(57)【要約】  本開示は、胎盤抽出物を含有する、血管新生を誘導および／または調節する方法ならびに組成物；血管新生の調節因子を同定する方法、ならびに血管新生の調節因子を同定するアッセイを提供する。本開示はまた、血管新生を誘導および／または調節することができる胎盤抽出物を含有する、組成物を製造する方法をも提供する。
2016516091.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト胎盤からサンプルを得るステップと；
ヒト胎盤サンプルから血液を除去することによって胎盤粗抽出物を調製するステップと；
胎盤粗抽出物をタンパク質可溶化剤と混合することによって、粗抽出物中のタンパク質を可溶化するステップと；
固形物を可溶化タンパク質-胎盤抽出物混合物から分離するステップと；
可溶化タンパク質-胎盤抽出物混合物に対して透析を行うことによってタンパク質可溶化剤を混合物から除去して、ヒト胎盤抽出物を調製するステップ
とを含む、ヒト胎盤抽出物を製造する方法。
【請求項２】
胎盤サンプルから血液を除去するステップが、
ヒト胎盤サンプルをバッファーとともにホモジェナイズするステップと、
ホモジェナイズされたサンプルを遠心分離するステップと、
血液を含有する上清を捨てるステップ
とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質可溶化剤が尿素である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
尿素が、約0.5M〜約16Mの濃度を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
可溶化タンパク質-胎盤抽出物混合物を遠心分離して固形物を除去するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
透析液がTBSを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
透析液が一定間隔で交換され、胎盤抽出物がタンパク質可溶化剤を実質的に含まなくなるまで透析が繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
透析後、胎盤抽出物を遠心分離して更なる固形物を除去するステップを更に含む、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記方法が約-86℃〜約5℃の温度で行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が約4℃の温度で行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
ヒト胎盤サンプルから得られたヒト胎盤抽出物を含有する組成物であって、
血液および固形物が抽出物から実質的に除去され、前記抽出物がサイトカインおよび増殖因子を含む胎盤タンパク質を含有し、
前記胎盤タンパク質が胎盤サンプル中に存在したものである、
組成物。
【請求項１２】
胎盤抽出物が、
ヒト胎盤サンプルから得られたサンプルから血液を除去することによって胎盤粗抽出物を調製するステップと；
胎盤粗抽出物をタンパク質可溶化剤と混合することによって、粗抽出物中のタンパク質を可溶化するステップと；
固形物を可溶化タンパク質-胎盤抽出物混合物から分離するステップと；
可溶化タンパク質-胎盤抽出物混合物に対して透析を行うことによってタンパク質可溶化剤を混合物から除去して、ヒト胎盤抽出物を調製するステップ
とによって製造される、請求項１１に記載のヒト胎盤抽出物。
【請求項１３】
胎盤抽出物が、少なくとも20の異なるサイトカインを含む、請求項１１に記載のヒト胎盤抽出物。
【請求項１４】
タンパク質可溶化剤が尿素である、請求項１１に記載のヒト胎盤抽出物。
【請求項１５】
胎盤抽出物が、内皮細胞の増殖を促進することができる、請求項１１に記載のヒト胎盤抽出物。
【請求項１６】
胎盤抽出物が、血管新生を調節することができる、請求項１１に記載のヒト胎盤抽出物。
【請求項１７】
胎盤抽出物が、基底膜マトリックス（BMM）と比較して、様々な細胞株の増殖、分化、または両方に対して区別できる効果を有する、請求項１１に記載のヒト胎盤抽出物。
【請求項１８】
胎盤抽出物が、BMMと比較して、内皮細胞の増殖の増加を促進する、請求項１１に記載のヒト胎盤抽出物。
【請求項１９】
胎盤抽出物が、胎盤抽出物の非存在下で培養された内皮細胞での遺伝子発現と比較して、内皮細胞において１つ以上の遺伝子を上方制御し、
前記遺伝子が、血管新生遺伝子、細胞外マトリックスリモデリング遺伝子、および血管発生遺伝子からなる群より選択される、
請求項１１に記載のヒト胎盤抽出物。
【請求項２０】
血管新生遺伝子が、ANGPTL4、CXCL3、ヒト成長因子（HGF）、ANGPT2、PGF、TYMP、VEGFA、HIF1A、およびFGF1からなる群より選択される、請求項１９に記載のヒト胎盤抽出物。
【請求項２１】
細胞外マトリックスリモデリング遺伝子が、MMP2、MMP9、COL4A3、およびLAMA5からなる群より選択される、請求項１９に記載のヒト胎盤抽出物。
【請求項２２】
血管発生遺伝子が、CDH2、HAND2、LECT1、およびMDKなどからなる群より選択される、請求項１９に記載のヒト胎盤抽出物。
【請求項２３】
抽出物が、
バッファーとともにホモジェナイズすることおよび血液を分離するために遠心分離することによって胎盤サンプルから血液を除去するステップと、
尿素溶液と混合することによって胎盤タンパク質を可溶化するステップと、
抽出物から固形物を分離するステップと、
透析によって尿素を除去し、ヒト胎盤抽出物を提供するステップ
とによって製造される、請求項１２に記載のヒト胎盤抽出物。
【請求項２４】
血液および固形物を除去するために処理され、タンパク質可溶化剤と混合され、透析されてタンパク質可溶化剤を除去した、ヒト胎盤サンプルから得られたヒト胎盤抽出物の存在下で、内皮細胞を培養するステップを含む、細胞培養物において血管新生を誘導する方法であって、
前記胎盤抽出物が、サイトカインおよび増殖因子を含む胎盤タンパク質を含有する、方法。
【請求項２５】
細胞が少なくとも40,000細胞/cm2の密度で播種される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
細胞が少なくとも80,000細胞/cm2の密度で播種される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
宿主に生体材料を移植するステップを含む、in vivoにおいて生体材料の血管化を誘導する方法であって、
移植に先立って、生体材料がヒト胎盤抽出物中でインキュベートされ、
前記ヒト胎盤抽出物が、血液および固形物を除去するために処理され、タンパク質可溶化剤と混合され、透析されてタンパク質可溶化剤を除去した、ヒト胎盤サンプルから得られ、
前記胎盤抽出物が、サイトカインおよび増殖因子を含む胎盤タンパク質を含有する、方法。
【請求項２８】
生体材料が、ヒト由来の基質材料を含む人工の生物学的足場である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
生物学的足場が脱細胞化されたヒト臍帯静脈足場である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
ヒト臍帯静脈足場がヒト内皮細胞を播種される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
足場がヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を播種される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
ヒト内皮細胞が少なくとも約40,000細胞/cm2の密度で播種される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
宿主が哺乳動物である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
宿主がヒトである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
移植される生体材料が、基底膜マトリックス（BMM）中でインキュベートされた生体材料と比較して、減少した線維化を生じる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
移植される生体材料が、胎盤抽出物中でインキュベートされていない生体材料と比較して、増加した血管成長を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
血液および固形物を除去するために処理され、タンパク質可溶化剤と混合され、透析されてタンパク質可溶化剤を除去した、ヒト胎盤サンプルから得られたヒト胎盤抽出物中でインキュベートされた、ヒト由来の基質材料を含む人工の生物学的足場を含む、移植可能な人工の生物学的足場であって、
前記胎盤抽出物が、サイトカインおよび増殖因子を含む胎盤タンパク質を含有する、
移植可能な人工の生物学的足場。
【請求項３８】
血液および固形物を除去するために処理され、タンパク質可溶化剤と混合され、透析されてタンパク質可溶化剤を除去した、ヒト胎盤サンプルから得られたヒト胎盤抽出物の存在下で、ヒト内皮細胞の培養物を培養するステップであって、前記胎盤抽出物はサイトカインおよび増殖因子を含む胎盤タンパク質を含有する、ステップと；
ヒト内皮細胞培養物を試験化合物と接触させるステップと；
培養物における血管新生の量を測定するステップと；
細胞培養物における血管新生の量が、試験化合物の非存在下で培養された培養物の血管新生の量より多いかまたは少ない場合に、試験化合物を血管新生調節因子として同定するステップ
とを含む、血管新生調節因子を同定する方法。
【請求項３９】
試験化合物の非存在下で培養された培養物と比較した血管新生の量の増加が、試験化合物が血管新生を誘導することを示す、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
試験化合物の非存在下で培養された培養物と比較した血管新生の量の減少が、試験化合物が血管新生を阻害することを示す、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
試験化合物がトロンボスポンジン-1（TSP-1）であり、前記化合物が血管新生を阻害する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
血液および固形物を除去するために処理され、タンパク質可溶化剤と混合され、透析されてタンパク質可溶化剤を除去した、ヒト胎盤サンプルから得られたヒト胎盤抽出物の存在下で培養された内皮細胞の培養物を含む、血管新生の調節因子を同定するために試験化合物をスクリーニングするための分析物(assay)であって、
前記胎盤抽出物が、サイトカインおよび増殖因子を含む胎盤タンパク質を含有する、分析物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2013年4月2日に出願された、「Compositions and Methods for Induction and Modulation of Angiogenesis and methods and Assays for Identifying Angiogenesis Modulators」と題する米国仮特許出願第61/807,401号に基づく優先権を主張し、この仮出願は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府による助成金を受けた研究開発についての記載
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号HL088207のもとで政府支援によって行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
血管新生は、創傷治癒から癌にわたる生理的状態および病理的状態での血管の形成を可能にする。血管新生調節は、位置および刺激の両方に依存性であり、それぞれの事例は、調節分子の独特の組合せと関連しうる。
【０００４】
人工器官に血管を形成できないこと、および梗塞領域に血管を再形成できないことは、臨床に有効な再生医療の治療をもたらす上での主要な障害になっている。決定的な方法で血管新生を調節する能力は、正常および病的な血管生理の定義、組織／器官の再生、創傷治癒、梗塞組織の修復ならびに癌の抑制からの幅広い臨床応用に大きな影響を及ぼすであろう。血管新生を開始し、より大きな血管形成を促進するために、直接細胞播種（単培養および共培養）、幹細胞の使用、ならびにヒト由来調節因子／増殖因子の組合せなどの、様々な異なるアプローチが取られてきた。これまで、それらの離散的なタンパク質組成、非ヒト起源、腫瘍起源、または遺伝子発現を制御する方法の場合の遺伝子調節の欠如のため、通常、非ヒト動物の化合物を用いるこれらのin vitroでのアプローチを臨床に変換することはほとんど成功していなかった。
【０００５】
現在のin vitroでの血管新生を誘導する方法は、ヒト由来調節因子の単純な組合せで作られるか、動物由来の刺激因子を使用する、または評価のため生きた動物の使用に完全に依存している。ヒト由来の調節因子および／または動物由来の調節因子の単純な組合せで作られたこれらの現在のin vitroモデルを用いて、潜在的な血管新生阻害薬を試験することは、幅広くヒトのin vivoでの分子間相互作用を表すことができないため、スクリーニング過程を制限する。血管新生の調節は多くの代謝経路の誘導を必要とするため、選択された分子経路のみの調節はまた、人工器官に事前に血管形成させる試みをも制限する。また、現在、もっとも一般的な成功しているアプローチは、Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫細胞に由来する物質であるマトリゲル（商標）を用いるが、これはヒトの治療には不適切であると考えられる。従って、血管新生を誘導および調節するための改善されたヒトを基盤とする方法は、医薬開発と再生医療との両方を活性化しうる。
【発明の概要】
【０００６】
簡潔に述べると、本開示の実施形態は、ヒト胎盤抽出物およびヒト胎盤抽出物を製造する方法、血管新生を誘導する方法、生体材料の血管化（vascularization）を誘導する方法、移植可能な人工の生体材料、ならびに血管新生の調節因子を同定する方法および分析物(assay)を提供する。
【０００７】
ヒト胎盤抽出物を製造する方法のための本開示の実施形態は、最初にヒト胎盤からサンプルを得るステップ、およびヒト胎盤サンプルから血液を除去することによって胎盤粗抽出物を調製するステップを含む。方法は更に、胎盤粗抽出物をタンパク質可溶化剤と混合することによって、粗抽出物中のタンパク質を可溶化するステップ、固形物を可溶化タンパク質-胎盤抽出物混合物から分離するステップ、および可溶化タンパク質-胎盤抽出物混合物に対して透析を行うことによってタンパク質可溶化剤を混合物から除去して、ヒト胎盤抽出物を調製するステップを含む。
【０００８】
本開示はまた、ヒト胎盤サンプルから得られたヒト胎盤抽出物を含有する組成物をも提供する。血液および固形物は抽出物から実質的に除去され、抽出物は、サイトカインおよび増殖因子などの胎盤タンパク質を含有し、胎盤タンパク質は胎盤サンプル中に存在した。実施形態では、本開示は、胎盤抽出物を含み、それは、ヒト胎盤サンプルから得られたサンプルから血液を除去することによって胎盤粗抽出物を調製するステップ；胎盤粗抽出物をタンパク質可溶化剤と混合することによって、粗抽出物中のタンパク質を可溶化するステップ；固形物を可溶化タンパク質-胎盤抽出物混合物から分離するステップ；および可溶化タンパク質-胎盤抽出物混合物に対して透析を行うことによってタンパク質可溶化剤を混合物から除去して、ヒト胎盤抽出物を調製するステップによって製造される。
【０００９】
本開示によるin vitro（例えば、細胞培養物）またはin vivoにおいて血管新生を誘導する方法の実施形態は、ヒト胎盤抽出物の存在下で内皮細胞を培養するステップを含み、その胎盤抽出物は、血液および固形物を除去するために処理され、タンパク質可溶化剤と混合され、タンパク質可溶化剤を除去するために透析されたヒト胎盤サンプルから得られ、その胎盤抽出物は、サイトカインおよび増殖因子などの胎盤タンパク質を含有する。
【００１０】
実施形態では、本開示はまた、in vivoにおいて生体材料の血管化を誘導する方法をも含む。実施形態では、このような方法は、宿主に生体材料を移植するステップを含み、移植に先立って、生体材料はヒト胎盤抽出物中でインキュベートされ、そのヒト胎盤抽出物は、血液および固形物を除去するために処理され、タンパク質可溶化剤と混合され、タンパク質可溶化剤を除去するために透析されたヒト胎盤サンプルから得られ、その胎盤抽出物は、サイトカインおよび増殖因子などの胎盤タンパク質を含有する。
【００１１】
本開示はまた、ヒト胎盤抽出物中でインキュベートされたヒト由来の基質材料を含む人工の生物学的足場（bioscaffold）などの、移植可能な人工の生物学的足場をも提供する。実施形態では、ヒト胎盤抽出物は、血液および固形物を除去するために処理され、タンパク質可溶化剤と混合され、タンパク質可溶化剤を除去するために透析されたヒト胎盤サンプルから得られ、その胎盤抽出物は、サイトカインおよび増殖因子などの胎盤タンパク質を含有する。
【００１２】
実施形態では、本開示は、血管新生調節因子を同定する方法を提供し、その方法は、血液および固形物を除去するために処理され、タンパク質可溶化剤と混合され、タンパク質可溶化剤を除去するために透析されたヒト胎盤サンプルから得られたヒト胎盤抽出物の存在下で、（その胎盤抽出物は、サイトカインおよび増殖因子などの胎盤タンパク質を含有する）、ヒト内皮細胞の培養物を培養するステップ；ヒト内皮細胞培養物を試験化合物と接触させるステップ；培養物における血管新生の量を測定するステップ；ならびに、細胞培養物における血管新生の量が、試験化合物の非存在下で培養された培養物の血管新生の量より多いかまたは少ない場合に、試験化合物を血管新生調節因子として同定するステップを含む。
【００１３】
本開示の実施形態はまた、血管新生の調節因子を同定するために試験化合物をスクリーニングするための分析物をも含む。実施形態では、分析物は、ヒト胎盤抽出物の存在下で培養した内皮細胞の培養物を含み、その胎盤抽出物は、血液および固形物を除去するために処理され、タンパク質可溶化剤と混合され、タンパク質可溶化剤を除去するために透析されたヒト胎盤サンプルから得られ、その胎盤抽出物は、サイトカインおよび増殖因子などの胎盤タンパク質を含有する。
【００１４】
本開示の他の方法、組成物、plants、特徴、および利点は、下記の図面および詳細な説明の試験において、当業者にとって明白であるか、または明白になるであろう。このようなすべての更なる組成物、方法、特徴、および利点は、本記載に含まれ、本開示の範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本開示の更なる態様は、添付図面と合わせた場合、以下に記載されるその様々な実施形態の詳細な説明の再検討によって、より容易に理解される。
【００１６】
【図１】図１Ａ〜１Ｆは、ヒト胎盤抽出物（hPE）上で形成された血管新生ネットワークの特性評価を図示する。図１Ａは、ローダミンファロイジン（「赤」-灰色の分岐経路として示される）およびDAPI（「青」-分岐経路内のより薄い灰色の点として示される）を図示し、胎盤抽出物上で1日後の血管新生発芽の際の分岐した細胞糸状仮足を示している。図１Ｂは、ローダミンファロイジン（「赤」-灰色の分岐経路として示される）およびDAPI（「青」-分岐経路内のより薄い灰色の点として示される）を図示し、3日後の広範囲に及ぶ細胞コードを有する成熟した血管新生ネットワークを示している。図１Ｃは、カルセイン（「緑」-灰色の分岐として示される）およびDAPI（「青」-分岐内のより薄い灰色の点として示される）で染色された、胎盤抽出物上で1日後の初期段階の細胞コードおよび血管新生ネットワーク形成の間のHUVECを示す。図１Ｄは、DAPI（「青」-灰色の破線状の経路として示される）染色を図示し、胎盤抽出物上で3日後のHUVECの細胞コードを示している。図１Ｅは、4×104細胞/cm2で組織培養プレート上に播種され、内皮細胞培地中で3日間培養されたHUVECを示す。図１Ｆは、100μL PE/cm2で組織培養プレートの表面に付着した胎盤抽出物上に4×104細胞/cm2で播種され、その後、内皮細胞培地中で3日間培養されたHUVECによる血管新生ネットワークの形成を図示する。
【００１７】
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、hPEの生化学的分析およびhPE上に播種されたHUVECの遺伝子解析を図示する。図２Ａは、サンドイッチ法ベースのヒト血管新生抗体アレイを用いて行われたサイトカイン分析を示す棒グラフであり、データは陰性対照値（0％）から陽性対照値（100％）までの尺度で正規化された（データは3回の生物学的反復を代表するものである）。図２Ｂおよび２Ｃは、LC-MS/MSを用いて測定された免疫関連（２Ｂ）および血管新生関連（２Ｃ）BM関連タンパク質の正規化スペクトル存在量因子（normalized spectral abundance factor）（％）を示す棒グラフである。フィブリノゲンの正規化スペクトル存在量因子値は、FGAおよびFGGの値の合計として示され、ラミニンは、LAMA2、LAMA4、LAMA5、LAMB1、LAMB2、LAMB3、およびLAMC1の値の合計として示される。図２Ｄは、100μL PE/cm2上に80,000細胞/cm2の密度で播種され3日間のHUVECで行われた遺伝子解析を図示する。hPE上に播種された際、溶解液中に存在しないVEGFAなどのいくつかの血管新生関連タンパク質が、HUVECによって上方制御された。データは4回の生物学的反復を代表するものである。P値は、対照群および処理群のそれぞれの遺伝子に対する反復 2Λ（-デルタCt）値のスチューデントt検定を用いて計算される。
【００１８】
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、hPEおよびマトリゲルでコーティングされた組織培養フラスコ上に形成されたin vitro血管新生ネットワークを図示する。図３Ａは、異なる細胞播種密度で1日、3日、および5日後のhPEおよびマトリゲル上の、カルセイン染色されたHUVECを図示する。最大細管数/mm2までの時間として定義される血管新生ネットワークの成熟速度は、hPEサンプルにおいて、細胞播種密度を変えることによって調節された。定量分析は、40,000細胞/cm2では、血管新生ネットワークがそれらの最大細管密度（細管/mm2）に達するために3日目までかかったが、80,000細胞/cm2では、ネットワークは1日でそれらの最大細管密度に達することを示した（データは示されない）。マトリゲルサンプルでは、血管新生ネットワークは1日後は明確ではなかった。スケールバー、200ミクロン。図３Ｂは、胎盤抽出物上に播種した際には（３Ｂ. ｉ）、WPMY-1筋線維芽細胞は血管新生構造を持たなかったが、マトリゲル上に播種した際には（３Ｂ. ｉｉ）持っていたことを図示する。
【００１９】
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、hPEに基づく血管新生スクリーニングアッセイを用いた、抗血管新生性腫瘍抑制タンパク質のスクリーニングを図示する。図４Ａは、hPE、マトリゲル、および対照培養フラスコ（コーティングされていない）上で1日間、培地に添加されたTSP-1とともに培養され、その後カルセインCalcein AMを用いて染色された、HUVECを示す。スケールバー、200μm。図４Ｂのグラフは、hPEでコーティングされたフラスコにおいて、平均全細管長[mm]および平均分岐点数がともに、TSP-1濃度の増加に伴い直線的に減少したことを示す。図４Ｃのグラフは、正規化された血管新生ネットワーク被覆領域の減少率の比較を図示し、hPEでコートされた培養プレートは、マトリゲルでコートされた培養プレートより有意に高いTSP-1濃度への感受性を有し、R2値はそれぞれ0.97および0.36であった。
【００２０】
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、3D組織構築物におけるin vitroでの血管新生を図示する。図５Ａは、hPEに浸漬した（ヒト臍帯静脈）生物学的足場において播種および3日間培養した後in vitroで血管新生を誘導するための、胎盤由来細胞、足場、およびサイトカインを図示する概略図である。図５Ｂは、HUVECを播種したhPEに浸漬していない組織足場は血管新生ネットワークを形成しなかったことを示す。図５Ｃは、hPEに浸漬した生物学的足場の一連の代表的な画像を示し、培養3日後には血管新生の発芽型機構と陥入型機構との両方の発現を示している。20,000細胞/cm2のHUVEC細胞播種密度では、発芽型血管新生が最も多く見られた（図５Ｃ.ｉ.〜５Ｃ.ｉｉ.）。40,000細胞/cm2の播種密度では、発芽型血管新生と陥入型血管新生との両方の発現が観察され（図５Ｃ.ｉｉｉ.〜５Ｃ.ｉｖ.）、一方、60,000細胞/cm2の密度では（図５Ｃ.ｖ.〜５Ｃ.ｖｉ.）、血管新生細管は陥入によって形成された。
【００２１】
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、hPEでインキュベートされた生物学的足場におけるin vivoでの血管新生の図を示す。図６Ａは、ラットモデルの筋膜と筋層の間への移植に先立って2時間、PE、マトリゲル、またはリン酸緩衝生理食塩水（対照）中でインキュベートされた脱細胞化HUV 足場を示す概略図である。図６Ｂは、移植5日後に分析のために取り出された足場を示している一連の画像を示す。対照およびマトリゲルでインキュベートされた生物学的足場では、hPEでインキュベートされた足場と比較して、有意に多くの線維被膜形成が起こっていた（図６Ｂ.ｉ.〜６Ｂ. ｉｉｉ.）。半透明の生物学的足場シートの前頭面から取られた明視野像は、対照と比較して、マトリゲルおよびhPEでインキュベートされた足場が、毛細血管網の形成を有意に改善したことを示すが（図６Ｂ. ｉｖ.〜６Ｂ.ｖｉ.）、最も成熟した毛細血管床はhPE足場にあり、細静脈血流への毛細血管と連絡している細動脈を有する血管構造の形成を示している（図６Ｂ. ｖｉ.（破線の丸い囲み））。ヘマトキシリンおよびエオシン染色は、hPEでインキュベートされた足場が、対照およびマトリゲルの足場と比較して最も多くの足場再構築したことを示した（図６Ｂ. ｖｉｉ.〜６Ｂ.ｉｘ.）。対照の足場（図６Ｂ.ｖｉｉ.）は、それらの本来の線維配向の再構築をほとんど示さず、またHUV 生物学的足場の反管腔側（イタリック体の「I」で示される）の表面から足場内への細胞遊走も最も少なかった。マトリゲルでインキュベートされた足場は、hPEの足場と比較して、HUVの反管腔表面からのわずかに少ない細胞遊走を示し（図６Ｂ.ｖｉｉｉ.〜６Ｂ.ｉｘ.）；対照と比較した際、マトリゲルでインキュベートされた足場はまた、新たなコラーゲン線維配向およびより均一な細胞分布を有するhPEでインキュベートされた足場より、少ない均一な細胞分布とより少ない足場再構築を示した。
【００２２】
【図７】図７Ａ〜７Ｅは、動的な細胞培養条件を用いて培養されるヒト臍帯静脈足場（HUV）上での血管新生ネットワークの形成のための実施形態を図示する。図７Ａおよび７Ｂの概略図によって図示されるように、管状のHUV 足場は、細胞播種前に2時間、胎盤抽出物中でインキュベートされ、構築物は、5日間二重かん流バイオリアクター内で、標準的な細胞培養条件下で培養された。細胞は、足場の内腔上にとどまり、遊走しなかった（図７Ｃ）。細胞コード、細管形成の初期段階は、散在していた（図７Ｄおよび７Ｅ）。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
説明
本開示をより詳細に記載する前に、本開示は記載された特定の実施形態に限定されず、従って当然変更されうるものであることが理解されるべきである。また、本明細書において用いられる専門用語は、特定の実施形態を説明することを目的とし、限定することを意図しないことも理解されるべきである。
【００２４】
数値の範囲が規定される場合、その範囲の上限および下限とその所定の範囲内の他の任意の所定の値または介在値との間のそれぞれの介在値は、文脈が明らかに他を規定しない限り、下限の単位の10分の1まで、本開示に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立にそのより小さい範囲に含まれてもよく、また本開示に包含され、所定の範囲内の任意の明確に除外された限度を対象とする。所定の範囲が限度の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限度の一方または両方を除外している範囲もまた、本開示に含まれる。
【００２５】
他に定義されない限り、本明細書において用いられるすべての専門用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似のまたは同等の任意の方法および材料もまた、本開示の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料は、これから記載される。
【００２６】
本明細書に引用され、参照により組み入れられる任意の刊行物および特許文献は、参照により本明細書に組み入れられることによって、それに関連して刊行物が引用された方法および／または材料を開示し、記載する。任意の刊行物の引用は、出願日より前のその開示のためであり、本開示が、先の開示を理由に、このような刊行物に先行する権利がないことを認めると解釈されるべきではない。更に、示された公開日は、実際の公開日とは異なる可能性があり、別に確認されることが必要でありうる。
【００２７】
本開示を読む上で当業者にとって明らかなように、本明細書に記載され、説明される個々の実施形態のそれぞれは、本開示の範囲または趣旨から逸脱することなく、任意の他のいくつかの実施形態の特性から容易に分離され、またはそれらと組み合わせられうる個別の構成要素および特性を有する。任意の列挙された方法は、列挙された事象順で、または理論的に可能な他の任意の順序で、実施され得る。
【００２８】
本開示の実施形態は、他に指示されない限り、医学、生化学、分子生物学、生物学、薬理学などの技術を用い、これらは当技術分野の技術の範囲内である。このような技術は、文献中で完全に説明される。
【００２９】
本明細書および添付の実施形態において用いられる場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明らかに他を規定しない限り、複数形の指示対象を含むことに注意しなくてはならない。従って、例えば、「細胞（a cell）」への言及には、複数の細胞が含まれる。本明細書およびその後の実施形態では、多数の用語について言及されるが、反する意図が明白でない限り、下記の意味を有すると定義されるものとする。
【００３０】
様々な実施形態の記載に先立って、下記の定義が示され、他に指示されない限り、その定義が用いられなければならない。
【００３１】
定義
開示される対象物の記載において、下記の専門用語は、下記の定義に従って用いられる。
【００３２】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において用いられる場合、ペプチド結合によって連結された、連続した配列中の３つ以上のアミノ酸のポリマーを指す。「ポリペプチド」という用語は、タンパク質、タンパク質断片、タンパク質類似体、オリゴペプチドなどを含む。「ポリペプチド」という用語は、核酸によってコードされる、（鳥などの適切な起源から分離された）組換え技術によって生成されるか、または合成される、上記に定義されたようなポリペプチドを企図する。「ポリペプチド」という用語は、更に、化学修飾アミノ酸または標識リガンドと共有結合的にもしくは非共有結合的に結合したアミノ酸を含む、上記に定義されたようなポリペプチドを企図する。
【００３３】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸配列」という用語は、本明細書において同じ意味で用いられ、コード配列（適切な調節配列もしくは制御配列の制御下に置かれた時、in vitroまたはin vivoでポリペプチドに転写、翻訳されるポリヌクレオチドあるいは核酸配列）；制御配列（例えば、翻訳開始コドンおよび終止コドン、プロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写因子結合部位、転写終結配列、上流および下流の調節ドメイン、エンハンサー、サイレンサーなど）；ならびに調節配列（転写因子が結合し、プラス（誘導）またはマイナス（抑制）のいずれかに遺伝子のプロモーター活性を変えるDNA配列）を含むが、それらに限定されない。長さまたは合成起源についての制限は、本明細書に記載される用語によって示唆されない。
【００３４】
「遺伝子」という用語は、本明細書において用いられる場合、完全なRNA、完全なタンパク質、またはこのような完全なRNAもしくは完全なタンパク質の任意の一部分を合成するための遺伝情報をコードする核酸配列（RNAとDNAとの両方を含む）を指す。「遺伝子」は通常、染色体上の特定の位置を占め、生物の特徴または形質に対する遺伝的指令を含むDNAの配列に対応する遺伝性の単位を指す。「遺伝子産物」という用語は、遺伝子によってコードされるRNAまたはタンパク質を指す。
【００３５】
「治療する」、「治療（treating）」、および「治療（treatment）」という用語は、有益な、または望ましい臨床結果を得るための方法である。具体的には、有益な、または望ましい臨床結果は、症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の安定化（例えば、悪化しないこと）、疾患進行の遅延または減速、疾患の拡大の実質的予防、病状の改善または緩和、および検知可能、検知不可能に関わらず（部分的もしくは全体的な）回復を含むが、それらに限定されない。加えて、「治療する」、「治療（treating）」、ならびに「治療（treatment）」はまた、疾患および／もしくは疾患に起因する悪影響の部分的治癒または完治において治療効果があり得る。本明細書において用いられる場合、「予防的に治療する」または「予防的治療」という用語は、宿主において病気／疾患もしくはその１つ以上の症状を完全に、実質的に、または部分的に予防することを指す。同様に、「疾患発症の遅延」もまた、「予防的治療」に含まれ、疾患の素因を有する患者において実際の疾患発症前の時間を増加させる作用を指す。
【００３６】
「投与」とは、本開示の複合物（compound）を被験体内に導入することを意味し、それはまた、本開示の組成物を被験体に（例えば、処方することによって）供給する行為をも指しうる。
【００３７】
「生物」、「被験体」、または「宿主」という用語は、ヒト、哺乳動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ、マウス、ラット、ブタ（pigs, hogs）、ウシ、および他の家畜）、鳥類（例えば、ニワトリ）ならびに治療を必要とする他の生物種などの、治療を必要とする任意の生命体を指す。詳細には、「宿主」という用語は、ヒトを含む。本明細書において用いられる場合、「ヒト宿主」または「ヒト被験体」という用語は、通常ヒト宿主を指すために用いられる。本開示において、「宿主」という用語は、通常ヒト宿主を指し、従って、本開示において単独で用いられる場合、「宿主」という単語は、文脈が明らかに非ヒト宿主を指示する意図を示さない限り、ヒト宿主を指す。疾患の「素因を有する」宿主は、１つ以上のこれらの疾患の明らかな症状を示さないが、遺伝的、生理的、またはその他の点で、１つ以上のこれらの疾患を発症する危険性のある宿主と定義され得る。
【００３８】
「発現」という用語は、本明細書において用いられる場合、ポリペプチドを産生するために構造遺伝子が受ける過程を表す。それは、転写および翻訳の組合せである。発現は通常、ポリペプチドを産生するための核酸の「発現」を指すが、ポリペプチドの「発現」と言うことも一般的に受け入れられ、ポリペプチドが対応する核酸の発現によって産生されていることを示している。
【００３９】
「血管新生」は、新たな血管の成長を伴う生理的過程である。血管新生は、例えば、成長および発生、創傷治癒、胚発生などの生物学的過程の重要な部分である。疾患細胞が異常な量の血管新生増殖因子を産生し、天然の血管新生阻害剤の作用を圧倒した場合、過度の血管新生が起こり得る。血管新生増殖因子の産生と血管新生阻害剤の産生との間の不均衡は、不適切に調節された血管の成長または抑制を引き起こし得る。血管新生依存性疾患または血管新生関連疾患は、新たな血管が過剰にまたは不十分に成長した際に起こる。血管新生関連疾患は、例えば、限定はされないが、癌、前癌組織、腫瘍、心筋梗塞、および脳卒中などの疾患を含み得る。過度の血管新生は、癌、糖尿病性失明、加齢黄斑変性、関節リウマチ、乾癬、および70以上の他の疾患を含み得る。不十分な血管新生は、冠動脈疾患、脳卒中、および創傷治癒の遅延を含み、また本開示においてより詳細に議論されるような組織工学の要素でもある。
【００４０】
本明細書において用いられる場合、「調節する」ならびに／あるいは「調節因子」という用語は通常、細胞／生物において特定の機能および／もしくは形質を、直接的または間接的に促進する／活性化する／誘導する／増加させるあるいは干渉する／阻害する／減少させる作用を指す。ある場合には、調節因子は、その天然の状態と比べて、もしくは通常予測される標準レベルの活性と比べて、特定の活性または機能を増加あるいは減少させうる。調節は、（例えば、ペプチドの発現を上方制御もしくは下方制御するように作用することによって）ペプチドの過剰発現または低発現を引き起こすことを含み、あるいは、それは対象のペプチドと直接相互作用することによって、活性を増加および／または減少させうる。調節はまた、例えば、血管新生もしくは血管新生と関連した生物学的事象などの、特定の生物学的活性または生物学的事象の増加あるいは減少を引き起こすことをも含む。
【００４１】
本明細書において用いられる場合、「上方制御する」は、タンパク質もしくは他の遺伝子産物の発現および／または活性を増加させる作用を指す。「下方制御」は、タンパク質もしくは他の遺伝子産物の発現および／または活性を減少させることを指す。
【００４２】
「分離された細胞または細胞集団」という用語は、本明細書において用いられる場合、組織から摘出された、もしくは組織培養技術によってin vitroで培養された、分離された細胞または複数の細胞を指す。「細胞または細胞集団」という用語は、上述のように分離された細胞を指してもよく、または動物もしくはヒトの組織内のin vivoの細胞を指してもよい。
【００４３】
「組織」という用語は、通常、協調して生物学的機能を果たす、および／または、生物の器官のすべてもしくは一部を形成する（例えば、結合組織、内皮組織）などの生物学的な目的を果たすように組織化された、細胞の集団を指す。「組織」は通常、類似した細胞、またはすべて同一の種類の細胞の集団を含むが、組織はまた、細胞集団が全体として共通の目的を果たす1種類より多くの細胞をも含みうる。
【００４４】
本明細書において用いられる場合、「生体適合性」という用語は、生物学的物質もしくは生体系に対して過度のストレス、毒性、または悪影響を与えることなく、生きている生物学的物質および／あるいは生体系（例えば、細胞、細胞成分、生きている組織、器官など）と共存する能力を指す。
【００４５】
「生物学的足場」という用語は、生きている生物学的物質（例えば、生きている細胞）の成長を支持するために十分な構造安定性を有する（天然由来または合成の）任意の生体適合性物質を指す。本開示の実施形態では、生体適合性の足場材料は、天然由来の基質（例えば、生体から得られるが、更なる加工および処理を受けたもの；または天然源に由来する材料から得られたもの）、例えば、限定はされないが、脱細胞化されたヒト臍帯静脈足場などである。実施形態では、本開示の生物学的足場は、生きている細胞の三次元での成長を支持するために、（平面、二次元構造よりもむしろ）三次元構造を有する。
【００４６】
本明細書において用いられる場合、「生分解性」という用語は、時間とともに自然環境において（例えば、生体内もしくは生きている培養物内で）溶解、崩壊、または他の方法で分解し、その構造完全性を失い、その本来の構造形態に存在しなくなる材料を指す。本開示の実施形態では、生分解性材料は、一定期間にわたって宿主生物内で溶解／分解する。
【００４７】
本明細書において用いられる場合、「人工の」という用語は、操作される対象物が人によって作り出され、および／または改変されることを示す。操作される対象物は、天然由来の物質を含みうるが、対象物自体は、何らかの方法でヒトの介入および設計によって改変される。
【００４８】
本明細書において用いられる場合、「試験化合物」という用語は、ペプチド、ペプチド模倣薬、小分子、核酸配列、または生きている細胞もしくは生物に対して影響を及ぼしうる他の化合物を含みうる。いくつかの実施形態では、「試験化合物」は、生物学的活性、機能もしくは別の化合物への応答に対して調節作用を有することが疑われる化学薬品またはペプチドなどの化合物でありうる。例えば、本開示では、「試験化合物」は、例えば、血管新生活性を上昇させる、血管新生活性を低下させる、および／または異なる血管新生調節因子の作用を調節するなど、血管新生に対して調節作用を有することが疑われる化合物でありうる。
【００４９】
本明細書において用いられる場合、「除去された」または「実質的に除去された」という用語は、物質または化合物の量が、他の組成物から分離されていることを示すが、除去される物質が全く検出されないように、完全に除去される物質のすべてが残りの組成物から取り除かれる必要はない。例えば、血液が組成物から「除去された」または「実質的に除去された」場合、これは、組成物中の血液の相当な割合が除去されているが、いくらかの血液もしくは血液成分がまだ、厳密なスクリーニングにおいて微量に検出されうることを示す（例えば、「実質的に除去された」とは、組成物が「除去される」成分を100％含まない必要はなく、組成物または物質は、「除去される」成分を約99％含まない、約95％含まない、もしくは約90％含まない、または上記の例示パーセンテージ内の任意のパーセンテージもしくは範囲であり得る）。
【００５０】
考察
本開示の実施形態は、血管新生を誘導する方法および組成物ならびに血管新生を調節する方法および組成物、ならびに血管新生を調節する組成物の製造方法を包含する。本開示はまた、血管新生の調節因子を同定する方法および血管新生の調節因子を同定するアッセイをも含む。本開示の実施形態は更に、血管新生を調節するための組成物を送達する方法および組成物を含む。実施形態において、本開示は、組織構築物および／または天然の組織においてin vitroおよび／またはin vivoで血管新生を誘導および／または調節するために使用され得る胎盤抽出物、ならびに胎盤抽出物を組織構築物および／または天然の組織内の細胞に送達する方法および組成物を含む。本開示はまた、血管新生を調節する化合物を同定するためのアッセイに使用され得る胎盤抽出物をも含む。更に、本開示は、in vivoまたはin vitroの細胞集団に抽出物を制御放出することによって血管新生を誘導するための、胎盤抽出物を充填した送達ベヒクルの組成物を含む。
【００５１】
血管新生は、位置および刺激の両方に依存性の複雑な過程であり、それぞれの場合において、これらの過程を調節する能力は、調節分子の複雑な組合せを含みうる1，2。血管形成の制御は、２つの最もよく理解されている陥入（intussusception）および発芽（sprouting）を伴う、異なる形成機構によって更に複雑化される3，4。陥入（intussusception）は、既存の血管の管腔内への間質細胞の列の挿入を特徴とし5、発芽（sprouting）は、これまで微小血管が欠如している組織での血管新生刺激に向けた内皮細胞の発芽を特徴とする6。多くの分子が、血管新生を調節することが発見されており7、更に発見される可能性が高い。この血管新生誘導因子の多様性は、血管発生の研究、薬物スクリーニング、および再生医療の治療法に使用するための血管新生調節因子の継続的な検索ならびに開発を推進している8。
【００５２】
血管新生を研究するための従来のモデルは、動物由来の刺激因子を使用するか、または評価のために生きた動物の使用に完全に依存しているかのいずれかである9。in vivoでの動物実験は、ヒトの血管形成の際に起こる生体分子の経路および機構の複雑さに匹敵するより正確なモデルを提供する。一般的なin vivoでの血管新生モデルは、ウサギ角膜血新血管形成アッセイ、in vivo/in vitroニワトリ漿尿膜アッセイ、およびラット腸間膜窓アッセイを含む10。可能であれば、複雑な生物学的現象をより良く制御するために、in vitroでの血管新生モデルが選択されるが、これはしばしば、研究を限られた数の分子種、例えば、VEGFに制限する。この複雑なカスケードに単一の（または数個の）分子を用いた結果は、それ自体が限定されているかもしれず、そこでは、より複雑なまたは多因子の「混合」が、有効な血管化を促進するために必要とされうる。
【００５３】
in vitroでの血管新生モデルに関して、マウス由来基底膜マトリックス（BMM）すなわち「マトリゲル」アッセイは、in vitroモデルにin vivoでの複雑さをもたらし、結果はよりin vivoでの結果に匹敵すると思われるため、好ましいモデルである。しかし、それはEngelbreth-Holm-Swarm（EHS）マウス肉腫細胞に由来し、多数の動物の犠牲を必要とするため、臨床使用に適していない11。多数のin vitroヒト由来調節因子が、血管新生のモデルを作るために使用されてきた。歴史的に、これらは、単一の調節因子（FGF、TGF-β、VEGF）に基づいており、in vivoに本来備わっているサイトカインの多様性および化学勾配を欠如している12。動物由来のモデルと関連する種間の違い13，14およびヒト組換えタンパク質から多タンパク質製剤を得る複雑さを考えると、確固としたヒト由来のアプローチ（生理的な比率に近い複数のタンパク質のより複雑な混合物を含む）は、機構研究、血管新生薬のスクリーニング、および再生医療の治療法の臨床解釈を向上させる可能性に大きな影響を与えるであろう。加えて、異なる形成機構および形成段階に相当する血管新生過程を調節する能力は、血管化の間の重要な分子および分子経路を特徴づける改善された基盤を提供するであろう。
【００５４】
本開示は、in vitroおよびin vivoにおいて血管新生を誘導および調節する方法を提供する。in vitroおよびin vivoでの血管新生の誘導に加えて、このモデルは、微小血管ネットワークの成熟速度の調節ならびに発芽型および陥入型血管新生を選択的にモデル化することを可能にする。in vivoにおいてヒト胎盤抽出物（PE）は、投与されたコラーゲンベースの生物学的足場を用いて線維化を解消すると同時に、毛細血管形成を著しく促進することを示した。
【００５５】
本開示は、ヒト胎盤に由来する複雑な一連の調節可能な完全ヒト生体分子を用いて、in vitroおよびin vivoにおいて血管新生を誘導および調節するこのような方法を記載する。そのアプローチは、指示された分画および分離技術を用いることによって、ヒト胎盤から分離された活性のあるヒト生体分子の複合物を抽出する。in vitroでの血管新生およびin vivoでの血管新生の誘導および調節に加えて、本開示の方法および組成物は、微小血管ネットワークの成熟速度の調節ならびに発芽型および陥入型血管新生を選択的にモデル化することを可能にする。実施形態では、本開示の方法および組成物はまた、ポリマー由来およびex vivo由来の組織足場の両方で血管新生を誘導および調節する。これらの方法は、微小血管ネットワークの成熟速度の調節を可能にする。in vivoにおいて、本開示のヒト胎盤抽出物は、投与されたコラーゲンベースの生物学的足場を用いて線維化を解消すると同時に、毛細血管形成を著しく促進することを示した。
【００５６】
血管新生をもたらす増殖因子の持続的送達はまた、組織工学アプローチのために血管化を促進するための血管新生の調節の成功が直面している課題でもある。本開示はまた、in vitroとin vivoとの両方において血管新生を調節する、本開示の組成物の制御放出のための方法および組成物をも提供する。
【００５７】
ヒト胎盤抽出物
本開示は、血管新生の誘導および／または調節のための、ヒト胎盤抽出物（PE）を含む組成物および方法を提供する。本開示の実施形態では、PEは、ヒト胎盤からサンプルを得るステップ、胎盤サンプルから血液を除去することによって胎盤粗抽出物（粗PE）を調製するステップ、粗PEを尿素または他のタンパク質可溶化剤と混合することによって、抽出物中に存在するタンパク質を可溶化するステップ、残りの固形物を粗抽出物から除去するステップ；尿素-胎盤抽出物混合物を透析することによって、相当量の尿素を混合物から除去して、ヒトPEを調製するステップによって製造される。
【００５８】
実施形態では、ヒトPEを製造する過程は、約-86℃〜約5℃の温度で行われる。実施形態では、ヒト胎盤抽出物は約4℃以下の温度で製造される。
【００５９】
実施形態では、胎盤サンプルから血液を除去することによって胎盤粗抽出物を調製する過程は、ヒト胎盤サンプルをバッファーとともにホモジェナイズするステップ、ホモジェナイズされたサンプルを遠心分離するステップ、および血液を含有する上清を捨てるステップを含む。この過程は、粗PEを調製するために、実質的にすべての血液がサンプルから除去されるまで（例えば、サンプルは血液の約99％、約95％、約90％などを含まない）、複数回（例えば2回、3回、またはより多くの回数）繰り返され得る。ある実施形態では、バッファーは塩化ナトリウム溶液（NaCl）である。
【００６０】
実施形態では、胎盤粗抽出物中のタンパク質は、胎盤粗抽出物をタンパク質可溶化剤と混合することによって可溶化される。実施形態では、タンパク質可溶化剤は、タンパク質を恒久的に破壊することなく、もしくは他の方法で恒久的に不活性状態にすることなく、タンパク質を可溶化（例えば、変性）することができる、任意の化合物または化合物の混合物であり得る（例えば、可溶化は、タンパク質可溶化剤を除去した際などに、タンパク質がリフォールディングできるように、タンパク質を可逆的に変性しなければならない）。実施形態では、タンパク質可溶化剤は、尿素、グアニジン-HCl、または他の類似の化合物であり得るが、それらに限定されない。実施形態では、タンパク質可溶化剤は尿素であり、粗抽出物は、粗抽出物を尿素とともにホモジェナイズすることによって、尿素組成物と混合される。実施形態では、尿素は、約12〜36時間の期間、粗抽出物と混合される。実施形態では、尿素は、約24時間粗抽出物と混合される。実施形態では、尿素溶液は、約0.5M以上の尿素濃度を有する尿素バッファーである。実施形態では、尿素は、約2M以上、約4M以上、最大で約15Mまでである。実施形態では、尿素溶液は、約0.5M〜約15Mの濃度を有し得る。他の実施形態では、タンパク質可溶化剤は、約0.5M〜約15Mの濃度を有するグアニジン-HClである。実施形態では、グアニジン-HClは約6Mの濃度を有する。下記に記載される方法および組成物は、可溶化剤として尿素を用いて記載されるが、限定はされないが上記のものなどの他の適切な可溶化剤が尿素に代わり得ることが理解されるべきである。
【００６１】
実施形態では、尿素、または他のタンパク質可溶化剤と混合した後、固形物が、可溶化タンパク質-粗抽出物混合物（例えば、尿素-粗抽出物混合物）から除去される。実施形態では、固形物は、PE混合物を遠心分離し、沈澱（固形物を含む）を捨てることによって除去される。このステップは、複数回繰り返され得る。固形物の除去後、PE混合物（例えば、上清）は、尿素または他のタンパク質可溶化剤を胎盤抽出物から除去するために透析される。実施形態では、透析液はTBSである。実施形態では、透析液は一定期間後（例えば、1時間、2時間、3時間）交換され、透析が何回も（例えば、2、3、4回）繰り返されることによって、実質的にすべての尿素がPEから除去される（例えば、胎盤抽出物は、尿素の約99％、約95％などを含まない）。実施形態では、残りの固形物（例えば、重合したタンパク質など）を除去するために、PEは再度遠心分離されうる。実施形態では、残りのPEは、透明からピンクがかった粘性物質である。本開示の胎盤抽出物を製造する本開示の過程の実施形態についての更なる詳細は、下記の実施例において見出され得る。
【００６２】
このように、本開示の実施形態はまた、本開示の方法によって製造されるPEをも包含する。実施形態では、本開示は、ヒト胎盤サンプルから得られたサンプルから血液を除去することによって粗PEを調製するステップ；胎盤粗抽出物をタンパク質可溶化剤（限定はされないが、尿素、グアニジン-HClなど）と混合することによって、粗抽出物中のタンパク質を可溶化するステップ；固形物を可溶化タンパク質-PE混合物から分離するステップ；およびPE混合物に対して透析を行うことによってタンパク質可溶化剤（例えば、尿素）を混合物から除去して、ヒトPEを調製するステップによって製造されるPEを包含する。
【００６３】
本開示は、従って、実質的に除去される血液および固形物、ならびに胎盤サンプル中に存在していた残りの（いくつかまたはすべての）胎盤タンパク質を有する、ヒト胎盤（例えば、ヒト胎盤サンプル）から得られた抽出物を含むヒト胎盤抽出物を包含する。実施形態では、胎盤タンパク質は、サイトカインおよび増殖因子を含む。
【００６４】
本開示のPEの分析は、PEが多くのサイトカインおよび増殖因子を含む多くのタンパク質を含有することを示す。本開示の胎盤抽出物の実施形態では、抽出物は、少なくとも20の異なるサイトカインを含む。いくつかの実施形態では、それは最大40までの異なるサイトカインを含む。他の実施形態は少なくとも50のサイトカインを含む。本開示のPE中に存在し得るいくつかのサイトカインは、下記の実施例に記載されるものを含む。例えば、本開示のPE中に存在し得るいくつかのサイトカインは、アンギオジェニン、Acrp30Ag、IGFBP-1、NAP-2、およびFas/TNFGSF6、およびRANTES、およびMIFを含むが、それらに限定されない。
【００６５】
本開示の胎盤抽出物中に存在するサイトカインおよび増殖因子および他の胎盤化合物は、内皮細胞の培養物、組織、組織構築物、人工の生物学的足場などにおいて血管新生を誘導し得る。本開示の胎盤抽出物は、in vitroおよびin vivoにおいて血管新生を誘導し得る。本開示の胎盤抽出物は、内皮細胞の増殖を促進することができる。実施形態では、本開示のヒトPEは、血管新生を調節することができる。血管新生の誘導のために使用される他の従来の化合物、例えばBMM（単一の精製された血管新生調節因子（精製されたVEGF-αまたはSDF-1など）および精製されたフィブリンを含む複合物（comound））などと比較して、本開示のPEは、BMMと比較して、増加した内皮細胞の血管新生性増殖（例えば、細管およびネットワーク形成）ならびに減少した筋線維芽細胞の血管新生型増殖（例えば、細管形成）を刺激する。本開示のPEはまた、BMMと比較した場合、このような細胞の増殖／分化パターンがBMMによる増殖と区別できるような、様々な細胞株（例えば、幹細胞、平滑筋細胞など）に対する異なる増殖および／または分化パターンを刺激する。
【００６６】
本開示のPEはまた、内皮細胞において、PEの非存在下で培養された内皮細胞と比較して、様々な遺伝子を上方制御できる。いくつかのこのような遺伝子は、血管新生関連遺伝子、細胞外マトリックスリモデリング遺伝子、および血管発生遺伝子を含む。いくつかの血管新生関連遺伝子は、ANGPTL4、CXCL3、ヒト成長因子（HGF）、ANGPT2、PGF、TYMP、VEGFA、HIF1A、およびFGF1を含むが、それに限定されない。本開示の胎盤抽出物によって誘導され得るいくつかの細胞外マトリックスリモデリング遺伝子は、MMP2、MMP9、COL4A3、およびLAMA5を含むが、それらに限定されない。血管発生遺伝子は、CDH2、HAND2、LECT1、およびMDKを含むが、それらに限定されない。
【００６７】
血管新生を調節する方法
本開示はまた、細胞培養物において血管新生を誘導する方法をも包含し、その方法は、内皮細胞を本開示のヒト胎盤抽出物の存在下で培養することを含む。実施形態では、細胞培養物は、血液および固形物を除去するために処理され、尿素と混合され、尿素を除去するために透析されたヒト胎盤サンプルから得られた本開示の胎盤抽出物の存在下で培養され、その胎盤抽出物は、サイトカインおよび増殖因子などの胎盤タンパク質を含有する。実施形態では、内皮細胞はヒト内皮細胞であり、更に他の実施形態では、細胞はヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）である。細胞培養物において血管新生を誘導する方法の実施形態では、細胞は、少なくとも約40,000細胞/cm2の密度で播種される。実施形態では、それらは、少なくとも約80,000細胞/cm2の密度で播種される。実施形態では、細胞培養物は、増殖培地および本開示の胎盤抽出物を含むプレート上で培養され得る。
【００６８】
本開示はまた、生体材料を本開示のヒト胎盤抽出物を含有する組成物中でインキュベートするステップおよび生体材料を宿主に移植するステップを含む、in vivoにおいて生体材料の血管新生（vascularization）を誘導する方法をも包含する。実施形態では、生体材料は、天然由来の材料および／または細胞を含む。実施形態では、生体材料は、ヒト由来の基質材料を含む人工の生物学的足場を含む。実施形態では、人工の生物学的足場は、ヒト臍帯静脈足場を含む。実施形態では、ヒト臍帯静脈足場は、脱細胞化される。いくつかの実施形態では、生体材料は、限定はされないがヒト内皮細胞（例えば、HUVEC）などの内皮細胞を播種される。本開示の実施形態では、生体材料は、HUVECを播種されたヒト臍帯静脈足場などの人工の足場材料を含む。いくつかの実施形態では、HUVECは、少なくとも約40,000細胞/cm2の細胞密度で生物学的足場に播種される。実施形態では、それらは、少なくとも約80,000細胞/cm2の密度で播種される。実施形態では、生体材料は、少なくとも約2時間、胎盤抽出物中でインキュベートされる。  
【００６９】
生体材料および人工の生物学的足場の血管化
本開示はまた、人工の生体材料、天然由来の生体材料、および宿主に移植されるべき他の生体材料を含むがそれらに限定されない生体材料に血管形成する方法をも包含する。生体材料の血管化に加えて、本開示の胎盤抽出物による生体材料の処理はまた、生体許容性の補助、炎症の低下、拒絶反応および瘢痕化の低下などのために、in vivoで使用する生体材料を前処理するためにも使用され得る。従って、本開示の胎盤抽出物および本開示の胎盤抽出物を含有する組成物は、このような移植の成果を改善するために、任意の数の生体材料に「投与」するために使用され得る。 
【００７０】
本開示はまた、特に人工の生体材料、例えば、移植可能な、本開示のヒト胎盤抽出物を含有する組成物中でインキュベートされたヒト由来の基質材料を含む、人工の生物学的足場なども包含する。本開示の生物学的足場は、哺乳動物、例えばヒトなどに移植され得る。本開示の生物学的足場は、宿主への移植に適した任意の生体材料を含み得る。本開示で用いるための生物学的足場の例は、組織、マトリックス材料、任意の数の天然由来生体材料などを含む人工の生物学的足場を含むがそれらに限定されない。実施形態では、生物学的足場は、２Ｄまたは３Ｄの生物学的足場である。実施形態では、生物学的足場は、ヒト由来の基質材料を含む。実施形態では、生物学的足場は、脱細胞化されたヒト臍帯静脈足場を含む。実施形態では、生物学的足場は、限定はされないが、ヒト細胞、ヒト内皮細胞（例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC））、幹細胞、他の多能性細胞などの細胞を播種される。
【００７１】
下記の実施例に記載されるように、本開示の胎盤抽出物中でインキュベートされた本開示の生物学的足場は、血管新生誘導複合物（compound）BMMまたは対照化合物中でインキュベートされた生物学的足場と比べて、より多くの血管化（例えば、血管新生）およびより少ない線維化を誘導する。本開示の胎盤抽出物中でインキュベートされた生物学的足場はまた、BMMまたは対照中でインキュベートされた生物学的足場とは対照的に、炎症促進陽性マクロファージ（例えば、CD86(M1)）に対する免疫抑制および血管新生促進陽性マクロファージ（例えば、CD205(M2)）のより高い比率を有した。
【００７２】
血管新生スクリーニングアッセイ
本開示の胎盤抽出物は、細胞培養物において血管新生を誘導するので、血管新生調節因子の同定およびスクリーニングのための良好なアッセイを提供する。従って、本開示はまた、血管新生調節因子を同定する方法およびアッセイをも包含する。
【００７３】
実施形態では、方法は、ヒト内皮細胞の培養物を本開示のヒト胎盤抽出物を含有する複合物（compound）の存在下で培養するステップ、およびヒト内皮細胞培養物を試験化合物と接触させるステップを含む。胎盤抽出物は細胞培養物において血管新生を誘導するので、血管新生が予想されるより少ないかまたは多い場合、試験化合物は、血管新生調節因子として同定され得る。従って、その方法はまた、培養物において血管新生の量を測定するステップ、およびその細胞培養物における血管新生の量が、試験化合物の非存在下で培養された培養物の血管新生の量より多いかまたは少ない場合、試験化合物を血管新生調節因子として同定するステップを含む。実施形態では、試験化合物の非存在下で培養された培養物と比較した血管新生の量の増加は、試験化合物が血管新生を誘導することを示す。試験化合物の非存在下で培養された培養物と比較した血管新生の量の減少は、試験化合物が血管新生を阻害することを示す。下記の実施例に記載されるように、本開示の方法による化合物トロンボスポンジン-1（TSP-1）のスクリーニングは、その化合物を血管新生の阻害剤として同定した。本開示はまた、本開示のヒト胎盤抽出物の存在下で培養された内皮細胞の培養物を含む、血管新生の調節因子を同定するために試験化合物をスクリーニングするための分析物をも提供する。本開示の分析物は、血管新生の調節因子を同定するための本開示の方法とともに使用され得る。
【００７４】
本開示の試験および方法に関する更なる詳細は、下記の実施例において提供される。下記の特定の実施例は、単に実例として解釈されるべきであり、いかなる方法においても本開示の残りの部分の限定として解釈されるべきではない。更なる詳述なしに、当業者は、本明細書の記載に基づいて、本開示を最大限に利用することができると考えられる。本明細書に引用されるすべての刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【００７５】
本開示の実施形態、詳細には、任意の「好ましい」実施形態は、単に実施の可能性のある例であり、単に本開示の原理の明確な理解のために記載されることが、強調されるべきである。多くの変形および修正が、本開示の趣旨および原理から実質的に逸脱することなく、上述の本開示の実施形態に対して行われうる。このようなすべての修正および変形は、本開示の範囲内で本明細書に含まれ、下記の実施形態によって保護されることが意図される。
【００７６】
下記の実施例は、当業者に、本明細書に開示される方法ならびに組成物および化合物の使用を実施する方法の完全な開示ならびに記載を提供するために示される。数値（例えば、量、温度など）に関して正確さを確保する努力を払っているが、いくらかの誤差および偏差が予期されるべきである。他に指示されない限り、割合は重量部であり、温度は℃であり、圧力は大気圧またはその付近である。標準温度および圧力は、20℃および1気圧と定義される。
【００７７】
比率、濃度、量、および他の数値データは、本明細書において範囲の形式で表されうることに注意すべきである。このような範囲の形式は、利便性および簡便性のために使用され、従って、範囲の境界値として明確に挙げられた数値を含むだけでなく、あたかもそれぞれの数値および部分範囲が明確に列挙されているかのように、その範囲内に包含されるすべての個々の数値または部分範囲をも含むように、柔軟に解釈されるべきであることが理解される。説明すると、「約0.1％〜約5％」の濃度範囲は、明確に挙げられた約0.1 wt％から約5 wt％の濃度を含むだけでなく、示された範囲内の個々の濃度（例えば、1％、2％、3％、および4％）ならびに部分範囲（例えば、0.5％、1.1％、2.2％、3.3％、および4.4％）をも含むと解釈されるべきである。実施形態では、「約」という用語は、数値の有効数字に従った従来の数値丸め（端数処理）（rounding）を含み得る。
【実施例】
【００７８】
現在、本開示の実施形態を記載しているが、通常、下記の実施例は、本開示のいくつかの更なる実施形態を記載する。本開示の実施形態は、下記の実施例ならびに対応する文章および図面に関連して記載されるが、本開示の実施形態をこの記述に限定する意図はない。逆に、その意図は、本開示の実施形態の趣旨および範囲内に含まれるすべての代替、修正、ならびに同等物を網羅することである。
【００７９】
[実施例１]
ex vivo由来の生物学的足場での胎盤由来抽出物を用いた血管新生の誘導および調節
序論
本実施例は、複雑なヒト胎盤抽出物（PE）を用いた血管化を誘導する方法を記載する。PEは、ヒト胎盤に由来し、2Dおよび3D in vitroモデル、ならびにin vivoにおける生物工学的な組織移植片内で血管新生を誘導することができる。本実施例はまた、現在のin vitroモデルと比較して向上した感受性を有する、トロンボスポンジン-1を血管新生阻害タンパク質として積極的にスクリーニングするための胎盤抽出物の使用を記載する。特に、このモデルは、血管新生の速度および種類（陥入型対発芽型）にわたる調節を可能にし、従来のアプローチに勝る多くの利点ならびに再生医療および薬剤学の分野における幅広い用途を示す。
【００８０】
組織内での物質移動制限は、効果的な生体材料を作製するための１つの障害である。たとえ、これが一時的に克服され、ヒト生物学的足場内への細胞遊走が改善されたとしても、効果的な血管系の構築は、依然として、細胞の密集した材料に長期的な栄養送達を提供するための主要目的である。成人では、新たな血管は、主に、血管新生の生理的な過程によって作られ47、最終的に、栄養分に富んだ血管網の形成を引き起こす。本実施例は、血管新生が、ヒト臍帯静脈（HUV）血管移植片において誘導され、長期的な栄養送達システムをもたらし得ることを実証する。
【００８１】
人工器官の血管化を成功させること、および血管新生調節因子によって閉塞組織をin vivoで修復させることは、従来、臨床に再生医療の治療の成功をもたらすための、主要な障害であった。血管新生を開始し、より大きな血管形成を促進するために、直接細胞播種（単培養および共培養）、幹細胞の使用、ならびにヒト由来調節因子／増殖因子の組合せなどの、様々な異なるアプローチが取られてきた。これまで、通常、非ヒト動物の化合物を用いるこれらのin vitroでのアプローチを臨床に変換することはほとんど成功していなかった。
【００８２】
当分野での重要な問題は、ほとんどの一般的な／成功しているアプローチ（マトリゲルまたは基底膜マトリックス）が、Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫細胞に由来し、そのためヒトの治療には不適切だということである。従って、in vitro系とin vivo系との両方において血管形成を活発に促進するヒト由来の材料を用いたアプローチまたは機構は、大きな影響を与えるであろう。本実施例は、2Dおよび3D in vitroモデル、ならびにin vivoにおける生物工学的な組織移植片内で血管新生を誘導することができる、ヒト胎盤抽出物（hPE）を提供する。PEは、活性のあるヒト生体分子の複合物であり、本実施例は、in vivoおよびin vitroでの血管新生の誘導に加えて、ex vivo由来のヒト臍帯静脈血管移植片において、このモデルが血管新生の速度および段階にわたる調節を可能にすることを実証する。本実施例はまた、PEが毛細血管形成を促進すると同時に、投与されたコラーゲンベースの生物学的足場を用いて線維化を減少させることも実証する。
【００８３】
方法
胎盤抽出物の抽出。正期胎盤をUF Health Shands Hospital（Gainesville, FL）から生後12時間以内に回収した。臍帯および胎膜を除去し、胎盤を2 cm角に切断して冷凍した。-1℃/minの速度で-86℃まで段階的に冷凍した12時間後、胎盤角を4℃に維持した冷蔵室に移し、そこで残りの手順を遂行した。4℃にしたら直ちに、100グラムの組織を150 mLの冷却した3.4 M NaClバッファー（1 Lの蒸留水中、198.5 g NaCl、12.5 ml 2Mトリス、1.5 g EDTA、および0.25 g NEM）と混合した。NaClバッファー／組織混合物を、Tissuetek Homogenizerを用いて3200 RPMでペースト状にホモジェナイズし、その後、7000 RPMで15分間遠心分離して上清と分離した。このNaCl洗浄過程を更に2回繰り返し、毎回上清を捨てて、血液を除去した。
【００８４】
次に、沈澱を100 mLの4M尿素バッファー（1 Lの蒸留水中、240 g尿素、6 gトリス塩基、および9 g NaCl）中でホモジェナイズし、マグネチックスターラー上で24時間撹拌し、その後、14000 RPMで20分間遠心分離した（Sorvall RC6+ Centrifuge, Thermo Scientific, NC, USA）。上清を取り出し、1 LのTBS（1 Lの蒸留水中、6 gトリス塩基および9 g NaCl）ならびに滅菌のため2.5 mlのクロロホルム中に入れた8000 MW透析チューブ（Spectrum Laboratories, Inc., CA, USA）を用いて透析した。バッファーを更に4回、それぞれ2時間間隔で、新しいTBSと交換した。最後に、透析チューブの内容物を3000 RPMで15分間遠心分離して（Allegra X-12R Centrifuge, Beckman Coulter, Inc., CA, USA）、重合したタンパク質を除去し、上清（ピンク色の粘性のある溶解液）を回収して使用するまで-86℃で保存した。
【００８５】
生体分子組成分析。RayBiotech, Inc. からのサンドイッチ免疫アッセイアレイ（Human Cytokine Antibody Array C Series 1000, Inc, GA, USA）を用いて、相対サイトカインレベルを測定した。Foto/Analyst Luminaryfx Workstation（Fotodyne Incorporated, WI, USA）を用いて化学発光を検出し、TotalLab 100ソフトウェア（Nonlinear Dynamics, Ltd, UK）を用いてシグナル強度を測定した。基底膜生体分子の相対存在量は、Orbitrap Velos Pro（ThermoFisher, Waltham, MA）とインターフェース接続されたWaters NanoAcquity HPEC（Waters, Milford, MA）システムとともにnano LC/MS/MSを用いて、MSBioworks（Ann Arbor, MI）によって行われた。Mascotデータベース検索エンジン（Boston, MA）を用いて、一次配列データベースからタンパク質を同定した。
【００８６】
hPL誘導性血管新生ネットワーク由来の細胞のRT-PCR解析。384-ウェルRT2 Human Angiogenesis RT2 Profiler PCR Arrays（PAHS-024A, Quiagen, CA, USA）を用いて、相対的な血管新生遺伝子発現を測定した。Accutase（Innovative Cell Technologies, San Diego, CA）を用いてECを培養プレートから剥がし、直ちに100μlのRNAlater中で保存した。RNeasy Mini Kit（Qiagen, CA, USA）を用いてRNAを抽出し、RNase-Free DNase kit（Quiagen, CA, USA）を用いてゲノムDNAを消化した。RT2First Strand Kit（SA Biosciences, TX, USA）を用いて、42℃で15分間インキュベートした後、95℃で5分間インキュベートして反応を停止することによって、精製したRNAをcDNAに逆転写した。次に、cDNAをRT2 SYBR Green Mastermix（SA Biosciences, TX, USA）と混合し、384-ウェルHuman Angiogenesis PCR Arraysに添加した。Bio Rad CFX384 Real-Time System（Bio-Rad, CA, USA）を用いて、添加されたアレイプレートは10分間95℃の変性サイクル、30秒60℃で40サイクルのアニーリング／伸長サイクルを受け、最後に、60℃から95℃まで℃/秒の速度で傾斜をつけることによって融解曲線を得た。ΔΔCt法およびRT2 Profiler PCR Array Data Analysis Template v4.0ソフトウェアパッケージ（Quiagen, CA, USA）を用いて、データを解析した。
【００８７】
ヒト臍帯静脈内皮細胞の分離および筋線維芽細胞の培養。リン酸緩衝生理食塩水（Gibco, Invitrogen, NY, USA）中の1 mg/mlウシI型コラゲナーゼ溶液を用いて血管壁から剥離することによって、ヒト臍帯静脈（UF Health Shands Hospital, Gainesville, FLから回収された）から内皮細胞を得た。初代由来のヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）は、すべての実験において継代1〜3代の間に使用された。増殖のためには、完全VascuLife基礎培地（VascuLife VEGF Medium Complete Kit, Lifeline, MD, USA）を用いて細胞を培養した。血管新生実験のために、500 mLの（VascuLife VEGF Medium Complete Kit, Lifeline, MD, USA）に25 mlのグルタミン、0.5 mlのヒドロコルチゾン、0.5 mlのアスコルビン酸、10 mlのFBS、および1.25μlのbFGFを含むVascuLife基礎培地を用いて、内皮細胞培地を調製した。ヒト筋線維芽細胞（CRL 2854）は、継代5〜10代の間に使用され（ATCC, Manasses, VA）、10％FBSを補給した低グルコースDMEMを用いて培養された。
【００８８】
胎盤抽出物誘導性血管新生アッセイの準備。他に明記しない限り、32μlの胎盤抽出物を解凍し、96ウェルプレートの各ウェルにピペットで分注した。オービタルシェーカーを用いて30 RPMで1分間、抽出物を各ウェルの底に均一にコーティングした。コーティングしたプレートをその後、37℃で30分間インキュベートした。その後、直接ピペットで分注することにより、HUVECを20000細胞/cm2、40000細胞/cm2、または80000細胞/cm2で播種した。それぞれの濃度で、1、3、および5日間を含む複数の時点を調査した。内皮細胞培地で希釈された0、5、10、20、および35μg/μLの最終濃度を用いて、トロンボスポンジン-1を血管新生阻害薬として試験した。
【００８９】
血管新生ネットワークの形態学的特徴。内皮細胞培地とともに2μg/mL のCalcein AM（Invitrogen-Life Technologies, NY, USA）濃度で染色後、ネットワーク形成を分析した。暗室において、染色した細胞を37℃、5％C02で30分間インキュベートし、その後、Zeiss Axiovert 200倒立蛍光顕微鏡（Zeiss, Thornwood, NY）を用いて画像を撮影した。ImageJ 1.45s（NIH, Bethesda, MD）を用いて、画像を解析し、細管の長さ、細管の幅、分岐点、および他の網目特性を測定した。分岐点は、分岐が合流するかまたは細管が発芽するすべての結節点での位置として手作業で割り当てられ、細管の長さは、分岐点から連結した分岐点までの曲線長を測定することによって評価された。細管の幅の測定は、曲線長の開始および終了からそれぞれ10μmの２つの領域ならびに曲線長の中央の１つの領域を含む、細管あたり３つの異なる領域で行われた。被覆領域パーセントは、imageJの機能「binary≫convert to mask」を用いて画像を処理した後、「mean」の測定によって測定された。TSP-1実験では、最終値は、投与していないサンプルに対して正規化され、ピクセル値の総数に対して「1」のパーセンテージ値として計算され、「被覆領域％」として示された。
【００９０】
ヒト臍帯静脈足場の起源および胎盤抽出物インキュベーション。胎盤をUF Health Shands HospitalFlorida（Gainesville, FL）から回収し、以前に記載されたような自動化された方法を用いて32、HUVを切断した。切断したHUVサンプルを、1％SDS（Thermo Scientific, Rockford, IL）溶液中、20：1（w:v）の溶媒／組織量で脱細胞化した。サンプルをオービタルシェーカー上で100 rpm、24時間脱細胞化し、その後、PBS中70 U/mL DNase I溶液（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）の中で、一晩37℃でインキュベートする前に、PBSで洗浄した。サンプルを最終的に0.2％過酢酸／4％エタノール（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）溶液を用いて2時間滅菌し、最後にPBSを用いてpHを平衡化した（7.4）。脱細胞化に続いて、足場を1.5 cm×1.5 cm×0.075 cmのシートに切り、-85℃に事前凍結し、その後、Millrock卓上マニホールド型凍結乾燥機（Kingston, NY）を用いて24時間-85℃、10 mTの真空下で凍結乾燥した。細胞播種の直前に、足場を2時間、hPE、マトリゲル、またはPBS（対照）に浸し、播種した。
【００９１】
動物移植片の再血管形成試験。オスのSprague-Dawleyラット（6か月齢、200 g）をCharles River Laboratories（Wilmington, MA, USA）から購入し、すべての手順はUniversity of Florida IACUCの承認を受けた（UF#201207728）。生物学用フード内で、最終的に滅菌されたHUV足場を、それぞれ、5 mLのhPE、マトリゲル、またはPBS（対照）中で2時間インキュベートした。イソフルラン吸入を用いて動物を麻酔し、背中の左右側面に、はさみを用いた鈍的処理によって皮下ポケットを作った。各皮下ポケットに１つの足場を挿入し、4-0縫合糸（Coviden, Mansfield, MA）を用いて皮膚を縫合した。移植5日後、動物を安楽死させ、分析のためにサンプルを摘出した。
【００９２】
毛細血管網の形成を分析するために、動物から摘出した直後に、繊維被膜を外科用メスで切除し、HUVサンプルをスライドグラス上に載せた。Axiocam HRmデジタルカメラ（Zeiss, Oberkochen, Germany）を備えたImager M2光学顕微鏡（Zeiss, Oberkochen, Germany）を用いて、半透明の足場シートのトップダウン像を撮影した。細胞遊走および足場再構築を定量化するために、組織サンプルをNeg-50凍結切片用包埋剤中に包埋し、7μm切片にして（Microm HM550 cryostat, Thermo Scientific, Waltham, MA）、標準的なヘマトキシリンおよびエオシン（H&E）染色（Richard-Alan Scientific, Kalamazoo, MI）を用いて染色した。
【００９３】
統計。結果は、平均±標準偏差として報告される。直線回帰は、SPSS（IBM, Somers, NY）を用いて行われた。Rt-PCRデータは、RT2 Profiler PCR Array Data Analysis Software v3.2（SABiosciences, Valencia, CA）を用いて解析された。
【００９４】
HUV生物学的足場におけるかん流バイオリアクター培養および血管新生誘導。細胞を播種された管状構築物を、二重かん流バイオリアクター（図７）内で5日間、4 mL/min、60パルス/minの内腔流速で培養した。血管壁のせん断応力は、Haagen-Poisseuilleの式を用いて、培地の流れは一定および層流であり、血管は非弾性であり、円筒形で直線状であるとの仮定のもとで計算され134：
【数１】
2016516091.tif 000003
式中、Qは、平均体積流量であり、μは、水の37℃での動粘度に等しい（0.000692 kg/(m*s)）134。せん断応力は、各パルス間に0 dynes/cm2から0.04 dynes/cm2が繰り返される。環境は37℃および5％C02の標準的な細胞培養条件下に維持された。システム内の圧力は、反管腔側と内腔の両方の流れ回路において無視できるレベル（＜2 mmHg）で維持され、足場をはさんで存在する圧力勾配を生じない。バイオリアクター中の培地は、2日ごとに補充された。かん流培養の５日後、10 cmの長さの管状足場を、組織学的分析のために環状に切断した。
【００９５】
結果
ヒト胎盤抽出物の抽出および分析
最初の機械的均質化および遠心分離の後、抽出法は、尿素ステップを用いることによって、分子を線状にし、可溶化した。この後、透析分離によって、尿素を除去し、生体分子をその本来の立体構造にリフォールディングした。抽出のすべてのステップは冷蔵室において4℃で行われた。PEの最終溶液は、透明で、粘性が高く、8 kD〜868 kDの生体分子を含んでいた。
【００９６】
ヒト胎盤抽出物（hPE）の血管新生能は、hPEでコーティングされた組織培養プレート（TCP）上に初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を播種することによって、最初に分析された。初期段階の細胞のコード化および発芽は、細胞播種の1時間以内に見られ（データは示されない）、血管新生ネットワークは、実験終了の3日目まで成熟し続けた（図１Ａ〜Ｂ）。個々の細胞コード（多細胞性）の長さは、播種の1日目（図１Ｃ）から3日目（図１Ｄ）まで有意に増加した。培養3日後、細胞は、対照サンプルと比較して広範囲に及ぶ血管新生ネットワークを形成した（図１Ｅ、１Ｆ）。
【００９７】
胎盤抽出物の生体分子分析
評価された120のサイトカインのうち、54の血管新生関連サイトカインが、胎盤溶解液中に検出された（図２Ａ）。最もよく見られる血管新生関連サイトカインは、アンギオジェニンであり、それは新たな血管形成の強力な刺激因子である16。肝細胞増殖因子（HGF）、線維芽細胞増殖因子-4（FGF4）、レプチン（LEP）、ICAM-1、ICAM-2およびTIMP-2を含むがそれらに限定されない有意な血管新生促進サイトカインもまた検出された。LC-MS/MSは、アネキシン（ANXA1、ANXA2、ANXA4、およびANXA5）、好中球ディフェンシン（DEFA1）、インターロイキンエンハンサー結合因子（ILF2およびILF3）、IL27、ITBG1、ならびにMRC1を含む免疫関連タンパク質の存在を示した。血管新生関連基底膜（BM）タンパク質もまた、lc-ms/msを用いて検出され、ラミニン（LAMA2、LAMA4、LAMA5、LAMB1、LAMB2、LAMB3、およびLAMC1）、フィブロネクチン（FN1）、ヘパリン硫酸（HSPG2）ならびに4型コラーゲン（COL4A1、COL4A2、およびCOL4A3）を含むが、そのそれぞれは、血管新生において重要な役割を果たすことが示されている17-20。
【００９８】
hPE誘導性血管新生ネットワーク内での内皮細胞遺伝子発現
サイトカイン分析と併せて、HUVEC遺伝子解析は、胎盤抽出物の血管新生特性を更に支持した。RT-PCR解析は、hPE上に3日間播種された内皮細胞が、肝細胞増殖因子、上皮増殖因子、および胎盤増殖因子を含む幅広い必須の血管新生促進遺伝子を発現することを示した（図２Ｄ）。更なる上方制御された遺伝子は、MMP2およびMMP9を含み、それは、内皮細胞ならびにECMリモデリングと関連した他の細胞の遊走を促進するために、周囲の細胞外マトリックスの分解を助けるタンパク質分解酵素である21。IV型コラーゲンもまた上方制御され、それは、成熟した微小血管系における基底膜の形成と関連する22。
【００９９】
in vitroでの毛細血管の発達および形態の調節
歴史的に、in vitroアッセイは、血管新生の速度および段階をほとんどまたはまったく制御しない9。本データは、in vitroでのhPEによる血管新生アッセイが、初期の細胞播種密度を変えることによって、血管新生ネットワーク形成の成熟および形態を制御するために調節され得ることを示す。1日後、40,000細胞/cm2の密度で播種されたHUVECは、80,000細胞/cm2の密度での播種と比較してより明確な細管を形成したが、5日目までに、両密度で播種された細胞は、明確な細管を示した（図３Ａ）。これらの結果は、培養物がhPEに曝露される際、細胞播種密度を変えることによって、ネットワーク形成の成熟段階が制御され得ることを示す。例えば、高い細胞播種密度は、血管新生ネットワークのより遅い成熟を引き起こし、ネットワーク形成が延長されるため、血管新生の進行の分析を改善できるであろう。一方、より低い細胞密度は、血管新生ネットワークのより早い成熟を引き起こし、従って、抗癌剤による血管新生阻害剤の有効性を試験するためなどの、より迅速なスクリーニング法を可能にする。
【０１００】
in vitroでの血管新生アッセイのための歴史的に最も代表的な基準として、マトリゲル誘導性血管新生ネットワークを、hPE誘導性ネットワークと比較した（図３Ａ）。内皮細胞毛細血管網の形態は、細胞培養物をマトリゲルまたはhPEのいずれかに曝露することによって最初に分析され、Calcein AMを用いて生存およびネットワーク構造を決定した。播種1日後、マトリゲルコーティングプレートは、HUVECが明らかな血管新生細管ネットワークを形成することを示したが、3日後、ネットワーク構造は崩壊してアポトーシス細胞の球体となった。hPE誘導性ネットワークではいくらかの細胞死が認められたが、延長した5日間後、アポトーシス性球状構造は観察されなかった。
【０１０１】
血管新生の後期の間、ECは、平滑筋細胞（SMC）を動員して、毛細血管網が成熟するように血管を安定させる。そのため、平滑筋細胞の形態に対するhPEおよびマトリゲルの影響を評価した。興味深いことに、HUVECの非存在下では、マトリゲル上に播種されたSMCは、1日後に細管を形成した（図３Ｂ.ｉｉ）が、hPEコーティングプレート上では典型的な「凸凹（hill and valley）」構造が維持され（図３Ｂ.ｉ）、細胞型間での分子シグナル伝達経路の著しい違いを示唆した。SMCは微小血管形成の初期段階で細管を形成することは知られていないため、これらの結果は、hPEによる血管新生が、より正確に正常な生理機能を示すことを示唆するかもしれない。
【０１０２】
薬物スクリーニング応用のためのhPE誘導性血管新生の分析
その再生医療における役割に加えて、ヒト胎盤抽出物（hPE）によって引き起こされる血管新生は、in vitroにおいて血管新生関連薬をスクリーニングするその能力について試験された。マトリゲルおよびhPEによる血管新生アッセイは、新血管形成（neovascularization）に対して強力な阻害活性を有する糖タンパク質であるトロンボスポンジン-1（TSP-1）に対してスクリーニングされた。TSP-1は、固形腫瘍の抗血管新生療法のためのモデル薬物である23。培養の1日後、組織培養プレート上に直接播種された対照HUVECは、TSP-1によって影響を受けず、細胞は典型的な敷石状の形態を形成した。一方、hPE処理された培養プレート上で培養されたHUVECは、有意に低下した血管新生ネットワーク形成を有した（図４Ａ）。結果は、TSP-1濃度に応じて直線的に減少する全細管長および分岐点を示す（図４Ｂ）。重要なことに、これらの研究は、hPEによるアッセイが、マトリゲルによるアッセイと比較して、薬物濃度により感受性が高いことを示唆する。これは、TSP-1濃度と血管新生ネットワーク被覆領域の減少率との間のより高い相関によって示され、それぞれ、0.97および0.36のR2値を有する（図４Ｃ）。加えて、hPEはヒトに由来するため、非ヒトシステムを用いたスクリーニングに起因しうる種の違いに基づく不確実性を防ぐ13、14。
【０１０３】
3D生物学的足場内でのin vitroにおける血管新生ネットワーク形成
人工器官の血管化を成功させることは、従来、有効な再生医療の治療法の開発に対する主要な障害であったが24、ex vivo由来の生物学的足場において血管新生を誘導するhPEの潜在能力が分析された。これらの研究は、hPEが、人工の（脱細胞化された）ヒト臍帯静脈（HUV）生物学的足場において血管新生ネットワークの形成を誘導したことを示す（図５Ａ）。2D培養プレートでのアッセイと一致して、生物学的足場上に播種された内皮細胞（EC）は、連結して多細胞性のコードになる細長い形態を発達させ、複雑な相互連結性ネットワークを形成した。
【０１０４】
in vivoでの血管新生は、様々な機構によって起こり、最も一般的には発芽（sprouting）または陥入（intussusception）である。これらのデータは、hPEとともにインキュベートした際、発芽型（sprouting）対陥入型（intussusceptive）の血管新生が、細胞密度を変えることによってin vitroで調節され得ることを示す。より低い細胞密度（2×104細胞/cm2）では、hPEでインキュベートされた足場上のネットワーク形態は、発芽型血管新生を示し（図５Ｃ.ｉ、５Ｃ.ｉｉ）、中間の密度（4×104細胞/cm2）では、ネットワーク形態は、発芽型および陥入型血管新生の組合せを示し（図５Ｃ.ｉｉｉ、５Ｃ.ｉｖ）、より高い密度（6×104細胞/cm2）では、ネットワーク形態は、陥入型血管新生により類似していた（図５Ｃ. ｖ、５Ｃ.ｖｉ）。発芽は通常、毛細血管を欠く低い細胞密度領域において血管新生の早期の間に起こるため、細胞密度と血管新生の特定の機構との間の相関は、in vivoでの毛細血管およびネットワーク形成の現時点での理解を支持する。対照的に、陥入は、毛細血管および内皮細胞がすでに存在する、より高い細胞密度領域で起こる25、26。
【０１０５】
in vivoでの血管新生の誘導
皮下ラットモデルを用いて（図６Ａ）、投与された足場（マトリゲルおよびhPE）に対する血管新生反応を、移植5日後に評価した。対照とマトリゲルでインキュベートされた足場との両方は、足場周囲に顕著な線維化を示したが、一方、hPEを投与された足場は、移植片の周囲に目に見える線維化を示さなかった（図６Ｂ.ｉ〜６Ｂ.ｉｉｉ）。hPEサンプルにおける線維化の予防は、LC-MS/MSによって検出されたような、抗炎症性アネキシン（ANXA1、ANXA2、ANXA4、およびANXA5）27、DEFA128などの抗菌性ディフェンシンペプチド、ならびにMRC1を含むがそれらに限定されない免疫関連分子に起因すると考えられ、それらは、ウイルスおよび細菌などの潜在的な病原体と結合することが知られている。
【０１０６】
明視野顕微鏡検査によって示されたように、マトリゲルおよびhPEでインキュベートされた足場の両方は、対照と比較して新血管形成（neovascularization）の顕著な増加を示した（図６Ｂ.ｉｖ〜６Ｂ.ｖｉ）。全体の血管化は同様に見えるが、hPE処理は成熟した毛細血管床の形成を示す一方で、マトリゲルサンプルはより少なく構造化されたように見え、成熟した毛細血管床形成の証拠はなかった。H&E染色切片は、細胞がhPE中でインキュベートされた足場内および足場全体にわたって遊走した一方で、マトリゲルでインキュベートされたサンプルは減少した細胞浸潤を示し、対照サンプル内の細胞は足場辺縁部に限定されたことを示す（図６Ｂ.ｖｉｉ〜６Ｂ.ｉｘ）。マトリゲルおよびhPEでインキュベートされたサンプルの両方における細胞遊走の改善は、足場構造に吸着した走化性因子および増殖因子シグナルの結果であった。hPEおよびマトリゲルを投与された足場の両方による対照を超えて改善された細胞遊走にもかかわらず、サンプル群間での細胞再構築は差異を示した。マトリゲルでインキュベートされたサンプル中の細胞の高密度な領域は、もともとのHUV繊維の残存を示し、ほとんど完全に再構築され、より組織化された線維および細胞構造を示しているように見えるhPEでインキュベートされた足場と比較して、質的により不定形な全体構造を持っていた（図６Ｂ.ｖｉｉ〜６Ｂ.ｉｘ）。
【０１０７】
考察
組織再生、梗塞組織および虚血性創傷の修復は、創傷の回復または器官の置換のための戦略の改善が重大な臨床的影響を及ぼすであろう３つの臨床領域である。様々な用途での羊膜および絨毛膜の使用は、過去5年にわたって著しく成長を遂げており、周産期組織が大きな臨床的将来性を有することを示す多数の根拠の増加を伴っている29〜32。
【０１０８】
本明細書の結果は、生理的な比率のヒトに由来する強力な血管新生および組織再構築の刺激因子を濃縮し、送達するための新たなアプローチを詳述する。これらのデータは、毛細血管形成の開始に向かう細胞活性の向上（in vitroおよびin vivo）、増殖または成熟動態を調節する能力を伴った血管新生の際のEC表現型の制御、ならびにin vivoでの組織線維化の大幅な減少を示す。
【０１０９】
in vitroでの毛細血管網形成の成熟速度を調節する能力、ならびに発芽型および陥入型の血管新生ネットワーク形態の出現を制御する能力は、創傷治癒および器官再生の間の調節経路の理解を前進させる有用な基盤を提供しうる。マトリゲルとの比較に基づいて、hPEが細胞を刺激する機構は、根本的に異なっていると思われる。マトリゲルとインキュベートされたSMCは、毛細血管様の形成を開始したのに対して、hPEに曝露されたSMCは、それらの典型的な凸凹（hill and valley）形態を保持し、従って、ヒト由来hPEは、より複雑なモデルにおいて、生理的血管新生のより代表的なモデルを提供しうる。
【０１１０】
現行の方法の多くは、単一または個別の血管新生調節因子の組合せに依存するヒト由来の（組換え）調節因子に基づく33。個別の組み合わせは、変動を制御し、多くの異なる要素からなるアプローチに特有の複雑性を減少させる上で有用であるが、それらは、スクリーニング過程を制約し、抗血管新生、腫瘍抑制薬の可能性を試験する際に非常に重要となる可能性がある幅広いヒトのin vivoでの分子相互作用を表現できない。
【０１１１】
hPEに基づくモデルに特有の複雑性は、腫瘍抑制薬のためのより効果的なスクリーニング法を提供することによって、製薬業界に進歩をもたらしうる。現行の技術と比較して、ヒトECのhPEへの曝露は、より低い検出限界を有し、血管新生阻害薬濃度（TSP-1）に対する感受性の増加を有することが示された。
【０１１２】
hPEに基づくモデルは、生理的比率に近い幅広いヒト由来分子を用いて血管新生を誘導する。in vivoでの血管形成は複数の代謝経路の誘導を必要とするため、選択された分子経路のみの調節は、新規の抗血管新生薬を発見する試みを制限すると考えられる34、35。従って、薬物は、任意のこれらの多数の経路との相互作用によって血管新生を調節しうるが、局所環境の複雑性が欠如している場合、有効な血管新生を誘導する効果をほとんど持たないかもしれない。本実施例におけるin vivoでの分析の結果は、複雑なPEが多数の生化学的経路に影響を与え、様々な効果をもたらす更なる証拠を提供する。データは、hPEが血管新生特性の向上を示しただけでなく、また、hPEを投与された生物学的足場内での線維化の減少によって示されるように、免疫低下特性を有することも示された。血管新生と免疫学的分子経路との間の複雑な相互接続を考えると36、hPEの分子組成は、顕著な免疫学的反応および炎症反応なしに毛細血管形成を誘導するための、臨床に応用できる技術の開発に適した基盤を提供する。
【０１１３】
上述の研究の良好な結果は、PE中の重要な増殖因子（GF）および遺伝子調節因子の存在だけでなく、またそれらの生理的比率での存在とも関連していると思われる。例えば、VEGFは、hPE誘導性ECにおいて上方制御されたが、hPE溶液は検出可能なレベルを含まなかった。これは、スタンダードタイプとGFR（増殖因子減少）タイプとの両方において活性濃度のVEGFを含有するマトリゲル（BMM）とは対照的である。より成熟した毛細血管床形成を示す本明細書の結果と併せると、VEGFの存在は、多くの要因のうちの１つに過ぎず、他の調節因子の存在が、恐らく血管発達において重要な役割を果たす。同様に、血管新生を開始するために使用されるヒト組換えタンパク質と比較すると、これらは、高濃度の（通常）単一のGFに依存している37〜39。臨床適用された単一の反応性の高いGFでは問題が報告されており、望ましくない影響をもたらす40〜42。
【０１１４】
hPE血管新生モデルは、2Dおよび3Dのin vitroモデル、ならびにin vivoでの生物工学的な組織移植片内で有効性が確認され、容易に様々な臨床応用または薬学的応用に適用され得る。生理的に健康なヒト血管床からのその起源は、その血管新生特性および免疫低下特性と相まって、現行の血管新生モデルの間でそれを独特なものにする。本明細書に示されたデータは、代替的な、より有効なアプローチに対する需要が臨床的優先事項である多くの重要な臨床上の問題において、hPEが極めて重要な役割を果たすことを示す。
【０１１５】
（参考文献）
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ−Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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