(57)【要約】本発明は、慢性炎症性疾患の治療における使用のために、当該治療を必要とする個体に用いるＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物であって、追加化合物は胆汁酸、胆汁酸誘導体、ＴＧＲ５受容体作動物質、ＦＸＲ受容体作動物質またはそれらの組合せであるＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物を提供する。また、癌および／または線維症の予防における使用のためのＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物であって、追加化合物は、胆汁酸、胆汁酸誘導体、ＴＧＲ５受容体作動物質、ＦＸＲ受容体作動物質またはそれらの組合せであるＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性炎症性疾患または自己免疫性疾患の治療における使用のために、前記治療を必要とする個体に用いるＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物であって、
前記追加化合物は胆汁酸、胆汁酸誘導体、ＴＧＲ５受容体作動物質、ＦＸＲ受容体作動物質またはそれらの組合せであるＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物。
【請求項２】
請求項１に記載の使用のためのＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物において、
前記自己免疫性疾患は肝臓、腎臓、消化管、心臓血管系または代謝系の、慢性炎症性疾患または自己免疫性疾患であるＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の使用のためのＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物において、
前記肝臓の慢性炎症性疾患または自己免疫性疾患は、原発性胆汁性肝硬変  （ＰＢＣ）、胆汁酸下痢（慢性下痢）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、自己免疫性肝炎、肝臓移植関連移植片対宿主拒絶反応、門脈圧亢進症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）であるＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物。
【請求項４】
請求項１または２に記載の使用のためのＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物において、
前記慢性炎症性疾患または自己免疫性消化器疾患は、膵臓の慢性炎症、クローン病または潰瘍性結腸炎であるＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物。
【請求項５】
請求項１または２に記載の使用のためのＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物において、
前記心臓血管系の慢性炎症性疾患はアテローム性動脈硬化症であるＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物。
【請求項６】
請求項１または２に記載の使用のためのＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物において、
前記代謝系の慢性炎症性疾患または自己免疫性疾患は、肥満、インスリン抵抗性、メタボリック・シンドローム、Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病であるＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物。
【請求項７】
癌および／または線維症の予防における使用のためのＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物において、
前記追加化合物は、胆汁酸、胆汁酸誘導体、ＴＧＲ５受容体作動物質、ＦＸＲ受容体作動物質またはそれらの組合せであるＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載の使用のためのＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物において、
前記胆汁酸または胆汁酸誘導体は、ＦＸＲおよび／またはＴＧＲ５シグナル伝達アクチベータ（作動物質）であることを特徴とするＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の使用のためのＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物において、
前記胆汁酸誘導体はケノデオキシコール酸誘導体、好ましくは６−α−エチルケノデオキシコール酸または２３−置換胆汁酸を含むＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載の使用のためのＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物において、
前記胆汁酸は、ウルソデオキシコール酸またはケノデオキシコール酸であることを特徴とするＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の使用のためのＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物において、
前記ＣＤ４０シグナル伝達阻害物質は、ＣＤ４０を結合する抗体またはそのフラグメント若しくは誘導体であることを特徴とするＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の使用のためのＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物において、
前記ＣＤ４０を結合する抗体は、抗体５Ｄ１２、ｃｈ５Ｄ１２、ＰＧ１０２、ＣＨＩＲ−１２．１２、ＡＳＫＰ１２４０の可変領域、またはその誘導体であるＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物。
【請求項１３】
慢性炎症を病む個体の治療のための方法であって、
前記方法は、前記治療を必要とする前記個体にＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物を投与することを含み、
前記追加化合物は、胆汁酸、胆汁酸誘導体、ＴＧＲ５受容体作動物質、ＦＸＲ受容体作動物質またはそれらの組合せである治療方法。
【請求項１４】
ＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物を備えるキットであって、
前記追加化合物は、胆汁酸、胆汁酸誘導体、ＴＧＲ５受容体作動物質、ＦＸＲ受容体作動物質またはそれらの組合せであるキット。
【請求項１５】
請求項１４に記載のキットにおいて、
慢性炎症性疾患若しくは自己免疫性疾患の治療において、前記治療を必要とする個体にける使用、または癌および／若しくは線維症の予防において、前記予防を必要とする個体における使用のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は薬剤の分野に関する。本発明は、とりわけ、慢性炎症を病むまたは病むおそれのある個体を治療する手段および方法に関する。本発明は、また、癌および線維症を予防するための手段および方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、ＣＤ４０受容体の活性化を阻害する、ＣＤ４０結合抗体といった、ＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および胆汁酸またはその胆汁酸誘導体であって、慢性炎症若しくは炎症成分を持つ自己免疫疾患の治療、または消化器癌若しくは線維症、好ましくは肝臓、腎臓若しくは消化器の線維症の予防に用いるものに関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症、すなわち障害に対する組織の応答は、血流と血管透過性とが増加し、体液、白血球およびサイトカインといった炎症メディエータが蓄積する急性期を特徴とする。亜急性期／慢性期（以下、慢性期という）では、障害に対する組織の応答は、組織の障害部位に存在する病原体に対する特異的な液性および細胞性免疫応答の推移を特徴とする。急性および慢性炎症の経過中は、ともに、細胞接着分子の発現の増加と化学誘引を介した白血球動員に種々の可溶性因子が関与している。これらの可溶性メディエータの多くは、レジデント細胞（線維芽細胞、内皮細胞、組織マクロファージおよびマスト細胞など）と、新たに動員された炎症細胞（単球、リンパ球、好中球、好酸球など）の活性化を調節する。これらのメディエータのあるものは、炎症過程（例えば、発熱、低血圧、急性期タンパク質の合成、白血球増多症、悪液質など）の全身作用を生じる（Ｃ．Ａ．Ｆｅｇｈａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２，ｐｐ１２−２６）。可溶性因子とは別に、細胞−細胞媒介シグナル伝達経路が存在し、これらの経路は慢性炎症の維持と重篤度に関係するＣＤ４０シグナル伝達経路を含む。ほとんどの可溶性および細胞関連因子は多面的効果を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
炎症反応は微生物の成分により引き起こされ得るが、異物として認識されるタンパク質および多糖類といった巨大分子並びに低分子化合物によっても引き起こされ得る。炎症反応およびメカニズムは、感染から個体を保護し外来物質（異物）を除去することを意図したものであるが、ある状況においては組織の障害と疾病を引き起こす可能性がある。ある条件下では、自己（自家）分子が炎症反応を引き起こすことがあり、そのような反応は自己免疫応答と呼ばれ、これらの反応により引き起こされた疾病は自己免疫疾患と総称される（Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７Ｅ）。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明では、シグナル伝達阻害物質および追加化合物は組み合わせると慢性炎症の治療および癌または線維症の予防に好適である。追加化合物は、好ましくは、胆汁酸、胆汁酸誘導体、ＴＧＲ５受容体作動物質、ＦＸＲ受容体作動物質またはそれらの組合せである。本発明は、慢性炎症の治療に、それを必要とする個体に用いるＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物であって、該追加化合物が胆汁酸、胆汁酸誘導体、ＴＧＲ５受容体作動物質、ＦＸＲ受容体作動物質またはそれらの組合せであるものを提供する。本発明は、また、癌および／または線維症の予防に用いるＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物であって、該追加化合物が胆汁酸、胆汁酸誘導体、ＴＧＲ５受容体作動物質、ＦＸＲ受容体作動物質、またはそれらの組合せであるものを提供する。好適な一実施形態では、該線維症は肝臓若しくは腎臓の線維症、または消化器の線維症である。
【０００５】
胆汁酸および胆汁酸誘導体は、ミセルの形成を容易にするという主機能の他に大量のさまざまな作用を仲介し、食事脂肪の処理を促進する。これらの副次的作用には抗炎症作用が含まれる。これらの作用および他の作用は胆汁酸受容体への胆汁酸または誘導体の特異的な結合により仲介される。好適な胆汁酸受容体の例はＴＧＲ５受容体およびＦＸＲ受容体である。ＴＧＲ５は、Ｇタンパク質結合胆汁酸受容体１（ＧＰＢＡＲ１）、Ｇタンパク質結合受容体１９（ＧＰＣＲ１９）、胆汁酸の膜型受容体（Ｍ−ＢＡＲ）としても知られるＧ−タンパク質結合受容体である。ＴＧＲ５は、ヒトにおいては、ＧＰＢＡＲ１遺伝子によりコードされるタンパク質である。ＴＧＲ５は、マウスでは染色体１Ｃ３に、ヒトでは染色体２ｑ３５に位置する単一エクソンによりコードされる。ＴＧＲ５は普遍的に発現されるが、その発現量は組織毎に異なり、肝臓、腸、褐色脂肪組織および脾臓では高発現である。胆汁酸が異なるとＴＧＲ５およびＦＸＲの活性化に対する作用が異なることから、これら２種類の受容体は胆汁酸の作用の仲介における機能が異なっていることが分かる（Ｘｉａｏｓｏｎｇ  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ  （２０１１）  Ｅｘｐ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ．  Ｖｏｌ  ２０１１：  ｐｐ  １−５）。胆汁酸受容体またはＢＡＲ（遺伝子記号  ＮＲ１Ｈ４）としても知られるファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）は、核内受容体ファミリーの一員である。ＦＸＲは、胆汁酸（コレステロール異化の最終生成物）の細胞内レベルの主センサとして機能し、胆汁酸誘発転写プログラムの主たる実行体である。胆汁酸は直接にＦＸＲのリガンド結合ドメインと相互作用してＦＸＲのトランス活性化機能を向上させまたはこれに拮抗する。胆汁酸受容体としての機能に従い、ＦＸＲは正常な生理機能において通常状態で胆汁酸にさらされる組織：肝臓、腸および腎臓においてもっとも豊富に発現される。ＦＸＲおよびＴＧＲ５を介するシグナル伝達は、いくつかの代謝経路を調節し、ＢＡ合成および腸肝再循環だけでなくトリグリセリド、コレステロール、グルコースおよびエネルギーの恒常性を制御する（総説としては、Ｆｉｏｒｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．Ｖｏｌ  ３０：ｐ５７０−５８０がある）。
【０００６】
胆汁酸は、先天性免疫の細胞に直接に制御機能を及ぼすことが古くから知られている。そのような胆汁酸の例は、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）であり、一次胆汁酸およびＦＸＲリガンドである。ＣＤＣＡは、ＬＰＳにより刺激されたマクロファージからのＩＬ１ｂ、ＩＬ６およびＴＮＦの放出を減少するように制御する（Ｃａｌｍｕｓ  １９９２）。ＦＸＲの活性化はＮＦκＢ活性に拮抗し、それにより炎症性遺伝子の発現に拮抗することが示されている（Ｗａｎｇ  ２００８，Ｖａｖａｓｓｏｒｉ  ２００９）。
【０００７】
本発明において用いられる好適なＴＧＲ５作動物質は、とりわけ、Ｈｉｒｏｙｕｋｉ  Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ（２００８）．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５１，１８３１−１８４１に記載されている。Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌの最近の報告によると、ケノデオキシコール酸の２３−アルキル置換および６，２３−アルキル二置換誘導体、例えば６Ｒ−エチル−２３（Ｓ）−メチルケノデオキシコール酸はＴＧＲ５の強力かつ選択的な作動物質である。特に、天然型胆汁酸のＣ２３−（Ｓ）位置をメチル化すると、ＦＸＲを活性化するよりもＴＧＲ５に対する選択性が顕著となるが、６Ｒ−アルキル置換は両方の受容体において効力を増強させることが示された。非ステロイド化合物および天然型生成物のライブラリをスクリーニングした結果、６−メチル−２−オキソ−４−チオフェン−２−イル−１，２，３，４−テトラヒドロピリミジン−５−カルボン酸ベンジルエステル（ＷＯ２００４０６７００８）とオレアノール酸とがそれぞれ異なる構造のＴＧＲ５作動物質として見出された。近年さまざまな胆汁酸および胆汁酸誘導体が合成されている。例えば、鏡像異性ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびリトコール酸（ＬＣＡ）である。Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ（２００８）はさまざまな他のＴＧＲ５作動物質を記載しており、該文献は、引用によりＴＧＲ５作動物質に関して本明細書において参照される。この文献には、ＴＧＲ５選択的作動物質と、ＴＧＲ５、ＦＸＲの両受容体に対する（二重（ｄｕｏ））作動物質との両方が記載されている。ＴＧＲ５作動物質とＦＸＲ作動物質はさまざまの性質を有する。ある化合物がＳａｔｏ  ｅｔ  ａｌ（２００８）に記載されたＴＧＲ５作動物質検定において活性である場合、この化合物は本発明にとってＴＧＲ５作動物質である。ある化合物がＳａｔｏ  ｅｔ  ａｌ（２００８）に記載されたＦＸＲ作動物質検定において活性である場合、この化合物は本発明にとってＦＸＲ作動物質である。ある化合物がＳａｔｏ  ｅｔ  ａｌ（２００８）に記載されたＴＧＲ５検定およびＦＸＲ検定の両方において活性である場合、この化合物はＴＧＲ５、ＦＸＲ二重作動物質である。従って、この文献は、ＴＧＲ５およびＦＸＲ作動物質両試験の記載としても、引用により本明細書において参照される。本発明の好適なＴＧＲ５作動物質は（Ｇｉｏｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｔｈｅｒ．  Ｐａｔｅｎｔｓ．Ｖｏｌ２２：ｐｐ１３９９−１４１４）に記載されている。特に好適であるのは、（Ｇｉｏｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｔｈｅｒ．  Ｐａｔｅｎｔｓ．Ｖｏｌ２２：ｐｐ１３９９−１４１４）の表１、表２、表３、図１、図２または図３に記載されているＴＧＲ５作動物質である。また、本出願の表１、表２、図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、図３Ｅ、図３Ｆ、図３Ｇ、図３Ｈ、図３Ｉ、図３Ｊ、図４または図５に記載されたＴＧＲ５作動物質も好適である。好適なＴＧＲ５作動物質はＵＤＣＡ（図５）である。ＷＯ２００８／００２５７３；ＷＯ２００８／０９１５４０；ＷＯ２０１０／０５９８５９、ＷＯ２０１０／０５９８５３またはＷＯ２０１０／０１４８３６に記載されたＴＧＲ５作動物質��好適である。好適なＦＸＲ作動物質は、ＷＯ２０１０／０５９８５３；ＷＯ２００７／０９５１７４；ＷＯ２００８／００２５７３またはＷＯ２００２／０７２５９８に記載された作動物質である。好適なＦＸＲ作動物質は、文献Ｍｏｄｉｃａ  Ｓ．Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＦＸＲ  ｐａｒａｄｉｇｍ．ＮＲＳ２０１０；８：ｐｐ１−２８の図３の作動物質である。好適なＦＸＲ作動物質は図６Ａ、図６ＢのＦＸＲ作動物質である。
【０００８】
ＴＧＲ５作動物質はＵＳ２０１２／０１１５８３２にも記載されている。従って、この文献は、特に、さまざまなＴＧＲ５作動物質についての記載についても、引用により本明細書において参照される。
【０００９】
ＦＸＲ作動物質は、ＷＯ２００５／０８２９２５およびＵＳ２００８／０１８２８３２にも記載されている。従って、これらの文献は、特に、さまざまなＦＸＲ作動物質の記載について、引用により本明細書において参照される。好適なＦＸＲ作動物質は、ＷＯ２０１０／０５９８５３；ＷＯ２００７／０９５１７４；またはＷＯ２００２／０７２５９８に記載された作動物質である。
【００１０】
ＣＤ４０分子は、５０ｋＤａ  Ｉ型膜糖タンパク質であり、Ｂ細胞、単球／マクロファージ、樹状細胞（ＤＣｓ）および活性化された内皮細胞に発現される。１−６  ある条件下では、ＣＤ４０は線維芽細胞、上皮細胞、ケラチン生成細胞、その他の細胞にも見出すことができる。７  ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１５４）、３２ｋＤａ  ＩＩ型一体膜糖タンパク質は、活性化されたＣＤ４＋  Ｔ細胞および少数の活性化されたＣＤ８＋  Ｔ細胞において一時的に発現される。８，  ９  さらに、ＣＤ４０Ｌは活性化後の多数の他の細胞型において見出すことができ、該細胞型にはマスト細胞、好塩基球、Ｂ細胞、好酸球、ＤＣおよび血小板が含まれる。１０，１１  ＣＤ４０経路は炎症反応の開始およびエフェクター段階の両方におけるキー・スイッチであると考えられる。
【００１１】
ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの結合（ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌのライゲーションともいう）によりシグナル伝達カスケードがＣＤ４０発現細胞内で開始する。ＣＤ４０によるシグナル伝達は、一般的にＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌに結合する抗体により阻害される。ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用はＣＤ４０ＬまたはＣＤ４０のいずれか一方に対するモノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）を用いて阻害することができる。活性化された血小板にＣＤ４０Ｌが発現すると、高い服用レベルでの抗ヒトＣＤ４０Ｌ  ＩｇＧ１  Ｍａｂｓを用いたヒトの治療中に血栓塞栓性事象が生じ、これらのＭａｂｓの推移が停止する。１２，  １３  従って、ＣＤ４０結合抗体を介するＣＤ４０シグナル伝達阻害が、ヒトでは、より魅力的なアプローチであると思われる。Ｍａｂ  ５Ｄ１２（抗ヒトＣＤ４０）の阻害活性はＣＤ４０を有する異なる細胞型を用いたさまざまなイン・ビトロ研究において実証されている。１４，  １５  そして、そのキメラ５Ｄ１２（ｃｈ５Ｄ１２）ＣＤ４０阻害活性がさまざまな非ヒト霊長類の疾病モデルにおいて確認されている。１６，  １７  ｃｈ５Ｄ１２は、５Ｄ１２の重鎖および軽鎖のマウス可変領域を含む分子操作されたヒトＩｇＧ４抗体であり、ヒトに用いた場合に、抗原性となる可能性を低減するとともにマウス５Ｄ１２  Ｍａｂのイン・ビボ半減期を向上させるように構築されたものである。
【００１２】
多くの受容体と同様に、ＣＤ４０受容体は、ＣＤ４０Ｌまたは均等物の非存在下ではシグナル伝達を行わない。ＣＤ４０シグナル伝達阻害物質は、活性化因子（アクチベータ）が存在しないと受容体によるシグナル伝達を阻害しない。このように、ＣＤ４０シグナル伝達阻害物質は、ＣＤ４０受容体がさもなければ活性であるような条件下（すなわち阻害物質の不存在下）でシグナル伝達を阻害する。ＣＤ４０シグナル伝達を活性化する生理学的方法は、ＣＤ４０発現細胞にＣＤ４０Ｌを投与することによる。これはＣＤ４０Ｌ発現細胞を投与することにより、または可溶性ＣＤ４０Ｌを投与することにより行うことができる。ある化合物がＣＤ４０発現細胞においてＣＤ４０シグナル伝達の活性化を５０％以上低減する場合、この化合物はＣＤ４０シグナル伝達阻害物質である。そのような試験において、該化合物は、好ましくは、ＣＤ４０受容体を活性化する化合物または細胞が添加される前に添加される。しかしながら、常にそうする必要はない。この検定においてＣＤ４０受容体を活性化する化合物は、好ましくは、ＣＤ４０Ｌであり、ＣＤ４０Ｌ発現細胞を投与するか、または、好ましくは、可溶性ＣＤ４０Ｌを投与することにより添加される。現在、結合時にＣＤ４０受容体のシグナル伝達を活性化可能なさまざまなＣＤ４０結合抗体が入手できる。そのような抗体もＣＤ４０作動物質といわれる。
【００１３】
ＣＤ４０シグナル伝達阻害物質は、ＣＤ４０結合分子、ＣＤ４０Ｌ結合分子またはそれらの組合せであってもよい。ＣＤ４０−またはＣＤ４０Ｌ結合分子は一般的に抗体またはそのフラグメント若しくは誘導体若しくは模倣体である。様々なＣＤ４０シグナル伝達阻害物質がこの分野で知られている。好適なＣＤ４０シグナル伝達阻害物質は、ＣＤ４０発現細胞において、好ましくは上述の試験において、ＣＤ４０シグナル伝達を５０％以上阻害するＣＤ４０結合抗体である。好適な一実施形態では、ＣＤ４０シグナル伝達阻害物質は、ＣＤ４０結合ＣＤ４０阻害物質である。好適な一実施形態では、ＣＤ４０シグナル伝達阻害物質は、ヒトＣＤ４０に結合し、その活性化を阻害するモノクローナル抗体またはその抗原−結合部分である。抗体は、好ましくは、ＣＤ４０結合抗体５Ｄ１２，ｃｈ５Ｄ１２、ＰＧ１０２およびＡＳＫＰ１２４０（ＥＰ１３９１４６４）からなる群から選択された可変領域アミノ酸配列を含む。さらなる抗体は、好ましくは、ＵＳ２０１１／０２４３９３２に記載のＣＤ４０結合抗体からなる群から選択された可変領域アミノ酸配列を含む。非制限的な、好適な例は、上述のＣＤ４０結合抗体５Ｄ１２、ｃｈ５Ｄ１２、ＰＧ１０２、ＵＳ２０１１／０２４３９３２およびＡＳＫＰ１２４０である。ＰＧ１０２と他のＣＤ４０シグナル伝達阻害ＣＤ４０結合抗体はＷＯ２００７／１２９８９５に記載されている。そのような抗体は上述の試験においてＣＤ４０と結合し、ＣＤ４０受容体シグナル伝達を少なくとも５０％阻害する。特に好適なＣＤ４０シグナル伝達阻害物質は、ｃｈ５Ｄ１２、ＰＧ１０２、ＨＣＤ１２２（ＣＨＩＲ−１２．１２、ルカツムマブ）、ＵＳ２０１１／０２４３９３２およびＡＳＫＰ１２４０（ＥＰ１３９１４６４）である。特に好適な一実施形態では、ＣＤ４０シグナル伝達阻害物質はＰＧ１０２（可変領域のアミノ酸配列が図１に記載されている）である。これまでに、さまざまなＣＤ４０抗体の臨床試験が行われている（再発したまたは難治性の多発性骨髄腫患者に静脈内投与されたルカツムマブ、全ヒト抗ＣＤ４０拮抗モノクローナル抗体の第１相治験  Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｂｅｎｓｉｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  １５９，Ｉｓｓｕｅ  １，ｐａｇｅｓ５８−６６，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１２および再発した慢性リンパ性白血病における抗ＣＤ４０ヒト化モノクローナル抗体ルカツムマブ（ＨＣＤ１２２）の第１相治験Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ．２０１２  Ｎｏｖ；５３（１１）：２１３６−４２，２０１２  Ｊｕｎ  １２）。
他のＣＤ４０シグナル伝達阻害物質にはＣＤ４０Ｌに結合するものもある。これらの阻害物質は一般的にＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合を妨げる。そのようなＣＤ４０Ｌ結合阻害物質は、好ましくは、ＣＤ４０Ｌ結合抗体またはそのフラグメント、誘導体若しくは模倣体である。好適な、ＣＤ４０シグナル伝達阻害物質であるＣＤ４０Ｌ結合抗体は、Ｖｉｎｃｅｎｔｉ（２００２），Ａｍ．Ｊ．ｏｆ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｖｏｌ  ２，ｐｐ８９８−９０３および同文献に引用されている引用文献に記載されているＭＲ−１、ＩＤＥＣ１３１（Ｅ６０４００）、ＩＤＥＣ  ｈｕ５Ｃ８（ＢＧ９５８８）である。ＩＤＥＣ分子はヒトＣＤ４０Ｌに対抗し、ＭＲ−１はマウスＣＤ４０Ｌに対抗する。
【００１４】
現在、同様の結合特性を持つが抗体として種々の多くのタンパク質が存在する。これらの分子は、さらに、抗体均等物、抗体部分、誘導体または模倣体と呼ばれる。本発明の文脈では、そのような抗体均等物および部分、模倣体および誘導体は本発明の手段、用途および方法において提供される抗体に均等であると考えられる。そのような抗体均等物の非制限的な例は、非抗体骨格タンパク質バインダー、例えば、限定されないが、アンチカリン、Ｃ−型レクチン領域バインダー、アビマー、アドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ）およびＤＡＲＰｉｎｓ（設計されたアンキリン反復タンパク質）である（Ｓｈｅｒｉｄａｎ  Ｃ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００７，（２５），３６５−３６６参照）。
抗体部分または誘導体の非制限的な例は、抗体またはその均等物の重鎖および／または軽鎖の可変領域を含む。そのようなタンパク質の非制限的な例は、ＶＨＨ、ナノボディ、ヒト領域抗体（ｄＡｂｓ）、ユニボディ、サメ抗原反応性タンパク質（ＳｈＡｒｐｓ）、スモール・モジュラー・イムノファーマシューティカル（Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｄｕｌａｒ  ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ（ＳＭＩＰ（登録商標））ドラッグ、モノボディおよび／またはＩＭａｂｓ  （Ｓｈｅｒｉｄａｎ  Ｃ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００７，（２５），３６５−３６６参照）。好適な抗体部分または誘導体は、抗体またはその均等物の重鎖および軽鎖の可変領域を少なくとも有する。そのような結合分子の非制限的な例は、Ｆ（ａｂ）−フラグメントおよび一本鎖Ｆｖフラグメントである。ターゲットを特異的に結合するように操作することができるＩＧ折り畳み構造（ｆｏｌｄ）を有する、異なるタンパク質が多数存在する。そのような操作されたタンパク質は抗体の均等物または模倣体であると考えられる。好適な一実施形態では、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌ結合分子は抗体である。抗体は野生型抗体または合成抗体であってもよい。好適な一実施形態では、抗体は、抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３領域から成る。しかしながら、例えばファージ提示法により選択され得るＣＤＲ様領域の人工生成も本発明に含まれる。好適な一実施形態では、上述の抗体は、ヒト、ヒト化されたまたはヒト様抗体である。特に好適なのは、（特異性とは別に）  それ以上免疫系と相互作用しない結合分子である。抗体の場合は、好適なのは、その抗体が定常部位またはＩｇＧ４様定常部位からなることである。例えば、ＩｇＧ１分子の定常部位を変異させて、ターゲットに結合するともはや補体系を活性化しなくなるようにすることが可能である。
【００１５】
本発明において用いられる抗体は、鳥類およびほ乳類を含む任意の動物（例えば、ヒト、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ）に由来するものでもよい。好ましくは、本発明の抗体はヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である。本明細書において用いられる「ヒト」  抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含むとともに、ヒト免疫グロブリン・ライブラリ（限定されないが、ヒト免疫グロブリン配列に相同である、免疫グロブリン配列の合成ライブラリを含む）から単離された抗体またはヒト遺伝子からの抗体を発現するマウスから単離された抗体を含む。ヒトにおける抗体のイン・ビボ治療または診断用途およびイン・ビトロ検出検定を含む若干の用途においては、ヒト抗体またはキメラ抗体を使用するのが好適である。完全なヒト抗体は、ヒトである対象の治療に特に望ましい。ヒト抗体は、上述のファージ提示法をはじめとする当技術において知られた種々の方法により、ヒト免疫グロブリン配列またはヒト免疫グロブリン配列に相同の合成配列に由来する抗体ライブラリを用いて作製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号；並びにＰＣＴ公開公報第ＷＯ９８／４６６４５号、同第ＷＯ９８／５０４３３号、同第ＷＯ９８／２４８９３号および同第Ｗ０９８／１６６５４号をも参照のこと。これらの開示内容は引用によりその全体が本明細書において参照される。本発明の方法とともに用いられる抗体は、修飾された誘導体、すなわち、任意のタイプの分子を抗体に共有結合等により付加して修飾された誘導体を含む。さらに、この誘導体は１つ以上の非古典的なアミノ酸を含んでいてもよい。本発明のある実施形態では、本発明とともに用いられる抗体は、修飾されない抗体と比べて、ほ乳類、好ましくはヒトにおいて、半減期が延びている。イン・ビボ半減期が増加している抗体またはその抗原−結合フラグメントは当業者に知られた技法により生成することができる（例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ９７／３４６３１号参照）。ある実施形態では、本発明の方法を用いて使用される抗体は一本鎖抗体である。一本鎖抗体の設計と構築は当技術において周知である。ある実施形態では、本発明の方法を用いて使用される抗体は細胞内エピトープ、すなわち細胞内抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）である。細胞内抗体は、抗原の免疫特異性結合が可能な抗体の少なくとも一部分であって、好ましくは、その分泌をコードする配列を含まないものを備える。そのような抗体はその細胞内抗原と結合する。一実施形態では、細胞内抗体一本鎖Ｆｖ（"ｓＦｖ"）である。別の一実施形態では、細胞内抗体は、好ましくは、動作可能な分泌配列をコードせず、従って細胞内に留まる。細胞内抗体の生成は当業者に周知であり、例えば、米国特許第６，００４，９４０号；同第６，０７２，０３６号；および同第５，９６５，３７１号公報明細書に記載されている。これらの公報明細書は引用にそれらの全体を本明細書において参照される。一実施形態では、細胞内抗体は原形質中に発現される。別の一実施形態では、細胞内抗体は、さまざまな細胞内位置に局在している。そのような実施形態では、特異的な局在配列をヌ��レオチド内（ｉｎｔｒａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）ポリペプチドに結合して細胞内抗体を特異的な位置に向けることができる。本発明の方法とともに用いる抗体またはそのフラグメントは、当技術において知られた任意の抗体合成方法により、とりわけ化学合成または組み替え発現技法により製造することができる。モノクローナル抗体は、当技術において知られた広範囲の技法を用いて調製することができ、これらの技法には、ハイブリドーマ、組み替え体、ファージ提示法およびこれらの組合せの使用が含まれる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術において知られたものを含むハイブリドーマ技法を用いて製造することができる。本発明の抗体を作製するのに使用できるファージ提示法の例としては、Ｗ０９７／１３８４４および、米国特許第５，５８０，７１７号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，７８０，２２５号、および同第５，９６９，１０８号公報明細書に記載された方法が挙げられる。これらの公報明細書の内容は全体が引用により本明細書において参照される。上述の文献に記載されているように、ファージ選択の後、ファージからの抗体コード領域を単離し、これを用いてヒト抗体を含む全抗体、または任意の所望抗原結合フラグメントを生成する。そしてほ乳類の細胞、昆虫の細胞、植物の細胞、酵母およびバクテリアを含む任意の所望のホストにおいて、例えば、下記のように、発現することができる。組み替え体を用いてＦａｂ，Ｆａｂ'およびＦ（ａｂ'）２フラグメントを製造する技法を、当技術において知られた方法、例えばＰＣＴ公報第ＷＯ９２／２２３２４号に記載された方法を用いて使用することができる。治療に有効なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を製造することも可能である。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を製造する技術およびそのような抗体を製造するためのプロトコルの詳細な説明は、例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ９８／２４８９３号公報明細書を参照されたい。ここに引用される文献はそれらの全体が引用により本明細書において参照される。さらに、Ｍｅｄａｒｅｘ社（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、Ａｂｇｅｎｉｘ社（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）といった会社は、上述の技術と同様の技術を用いて選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに従事することが可能である。抗体、誘導体またはそのアナローグを製造するために用いる組み替え体（例えば、本発明の抗体の重鎖若しくは軽鎖若しくはその一部、または本発明の一本鎖抗体の一部分）は、抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築および適切なホスト細胞またはもっといえばイン・ビボにおけるそのベクターの発現を必要とする。ひとたび本発明の抗体分子、抗体の重鎖若しくは軽鎖、またはその一部分をコードするポリヌクレオチド（好ましくは、必須ではないが、重鎖または軽鎖変異領域を含む）が得られると、抗体分子の製造用のベクターを、当技術において周知の技法を用いた組み替えＤＮＡ技術により製造することができる。このように、抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現することによりタンパク質を調製する方法がここに記載されて���る。当業者に周知の方法を用いて、抗体コード配列並びに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、例えば、イン・ビトロ組み替えＤＮＡ技法、合成技法、およびイン・ビボ遺伝子組み換えを含む。本発明は、このように、複製可能なベクターであって、本発明の抗体分子をコードするヌクレオチド配列と、抗体の重鎖若しくは軽鎖と、抗体の重鎖若しくは軽鎖の可変領域若しくはその一部分、または重鎖若しくは軽鎖ＣＤＲとを、プロモーターに動作可能にリンクされて含む、複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは、抗体分子の定常部位をコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよく（例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ  ８６／０５８０７号明細書；ＰＣＴ公報第ＷＯ８９／０１０３６号明細書；および米国特許第５，１２２，４６４号公報明細書参照）、抗体の可変領域は、クローニングして完全な重鎖、完全な軽鎖、または完全な重鎖および軽鎖の両方を発現するためのそのようなベクターを得てもよい。発現ベクターは、従来技法によりホスト細胞に転移され、ついで形質転換された細胞は、従来技法により培養されて本発明の抗体を生成する。このように、本発明は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド若しくはそのフラグメント、若しくはその重鎖若しくは軽鎖、若しくはその一部分、または本発明の一本鎖抗体を、異種プロモーターに動作可能にリンクされて、含むホスト細胞を含む。二本鎖抗体の発現のための好適な一実施形態では、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターを、完全な免疫グロブリン分子の発現のためのホスト細胞内で以下に詳細に説明するように、共発現させてもよい。種々のホスト−発現ベクター系を用いて、本明細書において定義される抗体分子を発現させてもよい。ほ乳類のホスト細胞では、多数のウイルス・ベースの発現系を用いることができる。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、関心のある抗体コード配列をアデノウィルス転写／翻訳制御コンプレックス（複合体）、例えば、後期プロモーターおよび三連リーダー（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｌｅａｄｅｒ）配列に結合することができる。次いで、このキメラ遺伝子をアデノウイルス・ゲノムにイン・ビトロまたはイン・ビボ組み替えにより挿入することができる。ウイルス・ゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）に挿入すると、生存能力があり、かつ、感染したホストの抗体分子を発現する能力を有する組み替え体ウイルスが得られる。挿入された抗体コード配列を効率的よく翻訳するには特異的な開始シグナルも必要とされる。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、開始コドンは、完全な挿入体の翻訳が確実になされるように、所望のコーディング配列のリーディング／フレームと同調している必要がある。これらの外因性翻訳制御シグナルと開始コドンは野生型であると合成によるものであるとを問わず種々の由来のものを用いることができる。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネータ等を含めることで向上させることができる。ひとたび本発明の方法とともに用いられる抗体分子が組み替え体の発現により製造されると、この抗体分子は、免疫グロブリン分子の当技術において知られた任意の方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特にタンパク質Ａに対する特異的な抗原への親和性およびサイジング（ｓｉｚｉｎｇ）・カラム・クロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）、その他タンパク質の精製を行うための任意の標準技法により精製することができる。さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントを本明細書に記載されたまたは他の態様で当技術において知られた異種ポリペプチド配列に融合して精製を容易にしてもよい。上述のように、さらなる態様において、本発明は、治療のために上述のような抗体あるいはその均等物または誘導体を提供する。治療措置のために、抗体またはその均等物若しくは誘導体をイン・ビトロで製造しそれを必要とする患者に投与してもよい。抗体あるいはその均等物または誘導体は、任意の適切な経路により、好ましくはそのような経路に適合された医薬組成物の形態で、意図された治療に有効な薬用量を患者に投与してもよい。病気の進行速度を遅くするのに必要とされる治療、または病状を抑制するのに必要とされる治療に有効な薬用量は当業者が容易に決定することができる。別法として、抗体は上述のイン・ビボ抗体製造方法を用いて患者自身により製造されてもよい。好適には、そのようなイン・ビボ製造に用いられるベクターは、ウイルス・ベクター、好ましくは、本明細書において参照される特定の宿主細胞のための宿主細胞選択性を持つウイルス・ベクターである。したがって、さらに別の一態様では、本発明は、上述の抗体またはその均等物若しくは誘導体の使用であって、患者の治療に用いてその治療効果を達成する薬剤の製造における使用を提供する。この治療は、所望の治療効果を得るのに十分な薬用量の薬剤を投与することからなる。この治療は、抗体の反復投与であってもよい。さらに別の一態様では、本発明は、ヒトの治療方法であって、上述の抗体またはその均等物若しくは誘導体を所望の治療効果を得るのに十分な薬用量で投与することからなる治療方法を提供する。
【００１６】
慢性炎症性疾患は、好ましくは、炎症成分を持つ自己免疫疾患である。慢性炎症性疾患は、好ましくは、肝臓、腎臓、消化管、心臓血管系または代謝系の慢性炎症性疾患である。好ましい肝臓の慢性炎症性疾患は、胆管消失症候群（ＶＢＤＳ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、胆汁酸下痢（慢性下痢）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、自己免疫性肝炎、肝臓移植関連の肝移植片対宿主拒絶反応、門脈圧亢進症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である。好適な慢性炎症消化器疾患は、膵臓の慢性炎症、クローン病（Ｃｒｏｈｎ'  ｄｉｓｅａｓｅ）または潰瘍性結腸炎である。慢性炎症性心臓血管疾患は、アテローム性動脈硬化症であり、好ましい代謝系慢性炎症疾患は肥満であり、インスリン抵抗性、Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病である。
【００１７】
慢性炎症性または自己免疫性の疾患は、好ましくは、肝臓、腎臓、消化管、心臓血管系または代謝系、慢性炎症性または自己免疫性の疾患である。肝臓の好適な慢性炎症性または自己免疫性の疾患は、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、胆汁酸下痢（慢性下痢）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、自己免疫性肝炎、肝臓移植関連移植片対宿主拒絶反応、門脈圧亢進症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である。好適な慢性炎症性または自己免疫性の消化器疾患は膵臓の慢性炎症、クローン病（Ｃｒｏｈｎ'ｄｉｓｅａｓｅ）または潰瘍性結腸炎である。慢性炎症性の心臓血管疾患は、アテローム性動脈硬化症であり、代謝系の好適な慢性炎症性または自己免疫性の疾患は、肥満、インスリン抵抗性、メタボリック・シンドローム、Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病である。
【００１８】
慢性炎症は癌や線維症のように重篤な病気と関連していることが多いことと、本発明は慢性炎症を少なくとも改善することから、ＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物は癌の発症を少なくとも遅らせるとともに、処置された個体における線維症を少なくとも抑制するのに用いることができる。これは、少なくとも、癌予防治療または線維症予防治療を受けていない同じまたは類似の個体と比べた場合である。既存の線維症は可逆性でないことが多い。したがって、線維症を予防することは、治療がなされなかったとしたら発症していたと考えられる線維症を予防することを意味する。
【００１９】
胆汁酸または胆汁酸誘導体は、好ましくは、上述の胆汁酸または誘導体である。現在、多くの胆汁酸および胆汁酸誘導体をイン・ビトロで合成可能である。このように、ここで用いられる胆汁酸誘導体は、胆汁酸から導かれる化合物だけでなく、胆汁酸から導かれる化合物と同じ構造を持つ合成化合物をもいう。ケノデオキシコール酸誘導体は好適な胆汁酸誘導体である。好ましくは、胆汁酸誘導体は、６−α−エチルケノデオキシコール酸または２３−置換胆汁酸である。
【００２０】
好適な胆汁酸は、ウルソデオキシコール酸またはケノデオキシコール酸である。
【００２１】
好ましくは、胆汁酸または胆汁酸誘導体はＦＸＲおよび／またはＴＧＲ５シグナル伝達アクチベータである。そのような化合物は、当技術においては、ＦＸＲ−作動物質またはＴＧＲ５−作動物質とも呼ばれる。上述のように、さまざまなＴＧＲ５シグナル伝達アクチベータは、また、シグナル伝達アクチベータでもある。
【００２２】
本発明は、さらに、慢性炎症を患う個体を治療する方法であって、前記方法は、ＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物を、必要とする前記個体に投与することを含み、前記追加化合物は、胆汁酸、胆汁酸誘導体、ＴＧＲ５受容体作動物質、ＦＸＲ受容体作動物質、またはそれらの組合せである方法を提供する。
【００２３】
本発明は、また、ＣＤ４０シグナル伝達阻害物質および追加化合物を備えるキットであって、前記追加化合物は胆汁酸、胆汁酸誘導体、ＴＧＲ５受容体作動物質、ＦＸＲ受容体作動物質、またはそれらの組合せであるキットを提供する。このキットは、好ましくは、それを必要とする個体における慢性炎症性疾患の治療用のキットであるか、あるいはそれを必要とする個体において癌および／または線維症の予防用のキットである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】抗体ＰＧ１０２のアミノ酸配列を示す図である。
【図２Ａ】さまざまな胆汁酸骨格修飾を示す図である。
【図２Ｂ】胆汁酸誘導体、構造と強度を示す図である。
【図２Ｃ】Ｎｏｖａｒｔｉｓ社の胆汁酸誘導体を示す図である。（図２Ａ〜ＣはＧｉｏｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ．Ｖｏｌ  ２２：ｐｐ１３９９−１４１４から抜粋）
【図３Ａ】さまざまなＴＧＲ作動物質、構造と効力を示す図である。
【図３Ｂ】さまざまなＴＧＲ作動物質、構造と効力を示す図である。
【図３Ｃ】さまざまなＴＧＲ作動物質、構造と効力を示す図である。
【図３Ｄ】さまざまなＴＧＲ作動物質、構造と効力を示す図である。
【図３Ｅ】さまざまなＴＧＲ作動物質、構造と効力を示す図である。
【図３Ｆ】さまざまなＴＧＲ作動物質、構造と効力を示す図である。
【図３Ｇ】さまざまなＴＧＲ作動物質、構造と効力を示す図である。
【図３Ｈ】さまざまなＴＧＲ作動物質、構造と効力を示す図である。
【図３Ｉ】さまざまなＴＧＲ作動物質、構造と効力を示す図である。
【図３Ｊ】さまざまなＴＧＲ作動物質、構造と効力を示す図である。（図３Ａ〜ＪはＧｉｏｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ．Ｖｏｌ  ２２：ｐｐ１３９９−１４１４から抜粋）
【図４】さまざまな天然型ＴＧＲ５作動物質と効力を示す図である。（Ｇｉｏｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ．Ｖｏｌ  ２２：ｐｐ１３９９−１４１４から抜粋）
【図５】ＴＧＲ５およびＦＸＲ作動物質を示す図である。
【図６Ａ】ＦＸＲ作動物質を示す図である。
【図６Ｂ】ＦＸＲ作動物質を示す図である。図６Ａ、図６ＢはＭｏｄｉｃａ  Ｓ．  Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＦＸＲ  ｐａｒａｄｉｇｍ．ＮＲＳ  ２０１０；８：ｐｐ１−２８から抜粋。
【図７】ＰＧ１０２と６−ＥＣＤＣＡによるサイトカイン分泌の阻害を示す図である。ＰＢＭＣをＡ）ｍｅｇａＣＤ４０ＬまたはＢ）ｍｅｇａＣＤ４０ＬとＬＰＳを用いて刺激してサイトカインの分泌を誘発した。６−ＥＣＤＣＡおよび／またはＰＧ１０２を培養物に添加し、培養上清中のＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１２ｐ７０の濃度に対するそれらの効果を評価した。
【図８】実験中のマウスの体重を示す図である。マウスに２．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＤＳＳを含む飲用水を３日目から８日間投与して結腸炎を誘発した。毎日体重を測定し、１日目の体重に対する相対値で表した。
【図９】強制経口投与から４時間後の血漿中のＦＩＴＣ濃度により決定された腸透過性を示す図である。ＤＳＳ−措置８日後、マウスに強制経口投与によりＦＩＴＣを与えた。ＦＩＴＣ投与から４時間後にマウスを犠牲に供し、腸透過性の指標として血中蛍光量を測定した。
【図１０】結腸の長さを示す図である。実験終了時にマウスを犠牲に供し、結腸を単離した。結腸炎症の指標として結腸の長さを測定した。
【図１１】脾臓中の顆粒球の分析を説明する図である。実験終了時にマウスを犠牲に供し、脾臓を単離した。脾臓細胞を、ＧＲ−１およびＣＤ１１ｂに対する抗体を用いて染色し、顆粒球の相対的寄与度をＦＡＣＳ分析により決定した。
【図１２】ＰＭＡとイオノマイシン（Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）を用いて刺激した際の脾臓細胞からのＴＮＦ放出を示す図である。実験終了時にマウスを犠牲に供し、脾臓を単離した。ＰＭＡとイオノマイシンを用いて脾臓細胞を４．５時間刺激し、ＴＮＦ放出をＥＬＩＳＡにより測定した。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（実施例１）
ＴＨＰ１細胞による炎症性サイトカイン分泌に対するＰＧ１０２およびＧＷ４０６４および６−ＥＣＤＣＡのような合成ＦＸＲ作動物質の阻害作用。
【００２６】
材料と方法
細胞：ＴＨＰ１は、急性単球性白血病患者由来のヒト単球性細胞株である（Ｔｓｕｃｈｉｙａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ（１９８０）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２６（２）：１７１−６．）。ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞株はＳｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７７）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９（５）：６２１−６に記載されている。手短にいうと、１日目にＴＨＰ−１およびジャーカット３９．８／５０ヒト細胞を、イスコーブの修正ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ'ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＩＭＤＭ、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社、カタログ番号第ＢＥ１２−７２２Ｆ号）に１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ社、１０２７０−１０６参照）および５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号第１５７５０−０４５号）を補充したものの中で培養する。次いで、ＴＨＰ１細胞を無処置のままにするか、あるいは
＊     ｒｈｕＩＦＮγ（１０００Ｕ／ｍＬ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）を用いて４８時間予備処理してＣＤ４０発現を上方制御するか、または
＊  ＦＸＲ作動物質（ＧＷ４０６４（Ｓｉｇｍａ社Ｇ５１７２）もしくは６−ＥＣＤＣＡ（Ｃａｙｍａｎ社，１１０３１））を用いて１８時間予備処理する。
バイオアッセイの３日目にＴＨＰ−１細胞を洗浄し、下記のスキームに従って培養する。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
すべての条件について丸底細胞培養プレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ（登録商標））中で三重試験を次の順序：ＴＨＰ−Ｉ細胞５０μＬ（２ｘ１０４細胞／ウェルと同等）、試料５０μＬおよびＪ３９．８／５０細胞５０μＬで行った。全体積は１５０μｌ／ウェルである。細胞は３７℃で加湿した５％ＣＯ２雰囲気中で４８時間インキュベートした。５日目に、４８時間の培養時間経過後、７０μＬの細胞培養上清を捕集し、低結合性の丸底マイクロタイタープレートに移した。収穫した細胞培養上清を、多重サイトカイン検定試薬（Ｌｕｍｉｎｅｘ社）を用い、製造者の指示に従って、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１０をはじめとする多数のサイトカインの有無について検定した。試料を用いて種々の条件下で実現されたサイトカイン分泌の％阻害を計算する。
【００２９】
（実施例２）
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）により引き起こされた炎症性のサイトカイン分泌に対するＰＧ１０２と合成ＦＸＲ作動物質６−ＥＣＤＣＡとの相乗的阻害作用。
【００３０】
材料と方法：
ＰＢＭＣはヘパリン化人血からフィコール（Ｆｙｃｏｌｌ）密度勾配遠心分離法（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ；Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いて新たに単離されたものである。ＰＢＭＣは、丸底９６−ウェル・プレートにおいて、ＲＰＭＩを含む１０％ＦＣＳ中５Ｘ１０Ｅ５個／ｍＬの濃度で培養した。２種の異なる刺激を用いてＰＢＭＣからのサイトカイン分泌を誘発した。
１．ＰＢＭＣは、ＩＦＮ−γ（２５０Ｕ／ｍＬ）の存在下で２４時間培養してＣＤ４０の上方制御を誘発した。ついで、ｍｅｇａＣＤ４０Ｌ（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて２４時間ＣＤ４０経路を活性化した。
２．ＰＢＭＣは、ＩＦＮ−γの存在下２４時間培養して、ＣＤ４０の上方制御を誘発した。次いで、ｍｅｇａＣＤ４０Ｌ（１００ｎｇ／ｍＬ）とＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）を用いて、細胞を２４時間刺激した。
刺激されたＰＢＭＣを種々の濃度（５、１０および１００ｎｇ／ｍＬ）のＰＧ１０２の非存在下または存在下に、および／または種々の濃度（０．１、１および５μＭ）の６−ＥＣＤＣＡの非存在下または存在下に培養した。ＰＧ１０２の添加は刺激と同時に行った。これに対して、６−ＥＣＤＣＡは、刺激を加える３時間前に添加した。培養期間の終わりに、上清を捕集し、サイトカイン分析まで−８０℃で貯蔵した。ＢＤサイトメトリック・ビード・アレイ（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ））ヒト炎症サイトカイン・キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて培養上清中のＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＴＮＦおよびＩＬ−１２ｐ７０の濃度をそれぞれ測定した。検定は製造者の指示に従って行った。手短にいうと、関心のあるサイトカイン用の捕集ビーズを上清またはヒト炎症性サイトカイン標準品およびＰＥ検出試薬と混合した。サンプルを暗所で室温で３時間インキュベートした。次いで、サンプルを洗浄し、ＦＡＣＳ  ＣＡＮＴＯ  ＩＩサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で分析した。
データ分析は、ＦＣＡＰアレイ・ソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて行った。
【００３１】
結果：
ＣＤ４０−ＣＤ１５４経路を刺激すると、著量のＴＮＦ（７３３ｐｇ／ｍＬ）、ＩＬ−６（５．３ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−８（１９．５ｎｇ／ｍＬ）が製造された。ＩＬ−１２ｐ７０（５０ｐｇ／ｍＬ）もこれらの刺激条件下で製造された。ＩＬ−１β（７ｐｇ／ｍＬ）は検出されなかった。ＰＧ１０２は、薬容量依存的にＰＢＭＣからのこのサイトカイン放出を阻害し、１００ｎｇ／ｍＬのＰＧ１０２を用いると、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１２ｐ７０の放出を、それぞれ、８９％、８７％、７８％、８８％および９３％阻害した。６−ＥＣＤＣＡは単独で０．１または１μＭの濃度で用いるとそれらのサイトカイン放出を阻害しなかった。しかしながら、５μＭの６−ＥＣＤＣＡを用いると、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１２ｐ７０の放出をそれぞれ１４％、１８％、１７％、３５％および２０％阻害した。ＰＧ１０２と６−ＥＣＤＣＡを組み合わせて培養に添加すると、ＰＧ１０２単独または６−ＥＣＤＣＡ単独よりも強くサイトカイン放出を阻害し、ＰＧ１０２の非存在下ではサイトカイン放出に阻害作用を持たない濃度（１μＭ）で６−ＥＣＤＣＡを用いた場合よりも強く阻害した。図７Ａにおいて、サイトカイン分泌の％阻害がＰＧ１０２（５ｎｇ／ｍＬ）単独、６−ＥＣＤＣＡ（１μＭ）単独およびＰＧ１０２（５ｎｇ／ｍＬ）と６−ＥＣＤＣＡ（１μＭ）の組合せに対して図示されている。
【００３２】
別に、ＰＢＭＣをＣＤ４０経路とＴｏｌｌ様受容体の刺激（ＬＰＳ）との組合せにより刺激した。ＬＰＳはグラム陰性菌の外膜の主な成分であり、ヒトでは強い免疫反応を生じる。ＬＰＳをＴＬＲ４受容体に結合すると、ＣＤ４０経路を刺激した場合のように、ＮＦ−κＢが活性化され、炎症性のサイトカインが製造される。これらの刺激条件下で、すべての評価されたサイトカインが高い濃度で分泌された（ＴＮＦ：９ｎｇ／ｍＬ；ＩＬ−６：２３ｎｇ／ｍＬ；ＩＬ−８：２３ｎｇ／ｍＬ；ＩＬ−１β：１００ｐｇ／ｍＬ；ＩＬ−１２ｐ７０：１５００ｐｇ／ｍＬ）。ＰＧ１０２単独は、ＴＮＦ、ＩＬ−１２ｐ７０およびＩＬ−１ｂの分泌を薬容量に依存して阻害することが可能であるが、ＩＬ−８およびＩＬ−６の分泌にはほぼ影響を与えない。明らかに，  ＰＧ１０２は、これらの刺激条件下で、ＣＤ４０経路の排他的な刺激と比較するとそれほど強力ではない。ＰＧ１０２（１００ｎｇ／ｍＬ）は、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１２ｐ７０をそれぞれ３８％、０％、１７％、４３％および６７％阻害する。６−ＥＣＤＣＡは、ＬＰＳに誘発されるＴＮＦ製造を薬容量に依存して阻害することがすでに示されている（Ｇａｄａｌｅｔａ  ＲＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｕｔ  ２０１１；６０（４）：４６３−７２）。ここでは、６−ＥＣＤＣＡは、ＣＤ４０経路のみの活性化またはこれとＴＬＲ−４経路とを組み合わせた活性化により誘発される炎症性サイトカイン放出を阻害するのにそれほど効果的ではないことが示される。６−ＥＣＤＣＡ（５μＭ）は、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１２ｐ７０をそれぞれ２１％、０％、９％、１２％および２２％阻害した。ＰＧ１０２と６−ＥＣＤＣＡを組み合わせると、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１２ｐ７０の放出を単独または６−ＥＣＤＣＡ単独よりもより効果的に阻害した。これは、図７ＢにＰＧ１０２と６−ＥＣＤＣＡをそれぞれ５ｎｇ／ｍＬと１μＭの濃度で用いた場合について示されている。
【００３３】
データの示すように、ＰＧ１０２を６−ＥＣＤＣＡと組み合わせると、本研究において分析されたすべての炎症性サイトカインの分泌を、ＰＧ１０２単独または６−ＥＣＤＣＡ単独と比較してより効果的に阻害した。特に、サイトカイン誘発刺激がより強くなると、６−ＥＣＤＣＡとＰＧ１０２の組合せが炎症性サイトカイン放出に対する相乗的阻害作用を有するようになる。これらのデータによって示されるのは、６−ＥＣＤＣＡとＰＧ１０２を組合せると刺激方法と無関係に炎症を阻害することが可能であることである。このことは、微生物成分または自己免疫過程のどちらが炎症性サイトカイン放出の基礎となっているかに無関係であることを示している。このデータは、また、次のことを示す。すなわち、これらの剤を一緒に用いるとより低い濃度で使用し、有効性を損なうことなく安全性を高めることが可能である。
【００３４】
（実施例３）
ＭＲ−１および合成ＦＸＲ作動物質である６−ＥＣＤＣＡのＤＳＳ誘発結腸炎のマウス・モデルにおける相乗的阻害作用
【００３５】
材料と方法：
飲用水中に２．５％（重量／体積）のデキストラン・ソジウム・サルフェート（Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｓｕｌｐｈａｔｅ）（ＤＳＳ；分子量３６０００−５００００Ｄａ、ＭＰ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）を混入し８日間投与することによりＣ５７／Ｂｌ６野生型マウスにおいて結腸炎を誘発した。ＦＸＲの薬理的活性化を６−エチル−ケノデオキシコール酸（６−ＥＣＤＣＡ）を用いた処置により行った。６−ＥＣＤＣＡ（１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）またはベヒクルをＤＳＳ−処置の開始前に３日間にわたって強制経口投与により投与し、ＤＳＳ−処置の終了まで投与を継続した。ＤＳＳ処置の２日目（６−ＥＣＤＣＡ処置の４日目）に、マウスに２５０μｇの抗マウスＣＤ４０Ｌハムスター抗体、ＭＲ−１または対照群ＩｇＧ（ＬＥＡＦ（登録商標）；精製されたアルメニアンハムスター（Ａｒｍｅｎｉａｎ  Ｈａｍｓｔｅｒ）ＩｇＧ  Ｉｓｏｔｙｐｅ  Ｃｔｒｌ抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により投与した。
実験には５治療群（ｎ＝１０  マウス／群）を用いた。
１．−ＤＳＳ，＋ベヒクル  強制経口投与による（ｏ．ｇ．）＋対照群ＩｇＧ  ｉ．ｐ．
２．＋ＤＳＳ，＋ベヒクル  ｏ．ｇ．                   ＋対照群ＩｇＧ  ｉ．ｐ．
３．＋ＤＳＳ，＋ベヒクル  ｏ．ｇ．                 ＋抗ＣＤ４０Ｌ  ｉ．ｐ．
４．＋ＤＳＳ，＋６−ＥＣＤＣＡ  ｏ．ｇ．           ＋対照群ＩｇＧ  ｉ．ｐ．
５．＋ＤＳＳ，＋６−ＥＣＤＣＡ  ｏ．ｇ．           ＋抗ＣＤ４０Ｌ  ｉ．ｐ．
毎日の体重変化を評価し、２−１１日目における体重の１日目の体重に対する相対値として表した。腸透過性検定については、ＤＳＳ−処置の８日後に強制経口投与によりＦＩＴＣをマウスに投与した。ＦＩＴＣ投与４時間後、マウスを犠牲に供し、血中蛍光量を透過性の指標として測定した。結腸を単離し、結腸の長さを測定した。脾臓を捕集し、細胞を単離した。細胞を抗体混合物を用いて染色して脾臓の免疫細胞の組成をＦＡＣＳ分析により決定した。顆粒球をＧＲ−１とＣＤ１１ｂの発現に基づいて同定し、脾臓の生存細胞のパーセントとして表した。最後に、脾臓細胞をイン・ビトロでＰＭＡとイオノマイシンを用いて４．５時間刺激した。培養上清を捕集して、ＥＬＩＳＡを用いてＴＮＦを測定した。
【００３６】
結果
ＦＸＲ受容体作動物質６−ＥＣＤＣＡは、化学的に誘発された腸炎を阻害し、結腸炎症候群が改善し、上皮の透過性を阻害し、かつ杯細胞喪失を低下させることがすでに示されている（Ｇａｄａｌｅｔａ  ＲＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｕｔ  ２０１１；６０（４）：４６３−７２）。ＭＲ−１、すなわち拮抗的抗ＣＤ４０Ｌ抗体は、実験により作出された同系ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＣＤ４＋  Ｔ細胞を用いて再構成されたＳＣＩＤマウスの結腸炎モデルにおいて有効であった（Ｌｉｕ  Ｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００；１６４（１１）：６００５−１１）。本研究では、６−ＥＣＤＣＡの投与スキームは、Ｇａｄａｌｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．により報告されているものと同等である。確かに、本研究でも、６−ＥＣＤＣＡはＤＳＳにより誘発された結腸炎の疾病経過を阻害した。ＭＲ−１は、対照的に、準最適に（結腸炎誘発１日後に１回のみ）投薬され、ＣＤ４０経路阻害とＦＸＲ受容体活性化との相乗的効果を生じさせる。臨床においてＣＤ４０経路阻害の薬容量と頻度とを低下させると、副作用と不所望の免疫抑制の可能性が低下する。本研究の結果が示しているように、適用されたＭＲ−１の投与スキームは、単独投与では結腸炎の疾病経過を阻害するのに不十分であるが、ＦＸＲ受容体作動物質と組み合わされると、６−ＥＣＤＣＡは結腸炎の疾病経過を阻害することができる。
【００３７】
予想されるように、ＤＳＳは、ＤＳＳ投与開始の４日後となる７日目から体重の低下を引き起こした。この体重低下は、第５群、６−ＥＣＤＣＡとＭＲ−１（図８）の両方を投与されたマウスにおいて最小であった。また、ＤＳＳを投与されたマウスのうち、組合せ治療群において腸透過性の低下が最も少なかった（図９）。結腸の短小化は炎症の特徴である。ＤＳＳは主に炎症を引き起こし、結腸を短小化する。ＤＳＳ＋６−ＥＣＤＣＡ＋αＣＤ４０Ｌの組合せを投与されたマウスの結腸の長さは、ＤＳＳ（図１０）を投与されなかったマウスの結腸の長さと有意の差がない。６−ＥＣＤＣＡは、脾臓の顆粒球を増加させると思われるが、６−ＥＣＤＣＡをαＣＤ４０Ｌ（図１１）と組み合わせることによりその効果は減少した。図１２に示されているのは、６−ＥＣＤＣＡとαＣＤ４０Ｌの両方を投与されたマウスから単離された脾臓細胞は、イン・ビトロ刺激した際に、他のＤＳＳを処置した群（第２−第４群）から単離されたマウスの脾臓細胞と比べてＴＮＦの製造が少ないことである。結局、このマウス結腸炎モデルにおいて多数の評価綱目（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｍｅａｓｕｒｅｓ）で、ＭＲ−１は効果がないが、ＭＲ−１と６−ＥＣＤＣＡの組合せは、６−ＥＣＤＣＡ単独よりも優れた効果を示した。従って、ＦＸＲ受容体の活性化と抗ＣＤ４０の阻害を消化管自己免疫疾患に適用すると、この組合せにより、より低濃度の各薬剤をより低い投薬頻度で用いる、よりマイルドな投与スキームが使用可能になる。受容体の活性化とＣＤ４０の阻害の組合せは、安全性プロフィールの改善と炎症のより効果的な阻害に寄与する。
【００３８】
引用文献
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【００３９】
表１  さまざまな特許されたＴＧＲ５作動物質（Ｇｉｏｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ．Ｖｏｌ  ２２：ｐｐ１３９９−１４１４から抜粋）
【表２】
2016521744.tif 000003
2016521744.tif 000004
【００４０】
表２  さまざまなＴＧＲ５作動物質（Ｇｉｏｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ．Ｖｏｌ  ２２：ｐｐ１３９９−１４１４から抜粋）
【表３】
2016521744.tif 000005
【図１】
2016521744.tif 000006
【図２Ａ】
2016521744.tif 000007
【図２Ｂ】
2016521744.tif 000008
【図２Ｃ】
2016521744.tif 000009
【図３Ａ】
2016521744.tif 000010
【図３Ｂ】
2016521744.tif 000011
【図３Ｃ】
2016521744.tif 000012
【図３Ｄ】
2016521744.tif 000013
【図３Ｅ】
2016521744.tif 000014
【図３Ｆ】
2016521744.tif 000015
【図３Ｇ】
2016521744.tif 000016
【図３Ｈ】
2016521744.tif 000017
【図３Ｉ】
2016521744.tif 000018
【図３Ｊ】
2016521744.tif 000019
【図４】
2016521744.tif 000020
【図５】
2016521744.tif 000021
【図６Ａ】
2016521744.tif 000022
【図６Ｂ】
2016521744.tif 000023
【図７】
2016521744.tif 000024
【図８】
2016521744.tif 000025
【図９】
2016521744.tif 000026
【図１０】
2016521744.tif 000027
【図１１】
2016521744.tif 000028
【図１２】
2016521744.tif 000029
【国際調査報告】
2016521744.tif 000030
2016521744.tif 000031
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