(57)【要約】  オートファジー誘導化合物は、部分Ｒ１およびＲ２がそれぞれＮおよびＣ末端と直に隣接している、ベクリン１ペプチドを含むオートファジー誘導ペプチドを含み、前記ペプチド残基の最大６つは置換されていてよく、Ｒ１およびＲ２は、自然な状態ではベクリン１残基と隣接しておらず、Ｆ２７０およびＦ２７４は、置換されていてもよく、連結していてもよい。該化合物を使用して、オートファジーを誘導することができる。【選択図】なし表訳明細書【表１】表１．標的化突然変異誘発ペプチド配列＊配列番号活性野生型突然変異体特許請求の範囲【表１】ペプチド配列配列番号：野生型突然変異体【特許請求の範囲】
【請求項１】
オートファジー誘導化合物であって、
部分Ｒ１およびＲ２がそれぞれＮおよびＣ末端と直に隣接している、ベクリン１残基２７０−２７８（ＶＦＮＡＴＦＨＩＷＨＳ；配列番号：０１、残基２−１０）またはこの残基のＤ−レトロ−インベルソ配列を含むオートファジー誘導ペプチドを含み、
前記残基の最大６つは置換されていてよく、
Ｒ１およびＲ２は、自然な状態では前記ベクリン１残基と隣接しておらず、Ｆ２７０およびＦ２７４は、置換されていてもよく、連結していてもよい、オートファジー誘導化合物。
【請求項２】
前記ペプチドが、
【表１】
2016516734.tif 000005
2016516734.tif 000006
から選択される非置換配列、
または前記ペプチドのＤ−レトロ−インベルソ配列を含む、
請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１が、形質導入ドメイン、ホーミングペプチドまたは血清安定剤を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１が、ジグリシンリンカー、特にジグリシン−Ｔ−Ｎリンカーを介して前記ペプチドと連結しているｔａｔタンパク質形質導入ドメインである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ２がカルボキシルであるか、またはＲ２が、親和性タグもしくは検出可能な標識、特に蛍光標識を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
ａ）Ｆ２７０およびＦ２７４が、架橋性部分で置換されているおよび／もしくは連結しており、それぞれが、置換されていてもよい、ヘテロ低級アルキル、特に置換されていてもよい、ヘテロメチル、エチル、プロピルおよびブチルから選択されてもよい追加のα−炭素置換を含んでもよい；または
ｂ）Ｆ２７０およびＦ２７４が、ジスルフィド架橋を介して結合しているホモシステインで置換されて、環および尾部環状ペプチドを生成する、
請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｆ２７０およびＦ２７４の側鎖が、リンカー：
ラクタムペプチドを形成する−（ＣＨ２）ｎＯＮＨＣＯＸ（ＣＨ２）ｍ−、
［ここで、Ｘは、ＣＨ２、ＮＨまたはＯであり、ｍおよびｎは、整数１−４である］；
エーテルペプチドを形成する−ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨＣＨＣＨ２ＯＣＨ２−；または
ステープルドペプチドを形成する−（ＣＨ２）ｎＣＨＣＨ（ＣＨ２）ｍ−
によって置きかえられている、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
１から６つの残基が、アラニン置換されている；または
前記ペプチドが、置換：Ｈ２７５ＥおよびＳ２７９Ｄの少なくとも１つを含む；または
前記ペプチドが、１つ以上のＤ−アミノ酸、Ｌ−β−ホモアミノ酸、Ｄ−β−ホモアミノ酸もしくはＮ−メチル化アミノ酸を含む；または
前記ペプチドが、Ｄ−レトロ−インベルソ配列を含む、
請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
Ｄ−レトロ−インベルソ配列：
ＲＲＱＲＲＫＫＫＲＧＹ−ＧＧ−ＤＨＷＩＥＦＴＡＮＦＶ（配列番号：０８）
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
前記ペプチドが、アセチル化、アシル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、硫酸化またはグリコシル化されている、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｎ末端アセチル、ホルミル、ミリストイル、パルミトイル、カルボキシルもしくは２−フロシル基および／またはＣ末端ヒドロキシル、アミド、エステルもしくはチオエステル基を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
前記ペプチドが環化されている、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
前記ペプチドが、配列ＶＷＮＡＴＦＨＩＷＨＤ（配列番号：２６）または該配列のＤ−レトロ−インベルソ配列ＤＨＷＩＨＦＴＡＮＷＶ（配列番号：３０）を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
請求項１に記載の化合物を、投与可能な単位剤形で含む、医薬組成物。
【請求項１５】
オートファジーを誘導する方法であって、この誘導を必要とする人に、有効量の請求項１に記載の化合物を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって認められた認可番号Ｕ５４ＡＩ０５７１５６の下での政府支援により為された。政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
【０００２】
出願人らは、２０１３年３月１８日に出願された米国特許出願第６１／８０３，０９５号明細書に基づく優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
ベクリン１は、中央コイルドコイルドメインを持つ４５０アミノ酸タンパク質をコードする。ベクリン１は、Ｎ’末端内に、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬ等の抗アポトーシス分子との結合を媒介するＢＨ３のみのドメインを含有する。進化的に保存されたドメイン（ＥＣＤ）と称される最も高度に保存された領域がアミノ酸２４４−３３７にわたっており、この領域は、Ｖｐｓ３４との相互作用に重要である。ベクリン１の過剰発現は、オートファジーを誘導するために十分なものである。Ｆｕｒｕｙａ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  １，４６−５２，２００５；Ｐａｔｔｉｎｇｒｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １２２，９２７−３９，２００５．
本発明人らは、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１３／２２３５０号においてオートファジー誘導ベクリン１ペプチドを開示した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１３／２２３５０号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｆｕｒｕｙａ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  １，４６−５２，２００５；Ｐａｔｔｉｎｇｒｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １２２，９２７−３９，２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、オートファジーを誘導するための方法および組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様において、本発明は、オートファジー誘導化合物であって、部分Ｒ１およびＲ２がそれぞれＮおよびＣ末端と直に隣接している、ベクリン１残基２７０−２７８（ＦＮＡＴＦＨＩＷＨ；配列番号：０１、残基２−１０）またはこの残基のＤ−レトロ−インベルソ配列を含むオートファジー誘導ペプチドを含み、前記残基の最大６つは置換されていてよく、Ｒ１およびＲ２は、自然な状態ではベクリン１残基と隣接しておらず、Ｆ２７０およびＦ２７４は、置換されていてもよく、連結していてもよい、オートファジー誘導化合物である。
【０００８】
特定の実施形態において、本発明は、主題オートファジー誘導化合物であって、
本明細書で開示される非置換構造を有するか、または前記残基の最大６つが置換されていてよく、２つのＦ残基がＦ１およびＦ２であり、置換されていてもよく、連結していてもよい、または該ペプチドのＤ−レトロ−インベルソ配列である；
Ｒ１が、治療的安定性または該化合物の送達を促進する非相同部分である；
Ｒ１が、形質導入ドメイン、ホーミングペプチドまたは血清安定剤を含む；
Ｒ１が、ジグリシンリンカー、特にジグリシン−Ｔ−Ｎリンカーを介してペプチドと連結しているｔａｔタンパク質形質導入ドメインである；
Ｒ２がカルボキシルである；
Ｒ２が、親和性タグもしくは検出可能な標識、特に蛍光標識を含む；
Ｆ２７０およびＦ２７４が、置換されているおよび連結している；
Ｆ２７０およびＦ２７４が、架橋性部分で置換されているおよび／もしくは連結しており、それぞれが、置換されていてもよい、ヘテロ低級アルキル、特に置換されていてもよい、ヘテロメチル、エチル、プロピルおよびブチルから選択される追加のα−炭素置換を含んでもよい；
Ｆ２７０およびＦ２７４が、ジスルフィド架橋を介して結合しているホモシステインで置換されて、環および尾部環状ペプチドを生成する；
Ｆ２７０およびＦ２７４の側鎖が、リンカー：
ラクタムペプチドを形成する−（ＣＨ２）ｎＯＮＨＣＯＸ（ＣＨ２）ｍ−［ここで、Ｘは、ＣＨ２、ＮＨまたはＯであり、ｍおよびｎは、整数１−４である］；
エーテルペプチドを形成する−ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨＣＨＣＨ２ＯＣＨ２−；または
ステープルドペプチドを形成する−（ＣＨ２）ｎＣＨＣＨ（ＣＨ２）ｍ−
によって置きかえられている；
１から６つの残基が、アラニン置換されている；
ペプチドが、置換：Ｈ２７５ＥおよびＳ２７９Ｄの少なくとも１つを含む；
ペプチドが、１つ以上のＤ−アミノ酸、Ｌ−β−ホモアミノ酸、Ｄ−β−ホモアミノ酸もしくはＮ−メチル化アミノ酸を含む；
Ｄ−レトロ−インベルソ配列、特に、ＲＲＱＲＲＫＫＫＲＧＹ−ＧＧ−ＤＨＷＩＥＦＴＡＮＦＶ（配列番号：０８）を含む；
ペプチドが、アセチル化、アシル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、硫酸化またはグリコシル化されている；
Ｎ末端アセチル、ホルミル、ミリストイル、パルミトイル、カルボキシルもしくは２−フロシル（ｆｕｒｏｓｙｌ）基および／またはＣ末端ヒドロキシル、アミド、エステルもしくはチオエステル基を含む；ならびに／または
ペプチドが環化されている、
主題オートファジー誘導化合物である。
【０００９】
本発明は、主題化合物を、投与可能な単位剤形で含む医薬組成物、および、オートファジーを誘導する方法であって、この誘導を必要とする人に、有効量の主題化合物または組成物を投与するステップを含む方法も提供する。
【００１０】
本発明は、列挙されている特定の実施形態のすべての組み合わせを、各組み合わせが入念に別個に列挙されているかの如く包含する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
一態様において、本発明は、オートファジー誘導化合物であって、部分Ｒ１およびＲ２がそれぞれＮおよびＣ末端と直に隣接している、ベクリン１残基２７０−２７８（ＦＮＡＴＦＨＩＷＨ；配列番号：０１、残基２−１０）またはこの残基のＤ−レトロ−インベルソ配列を含むオートファジー誘導ペプチドを含み、前記残基の最大６つは置換されていてよく、Ｒ１およびＲ２は、自然な状態ではベクリン１残基と隣接しておらず、Ｆ２７０およびＦ２７４は、置換されていてもよく、連結していてもよい、オートファジー誘導化合物である。
【００１２】
実施形態において、ペプチドは、部分Ｒ１およびＲ２がそれぞれＮおよびＣ末端と直に隣接している、以下の表１の非置換変異配列またはこの配列のＤ−レトロ−インベルソ配列を含み、ここで、Ｒ１およびＲ２は、自然な状態ではベクリン１残基と隣接していない。
【００１３】
ペプチドおよび化合物活性は、定義された境界内の多様な追加の部分、隣接残基および置換に寛容である。ペプチドおよび化合物活性は、骨格修飾および置きかえ、側鎖修飾ならびにＮおよびＣ末端修飾にも寛容であり、いずれもペプチド化学の分野において慣例的である。
【００１４】
ペプチド結合の化学的修飾を使用して、酵素媒介性加水分解に対する代謝的安定性の増大を提供することができ、例えば、トリフルオロエチルアミン等のペプチド結合置きかえ（ペプチドサロゲート）は、代謝的により安定なおよび生物学的に活性なペプチド模倣薬を提供することができる。
【００１５】
ペプチド骨格を拘束するための修飾は、例えば、保護されたＣおよびＮ末端によりエクソペプチダーゼに対する代謝的安定性の強化を呈することができる環状ペプチド／ペプチド模倣薬を包含する。環化のための好適な技術は、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド架橋、ペプチドマクロラクタム、ペプチドチオエーテル、平行および逆平行環状二量体等を包含し、例えば、ＰＭＩＤ２２２３０５６３（ステープルドペプチド）、ＰＭＩＤ２３０６４２２３（ペプチド環化のためのクリックバリアント（ｃｌｉｃｋ  ｖａｒｉａｎｔｓ）の使用）、ＰＭＩＤ２３１３３７４０（環状ペプチドのＰＫ特性を最適化すること：側鎖置換の効果）、ＰＭＩＤ：２２７３７９６９（腸透過性のための主要な骨格モチーフの同定、ＰＭＩＤ１２６４６０３７（２−アミノ−ｄ，ｌ−ドデカン酸（Ｌａａ）をＮ末端（ＬａａＭＩＩ）とカップリングすることおよびＡｓｎをこのリポアミノ酸で置きかえることによる環化）を参照されたい。
【００１６】
特定の実施形態において、Ｆ２７０およびＦ２７４は、Ｆ２７０およびＦ２７４の側鎖がリンカーによって置きかえられている場合等、置換されているおよび連結している。例えば、これらの残基は、ジスルフィド架橋を介して結合しているホモシステインで置換されて、環および尾部環状ペプチドを生成することができる。加えて、これらの残基の側鎖は、置換および架橋されて、リンカー、例えば、ラクタムペプチドを形成する−ＣＨ２）ｎＯＮＨＣＯＸ（ＣＨ２）ｍ−［ここで、Ｘは、ＣＨ２、ＮＨまたはＯであり、ｍおよびｎは、整数１−４である］；エーテルペプチドを形成する−ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨＣＨＣＨ２ＯＣＨ２−；ステープルドペプチドを形成する−（ＣＨ２）ｎＣＨＣＨ（ＣＨ２）ｍ−等を形成することができる。リンカーは、追加の原子、ヘテロ原子または他の官能基を組み込んでよく、典型的には、Ｆ２７０およびＦ２７４における反応性側鎖から生成される。架橋性部分は、置換されていてもよい、ヘテロ低級アルキル、特に置換されていてもよい、ヘテロメチル、エチル、プロピルおよびブチル等の追加のα−炭素置換（ｓｕｂｓｔｉｔｉｔｉｏｎｓ）を包含してもよい。例示的な架橋性部分は、次のものを包含する：
【化１】
2016516734.tif 000002
【００１７】
他の好適な修飾は、アセチル化、アシル化（例えば、リポペプチド）、ホルミル化、アミド化、リン酸化（Ｓｅｒ、Ｔｈｒおよび／またはＴｙｒに対する）等を包含し、これらの修飾を使用して、ペプチドバイオアベイラビリティおよび／またはキレート剤（例えば、ＤＯＴＡ、ＤＰＴＡ）の活性、グリコシル化、スルホン化、組み込み等を改善させることができる。ＰＥＧ化は、ペプチド溶解度、バイオアベイラビリティ、インビボ安定性を増大させるおよび／または免疫原性を減少させるために使用することができ、多様な異なるＰＥＧ：ＨｉＰＥＧ、分枝および分岐ＰＥＧ、遊離可能なＰＥＧ；ヘテロ二官能性ＰＥＧ（末端基Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）エステル、マレイミド、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、アミンおよびカルボン酸を持つ）等を包含する。
【００１８】
好適な末端修飾は、Ｎ末端アセチル、ホルミル、ミリストイル、パルミトイル、カルボキシルおよび２−フロシル、ならびにＣ末端ヒドロキシル、アミド、エステルおよびチオエステル基を包含し、これらの末端修飾により、ペプチドは、天然タンパク質における荷電状態をより厳密に模倣し、および／またはエクソペプチダーゼによる分解に対してより安定となることができる。
【００１９】
ペプチドは、Ｄ−アミノ酸、Ｌ−β−ホモアミノ酸、Ｄ−β−ホモアミノ酸、Ｎ−メチル化アミノ酸等を包含する非定型または非天然アミノ酸を含有していてもよい。
【００２０】
多種多様な隣接部分Ｒ１および／またはＲ２、例えば、親和性タグ、形質導入ドメイン、ホーミングもしくは標的化部分、標識または他の官能基等を、バイオアベイラビリティおよび／もしくは活性を改善させるためならびに／または追加の特性を提供する等のために用いてよい。
【００２１】
そのような部分の１つの有用なクラスは、タンパク質由来（例えば、ｔａｔ、ｓｍａｃ、ｐｅｎ、ｐＶＥＣ、ｂＰｒＰｐ、ＰＩｓ１、ＶＰ２２、Ｍ９１８、ｐｅｐ−３）；キメラ（例えば、ＴＰ、ＴＰ１０、ＭＰＧΔ）または合成（例えば、ＭＡＰ、Ｐｅｐ−１、オリゴＡｒｇ）細胞透過性ペプチド等の細胞の透過度または取り込みを容易にする形質導入ドメインを包含し、例えば、「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」，Ｅｄ．Ｂｅｒｎｄ  Ｇｒｏｎｅｒ，２００９  ＷＩＬＥＹ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ，ＫＧａＡ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，ｅｓｐ．Ｃｈａｐ  ７：「Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，Ｍａｔｓ  Ｈａｎｓｅｎ，  Ｅｌｏ  Ｅｒｉｓｔｅ，ａｎｄ  Ｕｌｏ  Ｌａｎｇｅｌ，ｐｐ．１２５−１４４を参照されたい。
【００２２】
別のクラスは、ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号：０４）、ＮＧＲ（ＣＣＮＧＲＣ；配列番号：０５）、ＣＲＥＫＡ、ＬｙＰ−１（ＣＧＮＫＲＴＲＧＣ；配列番号：０６）、Ｆ３、ＳＭＳ（ＳＭＳＩＡＲＬ；配列番号：０７）、ＩＦ７およびＨ２００９．１（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１１  Ｓｅｐ  １５；１９（１８）：５４８０−９）等のホーミング生体分子、特にがん細胞ホーミングまたは標的化生体分子であり、ここで、好適な例は、当技術分野、例えば、例えばＨｏｍｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅｓ，Ｐｉｒｊｏ  Ｌａａｋｋｏｎｅｎ  ａｎｄ  Ｋｉｒｓｉ  Ｖｕｏｒｉｎｅｎ，Ｉｎｔｅｇｒ．Ｂｉｏｌ．，２０１０，２，３２６−３３７；Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  ＺＩＰ  Ｃｏｄｅｓ  ｂｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，Ｔｅｅｓａｌｕ  Ｔ，Ｓｕｇａｈａｒａ  ＫＮ，Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０１２；５０３：３５−５６において公知である。
【００２３】
そのような部分の他の有用なクラスは、ＰＥＧ、オリゴ−Ｎ−メトキシエチルグリシン（ＮＭＥＧ）、アルブミン、アルブミン結合タンパク質または免疫グロブリンＦｃドメイン等の安定剤；免疫タグ、ビオチン、レクチン、キレート剤等の親和性タグ；光学タグ（例えば、Ａｕ粒子、ナノドット）、キレートランタニド、蛍光染料（例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ローダミン）、ＦＲＥＴアクセプター／ドナー等の標識を包含する。
【００２４】
これらの部分、タグおよび官能基は、ポリグリシン、ε−アミノカプロン酸等、当技術分野で公知のリンカーまたはスペーサーを介して、ペプチドとカップリングすることができる。
【００２５】
化合物および／またはペプチドを、プロドラッグ等の潜在性または活性化可能形態として提示してもよく、ここで、活性ペプチドは代謝的に遊離しており、例えば、化合物）のアシルオキシアルコキシプロ部分（プロドラッグ１）または３−（２’−ヒドロキシ−４’，６’−ジメチルフェニル）−３，３−ジメチルプロピオン酸プロ部分（プロドラッグ２）を用いて調製された環状プロドラッグからの直鎖ペプチドの放出である。
【００２６】
特定の実施形態は、別個に説明されているかのように特定の実施形態のすべての組み合わせを包含し、例えば、ペプチドがＴ−ＮでＮ末端と隣接しており、ＴによってＣ末端と隣接している場合、第一の部分は、ジグリシンリンカーを介してペプチドと連結しているｔａｔタンパク質形質導入ドメインであり、ペプチドがＴ−ＮでＮ末端と隣接しており、ＴによってＣ末端と隣接している場合、第一の部分は、マレイミド−ＰＥＧ（３）リンカーを介してペプチドと連結している、Ｈ２００９．１として公知の四量体インテグリンα（ｖ）β（６）結合ペプチドである。
【００２７】
別の態様において、本発明は、オートファジーを誘導する方法であって、この誘導を必要とする人に、有効量の主題化合物または組成物を投与するステップを含む方法を提供する。応用は、オートファジーの強化を必要とする人を広く包括し、ならびに、細胞内病原体による感染症、神経変性疾患、がん、心筋症および老化を包含する、オートファジーの上方調節が治療的に有益である疾患および病理を包含する。
【００２８】
オートファジーは、生化学的に（Ａｔｇ８−ＰＥもしくはＬＣ３−ＩＩの生成またはｐ６２の分解を評価することによって）または顕微鏡的に（例えば、蛍光的にタグ付けしたＡｔｇ８またはＬＣ３の局在パターンを観察することによって）を包含する、本明細書で開示および／または例示されているもの等の慣例的なアッセイによって、直接的に、間接的にまたは推論的に検出することができる。
【００２９】
本明細書に記述されている実施例および実施形態は、例証のみを目的としたものであること、ならびに、種々の修正または該修正を踏まえた変更が当業者に示唆され、本出願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に包含されるであろうことが理解される。本明細書において引用されているすべての刊行物、特許および特許出願は、これらの中の引用を包含し、あらゆる目的のために、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【００３０】
［実施例］
本発明人らは、ベクリン１  ＥＣＤ構造を、合理的設計のためのおよびベクリン１ペプチドを治療薬として最適化するための基礎として使用した。
【００３１】
Ａｔｇ６／ベクリン１オルソログの配列アラインメントは、Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドのオートファジー誘導活性に必要とされる、該ペプチド内の２つの保存された芳香族残基（Ｆ２７０およびＦ２７４）を明らかにした［１］。ベクリン１  ＥＣＤ構造にマップされた場合、これらの芳香族側鎖は、Ｔ型形状で相互作用し、介在残基を表面が露出したループに位置づけるのに役立つ。本発明人らは、芳香族残基がＴａｔ−ベクリン１ペプチドにおいて類似の役割を果たし、故に、該ペプチドの構造的安定性に寄与すること、およびこの芳香族相互作用をより恒久的な化学結合で置きかえることが立体配座の安定性をさらに改善するはずであることを推論した［２］。例えば、２つの芳香族を、天然側鎖と同様の長さを呈するホモシステインで置きかえてよく、環化して、安定化した環および尾部ペプチド構造を形成することができる。ペプチドホルモンバソプレッシンの６アミノ酸環および３アミノ酸尾部構造［３］またはＲＮＡポリメラーゼ阻害ペプチドミクロシンの８アミノ酸環および１３アミノ酸尾部構造［４］等、同様の生物学的に活性な環状ペプチド構造が自然界において存在する。
【００３２】
オートファジー誘導活性に必要とされるベクリン１ペプチドの成分をさらに評価するために、一連のより短いペプチドを開発した。活性は、ｐ６２（オートファジーによって分解されたタンパク質）のウエスタンブロット検出およびＬＣ３−ＩからＬＣ３−ＩＩ（ＬＣ３の脂質化された（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）オートファゴソーム会合型）への変換のウエスタンブロット検出を包含する、生化学的オートファジーアッセイによって測定した。１０ミコモル濃度のＴａｔ−ＧＧ−ＶＦＮＡＴＦＥＩＷＨＤ（配列番号：０９）は、１０ミコモル濃度のＴａｔ−ベクリン１化合物と比較して増大したｐ６２分解および増大したＬＣ３−ＩＩ変換をもたらし、以下のＳｈｏｊｉ−Ｋａｗａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）を参照されたい。
【００３３】
Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドは、２つのＮ末端ベクリン１アミノ酸を失うことに耐えられるが、第三のＮ末端残基の除去とともに効能を失う。２つの必要とされる構造的残基（Ｆ２７０およびＦ２７４）は、活性を決定づけ得る表面ループを形成するベクリン１ペプチドのＮ末端半分を構成する。このＮ末端半分に対応するＴＡＴ融合を、単独でおよびＣ末端半分をトランス付加して試験した。これらのペプチドも該ペプチドの組み合わせも、オートファジーを誘導することができなかった。この活性の欠如は、Ｎ末端芳香族安定化ループに加えてＣ末端の何らかの成分の必要性を示唆している。ＥＣＤ構造において、Ｄの後のＣ末端残基（溶解度について変異したＳ２７９に対応する）は大部分が埋もれており、相互作用面に直接的に寄与する可能性は低い。したがって、ベクリン１ペプチドからのこれらの５つのＣ末端残基の欠落は、このようにして試験したオートファジーの最も強力な誘導因子を産出した。最小ペプチドの表面成分は、１）Ｎ末端Ｖ２）芳香族介在ＮＡＴおよび２）Ｃ末端ＷＨを包含する。これらの残基は、ＥＣＤを模倣しているペプチドにおいて結合表面に寄与すると推論され、ペプチドによるオートファジーの誘導に必要とされる。
【００３４】
本発明人らは、進化の過程で置換パターンに基づいて重要であることが予測されるアミノ酸の標的化突然変異誘発を使用した［ＰＭＩＤ  ８６０９６２８；１５０３７０８４］。このアプローチは、機能部位の活性を修飾する［ＰＭＩＤ  ２０３８５８３７］および機能を選択的にブロックする［ＰＭＩＤ  １６２８０３２３］点突然変異体を設計するために成功裏に適用されてきた。本発明人らは、同様に、各位置における一連の３または４つの異なる突然変異を使用して、標準的な遷移マトリックスに基づく保存的から非保存的までの両方の置換［ＰＭＩＤ  １４３８２９７］を、最小ペプチドにおける主要な結合残基を効率的に精密に記すために陰性対照ほど重要でないことが予測される残基への突然変異を使用して、調査する。効能を強化するためおよび活性決定因子を同定するために、本発明人らは、次第に保存的でなくなる置換、例えば、Ｖ２６９からＩ、Ｌ、Ｍ次いでＡ、またはＩ２７６からＶ、Ｌ、Ｆ等を介して、残基を次第に無秩序にすることができる。本発明人らは、各残基を１つずつ系統的に変化させるためのスキャニング突然変異誘発も使用する。
【００３５】
Ｆ２７０およびＦ２７４は、介在残基の配座柔軟性を制限するようにおよび結合のエントロピーコストを削減するように機能する。本発明人らは、標準的な固相ペプチド合成を介して、多数のより化学的に安定なリンカーを調製した。例えば、リジンによるＦ２７０のおよびアスパラギン酸またはグルタミン酸残基によるＦ２７４の置きかえは、徐々に大きくなる環サイズの大環状ラクタムペプチドの合成を可能にする。さらに一層化学的に安定な結合は、閉環メタセシス戦略を介して実現することができ、ここで、市販の非天然アミノ酸に由来する末端アルケンハンドルは、環化のための化学ハンドルを供与する。この後者の炭素−炭素ベースの環化様式は、多くの場合、ペプチド「ステープリング」と呼ばれ、広範に総説されている（ＰＭＩＤ  ２２２３０５６３）。骨格「ステープル」の利点は、炭素−炭素結合のタンパク質分解的切断に対する感受性の低減である。［３＋２］付加環化反応に由来する「クリック」バリアントを、ペプチド環化に使用してもよい（ＰＭＩＤ  ２３０６４２２３）。
【００３６】
これらの種々の環化戦略は、ベクリンペプチドの生物活性配座を強いて、環化されていないペプチドと比べて細胞透過性を増大させるために使用され得る。ペプチド配座は、細胞に浸透する巨大分子の能力に著しく影響を及ぼすことができる（ＰＭＩＤ：２３１３３７４０）。特に、骨格修飾は、細胞透過性に対して劇的な影響を有し得、環状ペプチドの経口投与の機会を潜在的に作成する（ＰＭＩＤ  ２２７３７９６９およびＰＭＩＤ  １２６４６０３７）。アミド加水分解をさらに限定する（ＰＭＩＤ  ２３３８２９６３）ために、レトロ−インベルソペプチド戦略と組み合わせてもよく、これらの組成物は、開示化合物をペプチド治療薬として使用することができる。
【表１】
2016516734.tif 000003
【００３７】
2016516734.tif 000004
【００３８】
＊ＨＩＶ  ＴＡＴ由来の１１アミノ酸ＰＴＤおよびジグリシンリンカーは収載されておらず、このことはすべてのペプチドについて同じである。突然変異体１７および該突然変異体の誘導体が最も活性であり、活性は、対応するＤ−レトロ−インベルソ配列（例えば、突然変異体３０）により保持される。活性を、上述した通り、オートファジー誘導活性として測定した。
【００３９】
参考文献
［１］Ｓ．Ｓｈｏｊｉ−Ｋａｗａｔａ，Ｒ．Ｓｕｍｐｔｅｒ，Ｍ．Ｌｅｖｅｎｏ，Ｇ．Ｒ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｚ．Ｚｏｕ，Ｌ．Ｋｉｎｃｈ，Ａ．Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｑ．Ｓｕｎ，Ｋ．Ｐａｌｌａｕｆ，Ｄ．ＭａｃＤｕｆｆ，Ｃ．Ｈｕｅｒｔａ，Ｈ．Ｗ．Ｖｉｒｇｉｎ，Ｊ．Ｂ．Ｈｅｌｍｓ，Ｒ．Ｅｅｒｌａｎｄ，Ｓ．Ａ．Ｔｏｏｚｅ，Ｒ．Ｘａｖｉｅｒ，Ｄ．Ｊ．Ｌｅｎｓｃｈｏｗ，Ａ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｄ．Ｋｉｎｇ，Ｏ．Ｌｉｃｈｔａｒｇｅ，Ｎ．Ｖ．Ｇｒｉｓｈｉｎ，Ｓ．Ａ．Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｄ．Ｖ．Ｋａｌｏｙａｎｏｖａ，Ｂ．Ｌｅｖｉｎｅ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｎａｔｕｒｅ，４９４  ２０１−２０６，２０１３．
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【配列表】
2016516734000001.app
【国際調査報告】
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2016516734.tif 000008
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