(57)【要約】  本開示は、一般にＭ−ＣＳＦに特異的に結合する抗体または抗体断片に関する。特に、Ｍ−ＣＳＦに結合し、かつ１０ｐＭ以下のＩＣ５０でＭ−ＣＳＦ受容体に対するＭ−ＣＳＦの結合を阻害する抗体および抗体断片を開示する。また、本発明は、本発明の抗体またはそれらの断片を発現する能力のある核酸、ベクターおよび宿主細胞、抗体またはそれらの断片を含んでなる医薬組成物および特定の疾患の治療を目的とした前記抗体またはそれらの断片ならびに組成物の使用に関する。【選択図】図１
2016516092.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍ−ＣＳＦに特異的に結合する単離抗体または抗体断片において、前記単離抗体または抗体断片が、１２．５ｐＭの最終濃度でＭ−ＣＳＦを含んでなる受容体結合阻害アッセイにおいて、Ｍ−ＣＳＦ受容体に対するＭ−ＣＳＦ結合を１０ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害できることを特徴とする単離抗体または抗体断片。
【請求項２】
請求項１に記載の単離抗体または抗体断片において、前記単離抗体または抗体断片が、
（ａ）配列番号８のＨＣＤＲ１領域、配列番号９のＨＣＤＲ２領域、配列番号１０のＨＣＤＲ３領域、配列番号１１のＬＣＤＲ１領域、配列番号１２のＬＣＤＲ２領域、および配列番号１３のＬＣＤＲ３領域、
（ｂ）配列番号１８のＨＣＤＲ１領域、配列番号１９のＨＣＤＲ２領域、配列番号２０のＨＣＤＲ３領域、配列番号２１のＬＣＤＲ１領域、配列番号２２のＬＣＤＲ２領域、および配列番号２３のＬＣＤＲ３領域、
（ｃ）配列番号２８のＨＣＤＲ１領域、配列番号２９のＨＣＤＲ２領域、配列番号３０のＨＣＤＲ３領域、配列番号３１のＬＣＤＲ１領域、配列番号３２のＬＣＤＲ２領域、および配列番号３３のＬＣＤＲ３領域、
（ｄ）配列番号３８のＨＣＤＲ１領域、配列番号３９のＨＣＤＲ２領域、配列番号４０のＨＣＤＲ３領域、配列番号４１のＬＣＤＲ１領域、配列番号４２のＬＣＤＲ２領域、および配列番号４３のＬＣＤＲ３領域、
（ｅ）配列番号４８のＨＣＤＲ１領域、配列番号４９のＨＣＤＲ２領域、配列番号５０のＨＣＤＲ３領域、配列番号５１のＬＣＤＲ１領域、配列番号５２のＬＣＤＲ２領域、および配列番号５３のＬＣＤＲ３領域、
（ｆ）配列番号５８のＨＣＤＲ１領域、配列番号５９のＨＣＤＲ２領域、配列番号６０のＨＣＤＲ３領域、配列番号６１のＬＣＤＲ１領域、配列番号６２のＬＣＤＲ２領域、および配列番号６３のＬＣＤＲ３領域、
（ｇ）配列番号８８のＨＣＤＲ１領域、配列番号８９のＨＣＤＲ２領域、配列番号９０のＨＣＤＲ３領域、配列番号９１のＬＣＤＲ１領域、配列番号９２のＬＣＤＲ２領域、および配列番号９３のＬＣＤＲ３領域、
（ｈ）配列番号９８のＨＣＤＲ１領域、配列番号９９のＨＣＤＲ２領域、配列番号１００のＨＣＤＲ３領域、配列番号１０１のＬＣＤＲ１領域、配列番号１０２のＬＣＤＲ２領域、および配列番号１０３のＬＣＤＲ３領域、または
（ｉ）配列番号１０８のＨＣＤＲ１領域、配列番号１０９のＨＣＤＲ２領域、配列番号１１０のＨＣＤＲ３領域、配列番号１１１のＬＣＤＲ１領域、配列番号１１２のＬＣＤＲ２領域、および配列番号１１３のＬＣＤＲ３領域、
を含んでなることを特徴とする単離抗体または抗体断片。
【請求項３】
請求項１または２に記載の単離抗体または抗体断片において、前記単離抗体または抗体断片が、
（ａ）配列番号１４の可変重鎖領域および配列番号１５の可変軽鎖領域、
（ｂ）配列番号２４の可変重鎖領域および配列番号２５の可変軽鎖領域、
（ｃ）配列番号３４の可変重鎖領域および配列番号３５の可変軽鎖領域、
（ｄ）配列番号４４の可変重鎖領域および配列番号４５の可変軽鎖領域、
（ｅ）配列番号５４の可変重鎖領域および配列番号５５の可変軽鎖領域、
（ｆ）配列番号６４の可変重鎖領域および配列番号６５の可変軽鎖領域、
（ｇ）配列番号９４の可変重鎖領域および配列番号９５の可変軽鎖領域、
（ｈ）配列番号１０４の可変重鎖領域および配列番号１０５の可変軽鎖領域、または
（ｉ）配列番号１１４の可変重鎖領域および配列番号１１５の可変軽鎖領域、
を含んでなることを特徴とする単離抗体または抗体断片。
【請求項４】
Ｍ−ＣＳＦに対する結合に関して請求項２または３に記載の抗体または抗体断片と競合することを特徴とする単離抗体または抗体断片。
【請求項５】
請求項２または３に記載の抗体または抗体断片と同一のエピトープに結合することを特徴とする単離抗体または抗体断片。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離抗体において、前記抗体が、野生型ＩｇＧ１サブタイプと比較して減少したエフェクター機能を有するＩｇＧ１サブタイプであることを特徴とする単離抗体。
【請求項７】
請求項６に記載の単離抗体において、前記抗体の２６５位（ＥＵ（欧州連合）インデックスによる番号付け）におけるアスパラギン酸残基がアラニン残基と置換されていることを特徴とする単離抗体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離抗体または抗体断片において、前記抗体または抗体断片が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であることを特徴とする単離抗体または抗体断片。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片において、前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であることを特徴とする抗体または抗体断片。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片において、前記抗体が、カニクイザルＭ−ＣＳＦ、マウスＭ−ＣＳＦ、および／またはラットＭ−ＣＳＦに対し交差反応性であることを特徴とする抗体または抗体断片。
【請求項１１】
薬剤における使用を目的とすることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離抗体または抗体断片。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離抗体または抗体断片、および薬学的に許容できる担体を含んでなることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片をコード化することを特徴とする核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸を含むこと、または請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体のいずれかをコード化することを特徴とするベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクター、請求項１３に記載の核酸または請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片をコード化する核酸を含んでなることを特徴とする単離宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般にＭ−ＣＳＦに特異的に結合する抗体または抗体断片に関する。特に、Ｍ−ＣＳＦに結合し、かつ１０ｐＭ以下のＩＣ５０でＭ−ＣＳＦ受容体に対するＭ−ＣＳＦの結合を阻害する抗体および抗体断片を開示する。また、本発明は、本発明の抗体またはそれらの断片を発現する能力のある核酸、ベクターおよび宿主細胞、抗体またはそれらの断片を含んでなる医薬組成物および特定の疾患の治療を目的とした前記抗体またはそれらの断片ならびに組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｍ−ＣＳＦは、マクロファージまたは他の関連細胞型に分化する造血幹細胞に影響を及ぼす分泌サイトカインである。Ｍ−ＣＳＦの活性形態は、ジスルフィド結合したホモダイマーとして細胞外に見られる。Ｍ−ＣＳＦの３つの異なるイソ型：分泌グリコシル化Ｍ−ＣＳＦ、分泌プロテオグリカンＭ−ＣＳＦ、および細胞表面Ｍ−ＣＳＦが細胞外に見られる。
【０００３】
Ｍ−ＣＳＦは、治療上の発明、特に例えば、関節リウマチなどの炎症性障害の治療に関する標的であることが確証されている。例えば、参照として援用されている米国特許出願第８，１４２，７７７号明細書を参照されたい。抗体アプローチなど、Ｍ−ＣＳＦを標的とする幾つかの分子が開発中である。例えば、国際公開第２００５／０３０１２４号パンフレット（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ／Ｐｆｉｚｅｒ）および国際公開第２００５／０３０１２４号パンフレット（Ｃｈｉｒｏｎ／Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を参照されたい。
【０００４】
本開示は、先行技術から知られていた抗Ｍ−ＣＳＦ抗体よりも優れた新規の抗体および抗体断片を提供する。特に、本開示の抗体および抗体断片は、Ｍ−ＣＳＦに特異的に結合し、かつ１２．５ｐＭの最終濃度でＭ−ＣＳＦを含んでなる受容体結合阻害アッセイにおいて、１０ｐＭ以下のＩＣ５０でＭ−ＣＳＦ受容体に対するＭ−ＣＳＦ結合を阻害する。さらに、これらの抗体は、臨床展開上きわめて望ましく、以前に見られなかった機能特性を示す。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、ヒトＭ−ＣＳＦに特異的に結合する抗体または抗体断片を提供する。また、本開示は、特定の親和性、例えば３０ｐＭ以下の親和性で、ヒトＭ−ＣＳＦに特異的に結合する抗体または抗体断片を提供する。また、本開示は、Ｍ−ＣＳＦに特異的に結合し、かつ１０ｐＭ以下のＩＣ５０でＭ−ＣＳＦ受容体に対するＭ−ＣＳＦの結合を阻害する抗体または抗体断片を提供する。また、本開示は、Ｍ−ＣＳＦに特異的に結合する抗体または抗体断片において、前記の単離抗体または抗体断片が、１２．５ｐＭの最終濃度でＭ−ＣＳＦを含んでなる受容体結合阻害アッセイにおいて、１０ｐＭ以下のＩＣ５０でＭ−ＣＳＦ受容体に対するＭ−ＣＳＦの結合を阻害できる抗体または抗体断片を提供する。
【０００６】
また、本開示は、６つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列によって規定された特定の抗体または抗体断片を提供する。また、本開示は、可変重鎖および可変軽鎖のアミノ酸配列によって規定された特定の抗体または抗体断片を提供する。
【０００７】
また、本開示は、本明細書に開示された特異的な抗体または抗体断片と競合する特異的な抗体または抗体断片を提供する。また、本開示は、本明細書に開示された特異的な抗体または抗体断片と同一のエピトープに結合する特異的な抗体または抗体断片を提供する。
【０００８】
また、本開示は、薬剤に使用される本開示の単離抗体または抗体断片を提供する。
【０００９】
また、本開示は、本開示の抗体または抗体断片の有効量を、炎症性障害などの障害に罹っている患者に投与することによって、患者を治療する方法を提供する。
【００１０】
また、本開示は、本開示の単離抗体または抗体断片を含んでなる医薬組成物、および薬学的に許容できる担体を提供する。
【００１１】
また、本開示は、本開示の抗体または抗体断片抗体をコード化する核酸を提供する。
【００１２】
また、本開示は、本開示の抗体または抗体断片抗体をコード化する核酸を含んでなるベクターを提供する。
【００１３】
また、本開示は、本開示の抗体または抗体断片をコード化するベクターまたは核酸を含んでなる宿主細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ヒトの膜結合Ｍ−ＣＳＦを安定して発現するＣＨＯ細胞によってＭ−ＮＦＳ−６０細胞の増殖が誘導されたアッセイにおいて、膜結合Ｍ−ＣＳＦイソ型の生物活性を阻害する本開示のＭ−ＣＳＦ特異的抗体の能力図を示す。抗体棒度を増加せせるにつれて、全てのＭ−ＣＳＦ特異的免疫グロブリンは、効果的に増殖を阻害する。これとは対照的に、リゾチウムに特異的なＭＯＲ０３２０７は増殖を阻害することができなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
用語の「単離（された）」とは、他の細胞物質および／または化学物質が実質的に存在しない化合物のことである。このような化合物が抗体または抗体断片である場合は、用語の「単離（された）」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体または抗原結合部分もまた存在しない抗体または抗体断片のことである。
【００１６】
本明細書で用いられる用語の「抗体」には、全ての抗体が含まれる。天然の「抗体」は、ジスルフィド結合で相互接続された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含んでなるタンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記）および重鎖不変領域からなる。重鎖不変領域は、特異的なＣＨドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記）および軽鎖不変領域からなる。軽鎖不変領域は、１つのドメイン、ＣＬからなる。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性領域とそれを散在させるより保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と称される領域にさらに分けることができる。各々のＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシル末端まで以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配列された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。抗体の不変領域は、宿主組織または免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）や古典的な相補系の第一成分（Ｃ１ｑ）などの因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介できる。抗体は、いずれのイソ型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、それらのサブクラスまたは修飾型（例えば、ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ）でもよい。抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体のいずれの種の抗体でもよい。
【００１７】
用語の「重鎖可変領域ＣＤＲ１」と「Ｈ−ＣＤＲ１」は交換可能に用いられ、用語の「重鎖可変領域ＣＤＲ２」と「Ｈ−ＣＤＲ２」、用語の「重鎖可変領域ＣＤＲ３」と「Ｈ−ＣＤＲ３」、用語の「軽鎖可変領域ＣＤＲ１」と「Ｌ−ＣＤＲ１」、用語の「軽鎖可変領域ＣＤＲ２」と「Ｌ−ＣＤＲ２」、および用語の「軽鎖可変領域ＣＤＲ３」と「Ｌ−ＣＤＲ３」抗体断片も同様である。
【００１８】
抗原結合は、無処置抗体の「断片」「抗体断片」「抗原結合断片」によって実施できる。本明細書において、双方の用語が交換可能に用いられる。抗体の用語「抗体断片」に包含される結合断片の例としては、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含んでなる二価断片であるＦ（ａｂ）２断片；ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；１つのＶＨドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄら著、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ、第３４１巻：ｐ．５４４〜５４６）；および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。
【００１９】
「一本鎖断片（ｓｃＦｖ）」は、ＶＬ領域とＶＨ領域の対が一価分子を形成するタンパク質一本鎖である（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄら著、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４２巻：ｐ．４２３〜４２６、およびＨｕｓｔｏｎら著、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第８５巻：ｐ．５８７９〜５８８３を参照されたい）。２つのドメインＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされているが、それらをタンパク質一本鎖として作製することを可能にする人工ペプチドリンカーにより、遺伝子組換え法を用いて結合させることができる。このような一本鎖抗体は、１つ以上の抗原結合部分を含む。これらの抗体断片は、当業者に知られた従来の技法を用いて得られ、断片は、完全抗体と同じ様式で有用性を目的にスクリーンされる。特定の態様において、本開示は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ２）’、Ｆ（ａｂ）２’およびｓｃＦＶからなる群から選択される抗体断片を提供する。
【００２０】
特定の態様において、本開示は、抗体または抗体断片を提供するが、前記抗体または抗体断片は、二重特異性である。特定の態様において、本開示は、前記抗体または抗体断片は、二重特異性ｓｃＦｖ、四価の二重特異性抗体、架橋Ｆａｂまたは二重特異性ＩｇＧからなる群から選択される二重特異性抗体由来のスカフォードである。
【００２１】
特定の態様において、本開示は、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ、カメリド抗体、アンキリン、ドメイン抗体、リポカリン、小型モジュール免疫薬、マキシボディ、Ａタンパク質およびアフィリンからなる群から選択される抗体または抗体断片を提供する。
【００２２】
本明細書に用いられる用語の「モノクローナル抗体」とは、単一分子組成の抗体分子調製物のことである。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対してユニークな結合特異性および親和性を有するユニークな結合部位を示す。特定の態様において、本開示は、Ｍ−ＣＳＦに特異的に結合するモノクローナル抗体または抗体断片を提供する。特定の態様において、本開示は、Ｍ−ＣＳＦに特異的に結合するポリクローナル抗体または抗体断片を提供する。
【００２３】
特定の態様において、本開示は、カニクイザルのＭ−ＣＳＦに交差反応性である単離抗体または抗体断片を提供する。特定の態様において、本開示は、マウスのＭ−ＣＳＦに交差反応性である単離抗体または抗体断片を提供する。特定の態様において、本開示は、ラットのＭ−ＣＳＦに交差反応性である単離抗体または抗体断片を提供する。特定の態様において、本開示は、カニクイザルおよび／またはマウスおよび／またはラットのＭ−ＣＳＦに交差反応性の単離抗体または抗体断片を提供する。
【００２４】
本明細書に用いられる用語の「ヒト抗体」は、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の双方がヒトの配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図している。本明細書に用いられるヒト抗体は、完全長の重鎖または軽鎖の重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含んでなる。特定の場合、ヒト抗体は、アミノ酸配列において生殖系免疫グロブリン遺伝子によってコード化されたアミノ酸配列に、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または少なくとも９５％、またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一性であり得る。それによって、前記ヒト抗体は、Ｂ細胞から単離されたＶＨ／ＶＬレパートリーのＰＣＲ増幅によって作製されたヒト生殖系列遺伝子由来の抗体を含んでなるテクノロジー・プラットフォームから得ることができるか、または合成的に作製する。テクノロジー・プラットフォームは、ファージ、リボソームまたは酵母に表示されたヒト免疫グロブリン遺伝子を含んでなる方法に基づいたライブラリを含む。各々の表示テクノロジーは、科学者共同体における基準である。さらに、ヒト免疫グロブリンのレパートリーを担持する遺伝子導入マウスの免疫化は、関心対象の抗原に対するヒト抗体を作製するもう１つのアプローチである。ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＨｕＣＡＬ（登録商標）コンセプト（Ｋｎａｐｐｉｋら著、２０００年、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、第２９６巻：ｐ．５７〜８６）に基づいた抗体ライブラリから選択された抗体または抗体断片は、完全にヒトのものであると考えられる。
【００２５】
「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体の反応性を保持している一方、ヒトでの免疫原性がより少ない抗体である。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持し、抗体の残りの部分を、それらのヒト対応物（すなわち、不変領域ならびに可変領域のフレームワーク部分）により置換することによって、達成することができる。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら著、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８１巻：ｐ６８５１〜６８５５；Ｍｏｒｒｉｓｏｎおよびオイ（Ｏｉ）著、１９８８年、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第４４巻：ｐ６５〜９２；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら著、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３９巻：ｐ１５３４〜１５３６；Ｐａｄｌａｎ著、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ、１９９１年、第２８巻：ｐ４８９〜４９８；およびＰａｄｌａｎ著、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ、１９９４年、第３１巻：ｐ１６９〜２１７を参照されたい。ヒト技術工学の他の例としては、米国特許第５，７６６，８８６号明細書に開示されたキソーマ（Ｘｏｍａ）テクノロジーが挙げられるが、これに限定されない。
【００２６】
用語の「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）を、異なった、もしくは変化させたクラス、エフェクター機能および／または種の不変領域に、または、キメラ抗体に新たな特性を与える全く異なった分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬剤などに結合させるために、不変領域またはその一部を変化、置換、または交換させた；または（ｂ）可変領域またはその一部が、異なった、もしくは変化させた抗原特異性を有する可変領域によって、変化、置換もしくは変換させた抗体分子である。例えば、マウス抗体は、その不変領域を、ヒト免疫グロブリンからの不変領域によって改変することができる。ヒト不変領域と置換することにより、キメラ抗体は、抗原認識における特異性を保持する一方で、元のマウス抗体と比べてヒトでの免疫原性が減少する。
【００２７】
特定の態様において、本開示は、Ｍ−ＣＳＦに特異的に結合するヒト抗体および抗体断片を提供する。特定の態様において、本開示は、Ｍ−ＣＳＦに特異的に結合するヒト化抗体および抗体断片を提供する。特定の態様において、本開示は、Ｍ−ＣＳＦに特異的に結合するキメラ抗体および抗体断片を提供する。特定の態様において、本開示は、ヒト重鎖不変領域およびヒト軽鎖不変領域を含んでなる抗体を提供する。
【００２８】
用語の「イソ型」とは、重鎖不変領域遺伝子によって提供される抗体クラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４などのＩｇＧ）のことである。また、イソ型は、Ｆｃ機能を変化させるために、例えば、エフェクター機能を、またはＦｃ受容体に対する結合を増大または低減させるために、改変がなされたこれらのうちの１クラスの改変型も含む。例えば、ＩｇＧ１  ＬＡＬＡは、エフェクター機能を有意に減少させたＩｇＧイソ型の改変型である。アミノ酸の特定の置換は、非改変抗体に比べて、ＦｃガンマＲＩ受容体に対する結合親和性を低下させる。ＩｇＧ１  ＬＡＬＡは、参照のためにその全体が援用されている米国特許出願第０８／４７９，７５２号明細書（ＳＣＯＴＧＥＮ  ＢＩＯＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ  ＩＮＣ．）に記載されている。本開示の特定の実施態様において、抗原結合部分は、抗体の抗原結合部分であり、ＩｇＧ型、ＩｇＭ型、ＩｇＡ型、ＩＧＥ型またはＩｇＤ型の抗体である。特定の実施態様において、抗体は、ＩｇＧ型の抗体である。本開示の特定の実施形態において、抗体は、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の抗体である。特定の実施形態において、抗体は、サブタイプＩｇＧ１またはＩｇＧ４の抗体である。他の特定の実施形態において、抗体は、サブタイプＩｇＧ１またはＩｇＧ１  ＬＡＬＡの抗体である。
【００２９】
本開示のある特定の実施形態において、抗体は、沈黙イソ型である。用語の「沈黙」イソ型とは、エフェクター機能が減少している任意の免疫グロブリンのことである。したがって、本開示の特定の実施形態において、抗体は、野生型のＩｇＧ１サブタイプに比べてエフェクター機能が減少しているＩｇＧ１サブタイプの抗体である。エフェクター機能の減少を達成させるために、特定の変異が特に適している。例えば、ＩｇＧ１  ＬＡＬＡサブタイプは、典型的な沈黙イソ型である。ＩｇＧ１イソ型の他の沈黙型も同様に本開示の抗体と共に使用できる。特に好ましい例は、Ｄ２６５Ａ変異を含んでいるＩｇＧ１イソ型である。このＩｇＧ１型においては、２６５位（ナンバリングはＥＵインデックスによる；ｈｔｔｐ：／／ＷＷＷ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌを参照）におけるアミノ酸のアスパラギン酸はアラニン残基に置換されている。このように特定の態様において、本開示の抗体は、沈黙ＩｇＧ１サブタイプの抗体である。他の態様において、本開示の抗体は、野生型ＩｇＧ１サブタイプに比べて、エフェクターが減少している変異ＩｇＧ１サブタイプの抗体である。他の態様において、本開示の抗体は、Ｄ２６５Ａ変異を担持するＩｇＧ１サブタイプの抗体である。他の態様において、本開示の抗体は、２６５位のアスパラギン酸がアラニン残基に置換されているＩｇＧ１サブタイプの抗体である。他の態様において、本開示の抗体は、２６５位（ＥＵインデックスによるナンバリング）のアスパラギン酸残基がアラニン残基に置換されている抗体である。サブタイプＩｇＧ２およびＩｇＧ４もまた、沈黙イソ型として知られている。
【００３０】
本明細書に用いられる用語の「アフィニティー（親和性）」とは、例えば、モノクローナル抗体のような抗原結合部分と単一抗原性部位における抗原との間の相互作用の強さのことである。各々の抗原性部位内で、抗体の「アーム」の可変領域は、多数の部位における抗原と弱い非共有力によって相互作用し、相互作用が大きいほど親和性が強い。
【００３１】
抗原へ「特異的に結合する」という用語は、タンパク質の異種集団および他の生物製剤において、抗原の存在下で決定できる結合反応を意味する。したがって、「抗原を認識する」および「抗原に特異的」という語句は、「抗原に特異的に結合する」という用語と共に交換可能に用いられる。抗原に対する、例えば、モノクローナル抗体のような抗原結合部分の特異的結合は、当該技術分野に知られた種々の確立された方法によって決定でき、それらの方法としては、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ウエスタンブロット、免疫ブロット、ＭＳＤ、ＢＩＡコアおよびＳＥＴが挙げられる。本開示において、抗原結合部分が、バックグランドよりも、少なくとも２倍、３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、特定の抗原に結合できることが示される場合に、その抗原結合部分は抗原に特異的であると考えられる。したがって、選択された抗原に対して非特異的であることが知られている抗原結合部分によって、または非関連抗原に対する結合との比較によって、バックグランドが決定される。本発明の抗体および抗体断片に対する抗原はＭ−ＣＳＦである。
【００３２】
完全長ヒトＭ−ＣＳＦ前駆体（ＣＳＦ−１またはマクロファージ・コロニー刺激因子としても知られている）は、５５４のアミノ酸長を有する。ヒトＭ−ＣＳＦ前駆体のアミノ酸配列は、配列番号１で示される（出所源：ユニプロット（Ｕｎｉｐｒｏｔ）、ヒトＭ−ＣＳＦ  Ｐ０９６０３）。
配列番号１（完全長ヒトＭ−ＣＳＦ前駆体）：
2016516092.tif 000003
【００３３】
スプライシングおよび翻訳後修飾の結果、３種の異なる細胞外イソ型：分泌グリコシル化Ｍ−ＣＳＦ（「ｓｇＭ−ＣＳＦ」）、分泌プロテオグリカンＭ−ＣＳＦ（「ｓｐＭ−ＣＳＦ」）、および細胞表面Ｍ−ＣＳＦ（「ｃｓＭ−ＣＳＦ」）が発現する。
【００３４】
ヒト血清中、最も顕著なイソ型は、２５５位のＭ−ＣＳＦ前駆体の開裂によって生成するｓｇＭ−ＣＳＦである。ヒトｓｇＭ−ＣＳＦのアミノ酸配列は、配列番号２で示される。
配列番号２（ヒト分泌グリコシル化Ｍ−ＣＳＦ（配列番号１の断片３３〜２５５））：
2016516092.tif 000004
【００３５】
ヒト分泌プロテオグリカンＭ−ＣＳＦは、４５６のアミノ酸長を有する。ｓｐＭ−ＣＳＦのアミノ酸配列は、配列番号３に示される。
配列番号３（ヒト分泌プロテオグリカンＭ−ＣＳＦ）：
2016516092.tif 000005
【００３６】
ヒト細胞表面Ｍ−ＣＳＦは、他のスプライシングによって生成し、２５６のアミノ酸長を有する。ｃｓＭ−ＣＳＦのアミノ酸配列は、配列番号４で示される。
配列番号４（ヒト細胞表面Ｍ−ＣＳＦ）：
2016516092.tif 000006
【００３７】
Ｍ−ＣＳＦの全ての３種のイソ型は、Ｍ−ＣＳＦ受容体に結合することができ、生物活性である。３種のイソ型は、共通してＮ末端受容体結合ドメイン（ｒｂｄＭ−ＣＳＦ）を有し、そのアミノ酸配列は、配列番号５で示される。
配列番号５（ヒト受容体結合ドメインＭ−ＣＳＦ（断片３３〜１９０））：
2016516092.tif 000007
【００３８】
また、本開示の抗体および抗体断片は、前臨床試験用の検査室でしばしば用いられるカニクイザル（オナガザル科（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））のＭ−ＣＳＦにも結合する。カニクイザルの分泌糖タンパクＭ−ＣＳＦをコード化する核酸分子は、胸部組織または膵臓組織から調製したカニクイザルのｃＤＮＡから標準的なＰＣＲ技法によってクローン化された。カニクイザルｓｇＭ−ＣＳＦの配列は、配列番号６で示される。
配列番号６（カニクイザルｓｇＭ−ＣＳＦ）：
2016516092.tif 000008
【００３９】
ヒトＭ−ＣＳＦ受容体（Ｍ−ＣＳＦＲまたはＣＳＦ１Ｒとしても知られている）は、９７２のアミノ酸長を有する。ヒトＭ−ＣＳＦＲのアミノ酸配列は、配列番号７（出所源：ユニプロット（Ｕｎｉｐｒｏｔ）、ヒトＭ−ＣＳＦＲ  Ｐ０７３３３）で示される：
配列番号７（ヒトＭ−ＣＳＦＲ）：
2016516092.tif 000009
【００４０】
また、本開示の抗体および抗体断片は、カニクイザルＭ−ＣＳＦ受容体に対するカニクイザルＭ−ＣＳＦの結合を阻害する。
【００４１】
特定の態様において、本開示は、ヒトＭ−ＣＳＦに対して指向されているか、または特異的に結合する単離抗体または抗体断片に関する。他の態様において、本開示は、配列番号１によってコード化されたポリペプチドに対して指向されているか、または特異的に結合する単離抗体または抗体断片に関する。
【００４２】
特定の態様において、本開示は、カニクイザルＭ−ＣＳＦに対して指向されているか、または特異的に結合する単離抗体または抗体断片に関する。他の態様において、本開示は、配列番号６によってコード化されたポリペプチドに対して指向されているか、または特異的に結合する単離抗体または抗体断片に関する。
【００４３】
特定の態様において、本開示は、ヒトＭ−ＣＳＦに対して指向されているか、または特異的に結合し、かつヒトＭ−ＣＳＦ受容体に対するヒトＭ−ＣＳＦの結合を阻害する単離抗体または抗体断片に関する。他の態様において、本開示は、配列番号１によってコード化されたポリペプチドに対して指向されているか、または特異的に結合し、かつ配列番号７によってコード化されたポリペプチドに対する配列番号１によってコード化されたポリペプチドの結合を阻害する単離抗体または抗体断片に関する。
【００４４】
特定の態様において、本開示は、カニクイザルＭ−ＣＳＦに対して指向されているか、または特異的に結合し、かつカニクイザルＭ−ＣＳＦ受容体に対するカニクイザルＭ−ＣＳＦの結合を阻害する単離抗体または抗体断片に関する。他の態様において、本開示は、配列番号６によってコード化されたポリペプチドに対して指向されているか、または特異的に結合し、かつ配列番号７によってコード化されたポリペプチドに対する配列番号６によってコード化されたポリペプチドの結合を阻害する単離抗体または抗体断片に関する。他の態様において、本開示は、配列番号６によってコード化されたポリペプチドに対して指向されているか、または特異的に結合し、かつカニクイザルＭ−ＣＳＦ受容体に対する配列番号６によってコード化されたポリペプチドの結合を阻害する単離抗体または抗体断片に関する。
【００４５】
特定の態様において、本開示は、分泌グリコシル化Ｍ−ＣＳＦ、分泌プロテオグリカンＭ−ＣＳＦおよび細胞表面Ｍ−ＣＳＦに結合する単離抗体または抗体断片に関する。特定の態様において、本開示は、ヒトＭ−ＣＳＦの全てのイソ型に結合する単離抗体または抗体断片に関する。特定の態様において、本開示は、配列番号２によってコード化されたポリペプチド、配列番号３によってコード化されたポリペプチドおよび配列番号４によってコード化されたポリペプチドに結合する単離抗体または抗体断片に関する。
【００４６】
特定の態様において、本開示は、Ｍ−ＣＳＦのＮ末端受容体結合ドメインに結合する単離抗体または抗体断片に関する。特定の態様において、本開示は、配列番号５によってコード化されたポリペプチドに結合する単離抗体または抗体断片に関する。
【００４７】
用語の「ポリペプチド」と「タンパク質」は、本明細書において交換可能に用いられ、アミノ酸残基のポリマーのことである。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的で化学的な模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーに適用される。別に指示されない限り、特定のポリペプチド配列は、その保存的に修飾された変更型も暗に包含する。
【００４８】
本明細書において用語の「核酸」は、用語の「ポリヌクレオチド」と交換可能に用いられ、一本鎖形態か、二本鎖形態のいずれかにおけるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドならびにそのポリマーのことである。この用語は、公知のヌクレオチド類縁体または修飾された主鎖残基または結合を含有する核酸であって、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される合成、天然および非天然の核酸を包含する。このような類縁体の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸類（ＰＮＡｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。別に指示されない限り、特定の核酸配列は、保存的に修飾されたその変型（例えば、縮重コドン置換物）および相補的配列、ならびに明白に指示された配列も暗に包含する。特に、下記のように、縮重コドンの置換は、１つ以上の選択された（または全ての）コドンのうちの第三位を混合塩基残基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することにより達成できる（Ｂａｔｚｅｒら著、１９９１年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、第１９巻：ｐ５０８１；大塚ら著、１９８５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６０巻：ｐ２６０５〜２６０８；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉら著、１９９４年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ、第８巻：ｐ９１〜９８）。
【００４９】
特定の態様において、本開示は、Ｍ−ＣＳＦに特異的に結合する本開示による抗体または抗体断片をコード化する核酸を提供する。特定の態様において、本開示は、表１の抗体または抗体断片をコード化する核酸を提供する。特定の態様において、本開示は、表２の抗体または抗体断片をコード化する核酸を提供する。
【００５０】
特定の態様において、本開示は、Ｍ−ＣＳＦに特異的に結合する本開示による抗体または抗体断片をコード化する核酸を含んでなるベクターを提供する。特定の態様において、本開示は、表１の抗体または抗体断片をコード化する核酸を含んでなるベクターを提供する。特定の態様において、本開示は、表２の抗体または抗体断片をコード化する核酸を含んでなるベクターを提供する。
【００５１】
特定の態様において、本開示は、本開示の抗体または抗体断片をコード化する核酸を含むベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。特定の態様において、本開示は、開示される本発明の抗体または抗体断片をコード化する核酸を含んでなる宿主細胞を提供する。
【００５２】
用語の「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）とは、組換え発現ベクターを導入した細胞のことである。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代も表すことが意図されていることを理解すべきである。変異または環境の影響により、後続世代には、ある修飾が生じ得るため、このような後代は、実際には親細胞と同一でないことがあり得るが、本明細書において用いられる用語「宿主細胞」の範囲内になお含まれる。
【００５３】
用語の「ベクター」とは、自身が結合したポリヌクレオチドを輸送することのできるポリヌクレオチド分子のことである。ベクターの１つのタイプは、追加のＤＮＡセグメントが結合できる環状二本鎖ＤＮＡループを表す「プラスミド」である。ベクターの別のタイプは、追加のＤＮＡセグメントがウィルスゲノム内に結合できるウィルスベクターである。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自律複製できる（例えば、細菌源の複製を有する細菌ベクターおよびエピソームの哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞内への導入時に、宿主細胞のゲノム内に組み込むことができ、そのため宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが操作可能に結合されている遺伝子発現を方向づけることができる。このようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技法に利用される発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドはベクターの最も一般的に用いられる形態であるため、本明細書においては、「プラスミド」と「ベクター」は交換可能に用いることができる。しかしながら、本開示は、等価の機能を働かせるウィルスベクター（例えば、複製欠如レトロウィルス、アデノウィルスおよびアデノ関連ウィルス）などの他の発現ベクター形態を含むことが意図されている。
【００５４】
特定の態様において、本開示は、Ｍ−ＣＳＦに特異的に結合し、かつ、１０ｐＭ以下のＩＣ５０で、Ｍ−ＣＳＦ受容体に対するＭ−ＣＳＦの結合を阻害する単離抗体または抗体断片を提供する。他の態様において、前記単離抗体または抗体断片は、２０ｐＭ以下のＩＣ５０、５．５ｐＭ以下のＩＣ５０、または５ｐＭ以下のＩＣ５０で、Ｍ−ＣＳＦ受容体に対するＭ−ＣＳＦの結合を阻害する。
【００５５】
特定の態様において、本開示は、Ｍ−ＣＳＦに特異的に結合する単離抗体または抗体断片を提供し、かつ、前記単離抗体または抗体断片は、１２．５ｐＭの最終濃度でのＭ−ＣＳＦを含んでなる受容体結合阻害アッセイにおいて、１０ｐＭ以下のＩＣ５０で、Ｍ−ＣＳＦ受容体に対するＭ−ＣＳＦの結合を阻害することができる。
【００５６】
特定の態様において、本開示は、Ｍ−ＣＳＦに特異的に結合する単離抗体または抗体断片を提供し、かつ、前記単離抗体または抗体断片は、０．６６ｎｇ／ｍｌの最終濃度でのＭ−ＣＳＦおよび２μｇ／ｍｌの最終濃度でのＭ−ＣＳＦ受容体を含んでなる受容体結合阻害アッセイにおいて、１０ｐＭ以下のＩＣ５０で、Ｍ−ＣＳＦ受容体に対するＭ−ＣＳＦの結合を阻害することができる。
【００５７】
特定の態様において、本開示は、Ｍ−ＣＳＦに特異的に結合し、かつ、実施例５に記載された受容体結合阻害アッセイにおいて、１０ｐＭ以下のＩＣ５０で、Ｍ−ＣＳＦ受容体に対するＭ−ＣＳＦの結合を阻害することのできる単離抗体または抗体断片を提供する。
【００５８】
特定の態様において、本開示は、Ｍ−ＣＳＦに特異的に結合し、かつ、先行技術の抗体ＨｅＲＸ１−１０Ｇ１および８．１０．３Ｆのいずれか１つのＩＣ５０の少なくとも２倍低いＩＣ５０でＭ−ＣＳＦ受容体に対するＭ−ＣＳＦの結合を阻害する単離抗体または抗体断片を提供する。他の前記単離抗体または抗体断片は、先行技術の抗体ＨｅＲＸ１−１０Ｇ１および８．１０．３Ｆのいずれか１つのＩＣ５０の少なくとも３倍低いＩＣ５０でＭ−ＣＳＦ受容体に対するＭ−ＣＳＦの結合を阻害する。
【００５９】
特定の態様において、本開示は、ＦＡＣＳアッセイで決定された際に、１０ｐＭ以下のＥＣ５０で、Ｍ−ＣＳＦに特異的に結合する単離抗体または抗体断片を提供する。他の態様において、前記単離抗体または抗体断片は、ＦＡＣＳアッセイで決定された際に、１５ｐＭ以下のＥＣ５０で、またはＦＡＣＳアッセイで決定された際に、５ｐＭ以下のＥＣ５０でＭ−ＣＳＦに特異的に結合する。
【００６０】
特定の態様において、本開示は、ＦＡＣＳアッセイで決定された際に、先行技術の抗体先行技術の抗体ＨｅＲＸ１−１０Ｇ１および８．１０．３Ｆのいずれか１つのＥＣ５０の少なくとも２倍の低さのＥＣ５０でＭ−ＣＳＦに特異的に結合する単離抗体または抗体断片を提供する。
【００６１】
特定の態様において、本開示は、Ｍ−ＣＳＦに特異的に結合し、かつ、１０ｐＭ以下のＩＣ５０で、Ｍ−ＣＳＦ誘導増殖を阻害する単離抗体または抗体断片を提供する。他の態様において、前記単離抗体または抗体断片は、２０ｐＭ以下のＩＣ５０、１５ｐＭ以下のＩＣ５０、または５ｐＭ以下のＩＣ５０でＭ−ＣＳＦ誘導増殖を阻害する。
【００６２】
特定の態様において、本開示は、Ｍ−ＣＳＦに特異的に結合し、かつ、先行技術の抗体ＨｅＲＸ１−１０Ｇ１および８．１０．３Ｆのいずれか１つのＩＣ５０の少なくとも２倍の低さのＥＣ５０でＭ−ＣＳＦ誘導増殖を阻害する単離抗体または抗体断片を提供する。
【００６３】
本明細書に用いられる用語「ＫＤ」とは、Ｋｄ対Ｋａの比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離常数のことである。例えば、モノクローナル抗体のような抗原結合部分に関するＫＤ値は、当該技術分野で十分に確立された方法を用いて決定することができる。例えば、モノクローナル抗体のような抗原結合部分のＫＤを決定する方法は、ＳＥＴ（溶解平衡滴定）またはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを用いる表面プラズモン共鳴である。本開示の抗体は、典型的に、５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０―１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１５Ｍ未満、または１０−１５Ｍ未満もしくはより低い解離常数（ＫＤ）（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を有する。
【００６４】
特定の態様において、本開示は、Ｍ−ＣＳＦに特異的であり、１×１０７Ｍ−１未満、１０８Ｍ−１未満、１０９Ｍ−１未満、１０１０Ｍ−１未満、１０１１Ｍ−１未満、１０１２Ｍ−１未満または１０１３Ｍ−１未満の解離常数（ＫＤ）で、Ｍ−ＣＳＦに結合する単離抗体または抗体断片を提供する。
【００６５】
本明細書に用いられる用語「ＥＣ５０」とは、アッセイにおいて、ベースラインと最大の中間での応答を誘導する抗体または抗体断片の濃度のことである。したがって、これは、最大効果の５０％が見られる抗体濃度を表す。
【００６６】
本明細書に用いられる用語「ＩＣ５０」とは、アッセイにおいて、最大応答とベースラインの中間での応答を阻害する阻害剤（例えば、抗体または抗体断片）の濃度のことである。これは、所与の応答を５０％減少させる抗体濃度を表す。
【００６７】
特定の態様において、本開示は、単離抗体および抗体断片を提供し、前記抗体または抗体断片は、配列番号８のＨＣＤＲ１領域、配列番号９のＨＣＤＲ２領域、配列番号１０のＨＣＤＲ３領域、配列番号１１のＬＣＤＲ１領域、配列番号１２のＬＣＤＲ２領域および配列番号１３のＬＣＤＲ３領域を含んでなる。
【００６８】
特定の態様において、本開示は、単離抗体および抗体断片を提供し、前記抗体または抗体断片は、配列番号１８のＨＣＤＲ１領域、配列番号１９のＨＣＤＲ２領域、配列番号２０のＨＣＤＲ３領域、配列番号２１のＬＣＤＲ１領域、配列番号２２のＬＣＤＲ２領域および配列番号２３のＬＣＤＲ３領域を含んでなる。
【００６９】
特定の態様において、本開示は、単離抗体および抗体断片を提供し、前記抗体または抗体断片は、配列番号２８のＨＣＤＲ１領域、配列番号２９のＨＣＤＲ２領域、配列番号３０のＨＣＤＲ３領域、配列番号３１のＬＣＤＲ１領域、配列番号３２のＬＣＤＲ２領域および配列番号３３のＬＣＤＲ３領域を含んでなる。
【００７０】
特定の態様において、本開示は、単離抗体および抗体断片を提供し、前記抗体または抗体断片は、配列番号３８のＨＣＤＲ１領域、配列番号３９のＨＣＤＲ２領域、配列番号４０のＨＣＤＲ３領域、配列番号４１のＬＣＤＲ１領域、配列番号４２のＬＣＤＲ２領域および配列番号４３のＬＣＤＲ３領域を含んでなる。
【００７１】
特定の態様において、本開示は、単離抗体および抗体断片を提供し、前記抗体または抗体断片は、配列番号４８のＨＣＤＲ１領域、配列番号４９のＨＣＤＲ２領域、配列番号５０のＨＣＤＲ３領域、配列番号５１のＬＣＤＲ１領域、配列番号５２のＬＣＤＲ２領域および配列番号５３のＬＣＤＲ３領域を含んでなる。
【００７２】
特定の態様において、本開示は、単離抗体および抗体断片を提供し、前記抗体または抗体断片は、配列番号５８のＨＣＤＲ１領域、配列番号５９のＨＣＤＲ２領域、配列番号６０のＨＣＤＲ３領域、配列番号６１のＬＣＤＲ１領域、配列番号６２のＬＣＤＲ２領域および配列番号６３のＬＣＤＲ３領域を含んでなる。
【００７３】
特定の態様において、本開示は、単離抗体および抗体断片を提供し、前記抗体または抗体断片は、配列番号６８のＨＣＤＲ１領域、配列番号６９のＨＣＤＲ２領域、配列番号７０のＨＣＤＲ３領域、配列番号７１のＬＣＤＲ１領域、配列番号７２のＬＣＤＲ２領域および配列番号７３のＬＣＤＲ３領域を含んでなる。
【００７４】
特定の態様において、本開示は、単離抗体および抗体断片を提供し、前記抗体または抗体断片は、配列番号７８のＨＣＤＲ１領域、配列番号７９のＨＣＤＲ２領域、配列番号８０のＨＣＤＲ３領域、配列番号８１のＬＣＤＲ１領域、配列番号８２のＬＣＤＲ２領域および配列番号８３のＬＣＤＲ３領域を含んでなる。
【００７５】
特定の態様において、本開示は、単離抗体および抗体断片を提供し、前記抗体または抗体断片は、配列番号８８のＨＣＤＲ１領域、配列番号８９のＨＣＤＲ２領域、配列番号９０のＨＣＤＲ３領域、配列番号９１のＬＣＤＲ１領域、配列番号９２のＬＣＤＲ２領域および配列番号９３のＬＣＤＲ３領域を含んでなる。
【００７６】
特定の態様において、本開示は、単離抗体および抗体断片を提供し、前記抗体または抗体断片は、配列番号９８のＨＣＤＲ１領域、配列番号９９のＨＣＤＲ２領域、配列番号１００のＨＣＤＲ３領域、配列番号１０１のＬＣＤＲ１領域、配列番号１０２のＬＣＤＲ２領域および配列番号１０３のＬＣＤＲ３領域を含んでなる。
【００７７】
特定の態様において、本開示は、単離抗体および抗体断片を提供し、前記抗体または抗体断片は、配列番号１０８のＨＣＤＲ１領域、配列番号１０９のＨＣＤＲ２領域、配列番号１１０のＨＣＤＲ３領域、配列番号１１１のＬＣＤＲ１領域、配列番号１１２のＬＣＤＲ２領域および配列番号１１３のＬＣＤＲ３領域を含んでなる。
【００７８】
特定の態様において、本開示は、単離抗体および抗体断片を提供し、前記抗体または抗体断片は、配列番号１４の可変重鎖領域および配列番号１５の可変軽鎖領域を含んでなる。
【００７９】
特定の態様において、本開示は、単離抗体および抗体断片を提供し、前記抗体または抗体断片は、配列番号２４の可変重鎖領域および配列番号２５の可変軽鎖領域を含んでなる。
【００８０】
特定の態様において、本開示は、単離抗体および抗体断片を提供し、前記抗体または抗体断片は、配列番号３４の可変重鎖領域および配列番号３５の可変軽鎖領域を含んでなる。
【００８１】
特定の態様において、本開示は、単離抗体および抗体断片を提供し、前記抗体または抗体断片は、配列番号４４の可変重鎖領域および配列番号４５の可変軽鎖領域を含んでなる。
【００８２】
特定の態様において、本開示は、単離抗体および抗体断片を提供し、前記抗体または抗体断片は、配列番号５４の可変重鎖領域および配列番号５５の可変軽鎖領域を含んでなる。
【００８３】
特定の態様において、本開示は、単離抗体および抗体断片を提供し、前記抗体または抗体断片は、配列番号６４の可変重鎖領域および配列番号６５の可変軽鎖領域を含んでなる。
【００８４】
特定の態様において、本開示は、単離抗体および抗体断片を提供し、前記抗体または抗体断片は、配列番号７４の可変重鎖領域および配列番号７５の可変軽鎖領域を含んでなる。
【００８５】
特定の態様において、本開示は、単離抗体および抗体断片を提供し、前記抗体または抗体断片は、配列番号８４の可変重鎖領域および配列番号８５の可変軽鎖領域を含んでなる。
【００８６】
特定の態様において、本開示は、単離抗体および抗体断片を提供し、前記抗体または抗体断片は、配列番号９４の可変重鎖領域および配列番号９５の可変軽鎖領域を含んでなる。
【００８７】
特定の態様において、本開示は、単離抗体および抗体断片を提供し、前記抗体または抗体断片は、配列番号１０４の可変重鎖領域および配列番号１０５の可変軽鎖領域を含んでなる。
【００８８】
特定の態様において、本開示は、単離抗体および抗体断片を提供し、前記抗体または抗体断片は、配列番号１１４の可変重鎖領域および配列番号１１５の可変軽鎖領域を含んでなる。
【００８９】
特定の態様において、本開示は、Ｍ−ＣＳＦに対する結合に関して、本明細書で具体的に開示された抗体と競合する単離抗体および抗体断片を提供する。他の態様において、本開示は、ヒトＭ−ＣＳＦに対する結合に関して、本明細書で具体的に開示された抗体と競合する単離抗体および抗体断片を提供する。他の態様において、本開示は、配列番号１によってコード化されたポリペプチドに対する結合に関して、本明細書で具体的に開示された抗体と競合する単離抗体および抗体断片を提供する。
【００９０】
用語の「競合する」または「交差競合する」とは、抗原の特定領域に結合する能力を共有する抗体または抗体断片のことである。本開示において、「交差競合的」である抗体または抗体断片は、標準的な競合結合アッセイにおいて、Ｍ−ＣＳＦに対する別の抗体または抗体断片の結合に干渉する能力を有する。このような抗体は、非限定的理論によれば、Ｍ−ＣＳＦ上の同一の、または関連した、または近傍の（例えば、構造的に類似の、または空間的に近位の）エピトープに結合し得る。互いに競合的に結合する抗体、例えば、抗原に対する結合に関して競合する抗体を見出すための交差競合試験を実施することができる。Ｍ−ＣＳＦに対する別の抗体または抗体断片の結合に干渉できる能力または程度、したがって、本発明により交差競合と言えるかどうかは、標準的な競合結合アッセイを用いて決定することができる。抗体Ａと抗体Ｂのうちの一方を欠いた陽性対照に比較して、抗体Ａが、少なくとも５０％、少なくとも６０％、特に少なくとも７０％、さらに特に少なくとも８０％、抗体Ｂの結合を減少させる場合、ならびにその逆の場合、交差競合が存在している。熟練技術者が認識しているように、競合は、種々のアッセイ装置で評価できる。好適なアッセイの一つは、表面プラズモン共鳴テクノロジーを用いて相互作用の程度を測定することのできるバイアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）テクノロジー（例えば、バイアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）３０００装置（バイアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）、ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）、スウェーデン国）を用いて）の使用を含む。交差結合を測定する別のアッセイは、ＥＬＩＳＡベースの方法を用いる。さらに、抗体の交差競合に基づいた抗体を「ビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）」するハイスループット法が、国際特許出願国際公開第２００３／４８７３１号パンフレットに記載されている。調査下の抗体が、抗体の一方の結合を、６０％以上、特に７０％以上、さらに特に８０％以上減少させ、かつ、抗体の一方が、Ｍ−ＣＳＦに対する前記抗体の結合を、６０％以上、特に７０％以上、さらに特に８０％以上減少させる場合に、交差結合が存在している。
【００９１】
特定の態様において、本開示は、表１に記載されている抗体と交差競合する、Ｍ−ＣＳＦに特異的な抗体または抗体断片に適用される。特定の態様において、本開示は、表２に記載されている抗体と交差競合する、Ｍ−ＣＳＦに特異的な抗体または抗体断片に適用される。
【００９２】
特定の実施形態において、表１に記載された抗体と交差競合する抗体または抗体断片は、ＥＬＩＳＡベースの交差競合アッセイにおいて、Ｍ−ＣＳＦに対する表１に記載された抗体の１つの結合を、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％減少させる。特定の実施形態において、表２に記載された抗体と交差競合する抗体または抗体断片は、ＥＬＩＳＡベースの交差競合アッセイにおいて、Ｍ−ＣＳＦに対する表２に記載された抗体の１つの結合を、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％減少させる。
【００９３】
特定の態様において、本開示は、本明細書に具体的に開示された抗体と同じエピトープに結合する単離抗体および抗体断片を提供する。特定の態様において、本開示は、表１に記載された抗体と同じエピトープに結合する単離抗体および抗体断片を提供する。特定の態様において、本開示は、表２に記載された抗体と同じエピトープに結合する単離抗体および抗体断片を提供する。
【００９４】
用語の「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体によって特異的に認識されるか、または他に分子と相互作用するタンパク質性領域を含む。一般にエピトープは、アミノ酸または炭水化物または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面群であり、一般に特定の三次元構造特性ならびに特定の電荷特性を有し得る。当業者により認識されるように、抗体が特異的に結合できる物は、実際にはどれもエピトープであり得る。
【００９５】
特定の態様において、本開示は、表１に記載された抗体と同じエピトープと相互作用する（例えば、結合、安定化、空間配置によって）Ｍ−ＣＳＦに特異的な抗体または抗体断片に適用される。特定の態様において、本開示は、表２に記載された抗体と同じエピトープと相互作用する（例えば、結合、安定化、空間配置によって）Ｍ−ＣＳＦに特異的な抗体または抗体断片に適用される。
【００９６】
特定の態様において、本開示は、薬剤に使用する目的で本明細書に開示された抗体または抗体断片に適用される。
【００９７】
特定の態様において、本開示は、Ｍ−ＣＳＦに指向されているか、またはＭ−ＣＳＦに結合する単離抗体または抗体断片および薬学的に許容できる担体を含んでなる医薬組成物に適用される。特定の態様において、本発明は、本開示の単離抗体または抗体断片および薬学的に許容できる担体を含んでなる医薬組成物を提供する。別の実施形態において、本明細書に開示された単離抗体または抗体断片は薬剤として使用される。
【００９８】
本発明の組成物は、炎症性障害の治療を目的とした、Ｍ−ＣＳＦに指向されているか、またはＭ−ＣＳＦに結合する単離抗体および薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤を含んでなる医薬組成物であることが好ましい。このような担体、希釈剤および賦形剤は、当該技術分野によく知られており、当業者は、本発明の抗ＭＣＳＦを用いて対象を治療するのに最も適した剤形および投与経路を見出すであろう。
【００９９】
特定の態様において、本発明は、Ｍ−ＣＳＦに指向されているか、またはＭ−ＣＳＦに結合する抗体または抗体断片の有効量を対象に投与するステップを含んでなる、対象における炎症性障害の治療または予防のための方法を提供する。特定の態様において、前記対象はヒトである。別の態様において、前記対象は、ラットまたはマウスなどのげっ歯類である。
【０１００】
動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官、または生体液に適用される場合の「投与」および「治療」とは、外因性薬剤、治療薬、診断薬または組成物と動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官、または生体液との接触のことである。「投与」および「処置」は、例えば、治療的、薬物動態的、診断的、研究的および実験的な方法のことであり得る。細胞の処置は、試薬と細胞との接触、ならびに試薬と細胞に接触している体液との接触を包含する。また、「投与」および「処置」は、試薬、診断薬、結合組成物による、または他の細胞による、例えば、細胞のインビトロ処置およびエクスビボ処置も意味する。ヒト、家畜、または研究対象に適用される場合の「処置」とは、研究適用および診断適用に対する治療的処置、予防手段または防止手段のことである。ヒト、家畜、または研究対象、または細胞、組織、または器官に適用される場合の「処置」は、薬剤と動物対象、細胞、組織、生理学的区画、または生理学的体液との接触を包含する。「細胞の処置」はまた、例えば、体液相またはコロイド相において薬剤がＰＩＬＲに接触する状況のみならず、アゴニストまたはアンタゴニストが、細胞または受容体に接触しない状況も包含する。
【０１０１】
用語の「対象」は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、全ての家畜、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類および爬虫類などのような哺乳類および非哺乳類を含む。特記しない限り、用語の「患者」または「対象」は、本明細書において交換可能に用いられる。
【０１０２】
別の態様において、本開示は、Ｍ−ＣＳＦに特異的であって、表１における抗体のうちのいずれかの６つのＣＤＲを含んでなる抗体または抗体断片を提供する。別の態様において、本開示は、Ｍ−ＣＳＦに特異的であって、表２における抗体のうちのいずれかの６つのＣＤＲを含んでなる抗体または抗体断片を提供する。
【０１０３】
別の態様において、本開示は、Ｍ−ＣＳＦに特異的であって、表１における抗体のうちのいずれかの可変重鎖および可変軽鎖を含んでなる抗体または抗体断片を提供する。別の態様において、本開示は、Ｍ−ＣＳＦに特異的であって、表２における抗体のうちのいずれかの可変重鎖および可変軽鎖を含んでなる抗体または抗体断片を提供する。
【０１０４】
別の態様において、本開示は、Ｍ−ＣＳＦに特異的であって、表１における核酸のうちのいずれかによってコード化されている抗体または抗体断片を提供する。別の態様において、本開示は、Ｍ−ＣＳＦに特異的であって、表２における核酸のうちのいずれかによってコード化されている抗体または抗体断片を提供する。別の態様において、本開示は、表１の核酸を含んでなるベクターを提供する。別の態様において、本開示は、表２の核酸を含んでなるベクターを提供する。別の態様において、本開示は、表１の核酸を含むベクターを含んでなる単離宿主細胞を提供する。別の態様において、本開示は、表２の核酸を含むベクターを含んでなる単離宿主細胞を提供する。さらなる実施形態において、前記単離宿主細胞は哺乳動物の細胞である。
【実施例】
【０１０５】
実施例１：Ｍ−ＣＳＦに特異的であるＦａｂ断片および抗体の作製
Ｍ−ＣＳＦに特異的に結合する抗体の選択に関しては、商品として入手できるファージ・ディスプレイ・ライブラリであるＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＨｕＣＡＬ  ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ライブラリを用いた。前記抗体ライブラリは、ＨｕＣＡＬ（登録商標）コンセプト（Ｋｎａｐｐｉｋら著、２０００年、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、第２９６巻：ｐ．５７〜８６）に基づき、ファージ表面上にＦａｂを表示するためにＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（登録商標）テクノロジーを用いる。しかしながら、Ｍ−ＣＳＦ抗体を同定するために、他の任意の入手可能な抗体ライブラリも適しているであろう。
【０１０６】
Ｍ−ＣＳＦ特異的抗体を同定するために、種々のパンニング方式を用いた。各々のパンニング方式は、ヒトＭ−ＣＳＦ（ｒｂｄＭ−ＣＳＦ）の受容体結合ドメインに対し、パンニングの少なくとも３つの個別ラウンドを含んでなり、その配列は、配列番号５に示される。
【０１０７】
最初のリード分子のアフィニティーおよび／または機能性を増大させるために、同定された単離バインダを成熟させ、改変し、および／または生殖系列化した。機能性に関して数百のバインダをスクリーンし、厳密に試験した。
【０１０８】
４５の候補分子のサブセットを探索スケールで作製し、以下のインビトロアッセイにて特性化した：
・ＥＬＩＳＡにおけるヒトおよびカニクイザルのＭ−ＣＳＦに対する結合。
・安定性膜Ｍ−ＣＳＦ形質移入ＣＨＯ細胞および内因性膜Ｍ−ＣＳＦ発現ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞（出所源：ＡＴＣＣ、注文番号：ＨＴＢ−２６）に対する結合。
・開発可能性のリスクランキング。
・ヒトＭ−ＣＳＦを用いる受容体阻害アッセイ（ＲＩＡ）における機能性。
・ヒトＭ−ＣＳＦを用いるＭ−ＮＦＳ−６０細胞（出所源：ＡＴＣＣ、注文番号：ＣＴＬ−１８３８）の生死判別アッセイにおける機能性。
【０１０９】
総計で８つの好ましいリード分子が同定され、それらは本明細書においてさらに下記に示す。これら８つのバインダの可変領域およびＣＤＲ類のアミノ酸配列と核酸配列を表１に示す。
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【０１１０】
抗体Ｃａｌｉｎｅ、ＣａｍｉｌｌｅおよびＣｅｌｉｎｅは、親抗体Ｂｌａｎｃｈｅの誘導体である。抗体Ｍａｄｅｌｅｉｎｅ、ＭａｅｌｌｅおよびＭｅｒｉｅｍは、親抗体Ｌａｕｒｉｎｅの誘導体である。抗体ＳａｔｉｎｅおよびＳｅｒｖａｎｅは、親抗体Ｒｏｍａｉｎｅの誘導体である。親抗体の可変領域およびＣＤＲ類のアミノ酸配列と核酸配列を表２に示す。
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【０１１１】
実施例２：Ｍ−ＣＳＦ特異的抗体の特性化およびベンチマーキング
８つの好ましいＭ−ＣＳＦ特異的抗体は、本明細書の下記のとおり完全に特性化した。これらの抗体は、個々の親抗体および臨床的開発用に作製された２つの先行技術の抗体と比較した。ＨｅＲＸ１−１０Ｇ１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）のアミノ酸配列は、例えば、国際公開第２００５／０６８５０３号パンフレットに開示されており、また表３にも示している。８．１０．３Ｆ（Ｐｆｉｚｅｒ）のアミノ酸配列は、例えば、国際公開第２００５／０３０１２４号パンフレットに開示されており、また表３にも示している。ＨｅＲＸ１−１０Ｇ１および８．１０．３Ｆは、従来の分子生物学的技法を用いて合成された。
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【０１１２】
本開示の抗体は、任意のフォーマット、すなわち本明細書に記載された完全長免疫グロブリンとして、または抗体断片として使用することができる。完全長抗体は、任意の免疫グロブリンのイソ型またはクラスに使用することができる。２、３の例を除いて、本発明の抗体は、ＩｇＧ１フォーマットおよびＦｃ領域におけるＤ２６５Ａ変異を含んでいる沈黙ＩｇＧ１フォーマットにて試験した。抗体８．１０．３Ｆもまた、ＩｇＧ２フォーマットにて試験した。
【０１１３】
実施例３：ＥＬＩＳＡアッセイにて測定されたＭ−ＣＳＦに対する特異性
ヒトＭ−ＣＳＦおよびカニクイザルＭ−ＣＳＦに関する特異性は、ＥＬＩＳＡアッセイにて試験した。ＢＳＡは、陰性対照基質として用いた。
【０１１４】
Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）の３８４のウェルプレートは、ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌの濃度でヒトｒｂｄＭ−ＣＳＦ、ヒトｓｇＭ−ＣＳＦ、カニクイザルｓｇＭ−ＣＳＦまたはマウスｓｇＭ−ＣＳＦでコーティングした。ＰＢＳ中５％の脱脂粉乳でプレートをブロッキング後、Ｆａｂ含有の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶菌液、ＩｇＧ含有の細胞培養上澄液、または精製ＩｇＧ、またはＦａｂタンパク質を加えた。Ｆａｂ類またはＩｇＧ類の結合は、Ａｔｔｏｐｈｏｓ蛍光基質（Ｒｏｃｈｅ、番号１１６８１９８２００１）を用い、アルカリホスファターゼ（Ｄｉａｎｏｖａ、カタログ番号１０９−０５５−０９７；１：５０００希釈）に結合させたＦ（ａｂ）２特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧにより検出した。５３５ｎｍにおける蛍光発光が、４３０ｎｍでの励起を伴って記録された。
【０１１５】
代わりの実験構成において、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）の３８４のウェルプレートは、ＰＢＳ中１：１０００で希釈したＦｄ断片特異的ヒツジ抗ヒトＩｇＧ（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ、番号ＰＣ０７５）でコーティングした。ＰＢＳ中５％の脱脂粉乳でプレートをブロッキング後、Ｆａｂ含有の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶菌液を加えた。引き続いて、捕獲されたＨｕＣＡＬ（登録商標）−Ｆａｂ断片を、０．５μｇ／ｍｌのビオチン化Ｍ−ＣＳＦ（ヒトｓｇＭ−ＣＳＦ、ヒトｒｂｄＭ−ＣＳＦ、またはマウスｓｇＭ−ＣＳＦ）に結合させ、アルカリホスファターゼに結合させたストレプタビジンと共にインキュベーションした後、Ａｔｔｏｐｈｏｓ蛍光基質（Ｒｏｃｈｅ、番号１１６８１９８２００１）の添加によって検出した。５３５ｎｍにおける蛍光発光が、４３０ｎｍでの励起を伴って記録された。
【０１１６】
表１、２および３に示された全ての抗体は、ヒトＭ−ＣＳＦおよびカニクイザルＭ−ＣＳＦに強く結合（＞３５，０００単位）するが、一方、ＢＳＡにはいずれの抗体も結合しない（＜１，０００）。したがって、全ての抗体は、Ｍ−ＣＳＦに対して高度に特異的である。
【０１１７】
実施例４：ＦＡＣＳ実験において測定されたＭ−ＣＳＦに対する特異性；ＥＣ５０
本開示の抗体は、細胞上に発現したＭ−ＣＳＦにも結合するかどうかを試験するために、ＦＡＣＳ試験を実施した。この目的のために、２種の細胞系が用いられた：Ｍ−ＣＳＦを安定的に形質移入されたＣＨＯ細胞、および内因的にＭ−ＣＳＦを発現する細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１。双方の細胞系を用いて、明白なＫＤ値（ＥＣ５０）を測定した。これらの結果は表４に示す。値は全て［ｎＭ］である。
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【０１１８】
本発明の抗体は全て、先行技術の抗体ＨｅＲＸ１−１０Ｇ１および８．１０．３ＦのＥＣ５０値と少なくとも同等に良好であるＥＣ５０値を示し、多くの抗体は、先行技術の抗体のＥＣ５０値よりも良好な（低い）ＥＣ５０値を示す。
【０１１９】
実施例５：受容体結合の阻害
本実験において、組換えヒトＭ−ＣＳＦ受容体（Ｆｃ融合タンパク質として提供）に対するヒトまたはカニクイザルのＭ−ＣＳＦ結合をブロックする抗体能力を評価した。
【０１２０】
以下の組換えリガンド／受容体の組合せを用いた：
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【０１２１】
１２．５ｐＭ（０．６６ｎｇ／ｍｌ）の最終濃度でのＭ−ＣＳＦは、種々の濃度（０．１ｐＭ〜１００ｎＭ；全てＥＣＬ緩衝液中で希釈）の抗Ｍ−ＣＳＦ抗体と共に室温で１時間プレインキュベートした。次いで複合体は、２μｇ／ｍｌの対応する受容体でコーティングした３８４ウェルのＭＳＤプレートに移した。次にプレートを洗浄し、ストレプタビジン／ＥＣＬ複合体と共に振とうしながら室温で２時間インキュベートした。次いで、表面活性剤と共に１ウェル当り３５μｌのＭＳＤ読取り緩衝液Ｔを加えてから、引き続きＭＳＤセクター・イメージャー（Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ）６０００を用いて測定した。
【０１２２】
ヒトＭ−ＣＳＦとカニクイザルＭ−ＣＳＦの双方に関して、ＩＣ５０値を算出した。これらの結果は、表６に示す。ＩｇＧ１フォーマット中のＨｅＲＸ１−１０Ｇ１およびＩｇＧ２フォーマット中の８．１０．３Ｆを除き、全ての値は［ｐＭ］ｎ＝４である。
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【０１２３】
候補物は全て、先行技術の抗体ＨｅＲＸ１−１０Ｇ１および８．１０．３Ｆよりも良好にＭ−ＣＳＦのその受容体に対する結合をブロックした。これは特に、親抗体ＢｌａｎｃｈｅおよびＬａｕｒｉｎｅから誘導される抗体に関して真性であり、これらは全て、１０ｐＭを下回るＩＣ５０値を示した。
【０１２４】
実施例６：組換えＭ−ＣＳＦにより誘導された増殖の阻害
Ｍ−ＣＳＦ依存性マウス骨髄細胞系Ｍ−ＮＦＳ−６０を用い、細胞生死判別アッセイにおいて、組換えＭ−ＣＳＦの生物活性をブロックする本開示の抗体能力を評価した。この細胞系の増殖は、ヒト、カニクイザル、ラットおよびマウスのＭ−ＣＳＦによって誘導することができる。抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を特性化するために、組換え溶解性Ｍ−ＣＳＦか、天然の溶解性Ｍ−ＣＳＦか、または細胞表面Ｍ−ＣＳＦを発現する形質移入体のいずれかによって増殖を誘導した。以下の成分を試験した（実施例５〜７）。
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【０１２５】
安定化グルタミン（Ｐａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＰＡＮ−Ｐ０４−１８５００）を含有するＲＰＭＩ１６４０中、１０％のＦＣＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳで添加し、９．５ｐＭ（０．５ｎｇ／ｍｌ）の組換えヒトまたはカニクイザルのＭ−ＣＳＦの存在下、抗体濃度を増加させながらＭ−ＮＦＳ−６０細胞を培養した（９６ウェルプレート）。培養３日後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ−７５７１）を用いて細胞の生存度を測定した。細胞の生存度（相対的ＡＴＰ含量）を測定するために、標準的ルミノメータにより蛍光を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてＩＣ５０値を測定した。これらの結果は、表８に示す。値は全て［ｐＭ］である。
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【０１２６】
試験された抗体は全て、Ｍ−ＣＳＦの受容体に対するＭ−ＣＳＦの結合をブロックした。特に、親抗体ＢｌａｎｃｈｅおよびＬａｕｒｉｎｅから誘導される抗体は、先行技術の抗体よりも効力があり、特に８．１０．３Ｆよりも効力がある。
【０１２７】
実施例７：天然Ｍ−ＣＳＦより誘導された増殖の阻害
天然のヒトＭ−ＣＳＦの生物活性をブロックする本開示の抗体能力は、Ｍ−ＮＦＳ−６０の細胞増殖アッセイにおいて評価した。ここでの増殖は、ヒト血清か、またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１の調整培地によって誘導した。抗体は、９６ウェルプレート内で血清中３０分間プレインキュベートした後、１０００個のＭ−ＮＦＳ−６０細胞を加えた。最終血清濃度は５０％であり、細胞培養培地には、ＦＣＳを添加しなかった。上記のとおり、細胞生存度は、３日後に測定した。免疫グロブリンを滴定してＩＣ５０を算出した。これらの結果は表９に示す。値は全て［ｐＭ］である。
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【０１２８】
試験した抗体は全て、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の調整培地中に存在するＭ−ＣＳＦの生物活性を効率よくブロックした。先行技術の抗体８．１０．３Ｆは、試験した他の抗体よりも効力が低かった。同様に、抗体は全て、ヒト血清中に存在するＭ−ＣＳＦの生物活性を阻害した。先行技術の抗体８．１０．３Ｆはやはり、試験した他の免疫グロブリンよりも効力が低かった。
【０１２９】
実施例８：細胞表面Ｍ−ＣＳＦによって誘導された増殖の阻害
Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞の増殖が、ヒト細胞表面Ｍ−ＣＳＦを安定的に発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ＿ｈＭ−ＣＳＦ細胞）により誘導されるアッセイにおいて、膜結合Ｍ−ＣＳＦイソ型の生物活性をブロックする本開示の抗体能力を評価した。１ウェル当り２０００個のＣＨＯ＿ｈＭ−ＣＳＦ細胞は、細胞培養９６のウェルプレート内において３７℃で一晩培養し、ＰＢＳで２回洗浄し、１ウェル当り１００μｌの２％グルタルアルデヒド／ＰＢＳを用いて３７℃で３０分間固定した。ＰＢＳで洗浄後、固定細胞を、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体（最終ＩｇＧ濃度０．０５ｎＭ、０．５ｎＭ、５ｎＭ、５０ｎＭ）により３７℃で３０分間インキュベートした。引き続き、１ウェル当り５０００個のＭ−ＮＦＳ−６０細胞を添加し、３７℃で７２時間培養した後、上記のとおり、細胞生存度を測定した。結果は、表１に示す。
【０１３０】
Ｍ−ＣＳＦ特異的免疫グロブリンは全て、Ｍ−ＣＳＦを発現するＣＨＯ細胞によって誘導された増殖を効率的に阻害した。阻害度は、ＩｇＧの濃度を増加させると共に増加する。阻害は、試験された最高ＩｇＧ濃度（５０ｎＭ）でほぼ１００％であった。リゾチームに特異性を有する抗体であるＭＯＲ３２０７は、増殖を阻害しなかった。
【０１３１】
実施例９：アフィニティー測定
本開示の抗体の一価アフィニティーは、溶解性平衡滴定（Ｈａｅｎｅｌら著、２００５年、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、第３３９巻、ｐ１８２〜４）により測定した。Ｆａｂフォーマットで抗体を精製し、ヒトおよびカニクイザルのＭ−ＣＳＦに対するＫＤを測定した。これらの結果は、表１０に示す。値は全て［ｐＭ］である。
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【０１３２】
表１０に示されるとおり、試験したＦａｂ類は全て、ヒトおよびカニクイザルのＭ−ＣＳＦに結合した。興味深いことに、殆どの抗体は、３０ｐＭ以下のＫＤ値を示した。すなわち、先行技術の抗体ＨｅＲＸ１−１０Ｇ１および８．１０．３Ｆよりも高いアフィニティーを示した。ヒトのＭ−ＣＳＦとカニクイザルのＭ−ＣＳＦとの間にアフィニティーの有意差は見られなかった。
【０１３３】
実施例１０：抗体の特異性
Ｆｒｅｓｅら著、２０１３年、ＭＡｂｓ、Ｆｅｂ１４；５（２）［プリントの巻号数が記載されていない］に記載された抗体Ｃａｍｉｌｌｅを用い、本発明の抗体の結合特異性を典型的に試験した。この特異性プロファイリング試験のために、種々のタンパク質および対照は、２枚の３８４のウェルＭＳＤプレート上、１μｇ／ｍｌの濃度で４℃で一晩コーティングした。プレートは、ＢＳＡでブロックし、０．０５％（ｖ／ｖ）のツイーン２０を有するＰＢＳで３回洗浄した。アッセイ緩衝液（０．５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）のツイーン２０を有するＰＢＳ）中、抗体サンプルを１００ｎＭと１０ｎＭとに希釈した。対照として非特異的抗体（ＭＯＲ０３２０７、抗リゾチーム）とアッセイ緩衝液を用いた。サンプルおよび対照は、室温で３時間インキュベートした。プレートは、３回洗浄し、１ウェル当り３０μｌの検出抗体（ＥＣＬ標識化抗ヒトＦａｂ）を加えて１時間インキュベートした。洗浄後、表面活性剤と共にＭＳＤ読取り緩衝液Ｔ（ＭＳＤ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔ）を加え、Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ６０００（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、ゲイサーズバーグ、メリーランド州、米国）を用いて電気化学的発光シグナルを検出した。
【０１３４】
ある特定のタンパク質上の抗体サンプルのシグナルは、評価のため参照抗体ＭＯＲ０３０２７に対して正規化した。結果は表１１に示す。
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【０１３５】
典型的な抗体カミール（Ｃａｍｉｌｌｅ）は、Ｍ−ＣＳＦに対し高度に特異的であり、本アッセイで試験した無関連タンパク質のいずれに対しても非特異的結合を示さなかった。
【０１３６】
実施例１１：典型的な抗体Ｃａｍｉｌｌｅと先行技術の抗体との比較
下表に抗体Ｃａｍｉｌｌｅの主要な特質は、先行技術の抗体ＨｅＲＸ１．１０Ｇ１および８．１０．３Ｆと比較した。
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【０１３７】
要約すると、抗体Ｃａｍｉｌｌｅ並びに本開示の他の抗体は、先行技術の全ての抗体よりも優れた結合アフィニティーを示す。このことはまた、Ｃａｍｉｌｌｅが、先行技術の抗体ＨｅＲＸ１．１０Ｇ１と８．１０．３Ｆと少なくとも同等に良好な結果を示すが、大部分のアッセイでは、より良好に機能する機能性アッセイにも反映されている。
【０１３８】
実施例１２：臨床試験における抗体の有効性
急性リウマチ様関節炎患者に静脈内投与された本開示の抗体の安全性、予備臨床活性および複数回投与の免疫原性を評価するために、多施設、無作為化、二重盲検、プラセボ対照試験を実施する。
【０１３９】
主要評価項目は、有害事象の発生率および安全性プロファイルである。二次的評価項目は、ＤＡＳ２８スコア、ＡＣＲスコアおよびＥＵＬＡＲ２８の応答基準を含んだ。
【０１４０】
臨床試験は、３つの治療アームからなる。各治療アームにおいて、プラセボまたは本開示の抗体（治療アーム１には０．３ｍｇ／ｋｇ体重、治療アーム２には１．０ｍｇ／ｋｇ体重、治療アーム３には１．５ｍｇ／ｋｇ体重）を患者に与えた。抗体およびプラセボは、全部で４回、毎週静脈内投与する。
【０１４１】
投与前に全ての患者の疾患活性は、ＤＡＳ２８スコア、２８関節の疾患活性スコア（例えば、Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ著、２００９年、第６８巻、ｐ９５４〜６０を参照）を算出することにより、受理されたガイドラインに従って測定する。ＲＡ患者の疾患状態を定量化するために、ＤＡＳ２８スコアは、検証済みの一般に用いられる手段である。平均的ＤＡＳ２８スコアは、全ての治療アームに関して同等である。
【０１４２】
本開示の抗体は、試験された全ての投与間で好ましい安全性プロファイルを示し、治療は安全である。
【０１４３】
抗体またはプラセボの第１回目の投与後４週目と８週目に、全ての患者のＤＡＳ２８スコアを測定する。ＤＡＳ２８スコアの低下は、疾患重症度の減少と相関する。
【０１４４】
本開示の抗体によって治療を受けた患者は全て、ＤＡＳ２８スコアの低下を示し、治療効果による疾患重症度の減少を示す。対照的に、プラセボで治療を受けた患者は、治療からの利益を示さなかった。
【０１４５】
有効性の別の目安として、ＡＣＲ２０基準を用いた。ＡＣＲ基準は、圧痛のある関節数または膨潤関節数における改善および特定の他のパラメータにおける改善を測定する。ＡＣＲスコアを測定する手順は、高度に標準化されている。本臨床試験は、ＥＭＥＡのそれぞれのガイドラインを適用した。
【０１４６】
ＤＡＳスコアの結果と一致して、ＡＣＲスコアの結果もまた、本開示の抗体による治療の際、患者の病態の高い臨床的改善を示す。４週目後の改善は、高度に有意である。
【図１】
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【国際調査報告】
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