(57)【要約】本出願は、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の位置選択的および立体選択的調製法、ならびにその中間体の調製法に関する。デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）は、アビラテロンアセテート（去勢抵抗性前立腺癌の処置に使用される薬剤）を包含するがそれに限定されないステロイド系分子の合成における、重要な中間体である。本出願の方法は、デヒドロエピアンドロステロンの調製のための酵素的方法に関する。本出願の酵素還元法は、環境に優しく、費用効率的であり、工業的に実現可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化４０】
2016521544.tif 000042
の３β−ヒドロキシアンドロスタ−５−エン−１７−オンの調製法であって、ケトレダクターゼ酵素を使用して、式（ＩＩ）：
【化４１】
2016521544.tif 000043
のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの３−オキソ基を、位置選択的および立体選択的に還元することを含む調製法。
【請求項２】
式（Ｉ）の化合物がアビラテロンアセテートに変換される、請求項１に記載の調製法。
【請求項３】
式（Ｉ）の化合物がＤＨＥＡエナンテートに変換される、請求項１に記載の調製法。
【請求項４】
式（Ｉ）：
【化４２】
2016521544.tif 000044
の３β−ヒドロキシアンドロスタ−５−エン−１７−オンの調製法であって、配列番号１のケトレダクターゼ酵素を使用して、式（ＩＩ）：
【化４３】
2016521544.tif 000045
のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの３−オキソ基を還元することを含む調製法。
【請求項５】
式（ＩＩＩ）：
【化４４】
2016521544.tif 000046
の化合物の調製法であって、下記工程：
ａ）ケトレダクターゼ酵素を使用して、式（ＩＩ）：
【化４５】
2016521544.tif 000047
のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの３−オキソ基を、位置選択的および立体選択的に還元して、式（Ｉ）：
【化４６】
2016521544.tif 000048
の３β−ヒドロキシアンドロスタ−５−エン−１７−オンを得る工程；
ｂ）式（Ｉ）の化合物を、式（ＩＩＩ）の化合物に変換する工程；
を含む調製法。
【請求項６】
式（ＩＩ）：
【化４７】
2016521544.tif 000049
のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの調製法であって、下記工程：
ａ）カリウムｔｅｒｔ−ブトキシドおよびｔｅｒｔ−ブタノ−ルを使用して、式（ＩＶ）：
【化４８】
2016521544.tif 000050
のΔ４−アンドロステン−３，１７−ジオンを異性化して、式（ＩＩ）：
【化４９】
2016521544.tif 000051
のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンを生成する工程；
ｂ）式（ＩＩ）の化合物を、ハロゲン化炭化水素から再結晶する工程；
を含む調製法。
【請求項７】
式（ＩＩ）：
【化５０】
2016521544.tif 000052
のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの調製法であって、下記工程：
ａ）カリウムｔｅｒｔ−ブトキシドおよびｔｅｒｔ−ブタノ−ルを使用して、式（ＩＶ）：
【化５１】
2016521544.tif 000053
のΔ４−アンドロステン−３，１７−ジオンを異性化して、式（ＩＩ）：
【化５２】
2016521544.tif 000054
のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンを生成する工程；
ｂ）式（ＩＩ）の化合物を、抗酸化剤の存在下に分離する工程；
を含む調製法。
【請求項８】
式（ＩＩＩ）：
【化５３】
2016521544.tif 000055
の化合物の調製法であって、下記工程：
ａ）式（ＩＶ）：
【化５４】
2016521544.tif 000056
のΔ４−アンドロステン−３，１７−ジオンを異性化して、式（ＩＩ）：
【化５５】
2016521544.tif 000057
のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンを生成する工程；
ｂ）ケトレダクターゼ酵素を使用して、式（ＩＩ）のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの３−オキソ基を、位置選択的および立体選択的に還元して、式（Ｉ）：
【化５６】
2016521544.tif 000058
の３β−ヒドロキシアンドロスタ−５−エン−１７−オンを得る工程；
ｃ）式（Ｉ）の化合物を、式（ＩＩＩ）の化合物に変換する工程；
を含む調製法。
【請求項７】
ケトレダクターゼ酵素が配列番号１を有している、請求項６に記載の調製法。
【請求項８】
式（Ｉ）の化合物がアビラテロンアセテートに変換される、請求項６に記載の調製法。
【請求項９】
式（Ｉ）の化合物がＤＨＥＡエナンテートに変換される、請求項６に記載の調製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
序論
本出願は、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の位置選択的および立体選択的調製法、ならびにその中間体の調製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
アンドロステノロンまたはプラステロンまたは３β−ヒドロキシアンドロスタ−５−エン−１７−オンまたは５−アンドロステン−３β−オル−１７−オンとしても既知の、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）は、重要な内因性ステロイドホルモンであり、下記式（Ｉ）の構造を有する：
【化１】
2016521544.tif 000002
【０００３】
デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）は、アビラテロンアセテート（去勢抵抗性前立腺癌の処置に使用される薬剤）を包含するがそれに限定されないステロイド系分子の合成における、重要な中間体である。
【０００４】
Ｊ．Ｂｒｙａｎ  Ｊｏｎｅｓらによる論文「Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｓｔｅｒｏｉｄａｓｅｓ．ＶＩ．Ｏｎ  ｔｈｅ  Ｃ−１７  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Δ５−３−ｋｅｔｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｏｆ  Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ  ａｎｄ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｍｉｃｅｌｌｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ」、Ｃａｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４６，１４５９−１４６５（１９６８）は、ＤＨＥＡの調製に使用される中間体であるアンドロスタ−５−エン−３，１７−ジオンの調製法を記載している。該文献に開示されている方法は、下記を含む：アンドロスタ−４−エン−３，１７−ジオンとカリウムｔ−ブトキシドとを、ｔ−ブチルアルコール中で、窒素雰囲気下に、９０分間、２０℃で反応させ、次に、１０％の酢酸水溶液の迅速添加によって反応生成物をクエンチし、過剰の炭酸水素ナトリウムを添加し、エーテルで抽出し、室温で蒸発させ、アセトンから再結晶して、アンドロスタ−５−エン−３，１７−ジオンを得る。
【０００５】
しかし、前記方法は下記の点で不利である：多量の塩基、即ち１０当量のカリウムｔｅｒｔ−ブトキシドの使用を含み、アンドロスタ−５−エン−３，１７−ジオンの酸化不純物の形成を生じ、工業規模において適していないと考えうるワークアップ手順を有し、従って、低く不満足な収量を生じる。
【０００６】
従って、先行技術の欠点を都合よく除去および減少させるアンドロスタ−５−エン−３，１７−ジオンの向上した調製法を提供することが必要とされている。
【０００７】
中国特許出願公開第１０２２１２０９９号は、１６−デヒドロプレグネノロンアセテートから開始するデヒドロエピアンドロステロンの調製のための多段階法を開示し、該方法は、下記反応式１に示されている反応段階を含む：
【化２】
2016521544.tif 000003
【０００８】
中国特許出願公開第１０２６０３８４１号は、４−アンドロステン−３，１７−ジオンからのデヒドロエピアンドロステロンの調製のための多段階法を開示し、該方法は、下記反応式２に示されている反応段階を含む：
【化３】
2016521544.tif 000004
【０００９】
中国特許出願公開第１０２６０３８３９号は、１６−デヒドロプレグネノロンアセテートから開始するデヒドロエピアンドロステロンの調製のための多段階合成法を記載し、該方法は、下記工程を含む：（ｉ）１６−デヒドロプレグネノロンアセテートオキシムを調製する工程、（ｉｉ）１６−デヒドロプレグネノロンアセテートオキシムをベックマン転移に付して、デヒドロエピアンドロステロンアセテートを得る工程、（ｉｉｉ）デヒドロエピアンドロステロンアセテートを加水分解して、デヒドロエピアンドロステロンを得る工程。該方法の反応段階は、下記反応式３に示されている：
【化４】
2016521544.tif 000005
【００１０】
中国特許出願公開第ＣＮ１０１３６２７８９号および第１０１７１７４２２号、韓国特許出願公開第２００４０４０５５５号も、デヒドロエピアンドロステロンの調製のための合成法を開示している。
【００１１】
デヒドロエピアンドロステロンの調製のための前記合成法は、多段階、およびＣ３位での立体選択的および位置選択的還元を行うための一連の保護／脱保護段階を含み、工業規模の合成に適していないと考えられる。
【００１２】
Ｍａｍｏｌｉらは、ＵＳ２１８６９０６において、シクロペンタノ−１０，１３−ジメチル−ポリヒドロ−フェナントレン系（Δ４，５−アンドロステンジオン）のケト化合物を同系の対応するヒドロキシル化合物（Δ４，５−アンドロステノール−１７−オン−３）に変換するための生化学的水素化法を記載し、該方法は、そのようなケト化合物を還元性酵母含有発酵液の作用に付すことを含む。
【００１３】
Ｍｉｓａｋｉらは、ＵＳ４７９１０５７において、分析される試料における成分（これは３β−ヒドロキシステロイドまたは３−ケトステロイドである）に関する高感度定量アッセイ法を記載し、該方法は下記工程を含む：該試料中のこの成分を、３β−ヒドロキシステロイド＆３−ケトステロイド・サイクリング反応に参加させる工程、および３β−ヒドロキシステロイドオキシダーゼおよびまたは３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを含む反応系における検出可能な変化を測定する工程。該サイクリング反応において、３β−ヒドロキシステロイドオキシダーゼはＯ２を消費し、３−ヒドロキシステロイドを３−ケトステロイドに変換し、還元ＮＡＤ（Ｐ）＋の存在下の３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼは、３−ケトステロイドを３−ヒドロキシステロイドに変換し、ＮＡＤ（Ｐ）を生じる。前記特許に記載されている３β−ヒドロキシステロイド＆３−ケトステロイド・サイクリング反応は、下記反応式４に概略的に示されている：
【化５】
2016521544.tif 000006
【００１４】
前記文献は、３−ヒドロキシステロイドの３−ケトステロイドへの酵素変換、またはその逆の酵素変換を開示しているが、それらはデヒドロエピアンドロステロンの調製法を開示しておらず、ステロイドの１７−オキソ基はそのままにして３−オキソ基を還元することによって必要とされる位置選択性を示し、かつ対応する３β−ヒドロキシ化合物を生成することによって立体選択性を示す向上した方法を開発することにおいて、困難な課題が残されている。
【００１５】
本出願の方法は、デヒドロエピアンドロステロンの調製のための酵素的方法に関する。本出願の酵素還元法は、環境に優しく、費用効率的であり、工業的に実現可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】中国特許出願公開第１０２２１２０９９号明細書
【特許文献２】中国特許出願公開第１０２６０３８４１号明細書
【特許文献３】中国特許出願公開第１０２６０３８３９号明細書
【特許文献４】中国特許出願公開第１０１３６２７８９号明細書
【特許文献５】中国特許出願公開第１０１７１７４２２号明細書
【特許文献６】韓国特許出願公開第２００４０４０５５５号明細書
【特許文献７】米国特許第２１８６９０６号明細書
【特許文献８】米国特許第４７９１０５７号明細書
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｒｙａｎ  Ｊｏｎｅｓら、「Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｓｔｅｒｏｉｄａｓｅｓ．ＶＩ．Ｏｎ  ｔｈｅ  Ｃ−１７  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Δ５−３−ｋｅｔｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｏｆ  Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ  ａｎｄ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｍｉｃｅｌｌｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ」、Ｃａｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４６，１４５９−１４６５（１９６８）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
発明の概要
ある実施態様において、本出願は、式（Ｉ）：
【化６】
2016521544.tif 000007
の３β−ヒドロキシアンドロスタ−５−エン−１７−オンの調製法を提供し、該方法は、ケトレダクターゼ酵素を使用して、式（ＩＩ）：
【化７】
2016521544.tif 000008
のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの３−オキソ基を、位置選択的および立体選択的に還元することを含む。
【００１９】
他の実施態様において、本出願は、式（Ｉ）：
【化８】
2016521544.tif 000009
の３β−ヒドロキシアンドロスタ−５−エン−１７−オンの調製法を提供し、該方法は、配列番号１のケトレダクターゼ酵素を使用して、式（ＩＩ）：
【化９】
2016521544.tif 000010
のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの３−オキソ基を還元することを含む。
【００２０】
ある実施態様において、本出願は、式（ＩＩ）：
【化１０】
2016521544.tif 000011
のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの調製法を提供し、該方法は下記工程を含む：
ａ）カリウムｔｅｒｔ−ブトキシドおよびｔｅｒｔ−ブタノ−ルを使用して、式（ＩＶ）：
【化１１】
2016521544.tif 000012
のΔ４−アンドロステン−３，１７−ジオンを異性化して、式（ＩＩ）：
【化１２】
2016521544.tif 000013
のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンを生成する工程；
ｂ）式（ＩＩ）の化合物を、ハロゲン化炭化水素から再結晶する工程。
【００２１】
他の実施態様において、本出願は、式（ＩＩ）：
【化１３】
2016521544.tif 000014
のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの調製法を提供し、該方法は下記工程を含む：
ａ）カリウムｔｅｒｔ−ブトキシドおよびｔｅｒｔ−ブタノ−ルを使用して、式（ＩＶ）：
【化１４】
2016521544.tif 000015
のΔ４−アンドロステン−３，１７−ジオンを異性化して、式（ＩＩ）：
【化１５】
2016521544.tif 000016
のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンを生成する工程；
ｂ）該式（ＩＩ）の化合物を、抗酸化剤の存在下に分離する工程。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
詳細な説明
ある実施態様において、本出願は、
式（Ｉ）：
【化１６】
2016521544.tif 000017
の３β−ヒドロキシアンドロスタ−５−エン−１７−オンの調製法を提供し、該方法は、ケトレダクターゼ酵素を使用して、式（ＩＩ）：
【化１７】
2016521544.tif 000018
のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの３−オキソ基を、位置選択的および立体選択的に還元することを含む。
【００２３】
式（ＩＩ）の化合物は、当分野で既知の方法によって、または本出願に開示されている方法によって、得ることができる。
【００２４】
式（ＩＩ）の化合物の位置選択的および立体選択的還元は、ケトレダクターゼ酵素の存在下に行われ、反応系は、補因子、補因子再生系、基質およびデヒドロゲナーゼ酵素、緩衝液および有機溶媒をさらに含有する。
【００２５】
本明細書に使用される場合、「立体選択的または立体選択性」は、化学反応または酵素反応における、他の立体異性体に対する１つの立体異性体の優先的形成を指す。立体選択性は、１つの立体異性体の形成が他の立体異性体の形成より優先される場合に、部分的であることができ、ただ１つの立体異性体が形成される場合に完全でありうる。立体異性体がエナンチオマである場合、立体選択性は、エナンチオ選択性、両エナンチオマの合計における１つのエナンチオマのフラクション（一般にパーセンテージで示される）を意味する。それは当分野において一般に、式［メジャーエナンチオマ−マイナーエナンチオマ］／［メジャーエナンチオマ＋マイナーエナンチオマ］から計算されるエナンチオマ過剰（一般にパーセンテージで示される）として示される。立体異性体がジアステレオマである場合、立体選択性は、ジアステレオ選択性、他のジアステレオマとの合計における１つのジアステレオマのフラクション（一般にパーセンテージで示される）を意味する。本開示の文脈において、立体選択性は、式（Ｉ）の３α−ヒドロキシ化合物に対する式（Ｉ）の３β−ヒドロキシ化合物のフラクション（一般にパーセンテージで示される）を意味する。
【００２６】
本明細書に使用される場合、「位置選択的または位置選択性」は、化学結合の形成または切断の１つの方向の、全ての他の可能な方向に対する優先性、または１つの生成物の形成の、他の生成物の形成に対する優先性を意味する。本開示の文脈において、位置選択性は、式（ＩＩ）の化合物の、１７−オキソ基、または３−オキソ基および１７−オキソ基の両方に対する、３−オキソ基の優先的還元を意味する。ある実施形態において、本開示の文脈における位置選択性は、式（ＩＩ）の化合物の投入重量に応じて、９０ｗｔ％より高い、好ましくは９５ｗｔ％より高い、より好ましくは９７ｗｔ％より高い、より好ましくは９９ｗｔ％より高い程度の、式（ＩＩ）の化合物の３−オキソ基の優先的還元を意味する。
【００２７】
「ケトレダクターゼ酵素」は、ケトンまたはアルデヒドの還元を触媒して対応するアルコールを形成する酵素を意味する。その反応は、補因子（ＮＡＤ（Ｐ）＋またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）の存在下に、必要に応じて、補因子再循環系を使用して行うことができる。ケトレダクターゼ酵素は、例えば、ＥＣ番号１．１．１に分類される酵素を包含する。そのような酵素は、ケトレダクターゼの他に、下記を包含するがそれらに限定されない様々な名称を与えられている：アルコールデヒドロゲナーゼ、カルボニルレダクターゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼ、ヒドロキシイソカプロエートデヒドロゲナーゼ、β−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、ステロイドデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、ヒドロキシステロイドオキシダーゼ、ケトステロイドレダクターゼ、アルドケトレダクターゼ（ＡＫＲ）およびアルドレダクターゼ。ＮＡＤＰＨ依存性ケトレダクターゼは、ＥＣ番号１．１．１．２、およびＣＡＳ番号９０２８−１２−０に分類される。ＮＡＤＨ依存性ケトレダクターゼは、ＥＣ番号１．１．１．１、およびＣＡＳ番号９０３１−７２−５に分類される。
【００２８】
ケトレダクターゼ酵素は、野生型酵素または組換え酵素であることができ、全細胞として、または分離形態／半精製形態で、使用することができる。好ましくは、ケトレダクターゼは分離されている。ケトレダクターゼは、任意の宿主、例えば、哺乳動物、糸状真菌、酵母および細菌から分離することができる。
【００２９】
他の実施形態において、ケトレダクターゼ酵素は、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｗｉｔｔｉｃｈｉｉ（株ＲＷ１／ＤＳＭ  ６０１４／ＪＣＭ  １０２７３）Ａ５ＶＢＧ８）から得られる酵素を包含する。
【００３０】
他の実施形態において、前記の立体選択的還元に使用されるケトレダクターゼ酵素は、配列番号１に対応するアミノ酸配列を有する酵素を包含するが、それに限定されない。本明細書に使用される場合、配列番号１の酵素は、配列番号１に対応するか、または配列番号１に少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性である。
【００３１】
ケトレダクターゼ酵素は、配列番号１の酵素、またはその等価製品であることができる。本明細書において使用される場合、「等価」という用語は、類似〜同一の酵素活性を有する酵素または製品を意味する。
【００３２】
ある実施形態において、ケトレダクターゼ酵素は、補因子依存性ケトレダクターゼを包含する。
【００３３】
本出願の方法によれば、補因子は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、それらの塩、およびそれらの混合物から成る群から選択しうる。好ましくは、ケトレダクターゼがＮＡＤＨ依存性である場合、補因子は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ＋、それらの塩、およびそれらの混合物から成る群から選択される。より好ましくは、補因子はＮＡＤＨまたはその塩である。好ましくは、ケトレダクターゼがＮＡＤＰＨ依存性である場合、補因子は、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＰ＋、それらの塩、およびそれらの混合物から成る群から選択される。より好ましくは、補因子はＮＡＤＰＨまたはその塩である。補因子の塩の例は、ＮＡＤテトラ（シクロへキシルアンモニウム）塩、ＮＡＤテトラナトリウム塩、ＮＡＤ＋テトラナトリウムハイドレート、ＮＡＤＰ＋ホスフェートハイドレート、ＮＡＤＰ＋ホスフェートナトリウム塩、およびＮＡＤＨジカリウム塩を包含する。
【００３４】
本出願の方法によれば、補因子再生系は、反応に参加する一組の反応物質を含有し、補因子の酸化形を還元する（例えば、ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨへ）。式（ＩＩ）の化合物のケトレダクターゼ触媒還元によって酸化された補因子は、補因子再生系によって還元形で再生される。例えば、補因子再生系は、還元性水素等価物の源であり、補因子の酸化形を還元することができる基質、および触媒、例えば、還元剤による補因子の酸化形の還元を触媒する酵素触媒を含有する。
【００３５】
好ましくは、補因子再生系は、Ｄ−グルコース／グルコースデヒドロゲナーゼ、蟻酸ナトリウム／蟻酸デヒドロゲナーゼ、ラクテート／ラクテートデヒドロゲナーゼ、およびホスファイト／ホスファイトデヒドロゲナーゼから成る群から選択される基質／デヒドロゲナーゼ酵素ペアを含有する。
【００３６】
ある実施形態において、Ｄ−グルコース／グルコースデヒドロゲナーゼ・ペアが使用される。グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）は、例えば、ＥＣ番号１．１．１．４７に分類されるものを包含し、例えば、Ｃｏｄｅｘｉｓ，Ｉｎｃ．からカタログ番号ＧＤＨ−ＣＤＸ−９０１で市販されている。
【００３７】
例えば、グルコース／グルコースデヒドロゲナーゼ補因子再生系が使用される場合、グルコン酸（ｐＫａ＝３．６）の同時生成は、生じるグルコン酸水溶液が中和されなければ、反応混合物のｐＨを低下させる。反応混合物のｐＨは、標準緩衝法（該方法において、緩衝液が、付与される緩衝能までグルコン酸を中和する）によって、または変換の進行と同時に塩基を付加することによって、所望のレベルに維持しうる。
【００３８】
還元反応は、約４〜約９、より好ましくは約４〜約８、より好ましくは約５〜約８、最も好ましくは約６〜約８、または約５〜約７のｐＨを有する緩衝液の存在下に行うことができる。好ましくは、緩衝液は塩の溶液である。好ましくは、塩は、リン酸カリウムまたはＴＲＩＳ塩、硫酸マグネシウム、およびそれらの混合物から成る群から選択される。必要に応じて、緩衝液はチオール化合物を含有する。
【００３９】
還元反応は、約１０℃〜約５０℃の温度で行うことができる。好ましくは、該工程は、周囲温度、約２０℃〜約４０℃、または約２５℃〜約３５℃の温度で行われる。
【００４０】
還元反応は、水溶性または不水溶性有機溶媒の存在下に行うことができ、該有機溶媒は、アルコール、例えばｔ−ブタノール、エステル、例えば、酢酸エチル、酢酸イソプロピル等、エーテル、例えば、テトラヒドロフラン、メチルテトラヒドロフラン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル等、芳香族炭化水素、例えばトルエン、および極性非プロトン性溶媒、例えば、ジメチルルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等から選択しうる。
【００４１】
ある実施形態において、不水溶性有機溶媒が使用される。好ましい実施形態において、水に対して２〜９８ｖ／ｖ％、より好ましくは２５〜７５ｖ／ｖ％の比率の不水溶性有機溶媒が使用される。
【００４２】
ある実施形態において、式（ＩＩ）のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの３−オキソ基の還元が、０．１〜５００ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも５０〜３００ｇ／Ｌの範囲の基質（式ＩＩ）濃度で行われる。
【００４３】
他の実施形態において、式（ＩＩ）のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの３−オキソ基の還元が、配列番号１のケトレダクターゼ酵素の存在下に行われる。
【００４４】
ある実施形態において、式（ＩＩ）のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの３−オキソ基の還元が、基質、即ち式（ＩＩ）に対して０．１〜２０ｗｔ％の範囲、好ましくは基質に対して１０ｗｔ％未満の酵素負荷で行われる。
【００４５】
他の実施形態において、式（ＩＩ）のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの３−オキソ基の還元が、ｐＨ６．５およびイオン強度５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液の存在下に行われる。
【００４６】
さらに他の実施形態において、式（ＩＩ）のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの３−オキソ基の還元が、補因子ＮＡＤ＋、ＮＡＤ（Ｐ）＋、グルコースおよびグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ−ＣＤＸ−９０１）を含有する補因子再生系の存在下に行われる。
【００４７】
ある実施形態において、式（ＩＩ）のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの３−オキソ基の還元が、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、テトラヒドロフラン、メチルテトラヒドロフラン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、トルエン、ジメチルホルムアミドまたはジメチルスルホキシドから選択される有機溶媒の存在下に行われる。
【００４８】
ある実施形態において、式（ＩＩ）のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの３−オキソ基の還元が、約２５℃〜約３５℃の温度で行われる。
【００４９】
好ましい実施形態において、式（ＩＩ）のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの３−オキソ基の還元が、配列番号１の酵素であるケトレダクターゼ酵素、ｐＨ６．５およびイオン強度５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、補因子ＮＡＤ＋、ＮＡＤ（Ｐ）＋、グルコースおよびグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ−ＣＤＸ−９０１）を含有する補因子再生系の存在下に行われる。
【００５０】
本出願の発明者らは、驚いたことに、本明細書に記載されている方法が、式（ＩＩ）のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの１７−オキソ基に対して３−オキソ基を選択的に還元する点で極めて位置特異的であり、かつ、式（ＩＩ）のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの３−オキソ基を選択的に還元して、対応する３β−ヒドロキシ化合物を与える点で立体特異的であることを見出した。
【００５１】
さらに、本出願の方法は、選択的であり、環境に優しく、定量的であり、保護／脱保護段階の使用を回避し、毒性酸化剤の使用も回避し、緩やかな条件（温度、ｐＨ）下に、高基質濃度で行われ、ＤＨＥＡおよびその誘導体への効率的かつ直接的な経路である点で有利である。
【００５２】
さらに、本出願の方法は、８０％〜９９％の範囲の収率を与え、かつ９５％より高い、好ましくは９９％より高い、より好ましくは９９．５％より高い立体選択性の程度を有する点で有利である。
【００５３】
他の実施態様において、本出願は、式（Ｉ）：
【化１８】
2016521544.tif 000019
の３β−ヒドロキシアンドロスタ−５−エン−１７−オンの調製法を提供し、該方法は、配列番号１のケトレダクターゼ酵素を使用して、式（ＩＩ）：
【化１９】
2016521544.tif 000020
のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの３−オキソ基を還元することを含む。
【００５４】
配列番号１のケトレダクターゼ酵素を使用して、式（ＩＩ）のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの３−オキソ基を還元する方法は、前記の手順に従って、または実施例に記載されている方法に従って、行うことができる。
【００５５】
ある実施形態において、本出願は、前記の方法によって得られる式（Ｉ）の化合物を、式（ＩＩＩ）：
【化２０】
2016521544.tif 000021
の化合物に変換する工程を含む方法を提供する。
【００５６】
他の実施形態において、本出願は、式（ＩＩＩ）：
【化２１】
2016521544.tif 000022
の化合物の調製法を提供し、該方法は、下記工程を含む：
ａ）ケトレダクターゼ酵素を使用して、式（ＩＩ）：
【化２２】
2016521544.tif 000023
のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの３−オキソ基を、位置選択的および立体選択的に還元して、式（Ｉ）：
【化２３】
2016521544.tif 000024
の３β−ヒドロキシアンドロスタ−５−エン−１７−オンを得る工程；
ｂ）式（Ｉ）の化合物を、式（ＩＩＩ）の化合物に変換する工程。
【００５７】
式（Ｉ）の化合物は、当分野で既知の方法によって、または本出願に開示されている方法によって、式（ＩＩＩ）の化合物に変換しうる。
【００５８】
ある実施態様において、本出願は、式（ＩＩ）：
【化２４】
2016521544.tif 000025
のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの調製法を提供し、該方法は下記工程を含む：
ａ）カリウムｔｅｒｔ−ブトキシドおよびｔｅｒｔ−ブタノ−ルを使用して、式（ＩＶ）：
【化２５】
2016521544.tif 000026
のΔ４−アンドロステン−３，１７−ジオンを異性化して、式（ＩＩ）：
【化２６】
2016521544.tif 000027
のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンを生成する工程；
ｂ）式（ＩＩ）の化合物を、ハロゲン化炭化水素から再結晶する工程。
【００５９】
工程ａ）の反応は、約１０℃〜約５０℃の温度で行うことができる。好ましくは、約２０℃〜約４０℃、または約２５℃〜約３５℃の温度である。
【００６０】
ある実施形態において、前記反応の終了後、酢酸を使用して、好ましくは１０％酢酸を使用して、式（ＩＩ）のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンを含有する反応混合物をクエンチし、無機塩基を使用して、好ましくは炭酸水素ナトリウムを使用して、該反応混合物のｐＨを約６．０〜約７．５に調整し、水を添加することによって式（ＩＩ）の化合物を分離する。
【００６１】
本出願の発明者らは、驚いたことに、ハロゲン化炭化水素溶媒からの式（ＩＩ）の化合物の再結晶が、より高い収率および純度の式（ＩＩ）の化合物を生じることを見出した。
【００６２】
工程ｂ）に使用しうるハロゲン化炭化水素は、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエテン、四塩化炭素、クロロホルム、１，１，１−トリクロロエタン、またはそれらの混合物から選択しうる。
【００６３】
他の実施態様において、本出願は、式（ＩＩ）：
【化２７】
2016521544.tif 000028
のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの調製法を提供し、該方法は下記工程を含む：
ａ）カリウムｔｅｒｔ−ブトキシドおよびｔｅｒｔ−ブタノ−ルを使用して、式（ＩＶ）：
【化２８】
2016521544.tif 000029
のΔ４−アンドロステン−３，１７−ジオンを異性化して、式（ＩＩ）：
【化２９】
2016521544.tif 000030
のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンを生成する工程；
ｂ）式（ＩＩ）の化合物を、抗酸化剤の存在下に分離する工程。
【００６４】
工程ａ）の反応は、約１０℃〜約５０℃の温度で行うことができる。好ましくは、約２０℃〜約４０℃、または約２５℃〜約３５℃の温度である。
【００６５】
本出願の発明者らは、驚いたことに、抗酸化剤の存在下の式（ＩＩ）の化合物の分離が、より高い収率および純度ならびに減少したまたは検出不能な量の反応中に形成される酸化不純物を有する式（ＩＩ）の化合物を生じ、それによって付加的精製が回避されることを見出した。
【００６６】
工程ｂ）に使用される抗酸化剤は、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カルシウム、アスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシルアニソール（ｈｙｄｒｏｘｙｌａｎｉｓｏｌｅ）、ブチル化ヒドロキシトルエン、２，４，５−トリヒドロキシブチロフェノン、４−ヒドロキシメチル−２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、エリトルビン酸、没食子酸プロピル、チオジプロピオン酸、ジラウリルチオジプロピオネート、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン、トコフェロールまたはそれらの混合物から成る群から選択しうる。ある実施形態において、アスコルビン酸ナトリウムが使用される。
【００６７】
使用される抗酸化剤の量は、触媒量、例えば、１モル当量の式（ＩＶ）につき約０．１〜約０．５当量の範囲であってよい。
【００６８】
ある実施形態において、工程ａ）で得られる式（ＩＩ）の化合物を含有する反応混合物を、酢酸、水および選択された抗酸化剤を含有する抗酸化剤混合物に添加しうる。
【００６９】
ある実施形態において、本出願は、式（ＩＩＩ）：
【化３０】
2016521544.tif 000031
の化合物の調製法を提供し、該方法は、下記工程を含む：
ａ）式（ＩＶ）：
【化３１】
2016521544.tif 000032
のΔ４−アンドロステン−３，１７−ジオンを異性化して、式（ＩＩ）：
【化３２】
2016521544.tif 000033
のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンを生成する工程；
ｂ）ケトレダクターゼ酵素を使用して、式（ＩＩ）のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの３−オキソ基を、位置選択的および立体選択的に還元して、式（Ｉ）：
【化３３】
2016521544.tif 000034
の３β−ヒドロキシアンドロスタ−５−エン−１７−オンを得る工程；
ｃ）式（Ｉ）の化合物を、式（ＩＩＩ）の化合物に変換する工程。
【００７０】
他の実施形態において、本出願は、式（ＩＩＩ）：
【化３４】
2016521544.tif 000035
の化合物の調製法を提供し、該方法は、下記工程を含む：
ａ）式（ＩＶ）：
【化３５】
2016521544.tif 000036
のΔ４−アンドロステン−３，１７−ジオンを異性化して、式（ＩＩ）：
【化３６】
2016521544.tif 000037
のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンを生成する工程；
ｂ）配列番号１のケトレダクターゼ酵素を使用して、式（ＩＩ）のΔ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの３−オキソ基を、位置選択的および立体選択的に還元して、式（Ｉ）：
【化３７】
2016521544.tif 000038
の３β−ヒドロキシアンドロスタ−５−エン−１７−オンを得る工程；
ｃ）式（Ｉ）の化合物を、式（ＩＩＩ）の化合物に変換する工程。
【００７１】
アセチル化は、当分野で既知の方法で行うことができる。使用しうるアセチル化剤は、塩化アセチル、無水酢酸、オルト蟻酸メチル、または同等のアセチル化剤を包含するが、それらに限定されない。使用しうる溶媒は、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、トルエン、クロロホルム、四塩化炭素、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、またはそれらの組み合わせを包含するがそれらに限定されない。使用しうる塩基は、下記を包含するがそれらに限定されない：ジイソプロピルアミン、ジメチルアミン、エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルメチルアミン、４−ジメチルアミノピリジン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、アニリン、ピリジン、ピペリジン等：および、無機塩基、例えば、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の炭酸塩、炭酸水素塩、水酸化物および酸化物、例えば、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、水酸化カリウム、酢酸カリウム、カリウムメトキシド、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、ナトリウムメトキシド、炭酸リチウム、炭酸水素リチウム、水酸化リチウム、酢酸リチウム、リチウムメトキシド、水酸化バリウム、酸化カルシウム等。
【００７２】
ある実施形態において、前記で得られたデヒドロエピアンドロステロンを、当分野で既知の方法によって、アビラテロンアセテートおよびＤＨＥＡエナンテートにさらに変換しうる。
【００７３】
本発明のある特定の実施態様および実施形態を以下の実施例に関連してさらに詳しく説明するが、該実施例は、例示目的のためだけに提示され、本発明の範囲を決して限定するものではないと理解すべきである。
【実施例】
【００７４】
実施例１：  ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの調製
ｔｅｒｔ−ブタノール（７５ｍＬ）を丸底フラスコに、２５〜３０℃で、窒素雰囲気下に装填し、窒素ガスバブリング下に１０分間撹拌する。カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（９．７９ｇ）を装填し、窒素雰囲気下に３０〜３５℃で１０〜１５分間撹拌する。４−アンドロステン−３，１７−ジオン（１０．０ｇ）をその丸底フラスコに３０〜３５℃で装填し、同温度で約９０分間維持する。酢酸（５．７５ｇ）、水（２００ｍＬ）およびアスコルビン酸ナトリウム（３．５ｇ）を第二丸底フラスコに装填し、２０〜２５℃で撹拌する。前記で得られた反応混合物を、第二丸底フラスコに添加し、２０〜２５℃で約３０分間撹拌する。得られた生成物を濾過し、水（１００ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥する。
収率：９０．５％
ＨＰＬＣによる純度：９３．６％
【００７５】
実施例２：  ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの調製
ｔｅｒｔ−ブタノール（２０００ｍＬ）を丸底フラスコに、窒素ガス雰囲気下に２５〜３０℃で装填し、窒素ガスバブリング下に１０分間撹拌する。カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（３１３．４ｇ）を装填し、窒素ガスバブリング下に３５〜４０℃で１０〜１５分間撹拌する。４−アンドロステン−３，１７−ジオン（８０．０ｇ）を、その丸底フラスコに３５〜４０℃で装填し、反応混合物を窒素ガスバブリング下に同温度で約９０分間撹拌する。反応混合物を１０％の酢酸水溶液（３１３０ｍＬ）と２０〜２５℃で合わし、反応混合物のｐＨを炭酸水素ナトリウム（２００ｇ）で６．５〜７．０に調整する。水（２５００ｍＬ）を前記反応混合物に添加し、約３０分間撹拌する。得られた固形物を濾過し、水（１０００ｍＬ）で洗浄し、吸引乾燥する。得られた生成物を、ジクロロメタン（５００ｍＬ）に溶解し、水性層を分離し、有機層を真空下に充分に蒸留して、５−アンドロステン−３，１７−ジオンを得る。
収率：８１．８％
ＨＰＬＣによる純度：９２．３０％
【００７６】
実施例３：  ５−アンドロステン−３，１７−ジオンの調製
ｔｅｒｔ−ブタノール（１５００ｍＬ）を丸底フラスコに、窒素ガス雰囲気下に２５〜３０℃で装填し、窒素ガスバブリング下に１０分間撹拌する。カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（２３５ｇ）を装填し、窒素ガスバブリング下に３５〜４０℃で１０〜１５分間撹拌する。４−アンドロステン−３，１７−ジオン（６０．０ｇ）を、その丸底フラスコに３５〜４０℃で窒素雰囲気下に装填し、反応混合物を窒素ガスバブリング下に同温度で約９０分間撹拌する。反応混合物を１０％の酢酸水溶液（２５００ｍＬ）に２０〜２５℃で添加し、１０〜１５分間撹拌した。水（１０００ｍＬ）を前記反応混合物に添加し、約３０分間撹拌する。反応混合物のｐＨを炭酸水素ナトリウム（１３５ｇ）で７．０〜７．５に調整する。反応混合物を３０〜４０分間撹拌する。得られた固形物を濾過し、水（５００ｍＬ）で洗浄し、吸引乾燥する。得られた生成物をジクロロメタン（１０００ｍＬ）に溶解し、無水硫酸ナトリウム（５０ｇ）で処理する。内容物を濾過し、減圧下に４０  ０Ｃ未満で充分に蒸留して、５−アンドロステン−３，１７−ジオンを得た。
収率：８３％
【００７７】
実施例４：  デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の調製
オーバーヘッド撹拌器を備えた５０ｍＬの反応器において、メチルテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中の５−アンドロステン−３，１７−ジオン（１．８０ｇ）を、ＮＡＤ＋（０．１ｍｇ／ｍＬ）、ＮＡＤＰ＋（０．１ｍｇ／ｍＬ）、ＭｇＣｌ２ヘキサハイドレート（２ｍＭ、０．４ｍｇ／ｍＬ）、グルコース（１００ｍＭ、１８．７５ｍｇ／ｍＬ）、グルコースデヒドロゲナーゼＧＤＨ  ＣＤＸ−９０１（０．１ｍｇ／ｍＬ）および配列番号１の酵素（５４ｍｇ、３ｗｔ／ｗｔ％）を含有するリン酸カリウム緩衝液（１０ｍＬ、イオン強度５０ｍＭ、ｐＨ６．５）の混合物に添加する。反応生成物を約３０〜３５℃において１０００ｒｐｍで撹拌する。反応生成物のｐＨを炭酸水素ナトリウムで約６．５に維持し、約３０〜３５℃において１０００ｒｐｍで約４時間〜約２４時間維持する。有機層を分離する。水性層を酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、蒸発乾固して、定量ＮＭＲにより純度９４．５％の粗デヒドロエピアンドロステロン（１．８６ｇ）を得、それをさらに精製せずに次の段階に使用した。
【化３８】
2016521544.tif 000039
【００７８】
実施例５：  デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の調製
オーバーヘッド撹拌器を備えた１００ｍＬの反応器において、メチルテトラヒドロフラン（３６ｍＬ）中の５−アンドロステン−３，１７−ジオン（３．５９ｇ）を、ＮＡＤ＋（０．０４４ｍｇ／ｍＬ）、ＮＡＤＰ＋（０．０４４ｍｇ／ｍＬ）、ＭｇＣｌ２ヘキサハイドレート（５ｍＭ、１．６７ｍｇ／ｍＬ）、グルコース（１００ｍＭ、１８．４４ｍｇ／ｍＬ）、グルコースデヒドロゲナーゼＧＤＨ  ＣＤＸ−９０１（０．２６ｍｇ／ｍＬ）および配列番号１（１００ｍｇ、２．８ｗｔ／ｗｔ％）を含有するリン酸カリウム緩衝液（１８ｍＬ、イオン強度５０ｍＭ、ｐＨ６．５）の混合物に添加する。反応生成物を約２０〜３２℃において１０００ｒｐｍで撹拌する。反応生成物のｐＨを炭酸水素ナトリウムで約６．５に維持し、約２０〜３２℃において１０００ｒｐｍで約４時間〜約２４時間維持する。メチルテトラヒドロフラン層を真空蒸発し、沈殿生成物を濾過によって分離し、５０ｍＬの水で２回洗浄し、次に、真空乾燥して、定量ＮＭＲにより７９％のポテンシ（ｐｏｔｅｎｃｙ）の粗生成物（３．４７ｇ）を得る。０．５０ｇの得られた粗生成物を、酢酸エチル／へプタンから再結晶して、デヒドロエピアンドロステロンを得る。
収量：０．３５ｇ
純度：＞９８％
【００７９】
実施例６：  デヒドロエピアンドロステロンアセテート（ＤＨＥＡアセテート）の調製
デヒドロエピアンドロステロン（１０ｇ、３５ｍｍｏｌ）およびピリジン（２５ｍＬ）を、丸底フラスコに２５〜３０℃で装填する。無水酢酸（２６ｍＬ、２７７ｍｍｏｌ）を前記反応混合物に滴下し、室温でアルゴン雰囲気下に約１２時間撹拌する。氷水（２０ｍＬ）を反応混合物に注ぐ。形成された白色沈殿物をジクロロメタン（２００ｍＬ）に溶解し、有機層を１Ｍ塩酸（３．２０ｍＬ）、５％炭酸水素ナトリウム（１．３０ｍＬ）、ブライン溶液（１．３０ｍＬ）および水（１．３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧蒸発して、粗デヒドロエピアンドロステロンアセテートを得る。得られた粗デヒドロエピアンドロステロンアセテートをアセトンから再結晶して、デヒドロエピアンドロステロンアセテートを得る。
収量：１０．９ｇ
純度：９５％
【００８０】
実施例７：  デヒドロエピアンドロステロンアセテート（ＤＨＥＡアセテート）の調製
粗デヒドロエピアンドロステロン（２．２１ｇ、７．６８ｍｍｏｌ）およびトルエン（２５ｍＬ）を、丸底フラスコに２５〜３０℃で装填する。４−ジメチルアミノピリジン（６６ｍｇ）、無水酢酸（１．４５ｍＬ、１．５７ｇ、１５．３６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２．３３ｇ、３．２ｍＬ、２３．０ｍｍｏｌ）を、前記溶液に添加し、室温で約３時間撹拌する。得られた反応生成物を、１Ｍ  ＨＣｌ（３０ｍＬ）でクエンチし、有機層を水（３０ｍＬ）、炭酸水素ナトリウム溶液（３０ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空濃縮して、デヒドロエピアンドロステロンアセテートを得る。
収率：８５％
ＨＰＬＣによる純度：８４．２％
【化３９−１】
2016521544.tif 000040
【化３９−２】
2016521544.tif 000041
【配列表】
2016521544000001.app
【国際調査報告】
2016521544.tif 000059
2016521544.tif 000060
2016521544.tif 000061