(57)【要約】  本開示は、肝細胞癌（ＨＣＣ）などの癌に対する免疫応答を刺激するために用いる癌幹細胞を提供する。前述の癌幹細胞を作製し、精製する方法も提供する。【選択図】なし
2016510756.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製された肝細胞癌（ＨＣＣ）癌幹細胞（ＣＳＣ）の集団に由来する腫瘍抗原によってｅｘ  ｖｉｖｏで活性化された樹状細胞を含む、免疫原性組成物
【請求項２】
腫瘍抗原が前記ＨＣＣ−ＣＳＣの細胞抽出物を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
腫瘍抗原がＨＣＣ−ＣＳＣの溶解物を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
腫瘍抗原がインタクトなＨＣＣ−ＣＳＣを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
インタクトな細胞が非増殖性にされている、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
インタクトな細胞が放射線照射によって非増殖性にされている、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
インタクトな細胞が核架橋剤への曝露によって非増殖性にされている、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
薬学的に許容される担体および／または賦形剤をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
アジュバントをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
アジュバントが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子である、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
活性化樹状細胞およびＨＣＣ−ＣＳＣを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
ＨＣＣ−ＣＳＣがＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイドの形状である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
ＨＣＣ−ＣＳＣが初期ＨＣＣ−ＣＳＣの形状である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
ＨＣＣ−ＣＳＣが混成ＨＣＣ−ＣＳＣの形状である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
ＨＣＣ−ＣＳＣがＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣの形状である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の前記免疫原性組成物を前記対象に投与することを含む、肝細胞癌を治療する方法。
【請求項１７】
免疫原性組成物が、各投与量が約５〜２０×１０6細胞を含む複数回の投与で投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
投与量が約１０×１０6細胞を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記投与量が毎週２〜５回投与、続いて毎月３〜６回投与で投与される、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
対象が６〜１０投与量の免疫原性組成物を投与される、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
肝細胞癌の治療用医薬の製造における、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物の使用。
【請求項２３】
肝細胞癌の治療のための、請求項４１〜１５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物の使用。
【請求項２４】
肝細胞癌（ＨＣＣ）癌幹細胞（ＣＳＣ）の集団を調製する方法であって、
ＨＣＣの試料を取得することと；
試料の細胞を解離させることと；
前記解離した細胞を非接着性基質上の所定の培地でｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することとを含み、
前記所定の培地が無血清であり、および分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を介して作用する少なくとも１つの成長因子が追加されており、それによってＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイドが形成され、
前記ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイド集団中の細胞の少なくとも８０％がバイオマーカーα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＥｐＣＡＭ、Ｏｖ１およびＯＶ６のうちの２つ以上を発現する、前記方法。
【請求項２５】
ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイド集団中の細胞の少なくとも８０％がさらに、バイオマーカーＣＫ７、ＣＫ１９およびＥ−カドヘリンのうちの１または複数を発現する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイド集団中の細胞の少なくとも９０％がバイオマーカーＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、Ｏｖ１およびＯＶ６のうちの２つ以上を発現する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
接着性基質上の所定の培地で前記ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイドを培養することをさらに含み、
前記所定の培地が無血清であり、および前記ＭＡＰＫ経路を介して作用する少なくとも１つの成長因子が追加されており、それによって初期ＨＣＣ−ＣＳＣの集団が形成され、前記初期ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がバイオマーカーＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびｃ−ｋｉｔのうちの２つ以上を発現する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
初期ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がさらに、バイオマーカーＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、Ｓｏｘ７、Ｓｏｘ１７、Ｆｏｘ２Ａ、Ｏｖ１、ＯＶ６、ＣＤ１３３およびＣＤ９０のうちの１または複数を発現する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
初期ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも９０％が、バイオマーカーＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびｃ−ｋｉｔのうちの２つ以上を発現する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
接着性基質上の所定の培地で前記ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイドを培養することをさらに含み、
前記所定の培地が血清を含み、および前記ＭＡＰＫ経路を介して作用する少なくとも１つの成長因子が追加されており、それによって混成ＨＣＣ−ＣＳＣの集団が形成され、
前記混成ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がバイオマーカーＡＦＰ、ＣＫ７、ＣＫ１９、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、Ｎａｎｏｇ、ＦｏｘＡ２、ＨＮＦ４ａおよびＡＢＣＧ２のうちの２つ以上を発現する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
混成ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも９０％がバイオマーカーＡＦＰ、ＣＫ７、ＣＫ１９、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、Ｎａｎｏｇ、ＦｏｘＡ２、ＨＮＦ４ａおよびＡＢＣＧ２のうちの２つ以上を発現する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
接着性基質上の所定の培地で前記ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイドを培養することをさらに含み、
前記所定の培地が血清源を含み、およびＭＡＰＫ経路を介して作用する少なくとも１つの成長因子が追加されており、それによって胚間葉転換（ＥＭＴ）−ＨＣＣ−ＣＳＣの集団が形成され、前記ＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がバイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｇ／ＳｎａｉｌおよびＴｗｉｓｔのうちの２つ以上を発現する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
ＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がさらにバイオマーカーＡＦＰ、Ｎ−カドヘリン、ＣＤ４４およびビメンチンのうちの１または複数を発現する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも９０％がさらにバイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｇ／ＳｎａｉｌおよびＴｗｉｓｔのうちの１または複数を発現する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
接着性基質上の所定の培地で前記ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイド、前記混成ＨＣＣ−ＣＳＣまたはＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣを培養することをさらに含み、
前記所定の培地は無血清であり、およびＭＡＰＫ経路を介して作用する少なくとも１つの成長因子が追加されており、それによって初期ＨＣＣ−ＣＳＣの集団を形成し、前記初期ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がバイオマーカーＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびｃ−ｋｉｔのうちの２つ以上を発現する、請求項２４、３０または３２に記載の方法。
【請求項３６】
初期ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がさらにバイオマーカーＣＫ７、ＣＫ１９およびＥ−カドヘリンのうちの１または複数を発現する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
初期ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも９０％がバイオマーカーＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびｃ−ｋｉｔのうちの１または複数を発現する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
接着性基質上の所定の培地で前記ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイド、前記初期ＨＣＣ−ＣＳＣまたはＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣを培養することをさらに含み、
前記所定の培地は血清源を含み、およびＭＡＰＫ経路を介して作用する少なくとも１つの成長因子が追加されており、それによって混成ＨＣＣ−ＣＳＣの集団が形成され、前記混成ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がバイオマーカーＡＦＰ、ＣＫ７、ＣＫ１９、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、Ｎａｎｏｇ、ＦｏｘＡ２、ＨＮＦ４ａおよびＡＢＣＧ２のうちの２つ以上を発現する、請求項２４、２７または３２に記載の方法。
【請求項３９】
混成ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも９０％がバイオマーカーＡＦＰ、ＣＫ７、ＣＫ１９、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、Ｎａｎｏｇ、ＦｏｘＡ２、ＨＮＦ４ａおよびＡＢＣＧ２のうちの２つ以上を発現する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４０】
接着性基質上の所定の培地で前記ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイド、前記初期ＨＣＣ−ＣＳＣまたは混成ＨＣＣ−ＣＳＣを培養することをさらに含み、
前記所定の培地が血清源を含み、およびＭＡＰＫ経路を介して作用する少なくとも１つの成長因子が追加されており、それによってＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣの集団が形成され、
前記ＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がバイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｇ／ＳｎａｉｌおよびＴｗｉｓｔのうちの２つ以上を発現する、請求項２４、２７または３０に記載の方法。
【請求項４１】
ＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がさらにバイオマーカーＡＦＰ、Ｎ−カドヘリン、ＣＤ４４およびビメンチンのうちの１または複数を発現する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも９０％がバイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｇ／ＳｎａｉｌおよびＴｗｉｓｔのうちの１または複数を発現する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
所定の培地が表２に記載の任意の培地である、請求項２４〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記所定の培地が表２および表３の組み合わせからの任意の培地である、請求項２４〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
所定の培地が表２、表３および表４の組み合わせからの任意の培地である、請求項２４〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
所定の培地が表２および表４の組み合わせからの任意の培地である、請求項２４〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
成長因子が、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）またはアクチビンＡのうちの１または複数である、請求項２４に記載の方法。
【請求項４８】
ＦＧＦが塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）である、請求項２５に記載の方法。
【請求項４９】
所定の培地はアクチビンＡが追加されていない、請求項２４〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
所定の培地がＨＣＣ幹細胞の自然分化を防止するのに有効な量で、アクチビンＡのアゴニストが追加されている、請求項２４〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
アクチビンＡのアンタゴニストが、アクチビンＡに結合するフォリスタチンまたは抗体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項５２】
培地に抗酸化剤が追加されていない、請求項２４〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
抗酸化剤がスーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオン、プトレシンまたはβ−メルカプトエタノールである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
培地にグルタチオンが追加されている、請求項２４〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
接着性基質が足場依存性細胞に接着して、収集するように構成されている、請求項２４〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
足場依存性細胞が線維芽細胞である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
非接着性基質が超低接着性のポリスチレン表面である、請求項２４〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
接着性基質が、ＲＧＤトリペプチドモチーフにおいて豊富なタンパク質で被覆された表面を備えている、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
請求項２４〜５８のいずれか１項に記載の方法によって調製された精製ＨＣＣ−ＣＳＣ細胞の集団。
【請求項６０】
精製ＨＣＣ−ＣＳＣ細胞がＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイドである、請求項５９に記載の集団。
【請求項６１】
精製ＨＣＣ−ＣＳＣ細胞が初期ＨＣＣ−ＣＳＣである、請求項５９に記載の集団。
【請求項６２】
精製ＨＣＣ−ＣＳＣ細胞が混成ＨＣＣ−ＣＳＣである、請求項５９に記載の集団。
【請求項６３】
精製ＨＣＣ−ＣＳＣ細胞がＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣである、請求項５９に記載の集団。
【請求項６４】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法によって調製されたＨＣＣ−ＣＳＣ細胞株。
【請求項６５】
ＨＣＣ−ＣＳＣがＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイドである、請求項６４に記載のＨＣＣ−ＣＳＣ細胞株。
【請求項６６】
ＨＣＣ−ＣＳＣが初期ＨＣＣ−ＣＳＣである、請求項６４に記載のＨＣＣ−ＣＳＣ細胞株。
【請求項６７】
ＨＣＣ−ＣＳＣが混成ＨＣＣ−ＣＳＣである、請求項６４に記載のＨＣＣ−ＣＳＣ細胞株。
【請求項６８】
ＨＣＣ−ＣＳＣがＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣである、請求項６４に記載のＨＣＣ−ＣＳＣ細胞株。
【請求項６９】
それを必要とする対象において肝細胞癌に対する免疫応答を刺激する方法であって、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の前記免疫原性組成物、請求項５９〜６３のいずれか１項に記載の前記ＨＣＣ−ＣＳＣ細胞、または請求項６４〜６８のいずれか１項に記載の前記ＨＣＣ−ＣＳＣ細胞株を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項７０】
肝細胞癌の治療用医薬の製造における、請求項５９〜６３のいずれか１項に記載の前記ＨＣＣ−ＣＳＣ細胞または請求項６４〜６８のいずれか１項に記載の前記ＨＣＣ−ＣＳＣ細胞株の使用。
【請求項７１】
肝細胞癌の治療のための、請求項５９〜６３のいずれか１項に記載の前記ＨＣＣ−ＣＳＣ細胞または請求項６４〜６８のいずれか１項に記載の前記ＨＣＣ−ＣＳＣ細胞株の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互作用
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１３年３月７日出願の米国特許仮出願第６１／７７４，５１７号に対する利益を主張する。本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１２年８月１５日出願の米国特許仮出願第６１／６８３，４７７号および２０１２年１０月２５日出願の米国特許仮出願第６１／７１８，６４３号に対して利益を主張する、２０１３年８月６日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ第２０１３／０５３８５０号の一部継続出願でもある。これらのすべての全内容は、参照により本明細書に組み込む。
本開示は、肝細胞癌幹細胞、それに由来する免疫原性組成物とその作製方法および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
固形腫瘍において、元の腫瘍と同じ組織学的多様性の腫瘍を開始する能力がある細胞は僅かな割合である。これらの細胞は癌幹細胞と呼ばれ、別名腫瘍開始細胞または癌開始細胞である。癌幹細胞は、一団の特性によって定義されることができる。第１に、癌幹細胞には、それ自身を再生する能力がある。第２に、癌幹細胞は、移植されると、新しい腫瘍を定着させることができる。第３に、癌幹細胞は、休止状態の腫瘍細胞または周期（細胞周期）が遅い腫瘍細胞として特徴付けることができる。第４に、癌幹細胞は、化学療法または放射線療法に対する癌の抵抗性に関与することもある。第５に、環境が癌幹細胞の未分化状態を維持している場合、癌幹細胞は、再生し、より分化した前駆細胞を生じさせる能力を維持する特定の微小環境に依存する。この微小環境としては、間葉系幹細胞、組織関連線維芽細胞および内皮細胞を挙げることができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養でスフェロイドを形成する能力は、癌幹細胞として特定の細胞の同定に寄与ことができるさらに別の特徴である。癌幹細胞の1つの非限定的な定義は、元の腫瘍の完全な不均一性を再生し、かつ複数の継代の後でも、連続的に増殖することができる細胞である。
【０００３】
特定の癌幹細胞集団は、腫瘍の起源になり得、治療された癌の再発源になり得る。また、組織中の癌幹細胞の亜集団は、特定のシグナルに曝露されると、増殖サイクルを再開することができ、腫瘍を再建することができる細胞を産生することができる。癌幹細胞ニッチは、適当なシグナル伝達が増殖サイクルへの再進入を誘発するまでは、休止状態にある。再進入シグナルは、外傷、細胞損傷、微生物侵襲（ウイルス、細菌または真菌）などの局所的事象から起こり得、または局所成長因子、サイトカインもしくは細胞間情報伝達による媒介され得る。また、ホルモンは組織特異的ニッチにおいて幹細胞を調節することができる。幹細胞ニッチの欠陥または突然変異は、上記の機能の混乱をもたらし得る。腫瘍はそのような混乱に起因することがあり、これらの混乱としては細胞周期の制御に影響を及ぼすランダム変異が挙げられる。癌の原因となる突然変異は、個人間で変わる。そのような可変性は、１人の乳癌患者対別の乳癌患者など１種類の癌の患者間で、並びに肝癌対黒色腫などの異なる種類の癌の間で観察されている。
【０００４】
癌に対して開発されている治療法としては、自己免疫応答を含む諸アプローチが挙げられる。これらのアプローチとしては、脱凝集されて、ワクチンベクターとして処方される、新しく収集された自己腫瘍細胞の使用が挙げられる。別のアプローチは樹状細胞ワクチンであり、樹状細胞は自己腫瘍ライセートでパルスされている。さらに別のアプローチは、ガラクトースポリマーによる患者の腫瘍細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ修飾であり、修飾腫瘍細胞を患者に注射で戻し、そこでガラクトース腫瘍細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって容易に吸収され、それによって抗腫瘍応答を増大させる。自己免疫療法を含むこれらのアプロ−チの不利な点は、バルク腫瘍またはバルク腫瘍抗原が免疫刺激として使用される場合、抗原のシグナル・ノイズ比が低いことである。大部分の腫瘍細胞はかなり分化されており、血管成分、結合組織、分化した腫瘍細胞、生育不能細胞と壊死細胞および正常な宿主組織などの正常な細胞と混合している。癌幹細胞は、腫瘍の大きさのごく一部、時にはより侵襲性腫瘍において最高４％まで、最も一般的には１％未満だけを表す。したがって、バルク腫瘍が抗原源として使用される場合、免疫応答は、より分化した細胞に対して向けられ、幹細胞が攻撃を回避できるようになり、腫瘍の再発または転移を引き起こすことが可能になる。
別の新しい療法は、癌においてさらに豊富に発現する正常な抗原に対する単一標的抗原である。特異的抗原を標的にする療法（例えば、抗ＣＤ１３３、抗ＥｐＣＡＭ、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ１３など）は、無差別であり、癌細胞と共に正常な細胞に影響を及ぼし、患者に広範囲の有害影響をもたらす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本明細書では、肝細胞（ＨＣＣ）癌幹細胞（ＣＳＣ）、ＨＣＣ−ＣＳＣ細胞株、および肝細胞癌の治療のためにＨＣＣ−ＣＳＣをロードした樹状細胞を含む免疫原性組成物を開示する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
具体的には、本明細書では、肝細胞癌（ＨＣＣ）癌幹細胞（ＣＳＣ）の集団を作製する方法を提供し、該方法は、ＨＣＣの試料を取得することと；試料の細胞を解離することと；非接着性基質上の所定の培地で解離した細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することとを含み、前記所定の培地は無血清であり、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を介して作用する少なくとも１つの成長因子を追加添加しており、それによってＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイドを形成し、ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイド集団中の細胞の少なくとも約８０％は、バイオマーカーα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＥｐＣＡＭ、Ｏｖ１およびＯＶ６のうちの２つ以上を発現する。別の実施形態において、ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイド集団中の細胞の少なくとも約８０％はさらに、バイオマーカーＣＫ７、ＣＫ１９およびＥ−カドヘリンのうちの１または複数を発現する。別の実施形態において、ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイド集団中の細胞の少なくとも約９０％は、バイオマーカーＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、Ｏｖ１およびＯＶ６のうちの２つ以上を発現する。
【０００７】
別の実施形態において、該方法は、接着性基質上の所定の培地でＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイドを培養することをさらに含み、前記所定の培地は無血清であり、ＭＡＰＫ経路を介した作用する少なくとも１つの成長因子を追加しており、それによって初期ＨＣＣ−ＣＳＣの集団を形成し、初期ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも約８０％はＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびｃ−ｋｉｔのうちの２つ以上を発現する。別の実施形態において、初期ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも約８０％はさらに、バイオマーカーＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、Ｓｏｘ７、Ｓｏｘ１７、Ｆｏｘ２Ａ、Ｏｖ１、ＯＶ６、ＣＤ１３３およびＣＤ９０のうちの１または複数を発現する。別の実施形態において、初期ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも約９０％は、バイオマーカーＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびｃ−ｋｉｔのうちの２つ以上を発現する。
【０００８】
別の実施形態において、該方法は、接着性基質上の所定の培地でＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイド培養することをさらに含み、前記所定の培地は血清を含み、ＭＡＰＫ経路を介して作用する少なくとも１つの成長因子を追加しており、それによって混成ＨＣＣ−ＣＳＣの集団を形成し、前記混成ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも約８０％はバイオマーカーＡＦＰ、ＣＫ７、ＣＫ１９、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、Ｎａｎｏｇ、ＦｏｘＡ２、ＨＮＦ４ａおよびＡＢＣＧ２のうちの２つ以上を発現する。別の実施形態において、混成ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも約９０％は、バイオマーカーＡＦＰ、ＣＫ７、ＣＫ１９、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、Ｎａｎｏｇ、ＦｏｘＡ２、ＨＮＦ４ａおよびＡＢＣＧ２のうちの２つ以上を発現する。
【０００９】
別の実施形態において、該方法は、接着性基質上の所定の培地でＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイドを培養することをさらに含み、前記所定の培地が血清源を含み、ＭＡＰＫ経路を介して作用する少なくとも１つの成長因子を追加しており、それによって胚間葉転換（ＥＭＴ）−ＨＣＣ−ＣＳＣの集団を形成し、前記ＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも約８０％はバイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｇ／ＳｎａｉｌおよびＴｗｉｓｔのうちの２つ以上を発現する。別の実施形態において、ＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも約８０％はさらに、バイオマーカーＡＦＰ、Ｎ−カドヘリン、ＣＤ４４およびビメンチンのうちの１または複数を発現する。さらに別の実施形態において、ＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも約９０％はさらに、バイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｇ／ＳｎａｉｌおよびＴｗｉｓｔのうちの１または複数を発現する。
【００１０】
別の実施形態において、該方法は、接着性基質上の所定の培地でＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイド、混成ＨＣＣ−ＣＳＣまたはＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣを培養することをさらに含み、前記所定の培地は無血清であり、ＭＡＰＫ経路を介して作用する少なくとも１つの成長因子を追加しており、それによって初期ＨＣＣ−ＣＳＣの集団を形成し、前記初期ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも約８０％は、バイオマーカーＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびｃ−ｋｉｔのうちの２つ以上を発現する。別の実施形態において、初期ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも約８０％はさらに、バイオマーカーＣＫ７、ＣＫ１９およびＥ−カドヘリンのうちの１または複数を発現する。さらに別の実施形態において、初期ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも約９０％は、バイオマーカーＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびｃ−ｋｉｔのうちの１または複数を発現する。
【００１１】
別の実施形態において、該方法は、接着性基質上の所定の培地でＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイド、初期ＨＣＣ−ＣＳＣまたはＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣを培養することをさらに含み、前記所定の培地は血清源を含み、ＭＡＰＫ経路を介して作用する少なくとも１つの成長因子を追加しており、それによって混成ＨＣＣ−ＣＳＣの集団を形成し、前記混成ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも約８０％は、バイオマーカーＡＦＰ、ＣＫ７、ＣＫ１９、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、Ｎａｎｏｇ、ＦｏｘＡ２、ＨＮＦ４ａおよびＡＢＣＧ２のうちの２つ以上を発現する。別の実施形態において、混成ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも約９０％は、バイオマーカーＡＦＰ、ＣＫ７、ＣＫ１９、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、Ｎａｎｏｇ、ＦｏｘＡ２、ＨＮＦ４ａおよびＡＢＣＧ２のうちの２つ以上を発現する。
【００１２】
別の実施形態において、該方法は、接着性基質上の所定の培地でＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイド、初期ＨＣＣ−ＣＳＣまたは混成ＨＣＣ−ＣＳＣを培養することをさらに含み、前記所定の培地は血清源を含み、ＭＡＰＫ経路を介して作用する少なくとも１つの成長因子を追加しており、それによってＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣの集団を形成し、前記ＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも約８０％は、バイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｇ／ＳｎａｉｌおよびＴｗｉｓｔのうちの２つ以上を発現する。別の実施形態において、ＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも約８０％は、バイオマーカーＡＦＰ、Ｎ−カドヘリン、ＣＤ４４およびビメンチンのうちの１または複数を発現する。さらに別の実施形態において、ＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも約９０％は、バイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｎｇ／ＳｎａｉｌおよびＴｗｉｓｔのうちの１または複数を発現する。
【００１３】
一実施形態において、所定の培地は、表２に記載の任意の培地、表２と表３の組み合わせからの任意の培地、表２、表３および表４の組み合わせからの任意の培地、または表２と表４の組み合わせからの任意の培地である。
【００１４】
一実施形態において、成長因子は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）またはアクチビンＡのうちの１または複数である。別の実施形態において、ＦＧＦは塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）である。さらに別の実施形態において、所定の培地はアクチビンＡを追加していない。別の実施形態において、所定の培地は、ＨＣＣ幹細胞の自然分化を防止するのに有効な量で、アクチビンＡのアゴニストを追加している。さらに別の実施形態において、アクチビンＡのアンタゴニストは、アクチビンＡに特異的に結合するフォリスタチンまたは抗体である。
別の実施形態において、培地は抗酸化剤を補充していない。別の実施形態において、抗酸化剤は、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオン、プトレシンまたはβ−メルカプトエタノールである。さらに別の実施形態において、所定の培地はグルタチオンを追加している。
別の実施形態において、接着性基質は、線維芽細胞などの接着依存性細胞に接着し、および収集するように構成されている。別の実施形態において、非接着性基質は、超低接着性ポリスチレン表面である。さらに別の実施形態において、接着性基質は、ＲＧＤトリペプチドモチーフ中の豊富なタンパク質で被覆された表面を備えている。
【００１５】
本明細書に開示した任意の方法によって作製された精製ＨＣＣ−ＣＳＣ細胞の集団も本明細書で提供する。特定の実施形態において、精製ＨＣＣ−ＣＳＣ細胞は、ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイド、初期ＨＣＣ−ＣＳＣ、混成ＨＣＣ−ＣＳＣまたはＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣである。
本明細書に開示する任意の方法によって作製されたＨＣＣ−ＣＳＣ細胞株も本明細書で提供する。特定の実施形態において、精製ＨＣＣ−ＣＳＣ細胞は、ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイド、初期ＨＣＣ−ＣＳＣ、混成ＨＣＣ−ＣＳＣまたはＥＭＴ−ＨＣＣ０ＣＳＣである。
一実施形態において、本明細書に開示する精製ＨＣＣ−ＣＳＣ細胞またはＨＣＣ−ＣＳＣ細胞株の集団に由来する腫瘍抗原によってｅｘ  ｖｉｖｏで活性化した樹状細胞を含んでいる免疫原性組成物を本明細書で提供する。別の実施形態において、腫瘍抗原は、精製ＨＣＣ−ＣＳＣ細胞またはＨＣ−ＣＳＣ細胞株の細胞抽出物を含む。別の実施形態において、腫瘍抗原は、精製ＨＣＣ−ＣＳＣ細胞またはＨＣＣ−ＣＳＣ細胞株のライセートを含む。別の実施形態において、腫瘍抗原は、インタクトな精製ＨＣＣ−ＣＳＣ細胞またはＨＣＣ−ＣＳＣ細胞株由来のインタクトな細胞を含む。
【００１６】
別の実施形態おいて、インタクトなＨＣＣ−ＣＳＣ細胞は、非増殖性になる。別の実施形態において、インタクトな細胞は、放射線照射によって非増殖性になる。さらに別の実施形態において、インタクトな細胞は、細胞を核架橋剤に曝露することによって非増殖性になる。
別の実施形態おいて、免疫原性組成物は、薬学的に許容される担体および／または賦形剤をさらに含む。別の実施形態において、免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含む。別の実施形態において、アジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子である。
さらに別の実施形態において、免疫原性組成物は、樹状細胞とＨＣＣ−ＣＳＣ細胞を含む。別の実施形態において、精製ＨＣＣ−ＣＳＣ細胞またはＨＣＣ−ＣＳＣ細胞株は、ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイド、初期ＨＣＣ−ＣＳＣ、混成ＨＣＣ−ＣＳＣまたはＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣの形状である。
治療を必要とする対象において、本明細書に開示した免疫原性組成物の投与を含む、肝細胞癌を治療する方法も提供する。一実施形態において、免疫原性組成物は、各投与量が約５〜２０×１０6細胞を含む、複数の投与で投与される。別の実施形態において、投与量は約１０×１０6細胞を含む。別の実施形態において、投与量は毎週２〜５投与、続いて毎月３〜６投与である。さらに別の実施形態において、対象は、６〜１０投与の免疫原性組成物を投与される。
【００１７】
また、それを必要とする対象において、本明細書に開示する免疫原性組成物、本明細書に開示するＨＣＣ−ＣＳＣまたは本明細書に開示するＨＣＣ−ＣＳＣ細胞株を該対象に投与することを含む、肝細胞癌に対する免疫応答を刺激する方法を提供する。
また、肝細胞癌の治療用の医薬の製造における、本明細書に開示する免疫原性組成物、本明細書に開示するＨＣＣ−ＣＳＣまたは本明細書に開示するＨＣＣ−ＣＳＣ細胞株の使用を提供する。
また、肝細胞癌の治療のために、本明細書に開示する免疫原性組成物、本明細書に開示するＨＣＣ−ＣＳＣまたは本明細書に開示するＨＣＣ−ＣＳＣ細胞株の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】切除した腫瘍（実線のボックスと矢印）由来または針生検などの小試料（破線のボックスと矢印）由来の肝細胞癌（ＨＣＣ）幹細胞（ＨＣＣ−ＣＳＣ）の増殖物を単離し、およびスフェロイドへ収集するプロセスに関するフローチャートである。スフェロイドの生成の後、ＨＣＣ−ＣＳＣ亜集団を生成する経路は、一般的な経路である。
【図２】スフェロイドの模式図を表す。
【図３】図3Aおよび３Bは種々の形と大きさのスフェロイドを表す。
【図４】増殖相でのＨＣＣ幹細胞を表す。
【図５】超低接着性基質に接着した細胞を表す。
【図６】アクチビンＡに非感受性のＨＣＣ幹細胞を表す。これらの細胞は、密接したコロニーで増殖し、正常な宿主組織（線維芽細胞）に囲まれている。より分化した腫瘍細胞は、アクチビンＡの存在によって除去される。
【図７】密接したコロニーで増殖する、幹細胞に特異的なアクチビンＡに曝露することによって選択されたＨＣＣ幹細胞を表す。
【図８】小さい、自己複製細胞を含んでいる胚性幹細胞様のコロニーによる、ＨＣＣの濃縮培養を表す。
【図９】ＨＣＣ腫瘍からの針生検の細胞を接着性基質上に播種してから７日後、酵素解離から生じる細胞を表す（位相差１０×）。
【図１０】図９の細胞の増殖１４〜２１日後の典型的な密度のコロニー形成を表す（位相差１０×）。
【図１１】複数継代後の確立した、高増殖性ＨＣＣ幹細胞株を表す（位相差１０×）。
【図１２】図１２AはＨＣＣ同一性を確認する、核対比染色剤（ビスベンズイミド）による、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）に対して陽性であるＨＣＣ細胞株の染色を表す（落射蛍光、２０×）。図１２BはＡＦＰ染色のために図１２Ａの細胞を赤色チャネル画像で表す。図１２Cはビスベンズイミドのために青色チャネル画像を表す。
【図１３】図１３Aは確立した培養物中で早期癌前駆細胞フェノタイプ選択を確認する、高率の神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）染色による細胞を表す（核対比染色剤、ビスベンズイミドを含む）（落射蛍光、４０×）。図１３ＢはＮＣＡＭ染色のために図１３Ａの細胞を赤色チャネル画像で表す。図１３Ｃはビスベンズイミドのために青色チャネル画像を表す。
【図１４】図１４Ａは侵襲性のマーカーであり、高転移能を有する癌幹細胞に特異的なＣＤ４４に対して陽性標識されたＨＣＣ細胞株を表す。この細胞は、核対比染色、ビスベンズイミドでも染色している（落射蛍光、４０×）。図１４ＢはＣＤ４４染色のために図１４Ａの細胞を緑色チャネル画像で表す。図１４Ｃはビスベンズイミドのために青色チャネル画像を表す。
【図１５Ａ】図１５Ａはビスベンズイミド核対比染色により、ＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣ細胞株における上皮間葉転換マーカーのビエンチンとＳｌｕｇ／Ｓｎａｉｌを表す。図１５ＢはＳｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ染色のために図１５Ａの細胞を赤色チャネル画像で表す。図１５Ｃはビメンチンのために図１５Ａの細胞を緑色チャネル画像で表す。図１５Ｄはビスベンズイミドのために青色チャネル画像を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本開示は、主に高純度癌幹細胞からなるヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）から得た細胞集団を提供する。実施形態において、細胞集団の純度は、癌幹細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％である。これらの癌幹細胞は、肝細胞癌の前駆細胞であり、持続的自己再生の能力と特定レベルまで分化する能力を有する。本開示は、さらに癌の自己免疫療法のための抗原源として使用するためのＨＣＣ由来幹細胞の精製集団を生成する方法に関する。
試験およびスクリーニング実施形態も、包含する。本開示は、個別化医療の製剤を推進する独特の変化を特定するための遺伝子解析用に高純度のＨＣＣ幹細胞集団を用いる。本開示は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで修飾される新規の細胞株を提供し、この修飾はＨＣＣの免疫刺激の特性を高める。ＨＣＣ細胞株は、優れた抗原のシグナル・ノイズ比を提供するので、腫瘍粗作製を用いる同様の技術の改善である。ＨＣＣ細胞株には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ適用を変え得るまたは減少させ得る、線維芽細胞などの混入物の細胞集団がない。本開示の例示的な細胞株は、ＨＣＣの治療用医薬の製造でも用いられる。
【００２０】
本明細書で用いる場合、１または複数の癌細胞に由来するペプチドに関連して、「由来する」という用語は、癌細胞からまたは癌細胞の集団からペプチドを取得するいずれの方法も包含する。癌細胞は、例えば、ホモジナイザーで、または浸透圧バーストで壊して、粗抽出物をもたらすことができる。粗抽出物のペプチド、オリゴペプチドおよびポリペプチドは、樹状細胞に曝露することができ、続いてペプチドは樹状細胞によってプロセシングされる。「由来する」という用語はインタクトな癌細胞も包含し、該癌細胞は生きている、または該癌細胞は放射線照射で処理されているが依然として代謝的に活性である、または該癌細胞は核酸架橋剤で処理されているが依然として代謝的に活性であり、したがって依然としてペプチドを含んでいる。また、「由来する」とは、癌細胞壊死組織片、遊離癌細胞タンパク質および照射癌細胞の混成物を含み、したがって癌細胞に由来する。
ヒト、哺乳動物、哺乳動物対象、動物、家畜対象、プラセボ被験者、研究被験者、被実験者、細胞、組織、器官または生体液に適用する場合、「投与」とは、外因性リガンド、試薬、プラセボ、低分子、医薬、治療薬、診断薬または組成物の、対象、細胞、組織、器官または生体液などとの接触を指すがこれに限定されない。「投与」とは、例えば、治療方法、薬物動態学的方法、診断方法、研究方法、プラセボ方法および実験方法を指すこともあり得る。投与とは、ヒト対象または動物対象のｉｎ  ｖｉｖｏ治療を指すこともあり得る。細胞の処置とは、細胞への試薬の接触、並びに体液への試薬の接触を包含し、該体液は細胞と接触する。「投与」とは、試薬、診断組成物、結合組成物を用いる、または別の細胞を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ処置も包含する。
【００２１】
「有効量」とは、病状または障害の少なくとも１つの症状もしくは徴候を寛解させる、逆転させる、緩和する、予防する、または診断することができる量を包含するが、これに限定されない。明示的に、または脈絡によって特に明記しない限り、「有効量」とは、所望の成果を達成するのに十分な必要最低限量に限定されず、または所望の成果を達成するのに十分な最適量に限定されない。
疾患または障害の重症度、並びに該疾患または障害を予防する、治療するまたは緩和する処置能力（所望の成果を達成する）は、いかなる限定の意味を含むことなく、バイオマーカーまたは臨床パラメータで測定することができる。バイオマーカーとしては、血球数、血清、尿または脳脊髄液中の代謝産物レベル、腫瘍細胞数、癌幹細胞数、腫瘍レベルが挙げられる。腫瘍レベルは、Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  Ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ  （ＲＥＣＩＳＴ）基準（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ，ら（２００９）  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．４５：２２８−２４７）によって決定することができる。発現マーカーは、ｍＲＮＡの遺伝子発現または遺伝子増幅、抗原の発現およびポリペプチドの発現を包含する。臨床パラメータとしては、いかなる限定の意味を含むことなく、無増悪生存期間（ＰＦＳ）、６ヵ月ＰＦＳ、無病生存期間（ＤＦＳ）、無増悪期間（ＴＴＰ）、無遠隔転移期間（ＴＤＭ）および全生存期間が挙げられる。
【００２２】
「標識された」組成物は、分光法、光化学法、生体化学法、免疫化学法、アイソトープ法または化学法によって直接的または間接的のいずれかで検出することができる。例えば、有用な標識としては、32Ｐ、33Ｐ、35Ｓ、14Ｃ、3Ｈ、125Ｉ、安定同位体、エピトープタグ、蛍光色素、高電子密度試薬、基質もしくは例えば酵素結合免疫アッセイで用いられる酵素、またはフルオレット（米国特許第６，７４７，１３５号に開示されており、フルオレットに関して同米国特許が開示するすべてを参照によって本明細書に組み込む）が挙げられる。
したがって、癌幹細胞の精製スフェロイドの集団またはスフェロイド由来の単細胞作製物を作製する方法を本明細書に開示し、該方法は、ＨＣＣの生検を取得することと、該生検の細胞を解離することと、解離した細胞を基質上の所定の培地でｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養することとを含み、精製スフェロイドの集団またはＨＣＣ幹細胞の単細胞作製物を得るために、前記所定の培地は、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を介して作用する少なくとも１つの成長因子を追加している。精製スフェロイドの集団または単細胞における癌幹細胞の少なくとも８０％は、バイオマーカーＡＴＰ−結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＧ５２９８２．１）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＣＤ９０、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、サトケラチン７（ＣＫ７）、ｃ−ｋｉｔ、Ｅ−カドヘリン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００２３４５．２）、フォークヘッドボックスＡ２（ＦｏｘＡ２）、肝細胞核因子４α（ＨＮＦ４ａ）、Ｋｉ−６７、Ｎａｎｏｇ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０２４８６５．２、ＮＰ＿０７９１４１．２０）、Ｎ−カドヘリン、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ；ＣＤ５６）、Ｏｃｔ３／４（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００２６９２．２；ＮＰ＿９７６０３４．４；ＮＰ＿００１１６７００２．１；ＮＰ＿０６８８１２．１０）、Ｏｖ１、ＯＶ６、Ｓｌｕｇ（ＳＮＡＩ２）／Ｓｎａｉｌ（ＳＮＡＩ１）（Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ）、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００３１０６．３；ＮＰ＿００３０９７．１）、Ｓｏｘ７、Ｔｗｉｓｔおよびビメンチンのうちの１もしくは複数、またはすべてを発現する。開示した細胞集団の形成のフローチャートは、図１に示す。
【００２３】
本明細書で用いる場合、「スフェロイド」という用語は、無血清培地で癌細胞の培養によって形成される癌幹細胞の球状凝集体を指す。スフェロイドを形成する能力は、癌幹細胞の特徴である。
特定の実施形態において、ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイド集団中の細胞の少なくとも約８０％は、バイオマーカーＡＦＰ、ＣＫ７、ＣＫ１９、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、Ｏｖ１およびＯＶ６のうちの２つ以上またはすべてを発現する。他の実施形態において、ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイド集団中の細胞の少なくとも８０％は、バイオマーカーＡＦＰ、ＣＫ７、ＣＫ１９、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、Ｏｖ１およびＯＶ６のうちの２つ以上またはすべてを発現する。別の実施形態において、ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイド集団中の細胞の少なくとも８０％は、バイオマーカーＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、Ｏｖ１およびＯＶ６のうちの２つ以上またはすべてを発現する。
【００２４】
また、癌幹細胞を含む精製スフェロイドの集団を提供し、前記精製スフェロイドの集団中の癌幹細胞の少なくとも８０％は、バイオマーカー：ＡＢＣＧ２、ＡＦＰ、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＫ１９、ＣＫ７、ｃ−ｋｉｔ、Ｅ−カドヘリン、ＥｐＣＡＭ、ＦｏｘＡ２、ＨＮＦ４ａ、Ｋｉ６７、Ｎａｎｏｇ、Ｎ−カドヘリン、ＮＣＡＭ（ＣＤ５６）、Ｏｃｔ３／４、Ｏｖ１、ＯＶ６、Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ７、Ｔｗｉｓｔおよびビメンチンのうちの１もしくは複数、またはすべてを発現する。
スフェロイド集団はさらに、培地組成よび基質などの培養条件を変えることによって、３つの異なる亜集団のうちの１つに拡張させることができる。バルク腫瘍集団、スフェロイド集団、初期集団、混成集団およびＥＭＴ集団の特徴を表１に示す。
【００２５】
2016510756.tif 000003
2016510756.tif 000004
【００２６】
さらに、初期ＨＣＣ−ＣＳＣ集団、混成ＨＣＣ−ＣＳＣ集団またはＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣ集団のいずれも、表１に開示する培地および条件を変えることによって、ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイド、初期ＨＣＣ−ＣＳＣ、混成ＨＣＣ−ＣＳＣまたはＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣから取得することができる。
【００２７】
一実施形態において、ＨＣＣスフェロイドをさらに、アクチビンＡ、ＦＧＦおよび無血清培地（選択培地）の存在下、接着性基質上で培養して、胚性幹細胞の特性を有する、本明細書でＨＣＣ−ＣＳＣの「初期」集団と呼ぶ小細胞のコロニーを取得し、初期ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％は、バイオマーカーＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ７、Ｓｏｘ１７、Ｏｃｔ３／４、Ｆｏｘ２Ａ、Ｏｖ１、ＯＶ６、ｃ−ｋｉｔ、ＣＤ１３３およびＣＤ９０のうちの２つ以上またはすべてを発現する。別の実施形態において、初期ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％は、バイオマーカーＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ７、Ｓｏｘ１７、Ｏｃｔ３／４、Ｆｏｘ２Ａ、Ｏｖ１、ＯＶ６、ｃ−ｋｉｔ、ＣＤ１３３およびＣＤ９０のうちの２つ以上またはすべてを発現する。別の実施形態において、初期ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも９０％は、バイオマーカーＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびｃ−ｋｉｔのうちの２つ以上またはすべてを発現する。
【００２８】
別の実施形態において、ＨＣＣスフェロイドをさらにＦＧＦ、ＥＧＦおよび血清添加培地（増殖培地）の存在下、接着性基質上で培養して、細胞が異質形態を有する単層と混合したコロニーを得る。これらの細胞は、本明細書では、混合した分化プロファイルを有するＨＣＣ−ＣＳＣの「混成」集団と呼び、混成ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％は、バイオマーカーＡＦＰ、ＣＫ７、ＣＫ１９、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、Ｎａｎｏｇ、ＦｏｘＡ２．ＨＮＦ４ａおよびＡＢＣＧ２のうちの２つ以上またはすべてを発現する。別の実施形態において、初期ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも９０％は、バイオマーカーＡＦＰ、ＣＫ７、ＣＫ１９、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、Ｎａｎｏｇ、ＦｏｘＡ２．ＨＮＦ４ａおよびＡＢＣＧ２のうちの２つ以上またはすべてを発現する。
【００２９】
さらに別の実施形態において、ＨＣＣスフェロイドをさらに、ＦＧＦおよび血清添加培地（増殖培地）の存在下、接着性基質上で培養して、本明細書では間葉様ＨＣＣ−ＣＳＣまたは「ＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣ」（胚間葉転換[ＥＭＴ]癌幹細胞）と呼ぶ、紡錘状細胞または不規則形細胞の単層を得る。この集団において、スフェロイドは、上皮マーカーＣＫ７、ＣＫ１９、ＥｐＣＡＭおよびＥ−カドヘリンのうちの少なくとも１つまたはすべての発現の消失を特徴とするＥＭＴの過程を経ている。本明細書で用いる場合、バイオマーカーの発現の消失とは、検出されない発現または細胞の４０％（あるいはそれ以下）の発現、細胞の３０％（あるいはそれ以下）の発現、細胞の２０％（あるいはそれ以下）の発現、細胞の１０％（あるいはそれ以下）の発現を指す。さらに、ＥＭＴ過程は、間葉マーカーＳｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ、Ｔｗｉｓｔ、ＣＤ４４、ＮＣＡＭ、Ｎ−カドヘリンおよびビメンチンのうちの少なくとも１つまたはすべての発現において、関心のバイオマーカー（複数可）を発現する集団中の細胞の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％までの増加を特徴とする。
【００３０】
一実施形態において、ＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％は、バイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｇ／ＳｎａｉｌおよびＴｗｉｓｔのうちの２つ以上またはすべてを発現する。さらに別の実施形態において、ＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％は、バイオマーカーＡＦＰ、ＮＣＡＭ、Ｎ−カドヘリン、Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ、Ｔｗｉｓｔ、ＣＤ４４およびビメンチンのうちの２つ以上またはすべてを発現する。さらに別の実施形態において、ＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも９０％は、バイオマーカーＡＦＰ、ＮＣＡＭ、Ｎ−カドヘリン、Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ、Ｔｗｉｓｔ、ＣＤ４４およびビメンチンのうちの２つ以上またはすべてを発現する。
【００３１】
細胞集団の特定の実施形態において、細胞は示したバイオマーカーのうちの１つまたは複数を発現する。他の実施形態において、細胞は示したバイオマーカーのうちの２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上または１０以上を発現する。さらに他の実施形態において、細胞は示したバイオマーカーのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５を発現する。
【００３２】
単細胞による、細胞の集団による、または単層もしくはスフェロイドなどの特定の構造内に位置している細胞の集団によるバイオマーカーの発現は、バイオマーカーのポリペプチド型またはバイオマーカーのｍＲＮＡ型の発現を測定することによって決定することができる。ポリペプチド発現は標識抗体を用いて測定することができるが、一方核酸発現は、当業者が利用できるハイブリダイゼーション技術によって測定することができる。オリゴ糖または低分子代謝産物などのポリペプチドまたは核酸ではないバイオマーカーも、当業者が利用できる方法で測定することができる。
また、Ｋｉ−６７を発現する細胞のパーセンテージが少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％である、ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイドの集団、またはそれに由来する単細胞を提供する。
【００３３】
また、ＡＦＰを発現する細胞のパーセンテージが少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％である、ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイドの集団、またはそれに由来する単細胞を提供する。
また、ＮＣＡＭを発現する細胞のパーセンテージが少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％である、ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイドの集団、またはそれに由来する単細胞を提供する。
【００３４】
また、Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌを発現するＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣのパーセンテージが少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％である、ＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣの集団を提供する。
また、ＣＤ４４を発現するＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣのパーセンテージが少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％である、ＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣの集団を提供する。
また、Ｎ−カドヘリンを発現するＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣのパーセンテージが少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％である、ＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣの集団を提供する。
【００３５】
また、バイオマーカーＣＫ７、ＣＫ１９、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリンおよびＡＢＣＧ２のうちの１つ、２つ、３つまたは４つの発現が検出されない、または細胞の４０％（もしくはそれ以下）が発現する、細胞の３０％（あるいはそれ以下）が発現する、細胞の２０％（あるいはそれ以下）が発現する、細胞の１０％（あるいはそれ以下）が発現する、ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイドの集団またはそれに由来する単細胞を本明細書に包含する。
Ｋｉ６７を発現する細胞のパーセンテージが少なくとも３０％、ＣＫ１９を発現する細胞のパーセンテージが４０％未満、ＮＣＡＭを発現する細胞のパーセンテージが少なくとも８０％、およびＣＫ７を発現する細胞のパーセンテージが１０％未満である、上記の任意の組み合わせ、例えば、球の集団または単細胞の集団を提供する。
また、本明細書では、種々の大きさ（１ｍｇから数グラム）の肝腫瘍試料から単離したＨＣＣ幹細胞の純粋な集団を得る方法を開示する。腫瘍試料は、採取したてまたは凍結されていることもあり得、機械的処理および／または酵素処理によって解離される、または必要最小限の機械的断片化によって直接、培養される。
【００３６】
また、本明細書では、非接着性基質が抗生物付着特性を有するいずれの生体適合性材料、または一般的な培養表面に塗布される抗生物付着特性（湿潤表面上での細胞の蓄積を低下させる）を有するコーティングを開示する。コーティングは、アミノシランなどのコーティング剤を用いて塗布されることができる。非接着性基質または抗生物付着基質がある場合、この基質は、約０〜２５日間、例えば０〜２１日間、５〜２０日間、５〜１０日間、１０〜２０日間、または０日と２５日の間の任意の期間で使用することができる。
接着性基質を使用する方法の別の実施例において、該接着性基質は、ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）トリペプチドモチーフ（例えば、コラーゲン、ゼラチン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標））が豊富なものであり得る。接着性基質は、足場依存性細胞に接着して、それを収集するように構成されている表面である。さらに、基質は、線維芽細胞である足場依存性細胞に接着して、それを収集するように構成されている接着性基質であり得る。ＲＧＤペプチドは、ポリスチレン、ヒアルロナン、ポリ乳酸またはその組み合わせなどの重合体骨格上に融合することもできる。重合体骨格はさらに、プロテオグリカンを運ぶことができる。プロテオグリカンは、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、アクチビンＡまたはフォリスタチンなどの成長因子を運ぶことができる。
【００３７】
非接着性基質は、癌幹細胞を有する培養物を迅速かつ効率的に濃縮することができる。十分に大きい試料が提供される場合、ＨＣＣ−ＣＳＣの精製が直ちに開始できるように、非接着性基質は、外科的に切除された腫瘍の一例で用いることができる。針求引または腹膜洗浄などの極めて小さい試料の場合、および非接着培養が実行できない場合、接着培養を初期増殖で用い、続いて非接着性基質上での精製ステップ、次いで接着条件下で別の増殖拡大を続けてもよい。代替プロセシング方法は、図１（破線とボックス）に、詳細は下記に示す。
特定の培養実施形態において、培養の第一期は、接着性基質上で、続いて培養の第二期は、非接着性基質上でもたらされる。また、非接着性基質上での培養の第一期、続いて接着性基質上での培養の第二期がもたらされる。期間は、例えば、半日、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日など、または２〜４日間もしくは８〜１０日間などのその任意の範囲であり得る。さらに、サイクルは、接着培養、続いて非接着培養、続いて接着培養などと繰り返すことができる。別の実施形態において、サイクルは、非接着培養、続いて接着培養、続いて非接着培養などと繰り返すことができる。
【００３８】
別の実施形態において、所定の培地は、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を介して作用する少なくとも１つの成長因子を追加している。一実施形態において、成長因子はＦＧＦとＥＧＦの一方もしくは両方、またはその類似体である。一実施形態において、ＦＧＦは塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）である。別の実施形態において、所定の培地はアクチビンＡを追加している。別の実施形態において、所定の培地はアクチビンＡを追加していない。ＨＣＣ幹細胞の自然分化を防止するのに有効な量で、アクチビンＡのアゴニストを追加している所定の培地も開示する。
また、（ａ）自己再生および多能性の幹細胞の特性と、分化する能力とを保有し、（ｂ）５０％を超えるなどの細胞の大多数において癌固有の遺伝子シグネチャーを保有する患者の原発性肝腫瘍から取得した、各患者固有のＨＣＣ幹細胞株を提供する。
本開示は、慣用名だけによって同一性を合理的に確立することができる、核酸、遺伝子産物、ポリペプチドおよびペプチド断片を包含する。また、核酸、ポリペプチドなどが、ＧｅｎＢａｎｋ番号のそれと少なくとも５０％の配列相同性、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一の配列相同性を有し、生化学機能または生理機能を少なくとも一部、あるいは無関係の機能を共有する特定のＧｅｎＢａｎｋ受入番号に基づいて、核酸、遺伝子産物、ポリペプチドおよびペプチド断片を包含する。
【００３９】
対象において癌に対する免疫応答が、本明細書に開示する諸組成物の一つで刺激される方法を提供する。刺激される免疫応答は、ＣＤ４+Ｔ細胞応答、ＣＤ８+Ｔ細胞応答およびＢ細胞応答のうちの１つまたは複数を含む。特定の実施形態において、ＣＤ４+Ｔ細胞応答、ＣＤ+Ｔ細胞応答またはＢ細胞応答は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイによって、四量体アッセイによって、または当業者に既知のアッセイにより抗原特異的抗体産生を検出することによって測定することができる。免疫応答は２年全生存期間（ＯＳ）などの生存期間を含むことができ、２年全生存率は少なくとも６０％である。患者における免疫応答は、客観的反応（ＲＥＣＩＳＴ基準）、全生存期間、無増悪生存期間（ＰＦＳ）、無病生存期間、無遠隔転移期間、６ヵ月ＰＦＳ、１２カ月ＰＦＳなどを含む、腫瘍学臨床試験で使われるエンドポイントによって評価されることもできる。
本明細書では、肝細胞癌の療法で用いるＨＣＣ幹細胞でｅｘ  ｖｉｖｏで刺激した樹状細胞、またはそれに由来する抗原も開示する。本明細書では、ＨＣＣ−ＣＳＣをｅｘ  ｖｉｖｏでロードした（ＨＣＣ−ＣＳＣに曝露した）樹状細胞を含む、ワクチン組成物などの免疫原性組成物を包含する。特定の実施形態において、樹状細胞と腫瘍細胞は、同一のヒト対象に由来するが、樹状細胞とＨＣＣ細胞が異なる対象に由来する実施形態も本開示の範囲内である。
【００４０】
樹状細胞は、ＨＣＣ腫瘍細胞の細胞全体、細胞ライセート、細胞抽出物、照射細胞またはいずれのタンパク質誘導体を含む、ＨＣＣ腫瘍細胞抗原をロードすることができる。樹状細胞免疫原性組成物は、作製し、当業者に既知の投与経路のうちの１または複数の経路でヒト対象に投与することができる。
特定の実施形態において、樹状細胞にロードする前に、細胞分裂を防止するためにＨＣＣ−ＣＳＣ細胞は照射されるか、さもなければ処置される。放射線の代替物としては、細胞分裂を防止する核酸架橋剤が挙げられる。上記で開示したように、自己免疫療法用の抗原源としてＨＣＣ幹細胞集団を用いる方法を提供し、例えばＨＣＣ幹細胞を放射線エネルギー（例えば、γ線、紫外線、Ｘ線）、温度（例えば、加熱するもしくは冷却する）、または化学（例えば、細胞増殖抑制、アルデヒド、アルコ−ル）方法、またはその組み合わせによって不活性化する。他の実施形態において、ＨＣＣ幹細胞は、樹状細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ活性化のための抗原源として用いられる。
本開示は、作製ＨＣＣ細胞を提供し、この作製ＨＣＣ細胞をロードした樹状細胞を提供し、作製ＨＣＣ細胞をロードした樹状細胞を含む免疫原性組成物（またはワクチン）を提供する。いかなる限定の意味を含むことなく、本開示の免疫原性組成物は、ＨＣＣスフェロイドをロードした樹状細胞、スフェロイドを含む細胞の集団をロードした樹状細胞、スフェロイドに由来し、樹状細胞にロードする前に、接着性表面上で増殖拡大した細胞の集団をロードした樹状細胞、樹状細胞にロードする前にホモジナイゼーションまたは超音波処理に掛けたスフェロイドをロードした樹状細胞、樹状細胞をロードする前に、ホモジナイゼーションまたは超音波処理にかけた増殖細胞の集団をロードした樹状細胞などを含むことができる。他の実施形態において、初期ＨＣＣ−ＣＳＣ、混成ＨＣＣ−ＣＳＣまたはＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣを樹状細胞にロードする。
【００４１】
また、本明細書では、少なくとも１種のＨＣＣ特異的抗原を発現する細胞に対する効果的な免疫応答を刺激することができるＨＣＣ−ＣＳＣ集団を開示する。前記ＨＣＣ−ＣＳＣ集団は少なくとも１つの樹状細胞と接触し、前記ＨＣＣ−ＣＳＣ集団は樹状細胞によってｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで処理され、効果的な免疫応答は、少なくとも１つの樹状細胞を対象に投与することに応答して対象内で起こる。
いかなる限定の意味を含むことなく、開示した組成物の免疫刺激量は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ結果を測定可能量で増加させる量、ＩＣＳアッセイ結果を測定可能量で増加させる量、四量体アッセイ結果を測定可能量で増加させる量、抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の血球集団を測定可能量で増加させる量、抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の血球集団を測定可能量で増加させる量であり、または好適な対照と比較すると、該増加は少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１．５倍、２．０倍、３．０倍などである。好適な対照は対照組成であり得、この場合、樹状細胞はＨＣＣ細胞をロードしていない、またはＨＣＣ細胞由来のペプチドをロードしていない。
【００４２】
また、本開示は、医薬、試薬、診断用キットを含むキットを提供し、医薬、試薬およびキットは、樹状細胞（ＤＣ）、抗体または抗原を含む。また、少なくとも１つの樹状細胞と少なくとも１つの抗原を含む組成物を投与する方法、抗体形成を刺激する方法、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激する方法、補体依存性細胞傷害を刺激する方法、および患者の適合性を決定するため、臨床試験または通常の内科的治療と関連して患者の選択／除外基準を決定するため、医薬または試薬に対する反応を予測するための方法とキットを提供する。本開示の医薬組成物、試薬および関連方法は、ＣＤ８３陽性樹状細胞を包含し、ＣＤ８３はＩＦＮ−γ処置または未処置の癌細胞をロードすることによって誘発される。本開示のＣＤ８３態様において、ＣＤ８３は少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、６％、７％、８％、９％、１０％などで誘発される。別の態様において、樹状細胞上のＣＤ８３がＩＦＮγをロードすることによって検出可能な程度に誘発されない場合、ＤＣ試薬またはＤＣ関連方法は除外される。
【００４３】
一実施形態において、本明細書に開示する方法によって腫瘍試料からＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイド、初期ＨＣＣ−ＣＳＣ、混成ＨＣＣ−ＣＳＣおよび／またはＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣを生成する試薬、および／またはＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイド、初期ＨＣＣ−ＣＳＣ、混成ＨＣＣ−ＣＳＣおよび／またはＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣを特徴付けるための試薬、ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイド、初期ＨＣＣ−ＣＳＣ、混成ＨＣＣ−ＣＳＣおよび／またはＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣを生成しおよび／または特徴付けるための説明書をすべて含むキットを提供する。別の実施形態において、キットは、さらに、あるいは代わりに、樹状細胞を単離するため、ＨＣＣ−ＣＳＣを樹状細胞にロードするため、および／またはＤＣ−ＨＣＣ組成物を対象に投与するための試薬と説明書を含む。
【００４４】
腫瘍試料の処理
本開示の肝細胞癌（ＨＣＣ）幹細胞集団は、患者の腫瘍から採取したての試料または凍結試料から始めることができる。腫瘍試料は、生検または腫瘍を含む組織の洗浄であり得る。ＨＣＣ幹細胞は、針生検および洗浄液体から単離される。
腫瘍試料は、動物血清またはヒト血清などの０〜１００％の濃度のタンパク質源、または０〜０．５％の濃度のアルブミン、または生理的な浸透圧を確実にする高分子を含有するＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、Ｗｉｌｌｉａｍｓまたは組み合わせなどの、ｐＨが約７．４（±０．６）の一般的な緩衝培地に移してもよい。天然高分子または人工高分子の例としては、ヒアルロナン、デキストラン、ポリビニルアルコールがあるが、これらに限定されない。ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンなどの抗生物質をアムホテリシンＢ、ＦＵＮＧＩＺＯＮＥ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）などの抗真菌薬と任意選択で組み合わせて緩衝培地で用いて、抗菌特性をもたらし、輸送中の混入のリスクを減少させることができる。
腫瘍試料は、培地温度を２〜３０℃に下げることによって代謝活性状態以下に保つことができる。このようにプロセシングの前の限られた時間（０時間と７２時間の間）の生存能力の維持か可能になる。包装（例えば、断熱包装）を用いて、輸送の間、適当な温度調節を確実にすることができる。
次いで、固体腫瘍組織は、鋭い刃または組織グラインダー装置を用いる機械解離によって１ｍｍ以下（または任意の寸法）の小断片に処理する。
【００４５】
固体組織は、任意選択でさらに、酵素解離で処理する。種々の酵素は、単細胞を単離するのに用いることができる。トリプシンおよびペプシンなどの非特異的タンパク質分解酵素をうまく使用することができる。コラゲナーゼ、ディスパーゼ、エラスターゼまたはその組み合わせを含む酵素に特異的な最小の細胞膜損傷を標的にすることを開示する方法で用いることができる。デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅ）を用いて、細胞作製の不必要な粘着性に関与する細胞デトリタスから遊離ＤＮＡを分解させることができる。解離後、懸濁液中の細胞は、５０〜１００μｍメッシュを通して濾過し、緩衝食塩水（ＰＢＳ、ＨＢＳＳ）または細胞培養培地中での遠心分離を繰り返すことによって過剰酵素および壊死組織片を洗い落とす。
【００４６】
細胞培養条件およびスフェロイド生成
上記の単細胞懸濁液は、幹細胞の単離、増殖拡大および分化細胞および／または正常細胞の抑制を促進する培養条件で移動させる。これは、物理的条件、化学環境および処置の適合によって達成される。
細胞懸濁液は、細胞付着ができない非接着性（抗生物付着）基質にさらされる。適当な接着性基質が準備されない場合、成熟細胞は一般的に足場依存性であり、迅速に除去される。抗生物付着基質は、例えば、超低接着性フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、自然の疎水特性を有する重合体（ポリビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、フルオロポリマー）または寒天、デンプンなどの自然の炭水化物重合体によるコーティングなどの商品に利用することができる。
癌幹細胞は凝集し、および／または高純度癌幹細胞を含むスフェロイド形態（図２）でクローン拡張する。癌幹細胞凝集体の培養は、図３Ａと３Ｂに示し、種々の大きさの容易に確認できるスフェロイド構造を有している。成熟細胞は、単離状態のままであり、非接着性である。重力差分離を用いて、単純に設定時間の垂直沈降または短時間低遠心力（１００×Ｇ未満）を可能にすることで単細胞から大きなスフェロイドを選択することができる。記述した選択方法は、以下を達成するように設計されている：（ａ）通常は、成熟した正常細胞である足場依存性細胞を除去する；（ｂ）付着非依存性である若い、幹細胞の小凝集塊またはスフェロイドでクローン拡張を促進する；（ｃ）幹細胞のクローン拡張の結果として、局所的なオートクリン活性を促進する；および（ｄ）正常な線維芽細胞または肝細胞によって分泌されるアクチビンＡのオートクリン供給源を除去する。
【００４７】
球体を形成する細胞の能力は、一部は、インテグリンと呼ばれている細胞表面タンパク質から生じる。細胞の表面で発現する同種親和性インテグリンは、同じ型の細胞が「一緒にとどまる」ことを確実にする。球体は、培養の早い段階で単細胞懸濁液である酵素消化物から直接形成されるか、または凍結試料もしくは既存の添付培養物からいつでも形成することができる。酵素消化物の播種は、特定の表面特性を有する細胞を組み込むこの球面形態になる。
例えば、線維芽細胞はスフェロイドに組み込まれておらず、重力補充の間に培養から除去される。同種親和性特性を有さない細胞の非特異的凝集を防止するために、および培養容器の表面への接着を防止するために、使用される培地には、接着性を促進する分子が欠けている。そのような細胞接着分子（ＣＡＭ）は、一般的に動物血清またはヒト血清で見つかる。したがって、無血清である培地組成は、非接着性スフェロイドの培養に好適である。
【００４８】
無血清の培地培養において、培地への追加としては、増殖と維持、または細胞生理と機能の他の所望の態様を支持するために必要とされる任意のホルモン、栄養分、ミネラルおよびビタミンを挙げることができる。一部の例において、ＦＧＦファミリーおよびＥＧＦなどの、細胞分裂活性を有する成長因子の量を添加または調節することで幹細胞の増殖を刺激し、維持することができる。
球形の癌幹細胞を含む、球形細胞（スフェロイド）は、標識抗体で固定し、染色し、続いて共焦点顕微鏡で観察することによってバイオマーカー発現に関して特徴付けることができる。バイオマーカーは、フローサイトメトリーなどの他の免疫化学方法によって測定することもできる。例えば、球形は、新鮮腫瘍から、または接着性細胞として増殖するように順応した細胞から取得した懸濁液から作製することができる。例えば、大きいおよび不規則対小さいおよびコンパクトなどの球形の形態は、培地の選択によって影響を及ぼし得る。
別の実施形態において、抗生物付着コーティングに対する接着性細胞集団は、プロテインキナーゼＢ（ＡＫＴ）および限局的接着キナーゼ（ＦＡＫ）シグナル伝達によって媒介される音波ヘッジホッグシグナル伝達の異常活性化に基づいて、単離することができる。これらの現象は、メタロプロテアーゼなどの酵素または解離で用いられる酵素（トリプシン／コラゲナーゼ）によって誘発される膜の修飾によって強化され得る。そのような細胞集団は、迅速な増殖性腫瘍および浸潤性腫瘍と関連し得る。図５は、超低接着性表面に付着して増殖拡大している代表的な細胞集団を表す。音波ヘッジホッグシグナル伝達の正常活性または異常活性を評価する方法は利用可能であり、当業者には既知である。
【００４９】
細胞培養で用いられる培地
ＨＣＣ幹細胞を単離するのに用いられる所定の培地は、細胞生存を促進し、選択のために特異的に調合されている。培地は糖質と脂質が豊富であるが、タンパク質は最小量（アルブミン０．１％〜３％または血清１％〜５％）である。培地は、１．５ｍＭｏｌ以下のカルシウム総量を含んでいるが、無機鉄化合物を含まず、むしろ鉄はトランスフェリンなどの輸送体に完全に結合している。培地は、過剰な必須アミノ酸と非必須アミノ酸および必須脂質（α−リノレン酸とリノール酸）が供給されている（表４）。任意選択で、培地はアクチビンＡを含まず、フォリスタチンなどのアクチビンＡ受容体遮断薬を含んでもよい。また、任意選択で、培地はスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）またはカタラーゼなどの抗酸化剤を含まず、グルタチオンなどのチオール抗酸化剤を含む。
【００５０】
表２に示すように、培地は、タンパク質（特定の調合物において）、アミノ酸、抗酸化剤、エネルギー性基質（グルコース、ガラクトース、Ｌ−グルタミン）、ビタミン（Ｂ１２）、ホルモン（甲状腺ホルモン、インスリン）および成長因子（ＦＧＦ、ＥＧＦ）を追加した、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、ＲＰＭＩ、Ｌｅｂｏｖｉｔｚなどの基本調合に存在する。
タンパク質は、０．１〜０．５％濃度のアルブミン、０．５％〜２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）であり得る。タンパク質は、０．１％〜０．５％の範囲の濃度で、デキストラン、ヒアルロナン、ポリビニルアルコールなどの高分子と置換することができる。そのような培地の組成は、表２、表３および表４に収載する。栄養補助剤は、培地に加え、および細胞培養物に補充するために混合する。
2016510756.tif 000005
2016510756.tif 000006
2016510756.tif 000007
2016510756.tif 000008
【００５１】
2016510756.tif 000009
【００５２】
2016510756.tif 000010
【００５３】
増殖が迅速な場合、週に３日のスケジュール（例えば、月曜−水曜日−金曜日）またはさらに高い頻度で、例えば一日おきもしくは毎日、培地を替えることができる。連続補充またはマイクロバッチ補充バイオリアクターは、増殖相に用いることができる。
培地は、ＦＧＦおよびＥＧＦなどのＭＡＰＫ経路を介して作用する成長因子を含有する。これらの成長因子の濃度は、０．１ｎｇ／ｍＬと１００ｎｇ／ｍＬの間で、一般的には約１０ｎｇ／ｍＬに変えることができる。
一実施形態において、培地は、ＦＧＦを約０．１〜１００ｎｇ／ｍＬ、約０．５〜５０ｎｇ／ｍＬ、約１〜４０ｎｇ／ｍＬ、約２〜３０ｎｇ／ｍＬ、約３〜２０ｎｇ／ｍＬ、約５〜１５ｎｇ／ｍＬ、約６〜１４ｎｇ／ｍＬ、約７〜１３ｎｇ／ｍＬ、約８〜１２ｎｇ／ｍＬ、約９〜１１ｎｇ／ｍＬまたは約１０ｎｇ／ｍＬで追加する。他の実施形態において、ＦＧＦは、約５ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、約１１ｎｇ／ｍＬ、約１２ｎｇ／ｍＬ、約１３ｎｇ／ｍＬ、約１４ｎｇ／ｍＬ、または約１５ｎｇ／ｍＬで培地中に存在する。
【００５４】
別の実施形態において、培地は、ＥＧＦを約０．１〜１００ｎｇ／ｍＬ、約０．５〜５０ｎｇ／ｍＬ、約１〜４０ｎｇ／ｍＬ、約２〜３０ｎｇ／ｍＬ、約３〜２０ｎｇ／ｍＬ、約５〜１５ｎｇ／ｍＬ、約６〜１４ｎｇ／ｍＬ、約７〜１３ｎｇ／ｍＬ、約８〜１２ｎｇ／ｍＬ、約９〜１１ｎｇ／ｍＬまたは約１０ｎｇ／ｍＬで追加する。他の実施形態において、ＥＧＦは、約５ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、約１１ｎｇ／ｍＬ、約１２ｎｇ／ｍＬ、約１３ｎｇ／ｍＬ、約１４ｎｇ／ｍＬ、または約１５ｎｇ／ｍＬで培地中に存在する。
また、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）またはカタラーゼの一方または両方を追加していない培地を提供する。抗酸化剤の使用には、陽性と陰性の両結果があり得る。癌幹細胞は、遊離基および解糖代謝に対して、正常細胞よりもはるかに寛容性がある。したがって、高密度、まれな培地交換、培地中の高濃度の代謝産物などの最適以下の培養では、正常な感受性細胞が最初に除去されることになるのは最も可能性が高い。抗酸化剤を培地に含まないことによって、癌起源になる可能性があり、正常細胞よりさらに耐性がありそうな細胞集団を選択することができる。したがって、特定の実施形態において、カタラーゼおよびＳＯＤの阻害剤などの抗酸化剤は培地に添加され、他の実施形態において、これらの化合物は培地から除外される。
【００５５】
別法では、アクチビン／フォリスタチン系を用いて、極めて初期の癌幹細胞を単離することができる。アクチビンＡを添加することで、アクチビンＡ耐性ＨＣＣ幹細胞の亜集団を選択することができる。アクチビンＡに７〜１４日間曝露した後に採取した初期ＨＣＣ幹細胞のコロニーを図６、７、８に示す。この亜集団は、ＨＣＣとさらに初期（分化されたものが少ない）の癌幹細胞のより侵襲的な形態に関連している。特に、内因的にアクシビンＡを分泌する多数の細胞、例えば線維芽細胞や正常な肝細胞が存在する場合、フォリスタチンを用いて、アクチビンＡ受容体を遮断し、ＨＣＣ幹細胞の自然分化を防止する。細胞がアクチビンＡに非感受性である、またはフォリスタチを内因的に分泌することができる高純度のＨＣＣ幹細胞集団に存在する場合、フォリスタチンの使用は効果がない。
アクチビンＡは、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのメンバーのタンパク質である。培地に添加されているまたは含まれているとき、アクチビンは、幹細胞多能性と自己再生を維持することに役立つ。しかし、アクチビンＡは、受容する若い肝細胞および癌細胞の成熟と分化を促進する。したがって、最初の目標は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの腫瘍の迅速な増殖であり、また培養内に適当なオートクリン環境を作ることによって、癌幹細胞の増殖を維持することである。アクチビンＡは極めて若い癌幹細胞の亜集団を選択することができるが、肝癌幹細胞がバルクで極めて低い濃度であるならば、製造の初期に適用されるそのような条件は、増殖を大幅に遅らせることになる。例えば、「迅速な増殖」とは、培養容器中の培地が消費の明らかな兆候（例えば、ｐＨの変化）を有するようになり、コンフルエンスの増加を反映して細胞の数が毎日目に見えて多くなる、増殖拡大のことである。
【００５６】
迅速な増殖の場合、アクチビンＡは培養成長を遅くさせるので、除外し、添加しないことが好ましい。一部の適用の場合、関心は極めて初期の幹細胞集団を得ることであり、アクチビンＡを使用することでその細胞集団が選択されることになる。したがって、一実施形態において、アクチビンＡを含む増殖拡大が開始され、アクチビンＡ活性化培養細胞を含む第１の組成物が対象に投与され、続いてアクチビンＡを含まない培養中でアクチビンＡ非感受性細胞を単離し、次いでアクチビンＡを含まない培養細胞を含む第２の組成物を前記対象に投与される。
一実施形態において、培地はアクチビンＡを約０．０１〜１０ｎｇ／ｍＬ、約０．０５〜９ｎｇ／ｍＬ，約０．１〜８ｎｇ／ｍＬ，約０．５〜７ｎｇ／ｍＬ、約１〜６ｎｇ／ｍＬ，約１〜５ｎｇ／ｍＬで追加する。別の実施形態において、アクチビンＡは、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約０．７ｎｇ／ｍＬ、約０．９ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約１．２５ｎｇ／ｍＬ、約１．５ｎｇ／ｍＬ、約１．７５ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約２．２５ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約２．７５ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ、約３．５ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ、約４．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬまたは約１０ｎｇ／ｍＬで培地中に存在する。
また、アクチビンＡに特異的に結合する、これに限定されないがフォリスタチンまたは抗体などのアクチビンＡのアンタゴニストを培地に追加する、一実施形態を開示する。
別の実施形態において、培地は、フォリスタチンを約０．１〜１００ｎｇ／ｍＬ、約０．５〜５０ｎｇ／ｍＬ、約１〜４０ｎｇ／ｍＬ、約２〜３０ｎｇ／ｍＬ、約３〜２０ｎｇ／ｍＬ、約５〜１５ｎｇ／ｍＬ、約６〜１４ｎｇ／ｍＬ、約７〜１３ｎｇ／ｍＬ、約８〜１２ｎｇ／ｍＬ、約９〜１１ｎｇ／ｍＬまたは約１０ｎｇ／ｍＬで追加する。他の実施形態において、フォリスタチンは約５ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、約１１ｎｇ／ｍＬ、約１２ｎｇ／ｍＬ、約１３ｎｇ／ｍＬ、約１４ｎｇ／ｍＬまたは約１５ｎｇ／ｍＬで培地中に存在する。
【００５７】
分裂促進因子（例えば、ＦＧＦ／ＥＧＦ）、アクチビンＡおよび接着性基質の組み合わせは、線維芽細胞または星状細胞などの正常細胞の増殖が増加する結果をもたらす。このように、富んだ環境、すなわち栄養特性または封入特性を有する細胞（例えば、線維芽細胞、星状細胞）が構成する「ストロマ」によってアクチビンＡに非感受性である、極めて初期のＨＣＣ幹細胞または前駆細胞の増殖拡大を促進するための条件を作成する。細胞培養から数日〜数週間のうちに、ＨＣＣコロニーはストロマに沿って発育し、空間的にストロマを移動させることが徐々に認められる（図７および８）。本方法で用いる培地は、表２、３および４に記載の調合の組み合わせである。
ＦＧＦ、ＥＧＦおよびアクチビンＡならびに「極めて初期のＨＣＣ癌幹細胞」の間に関係性がある。ＦＧＦおよびＥＧＦは、極めて初期の状態を含むいずれの分化状態においても、ＨＣＣ幹細胞の増殖を引き起こす。アクチビンＡが細胞培養の培地中に存在する場合、アクチビンＡは、アクチビンＡに非感受性である極めて初期のＨＣＣ幹細胞だけの増殖を許容する（可能にする）。ＨＣＣ幹細胞が感受性になる場合、増殖はアクチビンＡによって停止する、または減少する。
ＦＧＦおよびＥＧＦに対する非感受性は一般的でなく、天然の遮断薬がない。アクチビンＡに対する非感受性は、アクチビン受容体の天然の遮断薬であるフォリスタチンによって媒介されることができる。フォリスタチンは、同じ腫瘍細胞によって、または腫瘍を囲んでいる細胞によって分泌されることができる。アクチビンＡは一般的に、腫瘍を囲んでいる細胞によって分泌され、したがって、腫瘍の増殖拡大は囲んでいる細胞（阻害する）に依存し、および腫瘍（増殖拡大を促進する）により依存することが可能である。極めて初期の未分化癌幹細胞の特徴である、アクチビンＡの受容体がないため、囲む組織によって腫瘍の制御を阻止することができる。
【００５８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物は、胚性幹細胞様コロニーを含む。これらのコロニーは、正常な線維芽細胞、分化腫瘍細胞または間葉転換腫瘍細胞であり得る、ストロマ細胞によって囲まれていることもある。そのような培養を図７に示す。
本開示は、ＨＣＣ−ＣＳＣを作製する方法を提供し、培地の交換、再播種、遠心分離および沈降などの処理に必要とする時間を含む培養総時間は５ヵ月未満、４ヵ月未満、３ヵ月未満、２ヵ月未満、１ヵ月未満、１５０日未満、１２０日未満、９０日未満、６０日未満、３０日未満、または１５０日（±２０日）未満、１２０日（±２０日）未満、９０日（±２０日）未満、６０日（±２０日）未満、３０日（±２０日）未満である。排他的実施形態において、本開示は、処理で必要とする時間が上に開示した時間枠のうちの一つを超える場合、癌幹細胞を作製するいずれの方法も除外し、その方法によって作製された癌幹細胞のいずれの集団も除外し得る。また、上記の時間枠のうちの一つによって示される、接着培養における時間を提示する。また、上記の時間枠のうちの一つによって示される、非接着培養における時間を提示する。さらに、上記の時間枠のうちの一つによって示される、接着培養と非接着培養における総合時間を提示する。
【００５９】
上皮−間葉転換（ＥＭＴ）
上皮由来の腫瘍が消失する、または間葉状態に分化転換することは知られている。上皮表現型は固定されており、由来する組織に限定される腫瘍の容積増加に関与し、一般的にはさらに分化している。ＥＭＴが生じると、細胞は移動性を獲得し、隣接する組織の浸潤と遠隔転移をもたらす。転換細胞も幹細胞様の表現型を獲得し、複製および分化する能力は宿主組織において、由来（原発）腫瘍の特徴を有する新しい腫瘍（転移）をもたらす。ＥＭＴによって、腫瘍細胞はさらに免疫抑制能、薬ポンプおよび放射線抵抗性を得る。
培地組成および物理的な選択法によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＥＭＴ現象が促進される。免疫原としてＥＭＴ転換集団を使用する長所は、腫瘍再発の防止にある。ＥＭＴ癌細胞の抗原性は、免疫系が転移を引き起こす移動癌細胞を認識して、破壊することを可能にし得る。転移の過程では、これらの細胞は非常に小さい数で移動し、宿主組織に播種し、上皮性表現型（ＭＴＥ転換）に復帰し、増殖し、次いで原発性腫瘍と同様の特徴を有する新しい腫瘍を形成する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＥＭＴを生じさせるのに必要な条件は、無血清の培地でのスフェロイド形成、ｂＦＧＦによる刺激、次いでＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）ペプチドモチーフ（例えば、コラーゲン、ゼラチンなど）を含んでいる接着性基質上での播種である。
【００６０】
ＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣ亜集団は、表１および図１に記述する培養条件下で、ＨＣＣスフェロイドまたは初期ＨＣＣまたは混成ＨＣＣを培養することによって得られる。
本明細書で用いる場合、「ＨＣＣ−ＣＳＣ」という用語は、通常、ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイド、初期ＨＣＣ−ＣＳＣ、混成ＨＣＣ−ＣＳＣまたはＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣを指すことができる。
【００６１】
腫瘍の小供給源（針生検）からのＨＣＣ−ＣＳＣの取得
試料細胞の数が少ない場合、ＨＣＣ幹細胞選択の代替方法を用いる。例示のために、酵素解離後、腫瘍から得られる少数の生存細胞は、１０×１０6生存細胞未満である。本開示のために、小試料とは、例えば、針生検またはコア生検から得られる試料を指し、対照的に、切除した腫瘍から得られる試料は一般的に小試料と考えられず、少なくとも０．５から５〜１０ｇの重さである。コア生検は、１８または１６または１４ゲージの針で行われ、５〜５０ｍｇの試料をもたらす。真空補助下生検と呼ばれる、比較的新しい処置も、１１ゲージ針と真空補助装置（ＶＡＤ）を用いて行われる。真空補助装置と組になった１１ゲージプローブは、一般的に各コアで９４ｍｇの試料を採取する。真空補助による１４ゲージ針は、一般的に３７ｍｇを採取するが、自動生検銃と組になっている場合、採取するのはわずかに１７ｍｇである。図１に示した、この代替方法において、腫瘍試料から採取した細胞は、解離の前後に、ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）が豊富な化合物（例えば、コラーゲン、ゼラチンまたはＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標））を含み、本明細書に記述の選択（無血清）培地の存在下、接着性基質に移される。記述した選択方法は、（ａ）小さい数で存在する個々の癌幹細胞の最初のクローン拡張を促進する；および（ｄ）幹細胞のクローン増殖の結果として局所的オートクリン活性を促進するように設計されている。
【００６２】
接着性基質は、コラーゲンまたはゼラチンなどのＲＧＤの豊富なタンパク質である。接着性基質は、ポリスチレン、ポリカーボネート、環状オレフィン共重合体またはガラスなどの種々の材料にタンパク質またはペプチドを付着させることによって構築することができる。ＲＧＤペプチドは、ヒアルロン酸、ポリ乳酸および組み合わせなどの重合体骨格上に融合することができる。そのような重合体はさらに、プロテオグリカン（例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、硫酸ケラチン等）などの成長因子のために、担体末端で強化することができる。
細胞培養の表面は、直接使用することができるか、またはアミノシランなどのコーティング剤を使用することができる。コーティング剤は、細胞に対して接着特性（基質）を有する化合物であり、増殖容器材料の上部に塗布される。コーティング剤は、コラーゲンまたはゼラチンなどの天然化合物であり得、さらに前述の遊離基／末端を有するより多くの合成重合体で構築することができる。コーティング剤（シランなどの接着剤）を用いて、培養容器材料（例えばガラス）へのコーティングの粘着性を改善することができる。シランが所望に遊離基または末端基を含む場合、それだけを用いることができる。
この方法と調合により、多数の細胞は、比較的短い期間に得ることができる。数ミリグラムから開始して、１０3〜１０6細胞を含む針生検などの組織試料の培養物は、３〜４週間で約１０8細胞まで拡張させることができる。
【００６３】
ＨＣＣ幹細胞培養物の拡大および亜集団の生成
幹細胞のさらなる特徴として、ＨＣＣ−ＣＳＣは、成長させて、無期限に増殖拡大させることができる。接着性基質上での増殖拡大培養を図４に示す。
さらに、ＨＣＣ−ＣＳＣは部分的にまたは全体的に分化することができる。幹細胞増殖拡大条件が取り除かれた場合、ＨＣＣ幹細胞は、増殖の速度を落とす、または増殖を停止し、形態と表現型をより分化した細胞型に変えることができる。細胞形態は、複数の核（より成熟した肝細胞または星状細胞の特徴）を有する扁平、上皮様または星状になり得る。
足場依存性分化細胞を除去するために、接着培養物を単細胞懸濁液中で解離させて、非接着（抗生物付着）条件に変えることができる。２〜３日後に、幹細胞は凝集に向かい、差別沈降に基づいて単細胞から分離することができる小スフェロイドにクローン拡張する。スフェロイドは、接着条件下で再播種して、さらに成長させることができる。培養物が分化細胞または線維芽細胞などの正常細胞を幹細胞内容物の１−３０％から９０−９９％上回った場合、この方法は培養幹細胞内容物を精製する。幹細胞の純度を復元するために、この方法を必要な回数、繰り返すことができる。
【００６４】
小スフェロイドの寸法は、通常、０．１ｍｍと２ｍｍの間である。一小スフェロイド当たりの細胞数についての粒度分布は、大体、１０細胞と１０，０００細胞の間である。小スフェロイドの形は、球形または楕円形であり得、球形構造または楕円形構造の集合体としても生じ得る（図２および３）。
同じ患者に由来する正常な組織と比較する場合、患者特異的ＨＣＣ−ＣＳＣ細胞株は、腫瘍性転化の原因となるゲノム突然変異を特定するのに用いることができる。遺伝子突然変異は、分化のすべての段階で発現するわけではない。一部の調節タンパク質または転写調節因子は、一時的にのみ発現し、突然変異の間、消滅し、奇形細胞をもたらすこともあるが、正常なタンパク質では、奇形細胞は生じない。突然変異を最大限に発現する細胞集団を特定し、この集団を免疫系に曝すことは、免疫療法用の抗原源として癌幹細胞を用いる大きな利点であり得る。
【００６５】
遺伝子突然変異を特定することによって、例えば低分子、ＤＮＡ配列、アンチセンスＲＮＡまたは組み合わせを癌治療用に個別化製剤を作製することができる。
そのような細胞株をさらに用いて、創薬のためのスクリーニングプレート（例えば９６ウェル）を作製することができる。個人間の可変性に取り組むために、種々の患者に由来する複数の細胞株を単一のプレートに統合することができる。
肝細胞癌幹細胞は、タンパク質、成長因子およびホルモン（機能性腫瘍）の分泌などの由来組織の一部の特性を保持し得る。これらの特性は、細胞株の不死特性があるとすれば、同じ患者のために用いることができる「自己」タンパク質（例えば、アルブミン、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、インスリン、グルカゴン、ＤＯＰＡ等）を生成するように活用することができる。細胞は、小型バイオリアクターに導入され、同じ患者での使用のために、分泌物を収集し、精製し、次いで保管することができる。この方法は、患者が伝統的なバイオシミラーなどの免疫耐性を発現しないために、特に有利である。
【００６６】
樹状細胞のローディング
患者から採取した個々のＨＣＣ−ＣＳＣ細胞株を用いて、免疫療法用の抗原を生成することができる。精製幹細胞株を使用する利点は、より良好なシグナル・ノイズ比にある。腫瘍由来のより成熟した細胞は、抗原性をマスキングすることができ、および免疫系によって特定され得ない代償機序を有することができる。抗原源として、ＨＣＣ−ＣＳＣは、生きた状態で、有糸分裂的に不活性で、生育不能でまたは断片化して使用することができる。放射エネルギー（例えば、γ線、紫外線、Ｘ線）、温度（例えば、加熱するもしくは冷却する）、または化学物質（例えば、細胞増殖阻害薬、アルデヒド、アルコ−ル）またはその組み合わせなどの種々の方法を用いて、最適な抗原暴露のために細胞を修飾することができる。
例示的な実装形態において、本開示は、試薬と、例えば、ＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（ＴＬＲ９）、イミキモド（ＴＬＲ７）、ポリ（Ｉ：Ｃ）（ＴＬＲ３）、グルコピラノシルリピドＡ（ＴＬＲ４）、ムレイン（ＴＬＲ２）、フラジェリン（ＴＬＲ５）のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストなどの１種または複数種の免疫アジュバント、ならびに、ＣＤ４０−リガンドなどのＣＤ４０アゴニスト、またはサイトカイン、インターフェロン−γ、プロスタグランジンＥ２等のアジュバントで樹状細胞（ＤＣ）を活性化する方法とを包含する。例えば、米国特許第７，９９３，６５９号、同第７，９９３，６４８号、同第７，９３５，８０４号を参照されたい。これらの各々が樹状細胞を活性化することに関して開示するすべてを参照によって本明細書に組み込む。本開示は、上記のアジュバント試薬のうちの１種または複数種による樹状細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの処置と、または加えてもしくは代替的に、前記アジュバントをヒト対象、動物対象または家畜対象への投与とを包含する。
【００６７】
免疫系は、細胞性免疫、体液性免疫および補体反応を包含する。細胞性免疫としては、樹状細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞；細胞障害性リンパ球）とＣＤ４+Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）を含んでいる細胞のネットワークと現象が挙げられる。樹状細胞（ＤＣ）はポリペプチド抗原を獲得する。この場合、これらの抗原は、感染した微生物によってＤＣの外側から、または生合成したＤＣの内側から獲得されることができる。樹状細胞は、ポリペプチドを処理して、長さが約１０アミノ酸のペプチドをもたらし、このペプチドをＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩのいずれかに転送して複合体を形成し、次いで樹状細胞の表面に往復して複合体を輸送する。ＭＨＣクラスＩ／ペプチドの複合体を運んでいる樹状細胞がＣＤ８+Ｔ細胞と接触すると、活性化してＣＤ８+Ｔ細胞の増殖をもたらす。ＭＨＣクラスＩＩの役割に関しては、ＭＨＣクラスＩＩ／ペプチドの複合体を運んでいる樹状細胞がＣＤ４+Ｔ細胞と接触すると、活性化してＣＤ４+Ｔ細胞の増殖をもたらす。抗原をＴ細胞に提示する樹状細胞はそのＴ細胞を「活性化する」ことができるが、活性化したＴ細胞は有効な免疫応答を起こすことができないこともあり得る。ＣＤ８+Ｔ細胞による有効な免疫応答は、いくつかの相互作用のうちの１つまたは複数による樹状細胞の前刺激を必要とすることが多い。これらの相互作用としては、樹状細胞へのＣＤ４+Ｔ細胞の直接接触（樹状細胞ＣＤ４０受容体へのＣＤ４+Ｔ細胞のＣＤ４０リガンドの接触による）、または樹状細胞のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のうちの一つへのＴＬＲアゴニストの直接接触が挙げられる。
【００６８】
体液性免疫は、Ｂ細胞と抗体を参照する。Ｂ細胞は形質細胞に変わり、形質細胞は抗体を発現して分泌する。ナイーブＢ細胞はマーカーＣＤ２７を発現しないが、抗原特異的Ｂ細胞はＣＤ２７を発現する点で、ナイーブＢ細胞が識別される。分泌された抗体は、続いて、腫瘍細胞の表面にある腫瘍抗原と結合することができる。その結果、感染細胞または腫瘍細胞は、抗体のタグが付くようになる。抗体を感染細胞または腫瘍細胞に結合することで、結合した抗体は、感染細胞または腫瘍細胞の死滅を媒介する。この場合、死滅はＮＫ細胞による。ＮＫ細胞は特定の標的抗原を認識するように構成されていないが、Ｔ細胞が標的抗原を認識するように構成されている方法では、抗体の定常領域に結合するＮＫ細胞の能力は、ＮＫ細胞が抗体のタグが付いた細胞を特異的に死滅させることを可能にする。抗体のＮＫ細胞の認識は、抗体のＦｃ部分に結合している（ＮＫ細胞の）Ｆｃ受容体によって媒介される。この種の死滅は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と呼ばれる。ＮＫ細胞は、ＡＤＣＣの機序から独立して細胞を死滅させることもでき、この死滅は、標的細胞中では失われるか、または欠乏することになるＭＨＣクラスＩの発現を必要とする。
【００６９】
任意の特定の機構に拘束されることを望むことなく、本開示は、癌幹細胞抗原の投与、または癌幹細胞抗原をロードした樹状細胞を投与することを包含し、前記抗原は癌幹細胞抗原のうちの１つまたは複数を特異的に認識する抗体の産生を刺激し、前記抗体はＡＤＣＣを媒介する。抗原をロードしたという語句は、生細胞を捕捉する、壊死細胞を捕捉する、死細胞を捕捉する、ポリペプチドを捕捉する、またはペプチドを捕捉する等の樹状細胞の能力を指す。
交差提示による捕捉は、本開示に包含される。マクロファージまたはＢ細胞などの樹状細胞でない、抗原提示細胞の使用も包含される。
「遅延型過敏症反応」の技術は、主に細胞性免疫を含むか、または主に体液性免疫を含む免疫応答間を識別するのに用いられることができる。遅延型過敏症反応からの陽性シグナルは、細胞応答を示す。
本開示は、腫瘍細胞が例えば、放射線、核酸架橋剤、ポリペプチドリンカーまたはこれらの組み合わせによって不活性化される、組成物および方法を提供する。架橋結合は、鎖のいくつかの炭素原子を一次化学結合でつなぐ元素、基または化合物のいずれかで構成される、ブリッジによる重合体分子の２つの鎖の結合である。架橋結合は、成熟したコラーゲンのケラチンまたはインスリン、三価ピリジノリンおよびピロール架橋、およびグルタミン残基のγ−カルボキシアミン基とリジン残基のε−アミノ基の間の共有結合性ε−（γ−グルタミル）リジン架橋を含む血餅中の架橋において見られるように、２つのシステイン残基を含むジスルフィド結合によって結合されているポリペプチド鎖で構成される物質で天然に存在する。
【００７０】
架橋結合は、化学物質（架橋剤）を加える、または重合体を高エネルギー放射線にかける、のいずれかで、タンパク質中で人工的に引き起こすことができる。固定液および熱誘発凝集による架橋結合は、免疫応答を高め、ならびに増殖を完全に阻害することが示された。ＨＣＣ−ＣＳＣの表面でタンパク質を架橋するために用いることができ、およびしたがって増殖を阻害する物質としては、１０％中性緩衝ホルマリン液、４％パラホルムアルデヒド、１％グルタルアルデヒド、０．２５〜５ｍＭジメチルスベルイミダート、氷冷１００％アセトンまたは１００％メタノールが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解した１％グルタルアルデヒドと４％パラホルムアルデヒドの組み合わせを用いてもよい。
ホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドは、双方ともＴヘルパー細胞１型と２型の活性を誘発することが示された。特に、抗原の熱誘発凝集は、細胞傷害性Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ初回抗原刺激を高めることも示された。３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオナート）による抗原の架橋結合は、樹状細胞への抗原の結合の増加をもたらし、架橋結合している抗原は、抗原提示のためにプロテアソーム経路を介してプロセシングされる。さらに、ホルマリン固定肝細胞癌腫瘍細胞は、臨床試験で用いられたが、増殖の所見がなかった。
【００７１】
一実施形態において、全ＨＣＣ−ＣＳＣは、架橋剤で固定され、次いで抗原源として樹状細胞と組み合わせて用いられる。
別の実施形態において、細胞の核酸は、架橋結合している。例示的な核酸アルキル化剤は、β−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルである。例示的な架橋剤、例えばソラレンは、しばしば紫外線（ＵＶＡ）照射と組み合わせて、ＤＮＡを架橋結合するが、タンパク質を無修飾のままにしておく能力を有する。例えば、核酸標的化合物は、４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン（Ｓ−５９）であり得る。細胞は、１５０μＭプソラレンＳ−５９および３Ｊ／ｃｍ2ＵＶＡ光（ＦＸ１０１９照射装置、Ｂａｘｔｅｒ  Ｆｅｎｗａｌ，Ｒｏｕｎｄ  Ｌａｋｅ，ＩＬ）で不活性化されることができる。ＵＶ光によるＳ−５９での不活性化は、光化学処理と呼ばれ、細胞分裂は完全に阻止されるがポリペプチド抗原を含むポリペプチドへの損傷を最小限にする程度まで、架橋結合ＤＮＡに対してその処理条件を調節するまたは用量設定することができる。細胞は、０、１、１０、１００および１０００ｎＭのプソラレンＳ−５９を含む生理食塩水５ｍＬに懸濁させることができる。試料は、約２Ｊ／ｃｍ2の線量でＵＶＡを照射され得る。次いで、各試料を１５ｍＬの管に移し、遠心分離し、上清を除去し、次いで生理食塩水５ｍＬで洗浄し、遠心分離し、上清を除去し、最終ペレットを０．５ｍＬの生理食塩水に懸濁させる。米国特許第７，８３３，７７５号および同第７，６９１，３９３号を参照されたい。細胞の不活性化に関して、同特許が開示するすべてを参照によって本明細書に組み込む。
【００７２】
架橋結合剤で処理されるいずれの細胞調製物について、分裂能力は、標準培地で少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも２ヵ月間、少なくとも３ヵ月間、少なくとも４ヵ月間等、インキュベートするまたは培養することによって、当業者は試験することができる。細胞分裂は、染色体を示し、細胞分裂が起こっている、または起こっていないことを明らかにする染色によって評価することができる。細胞分裂は、細胞計数によって測定することもできる。このように、培養プレート中の細胞の数が２週間、１ヵ月間または２ヵ月間等、安定した状態を保っている場合、細胞が分裂できないと決定することは合理的であり得る。
一実施形態において、樹状細胞免疫原性組成物は、皮下（ＳＣ）投与される。さらなる実施形態において、各投与量は、ロードした樹状細胞が約５００万〜２０００万の範囲であり、６〜１０回投与を一連で繰り返す。特定の実施形態において、各投与量は、５日ごと、毎週、１０日ごと、隔週、３週ごとに、２、３、４、５または６回投与、続いて隔週、３週ごと、４週ごと、毎月、５週ごとまたは６週ごとに、２、３、４、５または６回追加投与、計６〜１０回投与が行われる。一実施形態において、最初の４回の注射は１ヵ月間毎週投与され、次いで次の４回の注射は毎月１回投与される。代替の実施形態において、投与は、週に１回を３週間、次いで毎月１回を５ヵ月間、計８回の投与が行われる。
【００７３】
各投与量は、ロードした樹状細胞を約５〜２０×１０6、ロードした樹状細胞を約５〜１７×１０6、ロードした樹状細胞を約６〜１６×１０6、ロードした樹状細胞を約７〜１５×１０6、ロードした樹状細胞を約７〜１４×１０6、ロードした樹状細胞を約８〜１３×１０6、ロードした樹状細胞を約８〜１２×１０6、ロードした樹状細胞を約９〜１１×１０6含む。さらなる実施形態において、各投与量は、ロードした樹状細胞を約８×１０6、ロードした樹状細胞を約９×１０6、ロードした樹状細胞を約１０×１０6、ロードした樹状細胞を約１１×１０6、ロードした樹状細胞を約１２×１０6を含む。ロードした樹状細胞は、樹状細胞と、樹状細胞によって吸収されなかった残存ＨＣＣ−ＣＳＣとの混合物を含む。投与される投与量は、これらの細胞の混合物を含み、該投与量はこの混合物を反映する。
別の実施形態において、ロードした樹状細胞は、薬学的に許容される担体または賦形剤とともに投与される。本明細書に記述する薬学的に許容される賦形剤、例えば、ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤は、当業者に周知であり、一般に容易に入手可能なものである。薬学的に許容される担体または賦形剤は、ロードした樹状細胞に対して化学的に不活性であり、使用条件下で有害な副作用または毒性がないものであることが好ましい。
【００７４】
賦形剤または担体の選択は一部、特定の治療組成物によって、ならびに組成物を投与するのに用いられる特定の方法によって、決定されることになる。本明細書に記述した調合物は単に例示的なものであり、決して限定するものではない。
生理学的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液であることが多い。生理学的に許容される担体の例としては、生理食塩水、溶媒、分散媒、細胞培地、例えばリン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸の水性緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０未満の残基）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖類、二糖類および他の糖質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
一部の例示的な実装形態において、ブーストアジュバント（ＧＭ−ＣＳＦ）は、各投与量と同時に投与される。特定の実施形態において、細胞投与量は、ＧＭ−ＣＳＦを含んでいる担体で懸濁される。代替の例示的な実装形態において、ＧＭ−ＣＳＦブーストアジュバントは投与されるが、一回量ごとではない。他の例示的な実装形態において、ＧＭ−ＣＳＦブーストアジュバントは、まったく含まれない。
限定されることなく、樹状細胞（例えば、自己由来または同種異系の樹状細胞）は、細胞ライセート、酸溶出、細胞抽出物、部分的に精製された抗原、精製抗原、単離抗原、部分的に精製されたペプチド、精製ペプチド、単離ペプチド、合成ペプチドまたはその任意の組み合わせとして、癌幹細胞抗原と接触される。次いで、樹状細胞は、対象、例えば、ＨＣＣを有する対象またはＨＣＣを有さない対照群の対象に投与される。例示的な実装形態において、樹状細胞は、皮下、腹腔内、結節内、筋肉内、静脈内、鼻孔内、吸入、経口の経路のうちの１つまたは複数の経路によって、腸管腔への適用等によって接触される、注入される、または投与される。さらに、免疫原性組成物は、腫瘍部位または転移部位に直接投与することができる。
【実施例１】
【００７６】
実施例１：針吸引生検由来のＨＣＣ癌幹細胞の単離および増殖拡大
正常な実質細胞、間質細胞および血管細胞とともに、多少分化した癌細胞からなる肝細胞癌（ＨＣＣ）腫瘍試料は、組織学的に異質である。本明細書で提示する方法の目的は、小ＨＣＣ試料に由来する癌幹細胞の集団を単離して、増殖拡大させることである。さらに、これらの細胞を用いて、ＨＣＣ再発の治療と予防のための自己由来療法を作製する。
処理および薬は、一般的な幹細胞を維持するように設計されており、分化した肝細胞、胆管上皮組織、血管内皮細胞、平滑筋細胞または線維芽細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの持続／増殖を維持しない。コルチコステロイドおよび血清などの文献に説明されている一般的な成分は省略し、その代わりに、タンパク質が追加された、アミノ酸およびビタミンの特定の比率による基本培地調合を用いた。
【００７７】
針吸引生検は、肉眼的に特定された病理的な部分から肝腫瘍と診断された患者から同意のもとで取得した。生検は、密閉容器中の輸送培地に直ちに移され、調節温度下（４〜８℃）で組織プロセシング施設に送った。次いで、生検をコラゲナーゼＩＶ溶液（４ｍｇ／ｍＬ）中で３０分間解離した。前述の細胞懸濁液は、遠心分離後、０．１％ゼラチンで被覆されているポリスチレン培養フラスコに移し、約２〜４週間増殖させておいた。一日おきに、幹細胞用の基本調合からなり、タンパク質／成長因子混合物を追加した、新しい培地を培養物に補充した。調合物は、表２、３および４に再現している。さらに、１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）と１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを混合して補充時に入れた。
強力な培養を確立した後、培養物が６０〜１００％のコンフルエンスに達したとき、タンパク質分解酵素（トリプシン、ＴｒｙｐＬＥ）を用いて培養物を解離し、次の２〜６継代の場合、１：２〜１：１０の割合でより大きい表面に再播種した。次いで、細胞をイメージング用チャンバーに播種し、肝細胞癌に特異的な抗体で染色した。
【００７８】
まず、培養物はゆっくりと増殖し始め（図９）、約１４〜２１日後、コロニーが再構成する構造（図１０）が確認された。酵素解離およびこれらのコロニーの継代により、増殖性の強い培養物からなる単層が生じた（図１１）。継代中コラゲナーゼＩＶによる解離により、この単層培養物が確立されるのを阻止した。
２〜６継代後、サイトケラチン（Ｃｋ１９、Ｃｋ７）、腫瘍特異的マーカー（α−フェトプロテイン［ＡＦＰ］、ＡＢＣＧ２）、接着分子（ＥｐＣＡＭ、ＮＣＡＭ、ＣＤ４４）、増殖マーカー（Ｋｉ６７）、および上皮間葉転換（ＥＭＴ）マーカー（Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ、Ｔｗｉｓｔ）について、細胞株を免疫細胞化学的に分析した。
【００７９】
結果が示すように、肝癌マーカーＡＦＰが不定に発現している（図１２Ａ〜Ｃおよび表５）が、ＮＣＡＭ（神経細胞接着分子、ＣＤ５６としても知られている）の存在は、高い増殖指標（Ｋｉ６７で示した通り、表５）で試料の１００％で見られる（図１３Ａ〜Ｃ、表５）。ＮＣＡＭは、細胞間接着を可能にし、腫瘍の浸潤能を説明する、同種親和性とヘテロ親和性の両特性を有する接着分子である。これまでの研究は、手術症例に由来するわずか８．３％の新鮮腫瘍がＮＣＡＭに対して陽性であることを示している。したがって、この培養条件はＨＣＣ−ＣＳＣの陽性選択および濃縮の原因となった。上皮マーカー（ＥｐＣＡＭ、サイトケラチン）の消失は顕著であり、ＨＣＣ細胞のより分化した表現型が培養条件によって維持されないことを示唆している。原発性ＨＣＣにおけるＮＣＡＭの存在は、悪性度の増大と転移能を示す。
【００８０】
2016510756.tif 000011
【００８１】
表面抗原ＣＤ４４（ヒアルロナン受容体）は、腫瘍細胞の運動能および転移性特性との関連性が知られている。分析した試料において、大部分の細胞（９０以上〜１００％）は、ＣＤ４４に対して陽性だった（図１４Ａ〜Ｃ）。
Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌおよびビメンチンマーカーの存在は、上皮マーカー（サイトケラチン、ＥｐＣＡＭ）の消失が上皮間葉転換プロセスに起因し、その間腫瘍細胞が腫瘍幹細胞特性（ＣＤ４４、ＮＣＡＭ）を獲得することを示している（図１５Ａ〜Ｄ）。
このデータは、示した無血清培地調合、基質および増殖方法が小針生検から取得した元の混成腫瘍集団由来の癌幹細胞前駆細胞の選択および／または転換をもたらしたことを示している。血清添加培地（０．５〜５％）中の拡大および増殖は、１〜２継代後、増殖相を速めることができるが、しかしコラーゲン系基質（ゼラチン、ＲＧＤペプチド）との組み合わせおよびＦＧＦとＥＧＦなどの成長因子は、選択相中に存続し得る線維芽細胞または筋芽細胞の不必要な増殖を引き起こし得る。
【実施例２】
【００８２】
実施例２：ロードした樹状細胞組成物の生成
抗原源は、患者の新鮮な腫瘍組織に由来する連続的に増殖し、自己複製する細胞からの自己腫瘍細胞である。これらの細胞には、腫瘍幹細胞の特徴がある。外科および病理環境では常に、生検は、試料が無菌であることを確実にするために、無菌プロトコルを厳守して扱われる。
病理学者は、患者の腫瘍の生検から新鮮な組織を得る。無菌メスとピンセットを使用して、試料を１０ｍｍのスライスに切断し、輸送培地を含んでいる輸送管に移し、試料の乾燥を回避するために迅速に作業する。試料は、４８時間内に外科的切除を行う製造施設に翌日配達便で送られる。
製造施設では、無菌室で試料を単細胞懸濁液に解離し、ＨＣＣ−ＣＳＣを濃縮し、増殖するよう設計された細胞培養条件下に置く。腫瘍試料のプロセシングの間、リンパ球、間質細胞および結合組織などの正常細胞は、除去する。増殖および精製ステップが終了すると、濃縮した増殖ＨＣＣ−ＣＳＣ（腫瘍細胞、ＴＣ）を放射線照射によって不活性（アポトーシス、抗原提示細胞への抗原曝露を促進する）し、気相液体窒素貯蔵しておく。このプロセスは、腫瘍試料の量と質によって、最高８週間まで続けることができる。
【００８３】
一旦腫瘍細胞生成物が品質保証をクリアするならば、患者は、白血球搬出法（通常は６リットル処置）と呼ばれている処置を受けるように通知される。このプロセスは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を収集するために、血液のフィルタリングを伴う。収集したＰＢＭＣは、水簸と呼ばれている向流密度遠心分離によって、さらなる精製のために製造施設に翌日配達便で送られる。抗原提示細胞または樹状細胞に変わることができる細胞を濃縮するために、水簸は、単球を他のリンパ球から精製するプロセスである。樹状細胞を生成するために、水簸した単球をサイトカインＧＭ−ＣＳＦおよびインターロイキン４（ＩＬ−４）とともに６日間、インキュベートする。
６日目に、精製した腫瘍細胞生成物を凍結保存から取り出し、解凍して、１８〜２４時間樹状細胞と結合させる。このプロセスは、樹状細胞を「ロードした抗原」をもたらす。最終生成物は、完全に樹状細胞であるか、または照射された腫瘍細胞の一部の残渣（許容できると考えられる）を含むこともあり、ＤＣ−ＴＣと呼ばれる。複合樹状細胞／腫瘍細胞の混合物を収集し、低温保存して、樹状細胞の生存力を維持し、次いで気相液体窒素中で保管する。
品質管理アッセイが完了すると、自己細胞療法生成物を放出し、気相液体窒素条件下で、このバッチを処理施設に送る。到着後、細胞療法生成物は、投与のために調製されるまで、気相液体窒素条件下で保管される。
【実施例３】
【００８４】
実施例３：肝細胞癌を有するＢ型肝炎陽性患者において、自己照射腫瘍幹細胞をパルスした自己樹状細胞による能動的特異的免疫療法の第Ｉ相臨床試験。
診断時に検出不可能である微小転移疾患のために、肝細胞癌は標準的治療によってめったに治癒しない。さらに、ＨＣＣはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染のエビデンスを伴うことが多く、そのため患者は肝移植には不適格になる。自己腫瘍幹細胞由来の抗原をロードした自己樹状細胞による能動的特異的免疫療法（ＡＳＩ）は、転移性黒色腫の患者において有望な長期生存結果と関連していたが、しかし、ＨＢＶ患者はこれらの臨床試験から除外されていた。このＡＳＩ方法は、ＨＣＣを含む他の腫瘍型においては評価に値する。外科的切除は、多くの患者にとって標準的治療の一部であり、それによって自己腫瘍細胞株の生成のための腫瘍源を提供する。ＡＳＩは、以前の臨床試験（黒色腫、第１相と第２相）で重要な毒性と関連していなかったが、理論的には、ＡＳＩはＨＢＶに対して内在性免疫応答を「そらす」ことができ得る、したがって、ウイルス感染を悪化させる。この理由で、ＨＣＣおよびＨＰＢの患者において第ＩＩ相有効性試験を考慮する前に、第Ｉ相安全性試験は是認された。
【００８５】
方法：患者登録のための主要な適格基準としては、外科的切除することができる、ここまで無処置だった原発性肝細胞癌（＞５ｃｍの孤立性病巣または多発病巣≧３ｃｍ）、ＨＢＶ既往歴、肝移植の候補者でない、白血球搬出法を受ける能力、肝動脈化学塞栓療法（ＴＡＣＥ）への立候補、チャイルドピュー評価Ａ、ＥＣＯＧ  ０〜１、および十分な血球数、アルブミン≧３．５ｍｇ／ｄＬを含む腎機能と肝機能が挙げられ、およびトランスアミナーゼの最高３倍までの上昇は認められた。
一連の増殖性ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイドを生成するために、腫瘍試料の３０〜６０分間のコラゲナーゼ消化に由来する細胞懸濁液を、超低接着性フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中の、ｂＦＧＦを１０ｎｇ／ｍＬおよびＥＧＦを１０ｎｇ／ｍＬ追加した、表２、３および４の培地に移し、１４日間維持した。
１００〜約１０，０００細胞からなるスフェロイドを形成し、補充時に差異重力によって精製した。次いで、０．１％のゼラチンで被覆したフラスコにスフェロイドを移し、接着させ、増殖させておいた。さらに３〜４週間にわたって、培養物を酵素解離させ、３〜７日ごとにさらに広い表面に播種することによって徐々に拡張させた。この段階で、培地に５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を追加添加した。最終的な収集で、細胞をコバルト６０源放射線装置で１００Ｇｙ照射に曝露した。照射効率は、いずれの場合も非増殖アッセイで確認した。
【００８６】
樹状細胞（ＤＣ）は、腫瘍試料として同じ患者から白血球搬出法によって採取した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来した。次いで、ＨＣＣ−ＣＳＣ（ＴＣ）をＤＣとともに終夜（１８〜２４時間）インキュベートして、ＤＣ／ＨＣＣ−ＣＳＣ組成物を作製し、それを低温保存した。一方、患者はＴＡＣＥを１クール投与され、６〜８週間後にＤＣ／ＴＣ組成物を開始した。治療時に、ＤＣ／ＴＣ組成物を解凍し、５００μｇの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）中に懸濁し、週一回、３週間、皮下注射を施し、さらに５週間、毒性について患者をモニターした。
【００８７】
結果：腫瘍は１８名の患者から収集し、細胞株をこれらに１８の患者試料から確立した。特徴付けを行ったＨＣＣ−ＣＳＣの表現型は、表６に示す。ＨＣＣ−ＣＳＣ表現型は、ＡＦＰとＮＣＡＭの十分な存在、高増殖（Ｋｉ６７）能力、および他の特異的マーカー（ＥｐＣＡＭ、ＣＫ１９、ＣＫ７、ＡＢＣＧ２）の種々のレベルと量によって規定した。現在、肝悪性腫瘍で臨床用に推奨されている、現在唯一のマーカーであるＡＦＰの存在は、調査したすべての試料で確認された。このデータは、患者由来の細胞株でのＡＦＰとＮＣＡＭの存在によって特徴付けられるＨＣＣ−ＣＳＣの陽性選択を示し、および上皮マーカー（ＥｐＣＡＭとサイトケラチン）の低い発現があるとすれば上皮間葉転換プロセスを示唆する。
【００８８】
2016510756.tif 000012
【００８９】
８名の患者をＤＣ／ＴＣ組成物で治療し、８名すべてに予定した３回の注射を投与した。治療した患者は、男性１名と女性７名であった。年齢の中央値は、３７〜７３歳の範囲で５６．５歳であった。治療時に、すべての患者のＥＣＯＧは、０であった。注射は、重大な急性毒性なしで良好な忍容性を示した。ＨＢＶ  ＤＮＡ定量分析を含む完全なウイルス定量検査によって明らかなように、肝臓トランスアミナーゼまたはＢ型肝炎ウイルス血症の増加は見られなかった。重篤または致命的な（グレード４または５）毒性は、記録されなかった。
【００９０】
結論：Ｂ型肝炎を伴うＨＣＣから単離された自己ＤＣ／ＴＣによる治療は、Ｂ型肝炎の悪化に関連していなかった。
【００９１】
特に明記しない限り、本明細書および特許請求の範囲で用いた成分の量を表しているすべての数、例えば分子量、反応条件等の特性は、すべての場合において、用語「約」で修正されると理解されたい。本明細書で用いる場合、「約」および「およそ」という用語は、１０〜１５％内、好ましくは５〜１０％内を意味する。したがって、特にそれとは反対の指示がない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る。少なくとも、および特許請求の範囲の均等物の適用を限定する試みではなく、各数値パラメータは、少なくとも、報告した有効数字の数を考慮し、および通常の丸め技法を適用することによって解釈されるべきである。それにも関わらず、本発明の広範な範囲を記載する数値範囲および数値パラメータは近似であり、特定の例に記載の数値は可能な限り正確に報告される。しかしいかなる数値でも、必然的に、それらのそれぞれの試験測定で見られる標準偏差から生じる特定の誤差を本質的に含む。
【００９２】
本発明を記述する内容（特に、添付の特許請求の範囲と関連して）で用いられる用語「一つ（ａ）」、「一つ（ａｎ）」「その（ｔｈｅ）」および類似の指示語は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈によって明瞭に否定されない限り、単数および複数の両方を含むものと解釈すべきである。本明細書の値の範囲の説明は、その範囲内に入る値をそれぞれ分離すために個々に引用する簡単な方法として役立つことを単に意図している。本明細書で特に指示されない限り、それぞれ個々の値は、本明細書で個々に引用されていたかのように、本明細書に組み込まれている。本明細書に記述するすべての方法は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈によって明瞭に否定されない限り、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書に記載するあらゆる例または例示的な文言（例えば「など」）は、特に主張しない限り、単に本発明をよりよく説明することだけを意図し、本発明の範囲に対する制限を設けるものではない。本明細書中のいかなる文言も、本発明の実施に不可欠である、いずれの請求項に記載されていない要素を示すものとは解釈されないものとする。
【００９３】
本明細書に開示する本発明の代替要素または実施形態のグループ分けは、限定と解釈されないものとする。各グループメンバーは、個々で、または本明細書で明らかにしたグループの他のメンバーまたは他の要素との任意の組み合わせで参照され、主張されることができる。一グループの１または複数のメンバーが便宜上および／または特許性の理由で、グループに包含される、またはグループから削除され得ると予想される。そのような包含または削除が生じるとき、本明細書は修正されたグループを含むと見なし、したがって添付の特許請求の範囲で用いられるすべてのマーカッシュグループの記載の説明を満たす。
本発明の特定の実施形態は、本明細書に記述されており、本発明を実施するべく本発明者らが既知の最良の形態を含んでいる。もちろん、当業者にとって、これらの記述された実施形態の変形は、前述の説明を読んだ上で明らかになろう。本発明者らは、当業者がそのような変形を必要に応じて使用すると予想し、および本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記述した以外に実施されることを意図する。したがって、適用される法律によって承認されるように、本発明は、本明細書に添付した特許請求の範囲に引用される主題のすべての修正および均等物を含む。さらに、そのすべての可能性がある変形における上述の要素のいずれの組み合わせも、本明細書で特に指示されない限り、または明らかに文脈と矛盾しない限り、本発明によって包含される。
【００９４】
本明細書で開示する特定の実施形態は、からなる、または本質的にからなる文言を用いる特許請求の範囲でさらに限定されることもある。特許請求の範囲で用いる場合、補正で提出されたかまたは追加されたかにどうかにかかわらず、移行語「からなる」とは、特許請求の範囲で特定されてないいずれかの要素、ステップまたは成分を除外する。移行語「本質的にからなる」とは、請求の範囲を、特定されている材料またはステップ、ならびに基本的特性と新規特性（複数可）に物理的に影響を及ぼさないものに限定する。そのように主張する本発明の実施形態は、本明細書に本質的にまたは明示的に記述され、可能な状態である。
さらに、本明細書全体を通して、多数の参照文献が特許および印刷された刊行物を引用している。上記の引用文献と印刷された刊行物の各々は、その全体を参照によって本明細書に個々に組み込む。
締めくくりに、本明細書に開示した本発明の実施形態は、本発明の原理を例示していることを理解すべきである。使用され得る他の修正は、本発明の範囲内である。このように、例としてであって、限定するのでなく、本発明の代替の構成は、本明細書の教示に従って利用することができる。したがって、本発明は、正確に示され、記述されていることに限定されるものではない。
【００９５】
このように、例示的な実装形態および／またはその態様に適用されるように、本開示の基本的な新規特徴を示し、説明し、指摘してきたが、例示的な実装形態、開示およびその態様の形式および詳細における種々の省略、再構成と置換および変更は、本開示および／または特許請求の範囲の趣旨から逸脱することなく、当業者によってなされ得ることが理解されよう。例えば、同じ結果を達成するために実質的に同じ方法で同じ機能を実質的に行うそれらの要素および／または方法ステップのすべての組み合わせは、本開示の範囲内であることが明示的に意図されている。さらに、いずれの開示した形式または実装形態に関連して示したおよび／または記述した、構造および／または要素および／または方法ステップは、設計変更の一般的事項として、いずれか他の開示されるまたは記述されるまたは提案される形式または実装形態に組み込まれ得ることを認識すべきである。したがって、意図は、本開示の範囲を限定しないことである。そのような修正のすべては、本明細書に添付した特許請求の範囲内であることが意図されている。
【００９６】
本明細書に引用した刊行物、特許、特許出願、参照文献および配列表のすべては、本明細書に完全に記述されているかのように、この参照により本明細書に組み込まれる。
要約は、読者が技術的開示の性質および要旨を迅速に確認することができるように、３７ＣＦＲ§１．７２（ｂ）に従って提供される。要約は、特許請求の範囲または意味を解釈する、または限定するのに用いられないという理解の下に提出される。
【図２】
2016510756.tif 000013
【図３Ａ】
2016510756.tif 000014
【図３Ｂ】
2016510756.tif 000015
【図４】
2016510756.tif 000016
【図５】
2016510756.tif 000017
【図６】
2016510756.tif 000018
【図７】
2016510756.tif 000019
【図８】
2016510756.tif 000020
【図９】
2016510756.tif 000021
【図１０】
2016510756.tif 000022
【図１１】
2016510756.tif 000023
【図１２Ａ】
2016510756.tif 000024
【図１２Ｂ】
2016510756.tif 000025
【図１２Ｃ】
2016510756.tif 000026
【図１３Ａ】
2016510756.tif 000027
【図１３Ｂ】
2016510756.tif 000028
【図１３Ｃ】
2016510756.tif 000029
【図１４Ａ】
2016510756.tif 000030
【図１４Ｂ】
2016510756.tif 000031
【図１４Ｃ】
2016510756.tif 000032
【図１５Ａ】
2016510756.tif 000033
【図１５Ｂ】
2016510756.tif 000034
【図１５Ｃ】
2016510756.tif 000035
【図１５Ｄ】
2016510756.tif 000036
【図１】
2016510756.tif 000037
【国際調査報告】
2016510756.tif 000038
2016510756.tif 000039
2016510756.tif 000040
2016510756.tif 000041