(57)【要約】  酵素および補酵素抑制剤の使用によりメタン生成バクテリアにおけるメタン生成を抑制する本願の方法は、嫌気性還元脱塩素化中に作用する。赤色酵母米、ビタミンＢ１０誘導体、エタンスルホン酸塩などの種々の化合物が、メタンの生成を担うこれらの異なる酵素および補酵素システムを破壊するために利用されるが、これらに限定されるものではない。本方法では、改善プロセス中に土壌や地下水のシステムに注入される有機水素供与体に対するメタン生成微生物とハローバクテリアの競合に影響を与える。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタン生成微生物によるメタン生成を抑制する方法であって、メタン生成微生物を、メタン生成の抑制に十分な有効量の、赤色酵母米、ビタミンＢ１０誘導体、またはエタンスルホン酸塩、あるいは、前記赤色酵母米、ビタミンＢ１０誘導体、またはエタンスルホン酸塩の任意の組み合わせ、を含む組成物に接触させることを含む方法。
【請求項２】
前記メタン生成微生物が環境媒体内に存在している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記環境媒体が、土壌または地下水である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記土壌または地下水の還元脱塩素化をもたらす、請求項３に記載の方法。 
【請求項５】
ビタミンＢ１０誘導体を含む前記抑制組成物が、メタン生成経路内の４-(β-Ｄ-リボフラノシル)アミノベンゼン-５’-リン酸塩（β-ＲＦＡ-Ｐ）シンターゼを阻止する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抑制組成物が、メタン生成経路内の３-ヒドロキシ-３-エチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ-ＣｏＡ）還元酵素を阻止する、請求項１に記載の方法。 
【請求項７】
前記抑制組成物が、メタン生成経路内の８-ヒドロキシ-５-デアザフラビン（補酵素Ｆ４２０）を阻止する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記抑制組成物が、天然に存在するスタチンである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記天然に存在するスタチンが、ロバスタチンである、請求項８に記載の方法。 
【請求項１０】
前記ロバスタチンの起源が、赤色酵母米である、請求項９に記載の方法。 
【請求項１１】
前記抑制組成物が、メタン生成経路内の２-スルタニルエタンスルホン酸塩（補酵素Ｍ）を阻止する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記補酵素Ｍ抑制組成物が、２-ブロモエタンスルホン酸塩（ＢＥＳ）、２-クロロエタンスルホン酸塩（ＣＥＳ）、２-メルカプトエタンスルホン酸塩（ＭＥＳ）、ルマジンから選択されたエタンスルホン酸塩である、請求項１１に記載の方法。 
【請求項１３】
前記方法が、環境媒体へ発酵性基質を添加するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。 
【請求項１４】
前記発酵性基質が、植物性油、落花生油、コーン油、または魚油を含む油である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記発酵性基質が、グルコースまたは発酵性グルコース生成化合物を含む炭水化物である、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本特許出願は、同一発明者による同時継続中の「嫌気性還元脱塩素化中のメタン生成の抑制」と題された２０１３年  ３月  ５日出願の特許出願第１３／７８５，８４０号の部分継続であり、その優先権が本明細書にて主張されている。
【０００２】
本発明は、メタンの生成に関与する異なる酵素および補酵素システムの各種抑制剤の使用に関する。本発明は、赤色酵母米、ビタミンＢ１０誘導体、エタンスルホン酸塩を使用して酵素および補酵素システムを破壊し、メタン生成におけるメタン生成微生物の生産性を制限するものである。
【背景技術】
【０００３】
塩素化脂肪族炭化水素（ＣＡＨｓ）を含むハロゲン化揮発性有機化合物（ＶＯＣｓ）は、スーパーファンド（Superfund）やその他米国内の有害廃棄物処理サイトの土壌や地下水中に最も頻繁に発生するタイプの汚染物質である。１９９６年にアメリカ合衆国環境保護庁（ＥＰＡ）は、これらサイトの浄化には今後数十年にわたって４５０億ドル以上の費用が掛かると見込んでいる。
【０００４】
ＣＡＨｓは、人工的な有機化合物である。それらは通常、１つまたはそれより多い水素原子を塩素原子に置換したり、あるいは塩素化化合物をより低度の塩素化状態に選択的に脱塩素化したりする各種プロセスを通して天然に存在する炭化水素成分（メタン、エタン、エテン）および塩素により作られる。ＣＡＨｓは、溶剤および脱脂剤としての使用、及び原材料の製造過程での使用を含む多種多様な用途で使用されている。ＣＡＨｓは、テトラクロロエテン（ＰＣＥ）、トリクロロエテン（ＴＣＥ）、四塩化炭素（ＣＴ）、クロロホルム（ＣＦ）、及び塩化メチレン（ＭＣ）などの溶剤を含む。ＣＡＨｓを含んだ廃棄物の過去これまでの管理では、米国の多くの汚染された地下水の領域にＣＡＨｓの存在を招き、結果的に土壌と地下水の汚染につながった。ＴＣＥは、これら汚染物質の中で最も普通に見られるものである。加えて、ＣＡＨｓおよびその分解生成物（ジクロロエタン（ＤＣＡ）、ジクロロエテン（ＤＣＥ）、塩化ビニル（ＶＣ）など）は地下に存続し続ける傾向にあり、公衆衛生と環境に危険を及ぼしている。
【０００５】
地下水中のＰＣＥ、ＴＣＥ、シス-１,２-ジクロルエテン（ｃｉｓ-１,２-ＤＣＥ）、ＶＣなどの塩素化炭水化物汚染物質を処理するための費用効率が良好で信頼性のある入手可能な技術のオプションは、特には以下のようなケースでは従来のポンプ・アンド・処理プロセス（pump-and-treat process）からは近年排除されてきている：
・非水相液体（ＮＡＰＬｓ）、マイクロエマルジョン、または高濃度の吸収物質が存在して高い溶解相濃度になっているケース。
・地表構造または使用性のために地下水へのアクセスが制限されているケース。
・地域の規制により、空気散布や自然減衰などの他の利用可能な技術の実施が禁止されているケース。
・ポンプ・アンド・処理技術が適用されてきたが、除去率が限界に達しているケース。
・リスクベースの閉鎖に対しては汚染が広範囲で濃度が高すぎるが、それ以外は比較的低いケース（通常は１００から７５００ ｐｐｂ）。 
・溶解ＣＡＨｓの土地の境界を越えた移動や隣接する表面水への移動が、長期的な浄化要求につながるケース。
・底にある飲料水帯水層への自由相ＣＡＨｓ（ＤＮＡＰＬ）の垂直移動が懸念されるケース。
【０００６】
各サイトでの環境化学は、そのサイトにおける塩素化溶剤の生分解速度を部分的に決定している。地下水中のクロロエテンやクロロエタンなどの塩素化溶剤の初期代謝は通常、連続還元脱塩素化と呼ばれる生化学的プロセスを含む。土地固有の(native)有機物などの電子供与体と、酸素や塩素化溶剤などの電子受容体の異なる形式および濃度の発生は、サイトの自然減衰の間にどれだけの還元脱塩素化が発生するかの決定に大きく係わっている。
【０００７】
実験室での研究によれば、酢酸塩(acetate)、プロピオン酸塩(propionate)、酪酸塩(butyrate)、安息香酸塩(benzoate)、グルコース、乳酸塩(lactate)、メタノール、およびトルエンを含む多様な有機物基質が、還元脱塩素化を刺激するであろうことを示している。糖蜜、乳清、コーン・スティープ・リカー、コーン油、水素化綿の実油ビーズ、固体食品ショートニング、牛脂、溶融コーン油マーガリン、ココナッツ油、大豆油、水素添加大豆油のような安価で複雑な基質が、完全な還元脱塩素化を支援する能力を備えている。
【０００８】
還元脱塩素化は、酸素が存在しない場合にのみ発生する；そして、塩素化溶剤は、そのプロセスを実行する微生物の生理内で実際に酸素の代役となる。この生理学的プロセスの間に塩素化溶剤を使用する結果、少なくともその一部が脱塩素化される。浄化処理技術では通常、このプロセスが直ちに発生することを確実にするために酸素除去剤を地下に導入している。
【０００９】
溶解された酸素を消費するため、しばしば有機栄養のバクテリアが使用され、これによって地下水の酸化還元能力を低減させている。加えて、そのバクテリアが有機粒子上で成長すると、それらは炭素を発酵して各種の揮発性脂肪酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸）を放出し、これが発酵部位から地下水プルーム内に拡散して脱ハロゲン化剤やハロ呼吸（halorespiring）の種を含む他のバクテリアのための電子供与体として作用する。鉄源は通常、直接的な化学的脱塩素化を刺激するかなりの反応表面領域を提供し、化学的な酸素除去を介して地下水の酸化還元能力の追加の低減となる。
【００１０】
バクテリアは一般に、１）エネルギを引き出す手段、２）必要とする電子供与体のタイプ、３）必要とする炭素の起源、によって分類される。地下でＣＡＨｓの生分解に関与しているバクテリアは、典型的には化学合成生物であり（化学的酸化還元反応からエネルギを引き出している）、有機化合物を電子供与体および有機炭素の起源として使用している（有機従属栄養生物）。しかしながら、バクテリアはさらに、使用する電子受容体、したがって地下で支配する領域のタイプによっても分類されている。相対的により多くのエネルギを発生させる酸化還元反応を引き起こすバクテリアの電子受容体のクラスは、相対的により少ないエネルギを発生させる酸化還元反応を引き起こすバクテリアの電子受容体のクラスよりも大きな部分を占めている。
【００１１】
ある種の微生物は、適用されるシステムから酸素や硝酸塩を除去する助けとなる。好塩性生物は塩を好む生物であり、高塩分濃度の環境に生息する。それらには主に原核及び真核の微生物が含まれ、環境の浸透圧をバランスさせ、塩の変性効果に抵抗する能力を有している。好塩性微生物の中には、多様な有機栄養やメタン生成の古細菌；光合成、無機栄養、有機栄養の各バクテリアや；光合成、有機栄養の真核生物がある。一方、メタン生成微生物は、他の形態の嫌気性呼吸で生成される余剰の水素や発酵生成物を除去しているため、嫌気性環境の中で極めて重要な環境作用を果たしている。メタン生成微生物は典型的には、ＣＯ２を除く全ての電子受容体（例えば、酸素、硝酸塩、三価鉄、および硫酸塩）が枯渇した環境下で繁栄している。
【００１２】
熱力学的に考察すれば、酸素と硝酸塩の方が塩素化溶媒よりもエネルギ面から有利な電子受容体であるため、還元脱塩素は、酸素と硝酸塩の双方が帯水層から枯渇した後にのみ発生するであろう。水素と酢酸塩に発酵されるほとんど全ての基質は、これらの材料が脱塩素化の微生物により使用されることから、還元脱塩素化を補強するために使用することがでる。しかしながら、水素はまた、メタン生成バクテリアをメタンに変換するメタン生成バクテリアにとっての基質でもある。水素を利用することにより、このメタン生成微生物は脱塩素化微生物と競合する。
【００１３】
メタン生成の抑制は、最終的に低メタン生成につながるが、これは主要関心事の各種環境側面に良好な影響を与え、また原位置浄化(in-situ remediation)プロセスにおける還元脱塩素化もしくは塩素化揮発有機化合物（ＣＶＯＣｓ）を増進させる環境条件を脱ハロゲン化バクテリアがより有効的に使用する助けとなるだろう。
【００１４】
したがって、嫌気性還元脱塩素化プロセスの間にメタン生成に係わる酵素及び補酵素システムを抑制するための方法の技術が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
嫌気性還元脱塩素化プロセスの間にメタン生成に係わる酵素及び補酵素システムを抑制するための方法の技術の必要性を解決するため、本発明がなされた。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、メタン生成に重要な役割を果たす各種酵素および補酵素の作用を抑えることによってメタン生成有機物からメタン生成を抑制する方法を提供する。本発明では、様々な酵素および補酵素がターゲットとされる。使用される当該抑制剤は、システム内に存在する他のバクテリアに対しては無害であることが見出されている。
【００１７】
酵素および補酵素抑制剤を使用してメタン生成微生物のメタン発生を抑制する本方法は、塩素化溶剤の原位置浄化において非常に有用となり得る。この方法は、浄化プロセスの間に土壌及び地下水システム中に注入される有機水素供与体に対するメタン生成微生物と好塩性バクテリアの競合に有効に作用することが期待される。この方法はまた、主要温室効果ガスと考えられているメタン排出量を低減させるための代替となるアプローチを提供する。この点において、本発明の少なくとも１つの実施の形態を説明する前に、本発明は、以下に記載された構造の詳細ならびに構成要素の配置の適用に限定されるものでないことは理解されるべきである。本発明は、他の実施の形態の可能性を含み、様々な態様で実行が可能である。また、本明細書中で用いられる表現および用語は説明目的であり、限定とみなすべきではないことは理解されるべきである。
【００１８】
以上より、当業者には、本開示に基づく概念は、本発明の各種目的を実行するための他の構造、方法、及びシステムを設計するための基礎として容易に利用できることが理解されよう。したがって、本願の特許請求の範囲は、本発明の精神と範囲から逸脱しない限り、このような同等の構成をも包含すると見ることが重要である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】表２にリストされたメタン濃度のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
ここに開示される内容は特に、メタン生成微生物によるメタン生成を抑制する方法に関するものであり、当該方法は、メタン生成微生物を、メタン生成を抑制するに十分となる有効量の赤色酵母米、ビタミンＢ１０誘導体、エタンスルホン酸塩(ethanesulfonate)を含む組成物に接触させることを含む。本発明の１つの態様として、本方法は土壌や地下水などの環境媒体の還元脱塩素化をもたらすものとなる。
【００２１】
本発明の１つの実施の形態によれば、本方法は、環境媒体へ発酵性基質を添加するステップをさらに含んでいる。当業者に知られた発酵性基質は、そのいずれもが本発明の方法にて動作可能である。例として幾つかの有用な発酵性基質を挙げれば、炭水化物；これにはブグルコース、グルコース生成化合物を含み；酢酸塩; プロピオン酸塩; 酪酸塩; 安息香酸塩; 乳酸塩;ギ酸塩；メタノール; トルエン；糖蜜；乳清；コーン・スティープ・リカー；コーン油、ピーナッツ油、ココナツ油、ダイズ油、水素化綿の実油ビーズを含む油；固形食品ショートニング、牛脂；溶融コーン油マーガリン；繊維性植物材料；キチン質および水素添加大豆があるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
生物学的メタンの形成は、メタン生成微生物により触媒される微生物プロセスである。本明細書で使用するメタン生成微生物の用語は、メタンを生成するバクテリアと古細菌（従来は古細菌バクテリアに分類されていた）の両方を含むメタン生成生物を意味する。メタン生成微生物のすべての種のメタン生成経路は、共通してメチル基からメタンへの変換を有しているが；ただし、メチル基の起源は異なっている。ほとんどの種は、還元剤となる水素分子（Ｈ２）またはギ酸塩により二酸化炭素（ＣＯ２）をメチル基に還元する能力を有している。ＣＯ２とＨ２を利用するメタン生成微生物のメタン生成経路には特定のメタン生成酵素が係わっており、これはユニークな補酵素を使用してユニークな反応を触媒する。
【００２３】
生合成酵素、４-(β-Ｄ-リボフラノシル)アミノベンゼン-５’リン酸（β-ＲＦＡ-Ｐ）シンターゼは、メタノプテリン(methanopterin)生合成の最初のステップを触媒する重要な酵素である。この酵素は、β-ＲＦＡ-Ｐ，ＣＯ２と無機ピロリン酸塩（ＰＰｉ）の汚染物質の形成と共に、パラアミノ安息香酸（ｐＡＢＡ）と５-ホスホ-α-Ｄ-リボシル-１-ピロリン酸塩（ＰＲＰＰ）の縮合を触媒する。この酵素は、ホスホリボシルトランスフェラーゼとデカルボキシラーゼで、ホスホリボシルトランスフェラーゼとｐＡＢＡ-依存酵素の中ではユニークであるＣ-リボシドを形成する。
【００２４】
β-ＲＦＡ-Ｐシンターゼは、テトラヒドロメタノプテリン（Ｈ４ＭＰＴ）の生合成内の初期ステップであり、メタン生成微生物の成長とエネルギ代謝に非常に重要な修飾された葉酸塩である。
【００２５】
メタノフランとＨ４ＭＰＴは、ＣＯ２からメチル基への可逆的還元における１炭素担体として機能する。Ｈ４ＭＰＴは、１つの炭素の反応がアミノ酸およびヌクレオチドの代謝に関与することから、メタン形成において複数のステップに関与するものとなる。Ｈ４ＭＰＴは、古細菌中およびバクテリアの１クラス（例えば、メチロバクテリウム・エキストロクエンス(Methylobacterium extorquens）)の内に見出されるが、これらの２つの葉酸塩（葉酸塩とメタノプテリン）の生合成経路は異なるもので、細胞の生理学では異なる機能的役割を果たしていることを示唆している（DumitruとRagsdale，2004）。
【化１】
2016516563.tif 000002
5,6,7,8-テトラヒト゛ロメタノフ゜テリン（H4MPT） 
テトラヒドロメタノプテリンの構造 
【００２６】
補酵素Ｆ４２０または８-ヒドロキシ-５- デアザフラビンは、多くの放線菌や散発的に他のバクテリア系列のメタン生成微生物における酸化還元反応に関与する２電子伝達補酵素である。それは全てのメタン生成の種における様々なレベルに存在し、ストレプトミセス・グリセウスおよびアナシスティス属ニデュランスにおいても特定されている。少なくとも４つの異なる形態の補酵素が言及されており、この全ては２つ、３つ、４つまたは５つのグルタミン酸残基からなる伸長側鎖を有するデアザリボフラビン(deazariboflavin)発色団を含んでいる。補酵素Ｆ４２０−２（すなわち、２つのグルタミン酸残基からなる側鎖を持つ）は、水素化（hydrogenotrophic）メタン生成微生物に存在する補酵素の形式とみられ、一方メチロトローフ種は、補酵素Ｆ４２０−４とＦ４２０−５を含んでいる（ReynoldsとColleran, 1987）。
【００２７】
補酵素Ｆ４２０の特徴の１つは、ＣＯ２からメチル基への還元における２つのステップに対して電子供与体として作用することである。メタノブレビバクター属スミシー(Methanobrevibacter smithii)からのＦ４２０依存ＮＡＤＰ酸化還元酵素は、ＮＡＤＰ＋とＦ４２０の間にメタン生成時の重要な電子移動ステップを触媒する。反応の間、ＮＡＤＰはＦ４２０から１つまたはそれより多くの水素化物（Ｈ−）を受けてＮＡＤＰＨに還元される。これは、Ｍ・スミシーなどのメタン生成バクテリア中でのメタン形成の重要なステップである。したがってＮＡＤＰ酸化還元酵素は、メタン形成に極めて重要な役割を果たす（Sherma他、2011）。
【化２】
2016516563.tif 000003
酸化状態                          還元状態（F420H2）
補酵素F420 (F420)
補酵素Ｆ４２０の構造
【００２８】
補酵素Ｍ（ＣｏＭ），２-スルファニルエタンスルホン酸塩(sulfanylethanesulfonate)は、自然界で知られている最小の補因子である。この補因子は、スルフヒドリル基にメチル化されてＣＨ３-Ｓ-ＣＯＭを形成し、これは全てのメタン生成経路における最終ステップを触媒するメチルレダクターゼのための基質となる。補酵素Ｂ，２-[(７-メルカプト-１-オキソヘプチル)アミノ]-３-ホスホノオキシブタン酸は、メチル補酵素Ｍ還元酵素のための第２の基質であり、反応の結果ＣｏＭ（ＣｏＢ-Ｓ-Ｓ-ＣｏＭ）を有するヘテロジスルフィド複合体を形成する（Ferry, 2002）。古細菌は、生合成ＨＭＧ-ＣＯＡ還元酵素を有することが知られた唯一のバクテリアであることから、３-ヒドロキシ-３-メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ-ＣＯＡ）還元酵素もまた、メタノブレビバクター属のメタン生成に極めて重要な他の酵素である（MillerとWollin, 2001）。 
【化３】
2016516563.tif 000004
【００２９】
Ｈ２を電子供与体とするＣＯ２からＣＨ４の還元（反応１）は、本発明の骨子となるメタン生成の経路である。
４Ｈ２+ＣＯ２→ＣＨ４+２Ｈ２Ｏ，ΔＧＯ’＝-１３０．４ｋＪ／モルＣＨ４  （１）
【００３０】
上記ＣＯ２還元経路は、メタノバクテリウム属サーモオートトロフィカム（Methanobacterium thermoautotrophicum）株の存在下で観察される（Ferry, 2002）。
【化４】
2016516563.tif 000005
ＣＯ２からＣＨ４への還元経路
【００３１】
ＣＯ２からＣＨ４に至る還元の間にたどるステップは以下のようである：最初に二酸化炭素がホルミル基レベルに還元され、その後ホルミル基がホルムアルデヒドレベルに還元される。次のステップで、メチレン基がメチルレベルまで還元され、最後にそのメチルレベルがメタンに変換される。上記還元ステップの４つ全てにつき以下に概要を述べる（Ferry, 1992）。
【００３２】
１．二酸化炭素からホルミルレベルへの還元 
ＣＯ２からホルミルレベルへの還元は、ホルミル・メタノフラン・デヒドロゲナーゼ（ＦＭＦ）により触媒される。ＦＭＦは、経路における最初の安定的中間体である。逆方向への酵素の活性は、Ｍ．サーモオートトロフィカム株の全ての抽出物中のメチルビオロゲンまたは補酵素Ｆ４２０のいずれかの還元に関連している。
【００３３】
２．ホルミルレベルからホルムアルデヒドへの還元 
還元の前に、ホルミル基は、反応２に示されるように５,６,７,８-テトラヒドロメタノプテリンに移転され、その後、反応３に示すように脱水環化によってメテニル誘導体に変換される。 
ＦＭＦ+Ｈ４ＭＰＴ→５-ホルミル-Ｈ４ＭＰＴ+２ＭＦ，ΔＧＯ’＝-４．４ｋＪ/モル（２）
５-ホルミル-Ｈ４ＭＰＴ+Ｈ＋→５,１０-メテニル-Ｈ４ＭＰＴ＋ +Ｈ２０，
ΔＧＯ’＝-４．６ｋＪ／モル  （３）
還元型補酵素Ｆ４２０による５,１０-メテニル-Ｈ４ＭＰＴからホルムアルデヒドレベルへの還元は反応４に示される。
５,１０-メテニル-Ｈ４ＭＰＴ＋+Ｆ４２０Ｈ２→５,１０-メチレン-Ｈ４ＭＰＴ +Ｆ４２０+Ｈ＋   ΔＧＯ’＝６．５ＫＪ／モル  （４）
上述したように、補酵素Ｆ４２０は、水酸化物イオンを供与または受容する必須の２電子担体である（酸化還元電位〜-３５０ｍＶ）。５,１０-メチレン-Ｈ４ＭＰＴデヒドロゲナーゼ活性の消失は、浄化手順の間もしくは空気への暴露によりＦ４２０に電子受容体としての依存度がより高まる。
【００３４】
３．メチレン基からメチルレベルへの還元
前記５,１０-メチレン-Ｈ４ＭＰＴ還元酵素は、反応５で還元型Ｆ４２０（Ｆ４２０Ｈ２）を生理的電子供与体として利用する。 
５,１０-メチレン-Ｈ４ＭＰＴ＋Ｆ４２０Ｈ２→５-メチル-Ｈ４ＭＰＴ＋Ｆ４２０，
ΔＧＯ’＝−５．２ｋＪ／モル  （５） 
この反応は、いずれの方向にも進行する；しかしながら、生理学的に適切なメチレン還元は、熱力学的に有利である。Ｈ２は電子の起源であるため（反応６）、この還元は発エルゴン的であり、したがって主な電気化学的ポテンシャルの発生を伴うであろう。
５,１０-メチレン-Ｈ４ＭＰＴ+Ｈ２→５-メチル-Ｈ４ＭＰＴ，
ΔＧＯ’＝−１４ｋＪ／モル  （６）
【００３５】
４.メチル基からメタンへの変換
ａ．メチル基の補酵素Ｍへの移転
還元の前に、５-メチルＨ４ＭＰＴのメチル基は、反応７に示すように補酵素Ｍ（ＨＳ-ＣｏＭ）に移転される。 
５-メチル-Ｈ４ＭＰＴ＋ＨＳ-ＣｏＭ→ＣＨ３-Ｓ-ＣｏＭ＋Ｈ４ＭＰＴ、
ΔＧＯ’＝-２９．７ｋＪ/モル  （７）
ｂ．ＣＨ３-Ｓ-ＣｏＭの還元脱メチル化
ＣＨ３-Ｓ-ＣｏＭのメチル還元性酵素は、反応８を触媒する。経路の最終還元ステップで、ＣｏＭ-Ｓ-Ｓ-ＨＴＰは、それぞれのスルフヒドリル補因子に還元される（反応９）。 
ＣＨ３-Ｓ-ＣｏＭ＋ＨＳ-ＨＴＰ→ＣＨ４＋ＣｏＭ-Ｓ-Ｓ-ＨＴＰ、
ΔＧＯ’＝−４５ｋＪ／モル （８）
ＣｏＭ-Ｓ-Ｓ-ＨＴＰ＋Ｈ２→ＨＳ-ＣｏＭ＋ＨＳ-ＨＴＰ、
ΔＧＯ’＝−４０ｋＪ／モル （９）
【００３６】
本発明は、酵素および補酵素の抑制のための追加の実施の形態を提供しており、それは上述したようにメタン生成プロセスの不可欠な部分である。ターゲットとなる酵素はメタノプテリンであり、ターゲットとなる補酵素は補酵素Ｆ４２０と補酵素ＡおよびＭである。
【００３７】
生合成酵素４-(β-Ｄ-リボフラノシル)アミノベンゼン-５ '-リン酸塩（β-ＲＦＡ-Ｐ）シンターゼは、メタノプテリン生合成の最初のステップを触媒する。メタノプテリンの還元型であるＨ４ＭＰＴは、メタン生成の複数のステップに関与しており；また、真核生物およびバクテリア中の主要な１炭素担体であるテトラヒドロ葉酸の機能の代替となる。メタン生成微生物による成長とエネルギ生産におけるＨ４ＭＰＴの重要性を考えると、ＲＦＡ-Ｐシンターゼの抑制は、特異的にメタノプテリン生合成を停止させるものであり、それによって他のバクテリアの代謝に障害を及ぼすことなくメタン発生を排除する。多くの研究者が上記仮説を支持する研究を行っている（Dumitru他  2003）。メタノプテリン生合成の最初のステップの間で、ＲＦＡ-Ｐシンターゼは、ホスホリボシルピロリン酸塩（ＰＲＰＰ）とｐＡＢＡの、ＣＯ２、無機ピロリン酸塩、およびβ-ＲＦＡ-Ｐへの転換を触媒する。
【化５】
2016516563.tif 000006
【化６】
2016516563.tif 000007
【００３８】
何人かの研究者は、メタン生成微生物ＲＦＡ-Ｐシンターゼを部分的に精製して特徴づけており、アルカエオグログブス属フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）由来の酵素が均質に精製されてクローニングされ、異所的に過剰発現された。反応は、オキソカルベニウム中間体と、ｐＡＢＡとのその付加物を介して進行する（RascheとWhite, 1998）。しかし最も重要なのは、他の研究グループ（Dumitru他,2003）が、ｐＡＢＡの構造類似体である競合性のある抑制剤の設計に焦点を当てたことである。アミノ基はほとんどのｐＡＢＡ依存反応において求核剤であり、一方、環炭素４はＲＦＡ-Ｐシンターゼで触媒された反応において求核剤であるため、ＲＦＡ-Ｐシンターゼを抑制するｐＡＢＡの類似体は極めて選択的である。
【化７】
2016516563.tif 000008
【００３９】
ドミトル（Dumitru，2003）他によって提示された抑制剤は、ＲＦＡ-Ｐシンターゼの活性を減じ、メタン生成微生物の純粋培養でメタン発生を阻止する。培養に過剰の自然基質ｐＡＢＡを供給すると抑制が緩和されることから、ＲＦＡ-Ｐシンターゼは細胞標的であることを示唆している。この抑制剤は、酢酸生成バクテリアの成長に悪影響を及ぼすことはない。
【００４０】
ｐＡＢＡは、ビタミンＢ１０としてより広く知られていることには留意すべきである。ビタミンＢ１０はビタミンＢ複合体の一部であり、水溶性ビタミンであると考えられる。ｐＡＢＡはプテロイドグルタミン酸塩の成分である。いくつかのバクテリアに対してプロビタミンとして働くため、一時はビタミンであると考えられ、ビタミンＢ-ｘと呼ばれた。
【００４１】
ドミトル（Dumitru，2003）他は、全てｐＡＢＡのＮ置換誘導体であった各種抑制剤を合成し、ＰＦＡ-Ｐシンターゼと共にそれらの抑制定数を特定した。その結果は、ＲＦＡ-ＰシンターゼのｐＡＢＡ結合部位が、アミノ基の近くに比較的大きな疎水性ポケットを持っていることを示唆している。各ｐＡＢＡ類似体は、メタン生成微生物Ｍ．マールブルゲンシス（M.marburgensis：従来はＭ．サーモオートトロフィカムとして知られた）のメタン生成と増殖とを抑制する能力についてテストされた。わずかな量のメタンが、成長は完全に抑制されたＭ．マールブルゲンシス培養のヘッドスペースで測定された。１００ｎＭにて、現在最も強力な抑制剤、４-[(２-ピリジルメチル)アミノ]安息香酸は、メタン生成微生物の成長とＭ．マールブルゲンシスによるメタンの形成を完全に阻止している。抑制は、ｐＡＢＡと媒体を補充することによって全て逆戻りとなり、ｐＡＢＡと多分ＲＦＡ-Ｐシンターゼと思われる細胞標的の抑制剤との間の競合相互作用を示している。
【００４２】
酢酸生成は、多くの嫌気性生息地でメタン発生微生物と競合する嫌気性および水素化バクテリアのプロセスである。各抑制剤は、酢酸生成バクテリアＭ．サーモアセティカ（M.Thermoacetica）の増殖に対する効果をテストされた。メタノプテリンは、バクテリアの生存のためには必要ではない：従って、ここで説明するＲＦＡ-Ｐシンターゼ抑制剤はいずれも、1ｍＭまでの濃度で、Ｍ．サーモアセティカの成長には影響を及ぼすことはない（Dumitru他，2003）。
【００４３】
前記抑制剤の効果が、メタンの形成および揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）生成でテストされた。メタンの生成は、５ｍＭの４-(エチルアミノ)安息香酸塩、または９ｍＭの４-(イソプロピルアミノ)安息香酸塩によって完全に抑制される。５ｍＭの４-(２-ヒドロキシエチル)安息香酸塩は、メタンの生成を対照レベルの２．５％に抑制した。対照として、メチル補酵素Ｍ還元酵素の抑制剤である１ｍＭのブロモエタンスルホン酸塩（bromoethanesulfonate）は、すべての実験でメタン生成を完全に抑制（Ｐ＜０．０１）した（Dumitru他、2003）。
【００４４】
ＶＦＡ生成に対する有効ないくつかの抑制剤の効果もテストされた。ＶＦＡ生成は、メタン生成を完全にブロックする濃度のＲＦＡ-Ｐシンターゼ抑制剤を添加しても抑えることはできなかった。例えば、７ｍＭの４-エチルアミノ安息香酸塩が人工的反芻システムに追加されたとき、酢酸塩（Ｐ＜０．０５）とプロピオン酸塩（Ｐ＜０．１０）のレベルが、抑制剤に暴露されていない対照に対して上昇している。これらの結果は、酢酸生成バクテリアの純粋培養での研究と一致しており、この抑制剤が他のバクテリアに対して悪影響を及ぼさないことを示している（Dumitru他、2003）。
【００４５】
シャルマ（Sharma，2011）他は、ロバスタチンとコンパクチン（メバスタチン）が有する潜在抑制効果を、メタン生成の間でＭ.スミシー由来のＦ４２０依存ＮＡＤＰ酸化還元酵素によりテストした。彼らの研究結果により、ロバスタチンとコンパクチン（メバスタチン）化合物の双方は、Ｆ４２０依存ＮＡＤＰ酸化還元酵素タンパク質の潜在的抑制剤として有効であることが見出された。
【００４６】
本発明によれば、本発明の組成物に含まれる天然に存在するスタチンは、メタン生成生物の経路内でメタン生成を抑制する働きをする。そのような天然に存在するスタチンの１つは、他の各種起源の中でも赤色酵母米から得られるロバスタチンである。ロバスタチン（Ｃ２４Ｈ３６Ｏ５）は、真菌類の成長の産生期 （idiophase：第２段階）の副産物であり、人間のコレステロール生成経路の主要な酵素でもある３-ヒドロキシ-３-エチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ-ＣＯＡ）還元酵素の抑制剤である。人間のコレステロール形成と古細菌の細胞膜の形成の間には、古細菌の細胞膜内のリン脂質の脂質側がイソプレノイド鎖であることから類似性がある。イソプレノイドの形成は、コレステロール生成経路（メバロン酸経路）の中間ステップであり、ＨＭＧ-ＣＯＡ還元酵素は、その生成のための重要な酵素でもある。したがって、ＨＭＧ-ＣＯＡ還元酵素の抑制剤として、ロバスタチンはイソプレノイドの生成を阻止し、これによりコレステロールの合成および古細菌における膜形成を阻止する。ウォーリンとミラー（Wolin and Miller, 2005）は、ロバスタチンがセルロース分解バクテリアに如何なる悪影響をも及ぼすことなく、純粋なメタン生成バクテリアの成長と活性を大幅に減退させることを立証している。
【００４７】
前述したように、Ｆ４２０Ｈ２-ＮＡＤＰは、ＮＡＤＰ＋とＦ４２０の間での電子移動、すなわちＦ４２０から１つもしくはそれより多い水素化物（Ｈ-）の受容によりＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元するステップの触媒に作用する補酵素の１つである。
【００４８】
シャルマ（Sharma, 2011）他は、Ｍ．スミシー由来のＦ４２０依存ＮＡＤＰ酸化還元酵素の３Ｄモデル構造を特定した。彼らのＦ４２０依存ＮＡＤＰ酸化還元酵素のタンパク質モデルに基づいて、彼らはそれらの残滓物がリガンド結合部位ポケットを作ることを発見し、その後のさらなる研究によって、リガンドＦ４２０がそのタンパク質の空洞に結合することを見出した。この抑制剤化合物ロバスタチンとコンパクチン（メバスタチン）は、天然リガンドＦ４２０と比較として、モデルタンパク質に対してより高い親和性を示す。それらは、Ｆ４２０によるものと同一の空洞を共有し、同様な残滓物により囲まれる。換言すれば、酵素は基質と結合することができず、これによってメタン生成が減退されることから、抑制剤化合物ロバスタチンとコンパクチン（メバスタチン）は、メタン生成に対してその活性を阻止するのに非常に有効であった。ロバスタチンは、アスペルギルス属テレウスの培養から単離された菌類の代謝産物であり、コンパクチン（メバスタチン）は、ペニシリウム属ブレビコンパクツムから得られた抗真菌性の代謝産物である。シャルマ（Sharma, 2011）他は、ロバスタチンとコンパクチン（メバスタチン）が、Ｆ４２０-依存ＮＡＤＰ酸化還元酵素タンパク質の活性部位を阻害するための強力な抑制剤として作用する可能性を打ち立てている。
【化８】
2016516563.tif 000009
コンハ゜クチン（メハ゛スタチン）  ロハ゛スタチン
【化９】
2016516563.tif 000010
補酵素F420
コンパクチン（メバスタチン）、ロバスタチン、Ｆ４２０の構造
【００４９】
研究者は、米の上の酵母（紅麹カビ、Monascus purpureus）を発酵させて作られるアジアの主食である赤色酵母米が、ロバスタチンなどのスタチン薬の活性成分を含むことを発見した。この研究により、赤色酵母米は、主要酵素ヒドロキシメチルグルタリル（hydroxymethylglutaryl）-ＳＣｏＡ(ＨＭＧ-ＣｏＡ)還元酵素を有効に抑制し、その結果メタン生成微生物の活性を抑制することが分かった。
【００５０】
ミラーとウォーリン（Miller and Wolin, 2001）は、主要前駆体メバロン酸塩の形成を抑制するためにロバスタチンを使用した。メバロン酸塩は、ヒドロキシメチルグルタリル-ＳＣｏＡ(ＨＭＧ-ＣｏＡ)の還元により形成される。その結果に基づき、彼らはロバスタチンがメタノブレビバクター属の成長とＣＨ４の生成を抑制することを見出した。実際、４ｎｍｏｌ／ｍｌの培養媒体が成長の５０％抑制を果たし、濃度≧１０ｎｍｏｌ／ｍｌの培養媒体が成長を完全に抑制した。メタンの形成も大幅に抑制された。同時に非メタン生成微生物の集団は影響を受けなかった。
【００５１】
補酵素Ｍ（ＣｏＭ；ＨＳＣＨ２ＣＨ２Ｓｏ３−）は、すべてのメタン生成微生物に見られる補因子であるが、他のバクテリアや古細菌には見られない（LiuとWhitman, 2008）。ＣｏＭは、メタン生合成の最終ステップに関与し、そこではＣｏＭに担持されたメチル基が、メチル-ＣｏＭ還元酵素によってメタンに還元される。このグループに関与するメタン生成微生物抑制剤には通常、２-ブロモエタンスルホン酸塩（ＢＥＳ）、２-クロロエタンスルホン酸塩（ＣＥＳ）、２-メルカプトエタンスルホン酸塩（ＭＥＳ）、およびルマジンが含まれる（Liu他、2011）。これらの抑制剤は、Ｈ２とＣＯ２を用いるメタン生成微生物中のメタン形成の間の最終ステップで、メチル転移反応を競合的に抑制することができる。通常の状況下では、これらの化合物は比較的低濃度でメタン生成微生物の全てのグループを抑制することができる。ＣｏＭとＢＥＳの伝統的な構造類似体は広く使用されており、微生物学的研究ではメタン生成微生物特異的な抑制剤と考えられてきた。コンラッド（Conrad, 2000）他は、１０ｍＭのＢＥＳが、イネの根システムにおける嫌気性メタン生成微生物を抑制する最適濃度であると報告している。嫌気性消化容器の好熱性環境内では、少なくとも５０ｍＭのＢＥＳを使用することでメタン生成の完全な抑制を達成することができる。水素化メタン生成微生物の抑制のためにはアセトクラスティック（acetoclastic）メタン生成微生物よりも高いＢＥＳ濃度が必要とされる（Zinder他、1984）；しかしながら、同様なシステムではメタン生成プロセスを抑制するために僅か１０ｍＭのＢＥＳが要求されるだけである（Siriwongrungson他、2007）。他の研究では、土壌中の５−２０ｍＭの濃度（Wuest他、2009）がメタン生成を抑制するのに極めて有効であることを示している。ＭＥＳとＣＥＳも共に同様の抑制効果を有しており、連続流メタン生成微生物固定フィルムのカラムにおけるメタン生成活性を減退させるために使用されていた（Bouwer and McCarty, 1983）。様々なレポートは、プテリン化合物ルマジン[２,４-(１Ｈ,３Ｈ)- プテリジンディオネ（pteridinedione）]が、０．６ｍＭの濃度でいくつかのメタン生成古細菌の成長を完全に抑制し、Ｍ．サーモオートトロフィカム株のマールブルグに対して殺菌性であることを示している（Nagar-Anthal他、1996）。
【００５２】
したがって、上述したものは本発明の原理の単なる例示と考えられる。さらに、多くの修正および変更が当業者に容易に想起されるため、本発明が表示し記述された構成と動作通りに限定されることを望むものではなく、したがって、全ての適用可能な修正ならびに均等事項は本発明の範疇にあるものと考えられる。
【実施例】
【００５３】
「メタン抑制剤ＲＹＲ」有効性のベンチテスト 
【００５４】
目的 
当該実験室研究の目的は、本願発明者らにより開発された組成物であるメタン抑制剤ＲＹＲ（ＭＩＲＹＲ）の有効性を評価することにある。当該製品は、メタン生成微生物の存在が確かめられ、それが活性である環境内でメタン生成を抑制するように設計された。
【００５５】
材料および方法 
対照（Control）とテストの２つの嫌気性反応器が使用された。これら２つの反応器には、活性メタン生成微生物集団を含む期限切れ栄養補助食品を処理するバイオマスが捲かれた。反応器には１週間に１度飼料が与えられ、キャシディ（Cassidy, 2008a, 2008b）他に記載された嫌気性シーケンシングバッチ反応器として運転された。当該記載内容は、参考として本明細書に含まれる［Cassidy DP, Hirl PJ, Belia E.（2008a）、嫌気性シーケンシャルバッチ反応器内でのエタノール副産物からのメタン生成、Water Science & Technology、58(4):789-793; Cassidy DP, Hirl PJ, Belia E.（2008b）。嫌気性シーケンシャルバッチ反応器内での溶解物（DDGS）を有する蒸留器の乾燥穀物の溶解性画分からのメタン生成、Water Environment Reserch.80(6):570-575］。
【００５６】
開始の第１週間は、反応器には土壌はなく、メタン生成微生物培養のみを含んでいた。
１週間の後にシルト砂が加えられ、その結果２０重量％の固形分濃度を有するスラリーが得られた。このシルト砂がメタン生成微生物活性に影響しないことを確かめるため、反応器はシルト砂と共にさらに１週間運転された。
【００５７】
当該バイオ反応器は容量が２．５Ｌあり、２Ｌのスラリーを含んでいた。反応器は気密であり、嫌気反応のために特別に設計されていた。反応器は、実験室温度の２２℃〜２４℃に維持された。反応器は、週に一度栄養補助飼料を供与して運転された。供与後の目標とする初期化学酸化デマンド（「ＣＯＤ」）濃度は２０００ｍｇ／Ｌであった。その週を通して、生成されるバイオガスの量が以下のように測定された。メタン含有量のためのガスサンプルを収集するために、反応器の上部の隔壁のあるポート内にシリンジが定期的に挿入された。バイオガス試料のメタン含有量は、その後火炎イオン化検出器（ＧＣ−ＦＩＤ）付きのガスクロマトグラフに注入することによって定量化された。該反応器は、ｐＨと酸化還元電位（「ＯＲＰ」）を測定するための専用プローブを有していた。各サイクルの後（すなわち、飼料供与の前）、総溶解固形分（「ＴＤＳ」）を測定するためにプローブが反応器に挿入され、ＣＯＤを測定するためにサンプルが採取された。サンプリングと飼料供与の間、反応器内容物への酸素の浸入を最小限に抑えるためミキサーのスイッチは切られた。
当該テスト反応器には、当初４０ｇ／Ｌ濃度のメタン抑制剤ＲＹＲ（ＭＩＲＹＲ）が投与された。一週間後、対照には２０ｍｇ／ＬのＭＩＲＹＲが投与された。
【００５８】
結果 
研究の最初の２週間は開始期間であり、次の２週間はテスト期間であった。開始期間には、２つの反応器内にメタン生成微生物集団が確立された。開始期間の最初の週には、反応器はシルト砂なしで運転され、第２週にはシルト砂（２０重量％）と共に運転された。テスト期間は、テスト反応器にＭＩＲＹＲ（４０ｇ／Ｌ）を投与して開始された。テスト期間の第１週目は、対照は適切な対照として維持され、すなわちＭＩＲＹＲは添加されていない。投与量４０ｍｇ／ＬのＭＩＲＹＲ /Ｌは、テスト反応器内でのメタン生成を減少させたため、試験期間の第２週目に２０ｇ／ＬのＭＩＲＹＲを対照反応器に投与することが決定された。この試験期間は１７日間続いた。
【００５９】
表１は、研究の間に対照とテストの反応器内で測定されたバイオガスの生成量、ｐＨ値、及びＣＯＤ、ＯＲＰ、ＴＤＳの濃度を示す。各飼料供与サイクル（すなわち、各週）に反応器内で生成されたバイオガスの量は、７２−８２ｍＬの範囲であった。このガス量は、開始期間の第２週目にシルト砂を導入したことによっても影響を受けていないことが分かる。テスト期間の第１週目のテストへの４０ｍｇ／ＬのＭＩＲＹＲの追加と、テスト期間の第２週目の２０ｍｇ／ＭＩＲＹＲの追加は、反応器内でのバイオガス量に目立った影響を与えていない。各シーケンシャルバッチ反応器サイクル後のＣＯＤ測定値は、５６から１０８ｍｇ／Ｌの範囲であった。反応器には各サイクルごとに２０００ｍｇ／Ｌの飼料が供与されており、したがって表１のＣＯＤ濃度は、ＣＯＤが嫌気性培養によって消費されたことを示している。ｐＨの値は６．１から６．４の範囲であった。ＯＲＰの値は全てが-３００ｍＶ近傍であり、これはメタン生成微生物条件の典型的なものである。反応器中のＴＤＳは、約１２００〜１２５０ｍｇ／Ｌの範囲であった。
【００６０】
表１
研究の間を通しての対照とテストの反応器内のバイオガス量、ｐＨ値、ＣＯＤ，ＯＲＰ，ＴＤＳの濃度  
【表１】
2016516563.tif 000011
【００６１】
表２は、１７日間の研究期間内に反応器中で生成されたバイオガス中に測定されたメタン含有量のリストである。図１は、表２に示されたメタン濃度のグラフを示す。開始期間中に、メタン濃度は約５５％から７０％の範囲となり、これは活発なメタン生成微生物の培養を意味する。テスト反応器内への４０ｍｇ／ＬのＭＩＲＹＲの投与は、１１日の間にバイオガスのメタン濃度を６２％から検出範囲（０．０５％）以下まで減少させている。テスト反応炉内のこの検出範囲以下のメタン濃度は、反応器が外される１７日まで維持された。７日目の対照反応器への２０ｍｇ／ＬのＭＩＲＹＲの投与は、１７日の間（すなわち、１０日後）でバイオガスのメタン濃度を６５％から検出範囲（０．０５％）以下まで減少させた。テスト期間中、テストと対照の反応器内で生成されたバイオガスの量は目立った変化はなく（表１）、バイオガスのメタン濃度だけが変化している。
【００６２】
表２
テスト期間中（すなわち、メタン抑制剤の投与後）バイオガス内に測定されたメタン濃度（％）のリスト
【表２】
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【００６３】
本発明は、記載された実施の形態や実施例に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に記載された精神と範疇に含まれる各種変更および同等な構成をも包含することが意図されていることは理解されよう。
【国際調査報告】
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