(57)【要約】  本発明は、移植後のヒト白血球抗原（HLA）に対する免疫応答の予測方法に関する。前記方法は、HLAミスマッチを判定するためのドナー及び／又はドナー材料並びにレシピエントのHLA型判定と予測される間接的に認識されるHLAエピトープ（PIRCHES）の数の決定を含む。したがって、本発明は、同種異系間移植のためのドナー材料の選択及び／又はスクリーニングのための方法、例えば、ミスマッチの非血縁ドナーから許容されるミスマッチを有するドナー材料を選択するための方法を提供する。好適な実施例では、該方法は、造血幹細胞、臍帯血、腎臓及び／又は他の細胞、組織又は臓器の移植後に起こり得る望ましくない同種抗原反応性の移植前予測に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植後のヒト白血球抗原（HLA）に対する免疫応答の予測方法であって、ここで前記免疫応答がドナーとレシピエントの間のHLAミスマッチに伴うものであって、
ここで、前記方法は、以下を含む。
HLAミスマッチを判定するためのドナー及び／又はドナー材料並びにレシピエントのHLA型判定、及び
予測される間接的に認識されるHLAエピトープ（PIRCHES）の数の決定、ここで前記PIRCHESがミスマッチのレシピエントHLAアリルからのレシピエント特異的又はドナー特異的HLA由来ペプチドであり、かつ共有される（マッチする）HLA分子により提示されることが予測され、ここで、PIRCHESの数が前記免疫応答の可能性と相関関係にある。
【請求項２】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記免疫応答の可能性がPIRCHESの増加数とともに増加する、前記方法。
【請求項３】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここでミスマッチのレシピエントHLAアリルからの前記レシピエント特異的又はドナー特異的HLA由来ペプチドがヒトプロテアソームの前記ペプチド内の切断部位を同定するためのコンピュータ実施方法により同定される、前記方法。
【請求項４】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここで共有される（マッチする）HLA分子によるペプチドの前記提示が任意のHLA分子への前記ペプチドの結合を予測するコンピュータ実施方法により判定される、前記方法。
【請求項５】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記移植が幹細胞の由来に関係なく、幹細胞の移植を含む、前記方法。
【請求項６】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記移植が造血幹細胞移植（HSCT）を含む、前記方法。
【請求項７】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記移植が臍帯血移植又は臍帯血細胞移植を含む、前記方法。
【請求項８】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記移植が腎移植を含む、前記方法。
【請求項９】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法を含む、同種異系間移植のための細胞又は組織標本又は器官の選択方法。
【請求項１０】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法を含む、許容されるミスマッチを有する同種異系間移植のためのドナー材料の選択及び／又はスクリーニングの方法。
【請求項１１】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法を含む、移植の治療結果の予測方法。
【請求項１２】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法を含む、移植の治療結果の予測方法であって、ここで前記治療結果が患者の生存、無病生存及び移植関連死からなる群から選択される、方法。
【請求項１３】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記免疫応答がT細胞媒介性応答を含む、前記方法。
【請求項１４】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記免疫応答が抗体媒介性応答を含む、前記方法。
【請求項１５】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記免疫応答が望ましくない同種抗原反応性を含む、前記方法。
【請求項１６】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記免疫応答が望ましい同種抗原反応性を含み、ここで望ましい同種抗原反応性が抗白血病性の同種抗原反応性であり得る、前記方法。
【請求項１７】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記免疫応答が急性の移植片対宿主病（aGVHD）又は慢性の移植片対宿主病（cGVHD）をもたらす、前記方法。
【請求項１８】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記免疫応答が腎移植後にドナー特異的HLA IgG抗体の新規発生をもたらす、前記方法。
【請求項１９】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記PIRCHESが長さ５〜２０アミノ酸であって、好ましくは長さ８〜１５アミノ酸である、前記方法。
【請求項２０】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記PIRCHESが九量体の（長さ９アミノ酸の）ペプチドである、前記方法。
【請求項２１】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記PIRCHESが共有されるHLAクラスI（PIRCHE I）又は共有されるHLAクラスII（PIRCHE II）により提示される、前記方法。
【請求項２２】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここでPIRCHE-Iペプチドが１０ μM以下、好ましくは１０００ nM以下、より好ましくは５００ nM以下の予測IC５０結合値を有する、前記方法。
【請求項２３】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここでPIRCHE-IIペプチドが２０ μM以下、好ましくは５ μM以下、より好ましくは１０００ nM以下の予測IC５０結合値を有する、前記方法。
【請求項２４】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここでHLA型判定がHLAサブタイプのHLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB１、HLA-DQB１、HLA-DPB１、HLA-DQA１、HLA-DPA１、HLA-G、HLA-E、HLA-F、MICA、MICB及び／又はKIRに対して行われる、前記方法。
【請求項２５】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここでHLA型判定がHLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB１及びHLA-DQB１に対して行われる、前記方法。
【請求項２６】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここでHLA型判定が血清学的及び／又は分子型判定を含む、前記方法。
【請求項２７】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここでHLA型判定が配列に基づく型判定法（sequence-based typing）により高解像度レベルで行われる、前記方法。
【請求項２８】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここでHLA型判定がHLAクラスIアリルのエクソン１〜７及びHLAクラスIIアリルのエクソン１〜６の配列決定を含む、前記方法。
【請求項２９】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここでHLA型判定がHLAクラスIアリルのためにエクソン２及びエクソン３、及びHLAクラスIIアリルのためにエクソン２の高解像度HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB１、及びHLA-DQB１型判定を含む、前記方法。
【請求項３０】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法を含む、許容可能なミスマッチを有する同種異系間移植のためのドナー材料の選択及び／又はスクリーニングのための方法であって、ここで該方法が移植に先立って行われる、方法。
【請求項３１】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここで同種異系間移植のためのドナー材料が、少なくとも１のアリルマッチを有するドナー由来である、前記方法。
【請求項３２】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここで同種異系間移植のためのドナー材料が、１０／１０マッチ並びに１のHLA-DPミスマッチを有するドナー由来である、前記方法。
【請求項３３】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここで同種異系間移植のためのドナー材料が、９／１０マッチの非血縁ドナー由来である、前記方法。
【請求項３４】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここでPIRCHE-Iの数が３以下、好ましくは２以下、より好ましくは１以下のとき、同種異系間移植のためのドナー材料が、望ましくない免疫応答を伴うリスクが低い、前記方法。
【請求項３５】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここでPIRCHE-IIの数が４以下、好ましくは３以下、より好ましくは２以下のとき、同種異系間移植のためのドナー材料が、望ましくない免疫応答を伴うリスクが低い、前記方法。
【請求項３６】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここでPIRCHE-I及びPIRCHE-IIの数の合計が６以下、好ましくは４以下、より好ましくは２以下のとき、同種異系間移植のためのドナー材料が、望ましくない免疫応答を伴うリスクが低い、前記方法。
【請求項３７】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここでHLA-DQB１の抗原性ミスマッチが調べられる、前記方法。
【請求項３８】
多重HLAミスマッチのドナーの中から最良のドナーを予測するための先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、多重ドナー間、例えば、２つの臍帯血ユニット間及び／又はマッチドナーとHLAミスマッチのドナー間の同種抗原反応性の予測を目的とする多重HLAミスマッチのドナーの分析及び比較をさらに含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移植後のヒト白血球抗原（HLA）に対する免疫応答の予測方法に関し、前記方法がHLAミスマッチを判定するためのドナーおよび／またはドナー材料（donor material）並びにレシピエントのHLA型判定と予測される間接的に認識されるHLAエピトープ（PIRCHES）の数の判定を含む、方法に関する。本発明は、したがって、同種異系間移植のためのドナー材料の選択および／またはスクリーニングの方法、例えば、ミスマッチの、好ましくは非血縁ドナーからの許容可能なミスマッチを有するドナー材料を選択する方法を提供する。好ましい実施態様では、該方法は、起源とは無関係な同種異系の幹細胞、造血幹細胞、臍帯血、腎臓および／または他の細胞、組織、臓器の移植後に起こり得る、望ましくない同種抗原反応性の移植前予測に関する。
【背景技術】
【０００２】
同種異系の細胞、組織および臓器の移植は、ますます魅力的な治療法の選択肢になりつつある発展中の治療法である。非血縁ドナーからの移植を受ける患者数は、近い将来に２倍になると予想される。移植後の同種抗原反応性は、有益効果と同様に、病理学的に、臨床結果に大きな影響を与える。HLAミスマッチは、移植後に免疫反応を引き起こすことが知られているが、しかしながら、望まれない免疫反応のリスクの予測に関わる要素は、よくわかっていない。
【０００３】
＜造血幹細胞移植＞
造血幹細胞移植（HSCT）は、急速に発展中の治療法の選択肢の一例である。HSCTの主要な限定要因は、相変わらず移植片対宿主病（GVHD）であり、HSCTを受ける患者数は増加することが予想されるため、GVHDを防ぐための新しいアプローチの提供を加速しなければならない。GVHDのリスクを克服するために、患者は、全てのHLAアリルについて完全にマッチしたドナーから移植されることが好ましい。しかし、母集団におけるHLA分子の多様性により、これらの完全にマッチしたドナーは、約４０％の患者について、利用できていない。完全にマッチしたドナーが利用可能でない場合、臨床医は、多くの場合、ミスマッチのドナーの中から最善のドナーを選択するという難しい判断に余儀なく直面する（すなわち、最も低いGVHDリスクを有するドナー）。今までのところ、どのドナーが最も適切であるかの決定は、１４日に及ぶ実験室での仕事を必要とする困難な分析に頼っている。
歴史的に、HSCT後の同種抗原反応性は、大部分は、ドナーT細胞によるHLAの不平衡の直接的な認識により、誘発されると考えられている。このことは、移植片T細胞は、宿主細胞の細胞表面上の未変化の分子として発現されるミスマッチHLAを認識することを意味する。本発明は、特に、間接的認識に基づいている。同種抗原反応性は、ミスマッチの宿主HLAアリルに由来するペプチドが、プロセシングを受け、共有HLA上に提示され、それによりドナーT細胞により認識されるときに、誘発され得る。
造血幹細胞移植（HSCT）後の同種抗原反応性は、有益効果と同様に病理学的に、臨床結果に大きな影響を与える。同種抗原反応性の病理学上の影響は、移植片対宿主病（GVHD）に反映される。急性GVHD（aGVHD）のリスクは、５つの遺伝子座の完全なマッチ（10/10マッチ）を最適マッチとした、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB１、及びHLA-DQB１アリルのマッチングのレベルに依存する。
マッチした非血縁HSCTのレシピエントは、単一のミスマッチドナーのレシピエントと比較して、重度のaGVHDの累積発生率は２４％低かった（参照文献1a）。10/10マッチのHSCTのレシピエントは、１つのHLA-Cアリルについてミスマッチのドナーを用いたHSCTと比較した場合に、白血病再発のハザード比（HR）が４７％増加したが（参照文献2a）、移植プロトコルは、全生存（overall survival）が部分的マッチの非血縁ドナーにおいて有意に低いため、10/10マッチドナーを優先的に選択する（参照文献1a）。しかし、完全マッチの非血縁ドナーは、全患者について利用可能ではなく、すなわち、この状況の４０％において、単一のHLAミスマッチドナー（9/10マッチ）が、代わりに利用できる最善のものである（参照文献3a）。
これらの状況において、最も許容されるミスマッチの定義は、GVHDとそれに続く悪い結果を防ぐのに役立つかもしれない。最近、ある特定の非許容のミスマッチが、重度のaGVHDの発症のリスクの増加に関して、疫学上の根拠に基づき、同定されてきた（参照文献4a）。これらの非許容のミスマッチを用いたHSCT後のGVHDのリスクの増加の根底にあるメカニズムは、依然として特性評価が進んでいない。
機能上、より良い許容可能なミスマッチは、細胞傷害性Tリンパ球前駆体頻度（CTLpf）分析により決定される。1/105を超えるCTLpfは、重度のaGVHDの発症を予測する（参照文献5a）。さらに、106 PBLにつき１以下のCTLpfは、より良い全生存に結びつく（参照文献：Heemskerk et al (2007) Bone Marrow Transplantation, 40, 193-200）。したがって、これらの基準は、潜在的ミスマッチのドナー間で、識別するために利用できる。しかし、CTLpf分析は、困難で、移植までの時間を遅らせ、したがって、多くの移植センターでは使用されていない。さらに、潜在的ドナーからの材料は、移植で使用する前に、輸送し、試験する必要がある。現在のところ、悪い結果をもたらす可能性を有するサンプルの除外に基づいた、輸送前の直接的なドナー選択に利用できる効果的な手段はない。
CTLpf分析の代替法を見出すために、多数の、現在まで失敗に終わってきた試みは、２つの一般的に利用可能な予測プログラム、HLAMatchmakerおよびHistoCheckを用いて、非許容のミスマッチを予測するために行われてきた。HLAMatchmakerは、抗体に対する潜在的エピトープを決定し、実質臓器移植に対する有効性を証明してきた（参照文献6a、7a）。HLAMatchmakerは、アミノ酸トリプレット（triplets）における違いをHLA上のエピトープとみなす。抗体は、GVHDの発症において役割を果たす可能性があるが、HLAMatchmakerに基づいた予測は、同種抗原反応性に相関しない（参照文献1a）。HistoCheckは、HLA不平衡の直接的な認識の概念、すなわち、ドナーT細胞が非多型的なペプチドとともに与えられた未変化のミスマッチHLA分子を認識するという概念に基づいている（参照文献9a）。HistoCheckは、T細胞受容体に接触しているペプチド結合溝またはペプチド結合領域において、HLA分子の構造の違いを判定する（参照文献10a）。これらの構造の違いを判定することにより、HLA不平衡の直接認識の可能性を予測することを目的としている。HistoCheckにより得られた相違点スコアも同種抗原反応性と相関しない（参照文献11a、12a）。
これまでの既存技術の観点から、HLAミスマッチである、移植のためのドナー材料が、移植の失敗、例えばGVHDの発症、および／または死亡率の増加につながるリスクを増加させるかどうかを予測する、より信頼できる方法が必要とされている。
【０００４】
＜腎移植＞
ヒト白血球抗原（HLA）のマッチングは、腎移植の結果を有意に改善する（参照文献1bにおいて検討された）。しかし、様々なHLA遺伝子座の高レベルの多型性および限られたドナーの数の結果として、ドナーおよびレシピエント間のHLAミスマッチは、死体腎移植の約８５％において存在する（Eurotransplant database; http://www.eurotransplant.org、2012年4月24日にアクセス）。明らかに、これらのHLAミスマッチは、移植片生着期間を短くし（参照文献2b）、再移植の選択肢を減少させる、HLA特異的抗体の生産を頻繁にもたらす。HLAに対する抗体産生を防ぐために、最適な腎移植片は、レシピエントに対してHLA同一であるか、抗体産生を誘導しない、許容可能なHLAミスマッチを発現するもののどちらかである。限定的に、これらの許容可能なミスマッチは、HLAMatchmakerアルゴリズムを用いて同定できる。
HLAMatchmakerは、epletsと呼ばれる、HLA抗体によりアクセス可能である、HLA分子上の多型エピトープを定義し、患者自身のHLA上に存在するそれらのepletsを差し引く（参照文献3b、4b）。腎移植片上に認識されるepletsが残らない場合、抗体産生反応は、期待されない（参照文献5b）。HLAMatchmakerは、どのHLA抗原が潜在的にHLA抗体産生を誘導し得るかを予測するが、同種異系のHLAへのT細胞反応性を予測しない（参照文献6ｂ）。
従来の研究において、レスポンダーのHLA-DR表現型がBw4特異的抗体の産生およびクラスI抗体増感グレードに影響を与えることが示されてきた(参照文献7b、8b)。このことは、患者の抗原提示細胞のHLAクラスII分子上のドナー由来のHLAペプチド間接的認識の役割を示唆する。この現象は、IgGアイソタイプのドナー特異的抗体（DSA）の産生をもたらすヘルパーT２細胞の応答を説明するはずである（参照文献9b）。
【０００５】
＜HLA分子に対するペプチドの結合＞
HLA分子に対するペプチドの結合は、予測可能である。予測される結合親和性と実験による測定の間の違いは、異なる実験室の間での測定における違いと同じくらい小さな違いとして、示されてきた（参照文献10b）。予測可能性は、HLAクラスI分子について、これらの分子が９個のアミノ酸の長さのペプチドについてより厳しい選択性を有し（9-mers）、明確に定義されたアンカー位置でアンカー残基として特異的アミノ酸を要求するため、特に高い（参照文献11b）。HLAクラスII分子については、予測可能性は、異なる長さのペプチドがアンカー残基として、異なる位置を用いて結合できるため、より低い（参照文献12b）。したがって、どのようにしてペプチドがHLAクラスII結合溝に整列するのか、およびペプチド中のどのアミノ酸残基がアンカーとして好まれるのかを決定することは難しい。この問題を解決するために、Nielsenらは、クラスII結合溝において、ペプチドがどのように位置するか推定するために、いわゆる主要予測因子（core predictor）を使用した（参照文献23a）。主要予測因子は、NetMHCIIと呼ばれる、正確なHLAクラスII予測因子の開発を可能とした（参照文献24a）。
クラスIおよびクラスII HLA分子に結合しているペプチドの予測の進歩に関わらず、同種抗原反応性およびドナー特異的抗体（DSA）の産生に関与する要素の評価において、なお大きな不確実性がある。腎移植後の望ましくない免疫反応を予測するために、現在利用可能なツールを考慮すると、移植に先立って、潜在的な有害反応を評価するために、より信頼できる方法を提供する必要性がある。
【０００６】
＜ミスマッチHLA抗原の間接的認識＞
概念的に、ミスマッチHLA介在性のT細胞同種抗原反応性は、HLA不平衡の直接および間接認識から生じるかもしれない。これまで、ミスマッチHLAに対する臨床的同種抗原反応性の説明と予測を目的とした研究は、主にHLA不平衡の直接認識に焦点を当てていた。直接認識は、非多型ペプチドとともに与えられた未変化のミスマッチHLA分子を認識するドナーT細胞を必要とする（参照文献9a）。HLAアリルの多型がペプチド結合溝の違いをもたらす場合、HLA分子の提示されたペプチドレパートリーは、実質的に異なるかもしれない。これらの異なるペプチドレパートリーは、T細胞応答につながるかもしれない。HistoCheckアルゴリズムは、T細胞受容体に接触しているペプチド結合溝またはペプチド結合領域におけるHLA分子の構造の違いを判定し、これにより相違点スコアを予測する（参照文献10a）。しかしながら、HistoCheckを用いて得られたスコアは、試験管内（in vitro）でも（参照文献6c）、生体内（in vivo）でも（参照文献7c、11a、12a）同種抗原反応性と相関しない。
T細胞関連の同種抗原反応性は、ミスマッチHLAアリルの間接的認識によっても誘起される可能性がある。間接的認識は、少ない組織適合性（H）抗原についてきわめて詳細に研究されてきた。これらのHLAに提示された多型タンパク質のミスマッチは、aGVHDのリスクの増加（参照文献13a）、および再発のリスクの減少（参照文献14a、15a）と関連がある。少ないHミスマッチ由来のペプチドに類似して、ミスマッチHLA分子由来のペプチドも、HLAにより提示され得る。
ミスマッチHLA抗原の間接認識は、T細胞関連の同種抗原反応性をもたらすかもしれない。間接的HLA認識の間に、T細胞は、共有される（マッチ）HLA分子により提示された多型HLA抗原由来のペプチドを認識する。ミスマッチHLA分子由来のペプチドは、頻繁にHLAにより提示される（参照文献10c）。これらの間接的に認識可能なHLAエピトープは、実質臓器移植において、急性および慢性の移植不全の両方と関連づけられてきた（参照文献11c、12c、13c、14c）。自己HLAとの関連でHLAミスマッチを間接的に認識するT細胞は、したがって、臨床的同種抗原反応性において重要な役割を果たしているかもしれない。
現在同定された約８８００のHLAアリルを用いて（参照文献15c）、全てのHLA抗原中で提示された、全ての潜在的HLA由来エピトープを実験的に判定することは、広範囲でほとんど不可能な課題である。これらの間接的に認識可能なHLAエピトープの同定を容易にするために、新規のアプローチは、開発されてきた。このアプローチは、立証された予測ツールに基づいている（参照文献18a、19a、21a、20a、20c）。
本発明は、予測される間接的に認識可能なHLAエピトープ（PIRCHES）として提示されることを予測されるHLA由来エピトープを指定する。本発明は、共有されるHLAクラスI（PIRCHE-I）およびHLAクラスII（PIRCHE-II）により別々に提示されるPIRCHESを同定する。PIRCHE-IIは、腎移植後の同種抗原反応性を誘導することを示され、すなわち、HLA-DRにより提示されるPIRCHESは、ドナー特異的HLA IgG抗体の新規産生と関連付けられた（参照文献21c）。
本発明は、したがって、HLA由来ペプチドの認識は、HLAミスマッチHSCT後の臨床的同種抗原反応性に影響を及ぼすという発見に基づいている。この目的のために、予測されるPIRCHE-IおよびPIRCHE-IIの数は、見積もることができ、その役割は、HSCTの有害な臨床的効果において評価された。このような研究に基づいて、本発明は、HSCT並びに他の細胞または臓器移植の前に非許容HLAミスマッチを予測できる、一般に応用可能な方法を説明する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
先行技術の観点から、本発明の基礎となる技術的課題は、移植手術を受けている患者における望ましくない免疫反応を予測する手段、移植の治療結果（生存、GVHD、再発、生着、移植片拒絶等）を予測する手段、または副作用のリスクが低い同種異系の移植に適したドナー細胞または組織標本（tissue preparations）を選択するさらなる手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この課題は、独立クレームの特徴により解決される。本発明の好ましい実施形態は、従属クレームにより提供される。
【０００９】
本発明は、したがって、移植後のヒト白血球抗原（HLA）に対する免疫応答の予測方法に関し、ここで前記免疫反応がドナーとレシピエントの間のHLAミスマッチに伴うものであって、
ここで、前記方法は、以下を含む。
HLAミスマッチを判定するためのドナー及び／又はドナー材料並びにレシピエントのHLA型判定、及び
予測される間接的に認識されるHLAエピトープ（PIRCHES）の数の決定、ここで前記PIRCHESがミスマッチのレシピエントHLAアリルからのレシピエント特異的又はドナー特異的HLA由来ペプチドであり、かつ共有される（マッチする）HLA分子により提示されることが予測され、ここで、PIRCHESの数が前記免疫応答の可能性と相関関係にある。
【００１０】
該方法は、したがって、好ましくは、移植後に起こり得る、ヒト白血球抗原（HLA）に対する望ましくない免疫応答の発症のリスクまたは可能性の移植前予測の手段を提供する。該方法のHLA型判定は、あらかじめ実行されてもよく、HLA型判定のデータは続いて本発明の方法により分析されてもよい。
【００１１】
本発明によると、PIRCHESは、HSCTおよびGVHD、GVLおよび生存率の低下の症例において、典型的なレシピエント特異的ペプチドであるが、一方、PIRCHESは、臓器または組織移植後、移植片拒絶の症例においてドナー特異的であるかもしれない。
【００１２】
ミスマッチ間の構造的適合性の程度を評価するHLAMatchmaker等の先行技術のアプローチ（参照文献8a）は、望ましくない免役反応のリスクの予測判定の効果的な手段を提供していない。HLAMatcmakerは、HLA抗原上のエピトープの構造的基礎がHLA抗体を誘導できるとみなす。短い配列の組み合わせ（トリプレット）として、HLAクラスI抗原を検査し、これらのトリプレットにおける違いを判定することにより、そのようにする。トリプレットミスマッチの程度は、aGVHDに有意に相関しなかった。先行技術のさらなる方法であるHistoCheck、SpellmanおよびAskarおよび同僚らにより評価された方法（参照文献11a、12a）は、HLA分子内の位置に基づいたHLAアリル産物の間のアミノ酸の違いおよびタンパク質内のアミノ酸の機能的類似性を評価する。このランキングシステムを用いて得られた相違点スコアは、aGVHDを予測しなかった。
【００１３】
計算法（computational methods）によるこれまでの試みは、GVHDを予測できなかったため、本発明の方法は、望ましくない、潜在的に危険である免疫応答の信頼できる、有効な移植前予測を用いて、HSCTのために、改善されたドナー選択を提供する、最初のコンピュータ実施方法である。さらに、これまでの試みは、HLA分子間の構造的／機能的相違点を主に評価するアプローチで行われたが（すなわち、HLA不平衡の直接的認識または抗体を介した認識の可能性に基づいている）、本発明は、好ましくは、HLAミスマッチ分子の予測される間接的認識に基づいている。本発明の方法は、以前は不可能であった、同種抗原反応性の予測に驚くほど適している。本発明は、したがって、予測される間接的に認識可能なHLAエピトープ（PIRCHES）の数は、移植後の望ましくない免疫応答の可能性と相関するという、驚くべき、予期しない原理に基づいている。このような関係性が存在するという示唆は、先行技術において提供されていない。
【００１４】
本発明は、したがって、同種抗原反応性のリスクと共有されるHLA分子により提示されたミスマッチHLA由来ペプチドの数の増加の間の関係性の技術的利用を示す。これらの数は、好ましくはコンピュータで決定することができ、同種抗原反応性、例えばGVHDの発症に関する予測マーカーとして利用できる。
【００１５】
本発明は、好ましくは、完全マッチドナーが利用できない場合に、困難な適合性解析を必要とすることなく、どのドナーが移植に適しているかを判定する、コンピュータ実施方法を提供する。本発明は、例えば、幹細胞、臍帯血細胞または実質臓器移植等の多数の移植環境に応用できる。移植後の同種抗原反応性または組織拒絶の判定において、HLAマッチング（HLA-matching）が役割を果たす、本質的にいかなる移植も、本発明により包含される。
【００１６】
移植後の望ましくない免疫応答を患う患者に対する莫大な医療費を考慮すると、安全に移植可能な材料の予測のための方法は、医学界にとって最も重要である。本願に説明された方法は、手術（または治療）の上流でのリスクの低下を可能とし、それにより、患者、医師および病院それぞれに対する相当の医療費および財務費用を回避する。
【００１７】
１つの実施形態において、本発明は、したがって、移植後のドナーとレシピエントの間のHLAミスマッチと関連があり、好ましくはそれにより誘導される、ヒト白血球抗原（HLA）に対する免疫応答の予測方法に関するものであり、ここでドナーとレシピエントのHLA型判定は、好ましくは配列に基づいた型判定を用いた、高解像度（high resolution）レベルで、ミスマッチを判定するために行われ、そして、予測される間接的に認識されるHLAエピトープ（PIRCHES）の数は、ミスマッチのレシピエントおよび／またはドナーHLAアリル由来のペプチドの提示および／または結合の判定によるコンピュータ実施方法を用いて同定され、それによりPIRCHESの数が前記免疫応答の可能性と関連付けられる。
【００１８】
１つの実施形態において、本発明は、本願に説明された方法に関するものであり、ここで前記移植は、造血幹細胞移植（HSCT）を含む。
【００１９】
１つの実施形態において、本発明は、本願に説明された方法に関するものであり、ここで前記移植は、臍帯血または臍帯血細胞移植を含む。
【００２０】
１つの実施形態において、本発明は、本願に説明された方法に関するものであり、ここで前記移植は、腎移植を含む。
【００２１】
本発明の方法は、続発性の流産、妊娠中の抗体産生等の他の医学的障害との関連での望ましくない免疫応答の予測、または角膜移植前のリスクの評価にも適用されてもよい。
１つの実施形態において、本発明は、本願に説明された方法に関するものであり、ここで前記免疫応答は、望ましくない同種抗原反応性を含む。
【００２２】
１つの実施形態において、本発明は、本願に説明された方法に関するものであり、ここで前記免疫応答は、望ましい同種抗原反応性を含み、それにより望ましい同種抗原反応性は、抗白血病性の同種抗原反応性であり得る。
【００２３】
１つの実施形態において、本発明は、本願に説明された方法に関するものであり、ここで前記免疫応答は、T細胞媒介性応答を含む。１つの実施形態において、本発明は、本願に説明された方法に関するものであり、ここで前記免疫応答は、急性移植片対宿主病（aGVHD）または慢性移植片対宿主病（cGVHD）をもたらす。
【００２４】
１つの実施形態において、本発明は、本願に説明された方法に関するものであり、ここで前記免疫応答は、抗体媒介性応答を含む。下記の実験例において示されるように、それに対して抗体が産生されるHLA分子は、統計学的により多数のPIRCHESを有する。
【００２５】
１つの実施形態において、本発明は、本願に説明された方法に関するものであり、ここで前記免疫応答の可能性は、PIRCHESの数の増加とともに増加する。本出願の実施例において広範囲にわたり説明されるように、HLAクラスIにより提示可能であるペプチドの数が、少数（２以下）である患者と比較して、多数（２より多い）である患者は、有意により早期にaGVHDを発症した（実施例１）。全身型cGVHDを患う患者は、ｃGVHDを発症していないか、または限局型cGVHDを患う患者と比較して、HLAクラスIおよびHLAクラスIIにより提示可能なペプチドの合計並びにHLAクラスIおよびHLAクラスII別々に提示可能なペプチドの数がより多い傾向を示した。全身型cGVHDは、HLAクラスIおよびHLAクラスIIの合計において多数のペプチドを提示することが予想された患者において、少数と比較して、より早期に発症した。PIRCHE-IおよびPIRCHE-II値の両方が低い患者は、10/10マッチ移植に類似して、最も低いリスク推定を示した。特に低PIRCHE-I群におけるドナー−レシピエントの組み合わせは、好ましく、すなわち、これらの組み合わせは、中高PIRCHE-I群の患者と比較して、生存および無病生存の可能性が有意に増加し、急性および慢性GvHDのリスクの低下を示す。これらの結果は、完全に前例のない、予期しない技術的効果を示すものである。本方法を通して、ミスマッチドナーは、HLAマッチドナーと同様に望ましくない免疫応答のリスクが本質的に低いものが選択されてもよい。
【００２６】
本発明のコンピュータによる実施は、同種異系間移植のための潜在的に許容可能なドナー材料の同定のための有効で、速く、信頼性の高い方法を可能とする。ソフトウェアにより処理されたデータは、完全または部分的に機械的に扱うことができ、それにより好ましい実施形態、自動化されたコンピュータ実施方法において扱うことができる。ドナーおよびレシピエントのHLA型判定に関するデータは、任意のドナー−レシピエントペアについて判定されたPIRCHESの数に加えて、電子的に保管でき、適切なデータベースにおいて維持できる。本発明は、したがって、本願に説明されたような方法を実行できるコンピュータソフトウェアにも関する。本発明は、さらに、好ましくは、移植後のヒト白血球抗原（HLA）に対する免疫応答の予測のための自動化されたコンピュータ実施方法に関する。
【００２７】
システムは、好ましくは、全ての公表されたHLAアリルについての情報を有するデータベースを含む。データベースは、新しいHLAアリル配列が公表されるときに更新されてもよい。コンピュータソフトウェアは、好ましくはPERLに基づくが、他のコンピュータ言語にも基づくことができ、PIRCHESの数の評価に要求される各プログラムを呼び出すことに加え、データベースを作成および／または更新するために使用できる（例えば、NetChop、NetMHC等）。
【００２８】
本発明は、移植後に起こるかもしれない、ヒト白血球抗原（HLA）に対する免疫応答の、好ましくは移植前予測のためのシステムをさらに含み、ここで前記免疫応答は、ドナーとレシピエント間のHLAミスマッチ、HLAミスマッチを判定するためのドナーおよび／またはドナー材料並びにレシピエントのHLA型判定を含む前記方法、および予測される間接的に認識されるHLAエピトープ（PIRCHES）の数の判定に結びつき、ここで前記PIRCHESは、ミスマッチレシピエントHLAアリルからのレシピエントまたはドナー特異的HLA由来ペプチドであり、共有される（マッチする）HLA分子により提示されることが予想され、ここでPIRCHESの数は、前記免疫応答の可能性と関連付けられる。システムは、コンピューティング装置（computing devices）、データ記憶装置および／または適切なソフトウェア、例えば、本願で説明した方法を実行するために互いに相互作用する各ソフトウェアモジュールを含んでもよい。
【００２９】
１つの実施形態において、システムは、データバンクまたは臍帯血バンクのデータベースを含んでもよく、それにより、各サンプルは、HLA型を調べられ、その情報は電子的に保管される。システムは、また、レシピエントのHLA型データが保管される、さらなるコンピューティング装置、例えば臨床医、移植センター、または病院の装置の間の接続を含んでもよい。２つのデータベース間の接続を通して、例えばインターネット上で、本発明の方法は、適切なソフトウェアを用いて実行できる。多数の潜在的ドナーサンプルおよび患者のHLA型は、比較されてもよく、任意の与えられたドナー−レシピエントペアについてのPIRCHESの数は、決定されてもよい。本願で説明された方法に基づいた分析の観点から、任意の与えられたドナー材料、例えば臍帯血バンクまたは他の細胞または組織バンクに保管されたサンプルが移植に適合するかどうかを臨床的に適切に予測することができる。本発明は、また、本願に説明された方法を実行するために適したソフトウェアに関する。
【００３０】
１つの実施形態において、本発明の方法は、したがって、適合する移植材料を同定するために、多数の潜在的ドナーサンプルと、レシピエントのHLA型判定に関するデータを比較することを含む。
【００３１】
本発明は、したがって、移植後のヒト白血球抗原（HLA）に対する免疫応答の予測に基づいた許容可能なミスマッチを有する同種異系間移植のためのドナー材料の選択および／またはスクリーニングの方法に関するものであり、ここで前記免疫応答は、ドナーとレシピエントの間のHLAミスマッチ、HLAミスマッチを判定するためのレシピエントのHLA型と多数のドナーサンプルのHLA型の比較を含む前記方法、および各ドナー−レシピエントペアについて予測される間接的に認識されるHLAエピトープ（PIRCHES）の数の判定と関連し、ここで前記PIRCHESは、ミスマッチレシピエントHLAアリルからのレシピエントまたはドナー特異的HLA由来ペプチドであり、共有される（マッチする）HLA分子により提示されることを予測され、ここでPIRCHESの数は、前記免疫応答の可能性と関連付けられる。
【００３２】
１つの実施形態において、ドナーおよび／またはレシピエントのHLA型判定は、計画された移植に先立って実行されてもよく、任意の与えられたドナー材料のHLA型判定に関連する対応データは、好ましくは、適切なソフトウェアによりアクセスできる、データベースおよび／またはデータバンク等の、適切なコンピュータストレージ（computer storage）および／またはコンピューティング媒体（computing medium）に保管されてもよい。そのようなデータベースは、幹細胞データベース、臍帯血データベースまたは組織または臓器データベース、例えば潜在的ドナー材料に関するデータの中央またはローカルストレージであってもよい。任意の移植により治療可能な状態と医療診断するとすぐに、患者（レシピエント）のHLA型判定は、実行されてもよく（既に実行されていなければ）、HLA型判定の結果は、潜在的ドナー材料について保管されたデータと比較されてもよい。このような比較は、標準的なソフトウェアにより実行されてもよい。
【００３３】
HLAマッチした材料を同定するとすぐに、移植は、行われ得る。ドナーとレシピエントの間のHLAミスマッチが明らかである材料が同定された場合、ミスマッチの許容性は、任意のまたは全ての可能性のあるドナー−レシピエントペアへの本発明の方法またはシステムの適用により確かめられる。PIRCHESの数の判定を実行可能である、適切なソフトウェアは、任意のドナー−レシピエントペアに適用してもよく、PIRCHESの数に基づいて、HLAミスマッチの許容性は、好ましくは自動的に、評価されてもよい。
【００３４】
特にHSCTについて、以下の調査に関する２つの選択肢がある：
１）多数の潜在的にマッチするドナーを同定し、前記潜在的にマッチするドナーを分類し、それらが一定のミスマッチを有するかどうかを判定し、続いてPIRCHESの分析に基づいて最良の（最も許容可能である）ドナーを選択し、および／または
２）一定の患者を完全マッチが困難または不可能であると同定し、有望な代わりの患者／ミスマッチに対してPIRCHEアルゴリズムを実行し、その後、低PIRCHESを有する潜在的ドナーからサンプルを呼び出す。
【００３５】
１つの実施形態において、本発明は、本願に説明された方法に関するものであって、ここでミスマッチのレシピエントHLAアリルからの前記レシピエントまたはドナー特異的HLA由来ペプチドは、ヒトプロテアソームの切断サイト（エンドペプチダーゼおよび／またはプロテアーゼサイト）を同定するためのコンピュータ実施方法により同定される。本発明のこの特徴の１つの好ましい実施形態は、ペプチド配列のプロテアソーム切断の決定が可能であるソフトウェアNetChop、または本願に説明されたような代わりとなるソフトウェアの使用に関する。
【００３６】
１つの実施形態において、本発明は、本願に説明された方法に関するものであって、ここで共有される（マッチする）HLA分子によるペプチドの前記提示は、任意のHLA分子への前記ペプチドの結合を予測するコンピュータ実施方法により、判定される。本発明のこの特徴の１つの好ましい実施形態は、HLAまたはMHC分子中の任意の、好ましくは九量体のペプチドの結合の判定（または予測）を可能とする、ソフトウェアNetMHCpanおよび／またはNetMHCII、または本願に説明されたような他の代わりとなるソフトウェアの使用に関する。
【００３７】
プロテアソーム切断予測およびHLA結合予測は、PIRCHESの数の自動判定を提供するために、配列中の両方のモジュールを組み入れるように設計されたソフトウェアにおいて実行されてもよい。
【００３８】
本発明の方法は、５−２０個、好ましくは８−１５個、より好ましくは９−１０個のアミノ酸のうちの任意の長さのペプチドが同定され、PIRCHESとみなされるような方法で実行されてもよい。好ましい実施形態において、本発明は、本願に説明された方法に関するものであって、ここで前記PIRCHESは九量体（９アミノ酸）ペプチドに関する。
【００３９】
１つの実施形態において、本発明は、本願に説明された方法に関するものであって、ここで前記PIRCHESは、共有されるHLAクラスI（PIRCHE I）により、または共有されるHLAクラスII（PIRCHE II）により、提示される。
【００４０】
１つの実施形態において、本発明は、本願に説明された方法に関するものであって、ここでPIRCHE-Iペプチドは、10 μM以下、好ましくは1000 nM以下、より好ましくは500 nM以下の予測されるIC50結合値を有する。
【００４１】
１つの実施形態において、本発明は、本願に説明された方法に関するものであって、ここでPIRCHE-IIペプチドは、20 μM以下、好ましくは5 μM以下、より好ましくは1000 nM以下の予測されるIC50結合値を有する。
【００４２】
他の結合基準は、ペプチドがHLA分子により提示されるかどうかを予測するために適用されてもよい。もたらされた値は、これまでに文献に記載された結合特性に基づく。しかし、PIRCHEが、提示されているHLAごとに結合し、値をカスタマイズさえできると合理的に考えられる場合に、異なる値が導き出されるか、または適用されてもよい。もっとも、現在の値は、本研究において本発明者らが使用し、うまくいくと思われるものである。
【００４３】
各ドナー−レシピエントペアについて、提示可能な、レシピエントまたはドナー特異的HLA由来ペプチド（PIRCHES）は、同定される。PIRCHE-Iは、好ましくは以下の２つのステップにおいて同定されてもよい。
１）プロテアソームおよびTAPチャネル経由の輸送によるアミノ酸配列の予想されたプロセシングのin silico（コンピュータ上）での評価は、好ましくはNetChopを用いて実行される。NetChopは、配列解析に基づいたヒトプロテアソームの切断サイトを同定する、公知のソフトウェアベースの方法である。九量体ペプチドは、好ましくは、解析に含まれる。
【００４４】
好ましい実施形態において、C末端切断可能性は、決定される。完全なHLAタンパク質は、切断され｛好ましくはin silico（コンピュータ上）で｝、切断可能な全ての位置が示される。示された位置とは逆に、クラスIへの結合について分析される、好ましくは九量体ペプチドは、同定される。
【００４５】
NetChopの代替物として、MAPP、PaProcまたはLuら（J Zhejiang Univ Sci B, 2013 Sep;14(9):816-28）やGinodiら（Bioinformatics, 2008 Feb 15;24(4):477-83）の文献に開示された方法等の様々なソフトウェアベースのアプローチが適用できたことは、当技術分野において知られている。
２）続いて、（ステップ１により）高確率でプロセシングを受けるペプチドは、ドナーとレシピエントの間で共有される（マッチする）HLA（好ましくはHLA-A、HLA-B、HLA-C）により提示される能力について、NetMHCpanを用いて試験される。NetMHCpanは、人工の神経ネットワーク（artificial neuron networks）を使用して、任意の既知のMHC分子に対するペプチドの結合を同定および／または予測する公知の方法である。該方法は、１５０を超える異なるMHC分子をカバーする、１５０，０００を超える定量的結合データ上でトレーニング（trained）される。予測は、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-EおよびHLA-Gアリルについてすることができる。予測値は、nM IC50値、または２０００００の無作為の天然ペプチドのセットに対する%-Rankとして与えられ得る。好ましくは、500 nM以下のIC50結合値を有するペプチドは、適切なバインダーとして選ばれる。
【００４６】
（PIRCHE-IIは、以下のように同定されてもよい）
好ましくは潜在的１５量体HLA-DR、HLA-DQ、およびHLA-DPバインダーの九量体結合コアは、好ましくはNetMHCIIPan 2.0、NetMHCII 1.0、またはNetMHCII 2.2を用いて分析されてもよい。NetMHCIIは、人工の神経ネットワークを使用して、HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP、およびマウスMHCクラスIIアリルに対するペプチドの結合の予測についての公知の方法である。予測は、９個のHLA-DRスーパータイプ、６個のHLA-DQ、６個のHLA-DP、および２個のマウスH2クラスIIアリルをカバーする１４個のHLA-DRアリルについて、得ることができる。予測値は、nM IC50値、および１００００００の無作為の天然ペプチドのセットに対する%-Rankとして与えられる。1000 nM以下のIC50結合値を有するペプチドは、適切であるとみなされる。
【００４７】
HLA結合の決定のために使用できた、当技術分野において公知であるいくつかの代替方法がある。SYFPEITHI（Rammensee et al. Immunogenetics 41, 178-228, 1995およびRammensee et al, Landes Bioscience 1997に記載された方法に基づく)およびBIMASは、周知の代替方法であり、クラスI結合について適切であるが、クラスII結合において、いくつかの欠点を示す。他の代替方法は、Tepitope（Sturniolo et al, 1999, Nat. Biotechnol. 17:555-561に基づく）、TepitopePAN、EpicCapo、PAAQD、POPI、PropredおよびMultipredに関する。
【００４８】
１つの実施形態において、提示している共有されるHLAアリルごとに、治療の環境に依存して、ドナーHLAアリル由来の予測されるバインダーは、ドナー自己ペプチドとみなされ、レシピエントHLAアリル由来の予測されるバインダーは、レシピエント自己ペプチドとみなされ、したがって、分析から除外される。一般的に、各ドナー−レシピエントペアについて、提示可能なレシピエントまたはドナー特異的ペプチド（ミスマッチのレシピエントHLAアリル由来であり、共有されるHLAにより提示されることが予測される）の数は、PIRCHESの数を生成するためにカウントされる。
【００４９】
１つの実施形態において、本発明は本願に記載された方法に関するものであって、ここでHLA型判定は、HLAサブタイプのHLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DPB1、HLA-DQA１、HLA-DPA1、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-MICA、HLA-MICBおよび／またはKIRについて実行される。
【００５０】
１つの実施形態において、本発明は本願に記載された方法に関するものであって、ここでHLA型判定は、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1について実行される。これら５つのアリルは、9/10マッチ非血縁ドナーを意味する、一般的に使用される専門用語である「9/10マッチ」のための基礎を提供する。このような場合、これら５個の遺伝子の１０個のアリルのうちの９個は、マッチを示すが、残る１個のアリルは、マッチしない。本発明は、したがって、好ましい実施形態において、このような9/10マッチ非血縁ドナーからの材料を使用することは安全かどうか、すなわちそのミスマッチは移植のために許容可能かどうかの判定を可能にする。
【００５１】
本発明は、また、一般的な9/10のシナリオよりも多くのミスマッチが存在するドナーサンプルの中で、許容可能なHLAミスマッチを発見することについて、本願に記載された方法に関する。本発明に包含される潜在的ドナーの１例は、許容可能なミスマッチドナー材料のために本願に記載された方法を用いて選抜されてもよい、ハプロタイプ一致のドナーである。ハプロタイプ一致の血縁ドナーは、患者に対して「50%マッチ」を有するドナーとして説明されてもよい。この種のドナーは、親、兄弟、子であり得る。定義によれば、患者の親または子は、遺伝物質の半分はそれぞれの親に由来するため、常にハプロタイプ一致のドナーである。兄弟がハプロタイプ一致のドナーである可能性は５０％である。ハプロタイプ一致のHSCTは、９０％の患者は１人のハプロタイプ一致の家族を有するため、より多くの人々にHCSTの選択肢を提供する。他の利点は、即時にドナーが入手できること；人種的背景に関係なく全ての患者に同等に利用できること；多数のドナーの中から選択できること；および必要な場合に追加の細胞を得られることを含む。あるいは、臍帯血ユニット（CBUs）は、高レベルのHLAマッチングを示さないかもしれないが、ミスマッチが本願に説明された方法により決定されるように許容可能であれば、移植に適する。CBUsは、典型的には、最小では4/6マッチであるが、このマッチは、しかしながらアリルレベルで、4/10または5/10の状況に導き得る。
【００５２】
本願に説明された方法は、ある程度共有されるHLAに依存することを考慮すると、最小のHLAマッチは、１アリルマッチである。これはHSCTに向きそうにないが、このようなシナリオは、利用可能なドナー材料の限られた数により、臓器移植では、よく起こる。本発明は、したがって、最小の１アリルマッチを有するミスマッチサンプルに対して、実行されてもよい。ミスマッチドナーは、したがって、1/10、2/10、3/10、4/10、5/10、6/10、7/10、8/10、9/10または10/10（DPミスマッチ）マッチに関してもよい。追加のアリルが試験される場合、ドナーは、さらに他のミスマッチを示してもよく、それにより、少なくとも１アリルマッチが存在する。移植に好まれるのは、有意なHLAマッチを有するドナーである。追加のアリルが型判定の対象である場合、ドナーは、したがって、例えば、11/12または13/14マッチであり得る。
【００５３】
１つの実施形態では、本発明は、本願に説明された方法に関するものであって、ここでHLA型判定は、血清学的および／または分子的型判定を含む。好ましい実施形態では、本発明は本願に説明された方法に関するものであって、ここでHLA型判定は、配列に基づいた型判定を用いて高解像度レベルで実行される。
【００５４】
１つの実施形態では、本発明は本願に説明された方法に関するものであって、ここでHLA型判定は、HLAクラスIアリルのエクソン１−７およびHLAクラスIIアリルのエクソン１−６の配列決定を含む。１つの実施形態では、本発明は本願に説明された方法に関するものであって、ここでHLA型判定は、HLAクラスIアリルについてエクソン２および３、HLAクラスIIアリルについてエクソン２の高解像度HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1およびHLA-DQB1型判定を含む。これらの特定のHLA型判定アプローチは、本願の実施例に説明されており、ミスマッチを同定するために型判定される必要があるアリルを完全にカバーする、以前の型判定方法を上回る利点を証明する。
【００５５】
本発明の方法は、原則として、ヒトプロテオーム／ゲノムにおける任意の多型タンパク質（または前記多型タンパク質をコードする対応する遺伝子）において、実行されてもよい。本発明のさらなる態様において、１つの方法は、移植後の任意の多型タンパク質に対する免疫応答の予測を提供し、ここで前記免疫応答は、ドナーとレシピエントの間の多型タンパク質における違いと関係があり、前記方法は、
例えば、潜在的に免疫学的に関連した多型を保有することが知られるゲノム領域の核酸配列決定による、および／または好ましくは「次世代」配列決定技術｛例えば、454パイロシークエンス法、イルミナ（Solexa）シークエンス法、SOLiDシークエンス法｝による全ゲノム配列決定による、ドナーとレシピエントの間の多型タンパク質の同定、および
予測される間接的に認識されるエピトープの数の決定、ここで前記エピトープがレシピエントまたはドナー特異的多型由来ペプチドであり、HLA分子により提示されることが予測され、ここでエピトープの数が前記免疫応答の可能性に関連付けられることを含む。
【００５６】
本発明のこの態様によると、全ゲノム配列決定は、HLA同一の兄弟移植のコホートに対して実行でき、ゲノム全体で、ドナーとレシピエントの間の全ての多型を同定できる。全てのこれらの多型は、その後、本願で説明されたアプローチを用いて、HLAミスマッチについて説明したデータベースと同様のデータベースを作成するために使用される。その後、免疫学的マッチングスコアは、相似性コンピューティングアプローチにより計算され、臨床結果について分析される。
【００５７】
本発明は、さらに本願に説明された方法を含む、移植治療結果の予測のための方法に関する。好ましい実施形態では、治療結果は、患者の生存、無病生存および移植関連死（transplant-related mortality）からなる群から選択される。本願実施例で証明されたように、PIRCHEの数は、移植後の治療結果とよく相関する。これらの実施形態によると、このような移植の成功だけでなく、特異療法の関連する治療効果もまた、本発明の方法、例えば本願で説明されたように潜在的ドナー材料のプレスクリーニングを行うことにより、保証できる。
【００５８】
本発明は、したがって、さらに、本願に説明された方法を含む、同種異系間移植のための細胞または組織標本を選択するための方法に関する。該方法は、好ましくは許容可能なミスマッチについての同種異系間移植のためにドナー材料を選択および／またはスクリーニングする方法に関する。本発明の方法は、移植レシピエントの健康と安全と直接関係があるコンピュータ実施手順を示す。
【００５９】
好ましい実施形態において、本発明は、本願に説明された方法に関するものであって、ここで同種異系間移植のためのドナー材料は、少なくとも１アリルマッチを有するドナー由来である。
【００６０】
好ましい実施形態において、本発明は、本願に説明された方法に関するものであって、ここで同種異系間移植のためのドナー材料は、10/10マッチおよびHLA-DPミスマッチを有するドナーに由来する。HLA-DPは、移植関連免疫応答に関するものとして知られる遺伝子座であり、これまでGVHDと結びつけられてきた。10/10マッチを有する患者において、HLA-DPミスマッチが存在することは、あり得る。本発明は、HLA-DPミスマッチ由来のPIRCHEを評価するためにも使用できる。
【００６１】
好ましい実施形態において、本発明は、本願に説明された方法に関するものであって、ここで同種異系間移植のためのドナー材料は、9/10マッチの非血縁ドナーに由来する。
【００６２】
１つの実施形態において、本発明は、本願に説明された方法に関するものであって、ここで同種異系間移植のためのドナー材料は、PIRCHE-Iの数が３以下であり、好ましくは２以下であり、より好ましくは１以下である場合に望ましくない免疫応答の低いリスクと関係がある。本願実施例において証明されたように、PIRCHEの数のこれらの値は、移植後の望ましくない免疫応答の頻度の低下と有意に相関する。
【００６３】
当技術分野において、このようなペプチドの「許容可能な数」についての閾値が存在するという示唆はされていない。本発明のこの態様は、安全または安全でないドナー材料を示唆する特性値により定義される更なる実施形態に加えて、複雑な生命現象を単純な「yes-no」読み取り（a simple "yes-no" read-out）の形式で評価することができ、それにより任意のドナー材料が適合するかどうか該方法のエンドユーザーへのフィードバックを提供する。これは、続いて、HLA型判定データを含む問い合わせデータバンク（interrogating databanks）に向けた、完全に自動化されたアプローチ、および好ましくは9/10ミスマッチドナーからの材料が適用するために比較的安全かどうか明確な指示が提供される方法を可能とする。
【００６４】
１つの実施形態において、本発明は、本願に説明された方法に関するものであって、ここで同種異系間移植のためのドナー材料は、PIRCHE-IIの数が４以下、好ましくは３以下、より好ましくは２以下の場合に望ましくない免疫応答の低いリスクに関係がある。本願実施例において証明されたように、PIRCHEの数のこれらの値は、移植後の望ましくない免疫応答の頻度の低下と有意に相関する。
【００６５】
１つの実施形態において、本発明は、本願に説明された方法に関するものであって、ここで同種異系間移植のためのドナー材料は、PIRCHE-IおよびPIRCHE-IIを合わせた数が６以下、好ましくは４以下、より好ましくは２以下である場合に望ましくない免疫応答の低いリスクに関係がある。本願実施例において証明されたように、PIRCHEの数のこれらの値は、移植後の望ましくない免疫応答の頻度の低下と有意に相関する。
【００６６】
望ましくない移植のリスクと関係があるPIRCHEの数についての特性値は、本願実施例において提供された分析に基づいている。実施例によると、人口は、用量反応（すなわちPIRCHE比率に対するリスク）において必ずしも比例性がなくてもよいという仮説に基づいて、三分位数（tertiles）に分割された。このような用量反応曲線は、天然においてS状であってもよく、またはある種のプラトー（plateau）を示してもよく、それにより三分位数に基づいた分析を示唆する。本願で提供されたPIRCHESの特性値は、これらの値は、本発明の定義にとって本質的ではない好ましい値を示すものであるにもかかわらず、目標値としてみなされてもよい。異なる長さのペプチド、またはHLA分子に対する異なる結合親和性の考察に適用された異なるストリンジェンシー（strigencies）の観点から、あるいは考慮される遺伝子座の数またはミスマッチの数の観点から、これらの値は、変更してもよい。好ましい実施形態では、免疫反応を有するPIRCHESの比較的高いレベルと許容可能なミスマッチを有する低いPIRCHEレベルの間の相関性は、本発明の客観的な表現に関係がある。該方法はしたがって、免疫応答のリスクの相対的評価も包含し、それにより多数の潜在的ドナーが評価され、相対的により少数のPIRCHESを有するそれらのドナーは、他のドナーと比較して、移植に好ましいとみなされる。
【００６７】
１つの実施形態において、本発明は、本願に説明された方法に関するものであって、ここでHLA-DQB1抗原性ミスマッチは、調べられる。実施例５に示されたように、HLA-DQB1抗原性ミスマッチは、PIRCHE-IとPIRCHE-IIの両方の最高数をもたらし、それにより、適した移植材料について、潜在的ミスマッチドナーをプレスクリーニングする場合に、このアリルが特に評価されるべきであることを示唆する。
【００６８】
１つの実施形態において、本発明は、多数のHLAミスマッチドナーの中から最善のドナーを予測するための本願に説明された方法に関する。１つの実施形態において、本発明は、本願に説明された方法に関するものであって、多数のドナー間、例えば２つの臍帯血ユニット間および／またはマッチドナーとミスマッチドナーの間の同種抗原反応性を予測する目的のために多数のHLAミスマッチドナーの分析と比較をさらに含む。移植のために、特に幹細胞または臍帯血は、より信頼でき、好ましい治療の選択肢になり、移植のために十分な材料を提供するために、時には多数のドナーサンプルが使用されなければならない。この観点から、本発明の方法は、「マルチドナー（multi-donor）」分析を可能とし、それにより、追加のドナーサンプルに先立って決定するために、ドナー−レシピエントマッチの比較だけでなく、追加でまたは代わりにドナー−ドナーマッチの評価は、お互いに加えて、レシピエントと一致してもよい。本発明は、したがって、過去の実験室に基づく方法の複雑さがなく、迅速で信頼できる「三方（three-way）」適合性評価を可能とする。
【００６９】
本発明の方法は、いくつかの有益な技術的な二次効果を可能とする。本願で説明された方法を通して、同種異系材料を用いた移植は、望ましくない免疫反応の本質的に同じまたは同等の低いリスクで実行されてもよい。この効果の観点から、本発明は、自動化されたおよび／またはコンピュータ実施により時間を節約し、健康リスクを低減し、潜在的な移植失敗による医療費を低減し、任意のレシピエントのための潜在的ドナー材料のプールを増加させ、そしてこれまで治療不可能であった患者（例えば極めて稀なHLAアリルを有する患者）を、許容可能なミスマッチを選択することによるリスクの低下により、同種異系材料を用いて治療可能にする。
【００７０】
（発明の詳細な説明）
「予測（prediction）」は、将来起こり得るイベントについての陳述（a statement）を意味する。専門用語"forecast"も使用されてもよい。本発明における「予測」は、移植後に起こる免疫応答の可能性またはリスクの評価を表す。予測、すなわちリスク評価に基づき、さらなる治療の選択肢を決定するために使用できる貴重な情報が潜在的な有害なイベントに先立って得られる。
【００７１】
専門用語「免疫応答（immune response）」は、本発明において、当業者により一般的に理解されているような免疫応答に関する。免疫応答は、抗原が外来性として認識された場合に起こる、免疫系の一部から抗原に対する応答として理解されてもよく、好ましくは続いて、「外来性（foreign）」抗原を破壊または固定化でき、あるいは無害にできる、抗体および／またはリンパ球の生産を誘導する。本発明の免疫応答は、移植された材料に対するレシピエントの免疫系の応答か、または移植された細胞、組織、臓器の細胞により影響された免疫応答のどちらに関するものでもよく、それにより例えば、GVHDにおいて、移植された材料のT細胞は、レシピエントの抗原または組織に対して反応および／または攻撃する。免疫応答は、外来性の組織等の外来性物質に対して体を守るというレシピエントの防御機能か、あるいはレシピエント細胞または組織に対する移植された材料の免疫細胞の反応であってもよい。
【００７２】
ヒト白血球抗原（HLA）系は、ヒトにおける主要組織適合遺伝子複合体（MHC）である。スーパー遺伝子座（the super locus）は、ヒトにおける免疫系機能に関する多数の遺伝子を含む。この遺伝子群は、第６染色体に存在し、細胞表面抗原提示タンパク質をコードし、多くの他の機能を有する。ある遺伝子によりコードされるタンパク質は、臓器移植における要素としてのその歴史的発見の結果として、抗原としても知られている。主要なHLA抗原は、免疫機能のための必須要素である。MHCクラスI（A、BおよびC）に対応するHLAは、細胞内からのペプチドを提示する（存在する場合、ウイルスペプチドを含む）。これらのペプチドは、プロテアソーム中で分解された分解タンパク質から産生される。一般的に、これらの特別なペプチドは、約９アミノ酸の長さの小さな重合体である。外来性抗原は、細胞を破壊するキラーT細胞（CD8陽性細胞または細胞傷害性T細胞ともよばれる）を引きつける。MHCクラスII（DP、DM、DOA、DOB、DQ、およびDR）に対応するHLAは、細胞の外側からTリンパ球に抗原を提示する。これらの特定の抗原は、特定の抗原に対する抗原を産生するために、抗原産生B細胞を次々に刺激するTヘルパー細胞の増殖を促進する。
【００７３】
MHC遺伝子座は、哺乳類において最も遺伝的に変異しやすい翻訳領域の遺伝子座のいくつかであり、ヒトHLA遺伝子座も例外ではない。多くのHLA遺伝子座は、各遺伝子座について、１２以上のアリル群を示す。６個の遺伝子座は、ヒト個体群において検出されてきた１００を超えるアリルを有する。この内、最も変異しやすいものは、HLA-BおよびHLA-DRB１である。
【００７４】
１つのアリルは、各アリルは少なくとも１箇所（一塩基多型、SNP）全ての他のアリルと異なるような、遺伝子座におけるヌクレオチド（DNA）配列の１つのバリアントである。これらの変化の多くは、タンパク質中の軽微なものから大きなものまで機能の違いを引き起こすアミノ酸配列の変化を引き起こす。
【００７５】
「HLA」は、例えば、レシピエントと組織移植片のドナーの間のマッチングの程度を判定するために使用される、HLA遺伝子（HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1等）からなる染色体6p21上のヒト白血球抗原遺伝子座を参照する。「HLAアリル（HLA allele）」は、２つ親の染色体のうちの１つの上の遺伝子座内のヌクレオチド配列を意味する。
【００７６】
「HLA型判定（HLA typing）」は、所与の遺伝子座（HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1等）の１つのHLAアリルの同定を意味する。遺伝子配列決定は、適用されてもよい。サンプルは、ドナーおよび／またはドナー材料並びにレシピエントからの血液または他の身体サンプルから得られてもよく、続いて分析されてもよい。一般的に、抗原の配列は、抗体反応性を決定し、したがって、良い配列決定能力（または配列に基づく型判定）を有することは、血清学的反応の必要性を除去する。HLA型判定への配列決定アプローチは、好ましい。配列決定は、Maxam-Gilbert法、Chain-termination法等の基本的な方法、ショットガン・シークエンシング法またはブリッジPCR法等の高度な方法や新規シークエンシング法、またはmassively parallel signature sequencing （MPSS）法、 454 pyrosequencing法、Illumina (Solexa) sequencing法、SOLiD sequencing法、または他の類似する方法等のいわゆる「次世代」法に関するものでもよい。
【００７７】
血清型判定が適用される場合、異なる血清型反応は、遺伝子配列を決定するためにHLAを配列決定する必要性を示唆してもよい。アリルの多様性により、血清型判定技術により誤って同定されるリスクが増加するため、幅広い抗原型判定とその後続く遺伝子配列決定の使用が好まれる。表現型解析は、適用されてもよい型判定のための血清学的アプローチに関する。遺伝子型判定は、代わりにまたは組み合わせて実行されてもよい。この戦略で、DNAのバリアント領域に特異的なPCRプライマーは、使用される（SSP-PCRと呼ばれる）。正しいサイズのPCR産物が発見される場合、HLAアリルが同定されたとみなされます。PCR-SSOもまた、プローブ・ハイブリダイゼーションと組み合わせて使用されてもよい。HLA型判定に対する技術的アプローチの検討は、Erlich H, Tissue Antigens, 2012 Jul;80(1):1-11およびDunn P, Int J Immunogenet, 2011 Dec;38(6):463-73において、提供される。
【００７８】
HLA型判定に関して、移植のための単離／調製の前、間または後、以前にドナー自身および／またはドナー材料から得られたサンプルは、HLA型判定およびその後のレシピエントからのHLA型判定データへの比較に使用されてもよい。例えば、ドナー自身のHLA型判定は、例えばHLA情報について、唾液、血液または他の体液を分析することにより、見出されてもよく、任意に、さらにまたは代わりに、移植のためにドナーから得られた材料（ドナー材料）は、HLA型判定の間に同一のおよび／または相補的なHLA型特性について分析されてもよい。
【００７９】
「HLAミスマッチ」は、任意の遺伝子座に存在する、ドナーとレシピエントにおける異なるアリルの認識として定義される。
【００８０】
ドナーは、レシピエントにおける移植のための細胞、組織、臓器、または他の身体部分、体液および／または標本等であるが、これらに限定されない、ドナー材料、または言い換えると、生物学的材料を供給する、１個人または複数の個人｛例えば、臍帯血ユニット（CBUs）等の複数のサンプルまたは標本が、移植のためにドナー材料の有効な治療上適切な量を要求される場合｝と一般に理解される。ドナー、またはドナーのHLA型判定（typing）への参照（reference）については、また、ドナー材料、またはドナー材料のHLA型判定を、それぞれ参照し（refer）てもよい。
【００８１】
該方法の対象レシピエントは、典型的に哺乳類、好ましくはヒトである。レシピエントは、移植を必要とする臓器不全等の、典型的に移植の必要性を特徴とする疾患を患う患者である。専門用語「臓器（organ）」により、身体の特定の機能、例えば、心臓、肺、脳、腎臓、皮膚、肝臓、骨髄等を実行するために組織される、異なる組織を含む、任意の身体構造または細胞群を含むことを意図される。１つの実施形態において、移植片は、同種移植片、すなわち該個人とドナーは同一の種である。対象は、また、疾患自体が内因性細胞の特定のサブセットの機能の不足または喪失により定義されない場合であっても、細胞の移植により、治療できる状況で苦しんでいてもよい。いくつかの疾患がある種の幹細胞の移植により、治療可能であってもよく、それにより、このような細胞の生来のまたは内因性のプールは、レシピエントにおいて、必然的に非機能性（non-functional）ではない。
【００８２】
本発明の方法は、移植によるダメージの原因（origin graft damage）または拒絶反応、および／または非移植片組織への免疫性のダメージの原因（immune origin damage）等の望ましくない免疫応答の可能性を予測するため、細胞、組織または臓器移植を必要とすることが予測される、またはこれから受けようとしている患者に特に利用可能である。例えば、該患者は、次の１、２、３、４、５、６、または１２か月において、移植を受けることが予測されてもよい。代わりに、分析は、免疫性の移植によるダメージの原因（immune origin graft damage）または拒絶反応、および／または非移植片組織への免疫性のダメージの原因の可能性を予測するために、移植を受けた個人に特に利用可能である。移植後、該方法は、（移植片臓器の）慢性の臓器機能障害または考えられる移植片対宿主病（GVHD）、特に慢性GVHDおよび特に移植片が骨髄移植である場合の証拠を示す患者に特に利用可能である。
【００８３】
移植は、レシピエントの損傷を受けたまたは欠損した臓器を交換することを目的とする、または治療効果を提供できる、幹細胞、他の細胞、組織または臓器を提供することを目的とする、１つの体（ドナー）から別の体（レシピエントまたは患者）へ、またはドナー側から患者自身の体の別の位置へ、または保管されたドナー材料からレシピエントの体へ、細胞、組織または１つの臓器を移動することである。
【００８４】
同種異系間移植（Allogeneic transplantation）または同種異系間移植（Allotransplantation）は、同一種の遺伝学的に非同一のドナーからレシピエントへの、細胞、組織、または臓器の移植である。移植片は、同種移植片（allograft）、同種移植片（allogeneic transplant）、または同種移植片（homograft）と呼ばれる。ほとんどのヒト組織または臓器移植片は、同種移植片である。同種移植片は、生体または死体ソースのいずれか由来であり得る。一般的に、移植できる臓器は、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、腸および胸腺である。組織は、骨、腱（筋骨格移植片として参照される）、角膜、皮膚、心臓弁、神経および血管を含む。世界的に、腎臓は、最もよく移植される臓器であり、続いて肝臓、それから心臓がよく移植される臓器である。角膜および筋骨格移植片は、最もよく移植される組織である。
【００８５】
本発明は、また、再生医療、例えば体外で構築され、移植を目的として、再構築されたドナー材料により、作られた臓器、細胞、または組織をスクリーニングする上での該方法の使用を包含する。幹細胞技術は、多くの医学的に適切な細胞型または組織の体外での生産を可能とする。本発明は、したがって、また、移植におけるその適合性のために、生物工学的および／または再生医学的方法により生産された同種異系材料のスクリーニングにも適用できる。
【００８６】
本発明は、免疫反応のリスク評価、好ましくは移植前リスク評価を包含し、それにより任意の幹細胞は、移植を目的としたドナー材料として考慮されてもよい。例えば、造血幹細胞移植（HSCT）は、多能性造血幹細胞の移植であり、通常骨髄、末梢血、または臍帯血由来である。それは、多発性骨髄腫または白血病等の血液または骨髄の特定の癌を患う患者に最もよく行われる、血液学および腫瘍学の分野において一般的な医療処置である。これらの場合において、レシピエントの免疫系は、移植前に通常放射線または化学療法で破壊される。感染および移植片対宿主病は、同種異系（allogenic）の（allogeneicとしても参照される）HSCTの主要な合併症である。
【００８７】
幹細胞は、特殊化した細胞に分化でき、より多くの幹細胞を生産するために（有糸分裂により）分割できる、未分化の生体細胞として理解される。高度に可塑性の成体幹細胞は、医学療法において、例えば骨髄移植において、日常的に使用される。幹細胞は、現在人工的に育成でき、細胞培養により筋肉または神経等の様々な組織の細胞に一致した特性を有する特殊化した細胞型に変換（分化）できる。治療的クローニングにより生産された胚細胞系および自家性胚性幹細胞も、将来の治療のために有望な候補として提案されている。潜在的幹細胞移植は、任意の幹細胞治療に関するものでもよく、それによりいくつかの幹細胞治療が存在する。医学研究者は、成体幹細胞および胚性幹細胞は、癌、１型糖尿病、パーキンソン病、ハンチントン病、セリアック病、心不全、筋損傷および神経障害、並びに多くの他の疾患を間もなく治療できると予想する。
【００８８】
体性幹細胞および生殖系列幹細胞としても知られる、幹細胞は、成人と同様に子供でもみられる。多能性成体幹細胞は、稀であり、通常数が少ないが、臍帯血を含むいくつかの組織でみられる。骨髄は、脊髄損傷、肝硬変、慢性虚血肢および末期心不全を含むいくつかの症状の治療に使用されてきた成体幹細胞の豊富なソースの一つであることがわかっている。成体幹細胞は、分化系列が限定されてもよく（多能性）、通常その組織起源により参照（referred）される（間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞、内皮幹細胞、歯髄幹細胞等）。
【００８９】
多能性幹細胞は、羊水においてもみられる。これらの幹細胞は、非常に活性が高く、フィーダーなしで広範囲に広がり、腫瘍原性ではない。羊水性幹細胞は、多能性であり、脂肪生成、骨形成、筋原性、内皮性、肝性並びに神経細胞系列の細胞に分化できる。ドナーまたは自家性の（autologuous）用途のために羊水性幹細胞を集めることが可能である。
【００９０】
臍帯血由来の多能性幹細胞は、胚性および造血性の特性を示す。表現型による特性評価は、（CB-SCsが）胚細胞マーカー｛例えば、転写因子OCT-4およびNanog、ステージ特異的胎児抗原（SSEA）-3、およびSSEA-4｝および白血球共通抗原CD45を示すが、それらが血球系列マーカー陰性であり得ることを証明する。さらに、CB-SCsは、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）抗原の非常に低レベルの発現により示されるのと同様に非常に低い免疫原性を示し、同種異系リンパ球の増殖を促進しない。
【００９１】
HSCは、一般的に、骨髄、末梢血幹細胞、羊水、または臍帯血から入手可能である。骨髄移植の場合、HSCは、骨の中心に届く大きな針により、ドナーの大きい骨、一般的には骨盤から取り除かれる。該技術は、骨髄採取として参照され、全身麻酔下で行われる。末梢血幹細胞は、同種異系間HSCTのための幹細胞の共通ソースである。それらは、アフェレーシスとして知られる工程により血液から回収できる。ドナーの血液は、ドナーの腕から無菌の針により回収され、白血球を除去する機械を通して渡される。赤血球はドナーに返されてもよい。末梢血幹細胞収量は、ドナーの骨髄から末梢循環に幹細胞を動員する働きをする顆粒球コロニー刺激因子の毎日の皮下注射により増加させてもよい。
【００９２】
羊水から造血幹細胞を抽出することも可能である。臍帯血は、出産後に幼児の臍帯および胎盤から得られる。臍帯血は、成人血液中で通常みられるよりも高濃度のHSCを有する。しかし、臍帯から得られる少量の血液（通常約50 mL）は、成人よりも小さな子供への移植により適する。しかしながら、複数のユニットが使用できる。臍帯血ユニットの体外での増大を用いたより新しい技術または異なるドナーからの２つの臍帯血ユニットの使用は、臍帯血移植片を成人に使用することを可能にする。臍帯血は、生まれている子供の臍帯から採取できる。
【００９３】
他の臓器とは異なり、骨髄細胞は、あまりにも多くの細胞を損傷することなく、長期間凍結（凍結保存）できる。細胞は、通常、移植治療に先立って、レシピエントから数か月かけて採取されるため、これは、自家HSCに不可欠である。同種異系間移植の場合、凍結融解の工程の間に起こるかもしれない細胞消失を回避するために、新鮮なHSCが好ましい。同種異系の臍帯血は、出産時にのみ入手可能であるため、臍帯血バンクで通常凍結保存される。HSCを凍結保存するために、保存剤DMSOを添加しなければならず、細胞は、氷晶形成中の浸透圧による細胞傷害を防ぐために、制御された速度の凍結装置において、非常にゆっくりと冷却しなければならない。HSCは、通常液体窒素を用いる凍結装置中で、何年も保管されてもよい。この観点から、本発明は、移植を考慮される前に、本願に説明されたように既に保管されたドナー材料の型判定およびリスク評価に関するものであってもよい。
【００９４】
本発明は、免疫反応のリスクの評価、好ましくは移植前リスク評価を包含し、それにより任意の臓器または組織が移植のためのドナー材料として考慮されてもよい。例えば、腎移植（kidney transplantation）または腎移植（renal transplantation）は、例えば末期腎疾患の患者への腎臓の臓器移植である。腎移植は、通常ドナー臓器のソースに応じて、死亡したドナー（deceased-donor、以前は"cadaveric"として知られた）または生体ドナー移植として分類される。生体ドナー腎移植は、ドナーとレシピエントの間に生物学的関係が存在するかどうかに応じて、遺伝学的に血縁（生体血縁）または非血縁（生体非血縁）移植としてさらに特徴づけられる。
【００９５】
同種抗原反応性は、外来性材料からの抗原として理解されてもよい、同種抗原を有するリンパ球または抗体の反応として定義される。同種抗原認識は、T細胞が同種抗原を認識してもよく、臓器移植後に潜在的に移植拒絶反応を引き起こしてもよい、直接的または間接的同種抗原認識により起こってもよい。
【００９６】
移植片対宿主病（GVHD）は、同種異系の細胞移植、組織移植または臓器移植の後に起こる比較的一般的な合併症である。それは一般的に幹細胞移植または骨髄移植に関連するが、この用語は、組織移植または臓器移植の他の形態にも適用する。組織（該移植片）における免疫細胞（典型的に白血球）は、レシピエント（該宿主）を「外来性」として認識する。移植された免疫細胞は、その後宿主の体細胞を攻撃する。GVHDは、使用された血液製剤が照射を受けていない場合、輸血後にも起こり得る。
【００９７】
プロテアソームは、全ての真核生物および古細菌の内部、並びにいくつかの細菌中のタンパク質複合体である。真核生物においては、プロテアソームは核および細胞質中に局在する。プロテアソームの主な機能は、ペプチド結合を破壊するタンパク質分解、化学反応により、不要なタンパク質または損傷されたタンパク質を分解することである。MHCクラスI分子により提示される抗原性ペプチドの多くは、プロテアソームによる細胞内タンパク質の分解により生じる。ミスマッチHLA抗原のプロテアソーム分解は、本願で説明された計算ツールにより予測できる。
【００９８】
実施例５との関連で、全生存（OS）は、任意の時点で病態とは無関係に、生存率として定義された。フォロー終了時に生きている患者が検閲された。無病生存（DFS）は、フォローの任意の時点で生きていてかつ無病である確率として定義される。フォロー終了時に生きている患者が検閲された。移植関連死（TRM）は、以前の病気の再発を除く死亡率として定義される。再発は競合イベントとして扱われる。急性GVHDの格付け（grading）は、国際合意により定義され、慢性GVHDは、シアトル基準（参照文献31c、32c）により定義された。再発発生率（RI）は、競合イベントとして扱われた任意の他の原因による死を伴う任意の時点の再発率として定義される。
【００９９】
本発明は以下の図により説明される。本願で提供される図は、本発明の特定の実施形態のサポートを表し、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】図１は、臨床結果ごとの提示可能なペプチドの数の箱ひげ図（boxplots）を示す。A-C：急性GVHDのグレードによる提示可能なペプチドの数。D-F：慢性GVHDのグレードによるペプチドの数。G-I：悪性疾患の再発／進行によるペプチドの数。J-L：生存によるペプチドの数。左のグラフは、HLAクラスIおよびIIにより提示可能なペプチドの合計の数を表し、中央のグラフは、HLAクラスIにより提示可能なペプチドの数を表し、右のグラフは、HLAクラスIIにより提示可能なペプチドの数を表す。水平な線は中央値を表し、白い四角は２５番目から７５番目の１００分位数（percentile）を表し、ひげ（the whiskers）は範囲を表す。ペプチドの数の違いは、マン・ホイットニーのU検定で試験された。提示可能なペプチドの数の有意でない増加は、aGVHDグレードII-IV、全身型cGVHDを発症した患者、および病気を再発／進行しなかった患者について観察された。aGVHDではない、またはaGVHDグレードI、並びにaGVHDグレードII−IVのそれぞれの患者の中央値は、HLAクラスIおよびIIにより提示可能なペプチドの合計については６、並びに８、HLAクラスIにより提示可能なペプチドについては２、並びに３、HLAクラスIIにより提示可能なペプチドについては４、並びに５である。cGVHDではない、または限局型cGVHD、並びに全身型cGVHDのそれぞれの患者の中央値は、HLAクラスIおよびIIにより提示可能なペプチドの合計については６、並びに１０、HLAクラスIにより提示可能なペプチドについては２．５、並びに４、HLAクラスIIにより提示可能なペプチドについては４、並びに６である。再発していない患者、並びに再発している患者のそれぞれの中央値は、HLAクラスIおよびIIにより提示可能なペプチドの合計については８、並びに８、HLAクラスIにより提示可能なペプチドについては４．５、並びに２、HLAクラスIIにより提示可能なペプチドについては４、並びに５である。生存している患者、並びに生存していない患者のそれぞれの中央値は、HLAクラスIおよびIIにより提示可能なペプチドの合計については８、並びに８、HLAクラスIにより提示可能なペプチドについては３、並びに２、HLAクラスIIにより提示可能なペプチドについては４、並びに５である。
【図２】図２は、臨床結果ごとの提示可能なペプチドの数が多数または少数である患者のカプラン・マイヤー曲線を示す。A-C：急性GVHDグレードII−IVの累積罹患率に対する提示可能なペプチドの数。D-F：全身型慢性GVHDの累積罹患率に対する提示可能なペプチドの数。G-I：悪性疾患の再発／進行の累積罹患率に対する提示可能なペプチドの数。J-L：死亡の累積発生率に対する提示可能なペプチドの数。左のグラフは、HLAクラスIおよびIIにより提示可能なペプチドの合計の数を表し、中央のグラフは、HLAクラスIにより提示可能なペプチドの数を表し、右のグラフは、HLAクラスIIにより提示可能なペプチドの数を表す。各臨床結果について、対照群の中央値は、図１に示されるようなカットオフ値として選択された。点線は、このカットオフ値より上のペプチド数を提示することが予測される患者を表し、実線は、カットオフ値またはカットオフ値より下のペプチド数を提示することが予測される患者を表す。ハザード比（Hazard Ratios）は、前者の群と後者の群を比較して決定した。NSは、有意差なしを意味する
【図３】図３は、８６９の腎移植ペアのコホートから抽出された、本発明者らの包含基準に適合する腎移植の研究対象集団を説明する。
【図４】図４は、免疫原性（黒丸）および非免疫原性（白い四角）HLAクラスIアリルにおけるPIRCHE-IIの数の比較を示す。A）非免疫原性アリルと比較して、免疫原性アリルにおいてより多数のPIRCHE-IIが観察された。B）ミスマッチドナー由来のHLAアリルが、スクランブルされたレシピエントDRB1バックグラウンドに対して分析された場合、差異は観察されなかった。報告されたp値は、マン・ホイットニーのU検定に由来する。
【図５】図５は、免疫原性（黒丸）および非免疫原性（白い四角）HLAクラスIアリルにおけるHLAMatchmaker triplets（A）およびeplets（B）の数の比較を示す。報告されたp値は、マン・ホイットニーのU検定に由来する。
【図６】図６は、２つの別々の実体として、epletsとPIRCHE-IIの同定を説明する。A）epletsの数とPPIRCHE-IIの数の間の相関性。免疫原性アリルは、黒丸で表され、非免疫原性アリルは、白い四角で表される。その結果の回帰曲線は、それぞれ実線と点線で表される。回帰係数は、２つの群の複合解析に基づく。重複するデータは、視覚化目的に限り、０．１ユニット位置を変えた。B）研究対象の腎移植コホートにおいて観察された、HLAクラスI分子上のPIRCHE-IIの局在。色は、免疫原性HLAクラスI抗原におけるアミノ酸の相対的存在を示す（緑は０、黄色は１〜４、オレンジは５〜９、および赤は１０以上）。非多型β-2m分子は、青で表される。C）１００００のシミュレーションされた移植の仮想移植コホートにおいて観察された、HLAクラスI分子中のPIRCHE-II（実線）対eplet関連残基（黒い棒）の局在。eplet関連残基は、3.0オングストロームepletパッチ（４）内に存在する多型残基として定義された。重複（灰色の棒）は、アミノ酸残基がepletとPIRCHE-IIの両方に存在した状況の割合として算出された。
【図７】AはPIRCHE-Iと全生存の相関性、BはPIRCHE-IIと全生存の相関性を示す。低PIRCHE-Iおよび低PIRCHE-II群の両方における患者は、10/10の患者と類似したOS比率を有する。中または高PIRCHE-IおよびPIRCHE-IIを有する患者は、10/10の患者と比較して有意にOSが低下する（表３）。３つのPIRCHE群を相互に比較した場合に、中または高PIRCHE群（PIRCHES中および高群の合計）の患者は、低PIRCHE群と比較して、OSが統計学的に有意に減少した（PIRCHE-I：p=0.029およびPIRCHE-II：p=0.048）。
【図８】Aは全生存に対するPIRCHESの影響、Bは無病生存に対するPIRCHESの影響、Cは移植関連死に対するPIRCHESの影響、Dは急性GVHDに対するPIRCHESの影響、Eは慢性GVHDに対するPIRCHESの影響を示す。対照の10/10マッチドナー（the reference 10/10 situation）と比較した異なるPIRCHE群の影響の多変量解析であり、急性GVHDの症例におけるHRまたはORは、95％信頼区間を示す。
【図９】AはPIRCHE-IとTRMの相関性、BはPIRCHE-IIとTRMの相関性を示す。低PIRCHE-IおよびPIRCHE-II群の両方の患者は、10/10と同様のTRM比率を有する。中または高PIRCHE-IおよびPIRCHE-IIの患者は、10/10の患者と比較してTRMのリスクが有意に増加する（表３）。低PIRCHE-IおよびPIRCHE-IIは、中高PIRCHESと比較して、有意に低いTRMに結びついた（それぞれp=0.038およびp=0.039）。
【図１０】図１０は、PIRCHE-IおよびPIRCHE-IIの相互作用分析、OSに対する影響を示す。提示するPIRCHE-IおよびPIRCHE-IIの数が両方低い患者は、10/10の患者に匹敵するOS比率を有する。
【発明を実施するための形態】
【０１０１】
（実施例）
本発明は、以下の実施例により説明される。本願で提供される実施例は、本発明の特定の実施形態の実際的なサポートを表す。これらは、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。これらの実施例は、１以上の非限定的実施形態の適切な技術的活動を証明する、可能な、潜在的に好ましい実施形態の説明を提供するものとして考慮される。
【実施例１】
【０１０２】
［共有されるHLA分子により提示されるレシピエント特異的なHLAペプチドの数の増加に伴うミスマッチHSCTの増加後の同種抗原反応性のリスク］
【０１０３】
＜実施例１の概要＞
背景：移植片対宿主病（GVHD）は、造血幹細胞移植（HSCT）の主要な制限因子の１つである。GVHDの確定した危険因子の１つがHLAミスマッチ（不適合）の非血縁ドナーによるHSCTである。いくつかのミスマッチは、より許容できるように見えるが、一方でGVHDの進行のリスクの増加をもたらすミスマッチもある。現在、こうした許容されないミスマッチによる同種抗原反応性の生物学的基礎は不明である。本実施例は、ドナーT細胞に対して共有されるHLAによる、許容されないミスマッチ及びそのようなミスマッチとレシピエント特異的なミスマッチHLA分子由来のペプチドの提示との関連を予測する方法の使用を説明するものである。
方法：遡及的に、９／１０マッチの非血縁ドナーから移植された、４８人の骨髄非破壊的前処置を受けた患者が分析された。HLA型判定は、配列に基づいた型判定により、高解像度レベルで判定された。共有されるHLAにより提示可能なレシピエント特異的HLAペプチドの数は、in silico（コンピュータ上）の手法を用いて予測され、対照群の予測されるペプチドの中央値がカットオフ値として選択された。
結果：HLAクラスI上でペプチドの中央値よりも多数を提示することが予測された患者は、急性のGVHD（aGVHD）がより早く、より頻繁に進行したが、一方で、HLAクラスI上及びHLAクラスII上の合計の中央値のペプチドよりも多数を提示することが予測された患者は、全身型慢性GVHD（cGVHD）が中央値以下のペプチドを提示することが予測された患者よりも早く進行した。さらに、HLAクラスI上でペプチドの中央値よりも多数を提示することが予測された患者は、悪性疾患の再発／進行の危険を低下させ、その上、発病はかなり遅かった。ミスマッチHSCT後の同種抗原反応性の発生は、HSCTの前にドナーとレシピエントのHLA型判定に基づいて予測することが可能である。
【０１０４】
＜方法＞
研究対象集団：２００１年から２０１１年の間に、オランダのユトレヒトのユトレヒト大学医療センターで９／１０マッチの非血縁ドナーから移植された患者が、遡及的に分析された。本分析対象の患者は骨髄非破壊的（NMA）前処置レジメンを受け、GVHに向かうミスマッチの移植をされた。生着しなかった患者は除かれた。ヘルシンキ宣言及び地域のIRBガイドラインに従い、患者の医療記録の研究への利用について、同意書により患者の同意を得た。
【０１０５】
治療：患者は、１日に２Gyの全身照射、４日間で２mg／kg／dayのATG（genzyme社）投与、３日間で３０mg／m２／dayのフルダラビン投与からなるNMA前処置の治療を受けた。患者は無操作の移植片を受容した。免疫療法は、１２０日目まで１日２回のシクロスポリンA  ４．５mg／kg投与からなり、その後GVHDが起こらない状態で、週に１０％の減量により投与量を徐々に減らした。シクロスポリンAは、ミコフェノール酸モフェチル１５mg／kgと組み合わせて、８４日目まで１日３回投与し、もしもGVHDが起こらなければ、２週間で徐々に減らし、終了した。全ての患者は、報告（参照文献１６a）のように、１日２回のコトリモキサゾール４８０mgの投与と１日２回のバラシクロビル５００mgの投与を含む、抗生物質予防投与を受けた。
【０１０６】
HLA型判定：高解像度HLA型判定は、５つの遺伝子座（HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DRB１、及びHLA−DQB１）のsequence−based typing法により、全ての患者とドナーに対して行われた。アリルと遺伝子型の不明瞭点は解決された。１組のHSCTペアの遡及的な高解像度HLA−C型判定のために、利用可能なDNAの残りはなかったが、しかし、低解像度レベルHLA−C型判定は、以前実施された。このドナー−レシピエントペアのために、高解像度HLA型判定は、HLA-B-C関連の頻度に基づいて推測された(参照文献１７a)。
【０１０７】
HLA由来ペプチド判定：好ましくは、各ドナー−レシピエントペアのために、提示可能なレシピエント特異的なHLA由来のペプチドが同定可能である。ドナーとレシピエントの全てのHLAアリルの中で、プロテアソームによるアミノ酸配列のプロセシングやTAPチャネルを介した輸送は、NetChop３．０を用いて予測される（参照文献１８a、１９a）。続いて、高確率でプロセシングされたペプチドは、NetMHCpan２．０を用いて、ドナーとレシピエントの間で共有されるHLAクラス1アリル（HLA−A及びHLA−B）により提示される可能性について、調べられる（参照文献２０a、２１a）。九量体のペプチドのみが分析される。IC５０結合値が５００nM以下のペプチドが、関連するバインダーとして選択される（参照文献２２a）。HLAクラスII提示（HLA−DRB１）のために、潜在的なバインダーは、NetMHCII１．０で予測され（参照文献２３a、２４a）、１０００nM以下のIC５０結合値は関連があるとみなされる（参照文献２５a）。提示されている共有されるHLAアリルごとに、ドナーHLAアリル由来の予測されたバインダーがドナー自己ペプチドとみなされ、分析から除かれる。各ドナー−レシピエントペアのために、提示可能なレシピエント特異的ペプチド(ミスマッチのレシピエント−HLAアリル由来であり、共有されるHLAにより提示されることが予測される)の数が数えられる。これらのレシピエント特異的ペプチドは、提示可能なペプチドの数として報告される。本願で同定される提示可能なペプチドは、クラスIアリル（PIRCHES−I）又はクラスIIアリル（PIRCHES−II）のどちらの場合も、予測される間接的に認識可能なHLAエピトープ（PIRCHES）と一般に呼ばれる。
【０１０８】
統計的手法：評価された臨床結果は、aGVHD、cGVHD、悪性疾患の再発／進行、及び全死亡（overall mortality）（任意の死因による死）である。これらの臨床エンドポイントとの関連を分析された因子は、提示可能なペプチドの数（合計、HLAクラスI及び2別々に）、ドナーリンパ球輸注（DL１）、レシピエント及びドナー間の性ミスマッチ、及び患者の年齢である。aGVHDの発生についてもcGVHDと関連して、分析された。再発／進行は、悪性疾患を有するレシピエントのみ分析された。死亡は、GVHDと再発の競合リスクとみなされた。DL１とレナリドマイドは、aGVHDの競合リスクとみなされた。中央値と連続変数（continuous variables）の範囲とカテゴリー変数（categorical variables）の割合が報告された。
【０１０９】
可能性のある臨床結果ごとの提示可能なペプチドの数の違いは、マン・ホイットニーのU検定を用いて統計的に分析された。各臨床結果のために、対照群（例えば、aGVHDグレードII〜IV、全身型cGVHD、再発、死亡率）の提示可能なペプチドの中央値は、カットオフ値として選択された。患者は、提示可能なペプチドが多数の（中央値よりも多い）群と提示可能なペプチドが少数（中央値より少ないか又は中央値である）群の２つの群に分けられた。カプラン・マイヤー曲線は、これらの群を、aGVHDとcGVHDの発病の時間の違い、再発／進行、及び死亡率について分析するために構築された。ログランク検定は、群を比較するために行われた。コックス回帰分析は、２群間のHRsの判定、及び他の変数の検定のために使用された。０．０５より小さいP値は、統計学的に有意であるとみなされた。統計的処理は、SPSS１７．０（SPSS  Inc、シカゴ、イリノイ州、アメリカ）ソフトウェアを用いて行われた。
【０１１０】
＜結果＞
研究対象集団：２００１年８月から２０１１年３月の間に、４８人のNMA前処置の患者が９／１０マッチの非血縁ドナーから移植された。大部分は、HLAクラスIミスマッチの移植をされた（７６％）。詳細な研究群の特徴を表１にリストする。これらの患者のために、ミスマッチHLA由来の提示可能なペプチドの数が予測される。８つの提示可能なペプチド（範囲０〜２４）の中央値が観察された。HLAクラスI提示可能なペプチドのための中央値は３つで（０〜１２）、HLAクラスII提示可能なペプチドのための中央値は４つであった（０〜２４）。
表１は、研究群の特徴を示している。２００１年から２０１１年の間のユトレヒト大学医療センターにおける、GVHに向かう単一のミスマッチを有するHSCTドナーの全てのレシピエントがリストされている。レシピエントの数は、特に指定がない限り、４８人であった。
【表１】
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【０１１１】
（aGVHD）
aGVHDグレードII−IVは全レシピエントのうち、１５人（３１％）で観察された（表１）。aGVHDグレードII−IVの患者は、aGVHDを発症しなかった又はグレードI aGVHDを発症した群と比較して提示可能なペプチドの数について、有意な増加がみられなかった（図１A−C）。
【０１１２】
aGVHD発病の時間における提示可能なペプチドの数の役割を決定するために、カプラン・マイヤー曲線は、多数の提示可能なペプチドを有することが予測される患者と少ないことが予測される患者を比較するために、構築された。多数のHLAクラスIにより提示可能なペプチドを有する（２より多い）患者は、少数を有する（２以下）患者と比較して、aGVHDの発病が有意に早く（推定の平均２２３日及び３５３日、p＝０．０３、図２A）、ハザード（HR３．４５、９５％−CI  １．０８−１１．０７、p＝０．０４）の増加を伴った。aGVHDの発病までの時間は、HLAクラスI及びIIの合計、又はHLAクラスII単独により多数の提示可能なペプチドを有することが予測された患者の有意差がなかった（図２B、C）。DL１、性別ミスマッチ、及び年齢は、aGVHDグレードII〜IVとは関連しない。
【０１１３】
（cGVHD）
cGVHDの経過観察時間の中央値は、１８６日だった。１１人の患者（２３％）が広範囲のcGVHDを発病した（表１）。  全身型cGVHDの患者は、非cGVHD又は限局型cGVHDの群と比較して、HLAクラスI及びIIの合計、並びにHLAクラスIとII別々に提示可能なペプチドが多数である傾向を示した（図１D−F）。
【０１１４】
全身型cGVHDは、HLAクラスI及びクラスIIの合計において、多数のペプチドを提示することが予測される（６より多い）患者において、少数（６以下）と比較して、早期に発病し（４０２日対５２３日、p＝０．０５、図２D）、前者の群は、全身型cGVHDのハザードの増加傾向を示した（HR／４．１８、９５％−CI  ０．９０−１９．４０、p＝０．０７）。これらの傾向は、HLAクラスI又はII単独により提示可能なペプチドには観察されなかった（図２E、F）。その他の試験された変数は、全身型cGVHDの増加したハザードとの関連はみられなかった。
【０１１５】
（再発／進行）
限られた患者数のため、悪性疾患の再発と進行は、統合された診療成果として分析された。再発／進行は、悪性腫瘍を患う４４人（９８％）の患者について検査され、このうち１７人（３９％）で発病した（表１）。再発性／進行群は、HLAクラスI提示可能であるペプチドが少数である傾向を示した（非再発性／進行の患者の中央値４．５及び再発性／進行の患者の中央値２、p＝０．１３、図１H）。HLAクラスI及びIIの合計、又はHLAクラスII単独により、提示されたペプチドの数に違いはみられなかった（図１G、I）。
【０１１６】
HLAクラスIにより、少数（４以下）との比較において、多数（４より多い）のペプチドを提示することが予測される患者では、ハザードの減少とともに（HR０．０８、９５％−CI０．０１−０．６１、p＝０．０２）、HSCT後に遅れて再発／進行が発症した（１５７３日対４１７日、p＜０．０１、図２H）。この効果は、HLAクラスI及びIIの合計又はHLAクラスII単独により少数又は多数のペプチドを提示することが予測される患者では、みられなかった（図２G、I）。全てのその他の試験された変数は、再発／進行の発生と有意な関連はみられなかった。
【０１１７】
（生存）
本研究コホートにおいて、１５人（３１％）の非生存者が観察された。生存者と比較した場合、提示可能なペプチドの数は、非生存者と統計学的に差がなかった（図１J−L）。死亡までの時間は、ペプチドを少数又は多数提示することを予測された患者を比較した場合に、差がなく、その他の試験された変数について、生存との有意な関連はみられなかった（図２J−L）。
【０１１８】
（実施例１のディスカッション）
９／１０マッチの非血縁ドナーからのHSCTに最も許容されるミスマッチを定義することにより、臨床結果が改善される（参照文献１a）。最善のミスマッチは、時間のかかるCTLpfアッセイの結果に基づき、よく選択される。好ましくは、本発明に係る方法は、９／１０マッチのHSCTの状況（the 9/10 HSCT setting）において、同種抗原反応性を予測する。本方法は、特にHLAの相違の間接的な認識というコンセプトに基づいている。すなわち、HLAの相違に由来するペプチドは、ドナーとレシピエントにより共有されるHLAアリルにより提示された場合にT細胞の標的となる可能性がある。多数のこれらのレシピエント特異的に提示可能なペプチドは、臨床の同種抗原反応性と関連する。
【０１１９】
HLAクラスI上で多数のペプチドを提示することが予測された患者では、少数を提示することが予測される患者よりも高いaGVHDの発症率と早期の発病が観察可能である（図２B）。この観察結果は、aGVHDの発病におけるCTLの通説の役割に一致している（参照文献１a）。さらに、CTLpfアッセイの予測的可能性と混合リンパ球培養（MLC）アッセイの予測可能性（the predictive potential）の欠如と一致する。すなわち、CTLpfアッセイは、HLAクラスIミスマッチへの応答に焦点を合わせているが、MLCアッセイは、主にHLAクラスIIミスマッチへの応答を試験する（参照文献２７a）。
【０１２０】
HLAクラスI及びII上の合計でペプチドを多数提示することが予測される患者は、少数を提示することが予測される患者と比較して、全身型cGVHDのハザードの増加傾向がみられた（図２D）。cGVHDの発病がプロフェッショナル抗原提示細胞（APC）によるHLA由来ペプチドの提示を含み、HLAクラスIIとCD４＋T細胞の間の相互作用を引き起こすことが好ましい。動物モデルにおいて、ホストとドナーの両方のAPCがドナーCD４＋T細胞のプライミングにおいて重要であることが示されたが、正確な臨床的関連性はいまだ不明である（参照文献２８a）。ヒトcGVHDの複雑な表現型と遅発性を完全に表すモデルがないため、cGVHDの発病におけるAPCの役割の試験は、依然として困難である。
【０１２１】
GVT反応性での提示可能なペプチド数の明確な効果が観察された。すなわち、HLAクラスIにより４より多いペプチドを提示することが予測された患者は、ずっと遅く再発／進行し、発症率の低下を伴った（図２H）。この効果は、ドナーT細胞が患者腫瘍細胞を認識する可能性の増加により説明可能である。本発明に係る方法は、このように好ましくは、HLAの相違の間接的な認識の病理学的効果を予測することができるだけでなく、望ましい効果も予測できる。しかし、再発の減少は、aGVHDのリスクが増加した患者に観察された（HLAクラスI上で２より多くのペプチドを提示することが予測された）。
【０１２２】
HLA-Cミスマッチは、同種抗原反応性のリスクの不均衡な増加をもたらす（参照文献２a、２９a）。HLA-Cが細胞表面上で不安定になるようにみえるため（参照文献３０a）、レシピエント特異的HLA-Cアリルの直接的認識は、ありそうにない。したがって、HLA-CミスマッチのHSCT後において、レシピエント特異的HLA-Cアリルの間接的認識は、同種抗原反応性の誘起の最も重要なルートになるかもしれない。HLA-Cの提示は、多数のHLA―Cミスマッチ由来のペプチドのため、考えられる説明となるかもしれない。HLAミスマッチ由来の提示可能なペプチドの数を予測するときに、HLA-A又はHLA-B由来のペプチドよりも、有意により多くのミスマッチのHLA-Cアリル由来のペプチドが、HLAクラスIにより提示されることが予測される（表２）。HLA-CとHLA-DQB１ミスマッチを比較したときに、同様の傾向が観察された。総合すると、これらの結果は、HLA-Cミスマッチによる同種抗原反応性のリスク増加は、HLA-Cミスマッチ由来の多数の提示可能なペプチドが原因であることを示している。
【０１２３】
表２は、ミスマッチのHLA遺伝子座ごとに予測された提示可能なペプチドの数を示している。HLA-C由来の提示可能なペプチドの数は、HLA-A又はHLA-B由来の提示可能なペプチドよりも有意に多い。HLA-DRB１では、２つのHLA-DRB１ミスマッチしかコホートに含まれなかったために、差異が判定できなかった。
【表２】
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【０１２４】
HLAミスマッチの違いを抗体のためのエピトープとして（HLAMatchmaker）、又はT細胞による直接認識の可能性として（HistoCheck）評価する計算法を用いた以前の試みは、ミスマッチのHSCTの前に同種抗原反応性を予測することに失敗した。実際に、コホートにおいて、HLAMatchmakerにより予測されたepletsの数及びHistoCheckの相違スコアは、同様に同種抗原反応性と相関がなかった。epletsの数及び相違スコアは、本発明者らが予測したペプチドの数と相関があって、全ての方法がHLA多型性の違いを評価するという事実と一致していた。本発明のHLAMatchmaker、HistoCheckの中で同種抗原反応性の予測可能性の違いは、同種抗原反応性を予測するHLA不均衡の間接認識の可能性を表すが、一方、直接認識又は抗体産生の可能性の予測は表さなかった。
【０１２５】
本発明は、提示可能なペプチドの数の効果を評価するために、NMA前処置の患者の均一のコホートに焦点を合わせることが好ましい。ＭＡ前処置の患者は、３つの理由から評価されなかった。最初に、広く示されてきたように、ＭＡレジメンは同種抗原反応性のリスクを増加させる（参照文献1a）。次に、NMA前処置は、最も頻繁に使用されているレジメンである。最後に、結果として、MA前処置の患者の数が少なすぎた（N=12）ため、前処置の効果に加えて、提示可能なペプチドの効果を適切に分析できなかった。
【０１２６】
本発明に記載の実施例１に示したように、共有HLAアリル上に提示可能であるレシピエント特異的なペプチドの数の予測は、同種抗原反応性と相関がある（すなわち、aGVHD及び再発／進行）。これらの提示可能なペプチドの数の予測は、9/10マッチの非血縁ドナーを受容している患者のために最良の提示可能なミスマッチの定義の助けとなる。この方法は、例えば１回又は２回の臍帯血移植において、ミスマッチのHSCTの択一的記載（alternative forms）による利益を受けることがさらに好ましい。好ましくは、該方法の使用は、ミスマッチのHSCTにおけるドナー選択を改善する。
【実施例２】
【０１２７】
［予測される間接的に認識可能なHLAエピトープは、臍帯血移植後の小児患者での慢性移植片対宿主病及び再発関連死と相関がある］
【０１２８】
＜背景と目的＞
HLAミスマッチのドナーによる、造血幹細胞移植（HSCT）は、移植片対宿主病（GVHD）のリスク因子である。本発明によれば、単一のHLAミスマッチの成人の非血縁ドナーからのHSCT後の移植片対宿主反応性は、事前に予測可能である。マッチしたHLA（予測される間接的に認識されるHLAエピトープ；PIRCHES）において提示されたミスマッチのHLAアリル由来のペプチドの数は、同種抗原反応性の発生と相関があることが好ましい。HLAミスマッチは、臍帯血（CB）の移植の場合には、より良好に許容されるため、CBドナーは、単一のHLAミスマッチよりも多い場合もよく選ばれる。本発明によれば、好ましくは、PIRCHESの数は、CB移植後の同種抗原反応性と相関がある。
【０１２９】
＜材料と方法＞
一人のCBドナーから移植された７９人の小児患者の医療成果は、遡及的に分析された。好ましくは、HLA型判定は、高解像度レベルで行われた。実施例１に記載のように、PIRCHESの数は、HLAクラスIにより提示されたPIRCHES（PIRCHES-I）のためにNetChopとNetMHC-Panを、HLAクラスIIにより提示されたPIRCHES（PIRCHES-II）のためにNetMHC-IIを用いて判定された。
【０１３０】
＜結果＞
実施例２によれば、より多い数のPIRCHES-IIは、全身型慢性GVHDの発病のリスクの増加と相関がある。より多い数のPIRCHES-Iは、好ましくは、再発による死亡率のリスクの減少と関係がある。非生着又は移植片拒絶の患者は、宿主対移植片の方向において、有意により多い数のPIRCHES-Iを提示する。PIRCHES-IIの数により、慢性のGVHDの発病が予測されるが、一方、PIRCHES-Iの数により、再発関連死の発生が予測される。本発明によれば、好ましくは、CB移植の結果は、移植片対白血病効果を損なうことなく全身型慢性GVHDの減少を引き起こすCB単位を選択することにより改善される。
【実施例３】
【０１３１】
［HLA-DRB1により提示された予測される間接的に認識可能なHLAエピトープは、腎移植後のドナー特異的HLA IgG抗体の新規産生と相関がある］
【０１３２】
本発明は、IgGアイソタイプのドナー特異的HLA抗体の産生において、レシピエントからのHLAクラスII分子により提示されたHLAクラスI分子由来のヘルパーT細胞エピトープの役割の予測方法を提供する。これらの抗体産生におけるレシピエントのHLA-DRB1分子の役割は、以前より提案されてきた。実施例３において、８００人を超える大規模コホートの腎臓レシピエントが使用される。このコホートから、最初の腎移植を受容している全ての非免疫患者、続いて拒絶反応並びに腎摘出術の全ての非免疫患者が選択される。ドナー特異的HLAクラスI抗体（DSA）の新規産生は、分析され、レシピエントのHLAクラスIIにより提示される予測される間接的に認識可能なHLAエピトープ（PIRCHE-IIと名付けられた）のデータと相関が示された。包含基準に適合したレシピエントの数が比較的少数であったにもかかわらず、免疫原性のHLAアリル、すなわちDSAを引き起こすアリルは、非免疫原性のアリルよりも多くのPIRCHE-IIを含むことを特に示すことができる。さらに、ランダムなHLA-DRB1バックグラウンドを使用することにより、この効果が提示されているHLAアリルに実際に制限されていることを示すことが可能であった。PIRCHE-IIとepletsの局在のデータは、これらのエピトープがドナー特異的HLA抗体の産生におけるepletsから独立した存在として実際に機能することを示唆している。本分析を通して、移植後の同種免疫の判定及び／又は予測のための方法を提供することができ、許容可能なミスマッチを定義するための追加の手段となる、潜在的な技術的効果が証明される。
【０１３３】
＜実施例３の概要＞
背景：HLAクラスIミスマッチは、腎移植後の抗体産生を選択的に誘導する。ドナー特異的IgG HLAクラスI抗体の新規産生は、認識されたHLAクラスI抗原内のヘルパーTエピトープを提示することによる患者のHLAクラスIIバックグラウンドに左右されるかもしれない。
【０１３４】
方法：個別のHLAクラスIミスマッチにおけるミスマッチのドナーのヒト白血球抗原（HLA）クラスIに対する抗体産生と、HLAクラスIIに限定された予測される間接的に認識可能なHLAエピトープ（PIRCHE-II）の数の間の相関は、本発明の実施例３で説明される。この目的のために、腎移植を受容した並びに拒絶した２１人の非免疫患者のコホートから腎摘出術後に採取した血清が分析される。
【０１３５】
結果：４９人のHLAクラスIミスマッチは、HLA-Matchmakerにより、その全てが免疫原性のepletsを含むことが判明した。ドナー特異的HLA抗体反応は、腎摘出術後に38のHLAクラスIミスマッチに対して検出された。これらのミスマッチは、ドナー特異的HLA抗体を誘導しなかったミスマッチと比較した場合に、より多数のPIRCHE-IIを含むことが判明した。大部分のPIRCHE-II（６０％以上）は、HLA-Matchmakerにより定義されたようにepletsの一部ではなかった。本発明は、したがって、レシピエントHLAクラスII分子によるドナー由来のHLAクラスIペプチドの提示がドナー特異的IgG HLA抗体の新規産生において、重要な役割を果たすという発見を利用する方法を提供する。
【０１３６】
＜レシピエント、材料、及び方法＞
【０１３７】
（移植レシピエント）
１９９０年から２００８年の間にオランダ、ユトレヒト、ユトレヒト大学医療センターにおいて実施された、８６９症例の腎移植のコホート全体が分析された。このコホートから、腎移植片が除去されたレシピエント、移植前に同種免疫イベントが起こらなかった、すなわち、妊娠、輸血、又は以前に臓器又は幹細胞移植をしていない、レシピエントが選択された。HLA-A及びHLA-B抗原に完全にマッチしたレシピエントペアは、本研究の目的にとって有益ではなかったために、除外された。１組は、レシピエントのHLAクラスIIアリルに利用可能なバインディング法がなかったために、除外された。これらの選択基準の結果、分析可能なレシピエント−ドナーペアは２１組になった。T細胞クロスマッチ解析は、全てのドナー−レシピエントの組み合わせで、基本的なNIH技術を用いて、分離されていない末梢血単核球細胞において、ジチオスレイトール存在下で、移植前に行われた。全てのクロスマッチ結果は、陰性であった。
【０１３８】
（サンプル）
血清サンプルは、２つの時点で得た。最初に、クロスマッチに使用された移植前の血清が、分析された。次に、移植後の血清は、移植摘出の３か月後に得られたものを使用された。後者の時点の理由は、その時に免疫抑制はなく、抗体分析は、ドナー腎臓の抗体フィルタリング効果による影響をもはや受けなかったためである。レシピエントの全ての血清は、正規のパネル反応性HLA抗体（PRA）スクリーニングを目的として得られた。
【０１３９】
（HLA型判定）
各レシピエントのために、２つの独立して採取されたサンプルは、異なる方法により型判定され、すなわち、１つのサンプルは、商業用の型判定トレー（Biotest, Dreieich, Germany）を用いた従来の補体依存性細胞傷害（CDC）手順を用いて、血清学的に型判定し、１つのサンプルは、商業用試薬を用いたルミネックス（Luminex）を組み合わせて、メーカー（OneLambda Inc., Canoga Park, CA, USA）の指示に従ったPCR-SSO法に基づいて、HLAクラスIおよびIIアリルを中間解像度で分子的に型判定した。ドナー型判定のために、１つのサンプルのみが、血清学的並びに分子的型判定の両方、続いてレシピエント型判定に関して同様の手順を行うために、局所的に利用可能であった。全ての症例において、当センターにおけるドナー型判定は、ドナーセンターにより提供されたHLA型判定を確認した。追加の高解像度型判定は、DNAがなお利用可能であった全てのレシピエントおよびドナーについて行われた。残りの５人について、全ての型判定の結果は、観察されたNMDP複対立遺伝子コード（multiple allele codes）内で報告されたHLA頻度に基づいて、最も可能性が高い高解像度型判定に変換された（参照文献15b）。１つの症例では、このアプローチが、１０％以上の頻度で複数の選択肢を導き、すなわち B44は、B*44:02またはB*44:03に変換可能であった（図３）。これらのHLA分子は、１つのアミノ酸、すなわちこのペアのための１つのみの違いではあるが、データは、両方の可能性について分析され、その結果は、このペアのために平均された。
【０１４０】
（HLA抗体スクリーニングおよび特性解析）
試験は、Labscreen Single Antigen kits（OneLambda Inc.）を使用して、標準のメーカーのガイドラインに従い、HLA-AおよびHLA-Bに対するHLA抗体の存在または欠如を判定するために行われた。ビーズは、Luminex 200 flow cytometer（Luminex Inc., Austin, TX, USA）で解析された。MFIが１０００を超える結果は、陽性として点数化された。
【０１４１】
（HLAクラスI由来のPIRCHE-IIの同定）
本発明によると、好ましくは、全てのミスマッチのHLAクラスI分子について、PIRCHE-IIの数は、エピトープ含有HLAクラスIアリルへの潜在的抗体反応を説明するために、調べられる。PIRCHE-IIは、本実施例において、ミスマッチのドナー由来HLAクラスI分子内のレシピエントHLAクラスII結合エピトープとして定義され、レシピエントの他のHLAクラスIアリルのいずれかによりカバーされない。HLAクラスI由来PIRCHE-IIは、HLAクラスII結合予測装置NetMHCIIを使用して予測される（参照文献23a）。この予測装置は、どのようにして潜在的リガンドがHLAクラスII分子の結合溝に整列するのか予測するために、SMM-align予測装置に基づいており（参照文献24a）、続いて、どれくらい整列されたリガンドが結合することが期待されるかについて予測される。予測される結合親和性が高い（ICが1000 nM未満である）場合（参照文献16b）、結合溝に整列した９個のアミノ酸は、HLAクラスIIエピトープとして定義される。
【０１４２】
（Matchmaker解析）
HLAMatchmaker epletsは、HLAMatchmaker version 2.1（http://www.HLAMatchmaker.net）に基づいて、HLAアリルに選定される（参照文献17b）。HLA-AおよびHLA-B遺伝子座のみが、これらの解析に含まれる。ミスマッチepletsの数は、レシピエントのHLA-AおよびHLA-B遺伝子座に存在しないドナーepletsの数として、判定された。
【０１４３】
（Tヘルパーリガンドとepletsの局在）
HLA分子内の異なる多型残基は、ミスマッチの異なる型の一因となり、すなわち、eplet-またはPIRCHE-II手法のどちらかにより判定されるものとなる。epletsおよび／またはPIRCHE-IIに関わった多型残基を同定するために、好ましくは、解析は、研究コホートおよびランダムに生成された仮想のレシピエント−ドナーペアのコホートから得られたデータの中から行われる。後者のコホートのために、白色人種のHLA-A/B/C/DR-ハプロタイプ頻度を反映している仮想人口は、生成された。これらのハプロタイプ頻度は、以前の研究から得られた（参照文献15b）。局所的なマッチプロフィールにマッチするレシピエント−ドナーの組み合わせをシミュレーションするために、組み合わせたHLA-AおよびHLA-B遺伝子座上の最大で３つのミスマッチ、およびHLA-DR遺伝子座上の１つのミスマッチが承認される。仮想の人（virtual imdividuals）の生成は、これらの要件に当てはまる仮想のレシピエント−ドナーの組み合わせの合計が１００００に達したときに止められた。続いて、ミスマッチのHLAクラスIアリルは、上述したeplet手法とPIRCHE-II手法を用いて評価された。相対度数プロット（relative frequency plots）は、HLA分子内のepletsおよびPIRCHE-IIの局在に基づいて構築された。PIRCHE手法とeplet手法の間の位置取り（position usage）の重複を測定するために、どちらかの手法による各アミノ酸の使用は、MHC-I分子中で変わりやすいそれらの位置で判定された。両方の手法について、使用回数（usage counts）は、合計が１００％となるように、標準化された。回数間の重複は、これらの標準化された使用回数の重複として判定された。
【０１４４】
（統計解析）
ドナー由来の全てのミスマッチのアリルは、DSAが検出された一群（免疫原性群）およびDSAが示されない一群（非免疫原性群）に分けられた。これら二群間で、非自己HLAクラスI由来のPIRCHE-IIの数および／またはHLAMatchmaker trpletsおよびepletの数は、マン・ホイットニーのU検定（GraphPad Prism 5.03, GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA）を用いて比較された。
【０１４５】
＜結果＞
（特異度の概要）
合計２２人のレシピエントが包含基準にマッチした（図３）。その中の２１人の血清中で、ドナー特異的抗体は、検出可能であった。合計３８の免疫原性アリル（18個のHLA-Aおよび20個のHLA-B）および１１の非免疫原性アリルHLAアリル（3個のHLA-Aおよび8個のHLA-B）が同定可能であった。これらの数は均一に分布した（カイ２乗検定、データは省略する）。
【０１４６】
（免疫原性アリルは、より多くのPIRCHE-IIを含む）
本発明によると、全てのミスマッチアリルについて、特に、レシピエントのHLA-DRB1アリルに結合可能である、非自己HLAクラスI由来PIRCHEの数が、予測される。図４Aに示されたように、免疫原性群は、非免疫原性群と比較してより多数のPIRCHE-IIを含む（マン・ホイットニーのU検定において、p < 0.01）。平均値は、それぞれ、3.0および1.2であった。これらの違いは、スクランブルされたDRB1バックグラウンドに対して、ミスマッチドナー由来HLAアリルが解析された場合に観察されなかったことから（図４B）、特定のレシピエントのDRB1バックグラウンドが、PIRCHE-II解析において、役割を果たすことを示唆している。
【０１４７】
（免疫原性アリルは、tripletsとepletsの数が増加した）
免疫原性群と非免疫原性群は、HLAMatchmakerにより判定されたように、tripletsとepletsの数を比較された。triplets（図５A）の数とepletsの数（図５B）の両方が、非免疫原性群よりも免疫群生群において有意に高い（マン・ホイットニーのU検定において、triplets: p < 0.005; eplets: p<0.0005）。
【０１４８】
（epletsはPIRCHE-IIと共存しない）
epletsとPIRCHE-IIの共有される生物学的起源に基づいて、epletsとPIRCHE-IIの数の間の相関関係が期待される。この問題を扱うために、PIRCHE-IIの数に対するepletsの数と実行された相関分析は、プロットされた。相関関係は、非免疫原性アリル（R2=0.14; 傾きの有意性: p < 0.0005）および免疫原性アリル（R2=0.14; 傾きの有意性: p<0.05; 図6A）の両方について観察された。２つの群の傾きは、相互に重複していた。続いて、関与したアミノ酸の位置により示唆された、研究コホートにおけるPIRCHE-IIの地形学的局在（the topographic location）は、分析された。これらのPIRCHE-IIの局在は、epletsの局在と比較された。PIRCHE-IIの多型アミノ酸は、HLAタンパク質のβシートおよびα3ドメインにおいて非常に大きな比率を占めるが、一方、epletsは、HLAタンパク質の表面残基上に局在し、抗体への接近が可能である。これらのデータは、１００００の仮想移植ペアでのシミュレーション実験により確かめられ（図６C）、これにより、多数のHLAクラスI由来の多型アミノ酸（６２％）が、PIRCHE-IIとして同定可能であるが、DSAにより認識されるepletの一部ではないことを示している。
【０１４９】
＜実施例３の検討＞
レスポンダーのHLA-DR表現型は、HLA抗原の抗原性において、決定的な役割を果たすかもしれない（参照文献7b、8b、18b）。Bw4特異的抗体の産生は、レスポンダーにおけるHLA-DR1またはHLA-DR3表現型のいずれかの存在と強く相関する。試験管内で、Bw4由来ペプチドは、DRB1*01およびDRB1*03発現細胞に強く結合するが、一方、対応するBw6ペプチドは、結合しない。同様に、HLA-DRB1*15:01は、HLA-A2ミスマッチ移植ペアにおけるHLA-A2抗体の産生のエンリッチメント（an enrichment）を示す（参照文献24a）。この考えに基づいて、腎移植の成果を改善するために、レスポンダーのHLA-DR表現型との関連で、ドナーのHLAクラスIミスマッチを考慮することが提案された。今までのところ、この考えは、レシピエントのHLAクラスIバックグラウンドを考慮することなく、唯一評価された。さらに、多数のHLAアリルを考慮して、巨大な移植コホートは、このアプローチの危険な状態である、全ての組み合わせを定義することが要求される。
【０１５０】
本発明によると、好ましくは、厳密に選択されたコホート上で、ドナー特異的HLA抗体を説明するために、自己HLAの下部構造へのHLA結合の計算的アプローチが適用され、すなわち移植前に免疫イベントがなく、その腎移植片が、HLA抗体の分析の前に取り除かれたレシピエントのみが含まれた。この選択により、より小さな研究対象母集団となったが、分析を単一の免疫イベント、すなわち腎移植に制限することができた。さらに、この選択は、血清中のドナー特異的HLA抗体の正しい検出を妨害し得る、残りのドナー臓器の吸収効果の影響を除外した（参照文献19a）。本研究により、DSAが検出可能であるアリルとして定義される、免疫原性のドナー由来HLAクラスIアリルは、レシピエントからのHLAクラスII分子、PIRCHE-IIにより提示可能であるエピトープを多数含むことが説明される。明らかに、ドナーおよびレシピエントのHLAクラスIアリル間の類似性のレベルは、PIRCHE-IIの数に影響し、すなわち類似性が低いほど、非自己エピトープを発見する可能性が高くなる。類似性のレベルよりもむしろレシピエントのHLA-DRが、観察結果を説明している。その確証は、したがって、例えば、無作為のHLA-DRバックグラウンドを用いるPIRCHE-IIの数の計測で得られる。これらの解析では、免疫原性および非自己免疫原性アリルは、無作為のHLA-DRバックグラウンドとの関連で、同様の数のペプチドを示した（図４B）。したがって、レシピエントの実際のHLA-DRバックグラウンドは、なぜ一定のミスマッチが免疫原性であるのか、あるいは免疫原性ではないのかについて説明するために、考慮に入れなければならない。レシピエント特異的HLA-DRバックグラウンドは、移植後のDSAの産生の可能性の予測に不可欠であり、観察される違いは、抗体提示における違いによるものであり、ミスマッチ間の類似性における違いによるものではない。HLAMatchmakerの結果およびPIRCHE-IIの結果は、２つの独立した指標であり、ともにDSAの産生を支持している。
【０１５１】
２つの要素が本発明者らの分析の成果を改善する；HLAクラスII結合予測の質並びにレシピエントおよびドナーのHLA型判定の解像度（the resolution）である。NetMHCIIにおいて、HLA結合モチーフは、11個の異なるHLA-DRB1アリルを含む、9個のHLA-DR抗原として明確に定義されている。したがって、HLA-DRB1アリルの数について、ペプチド結合特性は、決定されていない。HLA-DRB1アリルの高水準の多様性を考慮に入れると、ペプチドスクリーニング結合実験による個々のHLAクラスII結合モチーフの特性評価は、実行が困難である。したがって、代わりとなるアルゴリズム、NetMHCIIpanが計算的アプローチを介して、開発されてきた（参照文献20b）。
【０１５２】
NetMHCIIpanは、限られた実験の結合データが報告されてきた、アリルの情報を提供する、一次アミノ酸配列に基づいて、結合モチーフを定義できる（参照文献20b）。データセットについて、NetMHCIIpanは、HLA-DRB1*13:01アリルのより良い予測を提供するのみであると考えられる。そのため、NetMHCIIpanを用いた分析は、モデルの成績を高めなかった（データは省略する）。本遡及研究において、低解像度型判定データは、３人のドナーと２人のレシピエントについて、高解像度HLA型判定に外挿できなかった。これらの症例において、全ての有望な選択肢からの結果は、平均値を算出され（ドナー型判定の場合）、またはともに差し引かれた（レシピエント型判定の場合）。このアプローチは、例えば、誤った研究課題へと導き、続いて特異的抗体の誘導におけるヘルパーTリガンド数の効果の過小評価につながった。したがって、抗HLA IgG抗体の産生におけるPIRCHE-IIの効果は、例えば、報告されたよりも強い。
【０１５３】
本発明で説明されたPIRCHE-IIおよびHLAMatchmakerにより判定されたepletsの両方は、同じ現象に基づいており、すなわちレシピエントおよびドナーのHLAアリルにおけるミスマッチのアミノ酸である。そのため、これら２つの指標は、完全に分析することはできない。しかし、免疫原性アリルは、非免疫原性アリルよりも多数のeplets/tripletsを示すが、分析の様々な側面が、PIRCHE-IIが、少なくとも部分的に、eplets/tripletsの数から独立してふるまうことを示す。
【０１５４】
第一に、実際のHLA-DRB1バックグラウンドが不可欠であることが示されており、すなわちスクランブルされたHLA-DRB1バックグラウンドを使用する場合、免疫原性との相関はみられなかった（図４B）。第二に、非免疫原性群を分析した場合に、PIRCHE-IIの数とepletsの数の間に強い相関性があるが、この相関性は、免疫原性群においては、はるかに弱い（図６A）。第三に、潜在的ヘルパーTリガンドに含まれるアミノ酸の物理的位置は、epletsに関係するアミノ酸の位置と異なった分布をしている（図６B−C）；α3ドメイン並びにα1ドメインのN末端部分は、PIRCHE-IIが豊富であるようにみえるが、一方でほとんどepletsがみられない。まとめると、これらの２つの指標は、DSA産生の可能性を予測すると同時に、相互に相補的である。移植後のDSAの産生における、レシピエントHLAクラスIIにより提示されるドナーHLAクラスIの間接的認識は、遡及研究においてより良い予測値を導く。両方の指標が、移植後のDSAの産生のより良い予測のために相互に補完するという事実は、IgG抗体産生の免疫生物学的概念と一致する。抗体エピトープ（eplets）および多型クラスI由来ヘルパーTエピトープについての個々の物理的位置の発見は、「連鎖した認識（linked recognition）」の本発明者らの理解と関連があるかもしれない。
【０１５５】
本発明は、したがって、腎移植との関連で臨床的に関連する同種抗原を予測する新規の予測方法を提供する。
【０１５６】
本発明に係る方法は、ドナー特異的HLA IgG抗体の新規産生は、HLAクラスI由来のPIRCHE-IIの数とドナーのミスマッチのHLAクラスIアリルにおけるHLAMatchmaker epletsの数と相関するという発見の技術的利用を提供する。トポグラフィー分析（topographic analyses）とHLA-DRB1バックグラウンドのスクランブルは、例えば、これらの２つの現象が、２つのある程度独立した存在から生じることを示す。したがって、レシピエントHLAクラスII分子によるドナー由来のHLAクラスIペプチドの提示は、ドナー特異的HLA抗体のIgMからIgGへの同型転換における重要なメカニズムである。本発明は、好ましくは、臓器移植において、許容可能なHLAミスマッチのより良い定義、並びに移植片生着に対するこのメカニズムの効果をもたらす。
【実施例４】
【０１５７】
［10/10 HLAマッチの非血縁ドナー幹細胞移植におけるHLA-DRB1非許容のミスマッチの効果についての確認と説明：単一施設研究（a single center study）］
【０１５８】
HLA-DRB1ミスマッチドナーの造血幹細胞移植は、急性移植片対宿主病（aGVHD）のリスクの増加につながる。複数の研究は、T細胞エピトープ（TCE）群に基づいて、HLA-DPB1ミスマッチを分類するための潜在的な予後値（a potential prognostic value）を示唆している。
【０１５９】
HLA-DPB1ミスマッチの非許容性がHLA由来エピトープの間接認識により説明可能であるかどうか決定するために、予測される間接的に認識可能なHLAエピトープ（PIRCHES）の数が、本願に記載したように全ての移植ペアについて決定された。TCEアルゴリズムによりGVH非許容として分類されたミスマッチは、許容可能なミスマッチと比較して、より多数のHLAクラスIIにより提示されたPIRCHES-II（PIRCHE-II）と相関があり（p=0.026）、GVHおよびHVG非許容ミスマッチの両方とPIRCHE-Iについて同様の傾向がみられた（それぞれ、p=0.087およびp=0.061）。さらに、aGVHDグレードII−IVの患者は、グレードIまたはaGVHDではない患者と比較して、より多数のPIRCHE-I（p=0.050）を有する傾向があった。
【０１６０】
本発明は、したがって、より多数のPIRCHESが非許容ミスマッチと相関があることから、一定のHLA-DPB1の組み合わせの非許容性について、代わりとなる説明を提供する。データは、表３に要約する。
【表３】
2016509470.tif 000004
【実施例５】
【０１６１】
［許容可能なHLAミスマッチの同定：予測される間接的に認識可能なHLAエピトープ］
【０１６２】
＜実施例５の概要＞
背景：HLAミスマッチの造血幹細胞移植（HSCT）後の同種抗原反応性は、臨床結果において深刻な悪影響を及ぼす。この影響は、HLAマッチの（HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1がマッチした）移植と比較して、部分的にマッチした非血縁ドナー（MUDs）において、著しく低い全生存（OS）により反映される（参照文献1a）。HLAマッチのドナーは、全ての患者で利用可能ではない；20−40％の症例において、単一のHLAミスマッチを有するドナー（9/10マッチ）が可能性のある代案である（参照文献3a）。このような状況で最善の許容可能なミスマッチの定義は、臨床結果に役立てることができた。これまで、ある特定の非許容のミスマッチは、深刻な急性GVHDの発症のリスクの増加に関して、疫学的基礎に基づいて同定されてきた（参照文献4a）。以前に説明された方法は、しかしながら、限られた成果を示してきた。本実施例は、予測される間接的に認識可能なHLAエピトープ（PIRCHES）と名付けられた、ドナー−レシピエント共有HLAにより提示され得る、レシピエントのミスマッチHLA分子由来の、ペプチドの数とHSCT結果の関係を論証する。
【０１６３】
方法：本発明者らは、予測される間接的に認識可能なHLAエピトープ（PIRCHES）として名付けられた、ドナー−レシピエント共有HLAにより提示され得る、レシピエントのミスマッチHLA分子由来の、ペプチドの数のコンピュータ予測がHSCT結果と関係があるかどうか分析した。本発明者らは、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1およびHLA-DQB1型判定を用いて、単一のHLAミスマッチの非血縁ドナー（9/10）の909人のレシピエントについて、HLAクラスI（PIRCHE-I）およびHLAクラスII(PIRCHE-II)上に提示されるPIRCHESを予測した。PIRCHESがドナー選択ツールとして十分であるか試験するために、患者は、彼らのPIRCHESスコア（低い、中間および高い）により、同じサイズの三分位数に分けられた。これらの群の臨床結果は、評価され、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1およびHLA-DQB1マッチのドナー（10/10、n=1847）を移植された患者の参照群と比較された。
【０１６４】
結果：低いPIRCHE-IおよびPIRCHE-IIを提示している患者は、HLAマッチ移植と同等の全生存率を有したが（HR 0.98、CI 0.81-1.19、p=0.812）、一方、中間のまたは高いPIRCHE-IおよびPIRCHE-IIを提示している患者は、HLAマッチの移植と比較したときに、より高いリスク推定を示した（HR 1.23、CI 1.06-1.42、p=0.007）。同様の観察は、無病生存（HR 1.15、CI 1.00-1.32、p=0.044）、移植関連死（HR 1.36、CI 1.10-1.69、p=0.005）、急性（HR 1.64、CI 1.35-2.00、p<0.001）および慢性移植片対宿主病（HR 1.43、CI 1.10-1.86、p=0.008）についてみられた。HLAミスマッチの非血縁ドナーから移植された成人において、PIRCHESは、全生存と相関する。PIRCHESに基づいたドナー選択は、HLAマッチHSCTと同様に、HLAミスマッチHSCTについて、生存予後を提供するかもしれない。
【０１６５】
＜方法＞
（研究対象集団）
２９のドイツの移植センターで、悪性疾患のためにMUDsを移植された合計２７５６人の患者が、本分析に含まれた（表４）。このうち、n=909（33.0％）が、単一のHLAミスマッチドナー（9/10）から移植された。これらの患者が本研究群を形成した。残りのn=1847（67.0％）は、HLA同一の非血縁ドナー（10/10）からの移植を受け、対照群として使用された。１を超えるHLAミスマッチを有する患者は、除外された。データは、EMBTガイドラインに従って、集められた。患者年齢は、中央値52歳であった（範囲18-76）。骨髄破壊的前処置（MAC）は、患者のn=1696（61.5％）に使用され、強度軽減移植前治療（RIC）は、n=1060（38.5％）に使用された。移植片のソースは、骨髄（n=269、9.8％）と末梢血幹細胞（PBSC、n=2487、90.2％）であった。全ての移植片は、T細胞が豊富であった。
【０１６６】
（HLA型判定）
高解像度（4 digit）のHLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1およびHLA-DQB1型判定は、全てのレシピエントとドナーにおいて、行われた。エクソン2および3は、HLAクラスIアリルのために判定され、HLAクラスIIアリルのためにエクソン2が判定された。臨床的に関連するヌル対立遺伝子のあいまいさ（発現されないアリル）は、NMDP（National Marrow Donor Program）要件に従って除外された（参照文献24c）。アリルおよび抗原ミスマッチの両方は、HLAミスマッチとして分類され、ミスマッチのベクトル（the vector）を考慮されなかった（参照文献25c、26c）。PIRCHESの判定のために、HLAクラスIについて、エクソン１−７、並びにHLAクラスIIについて、エクソン1−６の全配列が、好まれる。本発明者らのコホートにおける大部分のHLAアリルについて、これらの全配列は、利用可能である（参照文献15c）。全配列が利用できない配列は、最隣接の原理（a nearest neighbor principle）に基づいて推定された。
【０１６７】
（PIRCHESの同定）
PIRCHESは、各レシピエント−ドナーペアについて同定された。
【０１６８】
PIRCHE-Iは、２つの段階で同定された。最初に、TAPチャネルを介したプロテアソーム介在の切断および輸送は、NetChop C-term 3.0.16を用いて、全てのドナーおよびレシピエントHLA分子について予測された（参照文献19a）。続いて、プロセシングが起こる確率（a processing probability）が0.5より大きいペプチドは、NetMHCpan 2.4を使用して、ドナーとレシピエントの間で共有された、HLA-A、HLA-B、HLA-C分子への結合能力について試験された（参照文献21a、20a）。IC50結合値が500nM以下である九量体のペプチドのみが、適切なバインダーとして認められた。このIC50値は、HLAクラスI結合ペプチドについて、一般的に認められたカットオフ値である（参照文献22a）。
【０１６９】
PIRCHE-IIについて、潜在的15量体HLA-DRB1バインダーの九量体の結合コアは、IC50結合値が1000 nM以下のものを適切とみなして、NetMHCIIPan 2.0（参照文献23a、24a）を用いて予測された（参照文献25a）。胸腺の知識に基づいて、共有されたHLA分子の提示により、ドナーHLA分子由来の予測されたバインダーは、ドナー−自己ペプチドとみなされ、したがって、レシピエント特異的PIRCHEレパートリーから除外された。各ドナー−レシピエントペアについて、PIRCHE-IおよびPIRCHE-IIの総数は別々に数えられた。
【０１７０】
（実施例5のための用語）
OSは、任意の時点において病態と独立した、生存の確立として定義された。フォロー終了時に生きている患者は、検閲（censored）された。無病生存（DFS）は、フォローの任意の時点で生きていて、かつ無病である確率として定義される。フォロー終了時に生きている患者は、検閲された。移植関連死（TRM）は、以前の疾患の再発を除く死亡発生率として定義される。再発は、競合イベントとして処理された。急性GVHDの格付けは、国際合意に従って定義され、慢性GVHDは、シアトル基準（参照文献31c、32c）に従って定義された。再発発生率（RI）は、競合イベントとして処理された任意の他の原因による死亡の任意の時点での再発の確率として定義される。
【０１７１】
（統計解析）
OSおよびDFSにおけるPIRCHESの影響の単変量解析は、カプラン・マイヤー生存分析およびログランク検定を用いて行われた。多変量解析は、時間依存効果のモデル構築を可能とした、拡大したコックス回帰モデルを用いて行われた。RI、TRMおよび慢性GVHDは、競合リスク分析を用いて分析された。GVHDの分析は、完全なデータを有し、少なくとも100日フォローした患者のサブセットにおいて、実行された。ロジスティック回帰分析は、急性GVHDの解析に使用された。層形成（stratification）は、診断の不均質を説明するために使用された。中心の効果（A center effect）は、ガンマ・フレイルティ（gamma-frailty term）を用いて調整された（参照文献33c）。統計モデルは、以下の臨床的予測因子（clinical predictors）を評価した。すなわち、患者の年齢、病期、移植までの時間、ドナー−レシピエントの性別の組み合わせ、ドナー−レシピエントKIRリガンドステータス、患者およびドナーCMVステータス、移植の年、前処置レジメンの強度、ドナーの出身（国内対国外）、幹細胞ソース（骨髄対PBSC）および抗胸腺細胞グロブリン（ATG）による治療である（参照文献23c）。CMVステータスとATG値による治療は、それぞれ、症例のn=727（26.4％）とn=537（19.5％）において欠損した。モデルは、欠損値を有する症例の削除と同様に、別の群として欠損した症例を包含することにより、交差検証された（参照文献34c）。交差検証の間、バイアスはみられなかった。単一のミスマッチ移植のPIRCHE値は、同じサイズの三分位数に分けられ、結果は、10/10マッチの移植の対照群と同様に、それぞれの群に相関した。全モデルは、比例ハザード仮説（proportional hazards assumption）について調べられ、違反（violations）はみられなかった。統計学的優位性は、p=0.05に設定された。全ての統計的処理は、R version 3.0.1で実行された。
【０１７２】
＜結果＞
（患者とドナーの特性）
9/10非血縁ドナーから移植された909人の患者並びにHLA同一のドナーから移植された1847人の対照の特性は、表4に記載されている。単一のHLAミスマッチドナーを受容した患者は、10/10移植と比較して、全体的により好ましい要素とともに移植された；9/10群の患者はより若く、より頻繁にRICレジメンを受け、PBSCがより少なく、性別ミスマッチの移植がより少なかった（女性ドナーから男性レシピエント）。しかし、10/10マッチのHSCTは、9/10よりも最近に実行された。
【０１７３】
9/10および10/10群の患者の特性。9/10群の患者は、全体的により好ましい特性とともに移植された。すなわち、彼らはより若く、より頻繁にRICレジメンを受け、PBSCがより少なく、性別ミスマッチの移植がより少なかった（女性ドナーから男性レシピエント）。
【表４】
2016509470.tif 000005
AML = 急性骨髄性白血病、ALL = 急性リンパ芽球性白血病、AL = 未分類の急性白血病、CML = 慢性骨髄性白血病、CLL = 慢性リンパ芽球性白血病、MDS = 骨髄異形成症候群、NHL = 非ホジキンリンパ腫、MM = 多発性骨髄腫、BM = 骨髄、PBSC = 末梢血幹細胞。
【０１７４】
HLAミスマッチドナーから移植された患者は、0-31のPIRCHE-Iおよび0-79のPIRCHE-IIを提示した。PIRCHESの影響を分析するために、患者は、三等分の群に分けられた。すなわち、表5に記載されたように、観察された三分位数により、低（low）、中間（中）｛intermediate (med)｝または高（high）PIRCHESを提示している群である。これらの３つのPIRCHE群への分類は、研究全体の臨床結果と相関した。
【０１７５】
PIRCHESスコアの分布。PIRCHESの影響を分析するために、患者は、三等分の群に分けられた。すなわち、観察された三分位数により、低、中間（中）または高PIRCHESを提示している群である。
【表５】
2016509470.tif 000006
低、中、高：PIRCHESスコアにより、等しいサイズの三分位数の群に分類、n=患者数、%=HLAミスマッチ群内の割合。
【０１７６】
（生存へのPIRCHESの影響）
臨床結果に対するPIRCHESの影響を分析するために、本発明者らは、PIRCHE三分位数のOSおよびDFS比率の違いを最初に試験した。低PIRCHESは、中高（中および高を統合した）PIRCHESと比較した場合に、改善されたOSおよびDFSと有意に相関した（図7；下記の表7参照）。HLAマッチの状況に関して、PIRCHESの影響を分析するために、本発明者らは、次に、PIRCHES三分位数を10/10群と比較した。低PIRCHE-IまたはPIRCHE-IIを提示している患者は、10/10 MUDから移植された患者と同様のOSおよびDFS比率を有した。しかし、中および高PIRCHE-IおよびPIRCHE-IIの両方は、10/10マッチと比較した場合に、有意に減少したOSおよびDFS比率を有した（図７AB、表６）。
【０１７７】
表６Aおよび６B：10/10 HSCTと比較したPIRCHES群についてのOS、DFSおよびTRMの単変量解析。低PIRCHE-IおよびPIRCHE-II群の患者は、10/10と比較して、同様のOS、DFSおよびTRM比率を有した。中および高PIRCHE-IおよびPIRCHE-II群の患者は、10/10と比較して、有意に減少したOSおよびDFS並びに有意に増加したTRM比率を有した。
【０１７８】
表6A：PIRCHEスコアによる生存率。
【表６Ａ】
2016509470.tif 000007
OS = 全生存、括弧内は信頼区間、ログランクp値は、10/10マッチ対照群に対してPIRCHES群を比較する、有意な結果は太字で示す。
【０１７９】
表6B：PIRCHEスコアによる生存率。
【表６Ｂ】
2016509470.tif 000008
DFS = 無病生存、TRM = 移植関連死、括弧内は信頼区間、ログランクp値は、10/10マッチ対照群に対してPIRCHES群を比較する、有意な結果は太字で示す。
【０１８０】
多変量解析において、中または高PIRCHE-Iを有する患者は、低PIRCHE-Iと比較した場合に、OSおよびDFSのハザードが有意に増加した（OS：HR 1.21、CI 1.00−1.46、p=0.049、DFS：HR 1.22、CI 1.03−1.45、p=0.024）。これは、PIRCHE-II群と比較した場合には観察されなかった。10/10マッチ移植と比較した場合に、低PIRCHE-IおよびPIRCHE-IIを提示している患者は、同様のOSおよびDFS比率を有した。しかし、有意により高い全死亡は、PIRCHE-II中群と同様に、PICHE-I中、高の患者について観察された（図８AB）。中および高PIRCHESは、10/10と比較した場合にDFSのより高いリスクとも相関したが、PIRCHE-I中群においてのみ、統計学的優位性に達した。
【０１８１】
TRMの単変量解析において、PIRCHE-IおよびPIRCHE-II中高（higher）は、PIRCHE-IおよびII低と比較して、TRMの発生率が有意により高かった（表6B参照）。完全マッチの移植と比較した場合に、PIRCHE-IおよびPIRCHE-II低群は、同様のTRM発生率を有したが、一方、PIRCHE-IおよびPIRCHE-II中および高群は、完全マッチの移植と比較して、統計学的に有意により高いTRMの発生率を有した（図9、表6）。低および中高PIRCHE-I間の多変量比較は、中高PIRCHE-I値について、TRMのリスクの増加に向かう傾向を示した（HR 1.26、CI 0.96-1.65、p=0.090）。同様の知見は、PIRCHE-II低を中高の値と比較した場合に、得られた（HR 1.28、CI 0.97-1.70、p=0.082）。PIRCHE群を10/10の状況と比較した場合に、PIRCHE-IおよびPIRCHE-II中・高の値は、TRMのより高いリスクと関連した（図８C）。
【０１８２】
表7：PIRCHE-IおよびPIRCHE-II相互作用モデル。
【表７】
2016509470.tif 000009
【０１８３】
（移植片対宿主病に対するPIRCHESの影響）
急性および慢性GVHDの分析は、フォロー少なくとも100日の患者のサブセットについて行われた（n=2054、74.5％）。HLAミスマッチ群内で、低PIRCHE-IまたはPIRCHE-II値と比較して、中高PIRCHE-IおよびPIRCHE-IIの値は、急性GVHDの確率の増加と統計学的に有意に関連した（PIRCHE-IおよびPIRCHE-IIそれぞれについて、OR 1.68、CI 1.27-2.21、p=0.001、OR 1.33、CI 1.01-1.75、p=0.045）。さらに、中高PIRCHE-Iは、低PIRCHE-Iと比較して、慢性GVHDの発症についてリスクの増加を示したが（HR 1.47、1.06-2.06、p=0.022）、一方、この影響は、PIRCHE-IIの値についてはみられなかった（HR 1.18、0.84-1.66、p=0.344）。低PIRCHE-IおよびPIRCHE-II群の患者は、急性および慢性GVHD両方について10/10マッチの移植と同様の比率を有したが、PIRCHE-IおよびPIRCHE-II高群は、急性および慢性GVHDのリスクの有意な増加を示した（図８DE）。
【０１８４】
（最適ドナー選択のためのPIRCHE-IおよびPIRCHE-IIの値）
PIRCHESに基づいたドナー選択は、低PIRCHE-Iおよび高PIRCHE-II、または高PIRCHE-Iおよび低PIRCHE-IIのいずれかの選択肢をもたらすかもしれない。PIRCHE群の異なる組み合わせの影響を分析するために、相互作用モデルは、形成され、OSと関連付けられた。サブグループの数を減らすために、PIRCHES中および高の三分位数は、中高群に統合された。低PIRCHE-IおよびPIRCHE-II値の両方を有する患者は、10/10マッチ移植と同様に、最も低いリスク推定を示した（n=288、HR 0.98、CI 0.81-1.19、p=0.817）。中および高PIRCHESの値を含む大部分の組み合わせは、やや高いリスク推定を示し、特に、中高PIRCHE-Iとの組み合わせは、中高PIRCHES-Iと低PIRCHES-IIの組み合わせと同様に、全死亡のリスクの増加とも明確に関連した（HR 1.73、CI 1.14-2.62、p=0.010、図8A、図10）。
【０１８５】
＜実施例５の検討＞
巨大コホートにおいて、本発明者らは、より多数の間接的に認識可能なHLAエピトープ、PIRCHESが有害なHSCT結果と関連することを論証する。より重要なことに、本発明者らは、少数のPIRCHESでのHSCTは、完全HLAマッチのHSCT後に観察されるものと同様の臨床結果をもたらすことを論証する（図８）。
【０１８６】
低PIRCHE-IおよびPIRCHE-IIは、10/10マッチのHSCTと同様の全死亡、DFS、TRM、急性および慢性GVHDのリスクに関連する。PIRCHE-IおよびPIRCHE-IIは、再発とは関連しなかった（図１１）。したがって、PIRCHESは、患者がHLA同一の非血縁ドナーから移植された場合と同様の予後を有するドナーを演繹的に選択することにより、HLAミスマッチドナーを含む選択手順を容易にしてもよい。特に、低PIRCHE-I群におけるドナー−レシピエントの組み合わせが好ましく、すなわちこれらの組み合わせは、中高PIRCHE-I群における患者と比較して、OSおよびDFSの確率が有意に増加し、急性および慢性GVHDのリスクの減少を示す。このPIRCHE-Iの相対的重要性は、相互作用分析の結果によっても反映され、すなわち中高PIRCHE-I群における患者は、低または中高PIRCHE-IIのいずれかと組み合わせた場合に、OS比率が減少するようにみえる。
【０１８７】
10/10マッチHSCTと関連するPIRCHESの影響を評価するために、PIRCHE群は、HLAマッチ移植の対照群と比較された。この対照群は、ベースライン特性にマッチしないが、むしろ非血縁ドナー移植のコホート全体からの完全選択とマッチした。したがって、ベースライン特性は、9/10 HSCTおよび10/10 HSCT間で異なった（表４）。全てのこれらのベースライン因子は、臨床結果との相関について分析され、成果と関連した場合に、多変量モデルに加えられた。同様の戦略は、また、PIRCHE群中のベースライン特性と比較しながら行われた（表8A、8B）。
【０１８８】
表８：PIRCHE-IおよびPIRCHE-II群における患者特性。
【０１８９】
表８A：患者特性PIRCHE-I群。
【表８Ａ】
2016509470.tif 000010
AML = 急性骨髄性白血病、ALL = 急性リンパ芽球性白血病、AL = 未分類の急性白血病、CML = 慢性骨髄性白血病、CLL = 慢性リンパ芽球性白血病、MDS = 骨髄異形成症候群、NHL = 非ホジキンリンパ腫、MM = 多発性骨髄腫、BM = 骨髄、PBSC = 末梢血幹細胞。
【０１９０】
表８B：患者特性PIRCHE-II群。
【表８Ｂ】
2016509470.tif 000011
AML = 急性骨髄性白血病、ALL = 急性リンパ芽球性白血病、AL = 未分類の急性白血病、CML = 慢性骨髄性白血病、CLL = 慢性リンパ芽球性白血病、MDS = 骨髄異形成症候群、NHL = 非ホジキンリンパ腫、MM = 多発性骨髄腫、BM = 骨髄、PBSC = 末梢血幹細胞。
【０１９１】
HSCTの結果に対するHLA-DQB1マッチングの関連性は、これまで議論の的になってきた（参照文献25c）。HLA-DQB1ミスマッチは、本コホートでの以前の分析において、死亡の増加と結びつけられたため、本実施例に含まれた（参照文献23c）。面白いことに、HLA-DQB1抗原性ミスマッチは、他の遺伝子座と比較した場合に、本コホートにおけるPIRCHE-IおよびPIRCHE-II両方の最多数をもたらした（データ省略）。このことは、なぜ本コホートにおけるHLA-DQB1ミスマッチは、有害事象（adverse events）に結びつくのかを示している。
【０１９２】
全配列が利用可能であることは、間接的認識に起因する同種抗原反応性のリスクを最も正確に推定するために好ましい。方法のセクションで述べた通り、本実施例では、不完全な配列は、アリル間の類似性に基づいて補完された。PIRCHESの予測可能性は、これらの配列がすべて解明されるときに、改善されてもよい。このように、本発明者らの研究は、新しいHLAアリルを説明するときに、全てのHLAクラスIアリルのエクソン１〜７および全てのHLAクラスIIアリルのエクソン１〜６の完全配列決定が好ましいことを強調する。
【０１９３】
HLAミスマッチHSCTは、有害事象のリスクの増加に高度に相関があるため、HSCTは、HLAミスマッチのドナーのみ利用可能である患者、特に非悪性疾患の患者については頻繁に行われない。これらの患者のために、臍帯血（CB）移植HLAマッチ基準は、それほど厳格ではないため、１つまたは２つの臍帯血（CB）ユニットが、代わりの幹細胞ソースとなり得る（参照文献36c）。しかし、非悪性疾患の患者について、CBの持続的な生着は、移植失敗率が９０％に到達するという報告がされており、問題となり得る（参照文献37c）。本実施例の結果は、したがって、少数のPIRCHESを有するHLAミスマッチの非血縁ドナーの選択は、合併症の減少をもたらすことを示唆する。したがって、非悪性骨髄疾患の患者は、HLAマッチドナーからの移植と同様の予後で、HLAミスマッチドナーの移植を受けられる可能性がある。
【０１９４】
要約すると、実施例５は、PIRCHESが臨床の同種抗原反応性と相互に関連があることを論証している。特に、低PIRCHE-Iを提示している患者は、HLAマッチドナーから移植された患者と同様の臨床結果を有する。本発明者らのデータは、したがって、T細胞によるミスマッチHLAの間接的認識は、HLAミスマッチのHSCTの後の臨床の同種抗原反応性において、重要なメカニズムであることを示唆する。HSCTに先立って潜在的ドナーに対するPIRCHESの数を判定することは、より多数のPIRCHESを認識し得る患者を避けることにより、HLAミスマッチのHSCT後の合併症の低減を可能とするかもしれない。本結果は、PIRCHESの数が少ないHLAミスマッチドナーの選択は、完全なHLAマッチの患者と同様の５年生存確率をもたらすかもしれないことを示唆する。
【実施例６】
【０１９５】
［許容可能なミスマッチを有する適切なドナー材料をスクリーニングする方法；HSCT移植］
【０１９６】
以下のステップが、HSCTのための適当なドナー材料をスクリーニングし、選択するために、行われる：
１．少なくともHLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB１およびHLA-DQB１について、レシピエントの高解像度型判定を行うステップ。
２．少なくともHLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB１およびHLA-DQB１について、好ましくは複数のドナーの高解像度型判定を行うステップ、または潜在的9/10マッチの非血縁ドナーの予測される高解像度型判定を理論的に判定するステップ。
３．本発明の方法を実行するために設計されたコンピュータプログラムに、得られたHLA型判定データを入れるステップ。
４．該プログラムが、続いて、好ましくは自動的に、PIRCHEの総数、PIRCHE-Iの数およびPIRCHE-IIの数を計算する（DNA型判定からの出力データおよびその後のPIRCHEの判定の一例として、下記の表9Aおよび表９B参照）。
５．もたらされた出力を用いて、リスク判定は、図８に示されたデータに基づいて、様々な結果について得られ、選択は、本願に開示された方法、および対応するソフトウェアにより評価されたものであるため、最も低いリスクに基づいて行うことができる。
【表９Ａ】
2016509470.tif 000012
【表９Ｂ】
2016509470.tif 000013
【産業上の利用可能性】
【０１９７】
本願に開示された実施例のように、説明されたように、本方法は、効果的な、好ましくは自動化されたおよび／またはコンピュータで実施される、好ましくは移植に先立って、免疫反応の可能性を評価する、方法を可能にする。本方法は、それにより、完全マッチのドナーと同じ同種抗原反応性のリスクを効果的に示す、ミスマッチドナー材料を選択する方法を可能にする。
【参照文献】
【０１９８】
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【図１−１】
2016509470.tif 000014
【図１−２】
2016509470.tif 000015
【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図２−８】
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【図２−９】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2016509470.tif 000027
【図６−１】
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【図６−２】
2016509470.tif 000029
【図７−１】
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【図７−２】
2016509470.tif 000031
【図８−１】
2016509470.tif 000032
【図８−２】
2016509470.tif 000033
【図９】
2016509470.tif 000034
【図１０】
2016509470.tif 000035
【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年12月16日(2014.12.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植後の免疫応答の予測のためのコンピュータ実施方法であって、ここで前記免疫応答がドナーとレシピエントの間でミスマッチであるヒト白血球抗原（HLA）に対するT細胞同種抗原反応性を含むものであって、
ここで前記方法は、以下を含む;
ドナー及び／又はドナー材料並びにレシピエントから得られたサンプルのHLA型判定及び／又はHLAミスマッチを判定するためのドナー及びレシピエントからのHLA型判定データの提供、及び
予測される間接的に認識されるHLAエピトープ（PIRCHES）の数の決定、ここで前記PIRCHESがミスマッチのレシピエントHLAアリルからのレシピエント特異的又はドナー特異的HLA由来ペプチドであり、かつ共有される（マッチする）HLA分子により提示されることが予測され、ここで、前記免疫応答の可能性がPIRCHESの増加数とともに増加する。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここでミスマッチのレシピエントHLAアリルからの前記レシピエント特異的又はドナー特異的HLA由来ペプチドがヒトプロテアソームの前記ペプチド内の切断部位を同定するためのコンピュータ実施方法により同定される、前記方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法であって、ここで共有される（マッチする）HLA分子によるペプチドの前記提示が任意のHLA分子への前記ペプチドの結合を予測するコンピュータ実施方法により判定される、前記方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記移植が幹細胞の由来に関係なく、幹細胞の移植を含む、前記方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記移植が造血幹細胞移植（HSCT）を含む、前記方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記移植が臍帯血移植又は臍帯血細胞移植を含む、前記方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記移植が腎移植を含む、前記方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法を含む、同種異系間移植のための細胞又は組織標本又は臓器の選択方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法を含む、許容されるミスマッチを有する同種異系間移植のためのドナー材料の選択及び／又はスクリーニングの方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法を含む、移植の治療結果の予測方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法を含む、移植の治療結果の予測方法であって、ここで前記治療結果が患者の生存、無病生存及び移植関連死からなる群から選択される、方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記免疫応答が抗体媒介性応答を含む、前記方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記免疫応答が望ましくない同種抗原反応性を含む、前記方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記免疫応答が望ましい同種抗原反応性を含み、ここで望ましい同種抗原反応性が抗白血病性の同種抗原反応性であり得る、前記方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記免疫応答が急性の移植片対宿主病（aGVHD）又は慢性の移植片対宿主病（cGVHD）をもたらす、前記方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記免疫応答が腎移植後にドナー特異的HLA IgG抗体の新規発生をもたらす、前記方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記PIRCHESが長さ５〜２０アミノ酸であって、好ましくは長さ８〜１５アミノ酸である、前記方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記PIRCHESが九量体の（長さ９アミノ酸の）ペプチドである、前記方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記PIRCHESが共有されるHLAクラスI（PIRCHE I）又は共有されるHLAクラスII（PIRCHE II）により提示される、前記方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法であって、ここでPIRCHE-Iペプチドが１０ μM以下、好ましくは１０００ nM以下、より好ましくは５００ nM以下の予測IC５０結合値を有する、前記方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法であって、ここでPIRCHE-IIペプチドが２０ μM以下、好ましくは５ μM以下、より好ましくは１０００ nM以下の予測IC５０結合値を有する、前記方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法であって、ここでHLA型判定がHLAサブタイプのHLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB１、HLA-DQB１、HLA-DPB１、HLA-DQA１、HLA-DPA１、HLA-G、HLA-E、HLA-F、MICA、MICB及び／又はKIRに対して行われる、前記方法。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法であって、ここでHLA型判定がHLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB１、HLA-DQB１に対して行われる、前記方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法であって、ここでHLA型判定が血清学的及び／又は分子型判定を含む、前記方法。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法であって、ここでHLA型判定が配列に基づく型判定法（sequence-based typing）により高解像度レベルで行われる、前記方法。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法であって、ここでHLA型判定がHLAクラスIアリルのエクソン１〜７及びHLAクラスIIアリルのエクソン１〜６の配列決定を含む、前記方法。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法であって、ここでHLA型判定がHLAクラスIアリルのためにエクソン２及びエクソン３、及びHLAクラスIIアリルのためにエクソン２の高解像度HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB１、及びHLA-DQB１型判定を含む、前記方法。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法を含む、許容可能なミスマッチを有する同種異系間移植のためのドナー材料の選択及び／又はスクリーニングのための方法であって、該方法が移植に先立って行われる、方法。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法であって、ここで同種異系間移植のためのドナー材料が、少なくとも１のアリルマッチを有するドナー由来である、前記方法。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法であって、ここで同種異系間移植のためのドナー材料が、１０／１０マッチ並びに１のHLA-DPミスマッチを有するドナー由来である、前記方法。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法であって、ここで同種異系間移植のためのドナー材料が、９／１０マッチの非血縁ドナー由来である、前記方法。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法であって、ここでPIRCHE-Iの数が３以下、好ましくは２以下、より好ましくは１以下のとき、同種異系間移植のためのドナー材料が、望ましくない免疫応答を伴うリスクが低い、前記方法。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法であって、ここでPIRCHE-IIの数が４以下、好ましくは３以下、より好ましくは２以下のとき、同種異系間移植のためのドナー材料が、望ましくない免疫応答を伴うリスクが低い、前記方法。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法であって、ここでPIRCHE-I及びPIRCHE-IIの数の合計が６以下、好ましくは４以下、より好ましくは２以下のとき、同種異系間移植のためのドナー材料が、望ましくない免疫応答を伴うリスクが低い、前記方法。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法であって、HLA-DQB１の抗原性ミスマッチが調べられる、前記方法。
【請求項３６】
多重HLAミスマッチのドナーの中から最良のドナーを予測するための請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法であって、多重ドナー間、例えば、２つの臍帯血ユニット間及び／又はマッチドナーとHLAミスマッチのドナー間の同種抗原反応性の予測を目的とする多重HLAミスマッチのドナーの分析及び比較をさらに含む、前記方法。
【国際調査報告】
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