(57)【要約】  本発明は、二級アルコールデヒドロゲナーゼを欠如するか、または不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む組換え酢酸生成性のカルボキシド栄養性細菌を提供する。この不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼは、細菌が、アセトンをイソプロパノールに変換し、またメチルエチルケトンを２−ブタノールに変換する能力を低減する不活性化突然変異を含む二級アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子によってコードされ得る。二級アルコールデヒドロゲナーゼを欠如する、または不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む細菌は、カルボニル含有化合物を蓄積するために、本発明は、アセトン及びメチルエチルケトンなどのカルボニル含有化合物を生成する方法も提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
二級アルコールデヒドロゲナーゼを欠如するか、または不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む、組換え酢酸生成性のカルボキシド栄養性（ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｒｏｐｈｉｃ）細菌。
【請求項２】
前記細菌が、クロストリジウム属の構成員である、請求項１に記載の前記細菌。
【請求項３】
前記細菌が、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、クロストリジウム・リュングダリイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、及びクロストリジウム・ラグスダレイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ）からなる群から選択される細菌に由来する、請求項１に記載の前記細菌。
【請求項４】
前記クロストリジウム・オートエタノゲナムが、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２３６９３として寄託されているクロストリジウム・オートエタノゲナムである、請求項３に記載の前記細菌。
【請求項５】
前記不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼが、不活性化一級−二級アルコールデヒドロゲナーゼである、請求項１に記載の前記細菌。
【請求項６】
前記不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼが、配列番号１のアミノ酸配列を含む二級アルコールデヒドロゲナーゼに由来する、請求項１に記載の前記細菌。
【請求項７】
前記不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼが、不活性化突然変異を含む二級アルコールデヒドロゲナー遺伝子によってコードされる、請求項１に記載の前記細菌。
【請求項８】
前記不活性化突然変異を含む前記二級アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子が、配列番号２または配列番号３の核酸配列に由来する、請求項７に記載の前記細菌。
【請求項９】
前記不活性化突然変異が、挿入である、請求項７に記載の前記細菌。
【請求項１０】
前記細菌が、チオラーゼ、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ、及びアセトアセテートデカルボキシラーゼのうちの１つ以上をコードする外来性遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の前記細菌。
【請求項１１】
前記細菌が、メソ−２，３−ブタンジオールをＭＥＫに変換するプロパンジオールデヒドラターゼをコードする外来性遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の前記細菌。
【請求項１２】
前記プロパンジオールデヒドラターゼが、クレブシエラ・オキシトカプロパンジオールデヒドラターゼである、請求項１１に記載の前記細菌。
【請求項１３】
前記細菌が、アセトン及びＭＥＫのうちの１つ以上を生成する、請求項１に記載の前記細菌。
【請求項１４】
アセトンを生成する方法であって、請求項１に記載の前記細菌を培養し、これによって、前記細菌がアセトンを生成することを含む、前記方法。
【請求項１５】
前記培養物から前記アセトンを回収することをさらに含む、請求項１４に記載の前記方法。
【請求項１６】
ＭＥＫを生成する方法であって、請求項１に記載の前記細菌を培養し、これによって、前記細菌がＭＥＫを生成することを含む、前記方法。
【請求項１７】
前記培養物から前記ＭＥＫを回収することをさらに含む、請求項１６に記載の前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１２月３日に出願された米国仮特許出願第６１／９１１，４４９号の利益を主張するものであり、この出願の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、本明細書と同時に提出され、２０１４年１２月１日に作成されたファイル名「ＬＴ１０１ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」の７，６１７バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト形式）ファイルとして特定されるヌクレオチド／アミノ酸配列表を含み、このファイルの全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
発明の技術分野
本発明は、工業用発酵に関する。特に、本発明は、ケトンなどの工業的に有用な溶媒を生成するための微生物の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
クロストリジウム・オートエタノゲナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、クロストリジウム・リュングダリイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、及びクロストリジウム・ラグスダレイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ）などの酢酸生成性のカルボキシド栄養性（ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｒｏｐｈｉｃ）細菌は、アセトンをイソプロパノールに、またメチルエチルケトン（ＭＥＫ）を２−ブタノールに変換する。したがって、これらの細菌は、アセトン及びＭＥＫなどのケトンを消費して、イソプロパノール及び２−ブタノールなどのアルコールを生成する。
【０００５】
しかしながら、ケトンそれ自体が、重要な商業製品である。アセトンは、年間約１００億米ドルの合算された市場価値を有する、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）及びポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）の工業溶媒及び前駆物質である。アセトンはまた、イソブチレンの前駆物質でもある（ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，９３：１３７７−１３８７，２０１２）。イソブチレンの市場価値も、年間約２４０憶米ドルで相当なものである。ＭＥＫは、年間約２０憶米ドルの広範な市場価値を有し、かつ年率約１．９％で増大している、塗料及びインクの重要な成分である。ＭＥＫはまた、年間１９０憶米ドルを超える市場価値を有し、年率約２．７％で増大している、１，３−ブタジエンの前駆物質でもある。さらに、アセトンは、ジェット燃料の生成のための前駆物質である（Ａｎｂａｒａｓａｎ，Ｎａｔｕｒｅ，４９１：２３５−２３９，２０１２）。
【０００６】
したがって、アセトン及びメチルエチルケトン（ＭＥＫ）などの工業的に有用な溶媒及び前駆物質を生成する改善された方法に対する必要性が残っている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、二級アルコールデヒドロゲナーゼを欠如する、または不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む、組換え酢酸生成性のカルボキシド栄養性細菌を提供する。好ましくは、この細菌は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイ由来の細菌などの、クロストリジウム属の構成員である。特定の実施形態では、この細菌は、受託番号ＤＳＭ２３６９３としてＤＳＭＺに寄託されているクロストリジウム・オートエタノゲナムに由来する。
【０００８】
不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼは、二級アルコールデヒドロゲナーゼまたは一級−二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素に由来してもよい。不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼは、不活性化突然変異を含む二級アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子によってコードされ得る。不活性化突然変異を含む二級アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、二級アルコールデヒドロゲナーゼまたは一級−二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子に由来してもよい。一実施形態では、不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼは、配列番号１のアミノ酸配列に由来する。別の実施形態では、不活性化突然変異を含む二級アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、配列番号２または配列番号３の核酸配列に由来する。具体的には、不活性化突然変異は、挿入であってもよい。
【０００９】
この細菌は、チオラーゼ、ｃｏＡ−トランスフェラーゼ、またはアセトアセテートデカルボキシラーゼなどの１つ以上の酵素をコードする外来性遺伝子をさらに含んでもよい。さらに、この細菌は、クレブシエラ・オキシトカプロパンジオールデヒドラターゼなどのメソ−２，３−ブタンジオールをＭＥＫに変換するプロパンジオールデヒドラターゼをコードする外来性遺伝子を含んでもよい。
【００１０】
不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼの存在は、ケトンの蓄積をもたらす。したがって、この細菌は、アセトンまたはＭＥＫなどのケトンを蓄積または生成することができる。
【００１１】
本発明は、不活性化突然変異を含む二級アルコールデヒドロゲナーゼによってコードされた不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む細菌を培養し、これによって、細菌がアセトン及びＭＥＫのうちの１つ以上を生成することによって、アセトンまたはＭＥＫなどのケトンを生成する方法をさらに提供する。この方法は、アセトンまたはＭＥＫを培地から回収することをさらに含んでよい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】クロストリジウム・オートエタノゲナムアルコールデヒドロゲナーゼの種々の基質に関する反応速度を示す表である。
【図２】二級アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子上のイントロン標的部位（２１１ｓ、２８７ａ、３８８ａ、４００ｓ、４３３ｓ、ならびに５５２ａ）及びプライマー結合部位（１５６Ｆならびに９３９Ｒ）を示す遺伝子マップである。
【図３Ａ】グループＩＩイントロン挿入を確認するゲル画像である。
【図３Ｂ】グループＩＩイントロン挿入を確認するゲル画像である。
【図３Ｃ】グループＩＩイントロン挿入を確認するゲル画像である。
【図４】ＬＺ１５６１及び不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼを有する（２８７ａ）変異体クロストリジウム・オートエタノゲナムによるアセトンのイソプロパノールへの変換（またはその欠如）を示すグラフである。
【図５Ａ】不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼを有する（４３３ｓ、３８８ａ）変異体クロストリジウム・オートエタノゲナムの培養物と比較されたＬＺ１５６１の培養物の４日間の増殖にわたって、光学密度（図５Ａ）、アセトンの変化（図５Ｂ）、及びイソプロパノールの変化（図５Ｃ）により測定された増殖を示すグラフである。
【図５Ｂ】不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼを有する（４３３ｓ、３８８ａ）変異体クロストリジウム・オートエタノゲナムの培養物と比較されたＬＺ１５６１の培養物の４日間の増殖にわたって、光学密度（図５Ａ）、アセトンの変化（図５Ｂ）、及びイソプロパノールの変化（図５Ｃ）により測定された増殖を示すグラフである。
【図５Ｃ】不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼを有する（４３３ｓ、３８８ａ）変異体クロストリジウム・オートエタノゲナムの培養物と比較されたＬＺ１５６１の培養物の４日間の増殖にわたって、光学密度（図５Ａ）、アセトンの変化（図５Ｂ）、及びイソプロパノールの変化（図５Ｃ）により測定された増殖を示すグラフである。
【図６Ａ】ＬＺ１５６１の安定な連続培養にＣＯ含有製鉄所ガスを基質として供給した場合の、高濃度及び高率でのアセトンのイソプロパノールへの完全な変換を示すグラフである。供給濃度は各グラフの下に示される。
【図６Ｂ】ＬＺ１５６１の安定な連続培養にＣＯ含有製鉄所ガスを基質として供給した場合の、高濃度及び高率でのアセトンのイソプロパノールへの完全な変換を示すグラフである。供給濃度は各グラフの下に示される。
【図７】不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼを有する変異体クロストリジウム・オートエタノゲナムの発酵の１１〜１４日目のアセテート（三角形）、エタノール（ひし形）、及びバイオマス（四角形）の濃度を示すグラフである。アセトンは、発酵槽に１１日目に、ＭＥＫは１２日目に供給された。
【図８】ＨＰＬＣにより検出されたアセトン（三角形）ならびにイソプロパノール（ひし形）の濃度、及び希釈率１．６でのアセトンについての理論的ウォッシュアウト曲線（点線）を示すグラフである。この不一致は、アセトンのガス揮散に起因する。
【図９】ＬＺ１５６１及び不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼを有する（２８７ａ）変異体クロストリジウム・オートエタノゲナムによるＭＥＫの２−ブタノールへの変換（またはその欠如）を示すグラフである。
【図１０】ＨＰＬＣにより検出されたＭＥＫ（三角形）ならびに２−ブタノール（ひし形）濃度、及び希釈率１．６でのＭＥＫについての理論的ウォッシュアウト曲線（点線）を示すグラフである。この不一致は、ＭＥＫのガス揮散に起因する。
【図１１】不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼを有する変異体クロストリジウム・オートエタノゲナムにおける連続発酵中のＣＯからのアセトンの生成を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
二級アルコールデヒドロゲナーゼは、カルボニル含有化合物をアルコールに変換する。したがって、二級アルコールデヒドロゲナーゼを含有する細菌は、アセトン及びＭＥＫなどのカルボニル含有化合物を、それぞれイソプロパノール及び２−ブタノールなどのアルコールに変換することができる。本発明は、二級アルコールデヒドロゲナーゼを欠如する、または不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む、組換え酢酸生成性のカルボキシド栄養性細菌を提供する。具体的には、不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼは、不活性化突然変異を含む二級アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子によってコードされ得、この不活性化突然変異は、アセトンをイソプロパノールに変換し、またＭＥＫを２−ブタノールに変換する細菌能能力を低減する。この不活性化突然変異が、カルボニル含有化合物の蓄積をもたらすために、本発明は、アセトン及びＭＥＫなどのカルボニル含有化合物を生成する方法も提供する。
【００１４】
カルボニルは、アルデヒドまたはケトンなどの、酸素原子に二重結合された炭素原子から構成される官能基である。カルボニル含有化合物としては、例えば、アセトイン、アセトン、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）（すなわち、２−ブタノン）、及びアセトアルデヒドが含まれる。
【００１５】
アルコールは、ヒドロキシル官能基が、飽和炭素原子に結合されている有機化合物である。アルコールとしては、例えば、イソプロパノール及び２−ブタノールが含まれる。
【００１６】
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）は、アルデヒドまたはケトン（アセトンなど）とアルコール（イソプロパノールなど）との間の相互変換を触媒する酵素のグループである。一級アルコールデヒドロゲナーゼは、アルデヒドを一級アルコールに変換することができ、または、逆も同様であり、二級アルコールデヒドロゲナーゼは、ケトンを二級アルコールに変換することができ、または、逆も同様である。さらに、いくつかのアルコールデヒドロゲナーゼは、アルデヒドを一級アルコールに（または、逆も同様）、かつケトンを二級アルコールに（または、逆も同様）変換することができる。これらのアルコールデヒドロゲナーゼは、一級−二級アルコールデヒドロゲナーゼと称されてもよく、なぜなら、これらは、一級アルコールデヒドロゲナーゼと、二級アルコールデヒドロゲナーゼとの両方の活性を示すためである。本明細書で使用される用語「アルコールデヒドロゲナーゼ」及び「二級アルコールデヒドロゲナーゼ」は、二級アルコールデヒドロゲナーゼと一級−二級アルコールデヒドロゲナーゼとの両方を包含する。
【００１７】
この細菌は、二級アルコールデヒドロゲナーゼを欠如してもよく、または二級アルコールデヒドロゲナーゼを発現しないように遺伝子操作されてもよい。具体的には、二級アルコールデヒドロゲナーゼを欠如するクロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイ（二級アルコールデヒドロゲナーゼを有することが知られている酢酸生成性細菌はこれらの種のみである）に由来の細菌であってもよい。
【００１８】
不活性化突然変異は、酵素、例えば、二級アルコールデヒドロゲナーゼまたは一級−二級アルコールデヒドロゲナーゼの活性を、低減し、実質的に排除し、または完全に排除する任意の突然変異である。この不活性化突然変異は、挿入、欠失、置換、もしくはナンセンス突然変異、または酵素の活性を低減または排除する任意の他のタイプの突然変異であってもよい。この不活性化突然変異は、細菌の酵素活性を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％まで低減することができる。酵素活性は、酵素の機能を低減することによって、または酵素の量を低減することによって、低減または排除されてもよい。不活性化突然変異を導入する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、不活性化突然変異は、化学的突然変異生成、トランスポゾン突然変異生成、ウイルス突然変異生成、またはインビトロ突然変異生成によって、行われてもよい。
【００１９】
核酸配列及びアミノ酸配列に関する、用語「由来する」とは、親もしくは野生型核酸配列またはアミノ酸配列の修飾を指す。例えば、不活性化突然変異を含む二級アルコールデヒドロゲナーゼ核酸配列またはアミノ酸配列は、それぞれ、不活性化突然変異を含まない親もしくは野生型核酸配列またはアミノ酸配列に由来し得る。好ましい実施形態では、不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼは、配列番号１のアミノ酸を含む野生型二級アルコールデヒドロゲナーゼに由来する。不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、配列番号２または配列番号３を含む核酸配列に由来してもよい。
【００２０】
本発明は、核酸が、実質的に同一の機能を実行するという条件で、その配列が本明細書に具体的に例示された配列とは異なる核酸を用いて実施されてもよい。タンパク質またはペプチドをコードする核酸配列については、これは、コード化タンパク質またはペプチドが、実質的に同一の機能を実行することを意味する。プロモータの核酸配列については、変異体配列は、１つ以上の遺伝子の発現を促進する能力を有するであろう。このような核酸は、「機能的に等価な変異体」と称されてもよい。例として、核酸の機能的に等価な変異体としては、対立遺伝子変異体、遺伝子の断片、遺伝子多型等が含まれる。他の微生物からの相同遺伝子は、本明細書に具体的に例示された配列の機能的に等価な変異体の例である。これらは、その配列情報が、ＧｅｎＢａｎｋまたはＮＣＢＩなどのウェブサイト上で公開されている、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ、またはクロストリジウム・ノビイ（Ｃ．ｎｏｖｙｉ）などの種における相同遺伝子を含まれる。フレーズ「機能的に等価な変異体」はまた、その配列が特定の生物に対するコドン最適化の結果として変化する核酸も含む。核酸の機能的に等価な変異体は、好ましくは、同定された核酸と、少なくともおよそ７０％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ８５％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、またはそれ以上の核酸配列同一性を有するであろう。
【００２１】
さらに、本発明は、酵素またはタンパク質が、実質的に同一の機能を実行するとの条件で、その配列が本明細書に具体的に例示された配列とは異なる酵素またはタンパク質を用いて、実施されてもよい。これらの変異体は、「機能的に等価な変異体」と称されてもよい。タンパク質またはペプチドの機能的に等価な変異体は、同定されたタンパク質またはペプチドと、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上のアミノ酸同一性を共有するこれらのタンパク質またはペプチドを含む。このような変異体は、タンパク質またはペプチドの断片を含み、この断片は、欠失が１個から５個まで、１０個まで、１５個まで、２０個まで、２５個までのアミノ酸であり得る、ポリペプチドの切断型を含む。欠失は、ポリペプチドのいずれかの末端で残基１〜２５まで延びてもよく、領域内の任意の長さであってもよく、または基質もしくは補因子の特異的触媒機能及び活性あるいは結合を授与するタンパク質の内部位置もしくは特異的ドメインにあってもよい。特異的な酵素またはタンパク質の機能的に等価な変異体は、例えば、前の段落で例示されたように、細菌の他の種の相同遺伝子によって発現されるポリペプチドも含む。
【００２２】
本発明の核酸配列及びアミノ酸配列は、外来性または内在性であってもよい。一実施形態では、外来性核酸は、微生物によって本来生成されない遺伝子を発現させるために、または微生物によって本来生成される遺伝子を過発現させるために、導入される。さらに、外来性核酸は、遺伝子のコピー数を増加させ、強力なもしくは構成的なプロモータを導入し、または調節エレメントを導入することができる。外来性核酸は、微生物のゲノムに組み込んでもよく、または染色体外状態で維持してもよい。
【００２３】
組換え核酸、タンパク質、または微生物は、一緒に結合された異なる個体、異なる種、または異なる属の部分を含有する。通常、これは、複合核酸が形成されるように、組換えＤＮＡ技術を用いてなされる。複合核酸は、例えば、複合タンパク質を作成するために使用され得る。これは、融合タンパク質を作成するよう使用され得る。この複合核酸を維持しかつ複製し、任意にタンパク質を、任意には複合タンパク質を発現する微生物を形質転換するために用いることができる。本発明の細菌は、組換え、すなわち非野生型である。
【００２４】
立体特異的タンパク質は、鏡像異性体を区別して認識し、また鏡像異性体との異なる反応を触媒する。したがって、１つのみの鏡像異性体が反応してもよく、または各鏡像異性体が、別個の生成物を産生してもよい。
【００２５】
「減衰発現」とは、親微生物中の発現と比べて減少されている核酸またはタンパク質の発現を指す。減衰発現はまた、核酸またはタンパク質が全く発現されていないことを指す「ゼロ」発現も含む。この「ゼロ」発現は、ＲＮＡサイレンシング、発現プロセスの修正（例えば、プロモータ機能の崩壊）、または酵素をコードする核酸のゲノムからの完全もしくは部分的除去（ノックアウト）を含める、当業者に既知の任意の方法によって達成されてもよい。
【００２６】
用語核酸「構築物」または「ベクター」及び類似用語は、遺伝物質を細胞に導入するためのビヒクルとしての使用に好適な任意の核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡを含める）を包含するように広範囲にとられるべきである。この用語は、プラスミド、ウイルス（バクテリオファージを含める）、コスミド、及び人工染色体を包含するよう取られるべきである。構築物またはベクターは、１つ以上の調節エレメント、複製開始点、マルチクローニング部位、及び／または選択マーカーを含んでもよい。構築物またはベクターは、構築物またはベクターによってコードされる１つ以上の遺伝子の発現を可能にするように適合され得る。核酸構築物またはベクターは、裸の核酸ならびに細胞への送達を容易にするための１つ以上の薬剤と調合された核酸（例えば、リポソーム結合核酸）を含む。
【００２７】
外来性核酸は、当該技術分野において既知の任意の方法を用いて、細菌に導入され得る。例えば、形質転換（形質導入またはトランスフェクションを含める）は、電気穿孔法、超音波処理、ポリエチレングリコール媒介形質転換、化学的もしくは自然的競合、プロトプラスト形質転換、プロファージ誘発もしくは接合によって達成され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９参照）。
【００２８】
電気穿孔法の使用は、クロストリジウム・リュングダリイ（Ｋｏｐｋｅ，ＰＮＡＳ，１０７：１３０８７−１３０９２，２０１０、国際公開第２０１２／０５３９０５号）、クロストリジウム・オートエタノゲナム（国際公開第２０１２／０５３９０５号）、クロストリジウム・アセチカム（Ｃ．ａｃｅｔｉｃｕｍ）（Ｓｃｈｉｅｌ−Ｂｅｎｇｅｌｓｄｏｒｆ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｂｉｏｌ，１５：  ２１９１−２１９８，２０１２）、及びアセトバクテリウム・ウッディ（Ａ．ｗｏｏｄｉｉ）（Ｓｔｒaｔｚ，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，６０：１０３３−１０３７，１９９４）を含む、いくつかのカルボキシド栄養性酢酸生成菌について報告されている。電気穿孔法の使用は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（Ｍｅｒｍｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１０：１９０−１９５，１９９２）、及びクロストリジウム・セルロリチカム（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）（Ｊｅｎｎｅｒｔ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１４６：３０７１−３０８０，２０００）を含めるクロストリジウム菌でも報告されている。さらに、プロファージ誘発は、クロストリジウム・スカトロゲネス（Ｃ．ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ）を含めるカルボキシド栄養性酢酸生成菌について立証され（Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ  ２５７７５  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｔａｎｔｓ，Ｍａｓｔｅｒｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｋｅｎｔｕｃｋｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１０）、接合は、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｈｅｒｂｅｒｔ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ，２２９：１０３−１１０，２００３）及びクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３６：８１９−８２６，１９９０）を含める多くのクロストリジウム菌について記述されている。同様の方法を、カルボキシド栄養性酢酸生成菌において用いることができた。
【００２９】
外来性核酸のメチル化は、特定の制限系が、宿主微生物中で活性である場合、必要とされる場合がある。
【００３０】
シャトル微生物は、メチルトランスフェラーゼ酵素が発現される微生物であり得、目的微生物とは区別される。シャトル微生物は、生合成後修飾を遺伝子操作された核酸に導入するために用いることができ、これは、最終の宿主生物中の遺伝子操作された核酸を保護することになる。目的微生物は、逆に言えば、発現構築物／ベクター中に含まれる遺伝子が発現される微生物であり、シャトル微生物とは区別される。
【００３１】
この細菌は、任意の組換えカルボキシド栄養性の酢酸生成性細菌であり得る。「組換え」とは、野生型または親微生物から遺伝子修飾されている微生物を指す。「カルボキシ栄養性」とは、一酸化炭素の高濃度に耐え得る微生物、好ましくは細菌を指す。「酢酸生成菌」とは、酢酸塩／酢酸を嫌気性発酵の生成物として自然に生成する微生物、好ましくは細菌を指す。
【００３２】
具体的には、この細菌は、クロストリジウム属に属することができる。例えば、この細菌は、クロストリジウム・アセチカム、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ベイジェリンキー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、クロストリジウム・カルボキシドビランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｏｖｉｒａｎｓ）、クロストリジウム・セルロリチカム、クロストリジウム・セルロボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・ジオリス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｏｌｉｓ）、クロストリジウム・ドラケイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ）、クロストリジウム・フォルミコアセチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・クルイベリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・マグナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｍａｇｎｕｍ）、クロストリジウム・ノビイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｏｖｙｉ）、クロストリジウム・パステリアニウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｒｉａｎｉｕｍ）、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、クロストリジウム・ラグスダレイ、クロストリジウム・サッカロブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、クロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）、クロストリジウム・スカトロゲネス、クロストリジウム・テルモセルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、またはこれらに由来の細菌であってもよい。この細菌は、酢酸生成性のカルボキシド栄養性細菌であり得る。好ましい実施形態では、この細菌は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイに由来する。この細菌は、クロストリジウム・オートエタノゲナム  ＤＳＭ１００６１、クロストリジウム・オートエタノゲナム  ＤＳＭ２３６９３（ＬＺ１５６１、クロストリジウム・オートエタノゲナム  ＤＳＭ１００６１の誘導体）、またはクロストリジウム・リュングダリイ  ＤＳＭ１３５２８に由来してもよい。好ましい実施形態では、この細菌は、不活性化突然変異を含む二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むクロストリジウム・オートエタノゲナム  ＤＳＭ２３６９３である。
【００３３】
他の細菌が用いられてもよい。例えば、この細菌は、アセトバクテリウム属、アルカリゲネス属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、カンジダ属、コリネバクテリウム属、エンテロコッカス属、大腸菌属、クレブシエラ属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、パエニバチルス属、ピチア属、シュードモナス属、ラルストニア属、ロドコッカス属、サッカロマイセス属、アルモネラ属、トリコデルマ属、またはザイモモナス属に属してもよい。具体的には、この細菌は、アセトバクテリウム・ウッディ、アルカリバクラム・バッティ（Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｃｃｈｉｉ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ブラウティア・プロダクタ（Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ）、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム（Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ユーバクテリウム・リモスム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、モーレラ・サーマウトトロフィカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、モーレラ・サーモアセティカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）、オキソバクター・フェニジイ（Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ  ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、スポロミューサ・オヴァタ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｏｖａｔａ）、スポロミューサ・シルバセチカ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ）、スポロミューサ・スファエロイデス（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、サーモアナエロバクター・キウヴ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｕｖ）、トリコデルマ・ローゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、またはこれらに由来する細菌であってもよい。
【００３４】
微生物（例えば、細菌）に関する用語「由来する」とは、親もしくは野生型微生物の修飾を指す。不活性化突然変異を含む二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含む細菌は、不活性化突然変異を含まない二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含む親もしくは野生型細菌に、または二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含まない親もしくは野生型細菌に由来してもよい。この細菌は、人工的もしくは自然の選択、突然変異、または遺伝子組換えなどの当該技術分野において既知の任意の方法を用いて、親もしくは野生型細菌に由来してもよい。親微生物は、以前に修飾されたが、本発明の１つ以上の酵素を発現しない、または過発現する生物であってもよい（例えば、ＬＺ１５６１）。好ましい実施形態では、この細菌は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイに由来する。特に好ましい実施形態では、この細菌は、受託番号ＤＳＭ２３６９３としてＤＳＭＺに寄託されているクロストリジウム・オートエタノゲナム（すなわち、ＬＺ１５６１）に由来する。
【００３５】
この細菌は、単離され得る。例えば、この細菌は、その天然の環境から、２つ以上の微生物を含む培養物から、または単一の微生物の異種（遺伝学的に異なる）集団を含む培養物から、物理的に単離されてもよい。単一細菌から増殖したコロニーまたは培養物も、単離されているとみなされる。
【００３６】
この細菌は、アルデヒドまたはケトンなどのカルボニル含有化合物を生成するための生合成経路中の１つ以上の酵素を発現または過発現するようにさらに修飾されてもよい。この生合成経路は、細菌にとって、内在性、部分的に内在性、または完全に内在性であってもよい。この生合成経路は、例えば、外来性酵素または他の種もしくは属に由来する酵素を含んでもよい。場合によっては、外来性酵素は、内在性酵素と協力して働き、その細菌中には本来存在しない生合成経路を形成してもよい。例えば、アセトンの生成は、本来アセトンを生成しない微生物中で立証されている（国際公開第２０１２／１１５５２７号）。チオラーゼ、ｃｏＡ−トランスフェラーゼ、及びアセトアセテートデカルボキシラーゼなどの酵素をコードする遺伝子が細菌に添加され、この細菌がアセトンを生成することを可能にしてもよい。これに加えて、または代えて、外来性プロパンジオールデヒドラターゼが細菌に添加され、この細菌がメソ−２，３−ブタンジオールを２−ブタノン（ＭＥＫ）に変換することを可能にしてもよい。外来性プロパンジオールデヒドラターゼは、クレブシエラ・オキシトカに由来してもよい。
【００３７】
ガス発酵は、ガス状基質が、エタノールまたは他の生成物もしくは化学物質の生成のための炭素及び／またはエネルギー源として用いられる代謝プロセスである。本明細書で使用される用語「発酵」は、プロセスの増殖期及び生成物生合成期の両方を包含する。ガス発酵は、微生物、通常は細菌によって行われる。
【００３８】
細菌培養物は、十分な供給源を培養物に提供する任意の液体栄養培地中で増殖させることができる。液体栄養培地は、例えば、ビタミン、ミネラル、及び水を含有し得る。好適な液体栄養培地は、当該技術分野で既知であり、エタノールまたは他の生成物の発酵に好適な嫌気性培地が含まれる（例えば、米国特許第５，１７３，４２９号、同第５，５９３，８８６号、及び国際公開第２００２／０８４３８号を参照）。
【００３９】
細菌培養物は、リアクター（バイオリアクター）内に含まれ得る。このリアクターは、細菌培養物の増殖のための１つ以上の容器及び／または塔もしくは配管を有する任意の発酵装置であってもよい。このリアクターは、例えば、固定化菌体リアクター、ガスリフトリアクター、気泡塔リアクター（ＢＣＲ）、循環ループリアクター、中空糸膜型バイオリアクター（ＨＦＭ  ＢＲ）などの膜型リアクター、連続流撹拌槽リアクター（ＣＳＴＲ）、またはトリクルベッドリアクター（ＴＢＲ）であってもよい。リアクターは、ＣＯ、ＣＯ２、及び／またはＨ２を含むガス状基質を受容するように適合されていることが好ましい。リアクターは、平行にまたは直列のいずれかに並んだ複数のリアクター（ステージ）を備えてもよい。例えば、リアクターは、細菌が培養される第１の増殖リアクターと、増殖リアクターからの発酵ブロスが送り込まれ得、発酵生成物の大部分が生成され得る第２の発酵リアクターとを備えてもよい。
【００４０】
発酵は、望ましくは、カルボニル含有化合物の生成が生じるために適切な発酵条件下で行われるべきである。考慮されるべき反応条件としては、圧力、温度、ガス流量、液体流量、培地のｐＨ、培地の酸化還元電位、撹拌速度（連続撹拌槽リアクターを用いる場合）、接種レベル、液相中のＣＯが制限されるようにならないことを保証する最大ガス基質濃度、及び生成物阻害を回避するための最大生成物濃度が含まれる。
【００４１】
発酵プロセスに関して使用される場合、用語「効率を高める」、「効率の増大」等は、発酵を触媒する微生物の増殖の速度、生成物の高濃度における増殖及び／または生成物の生成速度、消費される基質の容量当たりの生成される望ましい生成物の容量、所望の生成物の生成速度もしくは生成レベル、及び発酵の他の副産物と比較しての生成された所望の生成物の相対比率のうちの１つ以上を増加させることが含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
ガス状基質（「ガス」または「供給ガス」もしくは「発酵ガス」あるいは「基質」）は、発酵において炭素及び／またはエネルギー源として微生物によって使用される化合物もしくは元素を含有する任意のガスであってもよい。ガス状基質は、通常、かなりの割合のＨ２、ＣＯ２、及び／またはＣＯを含有することになり、さらに、Ｎ２または他のガスを含有してもよい。一実施形態では、ガス状基質は、ＣＯを含む。別の実施形態では、ガス状基質は、Ｈ２、ＣＯ２、及び／またはＣＯを含む。さらなる実施形態では、ガス状基質は、Ｏ２を含まないか、実質的に含まない。
【００４３】
ガス状基質の厳密な組成は、様々であってよい。ガス状基質は、例えば、約２０％〜約１００体積％のＣＯ、約２０％〜約７０体積％のＣＯ、約３０％〜６０体積％のＣＯ、または約４０％〜約５５体積％のＣＯを含有してもよい。具体的には、ガス状基質は、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％のＣＯ、約５５％のＣＯ、または６０体積％のＣＯを含有してもよい。ガス状基質は、例えば、約１％〜８０体積％のＣＯ２、または約１％〜約３０体積％のＣＯ２を含有してもよい。ガス状基質は、例えば、約２０％未満のＣＯ２、約１５％未満のＣＯ２、約１０％未満のＣＯ２、約５％未満のＣＯ２、または約０体積％のＣＯ２（実質的には存在しない）を含有してもよい。ガス状基質がＨ２を必ずしも含有する必要はないが、Ｈ２の存在は、所望の生成物の生成の改善された全体の効率をもたらす場合がある。ガス状基質は、例えば、Ｈ２：ＣＯの２：１、１：１、または１：２の比を含む。ガス状基質は、例えば、約３０％未満のＨ２、約２０％未満のＨ２、約１５％未満のＨ２、または約１０体積％未満のＨ２を含んでもよい。他の実施形態では、ガス状基質は、低濃度のＨ２、例えば、約５％未満のＨ２、約４％未満のＨ２、約３％未満のＨ２、約２％未満のＨ２、約１％未満のＨ２、または約０体積％のＨ２（実質的には存在しない）を含んでもよい。
【００４４】
さらに、ＣＯが基質である発酵反応の効率を増加させるために、基質流のＣＯ濃度（またはガス状基質中のＣＯ分圧）を増加させることが、多くの場合に望ましい。増大した圧力において運転することは、ＣＯのガス相から、ＣＯが微生物によって取り込まれ得る液相への移動の速度を著しく増加させる。これが、今度は、投入ガス流量で割られたバイオレアクター内の液体容量として定義される保持時間を低減する。最適な反応条件は、使用される特定の微生物に部分的には依存するであろう。しかしながら、一般には、周囲圧力よりも高い圧力で、発酵を行うことが好ましい。また、所定のＣＯ変換率が、一部分は、基質保持時間の関数であり、所望の保持時間を達成することが、バイオリアクターの必要とされる容積を規定するために、加圧系の使用は、必要とされるバイオリアクターの容積を大きく低減することができ、結果的に、発酵装置の資本費用を低減することができる。米国特許第５，５９３，８８６号に提供された例によると、リアクター容積は、リアクター動作圧の減少に線形比例して低減され得る。例えば、１０気圧で操作されるバイオリアクターは、１気圧で操作されるものの１０分の１の容積を必要とするに過ぎない。
【００４５】
発酵反応を供給するために用いられるガス流の組成は、発酵反応の効率及び／またはコストに及ぼす大きな影響を有し得る。例えば、Ｏ２の存在は、嫌気性発酵プロセスの効率を低下させる場合がある。発酵前後の発酵プロセスのステージにおける望ましくない、もしくは不必要なガスの処理は、ステージのエネルギー負荷を増加させ得る。例えば、ガス流が、バイオリアクターに入る前に圧縮される場合、エネルギーは、発酵に必要とされないガスを圧縮するために用いられる場合がある。
【００４６】
ガス状基質は、工業プロセスから供給されてもよい。具体的には、ガス状基質は、重金属類製品製造業（例えば、製鋼業）、非重金属類製品製造業、石油精製、石炭ガス化、電力生産、カーボンブラック製造、アンモニア製造、メタノール製造、またはコークス製造などの工業プロセスによって発生した廃棄ガスであってもよい。好ましい実施形態では、ガス状基質は、製鋼業のガスに由来する。
【００４７】
ガス状基質は、メタン、エタン、プロパン、石炭、天然ガス、原油、精油所からの低価値残留物（石油コークスまたはペットコークを含む）、固形の一般廃棄物、またはバイオマスなどの有機物質のガス化から供給されてもよい。バイオマスは、サトウキビからの糖、トウモロコシもしくは穀物からのデンプンなどの食糧の抽出もしくは加工中に得られた副産物、または林業によって生成された非食品バイオマス廃棄物を含む。これらの炭素質材料のいずれも、ガス化、すなわち、酸素によって部分的に燃焼され、合成ガス（シンガス）を生成することができる。シンガスは、通常、主として、ＣＯ、Ｈ２、及び／またはＣＯ２を含み、メチレン、エチレン、エタン、または他のガス量をさらに含有してもよい。ガス化装置の動作条件は、発酵プロセスにおける増加したアルコール生産性及び／または全体の炭素捕捉に最適化された、または望ましい組成を提供するために、発酵に望ましい組成を有する基質流または１つ以上の他の流れとの配合を提供するように調整され得る。
【００４８】
化学的または物理的不純物もしくは汚染物質を除去するために、ガス状基質が発酵プロセスで使用される前に、これを濾過し、こすって洗い流し、そうでなければ前処理することが望ましい場合がある。例えば、原料ガスは、水を通過させるか、そうでなければ濾過され、微粒子状物質、長鎖炭化水素、またはタールを除去してもよい。しかしながら、このような濾過または前処理は、必ずしも必要ではない。濾過されていない、未処理のガス状基質が、発酵培養物に直接提供されることも場合によっては可能である。
【００４９】
ガス状基質は、通常、ガスの形態で提供されるが、用語「ガス状基質」はまた、代替形態で提供されたＣＯ、ＣＯ２、及び／またはＨ２を含む基質も包含する。例えば、ＣＯを含有するガス状基質は、液体中に溶解されて提供されてもよい。基本的には、液体は、ＣＯ含有ガスで飽和され、次いでバイオリアクターに添加されてもよい。例示の方法は、マイクロバブル分散発生装置（Ｈｅｎｓｉｒｉｓａｋ，Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１０１：２１１−２２７，２００２）及び固体支持体上のガス状基質の吸着の使用を含む。
【００５０】
本発明は、不活性化突然変異を含む二級アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子によってコードされる不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む細菌を培養し、これによって、この細菌が、アセトン及びＭＥＫのうちの１つ以上を生成することによって、アセトンまたはＭＥＫなどのケトンを生成する方法をさらに提供する。この方法は、アセトンまたはＭＥＫを培養物から回収することをさらに含んでもよい。
【実施例】
【００５１】
以下の実施例は、本発明をさらに例証するが、当然のことながら、その範囲を多少なりとも限定するものと解釈されるべきではない。
【００５２】
実施例１
本実施例は、一般的な材料及び方法を記述する。
【００５３】
微生物及び増殖条件
【００５４】
クロストリジウム・オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１ならびにＤＳＭ２３６９３（ＤＳＭ１００６１に由来）、及びクロストリジウム・リュングダリイＤＳＭ１３５２８  は、ＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａsｅ  ７  Ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から供給された。クロストリジウム・ラグスダレイＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６２２は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１０８，ＵＳＡ）から供給され、大腸菌ＤＨ５αは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ  ９２００８，ＵＳＡ）から供給された。
【００５５】
大腸菌を、培地１．０Ｌ当たり１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母エキス、及び１０ｇのＮａＣｌを含有するＬＢ（ルリア−ベルターニ）培地中、３７℃で増殖させた。固体培地は、１．５％の寒天を含有した。
【００５６】
クロストリジウム菌株を、標準嫌気性技術（Ｈｕｎｇａｔｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３Ｂ：１１７−１３２，１９６９、Ｗｏｌｆｅ，Ａｄｖ  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，６：１０７−１４６，１９７１）を用いて、ｐＨ５．６のＰＥＴＣ培地中、３７℃で増殖させた。フルクトース（従属栄養増殖）またはヘッドスペース（独立栄養増殖）内の３０ｐｓｉのＣＯ含有製鉄所ガス（Ｇｌｅｎｂｒｏｏｋ，ＮＺのＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｓｔｅｅｌ敷地内で採集；組成：４４％ＣＯ、３２％Ｎ２、２２％ＣＯ２、２％Ｈ２）を基質として使用した。固体培地については、１．２％のＢａｃｔｏ寒天（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ  ０７４１７，ＵＳＡ）を添加した。
【表１】
2016538869.tif 000003
【表２】
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【表３】
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【００５７】
クロストリジウム・オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３を用いる発酵を、ＣＯ含有製鉄所ガスを唯一のエネルギー及び炭素源として用いて、１．５Ｌのバイオリアクター内で３７℃にて行った。ＭｇＣｌ、ＣａＣｌ２（０．５ｍＭ）、ＫＣｌ（２ｍＭ）、Ｈ３ＰＯ４（５ｍＭ）、Ｆｅ（１００μＭ）、Ｎｉ、Ｚｎ（５μＭ）、Ｍｎ、Ｂ、Ｗ、Ｍｏ、Ｓｅ（２μＭ）を含有する規定培地を調製した。この培地を、バイオリアクターに移し、１２１℃で４５分間オートクレーブ処理した。オートクレーブ処理後に、培地を、チアミン、パントテン酸塩（０．０５ｍｇ／Ｌ）、ビオチン（０．０２ｍｇ／Ｌ）で補充し、３ｍＭのシステイン−ＨＣｌで還元した。リアクター容器を、０．２μｍのフィルターを通して窒素でパージし、嫌気性条件を達成した。接種前に、ガスを、リアクターに連続供給されるＣＯ含有製鉄所ガスに切り換えた。ガス流を、最初に８０ｍｌ／分に設定し、撹拌を２００ｒｐｍから３５０ｒｐｍまで増加させながら、等比級数増殖期中に２００ｍｌ／分まで増加させた。Ｎａ２Ｓを、０．２５ｍｌ／時でバイオリアクターに投与した。ＯＤ６００が０．５に達したら、バイオリアクターを、１．０ｍｌ／分（希釈倍率０．９６ｄ−１）の連続モードに切り換えた。サンプルを取り出し、バイオマス及び代謝物質を測定し、流入及び流出ガスを分析した。
【００５８】
代謝物質の分析
ヘッドスペースのガス組成を、２つ設置チャネルを備えたＶａｒｉａｎ  ＣＰ−４９００  ｍｉｃｒｏ  ＧＣで測定した。チャネル１は、７０℃、２００ｋＰａのアルゴン、及び４．２秒のバックフラッシュタイムで運転する１０ｍの分子ふるいカラムであり、一方チャネル２は、９０℃、１５０ｋＰａのヘリウム、及びバックフラッシュ無しで運転する１０ｍのＰＰＱカラムであった。両カラムへのインジェクターの温度は、７０℃であった。運転時間を１２０秒に設定したが、関心の全ピークは、通常、１００秒前に溶出する。
【００５９】
代謝最終生成物のＨＰＬＣ分析を、３５℃で運転されるＲＩＤ（屈折率検出器）及び６０℃に保持されるＡｌｌｔｅｃｈ  ＩＯＡ−２０００有機酸カラム（１５０×６．５ｍｍ、粒径５μｍ）を装備したＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣシステムを用いて実施した。わずかに酸性の水（０．００５ＭのＨ２ＳＯ４）を、０．７ｍｌ／分の流量で、移動相として用いた。タンパク質及び他の細胞残渣を除去するために、４００μｌのサンプルを２％（ｗ／ｖ）の５−スルホサリチル酸１００μｌと混合し、１４，０００×ｇで３分間遠心分離し、沈殿残渣を分離した。次いで、分析のために、１０μｌの上清をＨＰＬＣに注入した。
【００６０】
代謝最終生成物のＧＣ分析を、Ｓｕｐｅｌｃｏ  ＰＤＭＳ  １００の１ｃｍのファイバ、Ａｌｌｔｅｃｈ  ＥＣ−１０００（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）カラム、及び水素炎イオン化検出器を装備したＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０ＮヘッドスペースＧＣを用いて実施した。５ｍｌのサンプルをＨｕｎｇａｔｅ管に移し、水浴中で４０℃に加熱し、ファイバに正確に５分間曝した。インジェクターを２５０℃に保った。ヘリウムをキャリアガスとして用いて、１ｍｌ／分の一定流量で維持した。オーブンを４０℃で５分間運転し、続いて１０℃／分で２００℃まで上昇させた。その後、温度を、５０℃／分の割合でさらに２２０℃まで上昇させて、続いてこの温度で５分間保持した。その後、温度を５０℃／分の割合で４０℃まで降下させて、続いてこの温度で１分間保持した。ＦＩＤを、メークアップガスとしての４０ｍｌ／分の水素、４５０ｍｌ／分の空気、及び１５ｍｌ／分の窒素を用いて、２５０℃に保った。
【００６１】
実施例２
本実施例は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイにおけるアセトンのイソプロパノールへの、またＭＥＫの２−ブタノールへの還元の要因である二級アルコールデヒドロゲナーゼの同定を立証する。
【００６２】
アセトンのイソプロパノールへの変換は、クロストリジウム・オートエタノゲナム（国際公開第２０１２／１１５５２７号）、クロストリジウム・リュングダリイ（国際公開第２０１２／１１５５２７号）、及びクロストリジウム・ラグスダレイ（国際公開第２０１２／１１５５２７号）などのカルボキシド栄養性細菌で記述されている（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒｉｙａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，１０８：２３３０−２３３８，２０１１）。クロストリジウム・ベイジェリンキーからの酵素（Ｉｓｍａｉｅｌ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７５：５０９７−５１０５，１９９３）に対して類似点を有する二級アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ；ＥＣ  １．１．１．２）も同定されている（国際公開第２０１２／１１５５２７号）。
【００６３】
クロストリジウム・オートエタノゲナムは、配列番号２の核酸配列によってコードされた、配列番号１のアミノ酸を有する二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む。クロストリジウム・リュングダリイは、クロストリジウム・リュングダリイのゲノム中の二級アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＮＣＢＩ  ＮＣ＿０１４３２８．１：２７５５５６５．．２７５６６２０、ＧｅｎｅＩＤ  ９４４６１０２、遺伝子座タグＣＬＪＵ−ｃ２４８６０）の核酸配列によってコードされた、配列番号１のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ  ＹＰ＿００３７８０６４６．１）を有する二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む。クロストリジウム・ラグスダレイは、配列番号３の核酸配列によってコードされた、配列番号１のアミノ酸配列を有する二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む。
【００６４】
この二級アルコールデヒドロゲナーゼ酵素が、アセトンのイソプロパノールへの変換の要因であることを立証するために、クロストリジウム・オートエタノゲナムの二級アルコールデヒドロゲナーゼを大腸菌中で過剰産生させ、その活性を測定した。配列番号２を、国際公開第２０１２／１１５５２７号に記載された通りに単離されたクロストリジウム・オートエタノゲナムのゲノムＤＮＡから増幅させ、ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを介してｐＢＡＤベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローンし、Ｓａｍｂｒｏｏｋに記載された標準法を用いて、電気穿孔法により大腸菌を形質転換させた。ＡＤＨ遺伝子の配列を、ＤＮＡシークエンシングによって確認した。形質転換細胞を、０．８のＯＤ６００に達するまで、アンピシリンを有する１００ｍＬのＬＢ中で３７℃にて増殖させた。この時点で、２０％アラビノース１ｍＬを添加し、残りの発現のために、培養物を２８℃でインキュベートした。細胞をペレット化させ、上清をデカントした。次いで、ペレットを、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭのＮａ−ＨＥＰＥＳ及び０．２ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０）中に再懸濁させ、ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（商標）（Ｍｅｒｃｋ、２５単位／μＬ）及びリゾチーム（Ｍｅｒｃｋ、３０ｋＵ／μＬ）の各０．２μＬを添加した。次いで、二級アルコールデヒドロゲナーゼを、固定化金属親和性クロマトグラフィーを用いて、融合Ｎ末端Ｈｉｓ６タグを介して精製した。氷上での３０分間のインキュベーション後に、細胞を超音波処理によって溶解し、不溶性破壊片をペレット化させ、０．２ミクロンのフィルターを用いて、上清を清澄化させた。清澄化された上清を、溶解用緩衝液で十分に洗浄されたＴＡＬＯＮ（商標）樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に添加した。５００μＬのベッドボリュームを精製用に用いて、タンパク質をＴＡＬＯＮ（商標）樹脂に４℃で１時間結合させ、次いで溶解用緩衝液で数回洗浄した。１５０ｍＭのイミダゾールで補充された溶解用緩衝液を用いて、タンパク質をカラムから溶離させ、その後、溶離液を、５００μｌのフラクションで採集した。精製プロセスを通して採取されたアリコート、ならびに溶離フラクションを、ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上を泳動させ、タンパク質の存在を確認し、精製の成功を判定した。ＡＭＩＣＯＮ（商標）Ｕｌｔｒａ−４遠心力フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、タンパク質を保存用緩衝液（５０ｍＭのリン酸カリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％ｖ／ｖのグリセロール、ｐＨ７．０）に取り換えた。このタンパク質は、大腸菌中で発現される場合、高度に可溶性であり、容易に精製された。活性アッセイを、０．２ｍＭの濃度のＮＡＤＰＨを補因子として、また３ｍＭのＭＥＫを基質として用いて、クオーツキュベットを備えたＵＶ／可視分光光度計で行った。アッセイ混合物は、１ｍＭのＤＴＴと共に、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を含有した。クロストリジウム・オートエタノゲナムの二級アルコールデヒドロゲナーゼは、アセトンのイソプロパノールへの還元に対する活性を示した。加えて、ＭＥＫの２−ブタノールへの、アセトインの２，３−ブタンジオールへの、及びアセトアルデヒドのエタノールへの還元も見出された。最高の活性は、アセトンで見られ、続いてＭＥＫで見られた（図１）。
【００６５】
二級アルコールデヒドロゲナーゼに加えて、イソプロパノールに対する活性を有する２つのブタノールデヒドロゲナーゼ（ＢＤＨ）酵素が記載されている（Ｔａｎ，Ｊ  Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，５４：９９６−１００４，２０１３）。これらのブタノールデヒドロゲナーゼもまた、クロストリジウム・オートエタノゲナム及びクロストリジウム・ラグスダレイ中に存在する。
【００６６】
実施例３
本実施例は、クロストリジウム・オートエタノゲナム中の二級アルコールデヒドロゲナーゼの不活性化を立証する。
【００６７】
クロストリジウム・オートエタノゲナムの同定された二級アルコールデヒドロゲナーゼ（配列番号２）を、ＣｌｏｓＴｒｏｎシステム（Ｈｅａｐ，Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈ，７０：４５２−４６４，２００７）を用いて、不活性化させた。ＣｌｏｓＴｒｏｎウェブサイト上で提供されるイントロン設計ツールを用いて、３４４ｂｐの標的化領域（配列番号４）を設計し、ならびにセンス及びアンチセンス鎖上で６つの標的部位（図２）  を同定した。標的化領域は、レトロ転位活性化ｒｍＢマーカー（ＲＡＭ）を含有するベクターｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２中で化学的に合成した。
【００６８】
ベクターを、国際公開第２０１２／０５３９０５号に記載された通りに、クロストリジウム・オートエタノゲナムに導入した。１５μｇ／ｍｌのチアンフェニコールを含むＰＥＴＣ  ＭＥＳ上で増殖させた単一コロニーを、５μｇ／ｍｌのクラリスロマイシンを含むＰＥＴＣ  ＭＥＳ上に植菌した。各標的からのコロニーを無作為に拾い上げ、フランキングプライマー１５５Ｆ（配列番号５）及び９３９Ｒ（配列番号６）を用いて、挿入についてスクリーニングした。ｉＮｔｒｏｎ  Ｍａｘｉｍｅ  ＰＣＲプレミックスを用いて、増幅を実施した。７８３ｂｐのＰＣＲ生成物は、ＬＺ１５６１遺伝子型を示したが、一方生成物サイズはおよそ２．６ｋｂであり、標的部位内のグループＩＩイントロンの挿入を示唆した（図３）。プラスミドの損失を、耐性マーカー（ｃａｔＰ）の増幅、及びグラム陽性複製開始点（ｐＣＢ１０２）の増幅用のプライマーＣａｔＲ（ＴＴＣＧＴＴＴＡＣＡＡＡＡＣＧＧＣＡＡＡＴＧＴＧＡ、配列番号７）及びＲｅｐＨＦ（ＡＡＧＡＡＧＧＧＣＧＴＡＴＡＴＧＡＡＡＡＣＴＴＧＴ、配列番号８）を有するプライマーを用いて、ＰＣＲによって確認した。
【００６９】
同じ戦略及びプラスミドを、クロストリジウム・リュングダリイまたはクロストリジウム・ラグスダレイにも適用することができる。形質転換プロトコールは、以前に記述されている（国際公開２０１２／０５３９０５号）（Ｌｅａｎｇ，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，７９：  １１０２−１１０９，２０１３）。
【００７０】
実施例４
本実施例は、不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼを有するクロストリジウム・オートエタノゲナムにおけるアセトンのイソプロパノールへの還元の排除を立証する。
【００７１】
アセトン（０、１、５、及び２０ｇ／Ｌ）を、（１）ＬＺ１５６１及び（２）２８７ａ及び２１１ｓ位での突然変異を備える不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼを有するＣｌｏｓＴｒｏｎ変異体クロストリジウム・オートエタノゲナムの血清瓶培養物に供給した。ＬＺ１５６１菌株は、１ｇ／Ｌのアセトンをイソプロパノールに完全に変換し、これにより、０．６５ｇ／ＬのイソプロパノールがＨＰＬＣで検出され、アセトンは検出されなかった。２０ｇ／Ｌのアセトンを供給した血清瓶中のイソプロパノールの濃度は、８．１ｇ／Ｌのイソプロパノールであり、残留する９．２５ｇ／Ｌのアセトンを伴った。ＣｌｏｓＴｒｏｎ二級アルコールデヒドロゲナーゼ変異体のいずれにおいても、アセトンのイソプロパノールへの検出可能な変換は観察されなかった（図４）。供給量と測定量との間の不一致は、アセトンを加圧された血清瓶に正確に添加することの難しさによるものであった。
【００７２】
追加の実験において、１６ｇ／Ｌのアセトンを、ＰＥＴＣ  ＭＥＳ中のＬＺ１５６１  ＳｅｃＡＤＨ：：ｅｒｍ  ４３３ｓ、ＬＺ１５６１  ＳｅｃＡＤＨ：：ｅｒｍ  ３８８ａ、及びＬＺ１５６１の血清瓶培養物に供給した。培養物を、製鉄所ガスのヘッドスペース下、３７℃で増殖させた。増殖の４日後に、ＬＺ１５６１は、アセトンのおよそ半分を、イソプロパノールに変換した。ｓｅｃＡＤＨ  ＣｌｏｓＴｒｏｎ変異体では、イソプロパノールは検出されなかった（図５）。
【００７３】
したがって、ＬＺ１５６１菌株は、アセトンをイソプロパノールに非常に効率的に還元するが、変異体菌株は、アセトンをイソプロパノールに還元することができなかった。この結果は、２つのブタノールデヒドロゲナーゼの存在にもかかわらず観察され、これらは、アセトンのイソプロパノールへの還元において、明らかに何の役割も果たさない。
【００７４】
バイオリアクター内の連続培養を伴う実験も実施した。ＬＺ１５６１を、上記のように、バイオリアクター内で増殖させた。連続モードにおいて安定なバイオマス及び代謝物質生成が得られたら、アセトンを、バイオリアクターと供給培地の両方に添加した。アセトンをある特定のレベルまでリアクターに投入し、その後、連続供給を行った。最初に、１ｇ／Ｌのアセトンを添加した。代謝物質濃度が安定化したら、濃度を５ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌに、第２の実験では、２０ｇ／Ｌまで増加させた。１５〜２０ｇ／Ｌの高濃度であっても、培養物は、全てのアセトンをイソプロパノールに高率で変換し、同定された二級アルコールデヒドロゲナーゼが、極めて有効であることを裏付けている（図６）（国際公開第２０１２／０２５２０８３号）。
【００７５】
同様のバイオリアクター実験を、２１１ｓ位に突然変異を備える、不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼを有するＣｌｏｓＴｒｏｎ変異体で実施した。５ｇ／Ｌのアセトンをバイオリアクターに投入した。アセトンのイソプロパノールへのほぼ瞬時の変換が観察された（図６）ＬＺ１５６１とは異なり、ＣｌｏｓＴｒｏｎ変異体では、アセトンの変換は観察されなかった（図７及び図８）。したがって、アセトンのイソプロパノールへの変換は、ＣｌｏｓＴｒｏｎ変異体においては、完全に排除された。
【００７６】
実施例５
本実施例は、アセトンの還元なしの１，２−プロパンジオールからのアセトンの生成を立証する。
【００７７】
プロパン−１，２−ジオールが、培地に添加される場合、クロストリジウム・オートエタノゲナムが、プロパン−１，２−ジオールを立体特異的に脱水して、プロパナールとアセトンとにすることが以前に立証されている。ＬＺ１５６においては、プロパノールとアセトンは、プロパン−１−オールとプロパン−２−オールに還元される。アセトンは、二級アルコールデヒドロゲナーゼによって還元される。プロパン−１，２−ジオールが、不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼを有するＣｌｏｓＴｒｏｎ変異体で接種された培地に添加される場合、生成されたアセトンは、プロパン−２−オールに還元されない。
【００７８】
プロパン−１，２−ジオールを、血清瓶内のＰＥＴＣ−ＭＥＳ培地に６６ｍＭまで添加した。この瓶を、ＣｌｏｓＴｒｏｎ−不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼ（ＳｅｃＡＤＨ：：ｅｒｍＢ  ２８７ａ）を有するクロストリジウム・オートエタノゲナムまたはＬＺ１５６１とインキュベート下。増殖の９６時間後に、ＬＺ１５６１は、１６．０±１．６ｍＭのプロパン−２−オールと、８．１±１．８ｍＭのプロパン−１−オールを生成し、一方、不活性化ｓＡＤＨ菌株は、５．７±１．５ｍＭのアセトンと、６．０±１．８ｍＭのプロパン−１−オールとを生成し、検出可能なプロパン−２−オールを生成しなかった。
【００７９】
実施例６
本実施例は、不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を有するクロストリジウム・オートエタノゲナムにおけるＣＯからのアセトンの生成を立証する。
【００８０】
チオラーゼ、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ、及びアセトアセテートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含むアセトンの合成のための遺伝子を有するプラスミドが設計され、クロストリジウム・オートエタノゲナム中に導入され、アセトンをほとんど含まずにイソプロパノールの生成をもたらした（国際公開２０１２／０２５２０８３号）。このようなプラスミドが、不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼを有するクロストリジウム・オートエタノゲナムのＣｌｏｓＴｒｏｎ変異体中に導入された場合、イソプロパナールを含まずにアセトンが生成された。培養物を、２５ｐｓｉのＣＯ／Ｈ２ガス上の嫌気性ジャーの内部の６ウェルプレート中で、ウェル当たり６ｍｌの容量で培養した。増殖の４日後に、培養物は、平均で、０．９５±０．０１ｇ／Ｌのアセトンと、５．６４±０．１１ｇ／Ｌのエタノールと、３．５８±１．３ｇ／Ｌのアセテートとを生成した。３７℃におけるアセトンの揮発性のために、２つの追加の６ウェルプレートで、アセトン生成細菌を含まない状態で、実験を繰り返した。アセトン生成培養物は、４日間で平均０．９２±０．０４ｇ／Ｌのアセトンを生成した。さらに、バックグラウンドプレートは、平均で０．５±０．０２ｇ／Ｌのアセトンを生成し、これは、ガス相のアセトンを介して運ばれたものであった。アセトンの移動を考慮に入れた最終的に調整された生成は、１．９ｇ／Ｌのアセトンであった。
【００８１】
アセトンの生成は、上述されたものと同一の菌株及び方法を用いての、バイオリアクターでの連続培養においても立証された。２０日間の期間にわたって、０．２ｇ／Ｌのアセトンがブロス中で絶えず観察された（図１１の「アセトン合計」は、培地中のアセトン（ＨＰＬＣにより観察）に、発酵槽を通過するガスによって培地から除去されることが計算されたアセトンを加えたものを指す）。バイオリアクターは、ブロス中およそ０．４ｇ／Ｌの生産性を提供しながら、１．５の希釈倍率で運転されていた。ブロス中の濃度に加えて、流出ガスの冷却されたノックアウトポットで決定されたように、かなりの量の（ブロス中の濃度の３０％を超える）アセトンが流出ガスによって揮散された。アセトンの揮発性及びガスがシステムを通過して流れることを考えれば、アセトンの揮散は、揮発性物質ほどではではないが、イソプロパノールに勝る利点をもたらす、理想的な、低コスト生成物分離を提供し、大部分は、例えば蒸留を通して、ブロスから抽出される必要がある。アセトンの揮散はまた、最終生成物の阻害を回避しながら、生成物合成のための駆動力も提供する。
実施例７
【００８２】
本実施例は、ＭＥＫの２−ブタノールの還元の排除を立証する。
【００８３】
ＭＥＫ（０、１、５、及び２０ｇ／Ｌ）を、（１）ＬＺ１５６１及び（２）２８７ａ及び２１１ｓ位に突然変異を伴う不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼを有するＣｌｏｓＴｒｏｎ変異体クロストリジウム・オートエタノゲナムの血清瓶培養物に供給した。ＬＺ１５６１は、検出可能なＭＥＫ残留物がない状態で、１ｇと５ｇのＭＥＫを、それぞれ０．９４と４．３４ｇ／Ｌの２−ブタノールに完全に変換した。２０ｇ／ＬのＭＥＫが供給された血清瓶中の２−ブタノールの最終濃度は、１７．３ｇ／ＬのＭＥＫが残留している状態で、６．３ｇ／Ｌの２−ブタノールであった。ＭＥＫの２−ブタノールへの変換は、ＣｌｏｓＴｒｏｎ二級アルコールデヒドロゲナーゼ変異体のいずれにおいても観察されなかった（図９）。
【００８４】
２１１位で不活性化された二級アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を不活性化することが、クロストリジウム・オートエタノゲナムのＭＥＫを２−ブタノールに変換する能力を完全に排除することを確認するために、１０ｇ／ＬのＭＥＫを、増殖している二級アルコールデヒドロゲナーゼ不活性化菌株を有するバイオリアクターに投入した。ＭＥＫの変換は観察されなかった（図７、図１０）。
【００８５】
実施例８
本実施例は、不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を有するクロストリジウム・オートエタノゲナムにおける２−３−ブタンジオールからのＭＥＫの生成を記述する。
【００８６】
クロストリジウム・オートエタノゲナム中でクレブシエラ・オキシトカからのプロパンジオールデヒドラターゼ遺伝子を発現させることが、外来性メソ−２，３−ブタンジオールの２−ブタノンへの変換を可能にすることが立証されている。生成された２−ブタノンは、クロストリジウム・オートエタノゲナム中に存在する二級アルコールデヒドロゲナーゼによって、２−ブタノールに還元される。
【００８７】
不活性化二級アルコールデヒドロゲナーゼを有するクロストリジウム・オートエタノゲナムのＣｌｏｓＴｒｏｎ変異体を、確立された方法を用いて、クレブシエラ・オキシトカからのジオールデヒドラターゼを発現するｐＭＴＬ８３１５５−ｐｄｄＡＢＣで形質転換する。得られた菌株を、外来性メソ−２，３−ブタンジオールの存在下、血清瓶中で独立栄養的に増殖させる。２−ブタノンに変換されたブタンジオールは、２−ブタノールに還元されない。
【００８８】
本明細書中で引用する刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての文献は、各文献が参照により組み込まれるものと個々に具体的に示され、またその内容の全てが本明細書で述べられているのと同じ程度、本明細書に参照により組み込まれる。本明細書における任意の先行技術に対する言及は、先行技術が、いずれかの国において力を入れている分野の技術常識の一部を形成することの承認ではなく、またそう解釈されるべきではない。
【００８９】
本発明の説明に関連して（特に以下の請求項に関連して）用いられる用語「ａ」ならびに「ａｎ」及び「ｔｈｅ」または同様の指示語の使用は、本明細書中で特に指摘したり、明らかに文脈と矛盾したりしない限り、単数及び複数の両方に及ぶものと解釈される。用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、〜を備える」、「ｈａｖｉｎｇ、〜を有する」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ、〜を含む」、及び「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ、〜を包含する」は、特に断りのない限り、オープンエンドターム（すなわち、「〜を含むが、限定されない」という意味）として解釈される。本明細書中の数値範囲の列挙は、本明細書中で特に指摘しない限り、単にその範囲内に該当する各値を個々に言及するための略記法としての役割を果たすことだけを意図しており、各値は、本明細書中で個々に列挙されたかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書中で説明される全ての方法は、本明細書中で特に指摘したり、または明らかに文脈と矛盾したりしない限り、あらゆる適切な順番で行うことができる。本明細書中で使用するあらゆる例、または例示的な言い回し（例えば「など」）は、特に主張しない限り、単に本発明をより良く説明することだけを意図し、本発明の範囲に対する制限を設けるものではない。明細書中のいかなる言い回しも、本発明の実施に不可欠である、請求項に記載されていない要素を示すものとは解釈されないものとする。
【００９０】
本明細書中では、本発明を実施するため本発明者が知っている最良の形態を含め、本発明の好ましい実施の形態について説明している。当業者にとっては、上記説明を読んだ上で、これらの好ましい実施の形態の変形が明らかとなろう。本発明者は、熟練者が適宜このような変形を適用することを予期しており、本明細書中で具体的に説明される以外の方法で本発明が実施されることを予定している。したがって、本発明は、準拠法で許されているように、本明細書に添付された請求項に記載の内容の変更及び等価物を全て含む。さらに、本明細書中で特に指摘したり、明らかに文脈と矛盾したりしない限り、全ての変形における上記要素のいずれの組合せも本発明に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2016538869.tif 000023
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