(57)【要約】  本発明は、インフルエンザＡウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）蛋白質の幹領域（ｓｔｅｍ  ｒｅｇｉｏｎ）内のエピトープに結合する２以上のインフルエンザＡウイルス中和結合分子を含む組成物であって、ｉ）Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５およびＨ９からなる群より選択される１つ以上のインフルエンザＡウイルスのサブタイプを中和させることができる第１結合分子と、ｉｉ）Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７およびＨ９からなる群より選択される１つ以上のインフルエンザＡウイルスのサブタイプを中和させることができる第２結合分子とを含む組成物を提供する。本発明の混合組成物は、系統発生グループ１および２の多重インフルエンザサブタイプの２つともを効果的に中和させ、化学的化合物とも併用して使用可能なため、インフルエンザウイルスによる疾患の予防および治療に非常に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザＡウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）蛋白質の幹領域（ｓｔｅｍ  ｒｅｇｉｏｎ）内のエピトープに結合する２以上のインフルエンザＡウイルス中和結合分子を含む組成物であって、
ｉ）Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５およびＨ９からなる群より選択される１つ以上のインフルエンザＡウイルスのサブタイプを中和させることができる第１結合分子と、
ｉｉ）Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７およびＨ９からなる群より選択される１つ以上のインフルエンザＡウイルスのサブタイプを中和させることができる第２結合分子とを含む組成物。
【請求項２】
第１結合分子のエピトープは、
ＨＡ１ポリペプチドの位置１８、３８、４０、２９１、２９２および３１８のアミノ酸残基（ｒｅｓｉｄｕｅ）を含み、
ＨＡ２ポリペプチドの位置１８、１９、２０、２１、４１、４２、４５、４８、４９、５２および５３のアミノ酸残基を含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
第２結合分子のエピトープは、
ＨＡ１ポリペプチドの位置２７８および３１８のアミノ酸残基を含み、
ＨＡ２ポリペプチドの位置３８、３９、４１、４２、４５、４８、４９、５２および５３のアミノ酸残基を含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
第２結合分子のエピトープは、ＨＡ第１単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）の前記ＨＡ１ポリペプチドおよびＨＡ２ポリペプチドの位置のアミノ酸残基を含み、
前記ＨＡ第１単量体に隣接したＨＡ第２単量体のＨＡ１ポリペプチドの位置２５、３２および３３のアミノ酸残基を追加的に含むことを特徴とする請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
第２結合分子のエピトープは、
ＨＡ２ポリペプチドの位置５８および９９のアミノ酸残基を追加的に含むことを特徴とする請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
第２結合分子のエピトープは、前記第１単量体に隣接した第２単量体のＨＡ１ポリペプチドの位置２７のアミノ酸残基を追加的に含むことを特徴とする請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
第２結合分子のエピトープは、
ＨＡ１ポリペプチドの位置５４、５５および２９１のアミノ酸残基、およびＨＡ２ポリペプチドの位置１９、２０、２１、４６、５６、５７および６０のアミノ酸残基を追加的に含むことを特徴とする請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
第２結合分子のエピトープは、前記ＨＡ第１単量体に隣接したＨＡ第２単量体のＨＡ１ポリペプチドの位置３１０、３１１および３１２のアミノ酸残基を追加的に含むことを特徴とする請求項４に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物は、ノイラミニダーゼ（ｎeｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）ポリペプチドの位置２７５のアミノ酸残基がヒスチジン（Ｈｉｓ）からチロシン（Ｔｙｒ）に置換されたＨ１Ｎ１突然変異を中和させることができることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、ノイラミニダーゼ（ｎeｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）ポリペプチドの位置２９２のアミノ酸残基がアルギニン（Ａｒｇ）からリジン（Ｌｙｓ）に置換されたＨ７Ｎ９突然変異を中和させることができることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記結合分子は、ウイルスと標的細胞の膜融合を抑制することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
第１結合分子は、１×１０−８Ｍ未満の結合親和度（ＫＤ）を有することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
第２結合分子は、１×１０−６Ｍ未満の結合親和度（ＫＤ）を有することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
第１結合分子は、Ｈ１サブタイプに２．０ｕｇ／ｍｌ以下、Ｈ２サブタイプに７．０ｕｇ／ｍｌ以下、Ｈ５サブタイプに７．０ｕｇ／ｍｌ以下、またはＨ９サブタイプに４．０ｕｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０値を有することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
第２結合分子は、Ｈ３サブタイプに４０．０ｕｇ／ｍｌ以下、Ｈ５サブタイプに２１２．０ｕｇ／ｍｌ以下、Ｈ７サブタイプに８．０ｕｇ／ｍｌ以下、またはＨ９サブタイプに８．０ｕｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０値を有することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物は、Ｈ１サブタイプに３．０ｕｇ／ｍｌ以下、Ｈ２サブタイプに１３．０ｕｇ／ｍｌ以下、Ｈ３サブタイプに７０．０ｕｇ／ｍｌ以下、Ｈ５サブタイプに９．０ｕｇ／ｍｌ以下、Ｈ７サブタイプに１４．０ｕｇ／ｍｌ以下、またはＨ９サブタイプに６．０ｕｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０値を有することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記第１結合分子は、
カバット方法（Ｋａｂａｔ  ｍｅｔｈｏｄ）に従って、
ｉ）配列番号１のＣＤＲ１領域、配列番号２のＣＤＲ２領域、および配列番号３のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号４のＣＤＲ１領域、配列番号５のＣＤＲ２領域、および配列番号６のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域とを含むポリペプチドと、
ｉｉ）配列番号７のＣＤＲ１領域、配列番号８のＣＤＲ２領域、および配列番号９のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号１０のＣＤＲ１領域、配列番号１１のＣＤＲ２領域、および配列番号１２のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域とを含むポリペプチドと、
ｉｉｉ）配列番号１３のＣＤＲ１領域、配列番号１４のＣＤＲ２領域、および配列番号１５のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号１６のＣＤＲ１領域、配列番号１７のＣＤＲ２領域、および配列番号１８のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域とを含むポリペプチドとからなる群より選択されるいずれか１つのポリペプチドを含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記第２結合分子は、
カバット方法（Ｋａｂａｔ  ｍｅｔｈｏｄ）に従って、
ｉ）配列番号１９のＣＤＲ１領域、配列番号２０のＣＤＲ２領域、および配列番号２１のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号２２のＣＤＲ１領域、配列番号２３のＣＤＲ２領域、および配列番号２４のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域とを含むポリペプチドと、
ｉｉ）配列番号２５のＣＤＲ１領域、配列番号２６のＣＤＲ２領域、および配列番号２７のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号２８のＣＤＲ１領域、配列番号２９のＣＤＲ２領域、および配列番号３０のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域とを含むポリペプチドと、
ｉｉｉ）配列番号３１のＣＤＲ１領域、配列番号３２のＣＤＲ２領域、および配列番号３３のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号３４のＣＤＲ１領域、配列番号３５のＣＤＲ２領域、および配列番号３６のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域とを含むポリペプチドと、
ｉｖ）配列番号３７のＣＤＲ１領域、配列番号３８のＣＤＲ２領域、および配列番号３９のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号４０のＣＤＲ１領域、配列番号４１のＣＤＲ２領域、および配列番号４２のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域とを含むポリペプチドとからなる群より選択されるいずれか１つのポリペプチドを含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記第１結合分子は、
配列番号４３のポリペプチド配列を含む軽鎖と、配列番号４４のポリペプチド配列を含む重鎖とを含むポリペプチドと、
配列番号４５のポリペプチド配列を含む軽鎖と、配列番号４６のポリペプチド配列を含む重鎖とを含むポリペプチドと、
配列番号４７のポリペプチド配列を含む軽鎖と、配列番号４８のポリペプチド配列を含む重鎖とを含むポリペプチドとからなる群より選択されるいずれか１つを含むポリペプチドを含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記第２結合分子は、
配列番号４９のポリペプチド配列を含む軽鎖と、配列番号５０のポリペプチド配列を含む重鎖とを含むポリペプチドと、
配列番号５１のポリペプチド配列を含む軽鎖と、配列番号５２のポリペプチド配列を含む重鎖とを含むポリペプチドと、
配列番号５３のポリペプチド配列を含む軽鎖と、配列番号５４のポリペプチド配列を含む重鎖とを含むポリペプチドと、
配列番号５５のポリペプチド配列を含む軽鎖と、配列番号５６のポリペプチド配列を含む重鎖とを含むポリペプチドとからなる群より選択されるいずれか１つを含むポリペプチドを含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記第１結合分子は、
カバット方法（Ｋａｂａｔ  ｍｅｔｈｏｄ）に従って、
配列番号７のＣＤＲ１領域、配列番号８のＣＤＲ２領域、および配列番号９のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、
配列番号１０のＣＤＲ１領域、配列番号１１のＣＤＲ２領域、および配列番号１２のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域とを含み、
前記第２結合分子は、
カバット方法（Ｋａｂａｔ  ｍｅｔｈｏｄ）に従って、
配列番号２５のＣＤＲ１領域、配列番号２６のＣＤＲ２領域、および配列番号２７のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、
配列番号２８のＣＤＲ１領域、配列番号２９のＣＤＲ２領域、および配列番号３０のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域とを含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記第１結合分子は、
配列番号４５のポリペプチド配列を含む軽鎖と、配列番号４６のポリペプチド配列を含む重鎖とを含み、
前記第２結合分子は、
配列番号５１のポリペプチド配列を含む軽鎖と、配列番号５２のポリペプチドを含む重鎖とを含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記結合分子は、抗体またはその抗原結合断片であることを特徴とする請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記抗体に抗−ウイルス薬物が追加的に付着していることを特徴とする請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物は、インフルエンザウイルス由来疾患の診断、予防または治療用であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物は、滅菌注射溶液、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）剤形、事前充填式注射（ｐｒｅ−ｆｉｌｌｅｄ  ｓｙｒｉｎｇｅ）溶液剤、経口型剤形、外用剤または坐剤であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
インフルエンザウイルスによって発生する疾患を有する対象に、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物を治療学的に有効な量で投与するステップを含むインフルエンザウイルス由来疾患の診断、予防または治療方法。
【請求項２８】
ｉ）インフルエンザウイルスによって発生する疾患を有する対象に、請求項１に記載の第１結合分子および第２結合分子を治療学的に有効な量で同時に投与するステップと、
ｉｉ）インフルエンザウイルスによって発生する疾患を有する対象に、請求項１に記載の第１結合分子を治療学的に有効な量で投与した後、後続して、前記対象に、請求項１に記載の第２結合分子を治療学的に有効な量で投与するステップと、または
ｉｉｉ）インフルエンザウイルスによって発生する疾患を有する対象に、請求項１に記載の第２結合分子を治療学的に有効な量で投与した後、後続して、前記対象に、請求項１に記載の第１結合分子を治療学的に有効な量で投与するステップとを含むインフルエンザウイルス由来疾患の診断、予防または治療方法。
【請求項２９】
抗−ウイルス薬物、ウイルス進入抑制剤またはウイルス付着抑制剤を投与するステップを追加的に含むことを特徴とする請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗−ウイルス薬物は、ノイラミニダーゼ抑制剤、ヘマグルチニン（ＨＡ）抑制剤、シアル酸抑制剤、Ｍ２イオンチャネル抑制剤またはＲＮＡポリメラーゼ抑制剤であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ノイラミニダーゼ抑制剤は、ペラミビル（Ｐｅｒａｍｉｖｉｒ）、ザナミビル（Ｚａｎａｍｉｖｉｒ）またはオセルタミビル（Ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ）であることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記Ｍ２イオンチャネル抑制剤は、アマンタジン（Ａｍａｎｔａｄｉｎｅ）またはリマンタジン（Ｒｉｍａｎｔａｄｉｎｅ）であることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＲＮＡポリメラーゼ抑制剤は、ファビピラビル（Ｆａｖｉｐｉｒａｖｉｒ）であることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
ｉ）サンプルと、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物とを接触させるステップと、
ｉｉ）前記組成物とサンプルとの反応を検出するステップとを含むインフルエンザウイルス感染有無の診断方法。
【請求項３５】
ｉ）請求項２５に記載のインフルエンザウイルス診断用組成物と、
ｉｉ）容器とを含むインフルエンザウイルス診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２以上のインフルエンザＡウイルス中和結合分子を含む組成物に関するものであって、より具体的には、インフルエンザＡウイルスに感染後回復した患者の血液から選別されたヒトＢ細胞が生産する、インフルエンザＡウイルスに対して中和活性を有する２以上のヒト単クローン抗体の混合組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは、インフルエンザウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）が呼吸器に感染して現れる病気で、冬場によく現れ、感染性が非常に高くて全年令層を対象に伝播しやすいが、特に老若年層が弱いことが知られている（Ｔｒｅａｎｏｒ  Ｊ，２００４，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３５０（３）：２１８−２０）。オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属する有外皮ウイルス（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｖｉｒｕｓ）で、８つの分節からなる陰性−極性および単一鎖（Ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｅｎｓｅ、ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ）のＲＮＡ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を誘電体として有するインフルエンザウイルスは、Ａ、ＢおよびＣグループに分類され、インフルエンザＡウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ）の場合、主要表面蛋白質であるＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）とＮＡ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）によってさらに様々なサブタイプ（サブタイプ）に分けられる。今のところ、１７種のＨＡと１０種のＮＡが知られている（Ｃｈｅｕｎｇ  ＴＫ  ａｎｄ  Ｐｏｏｎ  ＬＬ２００７，Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１１０２：１−２５；Ｔｏｎｇ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９：４２６９−４２７４）。インフルエンザウイルスは、種類によって鳥類、豚および人間に感染しうるという特性と、ＲＮＡ分節からなる遺伝体によって多様な遺伝子の組み合わせと突然変異で継続して変種ウイルスが発生する（Ｔｒｅａｎｏｒ  Ｊ，２００４．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３５０（３）：２１８−２０）。このような持続的な変異によって永久的な免疫力を得難いので、現在最も効果的と考えられる予防法は、毎年流行ると予測されるインフルエンザウイルスに対するワクチン（ｖａｃｃｉｎｅ）を接種して、特定タイプ（ｔｙｐｅ）に合わせた免疫力を毎年形成させることである。
現在毎年接種しているインフルエンザウイルスのワクチンは３価ワクチンで、ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ＡのＨ１とＨ３サブタイプのＨＡとｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂ  ｔｙｐｅのＨＡとを混合して使用している。
【０００３】
インフルエンザウイルスに対するワクチンは、一般的に卵を用いて生産されるが、これは長い時間を要する非効率的な方法である。そのため、ほぼ毎年短時間で十分な量のワクチンを生産するのに問題が発生する。このような問題を解決すべく、細胞培養（ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ）を利用したワクチンの生産方法が様々な製薬会社（ＧＳＫ、Ｂａｘｔｅｒ）で活発に行われている。また、インフルエンザウイルスの流行性感染（ｐａｎｄｅｍｉｃ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）が誘発される場合、これに対する迅速なワクチンの開発は時間的に極めて難しい。抗ウイルス剤（ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｄｒｕｇ）も、突然変異で抵抗性を有するウイルス出現の問題によって１００％信頼することができない。
【０００４】
このような問題を補うために、インフルエンザウイルスに対する抗体の使用および開発が行われてきており、近年活発に進んでいる（Ｔｈｒｏｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ，２００８，ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ３（ｅ３９４２）；Ｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｎａｔｕｒｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．１６（２６５−２７３）；Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ，２００７，ＰｌｏＳ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ４（ｅ１７８）；Ｗｒａｍｍｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０８（１８１−１９３）；Ｃｏｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｓｃｉｅｎｃｅ３３３（８５０−８５６））。
【０００５】
回復した患者の血液生産物は、多様なウイルスに感染した患者の治療に用いられ、流行性インフルエンザ感染（ｐａｎｄｅｍｉｃ  ｆｌｕ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）の治療にも用いられてきている。例として、スペインインフルエンザウイルス（Ｓｐａｎｉｓｈ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）に感染した患者が肺炎の症状を伴った場合、前記インフルエンザに感染後回復した患者から採取した血液生産物（ｂｌｏｏｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ）を治療に使用した（Ｌｕｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１４５：５９９）。このように、ハイパー免疫グロブリン（Ｈｙｐｅｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｇｌｏｂｕｌｉｎ：ＩｇＩｖ）はヒト血漿から精製され、多様なウイルスに感染した患者の治療に用いられるが、前記のように製造された生産物は、暫定的感染源に対して安全でなく、大量生産に非効率的である。
【０００６】
最近、本出願人が特許出願したインフルエンザＡウイルスに対する抗体は、多様なインフルエンザのサブタイプに対して中和効能を示し、特に韓国特許出願第１０−２０１１−００２００６１号に開示された抗体は主に系統発生グループ１（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ９）に、韓国特許出願第１０−２０１２−０１０７５１２号に開示された抗体は主に系統発生グループ２（Ｈ３、Ｈ７）に中和効能を示した。そこで、２種類以上の抗体を混合して同時に投与することにより、流行る可能性のあるグループ１とグループ２に属するウイルスに対してすべて予防と治療効果を奏しうるカクテル製剤を開発しようとした。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、系統発生グループ１と系統発生グループ２ともに中和効能を示す、２以上のインフルエンザＡウイルス中和結合分子を含む組成物を提供することである。
また、本発明が解決しようとする他の課題は、前記組成物を投与してインフルエンザＡウイルス由来疾患の診断、予防または治療方法を提供することである。
さらに、本発明が解決しようとする他の課題は、前記組成物を用いてインフルエンザＡウイルス感染有無の診断方法を提供することである。
なお、本発明が解決しようとする他の課題は、前記組成物を含むインフルエンザＡウイルス診断用キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の課題を解決すべく、本発明は、インフルエンザＡウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）蛋白質の幹領域（ｓｔｅｍ  ｒｅｇｉｏｎ）内のエピトープに結合する２以上のインフルエンザＡウイルス中和結合分子を含む組成物であって、
ｉ）Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５およびＨ９からなる群より選択される１つ以上のインフルエンザＡウイルスのサブタイプを中和させることができる第１結合分子と、
ｉｉ）Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７およびＨ９からなる群より選択される１つ以上のインフルエンザＡウイルスのサブタイプを中和させることができる第２結合分子とを含む組成物を提供する。
【０００９】
本発明の一具体例において、第１結合分子のエピトープは、ＨＡ１ポリペプチドの位置１８、３８、４０、２９１、２９２および３１８のアミノ酸残基（ｒｅｓｉｄｕｅ）を含むことができる。また、第１結合分子のエピトープは、ＨＡ２ポリペプチドの位置１８、１９、２０、２１、４１、４２、４５、４８、４９、５２および５３のアミノ酸残基を含むことができる。
【００１０】
本発明の一具体例において、第１結合分子のエピトープは、ＨＡ１ポリペプチドの位置１８、３８、４０、２９１、２９２および３１８のアミノ酸残基（ｒｅｓｉｄｕｅ）を含み、ＨＡ２ポリペプチドの位置１８、１９、２０、２１、４１、４２、４５、４８、４９、５２および５３のアミノ酸残基を含むことができる。
【００１１】
本発明の一具体例において、第２結合分子のエピトープは、ＨＡ１ポリペプチドの位置２７８および３１８のアミノ酸残基を含むことができる。また、第２結合分子のエピトープは、ＨＡ２ポリペプチドの位置３８、３９、４１、４２、４５、４８、４９、５２および５３のアミノ酸残基を含むことができる。また、第２結合分子のエピトープは、ＨＡ第１単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）の前記ＨＡ１ポリペプチドおよび／またはＨＡ２ポリペプチドの位置のアミノ酸残基を含み、前記第１単量体に隣接した第２単量体のＨＡ１ポリペプチドの位置２５、３２および３３のアミノ酸残基を追加的に含むことができる。
本発明の一具体例において、第２結合分子のエピトープは、ＨＡ１ポリペプチドの位置２７８および３１８のアミノ酸残基を含み、ＨＡ２ポリペプチドの位置３８、３９、４１、４２、４５、４８、４９、５２および５３のアミノ酸残基を含むことができる。他の具体例において、前記第２結合分子のエピトープは、ＨＡ第１単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）の前記ＨＡ１ポリペプチドおよびＨＡ２ポリペプチドの位置のアミノ酸残基を含み、前記第１単量体に隣接した第２単量体のＨＡ１ポリペプチドの位置２５、３２および３３のアミノ酸残基を追加的に含むことができる。
【００１２】
本発明の一具体例において、第２結合分子のエピトープは、ＨＡ１ポリペプチドの位置２７８および３１８のアミノ酸残基を含み、ＨＡ２ポリペプチドの位置３８、３９、４１、４２、４５、４８、４９、５２、５３、５８および９９のアミノ酸残基を含むことができる。他の具体例において、前記第２結合分子のエピトープは、ＨＡ第１単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）の前記ＨＡ１ポリペプチドおよびＨＡ２ポリペプチドの位置のアミノ酸残基を含み、前記第１単量体に隣接した第２単量体のＨＡ１ポリペプチドの位置２５、２７、３２および３３のアミノ酸残基を追加的に含むことができる。
【００１３】
本発明の一具体例において、第２結合分子のエピトープは、ＨＡ１ポリペプチドの位置５４、５５、２７８、２９１および３１８のアミノ酸残基を含み、ＨＡ２ポリペプチドの位置１９、２０、２１、３８、３９、４１、４２、４５、４６、４８、４９、５２、５３、５６、５７および６０のアミノ酸残基を含むことができる。他の具体例において、前記第２結合分子のエピトープは、ＨＡ第１単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）の前記ＨＡ１ポリペプチドおよびＨＡ２ポリペプチドの位置のアミノ酸残基を含み、前記ＨＡ第１単量体に隣接したＨＡ第２単量体のＨＡ１ポリペプチドの位置２５、３２、３３、３１０、３１１および３１２のアミノ酸残基を追加的に含むことができる。
【００１４】
前記エピトープのアミノ酸位置ナンバリング（ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）は、Ｈ３ＨＡナンバリングに基づく。
【００１５】
本発明の結合分子は、ウイルスと標的細胞の膜融合を抑制することができる。また、本発明の結合分子は、抗体のＦｃ機能、すなわちＡＤＣＣ、ＣＤＣによってウイルスを抑制することができる。
本発明による第１結合分子は、インフルエンザウイルスＡまたはその断片に、好ましくは１．０×１０−８Ｍ未満、より好ましくは１．０×１０−９Ｍ未満、さらに好ましくは１．０×１０−１０Ｍ未満、なおさらに好ましくは１．０×１０−１１Ｍ未満、最も好ましくは１．０×１０−１２Ｍ未満の結合親和度（ＫＤ）で結合することができる。
【００１６】
本発明による第２結合分子は、インフルエンザウイルスＡまたはその断片に、好ましくは１．０×１０−６Ｍ未満、より好ましくは１．０×１０−７Ｍ未満、さらに好ましくは１．０×１０−８Ｍ未満、さらに好ましくは１．０×１０−９Ｍ未満、さらに好ましくは１．０×１０−１０Ｍ未満、なおさらに好ましくは１．０×１０−１１Ｍ未満、最も好ましくは１．０×１０−１２Ｍ未満の結合親和度（ＫＤ）で結合することができる。
【００１７】
前記結合親和度（ＫＤ）は、表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡＣＯＲＥシステムを利用して測定されてもよい。
【００１８】
本発明の一具体例において、前記第１結合分子は、Ｈ１サブタイプに２．０ｕｇ／ｍｌ以下、Ｈ２サブタイプに７．０ｕｇ／ｍｌ以下、Ｈ５サブタイプに７．０ｕｇ／ｍｌ以下、またはＨ９サブタイプに４．０ｕｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０値を有することができる。
【００１９】
本発明の一具体例において、前記第２結合分子は、Ｈ３サブタイプに４０．０ｕｇ／ｍｌ以下、Ｈ５サブタイプに２１２．０ｕｇ／ｍｌ以下、Ｈ７サブタイプに８．０ｕｇ／ｍｌ以下、またはＨ９サブタイプに８．０ｕｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０値を有することができる。
【００２０】
本発明の一具体例において、前記組成物は、Ｈ１サブタイプに３．０ｕｇ／ｍｌ以下、Ｈ２サブタイプに１３．０ｕｇ／ｍｌ以下、Ｈ３サブタイプに７０．０ｕｇ／ｍｌ以下、Ｈ５サブタイプに９．０ｕｇ／ｍｌ以下、Ｈ７サブタイプに１４．０ｕｇ／ｍｌ以下、またはＨ９サブタイプに６．０ｕｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０値を有することができる。
【００２１】
前記ＥＣ５０値は、マイクロ中和試験法を利用して測定されてもよい。
本発明の一具体例において、前記第１結合分子は、
カバット方法（Ｋａｂａｔ  ｍｅｔｈｏｄ）に従って、
ｉ）配列番号１のＣＤＲ１領域、配列番号２のＣＤＲ２領域、および配列番号３のＣＤＲ３領域と、
ｉｉ）配列番号４のＣＤＲ１領域、配列番号５のＣＤＲ２領域、および配列番号６のＣＤＲ３領域と、
ｉｉｉ）配列番号７のＣＤＲ１領域、配列番号８のＣＤＲ２領域、および配列番号９のＣＤＲ３領域と、
ｉｖ）配列番号１０のＣＤＲ１領域、配列番号１１のＣＤＲ２領域、および配列番号１２のＣＤＲ３領域と、
ｖ）配列番号１３のＣＤＲ１領域、配列番号１４のＣＤＲ２領域、および配列番号１５のＣＤＲ３領域と、
ｖｉ）配列番号１６のＣＤＲ１領域、配列番号１７のＣＤＲ２領域、および配列番号１８のＣＤＲ３領域とからなる群より選択されるいずれか１つを含むポリペプチド配列を含む。
【００２２】
本発明の一具体例において、前記第１結合分子は、
カバット方法（Ｋａｂａｔ  ｍｅｔｈｏｄ）に従って、
配列番号１のＣＤＲ１領域、配列番号２のＣＤＲ２領域、および配列番号３のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、
配列番号４のＣＤＲ１領域、配列番号５のＣＤＲ２領域、および配列番号６のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域とを含む。
【００２３】
本発明の一具体例において、前記第１結合分子は、
カバット方法（Ｋａｂａｔ  ｍｅｔｈｏｄ）に従って、
配列番号７のＣＤＲ１領域、配列番号８のＣＤＲ２領域、および配列番号９のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、
配列番号１０のＣＤＲ１領域、配列番号１１のＣＤＲ２領域、および配列番号１２のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域とを含む。
【００２４】
本発明の一具体例において、前記第１結合分子は、
カバット方法（Ｋａｂａｔ  ｍｅｔｈｏｄ）に従って、
配列番号１３のＣＤＲ１領域、配列番号１４のＣＤＲ２領域、および配列番号１５のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、
配列番号１６のＣＤＲ１領域、配列番号１７のＣＤＲ２領域、および配列番号１８のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域とを含む。
【００２５】
本発明の一具体例において、前記第２結合分子は、
カバット方法（Ｋａｂａｔ  ｍｅｔｈｏｄ）に従って、
ｉ）配列番号１９のＣＤＲ１領域、配列番号２０のＣＤＲ２領域、および配列番号２１のＣＤＲ３領域と、
ｉｉ）配列番号２２のＣＤＲ１領域、配列番号２３のＣＤＲ２領域、および配列番号２４のＣＤＲ３領域と、
ｉｉｉ）配列番号２５のＣＤＲ１領域、配列番号２６のＣＤＲ２領域、および配列番号２７のＣＤＲ３領域と、
ｉｖ）配列番号２８のＣＤＲ１領域、配列番号２９のＣＤＲ２領域、および配列番号３０のＣＤＲ３領域と、
ｖ）配列番号３１のＣＤＲ１領域、配列番号３２のＣＤＲ２領域、および配列番号３３のＣＤＲ３領域と、
ｖｉ）配列番号３４のＣＤＲ１領域、配列番号３５のＣＤＲ２領域、および配列番号３６のＣＤＲ３領域と、
ｖｉｉ）配列番号３７のＣＤＲ１領域、配列番号３８のＣＤＲ２領域、および配列番号３９のＣＤＲ３領域と、
ｖｉｉｉ）配列番号４０のＣＤＲ１領域、配列番号４１のＣＤＲ２領域、および配列番号４２のＣＤＲ３領域とからなる群より選択されるいずれか１つを含むポリペプチド配列を含む。
【００２６】
本発明の一具体例において、前記第２結合分子は、
カバット方法（Ｋａｂａｔ  ｍｅｔｈｏｄ）に従って、
配列番号１９のＣＤＲ１領域、配列番号２０のＣＤＲ２領域、および配列番号２１のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、
配列番号２２のＣＤＲ１領域、配列番号２３のＣＤＲ２領域、および配列番号２４のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域とを含む。
【００２７】
本発明の一具体例において、前記第２結合分子は、
カバット方法（Ｋａｂａｔ  ｍｅｔｈｏｄ）に従って、
配列番号２５のＣＤＲ１領域、配列番号２６のＣＤＲ２領域、および配列番号２７のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、
配列番号２８のＣＤＲ１領域、配列番号２９のＣＤＲ２領域、および配列番号３０のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域とを含む。
【００２８】
本発明の一具体例において、前記第２結合分子は、
カバット方法（Ｋａｂａｔ  ｍｅｔｈｏｄ）に従って、
配列番号３１のＣＤＲ１領域、配列番号３２のＣＤＲ２領域、および配列番号３３のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、
配列番号３４のＣＤＲ１領域、配列番号３５のＣＤＲ２領域、および配列番号３６のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域とを含む。
【００２９】
本発明の一具体例において、前記第２結合分子は、
カバット方法（Ｋａｂａｔ  ｍｅｔｈｏｄ）に従って、
配列番号３７のＣＤＲ１領域、配列番号３８のＣＤＲ２領域、および配列番号３９のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、
配列番号４０のＣＤＲ１領域、配列番号４１のＣＤＲ２領域、および配列番号４２のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域とを含む。
【００３０】
本発明の一具体例において、前記第１結合分子は、
カバット方法（Ｋａｂａｔ  ｍｅｔｈｏｄ）に従って、
配列番号７のＣＤＲ１領域、配列番号８のＣＤＲ２領域、および配列番号９のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、
配列番号１０のＣＤＲ１領域、配列番号１１のＣＤＲ２領域、および配列番号１２のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域とを含み、
前記第２結合分子は、
カバット方法（Ｋａｂａｔ  ｍｅｔｈｏｄ）に従って、
配列番号２５のＣＤＲ１領域、配列番号２６のＣＤＲ２領域、および配列番号２７のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、
配列番号２８のＣＤＲ１領域、配列番号２９のＣＤＲ２領域、および配列番号３０のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域とを含む。
【００３１】
本発明において、可変領域のＣＤＲは、Ｋａｂａｔらにより考案されたシステムによって通常の方法で決定された（文献［Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（５ｔｈ），Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）］参照）。本発明に使用されたＣＤＲナンバリングはＫａｂａｔ方法を利用したが、その他、ＩＭＧＴ方法、Ｃｈｏｔｈｉａ方法、ＡｂＭ方法など、他の方法により決定されたＣＤＲを含む結合分子も本発明に含まれる。
【００３２】
本発明の一具体例において、前記第１結合分子は、配列番号４３〜４８からなる群より選択されるいずれか１つを含むポリペプチド配列を含む。
【００３３】
本発明の一具体例において、前記第１結合分子は、配列番号４３のポリペプチド配列を含む軽鎖と、配列番号４４のポリペプチド配列を含む重鎖とを含む。
【００３４】
本発明の一具体例において、前記第１結合分子は、配列番号４５のポリペプチド配列を含む軽鎖と、配列番号４６のポリペプチド配列を含む重鎖とを含む。
【００３５】
本発明の一具体例において、前記第１結合分子は、配列番号４７のポリペプチド配列を含む軽鎖と、配列番号４８のポリペプチド配列を含む重鎖とを含む。
【００３６】
本発明の一具体例において、前記第２結合分子は、配列番号４９〜５６からなる群より選択されるいずれか１つを含むポリペプチド配列を含む。
【００３７】
本発明の一具体例において、前記第２結合分子は、配列番号４９のポリペプチド配列を含む軽鎖と、配列番号５０のポリペプチド配列を含む重鎖とを含む。
【００３８】
本発明の一具体例において、前記第２結合分子は、配列番号５１のポリペプチド配列を含む軽鎖と、配列番号５２のポリペプチド配列を含む重鎖とを含む。
【００３９】
本発明の一具体例において、前記第２結合分子は、配列番号５３のポリペプチド配列を含む軽鎖と、配列番号５４のポリペプチド配列を含む重鎖とを含む。
【００４０】
本発明の一具体例において、前記第２結合分子は、配列番号５５のポリペプチド配列を含む軽鎖と、配列番号５６のポリペプチド配列を含む重鎖とを含む。
【００４１】
本発明の一具体例において、前記第１結合分子は、
配列番号４５のポリペプチド配列を含む軽鎖と、配列番号４６のポリペプチド配列を含む重鎖とを含み、
前記第２結合分子は、
配列番号５１のポリペプチド配列を含む軽鎖と、配列番号５２のポリペプチドを含む重鎖とを含む。
本発明の一具体例において、前記結合分子は、抗体またはその抗原結合断片である。また、前記抗体に薬物が追加的に付着してもよい。
【００４２】
本発明の一具体例において、前記組成物は、インフルエンザウイルス由来疾患の予防または治療用であってもよい。
【００４３】
本発明の一具体例において、前記組成物は、インフルエンザウイルス由来疾患の診断用であってもよい。
【００４４】
本発明の一具体例において、前記組成物は、薬剤学的に許容可能な賦形剤を含むことができる。
【００４５】
本発明の一具体例において、前記組成物は、滅菌注射溶液、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）剤形、事前充填式注射（ｐｒｅ−ｆｉｌｌｅｄ  ｓｙｒｉｎｇｅ）溶液剤、経口型剤形、外用剤または坐剤であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００４６】
また、本発明は、インフルエンザウイルスによって発生する疾患を有する対象に、前記組成物を治療学的に有効な量で投与するステップを含むインフルエンザウイルス由来疾患の治療方法を提供する。
【００４７】
さらに、本発明は、
ｉ）インフルエンザウイルスによって発生する疾患を有する対象に、前記第１結合分子および第２結合分子を治療学的に有効な量で同時に投与するステップと、
ｉｉ）インフルエンザウイルスによって発生する疾患を有する対象に、前記第１結合分子を治療学的に有効な量で投与した後、後続して、前記対象に、請求項１に記載の第２結合分子を治療学的に有効な量で投与するステップと、または
ｉｉｉ）インフルエンザウイルスによって発生する疾患を有する対象に、前記第２結合分子を治療学的に有効な量で投与した後、後続して、前記対象に、請求項１に記載の第１結合分子を治療学的に有効な量で投与するステップとを含むインフルエンザウイルス由来疾患の診断、予防または治療方法を提供する。
【００４８】
一具体例において、本発明は、
ｉ）インフルエンザＡウイルスによって発生する疾患を有する対象に、前記第１結合分子を治療学的に有効な量で投与するステップと、
ｉｉ）後続して、前記対象に、前記第２結合分子を治療学的に有効な量で投与するステップとを含むインフルエンザＡウイルス由来疾患の治療方法を提供する。
【００４９】
他の具体例において、本発明は、
ｉ）インフルエンザＡウイルスによって発生する疾患を有する対象に、前記第２結合分子を治療学的に有効な量で投与するステップと、
ｉｉ）後続して、前記対象に、前記第１結合分子を治療学的に有効な量で投与するステップとを含むインフルエンザＡウイルス由来疾患の治療方法を提供する。
【００５０】
本発明の一具体例において、前記診断、予防、または治療方法は、抗−ウイルス薬物、ウイルス進入抑制剤またはウイルス付着抑制剤を投与するステップを追加的に含むことができる。
【００５１】
前記抗−ウイルス薬物は、ノイラミニダーゼ抑制剤、ヘマグルチニン（ＨＡ）抑制剤、シアル酸抑制剤、Ｍ２イオンチャネル抑制剤またはＲＮＡポリメラーゼ抑制剤であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００５２】
前記ノイラミニダーゼ抑制剤は、ペラミビル（Ｐｅｒａｍｉｖｉｒ）、ザナミビル（Ｚａｎａｍｉｖｉｒ）またはオセルタミビル（Ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ）、ラニナミビル（Ｌａｎｉｎａｍｉｖｉｒ）であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００５３】
前記Ｍ２イオンチャネル抑制剤は、アマンタジン（Ａｍａｎｔａｄｉｎｅ）またはリマンタジン（Ｒｉｍａｎｔａｄｉｎｅ）であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００５４】
前記ＲＮＡポリメラーゼ抑制剤は、ファビピラビル（Ｆａｖｉｐｉｒａｖｉｒ）であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００５５】
また、本発明は、インフルエンザウイルスによって発生する疾患を有する対象に、前記組成物を治療学的に有効な量で投与するステップを含むインフルエンザウイルス由来疾患の予防方法を提供する。
【００５６】
一具体例において、本発明は、
ｉ）インフルエンザＡウイルスによって発生する疾患を有する対象に、前記第１結合分子を治療学的に有効な量で投与するステップと、
ｉｉ）前記対象に、前記第２結合分子を治療学的に有効な量で投与するステップとを含むインフルエンザＡウイルス由来疾患の予防方法を提供する。
【００５７】
他の具体例において、本発明は、
ｉ）インフルエンザＡウイルスによって発生する疾患を有する対象に、前記第２結合分子を治療学的に有効な量で投与するステップと、
ｉｉ）前記対象に、前記第１結合分子を治療学的に有効な量で投与するステップとを含むインフルエンザＡウイルス由来疾患の予防方法を提供する。
【００５８】
また、本発明は、
ｉ）サンプルと、前記組成物とを接触させるステップと、
ｉｉ）前記組成物とサンプルとの反応を検出するステップとを含む患者のインフルエンザウイルス感染有無の診断方法を提供する。
【００５９】
さらに、本発明は、ｉ）前記インフルエンザウイルス診断用組成物と、ｉｉ）容器とを含むインフルエンザウイルス診断用キットを提供する。
【発明の効果】
【００６０】
本発明の２以上のインフルエンザＡウイルス中和結合分子を含む組成物は、結合分子間で相互干渉せず、それぞれのサブタイプに対する結合分子の中和効能を維持して、結果的に付加的な（ａｄｄｉｔｉｖｅ）効果を示した。本発明の組成物は、化学的化合物との併用投与時にも亢進（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ）効果を示した。本発明の混合組成物は、系統発生グループ１および２の多重インフルエンザサブタイプ２つともを効果的に中和させ、化学的化合物とも併用して使用可能なため、インフルエンザウイルスによる疾患の予防および治療に非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、ＣＴ１０４、ＣＴ１２０およびＣＴ１２３抗体を対象とした単量体ヘマグルチニン（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；以下、「ＨＡ」と称する）および三量体ＨＡに対する抗体結合力を示すグラフである。
【図２】図２は、ＣＴ１４７、ＣＴ１４９、ＣＴ１６４、およびＣＴ１６６抗体を対象とした単量体ＨＡのサブユニット（ＨＡ１）および三量体ＨＡに対する抗体結合力を示すグラフである。
【図３】図３は、ｐＣＴ１４５（Ａ）とｐＣＴ１４７（Ｂ）のベクター地図である：Ａ：ｐＣＴ１４５ベクター；Ｂ；ｐＣＴ１４７ベクター；ｐａｃ：Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｔｒａｎｆｅｒａｓｅ（ＰＡＣ）をコーディングする遺伝子；およびＤＳ：ｄｙａｄ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ配列（ＥＢＮＡ１がｏｒｉＰにあるｄｙａｄ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ（ＤＳ）ｅｌｅｍｅｎｔに結合する）。
【図４】図４は、本発明の抗−インフルエンザＡウイルス単クローン抗体を発現する発現ベクター地図である。
【図５Ａ−Ｄ】図５Ａ〜図５Ｄは、Ｈ１（Ｈ１Ｎ１）、Ｈ２（Ｈ２Ｎ２）、Ｈ３（Ｈ３Ｎ２）またはＨ５（Ｈ５Ｎ１）サブタイプのＨＡを発現する細胞株を用いて、低いｐＨに露出した時、ＨＡによって誘導される膜融合に対するＣＴ１２０とＣＴ１４９抗体の抑制能力を検証したものである。
【図６Ａ−Ｂ】図６Ａは、本発明のＣＴ１２０、ＣＴ１４９抗体を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣ  ａｓｓａｙ結果であり、図６Ｂは、本発明のＣＴ１２０、ＣＴ１４９抗体を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＤＣ  ａｓｓａｙ結果である。
【図７】図７は、マウスＦｃを有するＣＴ１４９抗体を用いた動物実験結果である。
【図８Ａ−Ｃ】図８Ａは、ＣＴ１２０抗体のＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）ウイルスのＨＡ蛋白質に結合する部位を示したアミノ酸配列と模式図であり、図８Ｂ、図８Ｃはそれぞれ、ＣＴ１４９抗体のＡ／Ａｉｃｈｉ／１９６８（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）ウイルスのＨＡ蛋白質に結合する部位を示したアミノ酸配列と模式図である。
【図９】図９は、Ｈ１（Ｈ１Ｎ１）、Ｈ３（Ｈ３Ｎ２）またはＨ５（Ｈ５Ｎ１）サブタイプのＨＡを発現する細胞株を用いて、ＨＡに対する抗体（ＣＴ１２０、ＣＴ１４９、ＣＴ１２０とＣＴ１４９の混合抗体）の結合力をＣＥＬＩＳＡ方法で検証したグラフである。
【図１０】図１０は、マウスにＣＴ１２０とＣＴ１４９抗体を単独または混合投与して、Ｈ１Ｎ１に対する予防および治療効果を確認した動物実験結果である。
【図１１】図１１は、マウスにＣＴ１２０とＣＴ１４９抗体を単独または混合投与して、Ｈ３Ｎ２に対する予防および治療効果を確認した動物実験結果である。
【図１２】図１２は、マウスにＣＴ１２０とＣＴ１４９抗体を単独または混合投与して、Ｈ５Ｎ１に対する治療効果を確認した動物実験結果である。
【図１３】図１３は、マウスにＣＴ１４９抗体を投与して、Ｈ７Ｎ９に対する治療効果を確認した動物実験結果である。
【図１４】図１４は、Ｈ１Ｎ１ウイルスまたはＨ３Ｎ２ウイルスに対して最適化されていない濃度のＰｅｒａｍｉｖｉｒと抗体を単独または併用投与した場合、マウスの死亡率の変化を確認した結果である。
【図１５】図１５は、ＣＴ１４９抗体とＣＴ１２０／ＣＴ１４９混合抗体のＨ７Ｎ９（Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３、Ａ／上海／２／２０１３）に対するＭＮ  ａｓｓａｙ結果である。
【図１６Ａ−Ｂ】図１６Ａは、ＣＴ１４９抗体とＣＴ１２０／ＣＴ１４９混合抗体のＨ７Ｎ９（Ａ／上海／２／２０１３）野生型に対するＭＮ  ａｓｓａｙ結果であり、図１６Ｂは、ＣＴ１４９抗体とＣＴ１２０／ＣＴ１４９混合抗体のＮＡＩ耐性Ｈ７Ｎ９（Ａ／上海／２／２０１３）Ｒ２９２Ｋに対するＭＮ  ａｓｓａｙ結果である。
【図１７Ａ−Ｂ】図１７Ａは、ＣＴ１２０抗体とＣＴ１２０／ＣＴ１４９混合抗体のＨ１Ｎ１（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９）野生型に対するＭＮ  ａｓｓａｙ結果であり、図１７Ｂは、ＣＴ１２０抗体とＣＴ１２０／ＣＴ１４９混合抗体のＮＡＩ耐性Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９）Ｈ２７５Ｙに対するＭＮ  ａｓｓａｙ結果である。
【図１８Ａ−Ｂ】図１８Ａは、ＣＴ１２０抗体とＣＴ１４９抗体のＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／０５（Ｈ３Ｎ２）野生型とＨＡ  Ｄ１９Ｎ突然変異体に対する免疫蛍光染色結果であり、図１６Ｂは、ＣＴ１２０抗体とＣＴ１４９抗体のＡ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）野生型とＨＡ  Ｄ１９Ｎ突然変異体に対する免疫蛍光染色結果である。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
以下、本発明の単語を次のように定義する。
「インフルエンザＡウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ）」は、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属する有外皮ウイルス（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｖｉｒｕｓ）で、８つの分節からなる陰性−極性および単一鎖（Ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｅｎｓｅ、ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ）のＲＮＡ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を遺伝体として有し、Ａ、ＢおよびＣグループに分類され、主要表面蛋白質であるＨＡ（ｈｅｍａｇｇｕｔｉｎｉｎ）とＮＡ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）によってさらに様々なサブタイプ（サブタイプ）に分けられる。今のところ、１７種のＨＡと１０種のＮＡが知られている。
【００６３】
本発明に記載の「Ｈ１サブタイプ」には、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ１Ｎ３、Ｈ１Ｎ４、Ｈ１Ｎ５、Ｈ１Ｎ６、Ｈ１Ｎ７、Ｈ１Ｎ８、Ｈ１Ｎ９およびＨ１Ｎ１０が含まれる。
【００６４】
本発明に記載の「Ｈ２サブタイプ」には、Ｈ２Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ２Ｎ３、Ｈ２Ｎ４、Ｈ２Ｎ５、Ｈ２Ｎ６、Ｈ２Ｎ７、Ｈ２Ｎ８、Ｈ２Ｎ９およびＨ２Ｎ１０が含まれる。
【００６５】
本発明に記載の「Ｈ５サブタイプ」には、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ４、Ｈ５Ｎ５、Ｈ５Ｎ６、Ｈ５Ｎ７、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９およびＨ５Ｎ１０が含まれる。
【００６６】
本発明に記載の「Ｈ９サブタイプ」には、Ｈ９Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ９Ｎ３、Ｈ９Ｎ４、Ｈ９Ｎ５、Ｈ９Ｎ６、Ｈ９Ｎ７、Ｈ９Ｎ８、Ｈ９Ｎ９およびＨ９Ｎ１０が含まれる。
【００６７】
本発明に記載の「Ｈ３サブタイプ」には、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ３、Ｈ３Ｎ４、Ｈ３Ｎ５、Ｈ３Ｎ６、Ｈ３Ｎ７、Ｈ３Ｎ８、Ｈ３Ｎ９およびＨ３Ｎ１０が含まれる。
【００６８】
本発明に記載の「Ｈ７サブタイプ」には、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ５、Ｈ７Ｎ６、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ８、Ｈ７Ｎ９およびＨ７Ｎ１０が含まれる。
【００６９】
「ヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、以下、「ＨＡ」と称する）」は、インフルエンザウイルスの外皮（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）糖蛋白質を表す。ＨＡは、インフルエンザウイルスが宿主細胞に吸着して浸透することを媒介する。今のところ、１７種類のサブタイプが報告されている。
【００７０】
本発明で使用される「結合分子」は、キメラ、ヒト化またはヒト単クローン抗体のような単クローン抗体を含む完全な（ｉｎｔａｃｔ）イムノグロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、または抗原に結合するイムノグロブリン、例えば、インフルエンザＡウイルスの単量体ＨＡまたは三量体ＨＡとの結合のために完全な（ｉｎｔａｃｔ）イムノグロブリンと競争するイムノグロブリン断片を含む可変性ドメインまたは基質と結合可能な酵素、受容体、蛋白質を意味する。構造にかかわらず、抗原−結合断片は、完全な（ｉｎｔａｃｔ）イムノグロブリンによって認識された同一の抗原と結合される。抗原−結合断片は、結合分子のアミノ酸配列の２個以上の連続基、２０個以上の連続アミノ酸残基、２５個以上の連続アミノ酸残基、３０個以上の連続アミノ酸残基、３５個以上の連続アミノ酸残基、４０個以上の連続アミノ酸残基、５０個以上の連続アミノ酸残基、６０個以上の連続アミノ酸残基、７０個以上の連続アミノ酸残基、８０個以上の連続アミノ酸残基、９０個以上の連続アミノ酸残基、１００個以上の連続アミノ酸残基、１２５個以上の連続アミノ酸残基、１５０個以上の連続アミノ酸残基、１７５個以上の連続アミノ酸残基、２００個以上の連続アミノ酸残基、または２５０個以上の連続アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを含むことができる。「抗原−結合断片」は、特にＦａｂ、Ｆ（ａｂ′）、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単一−鎖抗体（ｓｃＦｖ）、２価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）単一−鎖抗体、単一−鎖ファージ抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ、テトラボディ、ポリペプチドへの特定抗原に結合するのに十分なイムノグロブリンの１つ以上の断片を含むポリペプチドなどを含む。前記断片は、合成で、または完全なイムノグロブリンの酵素的または化学的分解によって生成されるか、組換えＤＮＡ技術によって遺伝工学的に生成されてもよい。生成方法は当業界によく知られている。
【００７１】
本発明で使用される「薬剤学的に許容可能な賦形剤」という用語は、容認可能なまたは便利な投薬形態を製造するための薬物、製剤または結合分子のような活性分子で組み合わされる不活性物質を意味する。薬剤学的に許容可能な賦形剤は、非毒性であるか、少なくとも毒性が使用された容量および濃度において受容者にその意図された用途のために許容可能な賦形剤であり、薬物、製剤または結合粉剤を含む剤形化の他の成分と両立できる。
【００７２】
本発明で使用される「治療学的に有効な量」という用語は、インフルエンザＡウイルスの露出前または露出後に予防または治療に有効な本発明の結合分子の量を表す。
【００７３】
本発明による物質を含む組成物は、それぞれ通常の方法により、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、坐剤滅菌注射溶液、事前充填式注射（ｐｒｅ−ｆｉｌｌｅｄ  ｓｙｒｉｎｇｅ）溶液剤の形態または凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）した形態に剤形化することができる。詳しくは、製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製されてもよい。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記抽出物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート（ｃａｌｃｉｕｍｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混合して調製されてもよい。また、単純な賦形剤のほか、マグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使用可能である。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤の水、リキッドパラフィンのほか、様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤および坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが使用されてもよい。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、トゥイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用されてもよい。
【００７４】
診断組成物に使用される本発明の前記化合物は、検出可能に標識されることが好ましい。生分子を標識させるのに使用可能な多様な方法が当業者によく知られており、本発明の範疇内で考慮される。前記方法は、Ｔｉｊｓｓｅｎ，‘Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙｓ’，Ｂｕｒｄｅｎ，ＲＨ  ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｋｎｉｐｐｅｎｂｕｒｇ（Ｅｄｓ），Ｖｏｌｕｍｅ１５（１９８５），‘Ｂａｓｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ’；Ｄａｖｉｓ  ＬＧ，Ｄｉｂｍｅｒ  ＭＤ；Ｂａｔｔｅｙ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９９０），Ｍａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｅｄｓ）‘Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ’Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７），‘Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ’，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．に記述されている。
【００７５】
当業者に公知の標識方法と多くの他の標識がある。本発明で使用可能な標識種類の例としては、酵素、放射性同位元素、コロイド金属、蛍光化合物、化学発光化合物および生物発光化合物がある。
通常使用される標識は、蛍光物質（例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッドなど）、酵素（例えば、ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、放射性同位元素（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）、ビオチン、ジゴキシゲニン、コロイド金属、化学発光または生物発光化合物（例えば、ジオキセタン、ルミノールまたはアクリジニウム）を含む。酵素またはビオチニル基の共有結合法、ヨード化法、リン酸化法、ビオチン化法などのような標識方法が当分野によく知られている。
【００７６】
検出方法としては、オートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡、直接および間接酵素反応などがあり、これに限るものではない。通常使用される検出分析法としては、放射性同位元素または非−放射性同位元素方法がある。これらは中でも、ウェスタンブロッティング、オーバーレイ−分析法、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ  Ａｓｓａｙ）およびＩＲＭＡ（ＩｍｍｕｎｅＲａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ）、ＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ａｓｓａｙ）、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）、ＦＩＡ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ａｓｓａｙ）およびＣＬＩＡ（Ｃｈｅｍｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ａｓｓａｙ）がある。
【００７７】
本発明による抗体は、薬剤が結合された抗体−薬物接合体の形態で使用されてもよい。薬物を局所伝達するために、抗体−薬物接合体（ＡＤＣ）、すなわち免疫接合体を使用すると、前記薬物モイエティを感染した細胞に標的化伝達することができるが、前記薬物作用剤を接合させないまま投与すると、正常細胞に対しても許容できない水準の毒性が引き起こされかねないからである。薬物−連結性および薬物−放出性だけでなく、ポリクロナールおよびモノクロナール抗体（ｍＡｂ）の選択性を高めることにより、ＡＤＣの最大効能と最小毒性を改善することができる。
【００７８】
薬物モイエティを抗体に付着させる、すなわち共有結合を通じて連結させる通常の手段では、一般的に薬物モイエティが抗体上の数多くの部位に付着する不均質な分子混合物が誘発される。例えば、細胞毒性薬物を典型的に、時々抗体の数多くのリジン残基を介して抗体と接合させて不均質な抗体−薬物接合体混合物を生成させることがある。反応条件によって、このような不均質な混合物は典型的に、薬物モイエティに付着した抗体分布度が０〜約８以上である。また、特別な整数比の薬物モイエティ対抗体を伴った接合体の各亜群は、薬物モイエティが抗体上の各種部位に付着する、潜在的に不均質な混合物である。抗体は大きく、複雑で構造的に多様な生体分子であり、時々多くの反応性官能基を持っている。リンカー試薬および薬物−リンカー中間体との反応性は、ｐＨ、濃度、塩濃度および助溶媒のような要因によって左右される。
【００７９】
本発明では、既に特許出願（韓国特許出願第１０−２０１１−００２００６１号、韓国特許出願第１０−２０１２−０１０７５１２号）された抗体を混合したカクテル組成物の系統発生グループ１または２サブタイプのウイルスに対する反応性を、マイクロ中和試験法（ｍｉｃｒｏｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ：以下、「ＭＮテスト」と称する）で確認した。このうち、グループ１に対して特異的に中和能を有するＣＴ１２０と、グループ１の一部とグループ２に対して中和能を示すＣＴ１４９とを混合し、その前後の結合力と中和能力を確認した。本出願人が既に出願した韓国特許出願第１０−２０１１−００２００６１号および韓国特許出願第１０−２０１２−０１０７５１２号は、本発明の明細書に参照として組み込まれる。
【００８０】
抗体の結合力は、表面プラズモン共鳴技術を利用した方法と、Ｈ１、Ｈ３またはＨ５を発現する細胞株を用いてＣＥＬＩＳＡ（ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＥＮＺＹＭＥ−ＬＩＮＫＥＤ  ＩＭＭＵＮＯＳＯＲＢＥＮＴ  ＡＳＳＡＹ）方法で確認した。その結果、ＣＴ１２０とＣＴ１４９はそれぞれ、Ｈ１とＨ５のＨＡを発現する細胞株に結合し、これらを混合した場合、類似する結合力を示した。ＣＴ１４９は、Ｈ３のＨＡを発現する細胞株を用いたＣＥＬＩＳＡで結合能を示したが、ＣＴ１２０は結合することができなかった。これらを混合してＣＥＬＩＳＡを行った場合、ＣＴ１２０は、ＣＴ１４９の結合を阻害しなかった。
【００８１】
ＣＴ１２０とＣＴ１４９とを混合する前後の中和能力は、マイクロ中和試験法を利用して測定された。その結果、ＣＴ１２０とＣＴ１４９は、それぞれの本来の中和能を示しており、２つの抗体を混合した場合、干渉効果なしに効果のある抗体の中和能を示し、その結果、使用したグループ１とグループ２のインフルエンザＡウイルスに対してすべて中和効果を示した。
【００８２】
生体内での中和能力を調べるために、インフルエンザＡウイルスをネズミに感染させる前後にＣＴ１２０とＣＴ１４９をそれぞれ、または混合して投与した。その結果、抗体混合物（本発明において、ＣＴ−Ｐ２７と称する）を投与する場合、各抗体の効能をそれぞれ反映したり、混合された効能を示しており、相互干渉して阻害することはなかった。
【００８３】
ＣＴ１２０とＣＴ１４９は、抗体の混合投与だけでなく、化学的化合物との併用投与においても亢進の中和効果を示した。ペラミビル（Ｐｅｒａｍｉｖｉｒ）は、インフルエンザＡ感染時に使用するノイラミニダーゼ抑制剤（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）である。ネズミにインフルエンザＡウイルスを感染させ、中和効果を示しにくい量のＣＴ１２０あるいはＣＴ１４９を同様に低い濃度のペラミビルと併用投与する場合、単独投与に比べて亢進効能を示した。
【００８４】
そこで、本発明では、ＣＴ１２０に代表されるグループ１のインフルエンザＡウイルスに対して効果のある抗体（ＣＴ１０４、ＣＴ１２０、ＣＴ１２３）と、ＣＴ１４９に代表されるグループ２のインフルエンザＡウイルスに対して効果のある抗体（ＣＴ１４７、ＣＴ１４９、ＣＴ１６４、ＣＴ１６６）とを混合して投与する場合、グループ１と２のインフルエンザＡウイルスに対してすべて中和効能を示すことを確認した。また、各抗体を化学的治療剤と併用投与した場合にも、亢進の中和効能を示すことを確認した。
【００８５】
以下、本発明を実施例を通じて詳細に説明する。しかし、下記実施例は本発明の内容を例示するものに過ぎず、発明の範囲が実施例により限定されるものではない。本発明で引用された文献は、本発明の明細書に参照として組み込まれる。
【００８６】
実施例
実施例１：インフルエンザ回復患者からの血液からＰＢＭＣ分離準備
回復患者群は、新種インフルエンザ確定診断後２−４週経過した患者であって、血液中に新種インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）が存在しないことが確認され、新種インフルエンザウイルスに対する抗体を保有する志願者で構成され、これは臨床試験審査委員会（ＩＲＢ）の承認を受けて行われた。これら患者群の特徴は次の通りである。（１）季節インフルエンザに対するワクチンの接種を受けなかった。（２）他の伝染性ウイルス、すなわちＨＢｓＡｇに対して陰性反応を、ａｎｔｉ−ＨＣＶ抗体およびａｎｔｉ−ＨＩＶ抗体に対して陰性反応を示した。（３）血漿（ｐｌａｓｍａ）からインフルエンザＡウイルスＨ１Ｎ１サブタイプのＲＴ−ＰＣＲに陰性反応を示した。（４）血清からインフルエンザＡウイルスＨ１Ｎ１サブタイプのＨＡ（Ｈ１Ｎ１）に対するＥＬＩＳＡで１：１６０以上のタイター（ｔｉｔｅｒ）を血清で現した。志願者から約１００ｍｌの全血を得て、ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐＴＭ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ、Ｎｏｒｗａｙ、１１１４５４５）方法を利用してＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ）を分離した。分離されたＰＢＭＣは、リン酸緩衝溶液で３回洗浄した後、ＫＭ  ｂａｎｋｅｒ  ＩＩ（Ｃｏｓｍｏｂｉｏ、Ｊａｐａｎ、ＫＯＪ−１６０９２０１０）冷凍培地（ｆｒｅｅｚｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）で２ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度に合わせて液体窒素タンク（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｔａｎｋ）に保管された。
【００８７】
実施例２：単クローン抗体の一次選別
抗原特異抗体を分泌するＢ細胞の選別方法は、Ｊｉｎら（Ｊｉｎ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２００９．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１５，１０８８−１０９２）により説明された方法を利用した。簡略に、前記実施例１で分離されたＰＢＭＣを、用意されたマイクロアレイチップ上のそれぞれのウェルに１つずつ添加した。単一細胞から分泌した抗体は、予めコーティング（ｐｒｅｃｏａｔｅｄ）された抗−ヒトＩｇＧ抗体によって確認された。これにより選別された抗体分泌細胞（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）を対象に標識されたＨＡ抗原を用いて、ＨＡに結合する抗体の分泌の有無をＥＬＩＳＰＯＴ（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  ａｓｓａｙ：Ｓｅｄｇｗｉｃｋ  Ｊ．Ｄ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．３０２，ｐｐ．３１４）で確認した。確認された個別抗体分泌細胞から逆転写重合酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）方法を利用して、抗体の重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）および軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）遺伝子の全体配列を確保した。確保された重鎖および軽鎖ＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現ベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ、Ｖ７９０−２０）に挿入して抗体の軽鎖および重鎖をそれぞれ生産する発現ベクターを製造した後、前記製造された軽鎖および重鎖生産発現ベクターをＣＨＯ細胞に形質感染させた。その後、形質感染したＣＨＯ細胞から生産された抗体を用いて、下記実施例３に記載のＨＡ−ＥＬＩＳＡ方法によりＨＡに結合する抗体を一次的に選別した。この際には、抗体サンプルを連続的に希釈せず、ＨＡとの反応を示すすべての抗体を一次的に選別した。
【００８８】
実施例３：単クローン抗体の二次選別および抗体の生産
一次的に選別された抗体から、Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡに結合力の高い単クローン抗体を二次的に選別するために、単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）ＨＡと三量体（ｔｒｉｍｅｒ）ＨＡを確保してＨＡ−ＥＬＩＳＡを進行させた。インフルエンザＡウイルスの組換え単量体ＨＡは、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｎａ）から購入した。購入されたＡ／ＣＡ／０４／０９（Ｈ１Ｎ１）の単量体ＨＡ（１１０５５−Ｖ０８Ｈ）は、Ｃ−末端に１０個のヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）残基を含むＨＡの細胞外ドメイン（ｍｅｔ１−ｇｌｎ５２９）で構成されており、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／０７（Ｈ３Ｎ２）組換えＨＡ１サブユニット（１１０５６−Ｖ０８Ｈ１）は、Ｃ−末端にヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）残基を含むＨＡのＮ−末端分節（Ｍｅｔ１−Ａｒｇ３４５）で構成されており、形質感染したヒト細胞から生産された。Ａ／ＣＡ／０４／０９（Ｈ１Ｎ１）とＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／０７（Ｈ３Ｎ２）の組換え三量体ＨＡ（ＦＲ−１８０、ＦＲ−６１）は、ＩＲＲ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ、ＵＳＡ）から提供した。前記三量体ＨＡは、Ｃ−末端ペプチドにトロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）切断サイト、三量体形成誘導ドメイン（ｔｒｉｍｅｒｉｚｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ；ｆｏｌｄｏｎ）および６個のヒスチジン残基を含む構造であり、バキュロウイルスシステム（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ）を利用して生産された。
【００８９】
抗体の抗原（ＨＡ）との反応性は、抗原（ＨＡ）と抗体を用いた酵素結合免疫吸収分析法（ＥＬＩＳＡ）により測定された。詳しい方法は下記の通りである。まず、５０μｌの単量体ＨＡおよび三量体ＨＡ抗原（２５０ｎｇ／ｍｌ）をそれぞれ９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ、４４９８２４）のウェルに吸着させた。前記プレートを１％ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ）が含有されたリン酸緩衝溶液（Ｔｅｋｎｏｖａ、ＵＳＡ、Ｄ５１２０）で処理してブロッキングした後、３倍ずつ連続的に希釈した抗体サンプル（ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：１μｇ／ｍｌ）をプレートの各ウェルに追加した。以後、室温で１時間反応（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）させた後、過酸化酵素が標識された塩素の抗−ヒトガンマ抗体（Ｚｙｍｅｄ、ＵＳＡ、６２．８４２０）で感知した。室温で１時間反応後、テトラメチルベンジジン（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｙｄｉｎｅ：ＴＭＢ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ、Ｔ０４４０）と反応させ、該反応を１Ｎ  ＨＣｌで中止させた。プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ｐｌｕｓ３８４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて４５０／５７０ｎｍで吸光度を測定し、グラフパッドプリズムプログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．ＵＳＡ）を用いて抗原−抗体間の反応性をグラフで示した。
【００９０】
図１に示されるように、ＣＴ１０４、ＣＴ１２０およびＣＴ１２３抗体は、Ａ／ＣＡ／０４／０９（Ｈ１Ｎ１）の三量体ＨＡとは高い反応を示しているが、単量体ＨＡとはほとんど反応を示していない。
【００９１】
また、図２に示されるように、ＣＴ１４７、ＣＴ１４９、ＣＴ１６４およびＣＴ１６６抗体は、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／０７（Ｈ３Ｎ２）の三量体ＨＡにはよく結合したが、ＨＡ１サブユニットには結合しなかった。これは、選別された抗体が、既に知られているＨＡ１部分にあるエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）でなく、ＨＡ１とＨＡ２分節の境界面やＨＡ２に結合する可能性と、正常コンフォメーション（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を持っているＨＡにのみ結合する可能性を示唆している。
【００９２】
そこで、前記図１、図２の結果に基づいて、一次的に選別された抗体の中から、三量体ＨＡに高い反応性を示す抗体を二次的に選別し、これら抗体の発現量を高めるために、これら抗体遺伝子をｐｃＤＮＡベクターにおいてセルトリオン社固有の発現ベクターであるＭａｒＥｘ発現ベクターに、次のような再クローニング（ｒｅｃｌｏｎｉｎｇ）を進行させた。再クローニング後、これら抗体遺伝子を含むＭａｒＥｘ発現ベクターを用いて、マイクロ中和試験法（Ｍｉｃｒｏｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ；ＭＮ  ｔｅｓｔ）および血球凝集抑制試験（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ：ＨＩ  ｔｅｓｔ）に必要な抗体を生産した。
【００９３】
二次的に選定された抗体の重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子をそれぞれ含むｏｒｉｇｉｎａｌ  ｐｃＤＮＡベクターに制限酵素Ｎｈｅ  ＩとＰｍｅ  Ｉを処理して重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子を確保した後、確保された重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子をそれぞれ同一の制限酵素で処理されたｐＣＴ１４５ベクターとｐＣＴ１４７ベクターに挿入した。ｐＣＴ１４５およびｐＣＴ１４７ベクターはそれぞれ、抗体の重鎖と軽鎖をクローニングするために作製されたセルトリオン社固有のベクターである（図３）。以後、重鎖転写単位（プロモーター−重鎖遺伝子−ポリエー）と軽鎖転写単位（プロモーター−軽鎖遺伝子−ポリエー）を併せて共に含む発現ベクターを作製するために、重鎖遺伝子を含むｐＣＴ１４５ベクターに制限酵素Ｐａｃ  ＩとＡｓｃ  Ｉを処理して重鎖転写単位を確保した後、軽鎖遺伝子を含むｐＣＴ１４７ベクターに同一の制限酵素を処理して重鎖転写単位を挿入した。以後、制限酵素を用いて、重鎖転写単位と軽鎖転写単位を同時に含むベクターを選別した（図４）。選別されたベクターは、Ｅｎｄｏｆｒｅｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｍａｘｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１２３６２）を用いて抽出され、抽出されたＤＮＡのうちの一部を用いて、塩基配列分析により最終的に抗体の塩基配列を確認した。
【００９４】
以後、抽出された抗体のＤＮＡを用いて、浮遊培養中のセルトリオン社作製のＦ２Ｎ細胞株（韓国登録特許第１０−１００５９６７号参照）に形質感染して単クローン抗体を生産する一時的細胞株を製造し、方法は下記の通りである。細胞内の一時的形質感染のために、陽イオン性ポリマー（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ）のＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  Ｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ、１６４４７−１００）を使用し、製造会社の使用マニュアルに従って形質感染を行った。形質感染の前日、ＥＸ−ＣＥＬＬ２９３Ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉａ（ＳＡＦＣ、ＬＩＫ、１４５７１Ｃ、以下、「ＥＸ−ＣＥＬＬ２９３培地」と称する）で培養されたＦ２Ｎ細胞を、遠心分離を行って、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＥＸ−ＣＥＬＬ２９３培地（ＳＡＦＣ、ＬＩＫ、６５２３７、オーダーメイド注文生産）を用いて、ｍｌあたり１ｘ１０６個の細胞濃度で２５０ｍｌ  Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ  Ｆｌａｓｋに８０ｍｌまたは１ｌ  Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ  Ｆｌａｓｋに２００ｍｌ接種した。形質感染当日、８０ｍｌ接種した場合、単クローン抗体をコーディングするＤＮＡ１００μｇとＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  Ｍａｘ試薬１００μｌをそれぞれＯｐｔｉＰＲＯ  ＳＦＭ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ、１２３０９）培地を用いて１．６ｍｌのｖｏｌｕｍｅに希釈した後、軽く混合した。２００ｍｌ接種した場合、ＤＮＡ２５０μｇとＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  Ｍａｘ試薬２５０μｌをそれぞれＯｐｔｉＰＲＯ  ＳＦＭ  ＩＩ培地を用いて４ｍｌのｖｏｌｕｍｅに希釈した後、軽く混合した。それぞれ混合した後、直ちに希釈されたＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  Ｍａｘ試薬溶液をＤＮＡが希釈されている溶液と混合した後、常温で１９分間反応した。常温で１９分間反応している間、前日接種されたＦ２Ｎ細胞を新鮮なＭｏｄｉｆｉｅｄ  ＥＸ−ＣＥＬＬ２９３培地を用いて０．８ｘ１０６個の細胞濃度に希釈し、１９分間反応後、ＤＮＡとＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  Ｍａｘ試薬の混合溶液をＦ２Ｎ細胞に処理することにより、形質感染を進行させた。形質感染の翌日、同量のＥＸ−ＣＥＬＬ２９３培地を形質感染した細胞に添加して７〜８日間培養することにより、単クローン抗体を生産した。
【００９５】
実施例４：ウイルスに対する生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）中和活性の調査
本発明者らが選別した抗体を用いて多様なインフルエンザウイルスに対する生体外中和活性を確認するために、ＭＮ（Ｍｉｃｒｏｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）分析を行った。
【００９６】
実施例４−１：ＭＤＣＫ細胞株の培養とウイルス濃度の決定
ＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ  ｃａｎｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ）は、Ｌｏｎｄｏｎ  ｌｉｎｅ（ＭＤＣＫ−Ｌ）を使用した。ＭＤＣＫ細胞株を１０％のＦＢＳ（Ａｔｌａｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＵＳＡ、Ｆ０５００Ａ）、１Ｘペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｃｉｎｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ；Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ、１５１４０）、２５ｍＭヘペス（ＨＥＰＥＳ；Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ、１５６３０）および２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ；Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ、２５０３０）が含まれたＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ、１１９６５）培地を用いて、３７℃の５％ＣＯ２湿潤（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ）細胞培養器で培養した。
【００９７】
ウイルス濃度は、細胞ベースのＥＬＩＳＡ方法で定量して、ＴＣＩＤ５０（Ｍｅｄｉａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ）を求めた。前記方法は下記のように行われた。まず、ウイルス保存液（Ｖｉｒｕｓ  ｓｔｏｃｋ）をウイルス希釈剤（ｖｉｒｕｓ  ｄｉｌｕｅｎｔ）［ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）、３％ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ、１５２６０）、１Ｘペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｃｉｎｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）、２５ｍＭヘペス（ＨＥＰＥＳ、Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）］で１０倍ずつ連続希釈して、９６ウェルプレートのウェルに１００μｌずつ添加した。陰性対照群（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）としては、ウイルスが含まれていないウイルス希釈剤（ｖｉｒｕｓ  ｄｉｌｕｅｎｔ）を添加した。以後、培養中のＭＤＣＫ細胞株にトリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）を処理して培養容器から分離した後、ＭＤＣＫ培養培地を処理してトリプシンを中和した。リン酸緩衝溶液を用いて２回洗浄した後、ウイルス希釈剤で細胞ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を希釈して、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度に合わせた。ウイルスの入っている９６ウェルプレートに３−４μｇ／ｍｌ  ＴＰＣＫ−トリプシン（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を入れた直後に前記ＭＤＣＫ細胞株を１００μｌずつ添加して、３７℃の５％ＣＯ２湿潤（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ）細胞培養器で２０時間反応させた。反応させたプレートをリン酸緩衝溶液で１回洗浄した後、冷却させたアセトン（ａｃｅｔｏｎｅ）：リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）（８０：２０）の混合液を各ウェルに２００μｌずつ添加して８分間固定（ｆｉｘ）した後、常温で２０分間乾燥した。各プレートにリン酸緩衝溶液をウェルあたり２００μｌ添加して２回洗浄し、ビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）されたａｎｔｉ−ＮＰ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）単クローン抗体（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ、ＭＡＢ８２５７Ｂ）を１％ＢＳＡが含まれたリン酸緩衝溶液（リン酸緩衝溶液、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で２，０００倍希釈して、ウェルあたり１００μｌを添加して、常温で１時間反応させた。ウェルあたり２００μｌのリン酸緩衝溶液で３回洗浄した後、１％ＢＳＡが含まれたリン酸緩衝溶液に２０，０００倍希釈されたストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ）−ＨＲＰ接合抗体をウェルあたり１００μｌずつ添加して、常温で１時間反応させた。リン酸緩衝溶液で４回洗浄した後、ＴＭＢ溶液をウェルあたり１００μｌ添加して、常温で１０分間発色させ、硫酸を処理して反応を終了させた後、ＯＤ４５０を測定した。Ｒｅｅｄ＆Ｍｕｅｎｃｈ（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ１９３８）による方法を利用して測定されたＯＤ４５０からＴＣＩＤ５０を計算した。
【００９８】
実施例４−２：ＭＮ分析法
各抗体は、ウイルス希釈剤を用いて一次的に１０μｇ／ｍｌの濃度に合わせた。この濃度を初期濃度として、さらにウイルス希釈剤を用いて連続的に２倍ずつ希釈して、９６ウェルプレートのウェルあたり５０μｌずつ添加し、１００ＴＣＩＤ５０に相当する濃度のウイルスをウェルあたり５０μｌずつ添加して、３７℃の５％ＣＯ２湿潤（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ）細胞培養器で１時間反応させた。その後、３−４μｇ／ｍｌの濃度のＴＰＣＫ−ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ、Ｔ１４２６）を各ウェルに入れて、さらに１００μｌずつの処理されたＭＤＣＫ細胞株を入れた後、３７℃の５％ＣＯ２湿潤（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ）細胞培養器で２０時間反応させた。２０時間反応させてからの過程は、実施例４−１に言及されたウイルス定量化に利用された方法と同一の方法でＭＮ分析を進行させて、ＯＤ４５０数値を測定した。細胞のみ入れたウェルのＯＤ４５０数値より高い数値を示すウェルは、ウイルス感染したと判断した。各抗体ごとにウイルス抗原が検出されない様々なＯＤ４５０数値のうち抗体の最も低い濃度（μｇ／ｍｌ）を表に示し、抗体の濃度が低ければ低いほど、ウイルスに対する中和活性が高いことを意味する。
【００９９】
Ｈ１サブタイプのインフルエンザＡウイルスに対する特定抗体の中和能力は表１に示し、Ｈ３サブタイプのインフルエンザＡウイルスに対する特定抗体の中和能力は表２に示した。このうち、より効果の良いＣＴ１２０とＣＴ１４９を用いて、多様なグループのインフルエンザＡウイルスを用いてマイクロ中和試験を行った。その結果、ＣＴ１２０は、グループ１のインフルエンザＡウイルスに対して中和効能を示し、ＣＴ１４９は、グループ１の一部とグループ２のインフルエンザＡウイルスに対して中和効能を示した（表３）。
【０１００】
【表１】
2016516090.tif 000002
【０１０１】
【表２】
2016516090.tif 000003
【０１０２】
【表３】
2016516090.tif 000004
【０１０３】
実施例５：ウイルスによる赤血球凝集反応に対する抗体の抑制能力の調査
本発明の抗体は、ウイルスのＨＡを標的とする中和抗体であるので、ＨＡの機能に対してどの作用機序によって中和能を示すかを確認しようとした。ＨＡの機能のうちの１つは、細胞表面の受容体に結合してウイルスが細胞に付着できるようにすることである。これは、赤血球凝集反応で観察できるため、ＨＡによって誘導される赤血球の凝集反応に対して抗体の抑制効果を確認しようとした。このために、ｖ−ｂｏｔｔｏｍの９６ウェルプレート上で抗体を２倍ずつ連続的に希釈し、４倍のＨＡユニットのウイルスを添加して混合させた。混合したプレートを常温で３０分間反応させた後、それぞれのウェルに１％ａｖｉａｎ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌを添加した。血球凝集抑制エンドポイント（ｅｎｄ  ｐｏｉｎｔ）は、凝集反応が観察されない最も低い抗体濃度に決定した。
【０１０４】
その結果、Ｈ１サブタイプのインフルエンザＡウイルスに対する特定抗体（表４）や、Ｈ３サブタイプのインフルエンザＡウイルスに対する特定抗体（表５）とも、ＭＮでは中和効果を見せていたＡ／Ｔｅｘａｓ／０５／２００９とＡ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／１８／２００９、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／０７ウイルスに対して、高濃度（＞２０μｇ／ｍｌ）においても血球凝集を抑制することができなかった。
【０１０５】
【表４】
2016516090.tif 000005
【０１０６】
【表５】
2016516090.tif 000006
【０１０７】
実施例６：抗体による膜融合抑制能力に対する調査
中和抗体の作用機序を調べるために、ＨＡの他の機能である膜融合能力に対して抗体の抑制効果を確認した。ＨＡは、ウイルスがｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓによって細胞内に入った後、低いｐＨ環境に露出すると、ウイルスのｅｎｖｅｌｏｐｅとｅｎｄｏｓｏｍｅの膜融合を誘導してウイルスの遺伝物質が細胞内に浸透できるようにするのに役割を果たす。これをｉｎ  ｖｉｔｒｏで再現すべく、Ａ／ＣＡ／０４／０９（Ｈ１Ｎ１）またはＡ／Ｊａｐａｎ／３０５/１９５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／０７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）由来のＨＡを発現するＣＨＯ細胞株を開発して実験に活用した。各細胞株は、低いｐＨに露出する場合、様々な細胞の細胞膜が融合して多核体（Ｓｙｎｃｙｔｉａ）を形成する。各細胞株を６ウェルプレートにウェルあたり１×１０５個の細胞が入るように分注して、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を入れた後、３７℃の５％ＣＯ２湿潤細胞培養器で２日間培養した。ＰＢＳで洗浄し、ＦＢＳのないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に３０分間培養した後、ＨＡを活性化させるために、４μｇ／ｍｌのＴＰＣＫ−Ｔｒｙｐｓｉｎを入れて５分間処理した後、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２に培地を交換して２０分間培養した。各中和抗体を２０μｇ／ｍｌの濃度で処理した後、３７℃の５％ＣＯ２湿潤細胞培養器で１時間培養した。培養液をＰＢＳで洗浄した後、ｌｏｗ  ｐＨバッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ５．０）を入れて６分間処理した後、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２に培地を交換して１時間培養した。ＰＢＳで洗浄し、メタノールで固定させた後、ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅで染色して、顕微鏡で膜融合の程度を観察した。その結果、ＣＴ１２０は、Ａ／ＣＡ／０４／０９（Ｈ１Ｎ１）またはＡ／Ｊａｐａｎ／３０５/１９５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）のＨＡを発現するＣＨＯ細胞株の膜融合を抑制し、ＣＴ１４９は、Ａ／ＣＡ／０４／０９（Ｈ１Ｎ１）またはＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／０７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）のＨＡを発現するＣＨＯ細胞株の膜融合を抑制した（図５Ａ〜図５Ｄ）。
【０１０８】
したがって、実施例５および６の結果からみて、本発明の抗体は、ＨＡに結合して膜融合を抑制する方法でウイルスに対する中和効果を示すことが確認された。
【０１０９】
実施例７：抗体のＦｃ機能によるウイルス抑制効果に対する調査
実施例７−１：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣ  ａｓｓａｙ
抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を測定するために、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ放出法を利用した。
【０１１０】
インフルエンザＨ１Ｎ１（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９）のＨＡを発現するＣＨＯ  Ｋ１細胞株をターゲット細胞（ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ）として用いるために、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを投入させた。Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭの流入したターゲット細胞にＣＴ１２０、ＣＴ１４９と陰性対照群ＣＴ−Ｐ６（抗−Ｈｅｒ２抗体）を濃度別に処理し、次に、エフェクター細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌ）を処理した。３７℃で４時間反応後、プレートを遠心分離して上層液を不透明プレートに移して蛍光値を測定した。抗体濃度別％細胞毒性は、最大蛍光放出量（ＭＲ、ｍａｘｉｍａｌ  ｒｅｌｅａｓｅ）と自然蛍光放出量（ＳＲ、ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅｌｅａｓｅ）を用いて計算された。
【０１１１】
図６Ａのように、陰性対照群では、抗体濃度による％細胞毒性が現れなかったが、ＣＴ１２０とＣＴ１４９では、処理量が多いほど、高い％細胞毒性、すなわち高いＡＤＣＣ効能を示しており、その程度はＣＴ１２０がより強いと見られた。
【０１１２】
実施例７−２：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＤＣ  ａｓｓａｙ
補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）は、生きている細胞の数に比例して吸光度が高くなるＣＣＫ−８（Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８）を用いて測定した。
【０１１３】
インフルエンザＨ１Ｎ１（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９）のＨＡを発現するＣＨＯ  Ｋ１細胞株をプレートに付着させてターゲット細胞（ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ）として用いた。ターゲット細胞にＣＴ１２０、ＣＴ１４９と陰性対照群ＣＴ−Ｐ６を濃度別に処理し、次に、補体の源泉としてヒト血清を処理した。３７℃で２時間反応後、ＣＣＫ−８を処理して一晩中反応させ、吸光度を測定した。抗体濃度別％細胞毒性は、実験系の最大吸光度と最小吸光度を用いて計算した。
【０１１４】
図６Ｂのように、陰性対照群では、抗体濃度による％細胞毒性が現れなかったが、ＣＴ１２０とＣＴ１４９では、処理量が多いほど、高い％細胞毒性、すなわち高いＣＤＣ効能を示した。
【０１１５】
実施例７−３：マウスＦｃを有するＣＴ１４９抗体の生産
マウスＦｃを有するＣＴ１４９抗体を作るために、マウスＩｇＧ１不変部（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）は、ＮＣＢＩ  データｂａｓｅ上の５つのマウスＩｇＧ１配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｌ２７４３７．１、Ｌ３５０３７．１、ＡＢ０９７８４９．１、Ｑ７２４３２８．１、Ｍ７４５０９９．１）を比較して、他の配列と最もｉｄｅｎｔｉｔｙの高いＡＢ０９７８４９．１の不変部配列を選定した。マウスＩｇＧ２ａ不変部は、ＮＣＢＩ  データｂａｓｅ上の２つのマウスＩｇＧ２ａ配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ７０４２３．１、ＡＢ０９７８４７．１）を比較した時、１ｂｐの差があるものの、アミノ酸の配列は同一であったので、任意にＸ７０４２３．１の不変部配列を選定した。マウスｋａｐｐａ不変部は、ＮＣＢＩ  データｂａｓｅ上の４つのマウスｋａｐｐａ配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ６５５３５．１、ＢＣ０２８５４０．１、ＢＣ０９４０１３．１、ＢＣ００２１１２．１）を比較した時、不変部の配列がすべて同一であることを確認した。
【０１１６】
選定されたマウスＩｇＧ１とＩｇＧ２ａの不変部を合成し、ＣＴ１４９のｈｕｍａｎ可変部（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）とのｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ＰＣＲによりｈｕｍａｎ可変部とマウス不変部を有するｃｈｉｍｅｒｉｃ  ＩｇＧ１重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）を確保した。マウス軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）は、ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＲＮＡからｋａｐｐａ不変部をＲＴ−ＰＣＲした後、ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ＰＣＲによりｈｕｍａｎ可変部とマウス不変部を有するｃｈｉｍｅｒｉｃ軽鎖（ｋａｐｐａ）を確保した後、ＮＣＢＩ  データｂａｓｅにおける配列と同一であることを確認した。
【０１１７】
作られたｃｈｉｍｅｒｉｃ抗体遺伝子をセルトリオン社製発現ベクターにクローニングした後、それぞれＣＨＯ  Ｋ１細胞に導入し、８ｕｇ／ｍｌの濃度のｐｕｒｏｍｙｃｉｎが添加されたＳＦＭ４ＣＨＯ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：ＳＨ３０５４９．０２）培地で培養して、ｓｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅを選別した。選別されたｃｅｌｌ  ｌｉｎｅをｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅして、マウスＦｃを有するＩｇＧ１  ｆｏｒｍとＩｇＧ２ａ  ｆｏｒｍの抗体を生産した。
【０１１８】
実施例７−４：マウスＦｃを有するＣＴ１４９を用いた動物実験
５匹で構成されたマウスの各グループに鼻腔を通して５ＬＤ５０のＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／０９ウイルスを感染２４時間後に腹腔内注射により３ｍｇ／ｋｇの抗体を投与し、生存率を測定した。実験に使用した抗体は、ＣＴ１４９の抗原結合部位とヒトのＦｃあるいはマウス抗体のうちＩｇＧ１あるいはＩｇＧ２ａのＦｃを持っているものを使用した。マウス抗体の場合、ＩｇＧ２ａがＩｇＧ１よりＦｃｇＲに対する親和度が高い（Ｂｒｕｈｎｓ  Ｐ，２０１２，Ｂｌｏｏｄ，１１９（２４）：５６４０−５６４９）。
【０１１９】
実験の結果、図７のように、マウスＩｇＧ２ａのＦｃを持つＣＴ１４９は、他の形態の抗体よりも生存率を増加させた。したがって、本発明の抗体は、生体内においてもＦｃによる効果を示すことを確認することができた。
【０１２０】
実施例８：ＣＴ１２０およびＣＴ１４９抗体のＨ５およびＨ３サブタイプのＨＡ上の結合部位の決定
本発明の抗体がＨＡに結合する部位を決定するために、Ｘ線回折分析法を利用して抗体分節がＨＡ蛋白質上に結合するアミノ酸配列を分析した（図８Ａ、図８Ｂ）。その結果、ＣＴ１２０エピトープの主要構成要素は、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ２サブユニットのへリックス面を中心に位置していた（図８Ａ）。ＣＴ１４９の場合、Ａ／Ａｉｃｈｉ／１９６８（Ｈ３Ｎ２）のＨＡ２サブユニットのヘリックス面を中心に位置しながら、隣接する他の単量体にも結合して、１つのＨＡ三量体において３つのサブユニットにかけて結合した（図８Ｂ）。
【０１２１】
実施例８−１：組換えＨＡ蛋白質の発現
Ｘ線回折分析に使用するための組換えＨＡ蛋白質を生産するために、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）とＡ／Ａｉｃｈｉ／１９６８（Ｈ３Ｎ２）ウイルスのＨＡ遺伝子のｅｃｔｏｄｏｍａｉｎをｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓベクターのｐＡｃＧＰ６７−Ａ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）にそれぞれクローニングした。前記ベクターを用いて作製されたｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓを５−１０ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）でＴｒｉｃｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（Ｈｉｇｈ５）細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合して、２８℃で７２時間感染させた。発現、分泌したＨＡ蛋白質は、培養液を集めてｍｅｔａｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙとｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｇｅｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  １６／６０  ｃｏｌｕｍｎ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）方法で精製した。精製されたＨＡは、結晶を作る前に、３ユニットのトロンビンと４℃で１８時間反応して、Ｃ−末端にあるｆｏｌｄｏｎ／ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｔａｇを除去した。
【０１２２】
実施例８−２：抗体分節の精製
ＣＴ１２０とＣＴ１４９抗体をＰａｐａｉｎ（Ｒｏｃｈｅ  ＲＥＦ＃：１０１０８０１４００１）と１００：１の割合で混合した後、３７℃で１時間処理した後、２０ｍＭ  ＩＡＡ（Ｓｉｇｍａ：Ａ３２２１）を入れて、さらに３７℃で４５分間反応させた。反応液は、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃａｔ  Ｎｏ．１７−５０８７−０１）を用いて２０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２５ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０バッファーに切り替えた後、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃａｔ  Ｎｏ．１７−５４３８−０３）を用いてＦｃ部分を除去し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  ｕｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＲＥＦ＃：ＵＦＣ９０１０９６）を用いて１０ｍｇ／ｍｌの濃度にＦａｂ分節を濃縮した。濃縮されたＦａｂ分節は、ＰＢＳバッファーを用いてｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｇｅｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３００  ＧＬ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ  Ｎｏ：１７−５１７５−０１）を行って、追加の精製を行った。
【０１２３】
実施例８−３：抗体分節とＨＡ蛋白質の同時−結晶化
ＣＴ１２０のＦａｂ分節は三量体形態で、前記実施例７−１の方法で発現精製されたＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ蛋白質と、ＣＴ１４９Ｆａｂ分節は、Ａ．Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）のＨＡ蛋白質と５：１の割合で混合して結晶化した。生成された結晶は、ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｇｅｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３０  ｃｏｌｕｍｎ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌバッファーを用いて分離した後、それぞれ１５ｍｇ／ｍｌと１２ｍｇ／ｍｌの濃度に濃縮した。
【０１２４】
最初の疎行列結晶化スクリーンは、ＴｏｐａｚＴＭ自由界面拡散（Ｆｒｅｅ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ（ＦＩＤ））、（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）結晶化システムを利用した。ＣＴ１２０Ｆａｂ−Ｈ５複合体の初期結晶化条件は、ＰＥＧ６，０００沈殿剤が含まれた様々な条件の溶液で２４時間内に得られており、継続的な結晶最適化作業により回折分析が可能な程度の結晶が作られる条件を確立した。最終的に、２３℃で浮遊液滴蒸気拡散法を利用して１．０μＬのＣＴ１２０−Ｈ５複合体と同じ体積の１０％ＰＥＧ６，０００、１００ｍＭ  Ｎａ  Ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ（ｐＨ６．５）、４００ｍＭ  Ｎａ  Ｆｏｒｍａｔｅを混合することにより、結晶を成長させた。ＣＴ１２０Ｆａｂ−Ｈ５複合体の回折データセットを４．０Åの解像度でＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＰＳ）ＳＥＲ  ＣＡＴ２２−ＩＤビームラインで測定して集めた。ＣＴ１２０Ｆａｂ−Ｈ５の結晶群は、ｐ１原始三斜晶系で結晶化された。
【０１２５】
ＣＴ１４９Ｆａｂ−Ｈ３複合体の初期結晶化条件は、ＰＥＧ３，０００沈殿剤が含まれた様々な条件の溶液で２４時間内に得られており、継続的な結晶最適化作業により回折分析が可能な程度の結晶が作られる条件を確立した。最終的に、２３℃で浮遊液滴蒸気拡散法を利用して１．０μＬのＣＴ１４９Ｆａｂ−Ｈ３複合体を同じ体積の２０％ＰＥＧ３，０００、１００ｍＭ  Ｎａ  Ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ５．５）と混合することにより、結晶を成長させた。ＣＴ１４９Ｆａｂ−Ｈ３複合体の回折データセットを３．５Åの解像度でＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＰＳ）ＳＥＲ  ＣＡＴ２２−ＩＤビームラインで測定して集めた。ＣＴ１４９Ｆａｂ−ＨＡ３の結晶群は、ｐ３１原始三方晶系で結晶化された。
【０１２６】
実施例８−４：Ｘ線回折分析法
データ収集と補正統計は表６に記録した。データプロセッシングとスケーリングには、ＨＫＬ２０００とＤｅｎｚｏプログラムをパッケージで処理した。ＣＴ１２０Ｆａｂ−ＨＡ３複合体とＣＴ１４９Ｆａｂ−ＨＡ３複合体構造は、Ｐｈａｓｅｒプログラムのモレキュラーリプレースメント（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）方法で決定した。モレキュラーリプレイスメント方法で得られたソリューションをＲＥＦＭＡＣ５プログラムを用いてリジッドボディ（Ｒｉｇｉｄ−ｂｏｄｙ）とリストレイン（ｒｅｓｔｒａｉｎｅｄ）補正し、モデルの立て直しはクート（Ｃｏｏｔ）で進行させた。モデルの全般にわたって２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度はよく定義され、構造のリストレイン（ｒｅｓｔｒａｉｎｅｄ）補正はＲＥＦＭＡＣ５により仕上げた。
【０１２７】
【表６】
2016516090.tif 000007
【０１２８】
実施例８−５：構造データの評価と分析
２つの複合体のＨＡ部位の残基は、ＨＡ１、ＨＡ２サブユニットの完全な蛋白質形態を基準としてそれぞれ番号を付与した。構造の評価は、ＰｒｏｃｈｅｃｋとＲＣＳＢ  ＰＤＢ評価サーバを用いて評価した。炭水化物成分の連結性と名付けは、ＰＤＢＣＡＲＥ（Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ）ｓｉｔｅで評価をした。モデルの扱いとＲＭＳＤ計算および距離分子間距離の測定は、クート（Ｃｏｏｔ）とパイモル（Ｐｙｍｏｌ）を利用した。溶剤接近可能表面領域の計算は、ピサ（ＰＩＳＡ）とプロトープ（Ｐｒｏｔｏｒｐ）を利用した。
【０１２９】
実施例９：ＣＴ１４９抗体のＨ７サブタイプのＨＡ上の結合部位の決定
本発明のＣＴ１４９抗体がＨ７サブタイプ（Ｈ７Ｎ９、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３）のＨＡに結合する部位を決定するために、Ｘ線回折分析法を利用して抗体分節がＨＡ蛋白質上に結合するアミノ酸配列を分析した（図８Ｃ）。
【０１３０】
【表７】
2016516090.tif 000008
【０１３１】
実施例１０：表面プラズモン共鳴技術を利用した抗原−抗体親和度の決定
表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）検定（Ｂｉｏｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）は、正反応速度定数および逆反応速度定数の力学的測定により抗体の結合親和度を決定する。
【０１３２】
精製された組換えインフルエンザＨＡ蛋白質に対するＣＴ１２０およびＣＴ１４９抗体の結合は、２５℃で実行緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．００５％界面活性剤Ｐ２０）を使用するＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）装備で表面プラズモン共鳴−基本測定により決定された。１０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ５．０）中に希釈された約５０００ＲＵのａｎｔｉ−６ｘ  ｈｉｓ  ｔａｇ抗体を１μｇ／ｍｌとして、製造会社の指針および手順に従って、標準アミンカップリングキット（Ａｍｉｎｅ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｋｉｔ）を用いてＣＭ５研究用バイオセンサチップに直接的に固定させた。バイオセンサ表面で反応しない部分をエタノールアミン（ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）で遮断した。反応分析のために、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００コントロールソフトウェア、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００エバリュエーションソフトウェアを用いた。ＣＴ１２０とＣＴ１４９抗体は、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液に希釈した。ライゲート（ｌｉｇａｔｅ）として捕獲される組換えインフルエンザＨＡ蛋白質は、１０μｌ／分の流速で反応マトリックス上に注入した。検定の間、すべての測定は、捕獲された組換えインフルエンザＨＡのない捕獲表面を対照群として用いた。結合および分離速度定数Ｋａ（Ｍ−１ｓ−１）およびＫｄ（ｓ−１）は、３０μｌ／分の流速で決定した。速度定数は３倍の希釈シリーズとして、１．２３−１００ｎＭの範囲の相異なる抗原濃度で反応結合測定を実施し、緩衝液のみ含まれた注射液を重複対照群として用いることにより獲得した。次に、抗体と標的抗原との間の反応に対する平衡解離定数ＫＤ（Ｍ）を反応速度定数から次の等式により計算した：ＫＤ＝Ｋｄ／Ｋａ。結合は、時間と反応速度定数の関数を計算して記録する。
【０１３３】
精製された多様なインフルエンザウイルスのＨＡ蛋白質に対してＣＴ１２０とＣＴ１４９の結合親和度を決定した（表８〜表１８）。ＣＴ１２０は、Ｈ１に対してＣＴ１４９に比べて高い結合親和度を示したが、Ｈ３に対しては親和力がないことが明らかになった。ＣＴ１４９は、Ｈ３に対してウイルスのｓｔｒａｉｎによって異なるが、全般的に高い親和度を示した。Ｈ５に対しては、ＣＴ１２０とＣＴ１４９がいずれも高い親和度を示した。Ｈ７に対しては、ＣＴ１２０は親和力がないことが明らかになったが、ＣＴ１４９は高い親和度を示した。
【０１３４】
【表８】
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【０１３５】
【表９】
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【０１３６】
【表１０】
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【０１３７】
【表１１】
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【０１３８】
【表１２】
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【０１３９】
【表１３】
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【０１４０】
【表１４】
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【０１４１】
【表１５】
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【０１４２】
【表１６】
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【０１４３】
【表１７】
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【０１４４】
【表１８】
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【０１４５】
実施例１１：Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＥＬＩＳＡ（ＣＥＬＩＳＡ）方法
抗体のＨＡに対する結合力は、Ｈ１、Ｈ３またはＨ５由来のＨＡを発現する細胞株を用いてＣＥＬＩＳＡ方法で確認した。Ｈ１発現細胞株は、Ａ／ＣＡ／０４／０９ウイルスのＨＡ遺伝子情報を利用して遺伝子を合成した後、発現ベクターに入れてＣＨＯ−Ｋ１細胞株に入れた後、発現する細胞を選別した。Ｈ３発現細胞株は、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／０７ウイルスのＨＡ遺伝子情報を利用して確立した。Ｈ５発現細胞株は、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４ウイルスのＨＡ遺伝子情報を利用して確立した。各ＨＡ発現細胞株は、１０％ウシ血清が含まれたＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃の５％ＣＯ２湿潤（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ）細胞培養器で培養された。培養された細胞株は、トリプシンで細胞培養容器から分離した後、培養培地で中和し、遠心分離して、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度に培養培地に希釈した。希釈された細胞培養液１００μｌを９６ウェルプレートに入れて、１８時間、３７℃の５％ＣＯ２湿潤細胞培養器で培養して、９６ウェルプレートに付着させた。培養後、各ウェルを２００μｌの冷たいＰＢＳ溶液で２回洗浄した後、３．７％ホルムアルデヒド（Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）溶液１５０μｌを入れて、常温で１５分間反応させて細胞を固定した。各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液２００μｌで３回洗浄した後、希釈バッファー（ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ；ＴＥＫＮＯＶＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ５１２０）２００μｌを入れて、常温で６０分間ブロッキングした。各抗体試料（ＣＴ１２０またはＣＴ１４９）の濃度（ｕｇ／ｍｌ）を希釈バッファーで４倍ずつ段階別に希釈した後、抗体試料を各ウェルに１００μｌずつ入れて、常温で６０分間反応した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液２００μｌで３回洗浄した後、ＨＲＰが結合された抗−ヒトｋａｐｐａチェーン抗体を希釈バッファーに１０００倍希釈して、１００μｌずつ各ウェルに入れて、常温で４０分間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液２００μｌで３回洗浄した後、ＴＭＢ溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｔ０４４０）１００μｌを入れて、常温で６分間反応させ、１Ｎ硫酸１００μｌを入れて反応を中止させた後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１４６】
その結果、ＣＴ１２０とＣＴ１４９はそれぞれ、Ｈ１とＨ５のＨＡを発現する細胞株に結合し、これらを１：１で混合したＣＴ−Ｐ２７の場合、類似する結合力を示した（図９のＡ、図９のＣ）。ＣＴ１４９は、Ｈ３のＨＡを発現する細胞株を用いたＣＥＬＩＳＡで結合能を示したが、ＣＴ１２０は結合することができなかった。ＣＴ−Ｐ２７の場合、ＣＴ１４９に似た程度の結合力を示すことからみて、ＣＴ１２０は、ＣＴ１４９の結合を阻害しないことが分かった（図９のＢ）。
【０１４７】
実施例１２：混合前後による抗体のインフルエンザＡウイルスに対する中和活性
ＣＴ１２０とＣＴ１４９を１：１の割合で混合してＣＴ−Ｐ２７と名付け、実施例４のマイクロ中和試験法を変形して多様なインフルエンザウイルスのサブタイプに対してＥＣ５０値を求めた。ＥＣ５０値を求めるためには、 抗体 の初期濃度を８００〜６４００μｇ／ｍｌに合わせた後、連続的に４倍ずつ希釈して感染ウイルスを用意した。ＯＤ４５０数値を測定した後には、ウェルから培地のみを入れた時に出る基底値を差し引いた後、Ｓｉｇｍａ  ｐｌｏｔプログラムを用いて濃度に応じた４−パラメータグラフを描き、最高ＯＤ４５０数値から５０％減少する時の濃度を求めてＥＣ５０値を導出した。
【０１４８】
ＥＣ５０は、抗体がウイルスに対して最大中和活性の５０％を示す抗体の濃度であって、数値が低ければ低いほど、抗体の中和活性が高いことを意味する。
【０１４９】
実験の結果、ＣＴ１２０とＣＴ１４９はそれぞれ、そもそも中和活性を示していたウイルスに対して似た様相の中和能力を示しており、２つの抗体を混合した場合、干渉効果なしに効果のある抗体の中和能力を示した。したがって、ＣＴ１２０とＣＴ１４９を混合して使用する場合、グループ１とグループ２のインフルエンザＡウイルスに対してすべて中和効果を示した（表１９）。
【０１５０】
【表１９】
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実施例１３：動物実験を通した混合抗体のインフルエンザＡウイルスに対する予防および治療効果
ＣＴ１２０抗体とＣＴ１４９抗体をそれぞれ投与したり、混合して投与した場合、インフルエンザＡウイルスに対してマウスで予防および治療効果を有するかを調べるために、マウスの生存率実験を進行させた。５−１０匹で構成されたマウスの各グループに鼻腔を通して５−１０ＬＤ５０のインフルエンザウイルスを感染させた。抗体はｋｇあたり７．５ｍｇまたは１５ｍｇ、３０ｍｇの量をウイルス感染２４時間前、またはウイルス感染後２４時間後に腹腔内注射によりマウスに投与された。ＣＴ−Ｐ２７は、ＣＴ１２０とＣＴ１４９を１：１で混合して総量を表示したので、各成分は表示される量の半分に等しい。
【０１５１】
実験の結果、ＣＴ−Ｐ２７は、ＣＴ１２０とＣＴ１４９抗体の各効能を維持し、混合による干渉効果は現れなかった。
【０１５２】
１３−１．混合抗体のＨ１Ｎ１に対する予防および治療効果
５−１０匹で構成されたマウスの各グループに鼻腔を通して５−１０ＬＤ５０のＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／０９ウイルスを感染させる２４時間前、または感染２４時間後に腹腔内注射により抗体を投与して、生存率を測定した。
【０１５３】
実験の結果、図１０のように、ＣＴ１２０とＣＴ１４９、ＣＴ−Ｐ２７抗体をウイルス感染２４時間前に投与した場合、濃度にかかわらず、すべてのマウスが実験終了時まで生存した。感染２４時間後に投与した場合、ＣＴ１２０とＣＴ１４９、ＣＴ−Ｐ２７はいずれも投与抗体濃度が増加するに伴って生存率が増加した。ＣＴ１２０の場合、ＣＴ１４９に比べてもう少し生存率を増加させた。ＣＴ−Ｐ２７の場合、ＣＴ１２０とＣＴ１４９との合計に似た生存率を示しており（ａｄｄｉｔｉｖｅ効果）、混合による効能の低下は生じないことが観察された。
【０１５４】
１３−２．混合抗体のＨ３Ｎ２に対する予防および治療効果
５−１０匹で構成されたマウスの各グループに鼻腔を通して１０ＬＤ５０のＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／０７または５ＬＤ５０のＡ／Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ／２／８２ウイルスを感染させた。感染２４時間前または２４時間後に腹腔内注射により抗体を投与して、生存率を測定した。
実験の結果、図１１のように、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／０７ウイルス感染２４時間前に抗体を投与した時、ＣＴ１２０は生存率に寄与しなかったのに対し、ＣＴ１４９とＣＴ−Ｐ２７抗体投与群は、濃度にかかわらず、すべてのマウスが実験終了時まで生存した。Ａ／Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ／２／８２ウイルスを感染させ、２４時間後に抗体を投与した場合、ＣＴ１２０抗体は生存率に寄与しなかったが、ＣＴ１４９とＣＴ−Ｐ２７の場合、濃度が増加するに伴って生存率が増加した。ＣＴ−Ｐ２７の場合、構成成分中のＣＴ１４９抗体の濃度だけの生存率を示して、ＣＴ１２０とＣＴ１４９の混合による干渉効果はないことが明らかになった。
【０１５５】
１３−３．混合抗体のＨ５Ｎ１に対する治療効果
５−１０匹で構成されたマウスの各グループに鼻腔を通して１０ＬＤ５０のＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４ウイルスを感染させ、２４時間後に腹腔内注射により抗体を投与して、生存率を測定した。
実験の結果、図１２のように、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４ウイルスを感染させ、２４時間後に抗体を投与した場合、濃度にかかわらず、すべてのマウスが実験終了時まで生存した。
【０１５６】
１３−４．ＣＴ１４９抗体のＨ７Ｎ９に対する治療効果
１０匹で構成されたマウスの各グループに鼻腔を通して１０６ＰＦＵのＡ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３ウイルスを感染させ、感染２４時間後に腹腔内注射により抗体を投与して、生存率を測定した。
実験の結果、図１３のように、陰性対照用抗体を投与した場合、３日後からマウスが死に始めて７日後にすべてのマウスが死亡した。これに対し、ＣＴ１４９抗体を感染２４時間後に投与した場合には、投与抗体濃度が増加するに伴って生存率が増加した。
【０１５７】
実施例１４：混合抗体と化学的化合物の併用投与効果
５匹で構成されたマウスの各グループに鼻腔を通して５ＬＤ５０のｍｏｕｓｅ  ａｄａｐｔｅｄ  Ａ／ＣＡ／０４／０９または５ＬＤ５０のＡ／Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ／２／８２ウイルスを感染させた。感染２４時間後に腹腔内注射によりノイラミニダーゼ抑制剤のペラミビル（Ｐｅｒａｍｉｖｉｒ）を１回（ｘ１）または５日連続（ｘ５）投与したり、様々な濃度の抗体を単独またはペラミビルと併用投与して、生存率を測定した。
【０１５８】
実験の結果、図１４のＡのように、Ａ／ＣＡ／０４／０９ウイルス感染２４時間後に１５ｍｇペラミビルまたは１ｍｇ  ＣＴ１２０を単独で投与した時には、生存率がそれぞれ４０％と２０％であったが、１５ｍｇペラミビルと１ｍｇ  ＣＴ１２０を併用投与した時、８０％というはるかに良い生存率を示した。同様に、図１４のＢのように、Ａ／Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ／２／８２ウイルスを感染させ、２４時間後に１５ｍｇのペラミビルを単独投与した時には、４０％の生存率を示し、１ｍｇのＣＴ１４９の場合、８日目にすべてのマウスが死亡したのに対し、ペラミビルとＣＴ１４９を併用投与した時には、８０％というはるかに良い生存率を示した。単独投与の場合、最適化されていない濃度であるので、高い死亡率を示したのに対し、併用投与の場合、亢進効果（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ）を示した。
【０１５９】
実施例１５：混合抗体のノイラミニダーゼ抑制剤抵抗性Ｈ７Ｎ９突然変異Ｒ２９２Ｋに対する中和効果
ウイルスＡ／上海／２／２０１３とＡ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３に対して、ＣＴ１４９（ＣＴ−Ｐ２３）とＣＴ−Ｐ２７のｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和実験により、当該ウイルスの感染力に対する中和能試験を行った。実施例４で記述したように実験を行い、これに対する結果を図１５に示した。ＣＴ１４９とＣＴ−Ｐ２７とも当該ウイルスに対して中和能を示し、ＩＣ５０値は図１５に表示した。
【０１６０】
ウイルスＡ／上海／１／２０１３（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）とその突然変異型（Ｒ２９２Ｋ）に対しても同様に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和実験によりその効能を検定した。実施例４で記述したように実験を行い、これに対する結果を図１６Ａ、図１６Ｂにそれぞれ示した。ＣＴ１４９とＣＴ−Ｐ２７とも当該ウイルスに対して中和能を示し、ＩＣ５０値は表２０に表示した。
【０１６１】
【表２０】
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【０１６２】
実施例１６：混合抗体のノイラミニダーゼ抑制剤抵抗性Ｈ１Ｎ１突然変異Ｈ２７５Ｙに対する中和効果
ＣＴ１２０単独、そしてＣＴ１２０（ＣＴ−Ｐ２２）とＣＴ１４９（ＣＴ−Ｐ２３）を１：１の割合で混合してＣＴ−Ｐ２７と名付け、実施例４のマイクロ中和試験法を利用してノイラミニダーゼ抑制剤抵抗性Ｈ１Ｎ１突然変異Ｈ２７５Ｙに対するＥＣ５０値を求めた。ＥＣ５０値を求めるためには、 抗体の初期濃度を、ＣＴ１２０の場合に８００μｇ／ｍｌ、ＣＴ−Ｐ２７の場合に４００μｇ／ｍｌに合わせた後、連続的に４倍ずつ希釈して感染ウイルスを用意した。ＯＤ４５０数値を測定した後には、ウェルから培地のみを入れた時に出る基底値を差し引いた後、Ｓｉｇｍａ  ｐｌｏｔプログラムを用いて濃度に応じた４−パラメータグラフを描き、最高ＯＤ４５０数値から５０％減少する時の濃度を求めてＥＣ５０値を導出した。
【０１６３】
ＥＣ５０は、抗体がウイルスに対して最大中和活性の５０％を示す抗体の濃度であって、数値が低ければ低いほど、抗体の中和活性が高いことを意味する。
【０１６４】
実験の結果（図１７Ａ、図１７Ｂ）、ＣＴ１２０とＣＴ−Ｐ２７はそれぞれ、ノイラミニダーゼ抑制剤抵抗性Ｈ１Ｎ１突然変異Ｈ２７５Ｙウイルスに対して中和能力を示し、特に２つの抗体を混合した場合（ＣＴ−Ｐ２７）、干渉効果なしに効果のある抗体の中和能力を示した。
【０１６５】
実施例１７：混合抗体のＨＡ突然変異に対する結合能力
文献調査によれば、ＣＴ１４９に類似してグループ２に対して中和効果を示すＣＲ８０２０抗体の場合、自然的に現れるＨＡ  Ｄ１９Ｎ変異体に対して低い結合力を示した（Ｅｋｉｅｒｔ  ＤＣ．ｅｔ．ａｌ．２０１１，Ｓｃｉｅｎｃｅ３３３（６０４４）：８４３−５０）。そこで、ＣＴ１４９が結合するＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／０５（Ｈ３Ｎ２）とＡ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）のＨＡに人為的にＤ１９Ｎ突然変異を導入したＨＡを発現するＣＨＯ細胞株を作り、ＣＴ１４９を用いて免疫蛍光染色を行った。
【０１６６】
その結果、そもそも結合力のないＣＴ１２０は、全くＣＨＯ細胞を染色させることができなかったのに対し、ＣＴ１４９は、ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅはもちろん、Ｄ１９Ｎ突然変異の導入されたＨＡが発現したＣＨＯ細胞をすべて良く染色した。（図１８Ａ、図１８Ｂ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2016516090.tif 000039
【図１４】
2016516090.tif 000040
【図１５】
2016516090.tif 000041
【図１６Ａ−Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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