(57)【要約】  本発明は、成長因子及び／もしくは抗微生物性ペプチドを有する脂質ナノ粒子、及びそれらの調製方法に関わる。さらに、本発明は、このような脂質ナノ粒子と、医薬的に許容可能なキャリアとを有する医薬組成物に関わる。最後に、本発明はまた、医薬として使用するための、及び特に局所投与により、創傷治癒を促進するのに使用するための、前記医薬組成物に関わる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
室温で固体の少なくとも１つの脂質、少なくとも１つの非イオン性界面活性剤、及び１つの成長因子を有することを特徴とする、脂質ナノ粒子。
【請求項２】
前記成長因子は上皮成長因子である、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項３】
前記上皮成長因子は、組換えヒト上皮成長因子（ｒｈＥＧＦ）である、請求項２に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項４】
室温で固体の少なくとも１つの脂質をさらに有する、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項５】
室温で固体の少なくとも１つの脂質、少なくとも１つの非イオン性界面活性剤、及びカテリシジンＬＬ３７の抗微生物性ペプチドを有することを特徴とする、脂質ナノ粒子。
【請求項６】
室温で液体の少なくとも１つの脂質をさらに有する、請求項５に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項７】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子と、
請求項５又は６に記載の脂質ナノ粒子と
を有することを特徴とする、組成物。
【請求項８】
医薬として使用するための、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子又は請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
対象における創傷治癒を促進するのに使用するための、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子又は請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記創傷が、糖尿病性足潰瘍、圧迫性潰瘍、血管性潰瘍、虚血性創傷、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の脂質ナノ粒子又は組成物。
【請求項１１】
請求項１乃至６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子又は請求項７に記載の組成物と、
医薬的に許容可能なキャリアと
を有する、医薬組成物。
【請求項１２】
薬剤として使用するための請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
対象における創傷治癒を促進するために使用するための、請求項に記載１１の医薬組成物。
【請求項１４】
創傷治癒を促進するために、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子及び／又は請求項７に記載の組成物を有するキット。
【請求項１５】
以下のステップ：
（ｉ）非イオン性界面活性剤を有する水溶液を調製するステップ、
（ｉｉ）有機溶媒中で、室温で固体の親油性の脂質を有する溶液を調製するステップ、
（ｉｉｉ）水溶液（ｉ）を、親油性溶液（ｉｉ）に添加し、得られる混合物を、エマルションが得られるまで超音波処理に付すステップ、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で得られたエマルションから有機溶媒を蒸発させるステップ、及び
（ｖ）ナノ粒子を収集するステップ
を有する、請求項１乃至３及び５のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子を調製するための方法であって、
成長因子もしくはＬＬ３７ペプチドは、溶液（ｉｉ）に添加される、方法。
【請求項１６】
以下のステップ：
（ｉ）非イオン性界面活性剤を有する水溶液を調製するステップ、
（ｉｉ）液体固体の脂質と、液体脂質の融点よりも高い温度で溶融した液体の脂質とのブレンドを有する親油性溶液を調製するステップ、
（ｉｉｉ）水溶液（ｉ）を、親油性溶液（ｉｉ）と同じ温度まで加熱するステップ、
（ｉｖ）水溶液（ｉ）を、親油性溶液（ｉｉ）に添加し、得られる混合物を、エマルションが得られるまで超音波処理に付すステップ、
（ｖ）脂質を再結晶化及びナノ粒子形成させるため、エマルション（ｉｖ）を５℃±３℃で冷却するステップ、及び
（ｖｉ）ナノ粒子を収集するステップ
を有する、請求項４又は６に記載の脂質ナノ粒子を調製するための方法であって、
成長因子もしくはＬＬ３７ペプチドは、溶液（ｉｉ）に添加される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質ナノ粒子、及び創傷治癒のための医薬組成物としての、特に局所適用のためのナノ粒子懸濁液、包帯もしくはゲルとしての、それらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性創傷の治療は、世界的な保健システムにとって深刻な問題となっており、主要な経済及び公衆衛生上の課題を代表する。リスク因子（例えば人口の高齢化、喫煙、糖尿病及び肥満など）の増加は、治癒プロセスを悪化させ、且つ遅延させ得、創傷治癒を困難にする。
【０００３】
高圧酸素、負圧および外科的デブリードマンを含むいくつかの緩和治療は、現在、高齢者の慢性創傷の治療のために使用されている。また、慢性潰瘍の治療のための、商用合成包帯の広範囲が市販されているが、但し限られた治癒の効き目を示す。
【０００４】
上皮成長因子（ＥＧＦ）は、細胞遊走、分化及び増殖を刺激することにより、及びまた肉芽組織形成を促進することにより、組織修復および再生において重要な役割を果たす。臨床的な観点から、ＥＧＦは、特に糖尿病性脚部潰瘍において、創傷治癒を促進するために使用されてきた。臨床試験は、神経障害性の低グレードの潰瘍におけるＥＧＦの局所適用の有益な効果を実証した。；しかしながら、特に高グレードの創傷においてＥＧＦの局所製剤の効果は、低減され得る。なぜならば、このタイプの創傷においてプロテアーゼ活性の増加を確認したためである。Ｒｅｎｇｅｎ  Ｄ−１５０(登録商標)は、グレードＩおよびＩＩの糖尿病性潰瘍の治療のためにインドで製造されている組換えヒト上皮成長因子（ｒｈＥＧＦ）  １５０μｇ／ｇを含有するゲルです。それは、６週間の平均治療期間において一日二回の投与を必要とする。Ｈｅｂｅｒｐｒｏｔ(登録商標)（ｒｈＥＧＦ  ７５μｇを含有する凍結乾燥製剤）は、病巣内注射によって週３回投与される。これは、アルジェリア、アルゼンチン、コロンビア、キューバ、ドミニカ共和国、ベネズエラで販売されている。糖尿病患者２０名で行われたパイロット研究は、全層潰瘍を有する患者における慢性創傷の治癒を促進するのに、可能で安全な治療としてＨｅｂｅｒｐｒｏｔ(登録商標）を実証した。しかし、ｒｈＥＧＦの短い半減期は、上皮細胞に対するその分裂促進効果を高めるために（少なくとも６〜１２時間の）連続曝露を必要とする。従って、創傷治癒において有意な治療効果を達成するためには、用量，送達システム及び安全性の観点から、成長因子（例えば、ｒｈＥＧＦ）の投与を最適化する必要がある。この目的のためには、２０１０年にＣｈｕ  ｅｔ  ａｌ．は、２％ｒｈＥＧＦ含有量を有するポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）のポリマーのナノ粒子を調製する方法を開発した（“Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  ｆｕｌｌ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒａｔｓ”，  Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ  ２０１０；  １５：４９９−５０５）。ｒｈＥＧＦカプセル化効率は、８５．６％であり、且つ２４時間の生物学的に活性なｒｈＥＧＦの制御された放出を示した。糖尿病ラットにおいて誘発された全層創傷に対する、これらのナノ粒子の局所一日一回の局所適用は、カプセル化されていないｒｈＥＧＦに比べて、高い線維芽細胞の増殖レベル及び最速治癒率を促進した。
【０００５】
さらに特許ＥＰ１９８７８１７Ｂ１は、糖尿病性下肢の切断を防止するために、糖尿病患者の下肢への病変内投与のためのｒｈＥＧＦを含有するポリマーマイクロスフェアの製造方法を特許請求している。１．６乃至２．４％のｒｈＥＧＦ含有量を有する開発されたマイクロスフェアは、１４日間の間、一日当たり５乃至１０μｇのｒｈＥＧＦの制御された放出、及びカプセル化されていないｒｈＥＧＦに比べて、ヒトにおける優れた創傷治癒能力を示した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
驚くべきことに、本発明者らは、高いカプセル化効率で上皮成長因子を有する脂質ナノ粒子であって、週２回の局所製剤で適用され、創傷治癒を改善する脂質ナノ粒子を開発した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様によると、本発明は、室温で固体の（ｓｏｌｉｄｏ  ａ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒａ  ａｍｂｉｅｎｔｅ）少なくとも１つの脂質、少なくとも１つの非イオン性界面活性剤、及び１つの成長因子を有する脂質ナノ粒子（本発明のナノ粒子）に関する。
【０００８】
別の態様によれば、本発明は、以下のステップ：
（ｉ）非イオン性界面活性剤を有する水溶液を調製するステップ、
（ｉｉ）有機溶媒中で、室温で固体の（ｓｏｌｉｄｏ  ａ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒａ  ａｍｂｉｅｎｔｅ）親油性の脂質を有する溶液を調製するステップ、
（ｉｉｉ）水溶液（ｉ）を、親油性溶液（ｉｉ）に添加し、得られる混合物を、エマルションが得られるまで超音波処理に付すステップ、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で得られたエマルションから有機溶媒を蒸発させるステップ、及び
（ｖ）ナノ粒子を収集するステップ
を有することを特徴とする、脂質ナノ粒子を調製するための方法であって、
成長因子もしくはＬＬ３７ペプチドは、溶液（ｉｉ）に添加される、方法に関わる。
【０００９】
別の態様によれば、本願は、本発明の脂質ナノ粒子と医薬的キャリアとを有する医薬組成物（本発明の医薬組成物）に関する。
【００１０】
別の態様によれば、本願は、薬剤として使用するための、及び創傷治癒を促進するのに使用するための、本発明の脂質ナノ粒子に、及びそれを有する医薬組成物にも関する。
【００１１】
本発明の他の目的、特徴、利点および態様は、以下の説明および添付の特許請求の範囲から当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、細胞増殖に対する、ｒｈＥＧＦを装填した脂質ナノ粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果のグラフ表示を示す。
【図２】図２は、ＳＬＮ製剤及びＮＬＣ−ＮｉｌｅＲｅｄ−ＮｉｌｅＲｅｄ製剤の細胞取り込みの写真を示す。
【図３Ａ】図３は、  （Ａ）ｒｈＥＧＦを装填した固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）及び  （Ｂ）ｒｈＥＧＦを装填したナノ構造化キャリア（ＮＬＣ）の創傷閉鎖に対するｉｎ  ｖｉｖｏ効果のグラフ表示、並びに  （Ｃ）未処理のコントロールラット、及びでＳＬＮブランク(blancas)、ＮＬＣブランク(blancas)、ｒｈＥＧＦ−ＭＳ、コントロールＭＳブランク(vacias)、遊離ｒｈＥＧＦ、ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ  ２０μｇ、ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ  １０μｇ、ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣ  ２０μｇ、ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣ  １０μｇで治療したラットにおける創傷の写真を示す。平均値±標準偏差として示されるデータ。  ＊未処理対照よりも有意に高かった（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１且つ＊＊＊ｐ＜０．００１）；  ■ブランクＭＳコントロールよりも有意に高かった（■ｐ＜０．０５、■■ｐ＜０．０１且つ■■■ｐ＜０．００１）；  ●ブランクＳＬＮよりも有意に高かった（●ｐ＜０．０５、●●ｐ＜０．０１且つ●●●ｐ＜０．００１）；  ▼ブランクＮＬＣよりも有意に高かった（▼ｐ＜０．０５、▼▼ｐ＜０．０１且つ▼▼▼ｐ＜０．００１）；  ○遊離ｒｈＥＧＦよりも有意に高かった（○ｐ＜０．０５、○○ｐ＜０．０１且つ○○○ｐ＜０．００１）；  ◇ｒｈＥＧＦ−ＭＳ  ７５μｇよりも有意に高かった（◇ｐ＜０．０５、◇◇ｐ＜０．０１且つ◇◇◇ｐ＜０．００１）；  ▲ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ  １０μｇよりも有意に高かった（▲ｐ＜０．０５、▲▲ｐ＜０．０１且つ▲▲▲ｐ＜０．００１）。
【図３Ｂ】図３は、  （Ａ）ｒｈＥＧＦを装填した固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）及び  （Ｂ）ｒｈＥＧＦを装填したナノ構造化キャリア（ＮＬＣ）の創傷閉鎖に対するｉｎ  ｖｉｖｏ効果のグラフ表示、並びに  （Ｃ）未処理のコントロールラット、及びでＳＬＮブランク、ＮＬＣブランク、ｒｈＥＧＦ−ＭＳ、コントロールＭＳブランク(vacias)、遊離ｒｈＥＧＦ、ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ  ２０μｇ、ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ  １０μｇ、ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣ  ２０μｇ、ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣ  １０μｇで処置したラットにおける損傷の写真を示す。平均値±標準偏差として示されるデータ。  ＊未処理対照よりも有意に高かった（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１且つ＊＊＊ｐ＜０．００１）；  ■ブランクＭＳコントロールよりも有意に高かった（■ｐ＜０．０５、■■ｐ＜０．０１且つ■■■ｐ＜０．００１）；  ●ブランクＳＬＮよりも有意に高かった（●ｐ＜０．０５、●●ｐ＜０．０１且つ●●●ｐ＜０．００１）；  ▼ブランクＮＬＣよりも有意に高かった（▼ｐ＜０．０５、▼▼ｐ＜０．０１且つ▼▼▼ｐ＜０．００１）；  ○遊離ｒｈＥＧＦよりも有意に高かった（○ｐ＜０．０５、○○ｐ＜０．０１且つ○○○ｐ＜０．００１）；  ◇ｒｈＥＧＦ−ＭＳ  ７５μｇよりも有意に高かった（◇ｐ＜０．０５、◇◇ｐ＜０．０１且つ◇◇◇ｐ＜０．００１）；  ▲ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ  １０μｇよりも有意に高かった（▲ｐ＜０．０５、▲▲ｐ＜０．０１且つ▲▲▲ｐ＜０．００１）。
【図３Ｃ】図３は、  （Ａ）ｒｈＥＧＦを装填した固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）及び  （Ｂ）ｒｈＥＧＦを装填したナノ構造化キャリア（ＮＬＣ）の創傷閉鎖に対するｉｎ  ｖｉｖｏ効果のグラフ表示、並びに  （Ｃ）未治療のコントロールラット、及びでＳＬＮブランク、ＮＬＣブランク、ｒｈＥＧＦ−ＭＳ、コントロールＭＳブランク(vacias)、遊離ｒｈＥＧＦ、ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ  ２０μｇ、ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ  １０μｇ、ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣ  ２０μｇ、ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣ  １０μｇで処置したラットにおける損傷の写真を示す。
【図４Ａ】図４は、  炎症評価に対する（Ａ，Ｃ）、及び  再上皮化スコアに対する（Ｂ，Ｄ）ｒｈＥＧＦを装填した脂質ナノ粒子のｉｎ  ｖｉｖｏ効果のグラフ表示を表す。平均値±標準偏差として示されるデータ。  ＊未処理対照よりも有意に高かった（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１且つ＊＊＊ｐ＜０．００１）；  ■ブランクＭＳコントロールよりも有意に高かった（■ｐ＜０．０５、■■ｐ＜０．０１且つ■■■ｐ＜０．００１）；  ●ブランクＳＬＮよりも有意に高かった（●ｐ＜０．０５、●●ｐ＜０．０１且つ●●●ｐ＜０．００１）；  ▼ブランクＮＬＣよりも有意に高かった（▼ｐ＜０．０５、▼▼ｐ＜０．０１且つ▼▼▼ｐ＜０．００１）；  ○遊離ｒｈＥＧＦよりも有意に高かった（○ｐ＜０．０５、○○ｐ＜０．０１且つ○○○ｐ＜０．００１）；  ◇ｒｈＥＧＦ−ＭＳ  ７５μｇよりも有意に高かった（◇ｐ＜０．０５、◇◇ｐ＜０．０１且つ◇◇◇ｐ＜０．００１）；  ▲ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ  １０μｇよりも有意に高かった（▲ｐ＜０．０５、▲▲ｐ＜０．０１且つ▲▲▲ｐ＜０．００１）。
【図４Ｂ】図４は、  炎症評価に対する（Ａ，Ｃ）、及び  再上皮化スコアに対する（Ｂ，Ｄ）ｒｈＥＧＦを装填した脂質ナノ粒子のｉｎ  ｖｉｖｏ効果のグラフ表示を表す。平均値±標準偏差として示されるデータ。  ＊未処理対照よりも有意に高かった（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１且つ＊＊＊ｐ＜０．００１）；  ■ブランクＭＳコントロールよりも有意に高かった（■ｐ＜０．０５、■■ｐ＜０．０１且つ■■■ｐ＜０．００１）；  ●ブランクＳＬＮよりも有意に高かった（●ｐ＜０．０５、●●ｐ＜０．０１且つ●●●ｐ＜０．００１）；  ▼ブランクＮＬＣよりも有意に高かった（▼ｐ＜０．０５、▼▼ｐ＜０．０１且つ▼▼▼ｐ＜０．００１）；  ○遊離ｒｈＥＧＦよりも有意に高かった（○ｐ＜０．０５、○○ｐ＜０．０１且つ○○○ｐ＜０．００１）；  ◇ｒｈＥＧＦ−ＭＳ  ７５μｇよりも有意に高かった（◇ｐ＜０．０５、◇◇ｐ＜０．０１且つ◇◇◇ｐ＜０．００１）；  ▲ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ  １０μｇよりも有意に高かった（▲ｐ＜０．０５、▲▲ｐ＜０．０１且つ▲▲▲ｐ＜０．００１）。
【図４Ｃ】図４は、  炎症評価に対する（Ａ，Ｃ）、及び  再上皮化スコアに対する（Ｂ，Ｄ）ｒｈＥＧＦを装填した脂質ナノ粒子のｉｎ  ｖｉｖｏ効果のグラフ表示を表す。平均値±標準偏差として示されるデータ。  ＊未処理対照よりも有意に高かった（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１且つ＊＊＊ｐ＜０．００１）；  ■ブランクＭＳコントロールよりも有意に高かった（■ｐ＜０．０５、■■ｐ＜０．０１且つ■■■ｐ＜０．００１）；  ●ブランクＳＬＮよりも有意に高かった（●ｐ＜０．０５、●●ｐ＜０．０１且つ●●●ｐ＜０．００１）；  ▼ブランクＮＬＣよりも有意に高かった（▼ｐ＜０．０５、▼▼ｐ＜０．０１且つ▼▼▼ｐ＜０．００１）；  ○遊離ｒｈＥＧＦよりも有意に高かった（○ｐ＜０．０５、○○ｐ＜０．０１且つ○○○ｐ＜０．００１）；  ◇ｒｈＥＧＦ−ＭＳ  ７５μｇよりも有意に高かった（◇ｐ＜０．０５、◇◇ｐ＜０．０１且つ◇◇◇ｐ＜０．００１）；  ▲ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ  １０μｇよりも有意に高かった（▲ｐ＜０．０５、▲▲ｐ＜０．０１且つ▲▲▲ｐ＜０．００１）。
【図４Ｄ】図４は、  炎症評価に対する（Ａ，Ｃ）、及び  再上皮化スコアに対する（Ｂ，Ｄ）ｒｈＥＧＦを装填した脂質ナノ粒子のｉｎ  ｖｉｖｏ効果のグラフ表示を表す。平均値±標準偏差として示されるデータ。  ＊未処理対照よりも有意に高かった（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１且つ＊＊＊ｐ＜０．００１）；  ■ブランクＭＳコントロールよりも有意に高かった（■ｐ＜０．０５、■■ｐ＜０．０１且つ■■■ｐ＜０．００１）；  ●ブランクＳＬＮよりも有意に高かった（●ｐ＜０．０５、●●ｐ＜０．０１且つ●●●ｐ＜０．００１）；  ▼ブランクＮＬＣよりも有意に高かった（▼ｐ＜０．０５、▼▼ｐ＜０．０１且つ▼▼▼ｐ＜０．００１）；  ○遊離ｒｈＥＧＦよりも有意に高かった（○ｐ＜０．０５、○○ｐ＜０．０１且つ○○○ｐ＜０．００１）；  ◇ｒｈＥＧＦ−ＭＳ  ７５μｇよりも有意に高かった（◇ｐ＜０．０５、◇◇ｐ＜０．０１且つ◇◇◇ｐ＜０．００１）；  ▲ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ  １０μｇよりも有意に高かった（▲ｐ＜０．０５、▲▲ｐ＜０．０１且つ▲▲▲ｐ＜０．００１）。
【図５Ａ】図５は、ＳＬＮ−ＮｉｌｅＲｅｄ、及びパラフィン−ＮｉｌｅＲｅｄの皮膚取り込みの  顕微鏡写真（Ａ）及び  グラフ表示（Ｂ）を示す（ピクセル輝度（ＡＢＵ）の任意の値は、角質層、表皮および真皮内の蛍光バックグラウンドについて補正された）。  ＊パラフィン−ＮｉｌｅＲｅｄよりも有意に高かった（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１且つ＊＊＊ｐ＜０．００１）。追加された数字は、それぞれパラフィンクリームの浸透促進を与える（ＰＥＥ）。
【図５Ｂ】図５は、ＳＬＮ−ＮｉｌｅＲｅｄ、及びパラフィン−ＮｉｌｅＲｅｄの皮膚取り込みの  顕微鏡写真（Ａ）及び  グラフ表示（Ｂ）を示す（ピクセル輝度（ＡＢＵ）の任意の値は、角質層、表皮および真皮内の蛍光バックグラウンドについて補正された）。
【図６】図６は、細胞増殖に対するＬＬ−３７を装填した脂質ナノ粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果のグラフ表示を示す。
【図７Ａ】図７は、細胞増殖に対するｒｈＥＧＦ及びＬＬ−３７の組み合わせのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果のグラフ表示を示す。
【図７Ｂ】図７は、細胞増殖に対するｒｈＥＧＦ及びＬＬ−３７の組み合わせのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果のグラフ表示を示す。
【図８】図８は、  （Ａ）１５，２５，３６及び４３日の、豚における創傷閉鎖に対する、ブランクＮＬＣ、遊離ｒｈＥＧＦ及びｒｈＥＧＦ−ＮＬＣ  ２０μｇのｉｎ  ｖｉｖｏでの効果のグラフ表示、及び  （Ｂ）ブランクＮＬＣ、遊離ｒｈＥＧＦ及びｒｈＥＧＦ−ＮＬＣ  ２０μｇで処置した豚における創傷の写真を表す。
【図９】図９は、  （Ａ）１５、２５、及び４３日における異なる調査したグループにおける上皮の長さグラフ表示、及び  （Ｂ）１５、２５、及び４３日における損傷の組織学的画像を表す。平均値±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）として示されるデータ。  ＊＊＊ブランクＮＬＣ及び遊離ｒｈＥＧＦよりも有意に高かった（ｐ＜０．００１）。
【図１０】図１０は、１５日（Ａ）、２５日（Ｂ）及び４３日（Ｃ）後、創傷治癒の拡張（ｍｍ）のグラフ表示を表す。平均値±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）として示されるデータ。  ＊＊＊、ブランクＮＬＣ及び遊離ｒｈＥＧＦと比べてｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の第一の態様は、室温で固体の少なくとも１つの脂質、少なくとも１つの非イオン性界面活性剤、及び１つの成長因子を有することを特徴とする、脂質ナノ粒子に関する。
【００１４】
単数形ｅｌ，ｌａ，ｕｎ及びｕｎａは、文脈が明らかに他を示さない限り複数形を含むことに注意すべきである。
【００１５】
本発明の文脈においては、脂質ナノ粒子は、固体マトリックスを有するナノメートル範囲の粒子を指す。マトリックスは、室温でも、体温でも固体である脂質から構成される。固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）の場合、マトリックスは固体脂質のみからなる。ナノ構造化脂質キャリア（ＮＬＣ）の場合、マトリックスは、液体脂質（オイル）と固体の脂質との混合物からなるが、それでもこの混合物は、室温でも、また体温でも固体である（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２，  Ｓｏｌｉｄ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  （ＳＬＮ）  ａｎｄ  ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｃａｒｒｉｅｒｓ  （ＮＬＣ）  ｉｎ  ｃｏｓｍｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５４  （１）：  Ｓ１３１−Ｓ１５５）。「成長因子を装填する」という用語は、ナノ粒子のマトリックス内に埋め込まれた、またはカプセル化された成長因子を意味する。従って、特定の実施形態では、脂質ナノ粒子はＳＬＮであり、そして別の特定の一実施形態では、脂質ナノ粒子はＮＬＣである。従って、特定の一実施形態では、脂質ナノ粒子は、ＳＬＮ又はＮＬＣである。
【００１６】
特定の実施形態において、成長因子は、上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーのファミリー、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）ファミリー、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーに属する成長因子、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）からなる群から選択される。好ましくは、成長因子は、上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーに属し、且つより好ましくは、成長因子は、上皮成長因子（ＥＧＦ）である。特定の一実施形態では、脂質ナノ粒子は、ＥＧＦを装填したＳＬＮ（以後ＥＧＦ−ＳＬＮとも称する）及び／又はＥＧＦを装填したＮＬＣ（以後ＥＧＦ−ＮＬＣとも称する）である。本発明の特定の一実施形態では、上皮成長因子は、組換えヒト上皮成長因子（ｒｈＥＧＦ）である。前記ｒｈＥＧＦは、商業的に入手可能であるか（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｐｈａｒｍｃｈｅｍ、等）、又は例えばＭａｒｉｏｋａ−Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １９９１  Ｊａｎ  ２５；  ２６６（３）：  １７２８−３２）において、もしくは特許出願ＷＯ９１／１８９９９Ａ１において記載されるように、組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。特定の一実施形態では、本発明の脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子の総重量に対して、成長因子、特にＥＧＦの割合、０．０１％乃至２０重量％、好ましくは脂質ナノ粒子の総重量に対して０．１％乃至１０重量％、及びより好ましくは０．５％乃至５重量％有する。
【００１７】
上記のように、本発明の脂質ナノ粒子は、室温で固体の少なくとも１つの脂質を有する。本発明の文脈における「室温で固体脂質」とは、４５°Ｃ以下の温度で固体のままであり、飽和または不飽和でもよいと、理解される。この定義は、モノ−、ジ−、またはトリグリセリド、脂肪酸、ステロイド、およびワックスを包含する。同様に、酸基と、アルコールもしくはアミンとの反応の結果として生成される化合物を意味する、これら脂肪酸の誘導体を使用できる。従って、特定の実施形態では、室温で固体の脂質は、アシルグリセリド、少なくとも１０個の炭素原子の鎖を有する飽和脂肪酸又はその誘導体及びその混合物から選択される。好ましい実施形態では、アシルグリセリドは、パルミトステアリン酸グリセリル（Ｐｒｅｃｉｒｏｌ(登録商標）ＡＴ０５）、モノステアリン酸グリセリル（ＩＭＷＩＴＯＲ(登録商標）９００）及びベヘン酸グリセリル（Ｃｏｍｐｒｉｔｏｌ  ８８８ＡＴＯ）から選択される。より好ましい実施形態において、脂質成分は、パルミトステアリン酸グリセリル（Ｐｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴ０５）である。
【００１８】
本発明の特定の実施形態において、本発明の脂質ナノ粒子は、好ましくは、脂質ナノ粒子の総重量に対して、固体脂質の割合１％乃至４０重量％、好ましくは５％乃至１５重量％を有する。
【００１９】
上記のように、本発明の脂質ナノ粒子はまた、非イオン性界面活性剤を有する。用語「非イオン性界面活性剤」は、疎水性部分と、エマルションを製造することを可能にする親水性部分とを有する化合物として理解される。本発明の特定の実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート、ポリエチレングリコールコポリマー及びポリプロピレングリコールコポリマー、及びこれらの混合物から選択される。特定の実施形態では、非イオン性界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ，Ｓｐａｎ，Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ及びそれらの混合物からなる群から選択される。好ましい実施形態では、非イオン性界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ８０であり、別の好ましい実施形態では、非イオン性界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ８０とポロキサマーとの混合物である。
【００２０】
本発明の特定の実施形態では、非イオン性界面活性剤の割合は、好ましくは脂質ナノ粒子の全重量に対して、０．０１重量％乃至１０重量％、好ましくは０．０５％乃至５重量％である。
【００２１】
本発明の特定の実施形態において、本発明の脂質ナノ粒子は、１％乃至４０％の室温で固体の脂質、０．０１％乃至１０％の非イオン性界面活性剤、及び０．０１％乃至２０％の成長因子を有する（全てのパーセンテージは、脂質ナノ粒子の総重量の重量に対する重量で与えられる）。
【００２２】
特定の実施形態では、本発明の脂質ナノ粒子は、必要に応じて、凍結乾燥もしくは乾燥製品として提供することができる。
【００２３】
第２の態様において、本発明は、室温で液体の脂質をさらに含む、第１の態様の脂質ナノ粒子に関する。本発明の文脈において、「室温で液体の脂質」は、室温もしくは４５℃未満で液体のままであり、飽和もしくは不飽和であってもよい脂質と理解される。室温で液体の脂質は、飽和もしくは不飽和脂肪酸エステル、オイル、脂肪酸及び１０個未満の炭素原子を有する鎖を有するトリグリセリド、及びこれらの混合物（例えば、カプリル酸及びカプリン酸のトリグリセリド（Ｍｉｇｌｙｏｌ（登録商標））、ダイズ油、ミリスチン酸イソプロピル、ヒマシ油）から選択される。好ましい実施形態では、Ｍｉｇｌｙｏｌ（登録商標）は、液体脂質として使用される。好ましい実施形態においては、脂質ナノ粒子の脂質成分は、パルミトステアリン酸グリセリル（Ｐｒｅｃｉｒｏｌ登録商標ＡＴ０５）とカプリル酸及びカプリン酸のトリグリセリド（Ｍｉｇｌｙｏｌ（登録商標））との組み合わせである。本発明のこの第２の態様の別の変形において、室温で液体の脂質は、脂質ナノ粒子の総重量に対し、１乃至３０重量％、好ましくは５乃至１５％の割合で、ナノ粒子内に組み込まれる。別の実施形態では、固体脂質：液体脂質の割合は、０．５：１０乃至５：１０である。
【００２４】
第３の態様において、本発明は、
以下のステップ：
（ｉ）非イオン性界面活性剤を有する水溶液を調製するステップ、
（ｉｉ）有機溶媒中で、室温で固体の親油性の脂質を有する溶液を調製するステップ、
（ｉｉｉ）水溶液（ｉ）を、親油性溶液（ｉｉ）に添加し、得られる混合物を、エマルションが得られるまで超音波処理に付すステップ、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で得られたエマルションから有機溶媒を蒸発させるステップ、及び
（ｖ）ナノ粒子を収集するステップ
を有することを特徴する、上の段落で定義される本発明の第１の態様の脂質ナノ粒子を調製するための方法（本発明のメソッド１）であって、
成長因子もしくはＬＬ３７ペプチドは、溶液（ｉｉ）に添加される、方法に関わる。
【００２５】
このメソッド１で得られたナノ粒子は、ＳＬＮである。第１のステップ（ｉ）は、水溶液中、好ましくは水に非イオン性界面活性剤を溶解させることからなる。親油性溶液を調製する第２のステップ（ｉｉ）は、有機溶媒中で、室温で固体の脂質を溶解することによって行われる。その場合、固体脂質の割合は、有機溶媒の総重量に対して少なくとも１重量％である。成長因子、好ましくはＥＧＦ、より好ましくはｒｈＥＧＦ、は有機溶媒中の脂質と一緒に溶解される。有機溶媒の選択は、脂質成分に大幅に依存する。本発明の特定の実施態様において、有機溶媒は、ジクロロメタン、アセトン、クロロホルム、およびそれらの混合物から選択され、より好ましくは、ジクロロメタンである。
【００２６】
両方の溶液を調製した後、水溶液（ｉ）は、親油性溶液（ｉｉ）に添加される。得られる混合物は、エマルションが得られるまで、超音波処理に付される。次いで、有機溶媒は、当業者に公知の任意の方法により蒸発される。特定の実施形態では、有機溶媒を蒸発させるステップは、少なくとも６０分間、好ましくは少なくとも１２０分間、機械的攪拌下にエマルションを維持することによって達成される。有機溶媒を除去した後、親油性溶液が固化し、そしてナノ粒子の懸濁液が得られる。それからそれを遠心分離に濾過する。最後に、回収された脂質ナノ粒子を洗浄し、そして精製水中に再懸濁する。
【００２７】
本発明の第４の態様において、本発明は、以下のステップ：
（ｉ）非イオン性界面活性剤を有する水溶液を調製するステップ、
（ｉｉ）液体固体の脂質と、液体脂質の融点よりも高い温度で溶融した液体の脂質とのブレンドを有する親油性溶液を調製するステップ、
（ｉｉｉ）水溶液（ｉ）を、親油性溶液（ｉｉ）と同じ温度まで加熱するステップ、
（ｉｖ）水溶液（ｉ）を、親油性溶液（ｉｉ）に添加し、得られる混合物を、エマルションが得られるまで超音波処理に付すステップ、
（ｖ）脂質を再結晶化及びナノ粒子形成させるため、エマルション（ｉｖ）を５℃±３℃で冷却するステップ、及び
（ｖｉ）ナノ粒子を収集するステップ
を有することを特徴とする、上記段落で定義された本発明の第２の態様の脂質ナノ粒子を調製するための方法（本発明のメソッド２）であって、
成長因子もしくはＬＬ３７ペプチドは、溶液（ｉｉ）に添加される、方法に関する。
【００２８】
このメソッド２で得られた脂質ナノ粒子は、ＮＬＣである。第１のステップ（ｉ）は、水溶液中、好ましくは水に非イオン性界面活性剤を溶解させることからなる。親油性溶液を調製する第２のステップ（ｉｉ）は、液体脂質の融点より高い温度において固体脂質と液体脂質との混合物を溶融することによって行われる。成長因子、好ましくはＥＧＦ、より好ましくはｒｈＥＧＦは、脂質の混合物と一緒に溶解される。
【００２９】
一度、水溶液（ｉ）の混合物が、脂質のブレンドが溶解した温度まで加熱されたら、水溶液（ｉ）を、親油性溶液（ｉｉ）に添加する。次いで、得られる混合物を、エマルションが得られるまで超音波処理する。脂質の再結晶化及びナノ粒子の形成を可能にするため、引き続きエマルション（ｉｖ）を、５℃±３℃の温度に冷却する。脂質の再結晶化後、ナノ粒子懸濁液が得られる、次いで遠心分離によりナノ粒子懸濁液を濾過する。最後に、回収された脂質ナノ粒子を洗浄し、精製水中に再懸濁する。
【００３０】
第５の態様は、メソッド１により得られる脂質ナノ粒子及びメソッド２により得られる脂質ナノ粒子に関する。
【００３１】
本発明の第１、第２及び第５の態様の脂質ナノ粒子は、１μｍ以下の平均粒子サイズを有することを特徴とする。脂質ナノ粒子は、好ましくは平均サイズ１ｎｍ乃至１０００ｎｍ、より好ましくは１５０ｎｍ乃至４００ｎｍを含む平均サイズを有する。平均サイズは、当業者に知られている標準的な方法によって測定することができ、且つその標準的な方法は、例えば以下の実験の部に記載される（実施例２、表１）。加えて、脂質ナノ粒子は、（ゼータ電位により測定された）表面電荷を有してよい。表面電荷の大きさは、−５０ｍＶから＋８０ｍＶまで変動し得る（実施例２、表１）。また、脂質ナノ粒子は、４０％より大きい、特にＳＬＮの場合７０％より大きい、及びＮＬＣの場合９５％より大きいカプセル化効率を有する（実施例２、表１）。
【００３２】
本発明の脂質ナノ粒子の重要な特徴は、これら脂質ナノ粒子は、装填された成長因子を、持続的に放出することである。成長因子を装填した脂質ナノ粒子は、表面関連タンパク質の百分率に関係した初期放出（バーストリリース）と、続く４時間乃至２４時間の高速放出フェーズと、最後に、成長因子の合計量の放出で終わることが記載される、２４時間乃至７２時間の緩速フェーズとを特徴とする放出プロファイルを有する(実施例２、表３)。
【００３３】
この持続的放出特性は、遊離ＥＧＦを使用するもの（遊離ＥＧＦを使用するものは、同じ治療効果を達成するために、成長因子及び高投与量の連続投与を必要とする）と比べて、より安全な治療を可能にするので、重要な利点を提供する。また、投与量を減らすことにより、さらに望ましくない副作用を減少させることができる。なぜならば、カプセル化された成長因子は、経時的に、少用量がより効果的に、効果的に放出されるので、高用量の成長因子の投与は、もはや不要であるからだ。最後に、成長因子の持続的放出は、投与回数を減らし、患者による治療指示順守度(la  adherencia)及びその結果患者の生活の質を増加させる。
【００３４】
驚くべきことに本発明者らは、本発明の脂質ナノ粒子、すなわちＥＧＦを装填した脂質ナノ粒子は、遊離ＥＧＦよりも大きな、線維芽細胞の予期しないin  vitro増殖率を有することを発見した(実施例３、セクション３．１、図１)。また、本発明の脂質ナノ粒子、すなわちＥＧＦとＥＧＦ−ＳＬＮ−ＮＬＣは、細胞の内部へと進入できる（実施例３、セクション３．２、図２）。
【００３５】
興味深いことに、ｉｎ  ｖｉｖｏでの研究は、ｒｈＥＧＦの１０μｇ及び２０μｇの１用量中でｒｈＥＧＦ−ＳＬＮの局所投与４回は、病巣内適用４回におけるｒｈＥＧＦの３００μｇと比べて、創傷閉鎖（図３Ａ、３Ｃ）、炎症寛解（図４Ａ）及び再上皮化プロセス（図４Ｂ）に関して、創傷治癒をさらに改善することを示す。また、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験は、ｒｈＥＧＦの１０μｇ及び２０μｇの１用量中でｒｈＥＧＦ−ＮＬＣの局所投与４回は、病巣内適用４回におけるｒｈＥＧＦの３００μｇと比べて、創傷閉鎖（図３Ｂ、３Ｃ）、炎症寛解（図４Ｃ）及び再上皮化プロセス（図４Ｄ）に関して、創傷治癒をさらに改善することを示す。また、得られたデータは、創傷治癒プロセスが、７５μｇの乳酸・グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）マイクロスフェアｒｈＥＧＦ−ＭＳの病巣内投与１回と比べて、２０μｇもしくは１０μｇのｒｈＥＧＦを、ＳＬＮ及びＮＬＣ内にカプセル化したものにより、研究の８日及び１１日後の創傷閉鎖に関して、高度に改善されたことを明らかにする。このように、ナノ粒子のためのマトリックスとしての脂質の使用は、ＰＬＧＡなどの生分解性及び加水分解生分解性の一般的なポリマーを使用するよりも有利である。なぜならば、脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子内に分子を装填したものの局所投与を可能にするからだ。
【００３６】
同様に、実施例６（図８乃至１０）に示されたｉｎ  ｖｉｖｏ試験は、ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣのローカル及び局所（ｌｏｃａｌ及びｔｏｐｉｃａ）投与は、創傷治癒のスピード及び治癒した創傷の数に関して（創傷閉鎖測定）だけでなく、新たに形成された微小血管、繊維芽細胞遊走、コラーゲン沈着及び炎症応答の発達に基づく治癒の質に関しても、創傷治癒を改善し得ることを示す。また、これらの結果は、非常に関連している。なぜならば、局所投与された２０μｇ  ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣで処置された動物は、病巣内投与された７５μｇ遊離ｒｈＥＧＦで処理された損傷と比べて、有意に治癒を改善したからだ。閉じられた創傷及び再上皮化の百分率の結果と一緒にした、これらの結果は、ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣのｒｈＥＧＦ−ＮＬＣへのナノカプセル化は、局所投与を可能にし、且つ投与量を低減可能にすることを実証する。なぜならば、カプセル化は、創傷部位における成長因子分解を防ぐからだ。
【００３７】
興味深いことに、ＥＧＦ−ＳＬＮ及びＥＧＦ−ＮＬＣは、パラフィンクリームと比べて、改善された皮膚浸透能力を示す（実施例３、セクション３．４、図５）。これは重要な利点である。なぜならば脂質ナノ粒子内に装填された分子の局所投与を可能にするからだ。
【００３８】
従って、本発明の第６の態様は、
上の段落のいずれかに記載されたような、本発明の第１、第２及び第５の態様において定義された本発明の脂質ナノ粒子と、
医薬キャリアと
を有する医薬組成物を意味する。この態様の特定の実施形態において、医薬組成物は局所的に投与される。医薬組成物は、ゲル、クリーム、軟膏、包帯剤又はパッチとして投与することができる。従って、特定の実施形態において、医薬組成物は、コラーゲン、ヒアルロン酸、アロエ、フィブリン、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）ポリマーおよびセルロース誘導体をさらに有する。
【００３９】
さらに、本発明の第７の態様は、医薬として使用するための、上の段落のいずれかに記載されたような、本発明の第１、第２及び第５の態様において定義された本発明の脂質ナノ粒子を意味する。さらに、第８の態様において、本発明は、医薬として使用するための、第６の態様で定義される医薬組成物をも意味する。
【００４０】
上述のｉｎ  ｖｉｖｏ結果を考慮すると、本発明の別の態様、本発明の第９の態様は、対象における治癒の促進に使用するための、上の段落のいずれかに記載されたような、本発明の第１、第２及び第５の態様において定義された本発明の脂質ナノ粒子を意味する。好ましくは、本発明の第９の態様は、
対象における治癒の促進に使用するための、ＥＧＦを装填したＳＬＮ、及び
対象における治癒の促進に使用するための、ＥＧＦを装填したＮＬＣ
を意味する。さらに、第１０の態様において、本発明は、対象における治癒の促進に使用するための、第６の態様で定義される医薬組成物を意味する。本書で使用される用語「対象(sujeto)」は、任意の脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。本発明の文脈において、創傷は、慢性創傷、治癒困難な創傷、虚血性創傷及び熱傷を意味する。特定の実施形態において、創傷は、慢性創傷、虚血性創傷、熱傷およびそれらの組み合わせを有する群から選択される。好ましくは、慢性創傷は、糖尿病性足潰瘍、圧迫潰瘍、血管性潰瘍及びそれらの組み合わせを有する群から選択される。
【００４１】
本発明の文脈において、慢性創傷は、３ヶ月以上解剖学的および機能的完全性を回復するために規則的な且つ適切な修復プロセスを経て進行していない創傷として定義される。全創傷タイプは、慢性となる可能性を有する。例えば、慢性創傷は、伝統的には、病因によって、３つのカテゴリー：褥瘡、糖尿病性潰瘍及び血管潰瘍（静脈および動脈性潰瘍）に分割される。褥瘡は、圧力又は剪断力及び/又はそれらの任意の組み合わせの結果として、通常、骨の隆起を介して、皮膚及び/又は下層組織上の病変として定義される。糖尿病性足潰瘍は、それらが患者の生活の質に与える深刻な影響に起因する糖尿病の最も恐れられている合併症の一つであり、そして、それらは、そのような足の骨構造の立体構造における機械的変化、末梢神経障害（神経損傷）および末梢血管疾患（動脈閉塞）などの様々な要因の結果として現れる。これら全ては、糖尿病人口において高い頻度と強度で発生する。血管性潰瘍は、通常下肢にある。血管潰瘍の大多数は、慢性もしくは再発性である。これらは、末梢血管疾患を有する患者の間でかなりの罹患率を引き起こす。動脈又は虚血性創傷は、下肢に乏しい灌流によって引き起こされる。虚血は、栄養と酸素の供給を制限し、それによりエリア内の組織を殺し、開いた傷の形成を引き起こす。創傷への血流の減少は、治癒反応をひどく妨げ、それにより壊疽、及びそのため切断に至りかねない慢性創傷を引き起こす。最後に、治癒が困難な創傷は、持続性の慢性炎症性細胞、細胞外マトリックスの無秩序合成及びリモデリング、及び再上皮化の欠如を特徴とする。そして火傷は、熱、火、放射線、太陽放射、電気や化学物質の影響による皮膚病変である。
【００４２】
驚くべきことに本発明者らは、ＥＧＦとカテリシジンＬＬ３７に属する抗微生物性ペプチドとの組み合わせは、それぞれ遊離ＥＧＦ及び遊離ＬＬ３７よりも予想外の増加した細胞増殖を示すことを見出した（実施例４、図７）。ＬＬ３７ペプチドは、ヒトカテリシジン抗微生物性タンパク質、ｈＣＡＰ１８のＣ末端断片に相当する。ｈＣＡＰ１８は、自然免疫系の成分であり、抗微生物性活性の広いスペクトルを有する（Ｈｅｉｌｂｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  “Ｔｈｅ  Ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ  Ａｎｔｉ−Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＬＬ−３７  ｉｓ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｒｅ−Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｋｉｎ  Ｗｏｕｎｄｓ  ａｎｄ  ｉｓ  Ｌａｃｋｉｎｇ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｕｌｃｅｒ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ”  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １２０（３）：  ３７９−３８９）。従って、本発明の第１１の態様は、本発明の第１、第２及び第５の態様において定義された本発明の脂質ナノ粒子と、室温で固体の少なくとも１つの脂質を有する脂質ナノ粒子と、少なくとも１つの非イオン性界面活性剤と、ＬＬ３７ペプチドとを有する組成物（本発明の組成物）に関する。この態様の特定の実施形態において、組成物は、ＥＧＦを装填したＮＬＣとＬＬ３７を装填したＮＬＣとを有する。この態様の別の特定の実施形態において、組成物は、ＥＧＦを装填したＳＬＮとＬＬ３７を装填したＳＬＮとを有する。この態様の別の特定の実施形態において、本発明の組成物において、成長因子を装填した、好ましくはＥＧＦを装填した比例脂質ナノ粒子と、ＬＬ３７を装填した脂質ナノ粒子との比率は、１：１７乃至１：３４である。別の特定の実施形態において、組成物は、１５ｎｇ／ｍＬの脂質ナノ粒子ＥＧＦを装填した脂質ナノ粒子と０．２５乃至５μｇ／ｍＬのＬＬ３７を装填した脂質ナノ粒子とを有する。
【００４３】
本発明の第１２の態様は、最後の段落に記載されるような、本発明の第１１の態様に記載の組成と、医薬キャリアとを有する医薬組成物である。この態様の好ましい実施形態では、医薬組成物は局所的に投与される。従って、特定の実施形態において、医薬組成物は、コラーゲン、ヒアルロン酸、アロエ、フィブリン、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）ポリマー及びセルロース誘導体をさらに含む。
【００４４】
また、本発明の第１３の態様は、医薬として使用するための第１２の態様の医薬組成物に関する。
【００４５】
本発明の第１４の態様は、対象における治癒を促進するために使用するための、第１２の態様において定義される医薬組成物にも関する。
【００４６】
本発明の第１５の態様は、室温で固体の少なくとも１つの脂質と、少なくとも１つの非イオン性界面活性剤と、ＬＬ３７ペプチドとを有する脂質ナノ粒子に関する。本発明の第１の態様において記載される特定の実施形態は、成長因子もしくはＥＧＦをＬＬ３７ペプチドで置換している第１５の態様のＬＬ３７を装填した脂質ナノ粒子に適用可能である。
【００４７】
本発明の第１６の態様は、本発明の第１５の態様の脂質ナノ粒子に関わり、室温で液体脂質をさらに有する。本発明の第２の態様に記載された特定の実施形態は、成長因子もしくはＥＧＦをＬＬ３７ペプチドで置換している第１６の態様のＬＬ３７を装填した脂質ナノ粒子に適用可能である。
【００４８】
本発明の第１７の態様は、本発明の第１５の態様による脂質ナノ粒子を調製する方法であって、本発明の第３の態様に記載のメソッド１と同一のステップを特徴とするが、但し成長因子ではなく、ＬＬ３７ペプチドが親油性溶液（ｉｉ）に添加される。本発明の第３の態様に記載のメソッド１について記載した特定の実施形態は、成長因子もしくはＥＧＦをＬＬ３７ペプチドで置換しているメソッド３に適用可能である。
【００４９】
本発明の第１８の態様は、本発明の第１６の態様による脂質ナノ粒子を調製するための方法（以下メソッド４）であって、本発明の第４の態様に記載されるメソッド２と同一のステップを特徴とするが、但し成長因子ではなく、ＬＬ３７ペプチドが親油性溶液（ｉｉ）に添加される。
【００５０】
本発明の第１９の態様は、メソッド３により得られる脂質ナノ粒子と、それぞれ第１７及び第１８の態様に記載されるメソッド４により得られる脂質ナノ粒子とに関わる。
【００５１】
ＬＬ３７に関しては、このペプチドは、自動ペプチド合成および標準的なペプチド合成法を用いて合成することができる。さらに、このペプチドは、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから、商業的に入手することができる。ＬＬ３７は、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  １  （ＬＬＧＤＦＦＲＫＳＫＥＫＩＧＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲＮＬＶＰＲＴＥＳ）を有する。
【００５２】
本発明のＬＬ３７を装填した脂質ナノ粒子の重要な特徴は、装填されたＬＬ３７を持続的な放出方法で放出することである。ＬＬ３７を装填した脂質ナノ粒子は、表面関連ペプチド」の百分率に関係した初期放出（バーストリリース）と、続く４時間乃至２４時間の高速放出フェーズと、ＥＧＦの総量を放出することで終わると記載される２４時間乃至７２時間の緩速フェーズとを特徴とする放出プロファイルを示す（実施例２、表４）。
【００５３】
驚くべきことに本発明者らは、ＬＬ３７を装填した脂質ナノ粒子は、遊離ＬＬ３７よりも予想外の増加した線維芽細胞のin  vitro増殖を有する(実施例３、セクション３．３、図６）。従って、本発明の第２０の態様は、医薬として使用するための本発明の第１５、第１６及び第１９の態様のＬＬ３７を装填した脂質ナノ粒子に関する。
【００５４】
本発明の第２１の態様は、創傷治癒の態様を促進するための使用のための、本発明の第１５、第１６及び第１９の態様のＬＬ３７を装填した脂質ナノ粒子に関する。
【００５５】
本発明の第２２の態様は、本発明の第１５、第１６及び第１９の態様のＬＬ３７を装填した脂質ナノ粒子と、医薬的に許容可能なキャリアと有する医薬組成物に関する。この態様の好ましい実施形態では、医薬組成物は局所的に投与される。従って、特定の実施形態において、医薬組成物は、コラーゲン、ヒアルロン酸、アロエ、フィブリン、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）ポリマー及びセルロース誘導体をさらに含む。
【００５６】
第２３の態様において、本発明はまた、医薬として使用するための、ダウ２２の態様の医薬組成物に関する。
【００５７】
本発明の第２４の態様は、創傷治癒を促進するのに使用するための第２２の態様の医薬組成物に関する。
【００５８】
最後に、本発明の第２５の態様は、本発明の第１、第２、第５、第１５、第１６及び第１９の態様に記載される脂質ナノ粒子のいずれか１つ、又はそのそれらの混合物を有するキットに関する。また、第２５の態様は、本発明の第６、第１２及び第２２の態様に記載される医薬組成物のいずれかによる医薬組成物を有するキットに関する。
【００５９】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するため、且つ本書で粒子がどのように調整され、評価されるかについての完全な開示及び記載を脂質ナノ当業者に提供するためにあり、本発明の範囲を限定することを意図していない。特に断りのない限り実施例では、量および百分率は重量基準であり、温度は摂氏又は周囲温度にあり、圧力は大気圧又はその近傍である。
【実施例】
【００６０】
実施例１：  脂質ナノ粒子調製
ＳＬＮ及びＮＬＣは、乳化超音波処理に基づく方法により調製された（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２；  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０  （Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｏｒａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ  ｆｒｏｍ  ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｃａｒｒｉｅｒｓ：  Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ．  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ７４，  ４７４−４８２））。
【００６１】
ｒｈＥＧＦを装填したＳＬＮの場合には、１９ｍＬの１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ８０水溶液を、０．１％（ｗ／ｖ）市販のｒｈＥＧＦ及び１０％（ｗ／ｗ）Ｐｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ５を含有する２ｍＬのジクロロメタン溶液に添加した。直後に、混合物を５０Ｗで３０秒間乳化した（Ｂｒａｎｓｏｎ（登録商標）２５０  ｓｏｎｉｆｉｅｒ，ＣＴ，ＵＳＡ）。このステップは、ｏ／ｗエマルションを生成した。その後有機溶媒を除去するため、及び粒子を圧縮するため、エマルションを２時間撹拌した。その後、１００ｋＤａのポアサイズを有する遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社，スペイン）を使用する１０分間の２５００ｒｐｍにおける遠心分離により、ＳＬＮを収集し、そしてｍｉｌｉＱ水で３回洗浄した。最後に、トレハロースを、Ｐｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ５に対して１５％の水溶液中の凍結保護剤として添加した。
【００６２】
ｒｈＥＧＦを装填したＮＬＣの調製については、４０℃で１分間加熱された０．６７％（ｗ／ｖ）ポロキサマー及び１．３３％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ８０の温水溶液を、４０℃で１分間加熱された、２００ｍｇの溶融Ｐｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ５、２ｍｇの市販のｒｈＥＧＦ及び２０ｍｇのＭｉｇｌｙｏｌの混合物に注いだ。得られる混合物を、その後５０Ｗで１５秒間乳化し（Ｂｒａｎｓｏｎ（登録商標）２５０  ｓｏｎｉｆｉｅｒ，ＣＴ，ＵＳＡ）、ＮＬＣを形成させるため、４０℃で１２時間保持し、脂質を再結晶化させた。最後に、粒子を回収し、洗浄し、上記のように凍結乾燥した。ＳＬＮとＮＬＣの両方においてｒｈＥＧＦの装填は、１％（ｗ／ｗ）であった。
【００６３】
ＬＬ３７を装填したＳＬＮ及びＬＬ３７を装填したＮＬＣは、それぞれｒｈＥＧＦを装填したＳＬＮ及びｒｈＥＧＦを装填したＮＬＣについて記載されたように調製されたが、但しｒｈＥＧＦではなく、合成（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ９４２６１）もしくは組換え体ＬＬ３７を使用した。
【００６４】
実施例２−脂質ナノ粒子の特徴
２．１．
平均サイズ（Ｚ平均）及び多分散性指数（ＰＩ）を、光子相関分光法により測定した。ナノ粒子が凍結乾燥される前と後に、各アッセイを三重に行った。ゼータ電位（ζ）が、ドップラー流速計（ＬＤＶ）によって決定された。上述した全ての測定値は、機器Ｍａｌｖｅｒｎ（登録商標）Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ３０００（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，英国）を使用して評価した。表面外観及び形態は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ；Ｊｅｏｌ（登録商標）ＪＳＭ−３５  ＣＦ）及び透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により決定した。
【００６５】
２．２．
ＳＬＮ及びＮＬＣを収集するのに使用される濾過／遠心分離テクニックにより除去された遊離ｒｈＥＧＦ及び遊離ＬＬ３７（非カプセル化）を測定することにより、カプセル化効率（ＥＥ）は間接的に算出された。各サンプルを、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０及び０．１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）溶液で１：１００００に希釈した。遊離ｒｈＥＧＦ及び遊離ＬＬ３７の量は、ヒトＥＧＦ用（ヒトＥＧＦ  ＥＬＩＳＡ開発キット、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）及びヒトＬＬ３７用（ヒトＥＧＦ  ＥＬＩＳＡ開発キット、Ｈｙｃｕｌｔ  ｂｉｏｔｅｃｈ）市販のサンドイッチ酵素免疫測定法キットを、製造元の指示に従い使用して推定した。カプセル化効率（ＥＥ）は、以下の式を用いて検討した。
【数１】
2016523884.tif 000002
【００６６】
すべての試験は、三重に実施した。結果を、これらの試験の平均±標準偏差として表した。
表１：  ｒｈＥＧＦを装填したＳＬＮ及びＮＬＣ特性
【表１】
2016523884.tif 000003
表２：  ＬＬ３７を装填したＳＬＮ及びＮＬＣ特性
【表２】
2016523884.tif 000004
【００６７】
表１及び表２に示されるように、ＰＤＩ値は、凍結乾燥の前及び後のすべての配合(formulaciones)において０．５未満であり、均一なサイズ分布を確認した。サイズ測定のための乾燥粒子の再構成は、何ら問題を提示しなかったことは、サイズの増大にもかかわらず、粒子の融解または凝集がないことを示唆している。ゼータ電位として、両方の配合は、−３４ｍＶの領域において類似の表面電荷を示した。さらに、ＥＬＩＳＡ試験は、ＮＬＣのＥＥがＳＬＮのＥＥよりもわずかに高かったことを示した。
【００６８】
両配合において、粒子表面は滑らかで無孔性であった。一方、ＳＥＭ画像及びＴＥＭ画像は、両方ともＳＬＮはＮＬＣよりも規則的であることを示唆した（データは示していない）。
【００６９】
２．３  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出試験
２ｍＬの０．０２Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）２ｍｌ中３２ｍｇ及び２３ｍｇのＳＬＮもしくはＮＬＣ（〜２００μｇのｒｈＥＧＦもしくはＬＬ３７に対応する）を３日間インキュベートすることにより、放出試験を行った。選択された間隔で、放出媒体を濾過／遠心分離によって除去し、同一量のＰＢＳで置き換えた。ｒｈＥＧＦ及びＬＬ３の量は、セクション２．２に記載のプロトコルを使用するＥＬＩＳＡによって分析した。
【００７０】
表３：  時間中に放出されたｒｈＥＧＦの累積百分率
【表３】
2016523884.tif 000005
【００７１】
表４：  時間中に放出されたＬＬ３７の累積百分率
【表４】
2016523884.tif 000006
【００７２】
それぞれ表３および表４に記載されたｒｈＥＧＦ及びＬＬ３７のｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出プロファイルは、両方の配合は、同様の放出プロフィールを示したことを示す。まず表面関連タンパク質もしくはペプチドの百分率に関係した初期放出（バーストリリース）、続く４時間乃至２４時間の高速放出フェーズ、及び最後に、ｒｈＥＧＦ及びＬＬ３７の合計量の放出で終わることが記載される、２４時間乃至７２時間の緩速フェーズ。
【００７３】
実施例３：  細胞増殖、細胞取り込みおよびナノ粒子の皮膚浸透
３．１．  ｒｈＥＧＦを装填したナノ粒子の細胞増殖に対する効果
増殖を研究するため、２４ウェルプレートを使用した。１ｍＬの完全培地（１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ）内に再懸濁した３５０００線維芽細胞Ｂａｌｂ／Ｃ  ３Ｔ３を、各ウェルで培養した。８時間のインキュベーション後、培地を、０．２％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を補充したＤＭＥＭ  １ｍＬで置換し、細胞を一晩インキュベートした。その後、培地を１ｍｌの
（ｉ）０．２％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ、
（ｉｉ）０．２％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中の１５ｎｇ／ｍＬ  遊離ｒｈＥＧＦ、
（ｉｉｉ）０．２％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中のブランクの(vacias)ＳＬＮ
（ｉｖ）０．２％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中の１５ｎｇ／ｍＬ  ｒｈＥＧを装填したＳＬＮ（ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ）
（ｖ）０．２％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中のブランクのＮＬＣ及び
（ｖｉ）０．２％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中の１５ｎｇ／ｍＬ  ｒｈＥＧを装填したＮＬＣ（ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣ）
で置き換えた。
【００７４】
細胞を２４時間、４８時間、７２時間、同一条件下で増殖させた。実験は、三重に実施した。異なるインキュベーション時間の後、１００μＬのＣＣＫ−８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｉｓｅ，ＵＳＡ）を各ウェルに加えた（Ｚｈｏｕ，  Ｙ．，  Ｑｉａｎ，  Ｍ．，  Ｌｉａｎｇ，  Ｙ．，  Ｌｉｕ，  Ｙ．，  Ｙａｎｇ，  Ｘ．，  Ｊｉａｎｇ，  Ｔ．，  Ｗａｎｇ，  Ｙ．，  ２０１１．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ  ｏｎ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｄｏｎｔｏｂｌａｓｔｉｃ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｎｔａｌ  Ｐｕｌｐ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｅｎｄｏｄ．  ３７，  ８１９−８２４）。４時間のインキュベーション後、吸光度を、基準波長として４５０ｎｍ及び６５０ｎｍにおいて測定した。吸光度は、培地中の生存細胞の数に直接比例した。
【００７５】
Ｂａｌｂ／Ｃ  ３Ｔ３細胞で行われた増殖研究では、ｒｈＥＧＦの分裂促進効果を示した。図１に示すように、４８時間および７２時間後に、対照群よりもｒｈＥＦＧ処理群（ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣ，ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ及び遊離ｒｈＥＧＦ）において、より大きい増殖を示した。驚くべきことに、脂質ナノ粒子内へカプセル化されたｒｈＥＧＦ（ＮＬＣ及びＳＬＮの両方とも）は、遊離ｒｈＥＧＦよりもＢａｌｂ／Ｃ  ３Ｔ３線維芽細胞の分裂促進効果において大きな増加を示した。
【００７６】
３．２．  ＬＬ３７を装填したナノ粒子の細胞増殖に対する効果
セクション３．１に記載のように実験を行ったが、但しＨＵＶＥＣ細胞（臍帯のヒト内皮細胞）で行った。試験グループは以下の通りであった。
（ｉ）０．２％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ、
（ｉｉ）０．２％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中の０．５及び０．１μｇ／ｍＬ  遊離ＬＬ３７、
（ｉｉｉ）０．２％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中のブランクのＳＬＮ、
（ｉｖ）０．２％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中の０．５及び０．１μｇ／ｍＬ  ＬＬ３７を装填したＳＬＮ（ＬＬ３７−ＳＬＮ）、
（ｖ）０．２％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中のブランクのＮＬＣ、
（ｖｉ）０．２％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中の０．５及び０．１μｇ／ｍＬ  ＬＬ３７を装填したＮＬＣ（ＬＬ３７−ＮＬＣ）、
（ｖｉｉ）  ネガティブコントロールとして１０％ＤＭＳＯ。
【００７７】
ＨＵＶＥＣ細胞において行われた増殖研究は、ＬＬ３７の分裂促進効果を実証した。図６は、４８時間後、両方の用量の場合、処置した対照群よりもＬＬ３７（ＬＬ３７−ＮＬＣ、ＬＬ３７−ＳＬＮ及び遊離ＬＬ３７）で処理した群でより大きい増殖を示すことを示した。
【００７８】
３．３．  ＮｉｌｅＲｅｄ−ＳＬＮ及びＮｉｌｅＲｅｄ−ＮＬＣ配合物の細胞取り込み
５００００のＢａｌｂ／Ｃ３Ｔ３線維芽細胞及び１０００００のＨａＣａＴケラチノサイト細胞を、別々に、完全培地中、カバースリップ上で２４時間培養した。次いで、培地を１ｍＬのアッセイ培地で置換した。アッセイ培地のグループは、以下の通りであった。
（ｉ）完全ＤＭＥＭ中の２５μｇ  ＮｉｌｅＲｅｄ−ＳＬＮ、及び
（ｉｉ）完全ＤＭＥＭ中の２５μｇ  ＮｉｌｅＲｅｄ−ＮＬＣ。
１時間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、固定した。その後、核をＤＡＰＩで染色した（５００ｎｇ／ｍＬ）し、蛍光顕微鏡での検査のため、カバースリップをスライド上にマウントした。
【００７９】
細胞取り込みの研究の結果が図２に示される。原因ＳＬＮとＮＬＣの内部化に起因して、細胞質が赤色に変わる（図２の白い矢印）。図２は、ＳＬＮ−ＮｉｌｅＲｅｄ及びＮＬＣ−ＮｉｌｅＲｅｄが細胞に侵入する能力を示している。ＳＬＮとＮＬＣとの間に、内部化能力の差異は観察されなかった。
【００８０】
３．４．  ＳＬＮ及びＮＬＣ配合物の真皮取り込み
Ｋｕｅｃｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｓｋｉｎ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  −  Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｏｒｅ−ｍｕｌｔｉｓｈｅｌｌ−ｎａｎｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ａｎｄ  ｓｏｌｉｄ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ．；  ７１：２４３−２５０）に記載されるように、実験を行った。処置群と対照群のために同じ動物の皮膚を使用した。処理群は、
試験したグループは、
（ｉ）ＳＬＮ−ＮｉｌｅＲｅｄ、
（ｉｉ）ＮＬＣ−ＮｉｌｅＲｅｄ、及び
（ｉｉｉ）基準として使用されるナイルレッドを装填したパラフィンクリーム
であった（ｎ＝３）。全ての調製物は、０．００４％の同一濃度でナイルレッドを有していた。皮膚を３２℃で２４時間維持した。その後、皮膚をＰＢＳで洗浄し、乾燥させ、凍結ミクロトーム２８００  Ｆｒｉｇｏｃｕｔ  Ｎ（Ｌｅｉｃａ，Ｂｅｎｓｈｅｉｍ，ドイツ）を使用して厚さ２０μｍの縦の切片に切断した（下から上へ）。切片を−２０℃で保存し、それから通常の蛍光の光に曝露して、２４時間後、分析した。
【００８１】
全ての実験について、染料取り込みから得られたピクセル輝度の補正された任意の値（ＡＢＵ）は、ナイルレッドを装填したパラフィンクリームに関していた。浸透増強効果（ＰＥＥ）と呼ばれる得られるパラメータを、皮膚のすべての層について計算した。パラフィンクリームの値は、定義により１であった（Ｌｏｍｂａｒｄｉ  Ｂｏｒｇｉａ，  Ｓ．，  Ｒｅｇｅｈｌｙ，  Ｍ．，  Ｓｉｖａｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，  Ｒ．，  Ｍｅｈｎｅｒｔ，  Ｗ．，  Ｋｏｒｔｉｎｇ，  Ｈ．Ｃ．，  Ｄａｎｋｅｒ，  Ｋ．，  Ｒｏｄｅｒ，  Ｂ．，  Ｋｒａｍｅｒ，  Ｋ．Ｄ．，  Ｓｃｈａｆｅｒ−Ｋｏｒｔｉｎｇ，  Ｍ．，  ２００５．  Ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｓｋｉｎ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ−ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｄｒｕｇ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｍａｔｒｉｘ  ａｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐａｒｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌeａｓｅ．  １  １０：  １５１−１６３）。
【００８２】
皮膚セクションの補正された任意のピクセルの輝度（ＡＢＵ）の値から推定される浸透増強効果（ＰＥＥ）値は、図５に示される。ＰＥＥ値は、ＳＬＮ−ＮｉｌｅＲｅｄ及びＮＬＣ−ＮｉｌｅＲｅｄの浸透マーカーは、全ての皮膚層でパラフィンクリームにより見つかるものよりも高いことを表した。ＳＬＮ−ＮｉｌｅＲｅｄ及びＮＬＣ−ＮｉｌｅＲｅｄのＰＥＥ値は、角質層で４倍に（それぞれ４．７４および４．６２）、真皮内で約２倍に（それぞれ２．０９および２．０３）増加した。小さいが、それでも大幅に増大した浸透性はまた、真皮（それぞれ１．２９および１．３２）で観察された。最終的には、ＡＢＵ及び１を超えるＰＥＥ値は、パラフィンクリームに比べＳＬＮとＮＬＣの浸透性の改善を実証する。さらに、結果は、これらのナノ粒子がナイルレッドを、従ってｒｈＥＧＦ及びＬＬ３７を、皮膚へ送達する能力を反映する。
【００８３】
実施例４：  ｒｈＥＧＦ／ＬＬ３７／ｒｈＥＧＦとＬＬ３７との組み合わせのin  vitro増殖
セクション３．１に記載のように実験を行った。ＬＬ３７とｒｈＥＧＦとの相乗効果をＢａｌｂ／ＣおよびＨａＣａＴケラチノサイト細胞で評価した。増殖の研究のために、２４ウェルプレートを使用した。各ウェルに、完全培地１ｍＬ（１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ）中に再懸濁した３５０００のＢａｌｂ／Ｃ  ３Ｔ３線維芽細胞を播種した。８時間のインキュベーション後、培地を、０．２％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ  １ｍＬで置換し、そして細胞を、一晩インキュベートした。その後、培地を、１ｍＬの：
（ｉ）０．２％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭで、
（ｉｉ）１５ｎｇ／ｍｌの遊離ｒｈＥＧＦで、
（ｉｉｉ）５、０．５及び０．２５μｇ／ｍＬのＬＬ３７で、
（ｉｖ）  １５ｎｇ／ｍＬのｒｈＥＧＦと５、０．５及び０．２５μｇ／ｍＬのＬＬ３７とで
で置換した。細胞を３７℃、及び５％ＣＯ２雰囲気中で、２４時間、４８時間、及び７２時間培養した。
【００８４】
増殖研究は、ＨａＣａＴ細胞（ヒトケラチノサイト）において行われ、Ｂａｌｂ／Ｃ線維芽細胞は、４０時間後、２０及び５０ｎｇ／ｍＬ  ＬＬ３７及び１５ｎｇ／ｍＬのｒｈＥＧＦは、遊離ｒｈＥＧＦ単独よりも、有糸分裂をさらに増加させたことを示した。
【００８５】
実施例５：  ｒｈＥＧＦを装填したＳＬＮ及びｒｈＥＧＦを装填したＮＬＣによるin  vivo創傷治癒
ｒｈＥＧＦを装填したＳＬＮ及びｒｈＥＧＦを装填したＮＬＣのin  vivo創傷治癒の有効性を、２つの異なるｒｈＥＧＦ配合物：
（ｉ）７５μｇの凍結乾燥ｒｈＥＧＦ  ７５ｍｇ（市販Ｈｅｂｅｒｐｒｏｔ（登録商標）に類似）、及び
（ｉｉ）欧州特許出願ＥＰ１２３８２４７６に記載されているように、二重エマルション法を使用して、アルギン酸とポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）との組み合わせにより、我々の研究室で調整された１％（ｗ／ｗ）装填されたポリマーマイクロスフェア内にカプセル化された７５μｇのｒｈＥＧＦ、
で評価した。簡潔には、５％（ｗ／ｖ）のＰＬＧＡ（Ｒｅｓｏｍｅｒ  ＲＧ５０３）を含有する２ｍＬのジクロロメタン：アセトン（３：１）（ｗ／ｖ）を、０．０５％（ｗ／ｖ）ｒｈＥＧＦ、２．５％  ｍｇ（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、０．２５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）、及び２．５％（ｗ／ｖ）アルギン酸ナトリウムＭＶＧ（Ｐｒｏｎｏｖａ  ＵＰ，ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ  ＦＭＣ  ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ，Ｓａｎｄｖｉｋａ，ノルウェー）を含有する０．２ｍＬの内部水性相（ｍｉｌｉＱ水中）と、５０Ｗにおいて１５秒間の超音波処理により乳化させた。得られるエマルション（ｗ１／ｏ）を、５％のポリビニルアルコール（ＰＶＡ）及び５％のＮａＣｌを含有する１５ｍＬ水溶液内に注ぎ、そしてダブルエマルション（ｗ１／ｏ／ｗ２）を得るため、パドル攪拌機を使用して、６０秒間乳化させた。最後に、５％ＮａＣｌ及び０．６  ｍＭ塩化カルシウムの水溶液４００ｍＬの水溶液を添加し、３０分間混合した。ミクロスフェアを濾過によって回収し、凍結乾燥した。
【００８６】
５．１．  動物
８週齢、雄ｄｂ／ｄｂマウス８０匹を使用した。遺伝的に糖尿病のｄｂ／ｄｂマウス（ＢＫＳ．Ｃｇ−ｍ  ＋／＋  Ｌｅｐｒｄｂ／Ｊ）を、Ｊａｖｉｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  （Ｓａｉｎｔ  Ｂｅｒｔｈｅｖｉｎ  Ｃｅｄｅｘ）から得た。全ての手順を行った。
【００８７】
５．２．  実験手順
実験は、Ｍｉｃｈａｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  （ｄｂ／ｄｂ  ｍｉｃｅ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｓｅｖｅｒｅ  ｗｏｕｎｄ−ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔｓ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｏｔｈｅｒ  ｍｕｒｉｎｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｉｎ  ａ  ｓｉｌｉｃｏｎｅ−ｓｐｌｉｎｔｅｄ  ｅｘｃｉｓｉｏｎａｌ  ｗｏｕｎｄ  ｍｏｄｅｌ．  Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  １５，  ６６５−６７０）によって使用される手順を適合させることにより行った。動物を、以下の１０グループに分けた（ｎ＝８）。
（ｉ）未処理の対照、
（ｉｉ）７５μｇの遊離ｒｈＥＧＦ、
（ｉｉｉ）ブランクの(vacias)ＭＳ、
（ｉｖ）ブランクのＳＬＮ、
（ｖ）ブランクのＮＬＣ、
（ｖｉ）ｒｈＥＧＦ−ＭＳ  ７５μｇ、
（ｖｉｉ）ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ  １０μｇ、
（ｖｉｉｉ）ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ  ２０μｇ、
（ｉｘ）ｒｈＥＧＦ−  ＮＬＣ  １０μｇ、及び
（ｘ）のｒｈＥＧＦ−  ＮＬＣ  ２０ｍｇ。
【００８８】
先に２０μＬビヒクル（０．９％生理食塩水及び０．５％カルボキシメチルセルロースの緩衝液）に再懸濁させたナノ粒子を、マイクロピペットで１週間に２回局所投与し、創傷床全体に広げさせた。０．５ｍＬビヒクルに再懸濁した遊離ｒｈＥＧＦは、創傷に針を挿入し、病変内投与によって週に二回投与した。また、０．５ｍＬビヒクルに再懸濁したｒｈＥＧＦ−ＭＳ７５  ＵＧもまた、病巣内投与によって誘導された傷に一度だけ投与した。
【００８９】
５．３．  創傷治癒(cicatrizacion)の評価
手術当日の及び創傷導入後４、８、１１、及び１５日の創傷面積（ｃｍ２）を測定することにより、創傷治癒を改善するための治療の有効性を評価した（図３Ｂ）。測定は、デジタルカメラ（Ｌｕｍｉｘ  ＦＳ１６，Ｐａｎａｓｏｎｉｃ（登録商標），スペイン）と、画像解析ソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ（登録商標）、Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ，マックマスター大学，カナダ）とを使用した。創傷閉鎖は、元の創傷面積の百分率として表される。
【００９０】
全ての実験群（ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ  ２０及び１０μｇ、ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣ  ２０及び１０μｇ及びｒｈＥＧＦ−ＭＳ  ７５μｇ）は、対照群と比較して４日目（図３Ａ）以来、創傷領域における優れた減少を示した（ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ群の場合、それらのコントロールは遊離ｒｈＥＧＦ、ブランクＳＬＮ及び未処理対照であり；
ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣ群の場合、それらのコントロールは、遊離ｒｈＥＧＦ、ブランクＮＬＣ及び未処理対照であり；
ｒｈＥＧＦ−ＭＳ  ７５μｇの場合、そのコントロールは、遊離ｒｈＥＧＦ、ブランクＭＳ及び未処理対照である）。脂質配合物（ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ及びｒｈＥＧＦ−ＮＬＣ）間において、統計学的に有意な差は認められなかった。その反対に、傷の収縮が、ｒｈＥＧＦ−ＭＳ  ７５μｇ及び遊離ｒｈＥＧＦの群よりも有意に高かった（ｐ＜０．００１）。対照群としては、７５μｇ  ｒｈＥＧＦ−ＭＳはまた、統計的に有意な創傷閉鎖を示した。８日目では、創傷収縮は、全ての実験群と対照群の中で最大の相違点に達した。同様に、ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ、ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣ、及びｒｈＥＧＦ−ＭＳ  ７５ｍｇ配合物間では、相違が見られなかった。興味深いことに、傷害の誘導後１日目に、２０μｇのｒｈＥＧＦ−ＳＬＮで処置した動物は、その他の実験群（ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ  １０μｇ、ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣ  ２０及び１０μｇの場合ｐ＜０．０５であり、ｒｈＥＧＦ−ＭＳ  ７５μｇの場合ｐ＜０．００１である）及びそれらの対照群と比較して、創傷における有意に大きな減少を示した。しかしながら、その他の実験群も、少なくではあるが、創傷収縮を示した。研究の終わりに、１５日には、全ての脂質ナノ粒子配合物を投与した群の創傷はほぼ閉鎖していた。驚くべきことに、７５μｇ  ｒｈＥＧＦ−ＭＳは、脂質ナノ粒子（〜９５％）に比べて、遅れた創傷収縮（７３．１６±３．２４パーセント）を示した。実験を通して、複数回の遊離ｒｈＥＧＦ投与は、ナノ配合ｒｈＥＧＦ群により示されたものよりも、全ての対照群の間でわずかな違いを示したことは注目に値する。
【００９１】
表５:  創傷治癒（ｃｉｃａｔｒｉｚａｃｉｏｎ）
【表５】
2016523884.tif 000007
【００９２】
５．４．  創傷治癒の組織学的推定
８日目と１５日目に、ＣＯ２の吸入により動物たちを安楽死させた。創傷および周囲の組織（〜１ｃｍ）を切除し、２４時間３．７％パラホルムアルデヒド中で固定した。その後、固定組織を二等分し、パラフィンに包埋し、厚さ５μｍシートに切断した。形態観察のために、サンプルをヘマトキシリン−エオシン染色で処理した。
【００９３】
炎症からの回復消炎(resolucion)（図４Ａ）及び創傷成熟に関しては、２０００年にＣｏｔｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｏｔｒａｎ，  Ｒ．，  Ｋｕｍａｒ，  Ｖ．，  Ｃｏｌｌｉｎｓ，  Ｔ．，  ２０００．組織修復：細胞の再生および線維症。構造的および機能的病理学：  ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｉｎｔｅｒａｍｅｒｉｃａｎａ，２０００，ｐｐ９５−１２０）によって記載されたスケールを使用した。各創傷のためのスコアは、スコア０乃至４で半定量的に割り当てられた。
０：炎症応答なし、
１：急性炎症（フィブリン塊形成及び化膿性膜、多核白血球や好中球の遊走）、
２：びまん急性炎症の優勢（肉芽組織および化膿性膜の優位性、血管新生）、
３：慢性炎症の優勢（線維芽細胞増殖）、
４：消炎(resolucion)及び治癒（急性炎症の軽減もしくは消失、ただしこれｒは時折丸みを帯びた細胞を保持するかもしれない）。
【００９４】
再上皮化のプロセス（図４Ｂ、４Ｄ）を、Ｓｉｎｈａ  ｅｔ  ａｌ．  により確立された基準に従って測定した（Ｓｉｎｈａ，  Ｕ．Ｋ．，  Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，  Ｌ．Ａ．，  ２００３．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｔｅｅｌ  ｓｃａｌｐｅｌ，  ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｓｃａｌｐｅｌ，  ＣＯ２  ｌaｓｅｒ，  ａｎｄ  ｍｏｎｏｐｏｌａｒ  ａｎｄ  ｂｉｐｏｌａｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ｏｎ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｏｒａｌ  ｍｕｃｏｓａ．  Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ  ２００３；  １１３（２）：２２８−２３６）。
０：創傷の端で再上皮化、
１：創傷の半分未満をカバーする再上皮化、
２：創傷の半分以上をカバーする再上皮化、
３：不均一な厚さで創傷全体をカバーする再上皮化、
４：通常の厚さで創傷全体をカバーする再上皮化。
【００９５】
５．５．  統計解析
すべてのデータは平均±標準偏差として表される。ルビーン（Ｌｅｖｅｎｅ）検定に基づき、分散平均均一性の結果は、スチューデントｔ検定又は多重比較のための一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を用いて比較した。続いて、ＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉもしくはＴａｍａｈａｎｅのポストホックテストを適用した。差異は、ｐ＜０．０５で有意とみなした。計算は、ＳＰＳＳ  ２０．０（ＳＰＳＳ（登録商標），Ｉｎｃ．，シカゴ、イリノイ州）ソフトウェアを使用して行った。
【００９６】
８日目に、ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ  ２０μｇだけが、線維芽細胞の増殖が優勢である完全な消炎に近い慢性炎症の状態を有する（スコア３．６７±１．１５）（表６）。慢性重症の炎症状態優勢にほぼ近い２０μｇのｒｈＥＧＦ−ＮＬＣで処置した動物は、より少ない炎症スコアを示した（２．７５±０．４６）。これらの違いは、まだ統計的に有意ではなかった。また、両配合物は、それらのコントロールよりも良好な消炎を示した。また、ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ  １０μｇ及びｒｈＥＧＦ−ＮＬＣ  １０μｇは、急性炎症状態のままにしなかった（＜２．００）。しかしながら、これらの群と未処理対照群との差異が見られ（ｐ＜０．００１）、これは、炎症反応の不在を示した。ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣ  １０μｇは、制御（ＮＬＣブランク(blancas)）と差異（ｐ＜０．０５）を示した。
【００９７】
脂質ナノ粒子間の用量（２０又は１０μｇ）の応答関数の評価については、ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ  ２０μｇだけが、良好な消炎を提供した（ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ  １０μｇよりも高い）。
【００９８】
病理組織学的分析はまた、炎症状態で処置した創傷において、急性の炎症状態は２．１３±０．６４のスコアでびまん性炎症より優勢である（それらの対照群よりも有意に高い）。これらの差異は、脂質ナノスフェアのいずれとも（ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ又はｒｈＥＧＦ−ＮＬＣとのいずれとも）、統計的有意性に達しなかった。
【００９９】
上記のように、創傷の導入後１５日目には、差異は、低くなる傾向があり、いずれのグループ及び対照との統計的有意性に達しなかった。
【０１００】
再上皮化の程度については、８日目に得られたデータは、高用量（２０μｇ）を有する脂質ナノ粒子で処理されたグループ及び７５μｇ  ｒｈＥＧＦ−ＭＳで処理された動物のみが、傷の半分以上をカバーする新しい上皮を提示することを示した（＞２．００、Ｓｉｎｈａ  Ｕ．Ｋ．（２００３）基準による）。また、これらのグループとその対照（遊離ｒｈＥＧＦ、ブランクＳＬＮ、及びｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ  ２０μｇと遊離ｒｈＥＧＦとの未処理対照、ブランクＮＬＣ、及びｒｈＥＧＦ−ＮＬＣ  ２０μｇの未処理対照）との間の統計的に有意な差が発見された（図５）。これとは対照的に、脂質ナノ粒子とｒｈＥＧＦの最低用量（ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ  １０μｇ及びｒｈＥＧＦ−ＮＬＣ  １０μｇ）とで処理した群では、新しい上皮は、傷の半分以上をカバーした。また、有意差は、未治療群で見られたが（ｐ＜０．０１）、再上皮化のスコアはｒｈＥＧＦ  １０μｇを装填した脂質ナノ粒子では高かったものの、統計的有意性は、ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮ  １０μｇの場合のブランクＳＬＮ、ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣ  １０μｇの場合のブランクＮＬＣで、失われる傾向にあった（図４Ｂ）。ｒｈＥＧＦ−ＭＳ  ７５μｇについて、８日目より傷の半分以上をカバーする再上皮化面積、及びｒｈＥＧＦ−ＭＳ  ７５μｇとその対照群（未処理対照及びブランクＭＳ）との間に有意差が発見された。
【０１０１】
従って、再上皮のプロセスの研究は（表７）、７５μｇの遊離ｒｈＥＧＦの４用量で処置した動物は、それぞれ未処理群よりも高い再上皮化スコアを示したこと（それぞれ１．２５±０．８９及び０．００±０．００）を明らかにした。驚くべきことに、遊離のｒｈＥＧＦの病巣内の複数回投与の効果は、ｒｈＥＧＦ−ＳＬＮとｒｈＥＧＦ−ＮＬＣとの４回の局所投与、及びｒｈＥＧＦ−ＭＳ  ７５μｇの１回の病巣内用量で得られたものより、再上皮化において少ない改善を示した。
【０１０２】
傷害の誘導後１５日目、再上皮の研究では、群間に差がないことを明らかにした。
【０１０３】
表６：  炎症スコア
【表６】
2016523884.tif 000008
【０１０４】
表７：  再上皮化スコア
【表７】
2016523884.tif 000009
【０１０５】
実施例６：  ｒｈＥＧＦを装填したＮＬＣによるブタのin  vivo創傷治癒
６．１．  動物
使用する全てのプロトコル及び手順は、ＪＥＳＵＳ  ＵＳＯＮ低侵襲手術センター（ＣＣＭＩＪＵ）の動物福祉倫理委員会によって承認された。研究の開始においてベースラインで平均重量２６．８２±２．９０ｋｇで、２．９０×１．３５ｍの個々の囲いに分けられた、大きな白い雌のブタ６匹を使用した。研究における全ての動物は、以下の住宅条件が確立された順化部屋に無作為に分けられた。１２時間の明／暗サイクル、２０乃至２５℃の温度、ＨＥＰＡろ過による１時間当たり８回の空気変化、及び５０〜７０％の相対湿度。囲い環境の充実のため、ペンダントチェーンとゴムのチュアブルアイテムがインストールされていた。動物は、研究に含めるために耳のタグで識別された後に順応期間を果たした。
【０１０６】
６．２.  創傷モデル及び外科的手技
１２時間の固体絶食と６時間の液体絶食後、動物は、１５ｍｇ／ｋｇのケタミンと０．２ｍｇ／ｋｇのジアゼパムの筋肉内投与により鎮静させた。その後、挿管を可能にするため、プロポフォール（３ｍｇ／ｋｇ）の投与により、麻酔を誘発させた。直後に、1Ｌ/分の酸素流量で２．７％の濃度でセボフルラン麻酔薬として供給ファンに取り付けられた半円形のループ介して、動物は麻酔器に接続された。レミフェンタニルの鎮痛は、手術中に０．１μｇ／ｋｇ／分の速度で連続的な静脈内注入によって提供された。
【０１０７】
各動物は６個の潰瘍（６ｃｍ×５ｃｍ）を受けた。最初の創傷領域の恒久的な基準のための金型を使用して、潰瘍の縁を入れ墨した後、潰瘍間に最小１．５乃至２．０ｃｍを残した。潰瘍は、脂肪層を残して、２ｍｍ深さの虚血性エッジを得るため、凝固用モードでモノポーラジアテルミーを使用して作成された。術後鎮痛は、経皮フェンタニルパッチ及び１週間のアモキシシリン／クラブラン酸（２０ｍｇ／ｋｇ）で全身抗生物質療法によって投与された。
【０１０８】
６．３．  実験群
創傷誘導後２４時間の時点で（研究の第１日）、一次止血、血小板接着および凝集及び凝固カスケードの活性化を可能にするための治療投与が開始した。動物は無作為に３群に分けた（ｎ＝２）。
（ｉ）ブランクＮＬＣ、
（ｉｉ）２０μｇ  ｒｈＥＧＦ−ＮＣＬ、及び
（ｉｉｉ）７５μｇ  遊離ｒｈＥＧＦ。
先に１５０μＬのビヒクル（０．９％塩化ナトリウム及び０．５％カルボキシメチルセルロース）に再懸濁したナノ粒子は、週２回局所投与し、分散創傷床全体にそれらを分配した。
【０１０９】
研究の間、創傷を脱水し、細菌汚染を防ぐために覆った。包帯はまた、かさぶたの形成を防止し、治癒した創傷の面積を測定するために上皮エッジ観測を推進する。これを行うために、包帯付着を防止するため、各創傷はパラフィンガーゼで覆った。３つの滅菌コットンガーゼの上に、絆創膏で固定し、配置されたテープで固定した。包袋の交換は、これにより無菌状態の高いレベルを維持し、継続的に傷やその進化の状態を評価するために週２回実施した。新たに形成された肉芽組織の完全性を尊重しながら、洗浄プロセスが、滲出液や汚れを除去するために滅菌ガーゼや生理食塩水を使用して、細心の注意を払って行われる。
【０１１０】
６．４．  血液サンプル
動物の一般的な状態を監視するため、創傷誘導の非、１５日目、及び試験終了時（４３日目）に血液学的及び生化学的レベルを評価するため、血液サンプルを収集した。研究パラメーターは、ヘマトクリット、ヘモグロビン、赤血球容積（ＭＣＶ），平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）、白血球、総タンパク質及び血小板であった。
【０１１１】
また、ｒｈＥＧＦの全身吸収を評価するため、ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣ及び遊離ｒｈＥＧＦでした動物から血漿サンプル収集した。ＲｈＥＧＦ検出は、ＥＬＩＳＡ（ヒトＥＧＦ  ＥＬＩＳＡ開発キット、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）により行った。血漿中のｒｈＥＧＦレベルが高いと予想されたときに、サンプルを採取した。そのため、ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣで処理された動物から、サンプルを、実験の１日目（治療投与前）、投与後４時間目及び２４時間目に回収された。遊離ｒｈＥＧＦで処置した動物の血漿サンプルは、投与直後及び最初の投与後３０分に得られた。
【０１１２】
６．５．  治癒した傷の連続分析
１、１５、２５、３６及び４３日目に創傷閉鎖を測定することにより、治癒の動態を決定した（閉鎖創傷の初期百分率）。創傷領域は、標準化された方法で決定された。同一の照明を使用して、それらのその後の処理を可能にする測定基準の参照画像を導入するために創傷すぐそばに滅菌プラスチック定規を配置して、創傷表面に垂直に写真を撮影した。創傷領域は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（セクション5.3参照）を使用して計算した。彼らは95％以上の閉鎖を発表したときに創傷を治癒と考えられました。９５％以上の併催を示したとき、創傷は治癒したと見なされる。
【０１１３】
６．６．  創傷治癒の組織学的評価
滅菌メスを用いて、完全な皮膚生検を、瘢痕マージン潰瘍領域中央部から採取した（２ｍｍ）。収集したサンプルは、直ちに、４％ホルムアルデヒド中で固定し、パラフィンに包埋し(parafinadas)、厚さ５μｍの層に切断した。サンプルは、形態学的観察のためにヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）で染色した。創傷１、２及び３の場合１５日目に、及び全創傷の場合２５及び４３日目に、生検を採取した。３６日目に傷の写真を撮影したが、遅延治癒がなかったので、生検を集めなかった。
【０１１４】
治癒は、新たに形成された上皮を測定し、再上皮化の程度、及びＣｏｔｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）の基準による傷の成熟度と治癒の質とを考慮して決定した。
【０１１５】
６．７．  血液学的分析
血液学的分析は、研究を通じて研究のパラメータのいずれにも変化がないことを明らかにした。また、得られた全ての値は、健康な豚の正常範囲内であった（データは示さず）。
【０１１６】
ｒｈＥＧＦの全身使用は、異常な上皮成長に起因して制限されているので、血漿中ｒｈＥＧＦ濃度が高いことが予想された場合、全身循環へのｒｈＥＧＦ吸収を評価するために、ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣ及び遊離ｒｈＥＧＦで処置した動物から血漿サンプルを回収した。血漿採取の日は、ＥＧＦの平均寿命(半減期,vida  media)、投与経路及びｒｈＥＧＦ−ＮＬＣにカプセル化された成長因子の遅延放出に基づいて選択した。この点で、カプセル化に起因して、ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣに含まれるｒｈＥＧＦが、遊離ｒｈＥＧＦよりも遅く吸収されると予想されたので、実験１日目、ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣ投与後４時間目及び２４時間目に、血漿採取が行われた。遊離ｒｈＥＧＦで処置された動物に行われるような、投与後３０分にではない。そのため、ヒトと豚との大の著しい類似性のため、同様の血漿中ｒｈＥＧＦ濃度ｒｈＥＧＦが予想される。表８に示すように、ｒｈＥＧＦの血漿中濃度は、約０の値を示した。明らかにヒト基底部（basal）ｒｈＥＧＦ濃度（０．４ｎｇ／ｍＬ）以下である。これは非常に驚くべきことである。なぜならば、遊離ｒｈＥＧＦを創傷に直接注入しても、漸進的吸収の仮想不在は、副作用を最小化し、従って治療の安全性を改善し、損傷におけるｒｈＥＧＦのローカルな効果を確保することができるからである。
【０１１７】
表８：  ｒｈＥＧＦ血漿中濃度。結果は、平均±標準偏差として表される。
【表８】
2016523884.tif 000010
【０１１８】
６．８．  治癒した創傷の連続分析
改善された治癒は、１５、２５、３６及び４３日目の各実験グループにおける治癒した創傷の数を計算することにより評価された。グループ間の最大の相違は、実験の２５日目に見出された。図８に見られるように、１５日後には創傷が閉じていませんでした。２５日目に、ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣ処理群の場合の閉じた創傷の百分率は、ブランクＮＬＣ処理群よりも有意に高かった。また、ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣでの処理は、遊離ｒｈＥＧＦと比較してわずかに高い有効性を示した（それぞれ５０％及び４０％）ことは重要である。閉じられた創傷の百分率は、両群で同様であったが、ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣで処置した創傷は、ｒｈＥＧＦ  ２０μｇを週２回の局所投与を受けているのに対し、遊離ｒｈＥＧＦで処置されたこれらの創傷は、高用量（７５μｇを週２回）病巣内投与を受けているため、これらの結果は特に重要である。３６日目には、ほぼすべてのグループが完全に傷を閉鎖していた。ｒｈＥＧＦで処置した創傷（ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣ及び遊離ｒｈＥＧＦの両方）は、完全に閉鎖しており、ブランクＮＬＣで処置した創傷は、９０％の治癒を達成した。研究の終了時（４３日目）、全ての創傷は完全に閉鎖されました。
【０１１９】
６．９．  創傷治癒の組織学的研究
６．９．１．  再上皮化の程度：
図９Ａに見られるように、１５日目に新上皮の長さが、２０μｇ  ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣ局所投与で処置した動物において、ブランクＮＬＣで処置した創傷及び７５μｇ遊離ｒｈＥＧＦ病巣内投与を受けた創傷よりも有意に大きかった（ｐ＜０．００１）。遊離ｒｈＥＧＦと比べた、ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣの再上皮化の改善された効率は、ナノカプセル化は、増殖因子を創傷の微小環境から保護し、創傷領域におけるプロテアーゼおよび酸化ストレスによって及ぼされる不活性化を減少させることを示唆している。この保護は、in  vivo研究において観察されたｒｈＥＧＦ−ＮＬＣの改善された効果の原因であり得る。しかしながら、（遊離又はカプセル化された）ｒｈＥＧＦで処置した動物において２５日目に得られた平均値は、ブランクＮＬＣの場合のそれよりも高かったにも関わらず、２５及び４３日目では群間の差異は、統計的に有意ではなかった（図９Ａ）。
【０１２０】
６．９．２．  創傷の成熟度及び創傷治癒の品質：
作成した病変の寸法に起因して、同一組織サンプルにおいて、Ｃｏｔｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００の基準によると、治癒の異なる程度を観察することができる。図１０Ａに見られるように、１５日目に、ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣで処置した動物は、ブランクＮＬＣ及び遊離ｒｈＥＧＦを受けていたそれらの傷と比較して、統計学的に有意に低い程度の炎症組織（グレード２）を示しただけでなく、ほぼ完全に治癒した表皮の有意に高い程度を示した（グレード４）（ｐ＜０．００１）。これとは対照的に、ブランクＮＬＣ、遊離のｒｈＥＧＦで処置した創傷は、主にいくつかの多形核好中球、肉芽組織形成及び血管新生を伴う急性炎症の拡散存在を示した（グレード２）。
【０１２１】
２５日目に、全研究グループで継続した治癒プロセスに起因して、グレード２の拡張が、１５日目に観察されるものよりも有意に低く、且つグレード３及びグレード４の拡張は有意に高かった（ｐ＜０．００１）。また、２５日目に、グループ間に上皮再形成の程度の違いが見つからなかったものの、病変の成熟度及び治癒品質に違いが存在することは注目に値する図９Ａ及び図１０Ｂ）。ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣで処置した動物は、ブランクのＮＬＣ及び遊離ｒｈＥＧＦを受けたこれらのグループよりも、完全な治癒に最も近い治癒の程度を示した。ブランクのＮＬＣ及び遊離ｒｈＥＧＦを受けたこれらのグループは、まだ慢性炎症及び新しい血管が豊富な肉芽腫組織及び線維芽細胞増殖を示した。
【０１２２】
また、図９Ｂ及び図１０Ｃに示すように、４３日目に、全ての実験群の全ての創傷は、いくつかの慢性炎症（グレード３及び４）を示した。しかし、ｒｈＥＧＦ−ＮＬＣ処理された病変は、治癒グレード及び創傷成熟度において有意な改善を示した（ｐ＜０．００１）。
【図１】
2016523884.tif 000011
【図２】
2016523884.tif 000012
【図３Ａ】
2016523884.tif 000013
【図３Ｂ】
2016523884.tif 000014
【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
2016523884.tif 000016
【図４Ｂ】
2016523884.tif 000017
【図４Ｃ】
2016523884.tif 000018
【図４Ｄ】
2016523884.tif 000019
【図５Ａ】
2016523884.tif 000020
【図５Ｂ】
2016523884.tif 000021
【図６】
2016523884.tif 000022
【図７Ａ】
2016523884.tif 000023
【図７Ｂ】
2016523884.tif 000024
【図８】
2016523884.tif 000025
【図９】
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【図１０】
2016523884.tif 000027
【配列表】
2016523884000001.app
【国際調査報告】
2016523884.tif 000028
2016523884.tif 000029
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2016523884.tif 000035
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