(57)【要約】  本発明は概して、新規なプロテアーゼ耐性ペプチドリガンドの発見及びその使用に関する。具体的には、本発明は、生物学的製剤に結合可能であり且つ１つ以上の塩基性アミノ酸及び／又は芳香族アミノ酸を含む、３〜２０個のアミノ酸を備えたプロテアーゼ耐性ペプチドであって、アミノ酸の１つ以上が非天然アミノ酸類似体で置換されているプロテアーゼ耐性ペプチドを提供する。【選択図】図１
2016527231.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的製剤に結合可能であり且つ１つ以上の塩基性アミノ酸又は芳香族アミノ酸を含む、３〜２０個のアミノ酸を含むプロテアーゼ耐性ペプチドであって、前記アミノ酸の１つ以上が非天然アミノ酸類似体で置換されている、プロテアーゼ耐性ペプチド。
【請求項２】
前記非天然アミノ酸類似体が表６に挙げられている、請求項１に記載のプロテアーゼ耐性ペプチド。
【請求項３】
ヘキサペプチドである、請求項１に記載のプロテアーゼ耐性ペプチド。
【請求項４】
ヘキサペプチドであり且つ前記非天然アミノ酸類似体での置換前に配列ＨＷＲＧＷＶ、ＨＹＦＫＦＤ及びＨＦＲＲＨＬ（配列番号：１〜３）を有する、請求項１に記載のプロテアーゼ耐性ペプチド。
【請求項５】
エンドペプチダーゼによる消化に対して耐性である、請求項１に記載のプロテアーゼ耐性ペプチド。
【請求項６】
エクソペプチダーゼによる消化に対して耐性である、請求項１に記載のプロテアーゼ耐性ペプチド。
【請求項７】
前記エンドペプチダーゼがα−キモトリプシンである、請求項１に記載のプロテアーゼ耐性ペプチド。
【請求項８】
前記エンドペプチダーゼがトリプシンである、請求項１に記載のプロテアーゼ耐性ペプチド。
【請求項９】
請求項１に記載のプロテアーゼ耐性ペプチドにカップリングしている固形担体。
【請求項１０】
生物学的製剤の精製方法であって、以下の工程、
生物学的製剤が固形担体に結合するように、請求項９に記載の固形担体を生物学的製剤と適切な条件下で接触させる工程、
前記固形担体及び結合した生物学的製剤を洗浄する工程、並びに
前記生物学的製剤を前記固形担体から溶出させて前記生物学的製剤を精製する工程
を含む、方法。
【請求項１１】
前記生物学的製剤が抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の固形担体を備える診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、ＰＲＯＴＥＡＳＥ−ＲＥＳＩＳＴＡＮＴ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＬＩＧＡＮＤＳに関する２０１３年７月１５日出願のＭｅｎｅｇａｔｔｉらの米国仮特許出願第６１／８４６３２６号（代理人整理番号：ＮＳ１３００２ＵＳＶ）（参照により全て本願に援用される）の利益を請求するものである。
【０００２】
本発明は概して、新規なプロテアーゼ耐性ペプチドリガンドの発見に関する。
【背景技術】
【０００３】
序論
治療及び研究用途での哺乳動物の血清からの免疫グロブリンの精製は、工業的、医学的及び経済的に非常に価値がある問題である。ポリクローナル抗体をベースとした治療薬は複数のエピトープ及び標的に対して多価相互作用を示すことから、一部の疾患の予防又は治療に最適である。血漿由来のポリクローナル静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）製剤は免疫不全患者における感染症の予防に成功裡に適用されており、自己免疫性及び炎症性の問題に対しての使用が増加している。現在まで、ＩＶＩＧは世界の血液製剤市場でメジャーな血漿分画製剤であり、その年間消費量は着実に増加している。動物の血漿由来のポリクローナル抗体は現在、免疫測定法の開発研究並びに治療及び診断ツールの設計にも用いられている。
【０００４】
哺乳動物の血清からのポリクローナル抗体のアフィニティ精製は現在、殆どが、プロテインＡ及びプロテインＧ等のタンパク質リガンドの使用をベースとしている。しかしながら、これらのタンパク質リガンドには幾つかの欠点があり、例えば（１）コストの高さ（吸着剤１リットルあたり１５０００〜２００００ドル）、（２）低い化学的及び生化学的安定性、（３）免疫原性と、その結果としての、生成物の本流へのリガンドフラグメントの浸出に関連したリスク、また（４）高結合親和性を理由とする、溶出させたタンパク質の生理活性を脅かす厳しい溶出条件が挙げられる。更に、プロテインＡはヒトＩｇＧ３及び幾つかの動物の免疫グロブリンに結合しない。プロテインＧは全てのヒトＩｇＧサブクラスに結合するものの、ヒト及び動物の血漿並びにその画分中の主要なタンパク質であるアルブミンに対してもかなりの結合を示す。
【０００５】
これらの問題を克服するために、ペプチド、アミノ酸、トリアジンスキャフォールド及びチオフィリックな化合物をベースとした合成リガンドが抗体精製用に提案されている。我々の研究グループは、ＨＷＲＧＷＶ、ＨＹＦＫＦＤ及びＨＦＲＲＨＬ（配列番号：１〜３）の３種のヘキサペプチドリガンドを特定した。これらのリガンドはＩｇＧにＦｃ部を介して結合することでプロテインＡの結合機序を模倣する。特に、ペプチドＨＷＲＧＷＶに、細胞培養培地、ＣＨＯ細胞培養上清、遺伝子組み換えミルク及びホエイ、植物抽出物並びにヒト血漿のコーン画分ＩＩ＋ＩＩＩを含めた多種多様な複合的な原料からＩｇＧを単離するその能力についてさらなるキャラクタリゼーションを行った。これらの実験で得られた生成物収率及び純度は常に、プロテインＡを媒体として得られるものに匹敵していた。
【０００６】
しかしながら、ヒト血漿からのポリクローナル抗体の精製に使用する場合にタンパク質リガンド及び合成ペプチドリガンドが共に直面する問題に、その中に存在しているタンパク質分解酵素、特にはトリプシン及びα−キモトリプシンの作用がある。トリプシンは、リジン及びアルギニン残基のカルボキシル側でペプチド鎖を切断するセリンプロテアーゼである。キモトリプシンは疎水性残基、例えばチロシン、トリプトファン及びフェニルアラニンのカルボキシル側でペプチド鎖を切断する。哺乳動物の血清に長時間及び／又は繰り返し曝露されると、タンパク質又はペプチドリガンドはこれらのエンドプロテアーゼにより分解される。これらのエンドプロテアーゼによるプロテインＡの分解とそれに伴う高コストなアフィニティ樹脂の寿命の短縮を防止するために、酵素阻害剤を供給原料に添加してから注入を行う。しかしながら、これらの阻害剤自体がかなりの追加コストとなる。
【発明の概要】
【０００７】
特定の非限定的な実施形態において、本発明は、生物学的製剤に結合可能であり且つ１つ以上の塩基性アミノ酸及び／又は芳香族アミノ酸を含む、３〜２０個のアミノ酸を備えたプロテアーゼ耐性ペプチドを提供し、アミノ酸の１つ以上は非天然アミノ酸類似体で置換される。この非天然アミノ酸類似体は、表６に挙げられたものであってよい。
【０００８】
プロテアーゼ耐性ペプチドは、４−ｍｅｒ、５−ｍｅｒ、６−ｍｅｒ、７−ｍｅｒ、８−ｍｅｒ、９−ｍｅｒ、１０−ｍｅｒ、１１−ｍｅｒ、１２−ｍｅｒ、１３−ｍｅｒ、１４−ｍｅｒ、１５−ｍｅｒ、１６−ｍｅｒ、１７−ｍｅｒ、１８−ｍｅｒ又は１９−ｍｅｒになり得る。プロテアーゼ耐性ペプチドはヘキサペプチドであり且つ、非天然アミノ酸での置換前に配列ＨＷＲＧＷＶ、ＨＹＦＫＦＤ及びＨＦＲＲＨＬ（配列番号：１〜３）を有する。
【０００９】
プロテアーゼ耐性ペプチドは１つの非天然アミノ酸を有し得る。あるいは、２、３、４又は５個の非天然アミノ酸を有し得る。このペプチドでは、１０個のアミノ酸につき１個が非天然アミノ酸で置換され得る（１０％）。あるいは、１９個のアミノ酸につき１個が置換され得る（約５％）。ペプチドでは１０個のアミノ酸につき２個が置換され得て（２０％）、あるいは６個のアミノ酸につき２個が置換され得る（３３％）。ペプチドは５０％が非天然アミノ酸になり得て、例えば６個のうち３個又は８個のうち４個等である。
【００１０】
天然のペプチドがグルタミンを含有するならば、Ｎ−γ−エチル−グルタミンで置換してプロテアーゼ耐性ペプチドを生成し得る。天然の同等物がグルタミン酸を含有するならば、カルボキシ−グルタミン酸で置換し得る。天然のペプチドがプロリンを含有するならば、プロテアーゼ耐性ペプチドは、第２級水素がベンジル、ＯＨ又はフェニルで置換されたプロリンを有し得る。天然のペプチドがフェニルアラニンを含有するならば、プロテアーゼ耐性ペプチドは、アミノ基、エトキシ基、エチル基、メトキシ基、メチル基、ＯＨ又はフェニルで置換された１つ以上の芳香族水素をそのフェニルアラニン中に有し得る。天然のペプチドがチロシンを含有するならば、プロテアーゼ耐性ペプチドは、アミノ基、エトキシ基、エチル基、メトキシ基、メチル基、ＯＨ又はフェニルで置換された１つ以上の芳香族水素をそのチロシン中に有し得る。天然のペプチドがアルギニンを含有するならば、シトルリンでの置換又はメチル化によりプロテアーゼ耐性ペプチドを生成し得る。同様に、天然のペプチド中のアミノ基をメチルアミノ又はジメチルアミノ基で置換し得て、例えば、リジン中のアミノ水素をメチル化することでプロテアーゼ耐性ペプチドを生成し得る。
【００１１】
プロテアーゼ耐性ペプチドは、エンドペプチダーゼ又はエクソペプチダーゼによる消化に対して耐性となり得る。非限定的な一実施形態において、エンドペプチダーゼはα−キモトリプシン又はトリプシンになり得る。
【００１２】
本発明は、プロテアーゼ耐性ペプチドにカップリングさせた固形担体も含む。この固形担体は、樹脂ビーズとしての樹脂、例えばＴｏｙｏｐｅａｒｌになり得る。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は生物学的製剤の精製方法を提供し、この方法は、プロテアーゼ耐性ペプチドを備えた固形担体を生物学的製剤と適切な条件下で接触させることで生物学的製剤を固形担体に結合させ、固形担体及び結合した生物学的製剤を洗浄し、生物学的製剤を固形担体から溶出させることで生物学的製剤を精製することを含む。生物学的製剤は抗体になり得る。
【００１４】
本発明は、固形担体及びプロテアーゼ耐性ペプチドを備える診断キットも提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
（００１５）
【図１】クラスタ番号１の配列：（ａ）ＨＷＲＧＷＶ、（ｂ）ＨＦＲＲＨＬ（配列番号：１、３）、（ｃ）ＨＷMetＣｉｔＤＷMetＶ及び（ｄ）ＨＦMetＣｉｔＣｉｔＨＬ（配列番号：４〜５）。（００１６）
【図２】パネル（Ａ）〜（Ｄ）は、天然ペプチドバインダ及び修飾ペプチドバインダのタンパク質分解消化産物を示す。（００１７）
【図３】吸着剤を使用した、ヒト血漿のコーン画分ＩＩ＋ＩＩＩからのＩｇＧのクロマトグラフィ精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件）。（００１８）
【図４】異なる塩濃度のバインディングバッファで行ったヒト血漿のコーン画分ＩＩ＋ＩＩＩからのＩｇＧのクロマトグラフィ精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（００１９）  治療及び研究目的での哺乳動物の血清からの免疫グロブリンの精製は、バイオテクノロジー及びバイオ製造において密接に関連する問題である［１、２］。血漿由来のポリクローナル静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）製剤は免疫不全患者における感染症の予防に成功裡に適用されており、自己免疫性及び炎症性の障害に対しての使用が増加している［３、４］。現在まで、ＩＶＩＧは世界の血液製剤市場でメジャーな血漿分画製剤であり、その年間消費量は着実に増加している［５］。更に、免疫された動物の血清由来のポリクローナル抗体は現在、免疫測定法、治療法及び薬物送達の新しい戦略を開発するための医学的な研究においても用いられている［６〜９］。血清は、ずいぶんと時代遅れではあるものの依然としてモノクローナル抗体の開発にとって強力な研究ツールであるハイブリドーマテクノロジーの場合のように、モノクローナル抗体の原料にもなり得る［１０］。ハイブリドーマコロニーは主にウシ血清の濃度が高い培養培地で増殖させるため、これらの流体からのモノクローナル抗体の精製は実際、動物原料からのポリクローナル抗体の回収に似ている［１１］。抗体精製に最も一般的に用いられるアフィニティリガンドであるプロテインＡ及びプロテインＧはこのタイプの抗体精製にはあまり適していない［１２、１３］。コストの高さ、低化学的安定性、免疫原性、低解離定数（約１０-8Ｍ）に起因する厳しい溶出条件という既に知られている問題点に加えて、他にも幾つか懸念はある［１４、１５］。プロテインＡはヒトＩｇＧ3サブクラスには結合せず、マウスＩｇＧ1及びウシＩｇＧ1には弱い結合を示し、ヤギ及びマウスのＩｇＧ又はニワトリＩｇＹのサブクラスには結合しない［１６］。プロテインＧは、全てのヒトＩｇＧサブクラス及び動物抗体の殆どに結合するものの、血漿及び血清において断然多いタンパク質成分であるアルブミンも捕捉するため、血漿からの抗体精製には通常使用しない［１７］。アルブミン結合部位のない、工学的に作り出した形態のプロテインＧが開発されたが［１８］、これらは極めて高コストであり、安定性及び免疫原性の問題は懸念として残ったままである。これらの問題を克服するために、合成リガンドが抗体精製用に開発されており、これらはタンパク質リガンドより手頃且つ化学的に頑強であり、毒性及び免疫原性が低い［１９、２０］。
【００１７】
（００２０）  我々の研究グループは、ＨＷＲＧＷＶ、ＨＹＦＫＦＤ及びＨＦＲＲＨＬ（配列番号：１〜３）の３種のペプチドリガンドを特定した。これらのリガンドはＩｇＧにＦｃ部を介して結合することでプロテインＡの結合機序を模倣する［２１〜２３］。これらの配列は全てのヒト抗体サブクラス及び多くの動物（ウシ、マウス、ウサギ、ヤギ、ラマ、トリ）抗体に結合し、またヒト血漿のコーン画分ＩＩ＋ＩＩＩを含めた多種多様な原料からのモノクローナル及びポリクローナル抗体の精製に使用されてきた［２４〜２６］。これら全ての研究において、生成物収率及び純度は常に、プロテインＡで得られるものに匹敵すると判明した。それでいて結合強度は緩いため（ＫD約１０-5〜１０-6Ｍ）、より穏やかな条件（ｐＨ４．０〜５．０）下でアフィニティカラムから抗体を溶出させることができ、凝集が防止され、活性は維持される。これらのペプチドリガンド吸着剤の化学的安定性及び動的結合容量（ＤＢＣ）を上昇させるための研究も随分行われてきた。最適化のためのこれらの研究の結果、ＨＷＲＧＷＶ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（配列番号：６）吸着剤は、連続的な使用サイクルでの０．５ＭのＮａＯＨに対する高い耐性及び５０ｇ／Ｌの範囲のＤＢＣ値を示した［２７、２８］。したがって、これらのリガンドは、血清及び血漿からのモノクローナル及びポリクローナル抗体の工業規模でのアフィニティ精製の開発を可能にし得る。
【００１８】
（００２１）  動物の血漿からのポリクローナル抗体の精製に使用する際にタンパク質リガンド及び合成ペプチドリガンドが共に直面する問題に、タンパク質分解酵素、例えばトリプシン及びα−キモトリプシンの存在がある［２９、３０］。これらのプロテアーゼは、塩基性（アルギニン及びリジン）及び芳香族（トリプトファン、フェニルアラニン及びチロシン）アミノ酸のカルボキシル末端でそれぞれペプチド鎖を切断する［３１、３２］。アフィニティ吸着剤を血清に長時間にわたって曝露すると、トリプシン及びα−キモトリプシンはタンパク質又はペプチドリガンドの実質的な分解を引き起こし、結果的に結合容量を損失する。タンパク質リガンドの場合、プロテインＡ／Ｇと同様に、この問題は、生成物の本流への免疫原性フラグメントの流入により悪化する。予防手段として、注入前にプロテアーゼ酵素阻害剤を供給原料混合物に添加することが多い［３３］。しかしながら、これらの阻害剤は高コストであり、また最終生成物から除去する必要がある。
【００１９】
（００２２）  これらの問題に対する抜本的な解決策は、非天然アミノ酸を含むペプチドリガンドのバリアントを生成することである。これらのバリアントは、良好な標的親和性及び選択性をプロテアーゼに対する高い耐性と併せ持つと期待される。Ｖｅｒｄｏｌｉｖａらはアミノ酸のＤ型立体異性体を使用したペプチドリガンドの合成を提案しており、Ｄ型立体異性体は、天然のＬ型とは異なり、プロテアーゼにより認識も攻撃もされない［３４、３５］。しかしながら、Ｄ型アミノ酸はコストが非常に高くつく上、他の種類の化学分解（タンパク質溶出及び樹脂の衛生化に使用する酸及びアルカリ溶液のそれぞれによってアミノ酸官能基に引き起こされるもの等）を起こしやすい［３６〜３９］。これらの障害を克服するために、化学的に修飾した形態のＬ型アミノ酸をＤ型アミノ酸の代わりに用いることで、元の配列の標的親和性及び選択性を維持しながらも高い酵素耐性及び化学的安定性を呈するペプチドバリアントを生成することができる。これを目的として、本明細書においては、これらのリガンドを設計及び同定するための方法を提示し、この方法は、３つのステップ：（１）非天然アミノ酸を使用した、既知のペプチドリガンドのバリアントのバーチャルライブラリの設計、（２）分子ドッキングシミュレーションによる、標的生体分子に対するライブラリのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスクリーニング、（３）クロマトグラフィ樹脂上での選択したバリアントの合成と、得られた吸着剤の標的への結合及びプロテアーゼに対する耐性についての試験を含む。抗体結合ペプチドＨＷＲＧＷＶ、ＨＹＦＫＦＤ及びＨＦＲＲＨＬ（配列番号：１〜３）中のトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン及びリジンをアルキル化類似体で置換し、シトルリンをアルギニンの代わりに使用した。
【００２０】
（００２３）  他のバリアントは、Ｎin−ホルミル−トリプトファン及び４−カルバモイル−フェニルアラニンの使用、またＨＷＲＧＷＶにおけるアスパラギン酸でのグリシンの置換により作り出した。次に、ドッキングソフトウェアＨＡＤＤＯＣＫ（バージョン２．１）を使用して、ＩｇＧのｐＦｃ領域中の既知のＨＷＲＧＷＶ結合部位（Ｓｅｒ３８３〜Ａｓｎ３８９）に対してライブラリをスクリーニングした[４０、４１]。このプログラムはタンパク質−ペプチド相互作用をシミュレートし、外部ソフトウェアを介してファン・デル・ワールス相互作用、水素結合、変形ペナルティ、疎水作用、ＡＣＥ（ａｔｏｍｉｃ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｅｎｅｒｇｙ）、弱化したファン・デル・ワールス相互作用、部分静電気、結合自由エネルギーの追加推定値、双極子−双極子相互作用及び水の存在の評価に基づいて結合の自由エネルギーを見積もる[４０〜４５]。選択した配列をポリメタクリレート系クロマトグラフィ樹脂Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−Ａｍｉｎｏ−６５０Ｍ上に直接合成し、ＩｇＧ結合並びにトリプシン及びα−キモトリプシンに対する耐性について試験した。配列ＨＷMetＣｉｔＧＷMetＶ、ＨＦMetＣｉｔＣｉｔＨＬ及びＨＹMetＦMetＫ(Met)2ＦMetＤ（配列番号：４、５、７）を、ヒト血漿のコーン画分ＩＩ＋ＩＩＩからのポリクローナル抗体（ＩＶＩＧ）の精製用に選択した。
【００２１】
（００２４）  最後に、バインディングバッファの伝導率がＩｇＧ収率及び純度に及ぼす影響に関する研究を行うことで親ペプチドＨＷＲＧＷＶの結合機序をそのバリアントＨＷMetＣｉｔＧＷMetＶ及びＡｃ−ＨＷMetＣｉｔＧＷMetＶ（配列番号：８〜９）と比較した。後者では、より低いバインディングバッファ伝導率でＨＷＲＧＷＶより高いＩＶＩＧ収率及び純度が得られるため、大規模な下流側工程でコストを大幅に削減できると判明した。
【００２２】
（００２５）  非限定的な一実施形態において、本方法は４つのステップ：
（００２６）（１）非天然修飾アミノ酸を使用した、既知のペプチドリガンドのバリアントのライブラリの設計、
（００２７）（２）分子ドッキングシミュレーションでの標的生体分子に対するペプチドバリアントライブラリのスクリーニングによるリガンドサブセットの選択、
（００２８）（３）慣用のＦｍｏｃ／ｔＢｕカップリング化学反応によるクロマトグラフィ樹脂上での選択したリガンドの合成、
（００２９）（４）（ａ）標的生体分子の結合並びに（ｂ）クロマトグラフィ手順で用いるタンパク質分解酵素及び化学物質に対する耐性についてのアフィニティ吸着剤のクロマトグラフィ試験を含み得る。
【００２３】
（００３０）１：ペプチドリガンドＨＷＲＧＷＶのバリアントの設計
（００３１）  ペプチドバリアントのバーチャルライブラリ（表１）を設計した。
【００２４】
（００３２）
【表１】
2016527231.tif 000003
【００２５】
（００３３）２：分子モデリング
（００３４）  ペプチドバリアントについての座標ファイルをＰＹＭＯｌを使用して生成した［Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、バージョン１．２ｒ３ｐｒｅ、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ］。最もよくマッチする天然残基を観察し、それらの性質をコピーすることで修飾のためのパラメータ及びトポロジーファイルを決定して非天然アミノ酸エントリーを設計した。Ｎin−メチル化及びホルミル化トリプトファンを、標準的なトリプトファン残基に関するパラメータ及びトポロジーファイルに基づいて設計した。４−メチル−、４−メトキシ−及びカルバモイル−フェニルアラニンを、標準的なフェニルアラニン残基に関するパラメータ及びトポロジーファイルに基づいて設計し、特にカルバモイル官能性をアスパラギンから得た。シトルリンを、アルギニンのデルタ炭素及びアスパラギンをベースにしてモデリングした。メチル化及びジメチル化リジンＬｙｓ（Ｍｅ）及びＬｙｓ（Ｍｅ）2に関するファイルは既にＨＡＤＤＯＣＫでコードした。官能基の電気的中性がＨＡＤＤＯＣＫにある天然アミノ酸に関する全ての他のパラメータ及びトポロジーファイルと同じままとなるように単一原子に部分電荷を割り当てた。アミノ酸の修飾に関するトポロジー及びパラメータファイルを検証するために、パラメータ及びトポロジーファイルの変更部分をＰＲＯＤＲＧサーバに送信したものと照合した。ｈＩｇＧに関する座標ファイルをＲＣＳＢプロテインデータバンク（ＰＤＢ、１ＦＣＣ）から得た［Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．１９９５  Ｍａｒ  １５；３（３）：２６５−７８．Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃ２  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｆｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ．Ｓａｕｅｒ−Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  ＡＥ，Ｋｌｅｙｗｅｇｔ  ＧＪ，Ｕｈｌｅｎ  Ｍ，Ｊｏｎｅｓ  ＴＡ．］。ｈＩｇＧ上の残基Ｓｅｒ３８３〜Ａｓｎ３８９（ＳＮＧＱＰＥＮ）（配列番号：１５）を「活性である」と定義し、リガンドドッキング用の標的領域として使用した。プロテインＡを標的ＰＤＢファイルに、ペプチドリガンドとｈＩｇＧ上のプロテインＡ結合部位（残基３４１〜４４３）との間での相互作用を防止するための包括的制約として含めた。分子モデリングを、プログラムＨＡＤＤＯＣＫ（バージョン２．１）を使用して行った［Ｓ．Ｊ．ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ，Ａ．Ｄ．Ｊ．ｖａｎ  Ｄｊｉｋ，Ｍ．Ｋｒｚｅｍｉｎｓｋｉ，Ｍ．ｖａｎ  Ｄｉｊｋ，Ａ．Ｔｈｕｒｅａｕ，Ｖ．Ｈｓｕ，Ｔ．Ｗａｓｓｅｎａａｒ，Ａ．Ｍ．Ｂｏｎｖｉｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃ．Ｆｕｎｃｔ．＆Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ  ６９（２００７）７２６及びＣ．Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｒ．Ｂｏｅｌｅｎｓ，Ａ．Ｍ．Ｂｏｎｖｉｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５（２００３）１７３１］。各ペプチドバリアントで残基１〜２はｈＩｇＧの残基３８９〜３８７を標的とし、残基３〜４はｈＩｇＧの残基３８６〜３８３を標的とし、残基５〜６に標的はなかった。デフォルトのＨＡＤＤＯＣＫパラメータをドッキング手順で用いた。得られたドッキング構造を、４の最小クラスタサイズ及びプログラムＰｒｏＦｉｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐｒｏｆｉｔ／）を使用した２．５Å以下のＲＭＳＤ（ｒｏｏｔ−ｍｅａｎ−ｓｑｕａｒｅ−ｄｉｓｔａｎｃｅ：平均二乗距離の平方根）を割り当てることで、クラスタにグループ分けした。最低エネルギーでドッキングしたシミュレーション結果の目視検査に基づいて各配列について選択された全てのクラスタを、３つのファミリー：ｄＣｏｍｐｌｅｘ、ＸＳｃｏｒｅ（ＨＰＳｃｏｒｅ、ＨＭＳｃｏｒｅ、ＨＳＳｃｏｒｅ、−ｌｏｇ（Ｋｄ）及びΔiＧ）及びＦｉｒｅＤｏｃｋ（包括的、引力的ファン・デル・ワールス力、斥力的ファン・デル・ワールス力、ＡＣＥ及び水素結合）に分類される１２のスコアリング関数にしたがって分析した［Ｗａｎｇ，Ｒ．，Ｙ．Ｌｕ，  ａｎｄ  Ｓ．Ｗａｎｇ，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  １１  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｏｃｋｉｎｇ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，２００３．４６（１２）：ｐ．２２８７−３０３及びＡｎｄｒｕｓｉｅｒ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｃｋｉｎｇ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２００８．７３（２）：ｐ．２７１−８９及びＭａｓｈｉａｃｈ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦｉｒｅＤｏｃｋ：ａ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｆａｓｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｏｃｋｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２００８．３６（Ｗｅｂサーバ版）：ｐ．Ｗ２２９−３２及びＬｉｕ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｔａｔｅ  ｕｎｉｆｉｅｓ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｍｅａｎ  ｆｏｒｃｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２００４．５６（１）：ｐ．９３−１０１］。このようにして配列の順位を蓄積し、各関数で得られたスコアリング値に基づいて並べられた配列をリスト化した。この順位を最後に総計及び平均することで最終的な配列リストを得た。リストにおいて、低スコアは高親和性を示す。
【００２６】
（００３５）定義
（００３６）  用語「生物学的製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）」には、バイオ医薬品（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）又はバイオ治療薬（ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）、例えば治療用タンパク質が含まれる。これらは酵素及び／又は制御活性を有するタンパク質治療薬、あるいは特別な結合活性を有するタンパク質、例えばモノクローナル抗体又はＦｃ融合タンパク質、あるいはタンパク質ワクチン、あるいは診断用タンパク質になり得る。生物学的製剤は生体、例えば血液因子から単離し得て、あるいは遺伝子組み換え技術で製造し得る。Ｓｔｒｏｈｌ及びＫｎｉｇｈｔのＣｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，（２００９）２０：６６８−６７２を参照のこと（この文献の内容は参照により全て本願に援用される）。本明細書において、生物学的製剤にはウイルス及び微生物、例えば細菌、真菌、単細胞又は多細胞生物も含まれる。幾つかの非限定的な実施形態において、生物学的製剤は病原性タンパク質（例えば、プリオン）又は病原性微生物（例えば、細菌）等になり得る。
【００２７】
（００３７）  Ｎｅｌｓｏｎら及びＮｉｅｒｉらは近年、市場に出回っている又は臨床開発中の治療用抗体及びその現在の製造技法について概説した。Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ  ９  ７６７−７７４、Ｎｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２００９  Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １６  ７５３−７７９。
【００２８】
（００３８）  全長ヒト抗体もＣＨＯ細胞培養、また遺伝子導入動物及び植物により製造し得る。全長ヒトモノクローナル抗体は現在、遺伝子導入動物（例えば、乳牛、ヤギ）のミルクで抽出される。Ｒｅｄｗａｎ  ２００９  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ  ３０  ２６２−２９０。タバコ等の植物も抗体製造に使用される。タバコは、タバコウイルスを使用したトランスフェクションが比較的容易である。Ｙｕｓｉｂｏｖ  ｅｔ  ａｌ．２０１１  Ｈｕｍ  Ｖａｃｃ  ７（３）３１３−３２１。
【００２９】
（００３９）  「バイオポリマー」とは、１タイプ以上の反復単位のポリマーである。バイオポリマーは天然の生物系で見られ、特にはオリゴ糖及び多糖、ペプチド（この用語はポリペプチド及びタンパク質を含むものとして使用される）並びにポリヌクレオチド（この用語はＤＮＡ及びＲＮＡを含むものとして使用される）を含み、あるいは人工的な生合成により製造することができ、例えばペプトイド及びペプチド核酸（ＰＮＡ）である。本明細書において、用語「バイオポリマー」には生物活性を有する合成化合物が含まれ、例えばアミノ酸若しくはアミノ酸類似体、糖若しくは糖類似体又はヌクレオチド若しくは非ヌクレオチド基から構成される又はこれらを含有する天然化合物の類似体である。
【００３０】
（００４０）  幾つかの実施形態において、置換は保存的アミノ酸置換になり得る。生物活性に影響を及ぼしそうにない保存的アミノ酸置換の例には以下が含まれる：セリン代わりのアラニン、イソロイシン代わりのバリン、グルタメート代わりのアスパルテート、セリン代わりのトレオニン、グリシン代わりのアラニン、トレオニン代わりのアラニン、アスパラギン代わりのセリン、バリン代わりのアラニン、グリシン代わりのセリン、フェニルアラニン代わりのチロシン、プロリン代わりのアラニン、アルギニン代わりのリジン、アスパラギン代わりのアスパルテート、イソロイシン代わりのロイシン、バリン代わりのロイシン、グルタメート代わりのアラニン、グリシン代わりのアスパルテート及びこれらの逆の変更。例えば、Ｎｅｕｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７９）を参照のこと。この文献中の関連する記載は参照により本願に援用される。更に、ある基内の１つのアミノ酸を同一基内の別のアミノ酸と交換することが保存的置換であり、基は以下のものである：（１）アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、ノルロイシン及びフェニルアラニン、（２）ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン及びアスパラギン、（３）アスパルテート及びグルタメート、（４）セリン、トレオニン、アラニン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン及びシステイン並びに（５）グリシン、プロリン及びアラニン。
【００３１】
（００４１）  用語「固形担体（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ）」は、ポリマー質又は無機質の、親水性マクロ多孔質材料を備えた材料を意味し、本発明で使用し得る。固形担体には無機材料、有機材料及びこれらの組み合わせが含まれる。固形担体は、ヒドロキシル化固形担体又はヒドロキシル化複合体固形担体になり得る。固形担体はアクリルアミド誘導体、アガロース、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、ガラス、磁鉄鉱、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、シリカ、シリコン、ジルコニア及びこれらの組み合わせになり得る。固形担体材料は多孔質ビーズの形態になり得て、多孔質ビーズは球形になり得る。あるいは、担体は、他の規則的な又は不規則な形状を有する微粒子又は分割形態になり得る。適切な固形担体材料の他の例には、アルミナ、アルミナ担持ポリマー又は多糖から構成される膜、半透膜、キャピラリ、マイクロアレイ、モノライト（ｍｏｎｏｌｉｔｅ）、マルチウェルプレートが含まれる。本発明の固形担体は剛性材料又は非剛性の可撓性材料になり得て、例えば織物又は不織物になり得るファブリックである。適切な非剛性で可撓性の材料は膜になり得る（当該分野で公知の様々な技法で製造した鋳造、不織又はマイクロ若しくはナノ繊維）。
【００３２】
（００４２）  好ましい固形担体材料は、タンパク質の非特異的な結合が最小限であり且つ有機合成及び本発明で用いる精製工程で採用する条件（例えば、ｐＨ及びイオン強度における変化）に対して物理的及び化学的に耐性があるものである。本発明で使用の固形担体はアクリレートのポリマーになり得る。アクリレートポリマーの例には、以下に限定するものではないが、ポリメタクリレート、ポリヒドロキシメタクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル及び他のアクリレート誘導体が含まれる。好ましい非限定的な実施形態において、固形担体はメタクリレートポリマーである。
【００３３】
（００４３）組成物及びキット
（００４４）  本発明は、アッセイ（診断アッセイになり得る）において、本明細書に記載のプロテアーゼ耐性バインダペプチドを使用して目的とする特定の標的のタイプ及びレベルを検出及び／又は測定するための組成物及びキットを提供する。アッセイを行うための本発明のキットには典型的には、適切な収容手段、（ｉ）本発明のプロテアーゼ耐性バインダペプチドを備えたプローブ、（ｉｉ）プローブの存在を検出するための標識及び（ｉｉｉ）目的とする標的をどのようにして測定するかの説明書が含まれる。キットは１種以上のプロテアーゼ耐性バインダペプチド、例えば目的とする標的に特異的に結合し認識する第１プロテアーゼ耐性ペプチド及び／又は第２及び／又は第３及び／又は追加のプロテアーゼ耐性ペプチドを含み得る。キットの収容手段には概して、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、注射器並びに／又は本発明の第１プロテアーゼ耐性ペプチドを入れ得る及び／若しくは適切にアリコートし得る他の容器が含まれる。第２及び／又は第３及び／又は追加成分を入れる場合、キットは概して、その成分を入れ得る第２、第３及び／又は他の追加の容器も含む。あるいは、容器は２種以上のプロテアーゼ耐性ペプチドの混合物を収容し得て、各試薬は本発明にしたがって異なるマーカーに特異的に結合する。本発明のキットは典型的には、市場での販売用にプロテアーゼ耐性ペプチドプローブを密閉して収容するための手段も含む。そのような容器には、所望のバイアルを保持させる射出及び／又は吹込成形したプラスチック製容器が含まれ得る。
【００３４】
（００４５）  キットは、ポジティブ及びネガティブコントロール、また本発明の方法にしたがった、キットに入ったキット構成要素の使用についての説明書を更に備え得る。
【００３５】
（００４６）  そうでないとの定義がなされない限り、本明細書で使用の全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の通常の技術を有する人が普通に理解するものと同じ意味を有する。冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書において、１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）の冠詞の文法上の目的語に言及する際に使用される。例えば、「ある要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」とは、１つ以上の要素を意味する。
【００３６】
（００４７）  明細書全体を通して、「備えている（含んでいる）（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語又はその派生語、例えば「備える（含む）」は、記載の要素、整数若しくはステップ又は要素、整数若しくはステップ群が含まれることを含意すると理解されるが、他の要素、整数若しくはステップ又は要素、整数若しくはステップ群を排除しない。本発明は適宜、請求項に記載のステップ、要素及び／又は試薬「を備え得る（含み得る）」、「から成り得る」又は「から本質的に成り得る」。
【００３７】
（００４８）  請求項は任意の要素を除外するように起草し得ることに更に留意されたい。そのため、この陳述は、請求項の要素を挙げる際に「単独で」、「〜しか」等の除外を意味する文言又は「否定的な」限定を用いる場合の先行する根拠としての役割を果たすことを目的とする。
【００３８】
（００４９）  ある範囲の値が与えられる場合、その範囲の上限と下限との間の各中間値も、文脈に明らかに反しない限り下限の単位の１０分の１まで、具体的に開示されると理解される。記載のある範囲における任意の記載値又は中間値とその記載範囲の他の記載値又は中間値との間のより狭い各範囲は本発明に包含される。これらのより狭い範囲の上限及び下限は独立して範囲に含まれ得て又は範囲から除外され得て、上限及び下限のいずれか、いずれでもなく又は両方がそのより狭い範囲に含まれる各範囲も本発明に包含され、記載範囲において任意の限度が特別に除外される場合がある。記載範囲が上下限の一方又は両方を含む場合、含まれる上下限の一方又は両方を除外した範囲も本発明に含まれる。
【００３９】
（００５０）  以下の実施例は本発明をより詳しく説明するものであり、本発明の範囲を限定しようとするものではない。特に、本発明が記載の特定の実施形態には限定されないこと、したがって、当然のことながら、変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用の学術用語は特定の実施形態だけを説明することを目的としていること、また本発明の範囲は添付の請求項によってのみ限定されることから限定を意図したものではないことも理解されたい。
【実施例】
【００４０】
（００５１）選択したペプチドバリアントの合成
（００５２）材料
（００５３）  ペプチド合成用の保護アミノ酸及びカップリング剤をＣｈｅｍＩｍｐｅｘ  Ｉｎｃ．（ウッドデール、イリノイ州、米国）から購入した。トリプシン、α−キモトリプシン、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、ピペリジン、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、トリイソプロピルシラン（ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｙｌａｎｅ）（ＴＩＰＳ）、エタンジチオール（ＥＤＴ）、フェニルシラン、チオアニソール、ジエチルジチオカルバミド酸ナトリウム、インドール、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４及びカイザー（Ｋａｉｓｅｒ）テストキットはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州、米国）から調達した。Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ＨＰＬＣグレードアセトニトリル及び水、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、氷酢酸はＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ピッツバーグ、ペンシルバニア州、米国）から購入した。Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−Ａｍｉｎｏ−６５０Ｍ樹脂はＴｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（キングオブプラシャ、ペンシルバニア州、米国）から購入した。
【００４１】
（００５４）方法
（００５５）  選択した各配列を２００ｍｇのＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−Ａｍｉｎｏ−６５０Ｍ樹脂（ｄ＝７５〜１５０ミクロン、アミノ基密度＝０．４ｍｍｏｌ／ｇ）上で合成した。各アミノ酸カップリングステップを２５分間にわたって、テフロンフリットを取り付けたポリプロピレン管において連続的な窒素流及び温度３５℃の条件下で行った。樹脂をＤＭＦ中で１０分間にわたってすすいだ後、カップリングを１度、３ｍＬの無水ＤＭＦ中のＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（ベース樹脂官能基密度に対して３当量モル過剰）、ＨＣＴＵ（３当量）及びＤＩＰＥＡ（６当量）で行った。４ｍＬのＤＭＦ中の無水酢酸及びＤＩＰＥＡ（５０当量）でのアセチル化ステップを３０分間にわたって室温で行った。次に、Ｆｍｏｃ保護を、ＤＭＦ中の５ｍＬの２０％ピペリジンと２０分間にわたってインキュベートすることで外した。
【００４２】
（００５６）  ペプチド配列を慣用のＦｍｏｃ／ｔＢｕストラテジーで合成した。各アミノ酸について、Ｆｍｏｃ−アミノ酸（２当量）、ＨＣＴＵ（２当量）及びＤＩＰＥＡ（４当量）の無水ＤＭＦ溶液（２．５ｍＬ）を樹脂に添加した。カイザーテストでモニタしながら、２度のカップリングを各アミノ酸について行うことで全ての有効なアミノ基を飽和させた。最後のアミノ酸上のＦｍｏｃ保護をＤＭＦ中の５ｍＬの２０％ピペリジンで２０分かけて外し、各樹脂バッチを２つのアリコートに分割し、そのうちの１つを上述したようにアセチル化した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭですすいだ後、ペプチド脱保護を、ＴＦＡ／ＤＣＭ／インドール（７０／２８／２）を含有する切断カクテルを使用して１．５時間にわたって行った。次に、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦで十分にすすぎ、最後に真空下で乾燥させた。
【００４３】
（００５７）アフィニティ吸着剤のクロマトグラフィ試験
（００５８）材料
（００５９）  凍結乾燥形態にあるヒトポリクローナル免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）をＥｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．（カーンヴィル（Ｋｅｒｎｖｉｌｌｅ）、テキサス州、米国）から購入した。全ての研究を室温で行った。２４８７ＵＶディテクタと組み合わせたＷａｔｅｒｓ  ６２６  ＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ、マサチューセッツ州、米国）を全てのクロマトグラフィ試験に使用した。マイクロボアステンレススチールカラム（長さ３０ｍｍｘ内径２．１ｍｍ）はＡｌｔｅｃｈ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（サマセット、ペンシルバニア州、米国）から調達した。全ての実験を室温で行った。
【００４４】
（００６０）ＩｇＧ結合及びペプチドリガンドのタンパク質分解酵素への耐性のクロマトグラフィによる評価
（００６１）  全ての樹脂（各３５ｍｇ）を３０ｍｍｘ内径２．１ｍｍのマイクロボアカラム（０．１ｍＬ）（Ａｌｌｔｅｃｈ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、サマセット、ペンシルバニア州、米国）に充填し、２０％質量／質量のメタノールで膨潤させた。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）での平衡化後、３回のＩｇＧ結合試験を、１０ｍｇ／ｍＬのｈＩｇＧのＰＢＳ溶液を使用して行った。結合試験と結合試験との間に、樹脂を、０．１５ｍｇ／ｍＬのトリプシン又はα−キモトリプシンのＴｒｉｓＨＣｌバッファ（ｐＨ８．５）溶液と接触させた。５回の注入の全てに用いたクロマトグラフィのプロトコルは以下の通りである。１００マイクロリットルの供給物試料を流量０．０５ｍＬ／分（８７ｃｍ／時間）でカラムにロードした。流量０．２ｍＬ／分（３４８ｃｍ／時間）での２ｍＬの平衡化バッファによる洗浄ステップ後、溶出を、４ｍＬの０．２Ｍのアセテートバッファ（ｐＨ４．０）を流量０．４ｍＬ／分（６９６ｃｍ／時間）で使用して行った。最後に、吸着剤を４ｍＬの０．８５％リン酸で再生した。吸着剤ＨＷＲＧＷＶ−、ＨＹＦＫＦＤ−及びＨＦＲＲＨＬ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（配列番号：６、１６、１７）樹脂をコントロールとして使用した。溶出物を２８０ｎｍでの吸光度でモニタした。
【００４５】
（００６２）吸着剤ＨＷMetＣｉｔＧＷMetＶ−、ＨＹMetＦMetＫ(Met)2ＦMetＤ−及びＨＦMetＣｉｔＣｉｔＨＬ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（配列番号：１８〜２０）樹脂を使用したヒト血漿のコーン画分ＩＩ＋ＩＩＩからのＩＶＩＧの精製
（００６３）  コーン画分ＩＩ＋ＩＩＩをＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解させて約５ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ濃度を得て、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ポートワシントン、ニューヨーク州、米国）の０．４４μｍ及び０．２２μｍフィルタを使用して連続的に濾過した。上述したように各ペプチド樹脂を充填し、膨潤させた。０．２５ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳバッファでの平衡化後、１００μＬの供給物試料をカラムに流量０．０５ｍＬ／分（８７ｃｍ／時間）でロードした。カラムを２ｍＬの平衡化バッファで流量０．２ｍＬ／分（３４８ｃｍ／時間）で洗浄した後、溶出を４ｍＬの０．２Ｍのアセテートバッファ（ｐＨ５．０）で流量０．４ｍＬ／分（６９６ｃｍ／時間）で行った。清浄化及び再生を４ｍＬの０．８５％リン酸を使用して行い、続いてアセテートバッファ（ｐＨ４．０）中の４ｍＬの２Ｍの尿素で洗浄した。Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ−６５０Ｆ樹脂をポジティブコントロールとして使用した。製造業者の指示にしたがい、クロマトグラフィのプロトコルはＰＢＳ（ｐＨ７．４）（流量０．０５ｍＬ／分）との結合及び０．１Ｍのグリシンバッファ（ｐＨ２．５）（流量０．４ｍＬ／分）での溶出を含んだ。溶出物を２８０ｎｍでの吸光度でモニタした。画分を回収し、後述するようなＩｇＧ純度及び収率の分析に使用した。
【００４６】
（００６４）吸着剤Ａｃ−ＨＷＲＧＷＶ−及びＡｃ−ＨＷMetＣｉｔＧＷMetＶ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（配列番号：２１〜２２）樹脂を使用したヒト血漿のコーン画分ＩＩ＋ＩＩＩからのＩｇＧ精製に伝導率が及ぼす影響
（００６５）  上述したように樹脂を充填し、膨潤させ、その間に注入用のコーン画分ＩＩ＋ＩＩＩを上述したように準備した。バインディングバッファの伝導率の影響を、ＰＢＳに添加する０、０．１３５及び０．２５ＭのＮａＣｌで調査した。バインディングバッファでの平衡化後、１００μＬの供給物をカラムに流量０．０５ｍＬ／分（８７ｃｍ／時間）でロードした。クロマトグラフィのプロトコル及び画分の回収を上述した通りに行った。
【００４７】
（００６６）収率及び純度についての試料分析
（００６７）  回収した画分中のＩｇＧ量を、１ｍＬ  ＨｉＴｒａｐプロテインＧカラムを使用してＨＰＬＣにより定量化した。ＩｇＧの収率を、溶出したＩｇＧのロードした全ＩｇＧに対する比として計算した。溶出した画分中のＩｇＧの純度を、還元条件下、Ｘｃｅｌｌ  ＳｕｐｅｒＬｏｃｋ（商標）ミニ−セルシステムにおいてＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）を使用し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により求めた。試料の準備を、５μＬのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳバッファ及び２μＬのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）還元剤を１３μＬの試料に添加し、得られた混合物を１０分間にわたって沸騰させることで行った。ゲルを、ＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎを使用してクーマシー染色した。ＩｇＧ純度を、ＩｍａｇｅＪ  １．３２ｊソフトウェア（アメリカ国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、米国）を使用して、クーマシー染色したゲルのデンシトメトリ分析により求めた。
【００４８】
（００６８）  生成物の純度を、２５及び５０ＫＤａでのＩｇＧバンドと同等な総面積に対する割合として計算した。
【００４９】
（００６９）結果及び考察
（００７０）  ７種の非天然アミノ酸、すなわちＮin−メチル−トリプトファン、Ｎin−ホルミル−トリプトファン、４−メチル−フェニルアラニン、４−カルバモイル−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−チロシン、ｅ，ｅ−ジメチル−リジン及びシトルリンを本研究のために選択した。これらの残基のパラメータ及びトポロジーファイルを、ベース構造としての対応する各標準アミノ酸について利用できるファイルを用いて作成した。側鎖官能基の修飾を、標準残基上の最もよくマッチする部分をコピーし、電荷分布を調節して電気的中性を確保することで導入した。得られたパラメータ及びトポロジーファイルの変更部分をＰＲＯＤＲＧサーバに送信したものと照合して、アミノ酸修飾のパラメータ化についての標準的な検証工程を行った。こうしてペプチド配列のバーチャルライブラリが作成され、ＨＡＤＤＯＣＫ２．１を使用してｈＩｇＧに対するスクリーニングを行った［Ｓ．Ｊ．ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ，Ａ．Ｄ．Ｊ．ｖａｎ  Ｄｊｉｋ，Ｍ．Ｋｒｚｅｍｉｎｓｋｉ，Ｍ．ｖａｎ  Ｄｉｊｋ，Ａ．Ｔｈｕｒｅａｕ，Ｖ．Ｈｓｕ，Ｔ．Ｗａｓｓｅｎａａｒ，Ａ．Ｍ．Ｂｏｎｖｉｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃ．Ｆｕｎｃｔ．＆Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ  ６９（２００７）７２６及びＣ．Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｒ．Ｂｏｅｌｅｎｓ，Ａ．Ｍ．Ｂｏｎｖｉｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５（２００３）１７３１］。
【００５０】
（００７１）  物理的に意味のあるドッキングを行うために、Ｙａｎｇらによるこれまでの発見に基づいた幾つかの制約をシミュレーションに取り入れた。第１に、ｈＩｇＧのＦｃフラグメントのプロテアーゼ消化産物のＭＳ分析により、ｐＦｃセグメント上でのＨＷＲＧＷＶに関する推定上の結合配列が明らかとなり、配列はループＳｅｒ３８３〜Ａｓｎ３８９（ＳＮＧＱＰＥＮ）を含み、ループはプロテインＡ結合部位（ｈＩｇＧ上の残基３４１〜４４３）とはまるで異なることが判明した［２３］。この結果はペプチドＨＷＲＧＷＶがｈＩｇＧ結合に関してプロテインＡと競合しないという観察結果と一致した。第２に、ペプチド配列の最初の３つのアミノ酸、すなわちヒスチジンとそれに続く芳香族残基及び塩基性残基を含む基本モチーフがＩｇＧ結合にとって極めて重要である。これは、ヘキサペプチドの固相ライブラリをスクリーニングすることで同定された、配列ＨＷＲＧＷＶ、ＨＹＦＫＦＤ及びＨＦＲＲＨＬ（配列番号：１〜３）に見られるコンセンサス配列により立証されている［２１］。この相同性に基づき、２つの配列ＨＹＦＫＦＤ及びＨＦＲＲＨＬがＨＷＲＧＷＶと同じｈＩｇＧの結合部位と相互作用すると考えるのはもっともである。
【００５１】
（００７２）  最後に、ペプチドのＣ末端はクロマトグラフィ樹脂の表面に繋ぎ止められているため、どちらかというとヘキサペプチドリガンドの残基５及び６はＩｇＧの標的化において限られた役割しか果たしていないと考えられる。この情報に基づき、ｈＩｇＧ上の残基Ｓｅｒ３８３〜Ａｓｎ３８９を「活性である」と定義し、リガンドドッキングのための標的として使用した。全ての活性な残基は、プログラムＮＡＣＣＥＳＳで明らかとなるように、４０％より高い相対的溶媒接触率を示す［Ｃａｍｐｂｅｌｌ＆Ｔｈｏｒｎｔｏｎ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２０，５０７−５３０］。
【００５２】
（００７３）  更に、各ペプチドバリアントに関し、残基１〜２はｈＩｇＧの残基３８９〜３８７を標的とし、残基３〜４は残基３８６〜３８３を標的とし、残基５及び６には標的を割り当てず、相互作用しようするＩｇＧ上のいずれの残基とも相互作用するがままとした。検証におけるバイアスを最小限にとどめるために、ドッキングシミュレーションで得られる複合体を選定するにあたって、以下の一般基準を案出した。（１）分子ドッキングの最終段階において各配列について決定した全ての構造を、デフォルトクラスタ化ＲＭＳＤ（平均二乗距離の平方根）カットオフは通常７．５Åに設定されるのに対して２．５Åの厳しいＲＭＳＤカットオフ、また４構造の最小クラスタサイズに基づいてクラスタ化した。（２）分析に使用した構造は、各クラスタで最もエネルギー的に好適なドッキング構造であった。（３）各クラスタを、三次元構造が既知である所与のタンパク質−リガンド複合体の結合親和性を見積もる経験的スコアリング関数であるスコアリング法：ｄＣｏｍｐｌｅｘ、ＸＳｃｏｒｅ及びＦｉｒｅＤｏｃｋを使用して分析した。
【００５３】
（００７４）  これらの関数はファン・デル・ワールス相互作用、水素結合、変形ペナルティ、疎水作用、ＡＣＥ、弱化したファン・デル・ワールス相互作用、部分静電気、結合自由エネルギーの追加推定値及び双極子-双極子相互作用を考慮する［Ｗａｎｇ，Ｒ．，Ｙ．Ｌｕ，ａｎｄ  Ｓ．Ｗａｎｇ，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  １１  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｏｃｋｉｎｇ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，２００３．４６（１２）：ｐ．２２８７−３０３及びＡｎｄｒｕｓｉｅｒ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｃｋｉｎｇ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２００８．７３（２）：ｐ．２７１−８９及びＭａｓｈｉａｃｈ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦｉｒｅＤｏｃｋ：ａ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｆａｓｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｏｃｋｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２００８．３６（Ｗｅｂサーバー版）：ｐ．Ｗ２２９−３２及びＬｉｕ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｔａｔｅ  ｕｎｉｆｉｅｓ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｍｅａｎ  ｆｏｒｃｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２００４．５６（１）：ｐ．９３−１０１］。複数のスコアリング法を用いたハイブリッドアプローチを採用することで、特定の１つの方法に結果が偏らないようにした。各クラスタをそれぞれのスコアリング法におけるその個々のスコアにしたがって順位づけし、そのようにして作成された個々の順位づけを総計及び平均した。元の配列及び幾つかの選択したバリアントの最終的な順位を表２に示す。図１は、クラスタ番号１の配列（ａ）ＨＷＲＧＷＶ、（ｂ）ＨＦＲＲＨＬ、（ｃ）ＨＷMetＣｉｔＤＷMetＶ及び（ｄ）ＨＦMetＣｉｔＣｉｔＨＬ（配列番号：１、３、４、５）を示す。
【００５４】
（００７５）  ドッキングシミュレーションにより１つの配列あたり複数のクラスタが生成されるものの、多くの場合、クラスタ番号１が、最多構造数及び上記のハイブリッドスコアリング法で最低の平均値を示した。そのような再現性はドッキングシミュレーションがうまくいったことを示し、主要クラスタより著しく低いエネルギーで出現する外れ値を除外することを可能にする。ＨＷＲＧＷＶ及びＨＦＲＲＨＬをこれらのバリアントＨＷＣｉｔＧＷＶ及びＨＦＣｉｔＣｉｔＨＬ（配列番号：１、３、１０、２３）と比較することで、前者は標的抗体との最も多くの接触部を有し、後者は最も多くの水素結合を有することが注目された。これは、アルギニンを含む元の配列と比べると、特には静電成分に関し、バリアントの結合機序が若干異なることを示している。実際、（ｐＨ７．４で）正に帯電したアルギニンを電気的に中性なシトルリンで置換すると、結合の静電成分は大幅に減少する。一方では、この置換により、ペプチドバリアントが標的抗体に結合する予想自由エネルギーは元の配列より低くなり、これは前者が後者より低い結合容量を有し得ることを示唆している。他方で、生成物の純度を低下させる負に帯電したタンパク質（特にはアルブミン）の非特異的な静電結合をバリアントが電位的に起こしにくくなる。これらの違いは、クロマトグラフィのプロトコル、特にはバインディングバッファの伝導率がＩｇＧ収率及び純度に及ぼす影響に直接影響し、それについては本明細書において論じる。
【００５５】
（００７６）  ＨＷＲＧＷＶ及びＨＦＲＲＨＬの他のバリアントをホルミル−トリプトファン及びカルバモイル−フェニルアラニンを使用して設計したが、どちらも良好なスコアを得られなかった。アスパラギン酸とＩｇＧ上の残基３８３〜３８６（ＳＮＧＱ）（配列番号：２４）との間に水素結合を電位的に形成して親和性を上昇させることを目的として、もう１つのバリアントＨＷMetＣｉｔＤＷMetＶ（配列番号：４）を、グリシンをアスパラギン酸で置換することで作成した。しかしながら、予想に反して、この配列のスコアは低かった。ＨＹＦＫＦＤ並びにその２つのバリアントＨＹMetＦMetＫMetＦMetＤ及びＨＹMetＦMetＫ(Met)2ＦMetＤ（配列番号：２、１３、７）にも行ったが、得られたスコアは平均して悪く、これはＨＷＲＧＷＶ、ＨＦＲＲＨＬ及びこれらのバリアントより親和性が低いことを示す。
【００５６】
（００７７）  表２に挙げた配列をＴｏｙｏｐｅａｒｌ樹脂上に、全て密度約０．１２ミリ当量／ｇで合成した。このようにして得られた各吸着剤をクロマトグラフィカラム（０．１ｍＬ）に充填し、ＩｇＧ結合について試験した。素通り画分及び溶出画分を回収し、プロテインＧクロマトグラフィで分析してＩｇＧ収率を求めた（表２）。各配列の平均順位と収率とを比較すると、ドッキングシミュレーションと抗体結合の実験結果とがよく一致していることがわかる。これは、バーチャルライブラリの設計、ドッキング制約の割り当て及びシミュレーション結果の分析がうまく行われ、ペプチドバリアントを選定するための効果的なストラテジーを構成していることを裏付けている。
【００５７】
（００７８）
【表２】
2016527231.tif 000004
【００５８】
（００７９）ＩｇＧ結合及びタンパク質分解酵素への耐性によるペプチドリガンドのクロマトグラフィによる評価
（００８０）  表２で報告した結果に基づき、元の配列ＨＷＲＧＷＶ、ＨＦＲＲＨＬ及びＨＹＦＫＦＤ（配列番号：１〜３）並びにこれらのバリアントＨＷMetＣｉｔＧＷMetＶ、ＨＦMetＣｉｔＣｉｔＨＬ及びＨＹMetＦMetＫ(Met)2ＦMetＤ（配列番号：４、５、７）を、酵素による消化に対するその耐性について試験した。配列ＨＷMetＣｉｔＧＷMetＶ、ＨＦMetＣｉｔＣｉｔＨＬをそれぞれの元のペプチドの最良のバリアントとして選択し、ＨＹMetＦMetＫMet2ＦMetＤをネガティブコントロールとして使用した。最後に、もう２つの配列ＨＷＣｉｔＧＷＶ及びＨＷMetＲＧＷMetＶを中間バリアントとして選択し、したがって１種の酵素にしか耐性を示さないと予測した。各吸着剤をクロマトグラフィに５回連続して供した。まず、１０ｍｇ／ｍＬの純粋なヒトポリクローナルＩｇＧのＰＢＳ溶液を注入して各吸着剤についてＩｇＧ収率を求めてからいずれの酵素とも接触させた。この最初の回で４種全てのペプチドバリアントが収率９１％を超えた。次に、樹脂を、Ｔｒｉｓバッファ（ｐＨ８．５）中のα−キモトリプシン溶液に１０分間接触させた。カラムにロードした酵素の量は、Ｖｅｒｄｏｌｉｖａら［３５］が行ったように、質量比１：１００のペプチド：酵素であった。樹脂をすすいだあと、次に２回目のＩｇＧ注入を行うことでα−キモトリプシンによるペプチドリガンドの消化を原因とする結合容量の損失を見積もった。次に、樹脂を第２の酵素溶液、すなわちＴｒｉｓバッファ（ｐＨ８．５）中のトリプシンと同じペプチド：酵素比で接触させた。２回目の酵素処理後、３回目のＩｇＧ注入を最後に行うことで各樹脂の残りの結合容量を見積もった。図４は、吸着剤ＨＷMetＣｉｔＧＷMetＶ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、ＨＷMetＲＧＷMetＶ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、ＨＷＣｉｔＧＷＶ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ及びＨＷＲＧＷＶ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（配列番号：１８、２５、２６、６）樹脂についての３回のＩｇＧ注入のクロマトグラムを示す。
【００５９】
（００８１）  ＨＷＲＧＷＶはトリプシン及びα−キモトリプシンの両方により明らかに分解されており、両方の酵素で処理した後の結合容量の損失で示される通りであるが（図２、ａ）、そのバリアントであるＨＷMetＣｉｔＧＷMetＶはどちらにも全く影響されない（図２、ｄ）。予想した通り、中間バリアントＨＷMetＲＧＷMetＶ及びＨＷＣｉｔＧＷＶはそれぞれα−キモトリプシン及びトリプシンの１種の酵素にしか耐性を示さない（図２、ｂ及びｃ）。残りの吸着剤について得られた結果を表３にまとめる。表３は、α−キモトリプシン（２回目のＩｇＧ注入）及びトリプシン（３回目のＩｇＧ注入）での処理前（１回目）及び処理後のＩｇＧ収率値を示す。
【００６０】
（００８２）  図２のパネル（Ａ）〜（Ｄ）は、天然のペプチドバインダ及び修飾ペプチドバインダのタンパク質分解消化産物を示す。
【００６１】
（００８３）  （Ａ）のクロマトグラムは、両方のタンパク質分解酵素が元のペプチドリガンドを消化することを示す。まず、トリプシンがＲを攻撃し、次にα−キモトリプシンがＷで切断する。
【００６２】
（００８４）  （Ｂ）のクロマトグラムは、修飾ＷMのおかけでα−キモトリプシンはペプチドを切断しないこと、その一方でトリプシンはペプチドをＲで切断することを示す。
【００６３】
（００８５）  （Ｃ）のクロマトグラムは同様の挙動を示すが、シトルリンがＲに取って代わるためトリプシンは効果がない。
【００６４】
（００８６）  （Ｄ）のクロマトグラムは、ＷをＷMに、またＲをシトルリンに置換したことで、どちらの酵素でも分解の兆候がないことを示す。
【００６５】
（００８７）  幾つかの他のペプチド配列を、複合培地からの抗体のアフィニティ精製用に同定した。マウスの腹水から抗顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）モノクローナル抗体を捕捉するために、配列ＡＰＡＲ（配列番号：２７）を合成テトラペプチドライブラリから選択した。ペプチドリガンドＰＤＴＲＰＡＰ（配列番号：２８）を、がん関連ＭＵＣ１ムチンに対して産生させた抗体を使用したエピトープマッピングにより同定した。Ｅｈｒｌｉｃｈ及び共同研究者はペプチド配列ＥＰＩＨＲＳＴＬＴＡＬＬ（配列番号：２９）を、ヒト化抗Ｔａｃ  ＩｇＧ１抗体（ＨＡＴ）のｐＦｃフラグメントに対するバイオパニングを通してファージディスプレイライブラリから単離した。Ｆａｓｓｉｎａ及び共同研究者は、ＴＧ１９３１８又はＰＡＭ（プロテインＡ模倣物）としても知られる、ＩｇＧのＦｃ部に結合するトリペプチドテトラマー（Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ）4−Ｌｙｓ2−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号：３０）を同定した。昨今、Ｌｕｎｄらは、Ｄ2ＡＡＧ（配列番号：３１）と称される、ＩｇＧ精製用のペプチドリガンドを発表し、このペプチドリガンドはアルギニン（Ａ）及びグリシン（Ｇ）並びに合成の芳香族の酸である２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシベンジルアクリレート（Ｄ）を含む。抗体精製で知られるこれらのペプチドリガンドは全て、芳香族（トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン）又は塩基性アミノ酸（リジン及びアルギニン）のいずれかを含有し、これらがペプチドリガンドをトリプシン及び／又はα−キモトリプシンによるタンパク質分解を起こしやすくしている。したがって、ここで提案する方法は、プロテアーゼ耐性ペプチドバリアントの設計に関して極めて広い有効性を有する。したがって、酵素による切断に耐性があるペプチドリガンドバリアントの構築が可能である。これらのリガンドは、動物の血漿からのＩｇＧ及び他の目的とするタンパク質の精製に使用することができる。
【００６６】
（００８８）  追加の注釈として、生化学的に安定なペプチドリガンドを製造するための本明細書に記載の方法は概してタンパク質分解酵素を含有し得る任意の体液から精製しようとする全種類の標的生体分子に対して有効であるため、リガンドバリアントの設計及び標的生体分子に対するそのスクリーニングの工程のオートメーション化が可能なことに留意すべきである。天然アミノ酸を含む所与のペプチドリガンドについて、ソフトウェアは、修飾アミノ酸を使用してペプチドバリアントのライブラリを作成する。また、この設計ユニットは続くドッキングモジュールに連結され、ドッキングモジュールは設計した配列を標的分子又は、より理想的には、標的分子上の既知の結合領域にドッキングさせる。このソフトウェアパッケージは、本格的なドッキングプログラムがある設備を持ち合わせていないユーザにとって非常に価値があるものとなり得る。
【００６７】
（００８９）
【表３】
2016527231.tif 000005
【００６８】
（００９０）  リガンドＨＦＲＲＨＬ及びその誘導体ＨＦMetＣｉｔＣｉｔＨＬで得られた結果はＨＷＲＧＷＶ及びＨＷMetＣｉｔＧＷMetＶの結果に非常によく似ている。配列ＨＷＲＧＷＶはトリプシンにとって申し分のない基質であり、これはアルギニンに対してＣ位にあるグリシンが酵素によるペプチド攻撃にとって立体的に好ましいからである可能性が最も高い。配列上でのアルギニンの近接により酵素攻撃は若干弱るものの、ペプチドＨＦＲＲＨＬもトリプシンにとって良い基質である。逆に、ＨＹＦＫＦＤはトリプシンによる攻撃の影響を殆どうけないが、これはペプチド上での酵素活性部位の効果的な係留を妨げ得る、リジンに隣接する残基の立体障害のせいであると考えられる。そのバリアントＨＹMetＦMetＫ(Met)2ＦMetＤは、配列がタンパク質回収には不向きであることが低収率値により示されてはいるものの、タンパク質分解に対して高い耐性を示す。
【００６９】
（００９１）  配列次第であるが、これらの結果は、同様の抗体結合特性を維持したまま天然アミノ酸が類似の合成残基に置換されることをはっきりと実証している。
【００７０】
（００９２）  ドッキングシミュレーションで予測されるように、元の配列の時の結合特性が、酵素による消化に対する高い耐性をもたらす。芳香族アミノ酸のメチル化がα−キモトリプシンによるタンパク質分解攻撃を大幅に弱化させ、シトルリン及びメチル化リジンの使用がトリプシンの作用を完全に防止すると思われる。提案する置換の中で最も重要と思われるにも関わらず、結合の静電成分を減少させる限り、シトルリンは標的への結合及び生化学的耐性の両方の観点から極めて優れた置換基であることが判明した。
【００７１】
（００９３）吸着剤ＨＷMetＣｉｔＧＷMetＶ−、ＨＦMetＣｉｔＣｉｔＨＬ−及びＨＹMetＦMetＫ(Met)2ＦMetＤ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ樹脂を使用したヒト血漿のコーン画分ＩＩ＋ＩＩＩからのＩＶＩＧの精製
（００９４）  ＩＶＩＧ精製用に提案のリガンドバリアントの適用可能性を測るために、配列ＨＷMetＣｉｔＧＷMetＶ、ＨＦMetＣｉｔＣｉｔＨＬ及びＨＹMetＦMetＫ(Met)2ＦMetＤをヒト血漿のコーン画分ＩＩ＋ＩＩＩからのポリクローナル抗体の精製に使用した。元のペプチドリガンドをポジティブコントロールとして使用した。コーンＩＩ＋ＩＩＩペーストの粗原料をＰＢＳで希釈して供給物試料を調製し、固体粒子を濾過により除去してからカラムに注入した。この作業で採用したクロマトグラフィのプロトコルは前もっての最適化から導きだされ、バインディングバッファとしてのＰＢＳ中の０．２５ＭのＮａＣｌ及び溶出用の０．２Ｍのアセテートバッファ（ｐＨ５．０）の使用を含んだ［２４］。画分を回収し、プロテインＧクロマトグラフィ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３）により分析することでＩｇＧ収率及び純度をそれぞれ求めた。結果を表４にまとめた。
【００７２】
（００９５）
【表４】
2016527231.tif 000006
【００７３】
（００９６）  バリアントＨＷMetＣｉｔＧＷMetＶ及びＨＦMetＣｉｔＣｉｔＨＬで得られた生成物の収率及び純度は、元の配列及びプロテインＡで得られる結果に全く引けをとらない。溶出した画分中に少量のアルブミンを検出する場合があるものの（図３）、両方のリガンドが極めて高い生成物収率及び純度をもたらした。観察可能な汚染物質の殆どはカラムをあっさりと通過し、他の免疫グロブリン（すなわち、ＩｇＡ及びＩｇＭ）が結合することが一部あるものの、溶出条件（ｐＨ５．０）を選択することで溶出画分でのその存在を最小限に抑えた［４９］。バリアントＨＹMetＦMetＫ(Met)2ＦMetＤでは高い生成物純度が得られたが、収率の点で劣った。後者は上記の結果から予想できたが、溶出画分における高ＩｇＧ純度は予想外であった。アルキル化アミノ酸の使用に起因する高い配列疎水性にも関わらず疎水性相互作用による不純物の非特異的な結合が殆どなかったのは驚きである。
【００７４】
（００９７）  また、ペプチドバリアントと結合するアルブミン及び他の不純物の量が元の配列で観察されるものより終始一貫して少ないことに注目すると興味深い。このことはこれまでの発見及びドッキングシミュレーションで得られた情報を考慮すると説明することができる。例えば、ｐＨ７．４で２つの正電荷（１つはアルギニン、もう一方はペプチドＮ末端）を有する元の配列ＨＷＲＧＷＶは、血漿中に存在する最も豊富で負に帯電したタンパク質であるアルブミン（ｐＩ＝４．７）を静電的相互作用により捕捉すると判明した。アルブミン及び類似のタンパク質不純物のこの非特異的な結合を回避するために、生成物の収率及び純度の点で最良の妥協点がもたらされる最適レベルまで塩化ナトリウムを添加することで、バインディングバッファの伝導率を上昇させた［２５］。しかしながら、塩の使用は、精製工程に更に費用がかかるということである。正に帯電した残基をシトルリン、ジメチル化リジン等の電気的に中性なアミノ酸で置換することで、バインディングバッファ中に存在する塩の量に関係なく、静電結合の程度は本質的に低下する。これらの発見は、リガンドバリアントで得られる高い純度を説明する一方で（表３）、塩が収率及び純度に及ぼす影響についてのより徹底した研究を必要とし、この研究については後出のセクションで紹介する。
【００７５】
（００９８）吸着剤ＨＷＲＧＷＶ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、Ａｃ−ＨＷＲＧＷＶ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、ＨＷMetＣｉｔＧＷMetＶ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ及びＡｃ−ＨＷMetＣｉｔＧＷMetＶ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（配列番号：６、３２、１８、２２）樹脂を使用したヒト血漿のコーン画分ＩＩ＋ＩＩＩからのＩｇＧの精製に伝導率が及ぼす影響
（００９９）  結合の静電成分の程度を測るために、バインディングバッファの伝導率が生成物の収率及び純度に及ぼす影響を、異なる電荷値及び分布を有する４種のペプチドリガンド：（ａ）元のＨＷＲＧＷＶ、（ｂ）そのアセチル化版Ａｃ−ＨＷＲＧＷＶ、（ｃ）バリアントＨＷMetＣｉｔＧＷMetＶ及び（ｄ）そのアセチル化版Ａｃ−ＨＷMetＣｉｔＧＷMetＶを使用して研究した。
【００７６】
（０１００）  これら４種の配列を、コーン画分ＩＩ＋ＩＩＩからのＩＶＩＧの精製に使用した。ＨＷＲＧＷＶを使用したＩＶＩＧ精製のこれまでの研究において上述したように、ＰＢＳ＋０．２５ＭのＮａＣｌを最適なバインディングバッファとして選択した。前出のセクションで得られた結果は、正に帯電したアミノ酸を中性の残基で置換するとリガンドの静電挙動が減少するため生成物純度が上昇するという仮説につながった。この仮説を検証するために、結合研究を上で挙げた配列並びにＰＢＳ中に０Ｍ、０．１３Ｍ及び０．２５ＭのＮａＣｌを含む３種のバインディングバッファを使用して繰り返した。図４は４種の吸着剤のそれぞれでの、異なる伝導率で得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、表９は得られた生成物収率及び純度の値を示す。図３。吸着剤（ａ）ＨＷＲＧＷＶ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ樹脂及びＨＷMetＣｉｔＧＷMetＶ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ樹脂、（ｂ）ＨＦＲＲＨＬ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ樹脂及びＨＦMetＣｉｔＣｉｔＨＬ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ樹脂並びに（ｃ）ＨＹＦＫＦＤ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ樹脂及びＨＹMetＦMetＫ(Met)2ＦMetＤ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ樹脂を使用した、ヒト血漿のコーン画分ＩＩ＋ＩＩＩからのＩｇＧのクロマトグラフィ精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件）。表記：ＦＴ−素通り画分、ＥＬ−溶出画分。
【００７７】
（０１０１）
図４異なる塩濃度のバインディングバッファで行ったヒト血漿のコーン画分ＩＩ＋ＩＩＩからのＩｇＧのクロマトグラフィ精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件）。（ａ）ＨＷＲＧＷＶ及びＡｃ−ＨＷＲＧＷＶ、（ｂ）ＨＷMetＣｉｔＧＷMetＶ及びＡｃ−ＨＷMetＣｉｔＧＷMetＶ。表記：ＦＴ−素通り画分、ＥＬ−溶出画分。
【００７８】
（０１０２）
【表５】
2016527231.tif 000007
【００７９】
（０１０３）  表５が示すように、ペプチド上の正電荷の数値の低下はより高いＩｇＧ純度につながる。予想通り、バインディングバッファの伝導率が生成物の純度に及ぼす影響は、２つの正電荷を有するため静電力の遮蔽の影響を最も受けやすいＨＷＲＧＷＶで極めて明白であり、Ａｃ−ＨＷMetＣｉｔＧＷMetＶでは、伝導率の影響はほぼ無視してよいものである。後者とＨＷMetＣｉｔＧＷMetＶ、また元の配列及びそのアセチル化形態とを比較すると、ペプチドＮ末端のアセチル化は、シトルリンによるアルギニンの置換より生成物の収率及び純度への影響が少ないことがわかる。低伝導率のバインディングバッファを使用してＡｃ−ＨＷMetＣｉｔＧＷMetＶで得られたＩｇＧ純度（９３％）は、ＨＷＲＧＷＶを使用して得られたどの値（８１〜８３％）よりも高い。とりわけ、収率を犠牲にして高純度が達成されたことはなく、このバリアントに関して元の配列のものより若干低い結合のΔiＧを予測したドッキング計算の結果に基づいて幾らかの低下を予測していたにも関わらず、純度は安定して９０％を超え続けた。配列Ａｃ−ＨＷMetＣｉｔＧＷMetＶは、小ペプチドリガンドアフィニティクロマトグラフィをベースとした手頃且つロバストな抗体精製法に必要とされる特徴を数多く有する。
【００８０】
（０１０４）結論
（０１０５）  本研究は、標的親和性及び選択性並びに生化学的安定性の極めて優れた特徴を有する、非天然アミノ酸を含む小ペプチドリガンドを設計するためのストラテジーを提供する。既知のペプチド配列について得られる情報（特には、標的とする生体分子上での結合部位）及び最先端のモデリングツールの使用をベースとして、本方法は、鍵アミノ酸残基を非天然バリアントで置換することで結合機序を都合よく変化させる又は化学的及び生物学的な物質（例えば、強酸、強塩基及びタンパク質分解酵素）に対する安定性を付与することを指導する。ＨＷＲＧＷＶ、ＨＹＦＫＦＤ及びＨＦＲＲＨＬの３種の抗体結合ペプチドを、より高いタンパク質分解耐性を示し且つ高い標的親和性及び特異性を維持するリガンドバリアントを開発するためのモデルとして利用した。コーン画分及びハイブリドーマ細胞培養液等の血漿をベースとした流体から回収される抗体の価値が高いことから、本研究はこれらのペプチドに主要な血漿プロテアーゼであるトリプシン及びα−キモトリプシンに対する生化学的安定性を付与することを目指した。これを目的とし、芳香族及び塩基性アミノ酸をメチル化バリアント及びシトルリンで置換することでバリアントのバーチャルライブラリを設計し、次に分子ドッキングソフトウェアＨＡＤＤＯＣＫを使用してＩｇＧ上のペプチド結合部位（Ｓｅｒ３８３〜Ａｓｎ３８９）に対するｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスクリーニングを行った。
【００８１】
（０１０６）  ドッキング計算の結果に基づいて選択したペプチドバリアントをクロマトグラフィ樹脂上に合成し、タンパク質分解に対する耐性及びヒト血漿のコーン画分ＩＩ＋ＩＩＩからのＩＶＩＧの精製について試験した。これらのバリアントはこれらの親配列に匹敵する標的親和性及びはるかに高い生化学的耐性を有する。更に、ＨＷＲＧＷＶ関連バリアントのＩｇＧ結合機序の静電成分についての徹底的な研究により、元の配列ＨＷＲＧＷＶより高い選択性を示す配列Ａｃ−ＨＷMetＣｉｔＧＷMetＶが同定された。アルブミン及び他の不純物との結合が本質的に少ないことを吸着剤Ａｃ−ＨＷMetＣｉｔＧＷMetＶ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ樹脂は示し、これは高ＩｇＧ純度を得るのにバインディングバッファで必要とされる塩の量が減少するため精製コストが低下するということである。
【００８２】
（０１０７）  本発明で用いたアプローチは概して、生体分子を標的とするいずれの小合成又は天然ペプチドリガンドでも有効である。結合部位が一旦うまく絞れたならば、分子ドッキング用の信頼性の高いプログラムを使用して大きなライブラリを迅速且つ安価に設計及びスクリーニングすることが可能である。結合強度を適切に見積もることに加え、これらのツールは、リガンド−標的相互作用の性質に関する洞察も与える。アミノ酸置換基を慎重に選択することで、ペプチドリガンドの生化学的性質を微調整することができる。特に、電荷並びに疎水性及び親水性基の分布を変更することで、生化学的安定性に加えて親和性及び選択性を強化することが可能である。化学分解しやすいアミノ酸（例えば、アルカリ性条件下でアミド分解を起こすアスパラギン及びグルタミン）の代わりに合成バリアントを使用することは、タンパク質溶出並びにカラムの清浄化及び衛生化にきつい化学物質を使用するアフィニティクロマトグラフィ用のペプチドリガンドの設計に特に適している。化学分解の度合いの低下は吸着剤の寿命が延びることを意味する。
【００８３】
（０１０８）  また、本明細書で提示のアプローチには、タンパク質活性機序の根底にある非共有結合性相互作用についての基礎的な研究の余地がある。適切なアミノ酸を使用して特定の結合成分を抑制する又は活性化することで、生体認識現象を研究し、標的とリガンドとの特異的相互作用を制御する小生体分子を設計することが可能である。本研究は、標的抗体への結合において幾つかの点でプロテインＡをしのぐ小ペプチドバリアントを提示することでこの方向の一例を示すものである。これらの発見は、バイオセパレーション、より広くはバイオテクノロジーにおける多種多様な用途向けの、大きな可能性を秘めた最適な合成タンパク質模倣物に向けての前進である。
【００８４】
参考文献
［１］Ｏ．Ｈ．  Ｂｒｅｋｋｅ，  Ｉ．  Ｓａｎｄｌｉｅ，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２  （２００３）  ５２．
［２］Ｃ．  Ｎｅｗｃｏｍｂｅ，  Ａ．Ｒ．  Ｎｅｗｃｏｍｂｅ，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｂ  ８４８  （２００７）  ２．
［３］Ａ．  ＥｌＢａｋｒｉ，  Ｐ．Ｎ．  Ｎｅｌｓｏｎ，  Ａ．Ｏ．Ｒ．Ｏ．  Ａ．，  Ｈｕｍ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７１  （２０１０）  １２４３．
［４］Ｎ．  Ｒｏｎｄａ，  Ｖ．  Ｈｕｒｅｚ，  Ｍ．Ｄ．  Ｋａｚａｔｃｈｋｉｎｅ，  Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．  ６４  （１９９３）  ６５．
［５］Ｍ．Ｄ．  Ｋａｚａｔｃｈｋｉｎｅ，  Ｓ．Ｖ．  Ｋａｖｅｒｉ，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４５  （２００１）  ７４７．
［６］Ｕ．  Ｊｅｓｃｈｋｅ，  Ａ．  Ｂｉｓｃｈｏｆ，  Ｒ．  Ｓｐｅｅｒ，  Ｖ．  Ｂｒｉｅｓｅ，  Ｄ．Ｕ．  Ｒｉｃｈｔｅｒ，  Ｃ．  Ｂｅｒｇｅｍａｎｎ，  Ｉ．  Ｍｙｌｏｎａｓ，  Ｎ．  Ｓｈａｂａｎｉ，  Ｋ．  Ｆｒｉｅｓｅ，  Ｕ．  Ｋａｒｓｔｅｎ，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２５  （２００５）  １５８１．
［７］Ｎ．  Ｌｏｎｂｅｒｇ，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３  （２００５）  １１１７．
［８］Ｊ．Ｗ．  Ｓｔａｖｅ，  Ｆｏｏｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  １０  （１９９９）  ３６７．
［９］Ｈ．  Ｚｏｌａ，  ｅＬＳ  （２００５）．
［１０］Ｃ．  Ｚｈａｎｇ，  ｉｎ  Ｇ．  Ｐｒｏｅｔｚｅｌ，  Ｈ．  Ｅｂｅｒｓｂａｃｈ  （Ｅｄｉｔｏｒｓ），  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０１２，  ｐ．  １１７．
［１１］Ｍ．Ｐ．  Ｂａｃｋｅｒ，  Ｌ．Ｓ．  Ｍｅｔｚｇｅｒ，  Ｐ．Ｌ．  Ｓｌａｂｅｒ，  Ｋ．Ｌ．  Ｎｅｖｉｔｔ，  Ｇ．Ｂ．  Ｂｏｄｅｒ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ３２  （１９８８）  ９９３．
［１２］Ａ．Ｃ．  Ｇｒｏｄｚｋｉ，  Ｅ．  Ｂｅｒｅｎｓｔｅｉｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５８８  （２０１０）  ３３．
［１３］Ｒ．  Ｈａｈｎ，  Ｒ．  Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，  Ａ．  Ｊｕｎｇｂａｕｅｒ，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ７９０  （２００３）  ３５．
［１４］Ｄ．Ｋ．  Ｆｏｌｌｍａｎ，  Ｒ．Ｌ．  Ｆａｈｒｎｅｒ，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ａ  １０２４  （２００４）  ７９．
［１５］Ｓ．  Ｈｏｂｅｒ，  Ｋ．  Ｎｏｒｄ，  Ｍ．  Ｌｉｎｈｕｌｔ，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｂ  ８４８  （２００７）  ４０．
［１６］Ｇ．Ｅ．  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  ｉｎ  Ｄ．Ｆ．−．−．  ＡＡ  （Ｅｄｉｔｏｒ），  ２００５．
［１７］Ｐ．Ａ．  Ｎｙｇｒｅｎ，  Ｍ．  Ｅｌｉａｓｓｏｎ，  Ｌ．  Ａｂｒａｈｍｓｅｎ，  Ｍ．  Ｕｈｌｅｎ，  Ｅ．  Ｐａｌｍｃｒａｎｔｚ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１  （１９８８）  ６９．
［１８］Ｍ．  Ｐａｇｅ，  Ｒ．  Ｔｈｏｒｐｅ，  ｉｎ  Ｊ．Ｍ．  Ｗａｌｋｅｒ  （Ｅｄｉｔｏｒ），  Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｈａｎｄｂｏｏｋ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９６，  ｐ．  ７３３．
［１９］Ｐ．  Ｇａｇｎｏｎ，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ａ  １２２１  （２０１２）  ５７．
［２０］Ｂ．  Ｖｉｊａｙａｌａｋｓｈｍｉ  Ａｙｙａｒ，  Ｓ．  Ａｒｏｒａ，  Ｃ．  Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｒ．  Ｏ’Ｋｅｎｎｅｄｙ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５６  （２０１２）  １１６．
［２１］Ｈ．  Ｙａｎｇ，  Ｐ．Ｖ．  Ｇｕｒｇｅｌ，  Ｒ．Ｇ．  Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ，  Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｒｅｓ．  ６６  Ｓｕｐｐｌ  （２００５）  １２０．
［２２］Ｈ．  Ｙａｎｇ，  Ｐ．Ｖ．  Ｇｕｒｇｅｌ，  Ｒ．Ｇ．  Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ａ  １２１６  （２００９）  ９１０．
［２３］Ｈ．Ｇ．  Ｙａｎｇ，  Ｐ．Ｖ．  Ｇｕｒｇｅｌ，  Ｄ．Ｋ．  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｂ．Ｇ．  Ｂｏｂａｙ，  Ｊ．  Ｃａｖａｎａｇｈ，  Ｄ．Ｃ．  Ｍｕｄｄｉｍａｎ，  Ｒ．Ｇ．  Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．  ２３  （２０１０）  ２７１．
［２４］Ｓ．  Ｍｅｎｅｇａｔｔｉ，  Ａ．Ｄ．  Ｎａｉｋ，  Ｐ．Ｖ．  Ｇｕｒｇｅｌ，  Ｒ．Ｇ．  Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ，  Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｓｃｉ  （２０１２）．
［２５］Ａ．Ｄ．  Ｎａｉｋ，  Ｓ．  Ｍｅｎｅｇａｔｔｉ，  Ｐ．Ｖ．  Ｇｕｒｇｅｌ，  Ｒ．Ｇ．  Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ａ  １２１８  （２０１１）  １６９１．
［２６］Ａ．Ｄ．  Ｎａｉｋ，  Ｓ．  Ｍｅｎｅｇａｔｔｉ，  Ｈ．Ｒ．  Ｒｅｅｓｅ，  Ｐ．Ｖ．  Ｇｕｒｇｅｌ，  Ｒ．Ｇ．  Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ａ  （２０１２）．
［２７］Ｗ．Ｓ．  Ｋｉｓｈ，  Ａ．Ｄ．  Ｎａｉｋ，  Ｓ．  Ｍｅｎｅｇａｔｔｉ，  Ｒ．Ｇ．  Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ，  Ｉｎｄ．  Ｅｎｇ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．  （２０１２）．
［２８］Ｓ．  Ｍｅｎｅｇａｔｔｉ，  Ａ．Ｄ．  Ｎａｉｋ，  Ｐ．Ｖ．  Ｇｕｒｇｅｌ，  Ｒ．Ｇ．  Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ａ  １２４５  （２０１２）  ５５．
［２９］Ｊ．Ｍ．  Ａｒｔｉｇａｓ，  Ｍ．Ｅ．  Ｇａｒｃｉａ，  Ｍ．Ｒ．  Ｆａｕｒｅ，  Ａ．Ｍ．  Ｇｉｍｅｎｏ，  Ｐｏｓｔｇｒａｄ．  Ｍｅｄ．  Ｊ．  ５７  （１９８１）  ２１９．
［３０］Ｒ．Ｂ．  Ｌｌｆｋｏｗｉｔｚ，  Ｊ．Ｙ．  Ｍａｒｃｉｎｉａｋ，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ３１  （２０１０）  ４０３．
［３１］Ｊ．Ｖ．  Ｏｌｓｅｎ，  Ｓ．Ｅ．  Ｏｎｇ，  Ｍ．  Ｍａｎｎ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ３  （２００４）  ６０８．
［３２］Ｗ．  Ａｐｐｅｌ，  Ｃｌｉｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９  （１９８６）  ３１７．
［３３］Ｒ．Ｌ．  Ｆａｈｒｎｅｒ，  Ａ．  Ｌａｖｅｒｄｉｅｒｅ，  Ｐ．Ｊ．  ＭｃＤｏｎａｌｄ，  Ｒ．Ｍ．  Ｏ’Ｌｅａｒｙ，  ｉｎ  Ｕ．Ｐ．  Ｏｆｆｉｃｅ  （Ｅｄｉｔｏｒ），  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，  ２０１０．
［３４］Ｂ．  Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ，  Ｐ．  Ｂｅｌｌｏｆｉｏｒｅ，  Ｔ．  Ｄｅ  Ｍａｒｔｉｎｏ，  Ｃ．  Ｐｕｎｚｏ，  Ｖ．  Ｒｉｖｉｅｃｃｉｏ，  Ａ．  Ｖｅｒｄｏｌｉｖａ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３３３  （２００８）  １２６．
［３５］Ａ．  Ｖｅｒｄｏｌｉｖａ，  Ｆ．  Ｐａｎｎｏｎｅ，  Ｍ．  Ｒｏｓｓｉ，  Ｓ．  Ｃａｔｅｌｌｏ，  Ｖ．  Ｍａｎｆｒｅｄｉ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７１  （２００２）  ７７．
［３６］Ｒ．  Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，  Ｈ．Ｖ．  Ｋｏｌｂｅ，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ａｐｐｌ．  ６６２  （１９９４）  ２６１．
［３７］Ａ．Ｂ．  Ｊｏｓｈｉ，  Ｌ．Ｅ．  Ｋｉｒｓｃｈ，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ９１  （２００２）  ２３３１．
［３８］Ｋ．Ｌ．  Ｓｃｈｅｙ，  Ｅ．Ｌ．  Ｆｉｎｌｅｙ，  Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．  ３３  （２０００）  ２９９．
［３９］Ｔ．Ｊ．  Ｓｉｍａｔ，  Ｈ．  Ｓｔｅｉｎｈａｒｔ，  Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  ４６  （１９９８）  ４９０．
［４０］Ｓ．Ｊ．  ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ，  Ａ．Ｄ．Ｊ．  ｖａｎ  Ｄｊｉｋ，  Ｍ．  Ｋｒｚｅｍｉｎｓｋｉ，  Ｍ．  ｖａｎ  Ｄｉｊｋ，  Ａ．  Ｔｈｕｒｅａｕ，  Ｖ．  Ｈｓｕ，  Ｔ．  Ｗａｓｓｅｎａａｒ，  Ａ．Ｍ．  Ｂｏｎｖｉｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃ．  Ｆｕｎｃｔ．  ＆  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ  ６９  （２００７）  ７２６．
［４１］Ｃ．  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，  Ｒ．  Ｂｏｅｌｅｎｓ，  Ａ．Ｍ．  Ｂｏｎｖｉｎ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２５  （２００３）  １７３１．
［４２］Ｒ．  Ｗａｎｇ，  Ｙ．  Ｌｕ，  Ｓ．  Ｗａｎｇ，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ４６  （２００３）  ２２８７．
［４３］Ｎ．  Ａｎｄｒｕｓｉｅｒ，  Ｅ．  Ｍａｓｃｈｉａｃｈ，  Ｒ．  Ｎｕｓｓｉｎｏｖ，  Ｈ．Ｊ．  Ｗｏｌｆｓｏｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ７３  （２００８）  ２７１．
［４４］Ｅ．  Ｍａｓｃｈｉａｃｈ，  Ｄ．  Ｓｃｈｎｅｉｄｍａｎ−Ｄｕｈｏｖｎｙ，  Ｎ．  Ａｎｄｒｕｓｉｅｒ，  Ｒ．  Ｎｕｓｓｉｎｏｖ，  Ｈ．Ｊ．  Ｗｏｌｆｓｏｎ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３６  （２００８）  Ｗ２２９．
［４５］Ｓ．  Ｌｉｕ，  Ｃ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｈ．  Ｚｈｏｕ，  Ｙ．  Ｚｈｏｕ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ５６  （２００４）  ９３．
［４６］Ａ．Ｅ．  Ｓａｕｅｒ−Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，  Ｇ．  Ｋｌｅｙｗｅｇｔ，  Ｍ．  Ｕｈｌｅｎ，  Ｔ．Ａ．  Ｊｏｎｅｓ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ３  （１９９５）  ２６５．
［４７］Ｒ．  Ｗａｎｇ，  Ｌ．  Ｌａｉ，  Ｓ．  Ｗａｎｇ，  Ｊ．  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．  Ｄｅｓ．  １６  （２００２）  １１．
［４８］Ｓ．Ｊ．  Ｈｕｂｂａｒｄ，  Ｓ．Ｆ．  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  Ｊ．Ｍ．  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２０  （１９９１）  ５０７．
［４９］Ｚ．  Ｌｉｕ，  Ｐ．Ｖ．  Ｇｕｒｇｅｌ，  Ｒ．Ｇ．  Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ａ  １２６２  （２０１２）  １６９．
【００８５】
（０１０９）  本発明について詳述してきたが、上記は本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。本発明の他の態様、利点及び改変は、後述する請求項の範囲に含まれる。本明細書で引用の全ての出版物、特許及び特許出願は、個々の出版物又は特許出願があたかも参照により具体的且つ個別に示されて援用されたかのように、参照により本願に援用される。
【００８６】
【表６】
2016527231.tif 000008
2016527231.tif 000009
【図１】
2016527231.tif 000010
【図２】
2016527231.tif 000011
【図３（Ａ）】
2016527231.tif 000012
【図３（Ｂ）】
2016527231.tif 000013
【図３（Ｃ）】
2016527231.tif 000014
【図４（Ａ）】
2016527231.tif 000015
【図４（Ｂ）】
2016527231.tif 000016
【配列表】
2016527231000001.app
【国際調査報告】
2016527231.tif 000017
2016527231.tif 000018