(57)【要約】本発明は、被検体からの試料中の補体因子Ｈ関連タンパク質１（ＣＦＨＲ１）を特異的に検出するためのアッセイ、ならびにそれに関連するキットおよび剤に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）補体因子Ｈ  Ｒ１（ＣＦＨＲ１）タンパク質に結合できる第１剤、および、
ｂ）補体因子Ｈ  Ｒ１（ＣＦＨＲ１）タンパク質に結合できる第２剤を含むキットであって、
第１剤と第２剤は異なるオーバーラップしないエピトープに結合し、
第１剤および第２剤の両方がＣＦＨと交差反応することはなく、
第１剤および第２剤の両方がＣＦＨＲ２と交差反応することはなく、
第１剤および第２剤の両方がＣＦＨＲ３と交差反応することはなく、
第１剤および第２剤の両方がＣＦＨＲ４と交差反応することはなく、
第１剤および第２剤の両方がＣＦＨＲ５と交差反応することはなく、
一方の剤は検出可能な標識で標識され、
他方の剤は固相に固定することができる、
前記キット。
【請求項２】
ａ）第１剤はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２のアミノ酸１４４−３３０内のエピトープに結合し、および／または、
ｂ）第２剤はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２のアミノ酸１−１４３内のエピトープに結合する、
請求項１に記載のキット。
【請求項３】
ａ）第１剤はＣＦＨおよびＣＦＨＲ５と交差反応するが、ＣＦＨＲ２、ＣＦＨＲ３、およびＣＦＨＲ４とは交差反応せず、および／または
ｂ）第２剤はＣＦＨＲ２と交差反応するが、ＣＦＨ、ＣＦＨＲ３、ＣＦＨＲ４およびＣＦＨＲ５とは交差反応しない、
請求項１または２に記載のキット。
【請求項４】
ａ）第１剤は、抗体、特に抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３であって、重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４１の配列を有し、軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４３の配列を有するもの、または、ＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３のＣＤＲ配列を含む抗体であり、および／または、
ｂ）第２剤は、抗体、特に抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５であって、重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６の配列を有し、軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８の配列を有するもの、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３の配列ならびにアミノ酸配列ＩＴＳによるＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５のＣＤＲ配列を含む抗体である、
請求項１〜３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５】
被検体から得た試料中の補体因子Ｈ  Ｒ１（ＣＦＨＲ１）タンパク質を検出するためのインビトロアッセイ法であって、
ａ）試料を請求項１〜４に記載のいずれかのキットの剤と接触させること、
ｂ）形成された複合体を固相に固定すること、および、
ｃ）ＣＦＨＲ１を検出し、特にＣＦＨＲ１の量および／または濃度を決定すること、を含み、
その際、工程ｂ）は工程ａ）の前、工程ａ）の後、または工程ａ）と同時に実施できる、
前記インビトロアッセイ法。
【請求項６】
神経発達障害、神経障害または神経精神障害を伴なう患者について、グリシン再取込み阻害薬（ＧＲＩ）で処置した場合の応答を予測するインビトロ法であって、下記を含む前記インビトロ法；
ｉ）請求項５に記載のアッセイを実施することにより、患者の試料中のＣＦＨＲ１のタンパク質濃度を決定する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で決定したタンパク質濃度を、神経発達障害、神経障害または神経精神障害を伴なう患者におけるＣＦＨＲ１のカットオフ値と比較する工程、
ｉｉｉ）その際、カットオフ値を超える、神経発達障害、神経障害または神経精神障害を伴なう患者の試料中のＣＦＨＲ１のタンパク質濃度は、ＧＲＩ処置から臨床有益性が得られるであろう患者の指標であり、および、
ｉｖ）神経発達障害、神経障害または神経精神障害を伴なう患者についてＧＲＩ処置を選択する工程。
【請求項７】
試料が血液、血清、髄液または血漿である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
ａ）神経発達障害、神経障害または神経精神障害が、統合失調症の陰性または陽性症状、双極性障害、物質依存症、自閉症および強迫性障害、特に統合失調症の陰性または陽性症状を含み、および／または、
ｂ）患者が統合失調感情障害に罹患しており、および／または、
ｃ）ＧＲＩが［４−（３−フルオロ−５−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イル）−ピペラジン−１−イル］−［５−メタンスルホニル−２−［［（２Ｓ）−１，１，１−トリフルオロプロパン−２−イル］オキシ］フェニル］メタノンである、
請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ａ）アッセイが酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）または電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）であり、および／または、
ｂ）ＣＦＨＲ１タンパク質の検出範囲が０．０２〜約５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．０５〜約３５μｇ／ｍｌであり、および／または、
ｃ）第１剤および第２剤がモノクローナル抗体であり、および／または、
ｄ）第１剤は検出可能な標識で標識されているＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３であり、第２剤は固相に固定することができるＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５である、および／または、
ｅ）アッセイが組換えＣＦＨＲ１タンパク質キャリブレーターにより標準化され、特に組換えＣＦＨＲ１タンパク質がＨＥＫ細胞において産生されるものであり、および／または、
ｆ）ＣＦＨ、ＣＦＨＲ２、ＣＦＨＲ３、ＣＦＨＲ４および／またはＣＦＨＲ５に対してより低い交差反応性をもつ剤を、他方の剤を試料と接触させる前に、請求項６の工程ａ）により試料と接触させる、
請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ａ）第１剤は固相に固定することができ、第２剤は検出可能な標識で標識されている、または、
ｂ）第１剤は検出可能な標識で標識されており、第２剤は固相に固定することができる、
請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＦＨＲ１に結合できる下記の剤；
ａ）（ｉ）モノクローナル抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５であって、重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６の配列を有し、軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８の配列を有するもの、または、
（ｉｉ）モノクローナル抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３であって、重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５の配列を有し、軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７の配列を有するもの、または、
（ｉｉｉ）モノクローナル抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．５３であって、重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２９の配列を有し、軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３１の配列を有するもの、または、
（ｉｖ）モノクローナル抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．７４であって、重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３３の配列を有し、軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３５の配列を有するもの、または、
（ｖ）モノクローナル抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．３．２３であって、重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３７の配列を有し、軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３９の配列を有するもの、
または、
ｂ）（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３ならびにアミノ酸配列ＩＴＳによるＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５のＣＤＲ配列を含む抗体、および／または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３によるＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５のＣＤＲ３配列を含む抗体、または、
（ｉｉ）ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．５３、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．７４、もしくはＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．３．２３のＣＤＲ配列を含む抗体、および／または、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．５３、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．７４、もしくはＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．３．２３のＣＤＲ３配列を含む抗体、
または、
ｃ）ａ）またはｂ）の機能活性バリアント。
【請求項１２】
請求項１１に記載の抗体をコードする１以上の核酸であって、特にベクター中に存在する前記核酸、および／または、
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５および１７による核酸、および／または、
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４および２６による核酸、および／または、
（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８および３０による核酸、および／または、
（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３２および３４による核酸、および／または、
（ｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６および３８による核酸、であって、
特にベクター中に存在する前記核酸。
【請求項１３】
請求項１１に記載の剤を産生する細胞系。
【請求項１４】
ＣＦＨＲ１を結合できる請求項１１に記載の剤であって、
検出可能な標識で標識され、および／または、固相に固定することができる、前記剤。
【請求項１５】
ａ）被検体から得た試料中のＣＦＨＲ１の量および／または濃度を決定するため、および／または、
ｂ）グリシン再取込み阻害薬で処置する患者について臨床有益性を予測するため、および／または、
ｃ）神経発達障害、神経障害または神経精神障害を伴なう患者について、グリシン再取込み阻害薬（ＧＲＩ）で処置した場合の臨床有益性を予測するための、
請求項１〜４のいずれか１項に記載のキット、または請求項１１もしくは１４に記載の剤、および／または請求項１２に記載の１以上の核酸、および／または請求項１３に記載の細胞系の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検体からの試料中の補体因子Ｈ関連タンパク質１（ＣＦＨＲ１）を特異的に検出するためのアッセイ、ならびにそれに関連するキットおよび剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
補体因子Ｈ（Ｈ因子としても知られている）は、微生物防御、免疫複合体プロセシング、プログラム細胞死および加齢黄斑変性に関与する補体仲介免疫系の調節に不可欠な役割を果たすシアル酸含有糖タンパク質である。補体因子Ｈは補体因子Ｈタンパク質ファミリーのうち最も良く特性解明されたメンバーである。補体因子Ｈファミリーは下記のメンバーからなる：補体因子Ｈ（ＣＦＨ）、補体因子Ｈ関連タンパク質１（ＣＦＨＲ１）、補体因子Ｈ関連タンパク質２（ＣＦＨＲ２）、補体因子Ｈ関連タンパク質３（ＣＦＨＲ３）、イソ型４Ａおよび４Ｂを含む補体因子Ｈ関連タンパク質４（ＣＦＨＲ４ＡおよびＣＦＨＲ４Ｂ）、ならびに補体因子Ｈ関連タンパク質５（ＣＦＨＲ５）。補体因子Ｈ関連タンパク質は補体因子Ｈ遺伝子の下流にコードされ、補体因子Ｈのサブドメインとの高度の相同性を共有する。補体因子Ｈ関連タンパク質は、機能類似性も共有する(Jozsi, M. and Zipfel, P.F., Trend in Immunology 29 (2008) 380-387)。
【０００３】
この補体系は、体液中または細胞および組織の表面に存在する約４０種類のタンパク質からなり、３つの主経路によりカスケード様の様式で活性化される(Walport, M.J.N., Engl. J. Med. 344, 1058-1066)。中心的成分Ｃ３の自然加水分解により第二経路が低速で連続的に活性化され、微生物炭水化物を認識するマンノース結合レクチンまたはフィコリン類によりレクチン経路が開始され、Ｃ１ｑが抗原結合性免疫グロブリンに結合することにより古典的経路が活性化される。酵素工程により補体成分の活性フラグメントが生成し、さらなる増幅を始動させる。これら３つの経路がＣ３の集束点で合流し、Ｃ３は活性化されるとＣ３ａとＣ３ｂに開裂する。補体因子Ｈは無制限な補体活性化により生じる傷害から宿主細胞を保護する。補体因子Ｈは、第１因子仲介Ｃ３ｂ開裂、および第二経路Ｃ３コンベルターゼＣ３ｂＢｂに対抗する崩壊促進活性について両方の補因子活性を保有することにより、自己細胞における補体活性化を調節する。補体因子Ｈは自己細胞を補体活性化から保護するが、細菌／ウイルスに対しては保護しない。補体の調節に際して補体因子Ｈは中心的役割を果たすため、異常なＣＦＨ活性から生じる多数の臨床関連事項がある。補体因子Ｈ遺伝子の変異は下記のものを含めた重篤かつ多様な疾患を随伴する：稀少腎障害である溶血性尿毒症症候群(hemolytic uremic syndrome)（ＨＵＳ）および膜性増殖性糸球体腎炎(membranoproliferative glomerulonephritis)（ＭＰＧＮ）：デンスデポジット病(dense deposit disease)（ＤＤＤ）またはＩＩ型膜性増殖性糸球体腎炎とも呼ばれる；ならびにより高頻度の網膜疾患である加齢黄班変性(age related macular degeneration)（ＡＭＤ）。補体因子Ｈは、それの補体調節活性のほかに多数の生理活性をもち、１）細胞外マトリックス成分として作用し、２）インテグリンタイプの細胞受容体に結合し、３）広範なリガンド、たとえばＣ反応性タンパク質、トロンボスポンジン、骨シアロタンパク質、オステオポンチン、およびヘパリンと相互作用する。
【０００４】
補体因子Ｈタンパク質ファミリーは、タンパク質ＣＦＨ、ＣＦＨＲ１、ＣＦＨＲ２、ＣＦＨＲ３、ＣＦＨＲ４Ａ、ＣＦＨＲ４ＢおよびＣＦＨＲ５を含む。
先行技術には、血液、血清、血漿、髄液試料、または他のいずれかの体液中の補体因子Ｈ関連タンパク質１（ＣＦＨＲ１）のインビトロ検出に利用できる特定の方法は無いと思われる。本発明者らは、個体から得た血液、血清、血漿、または髄液試料中のＣＦＨＲ１を特異的に決定する方法を今回見出して確立することができた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Jozsi, M. and Zipfel, P.F., Trend in Immunology 29 (2008) 380-387
【非特許文献２】Walport, M.J.N., Engl. J. Med. 344, 1058-1066
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、たとえばＣＦＨＲ１関連の疾患および障害を診断するために、試料における簡単で経費効率の高いＣＦＨＲ１検出方法を提供することである。
全血、血清または血漿は、臨床ルーティンで最も広く用いられている試料源である。特定の疾患の信頼できる検出を補助するかまたは早期予後情報を提供するマーカーの同定は、この疾患の診断および管理を大幅に補助する方法をもたらすことができる。早期介入は機能障害を低減し、長期転帰を改善できるので、特定の疾患の早期診断を改善することは特に重要である。
【０００７】
本発明の目的は、ＣＦＨＲ１をインビトロで、好ましくは被検体の体液試料において、特異的に、すなわち他のＣＦＨファミリーメンバーとの交差反応なしに査定する方法を研究することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、意外にも、補体因子Ｈファミリーメンバーのタンパク質である補体因子Ｈ関連タンパク質１（ＣＦＨＲ１）を、本発明のキットを用いて特異的に検出する方法を立証することができた。
【０００９】
本発明方法は、特に被検体の血液、血清、血漿または髄液試料中のＣＦＨＲ１のインビトロ査定に適する。
開示する方法およびキットは、ＣＦＨファミリーメンバーの査定に利用できる現在知られている方法の幾つかの問題点を克服できる。
【００１０】
１態様において、本発明は：
ａ）補体因子Ｈ  Ｒ１（ＣＦＨＲ１）タンパク質に結合できる第１剤、および、
ｂ）補体因子Ｈ  Ｒ１（ＣＦＨＲ１）タンパク質に結合できる第２剤を含むキットであって、
第１剤と第２剤は異なるオーバーラップしないエピトープに結合し、
第１剤および第２剤の両方がＣＦＨと交差反応することはなく、
第１剤および第２剤の両方がＣＦＨＲ２と交差反応することはなく、
第１剤および第２剤の両方がＣＦＨＲ３と交差反応することはなく、
第１剤および第２剤の両方がＣＦＨＲ４と交差反応することはなく、
第１剤および第２剤の両方がＣＦＨＲ５と交差反応することはなく、
一方の剤は検出可能な標識で標識され、
他方の剤は固相に固定することができる、前記キットに関する。
【００１１】
好ましい態様において、オーバーラップしないエピトープはＣＦＨＲ１の異なるドメインに位置するエピトープである。
意外にも、実施例７、８、９および１０に示すように、そのようなキットは被検体からの試料中のＣＦＨＲ１を特異的に検出できることが見出された。特に、標識モノクローナル抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５およびビオチン標識抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３を含むキットの使用が有効であった。実施例に記載するように、ビオチン標識抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３をストレプトアビジンでコートした磁性粒子に結合させることにより固相に固定できる。また、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５をルテニウム化し(ruthenylate)、電気化学発光により検出することができる。また、これら２種類の抗体は異なるオーバーラップしないエピトープに結合する；ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５を産生させるためにはＣＨＦＲ１のアミノ酸１−１４３（＝ＣＨＦＲ１のＳＣＲ(short consensus repeat；ショートコンセンサスリピート）ドメイン１−２）に対応する免疫原を用い、一方、ＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３はＣＦＨＲ１のよりＣ−末端部分内の、すなわちＣＨＦＲ１のＳＣＲドメイン３−４−５内のエピトープに結合するからである。
【００１２】
第１剤および第２剤はポリペプチドまたはポリペプチド複合体であると解釈される。
したがって、本発明のキットの好ましい態様において、第１剤はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２のアミノ酸１４４−３３０内のエピトープに結合する。
【００１３】
したがって、本発明のキットの他の好ましい態様において、第２剤はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２のアミノ酸１−１４３内のエピトープに結合する。
表１に示すように、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５はＣＦＨと交差反応しないが、ＣＦＨＲ２とは交差反応を示す。また、表１は、ＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３がＣＦＨおよびＣＦＨＲ５と交差反応するが、ＣＦＨＲ２とは交差反応しないことを示す。
【００１４】
それぞれ、ＣＦＨＲ２ならびに／あるいはＣＦＨおよびＣＦＨＲ５と交差反応しないことは、きわめて重要である；ＣＦＨタンパク質のこれらのメンバーはＣＦＨＲ１との最大の構造類似性を示すからである。
【００１５】
したがって、本発明のキットの他の好ましい態様において、第１剤はＣＦＨＲ２と交差反応しない。
本発明のキットの他の好ましい態様において、第２剤はＣＦＨと交差反応しない。
【００１６】
本発明のキットの他の好ましい態様において、第２剤はＣＦＨＲ５と交差反応しない。
本発明のキットの他の好ましい態様において、第２剤はＣＦＨおよびＣＦＨＲ５と交差反応しない。
【００１７】
キットの好ましい態様において、第１剤はＣＦＨおよびＣＦＨＲ５と交差反応するが、ＣＦＨＲ２、ＣＦＨＲ３およびＣＦＨＲ４とは交差反応しない。
キットの他の好ましい態様において、第２剤はＣＦＨＲ２と交差反応するが、ＣＦＨ、ＣＦＨＲ３、ＣＦＨＲ４およびＣＦＨＲ５とは交差反応しない。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図1は、ＣＦＨおよびＣＦＨ関連タンパク質のタンパク質構造を示す(Jozsi M, Zipfel PF “Factor 8 family proteins and human diseases” Trends Immunol. 2008; 29(8):380-7)。
【図２−１】図２は、モノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５の重鎖配列を示し、ＣＤＲ領域に下線を施した。配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５（ＤＮＡ）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６（タンパク質）に対応する。
【図２−２】図２は、モノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５の重鎖配列を示し、ＣＤＲ領域に下線を施した。配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５（ＤＮＡ）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６（タンパク質）に対応する。
【図３−１】図３は、モノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５の軽鎖配列を示し、ＣＤＲ領域に下線を施した。配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７（ＤＮＡ）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８（タンパク質）に対応する。
【図３−２】図３は、モノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５の軽鎖配列を示し、ＣＤＲ領域に下線を施した。配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７（ＤＮＡ）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８（タンパク質）に対応する。
【図４−１】図４は、組換えＣＦＨＲ１〜ＣＦＨＲ５およびＣＦＨＬ１誘導体のアミノ酸配列を示す。
【図４−２】図４は、組換えＣＦＨＲ１〜ＣＦＨＲ５およびＣＦＨＬ１誘導体のアミノ酸配列を示す。
【図５】図５は、モノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３の重鎖配列を示し、ＣＤＲ領域に下線を施した。配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４（ＤＮＡ）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５（タンパク質）に対応する。
【図６−１】図６は、モノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３の軽鎖配列を示し、ＣＤＲ領域に下線を施した。配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６（ＤＮＡ）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７（タンパク質）に対応する。
【図６−２】図６は、モノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３の軽鎖配列を示し、ＣＤＲ領域に下線を施した。配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６（ＤＮＡ）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７（タンパク質）に対応する。
【図７】図７は、モノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．５３の重鎖配列を示し、ＣＤＲ領域に下線を施した。配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８（ＤＮＡ）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９（タンパク質）に対応する。
【図８−１】図８は、モノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．５３の軽鎖配列を示し、ＣＤＲ領域に下線を施した。配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０（ＤＮＡ）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１（タンパク質）に対応する。
【図８−２】図８は、モノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．５３の軽鎖配列を示し、ＣＤＲ領域に下線を施した。配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０（ＤＮＡ）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１（タンパク質）に対応する。
【図９】図９は、モノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．７４の重鎖配列を示し、ＣＤＲ領域に下線を施した。配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２（ＤＮＡ）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３（タンパク質）に対応する。
【図１０−１】図１０は、モノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．７４の軽鎖配列を示し、ＣＤＲ領域に下線を施した。配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４（ＤＮＡ）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５（タンパク質）に対応する。
【図１０−２】図１０は、モノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．７４の軽鎖配列を示し、ＣＤＲ領域に下線を施した。配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４（ＤＮＡ）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５（タンパク質）に対応する。
【図１１】図１１は、モノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．３．２３の重鎖配列を示し、ＣＤＲ領域に下線を施した。配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６（ＤＮＡ）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７（タンパク質）に対応する。
【図１２−１】図１２は、モノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．３．２３の軽鎖配列を示し、ＣＤＲ領域に下線を施した。配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８（ＤＮＡ）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９（タンパク質）に対応する。
【図１２−２】図１２は、モノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．３．２３の軽鎖配列を示し、ＣＤＲ領域に下線を施した。配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８（ＤＮＡ）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９（タンパク質）に対応する。
【図１３】図１３は、モノクローナル抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３の重鎖配列を示し、ＣＤＲ領域に下線を施した。配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０（ＤＮＡ）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１（タンパク質）に対応する。
【図１４−１】図１４は、モノクローナル抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３の軽鎖配列を示し、ＣＤＲ領域に下線を施した。配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２（ＤＮＡ）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３（タンパク質）に対応する。
【図１４−２】図１４は、モノクローナル抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３の軽鎖配列を示し、ＣＤＲ領域に下線を施した。配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２（ＤＮＡ）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３（タンパク質）に対応する。
【図１５】図１５は、ＭＡＫ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５を一次抗体として用い、ＰＡＫ＜Ｍ−ＩｇＧ＞Ｓ−ＩｇＧ−ＰＯＤを二次抗体として用いたウェスタンブロットを示す。列１はＭａｇｉｃＭａｒｋ  ＸＰサイズ標準品であり、列４は血清−精製ＣＦＨ（２００ｎｇ／ウェル）であり、列５は血清−精製ＣＦＨ（２０００ｎｇ／ウェル）である。３７ｋＤａの二重バンドはＣＦＨＲ１に対応する。２２０ｋＤａ周囲のスミアは、精製ＣＦＨ中の残りのＣＦＨＲ１のより良好な検出を達成するために過剰装填したウェルによるものである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明によれば、“交差反応する”は、ある剤（特に抗体）が指向するターゲットタンパク質とは異なる当該タンパク質に対する結合強度が、ターゲットタンパク質について測定した結合強度の少なくとも０．２％、好ましくは少なくとも０．１％であることを意味する。結合強度は、特にＢｉａＣｏｒｅを用いて本発明の実施例の親和性試験を適用することにより測定できる。当業者に既知のとおり、Ｋｄとして示すならば、結合強度がより良好である／より高いほど、Ｋｄはより低い。
【００２０】
ＣＦＨはある体液中には比較的多量に、ＣＦＨＲ１の約１０倍の濃度で存在する。
本発明に用いる２種類の剤は、ＣＦＨファミリーの他のメンバーに対する交差反応性を示す可能性がある。しかし、本発明に用いる２種類の剤は、ＣＦＨファミリーの同一メンバーとは交差反応しない；すなわち、それぞれＣＦＨ、ＣＦＨＲ２、ＣＦＨＲ３、ＣＦＨＲ４およびＣＦＨＲ５と交差反応するのは、それらの剤のうち多くとも一方である。
【００２１】
したがって、本発明のキットの好ましい態様において、第１剤はＣＦＨと交差反応する可能性があるが、２以上の他のＣＦＨファミリーメンバーとは交差反応しない。
したがって、本発明のキットの他のより好ましい態様において、第１剤はＣＦＨＲ５と交差反応する可能性があるが、２以上の他のＣＦＨファミリーメンバーとは交差反応しない。
【００２２】
したがって、本発明のキットのよりさらに好ましい態様において、第１剤はＣＦＨＲ５およびＣＦＨと交差反応する可能性があるが、他のＣＦＨファミリーメンバーとは交差反応しない。
【００２３】
したがって、本発明のキットの他の好ましい態様において、第２剤はＣＦＨＲ２と交差反応する可能性があるが、他のＣＦＨファミリーメンバーとは交差反応しない。
本出願による“ＣＦＨＲ４”は、天然バリアントＣＦＨＲ４ＡおよびＣＦＨＲ４Ｂを包含する。本出願の図１から分かるように、ＣＦＨＲ４の２種類のイソ型、すなわちＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５に開示するＣＦＨＲ４Ａ、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６に開示するＣＦＨＲ４Ｂが存在する。ＣＦＨＲ４ＡとＣＦＨＲ４Ｂは同一のＮ末端配列をもつが、ＣＦＨＲ４Ｂはより短いＣ末端部分をもつ。ＣＦＨＲ４をコードする遺伝子転写体が選択的スプライシングされて(alternatively spliced)、異なるＣＦＨＲ４バリアントが発現する。長さ３３１アミノ酸をもつＣＦＨＲ４ポリペプチドおよび５７７アミノ酸バリアントをコードするバリアントがある。後者は“ＣＦＨＲ４Ａ”と呼ばれ、これに対し短いイソ型は“ＣＦＨＲ４Ｂ”と呼ばれる。両方のバリアントがヒト肝臓で発現するが、本発明に用いるものとしては短いイソ型のみをクローニングおよび発現させた。両方のバリアントの相同性解析は、ＳＣＲドメイン１が両方のバリアントにおいて同一であることを示した。ＣＦＨＲ４ＡのＳＣＲ２−５はＣＦＨＲ４ＢのＳＣＲ２−４とほぼ同一であり、数個のアミノ酸が異なるにすぎない。さらに、ＣＦＨＲ４ＢのＳＣＲ６−９はＣＦＨＲ４ＡのＳＣＲ２−５との１００％同一性をもつ(Joszi, Richter, Loeschmann et al., European Journal of Human Genetics, 2005, 13, 321-329)。したがって、ＣＦＨＲ４Ａはそのドメイン組成がＣＦＨＲ４Ｂにより既に代表されているのでクローニングおよび発現を行なわず、交差反応性アッセイに用いなかった。したがって、実験に際してはＣＦＨＲ４に対する交差反応性を決定するためにＣＦＨＲ４Ｂを用いた。したがって、ＣＦＨＲ４Ｂについて得られた実験結果は、バリアントＣＦＨＲ４Ａにも、したがってＣＦＨＲ４にも、全般的に適用される。
【００２４】
よりさらに好ましい態様において、第１剤は抗体、特に抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３である。特に、ＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３の重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４１の配列をもち、軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４３の配列をもつ。さらなる好ましい態様において、ＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３のＣＤＲ配列を含む抗体を用いる。
【００２５】
よりさらに好ましい態様において、第１剤は抗体、特に抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５である。特に重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６の配列をもつ。さらなる好ましい態様において、軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８の配列をもつ。さらなる好ましい態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３ならびにアミノ酸配列ＩＴＳによるＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５のＣＤＲ配列を含む抗体を用いる。
【００２６】
本明細書中で用いる用語“検出可能な標識”は、直接または間接検出により信号を発生できるいずれかの物質を表わす。したがって、検出可能な標識は、直接または間接的に検出できる。本発明に用いるのに適した直接検出標識は、いずれか既知のマーカーグループから選択できる；たとえば、色原体、蛍光性グループ、化学発光性グループ（たとえば、アクリジニウムエステル類またはジオキセタン類）、電気化学発光性化合物、触媒、酵素、酵素基質、色素、蛍光色素（たとえば、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、オキサジン、レゾルフィン、シアニン、およびその誘導体）、コロイド金属粒子および非金属粒子、ならびに有機ポリマーラテックス粒子。検出可能な標識の他の例は、発光性金属錯体、たとえばルテニウム錯体またはユーロピウム錯体、たとえばＥＣＬＩＡに用いられるもの、酵素、たとえばＥＬＩＳＡに用いられるもの、および放射性同位体、たとえばＲＩＡに用いられるものである。
【００２７】
間接検出系は、たとえば検出試薬、たとえば検出抗体を、バイオアファイン(bioaffine)結合対の第１パートナーで標識することを含む。適切な結合対の例は、ハプテンまたは抗原／抗体、ビオチンまたはビオチンアナログ（たとえばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン）／アビジンまたはストレプトアビジン、糖／レクチン、核酸または核酸アナログ／相補的核酸、および受容体／リガンド、たとえばステロイドホルモン受容体／ステロイドホルモンである。好ましい第１結合対メンバーには、ハプテン、抗原およびホルモンが含まれる。特に好ましいのはハプテン、たとえばジゴキシンおよびビオチンならびにそのアナログである。そのような結合対の第２パートナー、たとえば抗体、ストレプトアビジンなどは、直接検出できるように、通常はたとえば前記の検出可能な標識により標識される。
【００２８】
好ましい態様において、本発明のキットはさらに、測定を実施するための補助試薬を含む。
好ましい１態様において、本発明のキットはさらに、抗原を固定できるチップを含む。
【００２９】
本発明のキットの第１剤および第２剤は、異なるオーバーラップしないエピトープに結合する。そのようなエピトープは線状または高次構造であってよい。第１剤および第２剤は、それぞれ他方の剤の結合を妨害せずにＣＦＨＲ１上のそれらの各エピトープに結合できる。
【００３０】
本発明は、被検体の試料中のＣＦＨＲ１の特異的検出を初めて可能にする。本発明はまた、ＣＦＨＲ１関連の疾患および障害、たとえば統合失調症の診断を初めて可能にする。
１態様において、本発明は、試料中の補体因子Ｈ関連タンパク質  １（ＣＦＨＲ１）を特異的に測定するための、下記の工程を含む方法に関する：（ａ）試料を、補体因子Ｈ  Ｒ１（ＣＦＨＲ１）タンパク質を結合することができる第１剤および補体因子Ｈ  Ｒ１（ＣＦＨＲ１）タンパク質を結合することができる第２剤と接触させ、これにより第１剤、ＣＦＨＲ１および第２剤の間に複合体を形成させ、そして（ｂ）（ａ）で形成された複合体を測定する；その際、第１剤と第２剤は両方ともＣＦＨＲ１に結合し、両方がＣＦＨＲ１以外の同一ＣＦＨファミリーメンバーと交差反応することはない。
【００３１】
さらなる態様において、本発明は、被検体から得た試料中の補体因子Ｈ  Ｒ１（ＣＦＨＲ１）タンパク質を検出するためのインビトロアッセイ法であって、
ａ）試料を本発明のいずれかのキットの剤（複数）と接触させること、
ｂ）形成された複合体を固相に固定すること、および、
ｃ）ＣＦＨＲ１を検出すること、を含み、
その際、工程ｂ）は工程ａ）の前、工程ａ）の後、または工程ａ）と同時に実施できる、前記インビトロアッセイ法に関する。
【００３２】
好ましい態様において、ＣＦＨＲ１に結合できる一方の剤を固体支持体に固定した後にこのプレコートした固相を試料と接触させることができ、それを固相と共に本発明のいずれかのキットの他の剤（単数または複数）と同時または逐次にインキュベートすることができる。
【００３３】
さらなる態様において、ＣＦＨＲ１に結合できる一方の剤を固体支持体に固定し、その間に試料を本発明のいずれかのキットの他の剤（単数または複数）と接触させることができる。この態様において、固相への形成された複合体の固定は工程ａ）と同時に行なわれるであろう。
【００３４】
好ましい態様において、ＣＦＨ、ＣＦＨＲ２、ＣＦＨＲ３、ＣＦＨＲ４および／またはＣＦＨＲ５に対する交差反応性が低い方の剤を、工程ａ）に従って試料と接触させた後、他方の剤を試料と接触させる。
【００３５】
好ましい態様において、ＣＦＨＲ１の量および／または濃度を工程ｃ）で決定する。
本発明の方法を実施すると、前記のようにＣＦＨＲ１と第１剤および第２剤は複合体を形成し、その際、第１剤および第２剤はそれぞれＣＦＨＲ１に結合している。複合体形成は、ＣＦＨＲ１への第１剤および第２剤の共有結合または非共有結合のいずれによるものであってもよく、好ましくは非共有結合によるものである。したがって、本発明により“形成された複合体”は、ＣＦＨＲ１、前記に定義した第１剤および第２剤を含む複合体であり、その際、これら３分子間の結合は共有結合または非共有結合のいずれによるものであってもよいと解釈される。
【００３６】
固相に固定できる剤を工程ａ）の前に固相に固定することができる。試料を本発明による剤（複数）と接触させると、同時に固定および形成された複合体が生成するであろう。
あるいは、実施例７に記載するように、形成された複合体を複合体形成後に固定する。実施例７では、形成された複合体を磁性粒子への非共有結合により固定し、次いで電極を用いてそれらを表面に固定する。この態様において、工程ｂ）は工程ａ）の後に実施される。
【００３７】
一般に、固定は直接または間接的に、共有結合または非共有結合手段で実施できる。
好ましい態様において、固定は磁性粒子上に行なわれる。本発明の剤をそのような磁性粒子に共有結合または非共有結合により結合させることができる。実施例７では、結合はビオチン−ストレプトアビジン結合により行なわれる。磁性粒子をストレプトアビジンでコートし、これに対し抗体をビオチニル化する。
【００３８】
好ましい態様において、バイオアファイン結合対を固定に用いる。適切な結合対の例は、ハプテンまたは抗原／抗体、ビオチンまたはビオチンアナログ（たとえばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン）／アビジンまたはストレプトアビジン、糖／レクチン、核酸または核酸アナログ／相補的核酸、および受容体／リガンド、たとえばステロイドホルモン受容体／ステロイドホルモンである。好ましい第１結合対メンバーには、ハプテン、抗原およびホルモンが含まれる。特に好ましいのはハプテン、たとえばジゴキシンおよびビオチンならびにそのアナログである。そのような結合対の第２パートナー、たとえば抗体、ストレプトアビジンなどを、通常は固相に結合させ、あるいはそのような固相に、たとえば磁性ビーズに、共有結合させる。
【００３９】
ある態様において、固相は試験片、チップ、特にマイクロアレイもしくはナノアレイチップ、マイクロタイタープレート、または微粒子である。
試料中のＣＦＨＲ１の濃度のインビトロ決定により、神経発達障害、神経障害または神経精神障害を伴なう患者について、グリシン再取込み阻害薬（ＧＲＩ）による処置からの臨床有益性を予測できることが見出された。
【００４０】
グリシン再取込み阻害薬（ＧＲＩ）は、グリシンの細胞外濃度を高めることによりＮＭＤＡ受容体（ＮＭＤＡ−Ｒ）仲介伝達を増強すると考えられる新規クラスの化合物である。健康な個体、精神病患者および動物における研究から、ならびに遺伝子解析から、神経発達障害、神経障害または神経精神障害の病態にＮＭＤＡ受容体（ＮＭＤＡ−Ｒ）機能低下が関与する証拠が過去１５年間にわたって蓄積された。グリシンはＮＭＤＡ−Ｒ複合体に不可避の補助アゴニストであるので、ＮＭＤＡ−Ｒ仲介神経伝達を増強する１方策は、ＮＭＤＡ受容体類の局所微細環境におけるグリシンの細胞外濃度を高めることである。グリシン増加は、シナプス間隙からのグリシン排除に関与するＧＲＩの阻害により達成できる。既存の神経療法および神経精神療法に優る利点の可能性には、良好な有効性をもつという点でのグリシン再取込み阻害薬の効力、ならびに統合失調症の陰性陽性症状（陽性陰性症状）、双極性障害、物質依存症（アルコール、コカイン）、自閉症、または強迫性障害(obsessive compulsive disorder)（ＯＣＤ）の処置に対する耐容性プロファイル(tolerability profile)の改善が含まれる。グリシン再取込み阻害薬は神経発達障害、神経障害または神経精神障害、たとえば統合失調症の処置に使用できることが知られている。
【００４１】
統合失調症は、一般に青年期後期または成人期早期に発現する、成人集団の約１％の世界的罹病率をもつ重篤な精神障害であり、著しい社会的および経済的影響をもつ。統合失調症についてのAssociation of European Psychiatrists（ＩＣＤ）およびAmerican Psychiatric Association（ＤＳＭ）の基準は、２以上の特徴的症状の存在：妄想、幻覚、解体した会話(disorganized speech)、著しく解体したもしくは緊張した行動(grossly disorganized or catatonic behavior)、または陰性症状（アロギー(alogia)、情動平坦化(affective flattening)、動機付け欠如(lack of motivation)、性快感消失(anhedonia)）、ならびに他の要件の存在、たとえば感情障害の除外、および機能障害の存在を要求する。グループとして、統合失調症を伴なう人々は機能障害をもち、それは小児期に開始して成人生涯を通して継続し、大部分の患者が正常な雇用を維持しまたは正常な社会的機能をもつのを不可能にする場合がある。彼らはまた一般集団と比較して短い寿命をもち、抗精神病治療以前は重篤な物質乱用、強迫性症状および異常な不随意運動を含めた多種多様な他の神経精神症状の罹病率が高い。統合失調症は広範な認知障害をも随伴し、その重篤性は精神症状が良好に制御された場合ですら彼らの機能を制限する。
【００４２】
グルタミン酸作動性伝達(glutamatergic transmission)に関連する他の適応症は、双極性障害、物質依存症（アルコール、コカイン）、自閉症、または強迫性障害（ＯＣＤ）である。
【００４３】
したがって本発明はまた、神経発達障害、神経障害または神経精神障害を伴なう患者について、グリシン再取込み阻害薬（ＧＲＩ）で処置した場合の応答を予測するインビトロ法であって、下記を含む前記インビトロ法に関する；
ｉ）本発明のアッセイを実施することにより、患者の試料中のＣＦＨＲ１のタンパク質濃度を決定する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で決定したタンパク質濃度を、神経発達障害、神経障害または神経精神障害を伴なう患者におけるＣＦＨＲ１のカットオフ値と比較する工程、
ｉｉｉ）その際、カットオフ値を超える、神経発達障害、神経障害または神経精神障害を伴なう患者の試料中のＣＦＨＲ１のタンパク質濃度は、ＧＲＩ処置から臨床有益性が得られるであろう患者の指標であり、および
ｉｖ）神経発達障害、神経障害または神経精神障害を伴なう患者についてＧＲＩ処置を選択する工程。
【００４４】
さらなる好ましい態様において、神経発達障害、神経障害または神経精神障害には、統合失調症の陰性または陽性症状、双極性障害、物質依存症、自閉症および強迫性障害、特に統合失調症の陰性または陽性症状が含まれる。
【００４５】
さらなる好ましい態様において、患者は統合失調感情障害(schizoaffective disorder)に罹患している。
したがって、１態様において本発明は、被検体から得た試料中のＣＦＨＲ１の量および／または濃度を決定するための、本発明のキットの使用に関する。
【００４６】
さらに、体液中のＣＦＨＲ１濃度を決定することによりＧＲＩ処置に対するレスポンダーおよびノンレスポンダーを信頼性をもって同定できることが見出された。
したがって、さらなる態様において、本発明は、グリシン再取込み阻害薬で処置する患者について臨床有益性を予測するための、本発明のキットの使用に関する。
【００４７】
したがって、さらなる態様において、本発明は、神経発達障害、神経障害または神経精神障害を伴なう患者についてグリシン再取込み阻害薬（ＧＲＩ）で処置した場合の臨床有益性を予測するための、本発明のキットの使用に関する。
【００４８】
たとえば、ＣＦＨＲ１ベースライン血清値についてのカットオフ値を１０μｇ／ｍｌとして計算し、１０μｇ／ｍｌ以下のＣＦＨＲ１値をもつ患者を“低ＣＦＨＲ１(CFHR1-low)”と層別化し、一方、１０μｇ／ｍｌを超える補体因子Ｈ血清値をもつ患者を“高ＣＦＨＲ１(CFHR1-high)”と層別化することができる。プラセボ処置した患者は両サブグループにおいて大きな差を示さないが、１０ｍｇおよび３０ｍｇのＧＲＩで処置した患者は高ＣＦＨＲ１グループにおいてより強い応答を示す。
【００４９】
さらなる態様において、本発明は、ＣＦＨＲ１関連疾患または障害を診断するための方法であって、
ａ）被検体から得た試料を本発明のいずれかのキットの剤（複数）と接触させる工程、
ｂ）一方の剤を固相に固定する工程、および、
ｃ）ＣＦＨＲ１の量を決定する工程、を含み、
その際、工程ｂ）は工程ａ）の前、工程ａ）の後、または工程ａ）と同時に実施でき、
対照と比較して変化したＣＦＨＲ１量はＣＦＨＲ１関連疾患または障害の指標となる、前記方法に関する。
【００５０】
好ましい態様において、ＣＦＨに対してより少ない交差反応性をもつ剤を工程ａ）に従って試料と接触させた後、他方の剤を試料と接触させる。
本発明の方法およびキットは、特に被検体からの体液試料中のＣＦＨＲ１を検出し、ＣＦＨＲ１の量および／または濃度を決定するのに適する。被検体からの好ましい体液は、血液、血清、髄液および血漿である。したがって、本発明の好ましい態様において、本発明の方法では試料は血液、血清、血漿または他の体液である。１態様において、試料は血清または血漿から選択される。
【００５１】
本発明は、被検体からの試料中のＣＦＨＲ１を特異的に検出することにより、被検体における統合失調症の存在もしくは非存在および／または統合失調症の重症度の診断を初めて可能にする。
【００５２】
本発明はまた、被検体の試料中のＣＦＨＲ１タンパク質の量および／または濃度を信頼性をもって決定することを初めて可能にし、特にその際、カットオフ値を超えるかまたは未満の濃度は疾患の存在および／または重症度の指標となる。
【００５３】
本発明のさらなる好ましい態様において、ＣＦＨＲ１関連の疾患または障害は、統合失調症、稀少腎障害である溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）または非定型ＨＵＳ（ａＨＵＳ）、および膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）：デンスデポジット病（ＤＤＤ）またはＩＩ型膜性増殖性糸球体腎炎とも呼ばれる；ならびに網膜疾患である加齢黄班変性（ＡＭＤ）から選択され、より好ましくはＣＦＨＲ１関連の疾患または障害は統合失調症である。
【００５４】
血漿中にＣＦＨＲ１が存在しないことは、下記の障害の進行に対して反対の効果をもつ：その欠失はａＨＵＳにおいてリスク因子を表わすと思われ、これに対しＡＭＤにおいてはそれは保護効果をもつと記載されている(P. Zipfel and Skerka, Nature Reviews Immunology, 2009 9 (10): 729-740)。補体因子Ｈ関連１（ＣＦＨＲ１）の欠失はａＨＵＳのリスクを高める(Zipfel P. et al., 2007, PLoS Genet 3(3): e41)。ＣＦＨＲ１の欠失は加齢黄班変性のリスク低下と関連する(A. Hughes, Nature genetics, 2006, 38, 1173 - 1177)。
【００５５】
したがって１態様において、ａＨＵＳの場合、カットオフ値未満の濃度はこの疾患の存在および／または重症度の指標となる。
したがって他の態様において、ＡＭＤの場合、カットオフ値を超える濃度はこの疾患の存在および／または重症度の指標となる。
【００５６】
適切なカットオフ値は、当業者に知られているように、また以下にさらに詳細に記載するように決定できる。
また、本発明のさらなる好ましい態様において、基準量および／または濃度および／またはカットオフ値を超えるかまたは未満のＣＦＨＲ１タンパク質の量および／または濃度は、ある疾患の存在および／または重症度の指標となる。
【００５７】
したがって、１態様において、被検体から得た試料中のＣＦＨＲ１の量の決定のために、および／またはＣＦＨＲ１関連の疾患または障害のインビトロ診断のために、本発明のキットを使用できる。
【００５８】
アッセイの読出しは、使用する検出可能な標識に依存する。実施例では、ルテニウム化した抗体を用いた。そのような抗体を電気化学発光の測定により決定した。あるいは、他のいずれかの適切な標識に結合した、たとえば酵素に結合した抗体を使用できる。次いでそのような酵素を検出可能な物質の生成に用いる。
【００５９】
本発明による方法のある態様において、ＣＦＨＲ１をイムノアッセイ法で測定する。
イムノアッセイは当業者に周知である。そのようなアッセイを実施するための方法ならびに実際の適用および手順は関連テキストに総説されている。関連テキストの例は、下記のものである：Tijssen, P., Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates, In: Practice and theory of enzyme innunoassays, pp. 221-278、Burdon, R.H. and v. Knippenberg, P.H. (eds.), Elsevier, Amsterdam (1990)、およびMethods in Enzymology, Colowick, S.P., and Caplan, N.O. (eds.), Academic Press)の免疫検出法に関する種々の巻、特にvolume 70, 73, 74, 84, 92および121。
【００６０】
好ましい態様において、ＣＦＨＲ１はサンドイッチアッセイで検出される。
好ましい態様において、ＣＦＨＲ１は酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で検出される。ＣＦＨＲ１は、さらなる好ましい態様において、（電気）化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）で検出される。ＣＦＨＲ１は、さらなる態様において、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で検出される。さらなる好ましいアッセイは、サンドイッチ蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、微粒子捕獲型酵素イムノアッセイ(Microparticle capture enzyme immunoassay)（ＭＥＩＡ）、固相蛍光イムノアッセイ(Solid-phase fluorescence immunoassay)（ＳＰＦＩＡ）、粒子濃縮型蛍光イムノアッセイ(Particle concentration fluorescence immunoassay)（ＰＣＦＩＡ）、ラテックス粒子増強型または非増強型ネフェロメトリーおよびタービディメトリーアッセイ（ＬＰＩＡ）である。また、アッセイは試験片の形態であってもよい。
【００６１】
好ましい態様において、試料中のＣＦＨＲ１を決定するためにサンドイッチイムノアッセイを使用する。実施例に示すように、そのようなサンドイッチイムノアッセイは試料中のＣＦＨＲ１を特異的に検出する。
【００６２】
サンドイッチアッセイにおいて、一方で第１剤を用いてＣＦＨＲ１を捕獲し、他方で直接または間接的に検出できるように標識された第２剤を用いる。サンドイッチ型アッセイフォーマットに用いる剤（複数）は、ＣＦＨＲ１を結合する抗体であってもよい。本発明のキットの剤（複数）はオーバーラップしないエピトープに結合する。
【００６３】
１態様において、本発明のキットは定性（ＣＦＨＲ１の存在または非存在）または定量（ＣＦＨＲ１の量を決定する）または半定量（相対量、特にカットオフ値より上か下かが得られる）イムノアッセイのために用いられる。
【００６４】
好ましい態様において、ＣＦＨＲ１を電気化学または電気化学発光イムノアッセイ（＝ＥＣＬＩＡ）により検出する。電気化学または電気化学発光アッセイにおいては、結合した分析物分子（ターゲット分子）を検出剤に連結した標識により検出する。検出剤に連結した化学標識の発光を電極が電気化学的に開始させる。標識により放射される光が光検出器により測定され、結合した分析物分子／ターゲット分子複合体の存在または量を指示する。ＥＣＬＡ法は、たとえばU.S. Patent No. 5,543,112; 5,935,779;および6,316,607に記載されている。精確かつ高感度の測定のために、種々の分析物分子濃度について信号調節を最大化することができる。
【００６５】
さらに、実施例９および１０において、本発明のアッセイがＣＦＨファミリーの他のメンバーに対して何ら有意の交差反応性を示さないことを示すことができた；すなわち、ＣＦＨファミリーのＣＦＨＲ１以外のいずれかのメンバーに対する交差反応性は０．２％よりはるかに低く、特に０．１％未満であることが見出された。したがって、他のＣＦＨファミリーメンバーの存在下ですら、少量のＣＦＨＲ１も特異的に信頼性をもって検出できる。
【００６６】
好ましい態様において、ＣＦＨＲ１タンパク質の検出範囲は約０．０２から約５０μｇ／ｍｌまで、より好ましくは約０．０５から約３５μｇ／ｍｌまでである。
本発明の実施例において、当技術分野で既知の抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３および本発明のＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５が有効に用いられた。
【００６７】
したがって、好ましい態様において、第１剤および／または第２剤は抗体、特にモノクローナル抗体である。
より好ましい態様において、第１剤はＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３であり、これは検出可能な標識で標識されており、あるいは固相に固定することができる。より好ましい態様において、第１剤はＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３であり、これは固相に固定することができる。よりさらに好ましい態様において、第１剤はＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３であり、この抗体はビオチニル化されている。
【００６８】
さらなる好ましい態様において、第１剤は固相に固定することができる。
他のより好ましい態様において、第２剤はＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５であり、これは検出可能な標識で標識されており、あるいは固相に固定することができる。より好ましい態様において、第２剤はＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５であり、これは検出可能な標識で標識されている。よりさらに好ましい態様において、第２剤はＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５であり、これはルテニウム化されている。
【００６９】
“ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５”はモノクローナル抗体であると解釈され、その際、重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６による配列をもち、軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８による配列をもつ。ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５はＣＦＨＲ１に結合する。
【００７０】
“ＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３”はモノクローナル抗体であると解釈され、その際、重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４１による配列をもち、軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４３による配列をもつ；あるいは“抗補体因子Ｈ，クローン：Ｌ２０／３”（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからカタログ番号ＧＡＵ  ０２０−０３−０２として入手できる）である。
【００７１】
本発明のアッセイのために、少なくとも１つの剤を検出可能な標識で標識し、少なくとも１つの剤を固相に固定できる。好ましい態様において、１つの剤は検出可能な標識で標識されており、１つの剤は固相に固定できる。
【００７２】
したがって、本発明方法の１態様において、第１剤は固相に固定することができ、第２剤は検出可能な標識で標識されている。したがって、本発明方法のさらなる１態様において、第１剤は検出可能な標識で標識されており、第２剤は固相に固定される。
【００７３】
好ましい態様において、第１剤は固相に固定することができ、より好ましくはＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３は固相に固定することができる。１態様において、ＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３はビオチニル化されている。
【００７４】
他の好ましい態様において、第２剤は検出可能な標識で標識されており、より好ましくはＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５は検出可能な標識で標識されている。１態様において、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５はルテニウム化されている。
【００７５】
キャリブレーターを用いてアッセイを標準化することが好ましい。より好ましい態様において、そのようなキャリブレータータンパク質を組換えによって、特にＨＥＫ細胞において産生させる。
【００７６】
実施例４に示すように、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５は、ＣＦＨＲ１に対する高い親和性を示し、ＣＦＨファミリーの他のメンバーに対しては低い交差反応性を示すにすぎない、モノクローナル抗体として同定された。特に、ＣＦＨＲ２に対する交差反応性が検出されたにすぎない（表２を参照）。さらに、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５は意外にも被検体の試料において信頼性のある高感度のＣＦＨＲ１検出を初めて可能にした（実施例９を参照）。ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５の重鎖の配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６である。ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５の軽鎖の配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８である。
【００７７】
したがって、本発明はまた、ＣＦＨＲ１を結合できる剤、特に抗体に関するものであり、その抗体はモノクローナル抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５であり、その際、重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６の配列をもち、軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８の配列をもつ。
【００７８】
さらに、ＣＦＨＲ１に対する結合性を示すさらなる抗体が実施例３および４に従って同定され、それらも実施例９に示すように本発明のキットおよび方法に使用できる。
したがって、さらなる態様において、本発明は下記のものに関する：
（ｉ）モノクローナル抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３であって、重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５の配列をもち、軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７の配列をもつもの、または
（ｉｉ）モノクローナル抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．５３であって、重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２９の配列をもち、軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３１の配列をもつもの、または
（ｉｉｉ）モノクローナル抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．７４であって、重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３３の配列をもち、軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３５の配列をもつもの、または
（ｉｖ）モノクローナル抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．３．２３であって、重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３７の配列をもち、軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３９の配列をもつもの。
【００７９】
さらなる態様において、本発明は、ＣＦＨＲ１を結合することができる剤、特にＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３ならびにアミノ酸配列ＩＴＳによるＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５のＣＤＲ配列を含む抗体に関する。ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５の重鎖のＣＤＲ１配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９による配列をもつ。ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５の重鎖のＣＤＲ２配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０による配列をもつ。ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５の重鎖のＣＤＲ３配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１による配列をもつ。ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５の軽鎖のＣＤＲ１配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２による配列をもつ。ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５の軽鎖のＣＤＲ２配列は、アミノ酸配列ＩＴＳをもつ。ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５の軽鎖のＣＤＲ３配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３による配列をもつ。
【００８０】
さらなる態様において、本発明は、ＣＦＨＲ１を結合することができる剤、特にＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１および２３によるＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５の重鎖および軽鎖のＣＤＲ３配列を含む抗体に関する。
【００８１】
さらにさらなる態様において、本発明は下記の抗体に関する：
ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．５３、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．７４、もしくはＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．３．２３のＣＤＲ配列を含む抗体、
および／または
ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．５３、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．７４、もしくはＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．３．２３のＣＤＲ３配列を含む抗体。
【００８２】
これらの抗体のＣＤＲ３配列を含めたＣＤＲ配列は、本出願の図５〜１２に開示されている。
さらなる態様において、本発明は、本発明に従ってＣＦＨＲ１を結合することができる剤の、特に抗体の、機能活性バリアントに関する。
【００８３】
当業者に知られているように、抗体の結合特性は可変ドメインにより仲介される。抗原への結合のためには、重鎖からの適切な可変ドメイン、および軽鎖からの共作用性(co-acting)可変ドメインが存在し、共作用可能な順序で配置されていることが必須である。可変ドメインはＦＶ領域とも呼ばれ、抗原に結合するために最も重要な領域である。より詳細には、可変ループ、すなわち軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）上のそれぞれ３つが抗原への結合に関与する。これらのループは相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる。これら３つのループは、ＶＬについてＬ１、Ｌ２およびＬ３、ＶＨについてＨ１、Ｈ２およびＨ３と呼ばれる。重鎖からの可変ドメイン、および軽鎖からの共作用性可変ドメイン、ならびに重鎖のＣＤＲおよび軽鎖のＣＤＲの、多種多様なアレンジメントが当技術分野で知られている。
【００８４】
これまでに多種多様な抗体フォーマットが開発または同定されている。そのフォーマットまたはアレンジメントがＣＦＨＲ１への結合を可能にする限り、これらのいずれかまたは他の適切なアレンジメントを本発明の剤のために使用できる。
【００８５】
本発明の剤（複数）および本発明のキットの剤（複数）において、ＣＤＲ配列を１つのポリペプチドまたはペプチド複合体中に配置することができる。それらを１つのポリペプチド中に配置する場合、２配列をリンカー配列、好ましくはペプチドリンカーにより、たとえば融合タンパク質として連結することができる。それらをポリペプチド複合体中に配置する場合、２以上のポリペプチドを、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、および親水性相互作用を含めた非共有結合により互いに結合させる。上記の配列またはその機能活性バリアントは本発明の剤を構成することができ、あるいはその一部であってもよい。
【００８６】
ポリペプチド（タンパク質としても知られている）は、直鎖状に配置されたα−アミノ酸からなる有機化合物である。ポリマー鎖中のアミノ酸は、隣接アミノ酸残基のカルボキシル基とアミノ基とのペプチド結合により互いに連結している。一般に遺伝子コードは２０種類の標準アミノ酸を特定する。合成の後、または合成の途中ですら、タンパク質中の残基は翻訳後修飾により化学修飾される可能性があり、これによりタンパク質の物理的および化学的特性、フォールディング、安定性、活性、および最終的に機能が変化する。
【００８７】
本明細書中で定義する剤（複数）は、ＣＦＨＲ１を選択的に認識して結合し、したがってＣＦＨＲ１結合剤である。
特定の態様において、ＣＦＨＲ１結合剤または抗体はヒトＣＦＨＲ１に１×１０−６以下のＫＤで結合する。特定の態様において、ＣＦＨＲ１結合剤または抗体はヒトＣＦＨＲ１に５×１０−７以下、２×１０−７以下、または１×１０−７以下のＫＤで結合する。さらに他の態様において、ＣＦＨＲ１結合剤はヒトＣＦＨＲ１に１×１０−８以下のＫＤで結合する。他の態様において、ＣＦＨＲ１結合剤はヒトＣＦＨＲ１に５×１０−９以下、または１×１０−９以下のＫＤで結合する。さらなる態様において、ＣＦＨＲ１結合剤はヒトＣＦＨＲ１に１×１０−１０以下のＫＤ、１×１０−１１以下のＫＤ、または１×１０−１２以下のＫＤで結合する。特定の態様において、ＣＦＨＲ１結合剤またはＣＦＨＲ１結合抗体は前記のようにＣＦＨタンパク質ファミリーの他のタンパク質に結合する可能性がある。
【００８８】
本発明のアッセイはＣＦＨＲ１に特異的である。本明細書中で用語“選択的”または“特異的”の使用は、本発明のアッセイがＣＦＨタンパク質ファミリーの他のタンパク質を検出しないか、あるいはＣＦＨタンパク質ファミリーの他のタンパク質を０．２％まで、好ましくは０．１％までの交差反応性で検出するという事実を表わす。
【００８９】
ＫＤは、ｋｄ（特定の結合分子−ターゲットタンパク質相互作用の解離速度；ｋｏｆｆとも呼ばれる）とｋａ（特定の結合分子−ターゲットタンパク質相互作用の会合速度；ｋｏｎとも呼ばれる）の比、すなわちｋｄ／ｋａから得られる解離定数を表わし、これはモル濃度（Ｍ）として表現される。ＫＤ値は当技術分野で十分に確立されている方法を用いて決定できる。結合分子のＫＤを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴、たとえばＢｉａｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）システムなどのバイオセンサーシステムの使用によるものである（実施例４を参照）。
【００９０】
本発明の剤は、本発明の抗体の前記配列の機能活性バリアントをも含むことができる。本発明の機能活性バリアントはＣＦＨＲ１に結合すること、好ましくはＣＦＨＲ１に強く結合することを特徴とする。
【００９１】
バリアントは、ＣＦＨＲ１に対するそのバリアントの結合活性（場合によりＫＤとして表わしたもの）が、配列変更をもたない剤または抗体の活性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、よりさらに好ましくは少なくとも７０％、よりいっそう好ましくは少なくとも８０％、特に少なくとも９０％、格別には少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％であれば、本発明に関して機能活性である。ＣＦＨＲ１に対する結合活性を決定するのに適した方法を、前記のように実施例に示す。機能活性バリアントは限られた数のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入により得ることができる。
【００９２】
本発明の好ましい態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８の機能活性バリアントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８の各配列の相補性決定領域Ｌ３（ＣＤＲ  Ｌ３）、好ましくはＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２およびＣＤＲ  Ｌ３を含む；ならびに／あるいは配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の機能活性バリアントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の各配列の相補性決定領域Ｈ３（ＣＤＲ  Ｈ３）、好ましくはＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２およびＣＤＲ  Ｈ３を含む。最も好ましい態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８の機能活性バリアントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８の各配列のＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２およびＣＤＲ  Ｌ３を含む；ならびに配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の機能活性バリアントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の各配列のＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２およびＣＤＲ  Ｈ３を含む。あるいは、これらの配列のうち一方は何ら配列変更をもたないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６または１８であってもよく、他方は本明細書中に定義するバリアントであってもよい。
【００９３】
可変領域のＣＤＲを同定する種々の方法が記載されている。さらに、一連のソフトウェアプログラムが知られており、それらをこの目的に使用できる。配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６および１８にこれらの配列中のＣＤＲを同定するために適用されている一組の規則が当技術分野で知られており、たとえば下記に記載されている：www.bioinf.org.uk; MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol.262 (5): 732-745; Antibody Engineering Lab Manual, Chapter “Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains”, Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg。指示したＣＤＲを含む配列を図２および３に示す。
【００９４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７および３９の機能活性バリアントに同じことが適用される。
前記に詳述したように、ＶＨおよびＶＬ内に、抗体間で最も大きな配列可変性を示す超可変領域、および可変性がより低いフレームワーク領域がある。フォールディングにより超可変領域が一緒になって抗原結合ポケットを形成する。抗体と抗原の間で最接近するこれらの部位が抗体のＣＤＲであり、それが抗体の特異性を仲介する。したがって、それらは抗原結合に特に重要である。機能活性バリアントは３つすべてのＣＤＲを含むことが好ましいが、ある抗体については特異性を与えるのにＣＤＲ−Ｌ３およびＣＤＲ−Ｈ３で十分であることが認められた。したがって、１態様において、ＣＤＲ−Ｌ３およびＣＤＲ−Ｈ３の存在が必須である。いずれの場合も、ＣＤＲは抗原（本発明においてはＣＦＨＲ１）への結合が可能であるように配置されなければならない。
【００９５】
本発明の好ましい態様において、ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ３および−Ｈ３；またはＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２、−Ｌ３、−Ｈ１、−Ｈ２および−Ｈ３）は、一般的な可変ドメイン内に、すなわちＬ１、Ｌ２およびＬ３はＶＬのフレームワーク内に、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３はＶＨのフレームワーク内に配置される。これは、いずれか適切な方法で同定した、または図２および３に示すＣＤＲを、図示した隣接配列から分離して他の（第２）可変ドメイン内へ移入し、これにより第２可変ドメインのＣＤＲを置換できることを意味する。さらに、図２および３に示していない可変ドメインのフレームワークを使用できる。多様な可変ドメインまたは抗体配列が当技術分野で知られており、この目的のために使用できる。たとえば、目的とするＣＤＲを挿入する可変ドメインは、いずれかの生殖細胞系または再配列したヒト可変ドメインから得ることができる。可変ドメインは合成により作製することもできる。ＣＤＲ領域は組換えＤＮＡ技術を用いてそれぞれの可変ドメインに導入できる。これを達成できる１手段がMarks et al., 1992, Bio/Technology 10:779-783に記載されている。可変重鎖ドメインを可変軽鎖ドメインと対合させて、抗原結合部位を得ることができる。さらに、独立した領域（たとえば、可変重鎖ドメインのみ）を用いて抗原を結合することができる。
【００９６】
最後に、他の態様において、ＣＤＲを可変ドメインではない隣接配列へ移入することができる；ただし、その隣接配列がそれらのＣＤＲをＣＦＨＲ１に結合させることができる限りにおいてである。
【００９７】
本発明の好ましい態様において、剤は抗体である。
天然抗体は、基本構造を共有する免疫グロブリンとしても知られている球状の血漿タンパク質（約１５０ｋＤａ(http://en.wikipedia.org/wiki/Dalton_unit))である。それらはアミノ酸残基に付加した糖鎖をもつので、それらは糖タンパク質である。各抗体の基本的な機能単位は免疫グロブリン（Ｉｇ）モノマー（１つのＩｇ単位のみを含む）である；分泌された抗体は、ＩｇＡの場合のように２つのＩｇ単位を含むダイマー状、真骨魚類(teleost fish)ＩｇＭのように４つのＩｇ単位を含むテトラマー状、または哺乳動物ＩｇＭのように５つのＩｇ単位を含むペンタマー状である可能性もある。本発明において、適切なフォーマットの例には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭとして知られている抗体イソ型を含めた天然抗体のフォーマットが含まれる。
【００９８】
Ｉｇモノマーは４つのポリペプチド鎖からなる“Ｙ”字形分子である；システイン残基間のジスルフィド結合により連結され２つの同一重鎖および２つの同一軽鎖。それぞれの重鎖は約４４０アミノ酸の長さである；それぞれの軽鎖は約２２０アミノ酸の長さである。重鎖および軽鎖はそれぞれ、それらのフォールディングを安定化する鎖間ジスルフィド結合を含む。それぞれの鎖はＩｇドメインと呼ばれる構造ドメインで構成されている。これらのドメインは７０〜１１０個のアミノ酸を含み、それらのサイズおよび機能に従って種々のカテゴリーに分類される（たとえば、可変またはＶ、および定常またはＣ）。それらは、２つのベータシートが“サンドイッチ”形を形成し、保存されたシステインおよび他の荷電アミノ酸の間の相互作用により互いに保持された、特徴的な免疫グロブリンフォールドをもつ。
【００９９】
α、δ、ε、γおよびμにより表示される５タイプの哺乳動物Ｉｇ重鎖がある。存在する重鎖のタイプが抗体のイソ型を規定する；これらの鎖はそれぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体にみられる。
【０１００】
別個の重鎖はサイズおよび組成が異なる；αおよびγは約４５０個のアミノ酸を含み、δは約５００個のアミノ酸を含み、一方、μおよびεは約５５０個のアミノ酸をもつ。それぞれの重鎖は２つの領域、すなわち定常領域（ＣＨ）および可変領域（ＶＨ）をもつ。１つの種において、定常領域は同一イソ型のすべての抗体において同一であるが、異なるイソ型の抗体においては異なる。重鎖γ、αおよびδは３つのタンデムＩｇドメインで構成される定常領域、およびフレキシビリティーを付加するヒンジ領域をもつ；重鎖μおよびεは、４つの免疫グロブリンで構成される定常領域をもつ。重鎖の可変領域は、異なるＢ細胞により産生された抗体においては異なるが、単一のＢ細胞またはＢ細胞クローンにより産生されたすべての抗体について同一である。それぞれの重鎖の可変領域は約１１０アミノ酸の長さであり、単一のＩｇドメインで構成されている。
【０１０１】
哺乳動物にはλおよびκと表示される２タイプの免疫グロブリン軽鎖がある。軽鎖は２つの連続ドメインをもつ：１つの定常ドメイン（ＣＬ）および１つの可変ドメイン（ＶＬ）。軽鎖のおおよその長さは２１１または２１７アミノ酸である。それぞれの抗体が２つの軽鎖を含み、それらは常に同一である；哺乳動物の抗体につき１タイプの軽鎖、κまたはλのみが存在する。他のタイプの軽鎖、たとえばι鎖が、軟骨魚類(Chondrichthyes)および硬骨魚類(Teleostei)のような下等脊椎動物にみられる。
【０１０２】
天然抗体のほかに、抗体フラグメントを含めた人工抗体フォーマットが開発された。それらのうち幾つかを以下に記載する。ただし、前記ポリペプチド（単数または複数）を含むかまたはそれらからなり、かつＣＦＨＲ１に結合できる、他のいずれかの抗体フォーマットも本発明に包含される。
【０１０３】
すべての抗体の全般的構造はきわめて類似するが、その抗体のユニークな特性は前記に詳述したように可変（Ｖ）領域により決定される。より具体的には、それぞれ軽（ＶＬ）鎖上の３つおよび重（ＶＨ）鎖上の３つの可変ループが、抗原への結合、すなわちそれの抗原特異性に関与する。これらのループは相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる。ＶＨドメインとＶＬドメインの両方からのＣＤＲが抗原結合部位に寄与するので、最終的な抗原特異性を決定するのは重鎖と軽鎖の組合わせであって、いずれか一方のみではない。
【０１０４】
したがって、本明細書中で用いる“抗体”は、天然抗体に対する構造類似性をもち、かつＣＦＨＲ１に結合できるいずれかのポリペプチドであって、結合特異性がたとえば図２および３に示すポリペプチドのＣＤＲにより決定されるものを意味する。よって、“抗体”はＣＦＨＲ１に結合する免疫グロブリン由来の構造体に関するものとし、これには下記のものが含まれるが、これらに限定されない：全長もしくは完全抗体、抗原結合性フラグメント（抗体構造体から物理的にまたは概念的に誘導されたフラグメント）、以上のいずれかの誘導体、キメラ分子、以上のいずれかと他のポリペプチドの融合体、または代替構造体／組成物であって、ＣＦＨＲ１に選択的に結合するもの。抗体は少なくとも１つの抗原結合性フラグメントを含むいずれのポリペプチドであってもよい。抗原結合性フラグメントは少なくとも重鎖の可変ドメインおよび軽鎖の可変ドメインからなり、これらは両ドメインが一緒になって特定の抗原を結合できるように配置されている。
【０１０５】
“全長”または“完全”抗体は、ジスルフィド結合により相互連結された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含むタンパク質を表わし、それらは下記を含む：（１）重鎖に関しては、可変領域、ならびに３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む重鎖定常領域；ならびに（２）軽鎖に関しては、軽鎖可変領域、および１つのドメインＣＬを含む軽鎖定常領域。用語“完全抗体”に関しては、天然抗体の典型的な全ドメイン構造をもついずれかの抗体（すなわち、それぞれの可変ドメインのほかに、３または４つの定常ドメインをもつ重鎖および１つの定常ドメインをもつ軽鎖を含むもの）を意味する；ただし、各ドメインは、全ドメイン構造を変化させないさらなる修飾、たとえば変異、欠失または挿入を含むことができる。たとえば、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５は全長抗体である。
【０１０６】
“抗体フラグメント”も、前記のように少なくとも１つの抗原結合性フラグメントを含み、そのフラグメントが由来する完全抗体と本質的に同じ機能および特異性を示す。パパインによる限定的なタンパク質分解性消化により、Ｉｇ原型は３つのフラグメントに開裂する。それぞれ１つの完全Ｌ鎖およびほぼ半分のＨ鎖を含む２つの同一のアミノ末端フラグメントは、抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）である。サイズは類似するけれども両方の重鎖のカルボキシル末端側の半分を鎖間ジスルフィド結合と共に含む第３フラグメントは、結晶性フラグメント（Ｆｃ）である。Ｆｃは、炭水化物、補体結合部位、およびＦｃＲ結合部位を含む。限定的なペプシン消化により、両方のＦａｂ片およびヒンジ領域（Ｈ−Ｈ鎖間ジスルフィド結合を含む）を含む１つのＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。Ｆ（ａｂ’）２は抗原結合について二価である。Ｆａｂ’を得るためにＦ（ａｂ’）２のジスルフィド結合を開裂させることができる。さらに、重鎖および軽鎖の可変領域を互いに融合させて一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を形成することができる。
【０１０７】
第１世代の全長抗体は幾つかの問題を提起したので、多くの第２世代抗体は抗体のフラグメントのみで構成された。可変ドメイン（Ｆｖ）は、１つのＶＬおよび１つのＶＨからなる無傷の抗原結合性ドメインを備えた最小フラグメントである。結合ドメインのみを含むそのようなフラグメントは、酵素法、またはたとえば細菌および真核細胞における関連遺伝子フラグメントの発現により作製できる。種々のアプローチを採用できる；たとえば、Ｆｖフラグメントのみ、またはＦｖと第１定常ドメインを含む“Ｙ”の上側アームの１つからなる‘Ｆａｂ’フラグメント。これらのフラグメントは、通常は２つの鎖間にポリペプチドリンクを導入することによって安定化され、結果的に一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が生成する。あるいは、ジスルフィド連結したＦｖ（ｄｓＦｖ）フラグメントを使用できる。全長抗体を作製するためにフラグメントの結合ドメインをいずれかの定常ドメインと組合わせることができ、あるいは他のタンパク質およびポリペプチドと融合させることができる。
【０１０８】
組換え抗体フラグメントは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントである。一般に、それはそれの抗原に対して高い親和性をもち、多様な宿主において発現させることができる。これらおよび他の特性により、ｓｃＦｖフラグメントは医療に利用できるだけでなく、バイオテクノロジー利用にも有効である。前記に詳述したように、ｓｃＦｖフラグメントにおいてはＶＨドメインとＶＬドメインが親水性のフレキシブルペブチドリンカーで連結され、これにより発現およびフォールディングの効率が改善される。通常は、約１５アミノ酸のリンカーが用いられ、それらのうち（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーが最も頻繁に用いられている。ｓｃＦｖ分子は、用いるリンカーによっては容易にタンパク質分解される可能性がある。遺伝子工学技術の発達に伴なって、機能および安定性の改善に注目した研究により、これらの制限を実際に克服することが可能になった。一例はジスルフィド安定化した（またはジスルフィド連結した）Ｆｖフラグメントの作製であり、これらにおいてはＶＨ−ＶＬダイマーが鎖間ジスルフィド結合によって安定化される。システインをＶＬドメインとＶＨドメインの境界に導入して、ジスルフィド橋を形成し、これが２つのドメインを相互に保持する。
【０１０９】
ｓｃＦｖが解離するとモノマーｓｃＦｖが生成し、これらを複合体化してダイマー（(diabody)）、トリマー（(triabody）)、またはより大型の凝集体、たとえばＴａｎｄＡｂおよびＦｌｅｘｉｂｏｄｉｅｓにすることができる。
【０１１０】
２つの結合ドメインを備えた抗体は、２つのｓｃＦｖを単純なポリペプチドリンクで結合させることにより（ｓｃＦｖ）２、または２つのモノマーの二量体化により（ディアボディ）作製できる。最も単純なデザインは、同一でも類似するものでもよい２つの機能性抗原結合性ドメインをもつディアボディ（二価ディアボディ）、または別個の抗原に対する特異性をもつディアボディ（二重特異性ディアボディ）である。これらの二重特異性抗体はターゲット細胞に対する新たなエフェクター機能（たとえば、細胞傷害性Ｔ細胞）を動員することができ、これによりそれらは医療に利用するのにきわめて有用になる。
【０１１１】
最近、４つの重鎖可変ドメインおよび４つの軽鎖可変ドメインを含む抗体フォーマットが開発された。これらの例には、四価二重特異性抗体（ＴａｎｄＡｂおよびＦｌｅｘｉｂｏｄｉｅｓ、Ａｆｆｉｍｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ＡＧ，ドイツ、ハイデルベルク）が含まれる。二重特異性ディアボディと対照的に、二重特異性ＴａｎｄＡｂは１種類のポリペプチドのみからなるホモダイマーである。ディアボディは、２つの異なる鎖があるため３種類の異なるダイマーを形成する可能性があり、それらのうち１種類だけが機能性である。したがって、この均質な製品の調製および精製はより簡単かつ安価である。さらに、ＴａｎｄＡｂは通常はより良好な結合特性（２倍の結合部位数をもつ）および増大したインビボ安定性を示す。ＦｌｅｘｉｂｏｄｉｅｓはｓｃＦｖとディアボディマルチマーモチーフの組合わせにより、細胞表面にある互いにかなり離れた２分子の連結について高度のフレキシビリティーを備えた多価分子になったものである。２より多い機能性抗原結合性ドメインが存在し、それらが別個の抗原に対する特異性をもつならば、その抗体は多重特異性である。
【０１１２】
まとめると、開示する特定の配列をそれに挿入できるかあるいは代わりにその本質的部分を形成できる具体的な免疫グロブリンには、本発明の特定の態様をなす下記の抗体分子が含まれるが、それらに限定されない：Ｆａｂ（可変軽鎖（ＶＬ）、可変重鎖（ＶＨ）、定常軽鎖（ＣＬ）および定常重鎖１（ＣＨｌ）ドメインを含む一価フラグメント）、Ｆ（ａｂ’）２（ヒンジ領域においてジスルフィド橋その他により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント）、Ｆｖ（ＶＬおよびＶＨドメイン）、ｓｃＦｖ（ＶＬおよびＶＨが、リンカー、たとえばペプチドリンカーにより連結された一本鎖Ｆｖ）、二重特異性抗体分子（本明細書に開示するポリペプチドを含む抗体分子が、その抗体とは異なる結合特異性をもつ第２の機能性部分、たとえば限定ではなく他のペプチドもしくはタンパク質、たとえば抗体、または受容体リガンドに連結したもの）、二重特異性一本鎖Ｆｖダイマー、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ（ｓｃＦｖがＣＨ３に連結したもの）。
【０１１３】
Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ディアボディ分子、またはドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ）を含めた（これらに限定されない）特定の抗体分子は、ＶＨドメインとＶＬドメインを連結するジスルフィド橋を取り込ませることによって安定化できる。二重特異性抗体は常法により作製でき、その具体的方法には化学的製造、またはハイブリッドハイブリドーマからの作製、および他の技術が含まれ、これにはＢｉＴＥ（商標）技術（異なる特異性をもつ抗原結合領域をもち、ペプチドリンカーを含む分子）およびknobs-into-holes工学操作が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１４】
したがって、抗体はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、二価抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、またはミニボディであってもよい。
【０１１５】
他の好ましい態様において、抗体はモノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。モノクローナル抗体は単一特異性抗体であり、それらはすべてが単一親細胞のクローンである１タイプの免疫細胞により産生されるので同一である。キメラ抗体は、１つの種の免疫グロブリンの少なくとも１つの領域を、それの免疫原性を低下させるために遺伝子工学により他の種の免疫グロブリンの他の領域に融合させた抗体である。たとえば、ネズミのＶＬおよびＶＨ領域をヒト免疫グロブリンの残りの部分に融合させることができる。特別なタイプのキメラ抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲをコードするＤＮＡをヒト抗体産生ＤＮＡと融合させることにより作製される。次いで、得られたＤＮＡ構築体を用いて抗体を発現および産生させることができる；それらはＣＤＲだけが非ヒトであるので、通常は非ヒト親抗体またはキメラ抗体ほど免疫原性ではない。
【０１１６】
本発明の好ましい態様において、本発明の剤は下記のものからなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む：ヒトＩｇＭ定常ドメイン、ヒトＩｇＧｌ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、ヒトＩｇＥ定常ドメイン、およびヒトＩｇＡ定常ドメイン。
【０１１７】
本発明の抗体に関して前記に詳述したように、天然抗体の重鎖はそれぞれ２つの領域、すなわち定常領域および可変領域をもつ。５タイプの哺乳動物免疫グロブリン重鎖：γ、δ、α、μおよびεがあり、それらがそれぞれ免疫グロブリンのクラスＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥを規定する。
【０１１８】
この場合、ヒトには４つのＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、２、３および４）があり、血清中におけるそれらの存在量の順に命名されている（ＩｇＧ１が最も多量に存在する）。ＩｇＧサブクラスのそれらのＦｃ領域間には約９５％の類似性があるが、ヒンジ領域の構造は比較的異なる。両方の重鎖のＦａｂアーム（抗原結合性フラグメント）と２つのカルボキシ末端ドメインＣＨ２およびＣＨ３との間にあるこの領域が、その分子のフレキシビリティーを決定する。上側ヒンジ（アミノ末端側）セグメントが、Ｆａｂアーム間の角度（Ｆａｂ−Ｆａｂフレキシビリティー）およびそれぞれ個々のＦａｂの回転フレキシビリティーの変動を可能にする。下側ヒンジ領域（カルボキシ末端側）のフレキシビリティーは、Ｆｃ領域に対するＦａｂアームの位置（Ｆａｂ−Ｆｃフレキシビリティー）を直接決定する。ヒンジ依存性Ｆａｂ−ＦａｂおよびＦａｂ−Ｆｃフレキシビリティーは、さらなるエフェクター機能、たとえば補体活性化およびＦｃ受容体結合を始動させる際に重要となる可能性がある。したがって、ヒンジ領域の構造は４つのＩｇＧクラスそれぞれにそれらのユニークな生物学的プロファイルを与える。
【０１１９】
ヒンジ領域の長さおよびフレキシビリティーは、ＩｇＧサブクラス間で異なる。ＩｇＧ１のヒンジ領域はアミノ酸２１６−２３１を含み、それは易フレキシブルであるので、Ｆａｂフラグメントはそれらの対称軸の周りを回転して、２つのうち最初の重鎖間ジスルフィド橋を中心とする球体内で運動できる。ＩｇＧ２はＩｇＧ１より短いヒンジをもち、１２個のアミノ酸残基および４つのジスルフィド橋を含む。ＩｇＧ２のヒンジ領域はグリシン残基を欠如し、それは比較的短く、余分な重鎖間ジスルフィド橋によって安定化された剛直なポリプロリン二重らせんを含む。これらの特性はＩｇＧ２分子のフレキシビリティーを制限する。ＩｇＧ３は、それのユニークな長いヒンジ領域（ＩｇＧ１ヒンジの約４倍の長さ）によって他のサブクラスと異なり、６２個のアミノ酸（２１個のプロリンおよび１１個のシステインを含む）を含み、非フレキシブルなポリプロリン二重らせんを形成している。ＩｇＧ３において、ＦａｂフラグメントはＦｃフラグメントから比較的離れており、その分子に、より大きなフレキシビリティーを与えている。ＩｇＧ３における長いヒンジは、他のサブクラスと比較してより大きなそれの分子量にも関与する。ＩｇＧ４のヒンジ領域はＩｇＧ１のものより短く、それのフレキシビリティーはＩｇＧ１とＩｇＧ２のものの中間である。
【０１２０】
本発明の好ましい態様において、本発明は下記の機能活性バリアントに関する：モノクローナル抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５であって、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６の配列をもち、軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８の配列をもつもの、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３ならびにアミノ酸配列ＩＴＳによるＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５のＣＤＲ配列を含む抗体、ならびに／あるいはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３によるＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５のＣＤＲ３配列を含む抗体。
【０１２１】
本発明はさらに、他の好ましい態様において、下記の機能活性バリアントに関する：モノクローナル抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３であって、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５の配列をもち、軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７の配列をもつもの、あるいはモノクローナル抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．５３であって、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２９の配列をもち、軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３１の配列をもつもの、あるいはモノクローナル抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．７４であって、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３３の配列をもち、軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３５の配列をもつもの、あるいはモノクローナル抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．３．２３であって、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３７の配列をもち、軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３９の配列をもつもの、あるいはＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．５３、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．７４もしくはＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．３．２３のＣＤＲ配列を含を含む抗体、および／またはＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．５３、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．７４もしくはＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．３．２３のＣＤＲ３配列を含む抗体。
【０１２２】
たとえば、バリアントは下記により定義される：そのバリアントは
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、１８、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７および／または３９のいずれかのアミノ酸配列の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、よりさらに好ましくは少なくとも９０％、よりいっそう好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは９９％からなる機能活性フラグメントである；
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、１８、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７および／または３９のいずれかのアミノ酸配列の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、よりさらに好ましくは少なくとも９０％、よりいっそう好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは９９％を含む機能活性バリアントである；あるいは
ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、１８、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７および／または３９のいずれかのアミノ酸配列、ならびに１〜５０個の付加アミノ酸残基、好ましくは１〜４０、より好ましくは１〜３０、よりいっそう好ましくは最大で１〜２５個、よりさらに好ましくは最大で１〜１０個、最も好ましくは１、２、３、４または５個の付加アミノ酸残基からなる。
【０１２３】
ａ）に定義するフラグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、１８、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７および３９のいずれかの配列から、１以上の欠失により誘導されることを特徴とする。欠失（単数または複数）はＣ末端、Ｎ末端および／または内部におけるものであってよい。好ましくはそのフラグメントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０、より好ましくは１、２、３、４または５、よりいっそう好ましくは１、２または３、よりさらに好ましくは１または２、最も好ましくは１つの欠失により得られる。本発明の機能活性フラグメントは、ＣＦＨＲ１に結合する能力を特徴とする。ある抗原のフラグメントは、そのフラグメントの結合が、配列変更を含まない抗原の活性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、よりいっそう好ましくは少なくとも７０％、よりさらに好ましくは少なくとも８０％、殊に少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％であれば、本発明に関して機能活性である。
【０１２４】
ｂ）に定義するバリアントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、１８、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７および３９のいずれかの配列から１以上のアミノ酸修飾（欠失、付加および／または置換を含む）により誘導されることを特徴とする。修飾（単数または複数）はＣ末端、Ｎ末端および／または内部におけるものであってよい。好ましくはそのバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０、より好ましくは１、２、３、４または５、よりいっそう好ましくは１、２または３、よりさらに好ましくは１または２、最も好ましくは１つの修飾により得られる。本発明の機能活性バリアントは、ＣＦＨＲ１に結合する能力を特徴とする。ある抗原のバリアントは、そのバリアントの結合が、配列変更を含まない抗原の活性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、よりいっそう好ましくは少なくとも７０％、よりさらに好ましくは少なくとも８０％、殊に少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％であれば、本発明に関して機能活性である。
【０１２５】
ｃ）に定義するバリアントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、１８、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７または３９のいずれかのアミノ酸配列、ならびに１〜５０個の付加アミノ酸残基からなることを特徴とする。付加（単数または複数）はＣ末端、Ｎ末端および／または内部におけるものであってよい。好ましくはそのバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０、より好ましくは１、２、３、４または５、よりいっそう好ましくは１、２または３、よりさらに好ましくは１または２、最も好ましくは１つの付加により得られる。この機能活性バリアントはさらに前記のように定義される（ｂ）のバリアントを参照）。
【０１２６】
（ｂ）および／または（ｃ）の付加アミノ酸残基（単数または複数）はいかなるアミノ酸であってもよく、Ｌ−および／またはＤ−アミノ酸、天然その他のいずれであってもよい。好ましくは、アミノ酸はいずれかの天然アミノ酸、たとえばアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンである。
【０１２７】
しかし、アミノ酸は修飾アミノ酸または稀少アミノ酸であってもよい。それらの例は下記のものである：２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、ベータ−アラニン、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４−ジアミノ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、６−Ｎ−メチルリジン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシンまたはオルニチン。さらに、アミノ酸は翻訳後修飾などの修飾を受ける可能性がある。修飾の例には、アセチル化、アミド化、ブロッキング、ホルミル化、γ−カルボキシグルタミン酸ヒドロキシル化、グリコシル化、メチル化、リン酸化および硫酸化が含まれる。２以上の付加または異種アミノ酸残基がペプチド中に存在する場合、それらのアミノ酸残基は互いに同一でも異なってもよい。
【０１２８】
配列同一性パーセントは、たとえば配列アラインメントにより決定できる。比較のための配列アラインメント方法は当技術分野で周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、たとえばSmith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981またはPearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. US. A. 85: 2444, 1988に記載されている。
【０１２９】
NCBI Basic Local Alignment Search Tool（ＢＬＡＳＴ）(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990)を、National Center for Biotechnology Information（国立生物工学情報センター）（ＮＣＢＩ，メリーランド州ベテスダ）およびインターネットを含む幾つかの提供源から、配列アラインメント分析ブログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと接続して使用するために入手できる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６および１８の配列のいずれかのバリアントは、一般にＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔ  ２．０、デフォルトパラメーターに設定されたギャップ付きｂｌａｓｔｐを用いて解明できる。少なくとも３０個のアミノ酸のアミノ酸配列の比較のためには、Ｂｌａｓｔ  ２配列関数を採用し、デフォルトパラメーター（ギャップ存在コスト(gap existence cost)１１、および残基当たりギャップコスト(per residue gap cost)１）に設定されたデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを用いる。短いペプチド（約３０アミノ酸未満）をアラインさせる場合、アラインメントは、Ｂｌａｓｔ  ２配列関数を用い、デフォルトパラメーター（オープンギャップ９、エクステンションギャップ１のペナルティー）に設定されたＰＡＭ３０マトリックスを採用して実施される。１５アミノ酸以下のような短いウインドウにわたる配列同一性を決定するための方法は、National Center for Biotechnology Information（メリーランド州ベセスダ）が管理しているウェブサイトに記述されている。
【０１３０】
より好ましい態様において、前記に定義した機能活性バリアントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６および１８のいずれかのアミノ酸配列から、１以上の保存的アミノ酸置換により誘導できる。
【０１３１】
保存的アミノ酸置換は、当業者に認識されるように、あるアミノ酸残基を類似またはより良好な（意図する目的について）機能特性および／または化学的特性を付与するもので置き換える置換である。たとえば、保存的アミノ酸置換はしばしば、類似の側鎖をもつアミノ酸残基でアミノ酸残基を置き換えるものである。類似の側鎖をもつアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で規定されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖をもつアミノ酸残基（たとえば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖をもつアミノ酸残基（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖をもつアミノ酸残基（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖をもつアミノ酸残基（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン，フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ−分枝側鎖をもつアミノ酸残基（たとえば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖をもつアミノ酸残基（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。そのような修飾は、それらが本発明の剤の結合特性または機能的阻害特性を改善することはあっても、そのような特性を有意に低減または変化させるようには設計されない。置換を行なう目的は重要ではなく、ある残基を、その分子の構造、その分子の電荷もしくは疎水性、またはその分子のサイズをより良好に維持または増強できるもので置き換えることを含むことができるが、決してこれらに限定されない。たとえば、より望ましくない残基を単純に同じ極性または電荷のもので置換することを希望する場合がある。そのような修飾は当技術分野で既知の標準法、たとえば部位特異的変異形成およびＰＣＲ仲介変異形成により導入できる。当業者が保存的アミノ酸置換を達成する具体的手段のひとつは、アラニンスキャンニング変異形成である。次いで、当技術分野で入手できるかまたは実施例に記載する機能アッセイを用いて、それらの変異したポリペプチドを保持された機能またはより良好な機能について検査する。本発明のより好ましい態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、１８、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７または３９のいずれかの配列における保存的置換の数は最大で２０、１９、１８、２７、２６、１５、１４、１３、１２または１１、好ましくは最大で１０、９、８、７または６、殊に最大で５、４、３、特に２または１である。
【０１３２】
さらなる態様において、本発明は、本発明の剤、特に抗体をコードする、１以上の核酸に関する。
本発明の核酸分子は、ＲＮＡ、たとえばｍＲＮＡもしくはｃＲＮＡの形態、またはＤＮＡ（たとえば、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）の形態であってよく、それらはたとえばクローニングにより得られ、または化学合成法により製造され、またはその組合わせにより得られる。ＤＮＡは三本鎖、二本鎖または一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡはコード鎖（センス鎖としても知られている）であってもよく、あるいはそれは非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られている）であってもよい。本発明に用いる核酸は、特に一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖と二本鎖の混合物であるＤＮＡ、ＲＮＡ、ならびに一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子（一本鎖、もしくはより一般的には二本鎖、もしくは三本鎖、または一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であってもよい）をも表わす。さらに、本発明に用いる核酸は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む、三本鎖領域を表わす。
【０１３３】
核酸には、遺伝子コードの縮重の結果である配列も含まれる。２０種類のアミノ酸があり、それらの大部分は２以上のコドンにより特定される。したがって、前記に定義するペプチド（単数または複数）を生成するすべてのヌクレオチド配列が本発明に含まれる。
【０１３４】
さらに、核酸は１以上の修飾塩基を含むことができる。そのような核酸は、生理的環境におけるその分子の安定性および半減期を増大させるためにリボース−ホスフェート主鎖中にも修飾を含むことができる。したがって、安定性その他の理由で修飾された主鎖をもつＤＮＡまたはＲＮＡは、その特徴が本発明において意図するものであるので、“核酸分子”である。さらに、稀少塩基、たとえばイノシン、または修飾塩基、たとえばトリチル化塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ（２例を挙げたにすぎない）は、本発明の概念に含まれる核酸分子である。ＤＮＡおよびＲＮＡに対して当業者に知られている多くの有用な目的に役立つ多種多様な修飾がなされていることは認識されるであろう。本明細書中で用いる核酸分子という用語は、そのような化学的に、酵素により、または代謝により修飾された形態の核酸分子、ならびにウイルスおよび細胞（特に単細胞および複雑細胞を含む）に特徴的な化学的形態のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。たとえば、その核酸によりコードされるポリペプチドに影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行なうことができ、したがって前記に定義した抗原またはそのフラグメントもしくは機能活性バリアントをコードする核酸分子はいずれも本発明に包含される。
【０１３５】
さらに、本発明の１以上の剤（そのフラグメントもしくは機能活性バリアントを含む）をコードするいずれかの核酸分子を、標準法、たとえば標準クローニング法により、いずれか希望する調節配列、リーダー配列、異種マーカー配列(heterologous marker sequence)、または異種コード配列(heterologous coding sequence)に機能的に連結させて、融合タンパク質を作製することができる。
【０１３６】
本発明の核酸は、一般にインビトロまたは培養細胞において、エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼおよび／またはポリメラーゼおよび／またはリガーゼおよび／またはリコンビナーゼ、あるいは当業者に知られている核酸製造のための他の方法により核酸を操作して、独自に形成できる。
【０１３７】
好ましい態様において、核酸（単数または複数）はベクター内に配置される。ベクターは、さらに、宿主細胞においてそれを複製できるようにする核酸配列、たとえば複製起点、１以上の療法遺伝子、および／または選択マーカー遺伝子、ならびに当技術分野で知られている他の遺伝子エレメント、たとえばコードされたタンパク質の転写、翻訳および／または分泌を指令する調節エレメントを含むことができる。ベクターを細胞の形質導入、形質転換または感染に使用し、これによりその細胞にとって自然ではない核酸および／またはタンパク質を細胞に発現させることができる。ベクターは場合により、細胞への核酸の進入の達成を補助するための材料、たとえばウイルス粒子、リポソーム、タンパク質コーティングなどを含む。標準的な分子生物学的手法によるタンパク質発現のための多数のタイプの適切な発現ベクターが当技術分野で知られている。そのようなベクターは、昆虫を含めた一般的なベクタータイプ、たとえばバキュロウイルス発現系、または酵母、真菌、細菌もしくはウイルス発現系のうちから選択される。他の多数のタイプの適切な発現ベクターが当技術分野で知られており、それらもこの目的に使用できる。そのような発現ベクターを得るための方法は周知である（たとえば、Sambrook et al, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)を参照）。１態様において、ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターにはレトロウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３８】
この方法によるトランスフェクションに適した宿主細胞または細胞系には、細菌細胞が含まれる。たとえば、大腸菌(E. coli)の種々の株がバイオテクノロジー分野における宿主細胞として周知である。枯草菌(B. subtilis)、シュードモナス属(Pseudomonas)、ストレプトミセス属(Streptomyces)、および他の杆菌などの種々の株もこの方法に使用できる。当業者に知られている多数の酵母細胞株も、本発明のペプチドの発現のための宿主として利用できる。他の真菌細胞または昆虫細胞、たとえばヨトウガ(Spodoptera frugiperda)（Ｓｆ９）細胞も発現系として使用できる。あるいは、哺乳動物細胞、たとえばヒト２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、サルＣＯＳ−１細胞系、またはＳｗｉｓ、ＢＡＬＢ／ｃもしくはＮＩＨマウスに由来するネズミ３Ｔ３細胞を使用できる。さらに他の適切な宿主細胞、ならびにトランスフェクション、培養、増幅、スクリーニング、産生および精製のための方法が当技術分野で知られている。
【０１３９】
ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５および１７である。よって、好ましい態様において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５による核酸に関する。さらなる好ましい態様において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７による核酸に関する。好ましい態様において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５による核酸に関するものであり、その核酸はベクター内にある。さらなる好ましい態様において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５による核酸に関するものであり、それらの核酸はベクター内にある。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５による核酸は同一または異なるベクター内にあってよい。
【０１４０】
ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４および２６である。よって、好ましい態様において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４による核酸に関する。さらなる好ましい態様において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６による核酸に関する。好ましい態様において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６による核酸に関するものであり、その核酸はベクター内にある。さらなる好ましい態様において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６による核酸に関するものであり、それらの核酸はベクター内にある。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６による核酸は同一または異なるベクター内にあってよい。
【０１４１】
ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．５３の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８および３０である。よって、好ましい態様において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８による核酸に関する。さらなる好ましい態様において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３０による核酸に関する。好ましい態様において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３０による核酸に関するものであり、その核酸はベクター内にある。さらなる好ましい態様において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３０による核酸に関するものであり、それら核酸はベクター内にある。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３０による核酸は同一または異なるベクター内にあってよい。
【０１４２】
ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．７４の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３２および３４である。よって、好ましい態様において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３２による核酸に関する。さらなる好ましい態様において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３４による核酸に関する。好ましい態様において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３２またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３４による核酸に関するものであり、その核酸はベクター内にある。さらなる好ましい態様において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３４による核酸に関するものであり、それら核酸はベクター内にある。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３４による核酸は同一または異なるベクター内にあってよい。
【０１４３】
ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．３．２３の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６および３８である。よって、好ましい態様において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６による核酸に関する。さらなる好ましい態様において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８による核酸に関する。好ましい態様において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８による核酸に関するものであり、その核酸はベクター内にある。さらなる好ましい態様において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８による核酸に関するものであり、それらの核酸はベクター内にある。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８による核酸は同一または異なるベクター内にあってよい。
【０１４４】
本発明の剤、特に抗体は、本発明の核酸を適切な宿主細胞において発現させることにより調製できる。宿主細胞を、たとえばエレクトロポレーションなどの一般的手段により、転写調節配列の制御下に本発明の核酸を含む少なくとも１つの発現ベクターでトランスフェクションすることができる。トランスフェクションまたは形質転換した宿主細胞を、次いでそのタンパク質の発現が可能な条件下で培養する。発現したタンパク質を、当業者に知られている適宜な手段で細胞から（または、細胞外に発現するならば培地から）回収し、単離し、場合により精製する。たとえば、細胞溶解後にタンパク質を可溶性形態で単離し、あるいは既知の手法を用いて、たとえば塩化グアニジニウム(guanidine chloride)中に抽出する。所望により、本発明の剤（単数または複数）を融合タンパク質として調製する。そのような融合タンパク質は前記のものである。あるいは、たとえば、選択した宿主細胞における発現を増大させるために、または精製を改善するために、融合タンパク質を産生させることが望ましい場合がある。本発明の剤を含む分子は、多様な一般法のいずれかを用いてさらに精製することができ、それには下記の方法が含まれるが、それらに限定されない：ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣなどを用いる液体クロマトグラフィー、たとえば順相もしくは逆相；アフィニティークロマトグラフィー（たとえば、無機リガンドまたはモノクローナル抗体について）；サイズ排除クロマトグラフィー；固定金属キレートクロマトグラフィー；ゲル電気泳動など。当業者は本発明の範囲から逸脱することなく最適な単離法および精製法を選択できる。そのような精製により、微生物の他のタンパク質または非タンパク質物質を実質的に含まない形の抗原が得られる。
【０１４５】
本発明はさらに、ＣＦＨＲ１を結合できる本発明の剤を、特に抗体を産生する細胞系に関する。モノクローナル抗体の場合、細胞系は好ましくはハイブリドーマ細胞系である。
ＣＦＨＲ１を結合できる剤、特に抗体を本発明のアッセイに用いるために、抗体を検出可能な標識で標識し、および／または固相に固定することができる。したがって、さらなる態様において、本発明はＣＦＨＲ１を結合できる本発明の剤、特に抗体に関するものであり、その抗体は検出可能な標識で標識されており、および／または固相に固定することができる。
【０１４６】
本発明の剤、特に抗体は、疾患および障害、特にＣＦＨＲ１関連の疾患または障害の診断に有用である。したがって、さらなる態様において、本発明は、疾患および障害、特にＣＦＨＲ１関連の疾患または障害、より好ましくは統合失調症の診断に使用するための、ＣＦＨＲ１を結合できる剤、特に抗体、および／または本発明の１以上の核酸、および／または本発明の細胞系に関する。
【０１４７】
さらなる態様において、本発明は、疾患および障害、特にＣＦＨＲ１関連の疾患または障害、より好ましくは統合失調症の治療および／または予防に使用するための、ＣＦＨＲ１を結合できる剤、特に抗体、および／または本発明の１以上の核酸、および／または本発明の細胞系に関する。
【０１４８】
さらにさらなる態様において、下記のための、ＣＦＨＲ１を結合できる剤、特に抗体、および／または本発明の１以上の核酸、および／または本発明の細胞系のインビトロでの使用に関する：
ａ）被検体から得た試料中のＣＦＨＲ１の量および／または濃度を決定する、ならびに／あるいは
ｂ）グリシン再取込み阻害薬で処置する患者について臨床有益性を予測する、ならびに／あるいは
ｃ）神経発達障害、神経障害または神経精神障害を伴なう患者について、グリシン再取込み阻害薬（ＧＲＩ）で処置した場合の臨床有益性を予測する。
【０１４９】
冠詞“a”および“an”は、本明細書中でその冠詞の１または２以上の（すなわち、少なくとも１）の文法上の目的語を表わすために用いられる。たとえば、“a marker”は１種類のマーカーまたは２種類以上のマーカーを意味する。用語“少なくとも”は、場合により１または２以上のさらなる目的語が存在してもよいことを示すために用いられる。
【０１５０】
“２以上(one or more)”という表現は、１〜５０、好ましくは１〜２０を表わし、同様に好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２または１５を表わす。
本明細書中で用いる用語“マーカー”または“生化学マーカー”は、個体の検査試料を分析するためのターゲットとして用いる分子を表わす。１態様において、そのような分子ターゲットの例はタンパク質またはポリペプチドである。本発明においてマーカーとして用いるタンパク質またはポリペプチドには、そのタンパク質の天然バリアント、およびそのタンパク質またはバリアントのフラグメント、特に免疫検出可能なフラグメントが含まれるものとする。免疫検出可能なフラグメントは、好ましくはそのマーカーポリペプチドの少なくとも６、７、８、１０、１２、１５または２０個の連続アミノ酸を含む。細胞により放出されるタンパク質または細胞外マトリックス中に存在するタンパク質がたとえば炎症に際して損傷を受けて分解するかまたは開裂してそのようなフラグメントになる可能性があることは、当業者に認識されるであろう。あるマーカーは不活性形態で合成され、それが後にタンパク質分解によって活性化される可能性がある。当業者に認識されるように、タンパク質またはそのフラグメントは複合体の一部として存在する可能性もある。そのような複合体も本発明の意味におけるマーカーとして使用できる。さらに、または一方で、マーカーポリペプチドまたはそのバリアントは翻訳後修飾を受けている可能性がある。好ましい翻訳後修飾はグリコシル化、アシル化またはリン酸化である。
【０１５１】
本発明の意味における“マーカー”は、単一マーカーとして、またはマーカーＣＦＨＲ１と組み合わせれば、特定の疾患の査定に際して検査中の診断問題に関連情報を追加するマーカーである。そのマーカーを既にマーカーＣＦＨＲ１を含むマーカーパネル（マーカー組合わせ）に含めることによって特定の疾患の査定についてそれぞれ一定の特異度で感度を改善できるかまたは一定の感度で特異度を改善できるならば、その情報は関連性があるまたは相加値があるとみなされる。好ましくは、それぞれ感度または特異度の改善はｐ＝０．０５、０．０２、０．０１またはそれ未満の有意性レベルで統計的に有意である。
【０１５２】
本明細書中で用いる用語“試料”または“検査試料”は、インビトロ評価の目的で被検体から得た生体試料を表わす。本発明方法において、試料または患者試料は、本発明の態様においていずれかの体液試料を含むことができる。本発明の態様において、試料は体液(body fluidまたはbody liquid)、好ましくは血液、血清、血漿または髄液である。特に好ましい試料は血清および血漿である。被検体は動物、好ましくはヒトである。
【０１５３】
ＣＦＨＲ１、特に可溶性形態のＣＦＨＲ１のタンパク質濃度は、インビトロで適切な試料において決定される。本発明の態様において、“ＣＦＨＲ１”は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２によるＣＦＨＲ１のそれぞれバリアントまたはイソ型、特にＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２について示したバリアント、すなわちバリアントＨ１５７Ｙ、Ｌ１５９Ｖ、Ｅ１７５ＱおよびＡ２９６Ｖを含む。
【０１５４】
用語“ＣＦＨ”は、すべてのＣＦＨイソ型を含み、これにはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１によるＣＦＨタンパク質イソ型１および２（ＣＦＨＬ１と表示される）が含まれる。
“約”は、指示した数値±１０％標準偏差を意味すると解釈される。
【０１５５】
本発明方法により検出されたＣＦＨＲ１を、１態様において、基準濃度または基準量と比較することは当業者に知られている。そのような基準濃度は、陰性基準試料、陽性基準試料、または１もしくは２以上のこれらのタイプの対照を含む混合基準試料を用いて決定できる。陰性基準試料には、好ましくは、特定の疾患が診断されていない明らかに健康な個体からの試料、または特定の疾患が診断されていない明らかに健康な個体の試料中のＣＦＨＲ１の量もしくは濃度に相当する量もしくは濃度のＣＦＨＲ１を含む試料が含まれるであろう。陽性試料には、好ましくは疾患を診断された被検体からの試料、または疾患を診断された被検体の試料中のＣＦＨＲ１の量もしくは濃度に相当する量もしくは濃度のＣＦＨＲ１を含む試料が含まれるであろう。
【０１５６】
“決定された濃度を基準濃度または基準量と比較する”という表現は、いずれしろ当業者に明らかなことをさらに説明するために用いるにすぎない。基準濃度は対照試料において確立される。対照試料は内部対照試料でも外部対照試料でもよい。１態様において、内部対照試料を用いる；すなわち、検査試料および同一被検体から採取した他の２以上の試料（単数または複数）においてマーカーレベル（単数または複数）を査定して、そのマーカー（単数または複数）のレベル（単数または複数）に何らかの変化があるかどうかを判定する。他の態様において、外部試料を用いる。外部試料については、その個体に由来する試料中のマーカーの存在または量を、特定の状態に罹患していることが分かっているかまたはそのリスクを伴なうことが分かっている個体あるいは特定の状態を伴なわないことが分かっている個体（すなわち“正常な個体”）におけるそれの存在または量と比較する。たとえば、患者試料中のマーカー濃度を、ある疾患の特定コースを伴なうことが分かっている濃度と比較することができる。
【０１５７】
通常は、試料のマーカー濃度を直接または間接的に診断と相関させ、そのマーカー濃度は、たとえば個体が特定の疾患のリスクをもつかどうかを判定するために用いられる。
あるいは、試料のマーカー濃度を、たとえば下記に関連することが分かっているマーカー濃度と比較することができる：特定の疾患における療法に対する応答、特定の疾患の診断、特定の疾患の重症度の査定、特定の疾患に適切な薬物を選択するための指針、疾患進行のリスクの判定、または患者の追跡調査。意図する診断用途に応じて、そのマーカーに適切な対照試料、およびそれらにおいて確立された対照値または基準値を選択する。１態様において、そのような対照試料が同年齢の混同される疾患を伴なわない基準集団から得られることは当業者に認識されるであろう。対照試料において確立された絶対マーカー値が用いたアッセイに依存するであろうということも当業者に自明である。好ましくは、適切な基準集団に属する１００人の十分に特性解明された個体からの試料を用いて対照（基準）値を確立する。同様に好ましくは、２０、３０、５０、２００、５００または１０００人の個体からなるように基準集団を選択することができる。健康な個体は対照値を確立するための好ましい基準集団である。
【０１５８】
用語“測定(measurement、measuring)または“決定(determining)”は、定性、半定量または定量測定を含む。本発明において、ＣＦＨＲ１は好ましくは体液試料において定量測定として測定される；すなわち、明確なＣＦＨＲ１濃度を測定する。
【０１５９】
好ましい態様において、対照グループまたは対照集団において決定したＣＦＨＲ１についての濃度または量の値を用いて、カットオフ値または基準範囲を確立する。ある態様において、そのようなカットオフ値を超えるかまたは基準範囲の上端の外側にある値は、特定の疾患の存在について高いかまたはその指標であるとみなされ、あるいはより重篤な形態の特定の疾患の存在の指標である。ある態様において、そのようなカットオフ値未満であるかまたは基準範囲の下端の外側にある値は、特定の疾患または障害の非存在の指標であるとみなされ、あるいはより重篤な形態の疾患の非存在の指標である。
【０１６０】
本発明のある態様において、固定したカットオフ値を確立する。そのようなカットオフ値は、目的とする診断疑問に適合するように選択される。１態様において、カットオフは９０％の特異度になるように設定され、好ましくは９５％の特異度になるように設定され、より好ましくは９８％の特異度になるように設定される。
【０１６１】
ある態様において、カットオフは９０％の感度になるように設定され、同様に好ましくはカットオフは９５％の感度になるように設定され、同様に好ましくはカットオフは９８％の感度になるように設定される。
【０１６２】
１態様において、対照グループまたは対照集団において決定したＣＦＨＲ１についての量または濃度の値を用いて、基準範囲を確立する。好ましい態様において、ＣＦＨＲ１の濃度または量は、決定した値が基準範囲の９０％−パーセンタイルを超えれば高いとみなされる。さらなる好ましい態様において、ＣＦＨＲ１のタンパク質濃度は、決定した値が基準範囲の９５％−パーセンタイル、９６％−パーセンタイル、９７％−パーセンタイルまたは９７．５％−パーセンタイルを超えれば、高いとみなされる。
【０１６３】
カットオフ値を超える値は、たとえば特定の疾患の存在または処置に対する応答の指標となる可能性がある。カットオフ値未満の値は、たとえば特定の疾患の非存在または処置に対する非応答の指標となる可能性がある。
【０１６４】
前記のように、カットオフ値を超えるＣＦＨＲ１は、神経発達障害、神経障害または神経精神障害を伴なう患者のＧＲＩ処置に対する応答の指標である。
さらなる好ましい態様において、ＣＦＨＲ１の測定は定量測定である。さらなる態様において、ＣＦＨＲ１の濃度は根底にある診断疑問と相関する。
【０１６５】
特定の設定で既に確認された疾患を伴なう患者から得た試料を陽性試料として使用でき、好ましくは検査すべき試料と並行してアッセイする。そのような設定において、陽性対照試料中のタンパク質ＣＦＨＲ１について陽性結果は、その検査法が技術レベルで作動したことを示す。
【０１６６】
当業者に認識されるように、そのような査定はいずれもインビトロで行なわれる。試料（検査試料）はその後、廃棄される。試料は本発明のインビトロ診断法に用いられるにすぎず、試料の物質は患者の体内へ戻されない。一般に、試料は体液試料、たとえば血液、血清、血漿または髄液である。本発明による方法は、個体から得た液体、すなわち体液の試料、およびそのような試料中のＣＦＨＲ１のタンパク質濃度のインビトロ決定に基づく。本明細書中で用いる“個体”、“被検体”または“患者”は、単一動物、特にヒトを表わす。
【０１６７】
好ましくは、ＣＦＨＲ１のタンパク質濃度は、本発明のキットを用いてインビトロで液体試料から決定される。
本発明者らは、意外にも体液試料中のＣＦＨＲ１を検出することができる。好ましい態様において、本発明による方法（単数または複数）は、試料材料としての血清について実施される。さらなる好ましい態様において、本発明による方法（単数または複数）は、試料材料としての血漿について実施される。さらなる好ましい態様において、本発明による方法（単数または複数）は、試料材料としての全血について実施される。さらなる好ましい態様において、本発明による方法（単数または複数）は、試料材料としての髄液について実施される。
【０１６８】
さらなる態様において、本発明は、個体から得た血液、血清、血漿または髄液試料（血清または血漿が好ましい）から特定の疾患をインビトロ査定する際のマーカー分子としてのＣＦＨＲ１の使用に関する。
【０１６９】
診断のための理想的シナリオは、単一の事象またはプロセスがたとえば感染性疾患などにおける各疾患を引き起こす状況であろう。他のすべての場合、特に統合失調症の症例のようにその疾患の原因が完全には分かっていない場合、適正な診断がきわめて困難な可能性がある。当業者に認識されるように、たとえば統合失調症のような特定の多因子疾患について１００％の特異度で、同時に１００％の感度で診断できる生化学マーカーは無い。むしろ、複数の生化学マーカーを用いて一定の尤度または予測値で、根底にある診断疑問、たとえばある疾患の存在、非存在または重症度を査定する。したがって、ルーティンの臨床診断においては、原疾患の査定に際して一般に種々の臨床症状および生化学マーカーを一緒に考慮する。当業者は、査定すべき診断疑問について相対リスクまたは尤度を計算するためにルーティンに用いられる数学的／統計学的方法に十分に精通している。ルーティンな臨床実施に際して、医師は原疾患を診断、処置および管理する際に種々の臨床症状および生化学マーカーを一般に一緒に考慮する。
【０１７０】
別に定義しない限り、本明細書中で用いる技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の専門家が一般に理解しているものと同じ意味をもつ。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994); March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure, 4th ed., John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1992); Lewin, B., Genes V, 発行: Oxford University Press (1994), ISBN 0-19-854287-9; Kendrew, J. et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, 発行: Blackwell Science Ltd. (1994), ISBN 0-632-02182-9;およびMeyers, R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, 発行: VCH Publishers, Inc. (1995), ISBN 1-56081-569-8は、本明細書中で用いる多数の用語に対する全般的指針を当業者に提供する。
【０１７１】
本発明の実施には、別に指示しない限り、当業者が容易になしうる分子生物学（組換え法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の一般的手法が採用されるであろう。そのような手法は文献、たとえばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (1989); Gait, M.J., Oligonucleotide Synthesis (1984); Freshney, R.I. (ed.), Animal Cell Culture (1987); Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.; Ausubel, F.M. et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, (1987) および定期的最新版; Mullis et al. (eds.), PCR: The Polymerase Chain Reaction (1994)に十分に説明されている。
【０１７２】
配列の記載
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１  ヒト補体因子Ｈタンパク質イソ型１（ＣＦＨ）およびイソ型２（ＣＦＨＬ１）のアミノ酸配列を示す；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースアクセッション番号：Ｐ０８６０３−１ａｎｄ  Ｐ０８６０３−２．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２  ヒト補体因子Ｈ関連タンパク質１（ＣＦＨＲ１）のアミノ酸配列を示す；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースアクセッション番号：Ｑ０３５９１．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３  ヒト補体因子Ｈ関連タンパク質２（ＣＦＨＲ２）のアミノ酸配列を示す；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースアクセッション番号：Ｐ３６９８０．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４  ヒト補体因子Ｈ関連タンパク質３（ＣＦＨＲ３）のアミノ酸配列を示す；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースアクセッション番号：Ｑ０２９８５．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５  ヒト補体因子Ｈ関連タンパク質４Ａ（ＣＦＨＲ４Ａ）のアミノ酸配列を示す；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースアクセッション番号：Ｃ９Ｊ７Ｊ７．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６  ヒト補体因子Ｈ関連タンパク質４Ｂ（ＣＦＨＲ４Ｂ）のアミノ酸配列を示す；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースアクセッション番号：Ｑ９２４９６．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７  ヒト補体因子Ｈ関連タンパク質５（ＣＦＨＲ５）のアミノ酸配列を示す；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースアクセッション番号：Ｑ９ＢＸＲ６．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８  ＣＦＨＲ１＿１，２−ＧＳ−Ｈｉｓ８のアミノ酸配列を示す；それを本発明の実施例において免疫原として用いる．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９  ＣＦＨＲ１＿１−５のアミノ酸配列を示す；それを本発明の実施例においてキャリブレーター物質として用いる．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０  ＣＦＨＲ２−ＧＳ−Ａｖｉ−ＧＳ−Ｈｉｓ８のアミノ酸配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１  ＣＦＨＲ３−ＧＳ−Ａｖｉ−ＧＳ−Ｈｉｓ８のアミノ酸配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２  ＣＦＨＲ４−ＧＳ−Ａｖｉ−ＧＳ−Ｈｉｓ８のアミノ酸配列を示す；それにはＣＦＨＲ４バリアントＢを用いた．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３  ＣＦＨＲ５−ＧＳ−Ａｖｉ−ＧＳ−Ｈｉｓ８のアミノ酸配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４  ＣＦＨＬ１−ＧＳ−Ａｖｉ−ＧＳ−Ｈｉｓ８のアミノ酸配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５  本発明のモノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５のＤＮＡの重鎖のｃＤＮＡ配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６  本発明のモノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５の重鎖のアミノ酸配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７  本発明のモノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５のＤＮＡの軽鎖のｃＤＮＡ配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８  本発明のモノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５の軽鎖のアミノ酸配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９  本発明のモノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５の重鎖のｈＣＤＲ１アミノ酸配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０  本発明のモノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５の重鎖のｈＣＤＲ２アミノ酸配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１  本発明のモノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５の重鎖のｈＣＤＲ３アミノ酸配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２  本発明のモノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５の軽鎖のＬＣＤＲ１アミノ酸配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３  本発明のモノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５の軽鎖のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４  本発明のモノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３のＤＮＡの重鎖のｃＤＮＡ配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５  本発明のモノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３の重鎖のアミノ酸配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６  本発明のモノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３のＤＮＡの軽鎖のｃＤＮＡ配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７  本発明のモノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３の軽鎖のアミノ酸配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８  本発明のモノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．５３のＤＮＡの重鎖のｃＤＮＡ配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９  本発明のモノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．５３の重鎖のアミノ酸配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０  本発明のモノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．５３のＤＮＡの軽鎖のｃＤＮＡ配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１  本発明のモノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．５３の軽鎖のアミノ酸配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２  本発明のモノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．７４のＤＮＡの重鎖のｃＤＮＡ配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３  本発明のモノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．７４の重鎖のアミノ酸配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４  本発明のモノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．７４のＤＮＡの軽鎖のｃＤＮＡ配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５  本発明のモノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．７４の軽鎖のアミノ酸配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６  本発明のモノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．３．２３のＤＮＡの重鎖のｃＤＮＡ配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７  本発明のモノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．３．２３の重鎖のアミノ酸配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８  本発明のモノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．３．２３のＤＮＡの軽鎖のｃＤＮＡ配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９  本発明のモノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．３．２３の軽鎖のアミノ酸配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０  本発明のキットのモノクローナル抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３のＤＮＡの重鎖のｃＤＮＡ配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１  本発明のキットのモノクローナル抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３の重鎖のアミノ酸配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２  本発明のキットのＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３のＤＮＡの軽鎖のｃＤＮＡ配列を示す．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３  本発明のキットのＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３の軽鎖のアミノ酸配列を示す．
【実施例】
【０１７３】
実施例１：ＣＦＨＲ１特異的アッセイに用いた抗体
ＣＦＨＲ１特異的アッセイを開発するために、下記のモノクローナル抗体を用いた：ＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３（提供社：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログｎｏ．：ＧＡＵ  ０２０−０３−０２）、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４４２１２７（提供社：Ｒ＆Ｄ−ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログｎｏ．：ＭＡＢ４２４７）、ならびにそれぞれ本発明に従って自社開発したモノクローナル抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．５３、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．７４、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．３．２３、およびＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５；それらを実施例３、４、１０および１２に記載する。
【０１７４】
実施例２：組換え体ＣＦＨＲ１〜ＣＦＨＲ５およびＣＦＨＬ１誘導体の調製
プラスミドＤＮＡのトランスフェクションによる一過性遺伝子発現(transient gene expression)（ＴＧＥ）は、哺乳動物細胞培養においてタンパク質を産生させるための迅速な方法である。ＣＦＨＲ１、ＣＦＨＲ２、ＣＦＨＲ３、ＣＦＨＲ４Ｂ、ＣＦＨＲ５およびＣＦＨＬ１をコードするｃＤＮＡをＳｏｕｒｃｅ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓから購入した。図４に挙げるタンパク質（ＣＦＨＲ４Ａを除く）を得るために、これらのコード配列をＰＣＲ増幅し、Ａｖｉ−ＧＳ−Ｈｉｓタグをコードするカセット内への標準組換えクローニング法により、ｐＭ１ＭＴ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）内へクローニングした。ＣＦＨＲ４Ａを調製しなかったのは、この分子のＳＣＲ−１のタンパク質配列がＣＦＨＲ４ＢのＳＣＲ１−２と同一であり、かつＣＦＨＲ４ＡのＳＣＲ２はＣＦＨＲ４Ｂと９２％同一であり、したがって交差反応性はそれぞれＣＦＨＲ４ＡおよびＣＦＨＲ４Ｂの両方について同じであると推測したからである。
【０１７５】
ｐＭ１ＭＴの使用により、上記コード配列の発現はヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）極初期エンハンサー／プロモーター領域、発現増強のためのイントロンＡ、およびＢＧＨポリアデニル化シグナルの制御下に置かれる。
【０１７６】
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異形成（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造業者の推奨に従って用いて終止コドンをＣＦＨＲ１＿１−５−ＧＳ−Ｈｉｓ８発現構築体に導入することにより、全長成熟ＣＦＨＲ１に対応するＴａｇ−ｌｅｓｓ  ＣＦＨＲ１＿１−５を作製した。すべての変異体を自動配列決定装置（Ｓｅｑｕｉｓｅｒｖｅ）により確認した。
【０１７７】
ヒト胎児由来腎（ＨＥＫ）２９３細胞における一過性遺伝子発現のために、本発明者らは振とう培養フラスコ内で培養した無血清懸濁培養に適応したＨＥＫ２９３細胞系を用い、それを約１〜２×１０６ｖｃ／ｍｌで、２９３−Ｆｒｅｅ（商標）（Ｍｅｒｃｋ）トランスフェクション試薬により複合体形成した発現プラスミド（０．５〜１ｍｇ／Ｌ  細胞培養物）でトランスフェクションした。トランスフェクションの約７日後、後続プロセスのために培養上清を収穫した：５０ｍＭ  Ｋ−ＰＯ４（ｐＨ７．５）、３５ｍＭ  ＮａＣｌ（１２ｍＳ）に対する透析濾過、完全プロテアーゼ阻害カクテル錠（Ｒｏｃｈｅ）の添加、およびＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）処理に続いて、Ｈｉｓ−タグ付き誘導体をＮｉ−ＮＴＡ（Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ，Ｑｉａｇｅｎ）クロマトグラフィー工程、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。最後に、タンパク質を５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、６．５％サッカロース、１０ｍＭシステインに対して透析し、−８０℃で保存して、相対力価アッセイ、分析用ゲル濾過および／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示された＞９５％純度の機能性かつ安定なタンパク質画分が得られた。
【０１７８】
実施例３：モノクローナル抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．５３、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．７４およびＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．３．２３の調製
３．１．マウスの免疫化
それぞれ８〜１２週齢の雌ＢＡＬＢ／Ｃおよび／またはＮＭＲＩマウスを、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８による配列をもつ組換えＣＦＨＲ１＿１，２−ＧＳ−Ｈｉｓ８抗原により、３週間隔で３回免疫化した。初回注射は、完全フロイントアジュバント中に乳化した３０μｇの抗原で腹腔内に行なわれた。２回目の免疫化はＡｂｉｓｃｏアジュバント（Ｉｓｃｏｎｏｖａ）と混合した１０μｇの抗原で皮下に行なわれ、３回目の注射は５μｇの抗原で腹腔内に行なわれた。最終免疫化の１０日後、血液を採取し、免疫化したマウスの血清における抗体力価を決定した。融合の３日前に、選択したマウスに、ＰＢＳに溶解した５０μｇの組換えＣＦＨＲ１＿１，２＿ＧＳ＿Ｈｉｓ８の静脈内ブースター注射を行なった。
【０１７９】
３．２．ハイブリドーマ作製
Galfre and Milstein (1981) Meth. Enzymol. 73, 3-46の方法に従って、免疫化マウスの脾細胞を骨髄腫細胞と融合させた。免疫化したマウスの脾細胞１×１０８個を２×１０７個の骨髄腫細胞（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−６５３，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）と混合し、遠心した。次いで細胞をＲＰＭＩ  １６４０培地（ＦＣＳを含まない）で１回洗浄し、４００ｇで再び遠心した。上清を廃棄し、細胞沈降物を軽く叩いて穏やかにほぐし、これに１分以内に１ｍｌのＰＥＧを添加し、３７℃の温水浴内で穏やかに旋回させることにより細胞と混合した。その後、５ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０培地（ＦＣＳを含まない）を５分以内に滴加し、３７℃の温水浴内で連続旋回により混合した。２５ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０培地（ＦＣＳを含まない）を添加した後、細胞を４００ｇで１０分間遠心した。細胞ペレットをＲＰＭＩ  １６４０培地（５％のＦＣＳ）に装入し、アザセリン−ヒポキサンチン選択培地（５％のＦＣＳを補充したＲＰＭＩ  １６４０中、５．７μＭのアザセリン、１００μＭのヒポキサンチン、２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０μＭの２−メルカプトエタノールおよび１００μＭの非必須アミノ酸）中へ播種した。マウス組換えインターロイキン６（５０Ｕ／ｍｌ）を増殖因子として培地に添加した。１０日後、この初代培地物をＣＦＨＲ１結合性抗体の合成について検査した。ＣＦＨＲ１結合性ハイブリドーマの初代培養物をマイクロタイタープレートに蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によりクローニングした。
【０１８０】
３．３．産生された抗体の結合および特異性の判定
ハイブリドーマ培養上清におけるＭＡｂ産生を間接的な酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によりアッセイした。ストレプトアビジンでコートしたマイクロタイタープレート（Ｍｉｃｒｏｃｏａｔ，Ｂｅｒｎｒｉｅｄ，ドイツ）を、インキュベーション用緩衝液（リン酸緩衝化生理食塩水  ｐＨ７．３、０．５％のＢｙｃｏ  Ｃ）に１：２０００希釈したＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３モノクローナル抗体のビオチニル化Ｆａｂフラグメントと共に、室温で１時間インキュベートした。洗浄用緩衝液（０．９％  ＮａＣｌ溶液，０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０）で洗浄した後、マイクロタイタープレートを室温で１時間、インキュベーション用緩衝液中に希釈した１００ｎｇ／ｍｌの精製した組換えＣＦＨＲ１およびＣＦＨタンパク質と共にインキュベートした。マイクロタイタープレートを再び洗浄し、コートしたウェルにハイブリドーマ上清を添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、結合したモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を、インキュベーション用緩衝液に１：５０００希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ  ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ドイツ）との１時間のインキュベーション、続いてさらなる洗浄工程後のＡＢＴＳ溶液（Ｒｏｃｈｅ，ドイツ）との基質反応により検出した。２０〜３０分後にＥＬＩＳＡリーダーで４０５／４９０ｎｍにおける色の変化を測定した。ＣＦＨとの交差反応性をもたない幾つかのＣＦＨＲ１特異的クローンが選択された。
【０１８１】
３．４．サンプルＩｇＧの調製
選択したハイブリドーマクローンを、０．１％のＮｕｔｒｉｄｏｍａ  ＣＳ（Ｒｏｃｈｅ，ドイツ）を補充した無血清培地（ＨｙＣｌｏｎｅ  ＡＤＣＦ−ＭＡｂ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）に適応させ、１７５ｃｍ２の組織培養フラスコ内で１×１０５細胞／ｍｌの密度まで培養した。この前培養から得た２×１０７個の細胞を１０ｍｌの新鮮な培地に再懸濁し、ＣＥＬＬｉｎｅ  ｃｌａｓｓｉｃ  １０００バイオリアクター（Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ドイツ）の細胞コンパートメント内へ播種した。５００ｍｌの新鮮な培地を培地コンパートメントに添加し、細胞をＣＯ２インキュベーター内で６〜７日間インキュベートした。最初のインキュベーションの後、培地コンパートメント内の培地交換および細胞コンパートメントからの５ｍｌハイブリドーマ懸濁液の収穫を週２回実施した。収穫した細胞懸濁液を４００ｇで遠心し、無細胞上清をその後のＩｇＧ精製のために採集した。クローンのうちの１つ、すなわちクローン５．１．５はＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５を産生するクローンに対応していた。他のクローンは、それぞれＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．５３、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．７４、およびＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．３．２３を産生するクローンに対応していた。
【０１８２】
実施例４：抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨ  ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４４２１２７、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３およびＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５のＢｉａＣｏｒｅ分析
抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４４２１２７、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３およびＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５をＢｉａＣｏｒｅで分析した。ウサギ抗マウスＩｇＧでコートしたチップＣＭ５を用いて精製モノクローナルマウス抗体を結合させた。次の工程で、天然ＣＦＨまたはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：９〜１３による組換えＣＦＨＲ１、ＣＦＨＲ２、ＣＦＨＲ３、ＣＦＨＲ４ＢもしくはＣＦＨＲ５タンパク質を添加して、種々の抗体の結合親和性を判定した。結果を表１に示す。
【０１８３】
表１：種々のＣＦＨＲ１抗体の結合親和性（ＫＤ，ｎＭで）
【０１８４】
【表１】
2016510870.tif 000002
【０１８５】
ｎ．ｄ．＝検出できず
抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３は、ＣＦＨＲ１に対して高い反応性を示し、ＣＦＨおよびＣＦＨＲ５に対してより低い親和性を示す。この抗体はＣＦＨで免疫化することにより産生されたにもかかわらず、意外にもＣＦＨＲ１に対する親和性がＣＦＨに対する反応性より高い。３種類のＣＦＨＲ１結合抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４４２１２７、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５およびＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３は、異なる反応パターンを示す。抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５およびＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３は、ＣＦＨＲ１との高い反応性およびＣＦＨＲ２に対するごくわずかな反応性を示し、ＣＦＨおよびＣＦＨＲ５それぞれに対しては測定可能な結合を示さない。対照的に、抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４４２１２７はＣＦＨＲ２およびＣＦＨＲ５に対する交差反応性を示さないが、低いＣＦＨ結合を示す。ＣＦＨに対する交差反応性のため、この抗体は特異的ＣＦＨＲ１アッセイ法を開発するにはより適さない。ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５およびＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３はＣＦＨに対する交差反応性およびＣＦＨＲ５に対する交差反応性をもたないので、ＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３との組合わせでＣＦＨＲ１特異的アッセイが可能である。
【０１８６】
このように、交差反応性プロフィールに関して、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５と比較して類似の結果がＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３についてみられた。ただし、ＣＦＨＲ１に対するＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３の親和性はＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５と比較して、より低い。したがって、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３抗体もＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３との組合わせで本発明のキット、アッセイおよび方法に使用できる。
【０１８７】
実施例５：モノクローナルＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３のＦａｂフラグメントのビオチン化；化学量論１：１．３
クローンＬ２０／３のモノクローナルマウスＩｇＧ（提供社：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログｎｏ．：ＧＡＵ  ０２０−０３−０２）をパパイン（３ｍＵ／ｍｇ  ＩｇＧ）を用いて消化して、Ｆａｂフラグメントを調製した。消化したＦｃフラグメントをＤＡＥ−セファロース上でのクロマトグラフィーにより除去した。残留ＦｃのＦｃγ吸着、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００サイズ排除により、Ｆａｂを精製した。
【０１８８】
１００ｍＭ  ＫＰＯ４，ｐＨ８．５中における、１０ｍｇ／ｍｌのＬ２０／３−Ｆａｂフラグメント溶液に、ｍｌ当たり５０ｕｌのビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３．６ｍｇ／ｍｌ，ＤＭＳＯ中）を添加した。室温で４５分後、サンプルを１００ｍＭ  ＫＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２に対して透析し、そして凍結した。
【０１８９】
実施例６：モノクローナルＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４４２１２７、ならびに完全自社製モノクローナルＭＡＢｓ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ、すなわち５．１．５、４．１．３、４．２．５３、４．２．７４および５．３．２３それぞれのルテニウム化；化学量論１：３
１００ｍＭ  ＫＰＯ４，ｐＨ８．５中における、５ｍｇ／ｍｌのモノクローナルマウスＩｇＧ（ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４４２１２７；クローン４４２１２７，提供社：Ｒ＆Ｄ−ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ−ｎｏ．：ＭＡＢ４２４７、または見出しに列記した自社製ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞のそれぞれ）の溶液に、１２５ｕｇのルテニウム−（ｂｐｙ）２−ｂｐｙＣＯ−Ｏｓｕを添加した。室温で７５分後、１０ｍＭリジンの添加によりルテニウム化を停止した。凝集物を分離するために、サンプルの適切な画分をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００サイズ排除クロマトグラフィーから採集した。
【０１９０】
実施例７：ビオチニル化Ｌ２０／３  Ｆａｂフラグメントおよびルテニウム化ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５−Ｒｕを用いるＣＦＨＲ１アッセイ１
特にヒトの血清または血漿試料中のＣＦＨＲ１の特異的測定のための電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）を、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ｃｏｂａｓ分析計ｅ６０１を用いて開発した。Ｅｌｅｃｓｙｓ  ＣＦＨＲ１イムノアッセイは、サンドイッチ原理で機能する電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）である。このアッセイには２種類の抗体、すなわちモノクローナル抗体  ＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３のビオチニル化Ｆａｂフラグメント（Ｌ２０／３−Ｂｉ；捕獲抗体）およびルテニウム化モノクローナル抗ＣＦＨＲ１抗体  ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５（ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５−Ｒｕ；検出抗体）が含まれ、それらが試料中のＣＦＨＲ１とサンドイッチイムノアッセイ複合体を形成する。次いでこの複合体を固相であるストレプトアビジンコートした微粒子に結合させる。これらの微粒子を電極の表面に磁気捕獲し、電極に電圧をかけると化学発光が誘発され、それを読出しのための光電子増倍管により測定する。結果を計器特定検量曲線により判定する。
【０１９１】
Ｄｉｌｕｅｎｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，Ｎｏ．０３１８３９７１）を用いて試料を１：４００希釈する。アッセイプロトコル１０を適用して、前希釈した試料１０ｕｌを下記のものと共に９分間プレインキュベートする；８０ｕｌの試薬１（Ｒ１）：１．５μｇ／ｍｌのビオチニル化ＭＡＢ＜ＣＦＨ／ＣＦＨＲ１＞Ｍ−Ｌ２０／３  Ｆａｂフラグメントを反応用緩衝液（Ｈｅｐｅｓ  ５０ｍＭ，ＮａＣｌ  １５０ｍＭ；Ｔｈｅｓｉｔ／Ｐｏｌｉｄｏｃａｎｏｌ  ０．１％；ＥＤＴＡ  １ｍＭ；ウシ血清アルブミン０．５％）中に含有するもの、および試薬２（Ｒ２）：１．０μｇ／ｍｌのルテニウム化ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５を同じ反応用緩衝液中に含有するもの。第２工程で、３０μｌの微粒子懸濁液を添加し、さらに９分間インキュベートする。インキュベーションに際して、微粒子に結合した抗体−分析体−抗体のサンドイッチが形成される。最後に、微粒子を信号の発生および読出しのためにＥｌｅｃｓｙｓシステムの検出チャンバーへ移す。検量のために、種々の濃度の組換えＣＦＨＲ１（０ｎｇ／ｍｌ，７．５ｎｇ／ｍｌ，１５．２５ｎｇ／ｍｌ，３０．２５ｎｇ／ｍｌ，６０．７５ｎｇ／ｍｌおよび１２１．２ｎｇ／ｍｌ）を含む一連のキャリブレーターを希釈剤Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（Ｒｏｃｈｅ−Ｉｄ．  ０３６０９９８７  １９０）中に調製する。非線形最小二乗曲線フィッティング（ＲＣＭ−Ｒｏｄｂａｒｄ）により検量曲線の方程式を計算し、読出し信号を対応する濃度値に換算するために用いた。それらの結果にアッセイの希釈係数（＝４００）を掛けた。
【０１９２】
実施例８：ビオチニル化Ｌ２０／３  Ｆａｂフラグメント、ならびにＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４４２１２７−Ｒｕ、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３−Ｒｕ、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．５３−Ｒｕ、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．７４−ＲｕおよびＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．３．２３−Ｒｕそれぞれを用いる他のＣＦＨＲ１アッセイの記載
これら種々のサンドイッチアッセイのために、実施例７の場合と同じモノクローナル抗体 Ｆａｂ  Ｌ２０／３−Ｂｉのビオチニル化Ｆａｂフラグメント（捕獲抗体）を同じ緩衝液組成物中で用いた。ＣＦＨＲ１アッセイ１との相異は、ルテニウム化（＝−Ｒｕ）モノクローナル抗ＣＦＨＲ１抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４４２１２７−Ｒｕ、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３−Ｒｕ、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．５３−Ｒｕ、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．７４−ＲｕおよびＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．３．２３−Ｒｕそれぞれを用いたことであった。これらの抗体を同様に試薬２（（Ｒ２），Ｈｅｐｅｓ  ５０ｍＭ，ＮａＣｌ  １５０ｍＭ；Ｔｈｅｓｉｔ／Ｐｏｌｉｄｏｃａｎｏｌ  ０．１％；ＥＤＴＡ  １ｍＭ；ウシ血清アルブミン０．５％）中に、それぞれ０．５ｍｇ／Ｌ、２ｍｇ／Ｌ、２ｍｇ／Ｌ、１，５ｍｇ／Ｌおよび２ｍｇ／Ｌの濃度で用いた。アッセイ操作および検量はＣＦＨＲ１アッセイ１に従った（実施例７を参照）。
【０１９３】
実施例９：ＣＦＨ、ＣＦＨＲ２およびＣＦＨＲ５に対する自社ＣＦＨＲ１アッセイの交差反応性
実施例７および８の５種類すべての自社ＣＦＨＲ１アッセイについて、潜在的交差反応性血清成分であるＣＦＨ（自社精製した天然ＣＦＨ）、ならびに組換え作製したＣＦＨＲ２およびＣＦＨＲ５の個別濃度を測定することにより、最も重要なＣＦＨ関連タンパク質に対する交差反応性を判定した。この実験のために、潜在的交差反応性タンパク質をアッセイ希釈剤に溶解し、アッセイ記述に従って測定した。結果を表２に示す。
【０１９４】
表２：潜在的交差反応性タンパク質の分析
【０１９５】
【表２】
2016510870.tif 000003
【０１９６】
５種類すべての自社ＣＦＨＲ１アッセイが同等の交差反応性を示す。ＣＦＨＲ２およびＣＦＨＲ５に対する交差反応性はなく、ＣＦＨに対しては０．１％のごくわずかな反応性がある。精製ＣＦＨがＣＦＨＲ１の不純物を示すという事実のため（図１５のウェスタンブロット分析を参照）、ＣＦＨに対する真の（交差）反応性があるとすれば０．１％未満である。
【０１９７】
実施例１０：他のすべてのＣＦＨ関連タンパク質に対する選択された２種類のＣＦＨＲ１アッセイの交差反応性
それぞれ実施例７および８の好ましいＣＦＨＲ１アッセイ（Ｌ２０／３−Ｂｉ／５．１．５−Ｒｕ）およびＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４４２１２７を用いるＣＦＨＲアッセイの（交差）反応性を、潜在的交差反応性血清成分であるＣＦＨ（精製した天然ＣＦＨ，Ｎｏ．４４００−９５５４，ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃ）ならびにタグ付き組換えタンパク質ＣＦＨＬ１、ＣＦＨＲ２、ＣＦＨＲ３、ＣＦＨＲ４ＢおよびＣＦＨＲ５の個別濃度を測定することにより判定した。この実験にＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃからの精製ＣＦＨを用いたのは、この物質がきわめて低いＣＦＨＲ１濃度を示すからである。これらの潜在的交差反応性タンパク質をアッセイ希釈剤に溶解し、アッセイ記述に従って測定した。これらの結果を表３に示す。さらに、ＣＦＨに対する交差反応性を詳細に調べるために第２実験を実施した。ＣＦＨＲ１を欠失する患者から採集した試料、すなわちＣＦＨＲ１が存在しない試料を選択し、両アッセイ法で測定した。結果をさらに後記の表４に示す。
【０１９８】
表３：潜在的交差反応性タンパク質の分析
【０１９９】
【表３】
2016510870.tif 000004
【０２００】
本発明のモノクローナル抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５を用いる特異的な自社ＣＦＨＲ１アッセイ（実施例７）について、ＣＦＨに対して有意の交差反応性は判定されず、他のすべてのＣＦＨ関連タンパク質ＣＦＨＬ１、ＣＦＨＲ２、ＣＦＨＲ３、ＣＦＨＲ４Ｂ、ＣＦＨＲ５に対して交差反応性は判定されなかった。アッセイ１の定量限界は＜０．２５μｇ／ｍｌと査定され、交差反応体としてのＣＦＨについて測定されたＣＦＨＲ１濃度は測定範囲未満である。他方、ＣＦＨＲ１特異的抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４４２１２７を用いるＣＦＨＲ１アッセイ２は、ＣＦＨに対して約０．８〜１．０％の若干の交差反応性を示す。血清中のＣＦＨ濃度はＣＦＨＲ１濃度より有意に高いので、これが臨界値である。
【０２０１】
こうして、ＣＦＨＲ１のアッセイが確立された。
表４：ＣＦＨＲ１欠失患者から採集したヒト血清試料の結果
【０２０２】
【表４】
2016510870.tif 000005
【０２０３】
実施例１１：ＣＦＨＲ１基準物質の調製
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９による配列をもつ組換えＣＦＨＲ１＿１−５（ＡＡ１９−３３０，アフィニティータグ無し）を、ヒト胎児由来腎（ＨＥＫ）２９３細胞において一過性発現させた。澄明になった細胞培養上清を、カラムマトリックスに固定したＣＦＨＲ１特異的モノクローナル抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーによってさらに精製した。アフィニティーカラムに組換えＣＦＨＲ１を装填し、１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、２０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ８．５および１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０  ｐＨ８．５で洗浄して、非特異的に結合したタンパク質を除去した。ＲｅｃＣＦＨＲ１を１Ｍプロピオン酸でカラムから溶離し、２Ｍアルギニン／ＨＣｌ  ｐＨ９．２を用いて溶出液のｐＨを８．５に調整した。５ｍＭリン酸カリウム、５ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．５に対して透析した後、アフィニティー精製ｒｅｃＣＦＨＲ１をイオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｒｅｓｕｒｃｅ  Ｑ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に捕獲し、ＮａＣｌ勾配で溶離した。生成物を貯蔵用緩衝液（５０ｍＭのリン酸カリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ８．５）に対して透析し、０．２μｍのＳｕｐｏｒ（登録商標）  ＰＥＳメンブレンディスクフィルター（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いる濾過によって澄明にし、−８０℃で保存した。
【０２０４】
実施例１２：ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．５３、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．７４、およびＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．３．２３の配列分析
実施例３および４で同定したクローンからのマウスモノクローナル抗体＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．１．５の配列分析を、ＲＡＣＥ−ＰＣＲにより、Doeneke et al. (1997) Leukemia 11, 1787-1792に従って、５’／３’  ＲＡＣＥキットの第２世代（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて実施した。配列分析の結果を図２および３に示す。配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５〜１８に示されている。
【０２０５】
実施例３で同定したマウスモノクローナル抗体ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．１．３、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．５３、ＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−４．２．７４、およびＭＡＢ＜ＣＦＨＲ１＞Ｍ−５．３．２３の配列分析を、それに従って実施した。配列分析の結果を図５〜１２に示す。アミノ酸配列およびＤＮＡ配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４〜３９に示されている。
【図１】
2016510870.tif 000006
【図２−１】
2016510870.tif 000007
【図２−２】
2016510870.tif 000008
【図３−１】
2016510870.tif 000009
【図３−２】
2016510870.tif 000010
【図４−１】
2016510870.tif 000011
【図４−２】
2016510870.tif 000012
【図５】
2016510870.tif 000013
【図６−１】
2016510870.tif 000014
【図６−２】
2016510870.tif 000015
【図７】
2016510870.tif 000016
【図８−１】
2016510870.tif 000017
【図８−２】
2016510870.tif 000018
【図９】
2016510870.tif 000019
【図１０−１】
2016510870.tif 000020
【図１０−２】
2016510870.tif 000021
【図１１】
2016510870.tif 000022
【図１２−１】
2016510870.tif 000023
【図１２−２】
2016510870.tif 000024
【図１３】
2016510870.tif 000025
【図１４−１】
2016510870.tif 000026
【図１４−２】
2016510870.tif 000027
【図１５】
2016510870.tif 000028
【配列表】
2016510870000001.app
【国際調査報告】
2016510870.tif 000029
2016510870.tif 000030
2016510870.tif 000031