(57)【要約】  【解決手段】  Ｔ２Ｄの治療に有効な治療薬の同定に有用な組成物および方法を開示する。  【選択図】    なし
2016516720.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写因子７様２（ＴＣＦ７Ｌ２）をコードする核酸を含むＳＮＰと、表Ｉに列挙されたタンパク質の少なくとも１つとを有する単離結合複合体であって、前記ＳＮＰは、ｒｓ７９０３１４６である単離結合複合体。
【請求項２】
請求項１記載の単離結合複合体において、前記複合体は、表Ｉに列挙されたタンパク質の１つ、２つ、３つ、または４つを有する単離結合複合体。
【請求項３】
請求項２記載の単離結合複合体において、前記１つのタンパク質は、ＰＡＲＰ−１である単離結合複合体。
【請求項４】
請求項２記載の単離結合複合体において、前記１つのタンパク質は、Ｔｈｒａｐ３である単離結合複合体。
【請求項５】
請求項２記載の単離結合複合体において、前記１つのタンパク質は、ＲＮＡヘリカーゼＡである単離結合複合体。
【請求項６】
上記請求項のいずれか一項に記載の結合複合体を破壊し、それによりＴＣＦ７Ｌ２の機能を調整する薬剤を同定する方法であって、
ａ）有効量の前記薬剤の存在下および非存在下で前記複合体をインキュベートする工程であって、前記複合体は、少なくとも１つの検出可能に標識されたタンパク質または核酸を有する、前記インキュベートする工程と、
ｂ）前記薬剤の非存在下でみられる前記結合複合体の破壊に対する、前記薬剤の存在下における前記結合複合体の破壊を測定する工程であって、前記複合体を破壊する薬剤は、ＴＣＦ７Ｌ２の機能の調節因子として同定される、前記測定する工程と
を有する方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法において、前記方法は細胞内で行われ、前記ＴＣＦ７Ｌ２の機能は、Ｗｎｔシグナリング、クロマチンリモデリング、標的遺伝子の発現の活性化、並びにＤＮＡ損傷の検出および修復からなる群から選択される方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法において、前記薬剤は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小分子、およびペプチドからなる群から選択される方法。
【請求項９】
請求項７記載の方法において、前記細胞は、ＩＮＳ細胞、ＰＣ１２細胞、ＭＩＮ６細胞、膵島β細胞、およびαＴＣ６細胞からなる群から選択される方法。
【請求項１０】
請求項８記載の方法において、インスリン分泌、グルカゴン分泌、およびグルコサミン誘導β細胞アポトーシスからなる群から選択されるパラメータに対する前記ｓｉＲＮＡの調節効果が測定される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年３月１４日、２０１３年４月１日、および２０１３年１２月３０日にそれぞれ出願された米国仮特許出願第６１／７８２，６４６号、同第６１／８０７，０３６号、および同第６１／９２１，５８５号に対して優先権を主張する。前述の各出願の開示全体が、完全に記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、代謝性疾患の転写制御および薬物スクリーニングの分野に関する。より具体的には、本発明は、様々な障害に関与するＴＣＦ７Ｌ２変異体の全体に渡って結合する転写機構の機能的特性評価を提供する。様々な障害としては、これに限定されるものではないが、２型糖尿病、嚢胞性線維症関連糖尿病（ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｄｉａｂｅｔｅｓ：ＣＦＲＤ）、成人潜在性自己免疫性糖尿病（ｌａｔｅｎｔ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ：ＬＡＤＡ）、妊娠性糖尿病、若年患者における膵島抗体陰性の糖尿病、心血管疾患、微小血管疾患、および統合失調症が挙げられる。この複合体の形成を阻害する薬剤は、そのような障害の治療に効果があるはずである。
【背景技術】
【０００３】
本発明が関係する技術の水準を説明するために、いくつかの刊行物および特許文献が本明細書全体に渡り引用される。これらの各引用文献は、完全に記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
転写因子７様２（ＴＣＦ７Ｌ２）（Ｔ細胞特異的、ＨＭＧボックス）は、ＨＭＧボックス転写因子４またはＴ細胞特異的転写因子４としても知られ、Ｗｎｔシグナル伝達経路に関わるＴＣＦ／ＬＥＦファミリーのメンバーである（ｖａｎ Ｅｓ，Ｊａｙ ｅｔ ａｌ．２００５）。古典的Ｗｎｔ経路は、β−カテニンの安定化を制御する分泌性糖タンパク質群であるＷｎｔリガンドにより開始される。リガンドの非存在下では、細胞質性β−カテニンはＡＰＣおよびＡｘｉｎに結合し、キナーゼＣＫＩαおよびＧＳＫ３βにより高リン酸化され、最終的にユビキチン化され、プロテアソームにより分解される。Ｗｎｔタンパク質が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄファミリー受容体と膜貫通型ＬＲＰ−５／６／ａｒｒｏｗファミリー共受容体との細胞表面受容体複合体に結合すると、分解複合体（ＣＫＩα、ＧＳＫ３β、ＡＰＣ、Ａｘｉｎ）はβ−カテニンを破壊できず、β−カテニンの安定化につながる。蓄積したβ−カテニンは、核へ移行することができ、ＴＣＦ／ＬＥＦファミリー転写因子と相互作用して標的遺伝子の発現を活性化する（Ｌｏｇａｎ ａｎｄ Ｎｕｓｓｅ ２００４）。Ｗｎｔシグナル伝達経路は、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉａ）、および脊椎動物の間で進化的に保存され、細胞極性、細胞分化、胚発生、および癌などの多くの疾患で様々な重要な役割を果たす（Ｌｏｇａｎ ａｎｄ Ｎｕｓｓｅ ２００４）。ＴＣＦ７Ｌ２は、Ｗｎｔシグナル伝達の主要エフェクターである（Ｒａｖｉｎｄｒａｎａｔｈ，Ｏ‘Ｃｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．２００８；Ｇｒｏｖｅ ２０１１）。ＴＣＦ７Ｌ２は、配列特異的にＤＮＡモチーフに結合し、Ｗｎｔ標的遺伝子の発現を調節することができる。ＴＣＦ７Ｌ２は、抑制因子または活性因子として作用する。β−カテニンが存在しない場合、ＴＣＦ７Ｌ２は、Ｗｎｔ応答エレメントに結合して標的遺伝子の転写を抑制するが、一方、ＴＣＦ７Ｌ２に結合しているβ−カテニンは、遺伝子発現を活性化する。
【０００５】
転写因子７様２遺伝子（ＴＣＦ７Ｌ２）多型であるｒｓ７９０３１４６のＴアレルは、２型糖尿病に関連することがよく知られている（Ｇｒａｎｔ，Ｔｈｏｒｌｅｉｆｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００６；Ｓａｘｅｎａ，Ｇｉａｎｎｉｎｙ ｅｔ ａｌ．２００６；Ｓｃｏｔｔ，Ｂｏｎｎｙｃａｓｔｌｅ ｅｔ ａｌ．２００６；Ｈｅｌｇａｓｏｎ，Ｐａｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００７）。アフリカ系アメリカ人の遺伝子型決定により、ｒｓ７９０３１４６はこの遺伝子座の原因変異体であり、２型糖尿病のリスクをもたらす、という一般的な見解の一致が裏付けられている（Ｐａｌｍｅｒ，Ｈｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１１）。しかし、一塩基多型（ＳＮＰ）であるｒｓ７９０３１４６が、どのようにＴＣＦ７Ｌ２の機能を調節しているのかという基本的メカニズムは、依然として不明である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によれば、転写因子７様２（ＴＣＦ７Ｌ２）をコードする核酸を含むＳＮＰと、表Ｉに列挙されたタンパク質の少なくとも１つとを含む単離結合複合体であって、前記ＳＮＰは、ｒｓ７９０３１４６である単離結合複合体が提供される。１つの実施形態において、前記複合体は、表Ｉに列挙されたタンパク質の１つ、２つ、３つ、または４つを含む。好ましくは、前記複合体は、ＴＣＦ７Ｌ２核酸を含むＳＮＰとＰＡＲＰ−１とを少なくとも含む。
【０００７】
本発明の別の観点によれば、本明細書に記載の結合複合体を破壊し、それによりＴＣＦ７Ｌ２の機能を調節する薬剤を同定する方法が開示される。１つの例示的な方法は、有効量の前記薬剤の存在下および非存在下で前記複合体をインキュベートする工程であって、前記複合体は、少なくとも１つの検出可能に標識されたタンパク質または核酸を有する、前記インキュベートする工程（工程ａ）と、前記薬剤の非存在下でみられる前記結合複合体の破壊に対する、前記薬剤の存在下における前記結合複合体の破壊を測定する工程（工程ｂ）であって、前記複合体を破壊する薬剤は、ＴＣＦ７Ｌ２の機能の調節因子として同定される、前記測定する工程とを有する。前記方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは細胞内のｉｎ ｖｉｖｏで行うことができる。調節されるＴＣＦ７Ｌ２の機能としては、これに限定されるものではないが、Ｗｎｔシグナル伝達、クロマチン再構築、標的遺伝子の発現の活性化、並びにＤＮＡ損傷の検出および修復が挙げられる。例示的な薬剤として、ｓｉＲＮＡｓ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小分子、ペプチド、および現在その他の障害の治療のための臨床試験で知られているＰＡＲＰ１阻害剤が挙げられる。
【０００８】
本発明のさらに別の観点によれば、必要とする患者においてグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）の分泌を増加させる方法が提供される。１つの例示的な方法は、有効量のＰＡＲＰ−１阻害剤を投与することを伴い、前記阻害剤は、治療に有利な方法においてＧＬＰ−１分泌の増加に有効である。好ましい実施形態において、患者は２型糖尿病であり、ＧＬＰ−１分泌の増加により前記患者の糖尿病の症状が緩和する。この目的のための例示的なＰＡＲＰ−１阻害剤として、これに限定されるものではないが、オラパリブ（ｏｌａｐａｒｉｂ）、ルカパリブ（ｒｕｃａｐａｒｉｂ）、およびイニパリブ（ｉｎｉｐａｒｉｂ）が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、タンパク質同定のためのオリゴプルダウンの結果を示す。Ａ．タンパク質結合の同定のために使用された、ＳＮＰ ｒｓ７９０３１４６を含むビオチン標識二本鎖オリゴヌクレオチド。Ｂ．ビオチン標識二本鎖オリゴヌクレオチドに結合し、クマシーブルーＲ−２５０で染色された、ＨＣＴ１１６細胞の核溶解物からのタンパク質（総タンパク質量各２ｍｇ）。矢印で示される、ｒｓ７９０３１４６のオリゴプルダウンに特異的なタンパク質のバンド。
【図２Ａ】図２Ａは、ＳＩＬＡＣ実験のフローチャートを示す。ＨＣＴ１１６細胞は、ペプチドの質量（４Ｄａ）の差に基いて識別できるように、１３Ｃ６−リジンおよび１３Ｃ６−アルギニンで代謝的に標識される。ビオチン化ＤＮＡオリゴは、合成され、非標識（リジン−ｄ０）細胞および標識細胞からの核抽出物とともにインキュベートされる。ストレプトアビジンビーズを用いてタンパク質−ＤＮＡ複合体を固定する。トリプシンによるｉｎ ｇｅｌ消化の後、トリプシンペプチドを含み、特異的に標識されたリジンおよびアルギニンの標識体は、検出されて、質量分析（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＭＳ）により定量化される。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＳＩＬＡＣ分析に基いた、インスリン処理後のＰａｒｐ−１、ＲＮＡヘリカーゼＡ、およびＴｈｒａｐ３の結合の量的変化に関する表を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、測定されたＰａｒｐ−１、ＲＮＡヘリカーゼＡ、およびＴｈｒａｐ３の相対結合量を、棒グラフ形式を用いて示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ＨＣＴ１１６核抽出物を免疫共沈降に用いてタンパク質の相互作用を示した際に得られた結果を示す。ＴＣＦ７Ｌ２、Ｐａｒｐ−１、ＲＮＡヘリカーゼＡ、およびＴｈｒａｐ３は互いに作用し、複合体を形成する。
【図３Ｂ】図３Ｂは、クロマチンリモデリング、ＤＮＡ修復、および転写制御を調節していると思われるＴＣＦ７Ｌ２、ＲＮＡヘリカーゼ、およびＴｈｒａｐ３間の複合体形成を示す略図である。
【図４】図４は、ｒｓ７９０３１４６のＣおよびＴ対立遺伝子間のＸＲＣＣ５およびＲＰ−Ａ ｐ７０の相対ＤＮＡ結合親和性を示す。
【図５】図５は、オラパリブ、ルカパリブ、およびイニパリブの存在下および非存在下で基礎処理およびグルコース処理されたＮＣＩ−Ｈ７１６細胞における、ＥＬＩＳＡで決定されたＧＬＰ−１レベルの変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
ある特定の遺伝的関連の基本的な作用機序を解明することは、極めて困難であることが分かっている。しかしながら、複数の民族におけるベイジアンモデリングを用いた研究は、ＳＮＰであるｒｓ７９０３１４６がこの遺伝子内での原因変異体であることを強く示唆しているため、重要な２型糖尿病関連遺伝子座であるＴＣＦ７Ｌ２は、翻訳分析の機会を提供する。この変異体はまた、その他の様々な障害に関連している。我々は、タンパク質因子がこのイントロン領域に結合してＴＣＦ７Ｌ２の機能を調節すると仮定した。ＳＮＰ全体に渡る転写機構を解明するために、質量分析（ＭＳ）と組み合せたオリゴプルダウンを行った。ＨＣＴ１１６細胞からの核溶解物は、ＴＣＦ７Ｌ２が豊富に発現しているが、この核溶解物をｒｓ７９０３１４６にまたがるビオチン標識二本鎖６０ｂｐオリゴヌクレオチドとともにインキュベートした。ＤＮＡ−タンパク質複合体をストレプトアビジン−アガロースビーズで沈殿させ、結合したタンパク質を変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。トリプシン消化の後、サンプルをＭＳで分析した。
【００１１】
ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１：ＰＡＲＰ１）は、圧倒的に最も量が多い結合因子であることが観察された。我々はまた、安定同位体標識を用いて、インスリン処理後の結合親和性の変化を定量化した。ＰＡＲＰ１の結合は、穏やかに２０％増加したが、次に最も量が多い結合タンパク質の中で、ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼＡおよび甲状腺ホルモン受容体関連タンパク質３（ｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ３：ＴＨＲＡＰ３）は、それぞれ１２倍および７倍の顕著な結合増加を示した。興味深いことに、３つのタンパク質は全てＴＣＦ７Ｌ２自体と二量体化し、発現のフィードバックループという概念を支持している。また、我々は、結合量があまり多くないタンパク質、即ちＸ線修復クロス補足タンパク質５（ＸＲＣＣ５）およびＲＰＮｐ７０について、対立遺伝子の違いを示す証拠を発見した。
【００１２】
我々の結果は、インスリンおよび対立遺伝子の状態の両方に対して感受性があり、ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子内のｒｓ７９０３１４６全体に渡り結合するタンパク質複合体を指摘し、この遺伝子座がリスクをもたらす機構を明白にする。さらに、本明細書に記載するタンパク質とＤＮＡとの相互作用は、この変異体の存在に関連した代謝障害の治療に有効な薬剤を同定するスクリーニングアッセイに用いるための、医薬品になり得る（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）新たな標的を提供する。
【００１３】
定義  
以下の定義は、本発明の理解を容易にするために提供される。
【００１４】
本発明の目的上、冠詞「ａ」または「ａｎ」をつけて表記した物体は、１つまたは複数のその物体を意味する。例えば、「ａ ｃＤＮＡ」は、１つまたは複数のｃＤＮＡ、または少なくとも１つのｃＤＮＡを意味する。そのように、用語「１つの（「ａ」または「ａｎ」）」、「１つまたは複数の」、および「少なくとも１つの」は、本明細書において交換可能に使用される可能性がある。また、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、交換可能に使用される可能性があることにも留意されたい。さらに、「からなる群から選択される」化合物とは、後に続くリスト内の化合物のうち１つまたは複数を意味し、当該化合物のうち２つまたはそれ以上の混合物（即ち、組み合せ）を含む。疾患または障害を予防および／または改善する方法も含む。移行句（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｔｅｒｍｓ）である「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、添付の請求項において出願当初のおよび補正した形で使用される場合、列挙されていない追加の請求要素または工程があれば、それらは特許請求の範囲から除外されることに関して、特許請求の範囲を定める。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、包括的または非限定的（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ）であることが意図されたものであり、さらなる列挙されていない要素、方法、工程、または物質を除外しない。用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、請求項に規定されているもの以外の要素、工程、または物質を除外する。後者の例として、特定の物質に通常関連している不純物がある。用語「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、特許請求の範囲を特定の要素、工程、または物質、および請求した主題の基本的な特性および新規の特性に物質的に影響しないものに限定する。本発明によれば、単離されたまたは生物学的に純粋な分子は、その自然な環境から取り出された化合物である。そのように、「単離された」および「生物学的に純粋な」は、化合物が精製される程までを必ずしも反映しない。本発明の単離された化合物は、その自然源から得ることができ、実験の合成技術を用いて製造することができ、または任意のそのような化学合成経路により製造することができる。
【００１５】
「Ｔ２Ｄ関連ＳＮＰまたは特異的マーカー」とは、当該疾患に罹患していない正常な患者には見られない、Ｔ２Ｄの発症リスクの増減に関連しているＳＮＰまたはマーカーである。そのようなマーカーとしては、これに限定されるものではないが、核酸、それにコードされるタンパク質、またはその他の小分子が挙げられる。本発明のマーカーの関連情報は、www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?type=rs&rs=rs7903146のｄｂＳＮＰ登録にて確認することができる。
【００１６】
「２型糖尿病（Ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ：Ｔ２Ｄ）」という表現（以前はインスリン非依存性糖尿病（ｎｏｎｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ：ＮＩＤＤＭ）または成人発症型糖尿病）は、糖尿病の症例の約９０％を構成する。Ｔ２Ｄは、インスリン耐性および相対的インスリン欠乏により生じる高血糖による代謝障害である。十分なインスリンがないと、グルコースは、細胞内に入らずに血流内に蓄積する。身体は、グルコースが血流中で高レベルであるにもかかわらず、このグルコースを用いてエネルギーを得ることができず、空腹感が増長する。また、血中のグルコースレベルが高いことにより、患者は、より多く排尿し、続いて過度の口渇が生じる。
【００１７】
「一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）」は、ＤＮＡ内の単一塩基がその位置における通常の塩基と異なっている変化を意味する。これらの単一塩基の変化は、ＳＮＰｓまたは「スニップス（ｓｎｉｐｓ）」と呼ばれる。何百万ものＳＮＰｓがヒトゲノムにカタログ収録されてきた。鎌状細胞を生じるＳＮＰなど、ＳＮＰｓの中には、疾患の原因であるものもある。その他のＳＮＰｓは、ゲノム内の正常な変異である。
【００１８】
本明細書における用語「遺伝子変異」とは、１つまたは複数の核酸分子の野生型または参照配列からの変化を意味する。遺伝子変異としては、これに限定されるものではないが、既知の配列の核酸分子における少なくとも１つのヌクレオチドの塩基対の置換、挿入、および欠失などが挙げられる。
【００１９】
本明細書における用語「固体マトリックス」とは、ビーズ、微粒子、マイクロアレイ、マイクロ滴定ウェルまたは試験管の表面、ディップスティックまたはフィルターなどの任意の形態を意味する。マトリックスの物質は、ポリスチレン、セルロース、ラテックス、ニトロセルロース、ナイロン、ポリアクリルアミド、デキストラン、またはアガロースであってもよい。
【００２０】
本明細書における「標的核酸」とは、核酸複合体混合物中に存在する規定の核酸領域を意味し、その規定の野生型領域には、Ｔ１Ｄに関連している可能性があるまたはその可能性がない少なくとも１つの既知のヌクレオチド変異が含まれる。核酸分子は、ｃＤＮＡクローニングまたはサブトラクティブハイブリダイゼーションにより自然源から単離されても、または手作業で合成されてもよい。核酸分子は、トリエステル合成法により、または自動ＤＮＡ合成装置を用いて手作業で合成されてもよい。
【００２１】
本発明で使用する核酸に関して、用語「単離された核酸」を使用する場合がある。この用語は、ＤＮＡに適用する場合、そのＤＮＡ源である生物の自然に存在するゲノムにおいて、（５‘および３’の方向で）隣接している配列から分離したＤＮＡ分子を意味する。例えば、「単離された核酸」は、プラスミドベクターまたはウイルスベクターなどのベクターに挿入されたＤＮＡ分子、または原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子を含んでいてもよい。「単離された核酸分子」はまた、ｃＤＮＡ分子を含んでいてもよい。ベクターに挿入された、単離された核酸分子はまた、本明細書において、組み換え核酸分子と称することもある。
【００２２】
ＲＮＡ分子に関して、用語「単離された核酸」とは、主に、上記で定義した単離されたＤＮＡ分子にコードされたＲＮＡ分子を意味する。あるいは、この用語は、ＲＮＡ分子が「実質的に純粋な」形態で存在するように、その自然な状態（即ち、細胞内または組織内）で関連しているＲＮＡ分子から十分に分離されたＲＮＡ分子を意味してもよい。
【００２３】
核酸に関する用語「濃縮された」を用いることにより、特定のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列が、目的の細胞内または溶液中に存在する全ＤＮＡまたは全ＲＮＡに対して、正常な細胞内またはその配列を取得した細胞内と比較して、顕著に高い（２〜５倍）画分を構成することを意味する。これは、存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡの量の選択的減少、または特定のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列の量の選択的増加、またはこれら２つの組合せにより、人によって引き起こすことができる。しかしながら、「濃縮された」は、他のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列が存在しないことを示唆するわけではなく、目的の配列の相対量が顕著に増加したことを示唆するに過ぎないことに留意されたい。
【００２４】
また、目的によっては、ヌクレオチド配列が精製された形態であることは有利である。核酸に関する用語「精製された」は、絶対的な純度（均一な製剤など）を要求するものではない。代わりに、これは、配列が自然環境よりも比較的純粋であるという指標を示す（自然なレベルと比較して、このレベルは、例えばｍｇ／ｍｌ単位で、少なくとも２〜５倍高くなければならない）。ｃＤＮＡライブラリーから単離された個々のクローンは、電気泳動による均一性まで精製されてもよい。これらのクローンから得られた特許請求の範囲のＤＮＡ分子は、全ＤＮＡまたは全ＲＮＡから直接得ることができる。ｃＤＮＡクローンは、自然発生するものではなく、むしろ、部分的に精製された自然発生物（メッセンジャーＲＮＡ）の操作を介して得ることが好ましい。ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの構築は、合成物（ｃＤＮＡ）の作製を含み、純粋な個々のｃＤＮＡクローンは、ｃＤＮＡライブラリーを有する細胞のクローン選択により合成ライブラリーから単離することができる。したがって、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの構築、および異なるｃＤＮＡクローンの単離を含む工程により、天然の伝達事項の約１０−６倍の精製度を得ることができる。したがって、少なくとも１桁高い精製度、好ましくは２または３桁高い精製度、より好ましくは４または５桁高い精製度が、明示的に意図される。したがって、用語「実質的に純粋な」とは、目的化合物（例えば、核酸、オリゴヌクレオチドなど）を少なくとも５０〜６０重量％含む製剤を意味する。製剤は、目的化合物を、より好ましくは少なくとも７５重量％、最も好ましくは９０〜９９重量％含む。純度は、目的化合物に適した方法で測定される。
【００２５】
用語「相補的」とは、互いに複数の好適な相互作用を形成することができる２つのヌクレオチドを表す。例えば、アデニンはチミンと相補的であり、これらは２つの水素結合を形成することができる。同様に、グアニンとシトシンは相補的であり、３つの水素結合を形成することができる。したがって、核酸配列がチミン、アデニン、グアニン、およびシトシンの塩基配列を含む場合、この核酸分子の「相補体」は、チミンの代わりにアデニンを、アデニンの代わりにチミンを、グアニンの代わりにシトシンを、シトシンの代わりにグアニンを含む分子である。相補体は、親核酸分子と最適な相互作用を形成する核酸配列を含むことができるため、そのような相補体は、その親分子と高い親和性で結合することができる。
【００２６】
一本鎖核酸、特にオリゴヌクレオチドに関し、用語「特異的にハイブリダイズする」とは、当該技術分野で一般に用いられる所定の条件下でのハイブリダイゼーションを可能にする上で、十分に相補的な配列からなる２つの一本鎖ヌクレオチド分子間の会合を意味する（場合により、「実質的に相補的」と称される）。特に、当該用語は、オリゴヌクレオチドと、本発明の一本鎖のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子内に含まれる実質的に相補的な配列とのハイブリダイゼーションを意味し、オリゴヌクレオチドと、相補的でない配列を有する一本鎖核酸とのハイブリダイゼーションは実質的に排除することを意味する。例えば、特異的なハイブリダイゼーションは、Ｔ２Ｄに特異的なマーカー遺伝子または核酸にハイブリダイズするが、他のヌクレオチドにはハイブリダイしない配列を意味することができる。種々の相補性を有する一本鎖核酸分子の特異的なハイブリダイゼーションを可能にする適当な条件は、当該技術分野でよく知られている。
【００２７】
例えば、特定の配列相同性を有する核酸分子間でハイブリダイゼーションを起こすために必要なストリンジェンシー条件を計算する１つの一般的な式を、以下に記載する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９））：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ[Ｎａ＋]＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／二本鎖の塩基対数
上式の例として、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］および５０％ホルムアミドを用い、ＧＣ含有量４２％および平均プローブサイズ２００塩基とすると、Ｔｍは５７℃となる。ＤＮＡ二本鎖のＴｍは、相同性が１％減少する毎に１〜１．５℃下がる。したがって、配列同一性が約７５％を超える標的であれば、４２℃のハイブリダイゼーション温度で検出される。
【００２８】
ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、主に溶液の塩濃度および温度に依存する。一般にプローブとその標的のアニーリング率を最大限にするためには、ハイブリダイゼーションは、通常、算出されたハイブリッドのＴｍより２０〜２５℃低い塩および温度条件で行なう。洗浄条件は、標的用プローブの同一性の度合いに応じて、可能な限り厳しくするべきである。一般に、洗浄条件は、ハイブリッドのＴｍより約１２〜２０℃低く選択される。本発明の核酸に関して、中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションとは、６Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ デンハルト溶液、０．５％ ＳＤＳ、および変性サケ精子ＤＮＡ １００μｇ／ｍｌの４２℃でのハイブリダイゼーション、および２Ｘ ＳＳＣおよび０．５％ ＳＤＳによる５５℃での１５分間の洗浄と定義される。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションとは、６Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ デンハルト溶液、０．５％ ＳＤＳ、および変性サケ精子ＤＮＡ １００μｇ／ｍｌの４２℃でのハイブリダイゼーション、および１Ｘ ＳＳＣおよび０．５％ ＳＤＳによる６５℃での１５分間の洗浄と定義される。非常に高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションとは、６Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ デンハルト溶液、０．５％ ＳＤＳ、および変性サケ精子ＤＮＡ １００μｇ／ｍｌの４２℃でのハイブリダイゼーション、および０．１Ｘ ＳＳＣおよび０．５％ ＳＤＳによる６５℃での１５分間の洗浄と定義される。
【００２９】
本明細書における用語「オリゴヌクレオチド」とは、２つまたはそれ以上、好ましくは３つを超えるリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドからなる核酸分子と定義される。オリゴヌクレオチドの厳密なサイズは、種々の要因、およびオリゴヌクレオチドの特定の用途に依存する。オリゴヌクレオチドは、プローブおよびプライマーを含め、３ヌクレオチド〜核酸分子の全長までの任意の長さとすることができ、３ヌクレオチド〜ポリヌクレオチドの全長までの連続した核酸の全ての可能な数を明示的に含む。オリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド長であり、より好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド長である。
【００３０】
本明細書における用語「プローブ」とは、精製された制限酵素の分解生成物のように自然発生するか、合成されるかにかかわらず、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）であり、当該プローブに対して相補的な配列を有する核酸と、アニーリングまたは特異的にハイブリダイズできるものを意味する。プローブは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。プローブの厳密な長さは、温度、プローブ源、および方法の使用を含む多くの要因に依存する。例えば、診断用途においては、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプローブは、通常、１５〜２５またはそれ以上のヌクレオチドを含むが、より少数のヌクレオチドを含んでもよい。本明細書におけるプローブは、特定の標的核酸配列の種々の鎖に対し相補的であるよう選択される。これは、プローブが、一連の所定条件下で各々の標的鎖と「特異的にハイブリダイズ」またはアニーリングすることができるように、十分に相補的でなければならないことを意味している。したがって、プローブ配列は、標的の厳密な相補配列を反映している必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片がプローブの５’端または３’端に結合し、そのプローブ配列の残りの部分が標的鎖に対し相補的であってもよい。あるいは、プローブ配列が標的核酸の配列に対して十分に相補性があって特異的にアニーリングするのであれば、非相補的塩基またはより長い配列を当該プローブ内に散在させることもできる。
【００３１】
本明細書における用語「プライマー」とは、オリゴヌクレオチドであって、ＲＮＡまたはＤＮＡであり、一本鎖または二本鎖であり、生体系から得られるか、制限酵素分解により生成されるか、または合成され、適切な環境に置かれた場合には、鋳型に依存する核酸合成の開始剤として機能的に作用することができるものを意味する。適切な核酸鋳型、核酸の適切なヌクレオシド三リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、適切な補因子、および適切な温度やｐＨなどの条件が揃うと、ポリメラーゼの作用または類似の活性によりプライマーの３’端にヌクレオチドが加わることでプライマーが伸長し、プライマー伸長生成物が得られる。プライマーは、用途の特定の条件および要件に応じて長さが異なってもよい。例えば、診断用途においては、オリゴヌクレオチドプライマーは、通常、１５〜２５またはそれ以上の長さのヌクレオチドである。プライマーは、所望の伸長生成物の合成を準備するように、つまり、プライマーの３’ヒドロキシル部分を適切な並列状態で提供してポリメラーゼまたは類似酵素による合成の開始に使用するのに十分な態様で所望の鋳型鎖とアニーリングすることができるように、所望の鋳型と十分な相補性がなければならない。プライマー配列は、所望の鋳型の厳密な相補体に相当する必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチド配列であっても、その他は相補的なプライマーの５’端に結合することができる。あるいは、プライマー配列が所望の鋳型鎖の配列と十分に相補的であり、伸長生成物を合成するための鋳型−プライマー複合体を機能的に提供できるのであれば、非相補的塩基をオリゴヌクレオチドプライマー配列内に散在させてもよい。
【００３２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）については、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１９５号、および同第４，９６５，１８８号に記載されており、これらの開示全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【００３３】
用語「ベクター」は、細胞に感染し、トランスフェクトされ、または形質転換される一本鎖または二本鎖の環状核酸分子に関するものであり、独立して、または宿主細胞ゲノム内で自己複製する。環状の二本鎖核酸分子は、制限酵素での処理の際に、切断およびそれにより線形化することができる。当業者は、各種ベクター、制限酵素、および制限酵素の標的であるヌクレオチド配列に関する知識を容易に利用でき、これには、別の遺伝子配列または要素（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を結合させて結合させた配列または要素の複製を引き起こすことができる、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、またはウイルスなどの任意のレプリコンが含まれる。本発明の核酸分子は、制限酵素でベクターを切断し、その２片をライゲーションすることにより、当該ベクターに挿入することができる。
【００３４】
当業者は、原核生物または真核生物に対して、発現構築物による形質転換、トランスフェクション、または形質導入を容易にする多くの技術を利用できる。用語「形質転換」、「トランスフェクション」、「形質導入」とは、核酸および／または発現構築物を細胞または宿主生物に挿入する方法を意味する。これらの方法は、高濃度の塩、電場、または洗浄剤で細胞を処理して、宿主細胞の外膜または細胞壁を、目的の核酸分子、マイクロインジェクション、ＰＥＧ融合などに対して透過性にするなど種々の技術を含む。
【００３５】
用語「プロモーター要素」とは、ベクターに組み込まれているヌクレオチド配列であって、適切な細胞内に入ると、転写因子の作用および／またはポリメラーゼ結合を促進し、続いて当該ベクターＤＮＡの一部がｍＲＮＡに転写されることを促進するものを表す。一実施形態において、本発明のプロモーター要素は、Ｔ１Ｄに特異的なマーカー核酸分子の５’端の前方にあり、それにより前記マーカー核酸分子がｍＲＮＡに転写される。その後、宿主細胞の機構によりｍＲＮＡがポリペプチドに翻訳される。
【００３６】
当業者であれば、核酸ベクターは、プロモーター要素およびＴ１Ｄ特異的マーカー遺伝子核酸分子以外の核酸要素を含むことができることを理解する。これらの他の核酸要素としては、これに限定されるものではないが、複製起点、リボソーム結合部位、薬剤耐性酵素またはアミノ酸代謝酵素をコードする核酸配列、および分泌シグナル、局在化シグナル、またはポリペプチドの精製に有用なシグナルをコードする核酸配列が挙げられる。
【００３７】
「レプリコン」とは、任意の遺伝要素であり、例えば、プラスミド、コスミド、バクミド、プラスチド、ファージ、またはウイルスであって、おおむね独自の制御のもとで複製が可能である。レプリコンは、ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよく、一本鎖または二本鎖であってもよい。
【００３８】
「発現オペロン」とは、核酸セグメントであって、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（例えば、ＡＴＧコドンまたはＡＵＧコドンなど）、ポリアデニル化シグナル、終止コドンなどの、転写および翻訳の制御配列を有し、宿主細胞または宿主生物内でポリペプチドコード配列の発現を促進するものを意味する。
【００３９】
本明細書における用語「レポーター」、「レポーター系」、「レポーター遺伝子」、または「レポーター遺伝子産物」とは、発現の際にレポーターシグナルを生じる生成物をコードする遺伝子を核酸が含む遺伝子操作系を意味する。レポーターシグナルは、例えば、バイオアッセイ、イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイなどにより、または比色法、蛍光検出法、化学発光法、若しくはその他の方法により、容易に測定可能である。核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡであり、線状または環状であり、一本鎖または二本鎖であり、アンチセンス極性またはセンス極性を有し、レポーター遺伝子産物の発現に必要な制御エレメントに作用可能に結合することができる。当該必要な制御エレメントは、レポーター系の性質、およびレポーター遺伝子の形態がＤＮＡであるかまたはＲＮＡであるかによって異なるが、プロモーター、エンハンサー、翻訳制御配列、ポリＡ付加シグナル、転写終了シグナルなどの要素を含んでもよく、これに限定されるものではない。
【００４０】
導入された核酸は、受容細胞または受容生物の核酸に統合される（共有結合的に結合する）こともそうでないこともある。例えば細菌、酵母、植物、および哺乳類の細胞では、導入された核酸は、エピソーム要素として、またはプラスミドなどの独立したレプリコンとして維持される可能性がある。あるいは、導入された核酸は、受容細胞または受容生物の核酸へと統合され、その細胞内または生物内で安定して維持され、さらに受け継がれるかまたは前記受容細胞または受容生物の子孫細胞または子孫生物へと継承される可能性がある。最後に、導入された核酸は、受容細胞内または宿主生物内で、単に一時的に存在する可能性がある。
【００４１】
用語「選択可能なマーカー遺伝子」とは、発現の際に、抗生物質に対する耐性などの選択可能な表現型を形質転換細胞にもたらす遺伝子を意味する。
【００４２】
用語「作用可能に結合される」とは、コード配列が効果的に発現するように、当該コード配列の発現に必要な調節配列が、ＤＮＡ分子内で当該コード配列に対して適切な位置に配置されることを意味する。これと同じ定義が、発現ベクターにおいて、転写単位およびその他の転写制御エレメント（例えば、エンハンサーなど）の配置に適用される場合もある。
【００４３】
用語「遺伝子組み換え生物」または「トランスジェニック生物」とは、遺伝子または核酸分子の新たな組み合わせを有する生物を意味する。遺伝子または核酸分子の新たな組み合わせは、当業者が利用できる多様な核酸操作技術を用いて生物に導入することができる。用語「生物」は、少なくとも１つの細胞からなるあらゆる生物に関する。生物は、真核単細胞のように単純なものでもよく、哺乳類のように複雑なものでもよい。したがって、「遺伝子組み換え生物」という表現は、遺伝子組み換え細胞も、遺伝子を組み換えた真核生物および原核生物も包含する。
【００４４】
本明細書において、用語「単離されたタンパク質」または「単離および精製されたタンパク質」を使用することがある。この用語は、主に本発明の単離された核酸分子の発現により生成されたタンパク質を意味する。あるいは、この用語は、「実質的に純粋な」形態で存在するように、自然状態で関連する他のタンパク質から十分に分離されたタンパク質を意味する。「単離された」は、他の化合物または物質との人工混合物または合成混合物を除外することを意図したものではない。また、「単離された」は、基本的な活性に干渉しない不純物であって、例えば、不完全な精製、安定剤の付加、または免疫原性製剤や薬学的に許容可能な製剤などへの配合により存在する可能性がある不純物の存在を除外することを意図したものでもない。
【００４５】
「特異的結合ペア」は、相互に特定の特異性を有し、通常条件では他の分子より優先して相互に結合する特異的結合メンバー（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｅｍｂｅｒ：ｓｂｍ）および結合パートナー（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐａｒｔｎｅｒ：ｂｐ）を含む。特異的結合ペアの例は、抗原および抗体、リガンドおよび受容体、並びに相補的なヌクレオチド配列などである。当業者であれば、多くの他の例も把握している。さらに、用語「特異的結合ペア」は、特異的結合メンバーの一方または双方と、その結合パートナーとが、大分子の一部を含む場合にも適用される。特異的結合ペアが核酸配列を含む実施形態において、それらの核酸配列は、アッセイ条件下で互いにハイブリダイズする長さになり、好ましくは１０ヌクレオチド長を超え、より好ましくは１５または２０ヌクレオチド長を超える
「試料」、「患者試料」、または「生体試料」とは、一般に、特定の分子、好ましくはＴ２Ｄ特異的なマーカー分子について検査することができる試料を意味する。試料としては、これに限定されるものではないが、血液、血清、血漿、尿、唾液、涙、胸膜液などを含む細胞や体液などが挙げられる。
【００４６】
本発明のタンパク質ＤＮＡ複合体を使用してＴ２Ｄの治療に有用な薬剤をスクリーニングする方法  
本明細書で同定されたタンパク質ＤＮＡ結合複合体は、Ｔ２Ｄの病因に関連しているため、核酸とそれと相互作用するタンパク質とを含むＴＣＦ７Ｌ２のＳＮＰの活性を調節する薬剤を同定する方法により、この疾患に伴う様々な障害を治療するための有効な治療薬が生成されるはずである。
【００４７】
これらのＤＮＡタンパク質結合複合体は、本明細書で同定したＤＮＡ結合タンパク質の活性を調節することによりＴ２Ｄの表現型に干渉する治療薬の、合理的な設計に適した標的を提供する。これらの領域に対応する小核酸分子またはペプチドは、コードされたタンパク質の活性を効果的に調節する治療薬を設計する上で生かすことができる。
【００４８】
分子モデリングは、機能に必要な立体構造または重要なアミノ酸残基に基づいた、ＳＮＰ含有ＴＣＦ７Ｌ２核酸に結合するタンパク質の活性部位に結合することができる特異的な有機分子の同定を、容易にするはずである。コンビナトリアルケミストリーのアプローチを用いて最も活性の高い分子が同定され、その後、これらの分子の繰り返しがさらなるスクリーニングサイクルのために開発されるであろう。
【００４９】
薬物スクリーニングアッセイに使用されるポリペプチドまたは断片は、溶液中に遊離していても、固体の支持物に固定されていても、または細胞内にあってもよい。１つの薬物スクリーニング法では、ポリペプチドまたは断片を発現する組み換えポリヌクレオチドにより安定して形質転換された真核宿主細胞または原核宿主細胞を、好ましくは競合結合アッセイで利用する。そのような細胞は、生細胞であれ固定細胞であれ、標準的な結合アッセイに使用することができる。例えば、ポリペプチドまたは断片と被検薬剤との複合体形成を測定すること、またはポリペプチドまたは断片と既知の基質との複合体形成が被検薬剤により妨げられる程度を検討することができる。
【００５０】
ＤＮＡ／ＰＡＲＰ−１結合の破壊を検査することができる薬剤としては、これに限定されるものではないが、癌などの他の疾患に対する臨床試験で現在試験されている薬剤が挙げられる。薬剤の例としては、イニパリブ（ＢＳＩ２０１）、オラパリブ（ＡＺＤ−２２８１）、ルカパリブ（ＡＧ０１４６９９、ＰＦ−０１３６７３３８）、ベリパリブ（ＡＢＴ−８８８）、ＣＥＰ９７２２、ＭＫ４８２７、ＰＡＲＰ１およびＰＡＲＰ２の阻害剤、ＢＭＮ−６７３および３−アミノベンズアミド、原型的なＰＡＲＰ阻害剤が挙げられる。
【００５１】
別の薬物スクリーニング技術では、コードされたポリペプチドに対して適切な結合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニングを提供しており、１９８４年９月１３日付けで公開されたＧｅｙｓｅｎの国際公報第８４／０３５６４号に詳細に記載されている。簡潔に説明すると、上記の化合物など、多数の種々の小ペプチド試験化合物を、プラスチックピンや他の何らかの表面などの固体基板上で合成する。当該ペプチド試験化合物を標的ポリペプチドと反応させ、洗浄する。その後、結合したポリペプチドを、当該技術分野でよく知られた方法で検出する。
【００５２】
さらなる薬物スクリーニング技術では、ＳＮＰ含有ＴＣＦ７Ｌ２対立遺伝子を有する宿主真核細胞株または宿主真核細胞（上述のものなど）の使用を含む。これら宿主細胞株または宿主細胞を、薬物化合物の存在下で培養する。宿主細胞の細胞代謝率を測定して、当該化合物が、細胞代謝または糖尿病の表現型に関連している他の細胞パラメータを調節可能かどうかを確認する。そのようなスクリーニングアッセイに使用するための様々な細胞株が市販されている。ＤＮＡ分子の導入方法もまた、当業者によく知られている。そのような方法は、その開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ&Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ． １９９５に記載されている。
【００５３】
タンパク質とＳＮＰ含有ＴＣＦ７Ｌ２核酸との相互作用の阻害がグルコース代謝に及ぼす作用を研究する上で適した細胞および細胞株と、それを使用して創薬を行なう方法とを提供する。そのような細胞および細胞株は、本明細書に記載のＳＮＰをコードする核酸でトランスフェクトされ、グルカゴン分泌、インスリン分泌、および／またはβ細胞アポトーシスへの作用を決定することができる。また、そのような細胞および細胞株は、本明細書で提供するｓｉＲＮＡ分子と接触させることにより、グルカゴン分泌、インスリン分泌、および／またはβ細胞アポトーシスに及ぼす作用が評価される。ｓｉＲＮＡ分子は、単独で、並びに２つ、３つ、４つ、および５つのｓｉＲＮＡの組み合わせで試験されて、最も有効な組み合わせが特定される。これらの目的に適した細胞としては、これに限定されるものではないが、ＩＮＳ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １１６０５）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７２１）、ＭＩＮ６細胞、α−ＴＣ６細胞、およびＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．（２００７）．７：４００−４１１）などがある。膵島細胞は、Ｊｏｓｅｐｈ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００４）２７９：５１０４９）に記載されているように、単離および培養することができる。Ｄｉａｏ ｅｔ ａｌ．，（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５）２８０：３３４８７−３３４９６）は、本明細書で提供するＳＮＰをコードする核酸および／またはｓｉＲＮＡが、グルカゴン分泌およびインスリン分泌に及ぼす作用を評価する方法論を提供している。Ｐａｒｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｃｈ．ａｎｄ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００７）４０：１０５８−６８）は、これらの核酸分子が、膵島細胞でグルコサミンにより誘発されるβ細胞アポトーシスに及ぼす作用を評価する方法論を 提供している。
【００５４】
本発明の配列を発現するように改変することが可能な広範な種々の発現ベクターが利用できる。本明細書に例示する具体的なベクターは、例示的なものに過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。発現方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｏｒ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １６．３−１７．４４（１９８９）に記載されている。サッカロマイセスにおける発現方法もまた、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９）に記載されている。
【００５５】
本発明の実施において使用に適したベクターとしては、ｐＮＨベクター（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．），１１０９９ Ｎ．Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｄ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，カリフォルニア州９２０３７）、ｐＥＴベクター（ノボジェン社（Ｎｏｖｏｇｅｎ Ｉｎｃ．），５６５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州、５３７１１）、およびｐＧＥＸベクター（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジ一社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．），Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ニュージャージー州０８８５４）などの原核ベクターが挙げられる。本発明の実施に有用な真核ベクターの例としては、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、およびｐＲＥＰベクター（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），１１５８８ Ｓｏｒｒｅｎｔｏ Ｖａｌｌｅｙ Ｒｄ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，カリフォルニア州９２１２１）、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５&Ｈｉｓベクター（インビトロジェン社）、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、またはｐＡＣ３６０（インビトロジェン社）などのバキュロウイルスベクター、ＹＲＰ１７、ＹＩＰ５、およびＹＥＰ２４（ニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ），Ｂｅｖｅｒｌｙ，マサチューセッツ州）やｐＲＳ４０３およびｐＲＳ４１３（ストラタジーン社）などの酵母ベクター、ｐＨＩＬ−Ｄ１（フィリップスペトロレウム社（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ Ｃｏ．），Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，オクラホマ州７４００４）などのピチアベクター、ＰＬＮＣＸおよびｐＬＰＣＸ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））などのレトロウイルスベクター、並びにアデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。
【００５６】
本発明の発現ベクターに使用されるプロモーターとしては、原核細胞または真核細胞において作用可能なプロモーターが挙げられる。原核細胞で作用可能なプロモーターとしては、ラクトース（ｌａｃ）制御エレメント、バクテリオファージλ（ｐＬ）制御エレメント、アラビノース制御エレメント、トリプトファン（ｔｒｐ）制御エレメント、バクテリオファージＴ７制御エレメント、およびこれらのハイブリッドが挙げられる。真核細胞で作用可能なプロモーターとしては、エプスタインバーウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ：ＣＭＶ）プロモーター、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターなどのバキュロウイルスプロモーター、アルコールオキシダーゼプロモーターなどのピチアプロモーター、ｇａｌ４誘導プロモーターなどのサッカロマイセスプロモーター、およびＰＧＫ構成的プロモーター、さらに神経細胞特異的血小板由来成長因子プロモーター（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｍｏｔｅｒ：ＰＤＧＦ）およびＴｈｙ−１プロモーターが挙げられる。
【００５７】
また、本発明のベクターは、形質転換した宿主細胞の選別を容易にする多数の種々のマーカーのいずれか１つを含んでいてもよい。そのようなマーカーとしては、温度感受性に関連した遺伝子、薬剤耐性に関連した遺伝子、または宿主生物の表現型の特徴に関連した酵素の関連遺伝子が挙げられる。
【００５８】
Ｔ２Ｄ関連ＳＮＰ、および当該ＳＮＰまたはその機能断片に結合するタンパク質を発現する宿主細胞は、Ｔ２Ｄの発症を調節することができる候補化合物または候補薬剤をスクリーニングするシステムを提供する。したがって、１つの実施形態において、本発明の核酸分子を用いて、糖尿病表現型の側面を調節する薬剤を同定するアッセイに使用するための遺伝子組み換え細胞株を作製することができる。また、本明細書において、後述のＳＮＰ含有核酸に結合するタンパク質の機能を調節することができる化合物をスクリーニングする方法も提供する。
【００５９】
別のアプローチでは、ＳＮＰ含有核酸が結合したポリペプチドの断片をファージ表面に提示するように作られたファージディスプレイライブラリーを使用することを伴う。次いで、そのようなライブラリーをコンビナトリアルケミカルライブラリーと接触させる。この接触は、提示されたペプチドとケミカルライブラリーの構成成分との結合親和性が検出できるような条件の下で行う。米国特許第６，０５７，０９８号および同第５，９６５，４５６号は、そのようなアッセイを行うための方法および装置を提供している。
【００６０】
合理的な薬剤設計の目標は、目的の生物活性ポリペプチドの、またはそれらと相互作用する小分子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤など）の構造的類似体を作製して、薬物を構築することである。当該薬物としては、例えば、より活性の高い若しくはより安定した形態のポリペプチド、または、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏポリペプチドの機能をで促進若しくは阻害するものである。例えば、Ｈｏｄｇｓｏｎ，（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１９−２１を参照。１つのアプローチにおいて、上述したように、目的のタンパク質の３次元構造、または、例えばタンパク質−基質複合体の３次元構造を、Ｘ線結晶構造解析、核磁気共鳴、コンピュータモデリング、または最も一般的にはアプローチの組み合わせを用いて解明する。頻度は低いものの、相同タンパク質の構造に基づいたモデリングにより、ポリペプチドの構造に関する有用な情報を得ることもできる。合理的な薬剤設計の一例は、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の開発である（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５２７−５３３）。また、アラニンスキャンによりペプチドを分析してもよい（Ｗｅｌｌｓ，（１９９１）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３９０−４１１）。この技術では、アミノ酸残基をＡｌａで置換し、それがペプチドの活性に及ぼす影響を評価する。このようにしてペプチドの各アミノ酸残基を分析し、ペプチドの重要な領域を決定する。
【００６１】
また、機能的アッセイにより選択された標的特異的な抗体を単離した後、その結晶構造を解析することも可能である。原則的には、このアプローチでは、その後の薬剤設計のベースとすることができるファーマコフォアが得られる。
【００６２】
機能的な薬理活性抗体に対する抗イディオタイプ抗体（ａｎｔｉ−ｉｄｓ）を生成することにより、タンパク質の結晶構造解析を完全に省略することも可能である。鏡像の鏡像として、ａｎｔｉ−ｉｄの結合部位は、元の分子の類似体であることが予想されるであろう。次に、当該ａｎｔｉ−ｉｄを用いて、化学的または生物学的に作製されたペプチドバンクからペプチドを同定し、単離する。その後、選択されたペプチドは、ファーマコフォアの役割を果たすであろう。
【００６３】
したがって、例えば、ポリペプチドの活性または安定性が改善された薬物、またはポリペプチド活性の阻害剤、アゴニスト、アンタゴニストなどとして作用する薬物をデザインしてもよい。本明細書に記載するタンパク質およびＳＮＰ含有核酸配列の結合複合体の利用可能性により、Ｘ線結晶構造解析などの分析的研究を行う上で十分な量のコードされた複合体を利用できるようになる。また、本明細書で提供するタンパク質配列の知識は、Ｘ線結晶構造解析の代わりに、またはそれに加えて、コンピュータモデリング技術を使用する者の助けとなるであろう。
【００６４】
医薬品およびペプチド治療法
本明細書に記載のＴ２Ｄ関連ＳＮＰが細胞代謝において果たす役割を解明することは、Ｔ２Ｄの治療および診断に有用な医薬組成物の開発を容易にする。これらの組成物は、上記の物質の１つに加えて、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、バッファー、安定剤、または当業者によく知られている他の物質を含んでいてもよい。そのような物質は、非毒性であるべきであり、有効成分の有効性に干渉するべきではない。それが、個人に投与されるのが、ポリペプチド、抗体、ペプチド、核酸分子、小分子、または本発明に係る他の薬学的に有用な化合物のいずれであっても、「予防的有効量」または「治療的有効量」（場合によっては、予防が治療と見なされてもよいが）で投与されることが好ましく、これは個人に有効であることを示すのに十分な量である。
【００６５】
現在理解されているように、ＲＮＡ干渉は、多段階プロセスを伴う。二本鎖ＲＮＡｓは、エンドヌクレアーゼダイサーによって切断されて、ヌクレオチド断片（ｓｉＲＮＡ）を生成する。ｓｉＲＮＡ二本鎖は、２つの一本鎖ＲＮＡｓへと分解され、その一本鎖は、標的ＲＮＡの切断を導くガイド ＲＮＡとして機能するタンパク質含有複合体へ取り込まれ（Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．１０：５３７ ５４８（２００２），Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ １０１：２５ ３３（２０００））、それにより、特異的な遺伝的メッセージを発現抑制する（Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００：９７７９（２００３）も参照。）。
【００６６】
本発明は、哺乳類におけるＴ２Ｄの治療方法を含む。例示的な方法は、ＰＡＲＰ−１を対象としたｓｉＲＮＡ分子の薬学的有効量を哺乳類へ投与することを伴う。そのような分子は、ダーマコン社（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）より市販されている。当該ｓｉＲＮＡは、上記の遺伝子の発現を阻害する。好ましくは、哺乳類はヒトである。本明細書で用いられるように、用語「患者」は、ヒトを意味する。
【００６７】
送達方法と同様に、ＰＡＲＰ−１の発現を阻害することを目的とした特異的ｓｉＲＮＡ製剤は、Ｔ２Ｄを治療するための新規の治療法として提供される。ｓｉＲＮＡは、後述のように、患者へｉｎ ｖｉｖｏで全身的にまたは局所的に担体と共に送達することができる。本発明の組成物は、単独で、若しくは当該組成物の有効性を増強させる他の薬剤またはタンパク質をコードする遺伝子と組み合わせて使用してもよい。
【００６８】
「膜透過性ペプチド配列」とは、ｓｉＲＮＡ阻害剤が細胞膜を横切って透過および移行することを促進可能なペプチド配列を意味する。ペプチドの例としては、これに限定されるものではないが、本明細書に例示したカポジ線維芽細胞増殖因子由来のシグナル配列、ＨＩＶ ｔａｔペプチド（Ｖｉｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１６０１０−１６０１７，１９９７）、プロタミン由来の非毒性の膜輸送ペプチド（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１９（１１）：１５５５−７，２００５）、ＣＨＡＲＩＯＴ（登録商標）導入試薬（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ；米国特許第６，８４１，５３５号）、および抗菌ペプチドＢｕｆｏｒｉｎ ２が挙げられる。
【００６９】
本発明の１つの実施形態において、ｓｉＲＮＡｓは治療的利益のために送達される。本発明のｓｉＲＮＡをｉｎ ｖｉｖｏで投与してＴ２Ｄを治療する方法がいくつかあり、これに限定されるものではないが、ネイキッドｓｉＲＮＡ送達、ｓｉＲＮＡ共役および送達、リポソーム担体媒介送達、ポリマー担体送達、ナノ粒子組成物、プラスミドベースの方法、およびウイルスの使用が挙げられる。
【００７０】
本発明のｓｉＲＮＡ組成物は、対象へ投与するためのリポソームを含めた送達媒体、担体、および希釈剤、並びにそれらの塩を含むことができ、かつ／または薬学的に許容可能な処方に含めることができる。これは、ｓｉＲＮＡが細胞膜を通過するようにし、分解を防ぐために必要となる可能性がある。核酸分子を送達するための方法は、Ａｋｈｔａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．，２，１３９；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，１９９５，Ｍａｕｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．，１６，１２９−１４０；Ｈｏｆｌａｎｄ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，１９９９，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３７，１６５−１９２；およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，ＡＣＳ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，７５２，１８４−１９２に記載されている。Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許番号第６，３９５，７１３号、およびＳｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．の国際公報第９４／０２５９５号にはさらに、核酸分子を送達するための一般的な方法が記載されている。これらのプロトコールは、実質的にあらゆる核酸分子を送達するために使用することができる。
【００７１】
また、患者へのｓｉＲＮＡの投与頻度は、いくつかの因子に依存して異なり、これに限定されるものではないが、治療されるＴ２Ｄのタイプおよび重症度、投与経路、個人の年齢および健康全般、ｓｉＲＮＡの性質などが挙げられる。患者へのｓｉＲＮＡの投与頻度は、数ヶ月に約１回から１ヶ月に約１回、１週間に約１回、１日に約１回、１日に約数回と異なることが考えられる。
【００７２】
本発明の方法において有用な医薬組成物は、非経口、経口固形および液体処方、眼科用、坐薬、エアロゾル、外用薬または他の類似処方により全身投与されてもよい。適切なｓｉＲＮＡに加えて、これらの医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体、並びに薬剤投与を増強および促進することが知られている他の成分を含んでもよい。したがって、そのような組成物は、例えば水酸化アルミニウムおよび水酸化マグネシウムの水性懸濁液などのアジュバントといった他の成分、および／または生理食塩水などの他の薬学的に許容可能な担体を任意に含んでもよい。ナノ粒子、リポソーム、再シールした赤血球、および免疫学に基づく系などの他の可能な処方もまた、本発明の方法に従って、患者へ適切なｓｉＲＮＡを投与するために使用されてもよい。ｓｉＲＮＡを送達するためのナノ粒子、および使用可能な細胞膜透過性ペプチド担体の使用は、Ｃｒｏｍｂｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｖ３５：ｐ４４（２００７）に記載されている。
【００７３】
Ｔ２Ｄを治療するための本発明の方法は、少なくとも１つの、医薬組成物中のＰＡＲＰ−１対象ｓｉＲＮＡの投与に関連している。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡおよび薬学的に許容可能な担体を有する医薬組成物として個人へ投与される。薬学的に許容可能な担体は、当該技術分野でよく知られており、生理学的緩衝食塩水などの水性溶液、グリコール、グリセロール、オリーブオイルなどのオイル、若しくは注射可能な有機エステルなどの他の溶媒または媒体が挙げられる。
【００７４】
薬学的に許容可能な担体は、例えば、ｓｉＲＮＡを安定化する、または薬剤の吸収を増加させるように作用する生理学的に許容可能な化合物が含むことができる。そのような生理学的に許容可能な化合物としては、例えば、グルコース、スクロース、若しくはデキストランなどの糖類、アスコルビン酸若しくはグルタチオンなどの抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、または他の安定剤若しくは賦形剤が挙げられる。当業者であれば、生理学的に許容可能な化合物を含めた薬学的に許容可能な担体の選択は、例えばｓｉＲＮＡの投与経路に依存していることを理解しているであろう。
【００７５】
当業者であれば、ｓｉＲＮＡを含む医薬組成物を、例えば、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内、皮下、眼窩内、鼻腔内、関節内（ｉｎｔｒａｃａｐｓｕｌａｒｌｙ）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、大槽内、気管内（ｉ．ｔ．）、または関節内（ｉｎｔｒａ−ａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ）などの経口または非経口を含めた様々な経路により、若しくは受動的または促進的吸収により、対象に投与することができることを理解している。同じ投与経路は、例えば、上述のような小分子、核酸分子、ペプチド、抗体およびポリペプチドなどの他の薬学的に有用な化合物にも使用することができる。
【００７６】
ｓｉＲＮＡ阻害剤を含む医薬組成物もまた、必要に応じて、リポソーム、微小球、微小気泡、または他のポリマーマトリックスへ取り込むことができる（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ ｔｏ ＩＩＩ，２ｎｄ ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ Ｆｌａ．（１９９３））。例えば、リポソームは、リン脂質または他の脂質からなり、非毒性で、生理学的に許容可能で、かつ代謝可能な、製造および投与が比較的し易い担体である。
【００７７】
医薬品は、本明細書に記載の配列を含むＳＮＰを標的としたｓｉＲＮＡ、または当該ｓｉＲＮＡをコードする発現ベクターを含む。そのような医薬品は、Ｔ２Ｄの治療のために患者に投与することができる。
【００７８】
ｓｉＲＮＡ分子の発現用の発現ベクターは、好ましくは、構成的または制御されていてもよい強力なプロモーターを使用する。そのようなプロモーターは、当該技術分野でよく知られており、これに限定されるものではないが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータ、およびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターＵ６およびＨ１が挙げられる（例えば、Ｍｙｓｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９：２５０２ ０９を参照）。
【００７９】
処方されたｓｉＲＮＡ組成物は、１つ若しくは複数のｓｉＲＮＡ分子、または１つ若しくは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードするベクターを、単独で、または陽イオン性脂質、中性脂質、および／若しくはポリエチレングリコール−ジアシルグリセロール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｏｌ：ＰＥＧ−ＤＡＧ）共役体若しくはＰＥＧ−コレステロール（ＰＥＧ−Ｃｈｏｌ）共役体との組み合わせで含む組成物であってもよい。発現ベクターの非限定的例は、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５０５：Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ａｎｔ Ｔａｉｒａ，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，４９７；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５００−５０５に記載されている。
【００８０】
脂質ナノ粒子組成物は、１つ若しくは複数の生物学的活性分子を、単独で、または陽イオン性脂質、中性脂質、および／若しくはポリエチレングリコール−ジアシルグリセロール（即ち、ポリエチレングリコールジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−コレステロール、またはＰＥＧ−ＤＭＢ）共役体との組み合わせで含む組成物である。１つの実施形態において、生物学的活性分子は、本発明の生物学的活性分子（即ち、ｓｉＲＮＡ）を含む水溶液を提供する工程、脂質ナノ粒子を含む有機溶液を提供する工程、両溶液を混合する工程、その溶液をインキュベートする工程、希釈し限外濾過する工程によりナノ粒子組成物を製造するのに適した濃度となり、その結果、脂質ナノ粒子に被包される。
【００８１】
核酸分子は、生分解性ポリマー、ハイドロゲル、シクロデキストリン（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１０，１０６８−１０７４；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，国際公報第０３／４７５１８号および同第０３／４６１８５号を参照）、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ）ａｃｉｄ：ＰＬＧＡ）およびＰＬＣＡ微小球（例えば、米国特許第６，４４７，７９６号および米国特許出願公報第２００２／１３０４３０号を参照）、生分解性ナノカプセル、および生物接着性微小球などの他の媒体への取り込みにより、またはタンパク質ベクター（Ｏ’Ｈａｒｅ ａｎｄ Ｎｏｒｍａｎｄ、国際公報第００／５３７２２号）により、細胞に投与することができる。
【００８２】
陽イオン性脂質およびポリマーは、負に帯電したｓｉＲＮＡと複合体を形成することができる、２つのクラスの非ウイルス性ｓｉＲＮＡ送達である。自己組織化ＰＥＧ化（ＰＥＧ−ｙｌａｔｅｄ）ポリカチオンであるポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ：ＰＥＩ）もまた、ｓｉＲＮＡを凝集させかつ保護するために使用されてきた（Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：１４１−１１０）。ｓｉＲＮＡ複合体は、ナノ粒子へと凝集され、エンドサイトーシスを通じてそのｓｉＲＮＡの効率的な取り込みが可能となる。さらに、プロタミンの核酸凝集特性は、特異的抗体と組み合わされてｓｉＲＮＡｓを送達し、本発明において使用することができる（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：７０９−７１７）。
【００８３】
Ｔ２Ｄに罹患した個人を治療して、疾患の徴候または症状を軽減するために、ｓｉＲＮＡは、有効な用量で投与されなければならない。総治療用量は、対象へ単一用量で投与されるか、または、分割された治療プロトコールを用いて投与される。この治療プロトコールにおいて、複数回投与とは、例えば１日以上かけて１日投与量を投与するなどのより長時間をかけて投与されるか、または、望ましい時間以上で用量を投与するためにより長い時間をかけて投与されることである。当業者であれば、対象において有効な用量を得るために必要とされるｓｉＲＮＡの量は、対象の年齢、体重、および健康全般、さらには投与経路および投与される治療数を含めた多くの因子に依存していることを承知しているであろう。これらの因子を考慮して、当業者は、特定の用量を調節して、Ｔ２Ｄに罹患した個人を治療するのに有効な用量を得るようにする。
【００８４】
ｓｉＲＮＡの有効量は、投与方式、および治療される個人の体重に依存する。本明細書に記載の用量は、一般的に平均成人に対する用量であるが、小児の治療用に調節することができる。用量は、一般的に、約０．００１ｍｇ〜約１０００ｍｇの範囲である。
【００８５】
特定の処方におけるｓｉＲＮＡの濃度は、投与の方式および頻度に依存する。所定の１日投与量は、処方におけるｓｉＲＮＡ濃度が望ましい１日投与量を満たす限り、単一用量または複数回用量で投与することができる。当業者であれば、処方におけるｓｉＲＮＡの量を調節して、所定の期間でｓｉＲＮＡの望ましい濃度を提供するような単一用量または複数回用量の投与することができる。
【００８６】
Ｔ２Ｄを罹患した個人において、特により重症型の疾患において、ｓｉＲＮＡの投与は、例えば、そのような疾患を治療するための従来の薬剤との組み合わせで投与された場合、特に有用である。当業者は、単独でまたは組み合わせでｓｉＲＮＡを投与し、膵ベータ細胞機能測定、放射線学的方法、免疫学的方法、または記載がある場合は、病理組織学的方法など、常法を用いてそのような治療の有効性をモニタリングする。他の従来の糖尿病治療薬としては、インスリン投与、グルカゴン投与、若しくはこれらの２つの分子のどちらかのレベルを変える薬剤が挙げられる。Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ（登録商標）、Ａｖａｎｄｉａ（登録商標）、Ａｃｔｏｓ（登録商標）、Ｊａｎｕｖｉａ（登録商標）およびＧｌｕｃｏｖａｎｃｅ（登録商標）は、そのような薬剤の一例である。
【００８７】
医薬品の投与は、好ましくは、個人に利益を示すのに十分な「有効量」で行う。この量は、患者におけるＴ２Ｄ症状の重症度を予防、軽減、寛解、または減少させる。
【００８８】
医薬品は、投与の容易さおよび投与量の均一性のために投与量単位形態で処方される。本明細書で用いられたように、投与量単位形態とは、治療を受ける患者に適切な医薬品の物理学的に別個の単位を意味する。各投与量は、選択された薬学的担体と関連して望ましい効果を生じるように計算された量の有効成分を含むべきである。適切な投与量単位を決定するための手順は、当業者によく知られている。
【００８９】
投与量単位は、患者の体重に比例して増減させてもよい。特定の病態を軽減するために適切な濃度は、当該技術分野で知られている投与量濃度曲線計算により決定されてもよい。
【００９０】
キットおよび製品  
上記製品はいずれも、キットに組み込むことができ、キットは、Ｔ２Ｄ関連ＳＮＰ特異的マーカーＴＣＦ７Ｌ２ポリヌクレオチド、または遺伝子チップ（Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ）上に固定された１つ若しくは複数の当該マーカー、オリゴヌクレオチド、本明細書に記載の核酸を含むＳＮＰに結合するポリペプチド、当該結合を分断するように設計されたペプチド、ｓｉＲＮＡ、小分子、抗体、ラベル、マーカー、またはレポーター、薬学的に許容可能なキャリア、生理学的に許容可能なキャリア、取り扱い説明書、容器、投与のための容器、アッセイ用基板、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【００９１】
以下に記載の方法は、本発明の実施を促進するために提供される。
【００９２】
細胞培養および核抽出物の調製
ヒトＨＣＴ１１６細胞をＤＭＥＭ（４．５ｇ／ｌグルコース、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および１００ｉｇ／ｍＬストレプトマイシン）中で培養した。インスリン刺激実験のため、細胞を、１ｕＭインスリンで１時間処理した。ＳＩＬＡＣ実験のため、培養物を、標準的な細胞培養手順に従い、１０％透析ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）、１３Ｃ６−リジン、および１３Ｃ６−アルギニンを加えたＳＩＬＡＣライトおよびＳＩＬＡＣヘビーでラベルしたダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ、サーモフィッシャー社（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ））中で増殖させた。細胞を、冷リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）で洗浄し、こそげとって回収し、５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。１０８個の細胞を、５分ごとに１０秒間ボルテックスしながら氷上で２０分間インキュベートすることにより、２５０ｕｌの低塩緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．５％ＮＰ−４０、プロテアソーム阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、１０％グリセロール、ｐＨ７．９）中に溶解させた。核を、１０，０００ｒｐｍ、４℃で１分間遠心分離して、細胞質画分から分離した。核ペレットを、冷低塩緩衝液で１回洗浄し、遠心分離して回収した。高塩緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、４２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、プロテアソーム阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、２５％グリセロール、ｐＨ７．９）により核タンパク質を放出させ、１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して、上清を回収した。
【００９３】
オリゴヌクレオチドプルダウン  
ＳＮＰであるｒｓ７９０３１４６ ５‘ビオチン標識二本鎖オリゴヌクレオチドを、インテグレイテッドＤＮＡテクノロジーズ社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）にて合成した。オリゴヌクレオチドの配列は、以下の通りである。
【００９４】
【化１】
2016516720.tif 000003
【００９５】
１０μｍのフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドを、使用前にアニールした。４ピコモルのオリゴヌクレオチドを、１ｍｇの核抽出物と、結合緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、プロテアソーム阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、２５％グリセロール、ｐＨ７．９）中で、総量１ｍｌで混合した。混合物を４℃で１時間、ローテーター上でインキュベートした。６０マイクロリットルのストレプトアビジンを各チューブに加え、混合物をさらに４℃で３０分間、ローテーター上でインキュベートした。ビーズを８００ｇで３０秒間回転させた後、５００μｌの結合緩衝液中で５回洗浄した。上清を捨て、タンパク質をＳＤＳサンプル緩衝液中に沸騰により溶出させた。溶出液をＳＤＳ−ｐａｇｅゲルで分離し、クマシーブルーＲ−２５０で染色した。質量分析のため、目的のバンドをゲルから切り出し、トリプシン消化した。
【００９６】
質量分析  
サンプルをトリプシン消化し、ペンシルベニア大学のＰｅｎｎ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ＣｏｒｅにてナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析した（グラントＰ３０ＣＡ０１６５２０（アブラムソンがんセンター（Ａｂｒａｍｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ））およびグラントＥＳ０１３５０８−０４（ＣＥＥＴ）による支援を受けている）。データを、Ｓｅｑｕｅｓｔ（サーモフィニガン社（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、カリフォルニア州、バージョン：ＳＲＦ ｖ．５）で分析した。Ｓｃａｆｆｏｌｄ（バージョン：Ｓｃａｆｆｏｌｄ＿３．６．０、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、オレゴン州）を用いて、ＭＳ／ＭＳに基づいたペプチドおよびタンパク質同定を検証した。ＳＩＬＡＣ実験のため、質量分析法にズームスキャンを加え、標識および非標識ペプチドをモニターする。ズームスキャンしたＳＬＩＣＡピークを定量に使用できるようにカスタマイズ改変したＰｒｏｔｅｏＩＱソフトウェアで、ＳＩＬＡＣピークの定量を行った。
【００９７】
免疫沈降およびウェスタンブロッティング  
ＩＰ緩衝液（５０ｍＭ ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、プロテアソーム阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、１０％グリセロール、ｐＨ８．０）を用いて、４℃で一晩、ローテーター上で免疫共沈降を行った。標準的手順に従い、ウェスタンブロッティングを行った。抗ＴＣＦ７Ｌ２抗体（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、０５−５１１）、抗Ｐａｒｐ−１抗体（セルシグナリング社（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、４６Ｄ１１）、抗ＲＮＡヘリカーゼＡ抗体（アブカム社（Ａｂｃａｍ）、Ａｂ２６２７１）、抗ＴＨＲＡＰ３（ノーバス社（Ｎｏｖｕｓ）、ＮＢ１００−４０８４８）を用いた。
【００９８】
以下の実施例は、本発明の実施形態を促進するために提供される。これらは、決して本発明を制限することを意図するものではない。
【実施例１】
【００９９】
Ｐａｒｐ−１、ＲＮＡヘリカーゼＡ、およびＴｈｒａｐ３は、ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子のイントロン３内でＳＮＰであるｒｓ７９０３１４６を囲むＤＮＡエレメントと相互作用する
ＳＮＰであるｒｓ７９０３１４６のＴＣＦ７Ｌ２−Ｔ２Ｄ関連作用における役割を解明するため、我々は、トランス作用タンパク質因子がこのゲノム領域に結合して、ＴＣＦ７Ｌ２機能を調節するという仮説を立てた。この仮説を試験するために、我々は、質量分析計を用いて、ＳＮＰ ｒｓ７９０３１４６を含むエレメントと相互作用するいくつかのタンパク質を同定した。表１を参照。ＨＣＴ１１６細胞からの核溶解物を、ＳＮＰ ｒｓ７９０３１４６全体に渡るビオチン標識二本鎖オリゴヌクレオチドと共にインキュベートした（図１Ａ）。ＤＮＡ−タンパク質複合体をストレプトアビジンビーズで沈殿させ、結合したタンパク質を変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クマシーブルーＲ−２５０で染色した。図１Ｂに示されるように、プルダウンサンプルにおいて、いくつかのバンドが見られた。１つの主要なバンドが、ＳＮＰ ｒｓ７９０３１４６サンプルにおいては見られたが、混合サンプルでは見られなかった。この特定のバンドをゲルから切り出し、トリプシン消化した後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。同定したペプチド数に関して、Ｎ＝１０でカットオフした。カットオフ以上の同定したタンパク質を、上から下へペプチドの多い順に表１に列挙する。ここで、我々は３種の多量に存在するタンパク質：顕著に結合したポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（Ｐａｒｐ−１）と、インスリン応答性であったＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼＡおよび甲状腺ホルモン受容体関連タンパク質３（Ｔｈｒａｐ３）とに焦点を当てた。「サンプル４ Ｃ ＰＡＲＰバンド１１０ｋＤ ｉｎｓ」を参照。
【０１００】
【表１】
2016516720.tif 000004
【０１０１】
我々の発見を確認するため、次に我々は、オリゴプルダウンサンプルのウェスタンブロッティングを行った。図１Ｃに示されるように、Ｐａｒｐ−１、ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼＡ、およびＴｈｒａｐ３は、ＳＮＰ ｒｓ７９０３１４６を含むオリゴヌクレオチドと関係性を示した。この実験は、これらの３種のタンパク質がこのゲノム領域と相互作用することを示唆する、さらなるｉｎ ｖｉｔｒｏの証拠となる。
【０１０２】
Ｐａｒｐ−１がＤＮＡ損傷の検出および修復に関与することは確立している（Ｗａｌｄｍａｎ ａｎｄ Ｗａｌｄｍａｎ １９９１；Ｓｃｈｕｌｔｓ，Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ．２００３；Ｇｏｄｏｎ，Ｃｏｒｄｅｌｉｅｒｅｓ ｅｔ ａｌ．２００８）。最近の研究により、クロマチンおよび転写制御におけるＰａｒｐ−１の重要な役割が明らかになった（Ｋｒａｕｓ ａｎｄ Ｌｉｓ ２００３；Ｔｕｌｉｎ，Ｃｈｉｎｅｎｏｖ ｅｔ ａｌ．２００３；Ｋｉｍ，Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００５，Ｊｕ，Ｌｕｎｙａｋ ｅｔ ａｌ．２００６；Ｋｒｉｓｈｎａｋｕｍａｒ，Ｇａｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．２００８；Ｄｏｅｇｅ，Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．２０１２）。ＲＮＡヘリカーゼは、３’から５’の方向に二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡをほどくことができるため、タンパク質とＤＮＡまたはＲＮＡとの相互関係を調節することができる（Ｗｅｉｄｅｎｓｄｏｒｆｅｒ，Ｓｔｏｈｒ ｅｔ ａｌ．２００９）。ＲＮＡヘリカーゼは、転写、スプライシング、および翻訳を含めた、多数の生物学的過程に関与している（Ｓｃｈｍｉｄ ａｎｄ Ｌｉｎｄｅｒ １９９２；Ｌａｕｂｅｒ，Ｆａｂｒｉｚｉｏ ｅｔ ａｌ．１９９６，Ｌｕｋｉｎｇ，Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．１９９８；Ｔｅｔｓｕｋａ，Ｕｒａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２００４；Ａｂｄｅｌｈａｌｅｅｍ ２００５；Ｃｏｒｄｉｎ，Ｂａｎｒｏｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．２００６）。Ｔｈｒａｐ３は、ｍＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）のスプライシングおよびｍＲＮＡの即時分解の活性化因子として機能する（Ｌｅｅ，Ｈｓｕ Ｉａ ｅｔ ａｌ．２０１０）。最近の研究により、Ｔｈｒａｐ３もまた、ＤＮＡ損傷に関与していることが示された（Ｂｅｌｉ，Ｌｕｋａｓｈｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．２０１２）。しかしながら、Ｔｈｒａｐ３の基本的メカニズムは、ほとんど解明されていないままである。我々のデータは、ＴＣＦ７Ｌ２の転写に対するＴｈｒａｐ３の重要な役割を示唆している。
【０１０３】
Ｐａｒｐ−１、ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼＡ、およびＴｈｒａｐ３の結合親和性は、その後のインスリン刺激により増加した
Ｐａｒｐ−１、ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼＡ、およびＴｈｒａｐ３のＳＮＰ ｒｓ７９０３１４６領域に対する動的結合を調べるため、我々は、細胞培養（ＳＩＬＡＣ）においてアミノ酸による安定同位体標識を用い（Ｏｎｇ，Ｂｌａｇｏｅｖ ｅｔ ａｌ．２００２）、インスリン処理の有無による結合親和性の変化を定量化した。
【０１０４】
ヘビー（ｈｅａｖｙ）細胞を、１３Ｃ６−リジンおよび１３Ｃ６−アルギニンを加えたＳＩＬＡＣ培地において同位体標識し、インスリンで処理した。一方、同位体標識したライト（ｌｉｇｈｔ）細胞は、コントロールの役割を果たした。２つのＳＩＬＡＣ標識した細胞集団からの等量の核抽出物を、オリゴプルダウンに用いた。プルダウン後、ライト細胞およびヘビー細胞を混合し、ＳＤＳ ｐａｇｅゲルで分離し、トリプシン消化した後、質量スペクトル分析を行った。このアプローチを用いて、Ｐａｒｐ−１、ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼＡ、およびＴｈｒａｐ３を含め、インスリン処理有りとインスリン処理無しとでの相対的なタンパク質量を定量した。図２に示されるように、Ｐａｒｐ−１は、刺激に対してわずかに２０％上方制御され、ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼＡおよびＴｈｒａｐ３は、それぞれ１２倍、７倍にまで顕著に増加した。総括すると、我々の結果により、ＴＣＦ７Ｌ２は、インスリン刺激を経てＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼＡおよびＴｈｒａｐ３により調節されているようであることが示された。
【０１０５】
ＴＣＦ７Ｌ２、Ｐａｒｐ−１、ＲＮＡヘリカーゼＡ、およびＴｈｒａｐ３は、ＨＣＴ１１６で複合体を形成する
Ｐａｒｐ−１、ＲＮＡヘリカーゼＡ、およびＴｈｒａｐ３は、同じオリゴプルダウンサンプルから同定されたため、我々は、これらの因子がＴＣＦ７Ｌ２ゲノム機構においてどのように関与しているのかを理解するために、これらの間の相互作用を特徴付けようと試みた。我々は、これらはＳＮＰ ｒｓ７９０３１４６領域に結合する複合体を形成するように互いに相互作用している可能性があると提案した。この仮説を試験するために、免疫共沈降実験を行った。図３Ａに示されるように、Ｐａｒｐ−１は、ＲＮＡヘリカーゼＡおよびＴｈｒａｐ３と強い相互作用を示した。興味深いことに、我々はまた、ＴＣＦ７Ｌ２がこれらのタンパク質と相互作用することを発見した。我々が以前行ったＴＣＦ７Ｌ２のｃｈｉｐ−ｓｅｑ結果により、ＴＣＦ７Ｌ２ゲノム内の４つのサイトが特徴付けられている（Ｚｈａｏ，Ｓｃｈｕｇ ｅｔ ａｌ．２０１０）。総括して、我々は、ＴＣＦ７Ｌ２が、Ｐａｒｐ−１、ＲＮＡヘリカーゼＡ、およびＴｈｒａｐ３と相互作用して、複合体を形成し、ＴＣＦ７Ｌ２それ自身を調節するというメカニズムの可能性を提案した（図３Ｂ）。これらの相互作用の機能的効果をさらに特徴付けるために、これらのタンパク質のより詳細な研究を行っている。
【０１０６】
Ｘ線修復クロス補足タンパク質５、および複製タンパク質Ａの７０ｋＤａ ＤＮＡ結合サブユニットは、選択的にｒｓ７９０３１４６のＴ対立遺伝子に結合する
いくつかの独立した研究により、転写因子７様２遺伝子（ＴＣＦ７Ｌ２）多型ｒｓ７９０３１４６のＴ対立遺伝子が、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）に関与していることが示されている（Ｇｒａｎｔ，Ｔｈｏｒｌｅｉｆｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００６，Ｓａｘｅｎａ，Ｇｉａｎｎｉｎｙ ｅｔ ａｌ．２００６；Ｓｃｏｔｔ，Ｂｏｎｎｙｃａｓｔｌｅ ｅｔ ａｌ．２００６，Ｈｅｌｇａｓｏｎ，Ｐａｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｐａｌｍｅｒ，Ｈｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１１）。多数の民族での研究により、イントロン３における単一の変異体ｒｓ７９０３１４６への関与が特定された。これにより、ＳＮＰ ｒｓ７９０３１４６は、全体的な共通性により糖尿病の原因である感受性変異体と考えられている。しかしながら、ＳＮＰがＴＣＦ７Ｌ２の機能に作用するメカニズムは分かっていない。我々は、ＳＮＰ全体に渡って結合し、それによりＴＣＦ７Ｌ２の機能を調節する対立遺伝子選択的な結合タンパク質があることを提案する。我々の仮説を試験するために、我々は、「双方向の」オリゴプルダウン実験を行った。フォーワード実験において、ＳＩＬＡＣ培地内で同位体標識したライト細胞からの核抽出物を、Ｃ対立遺伝子オリゴによるプルダウン実験に用いた一方、ＳＩＬＡＣ培地内で同位体標識したヘビー細胞からの核抽出物を、Ｔ対立遺伝子オリゴによるプルダウン実験に用いた。当該ＳＩＬＡＣ標識抽出物を、リバース実験に切り替えた。このデザインは、アプローチの信頼性および再現性を改善することができる。
【０１０７】
興味深いことに、Ｘ線修復クロス補足タンパク質５（ＸＲＣＣ５）および複製タンパク質Ａの７０ｋＤａ ＤＮＡ結合サブユニットの２つのタンパク質は、選択的にＣ対立遺伝子よりもＴ対立遺伝子に結合することを確認した（図４）。双方向のプルダウンからの一貫した結果は、これらの２つタンパク質が、対立遺伝子特異的な結合優先によりＴＣＦ７Ｌ２の調節に関与している可能性を示唆している。ＸＲＣＣ５は、ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼＩＩ複合体の構成要素である。ＸＲＣＣ５／６ヘテロダイマーは、ＤＮＡの損傷および修復に関与している（Ｔａｃｃｉｏｌｉ，Ｇｏｔｔｌｉｅｂ ｅｔ ａｌ．１９９４；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓｔｒａｎｄｅ ｅｔ ａｌ．２０１０）。ＸＲＣＣ５／６ヘテロダイマーは、ｐ３００、ＣＲＥＢ結合タンパク質との相互作用を通じて、ＥＴＳ因子ＥＳＥ−１の転写作用の負の調節因子として作用することもまた、報告された（Ｗａｎｇ，Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００４）。これらの結果は、ＸＲＣＣ５／６が、ＤＮＡ結合親和性メカニズムを通じてＴＣＦ７Ｌ２を調節している可能性を示唆している。
【０１０８】
複製タンパク質Ａの７０ｋＤａ ＤＮＡ結合サブユニット（ＲＰ−Ａ ｐ７０）はまた、複製因子Ａタンパク質１とも呼ばれ、３つのサブユニットタンパク質、ＲＰＡ１、ＲＰＡ２、およびＲＰＡ３からなる複製因子Ａタンパク質１ファミリーに属する（Ｕｍｂｒｉｃｈｔ，Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．１９９４）。それは、再結合、複製、損傷、および修復を含めた、ＤＮＡ代謝における多数の生物学的過程に関与している（Ｍａｓｏｎ，Ｈａｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｋｅｍｐ，Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１０）。ＲＰ−Ａ ｐ７０は、ＤＮＡポリメラーゼ触媒サブユニットＰＯＬＡ１／ｐ１８０と相互作用し、ＤＮＡ複製の忠実度を制御する（Ｂｒａｕｎ，Ｌａｏ ｅｔ ａｌ．１９９７；Ｉｋｅｇａｍｉ，Ｋｕｒａｏｋａ ｅｔ ａｌ．１９９８）。ＲＰ−Ａ ｐ７０は、細胞周期の進行において重要な役割を果たす。ＲＮＡｉによるＲＰＡ１の破壊により、細胞周期においてＧ２／Ｍの停止がもたらされ、続いて細胞死を増加させることが、いくつかの研究で報告されている（Ｄｏｄｓｏｎ，Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｈａｒｉｎｇ，Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００８）。成人β細胞の増殖能力の限界、およびアポトーシスの増加によるβ細胞の減少は、２型糖尿病の発症に寄与する重要なメカニズムであることは、よく確立された見解である（Ｒｈｏｄｅｓ ２００５）。しかしながら、ＲＰ−Ａ ｐ７０作用の調節が、２型糖尿病におけるβ細胞の機能障害に寄与しているかどうかは、依然として明らかではない。
【０１０９】
ＣおよびＴ対立遺伝子間における、これらの２つのタンパク質のＤＮＡ結合親和性の差は、中程度（ｍｏｄｅｒａｔｅ）であることに留意すべきである。実際に、ｒｓ７９０３１４６の（Ｔ）危険対立遺伝子のオッズ比は、ＧＷＡＳ研究において、１．４５である。一般的な疾患は、小さいエフェクトサイズの多数の原因変異により生じるため、ＧＷＡ研究で報告されたオッズ比は、通常小さい（Ｓｔｒｉｎｇｅｒ，Ｗｒａｙ ｅｔ ａｌ．２０１１）。故に、生物学的過程における信頼できる定量的な分析のための新しいアプローチの発展が、必要である。従って、質量分析のような、定量的でハイスルーなプロテオミクスにより、ＧＷＡＳ機能研究後の強力なツールが提供される。
【０１１０】
本明細書に上述した通り、表Ｉに列挙したタンパク質は、Ｔ２Ｄの治療に有効な新しい治療薬の発展に新規の標的をもたらす。特に、より当該疾患が発症し易いこれらの患者において、これらの遺伝子の発現を抑制することが望ましい。この点で、本明細書に記載の治療ｓｉＲＮＡｓは、患者のシグナルに基づいて遺伝子産物の発現を抑制し、それによりＴ２Ｄで生じる膵β細胞の破壊を阻害するために使用することができる。
【０１１１】
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【実施例２】
【０１１２】
ＴＣＦ７Ｌ２変異体はまた、糖尿病の他のサブフォームに関与している。これらとしては、例えば、嚢胞性線維症関連糖尿病（Ｂｌａｃｋｍａｎ ＳＭ，ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．２００９ Ｓｅｐ；５２（９）；１８５８−６５）、成人潜在性自己免疫性糖尿病（Ｃｅｒｖｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２００８ Ｍａｙ；５７（５）：１４３３−７；Ｌｕｋａｃｓ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．２０１２ Ｍａｒ；５５（３）：６８９−９３）、妊娠性糖尿病（Ｍａｙｏ Ｈ，ｅｔ ａｌ．ＰｌｏＳ Ｏｎｅ．２０１２；７（９）：ｅ４５８８２；Ｊ Ｍａｔｅｒｎ Ｆｅｔａｌ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｍｅｄ．２０１２ Ｓｅｐ；２５（９）：１７８３−６）、若年患者における膵島抗抗体陰性の糖尿病（ｉｓｌｅｔ ａｎｔｉ−ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｄｉａｂｅｔｅｓ）が挙げられる（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．２００９ Ｆｅｂ；９４（２）：５０４−１０）。
【０１１３】
ＴＣＦ７Ｌ２変異体の存在はまた、正常なヒトの発達に影響を及ぼす。例えば、Ｆｒｅａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．は、２４，０５３人の研究にてＴＣＦ７Ｌ２危険遺伝子型が出生体重を変化させることを示した（Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２００７ Ｊｕｎ；８０（６）：１１５０−６１）。当該変異体はまた、早発アドレナーキ（思春期早発症）にも関与している。例えば、Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．２００９ Ｓｅｐ；５８（９）：１２６３−９を参照。
【０１１４】
上記の通り、当該変異体は、糖尿病性合併症に関連する、または関連しない、いくつかの異なる代謝異常に関与している。例えば、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．は、転写因子７様２（ＴＣＦ７Ｌ２）多型が、高血圧であるか、または糖尿病ではない白人において、焦点細動脈狭窄に関与している可能性があることを示した（ＢＭＣ Ｅｎｄｏｃｒ Ｄｉｓｏｒｄ．２０１０ Ｍａｙ １７；１０：９）。また、Ｍｅｌｚｅｒ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｍｅｄ．２００６ Ｄｅｃ ２０；４：３４を参照。
【０１１５】
ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子多型はまた、糖尿病性網膜症および心血管系自律神経機能障害にも関与している（Ｃｉｃｃａｃｃｉ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｄｉａｂｅｔｏｌ．２０１２Ｊｕｌ ２８，Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２０１３ Ｆｅｂ ２２）。
【０１１６】
心血管系の合併症はまた、この変異体を有する患者でも認められている。ＴＣＦ７Ｌ２多型ｒｓ７９０３１４６は、冠動脈疾患の重症度および死亡率にも関与している。Ｓｏｕｓａ ＡＧ，ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２００９ Ｎｏｖ１７；４（１１）：ｅ７６９７を参照。当該変異体はまた、Ｐｅｒｅｚ Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｐ，ｅｔ ａｌ．ＰＬｏｓ Ｏｎｅ．２０１２；７（８）：ｅ４３３９０に記載されているように、３つの異なる集団の脂質代謝に影響を与える。
【０１１７】
何人かの研究者により、ＴＣＦ７Ｌ２の一塩基変異多型が、糖尿病性の冠状動脈アテローム性動脈硬化症に関連していることが報告されている。Ｍｕｅｎｄｌｅｉｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１１ Ｍａｒ １５；６（３）：ｅ１７９７８およびＫｕｃｈａｒｓｋａ−Ｎｅｗｔｏｎ ＡＭ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｏｂｅｓ．２０１０；２０１０を参照。
【０１１８】
このＴＣＦ７Ｌ２変異体はまた、アラブーイスラエルファミリーのサンプルにおける統合失調症などの精神神経疾患にも関与している（Ａｌｋｅｌａｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．ＰｌｏＳ Ｏｎｅ．２０１２；７（１）：ｅ２９２２８）。Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．は、変異体を有する患者における統合失調症のリスク増加を報告している。Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２０１１ Ｊｕｌ １；７０（１）：５９−６３．また、Ｉｒｖｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒ Ｒｅｓ．２００９ Ｏｃｔ；１１４（１−３）：５０−６）を参照。Ｉｒｖｉｎ ｅｔ ａｌ．は、統合失調症または統合失調性感情障害を罹患しているアフリカンーアメリカン患者における薬理学的介入と共に２型糖尿病の遺伝的危険因子について記載している。
【０１１９】
ＴＣＦ７Ｌ２多型と癌との間の関連性は、文献に記載されている。ヒスパニックおよびヒスパニックではない白人女性の間での乳癌のリスク増加（乳癌健康格差研究（Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｓｐａｒｉｔｉｅｓ Ｓｔｕｄｙ））について、Ｃａｎｎｏｒ ＡＥ，ｅｔ ａｌ．により記載されている（Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ．２０１２ Ｎｏｖ；１３６（２）：５９３−６０２）。Ａｌａｎａｚｉ ＭＳ，ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３；８（３）：ｅ５９５５５の報告によれば、一塩基変異多型は、サウジの患者において、乳癌と共にＷｎｔシグナル伝達経路遺伝子に影響を与えるようである。また、Ｎａｉｄｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ Ｏｎｃｏｌ．２０１２Ｊｕｎ；２９（２）：４１１−７も参照。変異体はまた、大腸癌のリスクを調節するようである。Ｓａｉｎｚ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．２０１２ Ｍａｙ；９７（５）：Ｅ８４５−５１を参照。ＴＣＦ７Ｌ２における変異および大腸癌のリスクの増加（地域アテローム性動脈硬化症リスク（ｔｈｅ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｒｉｓｋ ｉｎ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ：ＡＲＩＣ）試験）について、Ｆｏｌｓｏｍ ＡＲ，ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ．２００８ Ｍａｙ；３１（５）：９０５−９により記載された。
【０１２０】
ギリシャ人の集団におけるＴＣＦ７Ｌ２およびＫＣＮＪ１１遺伝子の遺伝子変異は、多嚢胞性卵巣症候群に関与している（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２００８ Ｓｅｐ．２４（９）：４８６−９０）。変異体はまた、地域住民を対象としたコホートにおいて、ＣＫＤの進行および腎機能に関与している。Ｋｏｔｔｇｅｎ Ａ，ｅｔ ａｌ，（Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．２００８ Ｏｃｔ；１９（１０）：１９８９−９９）を参照。
【０１２１】
ＴＣＦ７Ｌ２変異体と上記の各疾患との関係を考慮すれば、変異体の作用を変化させる薬剤が重要な臨床的利点をもたらす可能性があることは明らかである。従って、この変異体でのタンパク質複合体の形成を阻害する薬剤は、非常に望ましく、本明細書の上記のスクリーニング方法を用いて容易に同定可能である。
【０１２２】
この変異体の別の重要な使用においては、試験および疾病管理の治療パラダイムが必要となる。患者は、変異体の有無について試験され、変異体が存在する場合は、このことにより、臨床医は現在利用可能な新しく開発された治療薬の適切な使用に導かれるであろう。ＴＣＦ７Ｌ２転写複合体に存在する種々の構成要素を同定することにより、そのような治療薬の開発に新たな道が提供される。
【実施例３】
【０１２３】
Ｐａｒｐ−ｌの阻害によりグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の分泌が促進される  
グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、グルコース刺激によるインスリン分泌の促進、β細胞抗アポトーシスの刺激およびグルカゴン分泌の促進と阻害、食物摂取、および胃内容排出を含め、多数の生理学的機能を有する。ＧＬＰ−１のこれらの抗糖尿病特性は、２型糖尿病に罹患した患者の治療のための、この短いペプチドおよびそのアゴニストの使用に対する強い関心を生んでいる。ＧＬＰ−１分泌の基本的メカニズムをより良く理解することにより、２型糖尿病の治療に使用される新規のアプローチに繋がる可能性がある。ＴＣＦ７Ｌ２は、２型糖尿病に最も強く関連した遺伝子座であり、プログルカゴン遺伝子のプロモーター領域に結合することが長年にわたり知られている。また、オリゴプルダウンを使用し、続いて質量分析することにより、我々は、これまでの実施例において、原因と考えられる変異体であるＴＣＦ７Ｌ２内のｒｓ７９０３１４６に結合する特定のタンパク質因子（そのうち最も多量なものはＰＡＲＰ−１である）を同定した。興味深いことに、ＴＣＦ７Ｌ２およびＰＡＲＰ−１は共に作用し、ＰＡＲＰ−１ノックアウトマウスは、糖尿病の誘発から保護されることを示唆する文献が既にいくつかある。そのため、我々は、腫瘍研究で以前試験した既存のＰＡＲＰ−１阻害剤が、ＧＬＰ−１アゴニスト作用を有するかどうかを調査した。この関連の可能性を調べるためのＧＬＰ−１分泌評価のため、標準ヒトＬ細胞株であるＮＣＩ−Ｈ７１６を使用した。細胞を、３種の異なるＰＡＲＰ−１阻害剤、オラパリブ、ルカパリブ、およびイニパリブを用いて、グルコース刺激（１６．８ｍＭ）有りと無しとで、４８時間前処理した。得られたＧＬＰ−１の濃度を、ＥＬＩＳＡキット（ミリポア社）を用いて測定した。データにより、ＧＬＰ−１の基礎レベルがグルコースにより上昇したこと分かる。しかしながら、グルコースは無いが阻害剤が有る場合には、同等またはそれ以上のＧＬＰ−１分泌レベルが認められた。また、この分泌の増加は、グルコースの添加によりさらに上昇した。図５を参照。この結果を踏まえると、ＰＡＲＰ−１阻害剤が、ＧＬＰ−１分泌を増加させるため、２型糖尿病の治療のための新規の治療戦略が存在するように思われる。
【０１２４】
本発明の特定の好ましい実施形態が記載され、具体的に上記に例示されたが、これは本発明をそのような実施形態に制限することを意図するものではない。以下の請求項に記載されるように、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更および修飾を行うことができることは、当業者に明らかであるだろう。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
2016516720.tif 000009
【図３Ｂ】
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【図４−１】
2016516720.tif 000011
【図４−２】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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