(57)【要約】  ワクチン組成物及び使用方法が本明細書に記載される。一実施形態では、ワクチン組成物は、アジュバントと組み合わせてＲＳＶ−Ｆタンパク質を含む。より具体的な実施形態では、ワクチン組成物は、脂質Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストと組み合わせてＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む。さらに具体的な実施形態では、アジュバントは、グルコピラノシルリピドＡ（ＧＬＡ）を含む。別の実施形態では、アジュバントは、安定した水中油形エマルジョン中のＧＬＡ（ＧＬＡ−ＳＥ）を含む。【選択図】図１Ａ−Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも約１μｇ及び最大約２００μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質と、脂質Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含む少なくとも約１μｇ及び最大約２０μｇのアジュバントとを含有するワクチン組成物。
【請求項２】
前記ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質が、Ｃ末端膜貫通ドメインを欠失している、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質が、細胞質尾部ドメインを欠失している、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質が、ヒト株Ａ２（配列番号２）由来のＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質のアミノ酸１〜５２４を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質が、配列番号７を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記アジュバントが、（ＴＬＲ）４アゴニストを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記アジュバントが、合成ヘキシル化リピドＡ誘導体を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記アジュバントが、グルコピラノシルリピドＡ（ＧＬＡ）を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記アジュバントが、下記式：
【化１】
2016516755.tif 000006
（式中、Ｒ1、Ｒ3、Ｒ5及びＲ6は、Ｃ11〜Ｃ20アルキルであり；Ｒ2及びＲ4は、Ｃ12〜Ｃ20アルキルである）
を有する化合物を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記アジュバントが、安定した水中油形エマルジョン中のＧＬＡ（ＧＬＡ−ＳＥ）を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記アジュバントが、安定化したスクアレンベースエマルジョン中のＧＬＡを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
前記アジュバントが、少なくとも約１％及び最大約５％の濃度を有する安定化水中油形エマルジョン中のＧＬＡを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
前記アジュバントが、少なくとも約５０ｎｍ及び最大約２００ｎｍの平均粒度を有する安定化水中油形エマルジョン中のＧＬＡを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
少なくとも約５μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
少なくとも約１０μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
少なくとも約２０μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
少なくとも約３０μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
少なくとも約５０μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
少なくとも約１００μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
少なくとも約２．５μｇのアジュバントを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
少なくとも約５μｇのアジュバントを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２１】
約１０μｇ〜約１００μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質と、約１μｇ〜約５μｇのＧＬＡ−ＳＥとを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２２】
約１０μｇ〜約１００μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質であって、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質は、ヒト株Ａ２（配列番号２）由来のＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質のアミノ酸１〜５２４を含む、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質と、濃度約１％〜５％の安定化水中油形エマルジョン中の約１μｇ〜約５μｇのＧＬＡとを含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項２３】
薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、又はこれらの組み合わせをさらに含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２４】
非経口投与のために製剤化される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２５】
筋内投与のために製剤化される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２６】
皮下投与のために製剤化される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２７】
約５０μｌ〜約５００μｌの量を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２８】
哺乳動物において呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染症を予防する方法であって、以下：少なくとも約１μｇ及び最大約２００μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質と、前記哺乳動物においてＲＳＶ感染症を予防するのに十分な脂質Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含む少なくとも約１μｇ及び最大約２０μｇのアジュバントとを含有する、治療に有効な量のワクチン組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項２９】
哺乳動物において免疫応答を誘導する方法であって、以下：少なくとも約１μｇ及び最大約２００μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質と、前記哺乳動物において防御免疫応答を誘発するのに十分な脂質Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含む少なくとも約１μｇ及び最大約２０μｇのアジュバントとを含有する、治療に有効な量のワクチン組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項３０】
過去にＲＳＶに暴露されたことがある哺乳動物においてＴｈ１バイアス細胞性免疫応答を増強する方法であって、以下：少なくとも約１μｇ及び最大約２００μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質と、前記哺乳動物において前記Ｔｈ１バイアス細胞性免疫応答を増強するのに十分な脂質Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含む少なくとも約１μｇ及び最大約２０μｇのアジュバントとを含有する、治療に有効な量のワクチン組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項３１】
前記哺乳動物の細胞性免疫応答が、前記Ｔｈ１細胞性免疫応答及びＴｈ２細胞性免疫応答を少なくとも１．２：１の比で含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記哺乳動物の細胞性免疫応答は、ＩＦＮγが優勢である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
哺乳動物においてＴｈ２バイアス免疫応答を転換する方法であって、以下：少なくとも約１μｇ及び最大約２００μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質と、前記哺乳動物において前記Ｔｈ２バイアス免疫応答を転換するのに十分な脂質Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含む少なくとも約１μｇ及び最大約２０μｇのアジュバントとを含有する、治療に有効な量のワクチン組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項３４】
哺乳動物においてＲＳＶに対する中和抗体を誘導する方法であって、以下：少なくとも約１μｇ及び最大約２００μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質と、前記哺乳動物においてＲＳＶに対する中和抗体を誘導するのに十分な脂質Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含む少なくとも約１μｇ及び最大約２０μｇのアジュバントとを含有する、治療に有効な量のワクチン組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項３５】
前記ＲＳＶ中和抗体力価が、１０．０Ｌｏｇ2より大きい、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ワクチン組成物の投与後の前記ＲＳＶ中和抗体力価が、投与前の血清ＩｇＧ力価と比較して、少なくとも約１０倍及び最大約２００倍の血清ＩｇＧ力価を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
哺乳動物においてＲＳＶウイルス力価を低減する方法であって、以下：少なくとも約１μｇ及び最大約２００μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質と、前記哺乳動物においてＲＳＶに対する中和抗体を誘発するのに十分な脂質Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含む少なくとも約１μｇ及び最大約２０μｇのアジュバントとを含有する、治療に有効な量のワクチン組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項３８】
ＲＳＶウイルス力価が、約５０〜約１０００倍低減する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ワクチン組成物の投与後、ＲＳＶウイルス力価が、２ｌｏｇ１０ｐｆｕ／グラムを下回る、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記ワクチン組成物の投与から約１週間〜１年後に、ＲＳＶウイルス力価が、２ｌｏｇ１０ｐｆｕ／グラムを下回る、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記哺乳動物が、高齢のヒトである、請求項２８〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳動物が、少なくとも約５０歳の実年齢に達している高齢のヒトである、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記哺乳動物が、少なくとも約５５歳の実年齢に達している高齢のヒトである、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記哺乳動物が、少なくとも約６０歳の実年齢に達している高齢のヒトである、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記哺乳動物が、少なくとも約６５歳の実年齢に達している高齢のヒトである、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記哺乳動物が、ＲＳＶ血清陽性である、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
単一用量レジメンを含む、請求項２８〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
１回目及び２回目用量を含む２用量レジメンを含む、請求項２８〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記１回目用量から少なくとも約１週間後に前記２回目用量を投与する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記１回目用量から少なくとも約１ヵ月後に前記２回目用量を投与する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記１回目用量から少なくとも約１年後に前記２回目用量を投与する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記ワクチン組成物を非経口で投与する、請求項２８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ワクチン組成物を筋内投与する、請求項２８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ワクチン組成物を皮下投与する、請求項２８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＲＳＶ可溶性タンパク質が、Ｃ末端膜貫通ドメインを欠失している、請求項２８〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＲＳＶ可溶性タンパク質が、細胞質尾部ドメインを欠失している、請求項２８〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質が、ヒト株Ａ２（配列番号２）由来のＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質のアミノ酸１〜５２４を含む、請求項２８〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質が、配列番号７を含む、請求項２８〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記アジュバントが、（ＴＬＲ）４アゴニストを含む、請求項２８〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記アジュバントが、合成ヘキシル化リピドＡ誘導体を含む、請求項２８〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記アジュバントが、グルコピラノシルリピドＡ（ＧＬＡ）を含む、請求項２８〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記アジュバントが、下記式：
【化２】
2016516755.tif 000007
（式中、Ｒ1、Ｒ3、Ｒ5及びＲ6は、Ｃ11〜Ｃ20アルキルであり；Ｒ2及びＲ4は、Ｃ12〜Ｃ20アルキルである）
を有する化合物を含む、請求項２８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記アジュバントが、安定した水中油形エマルジョン中のＧＬＡ（ＧＬＡ−ＳＥ）を含む、請求項２８〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記アジュバントが、安定化したスクアレンベースエマルジョン中のＧＬＡを含む、請求項２８〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記アジュバントが、少なくとも約１％及び最大約５％の濃度を有する安定化水中油形エマルジョン中のＧＬＡを含む、請求項２８〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記アジュバントが、少なくとも５０ｎｍ及び最大約２００ｎｍ（１００ｎｍ）の平均粒度を有する安定化水中油形エマルジョン中のＧＬＡを含む、請求項２８〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
少なくとも約５μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む、請求項２８〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
少なくとも約１０μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む、請求項２８〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
少なくとも約２０μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む、請求項２８〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
少なくとも約３０μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む、請求項２８〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
少なくとも約５０μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む、請求項２８〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
少なくとも約１００μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む、請求項２８〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
少なくとも約２．５μｇのアジュバントを含む、請求項２８〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
少なくとも約５μｇのアジュバントを含む、請求項２８〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
約１０μｇ〜約１００μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質と、約１μｇ〜約５μｇのＧＬＡ−ＳＥとを含む、請求項２８〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
約１０μｇ〜約１００μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質であって、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質は、ヒト株Ａ２（配列番号２）由来のＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質のアミノ酸１〜５２４を含む、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質と、濃度約１％〜５％の安定化水中油形エマルジョン中の約１μｇ〜約５μｇのＧＬＡとを含む、請求項２８〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記ワクチン組成物が、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、又はこれらの組み合わせをさらに含む、請求項２８〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記ワクチン組成物が、非経口投与のために製剤化される、請求項２８〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記ワクチン組成物が、筋内投与のために製剤化される、請求項２８〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記ワクチン組成物が、皮下投与のために製剤化される、請求項２８〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記ワクチン組成物が、約５０μｌ〜約５００μｌの量を含む、請求項２８〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１３年４月８日に提出された先の米国仮特許出願第６１／８０９，５６３号明細書の利益を主張する。尚、この文献は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
【０００２】
電子データにて提出した配列表の参照
本出願と一緒に提出したＡＳＣＩＩテキストファイル（名称：ＲＳＶＦｓｅｑｌｉｓｔ．ｔｘｔ；サイズ：４６，２０２バイト；及び作成日：２０１４年４月３日）は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
【０００３】
本発明は、概して、ウイルス感染症に対する防御をもたらす、又は防御抗体を誘発するワクチンに関する。より具体的には、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、とりわけ、ヒト呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質（ＲＳＶ−Ｆ）に対するワクチン製剤について記載する。
【背景技術】
【０００４】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、乳児及び小児における下気道疾患の主な原因である（Ｆｅｉｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．編，１９８７，Ｉｎ：Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１６５３〜１６７５頁；Ｎｅｗ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｐｒｉｏｒｉｔｉｅｓ，Ｖｏｌ．１，１９８５，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，３９７〜４０９頁；及びＲｕｕｓｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｂｌ．Ｐｅｄｉａｔｒ．２３：５０−７９）。ＲＳＶ感染症の毎年の流行性は世界規模で明らかであるが、所与のシーズンでのＲＳＶ感染症の発生率及び重症度は、地域によって異なる（Ｈａｌｌ，Ｃ．Ｂ．，１９９３，Ｃｏｎｔｅｍｐ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１０：９２−１１０）。北半球の温暖な地域では、これは、通常、秋後半に始まり、春後半に終わる。一次ＲＳＶ感染症は、最も一般的には、生後６週間から２歳の小児に起こり、稀に、院内感染の場合、生後４週間で起こることもある（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３００：３９３−３９６）。ＲＳＶ感染の危険性が高い小児としては、早産児（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３００：３９３−３９６）並びに気管支肺異形成症（Ｇｒｏｏｔｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ８２：１９９−２０３）、先天性心疾患（ＭａｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０７：３９７−４００）、先天性又は後天性免疫不全（Ｏｇｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．７：２４６−２４９；及びＰｏｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６５：１６６−１６９）、及び嚢胞性線維症（Ａｂｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１１３：８２６−８３０）を有する小児が挙げられる。ＲＳＶ感染で入院し、かつ心臓又は肺疾患を有する小児の致死率は、３％〜４％である（Ｎａｖａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１２１：３４８−３５４）。
【０００５】
ＲＳＶは、乳児及び小児同様、成人にも感染する。健康な成人において、ＲＳＶは、主に上気道疾患を引き起こす。近年、一部の成人、特に高齢者は、以前報告されているより高い頻度で症状性ＲＳＶ感染を有することが明らかになっている（Ｅｖａｎｓ，Ａ．Ｓ．編，１９８９，Ｖｉｒａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎｓ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，第３版，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｏｏｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，５２５〜５４４頁）。療養施設患者及び若年青年の入院患者の間でもいくつかの流行が報告されている（Ｆａｌｓｅｙ，Ａ．Ｒ．，１９９１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｈｏｓｐ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１２：６０２−６０８；及びＧａｒｖｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ．２８１：１２５３−１２５４）。最後に、ＲＳＶは、免疫抑制された人、とりわけ骨髄移植患者において重篤な疾患を引き起こし得る（Ｈｅｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６８：２６９−２８１）。
【０００６】
定着したＲＳＶ感染症についての治療の選択肢は限られている。下気道の重篤なＲＳＶ感染症は、多くの場合、加湿酸素の供給及び呼吸補助などの相当な支持療法を必要とする（Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．編，１９９０，Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版，Ｖｏｌ．１，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１０４５〜１０７２頁）。抗ウイルス剤のリバビリンは、感染症の治療のために承認されている（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１９９３，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ９２：５０１−５０４）。これは、免疫応答性小児における重篤なＲＳＶ感染症の経過を改変し、ＲＳＶ性肺炎及び細気管支炎の治療に有効であることが証明されている（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２５：２４−２９）。しかし、リバビリンは、長時間にわたるエーロゾル投与を必要とするとことと、妊婦が、病院の環境においてその投与中に薬物に暴露され得る潜在的危険性についての懸念から、その使用が限定されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｆｅｉｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．編，１９８７，Ｉｎ：Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１６５３〜１６７５頁
【非特許文献２】Ｎｅｗ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｐｒｉｏｒｉｔｉｅｓ，Ｖｏｌ．１，１９８５，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，３９７〜４０９頁
【非特許文献３】Ｒｕｕｓｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｂｌ．Ｐｅｄｉａｔｒ．２３：５０−７９
【非特許文献４】Ｈａｌｌ，Ｃ．Ｂ．，１９９３，Ｃｏｎｔｅｍｐ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１０：９２−１１０
【非特許文献５】Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３００：３９３−３９６
【非特許文献６】Ｇｒｏｏｔｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ８２：１９９−２０３
【非特許文献７】ＭａｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０７：３９７−４００
【非特許文献８】Ｏｇｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．７：２４６−２４９
【非特許文献９】Ｐｏｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６５：１６６−１６９
【非特許文献１０】Ａｂｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１１３：８２６−８３０
【非特許文献１１】Ｎａｖａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１２１：３４８−３５４）
【非特許文献１２】Ｅｖａｎｓ，Ａ．Ｓ．編，１９８９，Ｖｉｒａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎｓ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，第３版，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｏｏｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，５２５〜５４４頁
【非特許文献１３】Ｆａｌｓｅｙ，Ａ．Ｒ．，１９９１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｈｏｓｐ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１２：６０２−６０８；及びＧａｒｖｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ．２８１：１２５３−１２５４
【非特許文献１４】Ｈｅｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６８：２６９−２８１
【非特許文献１５】Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．編，１９９０，Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版，Ｖｏｌ．１，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１０４５〜１０７２頁
【非特許文献１６】Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１９９３，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ９２：５０１−５０４
【非特許文献１７】Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２５：２４−２９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ワクチン開発に関する１つの大きな障害は、安全性である。ホルマリン不活性化ワクチンは、免疫原性ではあるが、意外にも、同様に調製した三価パラインフルエンザワクチンで免疫した乳児より、高い発生率及び重症度のＲＳＶ性下気道疾患を免疫乳児に引き起こした（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９，Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．８９：４２２−４３４；及びＫａｐｉｋｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９，Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．８９：４０５−４２１）。このように、５０年を超える研究にもかかわらず、ＲＳＶに対する好適なワクチンは開発されていない。従って、ＲＳＶに対する安全かつ有効なワクチンの未だ満たされていない切迫した医療ニーズが残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ワクチン組成物を本明細書に記載する。特に、ワクチン組成物は、ＲＳＶ−Ｆタンパク質を含む。一実施形態において、ワクチン組成物は、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む。一実施形態では、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質は、Ｃ末端膜貫通ドメインを欠失している。より具体的な実施形態では、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質は、細胞質尾部ドメインを欠失している。一実施形態では、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質は、ヒト株Ａ２（配列番号２）由来のＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質のアミノ酸１〜５２４を含む。別の実施形態では、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質は、配列番号７を含む。
【００１０】
より具体的な実施形態において、ワクチン組成物は、アジュバントと組み合わせてＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む。一実施形態では、アジュバントは、脂質ｔｏｌｌ様受容体である。一実施形態では、アジュバントは、（ＴＬＲ）４アゴニストである。一実施形態では、アジュバントは、合成ヘキシル化リピドＡ誘導体である。より具体的な実施形態では、アジュバントは、グルコピラノシルリピドＡ（ＧＬＡ）を含む。一実施形態では、アジュバントは、下記式：
【化１】
2016516755.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は、Ｃ１１〜Ｃ２０アルキルであり；Ｒ２及びＲ４は、Ｃ１２〜Ｃ２０アルキルである）
を有する化合物を含む。一実施形態では、アジュバントは、安定した水中油形エマルジョン中のＧＬＡ（ＧＬＡ−ＳＥ）を含む。別の実施形態では、アジュバントは、安定化したスクアレンベースエマルジョン中のＧＬＡを含む。
【００１１】
一実施形態では、少なくとも約１μｇ及び最大約２００μｇのＲＳＶ−Ｆタンパク質をワクチン組成物に含有させる。一実施形態では、ＲＳＶ−Ｆタンパク質は、可溶性ＲＳＶ−Ｆタンパク質を含む。一実施形態では、少なくとも約１μｇ及び最大約２０μｇのアジュバントをワクチン組成物に含有させる。一実施形態では、アジュバントは、ＧＬＡを含む。より具体的な実施形態では、アジュバントは、ＧＬＡ−ＳＥを含む。より具体的な実施形態では、アジュバントは、濃度が少なくとも約１％及び最大約５％の安定化水中油形エマルジョン中のＧＬＡを含む。一実施形態では、アジュバントは、平均粒度が少なくとも約５０ｎｍ及び最大約２００ｎｍの安定化水中油形エマルジョン中のＧＬＡを含む。一実施形態では、ワクチン組成物はまた、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又はこれらの組み合わせも含む。ワクチン組成物は、例えば、筋内又は皮下投与などの非経口投与用に製剤化することができる。一実施形態では、ワクチン組成物は、約５０μｌ〜約５００μｌの量を有する。
【００１２】
別の実施形態では、哺乳動物において呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染症を予防する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、治療に有効な量の本明細書に記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することを含む。別の実施形態では、哺乳動物において免疫応答を誘導する方法であって、本方法は、有効量の本明細書に記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することを含む。別の実施形態では、過去にＲＳＶに暴露されたことがある哺乳動物においてＴｈ１バイアス細胞性免疫応答を増強する方法であって、本方法は、有効量の本明細書に記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することを含む。一実施形態では、哺乳動物の細胞性免疫応答は、Ｔｈ１細胞性免疫応答と、Ｔｈ２細胞性免疫応答を少なくとも約１．２：１の比で含む。別の実施形態では、哺乳動物においてＲＳＶに対する中和抗体を誘発する方法であって、本方法は、有効量の本明細書に記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することを含む。一実施形態では、ＲＳＶ中和抗体力価は、１０．０Ｌｏｇ２より大きい。一実施形態では、ワクチン組成物の投与後のＲＳＶ中和抗体力価は、投与前の血清ＩｇＧ力価と比較して少なくとも約４倍の血清ＩｇＧ力価を含む。一実施形態では、ワクチン組成物の投与後のＲＳＶ中和抗体力価は、投与前の血清ＩｇＧ力価と比較して少なくとも約１０倍及び最大約２００倍の血清ＩｇＧ力価を含む。一実施形態では、哺乳動物においてＲＳＶウイルス力価を低減する方法であって、本方法は、有効量の本明細書に記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することを含む。一実施形態では、感染後のＲＳＶウイルス力価が、約５０〜約１０００倍低減する。別の実施形態では、ワクチン組成物の投与後、ＲＳＶウイルス力価は、２ｌｏｇ  １０ｐｆｕ／グラムを下回る。より具体的な実施形態では、ワクチン組成物の投与から約１週間〜１年後に、ＲＳＶウイルス力価は、２ｌｏｇ  １０ｐｆｕ／グラムを下回る。
【００１３】
一実施形態では、哺乳動物はヒトである。別の実施形態では、哺乳動物は、高齢のヒトである。より具体的な実施形態では、哺乳動物は、少なくとも約５０歳の実年齢に達している高齢のヒトである。一実施形態では、哺乳動物は、ＲＳＶ血清陽性である。
【００１４】
一実施形態では、ワクチン組成物は、単一用量レジメンで投与する。別の実施形態では、ワクチン組成物は、１回目及び２回目用量を含む２用量レジメンで投与する。一実施形態では、２回目用量は、１回目用量から少なくとも約１週間、２週間、３週間、１ヵ月又は１年後に投与する。別の実施形態では、ワクチン組成物は、３用量レジメンで投与する。
【００１５】
図面は、本技術の実施形態を説明するものであり、限定するものではない。説明を明瞭かつ容易にするために、図面は一定の比例で作成されているわけではなく、場合によっては、特定の実施形態を理解しやすくするために、様々な側面を強調又は拡大して示すこともある。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ−Ｂ】ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるアジュバント添加ＲＳＶｓＦワクチンに対する免疫応答を示すグラフである。マウス（群当たりＮ＝７）を第０及び１４日に、表示するワクチンで免疫し、第２８日に６ｌｏｇ10ＰＦＵのＲＳＶで攻撃した。全ての群で実施した２回の実験のうち１つからの代表的データを示す。（Ａ）肺ウイルス力価。攻撃から４日後の動物の肺における残留ウイルスをプラークアッセイにより定量した。群幾何平均を示すバーと一緒に、個々の結果をｌｏｇ10で表示する。検出不能な力価を有する個体は、アッセイの検出限界（ＬＯＤ）、約１．４ｌｏｇ10でスコアを付与した。（Ｂ）血清ＲＳＶ−ＧＦＰ中和力価。群幾何平均を示すバーと一緒に、個別の第２８日血清の結果を、ウイルスの５０％減少蛍光フォーカス単位（ＦＦＵ）をもたらす血清のｌｏｇ2希釈率として表示する。検出不能な力価を有する個体は、破線により示す、３．３ｌｏｇ2のアッセイの検出限界（ＬＯＤ）でスコアを付与した。有意な差（一元配置分散分析（１  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）による）は、＊＊＊で示す。（Ｃ）Ｆ特異的ＣＤ４Ｔ細胞サイトカイン応答。脾細胞（群当たりｎ＝３）を攻撃から４日後に採取し、７２時間再刺激した。免疫優性ＭＨＣＩＩ制限ＲＳＶ−Ｆペプチドプールに対する特異的ＩＦＮγ、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、及びＩＬ−１７応答を示し、これらは、多重サイトカイン分析で得られた試験値から培地対照値を差し引くことにより算出した。群平均及びＳＥＭを示す。（Ｄ）血清Ｆ特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ力価。第２８日血清（群当たりｎ＝７）を、終点力価ＥＬＩＳＡにより、Ｆ特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａアイソタイプについて評価した。データは、５．６４ｌｏｇ2の検出限界（ＬＯＤ）と共に、ｌｏｇ2反復血清終点希釈率（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｓｅｒｕｍ  ｅｎｄｐｏｉｎｔ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）として表示する。９５％信頼区間を有する群幾何平均を示し、群同士の有意な差（一元配置分散分析（１  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）による）は、＊＊＊で示す。（Ｅ）ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ。攻撃から４日後に採取した脾細胞を免疫優性ＲＳＶ−Ｆ由来のＭＨＣ１制限ペプチドで再刺激して、ＣＤ８Ｔ細胞応答を評価した。群同士の有意な差（一元配置分散分析（１  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）による）は、＊＊＊で示す。代表的実験（２〜７回繰り返した）の３匹／群について、群平均を示すバーと一緒に、個々のマウスの結果を示す。（Ｆ）グランザイムＢ  ＥＬＩＳＰＯＴ。脾細胞を採取し、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴと同様に処理した。群同士の有意な差（一元配置分散分析（１  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）による）は、＊＊＊で示す。３匹／群について、群平均を示すバーと一緒に、個々のマウスの結果を示す。
【図１Ｃ−Ｄ】図１Ａ−Ｂと同じ。
【図１Ｅ−Ｆ】図１Ａ−Ｂと同じ。
【図２Ａ−Ｂ】一定及び変動量のＧＬＡ−ＳＥと共にＲＳＶ−ｓＦを含む組成物についてのＩＦＮγへの抗原用量漸増（ｄｏｓｅ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）の作用を示すグラフである。（Ａ）ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴに対する抗原用量漸増の作用。一定量のＧＬＡ−ＳＥ中、表示用量のＲＳＶ  ｓＦを投与した５匹／群について、群平均を示すバーと一緒に、個々のマウスの結果を示す。（Ｂ）ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴに対するアジュバント用量漸増の作用。一定量の０．３μｇのＲＳＶ  ｓＦと共に表示用量のＧＬＡ−ＳＥを投与した３〜４匹／群について、群平均を示すバーと一緒に、個々のマウスの結果を示す。
【図３Ａ−Ｄ】Ｆ特異的ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞誘導及びプライミングを示すグラフである。第０及び１４日に、１０μｇのＲＳＶ  ｓＦ単独で、又は表示のＧＬＡ−ＳＥ若しくはＳＥアジュバントと共に製剤化した１０μｇのＲＳＶ  ｓＦでマウスを筋内免疫した。脾細胞（群当たりｎ＝５）を採取し、第２８日（追加免疫から１４日後）、又は第３２日、すなわち６ｌｏｇ10ＲＳＶ  Ａ２での攻撃から４日後のいずれかの表示時点で、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴにおいて表示Ｆペプチドで再刺激した。２つの代表的実験のうち１つの個々の動物の結果を、群平均と一緒に示し、群同士の有意な差（一元配置分散分析（１  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）による）は、＊＊＊で示す。（Ａ）追加免疫から１４日後のＣＤ４応答。追加免疫から１４日後のＭＨＣ  ＩＩ制限（ＣＤ４）Ｆペプチドプールに対するＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答。（Ｂ）追加免疫から１４日後のＣＤ８応答。追加免疫から１４日後の免疫優性ＭＨＣ  Ｉ制限（ＣＤ８）Ｆペプチドに対するＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答。（Ｃ）攻撃から４日後のＣＤ４応答。攻撃から４日後のＭＨＣ  ＩＩ制限（ＣＤ４）Ｆペプチドプールに対するＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答。（Ｄ）攻撃から４日後のＣＤ８応答。攻撃から４日後の免疫優性ＭＨＣ  Ｉ制限（ＣＤ８）Ｆペプチドに対するＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答。
【図４Ａ−Ｂ】肺におけるＲＳＶに対するリコールＣＤ８Ｔ細胞応答を示すグラフである。第０及び１４日に、表示のワクチン製剤（１回の免疫当たり０．３μｇのＲＳＶ  ｓＦを用いて）でマウスを免疫し、第２８日に、６ｌｏｇ10ｐｆｕのＲＳＶで攻撃した。攻撃から４日、７日、又は１２日後に肺を採取し（各群及び時点につきｎ＝３）、（Ａ）ＲＳＶ−Ｆ由来のＨ−２Ｋd制限ペプチド又は（Ｂ）ＲＳＶ  Ｍ２由来Ｈ−２Ｋd制限ペプチドのいずれかで６時間再刺激した。細胞をＣＤ３及びＣＤ８のために表面染色し、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びＩＬ−２のために細胞内染色してから、応答ＣＤ８Ｔ細胞の頻度についてＬＳＲ２で分析した。＊＊＊で示す群同士の有意な差（一元配置分散分析（１  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）による）と共に、群平均を示す。２回の実験のうちの１つからの代表的データを示す。
【図５Ａ−Ｆ】ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＲＳＶ攻撃に対する肺応答を示すグラフ及び組織学被検体である。第０及び１４日に、表示のワクチンでマウス（群当たりｎ＝７）を免疫し、第２８日に、６ｌｏｇ10ｐｆｕのＲＳＶで攻撃した。攻撃から４日後に肺を採取した。全ての群で実施した２回の実験のうちの１つからの代表的データを示す。（Ａ〜Ｆ）肺ホモジネート中のサイトカイン。清澄化した肺ホモジネート中のＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＦＮγ、ＩＬ−１７、及びエオタキシンを多重サイトカイン分析により定量してから、採取した肺のグラム当たりの量として計算した。個々のマウスの結果を、群平均を示すバーと一緒に示す。ＩＦＮγ：ＩＬ−５比を計算するために、計算の前に、まず各値に１を加えることにより、値をゼロ点調整した。
【図６Ａ−Ｆ】肺細胞浸潤。ホルマリン固定肺切片をＨ＆Ｅ染色した後、炎症マーカについて評価した。各群について代表的１０×実視野を示す。
【図７Ａ−Ｃ】ナイーブコットンマウスにおけるアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦワクチンに対する免疫応答を示すグラフである。第０及び２１日に、表示のワクチン製剤（１回の免疫当たり０．３μｇのＲＳＶ  ｓＦを用いて）でラットを免疫し、第４２日に、６ｌｏｇ10ｐｆｕのＲＳＶで攻撃した。（Ａ）肺ウイルス力価。攻撃から４日後に、個々のラット（群当たりｎ＝８）から肺を採取して、プラーク形成アッセイにより残留ウイルスを定量した。群幾何平均を示すバーと一緒に、個々の結果をｌｏｇ10で表示する。点線は、対照ＰＢＳ＋ＧＬＡ−ＳＥ群と比較した、残留ウイルスの３ｌｏｇ10減少を示す。個々の群及び生ＲＳＶ  Ａ２群同士の有意な差（一元配置分散分析（１  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）による）を＊＊＊で示す。（Ｂ）鼻ウイルス力価。攻撃から４日後に、個々のラット（群当たりＮ＝８）から鼻及び鼻甲介を採取して、プラーク形成アッセイにより残留ウイルスを定量した。群幾何平均を示すバーと一緒に、個々のデータをｌｏｇ10で表示する。点線は、対照ＰＢＳ＋ＧＬＡ−ＳＥ群と比較した、残留ウイルスの３ｌｏｇ10減少を示す。個々の群及び生ＲＳＶ  Ａ２群同士の有意な差（一元配置分散分析（１  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）による）を＊＊＊で示す。（Ｃ）血清ＲＳＶ中和力価。第４２日血清（群当たりＮ＝５）を熱不活性し、蛍光フォーカスアッセイによって標的細胞のＲＳＶ−ＧＦＰ感染の中和について試験した。データは、ウイルスの５０％低減蛍光フォーカス単位（ＦＦＵ）をもたらす血清のｌｏｇ2希釈率として表示し、３．３ｌｏｇ2の検出限界（ＬＯＤ）を破線で示す。群平均及び９５％信頼区間を示すバーと一緒に、個々の結果を示す。個々のワクチン群同士の有意な差（一元配置分散分析（１  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）による）を＊＊＊で示す。（Ｄ）ＲＳＶ  ｓＦに特異的な血清ＩｇＧ力価。第４２日の血清（群当たりＮ＝５）を終点ＥＬＩＳＡによりＲＳＶ  ｓＦの結合について試験した。データは、ＯＤ＞３×バックグラウンドをもたらす血清のｌｏｇ2希釈率として表示し、３．３ｌｏｇ2の検出限界（ＬＯＤ）を破線で示す。群平均及び９５％信頼区間を示すグレーのバーと一緒に、個々の結果を示す。個々のワクチン群同士の有意な差（一元配置分散分析（１  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）による）を＊＊＊で示す。（Ｅ）ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ。ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴにおいて、攻撃から４日後に採取した脾細胞（群当たりＮ＝４〜５）を培地又はＲＳＶ  ｓＦタンパク質のいずれかで再刺激した。試験値から培地対照値を差し引くことにより、Ｆ特異的応答を定量した。個々のワクチン群同士の有意な差（一元配置分散分析（１  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）による）を＊＊＊で示す。（Ｆ）ＩＦＮγ：ＩＬ−４ＥＬＩＳＰＯＴの比。Ｆ特異的ＩＬ−４ＥＬＩＳＰＯＴ応答を評価した後、各値に１を加えることにより値のゼロ点調整を実施してから、ＩＦＮγ：ＩＬ−４スポット形成単位の比を計算した。
【図７Ｄ−Ｆ】図７Ａ−Ｃと同じ。
【図８Ａ−Ｆ】コットンラットにおけるＲＳＶ攻撃に対する肺応答を示す組織学的サンプルである。第０及び２１日に、表示のワクチンでコットンラットを免疫し、第４２日に、６ｌｏｇ10ｐｆｕのＲＳＶで攻撃した。攻撃から４日後に、肺を採取した。ホルマリン固定した肺切片をＨ＆Ｅ染色して、炎症性マーカについて評価した。各群（群当たりｎ＝５）からの代表的１０×実視野を示す。
【図９Ａ−Ｂ】アフィニティ精製ＲＳＶ  ｓＦタンパク質のゲル分析の写真である。還元（レーンａ）及び非還元（レーンｂ）条件下、１０〜１２％ポリアクリルアミドゲル中で精製ｓＦタンパク質を分解し、Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙで視覚化した。分子量マーカを余白に示す。
【図１０Ａ−Ｂ】マウス血清抗ｓＦ抗体力価を示すグラフである。第０及び１４日に、アジュバントを含まないか、又はＧＬＡ−ＳＥを含む表示用量のＲＳＶ  ｓＦでマウスを免疫し、第２８日に、６ｌｏｇ10ｐｆｕのＲＳＶで攻撃した。（Ａ）第２８日の血清を、終点力価ＥＬＩＳＡにより、Ｆ特異的ＩｇＧについて評価した。個々のマウスについてｌｏｇ2反復血清希釈率を表示し、バーは、群幾何平均を示す。アッセイの検出限界（ＬＯＤ）は、５．６４ｌｏｇ2であり、点線で示す。（Ｂ）第３２日の血清を、終点力価ＥＬＩＳＡにより、Ｆ特異的ＩｇＡについて評価した。個々のマウスについてｌｏｇ2反復血清希釈率を表示し、グレーのバーは、群幾何平均を示す。アッセイの検出限界（ＬＯＤ）は、４．３２ｌｏｇ2であり、点線で示す。
【図１１Ａ−Ｂ】ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＲＳＶ  ｓＦ抗体の最適ｉｎ  ｖｉｖｏ用量の決定を示すグラフである。第０及び１４日に、アジュバントを含まないか、又は５μｇのＧＬＡ−ＳＥを含む表示用量のＲＳＶ  ｓＦ（０．０１〜１．５μｇ）でマウスを免疫し、第２８日に、６ｌｏｇ10ｐｆｕのＲＳＶで攻撃した。（Ａ）攻撃から４日後に、ｌｏｇ10ｐｆｕ／グラムで測定した肺中の残留ウイルス力価についてのプラークアッセイ。（Ｂ）第２８日の、ｌｏｇ2反復血清希釈率で表すＲＳＶ血清中和力価。
【図１２】細胞内サイトカイン染色を示すグラフである。マウス（群当たりｎ＝３〜５）を第０及び１４日に、表示ワクチンで免疫し、第２８日に６ｌｏｇ10ｐｆｕのＲＳＶで攻撃した。第３２日、すなわち攻撃から４日後に脾細胞を採取し、免疫優性ＲＳＶ−Ｆ由来ＭＨＣ  Ｉ制限ペプチドで再刺激して、ＣＤ８Ｔ細胞応答を評価した。細胞内サイトカイン染色及びフローサイトメトリー分析による、多機能性ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−２＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の定量。
【図１３】第０及び１４日に、ＰＢＳ又はＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥで免疫したナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスからの免疫血清による複数のＲＳＶ単離物の交差中和を示す表である。過去１０年にわたって得られた広範な米国地理的分布（ＮＹ、ＣＯ、ＣＡ、ＮＭ／ＡＺ）からのＲＳＶ臨床分離株の中和について、第２８日血清を試験した。
【図１４Ａ−Ｂ】ＧＬＡ−ＳＥ（２％中５μｇ）を含まないか、又は含む表示のＲＳＶ  ｓＦ用量（０．４、２、又は１０μｇ）によるワクチン接種の２８日前に、ＲＳＶの１回感染により血清陽性にしたＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ワクチン接種後の各時点についての血清Ｆ特異的ＩｇＧ終点力価を示すグラフである。各時点で、血清を終点力価ＥＬＩＳＡによりＦ特異的ＩｇＧについて評価し、カットオフ値は、Ａ450＞３×平均バックグラウンドである。データは、ｌｏｇ2で示し、検出限界（ＬＯＤ）は、５〜５．６４である。（Ａ）第０日での血清陽性を例証するために、個々のマウスの結果を、群平均（群当たりｎ＝８〜９）を表すバーと一緒に示す。（Ｂ）ｎ＝６〜９匹についてワクチン接種後の各時点での群平均Ｆ特異的ＩｇＧ力価を示し、エラーバーは、９８％信頼区間を表す。
【図１５】１×血清陽性ＢＡＬＢ／ｃマウスのワクチン接種後の血清ＲＳＶ中和力価の時間経過を示すグラフである。各時点での個々のマウスからの血清を熱不活性化し、補体の非存在下で標的細胞のＲＳＶ−ＧＦＰ感染の中和について蛍光フォーカスアッセイにより試験した。データは、蛍光フォーカス単位（ＦＦＵ）を５０％低減した血清のｌｏｇ2希釈率として表示する。値＜３．３２の検出限界（ＬＯＤ）は、計算の目的で、２．３２として記録した。ｎ＝６〜９匹について各時点の群幾何平均を示し、エラーバーは、９５％信頼区間を表す。ＰＢＳ（血清陰性）群に対して、一元配置分散分析（ｏｎｅ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）によりｐ＜０．０５である群を＊で示す。
【図１６】１×血清陽性ＢＡＬＢ／ｃマウスのワクチン接種後の第１４日の血清Ｆ特異的ＩｇＡを示すグラフである。ワクチン接種から１４日後の動物の血清終点抗体力価を、３倍連続希釈を用いて、ＥＬＩＳＡにより定量した（群当たりＮ＝５〜６）。データは、ｌｏｇ２で表示し、本アッセイのＬＯＤは、４．３２である。個々のマウスの結果は、群平均及び９５％信頼区間を表すエラーバーと一緒に示す。ＰＢＳをワクチン接種した血清陽性群と比較して有意な差（ｐ＜０．０５）を＊で示す。
【図１７Ａ−Ｂ】１×血清陽性ＢＡＬＢ／ｃマウスのワクチン接種後の第０日及び第４２日の血清Ｆ特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａを示すグラフである。血清は、Ａ450＞３×ブランクの平均値のカットオフ値で、終点力価ＥＬＩＳＡによりＦ特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａについて評価した。データは、ｌｏｇ2で表示する。バーは、９５％信頼区間の群幾何平均を示す。（Ａ）Ｎ＝８〜９匹／群で、検出限界（ＬＯＤ）は、ＩｇＧ１の場合、４．０５、ＩｇＧ２ａは４．５である。（Ｂ）Ｎ＝５〜６匹で、ＬＯＤは、いずれのアッセイについても５．０である。
【図１８Ａ−Ｃ】１×血清陽性ＢＡＬＢ／ｃマウスのワクチン接種後の第４２日の血清部位特異的競合ＥＬＩＳＡを示すグラフである。ワクチン接種から４２日後に個々のマウスからの血清を、ＲＳＶ−Ｆ部位特異的抗体の１：２５〜１：２×１０6の希釈率範囲にわたって、部位Ａ、Ｂ及びＣにそれぞれ結合する部位特異的ｍＡｂ１１２１、８５９９、及び１３３１Ｈとの競合ＥＬＩＳＡにより評価した。群当たりＮ＝６。このアッセイでは、検出された吸光度が低いほど、部位特異的ｍＡｂとＲＳＶ  ｓＦの結合に対するポリクローナル血清による大きな競合を示す。１：１２５の代表的希釈の競合率（％）（１００×［１−｛血清ＯＤ／ｍＡｂＯＤ平均｝］）を個々のマウス血清について示し、共に表示するバーは、群平均を示す。対応する非アジュバント添加群と比較して有意性（ｐ＜０．０５）を＊＊で示す。
【図１９Ａ−Ｂ】ワクチン接種後の第１０及び第７３日の、ワクチン接種１×血清陽性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＲＳＶ  ｓＦに対するＣＤ４Ｔ細胞サイトカイン応答を示すグラフである。脾細胞を採取した後、培地又はＲＳＶ  ｓＦタンパク質で再刺激して、ＣＤ４Ｔ細胞応答を評価した（群当たりＮ＝３）。７２時間の再刺激後、上清中のＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、及びＩＬ−１７をＢｉｏｐｌｅｘ多重サイトカイン分析により測定した。試験値から培地対照値を差し引くことにより、Ｆ特異的応答を計算した。標準偏差を示すエラーバーと共に群平均を示す。Ａ）ワクチン接種後の第１０日、群当たりｎ＝３。Ｂ）第７３日、すなわちＲＳＶ攻撃から４日後、群当たりｎ＝３〜５。
【図２０Ａ−Ｂ】ワクチン接種後の第１０日の、１×血清陽性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫優性ＲＳＶ−Ｆペプチドに対するＣＤ８Ｔ細胞応答を示すグラフである。ワクチン接種から１０日後に脾細胞を採取した後、免疫優性ＲＳＶ−Ｆ由来ＭＨＣ  Ｉ制限ペプチドで再刺激して、ＣＤ８Ｔ細胞応答を評価した（群当たりＮ＝３）。（Ａ）ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ。個々の結果を、群平均を示すバーと一緒に表示する。（Ｂ）細胞内サイトカイン染色のフローサイトメトリー分析により測定した６時間の再刺激後の総ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（％）として示す、多機能性ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−２＋ＣＤ８＋Ｔ細胞。群平均及び標準誤差を示す。
【図２１Ａ−Ｂ】ワクチン接種後の第７３日の、１×血清陽性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫優性ＲＳＶ−Ｆペプチドに対するＣＤ８Ｔ細胞応答を示すグラフである。攻撃から４日後に脾細胞を採取した後、免疫優性ＲＳＶ−Ｆ由来ＭＨＣ  Ｉ制限ペプチドで再刺激して、ＣＤ８Ｔ細胞応答を評価した（群当たりＮ＝３〜５）。（Ａ）ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ。個々の結果を、群平均を示すバーと一緒に表示する。（Ｂ）細胞内サイトカイン染色のフローサイトメトリー分析により測定した６時間の再刺激後の総ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（％）として示す、選択群における多機能性ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ２＋ＣＤ８＋Ｔ細胞。群平均及び標準誤差を示す。
【図２２】ＲＳＶによる再攻撃前に、ワクチン接種した１×血清陽性ＢＡＬＢ／ｃマウスから採取した肺ホモジネート中のサイトカイン応答を示すグラフである。６ｌｏｇ10ｐｆｕのＲＳＶによる攻撃から４日後のマウスの肺におけるサイトカインを肺ホモジネートの多重サイトカイン分析により定量した（群当たりＮ＝５〜６）。群平均及び９５％信頼区間を示すバーと一緒に、個々のマウスの結果を２つの最も重要なサイトカイン（ＩＦＮγ及びＩＬ−５）について表示する。
【図２３】ｓＦワクチンによるワクチン接種前の１×血清陽性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＥＬＩＳＡによる血清Ｆ特異的ＩｇＧを示すグラフである。データは、参照標準と比較してＥＬＩＳＡにより定量して、ｍｇ／ｍＬ当量で表示する。個々のマウスの結果を、群平均（群当たりｎ＝８〜９）を示すバーと一緒に表示する。
【図２４】ＲＳＶ  ｓＦワクチンで１×血清陽性ＢＡＬＢ／ｃマウスのワクチン接種から２週間後のＥＬＩＳＡによる血清Ｆ特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａアイソタイプを示すグラフである。データは、参照標準と比較してＥＬＩＳＡにより定量して、ｍｇ／ｍＬ当量で表示し、検出限界（ＬＯＤ）は８ｍｇ／ｍＬである。バーは、９５％信頼区間を有する、Ｎ＝６〜７匹／群の群幾何平均を示す。
【図２５】１×血清陽性ＢＡＬＢ／ｃマウスのワクチン接種後の血清ＲＳＶ中和力価の時間経過を示すグラフである。各時点の個々のマウスからの血清を熱不活性化し、補体の非存在下で標的細胞のＲＳＶ−ＧＦＰ感染の中和について蛍光フォーカスアッセイにより試験した。データは、蛍光フォーカス単位（ＦＦＵ）を５０％低減した血清のｌｏｇ２希釈率として表示する。値が＜３．３２の検出限界（ＬＯＤ）である場合、計算の目的で、２．３２として記録する。ｎ＝６〜９匹について各時点の群幾何平均を示し、エラーバーは、９５％信頼区間を表す。
【図２６Ａ】ワクチン接種から１０日後の、１×血清陽性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫優性ＲＳＶ  Ｆペプチドに対するＣＤ８Ｔ細胞応答を示すグラフである。ワクチン接種から１０日後に脾細胞を採取した後、免疫優性ＲＳＶ−Ｆ由来ＭＨＣ  Ｉ制限ペプチドで再刺激しした（群当たりＮ＝３〜４）。Ａ）ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ。個々の結果は、群平均を示すバーと一緒に表示する。Ｂ）細胞内サイトカイン染色のフローサイトメトリー分析により測定した６時間の再刺激後の総ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（％）として示す、多機能性ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−２＋ＣＤ８＋Ｔ細胞。群平均及び標準誤差を示す。
【図２６Ｂ】図２６Ａと同じ。
【図２７】各種アジュバントを含まないか、又は含む１０μｇＲＳＶ  ｓＦによる１×血清陽性ＢＡＬＢ／ｃマウスのワクチン接種後の血清ＲＳＶ中和力価の時間経過を示すグラフである。各時点の個々のマウスからの血清を熱不活性化して、補体の非存在下で標的細胞のＲＳＶ−ＧＦＰ感染の中和について蛍光フォーカスアッセイにより試験した。データは、蛍光フォーカス単位（ＦＦＵ）を５０％低減した血清のｌｏｇ2希釈率として表す。値が＜３．３２の検出限界（ＬＯＤ）である場合、計算の目的で、２．３２として記録する。ｎ＝６〜９匹について各時点の群幾何平均を示し、エラーバーは、９５％信頼区間を表す。ＰＢＳ（血清陰性）群に対し、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）によるｐ＜０．０５の群を示す。
【図２８Ａ−Ｂ】ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＲＳＶ攻撃に対する肺応答を示すグラフである。マウス（群当たりｎ＝７）を第０及び１４日に、表示ワクチンで免疫し、第２８日に６ｌｏｇ10ｐｆｕのＲＳＶで攻撃した。攻撃から４日後、肺を採取した。全ての群で実施した２回の実験のうちの１つからの代表的データを示す。（Ａ〜Ｂ）肺ホモジネート中のサイトカイン。清澄化した肺ホモジネート中のエオタキシン及びＩＬ−１３のレベルを多重サイトカイン分析により定量してから、採取した肺のグラム当たりの量として計算した。個々のマウスの結果を、群平均を示すバーと一緒に示す。
【図２９Ａ−Ｂ】各種アジュバントを含まないか、又は含む１０μｇＲＳＶ  ｓＦによるワクチン接種後の第１０日の、１×血清陽性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫優性ＲＳＶ−Ｆペプチドに対するＣＤ８Ｔ細胞応答を示すグラフである。ワクチン接種から１０日後に脾細胞を採取した後、免疫優性ＲＳＶ−Ｆ由来ＭＨＣ  Ｉ制限ペプチドで再刺激して、ＣＤ８Ｔ細胞応答を評価した（群当たりＮ＝３）。（Ａ）ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ。個々の結果を、群平均を示すバーと一緒に表示する。（Ｂ）細胞内サイトカイン染色のフローサイトメトリー分析により測定した６時間の再刺激後の総ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（％）として示す、多機能性ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−２＋ＣＤ８＋Ｔ細胞。群平均及び標準誤差を示す。
【図３０Ａ−Ｂ】非ワクチン接種ナイーブスプラーグ・ドーリーラットにおけるＲＳＶ複製動力学を示すグラフである。ナイーブ５〜６週齢雌スプラーグ・ドーリーラットは、第０日に鼻内接種により２×１０6ｐｆｕのＲＳＶ  Ａ２を受けた。清澄化した肺又は鼻ホモジネートの連続希釈を用いたプラークアッセイによりＲＳＶ力価を定量した（１時点につきＮ＝５）。群幾何平均ＲＳＶ力価を示すバーと一緒に、個々の結果を表示する。最も高い検出限界（ＬＯＤ）を実線で示す。力価＜ＬＯＤの個体には、グラフ作成及び統計計算のために、４．０の値を付与した。
【図３１Ａ−Ｂ】ナイーブスプラーグ・ドーリーラットのワクチン接種から６時間後の血清サイトカインを示すグラフである。多重ビーズベースＥＬＩＳＡにより、血清をラットＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−１β及びＧＲＯ／ＫＣについて評価した。ｐｇ／ｍＬでの定量を標準曲線との比較により決定した。バーは、９５％信頼区間を有する群幾何平均を示す（Ｎ＝５〜６匹／群）。検出下限を破線で示す。力価＜ＬＯＤの個体には、グラフ作成及び統計計算のために、ＬＯＤと等しい値を付与した。
【図３１Ｃ−Ｄ】図３１Ａ−Ｂと同じ。
【図３２Ａ−Ｃ】ナイーブスプラーグ・ドーリーラットのワクチン接種後のＲＳＶ  ｓＦ特異的ＩｇＧ力価を示すグラフである。ＥＬＩＳＡによるＲＳＶ−Ｆ特異的ＩｇＧの終点力価をｌｏｇ2で表示する。バーは、第１４日のｎ＝３匹／群及び第２２及び４２日のｎ＝４〜６匹／群からの９５％信頼区間を有する群幾何平均を示す。５．６４のアッセイ検出限界（ＬＯＤ）（破線で示す）を下回るサンプルには、グラフ作成のために、５．６４の値を付与した。＊は、ＰＢＳ群に対するｐ＜０．０５を示し、＊＊は、テューキー（Ｔｕｋｅｙ）のポストテストと共に一元配置分散分析（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を用いた、対応するＲＳＶ  ｓＦ群に対するｐ＜０．０５を示す。Ａ）ワクチン接種後の第１４日。Ｂ）ワクチン接種後の第２２日。Ｃ）ワクチン接種後の第４２日。
【図３３】ナイーブスプラーグ・ドーリーラットのワクチン接種後の第４２日の血清ＲＳＶ  ｓＦ特異的アイソタイプを示すグラフである。終点ＥＬＩＳＡにより、ＲＳＶ−Ｆ  ｓＦ特異的ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧ２ｂアイソタイプを測定した。バーは、ｎ＝４〜６匹／群からの群幾何平均を示す。５．６４のアッセイ検出限界（ＬＯＤ）（破線で示す）を下回るサンプルには、グラフ作成のために、５．６４の値を割り当てた。＊は、ＰＢＳ群に対するｐ＜０．０５を示し、＊＊は、テューキー（Ｔｕｋｅｙ）のポストテストを用いた一元配置分散分析（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）による、対応するＲＳＶ  ｓＦ群に対するｐ＜０．０５を示す。
【図３４Ａ−Ｂ】ナイーブスプラーグ・ドーリーラットのワクチン接種後のＲＳＶ中和力価を示すグラフである。表示ワクチンを接種した個々のラット及び対照からの血清を熱不活性化して、補体の非存在下で標的細胞のＲＳＶ−ＧＦＰ感染を中和するそれらの能力について蛍光フォーカスアッセイにより試験した。データは、蛍光フォーカス単位（ＦＦＵ）を５０％低減した血清のｌｏｇ2希釈率として表示する。３．３２の検出限界（ＬＯＤ）を下回るサンプルには、グラフ作成及び統計計算の目的で、３．３０の値を付与した。群当たりｎ＝４〜６匹について個々の結果を示し、９５％信頼区間を表すエラーバーと一緒に群幾何平均も表示する。＊は、ＰＢＳ群に対するｐ＜０．０５を示し、＊＊は、テューキー（Ｔｕｋｅｙ）のポストテストを用いた一元配置分散分析（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）による、対応する非アジュバントＲＳＶ  ｓＦ群に対するｐ＜０．０５を示す。
【図３５】ワクチン接種したナイーブスプラーグ・ドーリーラットからの脾細胞におけるＲＳＶ  Ｆ特異的ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答を示すグラフである。ＲＳＶ  Ａ２攻撃から４日後に脾細胞を採取し、ＲＳＶ  ｓＦタンパク質再刺激に対する応答についてＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴにより評価した（群当たりＮ＝４〜６）。各処理群について個々の結果並びに群平均及び標準偏差を表示する。＊は、ＰＢＳと比較したｐ＜０．０５を示し、＊＊は、ボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）の多重比較ポストテストを用いた一元配置分散分析（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）による、対応する非アジュバント添加ｓＦと比較したｐ＜０．０５を示す。
【図３６Ａ−Ｂ】ワクチン接種したナイーブスプラーグ・ドーリーラットにおける攻撃後のＲＳＶ  Ａ２力価を示すグラフである。第４２日に、全てのワクチン群を２×１０6ｐｆｕのＲＳＶ  Ａ２でＩＮ攻撃した。清澄化した肺又は鼻ホモジネートの連続希釈を用いて、攻撃から４日後のプラークアッセイによりＲＳＶ力価を定量した（群当たりＮ＝４〜６）。群幾何平均ＲＳＶ力価を示すバーと一緒に、個々の結果を表示する。検出限界（ＬＯＤ）を実線で示し（肺の場合は、８．７ｐｆｕ／グラム、鼻の場合は４．０ｐｆｕ／グラム）、ＬＯＤに満たないサンプルには、グラフ作成及び統計計算のために、ＬＯＤ値を割り当てた。
【図３７Ａ−Ｂ】ＲＳＶ  ｓＦワクチンを投与したナイーブげっ歯類における経時的体重変化を示すグラフである。（Ａ）第０日及び第２１日に、アジュバントを含まないか、又はアジュバントＧＬＡ−ＳＥ（５μｇ／２％）、ＧＬＡ（５μｇ）、ＳＥ（２％）、若しくはミョウバン（１００μｇ）を含む０．３μｇのＲＳＶ  ｓＦで、ナイーブコットンラットにワクチン接種し、第０日から第２５日までその体重変化率（％）を追跡した。（Ｂ）第０日及び第２１日に、ＧＬＡ−ＳＥ（２．５μｇ／２％）を含まないか、又は含む１０〜１００μｇのＲＳＶ  ｓＦでナイーブスプラーグ・ドーリーラットをワクチン接種し、第０日から第４２日までその体重変化率（％）を追跡した。
【図３８】ＲＳＶ血清陽性マウスの中和力価を示すグラフである。第０日及び第３５日に、１×１０６ＰＦＵのＲＳＶ  Ａ２をマウスに鼻内経路で投与した。第２８日（生ＲＳＶ  Ａ２の１回投与後）及び第５６日（生ＲＳＶ  Ａ２の２回目投与から２８日後）に、３．３の下限ＬＯＤを用いたマイクロ中和アッセイにより中和Ａｂ力価を定量した。ナイーブマウスサブセットの力価も示す。ＦＦＵの５０％低減をもたらした最近似希釈率のｌｏｇ２として力価を計算した。最初の血清希釈率（１：１０）が、蛍光フォーカス単位数≦投入ウイルスの５０％をもたらさなかった場合、力価は１０として記録し、分析のために３．３ｌｏｇ２の値を用いた。ナイーブマウスについてはＮ＝８、第２８日及び第５６日はＮ＝３５。ＳＤと共に平均を示す。
【図３９】免疫から１４日後の中和抗体応答を示すグラフである。免疫から１４日後（第７０日）の中和Ａｂ力価を、３．３の下限ＬＯＤを用いたマイクロ中和アッセイにより定量した。ＦＦＵの５０％低減をもたらした最近似希釈率のｌｏｇ2として力価を計算した。最初の血清希釈率（１：１０）が、蛍光フォーカス単位数≦投入ウイルスの５０％をもたらさなかった場合、力価は１０として記録し、分析のために３．３ｌｏｇ2の値を入力した。平均及びＳＤと共にＮ＝４匹を示す。
【図４０】試験期間にわたる中和抗体応答を示すグラフである。第５６日、第７０日及び第８４日の中和抗体力価を、３．３の下限ＬＯＤを用いたマイクロ中和アッセイにより定量した。ＦＦＵの５０％低減をもたらした最近似希釈率のｌｏｇ２として力価を計算した。最初の血清希釈率（１：２０）が、蛍光フォーカス単位数≦投入ウイルスの５０％をもたらさなかった場合、力価は１０として記録し、分析のために３．３ｌｏｇ２の値を入力した。第５６日はＮ＝８匹、第７０日及び第８４日はＮ＝４匹であり、平均及びＳＥＭを一緒に示す。
【図４１】ワクチン接種前の血清陽性マウスにおけるベースラインＲＳＶ  Ｆ特異的ＩｇＧ応答を示すグラフである。個々のマウス血清について、ＲＳＶ  ｓＦ塗布プレート上でのＥＬＩＳＡにより総抗ＦＩｇＧ血清力価を定量した。モノクローナル抗体１３３１Ｈ（Ｂｅｅｌｅｒ及びｖａｎ  Ｗｙｋｅ  Ｃｏｅｌｉｎｇｈ，１９８９）を用いて、標準曲線を作成した。ナイーブ群はＮ＝８匹、ＲＳＶの２回連続感染を受けたマウスＮ＝３５匹。平均及びＳＤを示す。
【図４２】免疫から１４日後の総ＲＳＶ  Ｆ特異的ＩｇＧ力価を示すグラフである。個々のマウス血清について、ＲＳＶ  ｓＦ塗布プレート上でのＥＬＩＳＡにより総抗ＦＩｇＧ血清力価を定量し、力価のｌｏｇ２をグラフ化した。精製モノクローナル抗体１３３１Ｈ（Ｂｅｅｌｅｒ及びｖａｎ  Ｗｙｋｅ  Ｃｏｅｌｉｎｇｈ，１９８９）を用いて、標準曲線を作成した。Ｎ＝４で、平均ＳＤを共に示す。一元配置分散分析（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）及びテューキー（Ｔｕｋｅｙ）による統計分析。
【図４３】試験期間にわたる総ＲＳＶ  Ｆ特異的ＩｇＧ力価を示すグラフである。個々のマウス血清について、ＲＳＶ  ｓＦ塗布プレート上でのＥＬＩＳＡにより総抗ＦＩｇＧ血清力価を定量し、力価のｌｏｇ２をグラフ化した。精製モノクローナル抗体１３３１Ｈ（Ｂｅｅｌｅｒ及びｖａｎ  Ｗｙｋｅ  Ｃｏｅｌｉｎｇｈ，１９８９）を用いて、標準曲線を作成した。Ｎ＝４で、平均ＳＤを共に示す。Ｎ＝４で、平均ＳＤを共に示す。
【図４４】ＲＳＶ  Ｆ特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ応答を示すグラフである。個々のマウス血清について、ＲＳＶ  ｓＦ塗布プレート上でのＥＬＩＳＡにより、第８４日（免疫から２８日後）に抗ＦＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａ血清レベルを定量した。精製モノクローナル抗体１３３１Ｈ又は１３０８（Ｂｅｅｌｅｒ及びｖａｎ  Ｗｙｋｅ  Ｃｏｅｌｉｎｇｈ，１９８９）を用いて、標準曲線を作成した。Ｎ＝４で、平均及びＳＥＭを共に示す。
【図４５Ａ】ＲＳＶ攻撃から４日後の肺サイトカイン力価を示すグラフである：攻撃から４日後に単離した肺ホモジネートからの上清中のＩＦＮγ及びＩＬ−５肺サイトカイン力価をＢｉｏｐｌｅｘ多重サイトカイン分析により測定した。Ｎ＝４匹で、ＳＥＭを共に示す。
【図４５Ｂ】図４５Ａと同じ。
【図４６Ａ−Ｂ】ＲＳＶ攻撃から４日後の肺サイトカイン力価：エオタキシン（図４６Ａ）、ＩＬ−１３（図４６Ｂ）及びＲＡＮＴＥＳ（図４６Ｃ）を示すグラフである。攻撃から４日後に単離した肺ホモジネートからの上清中の肺サイトカイン力価をＢｉｏｐｌｅｘ多重サイトカイン分析により測定した。Ｎ＝４匹で、ＳＥＭを共に示す。
【図４６Ｃ】図４６Ａ−Ｂと同じ。
【図４７Ａ−Ｂ】ＥＬＩＳＰＯＴによるＣＤ８Ｔ細胞Ｆペプチド脾細胞再刺激を示すグラフである。免疫から１１日後（図４７Ａ）又は攻撃から４日後（図４７Ｂ）のいずれかに、脾細胞を単離した。Ｆ特異的ＣＤ８Ｔ細胞エピトープで脾細胞を刺激して、ＩＦＮγ分泌細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより決定した。マウス４匹の群平均を示す。一元配置分散分析（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）及びテューキー（Ｔｕｋｅｙ）ポストテストによる統計分析。
【図４８Ａ−Ｂ】血清陽性コットンラットにおける総ＲＳＶ  ＦＩｇＧ血清応答を示すグラフである。希釈率１：１０００の個々のマウス血清について、ＲＳＶ  ｓＦ塗布プレート上でのＥＬＩＳＡにより、総抗ＦＩｇＧ血清レベルを比較した。第２８及び３８日についてはＮ＝８匹の群平均を、また第４９及び５６日についてはＮ＝５匹の群平均をＳＤと共に示す。２週間置きに１×１０6ＰＦＵのＲＳＶ  Ａ２の４回反復した連続免疫を鼻内経路で受けたコットンラットから、正のコットンラット対照血清をプールした。負のコットンラット対照血清は、ナイーブラットからプールした。
【図４８Ｃ−Ｄ】図４８Ａ−Ｂと同じ。
【図４９Ａ−Ｂ】血清陽性コットンラットにおける中和抗体応答を示すグラフである。第２８日及び第４９日の中和抗体力価を、３．３の下限ＬＯＤを用いたマイクロ中和アッセイにより定量した。力価は、ＦＦＵの５０％低減をもたらす希釈率のＥＣ５０計算値のｌｏｇ２である。第２８日のＮ＝８匹及び第４９日のＮ＝５匹の群平均、並びにＳＤを示す。最初の血清希釈率（１：１０）が、蛍光フォーカス単位（ＦＦＵ）数≦投入ウイルスの５０％をもたらさなかった場合、力価は１０として記録し、分析のために３．３［ｌｏｇ2（１０）］の値を入力した。
【図５０Ａ−Ｂ】血清陽性コットンラットにおける中和抗体力価の増加倍数を示すグラフである。第２８、３８、４９及び５６日の中和抗体力価をマイクロ中和アッセイにより定量した。ＥＣ５０値は、投入ウイルスのＦＦＵの５０％低減をもたらす希釈率として計算した。増加倍数は、各コットンラットについて、表示日のＥＣ５０値を第２８日のＥＣ５０値で割ることにより計算した。第３８日のＮ＝８匹及び第４９及び５６日のＮ＝５匹についての群幾何平均を９５％信頼区間と共に示す。１の値は、中和力価の増大がないことを示す。
【図５０Ｃ】図５０Ａ−Ｂと同じ。
【図５１Ａ−Ｂ】血清陽性コットンラットにおける第５６日の部位特異的抗体応答を示すグラフである。第５６日の個々のラットからの血清を、部位Ａ、Ｂ及びＣにそれぞれ結合するＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）、１１１２及び１３３１Ｈとの競合ＥＬＩＳＡにより、ＲＳＶ  Ｆ部位特異的抗体の１：２５〜１：２×１０6の希釈率範囲にわたって評価した。個々の血清について１：１２５の代表的希釈率での競合率（％）（１００×［１−｛血清ＯＤ／ｍＡｂＯＤ平均｝］）を示す。
【図５１Ｃ】図５１Ａ−Ｂと同じ。
【図５２Ａ−Ｂ】血清陽性コットンラットにおける総ＲＳＶ  ＦＩｇＧ血清応答を示すグラフである。６．６ｌｏｇ2のＬＯＤで、個々のマウス血清について、ＲＳＶ−ｓＦ塗布プレート上での終点希釈ＥＬＩＳＡにより、総抗ＦＩｇＧ血清レベルを定量した。ブランクの平均値の２倍を超えるＯＤをもたらした最高希釈率のｌｏｇ2として終点を計算した。最初の血清希釈率（１：１００）が、ブランクの平均値の２倍以下であった場合、力価は１００として記録し、分析のために６．６（ｌｏｇ2１００）の値を使用した。ＳＤと共にＮ＝１１匹の群平均を示す。２週間置きに１×１０6ＰＦＵのＲＳＶ  Ａ２の４回反復した連続免疫を鼻内経路で受けたコットンラットから、正のコットンラット対照血清をプールした。負のコットンラット対照血清は、ナイーブラットからプールした。一元配置分散分析（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）及びテューキー（Ｔｕｋｅｙ）ポストテストによる統計分析。
【図５３】血清陽性コットンラットにおけるＲＳＶ  Ｆ特異的ＩｇＧ力価の増加倍数を示すグラフである。ＲＳＶ  ｓＦ特異的ＩｇＧ力価を第２８及び３日に定量した。増加倍数は、２を、各コットンラットについて第３８日のｌｏｇ２終点力価から第２８日のｌｏｇ２終点力価を差し引くことによって得られた値の累乗にすることによって計算した。９５％信頼区間を有するＮ＝１１匹の群幾何平均示す。点線は、Ｙ＝１及びＹ＝４地点である。１の値は中和力価の増大がないことを示す。２週間置きに１×１０6ＰＦＵのＲＳＶ  Ａ２の４回反復した連続免疫を鼻内経路で受けたコットンラットから、正のコットンラット対照血清をプールした。負のコットンラット対照血清は、ナイーブラットからプールした。
【図５４Ａ−Ｂ】血清陽性コットンラットにおけるＲＳＶ中和抗体応答を示すグラフである。第２８日及び第３８日の中和抗体力価を、３．３の下限ＬＯＤを用いたマイクロ中和アッセイにより定量した。力価は、ＦＦＵの５０％低減をもたらす希釈率のＥＣ５０計算値のｌｏｇ２である。Ｎ＝１１匹の群平均をＳＤと共に示す。最初の血清希釈率（１：１０）が、蛍光フォーカス単位（ＦＦＵ）数≦投入ウイルスの５０％をもたらさなかった場合、力価は１０として記録し、分析のために３．３［ｌｏｇ2（１０）］の値を入力した。２週間置きに１×１０6ＰＦＵのＲＳＶ  Ａ２の４回反復した連続免疫を鼻内経路で受けたコットンラットから、正のコットンラット対照血清をプールした。負のコットンラット対照血清は、ナイーブラットからプールした。一元配置分散分析（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）及びテューキー（Ｔｕｋｅｙ）ポストテストによる統計分析。
【図５５】血清陽性コットンラットにおけるＲＳＶ中和抗体力価の増加倍数を示すグラフである。第２８及び３８日の中和抗体力価をマイクロ中和アッセイにより定量した。ＥＣ５０値は、投入ウイルスのＦＦＵの５０％低減をもたらす希釈率として計算した。増加倍数は、各コットンラットについて、表示日のＥＣ５０値を第２８日のＥＣ５０値で割ることにより計算した。９５％信頼区間を有するＮ＝１１匹の群幾何平均を示す。点線は、１及び４地点である。１の値は、中和力価の増大がないことを示す。
【図５６Ａ−Ｂ】血清陽性コットンラットにおける第３８日の部位特異的抗体応答を示すグラフである。第５６日の個々のラットからの血清を、部位Ａ、Ｂ及びＣにそれぞれ結合するＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）、１１１２及び１３３１Ｈとの競合ＥＬＩＳＡにより、ＲＳＶ  Ｆ部位特異的抗体の１：２５〜１：２×１０6の希釈率範囲にわたって評価した。個々の血清について１：１２５の代表的希釈率での競合率（％）（１００×［１−｛血清ＯＤ／ｍＡｂＯＤ平均｝］）を示す。Ｎ＝１１匹の群平均をＳＤと共に示す。２週間置きに１×１０6ＰＦＵのＲＳＶ  Ａ２による４回反復した連続免疫を鼻内経路で受けたコットンラットから、正のコットンラット対照血清をプールした。負のコットンラット対照血清は、ナイーブラットからプールした。一元配置分散分析（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）及びテューキー（Ｔｕｋｅｙ）ポストテストによる統計分析。
【図５６Ｃ】図５６Ａ−Ｂと同じ。
【図５７Ａ−Ｂ】第７日から第１８３日までの個々のカニクイザルにおける抗ＦＩｇＧ抗体力価の時間経過を示すグラフである。矢印で示すように、第０、２８、及び１６９日に、ワクチン（第１群のＲＳＶ  ｓＦ又は第２群のＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥのいずれか）を投与した。個々のサルについての抗ＦＩｇＧ力価を試験時点でのｌｏｇ２値で表示し、アッセイの検出限界は６．６ｌｏｇ２（１：１００血清希釈率に相当する）である。検出限界を下回る値は、視覚化のために６．０と推定する。
【図５８Ａ−Ｂ】第７日から第１８３日までの個々のカニクイザルにおけるＲＳＶ中和抗体力価の時間経過を示すグラフである。赤い矢印で示すように、第０、２８、及び１６９日に、ワクチン（第１群のＲＳＶ  ｓＦ又は第２群のＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥのいずれか）を投与した。個々のサルについての中和ＩＣ50力価を試験時点でのｌｏｇ２値で表示し、アッセイの検出限界は２．３ｌｏｇ２（１：５血清希釈率に相当する）である。検出限界を下回る値は、視覚化のために２．３と推定する。
【図５９Ａ−Ｂ】第７日から第１８３日までの個々のカニクイザルにおけるＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答の時間経過を示すグラフである。赤い矢印で示すように、第０、２８、及び１６９日に、ワクチン（第１群のＲＳＶ  ｓＦ又は第２群のＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥのいずれか）を投与した。各々のサルについての個々の結果は、試験した時点での１００万ＰＢＭＣ当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）で表示する。応答動物（４倍増加及びベースラインからの＞５０ＳＦＣ／百万の変化の両方を呈示する動物）を星印で示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
１．定義
本明細書において別に定義しない限り、科学及び技術用語は、当業者に一般に理解されている意味を有する。さらに、文脈によって別段必要でない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【００１８】
本明細書で用いるように、用語「約」は、この技術分野において当業者には周知である、それぞれの値についての誤差の範囲を指す。
【００１９】
本明細書で用いるように、用語「アジュバント」は、製剤中の特定の免疫原と組み合わせて用いられる場合、得られる免疫応答を増大、あるいは改変又は修飾する化合物を指す。免疫応答の修飾は、抗体及び細胞性免疫応答のいずれか若しくは両方の強化又はその特異性の広幅化を含んでよい。免疫応答の修飾はまた、特定の抗原特異的免疫応答を低減又は抑制することを意味する場合もある。
【００２０】
用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を通して、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、又はこれらの組み合わせなどの標的を認識して、特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書で用いるように、用語「抗体」は、抗体が要望される生物活性を発揮するものである限りにおいて、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂｓ’）２、及びＦｕフラグメント）、一本鎖Ｆｕ（ｓｃＦｖ）突然変異体、少なくとも２つのインタクトな抗体から作製された二重特異性抗体などの多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、並びに抗原認識部位を含む他のあらゆる修飾免疫グロブリン分子を包含する。用語「抗体」は、さらに、次の４つのポリペプチド鎖：２つの軽（Ｌ）鎖と２つの重（Ｈ）鎖から成る分子量約１５０ｋＤａのＹ字型糖タンパク質も指すことができる。哺乳動物のＩｇ重鎖アイソタイプには、次のギリシャ文字：アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、及びミュー（μ）で示される５つのタイプがある。重鎖のタイプによって、抗体のクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが決定される。γ及びαクラスは、定常ドメイン配列及び機能の違いに応じて、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２などのサブクラスにさらに区分される。哺乳動物の場合、λ及びκの２つのタイプの免疫グロブリン軽鎖がある。抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ「ＶＨ」及び「ＶＬ」と呼ばれることもある。これらのドメインは、一般に、抗体の最も可変性（同じクラスの他の抗体に対して）の部分であり、抗原結合部位を含む。
【００２１】
本明細書で用いるように、用語「抗原製剤」又は「抗原組成物」は、脊椎動物、特に、鳥類又は哺乳動物に投与すると、免疫応答を誘導する調製物を指す。
【００２２】
本明細書で用いるように、年齢層には、若年期、性成熟期、及び高齢期がある。用語「若年（期）」は、哺乳動物が、誕生から性成熟期に達する時期までを指す。用語「性成熟（期）」は、当該種の哺乳動物が、概して、交配及び生殖することができる年齢にある哺乳動物を指す。本明細書で用いるように、用語「高齢（期）」は、性成熟期から死までの哺乳動物を指す。用語「高齢（期）」は、年代学（すなわち、年齢）；社会的役割の変化（すなわち、労働形態の変化、子供の成人及び閉経）；並びに／又は能力の変化（すなわち、病弱な状態、老化及び肉体的特徴の変化）に関して定義することができる。年代学に関して、ヒトについて述べる場合、用語「高齢（期）」は、一般に、少なくとも約５０、５５、６０又は６５歳の年齢に達した人を指す。
【００２３】
本明細書で用いるように、「ウイルス融合タンパク質」又は「融合タンパク質」又は「Ｆタンパク質」は、任意のウイルス融合タンパク質を指し、限定はしないが、ネイティブウイルス融合タンパク質又は可溶性ウイルス融合タンパク質、例えば、組換えウイルス融合タンパク質、合成により生成したウイルス融合タンパク質、並びに細胞から抽出したウイルス融合タンパク質などが挙げられる。本明細書で用いるように、「ネイティブウイルス融合タンパク質」は、天然起源のウイルス遺伝子又は天然に存在するウイルスＲＮＡによりコードされるウイルス融合タンパク質を指す。用語「可溶性融合タンパク質」又は「可溶性Ｆタンパク質」は、典型的に、ネイティブタンパク質のＣ末端領域に位置する機能性膜結合領域が欠失している融合タンパク質を指す。本明細書で用いるように、用語「組換えウイルス融合タンパク質」は、操作されたヌクレオチド配列から得られ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏ発現系で生成されるウイルス融合タンパク質を指す。ウイルス融合タンパク質は、様々なウイルス及びウイルス株（限定はしないが、ヒト及び非ヒト系統のウイルス株など）由来の関連タンパク質を含む。ウイルス融合タンパク質は、Ｉ型及びＩＩ型ウイルス融合タンパク質を含む。多数のＲＳＶ−融合タンパク質が記載されており、当業者には周知である。
【００２４】
本明細書で用いるように、用語「免疫原」又は「抗原」は、免疫応答を誘発することができるタンパク質、ペプチド、核酸などの物質を指す。いずれの用語も、エピトープを包含し、置換え可能に用いられる。
【００２５】
本明細書で用いるように、用語「免疫原性製剤」は、脊椎動物、例えば、哺乳動物に投与すると、免疫応答を誘導する調製物を指す。
【００２６】
本明細書で用いるように、「医薬組成物」は、薬学的に許容される担体と、必要に応じて１種又は複数の希釈剤若しくは賦形剤と一緒に、治療に有効な量のＲＳＶ−Ｆタンパク質を含む組成物を指す。本明細書で用いるように、用語「薬学的に許容される」とは、それが、哺乳動物、とりわけヒトへの使用について、連邦若しくは州政府の取締機関により承認されているか、又は米国薬局方、欧州薬局方、若しくは他の一般に認知されている薬局方に記載されていることを意味する。
【００２７】
本明細書で用いるように、用語「薬学的に許容されるワクチン」は、脊椎動物に投与することができ、感染症若しくは疾患を予防及び／若しくは改善する、並びに／又は感染症若しくは疾患の少なくとも１つの症状を軽減するために免疫を誘導するのに十分な防御免疫応答を誘導する形態で、ＲＳＶ−Ｆ免疫原を含有する製剤を指す。一実施形態では、ワクチンは、被検者におけるＲＳＶ感染症の少なくとも１つの症状を予防又は軽減する。ＲＳＶの症状は、当該技術分野ではよく知られている。その症状として、鼻漏、咽喉痛、頭痛、嗄声、咳、喀痰、熱、ラ音、喘鳴、及び呼吸困難などが挙げられる。従って、一実施形態では、本方法は、ＲＳＶ感染症に関連する少なくとも１つの症状の予防又は軽減を含み得る。症状の軽減は、例えば、被検者による自己評価、医師の評価又は適切なアッセイ若しくは測定（例えば、体温）、例えば、クォリティオブライフ評価、ＲＳＶ感染症若しくは別の症状の進行の減速、ＲＳＶ症状の重症度の軽減、又は好適なアッセイ（例えば、抗体力価及び／又はＴ細胞活性化アッセイ）により、主観的又は客観的に決定することができる。
【００２８】
本明細書で用いるように、用語「有効な量」は、要望される生物学的効果を実現するために必要な、又は十分な抗原の量を指す。用語「有効な用量」は、一般に、感染症若しくは疾患を予防及び／若しくは改善する、並びに／又は感染症若しくは疾患の少なくとも１つの症状を軽減するために免疫を誘導するのに十分な防御免疫応答を誘導することができる抗原の量を指す。用語「治療に有効な量」は、所与の状態に対する治療効果及び投与レジメンをもたらす量を指す。
【００２９】
本明細書で用いるように、用語「ナイーブ」は、特定の抗原、例えば、ＲＳＶに以前暴露されたことがない人又は免疫系を指す。ナイーブな人又は免疫系は、抗原に対する検出可能な抗体又は細胞性応答がない。用語「血清陽性」は、特定の抗原に以前暴露されたことがあり、従って、対象とする抗原に対して検出可能な血清抗体力価を有する哺乳動物又は免疫系を指す。用語「ＲＳＶ血清陽性」は、ＲＳＶ抗原に以前暴露されたことがある哺乳動物又は免疫系を指す。血清陽性の人又は免疫系は、特定の抗原への過去の暴露を示す血清中の抗体又は他の免疫マーカの存在により識別することができる。
【００３０】
本明細書で用いるように、フレーズ「防御的免疫応答」又は「防御的応答」は、感染因子又は疾患に対する抗体により媒介される免疫応答を指し、これは、脊椎動物（例えば、ヒト）により呈示され、感染症を予防若しくは改善する、又はその少なくとも１つの症状を軽減する。本明細書に記載されるＲＳＶ−Ｆタンパク質ワクチンは、例えば、感染因子を中和する、感染因子が細胞に進入するのを阻止する、感染因子の複製を阻止する、及び／又は宿主細胞を感染及び破壊から防御する抗体の生産を刺激することができる。この用語はまた、感染因子若しくは疾患に対してＴリンパ球及び／又は他の白血球により媒介される免疫応答も指し、これは、脊椎動物（例えば、ヒト）により呈示され、感染症若しくは疾患を予防若しくは改善する、又はその少なくとも１つの症状を軽減する。
【００３１】
本明細書で用いるように、用語「脊椎動物」又は「被検者」又は「患者」は、亜門網（ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ  ｃｏｒｄａｔａ）の任意のメンバーを指し、これらのメンバーとしては、限定はしないが、ヒト及びそれ以外の霊長類、例えば、チンパンジーなどの非ヒト霊長類及びその他の類人猿及びサル種が挙げられる。畜牛、ヒツジ、ブタ、ヤギ、及びウマなどの家畜；イヌ及びネコなどの家庭飼育哺乳動物；マウス、ラット（コットンラットを含む）及びモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物；飼育される鳥、野鳥および狩猟鳥を含む鳥類（例えば、ニワトリ、七面鳥並びに他のキジ目の鳥、アヒル、ガチョウなど）も非制限的例である。用語「哺乳動物」及び「動物」は、この定義に含まれる。成体及び新生個体の両方が対象となることが意図される。特に、乳児及び幼児は、ＲＳＶワクチンの適切な被検者又は患者である。
【００３２】
本明細書で用いるように、用語「ワクチン」は、死んだ、若しくは弱毒化した病原体、又は病原体から得た抗原決定基の調製物を指し、この調製物は、抗体の形成又は病原体に対する免疫を誘導するために用いられる。さらに、用語「ワクチン」は、例えば、防御的免疫、すなわち感染に関連する疾患を予防するか、又はその重症度を軽減する免疫を生成するために、脊椎動物に投与される免疫原（例えば、ＲＳＶ−Ｆタンパク質）の懸濁液若しくは溶液を指すこともある。
【００３３】
２．ウイルス融合糖タンパク質
ウイルス融合糖タンパク質は、ウイルスの感染中に、膜融合誘導により、宿主細胞へのウイルスの侵入を媒介するが、こうしたタンパク質として、シグナルペプチドを含む、又は含まない前駆体（Ｆ0）タンパク質、並びにＦ1及びＦ2サブユニットなどの活性化及び／又は成熟断片がある。本明細書で用いるように、用語「成熟」及び「活性化」は、宿主プロテアーゼにより前駆体タンパク質から成熟融合タンパク質に変換されたウイルス融合タンパク質を指す。典型的には、活性化ウイルス融合タンパク質は、膜アンカー型及び膜遠位サブユニットを含み、これらは、それぞれＦ1及びＦ2と称されている。活性Ｆ1及びＦ2サブユニットは、ジスルフィド結合により互いに連結されていることが多い。
【００３４】
３．ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）タンパク質
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ニューモウイルス亜科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）及びニューモウイルス属（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）のメンバーである。ＲＳＶは、２つの亜群Ａ及びＢに分けられ、これらは、主に、Ｇ遺伝子及びコードされたタンパク質の変異性に基づいて区別される。ＲＳＶは、３つの膜貫通構造タンパク質（Ｆ、Ｇ及びＳＨ）、２つのマトリックスタンパク質（Ｍ及びＭ２）、３つのヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ、Ｐ及びＬ）、並びに２つの非構造タンパク質（ＮＳ１及びＮＳ２）をコードする一本鎖ネガティブセンスＲＮＡゲノムを特徴とする包膜ウイルスである。
【００３５】
ＲＳＶの２つの主要な防御抗原は、包膜融合物（Ｆ）及び結合（Ｇ）糖タンパク質であり、これらは、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の表面上に発現され、中和抗体の標的となることがわかっている。これらの２つのタンパク質はまた、ウイルス認識及び標的細胞への侵入も主に担っている。Ｇタンパク質は、特定の細胞受容体に結合し、Ｆタンパク質は、ウイルスと細胞との融合を促進する。Ｆタンパク質は、感染細胞の表面にも発現され、後に他の細胞との融合を担い、合包体形成を引き起こす。従って、Ｆタンパク質に対する抗体は、ウイルスを中和するか、又はウイルスの細胞への侵入を阻止するか、あるいは合包体形成を防止することができる。Ａ及びＢサブタイプの間の抗原及び構造的違いが、Ｇ及びＦタンパク質の両方について記載されているが、より有意な抗原の違いはＧタンパク質にある。反対に、Ｆタンパク質に対して産生された抗体は、サブタイプＡ及びＢウイルスの間で高度の交差反応性を示す。ゆえに、Ｆタンパク質は、ウイルス表面に存在し、従って、免疫監視を利用可能であることから、ＲＳＶを中和するための魅力的な標的である。さらに、Ｆタンパク質は、Ｇタンパク質と比較して変異性が低い。
【００３６】
Ｆタンパク質は、Ｎ末端切断シグナルペプチドと、Ｃ末端付近の膜アンカーとを有するＩ型膜貫通表面タンパク質である。天然では、ＲＳＶ−Ｆタンパク質は、単一の不活性５７４アミノ酸前駆体（Ｆ0と称する）として発現される。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、Ｆ0は、小胞体においてオリゴマー化し、エンドプロテアーゼによりタンパク質分解性プロセッシングを受けて、２つのジスルフィド結合したサブユニット、Ｆ1及びＦ2を含有する連結ヘテロ二量体を生成する。これらの断片の小さい方が、Ｆ2と呼ばれ、Ｆ0前駆体のＮ末端部分に由来する。切断によって形成されるＦ1サブユニットのＮ末端は、疎水性ドメイン（融合ペプチド）を含有し、これは、宿主細胞膜と結合して、ウイルス、又は感染細胞の膜と、標的細胞膜との融合を促進する。一実施形態では、Ｆタンパク質は、Ｆ1／Ｆ2ヘテロ二量体の三量体又は多量体である。
【００３７】
本明細書に記載する組成物に用いるのに好適なＲＳＶ−Ｆタンパク質は、任意のＲＳＶ株又は当該技術分野では公知の分離株由来のものでよく、そのようなものとして、例えば、Ａ２、Ｌｏｎｇ、ＡＴＣＣ  ＶＲ−２６、１９、６２６５、Ｅ４９、Ｅ６５、Ｂ６５、ＲＳＢ８９−６２５６、ＲＳＢ８９−５８５７、ＲＳＢ８９−６１９０、及びＲＳＢ８９−６６１４などのヒト株；又はＡＴｕｅ５１９０８、３７５、及びＡ２Ｇｅｌｆｉなどのウシ株；又はヒツジ株が挙げられる。
【００３８】
一実施形態では、本明細書で用いるＲＳＶ−Ｆタンパク質は、本明細書に記載するＲＳＶ−Ｆアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含み得るか、又は本明細書に記載するＲＳＶ−Ｆアミノ酸配列に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０のアミノ酸修飾を含み得る。例えば、野生型ＲＳＶ−Ｆヒト株Ａ２のアミノ酸配列は、配列番号２に記載される。
【００３９】
ネイティブの完全長ウイルス融合タンパク質は、典型的に、膜結合領域を含む。往々にしてネイティブタンパク質のＣ末端領域に位置する機能性膜結合領域を欠失した組換え可溶性ウイルス融合タンパク質を作製することができる。組換え可溶性ウイルス融合タンパク質は、ウイルス融合タンパク質の機能性膜結合領域の欠失、突然変異、又は当該技術分野では公知の任意の様式の破壊によって作製することができる。例えば、膜結合領域の任意の部分若しくは全部を除去又は修飾することができる。但し、その場合、膜結合領域が、検出可能なほど機能性ではない（例えば、領域がもはや膜内に常在しない）、及び（ｉｉ）一定割合の膜結合領域が、残っている（例えば、約５０％以下が残っている）、除去されている（例えば、約５０％以上が除去されている）、又は修飾されている（例えば、約５０％以上が修飾されている）ことを条件とする。破壊された膜結合領域が、タンパク質と原形質膜の結合をもはやもたらさなくなる程度は、タンパク質の膜結合を評価することが可能な当該技術分野で公知の任意の技術により決定することができる。例えば、ウイルス融合タンパク質と既知膜結合タンパク質の共免疫染色を実施して、膜内に保持されるタンパク質を視覚化することができる。可溶性ウイルス融合タンパク質の例を本明細書に記載するが、これには可溶性ＲＳＶ−Ｆタンパク質が含まれる。可溶性ＲＳＶ−Ｆタンパク質は、本明細書においてＲＳＶ−ｓＦとも呼ばれる。可溶性ＲＳＶ−Ｆは、例えば、配列番号２のアミノ酸５２５〜５７４に対応するＲＳＶ−Ｆタンパク質の５０アミノ酸Ｃ末端膜貫通ドメインの少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の欠失により作製することができる。可溶性ＲＳＶ−Ｆのアミノ酸配列は、配列番号７に記載される。
【００４０】
呼吸器合胞体ウイルスのＡ２株（ＲＳＶ−Ｆ  Ａ２）の融合糖タンパク質について、３つの非重複抗原部位（Ａ、Ｂ、及びＣ）並びに１つの架橋部位（ＡＢ）が同定されている。（Ｂｅｅｌｅｒ及びＷｙｋｅ  Ｃｏｅｌｉｎｇｈ，（１９８９）“Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ：Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｕｐｏｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３（７）：２９４１−２９５０）。一実施形態では、ＲＳＶ−Ｆタンパク質は、１つ又は複数のインタクトなＡ、Ｂ若しくはＣ中和エピトープを含む。一実施形態では、ＲＳＶ−Ｆタンパク質は、少なくともＡエピトープを含む。別の実施形態では、ＲＳＶ−Ｆタンパク質は、少なくともＢエピトープを含む。別の実施形態では、ＲＳＶ−Ｆタンパク質は、少なくともＣエピトープを含む。他の実施形態では、ＲＳＶ−Ｆタンパク質は、少なくともＡ及びＢエピトープ、少なくともＢ及びＣエピトープ、又は少なくともＡ及びＣエピトープを含む。別の実施形態では、ＲＳＶ−Ｆタンパク質は、３つ全ての中和エピトープを含む（すなわち、Ａ、Ｂ及びＣ）。
【００４１】
４．ＲＳＶ−Ｆの組換え体発現
一実施形態では、ワクチン組成物は、ＲＳＶ−Ｆタンパク質を含む。本明細書で用いるように、用語「ＲＳＶ−Ｆタンパク質」は、完全長野生型ＲＳＶ−Ｆタンパク質、並びに、例えば、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質（ＲＳＶ−ｓＦとも呼ばれる）などのその変異体及び断片を指す。一実施形態では、ワクチン組成物は、組換えにより生産されたＲＳＶ−Ｆタンパク質を含む。より具体的な実施形態では、ワクチン組成物は、組換えにより生産される可溶性ＲＳＶ−Ｆタンパク質を含む。
【００４２】
組換えによりＲＳＶ−Ｆタンパク質を生産するために、ウイルス融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、ベクターの複製、ベクターの一部の転写（例えば、ＯＲＦの転写）及び／又は細胞でのタンパク質の発現用のベクターに挿入又はクローン化してよい。用語「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）は、ウイルス融合タンパク質、例えば、可溶性ウイルス融合タンパク質をコードする核酸配列を指し、これは、開始コドン（リボ核酸のＡＵＧ及びデオキシリボ核酸のＡＴＧ）と停止コドン（例えば、リボ核酸のＵＡＡ（オークル（ｏｃｈｒｅ））、ＵＡＧ（アンバー（ａｍｂｅｒ））若しくはＵＧＡ（オパール（ｏｐａｌ））及びデオキシリボ核酸のＴＡＡ、ＴＡＧ若しくはＴＧＡ）との間に位置する。
【００４３】
ベクターはまた、ＯＲＦ又は他の核酸エレメントのクローン化、複製、転写、翻訳及び／又は選択を容易にするエレメントを含んでもよい。従って、ベクターは、以下のエレメントの１つ又は複数又は全部を含んでもよい：１つ又は複数のプロモータエレメント、１つ又は複数の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、標的ヌクレオチド配列（「挿入エレメント」）を挿入することができる１つ又は複数の領域、１つ又は複数のＯＲＦ、１つ又は複数の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、及び選択エレメント。ＯＲＦのようなエレメントをベクター核酸に組み込むために、当業者には周知の任意の好都合なクローン化戦略を用いてよい。
【００４４】
本発明に適用することができる分子生物学的技術、例えば、クローン化、突然変異、細胞培養などを記載する一般的文献としては、以下のものが挙げられる：Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２０００（“Ｓａｍｂｒｏｏｋ”）並びにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（”Ａｕｓｕｂｅｌ”）。これらの文献は、突然変異誘発、ベクターの使用、プロモータ、並びに例えば、ＲＳＶ−Ｆタンパク質のクローン化及び突然変異に関する他の様々な関連項目を記載している。さらに、可溶性ウイルス融合タンパク質のためのクローン化戦略については、ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＯＦ  ＳＯＬＵＢＬＥ  ＶＩＲＡＬ  ＦＵＳＩＯＮ  ＧＬＹＣＯＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＩＮ  ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ  ＣＥＬＬＳと題する国際公開第２０１２／１０３４９６号パンフレットに、より詳しく記載されている。これらの参照文献の開示内容は、参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。
【００４５】
本明細書に記載する組成物は、ＲＳＶ−Ｆの変異体も包含する。変異体は、ＲＳＶ−Ｆタンパク質のアミノ酸配列に改変を含んでもよい。タンパク質に関する用語「変異体」は、参照配列に対して、１つ又は複数のアミノ酸により改変されているアミノ酸配列を指す。変異体は、「保存的」変化及び／又は「非保存的」変化を含み得る。また、他の変異は、アミノ酸欠失、挿入、置換、又はその組み合わせも含み得る。生物学的又は免疫学的活性を排除することなく、どのアミノ酸残基を置換、挿入することができるか、又は欠失させることができるかを決定する上での指針は、当該技術分野において公知のコンピュータプログラム、例えば、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウエアを用いてみいだすことができる。
【００４６】
一実施形態では、本明細書に記載のウイルス融合タンパク質をコードする核酸は、ヌクレオチド配列全体を通して、１つ又は複数のコドン内の１つ又は複数のヌクレオチド塩基を変更することにより、修飾することができる。本明細書で用いるように、「ヌクレオチド塩基」は、４つのデオキシリボ核酸塩基、すなわちアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、及びチミン（Ｔ）のいずれか、又は４つのリボ核酸塩基、すなわちアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）のいずれかを指す。本明細書で用いるように、「コドン」は、特定のアミノ酸をコードする、１組の３つのヌクレオチド塩基を指す。一般に、各アミノ酸は、１つ又は複数のコドンによってコードされ得る。表１は、各アミノ酸について考えられる実質的に全てのコドン候補を示す。
【００４７】
【表１】
2016516755.tif 000004
【００４８】
一実施形態では、ＲＳＶ−Ｆをコードする核酸は、１つ又は複数の置換を含んでよい。得られるタンパク質のアミノ酸を非保存的又は保存的に変更するように、置換を実施することができる。保存的変更は、一般に、得られるタンパク質の構造及び機能にあまり変化をもたらさない。非保存的変更は、得られるタンパク質の構造、活性又は機能を改変する傾向が大きい。一実施形態では、ＲＳＶ−Ｆをコードする核酸は、得られるタンパク質の活性又は結合特性を大きく改変しない１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を含む。
【００４９】
本明細書で用いるように、用語「保存的置換」は、１つ又は複数のアミノ酸残基が、構造は異なるが、化学的特性は類似した残基で置換される置換を指し、例えば、疎水性残基を疎水性残基で置換する場合、又は酸性残基を別の酸性残基で、又は極性残基を極性残基で、又は塩基性残基を塩基性残基で置換する場合などがある。非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられる。芳香環構造を含むアミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンである。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが挙げられる。正荷電（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられる。負荷電（酸性）アミノ酸としては、アスパルギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。保存的置換のより具体的な例として、限定はしないが、正電荷が維持されるように、Ａｒｇの代わりにＬｙｓ及びその逆；負電荷が維持されるように、Ａｓｐの代わりにＧｌｕ及びその逆；遊離−ＯＨが維持され得るように、Ｔｈｒの代わりにＳｅｒ；並びに、遊離ＮＨ2が維持され得るように、Ａｓｎの代わりにＧｌｕを用いるものが挙げられる。一実施形態では、ＲＳＶ−Ｆ免疫原は、１つ又は複数の保存的若しくは非保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態では、ＲＳＶ−Ｆ免疫原は、１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を含む。
【００５０】
本明細書で用いるように、用語「同一の」は、お互いに比較して、実質的に同じヌクレオチド配列を有する２つ以上のヌクレオチド配列を指す。２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が実質的に同一であるかどうかを決定するための一試験は、共通して有する同一のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の割合（％）を決定するものである。
【００５１】
配列同一性の計算は以下のようにして実施することができる。最適な比較の目的で配列をアラインメントする（例えば、最適アラインメントのために第１及び第２アミノ酸又は核酸配列の一方若しくは両方にギャップを導入することができ、また、比較の目的で非相同性配列は無視することができる）。比較の目的でアラインメントした参照配列の長さは、場合によっては参照配列の長さの３０％以上、４０％以上、５０％以上、往々にして６０％以上、さらに一般的には７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は１００％である。次に、それぞれ対応するヌクレオチド又はポリペプチド位置のヌクレオチド又はアミノ酸を、２つのアラインメントした配列同士で比較する。第１配列のある位置が、第２配列の対応する位置と同じヌクレオチド又はアミノ酸で占められている場合、ヌクレオチド又はアミノ酸は、その位置で同一であるとみなされる。２つの配列同士の同一性の割合（％）は、２つの配列の最適アラインメントのために導入したギャップの数、各ギャップの長さを計算に入れて、両配列が共通に有する同一の位置の関数である。
【００５２】
配列の比較及び２つの配列同士の同一性（％）の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列同士の同一性（％）は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓ＆Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ４：１１−１７（１９８９）のアルゴリズムを用いて決定することができ、その際、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を用いる。また、２つのアミノ酸配列同士の同一性（％）は、ＧＣＧソフトウエアパッケージ（ｈｔｔｐアドレス：ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能)中のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０）アルゴリズムを用いて決定することができ、その際、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２行列又はＰＡＭ２５０行列のいずれかを用いる。多くの場合、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２スコア行列と一緒に用いられるパラメータのセットは、ギャップオープンペナルティ１２、ギャップ延長ペナルティ４、及びフレームシフトギャップペナルティ５を含む。２つのヌクレオチド配列同士の同一性（％）は、ＧＣＧソフトウエアパッケージ（ｈｔｔｐアドレス：ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能)のＧＡＰプログラムを用いて決定することができ、その際、ＮＷＳ  ｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列並びにギャップ重量６０及び長さ重量４を用いる。
【００５３】
２つのヌクレオチド核酸が、実質的に同一であるかどうかを決定するための別の方法は、１つの核酸と相補的なポリヌクレオチドが、ストリンジェントな条件下で他方の核酸とハイブリダイズするかどうかを評価するものである。本明細書で用いるように、用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を指す。ストリンジェントな条件は、当業者には周知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，６．３．１−６．３．６（１９８９）にみいだすことができる。水性及び非水性方法が上記の参照文献に記載されており、いずれを用いてもよい。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、約４５℃にて６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション後、５０℃にて０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回又は複数回洗浄するものである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の別の例は、約４５℃にて６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション後、５５℃にて０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回又は複数回洗浄するものである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらに別の例は、約４５℃にて６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション後、６０℃にて０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回又は複数回洗浄するものである。多くの場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約４５℃にて６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション後、６５℃にて０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回又は複数回洗浄するものである。より一般的には、ストリンジェンシー条件は、６５℃にて０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳの後、６５℃にて０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで１回又は複数回洗浄するものである。
【００５４】
これまで、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の融合活性の研究は、組換え体の低い発現レベルのために妨げられてきた。特に、標準的発現ベクターからの組換えＦタンパク質発現レベルは、ＲＳＶ複製中に認められるＦタンパク質発現のレベルと比較して低い傾向がある（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０），“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｈｉｎｄｅｒｅｄ  ｂｙ  ｉｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｍＲＮＡ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，”Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ，４０：２１２−２２１）。この差は、ウイルス及び組換えＦタンパク質発現の間の違いによるものと考えられる。一般に、ウイルス及び組換えＦタンパク質発現の間には２つの大きな違いがある。第１に、ウイルス複製中のＦ遺伝子の転写は、細胞質中で起こるのに対し、標準的哺乳動物発現ベクターからの組換えＦタンパク質発現の場合、転写は核内で起こる。核から細胞質へのウイルス転写物の輸出は、核内で正常に複製するウイルスにとっても問題となり得る。ウイルス転写物の場合、阻害は、哺乳動物転写物より比較的高いＡＵ存在量の生成物であると考えられる。従って、一実施形態では、転写を増強するために、Ｆタンパク質遺伝子配列中のＧＣ存在量を修飾することができる（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０），“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｈｉｎｄｅｒｅｄ  ｂｙ  ｉｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｍＲＮＡ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，”Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ，４０：２１２−２２１）。
【００５５】
本明細書に記載するヌクレオチド配列は、コードされたウイルス融合タンパク質のアミノ酸配列が、非修飾ヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列と類似するように、１つ又は複数のコドン内の１つ又は複数のヌクレオチド塩基を変更することにより修飾することができる。一実施形態では、ＲＳＶ−融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２に示すＲＳＶ−Ｆ配列又は配列番号７に示す可溶性ＲＳＶ−Ｆ配列などの非修飾野生型ＲＳＶ−Ｆ配列によりコードされたタンパク質と、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。ある実施形態では、修飾ヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列は、配列番号２に示すＲＳＶ−Ｆの非修飾野生型ヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列又は配列番号７に示す可溶性ＲＳＶ−Ｆのアミノ酸配列と１００％同一である。
【００５６】
表１に示すように、アミノ酸のサブセット及び停止（ＳＴＯＰ）コドンは、少なくとも２つのコドン候補（ｃｏｄｏｎ  ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ）によりコードされ得る。例えば、グルタミン酸塩は、ＧＡＡ又はＧＡＧによりコードされ得る。グルタミン酸塩のためのコドンが、核酸配列内にＧＡＡとして存在する場合、ＡからＧまでの第３位置でのヌクレオチド塩基の変更により、やはりグルタミン酸塩をコードする修飾コドンが得られる。従って、コドン内の１つ又は複数のヌクレオチド塩基での特定の変更によって、やはり同じアミノ酸のコード化を達成することができる。このプロセスは、場合によっては、本明細書においてコドン最適化と呼ぶ。本明細書には、１つ又は複数のコドン内で１つ又は複数のヌクレオチド塩基を変更することにより修飾されたＲＳＶ−Ｆのヌクレオチド配列（配列番号８及び９に示す）の例を記載し、ここで、得られるＲＳＶ−Ｆアミノ酸配列は、非修飾ヌクレオチド配列（配列番号２に示す）によりコードされたアミノ酸配列と同一である。本明細書にはまた、例えば、１つ又は複数のコドン内で１つ又は複数のヌクレオチド塩基を変更することにより修飾された可溶性ＲＳＶ−Ｆのヌクレオチド配列（配列番号４、５及び６に示す）も記載され、ここで、ｓＲＳＶ−Ｆアミノ酸配列は、非修飾ヌクレオチド配列（配列番号７に示す）によりコードされたアミノ酸配列と同一である。
【００５７】
一実施形態では、ＲＳＶ−Ｆタンパク質（例えば、可溶性ＲＳＶ−Ｆなど）をコードするヌクレオチド配列は、１つ又は複数のコドン内で１つ又は複数のヌクレオチド塩基を変更することにより、以下のように修飾することができる：ａ）コードされたウイルス融合タンパク質のアミノ酸配列は、非修飾ヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列と類似しているか、又は同一であり；並びにｂ）グアニンとシトシンの合計割合（％ＧＣ）は、非修飾ヌクレオチド配列と比較して修飾ヌクレオチド配列において増加している。例えば、修飾核酸配列中の％ＧＣは、少なくとも約４５％、４６％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％であり得る。表１に示すように、第１、第２及び／又は第３コドン位置での核酸塩基の変更は、アミノ酸及び／又は停止コドン割当を保存しながらＡ又はＴがＧ又はＣに変更されるように実施することができる。
【００５８】
本明細書には、１つ又は複数のコドン内で１つ又は複数のヌクレオチド塩基を変更することにより、以下のように修飾されたＲＳＶ−Ｆのヌクレオチド配列（配列番号９に示す）の一例を記載する：ＲＳＶ−Ｆアミノ酸配列は、非修飾ヌクレオチド配列（配列番号２に示す）によりコードされたアミノ酸配列と同一であり、しかも、グアニンとシトシンの合計割合（％ＧＣ）が、非修飾ヌクレオチド配列（３５％ＧＣ；配列番号１に示す）と比較して修飾ヌクレオチド配列（５８％ＧＣ）において増加する。さらに、本明細書には、例えば、１つ又は複数のコドン内で１つ又は複数のヌクレオチド塩基を変更することにより、以下のように修飾された可溶性ＲＳＶ−Ｆのヌクレオチド配列（例えば、配列番号４、５及び６に記載される）も記載する：ｓＲＳＶ−Ｆアミノ酸配列は、非修飾ヌクレオチド配列（配列番号７に記載される）によりコードされたアミノ酸配列と同一であり、しかも、グアニンとシトシンの合計割合（％ＧＣ）が、非修飾ヌクレオチド配列（３５％ＧＣ；配列番号３に記載）と比較して修飾ヌクレオチド配列（配列番号４は４６％ＧＣ；配列番号６は５１％ＧＣ；配列番号５は５８％ＧＣ）において増加する。
【００５９】
本明細書に記載するヌクレオチド配列は、１つ又は複数のコドン内の１つ又は複数のヌクレオチド塩基を変更することにより、以下のように修飾することができる：ａ）コードされたウイルス融合タンパク質のアミノ酸配列は、非修飾ヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列と類似しているか、又は同一であり；ｂ）グアニンとシトシンの合計割合（％ＧＣ）は、非修飾ヌクレオチド配列と比較して修飾ヌクレオチド配列において増加し；並びにｃ）第３ヌクレオチドコドン位置でのグアニンとシトシンの合計割合（％ＧＣ３）は、非修飾ヌクレオチド配列と比較して修飾ヌクレオチド配列において増加している。一実施形態では、％ＧＣ３は、少なくとも約５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％であり得る。表１に示すように、考えられるほとんどのヌクレオチド塩基変更の候補は、第３ヌクレオチドコドン位置に存在する。ある実施形態では、停止コドンを含む全てのコドンは、第３ヌクレオチドコドン位置にＧ又はＣのいずれかをすでに有するか、又はアミノ酸割当を変更することなく、第３ヌクレオチドコドン位置にＧ又はＣを有するように修飾することができる。従って、いずれか任意のヌクレオチド配列について、ヌクレオチド配列全体で、各第３ヌクレオチドコドン位置（ＧＣ３）に最大１００％のＧ又はＣを含有させることが可能である。本明細書には、１つ又は複数のコドン内で１つ又は複数のヌクレオチド塩基を変更することにより、以下のように修飾されたＲＳＶ−Ｆのヌクレオチド配列（配列番号９に示す）の一例を記載する：ＲＳＶ−Ｆアミノ酸配列は、非修飾ヌクレオチド配列（配列番号２に示す）によりコードされたアミノ酸配列と同一であり、しかも、第３ヌクレオチドコドン位置におけるグアニンとシトシンの合計割合が、非修飾ヌクレオチド配列（３１％ＧＣ３；配列番号１に示す）と比較して修飾ヌクレオチド配列（１００％ＧＣ３）において増加する。また、本明細書には、一実施形態において、１つ又は複数のコドン内で１つ又は複数のヌクレオチド塩基を変更することにより、以下のように修飾されたｓＲＳＶ−Ｆのヌクレオチド配列（例えば、配列番号４、５及び６に示す）も記載する：ｓＲＳＶ−Ｆアミノ酸配列は、非修飾ヌクレオチド配列（配列番号７に記載される）によりコードされたアミノ酸配列と同一であり、しかも、第３ヌクレオチドコドン位置におけるグアニンとシトシンの合計割合は、非修飾ヌクレオチド配列（３１％ＧＣ３；配列番号３に記載）と比較して修飾ヌクレオチド配列（配列番号４は５８％ＧＣ３；配列番号６は７６％ＧＣ３；配列番号５は１００％ＧＣ３）において増加する。
【００６０】
一実施形態において、ＲＳＦ−Ｆタンパク質（ある実施形態では、可溶性ＲＳＶ−Ｆなど）は、少なくとも約４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％のＧＣ含有率を有すると共に、配列番号２若しくは配列番号７と少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９８％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するＲＳＶ−Ｆタンパク質（例えば、可溶性ＲＳＶ−Ｆなど）をコードする単離核酸配列を有する。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号８、若しくは配列番号９と６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９８％、９８％、９９％、又は１００％同一である。一実施形態では、可溶性ウイルス融合タンパク質は、機能性膜結合領域が欠失している。より具体的な実施形態では、可溶性ウイルス融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸５２５〜５７４に対応するＣ末端膜貫通領域アミノ酸が欠失している。
【００６１】
さらに、特定の実施形態において、（ｉ）少なくとも約５１％のＧＣ含有率を有し、（ｉｉ）配列番号１と少なくとも約７３％同一であり、しかも（ｉｉｉ）配列番号２と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むウイルス融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸を記載する。
【００６２】
一実施形態において、ＲＳＶ−Ｆタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１と少なくとも約６０％  ６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９８％、９８％、又は９９％同一である。
【００６３】
組換えウイルス融合タンパク質は、化学修飾、又は翻訳後修飾などにより、さらに修飾することができる。このような修飾として、限定はしないが、ペグ化、アルブミン化、グリコシル化、ファルネシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、ハシル化、カルバミル化、硫酸化、リン酸化、及び当該技術分野では公知の他のポリペプチド修飾が挙げられる。本明細書に記載するウイルス融合タンパク質は、一次アミノ酸配列の修飾、１つ又は複数のアミノ酸の欠失、付加、又は置換によってさらに修飾することができる。
【００６４】
一実施形態において、ウイルス融合タンパク質は、翻訳後グリコシル化により修飾する。組換えウイルス融合タンパク質は、完全にグリコシル化、一部グリコシル化、脱グリコシル化、又は非グリコシル化することができる。ある実施形態では、組換えウイルス融合タンパク質（例えば、ＲＳＶ−Ｆ融合タンパク質）は、対応するネイティブタンパク質のグリコシル化プロフィールと類似した、実質的に同一の、又は同一のグリコシル化プロフィールを有し得る（例えば、Ｒｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８３：６１−６６）。組換えウイルス融合糖タンパク質は、当該技術分野では公知の多重グリコシド結合のいずれを含んでもよい。
【００６５】
本明細書に記載するワクチン組成物で用いるのに好適なＲＳＶ−Ｆタンパク質は、当該技術分野では公知の構築物及び技術を用いて、発現させ、精製することができる。ＲＳＶ−Ｆなどのウイルス融合タンパク質を生産及び精製するシステム及び方法は公知であり、ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＯＦ  ＳＯＬＵＢＬＥ  ＶＩＲＡＬ  ＦＵＳＩＯＮ  ＧＬＹＣＯＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＩＮ  ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ  ＣＥＬＬＳと題する国際公開第２０１２／１０３４９６号パンフレットにさらに詳しく記載されている。尚、上記文献の開示内容は、参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。
【００６６】
５．ワクチン製剤
本願の背景技術の項ですでに述べたように、ＲＳＶワクチンの開発は困難である。インフルエンザなどの他のウイルスに対するワクチンの開発には成功しているが、現在まで、ＲＳＶに関してはいずれも開発に成功していない。ワクチンの観点から、呼吸器ウイルスは、次の２つの主な群に分けることができる：感染によって長期免疫が起こり、その生存の継続には絶えず突然変異が必要な群と、感染によって不完全な免疫が誘導され、突然変異はほとんど又は全くなくても、一般に感染が繰り返される群。インフルエンザウイルス及び呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、それぞれ前者及び後者の群の典型である。（Ｕ．Ｅ．Ｐｏｗｅｒ，２００８“Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）ｖａｃｃｉｎｅｓ−Ｔｗｏ  ｓｔｅｐｓ  ｂａｃｋ  ｆｏｒ  ｏｎｅ  ｌｅａｐ  ｆｏｒｗａｒｄ，”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．４１：３８−４４を参照のこと）。従って、インフルエンザウイルスに対してはワクチンの開発に成功しているが、ＲＳＶの場合には、数十年にわたる研究及びいくつかのワクチンアプローチにもかかわらず、成功していない。
【００６７】
ＲＳＶ感染症から防御するのに必要なＲＳＶ抗体と細胞性免疫の均衡は、よくわかっておらず、様々な年齢層で変動し得る。例えば、高齢者の場合、細胞性応答は、若年青年と比較して、誘導するのが難しく、Ｔｈ２バイアスであり、しかも急速に減少する（Ｋｕｍａｒ  Ｒ  ａｎｄ  Ｂｕｒｎｓ  ＥＡ（２００８）Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｅｃｌｉｎｅ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ７：４６７−４７９）。ＲＳＶ特異的Ｔ細胞応答は、特に年齢と共に低下する（Ｃｕｓｉ  ＭＧ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｇｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｍｅｍｏｒｙ  ｔｏ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ．Ｉｍｍｕｎ  Ａｇｅｉｎｇ  ７：１４）。高齢の個体は、ＲＳＶ中和力価が９〜１３ｌｏｇ２の血清陽性であるにもかかわらず、やはり重篤なＲＳＶ感染症に罹患し得る（Ｗａｌｓｈ  ＥＥ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｓｅｖｅｒｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｌｄｅｒｌｙ  ｐｅｒｓｏｎｓ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １８９：２３３−２３８）。高齢者は、これは若年青年には認められないＴ細胞のＲＳＶ応答性障害を有し（Ｃｕｓｉ  ＭＧ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｇｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｍｅｍｏｒｙ  ｔｏ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ．Ｉｍｍｕｎ  Ａｇｅｉｎｇ７：１４）、若年青年と同様の中和抗体力価を有するにもかかわらず（Ｆａｌｓｅｙ  ＡＲ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  ｅｌｄｅｒｌｙ  ａｄｕｌｔｓ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ  ５９：２２１−２２６）、感染後、ＲＳＶ感染症に罹患しやすい。これらの観察結果は、中和抗体及び低減するＲＳＶ特異的細胞性免疫を促進するために、高齢者に有効なＲＳＶワクチンが必要であることを示唆している。
【００６８】
前述したように、高齢者は、その免疫応答にＴｈ２バイアスを有する傾向がある。哺乳動物の細胞性免疫応答は、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞性免疫応答と、Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）細胞性免疫応答を含む。Ｔｈ１及びＴｈ２応答は、各応答で合成されたサイトカインプロフィールに基づき識別することができる。１型Ｔ細胞は、ウイルスの細胞性免疫応答に関与するサイトカインであるインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を産生する。そのため、ＩＦＮ−γは、「Ｔｈ１型サイトカイン」と呼ぶことができる。Ｔｈ２細胞は、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）及びインターロイキン１３（ＩＬ−１３）を選択的に生産し、これらは、体液性免疫の発生に参加すると共に、即時過敏症に重要な役割を有する。ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３は、「Ｔｈ２型サイトカイン」とも呼ぶことができる。Ｔｈ１応答は、応答して産生された抗体サブタイプによっても識別することができる。げっ歯類モデルでは、Ｔｈ１バイアス応答は、ＩｇＧ１抗体力価より高いＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ抗体力価を有する（ＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂは、Ｔｈ１サブタイプであり；ＩｇＧ１は、Ｔｈ２サブタイプである）。（極めて重要なことには、ヒトの場合、その逆である；ヒトＩｇＧ１がＴｈ１サブタイプであり、ヒトＩｇＧ２がＴｈ２サブタイプであり、Ｔｈ１バイアス応答は、ＩｇＧ２抗体力価より高いＩｇＧ１抗体力価を特徴とする）。げっ歯類及びヒトの両方で、Ｔｈ１応答はまた、増大したＣＤ８Ｔ細胞応答も特徴とする。Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカイン免疫応答における不均衡、特に動物の細胞性免疫応答におけるＴｈ２バイアスは、ＲＳＶの病原性及びとりわけ肺における感染症の重症度に影響を与え得る。さらに、Ｔｈ２バイアス一次免疫応答は、ＲＳＶ増進疾患（ＲＳＶ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）と相関している（Ｈｕｒｗｉｔｚ  ＪＬ（２０１１）Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  １０：１４１５−１４３３）。
【００６９】
過去にＲＳＶに暴露されたことがあるために、生弱毒化ＲＳＶウイルスワクチンは、高齢者集団において免疫原性が不十分となり得る。既存のＲＳＶ免疫が、ウイルスワクチンの複製を阻害し、その結果、生ＲＳＶワクチンがＲＳＶ免疫を促進する能力を制限することになる。従って、高齢者におけるＲＳＶ関連疾患を予防することができるワクチンは、この対象集団において満たされていない医療ニーズに対処するものである。
【００７０】
一実施形態では、ワクチン組成物が提供される。特に、ワクチン組成物は、本明細書に記載するＲＳＶ−Ｆタンパク質を含む。一実施形態では、ワクチン組成物は、本明細書に記載のように、組換えにより発現したＲＳＶ−Ｆタンパク質を含む。一実施形態では、ワクチン組成物は、本明細書に記載のように、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む。一実施形態では、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質は、Ｃ末端膜貫通ドメインを欠失している。より具体的な実施形態では、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質は、細胞質尾部ドメインを欠失している。
【００７１】
より具体的な実施形態において、ワクチン組成物は、アジュバントと組み合わせてＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む。多くの場合、精製されたタンパク質抗原は、固有の免疫原性を欠失しているため、免疫原性ワクチン製剤は、免疫応答の非特異的刺激物質（アジュバントとして知られる）を含むことが多い。一部のアジュバントは、抗原が提示される方式に影響を与える。例えば、ある例では、タンパク質抗原をミョウバンにより沈降させると、免疫応答が増大する。他の例では、抗原の乳化によって、抗原提示の持続時間を長く持続することができる。免疫プロトコルでは、多年にわたって、応答を刺激するためにアジュバントが用いられているため、アジュバントは、当業者には周知である。アジュバントは、本明細書に全体が参照により組み込まれる、Ｖｏｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（第２版）”に、より詳しく記載されている。
【００７２】
公知のアジュバントの例は、完全フロイントアジュバント（死滅させた結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含有する免疫応答の非特異的刺激物質）、不完全フロイントアジュバント及び水酸化アルミニウムアジュバントを含む。他の公知のアジュバントとしては、以下のものが挙げられる：顆粒菌・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＰ）、カルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）、水酸化アルミニウム、ｔｈｕｒ−ＭＤＰ及びｎｏｒ−ＭＤＰなどのムラミルジペプチド（ＭＤＰ）化合物、ムラミルトリペプチドホスファチジルエタノールアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、ＲＩＢＩのアジュバント（Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＭＴ）（２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ  ８０エマルジョン中に細菌から抽出された３つの成分、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）を含有する）。ＭＦ−５９、Ｎｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標）、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）抗原は、他の公知のアジュバントである。
【００７３】
ワクチン用のアジュバントとしてミョウバンがよく用いられるが、これは、体液性免疫を促進することで知られているが、有効な細胞性免疫の誘導についてはわかっていない（Ｌａｎｇｌｅｙ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａ  ｄｏｓｅ−ｒａｎｇｉｎｇ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ  ｓｕｂｔｙｐｅ  Ａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｗｉｔｈ  ａｎｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｄｕｌｔｓ＞ｏｒ＝６５ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ａｇｅ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７：５９１３−５９１９；Ｆａｌｓｅｙ  ＡＲ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ２  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ（ｒｓｖ）ｖａｃｃｉｎｅｓ−−ｎｏｎａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｌｕｍ−−ｇｉｖｅｎ  ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔｌｙ  ｗｉｔｈ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｏ  ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ  ｅｌｄｅｒｌｙ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９８：１３１７−１３２６；並びにＫｏｏｌ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ａｌｕｍ  ａｄｊｕｖａｎｔ：ｓｏｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒｉｃｋｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｌｄｅｓｔ  ａｄｊｕｖａｎｔ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６１：９２７−９３４）。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）９アゴニストを組み込んだ新規のアジュバント化合物は、マウスモデルにおいてＲＳＶワクチンに対するＴｈ１バイアス免疫細胞性応答を向上させることが判明している（Ｈａｎｃｏｃｋ  ＧＥ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）ＣｐＧ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｒｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｆｕｓｉｏｎ（Ｆ）ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）．Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：４８７４−４８８２；並びにＧａｒｌａｐａｔｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｉｎｎａｔｅ  ｄｅｆｅｎｓｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ）。モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）／ＱＳ−２１組み合わせ又はプロトリン（Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ）などのＴＬＲ４ベースのアジュバント、髄膜菌外膜タンパク質と複合体化したＬＰＳの製剤も、マウスにおいてＲＳＶワクチンに対し細胞性ＩＦＮγ生産を誘導することができている（Ｎｅｕｚｉｌ  ＫＭ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐ���ｎｓｅ  ｉｎ  ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｉｃｅ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ＦＧ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：５２５−５３２；Ｃｙｒ  ＳＬ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ−ｂａｓｅｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔ  ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ  ｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２５：５３７８−５３８９）。
【００７４】
腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）は、免疫系の強力な刺激物質である。しかし、アジュバントでのその使用は、その毒性によって制限されてきた。還元末端グルコサミンからコア炭水化物基及びリン酸塩を除去することにより生成される、ＬＰＳの非毒性誘導体であるモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）が、二糖骨格の３位からアシル鎖を除去することにより生成されるＭＰＬの別の解毒形態（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）と呼ばれる）と一緒に生産されている。ＴＬＲ４複合体のヒトＭＤ２分子との結合のために最適化された別の合成Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４アゴニストは、合成ヘキシル化リピドＡ誘導体であり、グルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）と呼ばれる（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａから市販されている）。ＧＬＡは、げっ歯類及び霊長類モデル系の両方で、強力なＴｈ１バイアスアジュバントであることが立証されている（Ｃｏｌｅｒ  ＲＮ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５：ｅ１３６７７；並びにＬｕｍｓｄｅｎ  ＪＭ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４  ａｇｏｎｉｓｔ  ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ａｎ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７９：３４９２−３５００）。
【００７５】
ＧＬＡは、“Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ａｄｊｕｖａｎｔ"と題する米国特許出願公開第２０１１／００７０２９０号明細書に詳しく記載されている。尚、この文献は、その全部を参照により本明細書に組み込むものとする。米国特許出願公開第２０１１／００７０２９０号明細書に記載されているように、ＧＬＡは、（ｉ）非還元末端グルコサミンのヘキソサミン１位と還元末端グルコサミンのヘキソサミン６位との間のエーテル結合により非還元末端グルコサミンに結合された還元末端グルコサミンを有するジグルコサミン骨格；（ｉｉ）非還元末端グルコサミンのヘキソサミン４位に結合したＯ−ホスホリル基；及び（ｉｉｉ）最大６つの脂肪アシル鎖を含み、ここで、脂肪アシル鎖の１つは、還元末端グルコサミンの３−ヒドロキシルとエステル結合により結合しており、また、脂肪アシル鎖の１つは、非還元末端グルコサミンの２−アミノとアミド結合により結合しており、かつ１２超の炭素原子のアルカノイル鎖とエステル結合により結合したテトラデカノイル鎖を含み、さらに、脂肪アシル鎖の１つは、非還元末端グルコサミンの３−ヒドロキシルとエステル結合により結合しており、しかも１２超の炭素原子のアルカノイル鎖とエステル結合により結合したテトラデカノイル鎖を含む。ＧＬＡは、下記式：
【化２】
2016516755.tif 000005
（式中、Ｒ1、Ｒ3、Ｒ5及びＲ6は、Ｃ11〜Ｃ20アルキルであり；Ｒ2及びＲ4は、Ｃ12〜Ｃ20アルキルである）
を有する。ある実施形態では、ＧＬＡは、安定した水中油形エマルジョン（ＳＥ）として製剤化され、これは、本明細書においてＧＬＡ−ＳＥと呼ぶ。
【００７６】
一実施形態では、ワクチン組成物は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストであるアジュバントを含む。一実施形態では、ワクチン組成物は、（ＴＬＲ）４アゴニストであるアジュバントを含む。ＴＬＲ４シグナル伝達により誘導されるサイトカイン（例えば、ＩＬ−６及びＩＦＮγなど）は、Ｂ細胞増殖因子として作用し、Ｆｃ受容体及び補体との相互作用について最適化された抗体へのクラススイッチを支持する（Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ  ＦＤ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｉｓｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ＩｇＧ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４０：１０２２−１０２７；並びにＮｉｍｍｅｒｊａｈｎ  Ｆ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ  ＪＶ（２００７）Ｆｃ−ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９６：１７９−２０４）。これらのサイトカインは、さらに、プロフェショナル抗原提示細胞を動員し、ＭＨＣ  Ｉ分子及び抗原プロセシングタンパク質上方制御を誘導することにより、Ｔ細胞のより良好な活性化を可能にする（Ｒａｍａｎａｔｈａｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ａｎｔｉｇｅｎ−ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤＲ８＋  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｔｏ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ，ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ａｒｃｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｅｘｐ（Ｗａｒｓｚ）５６：３１１−３２３）。ＴＬＲ４シグナル伝達により誘導されたＩ型ＩＦＮは、タンパク質抗原の交差提示を増大することができ（Ｄｕｒａｎｄ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｒｏｓｓ−ｐｒｉｍｉｎｇ  ａｎｄ  ＩＬ−１０  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７：１９１２−１９２２）、これにより、関連するオボアルブミンタンパク質に対する強力なＣＤ８Ｔ細胞応答の誘導を可能にする（Ｌａｓａｒｔｅ  ＪＪ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｔｈｅ  ｅｘｔｒａ  ｄｏｍａｉｎ  Ａ  ｆｒｏｍ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｔｏ  ＴＬＲ４−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７８：７４８−７５６；ＭａｃＬｅｏｄ  ＭＫ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）。より具体的な実施形態では、ワクチン組成物は、グルコピラノシルリピドＡ（ＧＬＡ）を含有するアジュバントを含む。一実施形態では、ワクチン組成物は、微粒子エマルジョンとして製剤化される。一実施形態では、ワクチン組成物は、安定した水中油形エマルジョン中のＧＬＡ（ＧＬＡ−ＳＥ）を含有するアジュバントを含む。別の実施形態では、ワクチン組成物は、安定化スクアレンベースエマルジョン中のＧＬＡを含有するアジュバントを含む。
【００７７】
ＲＳＶワクチン組成物の投与量は、例えば、年齢、健康状態、体重、性別、食事、投与時間、及び他の臨床要因に応じて変動し得るが、これは、当業者が決定することができる。一実施形態では、ワクチン組成物は、少なくとも約５０μｌ、７５μｌ、又は１００μｌ、及び最大約２００μｌ、２５０μｌ、５００μｌ、７５０μｌ又は１０００μｌの量を有する安定した水性懸濁液として製剤化する。
【００７８】
一実施形態では、少なくとも約１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ又は５０μｇ、及び最大７５μｇ、８０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ又は２００μｇの本明細書に記載のＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質が、ワクチン組成物に含まれる。一実施形態では、ワクチン組成物は、少なくとも約０．０１μｇ／μｌ、０．０５μｇ／μｌ、０．１μｇ／μｌ、及び最大約０．１μｇ／μｌ、０．２μｇ／μｌ、０．３μｇ／μｌ、０．４μｇ／μｌ、０．５μｇ／μｌ又は１．０μｇ／μｌの濃度でＲＳＶ−Ｆ免疫原を含有する。
【００７９】
一実施形態では、ワクチン組成物は、少なくとも約０．１μｇ、０．５μｇ、１．５μｇ、２μｇ、２．５μｇ及び最大３μｇ、４μｇ、５μｇ、１０μｇ又は２０μｇのアジュバントを含有する。一実施形態では、ワクチン組成物は、少なくとも約１ｎｇ／μｌ、２ｎｇ／μｌ、３ｎｇ／μｌ、４ｎｇ／μｌ又は５ｎｇ／μｌ及び最大約０．１μｇ／μｌ、０．２μｇ／μｌ、０．３μｇ／μｌ、０．４μｇ／μｌ又は０．５μｇ／μｌの濃後でアジュバントを含有する。
【００８０】
より具体的な実施形態では、アジュバントは、少なくとも約１％、２％又は３％及び最大約４％又は５％のＧＬＡ濃度を有する安定化水中油形エマルジョン中のＧＬＡを含む。一実施形態では、アジュバントは、安定化水中油形エマルジョン（ＳＥ）中のＧＬＡを含み、ここで、ＧＬＡは、少なくとも約２５ｎｍ、５０ｎｍ、７５ｎｍ又は１００ｎｍ及び最大約１００ｎｍ、１２５ｎｍ、１５０ｎｍ、１７５ｎｍ又は２００ｎｍの平均粒径を有する。
【００８１】
より具体的な実施形態では、ワクチン組成物は、約１００μｌ〜約５００μｌの最終量で、２％〜５％のＳＥ中の約１μｇ〜１０μｇのＧＬＡと組み合わせて、約１μｇ〜１００μｇのＲＳＶ−ｓＦ糖タンパク質を含む。より具体的な実施形態では、ワクチン組成物は、約２５０μｌ〜約５００μｌの最終量で、２％〜５％のＳＥ中の約１μｇ〜約５μｇのＧＬＡと組み合わせて、約１０μｇ〜約１００μｇのＲＳＶ−ｓＦ糖タンパク質を含む液体製剤である。さらに別の実施形態では、ワクチン組成物は、筋内注射用に製剤化され、約５００μｌの最終量で、２％又は５％のＳＥ中の約１μｇ、２．５μｇ若しくは５μｇのＧＬＡと組み合わせて、約１０μｇ、３０μｇ若しくは約１００μｇのＲＳＶ−ｓＦ糖タンパク質を含む。
【００８２】
投与の量及び頻度は、宿主の応答に応じて変動し得る。一実施形態では、ワクチン組成物は、単回用量として投与する。別の実施形態では、ワクチン組成物は、２回用量レジメンで投与する。別の実施形態では、ワクチン組成物は、例えば、ワクチン組成物の初回投与に続いて、ブースタ投与を実施する投薬スケジュールで投与する。一実施形態では、ワクチン組成物は、２回用量レジメンで投与するが、ここで、２回目の用量を、初回投与から少なくとも約１、約２、約３、若しくは約４週間後、又は初回投与から少なくとも約１、約２、約３、約４、約５若しくは約６か月後、又は初回投与から少なくとも約１年後に投与する。別の実施形態では、ワクチン組成物は、２回目の用量を、初回投与から少なくとも約１、約２、約３、若しくは約４週間後、又は初回投与から少なくとも約１、約２、約３、約４、約５若しくは約６か月後、又は初回投与から少なくとも約１年後に投与し、３回目の用量を、２回目の用量後、例えば、２回目の用量から少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６か月後、又は約１年後に投与する、投薬スケジュールで投与する。
【００８３】
別の実施形態では、ワクチン組成物は、免疫原が懸濁又は溶解している薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む。薬学的に許容される担体は公知であり、限定はしないが、注射用水、食塩液、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、滅菌等張水性バッファー、及びこれらの組み合わせが挙げられる。皮下注射などの非経口投与の場合、担体としては、水、食塩水、アルコール、脂肪、ロウ、バッファー又はこれらの組み合わせが挙げられる。薬学的に許容される担体、希釈剤、及び他の賦形剤全般については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．Ｎ．Ｊ．ｃｕｒｒｅｎｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ）に記載されており、その開示内容は、参照により全体を本明細書に組み込むものとする。製剤は、投与方法に適合させるべきである。好ましい実施形態では、製剤は、ヒトへの投与に好適であり、好ましくは、滅菌の非微粒子状及び／又は発熱性物質非含有である。
【００８４】
他の実施形態では、ワクチン組成物は、１種又は複数の希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、及び／又はアジュバントを含んでよい。例えば、ワクチン化合物は、ワクチン効果を向上させるために、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含んでよい。組成物は、再構成に好適な凍結乾燥粉末のような固形、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル、徐放剤、又は粉末であってよい。経口製剤は、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準担体を含んでよい。
【００８５】
また、ワクチン組成物に、送達ビヒクルなどの他の成分を含有させることが望ましい場合もあり、そのようなものとして、限定はしないが、アルミニウム塩、油中水形エマルジョン、生分解性油ビヒクル、水中油形エマルジョン、生分解性マイクロカプセル、及びリポソームが挙げられる。他の実施形態では、ワクチン組成物は、ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は硫酸水素ナトリウム；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩若しくはリン酸塩などのバッファー、並びに塩化ナトリウム若しくはデキストロースなどの張性の調節剤を含有してよい。
【００８６】
ワクチン組成物の投与は、全身又は局所であってよい。ワクチン組成物を投与する方法として、限定はしないが、非経口投与（例えば、皮内、筋内、静脈内及び皮下）、硬膜外、及び粘膜（例えば、鼻内及び口腔内若しくは肺経路又は座薬によるもの）が挙げられる。具体的な実施形態において、本明細書に記載の組成物は、筋内、静脈内、皮下、経皮又は皮内投与する。組成物は、任意の常用の経路、例えば、注入若しくはボーラス注射、上皮若しくは皮膚粘膜内層（例えば、口腔粘膜、結腸、結膜、鼻咽頭、中咽頭、膣、子宮、膀胱及び腸粘膜など）により投与してよく、他の生物活性剤と一緒に投与してもよい。ある実施形態では、組成物の鼻内又は他の粘膜投与経路によって、他の投与経路より実質的に高い抗体又は他の免疫応答を誘導することができる。別の実施形態では、本明細書に記載の組成物の鼻内若しくは他の粘膜経路によって、免疫部位での抗体又は他の免疫応答を誘導することができる。
【００８７】
６．キット及び製造品
一実施形態では、本明細書に記載のワクチン製剤の１つ又は複数の材料を充填した１つ又は複数の容器を含む医薬品パック又はキット。ワクチン組成物は、組成物の量を示すアンプル又はサシェットなどの密閉容器中に包装することができる。一実施形態では、組成物は、液体として供給する。別の実施形態では、組成物は、密閉容器中の乾燥した滅菌凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として供給し、ここで、被検者への投与に適切な濃度を得るために、例えば、水若しくは塩水で組成物を再構成することができる。
【００８８】
ワクチン組成物を、例えば、皮下又は筋内注射により全身投与する場合、針と注射器、又は無針注射器を用いることができる。ワクチン製剤は、ガラス若しくはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器又は多用量バイアル中に導入することができる。
【００８９】
７．免疫応答を刺激する方法
ＲＳＶ感染に応答して、ＲＳＶ−融合（Ｆ）及び結合（Ｇ）外皮糖タンパク質をターゲティングする中和抗体が産生される（Ｈｕｒｗｉｔｚ  ＪＬ（２０１１），“Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，”Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，１０：１４１５−１４３３）。Ｆ糖タンパク質は、ＲＳＶ  Ａ及びＲＳＶ  Ｂウイルス株の両方で高度に保存されており、ウイルスと細胞膜の融合に不可欠であり、ウイルスの侵入及び複製に不可欠であることから、Ｆ指向性中和応答が特に望ましい（Ｍａｈｅｒ  ＣＦ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）。低いＲＳＶ中和抗体力価は、より重症のＲＳＶ感染症の高い危険性と相関する（Ｌｅｅ  ＦＥ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎｓ  ｗｉｔｈ  Ａ２  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ  ６３：１９１−１９６）。ＲＳＶ中和抗体が、ＲＳＶ免疫において重要な役割を果たし、受身移入の際、ナイーブなヒト及びげっ歯類に防御をもたらすが、ＲＳＶに対する細胞性応答も疾患防御に一定の役割を果たすと考えられる（Ｋｒｉｌｏｖ  ＬＲ（２００２）Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２：７６３−７６９及びＧｒａｈａｍ  ＢＳ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｅｒｕｍ．Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｓ  ３４：１６７−１７２）。Ｆ糖タンパク質は、複数のマウス及びヒトＣＤ８及びＣＤ４Ｔ細胞エピトープを含有する（Ｏｌｓｏｎ  ＭＲ  ａｎｄ  Ｖａｒｇａ  ＳＭ（２００８）Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ：ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ７：１２３９−１２５５）。血清陽性成人にＲＳＶ特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答が検出されており（Ｃｕｓｉ  ＭＧ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｇｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｍｅｍｏｒｙ  ｔｏ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ．Ｉｍｍｕｎ  Ａｇｅｉｎｇ  ７：１４）、これは、動物モデルにおいて、ウイルス感染細胞を排除し、ＲＳＶ感染を消散する上で重要な役割を果たす（Ｂａｎｇｈａｍ  ＣＲ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ５６：５５−５９；Ｓｒｉｋｉａｔｋｈａｃｈｏｒｎ  Ａ  ａｎｄ  Ｂｒａｃｉａｌｅ  ＴＪ（１９９７）Ｖｉｒｕｓ−ｓ��ｅｃｉｆｉｃ  ＣＤＲ８＋Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ  ２  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｕｒｉｎｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８６：４２１−４３２；Ｈｕｓｓｅｌｌ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｔｈ２−ｄｒｉｖｅｎ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：３３４１−３３４９；及びＭｕｎｏｚ  ＪＬ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃ５７ＢＬ／６  ｍｉｃｅ：ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇｓ  ｗｉｔｈ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６５：４４９４−４４９７）。ＲＳＶ特異的ＣＤ４Ｔ細胞応答は、Ｂ細胞抗体産生及びＣＤ８応答の両方を促進し、Ｔｈ１型ＣＤ４応答は、Ｔｈ２型応答より有効にＣＤ８応答を促進する（Ｈｕｒｗｉｔｚ  ＪＬ（２０１１），“Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，”Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，１０：１４１５−１４３３）。
【００９０】
一実施形態では、免疫学的に有効な量の免疫原性ＲＳＶ−Ｆタンパク質含有組成物を被検者（ヒト又は動物被検者など）に投与する方法が提供される。一実施形態では、免疫原性ＲＳＶ−Ｆタンパク質と少なくとも１種のアジュバントを含有するワクチン組成物を哺乳動物に投与する方法が提供される。一実施形態では、ＲＳＶ−Ｆは、可溶性ＲＳＶ−Ｆ（ＲＳＶ−ｓＦとも称される）を含む。一実施形態では、アジュバントは、ＧＬＡである。より具体的な実施形態では、アジュバントは、ＧＬＡ−ＳＥである。一実施形態では、ＲＳＶに対する免疫応答を誘発する方法が提供される。一実施形態では、免疫応答は、体液性である。別の実施形態では、免疫応答は、細胞性である。一実施形態では、本方法は、ＲＳＶ感染又は少なくとも１つのその症状に対する防御免疫応答を誘導する。さらに別の実施形態では、前記疾患を有する患者、又は前記疾患と接触する危険性がある患者に、治療、又は予防に有効な量のワクチン組成物を投与することにより、疾患を予防又は治療する方法が提供される。一実施形態では、上記疾患は、呼吸系の疾患、例えば、ウイルス、とりわけＲＳＶに起因する疾患である。
【００９１】
一実施形態では、ワクチン組成物は、宿主において少なくとも１種の免疫応答を誘発することができる。一実施形態では、免疫応答は、以下：ＴH1型Ｔリンパ球応答、ＴH2型Ｔリンパ球応答、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答、抗体応答、サイトカイン応答、リンホカイン応答、ケモカイン応答、及び炎症性応答から選択される。一実施形態では、ワクチン組成物は、宿主において、以下から選択される少なくとも１つの免疫応答を誘発することができる：（ａ）インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）から選択される１種又は複数のサイトカインの産生、（ｂ）ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８及びＩＬ−２３から選択される１種又は複数のインターロイキンの産生、（ｃ）ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ４及びＣＣＬ５から選択される１種又は複数のケモカインの産生、並びに（ｄ）記憶Ｔ細胞応答、記憶Ｂ細胞応答、エフェクターＴ細胞応答、細胞傷害性Ｔ細胞応答及びエフェクターＢ細胞応答から選択されるリンパ球応答。
【００９２】
一実施形態では、ワクチン組成物は、ＩＬ−５／ＩＬ−４などのＴｈ２バイアスサイトカインと比較して、ＩＦＮγ（Ｔｈ１バイアス）などのＴｈ１型サイトカインの産生を優先的に含む免疫応答をもたらすことができる。一実施形態では、ワクチン組成物の投与によって、過去にＲＳＶに暴露されたことがある哺乳動物においてＴｈ１バイアス細胞性免疫応答が増強される。一実施形態では、Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞性免疫応答の比は、少なくとも約１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、又は２：１である。一実施形態では、Ｔｈ１型Ｆタンパク質特異的ＣＤ４又はＣＤ８応答を誘導若しくは増強する方法が提供される。一実施形態では、本明細書に記載するアジュバント添加ワクチン組成物の投与により、約４９〜約１５０Ｆタンパク質特異的ＣＤ４Ｔ細胞スポット形成単位（ＳＦＵ）／１０6総生存細胞、又は非アジュバント添加ワクチン組成物と比較して約５〜１０倍の増大が誘導される。別の実施形態では、本明細書に記載のアジュバント添加ワクチン組成物の投与により、約１０６９〜約３１７２Ｆタンパク質特異的ＣＤ８Ｔ細胞ＳＦＵ／１０6総生存細胞、又は非アジュバント添加組成物と比較して約１０〜２０倍の増大が誘導される。別の実施形態では、Ｔ細胞応答を生み出す細胞性ＩＦＮγ（すなわち、Ｔｈ１型サイトカイン）を誘導する方法が提供される。一実施形態では、アジュバント添加ワクチン組成物の投与により、非アジュバント添加組成物と比較して、ＩＦＮγ産生Ｔ細胞の少なくとも４５倍の増大がもたらされる。
【００９３】
一実施形態では、哺乳動物におけるＲＳＶに対する中和抗体を誘導する方法が提供される。一実施形態では、ＲＳＶ中和抗体力価は、以下：６Ｌｏｇ2、６．５Ｌｏｇ2、７．０Ｌｏｇ2、７．５Ｌｏｇ2、８．０Ｌｏｇ2、８．５Ｌｏｇ2、９．０Ｌｏｇ2、９．５Ｌｏｇ2、１０．０Ｌｏｇ2、１０．５Ｌｏｇ2、１１．０Ｌｏｇ2、１１．５Ｌｏｇ2、１２．０Ｌｏｇ2、１２．５Ｌｏｇ2、１３．０Ｌｏｇ2、１３．５Ｌｏｇ2、１４．０Ｌｏｇ2、１４．５Ｌｏｇ2、及び１５．０Ｌｏｇ2から選択される力価より高い。一実施形態では、ワクチン組成物の投与後のＲＳＶ中和抗体力価は、投与前の血清ＩｇＧ力価と比較して約１０倍〜約２００倍高いか、又は少なくとも約１０、２５、５０、７５、１００倍高く、最大１００、１５０若しくは２００倍高い血清ＩｇＧ力価を含む。一実施形態では、ワクチン組成物の投与後のＲＳＶ中和抗体力価は、投与前の血清ＩｇＧ力価と比較して少なくとも約１０倍、及び最大２００倍高い血清ＩｇＧ力価を含む。
【００９４】
一実施形態では、ワクチン組成物の投与は、ＲＳＶを中和することができる粘膜性（ＩｇＡ）及び全身性抗体（ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧ２ｂ）応答を誘導する。ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比は、ＩｇＧ２ａ＞ＩｇＧ１であることから、Ｔｈ1バイアス抗体応答を示した。
【００９５】
一実施形態では、ワクチン組成物の投与により、ＲＳＶウイルス力価の低下がもたらされる。一実施形態では、ＲＳＶウイルス力価は、約５０〜約１０００倍、又は少なくとも約５０、１００、２５０、５００倍、最大約５００若しくは１０００倍低下する。一実施形態では、ＲＳＶウイルス力価は、ワクチン組成物の投与後、２ｌｏｇ１０ｐｆｕ／グラムを下回る。
【実施例】
【００９６】
実施例１ａ及び１ｂ：ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウス及びコットンラット
ＢＡＬＢ／ｃマウス及びコットンラットは、ＲＳＶ感染の特徴がはっきりした２種のげっ歯類モデルである。この実施例では、これらの２つのモデルを用いて、筋内（ＩＭ）投与ＲＳＶワクチン候補の免疫原性を評価したが、これは、ＴＬＲ４アゴニストグルコピラノシルリピドＡ（ＧＬＡ）、安定エマルジョン（ＳＥ）、グルコピラノシルリピドＡ安定エマルジョン（ＧＬＡ−ＳＥ）、又はミョウバンアジュバントを用いて製剤化した精製可溶性Ｆ（ｓＦ）タンパク質を含有した。膜貫通及び細胞質尾部ドメインを欠失した精製ｓＦタンパク質（Ｈｕａｎｇ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｈｉｎｄｅｒｅｄ  ｂｙ  ｉｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｍＲＮＡ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ４０：２１２−２２１）をＧＬＡ、ＳＥ、又はＧＬＡ−ＳＥと共に製剤化し、ミョウバンを用いて、又はアジュバントを添加しないまま製剤化したｓＦとワクチン性能を比較した。結果から、筋内投与したアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦワクチン製剤の各々が、ＲＳＶ中和力価を誘導し、ウイルス複製に対して防御免疫を付与したが、ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥワクチンだけが、ＢＡＬＢ／ｃ及びコットンラットモデルの両方で、ＩＦＮγ産生Ｔ細胞応答をプライミングしたことが明らかになった。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、これらのＴ細胞応答は、主としてＣＤ８＋であり、肺に到達することができ、Ｔｈ１バイアスサイトカイン応答と相関した。ＧＬＡ−ＳＥアジュバントを含むＲＳＶ  ｓＦは、ウイルス感染後にＴｈ２関連肺疾患を回避しながら、非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦに対して、重要な免疫学的及び防御読み出し情報を改善し、これらの研究において最良のワクチン製剤であることが判明した。
【００９７】
マウスモデルでは、全てのＲＳＶ  ｓＦワクチン製剤により、ＲＳＶ攻撃からの完全な防御、頑健な血清ＲＳＶ中和応答、及び抗ＦＩｇＧ応答が誘導された。アジュバントＧＬＡ−ＳＥを用いて製剤化した場合、ＲＳＶ  ｓＦタンパク質ワクチンは、Ｆ特異的Ｔｈ１バイアス体液性及び細胞性応答を誘導した。マウスの場合、Ｆ特異的ＣＤ４且つＣＤ８Ｔ細胞応答が認められた。ＲＳＶ攻撃後、Ｆ特異的多官能性ＣＤ８Ｔ細胞はマウスの肺に到達し、そこで、Ｔｈ２媒介性免疫続発症を起こすことなく、ウイルスのクリアランスが達成された。コットンラットの場合、ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥは、頑健な中和抗体、Ｆ特異的ＩＦＮγＴ細胞応答、及び十分な防御を誘導し、肺組織病理学のエビデンスはなかった。
【００９８】
本明細書でのデータから、ＲＳＶ  ｓＦ及びＧＬＡ−ＳＥを含有するタンパク質サブユニットワクチンが、ＲＳＶに対する頑健な体液性及び細胞性応答を誘導することができ、Ｔｈ１免疫媒介性機構によるウイルスクリアランスを増強することが明らかになった。頑健な中和抗体及びＴ細胞応答を誘導するアジュバント添加ＲＳＶワクチンは、ＲＳＶ感染症の危険性を有する集団に利益をもたらし得ると考えられる。
【００９９】
ワクチン成分
ＲＳＶ  Ａ２Ｆ配列のアミノ酸１〜５２４を含有し、膜貫通ドメインを欠失したＲＳＶ可溶性Ｆ（ｓＦ）タンパク質（Ｈｕａｎｇ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｈｉｎｄｅｒｅｄ  ｂｙ  ｉｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｍＲＮＡ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ４０：２１２−２２１）を、安定にトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の上清からのＲＳＶ−Ｆ特異的ｍＡｂ、パリビズマブ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．）と共に免疫−アフィニティ精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析から、アフィニティ精製したＲＳＶ  ｓＦタンパク質は、＞９５％純粋であり、約５０ｋＤ（Ｆ１）及び約２０ｋＤ（Ｆ２）バンドの両方として還元条件下で泳動することがわかった（図９Ａ及びＢ）。クライオイメージング（ｃｒｙｏｉｍａｇｉｎｇ）の結果から、ｓＦタンパク質が、三量体及びより大きな多量体のいずれもを形成することがわかり、ＥＬＩＳＡ結合試験により、該タンパク質が、インタクトな部位Ａ、Ｂ及びＣ中和エピトープを含有することを確認した（データは示していない）。ＲＳＶ  ｓＦをＢｒａｄｆｏｒｄアッセイにより定量し、これをＥＬＩＳＡアッセイにおける免疫及び塗布の両方で使用した。
【０１００】
この試験に使用したアジュバントは、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＮＪ）として取得したミョウバン（水酸化アルミニウム）を含有した。ミョウバンは、ワクチン用量当たり１００μｇで使用し、２２℃で３０分の混合によりタンパク質に吸着させた。ＧＬＡ、ＳＥ、及びＧＬＡ−ＳＥは、Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）から取得したが、これについては以前記載されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＲＣ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＴＬＲ４  ａｇｏｎｉｓｔ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  Ｓｕｒｆ  Ｂ  Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  ７５：１２３−１３２）。水性製剤においてＧＬＡをワクチン用量当たり５μｇ使用した。ＳＥは、平均粒度が約１００ｎｍの安定化スクアレンベースのエマルジョンであり、これを２％濃度で用いた。別途注記する場合を除いて、ＧＬＡ−ＳＥは、２％ＳＥ中５μｇのＧＬＡの用量で使用した。接種から２４時間以内に全ワクチン製剤を調製した。
【０１０１】
免疫及び攻撃にＲＳＶ  Ａ２株（ＡＴＣＣ）を用いた。ＥＭＥＭで成長させたＶｅｒｏ細胞においてウイルスを増殖させた。ウイルス上清を遠心分離することにより、細胞残屑を除去し、１×ＳＰ（０．２Ｍスクロース、０．００３８Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4、及び０．００７２Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4）で安定化し、使用まで、−８０℃にてアリコート中で急冷した。Ｔａｎｇ  ＲＳ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ３  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｎａｔｉｖｅ  ｏｒ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｕｓｉｏｎ（Ｆ）Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）ｃｏｎｆｅｒｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ＲＳＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｆｒｉｃａｎ  ｇｒｅｅｎ  ｍｏｎｋｅｙｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７８：１１１９８−１１２０７に記載されているように、Ｖｅｒｏ細胞単層上でのプラークアッセイによりウイルス力価を決定した。
【０１０２】
ワクチン接種及び攻撃
７〜１０週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）及び６〜８週齢の雌コットンラット（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を病原体のない条件下で収容した。マウス群に麻酔をかけ、１００μｌの量のプラセボ（ＰＢＳ）又はＲＳＶ  ｓＦ−／＋アジュバントで、２週間あけて２回筋内免疫した。別段記載しない限り、ＲＳＶ  ｓＦは、０．３μｇの用量で投与したが、これは、力価測定試験から、アジュバントの非存在下で準最適防御をもたらす量として決定された。各アジュバントの最も有効な用量を予備試験から選択した（データは示していない）。正の対照を１０6ＰＦＵのＲＳＶ−Ａ２を用いて第０日（Ｄ０）に１回鼻内感染させた。ワクチンは全て、投与時に良好な耐容性を示し、どの群にも注射部位反応はなかった。免疫から１４日及び２８日後に、眼窩後採血から血清を採取し、全血から分離して、評価するまで−２０℃で保存した。試験の第２８日に、１００μｌの量中１０6ＰＦＵの生ＲＳＶ  Ａ２ウイルスをマウスに鼻内接種した。最終免疫から１４日後、又は攻撃から４日後に、脾臓をＴ細胞アッセイのために採取した。プラークアッセイにより個々の肺ホモジネートにおける攻撃から４日後にウイルス力価を定量した。各マウスからの個々の肺葉を保存し、ＰＢＳ＋４％パラホルムアルデヒドで最大１週間膨潤させた後、脱水して、組織病理学試験のためにパラフィンで包埋した。初回プライミングから３週間後にマウスを追加免疫し、ブースタワクチンから３週間後に攻撃した以外は、コットンラット試験も同様に設計した。
【０１０３】
プラーク力価測定による肺ＲＳＶの定量
安楽死させたマウス及びコットンラットから切除した新鮮な肺を計量して、使い捨てヘッド付きのＯＭＮＩ組織ホモジナイザー（Ｏｍｎｉ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｋｅｎｎｅｓａｗ，ＧＡ）を用い、１×ＳＰバッファーを添加したＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で均質化した。遠心分離によりホモジネートを清澄化した。Ｔａｎｇ  ＲＳ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ３  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｎａｔｉｖｅ  ｏｒ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｕｓｉｏｎ（Ｆ）Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）ｃｏｎｆｅｒｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ＲＳＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｆｒｉｃａｎ  ｇｒｅｅｎ  ｍｏｎｋｅｙｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７８：１１１９８−１１２０７に記載されているように、Ｖｅｒｏ細胞単層上でのプラークアッセイによりウイルス力価を決定した。手短には、新しく調製した肺ホモジネートの連続希釈物を６ウェルプレート中のＶｅｒｏ細胞に添加して、１時間感染させた後、１％メチルセルロース／ＥＭＥＭで覆ってから、５〜７日間インキュベートすることにより、プラークを形成させた。被覆を除去し、細胞をメタノール固定した後、ヤギ抗−ＲＳＶ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、次いでＨＲＰ−ウサギ抗−ヤギ抗体及びＡＥＣ（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で染色することにより、プラークを視覚化した。
【０１０４】
血清ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＡ  ＥＬＩＳＡ
標準的ＥＬＩＳＡ技術を用いて、ＲＳＶ−Ｆ特異的ＩｇＧ抗体を評価した。高度結合９６ウェルプレートに精製ＲＳＶ  ｓＦを塗布した。ブロック後、血清の連続希釈物をプレートに添加した。ＨＲＰ結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ、ＩｇＧ１、又はＩｇＧ２ａ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を用いて結合抗体を検出した後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンで展開した（ＴＭＢ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。ＨＲＰ結合ヤギ抗−マウスＩｇＡ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いて、ＲＳＶ−Ｆ特異的ＩｇＡ抗体を検出した。ＥＬＡＳＴ  ＥＬＩＳＡ増幅キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて、シグナルを増幅した後、ＴＭＢで検出した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダにより４５０ｎｍで吸光度を測定した後、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて分析した。ブランクウェルの３ｘ平均値のカットオフを用いて、ｌｏｇ2終点力価として力価を報告した。
【０１０５】
ＲＳＶミクロ中和アッセイ
表示の時点で熱不活性化したマウス血清中のＲＳＶ中和抗体力価を、以前記載されているようにＧＦＰ標識ＲＳＶ  Ａ２マイクロ中和アッセイを用いて測定した（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ＤＩ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｈａｓｅ  １  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｌｉｖｅ，ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ３  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｊ  ３１：１０９−１１４）。手短には、密集Ｖｅｒｏ細胞単層を５００ＰＦＵのウイルス単独、又は連続希釈した血清サンプルと事前に混合したウイルスに感染させた後、３３℃及び５％ＣＯ2で２２時間インキュベートした。プレートを洗浄して遊離ウイルスを除去してから、ＩｓｏＣｙｔｅイメージスキャナー（Ｂｌｕｅｓｈｉｆｔ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いてＧＦＰ蛍光ウイルスフォーカスを計数した。中和力価は、４−パラメータ曲線当てはめアルゴリズムを用いて計算されるように、蛍光フォーカスの数の５０％減少（ＥＣ50力価）をもたらした細胞希釈率のｌｏｇ2逆数として表した。
【０１０６】
細胞単離
表示の採取時点で、１００ミクロンナイロンフィルタ（Ｆａｌｃｏｎ）を通して、個々の脾臓を破砕した。使用の前に、赤血球欠失脾細胞の生存能をＶｉＣｅｌｌにより決定してから、５％ＦＣＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン及び０．１％β−メルカプトエタノール（ｃＲＰＭＩ−５）を添加したＲＰＭＩ１６４０中に、１０×１０6生存細胞／ｍＬで細胞を懸濁させた。
【０１０７】
表示の採取時点で、肺白血球を酵素分散肺組織から単離した。肺を切除し、ＰＢＳで洗浄し、細かく刻んでから、ＲＭＰＩ５％ＦＣＳ、１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）及び３０μｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）中で４５分インキュベートした後、１００ミクロンナイロンフィルタ（Ｆａｌｃｏｎ）を通して破砕した。細胞を洗浄し、ｃＲＰＭＩ−５中に再懸濁させてから、全生存細胞数をＶｉＣｅｌｌにより決定した。
【０１０８】
サイトカインプロファイリング
サイトカイン再刺激アッセイのために、脾細胞を９６ウェルプレート中で、培地単独（ｃＲＰＭＩ−５）、又はＲＳＶ−Ｆ由来ＭＨＣ  ＩＩ（Ｉ−Ｅd）−結合ペプチドＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥＬＳＮＩＫＥ（配列番号１０）とＶＳＶＬＴＳＫＶＬＤＬＫＮＹＩ（配列番号１１）のペア（Ｏｌｓｏｎ  ＭＲ，Ｖａｒｇａ  ＳＭ（２００８）Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ：ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ７：１２３９−１２５５）（各５μｇ／ｍＬ）と一緒に７２時間インキュベートした。遠心分離により上清を清澄化し、評価するまで−８０℃で保存した。
【０１０９】
ＩＦＮγ、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７及びエオタキシンを含有するように設計されたマウスサイトカイン／ケモカイン多重キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて、再刺激脾細胞上清及び新鮮な肺ホモジネートを評価した。肺ホモジネートは、使用前に遠心分離により清澄化した。アッセイを製造者の指示に従って実施し、プレートをＬｕｍｉｎｅｘリーダ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で分析した。Ｆで刺激した値から培地単独での値を差し引くことにより、Ｆ特異的脾臓サイトカイン生産を決定した。
【０１１０】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
マウスＥＬＩＳＰＯＴアッセイのために、Ｍａｂｔｅｃｈ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）マウスＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴキットを使用した。事前に塗布したマイクロプレートをｃＲＰＭＩ−５でブロックしてから、細胞及び刺激物質を添加した。ブロックした塗布済みプレート上で２５０，０００細胞／ウェルを培地のみ、ＭＨＣ  ＩＩ（Ｉ−Ｅd）結合ペプチドＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥＬＳＮＩＫＥ（配列番号１０）及びＶＳＶＬＴＳＫＶＬＤＬＫＮＹＩ（配列番号１１）（Ｏｌｓｏｎ  ＭＲ，Ｖａｒｇａ  ＳＭ（２００８）Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ：ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ７：１２３９−１２５５）（各５μｇ／ｍＬ）、ＭＨＣ  Ｉ（Ｈ２−Ｋd）結合ペプチド、ＫＹＫＮＡＶＴＥＬ（配列番号１２）（Ｏｌｓｏｎ  ＭＲ（２００８）、又は正の対照としてＣｏｎＡ（５μｇ／ｍＬ）と一緒に、３回反復して３６〜４８時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗い流し、キットのプロトコルに従い、プレートを付属のビオチン化抗マウスＩＦＮγと一緒にインキュベートしてから、ＳＡ−ＨＲＰを実施し、付属のＴＭＢ試薬を用いて、スポットを検出した。ＣＴＬ  ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔリーダ及びソフトウエア（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ）を用いて、プレートの読み出し及び分析を行った。
【０１１１】
Ｒ＆Ｄ  ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ  Ｓｙｓｔｅｍで得られたコットンラットＩＦＮγ（＃ＤＹ５６５）又はＩＬ−４（＃ＤＹ５８４）について対合した抗体を、コットンラット細胞性免疫応答の評価のためのＥＬＩＳＰＯＴアッセイフォーマットで使用した。ＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬでキット付属の捕捉抗体（それぞれ抗ＩＦＮγ又は抗ＩＬ−４）で、９６ウェルＰＶＤＦプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を一晩コーティングした。プレートをｃＲＰＭＩ−５で２時間ブロックした。次に、ｃＲＰＭＩ−５中のブロックした塗布済みプレート上で、ＲＳＶ  ｓＦ（２μｇ／ｍＬ）、又は正の対照としてＣｏｎＡ（５μｇ／ｍＬ）と一緒に、３回反復して３６〜４８時間細胞をインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗い流し、プレートを付属のビオチン化検出抗体（ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬ＋１％ＢＳＡ）、続いてストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｍａｂｔｅｃｈ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）及び３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と一緒にインキュベートした。ＣＴＬ  ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔリーダ及びソフトウエア（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ）を用いて、プレートの読み出し及び分析を行った。
【０１１２】
フローサイトメトリー分析
赤血球除去脾細胞及び肺白血球を１．１０6細胞／ウェルで９６ウェルマイクロプレート中に、培地単独、ＭＨＣ  Ｉ（Ｈ２−Ｋd）結合ＦペプチドＫＹＫＮＡＶＴＥＬ（配列番号１２）（１０μｇ／ｍＬ）、ＭＨＣ  Ｉ（Ｈ２−Ｋd）結合Ｍ２ペプチドＳＹＩＧＳＩＮＮＩ（配列番号１３）（１０μｇ／ｍＬ）、又は正の対照としてＣｏｎＡと一緒に塗布した。細胞は、５％ＣＯ2中３７℃で５〜６時間インキュベートし、サイトカインの分泌を阻止するため刺激物中にＢｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａを１時間添加した。生存能について細胞をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤバイオレット、続いてＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ８−ＰＥ−Ｃｙ７、及びＣＤ１９−ＡＰＣ−Ｃｙ７で染色した。２％パラホルムアルデヒドを用いた固定化及びＣｅｌｌＰｅｒｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた透過処理の後、細胞をＩＦＮγ−ＡＰＣ、ＩＬ−２ＦＩＴＣ、及びＴＮＦα−ＰＥで染色した。ＬＳＲ２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で細胞分析し、１０，０００ＣＤ８＋イベントを収集した。
【０１１３】
肺組織病理学
ＲＳＶ攻撃から４日後に採取したパラフィン包埋ホルマリン固定肺葉から、ミクロトームを用いて、肺切片（５ミクロン）を調製した。ヘマトキシリン及びエオシンで染色した切片をデジタルスキャニングし、有資格病理学者による検査を実施した。肺切片を気管支過形成、肺胞炎、好酸球浸潤及び気管支周囲／血管周囲腔の浸潤の存在などの肺病変特徴について評価した。
【０１１４】
統計
Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄソフトウエアを用いて、データを分析した。示すデータは２回以上の実験を代表するものである。データは全て、算術平均±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。統計的有意性は、一元配置分散分析（Ｏｎｅ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）と、これに続くｐ＜０．０５のカットオフを用いたテューキーポストテスト（Ｔｕｋｅｙ  ｐｏｓｔ  ｔｅｓｔ）により計算した。
【０１１５】
結果
１．Ｔｈ１バイアス防御免疫を誘導するＧＬＡ−ＳＥアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦを用いると、アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦサブユニットワクチンは、ＢＡＬＢ／ｃマウスに防御免疫を付与する
アジュバントなしで投与するか、又はミョウバン、ＧＬＡ、ＳＥ、若しくはＧＬＡ−ＳＥのアジュバントを添加して投与する、２つの用量のＲＳＶ  ｓＦサブユニットで、ＢＡＬＢ／ｃマウスのコホートを筋内免疫した。ＲＳＶ  Ａ２ウイルスで攻撃した後、肺ウイルス力価を定量した。全てのワクチンが、肺ウイルス力価３．８ｌｏｇ10ｐｆｕ／グラムを示したＰＢＳ対照と比較して、有意な肺ウイルス力価の低減を達成した（図１Ａ）。ＰＢＳの負の対照群と比較して１００倍の低減を完全な防御とみなした。非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦによる免疫は、４／７匹が、２．３〜３．０ｌｏｇ10ｐｆｕ／グラムの検出可能な肺ウイルス力価を有し、マウスに部分的肺防御をもたらしたのに対し、アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦワクチンは、完全な肺防御を達成し、平均ウイルス力価は、１．８  ｌｏｇ10ｐｆｕ／グラムを下回り、ＲＳＶ  Ａ２免疫群で観測されたものと一致していた。
【０１１６】
攻撃前の血清ＲＳＶ中和力価は、全てのＲＳＶ  ｓＦアジュバント添加ワクチンで有意に増強された。ＧＬＡ−ＳＥ、ミョウバン及びＳＥのアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦワクチンは、第２８日に、それぞれ７．７ｌｏｇ2、８．１ｌｏｇ2及び８．１ｌｏｇ2の最も高いＲＳＶ中和力価を達成した（図１Ｂ）。この力価は、非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦ（４．１ｌｏｇ2）により達成された力価の１６倍大きかった。対照的に、ＧＬＡアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦは、相当の値ではあるが、これより有意に低い６．３ｌｏｇ2中和力価を達成した。非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦと、生ＲＳＶ  Ａ２ウイルスによる鼻内感染のいずれも、検出可能な血清中和力価（それぞれ、４．１ｌｏｇ2及び４．６ｌｏｇ2）を誘導したが、これらの応答は、ＰＢＳの負の対照群で認められた検出限界を有意に超えるものではなかった。血清Ｆ特異的ＩｇＧ及びＦ特異的ＩｇＡ全体についてのＥＬＩＳＡ力価は、同様の傾向を示した（図１０）。
【０１１７】
攻撃から４日後に採取した再刺激脾細胞からの上清（群当たりｎ＝３）を評価して、各ワクチン製剤により誘導されたＦ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のサイトカイン産生プロフィールを決定した。ＭＨＣ  ＩＩ（Ｉ−Ｅd）結合ＲＳＶ−Ｆ由来ペプチドを用いた再刺激（Ｏｌｓｏｎ  ＭＲ及びＶａｒｇａ  ＳＭ（２００８）Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ：ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ７：１２３９−１２５５）後に、ＩＦＮγをプロトタイプのＴｈ１型サイトカインとして、ＩＬ−５及びＩＬ−１３を代表的Ｔｈ２型サイトカインとして、またＩＬ−１７をＴｈ１７型サイトカインとして評価した。予測したように、ＰＢＳ対照動物からの再刺激脾細胞は、Ｆ特異的サイトカイン産生を示さないが、鼻内ＲＳＶ感染マウスからのものは、弱いＩＦＮγ優勢の応答を示した（図１Ｃ）。ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥワクチン群は、ＩＦＮγが優勢の強いＲＳＶ−Ｆ特異的応答を誘導し、これは、Ｔｈ１型応答を示している。対照的に、ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ群は、Ｔｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７サイトカインを含む均衡したＦ特異的応答を示したが、ＲＳＶ  ｓＦ、ＲＳＶ  ｓＦ＋ＳＥ、及びＲＳＶ  ｓＦ＋ミョウバン群は、ＩＬ−５及びＩＬ−１３サイトカインを特徴とするＴｈ２型応答を示した。
【０１１８】
ＩＦＮγは、マウスにおいてＩｇＧ１からＩｇＧ２ａへの抗体のクラススイッチを促進する（Ｘｕ  Ｗ及びＺｈａｎｇ  ＪＪ（２００５）Ｓｔａｔ１−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ−ｂｅｔ  ｆｏｒ  ＩｇＧ２ａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅａｒｌｙ  ｓｔａｇｅ  ｏｆ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７５：７４１９−７４２４）ことから、各動物からのＦ特異的抗体のアイソタイプも評価した。次の２群：ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥワクチン接種群と、ＲＳＶ  Ａ２による感染でプライミングした群だけがＦ特異的ＩｇＧ２ａ＞ＩｇＧ１力価を示し（図１Ｄ）、両群とも、ＭＨＣ  ＩＩ由来Ｆペプチドに対するＩＦＮγ優勢の応答を有した。ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥは、ＲＳＶ  ｓＦ単独又はＲＳＶ  ｓＦ＋ミョウバンより有意に多いＦ特異的ＩｇＧ２ａ抗体を誘導した。
【０１１９】
ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥに認められたようなワクチンに対するＴｈ１型応答は、強いＣＤ８Ｔ細胞応答の発生を支持し得る。従って、第３２日で、各ワクチン群からの代表的動物において、免疫優性ＭＨＣ  Ｉ（Ｈ２−Ｋd）結合Ｆ由来ペプチドを用いた再刺激（Ｏｌｓｏｎ  ＭＲ，Ｖａｒｇａ  ＳＭ（２００８）Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ：ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ７：１２３９−１２５５）により、ワクチン接種に対するＣＤ８Ｔ細胞応答を評価した。ＰＢＳ対照群中のＦ特異的ＣＤ８ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ計数は、ほぼ検出限界未満であったのに対し、非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦ群での計数は、百万個の細胞当たり約３０スポット形成単位（ＳＦＵ）であった（図１Ｅ）。対照的に、Ｆ特異的ＣＤ８ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答は、ＲＳＶ  ｓＦと比較してＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥワクチン群において有意に高かった（平均：６８４、非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦに対して２３倍の増加）。Ｆ特異的ＣＤ８ＩＦＮγ応答は、他のアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦワクチン製剤の方がやや高かったが、これは、非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦと比較して有意ではなかった。生ＲＳＶ感染によって、わずか１００ＳＦＵの弱いＦ特異的ＣＤ８ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答が発生したが、これは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＲＳＶ  Ａ２に対する免疫優性応答は、Ｍ２由来ペプチドに対するものであるため、予想外ではなかった（Ｏｌｓｏｎ  ＭＲ及びＶａｒｇａ  ＳＭ（２００８）Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ：ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ７：１２３９−１２５５）。これらの応答細胞の細胞溶解能力を評価するために、ＥＬＩＳＰＯＴによりＦ特異的グランザイムＢ分泌を評価した。ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥワクチンを受けたマウスからの脾細胞だけがＦ特異的グランザイムＢ応答を有し（平均１９７）、ｓＦ単独で投与したマウスに観測されたもの（平均１８）より有意に高かった（図１Ｆ）。ＩＦＮγ、ＴＮＦα（エフェクターサイトカイン）及びＩＬ−２（増殖に関連するサイトカイン）を共発現する多機能性Ｔ細胞が、ウイルスクリアランスで最も有効であり、その次に、ＩＦＮγ及びＴＮＦαを共発現するＴ細胞が有効であることが報告されている（Ｓｅｄｅｒ  ＲＡ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｔ−ｃｅｌｌ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｍｅｍｏｒｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８：２４７−２５８）ことから、細胞内サイトカイン染色によりＦ特異的ＣＤ８Ｔ細胞をさらに評価した。ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥワクチン群は、三重陽性及びＩＦＮγＴＮＦα二重陽性細胞の両方について最大数を有した（図１１）。
【０１２０】
これらの結果から、以下のことがわかる：ＲＳＶ  ｓＦは、単独で免疫原性であるが、アジュバントと共にＲＳＶ  ｓＦを製剤化すると、より高い力価の中和抗体をネイティブ動物で誘導し、また、ＧＬＡ−ＳＥと共にＲＳＶ  ｓＦを製剤化すると、Ｔｈ１バイアス免疫を生み出し、これは、ウイルスクリアランスの改善に寄与し得る強力なＦ特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答をプライミングする。
【０１２１】
２．ＧＬＡ−ＳＥアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦワクチンでプライミングしたＣＤ８Ｔ細胞応答は頑健である
ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥによる初回／追加ワクチン接種に続く攻撃後に観察されたＣＤ８Ｔ細胞応答は、様々な抗原及びアジュバント用量で頑健であった。定用量のＧＬＡ−ＳＥ（５μｇ／２％）と一緒に投与した０．３、７．５、又は３７．５μｇのＲＳＶ  ｓＦを受けた動物は全て、ＲＳＶ攻撃から４日後に実施したＥＬＩＳＰＯＴにより検出されるように、ＰＢＳ対照と比較して強力なＦ特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答を生み出した（図２Ａ）。投与したＲＳＶ  ｓＦの用量が高い動物ほど、高いスポット絶対数が認められた。様々な用量（２％ＳＥ中５μｇ、２．５μｇ、１μｇ、又は０．５μｇ）でＧＬＡ−ＳＥと一緒に投与した０．３μｇのＲＳＶ  ｓＦを受けた動物はさらに、攻撃から４日後に、ＰＢＳ対照群又はアジュバント単独対照群のいずれと比較しても、Ｆ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の有意に増加した数も示した（図２Ｂ）。２％ＳＥ中１〜２．５μｇのＧＬＡのアジュバント用量が、最適な脾臓Ｔ細胞応答を得るのに十分であった。
【０１２２】
３．ＧＬＡ−ＳＥアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦワクチンは、ウイルス暴露なしでＦ特異的ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導する
ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥワクチンでプライミングした攻撃後Ｆ特異的Ｔ細胞は、防御をもたらす全てのＲＳＶｓＦ用量で容易に検出された。しかし、０．３μｇ以下のＲＳＶｓＦでワクチン接種したコホートにおいては、ＲＳＶ攻撃前に有意な数のＦ特異的Ｔ細胞を検出するのは難しかった（データは示していない）。ＲＳＶ攻撃の非存在及び存在下でのＴ細胞誘導を評価するために、第０日及び第１４日に、ＧＬＡ−ＳＥ（２％ＳＥ中２．５μｇ若しくは１μｇ）でアジュバント添加した１０μｇのＲＳＶ  ｓＦでマウスにワクチン接種し、１コホートは、２回目のワクチン用量から１４日後に評価し、別のコホートは、生ＲＳＶ攻撃から４日後に評価した。追加免疫から１４日後に、ＰＢＳ又は非アジュバント添加ｓＦ群のいずれと比較しても、両ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥ群においてＦ特異的ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞数は有意に増大した（ＣＤ４応答は、平均４９〜１５０ＳＦＵ／１０6で、ＣＤ８応答は、１０６９〜３１７２ＳＦＵ／１０6）（図３Ａ〜Ｂ）。また、両ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥ群におけるＦ特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答は、ｓＦ＋ＳＥ群において観測されたものより有意に高かった。ＲＳＶ攻撃後、Ｆ特異的ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞数は、ＰＢＳ群と比較して、両ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥ群において有意に高かった（図３Ｃ〜Ｄ）。さらに、両ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥ群におけるＦ特異的ＣＤ８Ｔ細胞数も、非アジュバント添加ｓＦ群において観測されたものより有意に高かった。興味深いことに、Ｆ特異的脾臓ＣＤ８の絶対数は、攻撃前コホートと比較して攻撃後コホートにおいて低いことがわかったが、これは、恐らくこれらの細胞のウイルス攻撃の部位への再配置を示している。全体として、これらのデータは、ＧＬＡ−ＳＥでアジュバント添加したＲＳＶ  ｓＦタンパク質による免疫が、生ＲＳＶへのいずれの暴露の前にも存在する全身性Ｆ特異的ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞応答を誘発することを示している。
【０１２３】
４．ＧＬＡ−ＳＥアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦワクチンを用いたワクチン接種により誘導されるＣＤ８Ｔ細胞応答は、ＲＳＶ攻撃後に肺に動員される
ＧＬＡ−ＳＥアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦを用いた筋内ワクチン接種により産生された全身性Ｆ特異的ＣＤ８Ｔ細胞を、ＲＳＶ攻撃後に、肺に到達するその能力について評価した。アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦ（０．３μｇ）でワクチン接種してから、ＲＳＶ  Ａ２で攻撃したマウスは、攻撃から４日、７日又は１２日後、フローサイトメトリー分析のために肺リンパ球（群及び時点当たりｎ＝３）を採取した。ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥでワクチン接種したマウスは、攻撃から４日後までに、肺に３．３９％Ｆ特異的ＣＤ８Ｔ細胞を有し、ＰＢＳ免疫マウスの肺で観測された０．４８％Ｆ特異的ＣＤ８Ｔ細胞とは有意な差を示した（図４Ａ）。これらのＦ特異的ＣＤ８Ｔ細胞は、主にＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びＩＬ−２について三重陽性（平均１．７５％）であるか、又はＩＦＮγ及びＴＮＦαについて二重陽性（平均１．５％）であった。比較すると、ｓＦ＋ミョウバンワクチン群は、この時点で、肺にいずれかの機能の１．０％Ｆ特異的ＣＤ８しかなかった。攻撃から７日後までに、ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥでワクチン接種したマウスは、肺に７．２８％Ｆ特異的ＣＤ８Ｔ細胞を有し、ＰＢＳ免疫マウスの肺で観測された０．４４％Ｆ特異的ＣＤ８Ｔ細胞、ｓＦ＋ミョウバン免疫マウスに観測された０．８７％、又は生ＲＳＶ免疫マウスに観測された０．７６％とは有意な差を示した（図４Ａ）。攻撃から１２日後のこれらの群における肺局在化Ｆ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の差は、同様に有意であったが、この時点までに、主要なＴ細胞集団は、ＩＦＮγ及びＴＮＦαの二重陽性であり、ＩＬ−２産生を喪失していた。ＩＬ−２を欠失したＴ細胞は、増殖性が低下するため、これらの細胞は、収縮期の最初の段階の１つを表していると考えられる。これらのデータは、ＰＢＳ免疫マウス、ＲＳＶ  ｓＦ＋ミョウバン免疫マウス、あるいは生ＲＳＶ免疫マウスのいずれと比較しても、ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥ群において、ＲＳＶ攻撃後に肺への多機能性Ｆ特異的Ｔ細胞のより迅速な動員を示している。
【０１２４】
局所肺Ｆ特異的応答は、一次ＲＳＶ感染を有するマウスでは弱いが、肺での免疫優性Ｍ２特異的応答は、二次感染後急速に発達した（図４Ｂ）。全肺ＣＤ８集団の１２％超が、ＲＳＶ再感染から４日後までにＭ２特異的であったが、これは、他の群で観測された数（＜１％）より有意に高い数である。これらのＭ２特異的ＣＤ８Ｔ細胞は、主に三重陽性ＣＤ８Ｔ細胞であった。生ＲＳＶ群におけるＭ２特異的ＣＤ８Ｔ細胞の数は、経時的に有意に変化しなかったが、二重陽性ＣＤ８Ｔ細胞が優位になった。ＲＳＶ攻撃から７〜１２日後までには、Ｍ２特異的ＣＤ８Ｔ細胞の数は、ＰＢＳ、ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥ及びＲＳＶ  ｓＦ＋ミョウバン免疫群において増加したが、このことは、ウイルス複製の非存在下であっても、ＲＳＶ攻撃後、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてこの免疫優性エピトープに対するＣＤ８Ｔ細胞の急速な誘導を示している。
【０１２５】
５．ＧＬＡ−ＳＥアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦワクチンは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＲＳＶ攻撃後の肺Ｔｈ２応答及び肺組織病理悪化を回避する
ＢＡＬＢ／ｃ肺におけるＲＳＶ攻撃に対するＴｈ２型応答、特にＩＬ−１３産生を特徴とする応答は、ナイーブ動物における肺への好酸球浸潤及び組織病理悪化と関連することが報告されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＴＲ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−５，ｅｏｔａｘｉｎ−１，ａｎｄ  ＣＤ４＋  ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  Ｇ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ８４：７４８−７５９）。アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦワクチンのいずれかが免疫マウスの肺においてバイアスサイトカイン応答を誘導したかどうかを決定するために、ＲＳＶ攻撃から４日後に採取した個別の肺ホモジネート中のＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＦＮγ、ＩＬ−１７、及びエオタキシンを測定した。これらのサイトカイン読み出しにより、肺に動員されたあらゆる免疫細胞（マクロファージ、好酸球、Ｂ細胞、及びＴ細胞など）により産生されたサイトカインのスナップショットが得られる。ＩＬ−５及びＩＬ−１３は、非アジュバント添加ｓＦ、ＳＥアジュバント添加ｓＦ、又はミョウバンアジュバント添加ｓＦで免疫したマウスの肺にしか検出されなかったが、ＩＦＮγは、上記群のほとんどで検出された。Ｔｈ１／Ｔｈ２特性を表すのにＩＦＮγ：ＩＬ−５の比を用いたが、比＞１．０は、より高いＴｈ１型応答を示す。ＰＢＳ免疫マウスは、ＲＳＶ攻撃から早い時点で、予測通り、全ての試験サイトカインのレベルが低かった（図５Ａ〜Ｆ）。Ｔｈ１応答は、生ＲＳＶ群（平均ＩＦＮγ：ＩＬ−５比：２９．２）、ＧＬＡアジュバント添加ｓＦ群（平均比：７．８）及びＧＬＡ−ＳＥアジュバント添加ｓＦ群（平均比：５９．３）で観測された。しかし、Ｔｈ２型応答は、非アジュバント添加ｓＦ群（平均比：０．３）、ＳＥアジュバント添加ｓＦ群（平均比：０．４）、及びミョウバンアジュバント添加群（平均比：０．５）について観測された（図５Ａ〜Ｆ）。Ｔｈ１７細胞は、様々な前臨床肺感染モデルにおいて、炎症の増大及び防御の増強のいずれにも関連しているが、免疫マウスでは低レベルのＩＬ−１７しか検出されず、しかもこれらは、アジュバントの使用によって有意に変動しなかった（図５Ａ〜Ｆ）。好酸球浸潤に関連するケモカインであるエオタキシン（ＣＣＬ１１）（Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ＳＰ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＣＣＬ１１  ｉｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ  ｌｕｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９：２０５０−２０５７）は、ＰＢＳ群において１３５ｐｇ／ｍＬのベースラインレベルで、生ＲＳＶ群では２９７ｐｇ／ｍＬであった（図５Ａ〜Ｆ）。増大した肺エオタキシンレベルが、非アジュバント添加ｓＦ群（平均：９１１ｐｇ／ｍＬ）、ＳＥアジュバント添加ｓＦ群（平均：９６５ｐｇ／ｍＬ）、及びミョウバンアジュバント添加ｓＦ群（平均：７９６ｐｇ／ｍＬ）などの、Ｔｈ２型免疫応答を有する群で観測された。対照的に、Ｔｈ１型免疫応答を有する群の肺エオタキシンレベル���、ベースラインであり、ＧＬＡ−ＳＥアジュバント添加ｓＦ群は２４０ｐｇ／ｍＬであった。
【０１２６】
好酸球浸潤をさらに評価するために、各ワクチン群からの肺切片を、ＲＳＶ攻撃後の組織病理学的病変について採点した。ＲＳＶによる一次感染を経験した動物の肺には肺病変がほとんど検出されなかったが、二次ＲＳＶ感染を有する動物において低レベルの肺胞炎及び血管周囲浸潤が認められた（図６Ａ〜Ｆ）。ＧＬＡ−ＳＥアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦ製剤を受けた動物は、二次ＲＳＶ感染を経験したマウスと同様の低い肺炎症スコアを有した。しかし、ＳＥアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦ、ミョウバンアジュバント添加ｓＦ又は非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦを受けたマウスは、肺病変スコアが増加した。これらのデータ全体から、ＧＬＡ−ＳＥアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦを用いた免疫により達成され、観測された全身性Ｔｈ１バイアス免疫応答は、肺Ｔｈ１バイアス免疫応答、ベースライン肺エオタキシンレベル、及び他の試験製剤と比較して、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＲＳＶ攻撃後の低い肺炎症と一致することが明らかである。
【０１２７】
６．アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦサブユニットワクチンは、ＲＳＶ攻撃からの完全な防御を付与し、ナイーブコットンラットにおいてＲＳＶ中和力価及びＴｈ１バイアス媒介免疫の両方を誘導する
コットンラットは、ＲＳＶ研究のために確立されたモデルであり、有望なＲＳＶワクチン候補の前臨床評価でよく使用されている。２回目のＲＳＶ攻撃モデルにおいてＧＬＡ−ＳＥアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦワクチンの免疫プロフィールを確認するために、個々のコットンラットに同じＲＳＶ  ｓＦサブユニットワクチンを、マウスに用いたのと同様の用量で投与した。アジュバントなし、又はＧＬＡ、ＳＥ、ＧＬＡ−ＳＥ、若しくはミョウバンのアジュバントを含む０．３μｇのＲＳＶ  ｓＦを第０日及び第２２日に筋内投与した。コットンラットの１群を負の対照としてＧＬＡ−ＳＥ単独で免疫し、別の群には、正の対照として、第０日に１回の鼻内用量１×１０6ｐｆｕの生ＲＳＶ  Ａ２ウイルスを投与した。
【０１２８】
ＲＳＶ攻撃後、アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦワクチンを受けた全てのコットンラットは、生ＲＳＶ群と等しく、肺において完全に防御され、平均ＲＳＶ力価＜２ｌｏｇ10ｐｆｕ／グラムを有し、プラセボ群（５．５ｌｏｇ10ｐｆｕ／グラム）と比較して、ＲＳＶ力価は１０００倍低減した（図７Ａ）。マウスにおいて観測されたものとは対照的に、非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦでの免疫は、ＲＳＶ攻撃からコットンラットを防御しなかった。これら動物の肺における平均ウイルス力価（５．４ｌｏｇ10ｐｆｕ／グラム）は、プラセボ対照のものと類似していた。アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦワクチンは、ＲＳＶ攻撃からコットンラットの上気道（鼻）も防御することができた。ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥをワクチン接種したコホートは、生ＲＳＶ群と等しく、鼻での完全な防御を示し、これらのいずれも、平均ＲＳＶ力価＜１ｌｏｇ10ｐｆｕ／グラムを有し、プラセボ群（５．１ｌｏｇ10ｐｆｕ／グラム）と比較して、ＲＳＶ力価は１０００倍低減した（図７Ｂ）。ｓＦ＋ＧＬＡ（平均２．７ｌｏｇ10ｐｆｕ／グラム）、ｓＦ＋ＳＥ（平均１．４ｌｏｇ10ｐｆｕ／グラム）、又はｓＦ＋ミョウバン（平均２．１ｌｏｇ10ｐｆｕ／グラム）を受けた群では、上気道の部分的防御が観測されたが、これらの低減は、非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦワクチン群（平均４．９ｌｏｇ10ｐｆｕ／グラム）又はプラセボ群と比較して、全て有意であった。
【０１２９】
ＧＬＡ−ＳＥアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦワクチン群におけるコットンラットは、第４２日で最も高いＲＳＶ中和力価を生み出し、平均１４．７ｌｏｇ2ｐｆｕ／グラムであった（図７Ｃ）。これは、ＳＥアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦを除く他の全てのワクチン製剤より有意に高かった。ＧＬＡアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦワクチン群（平均１１．７ｌｏｇ2）、ＳＥアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦワクチン群（平均１３．３ｌｏｇ2）及びミョウバンアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦワクチン群（平均１２．９ｌｏｇ2）についても高い中和力価が認められた。これらの力価は、生ＲＳＶ  Ａ２ウイルス（平均９．７ｌｏｇ2）での鼻内感染、又は非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦ（平均４．３ｌｏｇ2）での筋内免疫によって達成されたものより有意に高く、高力価血清ＲＳＶ中和抗体の誘導におけるアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦの優位性を示している。初回ワクチン接種から４２日後の合計Ｆ特異的ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ力価も、非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦ群又は生ＲＳＶ群のいずれより、ＳＥ、ＧＬＡ−ＳＥ、若しくはミョウバンアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦ群の方が高かった（図７Ｄ）。
【０１３０】
コットンラットにおけるＴ細胞応答を、全ＲＳＶ  ｓＦタンパク質での再刺激後ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴにより測定した。ＧＬＡ−ＳＥアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦ群（平均：２６２６ＳＦＵ／百万個の細胞）において最も強力なＦ特異的ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答が検出されたが、これは、非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦ（平均：５８ＳＦＵ／百万）の４５倍増であり、他の全てのワクチンコホートで見られたものより有意に強力な応答であった（図７Ｅ）。検出可能ではあるが、ｓＦ特異的ＩＦＮγ応答は、非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦ群と比べても、ＧＬＡ（平均：約７スポット／百万）、ＳＥ（平均：約６４２）又はミョウバン（平均：１２４６）によって有意に増強されなかった。生ＲＳＶ感染群は、１９６スポットという比較的低い脾臓ｓＦ特異的ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答を生み出した。これらの結果は、ＢＡＬＢ／ｃマウスモデルで観測された結果と類似していた。
【０１３１】
ＥＬＩＳＰＯＴにより測定されるＩＦＮγ：ＩＬ−４特異的応答の比を用いて、コットンラットにおける細胞性免疫応答のＴｈ１バイアスを決定した。各群について得られたＩＦＮγ：ＩＬ−４比から、ＧＬＡ−ＳＥアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦが、最も高いＴｈ１バイアス細胞性応答（比：２６．９）を生み出し、それ以外は、１〜１０の間にとどまったことがわかった（図７Ｆ）。コットンラットにおけるこのＴｈ１バイアスは、ＢＡＬＢ／ｃマウスで認められたものと類似している。
【０１３２】
マウス試験について記載したように、ＲＳＶ攻撃から４日後の全てのラットから採取したコットンラット肺切片において、好酸球浸潤及びＲＳＶ肺疾患に関連する他の組織病理学的な肺の変化を評価し、採点した（図８）。コットンラットのいずれのワクチン接種群にも、二次ＲＳＶ感染後の生ＲＳＶ感染群において見られたものより有意に重症の組織病理は観測されなかった。
【０１３３】
論考：
この試験から、精製ＲＳＶ  ｓＦタンパク質を含有するＧＬＡ−ＳＥアジュバント添加ワクチンは、ＲＳＶ感染後の免疫疾患を一切示すことなく、ＲＳＶ攻撃からＢＡＬＢ／ｃマウス及びコットンラットを完全に防御すると同時に、高い中和力価及び多機能性ＣＤ８＋Ｔ細胞を特徴とする頑健なＴｈ１バイアス細胞性応答の両方を生み出し、高度に免疫原性であることが明らかである。対照的に、ミョウバン又はＳＥアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦは、高い中和力価を特徴とするが、弱いＴｈ２バイアス細胞性応答を呈示する防御応答（肺炎症の指標に関連する）を誘導し、また、非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦは、ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して部分的ＲＳＶ防御しかもたらさなかった。この試験により、組換えＲＳＶ  ｓＦが、恐らく融合後（ｐｏｓｔ−ｆｕｓｉｏｎ）であることと、マウスにおいて、ＧＬＡ−ＳＥアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦが、臨床ＲＳＶ  Ａ及びＢ分離株に対して頑健な交差中和抗体を誘導することが確認される。
【０１３４】
実施例２ａ：１×ＲＳＶ血清陽性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＲＳＶ−ｓＦの免疫原性
この試験により、ＲＳＶ血清陽性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＲＳＶ特異的免疫応答を促進及び維持する能力について、アジュバントと共に、又はなしで投与したＲＳＶ  ｓＦ糖タンパク質の用量応答を評価した。この試験の目標は、以下の通りである：（１）単回ワクチン投与後のＲＳＶ血清陽性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて免疫応答を促進するのに十分なＲＳＶ  ｓＦの用量を決定すること；（２）天然ＲＳＶ感染後のＲＳＶ免疫応答を促進する上でのＲＳＶ  ｓＦワクチン中のＧＬＡ−ＳＥアジュバントを評価すること；並びに（３）ＲＳＶ  ｓＦワクチンにより誘導されるＦ特異的免疫応答の持続性を決定すること。
【０１３５】
ＲＳＶ−Ｆヒト株Ａ２タンパク質の５０アミノ酸Ｃ末端膜貫通ドメイン（すなわち、アミノ酸５２５〜５７４）の欠失により、ＲＳＶ  ｓＦ（配列番号７）を作製した。マウスは、ワクチン試験の開始前に、１回鼻内投与した１用量の生ＲＳＶウイルスにより血清陽性にした。安定にトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞からＲＳＶ  ｓＦタンパク質を生成し、免疫アフィニティ精製した後、アジュバントを添加せず、又は安定エマルジョン中の糖ピラノシルリピドＡ（ＧＬＡ−ＳＥ）を添加して、０．４μｇ、２μｇ、又は１０μｇで雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに１回筋内投与した（第０日）。第０日（ベースライン）、並びにワクチン接種後１０週間にわたり２週間毎に血清学的抗Ｆ抗体応答及びＲＳＶ中和抗体応答を測定した。マウスの代表的サブセット（ｎ＝３／群）においてワクチン接種から１０日後、さらに、ワクチン接種から１０週間後のＲＳＶ攻撃の後に、Ｆ特異的ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞応答を測定した。ＲＳＶ攻撃後の局所肺特異的免疫が、抗体及びサイトカインの存在により明らかにされた。
【０１３６】
この試験から、アジュバントと共に、又はアジュバントなしで投与したＲＳＶ  ｓＦは、抗原用量依存的に、ＲＳＶに対する体液性免疫応答を促進するが、ＧＬＡ−ＳＥアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦは、抗原用量依存的に、ＣＤ８特異的免疫応答も促進することが判明した。さらに、上記試験から、これらの促進された応答は、免疫後少なくとも１０週間維持されることもわかった。従って、上記試験は、ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥが、ワクチン接種前に実験によりＲＳＶに感染させたマウスにおいて、体液性及び細胞性免疫応答の両方を促進したことを示しており、ＲＳＶ  ｓＦは、ＲＳＶ血清陽性の個体であっても広範なＲＳＶ免疫応答を促進するための有力な候補であるというエビデンスを提供する。ＲＳＶヒト株Ａ２（配列番号２）の膜貫通ドメインを欠失した可溶性Ｆ（ｓＦ）タンパク質構築物（配列番号７）を作製し、安定なクローンチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞から発現させて、免疫アフィニティ精製を用い、抗原的にインタクトな高度精製タンパク質を作製した。
【０１３７】
ＲＳＶワクチン評価に広く用いられるモデルは、ＢＡＬＢ／ｃマウスであり、これは、ＲＳＶ許容性がより高いマウス系統の１つである。有効なＲＳＶクリアランスと関連すると考えられる免疫応答の深さ分析（ｄｅｐｔｈ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を可能にするＢＡＬＢ／ｃマウスモデル用の試薬が入手可能である（Ｃｏｎｎｏｒｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＲＳＶ  Ｍ２  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｖａｃ−Ｍ２）ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌｓ，ｗｈｉｌｅ  ｔｈａｔ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｖａｃ−Ｆ  ｏｒ  Ｖａｃ−Ｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９９２；６６：１２７７−８１）。ＲＳＶに対する交差中和抗体（組織培養物中でＲＳＶ  Ａ及びＲＳＶ  Ｂ株感染の両方を阻害する）はマウスにおいて産生されるが、マウス及びヒト血清のいずれも、ＲＳＶ感染後に交差中和ＲＳＶ抗体を含有する。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ヒトと同様に、ＲＳＶ−Ｆ糖タンパク質に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を高めることができ、これによって、残留する感染細胞を排除して、疾患を制限することができる（Ｏｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｖａｒｇａ，Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ：ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２００８；７（８）：１２３９−５５）。これらのＦ特異的ＣＤ８Ｔ細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、Ｆ糖タンパク質、ＫＹＫＮＡＶＴＥＬ（配列番号１２）の免疫優性エピトープに対して検出することができる（Ｏｌｓｏｎ及びＶａｒｇａ，Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ：ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２００８；７（８）：１２３９−５５）。ＣＤＲ４＋Ｔ細胞応答は、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３などのＴｈ２型サイトカインより有効な細胞性抗ウイルス応答に関連するＩＦＮγなどのＴｈ１型サイトカインと共に、中和抗体及びＣＤ８＋Ｔ細胞両方の生産に影響するサイトカインを生成する。Ｔｈ１応答は、ウイルス感染の局所部位で、又は抗原再刺激脾臓培養物から産生されるサイトカインの形態で直接測定することもできるし、より高いＴｈ１型応答に関連するマウスＩｇＧ２ａアイソタイプを用い、抗体アイソタイプにより間接的に測定することもできる。Ｔｈ２バイアスを回避して、若年に比べ高齢者に見られるＴ細胞欠陥を解消する（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｌｏｃａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｓ  ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２００７；８８：２５５２−８）と同時に、Ｒ���Ｖ感染症の軽減に重要な役割を果たすことが判明している中和抗体を誘導して、高齢者におけるＲＳＶ特異的細胞性応答を促進する上で十分に免疫原性であるワクチン製剤を選択するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスでの前臨床動物評価を設計する。
【０１３８】
糖ピラノシルリピドＡ／安定エマルジョン（ＧＬＡ−ＳＥ）は、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて２用量ワクチンレジメンでＲＳＶ  ｓＦに対する体液性及び細胞性免疫応答の誘導を増強することが立証された併用アジュバント（Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）である。この試験では、ワクチン接種前に実験によりＲＳＶに感染させたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫応答を促進するために、単一用量のＲＳＶ  ｓＦワクチン接種レジメンにアジュバントが必要かどうかを決定した。
【０１３９】
評価するワクチン製剤は、アジュバントＧＬＡ−ＳＥと共に、又はこれを含まずに０．４μｇ、２μｇ、及び１０μｇでＲＳＶ  ｓＦを含有した。これらを、対照ＲＳＶ血清陰性マウス、プラセボワクチンを投与した血清陽性マウス、及びブースタとして二次ＲＳＶ感染を付与した血清陽性マウスと比較した。評価する免疫パラメータとして、以下のものが挙げられる：ＲＳＶ  ｓＦに対する血清抗体応答（総量、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ、及びウイルス中和力価）、ワクチン接種後、及びワクチン接種から１０週間後のリコール（ｒｅｃａｌｌ）攻撃後のＦ特異的インターフェロンγ（ＩＦＮγ）特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答、これらの両時点でのＦ特異的Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカイン産生ＣＤ４Ｔ細胞、並びにリコール攻撃から４日後の肺サイトカインレベル及びＦ特異的抗体。
【０１４０】
ナイーブ雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、各８〜９匹の表示ワクチンコホートに分け、第０日に投与した。９群のうち８群に、ワクチン投与の２８日前に、１０6ＰＦＵの生ＲＳＶ  Ａ２ウイルスを鼻内接種して、ＲＳＶ血清陽性マウスを作出した。第０日のＦ特異的ＥＬＩＳＡ終点力価により、血清転換が成功したことを確認した。マウス９匹の群に、ワクチン製剤を第０日に筋内（ＩＭ）接種した。攻撃から１０日後に、１群当たり３匹を細胞性免疫応答について評価し、残る１群あたり５〜６匹は、第７３日まで血清抗体応答について追跡した。残った動物は、第６９日に、生ＲＳＶ  Ａ２ウイルスで鼻内攻撃して、攻撃から４日後（第７３日）に残留リコール細胞性免疫応答の評価を可能にした。
【０１４１】
ＧＬＡ−ＳＥを含むか、又は含まない３つの異なる用量のＲＳＶ  ｓＦサブユニットワクチンを評価した。用いた用量は、マウス１匹当たり０．４μｇ、２μｇ、及び１０μｇのサブユニットタンパク質であり、これは、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスに用いた範囲を含み、ＲＳＶ  ｓＦ糖タンパク質の提案された最低臨床用量（１０μｇ）を含む。アジュバント添加群におけるＧＬＡ−ＳＥは、２％ＳＥ中５μｇのＧＬＡの用量で付与した。第０日に、鼻内経路での１０6ＰＦＵの生ＲＳＶ  Ａ２ウイルスによるブースタ感染を付与した接種血清陽性マウスは正の対照として用い、負の対照は、プラセボとしてＰＢＳを接種した血清陽性群と、プラセボとしてＰＢＳを接種した血清陰性群を含んだ。
【０１４２】
第０、１４、２８、４２、５６、及び７３日に、各群について血清学読み出しを実施した。マウスをイソフルランで軽度に麻酔した後、眼窩内から採血した。血清を分離し、−２０℃で保存し、試験のために解凍した。各時点で全抗ＦＩｇＧを測定し、第０日及び第４２日に抗ＦＩｇＧ１及び抗ＦＩｇＧ２ａＥＬＩＳＡ終点希釈力価を測定した。ＲＳＶ中和力価をＲＳＶ  Ａ２−ＧＦＰマイクロ中和アッセイにより決定した。第４２日に、ＲＳＶ−Ｆに対する部位特異的モノクローナル抗体を用いた競合ＥＬＩＳＡにより、抗ＦＩｇＧ応答のポリクローナル性を評価した。第１４日に、各群について抗ＦＩｇＡ終点希釈力価を測定した。
【０１４３】
ワクチン接種から１０日後に、代表的マウスにおいて、ワクチン接種に対する全身性細胞性免疫応答を評価した。別の代表的マウスは、第６９日にウイルス攻撃でリコールし、第７３日（ウイルス攻撃から４日後）に長期細胞性免疫応答について評価した。各々の群について、３〜５つの個別の脾細胞サンプルを調製した。ＲＳＶ  ｓＦを用いた７２時間の再刺激時間後の分泌サイトカイン（ＩＦＮγ、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、及びＩＬ−１７など）の集団の上清レベルの多重サイトカイン分析により、ＣＤ４Ｔ細胞読み出し情報を評価した。ＣＤ８Ｔ細胞読み出し情報は、次の２つの方法により評価した：Ｆ由来ＣＤ８ペプチド（ＫＹＫＮＡＶＴＥＬ  ａａ  ８５〜９３）（配列番号１２）による３６〜４８時間再刺激時間及び細胞内染色後のＩＦＮγ分泌細胞のＥＬＩＳＰＯＴ数、並びにＦ由来ＣＤ８ペプチドによる５時間の再刺激時間後のＦ特異的多機能性（ＩＦＮγ＋ＴＮＦα＋ＩＬ−２＋）ＣＤ８Ｔ細胞の割合（％）の定量。
【０１４４】
ウイルス攻撃に対する肺特異的応答を、第７３日（攻撃から４日後）に個別に採取した均質化肺について評価した。肺ホモジネート中のサイトカインレベル（ＩＦＮγ、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、エオタキシン）を局所細胞性免疫応答のバイオマーカとして測定した。抗体応答が肺にターゲティングされていることを明らかにするため、肺ホモジネート中のＦ特異的ＩｇＡ及びＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡ終点力価により測定した。テューキーポストテスト（Ｔｕｋｅｙ  ｐｏｓｔ  ｔｅｓｔ）及びｐ＜０．０５の有意性カットオフを用いたＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ一元配置分散分析（１  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）により、有意性を計算した。
【０１４５】
結果
ワクチン接種の２８日前に、高用量の１０6ｐｆｕのＲＳＶ  Ａ２ウイルスにＲＳＶ血清陽性群（群２〜１０）を鼻内感染させた。第０日に、Ｆ特異的ＩｇＧ終点ＥＬＩＳＡ力価により、これらマウスのＲＳＶ血清転換を確認した。全ての血清陽性マウスが、第０日に検出可能なＦ特異的ＩｇＧを呈示し、群平均終点力価は、１２．８１〜１５．３６（平均１４．６０）であった。対照的に、対照血清陰性群は、５．６４の平均力価を有した（図１４）。血清陽性マウスのほとんどは、第０日に低いものの、検出可能な中和抗体力価を有することも判明し、平均ｌｏｇ2５０％プラーク減少力価は、３．０７〜３．８８であった。
【０１４６】
第０日に全マウスにワクチンを投与した。１００μＬにおいて２％ＳＥ中５μｇＧＬＡの最終ワクチン用量を達成するために、１０％ＳＥ中２５０μｇＧＬＡ（ＧＬＡ−ＳＥ［１０％ＳＥ中１ｍｇ／ｍＬ］を１０％ＳＥで希釈することにより調製した）の使用原液（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｔｏｃｋ）を用いた。
【０１４７】
促進されたＦ指向抗体応答をワクチン接種から１４日、２８日、４２日及び７３日後に評価し、各ワクチンコホートについて第０日のベースライン血清学読み出し情報と比較した。第１４日の合計抗Ｆ血清ＩｇＧ力価は、ｓＦワクチンを受けた全ての血清陽性マウスが、抗原用量又はＧＬＡ−ＳＥとのその製剤化とは関係なく、力価の増大に迅速に応答したことを示している（図１４）。血清ＩｇＧの４倍増大は有意とみなされる。観測された増大は、第１４日で１３〜１３７倍であり、この日は、力価が全群を通し一貫して最も高かった。ＰＢＳワクチンを受けた血清陽性マウスは、ＩｇＧ力価増大が４倍に満たなかったが、生ＲＳＶ感染で促進されたマウスは、ＩｇＧ力価の増大は４倍近かった。興味深いことに、アジュバントなしで様々な用量のＲＳＶ  ｓＦを受けた群と、様々な用量のＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥを受けた群との間で、類似の総Ｆ特異的ＩｇＧ力価が観測された。増大した抗ＦＩｇＧ力価は、これら全ての群において、第７３日の１５倍より高く、用量又はアジュバント増強の差は認められなかった（図１４）。
【０１４８】
血清ＲＳＶ中和力価を複数の時点でも評価した。第０日のＲＳＶ血清陽性マウスの各群についての平均ｌｏｇ2５０％プラーク低減力価は、３．０７〜３．８８であった（図１５）。ワクチン接種から１４日後までに、生ＲＳＶ、ＲＳＶ  ｓＦ、又はＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥのいずれかで免疫したマウスは、それらの第０日の値に対して増大した中和力価を有した（図１５）。４倍の力価増大は有意とみなされる。非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦワクチンを受けた血清陽性マウスは、ＲＳＶ中和力価の１５〜２８倍増大を示したのに対し、ＧＬＡ−ＳＥアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦワクチンを投与されたマウスは、中和力価の５３〜８５倍増大を示した。対照的に、ＰＢＳワクチンを受けた血清陽性マウスは、第１４日の中和力価の増大は２倍に満たず、生ＲＳＶによる２回目の感染を受けたマウスは、７倍の中和力価増大しか示さなかった。このことは、ＲＳＶ  ｓＦワクチンが、ＲＳＶでの再感染より、高い度合まで血清陽性マウスにおいて中和力価を増大したことを示している。各用量群について第１４日の平均ＲＳＶ中和力価は、互いの２倍以内であった（非アジュバント添加用量の場合、８．３２、７．８２、及び８．６６であり、アジュバント添加の場合は、９．３２、８．８２、及び９．４９）ことから、ＲＳＶ  ｓＦの量（０．４〜１０μｇ）は、この誘導において重要ではなかった。アジュバントの含有は、ＲＳＶ血清陽性マウスの中和抗体促進に約２倍の増強しかもたらさず、これは、適切なアジュバントなしで、ＲＳＶ  ｓＦワクチンによって中和抗体がほとんど誘導されないナイーブマウスにおいて観測されたものとは対照的である。各群について中和力価は、第７３日まで、第１４日の８０％以内に維持され、場合によっては経時的に増加する（図１５）。これは、免疫から少なくとも１０週間にわたって機能性体液性免疫が存続することを示している。
【０１４９】
血清ＩｇＡは、生きたマウスにおいて粘膜ＩｇＡより測定がしやすいため、粘膜ＩｇＡのレベルの指標を与え得る。ワクチン接種から１４日後に、血清陰性マウスは、検出限界以下という非常に低いＦ特異的ＩｇＡ力価を有したが、全ての血清陽性マウスは、検出可能なＦ特異的ＩｇＡを有した（図１６）。ＲＳＶ  ｓＦ（１０μｇ）又は３用量のいずれかのＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥでワクチン接種した血清陽性マウスは、ＰＢＳワクチンを受けた血清陽性マウスより有意に高い血清Ｆ特異的ＩｇＡ力価をもたらした。また、２回目の生ＲＳＶ  Ａ２感染で免疫促進した血清陽性マウスも、有意に高い血清Ｆ特異的ＩｇＡ力価を示した。これは、ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥワクチンが、血清陽性マウスにおいて血清ＩｇＡ力価を増大することができることを示している。
【０１５０】
第０日及び第４２日での血清Ｆ特異的抗体を、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａアイソタイプについても評価し、ワクチン接種前及び後の血清陽性マウスのＴヘルパー型均衡を決定した。Ｆ特異的ＩｇＧ１力価（Ｔｈ２型サブタイプ）及びＦ特異的ＩｇＧ２ａ（Ｔｈ１型サブタイプ）力価はいずれも、第２８日に血清陽性マウスに存在した（図１７）。ＩｇＧ２ａ力価は、ワクチン接種前の血清陽性マウスにおいて優位であり、受けたワクチン製剤とは関係なく、第４２日にワクチン接種後のその優勢を維持した（図１７）。これは、ナイーブマウスにおける以前の試験とは対照的であり、その場合、アジュバントなしで投与されたＲＳＶ  ｓＦワクチンは、主としてＩｇＧ１応答を誘導し、ＩｇＧ２ａバイアスを誘導するためには、ＧＬＡ−ＳＥアジュバントの含有が必要であった。
【０１５１】
ＲＳＶ  ｓＦワクチンが、血清陽性マウスにおいてＲＳＶ  ｓＦの既知中和抗原部位に対するポリクローナル血清抗体を促進するかどうかを決定することも調べ、競合ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、部位Ａ、Ｂ及びＣ特異的ｍＡｂと、ＲＳＶ  ｓＦ抗原上の標的エピトープの結合を阻止するその能力を測定することにより、ワクチン接種後の血清のポリクローン性を評価した。全ての試験群からの血清は、部位Ａ及び部位Ｃ抗体との強力な競合、並びに部位Ｂ抗体との検出可能な競合を呈示したが、これは、ポリクローナルＲＳＶ−Ｆ指向性応答を示すものである（図１８）。ＲＳＶ  ｓＦワクチン接種群（±ＧＬＡ−ＳＥアジュバント）の各々からの血清は、ＰＢＳ又は生ＲＳＶで促進した血清陽性マウスからの血清より、部位Ａ及び部位Ｃについての競合で優れており、自然の感染に対するＲＳＶ  ｓＦワクチンの利点を示している。興味深いことに、部位Ｂ結合についての競合は、アジュバント及びＲＳＶ  ｓＦ用量依存的であった。２μｇ又は１０μｇの用量で、ＧＬＡ−ＳＥアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦを受けたマウスからの血清は、その対応する非アジュバント添加群からの血清と比較して、有意に増強された部位Ｂ競合応答を有する（図１８）。
【０１５２】
全身性ＣＤ４Ｔ細胞免疫応答を２つの個別の時点で評価した。ワクチン接種から１０日後に、各群の３匹のマウスから脾細胞を採取し、Ｂｉｏｐｌｅｘによるサイトカインの測定のために、ＲＳＶ  ｓＦタンパク質で７２時間再刺激した。血清陰性群は、試験した集団全体を通してＦ特異的サイトカイン応答をもたらさなかったが、全ての血清陽性群において、第１０日にＦ特異的ＩＦＮγ（Ｔｈ１７サイトカイン）が検出された（図１９）。応答の規模は、非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦを受けた血清陽性マウスと比較して、ＧＬＡ−ＳＥアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦ群の方が高いことがわかった。ＩＦＮγに比べ、ＩＬ−５（Ｔｈ２サイトカイン）、ＩＬ−１０（Ｔｈ０サイトカイン）、及びＩＬ−１７（Ｔｈ１７サイトカイン）は、非常に低レベルでしか検出されなかったが、これは、血清陽性マウスが、使用したワクチンとは関係なく、Ｔｈ１バイアス応答を提示することを示している。ＣＤ４Ｔ免疫応答は、第７３日、すなわちＲＳＶでのリコール感染から４日後にも評価した。各群の３〜５匹から脾細胞を採取し、Ｂｉｏｐｌｅｘによりサイトカインを測定した。やはり強力なＴｈ１応答を示すＦ特異的ＩＦＮγが、観測された優位なサイトカインであり、典型的Ｔｈ０、Ｔｈ２、又はＴｈ１７サイトカインのレベルは低かった（図１９）。このデータは、これらの血清陽性マウスで観測されたＦ特異的ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ力価と一致しており、ナイーブマウスにおいて認められたもの（非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦワクチンがＴｈ２型免疫応答を誘導した）とは対照的であった。これらのデータは、血清陽性マウスモデルにおいて、初回ＲＳＶ感染により形成されたＴｈ１バイアスが、ＲＳＶ−Ｆワクチンに対し将来増大する応答の特徴を知らせることを示唆している。このＴｈ１バイアスは、このモデルが、過去にＲＳＶ感染の経験を有する健康な成人を十分に表し得るが、ＲＳＶについて血清陽性である免疫老化高齢者集団では、ワクチン応答を呈示しない可能性があることを示唆している。
【０１５３】
同じ２つの時点で、ＣＤ８Ｔ細胞免疫応答を各群のマウスにおいて評価した。ワクチン接種から１０日後、ＣＤ８Ｆペプチド再刺激を用いたＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴにより、群当たり３匹を評価した。プラセボ群には、Ｆ特異的ＣＤ８応答がなかった（０ＳＦＵ／百万個の細胞）のに対し、血清陽性マウスは、６９ＳＦＵ／百万の低い検出可能なＣＤ８応答を有した（図２０）。対照的に、非アジュバント添加ｓＦを投与した群は、用量依存的Ｆ特異的ＣＤ８ＩＦＮγ応答を有した（平均７２〜２２４ＳＦＵ／百万）が、ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥを投与した群は、規模がより大きな用量依存的Ｆ特異的ＣＤ８ＩＦＮγ応答を有した（平均１７１〜１６９９ＳＦＵ／百万）。アジュバントを添加したＲＳＶ  ｓＦの最も高い用量で、観測されたＣＤ８応答の規模（１６９９ＳＦＵ／百万）は、アジュバントを含まない同じ用量より有意に高く（２２４ＳＦＵ／百万）、生ＲＳＶ追加群で観測されたもの（１４５ＳＦＵ／百万）よりはるかに高かった（図２０）。このＣＤ８ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答は、最も高い測定値であった。さらに、全ての群を細胞内フローサイトメトリーにより、ＩＦＮγ、ＴＮＦα（エフェクターサイトカイン）、及びＩＬ−２（生存サイトカイン）の発現を特徴とする多機能性ＣＤ８Ｔ細胞応答について評価した。多機能性ＣＤ８Ｔ細胞の存在はウイルス防御と関連しており、このことは、これらの細胞が、ウイルス感染細胞のクリアランスに関して、より有効であり得ることを示唆している（Ｂｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ，ＨＩＶ  ｎｏｎｐｒｏｇｒｅｓｓｏｒｓ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｍａｉｎｔａｉｎ  ｈｉｇｈｌｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＨＩＶ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ．２００６；１０７（１２）：４７８１−９）。ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答から予測されたように、有意なＧＬＡ−ＳＥアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦ用量依存的ＣＤ８応答が観測された。１０μｇのアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦで追加免疫した血清陽性マウスは、全ＣＤ８Ｔ細胞の０．４９％の頻度で三重陽性多機能性抗ＦＣＤ８Ｔ細胞を示した。全ＣＤ８Ｔ細胞の０．６２％が、二重ＩＦＮγ及びＴＮＦαＦ特異的活性を示した。これは、血清陰性プラセボ群（０．０１〜０．０２％）におけるＦペプチド再刺激応答の平均頻度の３倍に基づく閾値レベル（０．０３〜０．０６％）を優に超えるものであった（図２０）。検出可能な三重（０．１３％）及び二重（０．２７％）陽性多機能性Ｔ特異的ＣＤ８Ｔ細胞は、ＧＬＡ−ＳＥでアジュバント添加した２μｇのＲＳＶ  ｓＦを投与した群でも検出された（図２０）。
【０１５４】
ＣＤ８応答の存続を評価するために、第７３日（ＲＳＶ攻撃から４日後）に、リコールＣＤ８Ｔ細胞免疫応答について両方法により３〜５匹のマウス／群を評価した。ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴでは、ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥを投与した群において用量依存的Ｆ特異的ＣＤ８ＩＦＮγ応答（平均１４２〜５９８ＳＦＵ／百万）を検出した（図２１）。これは、対応する非アジュバント添加ｓＦ群で観測されたものより高く、この群も、用量依存的ＣＤ８ＩＦＮγ応答（６２〜２４３ＳＦＵ／百万）を示した。比較すると、血清陰性対照は、ＩＦＮγ応答を全く示さず（−４ＳＦＵ／百万）、ＰＢＳ（３５ＳＦＵ／百万）、又は生ＲＳＶ  Ａ２（６１ＳＦＵ／百万）で追加免疫すると、より低い応答が認められた。細胞内フローサイトメトリーでは、アジュバント添加した最も高い用量のＲＳＶ  ｓＦを受けた群で強力な多機能性Ｆ特異的ＣＤ８Ｔ細胞を検出した（０．２５％三重陽性及び０．２５％二重陽性）（図２１）。応答の規模は、ワクチン接種から１０日後に検出されたものよりやや低かったが、データは、ワクチン接種から１０週間後にＦ特異的ＣＤ８応答をリコールすることができることを示している。
【０１５５】
ＲＳＶ攻撃後の局所肺環境における免疫応答のＴｈ１特徴の存続を確認するために、ＩＦＮγ、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、及びエオタキシンなどのサイトカインのレベルを、第７３日の肺ホモジネートを用いて評価した（図２２）。これらのサイトカイン読み出し情報により、マクロファージ、好酸球、Ｂ細胞及びＣＤ４又はＣＤ８Ｔ細胞などの肺に動員されたあらゆる免疫細胞によって形成されるサイトカインのスナップショットが得られる。リコールＲＳＶ攻撃後、血清陽性免疫マウスからの肺ホモジネートに検出された主なサイトカインは、ＩＦＮγであり、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、又はＩＬ−１７はほとんど検出されなかった。ナイーブマウスにおける肺免疫疾患に関連する好酸球の化学走性を誘導することができるサイトカインであるエオタキシンは、ＲＳＶ感染に対する最初の応答を高めた血清陰性ナイーブマウスと類似したレベルで、全ての群において発現された。これらのデータは、ワクチン接種した血清陽性マウスにおける肺免疫応答が、全身性免疫応答の特徴を表し、好酸球増加の危険性は低いままでＴｈ１バイアス状態を維持することを示している。
【０１５６】
結論
この試験から、０．４〜１０μｇの抗原用量で、非アジュバント添加又はＧＬＡ−ＳＥアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦのいずれかを用いた１回の接種により、ＲＳＶ血清陽性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫の血清学的読み出しを有意に高められることが判明した。中和抗体をＲＳＶマイクロ中和アッセイにより検出したところ、ワクチン接種から１０週間存続する。ＲＳＶ  ｓＦに対する細胞性ＣＤ８免疫は、抗原用量依存的であり、ＧＬＡ−ＳＥアジュバントを必要とすることが判明し、ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥの最大（１０μｇ）用量で、血清陽性マウスにおける多機能性ＣＤ８Ｔ細胞の数が有意に増大した。これは、ワクチン接種から１０日以内と、ワクチン接種から１０週間後のリコール攻撃後の両方で観測された。Ｔｈ１バイアス化アジュバントＧＬＡ−ＳＥは、この血清陽性モデルにおけるＣＤ８Ｔ細胞、血清ＲＳＶ−Ｆ部位Ｂ特異的抗体、血清Ｆ特異的ＩｇＡ力価の増強に重要な役割を果たすことが判明した。この血清陽性モデルにおいて、血清中和力価又は血清Ｆ特異的ＩｇＧを増大する上でのアジュバントの利点は認められなかった。Ｆ特異的ＣＤ４Ｔ細胞ＩＦＮγ応答、及び肺サイトカインレベル評価から、上記の血清陽性マウスモデルが、初回ＲＳＶ感染によりＴｈ１バイアス化されたことがわかったが、このことは、上記モデルが、ＲＳＶ血清陽性の健康な成人におけるＲＳＶワクチン接種応答のモデルとなり得ることを示唆している。高齢のヒトなどのＴｈ２バイアスＲＳＶ血清陽性宿主において、ＧＬＡ−ＳＥは、ナイーブマウスで観測されたように、Ｔｈ２ヘルパー応答をマウスＴｈ１様応答に転換することにより、さらなる利点を提供し得る。
【０１５７】
１０μｇ用量のＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥを投与した血清陽性マウスにおいて増大した中和抗体及び増強された細胞性免疫の観測結果を確認するために、第２の試験を１×血清陽性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて実施した。この試験では、以下を目標とする：１）１０μｇ用量のＲＳＶ  ｓＦ単独で認められる観測を繰り返すこと、２）前記応答を、ＧＬＡ（１又は２．５μｇ）のみと一緒に投与した１０μｇ用量のＲＳＶｓＦで達成されたものと比較すること、３）前記応答を、ＳＥ（０．５又は２％）のみと一緒に投与した１０μｇ用量のＲＳＶ  ｓＦで達成されたものと比較すること、４）前記応答を、より低用量のＧＬＡ−ＳＥ（１若しくは２．５μｇ＋０．５％ＳＥ又は１若しくは２．５μｇ＋２％ＳＥ）と一緒に投与した１０μｇ用量のＲＳＶ  ｓＦで達成されたものと比較すること、５）前記応答を、ミョウバンと一緒に投与した１０μｇ用量のＲＳＶ  ｓＦで達成されたものと比較すること。
【０１５８】
マウスを９匹ずつ１３群に分け、そのうち１２群（対照を除く全て）は、初回ワクチン接種の２８日前に高用量１０6ｐｆｕのＲＳＶ  Ａ２ウイルスを用いた単回鼻内感染により血清陽性にした。これらの動物におけるＲＳＶ血清転換を、ワクチン接種の日に血清Ｆ特異的ＩｇＧ終点ＥＬＩＳＡ力価により確認した（図２３）。マウスには、前回と同様に、１００μｌのＰＢＳ又は製剤化ＲＳＶ  ｓＦワクチンで筋内接種した。ワクチン接種から２週間後に、血清Ｆ特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａを評価した。ＲＳＶ  ｓＦワクチンは、ＰＢＳワクチン接種マウスで認められたもの、並びにＲＳＶ  Ａ２での２回目の感染により達成されたものを超えてＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ力価を増大したが、投与したワクチンとは関係なく、全ての血清陽性群が、ＩｇＧ１レベルより高いＩｇＧ２ａレベルを呈示し、本来のＴｈ１バイアスであることを示した（図２４）。ワクチン接種から２週間、４週間、及び６週間後、血清ＲＳＶ中和力価を評価した。アジュバントとは関係なく、１０μｇのＲＳＶ  ｓＦを受けた群は、ＰＢＳワクチン接種１×血清陽性対照を有意に超えて増大し、互いに差はなかった（図２５）。
【０１５９】
ＲＳＶ  ｓＦワクチン接種１×血清陽性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、アジュバントの選択は、中和抗体応答に影響を与えなかったが、達成された細胞性応答には影響を与えた。ワクチン接種から１０日後に、群当たり３〜４匹の代表的マウスからの脾細胞を採取して、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ及び細胞内サイトカイン染色（ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びＩＬ−２産生多機能性細胞について）の両方により、Ｆ特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答を評価した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイでは、ｓＦ＋２％ＳＥ中１若しくは２．５μｇ用量でのＧＬＡ−ＳＥを受けた群は、ｓＦ単独又はｓＦ＋ミョウバンのいずれかを受けた群より有意に高い応答を有した（図２６Ａ）。ｓＦ又はｓＦ＋ミョウバンと比較して有意に高いＧＬＡ−ＳＥに対するこの応答は、細胞内サイトカイン染色アッセイにおいても認められた（図２６Ｂ）。さらに、細胞内サイトカイン染色アッセイでは、ＲＳＶ  ｓＦのみを投与した群と比較して、ＲＳＶ  ｓＦ＋２％ＳＥ又はＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥを（０．５％ＳＥ中１若しくは２．５μｇ）を投与した群において向上したＦ特異的ＣＤ８応答が検出された。
【０１６０】
この実験では、ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥが、１×血清陽性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦと同様に、中和力価を増大する能力を確認すると共に、血清陽性マウスにおいてＦ特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答を促進する上で、他のアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦワクチンと比較して、ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥが最適製剤であることが判明した。
【０１６１】
実施例２ｂ：高度に血清陽性のＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＧＬＡ−ＳＥアジュバント添加ＲＳＶ−サブユニットワクチン
この実施例では、血清陽性ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて、ＲＳＶ  ｓＦ用量がどのように応答に影響を与えるか、及びアジュバントがどのように応答を調節するかを評価した。ＲＳＶ再感染は生涯を通して起こり、比較的高レベルの抗ＲＳＶ中和抗体にもかかわらず、高齢者（≧６５歳）は、ＲＳＶに再暴露されると、健康な成人より、重篤なＲＳＶ関連疾患に罹患しやすい（Ｍｕｌｌｏｏｌｙ  ｅｔ  ａｌ，；Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｄａｔａｌｉｎｋ  Ａｄｕｌｔ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ−  ａｎｄ  ＲＳＶ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚａｔｉｏｎｓ  ａｍｏｎｇ  ａｄｕｌｔｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２００７  ２５（５）：８４６−５５，Ｗａｌｓｈ  ＥＥ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ＤＲ，Ｆａｌｓｅｙ  ＡＲ．Ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｓｅｖｅｒｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｌｄｅｒｌｙ  ｐｅｒｓｏｎｓ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００４  １８９（２）：２３３−８)。高齢者におけるＲＳＶ関連疾患の重症度の増大は、部分的に、この集団における免疫老化及びＴｈ２バイアスへの転換によるものと考えられ、これは、感染後のＲＳＶの準最適排除を招き得る（Ｃｕｓｉ  ＭＧ，Ｍａｒｔｏｒｅｌｌｉ  Ｂ，Ｄｉ  Ｇｅｎｏｖａ  Ｇ，Ｔｅｒｒｏｓｉ  Ｃ，Ｃａｍｐｏｃｃｉａ  Ｇ，Ｃｏｒｒｅａｌｅ  Ｐ．Ａｇｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｍｅｍｏｒｙ  ｔｏ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ．Ｉｍｍｕｎ  Ａｇｅｉｎｇ．２０１０  Ｏｃｔ  ２０；７：１４．）。ウイルスから抽出及び精製したＲＳＶ  Ｆ又はＦ＋Ｇ＋Ｍを用いた以前の臨床試験では、一般に、これらのＲＳＶ抗原が、ミョウバンを用いて、又は用いずに既存のＲＳＶ抗体力価の程々の増大がもたらされることを明らかにしたが、こうした試験では、ＲＳＶ  ＣＭＩ応答の促進については報告されていない（Ｌａｎｇｌｅｙ  ＪＭ，Ｓａｌｅｓ  Ｖ，ＭｃＧｅｅｒ  Ａ，Ｇｕａｓｐａｒｉｎｉ  Ｒ，Ｐｒｅｄｙ  Ｇ，Ｍｅｅｋｉｓｏｎ  Ｗ，Ｌｉ  Ｍ，Ｃａｐｅｌｌａｎ  Ｊ，Ｗａｎｇ  Ｅ．Ａ  ｄｏｓｅ−ｒａｎｇｉｎｇ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ  ｓｕｂｔｙｐｅ  Ａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｗｉｔｈ  ａｎｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｄｕｌｔｓ＞ｏｒ＝６５  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ａｇｅ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２００９  ２７（４２）：５９１３−９．Ｆａｌｓｅｙ  ＡＲ，Ｗａｌｓｈ  ＥＥ，Ｃａｐｅｌｌａｎ  Ｊ，Ｇｒａｖｅｎｓｔｅｉｎ  Ｓ，Ｚａｍｂｏｎ  Ｍ，Ｙａｕ  Ｅ，Ｇｏｒｓｅ  ＧＪ，Ｅｄｅｌｍａｎ  Ｒ，Ｈａｙｄｅｎ  ＦＧ，ＭｃＥｌｈａｎｅｙ  ＪＥ，Ｎｅｕｚｉｌ  ＫＭ，Ｎｉｃｈｏｌ  ＫＬ，Ｓｉｍｏｅｓ  ＥＡ，Ｗｒｉｇｈｔ  ＰＦ，Ｓａｌｅｓ  ＶＭ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ２  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ（ｒｓｖ）ｖａｃｃｉｎｅｓ−−ｎｏｎａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｌｕｍ−−ｇｉｖｅｎ  ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔｌｙ  ｗｉｔｈ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｏ  ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ  ｅｌｄｅｒｌｙ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．２００８  Ｎｏｖ  １；１９８（９）：１３１７−２６．Ｆａｌｓｅｙ  ＡＲ，Ｗａｌｓｈ  ＥＥ．Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅ（ＰＦＰ−２）ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｅｌｄｅｒｌｙ．Ｖａｃｃｉｎｅ．１９９７  Ｊｕｌ；１５（１０）：１１３０−２．Ｆａｌｓｅｙ  ＡＲ，Ｗａｌｓｈ  ＥＥ．Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅ（ＰＦＰ−２）ｉｎ  ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ  ａｄｕｌｔｓ  ｏｖｅｒ  ａｇｅ  ６０．Ｖａｃｃｉｎｅ．１９９６  Ｓｅｐ；１４（１３）：１２１４−８．）。
【０１６２】
高齢のヒトのＲＳＶ血清状態に近づけるために、高度にＲＳＶ血清陽性のＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ＲＳＶ  ｓＦ単独、ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥ又はＲＳＶ  ｓＦ＋ミョウバンでの免疫により、ＲＳＶ特異的抗体及びＣＭＩ応答の促進を実施した。ＲＳＶ免疫応答の促進に加えて、この試験では、概してアジュバントが既存のＴｈバイアス宿主免疫応答を改変する能力に関するケーススタディとして、ＲＳＶ  ｓＦ＋ミョウバン（Ｔｈ２バイアス化アジュバント）を用いた免疫により、野生型ＲＳＶ感染により樹立された既存の免疫応答を改変できるのかどうかも決定する。前述した以前のマウス試験は、アフィニティ精製ＲＳＶ  ｓＦを用い、ＲＳＶナイーブマウスで実施された。対照的に、本試験で用いるＲＳＶ  ｓＦは、典型的なクロマトグラフィーにより精製した。ＲＳＶ  ｓＦは、１０００倍の範囲（０．０５〜５０μｇ）で、単独又はＧＬＡ−ＳＥ若しくはミョウバンと一緒に製剤化したものを投与して、事前に生ＲＳＶに２回感染させたＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＲＳＶ免疫応答を促進するその能力を評価した。
【０１６３】
材料及び方法
試験設計
６〜８週齢の１０３匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を１３の群に分けた。第１群は７匹で、第２〜１３群は８匹のマウスを有した。第０日及び第３５日に、麻酔後、１００μＬ中１×１０6プラーク形成単位（ＰＦＵ）の生ＲＳＶを第１〜１２群に鼻内（ＩＮ）経路で投与した。第１３群はＲＳＶに暴露しなかった。第５６日に、第１〜１１群をイソフルランで麻酔した後、プラセボ（ＰＢＳ）又はワクチン品目を用いて、筋内（ＩＭ）経路で免疫した。ワクチン品目は、合計１００μＬで製剤化し、後ろ足にそれぞれ５０μＬずつ投与した。第１２群をイソフルランで麻酔した後、１００μＬ中１×１０6ＰＦＵの生ＲＳＶを用いてＩＮ経路で免疫した。第８４日に、各群からのマウスのサブセットを麻酔した後、１×１０6ＰＦＵの生ＲＳＶを用いて鼻内経路で攻撃した。第０、２８、５６及び８４試験日に、眼窩後から採取した血液から血清を取得して、白血球から分離した後、評価するまで−２０℃で保存した。第６７日、すなわち免疫から１１日後、又は第８８日、すなわち攻撃から４日後に、各群の４匹からＴ細胞アッセイのために脾臓を採取した。攻撃から４日後に、個々の肺ホモジネート中の肺サイトカインをルミネックス（ｌｕｍｉｎｅｘ）アッセイ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）により定量した。
【０１６４】
ＲＳＶ  ｓＦ及びアジュバント
ＲＳＶ  Ａ２Ｆ配列のアミノ酸１〜５２４を含むＲＳＶ  Ｆタンパク質を安定ＣＨＯクローンから発現させて、典型的クロマトグラフィー法により精製した。ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、＞９０％純粋であったが、これを動物の免疫及びＥＬＩＳＡアッセイでの塗布の両方に使用した。ミョウバン（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ，Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＮＪ）は、ワクチン用量当たり１００μｇで使用し、室温で３０分の混合により、タンパク質に吸着させた。水性製剤中のＧＬＡを用量当たり５μｇで使用した。ＳＥは、２％濃度で使用した。ＧＬＡ−ＳＥは、２％ＳＥ中５μｇの用量で使用した。ワクチン製剤は全て、投与の２時間以内に調製した。
【０１６５】
血清ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａＥＬＩＳＡ
標準的ＥＬＩＳＡ技術を用いて、ＲＳＶ−Ｆ特異的ＩｇＧ抗体を評価した。高結合９６ウェルプレートを精製ＲＳＶ  ｓＦで塗布した。ブロック後、血清の連続希釈物をプレートに添加した。モノクローナル抗体１３３１Ｈ（Ｂｅｅｌｅｒ  ＪＡ，ｖａｎ  Ｗｙｋｅ  Ｃｏｅｌｉｎｇｈ  Ｋ．Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ：ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｕｐｏｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９８９；６３（７）：２９４１−５０）を用いて、全ＩｇＧ及びＩｇＧ１定量のための標準曲線を作成し、モノクローナル抗体１３０８を用いて、ＩｇＧ２ａ定量のための標準曲線を作成した。ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＧ１、又はＩｇＧ２ａ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を用いて、結合抗体を検出し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて展開させた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダにより４５０ｎｍで吸光度を測定した後、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて分析した。力価は、１３３１Ｈ又は１３０８同等物のμｇ／ｍＬとして記録する。
【０１６６】
ＲＳＶマイクロ中和アッセイ（ナイーブ試験と同じ）
表示の時点で熱不活性化したマウス血清のＲＳＶ中和抗体力価を、以前記載されているようにＧＦＰ標識ＲＳＶ  Ａ２マイクロ中和アッセイを用いて測定した（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ＤＩ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｈａｓｅ  １  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｌｉｖｅ，ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ３  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｊ  ３１：１０９−１１４）。手短には、密集Ｖｅｒｏ細胞単層を５００ＰＦＵのウイルス単独、又は連続希釈した血清サンプルと事前に混合したウイルスに感染させた後、３３℃及び５％ＣＯ2で２２時間インキュベートした。プレートを洗浄して遊離ウイルスを除去し、ＩｓｏＣｙｔｅイメージスキャナー（Ｂｌｕｅｓｈｉｆｔ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、ＧＦＰ蛍光ウイルスフォーカスを計数した。中和力価は、４−パラメータ曲線当てはめアルゴリズムを用いて計算されるように、蛍光フォーカスの数の５０％低減（ＥＣ50力価）をもたらした細胞希釈率のｌｏｇ2逆数として表した。
【０１６７】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（ナイーブ試験と同じ）
表示の採取時点で、１００ミクロンナイロンフィルタ（Ｆａｌｃｏｎ）を通して、個々の脾臓を破砕した。赤血球欠失脾細胞の生存能をＶｉＣｅｌｌにより決定し、使用する前に、５％ＦＣＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン、２ｍＭＬ−グルタミン及び０．１％β−メルカプトエタノール（ｃＲＰＭＩ−５）を添加したＲＰＭＩ１６４０中に、１０×１０6生存細胞／ｍＬで細胞を懸濁させた。
【０１６８】
マウスＥＬＩＳＰＯＴアッセイのために、Ｍａｂｔｅｃｈ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）マウスＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴキットを使用した。事前に塗布したマイクロプレートをｃＲＰＭＩ−５でブロックしてから、細胞及び刺激物質を添加した。ブロックした塗布済みプレート上で２５０，０００細胞／ウェルを培地単独、ＭＨＣ  ＩＩ（Ｉ−Ｅd）結合ペプチドＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥＬＳＮＩＫＥ（配列番号１０）及びＶＳＶＬＴＳＫＶＬＤＬＫＮＹＩ（配列番号１１）（Ｏｌｓｏｎ  ＭＲ，Ｖａｒｇａ  ＳＭ（２００８）Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ：ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ７：１２３９−１２５５）（各５μｇ／ｍＬ）、ＭＨＣ  Ｉ（Ｈ２−Ｋd）結合ペプチド、ＫＹＫＮＡＶＴＥＬ（配列番号１２）（Ｏｌｓｏｎ  ＭＲ（２００８）、又は正の対照としてＣｏｎＡ（５μｇ／ｍＬ）と一緒に、３回反復して３６〜４８時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗い流し、キットのプロトコルに従い、プレートを付属のビオチン化抗マウスＩＦＮγと一緒にインキュベートしてから、ＳＡ−ＨＲＰを実施し、付属のＴＭＢ試薬を用いて、スポットを検出した。ＣＴＬ  ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔリーダ及びソフトウエア（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ）を用いて、プレートの読み出し及び分析を行った。
【０１６９】
サイトカインプロファイリング（ナイーブ試験と同じ）
ＩＦＮγ、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７及びエオタキシン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を含有するように設計されたマウスサイトカイン／ケモカインマルチプレックスキットを用いて、肺ホモジネートを評価した。肺ホモジネートは、使用前に遠心分離により清澄化した。アッセイを製造者の指示に従って実施し、プレートをＬｕｍｉｎｅｘリーダ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で分析した。
【０１７０】
これらの実験から、高及び低ベースライン血清陽性度を有する血清陽性マウスにおいて、ＲＳＶ−ｓＦは、用いたアジュバント又は投与したＲＳＶ−ｓＦの用量とは関係なく、中和抗体応答を促進することが明らかにされた。しかし、ＧＬＡ−ＳＥと一緒にＲＳＶ−ｓＦを製剤化すると、血清陽性マウスにおいて最も強力なＣＤ８Ｔ細胞応答が誘発された。さらに、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＴｈ２応答を誘発したＲＳＶ  ｓＦ単独又はＲＳＶ  ｓＦ＋ミョウバンなどの製剤では、ＲＳＶに対する事前暴露により誘発された血清陽性動物のＴｈ１バイアスは変化しなかった。血清陽性動物において、ＲＳＶ−ｓＦの投与により、使用したアジュバント又は投与したＲＳＶ−ｓＦの用量とは関係なく、中和抗体応答が増大する。
【０１７１】
図２７は、血清陽性マウスにおいてＲＳＶ−ｓＦが中和抗体を増大することを示すグラフである。力価が増加する規模は、初期中和力価が低い動物ほど顕著であった。力価は、最大中和力価まで増加したとも考えられ、これは、ワクチン接種から７２日間維持された。やはり、増加はアジュバントとは独立であった。
【０１７２】
図２８Ａ及びＢは、エオタキシン及びＩＬ−１３が、ＲＳＶＡ２攻撃後に誘導されないことを示すグラフである。ランテスは、アジュバントの存在に影響される唯一のケモカイン／サイトカインである。
【０１７３】
図２９Ａ及びＢは、ＲＳＶ−ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥが、ＣＤ８Ｔ細胞応答を促進することと、ＣＤ８Ｔ細胞応答が用量依存的であることを示すグラフである。５０μｇのＲＳＶ−ｓＦで最大応答が達成されるかどうかは不明である。しかし、ＲＳＶ−ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥを含む製剤により、多機能性応答に関して最大規模を有するＣＤ８Ｔ細胞応答が得られた。
【０１７４】
結果
ＢＡＬＢ／ｃマウスの気道は、ＲＳＶ複製に関して半透過性でしかないため、生ＲＳＶの単回鼻内投与後に高レベルの血清中和力価を達成するのは難しい。ＲＳＶに複数回再感染したヒトに観測された血清中和力価のレベルにさらに近似させるために、第０及び３５日に、マウスを１×１０6ＰＦＵのＲＳＶに２回暴露した。予測通り、単回投与後に、全てのＲＳＶ感染マウスにおいて、低いものの、検出可能な中和力価が見られた（図３８）。平均ＲＳＶ中和力価は、４．２ｌｏｇ2であった。２回目の投与後、平均ＲＳＶ中和力価において、８．３ｌｏｇ2まで約１６倍の増大が見られた。しかし、個々のマウスの力価は、３．３〜１２ｌｏｇ2と広範囲であった。
【０１７５】
各種ＲＳＶ  ｓＦ製剤が、これらのＲＳＶ血清陽性マウスにおいて中和力価を増大する能力を決定するために、第５６日にマウスにワクチン接種し、７０及び８４日（ワクチン接種からそれぞれ１４及び２８日後）に採血した。図２は、追加免疫から１４日後の群の力価を示す。図３９は、試験期間にわたる中和力価の上昇を示す。データは、全てのＲＳＶ  ｓＦワクチンが、アジュバントの存在又はアジュバントの種類とは関係なく、免疫から１４日後に、８．３ｌｏｇ2の群平均から９．３ｌｏｇ2及び１１．９ｌｏｇ2まで中和力価を増大する能力があったことを示している。従って、ＲＳＶ  血清陽性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ＲＳＶ中和力価は、極めて少量の非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦにより、５０μｇという最も高いアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦ用量で達成された力価のわずか約６倍低いレベルまで増大することができた。
【０１７６】
ＲＳＶ感染前の第０日及び２回のＲＳＶ投与後の第５６日に、総ＲＳＶ  Ｆ特異的ＩｇＧ力価を測定した。図４１は、ワクチン品目での免疫前に生ＲＳＶＡ２への２回の連続暴露後、高レベルの抗Ｆ特異的ＩｇＧ力価が認められたことを示す。図４２は、追加免疫から１４日後の群の力価を示す。図４３は、試験期間にわたるＩｇＧ力価の上昇を示す。中和力価とは異なり、わずかな用量応答が見られる。０．０５μｇ用量のＲＳＶ  ｓＦは、５０μｇのＲＳＶ  ｓＦより統計的に低い増大をもたらし、ＧＬＡ−ＳＥを含む０．０５μｇのＲＳＶ  ｓＦは、ＧＬＡ−ＳＥを含む５０μｇのＲＳＶ  ｓＦより統計的に低い増大をもたらした。さらに、ＧＬＡ−ＳＥ又はミョウバンの存在も、応答を増強する。５及び５０μｇＲＳＶ  ｓＦ群のいずれも、ＧＬＡ−ＳＥ又はミョウバンと混合した対応用量より統計的に低いレベルまでＲＳＶ  ｓＦ特異的ＩｇＧ力価を増大した。
【０１７７】
第８４日、すなわち免疫から２４日後に、抗ＲＳＶ  ｓＦ特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ血清力価を測定した（図４４）。ナイーブマウスにおける以前の試験では、生ＲＳＶ  Ａ２での感染によってＴｈ１バイアス応答が得られたが、ＲＳＶ  ｓＦ単独又はミョウバンに吸着させたＲＳＶ  ｓＦによる免疫では、Ｔｈ２バイアス応答がもたらされた。対照的に、本試験では、Ｔｈ１バイアス血清陽性ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＲＳＶ  ｓＦ単独又はミョウバンに吸着させたＲＳＶ  ｓＦによる免疫後、Ｔｈ１バイアスを維持した。従って、事前に確立された宿主Ｔｈ１スキューイングは、ＲＳＶ  ｓＦ又はＲＳＶ  ｓＦ＋ミョウバンを用いた免疫によって改変されなかった。
【０１７８】
ＲＳＶ  ｓＦ単独、ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥ、ＲＳＶ  ｓＦ＋ミョウバン又はＲＳＶでの一次感染を用いた、ＲＳＶナイーブマウスでの事前の免疫試験では、攻撃から４日後に高いＩＦＮγレベルが得られた。さらに、ＲＳＶ  ｓＦ単独、又はミョウバンに吸着させたＲＳＶ  ｓＦによって、ＲＳＶ攻撃後にＩＬ−５応答の誘導が起こったが、これは、これらの２つの群についてＴｈ２バイアス応答を示すものである。本試験では、第８８日、すなわち１×１０6ＰＦＵのＲＳＶ  Ａ２による攻撃から４日後に、肺においてＩＦＮγ及びＩＬ−５力価を測定した（図４５）。ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスとは異なり、ＲＳＶ  ｓＦ又はミョウバンに吸着させたＲＳＶ  ｓＦを用いた免疫化によって、マウスは、ＲＳＶ攻撃に応答してＩＬ−５を誘導しなかったが、これは、血液中で測定したＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａの比（Ｔｈ１バイアスを示す）と一致するものであった。従って、ＲＳＶ感染ＢＡＬＢ／ｃマウスは、以前のＲＳＶ感染によって樹立されたＴｈ１バイアス免疫応答を維持し、ＲＳＶ  ｓＦ単独又はＲＳＶ  ｓＦ＋ミョウバンでの免疫後に同じＴｈ応答を呈示し続けると考えられる。
【０１７９】
ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスモデルにおいて、攻撃から４日に、好酸球動員の代替免疫マーカとしてエオタキシン及びＩＬ−１３を測定したが、これは、ワクチン安全性の有望な指標である。これら事前の試験は、ＲＳＶ  ｓＦ単独又はＲＳＶ  ｓＦ＋ミョウバンの両方を用いた免疫によって、マウスは、ＲＳＶ攻撃後にエオタキシン及びＩＬ−１３応答を取得したが、これは、一次ＲＳＶ  Ａ２感染により誘導されるものより高かった。対照的に、ＲＳＶ  ｓＦ単独又はＲＳＶ  ｓＦ＋ミョウバンで免疫したＲＳＶ血清陽性マウスは、ＲＳＶ攻撃後に、ＲＳＶに感染させたコホートを含む他のいずれの群より高いエオタキシン又はＩＬ−１３レベルを誘導しなかった（図４６）。
【０１８０】
ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａデータ及び肺サイトカインデータのいずれも、ワクチン品目の製剤が、血清陽性マウスにおける既存のＴｈ１バイアスに影響しないことを示唆している。ＲＳＶ  ｓＦ用量又はアジュバントの存在のいずれかによる影響がこれと異なることが判明した唯一の肺サイトカインは、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）であった（図４６）。アジュバントを添加した全てのＲＳＶ  ｓＦワクチン品目が、ＲＳＶ  Ａ２暴露後にランテス（ＲＡＮＴＥＳ）の発現を誘導したが、ＲＳＶ  ｓＦ単独で免疫した群では、誘導されたランテス（ＲＡＮＴＥＳ）のレベルは、ＲＳＶ  ｓＦの量の増加と共に上昇した。
【０１８１】
Ｆ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の全身性リコール応答を免疫から１１日後（第６７日）及び攻撃から４日後（第８８日）の両方で測定して、異なるワクチン品目によって誘発された応答の規模を比較した。ＣＤ８特異的ＲＳＶ  Ｆペプチドを用いて、脾細胞を３６時間刺激した後、ＥＬＩＳＰＯＴによりＩＦＮγ分泌細胞を検出した（図４７）。ＲＳＶ  ｓＦ単独、ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥ及びＲＳＶ  ｓＦ＋ミョウバンの場合、ＲＳＶ  ｓＦの用量が増加すると、Ｆ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の平均数も増加した。しかし、ＲＳＶ  ｓＦ単独又はＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥ若しくはミョウバンによって誘発された応答にほとんど差がなかった血清学の結果とは異なり、ＧＬＡ−ＳＥは、ＲＳＶ血清陽性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＣＭＩ応答を促進する上で優れたアジュバントとしてはっきりと区別された。
【０１８２】
結果
典型的クロマトグラフィーにより精製したＲＳＶ  ｓＦを用いて、本試験では、生ＲＳＶで２回連続的に感染させた高度にＲＳＶ血清陽性のＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、血清学的応答に対するＲＳＶ  ｓＦ用量（０．０５〜５０μｇのＲＳＶ  ｓＦ）の作用を特性決定した。比較的高いＲＳＶ  ＦＩｇＧ及び中和ＲＳＶ力価を呈示したＲＳＶ血清陽性マウスにおいて、アジュバントを含む、又は含まない１０００倍範囲のＲＳＶ  ｓＦ用量は、中和力価の増大にわずかな作用しかもたらさなかった。アジュバントを含む、又は含まない０．０５μｇの用量は、中和力価の増大に関して５０μｇの用量とほとんど同等に有効であった。試験した全てのワクチン品目が、中和力価を２〜５倍増大した。総ＲＳＶ  Ｆ特異的ＩｇＧ力価については、ＧＬＡ−ＳＥ又はミョウバンのいずれかを含むＲＳＶの  ｓＦより高い用量が、０．０５μｇのＲＳＶ単独より高い増大を促進した。しかし、この差は、約５．７倍の増強という控えめなものであり、このことは、血清抗体の促進が、ＲＳＶ血清陽性マウスにおいて、比較的少量のＲＳＶ  ｓＦ単独  Ｆで達成できることをさらに示唆している。
【０１８３】
生ＲＳＶ  Ａ２への暴露前に、ＢＡＬＢ／ｃマウスでは、Ｔｈ１バイアス応答を誘発することから、既知のＴｈ２スキューイングワクチン品目（例えば、非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦ又はＲＳＶ  ｓＦ＋ミョウバン）が、Ｔｈ１バイアスＲＳＶ応答をＴｈ２バイアス応答に転換することができるかどうかを決定するのは興味深いことであった。血液中のＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａの比、並びに攻撃から４日後の肺サイトカインプロフィールのいずれも、ＲＳＶ  ｓＦ単独又はＲＳＶ  ｓＦ＋ミョウバンでの免疫が、以前のＲＳＶ注射により確立された既存のＴｈ免疫プロフィールを変化させないことを示唆している。強力なＴｈ１バイアス化ワクチンであるＲＳＶ  Ｆ＋ＧＬＡ／ＳＥが、Ｔｈ２バイアスＲＳＶ血清陽性高齢者集団において生み出す免疫応答のタイプは、まだ評価されていない。
【０１８４】
本試験はまた、ＲＳＶ  ｓＦ用量並びにアジュバントを、それらがＲＳＶ血清陽性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＤＣ８Ｔ細胞応答を促進する能力についても特性決定した。ナイーブマウスにおいて認められたものと同様に、ＲＳＶ  ｓＦの用量が大きいほど、小さいＲＳＶ  ｓＦ用量より大きな規模の増大を促進した。さらに、ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥは、同じ非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦ又はミョウバン吸着ＲＳＶ  ｓＦと比較して、最も高い増大をもたらした。
【０１８５】
実施例２ｃ：血清陽性コットンラットにおけるＧＬＡ−ＳＥでアジュバント添加したＲＳＶ−Ｆサブユニットワクチン
この試験では、血清陽性コットンラットモデルを用いて、実施例２ｂで用いたものと類似のプロトコルに従い、ＲＳＶ  ｓＦ用量がどのように応答に影響するか、及びアジュバントが、応答を調節するかどうかを評価した。
【０１８６】
手短には、第０日に、９６匹のコットンラットに１ｅ６ｐｆｕのＲＳＶＡ２を鼻内経路で投与した。第２８日に、下記組成物のうちの１つで、ラットを筋内免疫した：リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）；ＰＢＳ＋ＧＬＡ−ＳＥ；０．１μｇ、１．０μｇ若しくは１０μｇのＲＳＶ−ｓＦ；ＧＬＡ−ＳＥと製剤化した０．１μｇ、１．０μｇ若しくは１０μｇのＲＳＶ−ｓＦ；１０μｇのＲＳＶ−ｓＦ＋ＧＬＡ；１０μｇのＲＳＶ−ｓＦ＋ＳＥ；１０μｇのＲＳＶ−ｓＦ＋ミョウバン；又は生ＲＳＶ  Ａ２。ラットを第１４日、第２８日、第３８日、第４９日及び第５６日に採血した。次いで、第６７日に、１×１０６  ＰＦＵ  ＲＳＶ  Ａ２でラットを攻撃し、第７１日に脾臓／肺を採取した。別の試験では、第０日に、１×１０６  ＰＦＵ  ＲＳＶ  Ａ２を鼻内経路でラットに投与した。第２８日に、下記化合物のうちの１つで、ラットを筋内免疫した：ＰＢＳ；ＰＢＳ＋ＧＬＡ−ＳＥ；１０μｇのＲＳＶ−ｓＦ；ＧＬＡ−ＳＥと製剤化した１０μｇのＲＳＶ−ｓＦ；１０μｇのＲＳＶ−ｓＦ＋ＧＬＡ；１０μｇのＲＳＶ−ｓＦ＋ＳＥ；１０μｇのＲＳＶ−ｓＦ＋ミョウバン；又は生ＲＳＶ  Ａ２。第２８日及び第３８日にラットを採血した。
【０１８７】
ＲＳＶ  Ａ２Ｆ配列のアミノ酸１〜５２４を含むＲＳＶ  Ｆタンパク質を安定ＣＨＯクローンから発現させて、典型的クロマトグラフィー法により精製した。ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、＞９０％純粋であったが、これをラットの免疫及びＥＬＩＳＡアッセイでの塗布の両方に使用した。ミョウバン（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ，Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＮＪ）は、ワクチン用量当たり１００μｇで使用し、室温で３０分の混合により、タンパク質に吸着させた。水性製剤中のＧＬＡを用量当たり５μｇで使用した。ＳＥは、２％濃度で使用した。ＧＬＡ−ＳＥは、２％ＳＥ中５μｇの用量で使用した。ワクチン製剤は全て、投与の２時間以内に調製した。
【０１８８】
標準的ＥＬＩＳＡ技術を用いて、ＲＳＶ−Ｆ特異的ＩｇＧ抗体を評価した。高結合９６ウェルプレートに精製ＲＳＶ  ｓＦを塗布した。ブロック後、血清の連続希釈物をプレートに添加した。ＨＲＰ結合ニワトリ抗コットンラットＩｇＧ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ  Ｌａｂ）を用いて、結合抗体を検出し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて展開させた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダにより４５０ｎｍで吸光度を測定した後、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて分析した。力価は、１：１０００血清希釈での吸光度として、又はブランクウェルの平均値の２倍のカットオフを用いたｌｏｇ２終点力価として記録した。部位特異的抗体を競合ＥＬＩＳＡアッセイにより定量した。手短には、高結合９６ウェルプレートに精製ＲＳＶ  ｓＦを塗布した。ブロック後、血清の連続希釈物を、部位Ａ、部位Ｂ又は部位Ｃを認識した定濃度のビオチン化抗体と混合した（Ｂｅｅｌｅｒ  ＪＡ，ｖａｎ  Ｗｙｋｅ  Ｃｏｅｌｉｎｇｈ  Ｋ．Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ：ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｕｐｏｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９８９；６３（７）：２９４１−５０）。代表的希釈率の個々の血清についての競合度（％）を計算した（１００×［１−｛血清ＯＤ／ｍＡｂＯＤ平均｝］）。ナイーブマウス試験について既述したように、マイクロ中和力価を決定した。
【０１８９】
結果
免疫前のベースライン抗体力価を決定するために、ＲＳＶ感染から２８日後、また免疫後の抗体力価の増大を測定するために、第３８日、第４９日及び第５６日に、総ＲＳＶ−Ｆ特異的ＩｇＧ力価のレベルを測定した。第２８日に、生ＲＳＶ  Ａ２への１回の暴露後に有意なレベルのＲＳＶ  Ｆ特異的ＩｇＧが認められた。第３８日、第４９日及び第５６日についてのデータから、ＲＳＶ  ｓＦでワクチン接種した全ての群が、用量とは関係なく、ＲＳＶ  ｓＦ特異的ＩｇＧ力価を増大しており、増大は、アジュバントの存在によって有意に増強されなかったことが明らかである（図４８）。第３８日及び第４９日に、１：１０００希釈率の平均Ａ４５０  ＯＤ値は全て、プラセボ免疫群及び生ＲＳＶ  Ａ２への２回目の暴露を受けた群と比較してこれらの群で有意に高かった。第５６日に、アジュバントを含まない０．１μｇのＲＳＶ  ｓＦ用量のみが、血清陽性／プラセボ群及び生ＲＳＶ  Ａ２への２回目の暴露を受けた群と、統計的に相違しなかった。第３８及び第４９日の傾向は、１００倍のＲＳＶ  ｓＦ（１０μｇ対０．１μｇ）によって、ＲＳＶ  ｓＦ±ＧＬＡ−ＳＥについて最も高いＲＳＶ  ｓＦ用量でわずかに高い力価が得られることを示唆している。全体としてこれらのデータは、ＲＳＶ  ｓＦの用量又はアジュバントの存在のいずれも、ＲＳＶ  ｓＦ特異的血清力価の増大に大きく影響しないことを示し、これは、血清陽性ＢＡＬＢ／ｃマウスで得られた同様の結論を支持するものである。
【０１９０】
ベースライン中和力価を決定するために第２８日に、また免疫後の抗体力価の増大を測定するために、第３８日、第４９日及び第５６日に、ＲＳＶ中和抗体力価のレベルを測定した。第２８日に、各血清陽性群の平均値は、少なくとも１０ｌｏｇ2であった（図４９）。コットンラットは、ＲＳＶ複製に対して、より許容性が高いため、ＲＳＶでの１回の感染後の中和力価によって、ＢＡＬＢ／ｃマウスで観測されたものよりかなり高い平均力価が得られる。ＢＡＬＢ／ｃマウスの場合、１×１０6ＰＦＵの生ＲＳＶ  Ａ２での１回感染後の平均中和力価は、４ｌｏｇ2〜６ｌｏｇ2の範囲である。
【０１９１】
第４９日、すなわち免疫から２１日後の中和力価は、力価が、１１．４〜１３．１の平均値まで増大したことを示す（図４９）。ＲＳＶ  ｓＦ（１０μｇ）コホートを除く全て群が、血清陽性／プラセボコホートより有意に高い力価まで増大した。非アジュバント添加群のいずれか、及びＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥ群のいずれかの間で、統計的差はなかったが、これは、０．１μｇから１０μｇまでのＲＳＶの用量の増加が、免疫後の平均中和力価に影響をもたらさなかったことを示している。
【０１９２】
中和力価の増大の規模を評価するために、免疫から１０日、２１日及び２８日後の各ラットについてベースラインの増加倍数を計算した（図５０）。アジュバントを含むか、又は含まないＲＳＶ  ｓＦで免疫した全ての群が、血清陽性／プラセボワクチン接種群より高い幾何平均増加を有したが、データが広範囲なため、１μｇのＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥ及び１０μｇのＲＳＶ  ｓＦ＋ミョウバンで免疫した群のみが、免疫から１０日後、血清陽性／プラセボワクチン接種群より有意に高かった。免疫から２１日後、１０μｇのＲＳＶ  ｓＦ＋ミョウバン群のみが、プラセボより有意に高かった。ＲＳＶ  ｓＦ（１０μｇ）、ＲＳＶ  ｓＦ（１μｇ）＋ＧＬＡ−ＳＥ、ＲＳＶ  ｓＦ（１０μｇ）＋ＧＬＡ−ＳＥ、ＲＳＶ  ｓＦ（１０μｇ）＋ＧＬＡ及びＲＳＶ  ｓＦ（１０μｇ）＋ミョウバンは、４倍以上の幾何平均増加を示した。中和力価におけるこの低から中程度の増大は、恐らく、１０ｌｏｇ2という高いベースラインによるものであろう。この力価は、コットンラットにおいて最大限の達成可能なＲＳＶ力価に近い。これらのデータ全体は、アジュバントを含むか、又は含まないＲＳＶ  ｓＦの用量が、中和力価の増大にわずかな影響しかもたらさないことを示し、これは、総ＲＳＶ  ｓＦ特異的ＩｇＧの結果を支持するものである。わずかな増大は、恐らくベースライン力価が、コットンラットにおいて最大限の達成可能なＲＳＶ力価に近かったことによるものであろう。同様の結論は、ＢＡＬＢ／ｃ血清陽性マウスモデルにおいても得られた。
【０１９３】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質に特異的な中和モノクローナル抗体（Ｍａｂ）を作製し、次の３つの主要部位にマッピングした：部位Ａ、部位Ｂ及び部位Ｃ（Ｂｅｅｌｅｒ  ＪＡ，ｖａｎ  Ｗｙｋｅ  Ｃｏｅｌｉｎｇｈ  Ｋ．Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ：ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｕｐｏｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９８９；６３（７）：２９４１−５０）。免疫後のコットンラットにおいて部位Ａ、部位Ｂ又は部位Ｃに対して産生された抗体の相対量を測定するために、１つの部位Ａ  Ｍａｂ（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標））１つの部位Ｂ（１１１２）及び１つの部位Ｃ  Ｍａｂ（１３３１Ｈ）を各々、競合ＥＬＩＳＡで使用した（図５１）。これらの平均値は、ＲＳＶ  ｓＦ単独及びアジュバントのいずれかを含むＲＳＶ  ｓＦの両方が、プラセボ又はＲＳＶ  Ａ２への２回目の暴露より良好に、特異的中和部位に対する抗体応答を促進することを示唆している。このアッセイでは、ＧＬＡ−ＳＥを含むか、又は含まない０．１、１．０及び１０μｇのＲＳＶ  ｓＦコホートの間の差は、有意に相違しないが、これらの傾向は、より高い用量のＲＳＶ  ｓＦ及びアジュバントの存在が、部位特異的抗体応答を促進する上で有益となりうることを示唆している。
【０１９４】
２回目の血清陽性コットンラット試験において、免疫前のベースライン抗体力価を決定するために、ＲＳＶ感染から２８日後に、また、免疫後の抗体力価の増大を測定するために、第３８日に、総ＲＳＶ  Ｆ特異的ＩｇＧ力価のレベルを測定した。第２８日に、生ＲＳＶ  Ａ２に対する１回の暴露後、有意なレベルのＲＳＶ  Ｆ特異的ＩｇＧが認められた（図４８）。全ての群が、１３．４〜１４．７ｌｏｇ2の平均力価に到達する。第３８日のデータは、アジュバントとは関係なく、ＲＳＶ  ｓＦでワクチン接種した全ての群が、プラセボ（ＰＢＳ＋ＧＬＡ−ＳＥ）又は２回目の用量のＲＳＶ  Ａ２より有意に高いレベルの力価までＲＳＶ  ｓＦ特異的ＩｇＧを増大した。
【０１９５】
血清ＩｇＧ力価の増大の規模を評価するために、免疫から１０日後の各ラットについてベースラインの増加倍数を計算した（図４９）。アジュバントを含むか、又は含まないＲＳＶ  ｓＦで免疫した全ての群が、４倍超の幾何平均増加を有し、１２．０〜２５．０であった。ナイーブ及び血清陽性／プラセボ群、並びに２回目用量のＲＳＶ  Ａ２を受けた群などの対照群は、血清力価に増大がなく、算出された増加倍数は２に満たなかった。
【０１９６】
ベースライン中和力価を決定するために、第２８日に、また、免疫後の中和抗体力価の増大を測定するために、第３８日に、ＲＳＶ中和抗体力価のレベルを測定した。各血清陽性群の第２８日の平均値は、少なくとも９ｌｏｇ2であり、９．０〜９．５ｌｏｇ2の範囲であった（図５０）。前の血清陽性コットンラット試験では、第２８日の平均中和力価は、１０．１〜１１．７であった。コットンラットは、ＲＳＶ複製に対して、より許容性が高いため、ＲＳＶでの１回の感染後の中和力価によって、ＢＡＬＢ／ｃマウスで観測されたものよりかなり高い平均力価が得られる。ＢＡＬＢ／ｃマウスの場合、１×１０6ＰＦＵの生ＲＳＶ  Ａ２による１回の感染後の平均中和力価は、４ｌｏｇ2〜６ｌｏｇ2の範囲である。
【０１９７】
第３８日、すなわち免疫から１０日後の中和力価は、力価が、１２．３〜１３．９の平均値まで増大したことを示す（図５０）。前の血清陽性コットンラット試験でも、同様の免疫力価が観測された。全てのＲＳＶ  ｓＦ群が、プラセボ群より有意に高い力価まで促進された。血清ＩｇＧ力価のデータとは異なり、生ＲＳＶ  Ａ２群も、プラセボ群より有意に高い中和力価の増大を有した。さらに、ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥ、ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ、及びＲＳＶ  ｓＦ＋ミョウバン群は、ＲＳＶ  Ａ２より高い力価まで促進された。中和力価の増大の規模を評価するために、免疫から１０日後の各ラットについてベースラインの増加倍数を計算した（図５１）。アジュバントを含むか、又は含まないＲＳＶ  ｓＦで免疫した全ての群が、８．１〜２１．９の平均増加倍数を有し、血清ＩｇＧ力価で認められた増加倍数と類似する範囲であった。前の血清陽性コットンラット試験とは違い、中和力価の増大は、出発ベースライン力価が、１０ｌｏｇ2に対し９ｌｏｇ2と低く、また、各群のばらつきもこの試験の方が小さかったため、観測しやすかった。これらのデータ全体は、平均ＲＳＶ  ｓＦ＋アジュバントの中和力価が、ＲＳＶ  ｓＦ単独よりわずか２〜３倍高かったことから、アジュバントの存在は、中和力価の増大にわずかな影響しかもたらさないことを示している。これらのデータはまた、総ＲＳＶ  ｓＦ特異的ＩｇＧデータを支持している。血清陽性ＢＡＬＢ／ｃマウス試験でも同様の結論が得られている。
【０１９８】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質に特異的な中和モノクローナル抗体（Ｍａｂ）を作製し、次の３つの主要部位にマッピングした：部位Ａ、部位Ｂ及び部位Ｃ（Ｂｅｅｌｅｒ  ＪＡ，ｖａｎ  Ｗｙｋｅ  Ｃｏｅｌｉｎｇｈ  Ｋ．Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ：ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｕｐｏｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９８９；６３（７）：２９４１−５０）。免疫後のコットンラットにおいて部位Ａ、部位Ｂ又は部位Ｃに対して産生された抗体の相対量を測定するために、１つの部位Ａ  Ｍａｂ（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標））１つの部位Ｂ（１１１２）及び１つの部位Ｃ  Ｍａｂ（１３３１Ｈ）を各々、競合ＥＬＩＳＡで使用した（図５１）。ＲＳＶ  ｓＦ単独及びアジュバントのいずれかを含むＲＳＶ  ｓＦの両方が、プラセボ又はＲＳＶ  Ａ２への２回目の暴露より良好に、上記の特異的中和部位に対し抗体応答を促進した。唯一の例外は、ＲＳＶ  ｓＦ＋ＳＥであり、この場合、部位Ｂ力価の増大が、２回目の用量のＲＳＶ  Ａ２より有意に高かったが、プラセボ群より統計的に高くなかった。興味深いことに、２回目の用量のＲＳＶ  Ａ２が、プラセボ群より有意に高く力価を増大した唯一の部位は、部位Ｃであった。
【０１９９】
結論
典型的に精製したＲＳＶ  ｓＦを用いて、この試験では、ＲＳＶ血清陽性コットンラットにおける血清学的応答に対する１００倍の範囲（０．１〜１０μｇのＲＳＶ  ｓＦ）にわたるＲＳＶ  ｓＦ用量の作用並びにアジュバントの作用を特性決定した。ナイーブ動物モデルとは違い、ＲＳＶ  ｓＦ用量は、アジュバント添加又は非添加のいずれで投与しても、総ＩｇＧ、部位特異的応答又は総中和力価の増大の規模に対する作用は、最小から皆無であった。同様に、最も高いＲＳＶ  ｓＦ用量で、アジュバントのいずれが存在しても、応答の規模をそれ以上高めることに対する作用は、ほとんどないから皆無であった。
【０２００】
実施例３：ナイーブスプラーグ・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）ラットにおけるＲＳＶ−ｓＦ免疫原性
本試験は、薬剤及びワクチン開発において毒性試験に常用的に用いられるモデルであるスプラーグ・ドーリーラットにおいて、ＲＳＶ−ｓＦワクチン製剤の免疫原性を評価した。この試験の目標は、以下の通りである：（Ａ）非ワクチン接種スプラーグ・ドーリーラットが、肺及び鼻においてＲＳＶ  Ａ２複製を支持することを確認し、ピークＲＳＶ複製の日を明らかにすること；（Ｂ）２．５μｇ／２％ＳＥのＧＬＡ−ＳＥを含む１０μｇ又は１００μｇのＲＳＶ  ｓＦを投与したとき、ナイーブスプラーグ・ドーリーラットにおけるＦ特異的体液性、細胞性、及び防御性免疫応答のレベルを定量すること；（Ｃ）ＲＳＶ  ｓＦの用量が、ナイーブスプラーグ・ドーリーラットにおけるＲＳＶ−ｓＦ誘導の体液性、細胞性、及び防御性免疫応答のレベルに影響を与えるかどうかを決定すること；並びに（Ｄ）ＧＬＡ−ＳＥ活性が、ナイーブスプラーグ・ドーリーラットにおける体液性、細胞性、及び防御性免疫応答を誘導するのに必要かどうかを明らかにすること。
【０２０１】
鼻内接種後の鼻及び肺におけるＲＳＶ  Ａ２のウイルス複製をこの動物モデルで明らかにした。ＲＳＶ  ｓＦタンパク質を安定にトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞から生産して、カラム精製した。第０日及び第２２日に、非アジュバント添加又は２．５μｇ／２％用量のＧＬＡ−ＳＥでアジュバント添加した１０μｇ若しくは１００μｇのＲＳＶ  ｓＦを、雌スプラーグ・ドーリーラットに筋内投与し、全てのラット（ｎ＝４〜６／群）においてワクチン接種から１４、２２及び４２日後に、血清学的抗Ｆ抗体応答及びＲＳＶ中和抗体応答を測定した。全てのラット（ｎ＝３〜４／群）において、第４６日、すなわちＲＳＶ攻撃から４日後に、Ｆ特異的Ｔ細胞応答を測定した。攻撃から４日後に肺及び鼻からのＲＳＶのクリアランスにより、ＲＳＶ攻撃後の局所防御免疫を明らかにした。この試験から、ＲＳＶ−Ｆ特異的細胞性免疫応答が、アジュバント添加及び非添加の抗原の用量の両方によって誘導されたが、ＲＳＶ−Ｆ特異的細胞性免疫応答は、抗原及びアジュバント依存的であったことが判明した。スプラーグ・ドーリーラットにおいてＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥワクチン候補により誘導された体液性及び細胞性免疫応答は、肺及び鼻の両方で、ＲＳＶ攻撃からの完全な防御をもたらす。
【０２０２】
ワクチン組成物は、筋内注射による投与のために、グルコピラノシルリピドＡ／安定エマルジョン（ＧＬＡ−ＳＥ）をアジュバント添加した精製ＲＳＶ可溶性Ｆ（ｓＦ）タンパク質（Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を含有した。組換えＲＳＶ  ｓＦタンパク質を安定なクローンチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株から作製した。典型的なカラム精製方法を用いて、本試験のためにＲＳＶ  ｓＦを精製した。
【０２０３】
理想的な毒性試験動物種は、（ｉ）ワクチン抗原及びアジュバントに対し、全ての重要な免疫学的応答で応答し、（ｉｉ）ワクチン標的病原体に対して感受性であり、しかも（ｉｉｉ）十分なヒト用量の送達に適合するものである。毒性学モデルは、Ｆ特異的体液性免疫応答、Ｆ特異的Ｔ細胞応答を呈示すると共に、非ワクチン接種状態ではＲＳＶ感染に対して許容性であるが、いったんワクチン接種されたら、ＲＳＶ攻撃から防御されるものでなければならない。スプラーグ・ドーリーラットは、最大５００μＬを筋内投与することができる標準的毒性試験種である。この試験では、ナイーブスプラーグ・ドーリーラットにおいてＲＳＶ  Ａ２株の複製を確認し、ＲＳＶ−ｓＦが、ＲＳＶ攻撃から防御する体液性及び細胞性免疫を誘導し、従って、ＲＳＶワクチン候補を評価するために好適な毒性試験モデルの全ての基準を満たすことをみいだした。
【０２０４】
ＲＳＶ  Ａ２複製を確認し、ナイーブラットにおいてＲＳＶ  Ａ２感染後のピークウイルス力価の日を決定するために、最初の試験を実施した。５コホートのＲＳＶナイーブ雌ＳＤラットを、２×１０6ｐｆｕのＲＳＶ  Ａ２に鼻内感染させた。感染から１、４、６、８、及び１４日後、群当たり５匹の安楽死させたラットから肺及び鼻を個別に採取し、同じ日に均質化した後、プラークアッセイによりＲＳＶについて力価測定した。この試験から、ピークウイルス複製の日が、ＲＳＶ感染から４日後であることが判明した。この試験では、それ以外のアッセイは実施しなかった。
【０２０５】
続く試験では、ＲＳＶ−ＳＦのプライム−ブーストレジメン後の免疫原性及び防御を評価した。４０匹のナイーブ雌スプラーグ・ドーリーラットを、コホート当たり５〜６匹の指定ワクチンコホートに分けた。手短には、試験群に、アジュバントなしのＲＳＶ  ｓＦ（１匹当たり１０μｇ若しくは１００μｇ）又はＧＬＡ−ＳＥ（２％ＳＥ中２．５μｇ）を含むＲＳＶ  ｓＦ（１匹当たり１０μｇ若しくは１００μｇ）を投与した。負の対照群にプラセボ（ＰＢＳバッファー）又はＲＳＶ  ｓＦなしのアジュバントＧＬＡ−ＳＥ（２％ＳＥ中２．５μｇ）を投与した。正の対照群には、２×１０6ｐｆｕの生ＲＳＶ  Ａ２を鼻内接種した。第１〜６群には、第０日及び第２２日に、５００μＬの指定ワクチン品目をＩＭ接種し、第７群には、第０日にのみ、２００μＬのＲＳＶ  Ａ２ウイルスをＩＮ接種した。第４２日に、全てのラットを２×１０6ｐｆｕの生ＲＳＶ  Ａ２ウイルスでＩＮ攻撃した。試験１から決定したピークウイルス複製の日である第４６日、すなわち攻撃から４日後にラットを安楽死させた。肺（ホルマリン固定した１肺葉を除く）及び鼻を均質化した後、ウイルス力価のために定量した。
【０２０６】
接種後のラットの直接観察、及び試験期間中毎週３回ラットの体重を追跡することにより、アジュバント添加ワクチン製剤の反応原性を評価した（データは示していない）。
【０２０７】
免疫から６時間後、全てのラットについて第２２日及び第４２日に、また群当たり３匹のサブセットについては第１４日に、ワクチン接種に対する血清学的応答を評価した。ラットをイソフルランで軽度に麻酔した後、眼窩内採血した。血清を分離し、−２０℃で保存し、試験のために解凍した。免疫から６時間後に得られた血清を、多重ＥＬＩＳＡにより、サイトカイン力価について評価した。総抗Ｆ  ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ終点希釈力価について、第１４、２２、及び４２日からの血清を測定した。第４２日の血清を、ＥＬＩＳＡ終点希釈力価により、ＩｇＧ、ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧ２ｂ抗Ｆ応答の特異的寄与について評価した。ＲＳＶ  Ａ２−ＧＦＰマイクロ中和アッセイにより、第２２及び４２日に、血清ＲＳＶ中和力価を決定した。
【０２０８】
ワクチン接種に対する全身性細胞免疫応答を、第４６日、すなわちＲＳＶ攻撃から４日後に全ての利用可能なラットにおいて評価した。群の各々について、個別の脾細胞サンプルを調製した。ＲＳＶ  ｓＦを用いた３６〜４８時間の再刺激後にＩＦＮγ分泌細胞のＥＬＩＳＰＯＴ数により、Ｔ細胞読み出しを評価した。有意性は、ｐ＜０．０５の有意性カットオフを用いたテューキー（Ｔｕｋｅｙ）又はボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）ポストテストのいずれかと共に、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ一元配置分散分析（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を用いて計算した。
【０２０９】
５００μＬ用量中に要望される最終量の抗原及びアジュバントを達成するように、ＩＭ投与用の試験品目を製剤化した。添加の順序は以下の通りである：ＰＢＳを最初に添加し、次にＧＬＡ−ＳＥアジュバント（使用する場合）を１：３最終希釈で添加後、ＲＳＶ  ｓＦ抗原（使用する場合）を１：５００最終希釈（１０μｇ用量の場合）又は１：５０最終希釈（１００μｇ用量の場合）のいずれかで添加する。製剤化した試験品目を３０秒間ボルテックスすることにより混合した後、動物に投与するまで最大１５時間４℃で保存した。保存した試験品目は、動物への投与のためにＡＣＦスタッフへの引き渡し前に、ボルテックスにより完全に混合した。
【０２１０】
ＩＮ接種及び攻撃用の生ＲＳＶ  Ａ２は、動物への投与の１時間未満前に調製した。ＲＳＶ  Ａ２アリコートを氷上で解凍した。２００μＬ中２×１０6ｐｆｕの用量の場合、１．６６×１０7ｐｆｕ／ｍＬの１２０．４μＬウイルス原液を７９．６μＬのＯｐｔｉｍｅｍ及び１×ＳＰで希釈した。平均３００μＬを調製し、動物への接種のためにＡＣＦスタッフに引き渡した。
【０２１１】
残りのワクチン製剤は、抗ＦｍＡｂ（パリビズマブ）を用いたウェスタンブロット分析に付すことにより、負の対照におけるＲＳＶ  ｓＦの欠失と、第３及び５群並びに第４及び６群における等量のＲＳＶ  ｓＦの存在を確認した（データは示してない）。ウェスタンブロット分析により消費されなかった全ての試験品目は破棄した。
【０２１２】
論考
スプラーグ・ドーリーラットの肺及び鼻におけるＲＳＶ  Ａ２株複製の時間経過を調べる最初の試験では、２５匹のラットを第０日に２×１０6ｐｆｕのＲＳＶ  Ａ２ウイルスでＩＮ攻撃した。第１、４、６、８、及び１４日後に採取し、均質化した肺及び鼻においてＲＳＶウイルス力価を測定した。第１、４、及び６日に、全ての試験ラットにおいて、ＲＳＶウイルス複製を検出したところ、肺及び鼻の両方で第４日にピークに達した（図３０）。攻撃から４日後に、肺の平均約１０5ｐｆｕ／ｇ、及び鼻ホモジネートの約１０3.4ｐｆｕ／ｇのピークウイルス負荷を検出した。第６日までに、ウイルス力価は約半分減少した。第８日には、５匹のうち１匹だけが肺にいく分の検出可能なウイルス力価を有したが、このラットの鼻には検出可能な力価が認められなかった。従って、スプラーグ・ドーリーラットにおけるＲＳＶ  ｓＦワクチン攻撃試験の場合、肺及び鼻をＲＳＶ攻撃から４日後に採取したが、それが、ピークウイルス複製の日を呈示した。
【０２１３】
ワクチンを調製し、第０日に全てのラットに投与した。第１〜６群は、第２２日に追加（ブースタ）ワクチンを受けた。全てのワクチンは、良好な耐容性を示し、いずれの群にも注射部位の反応は報告されなかった。動物の体重を追跡し、初期出発体重からの群変化率（％）として表示した。一般に、ラットは、試験期間中急速に増量し、投与したワクチン製剤とは関係なく接種後の体重減少はなかった。しかし、次の３匹は、採血前に投与したイソフルオラン麻酔のために試験期間にわたって体重が減少した：第０日に接種から６時間後の時点で第５群から２匹、及び第１４日に第３群から１匹。
【０２１４】
ＧＬＡ−ＳＥは、マウス、モルモット、ウサギ、サル、及びヒトにおいて活性を示したが、ラットではこれまで評価されていないＴＬＲ−４刺激アジュバントである。ＴＬＲ４アゴニストのモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）含有ワクチン製剤は、ワクチン接種から最初の６時間以内にマウスの血清中に検出可能なレベルのＩＬ−６及びＭＣＰ−１を誘導することが報告されている（Ｄｉｄｉｅｒｌａｕｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ，ＡＳＯ４，ａｎ  ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｓａｌｔ−  ａｎｄ  ＴＬＲ４  ａｇｏｎｉｓｔ−ｂａｓｅｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ，ｉｎｄｕｃｅｓ  ａ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｌｏｃａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；１８３：６１８６−９７）。上記及び他の血清サイトカインは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ＧＬＡ−ＳＥ投与から６時間後までに、一貫して観測された。ＧＬＡ−ＳＥが、スプラーグ・ドーリーラットにおいて自然免疫刺激活性を有するかどうかを決定するために、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１β、及びＫＣなどのサイトカインの血清レベルを、免疫から６時間後、ビーズベースの多重ＥＬＩＳＡアッセイにより評価した。これらのサイトカインの各々について、ＧＬＡ−ＳＥ依存性血清サイトカイン応答を観測した（図３１）。血清中に検出されたこれらのサイトカインのうち最大量のものは、好中球走化性因子のＫＣ（ＣＸＣＬ１）であり、続いて、単球走化性因子ＭＣＰ−１（ＣＣＬ２）及びＭＩＰ−１α（ＣＣＬ３）並びに多能性サイトカインＩＬ−６であった。ＩＬ−１β及びＴＮＦαなどの複数の別のサイトカインも調べたが、ＧＬＡ−ＳＥによって調節され、かつアッセイベースラインを超えて検出可能であったサイトカインしか示していない。
【０２１５】
誘導されたＦ指向抗体応答をワクチン接種後の第１４日、２２日、及び４２日に評価し、各ワクチンコホートについて対照と比較した（図３２）。各時点で、ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥ群の応答は、それらの対応する非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦ群より有意に高かった。ＧＬＡ−ＳＥアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦコホートだけが、生ＲＳＶが達成したものより高い血清抗ＦＩｇＧ終点力価を生成し、第４２日には、この差は、ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥ両群について有意であった。しかし、どの時点でも、非アジュバント添加又はアジュバント添加にかかわらず、１０及び１００μｇのＲＳＶ  ｓＦにより誘導されるＩｇＧ力価に有意な差はなかった。これらの結果から、スプラーグ・ドーリーラットにおける血清抗ＦＩｇＧ力価の誘導は、１０から１００μｇまでＲＳＶの用量を増加することによって影響されないが、ＧＬＡ−ＳＥアジュバント添加により増強されたことがわかる。
【０２１６】
第４２日の血清Ｆ特異的抗体は、ワクチン接種後のＴヘルパー型均衡の指標として、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧ２ｂアイソタイプについても評価した。Ｆ特異的ＩｇＧ１力価（Ｔｈ２型サブタイプ）及びＦ特異的ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ力価（Ｔｈ１型サブタイプ）はいずれも、第４２日に、アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦワクチン又は生のＲＳＶ  ｓＦ  Ａ２を受けたラットに存在した（図３３）。ＩｇＧ２ａ力価は、生ＲＳＶ群においてＩｇＧ１力価と同等であったが、これは、Ｔｈバイアスが、ラットにおいてマウスほど明瞭に確定されていない可能性を示唆している。しかし、ＩｇＧ２ｂ力価は、生ＲＳＶ  Ａ２を受けたラットのＩｇＧ１力価より高く、これは、Ｔｈ１応答と一致している。非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦを受けたラットは、ＩｇＧ２ｂ力価より高いＩｇＧ１力価を示し、これは、Ｔｈ２応答と一致する。ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥでワクチン接種したラットは、同じ用量で非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦ群と比較して、全てのアイソタイプで高いレベルを示した。全体として、ＩｇＧ２ｂ力価の増加（約６４倍）は、ＧＬＡ−ＳＥを投与された群におけるＩｇＧ１力価の増加（約１６倍）より高かった。これは、ＧＬＡ−ＳＥが、スプラーグ・ドーリーラットにおいて、ＲＳＶ  ｓＦに対し、よりＴｈ１バイアスの免疫応答を促進すること示唆している。
【０２１７】
ＲＳＶワクチンの重要な機能性読み出し情報である、血清ＲＳＶ中和力価を第２２日（用量１から２２日後）及び第４２日（用量２から２０日後）に評価した。第２２日の免疫ラットの様々な群についてのＧＭＴ  ｌｏｇ2ＩＣ50血清中和力価は、プラセボ群の２．９６から、ｓＦ（１００μｇ）＋ＧＬＡ−ＳＥ群の９．４７の範囲であった（図３４）。非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦワクチンを投与したラットは、第２２日のプラセボと有意に変わらないＲＳＶ中和力価を示した。対照的に、第２２日の高い中和力価が、ＧＬＡ−ＳＥアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦワクチン群（ｌｏｇ2ＧＭＴ８．８９〜９．４７）及び生ＲＳＶ群（ｌｏｇ2ＧＭＴ８．１）によって達成され、これらは、負の対照群又は対応する非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦ群で観測されたものより有意に高かった。第２２日（ｌｏｇ2ＧＭＴ８．８９〜９．４７）と比較して、第４２日にＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥ群においてＲＳＶ中和力価の１０〜２０倍の増強（ｌｏｇ2ＧＭＴ１３．２５〜１２．８６）が観測されたように、中和抗体力価は、２回目用量のワクチンで増大した。同様に、第４２日時点では、ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥ免疫群は、負の対照及び対応する非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦペアの両方と比較して、有意に高い中和力価も呈示した。生ＲＳＶ群もまた、負の対照と比較して、有意に高い中和力価（ｌｏｇ2ＧＭＴ９．４１）を示した。興味深いことに、この試験において、ワクチン誘導血清中和力価に関するＲＳＶ  ｓＦ用量依存性は認められなかった。
【０２１８】
全身性Ｆ特異的Ｔ細胞免疫応答は、ＲＳＶ−ＳＦワクチンのもう一つの重要な機能性応答である。第４６日、すなわちＲＳＶ攻撃から４日後に、各群（ｎ＝４〜６）における個々のラットから脾細胞を採取した。ＲＳＶ  ｓＦタンパク質再刺激を用いて、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴにより評価した。プラセボ群、アジュバント単独群、及び非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦ群（１０及び１００μｇ）は、同等のＦ特異的応答（それぞれ、６１．０７、４７．７３、６４．００、及び８７．７８ＳＦＵ／百万個の細胞）を示した。しかし、ＧＬＡ−ＳＥアジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦ群（１０及び１００μｇ）、並びに生ＲＳＶ群は共に、プラセボ群より有意に高いＧ特異的ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答（それぞれ、２５９、３６２．６７、及び２５８．１３ＳＦＵ／百万個の細胞）を示した（図３５）。これは、ＲＳＶ−ＳＦが、スプラーグ・ドーリーラットにおいて、ＧＬＡ−ＳＥ依存的様式で、ＲＳＶ  ｓＦに対するＴ細胞応答をプライミングし得ることを示した。Ｔ細胞のサブタイプ（ＣＤ４又はＣＤ８）は、このアッセイから決定することはできなかったが、ＲＳＶ  ｓＦタンパク質などの外来抗原は、ＣＤ４応答を再刺激する可能性が高い。
【０２１９】
ＲＳＶ攻撃からの防御は、ワクチン接種に対して測定された免疫応答が、ｉｎ  ｖｉｖｏでＲＳＶ複製を中和する上で有効であることを示すものである。ワクチン接種後、全ての群を第４２日に２×１０6ｐｆｕのＲＳＶ  Ａ２ウイルスで鼻内攻撃した。第４６日（攻撃から４日後）に採取して、均質化した肺及び鼻においてＲＳＶを力価測定した。肺におけるウイルス複製は、全ての負の対照ラットで予測されたが、これは、本試験では、初期のウイルス複製経時試験ほど一貫していなかった。本試験では、５匹のプラセボラットのうち３匹と、５匹のアジュバントのみのラットのうち３匹しか攻撃後の肺に検出可能なＲＳＶを示さなかった（図３６）。鼻における複製の方が、予測した結果と一致しており、５匹のプラセボラットのうち５匹と、５匹のアジュバントのみのラットのうち４匹に検出可能なＲＳＶウイルス負荷が認められた。プラセボウイルス力価は、肺において１０2.30（平均ＬＯＤ１０0.94）及び鼻において１０2.62（平均ＬＯＤ１０0.60）であった。非臨床動物モデルにおける有意なＲＳＶ防御は、ワクチン接種及びプラセボラット間で、歴史的に≧１０2として定義されているが、この差は、プラセボラットにおける低レベルの複製によって得られたわけではない。しかし、生ＲＳＶ  Ａ２への事前の感染によって、この群における全ての攻撃ラットの上下気道におけるＲＳＶ複製が完全に阻害され、６匹中６匹が、肺又は鼻においてアッセイＬＯＤを超えるウイルス力価を示さなかった。ＲＳＶ  ｓＦ（１０μｇ）＋ＧＬＡ−ＳＥにおいても、４匹の全てが、上下気道の両方でＲＳＶ攻撃から完全に防御された。ＲＳＶ  ｓＦ（１００μｇ）＋ＧＬＡ−ＳＥワクチン接種は、６匹のうち５匹の肺及び６匹のうち４匹の鼻においてウイルス複製を阻害した。対照的に、非アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦ（１０又は１００μｇ）は、プラセボ又はＧＬＡ−ＳＥ単独でワクチン接種したラットと同じ幅のウイルス力価を示し、群当たりわずか１〜２匹が検出限界に満たない力価を有した。このデータは、スプラーグ・ドーリーラットにおけるＲＳＶ−ＳＦワクチン接種の防御効果と一致している。
【０２２０】
結論
この試験から、２％ＧＬＡ−ＳＥ中の２．５μｇを含む１０又は１００μｇのＲＳＶ  ｓＦによるプライム−ブースト接種が、ＲＳＶ攻撃からのスプラーグ・ドーリーラットを防御したＲＳＶ−Ｆ特異的体液性及び細胞性免疫を誘導することが判明した。Ｆ特異的ＩｇＧは、ＲＳＶ−ＳＦでの単回接種から１４日後という早期に検出可能であり、第４２日までにＴｈ１様（ＩｇＧ２ｂ＞ＩｇＧ１）として特性決定された。ＲＳＶ中和抗体の有意な力価が、ＲＳＶ−ＳＦでの単回接種後第２２日までに検出可能であり、これは、ＲＳＶ−ＳＦでの２回目の接種によって増大された。両方のＲＳＶ−ＳＦ免疫コホートにおいて、攻撃後にＦ特異的Ｔ細胞応答が検出された。ＲＳＶ  ｓＦの高及び低用量では、同等の体液性及び細胞性免疫応答が得られたが、ＧＬＡ−ＳＥの存在は、体液性応答を有意に増加し、これは、ＲＳＶ  ｓＦに対する細胞性応答に不可欠であった。ＧＬＡ−ＳＥは、接種から６時間後の血清中のＩＬ−６、ＫＣ、ＭＣＰ−１、及びＭＩＰ−１αなどのサイトカインの検出により立証されるように、ラットにおいて自然免疫刺激能力を有する。ワクチンに対する自然応答は、体重の減少又は注射部位反応を一切引き起こさなかった。単独で投与したＧＬＡ−ＳＥは、ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥと類似する自然免疫刺激能力を有したが、これは、ＲＳＶ特異的体液性及び細胞性応答を誘導せず、しかもＲＳＶ攻撃からの防御もしなかった。従って、スプラーグ・ドーリーラットは、ＲＳＶ−ＳＦの安全性を評価する上で好適な毒性試験動物モデルである。
【０２２１】
図３７Ａ及びＢは、様々な組成物の注射耐容性を示すグラフである。（Ａ）ワクチン接種したコットンラットの体重変化；及び（Ｂ）ワクチン接種したスプラーグ・ドーリー（ＳＤ）ラットの体重変化。ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥワクチンは、コットンラット（ＣＲ）及びスプラーグ・ドーリー（ＳＤ）ラットにおいて、許容可能な反応原性を有する。ワクチン接種後、部位応答はなく、＜５％の体重減であった。
【０２２２】
実施例４：非ヒト霊長類免疫原性データ
アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦワクチンは、非ヒト霊長類において長期持続Ｆ特異的体液性及び細胞性免疫を誘導する
カニクイザルは、毒性試験に一般に使用される非ヒト霊長類（ＮＨＰ）種であり、アジュバント添加ＲＳＶ  ｓＦ候補ワクチンに対する免疫応答に関して調べた。この非ＧＬＰ試験では、カニクイザルにおいて、筋内投与したＲＳＶワクチン候補（２％安定エマルジョン（ＳＥ）アジュバント中のＴＬＲ４アゴニストグルコピラノシルリピドＡ（ＧＬＡ）と共に製剤化した精製可溶性Ｆ（ｓＦ）タンパク質から成る）の免疫原性をｓＦタンパク質単独の場合と比較した。４匹のＮＨＰからなる第１群（第１群）は、アジュバントを含まない１００μｇのＲＳＶ  ｓＦで免疫し、４匹のサルからなる第２群（第２群）は、２％ＳＥ中の５μｇＧＬＡアジュバントと共に製剤化した１００μｇのＲＳＶ  ｓＦで免疫した。第０及び第２８にサルを免疫し、試験前の第−７日から第１６９日まで体液性及び細胞性免疫についてモニターした。続いて、第１６９日に、非アジュバント添加（第１群）又はアジュバント添加ワクチン（第２群）のいずれかでＮＨＰにそれぞれ追加免疫し、さらに１４日間（第１８３日まで）追跡して、長期記憶応答を評価した。
【０２２３】
ワクチン誘導の抗ＦＩｇＧ力価及びＲＳＶ中和抗体（Ａｂ）応答の両方に関して、血清学的応答を評価した。両群の全ての動物が、免疫前に検出限界に満たない抗ＦＩｇＧ又はＲＳＶ中和力価を有し、これらがＲＳＶ血清陰性であることを示していた。ＲＳＶ  ｓＦタンパク質ＥＬＩＳＡによって、抗ＦＩｇＧ力価を決定した。第４２日の応答のピークで、ＲＳＶ  ｓＦ単独を受けた第１群（１０．４５±２．６８ｌｏｇ２）より、ＧＬＡ−ＳＥを含むＲＳＶ  ｓＦを受けた第２群（１５．６７±０．５３ｌｏｇ２）の方が、幾何平均抗ＦＩｇＧ力価が有意に高かった（ｐ＝０．０３２）（図５７）。ＲＳＶ  ｓＦ特異的ＩｇＧ  Ａｂ力価は、両群共に時間経過により低下した（第２群で１２．８５ｌｏｇ２に、また第２群で１０．１３ｌｏｇ２に）が、検出可能な応答は、第１６９日、すなわちワクチン接種から５か月後まで依然として観測され、この時点で、追加ワクチン接種を実施した。リコールから１４日後の第１８３日に、ｓＦ単独群（幾何平均１２．５５±２．１６ｌｏｇ２）と比較して、ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥ群（幾何平均１５．８６±０．８５ｌｏｇ２）で、より高い応答がまた観測された。ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥ群の全ての動物が、第１６９日と比較して第１８３日で≧４倍のＩｇＧ力価増加を示したのに対し、ｓＦ単独群では４匹のうち２匹のみが、第１６９日と比較して第１８３日で≧４倍のＩｇＧ力価増加を示した。これらのデータから、ＧＬＡ−ＳＥがいずれも、ｓＦ単独と比較して、ｓＦに対するＩｇＧ応答を増強し、カニクイザルＮＨＰモデルにおいて、免疫に対するより均質な応答をもたらすことが明らかである。
【０２２４】
ｓＦへのＧＬＡ−ＳＥの添加により、血清ＲＳＶ中和力価も増強されたかどうかを決定するために、緑色蛍光タンパク質（ＲＳＶ  Ａ２−ＧＦＰ）を発現するように操作したＲＳＶ  Ａ２株によるＶｅｒｏ細胞の感染を中和するのに必要なｌｏｇ２ＩＣ５０血清希釈力価に関して、ＲＳＶ中和Ａｂレベルを測定した。第４２日の応答のピークで、ＲＳＶ  ｓＦ単独を受けた群（３．５２±１．１４ｌｏｇ２）と比較して、ＧＬＡ−ＳＥを含むＲＳＶ  ｓＦを受けた群（６．３６±１．４２ｌｏｇ２）の方が、幾何平均ＲＳＶ中和Ａｂ力価が有意に高かった（ｐ＝０．０２２）（図５８）。第４２日に、ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥ群における４／４匹が第−７日レベルから中和力価の４倍増大を示したが、ＲＳＶ  ｓＦ単独群では１／４匹しか中和力価の４倍増大を示さなかった。ＲＳＶ中和Ａｂ力価は、両群で時間経過と共に低下した（第１６９日に、第２群で３．６０ｌｏｇ２に、また第１群で２．９７ｌｏｇ２に）。第１６９日、すなわちワクチン接種から５か月後に、追加ワクチン接種を実施した。３回目の免疫から１４日後の第１８３日に、ｓＦ単独群（幾何平均４．４６±１．７９ｌｏｇ２）と比較して、ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥ群（幾何平均６．７０±１．０３ｌｏｇ２）で、より高い中和Ａｂ力価が観測された。これらのデータから、ｓＦへのＧＬＡ−ＳＥの添加によって、Ｆ特異的ＩｇＧ及びＲＳＶ中和Ａｂ応答の両方の規模及び持続時間のいずれも増加することがわかる。
【０２２５】
ＧＬＡ−ＳＥと共に製剤化したｓＦによる免疫が、Ｆ特異的Ｔ細胞応答を増強するかどうかを決定するために、ＲＳＶ  Ｆタンパク質配列由来の重複１５−ｍｅｒのペプチドプールで再刺激した後、ＥＬＩＳＰＯＴによりＦ特異的ＩＦＮγＴ細胞応答を測定した。第４２日の応答のピークで、ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥ群の全４匹のＮＨＰが、試験前ベースライン（第−７日）からの５０スポット形成数（ＳＦＣ）／百万ＰＢＭＣの最低増加及び第−７日からのＳＦＣ／百万ＰＢＭＣの最低４倍増加として定義される陽性応答を示したのに対し、ＲＳＶ  ｓＦ単独群の４匹のサルのうち陽性応答を示したのは０匹であった。第４２日に、ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥ群の平均応答は、３９２ＳＦＣ／百万ＰＢＭＣであり、Ｆ単独群（８ＳＦＣ／百万ＰＢＭＣ）より有意に高かった（ｐ＝０．０１９）（図５９）。ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥ群のＴ細胞の数は、時間経過と共に減少したが、１匹だけは、第１６９日まで陽性応答の定義を満たした。第１６９日、すなわちワクチン接種から５か月後に、追加ワクチン接種を実施した。３回目の免疫から１４日後の第１８３日に、応答が衰えていたｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥ群の３匹でＩＦＮγ細胞が有意に高くなったため、ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥ群では合計応答率４匹中４匹を達成した（平均２６１ＳＦＣ／百万ＰＢＭＣ）。これに比べ、ｓＦ単独群でＩＦＮγ分泌Ｆ特異的Ｔ細胞の増加を伴って応答したのは、４匹中０匹であった（平均５ＳＦＣ／百万ＰＢＭＣ）。
【０２２６】
結論として、頑健な血清抗ＦＩｇＧ応答、ＲＳＶ中和応答、及びＦ特異的ＩＦＮγＴ細胞応答が、非アジュバント添加ｓＦ単独での免疫群で観測されたものより有意に高いレベルでｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥ免疫動物において観測された。これらの応答は、２回目の免疫から２週間後にピークに達し、ワクチン接種後３〜５か月にわたって検出可能なまま維持され、この時点で３回目の免疫により、同等又はそれより高いレベルに促進された。これらの試験から、ＲＳＶ  ｓＦ＋ＧＬＡ−ＳＥのタンパク質サブユニットワクチンが、非ヒト霊長類において、ＲＳＶに対して頑健かつ長く持続する体液性及び細胞性応答を誘導することができることがわかる。
【０２２７】
参照による組み込み
特許、特許出願、論文、テキストブックなど、並びにこれらに引用される参照文献を含む、本明細書に引用した全ての参照文献は、それらがまだされていない範囲まで、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
【０２２８】
均等物
以上記載した明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするのに十分であると考えられる。以上の説明及び実施例は、本発明の好ましい実施形態を詳しく述べている。しかし、本発明は、多くの方法で実施することができ、添付の特許請求の範囲及びそのあらゆる均等物に従って解釈すべきである。
【図１Ａ−Ｂ】
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【図１Ｃ−Ｄ】
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【図１Ｅ−Ｆ】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図３Ａ−Ｄ】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図５Ａ−Ｆ】
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【図６Ａ−Ｆ】
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【図７Ａ−Ｃ】
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【図７Ｄ−Ｆ】
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【図８Ａ−Ｆ】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図１０Ａ−Ｂ】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ−Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ−Ｂ】
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【図１８Ａ−Ｃ】
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【図１９Ａ−Ｂ】
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【図２０Ａ−Ｂ】
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【図２１Ａ−Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
2016516755.tif 000037
【図２７】
2016516755.tif 000038
【図２８Ａ−Ｂ】
2016516755.tif 000039
【図２９Ａ−Ｂ】
2016516755.tif 000040
【図３０Ａ−Ｂ】
2016516755.tif 000041
【図３１Ａ−Ｂ】
2016516755.tif 000042
【図３１Ｃ−Ｄ】
2016516755.tif 000043
【図３２Ａ−Ｃ】
2016516755.tif 000044
【図３３】
2016516755.tif 000045
【図３４Ａ−Ｂ】
2016516755.tif 000046
【図３５】
2016516755.tif 000047
【図３６Ａ−Ｂ】
2016516755.tif 000048
【図３７Ａ−Ｂ】
2016516755.tif 000049
【図３８】
2016516755.tif 000050
【図３９】
2016516755.tif 000051
【図４０】
2016516755.tif 000052
【図４１】
2016516755.tif 000053
【図４２】
2016516755.tif 000054
【図４３】
2016516755.tif 000055
【図４４】
2016516755.tif 000056
【図４５Ａ】
2016516755.tif 000057
【図４５Ｂ】
2016516755.tif 000058
【図４６Ａ−Ｂ】
2016516755.tif 000059
【図４６Ｃ】
2016516755.tif 000060
【図４７Ａ−Ｂ】
2016516755.tif 000061
【図４８Ａ−Ｂ】
2016516755.tif 000062
【図４８Ｃ−Ｄ】
2016516755.tif 000063
【図４９Ａ−Ｂ】
2016516755.tif 000064
【図５０Ａ−Ｂ】
2016516755.tif 000065
【図５０Ｃ】
2016516755.tif 000066
【図５１Ａ−Ｂ】
2016516755.tif 000067
【図５１Ｃ】
2016516755.tif 000068
【図５２Ａ−Ｂ】
2016516755.tif 000069
【図５３】
2016516755.tif 000070
【図５４Ａ−Ｂ】
2016516755.tif 000071
【図５５】
2016516755.tif 000072
【図５６Ａ−Ｂ】
2016516755.tif 000073
【図５６Ｃ】
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【図５７Ａ−Ｂ】
2016516755.tif 000075
【図５８Ａ−Ｂ】
2016516755.tif 000076
【図５９Ａ−Ｂ】
2016516755.tif 000077
【配列表】
2016516755000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年10月9日(2015.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも約１μｇ及び最大約２００μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質と、脂質Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含む少なくとも約１μｇ及び最大約２０μｇのアジュバントとを含有するワクチン組成物。
【請求項２】
前記ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質が、Ｃ末端膜貫通ドメインを欠失している、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質が、細胞質尾部ドメインを欠失している、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質が、ヒト株Ａ２（配列番号２）由来のＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質のアミノ酸１〜５２４を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質が、配列番号７を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記アジュバントが、（ＴＬＲ）４アゴニストを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記アジュバントが、合成ヘキシル化リピドＡ誘導体を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記アジュバントが、グルコピラノシルリピドＡ（ＧＬＡ）を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記アジュバントが、下記式：
【化１】
2016516755.tif 000078
（式中、Ｒ1、Ｒ3、Ｒ5及びＲ6は、Ｃ11〜Ｃ20アルキルであり；Ｒ2及びＲ4は、Ｃ12〜Ｃ20アルキルである）
を有する化合物を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記アジュバントが、安定した水中油形エマルジョン中のＧＬＡ（ＧＬＡ−ＳＥ）を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
前記アジュバントが、安定化したスクアレンベースエマルジョン中のＧＬＡを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
前記アジュバントが、少なくとも約１％及び最大約５％の濃度を有する安定化水中油形エマルジョン中のＧＬＡを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
前記アジュバントが、少なくとも約５０ｎｍ及び最大約２００ｎｍの平均粒度を有する安定化水中油形エマルジョン中のＧＬＡを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
少なくとも約５μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
少なくとも約１０μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
少なくとも約２０μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
少なくとも約３０μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
少なくとも約５０μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
少なくとも約１００μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
少なくとも約２．５μｇのアジュバントを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２１】
少なくとも約５μｇのアジュバントを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２２】
約１０μｇ〜約１００μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質と、約１μｇ〜約５μｇのＧＬＡ−ＳＥとを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２３】
約１０μｇ〜約１００μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質であって、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質は、ヒト株Ａ２（配列番号２）由来のＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質のアミノ酸１〜５２４を含む、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質と、濃度約１％〜５％の安定化水中油形エマルジョン中の約１μｇ〜約５μｇのＧＬＡとを含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項２４】
薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、又はこれらの組み合わせをさらに含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２５】
非経口投与のために製剤化される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２６】
筋内投与のために製剤化される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２７】
皮下投与のために製剤化される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２８】
約５０μｌ〜約５００μｌの量を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２９】
哺乳動物において呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染症を予防する方法であって、以下：少なくとも約１μｇ及び最大約２００μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質と、前記哺乳動物においてＲＳＶ感染症を予防するのに十分な脂質Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含む少なくとも約１μｇ及び最大約２０μｇのアジュバントとを含有する、治療に有効な量のワクチン組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項３０】
哺乳動物において免疫応答を誘導する方法であって、以下：少なくとも約１μｇ及び最大約２００μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質と、前記哺乳動物において防御免疫応答を誘発するのに十分な脂質Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含む少なくとも約１μｇ及び最大約２０μｇのアジュバントとを含有する、治療に有効な量のワクチン組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項３１】
過去にＲＳＶに暴露されたことがある哺乳動物においてＴｈ１バイアス細胞性免疫応答を増強する方法であって、以下：少なくとも約１μｇ及び最大約２００μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質と、前記哺乳動物において前記Ｔｈ１バイアス細胞性免疫応答を増強するのに十分な脂質Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含む少なくとも約１μｇ及び最大約２０μｇのアジュバントとを含有する、治療に有効な量のワクチン組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項３２】
前記哺乳動物の細胞性免疫応答が、前記Ｔｈ１細胞性免疫応答及びＴｈ２細胞性免疫応答を少なくとも１．２：１の比で含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記哺乳動物の細胞性免疫応答は、ＩＦＮγが優勢である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
哺乳動物においてＴｈ２バイアス免疫応答を転換する方法であって、以下：少なくとも約１μｇ及び最大約２００μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質と、前記哺乳動物において前記Ｔｈ２バイアス免疫応答を転換するのに十分な脂質Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含む少なくとも約１μｇ及び最大約２０μｇのアジュバントとを含有する、治療に有効な量のワクチン組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項３５】
哺乳動物においてＲＳＶに対する中和抗体を誘導する方法であって、以下：少なくとも約１μｇ及び最大約２００μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質と、前記哺乳動物においてＲＳＶに対する中和抗体を誘導するのに十分な脂質Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含む少なくとも約１μｇ及び最大約２０μｇのアジュバントとを含有する、治療に有効な量のワクチン組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項３６】
前記ＲＳＶ中和抗体力価が、１０．０Ｌｏｇ2より大きい、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ワクチン組成物の投与後の前記ＲＳＶ中和抗体力価が、投与前の血清ＩｇＧ力価と比較して、少なくとも約１０倍及び最大約２００倍の血清ＩｇＧ力価を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
哺乳動物においてＲＳＶウイルス力価を低減する方法であって、以下：少なくとも約１μｇ及び最大約２００μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質と、前記哺乳動物においてＲＳＶに対する中和抗体を誘発するのに十分な脂質Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含む少なくとも約１μｇ及び最大約２０μｇのアジュバントとを含有する、治療に有効な量のワクチン組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項３９】
ＲＳＶウイルス力価が、約５０〜約１０００倍低減する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ワクチン組成物の投与後、ＲＳＶウイルス力価が、２ｌｏｇ１０ｐｆｕ／グラムを下回る、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記ワクチン組成物の投与から約１週間〜１年後に、ＲＳＶウイルス力価が、２ｌｏｇ１０ｐｆｕ／グラムを下回る、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項２９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記哺乳動物が、高齢のヒトである、請求項２９〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記哺乳動物が、少なくとも約５０歳の実年齢に達している高齢のヒトである、請求項２９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記哺乳動物が、少なくとも約５５歳の実年齢に達している高齢のヒトである、請求項２９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記哺乳動物が、少なくとも約６０歳の実年齢に達している高齢のヒトである、請求項２９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記哺乳動物が、少なくとも約６５歳の実年齢に達している高齢のヒトである、請求項２９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記哺乳動物が、ＲＳＶ血清陽性である、請求項２９〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
単一用量レジメンを含む、請求項２９〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
１回目及び２回目用量を含む２用量レジメンを含む、請求項２９〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記１回目用量から少なくとも約１週間後に前記２回目用量を投与する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記１回目用量から少なくとも約１ヵ月後に前記２回目用量を投与する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記１回目用量から少なくとも約１年後に前記２回目用量を投与する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記ワクチン組成物を非経口で投与する、請求項２９〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ワクチン組成物を筋内投与する、請求項２９〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ワクチン組成物を皮下投与する、請求項２９〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＲＳＶ可溶性タンパク質が、Ｃ末端膜貫通ドメインを欠失している、請求項２９〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＲＳＶ可溶性タンパク質が、細胞質尾部ドメインを欠失している、請求項２９〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質が、ヒト株Ａ２（配列番号２）由来のＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質のアミノ酸１〜５２４を含む、請求項２９〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質が、配列番号７を含む、請求項２９〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記アジュバントが、（ＴＬＲ）４アゴニストを含む、請求項２９〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記アジュバントが、合成ヘキシル化リピドＡ誘導体を含む、請求項２９〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記アジュバントが、グルコピラノシルリピドＡ（ＧＬＡ）を含む、請求項２９〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記アジュバントが、下記式：
【化２】
2016516755.tif 000079
（式中、Ｒ1、Ｒ3、Ｒ5及びＲ6は、Ｃ11〜Ｃ20アルキルであり；Ｒ2及びＲ4は、Ｃ12〜Ｃ20アルキルである）
を有する化合物を含む、請求項２９〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記アジュバントが、安定した水中油形エマルジョン中のＧＬＡ（ＧＬＡ−ＳＥ）を含む、請求項２９〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記アジュバントが、安定化したスクアレンベースエマルジョン中のＧＬＡを含む、請求項２９〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記アジュバントが、少なくとも約１％及び最大約５％の濃度を有する安定化水中油形エマルジョン中のＧＬＡを含む、請求項２９〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記アジュバントが、少なくとも５０ｎｍ及び最大約２００ｎｍ（１００ｎｍ）の平均粒度を有する安定化水中油形エマルジョン中のＧＬＡを含む、請求項２９〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
少なくとも約５μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む、請求項２９〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
少なくとも約１０μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む、請求項２９〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
少なくとも約２０μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む、請求項２９〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
少なくとも約３０μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む、請求項２９〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
少なくとも約５０μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む、請求項２９〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
少なくとも約１００μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含む、請求項２９〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
少なくとも約２．５μｇのアジュバントを含む、請求項２９〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
少なくとも約５μｇのアジュバントを含む、請求項２９〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
約１０μｇ〜約１００μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質と、約１μｇ〜約５μｇのＧＬＡ−ＳＥとを含む、請求項２９〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
約１０μｇ〜約１００μｇのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質であって、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質は、ヒト株Ａ２（配列番号２）由来のＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質のアミノ酸１〜５２４を含む、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質と、濃度約１％〜５％の安定化水中油形エマルジョン中の約１μｇ〜約５μｇのＧＬＡとを含む、請求項２９〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記ワクチン組成物が、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、又はこれらの組み合わせをさらに含む、請求項２９〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記ワクチン組成物が、非経口投与のために製剤化される、請求項２９〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記ワクチン組成物が、筋内投与のために製剤化される、請求項２９〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記ワクチン組成物が、皮下投与のために製剤化される、請求項２９〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記ワクチン組成物が、約５０μｌ〜約５００μｌの量を含む、請求項２９〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
2016516755.tif 000080
2016516755.tif 000081
2016516755.tif 000082