＬＡＲＥＬＥＥＴＩＱＲＥＧＡＤＴＩＡＧＦＦＡＥＰＶＭＧＡＧＧＶＩＰＰＡＫＧＹＦＱＡＩＬＰＩＬＲＫＹＤＩＰＶＩＳＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＮＴＷＧＣＶＴＹＤＦＴＰＤＡＩＩＳＳＫＮＬＴＡＧＦＦＰＶＧＡＶＩＬＧＰＡＬＳＫＲＬＥＴＡＩＥＡＩＥＥＦＰＨＧＦＴＡＧＧＨＰＶＧＣＡＩＡＬＫＡＩＤＶＶＭＮＥＧＬＡＥＮＶＲＲＬＡＰＲＦＥＥＲＬＫＨＩＡＥＲＰＮＩＧＥＹＲＧＩＧＦＭＷＡＬＥＡＶＫＤＫＡＳＫＴＰＦＤＧＮＬＳＶＳＫＲＩＡＮＴＣＱＤＬＧＬＩＣＳＡＭＧＱＳＶＩＬＳＰＰＦＩＬＴＥＡＱＭＤＥＭＦＤＫＬＥＫＡＬＤＫＶＦＡＥＶＡ（配列番号５）
【０２８３】
（実施例３４ｄ）
Ｖｆａｔ１０２０
ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＧＡＡＧＣＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＡＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＧＴＡＣＧＧＣＴＴＣＡＣＴＧＡＴＡＴＧＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＡＣＧＡＧＣＧＴＧＧＴＡＣＣＧＴＧＧＴＴＧＴＣＡＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＣＡＴＡＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＣＡＡＣＧＧＴＣＧＣＣＧＴＴＡＣＣＴＧＧＡＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＡＴＧＧＴＴＧＣＣＧＧＣＴＴＣＧＡＣＣＡＣＡＡＧＧＧＴＣＴＧＡＴＣＧＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＧＣＣＣＡＧＴＡＣＧＡＡＣＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＣＣＡＴＡＧＣＴＴＣＴＴＣＧＧＴＣＧＴＡＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＡＡＣＴＧＴＴＡＴＧＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＡＣＴＧＧＴＡＧＡＧＧＴＧＴＣＴＣＣＡＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＧＴＣＧＣＧＴＧＴＴＣＴＡＴＡＣＴＡＡＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＡＧＧＣＴＡＡＣＧＡＴＡＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＣＡＧＡＧＧＧＣＡＡＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＣＧＣＡＡＡＡＴＣＣＴＧＡＣＴＣＧＴＣＡＡＡＡＣＧＣＡＴＡＣＣＡＣＧＧＴＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＧＧＴＣＴＧＣＣＧＣＡＣＡＡＣＴＣＴＧＴＡＴＴＣＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＧＧＴＴＴＣＧＴＴＣＡＣＣＴＧＧＧＴＴＧＴＣＣＧＣＡＣＴＡＴＴＧＧＣＧＴＴＡＣＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡＡＡＣＣＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣＴＣＧＴＣＴＧＧＣＣＣＧＣＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＣＴＡＴＣＣＡＡＣＧＴＧＡＡＧＧＣＧＣＧＧＡＣＡＣＧＡＴＴＧＣＧＧＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＡＧＣＣＧＧＴＣＡＴＧＧＧＣＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＴＡＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＣＧＡＡＡＧＧＴＴＡＣＴＴＣＣＡＧＧＣＧＡＴＣＣＴＧＣＣＧＡＴＴＣＴＧＣＧＴＡＡＧＴＡＣＧＡＣＡＴＣＣＣＧＧＴＴＡＴＣＴＣＴＧＡＴＧＡＡＧＴＴＡＴＣＴＧＣＧＧＣＴＴＴＧＧＴＣＧＴＡＣＣＧＧＴＡＡＴＡＣＴＴＧＧＧＧＴＴＧＣＧＴＴＡＣＣＴＡＴＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＣＧＧＡＴＧＣＧＡＴＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＡＡＡＴＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＧＴＴＴＣＴＴＴＣＣＧＧＴＴＧＧＴＧＣＴＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＣＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＡＡＣＧＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＧＣＧＡＴＣＧＡＡＧＣＴＡＴＣＧＡＡＧＡＧＴＴＣＣＣＧＣＡＣＧＧＣＴＴＴＡＣＧＧＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＣＧＧＴＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＡＴＣＧＣＴＣＴＧＡＡＡＧＣＡＡＴＣＧＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＡＴＧＡＧＧＧＴＣＴＧＧＣＡＧＡＧＡＡＣＧＴＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＧＴＴＴＴＧＡＧＧＡＧＣＧＴＣＴＧＡＡＡＣＡＣＡＴＴＧＣＣＧＡＡＣＧＴＣＣＧＡＡＣＡＴＣＧＧＴＧＡＡＴＡＴＣＧＴＧＧＣＡＴＣＧＧＴＴＴＴＡＴＧＴＧＧＧＣＡＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＴＧＡＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＡＴＣＴＡＡＡＡＣＣＣＣＡＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡＡＴＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＣＧＴＡＴＣＧＣＴＡＡＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＡＴＣＴＧＴＡＧＣＧＣＧＡＴＧＧＧＴＣＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＣＴＧＡＧＣＣＣＧＣＣＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣＧＡＧＧＣＧＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＡＧＡＴＧＴＴＴＧＡＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＧＴＣＴＴＴＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＴＡＡ（配列番号１４）
アミノ酸配列：
ＭＮＫＰＱＳＷＥＡＲＡＥＴＹＳＬＹＧＦＴＤＭＰＳＬＨＥＲＧＴＶＶＶＴＨＧＥＧＰＹＶＶＤＶＮＧＲＲＹＬＤＡＮＳＧＬＹＮＭＶＡＧＦＤＨＫＧＬＩＤＡＡＫＡＱＹＥＲＦＰＧＹＨＳＦＦＧＲＭＳＤＱＴＶＭＬＳＥＫＬＶＥＶＳＰＦＤＳＧＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＡＮＤＴＭＶＫＭＬＷＦＬＨＡＡＥＧＫＰＱＫＲＫＩＬＴＲＱＮＡＹＨＧＶＴＡＶＳＡＳＭＴＧＬＰＨＮＳＶＦＧＬＰＬＰＧＦＶＨＬＧＣＰＨＹＷＲＹＧＥＥＧＥＴＥＥＱＦＶＡＲＬＡＲＥＬＥＥＴＩＱＲＥＧＡＤＴＩＡＧＦＦＡＥＰＶＭＧＡＧＧＶＩＰＰＡＫＧＹＦＱＡＩＬＰＩＬＲＫＹＤＩＰＶＩＳＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＮＴＷＧＣＶＴＹＤＦＴＰＤＡＩＩＳＳＫＮＬＴＡＧＦＦＰＶＧＡＶＩＬＧＰＥＬＳＫＲＬＥＴＡＩＥＡＩＥＥＦＰＨＧＦＴＡＧＧＨＰＶＧＣＡＩＡＬＫＡＩＤＶＶＭＮＥＧＬＡＥＮＶＲＲＬＡＰＲＦＥＥＲＬＫＨＩＡＥＲＰＮＩＧＥＹＲＧＩＧＦＭＷＡＬＥＡＶＫＤＫＡＳＫＴＰＦＤＧＮＬＳＶＳＫＲＩＡＮＴＣＱＤＬＧＬＩＣＡＡＭＧＱＳＶＩＬＳＰＰＦＩＬＴＥＡＱＭＤＥＭＦＤＫＬＥＫＡＬＤＫＶＦＡＥＶＡ（配列番号６）
【０２８４】
（実施例３４ｅ）
Ｖｆａｔ１０３０
ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＧＡＡＧＣＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＡＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＧＴＡＣＧＧＣＴＴＣＡＣＴＧＡＴＡＴＧＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＡＣＧＡＧＣＧＴＧＧＴＡＣＣＧＴＧＧＴＴＧＴＣＡＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＣＡＴＡＣＡＴＣＧＴＧＧＡＣＧＴＣＣＡＣＧＧＴＣＧＣＣＧＴＴＡＣＣＴＧＧＡＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＡＴＧＧＴＴＧＣＣＧＧＣＴＴＣＧＡＣＣＡＣＡＡＧＧＧＴＣＴＧＡＴＣＧＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＧＣＣＣＡＧＴＡＣＧＡＡＣＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＣＣＡＴＡＧＣＴＴＣＴＴＣＧＧＴＣＧＴＡＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＡＡＣＴＧＴＴＡＴＧＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＡＣＴＧＧＴＡＧＡＧＧＴＧＴＣＴＣＣＡＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＧＴＣＧＣＧＴＧＴＴＣＴＡＴＡＣＴＡＡＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＡＧＧＣＴＡＡＣＧＡＴＡＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＣＡＧＡＧＧＧＣＡＡＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＣＧＣＡＡＡＡＴＣＣＴＧＡＣＴＣＧＴＣＡＡＡＡＣＧＣＡＴＡＣＣＡＣＧＧＴＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＧＧＴＣＴＧＣＣＧＣＡＣＡＡＣＴＣＴＧＴＡＴＴＣＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＧＧＴＴＴＣＧＴＴＣＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＴＣＣＧＣＡＣＴＡＴＴＧＧＣＧＴＴＡＣＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡＡＡＣＣＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣＴＣＧＴＣＴＧＧＣＣＣＧＣＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＣＴＡＴＣＣＡＡＣＧＴＧＡＡＧＧＣＧＣＧＧＡＣＡＣＧＡＴＴＧＣＧＧＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＡＧＣＣＧＧＴＣＡＴＧＧＧＣＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＴＡＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＣＧＡＡＡＧＧＴＴＡＣＴＴＣＣＡＧＧＣＧＡＴＣＣＴＧＣＣＧＡＴＴＣＴＧＣＧＴＡＡＧＴＡＣＧＡＣＡＴＣＣＣＧＧＴＴＡＴＣＴＣＴＧＡＴＧＡＡＧＴＴＡＴＣＴＧＣＧＧＣＴＴＴＧＧＴＣＧＴＡＣＣＧＧＴＡＡＴＡＣＴＴＧＧＧＧＴＴＧＣＧＴＴＡＣＣＴＡＴＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＣＧＧＡＴＧＣＧＡＴＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＡＡＡＴＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＧＴＴＴＣＴＴＴＣＣＧＧＴＴＧＧＴＧＣＴＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＣＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＡＡＣＧＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＧＣＧＡＴＣＧＡＡＧＣＴＡＴＣＧＡＡＧＡＧＴＴＣＣＣＧＣＡＣＧＧＣＴＴＴＡＣＧＧＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＣＧＧＴＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＡＴＣＧＣＴＣＴＧＡＡＡＧＣＡＡＴＣＧＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＡＴＧＡＧＧＧＴＣＴＧＧＣＡＧＡＧＡＡＣＧＴＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＧＴＴＴＴＧＡＧＧＡＧＣＧＴＣＴＧＡＡＡＣＡＣＡＴＴＧＣＣＧＡＡＣＧＴＣＣＧＡＡＣＡＴＣＧＧＴＧＡＡＴＡＴＣＧＴＧＧＣＡＴＣＧＧＴＴＴＴＡＴＧＴＧＧＧＣＡＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＴＧＡＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＡＴＣＴＡＡＡＡＣＣＣＣＡＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡＡＴＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＣＧＴＡＴＣＧＣＴＡＡＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＡＴＣＴＧＴＡＧＣＧＣＧＡＴＧＧＧＴＣＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＣＴＧＡＧＣＣＣＧＣＣＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣＧＡＧＧＣＧＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＡＧＡＴＧＴＴＴＧＡＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＧＴＣＴＴＴＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＴＡＡ（配列番号１５）
アミノ酸配列：
ＭＮＫＰＱＳＷＥＡＲＡＥＴＹＳＬＹＧＦＴＤＭＰＳＬＨＥＲＧＴＶＶＶＴＨＧＥＧＰＹＩＶＤＶＨＧＲＲＹＬＤＡＮＳＧＬＹＮＭＶＡＧＦＤＨＫＧＬＩＤＡＡＫＡＱＹＥＲＦＰＧＹＨＳＦＦＧＲＭＳＤＱＴＶＭＬＳＥＫＬＶＥＶＳＰＦＤＳＧＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＡＮＤＴＭＶＫＭＬＷＦＬＨＡＡＥＧＫＰＱＫＲＫＩＬＴＲＱＮＡＹＨＧＶＴＡＶＳＡＳＭＴＧＬＰＨＮＳＶＦＧＬＰＬＰＧＦＶＨＬＳＣＰＨＹＷＲＹＧＥＥＧＥＴＥＥＱＦＶＡＲＬＡＲＥＬＥＥＴＩＱＲＥＧＡＤＴＩＡＧＦＦＡＥＰＶＭＧＡＧＧＶＩＰＰＡＫＧＹＦＱＡＩＬＰＩＬＲＫＹＤＩＰＶＩＳＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＮＴＷＧＣＶＴＹＤＦＴＰＤＡＩＩＳＳＫＮＬＴＡＧＦＦＰＶＧＡＶＩＬＧＰＥＬＳＫＲＬＥＴＡＩＥＡＩＥＥＦＰＨＧＦＴＡＧＧＨＰＶＧＣＡＩＡＬＫＡＩＤＶＶＭＮＥＧＬＡＥＮＶＲＲＬＡＰＲＦＥＥＲＬＫＨＩＡＥＲＰＮＩＧＥＹＲＧＩＧＦＭＷＡＬＥＡＶＫＤＫＡＳＫＴＰＦＤＧＮＬＳＶＳＫＲＩＡＮＴＣＱＤＬＧＬＩＣＳＡＭＧＱＳＶＩＬＳＰＰＦＩＬＴＥＡＱＭＤＥＭＦＤＫＬＥＫＡＬＤＫＶＦＡＥＶＡ（配列番号７）
【０２８５】
（実施例３５）
３−イソブチリデン−２−オキソペンタン二酸からプレガバリンへの生体内変換
【０２８６】
【化８７】
2016516744.tif 000104
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）四硝酸ペンタエリスリトールレダクターゼ、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）アルコールデヒドロゲナーゼ、およびビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）ω−トランスアミナーゼの遺伝子を、発現ベクターｐＤＳＴＲＣ５２（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）にクローン化し、発現株大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＤＧ６２（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）に入れた。培養物を成長させ、酵素生成を、実施例２２で記述されている通りに誘導した。酵素発現は、ノベックスゲルおよび染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用するポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定した。
【０２８７】
反応（１．０ｍＬ）は、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）デカルボキシラーゼ、Ｖ．フルビアリス（Ｖ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）トランスアミナーゼ、Ｌ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）アルコールデヒドロゲナーゼ、Ｅ．クロアカエ（Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ）四硝酸ペンタエリスリトールレダクターゼおよびＮＡＤＰ（０．１ｍＭ）を１つの細胞内に加えたリン酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ６．４）中、４０℃で行った。２００μＬの１Ｍ  ３−イソブチリデン−２−オキソペンタン二酸、１００μＬの１ｍＭ  ＴｈＤｐ＋２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、４０μＬの５０ｍＭ  ＰＬＰ、３０μＬのイソプロパノール、２５０μＬの２Ｍイソプロピルアミン。ｐＨを６．４に２４時間調整し、次いで、ｐＨを６．８に追加で２４時間調整する。アリコート（０．５ｍＬ）の反応物を、１Ｍ重炭酸ナトリウム水溶液（０．０５ｍＬ）およびマーフィー試薬（Ｎ−α−（２，４−ジニトロ−５−フルオロフェニル）アラニンアミド、０．５ｍＬのアセトニトリル中５ｇ／Ｌ溶液）により、４０℃で処理した。１時間後、誘導体化反応物を、０．０５ｍＬの１Ｎ塩酸水溶液でクエンチした。誘導体化された反応試料を濾過し、水：アセトニトリル（６０：４０、ｖ／ｖ）中０．１％トリフルオロ酢酸により１．３ｍＬ／分で溶離するＵＰＬＣ（カラム：Ａｇｉｌｅｎｔエクリプス・プラスＣ１８カラム（１００ｍｍ×３．０ｍｍ、１．８μｍ）によって分析した。カラムを３０℃で維持し、流出物を３４０ｎｍおよびＥＳ＋質量分析でモニターした。反応により、少量のプレガバリンを産出し、その８２％が所望のＳ−異性体であった。
【０２８８】
（実施例３６）
３−（２−メチルプロピル）−２−オキソペンタン二酸からプレガバリンへの生体内変換
【０２８９】
【化８８】
2016516744.tif 000105
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼおよびビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）ω−トランスアミナーゼの遺伝子を、発現ベクターｐＤＳＴＲＣ５２（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）にクローン化し、発現株大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＤＧ６２（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）に入れた。培養物を成長させ、酵素生成を、実施例２２で記述されている通りに誘導した。酵素発現は、ノベックスゲルおよび染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用するポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定した。
【０２９０】
反応（２．０ｍＬ）は、１つのプラスミド中でクローン化したＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）デカルボキシラーゼおよびＶ．フルビアリス（Ｖ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）ω−トランスアミナーゼを加えた２４時間発酵タンクからの５００μＬの培養物（４２．５ｍｇ乾燥細胞重量）、４００μＬの０．５Ｍ  ３−（２−メチルプロピル）−２−オキソペンタン二酸、２００ｕＬの１０×ＴｈＤＰ（最終０．１ｍＭ）ならびにＭｇＳＯ４（最終２．５ｍＭ）、８０μＬの５０ｍＭ  ＰＬＰ（最終２ｍＭ）、３００μＬの２Ｍイソプロピルアミン（最終０．３Ｍ）を加えたリン酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ６．４）中、４０℃で行った。ｐＨを６．４に調整し、４５℃で２４時間インキュベートし、次いで、ｐＨを６．８に追加で２４時間調整する。アリコート（０．５ｍＬ）の反応物を、１Ｍ重炭酸ナトリウム水溶液（０．０５ｍＬ）およびマーフィー試薬（Ｎ−α−（２，４−ジニトロ−５−フルオロフェニル）アラニンアミド、０．５ｍＬのアセトニトリル中５ｇ／Ｌ溶液）により、４０℃で処理した。１時間後、誘導体化反応物を、０．０５ｍＬの１Ｎ塩酸水溶液でクエンチした。誘導体化された反応試料を濾過し、水：アセトニトリル（６０：４０、ｖ／ｖ）中０．１％トリフルオロ酢酸により１．３ｍＬ／分で溶離するＵＰＬＣ（カラム：Ａｇｉｌｅｎｔエクリプス・プラスＣ１８カラム（１００ｍｍ×３．０ｍｍ、１．８μｍ）によって分析した。カラムを３０℃で維持し、流出物を３４０ｎｍおよびＥＳ＋質量分析でモニターした。反応により、１００μｇ／ｍＬのプレガバリンを産出し、その６５％が所望のＳ−異性体であった。
【０２９１】
（実施例３７）
５−メトキシ−４−（２−メチルプロピル）−ジヒドロフラン−２（３Ｈ）−オンの加水分解および酵素的アミノ基転移を介する（Ｓ）−プレガバリンの調製
【０２９２】
【化８９】
2016516744.tif 000106
５−メトキシ−４−（２−メチルプロピル）−ジヒドロフラン−２（３Ｈ）−オン（２．５８ｇ、１５ｍｍｏｌ、実施例１３を参照）をＤＩＷ（５．２ｇ）に懸濁し、氷／水浴中で冷却した。ＫＯＨ水溶液（５０％ｗ／ｗ、１．７７ｇ、１．０５当量）を、シリンジを介して５分間かけて滴下添加した。反応物を氷／水浴から除去し、室温で９０分間撹拌した。ギ酸を使用して、ｐＨを７．０に調整した。次いで、反応混合物を、後続のトランスアミナーゼ反応において原料として使用した。
【０２９３】
トランスアミナーゼ酵素溶液（１２．５ｇ）、ＰＬＰ（３５ｍｇ）、ＤＩＷ（１５ｍＬ）および４．０Ｍイソプロピルアミン．ＨＣｌ水溶液（７．５ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのフラスコに投入し、４５℃に加温した。加水分解反応物を一度に、続いてＤＩＷ（６ｍＬ、容器すすぎ液として使用されるもの）を添加した。未希釈イソプロピルアミンを使用して、反応物のｐＨを７．２５に調整し、反応物を反応完了まで４５℃で撹拌した。次いで、反応混合物を５５℃の内部温度に加熱し、９５％ギ酸を使用してｐＨを４．０に調整した。ダルコ炭素（１２５ｍｇ）を添加し、混合物を室温に冷却させた後、氷／水で２０分間冷却した。次いで、混合物を、ワットマン紙３番に通して濾過した。濾液をその重量の１／３に濃縮し、次いで５５℃に加熱した。次いで、５０％ＫＯＨを使用して溶液のｐＨをｐＨ７．５に調整し、その後、溶液を周囲温度に、次いで、氷／水浴中で０〜５℃に冷却した。冷却中に生成物の沈殿が観察された。スラリーを濾過し、ＤＩＷ／ＥｔＯＨ（１０ｍＬ、１：１、０℃）で洗浄した。白色沈殿物を、真空オーブン（４５℃）内で１２時間乾燥させて、（Ｓ）−プレガバリンを、６１％収率、９８．６％ｗ／ｗ純度および９９．８％ｅｅ（好ましいＳ−異性体）で産出した。
【０２９４】
（実施例３８）
５−ブトキシ−４−（２−メチルプロピル）−ジヒドロフラン−２（３Ｈ）−オンの加水分解および酵素的アミノ基転移を介する（Ｓ）−プレガバリンの調製
【０２９５】
【化９０】
2016516744.tif 000107
５−ブトキシ−４−（２−メチルプロピル）−ジヒドロフラン−２（３Ｈ）−オン（３．２１ｇ、１５ｍｍｏｌ、実施例１３Ｃを参照）をＤＩＷ（８．５ｇ）に懸濁し、氷／水浴中で冷却した。ＫＯＨ水溶液（５０％ｗ／ｗ、２．０２ｇ、１．２当量）を、シリンジを介して５分間かけて滴下添加した。反応物を氷／水浴から除去し、室温で９０分間撹拌した。次いで、ギ酸を使用して反応物ｐＨをｐＨ７．０に調整し、次いで、反応混合物を、後続のトランスアミナーゼ反応において原料として使用した。
【０２９６】
トランスアミナーゼ酵素溶液（１２．５ｇ）、ＰＬＰ（３５ｍｇ）、ＤＩＷ（１５ｍＬ）および４．０Ｍイソプロピルアミン．ＨＣｌ溶液（７．５ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのフラスコに投入し、４５℃に加温した。加水分解反応物（上記参照）を一度に、続いてＤＩＷ（６ｍＬ、容器すすぎ液として使用されるもの）を添加した。未希釈イソプロピルアミンを使用して、反応物のｐＨを７．２５に調整し、反応物を４５℃で撹拌した。
【０２９７】
反応混合物を５５℃の内部温度に加熱し、９５％ギ酸を使用してｐＨを４．０に調整した。ダルコ炭素（１２５ｍｇ）を添加し、混合物を室温に冷却させた後、氷／水で２０分間冷却した。次いで、混合物を、ワットマン紙３番に通して濾過した。濾液をその重量の１／３に濃縮し、次いで５５℃に加熱した。次いで、５０％ＫＯＨを使用して溶液のｐＨをｐＨ７．５に調整し、その後、溶液を周囲温度に、次いで、氷／水浴中で０〜５℃に冷却した。冷却中に生成物の沈殿が観察された。スラリーを濾過し、ＤＩＷ／ＥｔＯＨ（１０ｍＬ、１：１、０℃）で洗浄した。白色沈殿物を、真空オーブン（４５℃）内で１２時間乾燥させて、（Ｓ）−プレガバリンを、５１％収率、９８．４％ｗ／ｗ純度および９９．９％ｅ．ｅの好ましいＳ−異性体で産出した。
【０２９８】
（実施例３９）
酵素的アミノ基転移を介する５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）−ジヒドロフラン−２（３Ｈ）−オンからの（Ｓ）−プレガバリンの調製
【０２９９】
【化９１】
2016516744.tif 000108
５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）−ジヒドロフラン−２（３Ｈ）−オン（２．０ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）をＤＩＷ（８．５ｇ）に懸濁し、氷／水浴中で冷却した。炭酸カリウム（０．８６３ｇ、６．３ｍｍｏｌ）を５分間にわたって小分けにして添加した。反応物を氷／水浴から除去し、室温で９０分間撹拌した。ギ酸を使用してｐＨを７．０に調整し、次いで、反応混合物を、後続のトランスアミナーゼ反応において原料として使用した。
【０３００】
トランスアミナーゼ酵素溶液（１０．４ｇ）、ＰＬＰ（３０ｍｇ）、ＤＩＷ（１２．５ｍＬ）および４．０Ｍイソプロピルアミン．ＨＣｌ水溶液（６．３ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのフラスコに投入し、４５℃に加温した。加水分解反応物を一度に、続いてＤＩＷ（５ｍＬ、容器すすぎ液として使用されるもの）を添加した。未希釈イソプロピルアミンを使用して、反応物のｐＨを７．２５に調整し、反応物を４５℃で撹拌した。反応混合物を５５℃の内部温度に加熱し、９５％ギ酸を使用してｐＨ４．０に調整した。ダルコ炭素（１２５ｍｇ）を添加し、混合物を室温に冷却させた後、氷／水で２０分間冷却した。次いで、混合物を、ワットマン紙３番に通して濾過した。濾液をその重量の１／３に濃縮し、次いで５５℃に加熱した。次いで、５０％ＫＯＨを使用して溶液のｐＨをｐＨ７．５に調整し、その後、溶液を周囲温度に、次いで、氷／水浴中で０〜５℃に冷却した。冷却中に生成物の沈殿が観察された。スラリーを濾過し、ＤＩＷ／ＥｔＯＨ（１０ｍＬ、１：１、０℃）で洗浄した。白色沈殿物を、真空オーブン（４５℃）内で１２時間乾燥させて、（Ｓ）−プレガバリンを、６１％収率、９８．３％ｗ／ｗ純度および９９．９％ｅ．ｅの好ましいＳ−異性体で産出した。
【０３０１】
（実施例４０）
５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オンの還元的アミノ化を介する（Ｒ／Ｓ）−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸の調製
【０３０２】
【化９２】
2016516744.tif 000109
３０％アンモニア水溶液中の５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロパ−１−エン−１−イル）フラン−２（５Ｈ）−オンの０．０１Ｍ溶液を、１０ｍｏｌ％ラネーニッケル触媒の存在下、４８時間水素化（１０ｂａｒ、周囲温度）した。触媒を濾過し、溶液を濃縮すると、固体が残った。メタノール懸濁液への塩酸の添加によって生成物が単離され、純粋な３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸塩酸塩であることが分かった。
【０３０３】
触媒としてのパラジウムの使用により、３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸および対応する第二級アミン、３−［（２−カルボキシルメチル−４−メチル−ペンチルアミノ）−メチル］−５−メチル−ヘキサン酸の混合物を得た。
【０３０４】
（実施例４１）
トランスアミナーゼを使用するＲ−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸から５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）−３，４−ジヒドロ−５Ｈ−２−フラノンへの変換
【０３０５】
【化９３】
2016516744.tif 000110
ｐＨ７．５／４５℃のＤ．Ｉ．水中のＲ−３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸の溶液を、トランスアミナーゼ酵素溶解物、またはピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）およびアセトンを含有する全細胞調製物とともに撹拌する。生成されたイソプロピルアミンを、窒素スイープを介して除去する。２４時間後の溶液の分析は、より低いｅ．ｅ．を持つ３−アミノメチル−５−メチルヘキサン酸、および化合物５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）−３，４−ジヒドロ−５Ｈ−２−フラノンの存在を示す。５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）−３，４−ジヒドロ−５Ｈ−２−フラノンのキラル純度の低下は、（４Ｓ）−５−ヒドロキシ−４−（２−メチルプロピル）−３，４−ジヒドロ−５Ｈ−２−フラノンからＳ−プレガバリンへの選択的変換によるものである。
【０３０６】
（実施例４２）
トランスアミナーゼを使用するｒａｃ−プレガバリンの脱ラセミ化
【０３０７】
【化９４】
2016516744.tif 000111
ｐＨ７．５のＤＩＷ中のラセミプレガバリンの溶液を、好適なトランスアミナーゼ溶解物で処理する。ＰＬＰを添加し、反応を、窒素スイープにより、４５℃で１２時間進行させる。次いで、イソプロピルアミンを添加し、反応をさらに１２時間続ける。生成物を実施例３８のように単離して、鏡像異性的に富化されたプレガバリンを得る。
【０３０８】
好適なアミンオキシダーゼ／イミンレダクターゼ酵素系を、ＮＡＤＰ等の補因子とともに使用して、実施例４１および４２において例示されている転換に影響を及ぼすことも可能である。
【配列表フリーテキスト】
【０３０９】
配列番号１
一般的なＶｆａｔ  ａａ配列
ＭＮＫＰＱＳＷＥＡＲＡＥＴＹＳＬＹＧＦＴＤＭＰＳＬＨＸ２７ＲＧＴＶＶＶＴＨＧＥＧＰＹＸ４１ＶＤＶＸ４５ＧＲＲＹＬＤＡＮＳＧＬＹＮＭＶＡＧＦＤＨＫＧＬＩＤＡＡＫＡＱＹＥＲＦＰＧＹＨＳＦＦＧＲＭＳＤＱＴＶＭＬＳＥＫＬＶＥＶＳＰＦＤＳＧＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＡＮＤＴＭＶＫＭＬＷＦＬＨＡＡＥＧＫＰＱＫＲＫＩＬＴＲＸ１４７ＮＡＹＨＧＶＴＡＶＳＡＳＭＴＧＸ１６３ＰＸ１６５ＮＳＶＦＧＬＰＬＰＧＦＶＨＬＸ１８０ＣＰＨＹＷＲＹＧＥＥＧＥＴＥＥＱＦＶＡＲＬＡＲＥＬＥＥＴＩＱＲＥＧＡＤＴＩＡＧＦＦＡＥＰＶＭＧＡＧＧＶＩＰＰＡＫＧＹＦＱＡＩＬＰＩＬＲＫＹＤＩＰＶＩＳＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＮＴＷＧＣＶＴＹＤＦＴＰＤＡＩＩＳＳＫＮＬＴＡＧＦＦＰＶＧＡＶＩＬＧＰＥＬＸ３０４ＫＲＬＥＴＡＩＥＡＩＥＥＦＰＨＧＦＴＡＸ３２４ＧＨＰＶＧＣＡＩＡＬＫＡＩＤＶＶＭＮＥＧＬＡＥＮＶＲＲＬＡＰＲＦＥＥＲＬＫＨＩＡＥＲＰＮＩＧＥＹＲＧＩＧＦＭＷＡＬＥＡＶＫＤＫＡＳＫＴＰＦＤＧＮＬＳＶＳＸ４０１ＲＩＡＮＴＣＸ４０８ＤＬＧＬＩＣＸ４１５Ｘ４１６Ｘ４１７ＧＱＳＶＩＬＸ４２４ＰＰＦＩＬＴＥＡＱＭＤＥＭＦＤＫＬＥＫＡＬＤＫＶＦＡＥＶＡ
Ｘ２７は、グルタミン（Ｑ）およびグルタミン酸（Ｅ）から選択され、Ｘ４１は、イソロイシン（Ｉ）およびバリン（Ｖ）から選択され、Ｘ４５は、アスパラギン（Ｎ）およびヒスチジン（Ｈ）から選択され、Ｘ１４７は、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）から選択され、Ｘ１６３は、ロイシン（Ｌ）およびメチオニン（Ｍ）から選択され、Ｘ１６５は、チロシン（Ｙ）およびヒスチジン（Ｈ）から選択され、Ｘ１８０は、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）から選択され、Ｘ３０４は、アラニン（Ａ）およびセリン（Ｓ）から選択され、Ｘ３２４は、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）から選択され、Ｘ４０１は、リシン（Ｋ）およびグルタミン酸（Ｅ）から選択され、Ｘ４０８は、トレオニン（Ｔ）およびグルタミン（Ｑ）から選択され、Ｘ４１５は、セリン（Ｓ）およびアラニン（Ａ）から選択され、Ｘ４１６は、プロリン（Ｐ）およびアラニン（Ａ）から選択され、Ｘ４１７は、ロイシン（Ｌ）およびメチオニン（Ｍ）から選択され、Ｘ４２４は、システイン（Ｃ）およびセリン（Ｓ）から選択される。
配列番号２
Ｖｆａｔ８８８  ａａ配列
ＭＮＫＰＱＳＷＥＡＲＡＥＴＹＳＬＹＧＦＴＤＭＰＳＬＨＱＲＧＴＶＶＶＴＨＧＥＧＰＹＩＶＤＶＮＧＲＲＹＬＤＡＮＳＧＬＹＮＭＶＡＧＦＤＨＫＧＬＩＤＡＡＫＡＱＹＥＲＦＰＧＹＨＳＦＦＧＲＭＳＤＱＴＶＭＬＳＥＫＬＶＥＶＳＰＦＤＳＧＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＡＮＤＴＭＶＫＭＬＷＦＬＨＡＡＥＧＫＰＱＫＲＫＩＬＴＲＮＮＡＹＨＧＶＴＡＶＳＡＳＭＴＧＬＰＹＮＳＶＦＧＬＰＬＰＧＦＶＨＬＴＣＰＨＹＷＲＹＧＥＥＧＥＴＥＥＱＦＶＡＲＬＡＲＥＬＥＥＴＩＱＲＥＧＡＤＴＩＡＧＦＦＡＥＰＶＭＧＡＧＧＶＩＰＰＡＫＧＹＦＱＡＩＬＰＩＬＲＫＹＤＩＰＶＩＳＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＮＴＷＧＣＶＴＹＤＦＴＰＤＡＩＩＳＳＫＮＬＴＡＧＦＦＰＶＧＡＶＩＬＧＰＥＬＡＫＲＬＥＴＡＩＥＡＩＥＥＦＰＨＧＦＴＡＳＧＨＰＶＧＣＡＩＡＬＫＡＩＤＶＶＭＮＥＧＬＡＥＮＶＲＲＬＡＰＲＦＥＥＲＬＫＨＩＡＥＲＰＮＩＧＥＹＲＧＩＧＦＭＷＡＬＥＡＶＫＤＫＡＳＫＴＰＦＤＧＮＬＳＶＳＥＲＩＡＮＴＣＴＤＬＧＬＩＣＳＰＭＧＱＳＶＩＬＣＰＰＦＩＬＴＥＡＱＭＤＥＭＦＤＫＬＥＫＡＬＤＫＶＦＡＥＶＡ
配列番号３
Ｖｆａｔ９０６  ａａ配列
ＭＮＫＰＱＳＷＥＡＲＡＥＴＹＳＬＹＧＦＴＤＭＰＳＬＨＥＲＧＴＶＶＶＴＨＧＥＧＰＹＩＶＤＶＮＧＲＲＹＬＤＡＮＳＧＬＹＮＭＶＡＧＦＤＨＫＧＬＩＤＡＡＫＡＱＹＥＲＦＰＧＹＨＳＦＦＧＲＭＳＤＱＴＶＭＬＳＥＫＬＶＥＶＳＰＦＤＳＧＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＡＮＤＴＭＶＫＭＬＷＦＬＨＡＡＥＧＫＰＱＫＲＫＩＬＴＲＮＮＡＹＨＧＶＴＡＶＳＡＳＭＴＧＬＰＹＮＳＶＦＧＬＰＬＰＧＦＶＨＬＴＣＰＨＹＷＲＹＧＥＥＧＥＴＥＥＱＦＶＡＲＬＡＲＥＬＥＥＴＩＱＲＥＧＡＤＴＩＡＧＦＦＡＥＰＶＭＧＡＧＧＶＩＰＰＡＫＧＹＦＱＡＩＬＰＩＬＲＫＹＤＩＰＶＩＳＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＮＴＷＧＣＶＴＹＤＦＴＰＤＡＩＩＳＳＫＮＬＴＡＧＦＦＰＶＧＡＶＩＬＧＰＥＬＳＫＲＬＥＴＡＩＥＡＩＥＥＦＰＨＧＦＴＡＧＧＨＰＶＧＣＡＩＡＬＫＡＩＤＶＶＭＮＥＧＬＡＥＮＶＲＲＬＡＰＲＦＥＥＲＬＫＨＩＡＥＲＰＮＩＧＥＹＲＧＩＧＦＭＷＡＬＥＡＶＫＤＫＡＳＫＴＰＦＤＧＮＬＳＶＳＫＲＩＡＮＴＣＱＤＬＧＬＩＣＳＡＬＧＱＳＶＩＬＣＰＰＦＩＬＴＥＡＱＭＤＥＭＦＤＫＬＥＫＡＬＤＫＶＦＡＥＶＡ
配列番号４
Ｖｆａｔ９９９  ａａ配列
ＭＮＫＰＱＳＷＥＡＲＡＥＴＹＳＬＹＧＦＴＤＭＰＳＬＨＥＲＧＴＶＶＶＴＨＧＥＧＰＹＶＶＤＶＮＧＲＲＹＬＤＡＮＳＧＬＹＮＭＶＡＧＦＤＨＫＧＬＩＤＡＡＫＡＱＹＥＲＦＰＧＹＨＳＦＦＧＲＭＳＤＱＴＶＭＬＳＥＫＬＶＥＶＳＰＦＤＳＧＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＡＮＤＴＭＶＫＭＬＷＦＬＨＡＡＥＧＫＰＱＫＲＫＩＬＴＲＱＮＡＹＨＧＶＴＡＶＳＡＳＭＴＧＬＰＨＮＳＶＦＧＬＰＬＰＧＦＶＨＬＴＣＰＨＹＷＲＹＧＥＥＧＥＴＥＥＱＦＶＡＲＬＡＲＥＬＥＥＴＩＱＲＥＧＡＤＴＩＡＧＦＦＡＥＰＶＭＧＡＧＧＶＩＰＰＡＫＧＹＦＱＡＩＬＰＩＬＲＫＹＤＩＰＶＩＳＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＮＴＷＧＣＶＴＹＤＦＴＰＤＡＩＩＳＳＫＮＬＴＡＧＦＦＰＶＧＡＶＩＬＧＰＥＬＳＫＲＬＥＴＡＩＥＡＩＥＥＦＰＨＧＦＴＡＧＧＨＰＶＧＣＡＩＡＬＫＡＩＤＶＶＭＮＥＧＬＡＥＮＶＲＲＬＡＰＲＦＥＥＲＬＫＨＩＡＥＲＰＮＩＧＥＹＲＧＩＧＦＭＷＡＬＥＡＶＫＤＫＡＳＫＴＰＦＤＧＮＬＳＶＳＫＲＩＡＮＴＣＱＤＬＧＬＩＣＳＡＬＧＱＳＶＩＬＳＰＰＦＩＬＴＥＡＱＭＤＥＭＦＤＫＬＥＫＡＬＤＫＶＦＡＥＶＡ
配列番号５
Ｖｆａｔ１０１０  ａａ配列
ＭＮＫＰＱＳＷＥＡＲＡＥＴＹＳＬＹＧＦＴＤＭＰＳＬＨＥＲＧＴＶＶＶＴＨＧＥＧＰＹＩＶＤＶＮＧＲＲＹＬＤＡＮＳＧＬＹＮＭＶＡＧＦＤＨＫＧＬＩＤＡＡＫＡＱＹＥＲＦＰＧＹＨＳＦＦＧＲＭＳＤＱＴＶＭＬＳＥＫＬＶＥＶＳＰＦＤＳＧＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＡＮＤＴＭＶＫＭＬＷＦＬＨＡＡＥＧＫＰＱＫＲＫＩＬＴＲＱＮＡＹＨＧＶＴＡＶＳＡＳＭＴＧＭＰＨＮＳＶＦＧＬＰＬＰＧＦＶＨＬＴＣＰＨＹＷＲＹＧＥＥＧＥＴＥＥＱＦＶＡＲＬＡＲＥＬＥＥＴＩＱＲＥＧＡＤＴＩＡＧＦＦＡＥＰＶＭＧＡＧＧＶＩＰＰＡＫＧＹＦＱＡＩＬＰＩＬＲＫＹＤＩＰＶＩＳＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＮＴＷＧＣＶＴＹＤＦＴＰＤＡＩＩＳＳＫＮＬＴＡＧＦＦＰＶＧＡＶＩＬＧＰＡＬＳＫＲＬＥＴＡＩＥＡＩＥＥＦＰＨＧＦＴＡＧＧＨＰＶＧＣＡＩＡＬＫＡＩＤＶＶＭＮＥＧＬＡＥＮＶＲＲＬＡＰＲＦＥＥＲＬＫＨＩＡＥＲＰＮＩＧＥＹＲＧＩＧＦＭＷＡＬＥＡＶＫＤＫＡＳＫＴＰＦＤＧＮＬＳＶＳＫＲＩＡＮＴＣＱＤＬＧＬＩＣＳＡＭＧＱＳＶＩＬＳＰＰＦＩＬＴＥＡＱＭＤＥＭＦＤＫＬＥＫＡＬＤＫＶＦＡＥＶＡ
配列番号６
Ｖｆａｔ１０２０  ａａ配列
ＭＮＫＰＱＳＷＥＡＲＡＥＴＹＳＬＹＧＦＴＤＭＰＳＬＨＥＲＧＴＶＶＶＴＨＧＥＧＰＹＶＶＤＶＮＧＲＲＹＬＤＡＮＳＧＬＹＮＭＶＡＧＦＤＨＫＧＬＩＤＡＡＫＡＱＹＥＲＦＰＧＹＨＳＦＦＧＲＭＳＤＱＴＶＭＬＳＥＫＬＶＥＶＳＰＦＤＳＧＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＡＮＤＴＭＶＫＭＬＷＦＬＨＡＡＥＧＫＰＱＫＲＫＩＬＴＲＱＮＡＹＨＧＶＴＡＶＳＡＳＭＴＧＬＰＨＮＳＶＦＧＬＰＬＰＧＦＶＨＬＧＣＰＨＹＷＲＹＧＥＥＧＥＴＥＥＱＦＶＡＲＬＡＲＥＬＥＥＴＩＱＲＥＧＡＤＴＩＡＧＦＦＡＥＰＶＭＧＡＧＧＶＩＰＰＡＫＧＹＦＱＡＩＬＰＩＬＲＫＹＤＩＰＶＩＳＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＮＴＷＧＣＶＴＹＤＦＴＰＤＡＩＩＳＳＫＮＬＴＡＧＦＦＰＶＧＡＶＩＬＧＰＥＬＳＫＲＬＥＴＡＩＥＡＩＥＥＦＰＨＧＦＴＡＧＧＨＰＶＧＣＡＩＡＬＫＡＩＤＶＶＭＮＥＧＬＡＥＮＶＲＲＬＡＰＲＦＥＥＲＬＫＨＩＡＥＲＰＮＩＧＥＹＲＧＩＧＦＭＷＡＬＥＡＶＫＤＫＡＳＫＴＰＦＤＧＮＬＳＶＳＫＲＩＡＮＴＣＱＤＬＧＬＩＣＡＡＭＧＱＳＶＩＬＳＰＰＦＩＬＴＥＡＱＭＤＥＭＦＤＫＬＥＫＡＬＤＫＶＦＡＥＶＡ
配列番号７
Ｖｆａｔ１０３０  ａａ配列
ＭＮＫＰＱＳＷＥＡＲＡＥＴＹＳＬＹＧＦＴＤＭＰＳＬＨＥＲＧＴＶＶＶＴＨＧＥＧＰＹＩＶＤＶＨＧＲＲＹＬＤＡＮＳＧＬＹＮＭＶＡＧＦＤＨＫＧＬＩＤＡＡＫＡＱＹＥＲＦＰＧＹＨＳＦＦＧＲＭＳＤＱＴＶＭＬＳＥＫＬＶＥＶＳＰＦＤＳＧＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＡＮＤＴＭＶＫＭＬＷＦＬＨＡＡＥＧＫＰＱＫＲＫＩＬＴＲＱＮＡＹＨＧＶＴＡＶＳＡＳＭＴＧＬＰＨＮＳＶＦＧＬＰＬＰＧＦＶＨＬＳＣＰＨＹＷＲＹＧＥＥＧＥＴＥＥＱＦＶＡＲＬＡＲＥＬＥＥＴＩＱＲＥＧＡＤＴＩＡＧＦＦＡＥＰＶＭＧＡＧＧＶＩＰＰＡＫＧＹＦＱＡＩＬＰＩＬＲＫＹＤＩＰＶＩＳＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＮＴＷＧＣＶＴＹＤＦＴＰＤＡＩＩＳＳＫＮＬＴＡＧＦＦＰＶＧＡＶＩＬＧＰＥＬＳＫＲＬＥＴＡＩＥＡＩＥＥＦＰＨＧＦＴＡＧＧＨＰＶＧＣＡＩＡＬＫＡＩＤＶＶＭＮＥＧＬＡＥＮＶＲＲＬＡＰＲＦＥＥＲＬＫＨＩＡＥＲＰＮＩＧＥＹＲＧＩＧＦＭＷＡＬＥＡＶＫＤＫＡＳＫＴＰＦＤＧＮＬＳＶＳＫＲＩＡＮＴＣＱＤＬＧＬＩＣＳＡＭＧＱＳＶＩＬＳＰＰＦＩＬＴＥＡＱＭＤＥＭＦＤＫＬＥＫＡＬＤＫＶＦＡＥＶＡ
配列番号８
リコペルシコン・エスカレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）（トマト）１２−オキソフィトジエン酸レダクターゼ１タンパク質配列：
ＭＥＮＫＶＶＥＥＫＱＶＤＫＩＰＬＭＳＰＣＫＭＧＫＦＥＬＣＨＲＶＶＬＡＰＬＴＲＱＲＳＹＧＹＩＰＱＰＨＡＩＬＨＹＳＱＲＳＴＮＧＧＬＬＩＧＥＡＴＶＩＳＥＴＧＩＧＹＫＤＶＰＧＩＷＴＫＥＱＶＥＡＷＫＰＩＶＤＡＶＨＡＫＧＧＩＦＦＣＱＩＷＨＶＧＲＶＳＮＫＤＦＱＰＮＧＥＤＰＩＳＣＴＤＲＧＬＴＰＱＩＲＳＮＧＩＤＩＡＨＦＴＲＰＲＲＬＴＴＤＥＩＰＱＩＶＮＥＦＲＶＡＡＲＮＡＩＥＡＧＦＤＧＶＥＩＨＧＡＨＧＹＬＩＤＱＦＭＫＤＱＶＮＤＲＳＤＫＹＧＧＳＬＥＮＲＣＲＦＡＬＥＩＶＥＡＶＡＮＥＩＧＳＤＲＶＧＩＲＩＳＰＦＡＨＹＮＥＡＧＤＴＮＰＴＡＬＧＬＹＭＶＥＳＬＮＫＹＤＬＡＹＣＨＶＶＥＰＲＭＫＴＡＷＥＫＩＥＣＴＥＳＬＶＰＭＲＫＡＹＫＧＴＦＩＶＡＧＧＹＤＲＥＤＧＮＲＡＬＩＥＤＲＡＤＬＶＡＹＧＲＬＦＩＳＮＰＤＬＰＫＲＦＥＬＮＡＰＬＮＫＹＮＲＤＴＦＹＴＳＤＰＩＶＧＹＴＤＹＰＦＬＥＴＭＴ
配列番号９
リコペルシコン・エスカレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）（トマト）１２−オキソフィトジエン酸レダクターゼ１コドン最適化配列：
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配列番号１０
Ｖｆａｔ  ８８８  ＤＮＡ配列
ＡＴＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＧＡＡＧＣＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＡＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＧＴＡＣＧＧＣＴＴＣＡＣＴＧＡＴＡＴＧＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＧＴＡＣＣＧＴＧＧＴＴＧＴＣＡＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＣＡＴＡＣＡＴＣＧＴＧＧＡＣＧＴＣＡＡＣＧＧＴＣＧＣＣＧＴＴＡＣＣＴＧＧＡＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＡＴＧＧＴＴＧＣＣＧＧＣＴＴＣＧＡＣＣＡＣＡＡＧＧＧＴＣＴＧＡＴＣＧＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＧＣＣＣＡＧＴＡＣＧＡＡＣＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＣＣＡＴＡＧＣＴＴＣＴＴＣＧＧＴＣＧＴＡＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＡＡＣＴＧＴＴＡＴＧＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＡＣＴＧＧＴＡＧＡＧＧＴＧＴＣＴＣＣＡＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＧＴＣＧＣＧＴＧＴＴＣＴＡＴＡＣＴＡＡＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＡＧＧＣＴＡＡＣＧＡＴＡＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＣＡＧＡＧＧＧＣＡＡＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＣＧＣＡＡＡＡＴＣＣＴＧＡＣＴＣＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＴＡＣＣＡＣＧＧＴＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＧＧＴＣＴＧＣＣＧＴＡＣＡＡＣＴＣＴＧＴＡＴＴＣＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＧＧＴＴＴＣＧＴＴＣＡＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＡＣＴＡＴＴＧＧＣＧＴＴＡＣＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡＡＡＣＣＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣＴＣＧＴＣＴＧＧＣＣＣＧＣＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＣＴＡＴＣＣＡＡＣＧＴＧＡＡＧＧＣＧＣＧＧＡＣＡＣＧＡＴＴＧＣＧＧＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＡＧＣＣＧＧＴＣＡＴＧＧＧＣＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＴＡＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＣＧＡＡＡＧＧＴＴＡＣＴＴＣＣＡＧＧＣＧＡＴＣＣＴＧＣＣＧＡＴＴＣＴＧＣＧＴＡＡＧＴＡＣＧＡＣＡＴＣＣＣＧＧＴＴＡＴＣＴＣＴＧＡＴＧＡＡＧＴＴＡＴＣＴＧＣＧＧＣＴＴＴＧＧＴＣＧＴＡＣＣＧＧＴＡＡＴＡＣＴＴＧＧＧＧＴＴＧＣＧＴＴＡＣＣＴＡＴＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＣＧＧＡＴＧＣＧＡＴＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＡＡＡＴＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＧＴＴＴＣＴＴＴＣＣＧＧＴＴＧＧＴＧＣＴＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＣＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＡＡＡＣＧＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＧＣＧＡＴＣＧＡＡＧＣＴＡＴＣＧＡＡＧＡＧＴＴＣＣＣＧＣＡＣＧＧＣＴＴＴＡＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＴＣＡＣＣＣＧＧＴＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＡＴＣＧＣＴＣＴＧＡＡＡＧＣＡＡＴＣＧＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＡＴＧＡＧＧＧＴＣＴＧＧＣＡＧＡＧＡＡＣＧＴＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＧＴＴＴＴＧＡＧＧＡＧＣＧＴＣＴＧＡＡＡＣＡＣＡＴＴＧＣＣＧＡＡＣＧＴＣＣＧＡＡＣＡＴＣＧＧＴＧＡＡＴＡＴＣＧＴＧＧＣＡＴＣＧＧＴＴＴＴＡＴＧＴＧＧＧＣＡＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＴＧＡＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＡＴＣＴＡＡＡＡＣＣＣＣＡＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡＡＴＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＴＡＴＣＧＣＴＡＡＣＡＣＣＴＧＴＡＣＣＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＡＴＣＴＧＴＡＧＣＣＣＧＡＴＧＧＧＴＣＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＣＴＧＴＧＣＣＣＧＣＣＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣＧＡＧＧＣＧＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＡＧＡＴＧＴＴＴＧＡＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＧＴＣＴＴＴＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＴＡＡ
配列番号１１
Ｖｆａｔ  ９０６  ＤＮＡ配列
ＡＴＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＧＡＡＧＣＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＡＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＧＴＡＣＧＧＣＴＴＣＡＣＴＧＡＴＡＴＧＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＡＣｇＡＧＣＧＴＧＧＴＡＣＣＧＴＧＧＴＴＧＴＣＡＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＣＡＴＡＣＡＴＣＧＴＧＧＡＣＧＴＣＡＡＣＧＧＴＣＧＣＣＧＴＴＡＣＣＴＧＧＡＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＡＴＧＧＴＴＧＣＣＧＧＣＴＴＣＧＡＣＣＡＣＡＡＧＧＧＴＣＴＧＡＴＣＧＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＧＣＣＣＡＧＴＡＣＧＡＡＣＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＣＣＡＴＡＧＣＴＴＣＴＴＣＧＧＴＣＧＴＡＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＡＡＣＴＧＴＴＡＴＧＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＡＣＴＧＧＴＡＧＡＧＧＴＧＴＣＴＣＣＡＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＧＴＣＧＣＧＴＧＴＴＣＴＡＴＡＣＴＡＡＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＡＧＧＣＴＡＡＣＧＡＴＡＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＣＡＧＡＧＧＧＣＡＡＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＣＧＣＡＡＡＡＴＣＣＴＧＡＣＴＣＧＴａａｃＡＡＣＧＣＡＴＡＣＣＡＣＧＧＴＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＧＧＴＣＴＧＣＣＧＴＡＣＡＡＣＴＣＴＧＴＡＴＴＣＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＧＧＴＴＴＣＧＴＴＣＡＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＡＣＴＡＴＴＧＧＣＧＴＴＡＣＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡＡＡＣＣＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣＴＣＧＴＣＴＧＧＣＣＣＧＣＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＣＴＡＴＣＣＡＡＣＧＴＧＡＡＧＧＣＧＣＧＧＡＣＡＣＧＡＴＴＧＣＧＧＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＡＧＣＣＧＧＴＣＡＴＧＧＧＣＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＴＡＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＣＧＡＡＡＧＧＴＴＡＣＴＴＣＣＡＧＧＣＧＡＴＣＣＴＧＣＣＧＡＴＴＣＴＧＣＧＴＡＡＧＴＡＣＧＡＣＡＴＣＣＣＧＧＴＴＡＴＣＴＣＴＧＡＴＧＡＡＧＴＴＡＴＣＴＧＣＧＧＣＴＴＴＧＧＴＣＧＴＡＣＣＧＧＴＡＡＴＡＣＴＴＧＧＧＧＴＴＧＣＧＴＴＡＣＣＴＡＴＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＣＧＧＡＴＧＣＧＡＴＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＡＡＡＴＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＧＴＴＴＣＴＴＴＣＣＧＧＴＴＧＧＴＧＣＴＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＣＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＡＡＣＧＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＧＣＧＡＴＣＧＡＡＧＣＴＡＴＣＧＡＡＧＡＧＴＴＣＣＣＧＣＡＣＧＧＣＴＴＴＡＣＧＧＣＣｇｇｃＧＧＴＣＡＣＣＣＧＧＴＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＡＴＣＧＣＴＣＴＧＡＡＡＧＣＡＡＴＣＧＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＡＴＧＡＧＧＧＴＣＴＧＧＣＡＧＡＧＡＡＣＧＴＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＧＴＴＴＴＧＡＧＧＡＧＣＧＴＣＴＧＡＡＡＣＡＣＡＴＴＧＣＣＧＡＡＣＧＴＣＣＧＡＡＣＡＴＣＧＧＴＧＡＡＴＡＴＣＧＴＧＧＣＡＴＣＧＧＴＴＴＴＡＴＧＴＧＧＧＣＡＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＴＧＡＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＡＴＣＴＡＡＡＡＣＣＣＣＡＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡＡＴＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＧＣａａａＣＧＴＡＴＣＧＣＴＡＡＣＡＣＣＴＧＴｃａｇＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＡＴＣＴＧＴＡＧＣｇＣＧＣＴＧＧＧＴＣＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＣＴＧＴＧＣＣＣＧＣＣＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣＧＡＧＧＣＧＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＡＧＡＴＧＴＴＴＧＡＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＧＴＣＴＴＴＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＴＡＡ
配列番号１２
Ｖｆａｔ  ９９９  ＤＮＡ配列
ＡＴＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＧＡＡＧＣＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＡＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＧＴＡＣＧＧＣＴＴＣＡＣＴＧＡＴＡＴＧＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＡＣＧＡＧＣＧＴＧＧＴＡＣＣＧＴＧＧＴＴＧＴＣＡＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＣＡＴＡＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＣＡＡＣＧＧＴＣＧＣＣＧＴＴＡＣＣＴＧＧＡＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＡＴＧＧＴＴＧＣＣＧＧＣＴＴＣＧＡＣＣＡＣＡＡＧＧＧＴＣＴＧＡＴＣＧＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＧＣＣＣＡＧＴＡＣＧＡＡＣＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＣＣＡＴＡＧＣＴＴＣＴＴＣＧＧＴＣＧＴＡＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＡＡＣＴＧＴＴＡＴＧＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＡＣＴＧＧＴＡＧＡＧＧＴＧＴＣＴＣＣＡＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＧＴＣＧＣＧＴＧＴＴＣＴＡＴＡＣＴＡＡＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＡＧＧＣＴＡＡＣＧＡＴＡＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＣＡＧＡＧＧＧＣＡＡＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＣＧＣＡＡＡＡＴＣＣＴＧＡＣＴＣＧＴＣＡＡＡＡＣＧＣＡＴＡＣＣＡＣＧＧＴＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＧＧＴＣＴＧＣＣＧＣＡＣＡＡＣＴＣＴＧＴＡＴＴＣＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＧＧＴＴＴＣＧＴＴＣＡＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＡＣＴＡＴＴＧＧＣＧＴＴＡＣＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡＡＡＣＣＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣＴＣＧＴＣＴＧＧＣＣＣＧＣＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＣＴＡＴＣＣＡＡＣＧＴＧＡＡＧＧＣＧＣＧＧＡＣＡＣＧＡＴＴＧＣＧＧＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＡＧＣＣＧＧＴＣＡＴＧＧＧＣＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＴＡＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＣＧＡＡＡＧＧＴＴＡＣＴＴＣＣＡＧＧＣＧＡＴＣＣＴＧＣＣＧＡＴＴＣＴＧＣＧＴＡＡＧＴＡＣＧＡＣＡＴＣＣＣＧＧＴＴＡＴＣＴＣＴＧＡＴＧＡＡＧＴＴＡＴＣＴＧＣＧＧＣＴＴＴＧＧＴＣＧＴＡＣＣＧＧＴＡＡＴＡＣＴＴＧＧＧＧＴＴＧＣＧＴＴＡＣＣＴＡＴＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＣＧＧＡＴＧＣＧＡＴＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＡＡＡＴＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＧＴＴＴＣＴＴＴＣＣＧＧＴＴＧＧＴＧＣＴＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＣＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＡＡＣＧＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＧＣＧＡＴＣＧＡＡＧＣＴＡＴＣＧＡＡＧＡＧＴＴＣＣＣＧＣＡＣＧＧＣＴＴＴＡＣＧＧＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＣＧＧＴＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＡＴＣＧＣＴＣＴＧＡＡＡＧＣＡＡＴＣＧＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＡＴＧＡＧＧＧＴＣＴＧＧＣＡＧＡＧＡＡＣＧＴＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＧＴＴＴＴＧＡＧＧＡＧＣＧＴＣＴＧＡＡＡＣＡＣＡＴＴＧＣＣＧＡＡＣＧＴＣＣＧＡＡＣＡＴＣＧＧＴＧＡＡＴＡＴＣＧＴＧＧＣＡＴＣＧＧＴＴＴＴＡＴＧＴＧＧＧＣＡＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＴＧＡＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＡＴＣＴＡＡＡＡＣＣＣＣＡＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡＡＴＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＣＧＴＡＴＣＧＣＴＡＡＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＡＴＣＴＧＴＡＧＣＧＣＧＣＴＧＧＧＴＣＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＣＴＧＡＧＣＣＣＧＣＣＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣＧＡＧＧＣＧＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＡＧＡＴＧＴＴＴＧＡＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＧＴＣＴＴＴＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＴＡＡ
配列番号１３
Ｖｆａｔ  １０１０  ＤＮＡ配列
ＡＴＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＧＡＡＧＣＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＡＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＧＴＡＣＧＧＣＴＴＣＡＣＴＧＡＴＡＴＧＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＡＣＧＡＧＣＧＴＧＧＴＡＣＣＧＴＧＧＴＴＧＴＣＡＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＣＡＴＡＣＡＴＣＧＴＧＧＡＣＧＴＣＡＡＣＧＧＴＣＧＣＣＧＴＴＡＣＣＴＧＧＡＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＡＴＧＧＴＴＧＣＣＧＧＣＴＴＣＧＡＣＣＡＣＡＡＧＧＧＴＣＴＧＡＴＣＧＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＧＣＣＣＡＧＴＡＣＧＡＡＣＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＣＣＡＴＡＧＣＴＴＣＴＴＣＧＧＴＣＧＴＡＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＡＡＣＴＧＴＴＡＴＧＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＡＣＴＧＧＴＡＧＡＧＧＴＧＴＣＴＣＣＡＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＧＴＣＧＣＧＴＧＴＴＣＴＡＴＡＣＴＡＡＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＡＧＧＣＴＡＡＣＧＡＴＡＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＣＡＧＡＧＧＧＣＡＡＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＣＧＣＡＡＡＡＴＣＣＴＧＡＣＴＣＧＴＣＡＡＡＡＣＧＣＡＴＡＣＣＡＣＧＧＴＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＧＧＴＡＴＧＣＣＧＣＡＣＡＡＣＴＣＴＧＴＡＴＴＣＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＧＧＴＴＴＣＧＴＴＣＡＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＡＣＴＡＴＴＧＧＣＧＴＴＡＣＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡＡＡＣＣＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣＴＣＧＴＣＴＧＧＣＣＣＧＣＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＣＴＡＴＣＣＡＡＣＧＴＧＡＡＧＧＣＧＣＧＧＡＣＡＣＧＡＴＴＧＣＧＧＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＡＧＣＣＧＧＴＣＡＴＧＧＧＣＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＴＡＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＣＧＡＡＡＧＧＴＴＡＣＴＴＣＣＡＧＧＣＧＡＴＣＣＴＧＣＣＧＡＴＴＣＴＧＣＧＴＡＡＧＴＡＣＧＡＣＡＴＣＣＣＧＧＴＴＡＴＣＴＣＴＧＡＴＧＡＡＧＴＴＡＴＣＴＧＣＧＧＣＴＴＴＧＧＴＣＧＴＡＣＣＧＧＴＡＡＴＡＣＴＴＧＧＧＧＴＴＧＣＧＴＴＡＣＣＴＡＴＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＣＧＧＡＴＧＣＧＡＴＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＡＡＡＴＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＧＴＴＴＣＴＴＴＣＣＧＧＴＴＧＧＴＧＣＴＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＣＧＧＣＡＣＴＧＡＧＣＡＡＡＣＧＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＧＣＧＡＴＣＧＡＡＧＣＴＡＴＣＧＡＡＧＡＧＴＴＣＣＣＧＣＡＣＧＧＣＴＴＴＡＣＧＧＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＣＧＧＴＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＡＴＣＧＣＴＣＴＧＡＡＡＧＣＡＡＴＣＧＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＡＴＧＡＧＧＧＴＣＴＧＧＣＡＧＡＧＡＡＣＧＴＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＧＴＴＴＴＧＡＧＧＡＧＣＧＴＣＴＧＡＡＡＣＡＣＡＴＴＧＣＣＧＡＡＣＧＴＣＣＧＡＡＣＡＴＣＧＧＴＧＡＡＴＡＴＣＧＴＧＧＣＡＴＣＧＧＴＴＴＴＡＴＧＴＧＧＧＣＡＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＴＧＡＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＡＴＣＴＡＡＡＡＣＣＣＣＡＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡＡＴＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＣＧＴＡＴＣＧＣＴＡＡＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＡＴＣＴＧＴＡＧＣＧＣＧＡＴＧＧＧＴＣＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＣＴＧＡＧＣＣＣＧＣＣＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣＧＡＧＧＣＧＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＡＧＡＴＧＴＴＴＧＡＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＧＴＣＴＴＴＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＴＡＡ
配列番号１４
Ｖｆａｔ  １０２０  ＤＮＡ配列
ＡＴＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＧＡＡＧＣＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＡＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＧＴＡＣＧＧＣＴＴＣＡＣＴＧＡＴＡＴＧＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＡＣＧＡＧＣＧＴＧＧＴＡＣＣＧＴＧＧＴＴＧＴＣＡＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＣＡＴＡＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＣＡＡＣＧＧＴＣＧＣＣＧＴＴＡＣＣＴＧＧＡＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＡＴＧＧＴＴＧＣＣＧＧＣＴＴＣＧＡＣＣＡＣＡＡＧＧＧＴＣＴＧＡＴＣＧＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＧＣＣＣＡＧＴＡＣＧＡＡＣＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＣＣＡＴＡＧＣＴＴＣＴＴＣＧＧＴＣＧＴＡＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＡＡＣＴＧＴＴＡＴＧＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＡＣＴＧＧＴＡＧＡＧＧＴＧＴＣＴＣＣＡＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＧＴＣＧＣＧＴＧＴＴＣＴＡＴＡＣＴＡＡＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＡＧＧＣＴＡＡＣＧＡＴＡＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＣＡＧＡＧＧＧＣＡＡＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＣＧＣＡＡＡＡＴＣＣＴＧＡＣＴＣＧＴＣＡＡＡＡＣＧＣＡＴＡＣＣＡＣＧＧＴＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＧＧＴＣＴＧＣＣＧＣＡＣＡＡＣＴＣＴＧＴＡＴＴＣＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＧＧＴＴＴＣＧＴＴＣＡＣＣＴＧＧＧＴＴＧＴＣＣＧＣＡＣＴＡＴＴＧＧＣＧＴＴＡＣＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡＡＡＣＣＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣＴＣＧＴＣＴＧＧＣＣＣＧＣＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＣＴＡＴＣＣＡＡＣＧＴＧＡＡＧＧＣＧＣＧＧＡＣＡＣＧＡＴＴＧＣＧＧＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＡＧＣＣＧＧＴＣＡＴＧＧＧＣＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＴＡＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＣＧＡＡＡＧＧＴＴＡＣＴＴＣＣＡＧＧＣＧＡＴＣＣＴＧＣＣＧＡＴＴＣＴＧＣＧＴＡＡＧＴＡＣＧＡＣＡＴＣＣＣＧＧＴＴＡＴＣＴＣＴＧＡＴＧＡＡＧＴＴＡＴＣＴＧＣＧＧＣＴＴＴＧＧＴＣＧＴＡＣＣＧＧＴＡＡＴＡＣＴＴＧＧＧＧＴＴＧＣＧＴＴＡＣＣＴＡＴＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＣＧＧＡＴＧＣＧＡＴＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＡＡＡＴＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＧＴＴＴＣＴＴＴＣＣＧＧＴＴＧＧＴＧＣＴＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＣＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＡＡＣＧＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＧＣＧＡＴＣＧＡＡＧＣＴＡＴＣＧＡＡＧＡＧＴＴＣＣＣＧＣＡＣＧＧＣＴＴＴＡＣＧＧＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＣＧＧＴＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＡＴＣＧＣＴＣＴＧＡＡＡＧＣＡＡＴＣＧＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＡＴＧＡＧＧＧＴＣＴＧＧＣＡＧＡＧＡＡＣＧＴＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＧＴＴＴＴＧＡＧＧＡＧＣＧＴＣＴＧＡＡＡＣＡＣＡＴＴＧＣＣＧＡＡＣＧＴＣＣＧＡＡＣＡＴＣＧＧＴＧＡＡＴＡＴＣＧＴＧＧＣＡＴＣＧＧＴＴＴＴＡＴＧＴＧＧＧＣＡＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＴＧＡＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＡＴＣＴＡＡＡＡＣＣＣＣＡＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡＡＴＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＣＧＴＡＴＣＧＣＴＡＡＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＡＴＣＴＧＴＡＧＣＧＣＧＡＴＧＧＧＴＣＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＣＴＧＡＧＣＣＣＧＣＣＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣＧＡＧＧＣＧＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＡＧＡＴＧＴＴＴＧＡＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＧＴＣＴＴＴＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＴＡＡ
配列番号１５
Ｖｆａｔ  １０３０  ＤＮＡ配列
ＡＴＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＧＡＡＧＣＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＡＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＧＴＡＣＧＧＣＴＴＣＡＣＴＧＡＴＡＴＧＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＡＣＧＡＧＣＧＴＧＧＴＡＣＣＧＴＧＧＴＴＧＴＣＡＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＣＡＴＡＣＡＴＣＧＴＧＧＡＣＧＴＣＣＡＣＧＧＴＣＧＣＣＧＴＴＡＣＣＴＧＧＡＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＡＴＧＧＴＴＧＣＣＧＧＣＴＴＣＧＡＣＣＡＣＡＡＧＧＧＴＣＴＧＡＴＣＧＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＧＣＣＣＡＧＴＡＣＧＡＡＣＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＣＣＡＴＡＧＣＴＴＣＴＴＣＧＧＴＣＧＴＡＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＡＡＣＴＧＴＴＡＴＧＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＡＣＴＧＧＴＡＧＡＧＧＴＧＴＣＴＣＣＡＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＧＴＣＧＣＧＴＧＴＴＣＴＡＴＡＣＴＡＡＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＡＧＧＣＴＡＡＣＧＡＴＡＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＣＡＧＡＧＧＧＣＡＡＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＣＧＣＡＡＡＡＴＣＣＴＧＡＣＴＣＧＴＣＡＡＡＡＣＧＣＡＴＡＣＣＡＣＧＧＴＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＧＧＴＣＴＧＣＣＧＣＡＣＡＡＣＴＣＴＧＴＡＴＴＣＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＧＧＴＴＴＣＧＴＴＣＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＴＣＣＧＣＡＣＴＡＴＴＧＧＣＧＴＴＡＣＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡＡＡＣＣＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣＴＣＧＴＣＴＧＧＣＣＣＧＣＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＣＴＡＴＣＣＡＡＣＧＴＧＡＡＧＧＣＧＣＧＧＡＣＡＣＧＡＴＴＧＣＧＧＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＡＧＣＣＧＧＴＣＡＴＧＧＧＣＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＴＡＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＣＧＡＡＡＧＧＴＴＡＣＴＴＣＣＡＧＧＣＧＡＴＣＣＴＧＣＣＧＡＴＴＣＴＧＣＧＴＡＡＧＴＡＣＧＡＣＡＴＣＣＣＧＧＴＴＡＴＣＴＣＴＧＡＴＧＡＡＧＴＴＡＴＣＴＧＣＧＧＣＴＴＴＧＧＴＣＧＴＡＣＣＧＧＴＡＡＴＡＣＴＴＧＧＧＧＴＴＧＣＧＴＴＡＣＣＴＡＴＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＣＧＧＡＴＧＣＧＡＴＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＡＡＡＴＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＧＴＴＴＣＴＴＴＣＣＧＧＴＴＧＧＴＧＣＴＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＣＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＡＡＣＧＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＧＣＧＡＴＣＧＡＡＧＣＴＡＴＣＧＡＡＧＡＧＴＴＣＣＣＧＣＡＣＧＧＣＴＴＴＡＣＧＧＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＣＧＧＴＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＡＴＣＧＣＴＣＴＧＡＡＡＧＣＡＡＴＣＧＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＡＴＧＡＧＧＧＴＣＴＧＧＣＡＧＡＧＡＡＣＧＴＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＧＴＴＴＴＧＡＧＧＡＧＣＧＴＣＴＧＡＡＡＣＡＣＡＴＴＧＣＣＧＡＡＣＧＴＣＣＧＡＡＣＡＴＣＧＧＴＧＡＡＴＡＴＣＧＴＧＧＣＡＴＣＧＧＴＴＴＴＡＴＧＴＧＧＧＣＡＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＴＧＡＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＡＴＣＴＡＡＡＡＣＣＣＣＡＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡＡＴＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＣＧＴＡＴＣＧＣＴＡＡＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＡＴＣＴＧＴＡＧＣＧＣＧＡＴＧＧＧＴＣＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＣＴＧＡＧＣＣＣＧＣＣＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣＧＡＧＧＣＧＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＡＧＡＴＧＴＴＴＧＡＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＧＴＣＴＴＴＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＴＡＡ
【配列表】
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【国際調査報告】
2016516744.tif 000139
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