(57)【要約】  本文で開示の発明は、痴呆の有無に関係のない運動神経疾患、及び痴呆症に対する新規治療標的（神経細胞内のカーゴ分子の微小管と微小管媒介軸索内輸送の運動変化）を説明する。また、痴呆の有無に関係のない確証、初期または潜伏運動神経疾患、及び痴呆症を患う対象者におけるこの治療標的の活性状態の測定方法を説明する。さらに、運動神経疾患を患っている対象者における神経細胞微小管運動を調整する薬剤の発見、そのような薬剤の単独での、あるいは組合せでの投与が、軸索に沿っての、及び軸索を介してのカーゴ分子のＭＴ媒介輸送を改善することができるという発見、微小管運動の変化に対するそのような調整と、軸索に沿った分子のＭＴ輸送における改善が、運動神経疾患を患っている対象者に対して、症状の遅延及び寿命の延長を含む著しい神経保護性治療を提供可能であるという発見、及び、痴呆の有無に関係のない運動神経疾患、及び痴呆症を患う対象者に対する治療的処置への応答としてのカーゴ分子の微小管媒介軸索内輸送のモニタリングが、個々の対象者における、あるいは薬剤試験における治療法及び治療計画を最適化するための診断モニタリングを可能にするという発見を説明する。【選択図】図１０
2016516202.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
痴呆の有無に関係なく運動神経疾患を、あるいは痴呆症（アルツハイマー病）を患う対象者における、薬剤の効果のモニターリング方法であって、
ａ）被験生体系を一つ以上の薬剤に曝露すること、
ｂ）前記生体系へ同位元素標識サブストレートを、前記同位元素標識サブストレートが運動神経または神経細胞の他の亜集団の軸索内の一つ以上のカーゴ分子内に入るのに十分な時間に渡って投与すること、
ｃ）前記生体系から複数の試料を採取すること、
ｄ）前記複数の試料からの、一つ以上の分泌小胞カーゴ分子における同位体濃縮の経時変化、パターンまたは量を定量化すること、
ｅ）コントロール系からの試料内の分泌小胞カーゴ分子における同位体濃縮の経時変化、パターンまたは量を測定すること、
ｆ）前記生体系内の前記単離小胞カーゴ分子における同位体濃縮の前記経時変化、パターンまたは量を、コントロール生体系における同じパラメータに比較すること、及び
ｇ）運動神経または神経細胞の他の亜集団における、微小管（ＭＴ）媒介低速及び高速軸索内輸送の速度に関する前記薬剤の効果を判定することからなる、前記方法。
【請求項２】
前記一つ以上の分泌小胞カーゴ分子が、成長因子、神経伝達物質、グリコプロテイン、タンパク質、ニューロペプチド及び分泌酵素からなるグループから選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
前記一つ以上の分泌小胞カーゴ分子が、クロモグラニンＢ、プロエンケファリンＡ、神経分泌ＶＧＦ及びクラステリンからなるグループから選択される、請求項１または２の方法。
【請求項４】
前記被験生体系からの運動神経または神経細胞の他の亜集団における、分泌小胞カーゴ分子の同位体濃縮の経時変化、パターンまたは量と、それに依存するＭＴ媒介軸索内輸送の効率が、前記コントロール生体系からの運動神経または神経細胞の他の亜集団における、分泌カーゴ分子の同位体濃縮の経時変化、パターンまたは量と、それに依存する高速軸索内輸送の効率へ比較される、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
複数の薬剤が、単独で、あるいは併用で投与される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記試料が、ＣＳＦ、血液、尿または組織試料からなる、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記試料が、複数の時点で採集される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
痴呆の有無に関係のない運動神経疾患、あるいは痴呆症（アルツハイマー病）の、脳内の特定な位置へのマッピング方法であって、
ａ）痴呆の有無に関係なく既知の運動神経疾患を、または既知の痴呆症（アルツハイマー病）を患う対象者へ、同位元素標識サブストレートを、前記同位元素標識サブストレートが運動神経の軸索内の一つ以上のカーゴ分子へ入るのに十分な時間に渡って投与すること、
ｂ）痴呆の有無に関係なく運動神経疾患を、あるいは痴呆症（アルツハイマー病）を患っていない対象者へ、同位元素標識サブストレートを、前記同位元素標識サブストレートが運動神経または神経細胞の他の亜集団の軸索内の一つ以上のカーゴ分子へ入るのに十分な時間に渡って投与すること、
ｃ）痴呆の有無に関係なく既知の運動神経疾患を、あるいは痴呆症（アルツハイマー病）を患う前記対象者から、複数の試料を採取すること、
ｄ）痴呆の有無に関係なく運動神経疾患を、あるいは痴呆症（アルツハイマー病）を患っていない前記対象者から、複数の試料を採取すること、
ｅ）痴呆の有無に関係なく既知の運動神経疾患を、あるいは痴呆症（アルツハイマー病）を患う前記対象者における、前記単離小胞カーゴ分子内の同位体濃縮の経時変化、パターンまたは量を、痴呆の有無に関係なく運動神経疾患を、あるいは痴呆症（アルツハイマー病）を患っていない前記対象者における、前記単離小胞カーゴ分子内の同位体濃縮の経時変化、パターンまたは量に比較すること、
ｇ）痴呆の有無に関係なく既知の運動神経疾患を、あるいは痴呆症（アルツハイマー病）を患う前記対象者からの試料内に存在し、痴呆の有無に関係なく運動神経疾患を、あるいは痴呆症（アルツハイマー病）を患っていない前記対象者からの試料内に存在しない一つ以上のカーゴ分子を判定することからなる、前記方法。
【請求項９】
前記痴呆の有無に関係のない運動神経疾患、あるいは前記痴呆症（アルツハイマー病）が、パーキンソン病（ＰＤ）、パーキンソン病痴呆（ＰＤＤ）、アルツハイマー病痴呆（ＡＤＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、進行性延髄麻痺（ＰＢＰ）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）及び脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）からなる疾患のグループから選択される、請求項８の方法。
【請求項１０】
前記一つ以上の分泌小胞カーゴ分子が、成長因子、神経伝達物質、グリコプロテイン、タンパク質、ニューロペプチド及び分泌酵素からなるグループから選択される、請求項８または９の方法。
【請求項１１】
前記一つ以上の分泌小胞カーゴ分子が、クロモグラニンＢ、プロエンケファリンＡ、神経分泌ＶＧＦ及びクラステリンからなるグループから選択される、請求項８から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記試料が、ＣＳＦ、血液、尿または組織試料からなる、請求項８から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記試料が、複数の時点で採集される、請求項８から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
脳内の特定な部位についての、痴呆の有無に関係のない運動神経疾患、あるいは痴呆症（アルツハイマー病）の診断方法であって、
ａ）前記生体系へ同位元素標識サブストレートを、前記同位元素標識サブストレートが運動神経の軸索内の一つ以上のカーゴ分子へ入るのに十分な時間に渡って投与すること、
ｂ）前記生体系から、複数の試料を採取すること、
ｃ）前記複数の試料からの、一つ以上の分泌小胞カーゴ分子における同位体濃縮の経時変化、パターンまたは量を定量化すること、
ｄ）コントロール系からの試料内の分泌小胞カーゴ分子における同位体濃縮の経時変化、パターンまたは量を測定すること、
ｅ）前記生体系の前記単離小胞カーゴ分子内における同位体濃縮の前記経時変化、パターンまたは量を、コントロール生体系の同じパラメータに比較すること、及び
ｆ）運動神経または神経細胞の他の亜集団における、微小管（ＭＴ）媒介低速及び高速軸索内輸送の速度に関する前記薬剤の効果を判定することからなる、前記方法。
【請求項１５】
前記痴呆の有無に関係のない運動神経疾患、あるいは前記痴呆症（アルツハイマー病）が、パーキンソン病（ＰＤ）、パーキンソン病痴呆（ＰＤＤ）、アルツハイマー病痴呆（ＡＤＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、進行性延髄麻痺（ＰＢＰ）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）及び脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）からなる運動神経疾患のグループから選択される、請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記一つ以上の分泌小胞カーゴ分子が、成長因子、神経伝達物質、グリコプロテイン、タンパク質、ニューロペプチド及び分泌酵素からなるグループから選択される、請求項１４または１５の方法。
【請求項１７】
前記一つ以上の分泌小胞カーゴ分子が、クロモグラニンＢ、プロエンケファリンＡ、神経分泌ＶＧＦ及びクラステリンからなるグループから選択される、請求項１４から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記試料が、ＣＳＦ、血液、尿または組織試料からなる、請求項１４から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記試料が、複数の時点で採集される、請求項１４から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
痴呆の有無に関係のない運動神経疾患、あるいは痴呆症（アルツハイマー病）の診断方法であって、
ａ）生体系へ同位元素標識サブストレートを、前記同位元素標識サブストレートが運動神経または神経細胞の他の亜集団の軸索内の一つ以上のカーゴ分子へ入るのに十分な時間に渡って投与すること、
ｂ）前記生体系から、複数の試料を採取すること、及び
ｃ）前記複数の試料からの、一つ以上の分泌小胞カーゴ分子における同位体濃縮の経時変化、パターンまたは量を定量化することからなり、
一つ以上の分泌小胞カーゴ分子は、クロモグラニンＢ、プロエンケファリンＡ、神経分泌ＶＧＦ及びクラステリンからなるグループから選択され、
前記痴呆の有無に関係のない運動神経疾患、または痴呆症（アルツハイマー病）が、ＰＤ、ＰＤＤ及びＡＤＤからなるグループから選択される、前記方法。
【請求項２１】
クロモグラニンＢで富化された試料が、ＰＤまたはＰＤＤを示唆する、請求項２０の方法。
【請求項２２】
プロエンケファリンＡで富化された試料が、ＰＤＤを示唆する、請求項２０の方法。
【請求項２３】
神経分泌タンパク質ＶＧＦで富化された試料が、ＰＤＤを示唆する、請求項２０の方法。
【請求項２４】
クラステリンで富化された試料が、ＰＤＤを示唆する、請求項２０の方法。
【請求項２５】
プロエンケファリンＡ、クロモグラニンＢ、神経分泌タンパク質ＶＧＦ及びクラステリンで富化された試料が、ＰＤＤを示唆する、請求項２０の方法。
【請求項２６】
分泌タンパク質ＶＧＦ及びクラステリンで富化された試料が、ＡＤＤを
プロエンケファリンＡ、神経示唆する、請求項２０の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１３年３月１５日に出願のＵ．Ｓ．Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｉａｌ  Ｎｏ．６１／８０１，８８２への優先権を主張する。その開示の全文が、すべての目的において、参照により本文に援用される。
【０００２】
本発明は、脳内の運動神経集団の機能である運動神経活性及び活動性へ影響を与える新規医薬化合物に関する。本発明は、さらに、痴呆の有無に関係なく、筋萎縮性側索硬化症及びパーキンソン病などの運動神経疾患の治療への、及び痴呆症の治療への、そのような新規医薬化合物の使用に関する。本発明は、さらに、そのような運動神経疾患の有無について、被験者をスクリーニング及びモニタリングすることに関する。
【背景技術】
【０００３】
運動神経疾患は、話す、歩く、呼吸する、嚥下する等の随意筋活性を支配する細胞である上部（脳）及び下部（脳幹及び脊髄）運動神経の両方に損傷を与える、あるいは破壊する一群の進行性神経疾患である。運動神経疾患の特徴的症状は、進行性衰弱、活力の喪失及び筋肉量の減失（消耗）、筋肉の単収縮を含む不随意運動、腕及び脚の痙縮または硬直、及び、過敏性腱反射を含む。運動神経疾患の他の症状は、随意運動の緩徐化（運動緩慢）、運動の欠如（運動低下、仮面状の顔）、常同性反復不随意運動（舞踏病アテトーシス）、及び姿勢固化または情動不安（アカシジア）を含むこともある。例えば、（ＡＬＳ、ルー・ゲーリック病と一般に呼ばれる）筋萎縮性側索硬化症などのタイプの運動神経疾患においては、筋力低下は、進行性であり、典型的に呼吸筋機能の喪失と関連して、最終的に死に至る。他のタイプの運動神経疾患は、ゆっくりと長年に渡って進行する。運動神経疾患（ＭＮＤ）を持つ患者には、通常、認知障害はないが、ＭＮＤ患者の特定なサブグループと痴呆との関連を支持する証拠が明らかになって来ている。例えば、ＡＬＳ、ＰＤ及びＨＤを含む運動神経疾患は、認知及び気分障害を引き起こすこともある。ＡＬＳ、ＰＤ及びＨＤにおける認知障害は、運動領域を超えて、大脳皮質の病理学的な変化、及びＸ線撮影可視的な変化に相関している（引用文献：Ｍｏｎａｓｔｅｒｏ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ｍｉｌｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ  Ｄｉｓ．２０１２；１０（１−４）：１８７−９０；Ｐｏｌｅｔｔｉ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｌｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ−ｍｏｔｏｒ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｉｎ  ｎｅｗｌｙ  ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  ｄｒｕｇ−ｎａｉｖｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ２０１２；８３（６）：６０１−６；Ｒｉｐｐｏｎ  ＧＡ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｉｎ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．  Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．２００６；６３（３）：３４５−５２．；Ｄｕｍａｓ  ＥＭ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  ２０１３；５：１−１８）。
【０００４】
運動神経疾患は、成人及び小児に発症し、女性よりも男性で、一般的である。成人における症状は、通常４０歳以降で現れ、非特異的であり、診断が難しい。小児における、特に遺伝性の疾患では、症状は、出生時から存在することもある。遺伝性運動神経疾患は、運動神経の退化を引き起こす遺伝子突然変異または遺伝子欠失に起因する。遺伝性運動神経疾患は、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）と、脊髄性筋萎縮症として知られる一群の小児疾患を含む。非遺伝性（散発性とも呼ぶ）運動神経疾患は、環境毒素またはウイルスが、病気の引き金として作用するのかも知れないが、未知の要因によって発症する。非遺伝性運動神経疾患は、（若干の遺伝性のものが存在するが）ＡＬＳ、進行性延髄麻痺、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、仮性球麻痺、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮症、パーキンソン病、糖尿病性神経障害、ポリオ後症候群、及び、その他の多くを含む。運動神経疾患と、痴呆を伴う運動神経疾患を診断するための特殊な臨床検査は、全く存在しない。
【０００５】
ＡＬＳは、容赦なく進行する、末梢神経系の常に致命的な疾患である。具体的には、ＡＬＳは、軸索の機能障害を特徴とする運動神経の疾患である。現在、有効な治療法は全く存在しない。リルゾール（Ｒｉｌｕｔｅｋ（商標））は、１９９５年にＦＤＡの承認を得たが、疾病進行を僅かに遅延させるだけである。非遺伝性ＡＬＳに加えて、遺伝性ＡＬＳも存在する。家族性ＡＬＳを持つ患者の２０％までは、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）遺伝子に変異を持つ。この成果は、ＡＬＳの信頼できるマウス・モデルの開発を可能にした。このモデル、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ遺伝子導入マウス（「ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ・ＴＧＮマウス」）は、ＡＬＳを模倣する神経疾患を発症し、生後１８から１９週目に死に至る。
【０００６】
ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ・ＴＧＮマウスは、前臨床的発見及び薬剤の試験に非常に有用となった。ＡＬＳのこの特殊な遺伝子導入マウス・モデルは、変異体ヒトＣｕ，ＺｎＳＯＤの比較的に高い発現と、比較的に短い疾患過程（１８−１９週）を示す。そのため、潜在的治療薬の評価は、より速く、より効率的に行える。また、このよりアグレッシブな（すなわち、発現度の高い）マウス・モデルの治療効果の実証は、クリニックにおける成功を予測するための最も厳しい示標を提供するかもしれない。ヒト臨床試験を組織するために必要な費用及び時間を考慮すると、最も有効で強力な候補薬のみが、患者での評価のために提示されるべきである。種々の潜在的治療薬が、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ・ＴＧＮマウスでテストされている。他の治療法、例えばヒト神経幹細胞の移植なども、このモデルでテストされている。リルゾールと神経幹細胞移植を含んで、現在までテストされたすべての治療法は、このモデルにおいて、発症及び死亡率を２０から３０日遅延させるのみである。
【０００７】
ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ・ＴＧＮマウスにおける候補剤の成功が比較的に不足していることは、運動神経疾患の根底にあるメカニズムの理解の基本的な欠如を反映しているのかもしれない。疾病進行に関わる根底にある分子標的及び経路が分かっているならば、運動神経疾患に対するより効果的な治療法が発見及び開発されるかもしれない。
【０００８】
Ｕ．Ｓ．Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｎｏ．６０／７２２，８９７，ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２８０６９及びＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．１０／２７９，３９９の全文が、参照により本文に援用される。
【発明の概要】
【０００９】
したがって、一つの態様において、本発明は、第一の神経保護剤及び第二の神経保護剤からなる医薬組成物を提供する。通常、神経保護剤の少なくとも一つは、例えばノスカピン等の、微小管標的調節剤（ＭＴＭＡ）である。時には、医薬組成物は、単一神経保護剤のみからなり、特に、ノスカピン等の微小管標的調節剤（ＭＴＭＡ）からなる。時には、医薬組成物は、三つの神経保護剤からなり、特に、それらの神経保護剤の一つまたは二つがＭＴＭＡである。神経保護剤は、ＭＴＭＡ、チアゾリジンジオン及び非チアゾリジンジオン・ペルオキシゾーム増殖因子活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲγ）作用薬を含む抗炎症剤、例えば、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体などの、電位依存型ナトリウム・チャネル（ＶＧＮＨ）及び電位依存型カルシウム・チャネル（ＶＧＣＨ）を含む電位依存型イオン・チャネルに対する拮抗剤等の、選択的及び非選択的グルタミン酸受容体拮抗剤を含むイオン・チャネル調節因子、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）拮抗剤、神経膠モジュレーター、低電位感知カルシウム・チャネル（Ｌ−ＶＳＣＣＳ）遮断剤、Ｎ型及びＰ／Ｑ型電位依存性カルシウム電流阻害剤、エンドカンナビノイド及びカンナビノイド受容体作用薬を含むカンナビノイド等の、ＣＢ１受容体及びＣＢ２受容体作用薬、脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）阻害剤を含む、ＡＥＡ輸送、加水分解及び再摂取阻害剤、誘導可能な一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）阻害剤、フリーラジカル・トラッパー／スカベンジャー、及び、銅（II）及び亜鉛（II）キレーターを含む金属イオン・キレーター等の抗酸化剤、神経栄養因子、及び、アポトーシス阻害剤から選択される。組成物の各神経保護剤は、他から分離して、バイアル内にあってもよい。
【００１０】
追加の態様においては、本発明は、一つ、二つ、三つ以上の神経保護剤からなる医薬組成物を投与することからなる運動神経疾患の治療方法を提供する。医薬組成物は、さらに、医薬担体を含んでもよい。
【００１１】
更なる態様において、本発明は、一つ、二つ、三つ以上の神経保護剤からなる医薬組成物を投与することからなるＡＬＳ及びＰＤの治療方法を提供する。医薬組成物は、さらに、医薬担体を含んでもよい。そのような治療は、ＡＬＳ及びＰＤの発症を遅らせる、またはＡＬＳ及びＰＤ症状を緩和させる可能性がある。
【００１２】
もう一つの態様においては、本発明は、患者へＭＴＭＡ及び医薬担体を投与することからなる、患者におけるＡＬＳ及びＰＤ症状の寛解方法を提供する。
【００１３】
更なる態様において、本発明は、治療が必要な患者へ、ＭＴＭＡ及び医薬担体をその患者にとって治療的に有効な量投与することからなる運動神経疾患の治療方法を提供する。
【００１４】
更なる態様において、本発明は、運動神経疾患を患う対象者における薬剤の効果のモニタリング方法を提供する。この方法は、被験生体系を一つ以上の薬剤に曝露すること、及び、同位元素標識サブストレートが、一つ以上のチュービュリン・サブユニット内へ入ることによって、一つ以上の微小管分子に入り、それを標識するのに十分な時間、生体系へ同位元素標識サブストレートを投与することからなる。それから、その生体系から、運動神経細胞からなる第一の試料を採取し、第一の試料からの微小管の亜集団の同位体濃縮を定量化する。また、コントロール系からの微小管の亜集団の同位体濃縮を定量化する、あるいはそれは提供される。そして、運動神経細胞内の微小管標識に対する薬剤の影響を判定するために、生体系内の微小管における濃縮の比率を、コントロール生体系内の比率に比較する。
【００１５】
更なる態様における方法は、さらに、標識微小管の運動を計算することからなる。この場合、比較ステップは、遊離チュービュリンの同位体濃縮に対する微小管内の同位体濃縮、すなわち運動の比率を計算すること、及び、その比率を、コントロール生体系における対応比率に比較することからなる。
【００１６】
もう一つの態様における方法は、被験生体系の成長円錐微小管からの微小管の同位体濃縮、すなわち運動を、コントロール生体系の成長円錐微小管からの標識微小管の同位体濃縮、すなわち運動に比較することからなる。
【００１７】
更なる態様における方法は、被験生体系の軸索微小管からの微小管の同位体濃縮、すなわち運動を、コントロール生体系の軸索微小管からの微小管の同位体濃縮に比較することを利用する。
【００１８】
もう一つの態様においては、被験生体系が曝露される薬剤は、神経保護因子である。薬剤は、単独で、または他の薬剤との組合せで投与できる。
【００１９】
更なる態様において、本発明は、神経細胞微小管の活動性を修正する薬剤を投与することによる、運動神経疾患の治療方法を提供する。
【００２０】
もう一つの態様においては、本発明は、微小管の活動性を修正する薬剤を神経に接触させることからなる、運動神経疾患に有効な薬剤のスクリーニング方法を提供する。
【００２１】
更なる態様において、本発明は、運動神経疾患を患う対象者における治療効果の診断またはモニタリング方法を提供する。この方法は、同位元素標識サブストレートが、一つ以上のチュービュリン・サブユニットに入ることによって、一つ以上の微小管ポリマー分子に入り、それを標識するに十分な時間、生体系へ同位元素標識サブストレートを投与すること、及び、生体系の運動神経細胞からなる第一の試料を採取することからなる。第一の試料からの軸索コンパートメント内の微小管の亜集団の同位体濃縮、及び軸索コンパートメントからの非合体標識チュービュリンの亜集団の同位体濃縮を定量化し、運動神経疾患の有無を判定するために、軸索コンパートメントの微小管の亜集団の濃縮比率を、軸索コンパートメントからの非合体標識チュービュリンの亜集団の比率に比較する。
【００２２】
更なる態様において、本発明は、運動神経疾患を患う対象者における治療効果の非侵襲性診断またはモニタリング方法を提供する。この方法は、同位元素標識サブストレートが、通常ニューロンから分泌されて輸送される一つ以上の神経細胞分子内へ入るのに十分な時間、生体系へ同位元素標識サブストレートを投与すること、及び、生体系の組織または体液から第一の試料あるいは経時シリアル試料を採取することからなる。なお、神経細胞分子は、例えば、微小管輸送系を介して軸索のコースに沿って輸送される成長因子、神経伝達物質、ニューロペプチド、（酵素及びグリコプロテイン等を含む）タンパク質、または他の分子（「カーゴ分子」または「カーゴ」）である。軸索に沿って、及び通して輸送された分泌分子の同位体濃縮の経時変化は、採取した一つ以上の体液または組織内の分泌分子における同位体標識の経時変化に基づいて測定する。個人から採取した分泌分子における濃縮経時変化を、治療的処置への反応としての同じ個人の、あるいは比較対象者の分泌分子における濃縮経時変化に比較する。そうすることによって、個人における分泌分子の障害性微小管（ＭＴ）媒介軸索内輸送を伴う運動神経疾患の有無を評価できる。同様に、個人あるいは一グループの対象者における処置前後の輸送速度を比較することによって、このタイプの病状による治療への応答を査定できる。成長因子、神経伝達物質、神経ペプチド、分泌酵素、グリコプロテイン、タンパク質、または神経細胞から分泌される他の「カーゴ」分子の輸送速度の動態解析は、これら対象者の神経細胞内に微小管媒介軸索内輸送の障害が存在するかどうかを評価する目的で、患者から脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、尿または組織試料を採取することによって実行可能である。
【００２３】
更なる態様において、本発明は、運動神経疾患を患う対象者の臨床試験においてテストされている候補剤の治療有効性の評価及びモニターリング方法を提供する。この方法は、同位元素標識サブストレートが、一つ以上のチュービュリン・サブユニット内に入ることによって、一つ以上の微小管ポリマー分子へ入り、それを標識するのに十分な時間、生体系へ同位元素標識サブストレートを投与すること、及び、生体系の運動神経細胞からなる第一の試料を採取することからなる。第一の試料からの軸索コンパートメント内の微小管の亜集団の同位体濃縮、及び軸索コンパートメントからの非合体標識チュービュリンの亜集団の同位体濃縮を定量化し、運動神経疾患の有無を判定するために、軸索コンパートメントの微小管の亜集団の濃縮比率を、軸索コンパートメントからの非合体標識チュービュリンの亜集団の比率に比較する。候補剤の治療有効性を統計的に評価するために、異なる投与群を比較する。また、治療期間中、候補剤の有効性に対する治療的作用または変化をモニターするために、反復計測及び分析を実行できる。
【００２４】
更なる実施形態においては、本発明は、痴呆の有無に関係なく運動神経疾患を、あるいは痴呆症（アルツハイマー病）を患う対象者における、薬剤の効果のモニターリング方法を含む。特定な実施形態における方法は、被験生体系を一つ以上の薬剤に曝露するステップからなる。特定な実施形態における方法は、同位元素標識サブストレートが、運動神経または神経細胞の他の亜集団の軸索内の一つ以上のカーゴ分子内に入るのに十分な時間、生体系へ同位元素標識サブストレートを投与するステップからなる。特定な実施形態における方法は、その生体系から複数の試料を採取するステップからなる。特定な実施形態における方法は、それら複数の試料からの、一つ以上の分泌シナプス小胞カーゴ分子内における同位体濃縮の経時変化、パターンまたは量を定量化するステップからなる。特定な実施形態における方法は、コントロール系からの試料の分泌シナプス小胞カーゴ分子内における同位体濃縮の経時変化、パターンまたは量を測定するステップからなる。特定な実施形態における方法は、生体系の単離シナプス小胞カーゴ分子内における同位体濃縮の経時変化、パターンまたは量を、コントロール生体系の同じパラメータに比較するステップからなる。特定な実施形態における方法は、運動神経または神経細胞の他の亜集団における、微小管（ＭＴ）媒介低速及び高速軸索内輸送の速度に関する薬剤の効果を判定するステップからなる。
【００２５】
特定な実施形態における一つ以上の分泌シナプス小胞カーゴ分子は、成長因子、神経伝達物質、グリコプロテイン及び分泌酵素からなるグループから選択される。特定な実施形態における一つ以上の分泌シナプス小胞カーゴ分子は、クロモグラニンＢ、プロエンケファリンＡ、神経分泌ＶＧＦ及びクラステリンからなるグループから選択される。特定な実施形態においては、被験生体系から運動神経または神経細胞の他の亜集団における分泌シナプス小胞カーゴ分子内の同位体濃縮の経時変化、パターンまたは量と、それによるＭＴ媒介軸索内輸送の効率が、コントロール生体系からの運動神経または神経細胞の他の亜集団における分泌カーゴ分子内の同位体濃縮の経時変化、パターンまたは量と、それによる高速軸索内輸送の効率に比較される。特定な実施形態においては、複数の薬剤が、単独で、あるいは併用で投与される。
【００２６】
特定な実施形態における試料は、ＣＳＦ、血液、尿または組織試料からなる。特定な実施形態における試料は、複数の時点で採集される。
【００２７】
更なる実施形態においては、本発明は、脳内の特定な位置への、痴呆の有無に関係のない運動神経疾患の、あるいは痴呆症（アルツハイマー病）のマッピング方法を含む。特定な実施形態における方法は、痴呆の有無に関係なく既知の運動神経疾患を、または既知の痴呆症（アルツハイマー病）を患う対象者へ、同位元素標識サブストレートが、運動神経の軸索内の一つ以上のカーゴ分子へ入るのに十分な時間、同位元素標識サブストレートを投与するステップからなる。特定な実施形態における方法は、痴呆の有無に関係なく運動神経疾患を、あるいは痴呆症（アルツハイマー病）を患っていない対象者へ、同位元素標識サブストレートが、運動神経または神経細胞の他の亜集団の軸索内の一つ以上のカーゴ分子へ入るのに十分な時間、同位元素標識サブストレートを投与するステップからなる。特定な実施形態における方法は、痴呆の有無に関係なく既知の運動神経疾患を、あるいは痴呆症（アルツハイマー病）を患う対象者から、複数の試料を採取するステップからなる。特定な実施形態における方法は、痴呆の有無に関係なく運動神経疾患を、あるいは痴呆症（アルツハイマー病）を患っていない対象者から、複数の試料を採取するステップからなる。特定な実施形態における方法は、痴呆の有無に関係なく既知の運動神経疾患を、あるいは痴呆症（アルツハイマー病）を患う対象者の単離シナプス小胞カーゴ分子における同位体濃縮の経時変化、パターンまたは量を、痴呆の有無に関係なく運動神経疾患を、あるいは痴呆症（アルツハイマー病）を患っていない対象者の単離シナプス小胞カーゴ分子における同位体濃縮の経時変化、パターンまたは量に比較するステップからなる。特定な実施形態における方法は、痴呆の有無に関係なく既知の運動神経疾患を、あるいは痴呆症（アルツハイマー病）を患う対象者からの試料内に存在し、痴呆の有無に関係なく運動神経疾患を、あるいは痴呆症（アルツハイマー病）を患っていない対象者からの試料内に存在しない一つ以上のカーゴ分子を判定するステップからなる。
【００２８】
特定な実施形態における痴呆の有無に関係のない運動神経疾患、あるいは痴呆症（アルツハイマー病）は、パーキンソン病（ＰＤ）、パーキンソン病痴呆（ＰＤＤ）、アルツハイマー病痴呆（ＡＤＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、進行性延髄麻痺（ＰＢＰ）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）及び脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）からなる疾患のグループから選択される。
【００２９】
特定な実施形態における一つ以上の分泌シナプス小胞カーゴ分子は、成長因子、神経伝達物質、グリコプロテイン及び分泌酵素からなるグループから選択される。特定な実施形態における一つ以上の分泌シナプス小胞カーゴ分子は、クロモグラニンＢ、プロエンケファリンＡ、神経分泌ＶＧＦ及びクラステリンからなるグループから選択される。
【００３０】
特定な実施形態における試料は、ＣＳＦ、血液、尿または組織試料からなる。特定な実施形態における試料は、複数の時点で採集される。
【００３１】
更なる実施形態においては、本発明は、脳内の特定な位置に関する、痴呆の有無に関係のない運動神経疾患、あるいは痴呆症（アルツハイマー病）の診断方法を含む。特定な実施形態における方法は、同位元素標識サブストレートが、運動神経の軸索内の一つ以上のカーゴ分子へ入るのに十分な時間、生体系へ同位元素標識サブストレートを投与するステップからなる。特定な実施形態における方法は、その生体系から複数の試料を採取するステップからなる。特定な実施形態における方法は、それら複数の試料からの、一つ以上の分泌シナプス小胞カーゴ分子内における同位体濃縮の経時変化、パターンまたは量を定量化するステップからなる。特定な実施形態における方法は、コントロール系からの試料の分泌シナプス小胞カーゴ分子内における同位体濃縮の経時変化、パターンまたは量を測定するステップからなる。特定な実施形態における方法は、生体系の単離シナプス小胞カーゴ分子内における同位体濃縮の経時変化、パターンまたは量を、コントロール生体系の同じパラメータに比較するステップからなる。特定な実施形態における方法は、運動神経または神経細胞の他の亜集団における、微小管（ＭＴ）媒介低速及び高速軸索内輸送の速度に関する薬剤の効果を判定するステップからなる。
【００３２】
特定な実施形態における痴呆の有無に関係のない運動神経疾患、あるいは痴呆症（アルツハイマー病）は、パーキンソン病（ＰＤ）、パーキンソン病痴呆（ＰＤＤ）、アルツハイマー病痴呆（ＡＤＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、進行性延髄麻痺（ＰＢＰ）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）及び脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）からなる運動神経疾患のグループから選択される。特定な実施形態における一つ以上の分泌シナプス小胞カーゴ分子は、成長因子、神経伝達物質、グリコプロテイン及び分泌酵素からなるグループから選択される。特定な実施形態における一つ以上の分泌シナプス小胞カーゴ分子は、クロモグラニンＢ、プロエンケファリンＡ、神経分泌ＶＧＦ及びクラステリンからなるグループから選択される。
【００３３】
特定な実施形態における試料は、ＣＳＦ、血液、尿または組織試料からなる。特定な実施形態における試料は、複数の時点で採集される。
【００３４】
更なる実施形態においては、本発明は、痴呆の有無に関係のない運動神経疾患、あるいは痴呆症（アルツハイマー病）の診断方法を含む。特定な実施形態における方法は、同位元素標識サブストレートが、運動神経または神経細胞の他の亜集団の軸索内の一つ以上のカーゴ分子内に入るのに十分な時間、生体系へ同位元素標識サブストレートを投与するステップからなる。特定な実施形態における方法は、その生体系から複数の試料を採取するステップからなる。特定な実施形態における方法は、それら複数の試料からの、一つ以上の分泌シナプス小胞カーゴ分子内における同位体濃縮の経時変化、パターンまたは量を定量化するステップからなる。
【００３５】
特定な実施形態における一つ以上の分泌シナプス小胞カーゴ分子は、クロモグラニンＢ、プロエンケファリンＡ、神経分泌ＶＧＦ及びクラステリンからなるグループから選択される。
【００３６】
特定な実施形態における痴呆の有無に関係のない運動神経疾患、あるいは痴呆症（アルツハイマー病）は、ＰＤ、ＰＤＤ及びＡＤＤからなるグループから選択される。特定な実施形態においては、クロモグラニンＢで富化された試料は、ＰＤまたはＰＤＤを暗示する。特定な実施形態においては、プロエンケファリンＡで富化された試料は、ＰＤＤを暗示する。特定な実施形態においては、神経分泌タンパク質ＶＧＦで富化された試料は、ＰＤＤを暗示する。特定な実施形態においては、クラステリンで富化された試料は、ＰＤＤを暗示する。特定な実施形態においては、プロエンケファリンＡ、クロモグラニンＢ、神経分泌タンパク質ＶＧＦ及びクラステリンで富化された試料は、ＰＤＤを暗示する。特定な実施形態においては、プロエンケファリンＡ、神経分泌タンパク質ＶＧＦ及びクラステリンで富化された試料は、ＡＤＤを暗示する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】図１は、同位元素標識水から選択遊離アミノ酸への標識水素（２Ｈまたは３Ｈ）交換経路を表す。一例として、二つのＮＥＡＡ（アラニン、グリシン）及びＥＡＡ（ロイシン）を示す。図１Ａにアラニン及びグリシンを示し、図１Ｂにロイシンを示す。略語：ＴＡ、トランスアミナーゼ；ＰＥＰ−ＣＫ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ；ＴＣＡＣ、トリカルボン酸サイクル；ＳＴＨＭ、セリンテトラヒドロ葉酸メチルトランスフェラーゼ。図１Ｃは、タンパク質合成のための、Ｈ２１８Ｏによる遊離アミノ酸の１８Ｏ標識を表す。
【図１Ｂ】図１は、同位元素標識水から選択遊離アミノ酸への標識水素（２Ｈまたは３Ｈ）交換経路を表す。一例として、二つのＮＥＡＡ（アラニン、グリシン）及びＥＡＡ（ロイシン）を示す。図１Ａにアラニン及びグリシンを示し、図１Ｂにロイシンを示す。略語：ＴＡ、トランスアミナーゼ；ＰＥＰ−ＣＫ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ；ＴＣＡＣ、トリカルボン酸サイクル；ＳＴＨＭ、セリンテトラヒドロ葉酸メチルトランスフェラーゼ。図１Ｃは、タンパク質合成のための、Ｈ２１８Ｏによる遊離アミノ酸の１８Ｏ標識を表す。
【図１Ｃ】図１は、同位元素標識水から選択遊離アミノ酸への標識水素（２Ｈまたは３Ｈ）交換経路を表す。一例として、二つのＮＥＡＡ（アラニン、グリシン）及びＥＡＡ（ロイシン）を示す。図１Ａにアラニン及びグリシンを示し、図１Ｂにロイシンを示す。略語：ＴＡ、トランスアミナーゼ；ＰＥＰ−ＣＫ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ；ＴＣＡＣ、トリカルボン酸サイクル；ＳＴＨＭ、セリンテトラヒドロ葉酸メチルトランスフェラーゼ。図１Ｃは、タンパク質合成のための、Ｈ２１８Ｏによる遊離アミノ酸の１８Ｏ標識を表す。
【図２】図２は、微小管ポリマー内への２Ｈ標識チュービュリン・ダイマーの組み込みを表す。
【図３】図３は、マウス脳内におけるチュービュリン・ダイマーと微小管の生体内交換を表す。（Ａ）神経細胞の微小管（ＭＴ）集団を単離するためのストラテジーの概略図。（Ｂ）抗タウ列に渡って切り離した、入力（レーン１）の抗タウ及び抗ＭＡＰ２ウエスタンブロット、タウ非関連（レーン２）及びタウ関連（レーン３）フラクションは、タウ関連ＭＴの量的キャプチャを示す。ＭＡＰ２関連ＭＴは、非結合フラクション内にある。（Ｃ）重水（２Ｈ２Ｏ）からチュービュリン・ダイマー及び異なるＭＴフラクションへの２Ｈ組み込みの動特性。マウスは、種々の時間に、体内水分中、約５％の２Ｈ２Ｏで標識し、脳を解剖した。（Ａ）でのように単離したＭＴ集団を加水分解した。ＮＣＩ−ＧＣ／ＭＳによって、アラニンのＣ−Ｈ結合への２Ｈ組み込みを測定し（平均±標準偏差、ｎ＝３）、代謝回転フラクションとして表現した（標識期間中に新しく合成されるアラニンの％）。単一指数近似曲線は、皮質におけるｔ１／２が約５から６時間、及び海馬におけるｔ１／２が約３時間であり、チュービュリン・ダイマーに対する新しいアラニンが約２０％で横ばいで、タウ−及びＭＡＰ２／ＳＴＯＰ−ＭＴ、各々に対するこの値が２分の１または３分の１であることを示す。
【図４】図４は、ＳＯＤ−Ｇ９３Ａ・ＴＧＮマウスにおける進行性軸索機能障害の進行過程にある微小管運動の測定値を表す。野生型及びＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ・ＴＧＮマウス（一群につきｎ＝３）を、各々、２Ｈ２Ｏで生後７週目（Ａ）、８．５週目（Ｂ）、及び１２．５週間目（Ｃ）に標識した。座骨神経を解剖し、精製後の特異な微小管集団（成長円錐及び軸索幹）を加水分解した。アラニンのＣ−Ｈ結合への２Ｈ組み込みを、ＮＣＩ−ＧＣ／ＭＳによって測定し、フラクション合成として表現した（標識期間中に新しく合成される％、平均±ＳＤ）。動物は、４８時間２Ｈ２Ｏで標識した（体内水分の約５％濃縮）。
【図５】図５は、野生型及びＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ・ＴＧＮマウスの歩長の測定値に基づく、歩行足跡パターンの定量分析を表す。生後７週間目では、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ・ＴＧＮマウスの歩長測定値は、野生型マウスのものと区別がつかないが、生後８．０週間目には、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ・ＴＧＮマウスは、野生型コントロール・マウスに比べ、歩長の減少を示し始める。グラフは、各週齢の群及び各測定毎、ｎ＝３マウスに対する平均±ＳＤを示す。
【図６】図６は、ノスカピン−ＭＫ８０１の組合せが、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ・ＴＧＮマウスにおける疾患の発症及び死を遅延させることを示す。単一薬剤及び二薬剤の療法を、病期の初期段階（すなわち、症状が現れる前に）開始した（７週）。ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ・ＴＧＮマウスは、週に３回、ノスカピン（０．２ｍｇ／ｋｇ体重）及び／またはＭＫ−８０１（１２ｍｇ／ｋｇ体重／日）を投与した。マウスは、腹膜内にノスカピンを、及び飲料水中にＭＫ−８０１を受けた。歩長測定中、ノスカピン−ＭＫ８０１の組合せで処置されたマウスは、いずれの化合物単独で処置されたマウスに比べ、有意に優れて行動した。ＭＫ−８０１とノスカピンの組合せは、未処置のＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ・ＴＧＮマウスと比較して、症状の発症（３２日）及び死の発現を（２１日まで）有意に遅延させた。グラフは、各週齢の群及び各測定毎、ｎ＝３マウスに対する平均±ＳＤを示す。
【図７】図７は、週齢１２．５のＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ・ＴＧＮマウスの座骨神経内の微小管亜集団における、相対活力（２Ｈ標識組み込み）に対するノスカピン−ＭＫ８０１の組合せの影響を表す。ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ・ＴＧＮマウスにおけるノスカピン−ＭＫ８０１の組合せは、無処置のマウスに比較して、微小管運動を、成長円錐において〜３５％、軸索幹において５０％減少させた。動物は、４８時間２Ｈ２Ｏで標識した。グラフは、各測定値について、ｎ＝３マウスに対する平均±ＳＤを示す。
【図８】図８は、神経細胞内における微小管集団の特異な分布を表す。
【図９】図９は、多数の異なるＮＭＤＡ受容体拮抗剤を表す。
【図１０】図１０は、ＡＬＳのＳＯＤ１マウス・モデルへの、ノスカピン−ＭＫ８０１投与の１８週間に渡る結果を表す。
【図１１Ａ】図１１は、本発明を使用することによる、第一の症状、臨床開始及び死亡に関する時間的な違いを表す。
【図１１Ｂ】図１１は、本発明を使用することによる、第一の症状、臨床開始及び死亡に関する時間的な違いを表す。
【図１１Ｃ】図１１は、本発明を使用することによる、第一の症状、臨床開始及び死亡に関する時間的な違いを表す。
【図１２】図１２は、異なる治療に対する生存の全体的な統計を表す。
【図１３】図１３は、治療を継続する、あるいは停止するのかを決定するための手段として、神経細胞微小管運動に対する影響（すなわち、本発明の方法によって採集されたデータ）を用いる新薬発見、開発及び許可（ＤＤＤＡ）プロセスを示す概略図である。
【図１４】図１４は、新薬発見プロセスにおける本発明の使用を例示する。
【図１５】図１５は、ノスカピンのみ、及び、ＭＫ８０１のみの、単独投与の結果を示す。
【図１６】図１６は、ＭＴＭＡ／ＫＭ−ＩＤ０５が、週齢１３のＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの中央神経系（ＣＮＳ）及び末梢神経系（ＰＮＳ）における過活力性微小管を強力に減少させることを示す（ｎ＝３、平均±ＳＤ）。
【図１７】図１７は、ＭＴＭＡ／ＫＭ−ＩＤ０５が、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける自発運動活性を改善し、疾患発症を遅延させたことを示す。治療は、徴候段階（生後１０週）で開始した。マウスを、歩長測定値を用いて、自発運動活性異常について評価した（ｎ＝２０、平均±ＳＤ）。
【図１８】図１８は、生後１５週目のＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける、ＭＴＭＡ／ＫＭ−ＩＤ０５での治療の神経保護性効果を表す。（Ａ）ニッスルのために染色された脊髄セクションであり、野生型（ＷＴ）無処置及び処置ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの坐骨神経のモータープール（矢じり）における運動神経を示す。（Ｂ）各実験群（平均±ＳＤ）における運動神経の生存。
【図１９】図１９は、微小管運動アッセイが、症候性ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける、新規治療薬の前臨床新薬発見のためのプラットホームとして使用されることを示す。微小管運動をＷＴ同腹仔で観察されるレベルに回復させるために、種々の薬剤の効力を比較することによって、神経保護活性を測定した。パーセント神経保護は、ＷＴ同腹仔に比較した、無処置ＳＯＤ１Ｇ９３Ａの過活力性微小管を安定させる薬剤の効力として定義した。したがって、より高い値（最高１００％）は、より高い神経保護活性を表す。治療のすべては、生後１０週の徴候段階（ｎ＝３マウス／群）で開始した。マウスは、脊髄運動神経の神経細胞コンパートメント内の微小管運動を測定するために、３週間の治療後（週齢１３）に犠牲にした（これに、すべてのコンパートメントの平均値を平均±ＳＤとして示す）。
【図２０】図２０（Ａ）五つの神経保護性候補剤に関する生存プロット及び生存の統計分析。（Ｂ）異なる薬剤に対するＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける、微小管運動対生存結果として表した、バイオマーカー予想性のグラフ（平均±ＳＤ）。
【図２１】図２１は、ＦＤＡ認可薬リルテック（商標）に比較した、ＡＬＳ−ＳＯＤ１動物実験からの選択潜在的臨床薬剤を表す。
【図２２】図２２は、ノスカピンの構造を表す。
【図２３】図２３は、２Ｈ標識チュービュリンのＭＴ媒介低速軸索内輸送が、通常の野生型（ＷＴ）同腹仔と比較して、遺伝子組換え症候性ＳＤＯ１Ｇ９３Ａの座骨神経運動軸索内で減少していることを表す。各データ・ポイントは、３０から３５ｍｌ／ｋｇの２Ｈ２Ｏの単一大量瞬時投与後２１日に犠牲にした、週齢１３のマウスのＬ５根及び座骨神経からの、連続的な２ｍｍセグメントを表す。しかしながら、ＭＴＭＡでの３週間に渡る治療の後、微小管運動と２Ｈ−チュービュリンの低速軸索内輸送は大いに回復するが、リルゾールでは、有意な影響は全く現れなかった。
【図２４】図２４は、図２４に示す正常運動神経対変性運動神経に関して、神経細胞シナプス小胞カーゴ分子の分泌率を測定するための動的テクニックの模範的なモデルを例示する。ゴールは、疾患の影響を受けた神経細胞における、障害性ＭＴ媒介輸送の特異なリアルタイム指標を提供することである。ＭＴに基づく輸送系は、主要な細胞骨格系の一つであり、それに沿ってキネシン及びダイニン等のモーター・タンパク質が、力を発生させ、多くの細胞構成要素（例えば、シナプスの小胞）の通行を駆動する。ＭＴ媒介軸索内輸送は、主要な神経細胞の伝達及び輸送網であり、分泌小胞カーゴ、例えば、成長因子、神経伝達物質、酵素及びグリコプロテイン等のための経路として機能する。ここでテストする基本的なストラテジーは、ＭＴ活力に障害が発生すると、輸送されてから分泌される２Ｈ標識小胞「カーゴ」の比率（すなわち、細胞質体内での合成から、シナプスからの放出までの時間）が、ＭＴ輸送系による影響を受けるため、ＣＳＦの収集によって生体内で測定可能である、ということである。重水（２Ｈ２Ｏ）のパルス投与後、ＭＴ媒介高速軸索内輸送は、ＣＳＦ内への遅延動特性の出現、及び同時に、脊髄運動神経における、変性運動神経内の２Ｈ標識小胞カーゴ分子の保持が生じるため、遅くなる。
【図２５】図２５は、（Ａ）（ＡＬＳの動物モデルを表す）遺伝子組換えＳＯＤ・Ｇ９３Ａマウスは、運動神経内の分泌分子を標識するために、重水（２Ｈ２Ｏ）が与えられる（合計ｎ＝３０マウス）ことを表す。１６０ｎｍ小胞からなり、ＭＴ媒介軸索内輸送に基づく最高速移動輸送物質は、トランスゴルジ網（ＴＧＮ）から形質膜（軸索終末）へ、約２５０ｍｍ／日、すなわち約３μｍ／ｓの速度を持つと報告されている。したがって、小胞は、約１．２日で、３ｃｍの軸索の細胞体から終末へ移動すると予想される（１ｍの軸索を持つヒト被験者においては、これは、約４から５日かかるであろう）。一連の時点（２４時間、４８時間、７２時間、５日及び１０日）で、マウス（ｎ＝６／時点）から、ＣＳＦ（５から７マイクロリットル／マウス）及びプラズマ（１００マイクロリットル／マウス）を採集する。運動神経分泌小胞成長因子（例えばニューレグリン−１［ＮｕｅＲ−１］）及びグリコプロテイン・クロモグラニンＢ［Ｃｈｒ−Ｂ］を、市販の抗体を使用して、免疫沈降によってＣＳＦから単離する。（Ｂ）３０から３５ｍｌ／ｋｇの２Ｈ２Ｏの腹腔内パルス投与後、標識後２４時間、４８時間及び７２時間、５日及び１０日に、週齢１３の野生型（ＷＴ）及び症候性ＳＯＤ１・Ｇ９３ＡマウスからＣＳＦを採集した。ＣＳＦ試料は、第一に、プロテインＡ／Ｇビーズを用いて、ＩｇＧ免疫枯渇させてから、ニューレグリン−１抗体ビーズへの逐次結合によって分別した。溶出液は、１６時間１１０℃において、６ＮのＨＣｌで処置することによって加水分解した。タンパク質由来のアミノ酸は、ペンタフルオロベンジル誘導体へ誘導体化させ、ニューレグリン−１から解放されたアラニン内への２Ｈ組み込みを、ＧＣ／ＭＳによって測定した。同じプロトコルを用いて、グリコプロテイン・クロモグラニン−Ｂ［Ｃｈｒ−Ｂ］は、クロモグラニン−Ｂ［Ｃｈｒ−Ｂ］抗体への逐次結合によって、ニューレグリン−１［ＮｅｕＲ−１］非結合物質からキャプチャする。（Ｃ）経時変化は、週齢１３の通常の野生型（ＷＴ）及び遺伝子組換え症候性ＳＯＤ１Ｇ９３ＡマウスにおけるＣＳＦニューレグリン−１［ＮｅｕＲ−１］及びクロモグラニン−Ｂ［Ｃｈｒ−Ｂ］内へ２Ｈ標識の出現を示す。ＣＳＦ、血液及び／または尿からの単離後の分泌タンパク質（ニューレグリン−１［ＮｅｕＲ−１］及びクロモグラニンＢ［Ｃｈｒ−Ｂ］）は、１６時間１１０℃において、６ＮのＨＣｌで処置することによって加水分解する。他に詳細に説明するように、タンパク質由来のアミノ酸は、ペンタフルオロベンジル誘導体へ誘導体化させ、２Ｈ２Ｏから誘導体化アラニンへの２Ｈ組み込みを、ＧＣ／ＭＳによって測定する。［以下の各文献は参照によって本文に援用される。Ｆａｎａｒａ，Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｔａｂｌｅ  ｉｓｏｔｏｐｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｈｅａｖｙ  ｗａｔｅｒ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔａｘａｎｅｓ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，４９９４０−４９９４７（２００４）；Ｆａｎａｒａ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒｄｙｎａｍｉｃ  ｍｉｃｒ���ｔｕｂｕｌｅ  ｉｓ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ＡＬＳ．    Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２，２３４６５−２３４７２，（２００７），Ｆａｎａｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ａｘｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１２２，３１５９−３１６９（２０１２）］。２Ｈ濃縮は、アラニン誘導体の（Ｍ＋１）質量アイソトポマーの天然存在度に対する増加パーセントとして計算する。これらの結果は、遺伝子組換えＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスが、ＭＴ媒介高速軸索内輸送の緩徐化を示すモデルと一貫している。
【図２６】図２６は、通常の野生型（ＷＴ）及び遺伝子組換え症候性ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける脊髄腰部運動神経からの、シナプス小胞を含むニューレグリン−１［ＮｅｕＲ−１］及びクロモグラニン−Ｂ［Ｃｈｒ−Ｂ］のＭＴ輸送媒介分泌率を測定するためのパルス２Ｈ２Ｏ標識方法を示す。（Ａ）シナプス小胞は、シナプス小胞単離キット（シグマ）を用いて、脊髄腰部から単離した。抗シナプトフィジン抗体を使用する免疫ブロット分析は、最初に、濃縮シナプス小胞フラクションの存在を調べ、濃縮ステップを確認するために使用した。抗シナプトフィジン抗体には、小胞膜結合タンパク質シナプトフィジンに対する特異性がある［Ｇｉｎｇｅｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎａｐｔｏｐｈａｓｙｎ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｃｈａｎｎｅｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，８３，３２２３−３２２９，（２００２）、これは、参照によって本文に援用される］。（Ｂ）３０から３５ｍｌ／ｋｇの２Ｈ２Ｏの腹腔内パルス投与後、標識後２４、４８及び７２時間に、週齢１３の野生型（ＷＴ）及び症候性ＳＯＤ１・Ｇ９３Ａマウスから脊髄腰部を採集した（ｎ＝３、平均±ＳＤ）。脊髄腰部からの濃縮シナプス小胞フラクションは、ニューレグリン−１抗体ビーズへの逐次結合によって分別した。溶出液は、１６時間１１０℃において、６ＮのＨＣｌで処置することによって加水分解した。タンパク質由来のアミノ酸は、ペンタフルオロベンジル誘導体へ誘導体化させ、ニューレグリン−１から解放されたアラニン内への２Ｈ組み込みを、ＧＣ／ＭＳによって測定した。同じプロトコルを用いて、グリコプロテイン・クロモグラニン−Ｂ［Ｃｈｒ−Ｂ］は、クロモグラニン−Ｂ［Ｃｈｒ−Ｂ］抗体への逐次結合によって、ニューレグリン−１［ＮｅｕＲ−１］非結合物質からキャプチャする。経時変化は、週齢１３の野生型（ＷＴ）及び遺伝子組換え症候性ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの脊髄腰部からの、シナプス小胞を含む２Ｈ標識ニューレグリン−１［ＮｅｕＲ−１］及び２Ｈ標識クロモグラニン−Ｂ［Ｃｈｒ−Ｂ］の貯留動特性を示す。これらの結果は、同じカーゴ分子２Ｈ標識ニューレグリン−１［ＮｅｕＲ−１］及び２Ｈ標識クロモグラニン−Ｂ［Ｃｈｒ−Ｂ］の、ＣＳＦ内への出現動特性における遅延と一貫している。これらのデータは、遺伝子組換えＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスが、ＭＴ媒介高速軸索内輸送の緩徐化を示すことを確証する。
【図２７】図２７は、ＭＴＭＡノスカピンでの処置後の、シナプス小胞を含む２Ｈ標識ニューレグリン−１［ＮｅｕＲ−１］及び２Ｈ標識クロモグラニン−Ｂ［Ｃｈｒ−Ｂ］の正規化ＭＴ媒介高速軸索内輸送速度を表す。ＭＴＭＡノスカピン（１００ｍｇ／ｋｇ／ｄ及び２００ｍｇ／ｋｇ／ｄ）での３週間の処置後、３０から３５ｍｌ／ｋｇの２Ｈ２Ｏ・ＣＳＦの腹腔内パルス投与を行い、週齢１３の野生型（ＷＴ）及び症候性ＳＯＤ１・Ｇ９３Ａマウスから、各々、２４時間、４８時間及び７２時間にＣＳＦ及び脊髄腰部を採集した。ＣＳＦ分泌率と、シナプス小胞を含む２Ｈ標識ニューレグリン−１［ＮｅｕＲ−１］または２Ｈ標識クロモグラニン−Ｂ［Ｃｈｒ−Ｂ］の神経細胞貯留動特性は、上記のように測定した（図２３及び図２４）。これらの結果は、遺伝子組換えＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスが高速軸索内輸送の緩徐化を示す、及びノスカピンが、遺伝子組換えＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおけるこの遅延高速軸索内輸送を改善するモデルと一貫している。薬剤の神経保護作用は、経時変化、すなわち、採取された体液または組織内の標識分泌シナプス小胞「カーゴ」分子の出現の程度またはパターンを正常化するそれら薬剤の能力を比較することによって評価される。
【図２８】図２８は、パーキンソン病（ＰＤ）の二つの前臨床モデルにおける、変更された微小管（ＭＴ）代謝回転の具体例を表す。（Ａ）（週齢８のＣ５７ｂｌ／６マウスが、１日に４回２時間間隔で、２０ｍｇ／ｋｇを注射された）急性ＭＰＴＰ中毒ＰＤモデルは、最後の（第四）ＭＰＴＰ注入後３及び７日の線条体及び黒質内に、過活力性のタウ関連ＭＴ及び低温安定（ＣＳ）ＭＴを示す（群につきｎ＝４、週齢８のオス、平均±ＳＤ、＊Ｐ＜０．００１）。（Ｂ）生体内ＭＴ活力は、遺伝子組換えアルファーシヌクレインＡ５３Ｔ・ＰＤマウス（−／−／ＳＮＣＡＡ５３Ｔ）における、病期の発症前（４及び１０ヵ月）及び症候（１５ヵ月）期に、黒質及び線条体内で測定した。タウ関連ＭＴ及び低温安定（ＣＳ）ＭＴは、発症前のこれらの健康な状態で並外れた活力があり、病気の進行と共に運動は増加し続けた（群につきｎ＝３、平均±ＳＤ、＊Ｐ＜０．００１）。
【図２９】図２９は、ＭＴＭＡノスカピンで処置後のＭＰＴＰ注入ＰＤマウス・モデルにおける、症状の後退との、微小管（ＭＴ）代謝回転の正規化相関を表す。（Ａ）ノスカピンでの処置は、過活力性ＭＴを減少させた（群につきｎ＝４、週齢８のオス、平均±ＳＤ）。ノスカピンは、最後のＭＰＴＰ注入後７日に投与した。治療は、１０日間行われ、治療の最終日（第四のＭＰＴＰ注入後１７日）に、一パルスの２Ｈ２Ｏ標識を投与した。（Ｂ及びＣ）ノスカピンでの治療は、ＭＰＴＰ注入マウスにおける症状を後退させる。ノスカピンは、最後のＭＰＴＰ注入後７日に投与した。治療は、１０日間行われ、治療の最終日（第四のＭＰＴＰ注入後１７日）に、一パルスの２Ｈ２Ｏ標識を投与した。神経筋強度は、握力試験（Ｂ）及び格子吊り試験（Ｃ）を用いて測定した。握力試験は、前足による引きの張力ピーク（グラム単位の力）を測定した。その試験は、最後（第四）のＭＰＴＰ注入の１日前と、注入後（０日目）の１、２、３、４、５、７及び１７日に実行した（各時点につきオスで、ｎ＝１０）。吊り試験は、最後（第四）のＭＰＴＰ注入後１７日に実行した。成功パーセンテージを、吊り下がり最長時間／３００秒Ｘ１００として記録した（各時点につきオスで、ｎ＝１０）。
【図３０】図３０は、症候性ＡＬＳ、ＰＤ及びＨＤ前臨床モデルにおける神経細胞カーゴ・タンパク質輸送速度の差別的な遅延を表す。（Ａ）アミロイド前駆体タンパク質（ｓＡＰＰα）の２Ｈ−クロモグラニン−Ｂ［Ｃｈｒ−Ｂ］、２Ｈ−ニューレグリン−１［ＮｅｕＲ−１］及び２Ｈ−分泌非アミロイド形成Ｎ末端フラグメントの出現、Ｔｍａｘ及び消滅時間における遅延は、同齢野生型コントロールに比べ、症候性ＡＬＳ・ＳＯＤ１Ｇ９３ＡマウスのＣＳＦで、観察された（各時点につきｎ＝１０マウスで、二重に）。２Ｈ−アルファ・シヌクレイン（αＳｙｎ）のＣＳＦ分泌動特性には、同齢野生型コントロールに比較して、変化がなかった。（Ｂ）２Ｈ−Ｃｈｒ−Ｂ、２Ｈ−ｓＡＰＰα及び２Ｈ−αＳｙｎの出現、Ｔｍａｘ及び消滅時間における遅延は、同齢野生型コントロールに比べ、症候性ＰＤ・ＭＰＴＰ注入マウスからのＣＳＦで、観察された（各時点につきｎ＝１０マウスで、二重に）。２Ｈ−ＮｅｕＲ−１のＣＳＦ分泌動特性は、同齢野生型コントロールに比べ、変わらなかった。（Ｃ）２Ｈ−ｓＡＰＰα及び２Ｈ−ＮｅｕＲ−１の出現、Ｔｍａｘ及び消滅時間における遅延は、同齢野生型コントロールに比べ、症候性ＨＤ・Ｒ６／２マウスのＣＳＦで、観察された（各時点につきｎ＝１０マウスで、二重に）。２Ｈ−Ｃｈｒ−Ｂ及び２Ｈ−αＳｙｎのＣＳＦ分泌動特性は、同齢野生型コントロールに比べ、変わらなかった。
【図３１】図３１は、ＭＴＭＡノスカピンでの処置後の、ＡＬＳ及びＰＤ前臨床モデルの両方における神経細胞カーゴ・タンパク質の正規化輸送速度を表す。（Ａ）ノスカピンまたはリルゾールで３週間処置した後の症候性ＡＬＳ・ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける２Ｈ−Ｃｈｒ−Ｂ、２Ｈ−ＮｅｕＲ−１、２Ｈ−αＳｙｎ及び２Ｈ−ｓＡＰＰαのＣＳＦに基づく分泌動特性（出現、Ｔｍａｘ及び消滅）（各時点につきｎ＝１０マウスで、二重に）。ノスカピンは、同齢野生型コントロールのＣＳＦ内で観察されるレベルへ、症候性ＡＬＳ・ＳＯＤ１Ｇ９３Ａにおける２Ｈ−Ｃｈｒ−Ｂ、２Ｈ−ＮｅｕＲ−１及び２Ｈ−ｓＡＰＰαの輸送速度を正常化したが、リルゾールの効果は、非常に少ないものであった。２Ｈ−αＳｙｎの通常の動特性は、ノスカピン治療によって悪影響を受けることはなかった（＊Ｐ＜０．００１）。（Ｂ）ノスカピンでの治療は、症候性ＰＤ・ＭＰＴＰ注入マウスにおける２Ｈ−Ｃｈｒ−Ｂ、２Ｈ−ｓＡＰＰα及び２Ｈ−αＳｙｎの分泌動態を正常化した（各時点につきｎ＝１０マウスで、二重に）。２Ｈ−ＮｅｕＲ−１の通常の動特性は、ノスカピン治療によって悪影響を受けることはなかった（＊Ｐ＜０．００１）。ノスカピンは、最後のＭＰＴＰ注入後７日に投与し、治療は１０日間行った。一パルスの２Ｈ２Ｏ標識は、治療の最終日（第四最終ＭＰＴＰ注入後１７日）に投与した。
【図３２】図３２は、パーキンソン病の患者（ＰＤ）のＣＳＦ内での、神経細胞カーゴ・タンパク質の輸送速度における差別的な遅延を表す。（Ａ）コントロール非ＰＤボランティア及びＰＤ対象者におけるプラズマ体内水分２Ｈ濃縮の減少である。体内２Ｈ２Ｏ濃縮は、７日目にピークに達し、それから約７日の半減期で減衰した。これは、ヒトにおける体内水分の既知の代謝回転率に一貫していた。（Ｂ）２Ｈ２Ｏの経口投与を開始した後（７日間の標識期間中）、１人のＰＤ患者（ＰＤ６０８４）に対して、３、９、２１及び３８日目に）４回の腰椎穿刺（ＬＰ）を実施した。１１人のＰＤ対象者に対して、（１５、２１、２２または２３日目に）単一ＬＰを実施した。６人のコントロール・ボランティアに比較して、ＰＤ対象者からＣＳＦ内には、神経細胞２Ｈ−Ｃｈｒ−Ｂ、２Ｈ−αＳｙｎ及び２Ｈ−ｓＡＰＰαの出現時間に遅延が観察されたが、２Ｈ−ＮｅｕＲ−１に対する遅延はなかった（平均±ＳＤ、反復試料準備及び分析の技術的な複製によって生成）。実線及び破線は、各々、コントロール及びＰＤボランティアのデータに対する近似曲線を表す。
【図３３】図３３は、ＣＳＦ内の放出カーゴ・タンパク質の輸送活力に関するモデル及び動態学的解釈を例示する。（Ａ）主に生成される神経細胞の細胞体から、ＣＳＦ中へ放出される神経終末へ、分泌移動を行うことになる新しく合成されたカーゴ・タンパク質である。ＭＴに基づく輸送動特性は、生体内代謝標識後の、ＣＳＦ中への新合成２Ｈ標識神経細胞カーゴ・タンパク質の出現及び消滅のタイミングに基づく。２Ｈ−Ｃｈｒ−Ｂ及び２Ｈ−ＮｅｕＲ−１のＣＳＦ内への出現と、それからの消滅の動特性に関する、コントロール及びＰＤ対象者間の違いをまとめる。実線及び破線は、各々、コントロール及びＰＤボランティアのデータに対する近似曲線を表す。（Ｂ）２Ｈ標識カーゴ・タンパク質のＣＳＦの出現とそれからの消滅の遅延動特性は、ＣＳＦタンパク質濃度には関係がなかった。
【図３４】図３４は、パーキンソン病の診断のための、クロモグラニンＢ輸送動特性の識別特性を例示する。同じ一団（パーキンソン病痴呆）と、一団（早期アルツハイマー病）とを分離させるための比較。パーキンソン病（ＰＤ）及びパーキンソン病痴呆（ＰＤＤ）対アルツハイマー病（ＡＤ）の患者における選択カーゴ・タンパク質のＣＳＦに基づく軸索内輸送動特性を変更する。選択カーゴ・タンパク質クロモグラニンＢの軸索内輸送欠乏の動特性は、２Ｈ２Ｏ標識後のＣＳＦ採取時（Ｘ軸）に、ＡＤ及び健常コントロール対象者に比較した、ＰＤ患者におけるＣＳＦ中への出現遅延の増加として示される（「誕生日」からの遅れ、Ｙ軸）。認知機能障害に対する以下の臨床診断検査、ａ）ＰＤＤにおける軽症認知障害（ＭＣＩ）をモニターするための、ＭｏＣＡ（モントリオール認知評価）試験、及びｂ）ＡＤにおける進行型認知機能障害をモニターするための、ＭＭＳＥ（ミニメンタルステート検査）試験を実行した。
【図３５】図３５は、（ＡＤに比較した）パーキンソン病痴呆の診断のための、プロエンケファリンＡ輸送動特性の識別特性を例示する。パーキンソン病痴呆（ＰＤＤ）及びアルツハイマー病（ＡＤ）対パーキンソン病（ＰＤ）患者における、選択カーゴ・タンパク質のＣＳＦに基づく軸索内輸送動特性を修正する。選択カーゴ・タンパク質プロエンケファリンＡの軸索内輸送欠乏の動特性は、２Ｈ２Ｏ標識後のＣＳＦ採取時（Ｘ軸）に、痴呆のないＰＤ及び健常コントロール対象者に比較した、痴呆を伴うＰＤ及びＡＤにおけるＣＳＦ中への出現遅延の増加として示される（「誕生日」からの遅れ、Ｙ軸）。認知機能障害に対する以下の臨床診断検査、ａ）ＰＤＤにおける軽症認知障害（ＭＣＩ）をモニターするための、ＭｏＣＡ（モントリオール認知評価）試験、及びｂ）ＡＤにおける進行型認知機能障害をモニターするための、ＭＭＳＥ（ミニメンタルステート検査）試験を実行した。
【図３６】図３６は、（ＡＤと比較した）パーキンソン病痴呆の診断のための、神経分泌タンパク質ＶＧＦ輸送動特性の識別特性を例示する。パーキンソン病痴呆（ＰＤＤ）及びアルツハイマー病（ＡＤ）対パーキンソン病（ＰＤ）患者における、選択カーゴ・タンパク質のＣＳＦに基づく軸索内輸送動特性を変更する。選択カーゴ・タンパク質、神経分泌タンパク質ＶＧＦの軸索内輸送欠乏の動特性は、２Ｈ２Ｏ標識後のＣＳＦ採取時（Ｘ軸）に、痴呆のないＰＤ及び健常コントロール対象者に比較した、痴呆を伴うＰＤ及びＡＤにおけるＣＳＦ中への出現遅延の増加として示される（「誕生日」からの遅れ、Ｙ軸）。認知機能障害に対する以下の臨床診断検査、ａ）ＰＤＤにおける軽症認知障害（ＭＣＩ）をモニターするための、ＭｏＣＡ（モントリオール認知評価）試験、及びｂ）ＡＤにおける進行型認知機能障害をモニターするための、ＭＭＳＥ（ミニメンタルステート検査）試験を実行した。
【図３７】図３７は、（ＡＤと比較した）パーキンソン病痴呆の診断のための、クラステリン軸索内輸送動特性の識別特性を例示する。パーキンソン病痴呆（ＰＤＤ）及びアルツハイマー病（ＡＤ）対パーキンソン病（ＰＤ）患者における、選択カーゴ・タンパク質のＣＳＦに基づく軸索内輸送動特性を変更する。選択カーゴ・タンパク質クラステリンの軸索内輸送欠乏の動特性は、２Ｈ２Ｏ標識後のＣＳＦ採取時（Ｘ軸）に、痴呆のないＰＤ及び健常コントロール対象者に比較した、痴呆を伴うＰＤ及びＡＤにおけるＣＳＦ中への出現遅延の増加として示される（「誕生日」からの遅れ、Ｙ軸）。認知機能障害に対する以下の臨床診断検査、ａ）ＰＤＤにおける軽症認知障害（ＭＣＩ）をモニターするための、ＭｏＣＡ（モントリオール認知評価）試験、及びｂ）ＡＤにおける進行型認知機能障害をモニターするための、ＭＭＳＥ（ミニメンタルステート検査）試験を実行した。
【図３８】図３８は、アルツハイマー病と比較させた、パーキンソン病及びパーキンソン病痴呆の診断バイオマーカーをリストする表で、疾患特定動特性識別特性に対する選択カーゴ・タンパク質の輸送速度の遅延差である。アルツハイマー病（ＡＤ）患者に比較して、パーキンソン病（ＰＤ）及びパーキンソン病痴呆（ＰＤＤ）における特異な神経細胞の亜集団内に高度に発現される選択カーゴ・タンパク質のＣＳＦに基づく軸索内輸送動特性を変更する。
【図３９】図３９は、パーキンソン病（ＰＤ）及びパーキンソン病痴呆（ＰＤＤ）の診断バイオマーカーをまとめるベン図である。選択カーゴ・タンパク質の変更ＣＳＦに基づく軸索内輸送動特性は、アルツハイマー病（ＡＤ、合計６）患者から、パーキンソン病（ＰＤ）及びパーキンソン病痴呆（ＰＤＤ、５ＰＤ中の３）を区別する。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
運動神経細胞、運動神経疾患、痴呆を伴う運動神経疾患の生化学及び細胞生物学  
長さが細胞体直径の数桁倍に到達可能な、軸索樹状突起間プロセスの存在を特徴とする神経細胞の高度に非対称な形態構造が、そのようなプロセスを維持する細胞骨格の能力、また、非常に長い距離に渡って、細胞小器官、小胞またはタンパク質サブユニット及びコンプレックス（「カーゴ」）の輸送を支持する細胞骨格の能力によって判定される。主要な細胞骨格系の一つは、微小管に基づく輸送系であり、これに沿って、キネシン及びダイニン・モーター・タンパク質は、力を生じ、多くの細胞構成要素（例えば、シナプス小胞）の通行を推進する。微小管（ＭＴ）媒介軸索内輸送は、主な神経細胞の通信及び輸送網であり、成長因子（例えば、ニューレグリン−１［ＮｕｅＲ−１］）、神経伝達物質（例えば、アセチルコリン［Ａｃｈ］）、ニューロペプチド（例えば、プロエンケファリン）、酵素（例えば、アセチルコリンエステラーゼ［ＡＣｈＥ］）及びグリコプロテイン（例えば、クロモグラニンＢ［Ｃｈｒ−Ｂ］）を含む種々のタイプの分泌神経伝達物質のための経路として機能する。「カーゴ」分子は、それらの主要な生成部位である運動神経の細胞体から、神経終末へ移動し、そこでシナプス間隙内へ放出される。脳脊髄液（ＣＳＦ）は、神経細胞から分泌されるニューロペプチド、酵素及びグリコプロテインのための媒体である。分泌成長因子（例えば、ニューレグリン−１［ＮｕｅＲ−１］）、神経伝達物質（例えば、アセチルコリン［Ａｃｈ］）、ニューロペプチド（例えば、プロエンケファリン）、酵素（例えば、アセチルコリンエステラーゼ［ＡＣｈＥ］）及びグリコプロテイン（例えば、クロモグラニンＢ［Ｃｈｒ−Ｂ］）も放出され、血液または尿中を循環する。血液、尿または腰部ＣＳＦ内の成長因子、神経伝達物質、ニューロペプチド、酵素またはグリコプロテインの生体内動特性測定値は、ＭＴ機能の直接指数として使用してもよい。これにより、高速軸索内輸送における治療によって誘発された改善、及び神経系の分泌機能をモニタリングすることが可能である。ＡＬＳのような運動神経疾患、糖尿病性神経障害を含む種々の神経病及びパーキンソン病は、軸索内輸送障害及び分泌機能変化などの変化を共有する病状である。
【００３９】
微小管（「ＭＴ」）は、神経細胞内に豊富にあり、そこで、軸索突起（軸索及び樹状突起）の形成を促進し、安定性を与える。それらは、神経細胞の形態構造の主要な決定要素であり、軸索突起（軸索及び樹状突起）の形成を促進し、安定性を与える。（「微小管運動」として知られる）軸索微小管の組立及び分解プロセスは、神経細胞形態構造を決定し維持する能力の基礎をなす。また、神経細胞の構造安定性に必要なこのプロセスは、神経細胞内のシグナル経路をも代表する。微小管運動は、主に、微小管関連タンパク質（ＭＡＰ）によって規制されている。神経細胞のＭＡＰは、特有の極性分布を持ち、微小管の安定化において突出した役割を演ずる。
【００４０】
運動神経のような神経細胞は、神経細胞微小管の複数の特異な集団を持ち、これらは、通常、結合相手のＭＡＰによって分類される。「神経細胞微小管」は、チュービュリンのポリマーからなるタンパク質構造を意味し、生細胞内に、単独で、ペアで、トリプレットで、あるいは複数の束で発生する。「チュービュリン」は、微小管の主要なタンパク質成分を意味する。チュービュリンは、二つの球状ポリペチド、アルファ−チュービュリン及びベーターチュービュリン（α−及びβ−チュービュリン）からなるダイマーである。微小管は、ダイマー、α−及びβ−チュービュリンから組み立てられる。
【００４１】
神経細胞微小管は、異なる神経細胞コンパートメント（例えば、細胞体、樹状突起と軸索）内に、及び異なるＭＡＰ（例えば、タウ、ＭＡＰ２及びＳＴＯＰ）に関連して存在する。微小管は、神経分化、及び、遠隔シナプスへの神経伝達物質の軸索媒介長距離輸送を確立及び維持するために必要である。
【００４２】
一般に、神経細胞微小管には、主な三つの種類、（「軸索遠位」または「軸索先端」としても既知である）成長円錐微小管（「タウ−ＭＴ」としても本文及び図面で言及する）、樹枝状微小管（「ＭＡＰ−２・ＭＴ」としても本文で言及する）、及び、小丘及び軸索幹微小管（「ＳＴＯＰ−ＭＴ」としても本文及び図面で言及する）がある。総じて、用語は、各カテゴリーに結合する微小管関連タンパク質からのものである。「ＭＡＰ」または「微小管関連タンパク質」は、微小管への結合と同時に、それの機能及び／または作用を変化させるタンパク質である。したがって、例えば、成長円錐及び軸索遠位微小管のキャプチャは、タウ抗体への親和性結合を使用することによって実行される。それから、タウ非結合物質（樹枝状微小管）は、ＭＡＰ２抗体への親和性結合によってキャプチャされるため、ＭＡＰ２非結合フラクション中には、小丘及び軸索幹微小管（ＳＴＯＰ−ＭＴ）のみが残留することになる。代替的に、ＳＴＯＰ−ＭＴは、他のＭＴ亜集団に比較して特有な、寒冷温度及びミリモル濃度のＣａＣｌ２での解重合に抵抗するという特性を利用することによって、直接単離できる。
【００４３】
本文中で用いる「タウ」または「タウ・タンパク質」あるいは「タウＭＡＰ」は、脳から単離される微小管関連タンパク質（ＭＡＰ）の主要な種類である。神経細胞において、タウは、軸索成長円錐内に高度に濃縮される。タウ・タンパク質は、インヴィトロ・チュービュリン重合の核形成（イニシエーション）プロセスを促進する。タウは、脳内における動的な軸索成長円錐微小管の代謝回転あるいは組み立ての調節因子である、と知られている。化学修飾タウ・タンパク質も、アルツハイマー病に見られる神経原線維濃縮体及び糸屑状構造物の形成及び／または組成に関わるようである。
【００４４】
本文中で用いる「ＭＡＰ２」または「微小管関連タンパク質−２」は、神経細胞樹枝状微小管内に高度に濃縮される高分子微小管関連タンパク質である。特定な状況下では、ＭＡＰ２は、微小管へのチュービュリンの組み立てに必要であり、組立後の微小管を安定させ、それらの運動を規制する。
【００４５】
本文中で用いる「ＳＴＯＰ」または「安定細管限定ポリペプチド」は、神経細胞Ｃａ２＋−カルモジュリン規制微小管関連タンパク質である。ＳＴＯＰは、寒冷温度、ミリモルのカルシウムまたは薬剤によって誘発されるインヴィトロ分解に対して、際限なく微小管を安定させる。
【００４６】
「神経細胞低温安定微小管」は、薬剤及び寒冷温度の両方によって誘発される分解に対して安定な、軸索微小管の豊富な亜集団を意味する。薬剤及び寒冷温度による微小管分解に対する耐性は、主に、ＳＴＯＰとのポリマー会合による。
本発明の概要
【００４７】
本文で開示の発明は、以下のものに関する。（１）微小管運動の直接的な測定のための新規同位元素標識技術の使用による、痴呆の有無に関係のない運動神経疾患に対する新規治療標的の発見。言い換えれば、神経細胞微小管の活動性（すなわち、チュービュリン・ダイマーからの微小管に特有な亜集団の組み立て及び分解の比率）；（２）神経細胞微小管の運動は、同位元素標識技術の使用によって、生きている動物またはヒト対象者で測定できる、また、動物またはヒト対象者に身体症状の発現または神経機能の喪失が起こる前でさえも、ＡＬＳ、ＰＤ及びＨＤ等の運動神経疾患において著しく変化する、という発見；（３）ＡＬＳ、ＰＤ及びＨＤ等の運動神経疾患における神経細胞微小管の修正活動性は、限定せずに、ノスカピン、ノコダゾール、タキサン及び他の薬剤を含む特定な薬剤の投与によって調製できる、という発見。この場合の薬剤は、単独で、または、他の神経細胞系、受容体または経路を標的とする薬剤との組合せで投与される。；（４）ＡＬＳ、ＰＤ及びＨＤ等の確証または初期運動神経疾患を患う動物またはヒト対象者への、神経細胞内の微小管の運動を調整する薬剤の、単独で、あるいは薬剤の組合せでの投与は、運動神経疾患における神経機能の喪失を、著しく遅延させることができる、あるいは予防できる、という発見。これは、運動神経疾患の兆候及び症状の遅発、兆候及び症状の進行の緩徐化、及び、死の遅延（すなわち、寿命の延長）を含むため、神経保護性治療の成功を意味する。；（５）ＡＬＳ、ＰＤ及びＨＤ等の確証または初期運動神経疾患を患う動物またはヒト対象者における、神経保護性治療を提供することを意図した薬剤投与への反応においての、神経細胞微小管運動のモニタリングは、個々の対象者における、あるいは運動神経疾患を患う対象者の薬剤試験における最適治療方針について、適量、薬剤、薬剤の組合せ、療法、処置タイミング、治療期間または他の局面の識別を可能にする、という発見（すなわち、診断モニタリング）。
【００４８】
要約すると、本文で開示の発明は、以下のことを説明する。痴呆の有無に関係のない運動神経疾患に対する新規治療標的（神経細胞内の微小管の活動性の修正）；痴呆の有無に関係のない確証、初期または潜伏運動神経疾患を患う対象者における、この治療標的の活性状態の測定方法；痴呆の有無に関係のない運動神経疾患を患っている対象者における神経細胞微小管運動を調整する薬剤の発見；運動神経疾患を患っている対象者に対して、単独で、あるいは組合せで、そのような薬剤を投与することが、症状の遅延及び寿命の延長を含む著しい神経保護性治療を提供できる、という発見；運動神経疾患を患う対象者における神経細胞微小管運動の、治療的処置への反応のモニタリングは、個々の対象者に対する、または、薬剤試験に対する薬剤療法及び治療方針の最適化のための診断モニタリングを可能にする、という発見。
【００４９】
ＡＬＳ及びＰＤにおける神経保護ストラテジーの使用は、相当なアピールを持つ。しかし、これまで、このアプローチには、ＡＬＳ及びＰＤのリスクがある患者の識別手段の欠如、前臨床疾患活性を反映する実験マーカーの欠如、実証神経保護剤の欠如、及び治療の最適タイミング、用量または療法を認知不能という、固有の問題があった。散発性及び家族性ＡＬＳ及びＰＤのほとんどのタイプに対する特異性生化学マーカーの欠如は、また、リスクのある個人の前臨床的識別を排除していた。本発明は、ＡＬＳ（ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ・ＴＧＮマウス）及びＰＤ（ＭＴＰ注入及び遺伝子組換えアルファーシヌクレインＡ５３Ｔマウス）の確立動物モデルにおける、異常な微小管運動の生化学的測定を開示する。これは、疾患の真の生化学的発症が、臨床的欠乏の進展に先行することを、初めて証明した。したがって、神経細胞微小管運動の測定は、神経細胞の死につながる最終的な種々症状を予防する神経保護性化合物の使用のための「治療の窓」を提供する可能性がある。ＡＬＳ及びＰＤ等の運動神経疾患の発症には、多因子の病原性下流経路が関わっているので、疾病進行速度を遅らせて余命を延ばすためには、組合せのアプローチが必要な場合もある。
【００５０】
本発明は、ＡＬＳ及びＰＤ等の運動神経疾患では神経細胞微小管運動に著しい変化があるため、小丘及び軸索幹（構造的）微小管の微小管運動を調整することによって、初期、確証または潜伏運動神経疾患を患う対象者における運動神経細胞機能の喪失を最小にできる、という発見に関する。これは、微小管、運動神経細胞及び運動神経疾患を調整する効力に関して、痴呆の有無に関係のない運動神経疾患の治療に用いるための組成物、また、（例えば、診断モニタリングを介しての）候補剤及び最適な治療法のスクリーニング方法などの、種々の応用につながる。加えて、本発明は、運動神経細胞機能を維持するために、運動神経細胞生理学的に異なる箇所に作用することによって相乗効果を得る複数の組成物を用いる、運動神経細胞機能及び疾患の調整に関する。
【００５１】
したがって、本発明は、また、運動神経細胞内の微小管運動を調整する効力のある組成物、及び、そのような候補剤のスクリーニング方法に関する。加えて、本発明は、運動神経疾患を治療、寛解、あるいは予防する組成物、単一化合物と化合物の組合せとの両方を提供する。
【００５２】
本発明は、運動神経疾患を患っている動物またはヒト対象者の末梢神経内に存在する、大きく伸長して安定な微小管ポリマーの組立て及び分解の比率を、初めて測定することに基づいている。理論に束縛されることなく、いくつかの運動神経疾患は、栄養素及び他の重要な要素の軸索突起に沿った輸送を担う重要な細胞内細胞骨格構成要素の機能障害から、発症するように見える。本文に開示の発見は、運動神経疾患を患う動物の末梢神経における神経細胞微小管運動を直接的に測定するための新規同位元素質量分析技術の使用によるもので、軸索突起内の微小管ポリマーの著しく上昇した代謝回転（すなわち、劣化及び再生の一定な状態）に関する。この上昇した代謝回転は、（軸索突起それ自体の安定性を維持するのに必要な栄養素及び他の成分を含む）分子の流れを混乱させるように見える。したがって、出願人は、新しい基本メカニズムの発見を本文に開示する。それは、運動神経疾患を患っている対象者における、軸索突起（または「軸索投射」）の安定性を制御する微小管の代謝回転の上昇であり、軸索不安定性、その結果として生じる運動神経疾患に関連する症状も含んで、初めて詳細に記録される。
【００５３】
通常のマウスにおいては、座骨神経内の構造微小管は、チュービュリン・ダイマーからの、非常に低い速度の組立て及び分解、すなわち代謝回転を示す（図１及び図３を参照）。対照的に、ＳＯＤマウスにおける座骨神経内の同じ構造微小管は、極端な不安定性または極端な動態を示す（図４を参照）。重要な点は、この座骨神経内の構造微小管の安定性の喪失が、これらの動物で行動兆候または症状が観察可能になる前に存在する、ということである。このことは、疾患発病学的に、二次的因子と言うよりも、むしろ一次的なものであることを確証させる。したがって、ＳＯＤマウスの運動神経細胞内の軸索内輸送の後の喪失に至る前に先立って発生する、ＡＬＳの軸索機能障害は、これらの神経細胞内で通常、軸索微小管ポリマーを安定に維持するコントロール・プロセスの失敗によるように思える。
【００５４】
したがって、組立て及び分解の速度（すなわち、「運動」）を規制することによって微小管を調整する薬剤は、ＡＬＳ、ＰＤ及び他の運動神経疾患の中心的な病因を解決するかもしれない。微小管調節剤は既知であるが、ＡＬＳ、パーキンソン病及び糖尿病性神経障害などの運動神経疾患に対する潜在的治療用途としては、認められていない。出願人による、ＡＬＳのＳＯＤ遺伝子導入マウス・モデルにおける動特性に基づく軸索機能障害の識別は、微小管運動の潜在的変調剤に対して、潜在的に新しい治療的役割を付与した。
【００５５】
微小管系との相互作用が既知である薬剤の、単独で、あるいは他の神経細胞受容体、経路または系に作用する薬剤との組合せでの、生きている動物への、その後の投与結果は、微小管運動が、運動神経疾患に対する新しい基本的な治療標的である、という発見を確証させた。特に、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ・ＴＧＮマウスへのノスカピン−ＭＫ８０１の組合せ投与は、疾患症状の発症を遅らせ生存期間を延ばした（図６を参照）ばかりでなく、正常状態の方へ神経細胞微小管運動を減少させた（図７を参照）。異常な微小管運動の部分的な正常化（生化学的測定）と、臨床疾患の部分的な改善（機能神経学的結果）との間の相関関係は、微小管運動と運動神経疾患との原因論的な関連をサポートする。また、更なる治療的改善（すなわち、変化した微小管運動を完全に正常化する薬剤が識別可能かどうか）の余地を示唆する。
【００５６】
本文に薬剤活性のバイオマーカーとして概説される、ＳＯＤ遺伝子導入マウスの座骨神経内の微小管運動のアッセイの使用は、また、ＡＬＳ、パーキンソン病及び糖尿病性神経障害を含む運動神経疾患に対する新しい種類の治療の迅速な最適化をも可能にする。薬剤の一般的なスクリーニングまたは特殊な種類のスクリーニングを用いることで、症状の診断を、あるいは死を待つよりも、最適投薬量、化合物、療法などを、発症前ＳＯＤ遺伝子導入マウスで迅速に（例えば、数日あるいは数週間内に）テストできる。
【００５７】
本発明は、さらに、神経病変、または、ＡＬＳ、パーキンソン病、ハンチントン病及び糖尿病性神経障害などの運動神経疾患の患者における、微小管運動の測定方法を提供する。フェーズＩあるいはII臨床試験は、原則として、微小管運動の定量化のために、坐骨神経の神経生検を含む。したがって、ＡＬＳ等の運動神経疾患に対する確証的なバイオマーカー、すなわち、ＡＬＳ患者が共有する疾病の病原であるために、薬剤処置の標的及び薬剤有効性の測定基準となる測定可能な生化学的な異常の利用性は、ＡＬＳ（及び他の運動神経疾患）に対する種々の薬剤をテストするための、複数の特有な利点を提供する。効果のない薬剤は、貴重な臨床試験時間、資金及び患者リソースの浪費を回避するために、迅速に識別される。用量の最適化、患者の層別化及びサブグループの分析は、動特性バイオマーカーが運動神経疾患臨床試験に提供する他の用途である。
【００５８】
本発明は、さらに、別個のカーゴ分子の軸索内輸送での欠乏を、特有の神経細胞及び神経細胞亜集団の機能障害へ、また、特有の神経疾患へ関連付ける（仮説による）標的方法を提供する。特に、中枢神経系の異なる領域に分布されることが既知であるカーゴ分子を、運動神経疾患と痴呆を伴う運動神経疾患に関連させることは可能である。例として、運動機能に特殊化した神経細胞亜集団（例えば、脊髄、脳幹、運動皮質、連合野、基底神経節）内に分布及び高度に発現することが分かっているカーゴ分子（タンパク質、成長因子、神経伝達物質、ニューロペプチド、酵素またはグリコプロテイン）を選択し、ＣＳＦ内でのそれらの輸送速度の動特性を調べることによって、それら運動神経の機能状態を確認できる。他の実施例として、陳述記憶または顕在記憶に特殊化した神経細胞亜集団（例えば、中央側頭葉、間脳、海馬）、あるいは非陳述または潜在記憶に特殊化した神経細胞亜集団（例えば、線条体、新皮質、扁桃体、小脳）内に分布及び高度に発現する分子（タンパク質、成長因子、神経伝達物質、ニューロペプチド、酵素またはグリコプロテイン）を選択し、ＣＳＦ内でのそれらの輸送速度の動特性を調べることによって、本発明は、専門医が、神経細胞の細胞機能を、記憶障害に関わる中枢神経系の領域に関連付けることを可能にする。
【００５９】
本発明は、さらに、ＡＬＳ、ＰＤ、ＨＤ及び他の運動神経疾患の前臨床モデルからのＣＳＦにおける、新しいカーゴ分子（タンパク質、成長因子、神経伝達物質、ニューロペプチド、酵素またはグリコプロテイン）を発見し、それらの輸送動特性を、運動神経疾患及び痴呆を伴う運動神経疾患に冒された中枢神経系の未知の領域の機能障害へ相関させる無監督の（非仮説の、偏見のない）方法を提供する。
同位元素標識前駆体の投与
【００６０】
本発明の方法における第一のステップとして、同位元素標識前駆体が生体系へ投与される。「生体系」は、細胞、細胞系、疾患の動物モデル、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、他のペット動物、マウス、ネズミ、非ヒト霊長類及びヒトを含むが、これらに限定されるものではない。「個人」は、脊椎動物、通常、哺乳類、特にヒトである。「哺乳類」は、限定せずに、哺乳綱のいずれのメンバーをも含むことを意味する。例えば、ヒトと、チンパンジー、他の類人猿及び猿種属などの非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマ等の家畜、イヌ及びネコ等の飼いならされた哺乳類、マウス、ネズミ及びモルモット等の齧歯動物を含む実験動物である。用語は、特定の年齢や性別を意味しない。したがって、男女に関係なく、成人及び新生対象者、胎児も含むことを意図している。総じて、本文中で用いる「被験者」は、脊髄運動神経細胞微小管運動における変化に関して、及び／または運動神経疾患症状の改変に関して評価される個人である。
【００６１】
被験生体系からは、種々の生体試料が採取されるが、概して、本文に関しては、運動神経細胞試料が使用される。運動神経細胞試料は、例えば、坐骨神経または末梢神経組織、及び脳の運動皮質から試料を含むが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
分子流動率の測定における第一のステップは、生体系へ同位元素標識前駆体分子を投与することを伴う。同位元素標識前駆体分子の投与モードは、同位元素標識前駆体分子の吸収特性、及び各化合物が標的とする特異性生合成プールに応じて異なってもよい。前駆体は、生体内分析のために直接、実験動物及びヒトを含む生物に投与されてもよい。
【００６３】
通常、適切な投与モードは、生合成プール内に、及び／または少なくとも一時的な期間、そのようなプールを供給するレザバー内に、定常状態量の前駆体を生成するものである。一般的に、血管内投与または経口投与ルートが、ヒトを含む生物へ、そのような前駆体を投与するために用いられる。他の投与ルート、例えば、皮下または筋肉内投与も、オプションとして徐放性前駆体組成物と共に使用するのに適切である。注入組成物は、通常、無菌の医薬賦形剤内に調製される。同位元素標識前駆体分子を投与する経路の選択は、本技術分野の技術範囲内に該当する。
【００６４】
同位元素標識前駆体分子は、安定同位元素または放射性同位元素であってもよい。適用可能な同位元素標識は、有機系内に存在する元素の２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、３２Ｐ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、あるいは他の同位元素を含むが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
一つの実施形態における同位元素標識は、２Ｈである。
【００６６】
前駆体分子は、関心「モノマー」または「サブユニット」へ取り込める、同位元素標識を持ついずれの分子であってもよい。または、モノマーそれ自体であってもよい。同位元素標識前駆体分子を形成するために、本文で開示のすべての前駆体分子を修正する同位元素標識を使用してもよい。「同位元素標識サブストレート」は、生体系内の関心分子への取り込みが可能な、いずれの同位元素標識前駆体分子をも含む。同位元素標識サブストレートの実施例は、２Ｈ２Ｏ、３Ｈ２Ｏ、２Ｈグルコース、２Ｈ標識アミノ酸、２Ｈ標識有機分子、１３Ｃ標識有機分子、１４Ｃ標識有機分子、１３ＣＯ２、１４ＣＯ２、１５Ｎ標識有機分子及び１５ＮＨ３を含むが、これらに限定されるものではない。
【００６７】
前駆体分子全体が、一つ以上のチュービュリン・ダイマー・サブユニット内へ取り込まれてもよい。代替的に、前駆体分子の一部が、チュービュリン・ダイマー・サブユニット内へ取り込まれてもよい。
【００６８】
タンパク質前駆体分子は、本技術において既知である、いずれのタンパク質前駆体分子であってもよい。これらの前駆体分子は、ＣＯ２、ＮＨ３、グルコース、乳酸塩、Ｈ２Ｏ、アセテート及び脂肪酸を含むが、これらに限定されるものではない。
【００６９】
タンパク質の前駆体分子は、また、一つ以上のアミノ酸を含んでもよい。前駆体は、いずれのアミノ酸であってもよい。前駆体分子は、単独の、あるいは多数の重水素を入れたアミノ酸であってもよい。例えば、前駆体分子は、一つ以上の１３Ｃ−リシン、１５Ｎ−ヒスチジン、１３Ｃ−セリン、１３Ｃ−グリシン、２Ｈ−ロイシン、１５Ｎ−グリシン、１３Ｃ−ロイシン、２Ｈ５−ヒスチジン及び、いずれのジュウテリウムアミノ酸であってもよい。標識アミノ酸は、例えば、無希釈で、あるいは非標識アミノ酸で希釈されて投与されてもよい。すべての同位元素標識前駆体は、例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｓ（アンドーバー、マサチューセッツ州）から、市販のものを購入してもよい。
【００７０】
タンパク質前駆体分子は，また、翻訳後または翻訳前修正アミノ酸に対する、いずれの前駆体を含んでもよい。これらの前駆体は、グリシン、セリンまたはＨ２Ｏ等のメチル化前駆体、Ｈ２ＯまたはＯ２等のヒドロキシル化前駆体、ホスフェート、Ｈ２ＯまたはＯ２等のリン酸化前駆体、脂肪酸、アセテート、Ｈ２Ｏ、エチルアルコール、ケトン体、グルコースまたはフラクトース等のプレニル化前駆体、ＣＯ２、Ｏ２、Ｈ２Ｏまたはグルコース等のカルボキシル化前駆体、アセテート、エチルアルコール、グルコース、フラクトース、乳酸塩、アラニン、Ｈ２Ｏ、ＣＯ２またはＯ２等のアセチル化前駆体、グリコシル化前駆体、及び本技術において既知である他の翻訳後修飾を含むが、これらに限定されるものではない。
【００７１】
遊離アミノ酸内に存在する標識の程度は、実験的に判定してもよい、あるいは、アミノ酸内の標識部位の数に基づいて推定されてもよい。例えば、標識として水素同位元素が使用される場合、体内水分中の２Ｈ２Ｏに曝露中、遊離アミノ酸のＣ−Ｈ結合内に、または、より具体的にｔＲＮＡ−アミノ酸内に存在する標識が識別されてもよい。非必須アミノ酸の各々のＣ−Ｈ結合の総数は既知であり、例えば、アラニンでは４、グリシンでは２である。
【００７２】
タンパク質に対する前駆体分子は、水（例えば、重水）であってもよい。タンパク質のＯ−Ｈ及びＮ−Ｈ結合は水溶液中で不安定であるため、Ｃ−Ｈ結合の水素原子は、２Ｈ２Ｏからタンパク質合成を測定するために有用な、アミノ酸の水素原子である。そのように、２Ｈ２ＯからＯ−ＨまたはＮ−Ｈ結合への２Ｈ標識の交換は、遊離アミノ酸からのタンパク質の合成なしで発生する。Ｃ−Ｈ結合は、特異的酵素触媒性中間代謝反応中に、Ｈ２Ｏから遊離アミノ酸へ組み込まれる。したがって、２Ｈ２Ｏ投与後のタンパク結合アミノ酸のＣ−Ｈ結合内の２Ｈ標識の存在は、そのタンパク質が、２Ｈ２Ｏ曝露期間中に遊離型であったアミノ酸から構築されたこと、例えば、タンパク質が新しく合成されたことを意味する。分析的には、使用されるアミノ酸誘導体は、すべてのＣ−Ｈ結合を含まなければならないが、すべての汚染潜在性Ｎ−Ｈ及びＯ−Ｈ結合は取り除かなければならない。
【００７３】
体内水分からの水素原子（例えば、ジウテリウムまたはトリチウム）は、遊離アミノ酸へ組み込ませてもよい。標識水からの２Ｈまたは３Ｈは、中間代謝反応を介して、細胞内の遊離アミノ酸へ入ることができるが、ペプチド結合内に存在する、あるいは転移ＲＮＡに結合しているアミノ酸へ２Ｈまたは３Ｈは入ることはできない。遊離必須アミノ酸は、急速可逆性アミノ基転位反応を介して、体内水分からの単一水素原子を、α−炭素Ｃ−Ｈ結合へ組み込んでもよい。遊離非必須アミノ酸は、もちろん、非常に多くの代謝的に交換可能なＣ−Ｈ結合を含むため、新しく合成されたタンパク質内で、２Ｈ２Ｏからの、分子単位の、より高い同位体濃縮値を示すことが予期される。
【００７４】
当業者には、体内水分からの標識水素原子が、他の生化学的経路を介して、他のアミノ酸へ組み込まれてもよいことは明らかである。例えば、水からの水素原子は、クエン酸回路内の前駆体α−ケトグルタル酸の合成を介して、グルタミン酸塩へ組み込まれてもよいことは、本技術において既知である。グルタミン酸塩は、順に、グルタミン、プロリン及びアルギニンのための生化学前駆体であることが既知である。もう一つの実施例として、体内水分からの水素原子は、翻訳後修飾アミノ酸、例えば、３−メチルヒスチジン内のメチル基、ヒドロキシプロリンまたはヒドロキシリジン内のヒドロキシル基などへ組み込まれてもよい。他のアミノ酸合成経路は、当業者に既知である。
【００７５】
酸素原子（Ｈ２１８Ｏ）も、酵素触媒反応を介して、１８Ｏ２からアミノ酸へ組み込まれてもよい（ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジンまたは他の翻訳後修飾アミノ酸を含む）。例えば、アミノ酸のカルボン酸部分への酸素交換が、酵素触媒反応中に発生してもよい。アミノ酸への標識酸素の取込みは、当業者には既知である。
【００７６】
標識水からの水素及び酸素標識も、翻訳後修飾を介してアミノ酸へ組み込まれてもよい。一つの実施形態における翻訳後修飾は、翻訳後修飾前の生合成経路を介して、標識水素または酸素をすでに含んでいてもよい。もう一つの実施形態における翻訳後修飾は、翻訳後修飾ステップ（例えば、メチル化、ヒドロキシル化、リン酸化、プレニル化、硫酸化、カルボキシル化、アセチル化、グリコシル化または他の既知の翻訳後修飾）の前、あるいは後のいずれにおいても、体内水分からの遊離交換標識水素に関わる代謝誘導体からの、標識水素、酸素、炭素または窒素を組み入れてもよい。
【００７７】
対象者への投与に適切なタンパク質前駆体は、上記説明のタンパク質内に見られる標準アミノ酸に加えて、Ｈ２Ｏ、ＣＯ２、ＮＨ３及びＨＣＯ３を含むが、これらに限定されるものではない。
【００７８】
水は、タンパク質や他の生体分子の前駆体である（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．１０／２７９，３９９を参照、その全文が、参照により本文へ援用される）。そのように、標識水は、本文に教示の方法における前駆体として機能してもよい。「同位元素標識水」は、水素または酸素のいずれかの、一つ以上の特定な重同位元素で標識された水を含む。同位元素標識水の具体的な実施例は、２Ｈ２Ｏ、３Ｈ２Ｏ及びＨ２１８Ｏを含む。
【００７９】
Ｈ２Ｏの利用性は、（Ｈ２Ｏが細胞の内容物の約７０％、または＞３５モル濃度を占めるので）多分、細胞内の生合成反応を決して制限することはないが、Ｈ２Ｏからの水素及び酸素原子は、生合成経路に関わる多くの反応に化学量論的に関与する。例えば、Ｒ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ２Ｏ→Ｒ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ（脂肪酸合成）。
【００８０】
結果として、Ｈ−またはＯ−同位元素標識水の形態で提供される同位元素標識は、合成経路の一部としすなわち、急速に交換可能な、酵素触媒反応を必要としない）、または安て、生体分子へ組み込まれる。水素の取込みは、分子内の不安定な位置へ（定な位置へ（すなわち、急速に交換不可能な、酵素触媒作用を必要とする）の、二つの経路で発生可能である。酸素組み込みは、安定な位置で発生する。
【００８１】
細胞水からの生体分子内のＣ−Ｈ結合への水素組込ステップのいくつかは、生合成反応順序に明確に定義された酵素触媒ステップ中にのみ発生し、熟した最終生成分子内に入ってしまったら、不安定な（組織内の溶媒水と交換可能な）ものではない。例えば、グルコースのＣ−Ｈ結合は、溶液中での交換は不可能である。対照的に、以下のＣ−Ｈ位置の各々は、特異な酵素反応の逆転中に体内水分との交換が起こる。クレブス回路内のオキザロ酢酸／スクシナート配列、及び乳酸塩／ピルビン酸塩反応におけるＣ−１及びＣ−６；グルコース-６-リン酸／フラクトース−６−ホスフェート反応におけるＣ−２；グリセルアルデヒド−３−ホスフェート／ジヒドロキシアセトン−リン酸反応におけるＣ−３及びＣ−４；３−ホスホグリセリン酸／グリセルアルデヒド−３−ホスフェート反応及びグルコース-６-リン酸／フラクトース−６−ホスフェート反応におけるＣ−５。
【００８２】
分子の特異な非不安定な位置に共有結合で組み込まれた、水からの標識水素または酸素原子は、そのことによって、その分子の「生合成の歴史」を啓示している。すなわち、標識取込みは、細胞水中に同位元素標識水が存在していた期間中に、その分子が合成されたことを意味する。
【００８３】
これらの生体分子内の（非共有結合で関連する、あるいは交換可能な共有結合で存在する）不安定な水素は、分子の生合成の歴史を啓示しない。しかし、不安定な水素原子は、非標識水（Ｈ２Ｏ）での温置によって（すなわち、２Ｈまたは３Ｈが最初に組み込まれたと同じ非酵素性交換反応の逆転によって）、簡単に取り除くことができる。
【化１】
2016516202.tif 000003
【００８４】
結果として、生合成の歴史を反映しないが、非合成交換反応を介して組み込まれる汚染潜在性水素標識は、実践では、豊富な自然Ｈ２Ｏでの温置によって、簡単に取り除くことができる。
【００８５】
図１は、同位元素標識水から選択遊離アミノ酸への標識水素（２Ｈまたは３Ｈ）交換経路を表す。それらアミノ酸は、その後、微小管のサブユニットであるチュービュリン・ダイマーへ組み込まれる。図２は、微小管へのチュービュリン・ダイマーの組み込みを表す。図３は、神経細胞微小管集団を単離して測定する実験計画を表す。
【００８６】
生体分子への標識水素原子の組み込みを量的に測定するために、分析方法が利用できる（例えば、３Ｈに対しては、液体シンチレーション計数；２Ｈ及び１８Ｏに対しては、質量スペクトロメトリー、レーザー分光、ＮＭＲ分光法、または本技術において既知である他の方法）。同位元素標識水組み込みの理論に関する更なる議論については、参照によって本文に援用される例えば、Ｊｕｎｇａｓ  ＲＬ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  １９６８  ７：３７０８−１７を参照する。
【００８７】
標識水は、容易に購入可能である。例えば、２Ｈ２Ｏは、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｓ（アンドーバー、マサチューセッツ州）から購入してもよい。また、３Ｈ２Ｏは、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，  Ｉｎｃ．から購入してもよい。「二重水」は、一つ以上の２Ｈ同位元素が組み込まれた水に言及する。概して、２Ｈ２Ｏは非放射性があるため、放射性３Ｈ２Ｏに比べ、毒性の懸念が少ない。２Ｈ２Ｏは、例えば、全体水分に対するパーセントとして、例えば、消費全体水分の１％（例えば、一日につき３リットルの消費水に対しては、３０マイクロリットルの２Ｈ２Ｏの消費となるよう）投与してもよい。３Ｈ２Ｏを利用する場合は、当業者が容易に判定可能な無毒性量で投与する。
【００８８】
本発明の技術を用いれば、２Ｈ２Ｏの（例えば、全体水分の１から１０％が標識される）比較的高度な体内水分濃縮が、比較的安価に達成できる。この水濃縮は、毒性の証拠なしにヒト及び実験動物で、これらのレベルが数週間あるいは数ヶ月間維持されるほど比較的一定で安定である。多数の（＞１００人の）ヒト対象者でのこの所見は、２Ｈ２Ｏの高用量での前庭毒性に関する以前の懸念とは反対である。出願人の一人は、（例えば、少ない分割用量での最初の投与によって）体内水分濃縮の急速な変化が阻止される限り、２Ｈ２Ｏの高度体内水分濃縮が、毒性なしで維持できることを発見した。例えば、市販の２Ｈ２Ｏの価格が安いため、比較的に低い費用で、１から５％の範囲に濃縮を長期に渡って維持可能である（例えば、計算によれば、１０％の遊離ロイシン濃縮での２Ｈ−ロイシンの１２時間の標識によるその期間のロイシン前駆体プールにおける７から８％の濃縮に比べ、２％の２Ｈ２Ｏ濃縮での２ヵ月の標識によるアラニン前駆体プールにおける７から８％の濃縮に対するコストが低いことが分かる）。
【００８９】
Ｈ２１８Ｏの投与に対する比較的高度で比較的恒常的な体内水分濃縮も、１８Ｏ同位元素が有毒でなく重要な健康リスクを生じないため、達成可能である。
【００９０】
同位元素標識水は、連続的な同位元素標識水投与、不連続な同位元素標識水投与、または同位元素標識水投与の単一の、あるいは複数の投与を介して、投与してもよい。連続的な同位元素標識水投与においては、同位元素標識水は、個人に比較的恒常的な水濃縮を維持するのに十分な期間に渡って、個人へ投与される。連続法については、定常状態濃度を達成するのに十分な期間（例えば、ヒトで３から８週間、齧歯動物で１から２週間）、標識水が最適に投与される。
【００９１】
不連続な同位元素標識水投与においては、同位元素標識水は、１回以上、量を測定してから投与される。その後、同位元素標識水への投与は中断され、体水分プールからの同位元素標識水のウオッシュアウトを生じさせる。その時、標識解除の経時変化をモニターしてもよい。水は、生体分子内で検出可能なレベルに達するのに十分な期間、最適に投与される。
【００９２】
同位元素標識水は、本技術において既知である種々の方法で、個人または組織内へ投与されてもよい。例えば、同位元素標識水は、経口的に、非経口的に、皮下に、血管内に（例えば、静脈注入、動脈注入）、または腹膜内に投与されてもよい。２Ｈ２Ｏ及びＨ２１８Ｏは、Ｉｓｏｔｅｃ，  Ｉｎｃ．（マイアミズバーグ、オハイオ州）及びＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ，  Ｉｎｃ．（アンドーバー、マサチューセッツ州）を含む複数の販売会社から購入できる。投与される同位元素標識水の同位体含有量は、約０．００１％から約２０％の範囲に及び、生体分子の同位体含有量を測定するために使用する器具の分析感度に依存する。一つの実施形態においては、４％の２Ｈ２Ｏ飲料水が経口的に投与される。もう一つの実施形態においては、５０ｍｌの２Ｈ２Ｏが、ヒトへ経口的に投与される。
【００９３】
標識水が投与される個人は、哺乳類であってよい。一つのバリエーションでは、個人は、齧歯動物、霊長類、ハムスター、モルモット、イヌまたはブタを含む実験動物でもよいが、これらに限定されるものではない。薬剤、候補薬剤、リード薬剤、またはそれらの組合せの投与を伴うバリエーションでは、個人は、容認動物疾患モデルを含む実験動物等の哺乳類またはヒトであってもよい。食品添加物、産業的または職業的化学薬品、環境汚染物または化粧品の投与を伴うバリエーションでは、個人は、限定せずに、齧歯動物、霊長類、ハムスター、モルモット、イヌまたはブタ等の実験動物であってもよい。
一つ以上の注目標的チュービュリンあるいは微小管ポリマー分子の採取
【００９４】
本発明の方法を実践する際の一つの態様においては、タンパク質は、本技術において既知である方法によって、生体系から採取する。概して、試料は、被験者の種々の部位（例えば、脳の運動皮質、座骨神経、末梢神経）から採取可能な、運動神経細胞を含むが、座骨神経が特に有用である。
【００９５】
複数の微小管ポリマー及び／または遊離チュービュリン・ダイマー・サブユニットは、神経生物学の分野における周知の技術を用いて、生体系から得られる。一つ以上の生体試料は、神経組織等の、一つ以上の体液または組織であってよい。タンパク質は、神経細胞等の特定な細胞群、あるいは他の成長または非成長細胞から採取してもよい。タンパク質は、また、本技術において既知である標準的な生化学的方法を用いて、生体試料から採取され、オプションとして、部分的に精製あるいは単離されてもよい。より詳細には、異なる微小管フラクション（タウ−ＭＴ、ＳＴＯＰ−ＭＴ等）は、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２８０６９に概説されているように単離される。
【００９６】
生物学的試料採集の頻度は、異なる要因に応じて、変更できる。そのような要因は、試料採集の容易さ及び安全性、タンパク質の合成及び分解あるいは除去速度、及び、細胞、動物またはヒトへ投与された治療候補剤の半減期を含むが、これらに限定されるものではない。
【００９７】
タンパク質は、アッセイ条件に応じて、一つ以上の生体試料から部分的に精製及び／または単離されてもよい。概して、微小管ポリマー及び／またはチュービュリン・ダイマー・サブユニットは、試料中に存在する他の構成要素に応じて、当業者に既知である種々の方法で単離または精製されてもよい。標準的な精製法は、電気泳動的、分子的、免疫学的及びクロマトグラフ的技術を含み、例えば、イオン交換、疎水性、親和性及び逆位相ＨＰＬＣクロマトグラフィー、高速性能液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、化学的抽出、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー及びクロマトフォーカシングを含む。例えば、いくつかのタンパク質は、標準抗体カラムを用いて精製されてもよい。限外濾過及び透析濾過技術も、タンパク質濃度に関連して、有用である。適切な精製技術の一般的なガイダンスについては、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  ＮＹ（１９８２）を参照する。必要な精製度は、系のアッセイ及び構成要素に応じて異なる。いくつかの例においては、精製は全く必要でない。
【００９８】
もう一つの実施形態におけるタンパク質は、加水分解されてもよい、あるいは劣化させて、より小さな分子を形成させてもよい。加水分解法は、本技術において既知である、いずれの方法をも含み、例えば、化学的加水分解（酸加水分解など）及び生化学的加水分解（ペプチダーゼ分解など）を含むが、これらに限らない。加水分解または壊変は、タンパク質の精製及び／または単離の前に、あるいはその後に実行してもよい。タンパク質は、また、従来の精製法によって、部分的に精製されてもよい、あるいはオプションとして単離されてもよい。従来の精製法は、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、及び／または、当業者に既知の、化学化合物及び／または生化学化合物を分離する他のいずれの方法をも含む。
分析
【００９９】
タンパク質の同位体濃縮は、本技術において既知である、例えば、ＮＭＲ、レーザー分光、液体シンチレーション計数、ガイガー・カウンター及び質量スペクトロメトリー等の、種々の方法によって測定できる。質量スペクトロメトリーを用いる方法については、本発明で使用可能な、複数の異なるタイプの質量スペクトロメータがある。限定せずに、例えば、ガスクロマトグラフ質量スペクトロメトリー（ＧＣ-ＭＳ）、同位体比質量スペクトロメトリー、ＧＣ同位体比ＭＳ、ＧＣ同位体比熱分解ＭＳ、液体クロマトグラフィーＭＳ、エレクトロスプレー電離ＭＳ、マトリックス支援レーザ脱離飛行時間ＭＳ、フーリエ変換イオン・サイクロトロン共鳴ＭＳ、及びサイクロイドＭＳがある。
【０１００】
質量スペクトロメータは、タンパク質などの分子を、急速に移動するガス状イオンへ転換し、それらの質量対電荷比に基づいて、分別を行う。したがって、同位元素、イオンの同位体族またはイオン・フラグメントの分布は、複数のタンパク質内の同位体濃縮を測定するのに利用可能である。
【０１０１】
通常、質量スペクトロメータは、電離手段と質量分析器を含む。本技術においては、多数の異なるタイプの質量分析器が既知である。これらは、磁気セクタ・アナライザー、エレクトロスプレー電離、四極子、イオン・トラップ、飛行時間質量分析器、及びフーリエ変換分析器を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１０２】
質量スペクトロメータは、また、多数の異なるイオン化法を含んでもよい。これらは、電子衝撃、化学的電離、及び電界イオン化等の気相電離源、また、電界脱着、高速原子衝撃、マトリックス支援レーザ脱離あるいは電離、及び表面増強レーザ脱離あるいは電離等の脱離源を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１０３】
加えて、最初に前駆体イオンを分離させ、それから気相フラグメント・イオンを分離及び測定するために、二つ以上の質量分析器が結合されてもよい（ＭＳ／ＭＳ）。これらの機器は、最初のシリーズのタンパク質のイオン・フラグメントを生成し、それから、最初のイオンの二次フラグメントを生成する。
【０１０４】
異なるイオン化法も、本技術において既知である。一つの重要な進歩は、タンパク質を含む大きな不揮発性巨大分子の電離技術の開発であった。このタイプの技術は、エレクトロスプレー電離（ＥＳＩ）及びマトリックス支援レーザ脱離を含んでいる。これらは、ＭＳが、液体クロマトグラフィー及びキャピラリーゾーン電気泳動などの、強力な試料分離導入技術との組合せで適用されることを可能にした。
【０１０５】
加えて、質量スペクトロメータは、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）及び高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の分離手段に結合することも可能である。ガスクロマトグラフィー質量スペクトロメトリー（ＧＣ／ＭＳ）においては、ガスクロマトグラフからのキャピラリーカラムは、直接質量スペクトロメータに結合するが、オプションとして、ジェット分離器を使用してもよい。そのようなアプリケーションでは、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）カラムは、混合試料ガスから試料構成要素を分離し、分離構成要素は、イオン化されて、質量スペクトロメータ内で化学的に分析される。
【０１０６】
概して、タンパク質に対するベースライン質量アイソトポマー度数分布を測定するためには、そのような試料は、同位元素標識前駆体の注入前に採取される。そのような測定は、細胞、組織または生物における、タンパク質の質量アイソトポマーの自然発生頻度を確立する一つの手段である。細胞、組織または生物が、類似環境履歴を持つ対象集団の一部である場合、集団アイソトポマー度数分布は、そのような背景に対しての判定に使用されてもよい。加えて、そのようなベースライン・アイソトポマー度数分布は、同位元素の既知の平均天然存在度を用いて推定してもよい。例えば、自然環境では、有機炭素中に存在する１３Ｃの天然存在度は、１．１１％である。そのようなアイソトポマー度数分布の測定方法を、以下に記す。典型的に、タンパク質の試料は、同位元素標識前駆体の投与前に、及び投与後に採取される。
【０１０７】
一つの実施形態においては、相対及び絶対質量アイソトポマー存在度が測定される。測定質量スペクトルピークの高さ、または代替的に、ピーク下の面積は、親（０質量同位元素）アイソトポマーに対する比率として表現されてもよい。試料中のアイソトポマーの存在度に対して相対及び絶対値を提供する計算手段が、本発明の目的のために、そのようなデータを説明するのに用いられてもよいことは明らかである。
【０１０８】
一つの実施形態においては、微小管ポリマー等のタンパク質の標識対非標識比が計算される。それから、注目分子（例えば、チュービュリン・ダイマー、微小管ポリマー）の標識及び非標識比が計算される。専門医は、最初に、測定過剰モル比を、分子の単離アイソトポマー種属に対して判定する。専門医は、それから、過剰率の測定内部パターンを理論パターンと比較する。そのような理論パターンは、参照により本文に全文を援用するＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔｓ  Ｎｏｓ．５，３３８，６８６、５，９１０，４０３及び６，０１０，８４６に説明があるように、二項または多項分布関係を用いて計算できる。計算は、質量アイソトポマー分布分析（ＭＩＤＡ）を含んでもよい。質量アイソトポマー分布分析（ＭＩＤＡ）組合せアルゴリズムのバリエーションは、当業者に既知である多数の異なるソースで論じられている。その方法は、さらに、参照により本文に全文を援用するＨｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｎｅｅｓｅ（１９９９）やＣｈｉｎｋｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）、及びＫｅｌｌｅｈｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｓｔｅｒｓｏｎ（１９９２）、及び、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．１０／２７９，３９９において考察されている。
【０１０９】
上記の引用文献に加えて、その方法を実行する計算ソフトウェアが、カリフォルニア大学バークレー校のＭａｒｃ  Ｈｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎ教授から一般公開されている。
【０１１０】
理論パターンへの過剰モル比の比較は、関心分子に対して生成された表を用いて、あるいは確証関係を用いた図式で実行できる。これらの比較から、値ｐ等の値が決定される。これは、前駆体サブユニット・プール内におけるサブユニットの質量同位体濃縮の確率を表す。それから、この濃縮は、値ＡＸ＊等の値を決定するために使用される。この値は、各質量アイソトポマーについて新しく合成されたタンパク質の濃縮を表し、すべてのアイソトポマーが新しく合成された場合に存在が予期されるアイソトポマー過剰率を明らかにする。
【０１１１】
それから、フラクション存在度が計算される。（元素に対する）個々の同位元素または（分子に対する）質量アイソトポマーのフラクション存在度は、その特定な同位元素または質量アイソトポマーが代表する、総存在度に対する比率である。これは、相対存在度とは区別される。相対存在度の場合は、最も豊富な種属が値１００を与えられ、１００に対して、他の全ての種属が正規化され、パーセント相対存在度として表される。質量アイソトポマーＭｘについては、以下の式で表すことができる。
【０１１２】
【数１】
2016516202.tif 000004
Ｍｘのフラクション存在度＝Ａｘ＝、この場合、０からｎは、存在度が生じる最小質量（Ｍ０）の質量アイソトポマーに対する公称質量の範囲である。
【０１１３】
△フラクション存在度（濃縮または消耗）＝
【数２】
2016516202.tif 000005
、
この場合、下付き文字ｅは濃縮に言及し、ｂはベースライン、すなわち天然存在度に言及する。
【０１１４】
前駆体投与期間中に実際に新しく合成されたポリマーのフラクションを判定するためには、測定過剰モル比（ＥＭＸ）を、各々の質量アイソトポマーに対する新しく合成されたバイオポリマー（例えば、微小管）の濃縮を表す算出濃縮値、ＡＸ＊、に比較して、すべてのアイソトポマーが新しく合成された場合に存在が予期されるアイソトポマー過剰率を明らかにする。
【０１１５】
一つの実施形態においては、分子流動率が計算される。微小管の重合及び／または解重合速度の測定方法は、前駆体プール内における微小管の質量同位元素標識サブユニットの割合を計算すること、及び、この割合を、少なくとも一つの質量同位元素標識サブユニットを含む微小管の予想頻度を計算するために使用することを含む。この予想頻度を、それから、実際の、実験的に測定したアイソトポマー頻度に比較する。これらの値から、選択組み込み期間中に、加えた同位元素標識前駆体から形成された微小管の割合が判定できる。したがって、そのような期間中の合成速度も測定される。恒常的な濃度の系では、または、その系の濃度変化が測定可能である、あるいは、前記期間中の濃度変化が既知である場合、本技術において既知である計算を用いることにより、分解速度も分かる。それから、前駆体と生成物との関係を適用する。連続的標識方法については、同位体濃縮は、漸近（例えば、可能な最大）濃縮に比較し、動態パラメータ（例えば、合成速度）が、前駆体生成物方程式から計算される。フラクション合成速度（ｋｓ）は、連続的標識前駆体生成物式を適用することによって計算してもよい。
ｋｓ＝[−ｌｎ（１−ｆ）]／ｔ、
この場合、ｆ＝フラクション合成＝生成物濃縮／漸近前駆体／濃縮及びｔ＝研究対象系への標識投与の接触時間である。
【０１１６】
不連続な標識方法については、同位元素濃縮の低下速度が計算され、サブユニットの動態パラメータが、指数減衰方程式から計算される。この方法を実践する際は、微小管は、通常、微小管の複数の質量同位元素標識サブユニットを含む質量アイソトポマーで濃縮される。微小管のこれらの高い質量アイソトポマー（例えば、３または４の質量同位元素標識チュービュリン・ダイマーを含むタンパク質）は、天然質量同位元素標識前駆体（例えば、２Ｈ２Ｏ）の存在度が比較的に低いため、外因性前駆体（例えば、２Ｈ２Ｏ）を欠いた状態では、無視してもよい量が形成される。しかし、前駆体組み込み期間中（例えば、細胞、組織、器官または生物への２Ｈ２Ｏの投与中）は、多量に形成される。微小管は、順次の時点で、細胞、組織、器官または生物から採取され、高質量アイソトポマーの相対度数を測定する、または、微小管からのサブユニットの高質量アイソトポマーの相対度数を測定するために、質量スペクトロメトリーによって分析される。高質量アイソトポマーは、第一の時点の前に、ほとんど排他的に合成されるので、二つの時点間のその減衰は、サブユニットの崩壊速度の直接的な測定値となる。複数の質量同位元素標識サブユニットを含まない質量アイソトポマーの崩壊速度も計算できるため、本文に説明の方法にも使用できる。
【０１１７】
通常、第一の時点は、投与モードに応じて、前駆体（例えば、２Ｈ２Ｏ）投与の終了後、少なくとも２から３時間後になる。これは、質量同位元素標識サブユニット（例えば、微小管ポリマーのための標識チュービュリン・ダイマー）の割合が、前駆体投与以降、その最高レベルから実質的に減衰していることを保証するためである。一つの実施形態においては、以降の時点は、典型的に、第一の時点後の、１から４時間であるが、このタイミングは、バイオポリマー・プールの置換速度に依存する。
【０１１８】
微小管の崩壊速度は、同位元素標識サブユニットに対する崩壊曲線から判定される。本ケースでは、崩壊曲線が複数の時点によって定義される場合、崩壊動特性は、曲線を、指数関数的崩壊曲線に適合させることによって決定でき、それから、崩壊定数を決定する。
【０１１９】
分解速度定数（ｋｄ）は、指数関数的、あるいは他の動特性崩壊曲線に基づき計算されてもよい。
ｋｄ＝[−ｌｎｆ]／ｔ．
運動神経疾患の変調剤に対するスクリーニング方法
【０１２０】
本発明は、運動神経疾患の変調剤に対するスクリーニング方法を提供する（図４から７、図１０を参照）。この文脈における「変調剤」は、活性に対する作用薬及び拮抗剤を意味し、拮抗剤が特に有用である。変調剤は、逆機能活性が抑制され、患者の関連副作用も最小になるよう、選択される。
【０１２１】
本発明の一部は、運動神経細胞内の微小管運動に影響を与える生化学的経路が、運動神経疾患の治療に通じるという発見に関する。したがって、一つの実施形態においては、本発明は、軸索微小管運動を修正する薬剤を識別するための、候補剤のスクリーニング方法を提供する。したがって、運動神経疾患の症状を治療する、予防する、あるいは寛解させることができる。
【０１２２】
概して、本発明で使用される候補剤には、三つの種類がある。第一のクラスは、微小管運動を調整する効力が評価される一般的な候補剤からなる。より詳細には、軸索幹微小管と成長円錐及び／またはＭＡＰ２微小管とを区別する能力である。つまり、本発明が要約するように、これらの二つのプールの微小管は、非常に異なるチュービュリン交換動態性を示し、軸索微小管を優先して安定化させる薬剤が、特に有用である。したがって、微小管運動、すなわち運動神経細胞機能障害を変更する（例えば、修正する）薬剤に対する、候補剤ライブラリのスクリーニングが行われる。
【０１２３】
第二に、経路特定候補剤がテストできる。この実施形態においては、微小管交換動態性に影響を及ぼす疑いがある、あるいは影響を及ぼすと知られている薬剤が、本文に概説するように、運動神経細胞系でテストされる。
【０１２４】
加えて、運動神経疾患に関連すると知られているが、概して、微小管に対してではなく神経細胞系に作用すると信じられている多数の生化学的イベントがある。いくつかのケースでは、これらの生化学的イベントは、運動神経細胞レベルで発生している。他のケースでは、これらのイベントは、ＣＮＳ及び末梢神経系（ＰＮＳ）疾患両方の進行に影響を及ぼす後期段階イベントと関係している。例えば、後期段階パーキンソン病では、運動神経活性に混乱が生じることもある。同様に、後期段階ＡＬＳでは、小膠細胞の賦活化が発生する。したがって、本文に概説するものを含む併用療法アプローチは、非常に有用である。したがって、本発明は、神経保護活性の示度としての微小管運動を用いて、これらの病状に関わることが既知である薬剤の、及び薬剤の組合せの評価方法を提供する。これらの追加の経路は、小膠細胞賦活化に関連する炎症、酸化ストレスに関連する経路、及び本技術において既知である他のものをも含む。
一般的な候補剤
【０１２５】
一つの実施形態においては、候補剤は、運動神経細胞内の微小管活性を調整する効力に対してスクリーニングされる。本文で用いる「候補剤」または「候補薬剤」は、例えば、バイオ治療効果のある抗体及び酵素を含むタンパク質、既知の薬剤及び候補薬剤を含む小有機分子、多糖、脂肪酸、ワクチン、核酸などの、本文に概説するように、活性の有無に関してスクリーニングできる、いずれの分子をも表す。この文脈において、「一般的な」候補剤は、微小管、運動神経細胞及び／または運動神経疾患の調整に関連するとは知られていないものである。
【０１２６】
候補剤には、多数の化学的種類がある。一つの実施形態における候補剤は、有機分子であり、通常、１００を超え約２，５００ダルトン未満の分子量を持つ小さな有機化合物である。特に、１００を超え約２，０００ダルトン未満の分子量を持つ小さな有機化合物が有用であり、約１５００ダルトンより少なければ、より有効であり、約１０００のダルトンよりも少なければ、もっと有効であり、５００ダルトンよりも少なければ、更に有効である。候補剤は、タンパク質との構造的相互作用に必要な官能基からなり、特に水素結合、典型的に、アミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基の少なくとも一つ、通常、少なくとも二つの化学官能基を含む。候補剤は、しばしば、上記の官能基の一つ以上で置換された環状炭素または複素環構造及び／または芳香族あるいはポリ芳香族構造からなる。候補剤は、生体分子の中にも発見される。例えば、ペプチド、サッカライド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体、または、それらの組合せを含む。
【０１２７】
候補剤は、合成あるいは天然化合物のライブラリを含む多種多様なソースから入手できる。例えば、多数の手段が、多種多様な有機化合物及び生体分子のランダムな合成及び誘導合成に利用可能である。例えば、ランダムなオリゴヌクレオチド及びペプチドの発現及び／または合成を含む。代替的に、細菌性（菌性の）植物と動物性抽出物の形態に天然化合物のライブラリは、利用できるか、すぐに生成した。加えて、天然の、あるいは合成のライブラリ及び化合物は、従来の化学的、物理的及び生化学的手段を介して、容易に修正できる。既知の薬物は、例えば、構造類似体を生成するための、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの誘導的な、あるいはランダムな化学修飾を受けさせてもよい。
【０１２８】
候補生理活性薬剤は、タンパク質でもよい。本文の「タンパク質」は、少なくとも二つの共有結合アミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペチド、オリゴペプチド及びペプチドを含む。タンパク質は、天然に存在するアミノ酸及びペプチド結合、または合成ペプチド模倣構造から形成されてもよい。したがって、本文中で用いる「アミノ酸」または「ペプチド残基」は、天然アミノ酸及び合成アミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモ−フェニルアラニン、シトルリン及びノルロイシンは、本発明の目的において、アミノ酸と考える。「アミノ酸」は、また、プロリン及びヒドロキシプロリン等のイミノ酸残基をも含む。側鎖は、（Ｒ）または（Ｓ）配位のどちらでもよい。特に有用な実施形態におけるアミノ酸は、（Ｓ）またはＬ−配位である。非天然の側鎖を使用する場合は、例えば、生体内壊変を阻止する、あるいは遅延させるために、非アミノ酸置換基を使用してもよい。
【０１２９】
候補生理活性剤は、天然に存在するタンパク質、あるいは天然に存在するタンパク質のフラグメントでもよい。したがって、例えば、タンパク質を含む細胞抽出物、またはタンパク質細胞抽出物のランダムなダイジェスト、あるいは誘導ダイジェストが使用されてもよい。このように、本文で説明の系におけるスクリーニングのために、原核及び真核タンパク質のライブラリが構築されてもよい。この実施形態に有用なものは、細菌性、菌性、ウイルス性タンパク質、及び哺乳類タンパク質のライブラリであり、後者が特に有用であり、特にヒト・タンパク質が有用である。
【０１３０】
候補剤は、タンパク質の一種類である抗体であってもよい。用語「抗体」は、本技術において既知である抗体の全長、及び抗体フラグメントを含む。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、単鎖抗体（例えばＦｖ）、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体など、組換えＤＮＡ技術を用いて、抗体全体の修正によって生成した、あるいは合成デノボ、及び、それらの誘導体を含む。
【０１３１】
候補生理活性剤は、核酸でもよい。本文の「核酸」または「オリゴヌクレオチド」あるいは文法的に同等な表現は、一緒に共有結合された少なくとも二つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は、通常、ホスホジエステル結合を含む。しかし、いくつかのケースでは、下記に概説するように、代替性バックボーンを持つ可能性のある核酸類似物を含む。それらは、例えば、リンアミド（Ｂｅａｕｃａｇｅ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４９（１０）：１９２５（１９９３）及び以下の文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，３５：３８００（１９７０）；Ｓｐｒｉｎｚｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８１：５７９（１９７７）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４：３４８７（１９８６）；Ｓａｗａｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，８０５（１９８４），Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１０：４４７０（１９８８）；ａｎｄ Ｐａｕｗｅｌｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ，２６：１４１（１９８６））、ホスホロチオネート（Ｍａｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：１４３７（１９９１）及びＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，６４４，０４８）、リンジチオ酸塩（Ｂｒｉｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１：２３２１（１９８９））、Ｏ−メチルフォスフォルアミダイト・リンケージ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照する。）、及びペプチド核酸バックボーン及びリンケージ（参照により全文が援用されるＥｇｈｏｌｍ，  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：１８９５（１９９２）；Ｍｅｉｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３１：１００８（１９９２）；Ｎｉｅｌｓｅｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６（１９９３）；Ｃａｒｌｓｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，３８０：２０７（１９９６）を参照する。）からなる。他の類似核酸は、ポジティブなバックボーン（Ｄｅｎｐｃｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：６０９７（１９９５））、非イオン性バックボーン（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．５，３８６，０２３、５，６３７，６８４、５，６０２，２４０、５，２１６，１４１及び４，４６９，８６３、Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉ，  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ，３０：４２３（１９９１）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１０：４４７０（１９８８）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，１３：１５９７（１９９４）；Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ２  ａｎｄ  ３，ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ５８０，”Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，４：３９５（１９９４）；Ｊｅｆｆｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ，３４：１７（１９９４）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３７：７４３（１９９６））及び非リボース・バックボーンを持つものを含み、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．５，２３５，０３３  及び  ５，０３４，５０６、及び  Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ６  ａｎｄ  ７，  ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，”Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋに説明されているもの、及びペプチド核酸を含む。一つ以上の炭素環式糖を含む核酸も核酸の定義内に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，（１９９５）ｐｐ．１６９−１７６を参照する。）。複数の核酸類似物は、Ｒａｗｌｓ，Ｃ  ＆  Ｅ  Ｎｅｗｓ，Ｊｕｎｅ  ２，１９９７、３５ページに説明されている。これらの参照文献は、参照によって本文に援用される。リボース−ホスフェート・バックボーンのこれらの修正は、標識等の追加部分の添加を容易にする、あるいは生理的環境内のそのような分子の安定性及び半減期を増加させるために行われてもよい。加えて、天然に存在する核酸と類似物との混合物を作成することもできる。代替的に、異なる核酸類似物の混合物、及び天然に存在する核酸と類似物との混合物を作成してもよい。核酸は、指定に応じて、一本鎖でも二重鎖であってもよい。あるいは二重鎖及び一本鎖配列の両方を部分的に含んでもよい。例えば、制限フラグメント、ウイルス、プラスミド、染色体などを含む。核酸は、ＤＮＡ、ゲノム及びｃＤＮＡの両方、ＲＮＡまたは、核酸がデオキシリボ及びリボヌクレオチドのいずれの組合せをも含むハイブリッド、及び塩基のいずれの組合せでもでもよい。例えば、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロムウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチル−アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシンと２，６−ジアミノプリン等を含む。本発明の文脈においては、ヌクレオシド（リボースと塩基）及びヌクレオチド（リボース、塩基及び少なくとも一つのホスフェート）は、本文に特に明記しない限り、入れ替え可能に使用される。
【０１３２】
先にタンパク質に関して概説したように、核酸候補生理活性剤は、天然に存在する核酸、ランダムな核酸及び／または合成核酸でもよい。例えば、先にタンパク質に関して概説したように、原核または真核ゲノムのダイジェストが使用されてもよい。加えて、これにはＲＮＡが含まれる。
経路に基づく候補剤のスクリーニング
【０１３３】
先に概説したように、一般的な候補剤に加えて、本発明は、微小管活性、運動神経細胞機能障害及び／または運動神経疾患の変調剤に対するスクリーニング用途を見いだす。本文の「微小管活性」は、種々の微小管生物学的活性の一つを意味し、例えば、微小管重合及び／または解重合の速度、一つの細胞位置から他の箇所への細胞構成要素の輸送を維持する能力、微小管の細胞骨格機能などを含むが、これらに限らない。
【０１３４】
概して、スクリーニングが行われる、経路に基づく候補剤には、二つのタイプがあって、微小管活性に関わると知られている、あるいはその疑いがあるもの、及び、運動神経疾患に関連する他の生化学的イベントに関わるものである。
【０１３５】
したがって、本発明のいくつかの実施形態は、経路に基づく候補剤のスクリーニングを利用する。
微小管標的調節剤（ＭＴＭＡ）
【０１３６】
一つの実施形態においては、微小管標的調節剤がテストされる。本文の「微小管標的調節剤」または「ＭＴＭＡ」は、微小管重合及び／または解重合の速度に影響を及ぼすと以前から認識されている、あるいは提案されている薬剤を意味し、より詳細には、微小管不安定性（すなわち、運動）を減少させる、あるいは減速させるものを指す。
【０１３７】
一つの実施形態におけるＭＴＭＡは、オピオイド及びオピオイド誘導体である。オピオイドには、大きく四つの種類があり、体内で生成される内因性オピオイドペプチド、モルヒネ（原型オピオイド）及びコデイン等のアヘンアルカロイド、ヘロイン及びオキシコドン等の半合成オピオイド、及び、アヘンアルカロイドとは無関係な構造を持つペチジン及びメサドン等の完全合成オピオイドである。
【０１３８】
一つの実施形態におけるＭＴＭＡは、アヘンアルカロイドである。一つの実施形態におけるアヘンアルカロイドは、例えば、その全文が参照により本文へ援用されるＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，３７６，５１６に概説されているノスカピンまたはノスカピン誘導体である。ノスカピンは、鎮痛性あるいは鎮痙性活性を欠くアヘンアルカロイドであり、他のオピオイド（例えば、モルヒネ）に反して、麻薬あるいは常用性化合物ではない。さらに、パクリタキセル、ノコダゾール、ビンブラスチン及びコルヒチン等の他の微小管相互作用薬剤とは対照的に、ノスカピンは、生体外及び生細胞内の両方において、総チュービュリン・ポリマー質量に影響を及ぼすことなく、また、微小管組み立ての恒常的なダイマー／ポリマー平衡を変更することなく微小管運動を修正する。ノスカピンは、脳血液関門を透過し、ＣＮＳ組織（脳及び脊髄）とＰＮＳにおいても長い半減期を持つ。したがって、我々は、ノスカピンを、我々が発見した微小管運動の変化などの、細胞骨格異常に関連するＣＮＳ及びＰＮＳ疾患のための潜在的微小管相互作用化学療法剤として識別した（図４から図７を参照）。ノスカピンは、現在、咳抑制剤としてヒト用途に利用可能である。ＭＴＭＡとして有用な他のアヘンアルカロイドは、フェナントレン、イソキノリン及びパパベリンである。
【０１３９】
加えて、カンナビノイドは、単独で、または他の薬剤との組合せで、スクリーニングに使用できる。カンナビノイドは、ＣＢ１及びＣＢ２受容体を含む生体内因性カンナビノイド受容体を活性化させる一群の化学薬品である。現在、カンナビノイドには、三つの一般的なタイプがある。ハーバル・カンナビノイドは、比類なく大麻植物内に生じる。内因性カンナビノイドは、ヒト及び他の動物の体内で生成される。合成カンナビノイドは、実験室で生成される類似化合物である。適切な薬剤は、以下のものを含むが、これらに限定されるものではないものであって、アナンダミド及びアナンダミド類似物、ドコサテトラエンイルエタノールアミド及びホモ−γ−リノエンイルエタノールアミド、２−アラキドノイルグリセロール（２−ＡＧ）、パルミトイルエタノールアミド及びオレアミド等のエンドカンナビノイド、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）、特にマリノール（Δ９−ＴＨＣ）、カンナビジオール（ＣＤＢ）、カンナビノール（ＣＢＮ）、カンナビゲロール、カンナビクロメン、カンナビシクロール、カンナビバロール、テトラヒドロカンナビバリン、カンナビジバリン、カンナビクロメバリン、カンナビゲロバリン、カンナビゲロールモノエチルエーテル、ＣＰ−５５９４０、ＨＵ−２１０ １００、ＳＲ−１４４５２６、及びナビロンである。
【０１４０】
他の、経路に基づく候補剤は、イオン、特にカルシウム及びナトリウムの細胞内濃度を標的とするものである。カルシウム細胞内濃度は、微小管形成及び安定性に関わるということが知られているため、細胞内カルシウムを（特に細胞内カルシウム濃度を減少させることによって）調整する薬剤は、スクリーニングで特に注目すべきである。
イオン・チャネル拮抗剤
【０１４１】
Ｌ−グルタミン酸経路、主要な興奮性神経伝達物質に関わるリガンド開口型イオン・チャネル（イオノトロピック型受容体）には、三つの主なタイプがある。それらは、ＮＭＤＡ、ＡＭＰＡ及びカイニン酸受容体であり、各変調剤は、本発明における経路スクリーニングに有用である。
ＮＭＤＡ受容体拮抗剤
【０１４２】
ＮＭＤＡ受容体は、最初、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）による選択的活性化によって識別された。ＮＭＤＡ受容体は、ＮＲ１サブユニット及びＮＲ２サブユニットのアセンブリからなり、四つの別個の遺伝子産物（ＮＲ２Ａ−Ｄ）の一つであり得る。機能チャネルを形成には、両サブユニットの発現が必要である。ＮＲ１及びＮＲ２サブユニットが接合する箇所に、グルタミン酸結合ドメインが形成される（それゆえ、両サブユニットの発現が必要）。グルタミン酸に加えて、ＮＭＤＡ受容体は、受容体が機能するための結合に、共アゴニスト、グリシンが必要である。グリシン結合部位は、ＮＲ１サブユニット上に存在する。ＮＲ２Ｂサブユニットも、ＮＭＤＡ受容体の機能を調整する調節分子、ポリアミンに対する結合部位を持つ。グルタミン酸結合（ＮＭＤＡ）部位に加えて、ＮＭＤＡ受容体上には、調節化合物に対する多重結合部位がある。効率的なＮＭＤＡ受容体の活性化には、ＮＭＤＡのみでなく、グリシンも必要である。活性化は、ポリアミンの結合によっても調整できる。結合部（グルタミン酸、グリシン、ポリアミン）の各々は、受容体及び亜型選択化合物の生成のための潜在的標的として使用されている。
【０１４３】
ＮＭＤＡ阻害剤は、競合的または非競合的阻害剤のいずれであってもよく、結合部位のいずれにも結合できる。したがって、適切なＮＭＤＡ受容体拮抗剤は、アマンタジン、ケタミン、デキストロメトルファン（３−メトキシ−１７−メチル−９（アルファ），１３（アルファ），１４（アルファ）−モルヒナン臭化水素酸塩一水和物）、ジゾシルピン（ＭＫ−８０１としても既知である）、ＡＰ−７（２−アミノ−７−ホスホノヘプタン酸）、ＡＰＶ（ＡＰ−５とも呼ばれる、２−アミノ−５−ホスホノ吉草酸、ＤＣＫＡ（５，７−ジクロロキヌレン酸、グリシン部位に作用）、ハーコセライド（アセトアミド−Ｎ−ベンジル−３−メトキシプロピオナートとそのメタボライト、Ｈ−２０９）、ホモキノリン酸、（Ｒ）−ＡＰ５、（Ｒ）−ＣＰＰ−エン、ＰＢＰＤ、メマンチン、ケタミン、Ｌ−７０１−３２４、Ｌ−６８９，５６０、ＧＶ１９６７７１Ａ、Ｒｏ２５−６９８１、イフェンプロジル、Ｃｏ−１０１６７６、ＧＷ４６８８１６（グリシン部位拮抗剤）を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１４４】
これらの阻害剤のいくつかを図６に示す。
【０１４５】
ジゾシルピンは、特に興味深い。ジゾシルピンは、イオン・チャネルＮＭＤＡ受容体を介しての神経細胞へのカルシウムの過度な流入を減少させるカルシウム・チャネル遮断薬として識別されている。また、グルタミン酸作動性ＮＭＤＡ受容体亜型の競合的拮抗薬としても分類され、脳血液関門を透過する。グルタミン酸誘発興奮毒性は、複雑で多因子性であるが、神経細胞の損傷及び死をもたらす末端イベントの主成分である。それは、ＮＭＤＡ受容体を介してのカルシウムの過度な流入を伴う。
酸化ストレスの変調剤
【０１４６】
ＭＴＭＡ及び受容体拮抗剤に加えて、他の経路選択剤は、運動神経細胞内の酸化ストレスに影響を与えるものを含む。これらは、ビタミンＥ、プロシステイン、Ｎ−アセチルシステイン、リポ酸、及び種々のタイプのニトロン等の、一般的な酸化防止剤を含む。
小膠細胞活性化
【０１４７】
神経炎症は、最近、運動神経疾患の有意な一因となっている。例えば、ＡＬＳ組織の特徴は、散発性及び家族性ＡＬＳの両方で、あるいはＳＯＤ遺伝子導入マウス・モデル等で観察される炎症性変化である。そのような変化は、非常に多数の活性小膠細胞や星状細胞の蓄積を含む。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等の炎症誘発性サイトカインは、ＡＬＳにおいて、強く上方制御される。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−Ｒ１）に対する受容体は、疾患の徴候段階だけでなく、発症前後期にも上昇する。ＴＮＦは、その影響が複数の共同刺激性サイトカイン及びケモカインによって強化されるが、ＡＬＳの神経炎症に対する主要なドライバーとして作用する。これらの変化は、また、パーキンソン病を含む他の運動神経疾患、及び糖尿病性神経障害を含む種々の末梢神経障害でも観察される。
【０１４８】
ＡＬＳに対する有効性がテストされている複数の候補抗炎症剤がある。例えば、限定せずに、ミノサイクリン及びサリドマイドがある。
【０１４９】
したがって、本発明は、これらの薬剤の、他の候補剤とのテスト方法を提供する。他の候補剤は、特に、上記にいくつかリストした微小管標的調節剤（ＭＴＭＡ）、（同様に上記にいくつかリストした）イオン・チャネル拮抗剤、酸化防止剤、銅キレート剤、一酸化窒素阻害剤及びパーオキシナイトライトのスカベンジャー、及び神経栄養因子などである。
雑多な薬剤
【０１５０】
加えて、抗グルタミン酸剤、他の抗炎症剤及び他の抗痙攣剤のすべてがテスト可能である。もちろん、本発明は、いかなる特定の種類の化合物や、特定な化合物によって制限されることはない。本発明の方法は、いかなる化合物、あるいは化合物のどんな組合せにも使用できることを想定している。
医薬組成物
【０１５１】
本文に概説するように、運動神経疾患、特にＡＬＳを治療するのに使用できる種々の医薬組成物がある。一つの実施形態における医薬組成物は、本文に概説するように、ＭＴＭＡ薬剤及び医薬担体からなる。この実施形態においては、ノスカピンが特に有用である。
【０１５２】
多くの実施形態おける医薬組成物は、二つの異なる薬剤からなる。本文に概説した二つのタイプの神経保護剤の、いずれの組合せも可能である。いくつかのケースでは、治療のために、三つの神経保護剤が組み合わされる。
【０１５３】
一つの実施形態における医薬組成物は、二つの異なるＭＴＭＡからなる。例えば、エンドカンナビノイドを含むノスカピン及びカンナビノイドが、この実施形態には有用である。
【０１５４】
代替実施形態における医薬組成物は、ＭＴＭＡ及び、ＭＴＭＡでない神経保護剤からなる。
【０１５５】
一つの実施形態における神経保護剤は、電位依存型イオン・チャネル拮抗剤であり、電位依存型ナトリウム及びカルシウム・チャネル拮抗剤を含む。したがって、組成物は、少なくとも一つのＭＴＭＡからなり、チャネル拮抗剤は、特に有用である。
【０１５６】
多くの実施形態における医薬組成物は、ＭＴＭＡ、及びＮＭＤＡ受容体拮抗剤からなる。ノスカピン及びジゾシルピンからなる組成物は、いくつかの実施形態において、特に有用である。代替実施形態におけるＮＭＤＡ受容体拮抗剤は、メマンチンである。
【０１５７】
多くの実施形態における医薬組成物は、ＭＴＭＡと、ペルオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）作用薬からなる。ノスカピン及びピオグリタゾン（Ａｃｔｏｓ（商標））からなる組成物は、いくつかの実施形態において、特に有用である。代替実施形態におけるＰＰＡＲγ作用薬は、とりわけ、ロシグリタゾン（Ａｖａｎｄｉａ（商標））、Ｌ−７９６４４９、ＲＳ５４４４またはＧＩ２６２５７０であってもよい。
【０１５８】
多くの実施形態における医薬組成物は、ＭＴＭＡと、セラストロール、ニメスリドまたはイブプロフェン等の抗炎症剤からなる。
【０１５９】
多くの実施形態における医薬組成物は、ＭＴＭＡ及び酸化防止剤、特にｉＮＯＳ酸化防止剤からなる。ノスカピン及びＬ−ＮＭＭＡ（ティラルギニン）からなる組成物は、いくつかの実施形態において、特に有用である。代替実施形態における酸化防止剤は、とりわけ、セフトリアキソン、セラストロール、ＣｏＱ１０、ビタミンＥまたはＡＥＯＬ  １０１５０から選ぶことができる。
【０１６０】
多くの実施形態における医薬組成物は、ＭＴＭＡ及びフリーラジカル・トラッパー／スカベンジャーからなる。ノスカピン及び、とりわけ、マンガンポルフィリン酸化防止剤からなる組成物は、いくつかで実施形態において有用である。
【０１６１】
多くの実施形態における医薬組成物は、ＭＴＭＡ及び金属イオン・キレート剤、特に銅（II）及び亜鉛（II）キレート剤からなる。ノスカピンと、とりわけ、８−ヒドロキシキノリン、アセトヒドロキサム酸、またはＮ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジヒドロキシベンズアミド（ＤＭＢ）等の金属イオン・キレート剤からなる組成物が、いくつかの実施形態で有用である。
【０１６２】
多くの実施形態における医薬組成物は、ＭＴＭＡ及び低電位感知カルシウム・チャネル（Ｌ−ＶＳＣＣ）拮抗剤からなる。ノスカピン及びニモジピンからなる組成物が、いくつかの実施形態において、特に有用である。
【０１６３】
多くの実施形態における医薬組成物は、ＭＴＭＡ及び非競合的α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチルイソオキサゾール−４プロピオン酸（ＡＭＰＡ）／カイニン酸受容体拮抗剤からなる。ノスカピン及びＧＹＫＩ  ５２４６６からなる組成物が、いくつかの実施形態において、特に有用である。
【０１６４】
多くの実施形態における医薬組成物は、ＭＴＭＡ及び選択的あるいは非選択的グルタミン酸受容体拮抗剤からなる。ノスカピン及び非選択的グルタミン酸受容体拮抗剤  ５１（ＮＣ−１２００／ＭＶＬ−６９７６）からなる組成物が、いくつかの実施形態において、特に有用である。代替実施形態における選択的あるいは非選択的グルタミン酸受容体拮抗剤は、ＮＢＱＸ、ニメスルジン、リルゾール（Ｒｉｌｕｔｅｋ）、タランパネル、セフトリアキソンまたはナアラダーゼ阻害剤から選択できる。他の実施形態におけるグルタミン酸受容体拮抗剤は、ＯＮＯ−２５０６等の神経膠変調剤でもよい。
【０１６５】
多くの実施形態における医薬組成物は、ＭＴＭＡ及びアナンダミド（ＡＥＡ）輸送、加水分解または再取り込み阻害剤からなる。ノスカピン及びＮ−（４−ヒドロキシフェニル）−アラキドナミド（ＡＭ４０４）からなる組成物が、いくつかの実施形態において、特に有用である。代替実施形態におけるＡＥＡ輸送、加水分解または再取り込み阻害剤は、Ｎ−（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚエイコサテトラエニル）−４−ヒドロキシベンズアミド（ＡＭ１１７２）、またはＵＲＢ５９７等の脂肪酸アミドヒドロラーゼＦＡＡＨ阻害剤でもよい。加えて、ノスカピン、ＡＥＡ及びＡＭ４０４等の、二つのＭＴＭＡ及びＡＥＡ再取り込み阻害剤からなる組成物も有用である。
【０１６６】
多くの実施形態における医薬組成物は、ＭＴＭＡ及び神経栄養因子からなる。ノスカピン及びＩＧＦ１またはＩＧＦ−１−ＡＡＶからなる組成物が、いくつかの実施形態において有用である。
【０１６７】
多くの実施形態における医薬組成物は、ＭＴＭＡ及びアポトーシス阻害剤からなる。ノスカピン及びミノサイクリン、ＴＣＨ３４６またはタモキシフェンからなる組成物は、いくつかの実施形態において、有用である可能性がある。
【０１６８】
いくつかの実施形態においては、二つのＭＴＭＡが使用され、追加の神経保護剤も使用される。
【０１６９】
本文の「運動神経細胞関連疾患」、「運動神経疾患」または「病状」は、二つの神経保護剤からなる医薬組成物の投与によって寛解可能な疾患を意味する。医薬組成物は、典型的に少なくとも一つのＭＴＭＡからなるが、一つの、あるいは二つ以上の神経保護剤を加えてもよい。特に有用な実施形態においては、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療するために、微小管標的調節剤が使用される。
【０１７０】
多くの実施形態では、治療的に有効な用量の神経保護剤が、治療が必要な患者に投与される。本文の「治療的に有効な用量」は、投与によって影響が生じる用量を意味する。正確な用量は、治療の目的に依存し、当業者には、既知の技術を用いて確認可能である。特に有用な実施形態においては、約５μｇ／ｋｇの適用量が、静注または皮下投与される。本技術において既知であるように、薬剤壊変、全身または局所送達、及び新しいプロテアーゼの合成速度、また、年齢、体重、健康状態、性別、食事、投与時間、薬剤相互作用及び病状の重症度に対する調整が必要な場合もあるが、当業者には、日常的な実験で確認可能である。
【０１７１】
本発明の目的における「患者」は、ヒト及び他の動物の両方、特に哺乳類、及び生物を含める。したがって、方法は、ヒトの治療及び獣医科的用途の両方に適用できる。特に有用な実施形態における患者は、哺乳類であり、特に有用な実施形態における患者はヒトである。
【０１７２】
本発明の用語「治療」は、治療的処置のほか、病気あるいは疾患に対する治療及び予防または抑制処置を含む。したがって、例えば、運動神経疾患のケースでは、一つの、あるいは二つ以上の神経保護剤を加えてもよいのだが、疾患発症前の、典型的に少なくとも一つのＭＴＭＡからなる二つの神経保護剤の有効投与が、疾患の「治療」に至る。もう一つの実施例としては、疾患の臨床症状が現れた後の、疾患の症状を抑える神経保護剤の有効投与が、疾患の「治療」となる。「治療」は、また、病気を根絶するための疾患出現後の神経保護剤の投与を含む。発症後の、及び臨床症状出現後の薬剤の有効投与は、起こり得る臨床症状の縮減及びことによると疾患の寛解を含んで、疾患の「治療」となる。
【０１７３】
「治療が必要な」対象者は、既に病気あるいは疾患を患っている哺乳動物、病気または疾患を予防すべき者を含んで、病気あるいは疾患に罹りやすい者である。
【０１７４】
本発明の組成物は、典型的に、少なくとも二つの神経保護剤の組合せであるが、組成物は、一緒に、単一剤形（例えば、二つの薬剤を結合させた経口処方）として、または同時に、あるいは順次に、単独で、下記に概説する投薬形態で投与できる。例えば、一つの薬剤を経口的に、もう一つを腹膜内に、一緒に、または順次に投与できる。加えて、別々に投薬される場合、投薬は、異なる時間で、または異なる頻度でもよい。代替的に、少なくとも二つの薬剤が、同じ投薬形態で、例えば経口投与によって、別々に投与されてもよい。
【０１７５】
ヒトへの投与に適切な初期量は、生体外アッセイまたは動物モデルから判定してもよい。例えば、初期量は、生体外アッセイでの測定で、投与される化合物の特定な代謝活性剤が血清中濃度がＩＣ５０を達成するよう調製されてもよい。代替的に、ヒトのための初期量は、ＳＯＤマウス等の、ＡＬＳの動物モデルに有効と確認された投薬量に基づいてもよい。一つの実施例としては、本文に概説する医薬組成物の各構成要素に対する初期量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日から約２００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内であってもよい。または約０．１ｍｇ／ｋｇ／日から約１００ｍｇ／ｋｇ／日、あるいは約１ｍｇ／ｋｇ／日から約５０ｍｇ／ｋｇ／日、または約１０ｍｇ／ｋｇ／日から約５０ｍｇ／ｋｇ／日も使用可能である。しかし、投薬量は、患者の必要条件、治療を受ける重症度、及び使用化合物に応じて変化してもよい。投薬用量は、また、特定な患者における特定な化合物の投与に伴う有害な副作用の存在、性質及び程度によって決定してもよい。特定な状況に対する適切な投薬量の決定は、専門医が彼の技術において行う。概して、治療は、化合物の適量よりも少ない投薬量で開始される。その後、投薬量は、状況下での最適な影響が得られるまで、少量ずつ増加される。便宜上、１日分の投薬量は、必要に応じて分割し、一日中、部分投与されてもよい。
【０１７６】
薬剤組成物の活性化合物の濃度は、薬剤の吸収、分布、不活化及び排出速度、及び、当業者に既知である他の要因に依存する。注意すべきは、投薬量値が、緩和すべき病状の重症度によっても異なることである。特定な対象者に対しては、具体的な投与計画は、時間経過と共に、個々の必要、及び組成物投与の実行者または監督者の専門的な判断に応じて調節されなければならないこと、また、本文の濃度範囲は、模範例として記載されたもので、主張する組成物の範囲または実施を制限することを意図していないことは理解すべきである。有効成分は、１度に投与してもよいし、あるいは多数のより少ない用量に分割して、様々な時間間隔で投与してもよい。
【０１７７】
経口投与に適切な製剤は、以下のものから構成されてもよい。（ａ）水、食塩水またはＰＥＧ  ４００等の希釈液中に化合物の有効量を懸濁させた溶液、（ｂ）液体、固体、顆粒またはゼラチンとして所定量の有効成分を各々が含むカプセル、小袋または錠剤、（ｃ）適切な液体中の懸濁、及び（ｄ）適切なエマルジョン。錠剤形態は、一つ以上のラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉、微結晶性セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、及び他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈液、緩衝剤、湿潤薬剤、防腐剤、香味剤、染料、崩壊剤、及び薬学的に適合する担体を含むことができる。トローチ剤形態は、有効成分を、例えばスクロース等の香味内に入れることができる。また、有効成分を不活性ベース内に含めてトローチとすることも可能である。不活性ベースは、ゼラチン及びグリセリン、またはスクロース及びアカシア・エマルジョン、ジェル等であり、有効成分に加えて、本技術において既知である担体をも含む。
【０１７８】
経口組成物は、概して、不活性希釈液または食用担体を含む。ゼラチン・カプセルに入れられてもよいし、錠剤に圧縮されてもよい。治療的経口投与の目的では、活性化合物が賦形剤に組み込まれ、錠剤、トローチまたはカプセルの形態で使用されてもよい。薬学的に適切な結合剤、及び／またはアジュバント物質を、組成物の一部として含ませてもよい。
【０１７９】
活性化合物、または、それの医薬的に許容可能な塩は、エリキシル、サスペンション、シロップ、ウェーハー、チューインガム等の構成要素として投与されてもよい。シロップは、活性化合物に加えて、甘味料としてスクロース、また、特定な防腐剤、染料、着色剤及び香料を含んでもよい。
【０１８０】
活性化合物またはそれの医薬的に許容可能な塩は、所望の作用を損なわない他の活性物質と、あるいは所望の作用を補う物質と混合させてもよい。
【０１８１】
本文の用語「医薬的に許容可能な塩」は、上記識別化合物の所望の生物学的活性を保持し、毒物学的な影響をほとんど、あるいは全く示さない塩類に言及する。そのような塩類の例は、無機酸で形成された酸付加塩（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸など）、及び、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パモ酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸及びポリガラクツロン酸等の有機酸で形成された塩類を含むが、これらに限定されるものではない。化合物は、また、当業者に既知である医薬的に許容可能な第四級塩として投与することもできる。具体的には、この第四級塩は、式−−ＮＲ＋Ｚ−の第四級アンモニウム塩を含む。この場合、Ｒは、水素、アルキルまたはベンジルであり、Ｚは対イオンであり、例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物、−−Ｏ−アルキル、トルエンスルホナート、メチル・スルホン酸エステル、スルホン酸エステル、ホスフェートまたはカルボン酸エステル（ベンゾアート、スクシナート、アセテート、グリコレート、マレイン酸エステル、リンゴ酸エステル、シトラート、タータラート、アスコルベート、ベンゾアート、桂皮酸塩、マンデル酸塩、ベンジル酸メチル及びジフェニルアセテート等）を含む。
【０１８２】
単独で、あるいは他の適切な構成要素との組合せで選択した化合物は、吸入を介して投与すべきエアロゾル製剤にしてもよい（すなわち、「霧状に」できる）。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の、許容可能な加圧噴霧剤に入れることができる。
【０１８３】
直腸投与に適切な製剤は、例えば、座薬基剤で包装された化合物から構成される坐薬を含む。適切な座薬基剤は、天然または合成トリグリセライドまたはパラフィン系炭化水素を含む。加えて、例えば、液体トリグリセライド、ポリエチレングリコール及びパラフィン系炭化水素を含むベースと選択化合物の組合せから構成されたゼラチン直腸カプセルを使用することも可能である。
【０１８４】
例えば、関節内（関節間内）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、及び皮下経路などによる非経口投与に適切な製剤は、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤を含むことが可能な、水性及び非水性等張性無菌注入溶液、及び標的対象者の血液との等張性を製剤に付与する溶質、及び懸垂剤、可溶化剤、糊料、安定剤及び防腐剤を含むことが可能な水性及び非水性無菌サスペンションを含む。本発明の実施においては、組成物は、例えば、静脈内注入で、あるいは経口的に、局所的に、腹膜内に、膀胱内に、またはクモ膜下腔内に投与できる。非経口投与、経口投与、皮下投与及び静脈内投与は、特に有用な投与方法である。適切な溶液製剤の具体的な実施例は、水中に、約０．１から１００ｍｇ／ｍｌの化合物及び約１０００ｍｇ／ｍｌのプロピレングリコールを含んでもよい。適切な溶液製剤のもう一つの具体的な実施例は、水中に、約０．１または約０．２から約１００ｍｇ／ｍｌの化合物、及び約８００から１０００ｍｇ／ｍｌのポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）を含んでもよい。
【０１８５】
適切な懸濁製剤の具体的な実施例は、約０．２から３０ｍｇ／ｍｌの化合物と、水中に、以下のもの、約２００ｍｇ／ｍｌのエチルアルコール、約１０００ｍｇ／ｍｌの植物油（例えば、トウモロコシ油）、約６００から１０００ｍｇ／ｍｌの果汁（例えば、ブドウ液）、約４００から８００ｍｇ／ｍｌのミルク、約０．１ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルセルロース（または微結晶性セルロース）、約０．５ｍｇ／ｍｌのベンジルアルコール（またはベンジルアルコールと塩化ベンザルコニウムとの組合せ）及び約４０から５０ｍＭ緩衝液、ｐＨ７（例えば、ホスフェート緩衝液、酢酸緩衝液またはシトラート緩衝液、あるいは代替的に、緩衝液の代わりに５％のブドウ糖を使用してもよい）、からなるグループから選択される一つ以上の賦形剤を含んでもよい。
【０１８６】
適切なリポソーム懸濁製剤の具体的な実施例は、約０．５から３０ｍｇ／ｍｌの化合物、約１００から２００ｍｇ／ｍｌのレシチン（あるいは他のホスホリピド、またはホスホリピドの混成）及びオプションとして、５ｍｇ／ｍｌのコレステロール水溶液を含んでもよい。化合物の皮下投与については、１００ｍｇ／ｍｌのレシチンとの５ｍｇ／ｍｌの化合物水溶液、及び１００ｍｇ／ｍｌのレシチン及び５ｍｇ／ｍｌのコレステロールとの５ｍｇ／ｍｌの化合物水溶液を含むリポソーム懸濁製剤が、良い結果を提供する。
【０１８７】
化合物の調製は、アンプル及びバイアル等の、単位用量またはマルチ用量用密封容器に入れて提示されてもよい。注入溶液及び懸濁液は、上記に説明した種類の無菌粉末、顆粒及び錠剤から調製できる。
【０１８８】
医薬品は、特に単位投薬形態が有用である。そのような形態では、製剤が、化合物を適切な量だけ含む単位用量へ細分割されている。単位投薬形態は、パック製剤でよい、すなわち、パック錠剤、カプセル、及びバイアルまたはアンプルに入れた粉末などの、製剤を固有量で含むパッケージである。また、単位投薬形態は、カプセル、錠剤、カシェ剤またはトローチ剤それ自体でもよく、あるいは、それらを適切な数でパックした形態でもよい。組成物は、必要に応じて、下記に更に詳細に考察する他の互換性を持つ治療薬を含むこともできる。
【０１８９】
一つの実施形態においては、活性化合物は、体内からの急速な除去から化合物を保護する担体を含んで調製される。例えば、インプラント及びマイクロカプセル送達システムを含む放出制御製剤などである。例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸などの、生物分解可能な、生物学的適合性ポリマーが使用可能である。そのような製剤の調製方法は、当業者には明らかである。物質は、また、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（マウンテンビュー、カリフォルニア州）やＧｉｌｆｏｒｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（ボルチモア、メリーランド州）から購入することもできる。リポソーム懸濁液は、また、医薬的に許容可能な担体でもある。これらは、当業者に既知である方法によって、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，５２２，８１１（参照により全文が本文へ援用される）に説明があるように調製されてもよい。例えば、リポソーム製剤は、無機溶媒中に、（ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリン及びコレステロール等の）適切な脂質を溶かして調合してもよい。それから、蒸発させて、容器の表面上に乾燥脂質の薄膜を残留させる。それから、その容器へ、活性化合物またはその誘導体の水溶液を導入する。それから、手で容器を振盪させて容器の側面から脂質物質を遊離させ、脂質凝集体を分散させることによってリポソーム懸濁液をつくる。
運動神経疾患、アルツハイマー病及びアルツハイマー病痴呆の診断、及び、対象者における、及び臨床試験における薬剤活性のモニタリング
【０１９０】
一つの実施形態においては、本発明の方法は、本文に概説する生化学的マーカーの利用により、運動神経疾患の早期診断を可能にする。また、症状発症前の運動神経疾患の検出を可能にする。本発明の方法を利用し、例えば、小丘及び軸索幹（ＳＴＯＰ）微小管内における過剰な運動（例えば、不安定性、高代謝回転率）を検出することによって、ＡＬＳ等の運動神経疾患の存在が検出可能である。軸索微小管は、概して、非常に安定である（本質的に、標準アッセイ時間に渡るチュービュリン交換は全くない）ため、この文脈における『不安定性』は、運動神経細胞微小管内への新しいチュービュリン組み込みの、パーセンテージ上昇を指す。
【０１９１】
特定な実施形態においては、本発明の方法は、運動神経疾患、アルツハイマー病及びアルツハイマー病痴呆を診断するために使用できる。特定な実施形態における運動神経疾患は、痴呆症状に関連している。特定な実施形態における運動神経疾患は、パーキンソン病痴呆（ＰＤＤ）またはアルツハイマー病痴呆（ＡＤＤ）の痴呆症状に関連している。特定な実施形態においては、そうでない運動神経疾患は、痴呆の症状に関連している。特定な実施形態における運動神経疾患は、パーキンソン病（ＰＤ）またはアルツハイマー病（ＡＤ）の痴呆症状に関連している。
【０１９２】
特定な実施形態においては、本発明の方法は、パーキンソン病（ＰＤ）、パーキンソン病痴呆（ＰＤＤ）、アルツハイマー病、アルツハイマー病痴呆（ＡＤＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、進行性延髄麻痺（ＰＢＰ）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）及び脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を診断するために使用できる。
【０１９３】
特定な実施形態においては、本発明の方法は、運動神経疾患の進行をモニターするために使用できる。特定な実施形態における運動神経疾患は、痴呆症状に関連している。特定な実施形態における運動神経疾患は、パーキンソン病痴呆（ＰＤＤ）またはアルツハイマー病痴呆（ＡＤＤ）の痴呆症状に関連している。特定な実施形態においては、そうではない運動神経疾患は、痴呆症状に関連している。特定な実施形態における運動神経疾患は、パーキンソン病（ＰＤ）またはアルツハイマー病（ＡＤ）の痴呆症状に関連している。
【０１９４】
特定な実施形態においては、本発明の方法は、パーキンソン病（ＰＤ）、パーキンソン病痴呆（ＰＤＤ）、アルツハイマー病、アルツハイマー病痴呆（ＡＤＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、進行性延髄麻痺（ＰＢＰ）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）及び脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の進行をモニターするために使用できる。
【０１９５】
関連実施形態においては、本発明の方法は、例えば、小丘及び軸索幹微小管の運動における変化を検出することによって、運動神経疾患を患う個々の対象者の、治療的処置への反応のモニタリングを可能にする。
【０１９６】
もう一つの関連実施形態においては、本発明の方法は、運動神経疾患に対する治療として臨床試験でテストされている候補薬剤の有効性の評価を可能にする。候補治療薬での治療中、例えば、小丘及び軸索幹微小管の運動変化を、複数の処置群において評価し、それらを統計学的に比較して、治療法の生化学的有効性を判定できる。
運動神経疾患、アルツハイマー病及びアルツハイマー病痴呆に関連する生化学的マーカーの全身的な発現の、脳内の特定な領域へのマッピング
【０１９７】
一つの実施形態においては、本発明の方法は、運動神経疾患、アルツハイマー病及びアルツハイマー病痴呆に関連する全身的なバイオマーカーの、脳内の特定な領域へのマッピングを可能にする。具体的には、例えば、血液、尿またはＣＳＦの試料を、健康な対象者と、運動神経疾患、アルツハイマー病及びアルツハイマー病痴呆を患う対象者から採集し、それら試料からの生化学的マーカーを分析できる。特定な実施形態においては、運動神経疾患によって影響を受ける脳の部位は知られている。運動神経疾患、アルツハイマー病及びアルツハイマー病痴呆の影響を受けた脳の部位が既知である場合、運動神経疾患にリンクされて血液、尿またはＣＳＦ中に検出される生化学的マーカーは、脳内の特定な部位へさらにリンク（すなわち、マップ）できる。
【０１９８】
特定な非限定的な実施形態においては、脳の特定部位にマップされる運動神経疾患、アルツハイマー病及びアルツハイマー病痴呆は、パーキンソン病（ＰＤ）、パーキンソン病痴呆（ＰＤＤ）、アルツハイマー病、アルツハイマー病痴呆（ＡＤＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、進行性延髄麻痺（ＰＢＰ）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）及び脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）であり得る。
【０１９９】
特定な非限定的な実施形態においては、生化学的マーカー（及びそれらの相関運動神経疾患）は、大脳、小脳、大脳辺縁系、脳幹、前頭葉、頭頂葉、後頭葉、側頭葉、視床、視床下部、扁桃体、海馬、中脳、脳橋または延髄へマッピングできる。
模範的な生化学的マーカー
【０２００】
一つの実施形態においては、本発明の方法は、運動神経疾患の生化学的プロフィールを表す。特定な非限定的実施形態における生化学的マーカーは、クロモグラニンＢ、プロエンケファリンＡ、神経分泌タンパク質ＶＧＦ及びクラステリンである。
【０２０１】
セクレトニューリンとしても既知であるクロモグラニンＢは、セクレトグラニンII（クロモグラニンＣ）に由来する３３−アミノ酸ニューロペプチドである。それは、多種多様なペプチド作動性内分泌細胞に見られるチロシン硫酸化分泌タンパクであり、他の生物活性ペプチドに対する前駆体である可能性のある神経内分泌系分泌顆粒タンパク質として機能する。
【０２０２】
プロエンケファリンＡは、タンパク質切断を介してエンケファリン・ペプチドを生成する内因性オピオイドポリペプチドホルモンである。それは、痛み認識及びストレスへの反応を含む多数の生理的機能を果たす。さらに、それは、シネンケファリン、メトエンケファリン、ＰＥＮＫ（１１４−１３３）、ＰＥＮＫ（１４３−１８３）、メトエンケファリン−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−エンケファリン、ＰＥＮＫ（２３７−２５８）及びメトエンケファリン−Ａｒｇ−Ｐｈｅへ分割される。したがって、本発明の特定な態様においては、シネンケファリン、メトエンケファリン、ＰＥＮＫ（１１４−１３３）、ＰＥＮＫ（１４３−１８３）、メトエンケファリン−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−エンケファリン、ＰＥＮＫ（２３７−２５８）またはメトエンケファリン−Ａｒｇ−Ｐｈｅは、プロエンケファリンＡに代わる、あるいはそれに追加の標的生化学的マーカーであり得る。
【０２０３】
神経分泌タンパク質ＶＧＦは、神経系の成熟中、細胞間相互作用の規制またはシナプス形成に関わっている可能性がある。それは、概して中央及び末梢神経系に見られ、神経細胞及び神経内分泌系細胞だけで合成される。さらに、それは、神経内分泌調節ペプチド−１と神経内分泌調節ペプチド−２とに分割される。したがって、本発明の特定な態様においては、神経内分泌調節ペプチド−１または神経内分泌調節ペプチド−２は、神経分泌タンパク質ＶＧＦに代わる、あるいはそれに追加の標的生化学的マーカーであり得る。
【０２０４】
クラステリンは、細胞破片及びアポトーシスの一掃に関連する７５から８０ｋＤａの、二硫化物にリンクされたヘテロ二量体タンパク質である。それは、大部分の哺乳類の組織内に発現され、血漿、ミルク、尿、脳脊髄液及び精液内に見られる。研究によって、クラステリンとアルツハイマー病との関連も発見されている。さらに、研究は、アルツハイマー病を既に患っている人々が、アルツハイマー病でない人々に比べ、血液中により多くのクラステリンを含むことを示唆している。クラステリンは、クラステリン・ベータ鎖とクラステリン・アルファ鎖とに分割できる。したがって、本発明の特定な態様においては、クラステリン・ベータ鎖またはクラステリン・アルファ鎖は、クラステリンに代わる、あるいはそれに追加の標的生化学的マーカーであり得る。
新薬発見及び開発
【０２０５】
一つの実施形態における方法は、生体系が化合物または化合物の組合せに曝露された後に観察される微小管運動に対する影響を査定することを可能にする。したがって、生成及び分析データは、ＤＤＤＡ意思決定プロセスを容易にするため、新薬発見、開発及び認可（ＤＤＤＡ）プロセスに有用である。すなわち、（例えば微小管運動安定化データが有望に見える場合に）化合物または化合物の組合せに関して更に開発を続ける、または、例えば、微小管運動安定化データが好ましくない場合は、前記開発を停止する決定において、それは意思決定者に有用な情報を提供する（このプロセスを図解する図１３を参照）。
【０２０６】
さらに、方法は、当業者が、一種類の化合物内の『種類で最高のもの』を識別する、選択する及び／または特徴づけることを可能にする（すなわち、『クラス最高』）。一度識別、選択及び／または特徴づけを行ったら、当業者は、本発明の方法によって生成された情報に基づき、さらに深く『種類で最高の』ものを求める決定を下す、あるいは薬品会社またはバイオテクノロジー会社等の他の企業へ化合物のライセンスを付与できる（図１４を参照）。
【０２０７】
図１４は、新薬発見プロセスにおける、本文の発明の利用を例示する。ステップ０１で、複数の候補剤が選択される。ステップ０３では、細胞内または動物全身内の微小管運動が、通常、本文で考察の方法に従って研究される。代替実施形態においては、発明が、例えば、標的発見プロセスで使用される場合、最初にステップ０３が実行される。ステップ０５で、関連微小管運動データが識別される。例えば、微小管運動を減少させることが望ましいならば、その運動を減少させる化合物が、概してより有用であると思われる。逆に言えば、その運動を増加させる化合物は望ましくない。標的発見プロセスにおいては、他の表現型に対して微小管運動を増加させた、あるいは減少させた特定な表現型（例えば、患者に対して、健常者、すなわちコントロール）が、良い治療または診断標的である、あるいは良い治療または診断標的に向かっている、と見なされてもよい。ステップ０７で、注目の化合物、注目の標的または診断法が、選択され、さらに使用され、さらに開発される。標的のケースでは、そのような標的は、例えば、周知の小分子スクリーニング・プロセスの対象物などであってもよい（例えば、新しい化学物質の高スループット・スクリーニング）。代替的に、生物学的因子、あるいは既に承認された薬剤または他の候補剤（または候補剤の組合せ及び／または混合物）を使用してもよい。ステップ０９で、化合物または診断法が、販売あるいは配布される。販売あるいは配布されるものは、本発明の方法によって識別された『種類で最高の』ものである。もちろん、図１４のプロセスにおける一つ以上のステップは、最適な結果を得るために、ほとんどのケースで何度も繰り返されることが知られている。
【実施例】
【０２０８】
【実施例１】
【０２０９】
チュービュリン・ダイマー及びポリマーの単離
チュービュリンは、以前に説明したプロトコルにマイナーな修正を加えて精製した（Ｆａｎａｒａ，Ｐ．，Ｏｂａｃｋ，Ｂ．，Ａｓｈｍａｎ，Ｋ．，Ｐｏｄｔｅｌｅｊｎｉｋｏｖ，Ａ．，Ｂｒａｎｄｔ，Ｒ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＩＮＵＳ，ａ  ｓｍａｌｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｈａｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｓ  ａ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．１８，５６５−５７７（１９９９）；Ｆａｎａｒａ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｔａｂｌｅ  ｉｓｏｔｏｐｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｈｅａｖｙ  ｗａｔｅｒ．  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔａｘａｎｅｓ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，４９９４０−４９９４７（２００４））。生体外での精製のために、マウスをイソフルランで麻酔させ、頚椎脱臼によって安楽死させた。座骨神経は、以下の通りに解剖して単離した。体の下半分に渡って筋肉を曝露するために、皮膚を剥いだ。ハサミを用いて、脊髄は、腰部の直下と、広い仙椎領域の直ぐ上とで切断した。部分的に開いたハサミを、脊椎の腰部に沿って尻の広い腸骨部分に当たるまで滑らせた。これによって、座骨神経を、可能な限り脊髄の間近で切断する。鉗子を用いて、脚の腿部分（大腿骨）に渡って筋層を持ち上げた。それから、筋肉の浅葉を慎重に切開し、筋層間の白い神経を曝露させた。神経を覆う筋肉を切断し、切り込みを、足と腰の方へ広げた。腰で、神経は回って骨盤骨へ下る。小さなハサミの先端を、脊柱に平行に、第一の脊髄の切断箇所の方へ、筋肉内に滑り込ませた。これによって、座骨神経の最後のセクション（神経筋接合部の成長円錐）を曝露させた。鉗子を用いて、白い神経を握り、持ち上げた。より小さなハサミを使用し、筋肉に残っている僅かな部分を切断した。それから、すぐに組織をチューブに入れ、ＭＳＢ中に穏やかに均質化した。微小管ポリマーからの細胞質ゾル・チュービュリン・ダイマーを分離させるため、ポスト核上澄みを、２０℃で３５分間、１９０，０００×ｇで遠心分離した。（溶解二量体チュービュリンを含む）上澄みまたは非微小管フラクションを、（重合チュービュリンを含む）ペレットまたは微小管フラクションから分離させ、急速冷凍し、−２０℃で保存した。微小管ペレットは、連続的な免疫アフィニティー・クロマトグラフィー・ステップによって、さらに分別した。タウ関連微小管を単離するために、ＴＡＵ５抗体を、０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で、エポキシ活性化セファロース・ビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に共有結合させた。約０．２ｍｇの微小管ペレットを、室温で１時間、０．５ｍｌのＭＳＢ中にＴＡＵ−５ビーズと一緒に温置した。非結合物質を取り除き、ビーズを３回、０．５ｍｌのＭＳＢで洗浄した。結合物質は、１ＭのＮａＣｌを含む０．５ｍｌのＭＳＢ中で溶出させた。いくつかの実験では、ＭＡＰ２−関連微小管は、同じプロトコルを用いる免疫親和性・クロマトグラフィーによって、ＴＡＵ５−非結合物質から、ＭＡＰ２抗体に結合されたエポキシ活性化セファロース・ビーズ（１ｍｌのビーズにつき０．５ｍｇの抗体）上にキャプチャした。各調整におけるチュービュリンの相対存在度（チュービュリン・ダイマーと、ＴＡＵ５−結合、ＭＡＰ２−結合及び非結合微小管フラクション）を、ウエスタンブロットによって定量化し、以前に説明のように、これらフラクションからのチュービュリンは、イオン交換とサイズ排除クロマトグラフィーとによってさらに精製した（Ｆａｎａｒａ，Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｔａｂｌｅ  ｉｓｏｔｏｐｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｈｅａｖｙ  ｗａｔｅｒ．  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔａｘａｎｅｓ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，  ４９９４０−４９９４７（２００４））。
【実施例２】
【０２１０】
低温安定微小管の単離
低温安定微小管は、以前に説明したプロトコルのマイナーな修正にて単離した（Ｐｉｒｏｌｌｅｔ，Ｆ．，Ｄｅｒａｎｃｏｕｒｔ，Ｊ．，Ｈａｉｅｃｈ，Ｊ．，Ｊｏｂ，Ｄ．，Ｍａｒｇｏｌｉｓ，Ｒ．Ｌ．Ｃａ（２＋）−ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｂｏｖｉｎｅ  ｂｒａｉｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１，８８４９−８８５５（１９９２））。手短に言うと、細胞または組織の粗ホモジェネートを、１．５ｍＭのＣａＣｌ２を含む氷冷ＭＳＢ内で調製した（Ｆａｎａｒａ，Ｐ．，Ｏｂａｃｋ，Ｂ．，Ａｓｈｍａｎ，Ｋ．，Ｐｏｄｔｅｌｅｊｎｉｋｏｖ，Ａ．，Ｂｒａｎｄｔ，Ｒ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＩＮＵＳ，ａ  ｓｍａｌｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｈａｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｓ  ａ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．１８，５６５−５７７（１９９９））。緩衝液の細胞質量または脳組織に対する割合は、１．４：１（ｖｏｌ／ｗｔ）の比率にセットした。氷に２分間付けた後、ＥＧＴＡを加えて３ｍＭの終濃度にした。その混合液は、氷上で、さらに１分間均質化させた。抽出物は、４℃で３０分間、１５０，０００×ｇで遠心分離し、上澄みを採集した。上澄みを３０℃で温置することによって、微小管組み立てを開始した。１時間後、抽出物は、４℃で２０分間冷却し、微小管安定緩衝液中の５０％（ｗｔ／ｖｏｌ）のスクロース・クッションを介して、３０分間、２００，０００×ｇで遠心分離した。４℃で微小管不安定化緩衝液中に最終ペレット（低温安定微小管）を浮遊させた後、以前に説明したように、チュービュリンを精製した（Ｆａｎａｒａ，Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｔａｂｌｅ  ｉｓｏｔｏｐｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｈｅａｖｙ  ｗａｔｅｒ．  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔａｘａｎｅｓ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７９，４９９４０−４９９４７（２００４））。
【実施例３】
【０２１１】
ＧＣ／ＭＳ分析のためのチュービュリンの処理
チュービュリン試料は、１１０℃で１６時間、６ＮのＨＣｌで処置することによって加水分解した。タンパク質由来のアミノ酸は、ペンタフルオロベンジル誘導体へ誘導体化させ、アラニンへの２Ｈ組み込みを、他の文献に詳細に説明されているように、ＧＣ／ＭＳによって測定した（Ｆａｎａｒａ，Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｔａｂｌｅ  ｉｓｏｔｏｐｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｈｅａｖｙ  ｗａｔｅｒ．  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔａｘａｎｅｓ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７９，４９９４０−４９９４７（２００４））。２Ｈ濃縮は、（Ｍ＋１）質量アイソトポマーとして存在するアラニン誘導体のパーセンテージにおける、天然存在度に対するパーセント増加として計算した。
【実施例４】
【０２１２】
体内水分中の２Ｈ２Ｏ濃縮の測定
体内水分濃縮２Ｈ２Ｏ濃縮及び培養媒体を、上記説明のように測定した。手短に言うと、プラズマ水分からの陽子を、カルシウムカーバイドとの反応によって、アセチレンへ移した。それから、アセチレン試料を、ｍ／ｚ  ２６及び２７（Ｍ０及びＭ１）でイオンを記録するように修正されたシリーズ３０００サイクロイド質量分析計（Ｍｏｎｉｔｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、チェスウィック、ペンシルバニア州）を用いて分析し、非標識水に９９．９％の２Ｈ２Ｏを混合させて準備した標準曲線に対して較正した。体内水分２Ｈ濃縮は、薬剤治療（データは示さない）による影響を受けることはなかった。
【実施例５】
【０２１３】
ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ・ＴＧＮマウスのノスカピン−ＭＫ８０１治療
メスＳＯＤ−１Ｇ９３Ａ・ＴＧＮマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した（系統＃２７２６）。コントロールは、整合同腹仔仲間であった。治療群は、１群につき３匹であった。ノスカピンは、３回／週（０．２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）腿部に腹腔内へ注射した。ＭＫ８０１は、連続的に飲料水中に投与した（１２ｍｇ／ｋｇ／ｄ）。歩行分析を、参照により本文に全文を援用するＷｏｏｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ  ２００５  ３２（１）：４３−５０及びＣａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９（８）：３２４８−３２５７の方法によって行った。
【０２１４】
臨床評価のために、終点スコアリングを以下の通りに選択した。
グループ分類：発症前
【０２１５】
臨床徴候：完全な機動性があり、年齢が同じコントロールから行動の差異を観察不可能（歩行または歩長分析）
グループ分類：発症
【０２１６】
臨床徴候：異常歩行または歩長分析及び後肢衰弱：同年齢同腹仔に対して＞４０％の歩長減少
グループ分類：最終段階（安楽死）
【０２１７】
臨床徴候：顕著で完全な（この系統においては、他に比べ、一方の肢に、より発生する）後肢麻痺、及び、５秒間の時間枠での立ち直りが不可能。このステージは、通常、マウスが歩行分析試験に失敗し続け、最終段階に入ると開始する。したがって、遺伝子組換えＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ・ＴＧＮマウスは、顕著で完全な後肢麻痺及び５秒間の時間枠での立ち直り不能を発症したときに安楽死させる。
【０２１８】
無処置の遺伝子導入マウスは、生後１５週目、疾患発症後約１７日に完全な後肢麻痺を示し始め、最終的に、生後１６週目に安楽死させた（以下の症状を示した：広範囲な麻痺、完全な歩幅のための一肢の引きつけ不能［歩行分析で「０」スコア］及び５秒時間枠で立ち直り不能）。
【０２１９】
処置マウスの１匹は、生後１６週間目、疾患発症後２５日、完全な後肢麻痺を示し始め、最終的に、１７週の週齢で安楽死させた（以下の症状を示した：広範囲な麻痺、完全な歩幅のための一肢の引きつけ不能［歩行分析で「０」スコア］及び５秒時間枠で立ち直り不能）。
【０２２０】
他の２匹の処置遺伝子導入マウスは、生後約１８週目に（歩行分析によってスコアされる）後肢衰弱を現し始めたが、その時点では、まだ顕著で完全な後肢麻痺は発症していなかった。
表１
【表１】
2016516202.tif 000006
ＡＬＳ・ＳＯＤ１・Ｇ９３Ａマウスで以前に研究され、ＡＬＳ・ＴＤＦあるいは他の研究者によって発表されたリルゾールＡＬＳ治療との比較：
【表２】
2016516202.tif 000007
ノスカピン及び／またはＭＫ−８０１で処置されたＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ・ＴＧＮマウスにおける運動障害の発症及び死亡：
【表３】
2016516202.tif 000008
【実施例６】
【０２２１】
症候性ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける治療的処置
図１６に、新規二薬剤療法の良好な識別を示す。ＭＴＭＡ／ＫＭ−ＩＤ０５薬剤を、症候性ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウス（１０週）へ投与し、３週間、治療を続けた（ｎ＝３）。治療の最後の２日間で２Ｈ２Ｏ（８％）を投与し、４８時間の標識後に、マウスを犠牲にした。脊髄の（Ｌ２及びＬ５レベル間の）腰部と座骨神経の全長を、解剖によって慎重に取り出し、脊髄運動神経及び座骨神経のすべての神経細胞コンパートメント内の微小管運動を測定した。
【０２２２】
図１６に詳述するように、ＭＴＭＡ／ＫＭ−ＩＤ０５処置ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスは、野生型マウスのそれのレベル近くまで、過活力性微小管の有意義な減少を示した。ＭＴＭＡ／ＫＭ−ＩＤ０５のこの望ましい効果は、すべての神経細胞コンパートメント内で検出された。
【０２２３】
ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける疾病進行に対するＭＴＭＡ／ＫＭ−ＩＤ０５の影響を測定するために、歩長測定を行った（図１７）。歩長は、食品着色料で染めたグリセリンを足に塗ることによって測定した。マウスが真っ直ぐに歩き、４回連続で明確な歩長測定値が得られるまで、試験を繰り返した。歩長は、同じ足の足跡の間であって、一つの足跡の中心から次の足跡の中心までの距離である。
【０２２４】
分析は、常に、同性で同年齢の遺伝子組換え無処置、治療及びコントロール動物を用いて、その日の同じ時間に実行した（ｎ＝２０）。コントロール・マウスとは違って、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスは、運動行為の年齢依存的低下を示した（図１７）。ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける疾患の発症は、（１２．５週齢での）４０％の歩長減少を特徴とし、その後、完全な後肢麻痺（１７週）の段階へと進行した急速な減衰段階があった。注目すべきは、二薬剤治療は、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける疾患の発症を有意に遅らせ、試験期間に渡って運動行為を改善したことである（図１７）。ＭＴＭＡ／ＫＭ−ＩＤ０５は、また、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける体重減少を３０％有意に減少させた（データは示さない）。
【０２２５】
ＭＴＭＡ／ＫＭ−ＩＤ０５治療が運動神経の退化を減少させたのかどうかを査定するために、各脊髄の坐骨運動神経プールのセグメント内の運動神経の数を計数した。治療の影響は、１５週齢ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおいて査定した。
【０２２６】
図１８Ａに、野生型コントロール（ＷＴ）無処置（ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ）及び治療（ＳＯＤ１Ｇ９３ＡＭＴＭＡ／ＫＭ−ＩＤ０５）マウスのニッスル染色脊髄セクションの例を示す。ＭＴＭＡ／ＫＭ−ＩＤ０５処置ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおいて観察される運動神経生存の改善は、運動神経生存の増加に反映された。図１８Ｂに、結果を要約する。１５週目に、無処置ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおいては、坐骨神経プール内のかなりの数の運動神経が、既に死滅し、僅かに１９７（±１０．２）運動神経のみが生き残っていた。対照的に、ＷＴ同腹仔では３８７（±６．２）であった。しかし、ＭＴＭＡ／ＫＭ−ＩＤ０５での治療は、かなりの部分の運動神経を救ったので、２９８（±４．４）運動神経が生き残っていた。したがって、ＭＴＭＡ／ＫＭ−ＩＤ０５処置ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおいては、１５週目でさえも、無処置のＳＯＤ１Ｇ９３Ａ同腹仔に比べ、５０％より多くの運動神経が生き残る。
【０２２７】
次に、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウス（ｎ＝２０）の寿命に対する、ＭＴＭＡ／ＫＭ−ＩＤ０５での治療の影響を調べた。無処置ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスは、平均１１８．５（±４．２）日の寿命である。これらの実験の最終段階は、マウスが体重の１５％を失い、完全な後肢麻痺と毛づくろいの欠如を示し、且つ、立つことができないことによって決定される。
【０２２８】
ＭＴＭＡ／ＫＭ−ＩＤ０５は、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの生存を有意に２５．６日も延ばし、２２％寿命を延長させた。
【０２２９】
結論として、ＭＴＭＡ／ＫＭ−ＩＤ０５は、症候性ステージで投与されると、微小管過運動を強力に減少させることができる。ＭＴＭＡ／ＫＭ−ＩＤ０５の作用機構は、疾患症状を寛解したことに注目すべきである。このことは、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの運動神経生存及び寿命に対して、有意な増加を反映した。
【０２３０】
低速軸索内輸送における変化は、変異体ＳＯＤ１遺伝子導入マウスの発病に関連づけられている。低速軸索内輸送は、運動速度に基づく二つの要素を持つことが、以前に示されている。一方が〜０．５ｍｍ／日で、他方が〜１から２ｍｍ／日である。輸送の両要素は、チュービュリンを含む。ＭＴＭＡ／ＫＭ−ＩＤ０５治療が、障害を受けた軸索内輸送を回復させることができるかどうかを判定するために、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ遺伝子導入マウスのＬ５根及び座骨神経内における、２Ｈ標識チュービュリンの輸送速度を測定した。１３週齢の無処置ＳＯＤ１Ｇ９３Ａにおける近位軸索のＬ５根、小丘及び初節には、ＷＴ同腹仔に比べ、２Ｈチュービュリンの有意な蓄積が見られる。しかし、ＭＴＭＡ／ＫＭ−ＩＤ０５での治療は、軸索に沿った２Ｈ標識チュービュリンの輸送速度を、完全に正常状態へ回復させた。したがって、ＭＴＭＡ／ＫＭ−ＩＤ０５治療ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける微小管に基づく軸索内輸送は、無処置のＳＯＤ１Ｇ９３Ａ同腹仔に比べ、完全に回復する。
【０２３１】
まとめて考察すると、これらの結果は、微小管運動が疾患活性のバイオマーカーであることを証明する。したがって、それらは、新しい治療法を評価する、また、ＡＬＳで臨床有効性を予測するために利用できる。
【０２３２】
図１９に詳述するように、我々は、生体内試験によって、多数の候補組合せ薬剤の相対的な神経保護活性を査定及び比較するために、微小管運動アッセイを使用した。「強力な」及び「弱い」神経保護間の臨床有効性の予測を評価した（図１９）。ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの疾病進行を遅らせる、及び、寿命を延長させる効力に関して、さらに評価するために、五つの二薬剤組合せを選択した（各グループ、ｎ＝２０マウス）（図２０）。治療ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスは、神経保護（微小管安定性）効果の関数として、寿命の１０％から３２％の延長を示した。我々は、生体内微小管運動の生化学的基準と、難しい臨床結果との間の著しく緊密な相関関係を記録した（歩長及び生存）（図２０）。これらの調査結果は、微小管運動が、疾患活性及び治療反応の強力なＡＬＳバイオマーカーであることを証明する（図２１）。
【０２３３】
[実施例６]ＭＴ媒介低速軸索内輸送の侵襲的生体内測定である。図２３に示すように、２Ｈ標識チュービュリンのＭＴ媒介低速軸索内輸送は、通常の野生型（ＷＴ）同腹仔に比べ、遺伝子組換え症候性ＳＤＯ１Ｇ９３Ａの座骨神経運動軸索内で減少している。各データ・ポイントは、３０から３５ｍｌ／ｋｇの２Ｈ２Ｏの単一大量瞬時投与後２１日に犠牲にした１３週齢マウスのＬ５根及び座骨神経からの、連続的な２ｍｍセグメントを表す。しかし、ＭＴＭＡでの３週間の治療後、２Ｈチュービュリンの微小管運動及び低速軸索内輸送は大いに回復する。だが、リルゾールは、有意な影響を全く示さなかった。
【０２３４】
[実施例７]ＭＴ媒介高速軸索内輸送の非侵襲的生体内測定である。図２４に、健康な運動神経と変性運動神経とを対比させて、神経細胞シナプス小胞カーゴ分子の分泌速度を測定するための動的テクニックの模範的なモデルを示す。ゴールは、疾患の影響を受けた神経細胞における障害性ＭＴ媒介輸送に関する特定なリアルタイム指数を提供することである。ＭＴに基づく輸送系は、主要な細胞骨格系の一つであり、それに沿って、キネシン及びダイニン・モーター・タンパク質が力を生じ、多くの細胞構成要素（例えばシナプス小胞）の通行を駆動する。ＭＴ媒介軸索内輸送は、主要な神経細胞の伝達及び輸送網であり、成長因子、神経伝達物質、酵素及びグリコプロテイン等の分泌小胞カーゴのための経路として機能する。ここでのテストの基本的な計画は、ＭＴ運動に障害が発生すると、２Ｈ標識小胞「カーゴ」の輸送及び分泌速度（すなわち、細胞体内での合成から、シナプスからの放出までの時間）が、ＭＴ輸送系によって影響を受けるため、ＣＳＦの収集による生体内測定が可能である、ことである。重水（２Ｈ２Ｏ）のパルス投与後、ＭＴ媒介高速軸索内輸送は、変性運動神経内の２Ｈ標識小胞カーゴ分子に関して、ＣＳＦ内への出現の遅延動特性及び同時発生的な脊髄運動神経内への貯留に基づいて遅くなる。
【０２３５】
図２５（Ａ）に詳述するように、（ＡＬＳの動物モデルを表す）遺伝子組換えＳＯＤ・Ｇ９３Ａマウスは、運動神経内の分泌分子を標識するために、重水（２Ｈ２Ｏ）が与えられる（合計ｎ＝３０マウス）。１６０ｎｍの小胞からなり、ＭＴ媒介軸索内輸送に基づく最高速移動輸送物質は、トランスゴルジ網（ＴＧＮ）から形質膜（軸索終末）まで、約２５０ｍｍ／日、すなわち約３μｍ／ｓの速度を持つと報告されている。したがって、小胞は、３ｃｍの軸索の細胞体から末端まで、約１．２日で移動する（１ｍの軸索を持つヒト対象者においては、これには約４から５日かかる）と予測される。マウスにおいて、連続的な時点（２４時、４８時、７２時、５日及び１０日）（ｎ＝６／時点）で、ＣＳＦ（５から７マイクロリットル／マウス）及びプラズマ（１００マイクロリットル／マウス）を採集する。市販の抗体を用いる免疫沈降によって、ＣＳＦから、運動神経分泌小胞成長因子（例えば、ニューレグリン−１［ＮｕｅＲ−１］）及びグリコプロテイン・クロモグラニンＢ［Ｃｈｒ−Ｂ］を単離する。（Ｂ）３０から３５ｍｌ／ｋｇの２Ｈ２Ｏの腹腔内パルス投与の後、すなわち標識後、週齢１３の野生型（ＷＴ）及び症候性ＳＯＤ１・Ｇ９３Ａマウスから、２４時、４８時、７２時、５日及び１０日にＣＳＦを採集した。ＣＳＦ試料は、最初に、プロテインＡ／Ｇビーズを用いてＩｇＧ免疫枯渇させてから、ニューレグリン−１抗体ビーズへ逐次結合させることによって分別した。溶出液は、１１０Ｃで１６時間、６ＮのＨＣｌで処置することによって加水分解した。タンパク質由来のアミノ酸は、ペンタフルオロベンジル誘導体へ誘導体化させ、ニューレグリン−１から解放されたアラニン内への２Ｈ組み込みを、ＧＣ／ＭＳによって測定した。同じプロトコルを用いて、グリコプロテイン・クロモグラニン−Ｂ［Ｃｈｒ−Ｂ］は、クロモグラニン−Ｂ［Ｃｈｒ−Ｂ］抗体への逐次結合によって、ニューレグリン−１［ＮｅｕＲ−１］非結合物質からキャプチャする。（Ｃ）経時変化は、１３週齢の通常の野生型（ＷＴ）及び遺伝子組換え症候性ＳＯＤ１Ｇ９３ＡマウスにおけるＣＳＦニューレグリン−１［ＮｅｕＲ−１］及びクロモグラニンＢ［Ｃｈｒ−Ｂ］内への、２Ｈ標識の出現を示す。ＣＳＦ、尿及び／または血液から単離後の分泌タンパク質（ニューレグリン−１［ＮｅｕＲ−１］及びクロモグラニンＢ［Ｃｈｒ−Ｂ］）は、１１０℃で１６時間、６ＮのＨＣｌで処置することによって加水分解する。タンパク質由来のアミノ酸は、他の文献に詳細に説明されているように、ペンタフルオロベンジル誘導体へ誘導体化させて、２Ｈ２Ｏから誘導体化アラニンへの２Ｈ組み込みを、ＧＣ／ＭＳによって測定する［Ｆａｎａｒａ，Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｔａｂｌｅ  ｉｓｏｔｏｐｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｈｅａｖｙ  ｗａｔｅｒ．  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔａｘａｎｅｓ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，４９９４０−４９９４７（２００４）；Ｆａｎａｒａ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒｄｙｎａｍｉｃ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｉｓ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔ��ｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ＡＬＳ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２，２３４６５−２３４７２，（２００７）］。２Ｈ濃縮は、アラニン誘導体の（Ｍ＋１）質量アイソトポマーの、天然存在度に対する増加パーセントとして計算する。これらの結果は、遺伝子組換えＳＯＤ１Ｇ９３ＡマウスがＭＴ媒介高速軸索内輸送の緩徐化を示すモデルと一貫している。
【０２３６】
図２６に示すように、我々は、通常の野生型（ＷＴ）及び遺伝子組換え症候性ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの脊髄腰部運動神経からのシナプス小胞を含むニューレグリン−１［ＮｅｕＲ−１］及びクロモグラニンＢ［Ｃｈｒ−Ｂ］のＭＴ輸送媒介分泌率を測定するために、パルス２Ｈ２Ｏ標識方法を使用した。（Ａ）シナプス小胞は、脊髄腰部から、シナプス小胞単離キット（シグマ）を用いて単離した。濃縮シナプス小胞フラクションの存在を調べ、濃縮ステップを確認するために、抗シナプトフィジン抗体を用いる免疫ブロット分析を最初に使用した。抗シナプトフィジン抗体は、小胞膜結合タンパク質シナプトフィジンに対して特異なものである［Ｇｉｎｇｅｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎａｐｔｏｐｈａｓｙｎ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｃｈａｎｎｅｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，  ８３，３２２３−３２２９，（２００２）］。（Ｂ）３０から３５ｍｌ／ｋｇの２Ｈ２Ｏの腹腔内パルス投与の後、標識後２４時間、４８時間及び７２時間に、週齢１３の野生型（ＷＴ）及び症候性ＳＯＤ１・Ｇ９３Ａマウスから脊髄腰部を採集した（ｎ＝３、平均±ＳＤ）。脊髄腰部からの濃縮シナプス小胞フラクションは、ニューレグリン−１抗体ビーズへの逐次結合によって分別した。溶出液は、１１０Ｃで１６時間、６ＮのＨＣｌで処置することによって加水分解した。タンパク質由来のアミノ酸は、ペンタフルオロベンジル誘導体へ誘導体化させ、ニューレグリン−１から解放されたアラニン内への２Ｈ組み込みを、ＧＣ／ＭＳによって測定した。同じプロトコルを用いて、グリコプロテイン・クロモグラニン−Ｂ［Ｃｈｒ−Ｂ］は、クロモグラニン−Ｂ［Ｃｈｒ−Ｂ］抗体への逐次結合によって、ニューレグリン−１［ＮｅｕＲ−１］非結合物質からキャプチャする。経時変化は、週齢１３の野生型（ＷＴ）及び遺伝子組換え症候性ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの脊髄腰部からのシナプス小胞を含む２Ｈ標識ニューレグリン−１［ＮｅｕＲ−１］及び２Ｈ標識クロモグラニンＢ［Ｃｈｒ−Ｂ］の貯留動特性を示す。これらの結果は、ＣＳＦへの、同じカーゴ分子、２Ｈ標識ニューレグリン−１［ＮｅｕＲ−１］及び２Ｈ標識クロモグラニンＢ［Ｃｈｒ−Ｂ］の出現動特性における遅延と一貫している。これらのデータは、遺伝子組換えＳＯＤ１Ｇ９３ＡマウスがＭＴ媒介高速軸索内輸送の緩徐化を示していることを確証する。
【０２３７】
図２７に詳述するように、過活力性ＭＴの調整を介するＭＴＭＡ、ノスカピンの投与は、シナプス小胞を含む２Ｈ標識ニューレグリン−１［ＮｅｕＲ−１］及び２Ｈ標識クロモグラニンＢ［Ｃｈｒ−Ｂ］のＭＴ媒介高速軸索内輸送速度を正常化した。ＭＴＭＡ及びノスカピン（１００ｍｇ／ｋｇ／ｄ及び２００ｍｇ／ｋｇ／ｄ）での３週間の治療後、３０から３５ｍｌ／ｋｇの２Ｈ２Ｏ・ＣＳＦの腹腔内パルス投与を行った。週齢１３の野生型（ＷＴ）及び症候性ＳＯＤ１・Ｇ９３Ａマウスから、２４時間、４８時間及び７２時間に、各々、ＣＳＦ及び脊髄腰部を採集した。シナプス小胞を含む２Ｈ標識ニューレグリン−１［ＮｅｕＲ−１］または２Ｈ標識クロモグラニンＢ［Ｃｈｒ−Ｂ］のＣＳＦ分泌速度及び神経細胞貯留動特性を、上記説明の通りに測定した（図２３及び図２４）。これらの結果は、遺伝子組換えＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスが高速軸索内輸送の緩徐化を示す、また、ノスカピンが、遺伝子組換えＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける、この遅延高速軸索内輸送を改善するモデルと一貫している。
【図１Ａ】
2016516202.tif 000009
【図１Ｂ】
2016516202.tif 000010
【図１Ｃ】
2016516202.tif 000011
【図２】
2016516202.tif 000012
【図３】
2016516202.tif 000013
【図４】
2016516202.tif 000014
【図５】
2016516202.tif 000015
【図６】
2016516202.tif 000016
【図７】
2016516202.tif 000017
【図８】
2016516202.tif 000018
【図９】
2016516202.tif 000019
【図１０】
2016516202.tif 000020
【図１１Ａ】
2016516202.tif 000021
【図１１Ｂ】
2016516202.tif 000022
【図１１Ｃ】
2016516202.tif 000023
【図１２】
2016516202.tif 000024
【図１３】
2016516202.tif 000025
【図１４】
2016516202.tif 000026
【図１５】
2016516202.tif 000027
【図１６】
2016516202.tif 000028
【図１７】
2016516202.tif 000029
【図１８】
2016516202.tif 000030
【図１９】
2016516202.tif 000031
【図２０】
2016516202.tif 000032
【図２１】
2016516202.tif 000033
【図２２】
2016516202.tif 000034
【図２３】
2016516202.tif 000035
【図２４】
2016516202.tif 000036
【図２５】
2016516202.tif 000037
【図２６】
2016516202.tif 000038
【図２７】
2016516202.tif 000039
【図２８】
2016516202.tif 000040
【図２９】
2016516202.tif 000041
【図３０】
2016516202.tif 000042
【図３１】
2016516202.tif 000043
【図３２】
2016516202.tif 000044
【図３３】
2016516202.tif 000045
【図３４】
2016516202.tif 000046
【図３５】
2016516202.tif 000047
【図３６】
2016516202.tif 000048
【図３７】
2016516202.tif 000049
【図３８】
2016516202.tif 000050
【図３９】
2016516202.tif 000051
【国際調査報告】
2016516202.tif 000052
2016516202.tif 000053
2016516202.tif 000054
2016516202.tif 000055
2016516202.tif 000056
2016516202.tif 000057
2016516202.tif 000058
2016516202.tif 000059
2016516202.tif 000060