(57)【要約】治療有効量のミオスタチンの拮抗薬を投与することを含む、前立腺癌患者において悪液質を治療するもしくは調節する及び／または除脂肪体重を増加させる及び／または下肢筋肉量を増加させる方法が開示される。さらに、ミオスタチン拮抗薬のペプチボディ配列及びペプチボディの製剤が開示される。【選択図】図１３
2016516064.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪液質を治療するもしくは調節する及び／または除脂肪体重を増加させる及び／または体脂肪を減少させる及び／または下肢筋肉量を増加させることを、それらを必要とするヒト対象において行う方法であって、前記対象に、薬学的に許容される担体と混和して治療有効量のミオスタチン拮抗薬を投与することを含み、
前記ヒト対象が、前立腺癌を有し、アンドロゲン枯渇療法を受けており、
前記ミオスタチン拮抗薬が、配列番号６３５のアミノ酸配列（ＭＤＫＴＨＴＣＰＰＣ  ＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ  ＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤ  ＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶ  ＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥ  ＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶ  ＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴ  ＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴ  ＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬ  ＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹ  ＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰ  ＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡ  ＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹ  ＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴ  ＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶ  ＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶ  ＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮ  ＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤ  ＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ  ＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱ  ＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨ  ＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ  ＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧ  ＧＧＧＡＱＬＡＤＨＧ  ＱＣＩＲＷＰＷＭＣＰ  ＰＥＧＷＥ）からなる少なくとも１つのポリペプチドを含むペプチボディからなり、
前記ミオスタチン拮抗薬が、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、９％（ｗ／ｖ）スクロース、０．００４％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０、ｐＨ４．７５において製剤化され、
前記ミオスタチン拮抗薬が、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、または３．０ｍｇ／ｋｇの用量で、週１回、４週間皮下投与される、前記方法。
【請求項２】
悪液質を治療するもしくは調節する及び／または除脂肪体重を増加させる及び／または体脂肪を減少させる及び／または下肢筋肉量を増加させることを、それらを必要とするヒト対象において行う方法であって、前記対象に、薬学的に許容される担体と混和して、治療有効量のミオスタチン拮抗薬を投与することを含み、前記ヒト対象が、前立腺癌を有し、アンドロゲン枯渇療法を受けており、前記ミオスタチン拮抗薬が、配列番号３１１に記載のアミノ酸配列（ＬＡＤＨＧＱＣＩＲＷＰＷＭＣＰＰＥＧＷＥ）からなるポリペプチドを含む、前記方法。
【請求項３】
前記ミオスタチン拮抗薬が、配列番号６３５に記載のアミノ酸配列（ＭＤＫＴＨＴＣＰＰＣ  ＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ  ＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤ  ＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶ  ＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥ  ＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶ  ＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴ  ＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴ  ＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬ  ＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹ  ＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰ  ＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡ  ＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹ  ＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴ  ＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶ  ＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶ  ＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮ  ＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤ  ＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ  ＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱ  ＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨ  ＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ  ＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧ  ＧＧＧＡＱＬＡＤＨＧ  ＱＣＩＲＷＰＷＭＣＰ  ＰＥＧＷＥ）からなる少なくとも１つのポリペプチドを含むからペプチボディからなる、請求項２に記載の前記方法。
【請求項４】
前記ミオスタチン拮抗薬が、配列番号６３５に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのポリペプチドを含むペプチボディからなる、請求項２に記載の前記方法。
【請求項５】
前記ミオスタチン拮抗薬が、大腸菌において不溶性封入体で発現され、細胞採取、細胞溶解、封入体の可溶化、リフォールディング、濃縮、及びクロマトグラフィー精製を介して単離される、ペプチボディである、請求項２に記載の前記方法。
【請求項６】
前記ミオスタチン拮抗薬が、さらなる化合物に複合される、請求項２〜５に記載の前記方法。
【請求項７】
前記ミオスタチン拮抗薬が、薬学的組成物において製剤化される、請求項２〜６に記載の前記方法。
【請求項８】
前記ミオスタチン拮抗薬が、緩衝剤、抗酸化剤、低分子量分子、薬物、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、脂質、キレート剤、安定剤、または賦形剤を含む薬学的組成物において製剤化される、請求項２〜６に記載の前記方法。
【請求項９】
前記ミオスタチン拮抗薬が、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、９％（ｗ／ｖ）スクロース、０．００４％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０、ｐＨ４．７５において製剤化される、請求項２〜６に記載の前記方法。
【請求項１０】
前記ミオスタチン拮抗薬が、非経口でまたは経口で投与される、請求項２〜９に記載の前記方法。
【請求項１１】
前記ミオスタチン拮抗薬が、皮下投与される、請求項２〜９に記載の前記方法。
【請求項１２】
前記ミオスタチン拮抗薬が、０．０１〜１０．０ｍｇ／ｋｇ（境界値を含む）の用量で投与される、請求項２〜１０に記載の前記方法。
【請求項１３】
前記ミオスタチン拮抗薬が、０．３〜３．０ｍｇ／ｋｇ（境界値を含む）の用量で投与される、請求項２〜１０に記載の前記方法。
【請求項１４】
前記ミオスタチン拮抗薬が、０．３、１．０、または３．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２〜１０に記載の前記方法。
【請求項１５】
前記ミオスタチン拮抗薬が、１日２回、１日１回、週２回、週１回、月２回、または月１回投与される、請求項２〜１４に記載の前記方法。
【請求項１６】
前記ミオスタチン拮抗薬が、週１回、４週間投与される、請求項２〜１４に記載の前記方法。
【請求項１７】
前記ミオスタチン拮抗薬が、さらなる薬剤と共投与される、請求項２〜１６に記載の前記方法。
【請求項１８】
前記ミオスタチン拮抗薬が、抗前立腺癌剤を含むさらなる薬剤と共投与される、請求項２〜１６に記載の前記方法。
【請求項１９】
前立腺癌を有し、アンドロゲン枯渇療法を受けているヒト対象において悪液質を治療するもしくは調節する及び／または除脂肪体重を増加させる及び／または下肢筋肉量を増加させるための、あるいは医薬の製造における、ミオスタチン拮抗薬の使用であって、前記ミオスタチン拮抗薬が、配列番号３１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、前記使用。
【請求項２０】
前立腺癌を有し、アンドロゲン枯渇療法を受けているヒト対象において悪液質を治療するもしくは調節する及び／または除脂肪体重を増加させる及び／または下肢筋肉量を増加させるための、あるいは医薬の製造における、ミオスタチン拮抗薬の使用であって、前記ミオスタチン拮抗薬が、配列番号６３５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むペプチボディからなる、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
［０００１］
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７９９，９２８号の利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
連邦支援の研究または開発に関する声明
［０００２］
該当なし。
配列表
［０００３］
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１４年３月１３日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、２６３２４ＰＣＴ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称であり、２００，０００バイトのサイズである。
発明の分野
［０００４］
前立腺癌患者における悪液質の治療のために、ミオスタチン拮抗薬、例えば、ミオスタチン結合ペプチボディを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
［０００５］
成長因子の形質転換成長因子（ＴＧＦ）βスーパーファミリーは、筋肉組織の発達及びホメオスタシスを調節する多数の成長因子及び分化因子からなる。ＴＧＦ−βスーパーファミリーの一員であるミオスタチンは、ほぼ骨格筋内のみで発現され、筋成長の負の調節因子として作用する（Ｒｏｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｌｓｈ，２００４、Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ，２０００）。ミオスタチンは、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害因子（例えば、ｐ２１）の上方制御を生じさせ、それが次いでＣＤＫ２の下方制御及びＧ０／Ｇ１での細胞周期停止をもたらすことによって筋芽細胞の増殖を阻害する。さらに、ミオスタチンは、ＭｙｏＤの発現の減少を通して筋芽細胞分化を負に調節する（Ｌａｎｇｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，２００２）。
［０００６］
ミオスタチン遺伝子における機能喪失突然変異を有するマウス及びウシからの観察（Ｒｏｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｌｓｈ，２００４、Ｇｒｏｂｅｔ  ｅｔ  ａｌ，１９９８、Ｓｚａｂo  ｅｔ  ａｌ，１９９８、Ｇｒｏｂｅｔ  ｅｔ  ａｌ，１９９７、Ｋａｍｂａｄｕｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９７、ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，１９９７、ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）、ならびにミオスタチンの両対立遺伝子に影響を及ぼす機能喪失突然変異を有するヒト小児を記述する最近の症例報告（Ｓｃｈｕｅｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ，２００４）は、ミオスタチンが周産期の骨格筋の発達を調節するのに重要な役割を果たすという強力な証拠を提供する。成体マウスの筋肉において、ミオスタチンは、再生衛星細胞の活性化を阻害するように思われる（ＭｃＣｒｏｓｋｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。特に興味深いのは、筋特異的な条件付きのミオスタチン遺伝子の不活性化アプローチによって、一般の筋肉肥大は、構成的にミオスタチン欠損のノックアウトマウスにおける筋肉肥大と同様の程度まで、マウスにおいて生後に誘導され得る（Ｇｒｏｂｅｔ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。
［０００７］
骨格筋の消耗は、様々な状態及び病状、例えば、癌悪液質、アンドロゲン欠乏、末期腎疾患による腎悪液質、慢性閉塞性肺疾患、心臓悪液質、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ステロイド性ミオパチー、廃用性萎縮、高齢及び術後免疫療法によるサルコペニアにおいて、高頻度に見られ、臨床的に影響を及ぼす（Ｍｕｓｃａｒｉｔｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ，２００６、Ａｌｉｂｈａｉ  ｅｔ  ａｌ，２００６、Ｍｏｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，２００６、ＭａｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ，２００３、Ｒｏｕｂｅｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）。骨格筋の消耗は、筋力低下、身体的及び精神的障害、ならびに生活の質の低下をもたらす（Ｍｕｓｃａｒｉｔｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ，２００６、Ｒｏｕｂｅｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）。食欲刺激薬、栄養補給、コルチコステロイド、同化ステロイドホルモン、及び成長ホルモンを含む、病気または不動性の状況において筋肉の消耗に対して使用される現行の治療選択の有用性は限られており、著しい全身性副作用を伴い得る（Ｍｕｓｃａｒｉｔｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ，２００６、ＭａｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。
［０００８］
前立腺癌は、米国では、男性において最も一般的な悪性腫瘍であり、男性において癌に関連した２番目に多い死因である（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００５）。ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）作動薬の投与によるアンドロゲン枯渇療法（ＡＤＴ）は、転移性前立腺癌に対する治療の主力である。（Ｓｈａｒａｆｉ  ｅｔ  ａｌ  ＪＡＭＡ２００５）ネオアジュバント／アジュバントＡＤＴは、中程度のリスク及び高リスクの早期の前立腺癌に対する放射線療法を受けている男性における生存率を向上させる。アジュバントＡＤＴはまた、リンパ節陽性疾患に罹患している男性における前立腺切除術後の生存率の向上とも関連している。現代の臨床診療において、生化学的再発において一般的に見られる、ＧｎＲＨ作動薬による長期間治療は、アンドロゲン枯渇療法の最も一般的な形態である。（Ｓｈａｒａｆｉ  ｅｔ  ａｌ  ＪＡＭＡ２００５
［０００９］
ＡＤＴは、体重増加、体脂肪量の増加、除脂肪体重の減少、及び疲労を含む、様々な副作用を有する。（Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ，２００６Ａｕｇ；２０（４）：９０９−２３。前向き臨床研究において、ＡＤＴは、除脂肪体重及び筋肉サイズの減少ならびに体脂肪の増加を伴う。（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ，２００２、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ，２００１）。身体組成の変化は、治療の最初の６カ月以内で明らかであり、長期療法中、継続するように思われる。（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ  ＪＣＯ２０１２）。筋肉量及び筋力の低下は、前立腺癌を有する男性において、総合的な疲労及び生活の質の低下の一因となり得る。身体組成における治療に関連する変化はまた、ＡＤＴがインスリン感受性の低下及びＡＤＴに関連した糖尿病になるより高いリスクの一因となり得る。（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ２００６ＪＣＥＭ、Ｋｅａｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ２００６ＪＣＯ、Ｂｒａｇａ−Ｂａｓａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ２００６）。
［００１０］
ＡＭＧ７４５は、新規の抗ミオスタチンペプチボディである。構造的に、それは、Ｎ末端でヒトＦｃを有し、Ｃ末端でミオスタチンを中和する生物活性ペプチドを有する融合タンパク質である。ＡＭＧ７４５及び／またはＡＭＧ７４５のネズミサロゲートであるＡＭＧ７４５／Ｍｕ−Ｓは、正常マウス、免疫欠損マウス、ＭＤＸマウス（デュシェンヌ型筋ジストロフィーモデル）、結腸２６担腫瘍マウス（癌悪液質モデル）、後肢懸垂マウス（廃用性萎縮モデル）、及び睾丸摘出マウス（アンドロゲン欠乏マウスモデル）を含む、様々なマウスモデルにおいて試験されている。これらのモデルにおけるＡＭＧ７４５及び／またはＡＭＧ７４５／Ｍｕ−Ｓの効果には、対照マウスと比較して、体重増加の増加、骨格筋量の増加または維持の向上、及び体力の増加が含まれた。アンドロゲン欠乏に関連する筋力低下及び脂肪蓄積を特徴とする性腺機能低下症の疾患モデルである、睾丸摘出マウスにおける前臨床研究は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像によって評価すると、ＡＭＧ７４５／Ｍｕ−Ｓの投与が除脂肪体重の減少及び脂肪の蓄積を著しく弱化したことを示し、そしてさらに、インビボのミオスタチン阻害がアンドロゲン非依存性機構を介して骨格筋の成長を増進し得ることを示した。
［００１１］
ミオスタチン拮抗薬及びそれらの使用は、第ＷＯ／２００４／０５８９８８号として公開され、２００３年１２月１９日に出願された、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０４０７８１号、及び第ＷＯ２００７／０６７６１６号として公開され、２００６年１２月６日に出願された第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４６５４６号、ならびに関連する国内段階の出願において記載されている。
【発明の概要】
【０００３】
［００１２］
悪液質を治療するもしくは調節する及び／または除脂肪体重を増加させる及び／または体脂肪を減少させる及び／または下肢筋肉量を増加させることを、それらを必要とするヒト対象において行う方法が、本明細書に記載されており、当該方法は、当該対象に、薬学的に許容される担体と混和して、治療有効量のミオスタチン拮抗薬を投与することを含み、ヒト対象は、前立腺癌を有し、アンドロゲン枯渇療法を受けており、ミオスタチン拮抗薬は、配列番号６３５に記載のアミノ酸配列（ＭＤＫＴＨＴＣＰＰＣ  ＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ  ＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤ  ＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶ  ＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥ  ＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶ  ＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴ  ＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴ  ＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬ  ＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹ  ＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰ  ＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡ  ＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹ  ＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴ  ＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶ  ＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶ  ＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮ  ＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤ  ＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ  ＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱ  ＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨ  ＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ  ＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧ  ＧＧＧＡＱＬＡＤＨＧ  ＱＣＩＲＷＰＷＭＣＰ  ＰＥＧＷＥ）からなるポリペプチドを含むペプチボディからなり、ミオスタチン拮抗薬は、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、９％（ｗ／ｖ）スクロース、０．００４％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０、ｐＨ４．７５において製剤化され、ミオスタチン拮抗薬は、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、または３．０ｍｇ／ｋｇの用量で、週１回、４週間皮下投与される。
［００１３］
また、悪液質を治療するもしくは調節する及び／または除脂肪体重を増加させる及び／または体脂肪を減少させる及び／または下肢筋肉量を増加させることを、それらを必要とするヒト対象において行う方法も記載されており、当該対象に、薬学的に許容される担体と混和して、治療有効量のミオスタチン拮抗薬を投与することを含み、ヒト対象は、前立腺癌を有し、アンドロゲン枯渇療法を受けており、ミオスタチン拮抗薬は、配列番号３１１に記載のアミノ酸配列（ＬＡＤＨＧＱＣＩＲＷＰＷＭＣＰＰＥＧＷＥ）からなるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、配列番号６３５に記載のアミノ酸配列（ＭＤＫＴＨＴＣＰＰＣ  ＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ  ＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤ  ＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶ  ＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥ  ＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶ  ＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴ  ＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴ  ＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬ  ＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹ  ＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰ  ＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡ  ＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹ  ＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴ  ＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶ  ＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶ  ＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮ  ＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤ  ＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ  ＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱ  ＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨ  ＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ  ＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧ  ＧＧＧＡＱＬＡＤＨＧ  ＱＣＩＲＷＰＷＭＣＰ  ＰＥＧＷＥ）からなるポリペプチドを含むペプチボディからなる。他の実施形態において、配列番号６３５に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列からなるペプチボディからなるミオスタチン拮抗薬。
［００１４］
本方法に使用されるミオスタチン拮抗薬は、大腸菌において不溶性封入体で発現され、細胞採取、細胞溶解、封入体の可溶化、リフォールディング、濃縮、及びクロマトグラフィー精製を介して単離されるペプチボディであり得る。
［００１５］
いくつかの実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、さらなる化合物に複合される。
［００１６］
いくつかの実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、薬学的組成物において製剤化される。例としては、緩衝液、抗酸化剤、低分子量分子、薬物、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、脂質、キレート剤、安定剤、または賦形剤を含む薬学的組成物が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、製剤は、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、９％（ｗ／ｖ）スクロース、０．００４％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０、ｐＨ４．７５であり得る。
［００１７］
本方法は、例えば、非経口でまたは経口でまたは皮下での投与を使用し得る。
［００１８］
いくつかの実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、０．０１〜１０．０ｍｇ／ｋｇ（境界値を含む）の用量で、または０．３〜３．０ｍｇ／ｋｇ（境界値を含む）の用量で、または０．３、１．０、もしくは３．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。ミオスタチン拮抗薬は、例えば、１日２回、１日１回、週２回、週１回、月２回、または月１回、投与され得る。いくつかの実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、週１回、４週間投与される。
［００１９］
いくつかの実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、さらなる薬剤、例えば、抗前立腺癌剤と共投与される。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】［００２０］  ＴＮ８−１９ペプチドＱＧＨＣＴＲＷＰＷＭＣＰＰＹ（配列番号３２）及びＴＮ８−１９ペプチボディ（ｐｂ）に対して、以下の実施例に記載されるＣ２Ｃ１２ｐＭＡＲＥルシフェラーゼアッセイを用いて、それぞれに対してＩＣ５０を決定するために、発現したルシフェラーゼ活性（ｙ軸）対濃度（ｘ軸）によって測定された、ミオスタチン活性を示す。ペプチボディは、ペプチドと比較して、より低いＩＣ５０値を有する。
【図２】［００２１］  実施例８に記載される、ｈｕＦｃ対照により処置されたマウスと比較した、漸増投与量の１×ｍＴＮ８−１９−２１ペプチボディで１４日間にわたって処置されたＣＤ１ｎｕ／ｎｕマウスにおける全体重の増加を示すグラフである。
【図３】［００２２］  図３Ａは、図２（実施例８）において処置されたマウスの剖検での腓腹筋量の増加を示す。図３Ｂは、実施例８に記載される実験における０日目のＮＭＲを１３日目と比較することによって決定される、非脂肪量の増加を示す。
【図４】［００２３］  実施例８に記載される実験の０日目及び１３日目におけるＮＭＲによって決定される、漸増投与量の１×ｍＴＮ８−１９−３２ペプチボディの週２回の注射により処置されたＣＤ１ｎｕ／ｎｕマウスにおける除脂肪体重の増加を示す。
【図５】［００２４］  図５Ａは、実施例８に記載される、２×ｍＴＮ８−１９−７と比較した１×ｍＴＮ８−１９−７の週２回の注射により３５日間処置されたＣＤ１ｎｕ／ｎｕマウス及び対照動物における体重の増加を示す。図５Ｂは、ビヒクルを与えられている動物（ｈｕＦｃ）（対照）と比較した１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇでの１×型及び２×型における剖検時の除脂肪屠体量の増加を示す。
【図６】［００２５］  図６Ａは、一日おきに３か月間、親和性成熟化された１×ｍＴＮ８−１９−３３ペプチボディまたはｈｕＦｃビヒクルのいずれかで１０ｍｇ／ｋｇで皮下に処置された加齢ｍｄｘマウスにおける除脂肪筋肉量対体重の増加を示す。図６Ｂは、ＮＭＲによって決定される、３か月の処置後の同じマウスにおける体重と比較した脂肪量の変化を示す。
【図７】［００２６］  ペプチボディ２×ｍＴＮ８−１９−２１／ｍｕＦｃまたはｍｕＦｃビヒクルにより処置されたコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）動物、ならびに正常な非ＣＩＡ動物における体重の経時変化をグラムで示す。
【図８】［００２７］  ペプチボディ２×ｍＴＮ８−１９−２１／ｍｕＦｃまたはｍｕＦｃビヒクル対照により処置されたストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導性糖尿病マウスにおける相対体重の経時変化を示す。
【図９】［００２８］  ペプチボディ２×ｍＴＮ８−１９−２１／ｍｕＦｃまたはｍｕＦｃビヒクルによる処置後のストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導性糖尿病マウス及び年齢が一致した正常マウスにおけるクレアチンのクリアランス率を示す。
【図１０】［００２９］  図１０Ａは、ペプチボディ２×ｍＴＮ８−１９−２１／ｍｕＦｃまたはｍｕＦｃビヒクルによる処置後のストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導性糖尿病マウス及び年齢が一致した正常マウスにおける尿アルブミン排泄を示す。図１０Ｂは、ペプチボディ２×ｍＴＮ８−１９−２１／ｍｕＦｃまたはｍｕＦｃビヒクルによる処置後のストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導性糖尿病マウス及び年齢が一致した正常マウスにおける２４時間の尿量を示す。
【図１１】［００３０］  ペプチボディ２×ｍＴＮ８−１９−２１／ｍｕＦｃにより１週間、前処置され、５−フルオロウラシル（５−Ｆｕ）またはビヒクル（ＰＢＳ）により処置された２つの群；及び２×ｍＴＮ８−１９−２１／ｍｕＦｃにより２週間、前処置され、５−フルオロウラシルまたはビヒクル（ＰＢＳ）により処置された２つの群である、４つの群のＣ５７Ｂｌ／６マウスにおける体重の経時変化を示す。図の下に沿った三角形は、２×ｍＴＮ８−１９−２１／ｍｕＦｃによる２週間の前処置の投与時、２×ｍＴＮ８−１９−２１／ｍｕＦｃによる１週間の前処置の投与時、及び５−Ｆｕの投与時を示す。
【図１２】［００３１］  処置されない正常マウス、５−Ｆｕのみにより処置された動物、２×ｍＴＮ８−１９−２１／ｍｕＦｃにより１週間、前処理され、５−Ｆｕにより処置された動物、及び２×ｍＴＮ８−１９−２１／ｍｕＦｃにより２週間、前処理され、５−Ｆｕにより処置された動物を示す、上の図１１に記載される動物における生存率％を示す。
【図１３】［００３２］  ＡＭＧ７４５またはプラセボにより処置されたヒト対象における全除脂肪体重のベースラインからのパーセント変化を示す。プラセボ群は、ＥＯＳ及びＦＵＰのそれぞれにおいて左側にあり、ＡＭＧ７４５群は、ＥＯＳ及びＦＵＰのそれぞれにおいて右側にある。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
［００３３］
本発明は、アンドロゲン治療法を受けている前立腺癌患者において、配列番号３１１のミオスタチン結合ペプチドを含むミオスタチン拮抗薬、例えば、配列番号６３５からなるペプチボディの投与によって悪液質を治療する方法を提供する。
【０００６】
ミオスタチン
［００３４］
ＧＤＦ−８としても知られている成長因子であるミオスタチンは、ＴＧＦ−βファミリーの一員である。ミオスタチンは、骨格筋組織の負の調節因子であることが知られている。ミオスタチンは、タンパク質分解切断によって活性化される不活性なプレプロタンパク質として合成される（Ｚｉｍｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，上記（２００２））。前駆体タンパク質が切断されて、ＮＨ２末端不活性プロドメイン、及び約２５ｋＤａのホモ二量体の形態である成熟活性型のおよそ１０９アミノ酸のＣＯＯＨ末端タンパク質が生じる（Ｚｉｍｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，上記（２００２））。現在、成熟二量体は、プロペプチドに結合した不活性潜在性複合体として血液中で循環すると考えられている（Ｚｉｍｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，上記（２００２））。
［００３５］
本明細書で使用される「全長ミオスタチン」という用語は、ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ＵＳＡ９４，１２４５７（１９９７）に記載される全長ヒトプレプロタンパク質配列、ならびに対立遺伝子変異体及び種間相同体を含む、関連全長ポリペプチド（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．上記（１９９７））を指す。本明細書で使用される「プロドメイン」または「プロペプチド」という用語は、切断されて、活性ＣＯＯＨ末端タンパク質を放出する、不活性ＮＨ２末端タンパク質を指す。本明細書で使用される「ミオスタチン」または「成熟ミオスタチン」という用語は、単量体、二量体、多量体型、または他の型の、成熟な生物学的に活性であるＣＯＯＨ末端ポリペプチドを指す。「ミオスタチン」または「成熟ミオスタチン」はまた、生物学的に活性な成熟ミオスタチンの断片、ならびに対立遺伝子変異体、スプライス変異体、ならびに融合ペプチド及びポリペプチドを含む、関連ポリペプチドも指す。成熟ミオスタチンＣＯＯＨ末端タンパク質は、ヒト、マウス、ニワトリ、ブタ、七面鳥、及びラットを含む多くの種間で１００％配列同一性を有すると報告されている（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ９８，９３０６（２００１））。ミオスタチンは、どのように調製されたかに応じて、標的配列等のさらなる末端残基、またはメチオニン残基及びリジン残基、ならびに／あるいはタグまたは融合タンパク質配列を含んでも、含まなくてもよい。
【０００７】
ミオスタチン拮抗薬
［００３６］
本明細書に記載される治療方法は、配列番号３１１のミオスタチン結合ペプチドを含むミオスタチン拮抗薬、例えば、配列番号６３５からなる少なくとも１つのポリペプチドを含むペプチボディ、例えば、ペプチボディＡＭＧ−７４５を使用する。
［００３７］
本明細書で使用される「ミオスタチン拮抗薬」という用語は、「ミオスタチン阻害剤」と互換的に使用される。本発明によるミオスタチン拮抗薬は、ミオスタチンの少なくとも１つの活性を阻害または遮断するか、あるいは、ミオスタチンまたはその受容体の発現を遮断する。ミオスタチン活性の阻害または遮断は、例えば、ミオスタチンとその受容体との結合を妨げる、及び／またはミオスタチンのその受容体への結合を得られるシグナル伝達を遮断する、１つ以上の阻害剤を使用することによって達成され得る。拮抗薬には、ミオスタチンそれ自体に結合する薬剤、またはミオスタチン受容体に結合する薬剤が含まれる。
［００３８］
ミオスタチン拮抗薬の他の例としては、ホリスタチン、ミオスタチンプロドメイン、成長分化因子１１（ＧＤＦ−１１）プロドメイン、プロドメイン融合タンパク質、ミオスタチンに結合する拮抗抗体、アクチビンＩＩＢ型受容体と結合する拮抗抗体（複数を含む）断片、可溶性アクチビンＩＩＢ型受容体、可溶性アクチビンＩＩＢ型受容体融合タンパク質、可溶性ミオスタチン類似体（可溶性リガンド）、オリゴヌクレオチド、小分子、ペプチド模倣体、及びミオスタチン結合剤が挙げられるが、これらに限定されない。これらは以下で詳細に説明される。
［００３９］
ホリスタチンは、例えば、Ａｍｔｈｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ２７０，１９−３０（２００４）及び米国特許第６，００４，９３７号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される、ミオスタチンを阻害する。他の阻害剤には、例えば、Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ．１７（６）：１１４４−１１５４（２００３）に記載される、成長分化因子関連血清タンパク質−１（ＧＡＳＰ）を含むＴＧＦ−β結合タンパク質が含まれる。ミオスタチン拮抗薬には、ＰＣＴ公開第ＷＯ０２／０９６４１号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される、ＧＤＦ−１１を含むミオスタチン及び関連ＧＤＦタンパク質のプロペプチド領域が含まれる。ミオスタチン拮抗薬は、例えば、Ｂｏｇｄａｎｏｖｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ１９，５４３−５４９（２００５）に記載される、プロドメインのＦｃ領域を含む修飾及び安定化プロペプチドがさらに含まれる。さらなるミオスタチン拮抗薬には、単量体型または二量体型である、ミオスタチンプロタンパク質及び／または成熟タンパク質を含むミオスタチンに結合する及び阻害するまたは中和させる抗体または抗体断片が含まれる。そのような抗体は、例えば、米国特許出願第ＵＳ２００４／０１４２３８３号、及び米国特許出願第２００３／１０３８４２２号、及びＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／０９４４４６号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／１１６２６９号に記載されており、当該出願のすべては、参照により本明細書に組み込まれる。拮抗ミオスタチン抗体には、ミオスタチンプロタンパク質と結合し、成熟活性型への切断を防ぐ抗体がさらに含まれる。
［００４０］
本明細書で使用される「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｓ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８８）を参照のこと）及びモノクローナル抗体（例えば、米国特許第ＲＥ３２，０１１号、同第４，９０２，６１４号、同第４，５４３，４３９号、及び同第４，４１１，９９３号、ならびにＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ，ＭｃＫｅａｒｎ  ａｎｄ  Ｂｅｃｈｔｏｌ（ｅｄｓ．）（１９８０）を参照のこと）を含む無傷抗体を指す。本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃ、及び一本鎖抗体、またはこれらの組み合わせ等の抗体の断片も指し、それらは組換えＤＮＡ技術によって、または無傷抗体の酵素的もしくは化学的切断によって生成される。「抗体」という用語はまた、２つの異なる重／軽鎖対及び２つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である二重特異性抗体または二官能性抗体も指す。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含む、様々な方法により産生され得る。（Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０）、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと）。本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、１つ以上の非ヒト可変抗体免疫グロブリンドメインに結合されるヒト定常抗体免疫グロブリンドメインを有する抗体またはその断片（例えば、米国特許第５，５９５，８９８及び米国特許第５，６９３，４９３号を参照のこと）である、キメラ抗体も指す。「抗体」という用語はまた、「ヒト化」抗体（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号及び第ＷＯ９４／１０３３２号を参照のこと）、ミニボディ（第ＷＯ９４／０９８１７号）、一本鎖Ｆｖ−Ｆｃ融合（Ｐｏｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２５１：１２３−１３５（２００１））、及びトランスジェニック動物によって産生される抗体も指し、トランスジェニック動物は、ヒト抗体産生遺伝子の割合を含むが、ヒト抗体を産生することができる内因性抗体の産生を欠いている（例えば、Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１５：１４６−１５６（１９９７）及び米国特許第６，３００，１２９号を参照のこと）。「抗体」という用語はまた、多量体抗体、またはタンパク質の高次複合体、例えば、ヘテロ二量体抗体も含まれる。また、「抗体」には、抗イディオタイプ抗体も含まれる。
［００４１］
ミオスタチン拮抗薬には、ミオスタチンに結合し、少なくとも１つの活性を阻害する可溶性受容体がさらに含まれる。本明細書で使用される「可溶性受容体」という用語には、修飾された、またはそうでなければ、ミオスタチンに特異的に結合し、かつミオスタチンシグナル伝達を遮断または阻害することができる、ミオスタチン受容体の一部切除型または断片が含まれる。ミオスタチン受容体のこれらの一部切除型には、例えば、天然存在可溶性ドメイン、ならびにＮ末端またはＣ末端のタンパク質分解による変形が含まれる。可溶性ドメインには、単独の、あるいはさらなるペプチドまたは修飾に結合した、受容体の細胞外ドメインのすべてまたは一部が含まれる。ミオスタチンは、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ９８（１６），９３０６−９３１１（２００１）に記載される、アクチビンＩＩＢ型受容体（ＡｃｔＲＩＩＢ）及びアクチビンＩＩＡ型受容体（ＡｃｔＲＩＩＡ）を含むアクチビンに結合する。可溶性受容体融合タンパク質、例えば、米国特許出願公開第２００４／０２２３９６６号及びＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／０１２６２７号（これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる）に記載される、可溶性受容体Ｆｃもまた、拮抗薬として作用し得る。
［００４２］
ミオスタチン拮抗薬には、ミオスタチン受容体への結合に関してミオスタチンと競合する可溶性リガンドがさらに含まれる。本明細書で使用される「可溶性リガンド拮抗薬」という用語は、ミオスタチンアクチビンＩＩＢ型受容体（またはＡｃｔＲＩＩＡ）に結合し、ミオスタチンと競合することによって、ミオスタチン受容体シグナル伝達を遮断することができる、可溶性のペプチド、ポリペプチド、またはペプチド模倣体を指す。可溶性リガンド拮抗薬には、リガンドに対する実質的な相同性を維持するが、リガンドの活性を維持しない、Ｎ末端またはＣ末端切断、置換、欠失、及びアミノ酸残基に対する非アミノ酸ペプチド模倣体の置換等のアミノ酸配列における他の改変を含む、「ミオスタチン類似体」とも称される、ミオスタチンの変異体が含まれる。可溶性リガンド拮抗薬は、例えば、受容体に結合可能であってもよいが、シグナル伝達を可能にしない。本発明の目的のため、タンパク質は、アミノ酸配列において、互いに少なくとも８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％同一である場合、別のタンパク質に「実質的に類似」である。
［００４３］
ミオスタチン拮抗薬には、ポリヌクレオチド拮抗薬がさらに含まれる。これ拮抗薬には、標的ｍＲＮＡ（センス）またはＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合可能な一本鎖ポリヌクレオチド配列（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明に従って、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、ミオスタチンもしくはその受容体、転写因子、またはミオスタチンもしくはその受容体の発現に関与する他のポリヌクレオチドをコードする標的ポリヌクレオチド配列の断片を含む。そのような断片は、一般的に、少なくとも約１４ヌクレオチド、典型的には、約１４〜約３０ヌクレオチドを含む。所定のタンパク質をコードする核酸配列に基づいて、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを得る能力は、例えば、Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：２６５９，１９８８及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：９５８，１９８８に記載される。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は、ＲＮＡｓｅ  ＨによるｍＲＮＡの分解増進、スプライシングの阻害、転写もしくは翻訳の未成熟な終結、または他の手段を含むいくつかの手段のうちの１つによって、タンパク質の発現を遮断するまたは阻害する二重鎖の形成をもたらす。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質の発現を遮断するために使用され得る。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、修飾された糖−ホスホジエステル主鎖（または第ＷＯ９１／０６６２９号に記載されるもの等の他の糖連結）を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、そのような糖連結は内因性ヌクレアーゼに耐性である。耐性糖連結を持つ、そのようなオリゴヌクレオチドは、インビボで安定である（すなわち、酵素分解に抵抗可能である）が、標的ヌクレオチド配列に結合可能な配列特異性を保持する。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、第ＷＯ９０／１０４４８号に記載されるもの等の有機部分、及びポリ−（Ｌ）−リジン等の、標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる他の部分に、共有結合されたオリゴヌクレオチドが含まれる。さらになお、エリプチシン等の挿入剤、及びアルキル化剤または金属複合体を、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させて、標的ヌクレオチド配列に対するアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を修飾してもよい。
［００４４］
例えば、リポフェクション、ＣａＰＯ４媒介性ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含むいずれかの遺伝子トランスファー法によって、あるいはエプスタインバーウイルスまたはアデノウイルス等の遺伝子トランスファーベクターを用いることによって、標的核酸を含有する細胞に、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドが導入され得る。第ＷＯ９１／０４７５３号に記載される、リガンド結合分子との複合体を形成することによっても、標的核酸を含有する細胞に、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドが導入され得る。好適なリガンド結合分子には、細胞表面受容体、成長因子、他のサイトカイン、または細胞表面受容体に結合する他のリガンドが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、リガンド結合分子の複合は、リガンド結合分子が、その対応する分子または受容体に結合する能力に実質的に干渉せず、あるいはセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその複合型の細胞内への進入を実質的に遮断しない。あるいは、第ＷＯ９０／１０４４８号に記載されるように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成によって、標的核酸を含有する細胞に、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドが導入され得る。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは、内因性リパーゼによって、細胞内で解離される。
［００４５］
ミオスタチンまたはミオスタチン受容体の発現を防止するためのさらなる方法は、例えば、Ｂｏｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ２，Ｅ３１−Ｅ３６（２０００）に記載されるような、特異的小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の導入によって生じるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）である。
［００４６］
ミオスタチン拮抗薬には、ミオスタチンまたはその受容体のいずれかに結合する、小分子拮抗薬がさらに含まれる。小分子は、ミオスタチンまたはその受容体への結合に関してスクリーニングし、その後、本明細書に記載される結合剤の選択と同様に、特異的及び非特異的溶出を行うことによって選択される。
［００４７］
本明細書で使用される「ミオスタチンに結合可能な」または「ミオスタチンに結合親和性を有する」という用語は、以下の実施例に記載されるファージＥＬＩＳＡアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）またはＫｉｎＥｘＡ（商標）アッセイによって示されるような、ミオスタチンに結合する本明細書に記載される結合剤等のミオスタチン拮抗薬を指す。
［００４８］
本明細書で使用される「ミオスタチン活性を修飾可能」という用語は、ミオスタチンの少なくとも１つの生物学的活性に関する作動薬または拮抗薬のいずれかとしての薬剤の作用を指す。本明細書で使用される「作動薬」または「模倣薬」活性は、例えば、２００１年５月２日に出願された国際公開第ＷＯ０１／８３５２５号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるような、対象となるタンパク質と相互作用するタンパク質に匹敵する生物学的活性を有する薬剤を指す。
［００４９］
本明細書で使用される「ミオスタチン活性を阻害する」または「ミオスタチン活性を拮抗する」という用語は、例えば、ｐＭＡＲＥ  Ｃ２Ｃ１２細胞に基づくミオスタチン活性アッセイ等のインビトロアッセイによって、または以下に記載されるインビボ動物試験によって示されるように、ミオスタチン拮抗薬のミオスタチン活性またはシグナル伝達を減少させるかまたは遮断する能力を指す。
【０００８】
ミオスタチン結合剤
［００５０］
本発明の方法に使用されるミオスタチン拮抗薬は、例えば、少なくとも１つのミオスタチン結合ペプチド、例えば、配列番号３１１、例えば、ペプチボディＡＭＧ−７４５を含むミオスタチン結合剤を含む。
［００５１］
一実施形態において、本発明の結合剤は、ポリマーまたはＦｃドメイン等の少なくとも１つのビヒクルに共有結合した少なくとも１つのミオスタチン結合ペプチドを含む。ミオスタチン結合ペプチドの少なくとも１つのビヒクルへの結合は、結合剤の生物学的活性を増加させ、そして／またはインビボでの分解を減少させ、インビボでの半減期を増加させ、インビボでの毒性または免疫原性を減少させることによって、療法剤としての結合剤の有効性を増加させることを意図する。結合剤は、ペプチド及びビヒクルを連結するリンカー配列をさらに含み得る。ペプチド（複数を含む）が、直接、またはリンカー配列を介して間接的に、ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、またはアミノ酸側鎖で、ビヒクルに結合される。本実施形態において、本発明の結合剤は、以下の構造：
（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ、またはその多量体を有し、
式中、Ｆ１は、ビヒクルであり、Ｘ１及びＸ２は、各々独立して、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３、
及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４から選択され、
式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、及びＰ４は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、各々リンカーであり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは、各々独立して、０または１であるが、但し、ａ及びｂのうちの少なくとも１つは１である。
［００５２］
システイニル残基を含有するペプチドはいずれも、別のＣｙｓ含有ペプチドと架橋されることも可能であり、これらのいずれかまたは両方がビヒクルに連結されてもよい。１より多いＣｙｓ残基を有するペプチドはいずれも、ペプチド内ジスルフィド結合を形成することもまた、可能である。
［００５３］
一実施形態において、ビヒクルは、以下に定義されるＦｃドメインである。本実施形態は、「ペプチボディ」と称される。本明細書で使用される「ペプチボディ」という用語は、少なくとも１つのペプチドに結合した抗体Ｆｃドメインを含む分子を指す。ペプチボディの産生は、２０００年５月４日に公開されたＰＣＴ公開第ＷＯ００／２４７８２号に一般的に記載され、これは参照により本明細書に組み込まれる。典型的なペプチボディは、以下の実施例に記載されるように、それぞれ、１コピー及び２コピーのペプチド（タンデムに結合される）を有する、１×及び２×の形態として提供される。
【０００９】
ペプチド
［００５４］
一実施形態において、配列番号３１１からなるペプチドを含むミオスタチン拮抗薬を使用する。
［００５５］
本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって連結される約５〜約９０アミノ酸の分子を指す。本発明のペプチドは、好ましくは、約５〜約５０アミノ酸長、より好ましくは約１０〜３０アミノ酸長、最も好ましくは約１０〜２５アミノ酸長であり、ミオスタチンタンパク質に結合することが可能である。
［００５６］
本発明のペプチドは、天然存在タンパク質の配列の部分を含んでもよく、天然存在タンパク質由来のランダム化配列であってもよく、または完全にランダム化配列であってもよい。本発明のペプチドは、化学合成、タンパク質の消化、または組換え技術を含む、当該技術分野で知られている任意の方法によって生成され得る。ミオスタチンに結合可能なペプチドを生成するには、ファージディスプレイ及びＲＮＡ−ペプチドスクリーニング、及び他の親和性スクリーニング技術が、特に有用である。
［００５７］
ファージディスプレイ技術は、例えば、Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３８６（１９９０）、Ｄｅｖｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：４０４（１９９０）、１９９３年６月２９日に発行された米国特許第５，２２３，４０９号、１９９８年３月３１日に発行された米国特許第５，７３３，７３１号、１９９６年３月１２日に発行された米国特許第５，４９８，５３０号、１９９５年７月１１日に発行された米国特許第５，４３２，０１８号、１９９４年８月１６日に発行された米国特許第５，３３８，６６５号、１９９９年７月１３日に発行された米国特許第５，９２２，５４５号、１９９６年１２月１９日に公開された第ＷＯ９６／４０９８７号、１９９８年４月１６日に公開された第ＷＯ９８／１５８３３号に記載されており、当該特許の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。ファージライブラリーを用いて、繊維状ファージのコートタンパク質との融合によって、ランダムペプチド配列をディスプレイする。典型的には、ディスプレイされたペプチドは、標的分子に対して特異的または非特異的に親和性溶出される。保持されたファージを、親和性精製及び再増殖の連続周期によって濃縮してもよい。例えば、以下に記載されるファージＥＬＩＳＡを用い、配列決定することによって、さらなる分析のために、最適結合ペプチドが選択される。任意に、突然変異誘発ライブラリーを生成して、スクリーニングし、最適結合剤の配列をさらに最適化することも可能である（Ｌｏｗｍａｎ，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ２６：４０１−２４（１９９７））。
［００５８］
ミオスタチン結合ペプチドを生成する他の方法には、当該技術分野に知られているさらなる親和性選択技術が含まれる。ペプチドライブラリーをｌａｃリプレッサーのカルボキシル末端で融合させて、大腸菌で発現させることも可能である。大腸菌に基づく別の方法は、ペプチドグリカン会合リポタンパク質（ＰＡＬ）との融合によって、細胞の外膜上でのディスプレイを可能にする。以下、これらの方法及び関連法は、集合的に、「大腸菌ディスプレイ」と称する。別の方法において、リボソーム放出前にランダムＲＮＡの翻訳を停止して、会合するＲＮＡがまだ付着したポリペプチドのライブラリーを生じる。以下、この方法及び関連法は、集合的に、「リボソームディスプレイ」と称する。他の方法は、ＲＮＡに対するペプチドの化学的連結を使用する。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９４：１２２９７−３０３（１９９７）を参照のこと。以下、この方法及び関連法は、集合的に、「ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング」と称する。酵母２ハイブリッドスクリーニング法もまた、ミオスタチンに結合する本発明のペプチドを特定するのに使用され得る。さらに、化学的に得られるペプチドライブラリーが開発されてきており、ここでは、ペプチドは安定な非生物学的物質、例えばポリエチレンロッドまたは溶媒浸透性樹脂上に固定されている。別の化学的に得られるペプチドライブラリーは、フォトリソグラフィーを用いて、スライドガラス上に固定されたペプチドをスキャンする。以下、これらの方法及び関連法は、集合的に、「化学的ペプチドスクリーニング」と称する。化学的ペプチドスクリーニングは、Ｄ−アミノ酸及び他の類似体、ならびに非ペプチド物質の使用を可能にする点で有利であり得る。生物学的方法及び化学的方法は両方とも、Ｗｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３：３５５−６２（１９９２）に概説される。
［００５９］
さらに、ミオスタチンに結合可能な選択されたペプチドを、「合理的設計」の使用を通じて、さらに改善することもできる。このアプローチでは、ペプチド配列を段階的に変化させて、ペプチドの結合親和性または特異性、あるいはペプチドの何らかの他の特性に対する置換の影響を、適切なアッセイで観察する。この技術の一例は、「アラニンウォーク」または「アラニンスキャン」と称される、一度に１つの残基をアラニンで置換することである。２つの残基を置き換える場合は、「二重アラニンウォーク」と称される。アミノ酸置換を含有する得られたペプチドを、活性増進または何らかのさらなる有益な特性に関して試験する。
［００６０］
さらに、タンパク質−タンパク質相互作用の構造分析を用いて、より大きいタンパク質の相互作用を模倣するペプチドを示唆することも可能である。そのような分析において、タンパク質の結晶構造は、タンパク質の非常に重要な残基の同一性及び相対的な配向を示唆することも可能であり、この結晶構造からペプチドを設計してもよい。例えば、Ｔａｋａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ１５：１２６６（１９７７）を参照のこと。これらの方法を用いて、標的タンパク質と、ファージディスプレイまたは他の親和性選択プロセスによって選択されたペプチドとの間の相互作用を調べ、それによって、結合親和性及びペプチドがタンパク質の活性を阻害する能力を増加させる、ペプチドのさらなる修飾を示唆することもまた、可能である。
［００６１］
一実施形態において、ペプチドは、関連ペプチドのファミリーとして生成される。典型的なペプチドは、配列番号１〜１３２によって表される。これらの典型的なペプチドは、選択プロセスを通じて得られたものであり、選択プロセスでは、本明細書に記載されるような、ファージディスプレイ等の親和性選択技術によって、ファージディスプレイ技術により生成された最適結合剤をファージＥＬＩＳＡでさらに分析して、候補ペプチドを得た。しかしながら、本発明のペプチドは、以下に記載される化学合成を含むいかなる公知の方法によっても生成され得る。
［００６２］
ペプチドは、「親和性成熟」のプロセスによってさらに改善可能である。この手順は、ファージディスプレイまたは他の選択技術を用いて、本発明のペプチド及びペプチボディの親和性または活性を増加させることに関する。例えば、コンセンサス配列に基づいて、「コア」アミノ酸（コンセンサス配列から決定される）が一定に保持されるかまたはその発生頻度を偏向させた、定方向二次ファージディスプレイライブラリーを生成することが可能である。あるいは、個々のペプチド配列を用いて、偏向定方向ファージディスプレイライブラリーを生成することが可能である。よりストリンジェントな条件下での、そのようなライブラリーのパニングによって、ミオスタチンへの結合が増進した、ミオスタチンへの選択的結合が増進した、またはさらなる何らかの所望の特性を持つ、ペプチドを生じることが可能である。しかしながら、次いで、化学的合成または組換え的合成を含む、いくつもの既知の方法によって、親和性成熟配列を有するペプチドを産生してもよい。これらのペプチドを用いて、細胞に基づくアッセイ及びインビボアッセイにおいて、より高い阻害活性を示す、多様な形態のペプチボディ等の結合剤を生成する。
［００６３］
以下の実施例６は、親和性成熟ペプチドを産生するための、上述の「第１周期」ペプチドの親和性成熟を記載する。典型的な親和性成熟ペプチボディを表ＩＶ及びＶに示す。次いで、これらのペプチドから作製されて得られた１×及び２×ペプチボディを、結合親和性、ミオスタチン活性を中和する能力、アクチビン等の特定の他のＴＧＦ−βファミリーメンバーと対照的な、ミオスタチンに対する特異性、ならびに以下に記載される、さらなるインビトロ及びインビボ活性に関して、さらに特徴付けした。親和性成熟ペプチド及びペプチボディは、同じファミリーの第１周期ペプチドと区別するために、それらのファミリー名の前に接頭辞「ｍ」を付けて称される。
［００６４］
本発明に従ってさらなる親和性成熟のために選択される、典型的な第１周期ペプチドには、以下のペプチドが含まれた：
ＴＮ８−１９ＱＧＨＣＴＲＷＰＷＭＣＰＰＹ（配列番号３３）
直鎖−２ＭＥＭＬＤＳＬＦＥＬＬＫＤＭＶＰＩＳＫＡ（配列番号１０４）
直鎖−１５ＨＨＧＷＮＹＬＲＫＧＳＡＰＱＷＦＥＡＷＶ（配列番号１１７）
直鎖−１７，ＲＡＴＬＬＫＤＦＷＱＬＶＥＧＹＧＤＮ（配列番号１１９）
直鎖−２０ＹＲＥＭＳＭＬＥＧＬＬＤＶＬＥＲＬＱＨＹ（配列番号１２２）
直鎖−２１ＨＮＳＳＱＭＬＬＳＥＬＩＭＬＶＧＳＭＭＱ（配列番号１２３）
直鎖−２４ＥＦＦＨＷＬＨＮＨＲＳＥＶＮＨＷＬＤＭＮ（配列番号１２６）。
［００６５］
これら各々の親和性成熟ファミリーを以下の表ＩＶ及びＶに示す。
［００６６］
本発明のペプチドにはまた、ミオスタチンに結合可能な選択したペプチドの変異体及び誘導体が含まれる。本明細書で使用される「変異体」という用語は、元来のアミノ酸配列に１つ以上のアミノ酸が挿入されたか、欠失されたか、または置換され、そしてなおミオスタチンに結合可能なペプチドを指す。挿入変異体及び置換変異体は、天然アミノ酸、ならびに非天然存在アミノ酸を含有してもよい。本明細書で使用される「変異体」という用語には、ミオスタチンに結合する能力をなお保持するペプチド断片が含まれる。本明細書で使用される「誘導体」という用語は、挿入変異体、欠失変異体、及び置換変異体とは何らかの点で異なる、化学的に修飾されたペプチドを指す。本発明のペプチド及びペプチボディの変異体及び誘導体が以下により完全に記載される。
【００１０】
ビヒクル
［００６７］
本明細書で使用される「ビヒクル」という用語は、本発明の１つ以上のペプチドに結合することが可能な分子を指す。好ましくは、ビヒクルは、本発明の結合剤に少なくとも１つの所望の特性を与える。ペプチドは、単独では、腎臓濾過、細網内皮系における細胞性クリアランス機構、またはタンパク質分解的分解のいずれかによって、インビボで除去される可能性が高い。ビヒクルへの結合は、結合剤の分解を減少させ、そして／または半減期を増加させ、毒性を減少させ、免疫原性を減少させ、そして／または結合剤の生物学的活性を増加させることによって、結合剤の治療的価値を改善する。
［００６８］
典型的なビヒクルには、Ｆｃドメイン；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリリジン、デキストラン等の直鎖ポリマー；分枝鎖ポリマー（例えば、１９８１年９月１５日に発行されたＤｅｎｋｅｎｗａｌｔｅｒらの米国特許第４，２８９，８７２号；１９９３年７月２０日に発行されたＴａｍらの米国特許第５，２２９，４９０号；１９９３年１０月２８日に公開されたＦｒｅｃｈｅｔらによる第ＷＯ９３／２１２５９号を参照のこと）；脂質；コレステロール群（ステロイド等）；炭水化物またはオリゴ糖；あるいはサルベージ受容体に結合するいずれかの天然または合成タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドが含まれる。
［００６９］
一実施形態において、本発明のミオスタチン結合剤はペプチド（複数を含む）のアミノ酸残基の１つのＮ末端、Ｃ末端、または側鎖を通じて、少なくとも１つのビヒクル（Ｆ１、Ｆ２）に結合した少なくとも１つのペプチドを有する。複数のビヒクルもまた使用され得、例えば、各末端にＦｃドメインが、または１つの末端にＦｃドメインが、そしてもう一方の末端または側鎖にＰＥＧ基があってもよい。
【００１１】
Ｆｃドメイン
［００７０］
Ｆｃドメインは、１つの好ましいビヒクルである。本明細書で使用される「Ｆｃドメイン」という用語は、天然Ｆｃ及びＦｃ変異体分子、ならびに以下に定義されるような配列が含まれる。本明細書で使用される「天然Ｆｃ」という用語は、組換えＤＮＡ技術によって、または無傷抗体の酵素的またはもしくは化学的切断によって産生される、抗体の非抗原結合断片、またはその断片のアミノ酸配列を指す。好ましいＦｃは、完全ヒトＦｃであり、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２等の免疫グロブリンのいずれに由来してもよい。しかしながら、部分的にヒトであるか、または非ヒト種に由来するＦｃ分子もまた、本明細書に含まれる。天然Ｆｃ分子は、共有結合（すなわち、ジスルフィド結合）及び非共有結合によって二量体型または多量体型に連結されることも可能な、単量体ポリペプチドで構成される。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）に応じて、１〜４の範囲である。天然Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化から生じるジスルフィド結合二量体である（Ｅｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２），Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ１０：４０７１−９を参照のこと）。本明細書で使用される「天然Ｆｃ」という用語は、単量体型、二量体型、及び多量体型を指すように用いられる。
［００７１］
本明細書で使用される「Ｆｃ変異体」という用語は、例えば、第ＷＯ９７／３４６３１号及び第ＷＯ９６／３２４７８号に記載され、これらの両方は参照により本明細書に組み込まれる、サルベージ受容体への結合が維持されるという条件付きの天然Ｆｃ配列の修飾型を指す。Ｆｃ変位体は、例えば、残基を置換するかまたは欠失させるか、残基を挿入するか、あるいは部位を含有する部分を切断することによって、構築され得る。挿入残基または置換残基はまた、ペプチド模倣体またはＤ−アミノ酸等の改変されたアミノ酸であり得る。Ｆｃ変異体は、いくつかの理由で望ましくあり得、理由のいくつかが以下に記載される。典型的なＦｃ変異体には、以下の分子及び配列が含まれる：
［００７２］
１．ジスルフィド結合形成に関与する部位が除去されている。そのような除去は、本発明の分子を産生するのに用いる宿主細胞に存在する、他のシステイン含有タンパク質との反応が回避し得る。この目的のため、Ｎ末端のシステイン含有セグメントを一部切除してもよいし、あるいはシステイン残基を欠失させるか、または他のアミノ酸（例えば、アラニル、セリル）で置換してもよい。システイン残基を除去する場合であっても、一本鎖Ｆｃドメインはなお、非共有的に一緒に保持される二量体Ｆｃドメインを形成することも可能である。
［００７３］
２．選択した宿主細胞に、より適合するように、天然Ｆｃが修飾されている。例えば、典型的な天然ＦｃのＮ末端近傍に位置し、プロリンイミノペプチダーゼ等の大腸菌の消化酵素によって認識され得る、ＰＡ配列を除去してもよい。分子が大腸菌等の細菌細胞で組換え的に発現される場合は特に、Ｎ末端メチオニル残基を付加してもよい。
［００７４］
３．選択した宿主細胞で発現した際、Ｎ末端が不均一になるのを防止するため、天然ＦｃのＮ末端部分が除去されている。この目的のため、Ｎ末端の最初の２０アミノ酸残基のいずれか、特に、１位、２位、３位、４位、及び５位のものを欠失させてもよい。
［００７５］
４．１つ以上のグリコシル化部位が除去されている。典型的にグリコシル化される残基（例えば、アスパラギン）は、細胞溶解反応を与え得る。そのような残基を欠失させるか、または非グリコシル化残基（例えば、アラニン）で置換してもよい。
［００７６］
５．補体との相互作用に関与する部位、例えば、Ｃ１ｑ結合部位が除去されている。例えば、ヒトＩｇＧ１のＥＫＫ配列を欠失させるかまたは置換してもよい。本発明の分子には、補体動員は有利でない可能性もあり、したがって、そのようなＦｃ変異体によってこれを回避することもあり得る。
［００７７］
６．サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合に影響を及ぼす部位が除去されている。天然Ｆｃは、特定の白血球と相互作用するための部位を有する可能性があり、こうした部位は、本発明の融合分子には必要ではなく、したがって、除去してもよい。
［００７８］
７．ＡＤＣＣ部位が除去されている。ＡＤＣＣ部位は、当該技術分野で知られている。例えば、ＩｇＧ１におけるＡＤＣＣ部位に関しては、Ｍｏｌｅｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ２９（５）：６３３−９（１９９２）を参照のこと。これらの部位もまた、本発明の融合分子には必要ではなく、したがって、除去してもよい。
［００７９］
８．天然Ｆｃが非ヒト抗体に由来する場合、天然Ｆｃをヒト化してもよい。典型的には、天然Ｆｃをヒト化するために、非ヒト天然Ｆｃの選択残基を、ヒト天然Ｆｃに通常見られる残基で置換する。抗体をヒト化する技術は、当該技術分野で周知である。
［００８０］
「Ｆｃドメイン」という用語には、全抗体から消化されたか、または他の手段によって産生された、単量体型または多量体型の分子が含まれる。本明細書で使用される「多量体」という用語は、ＦｃドメインまたはＦｃドメインを含む分子に適用されるとき、共有結合、非共有結合、または共有結合と非共有結合の両方の相互作用によって連結された２つ以上のポリペプチド鎖を有する分子を指す。ＩｇＧ分子は、典型的には二量体を形成し、ＩｇＭは五量体、ＩｇＤは二量体、ＩｇＡは単量体、二量体、三量体、または四量体を形成する。多量体は、Ｆｃの天然Ｉｇ供給源の配列と得られた活性を利用することによって、またはそのような天然Ｆｃを誘導体化することによって、形成され得る。ＦｃドメインまたはＦｃドメインを含む分子に適用されるとき、「二量体」という用語は、共有結合または非共有結合によって連結された２つのポリペプチド鎖を有する分子を指す。
【００１２】
非Ｆｃビヒクル
［００８１］
さらに、本発明に従って別のビヒクルは、サルベージ受容体に結合可能な非Ｆｃドメインタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片、または小分子（例えば、ペプチド模倣体化合物）である。例えば、１９９８年４月１４日に発行された、Ｐｒｅｓｔａらの米国特許第５，７３９，２７７号に記載される、ポリペプチドをビヒクルとして使用され得、また、ＦｃＲｎサルベージ受容体に対する結合に関して、ファージディスプレイによってペプチドが選択され得る。そのようなサルベージ受容体結合化合物もまた、「ビヒクル」の意味の中に含まれ、本発明の範囲内である。そのようなビヒクルは、半減期を増加させ（例えば、プロテアーゼによって認識される配列を回避することによって）、免疫原性を減少させる（例えば、抗体ヒト化において発見されるような、非免疫原性配列を好むことによって）ように選択されるべきである。
［００８２］
さらに、ポリマービヒクルもまた、本発明の結合剤を構築するために使用され得る。ビヒクルとして有用な化学部分を結合させる多様な手段が現在利用可能であり、例えば、特許協力条約（「ＰＣＴ」）国際公開第ＷＯ９６／１１９５３号、表題「Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」を参照されたく、これは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。このＰＣＴ公報は、とりわけ、タンパク質のＮ末端への水溶性ポリマーの選択的結合を開示する。
［００８３］
好ましいポリマービヒクルは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧ基は、いかなる好適な分子量のものであってもよく、直鎖であってもまたは分枝鎖であってもよい。ＰＥＧの平均分子量は、好ましくは約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、より好ましくは約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、最も好ましくは約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａの範囲であろう。ＰＥＧ基は、一般的に、アシル化または還元的アルキル化を介し、ＰＥＧ部分上の反応基（例えば、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、またはエステル基）を通じて、本発明の化合物上の反応基（例えば、アルデヒド基、アミノ基、またはエステル基）に対して、本発明の化合物と結合されるであろう。合成ペプチドのＰＥＧ化のために有用な戦略は、溶液中で複合連結を形成することを通して、各々が他方に対して相互に反応性である特殊な官能性を担う、ペプチドとＰＥＧ部分とを結合することからなる。ペプチドは、当該技術分野で知られているような従来の固相合成で容易に調製可能である。ペプチドは、特定の部位において適切な官能基で「前活性化」されている。ＰＥＧ部分と反応させる前に、前駆物質を精製し、十分に特徴付ける。ペプチドとＰＥＧのライゲーションは、通常、水相で行われ、逆相分析ＨＰＬＣによって、容易にモニターすることができる。ＰＥＧ化ペプチドは分取ＨＰＬＣによって容易に精製でき、分析ＨＰＬＣ、アミノ酸分析、及びレーザー脱着質量分析によって特徴付けることができる。
［００８４］
多糖類ポリマーは、タンパク質修飾に使用され得る別の種類の水溶性ポリマーである。デキストランは、ａ１−６連結によって主に連結されたグルコースの個々のサブユニットからなる、多糖ポリマーである。デキストラン自体は、多くの分子量範囲で入手可能であり、約１ｋＤ〜約７０ｋＤの分子量のものが容易に入手できる。デキストランは、それ自体でまたは別のビヒクル（例えば、Ｆｃ）と組み合わせて、ビヒクルとして、本発明で使用するのに適した水溶性ポリマーである。例えば、第ＷＯ９６／１１９５３号及び第ＷＯ９６／０５３０９号を参照のこと。治療用または診断用免疫グロブリンに複合したデキストランの使用が報告されている；例えば、欧州特許公開第０  ３１５  ４５６号を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる。デキストランを本発明に従ってビヒクルとして用いる場合、約１ｋＤａ〜約２０ｋＤａのデキストランが好ましい。
【００１３】
リンカー
［００８５］
本発明で使用されるミオスタチン作動薬は、任意に、「リンカー」基をさらに含む。一実施形態において、リンカーは、配列ＧＧＧＧＧＡＱ（配列番号６３６）からなる。
［００８６］
リンカーは、主に、ペプチド及びビヒクルの間のスペーサー、または本発明の結合剤の２つのペプチドの間のスペーサーとして働く。一実施形態において、リンカーは、ペプチド結合によってともに連結されたアミノ酸、好ましくはペプチド結合によって連結された１〜２０アミノ酸で構成され、アミノ酸は２０の天然存在アミノ酸から選択される。これらのアミノ酸のうちの１つ以上は、当業者に理解されるように、グリコシル化され得る。一実施形態において、１〜２０アミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、及びリジンから選択される。好ましくは、リンカーは、立体障害とならない、グリシン及びアラニン等のアミノ酸で大部分が構成される。したがって、典型的なリンカーは、ポリグリシン（特に（Ｇｌｙ）５、（Ｇｌｙ）８）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、及びポリアラニンである。本明細書で使用される、記号表示「ｇ」はグリシンホモペプチドリンカーを指す。表ＩＩに示される、「ｇｎ」は、Ｎ末端の５×ｇｌｙリンカーを指し、一方、「ｇｃ」は、Ｃ末端の５×ｇｌｙリンカーを指す。Ｇｌｙ及びＡｌａの組み合わせもまた好ましい。本発明の結合剤を構築するのに有用な１つの典型的なリンカー配列は、以下の通りである：ｇｓｇｓａｔｇｇｓｇｓｔａｓｓｇｓｇｓａｔｇ（配列番号３０５）。このリンカー配列は、「ｋ」または１ｋ配列と称される。表ＩＩに見られるような記号表示「ｋｃ」は、Ｃ末端のｋリンカーを指し、一方、記号表示「ｋｎ」は、Ｎ末端のｋリンカーを指す。
［００８７］
本発明のリンカーはまた、非ペプチドリンカーであってもよい。例えば、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−（式中ｓ＝２〜２０）等のアルキルリンカーを使用することができる。これらのアルキルリンカーは、低級アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニル等のような立体障害とならない基のいずれかによってさらに置換されていてもよい。典型的な非ペプチドリンカーは、ＰＥＧリンカーであり、１００〜５０００ｋＤａ、好ましくは１００〜５００ｋＤａの分子量を有する。ペプチドリンカーを改変して、上と同じ方式で誘導体を形成してもよい。
【００１４】
典型的なミオスタチン拮抗薬、例えば、結合剤
［００８８］
ミオスタチン作動薬、例えば、本明細書に記載される方法で使用される結合剤は、ミオスタチンに結合可能な少なくとも１つのペプチド、例えば、配列番号３１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含む。
［００８９］
一実施形態において、ミオスタチン結合ペプチドは、約５〜約５０アミノ酸長であり、別の態様において、約１０〜３０アミノ酸長であり、別の態様において、約１０〜２５アミノ酸長である。一実施形態において、ミオスタチン結合ペプチドは、アミノ酸配列ＷＭＣＰＰ（配列番号６３３）を含む。他の実施形態において、ミオスタチン結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｃａ１ａ２Ｗａ３ＷＭＣＰＰ（配列番号３５２）を含み、式中、ａ１、ａ２、及びａ３は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸から選択される。別の実施形態において、ミオスタチン結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｃｂ１ｂ２Ｗｂ３ＷＭＣＰＰ（配列番号３５３）を含み、式中、ｂ１は、アミノ酸Ｔ、Ｉ、またはＲのいずれか１つから選択され、ｂ２は、Ｒ、Ｓ、Ｑのいずれか１つから選択され、ｂ３は、Ｐ、Ｒ、及びＱのいずれか１つから選択され、１０〜５０アミノ酸長であるペプチドと、その薬学的に許容される塩と、を含む。
［００９０］
他のミオスタチン結合ペプチドは、式：
ｃ１ｃ２ｃ３ｃ４ｃ５ｃ６Ｃｃ７ｃ８Ｗｃ９ＷＭＣＰＰｃ１０ｃ１１ｃ１２ｃ１３（配列番号３５４）を提供し、式中
ｃ１は、存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
ｃ２は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
ｃ３は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
ｃ４は、存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
ｃ５は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
ｃ６は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは塩基性アミノ酸であり、
ｃ７は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸であり、
ｃ８は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸であり、
ｃ９は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸であり、
ｃ１０〜ｃ１３は、任意のアミノ酸であり、２０〜５０アミノ酸長であるペプチドと、その薬学的に許容される塩と、を含む。
［００９１］
他のミオスタチン結合ペプチドは、式：
ｄ１ｄ２ｄ３ｄ４ｄ５ｄ６Ｃｄ７ｄ８Ｗｄ９ＷＭＣＰＰｄ１０ｄ１１ｄ１２ｄ１３（配列番号３５５）であって、式中
ｄ１は、存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
ｄ２は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
ｄ３は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
ｄ４は、存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
ｄ５は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
ｄ６は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは塩基性アミノ酸であり、
ｄ７は、アミノ酸Ｔ、Ｉ、またはＲのうちのいずれか１つから選択され、
ｄ８は、Ｒ、Ｓ、Ｑのうちのいずれか１つから選択され、
ｄ９は、Ｐ、Ｒ、及びＱのうちのいずれか１つから選択され、
ｄ１０〜ｄ１３は、任意のアミノ酸から選択され、
２０〜５０アミノ酸長であるペプチドと、その薬学的に許容される塩と、を含む。
［００９２］
他のミオスタチン結合ペプチドは、以下のペプチドのうちの少なくとも１つを含む：
（１）ミオスタチンに結合可能なペプチドであって、当該ペプチドは、配列ＷＹｅ１ｅ２Ｙｅ３Ｇ（配列番号３５６）であって、
式中、ｅ１は、Ｐ、Ｓ、またはＹであり、
ｅ２は、ＣまたはＱであり、
ｅ３は、ＧまたはＨである、当該配列を含み、７〜５０アミノ酸長である、ミオスタチンに結合可能なペプチド、及びその薬学的に許容される塩。
【００１５】
（２）ミオスタチンに結合可能なペプチドであって、当該ペプチドは、配列ｆ１ＥＭＬｆ２ＳＬｆ３ｆ４ＬＬ（配列番号４５５）であって、
式中、ｆ１は、ＭまたはＩであり、
ｆ２は、任意のアミノ酸であり、
ｆ３は、ＬまたはＦであり、
ｆ４は、Ｅ、Ｑ、またはＤである、当該配列を含み、
７〜５０アミノ酸長である、ミオスタチンに結合可能なペプチド、及びその薬学的に許容される塩。
【００１６】
（３）ミオスタチンに結合可能なペプチドであって、当該ペプチドは、配列Ｌｇ１ｇ２ＬＬｇ３ｇ４Ｌ（配列番号４５６）であって、式中
ｇ１は、Ｑ、Ｄ、またはＥであり、
ｇ２は、Ｓ、Ｑ、Ｄ、またはＥであり、
ｇ３は、任意のアミノ酸であり、
ｇ４は、Ｌ、Ｗ、Ｆ、またはＹである、当該配列を含み、８〜５０アミノ酸長である、ミオスタチンに結合可能なペプチド、及びその薬学的に許容される塩。
【００１７】
（４）ミオスタチンに結合可能なペプチドであって、当該ペプチドは、配列ｈ１ｈ２ｈ３ｈ４ｈ５ｈ６ｈ７ｈ８ｈ９（配列番号４５７）であって、式中
ｈ１は、ＲまたはＤであり、
ｈ２は、任意のアミノ酸であり、
ｈ３は、Ａ、Ｔ  Ｓ、またはＱであり、
ｈ４は、ＬまたはＭであり、
ｈ５は、ＬまたはＳであり、
ｈ６は、任意のアミノ酸であり、
ｈ７は、ＦまたはＥであり、
ｈ８は、Ｗ、Ｆ、またはＣであり、
ｈ９は、Ｌ、Ｆ、Ｍ、またはＫである、当該配列を含み、９〜５０アミノ酸長である、ミオスタチンに結合可能なペプチド、及びその薬学的に許容される塩。
［００９３］
他のミオスタチン結合ペプチドは、一般化された構造：
（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ、またはその多量体を有し、
式中、Ｆ１は、ビヒクルであり、Ｘ１及びＸ２は、各々独立して、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３、
及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４から選択され、
式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、及びＰ４は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、各々リンカーであり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは、各々独立して、０または１であるが、但し、ａ及びｂのうちの少なくとも１つは１である。
［００９４］
他のミオスタチン結合ペプチドは、この一般化された構造を有し、提供されるペプチドから選択され得るペプチドＰ１、Ｐ２、Ｐ３、及びＰ４は、配列番号６３３、配列番号３５２、配列番号３５３、配列番号３５４、配列番号３５５、配列番号３５６、配列番号４５５、配列番号４５６、または配列番号４５７の配列のうちのいずれかを含む１つ以上のペプチドから選択され得る。別の実施形態において、Ｐ  Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、及びＰ４は、独立して、配列番号３０５〜３５１及び配列番号３５７〜４５４の配列のうちのいずれかを含む１つ以上のペプチドから選択される。
［００９５］
さらなる実施形態において、上の一般式を有する結合剤のビヒクルは、Ｆｃドメインである。ペプチドは、したがって、直接的または間接的のいずれかでＦｃドメインに融合し、それによってペプチボディを提供する。本発明のペプチボディは、ミオスタチンに高い結合親和性を示し、本明細書に提供されるインビトロアッセイ及び動物におけるインビボ試験によって示されるように、ミオスタチンの活性を阻害可能である。
【００１８】
ペプチド及びペプチボディの変異体及び誘導体
［００９６］
ミオスタチン作動薬、例えば、本明細書に記載される結合剤はまた、本明細書に記載されるペプチド及びペプチボディの変異体及び誘導体も包含する。本発明のペプチド及びペプチボディの両方が、アミノ酸配列に関して記載されることも可能であるため、「変異体」及び「誘導体」という用語は、ペプチドのみ、またはペプチボディの構成要素としてのペプチドに適用して述べることも可能である。本明細書で使用される「ペプチド変異体」という用語は、元来のアミノ酸配列に１つ以上のアミノ酸残基が挿入されたか、欠失されたか、または置換され、ミオスタチンに結合し、その活性を修飾する能力を保持するペプチドまたはペプチボディを指す。本明細書で使用されるペプチドまたはペプチボディの断片は、「変異体」の定義内に含まれる。
［００９７］
例えば、本方法に使用されるミオスタチン拮抗薬は、配列番号６３５に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを含むペプチボディを含むことができる。
［００９８］
いかなる所定のペプチドまたはペプチボディが１つまたは２つまたは３つすべての種類の変異体を含有してもよいことが理解される。挿入変異体及び置換変異体は、天然アミノ酸、ならびに非天然存在アミノ酸、または両方を含有してもよい。
［００９９］
ペプチド及びペプチボディ変異体はまた、リーダー配列またはシグナル配列が除去された、成熟ペプチド及びペプチボディを含み、得られたタンパク質は、アミノ酸が天然であっても、非天然であってもよい、さらなるアミノ末端残基を有する。アミノ酸１位に追加メチオニル残基を有するペプチボディ（Ｍｅｔ−１−ペプチボディ）が企図され、２位及び１位に追加メチオニル残基及びリシン残基を有するペプチボディ（Ｍｅｔ−２−Ｌｙｓ−１−）も企図される。追加のＭｅｔ、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ残基（または、通常１つ以上の塩基性残基）を有する変異体は、細菌宿主細胞における組換えタンパク質産生を高めるために特に有用である。
［０１００］
本発明のペプチドまたはペプチボディ変異体はまた、特定発現系を使用して生ずる追加アミノ酸残基を有するペプチドも含む。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合産物の一部として所望のポリペプチドを発現する市販のベクターの使用は、所望のポリペプチドからＧＳＴ成分を切断後、アミノ酸１位に追加グリシン残基を有する所望のポリペプチドを提供する。ヒスチジンタグを、通常配列のカルボキシ及び／またはアミノ末端でアミノ酸配列に組み込んだものを含む他のベクター系での発現により生ずる変異体も企図される。
［０１０１］
一例において、天然存在または非天然存在アミノ酸のいずれかの１つ以上のアミノ酸残基がペプチドアミノ酸配列に付加される、挿入変異体が提供される。挿入は、タンパク質の片方または両方の末端に位置してもよいし、あるいはペプチボディアミノ酸配列の内部領域内に位置してもよい。片方または両方の末端に追加残基を有する挿入変異体には、例えば、融合タンパク質、及びアミノ酸タグまたは標識を含むタンパク質が含まれ得る。挿入変異体には、１つ以上のアミノ酸残基がペプチドアミノ酸配列に付加されているペプチドまたはその断片が含まれる。
［０１０２］
挿入変異体はまた、ペプチドまたはペプチボディのアミノ及びまたはカルボキシ末端が別のポリペプチド、その断片、または特定のタンパク質配列の一部として通常認識されないアミノ酸に融合している、融合タンパク質も含む。そのような融合タンパク質の例は、免疫原性ポリペプチド、免疫グロブリン定常領域等の長い循環半減期を有するタンパク質、マーカータンパク質、所望のペプチドまたはペプチボディの精製を容易にするタンパク質またはポリペプチド、及び多量体タンパク質の形成を促進するポリペプチド配列（二量体形成／安定性に有用なロイシンジッパーモチーフ等）である。
［０１０３］
この種の挿入変異体は、一般的に、Ｎ末端またはＣ末端で連結された天然分子の全部または実質的部分を有する。例えば、融合タンパク質は、典型的には、他の種由来のリーダー配列を使用して、異種宿主におけるタンパク質の組換え体発現を可能にする。別の有用な融合タンパク質には、融合タンパク質の精製を容易にする免疫学的活性ドメイン、例えば抗体エピトープの付加が含まれる。融合接合部またはその近傍に切断部位を含むと、精製後の外来ポリペプチドの除去が容易になるであろう。他の有用な融合には、酵素由来の活性部位等の機能ドメイン、グリコシル化ドメイン、細胞性標的シグナル、または膜貫通領域の連結が含まれる。
［０１０４］
本発明で使用され得る、多様な市販の融合タンパク質発現系がある。特に有用な系には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、マルトース結合タンパク質系（ＮＥＢ、Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，ＭＡ）、ＦＬＡＧ系（ＩＢＩ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）、及び６×Ｈｉｓ系（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）が含まれるが、これらに限定されない。これらの系は、少数の追加アミノ酸しか持たない組換えペプチド及び／またはペプチボディを産生することが可能であり、ペプチドまたはペプチボディの活性に有意に影響を及ぼす可能性が低い。例えば、ＦＬＡＧ系及び６×Ｈｉｓ系は両方とも、抗原性に乏しいことが知られており、ポリペプチドの天然配座へのフォールディングに悪影響を及ぼさない短い配列のみを付加する。有用であることが企図される別のＮ末端融合は、タンパク質またはペプチドのＮ末端領域でのＭｅｔ−Ｌｙｓジペプチドの融合である。そのような融合により、タンパク質発現または活性の有益な増加を生じ得る。
［０１０５］
他の融合系は、ポリペプチドハイブリッドを生じ、そこでは所望のペプチドまたはペプチボディから融合パートナーを切除することが望ましい。一実施形態において、融合パートナーは、プロテアーゼの特異的認識配列を含有するペプチド配列によって、組換えペプチボディに連結される。適切な配列の例は、タバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）または因子Ｘａ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，ＭＡ）によって認識されるものである。
［０１０６］
本発明はまた、一部切除組織因子（ｔＴＦ）と組み合わせて、本発明のペプチドまたはペプチボディのすべてまたは部分を含む融合ポリペプチドも提供する。ｔＴＦは、米国特許第５，８７７，２８９号、同第６，００４，５５５号、同第６，１３２，７２９号、同第６，１３２，７３０号、同第６，１５６，３２１号、及び欧州特許第ＥＰ０９８８０５６号に記載されるように、腫瘍血管凝固剤として作用する、ヒト凝血誘導タンパク質の一部切除型からなる血管標的剤である。ｔＴＦを抗ミオスタチンペプチボディまたはペプチド、あるいはその断片に融合させると、標的細胞、例えば骨格筋細胞、心筋細胞、線維芽細胞、前脂肪細胞、及び場合によって脂肪細胞への抗ミオスタチン拮抗薬の送達が促進される。
［０１０７］
別の態様において、本発明は、ペプチドまたはペプチボディ中の１つ以上のアミノ酸残基が除去されている欠失変異体を提供する。欠失は、ペプチボディの片方または両方の末端で、あるいはペプチボディアミノ酸配列内の１つ以上の残基の除去により生じ得る。欠失変異体には、必ず、ペプチドまたはペプチボディのすべての断片が含まれる。
［０１０８］
さらに別の態様において、本発明は、本発明のペプチド及びペプチボディの置換変異体を提供する。置換変異体には、１つ以上のアミノ酸残基が除去され、１つ以上の別のアミノ酸と置き換えられているペプチド及びペプチボディが含まれ、これらのアミノ酸は、天然存在であっても、非天然存在であってもよい。置換変異体は、２つの分子が、特定の割合で同一のアミノ酸を有する点で、元来のペプチドまたはペプチボディに「類似」であるペプチドまたはペプチボディを生成する。置換変異体は、ペプチドまたはペプチボディ内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、及び２０アミノ酸の置換を含み、置換の数は、ペプチドまたはペプチボディのアミノ酸の１０パーセントまでであることも可能である。１つの態様において、置換の性質は保存的であるが、本発明は、非保存的置換もまた含み、非従来アミノ酸もまた含む。
［０１０９］
関連ペプチド及びペプチボディの同一性及び類似性は、既知の方法によって容易に計算可能である。そのような方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ１，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）、及びＣａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載されるものが含まれる。
［０１１０］
２つのペプチドもしくはポリペプチドの関連性または同一性パーセント、またはポリペプチド及びペプチドの関連性または同一性パーセントを決定する好ましい方法を設計して、試験する配列間の最大のマッチを得る。同一性を決定する方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムに記述されている。２つの配列間の同一性を決定する好ましいコンピュータプログラム法には、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１２：３８７（１９８４）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ａｎｄ  ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））を含む、ＧＣＧプログラムパッケージが含まれるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、米国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）及び他のソース（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ２０８９４、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，上記（１９９０））から公的に利用可能である。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために使用され得る。
［０１１１］
２つのアミノ酸配列をアライメントするためのある特定のアライメントスキームは、２つの配列の短い領域のみのマッチングを生じることも可能であり、２つの全長配列間に有意な関係がない場合であっても、この小さいアライメント領域が非常に高い配列同一性を有する可能性もある。したがって、ある特定の実施形態において、選択されるアライメント法は、比較している標的ポリペプチドの全長の少なくとも１０パーセント、すなわち少なくとも４００アミノ酸の配列を比較している場合は、少なくとも４０の隣接アミノ酸、少なくとも３００〜約４００アミノ酸の配列を比較している場合は、３０の隣接アミノ酸、２００〜約３００アミノ酸の配列を比較している場合は、少なくとも２０の隣接アミノ酸、そして約１００〜２００アミノ酸の配列を比較している場合は、少なくとも１０の隣接アミノ酸にわたるアライメントを生じるであろう。例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、配列同一性パーセントを決定しようとする２つのポリペプチドを、それぞれのアミノ酸の最適マッチング（アルゴリズムによって決定されるような「マッチング化スパン」）のためにアライメントする。ある特定の実施態様において、ギャップ開始ペナルティ（通常、３×平均対角要素（ｄｉａｇｏｎａｌ）として計算される；「平均対角要素」とは、使用される比較マトリックスの対角要素の平均値である；「対角要素」とは、特定の比較マトリックスにより完全アミノ酸マッチにそれぞれ割り当てられるスコアまたは数値である）、ギャップ伸長ペナルティ（通常、ギャップ開始ペナルティの１／１０倍）が、例えば、ＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２等の比較マトリックスとともに、アルゴリズムと併せて使用される。ある特定の実施形態において、標準比較マトリックス（ＰＡＭ２５０比較マトリックスに関して、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５（３）（１９７８）、ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスに関して、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）を参照のこと）もまた、アルゴリズムにより使用される。
［０１１２］
ある特定の実施形態において、例えば、ポリペプチド配列の比較のためのパラメータは、アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３（１９７０）、比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，上記（１９９２）からのＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップペナルティ：１２、ギャップ長ペナルティ：４、類似性の閾値：０、エンドギャップに対してはペナルティなし、を用いて作成され得る。
［０１１３］
ある特定の実施形態において、（アミノ酸配列ではなく）ポリヌクレオチド分子配列比較のパラメータは、アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，上記（１９７０）；比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０；ギャップペナルティ：５０：ギャップ長ペナルティ：３、を用いて作成され得る。
［０１１４］
Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，１９９７に記載されるものを含む、他の典型的なアルゴリズム、ギャップ開始ペナルティ、ギャップ伸長ペナルティ、比較マトリックス、類似性の閾値等が、使用され得る。行うべき特定の選択は、当業者には明らかであり、ＤＮＡ−対−ＤＮＡ、タンパク質−対−タンパク質、タンパク質−対−ＤＮＡ等の、行おうとする特定の比較に応じて、さらに、比較が所定の配列対間である（この場合、一般的にはＧＡＰまたはＢｅｓｔＦｉｔが好ましい）か、または１つの配列及び大きな配列データベース間である（この場合、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＡが好ましい）かに応じるであろう。
［０１１５］
２０個の従来（天然存在）アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、α−，α−二置換アミノ酸等の非天然存在アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、及び他の非従来アミノ酸もまた、本発明のペプチドに適した構成要素であり得る。非天然存在アミノ酸の例には、例えば、アミノアジピン酸、ベータ−アラニン、ベータ−アミノプロピオン酸、アミノ酪酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸、アミノヘプタン酸、アミノイソ酪酸、アミノピメリン酸、ジアミノ酪酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、サルコシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン（ｏｒｉｔｈｉｎｅ）、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、及び他の類似のアミノ酸、及びアミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。
［０１１６］
天然存在残基は、共通の側鎖特性に基づいて、（重複する）種類に分けることも可能である：
１）中性疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ；
２）中性極性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
［０１１７］
アミノ酸の置換は、保存的であることが可能であり、そのような置換は、元来のペプチドと類似の機能的特性及び化学的特性を有するペプチドを生じる。保存的アミノ酸置換は、上記の種類の１つのメンバーと、同じ種類の別のメンバーを交換することを伴う。保存的変化は、非従来アミノ酸残基を含むことも可能であり、これは、典型的には、生物学的系における合成ではなく、化学的ペプチド合成によって取り込まれる。これらには、ペプチド模倣体、及びアミノ酸部分の他の逆転（ｒｅｖｅｒｓｅｄ）型または反転（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）型が含まれる。
［０１１８］
非保存的置換は、これらの種類の１つのメンバーと別の種類のメンバーとの交換を伴い得る。これらの変化は、ペプチドの機能的特性及び／または化学的特性に著しい変更を生じ得る。そのような変化を加える場合、ある特定の態様に従うと、アミノ酸のヒドロパシー指数が考慮され得る。各アミノ酸には、その疎水性及び電荷特性に基づいて、ヒドロパシー指数が割り当てられている。これらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸塩（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸塩（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）である。
［０１１９］
タンパク質に対して相互作用の生物学的機能を付与する際のアミノ酸ヒドロパシー指数の重要性は当該技術分野で理解されている。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３１（１９８２）。ある特定のアミノ酸が、類似のヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸で置換され、なお類似の生物学的活性を保持し得ることは公知である。ヒドロパシー指数に基づいて変化を加える場合、ある特定の実施態様において、ヒドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。ある特定の実施形態において、±１以内であるものが含まれ、ある特定の実施態様において、±０．５以内であるものが含まれる。
［０１２０］
また、類似アミノ酸の置換は、親水性に基づいて、特にそれによって生成される生物学的に機能性のあるペプチボディまたはペプチドが本発明のように、免疫学的実施態様における使用を目的とする場合には効果的になされ得ることも当該技術分野で理解されている。ある特定の実施形態において、隣接するアミノ酸の親水性により決定されるタンパク質の最高局所的平均親水性（ｌｏｃａｌ  ａｖｅｒａｇｅ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）は、その免疫原性及び抗原性、すなわちタンパク質の生物学的特性に相関している。
［０１２１］
以下の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸塩（＋３．０±１）；グルタミン酸塩（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；及びトリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて変化を加える場合、ある特定の実施態様において、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれ、ある特定の実施形態において、±１以内であるものが含まれ、ある特定の態様において、±０．５以内であるものが含まれる。また、親水性に基づいて、一次アミノ酸配列からエピトープを同定してもよい。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」とも称される。
［０１２２］
典型的なアミノ酸を以下の表Ａに示す。
【００１９】
【表１】
2016516064.tif 000003
【００２０】
［０１２３］
当業者は、例えば、ランダム置換によって本発明のペプチド及びペプチボディの変異体を産生し、本明細書に記載されるアッセイを用いて、結合活性に関して、得られたペプチドまたはペプチボディを試験することも可能であろう。
［０１２４］
さらに、当業者は、活性または構造にとって重要である残基を類似のポリペプチド中で特定するために、構造−機能研究または三次元構造分析を検討することができる。そのような比較を考慮して、類似のタンパク質において、活性または構造にとって重要であるアミノ酸残基に対応する、タンパク質中のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、そのようにして予測された重要なアミノ酸残基に関して、化学的に類似のアミノ酸置換を選択してもよい。次いで、本明細書に記載される活性アッセイを用いて、変異体をスクリーニングすることができる。
［０１２５］
多数の科学的刊行物が二次構造の予測に当てられている。Ｍｏｕｌｔ  Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７（４）：４２２−４２７（１９９６）、Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３（２）：２２２−２４５（１９７４）、Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１３（２）：２１１−２２２（１９７４）、Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４７：４５−１４８（１９７８）、Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２５１−２７６、及びＣｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７−３８４（１９７９）を参照のこと。さらに、二次構造を予測するのを補助するコンピュータプログラムが現在利用可能である。二次構造を予測する１つの方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、３０％を超える配列同一性、または４０％を超える類似性を有する、２つのポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば、類似の構造的トポロジーを有する。タンパク質の構造内の可能性のある折り畳みの数を含む、二次構造の予測可能性が向上したタンパク質構造データベース（ＰＤＢ）が最近開発された。Ｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２７（１）：２４４−２４７（１９９９）を参照のこと。所与のタンパク質における折り畳みの数は限られており、決定的な数の構造が解明されたら、構造予測は劇的により正確になるであろうと示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３６９−３７６（１９９７））。
［０１２６］
二次構造を予測するさらなる方法には、「縫合」（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３７７−８７（１９９７）、Ｓｉｐｐｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４（１）：１５−１９（１９９６））、「プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−１７０（１９９１）、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１８３：１４６−１５９（１９９０）、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４（１３）：４３５５−４３５８（１９８７））、及び「進化的連結」（Ｈｏｌｍ，上記（１９９９）及びＢｒｅｎｎｅｒ，上記（１９９７）を参照のこと）が含まれる。
［０１２７］
ある特定の実施形態において、ペプチドまたはペプチボディ変異体には、グリコシル化変異体が含まれ、変異体では、Ｎ結合型グリコシル化部位等の１つ以上のグリコシル化部位がペプチボディに付加されている。Ｎ結合型グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴付けられ、ここで、Ｘで表されるアミノ酸残基は、プロリン以外のあらゆるアミノ酸残基であり得る。この配列が生ずるようにアミノ酸残基の置換または付加により、Ｎ結合型炭水化物鎖を付加するための潜在的な新規の部位が提供される。あるいは、この配列を除去する置換は、存在するＮ結合型炭水化物鎖を除去するであろう。また、１つ以上のＮ結合型グリコシル化部位（典型的には天然存在のものである）を除去し、１つ以上の新規のＮ結合型部位を生成する、Ｎ結合型炭水化物鎖の再配置も提供される。
【００２１】
誘導体
［０１２８］
本発明はまた、本発明のペプチドまたはペプチボディの「誘導体」も提供する。本明細書で使用される「誘導体」という用語は、ミオスタチンへの結合能力を保持する、アミノ酸残基への挿入、欠失、または置換以外の、またはこれらに加えた修飾を指す。一実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、さらなる化合物に複合される。
［０１２９］
好ましくは、誘導体を産生するために本発明のペプチドに行う修飾は、共有性であり、例えば、ポリマー、脂質、他の有機部分、及び無機部分との化学的結合が含まれる。本発明の誘導体は、ペプチボディの循環半減期を増加させるように調製され得るか、またはペプチボディが、所望の細胞、組織、または臓器を標的とする能力を改善するように設計され得る。
［０１３０］
本発明は、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、及び同第４，１７９，３３７号に記載されるように、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレングリコール等の１つ以上の水溶性ポリマー付着物を含むように共有結合的に修飾された誘導体結合剤をさらに含む。本技術分野で知られているさらに他の有用なポリマーには、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物に基づくポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）及びポリビニルアルコール、ならびにこれらのポリマーの混合物が含まれる。特に好ましいのは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）サブユニットで共有結合的に修飾されたペプチボディである。水溶性ポリマーを、特定位置、例えばペプチボディのアミノ末端で結合され得るか、またはポリペプチドの１つ以上の側鎖にランダムに付着され得る。結合剤、例えばペプチボディ、及び特にヒト化抗体の治療能力を改善するためのＰＥＧの使用が、２０００年１０月１７日に発行されたＧｏｎｚａｌｅｓらの米国特許第６，１３３，４２６号に記載されている。
［０１３１］
本発明はまた、ミオスタチン結合剤のペプチド及び／またはビヒクル部分を誘導体化することも企図する。そのような誘導体は、化合物の可溶性、吸収、生物学的半減期等を改善し得る。部分は、別の方式で、化合物等のいかなる望ましくない副作用等も除去するかまたは減弱し得る。典型的な誘導体には、以下のような化合物が含まれる：
１．誘導体またはそのある部分が環状である。例えば、ペプチド部分を修飾して２つ以上のＣｙｓ残基（例えば、リンカー中に）を含有させてもよく、これをジスルフィド結合形成によって環状化することが可能である。
【００２２】
２．誘導体は、分子間で架橋されるかまたは分子間の架橋が可能であるようにされている。例えば、ペプチド部分を修飾して１つのＣｙｓ残基を含有し、それによって、同様の分子との分子間ジスルフィド結合を形成可能にすることが可能である。誘導体を、Ｃ末端を通じて架橋することもまた可能である。
【００２３】
３．１つ以上のペプチジル［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−］連結（結合）が、非ペプチジル連結により置き換えられる。典型的な非ペプチジル連結は、−ＣＨ２−カルバメート［−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−］、ホスホン酸塩、−ＣＨ２−スルホンアミド［−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−］、尿素［−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−］、−ＣＨ２−二次アミン、及びアルキル化ペプチド［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６−、式中、Ｒ６低級アルキルである］である。
【００２４】
４．Ｎ末端が誘導体化されている。典型的には、Ｎ末端は、アシル化されているかまたは置換アミンへと修飾され得る。典型的なＮ末端誘導体基には、−ＮＲＲ１（−ＮＨ２以外）、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ１、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ１、スクシンイミド、またはベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−（ＣＢＺ−ＮＨ−）が含まれ、式中、Ｒ及びＲ１は、各々独立して、水素または低級アルキルであり、フェニル環は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、クロロ、及びブロモからなる群から選択される１〜３個の置換基で置換され得る。
【００２５】
５．遊離Ｃ末端が誘導体化されている。典型的には、Ｃ末端は、エステル化されているかまたはアミド化されている。例えば、当該技術分野で記載される方法を用いて、本発明の化合物のＣ末端に（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２）２を付加してもよい。同様に、当該技術分野で記載される方法を用いて、本発明の化合物のＣ末端に−ＮＨ２を付加する（または−ＮＨ２基で「キャッピング」する）ことも可能である。典型的なＣ末端誘導体基には、例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２が含まれ、式中、Ｒ２は、低級アルコキシである、または−ＮＲ３Ｒ４が含まれ、式中、Ｒ３及びＲ４は、各々独立して、水素またはＣ１〜Ｃ８アルキル（好ましくはＣ１〜Ｃ４アルキル）である。
【００２６】
６．ジスルフィド結合を、別の、好ましくはより安定な架橋部分（例えば、アルキレン）と置き換える。例えば、Ｂｈａｔｎａｇａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ３９：３８１４−９（１９９６）、Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｉｒｔｅｅｎｔｈ  Ａｍ  Ｐｅｐ  Ｓｙｍｐ，３５７−９（１９９３）を参照のこと。
【００２７】
７．１つ以上の個々のアミノ酸残基が修飾されている。以下に詳細に記載されるように、多様な誘導体化剤が、選択した側鎖または末端残基と特異的に反応することが知られている。
［０１３２］
リジニル残基及びアミノ末端残基を、リジニル残基の電荷を逆転させるコハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させてもよい。αアミノ含有残基を誘導体化する他の適切な試薬には、メチルピコリンイミデート等のイミドエステル；ピリドキサールリン酸；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４ペンタンジオン；及びグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。
［０１３３］
フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンを含む、いくつかの従来の試薬のうちのいずれか１つまたは組み合わせとの反応によって、アルギニル残基を修飾してもよい。アルギニル残基の誘導体化には、グアニジン官能基のｐＫａが高いため、反応をアルカリ条件で行う必要がある。さらに、これらの試薬は、リジン基及びアルギニンイプシロン−アミノ基と反応し得る。
［０１３４］
チロシル残基の特異的修飾は、広く研究されてきており、特に、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によって、チロシル残基にスペクトル標識を導入することに関心が持たれている。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール及びテトラニトロメタンを用いて、それぞれ、Ｏ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を形成する。
［０１３５］
カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドとの反応によって、カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）を選択的に修飾してもよい。さらに、アンモニウムイオンとの反応によって、アスパルチル及びグルタミル残基をアスパラギニル残基及びグルタミニル残基に変換してもよい。
［０１３６］
グルタミニル残基及びアスパラギニル残基を脱アミド化して、対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基にしてもよい。あるいは、穏やかな酸性条件下で、これらの残基を脱アミド化する。これらの残基のいずれの型も本発明の範囲内に入る。
［０１３７］
システイニル残基をアミノ酸残基または他の部分と置き換えて、ジスルフィド結合を除去するか、または逆に架橋を安定化してもよい。例えば、Ｂｈａｔｎａｇａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（上記）を参照のこと。
［０１３８］
二官能性剤での誘導体化は、ペプチドまたはその機能する誘導体を、水不溶性支持体マトリックスに、または他の巨大分子ビヒクルに架橋するのに有用である。一般的に用いられる架橋剤には、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン等の二官能性マレイミドが含まれる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデート等の誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することが可能な光活性化可能な中間体を生じる。あるいは、米国特許第３，９６９，２８７号、第３，６９１，０１６号、第４，１９５，１２８号、第４，２４７，６４２号、第４，２２９，５３７号、及び第４，３３０，４４０号に記載される、臭化シアン活性化炭水化物等の反応性水不溶性マトリックス及び反応性基質が、タンパク質固定化に使用される。
［０１３９］
炭水化物（オリゴ糖）基を、タンパク質中のグリコシル化部位であることが知られている部位に、好適に結合させてもよい。一般的に、Ｏ結合型オリゴ糖は、セリン（Ｓｅｒ）残基またはスレオニン（Ｔｈｒ）残基に結合され、一方、Ｎ結合型オリゴ糖は、配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸であり得る）の一部であるとき、アスパラギン（Ａｓｎ）残基に結合される。Ｘは、好ましくは、プロリン以外の１９の天然存在アミノ酸の１つである。Ｎ結合型及びＯ結合型オリゴ糖の構造及び各種類に見られる糖残基は、異なる。両方に一般的に見られる糖の１種は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸と称される）である。シアル酸は、通常、Ｎ結合型及びＯ結合型オリゴ糖の両方の末端残基であり、その負電荷のため、グリコシル化化合物に酸性特性を与え得る。そのような部位（複数を含む）は、本発明の化合物のリンカー内に取り込まれてもよく、好ましくは、（例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳ等の哺乳動物細胞において）ポリペプチド化合物の組換え産生中に、細胞によってグリコシル化される。しかしながら、当該技術分野で知られている合成法または半合成法によって、そのような部位をさらにグリコシル化してもよい。
［０１４０］
他のあり得る修飾には、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル残基またはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、Ｃｙｓ中の硫黄原子の酸化、リジン側鎖、アルギニン側鎖、及びヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化が含まれる［例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ），ｐｐ．７９−８６（１９８３）を参照のこと］。
［０１４１］
また、本発明の化合物をＤＮＡレベルで変化させてもよい。化合物の任意の部分のＤＮＡ配列を、選択した宿主細胞とより適合するコドンに変化させてもよい。好ましい宿主細胞である大腸菌に関して、最適化コドンが当該技術分野で公知である。コドンを置換して、制限酵素部位を除去するか、またはサイレント制限酵素部位を含ませてもよく、これは選択した宿主細胞におけるＤＮＡのプロセシングを補助し得る。ビヒクル、リンカー、及びペプチドＤＮＡ配列を修飾して、前述の配列変化のいずれかを含ませてもよい。
［０１４２］
構造の安定化または生体分解の減少を提供する非ペプチド類似体を含むさらなる誘導体もまた、企図される。非ペプチド部分によって１つ以上の残基を置き換えることによって、選択した阻害ペプチドに基づいて、ペプチド模倣類似体を調製することができる。好ましくは、非ペプチド部分は、ペプチドがその天然コンフォメーションを保持するか、またはミオスタチンを認識し、ミオスタチンに結合する能力を保持する、好ましい、例えば生物活性のコンフォメーションを安定化するのを可能にする。一態様において、得られた類似体／模倣体は、ミオスタチンに対する結合親和性の増加を示す。ペプチドから非ペプチド模倣類似体を調製する方法の一例が、Ｎａｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｇｕｌ  Ｐｅｐｔ５７：３５９−３７０（１９９５）に記載される。望ましい場合、本発明のペプチドは、例えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、またはリン酸化によって、あるいは本発明のペプチドの酸付加塩、アミド、エステル、特にＣ末端エステル、及びＮ−アシル誘導体の生成によって修飾され得る。ペプチボディはまた、ペプチド誘導体を生成するように他の部分との共有結合または非共有結合複合体を形成することによっても修飾され得る。共有結合複合体は、ペプチボディを含むアミノ酸の側鎖上、またはＮもしくはＣ末端の官能基に化学物質部分を連結させることによって調製され得る。
［０１４３］
特に、放射標識、蛍光標識、酵素（例えば比色反応または蛍光分析反応を触媒する）、基質、固体マトリックス、または担体（例えばビオチンまたはアビジン）を含むが、これらに限定されない、レポーター基に、ペプチドを複合することが可能であることが予期される。したがって、本発明は、放射標識、蛍光標識、酵素、基質、固体マトリックス、及び担体からなる群から選択されるレポーター基をさらに含むことが好ましいペプチボディ分子を含む分子を提供する。そのような標識は、当業者に周知であり、例えば、ビオチン標識が特に企図される。そのような標識の使用は、当業者に周知であり、例えば、米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９９６，３４５号、及び同第４，２７７，４３７号に記載される。有用であろう他の標識には、放射能標識、蛍光標識、及び化学発光標識が含まれるが、これらに限定されない。そのような標識の使用に関する米国特許には、例えば、米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、及び同第３，９９６，３４５号が含まれる。本発明のペプチボディはいずれも、これらの標識のいずれかを１つ、２つ、またはそれより多く含んでもよい。
【００２８】
ペプチド及びペプチボディを作製する方法
［０１４４］
本明細書に記載されるミオスタチン作動薬及びペプチドは、当該技術分野で公知の多様な技術を用いて生成され得る。一実施形態において、ミオスタチン作動薬は、以下の実施例１７に記載される方法を用いて生成される。
［０１４５］
ペプチドは、従来の技術に従って、溶液中または固体支持体上で合成され得る。様々な自動化合成装置が商業的に入手可能であり、既知のプロトコルに従って使用され得る。例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ（上記）、Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，１０５：６４４２（１９８３）、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３２：３４１−３４７（１９８６）、Ｂａｒａｎｙ  ａｎｄ  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１−２８４、Ｂａｒａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ，３０：７０５−７３９（１９８７）、及び米国特許第５，４２４，３９８号を参照されたく、各々、参照により本明細書に組み込まれる。
［０１４６］
固相ペプチド合成法は、０．１〜１．０ｍＭアミン／ｇのポリマーを含有するコポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）を用いる。ペプチド合成のこれらの方法は、アルファ−アミノ基のブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）または９−フルオレニルメチルオキシ−カルボニル（ＦＭＯＣ）保護を用いる。どちらの方法も、ペプチドのＣ末端から始める各ステップで単一のアミノ酸を付加する段階的合成を含む（Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，Ｕｎｉｔ９を参照のこと）。化学合成が完了したら、ｔ−ＢＯＣまたはＦＭＯＣアミノ酸ブロッキング基を除去するために合成ペプチドを脱保護し、低下した温度で酸処理することによって（例えば、液体ＨＦ−１０％アニソールを用いて０℃で約０．２５〜約１時間）、ポリマーから切断させ得る。試薬を蒸発させた後、１％酢酸溶液を用いて、ポリマーからペプチドを抽出し、次いでこれを凍結乾燥して粗物質を生じる。これは、通常、溶媒として５％酢酸を用いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１５上でのゲル濾過等のような手法によって精製され得る。カラムの適切な画分を凍結乾燥すると、均質なペプチドまたはペプチド誘導体が得られ、これを次いで、アミノ酸分析、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、紫外吸光分光法、モル旋光度、可溶性等のような標準的手法によって特徴付けられ、固相エドマン分解によって定量化され得る。
［０１４７］
ファージディスプレイ技術は、上述のような本発明のペプチドを同定するのに特に有効であり得る。簡潔には、ファージライブラリーを調製し（例えば、ｍｌ１３、ｆｄ、またはラムダファージを用いる）、４〜約８０アミノ酸残基の挿入物をディスプレイする。挿入物は、例えば、完全縮重アレイまたは偏向アレイを示し得る。所望の抗原に結合する挿入物を有するファージを選択し、所望の抗原に結合するファージの再選択を数周期行って、このプロセスを反復する。ＤＮＡ配列決定を行って、発現されたペプチドの配列を特定する。このような方式で、所望の抗原に結合する配列の最小直鎖部分を決定し得る。最小直鎖部分の一部または全部を含有する挿入物に加えて、その上流または下流に１つ以上のさらなる縮重残基を含有する挿入物を含有する偏向ライブラリーを用いて、この手順は反復され得る。これらの技術は、本明細書に既に特定されている薬剤よりもミオスタチンに対してさらに高い結合親和性を持つ、本発明のペプチドを特定し得る。
［０１４８］
ペプチドを調製する方式にかかわらず、標準的組換えＤＮＡ法を用いて、そのようなペプチドの各々をコードする核酸分子を生成することも可能である。核酸コードの縮重を考慮するため、ならびに特定の宿主細胞におけるコドン選択を考慮するため、これらがコードするアミノ酸配列を変化させることなく、このような分子のヌクレオチド配列を適切に操作することも可能である。
［０１４９］
本発明はまた、本発明のペプチド及びペプチボディをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子も提供する。これらの核酸分子には、本発明のペプチド及びペプチボディ、ならびにペプチド及びペプチボディの変異体及び誘導体をコードするポリヌクレオチドを含有するベクター及び構築物が含まれる。典型的な核酸分子を以下の実施例に提供する。
［０１５０］
組換えＤＮＡ技術はまた、本発明の全長ペプチボディ及び他の巨大ポリペプチド結合剤、またはその断片を調製するための好適な方法も提供する。ペプチボディまたは断片をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入して、このベクターを次いで、本発明の結合剤を産生するために宿主細胞に挿入してもよい。本発明の典型的なペプチボディの調製が以下の実施例２に記載される。
［０１５１］
種々の発現ベクター／宿主系を使用して、本発明のペプチド及びペプチボディを発現し得る。これらの系には、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌等の微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）でトランスフェクションされたか、または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは動物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。１つの好ましい宿主細胞株は、以下の実施例２に記載されるようなペプチボディの発現に用いられる、大腸菌株２５９６（ＡＴＣＣ番号２０２１７４）である。組換えタンパク質産生に有用な哺乳動物細胞には、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−７等）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、及び２９３細胞が含まれるが、これらに限定されない。
［０１５２］
「発現ベクター」という用語は、ポリヌクレオチド配列からポリペプチドを発現するためのプラスミド、ファージ、ウイルス、またはベクターを指す。発現ベクターは、（１）遺伝子発現を制御する役割を有する、単数または複数の遺伝子要素、例えば、プロモーターまたはエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される結合剤をコードする構造または配列、ならびに（３）適切な転写開始及び終結配列の集合体を含む、転写単位を含み得る。酵母または真核発現系で使用するために意図される構造単位には、好ましくは、翻訳されたタンパク質が宿主細胞によって細胞外分泌されるのを可能にするリーダー配列が含まれる。あるいは、組換えタンパク質がリーダー配列または輸送配列なしで発現される場合には、アミノ末端メチオニル残基を含み得る。その後、この残基は、最終ペプチド産物を得るために発現された組換えタンパク質から切断されても、切断されなくてもよい。
［０１５３］
例えば、市販の発現系、例えば、ピキア発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、製造業者の指示に従って、ペプチド及びペプチボディを酵母中で組換えにより発現させてもよい。この系はまた、分泌させるためにプレ−プロ−α配列にも頼っているが、挿入物の転写は、メタノールによる誘導時に、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターによって駆動される。分泌されたペプチドは、酵母増殖培地から、細菌及び哺乳動物細胞上清からペプチドを精製するために用いられる方法を用いて精製される。
［０１５４］
あるいは、ペプチド及びペプチボディをコードするｃＤＮＡをバキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）内にクローニングしてもよい。このベクターは、ｓＦ９タンパク質不含培地中でＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を感染させ、組換えタンパク質を産生するために製造業者の指示（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）に従って使用され得る。組換えタンパク質は、培地からヘパリン−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製、濃縮され得る。
［０１５５］
あるいは、ペプチドまたはペプチボディは、昆虫系において発現され得る。タンパク質発現用の昆虫系は当業者に公知である。１つのそのような系では、オウトグラファカリフォルニア核多汗症ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｌａｒｖａｅにおいて外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用され得る。ペプチドコード配列は、ウイルスの非必須領域、例えば多面体遺伝子にクローン化し、多面体プロモーターの制御下に置かれ得る。ペプチドをうまく挿入すれば、多面体遺伝子は不活性となり、コートタンパク質コートを欠く組換えウイルスが生じる。組換えウイルスは、ペプチドが発現されているＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｌａｒｖａｅを感染させるために使用され得る（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ４６：５８４（１９８３）、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（ＵＳＡ）９１：３２２４−７（１９９４））。
［０１５６］
別の例では、ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ＰＣＲにより増幅され、適当なベクター、例えば、ｐＧＥＸ−３Ｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローン化され得る。ｐＧＥＸベクターは、ベクターによりコードされるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）及びベクターのクローニング部位に挿入されるＤＮＡ断片によりコードされるタンパク質を含む融合タンパク質を生ずるように設計されている。ＰＣＲ用プライマーは、例えば適当な切断部位を含むように作成され得る。融合部分を単に発現を容易とするために使用する場合、または対象となるペプチドへの結合として望ましくない場合には、組換え融合タンパク質を、その後融合タンパク質のＧＳＴ部分から切断してもよい。ｐＧＥＸ−３Ｘ／特異的結合剤ペプチド構築物を大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ）に形質転換し、個々の形質転換体を単離し、増殖させる。個々の形質転換体からのプラスミドＤＮＡを精製し、自動シークエンサーを用いて部分的に配列決定して適正な配向で、核酸挿入物をコードする所望の特異的結合剤の存在を確認することができる。
［０１５７］
融合タンパク質は、細菌中で不溶性封入体として産生され得、以下のように精製され得る。宿主細胞を遠心分離により収集し、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス、ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡで洗浄し、０．１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で、室温で１５分間処理する。溶解物を超音波処理によって清澄化し、細胞破片を１２，０００×ｇで１０分間遠心分離することによりペレット化し得る。融合タンパク質を含有するペレットを、５０ｍＭトリス、ｐＨ８、及び１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中に再懸濁し、５０％グリセロール上に重層し、６０００×ｇで３０分間遠心分離し得る。ペレットは、Ｍｇ＋＋もＣａ＋＋も含まない一般的なリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）中に再懸濁され得る。再懸濁したペレットを、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で画分することによって、融合タンパク質をさらに精製することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。タンパク質を可視化するためにゲルを０．４Ｍ  ＫＣｌ中に浸してもよく、これは切除されて、ＳＤＳを欠くゲル泳動緩衝液中で電気溶出され得る。ＧＳＴ／融合タンパク質を細菌中で可溶性タンパク質として産生される場合、タンパク質はＧＳＴ精製モジュール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製され得る。
［０１５８］
融合タンパク質を消化に供して、本発明のペプチドからＧＳＴを切断してもよい。消化反応物（０．５ｍｌ  ＰＢＳ中の２０〜４０ｍｇの融合タンパク質、２０〜３０単位のヒトトロンビン（４０００Ｕ／ｍｇ，Ｓｉｇｍａ）を室温で１６〜４８時間インキュベートし、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に装填して、反応生成物を画分し得る。タンパク質バンドを可視化するためにゲルを０．４Ｍ  ＫＣｌ中に浸してもよい。自動化配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ４７３Ａ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いたアミノ酸配列分析によって、ペプチドの期待される分子量に対応するタンパク質バンドが何かを確認することも可能である。あるいは、ペプチドのＨＰＬＣ及び／または質量分析を行うことによって、それが何であるかを確認することも可能である。
［０１５９］
あるいは、ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、所望のプロモーター、及び任意にリーダー配列を含有するプラスミド内にクローニングすることも可能である（Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：１０４１−４３（１９８８））。自動化配列決定によって、この構築物の配列を確認することも可能である。次いで、細菌のＣａＣｌ２インキュベーション及び熱ショック処理を使用する標準法を用いて、プラスミドを大腸菌株ＭＣ１０６１に形質転換することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。カルベニシリンを補充したＬＢ培地中で、形質転換細菌を増殖させることができ、適切な培地中の増殖によって、発現タンパク質の産生を誘導することができる。存在する場合、リーダー配列は、ペプチドの分泌をもたらし、分泌中に切断されることも可能である。
［０１６０］
組換えペプチド及びペプチボディの発現のための哺乳動物宿主系は当業者に周知である。宿主細胞株は、発現タンパク質をプロセシングするか、またはタンパク質活性を与えるのに有用であろう特定の翻訳後修飾を生ずるような特定能力について選択され得る。タンパク質のそのような修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、リピド化、及びアシル化が含まれるが、これらに限定されない。ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８等の異なる宿主細胞は、そのような翻訳後活性のための特定の細胞機構及び特徴的な機序を有し、導入した外来タンパク質の正しい修飾及びプロセシングが確実になるように選択可能である。
［０１６１］
形質転換細胞が長期高収率タンパク質産生に用いられることが好ましい。そのような細胞が、所望の発現カセットとともに、選択可能マーカーを含有するベクターで形質転換されると、選択培地に切り替える前に、細胞を強化培地で１〜２日間増殖させてもよい。導入された配列を発現するのに成功した細胞の増殖及び回収を可能にするように、選択可能マーカーを設計する。使用する細胞株に適した組織培養技術を用いて、安定に形質転換された細胞の耐性凝集塊を増殖させることも可能である。
［０１６２］
多くの選択系が、組換えタンパク質産生のために形質転換された細胞を回収するために使用され得る。そのような選択系には、それぞれｔｋ−細胞、ｈｐｇｒｔ−細胞、またはａｐｒｔ−細胞中の、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。また、代謝拮抗薬耐性が、メトトレキサートへの耐性を与えるｄｈｆｒ；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ；アミノ配糖体Ｇ４１８に対する耐性を与え、クロルスルフロンに対する耐性を与えるｎｅｏ；及びハイグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏに関する選択の基礎として使用され得る。有用であり得るさらなる選択可能遺伝子には、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用するのを可能にするｔｒｐＢ、または細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用するのを可能にするｈｉｓＤが含まれる。形質転換体同定のための視覚的指標を与えるマーカーには、アントシアニン、β−グルクロニダーゼ及びその基質ＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼ及びその基質、ルシフェリンが含まれる。
【００２９】
結合剤の精製及び再フォールディング
［０１６３］
いくつかの場合、ミオスタチン作動薬、例えば、本発明のペプチド及び／またはペプチボディ等の結合剤は、生物学的に活性になるために、「再フォールディング」され、酸化されて適切な三次構造になり、ジスルフィド連結が生成される必要があり得る。一実施形態において、ミオスタチン作動薬は、以下の実施例１７に記載される方法を用いて精製及び再フォールディングされる。
［０１６４］
再フォールディングは、当該技術分野で周知の多くの手順を用いて達成され得る。そのような方法には、例えば、カオトロピック剤の存在下で、通常７より高いｐＨに、可溶化したポリペプチド剤を曝露することが含まれる。カオトロープの選択は、封入体可溶化に用いる選択と類似であるが、典型的には、カオトロープは、より低い濃度で用いられる。典型的なカオトロピック剤は、グアニジン及び尿素である。ほとんどの場合、再フォールディング／酸化溶液はまた、還元剤に加えて特定の比でその酸化型を含有して特定の酸化還元電位を生じ、ジスルフィドシャフリングを可能にして、システイン架橋の形成を生じる。いくつかの通常用いられるレドックス対には、システイン／シスタミン、グルタチオン／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオスレイトールＤＴＴ／ジチアンＤＴＴ、及び２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂＭＥが含まれる。多くの場合、共溶媒が再フォールディングの効率を増加させるために使用され得る。一般に使用される共溶媒には、様々な分子量のグリセロール、ポリエチレングリコール、及びアルギニンが含まれる。
［０１６５］
本発明のペプチド及びペプチボディを精製することが望ましい場合がある。タンパク質精製技術は当業者に周知である。これらの技術は、１つのレベルで、タンパク質性画分及び非タンパク質性画分の粗分画を伴う。他のタンパク質からペプチド及び／またはペプチボディを分離するように、部分的精製または完全精製（または均質になるまでの精製）を達成するために、クロマトグラフィー技術及び電気泳動技術を用いて、対象となるペプチドまたはポリペプチドは、さらに精製され得る。本発明のペプチボディ及びペプチドの調製物に特に適した分析法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；等電点電気泳動である。ペプチドを精製する特に効率的な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィーまたは同等のＨＰＬＣである。
［０１６６］
本発明の特定の態様は、本発明のペプチボディまたはペプチドの精製に関し、特定の実施形態において、実質的な精製に関する。本明細書で使用される「精製されたペプチボディまたはペプチド」という用語は、他の構成要素から単離可能な組成物を指すよう意図され、ここでペプチボディまたはペプチドは、天然に得られ得る状態と比較して、いずれかの度合いに精製されている。したがって、精製されたペプチドまたはペプチボディはまた、天然に生じ得る環境にないペプチボディまたはペプチドも指す。
［０１６７］
一般的に、「精製された」は、多様な他の構成要素を除去する分画に供され、その発現される生物学的活性を実質的に保持する、ペプチド組成物またはペプチボディ組成物を指すであろう。「実質的に精製された」という用語を用いる場合、この意味は、ペプチボディまたはペプチドが組成物の主要な構成要素を形成し、例えば、組成物中で約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％またはそれ以上のタンパク質を構成する、ペプチド組成物またはペプチボディ組成物を指すであろう。
［０１６８］
本開示に照らして、ペプチドまたはペプチボディの精製の度合いを定量化する多様な方法が当業者に知られるであろう。これらには、例えば、活性画分の特異的結合活性を測定するか、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって、画分内のペプチドまたはペプチボディの量を評価することが含まれる。ペプチドまたはペプチボディ画分の純度を評価するための好ましい方法は、画分の結合活性を計算し、これを最初の抽出物の結合活性と比較して、こうして本明細書において「倍精製数」によって評価される、精製の度合いを計算することである。結合活性の量を表すのに用いられる実際の単位は、もちろん、精製を追跡するために選択された特定のアッセイ技術に依存するであろうし、ペプチボディまたはペプチドが検出可能な結合活性を示すかどうかに依存するであろう。
［０１６９］
精製に使用するのに適した多様な技術が、当業者に周知であろう。これらには、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体（免疫沈降）等を用いた沈殿、または熱変性、その後の遠心分離；親和性クロマトグラフィー（例えばプロテイン−Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシルアパタイト、及び親和性クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーステップ；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；ならびにこうした技術及び他の技術の組み合わせが含まれる。当該技術分野に一般的に知られるように、多様な精製ステップを行う順序を変化させることも可能であるし、または特定のステップを省略し、そしてなお、実質的に精製された結合剤の適切な調製法を生じることも可能であると考えられる。
［０１７０］
本発明の結合剤を常に最も精製された状態で提供しなければならないという一般的な必要条件はない。実際、実質的により精製されていない結合剤産物は、ある特定の実施形態において有用性を有するであろうことが企図される。より少ない精製ステップを組み合わせて用いることによって、または同じ一般的精製スキームの異なる型を利用することによって、部分的精製が達成され得る。例えば、ＨＰＬＣ装置を利用して行われる陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般的に、低圧クロマトグラフィー系を利用する同じ技術よりも高い「−倍」精製を生じるであろう。相対的により低い度合いの精製を示す方法は、ペプチドまたはペプチボディの総回収に、あるいはペプチドまたはペプチボディの結合活性を維持するのに有利であり得る。
［０１７１］
ペプチドまたはポリペプチドの移動が、ＳＤＳ／ＰＡＧＥの異なる条件で多様であり得、時によって著しく多様であり得ることが知られている（Ｃａｐａｌｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ，７６：４２５（１９７７））。したがって、異なる電気泳動条件下で、精製されたまたは部分的に精製された結合剤発現産物の見かけの分子量が多様であり得ることが理解されるであろう。
【００３０】
ミオスタチン結合剤及び他の拮抗薬の活性
［０１７２］
本明細書に記載される結合剤を含む拮抗薬は、ミオスタチンに結合し、ミオスタチン活性を阻害または遮断する能力に関して試験され得る。結合剤がミオスタチン活性を阻害するまたは遮断する能力を決定するために、いかなる数のアッセイまたは動物試験も用いられ得る。本発明のペプチド及びペプチボディを特徴付けるために使用されるいくつかのアッセイが、以下の実施例に記載される。１つのアッセイは、Ｃ２Ｃ１２ｐＭＡＲＥ−ｌｕｃアッセイであり、アッセイは、ミオスタチン／アクチビン応答要素（ＭＡＲＥ）を含有するルシフェラーゼレポーターベクターでトランスフェクションした、ミオスタチン応答性細胞株（Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞）を利用する。一連のペプチボディ希釈物をミオスタチンとプレインキュベーションし、次いで細胞をインキュベーション混合物に曝露することによって、典型的なペプチボディをアッセイする。得られたルシフェラーゼ活性を決定し、一連のペプチボディ希釈物から滴定曲線を生成する。次いで、ＩＣ５０（ルシフェラーゼ活性によって測定されるようなミオスタチン活性の５０％阻害を達成するペプチボディの濃度）を決定した。以下に記載される第２のアッセイは、ミオスタチン結合剤及びミオスタチンとその受容体に結合可能な抗体等の他の拮抗薬の動力学パラメータｋａ（会合速度定数）、ｋｄ（解離速度定数）、及びＫＤ（解離平衡定数）を決定するためのＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイである。解離平衡定数（ＫＤ、ｎＭで表される）が低いほど、ミオスタチンに対するペプチボディの親和性が高いことを示した。さらなるアッセイには、ペプチボディ等の結合剤が中和性である（ミオスタチンのその受容体への結合を妨げる）か、または非中和性である（ミオスタチンのその受容体への結合を妨げない）かどうかを決定する、遮断アッセイ；本発明の結合剤が、ミオスタチンに選択的に結合して、ある特定の他のＴＧＦ−βファミリーメンバーに結合しないかどうかを決定する、選択性アッセイ；及びＫＤをも決定し、いくつかの状況では、より感受性であると見なされる、ＫｉｎＥｘ  Ａ（商標）アッセイまたは溶液に基づく平衡アッセイが含まれる。これらのアッセイは実施例３に記載される。
［０１７３］
図１は、ペプチドのペプチボディ型のＩＣ５０と比較した、ペプチドのＩＣ５０を示す。これは、ミオスタチン活性を阻害する際に、ペプチボディがペプチドのみよりも、有意に有効であることを示す。さらに、親和性成熟ペプチボディは、一般的に、親ペプチド及びペプチボディと比較して、改善されたＩＣ５０及びＫＤ値を示す。いくつかの典型的な親和性成熟ペプチボディのＩＣ５０値を以下の実施例７の表ＶＩＩに示す。さらに、いくつかの場合、２つのペプチドがタンデムに結合された２×型のペプチボディを作製すると、インビトロ及びインビボの両方で、ペプチボディの活性が増加する。
［０１７４］
インビボ活性を以下の実施例に示す。結合剤の活性には、処置した動物モデルの総体重に対する増加した除脂肪筋肉量、増加した筋力、および減少した脂肪量が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載されるインビボ活性には、性腺機能低下症、リウマチ性悪液質、癌悪液質、及び不活動のモデルを含む動物モデルにおける、除脂肪筋肉量及び筋力の消耗の減弱がさらに含まれる。
【００３１】
治療方法
［０１７５］
本発明は、アンドロゲン治療法を受けている前立腺癌患者において、治療量の、ミオスタチン拮抗薬、例えば、配列番号３１１のミオスタチン結合ペプチド、例えば、配列番号６３５からなる少なくとも１つのポリペプチドを含むペプチボディを含む結合剤を投与することによって悪液質を治療する方法を提供する。
［０１７６］
本明細書で使用される「悪液質」という用語は、前立腺癌等のいくつかの疾患から生じる筋萎縮加速及び除脂肪体重の損失の状態を指す。以下の実施例に示されるように、本明細書に記載される典型的なペプチボディのようなミオスタチン拮抗薬が、除脂肪筋肉量を劇的に増加させ、体脂肪を減少させ、脂肪に対する筋肉の比を改変し、筋力を増加させる。
［０１７７］
また、ミオスタチン拮抗薬は、将来の筋力の消耗及び関連疾患から保護するために、治療等を必要とする対象において、予防的に投与することもできる。
［０１７８］
本発明のミオスタチン拮抗薬は、治療効果を増強するまたは潜在的副作用を減少させるために、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて使用され得る。
【００３２】
薬学的組成物
［０１７９］
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、薬学的組成物において製剤化されるミオスタチン拮抗薬を使用する。薬学的組成物には、例えば、緩衝剤、抗酸化剤、低分子量分子、薬物、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、脂質、キレート剤、安定剤、または賦形剤が含まれ得る。一実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、９％（ｗ／ｖ）スクロース、０．００４％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０、ｐＨ４．７５において製剤化される。
［０１８０］
そのような組成物は、治療的または予防的有効量の、薬学的に許容される薬剤と混和して１つ以上のミオスタチン拮抗薬を含む。薬学的組成物は、薬学的に許容される薬剤と混和して、ミオスタチンを部分的または完全に阻害する拮抗薬を含む。典型的には、拮抗薬は、対象への投与のために、十分に精製されているであろう。
［０１８１］
薬学的組成物は、例えば、組成物のｐＨ、オスモル濃度、粘度、透明度、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解速度もしくは放出速度、吸着、または浸透を改変するか、維持するか、または保持するための製剤化物質を含有してもよい。適切な製剤材料には、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン等）；抗菌剤；酸化防止剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウム等）；緩衝剤（ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、他の有機酸等）；増量剤（ｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（マンニトールまたはグリシン等）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン等）；充填剤（ｆｉｌｌｅｒ）；単糖；二糖及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリン類等）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等）；着色剤；香味剤及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドン等）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウム等）；保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール等）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトール等）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０等のポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ））；安定性増進剤（スクロースまたはソルビトール）；等張化増進剤（アルカリ金属ハロゲン化物（好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤、及び／または薬学的補助剤が含まれるが、これらに限定されない。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）。
［０１８２］
最適な薬学的組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式、及び所望の投薬量に応じて、当業者によって決定されるであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，上記を参照のこと。そのような組成物は、結合剤の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、及びインビボクリアランス速度に影響を及ぼし得る。
［０１８３］
薬学的組成物中の主なビヒクルまたは担体は、実際には、水性または非水性のいずれであり得る。例えば、非経口投与用の組成物中で一般的な他の材料が補充される可能性のある、適切なビヒクルまたは担体は、注射用水、生理的食塩水溶液、または人工脳脊髄液であり得る。中性の緩衝化された生理的食塩水または血清アルブミンと混合された生理的食塩水は、さらなる典型的なビヒクルである。他の典型的な薬学的組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のトリス緩衝液または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含み、これらはソルビトールまたは適切なその代替物をさらに含み得る。本発明の一実施形態において、凍結乾燥されたケーキまたは水性溶液の形態で、場合によって使用される製剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記）と、望ましい度合いの純度を有する選択された組成物を混合することによって、保存用の結合剤組成物を調製してもよい。さらに、スクロース等の適切な賦形剤を用いて、結合剤産物を凍結乾燥物として製剤化してもよい。
［０１８４］
薬学的組成物は、非経口送達、例えば、皮下のために選択することができる。あるいは、本組成物は、吸入または腸内送達のため、例えば経口、耳、眼、直腸、または膣送達のために選択され得る。そのような薬学的に許容される組成物の調製は、当該技術分野の技術範囲内である。
［０１８５］
製剤成分は、投与の部位に許容され得る濃度で存在する。例えば、緩衝剤を用いて、生理学的ｐＨまたはわずかにより低いｐＨ、典型的には約５〜約８のｐＨ範囲内に、組成物を維持する。
［０１８６］
非経口投与が企図される場合、本発明で使用する治療組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中の所望の結合剤を含む、発熱物質不含の、非経口的に許容される水性溶液の形態であり得る。非経口注射に特に適したビヒクルは、結合剤が適切に保存された無菌等張溶液として製剤化される、無菌蒸留水である。さらに別の調製物は、産物の制御放出または持続放出を提供し、次いで産物がデポ注射を介して送達され得る、注射可能なミクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー性化合物（ポリ乳酸、ポリグリコール酸）、ビーズ、またはリポソーム等の薬剤とともに所望の分子の製剤を含むことができる。ヒアルロン酸もまた使用可能であり、これは循環中での持続的な期間を促進するという効果を有し得る。所望の分子を導入する他の適切な手段には、移植可能な薬物送達デバイスが含まれる。
［０１８７］
別の態様において、非経口投与に適した薬学的配合物を、水性溶液、好ましくは生理学的に適合する緩衝液、例えばハンクス液、リンゲル液、または生理学的緩衝生理食塩水において製剤化され得る。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有してもよい。さらに、活性化合物の懸濁物を、適切な油性注射懸濁物として調製してもよい。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、ゴマ油等の脂肪油、またはオレイン酸エチル、トリグリセリド、もしくはリポソーム等の合成脂肪酸エステルが含まれる。非脂質ポリカチオン性アミノ酸ポリマーもまた、送達に使用可能である。任意に、懸濁物はまた、化合物の可溶性を増加させ、非常に濃縮された溶液の調製を可能にするのに適した安定化剤または薬剤を含有することも可能である。別の実施形態において、薬学的組成物は、吸入用に製剤化され得る。例えば、結合剤を、吸入用の乾燥粉末として配合してもよい。ポリペプチドまたは核酸分子の吸入溶液を、エアロゾル送達のため、噴霧剤とともに製剤化してもよい。なお別の実施形態において、溶液を噴霧してもよい。肺投与は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号にさらに記載され、出願は、化学的修飾タンパク質の肺送達を記載する。
［０１８８］
ある特定の製剤が経口で投与可能であることもまた、企図される。本発明の一実施形態において、この様式で投与される結合剤分子を、錠剤及びカプセル等の固体剤形の調合に通例用いられる担体を含み、または含まずに、製剤化することができる。例えば、生物学的利用能が最大になり、前全身分解が最小になる胃腸管の地点で、製剤の活性部分が放出されるように、カプセルを設計してもよい。結合剤分子の吸収を促進するために、さらなる薬剤を含むことができる。また、希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、及び結合剤も使用し得る。
［０１８９］
経口投与に適した投薬量で、当該技術分野に周知の薬学的に許容される担体を用いて、経口投与のための薬学的組成物を製剤化することもできる。そのような担体は、薬学的組成物が、患者により摂取される錠剤、丸剤、糖剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤として製剤化されることを可能にする。
［０１９０］
活性化合物を固体賦形剤と合わせて、得られた顆粒混合物を（場合によって粉砕した後）加工して、錠剤または糖剤コアを得ることによって、経口使用のための薬学的調製物を得ることも可能である。望ましい場合、適切な補助剤を添加することも可能である。適切な賦形剤には、炭水化物またはタンパク質充填剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、及びソルビトールを含む糖；トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース；アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム；ならびにゼラチン及びコラーゲン等のタンパク質が含まれる。所望の場合、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、及びアルギン酸、またはアルギン酸ナトリウム等のその塩等の、崩壊剤または可溶化剤を添加してもよい。
［０１９１］
アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタン、ラッカー溶液、及び適切な有機溶媒または溶媒混合物もまた含有可能である濃縮糖溶液等の、適切なコーティングと組み合わせて、糖剤コアを用いることも可能である。染料または色素を錠剤または糖剤コーティングに添加して、製品を識別するか、または活性化合物の量、すなわち投薬量を特徴付けることも可能である。
［０１９２］
経口で使用可能な薬学的調製物には、ゼラチンで作製された押し込み型カプセル、ならびにゼラチン及びコーティング、例えばグリセロールまたはソルビトールで作製されたソフト密封カプセルも含まれる。押し込み型カプセルは、ラクトースまたはデンプン等の充填剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、及び場合により安定化剤と混合された活性成分を含み得る。ソフトカプセル中、活性化合物は、安定化剤を含む、または含まずに、適切な液体、例えば脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコール中に溶解または懸濁され得る。
［０１９３］
別の薬学的組成物は、錠剤の製造に適した非毒性賦形剤と混合された、有効量の結合剤を含み得る。錠剤を、無菌水、または他の適切なビヒクルに溶解することによって、単位用量型で溶液を調製することも可能である。適切な賦形剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸ナトリウム、ラクトース、またはリン酸カルシウム等の不活性希釈剤；あるいはデンプン、ゼラチン、またはアカシア等の結合剤；あるいはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルク等の滑沢剤が含まれるが、これらに限定されない。
［０１９４］
さらなる薬学的組成物が当業者に明らかであり、こうした組成物には、持続送達または制御送達製剤中の結合剤分子を伴う製剤が含まれる。多様な他の持続送達または制御送達、例えば、リポソーム担体、生体内分解性微小粒子、または多孔ビーズ及び蓄積注射を製剤化する技術もまた、当業者に知られている。例えば、薬学的組成物の送達のための多孔ポリマー微小粒子の制御放出を記載する、ＰＣＴ／ＵＳ第９３／００８２９号を参照のこと。持続調製物のさらなる例には、成型物品、例えば、フィルムまたは微小カプセルの形の半透性ポリマーマトリックスが含まれる。持続放出マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（ＵＳ第３，７７３，９１９号、ＥＰ第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸及びガンマエチル−Ｌ−グルタメートのコピリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７，（１９８１）、Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，上記）、またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ第１３３，９８８号）が含まれ得る。持続放出組成物にはまた、当該技術分野で公知のいくつかの方法のいずれによっても調製可能なリポソームも含まれる。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），８２：３６８８（１９８５）、ＥＰ第３６，６７６号、ＥＰ第８８，０４６号、ＥＰ第１４３，９４９号を参照のこと。
［０１９５］
インビボ投与に用いられるべき薬学的組成物は、典型的には、滅菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過によって達成され得る。組成物を凍結乾燥する場合、この方法を用いた滅菌は、凍結乾燥及び再構成前にまたはその後に行われ得る。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥型で、または溶液中で保存され得る。さらに、非経口組成物は、一般的に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通可能な栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアル中に入れられる。
［０１９６］
一旦、薬学的組成物が製剤化されると、それは、溶液、懸濁物、ゲル、乳剤、固体、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として、滅菌バイアル中で保存され得る。そのような製剤は、すぐに使える型または投与前に再構築を要する（例えば、凍結乾燥した）型のいずれかで保存され得る。
［０１９７］
特定の実施形態において、本発明は、単回用量投与単位を生じるキットに関する。キットは、各々、乾燥タンパク質を有する第１の容器及び水性製剤を有する第２の容器の両方を含有し得る。本発明の範囲内にも含まれるのは、単一チャンバー及び多チャンバーの予め充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジ及び凍結乾燥シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅｓ））を含有するキットである。
【００３３】
投薬量
［０１９８］
治療的に使用されるべき薬学的組成物の有効量は、例えば、治療背景及び目的に応じて異なるであろう。したがって、当業者は、治療に適した投薬レベルが、部分的に、送達される分子、結合剤分子を用いようとする適応症、投与経路、ならびに患者の大きさ（体重、体表面積、または臓器の大きさ）及び状態（年齢及び全身の健康状態）に応じて異なることを認識するであろう。したがって、臨床医は、投薬量を滴定し、投与経路を調節して、最適治療効果を得ることも可能である。典型的な投薬量は、上述の要因に応じて、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲に及び得る。他の実施形態において、投薬量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲に及び得る。
［０１９９］
本明細書に記載される治療方法の一実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、０．０１〜１０．０ｍｇ／ｋｇ（境界値を含む）の用量で、または０．３〜３．０ｍｇ／ｋｇ（境界値を含む）の用量で、または０．３、１．０、もしくは３．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
［０２００］
いかなる化合物に関しても、まず、細胞培養アッセイにおいて、あるいはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、またはサル等の動物モデルにおいて、治療有効用量を推定することも可能である。動物モデルはまた、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するために使用してもよい。次いで、そのような情報は、ヒトにおける有用な用量及び投与経路を決定するために使用され得る。
［０２０１］
正確な投薬量は、治療を要する対象に関する要因を考慮して決定されるであろう。投薬量及び投与を調整して、十分なレベルの活性化合物を提供するか、または所望の効果を維持する。考慮に入れられ得る要因には、疾患状態の重症度、対象の全般的な健康状態、対象の年齢、体重、及び性別、投与の時間及び頻度、薬物の組み合わせ（複数を含む）、反応感度、ならびに療法への応答が含まれる。長時間作用性薬学的組成物を、特定の製剤の半減期及びクリアランス速度に応じて、３〜４日ごとに、毎週、または２週間に１回、投与することができる。
［０２０２］
いくつかの実施形態において、ミオスタチン拮抗薬は、１日２回、１日１回、週２回、週１回、月２回、または月１回、投与される。例えば、ミオスタチン拮抗薬は、週１回、４週間投与される。
［０２０３］
投薬頻度は、用いる製剤中の結合剤分子の薬物動態学パラメータに依存するであろう。典型的には、所望の効果を達成する投薬量に達するまで、組成物を投与する。したがって、単回投与として、または長期にわたる複数回投与として（同じまたは異なる濃度／投薬量で）、または連続注入として、組成物を投与してもよい。適切な投薬量のさらなる改良が、日常的になされる。適切な投薬量は、適切な用量−応答データの使用を介して確認され得る。
［０２０４］
薬学的組成物の投与経路は、例えば、経口的に、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋内、眼内、動脈内、門脈内、病巣内経路、髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所、舌下、尿道、膣、または結腸手段、持続放出系によるもの、あるいは埋め込みデバイスによるもの、等の公知の方法と一致する。望ましい場合、ボーラス注射によって、または注入によって連続して、または埋め込みデバイスによって組成物を投与してもよい。
［０２０５］
あるいは、またはさらに、所望の分子が吸収されているか、または被包されている、膜、スポンジ、または別の適切な材料の埋め込みを介して、組成物を局所に投与してもよい。埋め込みデバイスが使用される場合、このデバイスは、任意の適切な組織または臓器内に埋め込まれ得、所望の分子の送達は、分散、持続放出ボーラス投与、または連続投与を介してであり得る。
［０２０６］
いくつかの場合、エクスビボ方式で薬学的組成物を用いることが望ましい場合がある。そのような場合、患者から取り出された細胞、組織、または臓器を薬学的組成物は曝露され、その後に、これらの細胞、組織、及び／または臓器が引き続いて患者に移植して戻される。
［０２０７］
他の場合において、ペプチボディ等のミオスタチン拮抗薬は、本明細書に記載されるような方法を用いて、ポリペプチドを発現及び分泌するように遺伝的に操作された特定の細胞を移植することによって送達され得る。そのような細胞は、動物細胞またはヒト細胞であり得、自己、異種、または外因性の細胞であり得る。場合によって、これらの細胞は、不死化され得る。免疫学的応答の機会を減少させるために、これらの細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するために、カプセル化され得る。カプセル化材料は、典型的に、生体適合性の半浸透性ポリマー性包囲物または膜であり、これらは、タンパク質産物（複数を含む）の放出を可能にするが、患者の免疫系または周囲の組織からの他の有害な因子による細胞の破壊を防止する。
［０２０８］
本発明が記載されてきているが、以下の実施例は、例示の目的で提供され、限定のためではない。
【実施例】
【００３４】
実施例１：ミオスタチン結合ペプチドの特定
［０２０９］
３つの繊維状ファージライブラリー、ＴＮ８−ＩＸ（５×１０９独立形質転換体）、ＴＮ１２−Ｉ（１．４×１０９独立形質転換体）、及び直鎖（２．３×１０９独立形質転換体）（Ｄｙａｘ  Ｃｏｒｐ．）を用いて、ミオスタチン結合ファージに関して選択した。ミオスタチンでコーティングした表面上で各ライブラリーをインキュベートし、異なるパニング条件：非特異的溶出、及び組換えヒトアクチビン受容体ＩＩＢ／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）を用いた特異的溶出、または以下に記載されるミオスタチンプロペプチド溶出に供した。３つのライブラリーすべてに関して、第一の選択周期では、非特異的方式でファージを溶出させ、一方、第二及び第三の選択周期では、受容体及びプロミオスタチンを用いた。以下に記載されるように選択手順を行った。
【００３５】
ミオスタチンの調製
［０２１０］
以下のように、大腸菌Ｋ−１２株２５９６（ＡＴＣＣ番号２０２１７４）において、ミオスタチンタンパク質を組換え的に産生した。公開された国際特許出願ＷＯ００／２４７８２号に記載される手順に従って、発現ベクターｐＣＦＭ１６５６（ＡＴＣＣ番号６９５７６）及び米国特許第４，７１０，４７３号に記載される発現ベクター系に由来するｐＡＭＧ２１発現ベクター（ＡＴＣＣ番号９８１１３）に、ヒトプロミオスタチン分子をコードするポリヌクレオチドをクローニングした。プロミオスタチンをコードするポリヌクレオチドを哺乳動物発現ベクターから得た。標準的ＰＣＲ法ならびにＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩの制限酵素部位を導入する以下のＰＣＲプライマーを用いて、コード領域を増幅した。
【００３６】
５’プライマー：５’−ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＡＧＡＡＣＡＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＡＧ−３’（配列番号２９２）
３’プライマー：５’−ＡＧＡＧＡＧＧＧＡＴＣＣＡＴＴＡＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＣＡＧＣＧＧＴＣ−３’（配列番号２９３）
［０２１１］
ＰＣＲ産物及びベクターを両酵素で消化し、混合し、連結した。連結産物を大腸菌株＃２５９６に形質転換した。封入体の形で組換えタンパク質が発現されているかどうか、顕微鏡で単一コロニーを確認した。プラスミドを単離し、組換え遺伝子のコード領域を通じて配列決定して、遺伝的忠実度を確認した。
［０２１２］
バッチ法を用いて、３７℃で、１０Ｌの発酵物から細菌ペーストを生成した。９．６ＯＤ６００の細胞密度で培養物をＨＳＬで誘導し、１０４ＯＤ６００の濃度で、６時間後に採取した。ペーストを−８０℃で保存した。プロミオスタチンを発現する大腸菌ペーストを微小流動装置（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）中で１６，０００ｐｓｉで溶解し、遠心分離して不溶性封入体画分を単離した。ジチオスレイトールを含有する塩酸グアニジン中に封入体を再懸濁し、室温で可溶化した。次いで、これを水性緩衝液中で３０倍に希釈した。次いで、再フォールディングされたプロミオスタチンを濃縮し、２０ｍＭトリスｐＨ８．０に緩衝液交換し、アニオン交換カラムに適用した。増加する塩化ナトリウム勾配でアニオン交換カラムから溶出させた。プロミオスタチンを含有する画分をプールした。大腸菌で産生されるプロミオスタチンは、最初の２３アミノ酸を欠き、残基２４のアスパラギンの前のメチオニンで始まる。成熟ミオスタチンを産生するために、プールしたプロミオスタチンを、プロペプチドと成熟ミオスタチンＣ末端の間で酵素的に切断した。次いで、０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルの増加勾配を用いて、得られた混合物をＣ４−ｒｐＨＰＬＣカラムに適用した。成熟ミオスタチンを含有する画分をプールし、ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ中で乾燥させた。
［０２１３］
以下に記載される筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２に基づくアッセイにおいて、大腸菌から産生される組換え成熟ミオスタチンを試験し、哺乳動物細胞系で商業的に産生された組換えネズミミオスタチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）に比較したときに、完全に活性であることを見出した。大腸菌で産生される成熟ミオスタチンを、以下に記載されるファージディスプレイ及びスクリーニングアッセイに用いた。
【００３７】
ミオスタチンでコーティングした試験管の調製
［０２１４］
１ｍｌの０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中、８μｇのミオスタチンタンパク質の濃度で、５ｍｌのＩｍｍｕｎｏ（商標）試験管（ＮＵＮＣ）上にミオスタチンを固定した。ミオスタチンでコーティングしたＩｍｍｕｎｏ（商標）試験管を、軌道振盪（ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｉｎｇ）を伴って、室温で１時間インキュベートした。次いで、５ｍｌの２％ミルク−ＰＢＳを添加し、回転させながら室温で１時間インキュベートすることによって、ミオスタチンでコーティングしたＩｍｍｕｎｏ（商標）試験管を遮断した。得られたミオスタチンでコーティングしたＩｍｍｕｎｏ（商標）試験管を、ＰＢＳで３回洗浄した後、選択手順に供した。陰性選択のため、さらなるＩｍｍｕｎｏ（商標）試験管もまた、調製した（ミオスタチンなし）。ミオスタチンタンパク質の代わりに、１ｍｌの２％ＢＳＡ−ＰＢＳでＩｍｍｕｎｏ（商標）試験管をコーティングしたことを除いて、各パニング条件について、５〜１０のＩｍｍｕｎｏ（商標）試験管を上記手順に供した。
【００３８】
陰性選択
［０２１５］
各パニング条件について、ＴＮ８−ＩＸ及びＴＮ１２−Ｉライブラリー（ＴＮ８−ＩＸについては５×１０１１ｐｆｕ、及びＴＮ１２−Ｉについては１．４×１０１１ｐｆｕ）では、約１００のランダムライブラリー同等物、直鎖ライブラリー（２．３×１０１０ｐｆｕ）では約１０のランダムライブラリー同等物を、ライブラリーストックから一定量を分取し、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で１ｍｌに希釈した。陰性選択用に調製したＩｍｍｕｎｏ（商標）試験管に、１ｍｌの希釈したライブラリーストックを添加し、軌道振盪を伴い、室温で１０分間インキュベートした。ファージ上清を抜き取って、別の陰性選択ステップのため、第２のＩｍｍｕｎｏ（商標）試験管に添加した。この方式で、５〜１０の陰性選択ステップを行った。
【００３９】
ミオスタチン結合に関する選択
［０２１６］
上記の最後の陰性選択ステップ後、調製したミオスタチンでコーティングしたＩｍｍｕｎｏ（商標）試験管に、ファージ上清を添加した。軌道振盪を伴い、Ｉｍｍｕｎｏ（商標）試験管を室温で１時間インキュベートし、特異的ファージがミオスタチンに結合するのを可能にした。３つのライブラリー（ＴＮ８−ＩＸ、ＴＮ１２−Ｉ、及び直鎖ライブラリー）すべてを用いた、３周期の選択に関して、上清を廃棄した後、２％ミルク−ＰＢＳで約１５回、ＰＢＳＴで１０回、ＰＢＳで２回、Ｉｍｍｕｎｏ（商標）試験管を洗浄したが、ＴＮ８−ＩＸ及びＴＮ１２−Ｉのライブラリーの２回目の選択周期に関しては、２％ミルク−ＰＢＳで約１４回、２％ＢＳＡ−ＰＢＳで２回、ＰＢＳＴで１０回、ＰＢＳで１回、Ｉｍｍｕｎｏ（商標）試験管を洗浄したことが例外であった。
【００４０】
非特異的溶出
［０２１７］
最後の洗浄ステップ後、１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミン溶液（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を添加して、軌道振盪を伴い、１０分間インキュベートすることによって、結合したファージをＩｍｍｕｎｏ（商標）試験管から溶出させた。次いで、０．５ｍｌの１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を用いて、ファージ含有溶液のｐＨを中和した。
【００４１】
結合したファージの受容体（ヒトアクチビン受容体）溶出
［０２１８］
第２周期及び第３周期で、最後の洗浄ステップ後、１ｍｌの１μＭの受容体タンパク質（組換えヒトアクチビン受容体ＩＩＢ／Ｆｃキメラ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）を添加し、各条件に関して１時間インキュベートすることによって、結合したファージをＩｍｍｕｎｏ（商標）試験管から溶出させた。
【００４２】
結合したファージのプロペプチド溶出
［０２１９］
第２周期及び第３周期で、最後の洗浄ステップ後、１ｍｌの１μＭプロペプチドタンパク質（上述のように作製）を添加し、各条件に関して１時間インキュベートすることによって、結合したファージをＩｍｍｕｎｏ（商標）試験管から溶出させた。
【００４３】
ファージ増幅
［０２２０］
１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢ培地中で、新鮮な大腸菌（ＸＬ−１Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’）培養物をＯＤ６００＝０．５まで増殖させた。各パニング条件について、２０ｍｌのこの培養物を氷上で冷却し、遠心分離した。細菌ペレットを、１ｍｌのｍｉｎＡ塩溶液に再懸濁した。
［０２２１］
異なる溶出法由来の各混合物を濃縮細菌試料に添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。２ｍｌのＮＺＣＹＭ培地（２×ＮＺＣＹＭ、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン）を、各混合物に添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する巨大ＮＺＣＹＭ寒天プレート上に、得られた４ｍｌの溶液を播種し、３７℃で一晩インキュベートした。
［０２２２］
大型ＮＺＣＹＭ寒天プレート上で一晩増殖させた各細菌／ファージ混合物を、３５ｍｌのＬＢ培地中に掻き取り、さらなる３５ｍｌのＬＢ培地で、寒天プレートをさらにすすいだ。ＬＢ培地中の得られた細菌／ファージ混合物を遠心分離して、細菌をペレットにして除いた。５０μｌのファージ上清を新しい試験管に移し、１２．５ｍｌのＰＥＧ溶液（２０％ＰＥＧ８０００、３．５Ｍ酢酸アンモニウム）を添加し、氷上で２時間インキュベートして、ファージを沈殿させた。沈殿したファージを遠心分離して落とし、６ｍｌのファージ再懸濁緩衝液（２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭトリスｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に再懸濁した。残りの細菌を遠心分離して除き、１．５ｍｌのＰＥＧ溶液を添加することにより、ファージを２回沈殿させることによって、このファージ溶液をさらに精製した。遠心分離ステップ後、ファージペレットを４００μｌのＰＢＳに再懸濁した。この溶液を最後の遠心分離に供して、残りの細菌破片を取り除いた。標準的プラーク形成アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）によって、得られたファージ調製物の力価を決定した。
【００４４】
選択及び増幅のさらなる周期
［０２２３］
第２の周期において、第１の周期由来の増幅したファージ（１０１１ｐｆｕ）を投入ファージとして用いて、選択ステップ及び増幅ステップを行った。次に、第２の周期由来の増幅したファージ（１０１１ｐｆｕ）を投入ファージとして用いて、第３の周期の選択及び増幅を行った。第３の周期の溶出ステップ後、溶出したファージの小さな割合を上述のプラーク形成アッセイにおけるように播種した。個々のプラークを摘み取り、各ウェルに１００μｌのＴＥ緩衝液を含有する９６ウェルマイクロタイタープレートに播種した。これらのマスタープレートを４℃で一晩インキュベートして、ファージがＴＥ緩衝液に溶出するのを可能にした。
【００４５】
クローン分析
ファージＥＬＩＳＡ
［０２２４］
ファージクローンをファージＥＬＩＳＡに供して、次いで配列決定した。以下に論じるように配列をランク付けした。
［０２２５］
ファージＥＬＩＳＡを以下のように行った。ＯＤ６００が０．５に達するまで、大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’培養物を増殖させた。３０μｌのこの培養物を９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに分注した。１０μｌの溶出したファージを各ウェルに添加し、室温で１５分間細菌を感染させた。１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する約１２０μｌのＬＢ培地を各ウェルに添加した。次いで、マイクロタイタープレートを振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。ミオスタチンタンパク質（０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中２μｇ／ｍｌ）で、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレート（ＮＵＮＣ）を、４℃で一晩コーティングした。対照として、別個のＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレートを、ＰＢＳ中で調製した２％ＢＳＡでコーティングした。
［０２２６］
翌日、タンパク質でコーティングしたＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレート中の液体を廃棄し、ＰＢＳで３回洗浄し、各ウェルを、３００μｌの２％ミルク溶液で、室温で１時間遮断した。ミルク溶液を破棄し、ウェルをＰＢＳ溶液で３回洗浄した。最後の洗浄ステップ後、約５０μｌのＰＢＳＴ−４％のミルクを、タンパク質でコーティングしたＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレートの各ウェルに添加した。９６ウェルマイクロタイタープレート中の各ウェルから約５０μｌの一晩培養物を、ミオスタチンコーティングプレートの対応するウェル及び対照２％ＢＳＡコーティングプレートの対応するウェルに移した。２種のプレート中、１００μｌの混合物を、室温で１時間インキュベートした。Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレートから液体を廃棄し、ＰＢＳＴで約３回、続いてＰＢＳで２回、ウェルを洗浄した。ＨＲＰ複合した抗Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を約１：７，５００に希釈し、１００μｌの希釈溶液をＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレートの各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。液体を再び廃棄し、ＰＢＳＴで約３回、続いてＰＢＳで２回、ウェルを洗浄した。１００μｌのＬｕｍｉＧｌｏ（商標）化学発光基質（ＫＰＬ）を、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレートの各ウェルに添加し、反応が起こるように約５分間インキュベートした。Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレートの化学発光単位を、プレート読取装置（Ｌａｂ  Ｓｙｓｔｅｍ）上で読み取った。
【００４６】
ファージクローンの配列決定
［０２２７］
各ファージクローンに関して、ＰＣＲ法によって配列決定テンプレートを調製した。以下のオリゴヌクレオチド対を用いて、５００ヌクレオチド断片を増幅した：プライマー＃１：５’−ＣＧＧＣＧＣＡＡＣＴＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＡＧＣＴＧ−３’（配列番号２９４）及びプライマー＃２：５’−ＣＡＴＧＴＡＣＣＧＴＡＡＣＡＣＴＧＡＧＴＴＴＣＧＴＣ−３’（配列番号２９５）。各クローンに関して、以下の混合物を調製した。
【００４７】
【表２】
2016516064.tif 000004
【００４８】
［０２２８］
サーモサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ系９７００、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて、以下のプログラムを実行した：［９４℃５分、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃４５秒］×３０サイクル；７２℃７分；４℃に冷却。製造者のプロトコルに従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋマルチウェルＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、各反応由来のＰＣＲ産物を清浄にした。１０μｌの各ＰＣＲ反応物を、１μｌの染料（１０×ＢＢＸＳアガロースゲル装填色素）と混合して、１％アガロースゲル上で泳動することによって、ＰＣＲの清浄化産物を確認した。次いで、製造者が推奨するプロトコルに従って、ＡＢＩ３７７配列決定装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、残りの産物を配列決定した。
【００４９】
配列ランク付け及び分析
［０２２９］
ヌクレオチド配列から翻訳したペプチド配列をＥＬＩＳＡデータと相関させた。ミオスタチンでコーティングしたウェル中で高い化学発光単位を、２％ＢＳＡでコーティングしたウェル中で低い化学発光単位を示したクローンを特定した。複数回生じた配列を特定した。これらの基準に基づいて選択した候補配列を、ペプチボディとしてさらなる分析に供した。およそ１２００の個々のクローンを分析した。本発明のペプチボディを生成するために、これらのうち、１３２のペプチドを選択した。これらを以下の表Ｉに示す。配列番号１〜１２９を有するペプチドを用いて、同一名のペプチボディを生成した。表Ｉに示される配列番号１３０〜１４１を有するペプチドは、リンカー配列によって付着された、配列番号１〜１３２からの２つ以上のペプチドを含む。配列番号１３０〜１４１を、同一名のペプチボディを生成するのにも用いた。
［０２３０］
ペプチドのＴＮ−８由来群に関してコンセンサス配列を決定した。これらは以下の通りである：
ＫＤＸＣＸＸＷＨＷＭＣＫＰＸ（配列番号１４２）
ＷＸＸＣＸＸＸＧＦＷＣＸＮＸ（配列番号１４３）
ＩＸＧＣＸＷＷＤＸＸＣＹＸＸ（配列番号１４４）
ＸＸＷＣＶＳＰＸＷＦＣＸＸＸ（配列番号１４５）
ＸＸＸＣＰＷＦＡＸＸＣＶＤＷ（配列番号１４６）
［０２３１］
上記コンセンサス配列のすべてに関して、各コンセンサス配列の下線の「コア配列」は、常にその位置で生じるアミノ酸である。「Ｘ」は、任意の天然存在または修飾アミノ酸を指す。コア配列とともに含有される２つのシステインは、ＴＮ８−ＩＸライブラリーにおける固定アミノ酸である。
【００５０】
【表３−１】
2016516064.tif 000005
【００５１】
【表３−２】
2016516064.tif 000006
【００５２】
【表３−３】
2016516064.tif 000007
【００５３】
【表３−４】
2016516064.tif 000008
【００５４】
実施例２：ペプチボディの生成
ペプチド−Ｆｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡの構築
［０２３２］
ミオスタチンに結合可能なペプチドを、単独でまたは互いに組み合わせて用いて、ペプチドがヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに融合した、融合タンパク質を構築した。各ペプチボディのＦｃ部分のアミノ酸配列は以下の通りである（アミノ末端からカルボキシル末端）：
【００５５】
【表４】
2016516064.tif 000009
【００５６】
［０２３３］
ペプチドをＮ配置で融合させた（ペプチドをＦｃ領域のＮ末端に結合させた）か、Ｃ配置で融合させた（ペプチドをＦｃ領域のＣ末端に結合させた）か、またはＮ、Ｃ配置で融合させた（ペプチドをＦｃ領域のＮ末端及びＣ末端の両方に結合させた）。別個のベクターを用いて、Ｎ末端融合体及びＣ末端融合体を発現させた。選択したファージ核酸に、オリゴヌクレオチド対（「オリゴ」）をアニーリングさせ、ペプチドをコードする二本鎖ヌクレオチド配列を生成することによって、各ペプチボディを構築した。これらのポリヌクレオチド分子をＡｐａＬからＸｈｏＩの断片として構築した。この断片を、あらかじめＡｐａＬＩ及びＸｈｏＩで消化した、Ｎ末端配向用のｐＡＭＧ２１−Ｆｃ  Ｎ末端ベクターに、またはＣ末端配向用のｐＡＭＧ２１−Ｆｃ−Ｃ末端ベクターに連結した。標準手順を用い、エレクトロポレーションによって、得られた連結混合物で、大腸菌株２５９６細胞または４１６７細胞（株２５９６細胞のｈｓｄＲ−変異体）を形質転換した。組換えタンパク質産物を産生し、正しいヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を所持する能力に関して、クローンをスクリーニングした。修飾ペプチド各々に関して、単一のそのようなクローンを選択した。
［０２３４］
ｐＡＭＧ２１−２×Ｂｓ−Ｎ（ＺｅｏＲ）Ｆｃと称される別のベクターを用いて、構築物の多くを生成した。このベクターは、ベクター消化をＢｓｍＢＩで行ったことを除いて、上記ベクターと類似である。いくつかの構築物では、ペプチド配列をＦｃの両端で融合させた。これらの場合、ベクターは、ｐＡＭＧ２１−２×Ｂｓ−Ｎ（ＺｅｏＲ）Ｆｃ及びｐＡＭＧ２１−２×Ｂｓ−Ｃ−Ｆｃの複合体であった。
［０２３５］
ｐＡＭＧ２１の構築
公開された国際特許出願第ＷＯ００／２４７８２号に記載される手順に従って、発現ベクターｐＣＦＭ１６５６（ＡＴＣＣ番号６９５７６）及び米国特許第４，７１０，４７３号に記載される発現ベクター系から、発現プラスミドｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ番号９８１１３）を得、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５７】
Ｆｃ  Ｎ末端ベクター
［０２３６］
テンプレートとしてｐＡＭＧ２１Ｆｃ＿Ｇｌｙ５＿Ｔｐｏベクターを用いて、Ｆｃ  Ｎ末端ベクターを構築した。５’ＰＣＲプライマー（以下）を設計して、ｐＡＭＧ  Ｔｐｏ  Ｇｌｙ５のＴｐｏペプチド配列を除去し、ＡｐａＬＩ及びＸｈｏＩ部位を含有するポリリンカーと交換した。このベクターをテンプレートとして用い、以下の５’プライマー及び普遍的３’プライマーを用いて、Ｅｘｐａｎｄ  ＬｏｎｇポリメラーゼでＰＣＲを行った。
【００５８】
【表５】
2016516064.tif 000010
【００５９】
［０２３７］
得られたＰＣＲ産物をゲル精製し、制限酵素ＮｄｅＩ及びＢｓｒＧＩで消化した。Ｑｉａｇｅｎ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）ゲル精製スピンカラムを介して、プラスミド、及びそのリンカーとともに対象となるペプチドをコードするポリヌクレオチドの両方をゲル精製した。次いで、標準的な連結手順を用いて、プラスミド及び挿入物を連結し、得られた連結混合物を大腸菌（株２５９６）細胞に形質転換した。単一クローンを選択し、ＤＮＡ配列決定を行った。正しいクローンを特定し、本明細書に記載される修飾されたペプチドのベクター供給源としてこれを用いた。
【００６０】
Ｆｃ  Ｃ末端ベクターの構築
［０２３８］
テンプレートとしてｐＡＭＧ２１Ｆｃ＿Ｇｌｙ５＿Ｔｐｏベクターを用いて、Ｆｃ  Ｃ末端ベクターを構築した。３’ＰＣＲプライマーを設計して、Ｔｐｏペプチド配列を除去し、ＡｐａＬＩ及びＸｈｏＩ部位を含有するポリリンカーと交換した。普遍的５’プライマー及び３’プライマーを用いて、Ｅｘｐａｎｄ  ＬｏｎｇポリメラーゼでＰＣＲを行った。
５’プライマー：５’−ＣＧＴＡＣＡＧＧＴＴＴＡＣＧＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧ−３’（配列番号２９９）
３’プライマー：５’−ＴＴＴＧＴＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＡＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴ
ＴＴＣＴＧＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴＴＡＣ−３’（配列番号３００）
［０２３９］
得られたＰＣＲ産物をゲル精製し、制限酵素ＢｓｒＧＩ及びＢａｍＨＩで消化した。Ｑｉａｇｅｎゲル精製スピンカラムを介して、プラスミド、及びそのリンカーとともに対象となる各々のペプチドをコードするポリヌクレオチドの両方をゲル精製した。次いで、標準的な連結手順を用いて、プラスミド及び挿入物を連結し、得られた連結混合物を大腸菌（株２５９６）細胞に形質転換した。株２５９６（ＡＴＣＣ＃２０２１７４）は、ｌｕｘプロモーター、ならびに２つのラムダ温度感受性リプレッサー、ｃＩ８５７ｓ７及びｌａｃ  ＩＱリプレッサーを含有するように修飾された大腸菌Ｋ−１２株である。単一クローンを選択し、ＤＮＡ配列決定を行った。正しいクローンを特定し、本明細書に記載される各ペプチボディの供給源として用いた。
【００６１】
大腸菌における発現
［０２４０］
Ｔｅｒｒｉｆｉｃブロス培地（前述のＳａｍｂｒｏｏｋらの参考文献に引用される、Ｔａｒｔｏｆ  ａｎｄ  Ｈｏｂｂｓ，“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｄｉａ  ｆｏｒ  ｇｒｏｗｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ  ａｎｄ  ｃｏｓｍｉｄ  ｃｌｏｎｅｓ”，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ  Ｆｏｃｕｓ，Ｖｏｌｕｍｅ９，ｐａｇｅ１２，１９８７を参照のこと）中、３７℃で、大腸菌株２５９６中の各々のｐＡＭＧ２１−Ｆｃ融合構築物の培養物を増殖させた。合成自己誘導剤（ａｕｔｏｉｎｄｕｃｅｒ）、Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−ＤＬ−ホモセリンラクトンを、１ミリリットルあたり２０ナノグラム（ｎｇ／ｍｌ）の最終濃度になるように、培養培地に添加した後、ｌｕｘＰＲプロモーターからの遺伝子産物発現の誘導が達成された。培養物を３７℃でさらに６時間インキュベートした。次いで、封入体の存在に関して、細菌培養物を顕微鏡によって検査し、遠心分離によって収集した。誘導した培養物中に、屈折（ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ）封入体が観察されたことから、大腸菌の不溶性画分でＦｃ融合体が産生された可能性が最も高いことが示された。１０％β−メルカプトエタノールを含有するＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液に直接再懸濁することによって細胞ペレットを溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。大部分の場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に、適切な分子量の強いクマシー染色されたバンドが観察された。
【００６２】
ペプチボディのフォールディング及び精製
［０２４１］
高圧ホモジナイズ（１５，０００ＰＳＩで３パス）によって、水中（体積当たり１／１０体積）で細胞を破壊し、遠心分離（Ｊ−６Ｂ中４０００ＲＰＭで３０分間）によって封入体を採取した。６Ｍグアニジン、５０ｍＭトリス、８ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ８．０中、１／１０の比で、周囲温度で１時間、封入体を可溶化した。可溶化した混合物を、４Ｍ尿素、２０％グリセロール、５０ｍＭトリス、１６０ｍＭアルギニン、３ｍＭシステイン、１ｍＭシスタミン、ｐＨ８．５に２５倍に希釈した。混合物を低温中で一晩インキュベートした。次いで、１０ｍＭトリスｐＨ８．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５Ｍ尿素に対して、混合物を透析した。一晩透析した後、透析物のｐＨを酢酸でｐＨ５に調整した。遠心分離によって沈殿物を除去し、１０ｍＭ  ＮａＡｃ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５で平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムに、上清を４℃）で装填した。装填後、カラムを、１０ｍＭ  ＮａＡｃ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．２で洗浄してベースラインにした。２０カラム体積の、酢酸緩衝液中の５０ｍＭ〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配で、カラムを展開した。あるいは、ベースラインまで洗浄した後、５カラム体積の１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０でカラムを洗浄し、１５カラム体積の、リン酸塩緩衝液中の０〜４００ｍＭのＮａＣｌ勾配で、カラムを展開した。カラム画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。二量体ペプチボディを含有する画分をプールした。ゲル濾過によっても画分を分析し、凝集物が存在するかどうかを決定した。
［０２４２］
表Ｉのペプチドから多くのペプチボディを調製した。ペプチドをヒトＩｇＧ１Ｆｃ分子に結合させて、表ＩＩのペプチボディを形成した。表ＩＩのペプチボディに関して、Ｃ配置は、指定のペプチドが、ＦｃのＣ末端に結合したことを示す。Ｎ配置は、指定のペプチドが、ＦｃのＮ末端に結合したことを示す。Ｎ，Ｃ配置は、１つのペプチドが各Ｆｃ分子のＮ末端に、１つがＣ末端に結合したことを示す。２×の表示は、指定の２つのペプチドが、示したリンカーによって分離されて、互いにタンデムに結合し、そしてまた、ＦｃのＮ末端またはＣ末端に、あるいはＮ、Ｃ両末端に結合したことを示す。リンカーによって分離されてタンデムに結合した２つのペプチドは、例えば、ミオスタチン−ＴＮ８−２９−１９−８ｇと示され、これは、ＴＮ８−２９ペプチドが（ｇｌｙ）８リンカーを介して、ＴＮ８−１９ペプチドに結合したことを示す。特に明記しない限り、ペプチド（複数を含む）は、（ｇｌｙ）５リンカー配列を介して、Ｆｃに結合した。いくつかの場合、ペプチド（複数を含む）は、ｋリンカーを介して結合した。ｋまたは１ｋと示されるリンカーは、ｇｓｇｓａｔｇｇｓｇｓｔａｓｓｇｓｇｓａｔｇ（配列番号３０１）リンカー配列を指し、ｋｃは、ＦｃのＣ末端に結合したリンカーを指し、ｋｎは、ＦｃのＮ末端に結合したリンカーを指す。以下の表ＩＩにおいて、第４列は、Ｆｃを第１のペプチドに結合するリンカー配列を指し、第５列は、配置ＮもしくはＣまたは両方を指す。
［０２４３］
Ｆｃ分子は溶液中で二量体化するため、１つのペプチドを有するように構築されたペプチボディは、実際には、２コピーのペプチド及び２つのＦｃ分子を持つ二量体であり、タンデムに２つのペプチドを有する２×型は、実際には、４コピーのペプチド及び２つのＦｃ分子を持つ二量体であろう。
［０２４４］
表ＩＩに示すペプチボディは、大腸菌で発現されるため、最初のアミノ酸残基はＭｅｔ（Ｍ）である。したがって、Ｎ配置のペプチボディは、例えば、Ｍｅｔ−ペプチド−リンカー−ＦｃまたはＭｅｔ−ペプチド−リンカー−ペプチド−リンカー−Ｆｃである。Ｃ配置のペプチボディは、例えば、Ｍｅｔ−Ｆｃ−リンカー−ペプチドまたはＭｅｔ−Ｆｃ−リンカー−ペプチド−リンカー−ペプチドである。Ｃ，Ｎ配置のペプチボディは、両方の組み合わせ、例えば、Ｍｅｔ−ペプチド−リンカー−Ｆｃ−リンカー−ペプチドである。
［０２４５］
典型的なペプチボディをコードするヌクレオチド配列を以下の表ＩＩに提供する。本発明の典型的なペプチボディをコードするポリヌクレオチド配列には、以下のようなＦｃポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が含まれる：
【００６３】
【表６】
2016516064.tif 000011
【００６４】
［０２４６］
さらに、以下のような５つのグリシンｇｇｇｇｇリンカーをコードするポリヌクレオチドが含まれる：
５’−ＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴ−３’（配列番号３０２）
［０２４７］
ペプチボディをコードするポリヌクレオチドにはまた、メチオニンをコードするコドンＡＴＧ及びＴＡＡ等の停止コドンも含まれる。
［０２４８］
したがって、表ＩＩの第１のペプチボディの構造は、以下のような、Ｃ配置及び（ｇｌｙ）５リンカーを持つＴＮ８−Ｃｏｎ１である：Ｍ−Ｆｃ−ＧＧＧＧＧ−ＫＤＫＣＫＭＷＨＷＭＣＫＰＰ（配列番号３０３）。このペプチボディをコードする典型的なポリヌクレオチドは：
５’−ＡＴＧＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＴＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＡＧＡＣＡＡＡＴＧＣＡＡＡＡＴＧＴＧＧＣＡＣＴＧＧＡＴＧＴＧＣＡＡＡＣＣＧＣＣＧ−３’（配列番号３０４）であろう。
【００６５】
【表７−１】
2016516064.tif 000012
【００６６】
【表７−２】
2016516064.tif 000013
【００６７】
【表７−３】
2016516064.tif 000014
【００６８】
【表７−４】
2016516064.tif 000015
【００６９】
【表７−５】
2016516064.tif 000016
【００７０】
【表７−６】
2016516064.tif 000017
【００７１】
【表７−７】
2016516064.tif 000018
【００７２】
【表７−８】
2016516064.tif 000019
【００７３】
【表７−９】
2016516064.tif 000020
【００７４】
実施例３：インビトロアッセイ
Ｃ２Ｃ１２細胞に基づくミオスタチン活性アッセイ
［０２４９］
本アッセイは、ミオスタチンの受容体への結合を阻害する度合いを測定することによって試験される、阻害剤のミオスタチン中和能を示す。
［０２５０］
Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１７７２）をｐＭＡＲＥ−ｌｕｃ構築物でトランスフェクションすることによってミオスタチン応答性受容体細胞株を生成した。ミオスタチン／アクチビン応答要素（Ｄｅｎｎｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ１７：３０９１−３１００（１９９８））を表すＣＡＧＡ配列の１２の反復を、ＴＡＴＡボックスの上流で、ｐＬｕｃ−ＭＣＳレポーターベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２１９０８７）内にクローニングすることによって、ｐＭＡＲＥ−ｌｕｃ構築物を作製した。筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞は、天然に、その細胞表面上に、ミオスタチン／アクチビン受容体を発現する。ミオスタチンが細胞受容体に結合すると、Ｓｍａｄ経路が活性化され、リン酸化されたＳｍａｄが応答要素に結合し（Ｍａｃｉａｓ−Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ８７：１２１５（１９９６））、ルシフェラーゼ遺伝子の発現を生じる。次いで、製造業者のプロトコルに従って、市販のルシフェラーゼレポーターアッセイキット（カタログ番号Ｅ４５５０、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定する。ｐＭＡＲＥ−ｌｕｃでトランスフェクションされた安定株のＣ２Ｃ１２細胞（Ｃ２Ｃ１２／ｐＭＡＲＥクローン＃４４）を用い、以下の方法に従って、ミオスタチン活性を測定した。
［０２５１］
同数のレポーター細胞（Ｃ２Ｃ１２／ｐＭＡＲＥクローン＃４４）を９６ウェル培地に播種した。４ｎＭで固定したミオスタチン濃度で、ペプチボディの２つの希釈を用いて、最初の周期のスクリーニングを行った。組換え成熟ミオスタチンを、それぞれ、４０ｎＭ及び４００ｎＭのペプチボディと、室温で２時間、プレインキュベートした。レポーター細胞培養物を、ペプチボディを含み、または含まず、ミオスタチンで６時間処理した。処理した培養物において、ルシフェラーゼ活性を決定することによって、ミオスタチン活性を測定した。初めに、このアッセイを用いて、レポーターアッセイにおいて、ミオスタチンシグナル伝達活性を阻害したペプチボディヒットを特定した。続いて、４ｎＭに固定したミオスタチン濃度で、９点の滴定曲線を生成した。レポーター細胞培養物に混合物を添加する前に、ミオスタチンを、９つの濃度：０．０４ｍＭ、０．４ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、４０ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、２μＭ、及び４μＭのペプチボディの各々と２時間、プレインキュベートした。いくつかの典型的なペプチボディのＩＣ５０値を表ＩＩＩに提供し、親和性成熟ペプチボディに関しては、表ＶＩＩＩに提供する。
【００７５】
ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイ
［０２５２］
センサーチップＣＭ５、及びランニング緩衝液として、０．００５パーセントのＰ２０界面活性剤（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）装置上で、各候補ミオスタチンペプチボディの親和性分析を行った。製造業者の示唆するプロトコルに従って、アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を用い、一級アミン基を介して、研究用品質のＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）に、組換え成熟ミオスタチンタンパク質を固定化した。
［０２５３］
直接結合アッセイを用いて、ペプチボディをスクリーニングし、固定化ミオスタチンに結合する能力の順にランク付けした。２つの濃度（４０及び４００ｎＭ）の各候補ミオスタチン結合ペプチボディを、流速５０μｌ／分で３分間、固定化ミオスタチン表面に注入することによって、結合アッセイを行った。３分間解離させた後、表面を再生成した。結合シグナル強度に関して、ならびに解離速度に関して、結合曲線を定性的に比較した。ＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．１コンピュータプログラム（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて、ｋａ（会合速度定数）、ｋｄ（解離速度定数）、及びＫＤ（解離平衡定数）を含むペプチボディ結合動力学パラメータを決定した。解離平衡定数（ｎＭで表す）が低いほど、ミオスタチンに対するペプチボディの親和性が高くなる。ペプチボディＫＤ値の例を表ＩＩＩに示し、以下の親和性成熟ペプチボディに関しては、表ＶＩに示す。
【００７６】
ＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃ表面上の遮断アッセイ
［０２５４］
固定化ＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）及びミオスタチンを用いて、ペプチボディの存在下及び非存在下、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイ系で、遮断アッセイを行った。アッセイを用いて、非中和（ＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃへのミオスタチン結合を妨げないもの）または中和（ＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃへのミオスタチン結合を妨げるもの）として、ペプチボディを分類した。初めに、いかなるペプチボディも存在しない、ベースラインのミオスタチン−ＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃ結合を決定した。
［０２５５］
初期スクリーニング研究には、ペプチボディを、試料緩衝液中、４ｎＭ、４０ｎＭ、及び４００ｎＭに希釈し、４ｎＭミオスタチン（同様に、試料緩衝液中で希釈する）とインキュベートした。ペプチボディ：リガンド混合物が、室温で平衡に達するようにし（少なくとも５時間）、次いで、流速１０μｌ／分で、２０〜３０分間、固定化ＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃ表面上に注入した。結合反応の増加（ペプチボディを含まない対照の結合を越える）は、ミオスタチンへのペプチボディ結合が非中和性であることを示した。結合反応の減少（対照と比較）は、ミオスタチンへのペプチボディ結合が、ＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃへのミオスタチン結合を遮断することを示した。ＩＣ５０値（中和ペプチボディ）またはＥＣ５０（非中和ペプチボディ）を得るために、全濃度系列の遮断アッセイを用いて、選択したペプチボディをさらに特徴付けた。ペプチボディ試料を、２００ｎＭから０．０５ｍＭまで試料緩衝液中で連続希釈して、４ｍＭミオスタチンと、室温で平衡に達するまで（最小５時間）インキュベートした後、流速１０μｌ／分で２０〜３０分間、固定化ＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃ表面上に注入した。試料注入後、結合したリガンドを３分間、受容体から解離させた。ペプチボディ濃度に対して結合シグナルをプロットし、４ｎＭミオスタチンの存在下で、各ペプチボディのＩＣ５０値を計算した。例えば、ペプチボディＴＮ８−１９、Ｌ２、及びＬ１７は、細胞に基づくアッセイにおいて、ミオスタチン活性を阻害するが、ＴＮ−８−１９の結合は、ミオスタチン／ＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃ相互作用を遮断しないことから、ＴＮ−８−１９が、他の２つのペプチボディで観察されるものとは異なるエピトープに結合することが示された。
【００７７】
ペプチボディに対するエピトープビンニング
［０２５６］
精製ペプチボディをＢＩＡｃｏｒｅチップ上に固定化して、第２のペプチボディを注入する前に、ミオスタチンを捕捉し、捕捉されたミオスタチンに結合した二次ペプチボディの量を決定した。別個のエピトープを持つペプチボディのみが、捕捉されたミオスタチンに結合し、したがって類似のまたは別個のエピトープ結合特性を持つペプチボディのビンニングが可能になる。例えば、ペプチボディＴＮ８−１９及びＬ２３が、ミオスタチン上の異なるエピトープに結合することが示された。
【００７８】
選択性アッセイ
［０２５７］
ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）技術を用いて、これらのアッセイを行って、他のＴＧＦβファミリーメンバーへのペプチボディの結合の選択性を決定した。製造業者が示唆するプロトコルに従って、ＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃ、ＴＧＦβＲＩＩ／Ｆｃ、及びＢＭＰＲ−１Ａ／Ｆｃ（すべてＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮから得られた）を研究用品質のセンサーチップに共有結合的にカップリングした。ＢＩＡｃｏｒｅアッセイは屈折率の変化を検出するので、いかなるペプチボディも存在しない対照表面上の注入で検出された反応と比較した、固定化受容体表面上での注入で検出された反応の間の相違は、それぞれ、受容体へのアクチビンＡ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、及びＢＭＰ４の実際の結合を表す。ペプチボディ及びＴＧＦβ分子をプレインキュベートすると、結合反応の変化（増加または減少）は、ＴＧＦβファミリーの分子へのペプチボディ結合を示す。本発明のペプチボディはすべて、ミオスタチンに結合するが、アクチビンＡ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、またはＢＭＰ４に結合しない。
【００７９】
ＫｉｎＥｘ  Ａ（商標）平衡アッセイ
［０２５８］
ＫｉｎＥｘＡ（商標）技術（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を用いた、溶液に基づく平衡結合アッセイを用いて、ペプチボディ分子へのミオスタチン結合の解離平衡（ＫＤ）を測定した。この溶液に基づくアッセイは、いくつかの場合、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイよりもより感受性であると見なされる。Ｒｅａｃｔｉ−Ｇｅｌ（商標）６Ｘを約５０μｇ／ｍｌのミオスタチンで一晩プレコーティングし、次いで、ＢＳＡで遮断した。３０ｐＭ及び１００ｐＭのペプチボディ試料を、試料緩衝液中、様々な濃度（０．５ｐＭ〜５ｎＭ）のミオスタチンと室温で８時間インキュベートした後、ミオスタチンでコーティングしたビーズの間を流動させた。スーパーブロック中の１ｍｇ／ｍｌの蛍光（Ｃｙ５）標識したヤギ抗ヒトＦｃ抗体によって、ビーズに結合したペプチボディの量を定量化した。結合シグナルは、所定のミオスタチン濃度で平衡状態の未結合ペプチボディの濃度に比例する。ＫｉｎＥｘ  Ａ（商標）ソフトウェア（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）において提供される、二重曲線一部位均質結合モデルを用いた競合曲線の非線形回帰から、ＫＤを得た。
【００８０】
実施例４：ミオスタチン阻害剤の比較
［０２５９］
３つの典型的な第一周期ペプチボディが結合し（ＫＤ）、阻害する（ＩＣ５０）能力を、可溶性受容体融合タンパク質ａｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．）で得たＫＤ及びＩＣ５０値と比較した。実施例３に記載されるｐＭＡＲＥ  ｌｕｃ細胞に基づくアッセイを用いて、ＩＣ５０値を決定し、実施例３に記載されるＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）アッセイを用いて、ＫＤ値を決定した。
【００８１】
【表８】
2016516064.tif 000021
【００８２】
［０２６０］
ペプチボディは、受容体／Ｆｃ阻害剤よりも改善されたＩＣ５０を有し、２つのペプチボディにおいては、受容体／Ｆｃと匹敵する結合親和性を有する。
【００８３】
実施例５：ペプチド及びペプチボディがミオスタチンを阻害する能力の比較
［０２６１］
ペプチド配列：ＱＧＨＣＴＲＷＰＷＭＣＰＰＹ（ＴＮ８−１９）（配列番号３３）を用い、上の実施例２に記載される手順に従って、対応するペプチボディＴＮ８−１９（ｐｂ）を構築した。上の実施例３に記載されるＣ２Ｃ１２に基づくアッセイを用いて、ミオスタチン阻害活性に関して、ペプチドのみ及びペプチボディの両方をスクリーングした。図１から、ペプチボディのＩＣ５０（ミオスタチンを５０％阻害するのに有効な濃度）が、ペプチドのものより有意に低く、したがって、ペプチボディの配置を取ることによって、ペプチドがミオスタチン活性を阻害する能力が、実質的に改善されたことがわかる。
【００８４】
実施例６：親和性成熟ペプチド及びペプチボディの生成
［０２６２］
ペプチボディ生成に用いた第一周期ペプチドのいくつかを、親和性成熟のために選択した。選択されたペプチドには、次のものが含まれた：システイン拘束ＴＮ８−１９、ＱＧＨＣＴＲＷＰＷＭＣＰＰＹ（配列番号３３）、及び直鎖ペプチド、直鎖−２
ＭＥＭＬＤＳＬＦＥＬＬＫＤＭＶＰＩＳＫＡ（配列番号１０４）、直鎖−１５
ＨＨＧＷＮＹＬＲＫＧＳＡＰＱＷＦＥＡＷＶ（配列番号１１７）、直鎖−１７
ＲＡＴＬＬＫＤＦＷＱＬＶＥＧＹＧＤＮ（配列番号１１９）、直鎖−２０
ＹＲＥＭＳＭＬＥＧＬＬＤＶＬＥＲＬＱＨＹ（配列番号１２２）、直鎖−２１
ＨＮＳＳＱＭＬＬＳＥＬＩＭＬＶＧＳＭＭＱ（配列番号１２３）、直鎖−２４
ＥＦＦＨＷＬＨＮＨＲＳＥＶＮＨＷＬＤＭＮ（配列番号１２６）。コンセンサス配列に基づいて、「コア」アミノ酸（コンセンサス配列から決定する）を一定に維持するかまたはその発生頻度を偏向させた、定方向二次ファージディスプレイライブラリーを生成した。あるいは、個々のペプチド配列を用いて、偏向定方向ファージディスプレイライブラリーを生成することも可能である。よりストリンジェントな条件下での、そのようなライブラリーのパニングによって、ミオスタチンへの結合が増進した、ミオスタチンへの選択的結合が増進した、またはさらなる何らかの所望の特性を持つ、ペプチドを生じることが可能である。
【００８５】
ライブラリーのためのドープしたオリゴの産生
［０２６３］
コア配列が９１％「ドープ」された、すなわち各溶液が、表される塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）の９１％、及び他の３ヌクレオチドの各々３％である、ＤＮＡ合成装置中、オリゴヌクレオチドを合成した。ＴＮ８−１９ファミリーでは、例えば、二次ファージライブラリーの構築に用いた９１％ドープしたオリゴは、以下の通りであった：
５’−ＣＡＣ  ＡＧＴ  ＧＣＡ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ｃａＫ  ｇｇＫ  ｃａＫ  ｔｇＫ  ａｃＫ  ｃｇＫ  ｔｇＫ  ｃｃＫ  ｔｇＫ  ａｔＫ  ｔｇＫ  ｃｃＫ  ｃｃＫ  ｔａＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＣＡＴ  ＴＣＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  Ａ−３’（配列番号６３４）
ここで、「Ｎ」は、４つのヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、及びＧの各々が、等しく表されたことを示し、Ｋは、Ｇ及びＴが等しく表されたことを示し、小文字は、９１％の表記の塩基と他の塩基の各々３％の混合物を表す。この様式で調製されたオリゴヌクレオチドファミリーを上記のようにＰＣＲ増幅し、上記のプロトコルに従って、ファージミドベクター、例えば、修飾ｐＣＥＳ１プラスミド（Ｄｙａｘ）、または入手可能なファージミドベクターのいずれかに連結した。生成された二次ファージライブラリーは、すべて９１％ドープされ、１〜６．５×１０９の独立形質転換体を有した。上記のように、ライブラリーをパニングしたが、以下の条件を用いた：
【００８６】
【表９】
2016516064.tif 000022
【００８７】
［０２６４］
二次ライブラリーのパニングによって、ミオスタチンへの結合が増進したペプチドを得た。個々の選択クローンを上記のようにファージＥＬＩＳＡに供し、配列決定した。
［０２６５］
ペプチドの以下の親和性成熟ＴＮ８−１９ファミリーを以下の表ＩＶに示す。
【００８８】
【表１０−１】
2016516064.tif 000023
【００８９】
【表１０−２】
2016516064.tif 000024
【００９０】
［０２６６］
上に示す親和性成熟ＴＮ−８−１９−１からＣｏｎ２（ｍＴＮ８ｃｏｎ６配列を除く）由来のコンセンサス配列は：Ｃａ１ａ２Ｗａ３ＷＭＣＰＰ（配列番号３５２）である。これらのペプチドはすべて、配列ＷＭＣＰＰ（配列番号６３３）を含む。下線のアミノ酸は、すべての実施形態に存在するコアアミノ酸を表し、ａ１、ａ２、及びａ３は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸から選択される。このコンセンサス配列の一実施形態Ｃｂ１ｂ２Ｗｂ３ＷＭＣＰＰ（配列番号３５３）において、ｂ１は、アミノ酸Ｔ、Ｉ、またはＲのうちのいずれか１つから選択され、ｂ２は、Ｒ、Ｓ、Ｑのうちのいずれか１つから選択され、ｂ３は、Ｐ、Ｒ、及びＱのうちのいずれか１つから選択される。これらのペプチドはすべて、配列ＷＭＣＰＰ（配列番号６３３）を含む。配列番号３５２を含む親和性成熟ＴＮ８配列のより詳細な分析は、以下の式：
ｃ１ｃ２ｃ３ｃ４ｃ５ｃ６Ｃｃ７ｃ８Ｗｃ９ＷＭＣＰＰｃ１０ｃ１１ｃ１２ｃ１３（配列番号３５４）を提供し、式中
ｃ１は、存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
ｃ２は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
ｃ３は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
ｃ４は、存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
ｃ５は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
ｃ６は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは塩基性アミノ酸であり、
ｃ７は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸であり、
ｃ８は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸であり、
ｃ９は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸であり、式中
ｃ１０〜ｃ１３は、任意のアミノ酸である。
［０２６７］
上記式の一実施形態において、ｂ７は、アミノ酸Ｔ、Ｉ、またはＲのうちのいずれか１つから選択され、ｂ８は、Ｒ、Ｓ、Ｑのうちのいずれか１つから選択され、ｂ９は、Ｐ、Ｒ、及びＱのうちのいずれか１つから選択される。これは、以下の配列：
ｄ１ｄ２ｄ３ｄ４ｄ５ｄ６Ｃｄ７ｄ８Ｗｄ９ＷＭＣＰＰｄ１０ｄ１１ｄ１２ｄ１３（配列番号３５５）を提供する。
【００９１】
ｄ１は、存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
ｄ２は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
ｄ３は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
ｄ４は、存在しないか、または任意のアミノ酸であり、
ｄ５は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり、
ｄ６は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは塩基性アミノ酸であり、
ｄ７は、アミノ酸Ｔ、Ｉ、またはＲのうちのいずれか１つから選択され、
ｄ８は、Ｒ、Ｓ、Ｑのうちのいずれか１つから選択され、
ｄ９は、Ｐ、Ｒ、及びＱのうちのいずれか１つから選択され、
ｄ１０〜ｄ１３は、任意のアミノ酸から選択される。
［０２６８］
ｍＴＮ８ｃｏｎ６シリーズのコンセンサス配列は、ＷＹｅ１ｅ２Ｙｅ３Ｇ（配列番号３５６）であり、式中ｅ１は、Ｐ、Ｓ、またはＹであり、ｅ２は、ＣまたはＱであり、ｅ３は、ＧまたはＨである。
［０２６９］
ＴＮ−１９親和性成熟ファミリーに加えて、直鎖Ｌ−２、Ｌ−１５、Ｌ−１７、Ｌ−２０、Ｌ−２１、及びＬ−２４の第１周期のペプチドから、さらなる親和性成熟ペプチドを産生した。これらのファミリーを以下の表Ｖに示す。
【００９２】
【表１１−１】
2016516064.tif 000025
【００９３】
【表１１−２】
2016516064.tif 000026
【００９４】
【表１１−３】
2016516064.tif 000027
【００９５】
［０２７０］
次いで、表ＩＶ及びＶに提供される親和性成熟ペプチドを上記のペプチボディに組み立て、インビボアッセイを用いてアッセイした。
［０２７１］
親和性成熟Ｌ２ペプチドは、ｆ１ＥＭＬｆ２ＳＬｆ３ｆ４ＬＬ（配列番号４５５）のコンセンサス配列を含み、式中、ｆ１は、ＭまたはＩであり、ｆ２は、任意のアミノ酸であり、ｆ３は、ＬまたはＦであり、ｆ４は、Ｅ、Ｑ、またはＤである。
［０２７２］
親和性成熟Ｌ１５ペプチドファミリーは、配列Ｌｇ１ｇ２ＬＬｇ３ｇ４Ｌ（配列番号４５６）を含み、式中、ｇ１は、Ｑ、Ｄ、またはＥであり、ｇ２は、Ｓ、Ｑ、Ｄ、またはＥであり、ｇ３は、任意のアミノ酸であり、ｇ４は、Ｌ、Ｗ、Ｆ、またはＹである。親和性成熟Ｌ１７ファミリーは、配列：ｈ１ｈ２ｈ３ｈ４ｈ５ｈ６ｈ７ｈ８ｈ９（配列番号４５７）を含み、式中、ｈ１は、ＲまたはＤであり、ｈ２は、任意のアミノ酸であり、ｈ３は、Ａ、Ｔ  Ｓ、またはＱであり、ｈ４は、ＬまたはＭであり、ｈ５は、ＬまたはＳであり、ｈ６は、任意のアミノ酸であり、ｈ７は、ＦまたはＥであり、ｈ８は、Ｗ、Ｆ、またはＣであり、ｈ９は、Ｌ、Ｆ、Ｍ、またはＫである。コンセンサス配列はまた、上に示されるペプチドのｍＬ２０、ｍＬ２１、及びｍＬ２４ファミリーに関しても決定され得る。
［０２７３］
上記の実施例２に記載されるように、ＦｃのＮ末端（Ｎ配置）、Ｃ末端（Ｃ配置）、またはＮ末端及びＣ末端の両方（Ｎ、Ｃ配置）で、配列番号２９６を有するヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに結合するリンカーを用いて、上記のこれらの親和性成熟ペプチドからペプチボディを構築した。指定されたペプチドを、５グリシン（５Ｇ）、８グリシン、またはｋリンカー配列を介して、Ｃ末端またはＮ末端に結合させた。２×ペプチボディ型では、５ｇｌｙ、８ｇｌｙ、またはｋ等のリンカーでペプチドを結合した。親和性成熟ペプチド及びペプチボディは、例えば、ｍＴＮ８−１９−２２等の小文字「ｍ」で示される。本発明のペプチボディは、ペプチドがファージミドベクターにスプライシングされる２つのスプライス部位をさらに含有する。これらのスプライス部位の位置は、ＡＱ−ペプチド−ＬＥである。ペプチボディは、一般的に、これらのさらなるアミノ酸を含む（しかし、これらは表に列挙されるペプチド配列には含まれない）。いくつかのペプチボディでは、ＬＥアミノ酸をペプチド配列から除去した。これらのペプチボディは、−ＬＥと示される。
［０２７４］
典型的なペプチボディ、及びそれらをコードする典型的なポリヌクレオチド配列を、以下の表ＶＩに提供する。この表には、２×ｍＴＮ８−１９−７（配列番号６１５）等のペプチボディ配列（ペプチドのみと対照的に）及びＬＥ配列が欠失したペプチボディ（配列番号６１７）の例が含まれる。説明として、２×型のリンカー配列は、タンデムペプチド間のリンカーを指す。これらのペプチボディ配列は、Ｆｃ、リンカー、ＡＱ、及びＬＥ配列を含有する。付随するヌクレオチド配列は、存在する場合ＡＱ／ＬＥリンカー配列に加えてペプチド配列をコードするが、示されるリンカーはコードしない。
【００９６】
【表１２−１】
2016516064.tif 000028
【００９７】
【表１２−２】
2016516064.tif 000029
【００９８】
【表１２−３】
2016516064.tif 000030
【００９９】
【表１２−４】
2016516064.tif 000031
【０１００】
【表１２−５】
2016516064.tif 000032
【０１０１】
【表１２−６】
2016516064.tif 000033
【０１０２】
【表１２−７】
2016516064.tif 000034
【０１０３】
【表１２−８】
2016516064.tif 000035
【０１０４】
【表１２−９】
2016516064.tif 000036
【０１０５】
【表１２−１０】
2016516064.tif 000037
【０１０６】
【表１２−１１】
2016516064.tif 000038
【０１０７】
【表１２−１２】
2016516064.tif 000039
【０１０８】
【表１２−１３】
2016516064.tif 000040
【０１０９】
【表１２−１４】
2016516064.tif 000041
【０１１０】
【表１２−１５】
2016516064.tif 000042
【０１１１】
【表１２−１６】
2016516064.tif 000043
【０１１２】
実施例７：親和性成熟ペプチボディのインビトロスクリーニング
［０２７５］
上述のプロトコルに従って、以下の典型的なペプチボディをスクリーニングして、以下のＫＤ値及びＩＣ５０値を得た。表ＶＩＩは、ＫｉｎＥｘＡ（商標）溶液に基づくアッセイまたはＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイによって決定されるように、親ペプチボディと比較した、選択された親和性成熟ペプチボディのＫＤ値の範囲を示す。これらの値は、親ペプチボディと比較して、ミオスタチンに対する親和性成熟ペプチボディの増加した結合親和性を示す。表ＶＩＩＩは、いくつかの親和性成熟ペプチボディのＩＣ５０値を示す。値の範囲をこの表に示す。
【０１１３】
【表１３】
2016516064.tif 000044
【０１１４】
【表１４−１】
2016516064.tif 000045
【０１１５】
【表１４−２】
2016516064.tif 000046
【０１１６】
実施例８：典型的なペプチボディのインビボ同化活性
［０２７６］
ＣＤ１ｎｕ／ｎｕマウスモデル（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、ヒトＦｃ領域（ｈｕＦｃ）を含む本発明のペプチボディのインビボ有効性を決定した。このモデルは、迅速な同化反応で本発明の阻害剤に反応し、これは、乾燥筋量の増加及び筋線維タンパク質の増加を伴ったが、体内の水含量の集積は伴わなかった。
［０２７７］
一例において、１×ペプチボディｍＴＮ８−１９−２１のインビボでの有効性を以下の実験によって示した。１０匹の８週齢ＣＤ１ｎｕ／ｎｕマウスの群を、週２回または週１回、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇの投与量（皮下注射）で処置した。１０匹の８週齢ＣＤ１ｎｕ／ｎｕマウスの対照群は、週２回、１０ｍｇ／ｋｇでｈｕＦｃ（ビヒクル）の（皮下）注射を投与した。１日おきに動物の体重を測定し、０日目及び１３日目に、ＮＭＲによって除脂肪体重を決定した。次いで、１４日目に動物を殺処分し、腓腹筋のサイズを決定した。結果を図２及び３に示す。図２は、多様な投薬量でペプチボディを１４日間にわたって投与した際の、対照と比較した、マウスの総体重の増加を示す。図２からわかるように、すべての投薬量は、対照と比較して体重の増加を示し、投薬量のすべてが、１４日目までに、対照を超える、統計的に有意な増加を示した。図３は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（ＥｃｈｏＭＲＩ２００３、Ｅｃｈｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｘ）によって決定される、０日目及び１３日目の除脂肪体重の変化、ならびに１４日目に動物から切開された腓腹筋の重量変化を示す。
［０２７８］
別の例において、１×ｍＴＮ８−１９−３２ペプチボディを、ＣＤ１ｎｕ／ｎｕマウスに、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、及び３０ｍｇ／ｋｇで、週２回注射して投与し、ｈｕＦｃ対照（ビヒクル）と比較した。ペプチボディ処置動物は、総体重の増加（図示せず）、ならびにＮＭＲ測定によって決定されるように、０日目と比較して１３日目に除脂肪体重の増加を示す。除脂肪体重の増加を図４に示す。
［０２７９］
別の例において、インビボ同化有効性に関して、１×親和性成熟ペプチボディを２×親和性成熟ペプチボディと比較した。ＣＤ１ｎｕ／ｎｕ雄マウス（群あたり１０匹の動物）を、１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇの１×ｍＴＮ８−１９−７及び２×ｍＴＮ８−１９−７の週２回の注射で３５日間処置し、一方、対照群（１０匹の動物）には、ｈｕＦｃ（３ｍｇ／ｋｇ）を週２回注射して投与した。図５に示されるように、２×ペプチボディでの処置は、１×ペプチボディまたは対照と比較して、剖検時、より多い体重増加及び除脂肪屍体量を生じた。
【０１１７】
実施例９：筋力増加
［０２８０］
年齢が一致した正常な雄４カ月齢雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、週あたり５ｍｇ／ｋｇの２×ｍＴＮ８−１９−３３、２×ｍＴＮ８−１９−７、及びｈｕＦｃビヒクル対照群（１０匹の動物／群）の週２回の皮下注射で、３０日間処置した。さらなる注射を行わずに動物を回復させた。回復期１８日目に、握力を測定した。Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ測定装置、モデル１０２７ｄｓｍ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，Ｏｈｉｏ）を用いて、握力を測定した。ペプチボディ処置は、握力の有意な増加を生じ、２×ｍＴＮ８−１９−３３で前処置した動物は、対照処置動物と比較して、握力の１４％の増加を示し、一方、２×ｍＴＮ８−１９−７は、対照処置マウスと比較して、握力の１５％の増加を示した。
【０１１８】
実施例１０：薬物動態学
［０２８１］
ＬＥ配列を含まない代表的なペプチボディを用いて、インビボ薬物動態学実験を行った。１０ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇの投薬量を、ＣＤ１ｎｕ／ｎｕマウスに投与し、以下のパラメータを決定した：Ｃｍａｘ（μｇ／ｍＬ）、曲線下面積（ＡＵＣ）（μｇ−時間／ｍＬ）、及び半減期（時間）。親和性成熟ペプチボディの２×型が１×型よりも有意に長い半減期を有することが見出された。例えば、１×親和性成熟ｍＴＮ８−１９−２２は、動物において約５０．２時間の半減期を有し、一方、２×ｍＴＮ８−１９−２２は、約８５．２時間の半減期を有する。親和性成熟１×ｍＴＮ８−７は、約６５時間の半減期を有し、一方、２×ｍＴＮ８−１９−７は、約１０６時間の半減期を有する。
【０１１９】
実施例１１：ｍｄｘマウスの処置
［０２８２］
本発明のペプチボディは、動物において、除脂肪筋肉量を増加させることが示され、筋肉の消耗を伴う多様な障害の治療に有用である。筋ジストロフィーは、これらの障害の１つである。デュシェンヌ筋ジストロフィーのマウスモデルは、Ｄｕｃｈｅｎｎｅｍｄｘマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）である。老齢（１０カ月齢）ｍｄｘマウスに、ペプチボディ１×ｍＴＮ８−１９−３３（ｎ＝８／群）またはビヒクルｈｕＦｃタンパク質（Ｎ＝６／群）のいずれかを３カ月間注射した。投薬スケジュールは、１日おき、１０ｍｇ／ｋｇ、皮下注射によるものであった。ペプチボディ処置は、老齢ｍｄｘマウスの体重を増加させ、維持するのに正の影響を有した。図６Ａに示されるように、ｈｕ−Ｆｃ−処置対照群と比較して、ペプチボディ処置群では、体重の有意な増加が観察された。さらに、図６Ｂに示されるように、脂肪量に対する除脂肪体重の比もまた、対照群と比較して、ペプチボディ処置の結果として、老齢ｍｄｘマウスで有意に増加し、体重のうちの脂肪の割合が、対照群と比較して、ペプチボディ処置マウスで減少することが、ＮＭＲ分析により明らかになった。
【０１２０】
実施例１２：ＣＩＡ関節炎マウスモデルの処置
［０２８３］
コラーゲン誘導性関節炎マウスモデルは、リウマチ性関節炎のモデルとして広く用いられている。実験の１日目及び２１日目に、８週齢ＤＢＡ／１Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）の尾の付け根に１００μｇのウシコラーゲンＩＩ（Ｃｈｒｏｎｄｅｘ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）を投与して免疫を与え、関節炎を誘導した。関節及び足の発赤及び／または腫脹によってマウスの関節炎状態をスコア付けし、これに基づいて動物を選択した。動物の３群を確立した：コラーゲンを投与されない正常動物（正常、１２匹の動物）、コラーゲンに加えてネズミＦｃビヒクルを投与した動物（ＣＩＡ／ビヒクル、６匹の動物）、及びコラーゲンに加えて、ネズミＦｃに結合したペプチボディ２×ｍＴＮ８−１９−２１を投与した動物（２×ｍＴＮ８−１９−２１／ｍｕＦｃ、２×−２１とも称する）（ＣＩＡ／ペプチボディ、８匹の動物）。これらの実験及び以下の実施例に用いたネズミＦｃは、ネズミＩｇＧ由来のＦｃである。ＣＩＡ／ビヒクル動物及びＣＩＡ／ペプチボディ動物には、１日目及び２１日目のコラーゲンの投与に加えて、８日目から始め、５０日目まで連続して、週２回、５ｍｇ／ｋｇのミオスタチンペプチボディ２×ｍＴＮ８−１９−２１／ｍｕＦｃまたはネズミＦｃビヒクルのみを皮下（ｓ．ｃ．）注射した。動物の体重を４日ごとに測定した。結果を図７に示す。図７は、体重が減少したＣＩＡ／ビヒクル動物と比較して、ＣＩＡ／ペプチボディ（２×２１）動物の体重増加を示し、本本明細書に記載されるペプチボディを含むミオスタチン拮抗薬が、対照動物に示されるリウマチ性悪液質に対抗可能であることを示す。
【０１２１】
実施例１３：精巣摘出マウスの処置
［０２８４］
以下の実施例は、典型的なペプチボディでの精巣摘出Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの処置を記載する。年齢及び体重が一致した６月齢の外科的に精巣摘出したＣ５７Ｂｌ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）の２群を、ネズミＦｃまたはペプチボディ２×ｍＴＮ８−１９−２１／ｍｕＦｃ（群あたり１１匹の動物）のいずれかで処置した。マウスの２群に、３ｍｇ／ｋｇのペプチボディまたはネズミＦｃを、週２回、ＩＰ注射した。処置は、手術の３週間後に開始し、１０週間継続した。各生存動物に核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法を行って、研究開始時、７週目、及び１０週目の非脂肪量を評価した。以下の表でわかるように、ネズミＦｃで処置した精巣摘出マウスは、１０週目までに非脂肪量を喪失し始めた。Ｆｃビヒクルに対してペプチボディを投与された精巣摘出群の比較は、ネズミＦｃで処置した動物と比較して、ペプチボディが、精巣摘出動物において、除脂肪体重の増加を改善したことを示した。この結果を以下の表に示す。
【０１２２】
【表１５】
2016516064.tif 000047
【０１２３】
［０２８５］
さらに、抗ミオスタチンペプチボディによる精巣摘出マウスの処置は、テストステロンレベルの増加を生じなかった。これらの結果は、アンドロゲン枯渇状態を治療するために、本明細書に記載されるペプチボディ等のミオスタチン拮抗薬を用いることができることを示す。
【０１２４】
実施例１４：ＴＮＦ−αレベルの減少
［０２８６］
雌ＢＡＬＢ／ｃマウス、８〜１０週齢（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を、ＬＰＳ負荷の１日前に、ＰＢＳ対照または１０ｍｇ／ｋｇのペプチボディ２×ＴＮ８−１９−２１／ｍｕＦｃで前処置した。各群は、５匹の動物であった。１日目、０．５ｍｇ／ｋｇ（１０ｕｇ／マウス）のＬＰＳ（大腸菌０５５、Ｂ５由来のリポ多糖（Ｓｉｇｍａ）を静脈投与した。ＬＰＳ投与の３０分後に、血清試料を収集した。ｍＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）レベルを測定した。結果は、ペプチボディで前処置した動物が、減少したレベルの血中ｍＴＮＦ−αを有することを示した。ＰＢＳ処置動物では、血中のｍＴＮＦ−αが、平均およそ３８０ｐｇ／ｍｌであった。ペプチボディ処置動物では、血中のｍＴＮＦ−αが、平均およそ１２０ｐｇ／ｍｌしかなかった。これは、ミオスタチン拮抗薬が、炎症に寄与する少なくとも１つのサイトカインを減少させて、リウマチ性関節炎及び他の免疫障害を治療する際の拮抗薬の有効性に寄与し得ることを示す。
【０１２５】
実施例１５：糖尿病のＳＴＺ誘導モデル
［０２８７］
以下の実験の目的は、ストレプトゾトシン誘導性（ＳＴＺ）誘導性糖尿病動物モデルにおけるミオスタチン拮抗薬の効果を決定することであった。さらに、これらの実験は、ミオスタチン拮抗薬が、糖尿病腎症の進行または発展を遅延させるかまたは防止するかどうかを決定するために設計された。用いたペプチボディは、ネズミＦｃに結合した２×ｍＴＮ８−１９−２１（２×ｍＴＮ８−１９−２１／ｍｕＦｃまたは２×−２１）であった。対照ビヒクルは、ネズミＦｃのみであった。
【０１２６】
ストレプトゾトシン誘導性糖尿病：
［０２８８］
複数回の低用量ストレプトゾトシン注射によって、糖尿病動物モデルを生成した。８週齢Ｃ５７Ｂｌ／６マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。すべての動物を個々のケージで１週間飼育した。動物体重を測定し、次いで無作為に２群（ｎ＝２０／群）に分けた。２０匹のマウスに、４０ｍｇ／ｋｇ（０．１ｍｌのクエン酸緩衝液に溶解）の低用量のストレプトゾトシン（ＳＴＺ，Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．）を連続５日間注射した。別の群の２０匹のマウスに、ビヒクル（０．１ｍｌのクエン酸緩衝液）を連続５日間注射した。グルコースオキシダーゼ法を用いて、血中グルコースレベルを測定した（Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ  Ｅｌｉｔｅ，Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）。血中グルコースレベルの測定によって、糖尿病の誘導を定義した。１１ｍｍｏｌ／Ｌまたは２００ｍｇ／ｄｌを超える血中グルコースレベルを、高血糖と見なした。次いで、糖尿病及び年齢が一致した正常マウスをさらに４ヶ月間維持した。体重、食物摂取、及び血中グルコースレベルを毎月測定した。ＳＴＺ注射の４ヵ月後、２０匹のマウスのうち１６匹が糖尿病を発症し、これらを後の研究に用いた。体重に従って、糖尿病マウスを２つの処置群に分けた。年齢が一致した正常マウスもまた、２つの処置群に分けた。
【０１２７】
実験設計：
［０２８９］
０日目に開始して、両方の糖尿病群に、５ｍｇ／ｋｇのビヒクル（ｍｕ−Ｆｃ）または２×ｍＴＮ８−１９−２１を、週３回、６週間皮下注射した。体重及び食物摂取を週３回、測定した。ＳＴＺを注射しなかった非糖尿病マウスを、ビヒクル（ｍｕＦｃ）で、同じ用量及び同じスケジュールで６週間処置した。０日目、１５日目、３０日目、及び研究終了時に、グルコースオキシダーゼ法を用いて、血中グルコースレベルを測定した。研究設計を以下の表に提示する。
【０１２８】
【表１６】
2016516064.tif 000048
【０１２９】
［０２９０］
２×ｍＴＮ８−１９−２１／ｍｕＦｃで処置した糖尿病及び年齢が一致した正常マウスにおける除脂肪及び脂肪量の変化を評価するために、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｍｉｎｉｓｐｅｃ  ＮＭＲ（Ｅｃｈｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を用いて、開始時（０日目）、２週目（１５日目）、４週目（３０日目）、及び研究終了時（４５日目）に、体組成を測定した。
［０２９１］
研究終了時（４５日目）に、尿収集のために、マウスを個別代謝ケージに２４時間拘束した。２４時間尿体積を重量測定法で測定し、ネズミ微量アルブミン尿アッセイキット（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ）を用い、酵素結合免疫吸着アッセイで、尿アルブミン濃度を決定した。
［０２９２］
クレアチニンクリアランス速度を計算することによって、腎機能を評価した。自動分析装置Ｈｉｔａｃｈｉ７１７Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｕｔｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて、酵素的方法（ＣＲＥ，Ｍｉｚｕｈｏ  ｍｅｄｙ，Ｓａｇａ，Ｊａｐａｎ）によって、血漿クレアチニンレベル及び尿クレアチニンレベルを測定した。自動分析装置を用いることによって、血中尿素窒素レベルを測定した。
［０２９３］
研究完了に際して、すべての動物を殺処分した（４６日目）。ＣＯ２チャンバー中でマウスを安楽死させ、心臓血液試料を収集し、全体組織解剖を行った。生化学分析のために、血清試料を−８０℃で保存した。血中グルコースの血清レベル、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニンレベルを測定した。殺処分直後、腓腹筋及び除脂肪屍体量を取り出し、計量した。右側の腎臓の中央半分をイソペンタンＮ２溶液で固定し、パラフィン中に包埋した。糸球体構造を分析するために、片をＨ＆Ｅ及びＰＳＡ（過ヨウ素酸シッフ）で染色した。
［０２９４］
結果を平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。非対合Ｔ検定を行って、統計的な群間差を決定した。ｐ値が０．０５未満であるとき、統計的に有意であると見なした。
【０１３０】
結果：ＳＴＺ誘導性糖尿病マウスにおける体重及び血中グルコースの変化
［０２９５］
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの体重及び血中グルコースに対する、複数回の低用量ＳＴＺ注射により、年齢が一致した正常マウス群よりも有意により高い血中グルコースレベルを有するＳＴＺ処置マウスが生じ、最初は、２０匹の動物に関して、平均約１２０ｍｇ／ｄｌの平均血糖の正常レベルであったものが、ＳＴＺ注射後の２週目には、平均約２５０〜２８０ｍｇ／ｄｌに増加し、注射後の８〜１８週目には、最大３５０ｍｇ／ｄｌになった。抗ミオスタチンペプチボディ処置を開始するまでの４ヶ月の期間全体で、ＳＴＺ処置群及び対照群の間で、体重変化に関する統計的に有意な相違が見られた。対照群は、着実に体重を増加し、平均すると、２０週間にわたって、最大４０％の体重増加であり（平均２５ｇが、２０週間後、３４または３５グラムにまで増加した）、一方、ＳＴＺ群は、２０週間の期間にわたって少ししか体重を増加せず、２０週間にわたって、約１２〜１４％しか増加しなかった（２０週間後、２５ｇ〜約２８または２９ｇ）。
［０２９６］
ＳＴＺ糖尿病及び年齢が一致した正常マウスを２×ｍＴＮ８−１９−２１／ｍｕＦｃ及びビヒクルで６週間処置により、ビヒクル処置糖尿病群と比較して、２×−２１処置ＳＴＺ糖尿病マウスにおいて、体重増加の有意な増加が生じた。総体重は、ビヒクルが投与されたマウスと比較して、２×−２１が投与されたＳＴＺ処置マウスに関しては、最大約１．５グラムさらに増加した。それぞれの０日目のベースライン値と比較して、２×ｍＴＮ８−１９−２１／ｍｕＦｃまたはビヒクルで処置した６週間後の体重純変化として、体重増分量を示す。これを図８に示す。２×−２１での６週間の処置は、糖尿病動物において、体重喪失を有意に減弱した。
【０１３１】
２×−２１で処置したＳＴＺ糖尿病及び年齢が一致した正常マウスにおける体組成変化
［０２９７］
それぞれの０日目のベースライン値と比較して、２×−２１またはビヒクルで処置した６週間後の除脂肪体重純変化として、除脂肪体重を示す。これらの値を以下の表に示す。２×−２１での処置は、ビヒクル処置対照マウス（０．９４±１．９４ｇ及び１．６０±１．２８ｇ）と比較して、ＳＴＺ糖尿病マウス及び年齢が一致した正常マウスの両方（６．１６±０．８１ｇ及び８．５６±０．７５ｇ）の除脂肪体重の純増加を有意に増加させた（ｐ＜０．０５）。脂肪量の％変化は、各群におけるベースライン０日目の値と比較した、２×−２１またはビヒクルでの６週間の処置後の純変化を表す（以下の第２の表を参照のこと）。ＳＴＺ糖尿病マウスにおける脂肪量増加の割合％は、２×−２１（−１５．６０±７．０１）及びビヒクル処置群（−２１．５９±６．８４）の間で有意に異ならなかった。２×−２１処置は、年齢が一致した正常マウスにおいて、純脂肪量増加を減少させた（−１．５３±３．４２対７．１３±３．３８）が、統計的に有意な量には達しなかった。
【０１３２】
【表１７】
2016516064.tif 000049
【０１３３】
【表１８】
2016516064.tif 000050
【０１３４】
２×−２１で処置したＳＴＺ糖尿病及び年齢が一致した正常マウスにおける血中グルコース変化
［０２９８］
以下の表は、ＳＴＺ糖尿病及び年齢が一致した正常マウスにおける血中グルコース変化に対する２×ｍＴＮ８−１９−２１／ｍｕＦｃの効果を示す。血中グルコースレベルは、ＳＴＺ糖尿病マウスまたは年齢が一致した正常マウスのいずれにおいても、２×−２１処置群及びビヒクル処置群の間で有意には異ならなかった。
【０１３５】
【表１９】
2016516064.tif 000051
【０１３６】
腎臓重量／体重：
［０２９９］
ＳＴＺ糖尿病マウスの高血糖は、腎臓肥大を伴うようである。ＳＴＺ糖尿病マウスの体重に対する腎臓重量比は、年齢が一致した正常マウスのものより高かった（０．９８±０．０４対０．６７±０．０２）。６週間の２×−２１処置は、腎臓重量／体重比を、ビヒクル処置糖尿病マウスにおける０．９８±０．０４から０．８４±０．０４の値まで有意に減少させた（ｐ＜０．０５）。
【０１３７】
クレアチニンクリアランス速度
［０３００］
糖尿病マウスに関しては、非糖尿病正常対照マウスと比較して、クレアチニンクリアランス速度の増加傾向があった（図９）。糖尿病マウスの平均クレアチニンクリアランス速度は、年齢が一致した正常マウスよりも２倍以上高かった。図９に示されるように、２×−２１での処置は、ビヒクル措置糖尿病マウスと比較して、糖尿病マウスにおけるクレアチニンクリアランス速度を減少させ、腎機能を示した。
【０１３８】
２４時間尿体積及び尿アルブミン排出：
［０３０１］
尿アルブミン排出及び２４時間尿体積は、糖尿病腎症の初期段階中の腎傷害を決定する際に非常に重要なバイオマーカーである。結果は、尿アルブミン排出（図１０Ａ）及び２４時間尿体積の両方が、年齢が一致した正常マウスと比較した場合、ＳＴＺ糖尿病マウスで増加することを示した。２×−２１処置は、糖尿病マウスにおいて、尿アルブミンレベルを減少させ、２４時間尿体積も減少させた（図１０Ｂ）。これは、腎機能の正常化を示した。
［０３０２］
ミオスタチンペプチボディ２×ｍＴＮＦ８−１９−２１／ｍｕＦｃの投与は、ＳＴＺ誘導性糖尿病マウスにおいて、体重損失を有意に減弱させ、骨格筋量及び除脂肪体重を保持した。骨格筋及び非脂肪量の増加に加えて、２×ｍＴＮ８−１９−２１／ｍｕＦｃは、ＳＴＺ誘導性糖尿病マウスにおいて、腎臓肥大、クレアチニンクリアランス速度の増加を減弱させ、２４時間尿体積及び尿アルブミン排出を減少させた。これは、糖尿病腎症の発症の初期段階における、腎機能の改善を示す。
【０１３９】
実施例１６：５−フルオロウラシル化学療法誘導性悪液質のネズミモデルにおけるミオスタチン拮抗薬の効果
［０３０３］
化合物５−フルオロウラシル（５−Ｆｕ）は、一般的に、結腸直腸癌、乳癌、胃癌、または膵臓癌を有する患者において、療法剤として用いられる。５−Ｆｕ療法の副作用は、体重損失及び筋萎縮である。５−Ｆｕ−誘導性悪液質の治療における抗ミオスタチン拮抗薬療法の潜在的な療法的利点を調べた。用いたペプチボディは、２×ｍＴＮ８−１９−２１／ｍｕＦｃ（２×−２１とも称される）またはネズミＦｃに結合した２×ｍＴＮ８−１９−２１であった。対照ビヒクルは、ネズミＦｃのみであった。
［０３０４］
この研究において、正常雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを４群に分け（ｎ＝２４）、５−Ｆｕ（４５〜５０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）の連続５日間（０日目〜４日目）の腹腔内（ＩＰ）投与に供した。２群は、５−Ｆｕ処置を始めた日（０日目）の２週間前（−１３日目）または１週間前（−６日目）から開始し、週２回、１０ｍｇ／ｋｇの２×２１で前処置し、５−Ｆｕ処置後、２４日目の研究終了時まで継続した。体重、除脂肪体重、及び食物摂取を、５−Ｆｕ療法前及びその後に、週２回またはより頻繁にモニタリングした。最終研究のために、最後の投薬の０、２、２４、９６、１６８、３３６時間後に、血清を収集した。
［０３０５］
０日目及び５−ＦＵ療法前、２×２１で１週間または２週間、前処置した群の平均体重増加は、５−Ｆｕ対照群の６．４％と比較して、それぞれ１２．６％及び１３．９％であった（両方ともｐ＜０．０００１）。これは、５−Ｆｕのみの群の７．４％の増加と比較して、ペプチボディで１週間または２週間、前処置した群における除脂肪体重の１４．７％及び１６．２％の増加と匹敵した（ｐ＝０．００１及びｐ＜０．０００１）。５−Ｆｕ投薬後の６日目、１週間または２週間の２×２１前処置群の体重変化は、５−Ｆｕのみの群の−８．６％と比較して、−１．９％及び−１．４％であり（両方ともｐ値は、０．０００１未満であった）、除脂肪体重は、５−ＦＵのみの群の−８．８％と比較して、−１．３％及び−０．９％に変化した（両方ともｐ値は、０．０００１未満であった）。回復中の８日目、１週間または２週間の２×２１前処置群の体重変化は、５−Ｆｕのみの群の０．６％の増加と比較して、それぞれ、６．８％及び８．５％に有意に増加した（ｐ＝０．０００６及びｐ＜０．０００１）。同様に、除脂肪体重は、１週間または２週間で、４．９％及び６．０％に変化した。２×２１前処置群を、５−Ｆｕのみの群の−３．３％と比較した（それぞれ、ｐ＝０．００１及びｐ＜０．０００１）。結果は図１１に要約される。
［０３０６］
８日目〜２４日目に、ほぼすべてのマウスが重度の好中球減少症を示し、重度の副作用のため、死亡したマウスもいた。５−Ｆｕ投与の前に２×２１で、１週間または２週間、前処置した群の生存率は、５−Ｆｕのみの群の１３％の生存率と比較して、４６％であった（それぞれ、ｐ＝０．００１及びｐ＝０．００９）。生存結果は図１２に要約される。
［０３０７］
ＡＮＯＶＡ反復測定法を用いた統計分析は、５−Ｆｕのみで処置した群と比較して、５−Ｆｕ処置前に２×２１ペプチボディで１週間または２週間、前処置した群が、−１３日目〜８日目の研究経過全体を通じて、有意により高い体重及び除脂肪体重を有したことを示した（両方とも０．０００１未満のｐ値）。
［０３０８］
この研究からの結果は、１週間または２週間の１０ｍｇ／ｋｇ、週２回の抗ミオスタチンペプチボディ、２×２１での前処置は、Ｃ５７Ｂl／６マウスにおいて、５−Ｆｕが誘導する体重損失及び筋萎縮を有意に改善するのに有効であることを示した。さらに、ペプチボディでの前処置は、生存率及び５−Ｆｕ化学療法に反応する期間を増加させた。したがって、本発明のミオスタチン結合剤等のミオスタチン拮抗薬を、化学療法剤または他の化学剤での治療の前及び治療中に用いて、化学薬品悪液質を防止するかまたは改善することも可能である。
【０１４０】
実施例１７：除脂肪体重及び下肢筋肉量は、アンドロゲン枯渇療法を受けている前立腺癌を有するヒト患者におけるミオスタチンの薬理学的阻害後増加する。
［０３０９］
ヒトにおけるミオスタチン阻害の可能性を調べるために、ＡＤＴを受けている前立腺癌患者において、ＡＭＧ７４５を用いた研究が行われた。研究の目的には、ＡＭＧ７４５の安全性、忍容性、薬物動態学（ＰＫ）、及び薬理学（ＰＤ）の評価が含まれた。
【０１４１】
材料及び方法
一般研究設計
［０３１０］
これは、ＡＤＴを受けている前立腺癌に罹患している男性における多施設のランダム化二重盲検プラセボ対照並行群研究であった。この試験は、ＡＭＧ７４５の安全性、耐容性、ＰＫ、及び薬力学を評価するために設計された。
【０１４２】
ＡＭＧ７４５
［０３１１］
ＡＭＧ７４５は、新規の抗ミオスタチンペプチボディである。ペプチボディは、成分のペプチド（「ペプチ−」）と、抗体（「−ボディ」）に類似する全体構造における免疫グロブリンのＦｃ部分とを表す。この形式において、ペプチドの「弾頭」は、ミオスタチンと相互作用し、その受容体を通したシグナル伝達を阻害する。第２のドメインであるＦｃ成分は、体内で複合体を安定させ、内皮細胞のトランスサイトーシス及びＦｃＲｎ１を通した再生利用を可能にし、治療に有用な範囲への滞留時間を延長する。この研究からのデータは、ミオスタチンの阻害が標的組織において関連のある生理的効果を誘導することができることを示す。
［０３１２］
ＡＭＧ７４５は、ジスルフィド結合を介して共有結合的に連結される２つの同一のポリペプチド鎖からなる。各鎖のＮ末端部分は、抗ミオスタチンペプチドとグリシン（ＡＱに加えて５つのグリシン）リンカーを介してＣ末端で融合されるヒトＩｇＧ１Ｆｃ配列からなる。各ポリペプチド鎖は、アミノ酸メチオニンから始まってグルタミン酸で終わる２５５アミノ酸からなる。各ポリペプチド鎖上には、残基Ｃｙｓ４２−Ｃｙｓ１０２、Ｃｙｓ１４８−Ｃｙｓ２０６、及びＣｙｓ２４２−Ｃｙｓ２４９の間に３つの鎖間ジスルフィド結合があり、Ｃｙｓ７鎖１−Ｃｙｓ７鎖２及びＣｙｓ１０鎖１−Ｃｙｓ１０鎖２の間に２つの鎖間ジスルフィド結合がある。ＡＭＧ７４５分子を構成する５１０アミノ酸により、５７，０９９ダルトンの理論的な分子量を得る。微生物で発現したタンパク質として、ＡＭＧ７４５は、グリコシル化されない。
［０３１３］
ＡＭＧ７４５の各ポリペプチド鎖（配列番号６３５）の２５５残基アミノ酸配列を以下に示す。配列の単純フォント部分は、ＩｇＧ１Ｆｃ配列（配列番号２９６）を示す。太字フォント部分は、５つのグリシン＋ＡＱリンカー配列（配列番号６３６）を示す。配列の太字及び斜字部分は、抗ミオスタチンペプチド（配列番号３１１）を示す。
【０１４３】
【表２０】
2016516064.tif 000052
【０１４４】
発現及び調製
［０３１４］
ＡＭＧ７４５は、本明細書に記載される大腸菌の発酵による不溶性封入体として発現された。一般的な発酵は、誘導から１２〜１６時間後に開始し、続いて、ディスクスタック遠心分離機を用いて細胞採取する。高圧均質化を用いた細胞の溶解により、封入体を単離した。洗浄及び遠心分離後、得られた二重洗浄した封入体スラリー（ＤＷＩＢ）を精製まで−３０o±１０oＣで保存した。
［０３１５］
ＤＷＩＢの可溶化後、ＡＭＧ７４５は、尿素、グリセロール、アルギニン、及び酸化還元対システイン／シスタミンを含有する溶液中でリフォールディングした。リフォールディング後、産物を濃縮し、リフォールディング試薬を限外濾過及び透析（ＵＦ／ＤＦ）プロセス手段によって取り除いた。透析産物を酸性化し、続いて、清澄化した。その後、産物を３つの異なるクロマトグラフィーステップを通して精製した：２つのアニオン交換（Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）カラム（１つはフロースルーモードにおいて行われたもの、もう１つは、結合及び溶出モードで行われたもの）、及びＨＩＣ（Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）カラム。次いで、産物をさらに濃縮し、ＵＦ／ＤＦプロセスを用いて製剤緩衝液に透析した。次いで、製剤産物を、０．２μｍのフィルターを通してバルク容器に濾過し、−３０℃±１０℃で冷凍した。
［０３１６］
さらなるクロマトグラフィーステップを、臨床薬物プロセスのための精製プロセスに加えて、宿主細胞に関連する不純物を取り除いた。
【０１４５】
製剤
［０３１７］
３０ｍｇ／ｍＬのＡＭＧ７４５に対する最終投薬製剤は、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、９％（ｗ／ｖ）スクロース、０．００４％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０、ｐＨ４．７５であった。
【０１４６】
投薬量及び対象
［０３１８］
０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、及び３．０ｍｇ／ｋｇの皮下投与は、それぞれ、週１回、４週間行なわれ、逐次的コホートにおいて評価された。ＡＭＧ７４５またはプラセボに対して３：１の割り当て比でランダムに選ばれた８人の対象を、０．３ｍｇ／ｋｇの用量コホート及び１．０ｍｇ／ｋｇの用量コホートに登録した。除脂肪体重における４週間の用量の安全性、耐容性、ＰＫ、及び効果を評価するために、ＡＭＧ７４５またはプラセボに対して１：１の割り当て比でランダムに選ばれた３８人の対象すべてを、３．０ｍｇ／ｋｇの用量コホートに登録した。
［０３１９］
前回のコホートに登録された最後の対象が、治験薬の第３の用量を与えられた後、少なくとも１４日間追跡された後に、用量漸増決定が行われ、これらは、すべての利用可能な有害事象、バイタルサイン、及び検査値の盲目検査に基づいた。
［０３２０］
この研究は、地方の施設内治験審査委員会によって承認され、ＦＤＡ及びＩＣＨの良好な臨床実践ガイドラインに従って行われた。すべての対象は、研究の開始前に書面によるインフォームドコンセントを提供した。
【０１４７】
研究対象
［０３２１］
適格対象は、前立腺癌の文書化された病歴を有する；登録時、文書化された遠隔転移がない；登録前に前立腺癌に対する一次、アジュバント、またはサルベージ治療として少なくとも６カ月間ＡＤＴ（アンドロゲン枯渇療法）を受けている；ＡＤＴが断続的に投与されていた場合、スクリーニング時、血清総テストステロン濃度が５０ｎｇ／ｄＬ未満である；治験責任医師によって決定される、安定した前立腺特異抗原（ＰＳＡ）；一次筋肉疾患、ミオパシー、またはニューロパシーの病歴がない；体重が１３７ｋｇ（３００ｌｂ）以下であり、身長が７８インチ（約１．９８ｍ）以下である；スクリーニング時、米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）の一般状態が０である；臨床的に有意なクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）の上昇がない；糸球体濾過率（ＧＦＲ）が４０ｍＬ／分を超える；アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）またはアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）が正常値上限の２．５倍を超えない、男性であった。
【０１４８】
研究手順
［０３２２］
すべてのコホートに対して前研究及び研究中周期的に、以下の処置、すなわち身体検査、バイタルサイン、心電図、血液学的、化学的、尿検査、抗−ＡＭＧ７４５抗体スクリーニング、及びＰＫのための血液試料の採取を行った。３ｍｇ／ｋｇのコホートに関して、ＤＸＡ及び下肢ＣＴスキャンを、投与前、研究２９日目（研究の終了）、及び１カ月の追跡訪問時に行った。ＨｏｌｏｇｉｃまたはＧＥ  Ｌｕｎａｒスキャナーにおいて、すべてのＤＸＡスキャンを行った。個々の対象におけるすべての訪問で、同じスキャナーを使用した。検査及び分析におけるすべてのＤＸＡスキャンを中心となる読み取り施設に送信した。
［０３２２］
膝伸展機を用いて、１回の反復（１−ＲＭ）に対して引き上げられた最大重量に基づいて下肢の強度を評価した。２日目より前の２週間以内及び／または２日目まで、２９日目、及び１カ月の追跡訪問時に、評価を行った。
［０３２３］
１日目より前の２週間以内及び／または１日目まで、２９日目、及び１カ月の追跡訪問時に、簡易身体能力バッテリー（ＳＰＰＢ）を行った。ＳＰＰＢには、立位平衡、時限歩行テスト、５回椅子座りの評価が含まれた。
［０３２４］
すべての研究訪問時に、有害事象及び併用薬を記録した。
［０３２５］
統計的分析
［０３２６］
ＡＭＧ７４５またはプラセボに対して３：１の割り当て比でランダムに選ばれた８人の対象を、０．３ｍｇ／ｋｇの用量コホート及び１．０ｍｇ／ｋｇの用量コホートに登録して、複数回用量の投与後の安全性及びＰＫを特徴付けた。安全性／ＰＫを特徴付け、さらに全身組成におけるＡＭＧ７４５の効果を調べるために、ＡＭＧ７４５またはプラセボに対して１：１の割り当て比でランダムに選ばれた３８人の対象を、３ｍｇ／ｋｇの用量コホートに登録することを計画した。この計画された登録は、二次エンドポイントに対して処置群間差が１．５％であり、ベースラインから５週目までの除脂肪体重のパーセント変化（２．１の標準偏差；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．２００１）であると仮定され、１０％の有意水準の１つの片側検定に対して８０％の検出力を得た。分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、処置群間（３ｍｇ／ｋｇのＡＭＧ７４５対プラセボ）のベースラインからのパーセント変化を比較した。
［０３２７］
薬物動態解析には、薬物動態パラメータが推定され得たすべての処置された対象が含まれた。非コンパートメント法を用いて、薬物動態パラメータを推定した。各薬物動態パラメータに対して用量コホートによる要約統計量を生成した。個々の対象における血清ＡＭＧ７４５の濃度−時間プロファイル及び各用量の平均値のグラフを作成した。
［０３２８］
安全性分析に関して、ＡＭＧ７４５またはプラセボを受けたすべての対象が含まれ、すべてのコホートからプラセボで処置した対象を合わせて、複合プラセボ群を形成した。
【０１４９】
結果
［０３２９］
計５４人の対象が、治験薬を受け（３１人がＡＭＧ７４５、２３人がプラセボ）、これらの対象すべてが研究を完了した。治験薬を受けた５４人のうちの５３人の対象が４つの計画されたすべての用量を受けた。１人の対象（ＡＭＧ７４５  ３ｍｇ／ｋｇ）は、腹部の紅斑の有害事象により、第２の投与後、治験責任医師により中断され、この対象は、研究に残り、研究の追跡評価を完了した。研究集団の人口動態及びベースライン特性を表１に要約する。
［０３３０］
大部分の対象（８７％）は、白人／白色人種であった。平均（標準偏差）年齢は、ＡＭＧ７４５を受けた対象において７３．１（６．８）歳であり、プラセボを受けた対象において７３．５（６．７）歳であった。ベースラインの身長、体重、ボディマス指数（ＢＭＩ）、ならびに腫瘍量及び処置に関するベースライン特性が表２に要約される。これらのベースライン特性のすべては、概して、ＡＭＧ７４５を受けた対象とプラセボを受けた対象の間で均衡が取れていた。
【０１５０】
薬物動態学の結果
［０３３１］
ＡＭＧ７４５は、０．３〜３ｍｇ／ｋｇの用量範囲にわたる毎週のＳＣ用量投与４回の後に、用量−線形薬物動態を示した。中央値ｔｍａｘは、第１の投与から約２４〜７２時間後、及び第４の投与から約２４〜４８時間後の範囲に及び、第４の投与後の見かけの平均血清クリアランス（ＣＬ／Ｆ）は、１．８９〜２．２９ｍＬ／時／ｋｇの範囲に及ぶと推定された（表２）。
【０１５１】
抗ＡＭＧ７４５抗体の結果
［０３３２］
研究を完了した５４人の対象に関して、抗ＡＭＧ７４５（全分子）結合抗体のための表面プラズモン共鳴に基づくバイオセンサー免疫学的検定によって、血清試料が分析された。２人の対象からの試料は、免疫学的検定のうちの１つ以上において陽性結果を得た：
［０３３３］
ＡＭＧ７４５を受けた対象のうちで抗ＡＭＧ７４５（全分子）結合抗体の発生率は、１／３１（３％）であった。抗ＡＭＧ７４５抗体の陽性結果は、これらの対象において、ＡＭＧ７４５の曝露に影響を及ぼすように思われなかった。
［０３３４］
中和抗体は、バイオアッセイによる技術的な問題により評価され得なかった。
【０１５２】
薬力学的結果
［０３３５］
薬力学的効果の分析は、３ｍｇ／ｋｇの用量コホートに限定され、本研究は、除脂肪体重のパーセント変化における治療群間の統計的に有意な差を検出するために、８０％検出力を有するように設計された。
【０１５３】
除脂肪体重
［０３３６］
ベースラインからＥＯＳ（２９日目）までの除脂肪体重のパーセント変化（最小二乗平均［ＳＥ］）は、ＡＭＧ７４５対象において１．５％（０．５％）であり、プラセボ対象において−０．７％（０．５％）であり、群間差は２．２％（０．８％）であり、統計的に有意であった（ｐ＝０．００８）。この効果は、２９日目から１カ月後の追加訪問時まで維持された：除脂肪体重のパーセント変化は、ＡＭＧ７４５対象において１．９％（０．５％）であり、プラセボ対象において０．２％（０．５％）であり、１．７％（０．７％）の群間差は、統計的に有意であった（ｐ＝０．０２３）（表３、図１３）。
［０３３７］
ベースラインからＥＯＳ（２９日目）までの右脚＋左脚の非脂肪量のパーセント変化（最小二乗平均［ＳＥ］）は、ＡＭＧ７４５対象において正（１．３％［０．９％］）であり、プラセボ対象において負（−１．０％［０．９％］）であり、この差（最小二乗平均［ＳＥ］）は２．３％［１．３％］）であった（ｐ＝０．０８４）。追跡訪問時（２９日目から１カ月後）、ベースラインから追跡訪問までの右脚＋左脚の非脂肪量のパーセント変化（最小二乗平均［ＳＥ］）は、ＡＭＧ７４５対象において正（１．６％［０．８％］）であり、ラセボ対象において負（−０．６％［０．８％］）であり、この差（最小二乗平均［ＳＥ］）は２．１％［１．１％］）であった（ｐ＝０．０６５）（表３）。
【０１５４】
体脂肪量のパーセント変化
［０３３８］
ベースラインからＥＯＳ（２９日目）までの体脂肪量のパーセント変化（最小二乗平均［ＳＥ］）は、ＡＭＧ７４５対象において−０．７％（０．２％）であり、プラセボ対象において０．３％（０．２％）であり、−１．０％（０．３％）の群間差は、統計的に有意であった（ｐ＝０．００５）。ベースラインから追跡訪問（２９日目から１カ月後）までのパーセント変化は、ＡＭＧ７４５対象において−０．８％（０．３％）であり、プラセボ対象において０．０％（０．３％）であり、群間差は、−０．７％［０．４％］）であった（ｐ＝０．０６８）（表３）。
【０１５５】
下肢筋肉サイズ
［０３３９］
ベースラインからＥＯＳ（２９日目）までの下肢筋肉サイズのパーセント変化は、ＡＭＧ７４５対象において１．２％（０．７％）であり、プラセボ対象において−０．７％（０．７％）であり、群間差は、１．８％（１．０％）であった（ｐ＝０．０６５）。ベースラインから追跡訪問（２９日目から１カ月後）までの下肢筋肉サイズのパーセント変化は、ＡＭＧ７４５対象において２．７％（０．７％）であり、プラセボ対象において−０．１％（０．７％）であり、２．８％（１．０％）の群間差は、統計的に有意であった（ｐ＝０．００７）（表３）。
【０１５６】
体重及びボディマス指数
［０３４０］
除脂肪体重の観察された増加及び体脂肪の同時に起こる減少と一致して、体重またはＢＭＩのいずれにおける全体的効果もなかった。
【０１５７】
身体機能（ＳＰＰＢ）及び下肢強度（１−ＲＭの膝伸展）
［０３４１］
ベースラインからの変化の統計的分析は、ＳＰＰＢまたは１−ＲＭ膝伸展に関して行われなかったが、一般に、ＡＭＧ７４５に関連する効果は、４回の投与のこの短期間の研究においては見られなかった。
【０１５８】
生化学パラメータ
［０３４２］
空腹時血漿グルコース、インスリン、コレステロール、低密度リポタンパク質、高密度リポタンパク質、またはトリグリセリド（ｔｒｉｇｙｌｅｒｃｉｄｅｓ）に関して、治療群間（ＡＭＧ７４５対プラセボ）の見かけ上の差はなかった。
【０１５９】
安全性
［０３４３］
有害事象は、任意の用量のＡＭＧ７４５を与えられた３１人のうちの２５人の対象（８１％）に対して、プラセボを与えられた２３人のうちの１２人の対象（５２％）に対して報告された（表４）。対象の有害事象の発生率とＡＭＧ７４５の投与との間での関係は明らかではなかった。
［０３４４］
下痢（ＡＭＧ７４５、４／３１＝１３％；プラセボ、２／２３＝９％）、疲労（ＡＭＧ７４５、４／３１＝１３％；プラセボ、１／２３＝４％）；打撲傷（すべてＡＭＧ７４５［３／３１＝１０％］）；及び注射部位の変色（ＡＭＧ７４５、２／３１＝６％；プラセボ、１／２３＝４％）の４つの有害事象が、２人より多い対象において報告された。
［０３４５］
治験責任医師により治療とは無関係であると見なされた失神の１つの重篤な有害事象を除いて（３ｍｇ／ｋｇの用量コホートにおいてＡＭＧ７４５を与えられ、失神症状の前歴のあった対象において）、すべての有害事象は、重症度が軽度または中等度であり、深刻ではないと報告された。この事象は、最終の投与から２週間にわたって生じた。
［０３４６］
処置に関連する有害事象は、任意の用量のＡＭＧ７４５を与えられた３１人のうちの７人の対象（２３％）で、及びプラセボを与えられた２３人のうちの１人の対象（４％）で報告された。処置に関連する有害事象は、１人の対象を超えては報告されなかった。
［０３４７］
３ｍｇ／ｋｇの用量コホートにおいてＡＭＧ７４５を与えられていた１人の対象に関して、治験薬の投与は、腹部の紅斑の有害事象により、第２の投与後、治験責任医師により中断され、中等度の重症度（ＣＴＣＡＥ  ｖ３．０グレード２）から軽度に減少する（ＣＴＣＡＥ  ｖ３．０グレード１）と報告され、治験薬に関連した。
［０３４８］
一般に、実験変数、ＥＣＧ、バイタルサイン、テストステロンレベル、または前立腺特異抗原レベルにおけるＡＭＧ７４５の臨床的に重要な効果は、明らかではなかった。わずかに上昇した肝機能検査値が、ＡＭＧ７４５（０．３ｍｇ／ｋｇ）を与えられた１人の対象における有害事象として報告され（最大アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ［ＡＳＴ］、アラニンアミノトランスフェラーゼ［ＡＬＴ］、及びアルカリ性ホスファターゼ［ＡＰ］は、それぞれ、正常上限（ＵＬＮ）の２．２倍、１．７倍、及び１．５倍であった）、上述の失神の重篤な有害事象に関連して、心電図の変化の有害事象（中等度の重症度［ＣＴＣＡＥ  ｖ３．０グレード２］）が報告された。有害事象の要約を表５に示す。
［０３４９］
ＡＤＴを受けている前立腺癌に罹患している男性におけるこのランダム化二重盲検プラセボ制御複数回投与研究は、最大３．０ｍｇ／ｋｇで毎週のＳＣ用量を４回投与されたＡＭＧ  ７４５の忍容性が一般に良好であることを実証した。これらの結果はまた、除脂肪体重の増加、体脂肪の減少、及び下肢筋肉サイズの増加のような、ミオスタチンを薬理学的に阻害する薬力学的効果の第１の臨床的証拠をもたらした。
［０３５０］
この研究において得られたデータは、ＡＤＴにより治療されている前立腺癌に罹患している男性において、ＡＭＧ７４５によりミオスタチンの薬理学的な阻害が、２９日間の短期治療期間後でさえ、除脂肪体重を増加させ、体脂肪を減少させることを示す。
【０１６０】
【表２１−１】
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【０１６１】
【表２１−２】
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【０１６２】
【表２１−３】
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【０１６３】
【表２２】
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【０１６４】
【表２３】
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【０１６５】
【表２４】
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【０１６６】
【表２５】
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【０１６７】
［０３５１］
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によってその範囲が限定されるものではなく、特定の実施形態は、本発明の個々の態様の単なる説明として意図され、機能的に同等である方法及び構成要素が発明である。実際に、本明細書に示され、記載されるものに加えて、本発明の種々の修正が、前述の説明及び添付の図面から当業者には明らかであろう。このような修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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