(57)【要約】  本発明は、凝固を生じているサンプル中の水のNMR緩和特有のシグナルを測定してNMR緩和データを生成し、NMR緩和データから、形成している血餅特有のサンプル中の水の磁気共鳴パラメータを決定することにより、凝固プロセスをモニタリングする方法を特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第1の血液サンプル中の凝固又は溶解プロセスをモニタリングする方法であって、
(i)前記血液サンプル中の水の一連の磁気共鳴緩和率測定を行うステップと、
(ii)第1の血液サンプル内の2つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用して、前記測定値を変換するステップであり、各別個の水集団が、1つ以上の値を有する1つ以上の磁気共鳴パラメータによって特徴づけられるステップと、
(iii)ステップ(ii)の結果に基づいて、強固に結合している血餅が、前記プロセス中に形成又は溶解したかどうかを決定するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
第1の血液サンプルが、多血小板血漿サンプル、全血サンプル、又は凝固血サンプルである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに、フィブリノーゲンを添加する、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
ステップ(i)の前又は後に、第1の血液サンプルに、凝固開始剤又は凝固阻害剤を添加する、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
第1の血液サンプルに、RF、AA、ADP、CK、TRAP、エピネフリン、コラーゲン、組織因子、セライト、エラグ酸、及びトロンビンから選択される凝固開始剤を添加する、又は第1の血液サンプルに、血小板凝集阻害剤である凝固阻害剤を添加する、又はステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに、組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)、アプロチニン、アブシキシマブ(レオプロ)、又はサイトカラシン-Dを添加する、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
(iv)前記対象からの第2の血液サンプル中の水の一連の第2の緩和率測定を行うステップと、
(v)第2の血液サンプル内の2つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用して、第2の緩和率測定値を変換するステップであり、各別個の水集団が、1つ以上の磁気共鳴パラメータによって特徴づけられ、各磁気共鳴パラメータが、1つ以上の値を有するステップと、
(vi)ステップ(ii)及びステップ(v)の結果に基づいて、強固に結合している血餅が、前記プロセス中に形成又は溶解したかどうかを決定するステップと
をさらに含む、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
第1の血液サンプルが血漿サンプルであり、第2の血液サンプルが全血サンプルである；第1の血液サンプルが多血小板血漿サンプルであり、第2の血液サンプルが全血サンプルである；第1の血液サンプルが乏血小板血漿サンプルであり、第2の血液サンプルが全血サンプルである；又は第1の血液サンプルが単離及び洗浄した血小板を含み、第2の血液サンプルが全血サンプルである、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
ステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに血小板阻害剤を添加し、血小板阻害剤を第2の血液サンプルに添加しない；又はステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに血小板活性化因子を添加し、血小板活性化因子を第2の血液サンプルに添加しない；又はステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに組織因子、セライト、エラグ酸、RF、AA、及びCKから選択される凝固開始剤を添加し、ステップ(iv)の前に、第2の血液サンプルにADP及びトロンビンから選択される凝固開始剤を添加する；又はステップ(i)の前に、第1の血液サンプルにフィブリノーゲンを添加し、ステップ(iv)の前に第2の血液サンプルにフィブリノーゲンを添加する、請求項6又は7に記載の方法。
【請求項９】
前記磁気共鳴パラメータ値が、前記血液サンプル中の強固な血餅関連水分子に特有である、又は前記2つ以上の別個の水集団の少なくとも1つが、強固に結合している血餅の存在と正に相関する、又は前記アルゴリズムが、多指数関数アルゴリズム、双指数関数アルゴリズム、三指数関数アルゴリズム、減衰指数関数アルゴリズム、ラプラス変換、逆ラプラス変換、適合度アルゴリズム、SSEアルゴリズム、最小二乗アルゴリズム、及び非負最小二乗アルゴリズムからなる群から選択されるアルゴリズムを含む、又は前記緩和率が、T1、T2、T1/T2ハイブリッド、T1rho、T2rho、及びT2*からなる群から選択される、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
前記2つ以上の水集団が、血清関連T2シグナルを有する水集団及び強固に結合している血餅関連T2シグナルを有する水集団を含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
強固に結合している血餅関連T2シグナルを有する前記水集団が、40から250msの範囲のT2緩和率によって特徴づけられる、又は前記2つ以上の水集団が、血餅関連T2シグナルを有する水集団をさらに含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記緩和率測定がT2測定を含み、前記測定が減衰曲線を提供する、請求項9に記載の方法。
【請求項１３】
前記凝固又は溶解プロセスの開始後の所定の時点でのT2緩和スペクトルを、前記減衰曲線から計算するステップをさらに含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
血液サンプル中の凝固又は溶解プロセスの開始後、(a)前記プロセス中の前記血液サンプルに関する複数の緩和率測定を行って、複数の減衰曲線を作成するステップと、(b)複数のT2緩和スペクトルを前記複数の減衰曲線から計算するステップとをさらに含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記血液サンプル中の凝固又は溶解プロセスの開始後の時間の関数としての前記血液サンプル中の2つ以上の水集団に関する(a)T2緩和時間の変化と、(b) T2シグナル強度の変化とを示す3次元データセットを、前記複数のT2緩和スペクトルから計算するステップをさらに含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
第1の血液サンプル中の凝固又は溶解プロセスをモニタリングする方法であって、
(i)血液サンプルと接触している内部表面を有するサンプル管における前記血液サンプル中の水の一連の磁気共鳴緩和率測定を行うステップと、
(ii)第1の血液サンプル内の2つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用して、前記測定値を変換するステップであり、各別個の水集団が、1つ以上の値を有する1つ以上の磁気共鳴パラメータによって特徴づけられるステップと、
(iii)ステップ(ii)の結果に基づいて、血餅が、前記プロセス中に形成又は溶解したかどうかを決定するステップと
を含み、
サンプル管の内部表面がフィブリン接着を制御する、方法。
【請求項１７】
内部表面が、フッ素化材料、PEG化材料、又はコーティングされていない基材と比較してフィブリン接着を減少させる材料でコーティングされた基材を含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記基材が、ガラス又はベースポリマーである、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記基材が、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、及びポリアロマーから選択されるベースポリマーである、又は前記基材が、シラン処理されていないガラスと比較してフィブリン接着を減少させる材料でのシラン処理によってコーティングされたガラスである、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記材料が、界面活性剤、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリエチレングリコール、フッ素化材料、炭水化物、又はそれらの混合物を含む、請求項17から19のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
第1の血液サンプルが、血漿サンプル、乏血小板血漿サンプル、多血小板血漿サンプル、全血サンプル、凝固血サンプルである、又は第1の血液サンプルが、単離及び洗浄した血小板を含む、又はステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに、フィブリノーゲンを添加する、又はステップ(i)の前又は後に、第1の血液サンプルに、凝固開始剤又は凝固阻害剤を添加する、請求項16から20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
第1の血液サンプルに、RF、AA、ADP、CK、TRAP、エピネフリン、コラーゲン、組織因子、セライト、エラグ酸、及びトロンビンから選択される凝固開始剤を添加する、又は第1の血液サンプルに、血小板凝集阻害剤である凝固阻害剤を添加する、又はステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに、組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)を添加する、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
(iv)前記対象からの第2の血液サンプル中の水の一連の第2の緩和率測定を行うステップと、
(v)第2の血液サンプル内の2つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用して、第2の緩和率測定値を変換するステップであり、各別個の水集団が、1つ以上の磁気共鳴パラメータによって特徴づけられ、各磁気共鳴パラメータが、1つ以上の値を有するステップと、
(vi)ステップ(ii)及びステップ(v)の結果に基づいて、血餅が、前記プロセス中に形成又は溶解したかどうかを決定するステップと
をさらに含む、請求項16から22のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２４】
第1の血液サンプルが血漿サンプルであり、第2の血液サンプルが全血サンプルである；第1の血液サンプルが多血小板血漿サンプルであり、第2の血液サンプルが全血サンプルである；第1の血液サンプルが乏血小板血漿サンプルであり、第2の血液サンプルが全血サンプルである；又は第1の血液サンプルが単離及び洗浄した血小板を含み、第2の血液サンプルが全血サンプルである；又はステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに血小板阻害剤を添加し、血小板阻害剤を第2の血液サンプルに添加しない；又はステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに血小板活性化因子を添加し、血小板活性化因子を第2の血液サンプルに添加しない；又はステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに組織因子、セライト、エラグ酸、RF、AA、及びCKから選択される凝固開始剤を添加し、ステップ(iv)の前に、第2の血液サンプルにADP及びトロンビンから選択される凝固開始剤を添加する、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ(i)の前に、第1の血液サンプルにフィブリノーゲンを添加し、ステップ(iv)の前に、第2の血液サンプルにフィブリノーゲンを添加する；又は前記磁気共鳴パラメータ値が、前記血液サンプル中の血液血餅関連水分子に特有である；又は前記2つ以上の別個の水集団の少なくとも1つが、血餅の存在と正に相関する；又は前記アルゴリズムが、多指数関数アルゴリズム、双指数関数アルゴリズム、三指数関数アルゴリズム、減衰指数関数アルゴリズム、ラプラス変換、逆ラプラス変換、適合度アルゴリズム、SSEアルゴリズム、最小二乗アルゴリズム、及び非負最小二乗アルゴリズムからなる群から選択されるアルゴリズムを含む；又は前記緩和率が、T1、T2、T1/T2ハイブリッド、T1rho、T2rho、及びT2*からなる群から選択される、請求項23又は24に記載の方法。
【請求項２６】
前記2つ以上の水集団が、血清関連T2シグナルを有する水集団及び血餅関連T2シグナルを有する水集団を含む、又は前記2つ以上の水集団が、血餅関連T2シグナルを有する水集団をさらに含む、又は前記緩和率測定がT2測定を含み、かつ前記測定が減衰曲線を提供する、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記凝固又は溶解プロセスの開始後の所定の時点でのT2緩和スペクトルを、前記減衰曲線から計算するステップをさらに含む、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
血液サンプル中の凝固又は溶解プロセスの開始後、(a)前記プロセス中の前記血液サンプルに関する複数の緩和率測定を行い、複数の減衰曲線を作成するステップと、(b)複数のT2緩和スペクトルを、前記複数の減衰曲線から計算するステップとをさらに含む、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
前記血液サンプル中の凝固又は溶解プロセスの開始後の時間の関数としての前記血液サンプル中の2つ以上の水集団に関するa)T2緩和時間の変化と、(b) T2シグナル強度の変化とを示す3次元データセットを、前記複数のT2緩和スペクトルから計算するステップをさらに含む、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
(i)前記血液サンプルに関するADP濃度の関数としての血餅形成を測定するステップと、(ii)部分的な血餅形成を生じるADP濃度を決定するステップと、(iii)ステップ(ii)の結果に基づいて、対象が正常であるか、出血性状態を有するか、又は血栓形成促進性状態を有するかどうかを決定するステップとをさらに含む、請求項16から29のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３１】
(i)前記血液サンプルに関するAA濃度の関数としての血餅形成を測定するステップと、(ii)部分的な血餅形成を生じるAA濃度を決定するステップと、(iii)ステップ(ii)の結果に基づいて、対象が正常であるか、出血性状態を有するか、又は血栓形成促進性状態を有するかどうかを決定するステップとをさらに含む、請求項16から29のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３２】
血液サンプル中の凝固プロセスをモニタリングする方法であって、(a)凝固開始剤を、血液サンプルと接触している内部表面を有するサンプル管における前記血液サンプルに添加するステップと、(b)血餅が、前記プロセス中に形成したかどうかを決定するステップとを含み、サンプル管の内部表面が、フィブリン接着を制御する、方法。
【請求項３３】
ステップ(b)が、核磁気共鳴、光学的、トロンボエラストグラフィー、ターボデンシトメトリー、発色性、免疫性、比濁法、比濁分析、凝集、インピーダンス、機械的血餅検出、血小板凝集、電気化学的検出、凝固時間、フォトメカニカル、及び/又は電気機械的測定を含む、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
ステップ(b)が、T2磁気共鳴測定を含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
フィブリン接着を制御する内部表面を有するサンプル管。
【請求項３６】
内部表面が、フッ素化材料を含む、又は内部表面が、PEG化材料を含む、又は内部表面が、コーティングされていない基材と比較してフィブリン接着を減少させる材料でコーティングされた基材を含む、請求項35に記載のサンプル管。
【請求項３７】
前記基材が、ガラス又はベースポリマーである、請求項36に記載のサンプル管。
【請求項３８】
前記基材が、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、及びポリアロマーから選択されるベースポリマーである、又は前記基材が、シラン処理されていないガラスと比較してフィブリン接着を減少させる材料でのシラン処理によってコーティングされたガラスである、請求項37に記載のサンプル管。
【請求項３９】
前記材料が、界面活性剤、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリエチレングリコール、フッ素化材料、炭水化物、又はそれらの混合物を含む、請求項35から38のいずれか1項に記載のサンプル管。
【請求項４０】
前記サンプル管が、50μLから2mLの最大容量を保持する、請求項35から39のいずれか1項に記載のサンプル管。
【請求項４１】
(i)閉鎖部分と、(ii)縦軸及び該縦軸を概ね取り囲む壁を有する本体部分であって、そこを通してサンプルを分注することができる開口部を有する頭部分を備える本体部分とを含む、請求項35から39のいずれか1項に記載のサンプル管。
【請求項４２】
前記開口部が、約1cm未満の内径を有する、又は前記壁が、約0.05から約0.75mmの厚さを有する、又は前記サンプル管が、前記開口部の遠位にある閉鎖された端であって、前記開口部の前記内径の60％未満である幅までだんだんと細くなっている前記閉鎖された端を含む、請求項41に記載のサンプル管。
【請求項４３】
血液サンプルを、永久磁石及びRFパルスシーケンスを使用して生み出されたバイアス磁界に曝露することによって生成されるシグナルを検出するように構成されたRFコイルをさらに含む、請求項35から42のいずれか1項に記載のサンプル管。
【請求項４４】
RFコイルにおける又はRFコイルとの電気通信における可融性連結であって、可融性連結に過電流を印加した後に壊れ、RFコイルを動作不能にするように構成された可融性連結をさらに含む、請求項43に記載のサンプル管。
【請求項４５】
(a)血液サンプルを保持するためのウェルを規定し、使い捨てのサンプル管内に含有されウェルのあたりに配置されたRFコイルを有する使い捨てのサンプル管であり、前記RFコイルが、永久磁石及びRFパルスシーケンスを使用して生み出されたバイアス磁界に血液サンプルを曝露することによって生成されたシグナルを検出するように構成され、使い捨てのサンプルホルダーが1つ以上の可融性連結を含む、使い捨てのサンプル管と、
(b)(b1)磁界を規定する永久磁石と、(b2)RFパルスシーケンス及び検出コイルと、(b3)RFコイルと連通している1つ以上の電気素子であり、シグナルを増幅する、整流する、伝達する、及び/又はデジタル化するように構成された電気素子と、(b4)可融性連結と連通しており、過電流を可融性連結に印加するように構成され、所定の耐用年数後に連結を壊し、コイルを動作不能にする1つ以上の電気素子とを含むMRリーダーと
を備えたシステムであって、使い捨てのサンプル管が、請求項59から74のいずれか1項に記載のサンプル管である、システム。
【請求項４６】
RFコイルと連通している電気素子が、RFコイルに誘導結合している、請求項45に記載のシステム。
【請求項４７】
対象からの血液サンプルを評価する方法であって、
(i)血液サンプルの1つ以上のアリコート中の水の一連の磁気共鳴緩和率測定を行うステップであり、1つ以上のアリコートの少なくとも1つが、凝固開始剤と組み合わされているステップと、
(ii)血液サンプルの1つ以上のアリコート内の2つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用して、前記測定値を変換するステップと、
(iii)以下の測定:(a)血液サンプルに関するヘマトクリットの測定と、(b)血液サンプルに関するフィブリノーゲンレベルの測定と、(c)血液サンプルに関する凝固時間の測定と、(d)血液サンプルの血小板活性の測定であり、血液サンプル中の強固に結合している血餅の形成のモニタリングを含む測定、を行うステップと
を含む、方法。
【請求項４８】
前記アルゴリズムが、多指数関数アルゴリズム、双指数関数アルゴリズム、三指数関数アルゴリズム、減衰指数関数アルゴリズム、ラプラス変換、逆ラプラス変換、適合度アルゴリズム、SSEアルゴリズム、最小二乗アルゴリズム、及び非負最小二乗アルゴリズムからなる群から選択されるアルゴリズムを含む、請求項47に記載の方法。
【請求項４９】
血液サンプルの1つ以上のアリコート内の2つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムが、多指数関数又は逆ラプラス変換分析を含む、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
複数の測定値が、血液サンプルの複数のアリコートから同時に収集される、又は複数の測定値が、血液サンプルの複数のアリコートから連続して収集される、又は複数の測定値が、血液サンプルへの凝固開始剤の添加前及び後に作られた血液サンプルの単一のアリコートから収集される、請求項47に記載の方法。
【請求項５１】
ステップ(iii)の結果に基づいて、対象における凝固障害を診断するステップをさらに含む、請求項47から50のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５２】
前記凝固障害が、希釈性凝固障害、ショックの致死的三徴、アシドーシス及び低体温症、並びに外傷ショックの急性凝固障害(ACoTS)から選択される、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
ステップ(iii)の結果に基づいて、対象が、凝固亢進、凝固低下、又は正常であるかどうかを決定するステップをさらに含む、請求項47から50のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５４】
ステップ(iii)の結果に基づいて、対象が、血栓性合併症のリスクがあるか、又は対象が、抗血小板療法に抵抗性があるかどうかを決定するステップをさらに含む、請求項47から50のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５５】
ステップ(iii)の結果に基づいて、対象における抗血小板療法をモニタリングする及び/又は凝血促進療法をモニタリングするステップをさらに含む、請求項47から50のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2012年12月7日出願の米国仮特許出願第61/734,579号;2013年6月20日出願の米国仮特許出願第61/837,290号;2013年8月9日出願の米国仮特許出願第61/864,322号;2013年8月28日出願の米国仮特許出願第61/870,952号の利益を主張するものであり、その全てが参照により本明細書に組み込まれる、
【０００２】
本発明は、水性サンプル中のレオロジー変化をモニタリングする方法を特徴とする。
【背景技術】
【０００３】
血液は、酸素及び栄養物質を組織に運び、二酸化炭素及び種々の排出用代謝産物を除去する、生物の循環組織である。全血は、赤血球、白血球及び血小板が懸濁している淡黄色又は灰黄色流体、血漿からなる。
【０００４】
止血、すなわち、タイムリー且つ有効な様式で患者の血液が凝固及び溶解する能力を正確に測定することは、特定の外科的及び医学的手順にとって極めて重要である。異常止血を加速して(迅速に)正確に検出することはまた、止血障害を患っており、止血障害に寄与していると思われる患者の血液の異常成分、細胞又は「因子」を考慮した後に明確に決定しなければならない量の抗凝固薬、抗線溶薬、血栓溶解薬、抗血小板薬、又は血液成分を投与することが必要と思われる患者に与えるべき適当な処置に関して特に重要である。
【０００５】
止血は、凝固及び線溶タンパク質、活性化因子、阻害因子及び細胞要素、例えば、血小板細胞骨格、血小板細胞質顆粒及び血小板細胞表面を含む、多くの相互作用因子が関与する動的で、極めて複雑なプロセスである。結果として、活性化中、静的なままである又は孤立して働く因子はない。したがって、完全にするためには、非孤立又は静的様式の全血成分の純生産量として患者の止血の全相を連続的に測定することが必要である。止血の孤立部分の測定の結果の例を示すために、患者が、プラスミノーゲンの、血餅を破壊する酵素であるプラスミンへの活性化により引き起こされる線溶を発症したと仮定する。このシナリオでは、このプロセスの副産物のフィブリノーゲン分解産物が抗凝固薬としてふるまう。患者を抗凝固についてのみ試験し、それに従って処置すると、この患者は抗線溶薬により処置されていないことによりリスクがあるままとなり得る。
【０００６】
止血プロセスの最終結果は、血小板糖タンパク質IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)受容体結合と共に最終的な血餅を形成する、重合したフィブリノーゲン線維(すなわち、フィブリン)の三次元ネットワークである。このネットワーク構造の独特の特性は、それが循環血液の変形せん断応力に抵抗することができる、剛性の弾力性固体としてふるまうことである。最終的な血餅が変形せん断応力に抵抗する強さは、一部は、関与する血小板により加えられる力によって決定される。
【０００７】
血小板は、少なくとも二つの方法でフィブリンの機械的強度に影響を及ぼすことが示されている。第1に、これらは、結節分岐点として作用することにより、フィブリン構造剛性を有意に増強する。第2に、血小板アクトミオシン、細胞骨格媒介収縮装置の一部である筋タンパク質の収縮により、線維に「牽引」力を加えることによる。この収縮力は、フィブリン構造の強度をさらに増強する。血小板受容体GPIIb/IIIaは、重合線維を活性化血小板中の下にある細胞骨格収縮装置に固着し、それによって機械的力の伝達を媒介するのに極めて重要であると思われる。
【０００８】
したがって、止血活性化の結果として発達し、損傷した血管系に接着し、循環血液の変形せん断応力に抵抗する血餅は、本質的に、血管回復中に循環血液のせん断力に抵抗する「一時的ストッパー」を提供するために形成される、機械的装置である。循環血液の変形せん断力に抵抗する物理的特性である、血餅の動力学、強度及び安定性は、不適当な血栓症を許すことなく、出血を停止することである止血作業を行う能力を決定する。
【０００９】
血小板は、血栓形成促進性(血栓形成傾向)患者の虚血性合併症の媒介において重要な役割を果たす。血栓形成傾向患者に又は経皮的冠動脈形成術(PYCA)の補助としてGPIIb/IIIa阻害因子を使用することが、急速に標準治療になっている。GPIIb/IIIa受容体の阻害は、抗血小板療法の極めて強力な形であり、死亡リスク及び心筋梗塞の低下をもたらすことができるが、出血の劇的リスクももたらし得る。出血又は十分な治療レベルの血小板阻害を達成できない可能性の理由は、相当な個人間の変動性があるという事実にもかかわらず使用される体重により調整される血小板ブロッカー処置アルゴリズムである。これは、一部は血小板数の差並びに血小板当たりのGPIIb/IIIa受容体数及びそのリガンド結合機能の変動性による問題である。臨床的に有用となるためには、血小板阻害アッセイがベッドサイドにおいて受容体遮断に関する迅速且つ信頼できる情報を提供し、それによって所望の抗血小板効果を達成するための用量修正が可能にならなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
連続的に及び初期血餅形成から溶解までの全止血プロセスにわたって、治療的血小板遮断をモニタリングするため及び抗血小板薬の効果を測定するための、迅速で、信頼できる、定量的なポイントオブケア検査のための方法及び装置が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、第1の血液サンプル中の凝固又は溶解プロセスをモニタリングする方法であって、(i)前記血液サンプル中の水の一連の磁気共鳴緩和率測定を行うステップと、(ii)第1の血液サンプル内の2つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用して、前記測定値を変換するステップであり、各別個の水集団が、1つ以上の値を有する1つ以上の磁気共鳴パラメータによって特徴づけられるステップと、(iii)以下の測定を行うステップ：強固に結合している血餅が、前記プロセス中に形成又は溶解したかどうかを決定するステップとを含む方法に関する。強固に結合した血餅は、サンプル中の緩く結合した血餅の存在に付随して生じうる。血液サンプルは、多血小板血漿サンプル、全血サンプル、凝固血サンプル、血液由来検体、又は本明細書中に記載する他の種類の血液サンプルとすることができる。本方法の特定の実施形態では、ステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに、フィブリノーゲン（例えば、1±0.25、2±0.5、3±0.75、4±1、6±2、又は8±2 mg/mL）を添加する。本方法の特定の実施形態では、ステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに、凝固開始剤又は凝固阻害剤を添加する。凝固開始剤/阻害剤は、RF（レプチラーゼ及び第XIII因子）、AA（アラキドン酸）、ADP（アデノシン二リン酸）、CK（カオリンクレイ）、TRAP（トロンビン受容体活性化ペプチド）、トロンビン、血小板凝集阻害剤、組織因子、エラグ酸、セライト、カオリン破片、又は本明細書中に記載する任意の凝固開始剤若しくは凝固阻害剤から選択することができる。本方法のまた別の実施形態では、ステップ(i)の前又は後に、第1の血液サンプルに、組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)、又は線溶を阻害するためのアプロチニン、又は血餅収縮の阻害剤、例えばアブシキシマブ(レオプロ)若しくはサイトカラシン-Dを添加する。本方法はさらに、(iv)前記対象からの第2の血液サンプル中の水の一連の第2の緩和率測定を行うステップと、(v)第2の血液サンプル内の2つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用して、第2の緩和率測定値を変換するステップであり、各別個の水集団が、1つ以上の磁気共鳴パラメータによって特徴づけられ、各磁気共鳴パラメータが、1つ以上の値を有するステップと、 (vi)ステップ(ii)及びステップ(v)の結果に基づいて、強固に結合している血餅が、前記プロセス中に形成又は溶解したかどうかを決定するステップとをさらに含んでもよい。例えば、第1の血液サンプルが血漿サンプルであり、第2の血液サンプルが全血サンプルである；第1の血液サンプルが多血小板血漿サンプルであり、第2の血液サンプルが全血サンプルである；第1の血液サンプルが乏血小板血漿サンプルであり、第2の血液サンプルが全血サンプルである；第1の血液サンプルが単離及び洗浄した血小板を含み、第2の血液サンプルが全血サンプルである、あるいは本明細書に記載した他の任意の組の比較サンプルであってよく、例えば、同一サンプルであるが異なる化合物、開始剤若しくは添加剤が2つの同一サンプルに添加されたもの、又は同じサンプルかつ同じ化合物であり、両方の比較を確認測定若しくは再現性の測定として実施するものが含まれる。特定の実施形態において、ステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに血小板阻害剤を添加し、血小板阻害剤を第2の���液サンプルに添加しない；ステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに血小板活性化因子を添加し、血小板活性化因子を第2の血液サンプルに添加しない；又はステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに、RF、AA、ADP、CK、TRAP、エピネフリン、コラーゲン、組織因子、セライト、エラグ酸及びトロンビンから選択される凝固開始剤を添加し；ステップ(iv)の前に、第2の血液サンプルにADP及びトロンビンから選択される凝固開始剤を添加する。本方法の特定の実施形態において、ステップ(i)の前に、第1の血液サンプルにフィブリノーゲン（例えば、1±0.25、2±0.5、3±0.75、4±1、6±2、又は8±2 mg/mL）を添加し、ステップ(iv)の前に第2の血液サンプルにフィブリノーゲン（例えば、1±0.25、2±0.5、3±0.75、4±1、6±2、又は8±2 mg/mL）を添加する。特定の実施形態において、前記磁気共鳴パラメータ値は、前記血液サンプル中の強固な血餅関連水分子に特有である、又は前記2つ以上の別個の水集団の少なくとも1つが、強固に結合している血餅の存在と正に相関する。前記アルゴリズムは、多指数関数アルゴリズム、双指数関数アルゴリズム、三指数関数アルゴリズム、減衰指数関数アルゴリズム、ラプラス変換、逆ラプラス変換、適合度アルゴリズム、SSEアルゴリズム、最小二乗アルゴリズム、非負最小二乗アルゴリズム、又は本明細書に記載する任意のアルゴリズムからなる群から選択されるアルゴリズムを含むことができる。特定の実施形態において、前記アルゴリズムは逆ラプラス変換である。緩和率は、T1、T2、T1/T2ハイブリッド、T1rho、T2rho、及びT2*からなる群から選択することができる。特定の一実施形態において、緩和率測定はT2測定を含み、この測定は減衰曲線を提供する。別の特定の実施形態において、前記2つ以上の水集団は、血清関連T2シグナルを有する水集団及び強固に結合している血餅関連T2シグナルを有する水集団を含む。強固に結合している血餅関連T2シグナルを有する水集団は、40から250msの範囲（例えば50〜200ms又は75〜175ms）のT2緩和率によって特徴づけられる。
【００１２】
特定の実施形態において、2つ以上の水集団は、緩く結合した血餅関連T2シグナルを有する水集団をさらに含む。特定の実施形態において、緩和率測定はT2測定を含み、この測定は減衰曲線を提供する。本方法は、前記凝固又は溶解プロセスの開始後の所定の時点でのT2緩和スペクトルを、前記減衰曲線から計算するステップをさらに含んでもよい。例えば、本方法は、血液サンプル中の凝固又は溶解プロセスの開始後、(a)前記プロセス中の前記血液サンプルに関する複数の緩和率測定を行って、複数の減衰曲線を作成するステップと、(b)複数のT2緩和スペクトルを前記複数の減衰曲線から計算するステップとをさらに含んでもよい。場合により、本方法は、前記血液サンプル中の凝固又は溶解プロセスの開始後の時間の関数としての前記血液サンプル中の2つ以上の水集団に関する(a)T2緩和時間の変化と、(b) T2シグナル強度の変化とを示す3次元データセットを、前記複数のT2緩和スペクトルから計算するステップをさらに含んでもよい。
【００１３】
本発明はさらに、(i)サンプル中の水のNMR緩和率特有のシグナルを測定してNMR緩和データを得るステップと;(ii)NMR緩和データからサンプル中のレオロジー変化特有の磁気共鳴パラメータ値又は値のセットを決定するステップと;(iii)ステップ(ii)の結果を所定の閾値と比較するステップと、により水性サンプル中のレオロジー変化をモニタリングする方法を特徴とする。
【００１４】
関連する態様では、本発明は、(i)サンプル中の水の一連の磁気共鳴緩和率測定を行うステップと;(ii)サンプル中の二つ以上の観察可能な水集団を識別するアルゴリズムを使用して測定値を変換するステップであって、各観察可能な水集団はレオロジー変化中の一つ以上の時点で別個の緩和率及び別個のシグナル強度を有するステップと;(iii)二つ以上の観察可能な水集団の少なくとも一つについての緩和率又はシグナル強度に基づいて、サンプル中のレオロジー変化をモニタリングするステップとを含む、水性サンプル中のレオロジー変化をモニタリングする方法を特徴とする。
【００１５】
本発明はさらに、(i)サンプル中の二つ以上の観察可能な水集団を識別するサンプル中の水の一連の測定を行うステップであって、各観察可能な水集団はレオロジー変化中の一つ以上の時点で別個のシグナル及び/又は別個のシグナル強度を有するステップと;(ii)二つ以上の観察可能な水集団の少なくとも一つについて観察されたシグナル及び/又はシグナル強度に基づいて、サンプル中のレオロジー変化をモニタリングするステップとを含む、水性サンプル中のレオロジー変化をモニタリングする方法を特徴とする。測定は、核磁気共鳴測定、電子常磁性共鳴、マイクロ波分光測定、又は水の特性を測定するための当技術分野で既知の任意の他の技術であり得る。特定の実施形態では、水性サンプル中の水は放射標識されている(例えば、重水素又はトリチウムで標識されている)。
【００１６】
一態様では、本発明は、(i)第1の血液サンプル中の水の一連の磁気共鳴緩和率測定を行うステップと;(ii)第1の血液サンプル中の二つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用して測定値を変換するステップであって、各別個の水集団は一つ以上の値を有する一つ以上の磁気共鳴パラメータにより特徴づけられるステップと;(iii)ステップ(ii)の結果に基づいて、第1の血液サンプル中の凝固又は溶解プロセスをモニタリングするステップとを含む、第1の血液サンプル中の凝固又は溶解プロセスをモニタリングする方法を特徴とする。血液サンプルは血漿サンプル、乏血小板血漿サンプル、多血小板血漿サンプル、単離及び洗浄した血小板を含む血液サンプル、全血サンプル、凝固血サンプル、又は本明細書に記載する任意の他の種類の血液サンプルであり得る。本方法のある実施形態では、ステップ(i)の前に、フィブリノーゲン(例えば、1±0.25、2±0.5、3±0.75、4±1、6±2又は8±2mg/mL)を第1の血液サンプルに添加する。本方法の特定の実施形態では、ステップ(i)の前に、凝固開始剤又は凝固阻害剤を第1の血液サンプルに添加する。凝固開始剤/阻害剤は、RF(レプチラーゼ及び第XIII因子)、AA(アラキドン酸)、ADP(アデノシン二リン酸)、CK(カオリンクレイ)、TRAP(トロンビン受容体活性化ペプチド)、トロンビン、血小板凝集阻害因子、組織因子、トロンビン、エラグ酸、セライト、カオリン破片（fragment）、又は本明細書に記載する任意の凝固開始剤若しくは凝固阻害剤から選択することができる。本方法のなお他の実施形態では、ステップ(i)の前に、組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)を第1の血液サンプルに添加する。本方法は、(iv)対象の第2の血液サンプル中の水の一連の第2の緩和率測定を行うステップと;(v)第2の血液サンプル中の二つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用して第2の緩和率測定値を変換するステップであって、各別個の水集団は各々が一つ以上の値を有する一つ以上の磁気共鳴パラメータにより特徴づけられるステップと;(vi)ステップ(ii)及びステップ(v)の結果に基づいて、プロセスをモニタリングするステップとをさらに含むことができる。例えば、第1の血液サンプルは血漿サンプルであってもよく、第2の血液サンプルは全血サンプルであってもよく;第1の血液サンプルは多血小板血漿サンプルであってもよく、第2の血液サンプルは全血サンプルであってもよく;第1の血液サンプルは乏血小板血漿サンプルであってもよく、第2の血液サンプルは全血サンプルであってもよく;第1の血液サンプルは単離及び洗浄した血小板を含んでもよく、第2の血液サンプルは全血サンプル又は本明細書に記載する比較サンプルの任意の他のセットであってもよい。特定の実施形態では、ステップ(i)の前に、血小板阻害因子を第1の血液サンプルに添加し、血小板阻害因子を第2の血液サンプルに添加せず;ステップ(i)の前に、血小板活性化因子を第1の血液サンプルに添加し、血小板活性化因子を第2の血液サンプルに添加せず;又はステップ(i)の前に、RF、AA、ADP、CK、TRAP、エピネフリン、コラーゲン、組織因子、セライト、エラグ酸及びトロンビンから選択される凝固開始剤を第1の血液サンプルに添加し;ステップ(iv)の前に、ADP及びトロンビンから選択される凝固開始剤を第2の血液サンプルに添加する。本方法のある実施形態で��、ステップ(i)の前に、フィブリノーゲン(例えば、1±0.25、2±0.5、3±0.75、4±1、6±2又は8±2mg/mL)を第1の血液サンプルに添加し;ステップ(iv)の前に、フィブリノーゲン(例えば、1±0.25、2±0.5、3±0.75、4±1、6±2又は8±2mg/mL)を第2の血液サンプルに添加する。
【００１７】
上記方法では、磁気共鳴パラメータ値は、血液サンプル中の機能性フィブリノーゲン関連水分子特有であり得る。特定の実施形態では、二つ以上の別個の水集団の少なくとも一つは、血小板活性化、血小板阻害、凝固時間、血小板関連血餅強度、ヘマトクリット又はフィブリノーゲン関連血餅強度と正に相関する。なお他の実施形態では、磁気共鳴パラメータ値は、低血小板活性、高血小板活性、高機能性フィブリノーゲン活性又は低機能性フィブリノーゲン活性を示す。
【００１８】
上記方法のいずれかでは、アルゴリズムは、多指数関数アルゴリズム、双指数関数アルゴリズム、三指数関数アルゴリズム、減衰指数関数アルゴリズム、ラプラス変換、逆ラプラス変換、適合度アルゴリズム、SSEアルゴリズム、最小二乗アルゴリズム、非負最小二乗アルゴリズム、又は本明細書に記載する任意のアルゴリズムからなる群から選択されるアルゴリズムを含むことができる。特定の実施形態では、アルゴリズムは逆ラプラス変換である。
【００１９】
上記方法のいずれかでは、緩和率は、T1、T2、T1/T2ハイブリッド、T1rho、T2rho及びT2*からなる群から選択することができる。一つの特定の実施形態では、緩和率測定はT2測定を含み、測定は減衰曲線を提供する。
【００２０】
別の特定の実施形態では、二つ以上の水集団は、血清関連T2シグナルを有する水集団及び血餅関連T2シグナルを有する水集団を含む。本方法は、(i)赤血球を含む血液サンプル中の血餅形成を開始する前に水についてのT2値を計算し、T2値に基づいて、血液サンプルのヘマトクリットを決定するステップを含むことができる。本方法はまた、(a)凝固プロセスを生じている血液サンプルについての血清関連T2シグナルと血餅関連T2シグナルの差を計算するステップと;(b)差に基づいて、血液サンプル中に形成された血餅の強度を決定するステップとを含むことができる。方法は、(a)血小板を含み、凝固プロセスを生じている血液サンプルについての血清関連T2シグナルと血餅関連T2シグナルの差を計算するステップと;(b)差に基づいて、血液サンプル中の血小板の活性を決定するステップとを含んでもよい。一実施形態では、方法は、(a)血液サンプル中の凝固プロセスの開始後に、血餅関連T2シグナルの初期検出前の期間を測定するステップと;(b)期間に基づいて、血液サンプルについての凝固時間を決定するステップとをさらに含む。他の実施形態では、方法は、(a)血液サンプル中の凝固プロセスの開始後に、血清関連T2シグナルについてのT2時間曲線を計算するステップと;(b)T2曲線の二次導関数の最大値を計算するステップと;(c)ステップ(b)の結果に基づいて、凝固時間特有の値を計算するステップとをさらに含む。なお他の実施形態では、方法は、血液サンプル中の凝固プロセスの開始後に、血清関連T2シグナル及び血餅関連T2シグナルに基づいて、血液サンプルが凝固亢進、凝固低下又は正常かどうかを決定するステップを含む。
【００２１】
上記方法のいずれかの一実施形態では、方法は、凝固又は溶解プロセスの開始後の所定の時点でT2緩和スペクトルを減衰曲線から計算するステップをさらに含む。方法は、血液サンプル中の凝固又は溶解プロセスの開始後に、(a)プロセス中に血液サンプルに複数の緩和率測定を行い複数の減衰曲線を作成するステップと、(b)複数の減衰曲線から複数のT2緩和スペクトルを計算するステップとをさらに含むことができる。任意選択により、方法は、複数のT2緩和スペクトルから、血液サンプル中の凝固又は溶解プロセスの開始後の時間の関数として、血液サンプル中の二つ以上の水集団についての(a)T2緩和時間の変化及び(b)T2シグナル強度の変化を示す三次元データセットを計算するステップをさらに含んでもよい。
【００２２】
特定の実施形態では、方法は、(i)三次元データセットを安定データ及び移行データに分割するステップと、(ii)安定データ及び移行データに基づいて、血液サンプルが凝固亢進、凝固低下若しくは正常かどうかを決定する、又は血液サンプルが低血小板活性、高血小板活性、高機能性フィブリノーゲン活性若しくは低機能性フィブリノーゲン活性を示すかどうかを決定するステップとをさらに含む。ある実施形態では、方法は、(i)三次元データセットから、プロセス中の所定の期間にわたって血液サンプル中の二つ以上の水集団の各々について観察されたシグナルの相対ボリュームを計算するステップと、(ii)シグナルの相対ボリュームに基づいて、血液サンプルが凝固亢進、凝固低下若しくは正常かどうかを決定する、又は血液サンプルが低血小板活性、高血小板活性、高機能性フィブリノーゲン活性若しくは低機能性フィブリノーゲン活性を示すかどうかを決定するステップとをさらに含む。
【００２３】
上記方法のいずれかの別の特定の実施形態では、アルゴリズムは、1〜50ms(例えば、1〜10、1〜20、1〜30、5〜50、5〜30又は10〜50ms)のT2時定数についての下限及び1000〜4000ms(例えば、1000〜2000、2500〜4000、1000〜3000、1500〜4000、2000〜4000又は2000〜4000ms)のT2時定数についての上限を含む逆ラプラス変換である。例えば、血液サンプルは血漿、乏血小板血漿又は多血小板血漿であってもよく、T2時定数についての上限は2500〜4000ms(例えば、2500〜3500、2500〜3000、3000〜4000又は3500〜4000ms)である。他の実施形態では、血液サンプルは全血サンプル、赤血球を含むサンプル、又は磁性粒子を含むサンプルであり、T2時定数についての上限は1000〜2000ms(例えば、1500〜2000、1000〜1500又は1000〜1200ms)である。上記方法のいずれかのなお別の特定の実施形態では、アルゴリズムは、約1.0e-10〜約4.0e0の範囲の正則化パラメータ(α)を含む逆ラプラス変換である。
【００２４】
本発明はさらに、(i)対象から採取した血液を用意して血液サンプルを製造するステップと;(ii)血液サンプル中の水の一連の磁気共鳴緩和率測定を行うステップと;(iii)本発明の方法により、血液サンプル中の二つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用して測定値を変換して一つ以上の磁気共鳴パラメータ値を得るステップと;(iv)ステップ(iii)の結果に基づいて、対象が正常であるかどうか、出血状態にあるかどうか又は血栓形成促進状態にあるかどうかを決定するステップとを含む、対象の止血状態を評価する方法を特徴とする。
【００２５】
関連する態様では、本発明は、(i)単離及び洗浄した血小板を用意するステップと;(ii)単離及び洗浄した血小板を所定の最小レベルのフィブリノーゲンを含む乏血小板血漿と組み合わせて試験サンプルを形成するステップと;(iii)凝固開始剤を試験サンプルに添加することにより凝固プロセスを開始するステップと;(iv)試験サンプル中の水の一連の磁気共鳴緩和率測定を行うステップと;(v)試験サンプル中の二つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用して測定値を変換するステップであって、各別個の水集団は一つ以上の値を有する一つ以上の磁気共鳴パラメータにより特徴づけられるステップと;(vi)ステップ(v)の結果に基づいて、血小板活性を評価するステップとを含む、血小板活性を評価する方法を特徴とする。特定の実施形態では、凝固開始剤は、RF及びAA、ADP、RAP、エピネフリン、コラーゲン又はリストセチン（RISTOCETIN）の組み合わせである。なお他の実施形態では、方法は、(a)血小板活性化因子の存在下及び血小板活性化因子の非存在下で試験サンプルを測定するステップをさらに含む。
【００２６】
本発明はさらに、(i)全血サンプルを用意するステップと;(ii)単離及び洗浄した血小板を所定の最小レベルのフィブリノーゲンを含む乏血小板血漿と組み合わせて試験サンプルを形成するステップと;(iii)凝固開始剤を試験サンプルに添加することにより凝固プロセスを開始するステップと;(iv)試験サンプル中の水の一連の磁気共鳴緩和率測定を行うステップと;(v)試験サンプル中の二つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用して測定値を変換するステップであって、各別個の水集団は一つ以上の値を有する一つ以上の磁気共鳴パラメータにより特徴づけられるステップと;(vi)ステップ(v)の結果に基づいて、血小板活性を評価するステップとを含む、全血サンプル中の血小板活性を評価する方法を特徴とする。特定の実施形態では、凝固開始剤は、RF及び血小板活性化因子（例えば、AA、ADP、TRAP、エピネフリン、コラーゲン）の組み合わせである。特定の実施形態において、凝固開始剤はRF及びAAの組み合わせである。なお他の実施形態では、方法は、(a)血小板活性化因子の存在下及び血小板活性化因子の非存在下で試験サンプルを測定するステップをさらに含む。
【００２７】
別の態様では、本発明は、凝固又は溶解を生じているサンプル中の水のNMR緩和率特有のシグナルを測定してNMR緩和率データを得るステップと、NMR緩和率データから、サンプル中の凝固又は溶解プロセス特有の磁気共鳴パラメータ値又は値のセットを決定するステップとにより凝固プロセス又は溶解プロセスをモニタリングする方法を特徴とする。
【００２８】
関連する態様では、本発明は、一つ以上の水の集団を有する血液サンプル中の水のNMR緩和特有のシグナルを測定してNMR緩和データを得るステップと、NMR緩和データから、血液サンプル中の水の少なくとも一つの集団と相関する磁気共鳴パラメータ値又は値のセットを決定するステップとにより凝固プロセス又は溶解プロセスをモニタリングする方法であって、磁気共鳴パラメータ値又は値のセットは凝固又は溶解プロセス特有である方法を特徴とする。血液サンプルは少なくとも二つの水の集団又は少なくとも三つの水の集団を含むことができる。特定の実施形態では、磁気共鳴パラメータ値は、血液サンプル中の血小板関連水分子特有である。なお他の実施形態では、磁気共鳴パラメータ値は、血液サンプル中の機能性フィブリノーゲン関連水分子特有である。特許請求の範囲に記載する方法の特定の実施形態では、方法は、血小板関連機能性フィブリノーゲンの相対濃度を測定するステップを含む。
【００２９】
ある実施形態では、方法は、対象から採取した単一血液サンプルの凝固挙動に基づいて対象の止血状態を評価するステップを含む(例えば、外科手術を受けている患者の凝固管理のため、血栓性合併症のリスクがある患者を同定するため、抗血小板療法に抵抗性の患者を同定するため、患者における抗凝固療法をモニタリングするため、患者における抗血小板療法をモニタリングするため、及び/又は患者における凝血促進療法をモニタリングするため)。
【００３０】
本発明のなお他の実施形態では、方法は、サンプルから初期NMR緩和率シグナルを収集してから3分、5分、6分、10分、15分、20分、30分、45分又は60分以内に対象の止血状態を評価するステップを含む。
【００３１】
関連する態様では、本発明は、(i)血液サンプル中の水の一連の緩和率測定を行うステップと;(ii)血液サンプル中の二つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用して測定値を変換するステップであって、各別個の水集団は一つ以上の値を有する一つ以上の磁気共鳴パラメータにより特徴づけられるステップと;(iii)ステップ(ii)の結果に基づいて、血液サンプル中の血液凝固プロセスをモニタリングするステップとにより血液凝固プロセス又は溶解プロセスをモニタリングする方法を特徴とする。
【００３２】
本発明は、(i)血液サンプル中の水の一連の緩和率測定を行うステップと;(ii)血液サンプル中の二つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用して測定値を変換するステップであって、各別個の水集団は一つ以上の値を有する一つ以上の磁気共鳴パラメータにより特徴づけられるステップと;(iii)ステップ(ii)の結果に基づいて、血液サンプル中の血小板活性をモニタリングするステップとを含む、血小板活性をモニタリングする方法を特徴とする。
【００３３】
本発明はさらに、(i)血液サンプル中の水の一連の緩和率測定を行うステップと;(ii)血液サンプル中の二つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用して測定値を変換するステップであって、各別個の水集団は一つ以上の値を有する一つ以上の磁気共鳴パラメータにより特徴づけられるステップと;(iii)ステップ(ii)の結果に基づいて、血液サンプル中の血小板阻害をモニタリングするステップとを含む、血小板阻害をモニタリングする方法を特徴とする。特定の実施形態では、方法は、(iv)血小板阻害因子の存在下で第2の血液サンプル中の水の一連の緩和率測定を行うステップと;(v)第2の血液サンプル中の二つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用して測定値を変換するステップであって、各別個の水集団は一つ以上の値を有する一つ以上の磁気共鳴パラメータにより特徴づけられるステップと;(vi)ステップ(ii)及び(v)の結果に基づいて、血液サンプル中の血小板阻害をモニタリングするステップとをさらに含む。
【００３４】
本発明はまた、(i)対象の血液サンプル中の水の一連の緩和率測定を行うステップと;(ii)  血液サンプル中の二つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用して測定値を変換するステップであって、各別個の水集団は一つ以上の値を有する一つ以上の磁気共鳴パラメータにより特徴づけられるステップと;(iii)ステップ(ii)の結果に基づいて、対象の止血状態を評価するステップとにより対象の止血状態を評価する方法を特徴とする。
【００３５】
アルゴリズムは、それだけに限らないが、多指数関数アルゴリズム、双指数関数アルゴリズム、三指数関数アルゴリズム、減衰指数関数アルゴリズム、ラプラス変換、逆ラプラス変換、適合度アルゴリズム、SSEアルゴリズム、最小二乗アルゴリズム、非負最小二乗アルゴリズム、及び本明細書に記載する任意の他のアルゴリズムから選択することができる。特定の実施形態では、アルゴリズムは逆ラプラス変換である、又はアルゴリズムは式(1)(すなわち、双指数関数あてはめについて)若しくは(2)(すなわち、三指数関数あてはめについて)により与えられる。
【数１】
2016500443.tif 000002
【００３６】
式(1)及び(2)中、Iは測定値T2の強度であり;tは時間であり;AmpAは指数項exp(-t/T2A)が測定されたT2強度に寄与する程度を示す抽出係数であり;AmpBは指数項exp(-t/T2B)が測定されたT2強度に寄与する程度を示す抽出係数であり;AmpCは指数項exp(-t/T2C)が測定されたT2強度に寄与する程度を示す抽出係数であり;T2Aは水集団Aの測定されたT2強度への寄与を示す抽出緩和時間であり;T2Bは水集団Bの測定されたT2強度への寄与を示す抽出緩和時間であり;T2Cは水集団Cの測定されたT2強度への寄与を示す抽出緩和時間であり;Oはオフセット定数である。上記方法のいずれかでは、緩和率測定はT2測定を含むことができる。磁気共鳴パラメータ値はT2パラメータ値及び/又は振幅パラメータ値を含むことができる。
【００３７】
レオロジー移行を生じているサンプルについては、水の集団が、サンプルの成分及び/又は複雑性に依存して変化し得る。不均一サンプル、例えば、全血では、異なる水の集団、例えば、血漿水、区画水、すなわち、細胞(赤血球、白血球及び血小板)水、及び凝固(例えば、血清)又は血餅融解などの全血プロセスの機能的特徴に関連する水が存在する。本発明の方法により、サンプル中の位置、区画又は生じている変化にかかわらず、サンプル中の種々の水集団の変化をモニタリングすることが可能になる。この方法を使用して、所与のサンプルについてのレオロジー変化を調査する又は一つ以上の分析値(PPT、PT-INR、ヘマトクリット、血小板活性)を計算することができる。
【００３８】
上記方法のいずれかでは、サンプル中の水は第1の水集団及び第2の水集団を含むことができ、所与の水集団に関連するNMRパラメータはレオロジー変化と相関し得る。例えば、第2の水集団のNMRパラメータ値は血小板活性化と正に相関し得る。同様に、第1の水集団についてのT2パラメータ値は凝固時間と相関し得る。
【００３９】
上記方法のいずれかにおいて、サンプル中の水は、サンプル中の赤血球の沈降から生じる水集団を含むことができる。上記方法のいずれかの特定の実施形態において、サンプルは、サンプル成分の沈降を低減するために緩和測定を行う前に、攪拌（すなわち、振盪、回転、音波処理又は混合）する。
【００４０】
上記方法のいずれかでは、磁気共鳴パラメータ値は、250〜500ミリ秒の間の第1の水集団についてのT2値を含むことができる。
【００４１】
上記方法のいずれかでは、磁気共鳴パラメータ値は、200〜400ミリ秒の間の第2の水集団についてのT2値を含むことができる。
【００４２】
上記方法のいずれかでは、サンプルは、1〜200ミリ秒の間のT2値を有する第3の水集団をさらに含むことができる。
【００４３】
上記方法のいずれかでは、シグナルは、水中のプロトンをモニタリングすること又は水中の水素原子をモニタリングすることから生じる。あるいは、上記方法のいずれかでは、シグナルは、水中のプロトンをモニタリングすること又は水中の酸素原子をモニタリングすることから生じる。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態では、血液サンプルは、第4の水集団及び第5の水集団を含有し、第4の水集団は退縮した血餅に関連し、第5の水集団は退縮した血餅を囲む血清に関連する。第4及び/又は第5の水集団の存在は、本明細書に定義する第1、第2又は第3の水集団の存在を暗示も要求もしない。
【００４５】
上記方法のいずれかでは、方法は、磁気共鳴パラメータ値又は値のセットに基づいて、サンプルが凝固亢進、凝固低下又は正常かどうかを評価するステップをさらに含むことができる。
【００４６】
上記方法のいずれかでは、磁気共鳴パラメータは、対象の止血状態(例えば、出血状態又は血栓形成促進状態)特有であり得る。例えば、磁気共鳴パラメータは、低血小板活性を示す;高血小板活性を示す;高機能性フィブリノーゲン活性を示す;又は低機能性フィブリノーゲン活性を示すことができる。
【００４７】
本発明の特定の実施形態では、NMR緩和パラメータ特有のシグナルを測定する前に、常磁性剤(例えば、マンガン、マンガン錯体、ガドリニウム、ガドリニウム錯体又は磁性粒子)を血液サンプルに添加する。好ましい実施形態では、超常磁性粒子である。常磁性剤は、3〜40nmの間、30〜70nmの間、70〜100nmの間、100〜500nmの間、又は500〜1000nmの間の平均直径を有する超常磁性粒子であり得る。特定の実施形態では、本発明の方法を、常磁性剤の存在下及び非存在下の両方で単一患者の血液サンプルに行う。
【００４８】
本発明の方法の別の実施形態では、分析対象のサンプルは、2μL〜400μLの間(例えば、2μL〜10μL、10μL〜20μL、15μL〜50μL、50μL〜100μL、100μL〜250μL又は200μL〜500μL)の体積を有する。なお他の実施形態では、分析対象のサンプルは、400μL〜4000μLの間の体積を有する。
【００４９】
上記方法のいずれかでは、NMR緩和データは、T1、T2、T1/T2ハイブリッド、T1rho、T2rho及びT2*データから選択される。さらに、見かけの拡散係数(ADC)を決定及び評価することができる(VidmarらNMR in BioMedicine、2009;及びVidmarら、Eur J Biophys J. 2008参照)。さらに、本発明の方法は、パルス磁場勾配(すなわち、勾配強度の二乗の関数としてエコー減衰量の測定を用いる)、ハーンエコーシーケンス、スピンエコーシーケンス及び/又はFIDシグナル比を利用することができる。
【００５０】
本発明は、血液凝固プロセスをモニタリングするための磁気共鳴装置を特徴とし、この装置は血液サンプル中の二つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用するマイクロプロセッサを含み、各別個の水集団は磁気共鳴パラメータ値又は値のセットにより特徴づけられる。アルゴリズムは、それだけに限らないが、多指数関数アルゴリズム、双指数関数アルゴリズム、三指数関数アルゴリズム、減衰指数関数アルゴリズム、ラプラス変換、逆ラプラス変換、適合度アルゴリズム、SSEアルゴリズム、最小二乗アルゴリズム、非負最小二乗アルゴリズム、及び本明細書に記載する任意の他のアルゴリズムから選択することができる。
【００５１】
関連する態様では、本発明は、(i)凝固血サンプルを用意するステップと;(ii)凝固血サンプルを組織プラスミノーゲン因子(TPA)と組み合わせるステップと;(iii)凝固血サンプル中の水の一連の緩和率測定を行うステップと;(iii)血液サンプル中の二つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用して測定値を変換するステップであって、各別個の水集団は一つ以上の値を有する一つ以上の磁気共鳴パラメータにより特徴づけられるステップと;(v)ステップ(iv)の結果に基づいて、凝固血の溶解をモニタリングするステップと、を含む血餅の溶解をモニタリングする方法を特徴とする。
【００５２】
ある実施形態では、対象の止血状態を、対象から採取した血液サンプルの血液凝固挙動に基づいて評価する。血液凝固挙動の例としては、凝固時間(R)、血餅強度(MA)、血小板関連血餅強度(MAPLATELET)、機能性フィブリノーゲン関連血餅強度(MAFF)及びMA30分後の溶解％(LY30)が挙げられる。止血状態の例としては血栓形成促進、出血及び正常状態が挙げられる。凝固挙動又は止血状態は、初期NMR緩和データの収集後の一定の時間枠内(例えば、10、6又は3分以内)に確立され得る。さらに、凝固挙動を確立する際、もう一つの添加剤(例えば、フィブリノーゲン又はTPA)をサンプルに添加してもよい。
【００５３】
他の実施形態では、対象から採取した血液の血液凝固プロセスを、(i)第1の血液サンプル(例えば、添加剤で処理したサンプル)中の水の一連の第1の緩和率測定を行うステップと;(ii)第1の血液サンプル中の二つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用して第1の緩和率測定値を変換するステップと;(iii)対象の第2の血液サンプル(例えば、未処理サンプル)中の水の一連の第2の緩和率測定を行うステップと;(iv)第2の血液サンプル中の二つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用して第2の緩和率測定値を変換するステップであって、各別個の水集団は一つ以上の磁気共鳴パラメータにより特徴づけられ、各磁気共鳴パラメータは一つ以上の値を有するステップと;(v)ステップ(iv)の結果に基づいて、対象の血液の凝固プロセスをモニタリングするステップとによりモニタリングする。サンプルの一つ(例えば、第1のサンプル)は、フィブリノーゲン又は組織プラスミノーゲン活性化因子又はアプロチニン（aprotining）、サイトカラシンD、レオプロ又は他のインヒビターなどの添加剤を含んでもよい。いくつかの実施形態では、対象の止血状態を、モニタリングするプロセスの結果に基づいて評価又は診断する(例えば、止血状態を10、6又は3分以内に評価する)。
【００５４】
他の実施形態では、本発明は、(i)対象の血液サンプルを用意するステップと;(ii)血液サンプル中の水のNMR緩和率特有のシグナルを測定して磁気共鳴パラメータの一つ以上の値を得るステップと;(iii)ステップ(ii)の結果に基づいて対象を診断するステップとにより対象の止血状態を診断する方法を特徴とする。診断は、磁気共鳴パラメータ値(複数可)と所定の閾値(複数可)の比較に基づいてもよい。所定の閾値は、一定の止血状態(例えば、正常、血栓形成促進又は出血)を表すことができる。止血状態を、初期NMR緩和率シグナルを収集する一定の時間以内(例えば、10、6又は3分以内)に評価してもよい。
【００５５】
ある実施形態では、凝固挙動をはっきり定義されたデータ抽出法を使用して評価する。サンプルの凝固時間(R)は、(i)第1の水集団についてのT2時間曲線を計算するステップと;(ii)T2時間曲線の二次導関数の最大値を計算するステップと;(iii)ステップ(ii)の結果に基づいて、凝固時間(R)特有の値を計算するステップとにより収集したNMR緩和率データのセットから評価することができる。サンプルの血小板関連血餅強度(MAPLATELET)は、(i)第1の水集団についてのT2時間曲線を計算するステップと;(ii)T2曲線上のT2の初期値とT2曲線上のT2の最小値を結ぶ線の勾配を計算するステップと;(iii)ステップ(ii)の結果に基づいて、サンプルの血小板関連血餅強度(MAPLATELET)特有の値を計算するステップとにより評価することができる。サンプルの機能性フィブリノーゲン関連血餅強度(MAFF)は、(i)フィブリノーゲンで処理した第1のサンプル中の第1の水集団についての第1の振幅時間曲線を計算するステップと;(ii)第2の未処理のサンプル中の第1の水集団についての第2の振幅時間曲線を計算するステップと;(iii)第1の振幅時間曲線と第2の振幅時間曲線の差を計算するステップと;(iv)ステップ(iii)の結果に基づいて、サンプルの機能性フィブリノーゲン関連血餅強度(MAFF)特有の値を計算するステップとにより評価することができる。サンプルのMA30分後の溶解％(LY30)は、(i)TPAで処理した第1のサンプル中の第2の水集団についての第1のT2時間曲線を計算するステップと;(ii)第2の未処理のサンプル中の第2の水集団についての第2のT2時間曲線を計算するステップと;(iii)第1のT2時間曲線と第2のT2時間曲線の差を計算するステップと;(iv)ステップ(iii)の結果に基づいて、サンプルのMA30分後の溶解％特有の値を計算するステップとにより評価することができる。
【００５６】
他の実施形態では、(i)対象から採取した血液サンプル中の水のNMR緩和特有のシグナルを測定してNMR緩和データを得るステップと;(ii)NMR緩和データから対象の止血状態特有のT2サインを決定するステップとにより、T2サイン曲線を使用して対象の止血状態を評価又は診断する。T2サインを標準又は標準曲線のセットと比較して対象の止血状態を確立することができる。
【００５７】
他の実施形態では、本発明は、(i)液体流体状態からゲル状態に移行することができる水含有材料を用意するステップと;(ii)材料中の水のNMR緩和特有の一連のシグナルを測定してNMR緩和データを得るステップと;(iii)NMR緩和データから水含有材料特有の時間曲線を決定するステップとにより、水含有材料をモニタリングする方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、時間曲線は、T1時間曲線、T2時間曲線又はハイブリッドT1/T2時間曲線などのT2緩和曲線以外の緩和曲線である。関連する実施形態では、水含有材料は、全血、ポリアクリルアミドヒドロゲル、ポリビニルピロリドンヒドロゲル、ポリエチレングリコールヒドロゲル、ポリビニルアルコールヒドロゲル、ポリアクリル酸ヒドロゲル、カラギーナンゲル、アルギン酸塩ゲル又はゼラチンである。好ましい実施形態では、水含有材料はアクリルアミドヒドロゲルである。
【００５８】
別の態様では、本発明は、(i)液体流体状態からゲル状態に移行することができる水含有材料を用意するステップと;(ii)血液モニタリング装置を使用して水含有材料の特性を測定するステップと;(iii)ステップ(ii)で生成した特性を所定の閾値と比較することにより血液モニタリング装置の較正状態を評価するステップと、により血液モニタリング装置の較正状態を評価する方法を特徴とする。好ましい実施形態では、水含有材料はアクリルアミドゲル又は対照血漿物質（すなわち、使用前に水で再構成される凍結乾燥物質）であり、血液モニタリング装置はT2リーダー又はトロンボエラストグラフィ(TEG)アナライザーである。具体的な実施形態では、分析前に常磁性剤(例えば、マンガン、マンガン錯体、ガドリニウム、ガドリニウム錯体又は超常磁性粒子)をサンプルに添加する。常磁性剤は3〜40nmの間、30〜70nmの間、70〜100nmの間、100〜500nmの間又は500〜1000nmの間の平均直径を有する超常磁性粒子であり得る。
【００５９】
ある実施形態では、血液サンプルからの一連のNMR緩和率測定値を使用して、血液サンプル中の一定の水集団特有の一連の磁気共鳴パラメータ値(例えば、T2又は振幅値)を作成する。一連の磁気共鳴パラメータ値を時間の関数としてプロットして同様に水集団特有の時間曲線を作成することができる。例えば、サンプルが凝固を生じている際に、血液サンプル中の一定の水集団についてのT2時間曲線(又は振幅曲線)をプロットすることができる。これらの時間曲線をさらに使用して追加の曲線を作成してもよい。例えば、T2時間曲線の一次又は二次時間導関数をプロットすることができる。時間曲線を血液サンプルの凝固挙動又は血液サンプルを採取した対象の止血状態を評価するための基礎として使用することができる。同様に、同一対象から得た二つの異なるサンプル(例えば、処理サンプル及び未処理サンプル)から作成した曲線を、対象の血液の凝固挙動又は対象の止血状態を評価するための基礎として使用することができる。
【００６０】
他の実施形態では、サンプルの凝固挙動又は対象の止血状態を、サンプル若しくは対象に関連する磁気共鳴パラメータの値又は時間曲線を所定の閾値と比較することに基づいて評価することができる。所定の閾値は、いくつかの異なる方法で確立することができる。例えば、所定の閾値は、止血状態(例えば、正常、血栓形成促進又は出血状態)特有であり得る。閾値は、正常及び異常対象から採取した血液について観察される平均値又は値の範囲から決定することができる。あるいは、閾値は、本発明のNMRに基づく方法に使用すると同一パラメータ又は曲線を一貫して提供する標準サンプルから決定することができる(例えば、特定の様式で凝固するよう処置した血液サンプル、又はアクリルアミドゲル)。
【００６１】
別の態様では、本発明は、(i)対象から採取した血液サンプル中の水の一連の緩和率測定(例えば、T2緩和率測定)を行うステップであって、血液サンプルは凝固プロセス又は溶解プロセスを受けており、測定により二つ以上の減衰曲線が提供され、各減衰曲線はプロセス中の時点特有であるステップと;(ii)数学的変換(例えば、逆ラプラス変換)を二つ以上の減衰曲線に適用してプロセス中の二つ以上の時点での血液サンプル中の二つ以上の水集団(例えば、血清関連T2シグナルを有する水集団及び血餅関連T2シグナルを有する水集団)を同定して二つ以上のシグナル強度を有する二つ以上の磁気共鳴パラメータ値を得るステップであって、各水集団は特徴的磁気共鳴パラメータ値及び磁気共鳴パラメータ値のシグナル強度特有の濃度を有するステップと;(iii)(a)二つ以上の時点;(b)二つ以上の磁気共鳴パラメータ値;及び(c)二つ以上のシグナル強度から3Dデータセットを作成するステップと;(iv)3Dデータセットから、対象の止血状態特有の一つ以上の凝固挙動(例えば、凝固時間(R)、線溶挙動、血餅強度(MA)、血餅の動力学的挙動、血小板関連血餅強度(MAPLATELET)、機能性フィブリノーゲン関連血餅強度(MAFF)、MA30分後溶解％(LY30)又はヘマトクリット)を抽出するステップと;(v)一つ以上の凝固挙動に基づいて、対象の止血状態を評価するステップと、により対象の止血状態を評価する方法を特徴とする。
【００６２】
ある実施形態では、本発明は、抗血小板抗体又はFabフラグメント(例えば、アブシキシマブ(abciximab))を凝固プロセス又は溶解プロセスを生じているサンプル(例えば、全血サンプル)に添加するステップを特徴とする。他の実施形態では、本発明は、凝固活性化因子又は血小板阻害因子を凝固プロセス又は溶解プロセスを生じているサンプル(例えば、全血サンプル)に添加するステップを特徴とする。
【００６３】
別の態様では、本発明は、(i)血餅中の水のT2緩和率測定を行うステップであって、測定により減衰曲線が得られるステップと;(ii)数学的変換(例えば、逆ラプラス変換)を減衰曲線に適用して血餅中の水集団のシグナル強度を同定するステップであって、水集団は退縮した血餅水環境又は血清水環境に相当するステップと;(iii)水集団のシグナル強度に基づいて、血餅の強度又は血餅の血小板活性を評価するステップと、により血餅の強度又は血餅の血小板活性を評価する方法を特徴とする。
【００６４】
別の態様では、本発明は、(i)対象の血液サンプルを用意するステップと;(ii)サンプル中の水のT2緩和率測定を行うステップであって、測定により減衰曲線が得られるステップと;(iii)数学的変換(例えば、逆ラプラス変換)を減衰曲線に適用して血清関連T2シグナル及び血餅関連T2シグナルを同定するステップと;(iv)血清関連T2シグナルと血餅関連T2シグナルの差、又は血餅関連T2シグナルの出現に基づいて、対象の止血状態を評価するステップと、により対象の止血状態を評価する方法を特徴とする。
【００６５】
別の態様では、本発明は、(i)対象から採取した血液サンプル中の水の一連のNMR緩和率測定を行うステップと;(ii)処理のためにNMR緩和率測定値又はNMR緩和率測定値特有のデータを変換するステップであって、処理は本明細書に記載する方法のいずれかを含むステップと;(iii)ステップ(ii)の結果を受信し、結果に基づいて、対象を診断するステップと、により対象の止血状態を診断する方法を特徴とする。
【００６６】
本発明はさらに、(i)本明細書に記載する方法を使用して対象の止血状態を評価するステップと;(ii)ステップ(i)に基づいて、心臓補助装置の操作パラメータ(例えば、速度、強度、圧力、流量、ポンプ容積又は充填容積)を調整して対象の出血又は凝固のリスクを低下させるステップとを含む、心臓補助装置を装着した対象の出血又は凝固のリスクを低下させる方法を特徴とする。特定の実施形態では、心臓補助装置は、体外心臓バイパス装置及び埋め込み型血液ポンプ、例えば、左心室補助装置から選択される。
【００６７】
本発明はさらに、(i)本明細書に記載する方法を使用して対象の止血状態を評価するステップと;(ii)ステップ(i)に基づいて、抗凝固療法、抗血小板療法及び/又は凝血促進療法を対象に施用して対象の出血又は凝固のリスクを低下させるステップとを含む、心臓補助装置を装着している対象の出血又は凝固のリスクを低下させる方法を特徴とする。特定の実施形態では、心臓補助装置は、体外心臓バイパス装置及び埋め込み型血液ポンプ、例えば、左心室補助装置から選択される。
【００６８】
別の態様では、本発明は、本発明のNMRに基づく技術を使用して測定したサンプルの凝固又は溶解挙動を、当技術分野で既知のシステムを使用して同等サンプルで測定したレオロジー変化又は凝固又は溶解と比較する方法を特徴とする。
【００６９】
本発明の方法を使用してサンプル中の複数パラメータの同時測定を行うことができる(例えば、サンプルの凝固若しくは対象の止血状態に関連するパラメータを同時に測定する)。
【００７０】
上記方法のいずれかでは、方法は、(i)全血又はその成分を1種以上の添加剤(例えば、ヘパリン、クエン酸塩、ナノ粒子製剤、常磁性剤、フィブリノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)、アブシキシマブなどの抗血栓薬、又は本明細書に記載する任意の他の添加剤)を含有する管に添加するステップと、(ii)内容物を混合して凝固プロセスを開始するステップとを含むことができる。特定の実施形態では、1種以上の添加剤は全血又はその成分中で再構成可能な乾燥添加剤である。例えば、サンプル管の底に、コラーゲンの小ペレットを用いて全血又はその成分をin situで凝固させることができる。特定の実施形態では、サンプル管の少なくとも一部をコラーゲンでコーティングして凝固を開始する。なお他の実施形態では、サンプル管の局所的領域を凝固開始剤(例えば、コラーゲン又は本明細書に記載する別の凝固開始剤)でコーティングして血餅形成を空間的に制御することを可能にする。
【００７１】
上記方法のいずれかでは、方法は、T2リーダーを使用してサンプルのT2シグナルを測定するステップを含むことができる。例えば、約5×T2の総エコー時間という長い総エコー時間を利用するCPMGパルスシーケンスを使用して、血液(全血、希釈血液、PRP等)中の定量的T2測定を行うことができる(例えば、τは典型的には62.5μsより長く、1000μs未満である)。CPMGパルスシーケンスは、1〜10秒の滞留時間（ドウェル時間）と50％〜100％（例えば70％〜100％）のデューティサイクルを含んでもよく、場合により実行内で滞留時間とデューティサイクルは変動してもよい。特定の実施形態では、凝固プロセスを開始する前に、T2リーダーを使用してサンプルを所望の温度にプレインキュベートする。
【００７２】
未凝固血を含有するサンプルについては、未凝固血が沈降して一つ以上のT2値を有するサンプルを生成することができるが、この沈降の時間尺度は典型的には血餅形成より長いことが理解される。
【００７３】
本発明の方法は、生のNMRデータを分析して凝固又は溶解プロセスを生じているサンプル中の二つ以上の水集団についての情報を得ることに関する。データを逆ラプラス変換してサンプル中に同時に観察される異なる水集団から生じるシグナル強度を同定することが例証される。あるいは、サンプル中の二つ以上の水集団についての情報は、(i)ハーンエコーパルスシーケンスを使用した緩和測定;(ii)初期90°パルス後の固定時間遅延でのFIDシグナル振幅とその後の180°パルス後の固定遅延での振幅の差に基づく異なる測定;(iii)その緩和特性に基づいて水の特定の集団を減衰し、それによって水の他の集団を強調するよう構成されたパルス磁場勾配の存在下でのT2値及びエコー減衰の測定;並びに(iv)差の測定(すなわち、(a)単一90°パルス後のFID、(b)CPMG緩和曲線、(c)一連のハーンエコー又はスピンエコーにより得られる緩和曲線、又は(d)CP緩和曲線)などの当技術分野で既知のデータ取得及びデータ操作技術を使用して得てもよい。代替アプローチを本明細書に記載する方法のいずれかに使用することができる。
【００７４】
上記方法のいずれかの実施形態では、方法は、血液サンプルと接触している内部表面であって、フィブリン接着を制御するサンプル管の内部表面を有するサンプル管において行われる。サンプル管の内部表面は、本明細書に記載する材料及びアプローチのいずれかを使用して、改変又は選択することができる。
【００７５】
関連する態様では、本発明は、第1の血液サンプル中の凝固又は溶解プロセスをモニタリングする方法であって、(i)血液サンプルと接触している内部表面を有するサンプル管における血液サンプル中の水の一連の磁気共鳴緩和率測定を行うステップと、(ii)第1の血液サンプル内の2つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用して、測定値を変換するステップであり、各別個の水集団は、1つ以上の値を有する1つ以上の磁気共鳴パラメータによって特徴づけられるステップと、(iii)ステップ(ii)の結果に基づいて、プロセス中に血餅が形成又は溶解したかどうかを決定するステップとを含み、サンプル管の内部表面がフィブリン接着を制御する、第1の血液サンプル中の凝固又は溶解プロセスをモニタリングする方法を特徴とする。例えば、内部表面は、フッ素化材料若しくはPEG化材料、又は内部表面の親水性を増加させる材料を含むことができる。特定の実施形態では、内部表面は、コーティングされていない基材と比較してフィブリン接着を減少させる材料でコーティングされた基材を含む。基材は、例えば、ガラス又はベースポリマー(例えば、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリアロマー、又はサンプル管にするのに適した別のベースポリマー)とすることができる。いくつかの実施形態では、基材は、シラン処理されていないガラスと比較して、フィブリン接着を減少させる材料でのシラン処理によってコーティングされたガラスである。さらに他の実施形態では、材料は、界面活性剤、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリエチレングリコール、フッ素化材料、炭水化物、又はそれらの混合物を含む。血液サンプルは、血漿サンプル、乏血小板血漿サンプル、多血小板血漿サンプル、単離及び洗浄した血小板を含む血液サンプル、全血サンプル、凝固血サンプル、血液由来検体、又は本明細書に記載する血液サンプルの任意の他のタイプとすることができる。方法のいくつかの実施形態では、ステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに、フィブリノーゲン(例えば、1±0.25、2±0.5、3±0.75、4±1、6±2、又は8±2mg/mL)を添加する。方法の特定の実施形態では、ステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに、凝固開始剤又は凝固阻害剤を添加する。凝固開始剤/阻害剤は、RF(レプチラーゼ及び第XIII因子)、AA(アラキドン酸)、ADP(アデノシン二リン酸)、CK(カオリンクレイ)、TRAP(トロンビン受容体活性化ペプチド)、トロンビン、血小板凝集阻害剤、又は本明細書に記載する任意の凝固開始剤若しくは凝固阻害剤から選択することができる。方法のさらに他の実施形態では、ステップ(i)の前又は後に、第1の血液サンプルに、組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)若しくはアプロチニン又は線溶を阻害するための別の物質を添加する。方法は、(iv)対象からの第2の血液サンプル中の水の一連の第2の緩和率測定を行うステップと、(v)第2の血液サンプル内の2つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用して、第2の緩和率測定値を変換するステップであり、各別個の水集団が、1つ以上の磁気共鳴パラメータであって、各磁気共鳴パラメータが、1つ以上の値を有するパラメータによって特徴づけられるステップと、(vi)ステップ(ii)及びステップ(v)の結果に基づいて、プロセス中に血餅が形成又は溶解したかどうかを決定する��テップとをさらに含むことができる。例えば、第1の血液サンプルが血漿サンプルであってもよく且つ第2の血液サンプルが全血サンプルであってもよく、第1の血液サンプルが多血小板血漿サンプルであってもよく且つ第2の血液サンプルが全血サンプルであってもよく、第1の血液サンプルが乏血小板血漿サンプルであってもよく且つ第2の血液サンプルが全血サンプルであってもよく、第1の血液サンプルが単離及び洗浄した血小板を含むことができ且つ第2の血液サンプルが全血サンプルであってもよく、又はその他の点では同一である2つサンプルに異なる化合物、開始剤、又は添加剤が添加されている以外は同一のサンプルを含む、本明細書に記載する比較サンプルの任意の他のセットであってもよい。特定の実施形態では、ステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに、血小板阻害剤が添加され、血小板阻害剤が、第2の血液サンプルに添加されず；ステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに、血小板活性化因子が添加され、血小板活性化因子が、第2の血液サンプルに添加されない；又はステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに、RF、AA、ADP、CK、TRAP、エピネフリン、コラーゲン、組織因子、セライト、エラグ酸、及びトロンビンから選択される凝固開始剤が添加され、ステップ(iv)の前に、第2の血液サンプルに、ADP及びトロンビンから選択される凝固開始剤が添加される。他の実施形態では、第1及び第2の血液サンプルは、同じ活性化因子を含むが、第2の血液サンプルが、アプロチニンなどの線溶阻害因子を含む点で異なる。方法のいくつかの実施形態では、ステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに、フィブリノーゲン(例えば、1±0.25、2±0.5、3±0.75、4±1、6±2、又は8±2mg/mL)を添加し、ステップ(iv)の前に、第2の血液サンプルに、フィブリノーゲン(例えば、1±0.25、2±0.5、3±0.75、4±1、6±2、又は8±2mg/mL)を添加する。特定の実施形態では、磁気共鳴パラメータ値は、血液サンプル中の血餅関連水分子に特有である、又は2つ以上の別個の水集団の少なくとも1つは、血餅の存在と正に相関する。アルゴリズムは、多指数関数アルゴリズム、双指数関数アルゴリズム、三指数関数アルゴリズム、減衰指数関数アルゴリズム、ラプラス変換、適合度アルゴリズム、SSEアルゴリズム、最小二乗アルゴリズム、非負最小二乗アルゴリズム、又は本明細書に記載する任意のアルゴリズムからなる群から選択されるアルゴリズムを含むことができる。特定の実施形態では、アルゴリズムは、逆ラプラス変換である。緩和率は、T1、T2、T1/T2ハイブリッド、T1rho、T2rho、及びT2*からなる群から選択することができる。一つの特定の実施形態では、緩和率測定はT2測定を含み、この測定は減衰曲線を提供する。別の特定の実施形態では、2つ以上の水集団は、血清関連T2シグナルを有する水集団及び血餅関連T2シグナルを有する水集団を含む。特定の実施形態では、2つ以上の水集団は、血餅関連T2シグナルを有する水集団をさらに含む。いくつかの実施形態では、緩和率測定はT2測定であって、このT2測定は減衰曲線を提供する。方法は、凝固又は溶解プロセスの開始後の所定の時点でのT2緩和スペクトルを減衰曲線から計算するステップをさらに含むことができる。例えば、方法は、血液サンプル中の凝固又は溶解プロセスの開始後、(a)プロセス中に血液サンプルに関��る複数の緩和率測定を行い、複数の減衰曲線を生成するステップと、(b)複数のT2緩和スペクトルを複数の減衰曲線から計算するステップを含むことができる。任意選択により、方法は、血液サンプル中の凝固又は溶解プロセスの開始後の時間の関数としての血液サンプル中の2つ以上の水集団に関する(a)T2緩和時間の変化と、(b)T2シグナル強度の変化を示す3次元データセットとを、複数のT2緩和スペクトルから計算するステップとをさらに含む。上記方法の一つの特定の実施形態では、方法は、(i)血液サンプルに関するADP濃度の関数としての血餅形成を測定するステップと、(ii)部分的な血餅形成を生じるADP濃度を決定するステップと、(iii)ステップ(ii)の結果に基づいて、対象が正常であるか、出血性状態を有するか、又は血栓形成促進性状態を有するかどうかを決定するステップとを含む。例えば、方法は、(i)複数のサンプル管中に分配された対象からの血液を提供するステップと、(ii)異なる量のADPを、複数のサンプル管に添加するステップと、(iii)血液に関するADP濃度の関数としての血餅形成を測定するステップと、(iv)部分的な血餅形成を生じるADP濃度を決定するステップと、(v)ステップ(iv)の結果に基づいて、対象が正常であるか、出血性状態を有するか、又は血栓形成促進性状態を有するかどうかを決定するステップとを含むことができる。上記方法の別の特定の実施形態では、方法は、(i)血液サンプルに関するAA濃度の関数としての血餅形成を測定するステップと、(ii)部分的な血餅形成を生じるAA濃度を決定するステップと、(iii)ステップ(ii)の結果に基づいて、対象が正常であるか、出血性状態を有するか、又は血栓形成促進性状態を有するかどうかを決定するステップとを含む。例えば、方法は、(i)複数のサンプル管中に分配された対象からの血液を提供するステップと、(ii)異なる量のAAを、複数のサンプル管に添加するステップと、(iii)血液に関するAA濃度の関数としての血餅形成を測定するステップと、(iv)部分的な血餅形成を生じるAA濃度を決定するステップと、(v)ステップ(iv)の結果に基づいて、対象が正常であるか、出血性状態を有するか、又は血栓形成促進性状態を有するかどうかを決定するステップとを含むことができる。
【００７６】
関連する態様では、本発明は、血液サンプル中の凝固プロセスをモニタリングする方法であって、(a)凝固開始剤を、血液サンプルと接触している内部表面を有するサンプル管において血液サンプルに添加するステップと、(b)プロセス中に血餅が形成したかどうかを決定するステップとを含み、サンプル管の内部表面がフィブリン接着を制御する、血液サンプル中の凝固プロセスをモニタリングする方法を特徴とする。例えば、ステップ(b)は、T2磁気共鳴測定などの核磁気共鳴測定、又は本明細書に記載する任意の他の磁気共鳴技術を含むことができる。或いは、ステップ(b)は、光学的、トロンボエラストグラフィー、ターボデンシトメトリー、発色性、免疫性、比濁法、比濁分析、凝集、インピーダンス、機械的血餅検出、血小板凝集、電気化学的検出、凝固時間、フォトメカニカル、及び/又は電気機械的測定を含むことができる。
【００７７】
別の関連する態様では、本発明は、フィブリン接着を制御する内部表面を有するサンプル管を特徴とする。例えば、内部表面は、フッ素化材料若しくはPEG化材料又は内部表面の親水性を増加させる材料を含むことができる。特定の実施形態では、内部表面は、コーティングされていない基材と比較してフィブリン接着を減少させる材料でコーティングされた基材を含む。基材は、例えば、ガラス又はベースポリマー(例えば、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリアロマー、又はサンプル管にするのに適した別のベースポリマー)とすることができる。いくつかの実施形態では、基材は、シラン処理されていないガラスと比較して、フィブリン接着を減少させる材料でのシラン処理によってコーティングされたガラスである。さらに他の実施形態では、材料は、界面活性剤、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリエチレングリコール、フッ素化材料、炭水化物、又はそれらの混合物を含む。いくつかの実施形態では、サンプル管は、50μLから2mL(例えば、100±50μL、200±100μL、400±200μL、600±200μL、1.2±0.4mL、又は1.5±0.5mL)の最大容量を保持する。サンプル管は、(i)閉鎖部分(例えば、キャップ又はプラグ)と、(ii)縦軸及び縦軸を概ね取り囲む壁を有する本体部分とを含み、前記本体部分が、そこを通してサンプルを分注することができる開口部を有する頭部分を備えることができる。特定の実施形態では、開口部は、約1cm未満(例えば、約0.25±0.15cm、0.5±0.25cm、又は0.75±0.25cmの内径)の内径を有する。さらに他の実施形態では、壁は、約0.05から約0.75mm(例えば、0.1±0.05mm、0.25±0.1mm、又は0.5±0.25mm)の厚さを有する。いくつかの実施形態では、サンプル管は、開口部の遠位にある閉鎖された端であって、開口部の内径の60％、50％、40％、25％、20％、15％、10％又は5％未満である幅までだんだんと細くなっている閉鎖された端を含む。特定の実施形態では、サンプル管は、血液サンプルを、永久磁石及びRFパルスシーケンスを使用して生み出されたバイアス磁界に曝露することによって生成されるシグナルを検出するように構成されたRFコイルをさらに備える。サンプル管は、RFコイルにおける又はRFコイルとの電気通信における可融性連結であって、可融性連結に過電流を印加した後に壊れ、RFコイルを動作不能にするように構成された可融性連結をさらに備えることができる。
【００７８】
本発明は、血液サンプルをモニタリングするためのシステムであって、(a)血液サンプルを保持するためのウェルを規定し、使い捨てのサンプル管内に含有されウェルのあたりに配置されたRFコイルを有する使い捨てのサンプル管であり、前記RFコイルが、永久磁石及びRFパルスシーケンスを使用して生み出されたバイアス磁界に血液サンプルを曝露することによって生成されたシグナルを検出するように構成され、使い捨てのサンプルホルダーが1つ以上の可融性連結を含む、使い捨てのサンプル管と、(b)(b1)磁界を規定する永久磁石と、(b2)RFパルスシーケンス及び検出コイルと、(b3)RFコイルと連通している1つ以上の電気素子であり、シグナルを増幅する、整流する、伝達する、及び/又はデジタル化するように構成された電気素子と、(b4)可融性連結と連通しており、過電流を可融性連結に印加するように構成され、所定の耐用年数後に連結を壊し、コイルを動作不能にする1つ以上の電気素子とを含むMRリーダーとを備えるシステムであって、使い捨てのサンプル管が、本発明のコーティングされたサンプル管である、システムをさらに特徴とする。いくつかの実施形態では、RFコイルと連通している電気素子は、RFコイルに誘導結合している。
【００７９】
関連する態様では、本発明は、対象からの血液サンプルを評価する方法であって、(i)血液サンプルの1つ以上のアリコート中の水の一連の磁気共鳴緩和率測定を行うステップであり、1つ以上のアリコートの少なくとも1つが、凝固開始剤と組み合わされているステップと、(ii)血液サンプルの1つ以上のアリコート内の2つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用して、測定値を変換するステップと、(iii)ステップ(ii)の結果に基づいて、(a)血液サンプルに関するヘマトクリットの測定と、(b)血液サンプルに関するフィブリノーゲンレベルの測定と、(c)血液サンプルに関する凝固時間の測定と、(d)血液サンプルの血小板活性の測定であり、血液サンプル中の強固に結合している血餅の形成のモニタリングを含む測定を行うステップとを含む、方法を特徴とする。アルゴリズムは、多指数関数アルゴリズム、双指数関数アルゴリズム、三指数関数アルゴリズム、減衰指数関数アルゴリズム、ラプラス変換、逆ラプラス変換、適合度アルゴリズム、SSEアルゴリズム、最小二乗アルゴリズム、及び非負最小二乗アルゴリズムからなる群から選択されるアルゴリズムを含むことができる。方法は、血液サンプルの複数のアリコートから同時に収集される複数の測定値、血液サンプルの複数のアリコートから連続して収集される複数の測定値、又は血液サンプルへの凝固開始剤の添加前若しくは後に作られた血液サンプルの単一のアリコートから収集される複数の測定を行うステップを含むことができる。一実施形態では、方法は、ステップ(iii)の結果に基づいて、対象における凝固障害(例えば、希釈性凝固障害、ショックの致死的三徴、アシドーシス及び低体温症、又は外傷ショックの急性凝固障害(ACoTS))を診断するステップをさらに含む。別の実施形態では、方法は、ステップ(iii)の結果に基づいて、対象が、凝固亢進、凝固低下、又は正常であるかどうかを決定するステップをさらに含む。さらに別の実施形態では、方法は、ステップ(iii)の結果に基づいて、対象が、血栓性合併症のリスクがあるか、又は対象が、抗血小板療法に抵抗性があるかどうかを決定するステップをさらに含む。一つの特定の実施形態では、方法は、ステップ(iii)の結果に基づいて、対象における抗血小板療法をモニタリングする及び/又は凝血促進療法をモニタリングするステップをさらに含む。
【００８０】
本明細書で使用する場合、「3Dデータセット」という用語は、一定期間にわたって凝固プロセス又は溶解プロセスを生じているサンプル中の変化特有の3Dプロットに組み立てることができる測定及び/又は派生データポイントの集合を指す。3Dデータセットから得られる3Dプロットは、サンプル中の異なる水集団の出現及び/又は消滅を示すことができ、特定の時点での又は時間の範囲にわたる、これらの水集団の強度及び緩和時間(例えば、T2緩和時間)を定量化する。
【００８１】
本明細書で使用する場合、「第1の水集団」という用語は、凝固とともに減少する未凝固血の初期振幅により特徴づけられる全血サンプルの水集団を指す。第1の水集団はまた、集団Aとして本出願中の他で呼ばれる水集団を指すこともできる。第1の水集団から抽出した振幅及びT2データをそれぞれAmpA及びT2Aと呼ぶ。
【００８２】
本明細書で使用する場合、「第2の水集団」という用語は、凝固とともに増加する未凝固血の初期振幅により特徴づけられる全血サンプルの水集団を指す。第2の水集団は、血餅の血小板濃度と関連し得る。第2の水集団はまた、集団Bとして本出願中の他で呼ばれる水集団を指すこともできる。第2の水集団から抽出した振幅及びT2データをそれぞれAmpB及びT2Bと呼ぶ。
【００８３】
本明細書で使用する場合、「第3の水集団」という用語は、赤血球中の生体分子に結合した水と関連した又は強固に結合した血餅と関連した全血サンプルの水集団を指す。第3の水集団は、赤血球中の生体分子に結合した水と関連し得る。第3の水集団はまた、集団Cとして本出願中の他で呼ばれる水集団を指すこともできる。第3の水集団から抽出した振幅及びT2データをそれぞれAmpC及びT2Cと呼ぶ。
【００８４】
本明細書で使用する場合、「第4の水集団」という用語は、約400ms〜約2200msに及ぶ、T2値の広い分布により特徴づけられる全血サンプルの水集団を指す。第4の水集団に関連するT2値の範囲は、データ収集に使用するハードウェア及び材料(例えば、サンプル管)に依存し得る。第4の水集団は、退縮した血餅を囲む血清に関連し、血液サンプル中に抗血小板凝集薬(例えば、アブシキシマブ)を封入すると第5の水集団と融合し得る。第4の水集団の特徴は、血小板活性及び/又は血餅強度と一致し得る。
【００８５】
本明細書で使用する場合、「血清水環境」という用語は、未凝固血サンプル又は未凝固のままの血液サンプルの部分中に見られる水環境を指す。「血清関連T2シグナル」とは、血清水環境から生じるシグナル(例えば、退縮した血餅を囲む血清に関連する凝固血サンプル中の対応T2シグナル)を指す。血清関連T2シグナルは、典型的には退縮した血餅を含有するサンプルと退縮した血餅を除去した凝固サンプルの両方の中に存在する。血清関連T2シグナルは、血餅関連T2シグナルのT2値よりも高いT2値を有する分解ピークを含有する。血清水環境は、上記第4の水集団と関連し得る。
【００８６】
本明細書で使用する場合、「第5の水集団」という用語は、約80ms〜約500msに及ぶ、T2値の分布により特徴づけられる全血サンプルの水集団を指す。第5の水集団と関連するT2値の範囲は、データ収集に使用するハードウェア及び材料(例えば、サンプル管)に依存し得る。第5の水集団は、退縮した血餅と関連し得る。第5の水集団の特徴は、凝固時間及び/又は線溶活性と一致し得る。
【００８７】
本明細書で使用する場合、「退縮した血餅水環境」という用語は、退縮した血餅中に見られ、血餅形成に特有の水環境を指す。「血餅関連T2シグナル」とは、退縮した血餅水環境から生じるシグナルを指す(血餅が測定時に退縮しているかどうかによらない)。血餅関連T2シグナルは、退縮した血餅を含有する凝固全血サンプルと周囲血清を除去した退縮した血餅を含有するサンプルの両方の中に存在する。血餅関連T2シグナルは、血清関連T2シグナルのT2値よりも低いT2値を有する分解ピークを含有する。退縮した血餅水環境は、上記第5の水集団と関連し得る。
【００８８】
本明細書で使用する場合、「強固な血餅水環境」という用語は、強固な血餅中に見られる水環境を指す。「強固な血餅関連T2シグナル」とは、強固な血餅水環境から生じるシグナルを指し、これは、強固ではない血餅で観察されるものよりも緩慢な水交換速度を特徴とし（実施例21参照）、しばしばより短いT2緩和率を特徴とする。強固な血餅関連T2シグナルは、単一サンプルにおいて、血清関連T2シグナル及び別の血餅関連T2シグナル（すなわち緩い血餅からのシグナル）と共に現れることがある。
【００８９】
本明細書で使用する場合、「アルゴリズム」という用語は、データを処理又は変換するために使用する数値演算ルーチンを指す。
【００９０】
本明細書で使用する場合、「アッセイ」という用語は、血液凝固挙動をモニタリングする方法を指す。
【００９１】
本明細書で使用する場合、「凝固挙動」という用語は、血餅、形成している血餅又は溶解を生じている血餅に関連するパラメータ(例えば、凝固時間(R)、線溶挙動、血餅強度(MA)、血餅の動力学的挙動、血小板関連血餅強度(MAPLATELET)、機能性フィブリノーゲン関連血餅強度(MAFF)、MA30分後溶解％(LY30)等)を指す。
【００９２】
本明細書で使用する場合、「凝固プロセス」という用語は、サンプル中の溶媒水分子の局所的空間的変化をもたらし、水性液体中の溶媒水分子のNMR緩和率の変化により特徴づけられる液体のプロセスを指す。水性液体は溶媒水分子の一つ以上の集団を有することができ、各集団は水性サンプルが凝固プロセスを受けるにつれて変化するNMR緩和パラメータにより特徴づけられる。本発明の方法を使用して、それだけに限らないが、タンパク質性溶液(例えば、特に血液、血漿又はゼラチン)及び非タンパク質性ヒドロゲルを含むゲル形成成分を含有する水性溶液中の凝固プロセスをモニタリングすることができる。
【００９３】
本明細書で使用する場合、「溶解プロセス」という用語は、サンプル中の溶媒水分子の局所的空間的変化をもたらし、水性液体中の溶媒水分子のNMR緩和率の変化により特徴づけられる液体のプロセスを指す。水性液体は溶媒水分子の一つ以上の集団を有することができ、各集団は水性サンプルが溶解プロセスを受けるにつれて変化するNMR緩和パラメータにより特徴づけられる。本発明の方法を使用して、それだけに限らないが、タンパク質性溶液(例えば、特に血液、血漿又はゼラチン)及び非タンパク質性ヒドロゲルを含むゲル形成成分を含有する水性溶液中の溶解プロセスをモニタリングすることができる。
【００９４】
本明細書で使用する場合、「フィブリン接着を制御する」という用語は、血液サンプルを保持するサンプル管の内部表面について参照する場合、その内部表面が、コーティングされていないポリプロピレン管と比較して低減したフィブリン接着を示し、その一方で、血小板活性化の不在下で、自発的に収縮しない血餅の形成を許容することを意味する。フィブリン接着は、内部表面と接触するフィブリンによって直接起こることもあるし、又は内部表面に接着した他の1以上の血液成分と接触するフィブリンによって間接的に起こることもある。本発明の方法は、フィブリン接着を制御する内部表面を有するサンプル管を用いて実施することができる。T2MR法を使用して血餅形成を検出する場合、かかるサンプル管の使用は、緩い血餅形成に関連するT2MRシグナルの頑強性（例えば、信頼性及び再現性）を高めることができる。
【００９５】
本明細書で使用する場合、「機能性フィブリノーゲン」という用語は、血餅強度に寄与する血餅中のフィブリノーゲン又は得られるフィブリンを指す。
【００９６】
本明細書で使用する場合、「ゲル状態」という用語は、水分子の移動度が液体流体状態の水分子の移動度と比べて低下する、水及び固体を含む分散液を指す。ゲル状態は、ポリマー及び/又はタンパク質から(例えば、凝固血から、ゼラチンから、又は本明細書に記載する任意のゲル形成材料から)形成することができる。
【００９７】
本明細書で使用する場合、「アッセイの開始後の所与の時間」という用語は、血液凝固挙動をモニタリングすることを目的とするアッセイの開始後に凝固挙動を決定することができる時間を指す。アッセイの開始後の所与の時間の例としては、60分、35分、45分、10分、5分、2分及び1分が挙げられる。
【００９８】
本明細書で使用する場合、「心臓補助装置」という用語は、それだけに限らないが、体外心臓バイパス装置及び埋め込み型血液ポンプ、例えば、左心室補助装置を含む。
【００９９】
本明細書で使用する場合、「ヘマトクリット」という用語は、全血サンプル中の赤血球の体積百分率を指す。ヘマトクリット値は、2つの間の直接比例に起因するヘモグロビンレベルを決定するために用いることができる。
【０１００】
本明細書で使用する場合、「止血状態」という用語は、対象の血液の凝固挙動により特徴づけられる対象の状態を指す。止血状態は、血栓形成促進(血餅形成のリスクの増加)、出血(突発性出血のリスクの増加)又は正常(血栓形成促進でも出血でもない)であり得る。止血状態はまた、特定の血栓障害(例えば、プロテインC欠乏症、プロテインS欠乏症、プロテインZ欠乏症、アンチトロンビン欠乏症、抗リン脂質抗体症候群、抗凝固療法抵抗性、又は高ホモシステイン血症)を指すこともできる。他の例では、止血状態は、対象の生理学的状態に応じて又は対象の生理学的状態の発症を予防するために対象に投与される抗凝固薬による誘発され得る。このような生理学的状態には、心房細動、心筋梗塞、不安定狭心症、深部静脈血栓、肺塞栓症、及び急性虚血発作が含まれる。同様に、止血状態は、抗凝固薬を、関節置換術、手術置換人工心臓弁又は体に埋め込まれた他の装置などの侵襲外科手順を有する対象に投与することにより誘発され得る。対象の止血状態は、対象から採取した一つ以上の血液サンプルの一つ以上の凝固挙動を決定することにより評価され得る。
【０１０１】
本明細書で使用する場合、「磁気共鳴パラメータ」という用語は、NMR緩和率測定値から抽出した緩和率又は振幅を指す。
【０１０２】
本明細書で使用する場合、「NMR緩和率」という用語は、サンプル中の以下のいずれかを指す:T1、T2、T1rho、T2rho及びT2*。NMR緩和率は、T1/T2ハイブリッド検出法を使用して測定及び/又は表され得る。さらに、見かけの拡散係数(ADC)を決定及び評価することができる(VidmarらNMR in BioMedicine、2009;及びVidmarら、Eur J Biophys J. 2008)。
【０１０３】
本明細書で使用する場合、「血小板」という用語は、血餅形成に寄与する細胞要素を指す。
【０１０４】
本明細書で使用する場合、「所定の閾値」という用語は、本発明の方法から得られ、特定のレオロジー状態特有の又は正常若しくは異常結果特有の(正常対象の血液特有の又は異常止血状態を有する対象特有の)標準的パラメータ値又は値のセット、標準的時間曲線、又は標準的サイン曲線を指す。所定の閾値は、例えば、正常及び/又は異常対象の集団から採取した血液サンプル中のNMRパラメータ値を測定することにより得ることができる。所定の閾値は、サンプルについての二つ以上の異なる可能なレオロジー状態又はサンプルの種類に関連する二つ以上の異なる可能な臨床状態を識別するよう選択することができる。サンプルが血液サンプルである場合、所定の閾値を使用して、例えば、対象の止血状態を診断することができる。
【０１０５】
本明細書で使用する場合、「所定の耐用年数」という用語は、構成要素（例えば可融性連結を含む使い捨てのサンプル管）がその正常かつ意図する目的にとって機能的である時間の長さを指す。耐用年数は、設計により、例えば所定の数のNMRパルスの収集後に機能停止（failure）（例えば、50、500、1000又は10000より少ないパルス後の機能停止）する可融性連結を用いて、短縮又は長期化することができる。あるいは、所定の時間後（例えば、データ収集の30分、1時間、2時間又は3時間未満後）に可融性連結を有するサンプル管に過電流を印加して、連結を破壊し、コイルを動作不能にすることができる。
【０１０６】
本明細書で使用する場合、「リーダー」又は「T2リーダー」という用語は、サンプルの凝固及び線溶を含む凝固関連活性化を検出するための装置を指す。T2リーダーを使用して一般的にサンプル(例えば、血液などの生物学的サンプル又はアクリルアミドゲルなどの非生物学的サンプル)の特性を特徴づけることができる。このような装置は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2010/0513162号に記載されている。
【０１０７】
本明細書で使用する場合、「相対濃度」という用語は、ある水集団の別の(例えば、第2又は第3の)水集団に対する比較濃度又は体積分率を指す。例えば、水集団Aの相対濃度は、水集団Bの濃度よりも2倍(又は5倍又は10倍)大きくてもよい。
【０１０８】
本明細書で使用する場合、「水集団のシグナル強度」という用語は、(i)特定の水集団特有のピーク高さ又は(ii)特定の水集団特有のピーク(複数可)の積分として測定される、サンプル中の特定の水集団についての緩和率測定からの強度を指す。
【０１０９】
本明細書で使用する場合、「処理サンプル」という用語は、凝固開始剤(例えば、塩化カルシウム)の非存在下で正常サンプルの凝固を防ぐために必要とされるよりも高い濃度で添加剤を含有する血液サンプルを指す。
【０１１０】
本明細書で使用する場合、「未処理サンプル」という用語は、凝固開始剤(例えば、塩化カルシウム)の非存在下で正常サンプルの凝固を防ぐために必要とされるよりも高い濃度で添加剤を含有しない血液サンプルを指す。
【０１１１】
本明細書で使用する場合、「全血」という用語は、赤血球を含む対象の血液を指す。全血は、処理ステップを通して変化した又は添加剤(例えば、ヘパリン、クエン酸塩、ナノ粒子製剤、フィブリノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)、コラーゲン、アブシキシマブなどの抗血栓薬、又は他の添加剤)を添加することにより修飾された血液を含む。
【０１１２】
本明細書で使用する場合、「プールされた全血血小板」という用語は、多血小板血液又は血液製剤(例えば、血漿)を指す。プールされた全血血小板は、処理ステップを通して変化した又は添加剤を添加することにより修飾されたサンプルを含む。
【０１１３】
本明細書で使用する場合、「T1/T2ハイブリッド」という用語は、T1及びT2測定を組み合わせた任意の検出法を指す。例えば、T1/T2ハイブリッドの値は、二つ以上の異なるT1及びT2測定の比又は差の組み合わせを通して得られる複合シグナルであってもよい。T1/T2ハイブリッドは、例えば、T1及びT2が交互に測定される又は交互に取得されるパルスシーケンスを使用することにより得ることができる。さらに、T1/T2ハイブリッドシグナルは、T1とT2両方の緩和率又は機構で構成される緩和率を測定するパルスシーケンスを用いて取得することができる。
【０１１４】
本明細書で使用する場合、「T2サイン」という用語は、数学的変換(例えば、ラプラス変換又は逆ラプラス変換)を、レオロジーイベント中の離散的時点の又は設定期間にわたる緩和率パラメータに関連する減衰曲線に適用することにより確立される曲線を指す。T2サイン曲線は、血餅中の複数水集団の相対存在量についての情報を提供する。凝固又は線溶が進行するにつれて、T2サイン曲線は血餅中の変化を反映するだろう。T2サインを使用して、有利に対象の識別された止血状態をリアルタイムで評価することができる。さらに、T2サインは、二次元(強度対T2値又はT2値対時間)又は三次元表現(強度対T2値対時間)となり得る。二又は三次元表現中のT2値は、T1、T1/T2ハイブリッド、T1rho、T2rho及びT2*などの他のNMRシグナルと置き換える又は比較することができる。
【０１１５】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１Ａ】単一FIDのサンプル中の複数水集団についてのNMR緩和率を同定するためのグラフ及び式、並びにサンプルの凝固状態特有の緩和率から特徴を抽出する方法を示す図である。図1AはCKサンプルの三指数関数曲線フィット（あてはめ）(式2を使用する)を示すグラフである。
【図１Ｂ】単一FIDのサンプル中の複数水集団についてのNMR緩和率を同定するためのグラフ及び式、並びにサンプルの凝固状態特有の緩和率から特徴を抽出する方法を示す図である。図1Bは初期の速い相の打切り後のCKサンプルの双指数関数曲線フィット(式1を使用する)を示すグラフである。
【図１Ｃ】単一FIDのサンプル中の複数水集団についてのNMR緩和率を同定するためのグラフ及び式、並びにサンプルの凝固状態特有の緩和率から特徴を抽出する方法を示す図である。図1CはNMR緩和率の測定から血液凝固挙動を同定するために使用するアルゴリズムのグラフィック描写である。
【図２】凝固を生じている単一CK血液サンプル中の水の異なる集団について観察されたT2緩和値(T2A及びT2B)の変化を示す二つのプロットを示す図である。この図は、別個の水集団の緩和率を時間の関数としてモニタリングすることができることを示している。水集団AのT2値は、凝固プロセス中、最初に減少し、その後増加し、その後プラトーになる。水集団BのT2値は、凝固プロセス中最初に増加し、ピークになり、その後減少する。凝固又は溶解プロセスを生じている血液サンプル中の水集団についてのT2値の変化は、血液サンプルの凝固亢進又は凝固低下特有となり得る。
【図３−１】凝固を生じているCK血液サンプル中の水の異なる集団についての振幅値(AmpA及びAmpB)の変化を示す一連のプロットを示す図である。血液サンプルは、献血をするための基準を満たし、抗凝固薬を服用していない4人の異なる健常対象から採取した。凝固又は溶解プロセスを生じている血液サンプル中の水集団についての振幅値の変化は、血液サンプルの凝固亢進又は凝固低下特有となり得る。
【図３−２】図３−１の続き。
【図３−３】図３−２の続き。
【図３−４】図３−３の続き。
【図４】CK(カオリン)についてのAmpA及びAmpB対ADP(アデノシン二リン酸)+RF(レプチラーゼ及び第XIII因子)対2人の異なる患者からのA活性化サンプルの一連のプロットを示す図である(異なる活性化経路の記載については実施例1参照)。両サンプル中、カオリン活性化サンプルは、血餅形成中にAmpBの有意な増加を示した。両対象サンプル中、A活性化サンプルは、血餅形成中にAmpBの有意な増加を示さなかった。活性化因子RFはフィブリン形成を活性化する。ADP+RF活性化因子を使用すると、一対象のサンプルは血餅形成中にAmpBの有意な変化を示さなかったが、他の対象のサンプルは血餅形成中にAmpBの有意な変化を示した。異なる条件下(すなわち、異なる凝固開始剤又は凝固阻害剤の存在下)で凝固又は溶解プロセスを生じている血液サンプル中の水集団についてのNMRパラメータの値の変動は、血液サンプルの凝固亢進若しくは凝固低下特有及び/又はサンプルを採取した対象の止血状態特有となり得る。
【図５】単一患者についての代表的な処理したT2凝固曲線のセットを示す図である。元のT2A、T2B及びAmpB曲線を一番上の行に示す。中央の行は曲線の一次導関数を示し、一番下の行は曲線の二次導関数を示す。
【図６】T2A+pT2B曲線を計算する様式を示す図である;(a)pT2Bの添加がT2A曲線の形状にどのような影響を及ぼすかを示すT2Aプロット;(b)どのように最大T2B値と最大T2B値に達した後の全時点についての実測T2B値の差をとることによりpT2Bを計算するかを示すT2Bプロット;及び(c)T2A+pT2Bプロットを、同一時間記録器で、T2B曲線中の陰影部をT2A曲線に付加することにより作成する。
【図７】データシフト及び反映を抽出データに行ってTEGトレーシングを模倣したT2凝固曲線を示す図である。この図面は、水のプロービングにより、ミクロ的に早期の変化を明らかにし、凝固時間Rが観察される前から追加の情報を収集することが可能となることを示している。
【図８】未凝固血についてのT2シグナルはヘマトクリットレベルに反比例して変化することを示すグラフである。未凝固血についてのT2シグナルはヘマトクリット(HCT)レベルに反比例して変化する。図8(a)に示すように、広範囲のHCT基準値に及ぶ別個の患者のサンプルがこのことを一般的に示している。図8(b)に示すように、一定範囲のHCTにわたって希釈した単一患者サンプルに較正法を適用すると、HCTへの線形従属性を示す。
【図９】CK実行についてのT2 RとTEG Rとの間の相関プロットを示す図である;実線は相関プロットから計算した回帰線を表す。
【図１０】血小板関連血餅強度(MAPLATELET)に相当する、T2凝固特徴「T2A初期勾配」とTEG項(MATHROMVIN-MAA)との間の相関を示す図である。
【図１１】50％クエン酸塩添加全血中の機能性フィブリノーゲン滴定からのT2凝固結果を示す図である。二つのT2凝固振幅プロットは、同一強度スケールでAmpA及びAmpBを示す;(a)はフィブリノーゲンを添加していない50％クエン酸塩添加全血である;(b)は1.25mg/mLフィブリノーゲンを添加した50％クエン酸塩添加全血である;そして(c)は患者サンプルに行ったフィブリノーゲン滴定についての相関プロットを示す。
【図１２】線溶へのT2凝固感度を示す図である。2人の異なる患者についてのT2A曲線を(a)及び(b)に示し;同じ2人の異なる患者についてのT2B曲線を(c)及び(d)に示す。実線は線溶の非存在下でのカオリン曲線を示し、破線は線溶の存在下でのカオリン曲線を示す。
【図１３】健常及び線溶サンプルについてのT2凝固とTEGとの間の相関プロットを示す図である。実線円内のデータ点は健常K実行である。破線円内のデータ点は線溶K実行についてのものである。両円の外のデータ点は部分的線溶実行についてのものである。
【図１４】本発明の方法と既存の分析様式を比較する相関プロットを示す図である。Stagoを用いたPT/INRについての予備相関を、トロンボプラスチン試薬(Thrombotest、Axis Shield)及びT2MR用の全血の1:5希釈及び標準試薬及びStago Startシステム用の血漿プロトコルを使用して証明した(図14A参照)。TEG凝固時間との相関は、0.8より大きい非最適化R2相関で40を超える正常患者サンプルにわたって得られた(図14B参照)。血漿についてのStagoとの(図14D参照)及び全血についてのHemochronとの(図14C参照)PT時間相関も見られた。実施例7を参照されたい。
【図１５】T2減衰曲線及び対応するT2サイン曲線を示す図であり、サンプルの組成の変化の関数としてT2サイン曲線でサインの変化可能性がある。
【図１６】患者サンプルKP29476に相当するT2データの逆ラプラス変換と、分離後の血清及び退縮した血餅から得られたT2データの別々の逆ラプラス変換を示す図である。プロットは、強い血餅の形成により二つの別個の水集団(すなわち、血餅中の水の集団及び血清中の水の集団)がもたらされることを示している。高いT2時間でのシグナルは血清関連T2シグナルに相当し、低いT2時間でのシグナルは血餅関連T2シグナルに相当する。
【図１７】同一患者から採取した二つの異なるサンプルについての二つの重ねたT2緩和率及びTEG血餅強度(MA)を示す図である。弱い血餅(MA=19.2)を含有するサンプルは、強い血餅を含有するサンプル(MA=65;258ms)よりも、血餅関連シグナルと血清関連シグナルの差について低い値(182ms)を示した。図17に示すスペクトルはT2リーダーで収集した。
【図１８】血餅強度(MA値)を血餅関連シグナルと血清関連シグナルの差(ΔT2)と相関させた2人の患者についてのグラフである。データは、血餅強度の増加がΔT2と正に相関することを示している。
【図１９】二つの異なる時点においてT2リーダーで収集した患者サンプルについての二つのT2緩和スペクトルを示す図である。スペクトルは、サンプル中の血液と一致する時間0での初期の有意なピークを示している。20分で、二つの有意なピークが明らかである。低いT2時間(約200〜300ms)のピークはT2血餅水環境と一致し、高いT2時間(約450〜580ms)のピークはT2血清水環境と一致する。
【図２０】患者サンプル29328及び29350についての3Dプロットを示す図である。サンプル29328及び29350について測定されたTEG MA値はそれぞれ68.4及び61.9であった。
【図２１】実施例14に記載する、4種の異なる濃度のアブシキシマブを含有する4種のサンプルについての3Dプロットを示す図である。データはBruker minispecで収集した。
【図２２】実施例14に記載する、0.1分での異なる濃度のアブシキシマブを含有する5種の血液サンプルについてのT2緩和率スペクトルを示す図である。データはBruker minispecで収集した。
【図２３】実施例14に記載する、20分での異なる濃度のアブシキシマブを含有する4種の血液サンプルについてのT2緩和スペクトルを示す図である。4種のT2緩和スペクトル間の差は、抗血小板薬の、凝固中のサンプル中の別個の集団への水の分配に対する効果を示している。これらの差は、TEGにより測定される血餅強度の差に相当し、水集団がより高濃度のアブシキシマブで融合するにつれて血餅強度は低下する。データはBruker minispecで収集した。
【図２４】T2リーダーを使用して収集した3Dデータセットから構築した3Dプロットを示す図である。3Dプロットは、強度が急速に低下する初期の有意な水集団を示している。8〜10分の間の時間で、二つの異なる水集団は融合する。低いT2値を有する水集団(血餅関連T2シグナルに相当する集団)の出現は、凝固時間と一致する。
【図２５】(a)Reopro(登録商標)を添加していない天然サンプル及び(b)8μg/mLのReopro(登録商標)で阻害された血小板を含むサンプルについての、T2リーダーを使用して収集した3Dデータセットから構築した2つの3Dプロットを示す図である。3Dプロットは、強度が急速に低下する初期の有意な水集団を示している。(a)の天然サンプルについて、6.3〜8.5分の間の時間で二つの異なる水集団が融合する。血小板阻害は血餅関連シグナルのシグナル強度を低下させ、血清関連シグナルを低いT2値へ移動させる。
【図２６】異なるサイズの常磁性剤を含む及び含まない血液サンプルのT2緩和曲線の変化を示す図である。サンプルを、磁性粒子を用いないで(図26(A)参照)、CLIOナノ粒子を用いて(30nmサイズ;約0.05ng)(図26(B)参照)、Seramag超常磁性粒子を用いて(730nmサイズ;約0.05ng)(図26(C)参照)実行した。30nmナノ粒子を添加することにより、典型的なクエン酸塩添加カオリン実験で血餅シグナル(T2=200ms)が消え、T2約100msの1ピークのみが存在する。730nm超常磁性粒子を添加することは両ピークを観察する能力に干渉しない。実施例4を参照されたい。
【図２７】T2MR表面が全血線溶に感受性であることを示す図である。これを評価するために、健常ドナーサンプルに組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)を添加した。線溶についての結果への高感度及び速い時間が証明された。実施例19を参照されたい。
【図２８】サンプル中の水の種々の集団に関する交換速度を定性的に評価するためのD2Oの添加を有する、血液サンプルのT2緩和曲線の変化を示す図である(実施例21参照)。
【図２９】D2Oの添加を有する（図29B）及び有しない（図29A）、単離された強固な血液血餅に関するT2シグナルの変化を示す図である(実施例21参照)。
【図３０】標識された各特徴(特徴A〜特徴G)を有する血液サンプルのT2緩和曲線の変化を示す図である。特徴の元となる根底にある物理的変化の記述は、実施例22で提供する。
【図３１】フィブリン接着を制御する内部表面を有するサンプル管におけるADP活性化の滴定応答を示すグラフである(実施例23参照)。この図は、(i)ADP平地線の低レベル(0.5及び1mM、血餅形成シグナルは観察されない)、(ii)ADPの高レベルは、同等である(5、10、20mM、完全な血餅形成が観察される)、及び(iii)中間レベル(2.5mM ADP)で、部分的な血餅形成が観察されることを示している。
【図３２】フィブリン接着を制御するコーティングを有する及び有さないサンプル管における血液サンプルの5μM ADP活性化のT2MR応答を示すグラフである。コーティングされていないサンプル管において、血餅形成は、T2MRシグナルによって検出されない。対照的に、コーティングされた管において、血餅形成が明確に観察される。
【図３３】図33Aは、凝血及び血小板活性化を促進するためのEXTEM組織因子試薬を使用した、T2MR応答を示す一連のグラフである。このアッセイにおいて、35.3μLクエン酸塩添加全血を、200μLプラスチックPCR管において2.4μL ex-temプラス2.4μL star-temと混合した(ex-tem及びstar-temは、ROTEM試薬である)。サンプル混合物を、T2MR単一チャネルリラクソメータに37℃で置き、T2Hemostat(商標)ソフトウェアをデータ取得のために、ILT(逆ラプラス変換)処理を、CPMGをデコンボリューションして構成要素T2シグナルにするために使用して、データを取得した(CPMGベースライン減算での時点毎10秒取得)。示されたグラフによるアウトプットを、処理のためのMATLABにコード化した。図33Bは、0.1USP単位/mlヘパリンの存在下でカオリン活性化を使用した、T2MR応答を示す一連のグラフである。カオリンと予め混合した34μLクエン酸塩添加ヘパリン添加全血を、200μL PCR管における2μLの200mM塩化カルシウムで活性化した。サンプル混合物を、T2MR単一チャネルリラクソメータに37℃で置き、T2Hemostat(商標)ソフトウェアをデータ取得のために、ILT(逆ラプラス変換)処理を、CPMGをデコンボリューションして構成要素T2シグナルにするために使用して、データを取得した(CPMGベースライン減算での時点毎10秒取得)。示されたグラフによるアウトプットを、処理のためのMATLABにコード化した。
【図３４】1/T2とヘマトクリットとの間の関係を示すグラフである。1/T2とヘマトクリットとの間の関係は、直線的である。サンプルのヘマトクリットは、均一な血液サンプルのT2読み取りを測定し、図34で提供した曲線などの較正曲線を適用することによって決定することができる。
【図３５】ADP応答性及び非応答性ドナーサンプルに関するLTAとT2MRとの間の相関を示すグラフである(実施例24参照)。相関は、1mMアラキドン酸で試験した応答性及び非応答性ドナーサンプルに関する多血小板血漿におけるLTAと全血におけるT2MRとの間に見られる。非応答性サンプルを、600mMアスピリンへの曝露によって調製した。2つの相違したサンプルは、T2MRに対する応答性を示したが、LTAに対する応答性の基準を満たさなかった。
【図３６】図36Aは、血漿フィブリノーゲンアッセイに関する標準曲線を計算するために使用した一連の標準血漿希釈物を示すプロットである。図36Bは、全血フィブリノーゲン決定に関する単一T2MRトレースを示すプロットである。このアッセイは、トロンビンによるフィブリノーゲンからのフィブリン形成の最初の速度を測定する。
【図３７】血漿サンプル中のT2MR勾配とフィブリノーゲン濃度との相関関係を示す較正曲線を示すプロットである(実施例25参照)。
【図３８】フィブリン接着を制御する内部表面を有するサンプル管におけるエピネフリン活性化の滴定応答を示すグラフである(実施例26参照)。サンプルは、エピネフリン濃度の範囲にわたって反応性であり、血餅収縮のタイミングは、用量依存的である。
【図３９】フィブリン接着を制御する内部表面を有するサンプル管におけるエピネフリン活性化の滴定応答を示すグラフである(実施例27参照)。サンプルは、TRAPの範囲全体にわたって反応性であった。試験した濃度範囲にわたって、血餅収縮のタイミングへの用量依存性はなかった。
【発明を実施するための形態】
【０１１７】
本発明の方法及び装置を使用して、血管疾患を有する又は有する疑いがある患者、特に経皮介入を受けた、また例えば、ステント血栓症、血管再狭窄、心筋梗塞又は発作の急性リスクがあるような患者において、心筋虚血イベントを含む血栓性イベントのリスク及び発生を評価することができる。例えば、本発明の方法及び装置を使用して、薬物療法への応答性(例えば、クロピドグレル(clopidogrel)などの抗血小板薬の投与後の血小板反応性の変化により評価される)と独立した、心筋虚血などの血栓性イベントのリスクについての指標としての血小板反応性(すなわち、血餅中の血小板関連水分子の相対濃度)、凝固動力学、血餅強度、血餅安定性、及び時間-フィブリン生成(すなわち、R)を評価することができる。これらの指標を使用してステント血栓症又は再狭窄などの外科的及び経皮的血管手順(例えば、ステント留置又はバルーン血管形成術)から生じる合併症を予防することもできる。さらに、本発明の方法及び装置を使用して、血栓性イベントのリスクがある又は外科的手段を受けている患者のための安全で有効な療法(例えば、用量、レジメン、特に、抗血症板療法)を同定することができる。
【０１１８】
本発明の方法及び装置を使用して一つ以上の位置又は区画に水を有する複合サンプル(すなわち、一つ以上の水集団を有するサンプル)をモニタリングすることができる。例えば、不均一サンプル、すなわち全血中には、水の種々の集団、例えば、血漿水、区画水、すなわち、細胞(赤血球、白血球及び血小板)水、並びに凝固(例えば、血清、血餅)又は血餅溶解などの全血プロセスの機能的特徴に関連する水が存在する。同様に、レオロジー移行を生じているサンプル中には、一般的に一つ以上の水の集団;例えば、ゲル状態に関連する水、ゲル状態に関連しない水、及びいくつかの例では、サンプルの専門区画に関連する水(すなわち、細胞水)が存在する。本発明の方法により、サンプル中に存在する種々の水集団の変化を同時に観察することによりサンプル中の変化をモニタリングすることが可能になる。変化には、新たな水集団の形成又は既存の水集団の相対シグナルの変化が含まれ、この両方はレオロジー変化(例えば、サンプル中の構造の秩序化又は無秩序化)前、中又は後のサンプルの基礎をなす物理的特性特有であり得る。
【０１１９】
凝固開始
本発明の方法を行うために、種々の技術を使用して凝固を開始することができる。クエン酸塩添加カオリン(CK)、エラグ酸及びセライトは、aPTT(活性化部分トロンボプラスチン時間)及び全血凝固時間のための一般的で世界的な開始剤である。例えば、凝固プロセスを開始するために、塩化カルシウム及びカオリンをクエン酸塩添加血液サンプルと混合する。CK活性化サンプルは、血小板及びフィブリンが血餅に寄与する血餅形成により特徴づけられる。あるいは、活性化因子RFを使用して、TRAP、エピネフリン、AA、コラーゲン又はADPなどの血小板活性化因子へ添加して又は添加しないで凝固を開始することができる。A活性化サンプルは、血小板よりもむしろフィブリンが主に血餅に寄与する血餅形成により特徴づけられる。あるいは、ADP（又はADP＋RF）を使用して血餅を活性化してもよい。ADP活性化サンプルは、フィブリンが主に血餅に寄与し、血症板はより小さい程度に寄与する血餅形成により特徴づけられる。異なる活性化条件下で観察されるシグナル応答は、対象の止血状態の診断に役立つことができる。
【０１２０】
組織因子は、PT、希釈PT測定値、及び外的経路活性化（例えばEXTEM、トロンボエラストメトリ（血栓弾性率測定法）試験により行われるもの）にとって一般的な別の広範囲開始剤である。組織因子活性化サンプルは、CK活性化サンプルのような血餅強度及び凝固時間測定値を生じうる。
【０１２１】
本発明の方法に使用することができる他の血液凝固活性化因子には、コラーゲン、エピネフリン、リストセチン、トロンビン、カルシウム、組織因子、プロトロンビン、トロンボプラスチン、カオリン、セロトニン、血小板活性化因子(PAF)、トロンボキサンA2(TXA2)、フィブリノーゲン、フォンヴィルブランド因子(VFW)、エラスチン、フィブリノネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、トロンボスポンジン及びランタノイドイオン(例えば、ランタン、ユーロピウム、イッテルビウム等)が含まれる。活性化因子の組み合わせを使用して、例えば、凝固低下している対象の血液サンプルをもたらす基礎止血状態を同定するのを助けることができる。
【０１２２】
シグナル取得及び処理
核共鳴パラメータを決定するための標準的な高周波パルスシーケンスが当技術分野で知られており、例えば、緩和定数T2を決定しなければならない場合、Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)が伝統的に使用されている。シーケンスにおける高周波パルスの周波数、パルスパワー及びパルス長の選択を含む高周波パルスシーケンスの最適化は調査中のシステムに依存し、当技術分野で既知の手順を使用して行われる。
【０１２３】
本発明の方法を使用して得ることができる核磁気共鳴パラメータには、それだけに限らないが、T1、T2、T1/T2ハイブリッド、T1rho、T2rho及びT2*が含まれる。典型的には、本発明の方法を使用して得られる一つ以上の核共鳴パラメータの少なくとも一つはスピン-スピン緩和定数T2である。
【０１２４】
他の診断及び分析計装と同様に、NMRに基づく診断の目標は、サンプルから情報を抽出し、高信頼結果を使用者に伝えることである。情報は、サンプルから使用者に流れるにつれて、典型的には情報を特定の使用者に適合させるためのいくつかの変換を受ける。本発明の方法及び装置を使用して対象の止血状態についての診断情報を得ることができる。これは、NMR緩和シグナルを、例えば、凝固している又は凝固した血液サンプル中に存在する水分子の異なる集団を表す一つ以上の一連の成分シグナルに処理することにより達成される。例えば、T2などのNMR緩和データは、以下の式:
【数２】
2016500443.tif 000003
【０１２５】
［f(t)は時間tの関数としてのシグナル強度であり、Aiはi個目の成分についての振幅係数であり、(T)iはi個目の成分についての減衰定数(T2など)である］
により定義される減衰指数関数曲線にフィットし得る。ここで論じる緩和現象については、検出されるシグナルは離散した数の成分(i=1、2、3、4・・・n)の和である。このような関数をそれぞれ単一、双、三、四又は多指数関数と呼ぶ。科学及び工学において、多指数関数プロセスを分析する必要性が広がっているために、各係数についてAi及び(T)iの推定値を迅速に得るためのいくつかの確立された数学的方法が存在する。うまく適用されてきた、本発明の方法を使用して得られた生データの処理に適用することができる方法には、ラプラス変換、代数法、図式解析、非線形最小二乗法(多くの変種が存在する)、分染法、関数変調法、積分法、モーメント法、有理関数近似、Pade-Laplace変換、及び最大エントロピー法が含まれる(Istratov, A. A.及びVyvenko, O. F. Rev. Sci. Inst. 70:1233(1999)参照)。低磁場NMRについて具体的に示されてきた他の方法には、特異値分解(Lupu, M.及びTodor, D. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems 29:11(1995))及び因子分析法が含まれる。
【０１２６】
これらの指数関数あてはめ（フィッティング）法の一つ以上を使用するいくつかのソフトウェアプログラム及びアルゴリズムが利用可能である。指数関数あてはめプログラムについて最も広く引用されている供給源の一つはStephan Provencherにより書かれ、提供されているものであり、「DISCRETE」及び「CONTIN」(Provencher, S. W.及びVogel, R. H. Math. Biosci. 50:251(1980);Provencher, S. W. Comp. Phys. Commun. 27:213(1982))と呼ばれる。Discreteは多成分指数関数曲線中の最大9個までの別個の成分を解決するためのアルゴリズムである。CONTINは緩和時間の分布を有するサンプルを解決するために逆ラプラス変換を使用するアルゴリズムである。多指数関数解析を使用した市販のアプリケーションは、これらの又は類似のアルゴリズムを使用している。実際、Bruker minispecはその解析のいくつかに一般的に利用可能なCONTINアルゴリズムを使用している。ここに記載する発明については、緩和時間は各サンプルに特有の離散値であると予想されるので、CONTINのようなプログラムは、使用することができるであろうが、必要ではない。多くの他の指数関数あてはめ法についてのコードは、一般的に利用可能であり(Istrav, A. A.及びVyvenko, O. F. Rev. Sci. Inst. 70:1233(1999))、これを使用して本発明の方法による医学診断情報を得ることができる。シグナルとノイズの比及び総サンプリング時間が、決定することができる項の最大数、達成することができる最大解像度、及びフィットさせることができる減衰定数の範囲にどのように関連するのかに関する情報が利用可能である。約104のシグナルとノイズの比については、解析法と独立して測定される二つの減衰定数の解像度に関する理論限界は1.2より大きい解像度δ=(Ti/Ti+1)である(Istratov, A. A.及びVyvenko, O. F. Rev. Sci. Inst. 70:1233(1999))。したがって、解像可能な減衰定数間の差は、その大きさに比例して増加し、これは完全には直感的ではなく、光検出による解像度と異なっている。最大解像度及びシグナルとノイズ比の解像度への依存を理解することは、あてはめアルゴリズムの性能を評価することに役立つだろう。
【０１２７】
本発明の方法は、TEG(登録商標)、ROTEM(登録商標)又はSONOCLOT(登録商標)などの当技術分野で既知のシステム及び装置、或いはレオロジー変化を測定するための他の装置と比較することができる。さらに、本発明の方法を、ベンチトップNMRリラクソメータ(relaxometer)、ベンチトップ時間領域システム、又はNMR分析装置(例えば、ACT、Bruker、CEM Corporation、Exstrom Laboratories、Quantum Magnetics、GE Security division、Halliburton、HST-111 Magnetic Solutions、MR Resources、NanoMR、NMR Petrophysics、Oxford Instruments、Process NMR Associates、Qualion NMR Analyzer、SPINLOCK Magnetic Resonance Solutions又はStelar, Resonance Systems)で使用することができる。
【０１２８】
T2リーダーでデータを収集するために使用するCPMGパルスシーケンスを、サンプルの固有T2緩和時間を検出するよう設計する。典型的には、これは一つの値により指示されるが、複雑な状態の混合物を含有するサンプル(例えば、凝固プロセス又は溶解プロセスを生じているサンプル)については、T2値の分布を観察することができる。この状況では、CPMGシーケンスを用いて得たシグナルは指数関数の和である。T2リーダー出力から緩和情報を抽出するための一つの解法は、最小二乗様式で指数関数の和をフィットすることである。実際、これはいくつの関数をフィットするかについての先験的情報を要する。第2の解法は、逆ラプラス変換(ILT)を使用して観察される指数関数シグナルを構成するT2値の分布を解決することである。さらに、CPMGシーケンスS(t)の結果を指数関数の和であると仮定する:
【数３】
2016500443.tif 000004
【０１２９】
［Aiは緩和時間定数T2iに相当する振幅である。］
指数関数の離散的和の代わりに、シグナルをT2値の分布であると仮定すると、状態にわたる和はb:
【数４】
2016500443.tif 000005
【０１３０】
と表すことができる。これはILTと同じ関数型を有し:
【数５】
2016500443.tif 000006
【０１３１】
同様に処理することができる。指数関数のILTは解決するために制約を要する。制約を課すために使用することができる少数の方法は、CONTIN、有限混合モデル(FMM)及びニューラルネットワーク(NN)である。逆ラプラス変換も3Dデータセットの作成に使用することができる。3Dデータセットは、時系列のT2減衰曲線を収集し、逆ラプラス変換を各減衰曲線に適用して3Dデータセットを形成することにより作成することができる。あるいは、2D逆ラプラス変換を事前組立(pre-assembled)3Dデータセットに適用してT2時間の分布を記載する変換3Dデータを作成することができる。
【０１３２】
二つの相を含有する不均一環境では、いくつかの異なる交換体制が有効となり得る。二つの水集団(a及びb)を有するこのような環境では、ra及びrbが二つの集団中の水の緩和率に相当し;ｆa及びｆbが各相の核の分画に相当し;τa及びτbが各相中の滞留時間に相当し;a=(1/τa)+(1/τb)が化学交換率に相当する。交換体制は、(1)遅い交換:二つの集団が静的である又は緩和率ra及びrbに対してゆっくり交換している場合にシグナルが時定数T2a及びT2bで減衰する二つの別々の成分を含有する;(2)速い交換:二つの環境間で交換している水分子についての速度がra及びrbと比べて速い場合に全集団が別々の集団の緩和率の加重和により与えられる平均緩和率(rav)を有する単一指数関数減衰に従う;並びに(3)中間交換:二つの緩和率r1及びr2が存在し、ra<rb、Amp1+Amp2=1の遅い交換限界でr1がraと等しい場合と速い交換限界でr1,2が平均緩和率になる一般的な場合に、式7、8、9及び10を適用することができる:
【数６】
2016500443.tif 000007
【０１３３】
本発明はまた、緩和率データの収集にパルス磁場勾配又は固定磁場勾配を使用することを特徴とする。本発明はさらに、参照により本明細書に組み込まれる、Vidmarら(Vidmarら、NMR Biomed. 23:34〜40(2010))に記載されている拡散強調画像法(DWI)、又は多孔質材料NMRに使用される任意の方法(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Bergmanら、Phys. Rev. E51:3393〜3400(1995)参照)などの技術を使用することを特徴とする。
【０１３４】
他のシステムを使用して本発明を実施することもでき、例えば高解像度卓上NMR磁石及び分光計（例えばMagritek's ultra-compact spectromter、picospin45、NanalysisNMReady 60pは40MHz〜60MHzの範囲をカバーする）、高解像度低温システム、及び磁気共鳴映像システムがある。十分な磁場の均一性を有するものとして、NMR分光計を使用して、凝固中の血液サンプル内の1を超える水集団の化学シフトをモニタリングすることができる。この方法を使用して、特有の化学シフトシグナルを、強固に結合した血餅と関連付けることができる。血餅シグナル及び非血餅シグナルの異なる化学シフトは、核の固有の化学シフトから生じ、強固に結合した血餅内の水の拡散を緩慢にし、並びに赤血球内のヘムの常磁性中心に起因する微視的不均質性をもたらす。常磁性作用は、当技術分野で公知のように、いくつかの報告、例えばEvans NMR法など（Chu et al., Magn Reson Med, 13:239 (1990)参照）で化学シフトの変化を誘導することが示されている。
【０１３５】
あるいは、T2ではなくて、T2*又は自由誘導減衰の測定を使用して本発明の方法を行う場合、例えば、サンプル中の水プロトンの特定のクラスの緩和特性を、オフ共鳴放射(すなわち、正確にはラーモア歳差運動周波数でない放射)を使用して作成することができる。出力は完全エコートレインではなくT2測定パルスシーケンスを用いて得た単一エコーの高さの形であり得る。対照的に、正常T2測定は、T2を決定するためにいくつかのエコーの減少する高さを利用する。T2*アプローチは、印加した磁場の周波数又は強度をシフトするステップと、水プロトン吸収ピークの広さを測定するステップとを含むことができ、ここではより広いピーク又はエネルギー吸収がより高い値のT2と相関する。本方法は、水拡散を測定する技術を用いて、又はエコートレインの勾配を利用して実施することができる。特定の実施形態において、測定は、CPMGシーケンス、又はその一部を用いて行い、例えばサンプルホルダーに付随するシグナルを除去する。
【０１３６】
常磁性剤
本発明の方法は、例えば、凝固を開始する前に血液に添加される常磁性剤(例えば、マンガン、マンガン錯体、ガドリニウム、ガドリニウム錯体又は超常磁性粒子)の存在下で行うことができる。常磁性剤は遊離マンガン、マンガン錯体(例えば、マンガンのEDTA錯体)、遊離ガドリニウム、ガドリニウム錯体(例えば、ガドリニウムのDTPA若しくはDOTA錯体)又は超常磁性粒子であり得る。常磁性剤を使用して、凝固開始後のより早い時点で凝固サンプルを未凝固サンプルと識別することができる(図46参照)。
【０１３７】
本発明の方法に使用することができる超常磁性粒子には、例えば、その各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第7,564,245号及び米国特許出願公開第2003-0092029号に記載されているものが含まれる。超常磁性粒子は、一般的に抱合体の形態である、すなわち、超常磁性粒子は粒子と測定される全血サンプルの構成要素の特異的及び非特異的結合を最小化する部分でコーティングされている。粒子は、その鉄、金属酸化物又は他の強若しくはフェリ磁性体ナノ材料の超常磁性のために高い緩和度を有する。鉄、コバルト及びニッケル化合物及びこれらの合金、ガドリニウムなどの希土類元素、並びに金及びバナジウムなどの一定の金属間化合物が超常磁性粒子を製造するために使用することができる強磁性体である。超常磁性粒子は、単分散性(一超常磁性粒子当たり、単結晶の磁性材料、例えば、超常磁性酸化鉄などの金属酸化物)又は多分散性(例えば、一磁性粒子当たり複数の結晶)であり得る。磁性金属酸化物はまた、コバルト、マグネシウム、亜鉛又は鉄とこれらの金属の混合物を含むこともできる。超常磁性粒子は、典型的には、一結晶当たり約1〜25nm、例えば、約3〜10nm又は約5nmの直径の金属酸化物結晶を含む。超常磁性粒子はまた、例えば、約5〜20nm厚さ以上のコア及び/又はコーティングの形態のポリマー成分も含むことができる。超常磁性粒子の全体サイズは、例えば、20〜50nm、50〜200nm、100〜300nm、250〜500nm、400〜600nm、500〜750nm、700〜1200nm、1000〜1500nm又は1500〜2000nmであり得る。超常磁性粒子サイズは、反応条件を調節することにより、例えば、米国特許第5,262,176号に記載されているように、鉄塩を塩基で中和させる間に低温を使用することにより、制御することができる。均一粒径材料はまた、例えば、米国特許第5,492,814号に記載されているように、遠心分離、限外濾過又はゲル濾過を使用して粒子を分画することにより製造することができる。超常磁性粒子はまた、Molday(Molday, R. S.及びD. MacKenzie、「Immunospecific ferromagnetic iron-dextran reagents for the labeling and magnetic separation of cells」、J. Immunol. Methods、52:353(1982))の方法に従って合成し、過ヨウ素酸塩で処理してアルデヒド基を形成することができる。次いで、アルデヒド含有超常磁性粒子をジアミン(例えば、エチレンジアミン又はヘキサンジアミン)と反応させて、これによりシッフ塩基が形成し、次いでこれを水素化ホウ素ナトリウム又はシアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いて還元させることができる。超常磁性粒子は、強磁性流体(すなわち、超常磁性粒子の安定なコロイド懸濁液)から形成することができる。例えば、超常磁性粒子は、サイズが数十nm程度であり、粒子上に吸着されてこれを安定化する界面活性剤を含有する流体に分散させられた、又は金属イオン溶液の塩基性媒体中での沈殿による、複数金属酸化物結晶の複合体であり得る。適当な強磁性流体は、会社Liquid Research Ltd.により参照:WHKS1S9(A、B又はC)(直径10nmの粒子を有する磁鉄鉱(Fe3O4)を含む水系強磁性流体);WHJS1(A、B又はC)(直径10nmの磁鉄鉱(Fe3O4)の粒子を含むイソパラフィン系強磁性流体);及びBKS25デキストラン(直径9nmの磁鉄鉱(Fe3O4)の粒子を含む、デキストランで安定化された水系強磁性流体)で販売されている。本発明のシステム及び方法に使用するための他の適当な強磁性流体は、約70重量％のα-Fe2O3粒子(直径約10nm)、15重量％のオクタン、及び15重量％のオレイン酸を含む、Ademtechから市販されているオレイン酸安定化強磁性流体である。超常磁性粒子は、典型的には複数の金属酸化物結晶及び有機マトリックスを含み、超常磁性粒子の表面と結合部分を連結する官能基(すなわち、アミン基又はカルボキシ基)で装飾された表面を有する複合体である。例えば、本発明の方法に有用な超常磁性粒子には、Dynal、Seradyn、Kisker、Miltenyi Biotec、Chemicell、Anvil、Biopal、Estapor、Genovis、Thermo Fisher Scientific、JSR micro、Invitrogen及びAdemtechから市販されているもの、並びにその各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第4,101,435号;第4,452,773号;第5,204,457号;第5,262,176号;第5,424,419号;第6,165,378号;第6,866,838号;第7,001,589号;及び第7,217,457号に記載されているもの、並びにPCT公開第WO 2012/054639に記載されているものが含まれる。
【０１３８】
サイン曲線のデータベース
一実施形態では、本発明は、生の緩和NMRデータを止血状態特有のサイン曲線をもたらすフォーマットに変換するためのデータ処理ツールを特徴とする。好ましい変換には、ラプラス変換又は逆ラプラス変換(ILT)が含まれる。各T2測定についてのデータを、シグナル強度を時間に対してプロットする時間次元から「T2緩和」次元に変換することができる。ILTは、サンプル中に存在する異なる緩和率及びその相対的大きさについての情報だけでなく、これらのシグナルの分布の幅の報告も提供する。
【０１３９】
各取得されたT2緩和曲線は、異なる水の集団の全て、又は水がサンプル中で受けている異なるT2緩和環境をマップする、対応する二次元サインを有する。凝固時間次元の持続期間にわたってプロットを積み重ねることにより、これらの曲線を編集して3Dデータセットを形成することができる。これを使用して、どのように水の異なる集団が時間の関数として変化するかを示す3D表面を作成することができる。
【０１４０】
T2サインは、基礎病理学が現在の技術により識別されない場合には臨床的に関連するものとなり得る。例えば、異常なPT又はaPTT値を有する患者を、患者血液と正常な血漿の1:1混合物を使用したPT、aPTT又はPT及びaPTT解析を含む追加の試験(因子欠乏を除外するため)により精密検査し、この結果により特定の因子又はフォンヴィルブランド因子欠乏が示され得る。しかしながら、凝固因子欠乏の患者は頻繁に一つ以上の欠乏を有する又は不均衡若しくは抑制されていない凝固カスケードを有する。これらの患者では、一つの因子欠乏についての単一試験では完全な機能障害が明らかにならず、臨床医は臨床症候学(過剰の出血又は凝固)に頼らなければならず、不幸にも、時間により有害な結果がもたらされ得る。T2サイン(正常又は異常止血状態を有する患者について)を検出する能力により、複雑な病態生理学的凝固カスケード状態を迅速に理解することが可能になり、臨床結果が改善するだろう。
【０１４１】
本発明の方法を使用して集めたデータは、異なるNMRパラメータから作成した3Dプロットを使用して表すことができる。特定の患者型又は凝固曲線型を見ることにより、追加の次元を加えることができる。データ削減法を使用して利用可能な複雑な情報を単純化することができる。主成分分析(PCA)、特徴の自動抽出法、又は他のデータ処理法のような技術を使用することができる。理想的には、サイン、2D及び3Dプロットのライブラリーを多種多様な臨床状態について作成することができる。例えば、二次元(強度対T2値若しくはT2値対時間)又は三次元表現(強度対T2値対時間)である。二又は三次元表現のT2値をT1、T1/T2ハイブリッド、T1rho、T2rho及びT2*などの他のNMRシグナルと置き換える又は比較することができる。
【０１４２】
関連する実施形態では、サンプル中の凝固又は溶解プロセスを、サンプルから得た一つ以上の自由誘導減衰(FID)シグナルから抽出したNMRパラメータにより評価する。例えば、NMRパラメータを、FIDのシグナル対ノイズ比から、FIDと所定の閾値の比較から、FIDの積分から、又はFIDの異なる点を使用した比の計算から抽出することができる。この方法により得られたNMRパラメータを使用して種々の凝固又は溶解プロセスを特徴づけることができる。特定の例では、血液サンプルの一つ以上のFIDから抽出した値を使用して、凝固時間(R)、線溶挙動、血餅強度(MA)、血餅の動力学的挙動、血小板関連血餅強度(MAPLATELET)、機能性フィブリノーゲン関連血餅強度(MAFF)又はMA30分後溶解％(LY30)などの血液凝固挙動を計算することができる。同様に、FIDデータから抽出したデータを使用してサイン曲線のライブラリーを組み立てることができる。
【０１４３】
3Dデータプロット
凝固プロセス又は溶解プロセスを生じているサンプルのT2データの3D表現を、本発明の方法(例えば、実施例18に記載する方法)を使用して作成することができる。一定の実施形態では、作成した3Dプロットの次元は緩和時間(例えば、T2又は1/T2)次元、強度若しくは振幅次元、及び時間次元に相当する。時間次元は、凝固プロセスが進行した又は進行している時間を表す。凝固血液サンプルから得られた3Dプロットは、サンプル中の異なる物理的及び/又は化学的環境中の別々の水集団と一致する種々の3D表面特徴を示す。3Dプロット及び3Dプロットを作成するために使用するデータは、血液サンプルと関連する指標又は凝固挙動に利用することができる(例えば、ヘマトクリット、血餅強度(MA)、凝固時間(R)、血小板活性、フィブリノーゲン活性、線溶等)。3Dプロット又は3Dデータプロットを作成するために使用するデータを使用して新たな指標を発見することもできる。
【０１４４】
3Dプロット中で明らかな異なる3D表面特徴及び水集団中に含まれる情報は、特定の指標及び凝固挙動と関連し得る。3Dプロットを使用して特定のパラメータ又は指標についての定性的、半定性的及び/又は定量的結果を作成することができる。例えば、血液サンプルのヘマトクリットを初期水集団の特性から計算してもよく、凝固時間及び線溶挙動を80〜400msのT2時間を有する多岐にわたる水集団の特性から計算してもよく、血小板活性及び血餅強度を400〜2200msのT2時間を有する第2の多岐にわたる水集団の特性から計算してもよい。種々の方法を使用して3Dデータセットから指標又は凝固挙動を抽出することができる。例えば、3Dプロットの3D表面特徴の勾配又は湾曲は凝固挙動と相関し得る。3Dプロットの横断面を使用して凝固挙動を計算することもできる。特に、特定のT2時間についての時間の関数としてT2強度を示す横断面は、凝固時間(R)及び/又は線溶を計算するのに有用となり得る。所与の時間での強度の関数としてT2時間を示す3Dプロットの横断面(T2緩和スペクトル)は所与の時間でサンプル中に存在する種々の水集団を示す。T2緩和スペクトルの特徴は、一定範囲の凝固挙動に利用することができる。例えば、T2緩和スペクトル中の二つのシグナル間の差を使用して血餅強度を評価することができる。特定の特徴の体積又は3Dプロットの横断面からの曲線などの特定の3D表面特徴の積分も凝固挙動(例えば、血餅強度)を確立するのに有用となり得る。凝固挙動はまた、連続的又は異なる時点で収集した一定範囲のT2緩和スペクトルの積分を通して抽出することもできる。
【０１４５】
あるいは、3Dプロットを使用して血餅挙動特有の特徴を同定することができる。特徴は、凝固開始後特定の時間で約400ms又は1000msの平均T2緩和率を有する水集団を選択的にモニタリングするためにパルスシーケンスを介するなどの、3D解析を用いないで測定されるものであり得る。任意選択により、水集団をサンプル中の他の水集団を除いて測定する。
【０１４６】
特定のシグナルに関連するT2値の範囲を含む、T2緩和曲線の特徴は、データを収集するために使用する装置(例えば、T2リーダー又はBruker minispec)に基づいて変化し得る。同様に、所与のサンプルについてのT2値の範囲は、T2測定中にサンプルを含有する管を構成するために使用する材料(例えば、プラスチック又はガラス)に依存し得る。本発明は、血液サンプルを分析するのに使用する3Dデータセットの集合への任意の磁気共鳴装置及び任意のサンプル容器の使用を包含する。
【０１４７】
患者の管理
本発明の方法及び装置を使用して患者の止血状態のポイントオブケア評価を提供することができる(例えば、外科手術を受けている患者の凝固管理のため、血栓性合併症のリスクがある患者を同定するため、抗血小板療法に抵抗性の患者を同定するため、患者における抗凝固療法をモニタリングするため、患者における抗血小板療法をモニタリングするため、及び/又は患者における凝血促進療法をモニタリングするため、外傷に関連する異常な凝固障害、例えば外傷誘発性凝固障害、急性凝固障害の同定のためである。このような測定を用いて輸血の決定についての情報を提供することができる)。
【０１４８】
1)異常出血又は挫傷の原因の発見、2)自己免疫疾患の患者、3)基礎心血管障害の患者、4)あまりに多くの出血が懸念され得る手順又は外科手術の前、5)抗凝固療法のモニタリング、6)周術期及び外傷患者のモニタリング、及び7)敗血症又は敗血症性ショックの患者の同定を含む、凝固試験が要求される医学状況が存在する。
【０１４９】
心肺バイパス(CPB)のための抗凝固とCPB後の止血との間のバランスのために、心臓手術を受けている患者の凝固管理は複雑である。さらに、ますます多くの患者が、抗血小板薬物の投与により、ベースラインでの血小板機能障害を有している。CPB中、最適凝固は、凝固が拮抗され、血小板の活性化が防がれて、結果として血餅が形成しないことを示す。外科手術後、凝固異常、血小板機能障害及び線溶が起こり、止血完全性を取り戻さなければならない状況を作り出すおそれがある。ヘパリンによる抗凝固、プロタミンによる拮抗、及び術後止血療法の複雑なプロセスを、タイムリー且つ正確な様式で止血機能を評価する本発明の方法及び装置(ポイントオブケア検査)により導くことができる。
【０１５０】
乏しい肝機能に関連する課題(例えば、凝固因子の合成及びクリアランス低下並びに血小板欠陥)により、止血障害及び線溶亢進がもたらされ得る。敗血症及び播種性血管内血液凝固などの全身合併症が、既存の凝固障害をさらに複雑にする。同所性肝移植における止血の著しい変化は、無肝期(anhepatic phase)中及び臓器再灌流直後に起こり、主に線溶亢進が、不十分な肝クリアランス並びに外因性ヘパリン及び内因性ヘパリン様物質の放出による組織プラスミノーゲン活性化因子の蓄積から生じる。したがって、肝臓手術、特に同所性肝移植を受けている患者は、その凝固の攪乱が大きく、本発明の方法及び装置をこの患者集団をモニタリングするのに有用なものとしている。
【０１５１】
本発明の方法及び装置を使用してヘパリン療法、特に抗凝固療法を導くことができる。例えば、本発明の方法を、ヘパリナーゼを用いて行って、ヘパリンの抗凝固効果の非存在下での凝固状態を評価することができる。さらに、本発明の方法を利用してプロタミン療法を評価する、すなわち、プロタミン療法後の凝固をモニタリングし、ヘパリン又はプロタミン誘導性止血状態を処置することができる。同様に、分析を術前及び術後に行って、外科手術患者の抗凝固又は止血状態を決定することができるだろう。
【０１５２】
本発明の方法及び装置を使用して抗血小板療法を導く、及び抗血小板療法に対する抵抗性を同定することもできる。抗血小板療法は、急性脳イベント及び心血管イベントの発生率を低下させるために心血管疾患の一次及び二次予防のためにますます処方されている。抗血小板薬物は、典型的にはシクロオキシゲナーゼ1/トロンボキサンA2受容体(例えば、アスピリン(aspirin))、アデノシン二リン酸受容体(例えば、クロピドグレル)又はGPIIb/IIIa受容体(例えば、アブシキシマブ、チロフィバン(tirofiban))を阻害することを目標としている。抗血小板薬物は主に血小板凝集を低下させることにより作用すると考えられているが、これらはまた抗凝固薬として機能することが示されている。血小板は凝固全体で重要な役割を果たすので、血小板機能(その数よりも)を評価することが周術期設定において極めて重要である。
【０１５３】
本発明の方法及び装置を使用して抗凝固療法をモニタリングする及び/又は導くこともできる。抗凝固療法(例えば、特にリバロキサバン(rivaroxaban)、ダビガトラン(dabigatran))を、有効性及びコンプライアンスのために、並びに有害副作用及び/又は有害事象(例えば、出血イベント)を確実に回避するためにモニタリングすることができる。このような療法についての投与調整が大規模なランダム化研究で出血を制御することが報告されている。具体的には、直接の第Xa因子阻害因子を含む抗凝固薬の投与を使用して治療域(therapeutic window)の維持を助け、患者の心房細動及び深部静脈血栓における発作のリスクを低下させることができる。
【０１５４】
本発明の方法及び装置を使用して抗凝固療法に抵抗性の患者を同定することができる。抗凝固療法には、他の抗凝固薬の中でもアスピリン、プラビックス(plavix)、及びプラスグレル(prasugrel)が含まれる。本方法は、(i)抗凝固療法を対象に投与するステップと;(ii)本発明の方法を使用して対象の止血状態を評価するステップと;(iii)対象が血栓形成促進であることが分かった場合には、対象を抗凝固療法に対する非応答者と同定するステップとを含む。非応答者の同定により、医師が、患者が応答性の安全で有効な抗凝固薬を同定し、それによって有害事象(すなわち、血栓形成及び発作)のリスクを低下させることが可能になる。
【０１５５】
本発明の方法及び装置を使用して凝血促進療法をモニタリングすることができる。現代の凝固管理実行は、特定の成分療法の概念に基づき、凝血促進療法の迅速な診断及びモニタリングを要する。例えば、冠動脈バイパス術の周術期中の血小板輸血は深刻な有害事象のリスク増加と関連することが示されている。臨床判断のみでは誰が急性周術期設定における血小板輸血から利益を得るか予測することはできない。したがって、凝固産物の輸血は、好ましくは本発明の方法により提供される検査などのポイントオブケア検査により導かれるべきである。
【０１５６】
本発明の方法及び装置を使用して、臨床試験又は医学的利用における治療化合物の効果をモニタリングするためのコンパニオン診断分析又は試験を提供することができる。診断分析は、対象又は患者が療法に応答するか療法に応答しないかのいずれかを判定することを含むことができる。
【０１５７】
本発明の方法及び装置を使用して、血餅、凝固亢進、凝固過剰(hyperclotting)又は発作若しくは心停止のようなヒトにおいて有害な凝固を通して灌流を決定することができる。
【０１５８】
本発明の方法及び装置を分析のパネルの一部として使用することができる。パネルは、(i)凝固カスケードに関与するタンパク質の免疫測定法;(ii)フィブリン分解産物を検出するための免疫測定法;(iii)抗リン脂質抗体を検出するための免疫測定法;(iv)ヘパリン又はワルファリン(warfarin)又は他の抗凝固薬を検出して治療濃度を評価するためのアッセイ;(v)血漿プロトロンビン時間をモニタリングするPT又はaPTT又はPTTアッセイ;(vi)(a)トロンビンの形成若しくは溶解、(b)凝固カスケード、(c)ヘパリン結合、又は(d)治療活性に関連するタンパク質をコードする遺伝子の多形性差異を評価するための遺伝子検査を含むことができる。
【０１５９】
本発明の方法及び装置を使用して凝固障害に向かう推測（implication）により医療機器を管理することができる。例は、心臓移植を待つ患者のための橋渡しとして通常使用される心室補助装置である。このようなインプラントを有する患者は、装置の機能の結果として装置の内側及び外側に血餅形成を有することがあり、これらの血餅が発作又は別の血栓関連イベントを引き起こすおそれがある。これはまた感染症及び出血イベントをもたらすおそれもある。これらの問題を回避する方法は、装置の成功に影響をもたらす複数診断マーカーをモニタリングすることである。例えば、PT-INRの日常的検査により、患者の凝固状態をよりしっかりモニタリングすることが可能になり、したがって、出血及び凝固イベントをしっかり管理することができるだろう。
【０１６０】
INRは、使用する分析システム用の国際感度指標値の冪（power）まで上げられる、患者のトロンビン時間と正常(対照)サンプルの比である。高いINRレベル(例えば、INR=5)は出血の可能性が高いことを示す一方で、INR=0.5である場合、血餅を有する可能性が高い。健常人についての正常INR範囲は0.9〜1.3である。ワルファリン療法を受けている人々では、INR範囲は典型的には2.0〜3.0である。標的INRは、人工心臓弁を有する、又は周術期に低分子ヘパリン(エノキサパリン(enoxaparin)(Levenox))でワルファリンの橋渡しをする者などの、特定の状況でより高くなり得る。
【０１６１】
血小板機能、線溶、血餅強度及び他の因子をモニタリングすることは、結果を改善するのに等しく重要である。これらの因子の生理学的濃度又は活性を理解することは、装置との相互作用のためのみならず、これらの因子がこれらの装置を装着している患者に通常処方される多くの異なる療法(特に、アスピリン、リバロキサバン、プラビックス、ワルファリン)により調整されるために重要である。これらの種類の装置と共に使用する別の尺度は、ヘマトクリットであり、これは通常、心臓の機能を維持するために装置の機能(速度、強度等)を調整するために使用される。本発明の方法及び装置は、これらの結果(ヘマトクリット、血小板、PT、PT-INR等)の全てを潜在的に同時に提供することができ、血餅形成及び溶解に関する追加の情報を提供することができる。上記標準的尺度を、患者の状態及び装置の有効性を同定する指標又はサインに合体させることができる。
【０１６２】
本発明の方法及び装置は複数の方法で利用及び構成することができる。これらは実験室装置（例えば中央検査室又はSTAT実験室内）、ポイントオブケアシステム又は埋め込み型モニタリングシステムとしてさえ使用することができる。例えば、埋め込み型モニタリングシステムとして、サンプルは、他のサンプル流体の中でも、連続的にモニタリングされる血液;全血、血清若しくは血漿を含むバキュテナー;又はフィンガースティックで構成されてもよい。
【０１６３】
例えば、本発明の方法及び装置を、周術期及び外傷患者をモニタリングするために利用することができる(例えば、PT/INR、aPTT、ACT、Hct、血小板活性及び線溶についての尺度又は代理尺度を提供する)。患者が死亡率、虚血イベント、感染症、合併症の早期発症及びICU/入院日数の増加の約6倍増加を示し得るので、輸血が必要とされているかどうかを迅速且つ効率的に決定することがこれらの患者集団に必要とされている。具体的には、出血イベントの根本原因の決定(凝固カスケード対血小板活性化)により、迅速且つ集中した療法（すなわち、中でも、輸血管理、抗凝固モニタリング、抗血小板反応性、及び／又は血栓症リスクの予測）がもたらされ得る。
【０１６４】
本発明の方法及び装置を利用する文脈にかかわらず、本発明の方法を使用して少容積を迅速に測定することができることが血小板機能にとって特に重要である。これは、採血部位で凝固が開始するために、他のシステムを使用して測定することが以前は困難であった。
【０１６５】
凝固機構
凝固が起こるためには、トロンビンのフィブリノーゲンへの作用を介したフィブリン沈着に達する凝固カスケードの活性化がなければならない。凝固システムは、全プロセスの抑制と均衡を維持するための優雅なフィードバック規制機構を備えた初期刺激を増幅するタンパク分解性カスケードで構成される。凝固活性化の二つの相互接続した経路が存在する:(i)接触活性化(内因性経路);及び(ii)組織因子活性化(外因性経路)。両経路は、種々の凝固因子に依存している。プロトロンビンは第II凝固因子であり、トロンビンは第IIa凝固因子であり、フィブリノーゲンは第I凝固因子であり、フィブリンは第Ia凝固因子である。凝固因子に加えて、血小板は十分な血餅の誘導及び形成の両方にとって極めて重要である。血小板は、プロトロンビナーゼ複合体が形成されるリン脂質表面として作用し、血餅を発達させるための物理的足場として作用する。
【０１６６】
内因性凝固カスケード経路は、通常は損傷した血管からのコラーゲンと接触することにより活性化されるが、多くの負に帯電した表面がこの経路を刺激することができる。内因性経路は、通常は第VIIIa、IXa及びX因子を含むテナーゼ複合体を組み立てるために血小板活性化を要する。活性化プロセスは、イノシトール三リン酸(IP3)経路と関連し、血小板形状を変化させて最終的に接着することを可能にするために脱顆粒及びミオシン1cキナーゼ活性化を伴う。
【０１６７】
あるいは、凝固は、血管外細胞の表面からの組織因子を要する外因性凝固カスケード経路を介して活性化され得る。外因性経路は、第V、VII及びX凝固因子の複合体形成を伴う。インビボでの凝固の主要誘導因子は、47kDa糖タンパク質である組織因子(TF)である。血流中でTFを発現することができる唯一の細胞は、内皮細胞及び単球である。対照的に、外膜線維芽細胞を含む、血流の外側の多くの細胞はTFを構成的に発現するので、血管完全性が破壊された場合に凝固を開始することができる「血管外エンベロープ」を形成する。
【０１６８】
カスケードの最終段階は、両経路に共通であり、活性化複合体であるテナーゼ複合体を伴う。テナーゼは「10」及び接尾語「-ase」の短縮であり、複合体がその基質(不活性第X因子)を切断することにより活性化することを意味する。内因性テナーゼ複合体は、活性第IX(IXa)因子、その補助因子である第VIII(VIIIa)因子、基質(第X因子)を含有し、これらは負に帯電した表面(ガラス、活性血小板膜、時に、単球の細胞膜、又は赤血球膜など)により活性化される。外因性テナーゼ複合体は、組織因子、第VII因子、基質(第X因子)及び活性化イオンとしてのCa2+で構成される。
【０１６９】
内因性又は外因性経路のいずれかを介した第X因子の第Xa因子への活性化により、プロトロンビンからトロンビンへのタンパク質分解変換がもたらされ、これが今度は血餅の形成の開始を活性化し、血小板を活性化する。次いで、第VIII因子がトランスグルタミナーゼ反応を触媒してフィブリンモノマーを架橋して架橋ネットワークを形成する。
【０１７０】
血餅中の架橋フィブリン多量体は、セリンプロテアーゼであるプラスミンにより可溶性ポリペプチドに分解される。プラスミンは、その不活性前駆体プラスミノーゲンから産生され、二つの方法、フィブリン塊の表面での組織プラスミノーゲン活性化因子との相互作用により、及び細胞表面でのウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子との相互作用により、フィブリン塊の部位に補充され得る。第1の機構が、血管内での血餅の溶解を担う主要なものであると思われる。第2のものは、血餅溶解を媒介することができるが、通常は組織再構築、細胞移動及び炎症において主要な役割を果たし得る。
【０１７１】
血餅溶解は、二つの方法で制御される。第1に、効率的なプラスミン活性化及び線溶が血餅表面又は細胞膜上で形成された複合体でのみ起こり;血液中の遊離のタンパク質は非効率触媒であり、迅速に不活性化される。第2に、プラスミノーゲン活性化因子とプラスミン自体の両方が、特定のセルピン（セリンプロテアーゼに結合して安定な酵素的に不活性の複合体を形成するタンパク質）により不活性化される。薬理学的には、クロットバスター組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)及びストレプトキナーゼ若しくはウロキナーゼを使用してこの内部線溶機構を活性化する。
【０１７２】
医学的状態
本明細書に記載する本発明の方法及び装置は、凝固、血栓状態及び以下の疾患の結果としての血栓障害の診断のための、種々の液体、特に血液サンプルのレオロジー変化を検出するために使用することができる：例えば、敗血症及び播種性血管内血液凝固(DIC)、血友病A、血友病B、血友病C、他の凝固因子の先天的欠損、第XIII因子欠乏症、フォンヴィルブランド病、内因性抗凝固による出血性障害、脱線維素症候群、後天性凝固因子欠乏症、凝固欠損、他の、紫斑病、及び他の出血状態、アレルギー性紫斑病、ヘノッホ-シェーンライン紫斑病、血小板減少症、免疫性血小板減少性紫斑病、突発性血小板減少性紫斑病、続発性血小板減少症、鎌状赤血球貧血及び非特異性出血状態。
【０１７３】
心血管系はしっかり制御された止血を要する。過度の凝固は静脈又は動脈閉塞を引き起こすおそれがある一方で、凝固の失敗は過度の出血を引き起こすおそれがあり、両状態は有害な臨床状況をもたらす。ほとんどのヒト対象では、凝固バランスはいくぶん静的である。しかしながら、止血を変化させ、心血管機能不全をもたらし得る多くの異なる臨床パラメータ(遺伝性障害、疾患状態、治療薬物又は薬理学的ストレス要因など)が存在する。
【０１７４】
血友病(第VIII因子(血友病A)、第IX因子(血友病B)、第XI因子(血友病C))、アレキサンダー病(第VII因子欠乏症)、プロトロンビン欠乏症(第II因子欠乏症)、オーレン病(第V因子欠乏症)、スチュアート-プラワー欠乏症(第X因子欠乏症)、ハーゲマン因子欠乏症(第XII因子欠乏症)、フィブリノーゲン欠乏症(第I因子欠乏症)、及びフォンヴィルブランド病などの非機能性凝固因子の結果である多くの異なる既知の凝固障害が存在する。
【０１７５】
凝固カスケードの活性化は、末期敗血症で起こる多臓器不全の発達における必須構成要素であると思われる。敗血症の現在の療法は、末期の進行の調節のためにこれらのカスケードを特異的に標的とし、臓器不全を予防することを目標とする。
【０１７６】
本発明の方法及び装置を使用して血液サンプルのヘマトクリットを決定することができる。ヘマトクリットは、対象の血液中の赤血球が占める体積百分率の尺度であり、健常女性及び男性についての正常値はそれぞれ約36〜44％及び41〜50％である。ヘマトクリットは、サンプル中の赤血球の数と赤血球のサイズの両方に依存する。ヘマトクリットの測定は、対象の種々の生理学的状態を確立するのに有用となり得る。したがって、本発明の方法を正常ヘマトクリットよりも低い又は正常ヘマトクリットよりも高いことに関連する任意の状態の診断に使用することができる。正常ヘマトクリットよりも低いことは、貧血、鎌状赤血球貧血、内出血、赤血球の喪失、栄養不良、栄養欠乏(例えば、鉄、ビタミンB12若しくは葉酸欠乏)、又は水分過剰を示し得る。正常ヘマトクリットよりも高いことは、先天性心疾患、脱水、赤血球増加症、肺線維症、真性一次性赤血球増加症、又は薬物エリスロポエチンの乱用を示し得る。
【０１７７】
本発明の方法を使用して、癌、自己免疫疾患、紅斑性狼瘡、クローン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、深部静脈若しくは動脈血栓症、肥満、関節リウマチ、アルツハイマー病、糖尿病、心血管疾患、うっ血性心不全、心筋梗塞、冠動脈疾患、心内膜炎、発作、塞栓症、肺炎、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患、喘息、感染症、被移植者、肝疾患、肝炎、膵臓疾患及び障害、腎臓疾患及び障害、内分泌疾患及び障害、肥満、血小板減少症に関連する疾患又は障害、並びに医療(ステント、インプラント、大手術、関節置換術、妊娠)又は治療(癌化学療法)誘発性凝固障害(複数可)、並びにヘビースモーキング、多量のアルコール消費、座りがちなライフスタイルなどの危険因子などの、疾患、障害又は機能障害に関連する因子及び関連する凝固障害をモニタリングすることができる。本発明の方法を使用して凝固及び血液特性に影響を及ぼすゲノム及びプロテオミクス変化を評価することもできる。
【０１７８】
本発明の方法を使用して抗凝固及び/又は抗血小板療法を受けている患者をモニタリングすることもできる。本発明の方法を使用してモニタリングすることができる抗血栓薬(例えば、血栓溶解薬、抗凝固薬及び抗血小板薬)の例としては、それだけに限らないが、アセノクマロール(acenocoumarol)、クロリンジオン(clorindione)、ジクマロール(dicumarol)、ジフェナジオン(diphenadione)、エチルビスクムアセテート(ethyl biscoumacetate)、フェンプロクモン(phenprocoumon)、フェニンジオン(phenindione)、チオクロマロール(tioclomarol)及びワルファリン(warfarin)などのビタミンK拮抗薬;アンチトロンビンIII、ベミパリン(bemiparin)、ダルテパリン(dalteparin)、ダナパロイド(danaparoid)、エノキサパリン(enoxaparin)、ヘパリン、ナドロパリン(nadroparin)、パルナパリン(parnaparin)、レビパリン(reviparin)、スロデキシド(sulodexide)及びチンザパリン(tinzaparin)などのヘパリングループ(血小板凝集阻害因子);アブシキシマブ、アセチルサリチル酸(アスピリン)、アロキシプリン(aloxiprin)、ベラプロスト(beraprost)、ジタゾール(ditazole)、カルバサラートカルシウム(carbasalate calcium)、クロリクロメン(cloricromen)、クロピドグレル(clopidogrel)、ジピリダモール(dipyridamole)、エポプロステノール(epoprostenol)、エプチフィバチド(eptifibatide)、インドブフェン(indobufen)、イロプロスト(iloprost)、ピコタミド(picotamide)、プラスグレル(prasugrel)、チクロピジン(ticlopidine)、チロフィバン(tirofiban)、トレプロスチニル(treprostinil)及びトリフルサル(triflusal)などの他の血小板凝集阻害因子;アルテプラーゼ(alteplase)、アンクロッド(ancrod)、アニストレプラーゼ(anistreplase)、ブリナーゼ(brinase)、ドロトレコギンアルファ(drotrecogin alfa)、フィブリノリジン、プロセインC、レテプラーゼ(reteplase)、サルプラーゼ(saruplase)、ストレプトキナーゼ、テネクテプラーゼ(tenecteplase)及びウロキナーゼなどの酵素;アルガトロバン(argatroban)、ビバリルジン(bivalirudin)、デシルジン(desirudin)、レピルジン(lepirudin)、メラガトラン(melagatran)及びキシメラガトラン(ximelagatran)などの直接トロンビン阻害因子;ダビガトラン(dabigatran)、デフィブロタイド(defibrotide)、デルマタン硫酸(dermatan sulfate)、フォンダパリヌクス(fondaparinux)及びリバロキサバン(rivaroxaban)などの他の抗血栓薬;並びにクエン酸塩、EDTA及びシュウ酸塩などのその他が挙げられる。
【０１７９】
敗血症及び播種性血管内凝固
本発明の方法及び装置を使用して、敗血症又は播種性血管内凝固を患っている対象の止血状態を評価することができる。
【０１８０】
敗血症では、圧倒的な炎症反応がホストの微小循環に広い巻き添え損傷を引き起こす。内皮への損傷が組織因子を露出し、敗血症では、これが大規模に起こり得る。組織因子が今度は活性化第VII因子に結合する。結果として生じる複合体が第IX及びX因子を活性化する。第X因子はプロトロンビンをトロンビンに変換し、これがフィブリノーゲンをフィブリンに切断し、血餅の形成を誘導する。同時に、線溶系は阻害される。サイトカイン及びトロンビンが血小板及び内皮からのプラスミノーゲン活性化因子阻害因子-1(PAI-1)の放出を刺激する。血餅がヒト体内で形成すると、組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)により活性化されるプラスミンにより最終的に破壊される。PAI-1はTPAを阻害する。結果として、重度敗血症を患っている対象はプロテインC(血液凝固因子XIV)などの抗凝固薬で処置される。
【０１８１】
播種性血管内凝固(DIC)は、血管内フィブリンの産生並びに凝血原及び血小板の消費を伴う複雑な全身性血栓出血性障害である。結果としての臨床状態は、血管内凝固及び出血により特徴づけられる。DICは単独の病気ではなく、むしろ他の病気の合併症又は進行の作用であり、入院患者の最大1％に存在すると推定される。DICは常に基礎障害に次ぐものであり、一般的には全身性炎症の活性化を伴ういくつかの臨床状態と関連する。DICは、血管内凝固の活性化、凝固因子の枯渇、及び終末器官損傷を含むいくつかの一貫した構成要素を有する。DICは、重度敗血症及び敗血性ショックで最も一般的に観察される。実際、DICの発達及び重症度は、重症敗血症の死亡率と相関する。グラム陽性とグラム陰性生物の両方を含む菌血症がDICと最も一般的に関連し、ウイルス、真菌及び寄生虫感染症を含む他の感染症もDICを引き起こし得る。外傷、特に神経外傷もDICと頻繁に関連する。DICは全身性炎症反応症候群を発症している外傷を有する患者でより頻繁に観察される。証拠は、炎症性サイトカインが外傷患者と敗血症患者の両方のDICで中心的役割を果たすことを示している。実際、敗血症患者と外傷患者の両方の全身性サイトカインプロファイルはほぼ同一である。
【０１８２】
DICは、急性型と慢性型の両方で存在する。DICは、血液の組織因子(組織トロンボプラスチン)を含む凝血原への突然の暴露が起こり、血管内凝固をもたらすと急性的に発達する。代償性止血機構は急速に圧倒され、結果として出血をもたらす重度の消費性凝固障害が発症する。血液凝固パラメータの異常が容易に同定され、急性DICでは臓器不全が頻繁に起こる。対照的に、慢性DICは、血液が連続的又は間欠的に少量の組織因子に暴露すると発症する代償性状態を反映する。慢性DICでは、肝臓及び骨髄における代償性機構は圧倒されず、DICの存在についての明らかな臨床的又は実験室的徴候はほとんど存在しないだろう。慢性DICは固形腫瘍及び大きな大動脈瘤でより頻繁に観察される。
【０１８３】
循環中の組織因子への暴露は、内皮破壊、組織損傷、又は組織因子を含む凝血原分子の炎症性若しくは腫瘍細胞発現を介して起こる。組織因子は、第VIIa因子を伴う外因性経路により凝固を活性化する。第VIIa因子は、敗血症における血管内凝固の中心的媒体として意味づけられてきた。敗血症で第VIIa経路を遮断するとDICの発達が予防されることが示された一方で、代替経路を妨害すると凝固に対するいかなる効果も示さなかった。次いで、組織因子-VIIa複合体は、同時に血小板凝集を引き起こしながら、トロンビンを活性化し、今度はこれがフィブリノーゲンをフィブリンに切断するように作用する。証拠は、内因性(又は接触)経路もDICで活性化されるが、凝固の活性化よりも血行動態不安定及び低血圧に寄与することを示唆している。
【０１８４】
アンチトロンビンレベルの低下は、敗血症患者の死亡率上昇と相関する。トロンビン産生は通常、複数止血機構によりしっかり制御されている。アンチトロンビン機能は、トロンビンレベルを制御することを担う一つのこのような機構である。しかしながら、複数因子により、アンチトロンビン活性は敗血症患者で低下する。第1に、アンチトロンビンは進行中の凝固活性化により連続的に消費される。さらに、活性化好中球により産生されるエラスターゼがアンチトロンビン並びに他のタンパク質を分解する。さらに、アンチトロンビンは毛細血管漏出に失われる。最後に、アンチトロンビンの産生は低灌流及び微小血管凝固から生じる肝損傷に次いで損なわれる。
【０１８５】
組織因子経路阻害因子(TFPI)枯渇がDICの対象で明らかである。TFPIは、組織因子-VIIa複合体を阻害する。TFPIレベルは敗血症患者で正常であるが、DICにおいては相対的不十分性が明らかである。動物モデルにおけるTFPI枯渇はこれらの動物をDICに罹らせ、TFPIはヒトにおいて内毒素の凝血促進効果を遮断する。トロンビンにより産生される血管内フィブリンは通常は線溶と呼ばれるプロセスを介して排除される。炎症に対する初期反応は線溶作用の増強であるように思われる。しかしながら、この反応は、線溶の阻害因子が放出されるためにすぐに逆行する。高レベルのPAI-IがDICに先行し、臨床転帰不良を予測する。線溶はフィブリン形成の増加と共に進むことができないので、最終的に脈管構造への対立したフィブリン沈着がもたらされる。
【０１８６】
プロテインCは、プロテインSと共に、重要な抗凝固代償性機構で働く。正常な条件下では、プロテインCがトロンビンにより活性化され、トロンボモジュリンと内皮細胞表面上で複合体を形成する。活性化プロテインCが第Va及びVIIIa因子のタンパク質分解切断を介して凝固と戦う。しかしながら、敗血症及び他の全身性炎症性状態により産生されるサイトカイン(例えば、腫瘍壊死因子α(TNF-α)及びインターロイキン1(IL-1))がプロテインC経路を大きく無能力化する。炎症性サイトカインが内皮細胞表面でのトロンボモジュリンの発現を下方制御する。プロテインCレベルが消費、血管外漏出、肝臓産生減少及び自由に循環するプロテインSの減少によってさらに低下する。
【０１８７】
炎症及び凝固経路は実質的に相互作用する。DICで産生される活性化凝固因子の多くが、炎症誘発性サイトカインの内皮細胞放出を刺激することにより、炎症の伝播に寄与する。第Xa因子、トロンビン及び組織因子-VIIa複合体は、それぞれ、炎症誘発作用を誘発することが証明されている。さらに、活性化プロテインCの抗炎症作用があるとすると、DICにおけるその障害が炎症のさらなる調節不全に寄与する。
【０１８８】
DICの構成要素には、血液の凝血促進物質への暴露;微小血管系へのフィブリン沈着;線溶障害;凝固因子及び血小板の枯渇(消費性凝固障害);臓器損傷及び不全が含まれる。DICは敗血症患者の30〜50％で起こり得る。
【０１８９】
本発明の方法及び装置は、敗血症/重度感染症;外傷(神経外傷);臓器破壊;悪性腫瘍(固形及び骨髄増殖性悪性腫瘍);重度輸血反応;リウマチ病;分娩合併症(羊水栓塞症、胎盤早期剥離、溶血、死胎児症候群);血管異常(カサバッハ-メリット症候群、動脈瘤);肝不全;中毒反応;輸血反応、及び移植拒絶反応などの種々のDIC関連状態を有する対象をモニタリングすることに用途を見出すことができる。同様に、本発明を細菌感染症(例えば、グラム陰性敗血症、グラム陽性感染症若しくはリケッチア)、ウイルス感染症(例えば、HIV、サイトメガロウイルス、水疱瘡若しくは肝炎に関連するもの)、真菌感染症、寄生虫感染症(例えば、マラリア)、悪性腫瘍(例えば、急性骨髄性白血病)、分娩状態(例えば、子癇、胎盤早期剥離若しくは羊水塞栓症)、外傷、熱傷、輸血、溶血反応、又は移植拒絶反応に関連する急性DICにより特徴づけられる止血状態を有する対象に関して使用することができる。
【０１９０】
本発明のNMRに基づく方法を使用して、上記血液関連状態のいずれか及び全てをモニタリングすることができる。時間領域緩和時間測定法、特にT2緩和測定を使用してサンプルの凝固状態の変化を測定することができる。この測定は、サンプルの巨視的凝固状態の変化に感受性の水素核のNMRパラメータを測定することに頼るものである。水素核のほとんどはバルク水溶媒中にあるが、これらのかなりの分画はサンプル中の生物学的高分子及び細胞及び血小板中にある。このため、全水素核からの平均NMRシグナルの測定を、サンプルの凝固状態が上記臨床的理由のいずれかにより変化した場合にシグナルが明らかな様式で変化するように行うことができる。NMR測定は、T2緩和測定、又は「有効」T2緩和測定(例えば、シグナル取得のパラメータが、凝固イベントの最適読み出しのためであって、T2緩和値の最も正確な測定のために設定されるのではないT2緩和測定)であり得る。他の「時間領域」緩和測定法を適用して凝固挙動の変化を測定することができる。これらは、他の測定の中で特に時間領域自由誘導減衰分析を含むことができる。本明細書に記載するNMR時間領域測定を反復して行って、サンプル変化の凝固又は溶解特性として時間経過にわたってNMRシグナルの動的読み出しを得ることができる。
【０１９１】
正常及び異常止血プロファイルを有する対象
本発明の方法を使用して正常及び異常止血プロファイルを有する対象を識別することができる。例えば、正常及び異常止血プロファイル特有のNMR緩和パラメータ値及び/又はT2サインを決定し、対象（例えば鎌状赤血球貧血を有する対象）の差次的診断に使用することができる。異常止血プロファイルには、一つ以上の凝固因子、凝固補助因子及び/又は調節タンパク質(例えば、特に第XII因子、第XI因子、第IX因子、第VII因子、第X因子、第II因子、第VIII因子、第V因子、第III因子(組織因子)、フィブリノーゲン、第I因子、第XIII因子、フォンヴィルブランド因子、プロテインC、プロテインS、トロンボモジュリン及びアンチトロンビンIII)における共通の欠乏を共有する対象についてのプロファイルが含まれ得る。正常対象と異常対象との区別は、因子欠乏によるものではない疾患状態の指標となりうる。
【０１９２】
アンチトロンビンの欠乏は静脈血栓塞栓疾患患者の約2％に見られる。遺伝は常染色体優性形質として起こる。症候性アンチトロンビン欠乏症の罹患率は人口2000人当たり1人〜人口5000人当たり1人に及ぶ。欠乏症はアンチトロンビンの合成又は安定性に影響を及ぼす突然変異から、或いはアンチトロンビンのプロテアーゼ及び/又はヘパリン結合部位に影響を及ぼす突然変異から生じる。本発明の方法を使用して正常対象とアンチトロンビン欠乏症の対象を識別することができる。
【０１９３】
第XI因子欠乏症は、怪我に関連する出血傾向を与える。この欠乏症は、1953年に同定され、当初は血友病Cと呼ばれた。第XI因子欠乏症はアシュケナージ系ユダヤ人に極めて一般的であり、ホモ接合性又は複合ヘテロ接合性のいずれかで常染色体障害として遺伝する。本発明の方法を使用して正常対象と第XI因子欠乏症の対象を識別することができる。
【０１９４】
フォンヴィルブランド病(vWD)は、フォンヴィルブランド因子(vWF)の先天性欠乏によるものである。vWDはヒトの最も一般的な遺伝性出血障害である。vWFの欠乏により、血小板粘着欠陥が生じ、第VIII因子の二次欠乏を引き起こす。その結果、vWD欠乏症が血小板機能不全又は血友病により引き起こされるものと類似と思われる出血を引き起こし得ることになる。vWDはいくつかの主要なサブタイプに分類された極めて異種性の障害である。I型vWDが最も一般的であり、常染色体優性形質として遺伝する。この変異形は、全vWF多量体の単純な定量的欠乏による。2型vWDはまた、機能不全タンパク質が血小板との結合についての特定の実験室検査において減少した又は逆説的に増加した機能を有するかどうかに応じてさらに細分化される。3型vWDは臨床的に重度であり、劣性遺伝及びvWFの実質的非存在により特徴づけられる。本発明の方法を使用して正常対象とフォンヴィルブランド因子欠乏症の対象を識別することができる。
【０１９５】
いくつかの心血管危険因子がフィブリノーゲンの異常と関連している。血漿フィブリノーゲンの上昇が、冠動脈疾患、糖尿病、高血圧、末梢動脈疾患、高リポタンパク血症及び高トリグリセリド血症の患者で観察されている。さらに、妊娠、閉経、高コレステロール血症、経口避妊薬の使用及び喫煙が血漿フィブリノーゲンレベル上昇をもたらす。無フィブリノーゲン血症(フィブリノーゲンの完全な欠損)、低フィブリノーゲン血症(フィブリノーゲンレベルの低下)及び異常フィブリノーゲン血症(機能障害フィブリノーゲンの存在)を含む、フィブリノーゲンの遺伝障害が存在する。無フィブリノーゲン血症は、新生児臍帯出血、斑状出血、粘膜出血、内出血及び反復流産により特徴づけられる。この障害は常染色体劣性様式で遺伝する。低フィブリノーゲン血症は、100mg/dL未満のフィブリノーゲンレベル(正常は250〜350mg/dL)により特徴づけられ、後天性又は遺伝性のいずれかであり得る。本発明の方法を使用して正常対象とフィブリノーゲンの異常を有する対象を識別することができる。
【０１９６】
血小板モニタリング
本発明の方法及び装置を使用して、血小板機能を測定し、血小板凝集測定法と比較することができる(例えば、Harrisら、Thrombosis Research 120:323(2007)参照)。現在、血小板凝集測定法を行うためにFDAクリアランスと共に二つの検出方法が装置に使用されている:光学及びインピーダンス測定法。例えば、本発明の方法を使用して血小板凝集測定法により測定され得る対象の任意の血小板活性を同定する又は任意の血小板機能障害を診断することができる。血小板凝集測定法は、全血又は多血小板血漿サンプルに行う機能検査である。一般的に、血小板凝集法は、血小板活性化因子をサンプルに添加するステップと、誘導された血小板凝集を測定するステップとを含む。血小板凝集は、電極を、検査をする血液サンプルに浸漬することにより行うことができる。プローブに接着した血小板は安定な単層を形成する。活性化因子を添加すると、血小板凝集体が電極上に形成し、電極に印加されている電流に対する抵抗を増加させる。装置は、血小板凝集反応を反映する電気インピーダンスの変化をモニタリングする。凝集測定法はまた、凝集している血小板からのATPの放出を発光によりモニタリングすることに基づく技術を含む。血小板凝集の光学検出は、血小板が大きな凝集塊に凝集するにつれて、光透過率が増加するという知見に基づく。異なる凝集誘導剤が異なる活性化経路を刺激し、異なる様式の凝集が観察される。光学法の主な欠点は、これが典型的にはPRPに行われ、血小板を赤血球から分離すること及び血小板数を標準化値に調節することを要するということである。
【０１９７】
血小板凝集測定法のように、本発明の方法を使用して、対象の血液サンプルからの血小板数を評価する又は対象の血小板減少症(血小板数<150,000/μL)若しくは血小板増加症(血小板数>400,000/μL)の状態を診断することができる。このような診断を決定の基礎として使用して対象に血小板輸血又は抗凝固薬を提供することができる。同様に、本発明の方法を使用して対象の血小板輸血又は抗凝固薬に対する反応を評価することができる。
【０１９８】
以下の実施例は、当業者に、どのように本明細書で特許請求の範囲に記載する方法及び化合物を実施する、製造する、及び評価するかについての完全な開示及び説明を提供するために出すものであり、純粋に本発明を例示するものであることを意図されており、本発明者らがその発明とみなすものの範囲を限定することを意図されていない。
【０１９９】
T2MR凝固障害パネル
他の止血測定ツールとは異なり、T2MRは、別個の性質が異なるプラットフォームに関する単一アッセイとして通常は分析される種々の止血パラメータに関する多重の止血測定を可能にする。これらの多重の測定は、特にポイントオブケアの際に、単一の機器又はアッセイパネルでは可能でない診断アッセイの新規な組合せを可能にする。T2MRに基づくアッセイパネルは、好都合に、ポイントオブケアの際に病院検査室において使用することができる。
【０２００】
特定のT2MRアッセイパネルは、外傷に罹っている、手術室で処置を受けている、又は多面的な診断分析を必要とする根底にある複雑な疾患又は障害を有する患者の診断及び処置を助けるように設計されている。これらのアッセイによって提供された情報は、輸血、止血を回復させるための治療薬の投与、及び他の医学的介入に関する適切な決定を助ける。
【０２０１】
T2MR凝固障害パネルは、全血における止血パラメータの複数のカテゴリーの測定を可能にし、時間のかかるサンプル調製の必要性を除去する。これらは、(1)凝固時間パラメータ、(2)ヘマトクリット又はヘモグロビンレベル、(3)包括的な血小板活性/阻害測定値、(4)フィブリノーゲン測定値、及び(5)線溶測定値を含む。これらのパラメータは、診断パネルにおいて多重である。多重化は、(1)単一反応多重化の結果、(2)同一のサンプルの複数のアリコートから同時に得られた測定値、又は(3)サンプルの複数のアリコートで同一の機器において連続して得られた測定値のいずれかとして起こり得る。
【０２０２】
T2MR凝固障害パネルは、外科的な外傷を含めて、外傷を経験した又はこの疑いのある患者の管理に重要である複数の臨床パラメータを測定する。外傷を経験した又はこの疑いのある患者に関してこれらのパラメータを評価することは、2つの理由で価値がある:1)しばしば外傷によって引き起こされる、急性凝固障害を診断すること、及び2)輸血製品を必要としている患者に適切な療法を方向付けること。外傷は、多くの背景において生じ得る:1)事故-自動車及び他のもの、2)戦闘、3)銃撃を含めた、暴力行為の結果、4)出産、5)スポーツイベント、6)外科手術、及び鈍的外傷又は穿通創につながり得る全ての事象。改善された予後の助けとなる外傷を早期に同定する重要性を考慮すると、これらの因子を同定することは、外傷の場所(戦場、負傷の場所-スポーツイベント、自動車事故、銃創の場所、手術室)で、処置に向かう道(メデバック、ヘリコプター、救急車)の途中で、入院の場所(外傷トリアージセンター、救急室)で、又は集中型背景(病院検査室)において価値がある。外傷の結果として凝固障害につながる多くの原因及び機構がある(参照によって本明細書に組み込まれた、Hessら, J. Trauma 65:748 (2008)参照)。例えば、外傷後に起こる既知の臨床的症候群がある:希釈性凝固障害、ショックの致死的三徴、アシドーシス及び低体温症、並びに外傷ショックの急性凝固障害すなわちACoTS。外傷が、大部分の凝固障害につながる一方で、凝固障害は、他の疾患/障害、薬剤、及び遺伝的素因と関連し得ることも既知である。
【０２０３】
このT2MR包括的パネルは、急性凝固障害を同定することができ、これは介入を促すのに必要な情報を提供することになる一方で、特定のデータは、適切な輸血製品に方向付けることにもなる。例えば、低ヘマトクリットは、赤血球置換につながり得、低フィブリノーゲンは、フィブリノーゲン処置又は新鮮凍結血漿(FFP)投与につながり得、異常な凝固時間は、凝固因子又はFFPの投与につながり得、異常な血小板活性は、血小板輸血又は適切な薬剤を示唆することになる。特定の患者における凝血状況への外傷の影響は不明であるため、各測定されたパラメータを、個別に又は全ての他のものと組み合わせて使用することができる。因子欠乏の結果、異常な活性、又は結果における他の異常性に基づいて、特定の療法を選択することができる。他の因子とともに、凝固時間、ヘマトクリットレベル、フィブリノーゲンレベル及び血小板活性の広範な評価は、最も適切な輸血決定又は治療行為を提供することになり、アルゴリズムは、臨床的証拠に基づいて変動することになるが、しかしながら、潜在的なアプローチは、Maegleら, World J. Emerg. Med. 1:12 (2010)に報告されている。
【０２０４】
簡便な多重の凝固障害パネルを可能にするT2MR初期アッセイ構成は、単一の活性化因子を使用して、全血における凝固を誘発するアッセイ配置である。この活性化因子は、酵素的凝血及びその後のフィブリン形成を誘発するだけでなく、血小板活性及びその後の凝固収縮も誘発する。前者は、酵素的カスケードにおける凝固時間及び欠損又は阻害の測定を可能にし、後者は、血小板活性又は阻害並びに異常に低いフィブリノーゲンレベルの測定を可能にする。この多重の能力は、PT様凝固時間を測定することができず、線溶の測定に非感受性であることが示されており、血餅強度へのフィブリンの寄与と血餅強度への血小板の寄与を容易に測定し識別することができないトロンボエラストグラフィーとT2MR技術を識別する。加えて、反応の最初の部分中のT2MRシグナルの測定は、ヘマトクリットの決定を可能にする。最後に、望ましい場合、測定値を使用して、血餅収縮後のシグナルをモニタリングすること又は血餅形成若しくは収縮における欠乏をモニタリングすることによって、線溶の欠乏をモニタリングすることができ、この場合、線溶を阻害し、アプロチニンの非存在下で得られたものとサインを比較するために、アッセイにおけるアプロチニンなどの追加の試薬が必要であり得る。本質において、この凝固活性化因子カクテルは、ヘマトクリット、酵素的カスケード、血小板、及びフィブリノーゲンを含めた、包括的な止血性能の測定を可能にする。
【０２０５】
活性化カクテルは、T2MR凝固障害パネルの重要な特徴である。活性化カクテルは、1つ以上の活性化因子、開始剤、又は反応が起こるのに必要な化合物からなることできる。一実施形態では、それは、特定の濃度でのInnovinで開始することができる、希釈PT反応からなる。Innovinは、「組織因子」及び「脂質」の任意の調製物でより一般的に置換することができ、組織因子は組換え及び非組換えの両方を含み、脂質は、規定された及び規定されていないリン脂質の混合物及びCephalin又は血小板リン脂質の任意の他の天然の代替物を含む。本発明の別の実施形態では、活性化カクテルは、EXTEM反応を開始する(図33A参照)。本実施形態において、EXTEM対クエン酸塩添加全血の標準比率は、我々のサンプリング限界(典型的に40〜60μL)を含むサンプリング限界以下の容量で使用することができ、例えば、2.4μL EXTEM試薬プラス35.3μLクエン酸塩添加全血プラス2.4μL STAR-TEMは、反応の開始の10分以内に活性化シグナルを生成する。さらに別の実施形態では、活性化カクテルは、カオリン活性化を開始する(図33B参照)。本例において、34μLのクエン酸塩添加全血を、1μLのカオリン溶液(Haemonetics)及び2μLの0.2M CaCl2溶液と混合する。正常サンプル活性化を、4から8分で観察する。本アッセイ形式において、カオリン+/-カルシウム溶液は、反応管における乾燥した形とすることができる。
【０２０６】
他の実施形態では、活性化因子は、数ある中でも、組織因子(組換えヒト組織因子)、接触因子/aPTT試薬(セライト、エラグ酸、又はカオリンなど)、組織因子又は接触因子活性化因子プラスサイトカラシンD又はレオプロ(血小板活性化を遮断する)、組織因子+アプロチニン(線溶を遮断する)、リン脂質、セライト、又はトロンビンとすることができる。これらの活性化因子の全ては、クエン酸塩添加血との使用のために、カルシウムと組み合わせることができる。試験のこのセットで、血餅形成及び線溶の主要な経路を測定することができる。これらの活性化因子を、ヘパリン媒介影響を同定する助けとして、プロタミン若しくはヘパリナーゼのレベルと、又はADP、アラキドン酸、セロトニン、エピネフリン、リストセチン、コラーゲンと、及び熱、冷、若しくは血小板活性化を引き起こすための活発な混合の適用と組み合わせることができる。プロタミンは、ヘパリンに定量的に結合することによって、ヘパリンの効果を逆転させることになり、各100IU/mlヘパリンへの1mg/mlプロタミン硫酸塩の添加は、ヘパリンの抗凝血活性を逆転させることになる。プロタミン硫酸塩を含有するカクテルは、ヘパリン抗凝血の効果を逆転させることが期待されるが、因子欠乏などの凝固を阻害する他の機構への影響はほとんどない。
【０２０７】
活性化因子選択は、所望の感度を達成するために重大である。例えば、活性化因子は、測定されている凝固現象が、迅速凝固試験(PTのように)又は中程度(PTT、又はACTのように)又は緩徐凝固試験(TEGパラメータRにおけるR-のように)であるかどうかを決定することになる。加えて、活性化因子の選択は、凝固時間測定がどの抗凝血剤に感受性があるかを決定することになる。これらは、数ある中でも、ワルファリン、リバーロキサバン、ダビガトラン、ヘパリン、ヒルジン、又は直接トロンビン阻害剤の種々の組合せを含むことができる。多重の凝固障害パネルを、種々の患者の状況に合わせることができ、例えば、未分画ヘパリン(UFH)に関する心臓バイパス患者は、低レベルプロタミンを有するカクテルを必要とし、一方で、血液希釈剤を注入された患者は、手術中の患者の状況を十分にモニタリングするために高レベルの組織因子を必要とし得る。方法は、いろいろなカクテル混合物に適応させることができる。
【０２０８】
凝固障害パネルは、ヘマトクリット測定を含むことができる。ヘマトクリットは、それが、HCTに関するT2MR直接的感受性に依存するため、特定の試薬製剤を必要としない。しかしながら、HCT較正曲線は、多重のアッセイに関して、測定されたT2値がHCTレベルに正確に変換されるように作らなければならない(図34参照)。
【０２０９】
凝固障害パネルは、血小板活性化の測定を含むことができる。血小板活性化は、上記で列挙した包括的な活性化因子のいずれかとともに生じ得る。それは、特異的な活性化因子によっても生じ得る。T2MR血小板アッセイ構成は、応答性のサンプルに関する血餅退縮を誘導することになる特異的な血小板アゴニストとともに、フィブリンメッシュ血餅を迅速に形成するためのレプチラーゼ及び第XIIIa因子を適用することに基づく。内因的に産生されたトロンビンとは対照的に、トロンビン阻害剤も、退縮がアゴニストへの血小板の応答によって誘導されることを保証するための試薬製剤に含まれる。本形式において実行することができる臨床的に重要な血小板アゴニストは、アデノシン二リン酸、アラキドン酸、エピネフリン、コラーゲン、TRAP-6、及びリストセチンを含む。
【０２１０】
相関研究を行って、ADPによる血小板活性化への感受性に関して、全血中で行われるT2MRと、多血小板血漿(PRP)で行わなければならないLTA(光透過凝集測定)を比較した(実施例24参照)。T2MRは、多血小板血漿を調製するための追加の時間及び努力を必要とせず、これにより緊急時の血小板機能特徴づけのための遙かに良好な方法となる。
【０２１１】
凝固障害パネルを、結果の種々の組合せを出すように設定することができる。例えば:
(i)凝固時間、ヘマトクリット、及び包括的な血小板活性を、単一のチャネル使い捨ての管を使用して、単一の活性化因子から測定することができる。これは凝固時間に関する同一の活性化因子を使用して血小板を活性化することができるので、可能である。これは、アプロチニンなどの線溶阻害因子と組み合わせてもよいし又は組み合わせなくてもよい。
【０２１２】
種々のチャネルを使用して、種々のパラメータを測定することができ、アルゴリズムを、単一のチャネルにおいて又は種々のチャネルにわたってデータに関して使用することができる。例えば、包括的な活性化因子を、3つのチャネルにおいて使用することができるが、第2のチャネルにおいてサイトカラシンDなどの血餅収縮阻害因子が存在し、第3のチャネルにおいてアプロチニンなどの線溶阻害因子が存在する。これは、完全な止血システム機能性の存在下で、阻害された血小板の存在下で、及び阻害された線溶の存在下で、T2MRシグナルの測定を可能にする。次いで、3つのチャネルにわたってのシグナルの分析を使用して、凝固プロセスへの種々の成分の寄与をより正確に決定することができる。本実施形態では、各チャネルは、多重の結果を供給することになり、チャネルの組合せは、より大きいデータセットを供給することになる。
【０２１３】
別の実施形態は、トロンビン活性化及び全血フィブリノーゲンアッセイを使用して、1つのチャネルにおいてフィブリノーゲンの定量的な測定を可能にする(実施例25参照)。これは、他のパラメータを測定する1つ以上の他のチャネルと組み合わせることができる。
【０２１４】
本明細書に記載する凝固障害パネルに関するアルゴリズムは、単一指数関数、多指数関数又はILT分析を含むことができる。一次特徴抽出アルゴリズムを使用して、T2MRシグナルから凝固時間などの値を抽出し、凝固反応の経過中の経時的なT2の変化を利用する。一次特徴抽出アルゴリズムを、較正曲線又は正規化値の組合せで使用して、ヘマトクリット、INR又はフィブリノーゲンレベルなどの結果を生成することができる。二次特徴抽出方法は、適合するT2値(一次特徴抽出)対時間の結果である、組合せにおける同一又は異なる活性化因子を有する種々のチャネルからの結果を分析する。これは、血餅収縮を阻害しない活性化因子を使用するチャネルと比較した、血餅収縮を阻害する活性化因子を使用したチャネルに関する上部T2シグナルの比較であり得る。これらの特徴抽出方法は、望ましいパラメータ又はアッセイ品質管理を提供することができる。
【０２１５】
任意選択により、凝固障害パネルアッセイを、ピペットを使用して反応活性化因子及びサンプルを投入し使い捨ての反応管又はカートリッジを使用して行うことができる。別の実施形態では、使い捨て用品は、乾燥させた又は凍結させた活性化因子カクテルを前もって投入しておき、サンプルは、ピペットで投入する。さらに別の実施形態では、使い捨て用品は、定量化されていない様式での血液の添加を可能にし、使い捨て用品は、調節された方式で血液を反応物と組み合わせる。例えば、使い捨て用品は、種々の反応管間にサンプルを分割し、同時又は同時的な試験のいずれかが血液の同一のサンプルについて行われるのを可能にする能力を有し得る。
【０２１６】
他の使用
本明細書に記載する本発明のNMRに基づく方法は、物質又は物質の混合物が凝固プロセス又は溶解プロセスを生じている又は生じた種々の用途に使用することができる。本発明の方法を使用して、プロセスを生じている材料中の変化、又はプロセスを既に受けた材料の状態についての情報を得ることができる。
【０２１７】
石油製品の分野では、本発明の方法を使用して、アスファルト/ビチューメン、ビチューメン-ポリマー製造、ボイラー、粗製油、石炭灰、石炭スラリー、クラッキング、蒸留残渣、工学、流動ビチューメン、高粘度油、ファーネス油、潤滑剤、混合燃料油、油添加剤、油清澄化剤(oil clarificator)、混合油、油カウンター(ピペリン末端)、油摩耗制御、プラスチゾル、鉱物油、石油添加剤製造、石油製品、パイプラインカウンター、ピッチコーティング、ピッチ希釈、エリカ号の災害、クエンチ油、燃料油中の残渣変換、水、沈殿物及び油の分離、特殊油、合成ゴム、使用前のタール制御、超重油、並びに水-石炭スラリーをモニタリングすることができる。
【０２１８】
塗工及び塗料の分野では、本発明の方法を使用して、車の塗料、金属塗料、水性塗料、削り遊び用の特殊インク、アルミニウム若しくはプラスチック表面用の特殊インク、水性インク、PTFE塗工、白紙塗工、特殊紙塗工、壁紙、接着剤、ワニス、車用ワニス、エンジン用特殊塗料、インクの製造、フォトグラビア、染料、プリント板ワニス、磁気インク、磁気ワニス、光沢塗料、鏡用の銀引き、眼鏡用の特殊ワニス、及びエナメル粉末をモニタリングすることができる。
【０２１９】
食品及び飲料の分野では、本発明の方法を使用して、ベシャメルソース製造、パン製造、チョコレート製造、生地制御、発酵制御、フィッシュソリュブル(蒸発制御)、フレッシュチーズ製造、ゼラチン食品濃度、アイスクリーム製造、ジャム製造、マーガリン製造、マヨネーズ製造、溶けたチーズ製造、牛乳及びチーズ研究、パラフィンコーティング制御、タンパク質濃度制御、飼料用タンパク質、海藻ゼラチン、スロップ制御、煮込んだ果物、煎糖(結晶化制御)、糖ミキサー、すり身ペースト、合成香料、トマトソース、植物性マーガリン及び油、酵母、ヨーグルト、ビール/酵母制御、製パン所の生地、食品添加物、ゼラチン(タンパク質濃度)、牛乳微粒化、ヨーグルト、プロセスチーズ、加糖果汁、サラダソース、食品増粘剤、食品添加物、酵素濃度制御、凍結流体制御、人工食品香料、タバコ、酒、残存糖酒、産業用スープ、プディング、粉乳、ペットフード、家畜飼料、ベビーフード、無糖練乳、デンプンゲル、果実ペースト及び果汁をモニタリングすることができる。
【０２２０】
工業化学の分野では、本発明の方法を使用して、塗料製造用の塩基性樹脂、ポリマー、ポリマー-ビチューメン製造、重合制御、ポリカーボネート、PVC製造、二成分型樹脂、繊維及びポリマー、ケーブル樹脂、エポキシ樹脂、ポリアミド樹脂、クロラールメチル樹脂、PVC、カルボキシメチルセルロース、塩酸、ウレタン接着剤、トルエンジイソシアネート、MEKトルエン、プラスチック再利用、シリコーン油、ペースト、接着剤、PBU、エタノールトルオール、ポリカーボネート、ポリエステル樹脂製造、ポリエーテルポリオール制御、ポリイソブチレン、ポリマー樹脂製造、重合化ビニル+トルエン、重合産業、樹脂重合シリコーン油、不飽和ポリエステル樹脂、尿素-ホルモール樹脂、膠、ポリアミド樹脂、ナイロン、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン、エポキシ樹脂、ポリエフィン(polyephine)ワックス、酢酸ジメチル、フェノール系樹脂、プラスター、メラミン、及びメタクリル酸メチルをモニタリングすることができる。
【０２２１】
本発明の方法を使用して、生化学製品、酢酸セルロース、柔軟剤、酵素、ゲルコーティング、医薬カプセル、エアロゾル、化学物質製造(洗浄ベース)、化粧品製造及び制御、クリーム、化粧品機械における工学、発酵制御、眼鏡用ガラス、医薬品、写真乳剤、シャンプー製造、練り歯磨き、UV感受性ワニス、乳剤の粘度制御、ビタミンA、写真乳剤、ビデオテープ、ゲル、乳剤、精密化学、照明用蛍光ペースト、作動油、ラテックス微粒化、UV接着剤、ホットメルト接着剤、掘削泥水、プラスチゾル、酸濃度、水銀、蓄電池酸、洗剤、セラミック、スラリー、膠、接着剤ポリマー、炭酸カルシウム、アクリル系接着剤、石灰乳、アンモニア+MCB+油、高粘度可燃性燃料、粗製油カウント、2種の油の混合、潤滑油、動物性脂肪ボイラー、燃料油、廃水濃度、泥濃度、酵母汚泥、油混入、溶媒混入、油の難儀な制御、クエンチ油、切削油、及び塔を設置することを含むプロセスをモニタリングすることもできる。
【０２２２】
本発明の方法及び装置を、リード化合物及び化合物評価発見ツールとして使用することができる。本発明の方法及び装置は、一つ以上の候補化合物によるカスケードへの介入の関数として凝固カスケードの変動を同定する、又は候補化合物に応じた凝固カスケードの外側の変動(例えば、血小板形態)を同定することができる。本発明の方法及び装置を使用して、化合物ライブラリーをスクリーニングして活性剤を同定する並びに疾患及び処置についての新たな機構を指摘することができる。これらは凝固カスケード中にあると見られるが、多くは通常はカスケードに定義も同定もされない標的であるだろう。このアプローチを使用して既知の凝固障害とは区別される疾患状態を同定することもできる。
【０２２３】
凝固システムは、極めて複雑なシステムであり、このシステムを研究するために利用可能なツールは、薬物発見に従事する科学者に提供することができる情報の幅に限定される。多くの現在の薬物発見は標的に基づくスクリーニングによる一方で、その他は表現型スクリーニングによる。標的化方法は、遺伝子発現又はRNAiに類似の分子作用法を使用してアッセイにより目的の標的を単離し、次いでそのアッセイを使用して化合物を探すことを含む。表現型スクリーニングは、化合物又は剤により生じる生物学への変化を同定するので、それらが体内で所望の効果を有するために有望なリード化合物を特徴づける。標的の阻害の場合、標的の野生型構築物を使用することができる。標的の活性化の例では、標的の遺伝子組換え版を使用することができる。このアプローチは、全血などの基質中の標的も標的活性も見ることができない特定の既存のスクリーニング法の一つの制限に対処する。止血及び凝固における標的のためには、この制限は、任意の所与の標的が血液中で受け得る生物学的相互作用の複雑な性質のために問題となり得る。潜在的スクリーニング標的には、タンパク質、ペプチド、酵素、フィブリノーゲン、トロンビン、血小板、血小板受容体、血小板の疾患状態、凝固因子、これらの標的のいずれかの疾患状態が含まれる。
【０２２４】
本発明の方法及び装置は、特定の開始剤の添加による、患者サンプル血液又は血症の凝固からもたらされる情報に富むデータセットを産生することができる。種々の開始剤を使用して異なる開始点で血液凝固を誘因することができる。これらの異なる開始剤を使用して、カスケードの選択された点若しくは分岐での活性化及び/又はカスケードの選択された点若しくは分岐での阻害により、凝固カスケードの異なる点を分離又は強調することができる。所与の凝固反応について、本発明の方法により、ヘマトクリットレベル、凝固時間、血小板活性、線溶、並びに多くの他の生理学的及び生物学的パラメータなどの複数パラメータをとらえる3D表面データセットを作成することができる。したがって、特定の阻害因子を使用して特定の凝固経路を探索及び分離することができる。
【０２２５】
凝固経路又は止血の特定の部分を選択及び的を絞るための別の手段は、ノックアウトマウス又はラットなどの遺伝子組換え系を使用することである。これらの系/モデルにより、疾患状態を表す標的(例えば、疾患血小板)を製造し、本発明の方法を候補化合物の非存在及び存在下でこの系/モデルの血液に適用して疾患状態を回復させる化合物の効果を評価することが可能になる。T2MRのサンプル容積要求が小さいことは動物研究に有利となり得る。従来の血小板法は血液0.5〜2.5mLを要するが、本発明の方法ははるかに少ない容積を使用して行うことができる。
【０２２６】
本発明のスクリーニング法の別の利点は、多数の特徴がアンカーポイント、及び止血プロセスへの化合物の効果を測定するための感度特徴を同定するために利用可能であるということである。
【０２２７】
サンプル管
本発明の方法は、血小板誘導血餅収縮の観察を通して止血性の状態及びパラメータを評価するための測定を含む。これらは、数ある中で、血小板活性、凝固亢進及び凝固低下状況、並びに血餅溶解を含む。これらの反応と関連している動態及びシグナルは、変数の少なくとも3つのカテゴリーに依存している:(1)血小板活性、因子欠損、及び治療薬などの、サンプル内の固有の生物学的特徴、(2)サンプル中の凝固を開始するために使用される特異的な活性化因子の種類及び濃度、並びに(3)どのように血餅が形成し、サンプル管内で収縮するかの変動性。本発明の方法の1つの目標は、観察された実験値における変動性が、サンプルの固有の生物学的特徴(カテゴリー1)における変動性のみを反映していることを保証することである。この目的を達成するために、標準試薬製剤を使用して、任意の所与のサンプル測定に関する、血餅開始の所定の状態(カテゴリー2)から生じる変動性を調節及び減少させることができる。我々は、サンプル管の内部表面へのフィブリン接着(カテゴリー3)における変動性が、本発明の方法の感度及び再現性を減少し得るサンプル測定における変動性を導入することがあることを観察した(実施例23参照)。この変動性源を減少させるために、本発明の方法を、フィブリン接着を制御する内部表面を有するサンプル管において行うことができる。フィブリン接着を制御するサンプル管の使用は、より頑強な、感度の良い、再現性のある血餅収縮に基づくアッセイを生じることができ、それによって参照方法及び臨床転帰とより良好に相関するより正確なデータが生成される。
【０２２８】
本発明の方法において使用するサンプル管は、フィブリン接着を制御するサンプル管の内部表面を含むことができる。これは、サンプル管全体が作られる適切な材料の選択を通して、又はフィブリン接着を制御する材料でサンプル管の内部表面を(共有結合的若しくは非共有結合的に)コーティングすることによって達成することができる。例えば、内部表面は、フッ素化材料若しくはPEG化材料又はフィブリン接着への抵抗性を与えるための内部表面の親水性を増加させる材料を含むことができる。内部表面は、コーティングされていない基材と比較して、フィブリン接着を減少させる材料でコーティングされた基材を含むことができる。基材は、例えば、ガラス又はベースポリマー(例えば、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリアロマー、又はサンプル管を作製するのに適した別のベースポリマー)とすることができる。基材は、シラン処理されていないガラスと比較して、フィブリン接着を減少させる材料でのシラン処理によってコーティングされたガラスとすることができる。或いは、材料は、界面活性剤、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリエチレングリコール、フッ素化材料(例えば、フッ化炭素コーティング)、親水性のポリマー(例えばポリアクリレート、ポリビニルアルコールなど)、炭水化物(例えば、アガロース、セルロース、カルボキシメチルセルロース)、又はそれらの混合物を含む。
【０２２９】
本発明の方法において使用するサンプル管は、フィブリン接着に抵抗するように調整された/処理された(例えば、シラン処理、シリコン処理、薄膜蒸着、プラズマエッチング、プラズマクリーニングなど)内部表面を含むことができる。そのような処理は、管の内部表面から汚染物質を除去するための、又はフィブリン接着に抵抗する材料でコーティングするための表面を調製するための、又はフィブリン接着を制御するより滑らかな基材表面を作製するためのプラズマクリーニング(すなわち、コロナ処置)を含むことができる。例えば、本発明の方法において使用するサンプル管は、コンタクトレンズにおいてフィブリン接着を減少させることが報告された特徴である(Satoら, Proc. SPIE 5688, Ophthalmic Technologies XV, 260 (2005)参照)、サンプル管の下層の基材上に親水性又は疎水性の基でパターン形成された内部表面を含むことができる。或いは、サンプル管は、ポリエチレングリコール、フッ素化材料、又は貴金属(例えば、銀、金、白金、パラジウム)を含む薄膜などの、表面上に蒸着した薄膜を含むことができる。さらに別のアプローチでは、サンプル管の内部表面は、化学蒸着したポリ(p-キシリレン)ポリマー(すなわち、パリレンコーティング)に供することができる。
【０２３０】
本発明の方法において使用するサンプル管は、ポリテトラフルオロエチレン(Teflon(登録商標))、フッ素化エチレン-プロピレン(FEP)、パーフルオロアルコキシポリマー樹脂(PFA)、パラフィルム(すなわち、パラフィンワックスでコーティングされた表面)、又はシリコーンなどの、非固着性表面を提供する極めて低い摩擦係数を有する1つ以上の材料を有する内部表面を含むことができる。本発明の方法において使用するサンプル管は、ベースポリマーの表面に移動し、その表面特性を改変し得る添加物(例えば、滑沢剤、可塑剤、着色剤、及び他の通例使用される添加物)を含まないベースポリマーから形成される内部表面を含むことができる。例えば、内部表面は、高純度のポリスチレン(例えば、Dow666U)、又は高純度のポリアクリル酸(例えば、PMMA)から形成することができる。ベースポリマーは、任意選択により、親水性の内部表面を提供するように選択することができるか、又は親水性の内部表面を提供するために(例えば、酸素プラズマコーティング、空気プラズマコーティング、UV活性化コーティング、又は例えば、過マンガン酸塩での直接的な酸化によって、表面カルボキシレート基を作製する)共有結合的に修飾する。親水性の内部表面は、窒素及び/又は酸素を含有する官能基などの電気陰性の官能基の存在を制御することによって作製することができる。
【０２３１】
本発明の方法において使用するサンプル管は、界面活性剤でコーティングされた基材(例えば、ガラス又はポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリアロマー、又はサンプル管を作製するのに適した別のベースポリマーなどのベースポリマー)を含む内部表面を含むことができる。界面活性剤は、GAF CompanyからIGEPALの商品名で一般的に市販されている界面活性剤を含む多種多様な可溶性非イオン性表面活性剤から選択することができる。IGEPAL液体非イオン性界面活性剤は、ポリエチレングリコールp-イソオクチルフェニルエーテル化合物であり、様々な分子量名称、例えば、IGEPAL CA720、IGEPAL CA630、及びIGEPAL CA890で入手可能である。他の適した非イオン性界面活性剤は、BASF Wyandotte Corporationから商品名TETRONIC 909で入手可能なものを含む。この材料は、第1級ヒドロキシル基で終わる四官能性のブロックコポリマー界面活性剤である。適した非イオン性界面活性剤も、Vista Chemical CompanyからVISTA ALPHONICの商品名で入手可能であり、そのような材料は、様々な分子量の直鎖状の第1級アルコール混合物由来の非イオン性生分解性物であるエトキシレートである。界面活性剤も、商品名Synperonic PEシリーズ(ICI)、Pluronic(登録商標)シリーズ(BASF)、Supronic、Monolan、Pluracare、及びPlurodacで入手可能であるものなどの、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックコポリマーなどのポロキサマー、Tween(登録商標)20(PEG-20ソルビタンモノラウレート)などのポリソルベート界面活性剤、非イオン性洗浄剤(例えば、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール(NP-40)、4-オクチルフェノールポリエトキシレート(Triton-X100)、Brij非イオン性界面活性剤)、並びにエチレングリコール及びプロピレングリコールなどのグリコールから選択することができる。
【０２３２】
界面活性剤は、例えば、ポリエチレングリコールアルキルエーテル又はポリソルベート界面活性剤とすることができる。ポリエチレングリコールアルキルエーテル界面活性剤を使用して、本発明の方法において利用するサンプル管をコーティングすることができ、これは、それだけに限らないが、ラウレス9、ラウレス12及びラウレス20を含む。他のポリエチレングリコールアルキルエーテルは、それだけに限らないが、PEG-2オレイルエーテル、オレス-2(Brij92/93、Atlas/ICI)、PEG-3オレイルエーテル、オレス-3(Volpo3、Croda)、PEG-5オレイルエーテル、オレス-5(Volpo5、Croda)、PEG-10オレイルエーテル、オレス-10(Volpo10、Croda、Brij96/97 12、Atlas/ICI)、PEG-20オレイルエーテル、オレス-20(Volpo20、Croda、Brij98/99 15、Atlas/ICI)、PEG-4ラウリルエーテル、ラウレス-4(Brij30、Atlas/ICI)、PEG-9ラウリルエーテル、PEG-23ラウリルエーテル、ラウレス-23(Brij35、Atlas/ICI)、PEG-2セチルエーテル(Brij52、ICI)、PEG-10セチルエーテル(Brij56、ICI)、PEG-20セチルエーテル(Brij58、ICI)、PEG-2ステアリルエーテル(Brij72、ICI)、PEG-10ステアリルエーテル(Brij76、ICI)、PEG-20ステアリルエーテル(Brij78、ICI)、及びPEG-100ステアリルエーテル(Brij700、ICI)を含む。ポリソルベート界面活性剤を使用して、本発明の方法において利用するサンプル管をコーティングすることができる。ポリソルベート界面活性剤は、脂肪酸でエステル化されたPEG化されたソルビタン由来の油性液体である。ポリソルベートに関する通常の商品名は、Alkest、Canarcel及びTweenを含む。ポリソルベート界面活性剤は、それだけに限らないが、ポリオキシエチレン20ソルビタンモノラウレート(TWEEN20)、ポリオキシエチレン(4)ソルビタンモノラウレート(TWEEN21)、ポリオキシエチレン20ソルビタンモノパルミテート(TWEEN40)、ポリオキシエチレン20ソルビタンモノステアレート(TWEEN60)、及びポリオキシエチレン20ソルビタンモノオレエート(TWEEN80)を含む。
【０２３３】
いくつかの場合では、RFコイルを、使い捨てのサンプル管中に組み込むことができ、本発明の方法を実施するために使用するシステムの使い捨ての構成要素とすることができる。コイルは、固定されたNMR装置上の回路網との電気的接続を可能にするように置くことができるか、又は結合を回路に誘導的に行うことができる。
【０２３４】
検出方法
本発明は、(a)凝固開始剤を、血液サンプルと接触している内部表面を有するサンプル管において血液サンプルに添加するステップと、(b)プロセス中に血餅が形成したかどうかを決定するステップとを含む、血液サンプル中の凝固プロセスをモニタリングするための方法を特徴とする。例えば、ステップ(b)は、T2磁気共鳴測定(又は本明細書に記載する任意の他の磁気共鳴技法)などの核磁気共鳴測定を含むことができる。或いは、ステップ(b)は、光学的、トロンボエラストグラフィー、ターボデンシトメトリー、発色性、免疫性、比濁法、比濁分析、凝集、インピーダンス、機械的血餅検出、血小板凝集、電気化学的検出、凝固時間、フォトメカニカル、及び/又は電気機械的測定を含むことができる。血餅形成をモニタリングするための計測手段及び方法は、当技術分野で周知であり、それだけに限らないが、光学的又はターボデンシトメトリー測定のための方法(例えば、American Labor/Lab A.C.M. Inc.製のCD2000又はCoaData機器、Helena Laboratories製のAggRAM、Cascade M-4、又はCascade M機器、LABiTec GmbH製のCoaLAB 1000機器、又はSiemens Healthcare Diagnostics製のBFT II、Sysmex CA-530、Sysmex CA-560、Sysmex CA-1500、又はSysmex CA-7000機器を使用して)、発色性測定のための方法(例えば、Beckman Coulter Inc./Instrumentation Laboratory製のACL TOP 300 CTS、ACL TOP 500 CTS、ACL ELITEシリーズ、及びACL TOP 700シリーズ機器を使用して、又はSiemens Healthcare Diagnostics製のBCS XP機器を使用して)、血小板凝集のための方法(例えば、Chrono-Log Corp.製のPlatelet Aggregation Profiler、Model-PAP 8E機器を使用して、又はAccumetrics製のVerifyNow機器を使用して)、機械的血餅検出のための方法(例えば、Diagnostica Stago Inc.製のKC1Δ、KC4Δ、STart 4 Hemostasis Analyzer、STA Satellite、Destiny Plus、STA Compact Homeostasis System、STA Compact CT、STA Compact Plus、STA-R Evolution Expert Series、又はDestiny Max機器を使用して)、蛍光に基づく血餅検出のための方法(例えば、Diagnostica Stago Inc.製のCalibrated Automated Thrombogram機器を使用して)、トロンボエラストグラフィーに基づく血餅検出のための方法(例えば、Hemonetics製のTEG-5000機器を使用して、又はROTEM製のROTEM機器を使用して)、機械的血餅検出のための方法(例えば、ITC製のProTime Microcoagulation System、Hemochron Signature Elite、Hemochron Signature+、又はHemochron Response機器を使用して、Medtronic Cardiac Surgery製のHMS Plus又はACT Plus機器を使用して、Instrumentation Laboratory製のGEM PCL Plus機器を使用して、CoaguSense製のCoag-Sense PT/INR Monitoring System機器を使用して)、電流測定血餅検出のための方法(例えば、Roche Diagnostics製のCoaguChek XS PT Test System、CoaguChek XS Plus PT Test System、又はCoaguChek XS Pro PT Test Systemを使用して、又はROTEM製のROTEM機器を使用して)、電気機械的血餅検出のための方法(例えば、Helena Point of Care製のActalyke XL、又はActalyke Mini II機器を使用して、又はROTEM製のROTEM機器を使用して)、電気化学的血餅検出のための方法(例えば、Alere製のINRatio/INRatio2 PT INR Monitor機器を使用して、又はROTEM製のROTEM機器を使用して)、血小板活性化に基づく血餅検出による開口(aperature)閉鎖のための方法(例えば、Siemens Healthcare Diagnostics製のPFA-100装置を使用して)、起電性に基づく血餅検出のための方法(例えば、Abbott Point of Care製のi-STAT機器を使用して)、及びフォトメカニカルに基づく血餅検出のための方法(例えば、Helena Point of Care製のCascade POC機器を使用して)を含むことができる。
【０２３５】
T2MRユニット
本発明の方法を実行するためのシステムは、1つ以上のNMRユニットを含むことができる。バイアス磁石は、サンプルを通してバイアス磁界B0を樹立する。RFコイル及びRFオシレーターは、バイアス磁界B0の一次関数である、ラーモア周波数でのRF励起を提供する。一実施形態では、RFコイルは、サンプルウェルの周りに巻かれている。励起RFは、水プロトン(又は非水性溶媒中の遊離プロトン)のスピンにおける非平衡分布を生み出す。RF励起が遮断された場合、プロトンは、それらの元の状況に「緩和し」、血液サンプル中の水集団に関する情報を抽出するために使用することができるRFシグナルを放射する。コイルは、RFアンテナとして働き、シグナルを検出し、適用されたRFパルスシーケンスに基づいて、材料の種々の特性、例えばT2緩和を探索する。技術のいくつかの場合に関する興味のあるシグナルは、スピン-スピン緩和(一般的に10〜2000ミリ秒)であり、T2緩和と称される。コイルからのRFシグナルは、増幅及び処理されて、バイアス磁場B0における励起へのT2(減衰時間)応答を決定する。ウェルは、血液サンプルを含めたナノリットルからマイクロリットルのサンプル及びその周りに巻かれた適切なサイズのコイルを有する小さい毛細管又は他の管とすることができる。コイルは、典型的にサンプルの周りに巻かれており、サンプルの量に応じたサイズになっている。例えば(それだけに限らないが)、約10mlの量を有するサンプルに関して、長さが約50mmで直径が10から20mmのソレノイドコイルを使用することができ、約40μLの量を有するサンプルに関して、長さが約6から7mmで直径が3.5から4mmのソレノイドコイルを使用することができ、約0.1nlの量を有するサンプルに関して、長さが約20μmで直径が約10μmのソレノイドコイルを使用することができる。或いは、コイルを、ウェル又はサンプル管内、その周り、又は近くに設定することができる。NMRシステムは、多重（マルチプレックス）目的の検出のための複数のRFコイルを含むこともできる。いくつかの実施形態では、RFコイルは、6mm×6mm×2mmの寸法の円錐体の形状を有する。
【０２３６】
NMRユニットは、磁石(すなわち、超伝導磁石、電磁石、又は永久磁石)を含む。磁石設計は、開いているか又は部分的に閉じていてもよく、U又はC形状の磁石から、3及び4つの柱を有する磁石、サンプル配置のための小さい開口部を有する完全に囲まれた磁石にわたる。妥協点は、磁石の「最適部位（スイートスポット）」への利便性及び機械的安定性(高い場均一性が望ましい場合、機械的安定性は、問題となり得る)である。例えば、NMRユニットは、円柱の形状で、SmCo、NdFeB、又は約0.5から約1.5Tの範囲の磁界を提供する他の低磁界永久磁石(すなわち、適したSmCo及びNdFeB永久磁石が、Neomax、Osaka、Japanから入手可能である)でできている、1つ以上の永久磁石を含むことができる。例示の目的で、それだけに限らないが、そのような永久磁石は、双極子/ボックス永久磁石(PM)組立、又はホールバッチ設計(Demasら, Concepts Magn Reson Part A 34A:48 (2009)参照)とすることができる。NMRユニットは、それだけに限らないが、約20〜30ppmの場均一性及び中心にある、40μLの最適部位を有する約0.5T強度の永久磁石を含むことができる。この場均一性は、より安価な磁石を使用することを可能にし(組立/シミングを微調整する時間がより短い)、システムにおいて摂動をより起こしにくく(例えば温度ドリフト、経時的な機械的安定性−実際に任意のインパクトが見られないくらい非常に小さい)、漂遊磁界における強磁性又は伝導物体の運動を許容し(これらは、影響がより少なく、したがって、遮蔽がより少なくてよい)、アッセイ測定値を損なうことない(緩和測定値及び相関測定値は、高度に均一な場を必要としない)。
【０２３７】
NMRユニットの基本的な構成要素は、MRセンサーを含む、磁界内の調整されたRF回路、レシーバー、並びに前置増幅器、増幅器及び保護回路を含むことができる送信機電子機器などの電気的構成要素、データ収集構成要素、パルスプログラマー及びパルス発生器を含む。
【０２３８】
NMRシステムは、RFコイル及びその上に微細機械加工された電子機器を有するチップを含むことができる。例えば、チップは、構造体が基材の上部に構築されるように、表面が微細機械加工されていてもよい。構造体が、基材の上部に構築され、その中ではない場合、基材の特性は、バルク微細機械加工においてほどには重要ではなく、バルク微細機械加工において使用される高価なシリコンウエハーを、ガラス又はプラスチックなどのより安価な材料と交換することができる。しかしながら、代替の実施形態は、バルク微細機械加工されたチップを含むことができる。表面微細機械加工は、一般的にウエハー又は他の基材で開始し、上部に層を成長させる。これらの層は、フォトリソグラフィー及び酸を伴うウエットエッチ液又はイオン化気体を伴うドライエッチ液、又はプラズマによって選択的にエッチングされる。ドライエッチングは、化学エッチングを物理的エッチング、又は材料のイオン衝撃と組み合わせることができる。表面微細機械加工は、必要とされるだけ多くの層を伴うことができる。
【０２３９】
いくつかの場合において、安価なRFコイルを、本発明の使い捨てのサンプル管中、又は使い捨てのカートリッジ中に組み込むことができる。コイルは、固定されたNMR装置上の回路網との電気的接続を可能にするように置くことができるか、又は結合を回路に誘導的に行うことができる。
【０２４０】
緩和測定がT2である場合、正確さ及び反復性(精度)は、較正に関するサンプルの温度安定性、アッセイの安定性、シグナル対ノイズ比(S/N)、焦点を再び合わせるためのパルスシーケンス(例えば、CPMG、BIRD、Tangoなど)、並びに例えばシグナル調整(例えば、エコーシグナルの増幅、整流、及び/又はデジタル化)、時間/周波数ドメイン変換、及びシグナル処理アルゴリズムなどのシグナル処理因子の関数となる。シグナル対ノイズ比は、磁気バイアス磁界(B0)、サンプル量、充填率、コイル形状、コイルQ-因子、電子機器バンド幅、増幅器ノイズ、及び温度の関数である。
【０２４１】
T2測定の必要な精度を理解するために、アッセイの応答曲線を手元で見て、血液サンプル中に存在する水集団を決定する所望の精度と、測定可能なもの、例えば、いくつかの場合に関してT2の精度とを相互に関連づけるべきである。次いで、適当な誤差バジェットを形成することができる。本発明のシステム及び方法において使用するためのNMRユニットは、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第7,564,245号において報告されているものとすることができる。本発明のNMRユニットは、参照によって本明細書に組み込まれる、PCT公開WO09/061481において報告されている携帯型の磁気共鳴緩和計（リラクソメータ）において使用するための小さいプローブヘッドを含むことができる。
【０２４２】
本発明のシステムは、所定の数の測定を可能にするように構成された(すなわち、使用数が制限されるように設計されている)MRリーダーでの使用のための使い捨てのサンプル管又はサンプルホルダーを含むことができる。使い捨てのサンプル管又はサンプルホルダーは、RF検出コイルのエレメントを含まない、部分的に含む、又は全て含むことができる(すなわち、MRリーダーが、検出コイルを欠くように)。例えば、使い捨てのサンプル管又はサンプルホルダーは、MRリーダーに存在する「ピックアップ」コイルに誘導結合しているRF検出のための「リード」コイルを含むことができる。サンプル容器が、MRリーダーの内部にある場合、それは、ピックアップコイルの近くにあり、これを使用してNMRシグナルを測定することができる。或いは、使い捨てのサンプル管又はサンプルホルダーは、サンプル容器の挿入時にMRリーダーに電気接続される、RF検出のためのRFコイルを含む。したがって、サンプル容器が、MRリーダー中に挿入されている場合、適当な電気的接続が、検出を可能にするように樹立される。各使い捨てのサンプル管又はサンプルホルダーを利用できる使用数は、使い捨てのサンプルホルダー内の電気回路、又は使い捨てのサンプル管又はサンプルホルダーとMRリーダーとの間のいずれかに含まれる可融性連結を無能にすることによって制御することができる。使い捨てのサンプル管又はサンプルホルダーを使用して、サンプル中のNMR緩和を検出した後、機器を、可融性連結に過電流を印加し、連結が壊れ、コイルが動作不能になるように構成することができる。任意選択により、同時に働き、それぞれがシステム上のピックアップに接続しており、全てが壊れ、使い捨てのサンプル管又はサンプルホルダーが動作不能になるまで、それぞれがそれぞれの使用で個々に壊れている、複数の可融性連結を使用することができる。好ましくは、使い捨てのサンプル管は、本発明のコーティングされた管である。
【０２４３】
以下の実施例は、当業者に、どのように本明細書で請求する方法及び化合物を実施する、製造する、及び評価するかについての完全な開示及び説明を提供するために示すものであり、純粋に本発明を代表するものであることが意図されており、本発明者らがその発明とみなすものの範囲を限定することは意図されていない。
【０２４４】
［実施例１］
全血サンプルを使用した血液凝固プロセスのモニタリング
新鮮なクエン酸塩添加又はヘパリン添加全血サンプルを使用して凝固プロセスをモニタリングした。いくつかの異なる活性化経路を調査した。
【０２４５】
カオリン活性化経路(CK経路)については、クエン酸塩添加血液1mLをカオリンバイアル(PlateletMappingアッセイキット、Haemonetics)に添加した。バイアルを5回反転させてサンプルを混合した。血液/カオリン混合物34μLを37℃に予熱した200μL PCR管に移した。0.2M CaCl2 2μLをPCR管に添加し、T2測定を直ちに開始した。
【０２４６】
活性化因子経路(A経路)については、新たに調製した活性化因子溶液(A-P1、PlateletMappingアッセイキット、Haemonetics、本明細書では「RF」とも呼ぶ) 1μLを37℃に予熱した200μL PCR管に添加した。ヘパリナーゼバイアルに収集した血液36μLをPCR管に添加し、サンプルを、ピペット先端を用いて3〜4回混合した。T2測定を直ちに開始した。
【０２４７】
活性化因子(RF)+ADP経路については、新たに調製した活性化因子溶液(A-P1、PlateletMappingアッセイキット、Haemonetics) 1μL及び新たに調製した血小板作動薬溶液(ADP-P2、PlateletMappingアッセイキット、Haemonetics) 1μLを37℃に予熱した200μL PCR管に添加した。ヘパリナーゼバイアルに収集した血液36μLをPCR管に添加し、サンプルを、ピペット先端を用いて3〜4回混合した。T2測定を直ちに開始した。
【０２４８】
図4は、三つの異なる活性化経路に関連する凝固挙動の差を示している。
【０２４９】
［実施例２］
サンプル中の血液凝固を解釈するためのアルゴリズムを使用したデータ抽出
実施例1のT2リーダーからのデータ出力を、双指数関数フィットを行い、プロット及びチェックし、特徴抽出する三段階法を使用して処理した。
【０２５０】
双指数関数フィット
読出し時間を、NDXClientにより登録した。複合yデータを大きさに変換し、正規化した。最初の25msのx及びyを除いた。各緩和曲線を、デフォルト非線形最小二乗法を使用してフィットした。曲線を最初の五つの時点について使用した固定シード（fixed seeds）を有するAmpA、AmpB、T2A及びT2Bについての開始点(例えば、シード)を使用して双指数関数方程式にフィットさせた。6番目の時点のためのシードを最初の五つの時点の平均から得た。一般的に、時点は前の時点からの出力を用いてシード値を与えた。パラメータに対する負値は許可しなかった。あるいは、データを端と類似に働く、時系列の中央に最初にフィットすることができる。適合度の項を、フィット残差の二乗の和をとり、SSEと呼ばれる負でない値を除外することにより計算した(図1A及び1C参照)。パラメータAmpA、AmpB、T2A及びT2Bをそれぞれのカテゴリーにビニングしてテキストファイルを作成した。
【０２５１】
プロット及びチェック
SSE基準を満たさなかったフィットにフラグを付け、除去した。加重LLS及び一次の多項式を使用した局所回帰に基づく単純なスムージング機能を行い、外れ値データを処分した。各フィットパラメータを時間に対してプロットした(スムージング及び非スムージング)。データシフト及び反映を行い、TEGトレーシングを模倣し、T2凝固曲線を作成した。T2凝固曲線は、線形変換を抽出した磁気共鳴パラメータに適用することにより作成することができる。特に、T2凝固曲線は、データ点の各々から最小T2A値を減じ、各得られたデータ点の負を取り、x軸についての曲線を有効に反映することによりT2Aデータから得ることができるだろう。同様に、T2凝固曲線は、データ点の各々から最大T2B値を減じ、各得られたデータ点の負を取り、x軸についての曲線を有効に反映することによりT2Bデータから得ることができるだろう。振幅データAmpA及びAmpBを同様の方法によりT2凝固曲線に変換することができるだろう。
【０２５２】
特徴抽出
プロットした曲線を測定して凝固挙動「R」、「MA」及び「角度」に関連する値を抽出した。データ抽出は、当技術分野で既知の種々の方法のいずれかを使用して行うことができる。例えば、メトリクスを、結果として生じるデータの曲線形状から得る及び/又は一つ以上のNMRパラメータの値から計算することができる。
【０２５３】
［実施例３］
凝固挙動を測定するための毛細管法の使用
毛細管を使用して患者から血液サンプル2〜5μLを収集した。血液サンプルは、ランスを使用してフィンガースティックから収集し、サンプルをヘパリン添加毛細管に収集し粘土でキャップした。あるいは、血液をパイレックス(登録商標)管に収集し、粘土でキャップした。あるいは、血液サンプルをガラス製Dagan毛細管に収集し、粘土でキャップしたが、これは活性化因子を含有しなかった。T2 NMR緩和率についてのデータを、T2リーダーを使用して毛細管サンプルから記録した。収集データが単一指数関数であること、及びこれは標準的CK曲線中に存在するのとは異なる血餅構造を反映し得ることが決定された。おそらく、毛細管の表面が血液凝固を誘導する。
【０２５４】
［実施例４］
ナノ粒子による血液の処理
血液に超常磁性ナノ粒子をドーピングすることにより、血液中のバルク水の磁化率（susceptibility）の変化がもたらされる。同様の現象は、マンガンを血液に添加してバルク水のT2値を変化させ、使用可能な化学シフトが赤血球の内側及び外側の水の測定を交換することを可能にすることにより以前に使用されてきた。単一患者からの血液サンプルを実施例1に示すプロトコルに基づく実験に使用した。さらに、血液サンプルを非官能化800nm直径ナノ粒子で処理した。2種の異なる濃度のナノ粒子を試験した。2種の異なる濃度は、ナノ粒子10μL又はナノ粒子20μLのいずれかを添加することにより得た。T2データを、T2リーダーを使用して記録した。記録したT2データを、実施例2に記載するアルゴリズムを使用して処理した。ナノ粒子を含有するサンプルについてのAmpA及びAmpBの一連のプロットから、ナノ粒子が曲線中に観察されるノイズを減少させ、AmpA及びAmpBをより容易に識別することを可能にすることが認められた。ナノ粒子を含有するサンプルについてのT2A及びT2Bの一連のプロットから、ナノ粒子がT2Aのより大きな変化をもたらすことが認められた。超常磁性ナノ粒子は、(i)サンプル中のレオロジー変化に応じたシグナル変化(若しくはNMRパラメータの値の変化)を増加させる、及び/又は(ii)凝固若しくは溶解プロセスを生じているサンプル中のレオロジー変化のより早期の検出を可能にするために、本発明の方法に有用となり得る。
【０２５５】
別の実験では、超常磁性粒子のサイズの凝固している血液のT2MRに対する影響が観察された。血液サンプルは、クエン酸塩添加全血1mLと(TEG)からのカオリン試薬1チューブを5回反転させることにより穏やかに混合して混ぜ合わせることにより調製した。血液/カオリン混合物34μLをPCR管(200μL)に入れ、37℃で1分間予熱した。0.2M CaCl2 2μLを添加することにより凝固を開始し、管をT2リーダーに入れた。サンプルを、磁気粒子を用いないで(図26A参照)、CLIOナノ粒子(30nmサイズ;約0.05ng)を用いて(図26B参照)及びSaramag超常磁性粒子(730nmサイズ;約0.05ng)を用いて(図26C参照)実行した。
【０２５６】
30nmナノ粒子の添加により、典型的なクエン酸塩添加カオリン実験における血餅シグナル(T2=200ms)が消え、T2約100msの1ピークのみが存在する。730nm超常磁性粒子の添加は両ピークを観察する能力に干渉しない。
【０２５７】
［実施例５］
ドナー血液サンプルからの磁気共鳴パラメータの決定
データ抽出に使用した磁気共鳴パラメータは、ドナーから得た血液サンプルを使用して得た。血液サンプルを、TEG法とT2凝固法の両方を使用して評価した。いくつかの異なる種類のアッセイを実行した。T2凝固データは、いくつかのT2リーダーの一つを使用して収集した。
【０２５８】
全血凝固アッセイ
ドナー血液サンプルを、本発明の方法及びTEG法を使用して評価した。実施例1に記載するように、いくつかの異なる全血凝固アッセイを使用した。
【０２５９】
K試験は、血小板活性化とフィブリン形成をもたらす酵素カスケードの両方により血餅を生成する。この血餅は、任意の種類の血小板阻害因子薬を迂回し、全血凝固全体の評価を提供する。TEG R値は酵素経路の反映を提供し、TEG MAは血餅強度の反映を提供し、血餅強度は、血小板と酵素経路の産物であるフィブリンネットワークの両方により駆動される。
【０２６０】
RF、ADP及びAA試験はヘパリンを使用してトロンビン経路を阻害し、各特定の作動薬により活性化された経路を分離する。ADP及びAAは血小板を活性化し、フィブリンネットワークの形成による血餅強度への追加の寄与が存在する。RF実行は血小板を活性化しないが、フィブリンネットワークを活性化する。そのため、RF実行からのMAは、K、ADP又はAA実行から減算され、血小板のこれらのそれぞれの実行のMAへの寄与を決定することができる。これが血小板機能の間接的測定であることは注目に値する。
【０２６１】
患者にK及びADP血液凝固アッセイを実行することを使用して、ADP血小板阻害因子であるPlavix、Ticlid及びEffientなどの抗血小板療法により患者が受けている血小板阻害の量を決定することができる。K及びADP実行についてのTEG MA値を比較してこの阻害を決定する。
【０２６２】
K及びAA血液凝固アッセイを実行することを使用して、アスピリン、ReoPro(登録商標)、Aggrastat、Integrilin及び非ステロイド系抗炎症薬などの抗血小板療法により阻害されている血小板の割合（％）を決定することができる。これらの薬物は全て、AAにおいて作動薬により活性化される受容体である、GPIIb/IIIa血小板受容体を阻害する。これは、K及びAAについてのMA値を比較することにより行う。GPIIb/IIIa受容体は、血小板を活性化すると、血小板表面で発現する(Corporation, H.、TEG(登録商標) 5000 System Guide to PlateletMapping(登録商標) Assay 2010;Enriquez, L.J.及びL. Shore-Lesserson、Point-of care coagulation testing and transfusion algorithms. Br J Anaesth、2009. 103 Suppl 1:i14〜22頁;Kroll, M.H.、Thromboelastography: Theory and Practice in Measuring Hemostatis. Clinical Laboratory News、2010:8〜10頁)。
【０２６３】
FF試験は、凝固への血小板寄与を除外する。K MAからFF MAを減算することにより、おそらく血小板寄与による血餅強度をもたらす。これは血小板機能の間接的測定である。FF及びK試験からのMAを基準範囲と比較することにより、出血の問題が低い血小板から来ているのか又は低い機能性フィブリノーゲン活性から来ているのかが示され、それによって臨床医に適当な処置を導くことができる。同様に、血栓形成促進患者を、高い血小板活性若しくは高い機能性フィブリノーゲン活性又はその両方により診断することができる。フィブリノーゲンは一次止血と二次止血の両方の重要な構成要素であり、可逆性と不可逆性血小板凝集の両方に参加する。二次止血では、フィブリノーゲンが切断されフィブリンに変換されてフィブリンマトリックスを形成する(Corporation, H.、Guide to Functional Fibrinogen. 2009)。
【０２６４】
［実施例６］
特徴抽出のためのプロセス
相当な努力を行ってT2凝固とTEG曲線との間の特徴相関を決定した。相関を探したTEG曲線中の二つの主要な特徴はR及び最大振幅(MA)であった。全特徴抽出は、全曲線の1/15又は40個のデータ点ごとにスムージングしたT2A、T2B、AmpA及びAmpB曲線を使用して行った。
【０２６５】
特徴探索は、T2凝固曲線中のいくつかの時点に基づいた。曲線の全特徴を、単純な数計算によって、T2A曲線の二次導関数が最大値に達する時により決定したRについてのトップ候補から構築した。この時点を「Possible R 」と呼ぶ。T2Bが最小又は最大値にある時、及びT2Aが最小又は最大値にある時も特徴抽出に使用した。図5は、T2凝固曲線の一次及び二次導関数を用いた単一対象についてのT2凝固曲線を示している。
【０２６６】
特に一次及び二次導関数中に偽データ点が存在し得る。そのため、最小及び最大値を、T2Aが最大二次導関数を達成する最初の時間に最も近い極値点と定義した。T2凝固曲線並びにT2凝固曲線の一次及び二次導関数中のこれらの時点を同定した後、いくつかの異なる特徴を、時点、時点の組み合わせ、数値導関数、及びT2凝固曲線の差から計算した。これらの特徴を、TEG R、MA及びMAPLATELET値と比較した。
【０２６７】
標準回帰分析を使用して特徴相関の強度を決定した。二つの項、ピアソンの積率相関(r)係数及び決定係数(R2)項を使用して特徴探索を援助した。r項は有望な相関を得るための一般的ガイドとして使用し、R2項は相関が実際にどのくらい優れているのかの尺度として使用した。
【０２６８】
90を超える特徴を試験した。特徴の例としては、PossibleRでの一次数値導関数（first numerical derivative）の値;T2Aの最大加速度でのT2Aの勾配;T2B曲線上の最大値と最小値との間の差;及び最小T2A値と最大T2A値との間の勾配が挙げられる。
【０２６９】
T2A+部分T2B曲線
特徴抽出の一つの例では、T2A及びT2B曲線を組み合わせて、T2凝固曲線とTEG MA値との間の相関を探すのに有用であったT2A+部分T2Bを得ることができる。この複合曲線を「T2A+pT2B」と命名し、T2Bが最大である時点を同定し、そのT2B値とすべてのその後のT2B値との間の差の絶対値からなるベクトルを作り出すことにより計算する。次いで、このベクトルを同一時間記録器でT2Aに加える。図6は、どのようにT2A+pT2B曲線を計算するかの例を示している。T2A+pT2B曲線はTEG曲線の上半分を模倣している。
【０２７０】
上記のように作成されたT2A+pT2B曲線は、TEG MAとの潜在的相関を生み出した。T2A+pT2B曲線上のT2RでのT2と最後の50個の点にわたる平均T2との間のT2シグナルの変化からなる特徴を同定した。この特徴は、MAとの逆相関に従い、これはMA相関についての本発明者らの第一印象と一致した(図7参照)。すなわち、T2A+pT2B曲線についての最大T2変化はTEGカオリンMA値と逆相関した。サンプルの大きなセットにわたり、この特徴は0.39〜0.55の間のR2値との相関を与えた。これらのR2値は、TEGが感受性であるものよりも、血小板などの凝固の異なる態様に感受性であるT2凝固T2A曲線から生じ得る。
【０２７１】
凝固前T2A値
血液サンプルのヘマトクリットは、凝固前にサンプル中の単一の初期水集団から計算することができるだろう。血餅形成前、この単一の水集団は実施例2に記載する双指数関数あてはめ法を使用して確立されたT2A値に対応する。サンプルの初期T2A値は、当技術分野で知られている標準的な方法を使用して測定されるヘマトクリットとほぼ逆の線形相関を有することが分かった。較正曲線は、単一患者から採取した血液を使用して異なる希釈で4種の標準のセットを作成することにより確立した。凝固開始前に水集団Aについて観察されたヘマトクリット及び初期緩和率を互いに対してプロットして較正曲線を作成した。血液サンプルを10人の患者から採取し、較正曲線に対して照会した。未凝固血液についてのT2シグナルは、ヘマトクリット(HCT)レベルと逆に変化することが分かった。図8aに示すように、広範囲のHCT基準値にまたがる別個の患者サンプルがこれを一般的に証明する。図8bに示すように、較正法を一定範囲のHCTにわたり希釈した単一の患者サンプルに適用することにより、HCTへの一次従属性が示される。図8a及び8bは、本発明の方法を使用して血液サンプルのヘマトクリットを計算することが可能であることを示している。
【０２７２】
［実施例７］
抽出磁気共鳴パラメータとTEGにより決定される凝固挙動との間の相関
測定した平均NMR緩和率データから抽出した磁気共鳴パラメータは、TEGにより決定される凝固挙動と相関し得る。表1は、抽出したT2A値と、TEG Hemostasis Analyzerを使用して測定した凝固時間パラメータ「R」との間の相関を示している。
【０２７３】
TEG Hemostasis Analyzerは、血餅の物理的特性の定量的及び定性的測定を提供する(Samaraら、Thromb. Res. 115:89〜94、2005)。本実施例では、最大振幅(MA)及び凝固時間(R)をトロンビン産生血餅サンプルについて測定した。MAは、血餅形成又は血餅強度の粘弾性の指標であり、血小板凝集並びにフィブリン形成及び重合に依存する。Rは初期フィブリン形成までの潜伏時間であり、トロンビン産生の速度と相関した。
【０２７４】
AmpA及びAmpB測定、T2A測定並びにT2B測定のプロットから、抽出データ曲線の初期の部分は、対応するTEG曲線からは入手可能でない凝固挙動の指標(例えば、線溶又はLY30)を提供することができることが認められた。
【表１】
2016500443.tif 000008
【０２７５】
凝固時間(R)についてのT2凝固相関
凝固時間(R)をT2凝固特徴と相関させる方法を、上記のように、自動的にT2Aの二次数値導関数を得ることに基づいて開発した。25回の実行にわたり、0.80のR2(図9)がR(全血凝固時間)値についてT2とTEGとの間で観察された。この相関に使用したT2凝固曲線はカオリン実行(SSE≧2)であった。三つの外れ値実行を、そのT2A曲線を右に示して図9に強調する。三つのケース全てで、T2A曲線はR TEG時間前に最大加速(T2A''=0)を達成する。
【０２７６】
血小板関連血餅強度(MAPLATELET)についてのT2凝固相関
カオリン実行を使用してTEG MA時間及びT2凝固特徴を相関させるためにいくつかの特徴を探索した。カオリン実行について見られた最も顕著な相関は、時間0と最小T2値との間のT2凝固特徴であり、これはT2 R特徴の直前である。これは、T2A曲線の典型的な初期減少である。時間0と最小T2値との間のT2Aシグナルの勾配はTEG MAPLATELET値と相関する。TEGは血小板活性を直接測定することはできないので、血餅強度へのトロンビン誘導血小板寄与は、活性化因子若しくはA実行からMA項(MAA)、又はカオリン実行からMA項(MATHROMBINとも呼ぶ)を減算することにより導出される。図10は、14 T2凝固実行についてのTEG項MATHROMBIN-MAA、又はCK実行からのMA−A実行からのMAと28 TEG実行との間の相関を示す。R相関と同様に、SSE≧2を使用した。TEGを用いてMAPLATELET項を得るために、2種の異なるTEG曲線を得なければならず、使用者は手動演算を行って血餅強度への血小板寄与を決定しなければならない。しかしながら、T2凝固を用いれば、この情報は単一T2凝固実行の最初の6分以内に入手可能であり、セットアップがはるかに早い。
【０２７７】
機能性フィブリノーゲン関連血餅強度(MAFF)についてのT2凝固相関
NMR緩和データを収集する前に添加剤を血液サンプルに含めることにより、凝固挙動を決定することができる。フィブリノーゲンをサンプルに添加してMA値の範囲を有効に滴定することができる。図11は、機能性フィブリノーゲン滴定についてのT2凝固曲線及びFF実行のMAとT2凝固曲線からの特徴との間の相関についての明確な証拠を示している。このT2凝固特徴は、初期と最終T2凝固AmpA値の間の差(ΔAmpA)として計算した。フィブリノーゲンを3種の異なる濃度で(0.63、1.25及び2.5mg/mL)サンプルに添加した。図11(c)に見られるように、添加フィブリノーゲンを含有しないサンプルと比較して、これらの機能性フィブリノーゲン(FF)(MAFF)実行についてのΔAmpAとTEG MAとの間に強い相関が存在した。フィブリノーゲン滴定を2人の他の患者サンプルについて行ったところ、0.9より上及び0.98もの相関が得られた。このプロトコルでは、クエン酸塩添加全血をその元の濃度の50％まで希釈した。
【０２７８】
MAの30分後の溶解％(LY30)についてのT2凝固相関
線溶を検出するために使用するLY30項について相関が認められた。5人の異なる健常患者サンプルを使用してT2凝固が線溶に感受性であるかどうかを試験した。2種のレベルの組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)を健常患者血液に添加することにより、TPAの添加を使用して線溶を刺激した。フィブリンが形成するとTPAがフィブリンを切断する。線溶をT2凝固の10分以内に検出することができることが認められたが、これはTEGの検出に必要とされる時間の半分未満である。全5人の患者について、健常と線溶サンプルとの間の明確な差が存在した。図12は、非線溶(実線)サンプル及び線溶サンプル(破線)についてのT2A及びT2B曲線に関するT2凝固データを示している。
【０２７９】
図13に示すように、T2Bシグナル及びTEGからのLY30項の変化についての強い相関が存在する。この相関のために使用することができるいくつかの潜在的特徴が存在する。調査した三つは(i)最小及び最大T2B値(図13)、(ii)T2B曲線の最後の25分にわたるT2B値の平均、及び(iii)10分でのT2B値の間の差であった。全てが0.72〜0.79の間のR2値で相関を有していた。相関プロットは、TEGよりも線溶についてのT2凝固のより高い感度を示す。これは、図13の線溶の異なるレベルについてのグループ化により分かる。健常患者サンプルを実線で囲む。完全線溶サンプル(118ng/mLのCathflo(登録商標)、Genentechにより製造されている組換えアルテプラーゼを含有する)を破線で囲み、部分線溶サンプル(60 ng/mLのCathflo(登録商標)、Genentechにより製造されている組換えアルテプラーゼを含有する)は囲まない。T2凝固T2B項はわずか10分で検出することができ、これはTEG LY30項を検出することができるよりもはるかに速く、線溶のより迅速な測定のためにT2凝固シグナルが有用であることを示している。
【０２８０】
凝固時間、PT/INR及びaPTT
T2MRの血液及び血漿中での血餅形成に対する感度（感受性）を使用して、PT/INR、aPTT及びTEG Rなどの凝固時間を測定することができる。
【０２８１】
第1にT2時間曲線の時間0のT2値を確立し(すなわち、第1の点又はある種の平均又は最初の5〜10個のデータ点への線形あてはめを取り)、第2にT2値がサンプル中の凝固を示す所定の量(例えば、5％又は10％)変化した時のT2時間曲線中の時点(すなわち、凝固時間又はPT時間)を同定することにより、凝固時間をT2MRにより測定した。観察されたPT凝固時間から、INRをJanら、Clin. Chem. 35:840(1989)に記載されている方法を使用して計算した。
【０２８２】
Stagoを用いたPT/INRについての相関は、トロンボプラスチン試薬(Thrombotest、Axis Shield)及びT2MR用の全血の1:5希釈及び標準試薬及びStago Startシステム用の血漿プロトコルを使用して証明した(図14A参照)。18個の正常サンプル及び24個の異常サンプルを、20個の正常サンプルにより確立された基準範囲に対して試験した。PT時間が延長した異常サンプルは、増加したレベルの抗Xa阻害因子Ribaroxiban(10ng/mL〜1000ng/mL)を添加することにより得られた。TEG凝固時間との相関は、0.8より大きい非最適化R2相関で40超の正常患者サンプルにわたり得られた(図14B参照)。血漿についてのStago(図14D参照)及び全血についてのHemochron(図14C参照)を用いたPT時間相関も見られた。
【０２８３】
［実施例８］
T1緩和測定
T2測定を測定することができることに加えて、T2リーダーは、T1測定を測定することができるよう構成され得る。T1はサンプル中の水素原子スピン系の異なる物理的特性を測定する。そのため、T1データは、T2データと比べて、血液凝固についての代替及び相補的情報を提供する。従来のT1測定はT1シグナルを得る段階的性質のために時間を消費していたが(2〜3分)、z-リフォーカスエコー(z-refocused echo)(ZRE)法を使用して5秒未満以内にT1が得られた。天然及び凝固全血についてのT1緩和曲線の測定を行ったところ、T1の血液凝固に対する感度（感受性）が認められた(未凝固全血T1=787ms;凝固全血T1=860ms)。
【０２８４】
［実施例９］
T1/T2ハイブリッド検出法
T1/T2ハイブリッド検出法は当技術分野で既知である(これにより参照により組み込まれる、Edzes、J. Magn. Reson. 17:301〜313、1975;Sezginerら、J. Magn. Resn. 92:504〜527、1991)。これらの方法及び関連する方法を本発明に使用して磁気共鳴パラメータ値を評価及び/又はT2凝固曲線を確立することができる。
【０２８５】
T1は、典型的には反転回復法シーケンスによってサンプリングする。反転回復法シーケンスは、パルスシーケンスに使用するデータ測定の数により指示される、使用者が達成することを望む測定される緩和時間の精度に応じて、数分かけて得ることができる。反転回復法シーケンスについての詳細は、任意の標準的NMRテキストブックで検索することができるので、ここでは記載しない。
【０２８６】
T1ZREパルスシーケンスにより、完全な緩和までの磁化に要する時間(約3〜5×T1)にわたりT1を測定することが可能になる。これは、180°パルスにより磁化を反転させ、次いで、大きさを測定し、一連のパルスによってこれをもとの-z位置に戻すことにより磁化を平衡に戻しながら、磁化をサンプリングすることにより達成される。
【０２８７】
磁化をサンプリングするのにかかる時間をτcと呼び、サンプリング間の時間をτrと呼ぶ。実際の測定までのτcの開始後の時間はτmである。測定緩和定数は、R2とR1の組み合わせであり、R12と呼ぶ。三つの項は、
R12=(1-p)R1+pR2   (11)
［式中、p=τc/τr］
により関連する。この関係から、pが0になると、R12がR1になることが分かる。
【０２８８】
τrは点の総数及び測定の総持続時間に依存するだろう。T2凝固測定については、これは30個の点で約3秒にわたり100msのτrであった。τc項はパルスシーケンスから計算することができ、本質的には3×τ又は750μsに等しい。したがって、p項は0.0075に等しく、測定緩和又はハイブリッド、T1/T2(hT12)項は主にT1となるはずである。Sezginerらは、hT12シグナルからT1測定を得るための単純な式を提供しており、これは
【数７】
2016500443.tif 000009
【０２８９】
［T1measはhT12であり、T1はT1であり、Tbは二つの測定間の持続時間であり、tcpはエコー間遅延又はτの半分であり、T2は測定T2時間である］
である。
【０２９０】
上記記載はどのようにこのハイブリッド緩和時間を測定することができるかを単に説明するものである。ハイブリッド緩和定数を測定する及びT1を迅速に得るために使用することができる他のパルスシーケンスが存在する。
【０２９１】
使用するパルスシーケンスにかかわらず、本発明の概念は、凝固(すなわち、血液凝固)をモニタリングするための磁気共鳴緩和測定を迅速に得ることを目指している。他の種類の磁気共鳴パルスシーケンスを使用して凝固中にサンプル中のバルク水素シグナルをモニタリングすることができる。例としては自由誘導減衰(FID)に基づく分析、高速フーリエ変換に基づく分析(FFT)などのリラクソメータでの材料分析に一般的に使用されるT2、T1、T1/T2ハイブリッド時間、その逆転項のR2、R1、R12、及びパルスNMR測定が挙げられる。FID分析は、一般的に急速減衰シグナルと緩徐減衰シグナルを識別する。これらの二つのシグナルの強度を、その減衰定数のように比較することができる。これらのパルスシーケンスは、脂肪分析、脂肪含量及び固体対液体比、固体脂肪対液体比、水素含量決定、油含量、固形分、及び総脂肪含量決定、油水エマルジョン、並びに脂肪及び水分決定のために一般的に使用されている。同様のリアルタイム又は動力学的測定を、これらのNMRパラメータを用いて、凝固反応を生じているサンプルに行うことができる。
【０２９２】
別の緩和測定は、(1)凝固プロセスについてのより多くの情報;(2)T2測定により捉えられない特定の情報;及び(3)T2と新たなパラメータの両方が感受性である因子についての正規化、を提供するのに魅力的である。ポイント3をさらに説明するために、例えば、T1測定が患者間の変動に感受性であるがT1が凝固情報を含有しない場合、T1曲線を使用して、臨床サンプル中の望ましくない感度から生じるT2シグナルの部分を「減算する（subtract out）」ためのアルゴリズムが存在するべきである。このような望ましくない感度は、ヘマトクリット、血小板数等の変動であり得る。
【０２９３】
概念を説明するために、本発明者らは、Bruker minispecでCK凝固曲線を測定した。実験は300μLのサンプル容積で、ガラス製NMR管の内側で行った。このリラクソメータは、T2とハイブリッドT12(hT12)緩和時間の両方を迅速に測定することができるパルスシーケンスを有していた。T1は式12により得た。
【０２９４】
得られたT2凝固曲線は、本発明に使用したT2リーダーで得られたT2凝固曲線と極めて類似の形状及び特徴を示した。これは、使用したBruker minispecはT2リーダーとは極めて異なる検出コイル、磁石及び曲線あてはめアルゴリズムを有するので、他のT2凝固曲線の確認となる。記載するパルスシーケンス条件下で、T1/T2ハイブリッドは主にT1である。この実験では、T1/T2ハイブリッドシグナルを交互に得た。T2シグナルを、CPMGシーケンスを使用して得て、次いで、T1/T2シグナルを、T1ZREシーケンスを使用して得た。T1/T2ハイブリッド(主にT2)をT2Aで割ることにより、シグナルを互いに組み合わせて新たな曲線を作成することができ、これは血液サンプルの凝固亢進及び/又は凝固低下を評価する本発明の方法に有用であり得る。
【０２９５】
［実施例１０］
アクリルアミド合成凝固対照
アクリルアミドゲル重合をT2凝固測定のための合成対照として使用した。表2に列挙する量の脱イオン水、40％アクリルアミド、0.5M Tris pH6.8緩衝液、及び10％過硫酸アンモニウムを使用して混合物のセットを形成することにより、アクリルアミドゲルのセットを調製した。混合物を室温で30分間インキュベートした。各混合物36μLを、対照として使用するために別々のPCT管のセットに保存した。テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)2μLを各混合物に添加した。30分後、各対照のT2測定及び重合反応を行った。
【表２】
2016500443.tif 000010
【０２９６】
TEMED処理サンプルと対応する対照サンプルのT2値を比較することにより、T2の変化率（％）を計算した。測定データを表3に示す。
【表３】
2016500443.tif 000011
【０２９７】
15％、20％及び40％アクリルアミドゲルは、最大T2変化％を示した。これらの反応を時間経過T2測定に選択した。15％、20％及び40％アクリルアミドゲルを表3に従って調製した。TEMEDを添加したら、各サンプルを直ちにT2T2リーダーに入れ、測定を開始した。時間経過データにより、T2及び反応速度の全体変化がアクリルアミド百分率に依存することが明らかになった。これは、これらの異なる反応についての異なるポリマー密度を反映している。T2のポリマーゲル組成に対する感度（感受性）は、おそらく単一T2測定の時間経過中の水拡散の平均長さの変化に対するT2の感度（感受性）によるだろう。
【０２９８】
超常磁性ナノ粒子を合成凝固反応(例えば、アクリルアミドゲル形成)と共に使用することができる。40％アクリルアミドゲルを約800nmカルボキシSera-magナノ粒子(1μg/mLナノ粒子)の存在下で重合した場合、T2時間曲線の初期部分は平坦化した。上記T2測定に使用するCPMGパラメータは以下の通りである:パルス幅=6.8μs;高周波ブランキング幅=1μs;90〜180スペーシング=249.6μs;num 180s=7000;全励起=3494.902ms;反復(Tr)=1000ms;受信機位相=0;90位相=0;及び180位相=90。
【０２９９】
この実施例は、どのようにNMRパラメータ(例えば、T1又はT2)が相変化を生じているサンプルで変化するかを説明する。ポリマー密度を増加させると、T2のより急速な変化及びT2の全体的により大きい減少が生じ、T2シグナルのポリマーマトリックス密度、細孔径、及びゲルの他のパラメータへの依存を示している。同様の結果は、他の食品製品の中でも、カッパカラギーナンゲル(カリウムイオンを添加したゲル)、イオタカラギーナン（carrageen）ゲル(カルシウムイオンを添加したゲル)、アルギン酸ナトリウムカルシウム、ゼラチンなどの他のゲルで得ることができる。
【０３００】
［実施例１１］
細菌内毒素の検出
本発明の方法及び装置を使用して細菌内毒素、すなわち、グラム陰性菌の細胞壁物質を検出する。内毒素は、ヒトに高熱をもたらすことができ、結果として、血液に接触する注射用薬物及び医療機器は内毒素の存在について頻繁に試験されている。内毒素を検出するための凝固ベースアッセイは、細菌内毒素とアッセイに使用する特定の溶菌液との間の反応によるものである。カブトガニ、アメリカカブトガニ(Limulus polyphemus)の循環アメーバ様細胞から得られる溶菌液が使用することができる具体的な溶菌液である。アッセイでは、溶菌液を、内毒素の存在について試験するサンプルに導入する。凝固プロセスを介してゲルが形成すると、内毒素が存在するとみなされる。このようなゲルの形成及び特性を、本明細書に記載するNMRに基づく方法のいずれかによりモニタリングする。
【０３０１】
［実施例１２］
T2サイン曲線
NMRデータを処理して、血液サンプル中の個々の水集団を表す別個のシグナル(すなわち、最大値)を示すT2サイン曲線を作成する。数学的変換(すなわち、ラプラス変換又は逆ラプラス変換)を凝固イベント中の時点でT2に関連する減衰曲線に適用することにより、T2サイン曲線を作成する。図15は、T2減衰曲線及び対応するT2サイン曲線を示している。三つのシグナルは、血液サンプル中の三つの水集団を表す。図15はまた、シグナルが経時的に変化し得る一つの様式を示している。
【０３０２】
NMR緩和データ中に観察される水集団A及びBと凝固サンプルの成分との間の相関を、周囲血清から退縮した血餅を分離し、これら二つの構成要素についてのT2データを別々に測定することにより確認した(図16参照、凝固が完了した後のT2サイン曲線)。患者サンプルについての二つのT2緩和スペクトルを、二つの異なる時点で、T2リーダーで収集した(図18参照)。スペクトルは、サンプル中の血液と一致する時間0での初期の有意なピークを示している。20分では、二つの有意なピークが明らかである。より低いT2時間(約200〜300ms)のピークはT2血餅水環境と一致し、より高いT2時間(約450〜580ms)のピークはT2血清水環境と一致する。
【０３０３】
T2AとT2Bとの間の差(ΔT2)は、血餅強度と相関することが認められた。図17は、同一患者から採取した二つの異なるサンプルについての二つの重ねたT2緩和スペクトル及びTEG血餅強度(MA)を示している。弱い血餅(MA=19.2)を含有するサンプルは、強い血餅(MA=65;258ms)を含有するサンプルよりも、血餅関連シグナルと血清関連シグナルとの間の差についての低い値(182ms)を示した。このデータは、血餅強度の増加がΔT2と正に相関することを示している(R2=0.8771、図18参照)。
【０３０４】
全血中に見られたT2MRシグナルの解釈を補助するため、血液凝固に寄与する主要な成分を分離時及び再混合（recombination）後に測定した（表4）。緩和理論及び分析と一致して、T2MRシグナルは、血清において最高であり、血漿において中間であり、血液及び収縮した血餅において最低であった。健常ドナーからの全血に関するT2値の範囲は285〜400msであり、これはヘマトクリット値35〜55％に相当する。全血と比較して血清中の最高T2MRシグナルは、水プロトンの緩和を促進する赤血球（及び付随するヘモグロビン）の欠損によって生じている。血漿のT2MRシグナルは、緩和剤として作用する比較的高濃度のタンパク質に起因して、血清のものよりも低い（表4）。
【表４】
2016500443.tif 000012
【０３０５】
［実施例１３］
血餅中の水集団の3Dプロット
T2緩和率データを健常患者から採取したCK血液サンプルから収集した。各サンプルについて、一連のT2減衰曲線を50分の期間にわたって測定した。減衰曲線を逆ラプラス変換(ILT CONTIN)を使用して各々処理して、T2時間の関数としてT2強度を示す一通りの曲線を得た。逆ラプラス変換曲線を凝固時間次元の持続時間にわたって積み重ねてどのようにサンプル中の水の異なる集団が時間の関数として変化するかを示す3D表面を作成することにより、これらの曲線を、3Dデータセットを形成するようコンパイルした。図20は、Bruker minispecで収集した患者サンプル29328及び29350についての3Dデータセットを示している。3Dデータは、未凝固血液に相当する250〜500msのT2時間の初期水集団を示した。5分〜30分の間の時間で、単一水集団が二つの有意な水集団に分岐した。これらの二つの水集団は、血餅の二つの構成要素、すなわち、退縮した血餅及び退縮した血餅を囲む血清に相当する。第1の血餅関連水集団は80〜400msのT2時間を有し、退縮した血餅に相当する。第2の血餅関連水集団は400〜3000msのより広範囲のT2時間を有し、退縮した血餅を囲む血清に相当した。いくつかのサンプルについて、これらの二つのピークは完全には分解されなかった。凝固サンプルの水集団と構成要素との間の相関を、周囲血清から退縮した血餅を分離し、これらの二つの構成要素についてのT2データを別々に測定することにより確認した。
【０３０６】
［実施例１４］
アブシキシマブを使用した血小板活性の阻害
全血サンプルの凝固を、抗血栓薬アブシキシマブ(ReoPro(登録商標))を使用して摂動させた。アブシキシマブは、ヒト血小板のIIb/IIIa受容体に結合し、血小板凝集を阻害するヒト-マウスモノクローナル抗体のFabフラグメントである。アブシキシマブは、凝固プロセス中に血餅の退縮を阻害するよう作用する。
【０３０７】
アブシキシマブを含有するサンプルを以下の手順に従って調製し、μg/mLの単位のアブシキシマブ濃度に相当する数により本出願及び図面で参照する。
1. 血液を正常ドナーから6本のクエン酸塩添加管に採取した。正常ドナーは過去2週間にアスピリンも任意の抗血小板薬物も服用していてはならない。
2. 6本の管の血液をプールし、8〜10回穏やかに反転させることにより混合した。サンプルは収集してから2時間以内に使用した。
3. アブシキシマブ溶液(10mg/5mL)を希釈剤として生理食塩水を使用して1:4の比で希釈して「溶液1」を形成した。
4. 血液に、表5に従って、溶液1及び生理食塩水を添加した。
5. いずれかのサンプルをT2リーダー又はBruler minispecで測定する前にサンプルを少なくとも5分間静置した。
【０３０８】
【表５】
2016500443.tif 000013
【０３０９】
第1の実験では、患者サンプル29488の4分割量を、凝固プロセス開始前に異なるアブシキシマブ濃度(0、2、4及び8μg/mL)を有するよう調製した。四つのサンプルについてのT2緩和時間を血餅形成の経過にわたって測定し、対応する3Dプロットを実施例13に記載する技術を使用して決定した。明確な傾向が四つの3Dプロットで明らかとなり、高濃度のアブシキシマブが退縮した血餅水集団及び血清水集団の単一水集団への合体をもたらした。最高濃度のアブシキシマブでは、もはや二つの相は血餅中に見えなかった。この物理的変化は対応する3Dプロット(図21)で証明及び定量化され、最高濃度のアブシキシマブで均一サンプル中の水の高速変化を示している。
【０３１０】
第2の実験では、患者サンプル29494の5分割量を、凝固プロセス開始前に異なるアブシキシマブ濃度(0、2、4、8及び0μg/mL)を有するよう調製した。サンプルについてのT2緩和時間を連続して測定し、各測定セットは約50分持続した。試験した最初のサンプル及び試験した最終サンプルは添加アブシキシマブを含有しなかった。収集したT2減衰曲線を、実施例18に記載するように逆ラプラス変換を使用して処理した。五つのサンプルについての0.1分の時間でのデータを図22に示す。曲線は、アブシキシマブの存在下で、T2シグナルのより狭い分布が、血液サンプル中に存在する初期水集団中に観察されることを示している。その両方が添加アブシキシマブを含有していなかった最初サンプル実行と最終サンプル実行との間の曲線形状の差は、サンプル齢のT2時間分布に対する効果の証拠となり得る。最初の四つのサンプルについての20分の時間でのデータを図23に示す。これらのサンプルについての対応するTEG決定MA値は、それぞれ60.7、61.4、30.4及び22.0であった。強い血餅を形成し、分解が乏しいT2ピークを示した他の二つのサンプルよりも、最高濃度のアブシキシマブを有する二つのサンプルは、TEGにより測定されるように弱い血餅を形成し、狭く、より分解したT2ピークを示し、これらのサンプル中の複数の水集団及び環境の不均一性を示している。このデータは、本発明のNMRに基づく方法を使用して、凝固サンプル中の血小板活性を測定することができることを示している。図22及び23は、アブシキシマブなどの、サンプルの凝固挙動を調節する添加剤を有利に使用して、TEG決定指標(例えば、血餅強度及び血小板活性)と本発明の方法を使用して決定されるNMR由来データとの間の相関を確立することができることを示している。
【０３１１】
図24は、どのように3Dデータセットから構築した3Dプロットを使用して血液サンプルについての凝固時間を決定することができるかを示している。図25は、3Dデータセットから構築した3Dプロットを使用して、どのように血小板阻害が血餅関連シグナルのシグナル強度を低下させ、血清関連シグナルをより低いT2値に移動させるかを示している。
【０３１２】
［実施例１５］
データ品質及びフィット品質の評価
単一サンプルについてのT2凝固データは、S観察T2 CPMG緩和曲線{fj(t):0<t<T、j=0、1、2、3、…、S}(式中、j=0、1、2、…、Sはサンプルの凝固/血餅形成プロセスを通した時間の点であり、j=0は凝固開始に相当し、j=Sはサンプルが予想された凝固イベントを受けた後の点に相当する)の集合からなる。T2凝固アルゴリズムは、減衰関数のこの集合をT2×凝固時間領域にわたって減衰定数ポテンシャルの面に変換し、次いでこれらのポテンシャルからサンプルについての有用な情報を抽出する。
【０３１３】
単一T2 CPMG緩和データfj(t)は、式(3)を使用して加重指数関数減衰関数の有限和としてモデル化されるだろう。典型的には、nはサンプルの複雑さのために大きい(例えば、n>300)。このモデルのパラメータを推定するために多くのアルゴリズムが開発されてきた(Istrovら、Rev. Sci. Instrum. 70:1233(1999)参照)。例えば、Tikhonov正則化法(Tikhonov Sov. Math. Dokl. 4:1035(1963)参照)をCONTINに実行して(Provencher、Comput. Phys. Commun. 27:229(1982)参照)本発明の方法で収集した緩和データを評価することができる。一般的なように(Davies、Inversion Problems in Scattering and Imaging、M. Bertero及びE.R. Pike編(Adam Hilfer、Bristol、1992)、393頁)、T2凝固緩和データのための本発明の方法の使用は、前に提供するものなどの、特定の修正又は設定の適用を要し得る。
【０３１４】
逆ラプラス変換は、不良設定計算(多くの等しく正確な解法が所与の複合減衰データセットから生じ得ることを意味する)であることが知られている。これは、最も明確なデータに当てはまり、複合減衰曲線のノイズが多くなる又は単一指数関数減衰関数の和から著しく動くにつれて悪化する。
【０３１５】
CPMGデータ品質
この課題に対処するために、変換の前に、各T2CPMGデータセットを試験して、データセットと変換が成功する全体的尤度の両方の品質を確立することができる。信号対雑音比(SNR)は、緩和データの遅くに(すなわち、T近くのt)観察された変動と比べてt=0でのCPGM強度に基づいて推定する。初期シグナルの減少から生じた低いSNR値は、データから検討の資格を奪う装置及びオペレータのエラーに関連する。低いSNRは、CPMGデータの遅くの変動の増加から又は減衰プロセスの観察期間が短すぎる場合にも生じ得る。後者の場合は、所与のデータセットにおける減衰定数が予想よりも大きくなることが示唆される。Tikhonov正則化法は予想される最大T2値の知識を要するので、最大予測T2値(CONTINのパラメータ)を増加させることにより、T2アルゴリズムはCOMG曲線の遅くの線形傾向による低SNRの場合を適合させる（accommodate）。
【０３１６】
変動増加はまた、少数の極値点(複合減衰仮定に対する)がCPMG曲線の末尾に見られる場合にも生じる。単一指数関数減衰関数を用いてCPMG曲線のサブセクション(0<t1<t<t2<T)をあてはめた後、フィット残差の分布の正又は負の尾部に見られる点を変換の前に除去する。
【０３１７】
T2 CPMGデータが品質条件を満たした後、減衰プロセスがフィットのジャックナイフ検定の適用を可能にするのに十分長く観察された場合、CPMGデータを二つのサブセットTrain及びTestにランダムに分けて、結果としてTrainが8000個以下のデータ点を有し、残りがTestセットに割り当てられるようにする。Trainデータを変換し、多指数関数減衰関数を定義する得られたモデルパラメータを使用してTestデータのフィット品質を評価する。Testデータのフィット品質は、フィットの独立した尺度を与え、T2凝固アルゴリズムの特徴抽出相に使用される。
【０３１８】
CONTINパラメータ値
いくつかのCONTINパラメータは逆ラプラス変換の品質に劇的に影響を及ぼす。表6は、T2 CPMGデータを最良適合させるためにT2凝固アルゴリズムにより使用されるパラメータ及び値を記述している。正則化値(α)は、二つ以上のT2ピークを分解する能力において主要な役割を果たす。T2凝固アルゴリズムは、水分子の亜集団が自身を他の集団から識別し始めた場合の識別するための狭いピークを要する。表6に明示するα値の特定の範囲は、CONTINにこの亜集団識別を可能にする正則化加重を用いた解法を検索させる。
【０３１９】
【表６】
2016500443.tif 000014
【０３２０】
最小T2値は、典型的には1〜50msの範囲に設定する。これは、サンプル容器中のプラスチックから生じるCPMG時間定数を説明する。最小が1msより上に増加すると、ILTを行うCPMG曲線データを切断して逆転が認められない短時間定数を除外しなければならない。例えば、最小T2を40msに設定する場合、40msより前に収集したCPMGデータを、ILTを行う前に除去するだろう。
【０３２１】
最大T2値は、サンプル/アッセイの種類及び使用モードにより以下のように変化する。わずかなRBCを含有する多血小板及び乏血漿サンプルは、より大きな最大T2値を要する。PPP及びPRP最大T2値を2500〜3500msの範囲に設定する。RBC含有サンプルは、1000〜2000msの範囲の最大T2値を有するだろう。磁気粒子をサンプルに含めると、最大T2値を減少させることもできる。予測T2値が存在しない状況に関しては、最大T2値を2500〜4000msの範囲に設定して、新規のサンプルの種類を調査しながら潜在的T2値の最も広い範囲を認めることができる。ILTフィットはCPMG曲線全体を説明しようと試みるが、有限範囲のT2値にわたって説明するので、偽ピークがT2フィット境界で生じ得る。これを適応させるために、追加の0.5〜1秒を使用する最大T2値に添加する。上記範囲はこの追加の時間を含む。
【０３２２】
Tikhonov正則化法は、T2領域にわたる反転の平滑度を制御するパラメータ(α)を含む。小さすぎると、ピークは広くなり、化合物ピークを産生する可能性を有し、大きすぎると、ピークはより狭くなり、単一ピークをいくつかの近接配置されたピークに分割する可能性を有する。Tikhonovアルゴリズムの実行としてのCONTINは、これらの二つの極値間の妥協を求める正則化項を検索することができる。これは、約1.0e-10及び約4.0e0のアルファ値の範囲内で、コースアルファグリッド検索を用いないが、増加したファイングリッド検索(12反復)を用いてCONTINを実行することにより達成される。
【０３２３】
T2減衰定数ポテンシャル面の構築
いったん各ILTを行ったら、曲線{lj(τκ):1<τκ<最大T2、κ=1、2、3、…、N、j=0、1、2、3、…、Sの集合はCPMG曲線フィットの元の集合を置換する。所与のCPMG曲線fjについては、減衰定数τκはlj(τκ)を多指数関数分解に与えると推定される(式13参照):
【数８】
2016500443.tif 000015
【０３２４】
(式中、lj(τκ)は多くのκについて0であり得る)。非ゼロ減衰定数の変化及び上記時間にわたる分解へのその寄与はサンプルの変化に相当し、T2凝固アルゴリズムはこれらの値及びその変化を解釈してサンプルのレオロジー状態についての情報を得る又は対象の止血状態についての情報を得る。これらの特徴を抽出する前に、偽ピーク及び多峰ピークを分解する(以下に記載のように)。
【０３２５】
偽ピーク同定及び除去
一般に、所与のjについて、ILT振幅値lj(τκ)を、値が非ゼロである小(<6)領域の周りのT2領域にクラスタ化する。理想的には、非ゼロ強度のこれらの島は単峰であり、反転を行ったT2値の範囲の境界から離れている。これは常に当てはまるわけではないので、lj(τκ)を正確に解釈するよう注意しなければならない。
【０３２６】
lj(τκ)に適用する第1のフィルターは、T2値が、分析しているサンプルの種類に基づいて以前予測した値と一致しない非ゼロ値を除去するためのものである。これの例としては、サンプルを含有するプラスチックから生じるT2<50ms、サンプルが高濃度のタンパク質を有することが予想される場合のT2<100ms、及び本発明に使用する最大T2範囲又はその近くのT2が挙げられ、その存在はより大きい最大T2を使用してサンプルのCPMGデータを反転するべきであったことを示す。
【０３２７】
さらに、Tikhonov正則化法は、各lj(τκ)を推定しながら、lj(τκ)の標準誤差E(τκ)を計算する。lj(τκ)がほぼ0である場合、lj(τκ)<E(τκ)であることが一般的であり、これはほとんどの非ゼロ島の縁が、このような非ゼロ強度の集合の平均τκ近くの強いシグナルにもかかわらず曖昧であることを意味する。これらのlj(τκ)は除去しない。あるいは、lj(τκ)が極大であるτκでlj(τκ)<E(τκ)である場合、非ゼロ島全体を信頼できないとみなし、0に設定する。
【０３２８】
［実施例１６］
乾燥又は凍結試薬の使用
乾燥又は凍結試薬を本発明の方法に使用してもよい。以下の結果は、試薬を乾燥させること及び試薬を凍結することが、T2緩和により観察される凝固プロセスに識別可能な影響を及ぼさなかったことを示す。
【０３２９】
血小板活性化因子としての管乾燥コラーゲン
コラーゲンは、血小板の強力な活性化因子であり、細胞マトリックスから露出したコラーゲンの認識は血小板活性化についてのインビボシグナルの一つである。本発明者らは、マイクロチューブの底で乾燥させた小分割量のコラーゲンが全血とRBC-枯渇血漿の両方でT2MR血餅ピークを有効に生成することができることを示した。チューブを調製するために、2μg(1mg/ml溶液2μL)をマイクロチューブの底に堆積させ、チューブを37℃2〜5時間に置いた。このように調製したチューブを室温又は37℃で数週間保持することができる。T2MRサインを測定するために、クエン酸塩添加全血(又はRBC-枯渇血液)34μLを37℃でチューブに添加した。1分後、0.2M CaCl2 2μLを添加し、サンプルを緩和測定及び分析のために磁石に置いた。
【０３３０】
血小板のADP活性化のための凍結ワンポット製剤
本発明者らは、ヘパリン添加を使用してトロンビン活性を制御し、それによってトロンビンを介して血小板活性化の変動を最小化するクエン酸塩添加全血中の血小板のADP活性のための標準的製剤を開発した。このような系の凝固は、カルシウム(クエン酸塩を断つため（overcome）)及びレプチラーゼ/第XIIIa因子(トロンビンを置換するため)の組み合わせで開始される。ADPを介して血小板を活性化し、それゆえ、P2Y12 ADP受容体の状態をプロービングするのに有用な完全なワンポット活性化混合物は、ヘパリン、レプチラーゼ、第XIIIa因子、カルシウム及びADPを含有する。また、0.5〜1.0mMアラキドン酸で血小板を活性化した。
【０３３１】
本発明者らは、このような混合物を、少量バッチで製造し、ADP誘導血小板活性測定のT2MR測定のための単一使用分割量で凍結(-20℃で)することができることを示した。この混合物の使用は、室温で適当な量の試薬を含有する作り置きマイクロチューブを解凍するステップと、クエン酸塩添加全血34μLを添加するステップと、混合するステップと、サンプルを緩和測定分析のためにリーダーに入れるステップとからなる。
【０３３２】
乾燥カオリンアッセイ
カオリン実行により、血清及び血餅シグナルの分解が可能になる。患者サンプルにわたり、これらの実行は、使用者のエラーからの絶対T2値の変動を示し得る。乾燥試薬の使用により、ピペット操作エラーが回避され、すべての湿潤試薬実験中に通常遭遇する試薬添加変動が低減する。さらに、乾燥試薬を使用することにより、より単純なアッセイプロトコルがもたらされ、ここでは血液を、追加のピペット操作ステップなしで乾燥試薬を含有するチューブに直接添加する。
【０３３３】
CaCl2及びカオリンを含有する乾燥混合物を調製した。0.2M CaCl2 24μL及びカオリン(Haemonetics)10.8μLを混合し、分割量を10本のPCR管に分配した(調製した混合物2.9μLを各管に)。各管の内容物を、管の蓋を開けた状態で、インキュベータ中37℃で2時間にわたって乾燥させた。各管に蓋をし、チューブを2〜25℃で保管した。乾燥CK試薬混合物を含む予熱PCR管に、予熱クエン酸塩添加全血36μLを添加した。試薬及び血液を、100μLピペット先端を用いて、ピペット操作で上下に動かすことにより3回穏やかに混合した。混合物に蓋をし、サンプルを緩和測定分析のためにT2リーダーに入れた。湿潤試薬も、対照としてクエン酸添加全血と混ぜ合わせた。
【０３３４】
［実施例１７］
アスピリンの効果
この実験では、AA+RFによる活性化の前に600μMアスピリンをex vivoでヘパリン血液に添加することにより、血小板阻害をモニタリングした(サンプルを、アスピリンを用いて及び用いないで試験した)。血餅関連T2シグナルが、アスピリンをドープされたサンプルの存在下で劇的に減少又はなくなることが認められた。これらの試験により、血餅サインは血小板活性に依存することが確認された。これらの試験はまた、血小板阻害を測定するためのT2MRサインの有用性も示している。
【０３３５】
［実施例１８］
2-チオメチルAMP(MeSAMP)の効果
この実験では、血小板活性のPlavix阻害についての模倣物としてex vivoで添加したMeSAMP(2-チオメチルAMP、不可逆ADP P2Y12受容体阻害因子)を使用することによる血小板のP2Y12経路の阻害を試験した。
【０３３６】
ヘパリン、レプチラーゼ、第XIIIa因子、カルシウム及びADPを含む標準ADP活性化製剤を使用して、健常ドナーから得たクエン酸塩添加全血中の血小板を活性化した。サンプルを血小板活性化阻害因子MeSAMPの存在及び非存在下で試験した。本発明者らは再び、血餅サインが血小板活性に依存することを認めた。血餅関連T2シグナルはMeSAMPをドープされたサンプルの存在下で劇的に減少又はなくなることが認められた。
【０３３７】
［実施例１９］
組織プラスミノーゲン活性化因子の効果
T2MR表面はまた全血線溶にも感受性である。これを評価するために、健常ドナーサンプルに組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)を添加した。線溶をもたらす高い感度及び迅速な時間が証明された。
【０３３８】
TPAを100U/mLで健常ドナーの血液に添加した。TPAの非存在下で(図27(a)参照)、二つの安定なピークが予想された凝固時間に生じる。100U/mLのTPAでは(図27(b)参照)、血餅は予想された時間に形成するが、20〜30分後に不安定であることが判明する。不安定性と最終T2ピーク間の距離の両方は、TPAの存在により誘導される線溶への感度を示す。
【０３３９】
線溶に対するT2MR効果を、T2時間曲線中の血餅シグナル(又はT2B)について観察された最大と最小T2値との間の差を計算することにより得られるAU値(任意単位;図27(c)参照)で表現した。この差は、サンプル中の線溶度に感受性であることが分かった。
【０３４０】
線溶を、TPA(100U/mL)の添加を用いて及び用いないで五つの患者血液サンプルのT2磁気共鳴(T2MR)によりモニタリングした(図27(c))。一サンプル、27790は、TPAの添加なしで実質的な線溶を示した。他の全サンプルは、基準法により確認されるように、線溶を誘導するためにTPAを添加することを要した。
【０３４１】
［実施例２１］
強固な血液血餅における水交換
凝固血サンプルを観察して、特有の低T2緩和率を有する追加の血餅関連ピークを生成した。我々は、この追加のシグナルは、水の高度に統制された状況、したがって低T2緩和率を生成する、から生じると仮定した。この仮説を試験するために、我々は、追加のシグナルを起こす血餅環境と関連している水が、周囲の水(すなわち、血清水)と容易に交換するかどうかを研究した。交換速度を、凝固血サンプルにD2Oを添加し、どれくらい速く各シグナルが洗い流されるかを観察することによって測定した。
【０３４２】
クエン酸塩添加全血サンプルを、カルシウム(1×=11.1mM)及び1〜3u/mLでのトロンビンで活性化して、血液血餅を形成した。血餅が形成した後、D2O(100μL)の2×量を、サンプルに添加した(図28参照)。D2O添加は、おそらくそれらの環境におけるH2Oの全体的な濃度を急速に減らすために、血清関連及び緩い血餅関連T2シグナルをほぼ直ちに消滅させる。対照的に、強固な血液血餅関連シグナルは、おそらく強固な血液血餅におけるH2Oは、強固な血液血餅が、非常に緻密であるので溶媒水と容易に交換しないために、持続した。
【０３４３】
強固な血液血餅を形成し、独立した分析のために血液サンプルから分離した。強固な血液血餅は、本来の凝固血サンプルにおける明瞭な低T2値と同様に、約170msのT2緩和率を示した(図29A参照)。D2O(100μL)を、退縮した血餅サンプルに添加し、経時的なT2緩和率の変化をモニタリングした(図29B参照)。シグナルの喪失は遅く、遅い交換速度によって特徴づけられる強固な血液血餅を、本発明の方法を使用して別個にモニタリングすることができることを実証している。
【０３４４】
［実施例２２］
定性的凝血モデル
正常なクエン酸塩添加患者サンプル(ヘマトクリット=36.7％、血小板レベル=299,000/ul)を、11.8mMカルシウム及び0.1u/mlトロンビン(Chronolog)で37℃で活性化した。この実験を、合計2時間の間、20秒/ポイントで行った。いくらか上昇した血小板レベルは、血餅退縮を約20分で開始させ、3つのピークサインを可能にした(図30参照)。
【０３４５】
図30において、標識した特徴のそれぞれの記述を、以下に提供する。
【０３４６】
特徴A。最初のT2は、RBC水(約220ms)及び血漿水(約900ms)値の1/T2加重平均であり、秤量は、ヘマトクリットに基づく。水のこれらの集団間の交換は、エコーの総数の時間尺度上で速く、それらの間の平均距離は、単一のT2値のみが観察されるほど十分小さい。T2MRシグナルは、実験の過程中変化するので、種々の区画の効果的なHCTレベルを引き出すことができる。実験の開始時のT2の増加は、サンプルの最初の加熱による可能性が最も高く、この例では、室温で開始した。
【０３４７】
特徴B。これは、最初の凝血が起こった後だが、血餅退縮が始まる前の、サンプルのゲル段階である。サンプルは、見かけ上は均一であるので、2つのピークへの分割の最も可能性の高い原因は、細胞水と血漿水との間の交換速度の減少である。見かけ上の強度は、実際の集団未満であり、これは、ヘマトクリットによって規定され、観察されたT2値は、血漿とRBCに関する期待値の間であり、このことは、サインのこの部分が、総エコー時間(TET)に関する中間の交換を示していることを示唆している。ADP活性化は、典型的にこの段階に達するが、退縮は起こらない。
【０３４８】
特徴C。曲線の急な部分は、血餅退縮を示しており、可視の退縮を、サインのこの段階中に観察することができる。交換速度が変化し続けることも可能であるけれども、2つの層は分離するので、血清T2の変化の速度は、赤血球水と血清水との間の平均距離の変化の速度の大きさである。アラキドン酸活性化は、0.5〜1mMでの血餅退縮を典型的に引き起こす。
【０３４９】
特徴D。血清の最終T2(上部のトレース)は、血漿の測定された値よりも高く、この増加は、血漿からの凝固タンパク質(フィブリノーゲンなど)の喪失から来ている。最初のゲル段階と退縮した段階との間のRBC層のT2の増加は、この段階から強固に退縮した血餅(すなわち、ピペット先端での血餅の撹拌によって容易に破壊することができる緩い血餅)(一番下のシグナル)への赤血球の喪失の尺度である。
【０３５０】
特徴E。これは、退縮した血餅自体のT2の尺度であり、このシグナルは、サンプルの形状（geometry）及び強固に退縮した血餅のサイズに依存して、観察することができるか又はできない。特徴F。実験の終わりでの相対強度を、ヘマトクリットの近似の尺度として使用することができる。
【０３５１】
特徴G。全体の複合的な強度は、血漿/血清ピークT2値をたどるように思われる。
【０３５２】
［実施例２３］
コーティングされたサンプル管
本発明の方法は、血小板誘導血餅収縮の観察を通して止血性の状態及びパラメータを評価するための尺度を含む。これらは、数ある中で、血小板活性、凝固亢進及び凝固低下状態、並びに血餅溶解を含む。これらの反応と関連している動態及びシグナルは、変数の少なくとも3つのカテゴリーに依存している:(1)血小板活性、因子欠損、及び治療薬などの、サンプル内の固有の生物学的特徴、(2)サンプル中の凝固を開始するために使用される特異的な活性化因子の種類及び濃度、並びに(3)どのように血餅が形成し、サンプル管内で収縮するかにおける多様性。本発明の方法の1つの目標は、観察された実験値における変動性が、サンプルの固有の生物学的特徴(カテゴリー1)における変動性のみを反映していることを保証することである。この目的を達成するために、標準試薬製剤を使用して、任意の所与のサンプル測定に関する、凝固開始の所定の状態(カテゴリー2)から生じる変動性を調節及び減少させることができる。我々は、サンプル管の内部表面へのフィブリン接着(カテゴリー3)における変動性が、本発明の方法の感度及び再現性を減少し得るサンプル測定に変動性を導入し得ることを観察した。
【０３５３】
血小板誘導血餅収縮を、レプチラーゼ(RF)、第XIIIa因子(FXIIIa)、及びアラキドン酸(AA)又はアデノシン二リン酸(ADP)などの血小板アゴニストの製剤を使用して、血小板活性及び阻害を測定するために使用した。RF及びFXIIIaは、血小板を活性化することなく、フィブリンメッシュの形成を急速に誘導した。これは、血餅収縮と比較して、急速に起こる。
【０３５４】
アゴニストアラキドン酸(AA)に関する血小板活性アッセイを開発している時に、我々は、期待されたAAの濃度で滴定された再現性のあるT2MRサインを見ることができた(0.5mM、1.0mM、及び1.5mM AAで全血から獲得されたT2MR曲線)。典型的な血餅収縮シグナルにおいて、5から10分の間に急速に増加する上部T2MRシグナル及びほぼ同一時点での下部T2MRシグナルの出現がある。上部シグナルは、血餅から排出された水に相当し、下部シグナルは、収縮した血餅中に閉じ込められた水に相当する。最も下部のレベルは、最も遅い動態を有する。この血小板誘導血餅収縮シグナルは、AA活性化に頑強であることが観察された。
【０３５５】
PCR管として一般的に知られている、我々の標準0.2mLポリプロピレン管を使用して、これらのデータを獲得した。
【０３５６】
アゴニストADPに関する血小板活性アッセイを開発している時に、我々は、再現性に関する問題に遭遇した。例えば、3連の測定値(新鮮に採取された血液から同時に得られる3つのサンプル)において、血餅収縮シグナルは、1つのサンプルに関してのみ出現し、及び/又は3連の測定値は、血餅収縮シグナルのシグナル強度の点で異なり得る。
【０３５７】
再現性のある結果は、AAから得られたが、ADPからは得られなかった。これは、AAが、ADPよりも強い血小板活性化因子であるという事実に起因すると考えられる。この結論は、以下の観察によって支持される。第1に、典型的なレベルのAAは、強い血小板誘導血餅収縮を引き起こすことができたが、ADPの10倍の超過(標準レベルを超えて)は、弱く再現不可能な血小板誘導血餅収縮を生じた。第2に、血液をエイジングすることは、おそらくより多い血小板誘導血餅収縮につながった基本のトロンビン活性化により、より強い血餅収縮シグナルにつながり得る。第3に、低レベルのトロンビンの添加は、より多い血小板誘導血餅収縮につながり得る。したがって、AA及びADPに関する血小板活性化の強度における違いがある。
【０３５８】
これらの観察は、急速に形成して管の内部表面に接着するフィブリンメッシュを含むサンプル管における血小板誘導血餅収縮のプロセスに関するモデルと一致している。活性化された場合、血小板はこのメッシュに付着し、伸長し、次いでメッシュを収縮する。フィブリンメッシュが管の内部表面から遊離し、しばしば赤血球を閉じ込める収縮した血餅を形成しながら収縮する場合、メッシュは、収縮した血餅を形成する。
【０３５９】
管及びAAで活性化した血液サンプルの目視検査は、強固な、明白に収縮した血餅を示した。対照的に、管及びADPで活性化した血液サンプルの目視検査は、強固な、明白に収縮した血餅を示さず、収縮の欠如を示した。
【０３６０】
これらの結果により我々は、(i)管の内部表面にフィブリンメッシュを維持する保持力がある、(ii)フィブリンメッシュ上の血小板によって引き出された収縮力がある、(iii)収縮が起こるためには、収縮力は、保持力を超えなければならない、(iv)AAに関して、ドナーの血小板が活性があり、AAの正常なレベルが添加される限り、収縮力は、いつも保持力を超えた、(v)トロンビン又はカルシウム/カオリンなどの、高濃度の強い活性化因子に関して、ドナーの血小板が活性があり、中程度から高レベルの活性化因子が添加される限り、収縮力は、いつも保持力を超えた、そして(vi)ADPに関して、収縮力は、保持力よりも高いこともあれば、低いこともあったと結論した。
【０３６１】
したがって、サンプル管の内部表面からフィブリンメッシュに遊離して、血餅収縮が起こるのを可能にするために、収縮力は閾値力に達しなければならない。変動性の1つの可能な供給源は、サンプル管の内部表面へのフィブリン付着点の数及び形状への閾値力の依存である。強い活性化因子に関して、収縮力は、閾値力より大きく、閾値力の上限より大きい。弱い活性化因子に関して、収縮力は、閾値力の範囲内である。収縮が起こることもあれば、収縮が起こらないこともあるので、これは再現不可能な結果をもたらす。
【０３６２】
我々は、ADPなどの弱い活性化因子及び不活性な血小板を有するものなどの弱い応答性のサンプルに関して、フィブリン接着に抵抗する内部表面を有するサンプル管の使用が、閾値保持力を下げ、変動性を減少させる(アッセイの頑強性を増加させる)ことを観察した。
【０３６３】
簡潔に述べると、血液サンプルは、Triton X-100でコーティングされた0.2mLポリプロピレン管における異なるレベルのADPで活性化された。ADP活性化の滴定応答(図31参照)は、予想と一致していた:(i)より低いレベルのADP平地線(0.5及び1mM、血餅形成シグナルは観察されない)、(ii)より高いレベルのADPは、等しい(5、10、20mM、完全な血餅形成が観察される)、及び(iii)中間レベル(2.5mM ADP)で、部分的な血餅形成が観察される。この挙動は、AA活性化サンプルに関して観察されたものと類似している。加えて、ここで、ポリプロピレン表面が、Triton X-100でコーティングされている場合、20mM未満のレベルは、血餅収縮シグナルを示すことができる。さらに、このシグナルは、コーティングを有さないポリプロピレン管におけるADP活性化サンプルに関して以前観察されたものよりも遙かに強い。
【０３６４】
［実施例２４］
血小板機能試験プラットフォームとしてのT2磁気共鳴
光透過凝集測定法(LTA)を使用した血小板機能の臨床評価は、部分的にはエクスビボの操作への血小板の感受性のために、専門研究室に限定される。LTA結果の分析及び報告は、十分に標準化されておらず、結果は、インビボでの止血に対する最小の効果を有する薬剤に過度に感受性があり、アッセイは、血小板過敏性の状況を診断すること及び抗血小板療法をモニタリングすることに制限された有用性を示した。ここで、我々は、40μL未満の血液を必要とし、採取後にサンプル調製を必要としない全血中の血小板機能を試験するためのT2磁気共鳴(T2MR)に基づく簡単に使えるプラットフォームを導入する。我々は、2-メチルチオアデノシン5'-一リン酸(2-MeSAMP)又はアスピリンの存在下又は非存在下でのアデノシン二リン酸(ADP)及びアラキドン酸(AA)で試験した陽性及び陰性サンプルにわたる、LTAとの優れた相関を実証する。我々のデータは、LTAによっては明らかでない血餅退縮への血小板の寄与への洞察も提供する。
【０３６５】
方法:我々は、小型の、携帯型の機器を使用して、血小板阻害剤の存在下及び非存在下で特異的な血小板アゴニストで活性化された健康なドナー血小板からの全血サンプルのT2MRシグナルを測定した。特異的なアゴニストによって刺激された血小板活性へのシグナル応答を分離するために、我々は、カルシウム、トロンビンを阻害するためのヘパリン、レプチラーゼ及びフィブリンネットワークを急速に生み出すための第XIIIa因子、並びに血小板アゴニストを含む試薬混合物を使用した。試験を行うために、2-MeSAMP又はアスピリンを有する又は有さない34μLのクエン酸塩添加全血を、標準PCR管におけるADP又はAAのいずれかを有する4μLの活性化試薬に添加し、T2MRシグナルを、10分間モニタリングした。同一サンプルからの全血の数と一致した血小板数を有する多血小板血漿の血小板機能を、LTAと同時に試験した。相関を評価するために、我々は、6分を超えるLTAによる最大パーセント凝集率の基準、及び10分を超える血餅収縮を反映する、上部T2MRピークのT2MRシグナルにおける最大パーセント変化率の基準を使用した。陽性結果に関するカットオフは、LTAに関して55％シグナル変化であり、T2MRに関して100％シグナル変化であった。
【０３６６】
結果:5μM ADPで試験した20サンプルに関する陽性一致は、100％(20/20)であり、100μM 2-MeSAMPで処置した8サンプルにわたる陰性一致は、75％(6/8)であり、93％(26/28)の全体一致を得た。2つの相違したサンプルは、LTAに関する25及び30％の最大凝集を示し、これは、LTAに関するPRPの不完全な血小板活性化であるが、T2MRによって評価された全血の完全な血小板誘導血餅収縮を示唆している。低レベルのADP及び2-MeSAMPを使用した実験は、血小板媒介血餅退縮が、血小板凝集の第2の波の非存在下で起こり得ることを示した。エピネフリン及びPAR-1トロンビン受容体活性化ペプチド(TRAP)に関する相関も、報告されることになる。
【０３６７】
コーティングされた管(すなわち、管を親水性化合物でコーティングすること)を利用することにより、1μM ADPもの少なさで活性化されたサンプルの測定が可能になった。LTAとT2MRとの間の相関を調べるために、新鮮なドナーサンプルを、ADPの添加前に0又は100μMのいずれかの2-MeSAMPに曝露し、100μM 2-MeSAMPサンプルは、ノンレスポンダー状態として役立った。相関を測定するために選択した基準は、6分にわたるLTAに関する最大パーセント凝集率及び30分にわたる上部T2ピークのT2における最大パーセント変化率であった。LTAに関する最初の6分中55％最大凝集のLTAの臨床的使用に関する現在受け入れられているカットオフを使用した。血小板活性に関するこのT2MR特徴は、18μM ADPを使用した、アッセイ製剤の相関に我々が使用した特徴とは異なる。その特徴は、30分後の血餅ピークの％強度であった。この新規なアッセイ製剤、管のタイプ、及びT2MRシグナル特徴を使用して、測定された28のドナーサンプルのうち、26のドナーサンプルを観察して、T2MRとLTAとの間の強い相関が示された(図35参照)。2つの相違したサンプルは、T2MRに応答性であり、我々の基準によればLTAに非応答性であった。しかしながら、これらのサンプルの両方は、LTAへの中程度の血小板凝集をまさに示したが、55％最大凝集閾値を超える十分な活性化は示さなかった(図35参照)。T2MRは、これらのドナーに関する陽性の血小板活性を示し、これらのドナーは、血小板欠乏が存在しないことが既知であるので、これは、T2MRが、LTAよりもADPによる活性化により感受性があり得るという証拠である(図35、表7)。表7は、LTA及びT2MR ADPアッセイの2つのクラス予測を比較する分割表である。全体の一致は、陽性百分率一致100％(20/20)及び陰性百分率一致75％(6/8)で、93％(26/28)であった。
【０３６８】
【表７】
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【０３６９】
これらのドナーにおけるLTAの感受性の欠如は、多血小板血漿の調製中に導入されたアーティファクトにより生じている可能性がある。T2MRは、多血小板血漿を調製するための追加の時間及び努力を必要とせず、これによりT2MRは、緊急時の設定における血小板機能特徴づけのための遙かに良い方法となる。
【０３７０】
結論:これらの最初の研究は、完全に活性化された及び阻害されたサンプルに関する弱い及び強い血小板アゴニストに基づく血小板機能試験に関するT2MRとLTAとの間の優れた相関を示す。結果は、血小板媒介血餅退縮の評価が、中間のレベルのアゴニスト及び阻害剤に関するLTAを使用して明らかではない血小板機能の高感度な指標を提供することも示唆している。より広範な臨床試験が、血小板機能を評価するためのT2MRの適合性を完全に理解するために進行中であるが、これらの最初の結果は、サンプル調製を必要とせず、最小のサンプル量を必要とする、簡単で頑強な血小板機能試験を可能にするためのT2MRプラットフォームの潜在性を実証している。
【０３７１】
［実施例２５］
フィブリノーゲンアッセイ
T2MRは、トロンビンの存在下での全血又は血漿中のフィブリンの形成を直接的に測定する。トロンビン(STAGO、5U/mL)の溶液を、血漿(又は血液)の希釈液に添加し、T2シグナルの変化をモニタリングする。サンプルは、トロンビンの添加時にすぐに凝固し始め、T2シグナルの急速な減少を結果として生じる。測定されるT2シグナルにおけるより良好なサンプル緩和率を達成し、ノイズを減少させるために、常磁性の材料(MnSO4)を、45μMの希釈剤におけるMnSO4の最終濃度で、緩衝希釈剤(STAGO、Owren-Koller緩衝液)に添加する。常磁性の材料は、凝固プロセスに対する有意な効果を有さない。常磁性の材料を含有する緩衝希釈剤を使用して、80U/mLストックを希釈することによってトロンビン5U/mLストックを調製し、較正曲線のための標準希釈物を調製する。
【０３７２】
％ΔT2を、以下のように計算する:
【０３７３】
【数９】
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【０３７４】
ここでT2(t)は、時間tでのT2MR観測値であり、T2(0)は、時間0でのT2MR観測値である。％ΔT2対時間データは、4次多項式関数(y=a+bx+cx2+dx3+fx4)に適合し、推定の最初の反応速度に相当する得られた線係数(b)を、較正に使用し、血漿又は全血サンプル中のフィブリノーゲンレベルを決定する。血漿サンプルから得られたデータの例を、図36Aに示す。血液サンプルから得られたデータの例を、図36Bに示す。
【０３７５】
反応の最初の勾配は、サンプル中のフィブリノーゲンレベルと相関している(図37参照)。
【０３７６】
未知の血漿サンプル中のフィブリノーゲンレベルを決定するために、サンプルを、緩衝希釈剤(45μM MnSO4を含有するOwren-Koller緩衝液)中で6倍に希釈し、次いで13μLのトロンビン試薬(5U/mL)を、27μLの希釈したサンプルに添加する。速度パラメータを計算し使用して、標準較正曲線からフィブリノーゲンレベルを決定する。同様のアプローチを利用して、全血サンプル中のフィブリノーゲン濃度を決定する。
【０３７７】
新鮮なクエン酸塩添加正常全血サンプルから得られた3つの血漿サンプルに関するフィブリノーゲンレベルを、上記の較正曲線を使用して決定した。参照方法(STAGO、STart4)と比較した場合、平均％誤差は、3つのドナーにわたって12％未満であることが分かった。結果を、表8に提供する。
【０３７８】
【表８】
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【０３７９】
過剰なトロンビンを使用した、フィブリノーゲンレベルに関するT2MR測定原理は、フィブリノーゲンからフィブリンへのトロンビン変換に関する反応の動態学的速度を測定することである。この直接的な速度測定は、診断アッセイとして有利であることが判明し得る。このフィブリノーゲンアッセイを、血漿及び全血サンプルの両方に適用することができる。
【０３８０】
［実施例２６］
エピネフリン活性化滴定曲線
5〜20μMの範囲のエピネフリンの滴定を、活性化カクテル(レプチラーゼ、第XIIIa因子、カルシウム、及び血小板活性化因子からなる)に添加した。4μLの活性化カクテルを、コーティングされた管において36μLの全血に添加した。反応を含有する管を、T2MRリーダーに置いた。T2MR緩和曲線データを、逆ラプラス変換アルゴリズムで処理した。図38で示すように、サンプルは、エピネフリン濃度の範囲にわたって応答性であり、血餅収縮のタイミングは、用量依存的であった。
【０３８１】
［実施例２７］
TRAP活性化滴定曲線
3.12〜100μMの範囲のPAR-1受容体特異的ペプチド(SFLLRN)(TRAP)の滴定を、活性化カクテル(レプチラーゼ、第XIIIa因子、カルシウム、及び血小板活性化因子からなる)に添加した。4μLの活性化カクテルを、コーティングされた管において36μLの全血に添加した。反応を含有する管を、T2MRリーダーに置いた。T2MR緩和曲線データを、逆ラプラス変換アルゴリズムで処理した。図39に示すように、サンプルは、TRAPの全範囲にわたって反応性である。試験した濃度範囲にわたって、血餅収縮のタイミングへの用量依存性はなかった。
【０３８２】
他の実施形態
本明細書に言及する全ての刊行物、特許及び特許出願は、あたかも各独立の刊行物又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的且つ個別的に示されているのと同程度まで参照により本明細書に組み込まれる。
【０３８３】
本発明をその特定の実施形態に関して記載してきたが、さらなる修正が可能であり、本出願は、一般的に本発明の原理に従う本発明の任意の変形、使用又は適合を網羅することを意図されており、本発明が属する技術分野の中の既知の又は慣用的な慣習内で、上記の必須の特徴に適用することができ、かつ特許請求の範囲に従うような本開示からの逸脱を含んでいることが理解されるだろう。
【０３８４】
他の実施形態は、特許請求の範囲の範囲内である。
【図１Ａ】
2016500443.tif 000019
【図１Ｂ】
2016500443.tif 000020
【図１Ｃ】
2016500443.tif 000021
【図２】
2016500443.tif 000022
【図３−１】
2016500443.tif 000023
【図３−２】
2016500443.tif 000024
【図３−３】
2016500443.tif 000025
【図３−４】
2016500443.tif 000026
【図４】
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【図５】
2016500443.tif 000028
【図６】
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【図７】
2016500443.tif 000030
【図８】
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【図９】
2016500443.tif 000032
【図１０】
2016500443.tif 000033
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2016500443.tif 000040
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
2016500443.tif 000051
【図２９】
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【図３０】
2016500443.tif 000053
【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【国際調査報告】
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