(57)【要約】  本発明は、多発性骨髄腫におけるヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）バイオマーカーに関するものである。具体的には、当該バイオマーカーは、薬剤特異的な、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）またはＨＤＡＣ６バイオマーカーペプチドであり、それらは、多発性骨髄腫に対し、アセチル化されている。あるいは、当該バイオマーカーは、薬剤特異的な、ＨＤＡＣ６バイオマーカーペプチドであり、それらは多発性骨髄腫に対し、アセチル化または非アセチル化されている。本発明はまた、本発明のバイオマーカーペプチドを特定するための検出剤および説明書を含有するキットに関する。本発明はさらに、対象におけるＨＤＡＣ阻害剤の治療有効性をモニタリングするための方法に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１８、および３２３〜４９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、多発性骨髄腫に対する、アセチル化された、化合物Ｂ特異的ヒストン脱アセチル化酵素６（ＨＤＡＣ６）バイオマーカーペプチド。
【請求項２】
配列番号１〜３２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、多発性骨髄腫に対する、アセチル化された、ツバスタチンＡ特異的ヒストン脱アセチル化酵素６（ＨＤＡＣ６）バイオマーカーペプチド。
【請求項３】
配列番号１〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、多発性骨髄腫に対する、アセチル化された、化合物ＢおよびツバスタチンＡ共同特異的ヒストン脱アセチル化酵素６（ＨＤＡＣ６）バイオマーカーペプチド。
【請求項４】
配列番号１２〜１８、２４５〜３２２および４７６〜８１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、多発性骨髄腫に対する、アセチル化された、化合物Ａ特異的ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）バイオマーカーペプチド。
【請求項５】
配列番号８１８〜１５７２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、多発性骨髄腫に対する、アセチル化された、または、非アセチル化された、化合物Ｂ特異的ヒストン脱アセチル化酵素６（ＨＤＡＣ６）バイオマーカーペプチド。
【請求項６】
配列番号１〜８１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有するアセチル化バイオマーカーペプチドを特定するための、抗アセチル化リシン抗体および説明書を含有するキット。
【請求項７】
配列番号８１８〜１５７２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有するアセチル化バイオマーカーペプチドまたは非アセチル化バイオマーカーペプチドを特定するための、検出剤および説明書を含有するキット。
【請求項８】
対象におけるヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤の治療有効性をモニタリングするための方法であって：
ａ）対象にＨＤＡＣ阻害剤の治療有効量を投与すること；
ｂ）前記対象から生物学的試料を採取すること；
ｃ）配列番号１〜１５７２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有するＨＤＡＣバイオマーカーペプチドが前記試料中に存在するかどうかを測定すること；
ｄ）配列番号１〜１５７２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有するＨＤＡＣバイオマーカーペプチドが前記試料中に存在する場合、前記ＨＤＡＣ治療が有効であると結論づけること、および、配列番号１〜１５７２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有するＨＤＡＣバイオマーカーペプチドが前記試料中に存在しない場合、前記ＨＤＡＣ治療が有効ではないと結論づけること、を含む、前記方法。
【請求項９】
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、化合物Ａ、化合物Ｂ、およびツバスタチンＡからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ＨＤＡＣ６阻害剤である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＨＤＡＣ６阻害剤が、化合物ＢおよびツバスタチンＡからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料が、骨髄試料である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記測定工程が、抗体を活用する、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
「関連出願の相互参照」
本出願は、米国仮特許出願６１／８３０，３７１（２０１３年６月３日出願。参照によりその全体において本明細書に援用される）の優先権を主張するものである。
【０００２】
本明細書において、多発性骨髄腫におけるヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）バイオマーカーが開示される。具体的には、当該バイオマーカーは、多発性骨髄腫に対する、薬剤特異的な、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）またはＨＤＡＣ６のバイオマーカーペプチドであり、それらはアセチル化されている。あるいは、当該バイオマーカーは、多発性骨髄腫に対する、薬剤特異的な、ＨＤＡＣ６バイオマーカーペプチドであり、それらはアセチル化されており、または、非アセチル化されている。本発明はまた、本発明のバイオマーカーペプチドを特定するための検出剤および説明書を含有するキットに関する。本発明はさらに、対象におけるＨＤＡＣ阻害剤の治療有効性をモニタリングするための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
癌は、米国および世界における主要な死亡原因の１つである。米国においては、２０１２年に、新たに約１，６００万人の癌患者が発生すると推測されている。また、米国において、２０１２年に、約５７５，０００人が癌によって死亡すると推測されている。
【０００４】
癌は、正常細胞を超えて身体で増殖する。正常細胞は、身体が必要とした場合に増殖し、身体が必要としなくなった場合に死亡する。癌は、身体で細胞が増殖する際に発生し、制御不可能な状態で増殖する。
【０００５】
癌には多くの原因があり、たとえば、発がん性化学物質への曝露、喫煙、過剰なアルコールの摂取、環境性毒物への曝露、過剰な日光への曝露、遺伝的な問題、肥満、放射線およびウイルスがある。それに加え、多くの癌の原因は不明である。
【０００６】
多くの異なるタイプの癌が存在し、身体のほとんどすべての器官または組織で発生しうる。癌の１つのタイプが、多発性骨髄腫である。
【０００７】
多発性骨髄腫は、プラズマ細胞骨髄腫またはカーラー病（Ｋａｈｌｅｒ‘ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）とも呼ばれており、プラズマ細胞の癌である。多発性骨髄腫では、異常なプラズマ細胞の集団が骨髄に蓄積され、それにより正常な血液細胞の産生が干渉される。
【０００８】
多くの器官が骨髄腫により影響を受けるため、症状および兆候は非常に多岐にわたる。骨髄腫の作用としては、カルシウムの上昇、腎不全、貧血、および骨病変が挙げられる。
【０００９】
骨髄腫は通常、治療可能であるが、不治性であると考えられている。ステロイド、化学療法、プロテアソーム阻害剤、免疫調整剤（たとえば、サリドマイドまたはレナリドミド）および幹細胞移植を用いることにより寛解が誘導されうる。
【００１０】
骨髄腫は、毎年、１００，０００人あたり１〜４人が発症する。標準的な治療を行った場合、生存期間の中央値は３〜４年であり、高度な治療を行った場合には５〜７年以上延長されうる。多発性骨髄腫は、米国において、２番目に多い悪性血液疾患であり（１番目は非ホジキンリンパ腫）、全ての癌のうちの１％を占める。
【００１１】
従って、多発性骨髄腫における治療有効性の指標となるバイオマーカーを素早く、そして確実に特定する必要性がある。
【発明の概要】
【００１２】
そのために、本明細書において、多発性骨髄腫におけるヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）バイオマーカー、および当該バイオマーカーを使用する方法が開示される。具体的には、当該バイオマーカーは、多発性骨髄腫に対する、薬剤特異的な、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）またはＨＤＡＣ６のバイオマーカーペプチドであり、それらはアセチル化されている。あるいは、当該バイオマーカーは、多発性骨髄腫に対する、薬剤特異的な、ＨＤＡＣ６バイオマーカーペプチドであり、それらはアセチル化されており、または、非アセチル化されている。
【００１３】
本発明の実施態様には、多発性骨髄腫に対する、化合物Ｂ特異的ヒストン脱アセチル化酵素６（ＨＤＡＣ６）バイオマーカーペプチド（アセチル化されており、配列番号１〜１８、および３２３〜４９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する（または、からなる））が含まれる。
【００１４】
本発明の他の実施態様には、多発性骨髄腫に対する、ツバスタチンＡ（ＴｕｂａｓｔａｔｉｎＡ）特異的ヒストン脱アセチル化酵素６（ＨＤＡＣ６）バイオマーカーペプチド（アセチル化されており、配列番号１〜３２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する（または、からなる））が含まれる。
【００１５】
本発明のさらなる実施態様には、多発性骨髄腫に対する、結合化合物ＢおよびツバスタチンＡ特異的ヒストン脱アセチル化酵素６（ＨＤＡＣ６）バイオマーカーペプチド（アセチル化されており、配列番号１〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する（または、からなる））が含まれる。
【００１６】
本発明の他の実施態様には、多発性骨髄腫に対する、化合物Ａ（ＣｏｍｐｏｕｎｄＡ）特異的ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）バイオマーカーペプチド（アセチル化されており、配列番号１２〜１８、２４５〜３２２、および、４７６〜８１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する（または、からなる））が含まれる。
【００１７】
本発明の実施態様には、多発性骨髄腫に対する、化合物Ｂ（ＣｏｍｐｏｕｎｄＢ）特異的ヒストン脱アセチル化酵素６（ＨＤＡＣ６）バイオマーカーペプチド（アセチル化、または非アセチル化されており、配列番号８１８〜１５７２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する（または、からなる））が含まれる。
【００１８】
本発明のさらなる実施態様には、配列番号１〜８１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する（または、からなる）アセチル化バイオマーカーペプチドを特定するための、抗アセチル化リシン抗体、および、説明書、を含有するキットが含まれる。
【００１９】
あるいは、本発明の実施態様には、配列番号８１８〜１５７２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する（または、からなる）、アセチル化または非アセチル化バイオマーカーペプチドを特定するための、検出剤、および、説明書を含有するキットが含まれる。
【００２０】
本発明のさらなる実施態様には、以下を含有する、対象におけるヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤の治療有効性をモニタリングする方法が含まれる：ａ）ＨＤＡＣ阻害剤の治療有効量を対象に投与すること；ｂ）当該対象から生物学的試料を採取すること；ｃ）当該試料中に、配列番号１〜１５７２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する（または、からなる）ＨＤＡＣバイオマーカーペプチドが存在するか否かを測定すること；および、ｄ）当該試料中に、配列番号１〜１５７２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する（または、からなる）ＨＤＡＣバイオマーカーペプチドが存在する場合、ＨＤＡＣ治療が有効であると結論づけること、および、もし、当該試料中に、配列番号１〜１５７２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する（または、からなる）ＨＤＡＣバイオマーカーペプチドが存在しない場合、ＨＤＡＣ治療が有効ではないと結論づけること。好ましくは、ＨＤＡＣ阻害剤は、化合物Ａ、化合物Ｂ、およびツバスタチンＡからなる群から選択される。好ましくは、ＨＤＡＣ阻害剤は、ＨＤＡＣ６阻害剤である。好ましくは、ＨＤＡＣ６阻害剤は、化合物Ｂ、およびツバスタチンＡからなる群から選択される。好ましくは、生物学的試料は、骨髄試料である。１つの実施態様において、生物学的試料は、細胞内分画（たとえば、細胞質、可溶性核抽出物、または、不溶性核沈殿物）である。好ましくは、当該測定工程は、抗体を利用する。
【００２１】
本発明のさらなる実施態様には、以下を含有する、対象におけるヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤の治療有効性をモニタリングする方法が含まれる：ａ）ＨＤＡＣ阻害剤の治療有効量を対象に投与すること；ｂ）当該対象から生物学的試料を採取すること；ｃ）当該試料中に、配列番号１〜１５７２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する（または、からなる）ＨＤＡＣバイオマーカーペプチドが存在するか否かを測定すること；および、ｄ）もし、当該試料中の、配列番号１〜１５７２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する（または、からなる）ＨＤＡＣバイオマーカーペプチドのレベルが、対照試料と比較し、調節されている場合、ＨＤＡＣ治療が有効であると結論づけること、および、もし、当該試料中の、配列番号１〜１５７２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する（または、からなる）ＨＤＡＣバイオマーカーペプチドのレベルが、対照試料と比較し、調節されていない場合、ＨＤＡＣ治療が有効ではないと結論づけること。好ましくは、ＨＤＡＣ阻害剤は、化合物Ａ、化合物Ｂ、およびツバスタチンＡからなる群から選択される。好ましくは、ＨＤＡＣ阻害剤は、ＨＤＡＣ６阻害剤である。好ましくは、ＨＤＡＣ６阻害剤は、化合物Ｂ、およびツバスタチンＡからなる群から選択される。好ましくは、生物学的試料は、骨髄試料である。１つの実施態様において、生物学的試料は、細胞内分画（たとえば、細胞質、可溶性核抽出物、または、不溶性核沈殿物）である。好ましくは、当該測定工程は、抗体を利用する。好ましくは、対照試料は、健常な対象由来である。１つの実施形態において、試料中のＨＤＡＣバイオマーカーペプチドのレベルは、対照試料と比較し、増加している。他の実施形態において、試料中のＨＤＡＣバイオマーカーペプチドのレベルは、対照試料と比較し、減少している。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
「定義」
他で定義されない限り、本明細書において用いられているすべての技術的用語および科学的用語は、当分野において当業者により普遍的に理解されているものと同じ意味を有する。
【００２３】
本明細書において、冠詞の「一つの（ａおよびａｎ）」は、当該冠詞の文法上の目的語の１つ、または２以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために用いられる。例としては、「１つのバイオマーカー（ａ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）」は、１つのバイオマーカー、または２以上のバイオマーカーを意味する。
【００２４】
「投与する」または「投与」という用語は、たとえば、粘膜送達、皮内送達、静脈内送達、筋肉内送達、および／または、当分野に公知の、もしくは本明細書に開示される他の物理的送達法により、物質を、身体の外側で存在するままに（たとえば、本発明の製剤のままに）、患者へと注入する動作、または、物理的に送達する動作を指す。疾患またはその症状が治療される場合、通常、物質の投与は、疾患またはその症状の発生後に行われる。疾患またはその症状を予防する場合、通常、物質の投与は、疾患またはその症状の発生の前に行われる。
【００２５】
他で具体的に示されない限り、本明細書において用いられる「抗体」という用語は、２つのイムノグロブリン重鎖と２つのイムノグロブリン軽鎖を含有する抗体分子（すなわち、完全抗体分子）ならびに、その抗原結合断片を包含すると理解される。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」等という用語には、抗原に特異的に結合し、複合体を形成する、任意の天然型のポリペプチドもしくは糖タンパク質、酵素的に得られるポリペプチドもしくは糖タンパク質、または、遺伝子操作されたポリペプチドもしくは糖タンパク質が含まれる。抗体の抗原結合断片は、たとえば、任意の適切な標準的技術（たとえば、タンパク質分解、または、抗体可変ドメインおよび（任意選択的に）定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現に関する組換え遺伝子操作技術）を用いて、完全抗体分子から誘導されても良い。そのようなＤＮＡは公知であり、および／もしくは、たとえばＤＮＡライブラリ（たとえばファージ−抗体ライブラリが挙げられる）等が市販されており、または、合成することができる。ＤＮＡは、配列解析され、化学的に、または、分子生物学的技術（たとえば、１以上の可変および／または定常ドメインを適切な構成へとアレンジする技術、または、コドンを導入する、システイン残基を生成する、アミノ酸等を改変する、付加する、もしくは欠失する技術）を用いて操作されても良い。
【００２６】
対象の抗原に「結合する」抗体は、十分なアフィニティで当該抗原に結合することができるものであり、それにより、抗原の存在の検出に有用なものである。
【００２７】
「生物学的試料」という用語は、通常、個体、身体の液体、細胞株、組織培養、または他の源から得られた生物学的試料を意味するものとする。身体の液体とは、たとえば、血液、リンパ、血清、血漿、尿、精液、滑液、および髄液である。哺乳類から組織生検および身体の液体を得る方法は当分野に公知である。もし「試料」という用語が単独で用いられた場合、当該「試料」は、「生物学的試料」であることを意味するとする（すなわち、当該用語は相互交換可能に用いられる）。
【００２８】
「組成物」および「製剤」という用語は、特定の成分（たとえば、ＨＤＡＣ阻害剤）を、任意選択的に特定の量で含有する製品、ならびに、特定の成分の組み合わせから直接的または間接的に得られた任意の製品を、任意選択的に特定の量で含有する製品、を包含することが意図される。
【００２９】
「賦形剤」という用語は、薬剤に対し希釈物質、ビヒクル、保存剤、結合物質、安定化剤等として普遍的に用いられている不活性な物質を指し、限定されないが、タンパク質（たとえば、血清アルブミン等）、アミノ酸（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、グリシン、ヒスチジン等）、脂肪酸およびリン脂質（たとえば、スルホン酸アルキル、カプリル酸塩等）、界面活性剤（たとえば、ＳＤＳ、ポリソルベート、非イオン性界面活性剤等）、単糖（たとえば、スクロース、マルトース、トレハロース等）、およびポリオール類（たとえば、マンニトール、ソルビトール等）が挙げられる。また、Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, Pa.を参照のこと（その全体において参照により本明細書に援用される）。
【００３０】
「ＨＤＡＣ阻害剤を用いた治療に対し反応性」もしくは「ＨＤＡＣ６阻害剤を用いた治療に対し反応性」という表現、またはその類似の表現は、ＨＤＡＣ阻害剤（たとえば、ＨＤＡＣ６阻害剤）を用いた治療の結果から、または治療の結果として、たとえば癌等の疾患または状態に罹患している患者にもたらされた、臨床上の有益性を指す。臨床上の有益性とは、ＨＤＡＣ阻害剤を用いた治療から、または、治療の結果としてもたらされた、患者の完全な回復、部分的な回復、疾患の安定（進行しない）、無憎悪生存、無病生存、（疾患の）無憎悪期間における改善、死亡までの時間における改善、または、全生存期間における改善が挙げられる。治療に対する反応を決定するための基準が存在し、および、当該基準により、代替治療に対する有効性の比較が可能となる（Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, in Harrisons's Principles of Internal Medicine, 13th edition, eds. Isselbacher et al., McGraw-Hill, Inc., 1994）。たとえば、癌の完全反応または完全回復は、すべての検出可能な悪性疾患の消失である。癌の部分反応または部分回復とは、たとえば、１以上の病変部位の産物の最も大きな垂直直径における、およそ５０パーセントの減少であってもよく、または、任意の病変部位のサイズにおける増加が無いことであってもよく、もしくは、新たな病変部位の出現が無いことであっても良い。
【００３１】
「癌の進行」という用語は、癌の転移、再発、または、１つの病変部位の産物の最も大きな垂直直径における、少なくとも約２５パーセントの増加、または新たな病変部位の出現を含み、または、指しても良い。癌の再発または転移が減少、減速、遅延、または防がれた場合、癌の進行は、「阻害された」。
【００３２】
「マーカータンパク質」、「マーカーポリペプチド」、「バイオマーカータンパク質」または、「バイオマーカーポリペプチド」という用語は、多発性骨髄腫における治療有効性の有用な指標となるタンパク質またはポリペプチドを含む。
【００３３】
「キット」とは、バイオマーカータンパク質またはポリペプチドを特異的に検出するための試薬（たとえば、抗体）を少なくとも１つ含有する任意の製品（たとえば、パッケージまたは容器）である。
【００３４】
本明細書において、「小分子」という用語は、実験室で合成された、または、自然に存在のいずれかの非ペプチド性、非オリゴマー性の有機化合物を指す。本明細書において、小分子とは、「天然産物様」の化合物を指すこともできるが、「小分子」という用語は、「天然産物様」の化合物に限定はされない。むしろ、小分子は通常、いくつかの炭素−炭素結合を含有し、１５００未満の分子量を有するという点で特徴付けられるが、この特徴は、本発明の目的に対する限定であるとは意図されない。自然に存在する「小分子」の例としては、限定されないが、タキソール、ダイネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）およびラパマイシンが挙げられる。他の好ましい実施態様においては、天然産物様の小分子が利用される。
【００３５】
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、自然状態で存在する場合には通常、付随する成分が、実質的に、または本質的に無い物質を指す。純度および均一性は通常、たとえばポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィー等の分析化学手法を用いて測定される。特に、複数の実施態様において、化合物は、少なくとも８５％の純度、より好ましくは少なくとも９０％の純度、より好ましくは９５％の純度、および、最も好ましくは、９９％の純度である。
【００３６】
「療法」という用語は、疾患の予防、管理、治療、および／または、改善に用いることができる任意のプロトコール、方法、および／または、剤を指す。
【００３７】
「治療有効量」という用語は、対象に測定可能な効果をもたらす薬物の量を意味し、たとえば、腫瘍細胞の殺傷に有効な量、または、腫瘍細胞の増殖阻害に有効な量である。
【００３８】
「治療する」、「治療すること」および、「治療」とは、疾患および／またはそれに付随する症状を緩和する、または、減少させる方法を指す。
【００３９】
「治療有効性」という用語は、薬剤が、どの程度、その働きを発揮するか、すなわち、標的に作用して、どの程度、治療効果を生じさせるか、を意味する。
【００４０】
「細胞培養における、アミノ酸による安定アイソトープ標識（ＳＩＬＡＣ）」
本発明の実施態様において、２以上の細胞群の間の、タンパク質発現における差異を定量するために、ＳＩＬＡＣ法が用いられる。ＳＩＬＡＣ法は、非放射性アイソトープ標識を用いた、試料間のタンパク質存在量における差異を検出するための質量分析に基づいた技術である。ＳＩＬＡＣ法は当分野に公知であり、Ong et al., “Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics”, Molecular & Cellular Proteomics, vol. 1, pp. 376-386 (2002)、に詳細に記述されている（その全体において、参照により本明細書に援用される）。
【００４１】
簡潔に述べると、ＳＩＬＡＣ法には、細胞培養で２つの細胞群を増殖させることが含まれる。第一の細胞群は、通常のアミノ酸を含有する増殖培地（通常培地）で増殖される。第二の細胞群は、標準的な必須アミノ酸（たとえば、リシン）を欠いた培地中で増殖されるが、次いで、非放射性アイソトープで標識された当該必須アミノ酸が補充される（たとえば、通常の１２Ｃではなく、原子１３Ｃ原子で標識されたリシン）（「重培地」と呼称される）。２つの細胞群は各々、当該培地中で増殖する際、そのタンパク質のすべてに当該アミノ酸を組み込むこととなる。重培地で維持された細胞の増殖は、通常培地の増殖と差異は無い。重アミノ酸を含有するすべてのペプチドは、その通常のカウンターパートよりも重い。２つの細胞群の各々から採取された細胞を溶解する。次いで、２つの細胞群の各々由来の溶解物を混合する。次いで、混合細胞溶解物を、質量分析により解析する。異なる安定アイソトープ組成の化学的に同一なペプチドの対は、質量における差異によって、質量分析において区別することができる。当該ペプチド対の質量スペクトルにおけるピーク強度の比率は、２つタンパク質に対する存在比を反映している。
【００４２】
ＳＩＬＡＣ法には、対照細胞群と、検証細胞群が含まれる。検証細胞群は、薬物を用いた処置、または何らかの他の外的刺激に曝されていても良い。
【００４３】
好ましくは、検証細胞群は、ＨＤＡＣ阻害剤で処置されている。ＨＤＡＣ阻害剤の例としては、限定されないが、ヒドロキサム酸、環状テトラペプチド、ベンザミド、求電子性ケトン、および、脂肪酸化合物が挙げられる。
【００４４】
より好ましくは、検証細胞群は、ＨＤＡＣ６阻害剤で処置されている。ＨＤＡＣ６阻害剤の例としては、限定されないが、化合物ＢおよびツバスタチンＡが挙げられる。
【００４５】
あるいは、検証細胞群は、ＨＤＡＣ１、２、３および６を阻害するＨＤＡＣ阻害剤で処置されている。そのようなＨＤＡＣ阻害剤の例は、化合物Ａである。
【００４６】
細胞は、任意の細胞型であっても良く、どのような実験がなされるかに依存している。しかしながら、両細胞群は、同じ細胞型を含有しなければならない。好ましくは、癌細胞株がＳＩＬＡＣ法に用いられる。たとえば、細胞株は、乳癌、血液がん、大腸癌、肺癌、皮膚癌、脳腫瘍、腎癌、肝癌、前立腺癌、卵巣癌、および胃癌に特異的であっても良い。しかしながら、他の癌の形態に特異的な細胞株を用いても良い。
【００４７】
細胞は、増殖培地中で増殖される。細胞セットが、対照細胞群と検証細胞群を含有する場合、１つの細胞群が、通常アミノ酸を含有する増殖培地中で増殖され、他方の細胞群が、標準的な必須アミノ酸を欠いた培地（後に、当該必須アミノ酸の非放射性アイソトープ標識形態（たとえば、通常の１２Ｃではなく、原子１３Ｃ原子で標識されたリシン）が補充される）中で増殖される。
【００４８】
重培地は、必須アミノ酸を欠いているが、後に、当該必須アミノ酸の非放射性アイソトープ標識形態が補充される。２０の標準アミノ酸のうち、９つが必須アミノ酸である。当該９つの必須アミノ酸は：ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、およびバリンである。重培地は、上述の必須アミノ酸のうち、任意のものを１つ以上欠いていても良い。好ましくは、重培地は、通常のリシンを欠いている。しかしながら、重培地は、後に、当該必須アミノ酸の非放射性アイソトープ標識形態が補充されなければならない。好ましくは、当該非放射性アイソトープ標識された必須アミノ酸は、１３Ｃ標識リシンである。
【００４９】
アイソトープ標識は、生体分子中に存在する構成要素の特定の重同位体（重アイソトープ）を含んでも良い（たとえば、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３２Ｐ、３３Ｐ、３３Ｓ、３４Ｓ、１２５Ｉ、または、１３１Ｉ）。ゆえに、必須アミノ酸は、上述のアイソトープ、または他のアイソトープのうちの任意の１つで標識されていても良い。
【００５０】
細胞は、当分野公知の任意の手段により溶解されても良い。
【００５１】
質量分析の遂行に付いては、当分野に公知である。
【００５２】
「細胞質（Ｃ）、可溶性核抽出物（Ｎ）、および、不溶性核沈殿物（Ｐ）解析（ＣＮＰ解析）」
本発明の実施態様には、細胞群（たとえば、検証細胞群等）を３つの細胞内分画（細胞質（Ｃ）、可溶性核抽出物（Ｎ）、および不溶性核沈殿物（Ｐ））へと分画化することが含有される。
【００５３】
ＳＩＬＡＣ法は、上述のように行われる。
【００５４】
回収された「重標識細胞」および「軽標識細胞」は溶解される。次いで、各々からの上清を、遠心後に保存する。「重標識」上清および「軽標識」上清の両方のタンパク質濃度を測定する。上清中の等量の粗タンパク質を混合し、粗タンパク質を沈殿させる（これは、細胞質分画と呼ばれる）。洗浄後、タンパク質沈殿物を、トリプシン分解のために溶解させる。
【００５５】
残った細胞沈殿物をさらに溶解させる。得られた溶解物は、遠心により浄化させ、上清を核抽出物分画として保存する。「重」または「軽」標識上清のタンパク質濃度を測定する。上清中の等量の粗タンパク質を混合し、および、当該粗タンパク質を沈殿させる（これは、核抽出物分画と呼ばれる）。洗浄後、タンパク質沈殿物をトリプシン分解のために溶解させる。
【００５６】
最後に残った細胞沈殿物を、尿素中に溶解させ、クロマチン−結合タンパク質を抽出する。次いで、タンパク質濃度を測定する。尿素溶液中の等量のクロマチン−結合タンパク質を混合し、当該タンパク質を沈殿させる（これは、核沈殿物分画と呼ばれる）。洗浄後、タンパク質沈殿物をトリプシン分解のために溶解させる。
【００５７】
上述の３つの分画に対するトリプシン分解の後、Ｋａｃアフィニティ富化、次いでＭＳ解析を行い、データ照会を別々に行う。混合Ｋａｃデータは、化合物ＢとＤＭＳＯの対における総Ｋａｃプロファイリングデータを形成した。
【００５８】
この細胞内局在性を用いた、上述のＳＩＬＡＣ法において、たとえばＨＤＡＣ特異的等の薬剤特異的であると特定された任意のペプチドにより、細胞内でのペプチドの機能が理解される。
【００５９】
「生物学的経路の解析」
バイオマーカーペプチドが、ＳＩＬＡＣ法により特異的薬剤と特定された時点で、当該バイオマーカーペプチドを、生物学的経路データベースにおけるペプチド／タンパク質に関して比較し、薬剤の作用から暗示される主要な生物学的経路または機能を特定しても良い。好ましい経路解析ウェブサイトは、ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ（ｗｗｗ  ｄｏｔ  ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｄｏｔ  ｏｒｇ／ｇｓｅａ／ｉｎｄｅｘ  ｄｏｔ  ｊｓｐ）である。そのような解析は、薬剤の（たとえば、ＨＤＡＣまたはＨＤＡＣ６）特定の臨床効果に関連しうる。
【００６０】
「化合物Ｂで処置した細胞溶解物における総ペプチド（アセチル化および非アセチル化の両方を含む）の量の解析」
ＳＩＬＡＣ法を上述のように行う。化合物Ｂ−（１２Ｃ−リシン標識）およびＤＭＳＯ処置（１３Ｃ−リシン標識）細胞を溶解させる。試料をソニケートし、遠心して、残った残渣を除去する。上清中のタンパク質含量を測定する。各試料からの粗タンパク質を混合し、分離する。電気泳動後、ゲルを染色する。ゲル全体のレーンをスライスにカットし、トリプシンで消化させる。ゲルのバンドを、小さな立方体にカットし、洗浄する。ゲル片を脱水させる。上清を除去し、ゲル片を真空乾燥させる。ジスルフィド結合を開裂させ、次いで、アルキル化させる。ゲル片を脱水させ、再度、真空乾燥させる。ゲル片をトリプシン溶液（５０ｍＭの重炭酸アンモニウム緩衝液中、１０ｎｇ／μｌ）で覆う。インキュベート後、残ったトリプシン溶液を除去する。ゲル中のペプチドを抽出する。全ての上清を混合し、真空乾燥させ、次いで、質量分析を行う。
【００６１】
「ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤」
本明細書の実施例およびＳＩＬＡＣ法で有用なＨＤＡＣ阻害剤は、任意のＨＤＡＣ阻害剤（たとえば、小分子有機化合物、抗体、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、核酸、タンパク質またはペプチド等）であっても良い。好ましくは、ＨＤＡＣ阻害剤は、小分子有機化合物である。
【００６２】
好ましくは、ＨＤＡＣ阻害剤は、ＨＤＡＣ６阻害剤である。これは、ＨＤＡＣ阻害剤が、他の形態のＨＤＡＣよりも選択的にＨＤＡＣ６を阻害することを意味する。
【００６３】
特定の実施態様において、ＨＤＡＣ阻害剤は、以下の化学構造：
【００６４】
【化１】
2016523236.tif 000002
【００６５】
（本明細書において、化合物Ａと呼称される）を有する。化合物Ａは、当分野公知である。
【００６６】
他の特定の実施態様において、ＨＤＡＣ６阻害剤は、以下の化学構造：
【００６７】
【化２】
2016523236.tif 000003
【００６８】
（本明細書において、化合物Ｂと呼称される）を有する。化合物Ｂの作製方法は、当分野公知である。
【００６９】
さらに他の特定の実施態様において、ＨＤＡＣ６阻害剤は、以下の化学構造：
【００７０】
【化３】
2016523236.tif 000004
【００７１】
（本明細書において、ツバスタチンＡと呼称される）を有する。ツバスタチンＡの作製方法は、当分野に公知である。
【００７２】
ＨＤＡＣ阻害剤は、以下の特性のうちの１つ以上を有する：当該化合物は、ヒストン脱アセチル化酵素を少なくとも１つ阻害することができる；当該化合物は、ＨＤＡＣ６を阻害することができる；当該化合物は、選択的ＨＤＡＣ６阻害剤である；当該化合物は、ＨＤＡＣ６のポリユビキチン結合ドメインに結合する；当該化合物は、癌細胞（特に、多発性骨髄腫細胞、非ホジキンリンパ腫（ＮＭＬ）細胞、乳癌細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞）にアポトーシスを誘導することができる；および／または、当該化合物は、アグリソーム（ａｇｇｒｅｓｏｍｅ）形成を阻害することができる。
【００７３】
ＨＤＡＣ阻害剤は、金属結合部分、好ましくは、亜鉛結合部分（たとえば、ヒドロキサム酸）を含有しても良い。あるヒドロキサム酸は、ＨＤＡＣ６活性の強力な阻害物質である；学説に拘束されることは望まないが、これらヒドロキサム酸の効果は、少なくとも部分的には、当該化合物の亜鉛に結合する能力によるものである。ＨＤＡＣ阻害剤は、アグリソーム経路に関与する生物学的標的（たとえば、チューブリン脱アセチル化酵素（ＴＤＡＣ）またはＨＤＡＣ活性を有する生物学的標的（たとえば、ＨＤＡＣ６））に対する選択性を寄与するものであっても良い。ゆえに、一部のＨＤＡＣ阻害剤は、当該生物学的標的への結合に寄与する当該分子の他の部分から離れた亜鉛結合部分を含有する。
【００７４】
「バイオマーカー」
本明細書の実施例に示されているように、ＳＩＬＡＣ法を用いて、特定の細胞セットが殺傷される理由を教示するバイオマーカーを特定しても良い。すなわち、当該バイオマーカーは、ＨＤＡＣ阻害剤の指標であり、および、骨髄腫における細胞死の指標である。
【００７５】
細胞セットは、対照細胞群および検証細胞群を含有しても良い。この細胞群により、特定のタイプの癌細胞に、特定の薬剤がどのように作用するかを測定することができる。
【００７６】
好ましくは、バイオマーカーは、表１のペプチド（表２のペプチドと同一である）および表９のペプチドから選択される。
【００７７】
「キット」
本発明のある実施態様には、薬剤特異的、および疾患特異的なバイオマーカーを特定するための実験手法に用いられうるキットが含まれる。
【００７８】
たとえば、本発明の有る実施態様において、以下を１つ以上含有するキットが提示される：薬剤；細胞株；通常アミノ酸を含有する細胞増殖培地；標準的な必須アミノ酸を欠く細胞増殖培地；当該必須アミノ酸の非放射性アイソトープ標識形態；細胞溶解緩衝液；たとえばトリプシン等のプロテアーゼ；非特異的抗アセチル化アミノ酸抗体カクテル；検出試薬；ならびに、ＳＩＬＡＣ法を実施するための説明書、および、本発明のバイオマーカーペプチドを特定するための説明書。
【００７９】
「方法」
本発明の実施態様において、対象における、薬剤の治療有効性をモニタリングするための方法が開示される。好ましくは、当該薬剤は、ＨＤＡＣ阻害剤である。
【００８０】
特定の実施態様において、本発明により、以下を含有する、対象におけるヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤の治療有効性をモニタリングする方法が開示される：
ａ）対象にＨＤＡＣ阻害剤の治療有効量を投与すること；
ｂ）当該対象から生物学的試料を採取すること；
ｃ）配列番号１〜１５７２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有するＨＤＡＣバイオマーカーペプチドが当該試料中に存在しているか否かを測定すること；および、
ｄ）配列番号１〜１５７２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有するＨＤＡＣバイオマーカーペプチドが当該試料中に存在している場合、ＨＤＡＣ治療が有効であると結論づけること、および、配列番号１〜１５７２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有するＨＤＡＣバイオマーカーペプチドが当該試料中に存在していない場合、ＨＤＡＣ治療が有効ではないと結論づけること。
【００８１】
当該方法は、患者が受けているＨＤＡＣ治療が有効であるか否かをモニターするものである。すなわち、当該方法は、ＨＤＡＣ阻害の指標であり、および、細胞死の指標でありうる。
【００８２】
上述のように、ＨＤＡＣ阻害剤は、当分野公知の任意のＨＤＡＣ阻害剤であっても良い。好ましくは、ＨＤＡＣ阻害剤は、化合物Ａ、化合物Ｂ、およびツバスタチンＡからなる群から選択される。好ましくは、ＨＤＡＣ阻害剤は、ＨＤＡＣ６阻害剤である。より好ましくは、ＨＤＡＣ６阻害剤は、化合物ＢおよびツバスタチンＡからなる群から選択される。
【００８３】
ＨＤＡＣ阻害剤は、任意の治療有効量および任意の投与経路を用いて投与されても良い。
【００８４】
当該方法には、特定の疾患を有する患者における、薬剤の治療有効性を測定するため、患者から生物学的試料を採取することが含まれる。たとえば、当該生物学的試料は、全血、血清、血漿、精液、尿、粘膜、骨髄、または他の身体試料であっても良い。好ましい実施態様において、当該生物学的試料は、骨髄由来である。
【００８５】
測定工程において、本発明のアセチル化ペプチドまたは非アセチル化ペプチドを特定するための、当分野公知の任意の手段または検出剤を用いても良い。好ましくは、当該測定工程は、抗体を利用する。より好ましくは、当該測定工程は、本発明のアセチル化バイオマーカーペプチドを特定するために、非特異的抗アセチル化リシン抗体カクテルを利用する。あるいは、ペプチド特異的抗体を用いて、本発明の非アセチル化バイオマーカーペプチドを特定してもよい。
【００８６】
本明細書において言及されるすべての特許、特許出願、および公開文献は、その全体において、参照により各々が本明細書に援用される。
【実施例】
【００８７】
以下の実施例は、本発明の理解の一助となるために提示されるものである。本発明の主旨および範囲から逸脱することなく、以下に記述される手順に対し、改変を行うことが出来ることを理解されたい。
【００８８】
当分野の一般的技術の範囲内にある、分子生物学および核酸／タンパク質化学の標準的な技法は文献等に説明されており、および、本発明の実施に用いられる。たとえば、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Gait, M. J. (ed.), Oligonucleotide synthesis--a practical approach, IRL Press Limited, 1984; Hames, B. D. and Higgins, S. J. (eds.), Nucleic acid hybridisation--a practical approach, IRL Press Limited, 1985;および、a series, Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.（それらはすべて、参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【００８９】
「実施例１−ＳＩＬＡＣ法」
本実施例において、ヒト多発性骨髄腫細胞株に対する、３つの異なるＨＤＡＣ阻害剤（化合物Ａ、化合物ＢおよびツバスタチンＡ）と対照の効果を比較するために実施されるＳＩＬＡＣ実験について記述する。また、ＨＤＡＣ阻害剤を、その効果の差異を測定するために、ＨＤＡＣ阻害剤の中でも比較した。
【００９０】
ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＭＭ．１Ｓを、１２Ｃ（軽）または１３Ｃ（重）リシン含有培養培地のいずれかを用いて増殖させた。「重」細胞は、対照としてＤＭＳＯを処置し、「軽」細胞は、１つのＨＤＡＣ阻害剤で、６時間、３７℃で処置した。重細胞と軽細胞を溶解させ、溶解物を１：１の比率で混合し、トリプシンプロテアーゼで消化した。消化ペプチドプール中のアセチル化リシン含有ペプチド（ＨＤＡＣ阻害剤の作用による）は、非特異的抗アセチル化リシン抗体カクテル（当該抗体は、重アセチル化ペプチドおよび軽アセチル化ペプチドの両方を識別する）により捕捉され、数千の個々のペプチドを特定するために、質量分析に供した。
【００９１】
数千のペプチドは、公知の質量差により、対（１２Ｃおよび１３Ｃ）で特定された。次いで、２つの異なる処置がなされた細胞溶解物中の所与のペプチドのアミノ酸配列および量比（軽／重）を測定し、可能性のあるタンパク質（遺伝子）源を用いてアノテーションされた。
【００９２】
上述のように、３つのＨＤＡＣ阻害剤（化合物Ａ、化合物ＢおよびツバスタチンＡ）を用いた。ゆえに、ＳＩＬＡＣ法は、異なるＨＤＡＣ阻害剤と共に、毎回、対照と比較して、３回、行われた。従って、以下の表には３つの対の定量データが示されている（すなわち、化合物Ａ：ＤＭＳＯ、化合物Ｂ：ＤＭＳＯ、および、ツバスタチンＡ：ＤＭＳＯ）。次いで、１．３０倍の変化のカットオフを用いて、表中、「変化した」または「＋」と決定し、および、１．３倍未満の倍数変化のペプチドはいずれも、表中、「変化しない」または「０」であると決定した。特定されなかったペプチドは、表中、「ＮＡ」と記された。
【００９３】
本実験で用いられた濃度では、化合物ＡはＨＤＡＣ１、２、３および６を阻害することができ、および、化合物ＢおよびツバスタチンＡはＨＤＡＣ６のみを阻害することができるため、化合物ＢまたはツバスタチンＡにおけるＡｃＫ（アセチル化リシン）は、ＨＤＡＣ６特異的として呼称されうる。化合物ＢおよびツバスタチンＡの両方ともが、選択的ＨＤＡＣ６阻害剤ではあるが、従前に行われた一部の細胞生物学実験において、それらは異なる活性を有することが示されている。結果として、両化合物は、その類似性および差異を調査するために用いられた。
【００９４】
これら実験の結果を以下の表１に示す。
【００９５】
表１の最初の列は、ＳＩＬＡＣ法により特定されたアセチル化ペプチドのアミノ酸配列を示し、ここで、「（ａｃ）」とは、従前からアミノ酸がアセチル化されていたことを意味する。
【００９６】
表１の２番目、３番目、および４番目の列は、それぞれ、化合物Ａ、ツバスタチンＡ、および化合物Ｂに対するデータを示す。これら列中の数値は、各薬剤を処置された細胞群に対する、各ペプチドの軽と重の比率（Ｌ／Ｈ比率）を表す。数値はｌｏｇ２スケールであり、そのため、１は、２Ｘの変化を表し、０は、変化が無いことを表し、および、ＮＡは、不明を表す。
【００９７】
表１の５番目の列は、遺伝子名とアセチル化リシンに対する位置情報を示す（カッコ内）。カッコ内に１つの数値がある場合は、１つのリシンのみがアセチル化されたことを意味する。カッコ内に２つの数値がある場合、２つのリシンがアセチル化されたことを意味する。
【００９８】
表１の６番目の列は、５番目の列にあるペプチドに対する遺伝子記号を示す。
【００９９】
【表１】
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【０１００】
「実施例２−ＣＮＰ解析」
本実施例において、実施例１由来の化合物Ｂ処置細胞に対し行われたＣＮＰ解析を記述する。
【０１０１】
ＳＩＬＡＣ法は、実施例１に記述されるように行われた。
【０１０２】
回収された「重」および「軽」標識細胞は、氷上で１５分間、それぞれ、２Ｘ  ＮＥＴＮ緩衝液（２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．０％  ＮＰ−４０、ｐＨ７．２）を用いて最初に溶解された。上清を、４℃で１０分間、２０，０００ｇで遠心した後に保存した。「重」または「軽」標識上清中のタンパク質濃度の測定を行った後、上清中の等量の粗タンパク質を混合し、当該粗タンパク質を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を最終濃度１５％（ｖ／ｖ）で添加することにより沈殿させた（これは、細胞質分画と呼ばれる）。−２０℃のアセトンで２回洗浄した後、タンパク質沈殿物を、トリプシン消化のために１００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８．０）中に溶解させた。
【０１０３】
残った細胞沈殿物は、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を補充した１Ｘ  ＥＴＮ緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．２）を用いて、氷上で１５分間、それぞれ、さらに溶解させた。得られた溶解物は、１０分間、２０，０００ｇで遠心することにより浄化し、上清を、核抽出物分画として保存した。「重」または「軽」標識上清中のタンパク質濃度の測定を行った後、上清中の等量の粗タンパク質を混合し、当該粗タンパク質を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を最終濃度１５％（ｖ／ｖ）で添加することにより沈殿させた（これは、核抽出物分画と呼ばれる）。−２０℃のアセトンで２回洗浄した後、タンパク質沈殿物を、トリプシン消化のために１００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８．０）中に溶解させた。
【０１０４】
最後に残った細胞沈殿物は、８Ｍ尿素に溶解させ、クロマチン結合タンパク質を抽出した。タンパク質濃度を測定した後、尿素溶液中の等量のクロマチン結合タンパク質を混合し、当該タンパク質を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を最終濃度１５％（ｖ／ｖ）で添加することにより沈殿させた（これは、核沈殿物分画と呼ばれる）。−２０℃のアセトンで２回洗浄した後、タンパク質沈殿物を、トリプシン消化のために１００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中に溶解させた。
【０１０５】
上述の３つの分画のトリプシン消化の後、Ｋａｃアフィニティ富化、次いでＭＳ解析を行い、データ照会を別々に行った。混合Ｋａｃデータは、化合物ＢとＤＭＳＯの対における総Ｋａｃプロファイリングデータを形成した。
【０１０６】
化合物Ｂで処置された細胞溶解物は、上述のように、３つの細胞内分画‐細胞質（Ｃ）、可溶性核抽出物（Ｎ）、および不溶性核沈殿物（Ｐ）へと分画化した。この細胞内局在性に関する情報を伴う、実施例１においてＨＤＡＣ６特異的であると特定された任意のペプチドは、細胞内のそれらの機能の理解に非常に有用である。
【０１０７】
これら実験の結果を表２に示す。
【０１０８】
表２の最初の列は、ＳＩＬＡＣ法により特定されたアセチル化ペプチドのアミノ酸配列を示し、ここで、「（ａｃ）」とは、従前からアミノ酸がアセチル化されていたことを意味する。この列は、表１の最初の列と同一である。
【０１０９】
表２の２番目の列は、１番目の列のペプチドに対する遺伝子記号を示す。この列は、表１の６番目の列と同一である。
【０１１０】
表２の３番目、４番目、および５番目の列は、化合物Ｂに関するデータを示す。「＋」とは、各薬剤を処置された細胞群に対する、各ペプチドのトータル（Ｃ＋Ｎ＋Ｐ＝トータル）に対して標準化した場合の、ペプチドの量における１．３倍以上の変化を示す。「−」とは、各薬剤を処置された細胞群に対する、各ペプチドのトータル（Ｃ＋Ｎ＋Ｐ＝トータル）に対して標準化した場合の、ペプチドの量における１．２９倍以下の変化を示す。「ＮＯＮＥ（無し）」は、不明であることを示す。
【０１１１】
表２の６番目、７番目、および８番目の列は、化合物Ｂに対するデータを示す。これら列の数値は、各薬剤を処置された細胞群に対する、各ペプチドのトータル（Ｃ＋Ｎ＋Ｐ＝トータル）に対して標準化した場合の、ペプチドの量における倍数変化を表す。数値は、ｌｏｇ２スケールであり、そのため、１は、２Ｘの変化を表し、０は、変化が無いことを表し、および、ＮＯＮＥ（無し）は、不明を表す。
【０１１２】
【表２】
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【０１１３】
「実施例３−生物学的経路の解析」
本実施例では、化合物Ａ、化合物ＢおよびツバスタチンＡの各々に対して行われた生物学的経路の解析を記述する。
【０１１４】
実施例１のＳＩＬＡＣ法により、バイオマーカーペプチドが特定の薬剤（化合物Ａ、化合物Ｂ、またはツバスタチンＡ）に対して特定された時点で、当該薬剤の作用により示唆される、主要な生物学的経路、または、機能を特定するため、生物学的経路のデータベース（ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）におけるペプチド／タンパク質に対する、当該バイオマーカーペプチドの比較を行った。
【０１１５】
化合物Ｂ、ツバスタチンＡ、および化合物Ａの各々に対する生物学的経路の解析結果について、それぞれ、表３、５および７に示す。各薬剤に対し特定されたトップ５０の経路のみ、表３、５および７のそれぞれに列記する。
【０１１６】
表３、５および７の最初の列は、示唆された経路の名称を示す。
【０１１７】
表３、５および７の２番目の列は、各薬剤で処置された細胞群に対して観察された経路における遺伝子数を示す。
【０１１８】
表３、５および７の３番目の列は、１番目の列で記述された経路における遺伝子の総数を示す。
【０１１９】
表３、５および７の４番目の列は、２番目の列における数と、３番目の列における数の比率を示す。
【０１２０】
表３、５および７の５番目の列は、２番目と３番目の列における数に対するｐ値を示す。
【０１２１】
表３、５および７の６番目の列は、１番目の列で特定された経路に関する説明を示す。
【０１２２】
【表３】
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【０１２３】
以下の表４は、経路解析において検証された薬剤（化合物Ｂ、ツバスタチンＡ、および化合物Ａ）に対する、当該経路の関連性を、文字符号により示す。
【０１２４】
【表４】
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【０１２５】
【表５】
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【０１２６】
以下の表６は、経路解析において検証された薬剤（化合物Ｂ、ツバスタチンＡ、および化合物Ａ）に対する、当該経路の関連性を、文字符号により示す。
【０１２７】
【表６】
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【０１２８】
【表７】
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【０１２９】
以下の表８は、経路解析において検証された薬剤（化合物Ｂ、ツバスタチンＡ、および化合物Ａ）に対する、当該経路の関連性を、文字符号により示す。
【０１３０】
【表８】
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【０１３１】
「実施例４−化合物Ｂを処置した細胞の溶解物中の総ペプチド（アセチル化および非アセチル化の両方を含む）量の解析」
実施例１に記述されるようにＳＩＬＡＣ法を行った。化合物Ｂ（１２Ｃリシン標識）およびＤＭＳＯ処置（１３Ｃリシン標識）細胞を、２％ＳＤＳを用いて、５分間、９７℃で溶解させた。高強度超音波処理装置を用いて試料をソニケートし、４℃で１５分間、２０，０００ｇで遠心し、残留物を取り除いた。上清中のタンパク質含量は、ＢＣＡアッセイキット(Thermo Fisher, Waltham, MA)を用いて、メーカーの説明書に従い測定した。各試料の粗タンパク質２５μｇを混合し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離させた。電気泳動後、ゲルをクマシンブルーで染色した。ゲル全体のレーンを２０個のスライスに切り出し、トリプシンで消化させた。ゲルのバンドを、１ｍｍ３の小さな立方体に切り出し、５００μｌのＨ２Ｏで洗浄し、次いで、５００μｌの５０％エタノールにより、ミキサー上で一晩洗浄した。５００μｌのアセトニトリルを添加することにより、ゲル片を脱水させた。上清を棄て、ゲル片を真空乾燥させた。ジスルフィド結合は、１時間、５６℃で、５０ｍＭの重炭酸アンモニウム緩衝液に溶解させた１０ｍＭのＤＴＴ  ２００μｌと共にゲルをインキュベートすることにより開裂させた。システインのアルキル化は、暗所、室温で４５分間、５０ｍＭの重炭酸アンモニウム緩衝液に溶解させた５５ｍＭのヨードアセトアミド  ２００μｌと共に、ゲルをインキュベートすることにより行われた。ゲル片を脱水させ、再度、真空乾燥させた。ゲル片をトリプシン溶液（５０ｍＭの重炭酸アンモニウム緩衝液に溶解させた、１０ｎｇ／μｌ）で覆った。４℃で３０分間インキュベートした後、残ったトリプシン溶液を取り除き、５０ｍＭの重炭酸アンモニウムを加え、３７℃で一晩消化する間、ゲルが乾燥しないようにした。ゲル中のペプチドを１度、５０％アセトニトリルに溶解させた５％ＴＦＡ  ２００μｌにより抽出し、および、２度、１００％アセトニトリル  ２００μｌで抽出した。全ての上清を混合し、真空乾燥させ、次いで、質量解析を行った。
【０１３２】
化合物Ｂで処置された細胞に対する本実験の結果を以下の表９に示す。これらの結果において、化合物Ｂで処置された細胞の溶解物中の総ペプチド（アセチル化および非アセチル化）の量が示されている。データから、アセチル化状態に関わらず、化合物Ｂで処置することにより、どのペプチドレベルが変化したかが示される。
【０１３３】
表９の最初の列は、特定されたペプチドに対する遺伝子名を示す。
【０１３４】
表の２番目の列は、標準化後の、軽ペプチドと重ペプチドの比率を示す。
【０１３５】
表９の３番目の列は、変化量のメジアン値を示す（標準化後の軽ペプチドと重ペプチドの比率（２番目の列）から決定された）。もし倍数変化に関するメジアン値が１．３未満である場合、４番目の列と５番目の列が空白（データは示されず）になることに注意されたい（特定されたペプチドが、対象外であったため）。
【０１３６】
表９の４番目の列は、表の一番上の減少から、表の一番上の増加までの、倍数変化の推移を示す。
【０１３７】
表９の５番目の列は、特定された各ペプチドのペプチド配列を示す。
【０１３８】
【表９】
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【０１３９】
「実施例５：２−（ジフェニルアミノ）−Ｎ−（７−（ヒドロキシアミノ）−７−オキソヘプチル）ピリミジン−５−カルボキサミド（化合物Ａ）の合成」
【０１４０】
【化４】
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【０１４１】
【化５】
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【０１４２】
【化６】
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【０１４３】
ＤＭＦ（１００ｍｌ）に溶解したアニリン（３．７ｇ、４０ｍｍｏｌ）、エチル２−クロロピリミジン−５−カルボン酸１（７．５ｇ、４０ｍｍｏｌ）、  Ｋ２ＣＯ３（１１ｇ、８０ｍｍｏｌ）の混合物を脱気し、１２０℃、Ｎ２下で一晩攪拌した。反応混合物を室温まで冷却し、ＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）で希釈し、次いで、飽和ブライン（２００ｍｌｘ３）で洗浄した。有機層を分離させ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、乾燥するまで脱水させ、シリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ＝１０／１）により精製し、白色固形物として所望の産物を得た（６．２ｇ、６４％）。
【０１４４】
【化７】
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【０１４５】
ＴＥＯＳ（２００ｍｌ）に溶解した化合物２（６．２ｇ、２５ｍｍｏｌ）、ヨードベンゼン（６．１２ｇ、３０ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（９５５ｍｇ、５．０ｍｍｏｌ）、Ｃｓ２ＣＯ３（１６．３ｇ、５０ｍｍｏｌ）の混合物を脱気し、窒素で浄化した。得られた混合物を１４時間、１４０℃で攪拌した。室温まで冷却した後、残留物をＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）および９５％ＥｔＯＨ（２００ｍｌ）で希釈し、シリカゲル上のＮＨ４Ｆ−Ｈ２Ｏ［５０ｇ、水（１５００ｍｌ）に溶解したＮＨ４Ｆ（１００ｇ）をシリカゲル（５００ｇ、１００−２００メッシュ）に加えることにより前調製された］を加え、得られた混合物を室温に２時間置き、凝固した物質をろ過し、ＥｔＯＡｃで洗浄した。ろ過物を乾燥するまで脱水させ、残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ＝１０／１）により精製し、黄色固形物（３ｇ、３８％）を得た。
【０１４６】
【化８】
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【０１４７】
２Ｎ  ＮａＯＨ（２００ｍｌ）を、ＥｔＯＨ（２００ｍｌ）に溶解した化合物３（３．０ｇ、９．４ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。混合物を３０分間、６０℃で攪拌した。溶媒を蒸発させた後、溶液を２Ｎ  ＨＣｌで中性化し、白色沈殿物を得た。懸濁液をＥｔＯＡｃ（２ｘ２００ｍｌ）で抽出し、有機層を分離させ、水（２ｘ１００ｍｌ）、ブライン（２ｘ１００ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を除去し、茶色の固形物（２．５ｇ、９２％）を得た。
【０１４８】
【化９】
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【０１４９】
化合物４（２．５ｇ、８．５８ｍｍｏｌ）、アミノヘプタン酸５（２．５２ｇ、１２．８７ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３．９１ｇ、１０．３０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（４．４３ｇ、３４．３２ｍｍｏｌ）の混合物を一晩、室温で攪拌した。反応混合物をろ過した後、ろ過物を乾燥するまで脱水し、残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ＝２／１）により精製し、茶色固形物（２ｇ、５４％）を得た。
【０１５０】
【化１０】
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【０１５１】
化合物６（２．０ｇ、４．６ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＨ（５０ｍｌ）に溶解した水酸化ナトリウム（２Ｎ、２０ｍＬ）およびＤＣＭ（２５ｍｌ）の混合物を１０分間、０℃で攪拌した。ヒドロキシルアミン（５０％）（１０ｍｌ）を０℃まで冷却し、当該混合物に添加した。得られた混合物を２０分間、室温で攪拌した。溶媒を除去した後、混合物を１Ｍ  ＨＣｌで中性化し、白色沈殿物を得た。粗生成物をろ過し、プレＨＰＬＣにより精製し、白色固形物（９５０ｍｇ、４８％）を得た。
【０１５２】
「実施例６：２−（（１−（３−フルオロフェニル）シクロヘキシル）アミノ）−Ｎ−ヒドロキシピリミジン−５−カルボキサミド（化合物Ｂ）の合成」
化合物Ｂの合成スキーム：
【０１５３】
【化１１】
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【０１５４】
「１−（３−フルオロフェニル）シクロヘキサンカルボニトリルの合成：」
Ｄｒｙ  ＤＭＦ（１０００ｍｌ）に溶解した２−（３−フルオロフェニル）アセトニトリル（１００ｇ、０．７４ｍｏｌ）の溶液に、１，５−ジブロモペンタン（１７０ｇ、０．７４ｍｏｌ）を加え、および、ＮａＨ（６５ｇ、２．２ｅｑ）を氷槽で滴下して加えた。添加後、得られた混合物を５０℃で一晩、しっかりと攪拌させた。懸濁液を注意深く氷水により冷却し、エチル酢酸（３＊５００ｍｌ）で抽出した。混合有機溶液を濃縮し、粗生成物を得て、それをフラッシュカラム上で精製し、青白色固形物として１−（３−フルオロフェニル）シクロヘキサンカルボニトリル（１００ｇ、６７％）を得た。
【０１５５】
「１−（３−フルオロフェニル）シクロヘキサンカルボキサミドの合成：」
ＰＰＡ（５００ｍｌ）に溶解した１−（３−フルオロフェニル）シクロヘキサンカルボニトリル（１００ｇ、０．４９ｍｏｌ）の溶液を約５〜６時間、１１０℃で加熱した。完了後、得られた混合物を注意深く飽和ＮａＨＣＯ３溶液でｐＨ＝８〜９まで塩基性化した。沈殿物を回収し、水（１０００ｍｌ）で洗浄し、白色固形物として１−（３−フルオロフェニル）シクロヘキサンカルボキサミド（９５ｇ、８７％）を得た。
【０１５６】
「１−（３−フルオロフェニル）シクロヘキサンアミンの合成：」
ｎ−ＢｕＯＨ（８００ｍｌ）に溶解した１−（３−フルオロフェニル）シクロヘキサンカルボキサミド（９５ｇ、０．４３ｍｏｌ）の溶液に、ＮａＣｌＯ（２６０ｍｌ、１．４ｅｑ）を添加し、次いで、３Ｎ  ＮａＯＨ（４００ｍｌ、２．８ｅｑ）を０℃で加え、反応物を室温で一晩攪拌した。得られた混合物をＥＡ（２＊５００ｍｌ）で抽出し、混合有機溶液をブラインで洗浄し、次いで、乾燥させ、白色粉末として粗生成物（７２ｇ、７３％）を得て、それをＨＣｌ塩で処置して精製した。
【０１５７】
「エチル２−（１−（３−フルオロフェニル）シクロヘキシルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸の合成：」
ジオキサン（５０ｍｌ）に溶解した１−（３−フルオロフェニル）シクロヘキサンアミン塩酸塩（２．２９ｇ、１０ｍｍｏｌ）の溶液に、エチル２−クロロピリミジン−５−カルボン酸（１．８７ｇ、１．０ｅｑ）およびＤＩＰＥＡ（２．５８ｇ、２．０ｅｑ）を加えた。混合物を１１０〜１２０℃で一晩加熱した。得られた混合物を直接、シリカゲルカラム上で精製し、白色固形物として連結産物（１．３７ｇ、４０％）を得た。
【０１５８】
「化合物Ｂの合成：」
ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１０ｍｌ、１：１）に溶解したエチル２−（１−（３−フルオロフェニル）シクロヘキシルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸（１００ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）の溶液に、水（２ｍｌ、超過）に溶解した５０％  ＮＨ２ＯＨを加え、次いで、ＭｅＯＨ（２ｍｌ、超過）に溶解した飽和ＮａＯＨを０℃で加え、反応物を３〜４時間攪拌した。完了後、得られた混合物を濃縮し、２Ｎ  ＨＣｌでｐＨ＝４〜５まで酸性化した。沈殿物を回収し、水（１０ｍｌ）で洗浄し、ＮＨ２ＯＨを除去し、乾燥させて、白色粉末として化合物Ｂ（７０ｍｇ、７３％）を得た。
【配列表】
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【国際調査報告】
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