(57)【要約】本発明は、一般に、ゲノムのすべてまたは実質的にすべてのメチル化状態を含むメチロームを解明するための組成物および方法に関する。特に、それぞれが対象ターゲット核酸内の各ＣＧジヌクレオチド対のシトシン位置の、可能性のあるほぼあらゆるメチル化状態を提示する複数のオリゴヌクレオチド、およびそれら複数を使用する方法を本発明において提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲット生物のバイサルファイト変換ゲノム核酸試料の少なくとも一部にハイブリダイズすることができる複数のオリゴヌクレオチドであって、それぞれがターゲット生物の非変換ゲノム核酸中のシトシン−グアニンジヌクレオチド対に対して相補的なジヌクレオチド対の各位置において各シトシン相補位置にゆらぎ塩基を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
ゆらぎ塩基を、オリゴヌクレオチド合成中にヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）類の等モル混合物を用いて取り込ませる、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
各オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドのいずれかの末端または両方の末端にさらにアダプター配列を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドが支持体固定されている、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
少なくともサブセットのオリゴヌクレオチドが、非変換ゲノム核酸中のチミン一塩基多型（ＳＮＰ）を非メチル化シトシンから識別することができる、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
複数のフィーチャーを含み、各フィーチャーが、ターゲット生物のバイサルファイト変換ゲノム核酸試料の少なくとも一部にハイブリダイズすることができる複数の支持体固定オリゴヌクレオチドを含み、各オリゴヌクレオチドがターゲット生物の非変換ゲノム核酸中のシトシン−グアニンジヌクレオチド対に対して相補的なジヌクレオチド対の各位置において各シトシン相補位置にゆらぎ塩基を含む、ハイブリダイゼーションアレイ。
【請求項７】
ゆらぎ塩基を、オリゴヌクレオチド合成中にｄＮＴＰ類の等モル混合物を用いて取り込ませる、請求項６に記載のアレイ。
【請求項８】
各オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドのいずれかの末端または両方の末端にさらにアダプター配列を含む、請求項８に記載のアレイ。
【請求項９】
バイサルファイト変換ターゲット核酸配列内のメチル化塩基を同定するための方法であって、下記の工程を含む方法：
（ａ）複数のオリゴヌクレオチドをバイサルファイト変換核酸試料に接触させる；ここで、各オリゴヌクレオチドはターゲット生物のバイサルファイト変換ゲノム核酸試料の少なくとも一部にハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチドはターゲット生物の非変換ゲノム核酸中のシトシン−グアニンジヌクレオチド対に対して相補的なジヌクレオチド対の各位置において各シトシン相補位置にゆらぎ塩基を含み、その接触によってバイサルファイト変換ターゲット核酸分子が複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部とのハイブリダイゼーション複合体中にキャプチャーされる；
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体を、結合していない核酸分子および非特異的に結合した核酸分子から分離する；
（ｃ）キャプチャーされたバイサルファイト変換ターゲット核酸分子をハイブリダイゼーション複合体から溶離する；
（ｄ）溶離したバイサルファイト変換ターゲット核酸配列をシークエンシングする；そして
（ｅ）溶離したバイサルファイト変換ターゲット核酸配列のメチル化塩基を同定し、ここで、同定はターゲット生物の非変換ゲノム核酸を溶離したバイサルファイト変換ターゲット核酸配列と比較することを含み、その際、溶離したバイサルファイト変換ターゲット核酸配列中の対応する位置がチミンであれば非変換ゲノム核酸のシトシンがメチル化されていないと同定し、溶離したバイサルファイト変換ターゲット核酸配列中の対応する位置がシトシンであれば非変換ゲノム核酸のシトシンがメチル化されていると同定する。
【請求項１０】
ゆらぎ塩基を、オリゴヌクレオチド合成中にｄＮＴＰ類の等モル混合物を用いて取り込ませる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
さらに、溶離したバイサルファイト変換ターゲット核酸配列をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ターゲット核酸配列がゲノムＤＮＡである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
接触をバイサルファイト変換Ｃ０ｔ１  ＤＮＡの存在下で行なう、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチドが支持体固定されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
さらに、非変換ゲノム核酸中のチミン一塩基多型（ＳＮＰ）を非メチル化シトシンから識別することを含む、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、ゲノムのすべてまたは実質的にすべてのメチル化状態を含むメチローム(methylome)を解明するための組成物および方法に関する。特に、本発明は、対象ターゲット核酸の各ＣＧジヌクレオチド対のシトシン位置のメチル化状態を同定するための複数のオリゴヌクレオチド、およびそれら複数を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シトシン−グアニン（ＣＧ）ジヌクレオチド対のグアニンに隣接するシトシンの複製後メチル化を解明するためのゴールドスタンダードプロトコルは、バイサルファイト変換に続くＤＮＡシークエンシングである。対象核酸内の各ＣＧジヌクレオチド対のシトシン位置のメチル化状態はその分子の配列に従って異なり、０％メチル化（すなわち、そのようなシトシンはすべてバイサルファイト処理を受けやすい）と１００％メチル化（すなわち、そのようなシトシンはいずれもバイサルファイト処理を受けにくい）の間のいずれかのレベルで存在する可能性がある。したがって、真核細胞ゲノム（たとえば、ヒトゲノム）全体において、多数の潜在メチル化状態が変動する可能性がある。ゲノムＤＮＡ試料中のすべてのメチル化占有状態を同定するためには、バイサルファイト変換ゲノムＤＮＡにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドのセットはあらゆる潜在メチル化状態を提示するものでなければならないであろう。
【０００３】
ＤＮＡメチル化パターンを一塩基分析で、ただしゲノムワイドスケールで解明できる方法が、当技術分野で依然として求められている。メチル化占有状態をゲノムワイドスケールで同定し、かつ一塩基多型を非メチル化塩基から識別できる方法も、依然として求められている。
【発明の概要】
【０００４】
したがって、本発明は、ターゲット生物のバイサルファイト変換ゲノム核酸試料の少なくとも一部にハイブリダイズすることができる複数のオリゴヌクレオチドであって、それぞれがターゲット生物の非変換ゲノム核酸中のシトシン−グアニンジヌクレオチド対に対して相補的なジヌクレオチド対の各位置において各シトシン相補位置にゆらぎ塩基(wobble base)を含むオリゴヌクレオチドに関する。ゆらぎ塩基は、オリゴヌクレオチド合成中にヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）類の等モル混合物を用いて取り込ませることができる。その際、ｄＮＴＰ類の等モル混合物はデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）およびデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）を含む。そのｄＮＴＰ類の等モル混合物は、さらにデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、またはデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）を含むことができる。
【０００５】
複数のオリゴヌクレオチド内の各オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端または両方の末端にさらにアダプター配列を含むことができる。アダプター配列は、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端または両方の末端にさらにビオチンまたは発蛍光団を含むことができる。当技術分野で知られているように、複数のオリゴヌクレオチドは支持体固定されていてもよい。
【０００６】
１態様において、少なくともサブセットのオリゴヌクレオチドは、非変換ゲノム核酸中のチミン一塩基多型（ＳＮＰ）を非メチル化シトシンから識別することができる。
第２の側面では、本発明は、複数のフィーチャー(feature)を含み、各フィーチャーがターゲット生物のバイサルファイト変換ゲノム核酸試料の少なくとも一部にハイブリダイズすることができる複数の支持体固定オリゴヌクレオチドを含み、各オリゴヌクレオチドがターゲット生物の非変換ゲノム核酸中のシトシン−グアニンジヌクレオチド対に対して相補的なジヌクレオチド対の各位置において各シトシン相補位置にゆらぎ塩基を含む、ハイブリダイゼーションアレイを提供する。
【０００７】
そのようなアレイについて、ゆらぎ塩基は、オリゴヌクレオチド合成中にｄＮＴＰ類の等モル混合物を用いて取り込ませることができる。そのｄＮＴＰ類の等モル混合物は、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）およびデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）を含むことができる。さらに、そのｄＮＴＰ類の等モル混合物は、さらにデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、またはデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）を含むことができる。
【０００８】
そのようなアレイ内の各オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端または両方の末端にさらにアダプター配列を含むことができる。そのアダプター配列は、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端または両方の末端にさらにビオチンまたは発蛍光団を含むことができる。
【０００９】
１態様において、そのようなアレイのうち少なくともあるオリゴヌクレオチドは、ターゲット生物の非変換ゲノム核酸中のシトシン−グアニンジヌクレオチド対に対して相補的なジヌクレオチド対のメチル化塩基を同定することができる。特に、少なくともサブセットのオリゴヌクレオチドは、非変換ゲノム核酸中のチミン一塩基多型（ＳＮＰ）を非メチル化シトシンから識別することができる。
第３の側面では、本発明は、バイサルファイト変換ターゲット核酸配列内のメチル化塩基を同定するための方法であって、下記の工程を含む方法に関する：
（ａ）複数のオリゴヌクレオチドをバイサルファイト変換核酸試料に接触させる；各オリゴヌクレオチドはターゲット生物のバイサルファイト変換ゲノム核酸試料の少なくとも一部にハイブリダイズすることができ、各オリゴヌクレオチドはターゲット生物の非変換ゲノム核酸中のシトシン−グアニンジヌクレオチド対に対して相補的なジヌクレオチド対の各位置において各シトシン相補位置にゆらぎ塩基を含み、それによってこの接触によりバイサルファイト変換ターゲット核酸分子が複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部とのハイブリダイゼーション複合体中にキャプチャーされる；
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体を、結合していない核酸分子および非特異的に結合した核酸分子から分離する；
（ｃ）キャプチャーされたバイサルファイト変換ターゲット核酸分子をハイブリダイゼーション複合体から溶離する；
（ｄ）溶離したバイサルファイト変換ターゲット核酸配列をシークエンシングする；そして
（ｅ）溶離したバイサルファイト変換ターゲット核酸配列のメチル化塩基を同定し、その際、同定はターゲット生物の非変換ゲノム核酸を溶離したバイサルファイト変換ターゲット核酸配列と比較することを含み、その際、溶離したバイサルファイト変換ターゲット核酸配列中の対応する位置がチミンであれば非変換ゲノム核酸のシトシンをメチル化されていないと同定し、溶離したバイサルファイト変換ターゲット核酸配列中の対応する位置がシトシンであれば非変換ゲノム核酸のシトシンをメチル化されていると同定する。
【００１０】
ゆらぎ塩基は、オリゴヌクレオチド合成中にｄＮＴＰ類の等モル混合物を用いて取り込ませることができる。そのｄＮＴＰ類の等モル混合物はデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）およびデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）を含むことができ、さらにデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、またはデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）を含むこともできる。
【００１１】
本発明による方法は、さらに、溶離したバイサルファイト変換ターゲット核酸配列をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する工程を含むことができる。
ターゲット核酸配列は通常はゲノムＤＮＡであるが、例外的な場合には他のＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。
【００１２】
接触工程ａ）は、非特異的な偽塩基対合を避けるためにバイサルファイト変換Ｃ０ｔ１  ＤＮＡの存在下で行なうことができる。そのバイサルファイト変換Ｃ０ｔ１  ＤＮＡとターゲット生物は同一種であってもよい。
【００１３】
１態様において、各オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端または両方の末端にさらにアダプター配列を含む。そのアダプター種は、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端または両方の末端に標識、たとえばビオチンまたは発蛍光団を含むことができる。
【００１４】
さらに、新規方法は非変換ゲノム核酸中のチミン一塩基多型（ＳＮＰ）を非メチル化シトシンから識別する工程を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明に用いるワークフローの態様を示す。
【図２】図２は、ＤＮＡのバイサイファイト変換を示す。
【図３】図３は、特定領域についての天然配列、ｎｍｅプローブ（ＣｐＧアイランドのシトシンが変換されている）、ｍｅプローブ（シトシンは無変化のままである）、および可能性があるあらゆる組合わせからなるゆらぎプールを示す。
【図４】図４は、全ゲノムシークエンシングを用いるメチル化データ（図４Ａ）と本発明のキャプチャープローブおよびプロトコルを用いて得られたデータ（図４Ｂ）との比較を示す。
【図５】ＮＡ０４６７１細胞系に本発明のバイサルファイトシークエンシングを用いるターゲテッドエンリッチメントを施した例を示す。図５Ａ：カバレージメトリクスの深度；図５Ｂ：再現性（メチル化率をｒ−二乗したもの）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、生物の全ゲノムのメチル化状態、すなわち生物の“メチローム(methylome)”のゲノムワイドマッピングのための方法および組成物に関する。本発明は、少なくとも一部は、それぞれ対象ターゲット核酸内の各ＣＧジヌクレオチド対のシトシン位置の、可能性のあるほぼあらゆるメチル化状態を提示する複数のオリゴヌクレオチドを作製する方法を本発明者らが見出したことに基づく。ＣＧジヌクレオチドはゲノム全体に均一に分布しているのではなく、反復ゲノム配列の領域およびＣｐＧ“アイランド”に集中し、それらは一般に遺伝子プロモーターに付随する。真核細胞ゲノムのように大きなバイサルファイト変換核酸試料を含めた長いバイサルファイト変換核酸試料中の可能性のあるすべてまたはほぼすべてのメチル化部位を解明するのに十分なほど包括的である複数のオリゴヌクレオチドを得るためには、一般的なプローブ合成プロトコルの使用は技術的または経済的に実現可能ではなかったので、この本発明者らの知見および本明細書に提示する本発明は特に重要である。
【００１７】
組成物
したがって、１観点において、本発明は複数のオリゴヌクレオチドを提供する。好ましい態様において、複数のオリゴヌクレオチドはターゲット生物のバイサルファイト変換ゲノム核酸試料の少なくとも一部にハイブリダイズすることができる。ある場合には、各オリゴヌクレオチドはターゲット生物の非変換ゲノム核酸中のシトシン−グアニンジヌクレオチド対に対して相補的なジヌクレオチド対の各シトシン相補位置にゆらぎ塩基を含む。本明細書中で用いる用語“ゆらぎ塩基(wobble base)”は、２種類以上のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の既知の等モル混合物（たとえば、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）およびデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）を含むｄＮＴＰ類の等モル混合物）の存在下で合成した際にオリゴヌクレオチドの特定位置に取り込まれた選択的塩基(alternative base)を表わす。
【００１８】
本発明において提供される複数のオリゴヌクレオチドは二本鎖または一本鎖のオリゴヌクレオチドであってもよい。好ましくは、複数のオリゴヌクレオチドは支持体固定される。たとえば、本発明のオリゴヌクレオチドは、支持体（たとえば、固体支持体）上で、たとえばマスクレス・アレイ・シンセサイザー(maskless array synthesizer)（ＭＡＳ）を用いて合成することができる(U.S. Pat. No. 6,375,903に記載)。ＭＡＳは、固体支持体上でのオリゴヌクレオチド配列の直接的な in situ 合成を提供する。したがって、発生期オリゴヌクレオチドが支持体固定される。一般に、ＭＡＳベースのオリゴヌクレオチド合成技術は、４００万を超える固有オリゴヌクレオチドを標準的な顕微鏡スライドのきわめて小さな領域で並行合成することを可能にする。
【００１９】
ある場合には、オリゴヌクレオチドはさらにアダプター配列を含むことができる。アダプター配列は、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端または両方の末端にある。ある場合には、アダプター配列はビオチンを含むことができる。他の場合には、アダプター配列は発蛍光団を含むことができる。好ましくは、アダプター配列は精製および増幅用に、ならびにシークエンシング用に構成できる。
【００２０】
他の観点において、本発明は複数のフィーチャーを含むハイブリダイゼーションアレイを提供する。本明細書中で用いる用語“フィーチャー(feature)”（単数または複数）は、オリゴヌクレオチドが合成されるアレイ上の特定位置を表わす。ある場合には、アレイの各フィーチャーで１種類のヌクレオチド配列が合成される（すなわち、多数のプローブを各フィーチャーにおいて合成することができるが、そのフィーチャーにおけるすべてのプローブが同じヌクレオチド配列をもつ）。他の場合には、アレイの１つのフィーチャー内に異なる配列のオリゴヌクレオチドが存在することができる。これらのオリゴヌクレオチドの比率および方向（５’−３’、または３’−５’）を制御できる。
【００２１】
好ましい態様において、マスクレス・アレイ・シンセサイザー（ＭＡＳ）は固体支持体上でのオリゴヌクレオチド配列の直接的な in situ 合成を提供する。一般に、ＭＡＳベースのオリゴヌクレオチド  マイクロアレイ合成法は、標準的な顕微鏡スライドガラスなどの固体支持体上の数百万の固有オリゴヌクレオチド  フィーチャーにおける並行オリゴヌクレオチド合成を可能にする。
【００２２】
バイサルファイト変換ターゲット核酸のワトソン(Watson)（フォワード、非相補）鎖およびクリック(Crick)（リバース、相補）鎖に対するオリゴヌクレオチドを得ることが目的である場合、下記のオリゴヌクレオチド設計プロトコルのうち１以上を使用できる。完全非メチル化試料に対するオリゴヌクレオチドを作製するためには、各オリゴヌクレオチドのすべてのシトシンをチミンに交換する。完全メチル化試料に対するオリゴヌクレオチドを作製するためには、ＣＧジヌクレオチド対内にあるもの以外のすべてのシトシンをチミンに交換する。非相補的リバース鎖にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドについては、シトシンを前記に従って改変し、続いて各オリゴヌクレオチド配列を逆相補的に元のクリック鎖へ戻す。ゆらぎ塩基を取り込ませるためには、グアニンに隣接しないすべてのシトシンをチミンに改変し、各例それぞれの場合のＣＧジヌクレオチド対を“ＹＧジヌクレオチド対”で置き換える；ここで、Ｙはその位置のシトシンまたはチミン／ウラシルのいずれかについての国際純正・応用化学連合(International Union of Pure and Applied Chemistry)（ＩＵＰＡＣ）コードを表わす。このＩＵＰＡＣコードは、核酸の多義表記を可能にする１６文字コードである。このコードは、核酸（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ／Ｕ）についての単一表記を含む状態を表わすことができ、あるいは２、３または４つの可能な核酸状態の多義性を可能にする。
【００２３】
本発明において提供する組成物は、たとえばバイサルファイト変換ターゲット核酸のメチル化塩基を同定するために有用である。酸性条件下で、亜硫酸ナトリウムは求核攻撃に際してシトシンを優先的に脱アミンしてウラシルにし、一方、５−メチルシトシン上のメチル基はそのアミノ基を脱アミンから保護する。その結果、メチル化シトシンはこれらの条件下で変換されない。したがって、バイサルファイト変換ＤＮＡ（たとえば、バイサルファイト変換ゲノムＤＮＡ）をシークエンシングし、非変換核酸の各シトシン−グアニン（ＣＧ）ジヌクレオチド対のシトシン位置を対象バイサルファイト変換核酸の配列中の対応する位置の塩基と比較することにより、元のメチル化状態を分析することができる。ターゲット生物の非変換ゲノム核酸と比較すると、調べたターゲット生物のバイサルファイト変換ＤＮＡ試料中に残るシトシン塩基はそのゲノム中のメチル化シトシンの指標となる。
【００２４】
好ましい態様において、亜硫酸ナトリウムを用いてシトシン−グアニン（ＣＧ）ジヌクレオチド対の非メチル化シトシン塩基をウラシルに変換する。亜硫酸ナトリウムはＮａＨＳＯ３とＮａ２Ｓ２Ｏ５の混合物であってもよい。ある場合には、バイサルファイト変換のために亜硫酸マグネシウムを使用できる。ある場合には、他の化合物を用いてシトシンをウラシルに変換することができる。たとえば、求核性有機硫黄化合物（たとえば、Ｘ２−Ｓ（Ｏ）−Ｘ１，ここでＸはメタノール、エタノール、または（ＣＨ２）５である）をバイサルファイトの代わりに使用できる。適切なモノ置換硫黄求核試薬には、限定ではなく、亜硫酸モノメチルエステル（たとえば、亜硫酸モノメチル）、亜硫酸メチルナトリウム、亜硫酸水素フェニル、亜硫酸フェニルナトリウム、メチル亜硫酸またはエチル亜硫酸が含まれる。他の可能な物質には、ビス置換硫黄求核試薬、たとえば亜硫酸ジメチルエステル、メタンスルフィニルメタン、２−メチル−プロパン−２−スルフィン酸ジエチルアミド、［１，３，２］ジオキサチオラン  ２−オキシド、および２，５−ジエチル  ［１，２，５］チアジアゾリジン  １−オキシドを含めることができる。
【００２５】
いずれか適切なバイサルファイト変換プロトコルを使用できる。好ましくは、バイサルファイト変換は高純度の（たとえば、フェノール−クロロホルム抽出した）核酸を用いて実施される。所望により、核酸試料のバイサルファイト変換に続いて脱スルホン工程を実施する。ある場合には、バイサルファイト変換核酸試料を後続使用のために精製することができる。バイサルファイト変換核酸試料を精製するためには、いずれか適切な方法を使用できる。ＤＮＡ精製の常法が幾つか当業者に知られている。
【００２６】
好ましい態様において、バイサルファイト変換した精製ＤＮＡを、続いてたとえば特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する；その際、ヌクレオチド塩基対合の規則に従ってウラシルはチミンに対応する。増幅したバイサルファイト変換ＤＮＡを用いて、いずれか適切な下流検出法を実施することができる。たとえば、いずれか適切なシークエンシング法またはマイクロアレイ検出法を実施することができる。
【００２７】
バイサルファイト変換核酸試料の鎖はもはや相補的ではない。ある場合には、たとえば鎖特異的ＰＣＲプライマーおよびＰＣＲを用いて、バイサルファイト変換核酸の各鎖を増幅および分析することが有用な可能性がある。したがって、鎖特異的プライマーは個々の鎖（たとえば、センスおよびアンチセンス）を増幅、クローニングおよびシークエンシングしてそれぞれのメチル化パターンを決定するように設計することができる。発生期の鎖はメチルトランスフェラーゼにより de novo メチル化されるため、センス鎖とアンチセンス鎖のメチル化パターンは同一のはずである。しかし、好ましい態様において、本発明において提供されるオリゴヌクレオチドは、一塩基多型（ＳＮＰ）と非メチル化塩基を識別するためにバイサルファイト変換核酸の両鎖を復元する能力をもつ。特に、本発明において提供されるオリゴヌクレオチドを用いて、相補鎖中の対応する位置のＡまたはＧ塩基を同定することにより、バイサルファイト変換核酸中のチミンＳＮＰと非メチル化部位を識別することができる。相補鎖中のこの対応する位置がグアニン（Ｇ）である場合、その位置はメチル化されていないと同定される。相補鎖中の対応する位置におけるアデノシン（Ａ）の存在は、対象ターゲット核酸中のＳＮＰの存在の指標となる。そのような分析には、バイサルファイト処理したターゲット核酸からセンス鎖およびアンチセンス鎖をキャプチャーすることが必要である。
【００２８】
ある場合には、バイサルファイト変換反応の触媒を使用する。たとえば、ある場合には、シトシンからウラシルへの変換を触媒するために、ポリアミン、たとえばテトラエチレンペンタアミン５塩酸塩(tetraethylenepentaminepenta-hydrochloride)（ＴＥＴＲＡＥＮ）を使用できる。アミン塩ＴＥＴＲＡＥＮは５つの触媒作用アミン基を含み、それらのそれぞれが、シトシン中の電子をバイサルファイト反応が行なわれるピリミジン環へ駆動させる反対電荷をもつ。本発明において提供される方法に有用な他の触媒作用ポリアミンには、限定ではなく、ジアミン類、トリアミン類（たとえば、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ））、グアニジン、テトラメチルグアニジン、テトラアミン類、および２以上のアミン基を含む他の化合物、ならびにその塩類が含まれる。
【００２９】
方法
さらなる観点において、本発明は、ターゲット核酸分子中のシトシン−グアニン（ＣＧ）ジヌクレオチド対のシトシン位置のメチル化状態を同定する方法を提供する。たとえば、本発明は、バイサルファイト変換核酸配列内のメチル化塩基を同定する方法を提供する。バイサルファイト変換およびシークエンシングは、対象生物の核酸のメチル化パターンの詳細な情報を一塩基分析で提供する。バイサルファイトシークエンシングは、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）および亜硫酸ナトリウムの存在下でのシトシン塩基からウラシル塩基への優先的脱アミンを利用する。メチル化シトシン塩基（５−メチルシトシン）が存在すれば、それらはほとんど例外なくＣＧジヌクレオチド対（たとえば、５’−ＣＧ−３’）のシトシン位置にある。酸性条件下で、亜硫酸ナトリウムは求核攻撃に際してシトシンを優先的に脱アミンしてウラシルにし、一方、５−メチルシトシン上のメチル基はそのアミノ基を脱アミンから保護する。その結果、メチル化シトシンはこれらの条件下で変換されない。したがって、バイサルファイト変換ＤＮＡをシークエンシングし、非変換核酸の各シトシン−グアニン（ＣＧ）ジヌクレオチド対のシトシン位置を対象バイサルファイト変換核酸の配列中の対応する位置の塩基と比較することにより、そのＤＮＡの元のメチル化状態を分析することができる。対象バイサルファイト変換核酸の配列中の対応する位置がその時点でチミンにより占有されていれば、非変換核酸の各シトシン−グアニン（ＣＧ）ジヌクレオチド対のシトシン位置はメチル化されていないと同定される。対象バイサルファイト変換核酸の配列中の対応する位置がシトシンにより占有されていれば、非変換核酸の各シトシン−グアニン（ＣＧ）ジヌクレオチド対のシトシン位置はメチル化されていると同定される。
【００３０】
好ましい態様において、本発明による方法は複数のオリゴヌクレオチドをターゲット生物のバイサルファイト変換核酸に接触させることを含むことができる。好ましくは、バイサルファイト変換核酸はゲノムＤＮＡ試料からのものである。たとえば、各オリゴヌクレオチドはターゲット生物のバイサルファイト変換ゲノム核酸試料の少なくとも一部にハイブリダイズすることができる。また、各オリゴヌクレオチドはターゲット生物の非変換ゲノム核酸中のシトシン−グアニン（ＣＧ）ジヌクレオチド対に対して相補的なジヌクレオチド対の各位置にゆらぎ塩基を含む。オリゴヌクレオチドを本明細書に記載するようにバイサルファイト変換核酸試料に接触させた結果、バイサルファイト変換ターゲット核酸分子を複数のオリゴヌクレオチドの少なくともサブセットとのハイブリダイゼーション複合体中にキャプチャーすることができる。
【００３１】
好ましい態様において、本発明方法はさらに、バイサルファイト変換Ｃ０ｔ１  ＤＮＡをブロッキング試薬として付与することを含む。バイサルファイト変換Ｃ０ｔ１  ＤＮＡを付与することにより、本発明において提供される方法の効率および特異性を改善できる。好ましくは、ブロッキング試薬は対象ターゲット核酸配列と同一の種からのバイサルファイト変換Ｃ０ｔ１  ＤＮＡである。たとえば、バイサルファイト変換核酸がヒトからのものであれば、バイサルファイト変換ヒトＣ０ｔ１  ＤＮＡをブロッキング試薬として付与することができる。したがって、ある場合には、本発明において提供される方法は、バイサルファイト変換Ｃ０ｔ１  ＤＮＡの存在下で複数のオリゴヌクレオチドをターゲット生物のバイサルファイト変換核酸に接触させることを含むことができる。ある場合には、バイサルファイト変換Ｃ０ｔ１  ＤＮＡとターゲット生物は同一種のものである。
【００３２】
本発明による方法は、さらに（ｉ）ハイブリダイゼーション複合体を、結合していない核酸分子および非特異的に結合した核酸分子から分離する工程；および（ｉｉ）キャプチャーされたバイサルファイト変換ターゲット核酸分子をハイブリダイゼーション複合体から溶離する工程を含むことができる。
【００３３】
本発明による方法は、溶離したバイサルファイト変換ターゲット核酸配列をシークエンシングする工程をも含むことができる。いずれか適切なＤＮＡシークエンシング法を本発明において提供される方法に従って使用できる。シークエンシングすると、溶離したバイサルファイト変換ターゲット核酸配列のメチル化塩基を同定できる。同定工程は、前記に従ってターゲット生物の非変換ゲノム核酸を溶離したバイサルファイト変換ターゲット核酸配列と比較することを含むことができる。
【００３４】
別途定義しない限り、本明細書中で用いるすべての技術用語および科学用語は本発明が関係する技術分野の当業者が一般に理解しているものと同じ意味をもつ。本明細書に記載したものと類似または均等な方法および材料をいずれも本発明の実施または試験に際して使用できるが、好ましい方法および材料を本明細書に記載する。
【００３５】
本発明は、限定ではない以下の実施例を考慮するとより十分に理解されるであろう。本明細書に記載するすべての報文および特許は、それらの全体を述べたと同様に本明細書に援用される。
【実施例】
【００３６】
ＤＮＡメチル化は、転位性遺伝因子のサイレンシング、幹細胞分化、胚発生、ゲノムインプリンティングおよび炎症を含めた生物学的プロセス、ならびに癌、心血管疾患および神経疾患を含めた多くの疾患のホストにおいて、役割をもつことが示されている。エピジェネティック修飾は、薬物の代謝および分布に関係する遺伝子の発現ならびに薬物ターゲットの発現を調節することにより薬物有効性に影響を及ぼして、個体間の薬物応答の多様性にも関与する可能性がある。現在、ＤＮＡメチル化状態を研究するための多数のツールがある；単一遺伝子座レベルでメチル化特異的ＰＣＲもしくはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなどの方法を用いるもの、またはより広いゲノムワイドレベルでＤＮＡマイクロアレイ、ｒｅｄｕｃｅｄ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＲＲＢＳ）、もしくは全ゲノムショットガン  バイサルファイトシークエンシングを用いるもの。後者の方法はＤＮＡメチル化状態を塩基対分析で提供し、ゲノム中の各位置のメチル化率の査定を可能にするので、多くの研究者によって好まれている。しかし、それは、一般に大部分の研究者にとってサブセットのゲノムのみに関心がある場合にそのようなデータを全ゲノムについて作成するには金額および分析に関して高価格である。１態様において、本発明はバイサルファイト処理したＤＮＡのターゲテッドエンリッチメントのためのシステムであり、研究者は高分解能メチル化分析のためにサブセットのゲノムに狙いを定めることができる。１０ｋｂから７５Ｍｂｐまでのサイズ範囲の領域をターゲティングすることができ、多重試料を一緒に多重処理およびシークエンシングして、多数の試料についてハイスループット様式での安価なメチル化データ作成方法を提供することができる。
【００３７】
図１は、本発明に用いるワークフローの態様を示す。大部分のシークエンスキャプチャープロトコル（たとえば、標準的なＳｅｑＣａｐ  ＥＺプロトコル，Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎから）と異なり、本発明方法はバイサルファイト変換ゲノムＤＮＡから開始する。図１において、研究者は、ある種の標準的なメチル化研究適用における全ゲノムの検査と対照的に、メチル化研究に適切なターゲット領域を決定する。ゲノム試料をフラグメント化し、バイサルファイト変換し、そしてメチル化シークエンシングアダプターを含むライブラリーを作製するか、あるいはバイサルファイト変換の前にメチル化シークエンスアダプターを含むライブラリーを作製してもよい。次いでシークエンシングアダプターを用いて試料を数サイクル、一般に４〜８サイクル増幅する。次いで、対象とする変換ゲノム領域にビオチニル化プローブのゆらぎプールをハイブリダイズさせることによりシークエンスキャプチャーを実施する（すなわち、ハイブリダイズさせ、ストレプトアビジン−ビオチンキャプチャーを実施し、洗浄して非特異的的に結合した材料を除去し、そしてＬＭ−ＰＣＲを１０〜１８サイクル実施する）。ある態様において、対象種からのバイサルファイト変換Ｃ０ｔ１  ＤＮＡをブロッキング剤として使用するのが有用である（たとえば、試料がヒトであれば、バイサルファイト変換ブロッキング剤はヒトＣ０ｔ１  ＤＮＡである）。さらに、特定の態様ではライブラリーアダプターに対して相補的な“ブロッキングオリゴ(blocking oligo)”も使用でき、これはライブラリーアダプター間での交差ハイブリダイゼーションを抑制するように設計され、したがってエンリッチメント特異性を高める、る。キャプチャーされたターゲットを一般に増幅し、次いでシークエンシングする。バイサルファイト変換リード(read)をマッピングし（すなわち、基準配列にアラインさせ、または de novo アセンブリングする）、メチル化状態を決定する。
【００３８】
図２は、ＤＮＡのバイサイファイト変換を示す。グアニンに隣接するシトシンはゲノムにおいてメチル化（ｍ）されている場合がある。図２は、シトシンが全くメチル化されていないもの（左欄，図２Ａ）を部分メチル化されている同じ配列（右欄，図２Ａ）と対比した同一配列を表わす。これらのゲノム試料をバイサルファイト変換すると、非メチル化シトシンはウラシルに変換され、一方、メチル化シトシンは無変化のままである。非メチル化シトシンは、ウラシルに変換されるとＤＮＡ対合の目的に対してチミンとして作用する。それらの鎖を次いでＰＣＲ増幅する。ＰＣＲ増幅の後、それらの鎖はもはや相補的ではない。フォワード鎖とリバース鎖はもはや相補的ではないので、バイサルファイト処理は効果的にゲノムのサイズを倍増する。ＣからＴへの部分変換はプローブ設計および分析をも複雑にする。
【００３９】
メチル化は組織、条件、および時間によって変動する。３つの可能なメチル化部位がある短い配列については、生成する可能性がある３２の可能な短いフラグメントがある：
【００４０】
【表１】
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【００４１】
したがって、バイサルファイト処理は試料を著しく複雑にする。したがって、ターゲテッドエンリッチメントは対象とする特定領域のメチル化状態を調べる際にきわめて有益である。
【００４２】
検査するゲノムの最も興味深い領域は、異なるメチル化状態を示す領域である。それらの領域は高メチル化、部分メチル化、または低メチル化の可能性がある。したがって、キャプチャープローブは、与えられたいかなる領域からのバイサルファイト変換分子の範囲にもハイブリダイズできなければならない。本発明は、３セットのキャプチャープローブを設計する戦略を用いる：すべてのＣｐＧがメチル化されており、したがってバイサルファイト変換後に保存されていると仮定したフラグメントに対する、１セットのプローブ（ｍｅ）。すべてのＣｐＧがメチル化されておらず、したがってすべてのＣがＴに変換されていると仮定したフラグメントに対する、第２セットのプローブ（ｎｍｅ）。最後のセットのプローブ（ゆらぎ）は、１以上のＣｐＧがメチル化されている残りのフラグメントをキャプチャーするように設計される。図３は、この戦略を表わし、特定領域についての天然配列、ｎｍｅプローブ（この場合、ＣｐＧアイランドのシトシンは変換される）、ｍｅプローブ（この場合、シトシンは無変化のままである）、および可能性のあるあらゆる組合わせからなるゆらぎプールを示す。ゆらぎプローブは、好ましくはマスクレス・アレイ合成(Maskless Array Synthesis)を用いる合成に際して、シトシンとチミンの混合物からなる“第５塩基”を用いて単一フィーチャー内で合成される。単一プローブ中の１０のＣｐＧは、単一フィーチャーから生成する２１０＝１０２４の異なるプローブを生じるであろう。
【００４３】
図４は、全ゲノムシークエンシングを用いるメチル化データ（図４Ａ）と本発明のキャプチャープローブおよびプロトコルを用いて得られたデータ（図４Ｂ）との比較を示す。この図は、対象ターゲテッド領域としての高メチル化領域により囲まれた低メチル化領域を示す２価(bivalent)ドメインから取得したデータを示す。この図において、カバレージトラックの深度(depth of coverage track)を同一高さのスケールとする。全ゲノムショットガン(Whole Genome Shotgun)（ＷＧＳ）バイサルファイトシークエンシングが提供するのは低深度のカバレージであり、このパターンのメチル化をほとんど認識不可能にする。他方、ゆらぎプローブを用いる本発明方法は、カバレージ深度の増大をもたらした。この増大した深度により、信頼性のある中間メチル化状態の判定が可能になった。
【００４４】
ＮＡ０４６７１、すなわちバーキットリンパ腫細胞系を、本発明のバイサルファイトシークエンシング法を用いるターゲテッドエンリッチメント処理した。カバレージメトリクスの深度を図５Ａの表に挙げ、再現性（メチル化率をｒ−二乗したもの）を図５Ｂに示す。このキャプチャーターゲット（プローブを設計できた場合）は９３％の一次ターゲット（対象領域）をカバーする。シークエンシングの各ランに約１／３のＭｉＳｅｑシークエンサーレーン（２ｘ１００ｂｐ）を用いた。全ゲノムショットガン  バイサルファイトシークエンシングに普通推奨されるカバレージ深度は３０Ｘ（各鎖について１５Ｘ）、すなわちＨｉＳｅｑ  ２０００の少なくとも２〜３レーン（２ｓｘ１００ｂｐ）である。
【００４５】
本発明を用いるキャプチャーおよびシークエンシングは、前例のないレベルでメチル化状態を調べる方法を提供する。対象領域を特異的にターゲティングすることにより、シークエンシングに向けるリソースが大幅に低減し、多数の試料を一緒に多重処理することができ、および／または試料当たりはるかに高いカバレージ深度を提供することができる。カバレージ深度の増大によってメチル化状態のわずかな変化を判定でき、異なるメチル化状態の領域を高感度で見出すための手段が提供される。
【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図１】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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