(57)【要約】  本発明は、植物細胞、植物、およびそれに由来する種子における遺伝子を修飾するための改良法を提供する。より詳細には本発明は、標的細胞遺伝子修復機構の構成要素の利用性を高める手法と遺伝子修復オリゴヌクレオチドの組合せによる、標的遺伝子突然変異の効率の増大に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中の標的デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列に遺伝子修復オリゴ核酸塩基（ＧＲＯＮ）仲介型突然変異を導入するための方法であって、
植物細胞へのＧＲＯＮの送達前および／または送達と同時に、１つまたは複数の細胞ＤＮＡ修復プロセスを増大させる条件下で細胞を培養すること
を含む方法。
【請求項２】
ＧＲＯＮの存在下で１つまたは複数の細胞ＤＮＡ修復プロセスを増大させる条件が、植物細胞ＤＮＡへの塩基除去修復の標的である１つまたは複数の部位の導入、植物細胞ＤＮＡへの非相同末端結合の標的である１つまたは複数の部位の導入、植物細胞ＤＮＡへのマイクロホモロジー媒介末端結合の標的である１つまたは複数の部位の導入、植物細胞ＤＮＡへの相同組換えの標的である１つまたは複数の部位の導入、ならびに植物細胞ＤＮＡへの修復を支援および増大させる標的である１つまたは複数の部位の導入の１つまたは複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１つまたは複数の細胞ＤＮＡ修復プロセスを増大させる条件が、植物細胞へのＧＲＯＮの送達前または送達と同時に、植物細胞に、一本鎖ニックまたは二本鎖ＤＮＡ切断を誘導する１つまたは複数の化合物を導入することを含む、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
一本鎖ニックまたは二本鎖ＤＮＡ切断を誘導する１つまたは複数の化合物が、１つまたは複数のヌクレアーゼおよび／または１つまたは複数のブレオマイシンファミリーの化合物を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
一本鎖ニックまたは二本鎖ＤＮＡ切断を誘導する１つまたは複数の化合物がＧＲＯＮに共有結合している、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
細胞が、キャノーラ、ヒマワリ、コーン、タバコ、テンサイ、ワタ、メイズ、コムギ、オオムギ、イネ、アルファルファ、オオムギ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、ジャガイモ、ニンジン、レタス、タマネギ、ダイズ、ダイズ種、サトウキビ、マメ科植物、ヒヨコマメ、フィールドピー、マメ科マメ、レンズマメ、カブ、スウェーデンカブ、芽キャベツ、ルピナス、カリフラワー、ケール、エンドウマメ、ポプラ、マツ、ユーカリノキ、ブドウ、カンキツ属、ライコムギ、アルファルファ、ライムギ、オートムギ、芝生と飼草、アマ、ナタネ、カラシナ、キュウリ、アサガオ、バルサム、コショウ、ナス、マリゴールド、ロータス属、キャベツ、デージー、カーネーション、チューリップ、アヤメ属、およびユリからなる群から選択される種の植物細胞である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
細胞がトランスジェニックである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
標的ＤＮＡ配列が細胞の内在性遺伝子である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細胞が、植物細胞であり、方法が、植物細胞からＧＲＯＮによって導入された突然変異を有する植物を再生するステップをさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
植物から種子を回収するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から８０のいずれか一項に記載の方法に従いＧＲＯＮによって導入されたゲノム修飾を含む植物細胞、または請求項９に記載の方法に従いＧＲＯＮによって導入されたゲノム修飾を含む植物、または請求項１０に記載の方法に従いＧＲＯＮによって導入されたゲノム修飾を含む種子。
【請求項１２】
細胞において、一本鎖ニックまたは二本鎖切断を導入する１つまたは複数の化合物を導入して、ドナーとしての遺伝子修復オリゴ核酸塩基（ＧＲＯＮ）により突然変異転換率を改善すること。
【請求項１３】
ＧＲＯＮの転換効率を評価する方法であって、
青色蛍光タンパク質をコードする標的ＤＮＡ配列を発現する植物プロトプラストにＧＲＯＮを導入することであって、ＧＲＯＮが、所定部位で標的ＤＮＡ配列を突然変異させて青色蛍光タンパク質の転換を引き起こすように構成されており、それにより青色蛍光タンパク質が異なる波長で蛍光を発し、ＧＲＯＮの導入前または導入と同時に、プロトプラスト内のＤＮＡが、ＧＲＯＮが標的とする部位内の標的ＤＮＡ配列に一本鎖ニックまたは二本鎖切断を導入する１つまたは複数の化合物と接触すること、および
転換の効率を決定すること
を含む方法。
【請求項１４】
一本鎖ニックまたは二本鎖切断を導入する１つまたは複数の化合物が１つまたは複数のヌクレアーゼを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
一本鎖ニックまたは二本鎖切断を導入する１つまたは複数の化合物が１つまたは複数のブレオマイシンファミリーの化合物を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
標的ＤＮＡ配列がプロトプラストの染色体ＤＮＡに存在する、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
標的ＤＮＡ配列がプラスミドに存在する、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
一本鎖ニックまたは二本鎖切断を導入する１つまたは複数の化合物が、一本鎖ニックまたは二本鎖切断を導入する１つまたは複数の化合物の不在下でＧＲＯＮに関して決定した効率と比較して増大した転換効率をもたらす、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照により本明細書に組み込まれている、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／８０１，３２０号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は一般に、ゲノムまたは他のヌクレオチド配列中の特定位置に対する、修飾の標的化の効率を改善するための新規な方法に関する。さらに本発明は、本明細書で開示している手法によって修飾、突然変異または顕在化された標的ＤＮＡに関する。本発明は、本発明の方法によって修飾された細胞、組織、および生物にも関する。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）によって生存細胞中で相同組換えが増し、これは操作型エンドヌクレアーゼの使用を介した標的ゲノム編集に利用されている。操作型ヌクレアーゼの主要成分は、ゲノムＤＮＡ二本鎖切断のためゲノムの標的部位にヌクレアーゼを誘導することができるＤＮＡ認識ドメインである。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による細胞ＤＳＢ修復は、突然変異による標的遺伝子の欠失／挿入をもたらす。あるいはＤＳＢは、内在標的遺伝子座と外から導入される所望の遺伝情報を有する相同ＤＮＡ断片の間の相同組換え、遺伝子標的化と呼ばれるプロセスを刺激する可能性がある。
【０００４】
遺伝子またはゲノム編集に関する最も有望な方法は、特注設計ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ジンクフィンガータンパク質のＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン（ＦＮ）からなるハイブリッドタイプの酵素である。ＺＦＮ技術は主に、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質のＤＮＡ結合ドメインとエンドヌクレアーゼＦｏｋＩの非特異的切断ドメイン由来のハイブリッドタンパク質の使用に関する。予め選択した部位での結合後に選択ＤＮＡ配列を認識するよう特注設計したモジュールとしてＺＦを構築することができ、ＦｏｋＩの切断ドメインの作用によりＤＳＢが生じる。
【０００５】
ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼは、細菌フラボバクテリウムオケアノコイテス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓ）から最初に単離された。このタイプのＩＩＳヌクレアーゼは、２つの別個のドメイン、Ｎ末端ＤＮＡ結合ドメインとＣ末端ＤＮＡ切断ドメインからなる。ＤＮＡ結合ドメインは非パリンドローム配列５’−ＧＧＡＴＧ−３７５’−ＣＡＴＣＣ−３’を認識するために働き、一方触媒ドメインは認識部位下流の９〜１３ヌクレオチドの一定距離で二本鎖ＤＮＡを非特異的に切断する。ＦｏｋＩは溶液中に不活性単量体として存在し、その標的ＤＮＡとの結合後および数種の二価金属の存在下で活性二量体になる。機能性複合体として、二本鎖ＤＮＡ分子とそれぞれ結合するＦｏｋＩの２分子は、ＤＮＡ二本鎖の有効な切断のためＤＮＡ触媒ドメインを介して二量体形成する。
【０００６】
同様の形式で、それらが特異的ＤＮＡ認識が可能である場合、他のタンパク質／ドメインを使用することによりヌクレアーゼを作製することもできる。ＴＡＬエフェクターは、様々なキサントモナス菌株に存在しタイプＩＩＩ分泌系、いわゆるタイプＩＩＩエフェクターにより宿主細胞に転座される細菌タンパク質の大群に属する。宿主細胞に存在すると、幾つかのＴＡＬエフェクターは、宿主の遺伝子状態に応じて、菌株毒性（疾患を引き起こす能力）または無毒性（宿主の耐性応答を誘発する能力）のいずれかに関するそれらの対応する宿主標的遺伝子を転写により活性化することが分かっている。それぞれのエフェクターは、真核生物転写アクチベーターに特徴的である機能的核局在化モチーフと強力な転写活性化ドメインを含有する。さらにそれぞれのエフェクターは、様々な数の３４アミノ酸反復単位からなる中心反復領域も含有し、ＤＮＡ結合ドメインとしての反復領域はそれぞれのエフェクターの生物学的特異性を決定する。
【０００７】
その全容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６１：２０−２７，２０１３は、ＴＡＬエフェクター様ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩの触媒ドメインの組合せに基づく操作型エンドヌクレアーゼであるＴＡＬＥＮ、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼの使用を開示する。ＤＮＡ結合ドメインの操作によって、これらのＴＡＬＥＮが、特異的ＤＮＡ結合ドメインを認識するよう容易に設計可能であることが報告されている。モデル系としてタバコプロトプラストを使用し、ＴＡＬＥＮ認識部位と連結した黄色蛍光タンパク質コード配列を含む一本鎖アニーリングポリヌクレオチドレポーターを使用して、ＴＡＬＥＮ活性が評価された。このレポーター系をプロトプラストに送達し、機能性ＹＦＰの発現によって切断および修復事象を測定することができた。
【発明の概要】
【０００８】
第１の態様において本発明は、植物細胞中の標的デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列に遺伝子修復オリゴ核酸塩基（ＧＲＯＮ）仲介型突然変異を導入するための方法に関する。これらの方法は特に、植物細胞へのＧＲＯＮの送達の前に、および／またはそれと同時に１つまたは複数の細胞ＤＮＡ修復プロセスを増大させる条件下で植物細胞を培養するステップを含む。
【０００９】
特定の実施形態では、１つまたは複数の細胞ＤＮＡ修復プロセスを増大させる条件は、ＧＲＯＮまたは塩基除去修復の標的である植物細胞ＤＮＡへの１つまたは複数の部位の導入、ＧＲＯＮまたは非相同末端結合の標的である植物細胞ＤＮＡへの１つまたは複数の部位の導入、ＧＲＯＮまたはマイクロホモロジー仲介型末端結合の標的である植物細胞ＤＮＡへの１つまたは複数の部位の導入、ＧＲＯＮまたは相同組換えの標的である植物細胞ＤＮＡへの１つまたは複数の部位の導入、およびＧＲＯＮまたは修復を助長する標的である植物細胞ＤＮＡへの１つまたは複数の部位の導入の１つまたは複数を含む。
【００１０】
特定の実施形態では、標的デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列が植物細胞ゲノム内に存在する。植物細胞は非トランスジェニックまたはトランスジェニックであってよく、標的ＤＮＡ配列は植物細胞の導入遺伝子または内在性遺伝子であってよい。
【００１１】
特定の実施形態では、１つまたは複数の細胞ＤＮＡ修復プロセスを増大させる条件は、植物細胞へのＧＲＯＮの送達の前またはそれと同時に、植物細胞への一本鎖または二本鎖ＤＮＡ切断を誘導する１つまたは複数の化合物の導入を含む。例示的な化合物は本明細書で後に記載する。
【００１２】
本明細書で記載する方法および組成物は、一般に植物に適用可能である。例えば、キャノーラ、ヒマワリ、コーン、タバコ、テンサイ、ワタ、メイズ、コムギ、オオムギ、イネ、アルファルファ、オオムギ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、ジャガイモ、ニンジン、レタス、タマネギ、ダイズ、ダイズ種、サトウキビ、マメ科植物、ヒヨコマメ、フィールドピー、マメ科マメ、レンズマメ、カブ、スウェーデンカブ、芽キャベツ、ルピナス、カリフラワー、ケール、エンドウマメ、ポプラ、マツ、ユーカリノキ、ブドウ、カンキツ属、ライコムギ、アルファルファ、ライムギ、オートムギ、芝生と飼草、アマ、ナタネ、カラシナ、キュウリ、アサガオ、バルサム、コショウ、ナス、マリゴールド、ロータス属、キャベツ、デージー、カーネーション、チューリップ、アヤメ属、およびユリからなる群から植物種を選択することができる。これらは、細菌、真菌および哺乳動物細胞およびさらにそれらのオルガネラ（例えば、ミトコンドリアと葉緑体）だけには限られないが、それらを含めた他の全ての生物系に全部または一部分を適用することもできる。
【００１３】
特定の実施形態では、方法は植物細胞からＧＲＯＮによって導入された突然変異を有する植物を再生するステップをさらに含み、植物から種子を回収するステップを含み得る。
【００１４】
関連態様において本発明は、本明細書で記載する方法に従いＧＲＯＮによって導入されたゲノム修飾を含む植物細胞、本明細書で記載する方法に従いＧＲＯＮによって導入されたゲノム修飾を含む植物、または本明細書で記載する方法に従いＧＲＯＮによって導入されたゲノム修飾を含む種子に関する。
【００１５】
本発明の他の実施形態は、以下に詳述する記載、例示的実施形態、および特許請求の範囲から明らかとなる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
定義
本発明は以下の定義に従い理解されよう。
【００１７】
オリゴ核酸塩基は核酸塩基のポリマーであり、そのポリマーはワトソン−クリック塩基対形成により相補配列を有するＤＮＡとハイブリダイズすることができる。
【００１８】
核酸塩基は、プリン、ピリミジン、またはそれらの誘導体もしくはアナログである塩基を含む。核酸塩基は、ペプチド核酸塩基、ペプチド核酸のサブユニット、およびモルホリン核酸塩基、ならびにヌクレオシドとヌクレオチドを含む。ヌクレオシドは、ペントースフラノシル成分を含有する核酸塩基、例えば場合によっては置換されたリボシドまたは２’−デオキシリボシドである。ヌクレオシドは数個の連結成分の１つによって連結することができ、それは亜リン酸を含有し得るかまたは含有し得ない。非置換ホスホジエステル結合によって結合したヌクレオシドはヌクレオチドと呼ばれる。
【００１９】
オリゴ核酸塩基鎖は、ポリマーの末端核酸塩基である一本鎖５’末端と３’末端を有する。特定オリゴ核酸塩基鎖は全タイプの核酸塩基を含有することができる。オリゴ核酸塩基化合物は、相補的でありワトソン−クリック塩基対形成によりハイブリダイズする１つまたは複数のオリゴ核酸塩基鎖を含む化合物である。核酸塩基はデオキシリボ型またはリボ型のいずれかである。リボ型核酸塩基は、２’炭素がヒドロキシ、アルキルオキシまたはハロゲンで置換されたメチレンであるペントースフラノシル含有核酸塩基である。デオキシリボ型核酸塩基はリボ型核酸塩基以外の核酸塩基であり、ペントースフラノシル成分を含有しない全ての核酸塩基を含む。
【００２０】
オリゴ核酸塩基鎖部分は一般に、オリゴ核酸塩基鎖とオリゴ核酸塩基鎖のセグメントまたは領域の両方を含む。オリゴ核酸塩基鎖部分は３’末端と５’末端を有する。オリゴ核酸塩基鎖部分が鎖と共に延長するとき、鎖部分の３’末端と５’末端は鎖の３’末端と５’末端でもある。
【００２１】
本発明によれば、植物器官には、葉、茎、根、枝芽、花芽、分裂組織、胚、子葉、内胚乳、がく片、花弁、めしべ、心皮、おしべ、やく、小胞子、花粉、花粉管、胚珠、子房および果実、またはこれらから得る切片、薄片もしくは薄板があるが、これらだけには限られない。植物組織には、カルス組織、地下組織、脈管組織、貯蔵組織、分裂組織、葉組織、苗条組織、根組織、菌こぶ組織、植物腫瘍組織、および生殖組織があるが、これらだけには限られない。植物細胞には、細胞壁を有する単離細胞、様々な大きさのそれらの凝集体、およびプロトプラストがあるが、これらだけには限られない。
【００２２】
２配列中のそれぞれヌクレオチドまたはアミノ酸残基の配列が、以下に記載するような最大対応性で一直線に並べたときに同じである場合、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは同一である。２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における用語「同一」または「同一率」は、以下の配列比較アルゴリズムの１つの使用または手動アライメントおよび目視により測定し、比較ウインドウにわたり最大対応性で比較し一直線に並べたとき、同じであるかまたは同じである特定の割合のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する２つ以上の配列または部分配列を指す。配列の保存的置換が異なるポリペプチドに関して、配列同一率を上方修正して置換の保存性を補正することができる。この修正を行うための手段は当業者にはよく知られている。典型的に、これは完全ミスマッチではなく部分的ミスマッチとしての保存的置換のスコアリングを含み、これによって配列同一率が増大する。したがって例えば、同一アミノ酸が１のスコアを与えられ非保存的置換がゼロのスコアを与えられる場合、保存的置換はゼロと１の間のスコアを与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えばプログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）で実行されるように、例えばＭｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．４：１１−１７（１９８８）のアルゴリズムに従い計算される。
【００２３】
２つの核酸またはポリペプチドの文脈における語句「実質的に同一」および「同一率」は、以下の配列比較アルゴリズムの１つの使用または手動アライメントおよび目視により測定し、比較ウインドウにわたり最大対応性で一直線に並べたとき、少なくとも５０％、有利には６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、および最も好ましくは９０〜９５％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一率を有する配列または部分配列を指す。この定義は、試験配列が参照配列と実質的同一性を有するとき、実質的配列または部分配列相補性を有する試験配列の相補配列も指す。
【００２４】
当業者は、２つのポリペプチドが免疫学的に類似している場合、その２つのポリペプチドは「実質的に同一」である可能性もあることを理解している。したがって、タンパク質の全体構造は類似している可能性はあるが、一方で２つのポリペプチドの一次構造は著しい差を示す。したがって、２つのポリペプチドが実質的に同一であるかどうか測定するための方法は、各ポリペプチドとモノクローナルまたはポリクローナル抗体の結合の測定を含む。第１のポリペプチドに特異的な抗体が、第１のポリペプチドに対するアフィニティーの三分の一のアフィニティーで第２のポリペプチドと結合する場合、２つのポリペプチドは実質的に同一である。配列比較用に、典型的には、試験配列と比較する参照配列として一配列が作用する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列と参照配列はコンピューターへのインプット値であり、対等な部分配列を明示し、必要な場合、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを明示する。したがって配列比較アルゴリズムは、明示したプログラムパラメーターに基づき、参照配列と比較した試験配列（複数可）の配列同一率を計算する。
【００２５】
比較用配列の最適アライメントは、例えばＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，０．４ｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（Ｉ９８Ｉ）の局所ホモロジーアルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のホモロジーアライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’Ｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ５８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、コンピューターによるこれらのアルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）の実行によって、ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｉｎｃ．ＭＤ，ＵＳＡによるＶＥＣＴＯＲ  ＮＴＩ  Ｖｅｒｓｉｏｎ＃６などのアライメント用ソフトウエアによって、ＣｌｕｓｔａｌＷ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ  Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．（１９９４）ＣＬＵＳＴＡＬＷに記載された手順によって、配列加重平均法、位置特異的ギャップペナルティーおよび加重平均マトリックス選択法、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３−４６８０を介した累進多重配列アライメントの感度の改善によって、または目視により実施することができる（一般に、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，のジョイントベンチャー、（１９９５増刊）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照）。
【００２６】
配列同一率および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの例は、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されたＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列内の同じ長さのワードと一直線に並べたとき一定のプラスの値の閾値スコアＴと一致するかまたはそれを満たす、クエリー配列中の長さＷの短いワードを確認することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を最初に確認することを含む。Ｔは隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ、上記）。これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを発見するための検索を開始するシードとして作用する。次いでワードヒットを、累積アライメントスコアが増大可能な限り各配列に沿って両方向に延長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関して、パラメーターＭ（一対のマッチ残基に関する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基に関するペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列に関しては、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを計算する。累積アライメントスコアが得られたその最大値から量Ｘだけ低下する、１つまたは複数の負のスコア残基アライメントの蓄積のため累積スコアがゼロ以下になる、またはいずれかの配列の末端に達したとき、各方向におけるワードヒットの延長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度と速度を決定する。（ヌクレオチド配列に関する）ＢＬＡＳＴＮプログラムは、デフォルト値として１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較値を使用する。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルト値として３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５（１９８９）を参照）。配列同一率の計算以外に、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２配列間の類似性の統計解析も実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって与えられる類似性の１つの測定値は最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これによって２ヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然生じる確率の指標を与える。例えば、試験核酸と参照核酸の比較における最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は参照配列に類似していると考えられる。
【００２７】
鎖切断
オリゴヌクレオチド中へのまたはオリゴヌクレオチドと一緒のいずれかの、一本鎖または二本鎖切断を誘導する化合物の封入によって、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー仲介末端結合（ＭＭＥＪ）、および相同組換えにより修復される損傷が生じる。例えば、ブレオマイシンファミリーの抗生物質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＦｏｋＩ（または任意のＩＩＳ型クラスの制限酵素）および他のヌクレアーゼを修復オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端に共有結合させて、修復オリゴヌクレオチドによる転換標的の部位近辺に二本鎖切断を導入することが可能である。ブレオマイシンファミリーの抗生物質は、ブレオマイシン、ゼオシン、フレオマイシン、タリソマイシン、ペプレオマイシンおよびその他を含めたＤＮＡ切断糖ペプチドである。
【００２８】
本発明の方法は、使用するＤＮＡ修復試薬の性質または型に制約を受けない。例えば、このようなＤＮＡ修復試薬はラジカルを放出し、これによってＤＮＡ鎖切断をもたらす。あるいは、試薬はＤＮＡをアルキル化して、複製および転写を遮断し得る付加体を形成する。別の代替では、試薬は細胞酵素を阻害する架橋または分子をもたらし、鎖切断をもたらす。オリゴヌクレオチドに結合してＴＦＯを形成するＤＮＡ修復試薬の例には、インドロカルバゾール、ナフタレンジイミド（ＮＤＩ）、トランスプラチン、ブレオマイシン、シクロプロパピロールインドールのアナログ、およびフェナントジヒドロジオキシンがあるが、これらだけには限られない。特に、インドロカルバゾールはトポイソメラーゼＩ阻害剤である。これらの酵素の阻害は、鎖切断およびＤＮＡタンパク質付加体形成をもたらす［Ａｒｉｍｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．８，７７７，２０００］。ＮＤＩはグアニンを酸化することができる光酸化剤であり、これはグアニン残基の部位に突然変異を引き起こす可能性がある［Ｎｕｎｅｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９，６１９０，２０００］。ＴＦＯが試薬と結合したとき、トランスプラチンが三本鎖標的中のＤＮＡと反応することが示されている。この反応は、突然変異誘発性であるＤＮＡ付加体の形成を引き起こす［Ｃｏｌｕｍｂｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４：４５１９，１９９６］。ブレオマイシンは、放射性模倣体として広く使用されているＤＮＡ切断物質である。それはオリゴヌクレオチドと結合し、その形式で切断物質として活性があることが示されている［Ｓｅｒｇｅｙｅｖ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ２３，４４００，１９９５；Ｋａｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４，１６７１５，１９９５］。シクロプロパピロールインドールのアナログはＴＦＯと結合し、三本鎖標的配列中のＤＮＡをアルキル化することが示されている。したがってアルキル化ＤＮＡは、突然変異誘発性である化学的付加体を含有する［Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５，５０７７，１９９７］。フェナントジヒドロジオキシンは、光活性化によりラジカル種を放出する遮蔽キノンである。それらはＴＦＯと結合し、光活性化により二本鎖ＤＮＡに切断をもたらすことが示されている［Ｂｅｎｄｉｎｓｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．９，５５５，１９９８］。
【００２９】
標的遺伝子の妨害をもたらすための一戦略は、部位特異的エンドヌクレアーゼにより引き起こされる一本鎖または二本鎖ＤＮＡ切断の発生によるものである。エンドヌクレアーゼは、藻類、植物、およびヒトを含めた巨大動物モデルなどの、より従来型の遺伝子標的法の影響を従来受けにくい生物における、標的遺伝子の妨害に最も頻繁に使用される。例えば、ＨＩＶ感染を治療および予防するための、ジンクフィンガーヌクレアーゼに関する現在進行中のヒト臨床試験が存在する。さらに、エンドヌクレアーゼ操作は、穀物中に望ましくない表現型をもたらす遺伝子を妨害する試みにおいて現在使用されている。
【００３０】
メガヌクレアーゼとしても知られるホーミングエンドヌクレアーゼは、それらの大きな（例えば１４ｂｐを超える）切断部位のため、高度の特異性でゲノムＤＮＡにおいて二本鎖切断を発生させる配列特異的エンドヌクレアーゼである。それらの標的部位に対するホーミングエンドヌクレアーゼの特異性によって誘導型ＤＮＡ切断の正確な標的化が可能になるが、ホーミングエンドヌクレアーゼの切断部位は希少であり、標的遺伝子中の本来存在する切断部位を発見する確率は低い。
【００３１】
操作型ホーミングエンドヌクレアーゼは、既存のホーミングエンドヌクレアーゼの特異性を改変することにより生成する。一手法では、本来存在するホーミングエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列に変異を導入し、次いで生成した操作型ホーミングエンドヌクレアーゼをスクリーニングして、標的結合部位を切断する機能性タンパク質を選択する。別の手法では、キメラホーミングエンドヌクレアーゼを、２つの異なるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位を組み合わせて各ホーミングエンドヌクレアーゼの半分の部位で構成される新たな認識部位を作製することによって操作する。
【００３２】
１クラスの人工エンドヌクレアーゼはジンクフィンガーエンドヌクレアーゼである。ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼは、非特異的切断ドメイン、典型的にはＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのドメインと、特異的ＤＮＡ配列と結合するように操作したジンクフィンガータンパク質ドメインを組み合わせる。ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼのモジュラー構造によって、それらはゲノムに部位特異的二本鎖切断をもたらす用途の広い基盤となる。ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼの１つの制約は、標的部位に対する低い特異性またはゲノムにおける多数の標的部位の存在が、オフターゲット切断事象をもたらし得ることである。ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼはジマーとして切断するので、オフターゲット切断事象を予防するための一戦略は、隣接９塩基対部位で結合するジンクフィンガードメインの設計となっている。
【００３３】
ＴＡＬＥＮは、特異的ＤＮＡ部位への一本鎖および二本鎖切断の誘導に使用される標的化可能ヌクレアーゼであり、次いでそれらは切断部位に配列変化を作製するのに利用可能な機構により修復される。
【００３４】
ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合領域を操作するのに使用される基本構成単位は、キサントモナス種プロテオバクテリアによってコードされる、天然に存在するＴＡＬＥ由来の高度に保存された反復ドメインである。ＴＡＬＥＮによるＤＮＡ結合は、反復単位のアミノ末端とカルボキシ末端で別のＴＡＬＥ由来ドメインと隣接した、高度に保存された３３〜３５アミノ酸反復単位のアレイによって仲介される。
【００３５】
これらのＴＡＬＥ反復単位はＤＮＡの一塩基と特異的に結合し、その同一性は、反復単位の位置１２と１３に典型的に見られる２つの超可変残基、および所望標的核酸の長さに相当するアレイ中の反復単位の数、標的核酸配列とマッチするよう選択した反復単位の同一性によって決定される。標的部位の選択性を最大にするため、標的核酸は１５〜２０塩基対であることが好ましい。標的核酸の切断は、典型的にＴＡＬＥＮ結合の５０塩基対以内で起こる。ＴＡＬＥＮ認識部位設計に関するコンピュータープログラムは当技術分野で記載されている。例えば、Ｃｅｒｍａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１１  Ｊｕｌｙ；３９（１２）：ｅ８２を参照。
【００３６】
所望標的配列とマッチするよう設計した後、ＴＡＬＥＮを組換えによって発現させ、外来タンパク質としてプロトプラストに導入し、またはプロトプラスト内でプラスミドから発現させることが可能である。
【００３７】
ＧＲＯＮ構造および植物細胞中への導入
組換え可能オリゴ核酸塩基は、マイクロキャリア（バイオリスティックデリバリー）、マイクロファイバー（ウィスカー）、エレクトロポレーション、直接的なＤＮＡの取り込みおよびマイクロインジェクションだけには限られないが、これらを含めた当技術分野で一般に使用される任意の方法を使用して、植物細胞に導入することができる。例示的な組換え可能オリゴ核酸塩基の例は以下に記載する。
【００３８】
参照により本明細書に組み込まれているＫｍｉｅｃＩとＫｍｉｅｃＩＩの特許に記載された立体配座および化学的性質を有する組換え可能オリゴ核酸塩基を用いて、本発明を実施することができる。ＫｍｉｅｃＩは、標的遺伝子に特異的遺伝子変化を導入するための方法を教示する。ＫｍｉｅｃＩおよび／またはＫｍｉｅｃＩＩにおける組換え可能オリゴ核酸塩基は２本の相補鎖を含有し、その１本は他の鎖のＤＮＡ型ヌクレオチドと塩基対形成する少なくとも１個のＲＮＡ型ヌクレオチドのセグメント（「ＲＮＡセグメント」）を含有する。
【００３９】
ＫｍｉｅｃＩＩは、プリンおよびピリミジン塩基含有非ヌクレオチドをヌクレオチドに置換することができることを開示している。それらの全容が各々参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，７５６，３２５号、同第５，８７１，９８４号、同第５，７６０，０１２号、同第５，８８８，９８３号、同第５，７９５，９７２号、同第５，７８０，２９６号、同第５，９４５，３３９号、同第６，００４，８０４号、および同第６，０１０，９０７号、および国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ００／２３４５７中、および国際特許公開番号ＷＯ９８／４９３５０、ＷＯ９９／０７８６５、ＷＯ９９／５８７２３、ＷＯ９９／５８７０２、ＷＯ９９／４０７８９、米国特許第６，８７０，０７５号、および米国特許出願公開２００３００８４４７３は、本発明に使用することができる別の組換え可能分子を開示している。用語「組換え可能オリゴ核酸塩基」を本明細書中で使用して、本発明の方法中で使用することができる分子を示し、これらは混合型二本鎖オリゴヌクレオチド、ＫｍｉｅｃＩＩにおいて教示された非ヌクレオチド含有分子、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド、ならびに前述の特許および特許公開に教示された他の組換え可能分子を含む。
【００４０】
一実施形態において、組換え可能オリゴ核酸塩基は、２’−ヒドロキシルとフルオロ、クロロもしくはブロモ官能基の置換または２’−Ｏ上の置換基の配置によって混合型二本鎖オリゴヌクレオチドのＲＮＡ型ヌクレオチドがＲＮａｓｅ耐性になった、混合型二本鎖オリゴヌクレオチドである。適切な置換基はＫｍｉｅｃＩＩによって教示された置換基を含む。別の置換基には、米国特許第５，３３４，７１１号（Ｓｐｒｏａｔ）によって教示された置換基と特許公開ＥＰ６２９３８７およびＥＰ６７９６５７（まとめて、Ｍａｒｔｉｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）によって教示された置換基があり、これらは参照により本明細書に組み込まれている。本明細書で使用する、リボヌクレオチドの２’−フルオロ、クロロもしくはブロモ誘導体、またはＭａｒｔｉｎ  ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓもしくはＳｐｒｏａｔ中に記載された置換基で置換された２’−ＯＨを有するリボヌクレオチドは「２’−置換リボヌクレオチド」と呼ばれる。本明細書で使用する用語「ＲＮＡ型ヌクレオチド」は、非置換ホスホジエステル結合またはＫｍｉｅｃＩもしくはＫｍｉｅｃＩＩによって教示された任意の非天然結合によって混合型二本鎖オリゴヌクレオチドの他のヌクレオチドと結合した、２’−ヒドロキシルまたは２’−置換ヌクレオチドを意味する。本明細書で使用する用語「デオキシリボ型ヌクレオチド」は、非置換ホスホジエステル結合またはＫｍｉｅｃＩもしくはＫｍｉｅｃＩＩによって教示された任意の非天然結合によってＭＤＯＮの他のヌクレオチドと結合することができる、２’−Ｈを有するヌクレオチドを意味する。
【００４１】
本発明の一実施形態では、組換え可能オリゴ核酸塩基は、非置換ホスホジエステル結合によってのみ結合した混合型二本鎖オリゴヌクレオチドである。代替実施形態では、結合は置換ホスホジエステル、ホスホジエステル誘導体、およびＫｍｉｅｃＩＩによって教示された非亜リン酸系結合による結合である。さらに別の実施形態では、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド中の各ＲＮＡ型ヌクレオチドは２’−置換ヌクレオチドである。２’−置換リボヌクレオチドの特に好ましい実施形態は、２’−フルオロ、２’−メトキシ、２’−プロピルオキシ、２’−アリルオキシ、２’−ヒドロキシルエチルオキシ、２’−メトキシエチルオキシ、２’−フルオロプロピルオキシおよび２’−トリフルオロプロピルオキシ置換リボヌクレオチドである。２’−置換リボヌクレオチドのより好ましい実施形態は、２’−フルオロ、２’−メトキシ、２’−メトキシエチルオキシ、および２’−アリルオキシ置換ヌクレオチドである。別の実施形態では、混合型二本鎖オリゴヌクレオチドは非置換ホスホジエステル結合によって結合している。
【００４２】
１型の２’−置換ＲＮＡ型ヌクレオチドのみを有する混合型二本鎖オリゴヌクレオチドはより好都合に合成されるが、本発明の方法は、２型以上のＲＮＡ型ヌクレオチドを有する混合型二本鎖オリゴヌクレオチドで実施することができる。ＲＮＡセグメントの機能が、２つのＲＮＡ型トリヌクレオチド間へのデオキシヌクレオチドの導入により引き起こされる介入によって影響を受ける可能性はなく、したがって用語ＲＮＡセグメントは「介入ＲＮＡセグメント」などを包含する。非介入ＲＮＡセグメントは隣接ＲＮＡセグメントと呼ばれる。代替実施形態では、ＲＮＡセグメントは改変ＲＮａｓｅ耐性および非置換２’−ＯＨヌクレオチドを含有し得る。混合型二本鎖オリゴヌクレオチドは、好ましくは１００個より少ないヌクレオチド、およびより好ましくは８５個より少ないヌクレオチド、ただし５０個を超えるヌクレオチドを有する。第１の鎖部分と第２の鎖部分はワトソン−クリックの法則に従い塩基対形成する。一実施形態では、混合型二本鎖オリゴヌクレオチドの鎖部分は、第１の鎖部分と第２の鎖部分が１つの３’末端と１つの５’末端を有する一本のオリゴヌクレオチド鎖のセグメントであるように、一本鎖ヘキサ、ペンタまたはテトラヌクレオチドなどのリンカーによって共有結合する。３’末端と５’末端は「ヘアピンキャップ」の付加によって保護することができ、これにより３’末端と５’末端ヌクレオチドはワトソン−クリックの法則に従い隣接ヌクレオチドと塩基対形成する。さらに第２のヘアピンキャップを、第１の鎖部分と第２の鎖部分の間のワトソン−クリックの法則に従う塩基対形成が安定するように、３’末端と５’末端から離れた第１の鎖部分と第２の鎖部分の間の接合部に置くことができる。
【００４３】
第１の鎖部分と第２の鎖部分は、標的ＡＣＣアーゼ遺伝子の２セグメントと相同的である２領域を含有する、すなわち標的遺伝子と同じ配列を有する。相同領域はＲＮＡセグメントのヌクレオチドを含有し、結合ＤＮＡセグメントの１つまたは複数のＤＮＡ型ヌクレオチドを含有する可能性があり、介在ＤＮＡセグメント内に存在しないＤＮＡ型ヌクレオチドを含有する可能性もある。２つの相同領域は、「異種領域」と呼ばれる標的遺伝子の配列と異なる配列を有する領域によって隔てられ、それぞれ隣接している。異種領域は１、２または３個のミスマッチヌクレオチドを含有し得る。ミスマッチヌクレオチドは隣接する可能性があり、または代替的に、標的遺伝子と相同的である１個または２個のヌクレオチドによって隔てられる可能性がある。あるいは異種領域は、挿入物、または１、２、３もしくは５個以下のヌクレオチドも含有し得る。あるいは、混合型二本鎖オリゴヌクレオチドの配列は、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド由来の１、２、３もしくは５個以下のヌクレオチドの欠失のみ標的遺伝子の配列と異なる可能性がある。異種領域の長さと位置は、この場合、異種領域内に混合型二本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが存在しないが、欠失部分の長さであると考えられる。２つの相同領域と相補的である標的遺伝子の断片間の距離は、１つまたは複数の置換が考えられるとき、異種領域の長さと同一である。異種領域が挿入物を含有する場合、相同領域は、遺伝子中のそれらの相補相同断片より遠く混合型二本鎖オリゴヌクレオチド中でそれによって隔てられており、異種領域が欠失をコードするときは逆のことが当てはまる。
【００４４】
混合型二本鎖オリゴヌクレオチドのＲＮＡセグメントは、それぞれ相同領域、すなわち標的遺伝子の断片と配列が同一である領域の一部分であり、これらのセグメントは、好ましくは少なくとも１３のＲＮＡ型ヌクレオチド、および好ましくは１６〜２５のＲＮＡ型ヌクレオチド、またはさらにより好ましくは１８〜２２のＲＮＡ型ヌクレオチド、または最も好ましくは２０のヌクレオチドを全体として含有する。一実施形態では、相同領域のＲＮＡセグメントは隔てられ、介在ＤＮＡセグメントと隣接、すなわち「結合」している。一実施形態では、異種領域のそれぞれのヌクレオチドは介在ＤＮＡセグメントのヌクレオチドである。混合型二本鎖オリゴヌクレオチドの異種領域を含有する介在ＤＮＡセグメントは、「ミューテーターセグメント」と呼ばれる。
【００４５】
標的遺伝子に導入される変化は異種領域によってコードされる。遺伝子に導入される変化は、その位置における原型アミノ酸を所望のアミノ酸に変える遺伝子配列の１つまたは複数の塩基の変化であり得る。
【００４６】
本発明の別の実施形態では、組換え可能オリゴ核酸塩基は一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドミューテーターベクターまたはＳＳＯＭＶであり、それは、その全容が参照により本明細書に組み込まれている、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／２３４５７中に開示されている。ＳＳＯＭＶの配列は、米国特許第５，７５６，３２５号、同第５，８７１，９８４号、同第５，７６０，０１２号、同第５，８８８，９８３号、同第５，７９５，９７２号、同第５，７８０，２９６号、同第５，９４５，３３９号、同第６，００４，８０４号、および同第６，０１０，９０７号中、ならびに国際公開Ｎｏｓ．ＷＯ９８／４９３５０、ＷＯ９９／０７８６５、ＷＯ９９／５８７２３、ＷＯ９９／５８７０２、ＷＯ９９／４０７８９、米国特許第６，８７０，０７５号、および米国公開特許出願第２００３００８４４７３号中に記載されたミューテーターベクターと同じ原理に基づく。ＳＳＯＭＶの配列は、ミューテーター領域と呼ばれる所望の遺伝子改変を含有する領域によって隔てられた、標的配列と相同的である２領域を含有する。ミューテーター領域は、標的配列中の相同領域を隔てる配列と同じ長さであるが、異なる配列を有する配列を有し得る。このようなミューテーター領域は置換を引き起こす。
【００４７】
ＳＳＯＭＶのヌクレオチドは、非修飾ホスホジエステル結合によって結合したデオキシリボヌクレオチドであるが、ただし１つの３’末端および／または５’末端ヌクレオチド間結合、または代替的に２つの３’末端および／または５’末端ヌクレオチド間結合がホスホロチオエートまたはホスホアミデートであり得る（上記参照）。本明細書で使用するヌクレオチド間結合は、ＳＳＯＭＶのヌクレオチドの間の結合であり、３’末端ヌクレオチドまたは５’末端ヌクレオチドとブロッキング置換基の間の結合は含まない。具体的実施形態では、ＳＳＯＭＶの長さは２１〜５５デオキシヌクレオチドであり、したがって相同領域の長さは全長少なくとも２０デオキシヌクレオチドであり、少なくとも２つの相同領域は少なくとも８デオキシヌクレオチドの長さをそれぞれ有するはずである。
【００４８】
標的遺伝子のコード鎖または非コード鎖のいずれかと相補的であるように、ＳＳＯＭＶを設計することができる。所望の突然変異が一塩基の置換であるとき、ミューテーターヌクレオチドの両方がピリミジンであることが好ましい。所望の機能的結果の獲得と一致する範囲で、相補鎖中のミューテーターヌクレオチドと標的ヌクレオチドの両方がピリミジンであることが好ましい。特に好ましいのは、トランスバージョン突然変異をコードする、すなわちそれぞれ相補鎖中のＣまたはＴヌクレオチドとＣまたはＴミューテーターヌクレオチドがミスマッチである、ＳＳＯＭＶである。
【００４９】
オリゴデオキシヌクレオチド以外に、ＳＳＯＭＶは、リンカーを介して５’末端炭素に結合した５’ブロッキング置換基を含有することができる。リンカーの化学的性質はその長さ以外は重要ではなく、長さは好ましくは少なくとも６原子長でなければならず、リンカーは柔軟性でなければならない。ビオチン、コレステロールもしくは他のステロイドなどの様々な非毒性置換基、または非挿入剤カチオン性蛍光色素を使用することができる。ＳＳＯＭＶを作製するのに特に好ましい試薬は、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  ＶＡ．（現在ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってＣｙ３（商標）およびＣｙ５（商標）として販売されている試薬であり、これらは、オリゴヌクレオチドへの取り込みによって、３，３，３’，３’−テトラメチルＮ，Ｎ’−イソプロピル置換インドモノカルボシアニンおよびインドジカルボシアニン色素をそれぞれ生成するブロッキングホスホラミダイトである。Ｃｙ３が最も好ましい。インドカルボシアニンがＮ−オキシアルキル置換状態であるとき、５’末端ホスフェートを有するホスホジエステルを介してオリゴデオキシヌクレオチドの５’末端とそれを好都合に結合させることが可能である。色素とオリゴデオキシヌクレオチドの間の色素リンカーの化学的性質は重要ではなく、合成しやすいように選択する。市販のＣｙ３ホスホラミダイトを指示通り使用するとき、生じる５’修飾はブロッキング置換基とリンカーからなり、それらはまとめてＮ−ヒドロキシプロピル，Ｎ’−ホスファチジルプロピル３，３，３’，３’−テトラメチルインドモノカルボシアニンである。
【００５０】
好ましい実施形態では、インドカルボシアニン色素はインドール環の３および３’位置でテトラ置換されている。理論について制限されずに、これらの置換基は色素が挿入色素となるのを妨げる。これらの位置における置換基の同一性は重要ではない。ＳＳＯＭＶは３’ブロッキング置換基をさらに有し得る。ここでも３’ブロッキング置換基の化学的性質は重要ではない。
【００５１】
別の好ましい実施形態では、組換え可能オリゴ核酸塩基は、３’末端ヌクレオチド、５’末端ヌクレオチドを有し、少なくとも２５デオキシヌクレオチドおよび６５を超えないデオキシヌクレオチドを有し、標的染色体遺伝子の少なくとも２領域とそれぞれ各々同一である少なくとも８デオキシヌクレオチドの各々少なくとも２領域を含む配列を有する、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドであり、それらの領域は全体で少なくとも２４ヌクレオチド長であり、それらの領域は、オリゴデオキシヌクレオチドの配列が標的染色体遺伝子の配列と同一ではないように、標的染色体遺伝子の配列中またはオリゴデオキシヌクレオチドの配列中または両方において少なくとも１ヌクレオチド隔てられている。参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，２７１，３６０号を参照。
【００５２】
マイクロキャリアとマイクロファイバー
投射浸透によりセルロース細胞壁を有する植物細胞にＤＮＡの巨大断片を導入するための金属製マイクロキャリア（ミクロスフェア）の使用は、当業者にはよく知られている（以後バイオリスティック送達）。米国特許第４，９４５，０５０号、同第５，１００，７９２号および同第５，２０４，２５３号は、それらの投射用マイクロキャリアおよびデバイスの選択に関する一般的な技法を記載する。米国特許第５，４８４，９５６号および同第５，４８９，５２０号は、コーンのカルス組織のマイクロプロジェクタイルボンバードメントを使用した、繁殖能力を有するトランスジェニックコーンの調製を記載している。バイオリスティック技法も、未熟なコーン胚の形質転換において使用される。
【００５３】
本発明の方法におけるマイクロキャリアの使用に関する具体的条件は国際公開ＷＯ９９／０７８６５中に記載されている。例示的一技法では、氷冷マイクロキャリア（６０ｍｇ／ｍｌ）、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド（６０ｍｇ／ｍｌ）、２．５ＭのＣａＣｌ2および０．１Ｍのスペルミジンをこの順で加え、混合物を軽く撹拌し、例えば１０分間撹拌し、次いで室温で１０分間放置し、この場合マイクロキャリアは５倍体積のエタノールに希釈し、遠心分離し１００％エタノールに再懸濁する。マイクロキャリア８〜１０μｇ／μｌ、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド１４〜１７μｇ／ｍｌ、ＣａＣ2１．１〜１．４Ｍおよびスペルミジン１８〜２２ｍＭの接着溶液中濃度で良い結果を得ることができる。マイクロキャリア８μｇ／μｌ、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド１６．５μｇ／ｍｌ、ＣａＣｌ１．３Ｍおよびスペルミジン２１ｍＭの条件下で最適な結果を観察した。
【００５４】
細胞壁および細胞膜に浸透させるためのマイクロファイバーを使用して本発明を実施するため、組換え可能オリゴ核酸塩基を植物細胞に導入することもできる。Ｃｏｆｆｅｅ  ｅｔ  ａｌへの米国特許第５，３０２，５２３号は、ブラックメキシカンスイートトウモロコシの懸濁培養物の形質転換を容易にするための３０×０．５μｍおよび１０×０．３μｍの炭化珪素繊維の使用を記載する。マイクロファイバーを使用した植物細胞の形質転換のためのＤＮＡ導入に使用することができる任意の機械的技法を使用して、本発明のＡＣＣａｓｅ突然変異体の作製において使用するための組換え可能オリゴ核酸塩基を送達することができる。組換え可能オリゴ核酸塩基のマイクロファイバー送達に関する例示的な技法は以下の通りである。滅菌マイクロファイバー（２μｇ）を、約１０μｇの混合型二本鎖オリゴヌクレオチドを含有する１５０μＬの植物培養培地に懸濁させる。懸濁培養物を沈殿させ、同体積の充填細胞および滅菌ファイバー／ヌクレオチド懸濁液を１０分間撹拌し平板培養する。個々の形質に適したように、選択培地に直後に、または最大約１２０時間遅らせて施用する。
【００５５】
エレクトロポレーション
代替実施形態では、当業者によく知られる技法に従った植物の一部に由来するプロトプラストのエレクトロポレーションにより、組換え可能オリゴ核酸塩基を植物細胞に送達することができる。例えば、Ｇａｌｌｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ５５：８９−１０７，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．；Ｋｉｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１３３：２１３−２２１，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．を参照。
【００５６】
組換え可能オリゴ核酸塩基を、エレクトロポレーションにより小胞子に導入することもできる。四分染色体の分離によって、小胞子は単核および薄壁状態になる。それは膨張し始め、外壁形成前に生殖細胞胞子を発生する。この段階における小胞子は、他の植物細胞より外来ＤＮＡを用いた形質転換に対する影響をおそらく受けやすい。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで小胞子の発生を変えて、植物に再生可能であるハプロイド胚または胚形成カルスのいずれかを生成することができる（Ｃｏｕｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．７：６１８−６２１，１９８９；Ｄａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．６７：８３−８８，１９９０；Ｍａｈｅｓｈｗａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ  Ｂｏｔ．６９：８６５−８７９，１９８２；Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ａｄｖ．Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ７：１６１−１８２，１９８９；Ｓｗａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．６：９４−９７，１９８７）。したがって形質転換小胞子は、標準法による染色体倍加によって、ハプロイド植物またはジハプロイド受粉植物に直接再生することができる。参照により本明細書に組み込まれている、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎという表題の同時係属出願Ｕ．Ｓ．Ｓｅｒ．Ｎｏ．０９／６８０，８５８も参照。
【００５７】
小胞子エレクトロポレーション法は、Ｊａｒｄｉｎａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．９３：１７７−１８４，１９９３およびＦｅｎｎｅｌｌ  ａｎｄ  Ｈａｕｐｔｍａｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ１１：５６７−５７０，１９９２に記載されている。植物プロトプラストにＭＤＯＮをエレクトロポレーションするための方法を、小胞子エレクトロポレーションにおける使用に適合させることも可能である。
【００５８】
ウィスカーとマイクロインジェクション
さらに別の代替実施形態では、組換え可能オリゴ核酸塩基を、植物細胞のウィスカーまたはマイクロインジェクションにより植物細胞に送達することができる。いわゆるウィスカー技法は、ほぼＦｒａｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６：９４１−９４８に記載されたように実施する。組換え可能オリゴ核酸塩基をウィスカーに加え、これを使用して植物細胞を形質転換する。組換え可能オリゴ核酸塩基は、オリゴヌクレオチドと標的配列の間の組換えが触媒されるように、植物細胞中でリコンビナーゼ複合体を形成することができるタンパク質をコードする配列を含むプラスミドと同時インキュベートすることができる。
【００５９】
植物の選択
様々な実施形態において、本明細書で開示している植物は、高木もしくは低木として成長する任意の樹木植物種、任意の草本植物種、または可食果実、種子もしくは野菜を生成する任意の種、または有色もしくは芳香性品種の花を生成する任意の種を含めた、任意の種の双子葉植物、単子葉植物または裸子植物であってよい。例えば植物は、それらが既に具体的に言及されていない限り、キャノーラ、ヒマワリ、コーン、タバコ、テンサイ、ワタ、メイズ、コムギ、オオムギ、イネ、アルファルファ、オオムギ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、ジャガイモ、ニンジン、レタス、タマネギ、ダイズ、ダイズ種、サトウキビ、マメ科植物、ヒヨコマメ、フィールドピー、マメ科マメ、レンズマメ、カブ、スウェーデンカブ、芽キャベツ、ルピナス、カリフラワー、ケール、エンドウマメ、ポプラ、マツ、ユーカリノキ、ブドウ、カンキツ属、ライコムギ、アルファルファ、ライムギ、オートムギ、芝生と飼草、アマ、ナタネ、カラシナ、キュウリ、アサガオ、バルサム、コショウ、ナス、マリゴールド、ロータス属、キャベツ、デージー、カーネーション、チューリップ、アヤメ属、ユリ、および堅果産生植物からなる群の植物種から選択することができる。
【００６０】
植物および植物細胞は、当技術分野で一般的に知られている方法を使用して、例えば除草剤の存在下で植物または植物細胞を成長させ、除草剤の不在下での成長速度と比較した成長速度を測定することによって、除草剤に対する抵抗性または耐性に関して試験することができる。
【００６１】
本明細書で使用する、植物、植物器官、植物組織または植物細胞の実質的に正常な成長は、対応する植物、植物器官、植物組織、または野生型ＡＨＡＳタンパク質を発現する植物細胞における成長速度または細胞分裂速度の少なくとも３５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７５％である、植物、植物器官、植物組織または植物細胞の成長速度または細胞分裂速度として定義する。
【００６２】
本明細書で使用する、植物、植物器官、植物組織または植物細胞の実質的に正常な発生は、対応する植物、植物器官、植物組織、または野生型タンパク質を発現する植物細胞で起こる事象と実質的に同じ、植物、植物器官、植物組織または植物細胞における１つまたは複数の発生事象の出現として定義する。
【００６３】
特定の実施形態において、本明細書で提供する植物器官には、葉、茎、根、枝芽、花芽、分裂組織、胚、子葉、内胚乳、がく片、花弁、めしべ、心皮、おしべ、やく、小胞子、花粉、花粉管、胚珠、子房および果実、またはこれらから得る切片、薄片もしくは薄板があるが、これらだけには限られない。植物組織には、カルス組織、地下組織、脈管組織、貯蔵組織、分裂組織、葉組織、苗条組織、根組織、菌こぶ組織、植物腫瘍組織、および生殖組織があるが、これらだけには限られない。植物細胞には、細胞壁を有する単離細胞、様々な大きさのそれらの凝集体、およびプロトプラストがあるが、これらだけには限られない。
【００６４】
植物に除草剤を施用し、同様に施用した非耐性の同様の植物によって与えられる曲線との比較時に右に移動した用量／応答曲線を与えるとき、植物は関連除草剤に実質的に「耐性がある」。このような用量／応答曲線はＸ軸にプロットされた「用量」、およびＹ軸にプロットされた「殺傷率」、「除草剤効果」などを有する。耐性植物は、所与の除草剤効果をもたらすのに、非耐性の同様の植物より多量の除草剤を必要とし得る。除草剤に実質的に「抵抗性がある」植物は、原野の雑草を殺傷するため農薬散布地域により典型的に利用される濃度と割合で除草剤を施用すると、示す場合でも、わずかな壊死、溶解、萎黄病または他の損傷を示す。除草剤に抵抗性がある植物は除草剤耐性でもある。
【００６５】
植物の作製
植物種の様々な組織の組織培養、およびそこからの植物の再生は知られている。例えば、組織培養によるキャノーラ品種の繁殖は、以下のいずれか、Ｃｈｕｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｈｙｐｏｃｏｔｙｌｓ  Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，」Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ４：４−６，１９８５；Ｂａｒｓｂｙ，Ｔ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，「Ａ  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ  Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ  ｏｆ  Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ，」Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ（Ｓｐｒｉｎｇ，１９９６）；Ｋａｒｔｈａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｐｌａｎｔ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｓｔｅｍ  Ｅｘｐｌａｎｔｓ  ｏｆ  Ｒａｐｅ」，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ，３１：２１７−２２０，１９７４；Ｎａｒａｓｉｍｈｕｌｕ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｓｈｏｏｔ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  Ｃｏｔｙｌｅｄｏｎａｒｙ  Ｅｘｐｌａｎｔｓ  ｏｆ  Ｂｒａｓｓｉｃａｓ，」Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ（Ｓｐｒｉｎｇ１９８８）；Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｅ．，「Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｂｒａｓｓｉｃａ，」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６，Ｃｈａｐｔｅｒ１７，ｐ．１５９，１９９０だけには限られないが、これらのいずれかに記載されている。
【００６６】
変種のさらなる生殖を組織培養および再生によって行うことができる。ダイズの様々な組織の組織培養およびそこからの植物の再生は、よく知られており広く公開されている。例えば、Ｋｏｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  Ｘ  Ｓｕｃｒｏｓｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｓｏｙｂｅａｎ」，Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．３１：３３３−３３７，１９９１；Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，「Ａｇｒｏｎｏｍｉｃ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ−Ｃｕｌｔｕｒｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｓｏｙｂｅａｎ  Ｐｌａｎｔｓ」，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８２：６３３−６３５，１９９１；Ｋｏｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｅｍｂｒｙｏｓ  ａｓ  Ａｆｆｅｃｔｅｄ  ｂｙ  Ｓｕｃｒｏｓｅ  ａｎｄ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｓｏｙｂｅａｎｓ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｇｒａｃｉｌｉｓ  Ｓｋｖｏｒｔｚ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒ．」Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，２８：１０３−１１３，１９９２；Ｄｈｉｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｅｒｔｉｌｅ  Ｐｌａｎｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ  ｏｆ  Ｓｏｙｂｅａｎ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ  Ｌ．Ｍｅｒｒ．）；Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ」、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ１１：２８５−２８９，１９９２；Ｐａｎｄｅｙ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｌｅａｆ  ａｎｄ  Ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ  Ｅｘｐｌａｎｔｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｗｉｇｈｔｉｉ（Ｗ．ａｎｄ  Ａ．）ＶＥＲＤＣ．ｖａｒ．ｌｏｎｇｉｃａｕｄａ」，Ｊａｐａｎ  Ｊ．Ｂｒｅｅｄ．４２：１−５，１９９２；ａｎｄ  Ｓｈｅｔｔｙ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｓｈｏｏｔ  Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（Ｍｅｒｒｉｌｌ．）ｂｙ  Ａｌｌａｎｔｏｉｎ  ａｎｄ  Ａｍｉｄｅｓ」，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ８１：２４５−２５１，１９９２を参照することができる。１９９１年６月１８日に発行されたＣｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌへの米国特許第５，０２４，９４４号および１９９１年４月１６日に発行されたＲａｎｃｈ  ｅｔ  ａｌへの米国特許第５，００８，２００号の開示は、参照によりそれらの全容が本明細書に組み込まれている。
【００６７】
以下の実施例は本発明の実践を例示するものであるが、本発明の範囲を制限するものとして解釈すべきではない。
【実施例１】
【００６８】
標的塩基変化付近で切断する転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）対と組み合わせた遺伝子修復オリゴ核酸塩基（ＧＲＯＮ）を介した標的１ヌクレオチド突然変異の導入による、トランスジェニックシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）細胞における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）への青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）遺伝子の劇的に改善された転換。
【００６９】
青色蛍光タンパク質遺伝子の多数のコピーを有するシロイヌナズナ系統を、当業者に知られる方法によって作製した（例えば、Ｃｌｏｕｇｈ  ａｎｄ  Ｂｒｅｎｔ，１９９８を参照）。根部由来分裂組織培養物をこの系統で樹立し、これをプロトプラスト単離および培養に使用した（例えば、Ｍａｔｈｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５を参照）。プロトプラストへのＧＲＯＮ送達は、プロトプラストへのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）仲介ＧＲＯＮ取り込みによって実施した。Ｆｕｊｉｗａｒａ  ａｎｄ  Ｋａｔｏ（２００７）によって記載された方法と類似した、９６ウエル形式を使用する方法を使用した。以下に、そのプロトコールを簡潔に記載する。所与の体積は、９６ウエル皿の個々のウエルに施用した体積である。
１．９６ウエルプレートの各ウエルにおいて、５×１０6細胞／ｍｌで６．２５μｌのＧＲＯＮ／ＴＡＬＥＮ混合物（８０μＭ  ＢＦＰ４コード／４１ｍｅｒＧＲＯＮ）と２５μｌのシロイヌナズナＢＦＰトランスジェニック根部分裂組織由来プロトプラストを混合する。
２．３１．２５μｌの４０％ＰＥＧ溶液を加えプロトプラストを混合した。
３．処置した細胞を氷上で３０分間インキュベートした。
４．各ウエルに２００μｌのＷ５溶液を加え細胞を混合した。
５．プレートを氷上で３０分間インキュベートし、各ウエルの底部にプロトプラストを沈殿させた。
６．沈殿したプロトプラスト上の培地２００μｌを除去した。
７．８５μｌの培養培地（ＭＳＡＰ，Ｍａｔｈｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）を加えた。
８．プレートは４８時間暗所において室温でインキュベートした。培養培地添加後のＧＲＯＮの最終濃度は８μＭである。
【００７０】
このプロトコールを使用して、異なる濃度のＴＡＬＥＮプラスミドをＧＲＯＮと共に導入した。ＧＲＯＮ送達後４８時間で、サンプルをフローサイトメトリーによって分析し、その緑色蛍光と黄色蛍光が対照プロトプラストのそれと異なるプロトプラストを検出した。緑色蛍光はＢＦＰ遺伝子における標的突然変異の導入によって引き起こされ、ＧＦＰの合成をもたらす。結果は図１中に示す。
【００７１】
【化１】
2016516408.tif 000002
【００７２】
図１．根部分裂組織由来プロトプラストを、ＢＦＰ遺伝子の突然変異を標的化しＧＦＰ遺伝子への転換を引き起こすＧＲＯＮと共に、様々な濃度のＴＡＬＥＮプラスミドで処置した。ＧＦＰの発現は、ＧＲＯＮ／ＴＡＬＥＮ送達後４８時間でフローサイトメトリーによって測定した。
【００７３】
以下の実施例２〜１１全てに関して、以下の凡例を適用する：
【００７４】
ＧＲＯＮ
ＢＦＰ−＞ＧＦＰ標的設計。
ＢＦＰ−＞ＧＦＰＨ６６ＹＣＡＣ−＞ＴＡＣ。
ＢＦＰ４／Ｃ／４１／５’Ｃｙ３／３’ｉｄＣ
ＶＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＨ
ＢＦＰ４／ＮＣ／４１／５’Ｃｙ３／３’ｉｄＣ
ＶＧＣＴＧＡＡＧＣＡＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＧＴＣＡＣＧＡＧＧＧＨ
【００７５】
ＢＦＰ非標的対照設計。
ＢＦＰＨ６６−ＣＡＣ
ＢＦＰ０／Ｃ／４１／５’３ＰＳ／３’３ＰＳ
ＶＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＣＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＨ
ＶＧＣＴＧＡＡＧＣＡＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＴＧＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＧＴＣＡＣＧＡＧＧＧＨ
【００７６】
ＴＡＬＥＮ：
【００７７】
【化２】
2016516408.tif 000003
【００７８】
ｐＣＬＳ１４１６５は、１つのプラスミド上に（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３に従い設計された）２つのＴＡＬアームを有し、それぞれのアームは下線の配列と結合しＦｏｋＩ単量体と連結する。この組合せによって、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）におけるものと同様に実施した以下の一本鎖アニーリングアッセイ（ＳＳＡ）において示されるように二本鎖切断（ＤＳＢ）が生じる。
【００７９】
【化３】
2016516408.tif 000004
【００８０】
ｐＣＬＳ１５７７１は、左アームのＦｏｋＩドメインに突然変異（Ｄ４５０Ａ）があるニッカーゼである。この構築物中の右アームはｐＣＬＳ１４１６５に従う。
【００８１】
ＧＲＯＮとＴＡＬＥＮを以下に示すように試験した。非標的ＧＲＯＮ（ＢＦＰ０／ＣまたはＢＦＰ０／ＮＣ）、およびＴＡＬＥＮ単独、ならびにＧＲＯＮまたはＴＡＬＥＮプラスミドを欠く４０％ＰＥＧ溶液を用いた擬似処置からなる対照処置に、有意な転換活性はなかった。
【００８２】
この系において、ＢＦＰ４／ＮＣＧＲＯＮ設計単独はＢＦＰ４／ＣＧＲＯＮ設計単独より優れている。これらとＤＳＢＴＡＬＥＮ（ｐＣＬＳ１４１６５）を組み合わせることにより、ＢＦＰ４／ＣＧＲＯＮでの最適活性と改善倍率の両方が改善する（多くの場合＞２桁）。有意な改善はＧＲＯＮとニッカーゼＴＡＬＥＮ対の組合せにおいても観察され、幾つかの遺伝子／遺伝子座／対立遺伝子で同時に突然変異を標的化するとき、付帯的損傷を最小にすることにより最も有効であると予想される。
【実施例２】
【００８３】
ＧＲＯＮおよびＴＡＬＥＮニッカーゼ。
【００８４】
【化４】
2016516408.tif 000005
【実施例３】
【００８５】
ＧＲＯＮおよびＴＡＬＥＮニッカーゼ。
【００８６】
【化５】
2016516408.tif 000006
【実施例４】
【００８７】
ＧＲＯＮおよびＴＡＬＥＮニッカーゼ。
【００８８】
【化６】
2016516408.tif 000007
【実施例５】
【００８９】
ＧＲＯＮおよびＴＡＬＥＮニッカーゼ。
【００９０】
【化７】
2016516408.tif 000008
【実施例６】
【００９１】
ＧＲＯＮおよびＴＡＬＥＮニッカーゼ。
【００９２】
【化８】
2016516408.tif 000009
【実施例７】
【００９３】
ＧＲＯＮおよびＴＡＬＥＮニッカーゼ。
【００９４】
【化９】
2016516408.tif 000010
【実施例８】
【００９５】
ＧＲＯＮおよびＴＡＬＥＮＤＳＢ。
【００９６】
【化１０】
2016516408.tif 000011
【実施例９】
【００９７】
ＧＲＯＮおよびＴＡＬＥＮ。
【００９８】
【化１１】
2016516408.tif 000012
【実施例１０】
【００９９】
ＧＲＯＮおよびＴＡＬＥＮニッカーゼ。
【０１００】
【化１２】
2016516408.tif 000013
【実施例１１】
【０１０１】
ＧＲＯＮおよびＴＡＬＥＮＤＳＢ。
【０１０２】
【化１３】
2016516408.tif 000014
【０１０３】
参考文献
Ｃｌｏｕｇｈ，Ｓ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｂｅｎｔ，Ａ．Ｆ．（１９９８）．Ｆｌｏｒａｌ  ｄｉｐ：Ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１６，７３５−７４３。
【０１０４】
Ｍａｔｈｕｒ，Ｊ．，Ｓｚａｂａｄｏｓ，Ｌ，ａｎｄ  Ｋｏｎｃｚ，Ｃ．（１９９５）Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｌｉｑｕｉｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ，ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１４，２２１−２２６
【０１０５】
Ｆｕｊｉｋａｗａ  Ｙ，Ｋａｔｏ  Ｎ（２００７）Ｓｐｌｉｔ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ５２：１８５−１９５
【０１０６】
Ｚｈａｎｇ  Ｙ，Ｚｈａｎｇ  Ｆ，ＬｉＸ，Ｂａｌｌｅｒ  ＪＡ  Ｑｉ  Ｙ，Ｓｔａｒｋｅｒ  ＣＧ，Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ  ＡＪ，Ｖｏｙｔａｓ  ＤＦ．（２０１３）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｅｎａｂｌｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｌａｎｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６１（１）：２０−７。
【配列表】
2016516408000001.app
【国際調査報告】
2016516408.tif 000015
2016516408.tif 000016
2016516408.tif 000017