(57)【要約】  本発明は、乳汁またはラクトフェリンをろ過に付して、ラクトフェリンを含む保持液画分と、成長因子および／またはＲＮアーゼを含む透過液画分とに、乳汁またはラクトフェリンを分離することを含む、乳汁またはラクトフェリンからＲＮアーゼおよび成長因子を精製するためのプロセスであって、成長因子および／またはＲＮアーゼが透過液に流入するように、ろ過前および／またはろ過中に、乳汁またはラクトフェリンを塩処理に付す、プロセスを提供する。本発明は、本発明のプロセスから得られるＲＮアーゼおよび成長因子も提供する。
2016500662.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳汁またはラクトフェリンをろ過に付して、ラクトフェリンを含む保持液画分と、成長因子および／またはＲＮアーゼを含む透過液画分とに、前記乳汁またはラクトフェリンを分離することを含む、乳汁またはラクトフェリンからＲＮアーゼおよび成長因子を精製するためのプロセスであって、成長因子および／またはＲＮアーゼが前記透過液に流入するように、ろ過前および／またはろ過中に、前記乳汁またはラクトフェリンを塩処理に付す、前記プロセス。
【請求項２】
乳汁またはラクトフェリンをろ過に付して、ラクトフェリンを含む保持液画分と、成長因子および／またはＲＮアーゼを含む透過液画分とに、前記乳汁またはラクトフェリンを分離することを含む、乳汁またはラクトフェリンからＲＮアーゼおよび成長因子を精製するためのプロセスであって、成長因子および／またはＲＮアーゼが前記透過液に流入するように、ろ過前および／またはろ過中に、ＲＮアーゼまたは成長因子のいかなる塊も脱凝集または脱会合させることができる塩処理に前記乳汁またはラクトフェリンを付す、前記プロセス。
【請求項３】
乳汁またはラクトフェリンを膜ろ過に付して、ラクトフェリンを含む保持液画分と、成長因子および／またはＲＮアーゼを含む透過液画分とに、前記乳汁またはラクトフェリンを分離することを含む、乳汁またはラクトフェリンからＲＮアーゼおよび成長因子を精製するためのプロセスであって、成長因子および／またはＲＮアーゼが前記透過液に流入するように、ろ過前および／またはろ過中に、いかなるＲＮアーゼまたは成長因子も膜から分離させることができる塩処理に前記乳汁またはラクトフェリンを付す、前記プロセス。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロセスから得られるＲＮアーゼおよび成長因子。
【請求項５】
ウイルス、細菌、または真菌およびそれらの毒素によって引き起こされる疾患の処置のための、ヒト粘膜表面の感染を引き起こす病原体を標的にするための、血管新生を促進するための、ミオスタチンの上昇を特徴とする障害を処置するための、フォリスタチンとアンギオゲニンの間の相互作用を使って組織における機能を改善することができる障害を処置するための、筋成長を促進するための、傷害または使用からの筋の回復を改善するための、筋力を改善するための、運動耐容能を改善するための、筋の比率を増加させるための、脂肪を減少させるための、個体の脂肪対筋比を減少させるための、神経疾患または神経障害を処置するための、脊椎損傷または脊椎疾患を処置するための、骨疾患または骨障害を処置するための、グルコースホメオスタシスが関与する疾患を処置するための、創傷治癒のための、または神経保護、神経系機能サポートを提供し、代謝性疾患を管理し、かつ／または個体の骨密度を増加させるための、炎症を処置するための、がんを処置するための、がん悪液質を処置するための、および歯周炎を処置するための、ならびに成長因子およびＲＮアーゼの他の全ての用途における、請求項４に記載のＲＮアーゼおよび成長因子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、乳汁から目的のタンパク質を精製するためのプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
食品産業および医薬産業では、タンパク質および他の産物の供給源として、家畜の乳汁が長年にわたって使用されており、これらの産物を単離するための技法は種々知られている。乳汁は、主に水中の脂肪、ラクトースおよびタンパク質から構成されるコロイド懸濁液である。反芻動物および実験動物の場合、乳汁は、種に依存して、１リットルあたり平均３０〜１４０グラムまたは約４〜１７重量％のタンパク質を含有している。これらのタンパク質の大部分はカゼインであり、それらはミセルと呼ばれる超分子構造でカルシウムおよびリン酸との複合体を形成している。乳タンパク質のもう一つの主要なクラスはホエータンパク質であり、これは主にベータ−ラクトグロブリンおよびアルファ−ラクトアルブミンから構成されるが、ラクトフェリン、免疫グロブリン、および血清アルブミンも含んでいる。
【０００３】
乳タンパク質は通常、膜ろ過技法ならびにイオン交換吸着手法を含むプロセスの組み合わせによって単離される。
【０００４】
ラクトフェリンは、唾液、胆汁、気管支粘液、胃腸液、頸膣粘液、精液、および乳汁などの生体液中に天然に見出される８０ｋＤの鉄結合性糖タンパク質である。ラクトフェリンの最も濃厚な供給源は哺乳動物の乳汁および初乳である。ウシ脱脂乳中のラクトフェリンの濃度は、通常は小さく、脱脂乳の低温殺菌および他の前処理歴を含む因子に依存して、典型的には８０〜２００ｍｇ／ｍｌである。乳汁中に存在するカゼインの沈殿後のウシホエー中のラクトフェリンの濃度は、ホエーの物理的および化学的前処理に依存して、典型的には、１０〜１００ｍｇ／ｍｌである。
【０００５】
成長因子は、乳汁中に、特にラクトフェリン含有画分中に、さまざまな程度に存在する。牛乳は、ＲＮアーゼ５などのＲＮアーゼと、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＰＤＧＦ、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、酸性ＦＧＦおよびＶＥＧＦを含む成長因子とを含有する。これらの成長因子はそれぞれ３０ｋＤ以下の分子量を有する（ＲＮアーゼ５は１７ｋＤの分子量を有する）。成長因子およびＲＮアーゼに富む乳汁画分は、当技術分野では（例えば国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ９１／００３０３および同ＰＣＴ／ＡＵ２００７／００１７１９に記載されているように）イオン交換クロマトグラフィーを使って調製される。
【０００６】
ＲＮアーゼ５および成長因子に富む乳汁画分は、筋成長の促進、神経保護、骨形成の促進、および神経疾患または神経障害、脊椎損傷または脊椎疾患、骨疾患または骨障害、グルコースホメオスタシスが関与する疾患の処置、創傷治癒、または神経系機能サポートの提供および代謝性疾患の管理などといった、複数の生物学的役割を有すると考えられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
乳汁、特に牛乳から、成長因子およびＲＮアーゼを精製して純度を改善するための改良された方法を提供することが、本発明の好ましい実施形態の目的である。
【０００８】
本明細書において引用する参考文献は、すべての特許または特許出願を含めて、いずれも参照により本明細書に組み込まれる。本明細書ではいくつかの先行技術刊行物に言及するが、この言及が、それらの文書のいずれかが当技術分野における共通一般知識の一部を形成しているとの自白を構成するわけではないことは、明確に理解されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１態様は、乳汁またはラクトフェリンをろ過に付して、ラクトフェリンを含む保持液画分と、成長因子および／またはＲＮアーゼを含む透過液画分とに、乳汁またはラクトフェリンを分離することを含む、乳汁またはラクトフェリンからＲＮアーゼおよび成長因子を精製するためのプロセスであって、成長因子および／またはＲＮアーゼが透過液に流入するように、ろ過前および／またはろ過中に、乳汁を塩処理に付す、プロセスを提供する。
【００１０】
カットオフが３０ｋＤまたは５０ｋＤである膜ろ過を使って乳汁からラクトフェリンを精製する際に、本発明者らは、ラクトフェリン保持液に成長因子およびＲＮアーゼが混入することを見出した。これらの成長因子およびＲＮアーゼは３０ｋＤ未満の分子量を有するので、膜を通過して透過液に入り、保持液ラクトフェリン画分中の不純物としては存在しないはずである。したがって、保持液中に成長因子およびＲＮアーゼが見つかったことは意外であった。本発明者らは、ろ過前に大量の塩を乳汁に加えると成長因子およびＲＮアーゼが保持液から除去され、それらが透過液中に濃縮されることを見出した。
【００１１】
理論に束縛されることは望まないが、通常の条件下では乳汁中のＲＮアーゼおよび成長因子が、凝集その他の形で、個々の分子量より大きな塊を形成していると、本発明者らは提唱する。塩処理はＲＮアーゼおよび成長因子を脱凝集または脱会合させると提唱する。
【００１２】
代替的一形態において、第１態様のプロセスは、乳汁またはラクトフェリンをろ過に付して、ラクトフェリンを含む保持液画分と、成長因子および／またはＲＮアーゼを含む透過液画分とに、乳汁またはラクトフェリンを分離することを含む、乳汁またはラクトフェリンからＲＮアーゼおよび成長因子を精製するためのプロセスであって、成長因子および／またはＲＮアーゼが透過液に流入するように、ろ過前および／またはろ過中に、ＲＮアーゼまたは成長因子のいかなる塊も脱凝集または脱会合させることができる塩処理に乳汁またはラクトフェリンを付す、プロセスを提供する。
【００１３】
理論に束縛されることは望まないが、もう一つの選択肢として、イオン強度が低い条件下では、タンパク質凝集物が膜と会合した状態になることにより、膜の孔径より小さな見かけ上の孔径を有する層が形成され、それが、乳汁中のＲＮアーゼおよび成長因子の膜通過を妨げているのかもしれないと、本発明者らは提唱する。塩処理は、タンパク質層の形成を防止するか、またはタンパク質層を除去することで、あらゆるＲＮアーゼおよび成長因子が膜を通過して透過液に入ることを可能にすると提唱する。
【００１４】
したがって代替的一形態において、第１態様のプロセスは、乳汁またはラクトフェリンを膜ろ過に付して、ラクトフェリンを含む保持液画分と、成長因子および／またはＲＮアーゼを含む透過液画分とに、乳汁またはラクトフェリンを分離することを含む、乳汁またはラクトフェリンからＲＮアーゼおよび成長因子を精製するためのプロセスであって、成長因子および／またはＲＮアーゼが透過液に流入するように、ろ過前および／またはろ過中に、いかなるＲＮアーゼまたは成長因子も膜から分離させることができる塩処理に乳汁またはラクトフェリンを付す、プロセスを提供する。
【００１５】
第２態様は、第１態様のプロセスから得られるＲＮアーゼおよび成長因子を提供する。
【００１６】
一実施形態では、第２態様のＲＮアーゼおよび成長因子をさらなる精製に付す。
【００１７】
第３態様は、ウイルス、細菌、または真菌およびそれらの毒素によって引き起こされる疾患の処置のための、ヒト粘膜表面の感染を引き起こす病原体を標的にするための、血管新生を促進するための、ミオスタチンの上昇を特徴とする障害を処置するための、フォリスタチンとアンギオゲニンの間の相互作用を使って組織における機能を改善することができる障害を処置するための、筋成長を促進するための、傷害または使用からの筋の回復を改善するための、筋力を改善するための、運動耐容能を改善するための、筋の比率を増加させるための、脂肪を減少させるための、個体の脂肪対筋比を減少させるための、神経疾患または神経障害を処置するための、脊椎損傷または脊椎疾患を処置するための、骨疾患または骨障害を処置するための、グルコースホメオスタシスが関与する疾患を処置するための、創傷治癒のための、または神経保護、神経系機能サポートを提供し、代謝性疾患を管理し、かつ／または個体の骨密度を増加させるための、炎症を処置するための、がんを処置するための、がん悪液質を処置するための、歯周炎を処置するための、ならびに当業者に知られている成長因子およびＲＮアーゼの他の全ての用途における、第２態様のＲＮアーゼおよび成長因子の使用を提供する。
【００１８】
代替的一形態において、第３態様は、第３態様において提案したように使用するための、または第３態様において提案したように使用するための医薬品の製造において使用するための、第１態様のプロセスから得られるＲＮアーゼおよび成長因子を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】５０ｋＤａ膜によるカチオン性乳タンパク質混合物の限外ろ過が、塩化ナトリウム（１００ｍＳ）の存在下では、ＲＮアーゼおよび他の成長因子の移行を選択的に許すことを示す図である。
【図２】５０ｋＤａ膜によるカチオン性乳タンパク質混合物の限外ろ過が、塩化ナトリウムの非存在下（０ｍＳ）では透過しないＲＮアーゼおよび他の成長因子の移行を、塩化ナトリウム（２０ｍＳまたは４０ｍＳ）の存在下では選択的に許すことを示す図である。
【図３】成長因子、例えばＲＮアーゼの移行の増加を示す図である。成長因子の移行は、０ｍＳと２０ｍＳの間で急速に増加する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、乳汁またはラクトフェリンからＲＮアーゼおよび成長因子を精製するための改良された方法、または乳汁もしくはラクトフェリンをそのような産物に関して濃縮するための改良された方法を提供する。
【００２１】
本発明者らは、濃縮されたＲＮアーゼおよび成長因子画分を効率よく調製することを可能にするプロセスの必要性を認識していた。
【００２２】
ＲＮアーゼまたは成長因子に関して本明細書において使用する「精製された」または「濃縮された」という用語は、透過液中に存在するＲＮアーゼ／成長因子：総タンパク質比が、ろ過ステップ前の乳汁またはラクトフェリン中に存在する比との比較で増加していることを意味する。ある画分が濃縮されたまたは精製されたとみなされるには、その画分が、ろ過ステップ前の乳汁またはラクトフェリンより少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２５、２７、２８、または３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９８、または９９％ｗ／ｗ高いＲＮアーゼ／成長因子含有量を有するべきである。
【００２３】
第１態様のプロセスは、透過液中のＲＮアーゼおよび成長因子の純度を増加させようとするものである。
【００２４】
本明細書において使用する用語「画分」は、部分精製された乳汁の一部、特にラクトフェリンを含む画分を指す。
【００２５】
「効率のよい」という用語の使用は、タンパク質を濃縮するために現在使用されている方法と比較した場合に安価で迅速なプロセスを意味すると解釈される。
【００２６】
本明細書にいう乳汁には、全乳、スキムミルク、バターミルク、ホエー（酸ホエーまたはチーズ／レンネット処理ホエーなど）またはホエー派生物（ホエータンパク質濃縮物またはホエータンパク質アイソレートフロースルーなど）、および初乳が含まれる。これには乳汁画分、例えばカチオン交換クロマトグラフィーなどの精製ステップに付された画分も含まれる。そのような画分には、乳塩基性タンパク質およびラクトフェリンを含有する画分が含まれる。
【００２７】
乳汁が、例えばウシ、ヒツジ、スイギュウ、ヤギ、およびシカなどの反芻動物、ヒトなどの霊長類を含む非反芻動物、およびブタなどの単胃動物などといった任意の泌乳動物から入手しうることは、当業者には明白であるだろう。本発明のプロセスではウシの全乳に由来するスキムミルクを使用することが好ましい。
【００２８】
第１態様のプロセスにおいて使用されるろ過は、膜ろ過を含む。一実施形態において、膜は、２５ｋＤ、３０ｋＤ、３５ｋＤ、４０ｋＤ、４５ｋＤ、５０ｋＤ、５５ｋＤ、６０ｋＤ、６５ｋＤ、７０ｋＤまたは７５ｋＤのサイズカットオフを有する。カットオフは、好ましくは、３０ｋＤ以上かつ５０ｋＤ以下である。
【００２９】
ろ過は、限外ろ過もしくはダイアフィルトレーションまたはその両方を伴いうる。
【００３０】
第１態様のプロセスにおいて使用される塩処理は、乳汁またはラクトフェリンのイオン強度が少なくとも０．２Ｍ（１．１％）ＮａＣｌ相当になるように、十分な塩の添加を伴う。一実施形態では、イオン強度が、透過液中のＲＮアーゼ濃度および／または成長因子濃度の必要な増加を得るのに必要な期間にわたって、少なくともこのレベルに維持される。この期間は、供給物質および所望する濃度増加または純度増加に依存して、少なくとも１０分、１５分、２０分、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間またはそれ以上でありうる。
【００３１】
もう一つの選択肢として、第１態様の方法において使用される塩処理は、乳汁またはラクトフェリンの導電率が少なくとも２０ｍＳになるように、十分な塩の添加を伴う。一実施形態では、導電率がろ過ステップ中は一貫して少なくともこのレベルに維持される。
【００３２】
一般に、乳汁またはラクトフェリンは、０．２Ｍ  ＮａＣｌ相当より大幅に低いイオン強度または２０ｍＳより大幅に低い導電率を有するだろうから、塩処理は、乳汁またはラクトフェリンのイオン強度または導電率を所望のレベルまで増加させるために、塩の添加を必要とする。しかし状況によっては、例えば乳汁がカチオン交換に付された画分である場合には、乳汁が、少なくとも０．２Ｍ  ＮａＣｌ相当でありうるイオン強度を有するか、または導電率が２０ｍＳ以上であるだろう。一般に、カチオン交換からの画分は塩を除去するための処理に付される（例えば水を使ったダイアフィルトレーション）。しかし、第１態様のプロセスでは、塩処理が、乳汁のイオン強度をろ過ステップ中は少なくとも０．２Ｍ（１．１％）ＮａＣｌ相当に維持するための処理であるか、または乳汁の導電率をろ過ステップ中は少なくとも２０ｍＳに維持するための処理である。
【００３３】
本明細書において「導電率」とは、電流を伝導する物質の能力である。導電率は、一般に、例えばハック・センスイオン５（Ｈａｃｈ  Ｓｅｎｓｉｏｎ  ５）などの導電率計を使って測定される。導電率を測定するための適切な代替手段は、当業者にはわかるであろう。ナトリウムイオン濃度と導電率の間には概して線形の関係がある。
【００３４】
塩処理に使用される塩に制約はなく、当業者であればＮａＣｌの代替物を知っているであろう。例えば、塩化物イオン、クエン酸イオン、リン酸イオン、酢酸イオン、硫酸イオン、重炭酸イオン、水酸化物イオン、イミダゾール、またはマレイン酸イオンの可溶性のナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムまたはリチウム塩など、任意の可溶性無毒性緩衝剤を使用することができる。トリズマ（Ｔｒｉｚｍａ）、ＨＥＰＥＳまたはトリシンなどの合成両性イオン緩衝剤も使用することができる。
【００３５】
ラクトフェリンからのＲＮアーゼおよび成長因子の分離を可能にするために、乳汁またはラクトフェリンのイオン強度は、ろ過ステップ前に、少なくとも０．２Ｍ（１．１％）ＮａＣｌ相当またはそれ以上でなければならない。一実施形態では、１．１％の塩、１．５％の塩、２％の塩、２．５％の塩、３％の塩、３．５％の塩、４％の塩、４．５％の塩、５％の塩、５．５％の塩、６％の塩またはそれ以上を加えることによって、乳汁のイオン強度を増加させる。もう一つの実施形態では、乳汁またはラクトフェリンのイオン強度を、０．２Ｍ、０．２２Ｍ、０．２４Ｍ、０．２６Ｍ、０．２８Ｍ、０．３０Ｍ、０．３２Ｍ、０．３４Ｍ、０．３６Ｍ、０．３８Ｍ、０．４０Ｍ、０．４２Ｍ、０．４４Ｍ、０．４６Ｍ、０．４８Ｍ、０．５０Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１．０Ｍ  ＮａＣｌ相当またはそれ以上まで増加させる。もう一つの実施形態では、導電率が、２０ｍＳ、３０ｍＳ、４０ｍＳ、５０ｍＳ、６０ｍＳ、７０ｍＳ、８０ｍＳ、９０ｍＳ、１００ｍＳ、１１０ｍＳ、１２０ｍＳまたはそれ以上である。
【００３６】
好ましい一実施形態では、塩処理が、ろ過ステップ前に乳汁またはラクトフェリンへの０．２〜０．５Ｍ  ＮａＣｌまたはＫＣｌの添加を伴う。
【００３７】
一実施形態では、塩処理が４〜１０度で行われる。
【００３８】
一実施形態では、塩処理が１０〜３０度で行われる。
【００３９】
一実施形態では、塩処理が３０〜５０度で行われる。
【００４０】
一実施形態では、塩処理が５０〜７０度で行われる。
【００４１】
一実施形態では、塩処理が２０度未満で行われる。
【００４２】
もう一つの実施形態では、塩処理が５０度以上で行われる。というのも、５０度を上回る温度では大腸菌群が低減するからである。ただし、ラクトフェリンはおよそ７０度で変性するので、６０度以上で塩処理を行うと、収量の減少が起こりうる。
【００４３】
一実施形態では、ろ過ステップが４〜１０度で行われる。
【００４４】
一実施形態では、ろ過ステップが１０〜３０度で行われる。
【００４５】
一実施形態では、ろ過ステップが３０〜５０度で行われる。
【００４６】
一実施形態では、ろ過ステップが５０〜７０度で行われる。
【００４７】
一実施形態では、塩処理が大気圧で行われる。
【００４８】
一実施形態では、ろ過ステップが、膜あたり２．５バール未満、さらに言えば２．０バール未満、さらに言えば１．５バール未満、理想的には１．０〜１．４バールの膜間差圧で行われる。ただし、０．０〜１．０バールの圧力でもなんとか作動するであろうが、膜貫通フラックスは低下する。
【００４９】
「処置する」または「処置」とは、治療的処置と予防的または防止的措置の両方を指し、その目的は、ある状態、疾患または障害を防止し、寛解させ、低減し、もしくは減退（軽減）させ、または改善することである。
【００５０】
本明細書において「処置する」または「処置」は、脊椎動物、哺乳動物、特にヒトにおける、ある状態の任意の処置または防止を包含する。
【００５１】
「防止する」、「防止」、「防止的」または「予防的」とは、ある状態、疾患、障害、または表現型（異常または症状を含む）の発生を避けること、またはその発生を妨害し、その発生から防御し、もしくはその発生から保護することを指す。防止を必要とする対象は、その状態を発生させやすい対象でありうる。
【００５２】
「寛解させる」または「寛解」という用語は、ある状態、疾患、障害、または表現型（異常または症状を含む）の減少、低減または排除を指す。処置を必要とする対象は、既にその状態にあるか、またはその状態に陥りやすいか、またはその症状を防止すべき対象でありうる。
【００５３】
本明細書において使用する「維持する」という用語は、ある状態を処置前レベルで持続させることを指す。
【００５４】
第２態様のＲＮアーゼまたは成長因子は、医薬組成物、獣医用組成物または栄養補助食品組成物として、または食品として提供することができる。
【００５５】
医薬組成物は、ヒトへの投与に適したものである。獣医用組成物は、動物への投与に適したものである。一般にそのような組成物は精製されたＲＮアーゼまたは成長因子を含有するか、最低でも、組成物の全ての構成要素が検証可能であるだろう。
【００５６】
医薬組成物または獣医用組成物は、１つ以上の担体と、場合によっては他の治療剤とを含みうる。各担体、希釈剤、佐剤および／または賦形剤は「許容できる」ものであるだろう。
【００５７】
「許容できる」とは、生物学的にも他の面でも望ましくないものではない物質、すなわちその物質は選ばれた活性剤と共に個体に投与することができ、その際、望ましくない生物学的効果を引き起こすことも、その物質を含有する医薬組成物または獣医用組成物の他の構成要素のいずれかと有害な形で相互作用することもないことを意味する。また、ここに提供される新規化合物の「許容できる」塩またはエステルは、生物学的にも他の面でも望ましくないものではない塩またはエステルである。
【００５８】
本明細書において「担体」とは、薬剤を対象に送達するための、許容できる溶媒、懸濁剤または媒体である。担体は液状であっても固形であってもよく、想定した予定の投与方法に応じて選択される。各担体は、生物学的にも他の面でも望ましくないものではないという意味で、すなわち有害反応を何もまたは実質的に引き起こすことなく担体を薬剤と共に対象に投与することができるという意味で、「許容できる」ものでなければならない。
【００５９】
医薬組成物または獣医用組成物は、通常の許容できる無毒性の担体、佐剤、および媒体を含有する製剤として、経口投与、外用投与、または非経口投与することができる。
【００６０】
本明細書において使用する非経口という用語には、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、結膜下、腔内、経皮および皮下注射、肺もしくは鼻腔への投与のためのエアロゾル、または注入（例えば浸透圧ポンプによるもの）による投与が含まれる。
【００６１】
医薬組成物または獣医用組成物は、錠剤、水性懸濁剤もしくは油性懸濁剤、口中錠、トローチ剤、散剤、顆粒剤、乳剤、カプセル剤、シロップ剤またはエリキシル剤として、経口投与することができる。経口使用のための組成物は、医薬的に洗練されていて服用しやすい調製物を生産するために、甘味剤、香味剤、着色剤および保存剤の群から選択される１つ以上の薬剤を含有しうる。適切な甘味料には、スクロース、ラクトース、グルコース、アスパルテームまたはサッカリンなどがある。適切な崩壊剤には、トウモロコシデンプン、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、キサンタンゴム、ベントナイト、アルギン酸または寒天などがある。適切な香味剤には、ハッカ油、冬緑油、サクランボ香味料、オレンジ香味料またはラズベリー香味料などがある。適切な保存剤には、安息香酸ナトリウム、ビタミンＥ、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベンまたは亜硫酸水素ナトリウムなどがある。適切な潤滑剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウムまたはタルクなどがある。適切な遅延剤には、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどがある。錠剤は、錠剤の製造に適した無毒性の医薬上許容できる賦形剤と混合された薬剤を含有しうる。
【００６２】
賦形剤は、例えば、（１）不活性希釈剤、例えば炭酸カルシウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム、（２）造粒剤および崩壊剤、例えばトウモロコシデンプンまたはアルギン酸、（３）結合剤、例えばデンプン、ゼラチンまたはアラビアゴム、および（４）潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであることができる。これらの錠剤は素錠であってもよいし、消化管における崩壊と吸収を遅らせることによって長期間にわたって持続的作用を提供するために、既知の技法でコーティングされていてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの遅延物質を使用することができる。
【００６３】
非経口投与用の調製物には、滅菌された水性または非水性の溶液、懸濁液、および乳液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体には、水、アルコール／水溶液、乳液または懸濁液、例えば食塩水および緩衝媒質などがある。非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルなどがある。静脈内媒体は、水分および栄養補給剤、電解質補給剤（例えばリンゲルデキストロースに基づくもの）などがある。保存剤および他の添加剤、例えば抗微生物剤、酸化防止剤、キレート剤、成長因子および不活性ガスなども、存在してよい。
【００６４】
医薬組成物または獣医用組成物は、治療機能を補足、追加、または強化する他の活性化合物も含有しうる。医薬組成物または獣医用組成物は、容器、梱包、またはディスペンサーに、投与のための説明書と一緒に含めることもできる。
【００６５】
医薬組成物または獣医用組成物は１回で投与するか、間隔をおいて、例えば１日１回、週に１回、および月に１回投与することができる。
【００６６】
投薬スケジュールは、活性剤の半減期または対象の状態の重症度に応じて調節することができる。
【００６７】
一般に、医薬組成物または獣医用組成物は、投与後、最大限長く、活性剤の循環レベルが最大になるように、ボーラス投与として投与される。ボーラス投与後に持続注入も使用することができる。
【００６８】
第２態様のＲＮアーゼまたは成長因子は、栄養補助食品組成物または食品に入れて提供してもよい。
【００６９】
本明細書において使用する「栄養補助食品」という用語は、食品から、この場合は乳製品から、単離または精製された食用に適した製品であって、経口投与された場合に、生理的利益を有するか、保護をもたらすか、急性または慢性の疾患または傷害を減弱させることが実証されているものを指す。したがって栄養補助食品は、飲食用調製物またはサプリメントの形態で、単独で、食用に適した食品または飲料と混合されて、存在しうる。
【００７０】
栄養補助食品組成物は、可溶性粉末、液状物、またはそのまま飲める調合物の形態をとりうる。あるいは、栄養組成物は、食品として固形であってもよく、例えばそのまま食べることができるバーまたは朝食用シリアルの形態であることができる。さまざまなフレーバー、繊維、甘味料、および他の添加剤も存在しうる。
【００７１】
栄養補助食品は、好ましくは、許容できる官能特性（例えば許容できる匂い、味および口当たり）を有し、ビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ１１、Ｂ１２、ビオチン、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＨおよびＫならびにカルシウム、マグネシウム、カリウム、亜鉛および鉄の少なくとも１つから選択されるビタミンおよび／またはミネラルを、さらに含みうる。
【００７２】
栄養補助食品組成物は通常どおりに生産することができる。例えば組成物は、タンパク質と他の添加剤とを一つに配合することによって調製することができる。使用するのであれば、乳化剤を配合物に含めることができる。追加のビタミンおよびミネラルをこの時点で加えてもよいが、通常は、熱分解を避けるために後で加えられる。
【００７３】
粉末栄養補助食品組成物の生産を望む場合は、タンパク質を粉末の形態で追加の構成要素と混合することができる。粉末は約５重量％未満の水分量を有するべきである。次に水、好ましくは逆浸透処理に付された水を混和して、液状混合物を形成させることができる。
【００７４】
すぐに消費できる液状物の形態で栄養補助食品組成物を提供したい場合は、細菌負荷量を低減するために、その組成物を加熱することができる。液状の栄養補助食品組成物の生産を望む場合、その液状混合物は、好ましくは、適切な容器に無菌的に充填される。容器の無菌充填は当技術分野において一般に利用することができる技法を使って行うことができる。この類の無菌充填を行うための適切な装置は市販されている。
【００７５】
好ましくは、栄養補助食品組成物は、１つ以上の医薬上許容できる担体、希釈剤または賦形剤も含む。栄養補助食品組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝剤、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストランなどの糖質、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、酸化防止剤、ＥＤＴＡなどのキレート剤、佐剤および保存剤も含みうる。
【００７６】
栄養補助食品は、人工栄養乳、特に乳児に投与するための母乳化調製乳でありうる。
【００７７】
食品として提供される場合、第２態様のＲＮアーゼまたは成長因子は、食品サプリメント、栄養調合物、スポーツ栄養サプリメントまたは人工栄養乳の形態をとることができる。一実施形態では、食品が動物飼料である。
【００７８】
本明細書の全体を通して、文脈上別段の必要がある場合を除き、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語またはその異形（例えば「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」または「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）は、明示した要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の包含を含意するが、他の要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の除外を含意するわけではない。
【００７９】
本明細書において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないことが明らかである場合を除き、複数態様を包含することにも、注意しなければならない。
【００８０】
明快になるように、理解の一助となるように、本発明をいくらか詳しく説明したが、本明細書に開示した発明概念の範囲から逸脱することなく、さまざまな変更および改変を、本明細書に記載する実施形態および方法に加えうることは、当業者には明らかであるだろう。
【実施例】
【００８１】
以下、下記の実施例を参照して、本発明をさらに詳しく説明する。本実施例は、例証のために記載するに過ぎず、別段の明記がある場合を除き、限定を意図していない。したがって本発明は、本明細書に提供する教示の結果として自明となるありとあらゆる異形を包含する。
【００８２】
［実施例１］
成長因子を単離するためのカチオン性乳タンパク質混合物の限外ろ過
ラクトフェリン、ラクトペルオキシダーゼ、ＲＮアーゼ、免疫グロブリンおよび成長因子を含むカチオン性乳タンパク質の混合物を含有する乳汁画分を、６インチ５０ｋＤａ膜による限外ろ過に付した。ベースライン圧力が３．２〜３．４バール、膜間差圧が１．２〜１．４バールになるように限外ろ過プラントを安定させた。供給材料は、１０ｍｇ／ｍＬのタンパク質、１００ｍＳ相当の塩化ナトリウムおよび水を含有していた。濃縮の最初と最後に供給材料、５０ｋＤａ保持液、５０ｋＤａ透過液の試料を採取した。５０ｋＤａ透過液をプールし、５ｋＤａ限外ろ過膜（ザルトリウス・ビバセル（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｖｉｖａｃｅｌｌ））または１ｋＤａナノろ過膜（２．５”コッホ（Ｋｏｃｈ）膜）のいずれかによって濃縮し、脱塩した。１ｋＤａ保持液は、ＲＮアーゼ（図１）とＩＧＦ−１、ＴＧＦ−β２その他を含む成長因子に富む。純度はカチオン交換ＨＰＬＣで評価した。
【００８３】
［実施例２］
成長因子を単離するためのカチオン性乳タンパク質混合物の限外ろ過
ラクトフェリン、ラクトペルオキシダーゼ、ＲＮアーゼ、免疫グロブリンおよび成長因子を含むカチオン性乳タンパク質の混合物を含有する乳汁画分を、６インチ５０ｋＤａ膜を使った限外ろ過に付した。ベースライン圧力が３．２〜３．４バール、膜間差圧が１．２〜１．４バールになるように限外ろ過プラントを安定させた。供給材料は、１０ｍｇ／ｍＬのタンパク質、１００ｍＳ相当の塩化ナトリウムおよび水を含有していた。限外ろ過プロセスを０、２０および４０ｍＳで試験した。透過液を収集し、カチオン交換ＨＰＬＣで分析した。２０ｍＳ以上の導電率では、成長因子（例示的タンパク質としてＲＮアーゼを使用）は膜を通過するが、大分子量のタンパク質（例示的タンパク質としてラクトペルオキシダーゼを使用）は膜を通過しないことがわかった（図２）。ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＰＤＧＦ、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、酸性ＦＧＦ、ＶＥＧＦを含む（ただしこの一覧に限定されるわけではない）他の成長因子も、ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼなどの高分子量タンパク質との比較で濃縮されるであろうと予想される。
【００８４】
［実施例３］
小分子を除去しラクトフェリン純度を増加させるためのラクトフェリンの限外ろ過
限外ろ過プラントに１つの６インチ５０ｋＤａ膜（シンダー（Ｓｙｎｄｅｒ））を装着し、次に、ベースライン圧力が３．２〜３．４バール、膜間差圧が１．２〜１．４バールになるように安定させた。ラクトフェリン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を各２Ｌの６ロットに分割した。導電率（０、２０、４０または６０ｍＳ）以外は同一である６つの実験において、２Ｌのラクトフェリン溶液をＵＦ供給タンクに加え、１７０Ｌまで水をつぎ足し、塩化ナトリウム溶液を加えることによって指定の導電率に調節した。保持液は供給タンクに循環させ、透過液を収集した。取り除いた透過液は同じ導電率のダイアフィルトレーション溶液で置き換えた。純度はカチオン交換ＨＰＬＣで評価した。
【００８５】
ラクトフェリン純度は９０．９％（０ｍＳ）から９３．５％（６０ｍＳ）まで増加した。これは２．５％の純度増加を表す。ラクトフェリン純度の増加は成長因子（一例としてＲＮアーゼを使用）の選択的除去によって達成された（図３）。
【００８６】
［実施例４］
限外ろ過膜
ＭＷＣＯの理由づけ：
−３０ｋＤａ膜は、収穫されたラクトフェリンをうまく保持し（膜を通るタンパク質の移行は、存在するタンパク質の０．６％である）、鍵となる夾雑物、特にＲＮアーゼが膜を通過することを許すことによって、純度を増加させる。
−塩化ナトリウム（５８Ｄａ）が３０ｋＤａ膜では保持されないのに対し、ラクトフェリン（８０ｋＤａ）は保持される。そのため、低い濃度（０．１％タンパク質）でカラムから溶出するラクトフェリンを、相応の塩濃度増加やタンパク質の喪失を伴わずに、３％タンパク質まで濃縮することができる。
【００８７】
ＵＦ５
タイプ：スパイラル型ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）  ＭＷＣＯ：５ｋＤａ
ブランド：シンダー  型番：ＭＴ２Ｂ−６３３８
【００８８】
ＵＦ５と呼ばれている限外ろ過プラントを使って、
１．カチオン交換カラムから溶出した非ラクトフェリンタンパク質を濃縮し、かつ
２．クロマトグラフィープロセスで再利用するために、２．５％塩を２．５％塩タンクに再循環した。
【００８９】
より広いラクトフェリン製造プロセス内でのプロセスの理由づけ：
−塩化ナトリウム（バッチあたり２，０００ｋｇ）は、ラクトフェリン製造プロセスでは、かなりのコスト（バッチあたり＄１，２００）であり、塩化ナトリウムを循環させることができれば、生産コストが劇的に低減する。
−塩化ナトリウムを循環させることによって環境の損壊が低減される。有機固形物を除去するためのレオンガタにおける３次処理後に、塩化ナトリウム含有流出液は海洋排水口を利用して処分され、生成する廃棄物の量を低減するためにあらゆる手段を講じなければならない。塩循環プロセスにより、必要な塩の量は８０％低減する。これは、環境に放出される塩化ナトリウムの量が、バッチあたり８，０００ｋｇ低減すること（３分の１がＵＦ５によるもの）を意味する。
【００９０】
膜タイプの理由づけ：
−スパイラル膜は、大きな膜面積を得る比較的安価な方法であり、これにより、設置面積の小さなプラントでの高いフラックスが可能になる。
−ＰＥＳは本質的に親水性の膜であり、迅速かつ完全に濡れて、優れた流速と高いスループットとを持つ迅速ろ過をもたらす。ＰＥＳ膜はタンパク質結合性も極めて低く、標的タンパク質結合の可能性を最小限にするが、それは、高い収量、安定した膜貫通フラックスおよび一貫した見かけの膜多孔度を意味する。
【００９１】
ＭＷＣＯの理由づけ：
−５ｋＤａ膜は非ラクトフェリン不純物を保持し、以後のラクトフェリン溶出中にそれらがクロマトグラフィープロセスに戻ってラクトフェリンに混入することを防止する。タンパク質混合物は、さらに小さいタンパク質を数多く含有するので（その多くは成長因子である）、さらに小さな膜が必要である。
−塩化ナトリウム（５８Ｄａ）が５ｋＤａ膜では保持されないのに対し、ラクトペルオキシダーゼ（８０ｋＤａ）、免疫グロブリン（１５０〜４２０ｋＤａ）および成長因子（５〜１７ｋＤａ）は保持される。そのため、低い濃度（０．１％タンパク質）でカラムから溶出するタンパク質を、相応の塩濃度増加やタンパク質の喪失を伴わずに、３％タンパク質まで濃縮することができる。
【００９２】
ＵＦ７
タイプ：スパイラル型ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）  ＭＷＣＯ：５０ｋＤａ
ブランド：シンダー  型番：  ＢＮ４Ｂ−６３３８  
【００９３】
ＵＦ７と呼ばれている限外ろ過プラントを使って、
１．非ラクトフェリンタンパク質を低減することによってラクトフェリン純度を増加させ、かつ
２．塩化ナトリウムおよび残存ラクトースを除去することによってタンパク質を＞９５％固形分に増加させた。
【００９４】
より広いラクトフェリン製造プロセス内でのプロセスの理由づけ：
−フェリチンＯＢ（Ｆｅｒｒｉｔｉｎ  ＯＢ）製造向けのラクトフェリンは、標準ラクトフェリンより高いラクトフェリン純度を有する。その高純度は、歴史的に使用されてきた５ｋＤａ膜の代わりに５０ｋＤａ膜を使用することによって得られる。
【００９５】
膜タイプの理由づけ：
−スパイラル膜は大きな膜面積を得る比較的安価な方法であり、これにより、設置面積の小さなプラントでの高いフラックスと相対的に短いプロセス時間が可能になる。
−親水性ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜は膜貫通フラックスが高く、タンパク質に対するアフィニティが低い。これらの理由から、膜孔を詰まらせるタンパク質はほとんどないので、プロセスの継続期間中はフラックスが高く保たれ、収量が高く保たれる。
【００９６】
ＭＷＣＯの理由づけ：
−５０ｋＤａ膜は、ラクトフェリンを保持したまま非ラクトフェリンタンパク質（ＲＮアーゼ、成長因子）の移行を改善することができるので、その使用は、小さな膜（歴史的には５ｋＤａ膜）より好ましい。非ラクトフェリンタンパク質の移行の増加は、ラクトフェリン純度の向上をもたらす（純度の平均増加量は１．８％タンパク質、Ｐ＜０．００１）。さらなる詳細は、「Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ  Ｐｕｒｉｔｙ  ｂｙ  Ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｆｉｔｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ５０  ｋＤａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ」（ＪＲ００１０）から入手することができる。
−塩化ナトリウム（５８Ｄａ）が５０ｋＤａ膜では保持されないのに対し、ラクトフェリン（８０ｋＤａ）は保持される。そのため、低い濃度（３％タンパク質）でカラムから溶出するラクトフェリンを、相応の塩濃度増加やタンパク質の喪失を伴わずに、＞２０％タンパク質まで濃縮することができる。
−水を除去することによって総固形分が増加し、それゆえに凍結乾燥器の固形分スループットが最大になる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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