(57)【要約】【課題】それを必要とする被験者における肥大型心筋症の処置又は予防において有用な遺伝子治療ベクター、該遺伝子治療ベクターを含む細胞、該遺伝子治療ベクター及び／又は該ベクターを含む細胞を含む医薬組成物、そして、該遺伝子治療ベクターを処置の必要がある被験者へ導入することによって、該被験者における肥大型心筋症を処置又は予防する方法を提供する。【解決手段】本発明の遺伝子治療ベクターは、心臓サルコメアタンパク質をコードする核酸配列、及び当該核酸配列に対して機能的に連結（リンク）された心筋細胞に特異的なプロモーターを含む。【選択図】図３
2016516423.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来性の核酸配列を発現するための遺伝子治療ベクターであって、
肥大型心筋症に寄与する心臓サルコメアタンパク質をコードする遺伝子に突然変異を保有する、哺乳類の被験者の肥大型心筋症を処置又は予防する方法において使用するためのものであり、
（ａ）機能性心臓サルコメアタンパク質をコードする核酸配列、及び
（ｂ）前記核酸配列に対して機能的（operably）に連結（リンク）された心筋細胞に特異的なプロモーターを含むことを特徴とする遺伝子治療ベクター。
【請求項２】
前記心臓サルコメアタンパク質が、β−ミオシン重鎖、ミオシン心室必須軽鎖１、ミオシン心室制御軽鎖２、心臓α−アクチン、α−トロポミオシン、心臓トロポニンＴ、心臓トロポニンＩ、心臓ミオシン結合性プロテインＣ、フォーアンドアハーフＬＩＭプロテイン１（four-and-a-half LIM protein 1）及びタイチンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法において使用するための遺伝子治療ベクター。
【請求項３】
前記心筋細胞に特異的なプロモーターが、ヒト心臓トロポニンＴプロモーター（ｈＴＮＮＴ２）である、請求項１又は２に記載の方法において使用するための遺伝子治療ベクター。
【請求項４】
ｈＴＮＮＴ２プロモーターが、配列番号５の配列か、又は配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする請求項３に記載の方法において使用するための遺伝子治療ベクター。
【請求項５】
前記心臓サルコメアタンパク質が、心臓ミオシン結合性プロテインＣ（ｃＭｙＢＰ−Ｃ）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法において使用するための遺伝子治療ベクター。
【請求項６】
前記ｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質が、配列番号２の配列か、又は配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有するその改変種である、請求項５に記載の方法において使用するための遺伝子治療ベクター。
【請求項７】
前記ベクターが、プラスミドであるか、又はウィルス性のベクターである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法において使用するための遺伝子治療ベクター。
【請求項８】
前記ウィルス性のベクターが、アデノ随伴ウィルス、アデノウィルス、レトロウィルス、オルトミクソウィルス、パラミクソウィルス、パポバウィルス、ピコルナウィルス、レンチウィルス、ヘルペスシンプレックスウィルス、ワクシニアウィルス、ポックスウィルス及びαウィルスからなる群から選択される、請求項７に記載の方法において使用するための遺伝子治療ベクター。
【請求項９】
前記被験者がヒトである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法において使用するための遺伝子治療ベクター。
【請求項１０】
前記ベクターが、静脈内又は心臓内への注射又は点滴によって心筋へ投与するために製剤化される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法において使用するための遺伝子治療ベクター。
【請求項１１】
外来性の核酸配列の発現が、ノーマルなレベルの前記心臓サルコメアタンパク質を前記被験者にもたらし、前記タンパク質の非機能性突然変異バージョンのレベルを低下させることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法において使用するための遺伝子治療ベクター。
【請求項１２】
請求項１〜１１のベクターを形質導入した単離された細胞。
【請求項１３】
ヒト細胞である、請求項１１に記載の単離された細胞。
【請求項１４】
心臓細胞である、請求項１１又は１２に記載の単離された細胞。
【請求項１５】
多能性の成体幹細胞である、請求項１１又は１２に記載の単離された細胞。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の遺伝子治療ベクター又は請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の細胞を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、処置又は予防を必要とする被験者における、肥大型心筋症の処置又は予防に有用な遺伝子治療ベクターに関する。本発明の遺伝子治療ベクターは、心臓サルコメアタンパク質をコードする核酸配列、及び当該核酸配列に対して機能的（operably）に連結（リンク）された心筋細胞に特異的なプロモーターを含む。本発明は、更に、遺伝子治療ベクターを含む細胞に関連する。遺伝子治療ベクター及び／又は当該ベクターを含む細胞、を含む医薬組成物も提供される。他の視点において、本発明は、処置の必要がある被験者へ本発明の遺伝子治療ベクターを導入することによって、被験者における肥大型心筋症を処置又は予防する方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
ニコチン、高コレステロール血症又は糖尿病などの環境因子によって生じる心臓病の予防、及び心臓病（heart conditions）の前兆段階での処置においてかなりの進歩がなされているが、遺伝性の心筋症の処置を改善する方法に対するニーズがいまだに存在する。遺伝要因によって生じる心筋症の中には、肥大型心筋症（ＨＣＭ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、及び不整脈原性の右心室心筋症（ＡＲＶＣ）が含まれる。
【０００３】
ＨＣＭは、所与の患者においてそれ自体で明確な程度の異常肥大をもたらし得る他の心臓病又は全身性の病気が無い状態での、説明のつかない左心室の異常肥大によって特徴づけられる最も一般的な心筋疾患である。ＨＣＭは、最初は正常（ノーマル）な心臓収縮機能が、拡張・弛緩性の機能を損なうことに関連する(Elliott et al., 2008, Eur Heart J 29:270-276; Gersch et al., 2011, J Thorac Cardiovasc Surg 142: el53-203)。ＨＣＭは、一般的な個体群において約１：５００の特に高い罹患率を有し(Maron et al., 1995, Circulation 92: 785-789)、かつ、それは、より若い人、特に運動選手における心臓病による突然死の主要要因である。ＨＣＭは生命を脅かす病気であるが、今日まで治癒処置は存在しない(Carrier et al., 2010, Cardiovasc Res 85: 330-338; Schlossarek et al., 2011, J Mol Cell Cardiol 50: 613-20)。
【０００４】
ＨＣＭは、心臓サルコメアの構成要素（components）をコードする少なくとも１０個の遺伝子における１０００を上回る異なる突然変異によって生じることが知られている常染色体優勢の病気である。心臓サルコメアの構成要素とは、心臓ミオシン結合性プロテインＣ（ＭＹＢＰＣ３）、β−ミオシン重鎖（ＭＹＨ７）、心臓トロポニンＴ（ＴＮＮＴ２）、心臓トロポニンＩ（ＴＮＮＩ３）、ミオシン心室必須軽鎖１（ＭＹＬ３）、ミオシン心室制御軽鎖２（ＭＹＬ２）、心臓α−アクチン（ＡＣＴＣ）、α−トロポミオシン（ＴＰＭ１）、タイチン（ＴＴＮ）、フォーアンドアハーフＬＩＭプロテイン１（four-and-a-half LIM protein 1：ＦＬＨ１）などである (Richard et al., 2003, Circulation 107: 2227-2232; Schlossarek et al., 2011, J Mol Cell Cardiol 50: 613-20; Friedrich et al., 2012, Hum Mol Genet 21: 3237-54)。ほとんどの突然変異は、全長突然変異体ポリペプチドをコードするミスセンス変異である。最も良く知られた例外は、ＭＹＢＰＣ３及びＦＨＬ１であり、それらはフレームシフト変異を示し、Ｃ末端が切り詰められた（truncated）タンパク質を導く。
【０００５】
ＨＣＭにおいて最も頻繁に突然変異が導入された遺伝子は、心臓ミオシン結合性プロテインＣ（ｃＭｙＢＰ−Ｃ）をコードするＭＹＢＰＣ３である(Bonne et al., 1995, Nature Genet 11 :438-440; Watkins et al., N Engl J Med., 2011, 364: 1643-56)。ｃＭｙＢＰ−Ｃは、サルコメアのＡ−バンドの主要な構成要素であり、ミオシン、アクチン及びタイチンと相互作用する(Schlossarek et al., 2011, J Mol Cell Cardiol 50:613-20)。ヒト及びマウスにおいてｃＭｙＢＰ−Ｃは、心臓において専ら検出され(Fougerousse et al, 1998, Circ Res 82: 130-133)、そして心臓の収縮及び弛緩の制御に関与する(Pohlmann et al., 2007, Circ Res Circ Res 101, 928-38; Schlossarek et al., 2011 , J Mol Cell Cardiol 50:613-20)。ＭＹＢＰＣ３遺伝子における突然変異の約７０％が、結果としてフレームシフトを生じ、そしてＣ末端が切り詰められたタンパク質をもたらす(Carrier et al., 1997, Circ Res 80:427-434)。切り詰められたタンパク質は不安定であり、患者の心筋組織においてかつて検出されたことがない(Marston et al., 2009, Circ Res 105:219-222; van Dijk et al., 2009, Circulation 119: 1473-1483; van Dijk et al., 2012, Circ Heart Fail 5:36-46)。
【０００６】
従って、減少したレベルのｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質は、ハプロ不全がＨＣＭの病気メカニズムでありそうだという、１つの論拠である。不十分な量の全長ｃＭｙＢＰ−Ｃは、太いフィラメント構成要素（thick filament components）の化学量論性のインバランスを生じさせ、サルコメアの構造及び機能を変化させることができるであろう。ハプロ不全は、ミスセンス又はフレームシフト変異の何れかを保有するＨＣＭのマウス及びネコモデルにも含まれる(Meurs et al., 2005, Hum Mol Genet 14:3587-3593; Vignier et al., 2009, Circ Res 105:239-248)。更に、低レベルであったとしても、ネコ及びマウスの両方において、ｃＭｙＢＰ−Ｃ（全長又は切り詰められた）突然変異体の存在についての証拠が存在する。従って、第２の病気メカニズムでありそうなものは、ドミナントネガティブ（優勢ネガティブ）な影響を誘導する有毒なポリペプチドの生成であり、最も可能性が高いものは野生型（ＷＴ）遺伝子産物との競合によるものであるだろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Carrier et al., 2010, Cardiovasc Res 85: 330-338
【非特許文献２】Schlossarek et al., 2011, J Mol Cell Cardiol 50: 613-20
【発明の概要】
【０００８】
現在の薬剤ベースのＨＣＭの処置は単に経験的なものであり、兆候を緩和することができるが、病気の根本的原因である遺伝学的要因を処置することはできない。明らかに、遺伝子ベースの治療又はＲＮＡベースの治療のみが、ＨＣＭの治癒的な処置であるだろう。遺伝子治療アプローチは、非遺伝性心臓病との関連において成功裏にテストされている(Jessup et al., 2011, Circulation 124:304-313)。
【０００９】
ＵＳ２００５／０２７６８０４号及びＵＳ２００７／０２９２４３８号は、ｃＭｙＢＰ−Ｃが遺伝性心臓疾患と関連することを開示する。しかしながら、ＵＳ２００５／０２７６８０４号は、これらの疾患を処置するためのレチノール結合タンパク質又はレチノイドの減少を示唆する。ＵＳ２００７／０２９２４３８号は、種々の遺伝子に破壊を有する異なるマウスモデルの開示に限定される。
【００１０】
ＵＳ２００４／００８６８７６号及びＵＳ２００２／０１２７５４８号は、ＨＣＭと関連するヒトＭＹＢＰＣ３遺伝子における突然変異の診断を開示する。更に、これらの出願は、突然変異が導入されていないｃＭｙＢＰ−Ｃをコードする核酸の、患者への投与によるＨＣＭの処置を示唆する。
【００１１】
Merkulov et al., 2012, Circ Heart Fail, 5:635-644は、ｃＭｙＢＰ−Ｃ欠損（ｃＭｙＢＰ−Ｃ−／−）マウスの心筋へのネズミ（murine）Ｍｙｂｐｃ３遺伝子の形質導入を開示する。該著者らは、ｃＭｙＢＰ−Ｃの不在が、結果として機能障害及び異常肥大をもたらすと推察している（assume）。遺伝子導入は、心臓収縮・弛緩的収縮性機能を改善し、ｃＭｙＢＰ−Ｃ欠損（ｃＭｙＢＰ−Ｃ−／−）マウスにおける左心室壁の厚さの減少を導いた。
【００１２】
Vignier et al., 2009, Circ Res 105:239-248は、Ｇ＞Ａの点突然変異を保有するＭｙｂｐｃ３をターゲットとしたノックイン（ＫＩ）マウスモデルを開発し、結果として異常な遺伝子転写及びスプライシングに起因する異なる突然変異体ｍＲＮＡｓ及びタンパク質がもたらされた。アドレナリン作用性のストレス又は加齢などの外因性のストレスが、ＫＩマウスにおけるユビキチン−プロテアソームシステム（ＵＰＳ）の飽和を、そして最終的には該システムの障害へと導き、潜在的にはその後の突然変異体ｃＭｙＢＰ−Ｃポリペプチドの蓄積を導くこと、が示された。
【００１３】
本願発明者らは、心臓サルコメアタンパク質をコードする遺伝子における、ドミナントネガティブな様式で作用するヘテロ対立遺伝子の突然変異に起因するＨＣＭを患う被験者において、突然変異が導入されていない対応遺伝子を提供する遺伝子導入ベクターの導入が、ノーマルなレベルのサルコメアタンパク質を回復させることのみならず、有毒な突然変異体ポリペプチド（さもなくば、突然変異体の対立遺伝子（単数又は複数）の転写を介して生成される）の有害な影響も最小化させること、を発見した。
【００１４】
つまり、ベクター誘導性の心筋細胞に特異的なプロモーターの制御下での外来性野生型（ＷＴ）遺伝子の発現は、突然変異したＭＹＢＰＣ３対立遺伝子を保有する被験者における突然変異体タンパク質のドミナントネガティブな影響を克服し、かつ、驚くべきことに、遺伝子治療ベクターを介したノーマルな対立遺伝子の発現は、内来性の突然変異体対立遺伝子の発現を効果的に減少させるので、毒性ではない。この効果は、サルコメアタンパク質の恒常性維持及びターンオーバーの厳密（tight）な細胞内コントロールに起因する心臓細胞における自律的な現象として生じると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｍｙｂｐｃ３をターゲットとしたノックイン（ＫＩ）マウス及び野生型（ＷＴ）マウスにおける心臓病の分子的解析を示す。（Ａ）Ｍｙｂｐｃ３遺伝子におけるＧ＞Ａへの変化は、Ｃｒｅ／ｌｏｘシステムを使用して取得し、結果としてＫＩマウスにおける３つの異なる突然変異体ｍＲＮＡｓがもたらされた。（Ｂ）ＷＴ及びホモ接合型ＫＩマウスの心室組織におけるトータルＭｙｂｐｃ３ｍＲＮＡレベルを示す。（Ｃ）特異的な抗体を使用するウェスタンブロットによって測定されたＷＴ及びＫＩ心室組織におけるｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質レベルを示す。マウスの匹数は、バー内に示される。
【００１６】
【図２】ヒト心臓トロポニンＴプロモーター（ｈＴＮＮＴ２）の制御下でＦＬＡＧタグ付きマウスＭｙｂｐｃ３を発現するｐＧＧ２ベクターの、模式的な直線状の図（上部パネル）及び環状の図（下部パネル）を示す。
【００１７】
【図３】Ｍｙｂｐｃ３をターゲットとしたノックイン（ＫＩ）新生仔マウスから単離された心筋細胞における、アデノ随伴ウィルスセロタイプ６を使用したＡＡＶ６媒介性のＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３遺伝子導入を示す。（Ａ）ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３（外来性のＭｙｂｐｃ３のｍＲＮＡ）、トータルＭｙｂｐｃ３（内来性及び外来性のＭｙｂｐｃ３のｍＲＮＡｓ）、及びＭｙｈ６（α−ミオシン−重鎖をコードする）のｍＲＮＡｓについてのＲＴ−ＰＣＲは、ＫＩ心室ＲＮＡにおいて実行した。「−ＲＴ」は、ｃＤＮＡ反応の間に逆転写酵素が無いことを示す。（Ｂ）トータルＭｙｂｐｃ３のＲＴ−ｑＰＣＲを、野生型（ＷＴ）マウス、及びＫＩ新生仔マウス（ＡＡＶ６−ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３を形質導入したもの（ＫＩ  ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３）、又は形質導入をしていないもの（ＫＩ  ｕｎｔｒ））から単離された心筋細胞において評価した。（Ｃ）ＲＴ−ｑＰＣＲを用いた異なる突然変異体Ｍｙｂｐｃ３のｍＲＮＡｓの検出を示す。（Ｄ）ＷＴ心筋細胞、ＫＩ心筋細胞（ＧＦＰを形質導入したもの（ＧＦＰ）、ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３を形質導入したもの（Ｍｙｂｐｃ３）、又は形質導入をしていないもの（ｕｎｔｒ））、又はＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ）から抽出したタンパク質溶解物に対して、抗ｃＭｙＢＰ−Ｃ抗体を用いてウェスタンブロットを実行した。（Ｅ）ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３を形質導入したＫＩ新生仔マウスの心筋細胞（ＮＭＣＭｓ）の免疫蛍光解析を示す。心筋細胞は、形質導入（ＭＯＩ  ３，０００）の７日間後に固定し、そして抗ＦＬＡＧ（ＦＬＡＧ）及び抗ｃＭｙＢＰ−Ｃ（ｃＭｙＢＰ−Ｃ）抗体を用いて２重染色した。核は、ＤＲＡＱ５（登録商標）を用いて染色した。ｍｅｒｇｅ画像は、そのより高い倍率のものを含んで、右パネルに示される。スケールバーが示される。
【００１８】
【図４】Ｍｙｂｐｃ３をターゲットとしたノックイン（ＫＩ）心臓細胞に由来する、遺伝子操作された心臓組織（ＥＨＴ）におけるＡＡＶ６媒介性のＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３遺伝子導入を示す。（Ａ）ＥＨＴにおけるＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲは、ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３のｍＲＮＡのみを検出するために、特異的なプライマーを使用して実行した。（Ｂ）トータルＭｙｂｐｃ３のｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを示す。（Ｃ）ＥＨＴの自発収縮活性は、培養７日目、９日目、１４日目及び１９日目において測定した。データは、ｍｅａｎ±ＳＥＭとして表現される。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．ＧＦＰ；＃Ｐ＜０．０５及び＃＃Ｐ＜０．０１ｖｓ．Ｃｔｒｌ。
【００１９】
【図５】新生仔のＭｙｂｐｃ３をターゲットとしたノックインマウスにおけるＡＡＶ９媒介性のＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３遺伝子導入を示す。（ａ）ＦＬＡＧ−タグが付けられたトータルＭｙｂｐｃ３のｍＲＮＡｓのＲＴ−ＰＣＲは、心室、肝臓及び骨格筋におけるＲＴ−ＰＣＲによって評価した。Ｃｔｒ：ＰＢＳ投与。（Ｂ）心室、肝臓及び骨格筋から抽出されたタンパク質のウェスタンブロットによるｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質の測定を示す。（Ｃ）ＡＡＶ９−ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３−形質導入ＫＩマウスの心筋切片の免疫蛍光解析を示す。１日齢のＫＩマウスの側頭静脈へ、７週間にわたって、ＡＡＶ９−ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３を投与した。凍結切片（１０μｍ〜の厚さ）は、ＦＬＡＧ及びｃＭｙＢＰ−Ｃを指向する（対する）抗体を用いて染色した。ｍｅｒｇｅ画像は、そのより高い倍率のものを含んで、右パネルに示される。免疫蛍光解析は、４０ｘの油浸対物レンズを用いた共焦点顕微鏡検査によって実行した。スケールバーが示される。（Ｄ）左心室内径短縮率（fractional area shortening：ＦＡＳ）及び体重に対する左心室容積の割合（left ventricular mass-to-body weight ratio：ＬＶＭ／ＢＷ）を、野生型（ＷＴ）、ＰＢＳ処置ノックイン（ＫＩ−）及びＡＡＶ９−ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３を注射したＫＩ（ＫＩ＋）における超音波心臓検査によって測定した。評価は、３、５、６及び７週齢において実行した。データは、ｍｅａｎ±ＳＥＭとして表現される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＷＴマウス。
【００２０】
【図６】ヒト心筋細胞における外来性ヒトｍｙｃ−ＭＹＢＰＣ３の発現を示す。ヒト心筋細胞はヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来し、ｍｙｃ−タグ付きヒトＭＹＢＰＣ３をコードするアデノウィルス（１０又は３０のＭＯＩ）を用いて形質導入した。（Ａ）ｉＰＳＣ由来のヒト心筋細胞における外来性ｍｙｃ−ＭＹＢＰＣ３のＲＴ−ＰＣＲを示す。外来性ＭＹＢＰＣ３のｍＲＮＡは、特異的なプライマーを用いて増幅し、トータルＭＹＢＰＣ３のｍＲＮＡは、外来性及び内来性ＭＹＢＰＣ３の両方を認識するプライマーを用いて増幅した。（Ｂ）ｉＰＳＣ由来のヒト心筋細胞における外来性ｍｙｃ−ｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質のレベルを示す。ウェスタンブロット解析は、ｍｙｃタグ配列（＝外来性ｍｙｃ−ｃＭｙＢＰ−Ｃ）又はｃＭｙＢＰ−Ｃ（＝トータルｃＭｙＢＰ−Ｃ）のＣＯ−Ｃ１ドメインの何れかを指向する抗体を使用して実行した。ポジティブコントロール（＋）は、同一のアデノウィルスを用いて形質導入したネズミ心筋細胞のサンプルに対応する。（Ｃ）免疫蛍光法によって解析した、ｉＰＳＣ由来のヒト心筋細胞における外来性ヒトｍｙｃ−ｃＭｙＢＰ−Ｃの局在化を示す。ｃＭｙＢＰ−Ｃ：抗ｃＭｙＢＰ−Ｃ抗体；ｍｙｃ（すなわち外来性ｃＭｙＢＰ−Ｃ）：抗ｍｙｃ抗体。スケールバーが図中に示される。略称：ＮＴ、形質導入していない；ＭＯＩ、感染の多重度；−ＲＴ、逆転写酵素無し。
【００２１】
【図７．１】図７．１は、グラフ／ブロットＡ−Ｃを示す。Ｍｙｂｐｃ３をターゲットとしたノックインマウスにおける長期間のＭｙｂｐｃ３遺伝子治療を示す。異なる投与量のアデノ随伴ウィルスセロタイプ９（ＡＡＶ９）−Ｍｙｂｐｃ３（１ｘ１０１１、３ｘ１０１１、１ｘ１０１２及び３ｘ１０１２のベクターゲノム（ｖｇ）／マウス）又はＰＢＳを、心臓病表現型が現れる前に１日齢のＭｙｂｐｃ３をターゲットとしたノックイン（ＫＩ）マウスへ投与した。全てのデータを、３４週後に取得した。（Ａ）心臓収縮機能（＝ｄＰ／ｄｔｍａｘ）及び心臓弛緩機能（＝ｄＰ／ｄｔｍｉｎ）の解析、及び、体重に対する心臓重量の割合の測定（ＨＷ／ＢＷ）を、３４週齢の、ＷＴマウス、ＰＢＳで処置したＫＩマウス及び最も高い投与量である３ｘ１０１２ｖｇで処置したＫＩマウスにおいて実行した。（Ｂ）外来性ＦＬＡＧタグＭｙｂｐｃ３（上部パネル）及びトータルＭｙｂｐｃ３（下部パネル）のｍＲＮＡのレベルを評価するためのＲＴ−ＰＣＲを示す。ＲＮＡは、心室組織から抽出し、そして各グループ（ｎ＝５〜１０／グループ）においてプールした。ＰＣＲ増幅されたバンドのサイズは、左側に示される。（Ｃ）トータルＭｙｂｐｃ３のｍＲＮＡのレベルを、３４週齢の、ＷＴマウス、ＰＢＳで処置したＫＩマウス及び最も高い投与量である３ｘ１０１２ｖｇで処置したＫＩマウスにおいて実行したＲＴ−ｑＰＣＲによって測定した。
【００２２】
【図７．２】図７．２は、グラフ／ブロットＤ−Ｅを示す。（Ｄ）外来性ＦＬＡＧタグｃＭｙＢＰ−Ｃ（上部パネル）及びトータルｃＭｙＢＰ−Ｃ（下部パネル）のタンパク質レベルの評価のためのウェスタンブロットを示す。各グループからの心室タンパク質抽出物は、解析のためにプールした。ブロット（各々の条件は上側部分に示される）は、ＦＬＡＧエピトープ又はトータルｃＭｙＢＰ−Ｃを指向する抗体を用いて染色した。ＧＡＰＤＨを指向する抗体は、ローディングコントロール（各々の条件の下側部分に示される）として使用した。（Ｅ）ＧＡＰＤＨ及び関連するＷＴに対して規格化（ノーマライズ）したｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質レベルの定量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、ＨＣＭを処置又は予防するための新規の治療アプローチに関連する。心臓サルコメアタンパク質をコードするいくつかの遺伝子における突然変異が、機能的な全長サルコメアタンパク質の減少したレベルを導くことが知られている。これは、通常はユビキチン−プロテアソームシステム（ＵＰＳ）によって分解される、切り詰められた突然変異体ポリペプチドを生成するフレームシフト変異に起因する。しかしながら、外因性ストレスの条件下では、ＵＰＳの機能は妨害され、結果として突然変異体ポリペプチドの蓄積をもたらし得る。つまり、該突然変異体ポリペプチドは、サルコメアに組み込まれ、野生型ｃＭｙＢＰ−Ｃに対してドミナントネガティブな様式の有毒性ペプチドとして作用することができ、ＨＣＭの病因に寄与する(上記のVignier et al, 2009)。類似の発見が、フォーアンドアハーフＬＩＭプロテイン１（four-and-a-half LIM protein 1）に関してなされている(Friedrich et al., 2012, Hum Mol Genet 21 :3237-3254)。どの突然変異体ｃＭｙＢＰ−Ｃポリペプチドも生じないＭｙｂｐｃ３をターゲットとしたノックアウトは、同一条件下であっても、いずれのＵＰＳの機能不全も示さなかった(Schlossarek et al. , 2012, Basic Res Cardiol 107: 1-13; Schlossarek et al., 2012, J Muscle Res Cell Motil 33: 5-15)。
【００２４】
本願において、遺伝子治療ベクターを介した、心臓サルコメアタンパク質の遺伝子に突然変異を保有する被験者への、機能的バージョンの心臓サルコメアタンパク質（ｃＭｙＢＰ−Ｃなど）をコードする野生型ｃＤＮＡの遺伝子導入は、心筋（すなわち、心筋細胞によって構成される心臓の筋肉組織）におけるノーマルなレベルのタンパク質を回復するのみならず、有毒なｍＲＮＡｓ及び／又は有毒なポリペプチドの生成（さもなくば、当該被験者のゲノム内の突然変異が導入された心臓サルコメアタンパク質をコードする対立遺伝子の発現によってもたらされるだろう）を防止すること、が示される。細胞内での過剰な量外来性野生型（ＷＴ）タンパク質をもたらすことが見出せなかったので、多量の遺伝子治療ベクターの導入が、処置される患者にとっての高いリスクと関連しないことも発見された。予想されなかったことに、心臓サルコメアタンパク質の発現が細胞内で化学量論的に厳密に制御されるように思われ、患者に対して有害であり得た量の外来性タンパク質をもたらすことができないことを意味する。従って、本発明は、被験者におけるＨＣＭを処置するための単純でかつ安全な方法を提供する。
【００２５】
十分なレベルのノーマルなｃＤＮＡを提供することの組み合わせ効果は、適切な心臓サルコメアタンパク質の生成、及び有毒なｍＲＮＡｓ／ポリペプチドの抑制をもたらし、結果的にＨＣＭの有効な処置をもたらす。いかなる理論と結びつけられることなく、遺伝子治療ベクターを介した外来性遺伝子の発現が、サルコメアの特異的な転写因子についての競合によって、突然変異が導入された対立遺伝子からの内来性の発現を減少させると考えられる。
【００２６】
従って、第１の視点において、本発明は、
（ａ）心臓サルコメアタンパク質をコードする核酸配列、及び、
（ｂ）核酸配列に対して機能的（operably）にリンク（連結）された心筋細胞に特異的なプロモーターを含む、外来性の核酸配列を発現するための遺伝子治療ベクターを提供する。
【００２７】
遺伝子治療ベクターは、処置の必要がある哺乳類の被験者、好ましくはヒト被験者のＨＣＭの処置又は予防における使用に適する。処置の必要がある被験者は、ＨＣＭに寄与する心臓サルコメアタンパク質をコードする対応遺伝子に突然変異を保有する者である。処置されるべき被験者への投与の後に、ベクターは、被験者、好ましくは被験者の心筋において、コードされる心臓サルコメアタンパク質の発現をもたらす。
【００２８】
被験者において発現される心臓サルコメアタンパク質は、ＨＣＭと関連することが知られている。すなわち、心臓サルコメアタンパク質をコードする遺伝子における突然変異が非機能的なタンパク質の改変種（バリアント）（例えば、全長又は切り詰められた改変種又は突然変異体）の発現を導き、最終的にＨＣＭを生じる。これまでに、異なる心臓サルコメアタンパク質をコードする少なくとも１０個の遺伝子における突然変異が、ＨＣＭを生じることが知られている。サルコメアは、筋肉の基本的なユニットであり、隣接する２つのＺ−ディスクの間のセグメントとして定義される。本発明によれば、サルコメアタンパク質が遺伝子治療ベクターによって発現されることは、心臓の筋肉のサルコメア内で当該タンパク質がナチュラルに生じることを意味する。
【００２９】
被験者において発現される心臓サルコメアタンパク質は、心臓サルコメアに存在する構造タンパク質又は制御タンパク質であり得る。該タンパク質は、 好ましくは、β−ミオシン重鎖（遺伝子MYH7, RefSeqGene NG_007884.1によってコードされる）、ミオシン心室必須軽鎖１（遺伝子MYL3, RefSeqGene NG_007555.2によってコードされる）、ミオシン心室制御軽鎖２（遺伝子MYL2, RefSeqGene NG_007554.1によってコードされる）、心臓αアクチン（遺伝子ACTC1, RefSeqGene NG_007553.1によってコードされる）、α−トロポミオシン（遺伝子TPMl, RefSeqGene NG_007557.1によってコードされる）、心臓トロポニンＴ（遺伝子TNNT2, RefSeqGene NG_007556.1によってコードされる）、心臓トロポニンＩ（遺伝子TNNI3, RefSeqGene NG_007866.2によってコードされる）、心臓ミオシン結合性プロテインＣ（遺伝子, RefSeqGene NG_007667.1によってコードされる）、タイチン（遺伝子TTN, RefSeqGene NG 011618.1によってコードされる）、及び、フォーアンドアハーフＬＩＭプロテイン１（遺伝子FHL1, RefSeqGene NG_015895.1によってコードされる）(Richard et al., 2003, Circulation 107:2227-2232; Friedrich et al., 2012, Hum Mol Genet, 21 :3237-54)からなる群から選択される。
【００３０】
本発明の遺伝子治療ベクターによって発現される心臓サルコメアタンパク質は心臓ミオシン結合性プロテインＣ（ｃＭｙＢＰ−Ｃ）であることが好ましい。該タンパク質は、マウス、ネコ、ブタ又はサルなどの異なる種に由来することができる。本発明の好ましい一実施形態において、発現されるｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質は、ネズミｃＭｙＢＰ−Ｃ、好ましくは、添付の配列表の配列番号４（NCBI accession number: NP_032679.2）に示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有するネズミｃＭｙＢＰ−Ｃである。配列番号４のネズミｃＭｙＢＰ−Ｃをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３（NCBI accession number: NM_008653.2）において表わされる。
【００３１】
本発明は、特に、ＨＣＭを患うヒト患者の処置を含む。従って、本発明の他の好ましい実施形態において、ベクターに挿入される核酸（ヒトｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質をコードする）はヒト起源のものである。好ましくは、ヒトｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質は、配列番号２（NCBI accession number: NP_000247.2）に示されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有する。ヒトｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１（NM_000256.2）において示されるヒトｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質をコードする。
【００３２】
発現されるタンパク質は、オリジナルのタンパク質と比較して顕著なアミノ酸配列同一性を示す、上述のタンパク質の１つの機能的な改変種でもあり得る。好ましくは、アミノ酸同一性の大きさは、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。好ましくは、改変種のアミノ酸同一性は、少なくとも７０％、８０％又は９０％である。この文脈において、用語「機能的な改変種」とは、サルコメアタンパク質の改変種が、ナチュラルに生じる心臓サルコメアタンパク質の機能を満足する、例えば、構造上の／機能的な支持をもたらすことが可能であることを意味する。
【００３３】
心臓サルコメアタンパク質の機能的な改変種は、例えば、それらの１以上のアミノ酸置換、欠損又は添加によってナチュラルに生じるものとは異なるタンパク質を含み得る。例えば、配列番号２に示されるヒトｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質の改変種タンパク質は、２、３、４、５、６個、又は１０、２０、３０個まで、又はより多くの位置で配列番号２に対して相対的に別のアミノ酸によって置換されているアミノ酸配列を有し得る。例えば、機能的な改変種は、例えば、ナチュラルに生じるエクソン５及び６が欠損したＭｙｂｐｃ３スプライシング改変種（改変種４と命名されたもの（配列番号２８に示す））からなる群から選択され得る。
【００３４】
アミノ酸置換は、保存的なもの又は非保存的なものであることができる。置換は、保存的な置換、すなわち、類似の極性のアミノ酸によるアミノ酸残基の置換であり、機能的な均等物として作用することが好ましい。好ましくは、置換先として使用されるアミノ酸残基は、置換元のアミノ酸残基と同一グループのアミノ酸から選択される。例えば、疎水性残基は他の疎水性残基で置換することができ、又は、極性残基は、同一の電荷を有する他の極性残基で置換することができる。保存的な置換に使用され得る機能的に相同性のアミノ酸は、例えば、グリシン、バリン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン及びトリプトファンなどの無極性のアミノ酸を含む。電荷を帯びていない極性アミノ酸の例は、セリン、スレオニン、グルタミン、アスパラギン、チロシン及びシステインを含む。電荷を帯びた極性（塩基性）のアミノ酸の例は、ヒスチジン、アルギニン及びリシンを含む。電荷を帯びた極性（酸性）のアミノ酸の例は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。
【００３５】
ナチュラルに生じるものとは１以上の（例えば２、３、４、５、１０、又は１５個の）追加のアミノ酸によって異なるタンパク質も、改変種として考慮される。これらの追加のアミノ酸は、オリジナルのサルコメアタンパク質のアミノ酸配列内に（すなわち挿入として）存在し得るし、又は、タンパク質の末端の一方又は両方に付け加えられ得る。基本的には、アミノ酸の追加が、ナチュラルに生じる心臓サルコメアタンパク質の機能を満足するポリペプチドの能力を損なわせないか、及び／又は処置された被験者におけるハプロ不全を救う場合には、挿入は、いかなる位置で行うこともできる。さらに、サルコメアタンパク質の改変種は、オリジナルのポリペプチドと比較して１以上のアミノ酸が欠損したタンパク質も含む。心臓サルコメアタンパク質のノーマルな機能を満足する能力を損なわせないか、及び／又はハプロ不全を救うことを条件として、そのような欠損は、どのアミノ酸位置にも影響し得る。
【００３６】
最終的には、心臓サルコメアタンパク質の改変種も、改変されたアミノ酸などの構造上の変更によってナチュラルに生じるタンパク質とは異なるタンパク質を意味する。本発明によれば、改変されたアミノ酸は、プロセッシング又は翻訳後修飾などのナチュラルなプロセスによるものか、又は本発明の技術分野において知られた化学的修飾プロセスによるもの何れかによって改変されているアミノ酸である。典型的なアミノ酸修飾は、リン酸化、グリコシル化、アセチル化、Ｏ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン化、グルタチオン付加、アシル化、分岐状化、ＡＤＰリボシル化、クロスリンキング、ジスルフィド架橋形成、ホルミル化、ヒドロキシル化、カルボキシ化、メチル化、脱メチル化、アミド化、環状化及び／又はホスファチジルイノシトール、フラビン誘導体、リポテイコ酸、脂肪酸又は脂質に対する共有結合又は非共有結合を含む。そのような修飾は、文献、例えば、in Proteins: Structure and Molecular Properties, T. Creighton, 2nd edition, W. H. Freeman and Company, New York (1993)に、広範囲に記載されている。本発明の好ましい実施形態において、核酸配列は、恒常的にリン酸化されたヒトｃＭｙＢＰ−Ｃのアイソフォームをコードする。これらのアイソフォームが特に心臓保護的であることが示されている(Sadayappan et al., (2005), Circ Res 97:1156-1163; Sadayappan et al., 2006; Proc Natl Acad Sci USA 103:16918-16923)。
【００３７】
遺伝子治療ベクターは、好ましくは、それを必要とする被験者におけるＨＣＭを処置又は予防するためのものである。ベクターで処置されるべき被験者は、ＨＣＭを有すると診断されている被験者、ＨＣＭを発症する増加したリスクを有する被験者、又はＨＣＭを発症する病気を患った被験者であることができる。本発明の好ましい視点において、被験者は、ＨＣＭと関連することが知られている心臓サルコメアタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子における突然変異の結果として、ＨＣＭを有すると診断されたヒト被験者である。
【００３８】
本発明の他の好ましい視点において、本発明のベクターで処置される被験者は、突然変異の結果として心臓サルコメアタンパク質の機能を損なう遺伝子突然変異を保有し、心臓サルコメアタンパク質をオリジンとする１つ以上の機能障害性のタンパク質種（species）を生成する。
【００３９】
本発明の他の好ましい視点において、心臓サルコメアタンパク質における突然変異は、被験者におけるハプロ不全を生じる。ハプロ不全は、１つの機能障害性の対立遺伝子によって特徴付けられ、残りの機能的な対立遺伝子が野生型の表現型をもたらす十分なレベルの遺伝子産物を生成しない、二倍体生命体の状態を示す。
【００４０】
本発明は、処置されるべき被験者のゲノムにおける突然変異を導入された対立遺伝子を補償する完全な（intact）外来性バージョンの野生型遺伝子をもたらす遺伝子治療ベクターの投与によって、ＨＣＭの表現型を効果的に改善（ないし回復）させる又は根絶することができるという驚くべき知見に基づく。予期されなかったことに、有毒なｍＲＮＡ及び／又はポリペプチド（両方とも、突然変異が導入された対立遺伝子に由来する）の蓄積を効果的に予防することができることが分かった。従って、１つの実施形態において、記載される遺伝子治療ベクターは、哺乳類の被験者の肥大型心筋症を処置又は予防する方法において使用するためのものであり、ここで被験者は、心臓サルコメアタンパク質をオリジンとする１以上の機能障害性のタンパク質種を生成し、そして、任意的であるが（optionally）、該治療を施すことによって、１以上の機能障害性のタンパク質種の減少がもたらされる。「減少」とは、１以上の機能障害性のタンパク質種のレベルのことを意味し、投与前のレベルと比較して、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％を上回って減少する。好ましい実施形態において、１以上の機能障害性のタンパク質種のレベルは、投与前のレベルと比較して、２０％を上回って減少する。
【００４１】
好ましくは、「１以上の機能障害性のタンパク質種のレベル」は、サルコメアタンパク質の全ての機能障害性の種を組み合わせたもの、すなわちサルコメアタンパク質の機能障害性の種の全体的なレベルである。
【００４２】
ＨＣＭとは、結果的に低下した完全性（integrity）をもたらす心臓の筋肉の劣化（deterioration）のことを意味する。これは、心拍リズムの疾患及び最終的には心不全を導き得る。ＨＣＭは、遺伝子学的及び臨床的に異質（heterogeneous）なサルコメアの病気であり、特に、それ自体で所与の患者において明確な程度の異常肥大をもたらすことができる他の心臓病の又は全身性の病気が無い状態で、心室中隔及び左心室における筋肉の壁が厚くなることによって特徴付けられる。壁が厚くなることの結果として、左心室からの流出管が狭く成り得る。ＨＣＭの特徴は、筋細胞の異常肥大、筋肉細胞の配列不良ないし乱雑化（disarray）、間質性線維症、小冠状動脈疾患（small vessel coronary disease）及び／又は左心室からの流出障害である。ＨＣＭは、最初はノーマルな心臓収縮と関連するが、大多数のケースにおいて弛緩機能を損なっている。従って、本発明の好ましい実施形態において、遺伝子治療ベクターは、それを必要とする被験者におけるＨＣＭを処置又は予防するためのものであり、ここで、ＨＣＭは、心室中隔及び／又は左心室における筋肉の壁が厚くなること、及び弛緩機能の障害によって特徴付けられる。
【００４３】
治療上のベクターが投与された被験者において、心臓サルコメアタンパク質、例えば上述のタンパク質の１つを外来的に発現する際に、突然変異が導入された対立遺伝子から発現した機能障害性の突然変異タンパク質を補うように全長タンパク質を発現することは必須ではないことがわかり得る。その代わりに、全長サルコメアタンパク質の機能的フラグメント又はその上記定義の改変種のみを発現することで十分であり得る。従って、本発明は、それを必要とする被験者におけるＨＣＭを処置又は予防するための、心臓サルコメアタンパク質の機能的フラグメント又はそれらの改変種の使用を含む。ここで使用されるように、本発明の心臓サルコメアタンパク質のフラグメントは、Ｎ末端及び／又はＣ末端における１又は複数のアミノ酸の欠損によってナチュラルに生じるタンパク質とは異なるタンパク質である。ここで、該異なるタンパク質は、ナチュラルに生じる心臓サルコメアタンパク質のノーマルな機能を満足する能力の少なくとも一部分を保持する。
【００４４】
心臓サルコメアタンパク質をコードする核酸配列は、遺伝子治療ベクターの形状で処置されるべき被験者に投与される。遺伝子治療ベクターとは、すなわち、プロモーター、コザック配列、ポリＡシグナル及び同様のものなどの外来性の核酸の発現をもたらすために必要とされる他の配列の隣に、翻訳及び終止コドンを含むコード配列を含む核酸構築物である。被験者において外来性の核酸配列を発現するための遺伝子治療ベクターは、本発明の技術分野において良く知られている。
【００４５】
例えば、遺伝子治療ベクターは、哺乳類の発現系の一部であり得る。有用な哺乳類の発現系及び発現構築物は、本発明の分野の先行文献において開示されている。いくつかの哺乳類の発現系も、異なる製造者によって供給されており、本発明において採用することができる。いくつかの哺乳類の発現系とは、プラスミド又はウィルスベクターをベースとしたシステムなどであり、例えば、LENTI-Smart（登録商標） (InvivoGen), GenScript（登録商標） Expression vectors, pAdVAntage（登録商標） (Promega), ViraPower（登録商標） Lentiviral, Adenoviral Expression Systems (Invitrogen) 及び adeno-associated viral expression systems (Cell Biolabs)である。
【００４６】
本発明の遺伝子治療ベクターは、例えば、ウィルス性の又は非ウィルス性の発現ベクターであることができる。当該発現ベクターは、外来性の核酸を、その後の当該核酸によってコードされるタンパク質を発現するための細胞に導入することに適するものである。ベクターは、特に、心筋細胞内でのコードされるサルコメアタンパク質の発現をもたらすように採用されるべきである。好ましい実施形態において、ベクターは、心筋細胞内でのコードされるサルコメアタンパク質の特異的な発現をもたらす。発現が他の非心臓細胞タイプ又は心筋細胞ではない心臓細胞におけるものよりも少なくとも２倍高い場合には、発現は「特異的」である。
【００４７】
発現ベクターは、エピソーマルベクター（すなわち宿主細胞内で自律的に自己複製することが可能なもの）か、又は組み込みベクター（すなわち細胞及びゲノムへ安定に組み込まれるもの）であることができる。宿主細胞における発現は、構成的（ないし恒常的）なもの又は制御性（例えば誘導性）のものであることができる。好ましくは、機能的な外来性の心臓サルコメアタンパク質は、細胞内に、好ましくは宿主細胞のサルコメア内に位置する。
【００４８】
本発明の遺伝子治療ベクターは、通常は、サルコメアタンパク質をコードする核酸に対して機能的に連結（リンク）されたプロモーターを含むだろう。プロモーター配列は、コンパクトであり、かつ強力な発現を保障しなければならない。好ましくは、プロモーターは、遺伝子治療ベクターで処置された患者の心筋におけるサルコメアタンパク質の発現を生ずる。より好ましくは、プロモーターは、患者の心筋におけるサルコメアタンパク質の特異的な発現を生ずる。発現が心筋に属さない細胞におけるものよりも少なくとも２倍高い場合には、発現は「特異的」である。実質的にサルコメアタンパク質が心筋に属さない細胞内で発現されないことが更に好ましい。この文脈において「実質的に〜ない」とは、ベクターから発現されるサルコメアタンパク質の１０％未満、５％未満、１％未満が心筋に属さない細胞内で発現されることを意味する。
【００４９】
適切なプロモーターは、例えば、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、サイトメガロウィルスエンハンサ＋ミオシン軽鎖２のプロモーター（CMV-MLC2, 又はCMV-MLC1.5, CMV-MLC260)、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、及び心臓トロポニンＴプロモーター（ＴＮＮＴ２）、及びいずれかの他のサルコメアに特異的なプロモーターを含む。好ましくは、これらのプロモーターは、ヒト遺伝子に由来する。
【００５０】
特に好ましい実施形態において、遺伝子治療ベクターは、心臓サルコメアタンパク質をコードする核酸配列に機能的（operably）に連結された心臓に特異的なプロモーターを含む。本願において使用される「心臓に特異的なプロモーター」とは、心臓細胞内での活性が、いずれかの他の非心臓細胞タイプ内での活性よりも少なくとも２倍高いプロモーターを意味する。好ましくは、本発明のベクター内での使用に適する心臓に特異的なプロモーターは、非心臓細胞タイプ内での活性と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、又は少なくとも５０倍高い心臓細胞での活性を有する。
【００５１】
更に好ましい実施形態において、遺伝子治療ベクターは、心臓サルコメアタンパク質をコードする核酸配列に機能的（operably）に連結された心筋細胞に特異的なプロモーターを含む。本願において使用される「心筋細胞に特異的なプロモーター」とは、心筋細胞内での活性が、いずれかの他の非心臓細胞タイプ又は心筋細胞でない心臓細胞における活性よりも少なくとも２倍高いプロモーターを明示する。好ましくは、本発明のベクターにおける使用に適する心筋細胞に特異的なプロモーターは、非心臓細胞タイプ又は心筋細胞ではない心臓細胞タイプにおける活性と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、又は少なくとも５０倍高い、心筋細胞内での活性を有する。
【００５２】
好ましくは、心臓に特異的な又は心筋細胞に特異的なプロモーターは、ヒトプロモーターである。本願の実施例において見出すことができるように、本発明のベクターにとって有用であることが証明されているプロモーターの１つは、配列番号５に示すヒトＴＮＮＴ２プロモーターなどの心臓トロポニンＴプロモーター（ＴＮＮＴ２）である。従って、本発明の心筋細胞に特異的なプロモーターは、好ましくは、配列番号５の配列、又は配列番号５に対して少なくとも８０％、より好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列同一性を有する機能的に均等の配列を含む。好ましい実施形態において、遺伝子治療ベクターは、心臓サルコメアタンパク質をコードする核酸配列に機能的（operably）に連結されたＴＮＮＴ２プロモーターを含む。更に好ましい実施形態において、ベクターは、心臓サルコメアタンパク質をコードする核酸配列に機能的（operably）に連結された配列番号５のヒトＴＮＮＴ２プロモーターを含む。他の心臓に特異的なプロモーターは、αミオシン重鎖プロモーター、ミオシン軽鎖２ｖプロモーター、αミオシン重鎖プロモーター、α−心臓アクチンプロモーター、α−トロポミオシンプロモーター、心臓トロポニンＣプロモーター、心臓トロポニンＩプロモーター、心臓ミオシン結合性プロテインＣ プロモーター、及びsarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase（ＳＥＲＣＡ）プロモーター（例えば、このプロモーターのアイソフォーム２（ＳＥＲＣＡ２））を含む。
【００５３】
心臓の筋肉組織は、サルコメアの繰り返しを有する横紋筋組織である。従って、更なる実施形態において、遺伝子治療ベクターは、デスミンプロモーター（desmin promoter）などの横紋筋プロモーターを含む。
【００５４】
心臓に特異的な又は心筋細胞に特異的なプロモーターは、心臓サルコメアタンパク質をコードする核酸配列に機能的（operably）に連結されており、このことは、細胞のゲノム内に組み込まれた場合又は細胞内でゲノム外の核酸構築物として存在する場合には、プロモーターの制御下で心筋細胞内でコード核酸の発現が可能なようにプロモーターがコード核酸と組み合わされることを意味する。
【００５５】
任意的に追加される構成要素として、遺伝子治療ベクターは、サルコメアタンパク質の発現レベルを増加させるためのエンハンサー要素を含むことができる。エンハンサー要素の例は、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー及びラウス肉腫ウィルスの長い末端反復配列（long terminal repeat：ＬＴＲ）を含む（Gorman et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. 79:6777）。ベクターは、ヒト及び／又は非ヒト抗原（単数又は複数）の改善された発現のために、転写終結配列及びポリアデニル化配列も任意的に含む。適切な転写終結因子及びポリアデニル化シグナルは、例えば、ＳＶ４０に由来するものであることができる（Sambrook et al (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual）。好ましくは、配列番号６の配列を含むか又は当該配列からなるＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが、本発明のベクターに使用される。ウッドチャック肝炎転写後制御因子（woodchuck hepatitis post transcriptional regulatory element：ｗＰＲＥ）などの、発現の効率又は特異性を支持する本発明の技術分野において知られたいずれかの他の要素が発現ベクターへ追加され得る。心臓に対する特異性を増強するために、ｍｉＲ１２２などのｍｉＲＮＡｓをコードする配列など、他の要素を導入して、他の組織内での遺伝子の発現を失活させることができる（Geisler et al., 2011, Gene Therapy 18: 199-209）。心臓における外来性の遺伝子発現を可視化するために、タグ配列（ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｈｉｓ及び同様のもの）、又は、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ等の蛍光色素などの他の任意的に追加される要素を導入することができる。
【００５６】
遺伝子の発現レベルを更に増加させるために、キメライントロンを本発明の遺伝子治療ベクターに導入することができる。本願において使用される「キメライントロン」とは、２つの異なる遺伝子に由来した少なくとも２つの異なるイントロンの部分を含む、イントロンを意味する。本発明の遺伝子治療ベクターにおいて使用するための特に好ましいキメライントロンは、例えば、ヒトβグロビン遺伝子及びヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）から由来のイントロン配列である。イントロンの例は、配列番号７に示される。好ましくは、キメライントロンは、プロモーターの下流直後へ挿入される。例えば、ＰＧＫプロモーターの下流直後へのβグロビン／Ｉｇイントロンの挿入が、約３７倍に遺伝子発現を増加させることが分かっている（Dominguez et al., 2011, Hum Mol Genet 20:681-693）。
【００５７】
遺伝子治療ベクターは、組み換えＤＮＡ技術又は化学合成などの本発明の技術分野において知られた標準的な方法によって構築及びクローン化することができる。標準的なクローニング方法は、例えば、Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Lab Pressに記載される。
【００５８】
特に好ましい視点において、遺伝子治療ベクターは、ウィルス性の発現ベクターである。本発明において使用されるウィルス性のベクターは、典型的には、異種性のポリヌクレオチドを導入するために天然の配列の１部分がウィルスの感染力を破壊することなく削除されたウィルスゲノムを含む。ウィルスの構成要素と宿主細胞受容体との間の特異的な相互作用に起因して、ウィルス性のベクターは、ターゲット細胞内への遺伝子の効率的な導入に関して高度に適切である。哺乳類細胞への遺伝子導入を促進するための適切なウィルス性のベクターは、本発明の技術分野において良く知られており、異なるタイプのウィルスに由来することができる。ウィルス性のベクターは、例えば、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）、オルトミクソウィルス、パラミクソウィルス、パポバウィルス、ピコルナウィルス、レンチウィルス、ヘルペスシンプレックスウィルス、ワクシニアウィルス、ポックスウィルス又はαウィルスに由来する。異なるウィルス性のベクターシステムの一概観に関しては、Nienhuis et al., Hematology, Vol. 16: Viruses and Bone Marrow, N.S. Young (ed.), 353-414 (1993)を参照されたい。
【００５９】
例えば、レトロウィルス性のベクターが使用され得る。レトロウィルス性のベクターは、ターゲット細胞のゲノムへの選択したポリヌクレオチドの形質導入及び組み込みによって、通常は機能する。レトロウィルス性のベクターは、いずれかのサブファミリーに由来することができる。例えば、ネズミ肉腫ウィルス、ウシ白血病ウィルス、ラウス肉腫ウィルス、ネズミ白血病ウィルス、ミンク細胞フォーカス形成ウィルス、細網内皮症ウィルス、又はトリ白血病ウィルス由来のベクターを使用することができる。当業者は、ＬＴＲｓ、ｔＲＮＡ結合サイトなどの異なるレトロウィルスに由来する部分とパッケージングシグナルとを組み合わせて、組み換えレトロウィルスベクターを提供することができるだろう。その際に、通常はこれらのレトロウィルス性のベクターが、形質導入コンピテントレトロウィルスベクター粒子を生成するために使用される。この目的のために、ベクターが、米国特許５，５９１，６２４号に記載のものなどの適切なパッケージング細胞系統へ導入される。レトロウィルス性の粒子へのキメラインテグラーゼ酵素の組み込みによって、レトロウィルスベクターを、宿主細胞のＤＮＡへの部位特異的な組み込みのために構築することもできる。例えば、ＷＯ９６／３７６２６号を参照されたい。
【００６０】
本発明によれば、遺伝子治療ベクターが、セロタイプ１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０からなる群から選択されるＡＡＶベクター又はそれら由来のキメラＡＡＶなどのアデノ随伴ウィルス性の（ＡＶＶ）ベクターであることが特に好ましく、目的の組織における高い効率の形質導入により良く適するであろう（Wu et al., 2006, Mol Therapy 14:316-27; Bowles et al., 2012, Mol Therapy 20:443-455）。形質導入の際に、ＡＡＶは、宿主において、（有ったとしても）マイナーな免疫反応のみしか誘発しない。さらに、他のベクターシステムと対照的に、ＡＡＶベクターは、血液から、最終的には分化した心筋細胞へ効率的に通過させることもできる。この観点において、ＡＡＶシステムは、例えば、レンチウィルスを使用することよりも優れている。従って、ＡＡＶは、遺伝子治療アプローチに高度に適する。マウスにおける形質導入のためには、ＡＡＶセロタイプ６及びＡＡＶセロタイプ９が特に適切である。ヒトへの遺伝子導入のためには、ＡＡＶセロタイプ１、６、８及び９が好ましい。従って、本発明の好ましい実施形態において、遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶセロタイプ６ベクターである。更に好ましい実施形態において、遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶセロタイプ８ベクターである。最終的には、遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶセロタイプ９ベクターであることが最も好ましい。ＡＡＶセロタイプ９ベクターは、心筋／心筋細胞の細胞内での発現の誘導に特に良く適する。
【００６１】
従来技術においてＡＡＶの治療上の遺伝子をパッケージするためのキャパシティは、およそ４．９ｋｂｐに限定されるが、一方で、より長い配列はＡＡＶ粒子のトランケーション（端部が切り詰められる）を導く（Wu et al., 2010, Mol Ther 18:80-86）。しかしながら、５．４ｋｂｐのオーバーサイズのＤＮＡ配列（２つの末端逆位反復配列（ＩＴＲｓ）、ヒトＴＮＮＴ２プロモーターの制御下のＦＬＡＧタグ付きのＭｙｂｐｃ３ｃＤＮＡ、キメライントロン及びＳＶ４０ポリアデニルシグナルを含む）のパッケージングは、ＡＡＶセロタイプ６又は９の生成に影響を及ぼさないことが本願において実証されている。１ｍＬあたりに１〜７×１０１２の力価のベクターゲノムが達成され、単離されたマウス心筋細胞及びインビボでのマウスの心臓におけるＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３遺伝子の顕著な発現を誘導した。従って、好ましい実施形態において、遺伝子治療ベクターは、少なくとも４．０ｋｂｐ、少なくとも４．５ｋｂｐ、少なくとも５ｋｂｐ、少なくとも５．１ｋｂｐ、少なくとも５．２ｋｂｐ、少なくとも５．３ｋｂｐ、少なくとも５．４ｋｂｐ、少なくとも５．５ｋｂｐ又は少なくとも５．６ｋｂｐのサイズを有するポリヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態において、遺伝子治療ベクターは、少なくとも４．５ｋｂｐのサイズを有するポリヌクレオチド配列を含む。遺伝子治療ベクターが少なくとも５ｋｂｐのサイズを有するポリヌクレオチド配列を含むことが特に好ましい。更なる実施形態において、遺伝子治療ベクターは、少なくとも５．３ｋｂｐのサイズを有するポリヌクレオチド配列を含む。
【００６２】
さらに、本発明の遺伝子治療ベクターは、好ましくは、ＡＡＶなどの高い効率でかつ医薬的に許容可能な形質導入ベクターの利点、及び、心臓に特異的なプロモーターを介したコードされる心臓サルコメアタンパク質の心筋細胞／心筋に特異的な発現の利点を組み合わせる。従って、遺伝子治療ベクターは、心臓サルコメアタンパク質をコードする核酸配列に機能的に連結された心臓に特異的なプロモーターを含むＡＡＶベクターであることが好ましい。第１の好ましい実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶセロタイプ６である。第２の好ましい実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶセロタイプ８である。第３の好ましい実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶセロタイプ９である。これらの実施形態のいずれかにおける心臓に特異的なプロモーターは、配列番号５のヒトＴＮＮＴ２であるか、又は当該配列に対して少なくとも８０％の、より好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する機能的な均等配列であることが特に好ましい。例えば、遺伝子治療ベクターは、心臓サルコメアタンパク質をコードする核酸配列に機能的に連結された心臓に特異的なプロモーターを含むＡＡＶ９ベクターである。ここで、これらの実施形態のいずれかにおける心臓に特異的なプロモーターは、配列番号５のヒトＴＮＮＴ２であるか、又は当該配列に対して少なくとも８０％の、より好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する機能的な均等配列である。
【００６３】
上記に概説されるように、遺伝子治療ベクターによってコードされる心臓サルコメアタンパク質は、好ましくは心臓ミオシン結合性プロテインＣ（ｃＭｙＢＰ−Ｃ）である。以下の例（実施例）に示すように、ＡＡＶベクターの利点、心筋細胞に特異的なプロモーターの利点、及び心臓ミオシン結合性プロテインＣの発現の利点を組み合わせる遺伝子治療ベクターは、ＨＣＭを患う患者の処置において高い効率を有する。
【００６４】
好ましい実施形態において、遺伝子治療ベクターは、配列番号５のヒトＴＮＮＴ２プロモーター、又は該プロモーター配列に対して少なくとも８０％の、より好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する機能的な均等配列を含むＡＡＶセロタイプ９ベクターである。ここで、プロモーターは、ｃＭｙＢＰ−Ｃ、好ましくは配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するネズミｃＭｙＢＰ−Ｃをコードする核酸配列もしくは該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列か、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するヒトｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質もしくは該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列に対して機能的に連結される。より好ましい実施形態において、遺伝子治療ベクターは、配列番号５のヒトＴＮＮＴ２プロモーターか、又は該プロモーター配列に対して少なくとも８０％の、より好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する機能的な均等配列を含むＡＡＶセロタイプ９ベクターである。ここで、プロモーターは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するヒトｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質をコードする核酸配列か、該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列に対して機能的に連結される。
【００６５】
従って、他の実施形態において、遺伝子治療ベクターは、配列番号５のヒトＴＮＮＴ２プロモーターか、又は該プロモーター配列に対して少なくとも８０％の、より好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する機能的な均等配列を含むＡＡＶセロタイプ６ベクターである。ここで、プロモーターは、ｃＭｙＢＰ−Ｃ、好ましくは配列番号４に示されるアミノ酸配列もしくは該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するネズミｃＭｙＢＰ−Ｃか、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列もしくは該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するヒトｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質をコードする核酸配列に対して機能的に連結される。より好ましい実施形態において、遺伝子治療ベクターは、配列番号５のヒトＴＮＮＴ２プロモーター又は該プロモーター配列に対して少なくとも８０％の、より好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する機能的な均等配列を含むＡＡＶセロタイプ６ベクターである。ここで、プロモーターは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するヒトｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質をコードする核酸配列か又は該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列に対して機能的に連結される。
【００６６】
従って、他の実施形態において、遺伝子治療ベクターは、配列番号５のヒトＴＮＮＴ２プロモーターか、又は該プロモーター配列に対して少なくとも８０％の、より好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する機能的な均等配列を含むＡＡＶセロタイプ８ベクターである。ここで、プロモーターは、ｃＭｙＢＰ−Ｃ、好ましくは配列番号４に示されるアミノ酸配列もしくは該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するネズミｃＭｙＢＰ−Ｃか、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列もしくは該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有するヒトｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質をコードする核酸配列に対して機能的に連結される。より好ましい実施形態において、遺伝子治療ベクターは、配列番号５のヒトＴＮＮＴ２プロモーター又は該プロモーター配列に対して少なくとも８０％の、より好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する機能的な均等配列を含むＡＡＶセロタイプ８ベクターである。ここで、プロモーターは、配列番号２に示されるアミノ酸配列又は該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有するヒトｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質をコードする核酸配列に対して機能的に連結される。
【００６７】
組み換えのウィルス性のベクターは、標準的技術に従って生成することができる。例えば、組み換えのアデノウィルス性の又はアデノ随伴ウィルス性のベクターは、ヒト２９３細胞（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ機能をトランス（異種補完的）に提供する）内で、１０７−１０１３のウィルス粒子／ｍＬの範囲の力価まで増殖することができる。それらのインビボでの適用の前に、ウィルス性のベクターは、セファロースカラムなどのゲル濾過法によって脱塩化され、そしてその後の濾過によって精製され得る。精製は、ベクターを投与された被験者において、有害な影響をもたらす可能性を減少させる。投与されるウィルスは、実質的に野生型及び複製コンピテントウィルスを含まない（フリー）。ウィルスの純度は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の後に銀染色することなど、適切な方法によって証明することができる。これは、ＡＡＶ及びアデノウィルス性のベクターの両方に適用可能である。
【００６８】
下記の例（実施例）に記載されるように、処置されるべき被験者への本発明の遺伝子治療ベクターの形質導入は、動物モデルにおいて示されているものと類似の方法（Katz et al., 2012, Gene Ther 19:659-669）において、全身性の適用、例えば、ベクターの静脈内送達、動脈内送達又は腹腔内送達によって達成することができる。好ましい実施形態において、遺伝子治療ベクターは、記載した肥大型心筋症を処置又は予防する方法における使用のためのものであり、ここで、遺伝子治療ベクターは全身に投与される。
【００６９】
その代わりに、本発明の遺伝子治療ベクターは、心臓組織への直接的な投与によって、例えば、冠状動脈内投与によって送達させることができる。好ましい実施形態において、遺伝子治療ベクターは、標準の５Ｆ又は６Ｆガイド又は診断カテーテルを使用して、血管造影法（血管バルーン閉塞無しでの経皮冠状動脈内送達）の後に、心臓カテーテル室での１０分間にわたる、順行性心外膜冠状動脈点滴（antegrade epicardial coronary artery infusion）による単回投与として投与される（Jaski et al., 2009, J Card Fail 15: 171-181）。
【００７０】
他の好ましい実施形態において、心筋の組織形質導入はカテーテル媒介性の心筋内送達によって達成される（Gao et al., 2011, Hum Gene Ther 22:979-84）。重要なことに、この後者の送達の仕方は、形質導入増強担体にカップル化された、又はカップル化されていないベクターフリーのｃＤＮＡを心筋内へ送達することにも使用することができる。心臓指向（ないし認知）性（cardiac tropism）を有する細胞由来のエキソソーム又は微粒子も、本発明のベクターの送達に使用することができる。ヒトにとってのＡＡＶの適切な投与量は、約１×１０１０〜１×１０１４ウィルス粒子の範囲、及び特に、約１×１０１２であるだろう。
【００７１】
ウィルス性のベクターとは別に、非ウィルス性の発現構築物も機能的な心臓サルコメアタンパク質をコードする遺伝子、又はその機能的改変種もしくはフラグメントを細胞又はヒト被験者へ導入するために使用され得る。ターゲット細胞内でのタンパク質のインビボ発現を許容する非ウィルス性の発現ベクターは、例えば、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１及びｐＺｅｏＳＶ（Invitrogen, Stratagene）などのベクターを含む。非ウィルス性のベクターをターゲット細胞へ導入することに適切な方法は、例えば、リポフェクション法、カルシウム−リン酸共沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン法及びマイクロガラスチューブ及び同様のものを使用した直接的ＤＮＡ導入法である。ベクターの導入の前に、心臓の筋肉細胞は、ホスファチジルコリン、ストレプトリジン、カプリン酸ナトリウム、デカノイルカルニチン、酒石酸、リソレシチン、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、及び同様のものなどの透過処理剤で処置され得る。
【００７２】
その代わりに、例えばバイオプシー手法によって被験者から取り出された、単離された細胞が、エクスビボ手法においてベクターを用いて導入され得る。次に、該細胞を、被験者へ、好ましくは細胞が取得された被験者へ、再移植する、あるいは投与することができる。従って、他の視点において、本発明は、本発明の遺伝子治療ベクターを形質導入した、心筋細胞又は幹細胞などの単離された細胞に関連する。ベクターの形質導入の後に、細胞は、ベクターによってコードされた心臓サルコメアタンパク質を発現する。該細胞は、好ましくは、心筋細胞などの心臓細胞、又は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する心筋細胞である。該細胞は、幹細胞でもあり得る。好ましくは、胚性幹細胞又は多能性成体幹細胞であり、より好ましくは、内来性の心臓幹細胞（ｅＣＳＣｓ）又は繊維芽細胞に由来するｉＰＳＣ（Okita et al., 2007, Nature 448:313-7; Yu et al., 207, Science 318:1917-20; Maekawa et al., 201 1, Nature 474: 225-229）、ケラチノサイトに由来したｉＰＳＣ（Aasen et al., 2008, Nat Biotech 11 :1276-1284; Aasen & Belmonte, 2010, Nat Protocol 5:371-382）もしくは血液細胞に由来したｉＰＳＣ（Staerk et al., 2010, Stem Cell Stem 7: 20-24; Seki et al., 2012, Nat Protocol 7:718-728）である。
【００７３】
当該細胞がヒト細胞であることが更に好ましい。細胞が採取（explanted）された被験者が、細胞を投与される被験者に対して遺伝子学的に類似である場合には、移植された細胞が拒絶される可能性は減少する。従って、本発明の細胞は、好ましくは、本発明の遺伝子治療ベクターをエクスビボで形質導入した自家細胞である。自家細胞の形質導入の後に、移植又は点滴などの適切な投与手段によって、細胞が被験者へ再導入される。
【００７４】
当該細胞は、好ましくは、被験者におけるＨＣＭを処置又は予防する方法において使用するためのものであり、ここで、心臓サルコメアタンパク質をコードする遺伝子における突然変異がＨＣＭと関連し、そして被験者は心臓サルコメアタンパク質の機能を損なう遺伝子突然変異を保有する。
【００７５】
本発明は、更に、本発明の遺伝子治療ベクターを含む医薬組成物に関連する。好ましい実施形態において、該組成物は、機能障害性の心臓サルコメアタンパク質を有する被験者におけるＨＣＭを処置又は予防する方法において使用するためのものである。
【００７６】
遺伝子治療ベクターを含む医薬組成物の調製方法は、調剤学の分野において働く者には、良く知られている。典型的には、そのような組成物は、溶液又は懸濁液の何れかとして調製される。本発明の医薬組成物は、希釈液及び担体などの一般的に使用される医薬的に許容可能な賦形剤を含むことができる。特に、組成物は、医薬的に許容可能な担体、例えば、水、生理食塩水、リンガー液、又はデキストロース溶液を含む。更なる適切な担体の例は、標準の教本、例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」, Mack Pub. Co., New Jersey (1991) に記載される。担体に加えて、組成物は、乳化剤、ｐＨバッファ化剤、安定化剤、染料及び同様のものも含むことができる。
【００７７】
医薬組成物は、治療的に有効な投与量の遺伝子を含むだろう。治療的に有効な遺伝子の投与量は、被験者に対して毒性をもたらすことなく、被験者における心筋症を予防又は処置することが可能な量である。心筋症の予防又は処置は、心筋症と関連した表現型の特徴の変化として評価することができ、そのような変化は心筋症を予防又は処置することに有効である。心筋症と関連した表現型の特徴は、例えば、左心室の（ＬＶ）異常肥大、左心室内径短縮率の減少（reduced fractional shortening）、間質性線維症、並びに、心臓弛緩機能及び心臓収縮機能の障害である。治療的に有効な投与量の遺伝子は、典型的には、ＨＣＭの表現型におけるポジティブな変化、ＨＣＭを患う被験者の表現型を、ＨＣＭ遺伝子突然変異を保有しない健康な被験者の表現型に近づける変化を誘導する。従って、治療的に有効な投与量の遺伝子は、生理学的に許容可能な組成物の状態で投与される場合には、典型的には、処置される被験者における病原性の心臓の表現型を改善又は予防することに十分な量である。
【００７８】
更なる他の視点において、本発明は、外来性の核酸配列を発現するための遺伝子治療ベクターを被験者に導入することによって被験者におけるＨＣＭを処置又は予防する方法に関連する。当該ベクターは、
（ａ）本願において他のところで定義された心臓サルコメアタンパク質をコードする核酸配列、及び、
（ｂ）当該核酸配列に対して機能的に連結（リンク）された心筋細胞に特異的なプロモーター（ここで、心臓サルコメアタンパク質をコードする遺伝子における突然変異はＨＣＭと関連し、かつ、被験者は心臓サルコメアタンパク質の機能を損なう遺伝子突然変異を保有する）。
【実施例】
【００７９】
実施例１：ホモ接合型のＭｙｂｐｃ３をターゲットとしたノックインマウスにおけるＧ＞Ａ移行の結果
エクスビボ研究及びインビボ研究の両方のために、Ｍｙｂｐｃ３遺伝子にＧ＞Ａ移行を保有するノックインマウス（Ｍｙｂｐｃ３をターゲットとしたノックイン；ＫＩ）を、Ｃｒｅ/ｌｏｘシステム（Vignier et al, 2009, Circ Res 105:239-248）を使用する遺伝子ターゲッティングによって開発した。手短に説明すると、マウスＭｙｂｐｃ３遺伝子の５´部分（エクソン１からエクソン１５までの上流の１７４７ｂｐをカバーする）を含む８１０５ｂｐのフラグメントを、１２９／Ｓｖｊマウスストレインに由来するＦＩＸ  ＩＩゲノムライブラリからのロングレンジＰＣＲ又はクローニングによって取得して、次にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ  ＫＳ＋ベクター（Stratagene）内へクローン化した。エクソン６の最後のヌクレオチドにおけるＧ＞Ａ移行は、２５８ｂｐのＰＣＲフラグメント上での部位指向性突然変異導入（site-directed mutagenesis、Stratagene）によって取得して、次に、Eco47RI/NsiIサイト内へクローン化した。
【００８０】
ＫＩマウスの表現型は、ノーマルのように見え、２年間まで生存可能であった（Vignier et al., 2009, Circ Res, 105:239-248）。超音波心臓検査は、野生型（ＷＴ）及びホモ接合型のＫＩマウスに対して、Ｖｅｖｏ２１００システム（VisualSonics, Toronto, Canada）を使用して実行した。マウスは、イソフルラン（１〜２％）で麻酔し、仰向け状態でワーミングプラットホーム（warming platform）に固定した。Ｂモード画像は、大人のマウスについてはＭＳ４００トランスデューサを使用して、新生仔マウスについてはＭＳ５５０トランスデューサを使用して取得した。画像は、傍胸骨短軸断層像及び傍胸骨長軸断層像において取得し、そして左心室の寸法は短軸視野で、心臓拡張期及び心臓収縮期において測定した。ＫＩマウスは、生誕後３〜４ヶ月のＷＴマウスと比較して、左心室の異常肥大、減少した左心室内径短縮及び間質性線維症を示した（Vignier et al., 2009, Circ Res, 105:239-248）。
【００８１】
Ｇ＞Ａ移行は、結果として３つの異なる突然変異体ｍＲＮＡｓをもたらした（図１Ａ参照）。変異体１（Mutant 1、ミスセンス）は、Ｇ＞Ａ移行を有し、約１５０ｋＤａのＥ２６４Ｋ突然変異体タンパク質を生成する。変異体２（ナンセンス）は、エクソン６のスキッピングの結果物であり、エクソン９におけるフレームシフト及び未成熟終止コドン（ＰＴＣ）を導く。予想されるタンパク質は、３２ｋＤａである。変異体３も、エクソン６のスキッピング及びリーディングフレームを回復（レストア）させるイントロン８の部分的な維持（retention）から結果的に生じる。このケースでは、１４７ｋＤａの突然変異タンパク質が生成される。これらの突然変異体のいずれもが、機能的なタンパク質をコードしない。
【００８２】
ＲＮＡ又はタンパク質は、ホモ接合型ＫＩ及びＷＴマウスの心室組織から抽出した。トータルＲＮＡは、SV Total RNA Isolation System Kit（Promega）を使用して、製造者の指示に従って、心室組織（３０ｍｇ）から単離した。ＲＮＡの濃度、純度及び品質は、NanoDrop（登録商標）ND-1000分光光度計（Thermo Scientific）を使用して測定した。逆転写（ＲＴ）は、オリゴ−ｄＴプライマー（SuperScriptR-III kit, Life Technologies）を使用して、１５０−２００ｎｇのＲＮＡから実行した。定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）は、プライマー＃１（フォワード：5'-GGA TTA CAA GGA TGA CGA CGA-3'；配列番号９）及び＃２（リバース：5'-TCC AGA GTC CCA GCA TCT TC-3 '；配列番号１０）、及びＳＹＢＲグリーンを使用して実行した。トータルＭｙｂｐｃ３ｍＲＮＡのレベルは、ワイルドＷＴマウスよりも、ホモ接合型のＫＩマウスの方が８０％低い（図１Ｂ）。
【００８３】
クルードタンパク質抽出物は、５％ＳＤＳ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５０ｍＭスクロース、７５ｍＭ尿素、１ｍＭのＤＴＴの中でホモゲナイズ（均質化処理）して、１３０００ｒｐｍで２分間遠心分離した、約１５ｍｇの心室組織から取得した。上清を収集し、そしてその濃度をBCA Protein Assay Kit（Pierce）を使用して測定した。タンパク質は、１０％−アクリルアミド／ビスアクリルアミド（２９：１）ゲルにロードし、０．４５μｍのポアサイズのニトロセルロースメンブレン（Invitrogen）上に電気的に転写した。メンブレンは、ｃＭｙＢＰ−Ｃを指向する抗体 （Ｃ０−Ｃ１１：１、０００）を用いて染色した。二次抗体は、ＨＲＰ（Sigma）に対してカップル化された。シグナルは、SuperSignal（登録商標）West Pico chemiluminescent substrate（Pierce）を用いて発光（revealed）させて、ChemilmagerTM 5500 （Alpha Innotech）を用いて取得した。シグナルの定量化は、NIH Image 1.63ソフトウェアを使用して行った。ホモ接合型のＭｙｂｐｃ３をターゲットとしたノックインマウスは、低いレベルの突然変異体タンパク質のみを発現した（図１Ｃ）。
【００８４】
結果は、低いレベルのｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質（＝ハプロ不全）（突然変異体ポリペプチド（＝毒性ポリペプチド）を含む）の存在を示し、該存在が、ＨＣＭの特徴（ホールマーク）である左心室の異常肥大及び機能障害を結果としてもたらす。
【００８５】
実施例２：ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｏｃ３を含むベクターの生成
ベクターｐＧＧ２−ｈＴＮＮＴ２−ＷＴ−Ｍｙｂｐｃ３は、先ず、ＸｈｏＩ制限サイト及びＦＬＡＧ配列を含むフォワードプライマー＃３（5'-TTC GAC CTC GAG ATG GAT TAC AAG GAT GAC GAC GAT AAG CCT GGT GTG ACT GTT CTC AA-3'；配列番号１１）と、ＢａｍＨＩ制限サイトを含むリバースプライマー＃４（5'-TTC GAC GGA TCC CTG GTC ACT GAG GAA CTC G-3'；配列番号１２）とを使用して、マウスの心室のＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによってエクソン１〜３４を含む全長のＦＬＡＧタグ付きマウスＭｙｂｐｃ３ｃＤＮＡ（GenBank accession number NM_008653.2）を増幅して、構築した。塩基−５０２から＋４２までのヒト心臓トロポニンＴ（ＴＮＮＴ２）５´ 領域（GenBank accession number NG_007556.1；配列番号５）は、ウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子（renilla luciferase reporter gene：ｐｄｓＴＮＮＴ２（−５０２＋４２）−Ｒｌｕｃ）及びキメラ（□−グロビン／Ｉｇ）イントロンを含むプラスミド内へのＭｌｕＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を用いたクローニングを可能にする、フォワードプライマー＃５（5 '-AAA AAA ACG CGT CTC AGT CCA TTA GGA GCC AGT AGC-3'；配列番号１３）と、リバースプライマー＃６（5'-CCC CCC CAA GCT TCT GCC GAC AGA TCC TGG AGG CG-3'；配列番号１４）とを使用するＰＣＲによって、ヒトｃＤＮＡライブラリから、オリジナルに増幅した。キメラ（□−グロビン／Ｉｇ）イントロンは、 遺伝子発現を増加させることが示されている（Dominguez et al., 2011, Hum Mol Genet 20, 681-93）。ｐＧＧ２−ｈＴＮＮＴ２−ＷＴ−Ｍｙｂｐｃ３プラスミドを生成するために、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩを用いてＴＮＮＴ２プロモーター及びキメライントロン（配列番号７；図２）を切り出して、ＳＶポリＡシグナル（配列番号６）を含むｐＧＧ２プラスミドベクター内へ連結した。ベクターは、９０２７ｂｐの大きさを有するとともに（図２）、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）パッケージングキャパシティ（Wu et ah, 2010, Mol Ther 18:80-86）を超える、５．４ｋｂｐの挿入物を２つのＩＴＲｓの間に含む（図２）。
【００８６】
ＡＡＶ６及びＡＡＶ９の偽型ベクター（pseudotyped vectors）は、２つのプラスミド形質導入方法（ＡＡＶ６；Muller et al., 2006, Cardiovasc Res 70:70-78）又は３つのプラスミド形質導入方法（ＡＡＶ９；Kaya et al., 2011, Cardiovasc Res 91 : 116-123）を用いて生成した。ＡＡＶ６偽型ベクターは、ｐＧＧ２−ｈＴＮＮＴ２−ＷＴ−Ｍｙｂｐｃ３転写プラスミドとＡＡＶパッケージングプラスミドｐＤＰ６ｒｓとの、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞への同時形質導入によって生成した。ｐＤＰ６ｒｓは、ＡＡＶ２ｒｅｐ及びＡＡＶ６ｃａｐ遺伝子とアデノウィルス性ヘルパー機能とをもたらす（Grimm et al, 2003, Mol Ther, 7: 839-850）。ＡＡＶ９偽型ベクターは、ｐＧＧ２−ＴＮＮＴ２−ＷＴ−Ｍｙｂｐｃ３転写プラスミドと、ｐ５Ｅ１８−ＶＤ２−９と、ｐＤＧｄｅｌｔａＶＰとの、３重同時形質導入によって生成した。ｐＤＧｄｅｌｔａＶＰは、アデノウィルス性のヘルパー機能をコードする（Kaya et al., 2011, Cardiovasc Res 91: 116-23）。組み換えＡＡＶ６及びＡＡＶ９粒子の生成は、以前に開示されたものに（Grieger et al., 2006, Nat Protoc 1 :1412-1428）、いくつかの変更を加えて実行した。プラスミドは、以前に記載されるように（Hauswirth et al., 2000, Methods Enzymol 316:743-761）、ポリエチレン−イミン（ＰＥＩ）を使用して、セルスタック内又は１５ｃｍの直径のプレート内で、２９３Ｔ  ＨＥＫ細胞へ、形質導入した。ＨＥＫ２９３Ｔ−ＡＡＶ細胞は、ＤＭＥＭ、高いグルコースを添加した１０％（ｖ／ｖ）熱失活ウシ胎仔血清、０．１ｍＭのＭＥＭ非必須アミノ酸、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＵＩ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン中で培養した。組織培養試薬は、Life technologiesから取得した。細胞は、７２ｈ後に収集して、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。３回の凍結・解凍周期の後に、ベンゾナーゼ（Merck；２５０Ｕ／ｍＬ）を３７℃で１時間添加した。
【００８７】
細胞のデブリをペレット状にして、そしてベクターを含む溶解物を、イオジキサノールステップ勾配（iodixanol step gradients）を使用して精製した（Hauswirth et al., 2000, Methods Enzymol 316:743-761）。
【００８８】
ＤＮａｓｅ抵抗性のＡＡＶ粒子のゲノムの力価は、以前に報告されるように（Veldwijk et al., 2002, Mol Ther 6:272-278）、SYBR Green qPCR Master MIX 2（Fermentas）及びABI PRISM（登録商標） 7900HT cycler（Applied Biosystem）を使用して、ｑＰＣＲ によって測定した。ベクターは、ＴＮＮＴ２プロモーター配列に対して特異的なプライマー＃７（フォワード：5'-CTC AGT CCA TTA GGA GCC AGT-3'；配列番号１５）と＃８（リバース：5'-AAG GCA ACC TCC AAG ACA CT-3'；配列番号１６）とを使用して定量化した。リアルタイムＰＣＲは、１０μｌのトータル体積において、各プライマーに関して０．３μＭづつ用いて実行した。ｐｄｓＡＡＶ−ＴＮＮＴ２−ｅＧＦＰプラスミドは、基準（スタンダード）コピー数として使用した。定量化のための標準曲線は、それぞれのプラスミドＤＮＡのシリアルな希釈液によって作成した。サイクリング条件は以下のようである：５０℃／２分間、９５℃／１０分間、その後３５サイクル（９５℃／１５秒及び６０℃／６０秒）。計算は、ＳＤＳ２．４ソフトウェア（Applied Biosystem）を使用して実行した。
【００８９】
実施例３：Ｍｙｂｐｃ３をターゲットとした新生仔ＫＩマウスから単離された心筋細胞への遺伝子導入の後のＭｙｂｐｃ３ｍＲＮＡ及びｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質レベル及び局在の評価
新生仔マウスの心筋細胞は、以前に記載されるように、新生仔マウスの心臓から単離した（Vignier et al, 2009, Circ Res 105:239-248）。心筋細胞は、プレートに蒔く（４．４×１０５細胞／ウェル）前に、懸濁液中で、３０分間、３７℃で３０００の感染多重度（ＭＯＩ）でｈＴＮＮＴ２の制御下にＡＡＶ６−ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３を形質導入した。心筋細胞は、収集する前に、７日間、３７℃でかつ１０％ＣＯ２で、培養液内で維持した。
【００９０】
ＨＥＫ２９３細胞は、ＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン）の１２ウェルのディッシュに、２×１０５細胞の密度でプレートに蒔き、そして、推奨されるコンフルエンス（５０〜７０％）に到達するまで、３７℃で７％ＣＯ２でインキュベートした。接着性のＨＥＫ２９３細胞へのＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３プラスミドの一時的（transient）の形質導入は、TurboFect transfection reagent（Fermentas）を使用して、製造者のプロトコルに従って実行した。
【００９１】
トータルＲＮＡは、培養した心筋細胞から、Total RNA Isolation System Kit（Promega）を使用して、製造者の指示に従って単離した。ＲＮＡの濃度、純度及び品質は、NanoDrop（登録商標）ND-1000分光光度計（Thermo Scientific）を使用して測定した。ＲＴは、１５０〜２００ｎｇのＲＮＡから、オリゴｄＴプライマー（SuperScript（登録商標）-III kit, Life Technologies）を使用して実行した。ゲノムの混入に関するコントロールとして、ＲＴなしでの反応を実行した。タッチダウンＰＣＲ増幅（６５℃〜６０ ℃）は、AmpliTaq（登録商標）Gold Polymerase（Applied Biosystems）を使用して、トータルが２０μｌの体積で３５サイクルで異なるプライマーペアを用いて実行した。ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３ｍＲＮＡは、フォワードプライマー＃９（5'-GGA TTA CAA GGA TGA CGA CGA-3'；配列番号１７）及びリバースプライマー＃１０（5'-TCC AGA GTC CCA GCA TCT TC-3'；配列番号１８）を使用して増幅した。トータルＭｙｂｐｃ３ｍＲＮＡは、フォワードプライマー＃１１（5'-CCT GGT GTG ACT GTT CTC AA-3'；配列番号１９）及びリバースプライマー＃１２（5'-TCC AGA GTC CCA GCA TCT TC-3'；配列番号２０）を使用して増幅した。Ｍｙｈ６ｍＲＮＡ（α−ミオシン重鎖をコードする）は、フォワードプライマー＃１３（5'-CTC AAG CTC ATG GCT ACA CTC TTC TC-3'；配列番号２１）及びリバースプライマー＃１４（5'-AGA GCA GAC ACT GTT TGG AAG GA-3'；配列番号２２）を使用して増幅した。ＰＣＲ産物は、１．５％アガロースゲル上で可視化した（図３Ａ）。形質導入を行っていない細胞（Ｕｎｔｒ）において、 突然変異体ｍＲＮＡｓのみが検出された（トータルＭｙｂｐｃ３パネル）。対照的に、ＫＩ心筋細胞へのＡＡＶ６−ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３の遺伝子導入の後に、ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３ｍＲＮＡが検出され（ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３パネル）、突然変異体ｍＲＮＡｓ（トータルＭｙｂｐｃ３パネル）の減少したレベルと関連した（トータルＭｙｂｐｃ３パネル）。Ｍｙｈ６のレベルは、グループ間では異ならなかった（Ｍｙｈ６パネル）。フォワードプライマー＃１５（-GAT GCG AGC CCT GAT GAC-3'；配列番号２３）及びリバースプライマー＃１６（5'-GAC TTG AGA CAC TTT CTT CC -3'；配列番号２４）並びにＳＹＢＲグリーンを使用した定量ＰＣＲは、ＡＡＶ６−ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３を形質導入したＫＩ心筋細胞におけるトータルＭｙｂｐｃ３ｍＲＮＡのレベルが、ＷＴ心筋細胞において見出されたレベルに到達したことを実証した（図３Ｂ）。さらに、特異的な加水分解性のＴａｑｍａｎプローブを使用した定量ＰＣＲを実行して、異なった突然変異体のｍＲＮＡｓのレベルを測定した。突然変異体（Ｍｕｔａｎｔ）−１はプローブ＃１（5'-VIC-CTC ACT GTC CAT AAG G-MGB-3'；配列番号２５）を用いて、突然変異体２＋３はプローブ＃２（5'-FAM-CCA GCA AGA GGC CA-MGB-3'；配列番号２６）、プローブ＃３（5'-FAM-TCG GAG AAC CAG CCC CTG CTA GCT C-TAMRA-3'；配列番号２７）を用いて可視化した（revealed）。このことは、ＡＡＶ６−ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３を形質導入したＫＩからのＫＩ心筋細胞において、突然変異体−１及び突然変異体−３のｍＲＮＡは全く存在せず、その一方で、突然変異体−２のｍＲＮＡは著しく減少することを示す（図３Ｃ）。
【００９２】
形質導入培養心筋細胞又は形質導入ＨＥＫ２９３細胞からのクルードタンパク質は、溶解バッファ（３０ｍＭトリスベース、ｐＨ８．８、５ｍのＥＤＴＡ、３０ｍＭのＮａＦ、３％ＳＤＳ、１０％グリセロール）で抽出して、タンパク質濃度をBradford protein assay（BioRad）によって測定した。トータルタンパク質（心筋細胞：３０μｇ／レーン、ＨＥＫ２９３：２．５μｇ／レーン）は、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド（２９：１）ミニゲル（BioRad）上で分離させ、電気的ブロッティングによってＰＶＤＦメンブレン上に転写した。メンブレンは、ｃＭｙＢＰ−ＣのＭｙＢＰ−Ｃモチーフを指向する一次抗体を用いてオーバーナイトで染色した（１：１，０００）。抗ウサギ（１：６，０００、Sigma）ペルオキシダーゼ−コンジュゲート型の二次抗体でのインキュベーションの後に、タンパク質をSuper Signal（登録商標） West Dura detection reagent（Thermo Scientific）を使用して可視化し、シグナルをChemiGenius2 Bio Imaging Systemを用いて検出した。ウェスタンブロット解析は、全てのレーンにおける特異的なｃＭｙＢＰ−Ｃを示す。更に、ＡＡＶ６−ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３を形質導入したＫＩ心筋細胞におけるｃＭｙＢＰ−Ｃのレベルが、形質導入をしていないＷＴ心筋細胞において見出されたレベルに到達したことを示す（図３Ｄ）。
【００９３】
トランスジェニックＦＬＡＧタグ付きｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質の局在を検査するために、免疫蛍光解析を実行した（図３Ｅ）。ＡＡＶ６−ＴＮＮＴ２−ＦＬＡＧ−ＷＴ−Ｍｙｂｐｃ３（ＭＯＩ３，０００）を形質導入したＫＩ心筋細胞は、細胞の固定、そしてＦＬＡＧエピトープ及びトータル全長ｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質を指向する抗体を用いた染色の後に、共焦点顕微鏡検査によって解析した。抗ｃＭｙＢＰ−Ｃ抗体を使用した形質導入心筋細胞の免疫蛍光像は、サルコメアのＡ−バンドにおいてダブレット状で位置するトータルｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質の典型的（classic）な筋状（ないし縞状）パターン（striation pattern）を示した（図３Ｅ、ｃＭｙＢＰ−Ｃ）。更に、ＦＬＡＧポジティブなシグナルは（図３Ｅ；ＦＬＡＧ）、ｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質の筋と共局在し、トランスジェニックＦＬＡＧタグ付きｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質の正確なサルコメアへの組み込みが確認された。
【００９４】
これらのデータは、ＫＩ心筋細胞へのＭｙｂｐｃ３遺伝子導入が、ｃＭｙＢＰ−Ｃハプロ不全を救い、そして同時に、突然変異体対立遺伝子の転写及び有害なｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質の蓄積を防止することを実証する。
【００９５】
実施例４：Ｍｙｂｐｃ３をターゲットとしたＫＩ新生仔の心臓に由来する遺伝子操作心臓組織における遺伝子導入後の内来性突然変異体Ｍｙｂｐｃ３及び外来性野生型Ｍｙｂｐｃ３の発現
野生型（ＷＴ）マウス及びＭｙｂｐｃ３をターゲットとしたノックイン（ＫＩ）新生仔マウスに由来する心臓を、トリプシン／コラゲナーゼオーバーナイト消化を使用する細胞の単離（Laug-witz et al, 2005, Nature 433:647-653; Moretti et al, 2006, Cell 127: 1151-65）のために取得した（出生後０〜１日目）。遺伝子操作心臓組織（ＥＨＴ）を生成するために、以下に示すように、再構成ミックスを氷上で調製した（最終濃度）：未精製の６．８×１０６細胞／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬのウシフィブリノーゲン（ストック溶液：２００ｍｇ／ｍＬ  プラス  アプロチニン、０．５μｇ／ｍｇフィブリノーゲンＮａＣｌ  ０．９％溶液、Sigma F4753）、１００μｌ／ｍＬマトリゲル（BD Bioscience 356235）。２ｘＤＭＥＭを加えて、フィブリノーゲン及びトロンビンストック（１００Ｕ／ｍＬ、Sigma Aldrich T7513）の体積を整合させて等張状態を保障した。キャスティングモールドは、以前に記載されるように調製した（Hansen et al., 2010, Circ Res 107:35-44）。
【００９６】
ＡＡＶ６−ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３又はＡＡＶ６−ＦＬＡＧ−ＧＦＰ、あるいはウィルス無しのコントロールを、ＭＯＩ１０００又はＭＯＩ３０００で、キャスティングの前に、直接的にＥＨＴマスターミックスに加えた。２ｘＤＭＥＭの体積は、ウィルスの体積を等張状態に維持するために採用した。各ＥＨＴに関して、９７μｌの再構成ミックスを、３μｌのトロンビンと手短に混合し、アガローススロット内へピペッティングした。フィブリノーゲンのポリマー化に関して、構築物を、３７℃、７％ＣＯ２の加湿細胞培養インキュベーター内に２ｈ置いた。ラック（棚）を、培養液で満たした２４ウェルプレートへ移した。ＥＨＴは、３７℃、７％ＣＯ２加湿細胞培養インキュベーター内で維持した。細胞培養液は、４８時間後に交換した。細胞培養液は、ＤＭＥＭ（Biochrom F0415）、１０％ウマ血清（Gibco 26050）、２％ヒヨコ胚抽出物、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco 15140）、インスリン（１０μｇ／ｍＬ、Sigma-Aldrich 19278）及びアプロチニン（３３μｇ／ｍｌ、Sigma Aldrich A1153を含んだ。ＥＨＴの培養５日目に、シトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシド（２５μｇ／ｍＬ、Sigma Aldrich C1768）を、４８ｈ、培養液に加えた。ＥＨＴｓの自発収縮活性を、光学的ビデオ録画を介して、７日目から１９日目までモニタした（Hansen, et al., 2010, Circ Res 107, 35-44）。収縮グラフは、自動的に記録（録画）して、評価した。最近の出版物（Hansen et al., 2010, Circ Res 107:35-44; Stoehr et al., 2013, J Mol Cell Cardiol 63: 189-98）のように、ネズミのＥＨＴｓの自発性収縮を測定するために、ＣＴＭＶソフトウェア（Pforzheim, Germany）を使用した。この目的のために、２４ウェルプレートは、ＣＯ２、湿度及び温度のコントロールそしてモニタリング目的のためのガラス屋根を有する細胞インキュベーターユニット内に置いた。Basler camera（Type A 602f-2）を、ＰＣコントロール様式で、上記の細胞培養液ユニット内に置いた。測定期間中に、筋条片（muscle strip）の端部の間の距離を収縮中に記録（録画）した。力は、ポストジオメトリー（post geometry）、Sylgard 184（Dow Corning）の弾性係数及びポスト距離のデルタ（delta of post distance）（ポスト偏位：post deflection）に基づいて、最近出版された式（Vandenburgh et al., 2008, Muscle Nerve, 37:438-47）に従って計算した。記録した収縮グラフの升目（squares）は確認されるピークを示し、該ピークは、頻度、平均の力、収縮期間及び弛緩期間（それぞれＴ１、Ｔ２）の計算に採用した。Ｔ１及びＴ２は、最大ピークの１０％で測定した。実験の最後に、ＥＨＴｓをポストから取り外して、トータルＲＮＡを抽出した。
【００９７】
ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３のｍＲＮＡは、実施例３において記載したように増幅すると、形質導入したＥＨＴｓにおいてのみ検出され、そしてそのレベルはＭＯＩの増加とともに上昇した（図４Ａ）。更に、全てのタイプのＭｙｂｐｃ３ｍのＲＮＡｓ（実施例３において記載したトータルＭｙｂｐｃ３）のＰＣＲ増幅は、以下の事象を示した（図４Ｂ）。ｉ）異なる突然変異体ｍＲＮＡｓが、形質導入していないＫＩ−ＥＨＴ及びＡＡＶ６−ＧＦＰを形質導入したＥＨＴの両方において類似のレベルで検出された。ｉｉ）ＫＩＥＨＴｓへのＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３遺伝子導入は、単一のタイプのｍＲＮＡを導く。このｍＲＮＡのレベルは、ＷＴ−ＥＨＴにおいて検出されたレベルとは異ならなかった。このことは、ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３の遺伝子導入が、ｍＲＮＡのハプロ不全を回復（repaired）させ、かつ、ＫＩ新生仔の心臓細胞に由来するＥＨＴにおける突然変異体ｍＲＮＡｓのコンテンツを減少させたことを示す。
【００９８】
ＥＨＴｓの自発収縮活性は、光学的ビデオ録画を介して培養７日目から培養１９日目までモニタした。全てのグループにおいて、１４日目に最大の力に到達した。発生した力は、ＫＩ（約６５μΝ）のほうが、ＷＴのＥＨＴｓ（約４０μΝ、データは示さず）よりも強く、非常に高い収縮性（hypercontractility）を示した。ＫＩＥＨＴへのＭｙｂｐｃ３遺伝子導入の後に、発生した力は、他のグループと比較して、顕著により低く（図４Ｃ）、ＷＴＥＨＴｓにおいて以前に見出されたレベルに到達した。
【００９９】
そして、これらのデータは、ＫＩ新生仔心臓細胞に由来するＥＨＴへのＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３遺伝子導入が、分子的表現型（ハプロ不全が無く、かつ、突然変異体ｍＲＮＡｓが無いこと）及び機能（非常に高い収縮性が無いこと）の両方を救うことを示す。
【０１００】
実施例５：Ｍｙｂｐｃ３をターゲットとしたＫＩ新生仔マウスへの遺伝子導入の後の内来性突然変異体Ｍｙｂｐｃ３及び外来性野生型Ｍｙｂｐｃ３の発現
全ての実験上のインビボ研究は、ＮＩＨによって出版された研究室動物の世話及び使用に関するガイドライン（Publication No. 85-23, revised 1985）、並びにドイツ国ハンブルグ特別市の科学・公衆衛生省によって採択されているドイツ国の動物保護に関する法律（Nr. 69/10）に従った。
【０１０１】
以前に記載されるように（Dominguez et al., 2011, Hum Mol Genet 20:681-693）、ＡＡＶ９−ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３（５×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ））又はコントロールとしてのＰＢＳを、３日齢のマウスへ、３０Ｇの針を使用する側頭静脈注射（Sands and Barker, 1999, Lab Anim Sci, 49:328-330）を介して投与した。全てのマウスは、注射から素早く回復した。心臓の表現型は、超音波心臓検査によって３週齢から毎週評価した（実施例１の詳細を参照）。マウスを７週齢において犠牲にして、異なる器官を抽出した。ＲＮＡ及びタンパク質を抽出した。心室、肝臓及び骨格筋のＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３及びトータルＭｙｂｐｃ３のｍＲＮＡｓを、実施例３に記載したように、ＲＴ−ＰＣＲによって評価した（図５Ａ）。
【０１０２】
ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３のｍＲＮＡのレベルは、心室の方が他の器官よりも遥かに高かった（図５Ａ、上部ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３パネル）。心室では、コントロールＫＩマウスにおいては異なる突然変異体Ｍｙｂｐｃ３のｍＲＮＡｓが増幅された（図５Ａ、下部トータルＭｙｂｐｃ３パネル）が、その一方で野生型コントロールマウス及びＡＡＶ９−ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３を形質導入したＫＩマウスにおいては主たるユニークバンドが検出された（図５Ａ、トータルＭｙｂｐｃ３パネル）。肝臓及び骨格筋においても、ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３遺伝子導入の後に、心室よりも低レベルであるが、（単一の）バンドが検出された。
【０１０３】
ウェスタンブロット解析は、実施例３において記載したように、ｃＭｙＢＰ−Ｃを指向する抗体を使用して実行した。そして、ＡＡＶ９−ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３遺伝子導入の後のｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質レベルは、ＰＢＳ又はＡＡＶ９−ＧＦＰを注射したＫＩマウスの場合よりも高く、ＷＴマウスにおいて見出されたレベルに到達したことが分かった（図５Ｂ）。ｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質は、ベクターの心臓に対する特異性に起因して、Ｍｙｂｐｃ３遺伝子導入の後に、肝臓及び骨格筋においては検出されなかった。
【０１０４】
外因的に発現したＦＬＡＧタグ付きｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質の局在を検査するために、ＡＡＶ９−ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３を７週間注射したＫＩマウスの心室の凍結切片上で、ＦＬＡＧエピトープ及びトータルｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質を指向する抗体を使用して、免疫蛍光解析を実行した。染色は、ｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質の典型的（classic）な筋状パターンがサルコメアのＡ−バンドにおけるダブレットに位置し（図５Ｃ；ｃＭｙＢＰ−Ｃ）、ｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質は、ＦＬＡＧシグナル（図５Ｃ；ＦＬＡＧ）と全体的に共染色されることを示した。核は、ＤＲＡＱ５（登録商標）を用いて染色した。つまり、過剰発現したｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質がサルコメア内に適切に組み込まれ、そして大部分（majority）のＦＬＡＧポジティブな筋状の心筋細胞がトータルｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質と共染色されているため、内来性の突然変異体のｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質が外来性のｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質に置き換えられたことが示唆された。
【０１０５】
心臓エコーグラフィック解析は、上記実施例１に記載したように実行した。３、５、６及び７週齢において、野生型（ＷＴ）、ＰＢＳを注射したノックイン（ＫＩ−）マウス及びＡＡＶ９−ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３（ＫＩ＋）を注射したＫＩマウスの、左心室内径短縮率（ＦＡＳ）及び体重に対する左心室容積の割合（ＬＶＭ／ＢＷ）を検査した。超音波心臓検査による心臓の機能の評価は、ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３遺伝子導入後の左心室内径短縮率（ＦＡＳ）及び体重に対する左心室容積の割合（ＬＶＭ／ＢＷ）の減少の救済を示した（図５Ｄ）。
【０１０６】
つまり、これらのデータは、 新生仔ＫＩマウスへのＡＡＶ９−ＦＬＡＧ−Ｍｙｂｐｃ３の単回投与が、分子的な表現型（ｃＭｙＢＰ−Ｃのハプロ不全が無く、かつ突然変異体ポリペプチドが無い）及び機能的な表現型（左心室の異常肥大及び機能障害が無い）を救済することを示した。
【０１０７】
実施例６：誘導多能性幹細胞に由来するヒト心筋細胞における外来性野生型ｍｙｃ−ＭＹＢＰＣ３の発現。
誘導多能性幹細胞 （ｉＰＳＣ）は、ヒトコントロール個人の皮膚バイオプシーから増殖させた繊維芽細胞の再プログラミングによって生成した。心筋細胞の分化は、Gordon Kelle氏のグループからのプロトコル（Yang L et al., 2008, Nature 22:524-8）から適合された。
【０１０８】
分化の後に、ヒト心筋細胞を、ＲＮＡ及びタンパク質の解析に関しては１２ウェルプレートに２ｘ１０５細胞／ウェルの密度で、又は、免疫蛍光解析に関しては４チャンバディッシュ（直径３５ｍｍ）に２．５ｘ１０４細胞／チャンバの密度で、蒔いた。心筋細胞は、異なるＭＯＩにおいて、ヒトｍｙｃ−ｃＭｙＢＰ−Ｃ（ＤＮＡ配列：配列番号２９に続いて配列番号１）をコードするｍｙｃタグ付きＭＹＢＰＣ３アデノウィルスを８日間形質導入した。
【０１０９】
ｍｙｃタグ付きヒトＭＹＢＰＣ３プラスミドの構造（構築法）は、従来文献に記載されている（Flavigny J et al., 1999, J Mol Biol 294, 443-456; Sarikas et al., 2005, Cardiovasc Res 66:33-44）。手短にいうと、ＡＴＧプラスｍｙｃエピトープ（配列番号３０）をコードする３０ヌクレオチド配列（配列番号２９）を、ＣＭＶプロモーター（配列番号３１）の後側、かつ、ヒトＭＹＢＰＣ３のｃＤＮＡ（配列番号１）の前側に挿入した。挿入物（インサート）は、ｍｙｃタグ付きヒトｃＭｙＢＰ−Ｃ（配列番号３２）をコードする。組み換えアデノウィルスは、従来文献（He T et al., 1998 Proc Natl Acad Sci U S A 95, 2509-2514）に記載されるように、シャトルベクターｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ内に、挿入物（ｍｙｃタグ付きヒトＭＹＢＰＣ３ｃＤＮＡ）をクローニングし、そし後に、このプラスミドを、ｐＡｄＥａｓｙ−１と共に大腸菌へ共形質転換することによって生成した。ｃＭｙＢＰ−Ｃの発現は、恒常的に活性なＣＭＶプロモーター（配列番号３１）によってもたらされる。
【０１１０】
異なるＭＹＢＰＣ３のｍＲＮＡｓ（外来性ｍｙｃ−ＭＹＢＰＣ３及びトータルＭＹＢＰＣ３）のヒト心筋細胞内での転写の評価は、上述したようにＲＴ−ＰＣＲによって実行した（図６Ａ）。外来性ＭＹＢＰＣ３ｍＲＮＡは、特異的なプライマー（ｍｙｃ配列内のフォワードプライマー、5'-GCA AAA GCT TAT TAG CGA GGA A-3'（配列番号３３）及びエクソン２内のリバースプライマー、5'-CAG GCC GTA CTT GTT GCT G -3'（配列番号３４））を用いて増幅し、そして、トータルＭＹＢＰＣ３のｍＲＮＡは、外来性ＭＹＢＰＣ３及び内来性ＭＹＢＰＣ３の両方を認識するプライマー（エクソン１内のフォワードプライマー、5'-GGG GAA GAA GCC AGT CTC AG -3'（配列番号３５）及びエクソン２内のリバースプライマー、5'-CAG GCC GTA CTT GTT GCT G -3'（配列番号３４））を用いて増幅した。ウィルスのドーズの増加と共に、ｍｙｃ−ＭＹＢＰＣ３のｍＲＮＡのレベルが増加した（図６Ａ、左パネル）。形質導入をしていない細胞（ＮＴ）及び逆転写酵素無しのネガティブコントロール（−ＲＴ）においては、Ｍｙｃ−ＭＹＢＰＣ３のｍＲＮＡは、検出されなかった。
【０１１１】
ウェスタンブロット解析は、ｃＭｙＢＰ−ＣのＣ０−Ｃ１ドメインを指向する抗体（図６Ｂ、トータルｃＭｙＢＰ−Ｃ、親切にも研究協力者によって提供された）、又はｍｙｃタグを指向する抗体（図６Ｂ、外来性ｍｙｃ−ｃＭｙＢＰ−Ｃ（rabbit polyclonal Sigma; catalog # C3956）を指向する抗体のいずれかを使用して、上述のように実行した。ポジティブコントロール（＋）は、同一のウィルスを用いて形質導入したネズミ心筋細胞のサンプルであった。トータルｃＭｙＢＰ−Ｃのレベルはアデノウィルスによる遺伝子導入の後にわずかに増加した。その一方で、ｍｙｃタグ付きｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質は、形質導入をしていないサンプル（ＮＴ）においては存在せず、ｍｙｃタグ付きｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質のレベルは、ＭＯＩの増加と共に上昇した（図６Ｂ）。
【０１１２】
ｉＰＳＣに由来するヒト心筋細胞における外来性ｍｙｃ−ｃＭｙＢＰ−Ｃの局在は、免疫蛍光法によって解析した。ヒト心筋細胞は、サルコメアの筋と予想されるものを示す、抗ｃＭｙＢＰ−Ｃ抗体を用いて染色した（図６Ｃ、ｃＭｙＢＰ−Ｃ）。外来性ｃＭｙＢＰ−Ｃは、抗ｍｙｃ抗体を用いて染色した（図６Ｃ、ｍｙｃ）。抗ｍｙｃ抗体は、タンパク質のＮ末端に位置するｍｙｃタグに対して結合する。外来性のｍｙｃ−タグ付きｃＭｙＢＰ−Ｃは、ヒトｉＰＳＣ由来の心筋細胞のサルコメアへ、Ａバンド内のダブレットとして正確に組み込まれることが観察された。
【０１１３】
これらのデータは、ｉＰＳＣに由来するヒト心筋細胞における外来性ヒトｍｙｃ−ＭＹＢＰＣ３の発現を初めて示した。外来性ヒトｍｙｃ−Ｍｙｂｐｃ３の発現は、サルコメアに組み込まれる安定なヒトｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質を結果としてもたらす。つまり、ＭＹＢＰＣ３のｃＤＮＡの過剰発現は、ヒト肥大型心筋症の遺伝子治療のために使用され得る。
【０１１４】
実施例７：長期間のＭｙｂｐｃ３遺伝子治療はＭｙｂｐｃ３のｍＲＮＡレベルを回復させ、そして、Ｍｙｂｐｃ３をターゲットとしたノックインマウスにおける心臓異常肥大及び機能障害を部分的に予防した。
異なる投与量のアデノ随伴ウィルスセロタイプ９（ＡＡＶ９）−Ｍｙｂｐｃ３（１ｘ１０１１、３ｘ１０１１、１ｘ１０１２及び３ｘ１０１２のベクターゲノム（ｖｇ）／マウス）又はＰＢＳを、１日齢のＭｙｂｐｃ３をターゲットとしたノックイン（ＫＩ）マウスの側頭静脈へ、心臓病の表現型が出現する前に、投与した。３４週間後に、マウスを、インビボの血行力学的解析及び組織解析に供した。ＷＴマウスを、コントロールとして使用した。
【０１１５】
心臓収縮機能（＝ｄＰ／ｄｔｍａｘ）及び心臓弛緩機能（＝ｄＰ／ｄｔｍｉｎ）の解析、そして、体重に対する心臓の重量の割合（ＨＷ／ＢＷ）の測定を、３４週齢のＷＴマウス、ＰＢＳで処置したＫＩマウス及び最も高いドーズである３ｘ１０１２ｖｇで処置したＫＩマウスにおいて実行した（図７．１Ａ）。ＷＴと比較して、心臓収縮機能のわずかな低下、心臓弛緩機能の顕著（有意）な低下、そしてＨＷ／ＢＷの割合の顕著な増加が、ＫＩマウスにおけるＭｙｂｐｃ３遺伝子治療によって防止された。
【０１１６】
更に、外来性ＦＬＡＧタグ付きＭｙｂｐｃ３のｍＲＮＡレベル（図７．１Ｂ、上部パネル）及びトータルＭｙｂｐｃ３のｍＲＮＡレベル（図７．１Ｂ、上部パネル）の評価のために、ＲＴ−ＰＣＲを実行した。ＲＮＡは、各グループにおいて、心室組織から抽出してプールした（ｎ＝５〜１０／グループ）。ＰＣＲ増幅されたバンドのサイズは、図７．１Ｂの左側に示される。この図７．１Ｂは、Ｍｙｂｐｃ３（外来性単独及びトータルの両方）の発現が、ＡＡＶ９−Ｍｙｂｐｃ３の投与量依存的様式で増加したことを示す。重要なことに、突然変異体ｍＲＮＡｓの発現は（突然変異体（Ｍｕｔａｎｔ）−１、突然変異体−２及び突然変異体−３についてのアンプリコンによって示されるように）、逆に、ＡＡＶ９−Ｍｙｂｐｃ３の投与量依存的様式で減少した。
【０１１７】
さらに、３４週齢の、ＷＴマウス、ＰＢＳで処置したＫＩマウス及び最も高いドーズである３ｘ１０１２のｖｇで処置したＫＩマウスにおいて実行したＲＴ−ｑＰＣＲによって、トータルＭｙｂｐｃ３のｍＲＮＡレベルを測定した（図７．１Ｃ）。ＷＴと比較して、ＫＩマウスにおけるＭｙｂｐｃ３のｍＲＮＡレベルの顕著な減少が、Ｍｙｂｐｃ３遺伝子治療によって完全に防止された。
【０１１８】
外来性ＦＬＡＧタグ付きｃＭｙＢＰ−Ｃのタンパク質レベル（図７．２Ｄ、上部パネル）、トータルｃＭｙＢＰ−Ｃのタンパク質レベル（下部パネル）を評価するために、ウェスタンブロット解析を実行した。解析のために、各グループから心室のタンパク質を抽出して、プールした。ブロットは、ＦＬＡＧエピトープ又はトータルｃＭｙＢＰ−Ｃを指向する抗体を用いて染色した（各条件の上側部分）。ＧＡＰＤＨを指向する抗体を、ローディングコントロールとして使用した（各条件の下側部分）。Ｍｙｂｐｃ３のｍＲＮＡに関して、この図７．２Ｄは、ｃＭｙＢＰ−Ｃ（外来性単独及びトータルの両方）のタンパク質レベルが、ＡＡＶ９−Ｍｙｂｐｃ３投与量依存的様式で増加したことを示す。
【０１１９】
ｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質レベルを定量して、ＧＡＰＤＨに関して規格化（ノーマライズ）し、そしてＷＴに対して関連付けた（図７．２Ｅ）。ＷＴと比較して、ＫＩマウスにおいて、ｃＭｙＢＰ−Ｃタンパク質レベルの著しい減少が、Ｍｙｂｐｃ３遺伝子治療によって顕著に防止された。
【０１２０】
以上まとめると、これらのデータは、長期間のＭｙｂｐｃ３遺伝子治療は、ＫＩマウスにおいて、ＷＴのＭｙｂｐｃ３のレベルを回復するのみならず、突然変異体Ｍｙｂｐｃ３のｍＲＮＡｓの転写をも防止したことを示した。肥大型心筋症の鍵である左心室の異常肥大及び弛緩機能障害の発生が、両者ともに部分的に顕著に防止された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７．１】
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【図７．２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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